УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ В ЭРИТРОЦИТЫ СПОСОБОМ ПРОТОЧНОГО ДИАЛИЗА
DEVICE FOR THE INCLUSION OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPONENTS IN RED BLOOD CELLS BY THE CONTINUOUS FLOW DIALYSIS METHOD

Область изобретения
Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к устройствам для создания лекарственных форм для различных ферментных препаратов, а также других биологически активных компонентов (БАК) на основе эритроцитов, которые могут быть использованы как в лечении ряда заболеваний, так и в целях диагностики.
Предшествующий уровень техники
Ферменты, включенные в эритроциты, могут быть использованы как в фермент-заместительной и противоопухолевой терапии, так и для удаления из кровотока ряда низкомолекулярных токсичных соединений, таких как аммиак, цианид, этиловый и метиловый спирт, ацетальдегид и т.д. [1]. В настоящее время фермент L-аспарагиназа (аспарагиназа) является неотъемлемой частью комплексной терапии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей и взрослых [2], а также некоторых других видов онкологических заболеваний [3]. Аспарагиназа это фермент, гидролизующий аминокислоту аспарагин до аспарагиновой кислоты и аммиака. Механизм ее противоопухолевого действия связан с уменьшением концентрации аспарагина в плазме, так как эта аминокислота необходима для синтеза белка и ее отсутствие приводит к замедлению деления опухолевых клеток из-за невозможности такого синтеза. Особенно эффективное действие аспарагиназа оказывает на клетки некоторых опухолей, которые, в отличие от нормальных клеток, не могут самостоятельно синтезировать аспарагин (например, при ОЛЛ) [4]. Однако внутривенное введение аспарагиназы ограничено существованием многих побочных эффектов, основными из которых являются возникновение сильных аллергических реакций, а также короткое время жизни аспарагиназы в кровотоке [5,6]. Создание новой лекарственной формы аспарагиназы (аспарагиназы, включенной в эритроциты) улучшает ее фармакологические свойства, т.к. сильно увеличивает время жизни аспарагиназы в кровотоке [7,8]. Это происходит потому, что аспарагиназа проводит свою реакцию, находясь внутри эритроцитов, что защищает ее от находящихся в плазме антител и протеаз, способных ее разрушить. Субстрат, с которым работает аспарагиназа - аспарагин, способен проникать из плазмы внутрь эритроцита через эритроцитарную мембрану [9]. Аспарагиназу для терапевтического применения получают из бактерий (Esherichia coli, либо из фитопатогенной Erwinia chryzanthemi), т.е. она является для организма человека чужеродным белком. Однако если такая аспарагиназа спрятана внутри собственных клеток организма, это предупреждает развитие аллергических реакций на введенный чужеродный белок. Аналогично обстоит дело и с другими ферментными препаратами, которые включены в эритроциты и могут быть использованы для терапии ряда заболеваний.
Включение в эритроциты других БАК, например, низкомолекулярного антрациклинового антибиотика доксорубицина или терпено-индольных алкалоидов винкристина и винбластина, которые также широко используются в терапии ряда онкологических заболеваний [10-12], позволяет создать в эритроцитах депо этих лекарственных препаратов, которые постепенно выходят из эритроцитов-носителей, поддерживая в кровотоке достаточную терапевтическую концентрацию лекарства в течение долгого времени. Это важно, т.к., несмотря на высокую эффективность этих препаратов при прямом внутривенном введении, дозы препаратов, которые могут быть введены в организм, лимитируются их высокой токсичностью, например, их супрессивным действием на костный мозг [12], кардио- и нефротоксичностью [13]. При введении этих препаратов в эритроциты удается избавиться от их высоких пиковых концентраций в плазме в момент введения, которые и определяют, в большой степени, токсичность препаратов. Таким образом, включение ряда лекарственных ферментов и других биологически активных компонентов в эритроциты может обеспечивать улучшение фармакологических свойств данных БАК (их фармакокинетики и фармакодинамики), а также снижение их токсических эффектов. Несмотря на это, на данный момент существует мало установок, пригодных для рутинного применения для получения подобных эритроцитов-носителей фармакологических препаратов (фармакоцитов) для клинического использования.
В настоящее время наиболее мягкими, эффективными и щадящими способами, которые позволяют получить эритроциты-носители лекарственных препаратов со свойствами близкими к свойствам исходных эритроцитов, являются способы, основанные на обратимом гипоосмотическом воздействии на клетки.
Из современного уровня техники известны несколько автоматизированных устройств-аналогов для включения аспарагиназы и других ферментов, а также низкомолекулярных БАК, в эритроциты способом обратимого гипоосмотического воздействия:
1. Ropars С., Nicolau Y.C., Chassaigne M. Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes, US Patent 4,752,586, June 21, 1988, C12M 1/00 [14].
2. Pages E., Ropars C., Bailleul C. Apparatus for causing medical products to penetrate into red blood cells. US Patent 5,589,389, December 31, 1996, CI 2M1/12, C12M 3/06) [15].
3. Устройство итальянской фирмы EryDel SpA (Societa per azioni) (до января 2010 г. фирма Dideco (Sorin Group Italia, Sri):
а). Magnani M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus thereof (Dideco Sri, Italy). Европейский патент ЕР 0 882 448, дата публикации 12.01.2005, бюллетень 2005/02, A61K 9/50) [16];
б). Мамбрини Д., Серафини С. Устройство и набор для инкапсуляции в эритроцитах по меньшей мере одного соединения для терапевтического и диагностического применения (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 595 844, дата публикации заявки РСТ 03.11.2011, A61K 9/50, А61М 1/36, B01J 4/00) [17];
в). Мамбрини Д., Бенатти Л., Капогросси Д., Мандолини М. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 670 070, дата публикации заявки РСТ 13.11.2014, A61K 9/50) [18].
4. Устройство французской фирмы EryTech Pharma:
Godfrin Y. Lisis/resealing process and device for incorporating an active ingredient, in particular asparaginase or inositol hexaphosphate, in erythrocytes (EryTech Pharma, France). US Patent 10,273,444 B2, data of prior publication 5.06.2014, data of patent 30.04.2019, A61K 9/50, C12M 1/00, A61K 35/38, A61K 31/6615 [19].
Все указанные устройства используют для включения ферментов и других БАК в эритроциты различные варианты гипоосмотического способа, принцип которого состоит в том, что эритроциты приводят в контакт с гипоосмотическим раствором (т.е. раствором, имеющим осмоляльность ниже физиологической, составляющей 300 мОсм/кг). В результате этого возникает разница в осмотическом давлении по обе стороны эритроцитарной мембраны. Для уравновешивания осмотического давления внутри и снаружи эритроцита в него начинает поступать вода. Эритроцит постепенно набухает, в результате чего, после достижения максимально возможного объема (при сохранении постоянной площади поверхности эритроцита), в его мембране появляются разрывные дефекты (поры) диаметром от 8 до 50 нм, через которые из эритроцита может выходить гемоглобин и другие соединения, а внутрь эритроцита могут поступать компоненты (в том числе аспарагиназа или другие ферменты и низкомолекулярные соединения, а также нагруженные БАК наночастицы), присутствующие во внешнем растворе. Диаметр пор был измерен экспериментально и составлял от 8 до 50 нм [20-23], при этом было установлено, что для выхода гемоглобина из эритроцита достаточно образования пор диаметром около 10 нм [23,24].
В устройстве, описанном в патенте US 4,752,586 (Ropars С., et al.) [14], для включения биологически активных веществ в эритроциты могут быть использованы различные частные случаи выполнения устройства, которые позволяют работать с широким диапазоном объемов упакованных эритроцитов (от 200 мл до нескольких мл), которые должны быть сначала выделены из соответствующего объема исходной крови (от 450 мл до 10 мл). Общими чертами всех вариантов выполнения устройства является использование диализного элемента (диализатора) для лизиса эритроцитов, состоящего из двух отсеков (компартментов), разделенных диализной мембраной. Устройство диализных элементов может быть различным. Они могут содержать 2 отсека, разделенных только одной плоской полупроницаемой мембраной, или множество полых волокон из полупроницаемой мембраны, окруженных внешним отсеком. В первом отсеке циркулирует суспензия эритроцитов, а во втором гипоосмотический раствор для обеспечения лизиса эритроцитов. Вещество, которое должно быть включено в эритроциты вводится с помощью насоса в трубку, через которую суспензия эритроцитов подается в диализный элемент (до прохождения этой суспензии через теплообменное устройство, обеспечивающее нужную для диализа клеток температуру). Запечатывание полученных эритроцитов-носителей может быть проведено путем запечатывания пор в мембранах этих эритроцитов, при восстановлении нормальной осмотичности в суспензии лизированных в присутствии включаемого препарата эритроцитов, путем их инкубации при температуре от 20°С до 40°С с гиперосмотическим раствором (т.е. раствором с осмоляльностью выше физиологической, составляющей 300 мОсм/кг) как в отдельном резервуаре, так и во втором диализном элементе, в первом отсеке которого циркулирует суспензия лизированных эритроцитов, а во втором - гиперосмотический раствор.
В отдельных частных случаях выполнения устройства для целей лизиса и запечатывания эритроцитов может быть использован один и тот же диализный элемент, после соответствующей замены буфера во втором отсеке и установления температуры, соответствующей каждому из процессов (примерно от 0°С до 10°С для лизиса и примерно от 20°С до 40°С для запечатывания эритроцитов). Устройство имеет целый ряд стандартных приспособлений для измерения температуры в отдельных его частях, а также давления жидкости (или суспензии эритроцитов) на входе в диализные элементы и осмотического давления жидкости (или суспензии эритроцитов), чтобы обеспечивать оптимальные условия прохождения всех процессов.
В качестве недостатков данного устройства следует отметить, что оно работает только с суспензией отмытых эритроцитов, а наиболее простым и реально используемым его воплощением является то, которое работает с большими объемами этой суспензии (полученными из объемов крови от 200 до 450 мл), тогда как работа с малыми объемами суспензии эритроцитов (в несколько мл) осложнена. Примеры такого использования устройства отсутствуют. Устройство не предусматривает концентрирования клеток после лизиса, а кинетика процесса изменяется при существенном разбавлении исходной суспензии эритроцитов, которое происходит в этом случае. Требуется строгий подбор параметров диализаторов (площади диализной мембраны и пропускной способности диализатора, которая определяется, в том числе, скоростью протекания суспензии эритроцитов и лизирующего раствора через отдельные компартменты диализного элемента), а также строгий выбор отношений площадей мембран диализных элементов для лизиса клеток и для их запечатывания, которые не всегда могут быть обеспечены существующими на сегодняшний день моделями диализных элементов. Устройство не включает приспособления для отмывания клеток и не является полностью автоматическим.
В устройстве, раскрытом в патенте US 5,589,389 (Pages Е., Ropars С. и Bailleul С., 1996), которое фактически является вариантом выполнения устройства по патенту US 4,752,586, для включения БАК (инозитолгексафосфата, ИГФ) используют большой объем исходной крови (1 трансфузионная единица, т.е. ~ 450 мл крови) [15]. Указанное устройство включает дополнительно блок отмывания, который позволяет получить суспензию отмытых эритроцитов, исходя из цельной крови или эритромассы. В данном варианте выполнения устройства для включения БАК в эритроциты используется тот же принцип обратимого гипоосмотического лизиса исходных эритроцитов, отмытых при 4°С, инкубация их с включаемым веществом (при 4°С) и последующее запечатывание полученных эритроцитов-носителей путем возвращения эритроцитарной суспензии нормальной осмоляльности при инкубации с гиперосмотическим раствором (при 37°С). В данном осуществлении изобретения в качестве примера описано включение в эритроциты инозитолгексафосфата, который добавляют в среду уже на второй и третьей ступени отмывания исходных эритроцитов. Устройство состоит также из модуля лизиса эритроцитов, в котором поддерживается температура ниже 10°С (оптимально 4°С), и модуля запечатывания полученных эритроцитов-носителей, в котором поддерживается температура выше 20°С (оптимально 37°С). Все элементы модулей лизиса и запечатывания, которые контактируют с эритроцитами, являются одноразовыми (легко заменяемыми и имеющими низкую стоимость).

В качестве элемента для отмывания эритроцитов в данном устройстве могут быть использованы любые известные устройства для отмывания эритроцитов, например, устройства фирмы Haemonetics V50, PCS или Cell Saver. Кроме того, в данном способе добавление включаемого вещества в суспензию эритроцитов предложено проводить еще на стадии отмывания исходных эритроцитов. Это отмывание состоит из трех последовательных ступеней, первую из которых проводят физиологическим раствором, а две следующих тем же раствором, содержащим добавленный ИГФ. Блоки для лизиса эритроцитов и запечатывания полученных эритроцитов-носителей, имеют принципиально схожее строение. В каждом из них присутствует емкость для доведения суспензии эритроцитов до нужной температуры (4°С или 37°С, соответственно), а также емкость, в которой проходит диализ в присутствии ИГФ термостатированных эритроцитов с добавлением гипоосмотического раствора или инкубация суспензии лизированных эритроцитов с гиперосмотическим раствором. Блок лизиса содержит также отдельную емкость, в которой уже лизированные в присутствии БАК эритроциты дополнительно инкубируются при 4°С, прежде, чем перейти в блок запечатывания. Емкость для диализа эритроцитов (диализный картридж) состоит из 2 отсеков, разделенных полупроницаемой мембраной, через один из которых прокачивается суспензия отмытых эритроцитов в присутствии БАК (снизу вверх), а через другой лизирующий гипоосмотический буфер (сверху вниз). Теплообменные блоки для термостатирования суспензии эритроцитов смонтированы на терморегулируемых пластинах из нержавеющей стали, с обратной стороны которых имеются электрические катушки для обеспечения необходимой температуры. Устройство в целом содержит несколько перистальтических насосов для обеспечения прокачки по системе магистралей (т.е. трубок, соединяющих отдельные элементы устройства) суспензии эритроцитов, лизирующего и гиперосмотического буферов, а также оптические или вакуумные устройства для определения наличия жидкости в магистралях, и устройство для определения трансмембранного давления в диализном картридже. Все перистальтические насосы управляются автоматически с помощью контролирующего процесс электронного блока с учетом данных, получаемых с различных датчиков. Трансмембранное давление в диализном картридже поддерживается на уровне 300 мм рт.ст.
В качестве недостатка данного устройства можно отметить то, что оно работает только с большим объемом исходной крови (примерно 450 мл). Это связано с тем, что устройство не имеет приспособления для концентрирования разбавленной суспензии эритроцитов, которая всегда получается при отмывании эритроцитов из малых объемов исходной крови на стандартных отмывающих эритроциты устройствах. Данные об эффективности включения БАК в эритроциты в данном патенте не представлены. Кроме того, добавление включаемого вещества (ИГФ) в раствор для отмывания эритроцитов сильно увеличивает расход этого вещества. Однако авторы пишут о том, что добавление включаемого вещества можно делать в суспензию и после отмывания эритроцитов (до подачи их в термостатирующий блок).
В патентах ЕР 0 882 448 (Dideco Sri, Italy), а также RU 2 595 844 и RU 2 670 070 С2 (EryDel SpA, Italy) раскрываются варианты устройства для включения БАК в эритроциты, выделенные из небольших объемов (обычно 50 мл, реже до 100 мл) цельной аутологичной крови пациента [16,17,18]. Исходную кровь центрифугируют, чтобы отделить эритроциты от плазмы, и отмывают эритроциты изоосмотическим (т.е. имеющим физиологическую осмоляльность равную 300 мОсм/кг) солевым раствором с помощью центрифужного колокола для отмывания эритроцитов, являющегося частью устройства. Для достижения открытия пор в эритроцитарной мембране используют способ предварительного постепенного набухания (pre-swelling), когда эритроциты помещают последовательно в два гипоосмотических раствора (причем осмоляльность второго раствора ниже осмоляльности первого из них). В патентах [16,17] осмоляльности гипоосмотических растворов выбраны так, что после контакта с первым раствором эритроциты набухают и сферулируются, а после добавления второго гипоосмотического раствора эритроциты лизируются (или частично лизируются), с образованием в эритроцитарной мембране временных пор. При этом суспензия эритроцитов каждый раз сильно разбавляется гипоосмотическим раствором (до финального гематокрита около 4%-2.5%), поэтому после этапа инкубации с гипоосмотическими растворами суспензию лизированных эритроцитов концентрируют. Для этого используют диализное устройство (например, картридж с полыми волокнами из полупроницаемой мембраны), в котором суспензия лизированных (или частично лизированных) эритроцитов прокачивается по внутреннему контуру диализатора, а из внешнего контура осуществляется частичная откачка лизирующего раствора во внешнее приемное устройство. Затем в сконцентрированную суспензию лизированных клеток добавляют водный раствор включаемого БАК, который начинает поступать внутрь эритроцитов через образовавшиеся в мембране эритроцита поры. После окончания процесса инкубации осмоляльность внешней среды восстанавливают до нормальной величины, добавляя в суспензию клеток гиперосмотический раствор, в результате чего поры в мембране эритроцита закрываются и часть включаемого компонента остается внутри эритроцитов-носителей. Большинство стадий процесса регулируется автоматически с помощью специального электронного блока.
В качестве недостатков устройства можно отметить, что оно не является полностью автоматическим. В данном устройстве отмывание исходных эритроцитов и полученных эритроцитов-носителей осуществляется с помощью устройства автоматически, однако ввод включаемого компонента и гиперосмотического раствора в суспензию эритроцитов производится оператором вручную. Недостатком устройства является относительно большая потеря внутриклеточного содержимого эритроцитов, обусловленная сильным разбавлением эритроцитов при инкубации и лизисе в присутствии гипоосмотических растворов, что в свою очередь приводит к снижению содержания внутриклеточных веществ в эритроцитах после того, как их мембрана становится частично лизированной. И хотя макромолекулы не могут уйти из гемофильтра (диализатора), в котором затем проводят концентрирование, содержание низкомолекулярных метаболитов гликолиза (с молекулярным весом меньше 10000 дальтон) должно снижаться при откачке водного раствора из внешнего контура диализатора, т.к. эти метаболиты сначала выходят в большой объем гипоосмотических растворов на стадии лизиса, а затем легко проходят через диализную мембрану на стадии концентрирования эритроцитов. В устройстве имеется качающаяся платформа с подогревом до определенной температуры для мешка, в котором происходит запечатывание лизированных эритроцитов с включенным препаратом, однако все стадии набухания и лизиса эритроцитов идут при комнатной температуре без охлаждения растворов и суспензии до примерно 4°С, что вызывает снижение выхода включения препарата, т.к. известно, что время жизни образующихся в мембране пор уменьшается при повышении температуры до комнатной. В устройстве отсутствуют датчики давления в диализаторе при концентрировании и датчики гематокрита.
В патенте RU 670 070 [18], устройство для включения БАК в эритроциты не отличается от устройства, ранее описанного в патентах [16,17], однако описан вариант способа получения БАК, при котором потеря внутриклеточного содержимого снижена, а эффективность включения БАК увеличена относительно ранее описанного в патентах [16,17] способа за счет того, что осмотичность второго гипоосмотического раствора выбрана такой, что лизиса набухших эритроцитов при контакте со вторым гипоосмотическим раствором не происходит.Эритроциты, набухшие после двух последовательных ступеней обработки гипоосмотическими растворами, где осмоляльность второго раствора ниже, чем осмоляльность первого гипоосмотического раствора, сначала концентрируются, а потом к ним добавляется водный раствор включаемого вещества, что и приводит к лизису набухших эритроцитов (уже в присутствии БАК). При этом осмотичность суспензии набухших эритроцитов после добавления первого гипоосмотического раствора составляет 250-200 мОсм/кг, осмотичность суспензии набухших эритроцитов после добавления второго гипоосмотического раствора составляет 200-170 мОсм/кг, а осмотичность суспензии эритроцитов после двух ступеней набухания и добавления включаемого биологически активного компонента составляет примерно 150-110 мОсм/кг.
Еще в одном известном устройстве, раскрытом в патенте US 10,273,444 (фирмы EryTech Pharma, France) [19], выбранном нами в качестве ближайшего аналога, для снижения осмоляльности среды снаружи эритроцитов используют процесс диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического раствора с помощью диализатора, в котором суспензия эритроцитов протекает по внутреннему контуру, а гипоосмотический раствор протекает противотоком по его внешнему контуру. БАК, который должен быть включен в эритроциты, при этом помещают либо в исходную суспензию отмытых эритроцитов (т.е. во внутренний контур), либо в суспензию уже лизированных эритроцитов после их выхода из диализатора. Затем загруженные БАК эритроциты запечатывают, восстанавливая, как и в других методах, осмоляльность внешней среды.
В качестве недостатков устройства также надо отметить отсутствие полной автоматизации процесса и невозможность проведения на данном устройстве всех стадий способа. Данное устройство не включает приспособлений для отмывания эритроцитов (исходных и полученных после включения препарата) и работает только с предварительно отмытой на каком-либо внешнем устройстве эритромассой. При этом объем этой эритромассы может быть от 10 мл до 250 мл упакованных эритроцитов.
Параметры процесса лизиса в диализаторе (скорость протекания суспензии эритроцитов по внутреннему контуру диализатора и/или осмоляльность лизирующего раствора) устанавливаются оператором вручную, в соответствии с предварительно измеренной осмотической хрупкостью используемых для включения лекарственного препарата эритроцитов. Измерение осмотической хрупкости эритроцитов также производится во внешнем устройстве. Это не позволяет полностью автоматизировать процесс включения БАК в эритроциты, т.к. коэффициенты в уравнениях, связывающих различные параметры проведения лизиса с отдельными показателями осмотической хрупкости исходных эритроцитов должны быть установлены для каждого вида используемых диализаторов отдельно, т.к. зависят от параметров самого диализатора.
Существо заявляемого изобретения
Техническая проблема, которую решает настоящее изобретение, заключается в устранении недостатков известных устройств.
Технической задачей, решаемой настоящим изобретением, является создание устройства, направленного на обеспечение высокой и воспроизводимой эффективности (степени) включения различных БАК в эритроциты и снижение потери внутриклеточного содержимого.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение высокой и воспроизводимой степени включения различных БАК в эритроциты, что обеспечивается использованием одинакового объема раствора, поданного на вход и откачиваемого на выходе из внешнего контура диализатора на этапе диализа, достижением нужной величины гематокрита суспензии эритроцитов, поддержанием стерильных условий, поддержанием трансмембранного давления и давления во внутреннем контуре диализатора в заданных для каждой стадии процесса диапазонах, поддержанием заданного температурного режима и возможностью работы с необходимым объемом крови или предварительно отмытой эритромассы без потери качества получаемых БАК.
Степень включения различных БАК в эритроциты превосходит степень включения БАК в эритроциты для известных устройств.
Техническим результатом является также простота монтажа устройства и его мобильность.
Технический результат достигается посредством создания полностью автоматизированного устройства для включения БАК путем проведения в стерильных условиях гипоосмотического проточного диализа эритроцитов в присутствии биологически активного компонента (или компонентов) с последующим запечатыванием полученных эритроцитов-носителей, являющегося предметом настоящей заявки.
Указанный технический результат достигается за счет создания устройства для включения в эритроциты, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, включающего блок отмывания эритроцитов, блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, блок запечатывания эритроцитов-носителей и блок управления, при этом
блок отмывания эритроцитов содержит:
устройство для отмывания эритроцитов;
блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов содержит:
по меньшей мере одну емкость для физиологического раствора,
по меньшей мере один диализатор, внешний и внутренний контуры которого соединены с по меньшей мере одной емкостью для физиологического раствора,
по меньшей мере три насоса, один из которых предназначен для перемещения растворов и эритроцитов через внутренний контур диализатора, а два других предназначены для перемещения растворов по внешнему контуру диализатора,
по меньшей мере один насос для БАК,
по меньшей мере один насос для гиперосмотического раствора,
по меньшей мере один датчик измерения гематокрита,
по меньшей мере два датчика давления, по меньшей мере один из которых установлен на входе во внутренний контур диализатора и по меньшей мере один из которых установлен на выходе из внешнего контура диализатора,
по меньшей мере три датчика наличия жидкости,
оборудование для термостатирования,
по меньшей мере две емкости для эритроцитов, соединенные с внутренним контуром диализатора и устройством для отмывания эритроцитов,
по меньшей мере одну емкость для гипоосматического раствора, соединенную с внешним контуром диализатора,
блок запечатывания эритроцитов-носителей содержит:
оборудование для термостатирования,
а также по меньшей мере одну емкость для эритроцитов, соединенную с внутренним контуром диализатора и с устройством для отмывания эритроцитов;
элементы устройства соединены между собой магистралями, а блок управления выполнен с возможностью синхронизации работы элементов устройства, посредством приема сигналов с датчиков и передачи сигналов управления на клапаны, расположенные на магистралях, и насосы устройства.
Элементы заявляемого устройства являются существенными признаками, и их совокупность оказывает влияние на достижение заявленного результата.
Согласно изобретению емкость, заполненная кровью пациента или донора, соединенная с устройством для отмывания эритроцитов посредством магистрали с клапанами и служащая на последующих этапах для сбора и инкубации с гиперосмотическим раствором эритроцитов, лизированных в присутствии биологически активного компонента, размещена в блоке запечатывания эритроцитов-носителей.

В блоке отмывания эритроцитов размещено устройство для отмывания эритроцитов. Данное устройство характеризуется наличием центрифуги, сменной центрифугируемой емкости, в частном случае, например, сменного центрифужного конуса для отмывания эритроцитов, необходимых насосов и емкостей с исходным и отработанным раствором для отмывания эритроцитов. Для работы устройства по изобретению могут быть использованы как любые известные устройства для отмывания эритроцитов, например, устройства фирмы Haemonetics V50, Cell Saver, АРС 215 и др., так и специально сконструированные и включенные в состав заявляемого устройства узлы для отмывания эритроцитов. При этом все применяемые устройства позволяют наполнять и опорожнять центрифугируемую емкость, без извлечения из центрифуги, что обеспечивается наличием соответствующего сочленения вращающейся и неподвижной частей устройства для отмывания.
Диализатор, емкость для сбора суспензии отмытых из цельной крови эритроцитов, или предварительно отмытых эритроцитов в случае работы с эритроцитарной массой, емкость для сбора отмытых запечатанных эритроцитов-носителей, емкости для физиологического раствора, емкость для гипоосмотического раствора, соединенные между собой и с диализатором посредством магистралей с клапанами, а также насосы, установленные на разных входах диализатора, шприцевые насосы, датчики давления и наличия жидкости в магистралях и датчики измерения гематокрита размещены в блоке лизиса и концентрирования.
Емкость с цельной кровью пациента или донора, являющаяся также емкостью для сбора и запечатывания лизированных в присутствии биологически активных компонентов эритроцитов, емкости с суспензией отмытых эритроцитов и с суспензией запечатанных эритроцитов-носителей установлены на шейкерах, обеспечивающих перемешивание в указанных емкостях их содержимого при требуемой температуре.
При этом в блоке отмывания эритроцитов осуществляют этапы при комнатной температуре, а в блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов поддерживается температура от +2°С до +10°С, предпочтительно, от +4°С до +6°С.
В блоке запечатывания полученных эритроцитов-носителей цельную кровь пациента или донора в начале процедуры и суспензию лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов на этапе ее сбора в данной емкости содержат при комнатной температуре, а последующий этап запечатывания лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов осуществляют при температуре от +25°С до +40°С.
На магистралях, отходящих от шприцевых насосов, от емкостей с физиологическим и гипоосмотическим растворами могут быть установлены бактериальные фильтры. В блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, на этапе концентрирования, насосы, установленные на внешнем контуре диализатора, выполнены с возможностью прокачивания по внешнему контуру диализатора физиологического раствора, причем один из указанных насосов выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с постоянной скоростью, а другой насос выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с переменной скоростью, поддерживая постоянное трансмембранное давление в диализаторе при концентрировании на уровне 90-120 мм рт.ст.
В блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, на этапе диализа, насосы, установленные на внешнем контуре диализатора, выполнены с возможностью прокачивания по внешнему контуру гипоосмотического раствора с одинаковой скоростью.
Насос, установленный на входе во внутренний контур диализатора, выполнен с возможностью прокачивания по внутреннему контуру диализатора суспензии эритроцитов с переменной скоростью, причем на этапе концентрирования скорость указанного насоса постепенно уменьшается, когда давление на входе во внутренний контур диализатора превышает атмосферное на 120 мм рт.ст., а на этапе диализа указанный насос функционирует с переменной скоростью для поддержания трансмембранного давления в диализаторе на уровне 160-180 мм рт.ст.
Все емкости присоединены к системе магистралей стерильно и удаляются из нее только после остановки работы устройства.
Датчики наличия жидкости в магистралях обеспечивают контроль за окончанием одной стадии процесса за счет передачи сигнала на блок управления, который принимает решение о необходимости переключения соответствующих клапанов в устройстве для перехода на следующую стадию. Это способствует полной автоматизации всего процесса без необходимости вмешательства оператора. Блок управления, получая сигналы с датчиков давления, регулирует трансмембранное давление в диализаторе и давление на входе во внутренний контур диализатора, путем изменения скоростей работающих насосов, не допуская повышения величины этого давления свыше допустимой, что может привести к разрушению эритроцитов, проходящих через диализатор в данных условиях.
Таким образом, датчики давления способствуют получению высокого выхода эритроцитов-носителей, а также улучшению их свойств, которые приближены к свойствам исходных нативных эритроцитов.
Наличие двух насосов, работающих на внешнем контуре диализатора, один из которых расположен на входе во внешний контур диализатора и подает в него на стадии диализа эритроцитов в присутствии БАК гипоосмотический раствор, а второй расположен на выходе из внешнего контура диализатора и откачивает прошедший через внешний контур диализатора гипоосмотический раствор, причем объем откачиваемого раствора точно соответствует объему раствора, поданного во внешний контур диализатора, не позволяет избыточной воде входить во внутренний контур диализатора, что снижает разбавление суспензии во внутреннем контуре диализатора в ходе диализа и способствует увеличению эффективности включения БАК в эритроциты.
В устройстве используются датчики гематокрита. Наличие указанных датчиков позволяет контролировать достижение нужной величины гематокрита суспензии, получаемой в процессе концентрирования разбавленных после процесса отмывания суспензий эритроцитов (исходных или запечатанных после лизиса в присутствии БАК).
Краткое описание фигур
Заявляемое устройство может быть проиллюстрировано следующими фигурами:
На фиг. 1 представлено схематическое изображение варианта заявляемого устройства.
На фиг. 2 представлена диаграмма потоков суспензии эритроцитов в заявляемом устройстве.
На фиг. 3 представлен алгоритм работы блока управления.
Термины и определения
БАК - биологически активный компонент.
В качестве биологически активного компонента для включения в эритроциты может быть использован целый ряд веществ, обладающих какой-либо лекарственной или биологической активностью. Он включает (но не ограничивается) следующие вещества и классы соединений: различные белки, в том числе ферменты; пептиды, олигопептиды и полипептиды, аминокислоты; нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, олигонуклеотиды, фосфаты нуклеотидов, в том числе ди- и трифосфаты; аналоги нуклеозидов, используемые как терапевтические агенты (иммуносупрессанты и ингибиторы роста опухолевых клеток), такие как 6-меркаптопурин, азатиопурин, флударабинфосфат; противовирусные агенты, такие как фосфорилированный азидотимидин, (АZТ), дидезоксицитозин (ddC), природные и синтетические иммуномодуляторы (активаторы и супрессоры), например, производные мурамилдипептида (MDP); вещества с антикарциногенной активностью (метатрексат, винкристин, винбластин, доксорубицин и т.п.); гормоны (например, кортикостероиды и глюкокортикостероиды); нестероидные противовоспалительные агенты; аллостерические регуляторы гемоглобина (например, инозитолгексафосфат или пиридоксальфосфат); вещества, защищающие гемоглобин или эритроциты (например, криопротекторы); простагландины; лейкотриены (например, лейкотриен II); цитокины; антитела; α-, β- и γ-интерфероны; глутатион; токсины; и другие вещества, имеющие фармакологическую активность. Кроме того, в качестве биологически активного компонента в эритроциты могут быть включены различные искусственные наночастицы, с включенными биологически активными препаратами или соединениями. Это позволяет, например, использовать эритроцит-носитель как депо-форму в случае наночастиц, которые из-за состава своей поверхности обладают коротким временем циркуляции в кровотоке. Кроме того, такие наночастицы могут обладать, например, сильной флюоресценцией или магнитными свойствами, которые могут быть использованы для создания биосенсоров, концентрирования лекарственного компонента в нужном органе с использованием магнитов или для усиления контрастности при создании биологических изображений, например, при магнитно-резонансной томографии (МРТ) и т.п.
Комнатная температура - температура от 20°С до 25°С.
Рабочие растворы - растворы, используемые на разных этапах работы заявляемого устройства для включения биологически активных компонентов в эритроциты, к которым относятся физиологический раствор, раствор Bio-Wash или другие изоосмотические растворы для отмывания эритроцитов, гипоосмотический и гиперосмотический растворы и т.п.
Исходный материал - цельная кровь пациента или соответствующая по группе цельная кровь донора (исходная кровь), или предварительно отмытые эритроциты (исходные эритроциты).
Эритроциты - красные клетки крови.
Эритроцитарная масса (эритромасса, упакованные эритроциты) - концентрированная суспензия отмытых эритроцитов с высоким гематокритом (60-80%).
Эритроциты-носители (ЭН) - эритроциты, содержащие включенный биологически активный компонент (или компоненты).
Лизированные эритроциты - эритроциты, полученные в результате обратимого гипоосмотического лизиса, например, путем диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического буфера с помощью диализного устройства (диализатора), в мембране которых образовались временные поры.
Лизированные эритроциты-носители - эритроциты, лизированные в присутствии БАК, например, путем диализа против гипоосмотического буфера, содержащего БАК, в мембране которых образовались временные поры, и часть БАК поступила внутрь эритроцитов.
Эритроциты-биореакторы - частный случай эритроцитов, нагруженных БАК. Эритроциты, нагруженные ферментным препаратом, способным проводить свою реакцию внутри клеток, в которые он включен.
Запечатанные эритроциты-носители - эритроциты, загруженные БАК, с восстановленной целостностью мембраны клетки, получаемые путем восстановления осмотичности в суспензии лизированных эритроцитов-носителей при добавлении к ней гиперосмотического раствора.
Эффективность (степень или выход) включения БАК (Е) - процент от общего количества, введенного в систему БАК, оказавшийся запечатанным внутри эритроцитов-носителей в результате проведения процедуры включения БАК в эритроциты (процент или выход инкапсуляции).
Относительная эффективность включения БАК (R) - процент, который составляет реально полученная в эритроцитах-носителях концентрация (или, в случае включения ферментов, активность) БАК от максимально возможной в данных условиях, за которую принимают концентрацию (или активность) БАК в суспензии отмытых из цельной крови или исходных предварительно отмытых эритроцитов.
Фармакоциты - эритроциты с включенным фармакологическим компонентом.
Магистрали - пластиковые или силиконовые гибкие трубки, соединяющие различные узлы устройства.
PBS - физиологический раствор, содержащий 10 мМ фосфатного буфера, имеющий рН 7.4.
Описание изобретения
Представленные ниже сведения приведены для лучшего понимания принципа работы заявленного устройства. Эти сведения не являются ограничивающими, а лишь иллюстрируют общие принципы работы устройства.
Для получения эритроцитов-носителей биологически активного компонента (компонентов) в качестве исходного материала может быть использована как цельная кровь пациента или донора с аналогичной группой крови, так и предварительно отмытые упакованные эритроциты (эритроцитарная масса, эритромасса).
На фиг. 1 представлено схематическое изображение варианта заявляемого устройства, которое можно условно разбить на блоки, выполняющие следующие функции:
- блок I - блок отмывания эритроцитов из исходной крови и отмывания полученных запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих включенный БАК, работающий при комнатной температуре;
- блок II - блок лизиса эритроцитов и концентрирования суспензии отмытых из исходной крови эритроцитов, а также суспензии запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих включенный БАК, температура внутри которого поддерживается постоянной в пределах от +2°С до +10°С (предпочтительно +4°С до +6°С);
- блок III блок запечатывания, в котором в одном из частных случаев воплощения устройства, при использовании в качестве исходного материала цельной крови, помещается сначала мешок с этой кровью, а затем в ходе выполнения последующих стадий, в любом из частных случаев воплощения устройства, в этот же мешок собирается суспензия лизированных в присутствии БАК эритроцитов, причем от начального этапа работы устройства до полного окончания сбора этих эритроцитов в данном мешке он находится при комнатной температуре, а после завершения сбора, выполняется стадия запечатывания лизированных в присутствии БАК эритроцитов при температуре от +25°С до +40°С.
Блоки II и III, для поддержания заданной температуры, могут находиться, например, в термостатируемых камерах, где возможно поддержание необходимой температуры (на схеме не показаны). Поддержание необходимой температуры в блоках II и III также может осуществляться за счет других средств.
В каждом указанном блоке размещаются емкости, предпочтительно, стандартные пластиковые мешки (контейнеры): так мешок 1 в одном из частных случаев воплощения устройства, предназначен для размещения в нем исходного материала - цельной крови пациента или крови донора с соответствующей группой крови, а затем, после осуществления стадии диализа, в любом из частных случаев воплощения устройства, мешок 1 служит для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей, содержащих БАК; мешок 2 мешок, в который в одном из частных случаев воплощения устройства помещают исходный материал - предварительно отмытые эритроциты, либо, в другом частном случае воплощения устройства, в него собирается суспензия эритроцитов, полученных из исходной цельной крови на стадии отмывания; мешок 3 - для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов-носителей, мешки 4.1, 4.2 и 5 - для физиологического раствора; мешок 6 - для гипоосмотического раствора; мешки 7.1 и 7.2 - для растворов, используемых на стадии исходного и финального отмывания эритроцитов; а также мешки 8, 9 и 10 - для сбора отработанных растворов. В качестве емкостей для раствора включаемого биологически активного компонента (компонентов) и гипертонического раствора используются шприцы, являющиеся сменным элементом шприцевых насосов 11 и 12, соответственно.
Элементы заявляемого устройства соединены магистралями, представляющими собой трубки, например, гибкие пластиковые или силиконовые трубки. На магистралях, отходящих от шприцевых насосов 11 и 12, а также от мешков 4.1, 4.2, 5 и 6 (с физиологическим и гипоосмотическим растворами), могут быть установлены бактериальные фильтры (на фиг. 1 номерами не обозначены).
Устройство включает диализатор 13, внутренний контур которого заключен внутри полых волокон из полупроницаемой мембраны и окружен внешним контуром, и устройство 21 для отмывания эритроцитов, включающее центрифужный конус, являющийся сменным элементом заявляемого устройства.
Диализатор 13, шприцы в шприцевых насосах, подводящие магистрали и центрифужный конус в устройстве 21, а также бактериальные фильтры, составляют одноразовый набор, используемый для работы заявляемого устройства.
Устройство для отмывания эритроцитов, насосы, в том числе и шприцевые, датчики давления, датчики наличия жидкости в магистралях и датчики гематокрита составляют набор многоразового использования, применяемый для работы данного устройства.

Устройство включает ряд датчиков. Датчики 14 и 15 - для измерения давления, на выходе из внешнего и входе во внутренний контур диализатора 13, соответственно, в качестве которых могут быть использованы любые известные датчики давления, например, манометр дифференциальный цифровой DT-8890 производства СЕМ (Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Everett, WA, USA), датчик давления Honeywell 26PCDFA6D (Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA) и т.п.; датчики 16 и 17 - для измерения гематокрита, например, оптические; датчики 18, 19 и 20, которые фиксируют наличие жидкости (растворов и суспензии эритроцитов) в соответствующих магистралях, в качестве которых могут быть использованы, например, ультразвуковой датчик компании Dongguan Lidit Electronics Co., Ltd (Dongguan, China), датчики Sonocheck ADB Air Bubble Sensors (например, ADB05) (SONOTEC Ultraschallsensorik Halle (Saale) GmbH, Germany) и т.п.
При необходимости количество датчиков может быть увеличено.
В качестве устройства 21 для отмывания эритроцитов может быть использовано любое известное устройство для такого отмывания, например, устройство фирмы Haemonetics АРС-215 (Haemonetics SA, Швейцария), или специально сконструированный встроенный в установку узел для отмывания, содержащий центрифугу, сменную центрифугируемую емкость, необходимые насосы и мешки с исходным и отработанным раствором для отмывания эритроцитов.
Для мягкого перемешивания суспензии эритроцитов в мешках 1, 2 и 3 используются шейкеры 22, 23 и 24, соответственно. Шейкер 22 размещен в блоке III, в котором поддерживается требуемая температура, или шейкер 22 может быть объединен с устройством, способным поддерживать различную температуру. Перемешивание в мешке 1 цельной крови на стадии отмывания из нее эритроцитов или сбор в данный мешок 1 суспензии лизированных в присутствии БАК эритроцитов осуществляется в условиях комнатной температуры. На стадии инкубации для запечатывания эритроцитов-носителей температура в блоке III поддерживается в пределах от +25°С до +40°С. Шейкеры 23 и 24, обеспечивающие перемешивание суспензии в мешках 2 и 3, расположены в термостатируемом блоке II, где поддерживается температура от +2°С до +10°С, предпочтительно от +4°С до +6°С.
Перемещение растворов и суспензии эритроцитов по системе магистралей обеспечивается работой насосов 25, 26 и 27, например, перистальтических, а направление, по которому перемещаются растворы и суспензия эритроцитов на каждом из этапов работы заявляемого устройства, обеспечивается открытием или перекрыванием соответствующих клапанов: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 и клапанов 39, 40 устройства 21 для отмывания эритроцитов. В термостатируемых блоках II и III, расположены датчики температуры (на фиг. 1 не показаны).
Схема последовательных этапов перемещения суспензии эритроцитов в ходе работы устройства представлена на фиг. 2, где используются следующие обозначения:
ПН1 - перистальтический насос 25, посредством которого суспензия эритроцитов поступает во внутренний контур диализатора 13, ПН2 и ПН3 - перистальтические насосы 26 и 27, посредством которых физиологический раствор из мешка 5 или гипоосмотический раствор из мешка 6 поступают во внешний контур диализатора 13 и откачиваются из этого контура, соответственно; ШН1 и ШН2 шприцевой насос 11 для подачи включаемого биологически активного компонента (или компонентов) и шприцевой насос 12 для гиперосмотического раствора, соответственно; ЭН - полученные эритроциты-носители, содержащие БАК.
Каждый этап работы устройства обозначен отдельным индексом. В различных частных случаях выполнения устройства в качестве исходного материала используется либо цельная кровь, либо предварительно отмытая эритромасса (указано, как этапы a1 или а2 на фиг. 2, соответственно, которые соответствуют введению в систему исходного материала). Перемещения суспензии эритроцитов по магистралям устройства на каждом этапе работы устройства обозначены следующим образом: a1 и а2 введение исходного материала (исходной крови или исходных отмытых эритроцитов, соответственно) в систему; b подача цельной крови из мешка 1 на отмывание; с сбор отмытых эритроцитов в мешок 2 для суспензии отмытых эритроцитов; d концентрирование отмытых эритроцитов; е - диализ и сбор лизированных в присутствии БАК эритроцитов в блок III для запечатывания; f - подача запечатанных ЭН на отмывание; g - сбор запечатанных эритроцитов-носителей после их отмывания в мешок 3 для суспензии ЭН; h концентрирование полученных ЭН после их отмывания.
Если в качестве исходного материала используют цельную кровь, то после этапа a1 последовательно осуществляются этапы b-h; если в качестве исходного материала используют предварительно отмытую эритромассу, то после этапа а2 осуществляются этапы e-h.
Все указанные элементы заявляемого устройства работают в автоматическом режиме и регулируются посредством блока управления, который выполнен с возможностью синхронизации работы элементов устройства, посредством приема и передачи сигналов управления на все элементы устройства. Указанный блок управления соединен с компьютером, на котором установлено разработанное для заявляемого устройства программное обеспечение. Компьютер может быть соединен с заявленным устройством или встроен в устройство.
Устройство может быть выполнено в едином корпусе.
Описание этапов работы устройства
Дополнительно для понимания работы устройства представлены этапы его работы.
Этап 1. Промывка диализатора, магистралей и заполнение мешка с исходной кровью дополнительным физиологическим раствором
Перед началом работы устройства с помощью сканера, соединенного с устройством, производится считывание штрих-кода исходного материала (исходной цельной крови или исходной эритромассы), который загружается в устройство.
Для осуществления включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа, блок управления сначала открывает все клапаны устройства и ожидает команды об успешной загрузке сменного одноразового набора, после чего закрывает все клапаны кроме 28, 36, 38. Проводится промывка диализатора и всей системы магистралей, чтобы избежать возможности образования в них воздушных пузырей.
Блок управления включает насос 25 и, для промывки системы магистралей, физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 посредством насоса 25 подается во внутренний контур диализатора 13, при этом клапаны 28 и 38 открыты. Отработанный физиологический раствор удаляется в мешок 10. Одновременно, блок управления включает насосы 26 и 27 и физиологический раствор из мешка 5 посредством насоса 26 подается во внешний контур диализатора 13. Отработанный физиологический раствор посредством насоса 27 удаляется в мешок 9. Промывка диализатора 13 осуществляется в течение 2-5 мин при максимальной скорости работы насосов 25, 26 и 27 (100 мл/мин).
В одном из частных случаев воплощения заявляемого устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента или донора с соответствующей группой крови (от 50 до 400 мл), ее помещают в мешок 1, который стерильно присоединяют в блоке III, например, посредством припаивания, к каналу одноразовой системы магистралей, ведущему к клапану 39.
В качестве отмывающего эритроциты устройства 21 может использоваться любое известное устройство, содержащее сменную центрифугируемую емкость, например, центрифужный конус. Предпочтительно иметь конус с объемом близким к объему крови, находящейся в мешке 1. Многие известные отмывающие устройства имеют достаточно большой объем конуса. В частности, устройство фирмы Haemonetics АСР-215, может иметь объем конуса 275 мл, поэтому если объем исходной цельной крови, находящейся в мешке 1, меньше этого объема, например, от 50 до 200 мл, перед началом отмывания эритроцитов, мешок необходимо дозаполнить дополнительным физиологическим раствором до указанного объема конуса. По окончании промывки диализатора 13 блок управления перекрывает клапаны 36, 38, выключает насосы 26 и 27, открывает клапан 31, и физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 посредством насоса 25 закачивается в мешок 1 со скоростью 100 мл/мин в течение 1-2 мин. После достижения в мешке 1 общего объема 275 мл, блок управления отключает насос 25, и перекрывает клапаны 28 и 31.
Количество добавляемого в мешок 1 физиологического раствора определяется объемом крови в мешке 1 и объемом выбранного конуса устройства 21 для отмывания эритроцитов.
В другом частном случае воплощения устройства, при использовании в качестве исходного материала предварительно отмытых упакованных эритроцитов (эритроцитарной массы), перед началом работы устройства ее помещают в мешок 2, который стерильно присоединяют, например, посредством припаивания, к трем каналам одноразовой системы магистралей устройства в блоке II, один из которых ведет к клапану 29 и датчику 16 для определения гематокрита, второй ведет к клапану 32 и датчику 18 наличия жидкости в магистрали и третий ведет к клапану 30 и датчику 17 для определения гематокрита, а мешок 1 остается незаполненным и на данном этапе не используется (см. фиг. 1 и фиг. 2).
Этап 2. Отмывание эритроцитов из исходной цельной крови
В частном случае выполнения устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента (или донора с соответствующей группой крови), которую помещают в мешок 1 в блоке III, необходимо сначала получить из этой крови суспензию эритроцитов для дальнейшего включения в них биологически активных компонентов. Для этого осуществляют этап отмывания эритроцитов из крови, помещенной в мешок 1.
Блок управления открывает клапан 39 и включает насос устройства 21. Кровь из мешка 1 при открытом клапане 39 посредством насоса, являющегося частью устройства 21 для отмывания эритроцитов (на фиг. 1 не показан), поступает в данное устройство 21. Из мешков 7.1 и 7.2 в конус устройства 21 для отмывания эритроцитов поступает раствор для отмывания эритроцитов, в качестве которого может быть использован физиологический раствор, раствор Bio-Wash, представляющий собой физиологический раствор с добавленной глюкозой (0.2%), или другие солевые растворы с нормальной осмотичностью. Отработанный отмывающий раствор затем удаляется в мешок 8. После завершения отмывания эритроцитов блок управления перекрывает клапан 39, открывает клапаны 40 и 32, и отмытые эритроциты посредством работы упомянутого насоса устройства 21 поступают в мешок 2 для отмытых эритроцитов через открытый клапан 32. Поступление отмытых эритроцитов в мешок 2 фиксируется датчиком 18 наличия жидкости в магистрали, ведущей в мешок 2.
Для установления наличия жидкости в магистралях могут быть использованы любые датчики наличия жидкости в магистралях, например, фиксирующие это наличие оптически, по вакуумному разряжению в магистрали, либо по электрическому сопротивлению и т.д.
По окончанию поступления отмытых эритроцитов в мешок 2, блок управления выключает насос устройства 21 и перекрывает клапаны 32, 40.
В другом частном случае воплощения устройства, когда в качестве исходного материала используют предварительно отмытую эритроцитарную массу (от 25 до 250 мл), которую перед началом работы устройства помещают в мешок 2 и стерильно присоединяют к системе соответствующих магистралей, этап отмывания эритроцитов не проводят, а мешок 1, размещенный в блоке III, остается на этом этапе незаполненным.
Этап 3. Концентрирование отмытых эритроцитов
В частном случае выполнения устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента или донора с соответствующей группой крови, которую помещают в мешок 1 в блоке III, суспензия отмытых эритроцитов после этапа отмывания поступает в мешок 2.
Объем и гематокрит полученной суспензии отмытых эритроцитов определяются объемом исходной крови, находящейся в мешке 1, а также объемом конуса устройства 21 для отмывания эритроцитов. Если объем исходной крови небольшой (например, 50-100 мл), а объем конуса устройства 21 такого, как устройство АРС-215, составляет, например, 275 мл, то после этапа отмывания получают достаточно разбавленную суспензию эритроцитов. Чтобы предотвратить большую потерю внутриклеточного содержимого в ходе последующего диализа эритроцитов, отмытые эритроциты необходимо предварительно сконцентрировать. Концентрирование отмытых эритроцитов осуществляется посредством диализатора 13. Блок управления открывает клапаны 29, 30, 36 и включает насосы 25, 26, 27. При мягком перемешивании суспензии эритроцитов в мешке 2 для поддержания ее однородности посредством работы шейкера 23, суспензия отмытых эритроцитов из мешка 2 через открытый клапан 29 посредством насоса 25 закачивается во внутренний контур диализатора 13 со скоростью 10-30 мл/мин, после чего прошедшая диализатор 13 суспензия отмытых эритроцитов возвращается в мешок 2 через открытый клапан 30. Одновременно, во внешнем контуре диализатора 13 из мешка 5 в мешок 9 посредством насоса 26 (работает с постоянной скоростью 20 мл/мин) и насоса 27 прокачивается физиологический раствор. Исходная скорость работы насоса 27, который работает с переменной скоростью, выше, чем у насоса 26, но посредством работы блока управления она снижается так, чтобы поддерживать в диализаторе 13 постоянное трансмембранное давление 90-120 мм  рт.ст. (предпочтительно 100 мм рт.ст.). Указанное трансмембранное давление определяется разностью показаний датчиков давления 14 и 15, сигнал с которых позволяет блоку управления контролировать давление в контурах диализатора 13 и определять режим работы насоса 27. Одновременно блок управления не позволяет абсолютному давлению на входе во внутренний контур диализатора (датчик давления 15) превышать атмосферное более чем на 120 мм рт.ст., для чего блок управления постепенно снижает скорость работы насоса 25. Концентрирование суспензии происходит за счет более высокой скорости работы насоса 27, откачивающего из внешнего контура диализатора больший объем раствора, чем тот, что был закачан в этот контур насосом 26. Таким образом, в ходе концентрирования суспензия отмытых эритроцитов прокачивается «по кольцу» до тех пор, пока скорости работы насосов 26 и 27 не станут одинаковыми. После этого процесс концентрирования прекращается, т.к. при равных скоростях подачи и выкачивания раствора из внешнего контура диализатора дальнейшего концентрирования суспензии во внутреннем контуре диализатора уже не происходит. Гематокрит суспензии отмытых эритроцитов в ходе концентрирования контролируется на выходе из мешка 2, а также после выхода из внутреннего контура диализатора 13 посредством датчиков 16 и 17 (например, оптических) для измерения гематокрита, соответственно. Показания этих датчиков фиксируются в протоколе эксперимента. Если уровень полученного гематокрита гораздо ниже необходимого (65-80%), блок управления сигнализирует о нарушенных условиях и включается лампочка, которая сигнализирует о нарушении условий, необходимых для проведения процедуры включения БАК в эритроциты (т.е. о том, что данный эксперимент неудачен). После окончания процедуры концентрирования блок управления выключает насосы 26 и 27 и перекрывает клапан 36. Далее блок управления перекрывает клапан 29 и открывает клапан 28, при этом через клапан 28 посредством насоса 25 через внутренний контур диализатора 13 физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 (примерно 30-40 мл) продолжает прокачиваться в мешок 2 с максимально возможной скоростью, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора не превышает атмосферное более, чем на 120 мм рт.ст., чтобы в мешок 2 были собраны оставшиеся в диализаторе 13 отмытые эритроциты. Одновременно блок управления включает насос 11, и посредством шприцевого насоса 11 в магистраль, ведущую в мешок 2, добавляется включаемый биологически активный компонент (или смесь нескольких компонентов). Затем блок управления перекрывает клапаны 28 и 30. Величина гематокрита суспензии в мешке 2 после окончания концентрирования и смыва туда оставшихся в диализаторе клеток составляет от 65 до 80%. Она фиксируется датчиком гематокрита 16 сразу после начала процедуры диализа.
В частном случае воплощения устройства, когда исходным материалом является предварительно отмытая эритроцитарная масса (от 25 до 250 мл), которую помещают в мешок 2 и стерильно присоединяют его к системе магистралей, блок управления включает насос 11 и в магистраль, ведущую в мешок 2, посредством шприцевого насоса 11 сразу после окончания промывки диализатора (см. этап 1) добавляется включаемый биологически активный компонент, после чего блок управления включает насос 25, который прокачивает 5 мл физиологического раствора из мешков 4.1 и 4.2 в мешок 2, чтобы полностью смыть в этот мешок добавленный раствор БАК. Если для включения в эритроциты используют несколько БАК, все они могут быть либо предварительно смешаны и одновременно введены в систему с помощью одного шприцевого насоса 11, либо для введения могут быть использованы несколько отдельных шприцевых насосов 11.
Все последующие этапы работы устройства осуществляются одинаково при использовании в качестве исходного материала, как цельной крови пациента или донора с соответствующей группой крови, так и предварительно отмытых упакованных эритроцитов.
Этап 4. Диализ
Величина гематокрита суспензии отмытых эритроцитов из мешка 2, которая поступает в диализатор 13 для прохождения процесса диализа, отличается от величины гематокрита, использованной исходной предварительно отмытой эритромассы или величины гематокрита, фиксированной датчиком гематокрита 17 на выходе из диализатора 13, при которой было закончено концентрирование суспензии эритроцитов, отмытых из исходной цельной крови (65-80%). Если в качестве исходного материала используется предварительно отмытая эритромасса, то в мешок 2 добавляется 5 мл физиологического раствора для полного смыва из магистрали, ведущей в мешок 2, БАК, добавленного в эту эритромассу. В случае отмывания эритроцитов из исходной цельной крови, после завершения этапа их концентрирования производится смыв в мешок 2 оставшихся в диализаторе 13 клеток дополнительными 30-40 мл физиологического раствора, а также добавление определенного объема раствора включаемого БАК. Реальная величина гематокрита суспензии эритроцитов, поступающей на диализ, фиксируется датчиком 16 для измерения гематокрита, установленным на выходе из мешка 2.
Перед началом диализа блок управления включает насосы 26, 27, открывает клапан 37 и через внешний контур диализатора посредством насосов 26 и 27 из мешка 6 в течение 1 минуты прокачивается гипоосмотический раствор (со скоростью 30 мл/мин), который сливается в мешок 9. Затем на этапе диализа блок управления включает насос 25, открывает клапаны 29 и 31, и из мешка 2 суспензия эритроцитов, содержащая включаемый биологически активный компонент (БАК), мягко перемешиваемая шейкером 23, посредством насоса 25 прокачивается через внутренний контур диализатора 13 и собирается в мешке 1. Одновременно, во внешнем контуре диализатора 13 в противоток суспензии эритроцитов, содержащей БАК, посредством насосов 26 и 27 прокачивается гипоосмотический раствор из мешка 6, который собирается в мешок 9. При этом насос 27 выкачивает раствор из диализатора 13 с той же скоростью, с которой насос 26 подает гипоосмотический раствор во внешний контур диализатора (20-30 мл/мин), что препятствует сильному разбавлению суспензии эритроцитов во внутреннем контуре диализатора 13. Во время диализа блок управления поддерживает постоянное трансмембранное давление 160-180 мм рт.ст. Это достигается регулированием скорости насоса 25, которая сначала устанавливается в пределах 1.5-10 мл/мин (оптимально 6-7 мл/мин), но затем, используя показания датчиков давления 14 и 15, блок управления, при необходимости, меняет скорость насоса 25, чтобы поддерживать трансмембранное давление в диализаторе 13 на выбранном уровне 160-180 мм рт.ст.
Блок управления фиксирует завершение откачивания из мешка 2 суспензии эритроцитов, содержащей включаемый биологически активный компонент, посредством датчика 20 наличия жидкости в магистрали. Блок управления перекрывает клапан 29 и останавливает работу шейкера 23 с мешком 2. Блок управления открывает клапан 28 и посредством насоса 25 физиологический раствор (30-40 мл) из мешков 4.1 и 4.2 продолжает прокачиваться по внутреннему контуру диализатора 13 в течение 3-15 мин (в зависимости от скорости потока суспензии эритроцитов через внутренний контур диализатора 13, которую выбирает блок управления таким образом, чтобы давление на входе во внутренний контур диализатора 13 не превышало атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст.), оставшиеся в диализаторе 13 эритроциты собираются в мешок 1, размещенный в блоке III при комнатной температуре. По окончании сбора в мешке 1 лизированных эритроцитов-носителей, содержащих включаемый биологически активный компонент (компоненты), блок управления выключает насосы 25, 26 и 27 и перекрывает клапаны 28, 31 и 37. Этапы, осуществляемые в блоке II, а именно диализ и концентрирование, проводятся при температуре от +2°С до +10°С, предпочтительно от +2°С до +6°С.
Этап 5. Инкубация суспензии лизированных эритроцитов-носителей для их запечатывания
Блок управления включает шприцевой насос 12 и посредством этого насоса 12 в магистраль, ведущую в мешок 1, содержащий лизированные в присутствии БАК эритроциты, добавляется рассчитанное количество гиперосмотического раствора. После окончания сбора лизированных в присутствии БАК эритроцитов в мешке 1, температура в блоке III повышается (или осуществляется подогрев шейкера 22), что обеспечивает в блоке III выбранную температуру в пределах от +25°С до +40°С. Запечатывание эритроцитов, содержащих БАК (эритроцитов-носителей) осуществляется посредством инкубации лизированных в присутствии БАК эритроцитов, находящихся в мешке 1, в течение 20-40 мин (предпочтительно 30 мин) при температуре от +25°С до +40°С (предпочтительно 37°С) при плавном перемешивании содержимого мешка 1 шейкером 22.
Этап 6. Отмывание запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих БАК, и промывка диализатора и его магистралей
Перед последующим использованием диализатора 13 для концентрирования полученных запечатанных эритроцитов-носителей проводится повторная промывка диализатора 13, а полученные и собранные в мешке 1 запечатанные эритроциты-носители, содержащие БАК, отмываются посредством устройства 21 для отмывания эритроцитов путем повторения описанных ранее этапов 1 и 2.
Сбор отмытых запечатанных эритроцитов-носителей осуществляется в свободный чистый мешок 3, для чего блок управления открывает клапаны 33 и 40 и перекрывает клапан 32. Заполнение мешка 3 отмытыми эритроцитами-носителями фиксируется датчиком 19 наличия жидкости в магистрали, ведущей в мешок 3. После заполнения мешка 3 блок управления перекрывает клапан 33.
Этап 7. Концентрирование запечатанных эритроцитов-носителей
Чтобы обеспечить в полученной суспензии эритроцитов-носителей после их отмывания гематокрит приемлемый для непосредственного введения этой суспензии пациенту без ее дополнительной обработки (т.е. гематокрит от 45 до 70%), запечатанные эритроциты-носители, собранные в мешке 3, концентрируются в нем аналогично тому, как описано ранее на этапе 3. Для этого блок управления открывает клапаны 34, 35 и 36 и включает насосы 25, 26 и 27. Суспензия отмытых запечатанных эритроцитов-носителей, находящаяся в мешке 3, при мягком встряхивании шейкером 24, посредством работы насоса 25 прокачивается через внутренний контур диализатора 13, после чего она снова возвращается в мешок 3. При этом насосы 26 и 27 прокачивают через внешний контур диализатора 13 физиологический раствор из мешка 5 в мешок 9. По достижении одинаковой скорости работы насосов 26 и 27 блок управления останавливает работу этих насосов и перекрывает клапаны 34 и 36. Блок управления открывает клапан 28 и посредством работы насоса 25 на максимальной возможной скорости, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора 13 не превышает атмосферное более чем на 120 мм рт. ст., через внутренний контур диализатора 13 прокачивается примерно 30-40 мл физиологического раствора из мешков 4.1 и 4.2, чтобы оставшиеся в диализаторе запечатанные эритроциты-носители собрать в мешок 3. После сбора оставшихся в диализаторе запечатанных эритроцитов-носителей в мешке 3 блок управления выключает насос 25 и перекрывает клапаны 28 и 35. Устройство прекращает свою работу и мешок 3, содержащий полученные эритроциты-носители, стерильно отсоединяется от системы одноразовых магистралей.
Ниже приведен пример включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа с помощью заявленного устройства.
Пример
Включение аспарагиназы в эритроциты с помощью заявляемого устройства
Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза, АСП) - фермент класса гидролаз, катализирующий гидролиз L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты и иона аммония согласно реакции (1):
Аспарагиназа является неотъемлемой частью комплексного курса терапии при ряде онкологических заболеваний, например, ОЛЛ у взрослых и детей. Так как прямое внутривенное введение свободного фермента имеет серьезные недостатки (главные из которых, сильные аллергические реакции, короткое время жизни фермента в кровотоке, снижение эффективности лекарства при повторных введениях из-за образования в плазме антител к данному ферменту, влияние высоких пиковых концентраций фермента в момент введения на систему свертывания крови, поджелудочную железу, печень и ряд других систем организма, и т.п.), в качестве лекарственной формы аспарагиназы, имеющей улучшенные фармакологические свойства, используют аспарагиназу, включенную в эритроциты [7].
Включение аспарагиназы в эритроциты было проведено с помощью заявляемого устройства, строго следуя описанному выше алгоритму работы устройства. Для включения аспарагиназы в эритроциты в качестве исходного материала была использована цельная кровь доноров, которую забирали с помощью пункции локтевой вены в стандартный раствор дигидрата трехосновного цитрата натрия (3.2%, 0.109 М), при соотношении цитрат : кровь составляющем 1:9, а также лиофилизованная L-аспарагиназа из Е. coli Веро-аспарагиназа (ВероФарм ООО, Россия) по 10000 МЕ/флакон, в состав субстанции которой входят дополнительно маннитол 50 мг и глицин 50 мг (на 10000 ME). Для проведения проточного диализа были использованы стандартные педиатрические диализаторы фирмы Fresenius (FX Paed) объемом 18 мл. Раствор аспарагиназы готовили путем разведения лиофилизата ферментного препарата буфером (0.015 М Трис-HCl, 0.015% бычьего сывороточного альбумина (BSА), рН 7.3) до конечной активности 4000 МЕ/мл.
В проведенных экспериментах (n=11) объем исходной крови составлял 100 мл, а объем добавляемого раствора аспарагиназы - 0.4 мл (с активностью 4000 МЕ/мл).
Активность аспарагиназы измеряли индооксиновым методом, используя в качестве субстрата аспарагиназы аспартат-β-гидроксамат (AHA) и определяя образовавшийся при этом гидроксиламин спектрофотометрически на длине волны 705 нм после его превращения в индооксин в присутствии 8-гидроксихинолина [25]. Для измерения активности аспарагиназы, включенной в эритроциты, клетки сначала лизировали, разбавляя водой в 200 раз, а затем определяли активность фермента в лизатах (для удобного измерения, активность аспарагиназы в растворе должна составлять примерно 100 МЕ/л).
В качестве показателя эффективности включения были рассчитаны либо относительная эффективность включения (R) (т.е. какой процент включенная в клетки удельная активность составляет от максимально возможной в данных условиях), либо суммарный процент инкапсуляции вещества (Е) (т.е. суммарный процент вещества, включенный в эритроциты с помощью использованного устройства), рассчитанные по формулам (2) и (3), соответственно.
исх. сусп. ЭР
сусп. ЭН
исх. сусп. ЭР
сусп. ЭН
исх. сусп. ЭР
сусп. ЭН
где А и А - активности фермента в исходной суспензии отмытых эритроцитов и в конечной суспензии эритроцитов-носителей с включенным ферментом, соответственно, V и V - объемы, a Ht и Ht - гематокриты этих суспензий соответственно.
При этом за максимально возможную включенную удельную активность принимали активность включаемого вещества в суспензии исходных эритроцитов сразу после его внесения в суспензию отмытых из исходной крови эритроцитов (до начала процедуры включения), т.к. именно такая активность должна установиться в клетках и окружающей среде, если вещество полностью уравновешивается между этими фазами.
Эффективность включения БАК в эритроциты способом проточного гипоосмотического диализа с помощью заявляемого устройства была также сравнена с эффективностью включения БАК в эритроциты с помощью обратимого гипоосмотического воздействия для других существующих устройств.
В Таблице 1 представлены такие показатели, приведенные в опубликованных работах или рассчитанные нами самостоятельно из опубликованных данных по включению БАК, с помощью каждого из известных устройств. В качестве показателя включения в разных работах авторы также рассчитывали либо относительную эффективность включения (R), либо суммарный процент инкапсуляции вещества (Е) рассчитанные по формулам (2) и (3), соответственно.
Представленные в Таблице 1 данные демонстрируют, что эффективность включения БАК с помощью заявляемого устройства превосходит аналогичные эффективности, получаемые в других устройствах.
Литература
1. Koleva L.D., Bovt E.A., Ataullakhanov F.I., Sinauridze E.I. Erythrocytes as carriers: from drug delivery to biosensors. Pharmaceutics 2020, 12(3), No 276 (44 pp.). DOI: 10.3390/pharmaceuticsl2030276.
2. Halfon-Domenech C., Thomas X., Chabaud S., Baruchel A., Gueyffier F., Mazingue F., Auvrignon A., Corm S., Dombret H., Chevallier P., et al. L-asparaginase loaded red blood cells in refractory or relapsing acute lymphoblastic leukaemia in children and adults: results of the GRASPALL 2005-01 randomized trial. Br. J. Haematol. 2011, 153(1), 58 65. DOI: 10.1111/j. 1365-2141.2011.08588.x.
3. Hammel P., Berardi R., Van Cutsem E., Feliu J., Greil R., Wasan H.S., Metges J.-P., Nygren P., Osterlund P. J., Parner V., et al. Trybeca-1: a randomized, phase 3 study of eryaspase in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone as second-line treatment in patients with pancreatic adenocarcinoma (NCT03665441). J. Clin. Oncol. 2019, 37(4), suppl. TPS471. DOI: 10.1200/JCO.2019.37.4 suppl.TPS471.
4. Batool Т., Макку E.A., Jalal M., Yusoff M.M. A Comprehensive review on L-asparaginase and its applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 2016, 178(5), 900 923. DOI: 10.1007/s12010-015-1917-3.
5. Van Den Berg H. Asparaginase revisited. Leuk. Lymphoma 2011, 52(2), 168 178. DOI: 10.3109/10428194.2010.537796.
6. Mtiller H., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit. Rev. Oncol.Hematol. 1998; 28(2), 97-113. DOI: 10.1016/s1040-8428(98)00015-8.
7. Борсакова Д.В., Синауридзе Е.И. L-аспарагиназа: новые подходы к улучшению фармакологических свойств. Вопросы гематол., онкол. и иммунопатол. в педиатрии. 2018, 17(4), 80-97. DOI: 10.24287/1726-1708-2018-17-4-80-97.
8. Kravtzoff R., Desbois I., Lamagnere J.P., Muh J.P., Valat C., Chassaigne M., Colombat P., Ropars, C. Improved pharmacodynamics of L-asparaginase loaded in human red blood cells. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1996, 49(6), 465-470. DOI: 10.1007/BF00195932.
9. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий B.M., Жаботинский A.M., Пичугин A.B. Проницаемость эритроцитов человека для аспарагина. Биохимия 1985, 50(10), 1733-1737.
10. Booser, D.J.; Hortobagyi, G.N. Anthracycline antibiotics in cancer therapy. Focus on drug resistance. Drugs 1994, 47(2), 223-258. DOI: 10.2165/00003495-199447020-00002.
11. Moudi M., Go R., Yong C., Nazre M. Vinca alkaloids. Int. J. Prev. Med. 2013, 4(11), 1231 1235. DOI: 10.2165/00128415-200711380-00080.
12. Arora R., Malhotra P., Mathur A., Mathur A., Govil СМ., Ahuja P.S. Anticancer alkaloids of Catharanthus roseus: transition from traditional to modern medicine. In: Herbal Medicine: A Cancer Chemopreventive and Therapeutic Perspective, 1st ed., Arora, R. Ed., Jaypee Brothers Medical Publishers: New Delhi, India, 2010, Chapter: 21, pp. 292-309. ISBN 9788184488418.
13. Sawyer D.B., Peng X., Chen В., Pentassuglia L., Lim C.C. Mechanisms of anthracycline cardiac injury: can we identify strategies for cardioprotection? Prog. Cardiovasc. Dis. 2010, 53(2), 105-113. DOI: 10.1016/j.pcad.2010.06.007.
14. Ropars C, Nicolau Y.C., Chassaigne M. Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes. US Patent 4,752,586, June 21, 1988, C12M 1/00.
15. Pages E., Ropars C, Bailleul C. Apparatus for causing medical products to penetrate into red blood cells. US Patent 5,589,389, December 31, 1996, C12M 1/12, C12M 3/06.
16. Magnani M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus thereof (Dideco Sri, Italy). EP 0 882 448 B1, data of publication 12.01.2005, bulletin 2005/02, 9/50.
17. Мамбрини Д., Серафини С. Устройство и набор для инкапсуляции в эритроцитах по меньшей мере одного соединения для терапевтического и диагностического применения (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 595 844, дата публикации заявки РСТ 03.11.2011, A61K 9/50, А61М 1/36, B01J 4/00.
18. Мамбрини Д., Бенатти Л., Капогросси Д., Мандолини М. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 670 070, дата публикации заявки РСТ 13.11.2014, A61K 9/50.
19. Godfrin Y. Lisis/resealing process and device for incorporating an active ingredient, in particular asparaginase or inositol hexaphosphate, in erythrocytes (EryTech Pharma, France). US Patent 10,273,444 B2, data of prior publication 5.06.2014, data of patent 30.04.2019, A61K 9/50, C12M 1/00, A61K 35/38, A61K 31/6615.
20. Linderkamp O., Meiselman H.J. Geometric, osmotic, and membrane mechanical properties of density-separated human red cells. Blood 1982, 59(6), 1121-1127.
21. Ponder E. Diffractometric measurements of the tonicity volume relations of human red cells in hypotonic systems. J. Gen. Physiol. 1951, 34(5), 567 571. DOI: 10.1085/jgp.34.5.567.
22. Evans J., Gratzer W., Mohandas N., Parker K., Sleep J. Fluctuations of the red blood cell membrane: Relation to mechanical properties and lack of ATP dependence. Biophys. J. 2008, 94(10), 4134-4144. DOI: 10.1529/biophysj.107.117952.
23. Seeman P. Transient holes in the erythrocyte membrane during hypotonic hemolysis and stable holes in the membrane after lysis by saponin and lysolecithin. J. Cell Biol. 1967, 32(1), 55-70. DOI: 10.1083/jcb.32.1.55.
24. Borsakova D.V., Protasov E.S., Nazarenko S.V., Alexandrovich Y.G., Butylin A.A., Ataullakhanov F.I., Sinauridze E.I. Ways to increase the activity of glutamate dehydrogenase in erythrocyte-bioreactors for the ammonium removal. Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 2019, 13(3), 212-224. DOI: 10.1134/S0233475519030046.
25. Lanvers C, Pinheiro J., Hempel G. et al. Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum. Anal. Biochem. 2002; 309(1): 117-126. DOI: 10.1016/S0003-2697(02)00232-4.
26. Mangani M., Rossi L., D'ascenzo M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Erythrocyte engineering for drug delivery and targeting. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998; 28(1): 1-6. DOI: 10.1111/j. 1470-8744.1998.tb00505.x