Способ получения материала с высоким титром вируса гепатита Е и анализ титрования вируса гепатита Е
METHOD OF PRODUCING MATERIAL WITH HIGH TITRE OF HEPATITIS E VIRUS AND ANALYSIS OF HEPATITIS E VIRUS TITRATION

ПРИОРИТЕТ И ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США 62/195936, поданной 23 июля 2015 года, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в машиночитаемом формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла DURC6_006AUS_SEQLIST.txt размером 1093 байт, созданного 31 мая 2016 года и окончательно измененного 31 мая 2016 года. Информация в перечне последовательностей в машиночитаемом формате включена в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
Настоящее изобретение относится к области вирусологии, более конкретно к способам получения материала вируса гепатита Е (далее HEV). В частности, в настоящем изобретении раскрыты способы размножения и титрования материала с высоким титром HEV.
Описание родственного уровня техники
HEV (род Hepevirus, семейство Hepeviridae) представляет собой небольшой вирус без оболочки/с псевдооболочкой, с одноцепочечной положительно-полярной нитью полиаденилированного РНК-генома приблизительно 7,2 т.п.о. Существует четыре генотипа HEV, которые были идентифицированы, но только один серотип. Генотипы 1 и 2 ответственны главным образом за инфекции, передаваемые через зараженную воду, в развивающихся странах и вызывают заболевание преимущественно у людей и высших приматов. Инфекции, как правило, являются саморазрешающимися и острыми, продолжительностью максимум от 2 до 7 недель, однако они могут быть фатальными, особенно для беременных женщин. Генотипы 3 и 4 ассоциированы с эндемическими (аутохтонными) инфекциями в промышленно развитых странах. Эти два генотипа вызывают заболевание большей частью у свиней, однако у людей могут становиться случайными хозяевами в результате пищевого или зоонозного воздействия. Клинически заболевание является, как правило, бессимптомным, с легким течением у молодых людей, но клинически проявляется у пожилых людей. Кроме того, инфекции генотипов 3 и 4 могут стать хроническими у людей с иммунодефицитом, таких как пациентов с трансплантацией органов или СПИДом.
В настоящее время гепатит Е классифицируется как передаваемое при переливании крови инфекционное заболевание. В виду распространения HEV в мире за последние годы возникла озабоченность, связанная с безопасностью продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы. Профиль вирусной безопасности продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы, может быть обеспечен путем осуществления исследований элиминации, демонстрирующих эффективность ослабления и/или элиминации вируса в процессе их производства. Во время этих исследований элиминации известное количество вируса преднамеренно вводится в промежуточный продукт крови или плазмы, и затем этот введенный материал подвергается обработке с использованием лабораторной модели производственного процесса. Ослабление и/или элиминация вируса за стадию определяется сравнением количества вируса до и после обработки.
Исследования элиминации вирусов требуют больших количеств вируса с высоким титром, и отсутствие эффективной клеточной культуральной системы для HEV препятствовало возможности осуществления таких исследований для HEV. Несколько клеточных культуральных HEV систем разрабатывается в настоящее время для решения этой проблемы.
8
Штаммы с генотипом 3 и генотипом 4 были адаптированы Okamoto и коллегами для выращивания в человеческих клетках легких А549 с достижением РНК-титров HEV 3,9×10 копий/мл. Кроме того, указанный штамм с генотипом 4 также был культивирован в клетках PLC/PRF/5 (клетки человеческой гепатомы), но с низкими титрами.
8
Второй генотип 3 (штамм Kernow-C1) был адаптирован Emerson и коллегами для выращивания в клетках человеческой гепатомы HepG2/C3A с получением титра 4,61×10 геномов/мл после 6 пассажей. Исследования показали, что адаптация для роста in vitro была достигнута после приобретения 174 рибонуклеотидов S17 человеческого рибосомального белкового гена.
Поскольку геномы с такой же инсерцией были обнаружены в первоначальном вирусном инокулюме, фекальной суспензии от хронически инфицированного HIV-1 пациента, случай рекомбинации/инсерции имел место в природе и не являлся артефактом клеточной культуры. Попытки вырастить указанный штамм в клетках PLC/PRF/5 и А549 не были успешными или приводили к низким титрам, однако вирус заражал и реплицировался в клетках почек от свиней, являющихся главным зоонозным хозяином для вирусов генотипа 3.
Клетки человеческой гепатомы сложны для выращивания и могут требовать специальных методов выращивания клеток, включая использование покрытий, таких как коллаген, фибронектин, желатин и/или поли-L-лизин, для облегчения прикрепления клеток и/или клеточного роста. Помимо этого, не все из этих покрытий хорошо работают для любых типов клеток.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
8
10
7
10
8
10
7
10
В некоторых воплощениях предложен способ получения высокого титра вируса гепатита Е, включающий: культивирование клеточной линии in vitro в среде, содержащей концентрацию полибрена, и инфицирование этой клеточной линии вирусом HEV. В некоторых воплощениях способа используемая клеточная линия представляет собой HepG2 (номер НВ-8065 в Американской коллекции типовых культур (АТСС)) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях способа концентрация полибрена составляет от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадии добавления концентрации полибрена к среде; пассирование HEV-инфицированной клеточной линии в среде, содержащей полибрен; и сбор среды и/или инфицированных клеток. В некоторых воплощениях способа концентрация полибрена составляет от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
В некоторых воплощениях предложен способ определения присутствия и/или уровня HEV в образце, включающий стадии: внесения образца в смесь, содержащую клеточную линию и культуральную среду, содержащую полибрен; инкубирования смеси, содержащей образец, с предыдущей стадии для обеспечения размножения HEV в случае его присутствия в образце; сбора порции с предыдущей стадии, содержащей HEV в случае его присутствия и размножения во время осуществления предыдущей стадии; и измерения присутствия и/или уровня биологического вещества, ассоциированного с HEV, в собранной порции. В некоторых воплощениях способа клеточная линия выбрана из группы, состоящей из клеточных линий HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях способа биологическое вещество содержит полинуклеотидную и/или полипептидную последовательность HEV. В некоторых воплощениях способа указанное измерение включает стадии: получения первой реакционной смеси путем смешивания собранной порции с первым раствором для обеспечения воздействия на полинуклеотид HEV в случае присутствия HEV в собранной порции, где полинуклеотид представляет собой РНК HEV; получения второй реакционной смеси путем добавления к первой реакционной смеси первого реагента для получения комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), которая по меньшей мере частично комплементарна указанной РНК HEV; получения третьей реакционной смеси путем добавления к второй реакционной смеси второго реагента, содержащего пару полинуклеотидов для амплификации последовательности кДНК, которая по меньшей мере частично комплементарна каждому из указанной пары полинуклеотидов; получения четвертой реакционной смеси путем амплификации указанной последовательности; и определения концентрации амплифицированной последовательности в указанной четвертой реакционной смеси. В некоторых воплощениях способа указанное определение концентрации включает: получение четвертой реакционной смеси; получение одного или более контролей, содержащих предварительно определенное количество кДНК HEV; добавление к указанной четвертой реакционной смеси и указанному(ым) одному или более контролям агента, где указанный агент является по меньшей мере частично специфичным к указанной амплифицированной последовательности в четвертой реакционной смеси и к кДНК HEV, содержащейся в указанном предварительно определенном количестве в указанном(ых) одном или более контролях; и расчет уровня распознавания HEV указанным агентом в данной четвертой реакционной смеси относительно указанного(ых) одного или более контролей. В некоторых воплощениях способа указанная пара полинуклеотидов включает:
а) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 1)
б) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2).
В некоторых воплощениях способа указанный агент включает:
5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
8
10
7
10
В некоторых воплощениях предложена культуральная среда для получения HEV с высоким титром, содержащая полибрен в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях высокий титр HEV составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. В некоторых воплощениях высокий титр HEV составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
В некоторых воплощениях предложен анализ титрования HEV, включающий использование полибрена. В некоторых воплощениях анализа концентрация используемого полибрена находится в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1А-1С показаны изображения, полученные при 20-кратном увеличении HepG2/C3A клеток, культивированных в течение 1 суток с использованием различных клеточных культуральных сред согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения.
На Фиг. 1А показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием среды DMEM плюс 10% FBS плюс заменимые аминокислоты, фунгизон, HEPES, гентамицин (NHG).
На Фиг. 1В показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват.
На Фиг. 1С показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват плюс полибрен.
На Фиг. 2А-2С показаны изображения, полученные при 10-кратном увеличении (слева) или 20-кратном увеличении (справа) HepG2/C3A клеток, культивированных в течение 3 суток.
На Фиг. 2А показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG.
На Фиг. 2В показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват.
На Фиг. 2С показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват плюс полибрен.
На Фиг. 3 показано сравнение РНК-титров HEV в хронически инфицированных HepG2 (человеческих) в MPK (свиных) клетках, как измерено посредством ПЦР-анализа HEV согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения. Полибрен не использовали для MPK клеток, поскольку прикрепление MPK клетки к поверхностям выращивания очень эффективное.
На Фиг. 4 показаны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, используемых для ПЦР-анализа HEV, и их расположение в геноме HEV, согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения.
На Фиг. 5 показана стандартная кривая для ПЦР-анализа HEV согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения материала с высоким титром вируса гепатита Е (HEV), подходящего для использования в исследованиях элиминации вируса и способе определения инфекционных титров HEV. Настоящее изобретение включает простой способ размножения HEV с высоким титром в клеточной культуре для использования в исследованиях по оценке эффективности элиминации HEV в процессах производства продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы.
Как обсуждалось выше, HEV был адаптирован для выращивания в клеточной культуре Okamoto и коллегами с использованием клеток человеческой гепатомы PLC/PRF/5 и человеческих клеток легкого А549 и Emerson и коллегами с использованием клеток человеческой гепатомы HepG2/C3A. Клетки человеческой гепатомы сложны для выращивания и могут требовать специальных методов выращивания клеток. Лаборатория Emerson's покрывает чашки коллагеном I из сухожилий крысиного хвоста перед высеванием клеток, в то время как лаборатория Okamoto's использует чашки, приобретенные в IWAKI, некоторые из которых покрыты коллагеном. В Таблице 1 приведено сравнение титров HEV из разных клеточных культуральных систем, и перечислены способы, используемые различными лабораториями для улучшения выращивания клеток. Коллаген и другие покрытия, такие как фибронектин, желатин и поли-L-лизин, облегчают прикрепление клеток и/или клеточный рост, так что сложные для выращивания клетки могут достичь более высоких плотностей и тем самым получения высокого титра вируса.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения, вместо использования покрытия, такого как коллаген или другие покрытия, для облегчения прикрепления клеток и/или клеточного роста, предложен способ культивирования HEV, включающий использование полибрена (также известного как бромид гексадиметрина и 1,5-диметил-1,5-диазаундека-метилен-полимето-бромид).
Полибрен представляет собой недорогой катионный полимер, обычно используемый в клеточной культуре для повышения инфицирующей способности ретровирусов посредством снижения отталкивания зарядов между вирусом и клетками. Способность полибрена теснее сближать различные объекты использована в данном изобретении для облегчения прикрепления клеток человеческой гепатомы к поверхностям культивирования и HEV к клеткам. Полибрен просто добавляют к клеточным культуральным средам, которые используют для клетки и размножения вируса. В настоящем изобретении избегают необходимости приобретать дорогостоящие чашки, предварительно покрытые коллагеном или другими покрывающими агентами, или наносить предварительное покрытие коллагеном или другими покрывающими агентами до высевания клеток и инфицирования вирусом.
HEV обычно реплицируется с низкими титрами in vivo, так что рост in vitro затруднен. Способы культивирования HEV для получения материала с высоким титром, подходящего для использования в исследованиях элиминации вируса, ранее не были доступны.
В одном аспекте раскрытого здесь изобретения размножение HEV с высоким титром в клеточной культуре возможно при использовании сред, обогащенных полибреном.
Полибрен представляет собой недорогой катионный полимер, используемый в клеточной культуре для повышения инфицирующей способности ретровирусов (оболочечных вирусов) посредством снижения отталкивания зарядов между вирусом и клетками. В некоторых воплощениях изобретения полибрен добавляют к клеточной культуральной среде для облегчения прикрепления HEV, вируса без оболочки/с псевдооболочкой, к клеткам. Кроме того, присутствие полибрена улучшает прикрепление клетки и пролиферацию, тем самым усиливая общую продукцию HEV в инфицированных клетках.
Таким образом, в первом воплощении настоящего изобретения предложен способ получения высокого титра HEV в культурах in vitro, основанный на добавлении полибрена к клеточной культуральной среде.
HEV не вызывает цитопатических эффектов (СРЕ) в клеточной культуре, поэтому детектирование HEV основано на ПЦР. Таким образом, в некоторых воплощениях детектирование HEV при низких концентрациях возможно посредством ПЦР-анализа по настоящему изобретению. ПЦР-анализ может быть использован для разработки, например, анализа инфекционной способности HEV, который является точным, надежным и достоверным.
ПЦР-анализ, изначально разработанный Национальным Институтом Здоровья (National Institutes of Health, NIH), был модифицирован для повышения чувствительности. Обратный праймер был изменен, и был разработан полностью новый зонд. В способах, использующих ПЦР-анализ по настоящему изобретению, соответственно оценивают образцы должным образом как положительные или отрицательные, и эти способы являются полезными в расчетах титров. Таким образом, в дополнительном воплощении настоящего изобретения раскрыты способы титрования HEV на основе ПЦР, включающие использование полибрена или культуральной среды (предпочтительно, клеточной культуральной среды), содержащей указанный полибрен.
В одном воплощении изобретение относится к способу, включающему: размножение HEV с высоким титром в клеточной культуре посредством использования сред, обогащенных полибреном; и детектирование HEV посредством чувствительного ПЦР-анализа.
Способ может быть специфичным к HEV, однако методики размножения вируса могут быть применимы к другим вирусам без оболочки. Например, в некоторых воплощениях настоящего изобретения был протестирован HEV генотип 3 штамм Kernow-C1 пассаж 6, полученный из лаборатории Emerson.
Подразумевается, что в некоторых воплощениях способ получения высокого титра HEV, упомянутый выше, осуществляют в культурах in vitro, предпочтительно в органе, ткани или клеточных культурах in vitro. В наиболее предпочтительном воплощении способ получения высокого титра HEV по настоящему изобретению осуществляют в клеточной культуре in vitro.
Как первичные клеточные культуральные линии, так и устойчивые клеточные культуральные линии могут быть использованы в способе по настоящему изобретению. Используемые клеточные культуральные линии могут иметь происхождение из любого организма. Например, подразумевается использование клеток насекомых или клеток млекопитающих. Предпочтительно, используемые линии клеточных культур имеют происхождение от свиней (или минипигов) и людей.
Кроме того, предпочтительно, когда используемые линии клеток имеют происхождение из печени или почек. Указанные печень или почка, из которых имеют происхождение линии клеток, могут быть здоровыми, или больными, или включать злокачественный или доброкачественный рост. В наиболее предпочтительном воплощении используют стабильные клеточные линии HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
В некоторых воплощениях концентрация полибрена составляет в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях концентрация полибрена составляет примерно 1, 2, 3, 4 или 5 мкг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация полибрена составляет примерно 4 мкг/мл.
8
10
7
10
9
Способ по настоящему изобретению в некоторых воплощениях обеспечил титры HEV в диапазоне от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. Способ по настоящему изобретению в некоторых воплощениях обеспечил титры HEV в диапазоне от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению обеспечил титры HEV примерно 10 копий/мл.
В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения высокого титра HEV, включающему стадии: а) выращивания клеток в культуральной среде, содержащей полибрен, и б) инфицирование культуры in vitro вирусом HEV. В некоторых воплощениях клеточную культуральную среду из культур in vitro собирают для получения высокого титра HEV.
После указанной выше стадии б) культивированные клетки могут быть собраны любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно, посредством трипсинизации), и аликвота может быть подвергнута анализу на содержание HEV. Указанное содержание HEV предпочтительно определяют посредством ПЦР, еще более предпочтительно с использованием ПЦР-анализа по настоящему изобретению и как описано ниже. См. Фиг. 5. В альтернативных воплощениях содержание HEV может быть определено путем анализа на основе иммунофлуоресценции (IF). См. Фиг. 5.
Кроме того, после указанной стадии б) культивированные клетки могут быть получены любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно трипсинизацией), и материал с HEV может быть получен любой методикой, известной в данной области техники. В предпочтительном воплощении материал с HEV получают замораживанием-оттаиванием клеток несколько раз, предпочтительно 1 или 2 раза. Полученный материал с HEV хранят предпочтительно при -65°C или холоднее.
Предусматривается, что в некоторых воплощениях способ, описанный выше, также включает стадии: в) добавления полибрена к клеточной культуральной среде; и г) дополнительного пассирования клеток, инфицированных вирусом HEV.
Стадии в) и г) можно повторять, например, для увеличения количества клеток, продуцирующих HEV, и для максимизации распространения вируса и инфицирования в культуре. Специалист в данной области техники может легко определить, сколько раз можно осуществлять повторение стадий в) и г), то есть число пассажей, которые инфицированная клетка может перенести, на основании, например, внешнего вида клеток и их кривых роста.
После стадии г) каждого пассажа культивированные клетки могут быть получены любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно трипсинизацией), и аликвота может быть проанализирована на содержание HEV. Указанное содержание HEV предпочтительно определяют посредством ПЦР, еще более предпочтительно посредством ПЦР-анализа по настоящему изобретению и как описано ниже. См. Фиг. 5.
Кроме того, после указанной стадии г) каждого пассажа культивированные клетки могут быть получены любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно трипсинизацией), и материал с HEV может быть получен любой методикой, известной в данной области техники. В предпочтительном воплощении материал с HEV получают замораживанием-оттаиванием клеток несколько раз, предпочтительно 1 или 2 раза. Полученный материал с HEV хранят предпочтительно при -65°C или холоднее.
Альтернативно, среду также можно собрать только после осуществления желаемого или требуемого числа пассажей с инфицированной клеточной линией (то есть, после повторений стадий в) и г) желаемое или требуемое количество раз).
Стадия г) пассирования клеток, инфицированных HEV, как это известно специалисту в данной области техники, подразумевает получение клеток любыми средствами, известными в данной области техники. В случае если клетки растут прикрепленными к поверхности (например, из колбы или чашки), клеткам может потребоваться открепление любыми средствами, известными в данной области техники, предпочтительно трипсинизацией. Когда ферменты (например трипсин) используют для открепления клеток, обычно указанные ферменты должны быть инактивированы. Как правило, в данной области техники указанную инактивацию осуществляют путем разбавления раствором, обогащенным белками, предпочтительно клеточной культуральной средой с FBS.
Принимая во внимание тот факт, что полибрен и культуральные среды, содержащие указанный реагент (предпочтительно, клеточная культуральная среда) обеспечивают эффективное инфицирование и получение HEV в культурах in vitro (предпочтительно, клеточных культурах in vitro), они также могут быть использованы в анализах титрования HEV.
Таким образом, в дополнительном воплощении настоящего изобретения раскрытые анализы титрования HEV характеризуются тем, что они включают использование полибрена или культуральной среды (предпочтительно клеточной культуральной среды), содержащей указанный полибрен.
Культура in vitro предпочтительно представляет собой орган, ткань или клеточную культуру in vitro. В наиболее предпочтительном воплощении культура in vitro представляет собой клеточную культуру in vitro.
Могут быть использованы как линии первичной клеточной культуры, так и линии стабильной клеточной культуры. Используемые линии клеточных культур могут иметь происхождение из любого организма. Например, предусматривается использование клеток насекомых или клеток млекопитающих. Предпочтительно, используемые линии клеточных культур имеют происхождение от свиней (или минипигов) и людей.
Кроме того, предпочтительно, когда используемые линии клеток имеют происхождение из печени или почек. Указанные печень или почка, из которых имеют происхождение линии клеток, могут быть здоровыми, или больными, или включать злокачественный или доброкачественный рост. В наиболее предпочтительном воплощении используют стабильные клеточные линии HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
50
Предпочтительно, анализ титрования HEV по настоящему изобретению представляет собой анализ дозы заражения 50% культуры ткани (TCID), осуществляемый как известно специалисту в данной области техники, за исключением того, что на присутствие вируса указывает положительный ПЦР-сигнал, а не вирусная цитопатология.
В указанных анализах титрования полибрен или клеточную культуральную среду, содержащую полибрен, используют для культуры клеток, в которых будут титровать образцы HEV.
В другом воплощении предложен способ детектирования HEV в исходных культурах HEV.
Указанное детектирование может быть осуществлено любыми методами или средствами, известными в данной области техники. Тем не менее, в предпочтительном воплощении детектирование осуществляют посредством ПЦР.
В предпочтительном воплощении, ПЦР, используемая для детектирования HEV, представляет собой ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени, которая включает первую стадию обратной транскрипции вирусной РНК с комплементарной ДНК (кДНК) и вторую стадию ПЦР в режиме реального времени, которую осуществляют предпочтительно с использованием зонда двойного гашения.
В наиболее предпочтительном воплощении на второй стадии следующие олигонуклеотиды используют в качестве праймеров и зондов (Фиг. 4):
a) прямой праймер: 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 1)
b) обратный праймер: 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2)
c) зонд: 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
Данные от исследований по оценке эффективности анализа инфекционной способности HEV на основе ПЦР сведены в Таблицу 2.
В предпочтительном воплощении клетки титруют в 96-луночном планшете и РНК HEV экстрагируют с помощью магнитных шариков Bioclone или магнитных Dynabeads, более предпочтительно используют Dynabeads.
Для лучшего понимания некоторые воплощения настоящего изобретения описаны более подробно, со ссылкой на прилагаемые фигуры, которые даны в качестве примера, и со ссылкой на иллюстративные примеры, которые не являются ограничением объема настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Картины клеточного роста HepG2/C3A клеток в различных средах для роста
6
2
HepG2/C3A (10) клетки высевали в колбы емкостью 25 см и культивировали на одной из следующих клеточных культуральных сред:
- DMEM +10% FBS + NHG (заменимые аминокислоты, фунгизон, HEPES, гентамицин);
- DMEM +10% FBS + NHG + 1MM пируват; или
- DMEM +10% FBS + NHG + 1 мМ пируват + 4 мкг/мл полибрена.
Изображения, снятые при 20-кратном увеличении через 1 сутки, показаны на Фиг. 1. HepG2/C3A клетки, культивированные в среде DMEM+10% FBS+NHG (А) или DMEM + 10% FBS + NHG + пируват (В), росли в виде скоплений, которые будут сильно затруднять инфицирование вирусом (например HEV). С другой стороны, когда HepG2/C3A клетки культивировали в среде DMEM + 10% FBS + NHG + пируват + полибрен (С), клетки прилипали и росли разряженно вплоть до монослоя, который будет легко инфицироваться вирусом (например HEV).
Изображения, снятые при 10- и 20-кратном увеличении через 3 суток, показаны Фиг. 2. Подобно 1-суточным клеткам, HepG2/C3A клетки, культивированные в среде DMEM + 10% FBS + NHG (А) или DMEM + 10% FBS + NHG + пируват (В), росли в виде скоплений, однако клетки, выращенные в среде DMEM + 10% FBS + NHG + пируват + полибрен (С), росли разряженно вплоть до монослоя. Поскольку скопления клеток будут затруднять равномерное инфицирование вирусами, эффективность HEV-инфекции будет по всей вероятности выше в клетке, выращенной в присутствии полибрена.
Пример 2. Получение стабильных HEV-инфициоованных клеток
6
2
Колбы для клеточных культур засевали для инфицирования следующим образом: HepG2 или HepG2/C3A клетки трипсинизировали согласно протоколам или методикам, известным в данной области техники. Десять мл среды для роста (основная среда в соответствии с потребностями используемой клеточной линии плюс полибрен в концентрации от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл) добавляли для нейтрализации трипсина и суспензию пипетировали вверх-вниз, для того чтобы разбить скопления клеток. Клетки затем высевали с плотностью приблизительно 10 клеток на колбу емкостью 150 см и оставляли на ночь в инкубаторе при 37°С.
Клетки инфицировали вирусом HEV путем удаления среды из колбы и добавления исходной культуры HEV (осветленного вирус-инфицированного клеточного лизата) при множественности заражения (MOI) 0,1-1,0 и в общем объеме 5-10 мл. Клетки инкубировали при 37°С в течение по меньшей мере 1 часа, во время которого колбу периодически качали взад-вперед для предупреждения высыхания клеток и для распределения вирусного инокулюма равномерно по всей поверхности клеток. Добавляли дополнительно среду для роста (10-20 мл на колбу) и колбу выдерживали при 37°С до конфлюэнтности клеточного монослоя (приблизительно 1 неделя).
2
Пример 3. Размножение НЕV-инфицированных клеток Инфицированные клетки (HepG2 или HepG2/C3A) в колбе емкостью 150 см трипсинизировали в соответствии с Примером 1 до конфлюэнтности клеточного монослоя. Если трипсинизацию проводили в нескольких колбах, клеточные суспензии объединяли вместе перед обработкой.
2
2
Аликвоту объемом не менее 1 мл трипсинизированной клеточной суспензии брали для анализа на РНК HEV посредством ПЦР. Оставшуюся клеточную суспензию отбрасывали или распределяли в другие колбы емкостью 150 см с плотностью, эквивалентной числу клеток в 1/6 от конфлюэнтного монослоя (деление 1:6). Среду для роста добавляли в каждую колбу емкостью 150 см до достижения конечного объема 20-25 мл, и эти колбы инкубировали до достижения клетками конфлюэнтности (приблизительно 1 неделя).
8
10
7
10
Эту процедуру повторяли каждую неделю до тех пор, пока количество РНК HEV в образце объемом 1 мл, который извлекали для проведения ПЦР-анализа, не достигло высоких титров. В некоторых воплощениях высокий титр находился в диапазоне от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. В некоторых воплощениях высокий титр находился в диапазоне от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл. Некоторые колбы затем подвергали трипсинизации и разделению для последующего пассирования HEV-инфицированных клеток, в то время как остальные колбы подвергали обработке в качестве материала с HEV.
Колбы с материалом с HEV подвергали замораживанию и оттаиванию 1-2 раза для разрушения инфицированных клеток и высвобождения вируса. Инфицированные лизаты затем объединяли вместе, разделяли на аликвоты в подходящие контейнеры и хранили при температуре не выше -65°С.
Пример 4. Анализ инфекционной способности HEV на основе ПЦР
В данном примере описано титрование HEV в 96-луночном формате планшета, однако анализ может быть легко адаптирован к многолуночным планшетам других размеров.
Проводили серийные разведения исходных культур HEV и добавляли в лунки, засеянные клетками HepG2 или HepG2/C3A. Вирусу давали возможность адсорбироваться в течение не менее 1 часа при 37°С и добавляли среду для роста. Планшеты инкубировали при 37°С в течение не менее 2 суток, а затем отсасывали среду из лунок и осуществляли промывку/отсасывание клеток не менее 2 раз с использованием буфера (например PBS). Планшеты затем подвергали экстрагированию для ПЦР или хранили при температуре не выше -65°С до готовности к экстрагированию.
Использовали набор Dynabeads mRNA DIRECT™ Micro Kit (Life Technologies) для экстрагирования полиаденилированной РНК (например РНК HEV) из клеток в каждой лунке титационного планшета, следуя инструкциям производителя. Полученный элюат (поли А РНК) сразу же подвергали ПЦР-амплификации или хранили при температуре не выше -65°С до готовности к ПЦР-амплификации.
Одностадийную ОТ-ПЦР использовали для детектирования РНК HEV в образцах, используя праймеры и зонды как обсуждалось ранее. Условия для анализа в каждой реакции были следующими:
a) реагенты: 5,0 мкл 4х TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Life Technologies), 0,08 мкл 100 мМ праймера F+R, 0,04 мкл 100 мМ зонда, 0,4 мкл SUPERase In (Life Technologies), 4,4 мкл воды и 10 мкл матрицы (всего 20 мкл)
b) реакция: 52°C 10 минут, 95°C 30 секунд и 40 циклов при 95°C 15 секунд, 56°C 45 секунд,
ПЦР и расчет значений порогового цикла (Ct) осуществляли с использованием системы АВ 7500 Real Time PGR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) и сопровождающего программного обеспечения согласно инструкциям производителя.
ПЦР проводили в формате количественного и качественного определения. Для количественной ПЦР, плазмидную кДНК, полученную из NIH, линеаризовали с помощью Mlul и транскрибировали с использованием набора mMESSAGE mMACHINE (Life Technologies) с получением РНК-транскриптов по 7,2 т.п.о. с 7-метилгуанозиновым кэпом и поли-А хвостом. Транскрипты очищали с использованием набора Ambion MegaClear (Life Technologies), подвергали количественному определению с использованием Quant-iT™ RiboGreen RNA Reagent and Kit (Invitrogen) и использовали в качестве стандартов для построения стандартных калибровочных кривых РНК.
Стандартные кривые РНК генерировали с помощью системы программного обеспечения АВ7500 путем откладывания значений Ct против логарифмов рассчитанных количеств копий для стандартов.
0
7
2
На Фиг. 5 (правая панель) показана типичная стандартная кривая. Все кривые имели широкий динамический диапазон в интервале от 10 до 10 копий на реакцию и были линейными с поправочным коэффициентом r>0,99. Процент эффективности амплификаций рассчитывали в виде %Е=[10(-1/угловой коэффициент)-1]*100. Исходя из n=22 стандартных кривых HEV qPCR, эффективность количественной ПЦР для HEV составила 100,4% (данные не показаны).
50
Для качественной ПЦР, лунки помечали как положительные или отрицательные на основании наличия положительного ПЦР-сигнала. Титры вируса рассчитывали в виде TCID/мл с использованием подходящих статистических методов: Spearman-Karber, IVIPN или Poisson.
Пример 5. Оценка эффективности анализа инфекционной способности HEV на основе ПЦР
Исследования по качеству анализов осуществляли для оценки операционных характеристик анализа инфекционной способности HEV. Оцениваемые параметры представляли собой точность, воспроизводимость, линейность, предел количественного обнаружения и динамический диапазон.
Критерии принятия были такими же, как типично используемые для других анализов титрования вирусов.
Результаты сведены в Таблицу 2 и показывают, что данные анализы прошли все тесты.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
HepG2: клетки гепатоцеллюлярной карциномы, полученные из Американской коллекции типовых культур (номер НВ-8065 в АТСС)
MPK: клетки почек минипигов, полученные из Американской коллекции типовых культур (номер CCL-66 в АТСС)
DMEM: среда Игла, модифицированная по Дульбекко
FBS: фетальная бычья сыворотка
НЕРЕS: N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота
NEAA: заменимые аминокислоты
NHG: смесь следующих компонентов: заменимые аминокислоты, фунгизон, HEPES и гентамицин
50
Титрование: процесс серийного разведения образца до установления ожидаемого вирусного титра и перенос этого разбавленного образца в чашку для определения значения TCID/мл
Титр: концентрация вещества (вируса) в растворе или эффективность такого вещества, определенная титрованием
SK: метод Спермана-Кербера представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с относительно высокими концентрациями вируса. Данный метод используют, когда доля положительных лунок при любом разведении составляет более 25%.
MPN: наиболее вероятное количество представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с относительно низкими концентрациями вируса. MPN используют, когда доля положительных лунок при всех разведениях составляет менее 25%.
Poisson: пуассоново распределение представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с экстремально низкими концентрациями вируса. Данный метод используют, когда не наблюдается никаких положительных лунок.
АТСС: Американская коллекция типовых культур
50
TCID: соответствует 50%-ной инфекционной дозе культуры ткани (конечная точка разведения). Она является мерой инфекционного вирусного титра, которая выражает количество вируса, необходимое для умерщвления 50% инфицированных клеток-хозяев или для вызывания цитопатического эффекта в 50% инокулированных клеток культуры ткани.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Okamoto Н (2011) Hepatitis Е virus cell culture models. Virus Research 161: 65-77.
2. Tanaka T, et al (2007) Development and evaluation of an efficient cell-culture system for Hepatitis E virus. J Gen Virol 88: 903-911.
3. Tanaka T, et al (2009) Development and Characterization of a Genotype 4 Hepatitis E Virus Cell Culture System Using a HE-JF5/15F Strain Recovered from a Fulminant Hepatitis Patient. J Clin Microbiol 47: 1906-1910.
4. Shukla P, et al (2011) Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. PNAS. 108 (6): 2438-2443.
5. Shukla P, et al (2012) Adaptation of a Genotype 3 Hepatitis E Virus to Efficient Growth in Cell Culture Depends on an Inserted Human Gene Segment Acquired by Recombination. J Virol 86 (10): 5697-5707
6. Предварительная заявка на патент США No 61/431377
7. Предварительная заявка на патент США No 61/554323
8. Заявка на патент США No. 13/978839
9. Международная РСТ заявка No. PCT/US2012/020830