Пиразолы тритерпеновых кислот солодки как противомикробные агенты

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ

ПИРАЗОЛЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ КИСЛОТ СОЛОДКИ КАК _ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ АГЕНТЫ_

Балтина Лидия Ашрафовна,

Докт. хим. наук, ведущий научный сотрудник Уфимский институт химии ФГБУН УФИЦ РАН, г. Уфа

Булгаков Айдар Казбекович,

Докт. мед. наук, проф. кафедры микробиологии и вирусологии ФГБОУВО БГМУ Минздрава РФ,

г. Уфа

Губайдуллин Азат Гирфанович,

Ассистент кафедры микробиологии и вирусологии ФГБОУВО БГМУ Минздрава РФ, г. Уфа

Кондратенко Римма Минибаевна, Докт. хим. наук, профессор кафедры общей химии ФГБОУВО БГМУ Минздрава РФ, г. Уфа

DOI: 10.31618/ESU.2413-9335.2018.3.56.36-39

АННОТАЦИЯ

С целью поиска новых противомикробных агентов синтезированы [2,3й]-пиразолы тритерпеновых кислот солодкового корня - глицирретовой (ГЛК) и 18,19-дегидро-ГЛК и проведена оценка их противо-микробной активности на панели штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Proteus vulgaris, Citrobacter diversus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloace и грибов Candida albicans). Установлено, что исследованные соединения обладают противомикробной активностью в отношении всех испытанных патогенных микроорганизмов с минимальной подавляющей концентрацией (МПК) 98-100 мкг/кг.

ABSTRACT

In order to search for new antimicrobial agents, [2,3d] pyrazoles of licorice root triterpenic acids, glycyrrhetic (GLA) and 18,19-dehydro-GLA, were synthesized and their antimicrobial activity was evaluated on a panel of gram-positive and gram-negative bacteria (Staphylococcus aureus, Klebsiella , Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Proteus vulgaris, Citrobacter diversus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloace and Candida albicans fungi). It was established that the studied compounds possess antimicrobial activity against all tested pathogenic microorganisms with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 98-100 ^g / kg.

Ключевые слова: глицирретовая кислота, пиразолы, противомикробная активность

Key words: glycyrrhetic acid, pyrazoles, antimicrobial activity

Введение

Поиск и разработка новых противомикробных агентов является одной из актуальных проблем современной химии и медицины, что обусловлено распространяющейся устойчивостью (резистентностью) патогенных микроорганизмов к существующим химиотерапевтическим агентам и распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к используемым антибиотикам [1, с. 1127; 2, с. 991]. Согласно эпидемиологическим данным, наблюдается также рост числа случаев грибковых инфекций, связанных со штаммами Candida и Aspergillus, устойчивых к антимикотическим средствам [3, с.11].

Природные соединения, несмотря на успехи методов синтетической химии и высокопроизводительного скрининга, продолжают играть ключевую роль в разработке новых лекарственных средств, в частности, антибактериальных, противогрибковых и противоопухолевых агентов и удерживают прочное лидерство по количеству внедренных препаратов [4, с. 629].

Одним из перспективных путей создания новых антибактериальных препаратов является химическая модификация известных антибиотиков и

других природных соединений, в том числе, растительных тритерпеноидов, обладающих противомикробной активностью [5, с. 84; 6, с. 35; 7, с. 564].

Основной пентациклический тритерпеноид экстрактов солодкового корня (Glycyrrhiza glabra L., Gl. uralensis Fisher) - глицирретовая кислота (ГЛК) 1 является активной в отношении тест-микробов стафилококковой, кишечной и спорообразу-ющей групп [8, с. 331; 9, с. 310], оказывает защитное действие при грибковой инфекции Candida albicans [10, с. 380], защищает мышей от гибели при пневмонии, вызванной Staphylococcus aureus [11, с. 241].

Настоящая работа посвящена синтезу и оценке противомикробной активности гетероциклических производных ГЛК 1 и ее 18,19-дегидро-аналога 2 - аннелированных с кольцом А тритерпеновых пиразолов 3 и 4 на панели штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Как известно, пиразольное кольцо входит в состав многих лекарственных препаратов, включая противо-микробные средства [12, с. 540]. О противомикроб-ных свойствах данных производных ГЛК в литературе не сообщалось.

COOH

COOH

a,b

COOMe

1a

.... COOMe

Ч - COOMe

a) CrO3. CH3COOH; b) HCO2Et, MeONa; c) NHNH2, EtOH, reflux

1

3

c

2

N

4

Результаты и обсуждение

Пиразолы 3 и 4 синтезировали реакцией 2-ок-симетилен-3-кетоэфиров 1а и 2а, полученных ранее из соответствующих 3-оксо-тритерпеноидов по методикам [8, с. 311; 13, с. 76], с гидразин-гидратом при кипячении в этаноле с выходами 85 и 80%, соответственно. Структура пиразолов подтверждена ЯМР (1Н и 13С) спектрами.

Проведена оценка противомикробной активности ГЛК и ее производных 3 и 4 в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Proteus

vulgaris, Citrobacter diversus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloace и грибов Candida albicans методом «диффузии в агар» и десятикратных серийных разведений в мясопептонном бульоне (МПБ) согласно [14, с. 832]. Данные по противомикробной активности для исследованных соединений представлены в таблице как минимальная подавляющая концентрация (МПК) (мкг/мл) препарата.

Соединения Минимальная подавляющая концентрация

Ей ^^is Sa Сd Еа Ра Ecl Саs

1 100 99 100 100 98 100 100 99 1000

2 99 100 98 98 98 99 100 98 1000

3 100 100 99 98 100 99 100 98 1000

Таблица. Противомикробная активность ГЛК и пиразолов 3 и 4

Примечание: Ec, Escherichia coli; Pv, Proteus vulgaris; Kp, Klebsiella pneumonia; Sa, Staphylococcus aureus; Cd, Citrobacter diversus; Ea, Enterobacter aerogenes; Pa, Pseudomonas aeruginosa; Ecl, Enterobacter cloace; Ca, Candida albicans; приведены средние результаты двух измерений МПК

Результаты исследования показали, что ГЛК и ее производные 3 и 4 обладают противомикробной активностью в отношении всех испытанных патогенных тест-микроорганизмов с МПК 98-100 мкг/кг и проявляют противогрибковую активность в отношении Candida albicans, что свидетельствует о широком спектре действия данных соединений. Введение гетероциклических (пиразольных) колец в

молекулу ГЛК и ее 18,19-дегидро-аналога не приводит к существенному изменению противомик-робных свойств соединений по сравнению с натив-ной молекулой (ГЛК).

Таким образом, исследованные пиразолы ГЛК и 18,19-дегидро-ГЛК 3 и 4 представляют интерес в качестве противомикробных агентов широкого

спектра действия для расширенных фармакологических исследований.

Экспериментальная часть

Спектры ЯМР 1Н и 13С регистрировали на импульсном спектрометре Вгикег АМХ-300 с рабочей частотой 300 (1Н) и 75.5 (13С) МГц в дейтеро-хлоро-форме. Химические сдвиги приведены в м.д. относительно сигнала внутреннего стандарта - тетраме-тилсилана (ТМС). ИК-спектр записан на спектрофотометре Ж Prestige-21 (Shimadzu) в пасте с вазелиновым маслом.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках Сорбфил (Сорбополимер), используя систему растворителей бензол-этанол, 10:1. Пятна веществ обнаруживали 5% раствором Н2Я04 в этаноле с последующим нагреванием при 110-120° С в течение 2-3 мин.

В работе использовали ГЛК и 18,19-дегидро-ГЛК, полученные согласно [8, с. 311]. 2-Оксимети-лен-3-кето-производные тритерпеноидов 1а и 2а получали по ранее опубликованным нами методикам [8, с. 311; 13, с 76]. Соединение 1а: Т. пл. 249250°, лит. [8, с. 311]: Т. пл. 2510. Соединение 2а: Т. пл. 180-182°, лит. [13, с. 76]: 182-184°.

Общая методика получения тритерпено-вых пиразолов (3,4). Раствор 1 ммоль 2-оксимети-лен-3-кетоэфиров (1а,2а) и 0.5 мл гидразингидрата в 30 мл этанола кипятили 2 ч, упаривали досуха и кристаллизовали из хлороформа-этанола.

Метиловый эфир [3^]-пиразоло- 180Н-олеан-12(13)-ен-11-он-30-овой кислоты (3). Выход 85%. Т. пл. 183 °С. Лит. [8, с. 311]: Т. пл. 181182 °С. ЯМР (CDaз, 5, м.д.): 7.25 (с, 1Н, Н-32), 5.75 (с, 1Н, Н-12), 3.78 (с, 1Н, Н-3?), 3.70 (с, 3Н, ОСНз), 2.57-1.45 (м, СН, СН2), 1.38 (с, 3Н, СНз-27), 1.32 (С, 3Н, СНз-23), 1.24 (с, 3Н, СНз-29), 1.18 (с, 3Н, СНз-24), 1.15 (с, 3Н, СНз-25), 1.10 (с, 3Н, СНз-

26), 0.84 (с, 3Н, СНз-28). Спектр ЯМР 1зС (CDaз, 5, м.д.): 199.9 (С-11), 176.9 (С-30), 169.7 (С-1з), 149.2 (С-3), 128.4 (С-12), 112.1 (С-2), 60.0 (С-9), 53.0 (С-5), 51.6 (С-з1), 49.7 (С-18), 48.1 (С-19), 45.1 (С-8), 44.8, 4з.8, 4з.1, 40.9, з8.1, з7.6, зб.7, зз.з, з1.8, з1.1, 28.4, 28.1, 26.4, 26.2, 2з.9, 2з.0, 18.2, 18.0, 15.5, 15.з. Найдено, %: С 75.60, Н 9.02, N 5.45. Вычислено, %: С 75.84, Н 9.15, N 5.5з. Сз2^6^0з. М.в. 506.70.

Метиловый эфир [3^]-пиразоло-180Н-олеан-12(13),18(19)-диен-11-он-30-овой кислоты (4). Выход 80% (порошок желтоватого цвета). ИК-спектр, V, см-1: 3214, 1729, 1662, 1461. Спектр ЯМР 1Н ^С1з, 5, м.д.): 7.32, 7.28 (оба с, 2Н, Н-32, Н-19), 5.84 (с, 1Н, Н-12), 3.68 (с, 3Н, ОСНз), 2.48-1.50 (м, СН, СН2), 1.33, 1.30, 1.26, 1.24, 1.20, 1.18, 0.97 (все с, 21 Н, 7СНз). Спектр ЯМР 1зС ^С1з, 5, м.д.): 199.9 (С-11), 176.3 (С-30), 163.0 (С-13), 149.2 (С-32), 142.8 (С-18), 133.8 (С-3), 129.9 (С-12), 124.3 (С-19), 112.1 (С-2), 60.8 (С-9), 59. 4 (С-5), 53.5 (С-з1), 45.3 (С-4), 44.4 (С-8), 43.4 (С-14), 42.5 (С-20), з8.з (С-1), 37.0 (С-22), 36.1 (С-10), 35.0 (С-16), 34.9 (С-17), 33.5 (С-21), 31.4 (С-7), 28.0 (С-23), 26.0 (С-15), 25.0 (С-29), 24.4 (С-28), 19.7 (С-27), (С-16), 23.8 (С-

27), 19.7 (С-24), 18.5 (С-27), 18.2 (С-6), 15.8 (С-26), 14.2 (С-25). Найдено, %: С 76.10, Н 8.50, N 5.48.

C32H43N2O3. Вычислено, %: С 76.30, Н 8.60, N 5.56. М.в. 503.7.

Оценка противомикробной активности соединений

В работе были использованы депонированные штаммы микроорганизмов в ГИСК (Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Тарасевича Минздрава России) и музея кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Citrobacter diversus, Enterobacter aerogenes Pseudomonas aeroginosa, Enterobacter cloace и Candida albicans.

Противомикробную активность исследуемых соединений определяли методом «диффузии в агар» и десятикратных серийных разведений в мя-сопептонном бульоне (МПБ) согласно [14, с. 832]. Для этого предварительно готовили раствор, содержащий 100 мг изучаемого соединения в 1 мл ДМСО с последующим разведением МПБ до рабочей концентрации 10 мг/мл. В ряд пробирок с последовательными десятикратно убывающими концентрациями исследованных соединений в МПБ вносили тестовые культуры микроорганизмов. При этом микробная нагрузка составила 2.0 х 106 микробных тел в 1 мл питательной среды. Посевы инкубировали при 37 °С в течение 72 ч и при 25 °С в течение 48 ч. О противомикробной активности соединений судили по отсутствию роста тест - культур при 37 °С через 24 часа. Данные по противомикробной активности представлены в виде минимальной подавляющей концентрации (МПК) (мкг/мл) исследованных соединений.

Работа выполнена по теме № АААА-А17-117011910025-6 госзадания.

Список литературы

1.Ваг1оссо D., Meneghetti F. Special Issue: Frontiers in Antimicrobial Drug Discovery and Design. // Molecules. - 2017. - V. 22. - P. 1127. - V. 22. - P. 1127-1130.

2.Rice L.B.. Unmet medical needs in antibacterial therapy. // Biochem. Pharmacol. - 2006. - V. 71. - P. 991-995.

3.Sanglard D. Emerging Threats in Antifungal-Resistant Fungal Pathogens. // Front. Med. (Lausanne). - 2016. - V. 3. - P. 11-21.

4.Newman D.J., Cragg G.M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. // J. Nat. Prod. - 2016. - V. 79. - P. 629-661.

5.Тевяшова А.Н., Олсуфьева Е.Н., Преображенская М.Н. Создание антибиотиков двойного действия как путь поиска новых перспективных лекарственных препаратов. // Успехи химии. - 2015. -T. 84. - C. 61-97.

6.Bauer A., Bronstrupt M. Industrial natural product chemistry for drug discovery and development. // Nat. Prod. Res. - 2014. - V. 31. - P. 35-60.

7.Covan M.M. Plants products as antimicrobial agents. // Clinical Microbiology Reviews. - 1999. - V. 12. - P. 564-582.

8.Tolstikov G.A., Baltina L.A., Grankina V.P., Kondratenko R.M. Licorice: biodiversity, chemistry, and application in medicine. Novosibirsk: Academic Publishing House "Geo". - 2007. - 311 p.

9.Wang L., Yang R., Yann B., Liu Y., Liu Ch. The antiviral and antimicrobial activities of licorice, a widely-used Chinese herb. // Acta Pharm. Sinica B. -2015. - V. 5. - P. 310-315.

10.Guo N., Takechi M., Uno C. Protective effects of glycyrrhetinic acid in mice with systematic Candida albicans infection and its mechanism. // J. Pharm. Pharmacol. - 1991. - V. 12. - P. 380-383.

11.Li H.-E., Qiu J.-Zh., Yang Zh.-Q., Dong J., Wang J.-F., Luo M.-J., Pan J., Dai X.- H., Zhang Y., Song B.-L., Deng X.-M. Glycyrrhetinic acid protects

mice from Staphylococcus aureus pneumonia. // Fitot-erapia. - 2012. - V. 83. - P. 241-248.

12.Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х т. - Изд. 14-е, перераб., испр. и доп. - М.: ООО Изд-во Новая Волна. - 2000. - 540 с.

13. Khudobko M.V., Mikhailova L.R., Baltina L.A. (jr.), Spirikhin L.V., Baltina L.A. Synthesis of 2,11-dioxo-norolean A(1)-12,18(19)-dien-30-oic acid. // Chem. Nat. Compd. - 2011. - V. 47. - P. 76-78.

14. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под. общ. ред. чл.-корр. РАМН, проф. Хабриева Р.У. - Изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. - 832с.

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТАНЦИИ НОВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО ХИНАЗОЛИН-4(ЗН)-ОНА МЕТОДОМ КИСЛОТНО-ОСНОВНОГО ТИТРОВАНИЯ В НЕВОДНОЙ СРЕДЕ

Волокитина Дарья Сергеевна

преподаватель кафедры фармацевтической и токсикологической химии, ПМФИ- филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ, Пятигорск Лазарян Джон Седракович доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии ПМФИ - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ, Пятигорск Волокитин Сергей Васильевич канд. фармацевт. наук, доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии, ПМФИ - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ, Пятигорск

АННОТАЦИЯ

В настоящее время увеличивается число людей, страдающих нарушением мозгового кровообращения. Данная ситуация требует расширения рынка фармацевтических препаратов, которые будут безопасными и эффективными, а также инновационными в диагностике и лечении данной проблемы. С этой целью на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Волгоградского государственного медицинского университета было синтезировано новое биологически активное соединение (БАС) -производное хиназолин-4(3Я)-она - субстанция VMA-10-13. Предварительные доклинические исследования показали что данное БАС может применятся в медицинской практике, в качестве ноотропного и про-тивогипоксического лекарственного средства [2]. Гарантией эффективности и безопасности нового лекарственного средства (ЛС) является создание стандартов их качества. Для его внедрения в медицинскую практику необходимо провести исследования, нацеленные на разработку способов оценки его качества и стандартизации. Ранее нами была показана возможность использования метода спектрофотометрии в ультрафиолетовой области для количественного определения субстанции VMA-10-13 с нормой содержания действующего вещества 100 ± 2% [3]. Целью настоящего исследования явилась разработка и валидация методики количественного определения VMA-10-13 в субстанции с нормой содержания действующего вещества 100 ± 1% методом кислотно-основного титрования в неводной среде.

Ключевые слова: хиназолин, ноотропный, стандартизация, кислотно-основное титрование, неводная среда.

ANNOTATION

Currently, the number of people suffering from cerebral circulation is increasing. This situation requires the expansion of the market for pharmaceutical products that are safe and effective, as well as innovative in the diagnosis and treatment of this problem. To this end, a new biologically active compound (ALS), a quinazolin-4 (3H) -one derivative, VMA-10-13, was synthesized at the Department of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry of Volgograd State Medical University. Pre-clinical studies have shown that this BAS can be used in medical practice as a nootropic and antihypoxic drug [2]. A guarantee of the effectiveness and safety of a new drug (drug) is the creation of standards for their quality. For its introduction into medical practice, it is necessary to conduct research aimed at developing ways to assess its quality and standardization. We have previously shown the possibility of using the spectrophotometry method in the ultraviolet region for the quantitative determination of the substance VMA-10-13 with a standard content of the active substance 100 ± 2% [3]. The purpose of this study