КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДВУХ ИЛИ БОЛЕЕ ИЗОФОРМ ФАКТОРА РОСТА ГЕПАТОЦИТОВ
COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS USING TWO OR MORE HEPATOCYTES GROWTH FACTOR ISOPHORMS

Область техники
Настоящее изобретение испрашивает приоритет по заявке на патент Кореи с регистрационным номером 10-2013-0126216, зарегистрированной Корейским ведомством по интеллектуальной собственности 22 октября 2013 г., и по заявке на патент Кореи с регистрационным номером 10-2014-0143377, зарегистрированной Корейским ведомством по интеллектуальной собственности 22 октября 2014 г., содержание которых полностью включено в материалы настоящей заявки посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста, гепатоцитов или полинуклеотид, кодирующий изоформы, для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза.
Предшествующий уровень техники
Боковой амиотрофический склероз (БАС), являющийся заболеванием двигательных нейронов, был впервые описан в 1869 г. французским врачом Жаном-Мартеном Шарко. Обычные люди узнали о БАС, когда в 1939 г. этот диагноз был поставлен Лу Геригу, знаменитому бейсболисту из США, и с этого времени БАС называют болезнью Лу Герига.
Прогноз в случае БАС основан на клинических признаках, результатах электрофизиологических диагностических тестов и исключении других медицинских состояний, сопровождающихся такими же симптомами. Молекулярно-генетический тест, который можно использовать в клинических тестах, связанных с некоторыми генами, участвующими в развитии БАС, играет важную роль в определении генотипа и генетическом консультировании.
БАС может наследоваться по аутосомно-доминантному типу, аутосомно-рецессивному типу или X-сцепленному типу. Генетическое консультирование и оценка риска зависят от точной диагностики конкретных генов.
Рилузол известен как лекарственный препарат, используемый для замедления прогрессирования БАС. Известно, что рилузол может снижать скорость прогрессирования БАС за счет ингибирования избытка глутаминовой кислоты, которую считают одной из причин деструкции двигательных нейронов. Однако клинические эффекты рилузола не облегчают симптомы БАС, и результаты его использования не выявили заметного увеличения продолжительности жизни без трахеостомы у пациентов с БАС, которым не была выполнена трахеостомия. Как указано выше, истинные клинические эффекты рилузола, который помогает пациентам с БАС, оказались очень ограниченными и неопределенными (Stewart et al., 2001). Тем не менее, нет эффективного профилактического или терапевтического средства для БАС, кроме рилузола, имеющего хотя бы сомнительную клиническую эффективность, и поэтому необходима разработка лекарственных средств, оказывающих эффекты предупреждения или лечения БАС.
Между тем, из предшествующего уровня техники известны векторы экспрессии, используемые в качестве системы доставки генов для генетической терапии. Подробное описание вектора рСК, использованного в примере осуществления настоящего изобретения, приведено в публикации PCT/KR1999/000855. Кроме того, в публикации PCT/KR2003/000548 раскрыта композиция, содержащая рекомбинантный вектор pCK-HGFX7, использованный в настоящем изобретении, предназначенная для лечения или предупреждения ишемических болезней или поражений печени. Содержание PCT/KR1999/000855 и PCT/KR2003/000548 полностью включено в данную заявку посредством ссылки.
В настоящей публикации даны ссылки на многочисленные статьи и патентные документы и приведены цитаты из них. Содержание процитированных статей и патентных документов полностью включено в данную заявку посредством ссылки, а область техники, к которой относится настоящее изобретение, и признаки настоящего изобретения разъяснены более подробно.
Подробное описание изобретения
Техническая проблема
Авторы настоящего изобретения провели исследования и попытались разработать лекарственные препараты, способные предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз (БАС). В результате авторы настоящего изобретения установили, что БАС можно лечить с использованием композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF; от англ.: hepatocyte growth factor) или полинуклеотид, кодирующий изоформы, и таким образом выполнили настоящее изобретение.
Поэтому аспектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
Другим аспектом настоящего изобретения является обеспечение способа предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания изобретения, формулы изобретения и графических материалов.
Техническое решение
Согласно первому аспекту настоящего изобретения обеспечена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза; эта композиция содержит в качестве активного ингредиента два или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.
Авторы настоящего изобретения провели исследования и попытались разработать лекарственные препараты, способные предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз. В результате авторы настоящего изобретения установили, что БАС можно лечить с использованием композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.
Стратегия терапии по настоящему изобретению может быть грубо классифицирована на два типа: белковая терапия и генная терапия. Согласно стратегии белкового терапевтического агента по настоящему изобретению используют два или более типов изоформ белков HGF. В то же время согласно стратегии генного терапевтического агента по настоящему изобретению используют по меньшей мере одну последовательность нуклеотидов, кодирующую два или более типов изоформ HGF. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая две или более изоформ HGF, может быть обеспечена одним полинуклеотидом или раздельными полинуклеотидами. Предпочтительно полинуклеотидная последовательность, кодирующая две или более изоформ HGF, обеспечена одним полинуклеотидом.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «изоформа HGF» относится к полипептиду HGF, содержащему последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична природной последовательности аминокислот HGF у животного, включая все аллельные варианты. Например, термин «изоформа HGF» имеет значение, которое включает нормальную форму или дикий тип HGF и различные варианты HGF (например, сплайсинговые варианты и делегированные варианты).
В варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF включают полноразмерный HGF (flHGF; от англ.: full-length HGF) и делетированный вариант HGF (dHGF; от англ.: deleted variant HGF). Использование композиции, содержащей полноразмерный HGF и делетированный вариант HGF, может эффективно предотвращать или лечить БАС.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «flHGF» относится к последовательности аминокислот с 1 по 728 белка HGF животного, предпочтительно млекопитающего и более предпочтительно человека.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «dHGF» относится к делетированному варианту белка HGF, полученного посредством альтернативного сплайсинга гена HGF животного, предпочтительно млекопитающего, и более предпочтительно термин относится к HGF человека, содержащему 723 аминокислоты, с делецией пяти аминокислот (F, L, Р, S и S) в первом крингл-домене альфа-цепи последовательности полноразмерного HGF.
В варианте осуществления настоящего изобретения полноразмерный HGF по настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а делетированный вариант HGF по настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.
В варианте осуществления настоящего изобретения изоформы HGF по настоящему изобретению кодируются отдельными последовательностями нуклеотидов или одной последовательностью нуклеотидов. Соответственно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит два или более полинуклеотидов, если различные типы изоформ HGF кодируются раздельными полинуклеотидами, и содержит по меньшей мере один полинуклеотид, включающий единый полинуклеотид, если различные типы изоформ HGF кодируются одной полинуклеотидной последовательностью. Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть функционально связан с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью (например, с промотором или энхансером), регулирующей экспрессию изоформ HGF.
Если два или более типов изоформ HGF кодируются раздельными полинуклеотидами, то кассета экспрессии может быть сконструирована двумя способами. Согласно первому способу кассету экспрессии конструируют посредством присоединения последовательности, регулирующей экспрессию, к кодирующей последовательности (CDS; от англ.: coding sequence) каждой изоформы. Согласно второму способу кассету экспрессии конструируют с использованием сайта внутренней посадки рибосом (IRES; от англ.: internal ribosomal entry site) и 2А-пептидов, например - «последовательность, регулирующая экспрессию - первая изоформа CDS - IRES - вторая изоформа CDS - последовательность терминации транскрипции». IRES обеспечивает начало трансляции с последовательности IRES, за счет чего экспрессируются два или более генов, представляющих интерес, в одной и той же конструкции.
Если два или более типов изоформ HGF кодируются одним полинуклеотидом, то полинуклеотид, кодирующий два или более типов изоформ, функционально связан с одной регулирующей экспрессию последовательностью.
В настоящем изобретении изоформы HGF могут кодироваться гибридным геном HGF, который одновременно экспрессирует два или более различных типов изоформ HGF, например-flHGF и dHGF.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения гибридный ген HGF содержит кДНК, соответствующую экзонам с 1 по 18 HGF человека, и интрон 4 гена HGF человека или его фрагмент, который инсерцирован между экзоном 4 и экзоном 5 кДНК.
Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения гибридный ген HGF содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 3 по SEQ ID NO: 10.
Гибридный ген HGF, содержащий интрон 4, имеет длину, равную 7113 bp (пар оснований; от англ.: base pairs), и включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. Гибридный ген HGF может избирательно содержать фрагмент интрона 4 между экзоном 4 и экзоном 5 кДНК HGF.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения последовательность, дополнительно инсерцированная между экзоном 4 и экзоном 5, содержит: интрон 4 гена HGF человека, нуклеотиды с 392 по 2247, нуклеотиды с 392 по 727, нуклеотиды с 2229 по 5471, нуклеотиды с 5117 по 5471, нуклеотиды с 3167 по 5471, нуклеотиды с 4167 по 5471, или их комбинацию, из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 3.
Более предпочтительно последовательность, дополнительно инсерцированная между экзоном 4 и экзоном 5 терапевтической последовательности нуклеотидов, используемой в настоящем изобретении, является (i) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 2229 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 5117 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 3167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (iv) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 4167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (v) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 2229 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (vi) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 5117 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (vii) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 3167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; или (viii) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 4167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3.
Терапевтическая последовательность нуклеотидов по настоящему изобретению в зависимости от последовательности, дополнительно инсерцированной между экзоном 4 и экзоном 5, в конечном итоге выглядит следующим образом: (i) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 2297 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (ii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 5117 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (iii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 392 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (iv) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 4167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (v) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 2229 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (vi) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 5117 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (vii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 3167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); и (viii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 4167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18).
В данной публикации гибридный ген HGF, содержащий фрагмент интрона 4, называют «HGF-Х», и HGF-X включает HGF-X2, HGF-X3, HGF-X4, HGF-X5, HGF-X6, HGF-X7 и HGF-X8, которые содержат нуклеотидные последовательности SEQ ID NOs: с 4 по 10. В настоящем изобретении предпочтительно используют HGF-X7. «Изоформа HGF», «HGF-Х» и «HGF-X7» из настоящего изобретения описаны в публикации PCT/KR2003/000548, содержание которой включено в данную работу посредством ссылки.
Аминокислотные или нуклеотидные последовательности изоформ HGF, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, конструируют так, чтобы они включали аминокислотные или нуклеотидные последовательности, по существу идентичные последовательностям изоформ дикого типа HGF человека. Термин «по существу идентичные» означает, что аминокислотную или нуклеотидную последовательность изоформы дикого типа HGF человека и другую нуклеотидную последовательность выравнивают так, чтобы они как можно больше соответствовали друг другу, и выравненные последовательности анализируют с использованием алгоритма, обычно используемого в данной области техники. Аминокислотная или нуклеотидная последовательность изоформы дикого типа HGF человека демонстрирует по меньшей мере 80%-ную идентичность, предпочтительно  по меньшей мере 90%-ную идентичность, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность. Способы выравнивания для сравнения последовательностей хорошо известны в данной области техники. Различные способы и алгоритмы выравнивания раскрыты в публикациях Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Соmр. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992); и Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). The Пакет программ NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) можно получить через Национальный центр биотехнологической информации США (NCBI), и его можно использовать в Интернете совместно с такими программами для анализа последовательностей, как blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx. В пакет BLAST можно войти по ссылке http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Способ сравнения идентичности последовательностей с использованием этого пакета программ можно подтвердить по ссылке http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «предотвращение» относится к действиям по подавлению бокового амиотрофического склероза или задержке прогрессирования бокового амиотрофического склероза посредством введения композиции по настоящему изобретению.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «лечение» относится к: (а) подавлению прогресса бокового амиотрофического склероза, (b) облегчению бокового амиотрофического склероза или (с) устранению бокового амиотрофического склероза.
Композиция по настоящему изобретению может предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз за счет образования и роста аксонов и роста и антиапоптоза двигательных нейронов.
Композицию по настоящему изобретению можно применять in vivo с использованием различных способов доставки, которые известны специалистам в области генной терапии.
В варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению является депротеинизированной ДНК или содержится в системе доставки гена. Примерами системы доставки гена являются плазмида, вектор и вирусный вектор.
(i) Плазмида (вектор)
Плазмиду (вектор) можно использовать в качестве системы доставки, которая доставляет полинуклеотид по настоящему изобретению. Полинуклеотид, включенный в вектор, предпочтительно находится в соответствующей кассете экспрессии. Предпочтительно полинуклеотид функционально связан с промотором в кассете экспрессии.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «функционально связан» относится к функциональной связи между регулирующей экспрессию последовательностью нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью или последовательностью из фактора регуляции транскрипции) и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, и за счет этой связи регуляторная последовательность регулирует транскрипцию и/или трансляцию другой последовательности нуклеиновой кислоты.
В настоящем изобретении промотор, связанный с полинуклеотидной последовательностью, может регулировать транскрипцию нуклеотидной последовательности в клетках животных, предпочтительно в клетках млекопитающих, и более предпочтительно в клетках человека, и содержит, например, промоторы, полученные из вирусов млекопитающих, и промоторы, полученные из геномов клеток млекопитающих. Примерами могут служить промотор цитомегаловируса (CMV; от англ.: cytomegalovirus), поздний промотор аденовируса, промотор гена белка 7,5 кДа вируса коровьей оспы, промотор вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40; от англ.: simian virus 40), промотор гена тимидинкиназы (tk; от англ.: thymidine kinase) вируса простого герпеса (HSV; от англ.: herpes simplex virus), промотора вируса саркомы Рауса (RSV; от англ: Rouse sarcoma virus), промотора альфа-субъединицы фактора 1 элонгации трансляции (EF1; от англ: elongation factor 1), промотора металлотионеина, промотора бета-актина, промотора гена интерлейкина-2 (IL-2; от англ.: interleukin-2) человека, промотора гена интерферона (IFN; от англ.: interferon) человека, промотора гена IL-4 человека, промотора гена лимфотоксина человека и промотора гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF; от англ.: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), но не ограничиваются ими. Еще более предпочтительно промотор, используемый в настоящем изобретении, является промотором, полученным из немедленного раннего (IE; от англ.: immediately early) гена CMV человека (hCMV; от англ.: human cytomegalovirus), или промотором альфа-субъединицы EF1, и наиболее предпочтительно - 5'-нетранслируемой областью (UTR; от англ.: untranslated region), включающей промотор/энхансер и полную последовательность экзона 1, непосредственно прилегающую к кодону инициации ATG-последовательности экзона 2 IE-гена hCMV.
Кассета экспрессии, используемая в настоящем изобретении, может включать последовательность полиаденилации, например терминатор бычьего гормона роста (Gimmi, Е.R., et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983-6998 (1989)), последовательность полиаденилации, полученную из SV40 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)), шпильку polyA ВИЧ-1 (Klasens, В. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), шпильку polyA β-глобина (Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), шпильку polyA HSV TK (Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) или шпильку polyA вируса полиомы (Batt, D.В and G.G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)), но не ограничивается ими.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения векторы рСК, рСР, pVAX1 или pCY могут быть использованы в качестве системы доставки полинуклеотида, и более предпочтительно может быть использован вектор рСК. Вектор рСК подробно описан в публикации WO 2000/040737, содержание которой включено в данную работу посредством ссылки.
(ii) Ретровирус
Ретровирус может внедрять свой ген в геном организма-хозяина для доставки многих экзотических генетических материалов, и спектр инфицируемых им клеток очень широк, так что большинство ретровирусов используют в качестве векторов доставки генов.
Для конструирования ретровирусного вектора полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, но не ретровирусную последовательность, инсерцируют в ретровирусный геном, получая тем самым вирусы с нарушенной репликацией. Для продукции вириона сконструирована пакующая клеточная линия, содержащая gag, pol и env гены, но не содержащая последовательности длинного терминального повтора (LTR; от англ.: long terminal repeat) и ψ-непоследовательности (Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)). Если рекомбинантную плазмиду, содержащую полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, LTR-последовательность и ψ-последовательность внедряют в клеточную линию, ψ-последовательность обеспечивает продукцию РНК-транскриптов рекомбинантной плазмиды, и эти транскрипты упаковываются с вирусами, которые выбрасываются в среду (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, собирают и концентрируют, а затем используют в качестве системы доставки гена.
Описана доставка гена с использованием ретровирусных векторов второго поколения. Kasahara et al. получили вариант вируса мышиного лейкоза Молони и химерный белок, обладающий новыми характеристиками связывания, посредством инсерцирования последовательности эритропоэтина (ЕРО; от англ.: erythropoietin) в сайт оболочки вируса (Science, 266: 1373-1376 (1994)). Полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению также можно включить в ретровирус согласно стратегии конструирования ретровирусных векторов второго поколения.
(iii) Аденовирус
Аденовирус обычно использовали в качестве вектора для доставки генов из-за средних размеров его генома, легкости генной инженерии, высокого титра, широкого спектра клеток-мишеней и высокой инфекционности. Оба конца генома содержат инвертированные терминальные повторы (ITRs; от англ.: inverted terminal repeats) размером 100-200 bp, которые являются цис-элементами, необходимыми для репликации и упаковки ДНК. Область Е1 (Е1А и Е1В) генома кодирует белки, ответственные за регуляцию транскрипции вирусного генома, и транскрипцию генов клетки-хозяина. Область Е2 (Е2А и Е2В) кодирует белки, участвующие в репликации вирусной ДНК.
Кроме разработанных к настоящему времени аденовирусных векторов обычно используют аденовирус с нарушенной репликацией, в котором делетирована область Е1. Однако делетированная Е3 область в нормальных аденовирусных векторах может обеспечить сайт инсерции для экзотических генов (Thimmappaya, В. et al., Cell, 31: 543-551 (1982); и Riordan, J.R. et al., Science, 245: 1066-1073 (1989)). Поэтому полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению предпочтительно инсерцируют либо в делетированную область Е1 (область Е1А и/или область Е1В), либо в делетированную Е3 область. Кроме того, полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению можно также инсерцировать в делетированную область Е4. В контексте настоящего изобретения термин «делеция», использованный в отношении последовательностей из вирусных геномов, охватывает полную делецию соответствующей последовательности и ее частичную делецию. Кроме того, аденовирус может включать примерно 105% генома дикого типа, обеспечивая емкость для примерно 2 дополнительных kb ДНК (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)). Поэтому указанные экзотические последовательности, инсерцированные в аденовирус, могут быть дополнительно соединены с аденовирусным геномом.
Аденовирус может быть любым из 42 различных серотипов и подгрупп A-F. Из них аденовирус типа 5, относящийся к подгруппе C, является наиболее предпочтительным исходным материалом для получения аденовирусного вектора по настоящему изобретению. Биохимическая и генетическая информация относительно аденовируса типа 5 хорошо известна. Экзотические гены, доставленные аденовирусом, реплицируются так же, как в эписоме, и поэтому обладают низкой генотоксичностью для клеток хозяина. Поэтому генная терапия с использованием аденовирусной системы доставки генов определена как безопасная.
(iv) Вектор AAV
Аденоассоциированные вирусы (AAV; от англ.: adeno-associated viruses) способны инфицировать не делящиеся клетки и обладают способностью инфицировать различные типы клеток; поэтому они пригодны для использования в качестве системы доставки генов по настоящему изобретению. Подробные описания применения и получения AAV-вектора приведены в публикациях US 5,139,941 и US 4,797,368.
Результаты исследования AAV как системы доставки генов приведены в публикациях La Face et al, Virology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp.Hematol. (NY), 21: 928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94: 1440-1448 (1994), и Flotte et al., Gene Therapy, 2: 29-37 (1995). Недавно AAV-вектор был утвержден для клинических исследований Фазы I на человеке с целью лечения муковисцидоза.
В характерном случае AAV-вирус получают посредством котрансфицирования плазмиды, содержащей последовательность целевого гена, фланкированную двумя терминальными повторами AAV (McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963-1973 (1988); и Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)), и экспрессирующей плазмиды, содержащей кодирующую последовательность AAV дикого типа без терминальных повторов (McCarty et al., J. Virol., 65: 2936-2945 (1991)).
(v) Другие вирусные векторы
Другие вирусные векторы можно использовать для доставки полинуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в биологический организм. Векторы, полученные из вирусов, таких как вирус коровьей оспы (Puhlmann М. et al., Human Gene Therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) и Coupar et al., Gene, 68: 1-10 (1988)), lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104 (11): R55-62 (1999)), или вирус простого герпеса (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 1411-1415 (1995)), также можно использовать в качестве системы доставки, способной доставлять полинуклеотид в клетки,
(vi) Липосомы
Липосомы образуются спонтанно из фосфолипидов, суспензированных в водной среде. Опосредованная липосомами доставка экзотической молекулы ДНК оказалась очень успешной, как описано в публикации Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987). Липосомы, содержащие полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, доставляют полинуклеотидную последовательность в клетки за счет взаимодействия с клетками по таким механизмам, как эндоцитоз, адсорбция на поверхностях клеток и слияние с плазматическими мембранами клеток.
В тех случаях, когда полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению включена в депротеинизированную рекомбинантную молекулу ДНК или в плазмиду (вектор), полинуклеотидную последовательность можно ввести в клетки посредством микроинъекции (Capecchi, M.R., Cell, 22: 479 (1980); и Harland & Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094-1099 (1985)), осаждения фосфатом кальция (Graham, F.L. et al., Virology, 52: 456 (1973); и Chen & Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)), электропорации (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982); и Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716-718 (1986)), опосредованной липосомами трансфекции (Wong, Т.К. et al., Gene, 10: 87 (1980); Nicolau & Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982); и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), обработки диэтиламиноэтил-декстраном (DEAE-dextran; от англ.: diethylaminoethyldextran) (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)) и бомбардировки генами (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)).
Если полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению сконструирована на основе вирусного вектора, полинуклеотидную последовательность можно доставить в клетки различными способами инфицирования вирусами, известными в данной области техники. Инфицирование клеток хозяина с использованием вирусных векторов описано в публикациях, процитированных выше.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектором по настоящему изобретению является плазмида, и наиболее предпочтительно может быть использован вектор рСК. Примером рекомбинантного вектора, содержащего один полинуклеотид, экспрессирующий два или более изоформ HGF, с использованием вектора рСК, может быть pCK-HGFX7, состав которого подробно описан в публикации PCT/KR 1999/000855 и PCT/KR 2003/000548, как указано выше.
Композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель, содержащийся в композиции по настоящему изобретению, обычно используют для приготовления композиции, и примеры носителей могут включать, но не ограничиваются этим, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать смазывающее вещество, смачивающее средство, подсластитель, вкусовую добавку, эмульгатор, суспензирующее средство, консервант и т.п., помимо указанного выше ингредиента. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и добавки подробно описано в публикации  Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
Предпочтительно фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно ввести парентерально, и, например, можно использовать внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, подкожное введение, интрадермальное введение, интраспинальное введение, интратекальное введение, интравентрикулярное введение, паренхимальное введение, интракраниальное введение, внутримышечное введение или местное введение. Наиболее предпочтительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена внутримышечно, интраспинально, интратекально, интравентрикулярно, паренхимально или интракраниально.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена и введена в форме инъекции. Подходящая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьируется в зависимости от ряда факторов, таких как способ приготовления, способ введения, возраст, масса тела и пол пациента, степень тяжести заболевания, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность ответа, и практикующий врач сможет легко определить и назначить дозу, эффективно обеспечивающую желаемое лечение или предотвращение болезни.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения изоформы HGF по настоящему изобретению вводят в дозе, лежащей в диапазоне от 1 мкг до 2,500 мг, а полинуклеотид, кодирующий изоформы, вводят в дозе, лежащей в диапазоне от 1 мкг до 2,500 мг. Если изоформы HGF или полинуклеотид, кодирующий изоформы, вводят повторно один или более раз, то доза при каждом введении может быть одинаковой или разной.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению приготавливают с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя способом, который легко может быть выполнен специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и фармацевтическую композицию можно приготовить в единичной лекарственной форме, или ее можно поместить в многодозовый контейнер. При этом лекарственная форма может быть раствором в масляной или водной среде, суспензией, эмульсией, экстрактом, порошком, гранулами, таблеткой или капсулой, и она может дополнительно содержать диспергатор или стабилизатор.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечен способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза, который включает введение млекопитающему композиции, содержащей в качестве активного ингредиента два или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.
В варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF по настоящему изобретению включают полноразмерный HGF (flHGF) и делетированный вариант HGF (dHGF).
В варианте осуществления настоящего изобретения полноразмерный HGF по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а делетированный вариант HGF по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Поскольку способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза по настоящему изобретению включает стадию введения фармацевтической композиции для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза, которая является аспектом настоящего изобретения, то перекрывающиеся описания были опущены во избежание чрезмерного усложнения публикации из-за повторных описаний.
Полезные эффекты
Признаки и преимущества настоящего изобретения можно обобщитьследующим образом:
(a) Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
(b) Настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
(c) Композицию или способ по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза за счет образования и роста аксонов в эмбриональных нервных клетках и роста и антиапоптоза двигательных нейронов.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 изображает эффект pCK-HGFX7 на образование аксонов эмбриональных нервных клеток (ENC; от англ.: embryonic neuronal cells) согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 2 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост эмбриональных нервных клеток согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 3 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост клеток NSC-34 согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 4 изображает эффект pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 5 изображает эффект pCK-HGFX7 на переживание клеток NSC-34 при культивировании в условиях оксидативного стресса согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 6 изображает эффект pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 при культивировании в условиях оксидативного стресса согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 7 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост клеток, в которые была доставлена hSOD1 с мутацией G93A, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 8 изображает эффект pCK-HGFX7 на силу захвата лапы БАС-мышей согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Описание примеров осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на примеры его осуществления. Эти примеры предназначены только для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.
Пример 1
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на созревание эмбриональных нервных клеток (ENC)
4
Из эмбриона мыши взяли только участок коры головного мозга для разделения на отдельные клетки, после чего к культуральной среде добавили 10 мкМ Ara-С 10 для культивирования только нервных клеток. Для подтверждения эффекта pCK-HGFX7 на созревание ENC высеяли 2×10 клеток и на следующий день клетки обработали 1,25 нг/мл белка, полученного из клеток 293F (Life Technologies, США), трансфицированных pCK-HGFX7, для проверки уровня отрастания аксонов, обнаруживаемого в ходе созревания клеток. Уровень отрастания аксонов подтвердили с использованием иммуноцитохимии по экспрессии TUJ-1 - тубулинового белка, специфически экспрессируемого нервными клетками.
Результаты подтвердили, что, как показано на Фиг. 1, длина аксонов была значимо большей в группе, обработанной pCK-HGFX7, чем в группе, обработанной рСК с целью контроля.
Пример 2
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток после созревания ENC
4
Проверили эффект pCK-HGFX7 на рост клеток после созревания ENC. Для этого высеяли 5×10 ENC, после чего они созревали в течение 6 дней. Через 6 дней клетки обработали 1,25 нг/мл белка, полученного из клеток 293F, трансфицированных pCK-HGFX7, для проверки эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток. После 3 дней обработки pCK-HGFX7 был выполнен анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ) для измерения роста клеток.
Результаты подтвердили, что, как показано на Фиг. 2, рост клеток значимо увеличивался примерно на 40% в группе, обработанной pCK-HGFX7, по сравнению с группой, обработанной рСК с целью контроля.
Пример 3
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток и апоптоз двигательных нервных клеток (NSC-34)
3-1. Клеточная линия и культура клеток
2
Клетки NSC-34 (Cellution Biosystem, Ванкувер, Канада), использованные в этом тесте, были двигательными нервными клетками мыши. Клетки NSC-34 соответствуют клеточной линии, в которой двигательные нервные клетки, полученные из спинномозгового нерва эмбрионов мышей, смешаны с клетками нейробластомы, и широко используются в исследованиях, связанных с двигательными нервами. Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Sigma), с добавлением 10% фетальной сыворотки коров и антибиотического материала (Gibco BRL, США) при 37°C и 5% CO. Среду, реагент и сыворотку для культуры клеток закупили в компаниях Gibco и Sigma Aldrich.
3-2. Получение и количественная оценка супернатанта, экспрессирующего белок HGF
6
Трансфекцию ДНК использовали для получения супернатанта, экспрессирующего белок HGF. Трансфекцию провели с использованием системы трансфекции FuGene HD (Promega, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки 293Т высеяли в количестве 1×10 клеток, и на следующий день клетки трансфицировали 3 мкг рСК, pCK-HGF728 (pCK-cHGF в публикации PCT/KR03/000548), pCK-HGF723 (pCK-dHGF в публикации PCT/KR03/000548) и рСК-HGFX7 ДНК. После культивирования в течение 48 часов соответствующие супернатанты собрали и профильтровали через фильтр с ячейками 0,22 мкм. Уровень экспрессии белка HGF, содержавшегося в каждом супернатанте, измерили с использованием иммуноанализа на HGF человека. Каждый супернатант снова разбавили до концентрации, равной 1 мкг/мл, перед проведением анализов. Рекомбинантный белок HGF человека, использованный в иммуноанализе на HGF человека, закупили в компании R&D (R&D Systems, Inc., MSP, США).
3-3. Эффект pCK-HGFX7 человека на клеточный рост в клетках NSC-34
4
Для подтверждения эффекта pCK-HGFX7 на рост двигательных нервных клеток клетки NSC-34 обработали pCK-HGFX7 и затем оценили уровень пролиферации клеток. Клетки культивировали в культуральной среде с добавлением 10% фетальной сыворотки коров, а затем перед использованием для анализов культуру суспензировали с использованием среды Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Sigma), с добавлением 1% фетальной сыворотки коров. Клетки засеяли в 6-луночный планшет так, что в 2 мл среды, содержавшей 1% сыворотки, находилось 3×10 клеток. Через 2 часа после посева соответствующие супернатанты, полученные от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, добавили в 6-луночный планшет в количестве, равном 100 мкл/ячейку, так что концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток 293Т вектором рСК, был использован в качестве контроля. После культивирования в течение 48 часов среду в 6-луночном планшете заменили. После добавления в каждую лунку 2 мл среды, содержавшей 1% фетальной сыворотки коров, в каждую лунку добавили супернатанты, полученные от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так что концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл, после чего культивировали в течение 48 часов. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток 293Т вектором рСК, был использован в качестве контроля. Культивированные клетки собрали и подсчитали. Вектор рСК использовали в качестве контроля.
В результате культивирования в течение 5 дней после засева клеток, когда группы, обработанные соответствующими супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, сравнили с группой, обработанной рСК, пролиферация клеток была индуцирована примерно на 20% в группах, обработанных pCK-HGF728 или pCK-HGF723, а рост клеток увеличился примерно на 48% в группе, обработанной pCK-HGFX7. Благодаря этим результатам удалось подтвердить, что pCK-HGFX7 может значимо увеличивать клеточный рост двигательных нервных клеток по сравнению с pCK-HGF728 или pCK-HGF723.
3-4. Эффект pCK-HGFX7 на апоптоз в клетках NSC-34
4
Клетки NSC-34 суспензировали в количестве, равном 3×10, в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% фетальной сыворотки коров и затем засеяли в 6-луночный планшет. После посева клетки стабилизировали в течение 2 часов, после чего добавили супернатанты, полученные от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так, чтобы концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток 293Т вектором рСК, был использован в качестве контроля. Клетки культивировали в течение 5 дней, причем среду и каждый из супернатантов заменяли с интервалами, равными от 2 до 3 дней.
РНК экстрагировали из клеток, которые культивировали в течение 5 дней, с использованием реагента Тризол (Life Technologies, США), и экстрагированную РНК использовали для синтеза кДНК с использованием набора First Strand cDNA (Roche, США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени провели с использованием синтезированной кДНК в качестве матрицы и полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 для гена Вах или полинуклеотидов SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 для гена Bcl-12 в качестве праймеров. ПЦР в реальном времени провели посредством смешивания 1 мкл матрицы кДНК, 1 мкл 10 пмоль/мкл каждого из праймеров, 12,5 мкл маточной смеси для ПЦР SYBR green (Life Technologies, США) и 9,5 мкл стерилизованной трижды дистиллированной воды с получением в общей сложности 25 мкл жидкой смеси, после чего провели реакцию в течение 2 мин при 50°C и в течение 10 мин при 95°C, а затем выполнили 40 циклов по 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C. Для коррекции каждого значения, полученного в реакции, ПЦР в реальном времени выполнили с использованием в качестве праймеров нуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 для GAPDH как конститутивного гена. Как показали результаты, экспрессия гена Вах, связанного с апоптозом, снижалась в каждой из групп, обработанной супернатантом с HGF, в большей мере, чем в группе, обработанной рСК, и, в частности, экспрессия Bcl-2, связанного с антиапоптозом, была в 1,3 раза выше в группе, обработанной pCK-HGFX7, чем в группе, обработанной рСК (см. Фиг. 4а). Благодаря этому тесту было подтверждено, что в среде, содержавшей 1% фетальной сыворотки коров, pCK-HGFX7 ингибировал апоптоз примерно на 40%, по сравнению с группой, обработанной рСК, которую использовали в качестве контроля (см. Фиг. 4b).
Пример 4
Подтверждение эффекта PCK-HGFX7 на переживание клеток NSC-34 в культуре в условиях оксидативного стресса
4-1. Выбор концентрации раствора пероксида водорода, вызывающей апоптоз клеток NSC-34 за счет оксидативного стресса
Перед проверкой эффекта pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34, вызванный раствором пероксида водорода, были выбраны концентрация клеток для посева, подходящая для оценки апоптоза клеток NSC-34, и концентрация раствора пероксида водорода, вызывающая апоптоз.
4
Клетки, культивировавшиеся в культуральной среде с добавлением фетальной сыворотки коров, собрали и затем суспензировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% плодной сыворотки коров, после чего подсчитали клетки. Подсчитанные клетки засеяли в 96-луночный планшет в концентрации 1×10 и на следующий день обработали растворами пероксида водорода, равными 10, 20, 30, 50 и 10 мкМ. В лунку, не обработанную раствором пероксида водорода, добавили фосфатный буферный раствор, и эту лунку использовали в качестве контроля. Через 24 часа измерили уровень апоптоза с использованием способа количественного анализа клеток с применением реагента ХТТ (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолиум-5-карбоксанилида) (Roche, США). Было обнаружено, что в исследованных группах, обработанных растворами пероксида водорода с различными концентрациями, был индуцирован апоптоз, превысивший контрольный уровень на 0%, 10%, 30%, 70% и 85%. На основании этих результатов была выбрана подходящая для индуцирования апоптоза клеток NSC-34 концентрация раствора пероксида водорода, равная 30 мкМ.
5
5
6
5
6
5
Кроме того, для проведения анализа на апоптоз в 6-луночном планшете клетки засеяли в 6-луночный планшет так, что в 2 мл среды, содержавшей 1% фетальной сыворотки коров, содержалось 1,5×10, 3×10 и 1×10 клеток. На следующий день клетки NSC-34 обработали раствором пероксида водорода с концентрацией, равной 30 мкМ, и подсчитали число клеток в дни 1, 4 и 7. В результате определения числа клеток в день 7 оказалось, что все клетки в лунке, куда было засеяно 1,5×10 клеток, погибли, и поэтому эту лунку нельзя было выбрать для анализа, а в лунке, куда было засеяно 1×10 клеток, не был индуцирован апоптоз. Исходя из этих результатов анализа, для испытаний на индукцию апоптоза были выбраны число клеток и концентрация раствора пероксида водорода, равные 3×10 и 30 мкМ соответственно.
4-2. Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на переживание клеток NSC-34 в культуре, находящейся в условиях оксидативного стресса
5
Клетки NSC-34 культивировали в культуральной среде с добавлением 10% фетальной сыворотки коров, и для использования в испытании на ингибирование апоптоза культуру суспензировали с использованием среды Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% фетальной сыворотки коров. Клетки засеяли в 6-луночный планшет так, что в 2 мл среды, содержавшей 1% сыворотки, содержалось 3×10 клеток. На следующий день соответствующие лунки обработали раствором пероксида водорода с концентрацией, равной 30 мкМ, выбранной из предварительного испытания, и затем обработали соответствующими супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так, чтобы концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Культуральную среду, полученную при трансфицировании клеток вектором рСК, использовали в качестве контроля. После культивирования клеток в течение 7 дней определили уровень апоптоза. Через 7 дней после посева клеток клетки собрали и подсчитали. В результате подсчета клеток было установлено, что лишь примерно от 60 до 70% клеток от первоначально засеянного количества выжило в исследованных группах, обработанных рСК, pCK-HGF728 и pCK-HGF723, тогда как клетки NSC-34, обработанные pCK-HGFX7, продемонстрировали примерно 92%-ное выживание, что свидетельствует о превосходном ингибировании апоптоза, по сравнению с группами, обработанными другими испытанными материалами. Эти результаты подтвердили, что белок HGFX7 эффективно ингибировал апоптоз двигательных нейронов, индуцированный оксидативным стрессом, вызванным раствором пероксида водорода (см. Фиг. 2).
4-3. Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 в культурах, находящихся в условиях оксидативного стресса
5
Клетки NSC-34 суспензировали в количестве, равном 3×10, в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% фетальной сыворотки коров и затем засеяли в 6-луночный планшет. На следующий день соответствующие лунки обработали раствором пероксида водорода с концентрацией, равной 30 мкМ, после чего обработали соответствующими супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так, чтобы концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл, и затем культивировали в течение 7 дней. Супернатант, полученный от клеток, трансфицированных вектором рСК, использовали в качестве контроля.
РНК экстрагировали из клеток, которые культивировали в течение 7 дней, с использованием реагента Trizol и использовали экстрагированную РНК для синтеза кДНК с использованием набора First Strand cDNA. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) провели с использованием синтезированной кДНК в качестве матрицы и полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 для гена Вах или полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 для гена Bcl в качестве праймеров. ПЦР в реальном времени провели посредством смешивания 1 мкл матрицы кДНК, 1 мкл 10 пмоль/мкл каждого из праймеров, 12,5 мкл маточной смеси для ПЦР SYBR green (Life Technologies, США) и 9,5 мкл стерилизованной трижды дистиллированной воды с получением в общей сложности 25 мкл жидкой смеси, после чего провели реакцию в течение 2 мин при 50°C и в течение 10 мин при 95°C, а затем выполнили 40 циклов по 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C. Для коррекции каждого значения, полученного в реакции, ПЦР в реальном времени выполнили с использованием в качестве праймеров полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 для GAPDH как конститутивного гена. Результаты испытания подтвердили, что экспрессия гена Вах, связанного с апоптозом, снижалась, а экспрессия гена Bcl-2, связанного с антиапоптозом, увеличивалась в каждой из групп, обработанной супернатантом с HGF, в большей мере, чем в группе, обработанной рСК. В частности, экспрессия гена Вах снизилась примерно на 70% (см. Фиг. 6а), а отношение Bax/Bcl-2 снизилось примерно на 75%, что свидетельствует о превосходном антиапоптотическом эффекте (см. Фиг. 6b) в группе, обработанной pCK-HGFX7, по сравнению с группой, обработанной рСК.
Пример 5
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток, в которые была доставлена hSOD1 с мутацией G93A
Анализ in vitro с использованием мутантной формы G93A супероксиддисмутазы 1 (SOD1; от англ.: superoxide dismutase 1), которая является одной из причин БАС, был разработан многими исследователями. В частности, сообщалось, что доставка мутантной G93A формы HSOD1 в клетки NSC-34, которые широко используют в исследованиях двигательных нейронов, может вызвать апоптоз (Cheema et al., 2005). Поэтому в данном испытании pCK-hSOD1 дикого типа и pCK-hSOD1-G93A были получены посредством инсерции человеческого гена SOD1 дикого типа (WT; от англ.: wild type) (NM_000454) и человеческого гена SOD1, в которой 93-й остаток аминокислоты был изменен с глицина на аланин, в сайт BamHI вектора рСК, соответственно. Описанное ниже испытание было проведено с целью исследования эффекта pCK-HGFX7 на клетки NSC-34, в которые hSOD1-G93A была доставлена с использованием полученной плазмиды.
4
Клетки NSC-34 засеяли в 96-луночный планшет так, что клетки были суспензированы в количестве, равном 1×10, в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 10% плодной сыворотки коров. На следующий день клетки трансфицировали рСК, pCK-hSOD1-WT (дикого типа) и pCK-hSOD1-G93A (мутантная форма, G93A) с использованием реагента липофектамина LTX (Life Technologies, США). Сразу же после трансфекции клетки, трансфицированные G93A, обработали супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728 и pCK-HGFX7, так, что концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток вектором рСК, использовали в качестве контроля.
После культивирования в течение 3 дней оценили клеточный рост посредством обработки реагентом ХТТ. Результаты показали, что клетки, в которые была доставлена hSOD1 дикого типа, и клетки, в которые был доставлен вектор рСК, продемонстрировали одинаковый клеточный рост. Однако клетки, в которые была доставлена мутантная G93A форма hSOD1, показали клеточный рост, составивший примерно 85% от роста клеток с доставленным вектором рСК, что свидетельствует о нарушении клеточного роста по сравнению с клетками, куда была доставлена hSOD1 дикого типа. Однако группа, обработанная pCK-HGFX7, показала клеточный рост, составивший примерно 92,9%, что свидетельствует об эффекте ингибирования нарушения клеточного роста, вызванного доставкой мутантной G93A формы hSOD1 (см. Фиг. 7).
[Последовательности генов]
SEQ ID NO: 11: GGC AGA CAG TGA CCA TCT TT
SEQ ID NO: 12: AGT GGA CCT GAG GTT TAT TG
SEQ ID NO: 13: CCA TCA АТС AAA GCC AAG CA
SEQ ID NO: 14: AGС CTT CAC GCA AGT TCA GG
SEQ ID NO: 15: CCA TCA CTG CCA CTC AGA AGA С
SEQ ID NO: 16: TCA TAC TTG GCA GGT TTC TCC
Пример 6
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на силу захвата лапы трансгенных мышей с мутантной человеческой SOD1-G93A (далее - БАС-мышей)
Поскольку обнаружено, что мутация супероксиддисмутазы 1 (SOD1) является одной из причин БАС, то разработана модель БАС на мышах с использованием этого гена, и к настоящему времени исследователи БАС во всем мире провели разнообразные исследования с использованием этой модели на животных. Из этих моделей была выбрана широко использовавшаяся модель B65JL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J (002726) и использована для испытаний. Получение модели БАС на мышах было заказано в компании Woo Jung BSC (Корея), и модель на мышах была использована для данного испытания, после того как было проверено, экспрессируется ли ген SOD1 мутантного типа, посредством генотипирования.
Мышей с БАС в возрасте 10 недель разделили на группы по 4 мыши, которым ввели Tg-pCK, Tg-pCK-HGF728 (pCK-cHGF в публикации PCT/KR03/00548) и Tg-pCK-HGFX7. Шесть мышей без трансгена выбрали и использовали в качестве отрицательного контроля (далее - non-Tg). Через две недели мышам из трех испытательных групп, кроме отрицательного контроля, ввели соответствующую плазмиду посредством внутримышечной инъекции. При этом 50 мкл соответствующей плазмиды ввели в концентрации 2 мкг/мл в трехглавую мышцу передней лапы, большеберцовую мышцу, прямую мышцу бедра и икроножную мышцу слева и справа соответственно. После двухнедельного введения (в возрасте 14 недель) силу захвата лап каждой мыши исследовали в поведенческом испытании. Для поведенческого испытания выполнили тест с силой захвата сетки. Испытание с силой захвата сетки было использовано для оценки силы захвата, при этом мышь помещали на проволочную сетку, которая содержала устройства, которые через предварительно заданные интервалы переворачивали проволочную сетку, после чего измеряли время, в течение которого мышь удерживалась на проволочной сетке. Это один из репрезентативных способов оценки мышечной силы мыши (Crawley J.N., 2008).
В результате теста было обнаружено, что non-Tg мыши в среднем удерживались на сетке в течение примерно 9 минут, однако среди Tg-мышей мыши, которые получали рСК, удерживались на сетке в среднем примерно через 30 с. Мыши, получившие плазмиду pCK-HGF728, продемонстрировали немного большее среднее время по сравнению с мышами, получавшими только рСК, и это время в среднем было равно 49 с. При этом мыши, получившие pCK-HGFX7, удерживались на сетке в течение более длительного времени по сравнению с мышами, получавшими рСК или pCK-HGF728, и среднее время было равно 3 минутам (см. Фиг. 8). Это показывает, что pCK-HGFX7 значимо улучшает функцию мышц, включая силу захвата у мышей с БАС по сравнению с рСК или pCK-HGF728.
Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные признаки, специалистам в данной области техники будет очевидно, что это описание относится только к предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Соответственно существенный объем настоящего изобретения определен формулой изобретения и ее эквивалентами.