Применение пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана в качестве носителей клеточных культур

Применение пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана в качестве носителей клеточных культур

О.В. Кокорев 1, Г.Ц. Дамбаев 2, В.Н. Ходоренко 1, В.Э. Гюнтер 1

1 НИИ медицинских материалов и имплантатов с памятью формы Томский государственный университет, Томск

2 Сибирский государственный медицинский университет, Томск

Usage of porous-penetrable titanium nickelide incubators as cell culture carriers

O.V. Kokorev 1, GZ. Dambaev 3, V.N. Chodorenko 1, V.E. Gunther

1 Tomsk State University, Tomsk

2 Sibirian State Medical University, Tomsk

В работе представлены данные о способности мульти-потентных мезенхимальных стромальных клеток образовывать популяции хондрогенных и остеогенных тканей в пористо-проницаемых инкубаторах из никелида титана.

Установлено достоверное увеличение активности щелочной фосфатазы и процентного веса сухого инкубатора в остеогенной среде, а также значительное повышение содержания ДНК в инкубаторе в хондрогенной среде. Сканирующая электронная микроскопия показывает развитие клеток в поровом пространстве инкубатора во временном интервале.

Комплексное исследование на патофизиологической модели опухолевого роста показало эффективное антиме-тастатическое действие общей популяции клеток аллоген-ного костного мозга в инкубаторах из пористого никелида титана и их пролонгированный эффект.

Ключевые слова: аллогенные клетки костного мозга, пористый инкубатор из никелида титана.

The present work assesses the potential of three-dimensional porous-penetrable nickelid titanium scaffolds for applications in cartilage and bone engineer-ing through in vitro experimentation. Determinated significant increased of activity of an alkaline phosphatase and percentage weight (calcium content) of a dry incubator in osteogene medium, and also considerable quantity of DNA (DNA content), in an incubator in chondrogenic medium is installed. The scanning submicroscopy shows development of cells in porous space of incubator in time. The scanning submicroscopy confirms the conforming quantitative results. Stages of development of tissues are adequately reflected in a histochemical staining of tissue layers of an incubator.

The complex probe on a pathophysiological model of growth tumor has shown more effective antimetastatic effect of common population cells of an allogenic bone marrow in volume incubators from a porous nickelid titan and their prolonged effect.

Keywords: scaffold, allogenic stem cells, NiTi-alloy, nickel-titanium alloy, bone marrow.

В настоящее время применение биоматериалов включает в основном следующие направления:

1) функциональные материалы;

2) системы доставки лекарственных препаратов;

3) скаффолды — временные и постоянные клеточные подложки, поддерживающие или корректирующие функцию органа;

4) внешние коммуникационные устройства;

5) поверхностные покрытия [1—4].

Новые «интеллектуальные» материалы требуют и новейших разработок тестирования, они должны чутко реагировать на температуру, pH, биоактивные молекулы [5, 6].

Стандартом культуральной системы является мо-послойная культура, где клетки выращиваются на плоской поверхности. Однако, она не может воспроизвести пространственное расположение клеток, аналогичное естественным тканям и редко переводит популяцию клеток в функционирующую ткань. В настоящее время большинство подложек, носителей, матриц (scaffolds) для клеток представляют собой трехмерную пористую поверхность, в которой ткань может расти и развиваться. В трехмерном объеме матрицы клетки способны строить заданный тип ткани с ее сложной объемной архитектоникой.

Цель биоинженеров заключается в создании трехмерного эквивалента ткани взамен поврежденной или

e-mail: kokorevov@yandex.ru

удаленной части, которая в инкубаторе может быть имплантирована в организм для излечения заболевания или устранения дефекта [7].

Технология создания матриц для клеточных культур предусматривает доступ клеток к питательным веществам и выводу ненужных метаболитов, а также обеспечивают трехмерное пространственное развитие. По этой причине большинство скаффолдов, независимо от материала, созданы пористыми [7]. Неорганические материалы, такие как биоактивные стекла, и фосфорнокислый кальций широко используются для воспроизведения (в данном контексте — инжениринга) костной ткани, в основном, из-за общих черт конфигурации структуры и их способности к интеграции с естественным минеральным комплексом кости [8]. Биоактивные стекла формируются и спекаются из порошка, и чтобы создать пористую структуру, их раствор вспенивают для образования пористого геля [9]. Точно так же пористость может быть спроектирована в полимерах, например, в полиэфирах (которые обладают преимуществом биологического разложения) [10, 11]. Пористые матрицы создают и из естественных материалов — например, гели коллагена могут быть высушены сублимацией перед клеточным засевом [12]. Но у каждого скаффолда есть свои недостатки. Неорганические скаффолды, такие как керамика и стекла, имеют низкий уровень

А

физико-механических свойств, и не могут использоваться в конструкциях, несущих значительную знакопеременную нагрузку. Биоактивные стекла, созданные всего 30 лет назад, ограничены в применении, из-за несоответствия их свойств свойствам тканей и используются лишь для замены малых объемов костей. Искусственные полимеры воспринимаются организмом как инородное тело, клетки к ним плохо адгезируются, они имеют низкий уровень проницаемости и смачиваемости из-за гидрофобных свойств поверхности. Продукты их деструкции, в случае полиэфиров и кислых веществ, опосредованно могут создать нефизиологически кислую, токсичную микросреду.

Материалы на основе коллагена могут быть более перспективными, хотя бы потому, что естественный процесс остеогенеза включает минерализацию именно коллагена [13]. Другие общие проблемы, возникающие с пористыми скаффолдами, связаны с прикреплением и адаптацией клеток в трехмерной макросреде пористого матрикса. Данная проблема решается до некоторой степени изменением структуры поверхности и уменьшением размера пор.

В НИИ медицинских материалов (Томск) созданы пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана, которые обладают уникальными свойствами: имеют пористо-проницаемую структуру за счет открытых пор, высокой смачиваемостью тканевыми жидкостями, высокой биологической, биомеханической и биохимической совместимостью на клеточном уровне и отвечают многим перечисленным выше требованиям [14].

Известно, что костный мозг содержит популяцию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), способных формировать несколько видов тканей, включая хрящевую и костную. Заместительная биоинженерия тканей и органов человека имеет неограниченный потенциал возможностей получения, сохранения и использования источника органов для клинического применения [15, 16]. Геометрический рост числа дегенеративных заболеваний скелетно-мышечной системы и травм, при этом высокая стоимость хирургических реконструкций, подводят нас к исследованиям, связанными с созданием на основе инкубаторов-носителей клеточных культур и тканей эквивалентов кости и хряща. Для этих целей используют пористые матрицы в комбинации с клеточными популяциями и добавлением различных диф-ференцировочных факторов [17—19]. В последующем данные комплексы имплантируются in vivo, восстанавливая и реконструируя больной организм. Более того, имплантация инкубаторов с развивающимися тканями в структуре пор приводит к более быстрой регенерации прилежащих тканей и ускорению закрытия дефекта по сравнению с другими типами лечения [20—22].

Исследования по биосовместимости никелид-ти-тановых подложек с клетками фетальной печени, в-клетками поджелудочной железы и костного мозга проводились на различных патофизиологических моделях [23—25]. Гибридные искусственные органы применялись и в онкологии [26]. В настоящее время одним из наиболее эффективных методов при лечении неоперабельных онкологических заболеваний используют так называемую миниаллогенную трансплантацию. При данном виде лечения основной упор делается на реакцию «трансплантат против опухоли», а не на цитостатическую терапию. Согласно предва-

рительным данным, проведение такого лечения позволяет надеяться на длительную ремиссию у больных с метастатическим раком, не ответившим на предшествующую терапию. Противоопухолевый иммунный ответ после аллогенной трансплантации может быть усилен за счет дополнительных трансфузий донорских лимфоцитов. Как показывают исследования, введение лимфоцитов донора позволяет добиться полной ремиссии опухоли даже в случае рецидива после аллогенной трансплантации от того же донора, но данные эффекты нестабильны и не продолжительны, из-за быстрой элиминации донорских лимфоцитов [27—29]. Пористые инкубаторы из никелида титана позволяют сохранить и пролонгировать действие введенных клеток [26].

Цель исследования — изучение возможности применения пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана, как матрицы для построения тканевых эквивалентов; изучение возможности модуляции противоопухолевого ответа при трансплантации аллоген-ного костного мозга в пористо-проницаемом инкубаторе из никелида титана.

Материал и методы

Пористо-проницаемые инкубаторы. Использовались пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана (4x4x10) с проницаемой пористостью в интервале — 40—60% и соответствующим распределением пор по размерам [14]. Перед испытанием инкубаторы выдерживались при Т=180°С, охлаждались и помещались в полную культуральную среду.

Клеточные культуры. Использованы костномозговые ММСК мышей-гибридов F1 CBA/j. После декапи-тации у животных в стерильных условиях извлекали бедренные кости. Костный мозг вымывали с помощью шприца во флаконы. Концентрацию клеток до-x

санные инкубаторы; помещали в 50 мл пластиковые флаконы (Corning). Проводили культивирование инкубатора без клеток и с клетками костного мозга в среде, которая состояла: из среды DMEM-F12 (ПанЗко, РФ), 10% сыворотки плодов коров (HyClone, США), гентамицина 40 мкг/мл (ПанЗко, РФ), глутамина 250мг/л (ПанЗко, РФ). В систему с остеогенной дифференцировкой были добавлены дифференциро-вочные добавки: p-глицерофосфат 3 мг/мл (Sigma, США) в комбинации с 0,15 мг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma, США). В хондрогенную среду был до-p

с клетками содержали при 37°С при 100% влажности с 5% С02. Культивирование продолжалось в течение 28 сут. с заменой среды через каждые 6 сут. Периодически проводили окраску материала специфическими красителями.

После 28 сут. культивирования проводили взвешивание влажных образцов, затем образцы высушивали и определяли их вес.

Содержание ДНК. Содержание ДНК в инкубаторах определяли замораживанием в 3 мл ddH20 и размораживанием под действием ультразвука, затем центрифугировали и освобождались от дебриза. К порции ДНК добавляли 95 мл нагретого 10 ТЕ-буфе-ра с 1,5 М NaCI и 5% SDS. Затем обрабатывали РНКа-зой (20 мг) и протеинкиназой К (800 мг). Раствор был экстрагирован хлороформом и затем преципи-тирован в изопропаноле, промыт в 70% этаноле и разведен в ТЕ-буфере. Количество и чистоту ДНК

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

определяли спектрофотометрически при длине волн 260 и 280 нм.

Активность щелочной фосфатазы. Исследование щелочной фосфатазы было произведено р-нитрофе-ноловым методом. Клетки вымывались смесью 10 мм Tris-HCI (ph = 7,6) и 0,1% Triton Х-100. Экстракты готовились на 0, 7, 14, 21, 28-е сут. Активность щелочной фосфатазы была измерена спектром поглощения р-нитрофенола при 405 nm (Sigma-Aldrich, США).

Гистологические окраски. Признаки хондрогенной дифференцировки определяли по ярко-голубой окраске толлуидиновым голубым.

Остеогенную дифференцировку культур определяли окраской ализариновым красным S (Даль, 1952). Навеску ализаринового красного S (Биолот, Россия) в 100 мг растворяли в 9,9 мл бидистиллированной воды. Доводили pH до 4,1—4,3 слабым раствором 10% аммиака. Препараты окрашивали в течение 1,5 мин.

Выявление солей кальция производили методом ван Косса. Использовался фиксированный клеточный материал — препараты, погружённые в приготовленный ex tempore 5% раствор нитрата серебра на 30 мин. Далее флакон помещали под ультрафиолетовое освещение. Промывали дистиллированной водой и фиксировали в 5% растворе натрия тиосульфата (Луппа X., 1980).

Сканирующая электронная микроскопия. Образцы были зафиксированы в течение 1 ч в 2,5% глюта-ральдегиде (Sigma-Aldrich, США), затем промыты

3 раза в PBS (15 мин каждый), далее их фиксировали 1 ч в 1% тетраоксиде осмия (Sigma-Aldrich, США), промывали 3 раза в PBS, и затем дегидратировали, пропуская через ряд растворов этанола (30%, 50%, 70%, 90%, 100%) по 15 мин в каждом. Фиксированные и дегидратированные образцы были высушены, и каждый образец инкубатора был исследован на растровом сканирующем электронном микроскопе Philips 513 и на Quanta 200 3D.

Модели in vivo. В работе использовали штамм солидной опухоли меланомы В-16 (пигментный вариант), которая была получена из лаборатории опухолевых штаммов Российского онкологического научного центра РАМН (Москва). Опухоль прививалась животным по общепринятой методике.

Для имплантации использовали ткани костного мозга мышей C57BI/6. Клеточные суспензии костного мозга получали общепринятыми методами, жизнеспособность клеток в суспензии при оценке методом витальной окраски трипановым синим составляла не менее 90%. Клеточная суспензия в концентрации 1х107 клеток в полной культуральной среде (ПС) засевалась на инкубатор из пористо-проницаемого никелида титана и культивировалась 24 ч при 37°С в 5% атмосфере С02. Затем инкубатор вшивался внут-рибрюшинно животному под эфирным наркозом. Материал для исследований забирали на 20—21 -е сут. роста опухоли. При постановке экспериментов животные распределялись по 4 группам:

— 1-я группа «контроль» — интактные мыши;

— 2-я группа «опухоль» — мыши с опухолью;

— 3-я группа «КМ» — мыши с опухолью и однократной инъекцией суспензии клеток аллогенного костного мозга внутрибрюшинно;

— 4-я группа «KM+TiNi» — мыши с опухолью и имплантированным пористым инкубатором из никелида титана с культивированными на нем клетками костного мозга.

Динамика роста опухолей оценивалась по изменению объема, который вычислялся по формуле Р. Шрека (1980) и массе опухоли. Об эффективности терапии судили по проценту торможения роста опухоли (ТРО), который вычислялся по формуле:

ТРО = (Vk-Vo)/Vkx 100%,

где Vk — объем опухоли в контроле; Vo — объем опухоли в опыте.

Распостраненность метастатического процесса оценивали по частоте метастазирования, среднему количеству и объему метастазов в легких. Для оценки антиметастатической активности вычисляли индекс ингибирования метастазов (ИИМ,%) по формуле:

ИИМ = ((AxB -AxB)/AxB) x 100%,

К К к к ’

где Ак и А — частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опытной групп; Вк и В — среднее число метастазов в контрольной и опытной группах.

Общий объем метастазов вычисляли, исходя из диаметра отдельных метастатических узлов:

V (мм3) = 0,52 D (мм).

Статистическую обработку проводили с использованием параметрических и непараметрических критериев оценки достоверности из пакета статистических компьютерных программ «Statistika-б».

Результаты и обсуждение

Эксперименты in vitro

Перед проведением эксперимента все инкубаторы подвергались контрольному взвешиванию. Далее образцы были взвешены непосредственно после извлечения из культуральной системы, затем они высушивались, и определялось процентное отношение к весу влажной конструкции. Масса влажных инкубаторов не имела достоверных различий после 28 сут. культивирования в различных средах. При сравнении процентного соотношения высушенных инкубаторов наблюдается достоверное увеличение их веса. Процентное соотношение веса инкубаторов, которые культивировались в остеогенной среде было в 2 раза больше по сравнению с контрольной группой и увеличено в 1,6 раз по сравнению с группой, где конструкции культивировались в хондрогенной среде. Данный факт говорит о наработке специфического матрикса остеогенными клетками, что, по-видимому, связано с большим количеством кальция, чем в матриксе хондрогенных клеток (рис. 1).

I ,

I .

Контроль КМ

Остео

Хондро

Рис. 1. Вес сухих инкубаторов [% соотношение) на 28-е сут. культивирования

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

Содержание ДНК и щелочной фосфатазы также указывает на различия в культивировании ММСК с различными факторами дифференцировки. При исследовании количества ДНК отмечен наибольший уровень в инкубаторах с хондрогенной дифференци-ровкой, где этот показатель достоверно превышал уровень контрольной группы в 1,8 раз и уровень инкубаторов, которые культивировались в остеогенной среде в 5,5 раз Срис. 2).

0,014

Контроль КМ Остео Хондро

Рис. 2. Количество ДНК в образцах [% соотношение) на 28 сут. культивирования

В то же время активность щелочной фосфатазы (ранний маркер остеобластического фенотипа) была наибольшей в инкубаторах с остеогенной диффе-ренцировкой и превышала данный показатель в 3,2 раза в инкубаторах контрольной группы и в 3,8 раза

Контроль КМ Остео Хондро

Рис. 3. Активность щелочной фосфатазы [единица активности на г влажного веса) в образцах на 28-е сут. культивирования

Развитие хондрогенной дифференцировки было доказано гистологически позитивной окраской толуи-диновым голубым, а остеогенная дифференцировка была подтверждена окраской по ван Косса коричнево-черными выделениями кальцифицированного матрикса и ализариновым красным. При этом сравнительная окраска контрольных препаратов значительно отличалась от окраски клеток в инкубаторах, которые культивировались в специализированных средах. Данный факт подтверждает возможность использования инкубаторов из никелида титана как подложки для культивирования ММСК. При этом клетки в инкубаторе возможно дифференцировать факторами дифференцировки двух направлениях — хондро- и остеогенном.

Развитие ММСК в поровом пространстве инкубаторов было исследовано с использованием сканирующего электронного микроскопа во временном промежутке (1 нед.). На рис. 4 (А) показана исходная пористая структура никелида титана, полученная методом самораспостраняющегося высокотемпературного синтеза. К концу первой недели внутри пор наблюдалось прикрепление клеток и их размножение (см. рис. 4Б). В течение второй недели происходило дальнейшее разрастание клеточной популяции в порах инкубатора и синтез межклеточного матрикса (рис. 5). В конце третьей недели большинство пор инкубатора оказываются полностью заполненными клетками и соответствующим матриксом (рис. 6). Данный эффект стабильно прослеживается как in vitro, так и in vivo — образцы инкубаторов прорастают тканями и заполняют поры инкубатора в течение 3—4 нед.

Рис. 4. Пористая структура инкубаторов из никелида титана до [А) и через 1 нед. после засева клеточной культурой [Б)

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

Рис. 5. Развитие матрикса в порах никепид-титанового инкубатора через 14 сут. после засева клетками

Рис. 6. Поры никелид-титанового инкубатора заполненные клетками и матриксом через 21 сут. после засева клетками

Структура пористо-проницаемых инкубаторов, по нашему мнению, не влияла на направленную диффе-ренцировку и развитие хондро- и остеогенных тканей из ММСК. Наблюдалось неуклонное заполнение внутреннего порового пространства инкубаторов специфическими клетками с образованием специализированного для данных тканей матрикса.

Пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана были исследованы на патофизиологической модели in vivo. Были получены результаты по модуляции противоопухолевого ответа после трансплантации аллогенного костного мозга (КМ) на пористо-проницаемых инкубаторах. Согласно полученным данным (табл. 1), введение костного мозга снижает метаста-зирование на 30% и обладает незначительным (10%) противоопухолевым эффектом. В то же время имплантация клеток КМ на инкубаторе-носителе приводит к более выраженным противоопухолевым (25%) и существенным антиметастатическим эффектам

(45%). Кроме того, продолжительность жизни животных с опухолями и имплантированным КМ на инкубаторе из никелида титана увеличивалась на 60%.

Показана умеренная противоопухолевая и антиме-тастатическая активность клеток костного мозга, трансплантированных на пористом носителе из никелида титана in vivo. Так как клетки костного мозга (КМ) не оказывают прямого антипролиферативного эффекта на опухолевые клетки-мишени in vitro, то можно считать, что одним из возможных механизмов влияния трансплантации костного мозга на опухолевый процесс является стимуляция эндогенных эффекторов противоопухолевого иммунитета.

Исследование морфофизиологических параметров иммунокомпетентных органов показало, что введение аллогенных клеток костного мозга способствует уменьшению регрессии тимуса и уменьшает сплено-мегалию у животных с перевиваемыми опухолями (табл. 2).

А

Таблица 1. Показатели противоопухолевой и антиметастатической активности у мышей С57В1./6 с меланомой В-1 В после трансплантации аллогенного костного мозга на пористо-проницаемых инкубаторах из никелида титана

Группы ЖИВОТНЫХ Торможение роста опухоли (%) Частота метастазирования (%) Среднее число метастазов Х±т Индекс ингибиции метастазирования (%) Средний объем метастазов (мм3) Х±т

Опухоль - 100 22,2±2,S - 26,8±2,7

КМ 10,3 80 16,8±2,0 29,S 20,1±2,1

P<0,0S P<0,0S

KM+TiNi 24,7 80 14,6±2,S 4SD8 18,2±3,9

P<0,0S P<0,0S

Примечание: Р<0,05 — различия достоверны с группой «Опухоль».

Таблица 2, Параметры опухоли и органов иммунитета после трансплантации аллогенного костного мозга на пористо-проницаемых инкубаторах из никелида титана у мышей С57ВІ./6 с меланомой В-1Є

Группы ЖивотныХ Масса селезенки

Контроль 74±SD8 33DS±1D8 - -

Опухоль 476±60 7,S±3,2 12,01S±1,074 31,6±1,72

КМ 299±96 17,1±1,6 11,S9S±0,663 30,2±1,02

KM+TiNi 242±S3 22D8±2D8 10,303±0,S88 29D6±1D44

P<0,0S P<0,0S P<0,0S

Примечание: Р<0,05 — различия достоверны с группой «Опухоль»

Заключение

Таким образом, показана направленная дифферен-цировка ММСК в хрящевую или костную ткани внутри пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана.

Выявлено, что трансплантация аллогенных клеток костного мозга на пористом инкубаторе пролонгирует и усиливает противоопухолевое и антиметастатическое действие по сравнению с инъекционным введением клеток. Это связано с обеспечением оптимальных условий сохранения жизнеспособности и функциони-

рования донорских клеток в пористо-проницаемой структуре инкубатора и маскирующем эффекте от воздействия иммунной системы хозяина.

Растровая электронная микроскопия позволила проанализировать заполнение порового пространства клетками и развитие клеток и тканей в поровом пространстве инкубатора во временном промежутке. Комплекс исследованных гистологических и патофизиологических параметров отображает высокую биосовместимость исследуемых инкубаторов с данными типами клеток.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Kirkpatrick C.J., Bittinger F., Wagner M. et al. Current trends in biocompatibility testing. Proc. Inst. Mech. Eng. 1998; 212: 75—84.

2. Pizzoferrato A., Ciapetti G., Stea S. et al. Cell culture methods for testing biocompatibility. Clin. Mater. 1994; 15: 173—90.

3. Ramakrishna S., Mayer J., Wintermantel E. et al. Biomedical applications of polymer-composite materials: a review. Compos. Sci.Technol. 2001; 61: 1189-224.

4. Seal B.L., Otero T.C., Panitch A. Polymeric biomaterials for tissue and organ regeneration. Mater. Sci. Eng. Rep. 2001; 34: 147—230.

5. Qiu Y., Park K. Superporous ipn hydrogels having enhanced mechanical properties. AAPS Pharmsci Tech. 2003; 4:E51.

6. Qiu Y, Park K. Environment-sensitive hydrogels for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 2001; 53: 321—39.

7. Sakiyama-Elbert S.E., Hubbell J.A. Functional biomaterials: design of novel biomaterials. Annu Rev Mater Res. 2001: 183—201.

8. Jones J.R., Ehrenfried L.M., Flench L.L. Optimising bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 2006; 27C7): 964—73.

9. Rezwana K., Chena Q.Z., Blakera J.J. et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2006; 27: 3413—41.

10. Ginty P.J., Floward D., Rose F.R. et al. Mammalian cell survival and processing in supercritical C02. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 7426-31.

11. Regen М., Murphy S., Murphy T. Drug users’ lay consultation processes: symptom identification and management. Advances in Medical Sociology 2002; 8: 323-41.

12. O’Brien F.J., Flarley B.A., Yannas I.V. et al. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials 2004; 25Ш): 1077—86.

13. Phillips J.E., Flutmacher D.W., Guldberg R.E. et al. Mineralization capacity of Runx2/Cbfa1-genetically engineered fibroblasts is scaffold dependent Biomaterials 2006; 27 [321: 5535^15.

14. Гюнтер B.3., Ходоренко В.FI., Ясенчук Ю.Ф. и др. Е1икелид титана. Медицинский материал нового поколения. Томск: Изд-во МИЦ; 2006.

15. Griffith L.G., Naughton G. Tissue engineering —current challenges and expanding opportunities. Science 2002; 295: 1009—114.

16. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering. Science 1993; 260: 920-26.

17. Rikli D.A., Regazzoni P., Perren S.M. Is there a need for resorbableimplants or bone substitutes? Injury 2002; 33: 2—3.

18. Rose F.R., Oreffo R.O. Bone tissue engineering: hope vs. hype. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 292: 1—7.

19. Vacanti J.P., Langer R. Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation. Lancet 1999; 354: 32—39.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

20. Cancedda R., Dozin B., Giannoni P. et al. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone. Matrix. Biol. 2DD3; 22: 81—91.

21. Kuo C.K., Li W.J., Mauck R.L. et al. Cartilage tissue engineering: its potential and uses. Curr Opin Rheumatol. 2DD6; 18: 64—73.

22. Sharma B., Elisseeff J.H. Engineering structurally organized cartilage and bone tissues. Ann. Biomed. Eng. 2DD4; 32: 148—59.

23. Гюнтер B.3., редактор. Материалы с памятью формы и новые технологии в медицине. Томск: Изд-во «НПП МИЦ»; 2DD6.

24. Кокорев О.В. Противоопухолевое действие трансплантатов фетальных клеток на пористом носителе из никелида титана. Автореф. дис. на соиск. учен. ст. к.м.н. — М.; 2DDD

25. Гюнтер В.З., редактор. Биосовместимые материалы и имплантаты с памятью формы. Томск: STT; 2DD1. — С. 45—53.

26. Gunther V.E., editor. Shape memory biomaterials and implants. Proceedings of international conference. Tomsk: STT; 2DD1. — C. 220—2.

27. Подольцева З.И. Реакция «трансплантат против опухоли» — перспективный метод иммунотерапии злокачественных новообразований. Практическая онкология 2DD3; 4[3): 175—82.

28. Барышников А.Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма. Практическая онкология 2DD3; 4[3): 127—30.

29. Rosenberg S.A., Yang J.C., Restifo N.P. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat Med. 2004; 10C9): 909—15.

Поступила 20,12,2009

А