Способ идентификации клопов вредителей рода Polymerus - P.cognatus и P.vulneratus на основе рестрикционного анализа гена цитохромоксидазы митохондриальной ДНК
METHOD FOR IDENTIFICATION OF BEDBUGS OF GENUS POLYMERUS - P_COGNATUS AND P_VULNERATUS BASED ON RESTRICTION ANALYSIS OF CYTOCHROME OXIDASE GENE OF MITOCHONDRIAL DNA

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к молекулярно-генетическим методам идентификации организмов - вредителей свеклы и бобовых культур - P. cognatus и P. vulneratus и может быть использовано при определении наличия этих вредителей на посевах растений.
Род Polymerus Hahn, 1831 включает 20 видов, относящихся к трем подродам - Polymerus s.str. (4 вида), Poeciloscytus Fieber, 1858 (14 видов) и Pachycentrum Gapon, 2014 (3 вида) (Kerzhner & Josifov, 1999; Gapon, 2014). Два вида в составе рода, P. cognatus и P. vulneratus (свекловичные клопы), относятся к числу вредителей свеклы и бобовых культур (люцерны, эспарцета, клевера, гороха, фасоли и др.) в Европе, особенно в ее восточной части (Sorauer, 1956; Putshkov, 1966, 1972; Golub, 1983). Их обитание, кроме природных экосистем, в агроэкосистемах совместно с другими видами рода требует оперативной идентификации. Однако различия в окраске тела, которые обычно используются при установлении видовой принадлежности, нечеткие, вследствие значительной и перекрывающейся изменчивости признаков. Изготовление препаратов гениталий и изучение микроскопических структур для точного определения видовой принадлежности особей рода Polymerus, представляет собой трудоемкую работу (Gapon D.A. Revision of the genus Polymerus (Heteroptera: Miridae) in the Eastern Hemisphere. Part 1: Subgenera Polymerus, Pachycentrum subgen. nov. and new genus Dichelocentrum gen. nov. Zootaxa, 2014, Vol, 3787 (1), 87 pp.). Она требует освоения сложной методики ручной работы, значительного времени, что не всегда отвечает требованиям защиты растений. Личинки ранних возрастов разных видов, особенно в подроде Poeciloscytus Fieber, 1858 фауны Палеарктики, практически не различаются, и ключей для их определения не существует. Однако в практике защиты растений от вредителей существует необходимость в своевременной диагностике присутствия вредителей на агрокультурах для прогнозирования их численности и проведения защитных мероприятий.
Идентификация P. cognatus и P. vulneratus от других представителей рода Polymerus на данный момент возможна по морфологическим признакам (Gapon D.A. Revision of the genus Polymerus (Heteroptera: Miridae) in the Eastern Hemisphere. Part 1: Subgenera Polymerus, Pachycentrum subgen. nov. and new genus Dichelocentrum gen. nov. Zootaxa, 2014, Vol, 3787 (1), 87 pp.), что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный специалист энтомолог.
Описан способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K гена DGAT1 (патент RU 2528743, МПК C12N 15/06, C12Q 1/68, 20.09.2014), включающий проведение ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K гена DGAT1. Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (=310 нм). На этапе ПЦР используются последовательности олигонуклеотидных праймеров: DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO: 1), DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO: 2), DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO: 3), а на этапе рестрикции применяется рестриктаза - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp, и генотип АК=100/82/18 bp.
Известен набор реагентов для детекции постельных клопов (патент US 2013/0011836 А1, 10.01.2013). Метод основан на молекулярно-генетическом способе идентификации клопов с использованием TaqMan зондов. Недостатком данного способа является его применимость только для идентификации клопов семейства Cimicidae.
Известен метод для идентификации паутинного клеща с помощью ПНР (патент CN102181552 А, 14.09.2011). Метод основан на использовании специализированного короткого праймера в полимеразной цепной реакции с последующей визуализацией результатов ПЦР с помощью электрофореза. Недостатком данного способа является возможность идентификации представленным способом только представителей клещей рода Tetranychus.
В качестве прототипа взят способ идентификации клопа вредной черепашки {Eurygaster integriceps) (патент RU 2617935, МПК C12Q 1/68, 28.04.2017), в котором производят сбор биологического материала и выделяют ДНК. Проводят ПЦР участка цитохромоксидазы митохондриальной ДНК. В качестве праймеров используют прямой EuCO1F: GAATATGAGCCGGAATAGTAGGA и обратный EuCO1R: ATGTGTTGAAGTTACGGTCA. Продукты ПЦР подвергают рестрикции. В качестве рестриктаз используют следующие: Ah1 I, BamH I, Bst2U I, Psi I. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Наличие одного из наборов фрагментов: 317, 268 п. н. для рестриктазы Ah1 I, 471, 114 п. н. для BamH I, 364, 221 п. н. для Bst2U I и 435, 150 п. н. для Psi I указывает на принадлежность вредителя к роду Eurygaster integriceps. Изобретение позволяет в течение от 4,5 до 6 часов осуществить идентификацию Eurygaster integriceps на разных стадиях его развития и вне зависимости от пола насекомого.
Задачей настоящего изобретения является разработка молекулярно-генетического метода идентификации вредителей свеклы и бобовых культур - Р. cognatus и P. vulneratus, не требующего присутствия узко квалифицированного специалиста, для повышения эффективности мер по обработке посевов от вредителя.
Существенным преимуществом заявляемого молекулярно-генетического метода идентификации вредителей является возможность его определения еще на стадии яйца, личинки и куколки в независимости от пола, что в свою очередь позволит применять превентивные меры защиты растений.
Нами предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности гена цитохромоксидазы субъединицы 1 у представителей рода Polymerus в России. Последовательности внесены в международную систему GenBank под номерами: МН607420-МН607427, МН607440, МН607441, МН607428, МН607436, МН607415-МН607419, МН752746-МН752750, МН607429, МН607437, МН607438, МН607439, МН607442. Установлены отличия в нуклеотидной последовательности между P. cognatus и P. vulneratus и остальными видами рода Polymerus, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации данных видов клопов на основе рестриционного анализа гена цитохромоксидазы субъединицы 1.
Идентификация вредителя в описываемом способе осуществляется на основе рестрикционного анализа предварительно амплифицированного гена цитохромоксидазы субъединицы 1 с рестриктазой RsaI.
Технический результат - проведение идентификации вредителя на его ранних стадиях развития (яйца, личинки) вне зависимости от пола насекомого, а также возможность проведения идентификационных процедур в течение нескольких часов, без привлечения узкоспециализированного специалиста-энтомолога.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации клопов вредителей рода Polymerus - P.cognatus и P.vulneratus на основе рестрикционного анализа гена цитохромоксидазы митохондриальной ДНК, включающем выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, последующее проведение ПЦР участка цитохромоксидазы субъединицы 1 митохондриальной ДНК, рестрикционный анализ ампликона, проведение электрофореза агарозном геле, согласно изобретению при ПЦР используют праймеры Перечня последовательностей: прямой mHemF1 (SEQ ID NO: 1) и обратный LepR1 (SEQ ID NO: 2), при рестрикционном анализе используют рестриктазу RsaI, причем наличие фрагментов: 131, 324 п. н для рестриктазы RsaI указывает на принадлежность вредителя к виду Polymerus vulneratus или Polymerus cognatus.
Способ идентификации вредителей P. cognatus и P. vulneratus на основе рестрикционного анализа предварительно амплифицированного гена цитохромоксидазы субъединицы 1 реализуется следующим образом:
1. Производится сбор биологического материала (взрослые насекомые, яйца, личинки) с посевов свеклы или бобовых растений. Если анализ производится не в тот же день, то образцы помещают в 70% спиртовой раствор.
2. Производится выделение ДНК из полученных образцов, выделение ДНК можно проводить как с помощью коммерческих наборов отечественных и зарубежных производителей ("ДНК-технологии", "Синтол", "Zymo research", БиоСилика и др.), так и общепринятыми методами (фенол-хлороформная экстракция, ЦТАБ-метод).
3. Проводят ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 35°С циклов 94°С 30 сек 54°С 30 сек, 72°С 40 сек, конечная элонгация 72°С 8 мин. В качестве праймеров используют следующие: прямой mHemF1 (SEQ ID NO: 1): GCATTYCCACGAATAAATAAYATAAG, обратный LepR1 (SEQ ID NO: 2): TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA, данные праймеры амплифицируют продукт гена цитохромоксидазы субъединицы 1 длиной 455 п. н.
4. Продукты ПЦР подвергают рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера и 10 ед. рестриктазы. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут.
Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве рестриктазы используют RsaI. Фермент рестрикции образует уникальные фрагменты для двух вредителей рода Polymerus - Р. cognatus и P. vulneratus (фиг. 1).
На фиг. 1 представлена Таблица 1: Длины ожидаемых фрагментов при расщеплении последовательности цитохромоксидазы длинной 455 п. н.; на фиг. 2 приведена Электрофореграмма продуктов рестрикции ПНР цитохромоксидазы, субъединица 1
Пример
На электрофореграмме (фиг. 2): 1 - образец ДНК №1; 2 - образец ДНК №2; 3 - образец ДНК №3; 4 - образец ДНК №4; 5 - образец ДНК №5; М - маркер длин фрагментов ДНК, значения выражены в пар нуклеотидов. К - продукт ПЦР до рестрикции; R - продукт ПЦР после рестрикции.
При обработке рестриктазой RsaI продукта ПЦР образцов ДНК №1-4 изолированных из клопов рода Polymerus фрагменты длиной 131 п. н. и 324 п. н. не образовались, следовательно, клопы, из которых были выделены эти образцы ДНК не относятся к вредоносным. При обработке рестриктазой RsaI продукта ПНР образца ДНК №5 образовались фрагменты длиной 131 п. н. и 324 п. н., следовательно, представитель клопа рода Polymerus, из которого был получен образец ДНК, относится к одному из вредоносных видов клопов - P. vulneratus или P. cognatus.
Предлагаемый способ идентификации клопов вредителей рода Polymerus - P. cognatus и P. vulneratus является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и не дорогим. В зависимости от используемого способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.
--->
Перечень последовательностей
<110>Воронежский государственный университет
<120>Праймеры для амплификации гена цитохромоксидазы субъединицы 1
<130>2019
<160>2
<210>1
<211>26
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность<400>1
gcattyccac gaataaataa yataag 26
<210>2
<211>26
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность<400>2
taaacttctg gatgtccaaa aaatca 26
<---