СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
METHOD OF STEM CELL PRODUCTION

Изобретения относятся к области биомедицины и могут быть использованы для лечения заболеваний, требующих регуляции изменения клеточного состава красного костного мозга (ККМ), в том числе управления продуцированием и размножением стволовых клеток (СК) и их способностью к процессам пролиферации и дифференцировки, а также для изучения в рамках нормальной и патологической физиологии и биофизики воздействия на организм низкоинтенсивных (нетепловых) электромагнитных полей (ЭМП) диапазона крайне высоких частот (KBЧ), модулированных инфранизкими частотами (ИНЧ), а также с право- или левосторонней круговой поляризацией с ИНЧ вращения плоскости поляризации.
2
Известен способ воздействия ЭМП КВЧ на регуляцию функций клетки (а.с. СССР №5522090, М. кл. А61N 5/02, Бюл. №12, 30.03.77), включающий использование воздействия низкоинтенсивного (нетеплового) ЭМП КВЧ с малыми энергиями квантов, например с частотами, соответствующими длинам электромагнитной волны (ЭМВ) от 5,7 до 8 мм.
Недостатком известного способа является то, что в нем не используется модуляция ИНЧ, диапазон используемого излучения ограничен сверху частотой 50 ГГц, не выявлено воздействие на ККМ, что ограничивает его терапевтические и профилактические возможности.
Известен также способ рефлексотерапии воздействием на биообъект ЭМП КВЧ (пат.Украины №19645 А, МПК 6 А61N 5/02, Бюл. 25.12.1977), включающий облучение биообъекта ЭМП КВЧ с амплитудной модуляцией треугольными импульсами, причем частота модуляции пропорциональна частоте пульсации крови в кровеносных сосудах.
Недостатком известного способа является то, что в нем используется модуляция ИНЧ в диапазоне 1-2 Гц (частота пульсации крови в кровеносных сосудах), что не является терапевтически значимым для ККМ, диапазон используемого излучения ограничен сверху частотой 55 Гц, не выявлено воздействие на ККМ, что ограничивает его терапевтические и профилактические возможности.
Известен также способ получения жизнеспособных клеток печени человека, в том числе печеночных СК/клеток-предшественников (пат. РФ №2346981, МПК 7 С12N 5/00, С12N 5/08, А61К 35/407, А61Р 1/16, G01N 33/00, A61К 48/00, С12Н 21/02, Бюл. №5, 20.02.2009), включающий получение популяции клеток из целой печени или из ее резецированной части, обогащенную жизнеспособными клетками печени человека, в том числе печеночными СК/клетками-предшественниками, а полученную популяцию клеток используют для лечения пациентов, имеющих заболевания печени.
Недостатком известного способа является то, что СК получают (регулируют) только in vitro (в пробирке) и не используется облучение внешними электромагнитными агентами, что в совокупности указанных недостатков не позволяет управлять продуцированием СК in vivo (в живом организме), тем самым и использовать способ в лечении и/или профилактике заболеваний, требующих регуляции изменения клеточного состава ККМ, в том числе управление продуцированием СК.
Известно также устройство, осуществляющее способ (прототип) производства и выращивания СК (полезная модель к патенту РФ №47651, МПК 7 А61В 17/435 А, Бюл. №25, 10.09.2005), включающий управление продуцированием СК in vitro, помещенных в сосуд-термостат с системой жизнеобеспечения СК, а облучение производится с помощью электроразрядника, выполненного с изменяемой геометрией параметров, задаваемых от подключенного к нему программатора задания программ геометрии параметров импульсов по току, напряжению, длительности и форме.
Недостаток прототипа в части способа состоит в том, что СК получают только in vitro, а в качестве внешнего агента электромагнитной природы используется электроразрядник, не позволяющий достичь тех эффектов продуцирования и регуляции СК, которые возможны при использовании высокочастотных модулированных ЭМВ с гибко управляемыми параметрами.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является обеспечение воздействия на организм биообъекта, в частности пациента с заболеванием, требующим для лечения регуляции изменения клеточного состава ККМ, в том числе управления продуцированием СК и их способностью к пролиферации и дифференцировке, внешнего агента электромагнитной природы, а именно локализованного в зоне анатомического расположения ККМ, то есть направленного облучения КВЧ-диапазона с модуляцией ИНЧ.
Техническим результатом, достигаемым в результате решения поставленной задачи, является амплитудная модуляция ЭМП КВЧ монохроматическим гармоническим сигналом ИНЧ или поляризационная модуляция ЭМП КВЧ в форме изменяемой право- или левосторонней круговой поляризации ЭМИ с инфранизкой частотой вращения плоскости поляризации ЭМВ КВЧ в диапазоне ИНЧ, причем в процессе облучения сохраняется идентичность его спектральных и пространственно-временных характеристик, имманентных структуре живого вещества (биоткани), то есть получения биотронного поля.
2
Указанный технический результат достигается тем, что в способе управления продуцированием СК, включающем облучение биообъекта внешним агентом электромагнитной природы с изменяемым параметрами, задаваемыми от подключенного к источнику агента программатором задания программ, причем облучение осуществляют in vivo в зоне анатомического расположения ККМ, внешним агентом - ЭМИ КВЧ в диапазоне 35-80 ГГц с поверхностной плотностью потока энергии в диапазоне 0,1-10 мВт/см, модулированным по амплитуде с изменением частоты модуляции в диапазоне 4-10 Гц. Кроме того, модуляцию производят в форме измененной право- или левосторонней круговой поляризации ЭМИ с частотой вращения плоскости поляризации излучения в диапазоне 4-10 Гц.
Способ управления продуцированием СК in vivo осуществляется следующим образом.
2
Рупорная направленная антенна специально разработанного генератора ЭМВ КВЧ с регулированием частоты несущей в диапазоне 35-80 ГГц, с обеспечением амплитудной модуляции в диапазоне ИНЧ 4-10 Гц и/или изменения право- или левосторонней круговой поляризации ЭМВ КВЧ с частотой вращения плоскости поляризации в диапазоне 4-10 Гц, содержащей аттенюатор, обеспечивающий изменение поверхностной плотности потока энергии в диапазоне 0,1-10 мВт/см, а также программатор, задающий программу изменения параметров облучения, устанавливается относительно биообъекта, в частности пациента, таким образом, чтобы направленное излучение было локализовано в зоне анатомического расположения ККМ. Далее производится процедура облучения, согласно программе осуществляемая в течение требуемого числа сеансов с заданной длительностью сеансов.
Режим облучения, который реализует программа, разработан исходя из результатов проведенных экспериментальных исследований и морфологического анализа на лабораторных животных-млекопитающих с соответствующей корректировкой для организма человека. При проведении экспериментов с лабораторными животными выполнялись нормы биоэтики, связанные с проведением экспериментов на животных, в том числе регламентированные в «Международных рекомендациях по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятые в 1985 г. Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS, 1985).
н
мод
2
Сущность проведенных экспериментов состояла в облучении крыс линии Вистар ЭМИ КВЧ с несущей частотой ƒ=37 ГГц, амплитудно-модулированной изменяемыми ИНЧ в диапазоне ƒ=4-10 Гц, с изменяемой поверхностной плотностью потока энергии в диапазоне 0,1-10 мВт/см с последующим морфологическим анализом клеточного состава ККМ. Указанный диапазон ИНЧ был выбран с учетом ранее выполненных авторами исследований, свидетельствующих о выраженном биотронном воздействии модулированного ЭМИ КВЧ на быстро делящиеся клетки.
Взятие ККМ осуществлялось из грудины и головки бедренной кости. Препараты окрашивались по Романовскому-Гимзе. Морфологические исследования проводились под световым микроскопом при увеличении 720 х. Оценка клеточного состава ККМ выполнялась спустя 24, 48, 72 часа и 6 суток после однократного пятнадцатиминутного воздействия амплитудно-модулированного (AM) ЭМИ КВЧ. В качестве контроля исследования ККМ после воздействия немодулированного ЭМИ КВЧ с прочими равными условиями.
мод
мод
э
2
Были выявлены при AM с изменяемыми частотами ИНЧƒ=4-10 Гц существенные изменения клеточного состава ККМ и способности СК к пролиферации и дифференцировке. Через 48 часов после облучения наблюдалось, наряду с уменьшением содержания клеток II-III классов, увеличение числа СК. Такая динамика изменения состава ККМ нарастала с течением времени после облучения. Наибольшая активация в части увеличения числа СК наблюдалась в интервале времени 48-72 часов. Результаты отличны от контрольной группы (без AM), для которой характерна выраженная стимуляция процессов пролиферации в ККМ. Поскольку к шестым суткам исследования в пунктате ККМ наблюдались только единичные СК, отличающиеся полиморфизмом, а переходные формы отсутствовали, что свидетельствует об угнетении процессов пролиферации и дифференцировки клеток ККМ, то при разработке режима облучения человека в лечебных/профилактических целях желательным является: а) увеличение AM ИНЧ ближе к верхним частотам диапазона, то есть брать ƒ=8-10 Гц; б) снижение поверхностной плотности потока энергии излучения до 0,1-10 мВт/см, а возможно и до сотых долей 0,1-10 мВт/см; в) уменьшение времени экспозиции AM ЭМИ ниже уровня t=15 мин.
Таким образом, оптимизированный терапевтический режим должен соответствовать условию обратимости процесса после облучения и не достигать порога, при котором начинает сказываться угнетение процесса кроветворения, самый крайний негативный случай - это формирование гипо- и апластического состояния ККМ. Оптимальным для предлагаемого способа управления продуцированием СК in vivo является тщательно выбранный, апробированный в экспериментах на животных-млекопитающих режим облучения, при котором наблюдается активация образования СК при одновременной стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток в ККМ.
В целом при оптимизации режима облучения следует учитывать, поскольку AM ИНЧ является основным действующим агентом внешнего воздействия, что ИНЧ являются, в общем случае, негативным фактором для процессов жизнедеятельности, в том числе кроветворения, но они же позволяют наиболее динамично управлять клеточным составом ККМ и управлять in vivo продуцированием СК и поэтому в необходимых для лечения жизненно необходимых ситуациях исходить из принципа допустимого вреда при достижении лечебного эффекта. Впрочем, этот подход является общим при использовании полевых воздействий в терапии, как-то: КВЧ-терапия, магнито- и лазеротерапия, рентгенотерапия и пр., то есть относится как к ионизирующим, так и к неионизирующим (биоинформационным, нетепловым) излучениям.
Для снижения (возможного) негативного воздействия несущей частоты, то есть ЭМП КВЧ, целесообразно использовать так называемые «терапевтические частоты», ранее выделенные (Школа акад. Н.Д.Девяткова): 42,19 ГГц (7,1 мм), 53,53 (5,6 мм) и 60,12 ГГц (4,9 мм).
Полученные выше экспериментальные данные в целом подтверждены для различных частот КВЧ-диапазона 35-80 ГГц и при использовании левосторонней круговой поляризации ЭМИ с частотой вращения плоскости поляризации в диапазоне 4-10 Гц.
Сопоставительный анализ показывает, что заявляемый способ управления продуцированием СК отличается от прототипа тем, что поля и режимы облучения отличны от использованных в прототипе, объектом управления являются СК in vivo (в организме), что недостижимо в прототипе.
Предложенный способ управления продуцированием СК in vivo базируется на том известном факте, что ККМ в силу своих физиологических и морфологических особенностей (полиморфизм клеток, высокая пролиферативная активность низкодифференциованных клеток, ведущая к формированию большого количества высокодифференцированных в морфологическом и функциональном отношении клонов клеток) представляет собой вид ткани, наиболее гибко и динамично изменяющей свой клеточный состав под воздействием различных агентов, в том числе внешних по отношению к организму и особенно электромагнитных излучений с достаточно сложным общим набором спектральных, дисперсионных, поляризационных и пространственно-временных характеристик, из которых организм в состоянии патологии того или иного органа и/или системы «отбирает» нужные для активизации/ингибирования процессов ликвидации патологии, то есть выздоровления (биофизический принцип Н.Винера).
Исходя из сказанного выше можно утверждать, что техническое решение отвечает критерию патентоспособности «новизна».