СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СКЛЕРОДЕРМИИ
METHOD OF TREATING SCLERODERMA

В данной заявке испрашивается более ранний приоритет, основанный на предварительных заявках США сер. номер 60/996175 и 61/100545, каждая из которых включена в описание в полном объеме в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
В настоящем изобретении предлагаются способы лечения склеродермии и уменьшения интенсивности ассоциированных с ней симптомов.
Предпосылки создания изобретения
Склеродермия, или системный склероз (ССК), является прогрессирующим изнуряющим аутоиммунным нарушением, которое характеризуется избыточным отложением белка фибробластами кожи в межклеточном матриксе, называемым также дермальный фиброз. В организме пациентов с обширным кожным заболеванием часто присутствуют уникальные маркеры, такие как регуляция с повышением в коже генов, индуцированных интерфероном типа I (ИФН), а также присутствие в сыворотке антиядерных аутоантител, специфичных в отношении топоизомеразы I. В пользу предположения о том, что ИФН играет роль в развитии кожного фиброза, свидетельствуют последние сообщения о том, что склеродермия возникает у пациентов, которые прошли курс лечения ИФН от хронической вирусной инфекции. Материалы по системной склеродермии приводятся в обзоре Varga и Abraham, J. Clin. Invest., 117, 557-567 (2007).
ИФН типа I, α, β, θ, κ и ω представляют собой цитокины, экспрессированные 13 функциональными генами ИФНα, одним геном ИФНβ, одним геном ИФНθ, одним геном ИФНκ и одним геном ИФНω (Theofilopoulos A.M., Baccala R., Beutler В., Kono D.H.. Type I Interferons (α/β) in immunity and autoimmunity. Immunol. Rev., 204 (апрель), 9-26 (2005)). Известно по меньшей мере 28 подтипов ИФНα, таких, например, как, но не ограничиваясь только ими, α1, α2a, α2b, α4, α5, α6, α7, α8, α10, α16, α17 и α21. В некоторых случаях ссылка на интерферон подтипа α2 включает α2a и α2b.
Все интерфероны человека типа I связываются с рецептором клеточной поверхности (рецептором ИФНα, ИФНαР), состоящим из двух трансмембранных белков, ИФНαР1 и ИФНαР2 (Uze и др., Cell, 60, 225 (1990), Novick и др., Cell, 77, 391 (1994)). Связывание с указанным рецептором приводит к активации внутриклеточных путей передачи сигнала (Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R., Silverman R.H., Schreiber R.D., Annu. Rev. Biochem., 67, 227-264 (1998)), инициируемых благодаря активации киназ Jak, Jaki и Tyk2. Указанные киназы последовательно фосфорилируют переносчика сигнала и белки-активаторы транскрипции (STAT), STAT1 и 2. Фосфорилированные белки STAT образуют комплекс фактора транскрипции, ИФН-стимулированный фактор 3 (ISGF3), который вместе с белком р48 транслоцируется в ядро. Указанные комплексы активируют ИФН-стимулированный респонсивный элемент (ИСРЭ), который индуцирует экспрессию ИФН-индуцибельных генов.
Наряду со специфическими противовирусными функциями ИФН типа I играют решающую роль в регуляции иммунной системы (Theofilopoulos A.N., Baccala R., Beutler В., Kono D.H.. Type I Interferons (a/p) in immunity and autoimmunity, Immunol. Rev., 204 (апрель), 9-26 (2005) и Belardelli F., Gresser I., The neglected role of type I Interferon in the T-cell response: implications for its clinical use, Immunol. Today, 17? 369-372 (1996)). Интерфероны типа I продуцируются различными типами клеток, включающих моноциты, макрофаги, дендритными клетками и лимфоцитами, а также другими гематологическими клетками в ответ на действие противовоспалительных цитокинов, а также компонентов различных патогенов. Указанные клетки также реагируют на ИФН типа I и усиливают экспрессию иммунологически важных соединений, таких как компоненты ГСТС класса I, CD38, интерлейкины (BLyS, IL-6, IL-10 и IL-15) и хемокины (IL-8, МСР-1, МСР-2, MIG, MIP1a, MIP1b и IP10). Кроме того, ИФН типа I индуцируют многие биологические функции ключевых компонентов иммунной системы, включающих дендритные клетки Т и В клетки и природные клетки-киллеры (ПК). Например, ИФН типа I стимулируют созревание дендритных клеток, пролиферацию CD8+Т клеток памяти, подавление апоптоза CD4+ Т клеток, активацию клеток ПК и дифференцировку В клеток (Banchereau J., Pascual V., Palucka А.К., Autoimmunity through Cytokine-induced dendritic cell activiation. Immunity, 20 (май), 539-550, (2004) и Taki S., Cytokine and Growth Factor Reviews, 13, 379-391 (2002) и Mailliard R.B„ Son Y.I., Redlinger R., Coates P.T., Giermasz A., Morel P.A., Storkus W.J., Kalinski P., J. Immunol., Sep 1, 171(5), 2366-2373 (2003).
В то время как почти все клетки могут продуцировать ИФН типа I в ответ на стимуляцию компонентами вирусов или бактерий, плазмацитоидные дендритные клетки (ПДК) или "природные ИФН-продуцирующие клетки" продуцируют ИФН типа I в 1000 раз эффективнее, чем другие типы клеток. Продуцирование ИФН типа I можно индуцировать за счет стимуляции эндосомальных Toll-Like рецепторов (TLR), таких как TLR7 и TLR9, моноцепочечной РНК (мцРНК), гипометилированных CpGs в бактериальной ДНК или иммунных комплексов аутоантиген/антитело.
Существует необходимость в более подробном изучении роли интерферонов типа I в патогенезе склеродермии для разработки новых способов лечения указанного заболевания и его клинических проявлений.
Подразумевается, что цитирование или обсуждение публикаций, упомянутых в качестве ссылок, не означает, что они являются известным уровнем техники для настоящего изобретения.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предлагаются композиции и способы лечения склеродермии и симптомов, ассоциированных со склеродермией, благодаря введению пациенту, который нуждается в лечении, терапевтически эффективного количества антагониста типа ИФН типа I. В настоящем изобретении также предлагаются способы ингибирования экспрессии гена, индуцибельного ИФН типа I, ассоциированного со склеродермией.
Краткое описание фигур
Некоторые варианты осуществления изобретения иллюстрируются следующими фигурами, не ограничивающими его объем.
На фиг.1 представлена схема развития модели системного склероза (ССК) у мышей, т.е. индукции заболевания, где RAG2-/-мышам вводили общий пул спленоцитов, по гистосовместимости (miHag), а симптомы ССК, такие как отложение дермального коллагена и аутоантитела, развивались в течение определенного времени.
На фиг.2А и Б представлены графики развития клинических признаков склеродермии в течение определенного времени у мышей в отсутствие заболевания (контроль) и у мышей с индукцией заболевания в присутствии антител против рецептора α-интерферона (ССК+αИФНАР) или у мышей с индукцией заболевания в присутствии изотипа Ig в качестве контрольного антитела (ССК+изотип Ig, фиг.2А) или (ССК+изотип Ig, фиг.2Б). На оси Y приводится оценка состояния кожи (фиг.2А) и протеинурии (фиг.2В). На фиг.2 В представлена фотография ткани мыши после индукции заболевания в присутствии антител против рецептора α-интерферона (ССК+αИФНАР, верхняя панель) или в присутствии изотипа Ig в качестве контрольного антитела (Ig контроль, верхняя панель).
На фиг.3А представлены в виде столбиков результаты гистопатологического анализа ССК кожи у RАG2-/-мышей в отсутствие заболевания (контроль), у мышей с заболеванием в присутствии антител против рецептора α-интерферона (ССК+αИФНАР) или у мышей с заболеванием в присутствии изотипа Ig в качестве контрольного антитела (ССК+изотип Ig). На оси Y приводятся суммарные оценки степени воспалительного процесса (0=норма, 1=слабый клеточный инфильтрат, 2=умеренный инфильтрат, 3=первазивный кожный инфильтрат) и отложения коллагена (0=норма, 1=слабое, 2=умеренное, 3=тяжелое). На фиг.3Б приводятся результаты иммуногистохимического анализа при стандартном окрашивании Н&Е (гематоксилином и эозином, левая панель) и трихромом по Мэссону (правая панель) образцов кожи мышей в отсутствие индукции заболевания (контроль), мышей с заболеванием в присутствии антител против рецептора α-интерферона (ССК+αИФНАР) или мышей с заболеванием в присутствии изотипа Ig в качестве контрольного антитела (ССК+изотип Ig).
На фиг.4А-4Е приводятся результаты иммуногистохимического анализа срезов кожи, окрашенных козьими анти-мышиными антителами Ig/ФИТЦ (зеленый цвет) или поликлональными крысиными анти-мышиными антителами C1q/PE (красный цвет) и помещенных в DAPI (синий цвет). Срезы кожи получали от сингенных привитых контрольных мышей (фиг.4А и 4Г), мышей с индукцией ССК в присутствии изотипа Ig в качестве контроля (фиг.4Б и 4Д), и мышей с индукцией ССК в присутствии антител против рецептора αИФН (фиг.4В и 4Е).
На фиг.5А приводятся в виде столбиков графики, отражающие уровень в сыворотке аутоантител анти-Scl-70 и анти-SSA (IgG, IgA, IgM) по результатам ИФА сыворотки мышей в отсутствие заболевания (контроль), мышей с индукцией заболевания в присутствии антител против рецептора α-интерферона (ССК+αИФНАР) или мышей с заболеванием в присутствии изотипа Ig в качестве контрольного антитела (ССК+изотип Ig). На фиг.5Б приводятся три графика, отражающие количество анти-Scl-70 IgG1 (верхняя панель), анти-Scl-70 IgG2 (средняя панель) и анти-SSA IgG1 (нижняя панель) в сыворотке мышей в отсутствие заболевания (отсутствие ТПХ), мышей с заболеванием в присутствии антител против рецептора α-интерферона (10 mpk 5A3) или мышей с заболеванием в присутствии изотипа Ig в качестве контрольного антитела ((10 mpk 1A7). На фиг.5В приводятся результаты иммуногистохимического анализа срезов селезенки сингенных привитых контрольных мышей (панели а и г), мышей с индукцией ССК в присутствии изотипа Ig в качестве контроля (панели б и д) и мышей с индукцией ССК в присутствии антител против рецептора αИФН (панели в и е), окрашенных красителем CD45R/B220 (коричневый цвет) и агглютинином из арахиса (красный цвет) с целью идентификации герминальных центров (ГЦ).
На фиг.6А приводятся в виде столбиков графики, отражающие результаты количественного анализа методом проточной цитометрии с использованием клеточного сортера (ПЦКС) плазмацитоидных дендритных клеток селезенки (ПДК, B220+/Gr-1lo/CD11b+/CD11c) у реципиентов, которым вводили общий пул спленоцитов, через 2 недели после прививки (ССК) или у непривитых RAG2-/- контрольных мышей (контроль). На фиг.6Б приводятся графики оценки состояния кожи (слева) и протеинурии (справа) у RAG2-/-мышей, которым прививали общий пул спленоцитов (miHag) или Gr-1 - дефицитный (т.е. ПДЕ-дефициитный) общий пул спленоцитов (miHag), т.е. Gr-1(-)-спленоцитов.
На фиг.7 представлена визуализированная карта, представляющая собой результаты анализа полного геномного микрочипа (ПГМ) генов, которые репрессированы (подавлены) или индуцированы в клетках кожи мышей в отсутствие индукции ССК (контроль), мышей с индукцией заболевания в присутствии изотипа Ig (Ig контроль) и мышей с индукцией ССК в присутствии антител против рецептора α-интерферона (αИФНАР). Клиническая оценка состояния кожи в каждом проанализированном методом ПГМ образце, которую проводили, как показано на фиг.3А, приводится под колонками.
На фиг.8А-8Г приводятся результаты серии экспериментов, направленных на анализ экспрессии в режиме реального времени ИФН типа I в коже ТПХ/ССК-мышей. На фиг.8А показаны результаты анализа методом кПЦР индукции мРНК ИФНα2, α5, α9 и β. На фиг.8Б и 8В показаны результаты анализа методом кПЦР ИФНγ и ИФНλ-2, соответственно (результаты двух исследований по 4 точкам). На фиг.8Г представлено иммуногистохимическое окрашивание ИФНλ-3 при ТПХ/ССК (нижняя панель) и в отсутствие ССК (верхняя панель) дермальных эпителиальных клеток (увеличение 400х).
На фиг.9А-9В представлены результаты ТПХ-индуцированного ССК на модели животных. Анализ методом кПЦР по методике фирмы Fluidigm Corp. проводили с использованием клеток из образцов кожи мышей, которым два раза в неделю вводили в дозе 10 мг/кг массы тела анти-ИФНАR1 мышиные антитела 5А3 (заштрихованные столбики) или контрольный Ig (черные столбики) и сравнивали с образцами из кожи мышей, не пораженных ССК (пустые столбики). На фиг.9А представлены результаты экспрессии четырех ИФН-индуцируемых генов (IFI44, МХ1, OASL, OAS2) по двум точкам, которые свидетельствуют о том, что ранняя экспрессия является ИФНАR1-незавивисимой, а хроническая экспрессия является ИФНАR1 - зависимой. На фиг.9Б представлены результаты, свидетельствующие о том, что экспрессия воспалительных генов (МРО, TNFα, IL-6, INOS) в коже снижается при лечении антителами анти-ИФНАR1. На фиг.9В представлены результаты, свидетельствующие о том, что экспрессия генов, ассоциированных с реконструкцией ткани (KLF10, TIMP, EPGN, ММР9), снижается при лечении антителами анти-ИФНАR1.
Подробное описание изобретения
Лечение склеродермии
В настоящем изобретении предлагаются способы лечения склеродермии или системного склероза, а также способы лечения симптомов склеродермии или системного склероза за счет введения антагониста ИФН типа I.
Введение "терапевтически эффективного количества" или "терапевтически эффективной дозы" антител анти-ИФН типа I, или анти-ИФНα, или анти-ИФНαР по изобретению предпочтительно приводит к снижению интенсивности симптомов заболевания, повышению частоты и продолжительности периодов, свободных от симптомов заболевания, или предотвращению недостаточности или потери трудоспособности из-за поражения болезнью. Например, в случае склеродермии терапевтически эффективное количество или доза предпочтительно предотвращает также ухудшение физических симптомов, ассоциированных со склеродермией или системным склерозом, такие, например, как дермальный фиброз, поражения кожи, алопеция, воспаление, кожные утолщения, отложение коллагена, протеинурия, продуцирование аутоантител и отложение комплемента. Терапевтически эффективное количество или доза предпочтительно предотвращает также или замедляет развитие склеродермии или системного склероза, так как это может потребоваться при наличии ранних или предварительных признаков заболевания. Аналогичным образом лечение включает замедление хронической прогрессии, ассоциированной со склеродермией или системным склерозом. При диагностике склеродермии или системного склероза используются лабораторные методы анализа, включающие методы химического анализа, гематологию, гистопатологию, серологию и радиологию. Соответственно, для определения терапевтически эффективной дозы, пригодной для лечения склеродермии или системного склероза, можно использовать любые клинические или биохимические методы анализа, которые регистрируют любые из вышеуказанных признаков заболевания. Специалист в данной области может определить эффективные количества активных ингредиентов с учетом таких факторов, как масса тела субъекта, интенсивность симптомов заболевания, конкретная композиция или способ введения.
Термин "лечение", используемый в описании заявки, обозначает облегчение, уменьшение интенсивности и/или снижение тяжести склеродермии или системного склероза и ассоциированных симптомов.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения одного или более симптомов склеродермии, которые включают дермальный фиброз, поражения кожи, алопецию, воспаление, кожные утолщения, отложение коллагена, протеинурию, продуцирование аутоантител и отложение комплемента.
Оценка тяжести и развития заболевания, а также ответной реакции на лечение и других клинических признаков склеродермии обычно включает обследование пациента с использованием оценки состояния кожных покровов по шкале Роднана, состояния Рейно, измерения форсированной жизненной емкости легких как части анализа функции легких, кровяного давления при катетеризации правых отделов сердца (предсердия и желудочка), уровня креатина в сыворотке крови, кровяного давления и числа форменных элементов крови, и уровня креатининкиназы в сыворотке крови (см., например, Furst, Rheumatology, 47, v29-v30 (2008) и Furst и др., J. of Rheumatology, 34, 5, 1194-1200 (2007)).
Анализ состояния кожи по шкале Роднана представляет собой клиническую оценку склеродермии с использованием обычной пальпации с целью выявления у пациента утолщений кожи, при этом обследуют 17 участков кожи и каждый участок оценивают по следующей шкале: 0=норма, 1=утолщенная кожа, 2=утолщенная и стойкая к ущемлению кожа и 3=утолщенная и неспособная к движению кожа, всего 51 балл (см. Czirjak и др., Ann. Rheum. Dis., 66(7), 966-969 (18.01.2007) и Brennan и др., Вr.J. Rheum., 31(7), 457-460 (1992)).
Соответственно, в некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов при оценке состояния кожи по шкале Роднана (т.е. снижению уровня измененной кожи).
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем у указанного пациента оценивают состояние кожи по шкале Роднана до лечения (на уровне от 1 до 51 балла) и после лечения на уровне от (1 до 51)-х, где х = от 1 до 51 (≥0).
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем у указанного пациента оценивают состояние кожи по шкале Роднана до лечения на уровне 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51, а после лечения на уровне 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0.
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает оценку состояния кожи по Роднану по меньшей мере на 1 балл. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает оценку модифицированной кожи по Роднану по меньшей мере на 5 баллов. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает оценку модифицированной кожи по Роднану по меньшей мере на 10 баллов. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает оценку модифицированной кожи по Роднану по меньшей мере на 25 баллов.
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает оценку модифицированной кожи по Роднану по меньшей мере на 1, по меньшей мере на 2, по меньшей мере на 3, по меньшей мере на 4, по меньшей мере на 5, по меньшей мере на 6, по меньшей мере на 7, по меньшей мере на 8, по меньшей мере на 9, по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 11, по меньшей мере на 12, по меньшей мере на 13, по меньшей мере на 14, по меньшей мере на 15, по меньшей мере на 16, по меньшей мере на 17, по меньшей мере на 18, по меньшей мере на 19, по меньшей мере на 20, по меньшей мере на 21, по меньшей мере на 22, по меньшей мере на 23, по меньшей мере на 24, по меньшей мере на 25, по меньшей мере на 26, по меньшей мере на 27, по меньшей мере на 28, по меньшей мере на 29, по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 31, по меньшей мере на 32, по меньшей мере на 33, по меньшей мере на 34, по меньшей мере на 35, по меньшей мере на 36, по меньшей мере на 37, по меньшей мере на 38, по меньшей мере на 39, по меньшей мере на 40, по меньшей мере на 41, по меньшей мере на 42, по меньшей мере на 43, по меньшей мере на 44, по меньшей мере на 45, по меньшей мере на 46, по меньшей мере на 47, по меньшей мере на 48, по меньшей мере на 49, по меньшей мере на 50 или 51 балл.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по оценке состояния Рейно (ОСР). ОСР представляет собой ежедневную самооценку активности феномена Рейно по шкале 0-10 с увеличением баллов по мере ухудшения симптомов, ассоциированных со склеродермией (см., например, Merkel и др., Arthritis и Rheumatism, 46, 9, 2410-2420 (2002)).
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанный пациент до лечения характеризуется величиной ОСР от 1 до 10, а после лечения величиной ОСР (от 1 до 10)-х, где х = от 1 до 10 (≥0).
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанный пациент до лечения характеризуется величиной ОСР 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, а после лечения величиной ОСР 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0.
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 1 балл. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 2 балла. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 3 балла. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 5 баллов. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 6 баллов. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 7 баллов. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 8 баллов. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 9 баллов. В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 10 баллов.
В одном варианте изобретения предлагается способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает величину ОСР по меньшей мере на 1, по меньшей мере на 2, по меньшей мере на 3, по меньшей мере на 4, по меньшей мере на 5, по меньшей мере на 6, по меньшей мере на 7, по меньшей мере на 8, по меньшей мере на 9 или 10 баллов.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам клинических измерений уровня креатинина в сыворотке крови.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам клинических измерений уровня креатинфосфокиназы в сыворотке крови.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам клинических измерений форсированной жизненной емкости легких как части анализа функции легких.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам измерений кровяного давления при катетеризации правых отделов сердца (предсердия и желудочка).
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам измерений кровяного давления и числа форменных элементов уровни.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам гистопатологического анализа образцов кожи пациента. В одном варианте указанное улучшение оценивают по результатам измерения воспалительного процесса, например, по снижению инфильтрата воспалительных клеток в образце ткани, по снижению отложения коллагена или общего утолщения кожи. В одном варианте лечение антагонистом интерферона типа I снижает воспалительный процесс в 2 раза. В другом варианте лечение антагонистом интерферона типа I снижает воспалительный процесс в 3 раза. В еще одном варианте лечение антагонистом интерферона типа I снижает воспалительный процесс в 5 раз.
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам анализа образцов кожи пациента методом кПЦР. См., например, WO/08070137A2 («Interferon Alpha-Induced Pharmacodynamic Markers»).
В некоторых вариантах изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает экспрессию гена воспалительного процесса, включающего, но не ограничиваясь только ими, МРО, ФНОα, ИЛ-6 и INOS. В одном варианте предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем до лечения указанный пациент характеризуется повышенной экспрессией гена воспалительного процесса, включающего, но не ограничиваясь только ими, МРО, ФНОα, ИЛ-6 и INOS, a после лечения указанный пациент характеризуется снижением экспрессии гена воспалительного процесса, включающего, но не ограничиваясь только ими, МРО, ФНОα, ИЛ-6 и INOS. В одном варианте предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает экспрессию гена воспалительного процесса по результатам измерения методом кПЦР по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. В другом варианте предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает экспрессию гена воспалительного процесса по результатам измерения методом кПЦР по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%.
В другом варианте изобретения предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает экспрессию гена, относящегося к реконструкции ткани, включающего, но не ограничиваясь только ими, KLF10, TIMP, EPGN и ММР9. В одном варианте предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем до лечения указанный пациент характеризуется повышенной экспрессией гена, относящегося к реконструкции ткани, включающего, но не ограничиваясь только ими, KLF10, TIMP, EPGN и ММР9, а после лечения указанный пациент характеризуется повышенной экспрессией гена, относящегося к реконструкции ткани, включающего, но не ограничиваясь только ими, KLF10, TIMP, EPGN и ММР9. В одном варианте предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает экспрессию гена, относящегося к реконструкции ткани, по результатам измерения методом кПЦР по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. В другом варианте предлагаются способы лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающиеся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I, причем указанное лечение снижает экспрессию гена, относящегося к реконструкции ткани, по результатам измерения методом кПЦР по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%.
В способах лечения пациентов терапевтическим агентом, который связывается с ИФН типа I и подавляет его активность, более предпочтительно активность ИФНα или ИФНαР, в способах идентификации пациентов, которых можно подвергать лечению терапевтическим агентом, который связывается с ИФН типа I и подавляет его активность, более предпочтительно активность ИФНα или ИФНαР, в способах диагностики пациента, страдающего от нарушения, ассоциированного с повышенным уровнем ИФН типа I, более предпочтительно уровнем ИФНα или активности ИФНαР, в способах контроля развития заболевания у пациента, проходящего курс лечения терапевтическим агентом, который связывается с ИФН типа I и подавляет его активность, более предпочтительно активность ИФНα или ИФНαР, и в способах идентификации пациентов, страдающих от нарушений, опосредованных ИФН типа I, более предпочтительно ИФНα или ИФНαР, можно использовать фармакодинамические (ФД) маркеры.
Одним объектом настоящего изобретения являются способы лечения пациента, страдающего от заболевания или нарушения, опосредованного ИФН типа I, заключающиеся в том, что пациенту вводят антагонист активности ИФН типа I, причем пациент характеризуется профилем экспрессии ФД маркера, индуцибельного ИФН типа I, причем указанный антагонист нейтрализует профиль экспрессии ФД маркера, индуцибельного ИФН типа I, в организме субъекта. В конкретном варианте изобретения заболеванием или нарушением является склеродермия или системный склероз.
Изобретение включает способы идентификации, диагностики, лечения и контроля развития заболевания у пациентов. Термин «пациент» включает любое животное, страдающее от заболевания, нарушения или состояния, индуцибельного ИФН типа I или ИФНα. Пациент может страдать от заболевания, нарушения или состояния в процессе доклинических испытаний, например, может представлять собой подопытную модель для испытания заболевания, нарушения или состояния. В другом варианте пациент может страдать от заболевания, нарушения или состояния независимо от каких-либо испытаний. Термин «пациент» включает человека, мышей, крыс, лошадей, свиней, кошек, собак и любое животное, используемое в качестве подопытного.
Способы идентификации, диагностики, лечения и контроля развития заболевания у пациентов с использованием профилей экспрессии ФД маркера, индуцибельного ИФН типа I или ИФНα, и/или с использованием антагониста, который нейтрализует профиль экспрессии ФД маркера, индуцибельного ИФН типа I или ИФНα, в организме субъекта, описаны в WO/08070137 A2 ("Interferon Alpha-induced Pharmacodynamic Markers,"), которая включена в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки.
Антагонист ИФН типа I, который связывается с ИФН типа I, или ИФНα, или ИФНαР и блокирует их активность, может нейтрализовать профиль, индуцибельный ИФН типа I или ИФНα. Нейтрализация профиля, индуцибельного ИФН типа I или ИФНα, представляет собой снижение профиля экспрессии по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми, по меньшей мере десяти, по меньшей мере двенадцати, по меньшей мере пятнадцати, по меньшей мере двадцати, по меньшей мере двадцати пяти, по меньшей мере тридцати, по меньшей мере тридцати пяти, по меньшей мере сорока, по меньшей мере сорока пяти или по меньшей мере пятидесяти генов, индуцированных ИФН типа I или ИФНα. Гены, индуцированные ИФН типа I или ИФНα, представляют собой любую группу генов, описанных в WO/08070137A2 ("Interferon Alpha-induced Pharmacodynamic Markers"). Нейтрализация профиля, индуцибельного ИФН типа I или ИФНα, представляет собой понижение любого профиля экспрессии, индуцибельного ИФН типа I или ИФНα, по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% любого одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми, по меньшей мере десяти, по меньшей мере двенадцати, по меньшей мере пятнадцати, по меньшей мере двадцати, по меньшей мере двадцати пяти, по меньшей мере тридцати, по меньшей мере тридцати пяти, по меньшей мере сорока, по меньшей мере сорока пяти или по меньшей мере пятидесяти генов. В другом варианте нейтрализация профиля экспрессии гена, индуцибельных ИФН типа I или ИФНα, обозначает снижение экспрессии генов, индуцибельных ИФН типа I или ИФНα, которое составляет не более 50%, не более 45%, не более 40%, не более 35%, не более 30%, не более 25%, не более 20%, не более 15%, не более 10%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2% или не более 1% от уровня экспрессии генов, индуцибельных ИФН типа I или ИФНα, в контрольном образце. Если агент, который связывается и модулирует, более предпочтительно подавляет активность ИФН типа I или ИФНα, является агентом биологического происхождения, таким как антитела, такой агент нейтрализует профиль ИФН типа I или ИФНα в дозах от 0,3 до 30 мг/кг, от 0,3 до 10 мг/кг, от 0,3 до 3 мг/кг, от 0,3 до 1 мг/кг, от 1 до 30 мг/кг, от 3 до 30 мг/кг, от 5 до 30 мг/кг, от 10 до 30 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг, от 3 до 10 мг/кг или от 1 до 5 мг/кг.
Агент, который связывается и модулирует, более предпочтительно подавляет активность ИФН типа I или ИФНα, может также или альтернативно нейтрализовать экспрессию одного или более подтипов ИФН типа I или ИФНα. Подтипы ИФНα или ИФН типа I могут включать любой из более одного, более двух, более трех, более четырех, более пяти, более шести, более семи, более восьми, более девяти или более десяти подтипов ИФНα или подтипов ИФН типа I. Указанные подтипы могут включать ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα6, ИФНα7, ИФНα8, ИФНα10, ИФНα14, ИФНα17, ИФНα21, ИФНβ или ИФНσ. Указанные подтипы могут включать все ИФНα1, ИФНα2, ИФНα8 и ИФНα14. В другом варианте указанные подтипы могут включать ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα6, ИФНα8, ИФНα10 и ИФНα21. Нейтрализация ИФНα или подтипов ИФН типа I может обозначать снижение активности по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% любого по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере семи, по меньшей мере восьми или меньшей мере десяти подтипов. Нейтрализация подтипов ИФНα или ИФН типа I может обозначать снижение экспрессии генов ИФНα или ИФН типа I, которое составляет не более 50%, не более 45%, не более 40%, не более 35%, не более 30%, не более 25%, не более 20%, не более 15%, не более 10%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2% или не более 1% от уровня экспрессии ИФНα или ИФН типа I в контрольном образце. Если агент, который связывается и модулирует, более предпочтительно подавляет активность ИФНα или ИФН типа I, является агентом биологического происхождения, таким как антитела, агент может нейтрализовать ИФНα или ИФН типа I в дозах от 0,3 до 30 мг/кг, от 0,3 до 10 мг/кг, от 0,3 до 3 мг/кг, от 0,3 до 1 мг/кг, от 1 до 30 мг/кг, от 3 до 30 мг/кг, от 5 до 30 мг/кг, от 10 до 30 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг, от 3 до 10 мг/кг или от 1 до 5 мг/кг.
Агент, который связывается и модулирует, более предпочтительно подавляет активность ИФНα или ИФН типа I, может также или альтернативно нейтрализовать экспрессию рецепторов ИФНα, ИФНαР1 или ИФНαР2 или обоих, или ФНОα, или ИФНγ или рецепторов ИФНγ (ИФНγР1, ИФНγР2 или обоих ИФНγР1 и ИФНγР2). Нейтрализация экспрессии рецепторов ИФНα, ИФНαР1 или ИФНαР2 или обоих, или ИФНα, или ИФНγ или рецепторов ИФНγ (ИФНγР1, ИФНγР2 или обоих ИФНγР1 и ИФНγР2) обозначает снижение экспрессии по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% любого одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере пяти или по меньшей мере шести указанных генов.
Нейтрализация экспрессии рецепторов ИФНα, ИФНαР1 или ИФНαР2 или обоих, или ИФНα, или ИФНγ или рецепторов ИФНγ (ИФНγР1, ИФНγР2 или обоих ИФНγР1 и ИФНγР2) обозначает снижение экспрессии, которое составляет не более 50%, не более 45%, не более 40%, не более 35%, не более 30%, не более 25%, не более 20%, не более 15%, не более 10%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2% или не более 1% от уровня экспрессии указанных генов в контрольном образце. Если агент, который связывается и модулирует, более предпочтительно подавляет активность ИФН типа I или ИФНα, является агентом биологического происхождения, таким как антитела, агент может нейтрализовать экспрессию рецепторов ИФНα, ИФНαР1 или ИФНαР2, ФНОα или ИФНγ или рецепторов ИФНγ, ИФНγР1 или ИФНγР2 в дозах от 0,3 до 30 мг/кг, от 0,3 до 10 мг/кг, от 0,3 до 3 мг/кг, от 0,3 до 1 мг/кг, от 1 до 30 мг/кг, от 3 до 30 мг/кг, от 5 до 30 мг/кг, от 10 до 30 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг, от 3 до 10 мг/кг или от 1 до 5 мг/кг.
Для описания некоторых объектов изобретения заявители предлагают следующий перечень вариантов осуществления изобретения.
1. Способ лечения склеродермии у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I (ИФН).
2. Способ уменьшения интенсивности одного или более симптомов, ассоциированных со склеродермией, у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество антагониста интерферона типа I.
3. Способ по вариантам 1 или 2, где указанным антагонистом являются антитела.
4. Способ по варианту 3, где указанные антитела являются антителами против ИФНαР.
5. Способ по варианту 3, где указанные антитела являются антителами против ИФНα.
6. Способ по вариантам 1 или 2, где симптомы выбирают из группы, включающей дермальный фиброз, поражения кожи, алопецию, воспаление, кожные утолщения, отложение коллагена, протеинурию и отложение комплемента.
7. Способ по вариантам 1 или 2, где антитела вводят в дозе от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг.
8. Способ по вариантам 1 или 2, где указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам оценки состояния кожи по шкале Роднана.
9. Способ по вариантам 1 или 2, где указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам оценки состояния Рейно (ОСР).
10. Способ по вариантам 1 или 2, где указанное лечение приводит к улучшению симптомов по результатам анализа образцов из кожи пациента методом кПЦР.
11. Способ по варианту 10, где указанное лечение приводит к снижению экспрессии генов воспалительного процесса, выбранных из группы, включающей МРО, ФНОα, ИЛ-6 и INOS.
12. Способ по варианту 10, где указанное лечение снижает экспрессию генов, ассоциированных с реконструкцией ткани, выбранных из группы, включающей KLF10, TIMP, EPGN и ММР9.
Дозы и способы введения
Количество композиции по изобретению, которое является эффективным для лечения, профилактики или контроля склеродермии/системного склероза и симптомов заболевания, определяют по стандартным методикам. Выбор предпочтительной эффективной дозы определяется (например, при проведении клинических испытаний) специалистом в данной области с учетом ряда факторов, известных в данной области. Такие факторы включают симптомы заболевания, массу тела пациента, иммунный статус пациента и другие известные специалисту факторы, позволяющие назначить точное количество вводимых фармацевтических композиций.
Точная доза, используемая в препаратах по изобретению, зависит также от способа введения и тяжести симптомов заболевания склеродермией и назначается в соответствии с оценкой лечащего врача и состояния пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать на основании графика доза/ответная реакция, полученного при анализе in vitro или при испытании на модели животных.
Антитела, гибридные белки или белки с мутациями обычно вводят пациенту в дозе от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела. В одном варианте доза, введенная пациенту, составляет от приблизительно 0,1 мг/кг до 20 мг/кг массы тела. В другом варианте доза, введенная пациенту, составляет от приблизительно 1 мг/кг до 10 мг/кг массы тела. В другом варианте доза, введенная пациенту, составляет от приблизительно 0,3 мг/кг до 30 мг/кг массы тела. В другом варианте доза, введенная пациенту, составляет от приблизительно 0,3 мг/кг до 3,0 мг/кг. В другом варианте доза, введенная пациенту, составляет 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 7,0 мг/кг, 8,0 мг/кг, 9,0 мг/кг, 10,0 мг/кг, 11,0 мг/кг, 12,0 мг/кг, 13,0 мг/кг, 14,0 мг/кг, 15,0 мг/кг, 16,0 мг/кг, 17,0 мг/кг, 18,0 мг/кг, 19,0 мг/кг, 20,0 мг/кг или 25 мг/кг. В конкретном варианте дозу, введенную пациенту, выбирают из группы, включающей 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг, 1,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг массы тела.
2
2
2
2
2
2
2
2
В конкретных вариантах дозы антител (необязательно в фармацевтически приемлемом носителе как части фармацевтической композиции) составляют по меньшей мере приблизительно 0,0005, 0,001, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25, 0,375, 0,5, 1, 2, 5, 5, 10, 20, 37,5 или 50 мг/м и/или менее приблизительно 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37.5, 20, 15, 10,5, 2.5, 1, 0,5, 0,375, 0,1, 0,075 или 0,01 мг/м. В некоторых вариантах доза составляет от приблизительно 0,0005 до приблизительно 200 мг/м, от приблизительно 0,001 до 150 мг/м, от приблизительно 0,075 до 125 мг/м, от приблизительно 0,375 до 100 мг/м, от приблизительно 2,5 до 75 мг/м, от приблизительно 10 до 75 мг/м и от приблизительно 20 до 50 мг/м. В некоторых вариантах доза антител против ИФНα или ИФНαР составляет по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5 мг/кг массы тела.
В конкретных вариантах доза антител против ИФНα или ИФНαР составляет по меньшей мере от приблизительно 1 до приблизительно 10, от приблизительно 5 до приблизительно 15, от приблизительно 10 до приблизительно 20 или от приблизительно 15 до приблизительно 25 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах доза антител против ИФНα или ИФНαР составляет по меньшей мере от приблизительно 1 до приблизительно 20, от приблизительно 3 до приблизительно 15 или от приблизительно 5 до приблизительно 10 мг/кг массы тела. В других вариантах доза антител против ИФНα или ИФНαР составляет по меньшей мере приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 или приблизительно 10 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах стандартная однократная доза антител (необязательно в фармацевтически приемлемом носителе) составляет по меньшей мере приблизительно 0,5, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 4, приблизительно 6, приблизительно 8, приблизительно 10, приблизительно 12, приблизительно 14, приблизительно 16, приблизительно 18, приблизительно 20, приблизительно 22, приблизительно 24, приблизительно 26, приблизительно 28, приблизительно 30, приблизительно 32, приблизительно 34, приблизительно 36, приблизительно 38, приблизительно 40, приблизительно 42, приблизительно 44, приблизительно 46, приблизительно 48, приблизительно 50, приблизительно 52, приблизительно 54, приблизительно 56, приблизительно 58, приблизительно 60, приблизительно 62, приблизительно 64, приблизительно 66, приблизительно 68, приблизительно 70, приблизительно 72, приблизительно 74, приблизительно 76, приблизительно 78, приблизительно 80, приблизительно 82, приблизительно 84, приблизительно 86, приблизительно 88, приблизительно 90, приблизительно 92, приблизительно 94, приблизительно 96, приблизительно 98, приблизительно 100, приблизительно 102, приблизительно 104, приблизительно 106, приблизительно 108, приблизительно 110, приблизительно 112, приблизительно 114, приблизительно 116, приблизительно 118, приблизительно 120, приблизительно 122, приблизительно 124, приблизительно 126, приблизительно 128, приблизительно 130, приблизительно 132, приблизительно 134, приблизительно 136, приблизительно 138, приблизительно 140, приблизительно 142, приблизительно 144, приблизительно 146, приблизительно 148, приблизительно 150, приблизительно 152, приблизительно 154, приблизительно 156, приблизительно 158, приблизительно 160, приблизительно 162, приблизительно 164, приблизительно 166, приблизительно 168, приблизительно 170, приблизительно 172, приблизительно 174, приблизительно 176, приблизительно 178, приблизительно 180, приблизительно 182, приблизительно 184, приблизительно 186, приблизительно 188, приблизительно 190, приблизительно 192, приблизительно 194, приблизительно 196, приблизительно 198, приблизительно 200, приблизительно 204, приблизительно 206, приблизительно 208, приблизительно 210, приблизительно 212, приблизительно 214, приблизительно 216, приблизительно 218, приблизительно 220, приблизительно 222, приблизительно 224, приблизительно 226, приблизительно 228, приблизительно 230, приблизительно 232, приблизительно 234, приблизительно 236, приблизительно 238, приблизительно 240, приблизительно 242, приблизительно 244, приблизительно 246, приблизительно 248 или приблизительно 250 мкг/м. В других вариантах стандартная однократная доза может составлять до приблизительно 1 г.
Композиции по изобретению можно вводить пациенту (человеку) любым способом, включающим, но не ограничиваясь только ими, внутривенный, внутрикожный, чрескожный, подкожный, внутримышечный, ингаляцией (например, в форме аэрозоля), трансбуккальный (например, сублингвальный), местный (т.е. на поверхность кожи, на слизистую, включая дыхательные пути), интратекальный, внутрисуставный, интраплевральный, интрацеребральный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, пероральный, интралимфатический, интраназальный, ректальный или вагинальный способы введения, перфузией через местный катетер или прямой инъекцией в очаг поражения.
В одном варианте композиции по изобретению вводят внутривенной инъекцией или внутривенным вливанием в течение определенного периода времени (например, от 0,5 до 2 ч). Композиции по изобретению можно вводить с использованием перистальтического насоса или в форме с замедленным высвобождением, хотя наиболее предпочтительный способ в каждом случае зависит от таких факторов, как вид, возраст, пол и общее состояние субъекта, природа и тяжесть состояния, подлежащего лечению, и/или свойства конкретной композиции (т.е. дозы, препарата), введенной субъекту. В конкретных вариантах способ введения представляет собой струйное вливание или непрерывное вливание в течение определенного периода времени один или два раза в неделю. В других конкретных вариантах способ введения представляет собой подкожную инъекцию, необязательно один или два раза в неделю. В одном варианте композиции и/или способы по изобретению используются в отношении амбулаторного больного. В другом варианте композиции и/или способы по изобретению используются с применением предварительно заполненных шприцов.
В некоторых вариантах доза композиции, включающей антитела против ИФНα или ИФНαР, измеряется в мг/кг массы тела пациента. В других вариантах доза композиции, включающей антитела против ИФНα или ИФНαР, измеряется в мг/кг приведенной массы тела пациента (т.е. массы тела минус масса жировой ткани). В другом варианте доза композиции, включающей антитела против ИФНα или ИФНαР, измеряется в мг/м поверхности тела пациента. В еще одних вариантах доза композиции, включающей антитела против ИФНα или ИФНαР, измеряется в количестве мг, введенных пациенту. В связи с композициями и способами по изобретению можно использовать любые указанные варианты измерения доз, которые можно легко пересчитать по стандартным методикам.
Для специалиста в данной области представляется очевидным, что дозы выбираются с учетом ряда факторов, включающих возраст, пол, вид и состояние субъекта (например, уровень развития склеродермии), требуемую степень удаления клеток, заболевание, подлежащее лечению, и/или конкретные антитела или антиген-связывающий фрагмент, и определяются специалистом в данной области. Например, эффективные количества композиций по изобретению можно экстраполировать на основании графика доза/ответная реакция, полученного при анализе in vitro или при испытании на модели животных (например, на хлопковом хомяке или обезьянах). Модели и способы оценки действия антител известны в данной области (см. статью Wooldridge и др., Blood, 89(8), 2994-2998 (1997), включенную в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки).
Примеры курсов лечения, которые можно использовать в способах по изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, введение ежедневно, три раза в неделю (с перерывами), один раз в неделю или каждые 14 дней. В некоторых вариантах курс лечения включает, но не ограничиваясь только ими, введение раз в месяц или каждые 6-8 недель, или раз в неделю в течение определенного периода времени. В одном варианте композиции вводят раз в неделю в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11 или 12 недель.
Для специалиста представляется очевидным, что на начальной фазе лечения дозы обычно выше и/или введение проводят чаще по сравнению с поддерживающими курсами лечения. Все вышеуказанные дозы являются типичными и могут использоваться в контексте композиций и способов по изобретению, однако вышеуказанные дозы могут снижаться, если антитела против ИФНα или ИФНαР используются в комбинации с противовоспалительным агентом.
В некоторых вариантах дозы и частота введения могут изменяться и/или скорость вливания может снижаться в зависимости от иммуногенной ответной реакции пациента на композиции и способы по изобретению. В другом варианте способов по изобретению можно провести предварительное лечение пациента композициями и способами по изобретению для определения иммуногенной ответной реакции или минимизации побочного действия композиций и способов по изобретению.
Антагонисты интерферона типа I
Термин "антагонист ИФН типа I", используемый в описании заявки, обозначает любой агент, который блокирует, ингибирует, подавляет, нейтрализует, снижает или иным способом конкурирует или исключает передачу сигнала при участии и/или активации рецептора α-интерферона (ИФНαР). Антагонисты ИФН типа I могут подавлять взаимодействие любого ИФН типа I и ИФНαР. Таким образом, антагонисты ИФН типа I действуют за счет связывания и подавления ИФН типа I или за счет связывания и подавления ИФНαР. Антагонисты ИФН типа I могут связываться с цепью ИФНαР1 или с цепью ИФНαР2 или они могут связываться с эпитопами, образующимися при комбинации двух цепей. В конкретных вариантах антагонисты ИФН типа I представляют собой антитела, которые связываются с цепью ИФНαР1, такие как антитела, описанные в US 2006/0029601, US 2006/0020118 и US 6713609, включенных в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки.
В некоторых вариантах настоящего изобретения предлагаются антагонисты, которые конкурируют за связывание ИФН типа I с лигандами, такими, например, как растворимые цепи рецептора (например, растворимые ИФНαR1 или ИФНαR2) или их фрагменты. В других вариантах предлагаются антитела или связывающие фрагменты антител, которые селективно связываются с одним или более интерферонами типа I или связываются с ИФНαР, конкурируя со связыванием лиганда, например, по механизму конкурентного, неконкурентного или бесконкурентного ингибирования. В других вариантах предлагаются антагонисты, которые блокируют передачу сигнала ИФНαР. Еще в одних вариантах предлагаются антагонисты, которые подавляют последующие действия интерферонов типа I.
Антагонист интерферона типа I можно вводить пациенту или пациента можно идентифицировать в качестве кандидата для введения агента или терапевтического агента. В некоторых вариантах изобретения антагонист интерферона типа I обозначает любое соединение, которое связывается и блокирует активность ИФН типа I, ИФНα или ИФНαР. Антагонист может представлять собой низкомолекулярное соединение или агент биологического происхождения. Низмолекулярный антагонист синтезируют или идентифицируют и выделяют из природного источника.
Антитела-антагонисты интерферона типа I
В некоторых вариантах настоящего изобретения антагонисты интерферона типа I включают антитела анти-ИФНАР и/или их фрагменты, которые связываются с рецептором интерферона типа I и тем самым блокируют связывание лиганда (т.е. α-интерферона, β-интерферона или ω-интерферона). В другом или дополнительном варианте антагонисты интерферона типа I представляют собой антитела против интерферона типа I и/или их фрагменты, которые связываются с интерфероном типа I (т.е. α-интерфероном, β-интерфероном или ω-интерфероном) и тем самым блокируют его связывание с рецептором (т.е. ИФНαР). Опосредованное антителами ингибирование связывания лиганда происходит по механизму конкурентного, неконкурентного или бесконкурентного ингибирования. В другом варианте антагонисты на основе антител могут предотвращать внутриклеточную передачу сигнала рецептором интерферона типа I.
Таким образом, настоящее изобретение включает химерные, приматизированные, маскированные, гуманизированные, деммунизированные и антитела анти-ИФНАР человека и антитела против интерферона типа I и/или их антиген-связывающие фрагменты. Антитела-антагонисты, пригодные для применения в способах лечения по настоящему изобретению, включают моноклональные антитела, такие, например, как антитела животных, химерные, приматизированные, гуманизированные, деммунизированные и/или полностью человеческие антитела или их антиген-связывающие фрагменты. Антитела-антагонисты могут также включать одну или более химических модификаций для увеличения периода полураспада антител или их антиген-связывающего фрагмента в кровотоке, таких, например, как конденсация с полиэтиленгликолем (т.е. пэгилирование).
В одном варианте антитела являются специфичными в отношении любого подтипа (подтипов) ИФН типа I или ИФНα. Например, антитела являются специфичными в отношении любого из интерферонов ИФНα, таких как ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα6, ИФНα7, ИФНα8, ИФНα10, ИФНα11, ИФНα17, ИФНα21, ИФНβ или ИФНω. В другом варианте антитела являются специфичными в отношении любых двух, любых трех, любых четырех, любых пяти, любых шести, любых семи, любых восьми, любых девяти, любых десяти, любых одиннадцати или любых двенадцати подтипов ИФН типа I или ИФНα. Если антитела специфичны в отношении более одного подтипа ИФН типа I, то они являются специфичными в отношении ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα8, ИФНα10 и ИФНα21, или они являются специфичными в отношении ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα8 и ИФНα10, или они являются специфичными в отношении ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα8 и ИФНα21, или они являются специфичными в отношении ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα10 и ИФНα21, или в отношении любых комбинаций указанных подтипов. Антитела, специфичные в отношении ИФН типа I или ИФНα, включают антитела MEDI-545, любые природные антитела или антитела, иные чем MEDI-545, антитела, описанные в US 11/009410, зарегистрированной 10 декабря 2004 г., и 11/157494, зарегистрированной 20 июня 2005 г., антитела 9F3 (и их гуманизированные варианты) и другие антитела, описанные в US 7087726, антитела NK-2 и YOK5/19 (WO 84/03105), антитела LO-22 (US 4902618), антитела 144 BS (US 4885166) и антитела EBI-1, EBI-2 и EBI-3 (ЕР 119476).
В одном варианте антителами-антагонистами являются антитела MEDI-545, которые представляют собой полностью человеческие моноклональный антитела IgG1k (MA, мол. массой 147000 Да), которые связываются со многими подтипами ИФНα. MEDI-545 на 100% составлены из аминокислотных последовательностей белка человека и поэтому являются полными моноклональными антителами человека. Такие моноклональные антитела обладают преимуществом по сравнению с другими формами моноклональных антител, такими как химерные и гуманизированные антитела, поскольку они характеризуются более благоприятным профилем безопасности и более медленно выводятся из организма человека, что позволяет понизить частоту введения препарата. Антитела MEDI-545 получали из антител IgG4k, 13H5, которые отбирали по результатам функциональных анализов как объекты, обладающие свойствами, необходимыми для терапевтического агента. Затем антитела 13H5 превращали в изотип антител IgG1, продуцировали в клетках СНО и отбирали по другим характеристикам и результатам доклинических испытаний с первоначальным названием MDX-1103, теперь MEDI-545. См. также US 2007/0014724, приоритетную заявку US 60/909232, озаглавленную "Antibodies with Decreased Deamidation Profiles", приоритетную заявку US 60/909117, озаглавленную "Antibody Formulation", WO/08070137A2, озаглавленную "Interferon Alpha-induced Pharmacodynamic Markers", и WO/08070135A2, озаглавленную "Methods of Treating Systemic Lupus Erythemaдosus", каждая из которых включена в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки. В конкретном варианте могут использоваться другие антитела (т.е. не MEDI-545).
Антителами по изобретению являются, но не ограничиваясь только ими, синтетические антитела, моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, интратела, полиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, синтетические антитела, одноцепочечные Fvs (scFv) (включая биспецифичные scFvs), соединения BiTE, одноцепочечные Fab фрагменты, F(ab') фрагменты, связанные дисульфидной связью Fvs (sdFv) и анти-идиотипические (анти-Id) антитела и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеуказанных антител. Антитела по настоящему изобретению прежде всего включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты иммуноглобулинов. Кроме того, антитела по изобретению могут присутствовать в виде любых изотипов. В одном варианте антителами по изобретению являются изотипы IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитела по изобретению могут представлять собой полноразмерные антитела, включающие вариабельные и константные области, или они могут представлять собой их антиген-связывающие фрагменты, такие как одноцепочечные антитела, или Fab или Fab'2 фрагменты.
В изобретении также предлагаются иммуноконъюгаты, включающие антитела по изобретению или их антиген-связывающий участок, связанные с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. В изобретении также предлагаются биспецифичные соединения, включающие антитела или их aнтиген-cвязывaющий участок, связанные со вторым функциональным фрагментом, обладающим другой специфичностью связывания, или его антиген-связывающим участком.
В изобретении также предлагаются композиции, включающие антитела или их антиген-связывающий участок, или иммуноконъюгат или биспецифичное соединение по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Антитела, которые связываются с ИФНαР, известны в области техники. Примеры указанных антител приводятся, например, но не ограничиваясь только ими, в US 2006/0029601, которая включена в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки. Антитела, которые связываются с интерферонами типа I, известны в области техники. Примеры указанных антител приводятся, например, но не ограничиваясь только ими, в US 61/006962, зарегистрированной 8 февраля 2008 г., US 61/034618, зарегистрированной 7 марта 2008 г., и US 61/049970, зарегистрированной 2 мая 2008 г., каждая из которых озаглавлена "Anti-IFNARl Antibodies with Reduced Fc Ligand Affinity". Антитела, которые связываются со многими подтипами α-интерферона, известны в области техники. Примеры указанных антител приводятся, например, но не ограничиваясь только ими, в US 7087726 и US 2007/0014724, которые включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки.
В некоторых вариантах, указанных выше, может оказаться необходимым изменить активность конкретных подтипов или комбинаций подтипов α-интерферона.
В некоторых вариантах может оказаться необходимым изменить период полураспада антител против интерферона типа I, антител против α-интерферона или антител анти-ИФНАР. В одном варианте может оказаться необходимым уменьшить период полураспада антител in vivo. В другом варианте может оказаться необходимым увеличить период полураспада антител in vivo. См., например, US 2006/0198840 А1, которая включена в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки.
Антитела или их фрагменты можно получать любым из множества известных способов биосинтеза, синтеза или продуцирования антител, прежде всего химическим синтезом или по методикам рекомбинантной экспрессии. См., например, Brinkman и др., J. Immunol. Methods, 182. 41-50 (1995), Ames и др., J. Immunol. Methods, 184, 177-186 (1995), Kettleborough и др., Eur. J. Immunol., 24, 952-958 (1994), Persic и др., Gene, 187, 9-18 (1997), Burton и др., Advances in Immunology, 57, 191-280 (1994), PCT/GB91/01134, WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, W097/13844, US 5698426,5223409,5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698,5427908,5516637,5780225,5658727, 5733743, 5969108, WO 92/22324, Mullinax и др., BioTechniques, 12(6), 864-869 (1992), Sawai и др., AJRI, 34, 26-34 (1995), Better и др. Science, 240, 1041-1043 (1988), US 4444887, US 4716111, WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, W098/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 91/1074, WO 98/24893, WO 96/34096, WO 96/33735, US 5413923, US 5625126, US 5633425, US 5569825, US 5661016, US 5545806, US 5814318, US 5939598, Morrison, Science, 229, 1202 (1985), Oi и др., BioTechniques, 4, 214 (1986), Gillies и др., J. Immunol. Methods, 125, 191-202 (1989), US 5807715, US 4816567, US 4816397, US 6311415, EP 239400, WO 91/09967, US 5225539, US 5530101, US 5585089, EP 592106, EP 519596, Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5), 489-498 (1991), Studnicka и др., Protein Engineering, 7(6), 805-814 (1994), Roguska и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973 (1994), US 5565332, US 6407213, US 5766886, WO 9317105, Tan и др., J. Immunol., 169, 1119-1125 (2002), Caldas и др.. Protein Eng., 13(5), 353-360 (2000), Morea и др., Methods, 20(3), 267-279 (2000), Васа и др., J. Biol. Chem., 272(16), 10678-84 (1997), Roguska и др., Protein Eng., 9(10), 895-904 (1996), Couto и др., Cancer Res., 55 (23 Supp), 5973-5977 (1995), Couto и др., Cancer Res. 55(8), 1717-1722 (1995), Sandhu J. S., Gene, 150(2), 409-410 (1994) и Pedersen и др., J. Mol. Biol., 235(3), 959-973 (1994), Queen и др.. US 5585089, Riechmann и др.. Nature, 332, 323 (1988), Kutmejer и др., BioTechniques, 17, 242 (1994), WO 86/05807, WO 89/01036 и US 5122464 и US 5807715 (каждый из указанных источников включен в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки).
Антагонистические полипептиды и низкомолекулярные соединения
В некоторых вариантах изобретения антагонистом ИФН типа I является полипептид. В конкретных вариантах антагонист представляет собой короткий полипептид или пептид, который является фрагментом ИФН типа I или фрагментов одной из цепей ИФНАР. Например, в качестве антагонистов ИФН типа I могут использоваться пептидные фрагменты цепи ИФНАР1, прежде всего пептидные фрагменты внеклеточного участка цепи ИФНАР1. Такие пептидные фрагменты ИФНАР описаны в US 2004/0067888, которая включена в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки. В конкретных вариантах пептидные антагонисты содержат приблизительно 9-12 аминокислотных остатков цепи ИФНАР1. Могут также использоваться пептидные аналоги, которые получены из цепей ИФНАР, в которых одна или более аминокислот заменены (например, в результате одной или более консервативных замен), и/или удалены, и/или добавлены, однако при этом пептид остается антагонистом ИФН типа I.
Пептид по изобретению можно вводить за счет экспрессии in vivo соответствующей нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, способная экспрессировать в соответствующих клетках субъекта/пациента пептид или полипептид по изобретению, предназначенный для применения в качестве антагониста ИФН типа I. Такой нуклеиновой кислотой может являться вирусный вектор или невирусный вектор, включающий такие векторы, представленные в форме, пригодной для доставки нуклеиновой кислоты по изобретению в клетки человека. Таким образом, нуклеиновые кислоты по изобретению включают вирусные векторы в форме, пригодной для терапии вирусными векторами, например в форме рекомбинантного ретровируса, аденовируса или ослабленного вируса гриппа. В другом варианте нуклеиновая кислота по изобретению может представлять собой невирусный вектор, например, в составе липосом или в составе ПАВ-содержащих векторных частиц.
Пептид или полипептид по изобретению можно получать синтезом по стандартным методикам или экспрессией нуклеиновой кислоты в клетках хозяина. Кроме того, такие пептиды можно получать фрагментацией более длинных цепей, например, гибридного полипептида, по сайтам, чувствительным к действию соответствующей протеазы, с целью получения требуемого пептида или полипептида по изобретению.
В одном варианте модуляторами являются белки, часто природные белки или их фрагменты. В некоторых вариантах указанные белки являются антагонистическими мутеинами интерферонов, причем такими мутеинами α-интерферона, которые подавляют ИФНАР. Таким образом, например, можно использовать клеточные экстракты, содержащие белки, или рандомизированные или направленные гидролизаты белковых клеточных экстрактов. Таким способом можно получать библиотеки белков, предназначенные для скрининга способов по изобретению. Конкретными вариантами являются библиотеки бактериальных, грибковых, вирусных белков и белков млекопитающих, предпочтительно белков млекопитающих, прежде всего белков человека. Прежде всего анализируемые соединения относятся к классу белков, которые являются белками-мишенями, например, субстратами ферментов или лигандами и рецепторами.
В некоторых вариантах изобретения модуляторами являются пептиды, содержащие от приблизительно 5 до приблизительно 30 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 20 аминокислот, наиболее предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 15 аминокислот. Пептиды могут представлять собой гидролизаты природных белков, указанных выше, рандомизированные пептиды или "смещенные" рандомизированные. Термин "рандомизированные" или грамматически эквивалентные термины обозначает, что нуклеиновая кислота или пептид состоит главным образом из случайных последовательностей нуклеотидов и аминокислот, соответственно. Поскольку указанные рандомизированные пептиды (или обсуждаемые ниже нуклеиновые кислоты) часто получают химическим синтезом, они могут включать любой нуклеотид или аминокислоту в любой позиции. Способы синтеза позволяют получать рандомизированные белки или нуклеиновые кислоты, при этом образуются все или почти все возможные комбинации по всей последовательности, т.е. образуется библиотека рандомизированных возможных биологически активных протеиноподобных агентов.
В одном варианте библиотека является полностью рандомизированной, не содержащей предпочтительных последовательностей или постоянных в любой позиции. В предпочтительном варианте библиотека является смещенной, т.е. некоторые позиции в последовательности являются постоянными или выбираются из ограниченного набора вариантов. В предпочтительном варианте нуклеотиды или остатки аминокислот являются рандомизированными в пределах определенного класса, например, группы гидрофобных аминокислот, гидрофильных остатков, стерически смещенных (небольших или более объемных) остатков, с целью получения доменов, связывающих нуклеиновую кислоту, введения остатков цистеина для сшивания цепи, введения остатков пролина для получения доменов SH-3, остатков серина, треонина, тирозина или гистидина для включения сайтов фосфорилирования и т.п.
Кроме антагонистов интерферона типа I на основе антител настоящее изобретение также включает антагонисты интерферона типа I и их композиции, включающие один или более низкомолекулярных соединений, которые конкурируют за связывание интерферона типа I с рецептором (т.е. ИФНАР).
В некоторых вариантах для поиска соединений, способных связываться с интерфероном типа I или с рецептором интерферона типа I, можно использовать комбинаторные библиотеки возможных низкомолекулярных антагонистов. Соответственно, новые химические группы с необходимыми свойствами выявляют в процессе идентификации соединения (называемого "главное соединение"), которое обладает некоторыми требуемыми свойствами или активностью, например ингибирующей активностью, синтеза вариантов главного соединения и оценки свойств и активности указанных вариантов соединения. При проведении таких анализов часто используют способы высокопроизводительного скрининга (ВПС).
В одном предпочтительном варианте способы высокопроизводительного скрининга включают создание библиотеки, содержащей множество возможных терапевтических соединений. Такие "комбинаторные библиотеки химических соединений" затем анализируют с использованием одного или более способов анализа для идентификации членов библиотеки (прежде всего химических групп или подклассов соединений), которые проявляют требуемую характеристическую активность. Идентифицированные таким образом соединения можно использовать в качестве соответствующих "главных соединений" или использовать в качестве возможных или действительных лекарственных средств для лечения заболеваний, ассоциированных со связыванием интерферона (IBD).
Комбинаторная библиотека химических соединений представляет собой коллекцию различных химических соединений, полученных химическим синтезом или биосинтезом за счет комбинирования ряда химических "структурных блоков", таких как реагенты. Например, библиотеку линейно-построенных химических соединений, такую как полипептидная библиотека (например, библиотека мутеинов), получают комбинированием структурных блоков, называемых аминокислотами, с целью построения соответствующего соединения (т.е. полипептида, содержащего соответствующее число аминокислот). Таким способом можно построить миллионы таких химических соединений. Gallop и др., J. Med. Chem. 37(9), 1233-1251 (1994).
Получение и скрининг комбинаторных библиотек химических соединений известно в области техники. Такие комбинаторные библиотеки включают, но не ограничиваясь только ими, библиотеки пептидов (см., например, US 5010175, Furka, Pept. Prot. Res., 37, 487-493 (1991), Houghдon и др., Nature, 354, 84-88 (1991)), пептоидов (WO 91/19735), кодированных пептидов (WO 93/20242), произвольных биоолигомеров (WO 92/00091), бензодиазепинов (US 5288514), диверсомеров, таких как гидантоины, бензодиазепинов и дипептидов (Hobbs и др., Ргос.Nat. Acad. Sci. USA, 90, 6909-6913 (1993)), винилогичных полипептидов (Hagihara и др., J. Amer. Chem. Soc., 114, 6568 (1992)), непептидных пептидомиметиков с каркасными фрагментами из P-D-глюкозы (Hirschmann и др., J. Amer. Chem. Soc., 114, 9217-9218 (1992)), библиотеки низкомолекулярных соединений, аналогичные библиотекам органического синтеза (Chen и др., J. Amer. Chem. Soc., 116, 2661 (1994)), олигокарбаматов (Cho и др. Science, 261, 1303 (1993)) и/или пептидилфосфонатов (Campbell и др., J. Org. Chem., 59, 658 (1994)). См. также Gordon и др., J. Med. Chem., 37, 1385 (1994), библиотеки нуклеиновых кислот (см., например, Strategene, Corp.), библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды, см., например, US 5539083), библиотеки антител (см., например, Vaughn и др., Nature Biotechnology, 14(3), 309-314 (1996) и PCT/US 96/10287), библиотеки углеводов (см., например, Liang и др., Science, 274, 1520-1522 (1996) и US 5593853) и библиотеки низкомолекулярных органических соединений (см., например, библиотеку бензодиазепинов, Baum, C&EN, 18 января 18, 33 (1993), изопреноидов, US 5569588, тиазолидинонов и метатиазанонов, US 5549974, пирролидинов, US 5525735 и 5519134, соединений морфолина, US 5506337, бензодиазепинов, US 5288514 и т.п.).
Программы для получения комбинаторных библиотек являются коммерческими продуктами (см., например, 357 MPS, 390 MPS, фирма Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Wobura, Mass., 433A, фирма Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, фирма Millipore, Bedford, Mass.).
Для проведения реакций в жидкой фазе разработан ряд известных автоматизированных систем. Указанные системы включают приборы для автоматизированного синтеза, такие как синтезатор фирмы Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japan), и множество автоматизированных систем, включающих автосамплеры (Zymate II, фирма Zymark Corporation, Hopkinton, Mass., Orca, фирма Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.), которые имитируют стадии синтеза, выполняемые химиком-синтетиком. Вышеуказанные синтезаторы с соответствующими модификациями пригодны для применения по настоящему изобретению. Кроме того, многие комбинаторные библиотеки являются коммерческими продуктами (см., например, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Москва, РФ, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd, Москва, РФ, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md., и др.).
Для регистрации взаимодействия интерферон/рецептор используются методы анализа, позволяющие детектировать передачу сигнала, опосредованного ИФН, такие как ИФН-опосредованнное подавление пролиферации клеток в культуре линий опухолевых клеток человека. Кроме того, можно использовать анализ репортерного гена, например репортерных генов, экспрессированных из ИФН-чувствительного генного промотора (Lallemand и др., J. Leukocyte Biol., 60, 137-146 (1996)). Пригодные репортерные гены включают гены, кодирующие люциферазу и зеленый флуоресцентный белок. В таком анализе экспрессия репортерного гена зависит от активности ИФН, а антагонист ИФН избирательно подавляет экспрессию гена, стимулированную ИФН.
Высокопроизводительные анализы, позволяющие оценить присутствие или отсутствие полипептидов, дать количественную оценку или определить другие свойства конкретных полипептидов, известны специалисту в данной области. Анализы связывания и анализы репортерного гена также известны в данной области. Например, в US 5559410 описаны высокопроизводительные способы анализа белков, в US 5585639 описаны высокопроизводительные способы анализа связывания нуклеиновой кислоты (т.е. при сборке комплекса), а в US 5576220 и US 5541061 описаны высокопроизводительные способы анализа связывания лиганд/антитело.
Кроме того, системы для проведения высокопроизводительных анализов являются коммерческими продуктами (см., например, фирма Zymark Corp., Hopkinton, Mass., фирма Air Technical Industries, Mentor, Ohio, фирма Beckman Instruments, Inc. Fullerton, Calif., фирма Precision Systems, Inc., Natick, Mass. и т.п.). Указанные системы обычно представляют собой автоматизированные методики, включающие пипетирование образца и реагента, диспергирование в жидкости, инкубацию в течение заданного времени и конечное считывание микропланшета на соответствующем детекторе. Указанные программируемые системы обеспечивают проведение высокопроизводительных анализов и быстрый запуск, а также высокую гибкость и быструю реализацию. Производители таких систем предлагают подробные описания различных высокопроизводительных систем. Таким образом, например, фирма Zymark Corp. предлагает технические бюллетени, описывающие системы анализа для детектирования модуляции транскрипции генов, связывания лиганда и т.п.
Комбинированная терапия
В некоторых вариантах изобретения для введения пациенту предлагается второй агент, который отличается от того агента, который связывается и подавляет активность ИФН типа I или более предпочтительно активность ИФНα. Такими дополнительными агентами являются, но не ограничиваясь только ими, нестероидные противовоспалительные средства, такие как ибупрофен, непроксен, сулиндак, диклофенак, пироксикам, кетопрофен, дифлунисал, набуметон, этодолак и оксапрозин, индометацин, противомалярийные лекарственные средства, такие как гидроксихлороквин, кортикостероидные гормоны, такие как преднизон, гидрокортизон, метилпреднизолон и дексаметазон, метотрексат, иммунодепрессанты, такие как азатиоприн и циклофосфамид, и агенты биологического происхождения, которые, например, воздействуют на Т клетки, такие как алефацепт и эфализумаб, или воздействуют на ФНОα, такие как энбрел, ремикад и гумира.
В других вариантах в комбинации с антагонистами по изобретению используется второй агент, предназначенный для противодействия негативным последствиям, ассоциированным с склеродермическим сосудистым заболеванием. Например, сообщается, что блокаторы кальциевого канала способствуют кровотоку в направлении поверхности кожи и к сердцу, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента (АКФ) снимают сужение кровеносных сосудов при склеродермическом почечном кризе, а босентан (новый ингибитор рецептора эндотелина-1) или эпопростенол (простациклин) улучшают кровоток в легких. Кроме того, лекарственные средства, которые снимают сужение кровеносных сосудов (блокаторы кальциевого канала, босентан, простациклин или оксид азота), все оказывают влияние на ход заболевания. Конечным результатом нелеченной склеродермии сосудов является закупорка сосудов из-за образования тромба или развитого фиброза внутренней оболочки сосудов. Соответственно, в комбинации с антагонистами по изобретению можно использовать антитромбоцитарную терапию в виде низких доз аспирина. Соответственно, в комбинации с антагонистами по изобретению можно использовать антифиброзные агенты, включающие, но не ограничиваясь только ими, колхицин, пара-аминобензойную кислоту (ПАБК), диметилсульфоксид и D-пеницилламин.
Подразумевается, что композиции по настоящему изобретению включают один или более антагонистов интерферона типа I, таких, например, как антитела против ИФН типа I или их фрагменты, антитела против ИФНАР или их фрагменты, белки, включая пептиды и низкомолекулярные соединения.
Фармацевтические композиции
Примеры фармацевтических композиций, включающих антитела против α-интерферона, предназначенных для применения по настоящему изобретению, приводятся в US 60/909117, озаглавленной "Antibody Formulation", которая включена в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки. Примеры фармацевтических композиций, включающих антитела против интерферона типа I, приводятся в WO 2006/0029601, которая включена в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки.
В одном варианте препарат по изобретению предназначен для парентерального введения. В одном варианте препарат по изобретению предназначен для введения инъекцией. В одном варианте препарат по изобретению предназначен для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения. В конкретном варианте препарат по изобретению включает антитела против ИФН типа I или антитела против α-интерферона или антитела против ИФНαР, причем указанный препарат предназначен для подкожной инъекции. В конкретном варианте антитела против ИФН типа I или антитела против α-интерферона или антитела против ИФНαР получают для подкожного введения в предварительно заполненном шприце.
В одном варианте препарат по изобретению предназначен для внутривенного введения, причем указанный препарат содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 40 мг/мл антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР или их фрагмента. В конкретном варианте препарат по изобретению предназначен для внутривенного введения, причем указанный препарат содержит от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 40 мг/мл антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР.
В одном варианте препарат по изобретению предназначен для подкожного введения, причем указанный препарат содержит от приблизительно 70 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР или их фрагмента. В конкретном варианте препарат по изобретению предназначен для подкожного введения, причем указанный препарат содержит от приблизительно 70 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР.
В одном варианте препарат по изобретению предназначен для введения аэрозолем.
В настоящем изобретении предлагается также стандартная лекарственная форма, пригодная для парентерального введения человеку, которая включает препарат антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР в пригодном контейнере. В одном варианте стандартная лекарственная форма по изобретению включает антитела против ИФН типа I или антитела против α-интерферона или антитела против ИФНαР. В одном варианте стандартная лекарственная форма по изобретению включает препарат антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения. В другом варианте стандартная лекарственная форма по изобретению включает препарат антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР для введения в виде аэрозоля. В конкретном варианте стандартная лекарственная форма по изобретению включает препарат антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР для подкожного введения. В другом варианте стандартная лекарственная форма по изобретению включает препарат антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР для введения в виде аэрозоля. В еще одном варианте стандартная лекарственная форма по изобретению включает препарат антител против ИФН типа I или антител против α-интерферона или антител против ИФНαР для введения интраназально.
В одном варианте препарат по изобретению предлагается в герметичном контейнере.
В настоящем изобретении предлагается также набор, включающий препарат антагониста интерферона типа I по изобретению.
Композицию антител против ИФНα или против ИФНαР получают в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает один или более нетоксичных материалов, которые не снижают эффективность действия активных ингредиентов. Такими материалами обычно являются соли, буферные агенты, консерванты, совместимые носители и необязательно другие терапевтические агенты. Такими фармацевтически приемлемыми материалами являются также совместимые твердые и жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующие агенты, пригодные для введения человеку. Соли, используемые в составе лекарственных средств, обычно являются фармацевтически приемлемыми солями, но для получения таких солей могут использоваться и фармацевтически неприемлемые соли, которые также включены в объем изобретения. Такие фармакологически и фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваясь только ими, соли следующих кислот: хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной, азотной, фосфорной кислот, а также малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной кислот и др. Кроме того, можно получать фармацевтически приемлемые соли щелочных или щелочно-земельных металлов, такие как соли натрия, калия или кальция. Термин "носитель" обозначает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, который используется в комбинации с активным ингредиентом для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также способны смешиваться с антителами по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что они не взаимодействуют с активным агентом и не оказывают существенного воздействия на фармацевтическое действие препарата.
В некоторых вариантах изобретения композиции антител против ИФНα или против ИФНαР получают для хранения смешиванием антител или иммуноконъюгата (с требуемой степенью чистоты) с биологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизирующими агентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol А., ред. (1999)) в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизирующие агенты являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферные вещества, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и метионин, консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол, и мета-крезол), низкомолекулярные пептиды (содержащие не более приблизительно 10 аминокислотных остатков), полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, такие как глюкоза, манноза или декстрины, комплексоны, такие как ЭДТУ, сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий, комплексы металлов (например, цинксодержащие белки) и/или неионные ПАВ, такие как твин, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Композиции антител против ИФНα или против ИФНαР необязательно содержат пригодные консерванты, такие как хлорид бензалкония, хлорбутанол, парабены и тимерозаль.
Композиции антител против ИФНα или против ИФНαР обычно получают в виде стандартных лекарственных форм любым способом, известным в области фармацевтики. Все способы включают стадию тщательного смешивания активного агента с носителем, который включает один или более дополнительных ингредиентов. В общем случае, композиции антител против ИФНα или против ИФНαР получают равномерным и тщательным смешиванием активного соединения с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или с теми и другими, а затем при необходимости формованием продукта.
В одном варианте композиции являются практически апирогенными.
Композиции, пригодные для парентерального введения, обычно представляют собой стерильный водный или неводный препарат антител против ИФНα или против ИФНαР, который предпочтительно является изотоничным с кровью реципиента. Указанные препараты получают известными способами с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может также представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. Пригодными носителями и растворителями являются вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя обычно используются стерильные жирные масла или суспендирующая среда. Для этих целей можно использовать любое легкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, для получения инъецируемых препаратов используются жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Носители, пригодные для перорального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и др. введения, описаны в справочнике "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA. В некоторых вариантах состав носителя, пригодного для различных способов введения, аналогичен или идентичен носителю, описанному для препарата RITUXAN™. См. материалы Physicians' Desk Reference, 958-960 и 1354-1357, Medical Economics Company, Inc., Montvale, NJ (2005), которые включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки. В некоторых вариантах изобретения композиции антител против ИФНα или ИФНαР получают в виде препаратов для внутривенного введения, содержащих хлорид натрия, дигидрат цитрата натрия, полисорбат 80 и стерильную воду, где величина рН композиции составляет приблизительно 6,5. Для специалиста представляется очевидным, что внутривенное введение является наиболее предпочтительным, поскольку благодаря кровотоку антитела быстро распределяются в организме. Однако внутривенное введение ограничено сосудистым барьером, включающим эндотелиальные клетки сосудистой сети и субэндотелиальный матрикс. В некоторых вариантах, композиции антител против ИФНα или ИФНαР вводятся подкожно самим пациентом. В таких вариантах композицию получают в виде лиофилизованного препарата или в буферном растворе (например, ФСБ и/или цитратном буферном растворе) с концентрацией приблизительно 50 мг/мл.
Препарат по изобретению может содержать несколько активных соединений, если это необходимо для лечения конкретного симптома заболевания, предпочтительно соединений с комплементарной активностью, которые не оказывают неблагоприятное действие друг на друга. Например, может оказаться необходимым применение дополнительного иммунодепрессанта. Такие соединения обычно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными при лечении соответствующего заболевания.
Активные ингредиенты можно также инкапсулировать в микрокапсулы, полученные, например, методом коацервации или межфазной полимеризации, например микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы поли(метилметакрилата), соответственно, помещать в коллоидные системы доставки (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol A., ред. (1980).
Препараты для применения in vivo обычно являются стерильными. Обычно стерилизацию проводят фильтрованием через мембраны для стерилизующей фильтрации. В одном варианте стерильный обозначает практически апирогенный.
Примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитела против ИФНα или ИФНαР, причем указанные матрицы получают в виде стандартных лекарственных форм, таких, например, как пленки или микрокапсулы. Примерами матриц с замедленным высвобождением являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочная кислота/гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы сополимера молочная кислота/гликолевая кислота и лейпролидацетата) и поли-D-()-3-гидроксимасляная кислота. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и молочная кислота/гликолевая кислота, высвобождают белки в течение 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более короткого времени. Инкапсулированные антитела, которые остаются в организме в течение длительного времени, могут денатурироваться или агрегировать под действием влаги и температуры 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможному изменению иммуногенности. Рациональным подходом является применение стабилизирующих агентов в соответствии с механизмом денатурации. Например, если агрегация связана с образованием внутримолекулярной S-S связи, стабилизация достигается за счет модификации сульфгидрильных групп, лиофилизации растворов с кислотным значением рН, контролирования содержания влаги, использования соответствующих добавок и разработки специальных композиций в полимерной матрице. В некоторых вариантах фармацевтически приемлемые носители, используемые в композициях по изобретению, не оказывают влияния на ЗАКЦ или КЗЦ человека.
Композиции антител против ИФНα или ИФНαР по изобретению можно также получать в виде иммунолипосом. "Липосома" представляет собой небольшую частицу, составленную из различных липидов, фосфолипидов и/или ПАВ, которая используется для доставки лекарственного средства (такого как антитела против ИФНα или против ИФНαР по изобретению) в организм человека. Компоненты липосомы обычно образуют липидный бислой, аналогичный бислою биологических мембран. Липосомы, содержащие антитела по изобретению, получают известными способами, такими как описанные в источниках Epstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3688 (1985), Hwang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4030 (1980), US 4485045 и US 4544545. Липосомы с повышенным временем циркуляции в кровотоке описаны в US 5013556. Липосомы получают методом испарения обращенной фазы липидной композиции, включающей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ/фосфатидилэтаноламин (ПЭГ/ФЭ). Липосомы фильтруют на фильтрах с небольшим размером пор для получения фракции с необходимым диаметром. Антитела по настоящему изобретению конъюгируют с липосомами по методике, описанной в статье Martin и др., J. Biol. Chem., 257, 286-288 (1982), с использованием реакции дисульфидного обмена. Терапевтический агент может также содержаться внутри липосомы. См. Gabizon и др., J. National Cancer Inst., (19), 1484(1989).
Примеры
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем. Подразумевается, что примеры включают любые и все варианты, которые становятся очевидными при ознакомлении с полученными результатами.
Пример 1
Индукция системного склероза (ССК) типа «трансплантат-против-хозяина» (ТПХ) на модели мыши
С целью уточнения роли интерферонов типа I (ИФН) в развитии кожного фиброза использовали моноклональные антитела против ИФНАР1 для блокирования сигналов ИФН типа I при системном склерозе на модели мыши, как описано ниже. При этом исследовали воздействие антител анти-ИФНАР на клинические, гистологические, серологические и молекулярные признаки заболевания кожи и почек с целью идентификации механизмов, с помощью которых сигнальный путь ИФН стимулирует дермальный фиброз.
ССК можно индуцировать в организме мыши переносом клеток селезенки от родственных мышей, которые не содержат минорных антигенов гистосовместимости (miHag), в организм мыши с дефицитом зрелых В- и Т-клеток. Суспензию спленоцитов выделяли из 6-10 недельных самок мышей B10.D2-Hc1H2dH2-T18c/nSnJ (B10.D2), при этом эритроциты лизировали при инкубации в 0,8% растворе хлорида аммония в течение 4 мин. Лейкоциты осаждали центрифугированием при 200 g, тщательно промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) и 30×10 клеток вводили мыши-реципиенту 129S6(B6)-Rag2tm 1 FwaN12 (RAG2-/-) через боковую хвостовую вену. Для исследования блокирования сигнального пути ИФН 10 мг/кг МА анти-ИФНАР или изотипа IgG1 в качестве контроля в 0,1 мл ФСБ вводили дважды в неделю внутрибрюшинно, начиная со дня 1 до прививки, и ткани отбирали для анализа через 2 и 4 недели.
Пример 2
Блокада передачи сигнала ИФН типа I при системном склерозе
Клиническая оценка и признаки склеродермии
2
2
2
Профилактическое введение 10 mpk МА анти-ИФНАР два раза в неделю существенно снижает поражение кожи у мышей с ССК (**р<001). Состояние кожи оценивали еженедельно по следующей шкале: 0=норма, 1=поражение<1 см, 2=поражение 1-2 см, 3=поражение >2 см. Минимальная оценка (поражения ушей, хвоста, лап) составляла 0,3 балла, максимальная оценка составляла 3,9 балла. Результаты трех повторных исследований представлены на фиг.2А.
Слабая форма протеинурии, индуцированной ССК, наблюдалась у обеих групп, получавших анти-ИФНАР и контрольный Ig, но не у сингенных привитых реципиентов (см. фиг.2Б).
Клинические признаки ССК: мыши из групп, которым вводили анти-ИФНАР и контрольный Ig в течение 4 недель после прививки, представлены на фиг.2С. У всех животных контрольной группы, которым вводили Ig, наблюдались тяжелые поражения кожи и алопеция, в то время как тяжелые поражения развивались только у 1/5 животных, которым вводили анти-ИФНАР.
Пример 3
Гистопатологический анализ кожи при системном склерозе
Для анализа ССК у подопытных и у контрольных животных из спинной области отбирали образцы кожи через 4 недели после прививки и сравнивали с образцами кожи непривитых RAG2-/-мышей. При этом получали срезы толщиной 5 мкм, окрашенные Н&Е (гематоксилином и эозином), трихромом по Мэссону, и оценивали степень развития воспалительного процесса (0=норма, 1=слабый клеточный инфильтрат, 2=умеренный инфильтрат, 3=первазивный кожный инфильтрат), отложения коллагена (0=норма, 1=слабый, 2=умеренный, 3=тяжелый). Оценки воспалительного процесса и отложения коллагена суммировали для получения гистопатологической оценки с максимальным баллом 6. Лечение анти-ИФНАР снижало общую патологию кожи на 75% (р<0,001). Результаты, приведенные на фиг.3А, являются средними из трех повторов (n=20, ССК+анти-ИФНАР, n=18, ССК+контрольный Ig1). Антитела анти-ИФНАР понижали уровень развития воспалительного процесса и утолщения дермиса при ССК кожи, как показано на фиг.3Б, где приводятся срезы кожи животных с ССК, которым вводили анти-ИФНАR и контрольный Ig, окрашенные Н&Е (слева) и трихромом по Мэссону (справа).
Пример 4
Отложение Ig и комплемента в дермисе при системном склерозе
Замороженные срезы (5 мкм) фиксировали в ацетоне в течение 10 мин, инкубировали в течение 30 мин в присутствии козьих анти-мышиных Ig/ФИТЦ антител (зеленый цвет) или поликлональных крысиных анти-мышиных C1q/PE антител (красный цвет), а затем помещали в DAPI (синий цвет). Результаты представлены на фиг.4А-4Е. Ig и C1q не детектировались у сингенных привитых контрольных животных (А и Г, соответственно), но Ig ярко проявлялся в дермальных фибробластах у мышей, которым вводили контрольный Ig (В) и анти-ИФНАР (В). Отложения C1q наблюдалось в дермальных фибробластах (указано стрелками), эпидермисе и других дермальных структурах у животных, которым вводили контрольный Ig (Д), но не детектировалось в коже животных, которым вводили анти-ИФНАР (Е).
Пример 5
Продуцирование аутоантител и переключение класса у животных при заболевании системным склерозом
В сыворотке животных с ССК (не контрольных) определяли аутоантитела анти-Scl-70 и анти-SSA (IgG, IgA, IgM) методом ИФА, при этом не наблюдалось существенных различий в содержании общего Ig в сыворотке мышей, которым вводили анти-ИФНАР. Результаты приводятся на фиг.5А. Установлено, что переключение класса Ig является интактным у мышей, которым вводили анти-ИФНАР. Результаты, приведенные на фиг.5Б, свидетельствуют о том, что преобладающим классом аутоантител анти-Scl-70 и анти-SSA является IgG1, и в данном случае не наблюдается дефекта в переключении класса после блокады ИФН. Кроме того, исследовали архитектуру ткани селезенки у животных с ССК через 4 недели после прививки. Результаты приводятся на фиг.5В. Замороженные срезы селезенки (толщиной 5 мкм) окрашивали красителем CD45R/B220 (коричневый) и агглютинином из арахиса (красный цвет) с целью идентификации герминальных центров (ГЦ). ГЦ более часто встречаются в селезенке мышей с ССК, а не в селезенке контрольных животных, но не наблюдается существенной разницы в частоте или размере ГЦ у групп мышей, которым вводили анти-ИФНАR и контрольный Ig.
Пример 6
Донорские ПДК являются главным источником ИФН типа I при ТПХ/ССК.
6
В данном примере исследовали ССК-индуцированное увеличение числа плазмоцитоидных дендритных клеток, при этом у реципиентов, которым вводили общий пул спленоцитов, через 2 недели после прививки определяли число ПДК селезенки (B220+/Gr-1lo/CD11b+/CD11c) количественным анализом с использованием ПЦКС. Результаты приводятся на фиг.6А. Число ПДК селезенки у сингенных привитых реципиентов аналогично числу ПДК у непривитых RAG2-/-животных контрольной группы (не приводится). При прививке ПДК-дефицитных донорских спленоцитов было установлено, что донорские ПДК являются главным источником ИФН типа I в модели ТПХ/ССК. Результаты приводятся на фиг.6Б. Спленоциты Gr-1(+) удаляли обработкой клеток в течение 30 мин крысиными анти-мышиными антителами Grl (клон RB68C5), а затем инкубировали в течение 30 мин в присутствии конъюгата овечьих анти-крысиных IgG, иммобилизованных на магнитных гранулах по методике фирмы-производителя. После подтверждения удаления клеток Gr-llo методом ПЦКС остальные спленоциты прививали RAG2-/-реципиентам (30×10 клеток/мышь). У обеих групп животных, которым прививали спленоциты и клетки Gr-1(-) в течение 4 недель развивалась слабая форма протеинурии, но только прививка спленоцитов индуцировала поражения кожи у подопытных животных (**р<0,01, ***р<0,001).
Пример 7
Визуализированная карта генов с повышенной экспрессией в коже мышей, которым вводили МА анти-ИФНАР
Результаты анализа полного геномного микрочипа (ПГМ) свидетельствуют о том, что экспрессия генов, обнаруженных с использование 308 наборов зондов, повышена по меньшей мере в 2 раза (р<0,05) в группе животных, которым вводили контрольные МА изотипа Ig, и нейтрализуется при введении МА анти-ИФНАР по меньшей мере на 50%. Результаты представлены на фиг.7. Наиболее важными путями, которые активируются в коже и которые нейтрализуются МА ИФНАР, являются клеточная адгезия, запускаемая онконстатином М с участием белков МАРК или Jak/Stat, CCR3. Гены, соответствующие 10 группам зондов, характеризуются повышенной экспрессией у группы животных, которым вводили контрольные МА Ig, по меньшей мере в 2 раза (р<0,05) и нейтрализуется в почках за счет введения МА ИФНАР по меньшей мере на 50%. Гены, индуцибельные ИФН типа I, подавляются МА анти-ИФНАР, включающими RSAD2, Ube216, Ube2S, Nfil3 и Lysmd2. Гены, индуцибельные ИФН типа I, определяли предварительной стимуляцией ex vivo цельной донорской крови здорового человека с использованием членов семейства ИФН типа I. Пути, подавляемые МА анти-ИФНАР, включают пути клеточной адгезии, воспаления, реконструкции цитоскелета и апоптоза. Напротив, при ССК почек наблюдается ограниченное действие МА анти-ИФНАР по сравнению с контрольной группой, которой вводили Ig (не приводится). Все образцы анализировали с использованием программного обеспечения Affymetrix mouse genome 430v2.0. Анализ иерархической кластеризации проводили с использованием программного обеспечения SpotFire и Pathway, а сетевые анализы данных генной экспрессии проводили с использованием программного обеспечения MetaCore, интегрированного с программным обеспечением фирмы GeneGo Inc. (St. Joseph, MI).
Пример 8
Количественная оценка экспрессии гена ССК после блокады ИФНАR1 методом ПЦР в режиме реального времени
Для определения экспрессии различных генов, ассоциированных с воспалением и реконструкцией ткани, использовали ТПХ-индуцированный ССК на модели мышей, описанный в примере 1. Результаты экспериментов приводятся на фиг.9А-9В. Образцы кожи быстро замораживали и генерировали кДНК методом обратной транскрипции с использованием очищенных мРНК. Зонды, специфичные в отношении ИФН-индуцируемых генов IFI44, МХ1, OASL и OAS2, воспалительных генов МРО, ФНОα, ИЛ-6 и INOS и генов реконструкции тканей KLF10, TIMP, EPGN и ММР9, наносили на чип Biomark 48.48 Dynamic Array (фирма Fluidigm Corp.) и кДНК анализировали по экспрессии генов. МА 5А3, блокирующие ИФНАР1, существенно подавляли индукцию всех четырех ИФН-индуцируемых генов через 4 недели (IFI44 на 93%, р<0,006, МХ1 на 85%, р<0,0001, OASL на 57%, р<0,02, OAS2 на 81%, р<0,0001), но не существенно воздействовали на экспрессию через 2 недели. Аналогичные результаты были получены при индукции провоспалительного гена, где антитела 5А3 полностью нейтрализовали экспрессию МРО, TNFα, IL-6 и INOS через 4 недели, хотя наблюдалась тенденция в отношении подавления экспрессии через 2 недели, которая не достигала статистической достоверности. Наконец, антитела 5А3 снижали индукцию KLF10, TGF-P респонсивного гена на 47% (р<0,06) через 2 недели и на 91% (р<0,0001) через 4 недели, что свидетельствовало о сильном подавлении главного пути развития фиброза. Антитела 5АЗ также нейтрализовали действие EPGN, митогена эпителиальных клеток, на уровне>95% (р<0,03) через 2 и 4 недели, в то время как гены, ассоциированные с гомеостазом матрикса, TIMP и ММР9, существенно подавлялись антителами 5А3 через 4 недели (на 100%, р<0,05 и 92%, р<0,03, соответственно). В сумме указанные данные свидетельствуют о том, что наряду с подавлением дермального воспаления блокада ИФНАР1 оказывает сильное воздействие на реконструкцию эпителия и количество фибробластов при ТПХ/ССК.
Резюме
В итоге при исследовании системного склероза на модели мышей установлено, что сигнальные пути ИФН типа I играют важную роль в развитии кожного фиброза. Подавление передачи сигнала ИФН с участием рецептора αИФН существенно снижает вероятность развития и тяжесть воспалительного заболевания кожи и способствует восстановлению кожных покровов, в то время как уровень протеинурии и аутоантител, ассоциированных со склеродермией, эквивалентен уровню, наблюдаемому в контролях.
В пользу предлагаемых нами антител свидетельствует наблюдение, что до удаления ПДК из популяций Gr-1(+) донорских спленоцитов не удается индуцировать повреждения кожи в организме мышей и даже существенно повлиять на протеинурию.
Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, для специалиста в данной области представляется очевидным, что возможны различные варианты, которые соответствуют сущности изобретения, описанного в прилагаемых пунктах формулы изобретения.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в описании, включены в текст заявки в качестве ссылки в полном объеме в каждом случае в той же степени, как если бы каждая публикация, патент и патентная заявка цитировались отдельно.