СЛИТЫЕ БЕЛКИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ
THERAPEUTIC FUSION PROTEINS

Настоящее изобретение относится к конструкции нового класса нацеливаемых ингибиторов секреции (TSIs), к способу их активации и к активированному продукту.
Нецитотоксические протеазы представляют собой хорошо известную группу протеаз, которые воздействуют на клетки-мишени путем ограничения функции клеток. Важно отметить, что нецитотоксические протеазы не убивают клетки-мишени, на которых они действуют. Некоторые из наиболее известных примеров нецитотоксических протеаз включают клостридиальные нейротоксины (например, ботулинический нейротоксин, который продается под такими названиями как Dysport™, Neurobloc™ и Botox™) и IgA протеазы.
Нецитотоксические протеазы оказывают свое действие путем протеолитического расщепления внутриклеточных транспортных белков, известных как белки SNARE (например, SNAP-25, WAMP или Syntaxin) - см. Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Сокращение SNARE является производным от термина Soluble NSF Attachment Receptor (рецептор растворимого белка присоединения NSF), где NSF означает N-ethylmaleimide-Sensitive Factor (N-этилмалеимид-чувствительный фактор). Белки SNARE являются неотъемлемой частью внутриклеточного образования везикул и, таким образом, секреции молекул посредством транспортировки везикул из клетки. Соответственно, как только они доставлены в желаемую клетку-мишень, нецитотоксические протеазы способны ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени.
Нецитотоксические протеазы можно использовать в их нативных или в практически нативных формах (т.е. как голотоксины, например, в случае Dysport™, Neurobloc™ и Botox™), и в этом случае нацеливание протеаз на конкретные типы клеток зависит от (i) локализованного введения протеаз и/или (ii) собственной связывающей способности нативной протеазы. В качестве альтернативы, нецитотоксические протеазы могут быть использованы в перенацеленной форме, где нативная протеазы модифицирована таким образом, что она включает экзогенный лиганд, известный как нацеливающий фрагмент (TM). ТМ выбирают таким образом, чтобы он обеспечивал специфичность связывания для требуемой клетки-мишени и, как часть способа перенацеливания, нативная связывающая часть нецитотоксической протеазы может быть удалена.
Авторы настоящего изобретения первыми выдвинули концепцию и разработали технологию перенацеливания на основе клостридиальных нейротоксинов, и получающиеся слитые белки известны как нацеливаемые ингибиторы секреции (TSIs).
Замену ТМ можно осуществить с помощью стандартных методов химического сопряжения, которые хорошо известны специалистам. В связи с этим можно сослаться на Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press и на Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press.
Однако химическое сопряжение часто является неточным. Например, после конъюгации ТМ может быть присоединен к остальной части конъюгата более чем в одном месте прикрепления. Химическое сопряжение также трудно контролировать. Например, ТМ может быть присоединен к остальной части модифицированного токсина на участке прикрепления на компоненте протеазы и/или на компоненте транслокации. Это вызывает проблемы, когда для терапевтической эффективности желательно присоединение только к одному из указанных компонентов (предпочтительно на одном участке). Таким образом, химическое конъюгирование приводит к смешанной популяции модифицированных молекул токсинов, что нежелательно.
В качестве альтернативы химической конъюгации замену ТМ можно осуществить путем рекомбинантного получения одноцепочечного полипептида слитый белок. Получение подобных молекул описано в WO 98/07864. Однако авторы настоящего изобретения определили, что приведенная в WO 98/07864 методика не подходит для всех типов TM.
Альтернативная WO 98/07864 система описана в WO 2006/059093. Согласно WO 2006/059093, ТМ центрально-презентированы (СР) в одноцепочечном слитом белке между компонентом нецитотоксической протеазы и компонентом домена транслокации. Сказанное приводит к одноцепочечному слитому белку, имеющему следующую структуру:
2
NH-[компонент протеазы]-[TM]-[компонент транслокации]-COOH
Вышеуказанные слитые белки активируются обработкой протеазой, которая способна осуществлять расщепление на участке, расположенном на С-конце компонента протеазы. Указанный процесс активации приводит к двухцепочечному белку, содержащему компонент протеазы, который ковалентно присоединен (посредством дисульфидной связи) к компоненту транслокации слитого белка. В случае WO 2006/059093 полученная двухцепочечная молекула имеет TM, который связан пептидной связью своим С-концом с N-концом компонента домена транслокации. Таким образом, N-концевая часть TM может свободно взаимодействовать и связывать желаемый рецептор. Подобное расположение имеет важное значение для класса TMs, которым для связывания с их рецептором необходим свободный N-конец или свободная N-концевая часть.
В качестве примера, после протеолитической активации, в WO 2006/059093 предлагаются полипептиды, имеющие следующую двухцепочечную конформацию:
<img file="00000001.jpg" he="15" wi="124" img-content="undefined" img-format="jpg" />
В указанной двухцепочечной конформации ТМ и компоненты транслокации представлены в форме одноцепочечного слитого белка, в котором С-конец ТМ связан пептидной связью с N-концом компонента транслокации.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что системы, описанные в WO 98/07864 и WO 2006/059093, не являются оптимальными для представления всех типов TM, и, таким образом, могут приводить к получению слитых белков, имеющих нежелательную/сниженную способность связываться с намеченными клетками-мишенями.
Таким образом, существует потребность в альтернативной или усовершенствованной системе для конструкции TSIs.
Настоящее изобретение решает одну или несколько из вышеуказанных проблем, предлагая одноцепочечный полипептид слитый белок, который включает:
(a) нецитотоксическую протеазу или ее фрагмент, при этом указанная протеаза или фрагмент протеазы способны расщеплять белок по экзоцитозному пути клетки-мишени;
(b) нацеливающий фрагмент, способный к связыванию с участком для связывания на клетке-мишени, при этом участок для связывания способен подвергаться эндоцитозу с тем, чтобы быть включенным в эндосомы внутри клетки-мишени;
(c) домен транслокации, способный перемещать протеазу или фрагмент протеазы из эндосомы через мембрану эндосомы в цитозоль клетки-мишени;
(d) первый участок протеолитического расщепления, где слитый белок способен расщепляться первой протеазой, при этом первый участок протеолитического расщепления расположен между нецитотоксической протеазой и доменом транслокации;
(e) второй участок протеолитического расщепления, где слитый белок способен расщепляться второй протеазой, при этом второй участок протеолитического расщепления расположен между доменом транслокации и нацеливающим фрагментом; и
(f) ковалентную связь между нацеливающим фрагментом и доменом транслокации, где, после протеолитического расщепления на втором участке протеолитического расщепления, нацеливающий фрагмент остается связанным с доменом транслокации с помощью указанной ковалентной связи.
Система, описанная в WO 2006/059093, предоставляет TSIs, содержащие TM с N-концом, который свободен и может взаимодействовать с участком связывания на клетке-мишени. Тем не менее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что система, описанная в WO 2006/059093, не подходит для TMs, которые для взаимодействия с участком связывания на клетке-мишени требуют наличия как свободного N-концевого домена, так и свободного С-концевого домена.
Таким образом, в отличие от WO 2006/059093, в настоящем изобретении предлагается система получения TSIs, где компонент TM имеет как свободный N-концевой домен, так и свободный С-концевой домен.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается одноцепочечный слитый белок, имеющего следующую ориентацию от N-конца к С-концу, где Р1 и Р2 представляют собой первый и второй участок протеолитического расщепления:
2
NH-[компонент протеазы]-[P1]-[TM]-[P2]-[компонент транслокации]-COOH
После расщепления на первом и втором участке расщепления указанный одноцепочечный слитый белок принимает вид следующей трехцепочечной структуры, в которой компонент TM и компонент транслокации ковалентно связаны друг с другом и в которой
А) компонент протеазы ковалентно связан с компонентом ТМ:
или В) компонент протеазы ковалентно связан с компонентом транслокации:
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается одноцепочечный слитый белок, имеющую следующие ориентацию от N-конца к С-концу, где Р1 и Р2 представляют собой первый и второй участок протеолитического расщепления:
2
NH-[компонент протеазы]-[P1]-[компонент транслокации]-[P2]-[TM]-COOH
После расщепления на первом и втором участке расщепления указанный одноцепочечный слитый белок принимает вид следующей трехцепочечной структуры, в которой компонент TM и компонент транслокации ковалентно связаны друг с другом и в которой
А) компонент протеазы ковалентно связан с компонентом транслокации:
или В) компонент протеазы ковалентно связан с компонентом ТМ:
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается одноцепочечный слитый белок, имеющего следующую ориентацию от N-конца к С-концу, где Р1 и Р2 представляют собой первый и второй участок протеолитического расщепления:
2
NH-[TM]-[P2]-[компонент протеазы]-[P1]-[компонент транслокации]-COOH
После расщепления на первом и втором участке расщепления указанный одноцепочечный слитый белок принимает вид следующей трехцепочечной структуры, в которой компонент TM и компонент транслокации ковалентно связаны друг с другом и в которой
А) компонент протеазы ковалентно связан с компонентом транслокации:
или В) компонент протеазы ковалентно связан с компонентом ТМ:
При его использовании полипептид TSI по настоящему изобретению связывается с клеткой-мишенью, при этом TM облегчает связывание. Компонент домена транслокации затем воздействует на транспортировку компонента нецитотоксической протеазы в цитозоль клетки-мишени. Оказавшись внутри, компонент нецитотоксической протеазы подавляет экзоцитозный путь клетки-мишени. Таким образом, за счет инактивации экзоцитозного пути клетки-мишени полипептид по настоящему изобретению ингибирует секрецию из клетки. Соответственно, полипептиды TSI по настоящему изобретению могут быть применены для подавления или лечения различных патофизиологических состояний или симптомов, связанных с клеточной секрецией.
Нецитотоксические протеазы
Биологически активный компонент TSI полипептидов по настоящему изобретению представляет собой нецитотоксическую протеазу. Таким образом, после доставки в цитозоль клетки-мишени, компонент нецитотоксической протеазы воздействует на расщепление SNARE внутри требуемой клетки-мишени. Поскольку белки SNARE являются важным компонентом секреторного процесса в клетках-мишенях млекопитающих, то их протеолитическая инактивации ингибирует/подавляет секрецию из указанных клеток-мишеней.
Нецитотоксические протеазы представляют собой отдельный класс молекул, которые не убивают клетки; вместо этого они действуют путем ингибирования клеточных процессов, отличных от синтеза белка. Нецитотоксические протеазы продуцируются различными высшими организмами (в частности, растениями и животными) - примером подобного высшего организма является бразильский скорпион. Кроме того, нецитотоксические протеазы продуцируются различными микроорганизмами, в частности бактериями, такими как Clostridium sp. и Neisseria sp.
Клостридиальные нейротоксины представляют собой основную группу молекул нецитотоксических токсинов и состоят из двух полипептидных цепей, соединенных друг с другом дисульфидной связью. Две цепи называют тяжелой цепью (Н-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. Именно L-цепь обладает функцией протеазы и проявляет высокую субстратную специфичность по отношению к везикулам и/или связанным с клеточной мембраной белкам (SNARE), участвующим в экзоцитозных процессах (например, таким как синаптобревин, синтаксин, SNAP и/или VAMP). Указанные субстраты являются важными компонентами механизма клеточной секреции.
Neisseria sp., в первую очередь вида N. gonorrhoeae, производят функционально подобные нецитотоксические молекулы токсина. Примером подобной нецитотоксической протеазы является протеаза IgA (см. WО 99/58571). Похожие протеазы IgA продуцируются стрептококками, такими как Streptococcus pneumoniae.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения нецитотоксическая протеаза по настоящему изобретению может быть протеазой клостридиального нейротоксина или протеазой IgA (см., например, WO 99/032272). Другим примером нецитотоксических протеаз является протеаза яда скорпиона, например, протеаза из яда бразильского скорпиона Tityus serrulatus или протеаза антареаза (см., например, WO 2011/022357).
Нацеливающий фрагмент (TM)
Компонент TM по настоящему изобретению отвечает за связывание полипептида по настоящему изобретению с участком связывания на клетке-мишени. Таким образом, компонент TM представляет собой лиганд, посредством которого полипептид по настоящему изобретению связывается с выбранной клеткой-мишенью.
В контексте настоящего изобретения клетки-мишени могут быть клетками любого млекопитающего (предпочтительно, клетками человека). Таким образом, ТМ может связываться с клетками, отличными от нейронных клеток, и/или с нейронными клетками.
Компонент TM полипептидов по настоящему изобретению имеет как свободную N-концевую часть, так и свободную С-концевую часть. Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения ТМ способен взаимодействовать с участком связывания (в частности, рецептором или акцептором) на клетке-мишени посредством взаимодействия между N-концевой частью нацеливающего фрагмента и доменом участка связывания. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ТМ способен осуществлять взаимодействие между С-концевой частью нацеливающего фрагмента и доменом участка связывания. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ТМ способен на двойное взаимодействие, при котором N-концевая часть нацеливающего фрагмента взаимодействует с доменом участка связывания и C-концевая часть нацеливающего фрагмента взаимодействует с доменом участка связывания. В указанном последнем варианте осуществления настоящего изобретения N-концевая и С-концевая части TM могут связываться с теми же самыми или с различными доменами участка связывания и/или они могут связываться с доменами на разных участках связывания.
2
Подходящие TMs для использования в полипептидах по настоящему изобретению включают цитокины, факторы роста, нейропептиды, лектины и антитела, а указанный термин включает моноклональные антитела, связывающие белковые структуры, фрагменты антител, такие как Fab, F(ab)', Fv, ScFv, и одноцепочечные антитела, такие как камелиды и т.д.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения компонент TM включает или состоит из лиганда пептида (в частности, пептидного гормона), который связывается с рецептором, присутствующим на клетке-мишени. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный лиганд пептида имеет аминокислотную последовательность, содержащую 5-200 последовательных аминокислотных остатков. В качестве примера, указанный лиганд пептида включает или состоит из аминокислотной последовательности, содержащей 5-150, или 5-100, или 5-50, или 5-40, или 5-30, или 5-25, или 5-20, или 7-12, или примерно 10 последовательных аминокислотных остатков.
Компонент ТМ включает N-концевую часть и С-концевую часть. Каждая из указанных частей обычно содержит, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20 или, по меньшей мере, 25 последовательных аминокислотных остатков.
1
1
1
1
2
1
1
1
1
2
3
1
1
2
3
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из лиганда пептида (или его аналога), который связывается с рецептором, выбранным из MRGPRX (например, рецептора пептида бычьего мозгового вещества надпочечников (BAM)), рецептора опиоидного пептида, OPRM или OPRD (например, рецептора пептида бета-эндорфин), BDKRB или BDKRB (например, рецептора пептида брадикинин), OPRM или OPRD (например, рецептора пептида мет- или лей-энкефалин), OPRK (например, рецептора пептида динорфин), GALR, GALR или GALR (например, рецептора пептида галанин), OPRL (например, рецептора пептида ноцицептин) и TACR, TACR или TACR (например, рецептора пептида вещества Р).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из лиганда пептида (или его аналога), выбранного из пептида бычьего мозгового вещества надпочечников (BAM), опиоидного пептида, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида мет- или лей-энкефалин, пептида динорфин, пептида галанин, пептида ноцицептин и пептида вещества P.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH). GnRH представляет собой составленный из 10 аминокислот пептидный гормон. N-концевые аминокислоты GnRH играют определенную роль в активации рецептора, в то время как С-концевые аминокислоты необходимы для высокоаффинного связывания с рецептором GnRH (см. публикацию Flanagan, Millar & Illing (1997) Reviews of Reproduction, 2, 113-120, которая во всей своей полноте включена в данное описание посредством ссылки). Функция GnRH в условиях in vivo заключается в воздействии на рецепторы GnRH, расположенные на передней доле гипофиза, и стимулируют синтез и высвобождение гонадотропинов, например, лютеинизирующего гормона (LH) и фолликулостимулирующего гормона (FSH). Ссылка на пептид GnRH охватывает все функциональные связывающие фрагменты, их варианты и аналоги. В качестве примера, термин пептид GnRH охватывает пептид GnRH, в котором аминокислота цистеин (ограниченная с боков двумя ахиральными аминокислотными остатками, такими как глицин и/или аланин) вставлена в качестве замены аминокислоты в положении 6 пептида GnRH. GnRH также известен как лютропин-высвобождающий гормон (LHRH). Дополнительные примеры включают пептиды GnRHI, пептиды GnRHII и пептиды GnRHIII, а также полноразмерный предшественник полипептида GnRH, содержащий 92 аминокислоты, и отдельные их части.
1
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида кортикотропин-высвобождающего фактора (CRF). CRF представляет собой состоящий из 41 аминокислот пептидный гормон гипоталамуса, который взаимодействует с рецепторами CRF и CRF. Основная функция CRF в условиях in vivo заключается в стимулировании высвобождения ACTH из кортикотропов в передней доле гипофиза. Ссылка на пептид CRF охватывает полноразмерный CRF, урокортин 1 и урокортин 2, а также все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из гастрин-высвобождающего пептида (GRP). GRP представляет собой содержащий 27 аминокислот пептидный гормон. GRP регулирует многочисленные функции желудочно-кишечного тракта и центральной нервной систем, в том числе высвобождение желудочно-кишечных гормонов, сокращение клеток гладких мышц и пролиферацию эпителиальных клеток, и является действенным митогеном для опухолевых тканей. Ссылка на пептид GRP охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
1
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из нейромедина B. Нейромедин В представляет собой содержащий 10 аминокислот пептидный гормон. Функция нейромедина B заключается в воздействии на рецепторы BB в условиях in vivo, и он является действенным митогеном и фактором роста для нормальных и опухолевых тканей легких и тканей желудочно-кишечного эпителия. Ссылка на пептид нейромедин B охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Ссылка на нейромедин B охватывает пептидный гомолог человека, бомбезин, и включает в себя полноразмерный бомбезин - состоящий из 14-аминокислот пептид, первоначально выделенный из кожи лягушки - а также отдельные его части и его пептидные аналоги.
1
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из гастрина или холецистокинина (ССК). Гастрин представляет собой содержащий 17 аминокислот пептидный гормон, а ССК представляет собой содержащий 8 аминокислот пептидный гормон. И гастрин, и холецистокинин действуют на рецепторы CCK и CCK в условиях in vivo, в основном в желудочно-кишечном тракте и центральной нервной системе, с целью модулирования секреции ферментов поджелудочной железы и сокращения гладких мышц желчного пузыря и желудка, тревоги, обезболивания, возбуждения и нейролептической активности. Ссылка на пептиды гастрин и холецистокинин охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
1
2
3
4
5
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида соматостатин (SST). Примеры подходящих TMs пептида SST включают полноразмерный SST и кортистатин (CST), а также отдельные их части и их пептидные аналоги, такие как BIM 23052, BIM 23056 или BIM23268; октреотидные пептиды, ланреотидные пептиды, BIM23027, CYN154806, BIM23027, вапреотидные пептиды, сенглитидные пептиды и SOM230. Указанные ТМ связываются с рецепторами sst, такими как рецепторы sst, sst, sst, sst и sst. SST и CST обладают значительной структурной гомологией и связываться со всеми известными рецепторами sst. Ссылка на пептиды SST или CST охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH). GHRH известен также как соматотропин-высвобождающий фактор (GRF или GHRF) или соматокринин. Подходящие пептиды GHRH включают полноразмерный пептид GHRH (1-44) и отдельные его части, такие как GHRH (1-27, 1-28, 1-29), GHRH (1-37) и GHRH (1-40, 1-43)-OH, а также пептидные аналоги, такие как BIM-28011 или NC-9-96. Ссылка на пептид GHRH охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида активированного протеиназой рецептора (PAR), например PAR1. Пептиды PAR представляют собой уникальную подтип связанных с G-белком рецепторов 7-трансмембранного рецептора, особенность которых заключается в том, что они протеолитически модифицированы с освобождением нового внеклеточного N-конца, который действует в качестве связанного активирующего лиганда. Были идентифицированы агонисты PAR1 (такие как TFLLR), которые активируют их родственный рецептор. Ссылка на пептид PAR охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из паратиреоидного гормона (PTH). PTH представляет собой пептид, который высвобождается паращитовидной железой и связывается с рецептором РТН-1. Указанный рецептор широко распространен, но особенно много его содержится в тканях-мишенях РТН, преимущественно, в почках и в костях. Ссылка на пептид PTH охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида, который связывается с секреторной клеткой слизистых оболочек или с нервной клеткой, контролирующей или направляющей секрецию слизи. Например, ТМ связывается с (а) клетками, секретирующими муцин, такими как эпителиальные бокаловидные клетки и секреторные клетки подслизистой железы, (b) клетками, которые секретируют водные компоненты слизи, таких как клетка Клара и белковая клетка, и/или (c) клетками, которые управляют или направляют секрецию слизи, такими как "сенсорно-афферентные" С-волокна или волокна NANC нейронной системы. Особо следует упомянуть следующие пептиды TMs: VIP; агонисты бета адренорецептора; гастрин-высвобождающий пептид; и пептид, связанный с геном кальцитонина. Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Так, TSIs по данному варианту осуществления настоящего изобретения находят терапевтическое применение при лечении гиперсекреции слизи, астме и/или хроническом обструктивном заболевании легких.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида, который связывается с эндокринной клеткой. Особо следует упомянуть здесь GHRH; тиреотропный гормон (TSH), инсулин, инсулиноподобный фактор роста; TSH высвобождающий гормон (протирелин); FSH/LH-высвобождающий гормон (гонадорелин); кортикотропин-высвобождающий гормон (CRH); и ACTH. Ссылка на указанные пептидные TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Так, TSIs по данному варианту осуществления настоящего изобретения находят терапевтическое применение при лечении: неоплазии железы внутренней секреции, в том числе MEN; тиреотоксикоза и других заболеваний, зависимых от гиперсекреции щитовидной железы; акромегалии, гиперпролактинемии, болезни Кушинга и других заболеваний, зависимых от гиперсекреции передней доли гипофиза; гиперандрогенизма, хронической ановуляции и других заболеваний, связанных с синдромом поликистозных яичников.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида, который связывается с воспалительной клеткой. Особо здесь следует упомянуть пептиды TMs (i) для тучных клеток, такие как С4-домен Fc IgE; (ii) для эозинофилов, такие как лиганды рецептора комплемента C3a/C4a-R, антигены, активные по отношению к рецептору комплемента CR4; (iii) для макрофагов и моноцитов, такие как макрофагальный стимулирующий фактор, (iv) для нейтрофилов, такие как антиген, связанный с рецептором комплемента iC3b, или IL8. Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Так, TSIs по данному варианту осуществления настоящего изобретения находят терапевтическое применение при лечении аллергии (сезонного аллергического ринита (сенной лихорадки), аллергического конъюнктивита, вазомоторного ринита и пищевой аллергии), эозинофилии, астмы, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, дискоидной красной волчанки, язвенного колита, болезни Крона, геморроя, зуда, гломерулонефрита, гепатита, панкреатита, гастрита, васкулита, миокардита, псориаза, экземы, хронического радиационно-индуцированного фиброза, рубцевания легких и других фиброзных расстройств.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида, который связывается с экзокринной клеткой. Особо здесь следует упомянуть пептид, активирующий аденилциклазу гипофиза (РАСАР-38). Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Так, TSIs по данному варианту осуществления настоящего изобретения находят терапевтическое применение при лечении гиперсекреции слизи секреторными клетками слизистых оболочек, расположенными в желудочно-кишечном тракте, в частности, в толстой кишке.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида, который связывается с иммунологическими клетками. Здесь следует упомянуть такие лиганды, как фрагмент/элемент поверхности вируса Эпштейна-Барра. Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Так, TSIs по данному варианту осуществления настоящего изобретения находят терапевтическое применение при лечении тяжелой псевдопаралитической миастении, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, дискоидной красной волчанки, при трансплантации органов, трансплантации тканей, трансплантации жидкостей, при лечении болезни Грейвса, тиреотоксикоза, аутоиммунного диабета, гемолитической анемии, тромбоцитопенической пурпуры, нейтропении, хронического аутоиммунного гепатита, аутоиммунного гастрита, злокачественной анемии, тиреоидита Хашимото, болезни Аддисона, синдрома Шегрена, первичного билиарного цирроза, полимиозита, склеродермии, системного склероза, пузырчатки обыкновенной, буллезного пемфигоида, миокардита, ревмокардита, гломерулонефрита (гудпасчерова типа), увеита, орхита, неспецифического язвенного колита, васкулита, атрофического гастрита, злокачественной анемии, сахарного диабета 1 типа.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида, который связывается с сердечно-сосудистой клеткой. Здесь состоит упомянуть тромбин и TRAP (пептидный агонист тромбинового рецептора) и лиганды, которые связываются с сердечно-сосудистыми эндотелиальными клетками, такие как антиген-распознающие антитела поверхности GP1b. Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Так, TSIs по данному варианту осуществления настоящего изобретения находят терапевтическое применение при лечении сердечно-сосудистых заболеваний и/или гипертензии.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из пептида, который связывается с костной клеткой. Здесь следует упомянуть лиганды, которые связываются с остеобластами при лечении заболевания, выбранного из остеопетроза и остеопороза, и включают кальцитонин, а также лиганды, которые связываются с остеокластами, в том числе факторами дифференцировки остеокластов (в частности, TRANCE, или RANKL, или OPGL). Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги. Так, TSIs по данному варианту осуществления настоящего изобретения находят терапевтическое применение при лечении заболеваний костной ткани.
9
1
Линейные и циклические интегрин-связывающие последовательности представляют собой еще одну группу пептидов TMs по настоящему изобретению. Многие интегрины распознают тройную пептидную последовательность Arg-Gly-Asp (RGD) (Ruoslahti, 1996). Фрагмент RGD можно найти более чем в 100 белках, включая фибронектин, тенасцин, фибриноген и витронектин. Взаимодействие RGD и интегрина используется многими патогенами, включая вирус Коксаки (Roivaninen et al., 1991) и аденовирус (Mathias et al., 1994), как консервативный механизм проникновение в клетку. Было показано, что линейные и циклические пептидные последовательности, соответственно, PLAEIDGIEL и CPLAEIDGIELC, связывают и интернализуют ДНК в клетках, экспрессирующих интегрин αβ (Schneider et al., 1999). Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
Другие TMs по настоящему изобретению, включают TMs, обнаруженные методами фагового отображения, в частности TMs, которые нацеливаются и интернализуются эпителиальными клетками дыхательных путей человека. Они включают линейные и циклические пептиды THALWHT (Jost et al., 2001); LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC), LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) и LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) (Wu et al., 2003); CDSAFVTVDWGRSMSLC (Florea et al., 2003); SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP (Writer et al., 2004); FSLSKPP, HSMQLST и STQAMFQ (Rahim et al., 2003). Ссылка на указанные пептиды TMs охватывает все функциональные связывающие фрагменты, варианты и их аналоги.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из первой и второй частей (в частности, доменов). В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая и вторая части нацеливающего фрагмента могут быть получены из того же самого лиганда (например, из любого из вышеуказанных лигандов TM). Первая и вторая части могут связываться с одним и тем же из различных участков на одном и том же рецепторе. В качестве альтернативы, первая и вторая части могут связывать участки на различных рецепторах.
Первую и вторую части нацеливающего фрагмент можно получить из различных лигандов (например, любых из вышеуказанных лигандов TM), которые могут связываться с тем же самыми или различными рецепторами. Соответственно, TM может быть гибридом двух TM. Первая и вторая части могут связываться с теми же самыми или различными участками одного и того же рецептора. В качестве альтернативы, первая и вторая части могут связывать участки на различных рецепторах.
TM может дополнительно включать третью и/или последующие части из других TMs (например, любого из вышеуказанных лигандов TM).
1
В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая часть (например, домен) включает или состоит из лиганда, который связывается посредством свободной N-концевой части (например, свободного N-конца) с его рецептором-мишенью. Примером подобного лиганда является лиганд, который связывается с опиоидными рецепторами (например, лиганд, который связывается с рецептором ORL, таким как опиоидный пептид). Другие примеры опиоидных пептидов включают ноцицептин, динорфин, бета-эндорфин и энкефалин. Другие отличные от опиоидных пептидов лиганды TM включают BAM, галанин, вещество Р, GnRH, CRF, GRP, нейромедин В, бомбезин, гастрин, CCK, SST, CST и пептиды GHRH (а также отдельные их части, варианты и аналоги).
В другом (или том же самом) варианте осуществления настоящего изобретения вторая часть (например, домен) включает или состоит из лиганда, который связывается посредством свободной С-концевой части (например, свободного С-конца) с его рецептором-мишенью. Примером подобного лиганда является лиганд, который связывается с рецептором брадикинина (например, с пептидом брадикинин) или рецептором вещества Р (например, пептидом вещества Р). Другие лиганды пептида TM включают BAM, галанин, вещество Р, GnRH, CRF, GRP, нейромедин В, бомбезин, гастрин, CCK, SST, CST и пептиды GHRH (а также отдельные их части, варианты и аналоги).
В качестве примера гибридный TM содержит первую часть, которая включает или состоит из пептида ноцицептин, и вторую часть, которая включает или состоит из пептида брадикинин (или пептида вещества Р). В других примерах первая часть включает или состоит из пептида ноцицептин, а вторая часть включает или состоит из пептида, выбранного из пептида BAM, опиоидного пептида, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида энкефалин, пептида динорфин, пептида галанин и пептида вещества P.
В другом примере гибридный TM содержит первую часть, которая включает или состоит из пептида динорфин, и вторую часть, которая включает или состоит из пептида брадикинин (или пептида вещества Р). В других примерах первая часть включает или состоит из пептида динорфин, а вторая часть включает или состоит из пептида, выбранного из пептида BAM, опиоидного пептида, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида энкефалин, пептида ноцицептин, пептида галанин и пептида вещества P.
В другом примере гибридный TM содержит первую часть, которая включает или состоит из пептида галанин, и вторую часть, которая включает или состоит из пептида брадикинин (или пептида вещества Р). В других примерах первая часть включает или состоит из пептида галанин, а вторая часть включает или состоит из пептида, выбранного из пептида BAM, опиоидного пептида, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида энкефалин, пептида ноцицептин, пептида динорфин и пептида вещества P.
В другом примере гибридный TM содержит первую часть, которая включает или состоит из пептида BAM, и вторую часть, которая включает или состоит из пептида брадикинин (или пептида вещества Р). В других примерах первая часть включает или состоит из пептида BAM, а вторая часть включает или состоит из пептида, выбранного из опиоидного пептида, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида энкефалин, пептида ноцицептин, пептида динорфин, пептида галанин и пептида вещества P.
В другом примере гибридный TM содержит первую часть, которая включает или состоит из пептида бета-эндорфин, и вторую часть, которая включает или состоит из пептида брадикинин (или пептида вещества P). В других примерах первая часть включает или состоит из пептида бета-эндорфин, а вторая часть включает или состоит из пептида, выбранного из опиоидного пептида, пептида BAM, пептида брадикинин, пептид энкефалин, пептида ноцицептин, пептида динорфин, пептида галанин и пептида вещества P.
В другом примере гибридный TM содержит первую часть, которая включает или состоит из пептида энкефалин (например, лей- и мет-энкефалина), и вторую часть, которая содержит или состоит из пептида брадикинин (или пептида вещества P). В других примерах первая часть включает или состоит из пептида энкефалин, а вторая часть включает или состоит из пептида, выбранного из опиоидного пептид, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида BAM, пептида ноцицептин, пептида динорфин, пептида галанин и пептида вещества P.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения TM включает или состоит из первой и второй частей (например, доменов), которые идентичны (или подобны) и в сочетании обеспечивают эффективное взаимодействие с рецептором на клетке-мишени. Кроме того, могут также быть включены (например, третьи и, необязательно, дополнительные и т.д.) идентичные/аналогичные части. Так, в данном варианте осуществления настоящего изобретения полипептиды по данному изобретению включают повторяющуюся структуру (например, TM-TM; TM-TM-TM и т.д.) одного и того же (или подобного) ТМ.
Примеры подобных повторяющихся структур TM (например, TM-TM, TM-TM-TM и т.д.) дает TM, выбранный из опиоидного пептида, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида BAM, пептида ноцицептин, пептида динорфин, пептида галанин, пептида энкефалин, пептида вещества P, пептида GnRH, пептида CRF, пептида GRP, пептида нейромедин B, пептида бомбезин, пептида гастрин, пептида CCK, пептида SST, пептида CST и пептида GHRH (и отдельные части, варианты и их аналоги).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая и вторая (и/или последующие) части ТМ отделены друг от друга спейсером, например, пептидной последовательностью. В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая и вторая (и/или последующие) части могут быть отделены друг от друга последовательностью, состоящей не более чем из 40, или самое большее из 35, или самое большее из 30, или самое большее из 25, или самое большее из 20, или самое большее из 15, или самое большее из 10, или самое большее из 5 аминокислотных остатков. В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая и вторая (и/или последующие) части могут быть отделены друг от друга последовательностями, составленными из 4, 3, 2, 1 или ноль аминокислотных остатков.
Слитые белки по настоящему изобретению обычно показывают сниженное сродство связывания (в диапазоне вплоть до 100 раз) к клеткам-мишеням, по сравнению с соответствующим "свободным" ТМ (т.е. изолированным TM самим по себе). Тем не менее, несмотря на это наблюдение, слитые белки по настоящему изобретению неожиданно демонстрируют хорошую эффективность. Это может быть связано с двумя основными их особенностями. Во-первых, компонент нецитотоксической протеазы оказывает каталитическое действие, таким образом, терапевтический эффект нескольких подобных молекул быстро усиливается в клетке-мишени. Во-вторых, рецепторам, присутствующим на клетках-мишенях, необходимо служить лишь в качестве шлюза для ввода терапевтического средства, и их не обязательно активировать до уровней, необходимых для достижения фармакологической реакции, опосредованной лигандом-рецептором. Соответственно, слитые белки по настоящему изобретению можно вводить с дозой, меньшей чем та, которую необходимо было бы использовать для других типов лекарственных молекул, которые обычно вводят с большими дозами в количестве от микрограммов до миллиграммов (и даже вплоть до нескольких сотен миллиграммов). Напротив, слитые белки по настоящему изобретению могут быть введены в значительно более низких дозах, обычно, по меньшей мере, в 10 раз меньших дозах, а более типично, в 100 раз меньших дозах.
Домен транслокации
N
Компонент транслокации по настоящему изобретению позволяет осуществить перенос нецитотоксической протеазы (или ее фрагмента) в клетку-мишень таким образом, что функциональная экспрессия активности протеазы происходит внутри цитозоли клетки-мишени. Компонент, транслокации, предпочтительно, способен образовывать ион-проницаемые поры в липидных мембранах (например, мембранах эндосом) в условиях низких значений рН. Компонент транслокации может быть получен из микробного белка, например, бактериального или вирусного белка. Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения компонент транслокации включает или состоит из домена транслокации фермента, такого как бактериальный токсин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен транслокации включает или состоит из домена транслокации вирусного белка. В одном варианте осуществления настоящего изобретения компонент транслокации по настоящему изобретению может включать или состоять из Н-цепи клостридиального нейротоксина или ее фрагмента, такого как домен H (или его транслокационный фрагмент) клостридиального нейротоксина.
Первый и второй участки протеолитического расщепления
Полипептиды по настоящему изобретению содержат первый участок протеолитического расщепления. Первый участок протеолитического расщепления позволяет осуществить расщепление (например, контролируемое расщепление) слитого белка в позиции между компонентом нецитотоксической протеазы и остальной частью слитого белка. Указанный процесс расщепления служит для "активации" одноцепочечной структуры (отличной от домена транслокации цитотоксической протеазы) и приводит к образованию "активированной" двухцепочечной структуры, в которой компонент нецитотоксической протеазы ковалентно связан (например, посредством дисульфидной связи) с остальной частью слитого белка.
Полипептиды по настоящему изобретению также содержат второй участок протеолитического расщепления. Второй участок протеолитического расщепления позволяет осуществить расщепление (например, контролируемое расщепление) слитого белка в позиции между компонентом нацеливающего фрагмента и компонентом домена транслокации. Указанный процесс расщепления служит для разделения одноцепочечной структуры (домена TM-транслокации) и приводит к образованию отдельной двухцепочечной структуры, в которой компонент TM ковалентно связан (например, посредством дисульфидной связи) с компонентом транслокации слитого белка. При этом окружающая структура компонента TM изменяется таким образом, что он презентируется в конформации, в которой как N-концевая, так и С-концевая части (например, домены) больше не связаны пептидной связью с остатком слитого белка и, таким образом, каждая из них может свободно взаимодействовать (например, связываться) с различными доменами связывания одного (или нескольких) рецепторов.
Таким образом, протеолитическое расщепление либо на первом, либо на втором участке протеолитического расщепления преобразует одноцепочечный полипептид слитый белок в двухцепочечный полипептид. В случае реакции расщепления на первом участке протеолитического расщепления компонент нецитотоксической протеазы остается связан ковалентной связью (например, посредством дисульфидной связи) с компонентом домена транслокации и/или компонентом TM. Указанная ковалентная связь может быть опосредованной, например, осуществляться с помощью одного (или нескольких) спейсера или линкера, который, в свою очередь, связан с компонентом нецитотоксической протеазы, компонентом TM и/или компонентом транслокации. Аналогично, в случае реакции расщепления на втором участке протеолитического расщепления компонент домена транслокации остается связан с компонентом TM ковалентной связью (например, посредством дисульфидной связи). Указанная ковалентная связь может быть опосредованной, например, осуществляться с помощью одного (или нескольких) спейсера или линкера, который, в свою очередь, связан с компонентом транслокации и/или TM.
В том случае, когда реакции расщепления протекают как на первом, так и на втором участке протеолитического расщепления, одноцепочечный полипептид слитый белок преобразуется в трицепочечный полипептид.
Первый и второй участки протеолитического расщепления могут быть введены (и/или же могут быть удалены любые соответствующие последовательности расщепления) на уровне ДНК с помощью обычных способов, например, путем сайт-направленного мутагенеза. Скрининг для подтверждения наличия последовательностей расщепления можно выполнить вручную или с помощью компьютерного программного обеспечения (например, программы MapDraw компании DNASTAR, Inc.)
Несмотря на то, что любой участок протеолитического расщепления может быть использован в качестве первого участка протеолитического расщепления и/или использован в качестве второго участка протеолитического расщепления, в полипептидах по настоящему изобретению предпочтительными являются следующие:
Энтерокиназа
(DDDDK↓)
Фактор Ха
(IEGR↓/IDGR↓)
TEV (вируса гравировки табака)
(ENLYFQ↓G)
Тромбин
(LVPR↓GS)
PreScission
(LEVLFQ↓GP)
Дополнительные не ограничивающие примеры включают участок расщепления папаина растений, участок расщепления папаина насекомых, участок расщепления папаина ракообразных, участок протеолитического расщепления риновируса 3C человека, участок протеолитического расщепления энтеровируса 3C человека, участок протеолитического расщепления вируса гравировки табака (TEV), участок расщепления вируса крапчатости листьев табака (TVMV), участок расщепления субтилизина, участок расщепления гидроксиламина или участок расщепления каспазы 3.
Термин участок протеолитического расщепления охватывает также интеин, который представляет собой саморасщепляемую последовательность. Реакцию аутосплайсинга можно контролировать, например, путем изменения концентрации присутствующего восстанавливающего агента. Кроме того, термин участок протеолитического расщепления охватывает последовательность расщепление, на который воздействует нецитотоксическая протеаза (например, клостридиальный нейротоксин). Примером подобного участка расщепления является последовательность участка расщепление белка SNARE - примеры нативной последовательности распознавания участка расщепления для ряда нецитотоксических протеаз приведены в последнем разделе настоящего описания.
Первый и второй участки расщепления могут быть одинаковыми или разными. Первый и второй участки расщепления могут расщепляться (лишь) одной протеазой или (лишь) различными протеазами.
В соответствии с отдельным аспектом настоящего изобретения, вышеупомянутые участки расщепления/расщепляющие протеазы могут быть использованы отдельно, как "деструктивные" участки расщепления/протеазы (см. ниже), в том случае, когда один из них должен быть включен в полипептид по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения в одноцепочечном полипептиде компонент нецитотоксической протеазы и компонент домена транслокации связаны друг с другом дисульфидной связью. Так, после расщепления первого участка протеолитического расщепления полипептид принимает двухцепочечную конформацию, где компонент протеазы и компонент транслокации остаются связаны друг с другом дисульфидной связью. Указанную реакцию расщепления обычно называют стадией "активации", поскольку она приводит к получению компонента нецитотоксической протеазы, обладающего повышенной (в частности, оптимальной) протеолитической активностью.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения компонент нецитотоксической протеазы образует ковалентную связь с доменом компонента транслокации слитого белка. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток компонента протеазы, который образует ковалентную связь, расположен в пределах последних 20, предпочтительно, в пределах последних 10 аминокислотных остатков С-конца компонента протеазы. Аналогично, в одном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток в компоненте транслокации, который образует вторую часть ковалентной связи, может быть расположен в пределах первых 20, предпочтительно, в пределах первых 10 аминокислотных остатков N-конца компонента транслокации.
Приведенные выше механизмы образования ковалентной связи имеют то преимущество, что компонент протеазы и компонент транслокации расположены так же, как и в нативной нецитотоксической протеазе (например, в нативном клостридиальном нейротоксине). Для сравнения, если обратиться к первичной аминокислотной последовательности для нативного клостридиального нейротоксина, соответствующие аминокислотные остатки цистеина разнесены друг от друга от 8 до 27 аминокислотными остатками - как указано в Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Chapter 9, в The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Ed. Alouf & Freer:
В одном варианте осуществления настоящего изобретения компонент нецитотоксической протеазы и компонент первого участка протеолитического расщепления одноцепочечного слитого белка по настоящему изобретению разделены не более чем 30, 25, 20, 15 или 10 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонента разделены внутри одноцепочечного слитого белка не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными остатками. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонента не разделены внутри одноцепочечного слитого белка ни одним аминокислотным остатком.
Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения участок нецитотоксической протеазы и первый участок протеолитического расщепления могут быть разделены с помощью первого спейсера, при этом указанный спейсер находится у N-конца первого участка протеолитического расщепления и у С-конца компонента нецитотоксической протеазы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения первый спейсер может включать часть участка или весь первый участок протеолитического расщепления или может быть частью компонента нецитотоксической протеазы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения компонент домена транслокации (или TM) и компонент первого участка протеолитического расщепления одноцепочечного слитого белка разделены не более чем 30, 25, 20, 15 или 10 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонента разделены внутри одноцепочечного слитого белка не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными остатками. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонента не разделены внутри одноцепочечного слитого белка ни одним аминокислотным остатком.
Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения домен транслокации (или ТМ) и первый участок протеолитического расщепления могут быть разделены вторым спейсером, при этом указанный второй спейсер находится у С-конца первого участка протеолитического расщепления и у N-конца компонента домена транслокации (или ТМ). Второй спейсер может быть идентичен или отличен от первого спейсера, отделяющего участок нецитотоксической протеазы и первый участок протеолитического расщепления. В одном варианте осуществления настоящего изобретения второй спейсер может содержать часть участка или весь второй участок протеолитического расщепления или может быть частью компонента домена транслокации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения компонент домена транслокации и второй компонент участка протеолитического расщепления одноцепочечного слитого белка разделены не более чем 30, 25, 20, 15 или 10 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонента разделены внутри одноцепочечного слитого белка не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных остатков. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонентов не разделены внутри одноцепочечного слитого белка ни одним аминокислотным остатком.
Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения домен транслокации и второй участок протеолитического расщепления могут быть разделены третьим спейсером, при этом указанный третий спейсер находится у N-конца или у С-конца домена транслокации. Третий спейсер может быть идентичен (или отличен от) одному или обоим из первого и второго спейсеров. В одном варианте осуществления настоящего изобретения третий спейсер может содержать часть участка или весь второй участок протеолитического расщепления или может быть частью компонента домена транслокации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения нацеливающий фрагмент и второй участок протеолитического расщепления разделены не более чем 30, 25, 20, 15 или 10 аминокислотными остатками. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонентов разделены внутри одноцепочечного слитого белка не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными остатками. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные два компонента не разделены внутри одноцепочечного слитого белка ни одним аминокислотным остатком.
Таким образом, после расщепления на втором участке протеолитического расщепления полипептид получает нацеливающий компонент, имеющий N-концевой домен и С-концевой домен, которые в значительной степени свободны от остальной части конъюгата. Указанное расположение облегчает взаимодействие между N-концевым и С-концевым компонентами нацеливающего фрагмент с участком связывания на клетке-мишени.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения нацеливающий фрагмент и второй участок протеолитического расщепления могут быть разделены четвертым спейсером, при этом указанный четвертой спейсер находится у N-конца или у С-конца нацеливающего фрагмента. Четвертый спейсер может быть идентичен (или отличен от) одному, двум или всем из первого, второго и третьего спейсера. В одном варианте осуществления настоящего изобретения четвертый спейсер может включать часть участка или весь второй участок протеолитического расщепления, или может быть частью компонента домена транслокации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая протеаза (посредством которой расщепляется первый участок протеолитического расщепления) такая же, как вторая протеаза (посредством которой расщепляется второй участок протеолитического расщепления).
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения обработка одноцепочечного полипептида слитый белок одной протеазой может привести к расщеплению как первого, так и второго участков протеолитического расщепления.
В любом из слитых белков по настоящему изобретению может быть использовано множество различных молекул спейсеров. Примеры подобных молекул спейсеров включают GS5, GS10, GS15, GS20, GS25 и Hx27.
Ковалентная связь
Полипептиды слитые белки по настоящему изобретению включают две ковалентные связи: первая подобная связь образована между компонентом нецитотоксической протеазы и остальной частью слитого белка, а вторая подобная связь образована между нацеливающим фрагментом и доменом транслокации. После протеолитического расщепления (соответствующего) первого и второго участков протеолитического расщепления указанные две ковалентные связи остаются без изменений. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ковалентные связи отличны от пептидных связей (т.е. ковалентные связи не являются пептидными связями). Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения одна или обе указанные ковалентные связи являются дисульфидными связями.
После протеолитического расщепления на втором участке протеолитического расщепления ковалентная связь остается неизменной. Расщепление на втором участке протеолитического расщепления раскрывает N-конец (или С-конец) нацеливающего фрагмента. Так, расщепление на втором участке протеолитического расщепления приводит к образованию нацеливающего фрагмента, имеющего свободный N-конец и свободный С-конец.
Таким образом, после расщепления на втором участке протеолитического расщепления компонент нацеливающего фрагмента больше не является частью той же самой полипептидной цепи, что и компонент домена транслокации, поскольку пептидная связь между нацеливающим фрагментом и доменом транслокации расщеплена. Тем не менее, нацеливающий фрагмент остается прикрепленным к домену транслокации благодаря наличию ковалентной связи.
Ковалентная связь может представлять собой любую ковалентную связь, способную образовываться или которая образуется между двумя аминокислотными остатками в полипептидной цепи.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь. Дисульфидная связь может образоваться между любыми двумя тиольными (т.е. -SH) группами, присутствующими в полипептиде. В качестве примера, дисульфидные связи могут образовываться между двумя остатками цистеина (или их функционально эквивалентными вариантами), расположенными в полипептидной цепи.
Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения остаток цистеина, расположенный в компоненте домена транслокации, образует ковалентную связь с другим остатком цистеина, расположенным в компоненте нацеливающего фрагмента. Подобные дисульфидные связи остаются неизменными после расщепления на втором участке протеолитического расщепления.
Аминокислотные остатки, расположенные в компоненте домена транслокации и в компоненте нацеливающего фрагмента, которые соединены ковалентной связью, могут естественным образом присутствовать в указанных компонентах. Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения ковалентная связь образуется между аминокислотным остатком, естественным образом имеющимся в компоненте домена транслокации, и остатком аминокислоты, естественным образом имеющимся в компоненте нацеливающего фрагмента. В качестве альтернативы, один или оба указанных аминокислотных остатка могут быть введены в компонент домена транслокации и/или компонент нацеливающего фрагмента. Аминокислотные остатки могут быть введены как замещения.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь, образованную между остатком цистеина, естественным образом присутствующим в компоненте домена транслокации, и остатком цистеина, естественным образом присутствующим в компоненте нацеливающего фрагмента. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения, остаток цистеина специально введен либо в домен транслокации, либо компонент нацеливающего фрагмента, либо и в тот и другой, с целью облегчения или обеспечения образования дисульфидной связи между указанными двумя компонентами.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или несколько остатков цистеина вводят в ТМ и/или домен транслокации. При осуществлении данной процедуры с боков введенного(ых) остатка(ов) цистеина могут быть присоединены два остатка небольших ахиральных аминокислот (таких как глицин и/или аланин). Использование подобных аминокислотных остатков позволяет избежать немедленного образования третичной структуры и облегчает образование дисульфидной связи. Остатки небольших ахиральных аминокислот могут присутствовать естественным образом или могут быть введены в ТМ и/или домен транслокации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения в дополнение к ковалентной связи между доменом транслокации и нацеливающим фрагментом расположен короткий полипептид (например, 1-20, или 1-10, или 5-10 аминокислотных остатков), который обеспечивает образование вторичной полипептидной структуры. Указанная вторичная полипептидная структура помогает расположить домен транслокации и нацеливающий фрагмент, способствуя тем самым (1) образованию ковалентной связи между TM и доменом транслокации и/или (2) позиционированию ТМ таким образом, что С-терминальный и N-терминальный концы отворачиваются в сторону от компонента транслокации.
Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения вторичная структура полипептида действует таким образом, что нацеливающий фрагмент сближается с доменом транслокации, в результате чего образование ковалентной связи становится энергетически более благоприятным.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, способный, как описано выше, образовывать вторичную полипептидную структуру, представляет собой полипептидную последовательность, содержащую, по крайней мере, один "объемный" аминокислотный остаток, такой как остаток пролина.
Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения между доменом транслокации и нацеливающим фрагментом располагается полипептид, содержащий, по меньшей мере, один из объемных аминокислотных остатков. Указанный объемный остаток помогает сформировать изгиб в полипептидной цепи, так что часть нацеливающего фрагмента сильнее сближается с доменом транслокации, чем в том случае, когда объемный остаток отсутствует.
Соответствующая ковалентная связь между компонентом нецитотоксической протеазы и остальной частью слитого белка (например, компонентом транслокации и/или компонентом TM) может быть образована таким же образом, как описано выше для ковалентной связи между компонентом домена транслокации и компонентом TM. Как описано выше, могут быть введены одна или несколько вторичных структур и/или один или несколько объемных аминокислотных остатков.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ковалентная связь между компонентом нецитотоксической протеазы и остальной частью слитого белка представляет собой ковалентную связь между компонентом нецитотоксической протеазы и компонентом домена транслокации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения в образовании ковалентной связи между компонентом нецитотоксической протеазы и компонентом домена транслокации используются природные остатки цистеина, размещенные в соответствующих компонентах, такие, например, как один или несколько остатков цистеина, приведенных ранее для пояснения в разделе описания. В качестве альтернативы, один или несколько подходящих остатков цистеина могут быть введены в соответствующие компоненты.
Слитый белок может включать одну или несколько меток очистки, которые расположены N-терминально по отношению к компоненту протеазы и/или С-терминально по отношению к компоненту транслокации.
Несмотря на то, что могут быть использованы любые метки очистки, предпочтительными являются следующие:
His-метка (например, 6 x гистидин), предпочтительно в виде С-концевой и/или N-концевой метки
MBP-метка (белок, связывающий мальтозу), предпочтительно в виде N-концевой метки
GST-метка (глутатион-S-трансфераза), предпочтительно в виде N-концевой метки
His-MBP-метка, предпочтительно в виде N-концевой метки
GST-MBP-метка, предпочтительно в качестве N-концевой метки
Тиоредоксин-метка, предпочтительно в качестве N-концевой метки
CBD-метка (хитин-связывающий домен), предпочтительно в качестве N-концевой метки.
Терапевтические применения
Компонент TM направляет лечебную молекулу нацеливаемого ингибитора секреции (TSI) по настоящему изобретению в нужную клетку-мишень.
В качестве примера, использование TMs, приведенных в настоящем описании (например, опиоидного пептида, пептида бета-эндорфин, пептида брадикинин, пептида BAM, пептида ноцицептин, пептида динорфин, пептида галанин, пептида энкефалин, пептида вещества P), направляет лечебную молекулу нацеливаемого ингибитора секреции (TSI) по настоящему изобретению в чувствительные к боли клетки (например, первичные афферентные клетки). Полученные слитые белки являются, таким образом, терапевтическими молекулами для подавления боли - авторы настоящего изобретения отсылают к документам WO 2006/059093, WO 2007/138339 и WO 96/33273, каждый из которых во всей полноте включен в настоящее описание посредством ссылки.
Приведенные в данном описании TMs могут быть использованы для направления молекул нацеливаемого ингибитора секреции (TSI) по настоящему изобретению в клетки, которые стимулируют нейрогенное воспаление. Таким образом, молекулы нацеливаемого ингибитора секреции (TSI) по настоящему изобретению представляют собой лечебные молекулы для подавления нейрогенного воспаления - авторы настоящего изобретения отсылают к документам WO 2010/138395, WO 2010/138392, WO 2010/138387, WO 2010138382 и WO 2010/138379, каждый из которых во всей полноте включен в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительные TMs для использования в подобных молекулах TSI и терапевтических методах включают опиоидные TMs, такие как ноцицептин и динорфин.
Приведенные в данном описании TMs могут быть использованы для направления молекул нацеливаемого ингибитора секреции (TSI) по настоящему изобретению в клетки, которые активируют урогенитальные-неврологические расстройства, такие как гиперактивность мочевого пузыря. Таким образом, молекулы нацеливаемого ингибитора секреции (TSI) по настоящему изобретению представляют собой лечебные молекулы для подавления урогенитальных-неврологических расстройств, таких как гиперактивность мочевого пузыря - авторы настоящего изобретения отсылают к документам WO 2010/138393, WO 2010/138389, WO 2010/138384 и WO 2010/138366, каждый из которых во всей полноте включен в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительные TMs для использования в подобных молекулах TSI и терапевтических методах включают опиоидные TMs, такие как ноцицептин и динорфин.
Такие TMs как пептид гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH), пептид CRF, пептид GRP, пептид нейромедин B, пептид бомбезин, пептид гастрин, пептид CCK, пептид SST, пептид CST и пептид GHRH могут использоваться для направления молекул TSI по настоящему изобретению в клетки, которые способствуют развитию рака или даже в раковые клетки как таковые. Таким образом, молекулы нацеливаемого ингибитора секреции (TSI) по настоящему изобретению представляют собой лечебные молекулы для подавления нейроэндокринных состояний, таких как акромегалия и болезнь Кушинга, и для подавления рака (например, рака легких, рака почки, рака мозга, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака надпочечников, рака пищевода, лимфомы, лейкоза, острого лейкоза, рака мочевого пузыря, рака костей, рака кишечника, рака шейки матки, хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, рака печени, рака кожи, рака ротоглотки, миеломы, рака предстательной железы, рака желудка, рака яичек, рака матки или саркомы Капоши) - авторы настоящего изобретения отсылают к документам WO 2009/150489, WO 2009/150470 и WO 2010/055358, каждый из которых во всей полноте включен в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительные TMs для использования в подобных молекулах TSI и терапевтических методах включают пептиды GHRH, пептиды SST и пептиды CST.
Деструктивные участки расщепления
Полипептиды по настоящему изобретению могут быть дополнительно модифицированы с тем, чтобы уменьшить или предотвратить нежелательные побочные эффекты, связанные с попаданием в не предназначенные для нацеливания области. В соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения, полипептид содержит деструктивный участок расщепления. Деструктивный участок расщепления отличается от участка "активации" (т.е. двухцепочечной конструкции) и от второго участка протеолитического расщепления (т.е. конструкции TM со свободными C-концевыми и N-концевыми доменами). Указанный деструктивный участок расщепления способен расщепляться третьей протеазой, а не первой или второй протеазой. Более того, при подобном расщеплении на деструктивном участке расщепления третьей протеазой полипептид по настоящему изобретению обладает пониженной действенностью (например, меньшей способностью связываться с предполагаемой клеткой-мишенью, сниженной транслокационной активностью и/или сниженной активностью нецитотоксической протеазы). В качестве примера, авторы настоящего изобретения отсылают к документам WO 2010/094905 и WO 02/044199, каждый из которых во всей полноте включен в настоящее описание посредством ссылки.
Так, в соответствии с данным вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается полипептид, который может быть контролируемым образом инактивирован и/или разрушен в определенном месте.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения деструктивный участок расщепления распознается и расщепляется третьей протеазой (т.е. деструктивной протеазой), выбранной из циркулирующей в крови протеазы (например, внеклеточной протеазы, такой как протеолитический фермент сыворотки крови, или протеазы, вызывающей каскадный процесс свертывания крови), тканеассоциированной протеазы (например, матричной металлопротеазы (MMP), такой как MMP мышц) и внутриклеточной протеазы (предпочтительно, протеазы, которая отсутствует в клетке-мишени). Таким образом, в процессе использования, если полипептид по настоящему изобретению рассеивается за пределами предполагаемой клетки-мишени и/или захвачен клеткой, отличной от клетки-мишени, то полипептид будет инактивирован путем расщепления деструктивного участка расщепления (третьей протеазой).
В контексте настоящего изобретения матричные металлопротеазы (MMPs) являются предпочтительной группой деструктивных протеаз. В этой группе ADAM 17 (EC 3.4.24.86, известная также как ТАСЕ) является предпочтительной, и она расщепляет различные прикрепленные к мембране белки клеточной поверхности, чтобы "скрывать" внеклеточные домены. Дополнительные предпочтительные MMPs включают адамализины, серрализины и астацины. Другой группой предпочтительных деструктивных протеаз являются протеолитические ферменты крови млекопитающих, такие как тромбин, фактор свертывания крови VIIa, фактор свертывания крови IXa, фактор свертывания крови Ха, фактор свертывания крови XIa, фактор свертывания крови Xlla, калликреин, белок С и MBP-ассоциированная серин-протеаза.
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, предлагается последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанный полипептид слитый белок.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения, последовательность ДНК получают как часть ДНК-вектора, при этом вектор содержит промотор и терминатор. Последовательность ДНК, кодирующая вышеуказанный полипептид слитый белок, расположена в прямом направлении от промотора; терминатор расположен в прямом направлении от последовательности нуклеиновой кислоты.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, вектор имеет промотор, выбранный из:
Промотор
Агент индукции
Типичные условия индукции
tac (гибрид)
IPTG
0,2 мМ (0,05-2,0 мМ)
AraBAD
L-арабиноза
0,2% (0,002-0,4%)
Оператор T7-lac
IPTG
0,2 мМ (0,05-2,0 мМ)
ДНК-конструкцию по настоящему изобретению, предпочтительно, разрабатывают в условиях in silico, а затем синтезируют с помощью обычных методов синтеза ДНК.
Информацию о вышеуказанной последовательности ДНК необязательно модифицируют, с целью присоединения к кодону в соответствии с системой экспрессии конечной клетки-хозяина (например, E. coli), которая должна быть использована.
Скелет ДНК, предпочтительно, подвергают скринингу на любую присущую последовательность нуклеиновой кислоты, которая при транскрипции и трансляции будет продуцировать аминокислотную последовательность, соответствующую участку протеолитического расщепления, кодируемому второй кодирующей пептид последовательностью. Указанный скрининг можно провести вручную или с помощью компьютерной программы (например, программы MapDraw компании DNASTAR, Inc.).
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, предлагается способ получения в клетке-хозяине одноцепочечного полипептида слитый белок, как указано выше, который включает экспрессирующую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вышеописанный слитый белок, или ДНК-вектор, как описано выше.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, предлагается способ получения нецитотоксического агента, который включает:
a. приготовление раствора, содержащего одноцепочечный полипептид слитый белок по настоящему изобретению;
b. добавление к указанному раствору первой протеазы, способной расщеплять первый участок протеолитического расщепления, и второй протеазы, способной расщеплять второй участок протеолитического расщепления;
c. расщепление первого участка протеолитического расщепления и второго участка протеолитического расщепления;
тем самым образуется трехцепочечный гибридный белок.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения первую протеазу и вторую протеазу добавляют последовательно. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения вторую протеазу добавляют перед первой протеазой. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения первую протеазу и вторую протеазу добавляют одновременно.
В соответствии с указанным аспектом предлагается трехцепочечный полипептид. Более подробно, полученный трехцепочечный полипептид, как правило, имеет конструкцию, в которой:
a. первая цепь включает нецитотоксическую протеазу или ее фрагмент, при этом протеаза или фрагмент протеазы способны расщеплять белок по экзоцитозному пути клетки-мишени;
b. вторая цепь включает домен транслокации, который способен перемещать протеазу или фрагмент протеазы из эндосомы через мембрану эндосомы в цитозоль клетки-мишени;
c. третья цепь содержит нацеливающего фрагмент, который способен связываться с участком связывания на клетке-мишени, при этом участок связывания способен подвергаться эндоцитозу с тем, чтобы быть включенным в эндосому в клетке-мишени;
d. первая и вторая цепь соединены друг с другом дисульфидной связью, а второй и третий домены связаны между собой непептидной ковалентной связью.
Доставка полипептида
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается одноцепочечный полипептид слитый белок, как указано выше, или нецитотоксический полипептид, как указано выше, для применения, с целью лечения, предотвращения или снижения интенсивности симптомов заболевания.
В процессе применения в настоящем изобретении используют фармацевтическую композицию, содержащую полипептид вместе, по меньшей мере, с одним компонентом, выбранным из фармацевтически приемлемого носителя, наполнителя, вспомогательного лечебного средства, газа-вытеснителя и/или соли.
Полипептиды по настоящему изобретению могут быть приготовлены для перорального, парентерального введения, непрерывного вливания, имплантации, ингаляции или для местного нанесения. Композиции, пригодные для инъекции, могут быть приготовлены в форме растворов, суспензий или эмульсий, или в форме сухих порошков, которые перед применением растворяют или суспендируют в подходящем носителе.
Средство для местной доставки может включать аэрозоль или другой спрей (например, распылитель). В связи с этим аэрозольные препараты обеспечивают доставку полипептида в легкие и/или другие дыхательные пути носоглотки и/или бронхов. Предпочтительный путь введения выбран из: системного (например, внутривенного), лапароскопического и/или в виде локализованной инъекции (например, транс-сфеноидальной инъекции непосредственно в клетку-мишень, такую как опухоль).
Препараты для инъекций необязательно включают фармацевтически активные вещества, помогающие удерживать полипептид или замедлять удаление полипептида из места введения. Одним из примеров подобного фармацевтически активного вещества является средство для сужения кровеносных сосудов, такое как адреналин. Преимущество подобного состава заключается в том, что он увеличивает время пребывания полипептида после его введения и тем самым повышает и/или усиливает его эффективность.
Диапазоны доз для введения полипептидов по настоящему изобретению таковы, чтобы получить желаемый терапевтический эффект. Должно быть понятно, что диапазон требуемой дозировки зависит от конкретного типа полипептида или композиции, способа введения, типа лекарственной формы, возраста пациента, вида, степени тяжести и трудности вылечивания состояния пациента, противопоказаний, если таковые имеются, и от решения лечащего врача. Вариации указанных доз можно подбирать путем стандартных эмпирических процедур оптимизации.
Подходящие суточные дозы (на кг массы пациента) находятся в диапазоне 0,0001-1 мг/кг, предпочтительно, 0,0001-0,5 мг/кг, более предпочтительно, 0,002-0,5 мг/кг и, наиболее предпочтительно, 0,004-0,5 мг/кг. Стандартные дозы могут меняться от менее чем 1 мкг до 30 мг, но обычно доза меняется в диапазоне от 0,01 до 1 мг, и ее можно вводить ежедневно или, предпочтительно, менее часто, например, раз в неделю или раз в шесть месяцев. Наиболее предпочтительный режим дозирования составляет 2,5 нг полипептида в качестве 1X дозы. В соответствии с этим, предпочтительные дозы находятся в диапазоне 1X-100X (т.е. 2,5-250 нг).
Жидкие дозировочные формы обычно готовят с использованием полипептида и апирогенного стерильного носителя. В зависимости от используемого носителя и используемой концентрации, полипептид может быть либо растворен, либо суспендирован в носителе. При получении растворов полипептид может быть растворен в носителе, при этом раствор при необходимости делают изотоническим путем добавления хлорида натрия и перед заполнением в подходящие стерильные виалы или ампулы и герметизации стерилизуют фильтрацией через стерильный фильтр с использованием асептических методов. В качестве альтернативы, если стабильность раствора достаточна, раствор в герметичных контейнерах можно стерилизовать в автоклаве. Предпочтительно, в носителе могут быть растворены добавки, такие как буферные добавки, солюбилизаторы, стабилизаторы, консерванты или бактерицидные вещества, суспендирующие или эмульгирующие агенты и или местные анестезирующие средства.
Сухие порошки, которые перед применением растворяют или суспендируют в подходящем носителе, могут быть получены путем заполнения предварительно стерилизованных ингредиентов в стерильный контейнер в стерильной зоне с использованием асептических методов. В качестве альтернативы, ингредиенты могут быть растворены в подходящих контейнерах с помощью асептической техники в стерильной зоне. Затем продукт сушат путем сублимационной сушки, и контейнеры запечатывают в асептических условиях.
Парентеральные суспензии, пригодные для внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекции, получают практически таким же образом, за исключением того, что стерильные компоненты не растворяют, а суспендируют в стерильном носителе, и стерилизацию нельзя осуществить путем фильтрации. Компоненты могут быть выделены в стерильном состоянии или же их можно стерилизовать после выделения, например, с помощью гамма-облучения.
В композицию для облегчения равномерного распределение компонентов, предпочтительно, включают суспендирующий агент, например, поливинилпирролидон.
Раздел определений
Нацеливающий фрагмент (TM) означает любую химическую структуру, которая функционально взаимодействует с участком связывания с тем, чтобы вызвать физическое связывание полипептида по настоящему изобретению с поверхностью клетки-мишени. Термин TM охватывает любую молекулу (например, естественную молекулу или ее химически/физически модифицированный вариант), которая способна к связыванию с участком связывания на клетке-мишени, при этом участок связывания способен к интернализации (например, образованию эндосомы), что называют также эндоцитозом, опосредованным рецептором. TM может обладать функцией транслокации эндосомной мембраны, и в таком случае отдельные компоненты TM и домена транслокации необязательно могут присутствовать в агенте по настоящему изобретению. Выше в данном описании были приведены конкретные TMs. Ссылка на указанные TMs является просто примером, и настоящее изобретение охватывает все их варианты и производные, которые сохраняют основную связывающую способность (т.е. нацеливание) приведенных примеров TMs.
Как указано ранее, предпочтительные TMs включают антитела (например, фрагменты антител), а также связующие каркасные соединения, в частности, коммерчески доступные антитела/фрагменты и каркасные соединения, разработанные с целью связывания (в частности, специфического связывания) с клетками-мишенями.
Каркасные белковые структуры являются новым поколением универсальных связывающих структур в дополнение к расширяющемуся иммунному репертуару терапевтических моноклональных антител и их производных, таких как scFvs, молекул Fab, dAbs (однодоменные антитела), камелиды, диантела и миниантитела, каждое из которых может быть использовано в качестве ТМ по настоящему изобретению. Каркасные системы создают или изменяют известные домены распознавания белков либо путем создание новых связующих структур, либо путем модификации известных доменов связывания белков. Подобные связующие соединения включают, однако этим не ограничиваясь:
(i) структуры на основе белка A - белки-миметики антител (Nord, K. et al. 1997 "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain", Nat. Biotechnol. 15, 772-777);
(ii) структуры на основе липокалина - антикалины (Skerra, 2008 "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities", FEBS J. 275:2677-83);
(iii) структуры на основе фибронектина - аднектин (Dineen et al., 2008 "The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer", BMC Cancer 8:352);
(iv) авидные мультимеры (Silverman et al., 2005 "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains", Nat. Biotechnol. 23:1556-61);
(v) структуры на основе анкирина - дарпины (Zahnd et al., 2006 "Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins", J. Biol. Chem. 281 :35167-75); и
(vi) сентириновые структуры - на основе укладки белка, который обладает значительной структурной гомологией с имеющими петли доменами Ig, которые аналогичны CDRs. Домены Ig являются общим модулем в белках человека и находят широкое применение в качестве альтернативных каркасных белков. Каждая из приведенных выше публикаций, посвященных "каркасам", включена (во всей полноте) в данное описание посредством ссылки.
Структурные связующие соединения могут использоваться для нацеливания конкретных типов клеток посредством взаимодействия с конкретными белками на клеточной поверхности, рецепторами или другими эпитопами поверхности клетки, такими как группы сахаров. Подобные модифицированные структуры могут быть сконструированы из полипептидов на основе рекомбинантной нецитотоксической протеазы по настоящему изобретению.
6
-1
7
-1
8
-1
9
-1
ТМ по настоящему изобретению связывается (предпочтительно, специфически связывается) с представляющей интерес клеткой-мишенью. Термин "специфически связывается", преимущественно, означает, что данный ТМ связывается с клеткой-мишенью с аффинностью связывания (Ka), равной 10 М или больше, предпочтительно, 10 М или больше, более предпочтительно, 10 М или больше, и, наиболее предпочтительно, 10 М или больше.
Ссылка на TM в настоящем описании охватывает его фрагменты и варианты, которые сохраняют способность связываться с представляющей интерес клеткой-мишенью. В качестве примера, вариант может обладать, по меньшей мере, 80%-ной, предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ной, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ной и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 97%-ной или, по меньшей мере, 99%-ной гомологией аминокислотной последовательности по отношению к эталонной последовательности TM. Так, вариант может включать один или несколько аналогов аминокислоты (например, искусственной аминокислоты) или замещенную связь. Кроме того, в качестве примера, термин фрагмент, когда его используют в связи с TM, означает пептид, включающий, по крайней мере, десять, предпочтительно, по меньшей мере, двадцать, более предпочтительно, по меньшей мере, тридцать, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, сорок аминокислотных остатков эталонной TM. Термин фрагмент также относится к вышеуказанным вариантам. Так, в качестве примера, фрагмент по настоящему изобретению может содержать пептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 10, 20, 30 или 40 аминокислот, в котором пептидная последовательность обладает, по меньшей мере, 80%-ной гомологией по отношению к соответствующей (смежной) аминокислотной последовательности эталонного пептида.
Легко подтвердить, что МТ связывается с выбранной клеткой-мишенью. Например, может быть использован простой эксперимент по радиоактивному смещению, при котором на ткани или клетки, принадлежащие представляющей интерес клетке-мишени, действуют меченным (например, содержащим метку трития) ТМ в присутствии избытка немеченого TM. Подобный эксперимент позволяет оценить относительные пропорции неспецифического и специфического связывания и тем самым позволяет подтвердить, что ТМ связывается с клеткой-мишенью. Указанный анализ необязательно может включать один или несколько антагонистов связывания, а также анализ может включать наблюдение за потерей TM-связывания. Примеры экспериментов данного типа можно найти в документе Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, в Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.
В контексте настоящего изобретения термин пептид TM охватывает его пептидные аналоги, при условии, что аналог связывается с тем же рецептором, что и соответствующий "эталонный" TM. Указанные аналоги могут включать синтетические остатки, такие как:
β-Nal = β-нафтилаланин
β-Pal = β-пиридилаланин
hArg(Bu) = N-гуанидино-(бутил)гомоаргинин
2
hArg(Et) = N,N'-гуанидино-(диметил)гомоаргинин
2
3
2
hArg(CHCF) = N,N-гуанидино-бис-(2,2,2-трифторэтил)гомоаргинин
3
hArg(CH, гексил) = N,N-гуанидино-(метил, гексил)-гомоаргинин
e
Lys(Me) = N-метиллизин
e
Lys(iPr) = N-изопропиллизин
AmPhe = аминометилфенилаланин
AChxAla = аминоциклогексилаланин
Abu= α-аминомасляная кислота
Тро = 4-тиапролин
MeLeu = N-метиллейцин
Orn = орнитин
Nle = норлейцин
Nva = норвалин
Trp(Br) = 5-бром-триптофан
Trp(F) = 5-фтор-триптофан
2
Trp(NO) = 5-нитро-триптофан
Gaba = γ-аминомасляной кислоты
Bmp = J-меркаптопропионил
Ас = ацетил
Pen = пенциламин
CC
CC
C
C
C
C
В полипептидах по настоящему изобретению может отсутствовать функциональный домен H или H клостридиального нейротоксина. Соответственно, указанные полипептиды не способны связывать синаптосомальные мембраны крысы (посредством клостридиального компонента H) в анализах на связывания, как описано в Shone et al. (1985) Euro. J. Biochem. 151, 75-82. В одном варианте осуществления настоящего изобретения в полипептидах отсутствуют последние 50 С-концевых аминокислотных остатка голотоксина клостридиального нейротоксина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения в полипептидах отсутствуют последние 100, 150, 200, 250, 300 или С-концевых аминокислотных остатков голотоксина клостридиального нейротоксина. В качестве альтернативы, активность связывания H может быть сведена на нет/снижена путем мутагенеза - в качестве примера, если для удобства сослаться на BoNT/A, модификация виде мутаций одного или двух аминокислотных остатков (W1266 для L и Y1267 для F) в ганглиозидном кармане связывания вызывает потерю участком H своей функции связывания с рецептором. Аналогичные мутации могут быть проведены для несеротипных A компонентов клостридиального пептида, например, конструкция на основе ботулинического B с мутациями (W1262 для L и Y1263 к F) или ботулинического E (W1224 для L и Y1225 к F). Другие мутации в активном центре позволяют добиться той же убыли активности связывания рецептора H, например, Y1267S в ботулиническом токсине типа А и соответствующем высоко консервативном остатке в других клостридиальных нейротоксинах. Подробности указанной и других мутаций описаны в публикации Rummel et al., (2004) (Molecular Microbiol 51: 631-634), которая включена в настоящее описание посредством ссылки.
C
CN
CC
CC
c
CC
CC
Пептид H нативного клостридиального нейротоксина содержит приблизительно 400-440 аминокислотных остатков и состоит из двух функционально различных доменов приблизительно по 25 кДа каждый, а именно, N-концевой области (обычно называемой пептидом или доменом H) и С-концевой области (обычно называемой пептидом или доменом H). Кроме того, документально установлено, что С-концевая область (H), которая представляет собой С-концевые 160-200 аминокислотных остатков, ответственна за связывание клостридиального нейротоксина со своими естественными клеточными рецепторами, а именно, нервными окончаниями нервно-мышечного синапса. Таким образом, ссылка в данном описании на клостридиальную тяжелую цепь, в которой отсутствует функциональный пептид (или домен) H тяжелой цепи, так что тяжелая цепь теряет способность связываться с рецепторами на клеточной поверхности, с которыми связывается нативный клостридиальный нейротоксин, означает, что в клостридиальной тяжелой цепи просто отсутствует функциональный пептид H. Другими словами, область пептида H либо частично, либо полностью удалена или иным образом изменена (например, путем обычного химического или протеолитического воздействия), с целью инактивировать его нативную связывающую способность к нервным окончаниям в нервно-мышечном синапсе.
N
CC
C
N
N
CC
C
N
N
CC
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения в клостридиальном пептиде H по настоящему изобретению отсутствует часть С-концевой порции пептида (H) клостридиального нейротоксина, и, следовательно, отсутствует функция связывания H нативного клостридиального нейротоксина. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, в расширенном по С-концу клостридиальном пептиде H отсутствует 40 С-концевых аминокислотных остатков, или 60 С-концевых аминокислотных остатков, или 80 С-концевых аминокислотных остатков, или 100 C-концевых аминокислотных остатков, или 120 С-концевых аминокислотных остатков, или 140 С-концевых аминокислотных остатков, или 150 С-концевых аминокислотных остатков, или 160 С-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи клостридиального нейротоксина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения в клостридиальном пептиде H по настоящему изобретению полностью отсутствует часть С-концевого пептида (H) клостридиального нейротоксина и, таким образом, отсутствует функция связывания H нативного клостридиального нейротоксина. В качестве примера, в одном варианте осуществления настоящего изобретения в клостридиальном пептиде H отсутствует 165 С-концевых аминокислотных остатков, или 170 С-концевых аминокислотных остатков, или 175 С-концевых аминокислотных остатков, или 180 С-концевых аминокислотных остатков, или 185 С-концевых аминокислотных остатков, или 190 С-концевых аминокислотных остатков, или 195 С-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи клостридиального нейротоксина. В качестве другого примера, в клостридиальном пептиде H по настоящему изобретению отсутствует опорная последовательность клостридиального H, выбранная из группы, которая включает:
Ботулинический нейротоксин типа А -
аминокислотные остатки (Y1111-L1296)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки (Y1098-E1291)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки
(Y1112-E1291)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки
(Y1099-E1276)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки (Y1086-K1252)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки (Y1106-E1274)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки (Y1106-E1297)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки (Y1128-D1315)
Вышеуказанные опорные последовательности следует рассматривать как ориентировочные, поскольку небольшие изменения могут произойти в соответствии с субсеротипами.
Протеазы по настоящему изобретению охватывают все нецитотоксические протеазы, которые способны расщеплять один или несколько белков по экзоцитозному пути в клетках эукариот. Протеаза по настоящему изобретению, преимущественно, представляет собой бактериальную протеазу (или ее фрагмент). Более предпочтительно, бактериальная протеаза выбрана из рода Clostridium или Neisseria/Streptococcus (например, клостридиальная L-цепь или IgA-протеаза нейсерии, предпочтительно, от N. gonorrhoeae или S. pneumoniae).
cat
m
Настоящее изобретение охватывает также вариантные нецитотоксические протеазы (т.е. варианты природных молекул протеаз), при условии, что вариант протеазы по-прежнему демонстрируют необходимую активность протеазы. В качестве примера, вариант может обладать, по меньшей мере, 70%-ной, предпочтительно, по меньшей мере, 80%-ной, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ной и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ной или, по меньшей мере, 98%-ной гомологией аминокислотной последовательности по отношению к эталонной последовательности протеазы. Таким образом, указанный термин "вариант" включает нецитотоксические протеазы, обладающие повышенной (или пониженной) активностью эндопептидазы - особо следует упомянуть здесь повышенное отношение K/K таких мутантов BoNT/A как Q161A, E54A и K165L, см. документ Ahmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s 10930-007-9118-8, который включен в данное описание посредством ссылки. Термин "фрагмент", когда его используют по отношению к протеазе, обычно означает пептид, имеющий, по крайней мере, 150, предпочтительно, по меньшей мере, 200, более предпочтительно, по меньшей мере, 250 и, наиболее предпочтительно, по крайней мере, 300 аминокислотных остатков эталонной протеазы. Как и для компонента "фрагмента" ТМ (см. выше), "фрагменты" протеазы по настоящему изобретению охватывают фрагменты вариантных протеаз на основе эталонной последовательности.
Протеаза по настоящему изобретению предпочтительно демонстрирует активность серин- или металлопротеазы (например, активность эндопептидазы). Протеазы, преимущественно, специфичны для белка SNARE (например, SNAP-25, синаптобревин/VAMP или синтаксин).
Особо следует упомянуть домены протеазы нейротоксинов, например, домены протеазы бактериальных нейротоксинов. Таким образом, настоящее изобретение охватывает применение доменов нейротоксинов, которые встречаются в природе, а также полученные рекомбинантными методами версии указанных природных нейротоксинов. Отдельные примеры нейротоксинов продуцируются клостридиями, а термин клостридиальный нейротоксин охватывает нейротоксины, которые продуцируют S. tetani (TeNT) и серотипы A-G C. botulinum (BoNT), а также близкие родственные BoNT-подобные нейротоксины, которые продуцируют C. baratii и C. butyricum. Вышеуказанные сокращения используются по всему настоящему описанию. Например, номенклатура BoNT/A обозначает источник нейротоксина как BoNT (серотип A).
C
N
BoNTs имеют общую структуру и представляют собой двухцепочечные белки размером ~150 кДа, которые состоят из тяжелой цепи (Н-цепи) размером ~100 кДа, ковалентно связанной одной дисульфидной связью с легкой цепью (L-цепью) размером ~50 кДа. Н-цепь состоит из двух доменов, каждый размером ~50 кДа. Для связывания с высоким сродством с нейронами требуется С-концевой домен (H), тогда как N-концевой домен (H) предназначен для участия в мембранной транслокации. L-цепь представляет собой цинк-зависимую металлопротеазу, ответственную за расщепление субстратных белков SNARE.
Термин "фрагмент L-цепи" означает компонент L-цепи нейротоксина, который демонстрирует активность металлопротеазы и способен протеолитически расщеплять везикулы и/или ассоциированную с белком цитоплазматическую мембрану, принимающую участие в клеточном экзоцитозе.
Примеры подходящих последовательностей протеаз (эталонных) включают:
Ботулинический нейротоксин типа А -
аминокислотные остатки(1-448)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки(1-440)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки(1-441)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки(1-445)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки(1-422)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки(1-439)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки(1-441)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки(1-457)
IgA-протеаза -
аминокислотных остатков (1-959)*
* Документ Pohlner, J. et al. (1987) Nature 325, pp. 458-462; включен в настоящее описание посредством ссылки.
Указанную выше эталонную последовательность следует рассматривать как справочную, поскольку небольшие изменения могут произойти в соответствии с субсеротипами. В качестве примера, в документе US 2007/0166332 (включен в настоящее описание посредством ссылки) приведены несколько отличающиеся клостридиальные последовательности:
Ботулинический нейротоксин типа А -
аминокислотные остатки (M1-K448)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки(M 1-K441)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки(M 1-K449)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки (M1-R445)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки(M 1-R422)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки(M 1-K439)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки(M 1-K446)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки(M-1 A457)
Множество фрагментов клостридиального токсина, содержащего легкую цепь, могут быть пригодны для использования в аспектах настоящего изобретения, при условии, что фрагменты указанной легкой цепи способны специфично нацеливать основные компоненты аппарата высвобождения нейротрансмиттеров и тем самым участвовать в осуществлении общего клеточного механизма, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Легкие цепи клостридиального токсина имеют приблизительно 420-460 аминокислот в длину и включают ферментативный домен. Исследования показали, что вся длина легкой цепи клостридиального токсина не является необходимой для ферментативной активности ферментативного домена. В качестве не ограничивающего примера, первые восемь аминокислот из легкой цепи BoNT/A не требуются для ферментативной активности. В другом не ограничивающем примере, первые восемь аминокислот легкой цепи TeNT не требуются для ферментативной активности. Аналогично, карбоксильный конец легкой цепи не является необходимым для активности. В качестве не ограничивающего настоящее изобретение примера, последние 32 аминокислоты легкой цепи BoNT/A (остатки 417-448) не требуются для ферментативной активности. В другом неограничивающем примере последние 31 аминокислота легкой цепи TeNT (остатки 427-457) не требуются для ферментативной активности. Таким образом, аспекты данного варианта осуществления настоящего изобретения могут включать легкие цепи клостридиального токсина, содержащие ферментативный домен, который имеет длину, например, по крайней мере, 350 аминокислот, по крайней мере, 375 аминокислот, по крайней мере, 400 аминокислот, по крайней мере, 425 аминокислот и, по крайней мере, 450 аминокислот. Другие аспекты данного варианта осуществления настоящего изобретения могут включать легкие цепи клостридиального токсина, содержащие ферментативный домен, который имеет длину, например, не более 350 аминокислот, не более 375 аминокислот, не более 400 аминокислот, не более 425 аминокислот и не более 450 аминокислот.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения нецитотоксическая протеаза расщепляет отличный от нейронного белок SNARE, такой как белок SNAP-23. В одном варианте осуществления настоящего изобретения нецитотоксическая протеаза представляет собой модифицированную L-цепь ботулинического токсина, способную расщеплять SNAP-23. Пример подобной модифицированной L-цепи описан в документе Chen and Barbieri, PNAS, vol. 106, no. 23, p. 9180-9184, 2009.
1
В одном варианте осуществления настоящего изобретения нецитотоксической протеазой является протеаза BoNT/A, BoNT/C или BoNT/E, а предпочтительным фрагментом SNARE является фрагмент SNAP (в частности, SNAP-25). В другом варианте осуществления настоящего изобретения нецитотоксической протеазой является протеаза BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F или BoNT/G или протеаза столбнячного нейротоксина (TeNT), а предпочтительным фрагментом SNARE является фрагмент VAMP. В другом варианте осуществления настоящего изобретения нецитотоксической протеазой является протеаза BoNT/C, а предпочтительным фрагментом SNARE является фрагмент синтаксина.
Полипептиды по настоящему изобретению, в частности, их компонент протеазы, может быть пегилирован - это может помочь увеличить стабильность, например продолжительность действия компонента протеазы. Пегилирование особенно предпочтительно в том случае, когда протеаза представляет собой протеазу BoNT/A, В или С. Пегилирование, преимущественно, включает добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ) к N-концу компонента протеазы. Например, N-конец протеазы может быть расширен с помощью одного или нескольких аминокислотных остатков (например, цистеина), которые могут быть одинаковыми или разными. Один или несколько из указанных аминокислотных остатков могут сами иметь присоединенные молекулы ПЭГ (например, ковалентно присоединенные). Пример подобной технологии описан в документе WO 2007/104567, который во всей своей полноте включен в данное описание посредством ссылки.
Домен транслокации представляет собой молекулу, которая способствует перемещению протеазы в клетку-мишень таким образом, что функциональная экспрессия активности протеазы происходит внутри цитозоли клетки-мишени. Обладает ли какая-либо молекула (например, белок или пептид) необходимой функцией транслокации по настоящему изобретению, может быть подтверждено любым из целого ряда обычных анализов.
+
Например, Shone C. (1987) описывает анализ in vitro с использованием липосом, в которые вводят тестируемые молекулы. Наличие необходимой функции транслокации подтверждается освобождением из липосом К и/или меченого NAD, что может быть легко проконтролировано [см. Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180]. Еще один пример предложен Blaustein R. (1987), который описывает простой in vitro анализ с использованием планарных двухслойных фосфолипидных мембран. В мембраны вводят тестируемые молекулы, и необходимые функции транслокации подтверждают по увеличению проводимости через указанные мембраны [см. Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120]. Дополнительные методики для проведения оценки слияния мембран и, таким образом, идентификации домена транслокации, которые пригодны для использования по настоящему изобретению, предложены в Methods in Enzymology Vol. 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993.
N
Настоящее изобретение также охватывает варианты доменов транслокации, при условии, что варианты доменов по-прежнему демонстрируют необходимую транслокационную активность. В качестве примера, вариант может обладать, по меньшей мере, 70%-ной, предпочтительно, по меньшей мере, 80%-ной, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ной и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ной или, по меньшей мере, 98%-ной гомологией аминокислотной последовательности по отношению к эталонному домену транслокации. Термин "фрагмент", когда его используют для домена транслокации, означает пептид, содержащий, по меньшей мере, 20, предпочтительно, по меньшей мере, 40, более предпочтительно, по меньшей мере, 80, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100 аминокислотных остатков эталонного домена транслокации. В случае клостридиального домена транслокации, фрагмент предпочтительно, содержит, по крайней мере, 100, предпочтительно, по крайней мере, 150, более предпочтительно, по крайней мере, 200, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, 250 аминокислотных остатков эталонного домена транслокации (например, домена H). Как и для компонента "фрагмента" ТМ (см. выше), "фрагменты" транслокации по настоящему изобретению охватывают фрагменты вариантов доменов транслокации на основе эталонных последовательностей.
Документально подтверждено, что определенные домены молекул бактериальных токсинов способны образовывать подобные поры. Кроме того, известно, что некоторые домены транслокации вирусно экспрессированных белков слияния мембран способны образовывать подобные поры. Подобные домены могут быть использованы в настоящем изобретении.
N
N
C
C
CC
C
Домен транслокации может иметь клостридиальное происхождение, например, домен H (или его функциональный компонент). H означает часть или фрагмент Н-цепи клостридиального нейротоксина, приблизительно эквивалентный амино-концевой половине H-цепи, или домен, соответствующий указанному фрагменту в нетронутой H-цепи. В связи с этим, если будет необходимо удалить H-функцию связывания клетки, это можно осуществить путем делеции аминокислотной последовательности H или H (либо на уровне синтеза ДНК, либо после синтеза действием нуклеазы или протеазы). В качестве альтернативы, H-функцию можно инактивировать действием химических или биологических агентов.
Примеры подходящих (эталонных) доменов транслокации включают:
Ботулинический нейротоксин типа А -
аминокислотные остатки (449-871)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки (441-858)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки (442-866)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки (446-862)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки (423-845)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки (440-864)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки (442-863)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки (458-879)
Указанные выше эталонные последовательности следует рассматривать как справочные, поскольку небольшие изменения могут произойти в соответствии с субсеротипами. В качестве примера, в US2007/0166332 (включен в данное описание посредством ссылки) приведены несколько отличные клостридиальные последовательности:
Ботулинический нейротоксин типа А -
аминокислотные остатки (A449-K871)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки (A442-S858)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки (T450-N866)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки (D446-N862)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки (K423-K845)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки (A440-K864)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки (S447-S863)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки (S458-V879)
N
N
N
N
N
В контексте настоящего изобретения различные H области клостридиального токсина, содержащие домен транслокации, могут быть пригодны в аспектах настоящего изобретения при условии, что указанные активные фрагменты могут способствовать освобождению нецитотоксические протеазы (например, клостридиальной L-цепи) из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени и, таким образом, участвовать в осуществлении общего клеточного механизма, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. H области тяжелых цепей клостридильных токсинов имеют длину приблизительно 410-430 аминокислот и включают домен транслокации. Исследования показали, что вся длина H области тяжелой цепи клостридильного токсина не обязательна для транслокационной активности домена транслокации. Таким образом, аспекты данного варианта осуществления настоящего изобретения могут включать области H клостридиального токсин, содержащие домен транслокации, который имеют длину, например, по крайней мере, 350 аминокислот, по крайней мере, 375 аминокислот, по крайней мере, 400 аминокислот и, по крайней мере, 425 аминокислот. Другие аспекты данного варианта осуществления настоящего изобретения могут включать H области клостридиального токсина, содержащие домен транслокации, который имеет длину, например, не более 350 аминокислот, не более 375 аминокислот, не более 400 аминокислот и не более 425 аминокислот.
N
N
N
N
За более подробной информацией о генетических основах продуцирования токсина в Clostridium botulinum и C. tetani авторы настоящего изобретения отсылают к Henderson et al (1997) in The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press. Термин H охватывает природные H области нейротоксина и модифицированные H области, содержащие аминокислотные последовательности, которые не встречаются в природе, и/или синтетические аминокислотные остатки, при условии, что модифицированные H области по-прежнему демонстрируют вышеуказанные функции транслокации.
В качестве альтернативы, домен транслокации может иметь неклостридиальное происхождение. Примеры домена транслокации (ссылочный материал) неклостридиального происхождения включают, однако этим не ограничиваясь, домен транслокации токсина дифтерии [O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; и London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51], домен транслокации экзотоксина типа A из Pseudomonas [Prior et al., Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], домены транслокации токсина сибирской язвы [Blanke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], различные способные к слиянию или гидрофобные пептиды с транслокационными функциями [Plank et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; и Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938] и амфифильные пептиды [Murata et al. (1992) Biochem, 31, pp.1986-1992]. Домен транслокации может быть зеркальным отображением домена транслокации, имеющегося в природном белке, или может включать вариации аминокислот, при условии, что вариации не разрушают транслокационную способность домена транслокации.
Конкретные примеры вирусных (ссылочный материал) доменов транслокации, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают определенные области транслокации экспрессируемых вирусами мембранных слитых белков. Например, Wagner et al. (1992) и Murata et al. (1992) описывают транслокационную функцию (в частности, слияние мембран и везикуляцию) ряда фузогенных и амфифильных пептидов, полученных из N-концевой области гемагглютинина вируса гриппа. Другие экспрессируемые вирусами мембранные слитые белки, для которых известно, что они обладают требуемой транслокационной активностью, представляют собой домен транслокации способного к слиянию пептида вируса леса Семлики (SFV), домен транслокации гликопротеина G вируса везикулярного стоматита (VSV), домен транслокации белка F вируса SER и домен транслокации гликопротеина оболочки пенящего вируса. Кодируемые вирусом белки Aspike находят конкретное применение в контексте настоящего изобретения, например, белок E1 из SFV и белок G из VSV.
Использование (ссылочный материал) доменов транслокации включает использование последовательности их вариантов. Вариант может содержать одну или несколько консервативных замен нуклеиновой кислоты и/или делеций нуклеиновой кислоты или вставок при условии, что вариант обладает необходимой транслокацинной функцией. Вариант может также содержать одну или несколько замен аминокислоты и/или делеций аминокислоты или вставок, при условии, что вариант обладает необходимой транслокацинной функцией.
Полипептиды по настоящему изобретению могут дополнительно содержать домен, облегчающий транслокацию. Указанный домен облегчает доставку нецитотоксической протеазы в цитозоль клетки-мишени, и указанные домены описаны, например, в документах WO 08/008803 и WO 08/008805, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.
В качестве примера, пригодные облегчающие транслокацию домены включают домен способного к слиянию пептида оболочечного вируса, например, пригодные домены способных к слиянию пептидов включают домен способного к слиянию пептида гриппа (в частности, домен способного к слиянию пептида вируса гриппа А, состоящий из 23 аминокислот), домен способного к слиянию пептида альфавируса (например, домен способного к слиянию пептида вируса леса Семлики, состоящий из 26 аминокислот), домен способного к слиянию пептида везикуловируса (например, домен способного к слиянию пептида вируса везикулярного стоматита, состоящий из 21 аминокислот), домен способного к слиянию пептида респировируса (например, домен способного к слиянию пептида вируса Сендай, состоящий из 25 аминокислот), домен способного к слиянию пептида вируса кори (например, домен способного к слиянию пептида вируса собачьей чумы, состоящий из 25 аминокислот), домен способного к слиянию пептида авулавируса (например, домен способного к слиянию пептида вируса болезни Ньюкасла, состоящий из 25 аминокислот), домен способного к слиянию пептида хенинавируса (например, домен способного к слиянию пептида вируса Хендра, состоящий из 25 аминокислот), домен способного к слиянию пептида метапневмовируса (например, домен способного к слиянию пептида метапневмовируса человека, состоящий из 25 аминокислот) или домен способного к слиянию пептида спумавируса, такой как домен способного к слиянию пептида пенящего вируса обезьян, или их фрагменты или варианты.
CN
CN
CN
В качестве еще одного примера, облегчающий транслокацию домен может представлять собой домен H клостридиального токсина или его фрагмент или вариант. Более конкретно, облегчающий транслокацию домен H клостридиального токсина может иметь длину, по крайней мере, 200 аминокислот, по крайней мере, 225 аминокислот, по крайней мере, 250 аминокислот, по крайней мере, 275 аминокислот. В связи с этим облегчающий транслокацию домен H клостридиального токсина предпочтительно имеет длину не более 200 аминокислот, не более 225 аминокислот, не более 250 аминокислот или не более 275 аминокислот. Конкретные примеры (ссылочный материал) включают:
Ботулинический нейротоксин типа А -
аминокислотные остатки (872-1110)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки (859-1097)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки (867-1111)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки (863-1098)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки (846-1085)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки (865-1105)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки (864-1105)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки (880-1127)
CN
Расположения приведенных выше последовательностей могут несколько варьировать в зависимости от серотипа/подтипа, и другие примеры подходящих (ссылочный материал) доменов H клостридиального токсина включают:
Ботулинический нейротоксин типа А -
аминокислотные остатки (874-1110)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки (861-1097)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки (869-1111)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки (865-1098)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки (848-1085)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки (867-1105)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки (866-1105)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки (882-1127)
CN
CN
Любой из вышеописанных облегчающих транслокацию доменов может быть объединен с любым из описанных выше пептидов домена транслокации, которые подходят для использования в настоящем изобретении. Так, в качестве примера, отличный от клостридиального облегчающий транслокацию домен может быть объединен с пептидом домена транслокации, отличным от клостридиального, или с пептидом клостридиального домена транслокации. В качестве альтернативы, облегчающий транслокацию домен H клостридиального токсина может быть объединен с пептидом домена транслокации, отличным от клостридиального. В качестве альтернативы, облегчающий транслокацию домен H клостридиального токсина может быть объединен с пептидом клостридиального домена транслокации, примеры которого включают:
Ботулинический нейротоксин типа A -
аминокислотные остатки (449-1110)
Ботулинический нейротоксин типа В -
аминокислотные остатки (442-1097)
Ботулинический нейротоксин типа С -
аминокислотные остатки (450-1111)
Ботулинический нейротоксин типа D -
аминокислотные остатки (446-1098)
Ботулинический нейротоксин типа Е -
аминокислотные остатки (423-1085)
Ботулинический нейротоксин типа F -
аминокислотные остатки (440-1105)
Ботулинический нейротоксин типа G -
аминокислотные остатки (447-1105)
Столбнячный нейротоксин -
аминокислотные остатки (458-1127)
Гомология последовательностей
Для определения процента идентичности может быть использован любой из различных методов выравнивания последовательностей, в том числе, без ограничения, глобальные методы, локальные методы и гибридные методы, такие как, например, методы сегментной аппроксимации. Методики определения процента идентичности являются стандартными процедурами для специалиста в данной области техники. Глобальные методы выравнивают последовательность от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание путем суммирования количества отдельных пар остатков и путем введения штрафов за пропуск в последовательности. Не ограничивающие данное изобретение методы включают, например, CLUSTAL W, см., в частности, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итерационное улучшение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Локальные методы выравнивают последовательности путем идентификации одного или нескольких консервативных фрагментов, которые являются общими для всех входных последовательностей. Не ограничивающие настоящее изобретение методы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); генерацию выборки по схеме Гиббса, см., например, C.E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, см., например, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004). Таким образом, процент идентичности последовательности определяют, используя стандартные методы. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Вкратце, две аминокислотные последовательности выравнивают, чтобы оптимизировать оценку выравнивания, используя штраф 10 за внесение делеции в выравнивание, штраф 1 за продолжение делеции и оценочную матрицу "blosum 62" из Henikoff and Henikoff.
В значительной степени гомологичные полипептиды характеризуются тем, что они имеют одну или несколько аминокислотных замен, делеций или добавлений. Эти изменения, предпочтительно, незначительны, т.е. представляют собой консервативные аминокислотные замены (см. ниже) и другие замены, которые не оказывают существенного влияния на укладку или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до приблизительно 30 аминокислот; и небольшие аминоконцевые или карбоксиконцевые удлинения, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид, содержащий приблизительно до 20-25 остатков, или аффинная метка.
Консервативные аминокислотные замены:
Основные:
аргинин; лизин; гистидин
Кислые:
глутаминовая кислота; аспарагиновая кислота
Полярные:
глутамин; аспарагин
Гидрофобные:
лейцин; изолейцин; валин
Ароматические:
фенилаланин; триптофан; тирозин
Небольшие:
глицин; аланин; серин; треонин; метионин
В дополнение к 20 стандартным аминокислотам в полипептидах по настоящему изобретению аминокислотные остатки могут быть заменены нестандартными аминокислотами (такими как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин). Ограниченное число неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, и синтетических аминокислот может замещать аминокислотные остатки клостридиального полипептида. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки.
Не встречающиеся в природе аминокислоты включают, без ограничений, транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидрокси-этилцистеин, гидроксиэтил-гомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области известно несколько способов включения в белки остатков не встречающихся в природе аминокислот. Например, могут быть использованы системы in vitro, где нонсенс-мутации подавляются с помощью химически аминоацилированных супрессоров тРНК. Способы синтеза аминокислот и способы аминоацилирования тРНК известны в данной области техники. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в свободной от клеток системе, содержащей экстракт S30 E. coli и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографически. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301. 1991 ; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах лягушки ксенопус путем микроинъекции мутированных мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). В третьем способе клетки E. coli культивируют в отсутствии природной аминокислоты, которая должна быть заменена (например, фенилаланина) и в присутствии нужной не встречающейся в природе аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланин). Не встречающуюся в природе аминокислоту включают в полипептид вместо ее природного аналога. См., Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Остатки встречающихся в природе аминокислот могут быть преобразованы в не встречающиеся в природе химические соединения путем химической модификации в условиях in vitro. Химическую модификацию можно комбинировать с сайт-направленным мутагенезом, с целью дальнейшего расширения диапазона замен (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).
Ограниченное число неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся в природе аминокислот и синтетических аминокислот могут заменять аминокислотные остатки в полипептидах по настоящему изобретению.
Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Участки биологического взаимодействия могут быть также определены путем физического анализа структуры, который проводят такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией предполагаемого участка контактирования аминокислот. См., например, de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Заключение об идентичности незаменимых аминокислот можно сделать на основании анализа гомологии с соответствующими компонентами (например, компонентом транслокации или компонентом протеазы) полипептидов по настоящему изобретению.
Множественные аминокислотные замены могут быть проведены и испытаны с помощью известных методов мутагенеза и скрининга, таких как описывают Reidhaar-Olson и Sauer (Science 241: 53-7, 1988) или Bowie и Sauer (Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Вкратце, указанные авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более позиций в полипептиде, отбора функционального полипептида и затем секвенирования подвергнутых мутагенезу полипептидов, с целью определения спектра допустимых замен для каждой позиции. Другие способы, которые можно использовать, включают фаговое отображение (например, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Патент США № 5223409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) и сегмент-направленный мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Множественные аминокислотные замены могут быть проведены и испытаны с помощью известных методов мутагенеза и скрининга, таких как описывают Reidhaar-Olson и Sauer (Science 241: 53-7, 1988) или Bowie и Sauer (Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Вкратце, указанные авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более позиций в полипептиде, отбора функционального полипептида и затем секвенирования подвергнутых мутагенезу полипептидов, с целью определения спектра допустимых замен для каждой позиции. Другие способы, которые можно использовать, включают фаговое отображение (например, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Патент США № 5223409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) и сегмент-направленный мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Краткое описание примеров
N
Пример 1. Разработка белка LHD, который включает полипептид GnRH на С-конце домена H.
N
Пример 2. Разработка белка LHA, который включает полипептид GnRH на С-конце домена H.
N
Пример 3. Разработка белка LHD, включающего полипептид GnRH на С-конце домена H, который содержит два различных участка распознавания протеазы.
N
Пример 4. Способ приготовления белка LHD, который включает полипептид GnRH на С-конце области H.
Пример 5. Демонстрация присутствия ковалентно присоединенного лиганда методом вестерн-блоттинга.
Пример 6. Демонстрация наличия ковалентно присоединенного TM методом масс-спектрометрии.
Пример 7. Оценка связывающей способности белка LHD, который включает полипептид GnRH.
Пример 8. Оценка in vitro функциональности белка LHD, который включает в себя полипептид GnRH.
N
Пример 9. Разработка белка LHD, который включает в себя динорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H.
N
Пример 10. Разработка белка LHA, который включает бета-эндорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H.
N
Пример 11. Разработка белка LHD, который включает в себя два полипептида GHRH на С-конце домена H.
N
Пример 12. Разработка белка LHD, который включает полипептид GnRH на С-конце домена H, разделенный 5 аминокислотами от второго участка активации протеазы.
N
Пример 13. Разработка белка LHA, который включает гастрин-высвобождающий пептид на С-конце домена H.
Пример 14. Способ лечения пациентов, страдающих от рака предстательной железы
Пример 15. Метод лечения пациентов, страдающих от нейрогенного воспаления.
Пример 16. Метод лечения пациентов, страдающих от эндометриоза
Краткое описание фигур
Фиг.1 иллюстрирует анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия активированных образцов (элюированных во фракциях 80 мМ + 250 мМ имидазола) из примера 4 в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.
Краткое описание последовательностей с идентификационными номерами (SEQ ID NOs)
Во всех следующих SEQ ID NOs может быть исключен любой начальный аминокислотный остаток метионина (или соответствующий кодон/последовательность N-концевой нуклеиновой кислоты).
SEQ ID 1. ДНК-последовательность LHD-GnRH
SEQ ID 2. Последовательность белка LHD-GnRH
SEQ ID 3. ДНК-последовательность LHA-GnRH
SEQ ID 4. Последовательность белка LHA-GnRH
SEQ ID 5. ДНК-последовательность LHD-GnRH с двумя разными участками протеазы
SEQ ID 6. Последовательность белка LHD-GnRH с двумя разными участками протеазы
N
SEQ ID 7. ДНК-последовательность LHD, которая включает динорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H
N
SEQ ID 8. Последовательность белка LHD, который включает динорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H
N
SEQ ID 9. ДНК-последовательность LHA, которая включает бета-эндорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H
N
SEQ ID 10. Последовательность белка LHA, который включает бета-эндорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H
N
SEQ ID 11. ДНК-последовательность LHD, которая включает два GHRH полипептида на С-конце домена H
N
SEQ ID 12. Последовательность белка LHD, который включает два GHRH полипептида на С-конце домена H
N
SEQ ID 13. ДНК-последовательность LHD, которая включает GnRH на С-конце домена H
N
SEQ ID 14. Последовательность белка LHD, который включает GnRH на С-конце домена H
N
SEQ ID 15 ДНК-последовательность LHA, которая включает гастрин-высвобождающий пептид на С-конце домена H
N
SEQ ID 16. Последовательности белка LHA, который включает гастрин-высвобождающий пептид на С-конце домена H
Далее приводится описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, которое поясняется примерами.
N
Пример 1. Разработка белка LHD, который включает полипептид GnRH на С-конце домена H
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/D и содержащего 10 аминокислот пептида GnRH, проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR). Поскольку таких цепочек не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы как для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, так и для расщепления пептидной связи между H и TM (GnRH).
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/D,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/D, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептидную последовательность IEGR на С-конце,
• содержащий 10 аминокислотных остатков пептид GnRH, который модифицирован таким образом, что он включает остаток Cys в позиции 6 вместо природного Gly (QHWSYCLRPG).
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 1, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 2.
N
Пример 2. Разработка белка LHA, который включает полипептид GnRH на С-конце домена H
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/A и содержащего 10 аминокислот пептида GnRH, проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR). Поскольку таких цепочек не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы как для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, так и для расщепления пептидной связи между H и TM (GnRH).
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/A,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/A, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептидную последовательность IEGR на С-конце,
• содержащий 10 аминокислотных остатков пептид GnRH, который модифицирован таким образом, что он включает остаток Cys в позиции 6 вместо природного Gly (QHWSYCLRPG).
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 3, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 4.
N
Пример 3. Разработка белка LHD, включающего полипептид GnRH на С-конце домена H, который содержит два различных участка распознавания протеазы
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/D и содержащего 10 аминокислот пептида GnRH, проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR) и энтерокиназы (DDDDK). Поскольку такой цепочки не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, а энтерокиназы для расщепления пептидной связи между H и TM (GnRH).
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/D,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/D, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептидную последовательность DDDDK на С-конце,
• содержащий 10 аминокислотных остатков пептид GnRH, который модифицирован таким образом, что он включает остаток Cys в позиции 6 вместо природного Gly.
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 5, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 6.
N
Пример 4. Способ приготовления белка LHD, который включает полипептид GnRH на С-конце области H.
ORF, разработанный в примере 1, клонируют в вектор экспрессии E. coli, (вектор PET (Novagen), который модифицирован для обеспечения недостаточности мобилизации) и трансформируют в штамм-хозяин E. coli, как правило, BL21.
Экспрессию слитого белка LHD-GnRH осуществляют по следующей методике. Инокулируют 100 мл модифицированного TB, содержащего 0,2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина, в колбе емкостью 250 мл с помощью изолированной колонии штамма для экспрессии LHD-GnRH. Культуру выращивают при 37°С, 225 об/мин в течение 16 час. Инокулируют 2х1 л модифицированного TB, содержащего 0,2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина в колбе 2×2 л с помощью 10 мл выращенной в течение ночи культуры. Выращивают культуру при 37°С до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет значения приблизительно 0,5, после чего температуру снижают до 16°С. Через 1 час индуцируют культуры с помощью 1 мМ IPTG и выращивают при 16°С еще в течение 16 час. После центрифугирования культуры получают 35,2 г пасты из клеток.
Очистку продукта слияния LHD-GnRH проводят с помощью аффинной хроматографии. Более подробно, в пробирке фирмы Falcon, содержащей 25 мл 50 мМ HEPES с рН 7,2 и 200 мМ NaCl, размораживают приблизительно 10 г клеточной пасты штамма E. coli BL21. Проводят обработку ультразвуком клеточной массы на льду, подавая мощность на 30 сек и убирая мощность на 30 сек в течение 10 циклов при 22 мкм, следя за тем, чтобы образец оставался холодным. Вращают подвергнутые лизису клетки со скоростью 18000 об/мин при 4°С в течение 30 минут. Помещают жидкость над осадком в колонку HisTrap HP с хелатирующей фазой (достаточна колонка 5 мл), уравновешенную с помощью 50 мМ HEPES, рН 7,2 и 200 мМ NaCl. После добавления 40 мМ имидазола, с целью удалить путем промывки неспецифически связанный белок, слитый белок элюируют в ступенчатом градиенте 80 мМ имидазола, 250 мМ имидазола и 500 мМ имидазола. Проводят диализ элюированного слитого белка по отношению к 5 л 50 мМ HEPES, рН 7,2 и 200 мМ NaCl при 4°С в течение ночи и измеряют оптическую плотность подвергнутого диализу слитого белка. Добавляют 10 единиц фактора Ха на 1 мг слитого белка и инкубируют при 25°С в течение ночи в статических условиях. Помещают в колонку HisTrap HP с хелатирующей фазой (достаточна колонка 5 мл), уравновешенную с помощью 50 мМ HEPES, рН 7,2 и 200 мМ NaCl. Промывают колонку до базового значения с помощью 50 мМ HEPES рН 7,2 и 200 мМ NaCl. Используя ступенчатый градиент от 10 до 40 мМ имидазола, удаляют путем промывки неспецифически связанный белок и элюируют слитый белок с помощью 100 мМ имидазола. Проводят диализ элюированного слитого белка по отношению 5 л 25 мМ Tris, 200 мМ NaCl c рН 8,0 при 4°С в течение ночи и концентрируют продукт слияния приблизительно до 2 мг/мл, а аликвоту образца замораживают при температуре -20°С. Проверяют очищенный белок с помощью OD, BCA и анализа на чистоту.
Образцы активированного белка анализируют методом SDS-PAGE как в восстанавливающих, так и невосстанавливающих условиях. Анализируют образцы, элюированные фракциями 80 мМ и 250 мМ имидазола - см. фиг.1.
Пример 5. Демонстрация присутствия ковалентно присоединенного TM методом вестерн-блоттинга
Присутствие ТМ в слитом белке можно определить различными способами. Один способ заключается в использовании специфической антисыворотки к ТМ и визуализации с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Антитела к TM можно получить коммерчески (например, антитела анти-GnRH можно получить от компании Abcam (AB76560) или Novus Biologicals (H00002796-B01)), или можно специфически достроить до заданного пептидной последовательности в организации, предоставляющей коммерческие услуги.
N
С помощью подобных методов подтверждают, что GnRH присутствует в полноразмерном активированном белке слияния, когда проводят процесс в невосстанавливающих условиях, но не присутствует в домене H, когда проводят процесс в восстанавливающих условиях.
Пример 6. Демонстрация наличия ковалентно присоединенного TM методом масс-спектрометрии
Присутствие ТМ в слитом белке может быть определено различными способами. Один из способов является использование масс-спектрометрии для определения массы слитого белка до и после восстановления.
Используя белок, полученный в соответствии с примером 4, различные образцы невосстановленного и восстановленного белка экстрагируют из SDS-PAGE (см. фиг.1) и анализируют методом масс-спектрометрии (Intertek, Манчестер).
Предсказанная масса неактивированного, невосстановленного слитого белка составляет 105271 Да. Наблюдаемая масса образцов равна 105284 Да, разница составляет лишь 13 Да, что находится в пределах погрешности оборудования. Таким образом, присутствие не измененного GnRH в неактивированном, невосстановленном слитом белке подтверждено.
Невосстановленный образец
Теоретическая масса
Соответствующая структура
Наблюдаемая масса
Разница в массе
105271 Да
Полная длина
105284 Да
13 Да
Предсказанная масса активированного невосстановленного слитого белка равна 105271 Да. Наблюдаемой массы для образцов равна 105321 Да, разница составляет всего в 50 Да, что находится в пределах погрешности оборудования. Таким образом, присутствие не измененного GnRH в активированном, невосстановленном слитом белке подтверждено.
Невосстановленный образец
Теоретическая масса
Соответствующая структура
Наблюдаемая масса
Разница в массе
105271 Да
Полная длина
105321 Да
50 Да
N
N
N
N
N
Когда анализируют восстановленные образцы LC и домена H, то домен H (которая должна представлять собой H+спейсер+участок активации) имеет предсказанную массу 49419 Да и наблюдаемую масса 49421 Да. Указанное свидетельствует о том, что редуцированный домен H не сохраняет пептид GnRH. Данный результат полностью совпадает с предсказанным, поскольку протеолиз и восстановление дисульфидной связи высвобождает последовательность GnRH из С-конца домена H.
Восстановленный образец: масса субъединицы H<sub>N</sub>
Теоретическая масса
Соответствующая структура
Наблюдаемая масса
Разница в массе
49419 Да
Тяжелая цепь + спейсер + сайт активации
49421 Да
2 Да
N
N
Полученные данные показывают, что лиганд GnRH присоединен к слитому белку до активации и восстановления, прикрепляется к слитому белку после активации в отсутствие восстанавливающего агента, но исчезает из домена H после активации и восстановления. Сказанное подтверждает, что слитый белок правильно активирован по обоим участкам протеолитического расщепления и что лиганд GnRH присоединен к домену H посредством искусственно созданной дисульфидной связи.
Пример 7. Оценка связывающей способности белка LHD, который включает полипептид GnRH
Белок, полученный по примеру 4, исследуют на функциональность взаимодействия лиганд-рецептор с помощью одного из целого ряда пригодных анализов. Например, анализ связывания рецептора лиганда гонадотропин-высвобождающего гормона GnRHR, поставляемого компанией Cisbio Bioassays, представляет собой конкурентный анализ, с помощью которого количественно оценивают связывающую активность в образце (http://www.htrf.com/products/gpcr/binding/ligands/inserts/C1TT1GNRH.pdf). В качестве альтернативы, ряд общедоступных анализов связывания описан в научной литературе (например, Christopher E. Heise, Susan K. Sullivan and Paul D. Crowe, J. Biomol. Screen. 2007 12: 235; DOI: 10.1 177/1087057106297362). Применение подобных анализов указывает на то, что GnRH ТМ способен взаимодействовать с рецептором-мишенью.
Приведенные данные показывают, что GnRH ТМ способен взаимодействовать с рецептором-мишенью.
Пример 8. Оценка in vitro функциональности белка LHD, который включает в себя полипептид GnRH
Белок, полученный по примеру 4, анализируют на его способность расщеплять белки SNARE внутри клетки-мишени. Если коротко, то клеточную линию альфа-T3-1 (линия иммортализованных гонадотропных клеток), которая экспрессирует высокие уровни рецептора гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH), инкубируют с соединением по настоящему изобретению. Через 24 часа клеточный материал собирают, и белки SNARE анализируют по методу вестерн-блоттинга. Данные показывают, что слитый белок, содержащий GnRH ТМ, способен взаимодействовать с мишенью-рецептором, что приводит к интернализации и расщеплению внутриклеточных белков SNARE.
N
Пример 9. Разработка белка LHD, который включает в себя динорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H
N
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/D и пептидов динорфин и брадикинин, проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR). Поскольку такой цепочки не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы как для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, так и для расщепления пептидной связи между H и пептидом динорфин. Между пептидами динорфин и брадикинин конструируют спейсер из 11 аминокислот, включающий единственный Cys для облегчения образования дисульфидной связи с H.
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/D,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/D, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептидную последовательность IEGR на С-конце,
• содержащий 17 аминокислот пептид динорфин,
• 11 аминокислот Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
• содержащий 9 аминокислот пептид брадикинин.
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 7, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 8.
N
Пример 10. Разработка белка LHA, который включает бета-эндорфин и полипептид брадикинин на С-конце домена H
N
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/A и пептидов бета-эндорфин и брадикинин, проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR). Поскольку такой цепочки не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы как для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, так и для расщепления пептидной связи между H и пептидом бета-эндорфин. Между пептидами бета-эндорфин и брадикинин конструируют спейсер из 11 аминокислот, включающий единственный Cys для облегчения образования дисульфидной связи с H.
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/A,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/A, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептидную последовательность IEGR на С-конце,
• содержащий 31 аминокислоту пептид бета-эндорфин,
• 11 аминокислот Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,
• содержащий 9 аминокислот пептид брадикинин.
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 9, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 10.
N
Пример 11. Разработка белка LHD, который включает в себя два полипептида GHRH на С-конце домена H
N
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/D и двух пептидов GHRH, проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR). Поскольку такой цепочки не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы как для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, так и для расщепления пептидной связи между H и пептидом GHRH. Между двумя пептидами GHRH конструируют спейсер из 11 аминокислот, включающий единственный Cys для облегчения образования дисульфидной связи с H.
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/D,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/D, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептидную последовательность IEGR на С-конце,
• содержащий 40 аминокислот пептид GHRH,
• 11 аминокислот Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,
• содержащий 40 аминокислот пептид GHRH.
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 11, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 12.
N
Пример 12. Разработка белка LHD, который включает полипептид GnRH на С-конце домена H, разделенный 5 аминокислотами от второго участка активации протеазы
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/D и содержащего 10 аминокислот пептида GnRH, проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR). Поскольку таких цепочек не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы как для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, так и для расщепления пептидной связи между H и спейсером у N-конца TM (GnRH).
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/D,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/D, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ille-Glu-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептид IEGR
• содержащий 10 аминокислотных остатков пептид GnRH, который модифицирован таким образом, что он включает остаток Cys в позиции 6 вместо природного Gly (QHWSYCLRPG).
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 13, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 14.
N
Пример 13. Разработка белка LHA, который включает гастрин-высвобождающий пептид на С-конце домена H
N
N
N
Первичную последовательность химерного белка, сконструированного путем генетического слияния LH фрагмента BoNT/A и содержащего 27 гастрин-высвобождающего пептида (GRP), проверяют на наличие аминокислотных цепочек, которые имеют сходство с прототипным участком распознавания фактора Ха (IEGR). Поскольку таких цепочек не обнаружено, выбор сделан в пользу использования FXa в качестве протеазы как для активирования слитого белка по месту соединения LC-H, так и для расщепления пептидной связи между H и TM (GRP).
ДНК, оптимизированную для экспрессии E. coli, получают коммерчески от компании Entelechon (Германия), с целью кодирования слитого белка, который имеет следующую структуру от N-конца к С-концу:
• 10 His N-концевая метка очистки,
• спейсер из 10 остатков аминокислоты аспарагин,
• LC из BoNT/A,
• междоменный линкер с первичной последовательностью, сходной с последовательностью, найденной в BoNT/A, которая модифицирована таким образом, что включает тетрапептид IEGR, являющийся субстратом для FXa,
N
• H из BoNT/A, модифицированный таким образом, что он включает С-концевой Cys,
• спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, включающий пептидную последовательность IEGR на С-конце,
• содержащий 28 аминокислотных остатков гастрин-высвобождающий пептид, который модифицирован таким образом, что он включает остаток Cys в позиции 17 вместо природного Arg и дополнительный остаток Gly на C-конце для замены необходимости в C-концевом амидировании (VPLPAGGGTVLTKMYPCGNHWAVGHLMG).
Использование кодона E. coli исследуют, проводя сравнение с компьютерной программой, такой как графический анализатор использования кодонов Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), и содержание %GC и коэффициент использования кодонов оценивают, проводя сравнение с опубликованными таблицами частоты использования кодонов (например, GenBank Release 143, September 13 2004) с тем, чтобы гарантировать, что конструкция не приводит к недостаточному использованию кодона. Перед трансформацией в хозяина, E. coli, ДНК вводят в стандартный клонирующий вектор, например pCR4. Целостность ORF ДНК проверяют секвенированием. Конечный ORF приведен в виде SEQ ID 15, а последовательность аминокислот продукта экспрессии приведена в виде SEQ ID 16.
Пример 14. Способ лечения пациентов, страдающих от рака предстательной железы
56-летний мужчина, страдающий от рака предстательной железы, близок к ситуации, когда антиандрогенной терапии уже не достаточно для борьбы с болезнью. Проводят лечение мужчины путем местного введения композиции, содержащей TSI по настоящему изобретению (в данном конкретном примере TSI на основе TM пептида GnRH), в непосредственную близость от простаты. Состояние пациента контролируют, и по прошествии приблизительно 2 месяцев после проведения лечения врач отмечает уменьшение размера опухоли, что указывает на успешное лечение с помощью композиции, содержащей молекулу по настоящему изобретению.
Пример 15. Метод лечения пациентов, страдающих от нейрогенного воспаления
62-летняя женщина с диагнозом ревматоидный артрит жалуется на тугоподвижность суставов и припухлость. Врач определяет, что тугоподвижность суставов и припухлость вызваны хроническим нейрогенным воспалением. Проводят лечение женщины путем местного введения композиции, содержащей TSI по настоящему изобретению (в данном примере TSI включает опиоидный TM - параллельно выполняются примеры с TSIs, содержащими TMs ноцицептина или динорфина) непосредственно вблизи от зоны поражения. Состояние пациентки контролируют, и примерно через 1-3 дней после начала лечения женщина отмечает, что тугоподвижность суставов и припухлость уменьшаются. На осмотрах, которые проводят по прошествии одного месяца и трех месяцев, женщина отмечает, что тугоподвижность суставов и припухлость в области лечения продолжает уменьшаться. Данное уменьшение симптомов хронического нейрогенного воспаления указывает на успешное лечение с применением композиции, содержащей молекулу по настоящему изобретению.
Пример 16. Метод лечения пациентов, страдающих от эндометриоза
39-летняя женщина жалуется на тазовую боль, вызванную эндометриозом, который не поддается адекватному лечению с помощью нестероидных противовоспалительных препаратов (NSAIDS) и комбинированных эстроген-прогестиновых контрацептивов. Врач назначает композицию, содержащую TSI по настоящему изобретению (в данном примере, TSI включает опиоидный TM - параллельно выполняются примеры с TSIs, содержащими TMs ноцицептина или динорфина). Состояние пациентки контролируют, и примерно через 1-3 дня после начала лечения женщина указывает на уменьшение боли. На осмотрах, которые проводят по прошествии одного и трех месяцев, женщина указывает, что боль продолжает сокращаться, и она ощущает большую свободу передвижения. Данное уменьшение симптомов, связанных с эндометриозом, указывает на успешное лечение с помощью композиции, содержащей молекулу по настоящему изобретению.
Пример 17. Метод лечения пациентов, страдающих от гиперактивности мочевого пузыря
58-летний мужчина жалуется на сильные неотложные позывы к мочеиспусканию. Врач диагностирует у пациента гиперактивность мочевого пузыря, включающую неврологические компоненты, обусловленные аномальной нейронной активностью. Мужчину лечат путем уретроскопических инъекций с применением композиции, содержащей TSI по настоящему изобретению (в данном примере, TSI включает опиоидный TM - параллельно выполняются примеры с TSIs, содержащими TMs ноцицептина или динорфина). В зависимости от места аномальной нейронной активности токсин может быть введен, например, в детрузор, шейку мочевого пузыря, в том числе внешний и внутренний уретральный сфинктер, треугольник, купол мочевого пузыря или другие области стенки мочевого пузыря и/или другие области, окружающие мочевой пузырь, такие как уретра, мочеточник, мочеполовая диафрагмы, нижние мышцы таза, предстательная железа, бульбоуретральная железа, луковица полового члена, ножка полового члена или пенис. Состояние больного контролируют, и приблизительно через 1-3 дня от начала лечения мужчина указывает, что неотложность позывов к мочеиспусканию снизилась. На осмотрах, которые проводят по прошествии одного и трех месяцев, мужчина указывает, что, по-прежнему, неотложность позывов к мочеиспусканию снижена. Данное снижение симптомов гиперактивного мочевого пузыря указывает на успешное лечение с помощью композиции, содержащей молекулу по настоящему изобретению.
Пример 18. Метод лечения пациентов, страдающих от нейрогенного воспаления
62-летняя женщина с диагнозом ревматоидный артрит жалуется на тугоподвижность суставов и припухлость. Врач определяет, что тугоподвижность суставов и припухлость вызваны хроническим нейрогенным воспалением. Проводят лечение женщины путем местного введения композиции, содержащей TSI по настоящему изобретению непосредственно вблизи от зоны поражения (в данном примере TSI включает опиоидный TM - параллельно выполняются примеры с TSIs, содержащими TMs ноцицептина или динорфина). Состояние пациентки контролируют, и примерно через 1-3 дней после начала лечения женщина отмечает, что тугоподвижность суставов и припухлость уменьшаются. На осмотрах, которые проводят по прошествии одного месяца и трех месяцев, женщина отмечает, что тугоподвижность суставов и припухлость в области лечения продолжает уменьшаться. Данное уменьшение симптомов хронического нейрогенного воспаления указывает на успешное лечение с применением композиции, содержащей молекулу по настоящему изобретению. Сходный тип местного назначения белка, раскрытого в данной изобретении, может применяться для лечения пациента, страдающего от хронического нейрогенного воспаления, связанного с моноартритом, олигоартритом или полиартритом, такого как, например, остеоартрит, ювенильный идиопатический артрит, септический артрит, спондилоартропатия (включая анкилозирующий спондилит, реактивный артрит (синдром Рейтера), псориатический артрит, энтеропатический артрит, связанный с воспалительной болезнью кишечника, болезнь Уиппла или болезнь Бехчета), синовит, подагра, псевдоподагра, болезнь Стилла-Шоффера, а также бурсит, острая ревматоидная лихорадка или тендосиновит. Кроме того, системное введение может быть использовано для назначения композиции, содержащей молекулу по настоящему изобретению, с целью лечения хронического нейрогенного воспаления.
Последовательности с идентификационными номерами (SEQ ID)