Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической болезнью почек – связь с биохимическими и гемостазиологическими показателями

Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической ...

165

Н. В. Бедило*, Н. А. Воробъева*л#, К. Н. Зеленин*л

Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической болезнью почек-

связь с биохимическими и гемостазиологическими показателями

* Первая городская клиническая больница скорой медицинской помощи

им. Волосевич Е. Е.

Л Северный государственный медицинский университет # Северный филиал ГНЦ, г. Архангельск

Как известно, пациенты, страдающие хронической болезнью п очек (ХБП) имеют значительный спектр нарушений метаболизма, затрагивающих белковый, углеводный, липидный, водносолевой и пуриновый обмены, а также нарушения регуляции системы гемостаза. Последнее, в частности, проявляется тромботическими, либо геморрагическими нарушениями у данной категории больных, особенно при проведении программного гемо-диалаза.

Целью данной работы являлось исследование агрегаци-онной функции тромбоцитов у пациентов с ХБП и поиск возможных корреляций с лабораторными маркерами нарушений системы гемостаза и рядом рутинных биохимических показателей.

Материал и методы исследования. Базой исследования явилось отделение хронического гемодиализа МУЗ «Первая городская клиническая больница скорой медицинской помощи им. Е. Е. Волосевич г. Архангельска». Проведена сплошная выборка всех пациентов с ХБП (n = 61) получающих заместительную терапию в отделении программного диализа (мужчин - 31, женщин - 30) в возрасте от 27 до 59 лет (Ме = 43,2).

Забор крови для исследования системы гемостаза проводился в вакутейнеры с цитратом натрия до введения антикоагулянтов. Исследование функциональной активности тромбоцитов проводилось на оптическом агрегометре «Chronolog» (США) с использованием в качестве индукторов агрегации растворов адреналина в конечной концентрации 5 мкмоль/л и аденозиндифос-

166

Вопросы физиологии и патологии системы гемостаза

фата в конечной концентрации 10 мкмоль/л (соотношение плазма/индуктор = 500 мкл/5 мкл). Для индукции агрегации тромбоцитов использовались реагенты фирмы «СЬгопо-log». Время наблюдения за агрегационной кривой в процессе исследования составляло 6 минут. Получение богатой тромбоцитами и бестромбоцитарной плазмы осуществлялось с помощью центрифуги Labsystems (Финляндия) при частоте вращения 1000 об/мин в течение 5 минут и 2700 об/мин в течение 15 минут соответственно.

Также была выполнена развернутая оценка коагуляционного звена гемостаза с определением активированного частично тромбинового времени (АЧТВ), тромбинового времени (ТВ), уровня фибриногена, Д-димера, функциональной активности антитромбина (АТ) III. Данные показатели определялись по стандартным методикам на автоматическом анализаторе «STA Compact» («Роше» Швейцария) с использованием реагентов «StagoDi-agnostica». Фибринолитическая активность плазмы (фибринолиз) определялась по методике эуглобулиного лизиса, активированного стрептокиназой, суть которой состоит в получении эуглобулиновой фракции плазмы, лишенной ингибиторов фибринолиза, с добавлением стандартной дозы тромбина и стрепто-киназы. Для данной методики, а также определения растворимых фибрин-мономерных комплексов (РКФМ) использовались реагенты фирмы «Технология-Стандарт» (Россия).

Из биохимических показателей оценивались концентрация общего кальция, неорганического фосфора, креатинина, мочевины, натрия, калия, альбумина с использованием стандартных методик на автоматическом биохимическом анализаторе «Cobas-Integra 400» («Роше», Швейцария) реагентами этой же фирмы. Концентрация ионизированного кальция определялась на ионоселективном анализаторе «AVL 9180».

Результаты и обсуждение

Причиной хронической почечной недостаточности в данной выборке пациентов явились: хронический гломерулонефрит (n=29); наследственные нефропатии (n=6); поликистоз почек (n=8), артериальная гипертензия (n=3), диабетическая нефропатия (n=4), хронический пиелонефрит (n=3); мочекаменная болезнь (n=1); синдром Альпорта (n=2); подагра (n=1); гидронефроз (n=1); острая почечная недостаточность, перешедшая в терминальную ХПН (n=2). На момент проведения исследования 36 из 61 пациентов получали терапию препаратами, способными повлиять на агрегационную функцию тромбоцитов, а именно дезагреганты, нестероидные противовоспалительные препара-

Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической ...

167

ты, ингибиторы АПФ. Терапию только НПВП получали 12 человек, из них 8 пациентов в сочетании с дезагрегантами. Аспиринсодержащие препараты принимали 25 пациентов с ХБП, ингибиторы АПФ назначены 9 пациентам. В качестве коррекции уровня анемии 44 пациента получали препараты эритропоэтина (эпо-крин, эпрекс). Всем больным перед каждой процедурой гемодиализа в диализный контур вводились антикоагулянты (нефракционированный или низкомолекулярный гепарины).

Таблица 1 - Результаты исследования агрегации тромбоцитов с индукцией АДФ и адреналином (АД)__________________________

Показатель n Диапазон полученных значений Среднее значение (x±m) Критерий достоверности (t) для р<0,005

АД, % АДФ, % АД, % АДФ, % АД, % АДФ, %

Референтные значения 78-88 71-88

1 Выраженная гипоагрегация 7 5-39 17-48 26,6±6,82 34,1±3,95 2,19 2,12

2 Умеренная агрегация с АДФ и выраженная с адреналином 18 9-47 50-77 31±3,1 62,9±2,38 2,052 2,05

3 Умеренная гипогрега- ция 13 50-76 51-69 61±3,11 62±2,46 2,074 2,074

4 Нормоагре- гация 11 84-97 70-83 87±2,6 74±4,39

5 гиперагре- гация 12 96-112 75-86 99±2,0 76±2,54 2,03 0,642

Как следует из данной таблицы, среди обследованных пациентов преобладают больные со сниженной агрегационной функцией (62,3%). Достоверность различий между каждой группой и выборкой нормоагрегации статистически значима. Тогда как различие в результатах агрегации с АДФ между 4 и 5 группами недостоверны, потому что гиперагрегация наблюдалась только с адреналином. Агрегация с АДФ в этой группе пациентов оставалась в пределах нормы.

168

Вопросы физиологии и патологии системы гемостаза

Таблица 2 - Внешние факторы, влияющие на агрегационную функцию тромбоцитов_____________________________________

n и ю 03 С СО с ж U ю аз 3 Е-1 X аз С-н а> Он С-н аз со а> К 1 ” аз . и с а> fco о СО СО |J“' а> ч: Ингибиторы АПФ, абс Гепарин / фраксипа-рин, абс Тромбоз шунтов, абс/% Уровень тромбоцитов, тыс

Выраженная гипоагрегация 7 1 1 2 0 4/3 5/71% 127±18,9

Выраженная гипоагр с АДР и умереная с АДФ 18 0 8 6 1 8/10 6/33% 233±21,06

Умеренная гипоагрегация 13 1 4 1 3 11/2 7/54% 198±15,15

Нормоагрега- ция 11 1 0 0 2 9/2 4/26% 214±24,0

гиперагрега- ция 12 0 6 0 3 10/2 5/62% 220±18,24

Пациентам с гипоагрегацией тромбоцитов по данным агрегатометрии активно назначались препараты, ее обуславливающие. Так, из 38 человек 24 принимали аспирин и НПВП, причем 9 из них - сочетание данных препаратов.

Среди пациентов с гиперагрегацией только шестеро из 12 получали дезагреганты. У остальных гиперагрегация, возможно, обусловлена нечувствительностью к препаратам аспирина, а также тем, что большая часть пациентов получала нефракционированный гепарин. По мнению отдельных авторов, применение нефракционированного гепарина (в отличие от низкомолекулярного) в ряде случаев может вызывать образование антител к тромбоцитарному фактору 4, что ускоряет разрушение тромбоцитов, вызывая гепарин-индуцированную тромбоцитопению и гепарин-индуцированные рикошетные тромбозы [11]. Агрега-ционная активность при этом может быть как усиленной, так и ослабленной. Частота тромботических осложнений у пациентов данной выборки с гиперагрегацией выше в сравнении с пациентами, имеющими нормоагрегацию (t =1,16), но уровень тромбоцитов находится в референсных пределах. Поэтому в данном случае гиперагрегация, скорее всего, не связана с применением нефракционированного гепарина практически у всех пациентов этой группы. В группе с выраженной гипоагрегацией, где 4 из 7

Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической ...

169

пациентов получают терапию НФГ, средний уровень тромбоцитов значимо ниже (t=2,0; p<0,05), коэффициент корреляции степени гипоагрегации с уровнем тромбоцитов (0,76). Частота тромбозов артерио-венозных шунтов в данной группе составляет 71% (t=1,92, р>0,05). Возможно, выраженная гипоагрегация у данной группы пациентов обусловлена не столько применением дезагрегантов, но и использованием нефракционированного гепарина.

Известно, что гиперагрегация при индукции адреналином может быть связана с нарушенным взаимоотношением альфа-2 и бета-2-рецепторов к адреналину. Стимуляция адреналином последних приводит к ингибиции агрегационной функции тромбоцитов. На тромбоцитарной мембране здорового человека преобладают рецепторы альфа-2 класса над рецепторами бета-2 класса, но в патологических условиях соотношение между ними может менятся. Так, известно, что при повышении уровня холестерина в плазме и мембранного соотношения холестерина к фосфолипидам - увеличивается плотность расположения на мембране альфа-2-рецепторов [5]. Весьма вероятно, что при ХПН в плазме появляются вещества, способные блокировать альфа-рецепторы, оставляя преимущество за бета-формами, что может индуцировать гиперагрегацию с адреналином. Гиперагрегацию с адреналином у пациентов, получающих дезагреганты отдельные авторы объясняют сведениями о способности адреналина восстанавливать агрегационную функцию тромбоцитов на фоне воздействия дезагрегантов [14].

Как показали результаты нашего исследования, в группах пациентов с гипоагрегацией той или иной степени выраженности дезагреганты получали 63,2% пациентов, возможно, что гипоагрегация у неполучающих эти препараты (14 пациентов) может быть связана с тромбоцитопенией, в том числе гепари-ниндуцированной (см. выше); тромбоцитопатией, связанной с выработкой антител к тромбоцитарным рецепторам, или влиянием каких-либо метаболитов, нарушающих их функциональную активность. Так, известно, что гипоагрегация при индукции АДФ, возможно обусловлена блокадой пуриновых Р2 рецепторов молекулами АТФ или аденозина [5]. Кроме того, агрегация с АДФ и адреналином может быть также ингибирована любыми пептидами, содержащими последовательность аминокислот Arg-Gly-Asp, которая узнается GP ПвШа рецепторами. Также возможна конкуренция этих пептидов с фибронектином, ф. Виллебранда, витронектином и фибриногеном за места связывания с GP ПвШа [15].

170

Вопросы физиологии и патологии системы гемостаза

Анализ причин хронической болезни почек показал, что хронический гломерулонефрит как заболевание, приведшее к ХПН, встречается с одинаковой частотой у пациентов с гипо-, нормо- и гиперфункцией тромбоцитов, за исключением пациентов с выраженной гипоагрегацией тромбоцитов. Известно, что при гломерулонефритах с выраженным иммунопатологическим процессом на территории клубочков с вовлечением эндотелиальных и мезангиальных клеток, а также при хронических тубулоинтерстициальных нефритах, имеет место постоянное воздействие цитокинов (интерлейкина-1, ФНО, интерферона) на эндотелиальные клетки. Как следствие этого прокоагулянтный потенциал эндотелия (тканевый тромбопластин, эндотелин-1, фактор Виллебранда, ингибитор активатора плазминогена) начинает преобладать над антикоагулянтным (простациклин, оксид азота, тромбомодулин). Это соответственно провоцирует сначала локальную, а в дальнейшем и общую активацию тромбоцитов. При этом лабораторным признаком данного процесса является повышение тромбоксана А2, 4 фактора тромбоцитов, а также агрегационной активности и активация плазменного звена гемостаза [1, 2, 3, 4]. Последнее нашло подтверждение в проведенном нами исследовании.

Таблица 3 - Результаты ^ исследования плазменного гемостаза

n АТ III, % Фибри- нолиз, сек Д- димер нг/мл РКФМ мг/дл Тром- бино- вое время, сек Фиб- рино- ген, г/л АЧТВ, сек

Референтные интервалы 80-120 70-85 0-0,5 0-4 14-22 2-4 28-40

Выраженная гипоагрега- ция 7 83,4 ±8,7 80,9 ±11,2 0,8 ±0,3 13,2 ±3,3 27,7 ±4,3 3,2 ±0,2 34,0 ±1,3

Выраженная гипоагрегация с АДР и умеренная с АДФ 18 87 ±4,4 92,2 ±9,0 0,6 ±0,2 19 ±2,4 23,5 ±2,4 3,7 ±0,2 35,3 ±1,1

Умеренная гипоагрега- ция 13 88 ±5,5 90,5 ±12,9 0,9 ±0,6 14,5 ±2,7 26,16 ±2,7 3,3 ±0,2 35,7 ±1,4

Нормоагре- гация 11 89 103 0,568 23 23 3,5 37,3

Гиперагре- гация 12 81 ±6,4 112 ±12,9 0,9 ±0,3 14 ±3,0 20,8 ±1,8 3,4 ±0,2 36,2 ±1,0

Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической ...

171

Как следует из таблицы 3, плазменный гемостаз по результатам нашего исследования был активирован у всех пациентов (включая группу нормоагрегации тромбоцитов). Так, средние значения Д-димеров и РКФМ были значительно повышены, а фибринолитическая активность снижена, что могло свидетельствовать о хроническом ДВС-синдроме. Известно, что на фоне ХПН и повреждающего воздействия диализных систем на клетки крови, а также воздействия на компоненты свертывающей системы неэкскретируемых почками продуктов метаболизма закономерно возникает гиперкоагуляционный синдром, провоцирующий тромбофилическое состояние. Статистически значимой разницы показателей гемостаза у пациентов разных выборок по сравнению с группой нормоагрегации тромбоцитов нами не было выявлено.

Следующим этапом нашей работы явилось выявление возможных корреляций между агрегационной функцией тромбоцитов и уровнем различных метаболитов, что потребовало исключения из групп пациентов с гипоагрегацией тех, кто принимал дезагреганты и НПВП.

Таблица 4 - Результаты исследования альбумина, мочевины и креатинина и их влияние на функциональную активность тромбоцитов______________________________________________

Число пациентов Креатинин

Референсный показатель 44-88 2.7-8.3 35-45

Выраженная гипоагрегация 3 970±111 27,7±5,8 41,8±2,1

Выраженная гипоагрегация с АДР и умеренная с АДФ 5 1067±87,5 28,2±4,2 40,0±1,7

Умеренная гипоагрегация 7 814±73 t=2,23;p<0.01 22,7±3,7 t=2,03;p<0,05 42,7±2.3

Нормоагрегация 11 977±179,2 30,0±9,2 40,9±2,6

Гиперагрегация 12 1039±82,8 27,3±3,4 41,3±1,2

По данным Schneider с соавторами [12], гипоагрегация у пациентов с ХПН связана с повышенными показателями мочевины, которая, по мнению автора, обуславливала снижение кислородного поглощения и содержания АДФ в тромбоците. В работе Horowitz с соавторами [5] указывается на возможность ингиби-

172

Вопросы физиологии и патологии системы гемостаза

ции АДФ гуандиносукциновой кислотой (продукт расщепления мочевины), что обусловливало гипоагрегацию тромбоцитов с АДФ. В ходе нашего исследования достоверного увеличения концентраций мочевины и креатинина у пациентов с гипоагрегацией тромбоцитов не выявлено по сравнению с пациентами с нормо- и гиперагрегацией. Уровень уремии был практически одинаков во всех группах. Также в нашем исследовании уровень альбумина был сопоставим у всех пациентов, хотя по данным Мовчан Е. А. [1] и Наточиной Н. Ю. [2] гиперагрегация тромбоцитов может быть обусловлена снижением количества альбумина, который не в состоянии связать арахидоновую кислоту, приводя к избыточному образованию тромбоксана А2.

Следующим этапом исследования был анализ взаимосвязи водно-электролитных нарушений и функциональной активности тромбоцитов (таблица 5).

Таблица 5 - Результаты исследования водно-электролитного баланса

Фосфор, ммоль/л Кальций общий, ммоль/л Кальций ионизиро- ванный, ммоль/л Натрий, ммоль/ л Калий, ммоль/ л

Референтные интервалы 0,85-1,45 2,1-2,6 1,12-1,33 135-150 3,8-5,4

Выраженная гипоагрегация (n=3) 2,68±0,3 t=3,085; p<0,01 2,43±0,2 1,03±0,1 139±4,0 5,74±0,6

Выраженная гипогрегация с АДР и умеренная с АДФ (n=5) 1,76±0,2 2,32±0,1 1,1±0,1 136±4,1 6,3±0,4

Умеренная гипоагрегация (n=7) 1,74±0,2 2,2±0,1 1,1±0,1 139±3,1 6,01±0,8

Нормоагрегация (n=11) 1,89±0,3 2,28±0.2 1,12±0,2 138±6,2 6,2±0,9

Гиперагрегация (n=12) 1,99±0,2 2,08±0.9 T=2,27; p<0,01 0,97±0.1 T=1,93; p>0,05 140±2,3 6,0±0,35

Нами была выявлена обратная зависимость между гиперагрегацией и уровнем кальция в сыворотке пациентов с ХБП. Известно, что плазматическая мембрана интактных тромбоцитов

Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической ...

173

в физиологических условиях мало проницаема для кальция. Поступлению кальция в тромбоцит постоянно противостоит Са-выделяющая система (кальциевая помпа, регулируемая Са-Hg-АТФ-азой и Ыа/Са каналы, регулируемые Иа/К-АТФ-азой). Тем не менее, поступление Са++ из плазмы в интактный тромбоцит все же происходит, что может иметь значение для пополнения его запасов в гранулах хранения, а при действии на мембрану определенных агонистов играет роль в повышении уровня кальция, опосредующего реакции активации [5,6]. Возможно, в условиях постоянной активации тромбоцитов при ХПН происходит депонирование ионизированного кальция в цитоплазме и органеллах тромбоцитов в больших количествах, чем в норме. Это наряду с другими факторами определяет их более выраженную агрегаци-онную готовность. Существуют данные о прямой зависимости между низкими концентрациями внеклеточного ионизированного кальция и количеством мест связи с фибриногеном на рецепторе GP IIbIIIa [5], что обуславливает усиление агрегации тромбоцитов. Именно низкие концентрации плазменного Са++ по данным ряда авторов обуславливают более выраженный эффект адреналина на альфа-2 рецепторы [13]. Таким образом, исходно низкий уровень Са++ у пациентов с ХПН возможно способствует развитию гиперагрегации с адреналином in vitro, когда происходит дополнительная нейтрализация кальция цитратом.

Уровень неорганического фосфата был повышен у всех пациентов ХПН за счет снижения его фильтрации в почечных клубочках, но в группе пациентов с гипоагрегацией тромбоцитов его значение было достоверно выше, чем в других группах. Анализ доступной литературы не привел к объяснению данного факта. Возможно, гиперфосфатемия такой степени приводит к изменению синтеза макроэргических соединений (АТФ, АДФ) и таким образом влияет на агрегационную функцию.

Выводы. В процессе исследования нами выявлены прямые зависимости между:

- выраженной гипоагрегацией и низким уровнем тромбоцитов;

- выраженной гипоагрегацией, низким уровнем тромбоцитов, тромбозами и применением нефракционированного гепарина. Это свидетельсвует о значимости использования в качестве основного антикоагулянта гепаринов низкомолекулярной массы в виду более низкого риска развития гепарин-индуцированной тромбоцитопении.

- гиперагрегацией и низким уровнем общего и ионизированного кальция;

174

Вопросы физиологии и патологии системы гемостаза

Корреляция между выраженной гипоагрегацией и высоким уровнем неорганического фосфора, возможно, вызвана малым количеством пациентов в группе. Все обнаруженные статистические закономерности подлежат дальнейшему изучению и обоснованию.

Список литературы

1. Мовчан, Е. А. Дисфункция эндотелия и тромбоцитов при хронической болезни почек: новый взгляд на старую проблему нарушений в системе гемостаза у больных гломерулонефритом / Е. А. Мовчан // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. -

С. 88-95.

2. Наточина, Н. Ю. Тромбоциты при гломерулонефрите: от тромбоза к воспалению / Н. Ю. Наточина // Российский вестник перинатологии и педиатрии.

3. Ставрова, Т. С. Состояние сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза у больных хроническим ту-булоинтертициальным нефритом /Т. С. Ставрова, Н. Л. Тов, Е. А. Мовчан // Терапевтический архив. - № 6. - 2007.

4. Дзгоева, Ф. У. Роль свободно-радикального окисления в развитии сердечно-сосудистых осложнений при хронической почечной недостаточности / Ф. У. Дзгоева, Т. М. Гатагонова // Терапевтический архив. - № 1. - 2010. - С. 51.

5. Тромбоцитарный гемостаз / А. С. Шитикова. - Санкт-Петербург, 2000. - С. 80-90, 36-40, 52-53, 144-145.

6. Kroll, M. N., Schafer, A. I. // Blood. - 1989. - Р. 1181-1195.

7. Общая патофизиология с основами иммунопатохимии / А. Ш. Зайчик, Л. П. Чурилов. - Санкт-Петербург, 2008. -С. 241-273.

8. Борисов, И. А. Хроническая почечная недостаточность / И. А. Борисов // В мире лекарств. - 1999. - № 1.

9. Патогенез геморрагического диатеза при почечной недостаточности / А. В. Папаян // Сборник статей под редакцией

A. Ф. Тур. Ленинград, 1972.

10. Коагулологические синдромы. Лабораторная диагностика / В. Т. Морозова, Н. А. Авдеева. - Москва, 2006. - 131 с.

11. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза /

B. В. Долгов, П. В. Свирин. - Москва, РМАПО, кафедра КДЛ, 2005. -

C. 176-183.

12. Trombos. Diath Haemorrh / W. Schneider, K. Schumacher, R. Gross. - 1969. - № 1. - С. 208-209.

13. Siess W. // Physiol. Rev. - 1989. - V. 69. - P. 58-178.

Агрегационная функция тромбоцитов у пациентов с хронической ...

175

14. Packham, M. A. Mustard, J. F. // Progress in hemostasis and thrombosis. New York, 1984. - P. 211-288.

15. Клиническая биохимия / В. Н. Бочков, А. Б. Добровольский, Н. Е. Кушлинский [и др.]. - Москва, ГЭОТАР-Медиа, 2006. -С. 224-238.

16. Анемический синдром в клинической практике / П. А. Воробьев. - Москва, «Ньюдиамед», 2001.