Биологическая активность нефтезагрязненного грунта при использовании криогеля

УДК 631.45

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОГО ГРУНТА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КРИОГЕЛЯ

© 2014 О.В. Гарайзуева, А.И. Фахрутдинов, Т.Д. Ямпольская

Сургутский государственный университет ХМАО-Югры

Поступила в редакцию 12.05.2014

В лабораторном эксперименте определена биологическая реакция естественной и нарушенной почвенной системы при применении криогеля в качестве криопротектора. Выяснено отсутствие значимой количественной и качественной физиологической реакции тест-культуры вне зависимости от концентрации криогеля на фоне различного нефтяного загрязнения. Изменение объемов микробной биомассы зафиксировано при сходных концентрациях криогеля и нефти 20%. Во всех остальных вариантах динамика микробной массы неоднозначна.

Ключевые слова: криогель, криопротектор, нефтяное загрязнение, тест-культура, микробная масса

Усиление техногенного давления на окружающую среду требует создания новых подходов и технологий восстановления нарушенных биологических систем. Ведущее место занимает загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами. Существующие биологические технологии обеспечивают высокие результаты снижения содержания остаточной нефти лишь в благоприятных биоклиматических условиях. В условия Крайнего Севера вегетационный период составляет 500-600 часов и длится в период июня-августа. Помимо этого существуют аномально холодные или жаркие летние сезоны. Применение новых синтетических, полусинтетических и природных материалов позволит увеличить время активного действия биологических технологий восстановления нарушенных экосистем, расширяя возможность их применения в период с май по октябрь. Одними из возможных способов является использование криопротекторных гелей на основе органических кислот. Криогель формирует структуру при замораживании с образованием кристаллов растворителя, что приводит к вытеснению твердых частиц в пространство между ними и концентрированию суспензии. При замораживании коллоидных растворов концентрирование приводит к образованию геля. [1-3]. Институтом химии нефти СО РАН созданы промышленные технологии на основе крио-гелей для увеличения нефтеотдачи пластов [4-6].

Гарайзуева Ольга Викторовна, младший научный сотрудник. E-mail: olga-garajzueva@yandex.ru Фахрутдинов Айвар Инталович, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии. E-mail: fachrutdinov_a_i@mail. ru

Ямпольская Татьяна Даниловна, кандидат биологических наук, доцент. E-mail: yampolska0105@mail.ru

Разработаны методы получения новых форм криогелей для создания противофильтрацион-ных завес в гидротехнических сооружениях, расположенных в районах Севера и вечной мерзлоты [7-9]. Криогели находят применение в медицинской биотехнологии, стоматологии, косметологии [10-16].

Предложен новый химико-биологический метод предотвращения эрозии почв с применением криогеля в комплексе с многолетними травами. Показано, что криогель не оказывает негативного влияния на аборигенную почвенную микрофауну, не препятствует росту растений, с образованием устойчивого зеленого покрова [17]. Перспективными носителями для иммобилизованных ферментов являются криогели поливинилового спирта (КГПВС) - макропористые вязкоупругие полимерные гелевые материалы, получаемые в результате криогенной обработки. Образующиеся криогели обычно имеют макропористую (от 0,1 до 10 мкм) и сверхмакропористую структуры (от 10 до 1000 мкм) с взаимосвязанными порами, что придает таким материалам уникальный набор физико-химических свойств, а также позволяет использовать их для решения ряда биомедицинских и биотехнологических задач [18, 19]. КГПВС были использованы в качестве носителей для ковалентного присоединения белков ферментов при получении макропористых сорбентов ряда иммобилизованных биокатализаторов, предназначенных для ферментолиза очень высокомолекулярных субстратов или для работы в маловодных средах [20-24].

Цель исследования: формирование биологической активной среды почвенной системы с использованием криопротекторного геля в условиях нефтяного загрязнения.

Для выяснения протекающих процессов заложен лабораторный эксперимент с различными уровнями нефтяного загрязнения и внесения криогеля (табл. 1). В заложенном эксперименте использовался образец дерно-подзолистой почвы, отобранной в Сургутском районе, имеющий следующие характеристики: рН 5,2, гидролитическая кислотность (Иг) - 1,9 мг экв/100 г почвы, емкость обменных оснований (8) - 12,6 мг экв/100 г почвы, общий азот (Кобщ) 2,9 мг. подвижный фосфор (Р2О5) - 17,2 мг. Вносилась нефть товарная Западно-Сургутского месторождения. В исследовании использовался криогель

Р, ТУ 2454-011-03534067-2013, производитель: ИХН СО РАН, г. Томск. В качестве углеводоро-окисляющих микроорганизмов применены штаммы бактерий Pseudomonas monteilli ВКМ В268Ш и Kocoria sp.ВКМ Ас-2606Д с титром 2,9 х 108 клеток на мл. Отбор образцов для исследования производился до и после замораживания образцов. Биомасса микроорганизмов в почве определялась регидратационным методом [25, 26]. Биотестирование определялось методом проращивания овса посевного (Avéna satwa) в качестве тест-культуры. Учитывался процент всхожести и длинна надземной и подземной частей [27]. Статистическая обработка данных выполнена в Microsoft Excel 2010.

Таблица 1. Уровни нефтяного загрязнения и внесения криогеля

Варианты 5% криогель 10% криогель 20% криогель

1 контроль контроль контроль

2 10% Н 10% Н 10% Н

3 10% Н +УОМ 10% Н +УОМ 10% Н +УОМ

4 20% Н 20% Н 20% Н

5 20% Н +УОМ 20% Н +УОМ 20% Н +УОМ

6 30% Н 30% Н 30% Н

7 30% Н +УОМ 30% Н +УОМ 30% Н +УОМ

Оценка количества проросших семян тест-культуры позволяет говорить о целостном влиянии токсических веществ, как положительном, и так отрицательном, на физиологические процессы формирования плодородия (рис. 1) Увеличение концентрации криогеля приводит к снижению энергии прорастания в вариантах использования УОМ, что вызвано антагонизмом внесенной микрофлоры с прорастающей тест-культурой. При высоком уровне нефтяного загрязнения (30%), отмечается различная динамика физиологической активности при 10% и 20% внесении криогеля, что объясняется действием криогеля на границе загрязненная почва - биологический объект. При оценке изменения процента прорастания с увеличением углеводородного загрязнения также отмечается антагонистическое действие в вариантах с УОМ. Во всех вариантах лабораторного эксперимента, четкого и однозначного криопротекторного действия по отношению к контрольному варианту не выявлено.

Формирование подземной и надземной частей тест-культуры происходит при влиянии различных компонентов и элементов грунта (рис. 2). Воздействие криогеля в различных концентрациях и сочетаниях с УОМ в разной степени отражает физиологическую реакцию семян. Увеличение концентрации криогеля не оказывает

влияние на развитие надземной части, и в динамике реакция схожа с контрольными вариантами. В вариантах с УОМ выявлены наиболее низкие значения.

Рис. 1. Изменение процента прорастания тест-культуры при различных концентрациях криогеля и нефти

Формирование подземной и надземной частей тест-культуры происходит при влиянии различных компонентов и элементов грунта (рис. 2). Воздействие криогеля в различных концентрациях и сочетаниях с УОМ в разной степени отражает физиологическую реакцию семян. Увеличение концентрации криогеля не оказывает влияние на развитие надземной части, и в динамике реакция схожа с контрольными вариантами. В вариантах с УОМ выявлены наиболее низкие значения.

А)

Б)

Рис. 2. Изменение длины тест-культуры при различных дозах внесенного криогеля: А) надземная часть, Б) подземная часть

Развитие подземной части семян тест-культуры в значительной степени повторяет вышеописанную тенденцию: наблюдается глубокий антагонизм почвенной системы по отношению к внесённым культурам УОМ. Анализ реакции надземной и подземной частей текст-культур при различных концентрациях нефти показывает значимый криопротекторный эффект в различных вариантах использования криогеля (рис. 3). Наилучшая динамика выявлена при сочетании внесения 20% криогеля и 20% углеводородного загрязнения.

А)

нефть 10 %

120,0 100,0 0,0 60,0 40,0 -20,0 -

Контроль ——КГ 5/10Н

—Д- КГ5/10Н/УОМ — X—КГ10/10Н -Ж- КГЮ/ЮН/УОМ —О—КГ20/10Н —+- КГ20/10Н/УОМ

^^^^ +

2 декада

3 декада

Рис. 3. Изменение длины тест-культуры при различных дозах внесения нефти: А) надземная часть, Б) подземная часть

140,0

0,0

Реакция почвенной системы на различные внесенные компоненты вызвали разнообразную и разнонаправленную динамику биологической активности, что позволяет говорить о стремлении сформированной экосистемы к стабильности независимо от температуры среды. Наибольшие значения при 10% нефтяном загрязнении

определено при 10% внесении криогеля в варианте с углеводородокисляющими микроорганизмами, но при снижении температуры среды происходит снижение этого показателя. В данном варианте криогель выступает как основа для развития микроорганизмов и сохранности ферментов, деструктурирующих углеводороды (рис. 4). Нефтяное загрязнение (10%) выступает как активный стимулятор биологических и биохимических процессов, но снижение температуры среды угнетает эти процессы в почвенной системе. В других вариантах криогель поддерживает развитие биологической активности при различных температурах среды жизнедеятельности почвенной системы. Нефтяное загрязнение (20%) также выступает как стимулятор биологических и биохимических процессов, но в 10 раз ниже, чем при 10% дозе нефти. Снижение температуры среды также угнетает эти процессы в почвенной системе. Увеличение дозы нефтяного загрязнителя (20%) выявляло резкий рост биологической активности при 5 и 10 % использования криогеля в вариантах с УОМ. Снижение температуры среды с 25 до 12 С0 определило

снижение данного показателя, в особенности в варианте с 10% дозой криогеля. Это вызвано физико-химическим антагонизмом углеводородов нефти и криогеля, что не обеспечивает сохранения жизнедеятельности микроорганизмов и активности ферментов. В оставшихся вариантах криогель поддерживает развитие биологической активности при различных температурах среды жизнедеятельности почвенной системы, но на порядок ниже, чем при 20% нефтяном загрязнении.

Увеличение дозы внесенного криогеля по направлению 5% ^ 10% ^ 20%, в вариантах без нефтяных углеводородов увеличивает биологическую активность при снижении температуры среды жизнедеятельности. Высокий уровень углеводородного загрязнения (30%) снижает значения уровня биологической активности во всех вариантах эксперимента. На момент 3 декады эксперимента, в варианте только с нефтью, значения приближались к нулевым, что вызвано токсическим действием и ухудшением водного и воздушного режимов почвы.

Рис. 4. Динамика микробной биомассы в вариантах с различным содержанием криогеля и нефти

Совместно действие криогеля и нефти, независимо от концентрации и внесенных угле-водородокисляющих микроорганизмов вызвало 2 увеличение биологической активности почвенной системы даже при понижении температуры среды. Этому способствует действие криогеля з. как криопротектора, способного создавать благоприятные зоны жизнедеятельности микроорганизмов на границе взаимодействия углеводородов нефти и криогеля. Подобное протекание 4 биологических процессов позволяет говорить о формировании искусственного почвенного агрегата, с присущими естественному почвенному агрегату свойствами и функциями, а именно: формирование условий протекания различных 5 анаэробных и аэробных окислительно-восстановительных реакций, биологического и минерального характера.

Выводы: применение различных доз криогеля повышает уровень биологической активности в естественных и загрязненных нефтью почвах, выступая в качестве носителя микроорганизмов и ферментов или криопротектора. Увеличение уровня нефтяного загрязнения вызывает изменение биологической активности почвы, от стимулирующего, при 10% нефти, до угнетающего при 30%, вне зависимости от температуры среды. Использование метода определения био- 7 логической активности почв регидратационным методом позволяет объективно оценить весь объем протекающих процессов как в естествен- g ной, так и в нарушенной почвенной системе.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Шляхтин, О.А. Криогель / Словарь нанотехноло- 9 гических и связанных с нанотехнологиями терминов - Режим доступа: http://thesaurus.rusnano.

сотМ1к1/ай1с1е2153 - Заглавие с экрана

Лозинский, В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Успехи химии. 2002. Т. 71. С. 559.

Савин, И.Н. Наполненные криогели поливинилового спирта: получение, влияние свойств дисперсной фазы, применение Савина, И. Н. Автореф кандит. диссерт. - М., 2003. 156 с.

Алтунина, Л.К. Криогели для тампонажных работ в гидротехнических сооружениях районов севера и вечной мерзлоты / Л. К Алтунина, В. А. Кувшинов - Режим доступа: http://www.ipc. tsc.rU/proekts/1/8/. - Заглавие с экрана

Криотропные полимерные материалы

Лабунский, А. Криогели помогают строить в вечной мерзлоте - Режим доступа: http://www.nkj .щ/ news/22634/ - Заглавие с экрана

Гибкий изоляционный материал для применения при низких и криогенных температурах - Режим доступа: http:// www. Cryoge1_10201_DS_12_ 11x85.ru - Заглавие с экрана

Криогель заживляет раны и дозирует лекарства -Режим доступа: http://www.2045.ru/news/ 30863.htm1 - Заглавие с экрана

10. Орехова, Л.Ю. Использование пролонгированных медикаментозных форм при лечении заболеваний пародонта / Л.Ю. Орехова, В.И. Калинин, Т.В. Кудрявцева - Режим доступа: http:// www.fesmu.гu/e1ib/Aгtic1e.aspx?id=17019 - Заглавие с экрана

11. Криогель-антицеллюлит «Faber1ic» - Режим доступа: http://faber1ic-nata1i.okis.ru/se11.17874.htm1 -Заглавие с экрана

12. Алтунина, Л.К. Метод защиты почв от эрозии с применением криогелей и многолетних трав / Л.К. Алтунина, М.С. Фуфаева, Д.А. Филатов и др. // Вестник Томского государственного педагогического университета. 2012. №7. С. 177-182.

13. Спиричева, О.В. Биокаталитические системы на основе иммобилизированных клеток Rhizopus oryzae. Автореф кандит.диссерт. -М., 2006. 160 с.

14. Шаскольский, Б.Л. Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментных препаратов, включенных в матрицу криоге-ля поливинилового спирта : диссертация ... канд. хим. наук. - М., 2009. 136 с.

15. Мартыненко, Н.Н. Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей: Диссертация ... докт. биол. наук. - Кашинцево, 2009. 414 с.

16. Шаскольский, Б.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Композитные иммобилизованные биокатализаторы с

частицами ферментного препарата, включенного в матрицу криогеля поливинилового спирта / Б.Л. Шаскольский и др. // Биотехнология. 2009. № 1. С.71-83.

17. Лозинский, В.И. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул / В.И. Лозинский, Ф.И. Плиева, А.Л. Зубов // Биотехнология. 1995. Т 1-2. С. 32-38.

18. Беляева, А.В. Протеиназы, иммобилизованные на криогеле поливинилового спирта, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде: Автореф канд. дисс. -М., 2006. 197 с.

19. Степанов, Н.И. Применение клеток дрожжей и мицелиальных грибов, иммобиилзованных в криогель поливинилового спирта, для получения этанола из различного сырья / Н.И. Степанов и др. // 4-й Межд. Моск. конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития. 2007». - М., 2007. 308 с.

20. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Учеб. пособие / Под ред. Д.Г. Звягинцева. -М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с.

21. Звягинцев, Д.Г. Биология почв / Д.Г.Звягинцев, И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. -М.: Изд-во: МГУ, 2005. 448 с.

22. Мелехова, О.П. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / О.П. Мелехова, Е.И. Егорова, Т.И. Евсеева и др.; под ред. О.П. Мелеховой и Е.И. Егоровой. - М.: Издательский центр «Академия», 2007. 288 с.

BIOLOGICAL ACTIVITY OF PETROPOLLUTED SOIL WHEN USING CRYOGEL

© 2014 O.V. Garayzuyeva, A.I. Fakhrutdinov, T.D. Yampolskaya

Surgut State University of Khanty-Mansi Autonomous District-Yugra

In laboratory experiment biological reaction of the natural and broken soil system at using cryogel as cry-oprotector is defined. Lack of significant quantitative and qualitative physiological reaction of test-culture regardless of concentration of cryogel against various oil pollution is found out. Change of microbial biomass volimes is recorded at similar concentration of cryogel and naphtha of 20%. In all other variants the dynamics of microbial mass is ambiguous.

Key words: cryogel, cryoprotector, oil pollution, test-culture, microbial mass

Olga Garayzueva, Minor research Fellow. E-mail: olga-garajzueva@yandex. ru

Ayvar Fakhrutdinov, Candidate of Biology, Associate Professor at the Microbiology Department. E-mail: fachrutdinov_a_i@mail.ru

Tatiana Yampolskaya, Candidate of Biology, Associate Professor. E-mail: yampolska0105@mail.ru