Способ выявления туморогенных клеток в первичной культуре фибробластов человека
METHOD FOR DETECTION OF TUMOURIGENIC CELLS IN PRIMARY CULTURE OF HUMAN FIBROBLASTS

Введение
Согласно Федеральному закону № 180, подача заявки для государственной регистрации биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) сопровождается обязательным отчетом (предоставлением данных) о результатах проведенных доклинических исследований (ДКИ). Этот отчет является ключевым документом, на основании которого эксперты принимают решение о возможности разрешения проведения клинических исследований (Федеральный закон Российской Федерации от 23 июня 2016 г. № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах»; Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 22 сентября 2017 г. № 669н «Об утверждении Правил надлежащей клинической практики биомедицинских клеточных продуктов»).
ДКИ в обязательном порядке включают в себя оценку туморогенности, что позволяет выявлять неопластические процессы в культуре используемых для БМКП клеток и предотвращать онкогенные процессы. Вопрос туморогенности особо остро стоит при использовании стволовых клеток, обладающих как пролиферативной активностью, так и дифференцировочным потенциалом. Туморогенность проверяется путем введения БМКП лабораторным модельным животным с последующей оценкой возможности образования опухолевой ткани, спровоцированной как самими опухолевыми клетками, так и нормальными клетками, входящими в состав БМКП, которые могут модифицироваться при их нахождении в организме. Длительность наблюдений за лабораторными животными после введения им БМКП должна превышать продолжительность исследований специфического воздействия БМКП на организм человека. Для опытов на лабораторных животных, таких как мыши и крысы, длительность эксперимента составляет 18 и 24 месяца, соответственно (Мельникова Е.В. и др. Дизайн доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов: особенности, ключевые принципы и требования // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2017. - Т. 17. - №. 3 (63)
in vitro
Наличие быстрого и простого способа оценки потенциальной туморогенности клеток, входящих в состав БМКП, в условиях  может играть ключевое значение в выборе культуры клеток для БМКП и снизить риск проявления ее туморогенного потенциала при проведении длительных и экономически затратных экспериментах на животных.
Подходящий способ должен выявлять как нормальные реакции и признаки используемых для БМКП клеток, так и возможные вариации этих признаков при проявлении туморогенных свойств. Выбор способа зависит от типа и свойств анализируемой клеточной культуры.
Оценка признаков, коррелирующих с потенциальной туморогенностью клеточного материала, должна по существующим нормативам проводиться дважды: как на ранней стадии получения клеточной культуры из ткани (1-2 пассаж), для выявления возможных неопластических клеток донора, так и перед непосредственным использованием клеток в составе БМКП, для выявления неопластических процессов, как результата культивирования (Мельникова Е.В. и др. Дизайн доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов: особенности, ключевые принципы и требования // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2017. - Т. 17. - №. 3 (63)
В настоящее время, фибробласты часто используются в качестве составного и основного действующего компонента БМКП. Изучение их безопасности и эффективности в применении должно осуществляться с учетом их свойств, особенностей поведения в культуре.
Уровень техники
2
Из источников: Супотницкий М.В. и др. Основные технологические процессы, используемые при производстве биомедицинских клеточных продуктов // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2015. - №. 2 (54); Lewis A.M. ‘Regulatory Implications of Neoplastic Cell Substrat Tumorigenicity // US Food and Drug Administration. - 2005. - 31 p. - 2005 известен способ оценки туморогенной безопасности БМКП на основе фибробластов, основанный на анализе процесса «репликативного старения», характерного для нормальных нетуморогенных клеток и заключающегося в постепенном снижении пролиферативного потенциала клеток, что проявляется в виде снижения в процессе культивирования дегидрогеназной активности, идентифицируемой методом МТТ. Для выполнения оценки «репликативного старения» с помощью МТТ-теста фибробласты культивируют на протяжении 20-30 пассажей, на каждом пассаже часть клеток рассевают в 96-луночные планшеты, окрашивают тетразолиевым красителем 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромидом (МТТ), инкубируют в течение суток при 37°С в атмосфере 5% СО и затем измеряют поглощение света при определенной длине волны (обычно между 500 и 600 нм) методом спектрофотометрии. В быстро делящихся клетках НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты восстанавливают МТТ в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Далее производят оценку количества быстро делящихся клеток в культуре, при этом на более поздних пассажах количество быстро делящихся клеток в культуре снижается, что говорит о наличии процесса репликативного старения и отсутствии в культуре туморогенных клеток.
Из источников Ткачук В.А., Нестеров А.Н., Литвинова Н.Ю. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов // М.: МГУ им. Ломоносова. - 2017; Wang Y, Zhang Z, Chi Y. et al. Long-term cultured mesenchymal stem cells frequently develop genomic mutations but do not undergo malignant transformation. Cell Death and Disease. 2013; 4: e950 известен способ оценки туморогенной безопасности БМКП на основе фибробластов, основанный на анализе процесса «репликативного старения», характерного для нормальных нетуморогенных клеток и заключающегося в постепенном снижении пролиферативного потенциала клеток, что сопровождается повышением уровня экспрессии в клетках фермента бета-галактозидазы. Для выполнения оценки репликативного старения с помощью теста на бета-галактозидазу клетки культивируют на протяжении 20-30 пассажей, на каждом пассаже часть клеток рассевают в чашки для культивирования и вносят в культуру клеток субстрат ONPG (о-нитрофенил-бета-D-галактопиранозид), гидролиз которого бета-галактозидазой сопровождается образованием ярко-желтого продукта. Затем измеряют поглощение света при длине волны 405-420 нм методом спектрофотометрии либо производят подсчёт ярко окрашенных клеток с помощью световой микроскопии. Далее производят оценку количества ярко окрашенных клеток в культуре, при этом на более поздних пассажах их количество в культуре возрастает, что говорит о наличии процесса «репликативного старения» и отсутствии в культуре туморогенных клеток.
Ещё одним способом является анализ экспрессии теломеразы hTERT, высокий уровень которой связан с опухолевой трансформацией, также свидетельствует о высоком туморогенном потенциале клеток (Скворцов Д.А., Зверева М.Э., Шпанченко О.В., Донцова О.А. Теломераза: методы определения активности. Acta Naturae. 2011. Т. 3. №1. С. 51-73).
В патенте РФ 2640487 описан способ оценки безопасности биомедицинского клеточного продукта (БМКП), включающий количественное определение и сравнение уровней теломеразной активности клеток, используемых для получения БМКП на «нулевом» пассаже - контроль 1, и клеток после пассирования при получении БМКП или входящих в состав БМКП - испытуемые клетки, характеризующийся тем, что устанавливаются контрольные количественные величины, характеризующие уровень теломеразной активности в клетках с различным туморогенным потенциалом:
- контроль 1: клетки, используемые для получения БМКП на нулевом пассаже;
- контроль 2, положительный: клетки HeLa;
- контроль 3, отрицательный: нормальные нераковые клетки;
- контроль 4, рабочий: мезенхимальные стволовые клетки человека;
сопоставляются уровни теломеразной активности в контролях, где контроли считаются корректными, если теломеразная активность в контролях 3 и 4 достоверно ниже, чем в контроле 2, и теломеразная активность в контроле 3 достоверно ниже, чем в контроле 4; далее проводится оценка безопасности испытуемых клеток, используемых для получения БМКП или клеток в составе БМКП; если уровень теломеразной активности в контроле 1 не превышает таковой в контролях 2 и 4, а теломеразная активность в испытуемых клетках не отличается от таковой в контроле 1, то БМКП признают нетуморогенными; если уровень теломеразной активности в клетках контроля 1 превышает таковую в контроле 4 и оказывается равным или выше аналогичного показателя в контроле 2, делают вывод о высоком туморогенном потенциале выделенной первичной культуры и невозможности ее использования для производства БМКП; если теломеразная активность в испытуемых клетках ниже таковой в контроле 1, делают вывод о старении клеточной культуры в процессе пассирования и невозможности ее использования для производства БМКП. Однако этот способ методически сложен, требует дорогостоящих оборудования и реактивов, квалифицированных работников и занимает много времени.
Приведенные способы, известные из уровня техники, хоть и обоснованы для применения в доклинических исследованиях, имеют один общий недостаток - анализируемый параметр нужно рассматривать в динамике в процессе длительного культивирования, сравнивая показатели на исходной точке и на момент включения клеток в состав БМКП. Культивирование 20-30 пассажей может занимать до 100 суток или более. Таким образом, данные исследования представляются длительными по времени и использующими дорогостоящее оборудование и реактивы, а также они могут быть реализованы высококвалифицированными сотрудниками, подготовка которых требует длительного обучения.
Технической задачей настоящего изобретения может быть преодоление недостатков существующих способов.
Сущность изобретения
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, может быть создание способа, который позволяет оценить туморогенную безопасность БМКП на основе фибробластов в течение 24 часов.
Техническим результатом настоящего изобретения может быть изобретение, характеризующееся признаками формулы.
2
В настоящем изобретении предлагается способ выявления раковых клеток в первичной клеточной культуре фибробластов, заключающийся в том, что клетки выращивают до плотности 4-5 тыс. клеток/см в адгезивной культуре, затем регистрируют треки клеточных движений в течение 24 часов с помощью анализа изображений покадровой съёмки клеток используя световую микроскопию либо лазерную сканирующую конфокальную микроскопию с интервалом между кадрами 15 мин или менее; затем по XY координатам треков, полученных от 100 клеток, строят усреднённый график зависимости среднего квадрата смещения клеток от времени, а также строят график зависимости от времени среднего квадрата смещения точечных объектов, координаты которых вычисляют с помощью компьютерной симуляции случайного блуждания 100 точечных объектов, построенной на основе данных о средней скорости и стандартном отклонении средней скорости тестируемых клеток; при этом построение графиков сопровождают построением 95 % доверительных интервалов; затем построенные графики отображают на одной координатной плоскости и сравнивают; если области 95% доверительных интервалов перекрываются хотя бы частично на отрезке времени от 1 до 24 часов, то клетки считают туморогенными.
Предлагаемый в настоящем изобретении способ позволяет уже через 24 часа проанализировать получаемую для использования в БМКП культуру клеток на предмет ее туморогенного потенциала и, в случае выявления последнего, отказаться от ее использования.
Подробное описание изобретения
Одной из характеристик мезенхимных стволовых клеток (МСК), представленных в культуре адгезирующими к культуральной поверхности фибробластоподобными клетками, является их подвижность и ее особенности.
Анализ клеточной подвижности МСК разного происхождения и сравнение аналогичных параметров у раковых клеток позволил выявить определенные закономерности, которые в дальнейшем могут быть использованы как способ быстрой детекции туморогенных клеток в культуре, предназначенной для потенциального использования в БМКП.
Из источника Bobkov D. et al. Replicative senescence in MSCWJ-1 human umbilical cord mesenchymal stem cells is marked by characteristic changes in motility, cytoskeletal organization, and RhoA localization // Molecular biology reports. - 2020. - Т. 47. - №. 5. - С. 3867-3883 известно, что для описания характера подвижности клеток в адгезивной культуре достаточно трех параметров: средняя скорость клеток; извилистость трека и безразмерная оценка максимального ожидаемого смещения траектории (E-max). Вместо того, чтобы анализировать извилистость траектории и E-max по-отдельности, мы можем использовать средний квадрат смещения в зависимости от времени (MSD), который является показателем рассеивания значений случайной величины относительно её математического ожидания. При оценке MSD групп клеток мы можем сравнивать их MSD симуляции случайного блуждания точечных объектов, построенной на основе данных о средней скорости и стандартном отклонении средней скорости тестируемых клеток и, таким образом, косвенно оценивать прямолинейность и извилистость траекторий. Методика построения симуляций случайного блуждания, а также методика построения графиков MSD с 95%-ыми доверительными интервалами описаны в статье Wortel I. M.N. et al. CelltrackR: an R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data // ImmunoInformatics. - 2021. - Т. 1. - С. 100003.
Формула для расчёта MSD:
(i)
(i)
Здесь x(0) - координаты положения i-й клетки в точке t=0, x(t) - координаты положения i-й клетки в момент времени t, N - число клеток, по которым идёт усреднение. График MSD(t) представляет из себя среднее квадратичное отклонение положения клетки от первоначального в зависимости от времени t.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 показаны микрофотографии клеток линии DF2, выращенных на пассаже 8 в лунке 6-луночного планшета. Изображения получены на разных временных точках из одного поля зрения. Линиями обозначены треки движений семи клеток. Время в мин от начала съёмки указано на изображениях. Масштабный отрезок - 200 мкм.
На Фиг. 2 (А) показаны нормализованные относительно точки начала движения треки 10 клеток линии DF2, двигающихся в течение 24 часов по поверхности лунки пластикового планшета для культивирования, а также соответствующие треки, полученные в результате компьютерной симуляции случайного блуждания 10 точечных объектов, построенной на основе данных о средней скорости и стандартном отклонении средней скорости 100 клеток линии DF2. По оси абсцисс расстояние в микрометрах, по оси ординат расстояние в микрометрах.
На Фиг. 2 (Б) показаны нормализованные относительно точки начала движения треки 10 опухолевых клеток, выделенных из глиобластомы человека, двигающихся в течение 24 часов по поверхности лунки пластикового планшета для культивирования, а также соответствующие треки, полученные в результате компьютерной симуляции случайного блуждания 10 точечных объектов, построенной на основе данных о средней скорости и стандартном отклонении средней скорости 100 опухолевых клеток, выделенных из глиобластомы человека. По оси абсцисс расстояние в мкм, по оси ординат расстояние в мкм.
На Фиг. 3 показаны графики усреднённых значений MSD(t) для 100 треков нормальных диплоидных фибробластов линии DF2, измеренные на различных пассажах: (А) - на пассаже 8, (Б) - на пассаже 15. Чёрные стрелки указывают на пересечение в пределах 95-го доверительного интервала графиков MSD и графиков соответствующих моделей случайного блуждания. По оси абсцисс время в часах, по оси и ординат среднее квадратичное отклонение положения клетки от первоначального.
На Фиг. 4 показаны графики усреднённых значений MSD(t) для 100 треков клеток, выделенных в первичную культуру из опухолевой ткани головного мозга пациентов с диагнозом мультиформная глиобластома; (A) - пациент младше 18 лет, (Б) - пациент старше 18 лет. Чёрные стрелки указывают на пересечение в пределах 95-го доверительного интервала графиков MSD и графиков соответствующих моделей случайного блуждания. По оси абсцисс время в часах, по оси и ординат среднее квадратичное отклонение положения клетки от первоначального.
Пример осуществления изобретения
2
Материалы и методы. Клетки линии DF2 получали в ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Получение и характеристики клеточной культуры DF2 подробно описаны в источнике Krylova T.A. et al. Derivation and characteristic of a non-immortalized cell lines of human dermal fibroblasts, generated from skin of the eyelids of adult donors of different age // Tsitologiia. - 2016. - Т. 58. - №. 11. - С. 850-864. Клетки DF2 культивировали при 37°C (5% CO, влажность 90%). в ростовой среде, содержащей 90% среды DMEM/F12 и 10% фетальной бычьей сыворотки. Микробиологический анализ подтвердил отсутствие бактериального, грибкового или микоплазменного загрязнения культивированной линии. Анализ подвижности клеток выполняли для 100 клеток на каждом из пассажей: 8, 1. Выполняли два независимых эксперимента, в каждом из которых одну апулу с клетками размораживали из криобанка; клетки пассировали; и на выбранных пассажах исследовали живые подвижные клетки в соответствии со следующими процедурами.
Анализ движения клеток проводили с использованием покадровой съемки. Для регистрации движения отдельных клеток использовали настольную систему цитометрии CQ1 с конфокальной технологией вращающегося диска, описанную в источнике Sakashita H. et al. The CQ1 confocal quantitative image cytometer and its application to biological measurement // Yokogawa Tech Rep Engl Ed. - 2015. - Т. 58. - №. 1. - С. 29-33. Клетки высевали на 6-луночные пластиковые планшеты и окрашивали ДНК с помощью красителя Hoechst 33342 для визуализации ядер. Изображения получали с помощью лазера 405 нм и освещения в светлом поле с использованием сухого объектива × 40 (числовая апертура 0,95). В каждой лунке в течение 24 ч каждые 15 мин регистрировали из 15 полей зрения изображения разрешением 2528 × 2136 пикселей с размером пикселя, эквивалентным 0,6579 мкм по осям X и Y.
В программе ImageJ из изображений извлекали наборы координат X - Y с помощью подключаемого модуля Manual Tracking. Анализировали только клетки, удовлетворяющие следующим условиям: клетка должна находиться в поле зрения во всех кадрах, и клетка не должна подвергаться делению. Для получения координат X - Y вручную отмечали середину ядра в каждый момент времени. В программной среде R из наборов координат X - Y получали треки, которые анализировали с помощью библиотек trajr и celltrackR, описанных в источниках McLean D.J., Skowron Volponi M.A. trajr: an R package for characterisation of animal trajectories // Ethology. - 2018. - Т. 124. - №. 6. - С. 440-448; Wortel I.M.N. et al. CelltrackR: an R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data //ImmunoInformatics. - 2021. - Т. 1. - С. 100003.
В исследовании использовались первичные клетки, полученные от пациентов со злокачественными опухолями головного мозга (1 пациент младше 18 лет, 1 пациент старше 18 лет). Выделение первичных клеток из опухолевого материала проводили по методике, известной из источника Seidel S., Garvalov B.K., Acker T. Isolation and culture of primary glioblastoma cells from human tumor specimens // Stem Cell Protocols. - Humana Press, New York, NY, 2015. - С. 263-275.. Кратко: образец опухоли механически и ферментативно диссоциировали. Для ферментативной обработки использовались папаин, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза I, гиалуронидаза и трипсин. Эритроциты лизировали с помощью Red Blood Cell Lysis Buffer (Roche Diagnostics). После обработки суспензию клеток подвергали многократной отмывке DPBS (Merck) и фильтрации через клеточные фильтры с диаметром пор 100 мкм и 70 мкм. Полученную суспензию клеток культивировали при 37°С, 5% CO2 в 3D-условиях в чашках Петри Nunclon Sphera 90 mm (Thermo Fisher Scientific) в культуральной среде DMEM/F-12 с добавлением гентамицина, амфотерицина В, B-27 без витамина А и Хепес буфера. Через 24-48 ч первичные клетки формировали трехмерные сфероиды. Частота образования сфероидов и их размер зависели от характеристик опухолевого материала (исходное количество клеток, их способность к самообновлению и т.д.). Смену среды проводили 2 раза в неделю, пересев 1:2 - каждые 10-12 дней. Анализ движения клеток проводили как указано выше.
Результаты. Получили микрофотографии 30 полей зрения как для нормальных фибробластов человека, так и для опухолевых клеток человека. Для каждого поля зрения получили 97 изображений, сделанных через каждые 15 мин. Пример изображений, полученных на разных временных точках из одного поля зрения, представлен на Фиг. 1. Получили треки клеточных движений. Примеры полученных треков представлены на Фиг. 2. Построили графики усреднённых (по 100 трекам движений клеток в течение 24 ч) значений MSD для нормальных фибробластов человека и опухолевых клеток человека (Фиг. 3, 4). На Фиг. 3 чёрная стрелка указывает на пересечение в пределах 95-го доверительного интервала графиков MSD и графиков соответствующих моделей случайного блуждания для нормальных фибробластов человека, из Фиг. 3 видно, что такое пересечение есть только на отрезке времени до 1 часа. На Фиг. 4 чёрная стрелка указывает на пересечение в пределах 95-го доверительного интервала графиков MSD и графиков соответствующих моделей случайного блуждания для опухолевых клеток человека, из Фиг. 4 видно, что такое пересечение есть не только на отрезке времени до 1 часа, но и на отрезке времени от 1 до 24 часов.
Выводы. Результаты экспериментов, выполненных как на нормальных фибробластах человека, так и на первичной культуре опухолевых клеток, полученных из ткани глиобластомы человека, показывают, что нормальные фибробласты человека обладают выраженным направленным движением, что на графиках усреднённых (по 100 трекам движений клеток в течение 24 ч) значений MSD(t) видно как линии, отстоящие от соответствующих графиков случайного блуждания вверх таким образом, что начиная от точки 1 час по оси Х (время) графики MSD и соответствующий график случайного блуждания не пересекаются в пределах 95-го доверительного интервала.