СПОСОБ ФЕРМЕНТНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ КОФАКТОРОВ

+
+
1. Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD/NADH и/или, в частности, и NADP/NADPH в совместной реакции, в котором в результате по меньшей мере двух катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций, протекающих в одной реакционной массе, (реакций образования продукта) один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме, отличающийся тем, что
а) в реакции регенерации, при которой восстановленный кофактор преобразуется в исходную окисленную форму, восстанавливают кислород или соединение общей формулы
1
1
4
1
4
где R - линейная или разветвленная (С-С)-алкильная группа или (С-С)-карбоксиалкильная группа, а
4
8
b) в реакции регенерации, при которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, окисляют (С-С)-циклоалканол или соединение общей формулы
2
3
1
6
1
6
6
12
1
4
3
8
где R и R независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, (C-С) алкил, где алкил является линейным или разветвленным, (C-С) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и содержит от одной до трех двойных связей, арил, в частности, С-С арил, карбоксил, или (С-С) карбоксиалкил, в частности, также циклоалкил, например, С-C циклоалкил.
+
+
2. Способ по п. 1 ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD/NADH и/или, в частности, и NADP/NADPH в совместной реакции, в котором в результате по меньшей мере двух катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций, протекающих в той же реакционной массе, (= реакций образования продукта) один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме, отличающийся тем, что
а) при регенерации окисленного кофактора восстанавливают соединение общей формулы
1
где R - замещенная или незамещенная С1-С4 алкильная группа, а
b) при регенерации восстановленного кофактора окисляют соединение общей формулы
2
3
где R и R независимо друг от друга выбраны из группы, включающей
1) -Н,
1
6
2) -(C-С) алкил, где алкил является линейным или разветвленным,
1
6
3) -(C-С) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и выборочно содержит от одной до трех двойных связей,
3
8
4) -циклоалкил, в частности, С-C циклоалкил,
6
12
5) -арил, в частности, С-С арил,
1
4
6) -(С-С) карбоксиалкил, а в случае, если соединение формулы I является пируватом, выборочно, также карбоксил.
2
3
1
6
1
6
6
12
1
4
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что R и R независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, (C-С) алкил, где алкил является линейным или разветвленным, (C-С) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и содержит от одной до трех двойных связей, арил, в частности, С-С арил, карбоксил или (С-С) карбоксиалкил.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что окислительная реакция (реакции) и восстановительная реакция (реакции) протекают на одном и том же субстрате (основной молекулярной цепи).
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что окислительная реакция (реакции) и восстановительная реакция (реакции) протекают хронологически параллельно.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что при реакции регенерации, в которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, 2-пропанол окисляют до ацетона с помощью спиртовой дегидрогеназы.
7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что при реакции регенерации, в которой восстановленный кофактор преобразуется в исходную окисленную форму, пируват восстанавливают до лактата с помощью лактат-дегидрогеназы.
2
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что при реакции регенерации, в которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, малат окисляют до пирувата и СО с помощью малат-дегидроненазы.
9. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что его используют для проведения по меньшей мере одной окислительной реакции и по меньшей мере одной восстановительной реакции соответственно в той же реакционной массе на соединениях общей формулы
4
где R - водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
5
R - водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метильная группа,
6
R - водород или гидроксигруппа,
7
13
13
1
4
1
4
R - водород, -COR, где R - С-С алкильная группа, незамещенная или замещенная гидроксигруппой, или С-С карбоксиалкильная группа, замещенная, в частности, гидроксигруппой или незамещенная,
6
7
или R и R вместе представляют собой оксогруппу,
8
R - водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
9
R - водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
10
R - водород, метильная группа или галоген,
11
R - водород, метильная группа, гидроксигруппа, оксогруппа или галоген, а
12
R - водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метильная группа, где структурный элемент
означает бензольное кольцо или кольцо, содержащее 6 атомов углерода и 0, 1 или 2 С-С-двойные связи; причем субстрат (субстраты) предпочтительно присутствуют в концентрации <5 мас. % в реакционной массе для восстановительной реакции (реакций), связанных с образованием целевого продукта.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что его используют для конверсии дегидроэпиандростерона (DHEA) формулы
в тестостерон формулы
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что его используют для ферментной эпимеризации 3α,7α-дигидрокси-5β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) формулы
в кетолитохолевую кислоту формулы
путем окисления
и в стереоизомерное гидроксисоединение 3α,7β-дигидрокси-5β-холановую кислоту (урсодеоксихолевую кислоту) формулы
путем последующего восстановления,
с использованием двух противоположно стереоспецифичных гидроксистероидных дегидрогеназ, в частности, где окислительную реакцию катализируют 7α-гидроксистероидной дегидронегазой из E.coli; и/или восстановительную реакцию катализируют 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой из Ruminococcus torques.
12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что его используют для ферментной эпимеризации 3α,7α,12α-тригидрокси-5β-холановой кислоты (холевой кислоты) формулы
либо А) путем окисления с получением 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-CDC) формулы
которая далее реагирует с получсением 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-KLC) формулы
и последующего восстановления до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы
либо В) путем окисления с получением 3α,12α-дигидрокси-7-оксо-5β-холановой кислоты формулы
с последующим ферментным окислением до 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-KLC) формулы XI и последующим восстановлением до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы XII,
либо С) путем окисления с получением 3α,12α-дигидрокси-7-оксо-5β-холановой кислоты формулы XIII с последующим ферментным восстановлением до 3α,7β,12α-тригидрокси-5β-холановой кислоты формулы
и последующего окисления до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы XII;
с использованием 3 стереоспецифичных гидроксистероидных дегидрогеназ, из которых 2 обладают противоположной стереоспецифичностью.
5
6
13. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что его используют для изомеризации С- или С-сахаров, в частности, для изомеризации глюкозы путем восстановления сорбитом и последующего окисления до фруктозы.
14. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что субстрат (субстраты) для окислительной реакции (реакций), связанных с получением продукта, вводят в реакционную массу в концентрации по меньшей мере 5 мас. % и более, предпочтительно 7 мас. % и более, особенно предпочтительно 9 мас. % и более.
15. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в реакциях получения продукта в целом достигается конверсия ≥70%, в частности ≥90%.