СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЙОДДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ И ИММУНОДЕФИЦИТОВ
METHOD FOR PREPARING AN AGENT FOR PREVENTING IODINE DEFICIENCY DISORDERS AND IMMUNODEFICIENCY

Изобретение относится к пищевой промышленности, а конкретно к функциональным ингредиентам, к пище для профилактики йоддефицитных состояний и иммунодефицитов. Средство содержит органически связанные йод, цинк с соевым гидролизатом. Средство может быть использовано для приготовления пищевых продуктов для обогащения их микронутриентами - йодом и цинком. В частности, средство может быть использована при производстве хлеба, хлебобулочных, макаронных и кондитерских изделий, молочных продуктов, детского питания, а также различных напитков: питьевой и фруктовой воды, пива, кваса.
3
Известно применение соли йодированной пищевой для компенсации недостатка йода, поступающего в организм. Иодированная соль представляет собой механическую смесь обычной соли (NaCl) и неорганических соединений йодида калия (KI) или йодата калия (KIO) (Monitoring Universal Salt Iodization Programmes. Published by PAMM/ICCIDD/MI, 1995).
В Российской Федерации используют йодированную соль с содержанием йода 40±15 мкг на 1 г продукта. Равномерное смешивание при таком соотношении компонентов является сложнейшей задачей. Кроме того, неорганические соли йода неустойчивы и постепенно улетучиваются при хранении и особенно при термической обработке пищи. Нормы потребления соли вариабельны у разных групп угол населения и составляют от 0 (при некоторых заболеваниях соль противопоказана) до 10-15 г в сутки, при этом в организм может поступать 375-825 мкг йода, что в 2,5-5,5 раз превышает физиологическую норму. Превышение физиологических норм потребления неорганического йода может вызвать заболевания щитовидной железы. Опыт использования йодированной соли для профилактики йодной недостаточности в странах Африки показывает увеличение частоты йодиндуцированного тиреотоксикоза у лиц пожилого возраста (Проблемы эндокринологии №4, 2005 г., Т 51 стр. 36).
Минеральные соединения йода в естественных условиях выступают в качестве вспомогательного источника йода, эволюционно же сложившийся механизм йодного обмена в первую очередь направлен на использование органической формы йода, преобладающей в натуральных продуктах питания.
Известно применение сухого крахмал йодистого комплекса для лечения или профилактики заболеваний, вызванных нехваткой йода (RU С1 №2110265, МПК 6 A61K 33/18, 1998). Йод находится в данном комплексе в основном в виде соединения включения, поэтому можно назвать данный комплекс пролонгированной формой препарата неорганического йода, который всасывается постепенно, по мере переваривания крахмала в желудочно-кишечном тракте.
Таким образом, применение крахмал йодистого комплекса не позволяет осуществлять регулировку йодного обмена, возможную при использовании органической формы йода. Кроме того, данный препарат невозможно использовать в виде добавки к пище, подвергаемой кулинарной обработке, так как он начинает разлагаться при 40°С.
Известно использование для профилактики йодной недостаточности биологически активной добавки в виде комплексного соединения неорганического йода и пектина (RU С1 №2265377, МПК 7 A23L 1/30, 2005; RU С1 №2265376, МПК 7 A23L 1/30, 2005).
В данном случае также имеется комплексное соединение неорганического йода, который постепенно всасывается по мере продвижения пектин йодного комплекса по желудочно-кишечному тракту. Индивидуальная регулировка йодного обмена в данном случае также невозможна. Использование данного препарата в качестве добавки к пище крайне неудобно, так как он является нерастворимым в воде порошком.
Известна биологически активная добавка к пище для профилактики йодной недостаточности на основе плодов черноплодной рябины с добавкой пектина для стабилизации содержания йода при хранении препарата (RU С1 №2271726, МПК 7 A23L 1/30, 20.03.2006). ^
Главным недостатком данного технического решения является чрезвычайно низкое удельное содержание йода в продукте: 70 мкг на 100 г продукта. Кроме того, поскольку требуются специальные меры для стабилизации содержания йода при хранении, значительная часть йода находится в неорганической форме.
Известны пищевые продукты, включающие йодсодержащие пищевые добавки: хлеб, хлебобулочные изделия, молоко, масло, мясные изделия (Сборник рецептур и технологических инструкций по приготовлению диетических и профилактических сортов хлебобулочных изделий, ГосНИИ хлебопекарной промышленности, Москва, Пищепродукт, 1997 г., Йодообогащающая пищевая добавка «Амитон», ТУ, ТИ, РЦ 9110-273-05747158-98). В качестве пищевых добавок в указанные продукты вводят неорганические соединения йода, ламинарию (морскую капусту), дрожжи, выращенные в йодированной водной среде.
Недостатком известных продуктов является то, что у дрожжей при выращивании на йодированной среде может измениться метаболизм, а продукты имеют явно выраженный неприятный привкус и запах. Это связано с разложением неорганических соединений йода на свету с выделением свободного йода. Морская капуста также содержит большое количество неорганических соединений йода и соотношение органических и неорганических форм йода сильно варьируется в зависимости от места и условий произрастания, способов переработки и транспортировки.
Известен способ получения биологически активной добавки к пище для оптимизации йодного обмена, который представляет собой проращивание зерна в воде, содержащей различные микроэлементы: йод, селен, кобальт, молибден, цинк, медь, марганец в определенной концентрации, высушивание пророщенного зерна, его помол и компаундирование в различных сочетаниях (RU С1 №2271725, МПК 7 A23L 1/30, 20.03.2006).
Преимущество данного метода в том, что вместе с йодом вводятся сопутствующие микронутриенты, улучшающие обмен йода в организме. Недостатком данного способа является то, что 20-50% среднесуточной потребности в йоде находятся в 40-70 г муки. Прием такого количества ежедневно явно неудобен, а нетехнологичный метод производства не позволяет заменить значительную часть производимой муки ее биологически активным аналогом.
Известен способ получения биологически активной добавки к пище путем ферментативного гидролиза животного белка - эластина и йодировании полученного гидролизата с последующим высушиванием продукта (RU С1 №2266021, МПК 7 A23L 1/30, 2005). Суточную норму йода содержит 1 - 4 г получаемого порошка.
Недостатком известного способа является необходимость растворять порошок перед добавкой к пищевым продуктам, а также использование добавки приводит к изменению вкуса продуктов. Кроме того, в данном случае восполняется недостаток только йода без введения других микронутриентов, участвующих в его обмене.
В ряде технических решений предлагают для профилактики йодной недостаточности использовать синтетическое органическое соединение с ковалентно связанным йодом, выбранное из различных групп природных органических соединений, включая белки растительного, животного или микробиологического происхождения и их различные смеси (RU С1 №2134520, МПК 6 A23J 1/20, 1999; RU С1 №2141205, МПК 6 A21D 2/02, 1999; RU C1 №2163127, МПК 7 A61K 33/18, 2001; RU C1 №2192150, МПК 7 A23L 1/304, 2002).
Преимуществом такого предложения является отсутствие гормональной активности получаемых синтетических органических соединений и легкость их добавки в пищевые продукты. К недостаткам можно отнести использование для синтеза ксенобиотиков, таких как хлорамин Т, хлористый йод или йод трихлорид. Необходимы специальные меры для контроля отсутствия их в конечном продукте. В известных способах также не вводятся сопутствующие йоду микроэлементы.
Известен способ получения йодированного белка (RU С1 №2188648, МПК 7 A61K 33/18, 2002) и средство для регулирования йодного обмена или профилактики йоддефицитных состояний (RU С1 №2151611, МПК 7 A61K 38/16, 2000), где белок йодируют добавлением к раствору белка йодирующего агента - хлористого йода, растворенного в соляной либо уксусной кислоте. В результате происходит присоединение йода к ароматическим кольцам аминокислот - тирозина, фенилаланина и триптофана. В ходе реакции снижается рН раствора и образуется осадок йодированного белка, который отделяют центрифугированием или фильтрованием и затем сушат. Полученное средство содержит йодированный белок или его низкомолекулярный компонент, в состав структуры которых входит, по крайней мере, одна из следующих аминокислот - фенилаланин, триптофан, В частном случае предлагают использовать для йодирования молочный белок - казеин.
При использовании данного средства невозможна передозировка, так как в желудочно-кишечном тракте йодированный белок разлагается до йодированных аминокислот, которые поступают в печень. В печени происходит отщепление от них йода под воздействием фермента-дейодиназы, активность которого зависит от степени йодной недостаточности и функционального состояния щитовидной железы. Излишнее количество йодированных аминокислот, превращаясь в глюкорониды, покидает организм.
Недостатком известного способа является использование йодистого хлора для получения йодированного белка (возможна примесь этого ксенобиотика в конечном продукте). Готовая форма в виде порошка не всегда удобна для добавки в пищевые продукты - необходима дополнительная стадия растворения. Данное средство вносит в организм только йод, а этого не всегда достаточно для регулировки йодного обмена, особенно на начальном этапе коррекции йоддефицитных состояний.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения биологически активной добавки к пище для профилактики йоддефицитных состояний и оптимизации йодного обмена, выполненной в виде казеина, содержащего в составе органических молекул как йод, так и цинк (RU C2 №2328878, МПК A23L 1/30, 2012). Способ включает добавление в раствор казеина раствора тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. Для йодирования ароматических аминокислот используют насыщенный раствор мелкокристаллического йода в растворе йодида калия, а для насыщения фосфорных групп казеина ионами цинка - раствор водорастворимой соли цинка.
Недостатком известного способа является то, что происходит одновременное смешивание йода и цинка без возможности регулирования концентраций микроэлементов.
Технический результат изобретения заключается в получении средства для профилактики йоддефицитных состояний, обеспечивающей эффективное регулирование йодного обмена и иммунодефицитов, возможность регулирования концентраций солей цинка и йода для разных типов потребителей, а также удешевление способа.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения средства  для профилактики йоддефицитных состояний и иммунодефицитов, предусматривающем ферментацию белка, введение растворов сульфата цинка и йодида калия. Согласно изобретению в качестве белка используют соевый белок, который растворяют в соляной кислоте, ферментацию проводят с использованием пепсина с получением пептидов соевого гидролизата, который нейтрализуют, центрифугируют, в полученный надосадочный раствор низкомолекулярных пептидов добавляют раствор сульфата цинка с последующим диализом, после связывания солей цинка в соотношении 1:1 с пептидами соевого гидролизата добавляют раствор йодида калия в соотношении 1:1 с последующим диализом.
Отличительными признаками заявляемого способа являются использование соевого белка, ферментация его пепсином с образованием низкомолекулярных пептидов, а также последовательное введение солей цинка и йода в раствор низкомолекулярных пептидов.
При концентрации соевого белка, равной 0,5%, концентрация растворимых пептидов в надосадочной жидкости была мала (см. табл. 1). При концентрациях белка от 2% и выше объем надосадочной жидкости был мал по сравнению с концентрациями менее 2%, что явилось бы нерациональным в виду повышенных затрат сырья. Поэтому в дальнейших исследованиях было решено использовать низкомолекулярные пептиды соевого гидролизата, образовавшиеся при воздействии пепсина на соевый белок в концентрации, равной 1-1,5%.
4
4
4
При концентрации ZnSO 0,05 М и выше происходила агрегация и осаждение пептидов соевого гидролизата. Оптимальной концентрацией ZnSO явилась концентрация, равная 0,01 М, содержание связанного цинка при этой концентрации составляло 34,7±3,12 мкг/мл. При уменьшении концентрации менее 0,01. М количество связанного цинка значительно уменьшалось: при концентрации ZnSO 0,005 М количество связанного цинка было равно 11,56±1,1 мкг/мл.
Экспериментально выявлено, что при концентрации 0,002 М содержание связанного йода наиболее оптимальное. При концентрации менее 0,002 М содержание связанного йода слишком мало, а при концентрации выше не выявлено значительного увеличения связанного йода.
При одновременном введении солей цинка и йода происходило взаимодействие солей друг с другом с появлением осадка. При последовательном введении йода, а затем цинка концентрация связанного цинка составляла 2,85 мкг/мл, а при последовательном введении солей цинка, а затем йода концентрация цинка составила 34,7 мкг/мл. Это обусловлено, по-видимому, тем, что на образование химических связей с цинком необходимо больше энергии. Таким образом, выявлено, что в первую очередь необходимо провести взаимодействие пептидов соевого гидролизата с солями цинка, а затем с солями йода. Последовательное связывание солей цинка и йода позволяет регулировать количество связанных микроэлементов, что позволяет применять полученную добавку в зависимости от факторов потребителей: начиная от различных субъектов Российской Федерации с различной необходимостью в хмикроэлементах, заканчивая потребителями, имеющими ограничения или противопоказания в дозе потребления микроэлементов.
На фиг. 1 показано, что иммобилизация цинка в соотношении 1:1 с образованием устойчивых связей с низкомолекулярными пептидами гидролизата происходит в течение 2 часов, при этом содержание связанного цинка составило 34,7 мкг/мл.
Была изучена зависимость связывания ионов йода с соевым гидролизатом в соотношении 1:1 в зависимости от времени инкубации (фиг. 2). По результатам проведенных исследований выбрана продолжительность выдержки с водным раствором йодида калия - 24 ч при комнатной температуре. При данных параметрах обработки 1 мг гидролизата белка сои связывал 1,6 мкг/мл йода.
Экспериментально было выявлено, что максимальное связывание соевого гидролизата и солей микроэлементов происходит при их соотношении 1:1.
Таким образом, выявленные отличительные признаки заявляемого способа, а именно использование соевого белка, ферментация его пепсином, последовательное введение солей цинка и йода в раствор низкомолекулярных пептидов обеспечивает эффективное регулирование йодного обмена и иммунодефицитов, возможность регулирования концентраций солей и йода, а также удешевление способа. Максимальной концентрацией сульфата цинка является значение 0,01М. Максимальная концентрация йодида калия равна 0,002 М.
Способ получения средства для профилактики йоддефицитных состояний и иммунодефицитов включает добавление в раствор 0,1М соляной кислоты соевого белка, их перемешивание и последующую ферментацию при температуре 37-38°С в течение 24 ч с использованием фермента пепсина. Полученный раствор нейтрализуют 10%-ным карбонатом натрия до значения рН 6,5-7,5. Далее раствор центрифугируют при 2000 оборотах в течение 20 минут для последующего отделения надосадочной жидкости. В полученный надосадочный раствор низкомолекулярных пептидов соевого гидролизата с концентрацией 19-20 мг/мл добавляют 0,05 М сульфат цинка в соотношении раствор соевого гиролизата: раствор сульфата цинка 1:1 с последующим диализом в течение 2 часов. После связывания солей цинка с пептидами соевого гидролизата добавляют 0,002 М йодид калия в соотношении раствор гидролизата и цинка: раствор йодида калия 1:1 с последующим диализом в течение 24 часов.
Возможность осуществления заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
5 г соевого белка перемешивают с 500 мл соляной кислоты (0,1 М), добавляют 250 мг пепсина и подвергают ферментации при температуре 37°С в течение 24 ч. Полученный раствор с концентрацией 1% белка нейтрализуют 10%-ным карбонатом натрия до значения рН 7,0. Далее раствор центрифугируют при 2000 оборотах в течение 20 минут для последующего отделения надосадочной жидкости. В полученный раствор пептидов соевого гидролизата с концентрацией 19,47 мг/мл вводят 0,01 М сульфат цинка в соотношении 1:1 с последующим диализом в течение 2 часов. После связывания солей цинка с пептидами соевого белка вводят 0,002 М йодид калия в соотношении 1:1 с последующим диализом в течение 24 часов. В результате получают 800 мл раствора, содержащего в своем составе: 19,47 мг/мл белка, 34,7 мкг/мл цинка, 1,6 мкг/мл йода.
Пример 2
7,5 г соевого белка перемешивают с 750 мл соляной кислоты (0,1 М), добавляют 375 мг пепсина и ферментируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Полученный раствор с концентрацией 1,5% белка нейтрализуют 10%-ным карбонатом натрия до значения рН 7,0. Далее раствор центрифугируют при 2000 оборотах в течение 20 минут для последующего отделения надосадочной жидкости. В полученный раствор пептидов соевого гидролизата с концентрацией 20,61 мг/мл вводят 0,05 М сульфат цинка в соотношении 1:1 с последующим диализом в течение 2 часов. В результате повышения концентрации цинка происходит осаждение соевого гидролизата, что ухудшает качество раствора и сроки хранения. После связывания солей цинка с пептидами соевого белка вводят 0,005 М йодид калия с последующим диализом в течение 24 часов. В результате получают 520 мл раствора, содержащего в своем составе: 24,37 мг/мл белка, 41,5 мкг/мл цинка, 1,8 мкг/мл йода.
Пример 3
2,5 г соевого белка перемешивают с 250 мл соляной кислоты (0,1 М), добавляют 125 мг пепсина и подвергают ферментации при температуре 37°С в течение 24 ч. Полученный раствор, концентрацией белка равной 0,5%, нейтрализуют 10%-ным карбонатом натрия до значения рН 7,0. Далее раствор центрифугируют при 2000 оборотах в течение 20 минут для последующего отделения надосадочной жидкости. В полученный раствор пептидов соевого гидролизата с концентрацией 10-11 мг/мл вводят 0,005 М сульфат цинка в соотношении 1:1 с последующим диализом в течение 2 часов. После связывания цинка с пептидами соевого белка вводят 0,001 М йодид калия в соотношении 1:1 с последующим диализом в течение 24 часов. В результате получают 1200 мл раствора, содержащего в своем составе: 10,21 мг/мл белка, 11,56 мкг/мл цинка, 0,8 мкг/мл йода. Содержание белка крайне мало при больших полученных объемах надосадочной жидкости.
Преимущества средства, полученного по заявленному способу, были подтверждены на экспериментальных моделях лабораторных животных.
Моделировали экспериментальный гипотериоз с помощью тиреостатика тирозола контрольной группе в течение 14 дней. Затем в течение 21 дня перорально вводили исследуемую добавку опытной группе животных.
Биологическую эффективность добавки оценивали по уровню гормонов (тироксина Т4, трийодтиронина Т3 и тиреотропрого гормона ТТГ) в сыворотке крови животных методом твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты исследования представлены в таблице 2.
* - достоверно относительно интактной группы
** - достоверно относительно контрольной группы
Как видно из полученных результатов, введение тирозола относительно интактной группы вызвало увеличение гормона ТТГ в 1,47 раза, уровень гормонов Т3 снизился в 1,19 раза, а уровень гормонов Т4 снизился в 1,46 раз, что указывало на возникновение гипотиреоза у подопытных животных.
При введении средства, полученного по заявляемому способу, наблюдалось восстановление уровня трийодтиронина и тиреотропного гормона в сыворотке крови животных на фоне тирозолового гипотиреоза до показателей интактной группы. Однако, как видно из таблицы 2, уровень гормона Т4 достоверно от контрольного не отличался, хотя повышение гормона Т3 достигло уровня интактных животных. Возможно, что уровень Т4 снизился в результате синтеза Т3 гормона и не смог восстановиться до уровня такового в интактной группе животных при данной вводимой дозировке связанного йода. На основании полученных данных можно сделать вывод, что доза органических форм микроэлементов не вызывает восстановления гормонального статуса животных по Т4 за 21 день восстановительной терапии.
Моделировали экспериментальный иммунодефицит с помощью иммуносупрессора азатиоприна контрольной группе в течение 7 дней. Затем в течение 14 дня перорально вводили исследуемую добавку опытной группе животных.
Биологическую эффективность добавки оценивали по концентрации иммуноглдобулинов в сыворотке крови животных методом твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты представлены в таблице 3.
Результаты исследований концентрации иммуноглобулинов сыворотки крови экспериментальных животных показали, что введение азатиоприна в концентрации вызывает снижение выработки иммуноглобулина А на 86,2%, иммуноглобулина М - на 98,2%, иммуноглобулина G - на 82,9%. Введение исследуемого средства на фоне иммунодефицита, вызванного введением азатиоприна, вызвало резкое увеличение выработки антител иммуноглобулина А, иммуноглобулина G, иммуноглобулина М. Уровень антител превысил соответствующие показатели интактных живтоных в 1,7-4 раза (иммуноглобулин А - в 4 раза, иммуноглобулин М - в 2 раза, иммуноглобулин G - в 1,7 раза), что указывает на стимулирующий характер действия БАД, полученной по заявляемому способу.