КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И НАБОРЫ ДЛЯ СИНТЕЗА И ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Композиция, содержащая
(a) по меньшей мере одну ДНК-полимеразу;
(b) по меньшей мере одну соль;
(c) по меньшей мере один пеногаситель;
(d) по меньшей мере один дНТФ; и
(е) по меньшей мере одно производное дНТФ.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная ДНК-полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу.
3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанную термостабильную ДНК-полимеразу выбирают из ДНК-полимеразы Taq; ДНК-полимеразы Tne; ДНК-полимеразы Tma; ДНК-полимеразы Pfu; ДНК-полимеразы KOD; ДНК-полимеразы Tfl; ДНК-полимеразы Tth; фрагмента Штоффеля ДНК-полимеразы; ДНК-полимеразы VENT™; ДНК-полимеразы DEEPVENT™; и их мутантов, вариантов или производных.
4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанная термостабильная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, происходящую от Taq.
5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанную соль выбирают из соли калия, соли магния, соли натрия и любой их комбинации.
6. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что общая концентрация указанной соли составляет от 5 мМ до 200 мМ.
7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный пеногаситель является пеногасителем на основе силикона.
8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанный пеногаситель на основе силикона выбирают из XIAMETER AFE-1010, AFE-1430, AFE-1510, AFE-1520, AFE-2210, пеногасителя Antifoam А, пеногасителя Antifoam В, пеногасителя Antifoam С, пеногасителя Antifoam Н-10, пеногасителя Antifoam SE-15, пеногасителя Antifoam SE-35, пеногасителя Antifoam SO-25, пеногасителя Antifoam Y-30 и пеногасителя Antifoam 289.
9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный пеногаситель является пеногасителем, не содержащим силикона.
10. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанный пеногаситель, не содержащий силикона, выбирают из органического сульфоната, полиэфира, органического фосфата, ацетиленового гликоля, фторуглеводорода, полиалкенполиамина и полиалкилениминового соединения.
11. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что указанное полиалкилениминовое соединение представляет собой пеногаситель Antifoam 204 или пеногаситель Antifoam О-30.
12. Композиция по п. 7 или 9, отличающаяся тем, что концентрация указанного пеногасителя составляет от 0,001% до 0,1%.
13. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный дНТФ представляет собой дГТФ.
14. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанное производное дНТФ представляет собой 7-дезаза-дГТФ (7-дезаза-2-дезокси-дГТФ).
15. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что концентрация указанного дГТФ составляет от 0,05 мМ до 1,0 мМ.
16. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что концентрация указанного 7-дезаза-дГТФ составляет от 0,05 мМ до 1,0 мМ.
17. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит дГТФ и 7-дезаза-дГТФ в соотношении от 1:2 до 2:1.
18. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит дГТФ и 7-дезаза-дГТФ в соотношении от 1:2 до 1:10.
19. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит дГТФ и 7-дезаза-дГТФ в соотношении от 2:1 до 10:1.
20. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит блокатор ингибитора ПЦР.
21. Композиция по п. 20, отличающаяся тем, что указанный блокатор ингибитора ПЦР представляет собой белок.
22. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что указанный белок-блокатор ингибитора ПЦР выбирают из альбумина, желатина и их комбинации.
23. Композиция по п. 22, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит желатин и сывороточный альбумин.
24. Композиция по п. 22, отличающаяся тем, что указанный желатин выбирают из желатина крупного рогатого скота, рыбьего желатина и их комбинации.
25. Композиция по п. 24, отличающаяся тем, что концентрация указанного желатина крупного рогатого скота составляет от 0,01% до 1,0% и/или концентрация указанного рыбьего желатина составляет от 0,01% до 1,0%.
26. Композиция по п. 23, отличающаяся тем, что указанный сывороточный альбумин является бычьим сывороточным альбумином.
27. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что концентрация указанного бычьего сывороточного альбумина составляет от 0,05 мг/мл до 5 мг/мл.
28. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит детергент.
29. Композиция по п. 28, отличающаяся тем, что указанный детергент является неионным детергентом.
30. Композиция по п. 29, отличающаяся тем, что указанный неионный детергент выбирают из группы, состоящей из тритона Х-100, Nonidet Р-40, твин-80, Brij 30, Brij 35 и Brij 58.
31. Композиция по п. 29, отличающаяся тем, что указанный детергент представляет собой неионный детергент, отличающийся от твин-20.
32. Композиция по п. 31, отличающаяся тем, что концентрация указанного неионного детергента составляет от 0,005% до 0,1%.
33. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит пассивный эталонный контрольный краситель.
34. Композиция по п. 33, отличающаяся тем, что указанный пассивный эталонный контрольный краситель является флуоресцентным красителем.
35. Композиция по п. 34, отличающаяся тем, что указанный флуоресцентный краситель представляет собой краситель ROX или краситель MLUSTANG PURPLE.
36. Композиция по п. 35, отличающаяся тем, что концентрация указанного пассивного эталонного красителя составляет от 50 нМ до 500 нМ.
37. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит дАТФ, дГТФ, дЦТФ и/или дУТФ.
38. Способ выполнения реакции синтеза нуклеиновой кислоты, включающий
(a) приведение композиции по любому из предшествующих пунктов в контакт с биологическим образцом, содержащим полинуклеотид-мишень с праймером, специфичным по отношению к мишени, с образованием реакционной смеси; и
(b) выполнение синтеза нуклеиновой кислоты.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанная реакция синтеза нуклеиновой кислоты представляет собой полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
40. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанная реакция синтеза нуклеиновой кислоты представляет собой реакцию амплификации.
41. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанный биологический образец представляет собой лизат.
42. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает (с) определение генотипа указанного полинуклеотида-мишени с использованием указанного продукта амплификации.
43. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает (с) определение количества копий указанного полинуклеотида-мишени с использованием указанного продукта амплификации.
44. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная ПЦР позволяет получить продукт амплификации за более короткое время по сравнению с эквивалентной ПЦР, выполненной с использованием стандартной реакционной смеси для ПЦР.
45. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная ПЦР представляет собой симплексную ПЦР.
46. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная ПЦР представляет собой мультиплексную ПЦР.
47. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанный лизат представляет собой необработанный лизат, содержащий один или более ингибиторов ПЦР.
48. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанный лизат получают из образца крови, мочи или слюны.
49. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает этап обнаружения.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что на указанном этапе обнаружения используют гидролизуемый зонд.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что указанный гидролизуемый зонд представляет собой зонд TaqMan.
52. Способ по п. 42 или 43, отличающийся тем, что указанный этап (с) включает применение гидролизуемого зонда.
53. Способ по п. 42, отличающийся тем, что указанный гидролизуемый зонд представляет собой зонд TaqMan.
54. Способ по п. 42, отличающийся тем, что указанное генотипирование характеризуется по меньшей мере 99% точностью.
55. Способ по п. 43, отличающийся тем, что вариация указанного количества копий улучшена по меньшей мере на 10% по сравнению с эквивалентным способом, выполненным с использованием стандартной реакционной смеси или другой композиции, доступной для приобретения.
56. Набор, содержащий композицию по п. 1, причем указанный набор дополнительно содержит по меньшей мере первую пару праймеров и/или первый меченый зонд, причем указанная первая пара праймеров и указанный первый меченый зонд являются специфичными по отношению к первой нуклеиновой кислоте-мишени.
57. Набор по п. 56, отличающийся тем, что указанный набор дополнительно содержит контрольный образец нуклеиновой кислоты и вторую пару праймеров и/или второй меченый зонд, причем указанная вторая пара праймеров и указанный второй меченый зонд являются специфичными по отношению к второй нуклеиновой кислоте-мишени, присутствующей в указанном контрольном образце нуклеиновой кислоты.
58. Набор по п. 56 или 57, отличающийся тем, что указанный меченый зонд представляет собой гидролизуемый зонд.
59. Набор по п. 58, отличающийся тем, что указанный гидролизуемый зонд представляет собой зонд TaqMan.
60. Композиция, содержащая
термостабильную ДНК-полимеразу;
соль калия;
пеногаситель;
дГТФ; и
дезаза-дГТФ, причем концентрация дезаза-дГТФ составляет от 0,05 мМ до 0,7 мМ.
61. Композиция, содержащая
термостабильную ДНК-полимеразу;
соль калия;
пеногаситель;
дГТФ; и
дезаза-дГТФ, причем соотношение концентрации дГТФ к концентрации дезаза-дГТФ составляет от 1:2 до 2:1.
62. Композиция, содержащая
термостабильную ДНК-полимеразу;
соль калия;
пеногаситель;
дГТФ; и
дезаза-дГТФ, причем соотношение концентрации дГТФ к концентрации дезаза-дГТФ составляет от 1:2 до 1:10.
63. Композиция, содержащая
термостабильную ДНК-полимеразу;
соль калия;
пеногаситель;
дГТФ; и
дезаза-дГТФ, причем соотношение концентрации дГТФ к концентрации дезаза-дГТФ составляет от 2:1 до 10:1.
64. Композиция по любому из пп. 60-63, отличающаяся тем, что пеногаситель содержит силикон.
65. Композиция по любому из пп. 60-63, дополнительно содержащая альбумин, желатин или их комбинацию.
66. Композиция по п. 65, отличающаяся тем, что композиция содержит комбинацию рыбьего желатина и желатина крупного рогатого скота.
67. Композиция по п. 65, отличающаяся тем, что композиция содержит рыбий желатин и бычий сывороточный альбумин.
68. Композиция по любому из пп. 60-63, дополнительно содержащая неионный детергент, отличающийся от твин-20.
69. Композиция по п. 68, отличающаяся тем, что концентрация неионного детергента составляет 0,005-0,05%.
70. Композиция по п. 68, отличающаяся тем, что неионный детергент выбирают из группы, состоящей из тритона Х-100, Nonidet Р-40, твин-80, Brij 30, Brij 35 или Brij 58.
71. Композиция по любому из пп. 60-63, дополнительно содержащая пассивный эталонный контрольный краситель.
72. Композиция, содержащая
термостабильную ДНК-полимеразу;
хлорид калия;
пеногаситель, причем пеногаситель содержит силикон;
дГТФ и дезаза-дГТФ, причем концентрация дезаза-дГТФ составляет от 0,05 мМ до 0,7 мМ;
неионный детергент, отличающийся от твин-20;
желатин крупного рогатого скота, причем концентрация желатина крупного рогатого скота составляет от 0,01 до 0,25%;
рыбий желатин, причем концентрация рыбьего желатина составляет от 0,05% до 1,0%; и
бычий сывороточный альбумин, причем концентрация бычьего сывороточного альбумина составляет от 0,05 мг/мл до 0,8 мг/мл.
73. Композиция по п. 72, отличающаяся тем, что отношение концентрации дГТФ к концентрации дезаза-дГТФ составляет от 1:2 до 2:1.
74. Композиция по п. 72, отличающаяся тем, что отношение концентрации дГТФ к концентрации дезаза-дГТФ составляет приблизительно 1:1.
75. Способ выполнения ПЦР, включающий
(а) приведение композиции по любому из пп. 1-37 и 60-74 в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид-мишень спраймером, специфичным по отношению к мишени, с образованием реакционной смеси; и b) выполнение ПЦР с использованием реакционной смеси с образованием продукта амплификации.
76. Способ по п. 75, дополнительно включающий с) определение генотипа образца нуклеиновой кислоты с использованием продукта амплификации.
77. Способ по п. 75, дополнительно включающий с) определение количества копий полинуклеотида-мишени с использованием продукта амплификации.
78. Способ по п. 75, отличающийся тем, что время выполнения ПЦР снижено по сравнению с эквивалентной ПЦР, выполненной с использованием стандартной реакционной смеси для ПЦР.
79. Способ по п. 75, отличающийся тем, что ПЦР представляет собой симплексную ПЦР.
80. Способ по п. 75, отличающийся тем, что ПЦР представляет собой мультиплексную ПЦР.
81. Способ по п. 75, отличающийся тем, что образец нуклеиновой кислоты представляет собой лизат.
82. Способ по п. 81, отличающийся тем, что лизат получен из крови или клеток из полости рта.
83. Способ по п. 75, отличающийся тем, что образец нуклеиновой кислоты получают из слюны, мочи или сыворотки.
84. Набор, содержащий композицию по любому из пп. 60-63, дополнительно содержащий пару праймеров и меченый зонд, являющиеся специфичными при ПЦР-амплификации и обнаружении ДНК мишени.
85. Набор, содержащий композицию по любому из пп. 60-63, дополнительно содержащий контрольный образец нуклеиновой кислоты, а также пару праймеров, специфичных при ПЦР-амплификации ДНК мишени в контрольном образце нуклеиновой кислоты.