Способ коррекции хронической печёночной недостаточности
METHOD OF CHRONIC HEPATIC FAILURE CORRECTION

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, а именно к гепатологии, и может быть использовано для лечения хронической печеночной недостаточности (ХПН).
Возрастающая во всем мире численность больных с печеночной недостаточностью, ранняя инвалидизация и высокая смертность ставят проблему лечения таких больных в число актуальных проблем современной медицины. По данным ВОЗ смертность от хронической печеночной недостаточности занимает пятое место среди других патологий, причем прогнозируется, что в предстоящие 10-20 лет смертность от заболеваний печени возрастет более чем в 2 раза [Плеханов А.Н., Товаршинов А.И. / Современные подходы к диагностике и лечению печеночной недостаточности (обзор литературы). //Бюллетень ВСНЦ, 2016, том 1, вып.4 (110), с. 136]. Указанные обстоятельства требуют продолжения поиска эффективных и доступных методов лечения хронической печеночной недостаточности.
К настоящему времени стало очевидным, что трансплантация печени, будучи самым эффективным методом лечения хронической печеночной недостаточности из-за дефицита донорских органов не может обеспечить всех нуждающихся в ней. Рассматривая высокую летальность при хронической печеночной недостаточности как следствие нарушения процессов регенерации в поврежденной печени, надежду на повышение эффективности лечения этих состояний стали связывать с регенерационной медициной, основанной на применении клеточных технологий. В эксперименте и клинике стали осуществлять трансплантацию сначала клеток донорской печени [F.M. Smets, S.F. Najimi, Е.М. Sokal / Cell transplantation in the treatment of liver diseases. // Pediatric Transplantation. - 2008.- Vol. 12.-P. 6-13.], а затем стали применять гемопоэтические и стромальные фракции клеток костного мозга, обладающие высоким регенерационным потенциалом [А.П. Киясов, А.Х. Одинцова, А.А. Гумерова и др. / Трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2008.- Т. - 3., вып. 1, С. 70-75].
Между тем, внедрение в практику регенеративной медицины клеточных технологий пока не получило единодушного одобрения из-за опасности малигнизации и генетических мутаций трансплантированных стволовых/прогениторных клеток, возможного развития реакции «трансплантат против хозяина», а также из-за малого времени жизни или быстрого снижения индукционной активности как аутологичных, так и аллогенных клеток.
Альтернативой клинического применения биомедицинских клеточных продуктов в регенерационной медицине, включая клеточно - и тканеинженерные конструкции, могут стать технологии, основанные на применении комплекса внутриклеточных биологически активных компонентов, выделенного из клеток костного мозга.
Вопрос о том, какие внутриклеточные структуры и сигнальные молекулы клеток костного мозга (ККМ) способны обеспечивать «адресный перенос регенерационной информации» к поврежденным органам долго не был предметом специальных исследований.
В последние годы, однако, появились исследования, из которых следует, что продуцентами и переносчиками регенерационной информации в межклеточной сигнальной системе выступают разнообразные по своим структурным и функциональным свойствам молекулы РНК [Н.В. Тишевская, А.Г. Бабаева, Н.М. Геворкян / Роль лимфоцитарных РНК в межклеточном информационном обмене и регуляции регенеративных процессов. // Российский Физиологический Журнал им. И.М. Сеченова. - 2016, - Т. 102. - вып. 11, С. 1280-1301].
Начиная с 2008 г., во всем мире проводятся интенсивные исследования свойств молекул малых белок некодирующих РНК - микроРНК, которые начали использовать не только как биомаркеры, но и в качестве терапевтических средств регуляции восстановительных процессов при различных патологиях [D.P. Bartel / MicroRNAs: target recognition and regulatory functions // Cell.-2009. - Vol. - 136(2).- P. 215-233]. Однако выделение какой-либо одной микроРНК с адресным эффектом для целей регенерационной терапии представляет собой сложный и дорогостоящий технологический процесс.
Уже к 2015 году было идентифицировано свыше 1800 вне - и внутриклеточных микроРНК человека [S.M. Peterson, J.A. Thompson, M.L. Ufkin, P. Sthyanarayana, L. Liaw, C.B. Congdon / Common features of microRNA target prediction tools. // Frontiers in Genetics.- 2014. -Vol. - 5 .- S.M. P. 23], при этом функция большинства из них остается неизвестной. Кроме того, вызывает сомнение возможность индукции и осуществления эффективного регенерационного процесса в поврежденных органах с помощью какой-либо одной выделенной микро-РНК, так как в процессах регенерации принимают участие разные классы молекул РНК [С.Li, L. Chang, Z. Chen, Z. Liu, Y. Wang, Q. Ye / The role of IncRNA MALAT1 in the regulation of hepatocyte proliferation during liver regeneration // Int. J. Mol. Med. 2017, Feb. - Vol. - 39(2). - Р. 347-356].
Известен способ коррекции печеночной недостаточности (RU 2650209, С1) в эксперименте, в котором было показано, что внутрибрюшинное или внутрипеченочное применение общей РНК (оРНК), в дозе 15-45 мкг/100 г веса животного, выделенной из фракции мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) и использованной, по меньшей мере, трехкратно с интервалом 1-3 суток между первым и вторым введением и далее через 2-5 суток между последующими введениями -позволяет эффективно и безопасно корригировать клинические (функциональные) и морфологические проявления хронического фиброзирующего повреждения печени, т.к. сохраняя высокую индукционную активность общая РНК из ММСК КМ позволяет избежать при применении опасных осложнений, связанных с применением стволовых/прогениторных ККМ.
Описанный способ применения оРНК из ММСК КМ для эффективной коррекции хронического фиброзирующего повреждения печени имеет ряд недостатков, ограничивающих его расширенное применение. К ним относятся высокая себестоимость способа и длительные сроки культивирования для получения достаточного количества ММСК КМ для выделения оРНК, что обусловлено низким содержанием ММСК (не более 0,15-1,7%) в составе суммарной мононуклеарной фракции ККМ [Van Epps, D.E., Bender, W. Lee, M. Schilling / Harvesting, characterization, and culture of CD34+cells from human bone marrow, peripheral blood, and cord blood // Blood cells. - 1994. - N 20. - p. 411-423.]. Так, для выделения в стерильных условиях достаточного количества оРНК из ККМ время культивирования составляет, по меньшей мере, 1 месяц, с 2-3 пассажами с заменой культуральной дорогостоящей среды через каждые 3-4 суток.
В качестве прототипа выбран способ коррекции хронического фиброзирующего повреждения печени в эксперименте, к котором в качестве клеточного материала для получения оРНК используют всю фракцию несортированных мононуклеарных клеток костного мозга без их предварительного культивирования, что существенно снижает себестоимость метода и способствует быстрому получению достаточного количества оРНК из ККМ [З.З. Гоникова, А.О. Никольская, Л.А. Кирсанова, М.Ю. Шагидулин, Н.А. Онищенко, В.И. Севастьянов / Сравнительный анализ регенераторной активности клеток костного мозга и общей РНК, выделенной из них, при хроническом фиброзирующем повреждении печени // Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2019, т. 21(3), С. 100-110].
В приведенной работе установлено, что однократное внутрибрюшинное введение оРНК из свежевыделенных мононуклеарных ККМ в дозе 30-60 мкг оРНК/100 г веса животного через 7 суток после моделирования ХПН, способствует активизации восстановительных процессов в поврежденной печени, причем регуляторное воздействие на клетки печени оРНК из ККМ было более выраженным, чем применение самих ККМ в эквивалентной дозе. Это, как полагают авторы, обусловлено более высокой проникающей и регуляторной способностью оРНК как химического вещества.
Между тем, анализ эффективности регуляторного воздействия оРНК из несортированных мононуклеарных ККМ на восстановительные процессы в печени при ХПН показал, что эффект от однократного применения оРНК из свежевыделенных ККМ при моделировании хронического токсического фиброзирующего повреждения печени был замедлен и развивался недостаточно интенсивно. Восстановление отдельных функциональных показателей происходило через 2 и даже 3 месяца, а активизация процессов дефиброзирования соединительно-тканных септ в печени наступала только через 3 месяца после введения оРНК из свежевыделенных ККМ.
Необходимо отметить также, что в клинике у больных с ХПН также констатируют низкую результативность применения клеточных технологий, указывая на краткосрочность индукции восстановления функциональных показателей печени при использовании мононуклеарых ККМ [А.С. Lyra, М.В. Soares, L.F. da Silva et al. / Infusion of autologous bone marrow mononuclear cells through hepatic artery results in a short-term improvement of liver function in patients with chronic liver disease: a pilot randomized controlled study. //European Journal of Gastroenterology & Hepatology.- 2010.-Vol. 22(1), Р. 33-42].
Таким образом, несмотря на существующие достоинства применения оРНК из свежевыделенных несортированных мононуклеарных ККМ при ХПН по сравнению с применением самих ККМ (отсутствие опасности возникновения мутаций и малигнизации, возможности развития реакции «трансплантат против хозяина», а также достоверно более высокая регуляторная активность) - сохраняется неудовлетворенность результатами ее индукционного воздействия на процессы восстановительной регенерации в печени при моделировании тяжелых форм ХПН.
Техническая проблема заключается в повышении эффективности лечения хронических, в том числе тяжелых форм печеночной недостаточности путем применения оРНК из свежевыделенных несортированных мононуклеарных ККМ за счет повышения активности ее индукционного и регуляторного воздействия на процессы восстановительной и репаративной регенерации печени, обеспечения ускорения темпа, надежности и результативности лечения тяжелых форм печеночной недостаточности.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого изобретения, заключается:
- в сокращении сроков и повышении эффективности устранения функциональных и структурных нарушения в печени, в том числе гистологических признаков фиброза (формирования соединительнотканных септ) в печени при моделировании ХПН путем повышения интенсивности регенерационного процесса в печени, формирующегося в рамках неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы на воздействия стресс-факторов слабой и умеренной биологической силы, за счет активации оРНК из несортированных мононуклеарных ККМ, предварительно подвергнутых аутофагии;
- в простоте и низкой себестоимости способа коррекции ХПН за счет процесса получения активированной оРНК из ККМ, предварительно подвергнутых аутофагии.
Нами предложена оригинальная «предварительная подготовка» несортированных мононуклеарных ККМ перед выделением их них оРНК. За счет хранения этих клеток при 4-6°С в несбалансированном водно-солевом растворе «Кустодиол» (раствор Бредшнейдера), в течение 3-18 часов происходит активация оРНК. Предлагаемый режим хранения, обеспечивая аутофагию ККМ, исключает при этом развитие необратимого апоптоза этих клеток.
По нашему мнению, недостаточная эффективность применения известных клеточных биотехнологий при тяжелых формах хронических заболеваний печени может быть связана с возникающим в ткани печени истощением резервов активации собственных тканевых адаптационно-приспособительных механизмов, запускающих и регулирующих процесс восстановительной регенерации: например, в результате формирования тяжелых деструктивных процессов в ткани печени при ХПН.
Такое представление обосновываются тем, что индукция регенерационных процессов в печени, как и в других органах, всегда начинается с активации и использования собственных сохранившихся резервов, необходимых для защиты и выживания клеток, а именно с процессов клеточной аутофагии, развивающихся в рамках эволюционно выработанного неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы для формирования энергетической, структурной и функциональной устойчивости клеток к действию различных стрессорных факторов внешней и внутренней среды организма.
Аутофагия представляет собой процесс прижизненной утилизации измененного метаболитами содержимого цитоплазмы клеток для поддержания их структурного и энергетического гомеостаза и поэтому в настоящее время аутофагию рассматривают даже не как процесс запрограмированного умирания, а как процесс преимущественно «запрограммированного выживания» клеток.
Аутофагия ингибирует развитие необратимого апоптоза клеток и играет защитную роль в условиях оксидативного стресса. Аутофагия в клетках печени служит важнейшим регулятором поддержания функциональной активности ее стволовых/прогениторных клеток, которые являются непременными участниками запуска процессов самообновления, пролиферации и дифференцировки клеток печени при регенерации.
Таким образом, из-за недостаточной выраженности процессов аутофагии в печени при ХПН в результате критического истощения ее индукционных резервов, наступающего при тяжелом и обширном повреждении, регенерационный эффект от применения оРНК из свежевыделенных несортированных мононуклеарных ККМ (по способу-прототипу) оказывается недостаточным при лечении тяжелых форм хронической печеночной недостаточности.
Разработанная нами схема раннего и двукратного (на седьмые и четырнадцатые сутки) применения активированной оРНК после моделирования ХПН, сопровождающейся процессом фиброзирования ткани печени, позволяет ускорить процесс восстановления функциональных показателей печени уже в течение 1 месяца после тяжелого повреждения и индуцировать процессы дефиброзирования соединительнотканных септ в печени в более ранние сроки, чем при использовании неактивированной оРНК, не через 3 месяца, а уже через 2 месяца.
В предлагаемом нами способе лечения ХПН, исходным материалом для получения активированной оРНК служит свежевыделенная фракция несортированных гемопоэтических мононуклеарных ККМ здорового донора, причем в качестве донора мононуклеарных клеток КМ для пациента с ХПН должен использоваться здоровый аллогенный донор.
В предлагаемом способе лечения ХПН используется предварительно активированная оРНК из мононуклеарных ККМ. Активированная оРНК содержит уже готовый спектр молекул РНК тех типов и классов, которые образовались в результате аутофагии мононуклеарных ККМ в ответ на применение их гипотермической консервации в растворе «Кустодиол» при температуре 4-6°С (биологически допустимый стресс-фактор умеренной силы) в сроках от 3 до 18 часов.
Длительная и надежная сохранность мононуклеарных ККМ обеспечивается составом консервирующего раствора и гипотермическими условиями хранения, которые воздействуют на выделенные ККМ, как адаптогены средней и слабой биологической силы, индуцирующие в самих ККМ гомеостатическую перестройку метаболизма (в том числе энергетического метаболизма) через активацию процессов аутофагии в рамках развития эволюционно выработанного в клетках неспецифического адаптационного синдрома.
При введении в организм для лечения ХПН активированная оРНК в биологически эффективной дозе, полученная из ККМ, предварительно подвергнутых аутофагии, действует более интенсивно, ускоренно и результативно на поврежденную печень, так как реализует свой эффект на клетки печени и как адаптоген (в рамках неспецифического адаптивного синдрома), и как готовый регулятор процессов регенерации, аккумулирующий в своем составе адекватный спектр молекул РНК, необходимых для запуска процессов аутофагии и регенерации поврежденной печени.
В результате активированная оРНК эффективно индуцирует в клетках поврежденной печени процессы аутофагии - ранней самой важной и определяющей фазы запуска регенераторного процесса, проявляющегося более ранней активацией восстановительных и пролиферативных процессов. Очевидно, ускоренный запуск регенерационного процесса в печени осуществляют содержащиеся в активированной оРНК многочисленные микро РНК, дополнительно образовавшиеся в процессе индукции аутофагии ККМ при их гипотермическом хранении в растворе «Кустодиол», а также микро РНК, экспрессировавшиеся в клетках поврежденной печени, в ответ на введение активированной оРНК.
Таким образом, достоинствами предлагаемого способа лечения хронической печеночной недостаточности, позволяющими обеспечить клиническую доступность метода и по существу достигнуть выраженного и надежного лечебного эффекта, являются:
- введение активированной оРНК в эффективной дозе в ранние сроки развития ХПН, сопровождающейся гистологическими признаками фиброзирующих процессов в печени, позволяет ускорить восстановление функциональных показателей печени (показатели резко нарушенными оставались только в течение 1 месяца), а также способствовать более ранней и ускоренной активации восстановительных процессов - процессы дефиброзирования печени активизировались не через 3, а уже через 2 месяца;
- возможность применения при необходимости повторных парентеральных введений активированной оРНК для достижения позитивного результата при использовании даже сниженных доз препарата;
- возможность обеспечить раннюю компенсаторную поддержку процессам восстановительной регенерации не только печени, но и адаптационную поддержку других органов (почки, легкие), относящихся к единой системе детоксикации организма и участвующих в поддержании печеночного гомеостаза, а также в снижении опасности возникновения летальных исходов;
- возможность проводить мощную и эффективную регенерационную терапию различных органов и систем в организме, так как активированная оРНК, выделенная из мононуклеарной фракции ККМ здорового донора сохраняет универсальность регуляторных свойств этих клеток, и будучи биохимическим препаратом, с высокой проникающей активностью обладает более мощным регуляторным воздействием, чем неактивированная оРНК.
- возможность использования стандартного ионсбалансированного водно-солевого консервирующего раствора «Кустодиол», применяющегося в трансплантологии для сохранения (консервации) различных органов перед пересадкой, делает процедуру индукции аутофагии в мононуклеарных ККМ, используемых для получения препарата активированной оРНК, доступной для широкого клинического применения.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Для коррекции хронической печеночной недостаточности в эксперименте получают несортированную фракцию мононуклеарных ККМ от крысы-донора. Полученную фракцию хранят в растворе «Кустодиол» при температуре 4-6°С в течение 3-18 часов. После чего получают из нее общую РНК и вводят внутрибрюшинно крысе, у которой предварительно проведено моделирование хронической печеночной недостаточности, в дозе 90-110 мкг/100 г веса животного на 7 и 14 сутки после создания модели.
4
Таким образом, для лечения в эксперименте тяжелой формы ХПН, созданной путем моделирования хронического токсического фиброзирующего повреждения печени (ХТФПП) в результате длительного применения CCl - четыреххлористого углерода в комбинации с неполным адъювантом Фрейнда, выделяют мононуклеарную фракцию клеток КМ от здорового животного-донора-крысы. Затем полученную фракцию несортированных мононуклеарных клеток активируют для индукции в этих клетках процессов аутофагии и адаптивной перестройки клеточного (в том числе энергетического) гомеостаза путем погружения их в охлажденный консервирующий ионсбалансированный раствор «Кустодиол» с допустимым сроком хранения в нем при температуре 4-6°С в течение от 3 до 18 часов (срок в течение которого клетки КМ преимущественно сохраняют жизнеспособность и в них развивается аутофагия, что контролируется по уровню появления в сохраняемых клетках необратимого апоптоза, составляющего не более 7-10% от общей массы клеток).
Затем из полученной фракции несортированных мононуклеарных клеток КМ, которые активированы процессом их хранения в охлажденном растворе «Кустодиол», выступающего в роли адаптогена, выделяют оРНК, которая является уже активированной, т.к. содержит в своем составе новый готовый спектр образовавшихся молекул РНК, способных запустить адаптационный и регенерационный процесс в печени после применения. Активированную оРНК вводят экспериментальному животному - крысе внутрибрюшинно: в дозе 90-110 мкг/100 грамм веса животного, дважды через 7 и 14 суток после завершения моделирования ХПН.
Предлагаемый способ, главным компонентом которого, является получение и применение активированной оРНК, обладает более функционально эффективным лечебным воздействием на поврежденную печень, чем неактивированная оРНК, полученная из свежевыделенных ККМ.
Формирование более интенсивного лечебного действия активированной оРНК обусловлено двумя механизмами:
1-активированная оРНК, будучи экзогенным адаптогеном, оказывает адаптивное воздействие на организм пациента с печеночной недостаточностью, вызывает гомеостатическую перестройку метаболизма (в том числе энергетического) в сохранившихся клетках печени, а также в клетках других органов, индуцируя в них раннюю фазу неспецифического адаптационного синдрома - процессы аутофагии; за счет, индукции процессов аутофагии создаются предпосылки для запуска процессов восстановительного морфогенеза (регенерации) в клетках печени, костного мозга, а также в клетках других органов (почки, легкие), участвующих в поддержании детоксикационной функции печени;
2 - активированная оРНК содержит дополнительно в своем составе новый уже готовый спектр именно тех регуляторных молекул РНК, которые образовались в процессе аутофагии мононуклеарных ККМ и которые более ускоренно и мощно запускают в организме регенераторные процессы, дополнительно усиливая морфорегуляторную активность клеток печени, костного мозга, а также клеток почек и легких, участвующих в поддержании функции печени, как у экспериментального животного, так и у пациента в клинике.
Сочетанная реализация обоих механизмов при использовании активированной оРНК существенно усиливает и ускоряет восстановительный процесс в поврежденной печени.
Способ осуществляется следующим образом.
4
Для коррекции (лечения) ХПН, развившейся после длительного токсического воздействия на печень CCl в комбинации с неполным адъювантом Фрейнда (в течение 42 суток), применяют оРНК из активированных мононуклеарных ККМ, предварительно подвергнутых процессу аутофагии в охлажденном консервирующем растворе «Кустодиол». В результате аутофагии в мононуклеарных ККМ происходит адаптивная структурно-функциональная перестройка, обеспечивающая повышение устойчивости этих клеток к действию стрессорных факторов. оРНК, полученная из этих ККМ, становится активированной, так как содержат в своем составе именно тот спектр готовых вновь образовавшихся молекул РНК, который отсутствует или недостаточен в поврежденном органе, но который при введении в организм ускоренно и более мощно адаптирует поврежденные органы (печень) и индуцирует в них приспособительные (аутофагию клеток печени) и восстановительные процессы (восстановительную регенерацию).
Комплекс активированных молекул оРНК содержит все необходимые типы РНК, в том числе все типы регуляторных РНК (прежде всего микро РНК), обеспечивающих перенос «регенерационной и сигнальной информации» ККМ и клеткам поврежденной печени пациента для ускоренной и мощной индукции восстановительных процессов в печени, а также для индукции адаптивно-приспособительных процессов в органах (почки, легкие), поддерживающих детоксикационную функцию печени.
Выполнение способа начинают с получения мононуклеарной фракции клеток из аспирата КМ животного. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала большеберцовых и бедренных костей крысы-донора получали ККМ путем аспирации их шприцом с иглой 18G, содержащим среду для забора (0.5 мл фосфатно-буферного раствора с 50 ЕД/мл гепарина и 0.25 мг/л гентамицина).
4
3
7
Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов и тромбоцитов (114 мМ NHCL, 7,5 mM KHCO, 100 мкМ EDTA) в течение 3 минут и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку («HyClonegold», USA), инсулин 0.4 мкМ, 0.25 мг/л гентамицина. Выделенные клетки представляли собой несортированную мононуклеарную фракцию, преимущественно гемопоэтических ККМ, суммарный выход которых колебался от 0,8-1.5×10 клеток. Далее удаляли среду DMEM, а выделенные мононуклеарные ККМ помещали в охлажденный до 4-6°С консервирующий раствор «Кустодиол» (Др. Франц Келер Хеми ГмбХ, Германия) и сохраняли при 4-6°С сроком от 3 до 18 часов, в течение которого мононуклеарные ККМ сохраняют жизнеспособность, поддерживая свой гомеостаз за счет эволюционно выработанного механизма адаптивной структурно-функциональной и энергетической перестройки собственных резервов клеток в ответ на стрессорное воздействие гипотермии и ионсбалансированного консервирующего раствора.
Этот процесс структурно-функциональной и энергетической перестройки, обеспечивающий сохранение жизнеспособности клеток КМ, сопровождается процессом аутофагии и развитием обратимого апоптоза клеток в процессе хранения, что контролировали путем измерения и объективной оценки количества жизнеспособных клеток с помощью витального красителя 7-AAD (7 аминоактиномицин D, фирмы Beckman Coulter, США), который проникает в ядра только нежизнеспособных клеток и интерколирует в двойную спираль ДНК. Позитивно окрашенные, то есть нежизнеспособные мононуклеарные клетки при использовании 7-AAD, составляли не более 7-10% после хранения в растворе «Кустодиол» в сроках от 3 до 18 часов. Жизнеспособность свежевыделенных мононуклеарных ККМ, то есть без холодового хранения, составляла 98-99%.
Рецептура консервирующего раствора «Кустодиол», предназначенного для осуществления противоишемической защиты донорских органов при трансплантации и использованного нами для получения активированных мононуклеарных клеток костного мозга представлена в таблице 1.
Далее приступали к выделению активированной оРНК из полученных и подвергнутых аутофагии мононуклеарных ККМ по методике «Extract RNA», разработанной фирмой «ЕВРОГЕН» (Россия).
6
К подвергнутых аутофагии фракции мононуклеарных клеток добавляли реагент Extract RNA из расчета 1 мл реагента на 1×10 клеток (в камере Горяева предварительно подсчитывали количество клеток), инкубировали смесь 15 минут, периодически пипетируя) и центруфугировали при 13400 об/мин 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов.
Супернатант переносили в новую пробирку и приступали к разделению фаз. Для этого добавляли 0.2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента Extract RNA, инкубировали смесь в течение 5 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая образец; затем образец центруфугировали при 13400 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре.
В ходе центруфугирования происходило разделение смесей на три фазы: нижнюю-органическую фенол - хлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. оРНК находится в верхней водной фазе, которую аккуратно собирали и переносили в чистую пробирку.
Следующим этапом было непосредственное выделение оРНК. Для этого в водную фазу добавляли 0.5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл использованного реагента (Extract RNA). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем аккуратно, по стенке пробирки, добавляли 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола, использованного ранее. Полученный образец центрифугировали на максимальной скорости (13400 об/мин) в течение 5 минут. Удаляли этанол пипеткой, осадок выделенной оРНК растворяли в 1 мл воды и определяли концентрацию оРНК в 100 мкл образца на спектрофотометре при длине волны 260 нм.
Из каждых 4-6 млн исходно использованных мононуклеарных ККМ в 1 мл определялось 380-500 мкг оРНК. Далее из этого концентрированного раствора оРНК готовили рабочие растворы оРНК, требуемой концентрации для введения в организм животного с целью лечения ХПН.
Активированная оРНК, выделенная из мононуклеарных ККМ, представляет собой биотехнологический продукт высокой степени очистки, который вводят парентерально внутрибрюшинно животным (крысы) с моделью ХПН.
Рабочий раствор активированной оРНК содержал 76-100 мкг РНК/мл (к 1.0 мл концентрированного раствора РНК добавляли 4 мл дистиллированной воды). Введение оРНК осуществляют в дозе 90-110 мкг/100 г веса животного.
У животных с ХПН активированную оРНК вводили в дозе 90-110 мкг/100 г веса животного внутрибрюшинно двукратно: на 7 и 14 сутки после завершения моделирования ХПН, т.е. крысе массой 300 г двукратно вводят по 300±30 мкг оРНК в виде 2,7-3,3 мл рабочего раствора оРНК при содержании в нем 100 мкг РНК/мл или 3,5-4,3 мл рабочего раствора оРНК при содержании в нем 76 мкг РНК/мл.
Приводим пример осуществления предлагаемого способа лечения ХПН после моделирования хронического токсического фиброзирующего повреждения печени.
Эффективность предлагаемого способа лечения ХПН изучали на крысах, у которых моделировали хроническое токсическое фиброзирующее повреждение печени (ХТФПП), при котором сохраняются признаки функционального и структурного повреждения (фиброзирования) печени в течение 6 месяцев.
Все исследования с использованием лабораторных животных проводили в строгом соответствии с законодательством Российской Федерации (в соответствии с Правилами лабораторной практики, утвержденными приказом Минздрава России №708 от 23.08.2010 г, а также стандартам ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к условиям содержания животных») и с соблюдением биотических принципов, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, 2005 г.
4
Работа выполнена на 140 крысах самцах породы Вистар весом 250-350 грамм, у 100 из которых воспроизводили модель ХТФПП; остальные крысы были использованы для получения мононуклеарных ККМ и для выделения из них оРНК. Модель ХТФПП создавали путем хронической затравки животных CCl - четыреххлористым углеродом в сочетании с применением неполного адъюванта Фрейнда в течение 42 суток по схеме (модель ХТФПП может быть создана по способу, указанному в патенте РФ №2633296).
При моделировании ХТФПП погибло 25 животных и к концу затравки выжило 75. Все выжившие крысы после моделирования ХТФПП были разделены на 4 группы: группа 1 - контрольная (n=15) с двукратным введением физиологическим раствора через 7 и 14 суток после окончания затравки; группа 2 - группа сравнения (n=20), в которой дважды на 7 и 14 сутки после завершения моделирования ХТФПП внутрибрюшинно вводили свежевыделенную неактивированную оРНК из ККМ здорового животного в дозе 90 мкг/100 грамм веса (n=10) и 110 мкг/100 грамм веса животного (n=10); группа 3 - опытная (n=20), в которой на 7 и 14 сутки после завершения моделирования ХТФПП дважды внутрибрюшинно вводили активированную оРНК из ККМ, активированных в течение 3 часов охлажденным до 4°С консервирующим раствором «Кустодиол» в дозе 90 мкг/100 грамм веса животного; группа 4 - опытная (n=20), в которой на 7 и 14 сутки после завершения моделирования ХТФПП дважды внутрибрюшинно вводили активированную оРНК из ККМ, активированных в течение 18 часов охлажденным до 6°С консервирующим раствором «Кустодиол» в дозе 110 мкг/100 г веса животного. Хранение выделенных ККМ в консервирующем растворе «Кустодиол» в течение 3 и 18 часов в условиях гипотермии при 4 и 6°С проводили для индукции в этих клетках процесса аутофагии. оРНК из ККМ выделяли методом, разработанным фирмой «Евроген» (Россия) реагентом Extract RNA, который позволял получать из каждых 4-6 млн выделенных мононуклеарных клеток около 380-500 мкг оРНК.
Эффективность стимулирующего действия оРНК из ККМ на процессы репаративной регенерации в печени после их введения животным с ХТФПП оценивали по летальности животных в 4 исследуемых группах, по динамике восстановления печеночного гомеостаза в организме животного и по динамике устранения структурных (фиброзирующих) нарушений в ткани печени на 7 сутки после завершения моделирования ХТФПП, а также через 2, 3 и 6 месяцев.
Динамику восстановления печеночного гомеостаза в организме оценивали путем измерения в сыворотке крови содержания общего белка и активности ферментов цитолиза клеток печени: аспарагиновой аминотрансферазы (АсАТ), аланиновой аминострасферазы (АлАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ).
Различия в структуре ткани печени в 1, 2, 3 и 4 группах исследовали на одинаковых сроках по степени выраженности фибролитических процессов в соединительной ткани и по количеству молодых новообразованных гепатоцитов в печеночной дольке. Для этого в указанные сроки иссекали печень, готовили из нее гистологические препараты с последующей окраской срезов гематоксилином и эозином и на соединительную ткань по Массону. Достоверность различий исследуемых показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью параметрического критерия t-Стьюдента при р<0.05.
Эффективность регуляторного воздействия активированной и неактивированной оРНК на восстановительные процессы в печени после моделирования ХТФПП оценивали, прежде всего, по летальности животных. Было констатировано, что в группе 1 (контроль) в течение первых двух месяцев из 15 крыс погибло 3 и это составило 20%; в группах 2, 3 и 4 летальность составила по 5% (по одной крысе в каждой группе) в течение всего срока наблюдения.
Сравнительное изучение динамики восстановления биохимических показателей функционального состояния печени в 4 исследуемых группах позволило установить их выраженное нарушение сразу после окончания затравки и постепенное восстановление во всех исследуемых группах. Между тем, темп восстановления исследуемых показателей в группах был разным (таблицы 2, 3, 4).
В таблице 2 представлена динамика изменения содержания общего белка (г/л) и активности ферментов цитолиза клеток печени (АсАТ, АлАТ и ЩФ) (Ед/л) в сыворотке крови крыс в группе 1 после моделирования ХТФПП и двукратного введения физиологического раствора (n=15).
В таблице 3 представлена динамика изменения общего белка (г/л) и ферментов цитолиза клеток печени (АсАТ, АлАТ и ЩФ) (Ед/л) в сыворотке крови крыс в группе 2 (n=20) - группа сравнения - после моделирования ХТФПП и двукратного введения неактивированной оРНК из ККМ в дозе 90 мкг/100 грамм веса (n=10), и в дозе 110 мкг/100 грамм веса животного (n=10). Из-за отсутствия различий измеряемых показателей по срокам наблюдения обе подгруппы были включены в группу 2.
В таблице 4 представлена объединенная динамика изменения общего белка (г/л) и ферментов цитолиза клеток печени (АсАТ, АлАТ и ЩФ) (Ед/л) в сыворотке крови крыс в опытных группах 3 (n=20) и 4 (n=20) после моделирования ХТФПП и двукратного введения активированной оРНК из ККМ, подвергнутых активации охлажденным консервирующим раствором «Кустодиол» в соответствии с режимами предлагаемого способа (n=40). Из-за отсутствия достоверных различий всех исследуемых показателей в группах 3 и 4 по срокам наблюдения они были объединены в общую опытную группу в таблице 4, и это позволило объективно оценивать и выявлять различия результатов предлагаемого способа с группой сравнения.
В контрольной группе 1 (таблица 2) значения показателей АсАТ и АлАТ в сыворотке крови оставались на достоверно более высоком уровне по сравнению с исходными значениями в течение двух месяцев, ЩФ - в течение трех месяцев, а содержание общего белка оставалось достоверно сниженным в течение четырех месяцев. В группе 2 - группе сравнения - с двукратным введением неактивированной оРНК (таблица 3) и в объединенной группе 3 и 4 с двукратным введением активированной оРНК (таблица 4) все исследуемые показатели оставались достоверно нарушенными по сравнению с исходными значениями в течение одного месяца после окончания моделирования ХТФПП. К концу второго месяца наблюдений во 2 и особенно четко в объединенной группе 3 и 4 значения АсАТ и АлАТ практически восстанавливались до исходного уровня, содержание общего белка уже приближалось к исходным значениям, уровень ЩФ, хотя и снижался в обеих группах к этому сроку по сравнению с контролем, но во 2-ой группе оставался на более высоком уровне, чем в объединенной группе по сравнению с исходом. При сравнении между собой значений АсАТ, АлАТ, ЩФ и общего белка через 2 месяца после моделирования ХТФПП в группе 2 и объединенной опытной группе достоверные различия были выявлены для ЩФ и общего белка.
Результаты сравнительного изучения динамики восстановления биохимических показателей, характеризующих функциональное состояние печени после моделирования ХТФПП и применения неактивированной и предварительно активированной оРНК, позволяют нам заключить, что и неактивированная и предварительно активированная оРНК способствуют более ускоренному восстановлению печеночного гомеостаза в организме при моделировании ХТФПП, однако эффект (темп восстановительных процессов) от применения активированной оРНК был более выражен.
Из литературы известно, что как в клинике при ХПН, так и в эксперименте при моделировании ХТФПП восстановление биохимических показателей печени под воздействием применяемой терапии обычно не сопровождается восстановлением печени на гистологическом уровне, особенно при ее цирротическом повреждении [Marcellin P., Levy S., Erlinger S. Therapy of hepatitis C: patients with normal aminotransferase levels. Hepatology 1997; 26 (3): 1335-1339; Серов B.B. Сравнительная морфологическая характеристика хронических вирусных гепатитов В и С.Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии 1999; 9(1): 36-40]. Эти обстоятельства заставили нас оценить в сравнительном аспекте эффективность воздействия неактивированной и активированной оРНК, примененной в тех же биологически эффективных дозах, не только на биохимические, но и на гистологические показатели печени при моделировании ХТФПП.
Изучение динамики развития морфологических изменений в печени крыс после моделировании ХТФПП показало, что во всех исследуемых группах уже к 2 месяцу наблюдений в печени формировался цирроз, однако, интенсивность дефиброзирующих процессов в печени по мере увеличения сроков наблюдения была в этих группах разной. Было установлено, что через 1 неделю у всех крыс после окончания затравки в перицентральных зонах печени выявляются выраженные некротические и дистрофические изменения гепатоцитов, а также обнаруживаются нарушения долькового строения паренхимы печени.
Через 2 месяца после окончания затравки и введения физиологического раствора в печени крыс 1- контрольной группы выявляется четкое нарушение балочного строения печеночной ткани и формирование ложных долек; гепатоциты в печени были без выраженных дистрофических изменений и отмечалась также не резко выраженная клеточная инфильтрация. Через 3 месяца в 1 группе процессы деструкции печеночной ткани продолжали нарастать.
Таким образом, уже к 2-му месяцу после окончания хронической затравки в печени крыс - группы 1 (контроль) формируется гистологическая картина цирроза 3-4 стадии по классификации [Desmet V.J., Gerber М., Hoofnagle Jay Н. et al. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. Hepatology 1994; 19:1513-1520]. Аналогичные результаты структурных нарушений в печени через 2 месяца были получены у крыс 2-ой группы, которым вводили неактивированную оРНК из неактивированных мононуклеарных ККМ.
Из рисунка 1 (ув.х100, окраска по Массону), дающего представление о гистологической картине структуры печени крысы через 2 месяца после окончания моделирования ХТФПП и двукратного введения неактивированной оРНК видно, что в ткани печени на этом сроке сохраняются сформированные ложные дольки (узлы) паренхимы, ограниченные фиброзными септами, что свидетельствует о сформировавшемся цирроз печени.
Между тем, у крыс объединенной 3 и 4 опытной группы, которым после окончания затравки двукратно вводили активированную оРНК, выделенную из активированных ККМ, на 2-м месяце на фоне уже сформировавшегося цирроза появляются отчетливые признаки фибролиза септ образовавшихся ложных долек.
На рисунке 2 (ув.х100, окраска по Массону), характеризующем состояние гистологической картины структуры печени крысы через 2 месяца после окончания моделирования ХТФПП и двукратного введения активированной оРНК из мононуклеарных ККМ видно, что на этом сроке в печени крыс появляются зоны лизиса септ ложных долек (указаны стрелками) и значительные участки молодых гепатоцитов (обведены кружками).
Выявленная гистологическая картина печени свидетельствует о том, что активированная оРНК у животных объединенной 3 и 4 опытной группы на 2 месяце начинает тормозить процессы фиброгенеза в печени по сравнению с 1 и 2 группами, где процессы фиброзирования остаются все еще отчетливо выраженными. Однако на 2-м месяце в печени крыс объединенной группы, также как в 1 и 2 группах, еще сохраняются ложные дольки и нарушение балочной структуры печени. Первые признаки дефиброзирования септ вокруг сформировавщихся ложных долек в печени крыс 2 группы -группы сравнения появляются только через 3 месяца, а в 1 группе (контрольной) только через 6 месяцев.
Полное восстановление структуры ткани печени в объединенной (3 и 4) группе происходит к 5-му месяцу, а во 2 группе через 6 месяцев, однако во 2 группе, в отдельных полях зрения даже на этом сроке сохраняются участки соединительно-тканных септ. Восстановление структуры ткани печени в 1 группе (контроль) происходит только через 9 месяцев.
Таким образом, сравнительное изучение восстановления структуры и функции ткани печени в 4 исследуемых группах позволяет сделать заключение о том, что внутрибрюшинное двукратное введение активированной оРНК из активированных мононуклеарных ККМ и в дозе 90 и в дозе 110 мкг/100 г веса животного более эффективно, чем оРНК из неактивированных ККМ, индуцирует восстановительные процессы в печени после моделирования ХТФПП.
Это выражается в более эффективном восстановлении не только функциональных, но и в более раннем восстановлении морфологических показателей печени после двукратного введения активированной оРНК: через 2 месяца возникает лизис фиброзных септ ложных долек и образуются многочисленные зоны молодых (новообразованных) гепатоцитов; к 5 месяцам происходит восстановление структуры печеночной ткани.
Под воздействием неактивированной оРНК процесс дефиброзирования септ ложных долек активируется в печени только через 3 месяца, и полное восстановление структуры печеночной ткани происходит к 6 месяцу. Процесс дефиброзирования печени в контроле начинался лишь на 6 месяце после затравки, а полное восстановление структуры ткани печени наступало лишь к 9 месяцу.
Таким образом, выделение и применение активированной оРНК из мононуклеарной фракции ККМ, предварительно активированных хранением в охлажденном консервирующем растворе «Кустодиол» в соответствии с предлагаемым способом коррекции ХПН после моделирования ХТФПП будет способствовать более ранней и ускоренной индукции восстановительной регенерации поврежденной печени, что позволит ускоренно восстановить структуру ткани печени за счет ускоренного осуществления в ней процессов дефиброзирования.
Консервирующий раствор «Кустодиол» охлажденный до t=4-6°C, действует на выделенные мононуклеарные ККМ как адаптоген и позволяет не только сохранить, но и активировать мононуклеарные ККМ при хранении их вне организма в сроках от 3 до 18 часов путем индукции в этих клетках эволюционно выработанных неспецифических адаптационно приспособительных изменений (процесс аутофагии), которые мобилизуют в клетках собственные энергетические и структурные резервы для выживания и выработки устойчивости к действию неблагоприятных (стрессорных) факторов, а также для стимуляции регенерационных процессов.
При использовании охлажденного консервирующего раствора «Кустодиол» в роли адаптогенов (стрессорных факторов) для клеток выступают: гипотермия, а также повышенный уровень калия (по сравнению с плазмой крови и внеклеточной жидкостью), которые, как было ранее показано [В.И. Шумаков и др. Фамакологическая защита трансплантата, Москва, Изд. Медицина, 1983, 230 с.], для поддержания клеточного гомеостаза в условиях стресса индуцируют гликолиз, а также снижение содержания в клетках свободной воды и повышение связанной воды.
Предлагаемый способ лечения ХПН, ускоряет темп не только восстановления функции печени после ХТФПП, но и способствует существенно более раннему восстановлению структуры ткани печени, активируя в ней процессы дефиброзирования.