Идентификация остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах методом масс-спектрометрии

УДК 543.544

Идентификация остаточных количеств антибиотиков

в пищевых продуктах методом масс-спектрометрии

Т.А. Краснова, аспирант

Владимирский государственный университет им. А.Г и Н.Г. Столетовых В.Г. Амелин, д-р хим. наук, профессор Федеральный центр охраны здоровья животных, г. Владимир

Применение различных антибиотиков в ветеринарии для предотвращения заболеваний птицы и скота приводит к появлению их в продуктах питания животного происхождения (мясо, яйца, молоко и пр.). Присутствие остаточных количеств антибиотиков в продуктах питания наносит существенный вред здоровью человека. В соответствии с действующей нормативной документацией антибиотики в продуктах животного происхождения определяют микробиологическими методами, основанными на использовании бактерий, обладающих чувствительностью к антибиотикам или сульфаниламидам, в качестве индикаторов и на их способности размножаться в продуктах питания [1]. Также для оп-

Ключевые слова: антибиотики; пищевые продукты; метод МС МАЛДИ.

Key words: antibiotics; foods; MALDI MS method.

ределения антибиотиков используют твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на конкуренции свободного антибиотика из пробы и иммобилизованного антибиотика на твердой фазе при реакции со специфичными антителами [2]. Микробиологические исследования и ИФА требуют сложной про-боподготовки, а продолжительность анализа достигает несколько часов.

В последнее десятилетие появились новые методики определения конкретных антибиотиков методом тандемной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Например, предложены методики определения хлорамфеникола в мясе и морепродуктах [3], одновременного определения 120 антибиотиков различных классов в почках животных [4]. Такие методы требуют тщательной очистки экстракта антибиотиков от соэкстрагируемых примесей (белки, жиры и сахара) или твердофазной экстракции.

С учетом сложности пробоподго-товки во всех указанных методах продолжается поиск более простого и точного способа идентификации и определения антибиотиков.В настоящее время один из развивающихся методов исследования органических соединений - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной диссоциацией/ионизацией (МС МАЛДИ) в сочетании с времяпролет-ным масс-анализатором [5, 6].

Цель данной работы заключалась в разработке экспресс-методики идентификации антибиотиков в пищевых продуктах методом МС МАЛДИ.

В работе применяли масс-спектрометр МАЛДИ с времяпролетным масс-анализатором Autoflex III smartbeam (Bruker Daltonic, Германия). Использовали режим работы с рефлектроном для положительных и отрицательных ионов, основные параметры анализа: УФ-азотный лазер с длиной волны 337 нм, длина импульса - 3 нс, мощность лазерного излучения - 106-107 Вт/см2. Применяли автоматическое подавление сигналов массой до 300 Да. Анализ спектров проводили с использованием программы FlexAnalysis ver. 3.3 (BrukerDaltonic, Германия).

Применяли стандарты антибиотиков CRSO (Corporate Reference Standards Organization) Eli Lilly and Company (США): монензин, нара-зин, авиламицин; Sigma-Aldrich (Швейцария): тилмикозин, канами-цин, неомицин, стрептомицин, ди-гидрострептомицин, ласалоцид, ла-идломицин, эритромицин, салино-мицин, джозамицин, спирамицин, рифабутин, семдурамицин, мадура-мицин, тилозин, хлортетрациклин, окситетрациклин, доксициклин, тетрациклин, метациклин, демеклоцик-лин; Dr. Ehrenstorfer (Германия): спектиномицин, рифампицин, ами-кацин, полимиксин сульфат, вали-номицин, бацитрацин.

Растворы антибиотиков 1 мг/мл готовили растворением соответствующих навесок в ацетонитриле

TECHNICAL SUPPLY OF INDUSTRY

Таблица 1

Характеристические массы для антибиотиков - аминогликозидов, макролидов и полипептидов, полученные МС МАЛДИ (матрица - б-циано-4-гидроксикоричная кислота) при регистрации положительных ионов

Антибиотик (мол. масса, класс) Ион m/z, Да Антибиотик (мол. масса, класс) Ион m/z, Да

Амикацин (585, аминогликозид) [АМ +Н] + 586,484 Рифампицин (823, макролид) [РФП + Н] + 824,323

[АМ +Na]+ 608,487 [РФП+ Na] + 846,315

[АМ + К+2Н] + 626,547 [РФП + К] + 862,400

Канамицин, (484, аминогликозид) [ НМ+Н] + 485,420 Спирамицин (843, макролид) [СПМ + Н]+ 843,683

Неомицин (614, аминогликозид) [НМЦ+Н] + 615,523 [СПМ + Na] + 865,695

Спектиномицин (332, аминогликозид) [СПМ+ Н] + 333,254 [СПМ + К] + 881,673

[СПМ+ Na] + 356,254 Рифабутин (846, макролид) [РФБ + Н] + 847,435

Стрептомицин (581, аминогликозид) [СТМ +Н] + 582,764 [РФБ + Na] + 870,478

Дигидрострептомицин (584, аминогликозид) [ДГС] + 584,721 [РФБ + К] + 885,639

Ласалоцид (588, макролид) [ЛСЦ + Н] + 589,756 Тилмикозин (868, макролид) [ТМ + Н] + 869,835

[ЛСЦ + Na] + 611,770 Семдурамицин (873, макролид) [СДМ + Н] + 874,383

Лаидломицин (669, макролид) [ЛДМ + Na] + 692,458 [СДМ + Na] + 896,195

[ЛДМ + К] + 708,354 [СДМ + К] + 912,373

Монензин (670, макролид) [МНЗ + Na] + 693,636 Мадурамицин (917, макролид) [МДМ + Н] + 918,234

[МНЗ + К] + 709,611 [МДМ + Na] + 940,476

[МНЗ + №-Н2О] + 675,616 [МДМ + К] + 956,532

Эритромицин (733, макролид) [ЭРМ + Na] + 756,689 Тилозин (915, макролид) [ТЛЗ+ Н] + 916,702

[ЭРМ + К] + 772,669 [ТЛЗ+ Na] + 938,713

[ЭРМ+ H] + 734,684 Авиламицин (1404, макролид) [АВМ + К] + 1444,137

Салиномицин (751, макролид) [СЛМ + Н] + 752,453 [АВМ +К+2Н] + 1445,735

[СЛМ + Na] + 774,245 [АВМ + 2К-Н2О-3Н] + 1461,715

[СЛМ + К] + 790,383 Валиномицин (1111, полипептид) [ВЛМ+Н] + 1112,092

Наразин (764, макролид) [НРЗ+ Na] + 787,721 [ВЛМ+К] + 1150,078

[НРЗ+ K] + 803,705 Полимиксин сульфат (1203, полипептид) [ПЛМ+Н] + 1204,097

Джозамицин (828, макролид) [ДЖМ + Н] + 828,630 [ПЛМ+K-3NH3] + 1190,071

[ДЖМ + Na] + 850,644 Бацитрацин (1422, полипептид) [БЦЦ+Н] + 1423,183

[ДЖМ + К] + 866,620 [БЦЦ+K-3NH3] + 1409,129

Таблица 2

Характеристические массы для тетрациклинов, полученные методом МАЛДИ (в скобках указаны молекулярные массы), при регистрации положительных ионов

Антибиотик МАЛДИ m/z, Да

Хлортетрациклин (478) [ХТЦ + H] + 479,300

[ХТЦ - NH3] + 461,279

[ХТЦ + H - NH3] + 462,279

Окситетрациклин (460) [ОКЦ + Н] + 461,263

[ОКЦ+Na - NH3 - H2O] + [ПК| I + H - NH ] + 447,581 428 257

Демеклоциклин (464) [ДМЦ + Н] + 465,344

«Prolabo» (Австрия). Рабочие растворы готовили в день использования разбавлением исходных ацето-нитрилом.

Матрицей служила б-циано-4-гидроксикоричная кислота (Bruker Daltonic, lot. 10.255344.284001). Раствор матрицы 20 мг/мл готовили растворением соответствующей навески в смеси ацетона и водного раствора трифторуксусной кислоты.

Отбирали 5 г гомогенизированного пищевого продукта в пластиковую пробирку емкостью 50 мл, приливали 10 мл ацетонитрила и 5 мл бидис-тиллированной воды, встряхивали в течение 5 мин и добавляли 4 г NaCl, интенсивно встряхивали 1-2 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 мин-1. Верхнюю ацетонитрильную фазу отбирали для анализа методом МС МАЛДИ. Раствор аналита смешивали с матрицей (20 мг/мл б-ци-ано-4-гидроксикоричной кислоты) в объемном соотношении 1:1 и 1 мкл смеси наносили на стальную подложку («MTP 384 groundsteelTF»).

Масс-спектры антибиотиков при регистрации положительных ионов

отличаются небольшим количеством хорошо разрешенных пиков, характерных для конкретных ионов соединения - в основном это протониро-ванные ионы [М + Н]+ и аддукты с натрием или калием ([М + N8]+, [М + К]+) (табл. 1). При исследовании макролидов, тетрациклинов и некоторых полипептидов в масс-спектрах наблюдаются пики ионов, связанные с дефрагментацией молекул, особенно это характерно для полипептидов и тетрациклинов - отщепление молекул воды и аммиака - [М + N8 - Н20]+, [М + К - Н20]+, [М + К -

3NH3] + ,[М + Н- NН3 - Н20] + , [М -NН3]+ (см. табл. 1, 2). Пределы обнаружения детектируемых компонентов при отношении сигнал/шум = 4 составили 0,01 - 0,3 мкг/кг.

В масс-спектрах ацетонитрильных экстрактов продуктов животного происхождения (свинина, говядина, печень свиная, сало, курица и яйца) установлено наличие пиков некоторых антибиотиков. В пробах свинины, говядины, свиной печени, сала, курицы и куриных яиц, приобретенных в розничной торговой сети г. Владимира, обнаружили присут-

ü ТЕХНИЧЕСКОЕ ОСНАЩЕНИЕ ОТРАСЛИ

* ТЕМАНОМЕРЛ

Рис. 2. Масс-спектр экстракта из сала

taiillLiül

ш 1

У, &

X •f. 3

? я EL

S S

m m

У. +

JlL-lJl.

m/z, Да

Таблица 3

Идентификация остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах животного происхождения методом МАЛДИ

Проба Характеристические массы (m/z), Да Отношение сигнал/ шум (S/N) Высота пика в спектре, отн. ед. Площадь пика в спектре, отн. ед. Идентифицированный антибиотик

Яйцо 869,743 4,5 51 7 Тилмикозин

Свинина 586,461 5,4 455 56 Амикацин

584,437 5,1 428 59 Дигидрострептомицин

709,567 8,2 465 61 Монензин

756,733 4,4 232 22 Эритромицин

Сало 615,390 9,0 1364 180 Неомицин

свинины 333,254 356,254 54,0 4,7 13635 1295 1056 120 Спектиномицин

787,808 803,503 41,4 10,6 3471 938 651 144 Наразин

428,515 46,6 10256 1050 Доксициклин

Говяди- 586,430 6,3 255 27 Амикацин

на 615,332 9,3 350 35 Неомицин

333,230 21,6 550 36 Спектиномицин

584,423 4,1 170 24 Дигидрострептомицин

803,383 4,0 102 14 Наразин

479,320 4,9 242 19 Хлортетрациклин

428,502 250,2 12918 1149 Доксициклин

Свиная 608,464 9,5 410 51 Амикацин

печень 615,348 10,6 453 59 Неомицин

333,231 356,293 13,1 4,7 715 277 47 23 Спектиномицин

584,440 18,7 824 98 Дигидрострептомицин

Курица 333,230 13,4 1100 78 Спектиномицин

461,139 4,3 337 27 Хлортетрациклин

ствие тилмикозина, амикацина, мо-нензина, эритромицина, наразина, доксициклина, хлортетрациклина и других макролидов и тетрацикли-нов. Макролиды практически во всех пробах воды представлены ионами [М + Na]+, [М + K]+, а тетра-циклины - ионами [М + Н - NH3 -H2O]+ (табл. 3, рис. 1, 2). В свинине, свиной печени и сале обнаружены амикацин, монензин, эритромицин, наразин, доксициклин, дигидрост-рептомицин и другие антибиотики. В мясе и печени одновременно идентифицированы амикацин и дигидро-стрептомицин (см. табл. 3). В свином сале и печени одновременно обнаружены неомицин и спектино-мицин. В говядине выявлено больше всего наименований различных антибиотиков, относящихся к макролидам, тетрациклинам и аминогли-козидам.

Таким образом, результаты проведенных исследований демонстрируют эффективность метода МС МАЛДИ с времяпролетным масс-анали-затором при идентификации антибиотиков различных групп в продуктах животного происхождения. Показана возможность скрининга проб различных пищевых продуктов.

ЛИТЕРАТУРА

1. ГОСТ Р 53912-2010 Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков. М.: Стандартинформ,

2011. - 10 с.

2. МУК 4.2.026 - 95 Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах. Методические указания.

3. Determination of the antibiotic chloramphenicol in meat and seafood products by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry/P. Mottier [et al.]//J. Chromatogr. A. - 2003. - V. 994. - P. 75-84.

4. Schneider, M.J. Evaluation of a multi-class, multi-residue liquid chromatography - tandem mass spectrometry method for analysis of 120 veterinary drugs in bovine kidney/ M.J. Schneider, S.J. Lehotay, A.R. Lightfield//Drug Test. Analysis. -

2012. - № 4. - P. 91-102.

5. Hillenkamp, F. The MALDI process and method/F. Hillenkamp, M. Karas/ /MALDI MS. A practical guide to instrumentation, methods and applications.Weinheim: Wiley - VCH Verlag GmbH & Co. KgaA. - 2007. - P. 1-28.

6. Cohen L. H. Small molecule analysis by MALDI mass spectrometry/ L.H. Cohen, A.I. Gusev//Anal. Bioanal. Chem. - 2002. - V. 373. - P. 571-586.