Развитие пространственно-временной структуры нейронной сети гиппокампа in vitro

Физиология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 243-248

УДК 576.5

РАЗВИТИЕ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ СТРУКТУРЫ НЕЙРОННОЙ СЕТИ ГИППОКАМПА IN VITRO

© 2011 г. А.А. Гладков \ М.В. Ведунова 1,2, С.А. Коротченко 1,2, Ю.Н. Захаров \

А.Н. Балашова 1, И.В. Мухина 2

1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

2 Нижегородская государственная медицинская академия

arseniy.gladkov@yahoo. com

Поступила в редакцию 13.04.2011

Изучено развитие пространственно-временной структуры нейрон-глиальной сети диссоциированной культуры гиппокампа мышей in vitro. С использованием световой микроскопии и иммуноцитохи-мических методов маркирования нейронов и глии показаны динамика развития пространственновременной архитектуры сетей и изменения размеров тел клеток в диссоциированной культуре гиппокампа.

Ключевые слова: нейрон, диссоциированная культура, гиппокамп, динамика, пространственно -временная структура.

Введение

Культивирование нервных клеток дает широкие возможности для исследований в области физиологии, биохимии, разработки математических моделей функционирования мозга. Нервные клетки в диссоциированной культуре активно взаимодействуют друг с другом и на определённом этапе развития формируют структурную нейронную сеть. Архитектура нейрон-глиальной сети динамична вследствие перемещений тел клеток в пространстве, а также вследствие процессов формирования и разрыва связей между клетками. Данное свойство нейросетевой архитектуры необходимо учитывать в исследованиях с биологическими нейронными сетями. В связи с этим, целью настоящего исследования было изучение развития пространственно-временной структуры нейронной сети гиппокампа in vitro.

Экспериментальная часть

В исследовании использованы культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов белых беспородных мышей. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0.25% трипсином (Invitrogen 25200-056).

Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде Neurobasal™ (Invitrogen 21103-049) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen 17504-044), глутамином (Invitrogen 25030-024), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко К055) и культивировали на муль-тиэлектродных матрицах и стеклах, предварительно обработанных полиэтиленимином (Sigma P 3143). Исходная плотность клеточной культуры составила 9000 клеток/мм2. Поддержание жизнеспособности культуры осуществлялось в условиях СО2-инкубатора при температуре 35.5оС и газовой смеси, содержащей 5% СО2. Для регистрации спонтанной биоэлектрической активности использовали мультиэлек-тродную систему MED64 (Alpha MED Sciences, Japan). Микрофотографии культуры диссоциированных клеток гиппокампа получали с помощью инвертированного микроскопа Leica DMIL HC через каждые 2-3 часа в течение первых пяти суток развития культуры in vitro (DIV), с 6 по 11 день развития культуры in vitro - через 610 часов и далее 1 раз в сутки до 37 дня.

Для изучения архетиктуры клеточной культуры на 37-ой день развития in vitro проводили иммуноцитохимическое маркирование глиального фибриллярного кислого белка (GFAP -chicken antibody Abcam ab 4674) и ядерного маркера зрелых нейронов (NeuN - mouse antibody Invitrogen). Для визуализации полученных результатов использовали вторичные антитела с флуоресцентной меткой. Антимышиные антитела, меченые флуоресцентным красителем

Alexa-fluo 430 - для визуализации белка NeuN (Alexa-fluo 430 anti mouse Invitrogen A 11Q63) и антикуриные антитела, меченые флуоресцентным красителем Су-5 - для визуализации белка GFAP (Су-5 anti cnk Millipor AP194S). Результаты оценивались с использованием конфокального лазерного микроскопа Zeiss LSM 510.

Данные анализировали в программах ImegeJ и Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

В первые часы после культивирования клетки были округлой формы, диаметром 7.74± ±0.17 мкм, не имели отростков (рис. 1, 2).

В течение 1 DIV увеличивалась только длина тел клеток (коэффициент корреляции Пирсона (г) между средними значениями длины и ширины был равен нулю). Далее вплоть до 15

Размер клеток, мкм

длина

ширина

00 02 04 06 08 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 ВО 32 34 36

DIV

Рис. 1. Динамика размеров тел клеток диссоциированной культуры гиппокампа эмбрионов мышей (Е18) в зависимости от дня развития in vitro

Рис. 2. Микрофотографии культуры диссоциированных клеток гиппокампа на разных сроках развития in vitro. Размер ячейки - 200x200 мкм

20 мкм

Рис. 3. Иммуноцитохимический анализ культуры диссоциированных клеток гиппокампа, 37 DIV. Зелёным цветом маркированы ядра нейронов

Рис. 4. Треки перемещающихся гиппокампальных клеток в первые шесть суток развития in vitro на произвольно выбранном участке. Границы выбранной области отмечены красным цветом на рис. 2. Цифрами I и VI обозначены места положения тела клетки в 1 и 6 сутки культивирования

DIV рост тел клеток происходил постепенно как 12.37±0.36 мкм. Начиная с 27 DIV происходит в длину, так и в ширину

уменьшились и составили 14.16±0.58 мкм (длина) и 11.95±0.46 мкм (ширина). После 30 DIV размеры клеток остаются постоянными.

Через 10 часов после начала культивирования у единичных клеток появлялись отростки, а через 2 DIV формировалась структурная сеть. На 3 DIV (65-70 часов) клетки образовывали кластеры, что соответствовало времени появления спонтанной спайковой активности нейронной сети. В течение 4-5 суток эти кластеры уплотнялись, сливались в более крупные (рис. 2). На 6 сутки (150 часов) культивирования наблюдалось разрастание и миграция глиальных клеток из кластеров. В результате кластеры становились реже или полностью распадались. Начиная с 12 DIV морфологическая структура сети гиппокампальных клеток оставалась стабильной вплоть до последнего срока наблюдения - 37 суток.

Иммуноцитохимические исследования на 37 DIV показали, что глиальные клетки в культуре располагались плотно и образовывали монослой (рис. 3). Общая толщина культуры составила 55 мкм. Явно выраженных скоплений тел клеток, как на 4-5 DIV, в глиальной сети не наблюдалось. Напротив, клетки располагались сравнительно равномерно в плоскости культуры.

Такую глиальную сеть можно было обнаружить при использовании фазово-контрастной микроскопии. Клетки глии выглядели как плоские звёздчатой формы клетки, расположенные среди густо переплетённых отростков нервных клеток. Во время миграции глиальных клеток из

кластеров сеть клеточных отростков была менее развита.

Миграция клеток в культуре осуществлялась посредством двух различных механизмов: 1) тело клетки мигрирует вдоль собственного отростка и 2) клетка перемещается вместе с глиальной клеткой, которая несет нейрон на себе как на подложке. Это наблюдение подтверждается литературными данными [1-5].

Клетки в культуре перемещались в различных направлениях. Каждая отдельная клетка была способна менять направление своего движения, отклоняясь от первоначального на углы различного размера, вплоть до 180о. Таким образом, траектория, пройденная телом клетки, представляла собой искривленную линию (рис. 4). Причем одновременно на небольшом участке развивающейся культуры клеток гиппокампа можно было отметить как активно перемещающиеся клетки, так и почти не изменяющие своего местоположения.

Динамика пространственно-временных изменений оценивалась измерением среднего смещения тел клеток в течение суток. Максимум смещения выявлен на 4-й день развития in vitro - 45.57±5.19 мкм (рис. 5).

Скоростные процессы оценивали, определяя смещения тел клеток за соответствующие промежутки времени. Максимумы активности наблюдались в течение первых 10 часов и через 90-100 часов (4 DIV) после культивирования. В процессе развития нейронной сети скорость перемещения тел клеток постепенно снижалась

Перемещение тела клетки, мкм

Рис. 5. Динамика смещения тел клеток первичной культуры гиппокампа в течение суток в зависимости от дня культивирования in vitro

Скорость перемещения тел клеток, мкм/ч

4.5 4

3.5

3

2.5 2

1.5

1

0.5

о

flHlHlnlaaai.il

4 10 18 26 39 46 52 58 66 73 80 88 95 101110118133 147168 186 212 238 263 332 405 481551

Время, ч

Рис. 6. Зависимость средней скорости перемещения тел клеток гиппокампа от времени культивирования in vitro

(рис. 6). Образование устойчивой структуры клеточных сетей диссоциированной культуры гиппокампа совпадает с появлением спонтанной электрофизиологической активности и может свидетельствовать о формировании функциональной структуры нейрон-глиальной сети.

Выявленная динамическая активность нейронной сети зависела, во-первых, от стадии онтогенетического развития глиальных клеток и нейронов in vitro; во-вторых, вероятно, от образования и накопления внеклеточного матрикса [6, 7], содержащего высокомолекулярные органические молекулы, которые затрудняли передвижение клеток.

Заключение

1. Клетки диссоциированной культуры гиппокампа начинали формировать структурную сеть на второй день развития in vitro.

2. В культуре клеток гиппокампа происходили агрегация и образование кластеров клеток, к 6 дню in vitro эти кластеры начинали распадаться в результате разрастания и миграции глиальных клеток.

3. Максимальное смещение тел клеток наблюдалось на 4-й день in vitro и составило 45.57±5.19 мкм. Далее в процессе культивирования смещение тел клеток уменьшалось до 1.54±0.31 мкм (36 DIV).

4. Максимальные скорости перемещения тел клеток наблюдались в первые 10 часов и через 100 часов (4 DIV) после культивирования и составляли 3.05±0.18 и 3.39±0.75 мкм/ч соответственно. Далее в процессе развития нейрон-глиальной сети скорость перемещения тел кле-

ток снижалась и к 6 DIV составила 0.76± ±0.14 мкм/ч, а после 18 DIV оставалась постоянной около 0.1 мкм/ч.

5. В первые часы после культивирования клетки были округлой формы, диаметром 7.74±0.17 мкм. К 15 DIV размеры тел нервных клеток составляли: длина - 15.79±0.60 мкм, ширина - 12.37±0.36 мкм.

Список литературы

1. Distasi C., Ariano P., Zamburlin P., Ferraro M. In vitro analysis of neuron-glial cell interactions during cellular migration // Eur. Biophys J. 2002. V. 31. P. 81-88.

2. Edmaondson J.C., Hatten M.E. Glial-Guided Granule Neuron Migration in vitro: A High-Resolution. Time-Lapse Video Microscopic Study // The Journal of Neuroscience. 1987. V. 7. № 8. P. 192-l94.

3. Nichols A.S., Carney L. H., Olson E.C. Comparison of slow and fast neocortical neuron migration using a new in vitro model // Bio. Med. Central Neuroscience. 2008. V. 5. P. 9-50.

4. Schoar B.T., McConnell S.K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration // Neuroscience. 2005. V. 102. № 38. P. 13652-13657.

5. Wichterle H., Garcia-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Direct evidence for homotypic, glia-independent neuronal migration // Neuron. 1997. V. 18. № 5. P. 779-791.

6. Wang H., Katagiri Y., McCann T.E. et al. Chon-droitin-4-sulfation negatively regulates axonal guidance and growth // J. Cell Science. 2008. № 3. P. 3083-3093.

7. Wen-Li Gu, Sai-Li Fu, Yan-Xia Wang, Ying Li et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate the growth, differentiation and migration of multipotent neural precursor cells through the integrin signaling pathway // Bio. Med. Central Neuroscience. 2009. V. 7. P. 10-128.

DEVELOPMENT OF SPATIOTEMPORAL STRUCTURE OF HIPPOCAMPAL NEURAL NETWORK IN VITRO

A.A. Gladkov, M. V. Vedunova, S.A. Korotchenko, Yu.N. Zakharov, A.N. Balashova,

I.V. Mukhina

The development has been studied of spatiotemporal structure of neuron-glial network in dissociated rat hippocampal culture in vitro. The dynamics of spatiotemporal network architecture and cell resizing in the dissociated hippocampal culture have been displayed using light microscopy and immunocytochemical methods for labeling of neurons and glia.

Keywords: neuron, dissociated culture, hippocampus, dynamics, spatiotemporal structure.