КОМПОЗИЦИИ, СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ АМПЛИФИКАЦИИ НА ОСНОВЕ ДВОЙНОЙ НИКАЗЫ CRISPR

1. Способ амплификации и/или обнаружения целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:
а. объединение образца, содержащего целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, с реакционной смесью для амплификации, где реакционная смесь для амплификации включает:
i. систему CRISPR для амплификации, где система CRISPR для амплификации содержит первый и второй комплекс CRISPR/Cas, где первый комплекс CRISPR/Cas содержит первую никазу на основе Cas и первую направляющую молекулу, которая направляет первый комплекс CRISPR/Cas к первому сайту целевой нуклеиновой кислоты, где второй комплекс CRISPR/Cas содержит вторую никазу на основе Cas и вторую направляющую молекулу, которая направляет второй комплекс CRISPR/Cas ко второму сайту целевой нуклеиновой кислоты; и
ii. полимеразу;
б. амплификацию целевой нуклеиновой кислоты;
в. добавление пары праймеров, включающей первый и второй праймеры, к реакционной смеси, где первый праймер содержит часть комплементарную первому сайту, а второй праймер содержит часть комплементарную второму сайту, и часть, содержащую сайт связывания для второй направляющей молекулы; и
г. дальнейшую амплификацию целевой нуклеиновой кислоты путем повторного удлинения и разрезания в изотермических условиях.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первая направляющая молекула направляет первый комплекс CRISPR/Cas к первой цепи целевой нуклеиновой кислоты, а вторая направляющая молекула направляет второй комплекс CRISPR/Cas ко второй цепи целевой нуклеиновой кислоты.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первый сайт целевой нуклеиновой кислоты и второй сайт целевой нуклеиновой кислоты находятся на первой цепи целевой нуклеиновой кислоты, тем самым генерируя оцДНК, содержащую последовательность первой цепи целевой нуклеиновой кислоты между первым сайтом целевой нуклеиновой кислоты и вторым сайтом целевой нуклеиновой кислоты.
4. Способ по п. 2, включающий амплификацию целевой нуклеиновой кислоты путем разрезания первой и второй цепей целевой нуклеиновой кислоты с использованием первого и второго комплексов CRISPR/Cas и смещения и удлинения разрезанных цепей с помощью полимеразы, тем самым генерируя дуплексы, содержащие последовательность целевой нуклеиновой кислоты между первым и вторым сайтами разрезания.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что никазу на основе Cas выбирают из группы, состоящей из никазы Cas9, никазы Cpf1 и никазы С2с1.
6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок никазы Cas9, который содержит мутацию в домене HNH.
7. Способ по п. 2, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок никазы Cas9, который содержит мутацию, соответствующую N863A в SpCas9 или N580A в SaCas9.
8. Способ по п. 3 или 4, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок Cas9, полученный из видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus thermophilus, S. mutans, S. agalactiae, S. equisimilis, S. sanguinis, S. pneumonia; C. jejuni, C. coli; N. salsuginis, N. tergarcus; S. auricularis, S. carnosus; N. meningitides, N. gonorrhoeae; L. monocytogenes, L. ivanovii; C. botulinum, C. difficile, C. tetani, C. sordellii, Francisella tularensis 1, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens и Porphyromonas macacae.
9. Способ по п. 2, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок никазы Cpf1, который содержит мутацию в домене Nuc.
10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок никазы Cpf1, который содержит мутацию, соответствующую R1226A в AsCpf1.
11. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок Cpf1, полученный из видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из Francisella tularensis, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium, Parcubacteria bacterium, Smithella sp., Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens and Porphyromonas macacae, Succinivibrio dextrinosolvens, Prevotella disiens, Flavobacterium branchiophilum, Helcococcus kunzii, Eubacterium sp., Microgenomates (Roizmanbacteria) bacterium, Flavobacterium sp., Prevotella brevis, Moraxella caprae, Bacteroidetes oral, Porphyromonas cansulci, Synergistes jonesii, Prevotella bryantii, Anaerovibrio sp., Butyrivibrio fibrisolvens, Candidatus Methanomethylophilus, Butyrivibrio sp., Oribacterium sp., Pseudobutyrivibrio ruminis и Proteocatella sphenisci.
12. Способ по п. 2, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок никазы С2с1, который содержит мутацию в домене Nuc.
13. Способ по п. 9, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок никазы С2с1, который содержит мутацию, соответствующую D570A, Е848А или D977A в АасС2с1.
14. Способ по п. 9 или 10, отличающийся тем, что никаза на основе Cas представляет собой белок С2с1, полученный из видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus contaminans, Alicyclobacillus macrosporangiidus, Bacillus hisashii, Candidatus Lindowbacteria, Desulfovibrio inopinatus, Desulfonatronum thiodismutans, Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12, Omnitrophica WORJ2 bacterium RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13, Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberi bacillus calidus, Bacillus thermoamylovorans, Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp.NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans, Alicyclobacillus herbarius, Citrobacter freundii, Brevibacillus agri (например, BAB-2500) и Methylobacterium nodulans.
15. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что первая никаза на основе Cas и вторая никаза на основе Cas являются одинаковыми.
16. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что первая никаза на основе Cas и вторая никаза на основе Cas отличаются.
17. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полимеразу выбирают из группы, состоящей из ДНК полимеразы Bst 2.0, ДНК полимеразы Bst 2.0 WarmStart, ДНК полимеразы Bst 3.0, полноразмерной ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bsu, ДНК полимеразы phi29, ДНК полимеразы Т7, Gst полимеразы, Taq полимеразы, фрагмента Кленова ДНК полимеразы I Е. coli, KlenTaq, ДНК полимеразы Pol III, ДНК полимеразы Т5, Gst полимеразы и ДНК полимеразы Секвеназа.
18. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при около 50-59°С.
19. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при около 60-72°С.
20. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при около 37°С или при около 65°С.
21. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при постоянной температуре.
22. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 20-30, около 30-40, около 40-50 или около 50-100 нуклеотидов.
23. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 100-200, около 100-500 или около 100-1000 нуклеотидов.
24. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 1000-2000, около 2000-3000, около 3000-4000 или около 4000-5000 нуклеотидов.
25. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что первый или второй праймер содержит промотор РНК полимеразы.
26. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий обнаружение амплифицированной нуклеиновой кислоты методом, выбранным из группы, состоящей из гель-электрофореза, обнаружения интеркалирующего красителя, ПЦР, ПЦР в реальном времени, флуоресценции, резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), масс-спектрометрии и CRISPR-SHERLOCK.
27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что амплифицированная нуклеиновая кислота обнаруживается с помощью метода CRISPR-SHERLOCK на основе Cas13.
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что целевую нуклеиновую кислоту определяют с аттомолярной чувствительностью.
29. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что целевую нуклеиновую кислоту определяют с фемтомолярной чувствительностью.
30. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что целевую нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК, плазмидной ДНК и синтетической двухцепочечной ДНК.
31. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что образец представляет собой биологический образец или образец окружающей среды.
32. Способ по п. 28, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, стул, мокроту, слизистую, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асцит, плевральный выпот, серому, слюну, спинномозговую жидкость, водное или стекловидное тело или любой секрет тела, транссудат, экссудат или жидкость, полученную из сустава, или мазок с кожи или поверхности слизистой оболочки.
33. Способ по п. 29, отличающийся тем, что образец представляет собой кровь, плазму или сыворотку, полученную от пациента-человека.
34. Способ по п. 28, отличающийся тем, что образец представляет собой образец растения.
35. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что образец представляет собой неочищенный образец.
36. Способ по любому из пп. 1-31, отличающийся тем, что образец представляет собой очищенный образец.
37. Способ амплификации и/или обнаружения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:
(а) преобразование одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце в целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту и
(б) выполнение стадий по п. 1.
38. Способ по п. 34, в котором целевая одноцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой молекулу РНК.
39. Способ по п. 35, в котором молекула РНК превращается в двухцепочечную нуклеиновую кислоту посредством стадии обратной транскрипции и амплификации.
40. Способ по п. 34, отличающийся тем, что целевая одноцепочечная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из одноцепочечной вирусной ДНК, вирусной РНК, информационной РНК, рибосомальной РНК, транспортной РНК, микроРНК, короткой интерферирующей РНК, малой ядерной РНК, синтетической РНК и синтетической одноцепочечной ДНК.
41. Система для амплификации и/или обнаружения целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, включающая:
а) систему CRISPR для амплификации, где система CRISPR для амплификации содержит первый и второй комплекс CRISPR/Cas, где первый комплекс CRISPR/Cas содержит первую никазу на основе Cas и первую направляющую молекулу, которая направляет первый комплекс CRISPR/Cas к первой цепи целевой нуклеиновой кислоты, и второй комплекс CRISPR/Cas, который содержит вторую никазу на основе Cas и вторую направляющую молекулу, которая направляет второй комплекс CRISPR/Cas ко второй цепи целевой нуклеиновой кислоты;
б) полимеразу;
в) пару праймеров, включающую первый и второй праймеры к реакционной смеси, где первый праймер содержит часть комплементарную первой цепи целевой нуклеиновой кислоты и часть, содержащую сайт связывания для первой направляющей молекулы, а вторая праймер содержит часть комплементарную второй цепи целевой нуклеиновой кислоты и часть, содержащую сайт связывания для второй направляющей молекулы; и необязательно
г) систему обнаружения для выявления амплификации целевой нуклеиновой кислоты.
42. Система по п. 41, отличающаяся тем, что никазу на основе Cas выбирают из группы, состоящей из никазы Cas9, никазы Cpf1 и никазы С2с1.
43. Система по п. 41 или 42, отличающаяся тем, что полимеразу выбирают из группы, состоящей из ДНК полимеразы Bst 2.0, ДНК полимеразы Bst 2.0 WarmStart, ДНК полимеразы Bst 3.0, полноразмерной ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bsu, ДНК полимеразы рhi29, ДНК полимеразы Т7 и ДНК полимеразы Секвеназа.
44. Система по любому из пп. 41-43, отличающаяся тем, что никаза на основе Cas и полимераза действуют при одинаковой температуре.
45. Система для амплификации и/или обнаружения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, содержащая:
а) реагенты для превращения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в двухцепочечную нуклеиновую кислоту;
б) компоненты по п. 38.
46. Набор для амплификации и/или обнаружения целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, включающий компоненты по п. 38 и набор инструкций по применению.
47. Набор по п. 46, дополнительно включающий реагенты для очистки двухцепочечной нуклеиновой кислоты в образце.
48. Набор для амплификации и/или обнаружения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, включающий компоненты по п. 43 и набор инструкций по применению.
49. Набор по п. 48, дополнительно включающий реагенты для очистки одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце.