Оценка адгезивных свойств спор вакцинных штаммов Bacillus anthracis на эритроцитах млекопитающих с помощью фотоколориметрии

УДК 616.981.51

Е.В.Пименов1, В.А.Оборин2, А.Г.Ивонин1

ОЦЕНКА АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ СПОР ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BACILLUS ANTHRACIS НА ЭРИТРОЦИТАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ПОМОЩЬЮ ФОТОКОЛОРИМЕТРИИ

1 Лаборатория сравнительной кардиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар;

2ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров

В статье приведены результаты изучения адгезии спор вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба к эритроцитам человека и животных с помощью фотоколориметрического метода. Установлены различия в адгезивной способности спор B. anthracis штаммов № 55 ВНИИВВиМ, СТИ-1 и II вакцины Ценковского. Выявлено, что уровень адгезии спор B. anthracis № 55 ВНИИВВиМ к эритроцитам млекопитающих зависит от чувствительности вида к инфицированию возбудителем сибирской язвы.

Ключевые слова: сибирская язва, споры, вакцинные штаммы, адгезия, эритроциты.

E.V.Pimenov, V.A.Oborin, A.G.Ivonin

Evaluation of the Adhesive Properties of Spores of Bacillus anthracis Vaccine Strains to the Mammalian Erythrocytes Using Photocolorimetry Technique

Laboratory of comparative cardiology of Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Syktyvkar; Vaytka State University, Kirov

Displayed are the results of studies concerning adhesion of spores of Bacillus anthracis vaccine strains to the erythrocytes of humans and other mammals using photocolorimetry technique. Determined are the differences in adhesive capacity of spores of B. anthracis vaccine strains № 55 VNIIVVM, STI-I and II Tsenkovsky. Discovered is the fact that the level of adhesive activity of B. anthracis № 55 VNIIVVM spores to the mammalian erythrocytes depends upon the sensitivity of the species to the anthrax agent.

Key words: Bacillus anthracis, spores, vaccine strains, adhesion, erythrocytes.

Адгезия представляет собой сложный многокомпонентный процесс, обеспечивающий колонизацию микроорганизмами любых плотных субстратов, включая ткани человека и животных [4, 11, 14]. Изучению адгезивной активности микроорганизмов бактериальной природы в последние годы уделяется пристальное внимание, однако об адгезивных свойствах споровых форм бактерий, в том числе возбудителя сибирской язвы, имеются лишь единичные сообщения [7]. Следовательно, изучение адгезивности спор B. anthracis является актуальной задачей.

На сегодняшний день для исследования адгезии бактерий на клетках организма хозяина предложены методы in vitro и in vivo [4]. Однако методы in vivo с использованием лабораторных животных являются достаточно трудоемкими, дорогостоящими и непригодными для изучения большого количества штаммов, кроме того, исключают возможность работы с клетками человеческого происхождения [12]. В связи с этим при определении адгезивности бактерий наиболее часто применяются методы in vitro с использованием в качестве клеток-мишеней эритроцитов [1, 5]. Считается, что гликофорин мембраны эритроцитов идентичен гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезинов микроорганизмов. Данное сходство и простота получения эритроцитов в необходимых количествах делает их универсальной моделью для изучения адгезивных свойств бактерий [12].

Для регистрации адгезии микроорганизмов к

эритроцитам применяется световая микроскопия [8], реакция гемагглютинации (РГА) [13], реже - электронная микроскопия [1]. Однако все эти методы не лишены определенных недостатков: для одних таковыми являются субъективность и недостаточная информативность, для других - трудоемкость и технические сложности.

Авторами статьи разработан метод изучения адгезии бактерий на эритроцитах in vitro при помощи фотоколориметрии, характеризующийся простотой исполнения, высокой чувствительностью и информативностью [10]. В данной статье приводятся результаты оценки адгезивной активности спор вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба фотоколориме-трическим методом.

Материалы и методы

В исследованиях использовали штамм B. ant-hracis № 55 ВНИИВВиМ, предоставленный ООО «Агровет» (Москва), а также штаммы B. anthracis СТИ-1 и II вакцины Ценковского, полученные в ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ» (Киров). Эксперименты проводили с суспензиями бактериальных спор, соответствующими 1,0 ед. оптической плотности (ОП) при длине волны проходящего света 540 нм.

Субстратом адгезии служили эритроциты человека 0 (I) Rh+ группы крови, а также лабораторных и сельскохозяйственных животных (белой крысы, морской свинки, кролика, коровы, свиньи). В каче-

стве антикоагулянтов при взятии крови применяли 3,8 % раствор лимонно-кислого натрия (1:10) или гепарин (3 ЕД/1,0 мл). Эритроциты трижды отмывали десятикратным объемом 0,9 % раствора хлорида натрия путем центрифугирования при 1000 об./мин в течение 5 мин и ресуспендировали в этом же растворе. Конечная концентрация эритроцитов в суспензии составляла 1,0-1012/л.

При проведении эксперимента в пробирках смешивали по 1,0 мл суспензии эритроцитов и по 2,5 мл суспензии спор. В качестве контроля использовали пробы, содержащие: 2,5 мл суспензии спор и 1,0 мл 0,9 % раствора хлорида натрия; 1,0 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Пробы инкубировали на вращающейся платформе при (3 7± 1) °С в течение 30 мин, после чего эритроциты осаждали путем центрифугирования при 1000 об./мин в течение 1,5 мин. Затем из проб отбирали надоса-дочную жидкость в объеме 2,0 мл и на фотоэлектроколориметре КФК-2 определяли величину ее ОП.

Фиксирующую активность эритроцитов в отношении спор вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба оценивали по формуле:

д , + д , - д

к 1 к2 оп

ПА =

д

X 100 %,

к 1

Таблица 1

Уровень адгезии спор вакцинных штаммов В. аМкгасю на эритроцитах человека 0

Штаммы B. anthracis

ПА, %

№ 55 ВНИИВВиМ СТИ-1

II вакцина Ценковского

46,31±2,77

43,29±3,52

57,63±3,14*

где ПА - показатель адгезии, Дк1 - ОП надоса-дочной жидкости в 1-й контрольной пробе, Дк2 - ОП надосадочной жидкости во 2-й контрольной пробе, Доп - ОП надосадочной жидкости в опытной пробе.

В каждой серии опытов выполняли по пять независимых определений, статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы для обработки медицинской информации «Bюstat версии 4.03».

Результаты и обсуждение

В настоящее время для специфической профилактики сибирской язвы в нашей стране разработаны живые вакцины на основе споровых форм штаммов B. anthracis № 55 ВНИИВВиМ, СТИ-1 и

II вакцины Ценковского [6, 9]. Вакцина из штамма № 55 ВНИИВВиМ применяется в ветеринарии, а из СТИ-1 используется для специфической профилактики сибирской язвы у людей. Штамм II вакцины Ценковского не нашел практического применения в профилактике заболевания ввиду достаточно высокой остаточной вирулентности.

Известно, что эффективность живых вакцин, используемых для профилактики бактериальных инфекций, во многом зависит от способности микробных клеток приживаться и размножаться в организме хозяина [3]. В свою очередь, приживление бактерий обусловлено их способностью к адгезии на клетках-мишенях макроорганизма [4]. Исходя из этого, на первом этапе исследований оценивали связывание спор вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба с эритроцитами человека (табл. 1).

*Различия с другими штаммами Б. апґИгаєіз достоверны (Р < 0,05) по критерию Стьюдента.

Анализ данных табл. 1 свидетельствует о том, что споры вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба проявляли выраженную адгезивную активность в отношении эритроцитов человека. При этом ПА для штамма В. anthracis II вакцины Ценковского был достоверно выше (Р < 0,05), чем для штаммов В. anthracis СтИ-1 и В. anthracis № 55 ВНИИВВиМ, что свидетельствовало о вариабельности адгезивных свойств у вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба.

В следующей серии экспериментов нами была проведена сравнительная оценка адгезивной активности спор В. anthracis № 55 ВНИИВВиМ в отношении эритроцитов различных видов млекопитающих (табл. 2).

Как показали результаты эксперимента, степень прикрепления спор В. anthracis № 55 ВНИИВВиМ к эритроцитам зависела от видовой принадлежности последних. Споры данного штамма проявляли достаточно высокий уровень адгезии на эритроцитах человека, кролика, морской свинки и коровы (ПА в пределах 39-47 %) и очень низкий - на эритроцитах белой крысы и свиньи (ПА около 4 %). Виды млекопитающих, эритроциты которых подвергались исследованию, были условно разделены нами на две группы (табл. 2). Для видов, относящихся ко 2-й группе, значения ПА были достоверно ниже (Р<0,05), чем для 1-й группы.

При сопоставлении результатов эксперимента с данными литературы по эпидемиологии сибирской язвы [2, 9] была установлена следующая закономерность: споры В. anthracis № 55 ВНИИВВиМ обладали выраженными адгезивными свойствами в отноше-

Таблица 2

Уровень адгезии спор В. аМНгасю № 55 ВНИИВВиМ к эритроцитам ряда млекопитающих по чувствительности к инфицированию возбудителем сибирской язвы

Группа Вид млекопитающих Количество обследо- ванных ПА, % (М±т) Чувствительность к инфицированию [2, 9]

1-я Человек 5 46,69±2,77 Высокая

Кролик 5 46,24±3,18 Высокая

Морская свинка 6 41,21±2,16 Высокая

Корова 5 39,18±2,24 Высокая

2-я Белая крыса 6 4,52±1,08* Низкая

Свинья 5 4,23±0,31* Низкая

*Различия с 1-й группой достоверны (Р < 0,05) по критерию

Стьюдента.

нии эритроцитов млекопитающих, чувствительных к инфицированию возбудителем (человек, корова, морская свинка, кролик), и очень незначительной адгезивной активностью в отношении эритроцитов животных, резистентных к инфицированию сибиреязвенным микробом (белая крыса, свинья). Это позволило предположить, что в чувствительности млекопитающих к инфицированию возбудителем сибирской язвы определенную роль играет способность эритроцитов связывать на своей поверхности бактериальные споры.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что споры штаммов В. anthracis № 55 ВНИИВВиМ, СТИ-1 и II вакцины Ценковского обладают способностью к адгезии на эритроцитах человека. Установлено, что степень проявления спорами сибиреязвенных бацилл адгезивной активности зависит как от штаммовых особенностей микроба, так и от видовой принадлежности эритроцитов. Сопоставление результатов оценки адгезии с данными литературы по чувствительности человека и животных к заражению возбудителем сибирской язвы позволило выдвинуть предположение о том, что способность эритроцитов фиксировать на своей поверхности споры В. anthracis, возможно, играет определенную роль в чувствительности того или иного вида млекопитающих к инфицированию данным микробом.

Работа выполнена в рамках программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» на 2011 год. Авторы выражают благодарность Президиуму РАН за возможность проведения данных исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ананьева Н.В., Ганина В.И., Ленченко Е.М., Ванина Н.Н. Оценка методов исследования взаимодействия бактерий с клетками животных. Докл. Российской акад. сельскохоз. наук. 2007; 3:53-5.

2. Бургасов П.Н, редактор. Патоморфогенез сибирской язвы. М.: Медицина; 2002. 240 с.

3. ГинзбургН.Н, редактор. Сибирская язва. М.: Медицина; 1975. 160 с.

4. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина; 1985. 240 с.

5. Зайцева Е.А. Сомов Г.П. Влияние температуры на адгезивные свойства листерий. Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол. 2006; 3:20-3.

6. Коротич А.С., Погребняк Л.И. Сибирская язва. Киев: Урожай; 1976. 160 с.

7. Курилова А.А., Проскурина В.А., Майская В.Д. Неоднородность штаммов Bacillus anthracis по способности к адгезии. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004; 3:81-3.

8. Макаренкова И.Д., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н., Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Потапов В.А. и др. Изучение возможности снижения адгезивной активности Corinebacterium diphtheria биополимерами природного происхождения. Антибиотики и химиотерапия 1999; 44:50-3.

9. Онищенко Г.Г., редактор. Сибирская язва: актуальные проблемы разработки и внедрения медицинских средств защиты. М.: Медицина; 2010. 424 с.

10. Романов В.Е., Ивонин А.Г., Бондаренко А.Л., Оборин В.А., Нехорошкина Е.Л. Способ определения бактериофиксиру-ющей активности эритроцитов. Патент № 2360969.

11. Сидоренко С.В. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом. Клин. микробиол. антимикроб. химиотерапия. 2001; 3(4):301-15.

12. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Бардых И.Х., Винокур Н.И. Адгезивные и некоторые другие свойства Vibrio chol-erae TCP+ CTX-, изолированных на объектах внешней среды Ростовской области в 2002 году. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004; 6:3-6.

13. Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Алутина Э.Л., Бревдо А.М. Влияние полиоксидония на адгезивные свойства Corinebacterium diphtheriae. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009; 2:11-5.

14. Labbate М., Zhu H., Thung L., Bandara R., Larsen M., Willcox M. et al. Quorum-sensing regulation of adhesion in Serratia marcescens MG1 is surface dependent. J. Bact. 2007; 189:2702-11.

References

1. Anan’eva N.V., Ganina VI., Lenchenko E.M., Vanina N.N. [Evaluation of methods of examination of interactions between bacteria and animal cells]. Report of the Russian Academy of Agricultural Sciences. 2007; 3:53-5.

2. BurgasovP.N., editor. [Pathological morphogenesis of Anthrax]. M.: Meditsina; 2002. 240 p.

3. GinzburgN.N., editor. [Anthrax]. M.: Meditsina; 1975. 160 p.

4. Ezepchuk Yu.V. [Pathogenicity as a Function of Biomolecules]. M.: Meditsina; 1985. 240 p.

5. Zaitseva E.A., Somov G.P. [Action of temperature on the adhesive properties of Listeria]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2006; 3:20-3.

6. Korotich A.S., Pogrebnyak L.I. [Anthrax]. Kiev: Urozhai; 1976.

160 p.

7. Kurilova A.A., Proskurina V.A., Maiskaya V.D. [Inhomogeneity of Bacillus anthracis strains as related to their adhesive capacity]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2004; 3:81-3.

8. MakarenkovaI.D., Zaporozhets T.S., BesednovaN.N., ElyakovaL.A., Zvyagintseva T.N., Potapov V.A. et al. [Analysis of the possibility to decrease adhesive activity of Corinebacterium diphtheria using naturally occurring biopolymers]. Antibiotiki. Khimioterapiya. 1999; 44:50-3.

9. Onishchenko G.G., editor. [Anthrax: Topical Issues of Development and Implementation of the Medical Protection Means]. M.: Meditsina; 2010. 424 p.

10.Romanov VE., Ivonin A.G., Bondarenko A.L., Oborin V.A., Nekhoroshkina E.L. [Method of identification of the bacteria-binding activity of erythrocytes]. Patent № 2360969.

11. Sidorenko S.V [Infection as a “dialogue” between host and parasite]. Klin. Microbiol. Antimikrob. Khimioterapiya. 2001; 3(4):301-15.

12. Telesmanich N.R., Lomov Yu.M., Bardykh I.Kh., Vinokur N.I. [Adhesive and some other properties of Vibrio cholerae TCP+ CTX-, isolated from the environmental objects in the territory of the Rostov region in 2002]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2004; 6:3-6.

13. Kharseeva G.G., Moskalenko E.P., Alutina E.L., Brevdo A.M. [Effect of the polyoxidonium on the adhesive properties of Corinebacterium diphtheria]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2009; 2:11-5.

Authors:

Pimenov E.V., Ivonin A.G. Laboratory of comparative cardiology of Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. Kommunisticheskaya St., 24, Syktyvkar, 167982, Russia. E-mail: alexivonin@mail.ru

Oborin V.A. Vyatka State University. Moskovskaya St., 36, Kirov, 610000, Russia.

Об авторах:

Пименов Е.В., Ивонин А.Г. Лаборатория сравнительной кардиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук. 167982, Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 24. E-mail: alexivonin@mail.ru

Оборин В.А. Вятский государственный университет. 610000, Киров, ул. Московская, 36.

Поступила 11.03.11.