Cd1o5+ селекция метод выделения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга без культивирования

мм

ш

Новости клеточных технологий

МЕТОДЫ

СйЮ5+ селекция - метод выделения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга без культивирования

Выделение истинных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) является важной задачей в связи с перспективами их терапевтического применения для лечения повреждений костной, хрящевой и мышечной тканей. Одной из основных проблем выделения чистой популяции ММСК является отсутствие единого мнения по фенотипичес-кой характеристике этих клеток. Довольно широко используемым методом выделения ММСК остается селекция в культуре по способности адгезии к пластику. Однако этот метод позволяет получить довольно гетерогенную популяцию клеток и требует определенного времени культивирования. Выделение клеток методами флюоресцентного или магнитного сортинга имеет ряд преимуществ по сравнению с селекцией популяции в культуре. Во-первых, это высокая чистота популяции [80-90% и более) и высокая скорость селекции. Во-вторых, культивирование несет в себе более высокий риск микробной контаминации и контаминации ксеногенными белками [сыворотка животных и заменители), а также удлиняет время селекции. Длительная экспансия ММСК, как правило, требует больших временных и материальных затрат, кроме того эти клетки спонтанно могут изменять свои свойства в культуре [1, 2]. В связи с этим, использование методик, позволяющих быстро и селективно выделять истинные ММСК без процесса культивирования, вызывает большой интерес. Ранее для выделения высокоочищенной популяции ММСК без культивирования различными исследовательскими группами были предложены методы селекции по маркерам, вы-сокоэкспрессирующимися этими клетками - STRO-1 [3, 4] и CD105 [5, 6].

Недавняя работа израильских ученых, опубликованная в он-лайн версии журнала Stem Cells, посвящена изучению остеогенных свойств популяции некультивированных ММСК, выделенных непосредственно из костного мозга человека с помощью иммуномагнитного сортинга. Выделение клеток было основано на их позитивной селекции по маркеру CD105 (эндоглин). Но в отличие от предыдущих работ, описывающих аналогичный метод [5, 6], авторы впервые исследовали мультипотентность этих клеток перед процессом экспансии [селекции) в культуре и продемонстрировали их высокую способность к остеогенной дифференцировке in vitro и in vivo.

По результатам исследования CD105+ фракция после селекции на магнитных бусах составила 2,3% от всех моно-нуклеарных клеток костного мозга. Чистота выделения фракции составила 79,7%. CD105+ клетки были способны образовывать в 6 раз больше фибробласт-подобных колоний, чем нефракционированные ядросодержащие клетки из костного мозга. Кроме того, CD 105+ клетки после экспансии в культуре экспрессировали маркеры - CD105, CD44, CD29, CD90 и CD106, но не CD14, CD34, CD45, CD31, то есть имели типичный фенотип ММСК. Эти клетки были способны дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях.

Важным функциональным тестом, демонстрирующим ос-теогенный потенциал свежевыделенных CD105+ клеток, стало изучение их способности отвечать на присутствие реком-бинантного BMP-2 in vivo. Для этого стимулированные BMP-2 клетки метили липофильным красителем Dil, помещали на коллагеновую губку и пересаживали NOD/SCID-мышам под кожу. При исследовании срезов под конфокальным микроскопом были обнаружены участки новообразования кости и хряща с участием меченых клеток.

Кроме того, исследователи продемонстрировали способность CD105+ клеток к трансфекции генетическими конструкциями, несущим гены LacZ и GFP. Эффективность составила 10% и 44% соответственно. Эти конструкции часто используются для идентификации меченых клеток после трансплантации. Таким образом, авторы показали, что данный тип ММСК может широко использоваться для тестирования в экспериментальных моделях, изучающих эффективность методов клеточной трансплантации и тканевой инженерии.

Метод одношаговой селекции высокоочищенной популяции ММСК методом иммуномагнитного сортинга по CD105 позволяет упростить процесс выделения и избежать значительных потерь клеток на каждом этапе. Авторы работы впервые показали, что потенциал к дифференцировке свежевыделенных ММСК сходен с таковым, при выделении другими ранее описанными методами. Это исследование еще раз продемонстрировало, что коммерчески доступные антитела к CD105 могут быть использованы для высокоселективного сортинга ММСК [5, 6]. Чистоту популяции [~ 80%) видимо можно будет увеличить, используя флюоресцентный сортинг. Тем не менее, для решения окончательного вопроса правомочности применения CD105+ или STRO-1 + ММСК в клинике, необходимо проведение дополнительных сравнительных исследований [с культивированными ММСК) в различных экспериментальных моделях.

В связи с перспективами одношагового выделения ММСК компании-производители реагентов для работы со стволовыми клетками уже сегодня предлагают новейшие киты, основанные на селекции ММСК по экспрессии одного более селективного маркера [7, 8]. Коммерческая доступность антител к CD105 сделает метод высоковоспроизводимым в различных лабораториях. Это еще одно преимущество такого подхода по сравнению с экспансией ММСК в культуре, где чистота популяции зависит от множества факторов. Кроме CD105 в качестве кандидатуры для сортинга ММСК также был предложен рецептор к фактору роста нервов (CD271) [8]. Еще одним перспективным подходом можно считать выделение мобилизованных ММСК из периферической крови на магнитных бусах, покрытых фибрином, описанным совсем недавно [9]. Таким образом, выбор оптимального маркера для выделения ММСК из любого источника на данный момент ограничивается спектром коммерчески доступных реагентов для выделения и степенью экспрессии выбранной молекулы.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 3 (5), 2006

мм

Новости клеточных технологий

^нтп

ЛИТЕРАТУРА:

1. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65: 3035-9.

2. Rombouts W.J., Ploemacher R.E. Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability following culture. Leukemia 2003; 17: 160-70.

3. Gronthos S., Simmons P.J. The growth factor requirements of STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro. Blood 1995; 85: 4.

4. Gronthos S., Zannettino A.C., Hay S.J. et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J. Cell Sci. 2003; 116: 1827-35.

5. Majumdar M.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells. J. Cell Physiol. 2000; 185: 198-206.

6. Goussetis E., Spiropoulos A., Theodosaki M. et al. Culture of bone marrow CD105+ cells allows rapid selection of pure BM-stromal cells for chimerism studies in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 2005; 36: 557-9.

7. MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR). Miltenyi Botec.

8. CD105 MicroBeads. Miltenyi Botec.

9. Kassis I., Zangi L., Rivkin R. et al. Isolation of mesenchymal stem cells from G-CSF-mobilized human peripheral blood using fibrin microbeads. Bone Marrow Transplant. 2006; 37(10): 967-7.

Подготовила B.C. Мелихова по материалам Stem Cells published online April 6, 2006

Метод генетической коррекции серповидноклеточной анемии через рекомбинацию гомологов в эмбриональных стволовых клетках

Серповидноклеточная анемия (СКА) - аутосомное рецессивное заболевание, причиной которого является мутация в гене р-глобина, в результате чего молекула гемоглобина (Hb) изменяется и нарушается функция переноса кислорода. Заболевание проявляется в первые несколько месяцев жизни, поскольку человеческий фетальный гемоглобин (HbF) обладает сильными «анти-серповидными» свойствами. коло 300 000 человек по всему миру страдают СКА и умирают в детском возрасте.

В модели сингенной трансплантации костного мозга у мышей было показано, что СКА можно лечить методом генной коррекции, трансфецируя гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) геном нормального глобина [1, 2]. В недавней работе, опубликованной в он-лайн версии журнала Blood, исследователями показана возможность полной генетической коррекции СКА методом рекомбинации эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Авторы исследования применили метод генетической коррекции ЭСК, описанный Rideout [3].

Была создана линия трансгенных мышей, ген глобина у которых был заменен на мутантный - человеческий, обусловливающий возникновение СКА. В течение недели после рождения мутантные мыши продолжали синтезиро-ванть HbF, однако затем происходило переключение на HbS и наблюдались тяжелые проявления заболевания. Такая модель позволила в точности копировать СКА человека, включая тяжелые признаки поражения со стороны внутренних органов (спленомегалия, очаговые некрозы печени, нефропатия).

Из эмбрионов мутантных мышей с моделью человеческой СКА были выделены эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и подвергнуты лечебной замене генов in vitro. Дефектный ген р-глобина (PS) человека был заменен на нормальную копию гена (рА) в ЭСК. Эффективность замены мутантного гена нормальным составила 14,2% (16 колоний ЭСК из 113). Затем проводили селекцию трансфеци-рованных колоний ЭСК, несущих здоровый ген. После чего

«пролеченые» ЭСК пересаживали в бластоцисты. Рожденные химерные самцы скрещивались с самками-гомозиготами по гену нормального глобина человека и гетерозиго-тами по мутантному гену СКА. Все потомство от таких пар было здоровым. Полная коррекция СКА была подтверждена генотипированием [выявлением замены на нормальный ген) и обнаружением эритроцитов нормальной формы [в отличие от контролей) в кровотоке мышей, полученных от родителей с коррекций СКА. Таким образом, гемопоэтические стволовые клетки, образующиеся из ЭСК, подвергшихся гомологичной рекомбинации, в процессе эмбриогенеза давали начало нормальным эритроцитам, что приводило к излечению анемии и связанной с ней патологии внутренних органов [в отличие от контрольных животных).

Возможно, что применение подобной методики у пациентов с СКА также может привести к коррекции заболевания. В 2002 году лаборатория Jaenisch впервые показала осуществимость такого подхода в модели наследственного иммунодефицита у нокаутных Rag-/- мышей [3]. Таким образом, базируясь на результатах этих двух работ можно предположить, что в будущем возможно создание индивидуальных нормальных гемопоэтических клеток у пациентов с моногенными наследственными дефектами. Такие клетки можно выделить из ЭСК, подвергшихся замене дефектного гена на нормальный в культуре, и в свою очередь, полученных методом переноса ядра клетки-донора самого пациента. Если такой подход будет возможен, то это даст шанс на излечение таких болезней как СКА после трансплантации собственных нормальных гемопоэтических стволовых клеток на фоне тотальной миелоабляции. В целом, технология направленного мутагенеза соматических клеток через рекомбинацию и селекцию ЭСК открывает широкие перспективы в изучении и лечении наследственных генетически обусловленных заболеваний. Примерная схема подхода к коррекции СКА представлена на рисунке.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 3 (5), 2006