УПАКОВКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ

1. Способ получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды, включающий этапы:
(a) обеспечение олигонуклеотидов, причем указанные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере один участок поли-G;
(b) денатурации указанных олигонуклеотидов, причем указанная денатурация включает этап
(i) инкубации водного раствора I, содержащего указанные олигонуклеотиды и хаотропный агент, при температуре I до тех пор, пока средний диаметр указанных олигонуклеотидов не составит 1 нм или менее, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура I составляет от 75°C до 99°C, а указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину;
(c) агрегации указанных олигонуклеотидов, причем указанная агрегация включает этапы
(i) инкубации водного раствора II, содержащего указанные олигонуклеотиды с указанным средним диаметром 1 нм или менее, полученные на этапе (b), хаотропный агент и катион, при температуре II с образованием указанных агрегированных олигонуклеотидов, при этом указанную инкубацию проводят до получения среднего диаметра указанных образованных агрегированных олигонуклеотидов 6-16 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура II составляет от 75°C до 99°C, а указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину;
(ii) доведения температуры указанного раствора II до температуры III, причем указанная температура III ниже 40°C, предпочтительно ниже 30°C;
при этом указанные этапы предпочтительно проводят в заданном порядке.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный водный раствор I не содержит одно- или двухвалентных ионов в такой концентрации, при которой происходит спонтанная самоагрегация указанных олигонуклеотидов.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, выбран из мочевины, фенола, изопропилового спирта, этанола и хлорида гуанидиния, причем указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, предпочтительно представляет собой мочевину.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанные олигонуклеотиды содержат на 5’-конце по меньшей мере 3 и максимум 15 единиц гуанозина и на 3’-конце - по меньшей мере 3 и максимум 15 единиц гуанозина, предпочтительно по меньшей мере 6 и максимум 13 единиц гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 6 и максимум 13 единиц гуанозина, более предпочтительно по меньшей мере 8 и максимум 11 единиц гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 8 и максимум 11 единиц гуанозина.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанные олигонуклеотиды содержат от 10 до 1000 нуклеотидов, предпочтительно от 10 до 200 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 20 до 40 нуклеотидов и еще более предпочтительно 30 нуклеотидов.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанные олигонуклеотиды содержат последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:
(a) G10: GGGGGGGGGGGACGAT CGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1);
(b) G10-11: GGGGGGGGGGGACG ATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:3);
(c) G12-11: GGGGGGGGGGGGGA CGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:4)
(d) G6: GGGGGGGACGATCGTCG GGGGG (SEQ ID NO:5);
(e) G7: GGGGGGGGACGATCGTC GGGGGGG (SEQ ID NO:6);
(f) G8: GGGGGGGGGACGATCGT CGGGGGGGG (SEQ ID NO:7);
(g) G9: GGGGGGGGGGACGATCG TCGGGGGGGGG (SEQ ID NO:8);
(h) G11: GGGGGGGGGGGGACGA TCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:9)
(i) G6-10: GGGGGGGACGATCG TCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:24);
(j) G7-10: GGGGGGGGACGATC GTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:25);
(k) G8-10: GGGGGGGGGACGA TCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:26); и
(l) G9-10: GGGGGGGGGGACGAT CGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:27);
причем указанные олигонуклеотиды предпочтительно имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGG ACGATCGTCGG GGGGGGGG (SEQ ID NO:1), и дополнительно указанные олигонуклеотиды предпочтительно состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что чистота указанных олигонуклеотидов, предпочтительно чистота указанных олигонуклеотидов с SEQ ID NO:1, составляет 90 % или более по определению методом ВЭЖХ, предпочтительно обращенно-фазовой ВЭЖХ или анионообменной ВЭЖХ, более предпочтительно обращенно-фазовой ВЭЖХ.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, выбран из мочевины, фенола, изопропилового спирта, этанола и хлорида гуанидиния, причем указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, предпочтительно представляет собой мочевину.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, и указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, являются одинаковым, причем указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, и указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, представляют собой мочевину.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 9-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты GGGGGGGGGGG ACGATCGTCGG GGGGGGGG (SEQ ID NO:1) (G10), и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
12. Композиция нуклеотидов, содержащая агрегированные олигонуклеотиды, причем указанная композиция нуклеотидов может быть получена способом по любому из пп. 1-11, при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды предпочтительно имеют средний диаметр 6-16 нм, предпочтительно 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
13. Композиция нуклеотидов, содержащая агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
14. Композиция нуклеотидов по п. 12 или п. 13, отличающаяся тем, что по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
15. Композиция нуклеотидов по любому из пп. 12-14, отличающаяся тем, что по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
16. Композиция нуклеотидов по любому из пп. 12-15, отличающаяся тем, что указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGGACG ATCGTCGGGG GGGGGG (SEQ ID NO:1), и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды предпочтительно состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
17. Способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, причем указанный способ включает этапы:
(а) создание смеси, причем указанная смесь содержит:
(i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага;
(ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и
(iii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС);
(b) удаление указанного агента из указанной смеси; и
(c) обеспечение возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
18. Способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, причем указанный способ включает этапы:
(а) создание смеси, причем указанная смесь содержит:
(i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага;
(ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и
(iii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды могут быть получены способом по любому из пп. 1-11 и имеют средний диаметр 6-16 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС);
(b) удаление указанного агента из указанной смеси; и
(c) обеспечение возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
19. Способ по п. 17 или п. 18, отличающийся тем, что указанный РНК-бактериофаг выбран из группы, состоящей из:
(a) бактериофага Qβ;
(b) бактериофага R17;
(c) бактериофага fr;
(d) бактериофага GA;
(d) бактериофага SP;
(e) бактериофага MS2;
(f) бактериофага M11;
(g) бактериофага MX1;
(h) бактериофага NL95;
(i) бактериофага f2;
(j) бактериофага PP7; и
(k) бактериофага AP205;
при этом указанный РНК-бактериофаг предпочтительно представляет собой Qβ.
20. Способ по любому из пп. 17-19, отличающийся тем, что чистота указанной композиции составляет по меньшей мере 99,5%, предпочтительно по меньшей мере 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере 99,7%, еще более предпочтительно по меньшей мере 99,8% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,9% при определении методом эксклюзионной хроматографии.
21. Композиция, получаемая способом по любому из пп. 17-20, содержащая (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу.
22. Композиция, содержащая (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16, предпочтительно 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
23. Композиция по п. 21 или п. 22, отличающаяся тем, что указанный РНК-бактериофаг представляет собой бактериофаг Qβ.
24. Композиция по любому из пп. 21-23, отличающаяся тем, что указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGG ACGATCGTCGG GGGGGGGG (SEQ ID NO:1), и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
25. Композиция по любому из пп. 21-24, отличающаяся тем, что по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
26. Композиция по любому из пп. 21-25, отличающаяся тем, что по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).