СОЕДИНЕНИЯ, ПОЛЕЗНЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ
COMPOUNDS, USEFUL FOR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE MALFUNCTIONS

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США, серийный номер 60/681,662, поданной 17 мая 2005 г., включенной в данную заявку во всей полноте посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к фармацевтически активным соединениям, полезным для лечения или ослабления тяжести протекания нейродегенеративных нарушений.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В ходе различных гистопатологических, генетических и биохимических исследований было установлено, что центральную роль в развитии болезни Альцгеймера играет амилоидный бета-пептид с длинной цепью, в частности Аβ(1-42). См. Selkoe, DJ, Physiol. Rev. 2001, 81:741-766, Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy (Болезнь Альцгеймера: гены, белки и терапия), and Younkin SG, J Physiol Paris. 1998, 92:289-92, The role of A beta 42 in Alzheimer's disease (Роль A beta 42 в болезни Альцгеймера). В частности, было обнаружено, что отложение Аβ(1-42) в мозге является ранним и инвариантным признаком всех форм болезни Альцгеймера. Фактически отложения возникают еще до того, как становится возможным диагностирование болезни Альцгеймера, и до появления отложений более короткой первичной формы А-бета, Аβ(1-40). См. Parvathy S, et al. Arch Neurol. 2001, 58:2025-32, Correlation between Abetax-40-, Abetax-42-, and Abetax-43- containing amyloid plaques and cognitive decline (Корреляция между Abetax-40-, Abetax-42-, и Abetax-43- содержащими амилоидные бляшки и когнитивные нарушения). Предположение об участии Аβ(1-42) в этиологии заболевания сделано исходя из наблюдения: мутации генов пресенилина (гамма секретазы), связанных с ранним проявлением семейных (наследственных) форм болезни Альцгеймера, приводят в конце концов к повышению содержания Аβ(1-42). См. Ishii K, et al. Neurosci Lett. 1997, 228:17-20, Increased A beta 42(43)-plaque deposition in early-onset familial Alzheimer's disease brains with the deletion of exon 9 and the missense point mutation (Hl 63R) in the PS-I gene (Увеличение отложений А бета 42(43) - бляшек в мозге субъектов с ранними проявлениями семейной формы болезни Альцгеймера с делецией экзона 9 и точечной миссенс-мутацией (Hl 63R) PS-I гена). Дополнительные мутации амилоидного прекурсора белка АРР увеличивают общее содержание Аβ, а в отдельных случаях - повышают содержание одного лишь Аβ(1-42). См. Kosaka Т, et al. Neurology, 48:741-5, Мутация бета АРР717 при болезни Альцгеймера, приводящая к повышению содержания в плазме бета-амилоидного белка, заканчивающегося А beta42(43). Несмотря на влияние различных мутаций АРР на тип, количество и расположение Аβ отложений, было обнаружено, что в образцах отложений в мозговой паренхиме преобладающие и первичные отложения представляют собой длинную форму Aβ (Mann). См. Mann DM, et al. Am J Pathol. 1996, 148:1257-66, Predominant deposition of amyloid-beta 42(43) in plaques in cases of Alzheimer's disease and hereditary cerebral hemorrhage associated with mutations in the amyloid precursor protein gene (Преобладающие отложения бета-амилоида 42(43) в бляшках при болезни Альцгеймера и наследственной церебральной геморрагии, связанных с мутацией гена предшественника амилоидного белка).
В отложениях Аβ на ранних стадиях, когда большая часть белковых отложений представляет собой аморфные или диффузные бляшки, практически весь Аβ присутствует в виде длинной формы. См. Gravina SA, et al. J Biol Chem, 270:7013-6, Бета-амилоидный белок (А бета) в мозге, пораженном болезнью Альцгеймера. Биохимический и иммуноцитохимический анализ с антителами, специфичными для форм с А бета 40 или А бета 42(43) концевым пептидом; Iwatsubo Т, et al. Am J Pathol. 1996, 149:1823-30, Бета-амилоиды (1-42(43)) полной длины (1-42(43)), амино-концевые модификации и отложения укороченного бета-амилоида 42(43) в диффузных бляшках; и Roher AE, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1993, 90:10836-40, Бета-амилоид (1-42) как главный компонент цереброваскулярных амилоидных отложений: участие в патологии болезни Альцгеймера. Первичные отложения Аβ(1-42) являются центрами образования отложений как длинной, так и укороченной формы Аβ(1-42). См. Tamaoka A, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1994, 205:834-42, Биохимические доказательства роли длинной формы (A beta 1-42/43) бета-амилоидного белка как молекулы-затравки при образовании церебральных отложений при болезни Альцгеймера.
Возникновение отложений у трансгенных животных с экспрессией Аβ связывают с повышением содержания Аβ (1-42); картина распределения отложений подобна наблюдаемой у человека с таким же заболеванием, за ранними отложениями Аβ(1-42) следует отложение Аβ(1-40). См. Rockenstein E, et al. JNeurosci Res. 2001, 66:573-82, Early formation of mature amyloid-beta protein deposits in a mutant APP transgenic models depends on levels of Abeta(1-42); и Terai K, et al. Neuroscience 2001, 104:299-310, beta-Amyloid depsits in transgenic mice expressing human beta-amyloid precursor protein have the same characteristics as those in Alzheimer's disease. Аналогичные картины локализации и времени развития отложений наблюдают у пациентов с синдромом Дауна; в этом случае экспрессия Аβ увеличена и скорость образования отложений также повышена. См. Iwatsubo Т, et al. Ann Neurol. 1995, 37:294-9, Отложения бета-амилоидного белка: Отложения А бета 42(43) предшествует отложению А бета 40 при синдроме Дауна.
Соответственно, селективное снижение содержания Аβ (1-42) может быть положено в основу специфической к конкретному заболеванию стратегии замедления развития амилоидных отложений всех форм Аβ, замедления или остановки формирования новых отложений Аβ, ингибирования образования растворимых токсических олигомеров Аβ и, таким образом, замедления или остановки нейродегенеративного процесса в целом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предложены соединения для лечения или ослабления тяжести нейродегенеративных нарушений. Настоящее изобретение предлагает также способы лечения или ослабления тяжести подобных нарушений, при этом указанные способы включают этап введения пациенту соединения согласно настоящему изобретению или композиции, содержащей указанное соединение. Упомянутые способы пригодны для лечения или ослабления тяжести, например, болезни Альцгеймера.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
1
На Фигуре 1 представлены Н ЯМР спектры хроматографических фракций sat14-9 и sat14-10.
1
На Фигуре 2 представлены Н ЯМР спектры хроматографических фракций sat14-11 и sat14-12.
1
На Фигуре 3 представлены Н ЯМР спектры хроматографических фракций sat15-1 и sat15-2.
1
На Фигуре 4 представлены Н ЯМР спектры хроматографических фракций sat15-4 и sat15-5.
На Фигуре 5 представлена хроматограмма, полученная на силикагеле С-18 методом обращенно-фазной ВЭЖХ, на которой видно увеличение эффективности хроматографического выделения фракции sat15-1, где числа 1-5 соответствуют времени выхода фракций sat16-1 - sat16-9.
1
На Фигуре 6 представлен Н ЯМР спектр фракции sat16-3, соответствующей соединению 6, чистота 98%.
На Фигуре 7 представлена суммарная схема процесса выделения соединения согласно протоколу 2.
На Фигуре 8 представлена хроматограмма ВЭЖХ экстракта клопогона кистевидного после полу-препаративной ВЭЖХ.
На Фигуре 9 представлена хроматограмма ВЭЖХ Соединения 6, на которой присутствует небольшой пик, соответствующий деацильной группе.
На Фигуре 10 представлена хроматограмма ВЭЖХ Соединения 6.
На Фигуре 11 представлен масс-спектр деацил-Соединения 6.
1
На Фигуре 12 представлен Н ЯМР спектр деацил-Соединения 6.
На Фигуре 13 представлена хроматограмма ВЭЖХ Соединения 6.
1
3
На Фигуре 14 представлен Н ЯМР спектр (CDOD) Соединения 6.
На Фигуре 15 представлен масс-спектр Соединения 6.
На Фигуре 16 представлена хроматограмма ВЭЖХ Соединения 6, выделенного согласно протоколу 2, детекция на волне 205 нм.
На Фигуре 17 представлена хроматограмма ВЭЖХ Соединения 6, выделенного согласно протоколу 2, детекция на волне 230 нм.
На Фигуре 18 представлена хроматограмма ВЭЖХ Соединения 6, детекция по светорассеянию испаренного образца (ELSD).
1
На Фигуре 19 представлен H ЯМР спектр Соединения 6, выделенного согласно протоколу 2.
На Фигуре 20 представлен масс-спектр Соединения 6, выделенного согласно протоколу 2.
На Фигуре 21 показано воздействие Соединения 6 на соответствующее количество бета-амилоида (1-40), (1-42), (1-37), (1-38) и (1-39), определенное методом иммунопреципитации в сочетании с масс-спектрометрией, IP-MS (immunoprecipitation combined with mass spectrometry).
На Фигуре 22 показано действие Соединения 6 на соответствующее количество бета-амилоида (1-40), (1-42), (1-37), (1-38) и (1-39) в клетках дикого типа (немутантных) и клетках с мутацией 717, определенное методом IP-MS.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ПРИМЕРОВ РЕАЛИЗАЦИИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Общее описание соединении согласно изобретению
Согласно одному из примеров реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль, где
каждое из колец А, В, С, D и Е независимо представляет собой насыщенное кольцо, частично ненасыщенное, или ароматическое кольцо;
2
G представляет собой S, СН, NR или О;
1
2
1
2
2
каждый R и R независимо представляет собой галоген, R, OR, соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, SR, соответствующим образом защищенную тиолгруппу, N(R) или соответствующим образом защищенную аминогруппу, или R и R вместе образуют 3-7-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера;
1-6
каждый R независимо представляет собой водород, возможно замещенную Cалифатическую группу, или возможно замещенное 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера, где
два R при одном атоме азота, возможно, вместе с указанным атомом азота образуют 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 1-4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера;
n принимает значение 0-2;
3
4
7
8
2
2
2
2
2
2
каждый R, R, R и R независимо выбран из группы: галоген, R, OR, соответствующим образом замещенная гидроксильная группа, SR, соответствующим образом замещенная тиолгруппа, SOR, OSOR, N(R), соответствующим образом замещенная аминогруппа, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R);
m принимает значение 0-2;
5
3
2
3
2
2
2
2
2
2
R представляет собой Т-С(R'), T~C(R')C(R”), R, OR, соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, SR, соответствующим образом защищенную тиолгруппу, SOR, OSOR, N(R), соответствующим образом защищенную аминогруппу, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R), или:
5
6
5
3
2
3
если R представляет собой Т-С(R') или Т-С(R')С(R”), то R и R' группа при Rвозможно вместе образуют 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатома, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера;
1-6
2
каждый Т независимо представляет собой валентную связь или возможно замещенную прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную C алкилиденовую цепь, где до двух метиленовых групп Т возможно содержат независимые заместители: -O-, -N(R)-, -S-, -С(O)-, -S(O)-, или -S(O)-;
2
2
2
2
2
2
каждый R' и R” независимо выбран из группы: R, OR, SR, SOR, OSOR, N(R), NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R);
6
2
2
2
2
2
2
R представляет собой галоген, R, OR, SR, SOR, OSOR, N(R), NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R);
9
9'
1
2
2
каждый R и R независимо выбран из группы: галоген, R, OR, SR, или N(R), или R и R вместе образуют 3-7-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатома, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера;
1-6
2
Q представляет собой возможно замещенную прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную C алкилиденовую цепь, где до двух метиленовых групп Q возможно содержат независимые заместители: -O-, -N(R)-, -S-, -С(O)-, -S(O)-, или -S(O)-;
и
10
R представляет собой R, соответствующим образом замещенную гидроксильную группу, соответствующим образом замещенную тиолгруппу, соответствующим образом замещенную аминогруппу, возможно замещенное 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное моноциклическое кольцо, содержащее от 0 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера; детектируемый компонент, полимерный остаток, пептид или сахаросодержащий или сахароподобный компонент.
Согласно другому примеру реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль, где
каждое из колец А, В, С, D и Е независимо представляет собой насыщенное кольцо, частично ненасыщенное, или ароматическое кольцо;
2
G представляет собой S, CH, NR или О;
1
2
1
2
2
каждый R и R независимо представляет собой галоген, R, OR, соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, SR, соответствующим образом защищенную тиолгруппу, N(R) или соответствующим образом защищенную аминогруппу, или R и R вместе образуют 3-7-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера;
1-6
каждый R независимо представляет собой водород, возможно замещенную Cалифатическую группу, или возможно замещенное 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера, где
два R при одном атоме азота возможно вместе с указанным атомом азота образуют 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 1-4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера;
n принимает значение 0-2;
3
4
7
8
2
2
2
2
2
2
каждый R, R, R и R независимо выбран из группы: галоген, R, OR, соответствующим образом замещенная гидроксильная группа, SR, соответствующим образом замещенная тиолгруппа, SOR, OSOR, N(R), соответствующим образом замещенная аминогруппа, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R);
m принимает значение 0-2;
5
3
2
3
2
2
2
2
2
2
R представляет собой Т-С(R'), T~C(R')C(R”), R, OR, соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, SR, соответствующим образом защищенную тиолгруппу, SOR, OSOR, N(R), соответствующим образом защищенную аминогруппу, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R), или:
5
6
5
3
2
3
если R представляет собой Т-С(R') или Т-С(R')С(R”), то R и R' группа при Rвозможно вместе образуют 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатома, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера;
1-6
2
каждый Т независимо представляет собой валентную связь или возможно замещенную прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную С алкилиденовую цепь, где до двух метиленовых групп Т возможно содержат независимые заместители: -O-, -N(R)-, -S-, -С(O)-, -S(O)-, или -S(O)-;
2
2
2
2
2
2
каждый R' и R” независимо выбран из группы: R, OR, SR, SOR, ОSОR, N(R), NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R);
6
2
2
2
2
2
2
R представляет собой галоген, R, OR, SR, SOR, OSOR, N(R), NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R);
9
9'
1
2
2
каждый R и R независимо выбран из группы: галоген, R, OR, SR, или N(R), или R и R вместе образуют 3-7-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатома, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера;
1-6
2
Q представляет собой возможно замещенную прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную C алкилиденовую цепь, где до двух метиленовых групп Q возможно содержат независимые заместители: -O-, -N(R)-, -S-, -С(O)-, -S(O)-, или -S(O)-;
и
10
R представляет собой R, соответствующим образом замещенную гидроксильную группу, соответствующим образом замещенную тиолгруппу, соответствующим образом замещенную аминогруппу, возможно замещенное 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное моноциклическое кольцо, содержащее от 0 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера; возможно замещенное 8-10-членное насыщенное, частично ненасыщенное, или арильное бициклическое кольцо, содержащее от 0 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера; детектируемый компонент, полимерный остаток, пептид или сахаросодержащий или сахароподобный компонент, при условии, что указанное соединение не является:
, ,
, , или
.
2. Определения
th
th
Соединения согласно настоящему изобретению, в общем описанные выше, далее представлены в примерах реализации, подпримерах и в виде описанных здесь отдельных соединений. В настоящем описании используются нижеследующие определения, если не указано иное. В настоящем изобретении химические элементы идентифицируют согласно Periodic Table of the Elements, CAS version. Handbook of Chemistry and Physics, 75 Ed. Кроме того, общие принципы органической химии изложены в "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, и "March's Advanced Organic Chemistry", 5 Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001, содержание которых включено в данную заявку во всей полноте посредством ссылок.
6
8
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
9'
10
Как указано выше, каждое из колец А, В, С, D и Е независимо представляет собой насыщенное, частично ненасыщенное или ароматическое кольцо. Подразумевается, что соединения согласно настоящему изобретению являются химически возможными соединениями. Соответственно, для любого специалиста в данной области очевидно, что если любое из колец А, В, С, D и Е является ненасыщенным, то определенные заместители в этом кольце отсутствуют, что соответствует общим закономерностям валентности. Например, если кольцо D является ненасыщенным у связи между кольцом D и кольцом Е, то R отсутствует. Альтернативно, если кольцо D является ненасыщенным у связи между кольцом D и кольцом С, то отсутствуют R и R. Настоящее изобретение включает все комбинации насыщенных и ненасыщенных колец А, В, С, D и Е. Для соблюдения общих закономерностей валентности соответственно подразумевается, что в зависимости от степени насыщенности или ненасыщенности любого из колец А, В, С, D и Е требуется наличие или отсутствие заместителей R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и QRсоответственно.
Описанные здесь соединения согласно изобретению возможно содержат один или несколько заместителей, описанных выше или представленных особыми классами, подклассами и отдельными примерами согласно настоящему изобретению. Подразумевается, что словосочетание «возможно замещенный» используется как синоним словосочетания «замещенный или незамещенный». В общем случае, термин «замещенный» (вместе с термином «возможно» или без него) относится к замещению водородных радикалов в данной структуре на определенные радикалы-заместители. Если не указано иное, возможно замещенная группа может содержать заместители во всех возможных положениях; а в случае, если любая из данных структур содержит более одного заместителя, выбранного из определенной группы, более чем в одном положении, то заместители в каждом из положений могут быть как одинаковыми, так и различными. Предпочтительны комбинации заместителей, представленных настоящим изобретением, приводящие к образованию стабильных или химически допустимых соединений.
Термин «стабильный», используемый в настоящем описании, относится к соединениям, которые не изменяют по существу своей структуры в условиях их приготовления, детекции и, предпочтительно, в условиях выделения, очистки и применения согласно одному или нескольких способов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым примерам реализации, стабильным или химически допустимым соединением является соединение, которое по существу не изменяет своей структуры при выдерживании при температуре 40°С или менее, в течение по меньшей мере одной недели, в отсутствие влаги и других химически активных условий воздействия.
3
8
8
12
Термин «алифатический» или «алифатическая группа», используемый здесь, относится к прямой (т.е. неразветвленной) или разветвленной, замещенной или незамещенной углеводородной цепи, полностью насыщенной, или содержащей один или несколько ненасыщенных компонентов; или к моноциклическому или бициклическому углеводороду, полностью насыщенному, или содержащему один или несколько ненасыщенных компонентов, но не являющемуся ароматическим (здесь также называемому «карбоциклом», «циклоалифатическим соединением» или «циклоалкилом»), связанному с остальной молекулой в одной точке. Если не указано иное, алифатические группы могут содержать 1-20 алифатических атомов углерода. Согласно некоторым примерам реализации, алифатические группы содержат 1-6 алифатических атомов углерода. Согласно другим примерам реализации, алифатические группы содержат 1-4 алифатических атомов углерода. Согласно другим примерам реализации, термин «циклоалифатическое соединение» (или «карбоцикл», или «циклоалкил») относится к моноциклическому С-C углеводороду или к бициклическому C-C углеводороду, полностью замещенному или содержащему один или несколько ненасыщенных компонентов, но не являющемуся ароматическим, связанному с остальной молекулой в одной точке, причем каждое отдельное кольцо упомянутой бициклической кольцевой системы состоит из 3-7 атомов углерода. Приемлемые алифатические группы включают без ограничения линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный алкил, алкенил, алкинил, а также их комбинации, такие как (циклоалкил)алкил, (циклоалкенил)алкил или (циклоалкил)алкенил. Согласно другим примерам реализации, два геминальных атома водорода, при замещении оксо-группой (бивалентным атомом кислорода карбонила =O), или заместителем, образующим кольцо, таким как -О- (прямой или разветвленный алкилен или алкилиден)-O-, образуют ацеталь или кеталь.
Согласно некоторым примерам реализации, примеры алифатических групп включают без ограничения этинил, 2-пропинил, 1-пропенил, 2-бутенил, 1,3-бутандиенил, 2-пентенил, винил(этенил), аллил, изопропенил, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, сек-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, сек-пентил, нео-пентил, трет-пентил, циклопентил, гексил, изогексил, сек-гексил, циклогексил, 2-метилпентил, трет-гексил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1,3-диметилбутил и 2,3-диметилбут-2-ил.
Термины «галоалкил», «галоалкенил» и «галоокси» относятся к алкил-, алкенил- или алкокси-группам, замещенным одним или несколькими атомами галогена. Термин «галоген» означает F, Cl, Вr или I. «Галоалкил», «галоалкенил» или «галоалкокси» группы могут быть замещены двумя или более заместителями, одинаковыми или различными галогенами, и возможно являются или не являются заместителями при одном и том же атоме углерода. Примеры включают хлорметил, периодометил, 3,3-дихлопропил, 1,3-дифторбутил, трифторметил и 1-бром-2-хлорпропил.
Термины «гетероцикл», «гетероциклил», «гетероциклоалифатическое соединение» или «гетероциклическое соединение», используемые в настоящем описании, относятся к неароматическим, моноциклическим, бициклическим или трициклическим кольцевым системам, в которых один или несколько членов кольца представляют собой независимо выбранный гетероатом. Согласно некоторым примерам реализации, «гетероциклическая», «гетероциклильная», «гетероциклоалифатическая» или «гетероциклическая» группа состоит из 3-14-членного кольца, в котором один или несколько членов кольца представляют собой гетероатом, независимо выбранный из группы: кислород, сера, азот или фосфор, а каждое кольцо в системе содержит от 3 до 7 членов.
+
Термин «гетероатом» относится к одному или более атомам, выбранным из группы: кислород, сера, азот, фосфор и кремний (включая все окисленные формы азоты, серы, фосфора и кремния; кватернизированную форму любого основного атома азота, или возможно замещенный атом азота гетероциклического кольца, например, атом N (как в 3,4-дигидро-2Н-пирролиле), NH (как в пирролидиниле) или NR(как в N-замещенном пирролидиниле).
Термин «ненасыщенный», используемый здесь, относится к группе, содержащей одну или несколько ненасыщенных связей.
Термины «алкокси» или «тиоалкил», используемые здесь, относятся к алкильной группе, описанной выше, связанной с главной углеродной цепью через атом кислорода («алкокси») или атом серы («тиоалкил»).
Термин «арил», используемый отдельно или как часть названия большей группы, например, «аралкил», «аралкокси» или «арилоксиалкил», относится к моноциклическим, бициклическим или трициклическим кольцевым системам, с общим количеством членов от 5 до 14, в которых по меньшей мере одно кольцо системы является ароматическим и каждое кольцо системы состоит из 3-7 членов. Термин «арил» является синонимом термина «арильное кольцо». Термин «арил» относится также к гетероарильным кольцевым системам, определение которых дано ниже.
Термин «гетероарил», используемый отдельно или как часть названия большей группы, например, «гетероаралкил» или «гетероарилалкокси», относится к моноциклическим, бициклическим или трициклическим кольцевым системам, с общим количеством членов от 5 до 14, в которых по меньшей мере одно кольцо системы является ароматическим; по меньшей мере одно кольцо системы содержит один или несколько гетероатомов и каждое кольцо системы состоит из 3-7 членов. Термин «гетероарил» является синонимом термина «гетероарильное кольцо» или термина «гетероароматическое соединение».
3
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
0-2
1-6
2
3
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Арильная (включая аралкил, аралкокси, арилоксиалкил и т.п.) или гетероарильная (включая гетероаралкил и гетероарилалкокси) группа может содержать один или несколько заместителей. Приемлемые заместители при ненасыщенном атоме углерода арильной или гетероарильной группы выбраны из группы: галоген; N, CN, R°; OR°; SR°; 1,2-метилен-диокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), возможно замещенный R; -O(Ph) возможно замещенный R; (CH)(Ph), возможно замещенный R; CH=CH(Ph), возможно замещенный R; NO; CN; N(R°); NRC(O)R; NR°C(O)N(R°); NRCOR; -NRNRC(O)R; NR°NR°С(O)N(R°); NRNRCOR; C(O)C(O)R; C(O)CHC(O)R; COR; C(O)R; C(O)N(R°); OC(O)N(R°); S(O)R; SON(R°); S(O)R; NR°SON(R°); NR°SOR°; C(=S)N(R°); C(=NH)-N(R°); или (CH)NHC(O)R°, где в каждом отдельном случае R выбран из группы: водород, возможно замещенная Cалифатическая группа, незамещенное 5-6-членное гетероарильное или гетероциклильное кольцо, фенил, O(Ph), или CH(Ph), или, вопреки определению, данному выше, два независимо выбранных R при одном заместителе, или при различных заместителях, вместе с атомом (атомами), к которому (которым) присоединена каждая R группа, образуют 3-8-членное циклоалкильное, гетероциклильное, арильное или гетероарильное кольцо, содержащее 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера. Возможные заместители в алифатической группе R выбраны из группы: N, CN, NH, NH(C алифатическая группа), N(C алифатическая группа), галоген, С алифатическая группа, ОН, O(Cалифатическая группа), NO, CN, СОН, СО(С алифатическая группа), O(гало Cалифатическая группа), или гало C алифатическая группа, причем во всех вышеуказанных C алифатических группах R° является незамещенным.
*
*
*
*
2
2
2
1-6
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
Алифатическая или гетероалифатическая группа неароматического гетероциклического кольца может содержать один или несколько заместителей. Приемлемые заместители при насыщенном атоме углерода алифатической или гетероалифатической группы, или при неароматическом гетероциклическом кольце выбраны из перечисленных выше заместителей для ненасыщенного атома углерода арильной или гетероарильной группы, включая дополнительно следующие: =O, =S, =NNHR, =NN(R), =NNHC(O)R, =NNHCO(алкил), =NNHSO(алкил) или =NR*, где каждый R независимо выбран из водорода и возможно замещенной C алифатической группы. Возможные заместители в алифатической группе R выбраны из группы: NH, NH(C алифатическая группа), N(C алифатическая группа), галоген, Cалифатическая группа, ОН, O(C алифатическая группа), NO, CN, COH, CO(Cалифатическая группа), O(гало C алифатическая группа) или гало(C алифатическая группа), причем во всех вышеупомянутых C алифатических группах R* является незамещенным.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1-6
2
2
1-2
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
Приемлемые заместители при атоме азота неароматического гетероциклического кольца выбраны из группы: R, N(R), C(O)R, COR, C(O)C(O)R, C(O)CHC(O)R, SOR, SON(R), C(=S)N(R), C(=NH)-N(R), или NRSOR; где Rпредставляет собой водород, возможно замещенную Cалифатическую группу, возможно замещенный фенил, возможно замещенный O(Ph), возможно замещенный CH(Ph), возможно замещенный (CH)(Ph); возможно замещенный CH=CH(Ph); или незамещенное 5-6-членное гетероарильное или гетероциклильное кольцо, содержащее от 1 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера; или, вопреки определению, данному выше, два независимо выбранных R при одном заместителе, или при различных заместителях, вместе с атомом (атомами), к которому (которым) присоединена каждая R группа, образуют 3-8-членное циклоалкильное, гетероциклильное, арильное или гетероарильное кольцо, содержащее 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера. Возможные заместители в алифатической группе или фенильном кольце Rвыбраны из: NH, NH(C алифатическая группа), N(Cалифатическая группа) галоген, C алифатическая группа, ОН, O(C алифатическая группа), NO, CN, COH, CO(C алифатическая группа), O(гало C алифатическая группа) или гало(C алифатическая группа), где каждая из вышеупомянутых Cалифатических групп Rявляется незамещенной.
0
+
0
+
0
+
0
0
0
+
0
2
Как показано выше, согласно некоторым примерам реализации, два независимых R (или R, или другие переменные, обозначенные подобным образом), вместе с атомом (атомами), к которому (которым) присоединена каждая переменная группа, образуют 3-8-членное циклоалкильное, гетероциклильное, арильное или гетероарильное кольцо, содержащее 0-4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера. Примеры колец, образуемых двумя независимо выбранными R (или R, или другими переменными, обозначенными подобным образом), вместе с атомом (атомами), к которому (которым) присоединена каждая переменная группа, включают без ограничения следующие: а) два независимо выбранных R (или R, или другие переменные, обозначенные подобным образом), связанные с одним и тем же атомом, вместе с указанным атомом образуют кольцо, например, N(R), где оба R вместе с атомом азота образуют пиперидин-1-ил, пиперазин-1-ил или морфолин-4-ил группы; и b) два независимо выбранных R (или R, или другие переменные, обозначенные подобным образом), связанные с разными атомами и вместе с обоими указанными атомами образуют кольцо, например, где фенильная группа замещена двумя OR
0
и оба R вместе с атомами кислорода, к которым они присоединены, образуют конденсированное 6-членное кольцо, содержащее кислород
0
+
Подразумевается, что, в случае, когда два независимых R (или R, или другие переменные, обозначенные подобным образом), связанные с атомом (атомами), к которому (которым) присоединена каждая переменная группа, может быть образовано множество различных других колец; таким образом, подразумевается, что примеры, представленные выше, не ограничивают объем настоящего изобретения.
32
33
35
14
Термин «детектируемый компонент», используемый в настоящем описании, используется как синоним термина «метка» и относится к любому компоненту, который можно определить, например, к первичным и вторичным меткам. Первичные метки, такие как радиоизотопы (например, Р, Р, S, или С), масс-метки, и флуоресцентные метки представляют собой репортерные группы, генерирующие сигнал, который можно детектировать без дополнительных модификаций.
Термин «вторичная метка», используемый в настоящем описании, относится к таким компонентам, как биотин и различные антигены белков, при их применении требуется присутствие второго промежуточного продукта для генерирования детектируемого сигнала. При применении биотина вторичный полупродукт возможно включает стрептавидин-ферментные конъюгаты. При применении антигенных меток, вторичные промежуточные продукты могут включать стрептавидин-ферментные конъюгаты. Некоторые флуоресцентные группы действуют как вторичные метки, так как передают энергию другой группе в процессе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), при этом вторая группа генерирует детектируемый сигнал.
5
Термины «флуоресцентная метка», «флуоресцентный краситель» и «флуорофор», используемые в настоящем описании, относятся к компонентам, поглощающим световую энергию на определенной длине волны при возбуждении и излучающим световую энергию на другой длине волны. Примеры флуоресцентных меток включают без ограничения красители Alexa Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660 and Alexa Fluor 680), AMCA, AMCA-S, красители BODIPY (BODIPY FL BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665), Карбоксиродамин 6G, карбокси-Х-родамин (ROX), Cascade Blue, Cascade Yellow, Кумарин 343, Цианиновые красители (Су3, Су5, Су3.5, Су5.5), Dansyl, Dapoxyl, Диалкиламинокумарин, 4',5'-дихлор-2',7'-диметокси-флуоресцеин, DM-NERF, Эозин, Эритрозин, Флуоресцеин, FAM, Гидроксикумарин, IR красители (IRD40, IRD 700, IRD 800), JOE, Lissamine rhodamine В, Marina Blue, Метоксикумарин, Нафтофлуоресцеин, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Родамин В, Родамин 6G, Родаминовый зеленый, Родаминовый красный, Rhodol Green, 2',4',5',7'-тетра-бромсульфон-флуоресцеин, Тетраметил-родаминовый (TMR), Карбокситетраметилродамин (TAMRA), Texas Red, Texas Red-X.
Термин «масс-метка», используемый в настоящем описании, относится ко всем компонентам, которые можно однозначно детектировать по их массе при помощи приборов масс-спектрометрии (МС). Примеры масс-меток включают метки, высвобождающиеся при электрофорезе, такие как as N-[3-[4'-[(p-метокситетра-флуоробензил)окси]фенил]-3-метилглицеронил]изонипекотиновая кислота, 4'-[2,3,5,6-тетрафтор-4-(пентафторфеноксил)]метилацетофенон и их производные. Синтез и применение упомянутых масс-меток описаны в патентах США 4,650,750, 4,709,016, 5,360,8191, 5.516,931, 5,602,273, 5,604,104, 5,610,020, и 5,650,270. Другие примеры масс-меток включают без ограничения нуклеотиды, дидеоксинуклеотиды, олигонуклеотиды различной длины и основного состава, олигопептиды, олигосахариды и другие синтетические полимеры различной длины и разного мономерного состава. В качестве масс-меток можно использовать различные органические молекулы как нейтральные, так и заряженные (биомолекулы и синтетические соединения) соответствующего диапазона масс (100-2000 дальтон).
Термин «субстрат», используемый в настоящем описании, относится к любому веществу или макромолекулярному комплексу, к которому можно присоединить функционализированную концевую группу соединения согласно настоящему изобретению. Примеры традиционно применяемых субстратов включают без ограничения стеклянные поверхности, кремниевые поверхности, пластиковые поверхности, металлические поверхности, поверхности с металлическим или химическим покрытием, мембраны (например, нейлоновые, полисульфоновые, кремниевые), микрогранулы (например, латекс, полистирол или другой полимер), пористые полимерные матрицы (например, полиакриламидный гель, полисахарид, полиметакрилат), макромолекулярные комплексы (например, белок, полисахарид).
Если не указано иное, подразумевается, что описанные здесь структуры включают также все изомерные (например, энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные)) формы структуры; например, R и S конфигурации для каждого центра асимметрии, (Z) и (Е) изомеры по двойной связи, а также (Z) и (Е) конформационные изомеры. Поэтому отдельные стереохимические изомеры, а также энантиомерные, диастреомерные и геометрические (или конформационные) изомерные смеси соединений согласно настоящему изобретению находятся в рамках настоящего изобретения.
Если не указано иное, все таутомерные формы соединений согласно настоящему изобретению находятся в рамках настоящего изобретения.
13
14
Кроме того, если не указано иное, подразумевается, что все описанные здесь структуры включают соединения, различающиеся только присутствием одного или нескольких атомов изотопов. Например, соединения с описанными структурами, различающиеся только тем, что водород в них замещен на атом дейтерия или трития или содержащийся в них углерод обогащен изотопами С или С, находятся в рамках настоящего изобретения. Такие соединения пригодны, например, в качестве аналитических средств или проб в биологических исследованиях.
3. Описание репрезентативных соединений
2
Как, в общем, описано выше, группа G формулы I представляет собой S, CH, NR, или О. Согласно некоторым примерам реализации, группа G формулы I представляет собой О.
1
2
1
2
1
2
1
2
2
1-6
Как, в общем, описано выше, каждый R и R формулы I независимо представляет собой галоген, R, OR, или соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, SR, соответствующим образом защищенную тиолгруппу, N(R), или соответствующим образом защищенную аминогруппу, или R и R вместе образуют 3-7-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатома, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера. Согласно некоторым примерам реализации, каждый R и R формулы I независимо представляет собой R или OR. Согласно другим примерам реализации, каждый R и Rформулы I независимо представляет собой R, где R представляет собой водород или возможно замещенную C алифатическую группу.
1
2
1
2
1
2
Согласно другому аспекту изобретения, R и R формулы I вместе образуют 3-6-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера. Согласно еще одному аспекту изобретение предлагает соединение формулы I, где R и R вместе образуют 3-6-членное насыщенное карбоциклическое кольцо. Согласно другим примерам реализации, R и R формулы I вместе образуют циклопропильное кольцо.
Согласно некоторым примерам реализации, n в соответствующей группе формулы I принимает значение 0 или 1. Согласно другим примерам реализации, n в соответствующей группе формулы I равно 1.
5
3
2
3
2
2
2
2
2
2
1-6
2
1-4
1-4
Как определено в общем выше, группа R представляет собой Т-С(R'), T~C(R')C(R”), R, OR, соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, SR, соответствующим образом защищенную тиолгруппу, SOR, OSOR, N(R), соответствующим образом защищенную аминогруппу, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R), где каждый Т независимо представляет собой валентную связь или возможно замещенную прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную C алкилиденовую цепь, где до двух метиленовых групп Т возможно содержат независимые заместители: -O-, -N(R)-, -S-, -С(O)-, -S(O)-, или -S(O)-. Согласно некоторым примерам реализации, каждый Т независимо представляет собой валентную связь или прямую или разветвленную Салкилиденовую цепь, где одна метиленовая группа Т возможно замещена на -O-, -N(R)-, или -S-. Согласно другим примерам реализации, каждый Т независимо представляет собой валентную связь или прямую или разветвленную С алкилиденовую цепь. Согласно другим примерам реализации, каждый Т независимо представляет собой валентную связь.
5
3
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
Если группа R формулы I представляет собой Т-С(R') или Т-С(R')С(R”), то каждый R' и R” независимо выбирают из группы: R, OR, SR, SOR, OSOR, N(R), NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R), NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R), или O(CO)N(R). Согласно некоторым примерам реализации, каждый R' и R” независимо представляет собой R, OR, OC(O)R, SR, или N(R). Согласно другим примерам реализации, каждый R' и R” независимо представляет собой R, OR или OC(O)R. Примеры групп R' и R” включают водород, СН, ОН и ОС(O)СН.
5
6
5
5
6
5
5
6
5
5
5
3
2
3
3
2
3
3
2
3
3
2
3
Как определено в общем выше, в случае, если группа R формулы I представляет собой Т-С(R') или T-C(R')C(R”), то группы R и R' в R возможно вместе образуют 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее 0-2 гетероатома, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера. Согласно некоторым примерам реализации, R представляет собой Т-С(R') или T-C(R')C(R”), a группы R и R' в R вместе образуют 5-7-членное насыщенное кольцо, содержащее от 1 до 2 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера. Согласно другим примерам реализации, R представляет собой Т-С(R') или Т-С(R')С(R”), а группы R и R' в R вместе образуют 6-членное насыщенное кольцо, содержащее 1 атом кислорода. В аналогичных соединениях формулы IIа, Т представляет собой валентную связь, а R представляет собой Т-С(R'). В соединениях формулы IIb R представляет собой T-C(R')C(R”).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
9'
10
где каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и QR определен выше или представлен в описании классов, подклассов и отдельных примеров согласно настоящему изобретению.
5
rd
5
Как определено в общем выше, группа R формулы I представляет собой, inter alia, соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, или соответствующим образом защищенную аминогруппу. Группы, защищающие гидроксил, хорошо известны специалистам в данной области и включают группы, описанные подробно в Protecting Groups in Organic Synthesis, Т.W.Greene and P.G.M.Wuts, 3 edition, John Wiley & Sons, 1999, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Примеры гидроксильных групп в группе R формулы I включают без ограничения сложные эфиры, аллиловые эфиры, эфиры, силиловые эфиры, алкиловые эфиры, арилалкиловые эфиры и алкоксилалкиловые эфиры. Примеры подобных сложных эфиров включают формиаты, ацетаты, карбонаты и сульфонаты. Частные примеры включают: формиат, бензоилформат, хлорацетат, трифторацетат, метоксиацетат, трифенилметоксиацетат, р-хлорфеноксиацетат, 3-фенилпропионат, 4-оксопентаноат, 4,4-(этилендитио)пентаноат, пивалоат (триметилацетил), кротонат, 4-метокси-кротонат, бензоат, р-бензилбензоат, 2,4,6-триметилбензоат, и карбонаты, такие как метил, 9-флуоренилметил, этил, 2,2,2-трихлорэтил, 2-(триметилсилил)этил, 2-(фенилсульфонил)этил, винил, аллил, и р-нитробензил. Примеры подобных силильных эфиров включают триметилсилил, триэтилсилил, t-бутилдиметилсилил, t-бутилдифенилсилил, триизопропилсилил и другие триалкилсилиловые эфиры. Алкиловые эфиры включают метил, бензил, р-метоксибензил, 3,4-диметоксибензил, тритил, t-бутил, аллил и аллилоксикарбонильные эфиры или их производные. Алкоксиалкиловые эфиры включают ацетали, такие как метоксиметил, метилтиометил, (2-метоксиэтокси)метил, бензилоксиметил, бета-(триметилсилил) этоксиметил и тетрагидропропаниловые эфиры. Примеры арилалкиловых эфиров включают бензил, р-метоксибензил (МРМ), 3,4-диметоксибензил, O-нитробензил, р-нитробензил, р-галобензил, 2,6-дихлорбензил, р-цианобензил, 2- и 4-пиколил.
rd
5
Группы, защищающие тиол, хорошо известны специалистам в данной области и включают группы, описанные подробно в Protecting Groups in Organic Synthesis, Т.W.Greene and P.G.M. Wuts, 3 edition, John Wiley & Sons, 1999, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Примеры соответствующим образом защищенных тиолгрупп в группе R формулы I включают без ограничения дисульфиды, тиоэфиры, силиловые тиоэфиры, сложные тиоэфиры, тиокарбонаты, тиокарбаматы и т.п. Примеры подобных групп включают без ограничения алкиловые тиоэфиры, бензиловые и замещенные бензиловые тиоэфиры, трифенилметилтиоэфиры, трихлорэтоксикарбонил (указано лишь несколько примеров).
5
5
3
2
2
3
2
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, группа R формулы I представляет собой группу, защищающую тиол, удаляемую в нейтральных условиях, например, при взаимодействии с AgNO, HgCl, и т.п. Другие нейтральные условия включают использование приемлемого агента-восстановителя. Приемлемые агенты-восстановители включают дитиотрейтол (DTT), меркаптоэтанол, дитионит, восстановленный глутатион, восстановленный глутаредоксин, восстановленный тиоредоксин, замещенные фосфины, такие как трискарбоксиэтилфосфин (ТСЕР), или любой другой пептид или агент-восстановитель на органической основе, или другой реагент, известный специалистам в данной области. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, группа R формулы I представляет собой группу, защищающую тиол, являющуюся «фоторазрушаемой» группой (группой, разлагающейся под действием света). Такие подходящие группы, защищающие тиол, известные специалистам в данной области, включают без ограничения группы нитробензил, тетрагидропиранил (ТНР), тритил, - CHSCH (MTM), диметилметоксиметил или -СН-S-S-пиридин-2-ил. Для специалиста в данной области очевидно, что многие приемлемые группы, защищающие гидроксил, могут выступать также в качестве групп, защищающих тиол.
5
rd
5
5
5
Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы I представляет собой соответствующим образом защищенную аминогруппу. Группы, защищающие аминогруппу, известны специалистам в данной области и включают группы, описанные подробно в Protecting Groups in Organic Synthesis, Т.W.Greene and P.G.M.Wuts, 3 edition, John Wiley & Sons, 1999, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Соответствующим образом защищенные аминогруппы указанной группы R включают без ограничения аралкиламины, карбаматы, циклические имиды, аллил амины, амиды и т.п. Примеры подобных групп включают без ограничения t-бутилоксикарбонил (ВОС), этилоксикарбонил, метилоксикарбонил, трихлорэтилоксикарбонил, аллилоксикарбонил (Аllос), бензилоксикарбонил (CBZ), аллил, фталимид, бензил (Вn), флуоренилметилкарбонил (Fmoc), формил, ацетил, хлорацетил, дихлорацетил, трихлорацетил, фенацетил, трифторацетил, бензоил и т.п. Согласно некоторым примерам реализации, защищенной аминогруппой группы Rявляется фталимидо-группа. Согласно другим примерам реализации, защищенной аминогруппой группы R является трет-бутилоксикарбонильная (ВОС) группа.
1-4
2
1-2
Как определено в общем выше, группа Q формулы I представляет собой валентную связь или возможно замещенную прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную С алкилиденовую цепь, где до двух метиленовых групп Q возможно содержат независимые заместители: -O-, -N(R)-, -S-, -С(O)-, -S(O)-, или -S(O)-. Согласно некоторым примерам реализации, Q представляет собой возможно замещенную прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную Салкилиденовую цепь, где не более одной метиленовой группы в Q возможно содержит заместители: -O-, -N(R)-, или -S-. Согласно другим примерам реализации, Q представляет собой -O-.
10
Как определено в общем выше, группа R формулы I представляет собой R, соответствующим образом замещенную гидроксильную группу, соответствующим образом замещенную тиолгруппу, соответствующим образом замещенную аминогруппу, возможно замещенное 3-8-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное моноциклическое кольцо, содержащее от 0 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера; возможно замещенное 8-10-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное бициклическое кольцо, содержащее от 0 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород и сера; детектируемый компонент, полимерный остаток, пептид или сахарсодержащий или сахароподобный компонент.
10
10
10
10
10
Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы I представляет собой сахарсодержащую группу. Подобные сахаросодержащие группы хорошо известны специалистам в данной области и включают группы, описанные в "Essentials of Glycobiology" Edited by Varki, A., et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y. 2002. Согласно некоторьм примерам реализации, группа Rформулы I представляет собой гликозид. Примеры групп R включают арабинопиранозиды и ксилопиранозиды. Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы I представляет собой ксилопиранозид. Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы I представляет собой арабинопиранозид.
10
Согласно другим примерам реализации, группа R формулы I представляет собой
.
10
Согласно другому примеру реализации, группа R формулы I представляет собой
.
10
Согласно еще одному примеру реализации, предложено соединение формулы I, в котором группа R представляет собой:
.
10
10
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, группа R формулы I представляет собой сахаромиметик. Подобные группы сахаромиметики хорошо известны специалистам в данной области и включают группы, описанные в "Essentials of Glycobiology". Например, группы сахаромиметики, предложенные согласно настоящему изобретению, включают циклитолы и т.п. Согласно некоторым примерам реализации, R представляет собой циклитол, где указанный циклитол представляет собой циклоалкан, содержащий одну гидроксильную группу на каждом из трех или более кольцевых атомов, согласно определению конвенции ИЮПАК. Согласно другим примерам реализации, подобные циклитольные группы включают инозитолы, такие как сцилло-инозитол.
10
10
Кроме того, приемлемые сахароподобные компоненты группы R формулы I включают ациклические группы сахаров. Подобные группы включают линейные алкитолы и эритритолы, и различные другие группы. Очевидно, что существуют группы сахаров как циклической, так и ациклической формы. Соответственно, приемлемыми сахароподобными компонентами группы R формулы I в настоящем изобретении являются ациклические формы группы сахаров.
10
10
Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы I представляет собой детектируемый компонент. Согласно другим примерам реализации, группа Rформулы I представляет собой флуоресцентную метку, флуоресцентный краситель или флуорофор, как описано выше.
10
10
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, группа R формулы I представляет собой полимерный остаток. Полимерные остатки хорошо известны специалистам в данной области и включают остатки, описанные подробно в "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" Shan S. Wong, CRC Press. Boca Raton, Florida. 1991. Приемлемые полимерные остатки группы R формулы I включают поли(алкиленоксиды), такие как PEG, поли(аминокислоты) и другие полимерные остатки, способные образовывать связи с соединениями согласно настоящему изобретению.
10
rd
10
Как определено в общем выше, группа R формулы I представляет собой, среди прочего, соответствующим образом защищенную гидроксильную группу, соответствующим образом защищенную тиолгруппу, соответствующим образом защищенную аминогруппу. Группы, защищающие гидроксил, хорошо известны специалистам в данной области и включают группы, описанные подробно в Protecting Groups in Organic Synthesis, Т.W.Greene and P.G.M.Wuts, 3 edition, John Wiley & Sons, 1999, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Примеры приемлемых групп R формулы I, защищающих гидроксил, включают без ограничения сложные эфиры, аллиловые эфиры, эфиры, силиловые эфиры, алкиловые эфиры, арилалкиловые эфиры и алкоксилалкиловые эфиры. Примеры подобных сложных эфиров включают форматы, ацетаты, карбонаты и сульфонаты. Частные примеры включают: формиат, бензоилформиат, хлорацетат, трифторацетат, метоксиацетат, трифенилметоксиацетат, р-хлорфеноксиацетат, 3-фенилпропионат, 4-оксопентаноат, 4,4-(этилендитио)пентаноат, пивалоат (триметилацетил), кротонат, 4-метокси-кротонат, бензоат, р-бензилбензоат, 2,4,6-триметилбензоат, и карбонаты, такие как метил, 9-флуоренилметил, этил, 2,2,2-трихлорэтил, 2-(триметилсилил)этил, 2-(фенилсульфонил)этил, винил, аллил, и р-нитробензил. Примеры подобных силильных эфиров включают триметилсилил, триэтилсилил, t-бутилдиметилсилил, t-бутилдифенилсилил, триизопропилсилил и другие триалкилсилиловые эфиры. Алкиловые эфиры включают метил, бензил, р-метоксибензил, 3,4-диметоксибензил, тритил, t-бутил, аллил и аллилоксикарбонильные эфиры или их производные. Алкоксиалкиловые эфиры включают ацетали, такие как метоксиметил, метилтиометил, (2-метоксиэтокси)метил, бензилоксиметил, бета-(триметилсилил)этоксиметил и тетрагидропропаниловые эфиры. Примеры арилалкиловых эфиров включают бензил, р-метоксибензил (МРМ), 3,4-диметоксибензил, O-нитробензил, р-нитробензил, р-галобензил, 2,6-дихлорбензил, р-цианобензил, 2- и 4-пиколил.
rd
5
Группы, защищающие тиол, хорошо известны специалистам в данной области и включают группы, описанные подробно в Protecting Groups in Organic Synthesis, Т.W.Greene and P.G.M.Wuts, 3 edition, John Wiley & Sons, 1999, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Примеры соответствующим образом защищенных тиолгрупп в группе R формулы I включают без ограничения дисульфиды, тиоэфиры, силиловые тиоэфиры, сложные тиоэфиры, тиокарбонаты, тиокарбаматы и т.п. Примеры подобных групп включают без ограничения алкиловые тиоэфиры, бензиловые и замещенные бензиловые тиоэфиры, трифенилметилтиоэфиры, трихлорэтоксикарбонил, и многие другие.
5
5
3
2
2
3
2
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, группа R формулы I представляет собой группу, защищающую тиол, удаляемую в нейтральных условиях, например, при взаимодействии с AgNO, HgCl, и т.п. Другие нейтральные условия включают использование приемлемого агента-восстановителя. Приемлемые агенты-восстановители включают дитиотрейтол (DTT), меркаптоэтанол, дитионит, восстановленный глутатион, восстановленный глутаредоксин, восстановленный тиоредоксин, замещенные фосфины, такие как трискарбоксиэтилфосфин (ТСЕР), или любой другой пептид или агент-восстановитель на органической основе, или другой реагент, известный специалистам в данной области. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, группа R формулы I представляет собой группу, защищающую тиол, являющуюся «фоторазрушаемой» группой (группой, разлагающейся под действием света). Такие приемлемые группы, защищающие тиол, известные специалистам в данной области, включают без ограничения группы нитробензил, тетрагидропиранил (ТНР), тритил, - СНSСН (МТМ), диметилметоксиметил или -СН-S-S-пиридин-2-ил. Для специалиста в данной области очевидно, что многие приемлемые группы, защищающие гидроксил, могут применяться также в качестве групп, защищающих тиол.
5
rd
5
5
5
Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы I представляет собой соответствующим образом защищенную аминогруппу. Группы, защищающие аминогруппу, известны специалистам в данной области и включают группы, описанные подробно в Protecting Groups in Organic Synthesis, Т.W.Greene and P.G.M.Wuts, 3 edition, John Wiley & Sons, 1999, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Соответствующим образом защищенные аминогруппы указанной группы R включают без ограничения аралкиламины, карбаматы, циклические имиды, аллил амины, амиды и т.п. Примеры подобных групп включают без ограничения t-бутилоксикарбонил (ВОС), этилоксикарбонил, метилоксикарбонил, трихлорэтилоксикарбонил, аллилоксикарбонил (Alloc), бензилоксикарбонил (CBZ), аллил, фталимид, бензил (Вn), флуоренилметилкарбонил (Fmoc), формил, ацетил, хлорацетил, дихлорацетил, трихлорацетил, фенацетил, трифторацетил, бензоил и т.п. Согласно некоторым примерам реализации, защищенной аминогруппой группы Rявляется фталимидогруппа. Согласно другим примерам реализации, защищенной аминогруппой группы R является трет-бутилоксикарбонильная (ВОС) группа.
Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I, где указанное соединение отлично от одного, двух или всех трех следующих соединений:
,
включая все их стереомеры.
Как описано в общем выше, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль, где каждая переменная описана выше, или представлена в описании классов и подклассов соединений. Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I, стереохимическая структура которого представлена формулой I-а:
или его фармацевтически приемлемую соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
1
2
1
2
1
2
Согласно некоторым примерам реализации, группы R и R вместе образуют 3-7-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее от 0 до 2 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера. Согласно другим примерам реализации, группы R и R вместе образуют 3-6-членное насыщенное кольцо, содержащее от 0 до 2 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера. Согласно другим примерам реализации, группы R и Rформулы I вместе образуют 3-6-членное насыщенное карбоциклическое кольцо. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложено соединение формулы I-b:
или его фармацевтически приемлемая соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I. Согласно другим примерам реализации, предложено соединение формулы I-c:
или его фармацевтически приемлемая соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
1
2
Как определено в общем выше, каждое из колец А, В, С, D и Е независимо представляет собой насыщенное, частично ненасыщенное или ароматическое кольцо. Согласно некоторым примерам реализации, кольцо В является ненасыщенным, а группы R и R отсутствуют, образуя при этом соединение формулы II:
или его фармацевтически приемлемая соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
Согласно некоторым примерам реализации, n в формуле II равняется 0 или 1, а группа G соединения формулы II представляет собой кислород.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение предлагает соединение формулы II-а:
или его фармацевтически приемлемую соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
Согласно некоторым примерам реализации, n в формуле II-а равняется 0 или 1, а группа G соединения формулы II-а представляет собой кислород.
1
2
6
Согласно другим примерам реализации, оба кольца, кольцо В и кольцо D, являются ненасыщенными, группы R, R и R отсутствуют, образуя при этом соединение формулы III:
или его фармацевтически приемлемую соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
Согласно некоторым примерам реализации, n в формуле III равняется 0 или 1, а группа G соединения формулы III представляет собой кислород.
Согласно другим аспектам, настоящее изобретение предлагает соединение формулы IV:
6
6
6
6
или его фармацевтически приемлемую соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I. Знак  обозначает здесь одинарную или двойную связь. Для специалиста в данной области очевидно, что, если знак  обозначает двойную связь, то R отсутствует. Наоборот, если знак  обозначает одинарную связь, то R присутствует. Соответственно, согласно некоторым примерам реализации, знак  обозначает двойную связь, и R отсутствует. Согласно другим примерам реализации, знак  обозначает одинарную связь, а присутствующая группа R определена выше.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение предлагает соединение формулы IV-a:
или его фармацевтически приемлемую соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
4
4
Согласно некоторым примерам реализации, группа G формулы IV-a представляет собой кислород. Согласно другим примерам реализации, группа Rформулы IV-a представляет собой R, OR, или соответствующим образом защищенную гидроксильную группу. Согласно другим примерам реализации, группа R формулы IV-a представляет собой R.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы IV-b:
или его фармацевтически приемлемой соли, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
1
2
1
2
Согласно некоторым примерам реализации, группы R и R формулы IV-b вместе образуют 3-7-членное насыщенное, частично ненасыщенное или арильное кольцо, содержащее от 0 до 2 гетероатомов, независимо выбранных из группы: азот, кислород, сера. Согласно другим примерам реализации, группы R и R формулы IV-b вместе образуют 3-6-членное насыщенное карбоциклическое кольцо. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложено соединение формулы IV-c:
или его фармацевтически приемлемая соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
7
Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы IV-c представляет собой -ОН.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложено соединение формулы IV-d:
или его фармацевтически приемлемая соль, где каждая переменная описана выше или представлена выше в описании классов и подклассов соединений, а также в описании соединений формулы I.
7
Согласно некоторым примерам реализации, группа R формулы IV-d представляет собой -ОН.
Примеры соединений согласно настоящему изобретению представлены ниже в Таблице 1.
Таблица 1
Примеры соединений формулы I
<img file="00000029.tif" he="33" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000030.tif" he="28" wi="56" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000031.tif" he="30" wi="56" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000032.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000033.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000034.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000035.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000036.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000037.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000038.tif" he="28" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000039.tif" he="28" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000040.tif" he="28" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примеры соединений формулы IV-a представлены ниже в Таблице 2.
Таблица 2
<img file="00000029.tif" he="33" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000034.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000035.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000037.tif" he="31" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000038.tif" he="28" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000039.tif" he="28" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000040.tif" he="28" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000041.tif" he="28" wi="58" img-content="undefined" img-format="tif" />
4. Общие способы приготовления соединений согласно настоящему изобретению
Соединения согласно настоящему изобретению можно приготовить или выделить общими синтетическими и/или полусинтетическими способами, известными специалистам в данной области, применяемыми для приготовления аналогичных соединений, и способами, описанными в представленных ниже Примерах.
Выделение активных компонентов
Отдельные соединения согласно настоящему изобретению выделяли из корня клопогона кистевидного, известного также как cimicifuga racemosa или actaea racemosa, структура указанных соединений известна. Экстракты, порошки и капсулы корня клопогона кистевидного являются коммерчески доступными; их применяют для лечения различных менопаузальных и гинекологических нарушений. Неожиданно было обнаружено, что некоторые соединения, содержащиеся в корне клопогона кистевидного полезны для регуляции и/или ингибирования продуцирования бета-амилоидных пептидов. В частности, некоторые соединения, выделенные из корня клопогона кистевидного, идентифицированы; эти соединения оказались полезными для регуляции и/или ингибирования продуцирования бета-амилоидных пептидов, в особенности бета-амилоидного пептида (1-42). Подобные соединения описывает формула I. Эти соединения можно выделить и применять в форме, не содержащей по существу других соединений, обычно содержащихся в корне. Альтернативно, экстракт можно приготовить из корня, при этом данный экстракт обогащают соединением согласно настоящему изобретению.
Как описано выше, определенные соединения согласно настоящему изобретения выделяют из стандартных экстрактов культурного или дикорастущего корня и корневища клопогона кистевидного. Очевидно также, что соединения согласно настоящему изобретению можно выделить из ткани корня растения, выращенной в культуре, или из культуральной среды культивируемой ткани растения. Подобные способы выращивания ткани корня растения в культуре хорошо известны специалистам в данной области и включают способы, описанные в Hairy Roots, Culture and Applications, edited by Pauline M. Doran, published by Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands. Copyright 1997 OPA (Overseas Publishers Association) Amsterdam B. V. ISBN 90-5702- 117-Х, включенной в данную заявку во всей полноте посредством ссылки.
Альтернативно, соединения согласно настоящему изобретению можно приготовить полусинтетическими способами, используя в качестве исходных соединений другие соединения, содержащиеся в экстракте клопогона кистевидного и родственных ему видов cimicifuga, приготовленных из корней и корневищ, или надземных частей этих растений. Это возможно при химической или биологической трансформации выделенных соединений, экстрагированной фракции или смеси соединений. Химическая трансформация возможна (без ограничения) при изменении температуры, рН и/или при применении различных растворителей. Биологическая трансформация возможна (без ограничения) при взаимодействии выделенного соединения, или экстрагированной фракции, или смеси соединений с тканью растения, экстрактами ткани растения, другими микробиологическими организмами или ферментами, выделенными из любого организма.
Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает экстракт корня клопогона кистевидного, где указанный экстракт содержит, по меньшей мере, 10% по весу соединения согласно настоящему изобретению. Согласно другим примерам реализации, настоящее изобретение предлагает экстракт корня клопогона кистевидного, где указанный экстракт содержит приблизительно от 10% по весу до 50% по весу соединения согласно настоящему изобретению. Согласно следующим примерам реализации, настоящее изобретение предлагает экстракт корня клопогона кистевидного, где указанный экстракт содержит приблизительно от 10% по весу до 50% по весу соединения согласно настоящему изобретению, при этом указанный экстракт по существу не содержит актеина.
Согласно другому примеру реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I, по существу не содержащее других соединений, обнаруживаемых в корне клопогона кистевидного. Термин «по существу не содержащий», используемый в настоящем описании, означает, что вещество содержит соединение формулы I в гораздо большем количестве по сравнению с веществом, обнаруживаемым в корне клопогона кистевидного или его экстрактах. Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I в количестве, составляющем приблизительно от 1% по весу до 99% по весу. Согласно конкретным примерам реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I химической чистоты более примерно 80%. Согласно другим примерам реализации, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I химической чистоты более примерно 90%. Согласно другим примерам реализации, площадь пика соединения формулы I на ВЭЖХ- хроматограмме составляет примерно не более 10% от площади пиков, соответствующих другим компонентам корня клопогона кистевидного, относительно общей площади пиков ВЭЖХ-хроматограммы. Согласно другим примерам реализации, площадь пика соединения формулы I на ВЭЖХ-хроматограмме составляет примерно не более 8% от площади пиков, соответствующих другим компонентам корня клопогона кистевидного, относительно общей площади пиков ВЭЖХ-хроматограммы, а согласно некоторым другим примерам реализации - не более 3% площади.
Способы определения степени чистоты соединений согласно настоящему изобретению от других соединений, содержащихся в корне клопогона кистевидного, известны специалистам в данной области. Соединения, ранее выделенные из корня клопогона кистевидного и идентифицированные, включают некоторые тритерпены на основе циклоартенола, включая актиол, ацетилактеол, 26-деоксиактиол, цимигенол, актеин, 26-деоксиактеин и цимицифугозид. Выделены и идентифицированы также (Е)-изоферуловая кислота и изофлавон формононетин. Репрезентативные соединения согласно настоящему изобретению имеют следующие структуры:
<img file="00000042.tif" he="30" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000043.tif" he="29" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000044.tif" he="42" wi="55" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000045.tif" he="42" wi="55" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соответственно, согласно другому примеру реализации, изобретение предлагает соединение формулы I, по существу не содержащее один или несколько соединений, выбранных из группы: актиол, ацетилактеол, 26-деоксиактиол, цимигенол, актеин, 26-деоксиактеин и цимицифугозид.
Согласно другому примеру реализации, настоящее изобретение предлагает экстракт корня клопогона кистевидного, обогащенного соединением формулы I, с пониженным содержанием одного или нескольких соединений, выбранных из группы: актиол, ацетилактеол, 26-деоксиактиол, цимигенол, актеин, 26-деоксиактеин и цимицифугозид. Согласно еще одному примеру реализации, настоящее изобретение предлагает экстракт корня клопогона кистевидного, обогащенного соединением формулы I, с пониженным содержанием каждого соединения из группы: актиол, ацетилактеол, 26-деоксиактиол, цимигенол, актеин, 26-деоксиактеин и цимицифугозид.
Специалистам известны различные способы экстрагирования, выделения и/или очистки индивидуальных активных компонентов корня клопогона кистевидного. Настоящее изобретение охватывает описанную здесь идентификацию этих активных компонентов, а также введение этих компонентов в композиции согласно изобретению.
Индивидуальные активные компоненты экстракта клопогона кистевидного можно идентифицировать описанными здесь способами, а также выделить и/или очистить любыми способами, известными специалистами в данной области. Активный компонент можно выделить непосредственно из корня в любом виде или из отвара смеси соединений из экстракта согласно настоящему изобретению, в том числе из экстракта, коммерчески доступного. Для очистки соединений применяют способы, включающие фильтрацию, селективное осаждение, экстракцию органическими растворителями, экстракцию водными растворителями, колоночную хроматографию (силикагель), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и другие способы, известные специалистам в данной области.
Согласно некоторым примерам реализации, экстракты согласно настоящему изобретению представляют собой экстракты, содержащие фракцию, выделенную из корня клопогона кистевидного. Термин «выделенная фракция» означает дополнительное количество вещества, содержащегося в корне растения, отделенного при помощи, например, хроматографии, дистилляции, осаждения, экстракции, фильтрации или другими способами, непосредственно из корня. Согласно другим примерам реализации, экстракты корня и фракции выделяют при помощи хроматографии, дистилляции, осаждения или экстракции. Подобные способы экстракции и дистилляции хорошо известны специалистам в данной области. Подробное описание некоторых из этих способов представлено ниже, в разделе Примеры.
Согласно другим примерам реализации настоящего изобретения, наличие и чистота активного соединение определяют химическими методами, включая ядерную магнитную спектроскопию (ЯМР), масс-спектроскопию, инфракрасную спектроскопию (ИК), ультрафиолетовую спектроскопию, элементный анализ, а также поляриметрию, рефрактометрию и другие способы. Подобные способы анализа известны специалистам в данной области. Согласно другим примерам реализации, химическую структуру активных соединений, выделенных из корня клопогона кистевидного, определяют способами, известными специалистам в данной области, включая ядерную магнитную спектроскопию (ЯМР), масс-спектроскопию, инфракрасную спектроскопию (ИК), ультрафиолетовую спектроскопию, элементный анализ, а также поляриметрию, рефрактометрию, рентгеновскую кристаллографию и другие.
Несмотря на то что здесь описаны отдельные примеры реализации, очевидно, что экстракты корня согласно настоящему изобретению можно приготовить способами, описанными в общем выше; с использованием соответствующих исходных материалов способами, доступными специалисту в данной области.
5. Применение, композиции и введение в организм
Фармацевтически приемлемые композиции
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение предлагает фармацевтически приемлемые композиции; указанные композиции включают любые из описанных здесь соединений и возможно содержат фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или наполнитель. Согласно некоторым примерам реализации, указанные композиции могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных терапевтических агентов.
Очевидно также, что некоторые соединения согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения как в свободном виде, так и в виде фармацевтически приемлемой соли.
Термин «фармацевтически приемлемая соль», используемый в настоящем описании, относится к солям, приемлемым с медицинской точки зрения для применения в контакте с тканями человеческого организма и организмов низших животных, не вызывающим интоксикации, раздражения, аллергического ответа и т.п., при приемлемом соотношении терапевтической пользы и риска при применении. Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится ко всем нетоксичным солям, или сложноэфирным солям соединения согласно настоящему изобретению, которые при введении в организм реципиента способны прямо или опосредованно образовывать соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически активный метаболит или остаток. Термин «фармацевтически активный метаболит или остаток», используемый в настоящем описании, означает, что метаболит или остаток является также фармацевтически активным соединением в соответствии настоящему изобретению.
+
1-4
4
Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны специалистам в данной области. Например, фармацевтически приемлемые соли подробно описаны в публикации Berge et al., J Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, включенной в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Фармацевтически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению включают соли, образованные соответствующими неорганическими и органическими кислотами и основаниями. Примерами фармацевтически приемлемых, нетоксичных солей кислот являются соли аминогрупп, образованные неорганическими кислотами, такими как хлороводородная, бромоводородная, фосфорная, серная и хлорная кислота, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, лимонная, янтарная или малоновая кислота, или же соли, полученные другими способами, известными специалистам в данной области, например, при помощи ионного обмена. Другие фармацевтически приемлемые соли включают адипаты, альгинаты, аскорбаты, аспартаты, бензолсульфонаты, бензоаты, бисульфаты, бораты, бутираты, камфораты, камфоросульфонаты, цитраты, циклопентанпропионаты, диглюконаты, додецилсульфаты, этансульфонаты, формиаты, фумараты, глюкогептанаты, глицерофосфаты, глюконаты, гемисульфаты, гептаноаты, гексаноаты, гидроиодиды, 2-гидрокси-этансульфонаты, лактобионаты, лактаты, лаураты, лаурилсульфаты, малаты, малеаты, малонаты, метансульфонаты, 2-нафталинсульфонаты, никотинаты, нитраты, олеаты, оксалаты, пальмитаты, памоаты, пектинаты, персульфаты, 3-фенилпропионаты, фосфаты, пикраты, пивалаты, пропионаты, стеараты, сукцинаты, сульфаты, тартраты, тиоцианаты, р-толуолсульфонаты, ундеканоаты, валераты и т.п. Соли, образованные соответствующими основаниями, включают соли щелочных и щелочноземельных металлов, соли аммония и N(C алкил). Настоящее изобретение предусматривает также кватернизацию любой из основных азотсодержащих групп описанных здесь соединений. Кватернизацией можно получить продукты, растворимые в воде или в масле, или диспергируемые продукты. Репрезентативные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают соли натрия, лития, калия, кальция, магния и т.п. Кроме того, фармацевтически приемлемые соли включают нетоксичные соли, образованные катионами аммония, четвертичного аммония и амина и противоионами, такими как галид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, низший алкилсульфонат и арилсульфонат.
Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество, или наполнитель, который, как указано в настоящем описании, включает любые и все растворители, разбавители или другие жидкие носители, дисперсионные или суспензионные добавки, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, агенты-загустители или агенты-эмульгаторы, консерванты, твердые связующие вещества, скользящие вещества и т.п., приемлемые для данной дозированной формы. Различные носители, приемлемые для использования в фармацевтически приемлемых композициях, а также применимые согласно методикам приготовления этих композиций, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E.W.Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980). В рамках настоящего изобретения приемлемы любые традиционные носители, за исключением вызывающих нежелательный биологический эффект или являющихся агрессивными по отношению к любому из компонентов, содержащемуся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Примеры веществ, которые могут являться фармацевтически приемлемыми носителями, включают без ограничения ионообменные вещества, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин; сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека; такие буферные вещества, как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота или сорбат калия; парциальные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как протамин сульфат, двунатриевый кислый фосфат, кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, полиакрилаты, воски, полиэтилен-полиоксопропилен-блокполимеры, ланолин; сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетатцеллюлоза; порошковый трагакант; солод, желатин, тальк; наполнители, такие как масло какао и суппозиторные воски; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафлоровое, кунжутное масло; оливковое масло; кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; вода, очищенная от пирогена; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы, а также другие нетоксичные совместимые скользящие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также колоранты, разрыхлители; агенты, входящие в состав покрытия; подсластители, ароматизаторы и парфюмирующие отдушки, консерванты и антиоксиданты, в соответствии с мнением специалиста, разрабатывающего композицию.
Композиции согласно настоящему изобретению можно применять в комбинированной терапии; т.е. данные соединения можно вводить в организм одновременно (или же предварительно, или последовательно) с одним или несколькими желательными терапевтическими агентами или медицинскими процедурами. При назначении комбинированной терапии (терапевтических агентов или процедур) для достижения желательного терапевтического эффекта следует принимать во внимание совместимость желательных терапевтических агентов и/или процедур. Подразумевается также, что применяемые способы лечения достигают желательного результата при лечении одного и того же нарушения (например, описанное здесь соединение можно вводить совместно с другим терапевтическим агентом, применяемым для лечения того же нарушения), или же направлены на достижение различных результатов (например, на регулирование нежелательных побочных эффектов).

Например, известные агенты, полезные для лечения нейродегенеративных нарушений, можно комбинировать с композициями согласно настоящему изобретению при лечении нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера. Примеры известных агентов, полезных для лечения нейродегенеративных нарушений, включают без ограничения такие агенты для лечения болезни Альцгеймера, как ингибиторы ацетилхолинэстеразы, включая донепезил, мемантин (и родственные соединения, такие как ингибиторы NMDA), Exelon; агенты для лечения болезни Паркинсона, такие как L- DOPA/карбидопа, энтакапон, ропинрол, прамипексол, бромокриптин, перголид, тригексефендил и амантадин; агенты для лечения рассеянного склероза, такие как бета интерферон (например, Avonex и Rebif), Copaxone, и митоксантрон; рилузол, а также антипаркинсонические агенты. Более полный список терапевтических агентов, применяемых для лечения нейродегенеративных нарушений, см. в списке лекарств, одобренных FDA, на сайте http://www.fda.gov, и в руководстве The Merck Manual, Seventeenth Ed. 1999, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки.
Согласно другим примерам реализации, соединения согласно настоящему изобретению комбинируют с другими агентами, полезными для лечения нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера,; данные агенты включают ингибиторы бета-секретазы, ингибиторы гамма-секретазы, ингибиторы агрегации, хелаторы металлов, антиоксиданты и нейропротекторы.
Термины «комбинация» и «комбинированный» и родственные им термины относятся к одновременному или последовательному введению в организм терапевтических агентов согласно настоящему изобретению. Например, соединение согласно настоящему изобретению можно вводить вместе с другим терапевтическим агентом одновременно или последовательно в виде отдельных дозированных форм или одновременно, в виде единой дозированной формы. Соответственно, настоящее изобретение предлагает единую дозированную форму, содержащую соединение формулы I, дополнительный терапевтический агент и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательный агент или наполнитель.

Примеры других агентов, с которыми также можно комбинировать ингибиторы согласно настоящему изобретению, включают без ограничения: агенты для лечения астмы, такие как албутерол и Singulair; агенты для лечения шизофрении, такие как зипрекса, риспердал, сероквел и галоперидол; противовоспалительные агенты, такие как кортикостероиды, TNF блокаторы, антагонисты рецептора IL-1, азатиоприн, циклофосфамид и сульфасалазин; агенты иммуномодуляторы и иммунодепрессанты, такие как циклоспорин, такролимус, рапамицин, микофенолят мофетил, интерфероны, кортикостероиды, циклофосфамид, азатиоприн и сульфасалазин; нейротрофические факторы, такие как ингибиторы этилхолинэстеразы, ингибиторы МАО, интерфероны, противосудорожные агенты, блокаторы ионных каналов, агенты для лечения кардиоваскулярных заболеваний, такие как бета-блокаторы, АСЕ ингибиторы, диуретики, нитраты, блокаторы кальциевых каналов и статины; агенты для лечения заболеваний печени, такие как кортикостероиды, холестирамин, интерфероны и противовирусные агенты; агенты для лечения заболеваний крови, такие как кортикостероиды, анти-лейкемические агенты и факторы роста; а также агенты для лечения иммунодефицитных состояний, такие как гамма-глобулин.
Количество дополнительного терапевтического агента, содержащегося в композициях согласно настоящему изобретению, не превышает количества агента, обычно вводимого в композицию, содержащую данный терапевтический агент в качестве единственного активного агента. Согласно некоторым примерам реализации, количество дополнительного терапевтического агента в настоящем изобретении варьирует приблизительно от 50% до 100% от количества, обычно содержащегося в композиции, содержащей данный терапевтический агент в качестве единственного активного агента.
Согласно альтернативным примерам реализации, способы согласно настоящему изобретению, в которых применяются композиции, не содержащие дополнительных терапевтических агентов, включают дополнительный этап отдельного введения в организм пациента дополнительного терапевтического агента. Если дополнительные терапевтические агенты вводят отдельно, их можно вводить в организм пациента одновременно с введением соединений согласно настоящему изобретению, или же до или после введения соединений.
Фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в организм человека и в организм животного перорально, ректально, парентерально, интрацистернально, интравагинально, интраперитонеально; буккально (в виде орального или назального спрея); возможно местное применение (в виде порошков, мазей или капель); и т.п., в зависимости от тяжести нарушения. Согласно некоторым примерам реализации, для достижения желательного терапевтического эффекта соединения согласно изобретению вводят в организм перорально или парентерально в дозах, составляющих приблизительно от 0,001 мг/кг до 50 мг/кг, предпочтительно приблизительно от 1 мг/кг до 25 мг/кг веса субъекта ежедневно, один или несколько раз в день.
Жидкие дозированные формы для перорального введения включают без ограничения фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных компонентов, жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, традиционно применяемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, агенты-солюбилизаторы и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, масло зародышей пшеницы или кукурузы, оливковое, касторовое и кунжутное масло), глицерол, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, а также их смеси. Кроме инертных разбавителей, композиции для перорального введения могут включать также вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты, агенты-эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, ароматизаторы и парфюмерные отдушки.
Составы для инъекций, например, стерильные водные или масляные суспензии для инъекций готовят способами, известными специалистам в данной области, с добавлением приемлемых смачивающих и суспендирующих агентов. Стерильный состав для инъекций может представлять также собой стерильный раствор, суспензию или эмульсию в нетоксичном разбавителе или растворителе, пригодном для парентерального введения, например раствор в 1,3-бутандиоле. Примеры приемлемых носителей и растворителей включают без ограничения воду, раствор Рингера, U.S.Р. и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно используют стерильные нелетучие масла. С этой целью можно использовать любое жидкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, для приготовления составов для инъекций используют такие жирные кислоты, как олеиновая кислота.
Составы для инъекций можно стерилизовать, например, путем фильтрации через противомикробный фильтр, или путем введения стерилизующего агента в стерильные твердые композиции, которые растворяют или диспергируют в стерильной воде или другой стерильной среде, пригодной для инъекций, непосредственно перед применением.
Для того чтобы пролонгировать эффект воздействия соединения согласно настоящему изобретению, зачастую желательным является замедление абсорбции соединения, введенного путем подкожной или внутримышечной инъекции. Этого достигают при применении жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества с низкой растворимостью в воде. Скорость абсорбции соединения зависит от скорости его растворения, которая в свою очередь может зависеть от размеров кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, замедленная абсорбция соединения, введенного парентерально, происходит при растворении или суспендировании соединения в масляном носителе. Препараты для инъекций замедленного всасывания готовят формированием микроинкапсулированных матриц соединения в биоразрушаемых полимерах, таких как полиактид-полиглицидол. Варьируя соотношение количества соединения к количеству полимера и природу конкретного применяемого полимера, можно регулировать скорость высвобождения соединения. Примеры других биоразрушаемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Составы для инъекций замедленного всасывания готовят также путем внедрения соединения в липосомы или микроэмульсии, совместимые с тканями организма человека.
Композиции для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые готовят смешиванием соединений согласно изобретению с приемлемыми не раздражающими наполнителями или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или суппозиторный воск, являющимися твердыми веществами при температуре окружающего воздуха и жидкими - при температуре тела. Благодаря этому свойству они плавятся в ректальной или вагинальной полости с высвобождением активного соединения.
Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В подобных твердых дозированных формах активное соединение смешивают с по меньшей мере одним инертным фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем, таким как цитрат натрия или двукальциевый фосфат и/или а) наполнители, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремниевая кислота, b) связующие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидинон, сахароза и гуммиарабик, с) увлажнители, такие как глицерол, d) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или кукурузный крахмал, е) агенты, замедляющие растворение, такие как парафин, f) ускорители абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония, g) смачивающие агенты, такие как, например, кетиловый спирт и глицерола моностеарат, h) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина, и i) скользящие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, натрий лаурилсульфат и их смеси. При приготовлении капсул, таблеток и пилюль дозированная форма может также содержать буферные агенты.
Твердыми композициями подобного типа можно заполнять мягкие и твердые желатиновые капсулы, в качестве наполнителей использовать лактозу или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п. Твердые дозированные формы в виде таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно приготовить с покрытием и оболочкой, например, с энтеросолюбильным (кишечнорастворимым) покрытием таблетки, а также с другими покрытиями и оболочками, хорошо известными специалистам в области приготовления лекарственных форм. Покрытия могут содержать контрастные агенты, их можно также применять в композициях, высвобождающих активный ингредиент (ингредиенты) исключительно (или предпочтительно) в определенном отделе желудочно-кишечного тракта, возможно, в замедленном режиме. Примеры композиций, приемлемых для изготовления покрытий и оболочек, включают полимерные вещества и воски. Твердыми композициями подобного типа можно заполнять мягкие и твердые желатиновые капсулы, в качестве наполнителей использовать лактозу или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Активные соединения можно заключить в микрокапсулы с одним или несколькими наполнителями, описанными выше. Твердые дозированные формы в виде таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно приготовить с покрытием и оболочкой, например, с энтеросолюбильным (кишечнорастворимым) покрытием таблетки, с оболочкой, замедляющей высвобождение лекарства, а также с другими покрытиями и оболочками, хорошо известными специалистам в области приготовления лекарственных форм. В подобных твердых дозированных формах активное соединение можно смешать с по меньшей мере одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Подобные дозированные формы обычно содержат также вспомогательные вещества, отличные от инертных разбавителей, например, добавляемые при таблетировании скользящие вещества и другие добавки, такие как стеарат магния и микрокристаллическую целлюлозу. Лекарственные формы в виде таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут содержать также буферные агенты. Покрытия могут содержать контрастные агенты, их можно также применять в композициях, высвобождающих активный ингредиент (ингредиенты) исключительно (или предпочтительно) в определенном отделе желудочно-кишечного тракта, возможно в замедленном режиме. Примеры композиций, приемлемых для изготовления покрытий и оболочек, включают полимерные вещества и воски.
Дозированные формы для местного применения или трансдермального введения в организм соединения согласно настоящему изобретению включают мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, порошки, растворы, спреи, ингалянты и пластыри. Активный компонент в условиях стерильности смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и всеми необходимыми консервантами или буферами. Настоящее изобретение охватывает также офтальмологические композиции, глазные и ушные капли. Кроме того, настоящее изобретение предлагает применение трансдермальных пластырей, обладающих дополнительным преимуществом в том, что они обеспечивают контроль доставки соединения в организм. Подобные дозированные формы готовят путем растворения или диспергирования соединения в соответствующей среде. Для увеличения скорости чрескожного проникновения соединения применяют также вещества, ускоряющие абсорбцию. Скорость проникновения можно регулировать либо применением мембраны, регулирующей скорость проникновения, либо диспергированием соединения в полимерной матрице или геле.
Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает композиции, содержащие соединение формулы I, в количестве, составляющем примерно от 1% по весу до 99% по весу. Согласно другим примерам реализации, площадь пика соединения формулы I на ВЭЖХ-хроматограмме составляет примерно не более 10% от площади пиков, соответствующих другим компонентам корня клопогона кистевидного, относительно общей площади пиков ВЭЖХ-хроматограммы. Согласно другим примерам реализации, площадь пика соединения формулы I на ВЭЖХ-хроматограмме составляет примерно не более 8% от площади пиков, соответствующих другим компонентам корня клопогона кистевидного, относительно общей площади пиков ВЭЖХ-хроматограммы, а согласно еще некоторым примерам реализации - не более 3% площади.
Применение соединений и фармацевтически приемлемых композиций
Соединения согласно настоящему изобретению полезны для регулирования и/или ингибирования продуцирования бета-амилоидного (1-42) пептида в организме пациента. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению полезны для лечения или облегчения состояний, связанных с продуцированием бета-амилоидного (1-42) пептида в организме пациента.
Соединения, экстракты и композиции, согласно способам, предложенным в настоящем изобретении, можно вводить в любых количествах и любым путем, обеспечивающим эффективность лечения или облегчения состояния при нейродегенеративных нарушениях. Точное количество вводимого соединения варьирует в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, его возраста, общего состояния больного, тяжести заболевания, конкретного применяемого агента, пути введения и т.п.
Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает способ модулирования и/или ингибирования продуцирования бета-амилоидного пептида (1-42) в организме пациента, где указанный способ включает этап введения в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение. Согласно другим примерам реализации, настоящее изобретение предлагает способ селективного модулирования и/или ингибирования продуцирования бета-амилоидного пептида (1-42) в организме пациента, где указанный способ включает этап введения в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение. Согласно некоторым другим примерам реализации, настоящее изобретение предлагает способ снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) в организме пациента, где указанный способ включает этап введения в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение. Согласно другим примерам реализации, настоящее изобретение предлагает способ снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) в клетке, включающий приведение в контакт указанной клетки с соединением формулы I. Другой пример реализации предлагает способ снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) в клетке без существенного снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-40) в клетке, включающий приведение в контакт указанной клетки с соединением формулы I. Согласно еще одному примеру реализации предложен способ снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) в клетке и повышения содержания по меньшей мере одного из бета-амилоидов - бета-амилоида (1-37) и бета-амилоида (1-39) в клетке, включающий приведение в контакт указанной клетки с соединением формулы I.
Термин «снижение содержания» или «снижать содержание», используемый в настоящем описании, относится к относительному уменьшению количества бета-амилоидов, достигаемому за счет введения соединения формулы I, по сравнению с количеством тех же бета-амилоидов без введения соединения формулы I. Например, снижение содержания бета-амилоида (1-42) означает, что количество бета-амилоида (1-42) в присутствии соединения формулы I ниже, чем количество бета-амилоида (1-42) в отсутствие соединения формулы I.
Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает способ селективного снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) в организме пациента, где указанный способ включает этап введения в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение. Согласно некоторым примерам реализации, согласно изобретению предложен способ снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) в организме пациента без существенного снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-40) в организме пациента, включающий введение указанному пациенту соединения формулы I или фармацевтически приемлемого состава, содержащего указанное соединение.
Согласно некоторым примерам реализации, настоящее изобретение предлагает способ снижения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) в организме пациента и повышения содержания по меньшей мере одного из бета-амилоидных пептидов, бета-амилоида (1-37) и бета-амилоида (1-39), в организме пациента, включающий введение в организм пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение.
Термин «повышение содержания» или «повысить содержание», используемый в настоящем описании по отношению к количеству бета-амилоида, относится к увеличению количества бета-амилоида, достигаемому за счет введения соединения формулы I (или приведения в контакт клетки с соединением формулы I), по сравнению с количеством бета-амилодов без введения соединения формулы I (или без приведения в контакт клетки с соединением формулы I). Например, повышение содержания бета-амилоида (1-37) означает, что количество бета-амилоида (1-37) в присутствии соединения формулы I выше, чем количество бета-амилоида (1-37) в отсутствие соединения формулы I. Относительное содержание одного из двух бета-амилоидов, бета-амилоида (1-37) и бета-амилоида (1-39), можно повысить либо путем усиленного продуцирования одного из двух бета-амилоидов - бета-амилоида (1-37) и бета-амилоида (1-39), или путем снижения удлиненных форм бета-амилоидных пептидов, например, бета-амилоида (1-40) и/или бета-амилоида (1-42). Кроме того, очевидно, что термин «повышение содержания» или «повысить содержание», используемый в настоящем описании по отношению к количеству бета-амилоида, относится к абсолютному увеличению количества бета-амилоида, достигаемому за счет введения соединения формулы I.
Для специалиста в данной области очевидно, что общее соотношение бета-амилоидных пептидов имеет значение в том случае, когда преимущественным является селективное снижение содержания бета-амилоида (1-42). Согласно некоторым примерам реализации, соединения согласно настоящему изобретению снижают общее отношение содержания бета-амилоидного пептида (1-42) к содержанию бета-амилоидного пептида (1-40). Соответственно, другой аспект настоящего изобретения предлагает способ снижения отношения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) к содержанию бета-амилоидного пептида (1-40) в организме пациента, включающий введение в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение. Согласно некоторым примерам реализации, отношение содержания бета-амилоидного пептида (1-42) к содержанию бета-амилоидного пептида (1-40) снижается от интервала примерно 0,1 до примерно 0,4 до интервала примерно 0,05 до примерно 0,08.
Согласно другим примерам реализации, предлагается способ снижения отношения содержания бета-амилоидного пептида (1-42) к содержанию бета-амилоидного пептида (1-40) в клетке, включающий приведение в контакт клетки с соединением формулы I. Согласно некоторым примерам реализации, отношение содержания бета-амилоидного пептида (1-42) к содержанию бета-амилоидного пептида (1-40) снижается от интервала примерно 0,1 до примерно 0,4 до интервала примерно 0,05 примерно 0,08.
Согласно одному аспекту, настоящее изобретение предлагает способ лечения или уменьшения степени тяжести нарушения, связанного с бета-амилоидным (1-42) пептидом, где указанный способ включает введение в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение. Подобные нарушения включают нейродегенеративные нарушения, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и синдром Дауна.
Согласно другим примерам реализации, настоящее изобретение предлагает способ лечения или ослабления тяжести болезни Альцгеймера у пациента, где указанный способ включает введение в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей указанное соединение.
Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, тем не менее, предполагают, что соединения согласно настоящему изобретению являются модуляторами гамма-секретазы, селективно снижающей содержание бета-амилоидов (1-42). Соответственно, согласно другому примеру реализации, настоящее изобретение предлагает способ модулирования гамма-секретазы у пациента, включающий введение в организм указанного пациента соединения формулы I или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей соединение формулы I. Согласно некоторым примерам реализации, соединения согласно настоящему изобретению представляют собой ингибиторы гамма-секретазы. Указанный способ является полезным для лечения или ослабления тяжести каких-либо нарушений, связанных с гамма-секретазой. Подобные нарушения включают без ограничения нейродегенеративные нарушения, например болезнь Альцгеймера.
Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно входят в состав единичной дозированной формы для облегчения введения в организм и равномерности дозирования. Выражение «единичная дозированная форма», используемое в настоящем описании, относится к физически дискретным единицам агента, вводимого в организм пациента, подвергаемого лечению. Подразумевается, что общую суточную дозу соединений и композиций согласно изобретению определяет лечащий врач на основании тщательного медицинского обследования. Конкретный уровень эффективной дозы для каждого отдельного пациента или организма будет зависеть от многих факторов, включая природу нарушения и степень его тяжести; активность конкретного применяемого соединения; особенности применяемой лекарственной композиции; возраст, вес тела пациента, общее состояние, пол и питание пациента; время введения, путь введения и скорость экскреции конкретного применяемого соединения; длительность лечения; лекарства, применяемые в комбинации или одновременно с конкретным применяемым соединением, и подобные факторы, известные специалистам в данной области. Термин «пациент», используемый в настоящем описании, относится к животному, предпочтительно к млекопитающему, наиболее предпочтительно к человеку.
ПРИМЕРЫ
Экстракт корня клопогона кистевидного, использованный согласно описанной ниже методике, приобрели в заказном порядке в Boehringer Ingelheim Nutriceuticals. Этот экстракт по существу эквивалентен USP препарату корня клопогона кистевидного, в котором для экстракции порошкообразного корня применяли прибмерно 50% водный этанол, затем экстракт сконцентрировали до практически сухого состояния.
Номера соединений, перечисленных ниже, соответствуют следующим соединениям:
Соединение 1: β-D-Ксилопиранозид, (3,12,16,23R,24R,25S,26S)-12-(ацетилокси)-16,23:23,26:24,25-триэпокси-26-гидрокси-9,19-циклоланостан-3-ил.
37
56
11
Известно также как «актеин», СНО; Мол. вес.: 676.83; Рег. номер 18642-44-9.
35
56
9
Соединение 2: Цимигенол 3-β-D-ксилопиранозид; СНO, Мол. вес: 620.81; Рег. номер 27994-11-2.
35
56
9
Соединение 3: Цимигенол 3-α-L-арабинозид. СНO, Мол. вес.: 620.81; Рег. номер 256925- 92-5.
37
60
11
Соединение 4: 24-O-Ацетилгидрошенгманол 3-β-D-ксилопиранозид. СНО, Мол. вес.: 680.87; Рег. номер 78213-32-8.
37
60
11
Соединение 5: 24-O-Ацетилгидрошенгманол 3-α-L-арабинопиранозид. СНО, Мол. вес: 680.87.
37
58
10
Соединение 6: 24-O-Ацетилгидрошенгманол 3-β-D-ксилопиранозид (дельта-16,17)-енольный эфир. СНО, Мол. вес: 662.85.
37
58
10
Соединение 7: 24-O-Ацетилгидрошенгманол 3-α-L-арабинопиранозид (дельта-16,17)-енольный эфир. СНO, Мол. вес: 662.85.
37
60
11
Соединение 8: 24-ерi-24-O-Ацетилгидрошенгманол 3-β-D-ксилопиранозид. СНО, Мол. вес: 680.87.
37
58
10
Соединение 9: 24-ерi-24-O-Ацетилгидрошенгманол 3-β-D-ксилопиранозид (дельта-16,17)-енольный эфир. СHО, Мол. вес: 662.85.
Протокол очистки 1
Колоночная флэш-хроматография
Экстракт корня клопогона кистевидного (15,6 г) суспендировали в 150 мл смеси 4:1 (объем/объем) метанол-вода при 25°С. Образовавшуюся смесь интенсивно перемешивали при помощи механической мешалки в течение 30 минут при указанной температуре, в результате чего образовалась коричневая эмульсия. К данной эмульсии при постоянном перемешивании добавили 51 г силикагеля (ICN silica 32-63 60 А). Смесь сконцентрировали при 25°С под вакуумом при помощи роторного испарителя до образования по существу гомогенного светло-коричневого порошкообразного вещества. Полученный продукт очистили колоночной хроматографией на силикагеле (ICN silica 32-63 60 А) на стеклянной колонке длиной 60 см с внутренним диамером 50 мм.
В ходе подготовки к колоночной хроматографии силикагель высыпали в 500 мл смеси 20:1 дихлорметан-метанол, образовавшуюся смесь вылили в стеклянную колонку. Силикагель отстаивали в течение 30 минут и покрыли слоем песка толщиной 1 см. Затем экстракт, абсорбированный на силикагеле, вылили в смесь 20:1 дихлорметан-метанол, образовавшуюся смесь вылили на верхний слой песка в колонке. Колонку с силикагелем элюировали следующими смесями растворителей под давлением 0,4 бар (аргон):
1.0 мл дихлорметан-метанол 20:1, затем
770 мл дихлорметан-метанол 10:1, затем
800 мл дихлорметан-метанол 7:1, затем
550 мл дихлорметан-метанол 5:1.
1
1
3
Собрали восемь фракций по 200 мл (sat 14-0 - sat 14-7); затем одиннадцать фракций по 100 мл (sat 14-8 - sat 14-18). Все фракции анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), на силикагелевых пластинах Bakerflex, элюировали смесью растворителей 5:1 дихлорметан-метанол. После проявления силикагелевые пластины обработали красителем анисовым альдегидом. На основании результатов тонкослойной хроматографии фракции sat 14-90 - sat 14-12 выпарили досуха в вакууме при 25°С; 10 мг пробы фракций анализировали Н-ЯМР спектроскопией, в качестве растворителя использовали CDOD. См. Фигуры 1 и 2 соответственно. Спектры анализировали на присутствие широкого мультиплета при 2,53 ppm и дублета на 2,2 Гц при 4,86 ppm, поскольку данные сигналы являются характеристическими для соединений 7 и 6. Дополнительные dqf-COSY (Correlation Spectroscopy) спектры для данных четырех образцов подтвердили, что сигналы при 2,53 и 4,86 ppm на самом деле относятся к соединениям 6 и 7. По Н-ЯМР спектру фракции sat 14-10 сделали заключение о том, что в данной пробе концентрация соединений 6 и 7 является максимальной, несколько меньшее количество этих соединений обнаружено во фракции sat 14-9. Обнаружены следы соединений 7 и 6 во фракции sat 14-11; во фракции sat 14-12 указанные соединения не обнаружены. На основании результатов анализа, фракция sat 14-10 была выбрана для дальнейшей очистки способом ВЭЖХ. Альтернативно, для получения дополнительного количества соединений 4-7 при необходимости можно использовать фракцию sat 14-10.
Основным компонентом фракции sat 14-10 является актеин (1) (JNP 2002, 65, 601-605), который выкристаллизовывался из метанольного раствора этой фракции. Чистый актеин получали после рекристаллизации. Основными компонентами фракции sat 14-11 являются цимигенол бета-D-ксилопиранозид (2) и цимигенол альфа-L-арабинозид (3), которые выкристаллизовались из этой фракции в виде смеси в примерном соотношении 2:1 (JNP 2000, 65, 905-910 и 1391-1397).
Фракционирование при помощи обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-хроматографии) на колонке С-18
1
Фракцию sat 14-10 растворили в 3,5 мл метанола. Раствор фракционировали при помощи ВЭЖХ-хроматографии на колонке SUPELCO Discovery RP - 18 (высота колонки - 25 см, внутренний диаметр - 10 мм), на ВЭЖХ системе AGILENT 1100 с автоматическим инжектором (устройством для ввода пробы) и детектором на диодной матрице для детекции при длине волны 190-400 нм. Градиент растворителя - от 30% (объем/объем) воды в метаноле в течение первых двух минут, с последующим линейным уменьшением содержания воды; с достижением 100% концентрации метанола через 20 минут. Через 2 минуты после достижения 100% концентрации метанола содержание воды увеличили до 30% и выдерживали данную концентрацию в течение дополнительных 8 минут. Для полного выделения образца sat 14-10 потребовалось провести 100 вводов пробы, по 35 мкл каждый ввод. Собрали 9 фракций, обозначенных sat 15-1 - sat 15-9. См. Фигуры 3 и 4 соответственно. Соединения 4-7 элюировали во фракциях sat 15-1, 15-2, 15-4 и 15-5: H ЯМР спектры фракций sat 15-1, 15-2, 15-4 и 15-5 представлены на Фигурах 4,а и 4,b.
Фракционирование при помощи обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-хроматографии) для выделения соединений 6, 4 и 9 на колонке С-8
1
Фракцию sat 15-5 растворили в 1,5 мл метанола. Раствор фракционировали при помощи ВЭЖХ-хроматографии на колонке SUPELCO supelcosil LC-8 (высота колонки - 25 см, внутренний диаметр - 10 мм), на ВЭЖХ-системе AGILENT 1100, описанной выше. Градиент растворителя - от 40% (объем/объем) воды в метаноле в течение первых двух минут, с последующим линейным уменьшением содержания воды; с достижением 100% концентрации метанола через 20 минут. Через 2 минуты после достижения 100% концентрации метанола содержание воды увеличили до 40% и выдерживали данную концентрацию в течение 8 минут. Для полного выделения образца sat 15-5 потребовалось провести 50 вводов пробы, по 30 мкл каждый ввод. Собрали пять фракций, которые обозначили sat 16-1 - sat 16-5 (Фигура 5). Соединение 6 элюировали во фракции sat 16-3, а соединение 4 элюировали во фракции sat 16-1. Небольшое количество чистого соединения 9 обнаружено во фракции sat 15-5. На Фигуре 6 представлен Н ЯМР спектр полученных 9.8 мг соединения 6, 98% чистоты.
Фракционирование при помощи обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-хроматографии) для выделения соединения 8 на колонке С-8
Фракцию sat 15-8 растворили в 0,65 мл метанола. Раствор фракционировали при помощи ВЭЖХ-хроматографии на колонке SUPELCO supelcosil LC-8 (высота колонки -25 см, внутренний диаметр - 10 мм), на ВЭЖХ-системе AGILENT 1100, описанной выше. Градиент растворителя - от 40% (объем/объем) воды в метаноле в течение первых двух минут, с последующим линейным уменьшением содержания воды; с достижением 100% концентрации метанола через 20 минут. Через 2 минуты после достижения 100% концентрации метанола содержание воды увеличили до 40% и выдерживали данную концентрацию в течение 8 минут. Собрали семь фракций, которые обозначили sat 18-1 - sat 18-7 (Фигура 5). Соединение 8 элюировали во фракции sat 18-6. ЯМР-спектроскопический анализ, включая анализ NOESY спектров, показал, что в метаболическом растворе соединение 8 находится в равновесии с соответствующим кетоном. Разбавленные метанольные растворы содержат около 4% кетона и 96% полуацеталя.
Фракционирование при помощи обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-хроматографии) для выделения соединений 7 и 5 на колонке С-8
Фракцию sat 15-2 растворили в 0,5 мл метанола. Раствор фракционировали при помощи ВЭЖХ-хроматографии на колонке SUPELCO supelcosil LC-8 (высота колонки - 25 см, внутренний диаметр - 10 мм), на ВЭЖХ-системе AGILENT 1100, описанной выше. Градиент растворителя - от 40% (объем/объем) воды в метаноле в течение первых двух минут, с последующим линейным уменьшением содержания воды; с достижением 100% концентрации метанола через 20 минут. Через 2 минуты после достижения 100% концентрации метанола содержание воды увеличили до 40% и выдерживали данную концентрацию в течение 8 минут. Собрали пять фракций, которые обозначили sat 19-3 - sat 19-7. Чистое соединение 7 выделили во фракции sat 19-7, а чистое соединение 5 - во фракции sat 19-5.
Протокол очистки 2
Далее представлен протокол альтернативного выделения/очистки соединения 6. Для специалиста в данной области очевидно, что при выделении соединения 6 происходит выделение и/или обогащение других соединений согласно настоящему изобретению. Итоговые результаты процесса выделения представлены на Фигуре 7.
При очистке согласно данному протоколу применяли следующее оборудование:
(a) ВЭЖХ-система Hitachi с детектором на диодной матрице
(b) Nova Prep™ 8000 (аппаратура для полупрепаративной ВЭЖХ с отдаленным ПК-контроллером с программным обеспечением от LC ReSponder™ Application Software
(c) УФ-детектор Hitachi UV Detector L-7400
(d) Детектор по светорассеянию испаренного образца (ELSD), Sedex 55.
(e) Колонка силикагелевая 75L Biotage silica column(KP-Sil; P/N FKO-1107-19073; Lot 027075L)
(f) Колонка 75L Biotage Cl 8 (Bakerbond, 40 µ)
(g) Колонка 75S Biotage Cl 8 (Vydac, 40 µ)
(h) Колонка для аналитической ВЭЖХ: Phenomenex Luna С 18, 3µ, 4.6×100 мм
(i) Колонка для полупрепаративной ВЭЖХ: Phenomenex Luna C8 HPLC колонка 20×250 мм
g) Колонка для полупрепаративной ВЭЖХ: YMC AQ С 18 HPLC колонка 21.2×250 мм; и
(k) Колонка для препаративной ВЭЖХ: ES Industries C1 8 Preparative HPLC колонка 5×25 см
Аналитический способ определения чистоты соединения 6 описан ниже.
Колонка: Phenomenex Luna Cl 8, 3µ, 4.6×100 мм
Подвижная фаза: изократическое элюирование А. 35% ацетонитрил, В. 30% очищенная (до наночистоты) вода, содержащая 0,05% уксусной кислоты, и С.35% МеОН, скорость потока: 1 мл/мин.
Детекция: 205, 230 нм, DAD (детектор на диодной матрице); и ELSD (детектор по светорассеянию испаренного образца)
Время проведения процесса: 8 мин
Температура колонки: 32°С
Данный способ применяли для анализа экстракта, фракций и конечного продукта. При указанных условиях соединение 6 элюировали примерно через 5,5 минут.
50 г неочищенного экстракта корня клопогона кистевидного фракционировали на силикагелевом картридже Biotage Silica (7.5×30 см). После загрузки провели элюирование смесью 5% MeOH/DCM (10 л) и 10% MeOH/DCM (5 л), собрали по 500 мл фракций. Скорость потока - 150-200 мл/мин. ВЭЖХ (УФ-детекция на волне 230 нм) выявила наличие соединения 6 во фракциях 23 (2.6 г) и 24 (2.3 г). Фракцию 23 (F23) выбрали для дальнейшей очистки способом полупрепаративной хроматографии на колонке С 8.
2
Провели 10 циклов, получили примерно 10 мг соединения 6. 50 мг F23 в 0,3 мл МеОН загрузили в полупрепаративную колонку Phenomenex Luna C-8 (21.2×250 мм, 10µ, 100 А). Элюирование проводили со скоростью потока 9,9 мл/мин 70% МеОН в НО с УФ-мониторингом на волне 205 нм. Вещества, соответствующие пикам, элюированным на 35 мин и 38 мин (как представлено на ВЭЖХ-хроматограмме (Фигура 8)), собрали по отдельности.
+
Фракции, соответствующие пику на 35 мин, с 10 цикла собрали и выпарили растворители при температуре окружающего среды. Полученные твердые вещества высушили в лиофилизаторе, получили 10,3 мг соединения 6 (2609-165-7). На ВЭЖХ-хроматограмме (Фигура 9) продукта 2609-165-7 присутствует пик полярной примеси, (11.3%), время удерживания (RT) 4.5 мин, хотя на ВЭЖХ-хроматограмме отдельных фракций присутствует только один основной пик (Фигура 10). Очевидно, что соединение 6 медленно превращалось в ходе процесса в более полярное соединение. Обнаружено, что более полярное соединение представляет собой деацетилпроизводное соединения 6, что очевидно из данных, полученных с помощью статической масс-спектрометрии вторичных ионов (СВИМС), где присутствует интенсивный [M+Na]пик при m/z 643 (Фигура 11), и с помощью протонного ЯМР анализа (Фигура 12) выделенной примеси (время удерживания - 4,5 мин), на котором отсутствует синглет, соответствует ацетилметилу.
3
Ряд экспериментов, оценивающих стабильность соединения 6, показали, что деацетилирование происходит в слабощелочном растворе МеОН. Однако соединение сохраняло стабильность и в слабокислом растворе. Поэтому 2609-165-7 вновь пропустили через колонку Luna С 8, в качестве элюента использовали 70% МеОН/ 30% воды, содержащей 0.05% АсОН; в результате получили 3.4 мг соединения 6 (2609-172-11). ВЭЖХ-хроматограмма 2609-172-11 представлена на Фигуре 13. Данные протонного ЯМР анализа (в CDOD) и СВИМС представлены на Фигурах 14 и 15.
Согласно другой методике, 250 г экстракта корня клопогона кистевидного перемешивали с 1250 мл МеОН в течение 1 часа при комнатной температуре в химическом стакане. Твердые вещества не растворились полностью, но ВЭЖХ-анализ фильтрата показал, что соединение 6, содержащееся в исходном экстракте, растворилось полностью (250 мг). Нефильтрованную смесь добавили к 750 г силикагеля (ICN, 60-200 µ) в круглодонной колбе объемом 5 л. МеОН удалили в роторном испарителе под вакуумом; получили сухое порошкообразное вещество весом 1100 г, содержащее 9% остаточного МеОН.
Экстракт корня клопогона кистевидного, высушенный на препарате силикагеля, разделили на четыре части, приблизительно по 270 г каждая. Смесь загрузили в SIM (модуль селективного ионного мониторинга) и вначале промыли 500-600 мл метиленхлорида для удаления неполярных примесей и остаточного МеОН. SIM соединили с 75L силикагелевой колонкой (KP-SiI; P/N FKO-1107-19073; Lot 027075L; 7.5×25 см или 1750 мл). Давление на основной колонке составило 413,68 кПа. Систему элюировали ацетоном при скорости потока 100 мл/мин, собрали фракции объемом 500-1000 мл. После элюирования соединения 6 колонку промыли 1,0 л МеОН и восстановили равновесие при помощи 2 л ацетона. Отмечено первичное элюирование соединения 6 во фракции 3 (1000 мл) после элюирования приблизительно 900-1000 мл ацетона во фракциях 1 и 2. В результате первых четырех циклов получили приблизительно 224 мг соединения 6. Второй объем исходного вещества для силикагелевой колонки Biotage приготовили из 100 г экстракта корня клопогона кистевидного и 500 мл МеОН и 300 г силикагеля. Два дополнительных цикла (5 и 6) с этим исходным материалом провели в условиях, аналогичных условиям первых четырех циклов, при этом получили дополнительно 93 мг соединения 6. Продукты каждого из шести циклов объединили, фильтрат упарили до образования твердого вещества при пониженном давлении.
2
2
2
2
Высушенное твердое вещество (80 г), полученное из элюата силикагелевой колонки Biotage, растворили в 720 мл МеОН и медленно добавили при перемешивании 480 мл НO. При этом произошло осаждение темных смолообразных веществ. Их отделили фильтрованием. Мутный фильтрат загрузили в колонку 75L (7.5×25 см) Bakerbond 60 А, 40µ Biotage Cl 8. После загрузки (анализ показал отсутствие соединения 6), колонку промыли 5 л 60% (v/v) МеОН/НО, затем элюировали соединение 64 л 70% МеОН/НО. После элюирования колонку промыли 2 л МеОН. Скорость потока составила примерно 60 мл/мин в течение всего процесса, подвижная фаза МеОН/НO содержала 0.05% уксусной кислоты для предотвращения разложения соединения 6. Весь элюат (4 л), содержащий продукт, сконцентрировали при пониженном давлении до удаления практически всего МеОН, образовавшийся осадок отфильтровали на воронке Бюхнера и высушили в глубоком вакууме при комнатной температуре.
2
2
2
Смолообразные твердые вещества, отделенные фильтрацией от раствора, собранного в первом цикле (колонка С18), с содержанием соединения 6 около 32 г, растворили в 2 л МеОН смыва с колонки после эксперимента, содержащего около 22 мг соединения 6. Смесь упарили до объема 1 л и смешали с 0,67 л воды. Выпавшие в осадок смолообразные вещества собрали на фильтре, растворили в 200 мл МеОН, смешали с 134 мл воды. Эту смесь также профильтровали для удаления небольшого количества смол и объединили фильтрат с первым фильтратом, затем загрузили в колонку 75S (7.5×9.0 см; 400 мл) колонка Vydac 300 А, 40 µ Biotage Cl 8. Колонку промыли 1 л 60% MeOH/HO и 2 л 70% МеОН/HО, элюировали 1 л 80% МеОН/HО (подвижные фазы содержали также 0.05% уксусной кислоты). Собранный продукт упарили, твердые вещества отделили фильтрованием, так же как в крупномасштабном эксперименте с колонкой Biotage.
Первую партию полученного на колонке С18 Biotage продукта (16,69 г) смешали с 70 мл МеОН. Смесь подвергли обработке ультразвуком, осадок отделили фильтрованием. Фильтрат прохроматографировали (пять циклов, по 14 мл каждый) на колонке ES Industries Chromegabond WR С 18, скорость потока - 177 мл/мин, элюент - 70% МеОН/30% воды, содержащий 0.05% АсОН. Фракции с 6 по 14 минуты каждого цикла собирали и упаривали для удаления МеОН. Осадок после удаления МеОН отделили центрифугированием, высушили в лиофилизаторе, получили 6,6 г сухого твердого вещества 2609-173-16 (соединение 6, 3.2%).
Вторую партию продукта (4,3 г), полученного на колонке С18 Biotage, обработали таким же способом, в результате получили 2,0 г сухого твердого вещества 2609-173-27 (соединение 6, 3.06%). 2609-173-16 и 2609-176-27 объединили, получили 8.6 г 2609-174-6.
2609-174-6 (400 мг) растворили в 1.3 мл МеОН, содержащего 0.1% АсОН. Раствор загрузили в колонку Phenomenex Luna С 8 и элюировали со скоростью потока 24 мл/мин, элюент - 68% МеОН/32% воды, содержащий 0,05% АсОН.
По данным аналитической ВЭЖХ, фракции от 15,8 до 19,8 минуты каждого цикла (всего 22 цикла) объединили, упарили для удаления МеОН и высушили лиофильной сушкой, в результате получили 2609-174-28 (1.4 г, содержащего 12.6% соединения 6). 2609-174-28 использовали в процессе окончательного выделения соединения 6 на колонке YMC-AQ С 18. Всего провели 28 циклов.
2609-174-28 (50 мг) растворили в 0.25 мл МеОН, содержащего 0.1% АсОН. Раствор ввели в колонку YMC AQ Cl 8. Элюировали со скоростью 9,9 мл/мин, элюент - 70% МеОН/30% воды, содержащий 0.05% АсОН. По данным аналитической ВЭЖХ собрали фракции, обычно между 48,4-50,4 мин. Собранные фракции из 28 циклов объединили, упарили, высушили лиофильной сушкой, получили соединение 6 (2609-176-30, 85 мг).
+
37
58
10
Фракции, собранные сразу перед временной точкой 48,4 мин, содержащие соединение 6, также собрали и высушили, из них получили 2609-176-35 (50 мг). 2609-176-35 подвергли повторной обработке (3 цикла) на той же колонке и с той же подвижной фазой, получили еще одну порцию соединения 6, которую объединили с 2609-176-30; получили 102 мг продукта (2609-177-10) хроматографическая чистота -95%. ВЭЖХ-хроматограммы (детекция - УФ на 205, 230 нм и ELSD), а также ЯМР-спектры представлены на Фигурах 16, 17, 18 и 19 соответственно. Спектр протонного ЯМР продукта 2609-176-10 соответствует спектру стандартного образца соединения 6. На СВИМС соединения 6 (Фигура 20) присутствует интенсивный пик [M+Na] при m/z 685, соответствующий молекулярной формуле СНO соединения 6.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
А. Исследование Аβ-42-игибирующего эффекта Соединения Формулы I
Соединения согласно настоящему изобретению и экстракты, содержащие описанные соединения, как ингибиторы бета-амилоидных (1-42) пептидов, можно исследовать in vitro или in vivo. Подобные способы исследования подробно описаны в патенте США 6,649,196, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки.
Обнаружено, что соединения согласно настоящему изобретению способны снижать содержание бета-амилоидных (1-42) пептидов. Исследование проводили способом клеточного анализа, по существу аналогичного описанному в патенте США 6,649,196.
В. Исследование воздействия Соединения Формулы I на общее содержание Аβ
Для исследования воздействия Соединения Формулы I на общее содержание β-амилоидного (1-42) пептида in vitro применили способ, по существу описанный в Wang et al., J Biol. Chem. 1996, 50:31894-31902, The Profile of Soluble Amyloid β Protein in Cultured Cell Media, включенном в данную заявку во всей полноте посредством ссылки. Данный способ анализа позволяет количественно оценить содержание бета-амилоидного белка при помощи иммунопреципитации и масс-спектрометрии (IP-MS). На примере Соединения 6 обнаружено, что данное соединение снижает содержание бета-амилоидного пептида (1-42), повышая при этом содержание бета-амилоидного пептида (1-37) и бета-амилоидного пептида (1-39). Результаты исследования представлены на Фигуре 21.
w
V717F
717
Соединение 6 исследовали также способом, описанным в Wang et al., с использованием клеток 7W (APPO и 7РА2 клеток (АРР). Мутации АРРповышают относительное содержание бета-амилоидного пептида (1-42). Данное исследование показало, что Соединение 6 снижает содержание бета-амилоидного пептида (1-42), повышая одновременно содержание бета-амилоидного пептида (1-39). Полученные результаты представлены на Фигуре 22.
Здесь описаны некоторые примеры реализации настоящего изобретения, однако очевидно, что эти основные примеры можно модифицировать и предложить другие примеры реализации с применением соединений и способов согласно настоящему изобретению. Исходя из этого подразумевается, что объем настоящего изобретения определяется в большей степени прилагаемой формулой изобретения, нежели конкретными примерами реализации, представленными в качестве Примеров.