Мутационный статус генов RAS-каскада у больных колоректальным раком

Раздел - молекулярная медицина

Мутационный статус генов RAS-каскада у больных колоректальным раком Телышева Е. Н., Новицкая Н. Н., Снигирева Г. П., Солодкий В. А.

ФГБУ "Российский научный центр рентгенорадиологии" Минздрава России 117997 Москва, ул. Профсоюзная, д. 86

Телышева Екатерина Николаевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики, ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России. Тел.: 8-917513-53-40. Электронная почта: telisheva k@mail.ru

Новицкая Наталия Николаевна - ведущий инженер-химик лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики, ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России

Снигирева Галина Петровна - д.б.н., заведующая лабораторией молекулярной биологии и цитогенетики, ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России

Солодкий Владимир Алексеевич - д.м.н., профессор, академик РАН, директор ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России

Резюме

Молекулярно-генетический анализ мутационного статуса генов RAS-каскада -КЯЛ8, ЫКЛ8 и БЯЛЕ имеет важное прогностическое и предиктивное значение при лечении колоректального рака (КРР).

В работе представлены результаты анализа частоты и спектра мутаций в генах RAS-каскада у 355 больных КРР, проходивших лечение в РНЦРР. Группу исследования составили пациенты в возрасте от 22 до 86 лет: 165 женщин и 190 мужчин. Показано, что частота мутаций в исследуемых генах достаточно высокая и составляет 48,2%. Мутации в гене КЯЛ8, частота которых составила 40,6%, в основном представлены точечными заменами в 12-м и 13-м кодонах 2-го экзона. Изменения в гене БЕЛГ встретились 6,2% случаев и были представлены единственным вариантом -

мутацией V600E в 15-м экзоне. У пяти больных была выявлена мутация Q61K в гене NRAS, что составило 1,4%.

Результаты генетического тестирования больных КРР наглядно демонстрируют необходимость и важность проведения молекулярно-генетического исследования, которое позволяет не только индивидуализировать терапию за счет оптимизации схем лечения, но и сократить экономические затраты при назначении таргетных и традиционных химиопрепаратов.

Ключевые слова: колоректальный рак (КРР), RAS-каскад, таргетная терапия Molecular-genetic analysis of mutation status of RAS-signaling cascade genes in patients with colorectal cancer

Telysheva E.N., Novitskaya N. N., Snigireva G.P., Solodkiy V. A.

FBSI "Russian Scietific Center of Roentgenology&Radiology" Ministry of Health 117997 Moscow, Profsoyuznaya 86

Telysheva Ekaterina - junior researcher of Laboratory of Molecular Biology and Cytogenetics of the Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Moscow

Novitskaya Nataliya - engineer of Laboratory of Molecular Biology and Cytogenetics of the Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Moscow

Snigireva Galina - dr. of science, head of Laboratory of Molecular Biology and Cytogenetics of the Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Moscow

Solodkiy Vladimir - MD, professor, academician of Russian Academy of Sciences, Director of Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Moscow

Summary

Molecular-genetic analysis of mutation status of KRAS, NRAS and BRAF genes has an important prognostic and predictive value in the treatment of colorectal cancer. Data on mutation frequencies in RAS- signaling cascade genes in 355 patients with colorectal cancer are presented

in this study. The research group included patients with colorectal cancer (165 women and 190 men) aged from 22 to 86 years.

The mutation frequency in investigated genes was 48.2%. The KRAS gene mutations were mainly presented by point mutations in the 12-13 codons of the second exon with the overall KRAS mutation frequency 40.6%. BRAF mutations were more rare (6.2% cases) and were presented by the only variant V600E in the 15th exon. Five patients (1.4%) had Q61K mutation in NRAS gene.

The results of the study demonstrate an importance of molecular genetic analysis of colorectal tumors. This analysis can help to individualize therapy and to reduce inefficient costs on target and traditional chemotherapy.

Key words: colorectal cancer, RAS-signaling cascade, target cancer therapy Введение

Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний. По данным Всемирной Организации Здравоохранения КРР занимает 3-е место в мире среди всех онкологических заболеваний, являясь также одной из наиболее частых причин смерти - в 2015 г. данная патология стала причиной смерти 774 тыс. человек [1]. Развитие КРР сопровождается минимальными клиническими симптомами, поэтому его диагностика на ранних стадиях заболевания часто затруднена, даже несмотря на имеющиеся возможности современных высокотехнологичных методов исследования.

В настоящее время перспективным направлением в онкологии является использование молекулярно-генетических методов, которые обладают большим потенциалом для ранней диагностики КРР и мониторинга заболевания [4]. Молекулярно-генетические методы широко используются для выявления генотипических и фенотипических особенностей опухоли и ее метастазов, что позволяет прогнозировать

развитие опухолевого процесса и определять тактику дальнейшего лечения. С помощью молекулярных методов можно также идентифицировать микрометастазы в лимфатических узлах и, соответственно, более точно оценивать стадию опухолевого процесса. Исключительно важным направлением молекулярно-генетических исследований, имеющим наибольший практический интерес, является идентификация маркеров-мишеней, которые определяют чувствительность и резистентность опухоли к лекарственной и лучевой терапии.

Фундаментальные исследования последних десятилетий привели к значительному прогрессу в области понимания биологии КРР. Важным фактором в патогенезе КРР является накопление широкого спектра активирующих мутаций в онкогенах и инактивирующих мутаций в генах-супрессорах, которые приводят к нарушению регуляции сигнальных путей, контролирующих ключевые клеточные процессы [5, 10]. Одной из ведущих причин опухолевой трансформации является постоянная активация сигнального пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Сигналы, передаваемые при активации рецептора EGFR по RAS/MAPK-зависимому сигнальному пути, влияют на пролиферативную активность опухолевой клетки, а также ее способность к дифференцировке, метастазированию, инвазии и т. д. Одной из причин подобной активации при КРР являются мутации в других генах сигнального пути, а именно в генах семейства RAS и BRAF. Вне зависимости от статуса EGFR, мутации в этих генах делают неэффективным применение моноклональных антител, способных инактивировать рецептор эпидермального фактора роста.

Мутации в генах RAS-каскада при метастатическом КРР обнаруживаются с достаточно высокой частотой - 35 - 60% [2, 6]. При этом, они, как правило, локализованы в специфических областях генов. Например, самым известным биомаркером при КРР считается мутантный статус 12-го и 13-го кодонов гена KRAS и 61-го кодона гена NRAS.

Наличие мутантных аллелей генов KRAS или NRAS является независимым предиктивным маркером ответа опухоли на терапию ингибиторами EGFR.

Имеющиеся на сегодняшний день данные, полученные в многочисленных клинических исследованиях по применению моноклональных антител, направленных против рецептора EGFR, в группах больных с мутантным и диким статусом KRAS, убедительно доказали необходимость проведения предварительного тестирования мутаций генов RAS-семейства в образцах опухоли больных, которым планируется проведение таргетной терапии [5, 7] .

Принимая во внимание, что спектр молекулярно-направленных лекарственных средств постоянно расширяется, необходимо активно внедрять генетическое тестирование мутационного статуса генов RAS-каскада при КРР в рутинную практику онкологических учреждений, что, в конечном итоге, позволит улучшить эффективность проводимого лечения за счет персонифицированного подхода.

Целью настоящей работы явилось изучение частоты и спектра мутаций в генах RAS-каскада при КРР.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 355 пациентов с морфологически верифицированным диагнозом "колоректальный рак", которые проходили обследование и лечение в РНЦРР МЗ РФ в период с 2010 по 2016 гг. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Российского научного центра рентгенорадиологии МЗ РФ (протокол № 3, 2014 г.). Все пациенты подписали письменное информированное согласие на добровольное проведение молекулярно-генетического исследования.

Критерием включения в исследование была морфологически подтвержденная злокачественная эпителиальная опухоль ободочной или прямой кишки. Гистологическая структура опухоли - аденокарцинома различной степени дифференцировки.

В группу исследования были включены пациенты в возрасте от 22 до 86. Средний возраст больных составил 63,72 ± 10,71. В группу вошло 165 женщин (46,5%) и 190 (53,5%) мужчин.

Материалом для молекулярно-генетического исследования служила опухолевая ткань, полученная после хирургической операции. ДНК из опухолевой ткани, содержащей не менее 60% опухолевых клеток, выделяли с помощью наборов DNA Clean&Concentrator-5 (фирма Zymo Recearch, USA) после предварительной депарафинизации материала операционного блока. Мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF определяли двумя методами - прямым секвенированием по Сэнгеру на автоматическом капиллярном секвенаторе «ABI PRISM 3100» («Applied Biosystems», США) и методом мутационно-специфической ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием наборов Insider (фирма «Евроген», Россия) на приборе Real-Time PCR System 7500 (фирма «Applied Biosystems», USA). Результаты и обсуждение

В период с 2010 по 2016 гг. было проведено молекулярно-генетическое исследование генов RAS-каскада - KRAS, NRAS и BRAF в опухолевой ткани 355 больных с КРР. Результаты исследования представлены в таблице 1. Мутации были выявлены у 171 больного КРР (48,2%). При этом у 144 человек из 171 пациента обнаружены мутации в гене KRAS (40,6%), у 22 - в гене BRAF (6,2%), и у 5 - в гене NRAS (1,4%).

Таблица 1. Частота и спектр мутаций генов RAS-каскада в группе больных КРР

Всего С диким С мутацией С мутацией С мутацией Всего с мутациями

больных

355 184 144 22 5 171

В нашем исследовании всего было обнаружено 146 мутаций (таблица 2).

Таблица 2. Спектр и частота мутаций в гене KRAS в группе больных КРР

Мутации Число мутаций

G12D 58

G13D 33

G12V 25

G12A 12

G12C 9

G12S 7

G12R 2

У одного пациента в образце опухолевой ткани было выявлено 2 мутации в гене KRAS - замена глицина на аланин и глицина на серин в 12-м кодоне (G12A, G12S), у второго пациента были выявлены мутации одновременно в гене KRAS (G12A - замена глицина на аланин в 12-м кодоне) и гене NRAS (N61Q - замена аспарагина на глутамин в 61-м кодоне).

Ген KRAS является одним из наиболее важных онкогенов при КРР, участвующих в активации сигнального пути EGFR (RAS/RAF/МАРК), тесно связанного с пролиферацией опухолевых клеток. Мутации гена KRAS при КРР в основном представлены точечными заменами в 12-м и 13-м кодонах 2-го экзона. Самыми распространёнными мутациями гена KRAS в ткани опухоли при КРР являются замены глицина на аспарагиновую кислоту в 12-м и 13-м кодонах (G12D и G13D). В нашем исследовании они составили 39,7% и 22,6%, соответственно, от общего числа мутаций при данной локализации. Наиболее значительным является онкогенный потенциал мутаций в 12 кодоне, в котором замена G12V характерна для наиболее агрессивных опухолей. В нашем исследовании эта мутация выявлена у 25 пациентов.

Есть предположения, что предиктивное значение мутаций в гене KRAS неодинаковое, однако подтвердить это можно будет только по результатам крупных

проспективных исследований [8, 9]. Поэтому на сегодняшний день применять дифференцированный подход при выявлении разных мутаций не представляется возможным. Полученные нами результаты по частоте мутаций в гене KRAS соответствуют литературным данным. При КРР мутации в гене KRAS встречаются примерно в 40% - 50% случаев, причем они сохраняются в течение всего процесса канцерогенеза, присутствуя как в первичной опухоли, так и в метастазах [3, 5, 6]. В связи с этим, как правило, нет необходимости выполнять дополнительную биопсию ткани опухоли для повторного определения мутационного статуса данного гена в процессе лечения. В выборке из 355 больных для 12 человек была возможность проанализировать мутационный статус генов KRAS, BRAF и NRAS в ДНК, выделенной не только из первичной опухоли, но и полученной из метастаза опухоли. Мутации в гене KRAS были выявлены в 4 образцах первичной опухоли и в соответствующих им образцах метастазов. В одном образце первичной опухоли была обнаружена мутация в гене BRAF, которая подтвердилась также и в метастазе. В 7 образцах первичной опухоли мутации не были выявлены, при этом анализ соответствующих образцов метастаза опухоли показал аналогичные результаты.

При обследовании 355 больных КРР мутация в 15-м экзоне гена BRAF была выявлена у 22 человек, что составило 6,2% (таблица 1). Изменение в гене BRAF представлено единственным вариантом - заменой валина на глутаминовую кислоту в 600 кодоне (V600E). Это самая распространенная мутация в 15-м экзоне гена BRAF при КРР. Ген BRAF, вовлеченный в сигнальный каскад EGFR, также оказывает влияние на процессы деления, выживания, миграции и дифференцировки клеток. Активирующие мутации в гене BRAF встречаются в 10-15% случаев КРР и являются взаимоисключающими с мутациями в гене KRAS. Активирующая точечная замена валина на глутаминовую кислоту в 600-м кодоне - V600E встречается примерно в 10% случаев КРР [3, 5]. Детекция мутантного гена BRAF также очень важна при назначении таргетной

терапиии, т.к. определяет устойчивость опухоли к анти-EGFR терапии и чувствительность к ингибиторам RAF. При этом наличие мутации в гене BRAF ассоциируется с неблагоприятным прогнозом - с более агрессивным типом опухоли, высокой активностью метастазирования, худшей выживаемостью и более ранним прогрессированием заболевания, что позволяет использовать мутантный статус данного гена в качестве прогностического маркера.

В нашем исследовании всем пациентам был проведен молекулярно-генетический анализ 3-го экзона гена NRAS. В пяти случаях из 355 была выявлена мутация Q61K (замена аспарагина на глутамин в 61-м кодоне), что составило 1,4% (таблица 1). У одного из пяти больных с выявленной мутацией в гене NRAS была также обнаружена мутация в гене KRAS (замена глицина на аланин в 12-м кодоне).

Ген NRAS, являясь членом суперсемейства RAS, также включен в активирующий сигнальный путь RAS/MAPK, определяет пролиферативную активность опухолевой клетки, способность ее к дифференцировке, метастазированию и апоптозу. Соматические мутации при КРР в гене NRAS наблюдаются в 2-5% случаев, в основном, в 61-м кодоне 3-го экзона, а также в 12-м и 13-м кодонах 2-го экзона [2, 6]. Как правило, наличие мутаций в KRAS, которые более распространены при КРР, исключает вероятность появления мутации в гене NRAS. Как и в случае KRAS, активация гена NRAS за счет мутации приводит к потере эффекта ингибирования EGFR моноклональными антителами, что позволяет рассматривать его в качестве независимого предиктивного маркера эффективности анти-EGFR терапии. Выводы

Проведенное исследование позволило на большом клиническом материале (355 больных) изучить частоту и спектр мутаций генов RAS-каскада - KRAS, NRAS и BRAF при КРР. В результате было установлено, что частота мутаций в этих генах достаточно высокая и составляет 48,2%. Принимая во внимание имеющиеся убедительные данные,

что активация генов RAS-семейства и BRAF делает неэффективным ингибирование EGFR моноклональными антителами, можно говорить о том, что данный вид терапии рекомендован к применению примерно только у половины больных КРР. Результаты генетического тестирования больных КРР, проходивших лечение в РНЦРР, наглядно демонстрируют необходимость и важность проведения молекулярно-генетического исследования, которое позволяет не только индивидуализировать терапию за счет оптимизации схем лечения, но и сократить экономические затраты при назначении таргетных и традиционных химиопрепаратов.

Список литературы

1. Информационный бюллетень ВОЗ, Февраль 2017 г.

2. Информационный портал молекулярно-генетической диагностики онкологических заболеваний (http://cancergenome.ru/)/

3. Кит О. И., Водолажский Д. И. Молекулярная биология колоректального рака в клинической практике. Молекулярная биология. 2015. Т. 49. №4. С. 531-540.

4. Кушлинский Н.Е., Исаков В.А., Делекторская В.В. и др. Обзоры колоректальный рак. Опухолевые маркеры и молекулярно-генетические методы диагностики. Сибирский онкологический журнал. 2004. № 2-3. С. 134-148

5. Armaghany T., Wilson J. D., Chu Q., et al. Genetic Alterations in Colorectal Cancer. Gastrointest Cancer Res. 2012. V. 5. P. 19-27.

6. Garde Noguera J., Jantus-Lewintre E., Gil-Raga M., et al. Role of RAS mutation status as a prognostic factor for patients with advanced colorectal cancer treated with first-line chemotherapy based on fluoropyrimidines and oxaliplatin, with or without bevavizumab: A retrospective analysis Mol Clin Oncol. 2017. V. 6. N. 3. P. 403-408. doi: 10.3892/mco.2017.1149.

7. National Comprehensive Cancer Network

8. Peeters M, Douillard JY, Van Cutsem E, et al. Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 2013. V. 31. N. 6. P. 759-765. doi: 10.1200/Jœ.2012.45.1492.

9. Tejpar S., Celik I., Schlichting M., et al. Association of KRAS G13D tumor mutations with

outcome in patients with metastatic colorectal cancer treated with first-line chemotherapy with or without cetuximab. J Clin Oncol. 2012. V. 30. N. 29. P. 3570-3577.

10. Walther A., Johnstone E., Swanton C., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 2009. V. 9. N. 7. P. 489-499.