СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОДУКЦИИ МИКРООРГАНИЗМАМИ ИНГИБИТОРОВ АНТИМИКРОБНОГО БЕЛКА ТРОМБОЦИТОВ (β-ЛИЗИНА)
METHOD OF MICROORGANISM ANALYSIS FOR PRODUCING INHIBITORS OF ANTIMICROBIAL THROMBOCYTE PROTEIN (β-LYSINE)

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в работе научно-исследовательских институтов и бактериологических лабораторий медицинских учреждений, определяющих факторы патогенности и персистенции микроорганизмов для установления их этиологической значимости при инфекционно-воспалительных процессах.
Известно, что переход инфекционного процесса в хроническую форму обеспечивают факторы микроорганизмов, направленные на инактивацию компонентов неспецифической противоинфекционной резистентности макроорганизма: лизоцима, комплемента, интерферона и др. (Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М., Медицина, 1999. - С.195-261).
Известны способы определения способности бактерий к инактивации лизоцима - антилизоцимной, комплемента - антикомплементарной, трипсина - антитрипсиновой, интерферона - антиинтерфероновой, карнозина - антикарнозиновой и других активностей микроорганизмов (Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М., Медицина, 1999. - С.86-99).
Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу является способ определения микробных ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (тромбоцитарного катионного белка, β-лизина) - антитромбоцитарной катионно-белковой активности микроорганизмов (RU 2120999, 27.10.1998).
Недостатками данного способа являются его неточность и трудоемкость (необходимость подсчета колоний тест-культуры на большом числе чашек, вариабельность числа выросших колоний тест-культуры в различных сериях экспериментов). Также недостатком данного способа является этап стерилизации супернатантов хлороформом, что способствует разрушению микробных клеток и выходу внутриклеточных факторов в среду. Данное обстоятельство препятствует тестированию наличия секреторных ингибиторов В-лизина, поскольку в среду выходят периплазматические факторы. Аналогичные данные были получены для микробных ингибиторов лизоцима (Гриценко В.А. Анализ взаимосвязи антилизоцимной активности и репродуктивной функции у эшерихий // ЖМЭИ. - 1997. - №4. - С.67-71).
Заявляемый способ решает задачу повышения точности и уменьшения трудоемкости при выявлении продукции микроорганизмами ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина).
Для решения указанной задачи в заявляемом способе выявления продукции микроорганизмами ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант от микробных клеток путем фильтрации через мембраны с размером пор 0.2-0.45 мкм, добавляют к супернатанту антимикробный белок тромбоцитов (β-лизина), параллельно готовят две контрольные пробы, добавляют в контроль 1 антимикробный белок тромбоцитов (β-лизина) и жидкую питательную среду, в контроль 2 вместо антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) добавляют физиологический раствор, инкубируют опытную и контрольные пробы, после инкубации добавляют во все пробы тест-культуру Bacillus subtilis ГИСК №010011, инкубируют, опытную и контрольные пробы центрифугируют, осажденные клетки тест-культуры ресуспендируют в жидкой питательной среде или 0.75 М растворе сахарозы, инкубируют, замеряют оптические плотности опытной и контрольных проб и по изменению роста тест-культуры в опытной пробе по сравнению с контрольными судят о продукции микроорганизмами ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина).
Новым в заявляемом способе является то, что супернатант исследуемой культуры микроорганизмов стерилизуют через мембраны с размером пор 0.2-0.45 мкм, после инкубации с тест-культурой опытную и контрольные пробы центрифугируют, отделяют супернатант, осажденные клетки тест-культуры ресуспендируют в жидкой питательной среде или 0.75 М растворе сахарозы, инкубируют, замеряют оптические плотности опытной и контрольных проб и по изменению роста тест-культуры в опытной пробе по сравнению с контрольными судят о продукции микроорганизмами ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (В-лизина).
Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что заявляемый способ позволяет повысить точность выявления продукции микроорганизмами ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (В-лизина) и сократить сроки при их выявлении.
Известно использование тест-культуры Bacillus subtilis ГИСК №010011 для тестирования биологической активности антимикробного белка тромбоцитов (RU 2120999, 27.10.1998).
Известно применение мембран с размером пор 0.2-0.45 мкм для стерилизации супернатантов бульонных культур микроорганизмов («Организация и контроль производства лекарственных средств. Стерильные лекарственные средства. Методические указания. Испытание стерилизующей способности мембранных фильтров дискового типа МУ 42-51-17-93», 08.02.1993, №МУ 42-51-1-93 + МУ 42-51-26-93; RU 2151798, 27.06.2000; Ivanov I.B., Gritsenko V.A., Kuzmin M.D. Staphylococcal secretory inhibitor of platelet microbicidal protein is associated with prostatitis source // J. Med. Microbiol. - 2006.- Vol.55. - P.1645-1648).
Авторами экспериментально установлено повышение точности выявления секреторных ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов при использовании заявляемого способа.
Проводился следующий эксперимент. Сравнительное описание эксперимента представлено в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, заявляемый способ и способ-прототип содержат одинаковое количество этапов. Однако заявляемый способ является более быстрым по времени.
Таблица 1.
Сравнительная характеристика заявляемого способа и способа-прототипа
Этапы
Способ-прототип
Заявляемый способ
1.
Приготовление взвесей исследуемых культур микроорганизмов (10<sup>9</sup> КОЕ/мл)
Приготовление взвесей исследуемых культур микроорганизмов (10<sup>9</sup> КОЕ/мл)
2.
Засев 0.1 мл взвеси в 3.0 мл мясопептонного бульона
Засев 0.1 мл взвеси в 3.0 мл жидкой питательной среды
3.
Инкубация при 37°С в течение 18-24 часов
Инкубация при 37°С в течение 18-24 часов
4.
Стерилизация бульонных культур хлороформом в течение 1 часа
Отделение супернатантов от микробных клеток фильтрацией через мембраны с размером пор 0.2-0.45 мкм
5.
Отделение супернатанта от микробных клеток центрифугированием (3000 об/мин - 15 мин)
Отсутствует
6.
Добавление к супернатанту антимикробного белка тромбоцитов
Добавление к супернатанту антимикробного белка тромбоцитов
7.
Приготовление контролем: а) контроль 1 (антимикробный
Приготовление контролей: а) контроль 1 (антимикробный
белок тромбоцитов + жидкая питательная среда); контроль 2 (физиологический раствор + жидкая питательная среда)
белок тромбоцитов + жидкая питательная среда); контроль 2 (физиологический раствор + жидкая питательная среда)
8.
Инкубация в течение 1 ч при 37°С
Инкубация в течение 1 ч при 37°С
9.
Добавление в опытную и контрольные пробы взвеси тест-культуры B.subtilis (OD=0.27 с разведением в 1000 раз)
Добавление в опытную и контрольные пробы взвеси тест-культуры B.subtilis (OD=0.27 с разведением в 1000 раз)
10.
Инкубация в течение 1 ч при 37°С
Инкубация в течение 1 ч при 37°С
11.
Высев на плотную питательную среду опытной и контрольных проб
Отсутствует
12.
Отсутствует
Центрифугирование опытной и контрольных проб (3000 об/мин - 15 мин). Удаление супернатантов из опытной и контрольных проб
13.
Отсутствует
Добавление в опытную иконтрольные пробы жидкой питательной среды или 0.75 М раствора сахарозы.
14.
Инкубация 24 ч при 37°С
Инкубация 2-18 ч при 37°С
15.
Учет результатов методом подсчета выросших колоний B.subtilis и расчет способности бактерий к инактивации антимикробного белка тромбоцитов
Учет результатов методом замера оптических плотностей опытной и контрольных проб и расчет способности бактерий к инактивации антимикробного белка тромбоцитов
Антимикробный белок тромбоцитов получали известным способом (Бухарин О.В., Черешнев В.А., Сулейманов К.Г. Антимикробный белок тромбоцитов.- Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - С.35-99).
В эксперименте использовали клинические штаммы Staphylococcus aureus (n=7) и Escherichia coli (n=5).
Исследования проводили в 5 независимых сериях. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, использование заявляемого способа позволяет более точно выявить и количественно определить продукцию микроорганизмами ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина).
Таблица 2.
Сравнительная характеристика способности микроорганизмов к продукции ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (В-лизина), %
Штаммы
Способность к продукции ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (В-лизина), %
Способ-прототип
Заявляемый способ
S.aureus 1
23.7 (16.8-35.0)*
25.1 (22.7-26.2)
S.aureus 2
13.4 (9.5-15.7)
11.8 (9.8-12.7)
S.aureus 3
16.9 (15.0-23.7)
18.7 (17.7-19.3)
S.aureus 4
7.3 (4.0-10.5)
8.9 (7.8-10.0)
S.aureus 5
12.4 (9.5-18.3)
11.2 (10.7-12.9)
S.aureus 6
14.7 (11.5-18.9)
13.5 (12.0-14.0)
S.aureus 7
6.8 (3.2-10.5)
8.7 (7.5-9.5)
E.coli 1
32.8 (22.4-39.0)
37.8 (35.0-40.5)
E.coli 2
27.7 (21.5-36.5)
28.9 (27.0-31.2)
E.coli 3
44.3 (36.0-49.5)
43.1 (40.9-44.5)
E.coli 4
21.8 (18.0-26.5)
22.3 (21.5-24.8)
E.coli 5
34.7 (30.0-39.5)
31.9 (29.7-34.5)
* - результаты представлены в качестве средних с разбросом значений, которые указаны в скобках.
Из таблицы 2 видно, что при использовании заявляемого способа при проведении нескольких серий эксперимента получается более узкий разброс значений количественного уровня ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина), чем при применении способа-прототипа. Таким образом заявляемый способ является более точным при количественном определении уровня ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина). Поскольку к нормальной микрофлоре относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее (RU 2260054, 10.09.2005), к нормальной микрофлоре отнесены штаммы S.aureus №№2, 3, 4, 5, 6, 7.
Способ осуществляется следующим образом
1. Исследуемые культуры микроорганизмов выращиваются в жидкой питательной среде в течение 18-24 ч (для анаэробных микроорганизмов срок выращивания увеличивается до 36-48 ч, а для грибов - до 5 сут) при 37°С.
2. Супернатант выросших культур микроорганизмов стерилизуют отделением от клеток фильтрацией через мембраны с размером пор 0.2-0.45 мкм.
3. В опытные пробирки разливают по 0.6 мл супернатантов исследуемых культур микроорганизмов и добавляют 0.3 мл разведения антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) в разведении 1/3 титра активности (за титр активности принимают то разведение антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина), при котором наблюдается 50% подавление роста тест-культуры B.subtilis). Параллельно готовят два контроля: а) контроль 1: к 0.3 мл антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) в указанном выше разведении добавляют 0.6 мл жидкой питательной среды, использованной для выращивания исследуемых видов микроорганизмов; б) контроль 2: к 0.3 мл физиологического раствора добавляют 0.6 мл жидкой питательной среды, использованной для выращивания исследуемых видов микроорганизмов.
4. Полученные смеси инкубируют в течение 1 ч при 37°С.
5. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси B.subtilis (способ приготовления взвеси: 16-18-часовую культуру B.subtilis смывают физиологическим раствором и готовят микробную взвесь, густота которой спектрофотометрически (длина волны 650 нм) соответствует оптической плотности 0.27. Полученную взвесь разводят физиологическим раствором в 1000 раз и используют).
6. Полученные смеси инкубируют в течение 1 ч при 37°С.
7. Осаждают клетки тест-культуры B.subtilis центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Удаляют надосадочную жидкость.
8. Осажденные клетки тест-культуры B.subtilis ресуспендируют в 2-3 мл жидкой питательной среды или 0.75 М раствора сахарозы.
9. Взвеси инкубируют в течение 2-18 ч при 37°С.
10. Замеряют оптические плотности выросшей тест-культуры B.subtilis в опытной и контрольных пробах и по изменению роста тест- культуры B.subtilis в опытной пробе по сравнению с контрольными судят о продукции микроорганизмами ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина).
Примеры конкретного выполнения способа
3
Пример 1. У больного С. с диагнозом «Хронический простатит. Обострение» из спермы в монокультуре была выделена E.coli, при этом ПМО не достигал этилогически значимого уровня (10 КОЕ/мл). Для решения вопроса об этиологической значимости у штамма E.coli была определена способность к продукции ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина). Для этого исследуемую культуру вырастили в 2-3 мл мясо-пептонного бульона при 37°С в течение 24 ч. Супернатант выросшей культуры стерилизовали отделением от клеток фильтрацией через мембраны с размером пор 0.2-0.45 мкм. В опытную пробирку разлили 0.6 мл супернатанта исследуемой культуры и добавили 0.3 мл разведения антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) в разведении 1/3 титра активности (за титр активности приняли то разведение антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина), при котором наблюдалось 50% подавление роста тест-культуры B.subtilis). Параллельно приготовили два контроля: а) контроль 1: к 0.3 мл антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) в указанном выше разведении добавили 0.6 мл мясо-пептонного бульона; б) контроль 2: к 0.3 мл физиологического раствора добавили 0.6 мл мясо-пептонного бульона. Полученные смеси инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Во все пробирки добавили по 0,1 мл взвеси B.subtilis (способ приготовления взвеси: 16-18-часовую культуру B.subtilis смыли физиологическим раствором и приготовили микробную взвесь, густота которой спектрофотометрически (длина волны 650 нм) соответствовала оптической плотности 0.27. Полученную взвесь развели физиологическим раствором в 1000 раз и использовали). Полученные смеси инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Осадили клетки тест-культуры B.subtilis центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Удалили надосадочную жидкость. Осажденные клетки тест-культуры B.subtilis ресуспендировали в 3 мл 0.75 М растворе сахарозы (рН 6.2). Взвеси инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Замерили оптические плотности выросшей тест-культуры B.subtilis в опытной и контрольных пробах, которые составили Do=0.137; Dk1=0.1; Dk2=0.22. По формуле (Do-Dk1)×100:(Dk2-Dk1) рассчитали количественное содержание ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов, которое составило 30.83%. Поскольку к нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее (RU 2260054, 10.09.2005), выявление у штамма Е.coli способности к продукции ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) позволило установить его этиологическую значимость в развитии простатита.
3
3
Пример 2. У больного В. с диагнозом «Хронический неспецифический уретрит» из уретры были выделены и по совокупности признаков идентифицированы Staphylococcus capitis (ПМО - 10 КОЕ/мл) и Enterococcus faecalis (ПМО - 10 КОЕ/мл). Для дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителя уретрита вышеописанным способом у выделенных штаммов была определена способность к продукции ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина). Штамм E.faecalis продуцировал ингибиторы антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина) - 27%, а штамм S.capitis - 12.3%, что позволило отнести последний к нормальной микрофлоре (RU 2260054, 10.09.2005). Изучение спектра чувствительности E.faecalis антибиотикам и проведение направленной терапии привело к элиминации возбудителя и выздоровлению больного.
Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро и точно выявить способность микроорганизмов к продукции ингибиторов антимикробного белка тромбоцитов (β-лизина), что повышает эффективность диагностики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний микробной этиологии.