КУРКУМИН-ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ И ИХ КОМПОЗИЦИИ
CURCUMIN-PEPTIDE CONJUGATES AND THEIR COMPOSITIONS

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки US №61/992,123, поданной 12 мая 2014 г. Payne et al., и озаглавленной "КУРКУМИН-ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ И ИХ КОМПОЗИЦИИ", описание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки, в том числе фигуры.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение относится к области препаратов нутрицевтиков, а более конкретно, к области препаратов, содержащих биодоступные куркуминоиды.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Куркума представляет собой приправу карри, получаемую из корневища Curcuma longa (куркума длинная) из семейства имбирных, и имеет долгую историю применения в аюрведической медицине и в традиционной азиатской диете. Основным биоактивным компонентом куркумы является куркумин (1,7-бис[4-гидрокси-3-метоксифенил]-1,6-гептадиен-3,5-дион), желтый пигмент, впервые обнаруженный в 1910 году. Куркумин широко применяют в Соединенных Штатах как пищевой краситель (например, в горчице, сыре, специях, крупах, картофельных хлопьях, супах, маринадах, мороженом и йогуртах), а также в качестве нутрицевтика. В последнее время куркумин стал центром фармацевтической разработки. В отчете июня 2011 г. сообщается, что Национальным институтом здоровья США зарегистрировано 61 клиническое испытание, которые были завершены или находились в процессе выполнения по применению пищевого куркумина в лечении различных клинических расстройств.
[0004] Промышленный куркумин содержит сам куркумин (77%), дезметоксикуркумин (DMC, 17%) и бисдезметоксикуркумин (BDMC, 3%); два последних вещества отличаются от куркумина только отсутствием одной или обеих метоксигрупп, соответственно. Так группу этих соединений и их производные для применения в фармацевтических целях, называют куркуминоиды. Среди основных клеточных метаболитов данных трех соединений находятся тетрагидрокуркуминоиды, в которых сокращены обе винилиденовые группы, т.е. ТНС (тетрагидрокуркумин), TDMC (тетрагидродезметоксикуркумин) и TBDMC (тетрагидробисдезметоксикуркумин). Тетрагидрокуркуминоиды сохраняют биологическую активность, но являются бесцветными и более химически стабильны, чем куркуминоиды.
[0005] Лечебные свойства куркумина включают известные эффекты, а именно антиоксидантный, противовоспалительный, противовирусный, антибактериальный и противогрибковый, антитератогенный, антипролиферативный и противоопухолевый, и он является безопасным для потребления человеком, даже на уровне 8 г/сутки при приеме внутрь в течение длительных периодов. Исследования показали, что в разной степени куркумин способствует заживлению ран и имеет терапевтический и/или профилактический эффекты против диабета, астмы, аллергий, катаракты, атеросклероза, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, миелодиспластических синдромов, муковисцидоза, инфарктов миокарда, высокого уровня холестерина, инсульта, малярии, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса герпеса типа 1 (HSV-1), псориаза и других. Заболеваниями, при которых куркумин дает благоприятный эффект, являются аутоиммунные заболевания, включая рассеянный склероз, ревматоидный артрит, псориаз, воспалительные заболевания кишечника, синдром Шегрена, системная красная волчанка, сахарный диабет I типа, нейродегенеративные заболевания, а также некоторые виды рака.
[006] Лекарственное применение куркумина было ограничено, так как соединение является практически нерастворимым (растворение только около 600 нг/мл) в воде при кислом и физиологическом значении рН, и быстро гидролизуется при щелочном значении рН. Концентрация в плазме у человека при высоких пероральных дозах (от 8 до 12 г/день) куркумина обнаруживается только в наномолярном диапазоне. В большинстве терапевтических in vitro исследований, куркумин растворяли в органических растворителях. Эти растворители включают диметилсульфоксид (ДМСО), ацетон и этанол, но они имеют ограниченную пригодность при исследовании in vivo. Плохая растворимость куркумина снижает его биодоступность по всему телу, и, в частности к головному мозгу, где куркумину не легко пересечь гемато-энцефалический барьер.
[007] Следовательно, существует постоянная потребность в способах и технологиях, увеличивающих биодоступность куркумина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[008] Раскрытые здесь соединения содержат куркуминоид-пептидный комплекс. Также раскрыты способы получения куркуминоид-пептидного комплекса, включающие получение куркуминоида; получения пептида; и смешивание куркуминоида и пептида в растворителе. Также раскрыты способы лечения субъекта, при этом способ включает выявление субъекта, нуждающегося в лечении расстройств, связанных с куркумином, и введение субъекту композиции нутрицевтика, содержащей куркуминоид-пептидный комплекс, как описано в данном документе. Также раскрыты терапевтические композиции, содержащие куркуминоид-пептидный комплекс, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[009] На фигуре 1 представлена фотография электрофореза геля, показывающая, как куркумин связывается с сывороточным белком.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что употребление в пищу куркумин-пептидного комплекса значительно увеличивает сывороточную биодоступность куркумина по сравнению с приемом в пищу куркумина вне комплекса.
[0011] Таким образом, в одном аспекте, здесь раскрыты куркуминоид-пептидные комплексы, содержащие соединение куркуминоида, связанного с пептидным соединением.
[0012] Под термином "пептид" в контексте "пептидное соединение" или "пептидный комплекс" подразумевают соединение, состоящее из одного или нескольких аминокислот. Когда у пептида более одной аминокислоты, пептид имеет по меньшей мере две аминокислоты, связанных друг с другом пептидной связью. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит любую из 20 природных аминокислот, или модифицированных аминокислот.В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой олигопептид, например, бипептид, имеющий две аминокислоты, трипептид, имеющий три аминокислоты, 4-мер, 5-мер, и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления олигопептид содержит от 2 до 20 аминокислот. В других вариантах осуществления пептидное соединение представляет собой полипептид, имеющий от 21 до 100 аминокислот. Под "N-мер", где N представляет собой целое число, подразумевают олиго- или полипептид, имеющий N аминокислот.
[0013] В других вариантах осуществления пептидное соединение представляет собой белок или фрагмент белка. В некоторых вариантах осуществления белок имеет природное происхождение и представляет собой полную полипептидную последовательность экспрессируемую клеткой. В других вариантах осуществления белок представляет собой синтетический белок, имеющий последовательность, которая не встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления синтетический белок экспрессируется клеткой с применением рекомбинантных технологий, в то время как в других вариантах осуществления синтетический белок синтезируется с применением пептидного синтезатора. Фрагмент белка представляет собой олиго- или полипептид, имеющий последовательность, идентичную фрагменту последовательности, найденного в белке.
[0014] Все аминокислоты, белки, или пептиды, в пределах объема настоящего изобретения и в формуле изобретения, могут быть либо искусственного либо натурального происхождения, или иметь любые формы модификаций (химической или ферментативной посттрансляции).
[0015] В некоторых вариантах осуществления соединение куркуминоида связывают с пептидным соединением с образованием комплекса. В этих вариантах осуществления соединение куркуминоида либо непосредственно связано с аминокислотой пептида, либо связано через линкерное соединение. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой алкил, алкенил или алкинил фрагмент, который может быть замещен заместителем, выбранным из группы, состоящей из -ОН, -SH, -СООН, -N-C(O)H, -N-C(O)OH, -C(O)NH, и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления линкер связан с аминокислотой или соединением куркуминоида через заместителя.
[0016] В других вариантах осуществления соединение куркуминоида связано водородными связями с пептидным соединением с образованием комплекса. В других вариантах осуществления соединение куркуминоида связано электростатическими силами с пептидным соединением с образованием комплекса. В других вариантах осуществления соединение куркуминоида связано липофильными взаимодействиями (например, силы Ван-дер-Ваальса или пистекинг) с пептидным соединением с образованием комплекса. В других вариантах осуществления соединение куркуминоида связано ковалентной связью с пептидным соединением с образованием комплекса.
[0017] В некоторых вариантах осуществления пептид представляет собой полноразмерный белок. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой белок, который обнаружен в сыворотке млекопитающего. В других вариантах осуществления белок получают из животного источника, кроме млекопитающих. В некоторых из этих вариантов осуществления белок птичий, например, яичный белок. В другом варианте осуществления белок получают из растений, таких как зерно, орехи, бобовые, фрукты, овощи и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления белок получают из молочной сыворотки, риса, гороха, льняного семени, соевых бобов, яиц. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой альбумин. В других вариантах осуществления пептид содержит цистеин или тирозин. В некоторых вариантах осуществления пептид представляет собой N-ацетил-цистеин. В некоторых вариантах осуществления используют только одиночную аминокислоту, например, цистеин или тирозин.
[0018] В некоторых вариантах осуществления, белок, полученный из природных источников, не является изолированным и очищенным белком. Вместо этого, белок представляет собой смесь различных белков, которые изолированы вместе. Эти белки представляют собой изоляты конкретного источника. Так, например, изолят сывороточного белка (WPI) представляет собой смесь из изолированных белков, полученных из молочной сыворотки, в то время как изолят рисового белка (RPI) представляет собой смесь из изолированных белков, полученных из риса. Обычные специалисты в данной области техники знают, как получить белковые изоляты, например WPI. В настоящем описании термины "сывороточный белок", "изолят сывороточного белка" и "WPI" используются как синонимы.
2+
[0019] Примеры олиго- и полипептидов и полноразмерных белков, применяемых в комплексах, описанных здесь, включают, но не ограничиваются ими, сывороточный белок, фактор некроза опухоли (TNF-α); циклооксигеназы (СОХ) (в том числе СОХ-1 и СОХ-2); α1-кислый гликопротеин (AGP) (также известен как орозомукоид); миелоидный белок дифференциации 2 (MD-2); любой из группы ферментов, называемых гистоновыми ацетилтрансферазами (HAT), такой как р300/CREB-связывающий белок (СВР); любой из группы ферментов, называемых гистоновыми деацетилазами (HDAC); глиоксалаза I (GLOI); ксантиноксидазу (ХО); протеасому; Са-аденозинтрифосфатазу (АТФаза) сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA); протеазу вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1); любую из ДНК-метилтрансфераз (DNMT), например DNMT1; ДНК-полимеразы (pol) λ; любую из рибонуклеаз (РНазы), например, РНазу А; любую из липоксигеназ (LOX); любую из матричных металлопротеиназ (ММР); лизоцим; любой из семейства ферментов протеинкиназы С (PKC); клеточную саркому (c-Src); гликоген-синтазы-киназы (GSK)-3β; ErbB2 (тирозиновая протеинкиназа); киназу фосфорилазы; любую из протеинредуктаз, например тиоредоксинредуктазу (TrxR) и альдозоредуктазу (ALR2); тиоредоксинредуктазу; любой из казеинов; альбумин человеческой сыворотки (HSA); альбумин бычьей сыворотки (BSA); фибриноген; β-лактоглобулин (β-LG); α-лактальбумин; иммуноглобулин (Ig) человеческой сыворотки; FtsZ (белок, кодируемый геном ftsZ); транстиретин (TTR); глутатион (GSH); и Kelch-подобный ЕСН-ассоциированный белок 1 (Keap1).
[0020] В некоторых вариантах осуществления куркуминоид-пептидный комплекс представляет собой комплекс куркумина и изолята сывороточного белка (WPI). В некоторых вариантах осуществления WPI представляет собой белок сыворотки молочного происхождения. Белок молочной сыворотки представляет собой смесь (3-лактоглобулина (приблизительно 65%), α-лактальбумина (приблизительно 25%), альбумина бычьей сыворотки (приблизительно 8%) и иммуноглобулинов. В некоторых из этих вариантов осуществления, комплекс образуют путем смешивания куркумина и WPI в этаноле. Таким образом, в этих вариантах осуществления, не существует ковалентной связи между куркумином и WPI. Тем не менее, в других вариантах осуществления, куркумин и WPI образуют ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления соотношение куркумин: WPI составляет 1:1 масс/масс (мг куркумина: г WPI). В других вариантах осуществления, соотношение куркумин: WPI составляет 1:≤10 масс/масс (мг:г). В других вариантах осуществления соотношение куркумин: WPI составляет 10:≥1 масс/масс (мг:г). В некоторых вариантах осуществления соотношение куркумин: WPI составляет 25:1 масс/масс (мг:г). В других вариантах осуществления соотношение куркумин: WPI составляет 1:50 масс/масс (мг:г). В некоторых вариантах осуществления WPI получают из коммерчески доступного источника, который содержит 85% WPI в доступном порошке. В некоторых вариантах осуществления куркумин получают из коммерчески доступного источника, который содержит 95% куркумина в доступном порошке.
[0021] В другом аспекте, в данном описании раскрыта нутрицевтическая композиция, содержащая куркуминоид-пептидный комплекс, как описано здесь, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
[0022] Термин "носитель" обозначает химическое соединение, которое облегчает внедрение соединения в клетки или ткани. Например, диметилсульфоксид (ДМСО), представляет собой обычный носитель, поскольку он облегчает поглощение многих органических соединений клетками или тканями организма. Обычным носителем является вода, где водный раствор продукта, представляющего интерес, получают и вводят субъекту.
[0023] Термин "разбавитель" обозначает химические соединения, разведенные водой, которая растворяет нужное соединение, а также стабилизирует биологически активную форму соединения. Соли, растворенные в буферных растворах, используют в качестве разбавителей в данной области техники. Одним из обычно применяемых буферных растворов является фосфатно-солевой буферный раствор, поскольку он имитирует солевые условия человеческой крови. Так как буферные соли могут контролировать уровень рН раствора при низких концентрациях, буферный разбавитель редко модифицирует биологическую активность соединения.
[0024] В некоторых вариантах осуществления, одно и то же вещество может действовать как носитель, разбавитель или эксципиент, или иметь какие-либо из этих двух назначений, или все три назначения. Таким образом, одна добавка к терапевтической композиции может иметь несколько функций.
[0025] Термин "физиологически приемлемый" обозначает носитель или разбавитель, который не отменяет биологическую активность и свойства соединения.
[0026] Терапевтические композиции, раскрытые здесь, могут быть получены способом, который сам по себе известен, например, с помощью способов обычного смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, сушки, инкапсулирования, захватывания или таблетирования.
[0027] Терапевтические композиции, раскрытые здесь, таким образом, могут быть получены обычным способом с применением одного или более физиологически приемлемых носителей, содержащих эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают обработку куркуминоид-пептидного комплекса в препараты, которые могут быть использованы нутрицевтически. Любые из хорошо известных способов, носителей и эксципиентов могут быть использованы как пригодные и как понятные в данной области техники; например, в книге Ремингтона "Фармацевтические науки" (Remington's Pharmaceutical Sciences), выше.
[0028] Для перорального введения, куркуминоид-пептидный комплекс может быть легко получен путем комбинирования куркуминоид-пептидного комплекса с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области техники. Такие носители позволяют раскрытым в настоящем документе комплексам быть приготовленными в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и тому подобное, для перорального приема субъектом. Терапевтические препараты для перорального применения могут быть получены путем смешивания одного или более твердых эксципиентов с раскрытым куркуминоид-пептидным комплексом, необязательного измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если это желательно, с получением таблеток или сердцевин драже. Подходящими эксципиентами являются, в частности, сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, камедь трагаканта, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон (PVP). При желании могут быть добавлены распадающиеся вещества, такие, как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.
[0029] Сердцевины драже обеспечивают подходящими покрытиями. Для этой цели могут быть применены концентрированные растворы сахара, которые могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть добавлены к таблеткам или драже для идентификации или обозначения различных комбинаций доз активных соединений.
[0030] Терапевтические препараты, которые можно применять перорально, включают плотные капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие, запаянные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Плотные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все препараты для перорального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения.
[0031] Терапевтические композиции, пригодные для применения в способах раскрытых здесь, включают композиции, в которых куркуминоид-пептидный комплекс содержится в количестве, эффективном для достижения его целевого назначения. Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество куркуминоид-пептидного комплекса, эффективного для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов заболевания или продления жизни субъекта, подлежащего лечению.
[0032] Как правило, диапазон дозы куркумина, вводимого субъекту, составляет от приблизительно 0,5 до 1000 мг/кг массы тела субъекта. Дозировка может быть одноразовой или серией из двух или более приемов в течение одного или более дней, как это необходимо субъекту. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от 0,1 мг до 50 мг. В других вариантах осуществления доза составляет от 1 мг до 30 мг. Другие диапазоны доз включают от 10 до 50 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 50 мг, от 40 до 50 мг, от 20 до 40 мг, от 10 до 20 мг, от 10 до 30 мг, от 20 до 30 мг, и от 30 до 40 мг. Доза может также быть в количестве 10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг или 50 мг.
[0033] В другом аспекте, раскрытый здесь способ лечения расстройств, связанных с куркумином, включает выявление субъекта, нуждающегося в этом, и введение субъекту терапевтически эффективного количества куркуминоид-пептидного комплекса, как раскрыто здесь.
[0034] Термин "субъект" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, и наиболее предпочтительно к человеку, который является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Млекопитающее может быть выбрано из группы, состоящей из мышей, крыс, кроликов, морских свинок, собак, кошек, овец, коз, коров, приматов, таких как обезьяны, шимпанзе, и высших приматов, и людей.
[0035] Термин "терапевтически эффективное количество" используется для указания количества куркуминоид-пептидного комплекса, которое вызывает указанный биологический или лечебный ответ. Этот ответ может проявляться в ткани, системе, животном или человеке, что устанавливается исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом, и включает ослабление симптомов заболевания, подвергаемого лечению.
[0036] Термин "лечить", "лечение" или любой другой его вариант, не указывает на полное излечение от расстройства. Любое улучшение облегчения симптомов заболевания или расстройства в любой степени, или любое увеличение комфорта субъекта, считается лечением.
max
max
[0037] В другом аспекте, раскрытый здесь способ лечения расстройств, связанных с куркумином, включает выявление субъекта, нуждающегося в этом, и введение субъекту терапевтически эффективного количества куркуминоид-пептидого комплекса, как описано здесь, где после введения, C куркумина в сыворотке составляет менее 500 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения C куркумина в сыворотке составляет менее 0,001% от введенной дозы куркумина.
[0038] "Расстройство, связанное с куркумином" представляет собой расстройство, при котором было показано улучшение состояния, при введении куркумина или соединения куркуминоида пациенту. Примеры расстройств, связанных с куркумином включают, но не ограничиваются ими, диабет, астму, аллергии, катаракту, атеросклероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, миелодиспластические синдромы, муковисцидоз, инфаркты миокарда, высокий уровень холестерина, инсульт, малярию, ВИЧ, HSV-1, псориаз и другие. Заболеваниями, при которых куркумин дает улучшающий состояние эффект, являются аутоиммунные заболевания, включая рассеянный склероз, ревматоидный артрит, псориаз, воспалительные заболевания кишечника, синдром Шегрена, системную красную волчанку, сахарный диабет I типа, нейродегенеративные заболевания, а также некоторые виды рака.
max
max
[0039] Определение фармакокинетического параметра C хорошо известно специалистам в данной области техники. Кратко, C представляет собой максимальную концентрацию в плазме крови наблюдаемую после введения дозы.
[0040] В другом аспекте, раскрытый здесь способ получения куркуминоид-пептидного комплекса, как описано выше, включает получение куркуминоида; получение пептида; и смешивание куркуминоида и пептида в растворителе.
[0041] В некоторых вариантах осуществления растворитель представляет собой полярный растворитель, в то время как в других вариантах осуществления растворителем является неполярный растворитель. В некоторых вариантах осуществления полярный растворитель представляет собой воду, в то время как в других вариантах осуществления полярный растворитель представляет собой спирт. В некоторых вариантах осуществления спирт представляет собой этанол.
[0042] В других вариантах осуществления, растворитель представляет собой щелочной раствор. В этих вариантах осуществления куркумин солюбилизируют в щелочном растворе, а затем добавляют белок. Затем раствор подкисляют перед сушкой куркумин-белковой смеси.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение комплекса куркумин-изолят сывороточного белка
[0043] Комплекс куркумин-WPI получали для введения субъекту, который является человеком. Были использованы следующие материалы:
WPI: 85 масс % белка
Порошок куркумина: 95% куркуминоидов
Этанол: 100% этиловый спирт
[0044] Соотношение куркумин: WPI 1:50 масс/масс. 0,5 масс/об % настойку (раствор) получали путем смешивания 5 г порошка куркумина с 1000 мл этанола. Смесь помещали на магнитную перемешивающую горячую плитку, с установленной средней скоростью и заданным значением температуры 50°С в течение 30 минут или до тех пор, пока раствор не становился прозрачным. К полученному раствору добавляли 250 г порошка WPI. Смесь помещали на роторный испаритель при низкой скорости (20-30 оборотов в минуту), имеющий температуру водяной бани 50°С, и низкий вакуум в течение 30 минут, или до тех пор, пока не выпаривали 90% этанола. Полученную смесь помещали в сушильную печь для удаления оставшейся части этанола. В качестве альтернативы, смесь помещали в лиофилизатор, или в качестве альтернативы, помещали под воздушный колпак или оставляли сохнуть на воздухе.
[0045] Комплекс куркумин/WPI представляет собой рассыпчатый порошок непрозрачного цвета в диапазоне от желтого до оранжевого. В отличие от чистого куркумина, порошок комплекса куркумин: WPI свободно смешивается с водой, образуя суспензию. Порошок куркумин: WPI можно легко очистить от стекла, пластмассовых и металлических поверхностей моющим средством. Комплекс куркумин: WPI только минимально окрашивает одежду. Энергичное промывание моющим раствором, как правило, достаточно для удаления пятен.
[0046] Соотношение куркумин: WPI 25:1 масс/масс (мг:г). Повторяли вышеописанный способ, за исключением 25 мг порошка куркумина и 1 г порошка WPI. Был получен аналогичный продукт.
[0047] Провели стандартный электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) комплекса куркумин: WPI, чтобы определить, был ли куркумин связан с белком. На фигуре 1 показан полученный в результате гель. Этот гель рассмотрели под УФ после электрофореза без фиксации или окрашивания. Пятно, которое видно на дорожках 6-8, является результатом окрашивания куркумином WPI. Дорожка, отмеченная маркером М является маркером молекулярного веса, который имеет три флуоресцентные полосы, идущие со скоростью 75, 50 и 25 кДа. Дорожки 1-8 соответствуют комплексу куркумин: WPI на 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160 и 320 микрограммах образца куркумин: WPI, соответственно. Как можно видеть на дорожках 6-8, куркумин соединен с WPI. Для дорожек 1-5, либо не хватает куркумина для визуализации, либо куркумин удален путем обработки геля SDS-PAGE лизирующим буфером, нагреванием или другими стадиями способа.
Пример 2: Получение комплексов куркумин-аминокислота
[0048] В соответствии со способом в примере 1, куркумин растворяли в 95% этаноле с последующим добавлением N-ацетилцистеина (NAC). Увеличение соотношения концентраций куркумина к н-ацетилцистеину использовали для нахождения уровня насыщения. Оптимальную концентрацию зафиксировали на уровне приблизительно 100 мг куркумина к 1000 мг NAC в 0,5% (масс/об) растворе куркумина в этаноле. Оптимальная концентрация была отмечена, когда низкое количество образований кристаллов куркумина наблюдали в макроскопическое поле.
[0049] Кроме того, куркумин растворяли в 95% этаноле, с последующим добавлением цистеина. Увеличение соотношения концентраций куркумина к цистеину использовали для нахождения уровня насыщения. Оптимальную концентрацию зафиксировали на уровне приблизительно 100 мг куркумина к 1000 мг цистеина в 0,5% (масс/об) растворе куркумина в этаноле. Оптимальная концентрация была отмечена, когда низкое количество образований кристаллов куркумина наблюдали в макроскопическое поле.
[0050] Кроме того, здоровому человеку, добровольно ставшему пациентом (субъектом), отмеряли 1,8 г комплекса цистеин-куркумин. Было обнаружено, что максимальная концентрация в крови комплекса цистеин-куркумина составляло 300 нг/мл. Это сравнили с двумя дозировками 25 мг/г комплекса куркумин:WPI (эквивалентно 50 мг куркумина), что привело к концентрации в крови 70 нг/мл.
[0051] В аналогичном эксперименте, куркумин растворяли в 95% этаноле, с последующим добавлением тирозина. Связывания куркумина и тирозина не наблюдали. Куркумин затвердевает в поверхностном слое над слоем тирозина. При наблюдении под микроскопом, слой тирозина визуально не имел окраски и кристаллы куркумина были полностью отделены от тирозина.
Пример 3: Введение комплекса куркумин: WPI
[0052] Двум здоровым людям вводили однократную дозу комплекса куркумин: WPI, имеющую соотношение куркумин: WPI 25:1 масс/масс (мг:г). Дозировка содержала 25 мг куркумина. Кровь отбирали у каждого человека через 20 мин, 50 мин и 90 мин, и вычисляли уровень куркумина в сыворотке. Результаты приведены в таблице 1, ниже.
Пример 4: Клинические исследования
[0053] Представлен 57-летний мужчина с коленным и тазобедренным артритом/бурситом и воспалительным заболеванием кишечника. Перед дозированием у него была умеренная боль в колене и бедре и спазмы в брюшной полости с умеренной диареей. Ему были даны несколько различных дозировок и препаратов. Дозирование и наблюдаемые эффекты сведены в таблицу 2.
Пример 5: Клинические исследования
[0054] Случай 1: Была представлена 70-летняя белая женщина с сезонной депрессией в истории болезни, которую соответственно контролировали препаратом Прозак. Пациентке вводили 1,2 г комплекса, полученного по примеру 1, дважды в день и получили полную ремиссию симптомов после 3 дней применения. Она продолжала принимать продукт для поддержания облегчения симптомов и прекратила применение Прозака.
[0055] Случай 2: Была представлена 69-летняя белая женщина с легким остеоартритом бедер, нижней части спины и плеч в истории болезни. Пациентке вводили 300 мг комплекса, полученного по примеру 1, три раза в день и получили полную ремиссию симптомов, в том числе восстановление диапазона движения. Она прекратила применение нестероидных противовоспалительных (NSAID) препаратов.
[0056] Случай 3: Был представлен 67-летний белый мужчина с повреждениями суставов и нарушениями подвижности в виде вторичного результата инфекции полиомиелита в детстве. Пациенту вводили 1,2 г комплекса, полученного по примеру 1, два раза в день в течение двух недель для полной ремиссии симптомов. Он продолжал принимать продукт для поддержания облегчения симптомов.
[0057] Случай 4: Был представлен 65-летний белый мужчина с нарушением подвижности после нескольких травматических повреждений в течение 20 с лишним лет. Пациенту вводили 1,2 г комплекса, полученного по примеру 1, два раза в день в течение двух недель, и сообщили об облегчении симптомов на 50%.
[0058] Случай 5: Был представлен 47-летний белый мужчина с трудно поддающимся лечению лучеплечевым бурситом в истории болезни, с лечением NSAID. Он не мог поднимать никакой вес своей пораженной рукой. Он сообщил о полной ремиссии симптомов после приема дозы, эквивалентной 1,5-2,0 г комплекса, полученного по примеру 1, два раза в день в течение двух недель, смешанных в TANG. Он продолжает принимать продукт для поддержания облегчения симптомов.
[0059] Случай 6: Был представлен 28-летний белый мужчина с сезонной аллергией в истории болезни. Пациенту вводили 1,2 г комплекса, полученного по примеру 1, два раза в день в течение двух недель для полной ремиссии симптомов сезонной аллергии. Он продолжает применять продукт для поддержания облегчения симптомов.
[0060] Случай 7: Был представлен 47-летний белый мужчина с жалобами на боль и потерю подвижности из-за перелома голеностопа, который произошел 1 год назад. Пациент сообщил о полном облегчении симптомов и восстановлении подвижности с использованием 1,2 г продукта, полученного по примеру 1, два раза в день в течение двух недель. Он продолжает принимать продукт для поддержания облегчения симптомов.
[0061] Случай 8: Была представлена 50-летняя белая женщина с маниакальной депрессией в истории болезни. Пациентке вводили 1,2 г комплекса, полученного по примеру 1, дважды в день в течение двух недель с небольшим облегчением симптомов депрессии и сообщили о ясном мышлении и повышенном настроении.
[0062] Случай 9: Был представлен 67-летний белый мужчина с легким артритом в правом плече в истории болезни. Пациенту вводили 1,2 г комплекса, полученного по примеру 1, два раза в день в течение двух недель со значительным облегчением симптомов артрита.
[0063] Случай 10: Была представлена 75-летняя женщина с изнурительным артритом обеих лодыжек. У нее была боль в состоянии покоя, и она находилась амбулаторно преимущественно в инвалидном кресле, с минимальной способностью стоять или ходить с ходунками. Она применяла различные NSAID и отпускаемые по рецепту наркотические средства против боли ежедневно. Пациентке вводили 25 мг куркумина три раза в день (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Она получила облегчение симптомов от артрита, которые включали уменьшение боли и повышение мобильности без использования инвалидного кресла или ходунков. Она прекратила использование наркотических средств и NSAID.
[0064] Случай 10: Была представлена 60-летняя женщина с артритом в руке, имеющая боль в покое и усиление боли во время трудовой деятельности (работы на сельской ферме). Она применяла различные NSAID ежедневно. Пациентке вводили 25 мг куркумина два раза в день; (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Она получила облегчение симптомов артрита и смогла увеличить трудовую деятельность. Она прекратила применение NSAID. После трех месяцев лечения куркумином, она прекратила применение продукта куркумина в течение 3-х недель и повторила двукратную дозу куркумина с теми же результатами.
[0065] Случай 11: Был представлен 61-летний мужчина с тяжелой формой остеоартрита/бурсита бедра, с болью в состоянии покоя, снижением подвижности, а также усилением боли во время трудовой деятельности (сельскохозяйственные работы). Пациент применял ежедневно различные NSAID и была запланирована замена тазобедренного сустава. Пациенту вводили 25 мг куркумина два раза в день (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Он показал облегчение симптомов артрита, включая повышение мобильности и повышение способности легче выполнять трудовую деятельность и с меньшей болью.
[0066] Случай 12: Была представлена 50-летняя женщина с артритом в плечах, бедрах и коленях, и болью в ногах. Пациентка жаловалась на боль в состоянии покоя и на снижение подвижности, например, пациентке требовалась прогулочная трость. Пациентке вводили 25 мг куркумина два раза в день (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Она показала облегчение симптомов артрита, наряду с увеличением подвижности с меньшей болью.
[0067] Случай 13: Была представлена 55-летняя женщина с артритом в коленях, наряду с болью в колене при повседневной и трудовой деятельности. Пациентке вводили 12,5 мг куркумина два раза в день (1 грамм продукта куркумин: WPI) в течение двух недель. Она показала облегчение симптомов артрита, наряду с уменьшением боли при повседневной и трудовой деятельности.
[0068] Случай 14: Была представлена 45-летняя женщина с артритом колена и плеча. Боли в колене и в плече проявлялись при нормальной и трудовой деятельности (сельскохозяйственные работы). Пациентке вводили 12,5 мг куркумина два раза в день (1 грамм продукта куркумин: WPI) в течение двух недель. Она показала облегчение симптомов артрита, наряду с уменьшением боли при повседневной и трудовой деятельности.
[0069] Случай 15: Был представлен 60-летний мужчина с артритом в коленях, наряду с болью в колене при нормальной и трудовой деятельности (сельскохозяйственные работы). Пациенту вводили 25 мг куркумина два раза в день (1 грамм продукта куркумин: WPI) в течение двух недель. Он показал облегчение симптомов артрита, наряду с уменьшением боли при повседневной и трудовой деятельности.
[0070] Случай 16: Был представлен 60-летний мужчина с лимфомой и многоочаговыми увеличенными лимфатическими узлов. Пациенту вводили 25 мг куркумина два раза в день (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Он показал умеренное уменьшение пораженных лимфатических узлов спустя две недели. Дальнейшее применение материала не имело никакого дополнительного эффекта.
[0071] Случай 17: Был представлен 57-летний мужчина с артритом в коленях, бурситом в бедрах, а также умеренной болью в колене и бедре при нормальной и трудовой деятельности. Пациенту вводили 25 мг куркумина два раза в день (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Он показал облегчение симптомов артрита, наряду с уменьшением боли при повседневной и трудовой деятельности.
[0072] Случай 18: Был представлен 57-летний мужчина с воспалительным заболеванием кишечника, сопровождаемый спазмами в животе, и от легкой до умеренной диареи. Пациенту вводили 25 мг куркумина два раза в день (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Он показал облегчение симптомов от IBD, наряду с полным освобождением от спазмов в животе; уплотненный стул.
[0073] Случай 19: Был представлен 58-летний мужчина с болью в коленях и спине при нормальной и трудовой деятельности. Пациенту вводили 25 мг куркумина два раза в день (25 мг куркумина/г WPI) в течение двух недель. Он показал облегчение симптомов артрита, наряду с уменьшением боли при Повседневной и трудовой деятельности.
[0074] Случай 20: Была представлена 67-летняя женщина с прогрессирующей болезнью Альцгеймера. До введения дозы, она ошиблась во всех вопросах при тестировании кратковременной памяти. Пациентке вводили 1,2 г куркумина два раза в день. Через 30 дней она ответила правильно на все вопросы при тестировании кратковременной памяти. Она до сих пор имеет долгосрочную пользу от терапии.
Пример 6: Исследования на животных
[0075] Случай 1: Был представлен 11-летний QH (скакун) кастрированный конь с остеоартритом в правой и левой передних лодыжках. Он показывал боль при сгибании лодыжки и "грубую походку" при галопе. Ему перорально вводили 200 мг продукта, полученного по примеру 1, два раза в день. Через неделю, конь показал снижение боли при сгибании лодыжек и ровную походку при галопе, наряду со спокойствием или уменьшением тревоги. Не было никаких негативных побочных эффектов.
[0076] Случай 2: Была представлена 5-летняя стерилизованная сука с остеоартритом. Она показывала боль при сгибании передних конечностей и снижение подвижности. Ей перорально вводили 25 мг продукта, полученного по примеру 1, два раза в день. Через неделю, собака показала уменьшение боли при сгибании конечностей, повышенную подвижность, способность бегать, и повышенный аппетит. Не было никаких негативных побочных эффектов.
[0077] Случай 3: Был представлен 11-летний QH кастрированный конь с болью при сгибании передних лодыжек и снижением подвижности. Ему вводили 800 мг продукта, полученного по примеру 1, с помощью назогастрального зонда один раз. Через 4 часа, лошадь показала уменьшение боли при сгибании лодыжек, наряду с выраженным успокаивающим и седативным эффектом. Не было никаких негативных побочных эффектов.
[0078] Случай 4: Была представлена 2-летняя QH молодая кобыла как беспокойная и тревожная. Она была очень нервной на тренировках и ее ограничили от взаимодействия с другими лошадьми. Она также показала снижение аппетита. Ей перорально вводили 200 мг продукта, полученного по примеру 1, два раза в день. Через одну неделю, лошадь показала снижение тревожности и нервозности в стойле, с сопутствующим повышением аппетита. Не было никаких негативных побочных эффектов.
Пример 7: Биодоступность комплекса куркумин: WPI
[0079] Комплекс куркумин: WPI: Каждой из шести мышей вводили 12,5 мг комплекса куркумин: WPI (приблизительно 312 мкг куркумина на мышь). Масса мыши приблизительно 25 г каждая. Кровь брали через каждые 30 минут в течение 180 минут. Средние значения куркумина (в нг/мл) приведены в таблице 3. Среднее значение Tmax составляло 60 минут, и среднее значение Cmax составляло 163 нг/мл куркумина.
[0080] Куркумин: Каждой из шести мышей вводили 0,625 мг куркумина (количество куркумина приблизительно в два раза больше, чем куркумина, вводимого в виде комплекса, выше). Масса мыши приблизительно 25 г каждая. Кровь брали через каждые 30 минут в течение 180 минут. Средние значения куркумина (в нг/мл) приведены в таблице 4 ниже.
[0081] Как показывают данные, свободный куркумин имеет очень плохую всасываемость, таким образом, его концентрации в плазме неизменно ниже предела обнаружения. Тем не менее, когда куркумин находится в виде комплекса с изолятом сывороточного белка (WPI), он становится легко биодоступным.
Пример 8: Фармакокинетика комплекса куркумин: WPI
[0082] Двоим здоровым добровольцам были введены различные препараты куркумина в нескольких различных дозах. Кровь брали способом прокола пальца у каждого индивидуума в различные моменты времени. Рассчитывали концентрацию куркумина в плазме и определяли Cmax. Результаты приведены в таблице 5.