Способ оценки рецептивности эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии
METHOD FOR ASSESSING ENDOMETRIAL RECEPTIVENESS IN ENDOMETRIOSIS-ASSOCIATED INFERTILITY

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии, гинекологии и репродуктологии и может быть использовано для выявления нарушений рецептивности эндометрия у женщин, страдающих эндометриозом и ассоциированным с ним бесплодием, с целью специфической диагностики имплантационных нарушений и прогноза вероятности наступления беременности в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
В настоящее время по данным мировой литературы выявлена тенденция к росту количества бесплодия и эндометриоза [1, 2, 3]. Так у 30-50% пациентов с эндометриозом диагностируется бесплодие, а у 25-50% бесплодных женщин - эндометриоз [4]. Несостоятельность рецепторного аппарата эндометрия характерна для пациенток с эндометриозом и нарушениями фертильности в виду его негативного влияния, в первую очередь, на экспрессию стероидных гормонов, приводящую к десинхронизации и нарушениям структурно-функциональных взаимоотношений в эндометрии, необходимых для успешной имплантации [5, 6]. Существует множество способов оценки рецептивности эндометрия, но в случае сопутствующего диагноза эндометриоза и ассоциированного с ним эндометриального фактора инфертильности, из-за прежде всего провоспалительного влияния на эндометрий и характерную резистентность к прогестерону, используемые методы не всегда эффективны ввиду ложных.результатов из-за применения неспецифичных маркеров. Таким образом, для диагностики рецептивности эндометрия у женщин, страдающих эндометриоз-ассоциированным бесплодием, требуется поиск новых специфичных для этого заболевания маркеров.
Среди известных в научно-медицинской и патентной литературе методов диагностики рецептивности эндометрия при эндометриозе нет ни одного, но общие методы диагностики рецептивности эндометрия известны.
Известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки уровня экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии женщин с бесплодием и повторными неудачами программы ЭКО (патент РФ 2580629, 15.05.2015 г.). Установлено, что в период «окна имплантации» рецепторный эндометрий характеризуется средней стадией фазы секреции, зрелыми пиноподиями более чем на 20% поверхностного эпителия и высоким уровнем экспрессии эзрина, как в эпителиальном компартменте, так и в пиноподиях. Изобретение позволяет прогнозировать наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и естественных циклах у женщин с бесплодием.
Недостатком данного способа прогнозирования является ориентация только на один из показателей из целого спектра молекул рецептивности эндометрия - экспрессию фактора адгезии - эзрина. Кроме того, способ прогнозирования основан только на исследовании пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и не учитывал другие факторы нарушения рецептивности эндометрия, такие как эндометриоз.
Известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в "окно имплаитации" в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программы ЭКО (патент РФ 2617515, 22.04.2016 г.). Прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают отставание секреторной трансформации эндометрия, снижение количества клеток, содержащих зрелые пиноподии в поверхностном эпителци, менее чем 20%, а также низкую экспрессию (<2 баллов) GnRG и GnRGR.
Недостатками способа являются отсутствие системной патогномоничной детерминации специфических молекул, характеризующих рецептивность эндометрия, лежащих в основе регуляции имплантации, а также отсутствием специфичных для эндометриоз-ассоциированного бесплодия маркеров. Установленная модель с целью прогнозирования имплантационных нарушений базировалась только на анализе эндометриального паттерна у женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия.
Известен способ оценки рецептивности эндометрия в период "имплантационного окна" (патент РФ 2651762С1, 23.04.2018 - прототип). Для достижения этой цели исследователи методом пайпель-биопсии эндометрия на 20-23 день менструального цикла проанализировали на основании метода иммуногистохимии с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и с применением ключевых биомолекул, отвечающих за имплантацию: стандартный набор моноклональных и поликлональных антител ERα в строме, PR в строме, р53 в железах, bcl 2 в строме, CD95 в строме, Ki67 в строме, LIFR в железах, LIF в железах эндометрия. На основании полученных результатов исследования авторы рассчитали прогноз рецептивности эндометрия по формуле: d=-l,389×1+0,022×2-0,044×3-0,019×4+0,041×5+0,006×6+0,015×7-3,248, где x1 - индекс ER/PR в строме эндометрия (баллы H-score для определения ядерной экспрессии ER и PR), х2 - р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х3 - bcl 2 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х4 - CD95+ в строме эндометрия (% окрашенных клеток), х5 - Ki67 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х6 - LIF-R в железах эндометрия (баллы H-score), х7 - LIF в железах эндометрия (баллы H-score). При значениях d>0 эндометрий характеризовали как рецептивный, при d≤0 эндометрий характеризуется как нерецептивный.
Недостатками данного метода являлось отсутствие оценки патогномоничных для эндометриоз-ассоциированной инфертильности биомолекул, отражающих эпителиомезенхимальные взаимоотношения в эутопическом эндометрии, приводящие к ложным результатам при исследовании рецептивности эндометрия у данной когорты пациенток.
Решаемой технической проблемой явилась необходимость повышения точности определения рецептивности эндометрия при бесплодии, ассоциированном с эндометриозом в период «имплантационного окна».
Учитывая, что стандартные методы оценки рецептивности эндометрия не специфичны и не чувствительны для эндометриального фактора инфертильности, обусловленного эндометриозом, в виду влияния множества различных причин (например, таких ассоциированных состояний как хронический эндометрит и/или синдром «тонкого эндометрия» и др.), в первую очередь, дизрегулирующих эстрогеновые и прогестероновые рецепторы, которые отражают готовность эндометрия к имплантации, предложенный нами способ, основанный на анализе комплекса патогномоничных маркеров эндометриального фактора несостоятельности, расширяет возможности оценки рецептивности у данной когорты пациенток и позволяет прогнозировать восприимчивость эндометрия к имплантации бластоцисты в период «имплантационного окна».
Согласно ряду зарубежных работ [7-10] и проведенного нами собственного исследования продемонстрирована высокая специфичность для эндометриоз-ассоциированного бесплодия таких транскрипционных факторов как GATA2, GATA6, SF-1 и маркера рецептивной состоятельности НОХА10, связанных единым патогенетическим механизмом - реализацией резистентности к прогестерону. Так, GATA6 и SF-1, экспрессия которых в нескомпроментированном эндометриозом эндометрии отсутствует, потенциируют воспалительные каскады, участвуя в стероидогенезе, что приводит к нарушению локального гормонального баланса, необходимого для активации прогестерон-зависимых сигнальных путей, запускающих механизмы, отвечающие за успешную имплантацию. В связи с этим GATA6 и SF-1 являются маркерами прогестерон-резистентного состояния рецепторов эутопического эндометрия при эндометриозе. В свою очередь, GATA2, являясь одним из транскрипционных факторов, регулирующих прогестерон-зависимый сигнальный путь имплантационной состоятельности эндометрия, характеризует прогестерон-устойчивое состояние рецепторов, но его высокая экспрессия, специфичная для эндометриоз-ассоциированного бесплодия, дизрегулирует данный путь. Маркер рецептивной состоятельности эндометрия - НОХА10 - обобщает все изменения, происходящие в эндометрии в связи с нарушениями регуляции преимущественно прогестероновых сигнальных путей, и отражает снижение имплантационного потенциала эндометрия при эндометриоз-ассоциированной инфертильности.
Достигаемым техническим результатом является точная оценка восприимчивости эндометрия к имплантации бластоцисты в период «имплантационного окна» у пациенток с бесплодием, обусловленном эндометриозом.
Способ основан на иммуногистохимическом исследовании уровней экспрессии ключевых биомолекул в эутопическом эндометрии в период «окна имплантации», отвечающих за резистентность к прогестерону при эндометриозе, дизрегулирующую имплантационную функцию эндометрия с целью прогнозирования несостоятельности эндометриального паттерна.
Разработан способ оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна», согласно которому на 7 день после пика лютеинизирующего гормона, определяемого в сыворотке крови при динамическом исследовании в околоовуляторный период (как правило, этот период соответствует 20-22 дням менструального цикла) производят пайпель-биопсию эндометрия. Полученный материал исследуют методом иммуногистохимии с применением наборов поликлональных антител к следующим маркерам: НОХА10, GATA2, GATA6, SF-1 в строме эндометрия. Производится подсчет процента окрашенных клеток, после чего проводится оценка реакции: нет реакции - ≤1%, низкая экспрессия - 2-10%, умеренная экспрессия - 11-50%, выраженная экспрессия - ≥51%. Трактовка ИГХ реакции проводится путем сравнения полученных данных с нормами значений, полученных от здоровых фертильных женщин без эндометриоза.
В настоящее исследование были включены 65 женщин в возрасте от 29 до 40 лет (средний возраст составил 35±4,2 года) с морфологически и лапароскопически верифицированным диагнозом наружный генитальный эндометриоз (код по МКБ10 - N80.0), а также инфертильностью (код по МКБ10 N 97.7, установленные в рубрике другие формы женского бесплодия).
Основную группу (n=32) составили пациентки с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием, вызванным эндометриальным фактором (средняя продолжительность бесплодия 4,5±0,8), имеющие de facto в анамнезе 2 и более безуспешные попытки переноса 1 эмбриона хорошего качества в полость матки при проведении программ ЭКО (группа ЭАБ - эндометриоз-ассоциированного бесплодия).
Группу сравнения (n=33) составили пациентки с наружным генитальным эндометриозом, реализовавшие свою репродуктивную функцию и не имевшие в анамнезе инфертильности, которые обратились Для хирургического лечения тазовой боли, ассоциированной эндометриозом (группа ЭФ - фертильные женщины с эндометриозом).
Группу морфологического контроля (n=13) составили фертильные женщины без эндометриоза, имеющие в анамнезе 2 и более родов доношенными здоровыми детьми, давшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, взятых методом пайпель-биопсии в период предполагаемого «окна имплантации» - на 7 день после пика лютеинизирующего гормона, определяемого в сыворотке крови при динамическом исследовании в околоовуляторный период (как правило, этот период соответствует 20-22 дням менструального цикла) - проводилось с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Ventana», «Cell Marque» и «Diagnostic BioSystems» США. Иммуногистохимическое окрашивание производилось в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHdSH (США) на парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигенов в СВЧ-печи с использованием соответствующих стандартных антител выявляли маркеры (таблица 1).
Был проведен анализ рецепторного аппарата эндометрия у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием, фертильных женщин с эндометриозом и фертильных женщин без эндометриоза, последние составили группу морфологического контроля (таблица 2).
В ходе исследования выявлено, что в эутопическом эндометрии в период «окна имплантации» у пациенток с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (группа ЭАБ) в сравнении с биоптатами женщин с эндометриозом и сохранной фертильной функцией (группа ЭФ) установлены достоверные иммуногистохимические признаки резистентности к прогестерону на фоне дисфункции эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в связи с транскрипторными нарушениями. Об этом свидетельствует статистически значимая высокая экспрессия GATA2 в строме (в 1,6 раза; 76,4% против 49,1%, соответственно), GATA6 в строме (в 1,7 раз; 2% против 1,17%, соответственно) и SF-1 в строме (в 1,5 раза; 2% против 1,3%, соответственно) при сравнении в группах ЭАБ и ЭФ соответственно (р<0,05). Кроме того, на фоне резистентности к прогестерону в эутопическом эндометрии женщин исследуемых групп определяется нарушение рецептивной состоятельности данного паттерна, обусловленное статистически значимым снижением экспрессии НОХА10 в стромальном компартменте (в 3,0 раза; 61,6% против 21%, соответственно, Р<0,05).
Таким образом, на основании полученных статистически значимых результатов установлены признаки имплантационной несостоятельности эутопического эндометрия у женщин с эндометриальным фактором инфертильности, вызванной эндометриозом.
При иммуногистохимическом исследовании биоптатов эутопического эндометрия у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием были установлены патогномоничные пределы чувствительности для эндометриоз-специфичных маркеров (GATA2, GATA6, SF-1) и маркера рецептивной состоятельности эндометрия (НОХА10) в стромальном компартменте эндометрия (таблица 3).
С целью прогноза наступления имплантации подсчитывается сумма полученных баллов GATA2+GATA6+SF-1+HOXA10:
4 балла - экстремально высокий риск имплантационной несостоятельности (прогноз отрицательный);
3 балла - высокий риск имплантационной-несостоятельности (прогноз отрицательный);
2 балла - умеренный риск имплантационной несостоятельности (прогноз сомнительный);
0-1 балл - низкий риск имплантационной несостоятельности (прогноз положительный).
Таким образом, в эутопическом эндометрии у пациенток с эндометриозом, обусловленным эндометриальным фактором инфертильности, наблюдаются в разной степени выраженности нарушения рецепторного аппарата эндометрия, связанные с повышенной экспрессией эндометриоз-специфичных маркеров и снижением экспрессии маркера рецептивной состоятельности в период «окна имплантации», свидетельствующие о реализации резистентности к прогестерону, транскрипторных нарушениях и ухудшении восприимчивости эндометрия, что в совокупности клинически детерминируется имплантационными неудачами.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят биопсию эндометрия в период предполагаемого «окна имплантации» - на 7 день после пика лютеинизирующего гормона, определяемого в сыворотке крови при динамическом исследовании в околоовуляторный период (как правило, этот период соответствует 20-22 дням менструального цикла) в спонтанном цикле, либо в цикле, предшествующем проведению ЭКО, с помощью аспирационной кюретки. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30, заливают в парафин на станции Leica EG 1150 (Германия). ИГХ окрашивание производят в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (США) на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Уровень экспрессии НОХА10, GATA2, GATA6, SF-1 в строме эндометрия определяют в соответствие с описанными выше методиками с применением соответствующих моноклональных и поликлональных антител. Производится подсчет процента окрашенных клеток, после чего производится оценка реакции: нет реакции - ≤1%, низкая экспрессия - 2-10%, умеренная экспрессия -11-50%, выраженная экспрессия - ≥51%. Трактовка результатов ИГХ реакции проводится с по стандартным методам оценки эстрогеновых и прогестероновых рецепторов. Трактовка ИГХ реакции для эндометриоз-специфических маркеров и маркера рецептивной несостоятельности проводится путем сравнения полученных данных со следующими параметрами:
если экспрессия GATA2 ≥76%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если <76%, низкий - 0 баллов;
если экспрессия GATA6 ≥2%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если <2%, низкий - 0 баллов;
если экспрессия SF-1 ≥2%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если <2%, низкий - 0 баллов;
если экспрессия НОХА10 ≤21%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если >21%, низкий - 0 баллов.
Далее с целью прогноза наступления беременности подсчитывается сумма полученных баллов GATA2+GATA6+SF-1+HOXA10 и делаются следующие заключения:
4 балла - очень высокий риск имплантационной несостоятельности (прогноз отрицательный);
3 балла - высокий риск имплантационной несостоятельности (прогноз отрицательный);
2 балла - умеренный риск имплантационной несостоятельности (прогноз сомнительный);
0-1 балл - низкий риск имплантационной несостоятельности (прогноз положительный).
Клинический пример 1.
Пациентка И., 34 лет, страдает первичным бесплодием при регулярной половой жизни без контрацепции в браке в течение 8 лет. Супруг обследован, мужской фактор бесплодия исключен. Соматически отягощена хроническим гастритом и хроническим циститом, в стадии ремиссии. Менархе с 13 лет, цикл 28-30 дней, регулярный, продолжительность менструаций 4-5 дней, безболезненные, характер менструаций умеренный. Гинекологические заболевания - наружный генитальный эндометриоз. В 2015 году проведена лапароскопия, энуклеация капсулы эндометриоидной кисты левого яичника (диагноз эндометриоза верифицирован морфологически). После операции было проведено гормональное лечение аГнРГ (3,75 мг подкожно 1 раз в месяц) в течение 3 месяцев, далее гестагенами (диеногест 2 мг в сутки) в течение 6 месяцев, после чего было рекомендовано восстановление фертильности естественным путем - беременность не наступила. В 2018 году по поводу рецидива наружного генитального эндометриоза (эндометриоидная киста левого яичника) была выполнена аналогичная операция, диагноз эндометриоза был повторно подтвержден при морфологическом исследовании. После гормональной терапии гестагенами (диеногест 2 мг в сутки) в течение 3 месяцев было рекомендовано лечение бесплодия методами ВРТ. В 2019 году в рамках программы ЭКО была проведена контролируемая овариальная стимуляция и получено 10 эмбрионов, из которых 5 -хорошего качества (4 АВ), выполнена их криоконсервация. При переносе 1 эмбриона хорошего качества (4 АВ) как в стимулированном цикле, так и в криоцикле беременность не наступила. По данным сонографического исследования перед переносом эмбрионов не было выявлено признаков рецидива наружного генитального эндометриоза и пролиферативных болезней эндометрия (толщина, структура и кровоснабжение эндометрия соответствовали дню менструального цикла на момент исследования). Перед проведением следующей попытки переноса эмбрионов была произведена контрольная пайпель-биопсия эндометрия на 22 день менструального цикла.
По данным иммуногистохимического исследования получены следующие результаты: НОХА10 в строме=15% (1б); GATA2 в строме=93,6% (1б); GATA6 в строме=2,6% (1б); SF-1 в строме=2,5% (1б).
Сумма баллов составляет 4б, что свидетельствует об очень высоком риске имплантационной несостоятельности эндометрия и отрицательном прогнозе о вероятности имплантации.
После этого пациентка направлена- на повторную попытку переноса эмбриона хорошего качества (4АВ) в следующем менструальном цикле, по исходу которого беременность не наступила.
Клинический пример 2.
Пациентка Е, 35 лет, обратилась с жалобами на отсутствие наступления беременности при регулярной половой жизни в браке без контрацепции в течение 10 лет. Соматически не отягощена. Менструальная функция в норме. В анамнезе 2 операции по поводу наружного генитального эндометриоза (II-III стадии AFS), диагноз которого установлен на основании гистологического результата исследования макропрепаратов. Было проведено консервативное лечение различными гормональными препаратами в течение 1 года после обеих операций. В связи с отсутствием наступления беременности была направлена в центр ВРТ для лечения бесплодия. В анамнезе 1 неудачная попытка переноса эмбриона хорошего качества (4АВ) в стимулированном цикле и 1 неудачная попытка переноса генетически полноценного эуплоидного эмбриона хорошего качества (перед переносом была проведена преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии). Результаты диагностической гистероскопии на 9 день менструального цикла после 2-х неудачных попыток переноса эмбрионов не выявили патологии в полости матки; аспират из полости матки показал соответствие пролифертивной фазе менструального цикла. Перед проведением следующей попытки переноса эмбрионов была произведена контрольная пайпель-биопсия эндометрия на 22 день менструального цикла.
По данным иммуногистохимического исследования получены следующие результаты: НОХА10 в строме=30% (0б); GATA2 в строме=81% (1б); GATA6 в строме=1% (0б); SF-1 в строме=1% (0б).
Сумма баллов составляет 1б, что свидетельствует о низком риске имплантационной несостоятельности эндометрия и положительном прогнозе о вероятности имплантации.
В следующем менструальном цикле был произведен перенос 1 эуплоидного эмбриона хорошего качества, наступила клиническая прогрессирующая маточная беременность (подтвержденная визуализацией сердцебиения эмбриона и соответствующему сроку уровню ХГЧ в крови), таким образом фертильность была достигнута.
Список литературы:
1. Vander Borght, М., Wyns, С.Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clin Biochem. 2018; 62: 2-10.
2. M.C. Inborn, P. Patrizio. Infertility around the globe: new thinking on gender, reproductive technologies and global movements in.the 21st century. Hum Reprod Update. 2015; 21 (4); 411-426.
3. Адамян JI.B. Клинические рекомендации по ведению больных. Эндометриоз: диагностика, лечение и реабилитация. 2016 г.
4. М.Р. Оразов, В.Е. Радзинский, М.Б. Хамошина, Е.В. Давтеладзе, В.Б. Шустова, Ю.Р. Цораева, Д.С.Новгинов. Бесплодие, ассоциированное с эндометриозом: от легенды к суровой реальности. Трудный пациент.2019: 1-2(17): 6-12.
5. Bruce A Lessey, J. Julie Kim. Endometrial Receptivity in Eutopic Endometrium of Women with Endometriosis It is affected, let me show you why. Fertil Steril. 2017 Jul; 108(1): 19-27.
6. M.P. Оразов, М.Б. Хамошина, JI.M. Михалева, С. В. Волкова, М.З. Абитова, В.Б. Шустова, Т.Н. Хованская. Молекулярно-генетические особенности состояния эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии. Трудный пациент; 1(18): 6-15. 2020.
7. Dyson М.Т, Roqueiro D, Monsivais D, Ercan CM, Pavone ME, Brooks DC, Kakinuma T, Ono M, Jafari N, Dai Y, Bulun SE. Genome-wide DNA methylation analysis predicts an epigenetic switch for GATA factor expression in endometriosis. PLoS Genet. 2014; 10: e1004158.
8. Bernardi LA, Dyson MT, Tokunaga H, Sison C, Oral M, Robins JC, Bulun SE. The Essential Role of GATA6 in the Activation of Estrogen Synthesis in Endometriosis. Reprod Sci. 2019; 26(1): 60-9.
9. Izawa M, Taniguchi F, Harada T. GATA6 expression promoted by an active enhancer may become a molecular marker in endometriosis lesions. Am J Reprod Immunol. 2019; 81(2): el3078.
10.  HOXA-10 gene expression in ectopic and eutopic endometrium tissues: Does it differ between fertile and infertile women with endometriosis? Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2019; 233: 43-8.