Применение диагностической латексной тест-системы для обнаружения антигенов лептоспир в крови экспериментально инфицированных животных

ПРИМЕНЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАТЕКСНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ ЛЕПТОСПИР В КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ИНФИЦИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ

Е.Г.ВОЛИНА, П.Е.ШКАРЛАТ, Н.В.ЯШИНА, Н.И.ПРОКОПОВ

Кафедра микробиологии РУДН. 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

Медицинский факультет

О.А.ВЕРХОВСКИЙ Лаборатория иммунологии и биотехнологии Российского НИИ экспериментальной ветеринарии. 109472, Москва. Кузьминки

Предложена диагностическая тест-система на основе антительных латексных диагностикумов (АЛД) для обнаружения антигенов легггоспир 2 серогрупп - Canicola и Icterohaemorrhagiae.

В опытах с использованием 15 штаммов различных серогрупп лептоспир было установлено, что каждый из приготовленных АЛД вступает в реакцию латекс-агглютинации (РЛА) только с культурами лептоспир гомологичных серогрупп. Рекомендованная тест-система используется для постановки РЛА на стекле. Время появления положительных результатов составляет 1,5-2 минуты, при концентрации лептоспир (3-4,5) 10б кл/мл.

Кровь экспериментально инфицированных лептоспирами мышей была исследована в РЛА с разработанными АЛД. Показана их высокая чувствительность и специфичность. Важно, что использование АЛД позволяет не только быстро обнаружить лептоспиры и их антигены в крови инфицированных животных, но и одновременно установить их серогрупповую принадлежность.

Клинический полиморфизм и особенности биологии и антигенной структуры лептоспир, представленных 202 серологическими вариантами, объединенными в 23 серологические группы, создают определенные трудности в диагностике лептоспирозной инфекции человека и животных.

Из лабораторных методов диагностики приоритетными являются бактериологический и серологический. Однако первый из них требует длительного времени (до 3 месяцев) проведения в связи с медленным размножением лептоспир (время генерации составляет 13-14 часов) и специальных навыков микроскопии в темном поле зрения микроскопа для контроля за размножением и последующей идентификации возбудителей в реакции микроагглютинации (РМА). Обнаружение антител в сыворотке крови инфицированных в РМА является поздним методом диагностики и требует поддержания набора из 15-23 живых эталонных патогенных культур лептоспир, что не всегда возможно. Кроме того, могут наблюдаться перекрестные реакции, в результате чего возникает необходимость в проведении трудоемкого иммуноабсорбционного теста.

Ранняя диагностика этой инфекции важна для проведения лечебных и профилактических мероприятий.

Целью работы явилась разработка диагностической тест системы на основе леп-тоспирозных антительных диагностикумов для раннего и быстрого обнаружения антигенов лептоспир и одновременно установления их серогрупповой принадлежности.

Материаллы и методы

Для внутривенной иммунизации 4 кроликов использовали 7-дневные культуры патогенных лептоспир серогрупп Canicola (штамм Каширский) и Icterohaemorrhagiae (штамм М-20). Штаммы культивировали при 28°С в водно-сывороточной среде, содержащей 8-10% инактивированной сыворотки кроликов.

В полученных от кроликов гипериммунных сыворотках определяли титры антител в реакции микроагглютинации (РМА). Из этих сывороток выделяли фракцию IgG-антилептоспирозных антител, которые адсорбировали на частицах полистирольного латекса. Адсорбцию проводили на ультразвуковой бане в течение 3 минут с последующей обработкой на встряхивателе при 4° С 2 часа и дальнейшей инкубацией при той же температуре до 4 суток. Трижды отмывали дистиллированной водой с центрифугированием при 4000 об/мин 10-15 минут. К полученному осадку сенсибилизированного IgG-антителами латекса добавляли физиологический раствор до первоначального объема и консервировали раствором азида натрия конечной концентрации 0,05%.

Для предварительной проверки приготовленных таким способом АЛД на чувствительность и специфичность использовали 15 штаммов патогенных лептоспир различных серологических групп: Australlis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Grippotyphosa, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Mini, Pomona, Pyrogenes, Sejroe, Shermani, Tarassovi. Контролем служила 10% водно-сывороточная среда для культивирования лептоспир. В положительных случаях отмечалась хорошо видимая агглютинация частиц латекса. Учитывали время появления агглютината.

Белых мышей инфицировали внутрибрюшинно штаммами Каширский и М-20, через 30, 90, 120, 150 минут мышей усыпляли, кровь из сердца засевали на водносывороточную среду и исследовали в РЛА, которую ставили следующим образом.

На предметное стекло наносили две капли цитратной крови инфицированной мыши, к каждой из них добавляли по капле дистиллированной воды. После того, как наступал гемолиз эритроцитов, в одну каплю вносили АЛД анти-Canicola, а в другую - АЛД анти-Icterohaemorrhagiae. Контролем служила капля цитратной крови неинфицированной мыши. Учитывали время появления агглютинации латексных частиц в положительных случаях.

Все опыты ставили не менее чем в двух повторностях.

Результаты и обсуждение

При проведении РЛА с эталонными штаммами патогенных лептоспир 15 серогрупп установлено, что РЛА выпадала положительной только в гомологичных системах. При использовании АЛД анти-Canicola агглютинация происходила в реакциях со штаммами Каширский и Hond Utrecht IV, а АЛД анти-Icterohaemorrhagiae со штаммом М-20 при концентрации лептоспир в культурах (3-4,5)-106 кл/мл в течение 1,5-2 минут. РЛА с леп-тоспирами других серогрупп была отрицательная. Эти результаты свидетельствуют о серогрупповой специфичности приготовленных АЛД.

При исследовании крови экспериментально инфицированных белых мышей в РЛА были получены следующие результаты

Таблица 1

Результаты исследования крови инфицированных мышей в РЛА и культуральным методом.

№ п/п Культура леп-тосиир 0*0 мы- шей РЛА с АЛД Контроль Время появления агглютината Время после инфици- рования Результат культу- рального метода

анти- Canicola анти- Ictero

1 Кашир- ский 2 - - - - 30 -

2 + - - 1,5 90 +

2 + - - 1,5 120 +

2 + - - 1,5 150 +

2 М-20 2 - + - 3 30 +

2 - + - 1,5 90 +

2 - + - 1,5 120 +

2 - + - 1,5 150 +

Как следует из таблицы, при исследовании белых мышей, инфицированных штаммом Каширский, через 30 минут после введения культуры результаты РЛА с АЛД анти-Сашсо1а и результаты посева на питательную среду были отрицательными. Вероятно, этого времени недостаточно для проникновения лептоспир этого штамма в кровь животного.

В более поздние сроки после инфицирования через 90, J20 и 150 минут результаты PJIA и результаты культурального анализа были положительными. Надо подчеркнуть, что у животных, инфицированных штаммом Каширский, уже через 1,5 минуты РЛА с АЛД анти-Canicola была положительной, а АЛД с анти-Icterohaemorrhagiae оставалась отрицательной до 10 минут и более. Следовательно, за 1,5 минуты было не только установлено присутствие антигена лептоспир, но и установлена его серогрупповая принадлежность. На питательной среде рост лептоспир был обнаружен через 4 -7 дней. Для установления серогруппы выросшей культуры было необходимо проведение РМА.

В случае инфицирования белых мышей культурой М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) РЛА с АЛД анти-Icterohaemorrhagiae была положительной уже через 30 минут после введения лептоспир. Но агглютинация латекса отмечалась через 3 минуты. Результаты посева крови от этих мышей на питательную среду подтвердили данные РЛА, но рост культуры был отмечен только через 10 дней. Вероятно, это связано с тем, что через 30 минут в кровь проникло очень небольшое количество лептоспир.

Исследования крови мышей, инфицированных штаммом М-20 в более поздние сроки в РЛА (90, 120, 150 минут), показали результаты, аналогичные тем, которые были получены при инфицировании мышей штаммом Каширский.

С АЛД анти-Icterohaemorrhagiae антигены лептоспир в крови этих белых мышей реагировали положительно в течение 1,5 минут, а с АЛД анти-Canicola агглютинации латекса не наступало.

Результаты РЛА с кровью неинфицированной мыши были всегда отрицательными.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности разработанной тест-системы на основе АЛД анти-Canicola и анти-Icterohaemorrhagiae.

Следует указать, что к настоящему времени известны разные варианты латексных диагностических тест-систем на основе антигенов лептоспир для обнаружения противо-лептоспирозных антитело. Однако эти тест - системы характеризуются родовой специфичностью и позволяют констатировать лишь факт присутствия антител, не уточняя, против какой серогруппы лептоспир они выработаны.

Важным преимуществом РЛА с использованием АЛД является возможность не только обнаружить лептоспирозные антигены в исследуемом материале от животных, но и одновременно в течение нескольких минут установить серогрупповую принадлежность возбудителя, не прибегая к использованию таких трудоемких методов, как РМА и иммуноабсорбционный тест. Это позволяет рекомендовать использование данной тест-системы как экспресс- метода в диагностике лептоспирозной инфекции.

Выводы

1. Разработана тест - система на основе антительных латексных дигностикумов анти-Canicola и анти-Icterohaemorrhagiae для обнаружения антигенов лептоспир этих серогрупп.

2. Установлено, что антительные латексные диагностикумы анти-Canicola и анти-Icterohaemorrhagiae обладают высокой чувствительностью и позволяют обнаружить наличие лептоспир в исследуемом материале в количестве (3-4,5)Т06кл/мл в течение 1,5-2 минут.

3. Установлена высокая чувствительность и серогрупповая специфичность разработанной тест системы при исследовании крови экспериментально инфицированных белых мышей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Arimitsu Y.,Kobayashi S.,Akama K.,Matuhasi T. Development of a simple serological method for diagnosing

leptospirosis: a microcapsule agglutination test// J. Of Clinical at Microbiollogy. i 982.15.5.P.835-841.

2. Erokhin E., Sergeev A.,Lukin Yu. at a). Immunodispersive test-system for diagnosis of leptospirosis.// Leptospirosis. VII European and IX leptospirosis research conference. М., 1991, P.55-56.

3. Seki M., Sato T., Arimitsu Y., Matuhasi T., Kobayashi S. One-point method for diagnosis of leptospirosis : a microcapsule agglutination test. // Epidem. Inf. 1987.22^.399-405.

DIAGNOSTIC LATEX TEST-SYSTEM FOR DETECTING OF LEPTOSPIRA ANTIGENS IN BLOOD SAMPLES OF EXPERIMENTALLY INFECTED ANIMALS AND ITS USING.

E.G. VOLINA, P.E.SHKARLAT, N.V. YASHINA, N.I.PROCOPOV

Microbiology department RPFU. Moscow. 117198, st. M-Maklaya,st.8.

Medical faculty O.A.VERKHOVSKY Laboratory of Immunology and Biotechnology All Russian research institute of experimental veterinary. Moscow. 109472, Kuxminky

Diagnostic test-system was prepared on base of Antibody Latex (AL) for Leptospira two serogroup antigens identification (Canicola and Icterohaemorrhagiae).

Experiments with 15 strains of different Leptospira serogroups show, that each of prepared AL reacts in Latex Agglutination Assay (LAA) only with Leptospira of homologous serogroups. Recommended test-system is used for LAA on slide. Reacting time continuos up to 1.5-2 minutes, with Leptospira concentration (3-4.5)-106 cells per ml.

The blood of experimentally infected mice was tested in LAA with diluted AL. AL expressed rather high sensitivity and specificity. Besides, it’s important, that AL allows to find Leptospira and their antigens in blood samples as quickly as to identify their serogroup.