ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА И Fab, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С АНТИГЕНОМ F1 ИЗ Yersinia pestis, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДРОЖЖЕЙ
HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST

Область техники
Изобретение относится к антителам, в частности к гуманизированным антителам, связывающимся с белком F1 из Yersinia pestis, способу получения указанных антител с использованием дрожжей.
Предшествующий уровень техники
Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированными с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in WO 91/09967.
Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497). Она включает в себя главным образом иммунизацию мыши антигеном, слияние клеток селезенки из иммунизированной мыши с клетками миеломы мыши и селекцию среди полученных таким образом гибридом одной или нескольких гибридом, которые секретируют моноклональное антитело, специфическое для целевого антигена.
Капсульный антиген F1 является основным иммунохимическим компонентом антигена, расположенного на поверхности Y. pestis. Антиген F1 присоединен к внешней мембране микроба Y. pestis в виде олигомерного белка, образующего гранулярный слой и постепенно диффундирующего в окружающую среду. Капсульный полимер состоит из множества похожих субъединиц гидрофобного белка, агрегированных при физиологических условиях. Субъединица F1 антигена изначально синтезируется из 170 аминокислот и обладает молекулярной массой 17.6 кДа, затем, после удаления сигнального пептида в ходе секреции на поверхность, формируется белок с молекулярной массой 15.6 кДа и изоэлектрической точкой 4.1 (Karlyshev et al., FEBS Lett. 1992 Feb 3; 297(1-2):77-80).
Для снижения неблагоприятных реакций пациентов при использовании антител в терапии указанные антитела или их части должны быть гуманизированы для того, чтобы быть менее иммуногенными, чем их мышиные прототипы. Так, авторы настоящего изобретения на основе каркасных участков антител человека сконструировали антитела, содержащие антигенсвязывающие участки, специфичные для антигена F1 из Yersinia pestis.
Краткое описание изобретения
Целью настоящего изобретения было получение реагента, в частности гуманизированного антитела или антигенсвязывающего участка (fragment antigen binding, Fab), для детекции Yersinia pestis и лечения чумы.
Указанная цель была достигнута путем конструирования гуманизированного антитела и антигенсвязывающего участка (Fab) на основе ранее изолированного авторами настоящего изобретения мышиного антитела, обладающего способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis, и демонстрации высокой специфичности указанного антитела в связывании антигена F1 из Yersinia pestis. Также указанная цель была достигнута путем создания способа получения указанных функциональных антител с использованием клеток дрожжей.
Также настоящее изобретение предоставляет новое гуманизированное антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое моноклональное мышиное антитело селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis.
Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий описанное выше антитело.
H
L
Также настоящее изобретение предоставляет гуманизированный антигенсвязывающий участок (Fab), который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1, соединенный с доменом C1 иммуноглобулина человека, и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2, соединенный с доменом C иммуноглобулина человека.
H
H
L
L
Также настоящее изобретение предоставляет гуманизированный антигенсвязывающий участок (Fab), описанный выше, в котором домен C1 является доменом C1 иммуноглобулина человека IgG1, а домен C является доменом C иммуноглобулина человека каппа.
Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий участок (Fab), описанный выше.
Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, трансформированную фрагментом ДНК, описанным выше, и обладающую способностью к продукции указанного Fab.
Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, описанную выше, где указанной клеткой дрожжей является Pichia pastoris.
Также настоящее изобретение предоставляет способ получения Fab, описанного выше, включающий выращивание указанных дрожжей в питательной среде и выделение указанного Fab из культуральной жидкости.
Краткое описание чертежей
H
На Фиг.1 показано конструирование и последовательность гуманизированного фрагмента V Fab против антигена F1 из Y. pestis. Каркасные участки подчеркнуты.
L
На Фиг.2 показано конструирование и последовательность гуманизированного фрагмента V Fab против антигена F1 из Y. pestis. Каркасные участки подчеркнуты.
H
H
На Фиг.3 показана последовательность гуманизированного фрагмента V Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенного с доменом C1 иммуноглобулина человека IgG1, содержащего сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах. Каркасные участки подчеркнуты, гипервариабельные петли (CDR) выделены курсивом.
L
L
На Фиг.4 показана последовательность гуманизированного фрагмента V Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенного с доменом C иммуноглобулина человека каппа, содержащего сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах. Каркасные участки подчеркнуты, гипервариабельные петли (CDR) выделены курсивом.
На Фиг.5 показана карта плазмид pPICZαA-F1-hybrid-H (А) и pPICZαA-F1-hybrid-L (В).
На Фиг.6 показана схематическая карта плазмиды pPICZαA-F1-hybrid-H-L.
Подробное описание настоящего изобретения
Антитела, полученные против определенных белков или мимотопов, могут обладать некоторыми преимуществами, поскольку такие антитела не сильно загрязнены антителами против других соединений, что могло бы, в противном случае, повлиять на точность диагностического метода. Способы получения таких антител известны из предшествующего уровня техники и подробно описаны Harlow и др, (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988), и включают в себя иммунизацию животных с целью получения препаратов антител, которые выделяют из, например, плазмы или асцитной жидкости и очищают способами, известными из уровня техники, с получением препаратов, дающих реакцию с антигеном. Множество видов имеют белки с близкими последовательностями и поэтому могут возникнуть сложности в ходе использования стандартных протоколов иммунизации при получении антител, которые узнают белок только одного вида. Поэтому также стоит рассмотреть модификации стандартных методов получения антител, таких как, например, разностные (вычитательные) гибридизационные методики. Такие модификации могут быть известны специалисту в данной области техники, также они описаны в настоящем описании. В других методах антитела, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, получают с использованием рекомбинантных методов, описанных Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)).
Вкратце, моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин "выращенные клетки", использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др., (см. выше). Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например, использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, keyhole limpet hemacyanin, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).
Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (а) назначение животному эффективного количества белка, пептида или его мимотопа с целью получения антител, (b) выделение указанных антител, (с) определение последовательности антител и конструирование гуманизированных антител.
Ранее авторы настоящего изобретения получили моноклональное мышиное антитело, обладающее способностью эффективно связывать антиген F1 из Yersinia pestis (Y. pestis), и определили последовательность Fab указанного антитела. Такое антитело содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO:5 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:6 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования антитела. Полученное моноклональное мышиное антитело продемонстрировало высокую специфичность и эффективность связывания антигена F1 из Y. pestis.
Затем авторы настоящего изобретения сконструировали каркасные участки с использованием аминокислот, которые наиболее часто встречаются в человеческих гомологах указанного мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis. С использованием базы данных недегенеративных последовательностей белков PubMed и программного обеспечения BlastP было найдено 100 наиболее близких человеческих гомологов для каждого каркасного участка каждой цепи антитела. На основе наиболее часто встречающихся аминокислот были составлены последовательности консенсусных каркасных участков. Окончательные последовательности гуманизированных вариабельных доменов антитела против антигена F1 из Y. pestis были составлены из последовательностей консенсусных каркасных участков и последовательностей мышиных CDR (Фиг.1 и 2). Термин "CDR" или "участок, определяющий комплементарность" относится к тем частям тяжелой и легкой цепи антитела, которые расположены в непосредственной близости друг от друга в трехмерном пространстве и формируют связывающую поверхность антитела.
Так было выполнено настоящее изобретение.
В частности, антителом согласно настоящему изобретению является гуманизированное антитело, обладающее способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis (Y. pestis).
Таким антителом является антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое гуманизированное антитело селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis. Консервативные участки тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению. Консервативные участки легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда могут быть использованы в качестве консервативных участков для легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению.
H
L
H
H
L
L
Также антигенсвязывающим фрагментом (Fab) согласно настоящему изобретению является изолированный Fab, который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и который включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1, соединенный с доменом C1 иммуноглобулина человека, и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2, соединенный с доменом C иммуноглобулина человека. Домен C1 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE может быть использован в качестве домена C1 тяжелой цепи Fab согласно настоящему изобретению. Домен C легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда может быть использован в качестве домена C легкой цепи Fab согласно настоящему изобретению. Такой Fab согласно настоящему изобретению представлен, но не ограничивается Fab, содержащим последовательности аминокислот SEQ ID NO:7 (тяжелая цепь) и SEQ ID NO:8 (легкая цепь) (Фиг.3 и 4).
В настоящем изобретении термин "антитело" использован для описания иммуноглобулинов или их фрагментов, мономеров или димеров легкой цепи или тяжелой цепи, одноцепочечных антител, таких как одноцепочечные антитела Fvs, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером, а также как природных, так и полученных методами рекомбинантных ДНК или другим образом, при условии, что антитело содержит по крайней мере один антигенсвязывающий участок. Остальная часть антитела не должна обязательно включать только последовательность, производную от иммуноглобулина. Например, может быть сконструирован ген, в котором последовательность ДНК, кодирующая часть цепи человеческого иммуноглобулина, соединена с последовательностью ДНК, кодирующей последовательность аминокислот полпептида эффектора или молекулы-репортера.
Термин "гуманизированное антитело" используется для описания антитела, содержащего по крайней мере один, а предпочтительно два или три, участка CDR в одном или обоих вариабельных участках, полученных из антитела из первого вида животного, это понимается как то, что он может содержать определенный выбранный каркасный участок из аминокислот, соединенный с определенной гипервариабельной последовательностью аминокислот. Оставшиеся части антитела, полученные из иммуноглобулина Ig, получают из одного или нескольких различных антител. Вариабельные домены могут быть получены с использованием техники рекомбинантных ДНК или пептидным синтезом.
Гуманизированные антитела или их связывающие белки согласно настоящему изобретению содержат последовательности аминокислот, включающие в себя все или части CDR, полученные главным образом из моноклонального антитела, обладающего специфичностью к антигену F1 из Yersinia pestis. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения таким моноклональным антителом является мышиное по происхождению антитело. Аминокислотные последовательности каркасных участков вариабельных доменов антитела или их части являются главным образом человеческими по происхождению в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения и следовательно "гуманизированными антителами". Эта "гуманизация" считается полезной в снижении иммуногенности указанного антитела при терапевтическом назначении пациентам. Определенные выбранные остатки в каркасных участках остаются мышиными, а не человеческими. Считается, что это необходимо для достижения нужной трехмерной структуры молекулы, и таким образом для повышения связывающей специфичности и аффинности к антигену F1 из Yersinia pestis.
Любая часть гуманизированных антител (и следовательно, в широком смысле определения термина антитела), полученная в соответствии с настоящим описанием, не выходит за рамки настоящего изобретения, при условии, что специфичность связывания и аффинность к антигену F1 из Yersinia pestis сохраняется. Таким образом, связывающие белки, полученные из указанных антител, без сомнений в рамках настоящего изобретения, как и другие фрагменты, которые способствуют проявлению из способности, по крайней мере в степени необходимой для терапевтического использования, как описано ниже.
В настоящем изобретении фраза "антитело или Fab, обладающий способностью к связыванию с антигеном F1 из Yersinia pestis" означает молекулу, которая связывается с антигеном F1 и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов. Термин "селективно связывает антиген F1 из Yersinia pestis" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с антигеном F1 в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к антигену F1, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом или Fab, которое предпочтительно связывается с антигеном F1, является антитело или Fab, которое связывается с антигеном F1, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с антигеном F1, с молекулой, не являющейся антигеном F1, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с антигеном F1, определить уровень антигена F1 из Y. pestis в образце. Примерами таких молекул и компонентов, которые могут присутствовать в образце, являются, но не ограничиваются ими, белки, не являющиеся антигеном F1, липиды и углеводы.
Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом ELISA и равновесным диализом. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Fab, пригодный для осуществления настоящего изобретения, - это Fab, обладающий способностью к связыванию антигена F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет от около 10 нг/мл и около 10 пг/мл. В частности, пригодные в рамках настоящего изобретения антитела связывают антиген F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет 10 нг/мл, около 1 нг/мл или менее, предпочтительно 100 пг/мл. Такие антитела и Fab описаны в сопутствующих Примерах.
Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело согласно настоящему изобретению, является экспрессирующийся фрагмент ДНК, содержащий промотор, сигнальную последовательность, последовательность нуклеотидов, кодирующую структурные части тяжелой и легкой цепей антитела, участок терминации транскрипции.
В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие структурные части тяжелой и легкой цепей антитела согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4), связанный с фрагментом ДНК, кодирующим консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Нуклеотидные последовательности, кодирующие Fab согласно настоящему изобретению, представлены, но не ограничиваются нуклеотидными последовательностями с 31 по 693 нуклеотид в SEQ ID NO:9 (тяжелая цепь) и с 31 по 669 нуклеотид в SEQ ID NO:10 (легкая цепь) (Фиг.3 и 4). Фрагмент ДНК, кодирующий Fab согласно настоящему изобретению, может быть получен любым методом, известным специалисту в данной области техники, включая ПЦР с использованием набора перекрывающихся праймеров, синтез по технологии Slonogene™ (Sloning Biotechnology GmbH), химическим способом и т.д.
Также, нуклеотидные последовательности, кодирующие Fab согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4).
Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO:3 или 4 при условии, что они кодируют участки цепей антитела с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2.
Клетками дрожжей согласно настоящему изобретению являются клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК, описанным выше, и обладающие способностью к продукции Fab против антигена F1 из Y. pestis.
Фраза «клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК» означает, что желаемый фрагмент ДНК был введен в клетку дрожжей с использованием методов, известных специалисту в данной области техники. Трансформация клетки дрожжей фрагментом ДНК приводит к увеличению экспрессии фрагмента ДНК, кодирующего антитело согласно настоящему изобретению. Присутствие сигнальной последовательности α-фактора приводит к секреции произведенного антитела в культуральную жидкость. Методы трансформации клеток дрожжей включают в себя все известные методы, например модифицированная версия процедуры, описанной для S. cerevisiae (Gietz and Schiestl, 1996).
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения Fab против антигена F1 из Y. pestis, включающий выращивание дрожжей в питательной среде и выделение полученного Fab из культуральной жидкости.
Примером клетки дрожжей, пригодных для продукции Fab согласно настоящему изобретению, являются, но не ограничивается ими, клетки дрожжей Pichia pastoris. Фраза "дрожжи Pichia pastoris" означает, что указанные дрожжи классифицируют как Pichia pastoris (Р. pastoris) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области микробиологии. Примерами дрожжей Р. pastoris, применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, дрожжи Р. pastoris GS115 (Invitrogen).
В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка Fab из культуральной жидкости и других жидкостей может быть осуществлена методом, сходным с традиционными методами ферментации, когда некий белок производится с использованием микроорганизма.
Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источник углерода, источник азота, минералы и, если это необходимо, подходящее количество питательных веществ, в которых нуждаются дрожжи для их роста. К источникам углерода относятся углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции у указанного микроорганизма может быть использован спирт, включая метанол, этанол, глицерин. В качестве источника азота могут быть использованы различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, источники природного азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, расщепленные ферментированные микроорганизмы. В качестве источника минералов могут быть использованы монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут быть использованы тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.
Выращивание предпочтительно осуществляют в аэробных условиях, таких как культивирование с перемешиванием, взбалтывание с аэрацией, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 28 до 30°С. рН среды обычно поддерживают в диапазоне от 2 до 9, предпочтительно в диапазоне от 6 до 7.5. рН среды может быть скорректирован с помощью аммиака, карбоната кальция, различных оснований и буферов. Обычно выращивание в течение от 1 до 7 дней приводит к накоплению Fab в культуральной жидкости.
После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем антитела или Fab могут быть выделены и очищены методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.
Для терапии, применяемой к людям, необходимо использовать человеческие изотипы для того, чтобы минимизировать антиглобулинный ответ а в течение этой терапии. Последовательности ДНК человеческих константных доменов, предпочтительно в сочетании с каркасными участками вариабельных доменов могут быть получены в соответствии с хорошо известными методиками. Примером такой методики является методика CAMPATH 1H, доступная у компании Burroughs Wellcome Ltd.
Антитело, обладающее способностью к связыванию антигена F1 из Y. pestis, использованное в настоящем изобретении, может содержаться в составе медицинской рецептуры. Например, антитело может быть объединено с буфером, в котором указанное антитело растворено, и/или с неким носителем. Буферы и носители, пригодные для этого, известны специалистам в данной области техники. Примерами таких буферов являются буферы, в которых указанное антитело может функционировать, селективно связывая антиген F1, такие как, но не ограничивающиеся солевым фосфатным буфером, водой, салином, фосфатным буфером, буфером HEPES (солевой буфер N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты), буфером TES (солевым буфером Трис-ЭДТА), буфером Трис и буфером ТАЕ (Трис-ацетат-ЭДТА). Примерами носителей являются, но не ограничены полимерными матрицами, токсоидами, сывороточными альбуминами, такие как бычий сывороточный альбумин. Носители могут быть комбинированы с антителами и конъюгированными (то есть, присоединенными) антителами так, что они несущественно влияют на способность антитела к селективному связыванию антигена F1.
Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Конструирование генов, кодирующих фрагмент Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis
С использованием базы данных последовательностей не дегенеративных белков PubMed с применением программного обеспечения BlastP было найдено 100 наиболее близких человеческих гомологов для каждого каркасного участка каждой цепи антитела. Консенсусные участки были составлены на основе наиболее часто встречающихся аминокислот. Окончательная последовательность гуманизированных вариабельных доменов антитела против антигена F1 из Y. pestis была составлена из консенсусных последовательностей каркасных участков и последовательностей мышиных CDR (Фиг.1 и 2, SEQ OD NO:1 и 2).
Пример 2. Конструирование экспрессионной системы для получения фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis и получение указанного фрагмента Fab с использованием дрожжей.
H
H
Фрагмент ДНК (SEQ ID NO:9), содержащий ген, кодирующий фрагмент V Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенный с доменом C1 иммуноглобулина человека IgG1, содержащий сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах, необходимые для клонирования в экспрессионный вектор, был составлен с помощью набора перекрывающихся синтетических праймеров и клонирован в вектор pPICZalpha A (Invitrogen).
L
L
Фрагмент ДНК (SEQ ID NO:10), содержащий ген, кодирующий фрагмент V Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенный с доменом C иммуноглобулина человека каппа, содержащий сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах, необходимые для клонирования в экспрессионный вектор, был составлен с помощью набора перекрывающихся синтетических праймеров и клонирован в вектор pPICZalpha A ΔMssI.
Вектор pPICZalpha A ΔMssI получали из вектора pPICZalpha A (Invitrogen) путем замены сайта рестрикции MssI (PmeI) на сайт рестрикции KspAI. Для этой цели в ходе ПЦР использовали 4 праймера (SEQ ID NO:11-14), плазмиду pPICZalpha А использовали в качестве матрицы. Полученный фрагмент ПЦР расщепляли с использованием рестриктаз SacI и Mph1103I и лигировали в вектор pPICZalpha А, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Таким образом были получены плазмиды pPICZalpha-F1-humanized-H и pPICZalphaΔMssI-F1-humanized-L.
Сборку обоих генов, кодирующих цепи фрагмента Fab, на одной плазмиде осуществляли лигированием фрагмента BglII-BamHI из вектора, содержащего легкую цепь, в сайт рестрикции BamHI вектора, содержащего тяжелую цепь.
Так была сконструирована экспрессионная плазмида pPICZαA-F1-humanized-H-L, содержащая последовательность, кодирующую обе цепи фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis, каждый из которых был непосредственно соединен в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью α-фактора из Saccharomyces cerevisiae под контролем промотора АОХ1.
Пример 3. Получение трансформантов дрожжей и анализ продукции фрагмента Fab
Экспрессионную плазмиду pPICZαA-F1-humanized-H-L, линеаризованную с помощью рестриктазы PmeI, вводили в клетки GS115 в соответствии с протоколом производителя INVITROGEN с помощью методики, использующей LiCl. Трансформанты отбирали на питательной среде YPDS (Invitrogen), содержащей глюкозу и Zeocin (100 мкг/мл). Интеграция линеаризованной плазмиды в хромосому подтверждали методом ПЦР с использованием ген-специфичных праймеров (SEQ ID NO:15 и 16 для тяжелой цепи и SEQ ID NO:17 и 18 для легкой цепи) и геномной ДНК трансформантов в качестве матрицы.
Отобранные трансформанты переносили на питательную среду BMMY (Invitrogen), содержащую метанол, для индукции экспрессии генов, кодирующих фрагмент Fab против антигена F1 из Y. pestis. Клоны штамма GS115/pPICZαA-F1-humanized-H-L выращивали в пробирках (V=4 мл) в течение 45 часов при 30°С и рН 6.0 (конечная оптическая плотность - OD 40). Измерение количества фрагментов Fab в культуральной жидкости осуществляли методом ELISA. В соответствии с результатами анализа был выбран штамм, продуцирующий до 5 мг/л фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis.
Анализ ELISA для фрагмента Fab в культуральной жидкости:
2
4
- Сорбция антитела 2А11, разбавленного 1/1000 в 20 мМ NaHPO (рН 7.2), 100 мкл на лунку, 2 часа при комнатной температуре. Антитела 2А11 связываются константные домены фрагмента Fab человеческого IgG1.
- Промывка лунок три раза буфером PBSt (0.1% Tween).
- Блокировка 0.5% БСА в PBSt (200 мкл на лунку) в течение 30 минут.
- Добавление образцов питательной среды (СМ), 100 мкл на лунку (20 мкл CM + 80 мкл человеческого IgG1, 25 нг/мл в 0.05% БСА), 2 часа при комнатной температуре. Образцы фрагмента Fab человеческого IgG1, 20 нг/мл в 0.05% БСА, использовали в качестве стандарта.
- Промывка лунок три раза буфером PBSt (0.1% Tween).
- Добавление меченных пероксидазой хрена анти-Fc антител, разбавленных 1/7000 в 0.05% БСА в PBS, 100 мкл на лунку, и инкубирование 90 минут при комнатной температуре.
- Промывка лунок шесть раз буфером PBSt (0.1% Tween).
2
2
- Добавление о-фенилендиамина 100 мкл (4 мг/10 мл) с HO в буфере рН 5.0.
2
4
- Остановка реакции добавлением 100 мкл 10% HSO.
Пример 4. Характеристика аффинности фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis, произведенного дрожжами.
Определение констант диссоциации рекомбинантных и природных фрагментов Fab
-8
Константы диссоциации (Kd) определяли в ходе двухступенчатого метода ELISA, как описано в Примере 3. Было установлено, что Kd для гуманизированного фрагмента Fab против антигена F1 из Y. pestis составляет 8×10 М.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы являются частью настоящей заявки, включенные путем ссылки.