УСТРОЙСТВО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНОЙ ПОДВИЖНОСТИ
DEVICE FOR ANALYSIS OF CELLULAR MOBILITY

Настоящее изобретение относится к мезомасштабной жидкостной системе для анализа клеточной подвижности в образце, в частности, подвижности клеток в образце спермы. Настоящее изобретение также относится к способу оценки количества и качества подвижных клеток в образце и к способу извлечения подвижных клеток из неподвижных клеток, в том числе с помощью мезомасштабной жидкостной системы.
Уровень техники
Информированность о снижении функции мужской фертильности была высокой в течение последних десятилетий, создавая, таким образом, спрос на анализ образцов спермы. В частности, известно, что концентрация подвижных сперматозоидов в образце является наиболее значимым фактором в отношении оценки фертильности образца (Tomlinson и др., 2013, Human Fertility, 1-19). В настоящее время анализ для оценки количества и подвижности клеток в образце спермы, как правило, осуществляется профессионалами в лабораторных условиях, а бытовым диагностическим устройствам для оценки мужской фертильности в предыдущем уровне техники было уделено внимание только в ограниченной степени. Такие бытовые диагностические устройства должны быть предпочтительно простыми в применении, и они должны быть доступными по низким ценам с целью иметь характер одноразового применения без необходимости в дополнительном оборудовании, таком как микроскопы, электроды для измерений полного сопротивления и тому подобном.
Одно устройство для испытания образца спермы в комфорте домашней среды описано в заявке WO 2012/126478. В заявке WO 2012/126478 описана мезомасштабная жидкостная система, способная отделять подвижные клетки в зависимости от их подвижности и обеспечивать возможность обнаружения и определения количества клеток. Система содержит первую камеру для анализа, находящуюся в жидкостном сообщении с дополнительной камерой для анализа через канал, причем канал имеет входное отверстие, находящееся в жидкостном сообщении с первой камерой для анализа, и выходное отверстие, находящееся в жидкостном сообщении с дополнительной камерой для анализа, при этом площадь поперечного сечения входного отверстия больше, чем площадь поперечного сечения выходного отверстия. Каждая камера для анализа дополнительно содержит блок разделения твердой и жидкой фаз, определяющий верхнюю поверхность, обращенную к камере для анализа, и нижнюю поверхность, обращенную к выводящему каналу, с тем, чтобы обеспечить возможность жидкостного сообщения между камерой для анализа и выводящим каналом через блок разделения твердой и жидкой фаз. Соединенные камеры для анализа обеспечивают возможность подвижным клеткам перемещаться из первой камеры для анализа в следующую, что обеспечивает оценку подвижности клеток в образце.
Заявка WO 2012/126478 также описывает вариант осуществления мезомасштабной жидкостной системы, дополнительно содержащей проницаемый для клеток фильтр, образующий сторону внесения образца, противоположную стороне кондиционирующей среды, при этом проницаемый для клеток фильтр имеет размер пор, позволяющий прохождение подвижных клеток через фильтр. Проницаемый для клеток фильтр используется для сведения к минимуму смешивание жидкости образца, внесенного на стороне внесения образца, с кондиционирующей средой, присутствующей или добавленной на сторону кондиционирующей среды. Таким образом, проницаемый для клеток фильтр предусматривается для того, чтобы клетки не перемещались со стороны внесения образца к стороне кондиционирующей среды посредством конвекции, таким образом, клетки, присутствующие на стороне кондиционирующей среды будут представлять собой подвижные клетки, которые пересекли проницаемый для клеток фильтр, проходя через него.
Существуют некоторые недостатки, связанные с устройствами предшествующего уровня техники, которые предусматривают ограниченную точность при оценке количества подвижных клеток. В частности, имеющиеся в настоящее время устройства не способны в достаточной степени снизить загрязнение, например, неподвижными клетками, даже в том случае, когда встроены проницаемые для клеток фильтры. Это, в свою очередь, означает, что неподвижные клетки могут быть включены в оценочные значения клеточной подвижности. Кроме того, миграция подвижных сперматозоидов через жидкостные каналы может снизить концентрацию в точке определения количества до уровня, который трудно обнаружить. Это особенно свойственно системам, содержащим несколько последовательно соединенных камер для образца.
Поэтому целью настоящего изобретения является устранение этих недостатков и предоставление мезомасштабной жидкостной системы с улучшенной точностью оценивания, и вместе с этим соответствующей требованиям функционального бытового диагностического устройства.
Описание изобретения
Первый аспект настоящего изобретения относится к мезомасштабной жидкостной системе, содержащей основу, имеющую камеру для образца и камеру для анализа; при этом камера для образца содержит проницаемый для клеток фильтр, имеющий отделение для внесения образца и отделение для кондиционирующей среды;
камера для образца содержит впускное отверстие для образца в отделении для внесения образца;
камера для анализа содержит входное отверстие и выходное отверстие;
отделение для кондиционирующей среды находится в жидкостном сообщении с входным отверстием камеры для анализа через канал;
при этом отделение для внесения образца находится ниже проницаемого для клеток фильтра, а отделение для кондиционирующей среды находится выше проницаемого для клеток фильтра.
Мезомасштабная жидкостная система в соответствии с настоящим изобретением может применяться для оценки количества подвижных клеток в образце, в частности, в жидком образце. В большинстве случаев образец добавляется в отделение для внесения образца, из которого подвижные клетки, присутствующие в образце, будут проходить через проницаемый для клеток фильтр в кондиционирующую среду, находящуюся в отделении для кондиционирующей среды. Жидкость в отделении для кондиционирующей среды может перемещаться в камеру для анализа, где клетки могут быть проанализированы, например, количественно определены. Поскольку подвижные клетки отделяются от неподвижных клеток, которые не проходят проницаемый для клеток фильтр, клетки, количественно определенные в камере для анализа, являются подвижными клетками.
Руководство для настоящего изобретения "Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию и обработке человеческой спермы" (пятое издание, Всемирная организация здравоохранения, 2010, ISBN 9789241547789) содержит справочную информацию о сперматозоидах, и данное руководство включено в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.
Основа может быть изготовлена из любого подходящего материала. Камера для образца может иметь любую подходящую форму или размер при условии, что камера для образца может быть разделена на два отдельных отделения посредством проницаемого для клеток фильтра. Проницаемый для клеток фильтр образует отделение для кондиционирующей среды и отделение для внесения образца, и проницаемой для клеток фильтр, таким образом, считается, имеющим сторону кондиционирующей среды и сторону внесения образца, обращенные к отделению для кондиционирующей среды и отделению для внесения образца соответственно. При предполагаемом применении системы кондиционирующая среда добавляется в отделение для кондиционирующей среды. Образец для анализа добавляют в отделение для внесения образца. Порядок добавления для кондиционирующей среды и образца не важен, хотя в конкретном варианте осуществления образец добавляется в отделение для внесения образца перед тем, как кондиционирующая среда добавляется в отделение для кондиционирующей среды. Таким образом, отделение для внесения образца и отделение для кондиционирующей среды соответственно могут иметь любой подходящий размер. Проницаемый для клеток фильтр образует отделение для внесения образца и отделение для кондиционирующей среды посредством перекрытия поперек камеры для образца таким образом, что присутствует только жидкостное сообщение между двумя отделениями через проницаемый для клеток фильтр. Проницаемый для клеток фильтр может иметь любую подходящую конструкцию, материал и форму, что позволяет подвижным клеткам, подлежащим анализу, проходить через фильтр, обеспечивая, таким образом, прохождение клеток из отделения для внесения образца в отделение для кондиционирующей среды. В частности, проницаемый для клеток фильтр выбирается с учетом размера и других характеристик отделяемых клеток, например, с учетом размера клеток по сравнению с размером пор проницаемого для клеток фильтра. Проницаемый для клеток фильтр, например поры проницаемого для клеток фильтра, может содержать материал, к которому притягиваются подвижные клетки. Отделение для внесения образца находится ниже проницаемого для клеток фильтра, а отделение для кондиционирующей среды, соответственно, находится выше проницаемого для клеток фильтра. Термин "ниже", следует рассматривать по отношению к гравитационному полю, так как сила тяжести будет прикладываться в направлении "сверху" "вниз". Проницаемый для клеток фильтр может перекрывать отделение для образца любым подходящим способом, который предусматривает расположение отделения для образца ниже отделения для кондиционирующей среды.
Авторы настоящего изобретения неожиданно выявили, что эффект применения проницаемого для клеток фильтра для отделения подвижных клеток от неподвижных клеток значительно улучшается, когда отделение для внесения образца находится ниже проницаемого для клеток фильтра, а отделение для средства находится выше проницаемого для клеток фильтра. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки количества подвижных клеток в образце, включающему этапы: обеспечения проницаемого для клеток фильтра;
внесения образца, содержащего подвижные клетки ниже проницаемого для клеток фильтра;
обеспечения возможности прохождения подвижных клеток в образце через проницаемый для клеток фильтр;
выявления подвижных клеток, прошедших через фильтр. В еще одном дополнительном аспекте данное изобретение относится к способу извлечения подвижных клеток из неподвижных клеток, включающему этапы: обеспечения проницаемого для клеток фильтра;
внесения ниже проницаемого для клеток фильтра образца, содержащего подвижные клетки и неподвижные клетки;
обеспечения возможности прохождения подвижных клеток в образце через проницаемый для клеток фильтр;
извлечения подвижных клеток, прошедших через фильтр. В большинстве случаев все видоизменения и варианты осуществления, описанные для любого аспекта изобретения, имеют отношение к любому другому аспекту изобретения, а отличительные признаки вариантов осуществления могут свободно комбинироваться.
Система или способы изобретения могут использовать среду для кондиционирования клеток, которая присутствует или добавляется ниже проницаемого для клеток фильтра. "Среда для кондиционирования клеток" в контексте изобретения представляет собой любую жидкость, предназначенную для поддержки клеток в образце, например, для сохранения клеток жизнеспособными, и она может, например, при необходимости содержать питательные вещества, соли, буферные растворы и/или модификаторы вязкости для конкретных клеток. Кроме того, система или способы изобретения могут использовать среду образца, которая присутствует или добавляется выше проницаемого для клеток фильтра. "Среда образца" может также при необходимости содержать питательные вещества, соли, буферные растворы и/или модификаторы вязкости для конкретных клеток, и она может быть такой же, как и среда для кондиционирования клеток, или среда образца и среда для кондиционирования клеток могут иметь разный состав. В некоторых вариантах осуществления среда для кондиционирования клеток и/или среда образца могут содержать маркирующее вещество. В определенном варианте осуществления мезомасштабная жидкостная система или способы не используют среду образца.
Любой подходящий способ определения количества подвижных клеток может применяться в системе в соответствии с настоящим изобретением, и камера для анализа может иметь любую подходящую форму или размер, которые обеспечивают выбранный способ. Камера для анализа содержит входное отверстие и выходное отверстие. В контексте изобретения "отверстие" является любым подходящим отверстием, обеспечивающим возможность жидкостного сообщения через отверстие. Отверстие может быть открытым автоматически, или оно может быть отверстием, закрывающимся при необходимости посредством исполнительного механизма, например, клапана. Входное отверстие обеспечивает доступ для жидкости, например, для кондиционирующей среды, содержащей подвижные клетки в камере для анализа. Выходное отверстие позволяет кондиционирующей среде выходить из камеры для анализа, а затем кондиционирующая среда может вноситься в отделение для кондиционирующей среды через выходное отверстие камеры для анализа. Кроме того, отверстия камеры для анализа обеспечивают возможность протекания жидкости через настоящую мезомасштабную систему. Входное отверстие и выходное отверстие могут иметь любую подходящую конструкцию, которая обеспечивает данные функциональные возможности, а также отверстия могут находиться в жидкостном сообщении с жидкостными каналами. В конкретном варианте осуществления впускное отверстие для образца находится в жидкостном сообщении, например, через канал, с приемным гнездом для приема образца, например образца спермы.
Соответственно, система и способы улучшают отделение подвижных клеток от неподвижных клеток в образце, где подвижные клетки затем могут быть подсчитаны в камере для анализа. Перемешивание жидкости образца с кондиционирующей средой сводится к минимуму, когда отделение для внесения образца отделено от отделения для кондиционирующей среды проницаемым для клеток фильтром. Авторы настоящего изобретения полагают, что наряду с тем, что применение проницаемого для клеток фильтра не может полностью предотвратить конвекцию, например, неподвижных клеток со стороны внесения образца к стороне кондиционирующей среды, они, между тем, наблюдали значительное снижение конвекции через проницаемый для клеток фильтр в системе в соответствии с настоящим изобретением, то есть, когда отделение для внесения образца находится ниже отделения для кондиционирующей среды. В контексте настоящего изобретения термин "конвекция" обычно описывает любой пассивный перенос массы, например, ситуацию, когда жидкие компоненты захватываются вместе с течением жидкости. Авторы настоящего изобретения полагают, что уменьшенная конвекция, а также диффузия, могут по меньшей мере частично относиться к силе тяжести, действующей на образец. То есть, направленная вниз сила действует на все частицы, такие как клетки в образце, ограничивая, таким образом, пассивное перемещение в направлении вверх. Неподвижные клетки, не имеющие никаких средств противодействия силе тяжести в меньшей степени перемещаются благодаря конвекции и диффузии через проницаемый для клеток фильтр. С другой стороны подвижные клетки, обладающие средствами для активного перемещения себя в любом направлении в жидкости образца, могут легко преодолеть силу тяжести, действующую на них, и посредством прохождения переместить себя через проницаемый для клеток фильтр. В частности, когда подвижные клетки сталкиваются с проницаемым для клеток фильтром, они, как правило, имеют склонность проходить вдоль встреченной поверхности, проходя, таким образом, через проницаемый для клеток фильтр. Таким образом, расположение образца ниже проницаемого для клеток фильтра в большей степени обеспечивает то, что клетки пассивно не перемещаются от стороны внесения образца к стороне кондиционирующей среды посредством конвекции. Таким образом, во время анализа образца спермы в системе в соответствии с настоящим изобретением клетки, присутствующие на стороне кондиционирующей среды, будут представлять собой подвижные клетки, которые пересекли проницаемый для клеток фильтр посредством прохождения через него. Дополнительным преимуществом настоящей системы является то, что расстояние, которое подвижные клетки должны будут пройти, является коротким по сравнению с системами, в которых подвижность измеряется расстоянием, пройденным клетками в канале. Таким образом, более короткие расстояния ведут к меньшему времени, необходимому для проведения анализа.
Авторы настоящего изобретения также выявили, что мезомасштабная жидкостная система и способы согласно изобретению дополнительно уменьшают загрязнение кондиционирующей среды в отделении для кондиционирующей среды. Образцы, такие как образцы спермы, как правило, содержат дополнительные частицы, клетки и молекулы, которые также могут проходить через проницаемый для клеток фильтр в кондиционирующую среду. Однако, внесение образца ниже проницаемого для клеток фильтра также уменьшает конвекцию и диффузию таких дополнительных компонентов образца, которые могли бы по другим причинам снизить качество последующего анализа содержимого для кондиционирующей среды. В частности, образец спермы, например, жидкость образца, может содержать ферменты, которые могут иметь отрицательное воздействие на анализ и, следовательно, отделение подвижных клеток от таких ферментов, содержащихся в жидкости образца, особенно целесообразно.
Следовательно, авторы настоящего изобретения выявили, что внесение образца с подвижными клетками ниже проницаемого для клеток фильтра, например, путем предоставления устройства, имеющего отделение для внесения образца ниже проницаемого для клеток фильтра, а отделение для кондиционирующей среды выше проницаемого для клеток фильтра, приводит к снижению загрязнения кондиционирующей среды неподвижными клетками, а также дополнительными загрязняющими компонентами образца. Это обеспечивает то, что только подвижные клетки поступят в камеру для анализа, что, таким образом, предотвращает негативное влияние неподвижных клеток, мусора и других компонентов, присутствующих в образце, на результат испытания в виде ложных положительных и/или ложноотрицательных вкладов.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения отделение для кондиционирующей среды дополнительно содержит впускное отверстие для среды, которое может находиться в жидкостном сообщении с внешней средой. Впускное отверстие для среды также может способствовать проникновению жидкости, например, среды для кондиционирования образцов, содержащей компоненты, необходимые для анализа клеток, и, кроме того, впускное отверстие для среды может обеспечивать функцию сброса давления, так как оно может находиться в жидкостном сообщении с внешней средой. Таким образом, впускное отверстие для среды обеспечивает неактивное перемещение образца в камере для внесения образца через проницаемый для клеток фильтр в отделение для кондиционирующей среды и/или камеру для анализа, когда отрицательное относительное давление прикладывается через выходное отверстие камеры для анализа, или когда положительное относительное давление прикладывается через впускное отверстие для среды, поскольку падение давления на проницаемом для клеток фильтре значительно больше, чем падение давления во впускном отверстии для среды. При загрузке жидкости или извлечении в или из отделения для кондиционирующей среды либо через входное отверстие камеры для анализа, либо через впускное отверстие для среды, прикладываемое давление будет сбрасываться через противоположное отверстие. Соответственно, когда кондиционирующая среда загружается в отделение для кондиционирующей среды через, например, входное отверстие камеры для анализа, давление, прикладываемое посредством любой избыточной кондиционирующей среды, будет сбрасываться через впускное отверстие для среды. Когда кондиционирующая среда извлекается из отделения для кондиционирующей среды через входное отверстие камеры для анализа, давление сбрасывается из впускного отверстия для среды, что, таким образом, предотвращает всасывание, например, клеток из камеры для внесения образца через проницаемый для клеток фильтр.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения камера для анализа содержит задерживающий клетки фильтр, имеющий верхнюю поверхность, обращенную к входному отверстию, и нижнюю поверхность, обращенную к выходному отверстию. Задерживающий клетки фильтр может иметь любую надлежащую конструкцию, материал и форму, которые обеспечивают возможность отделения, например удерживания, клеток от жидкости, содержащей суспендированные клетки, когда жидкость проходит через фильтр. Задерживающий клетки фильтр перекрывает поперек камеру для анализа таким образом, что жидкостное сообщение присутствует только между входным и выходным отверстием камеры для анализа через задерживающий клетки фильтр. Когда жидкость в отделении для кондиционирующей среды извлекается из камеры для образца, например посредством отводящего канала, находящего в жидкостном сообщении с отверстиями камеры для анализа, клетки удерживаются на верхней стороне задерживающего клетки фильтра, таким образом, клетки концентрируются в жидкости в камере для анализа или на верхней поверхности задерживающего клетки фильтра. Данный эффект концентрирования обеспечит возможность того, что подвижные клетки в образце, которые активно перемещаются в жидкости в отделении для кондиционирующей среды (например, в кондиционирующей среде), можно наблюдать визуально, например, на верхней поверхности задерживающего клетки фильтра. Результат также может быть виден на нижней поверхности задерживающего клетки фильтра. В альтернативном варианте клетки могут быть суспендированы в уменьшенном объеме жидкости, остающимся в камере для анализа таким образом, чтобы более высокая концентрация клеток была обеспечена в камере для анализа по сравнению с концентрацией в жидкости до выхода жидкости.
В предпочтительном варианте расположение задерживающего клетки фильтра по отношению к каналу, предусматривающему жидкостное сообщение между отделением для кондиционирующей среды и камерой для анализа, обеспечивает возможность того, что верхняя поверхность и/или нижняя поверхность задерживающего клетки фильтра наблюдается визуально. Например, канал для доставки отделения для кондиционирующей среды, находящегося в жидкостном сообщении с входным отверстием в камере для анализа, имеет поворот или т.п., так что наблюдение за верхней поверхностью задерживающего клетки фильтра, требует наблюдения по каналу только за частью канала между поворотом и задерживающим клетки фильтром. Соответственно, задерживающий клетки фильтр можно наблюдать непосредственно, и это также способствует простой интеграции с оптическим обнаружением.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения камера для анализа является физически доступной. Это обеспечивает возможность удаления одной или нескольких клеток из камеры для анализа и/или это обеспечивает возможность манипуляции клетками, уже присутствующими в камере. Система также может применяться для отделения клеток в зависимости от их подвижности с целью обеспечения подмножества клеток из образца, содержащего такие клетки. Это особенно полезно для отделения сперматозоидов с высокой подвижностью от сперматозоидов с более низкой подвижностью для использования во вспомогательных репродуктивных технологиях (ART). Таким образом, в системе в соответствии с изобретением может осуществляться отделение, и подвижные клетки могут извлекаться из камеры для анализа.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мезомасштабная жидкостная система дополнительно содержит средство для обеспечения движущей жидкость силы, чтобы переместить жидкость из камеры для образца в камеру для анализа и/или из камеры для анализа в камеру для образца. Когда жидкость перемещается из камеры для образца к камере для анализа, жидкость может представлять собой кондиционирующую среду, содержащую подвижные клетки. С другой стороны, когда жидкость перемещается из камеры для анализа в камеру для образца, жидкость может представлять собой кондиционирующую среду. В системе могут применяться любые средства, подходящие для обеспечения движущей жидкость силы.
В предпочтительном варианте осуществления средство для обеспечения движущей жидкость силы содержит шприц. Шприцом можно легко управлять, например, нажатием кнопки или активизацией другого исполнительного механизма, и, таким образом, работа шприца требует минимальных усилий конечного пользователя. Кроме того, механизм шприца работает по простому механическому принципу, способствующему общей надежности системы. Движение поршня в цилиндре шприца может также прикладывать движущую жидкость силу в любом направлении через мезомасштабную жидкостную систему, то есть из отделения для кондиционирующей среды в камеру для анализа или наоборот. Следовательно, одного шприца может быть достаточно как для загрузки системы кондиционирующей средой, так и для извлечения образца через систему.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения мезомасштабная жидкостная система дополнительно содержит среду образца, кондиционирующую среду и/или маркирующее вещество. В других вариантах среда образца, кондиционирующая среда и/или маркировочное вещество могут добавляться при применении мезомасштабной жидкостной системы. В любом случае система соответствует требованиям удобного в использовании бытового диагностического устройства, также оно дополнительно снижает риск человеческой ошибки, поскольку конечному пользователю требуется меньше этапов. В конкретном варианте осуществления среда образца, кондиционирующая среда и/или маркирующее вещество поставляются в одной или нескольких отдельных капсулах, шприцах и т.п., или соответствующие компоненты, например, маркирующее вещество или компоненты среды образца, или среда для кондиционирования клеток могут быть сухими или непосредственно нанесены в системе. Отдельная капсула или шприц может встраиваться в мезомасштабную жидкостную систему или он может быть внешним по отношению к мезомасштабной жидкостной системе. Содержание среды и/или компонентов среды, например, маркирующие вещества, в отдельных капсулах или шприцах может увеличить срок годности мезомасштабной жидкостной системы, так как отдельная среда может храниться в оптимальных условиях.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу оценки количества подвижных клеток в образце, а еще один аспект относится к способу извлечения подвижных клеток из неподвижных клеток, как описано выше. В обоих способах образец, содержащий подвижные клетки, наносится ниже проницаемого для клеток фильтра; образец, содержащий подвижные клетки, может также содержать неподвижные клетки, из которого могут отделяться подвижные клетки. В обоих способах среда для кондиционирования клеток выше фильтра может присутствовать или добавляться выше проницаемого для клеток фильтра, то есть на сторону кондиционирующей среды, а среда образца может присутствовать или добавляться ниже проницаемого для клеток фильтра. Среда для кондиционирования клеток и среда вносимого образца являются такими, как определено выше. Любой принцип выявления, относящийся к мезомасштабной жидкостной системе согласно изобретению, также имеет отношение к любому из вариантов осуществления аспекта способа изобретения, и для любого из вариантов осуществления аспектов способа проницаемый для клеток фильтр может быть как и в случае любого варианта осуществления мезомасштабной жидкостной системы. В конкретных вариантах осуществления проницаемый для клеток фильтр содержится в мезомасштабной жидкокостной системе в соответствии с изобретением. Любой вариант осуществления мезомасштабной жидкостной системы имеет отношение к обоим аспектам способа согласно изобретению. Когда применяется мезомасштабная жидкостная система, способ может дополнительно содержать этапы: добавления кондиционирующей среды в камеру для образца, в камеру для анализа и в канал между ними; факультативного добавления маркирующего вещества в камеру для образца; добавление образца в отделение для внесения образца; обеспечения возможности перемещения подвижных клеток образца в отделение для кондиционирующей среды; обеспечения движущей жидкость силы из камеры для образца в камеру для анализа; определения количества маркирующего вещества в камере для анализа, например, на задерживающем клетки фильтре, если присутствуют или извлекаются подвижные клетки из камеры для анализа. Мезомасштабная жидкостная система может, таким образом, предварительно заполняться средой, например, средой образца и/или средой для кондиционирования клеток, или данные среды могут вноситься в мезомасштабную жидкостную систему во время применения.
Авторы настоящего изобретения предусматривают способ применения системы в соответствии с настоящим изобретением, в котором кондиционирующая среда первоначально предусмотрена по меньшей мере в отделении для кондиционирующей среды камеры для образца. В некоторых вариантах осуществления кондиционирующая среда может присутствовать в резервуаре или в отделении для кондиционирующей среды камеры для образца при поставке конечному пользователю. Резервуар со средой, например со средой образца и/или кондиционированной клетками средой, или маркирующим веществом будет находиться в жидкостном сообщении с соответствующей камерой или отделением. В других вариантах осуществления кондиционирующая среда добавляется в отделение для кондиционирующей среды через камеру для анализа или через впускное отверстие для среды отделения для кондиционирующей среды, например, посредством применения движущей жидкость силы, такой как шприц. В зависимости от способа количественного определения маркирующее вещество может добавляться в камеру для образца. Маркирующее вещество может представлять собой подходящий краситель такой, чтобы подвижные клетки могли окрашиваться маркирующим веществом, обеспечивая возможность обнаружения и определения количества популяции клеток в камере для анализа по интенсивности окраски. Маркирующее вещество также может представлять собой флуоресцентный краситель такой, чтобы клетки могли определяться количественно при измерении сигнала флуоресценции при необходимости. Маркирующее вещество может присутствовать в резервуаре или может присутствовать уже в камере для образца, например, оно может быть сухим или непосредственно нанесенным в системе. Затем образец добавляется в отделение для внесения образца, и для подвижных клеток образца предоставляется промежуток времени для перемещения в отделение для кондиционирующей среды. Затем кондиционирующая среда протягивается через камеру для анализа посредством движущей жидкость силы, например, шприцем. Подвижные клетки, в кондиционирующей среде удерживаются в камере для анализа, и определяется количество удерживаемых клеток. Если подвижные клетки удерживаются задерживающим клетки фильтром, то маркирующее вещество обычно используется таким образом, что может быть определено количество клеток в камере для анализа посредством визуальных средств.
Соответственно, вышеупомянутые способы, например, способ, использующий мезомасштабную жидкостную систему согласно настоящему изобретению, облегчают точную оценку подвижных клеток в образце. Таким образом, для конечного пользователя возможно получить информацию о подвижности клеток посредством осуществления способа по образцу в домашних условиях без предварительного опыта и без дополнительных технических знаний.
Мезомасштабная жидкостная система и аспекты способа могут применяться для анализа количества и подвижности подвижных клеток в образце или для отделения подвижных клеток в зависимости от их подвижности, например, при необходимости для целей ART. Подвижные клетки могут представлять собой прокариотические клетки, например, бактериальные клетки, или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки, амебы, микро- и макропаразиты и т.п., или типы подвижных клеток млекопитающих. Предпочтительным типом клеток являются клетки спермы, в частности, сперматозоиды человека или сперматозоиды других млекопитающих, например домашних животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, собаки, кошки и т.д.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к комплекту деталей, содержащему мезомасштабную жидкостную систему по любому аспекту настоящего изобретения, маркирующее вещество, среду образца и среду для кондиционирования клеток. Маркирующее вещество, среда образца или среда для кондиционирования клеток могут присутствовать в мезомасштабной жидкостной системе, например, в резервуарах или в камерах, или они могут содержаться в контейнерах отдельно от мезомасштабной жидкостной системы. Комплект может также содержать инструкции по применению комплекта. Предпочтительным маркирующим веществом в комплекте является тетразолиевый краситель, такой как МТТ.
В дополнительном аспекте изобретение относится к системе анализа подвижных клеток в образце, при этом система содержит мезомасштабную жидкостную систему в соответствии с первым аспектом изобретения и внешнее детекторное устройство, содержащее: оптический детектор; машиночитаемый носитель, содержащий компьютерный программный код, выполненный с возможностью определения количества маркирующего вещества в камере для анализа или на задерживающем клетки фильтре мезомасштабной жидкостной системы, если таковой имеется; процессор данных для выполнения компьютерного программного кода.
В еще одном аспекте изобретение относится к мобильному терминалу пользователя, например, смартфону, содержащему компьютерный программный код, выполненный с возможностью определения количества маркирующего вещества в камере для анализа или на задерживающем клетки фильтре мезомасштабной жидкостной системы в соответствии с первым аспектом изобретения, если таковой имеется.
В еще одном аспекте изобретение относится к компьютерно реализуемому способу определения значения, поддающегося количественному измерению, клеточной подвижности для образца клеток, включающему этапы:
приема данных изображения, содержащих изображение по меньшей мере часть камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра мезомасштабной жидкостной системы; и
обработки данных изображения для определения значения измеримого показателя;
при этом этап обработки данных изображения включает этап отображения данных изображения в значении измеримого показателя, используя отображающую функцию, отображающая функция калибруется для отображения данных изображения камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра конкретной мезомасштабной жидкостной системы, как описано в отношении первого аспекта изобретения в значении количественно измеряемого показателя.
Следовательно, количественно определяемая мера может определяться автоматически и независимо от оператора.
Все этапы способа могут выполняться в единой системе обработки данных, такой как терминал пользователя, например, смартфон. Единая система обработки данных может представлять собой стационарную систему, например, клиническое диспансерное устройство. В качестве альтернативы, некоторые из этапов могут выполняться на удаленном компьютерном сервере, например, этап обработки данных изображения может выполняться на удаленном компьютерном сервере.
Количественно измеряемый показатель может представлять собой абсолютный показатель, например, число подвижных клеток в образце, относительный показатель, например, процент подвижных клеток в образце. Количественно измеряемый показатель также может описывать состояние, такое как "хорошее", "нормальное", "среднее", "низкое" и т.д. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию и обработке человеческой спермы, Приложение 1, предусматривает эталонные значения для анализа спермы, и Приложение 1 руководства ВОЗ по лабораторному исследованию и обработке человеческой спермы включено в данную заявку посредством ссылки.
Калибровка отображающей функции может быть выполнена путем анализа подвижности большого числа образцов с применением как конкретной мезомасштабной жидкостной системы, так и традиционных методов, например ручных методов с применением микроскопа. Процедуры для микроскопического анализа сперматозоидов описаны в главе 2, например 2.7 и 2.8, руководства ВОЗ по лабораторному исследованию и обработке человеческой спермы, которое включено в данную заявку посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает этап предварительной обработки данных изображения для определения, является ли данные изображения применимыми в качестве входных данных отображающей функции, при этом формируется сообщение об ошибке, если определено, что данные изображения неприменимы в качестве входных данных.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает этап:
отображения определенного значения измеримого показателя на дисплее.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к компьютерному программному продукту, содержащему средства программного кода, приспособленные для приведения системы обработки данных к выполнению этапов компьютерно реализуемого способа, описанного ранее, когда средства программного кода выполняются на системе обработки данных.
В некоторых вариантах осуществления компьютерный программный продукт включает в себя машиночитаемый носитель, содержащий сохраненные на нем средства программного кода.
Носитель данных может представлять собой переносной носитель, такой как DVD, USB накопитель или т.п. В альтернативном варианте носитель данных может представлять собой накопитель на жестких дисках на компьютерном сервере, подключенном к компьютерной сети, например, данные могут сохраняться с помощью интернет-сервисов, таких как Dropbox™, или с использованием удаленного хранилища данных.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к устройству для определения значения измеримого показателя клеточной подвижности в образце клеток, причем устройство содержит блок камеры для захвата изображения части камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра мезомасштабной жидкостной системы, блок обработки для обработки зафиксированного изображения, дисплей для отображения значения измеримого показателя клеточной подвижности и блока пользовательского ввода, при этом в ответ на активацию пользовательского ввода;
блок камеры выполнен с возможностью захвата изображения части камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра мезомасштабной жидкостной системы; и
блок обработки выполнен с возможностью обработки зафиксированного изображения, чтобы определить значение измеримого показателя клеточной подвижности с помощью отображающей функции, настроенной на отображение зафиксированного изображения в значении измеримого показателя, причем отображающая функция откалибрована для отображения данных изображения камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра конкретной мезомасштабной жидкостной системы, как описано в отношении первого аспекта изобретения, в значении измеримого показателя.
Блок камеры может представлять собой любой блок, способный собирать соответствующие данные изображения, например, цифровую камеру, лазерный сканер, считывающее устройство ПЗС, фотодиодный сканер или тому подобное.
Дисплей и блок ввода данных пользователем могут быть объединены в одном блоке, например, в сенсорном экране.
В конкретном варианте осуществления устройство содержит камеру корпуса для размещения мезомасштабного жидкостного устройства согласно изобретению. Камера корпуса может устанавливаться для управления условиями освещенности, окружающими мезомасштабное жидкостное устройство, например, камера корпуса может закрывать от внешнего света. Камера корпуса также может оснащаться лампами, например светодиодами, способными обеспечить свет с контролируемым составом, например, в отношении длин волн и интенсивности. Камера корпуса также может устанавливаться для образования определенного расстояния между мезомасштабным жидкостным устройством и блоком камеры, или расстояние может регулироваться, например, с помощью этапа или тому подобного.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к носителю данных, содержащему машиночитаемый код, при этом указанный машиночитаемый код выполняется с возможностью программирования терминала пользователя, содержащего блок обработки, дисплей и блок ввода данных пользователем для принятия вида устройства, непосредственно описанного выше.
Терминал пользователя может представлять собой смартфон или планшет. Терминал пользователя также может представлять собой портативный компьютер, например ноутбук, или стационарный компьютер. Таким образом, машиночитаемый код может представлять собой приложение, выполненное с возможностью программирования смартфона или планшета, например, приложение Apple IOS, приложение Windows Mobile и/или приложение Google Android. В качестве альтернативы, машиночитаемый код может представлять собой веб-страницу, выполненную с возможностью программирования терминала пользователя, например, веб-приложение.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Ниже следует подробное описание изобретения с помощью примеров вариантов осуществления и со ссылкой на схематические чертежи, на которых:
на фиг. 1 показано схематическое поперечное сечение мезомасштабной жидкостной системы согласно изобретению;
на фиг. 2 показан схематический чертеж устройства для определения значения измеряемого показателя клеточной подвижности для образца клеток в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
на фиг. 3 показаны данные для титрования образца спермы;
на фиг. 4 показаны фотографии задерживающего клетки фильтра мезомасштабного жидкостного устройства согласно изобретению после применения.
Следует понимать, что также предполагаются комбинации отличительных признаков в различных вариантах осуществления, и что различные отличительные признаки, детали и варианты осуществления могут сочетаться в других вариантах. В частности, предполагается, что все определения, отличительные признаки, детали и варианты осуществления, касающиеся мезомасштабной жидкостной системы, способ оценки количества подвижных клеток в образце и/или способ извлечения подвижных клеток из неподвижных клеток применяются точно так же по отношению друг к другу.
Ссылка на фигуры служит для пояснения изобретения и не должна истолковываться как ограничивающая отличительные признаки конкретными изображенными вариантами осуществления.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к мезомасштабной жидкостной системе, выполненной с возможностью отделения подвижных клеток в зависимости от их подвижности, например, отделения подвижных клеток от неподвижных клеток и из образца жидкости, и к способу оценки количества подвижных клеток в образце, и к способу извлечения подвижных клеток из неподвижных клеток. Данная система может применяться для анализа содержания или количества, а также подвижности клеток в образце, содержащем известные или предполагаемые подвижные клетки. Система также может применяться для отделения клеток в зависимости от их подвижности с помощью изобретения с целью предоставления подмножества клеток из образца, содержащего такие клетки. Это особенно удобно для отделения сперматозоидов с высокой подвижностью от сперматозоидов с более низкой подвижностью для применения во вспомогательных репродуктивных технологиях (ART).
В контексте настоящего изобретения термины "подвижные" и "подвижность" относятся к клеткам, которые способны перемещаться в жидкости независимо от любого течения жидкости. В частности, подвижные клетки способны перемещаться в нетекучих жидкостях. Подвижные клетки могут также называться "перемещающиеся" или "проходящие" и т.д. Подвижность может считаться случайной или клетки могут реагировать на раздражители посредством прохождения, например, посредством прохождения к или от заданного состояния. Распространенные раздражители могут представлять собой для подвижных клеток движение как реакцию на химический градиент ("хемотаксис"), температурный градиент ("термотаксис"), световой градиент ("фототаксис"), линию магнитного поля ("магнитотаксис") или электрическое поле ("гальванотаксис"). Соответствующие раздражители будут известны специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления клеточная подвижность может вызываться посредством предоставления раздражителя в отношении подвижных клеток, представляющих интерес для того, чтобы заставить клетки проходить от точки их добавления по направлению к камерам последующего анализа в системе. Например, хемокин или другие химические вещества могут помещаться в отделение для кондиционирующей среды, например, в кондиционирующую среду, или камеру для анализа, чтобы привлечь подвижные клетки, добавленные в отделение для внесения образца или приемное гнездо.
В контексте данного изобретения термин «мезомасштабный» охватывает диапазон размеров, где наименьший размер каналов находится в диапазоне приблизительно от 10 мкм до приблизительно 4 мм, например, приблизительно от 100 мкм до приблизительно 3 мм, обычно приблизительно 2 мм, однако, каналы могут также содержать сужения. Точно так же камера может иметь глубину приблизительно от 100 мкм до приблизительно 20 мм или более, например, приблизительно от 500 мкм до приблизительно 2 мм, например, приблизительно 500 мкм или приблизительно 1 мм, и самый большой горизонтальный размер может составлять приблизительно от 1 мм до приблизительно 50 мм, например, приблизительно от 1 мм до приблизительно 30 мм, или приблизительно от 1 мм до приблизительно 20 мм, или приблизительно от 1 мм до приблизительно 10 мм, например, приблизительно от 2 мм до приблизительно 6 мм. Размер приемного гнезда, если такой имеется, должен быть достаточным, чтобы удержать жидкий образец, чтобы заполнить отделение для внесения образца камеры для образца жидкостью для анализа, хотя также предполагается, что образец может быть разбавлен в приемном гнезде для того, чтобы заполнить отделение для внесения образца. Можно в целом сказать, что жидкости в мезомасштабных жидкостных системах будут текучими в ламинарном режиме, и жидкостные системы с каналами или камерами, отличающимися от тех, которые определены выше, могут также описываться как "мезомасштабные" до тех пор, пока жидкости, содержащиеся в системах протекают в ламинарном режиме.
Обратимся теперь к фигурам, мезомасштабная жидкостная система в соответствии с настоящим изобретением изображена на фиг. 1, упомянутая мезомасштабная жидкостная система 1 содержит основу 2, содержащую камеру 3 для образца и камеру 4 для анализа; при этом камера для образца содержит проницаемый для клеток фильтр 6, образующий отделение 7 для внесения образца и отделение 8 для кондиционирующей среды; при этом камера 3 для образца имеет впускное отверстие 15 для образца в отделении 7 для внесения образца; при этом камера 4 для анализа содержит входное отверстие 9 и выходное отверстие 10; при этом отделение 8 для кондиционирующей среды находится в жидкостном сообщении с входным отверстием 9 камеры 4 для анализа посредством канала 5; при этом отделение 7 для внесения образца находится ниже проницаемого для клеток фильтра 6, а отделение 8 для кондиционирующей среды находится выше проницаемого для клеток фильтра б. Мезомасштабная жидкостная система 1 может также содержать приемное гнездо 12, находящееся в жидкостном сообщении с отделением 7 для внесения образца. Камера для анализа может содержать задерживающий клетки фильтр 13.
"Фильтр" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать в широком смысле как блок, способный отделять твердую фазу, например, клетки, и жидкости. Таким образом, фильтр может представлять собой, например, фильтровальную бумагу, фильтрующую мембрану, и т.д., сетчатый фильтр, уплотненный слой частиц. Настоящая система содержит проницаемый для клеток фильтр, который позволяет клеткам проходить через фильтр. В некоторых случаях настоящая система также содержит задерживающий клетки фильтр, который позволяет жидкости проходить и задерживает клетки. Соответственно, эти два типа фильтров должны иметь разные размеры пор в зависимости от клеток, которые будут анализироваться. Проницаемый для клеток фильтр 6 может, например, иметь размер пор от 1 мкм до 20 мкм, например от 1 мкм до 3 мкм, например, 1, 3, 5, 8, 10, 12, 15 мкм и т.д., позволяя подвижным клеткам проходить через него, одновременно обеспечивая снижение давления на фильтре. Предпочтительный размер пор составляет приблизительно 10 мкм. В одном варианте осуществления проницаемый для клеток фильтр 6 представляет собой нуклеопоровый фильтр. Соответствующие материалы задерживающего клетки фильтра 13 могут иметь размер отсечения, например, приблизительно от 0,1 мкм до приблизительно 20 мкм, например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мкм, хотя большие размеры отсечения также могут быть уместными, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 12 мкм. Предпочтительные размеры отсечения составляют 0,2 мкм, 0,45 мкм, 1 мкм и 3 мкм. В частности, размеры отсечения проницаемого для клеток фильтра 6 и задерживающего клетки фильтра 13 выбирают таким образом, чтобы исследуемые подвижные клетки могли проходить через проницаемый для клеток фильтр 6, задерживаясь задерживающим клетки фильтром 13. В одном варианте осуществления задерживающий клетки фильтр представляет собой фильтр из смеси сложных эфиров целлюлозы.
Мезомасштабная жидкостная система согласно изобретению применяется с кондиционирующей средой. Термин "кондиционирующая среда" не предназначается для ограничения, а термин "кондиционирующая" означает, что среда может содержать компоненты, необходимые для анализа подвижных клеток, а также для поддержания клеток жизнеспособными. Таким образом, кондиционирующая среда может содержать рН буферные растворы, соли, питательные вещества, соответствующие типу исследуемых клеток. Кондиционирующая среда может также содержать маркирующее вещество, или маркирующее вещество может добавляться отдельно в кондиционирующую среду в систему или присутствовать в сухом виде в канале или камере.
Для обнаружения и количественного определения кондиционирующая среда обычно содержит маркирующее вещество. Маркирующее вещество может представлять собой или содержать краситель или партнер по связыванию для клетки, помеченной красителем, например, антитело в отличие от поверхностного маркера на клетке, антитело помечается красителем или радиоактивным изотопом или тому подобным. Соответствующие красители могут представлять собой флуоресцентные красители или другие красители; краситель может выполняться с возможностью специфически или неспецифически связываться с типом исследуемых клеток. Примерные красители для применения в качестве маркирующих меток для определения количества сперматозоидов содержат кумасси синий, трипановый синий, кристаллический фиолетовый, нильский синий, нильский красный, гематоксилин, кислотный фуксин, эозин, сафранин, нигрозин, акридиновый оранжевый, краситель Гимза, эритрозин, краситель Папаниколау, метиленовый синий, нейтральный красный, феноловый красный, краситель Хехста, резазурин, бисмарк коричневый, тетразолиевые красители, оранжевый Ж, реактив Шиффа, краситель Романовского-Райта, краситель Дженнера, краситель Лейшмана, краситель Гимза, краситель Романовского, судановый краситель, иодид пропидия и бромид этидия. Предпочтительными красителями являются любые тетразолиевые красители, такие как водорастворимые или водонерастворимые тетразолиевые соли или соединения, например, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид (ММТ), 2-(4-иодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенил-2Н-тетразолий (INT), например, как их бромид или хлористые соли, 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолия-5-карбоксанилид (ХТТ), 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий (МТС), 2,3,5-трифенил-2Н-тетразолий (TTC), например, в виде хлористой соли, или диметил тетразолий. Тетразолиевые красители и соответствующие им пробы для количественного анализа хорошо известны в данной области техники. Когда мезомасштабная жидкостная система применяется для отделения подвижных клеток в образце, например, для использования в ART, то предпочтительно, чтобы не присутствовали ни краситель или ни метка. В конкретных вариантах осуществления используются два или более различных маркирующих веществ, где дополнительные маркирующие вещества могут обнаруживать или количественно определять дополнительные характеристикам подвижных клеток, например, два или несколько маркирующих веществ, например, различные маркирующие вещества могут количественно определять две или более характеристики в зависимости от требований для маркирующих веществ, в частности, две или более различные характеристики. Например, соответствующие помеченные антитела могут применяться в качестве дополнительного маркирующего вещества с целью обнаружения или количественного определения специфического поверхностного антигена на подвижных клетках. Дополнительные маркирующие также могут применяться в качестве негативного контроля с целью подтверждения того, что конкретный компонент не присутствует в камере для анализа или на стороне кондиционирующей среды проницаемого для клеток фильтра. В целом, любой вариант осуществления изобретения может использовать два или более маркирующих вещества.
Когда несколько типов клеток присутствуют в образце, маркирующее вещество может предпочтительно специфически и, возможно, также выборочно связываться с исследуемыми клетками. Предпочтительно, чтобы маркирующее вещество меняло цвет после связывания с конкретным типом клеток, например живыми подвижными сперматозоидами. Таким образом, предпочтительное маркирующее вещество не будет иметь видимого цвета, когда оно не связано с клеткой, но при связывании с клеткой оно будет меняться, чтобы быть заметным, например видимым, окрашенным. Предпочтительно, чтобы маркирующее вещество не оказывало отрицательного влияния на клетки. В предпочтительном варианте осуществления кондиционирующая среда, содержащая маркирующее вещество, содержится в резервуаре, например, приемном гнезде, в то время как жидкость в камере для анализа и каналы не содержат маркирующее вещество. Это обеспечит возможность подвижным клеткам в камере для анализа или на поверхности задерживающего клетки фильтра не быть омытыми для обнаружения, поскольку маркирующее вещество в камеру для анализа было принесено только посредством подвижных клеток. В альтернативном варианте маркирующее вещество добавляют в приемное гнездо, содержащее кондиционирующую среду без маркирующего вещества, при добавлении образца. Это позволит достичь того же эффекта. В еще одном варианте осуществления, в частности, когда мезомасштабная жидкостная система не заполнена кондиционирующей средой, маркирующее вещество может присутствовать в сухом виде в канале или камере или в проницаемом для клеток фильтре, или маркирующее вещество может присутствовать в задерживающем клетки фильтре, или мезомасштабная жидкостная система может содержать маркирующее вещество, впитанное в мягкую подкладку или тому подобное. Например, маркирующее вещество может наноситься на стеки камеры или канала. Содержание маркирующего вещества в сухом виде обеспечит возможность легкой эксплуатации системы для конечного пользователя, поскольку маркирующее вещество будет присутствовать в правильной дозировке и будет легко повторно растворяться при внесении кондиционированной образцом среды. Несвязанное маркирующее вещество, как правило, будет вымыто через задерживающий клетки фильтр, в то время как клетки связанные с красителем будут задержаны. В других вариантах осуществления могут присутствовать вещества со специальными функциями, например, в высушенной форме в камере для анализа или канале.
В одном варианте осуществления маркирующее вещество представляет собой краситель, который растворен в кондиционирующей среде или высушен на задерживающем фильтре и растворяется при добавлении в систему кондиционирующей среды. В другом варианте осуществления маркирующее вещество представляет собой краситель, который помещается в отделение близко к впускному отверстию 11 для среды или каналу 5 в сухом виде и растворяется при заполнении отделения для кондиционирующей среды.
При применении образец, содержащий подвижных клетки, вводится в отделение 7 для внесения образца камеры 3 для образца, в некоторых случаях через приемное гнездо 12. Затем клеткам обеспечивается возможность перемещения в отделение 8 для кондиционирующей среды камеры 3 для образца. Допустимое время после добавления образца будет зависеть от типа подвижных клеток, но обычно составляет приблизительно от 10 минут до приблизительно 1 часа, тем не менее также могут использоваться более короткие или более длинные интервалы времени. Когда система применяться со сперматозоидами, допустимое время может составлять приблизительно 10 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 30 минут или приблизительно 40 минут. Когда время вышло, кондиционирующая среда может извлекаться из отделения 8 для кондиционирующей среды камеры 3 для образца и камеры 4 для анализа. Клетки в камере 4 для анализа могут обнаруживаться и/или подсчитываться, или клетки могут извлекаться из камеры 4 для анализа с применением, например, пипетки. Обнаружение подвижных клеток на задерживающем клетки фильтре 13 или в камере 4 для анализа может выполняться просто посредством сравнения наблюдаемой интенсивности окрашивания, например, на верхней по потоку поверхности задерживающего клетки фильтра, и сравнения с индикатором соответствия между количеством клеток и интенсивностью красителя, например, предусмотренным на основе 2 или факультативной камере управления.
Проницаемый для клеток фильтр 6 может дополнительно содержать соединения, например гиалуроновую кислоту, притягивающие клетки к проницаемому для клеток фильтру 6 для прохождения через него. Сторона кондиционирующей среды будет соединена с камерой 4 для анализа. Проницаемый для клеток фильтр 6 может дополнительно сводить к минимуму или даже предотвратить смешивание жидкости образца, нанесенного на сторону внесения образца, с кондиционирующей средой, присутствующей на или добавленной на сторону кондиционирующей среды. Таким образом, проницаемый для клеток фильтр 6 будет предотвращать перемещение клеток со стороны внесения образца к стороне кондиционирующей среды посредством конвекции или диффузии, таким образом, клетки, присутствующие на стороне кондиционирующей среды будут подвижными клетками, прошедшими через проницаемый для клеток фильтр 6, проплывая через него.
Мезомасштабная жидкостная система 1 согласно изобретению содержит основу 2, которая может быть выполнена из любого подходящего материала, такого как полимер, стекло, металл, керамический материал или их сочетания. Основа 2 образована неразъемной конструкцией, имеющей верхнюю часть, нижнюю часть и высоту, подходящую для того, чтобы вмещать мезомасштабные жидкостные конструкции, такие как камеры и каналы. Камеры мезомасштабных жидкостных конструкций могут быть открытыми или закрытыми, например, относительно окружающей среды. Например, отверстия, описанные выше, могут быть закрываемыми с помощью, например, клапанов, или камеры могут также содержать другие отверстия. Камеры могут быть постоянно закрыты сверху, или система может иметь любой тип закрываемого элемента, такой как раздвижная или откидная крышка или съемная крышка. Такие средства доступа могут применяться к целой системе или к отдельным камерам и/или каналам и/или конструкциям. В этом контексте термин "физический доступ", например, в отношении к камере 4 для анализа означает, что инструмент может быть вставлен в жидкость в камере 4 для анализа для совершения операций с содержимым камеры 4. Это совершение операции может быть предназначено для удаления одной или нескольких клеток из камеры 4 для анализа, или оно может включать совершение операций с клетками, уже присутствующими в камере 4. Данный тип физического доступа может также предусматриваться для камеры для образца.
В одном варианте осуществления основа 2 имеет форму, наиболее сходную с параллелепипедом. Основа 2 определяет нижнюю поверхность и одну или несколько боковых стенок камеры 3 для образца, камеру 4 для анализа и канал 5 между камерами. Все конструкции образованы в основе 2. Если смотреть сверху на основу 2, боковые стенки могут образовывать периметры для каждой из камер, определяя их форму. Указанная форма может быть круглой, квадратной, многоугольной или продолговатой и т.д. В предпочтительном варианте осуществления форма, образованная периметром, является круглой. Кроме того, канал 5 может иметь любую подходящую форму, если смотреть сверху. Если основа 2 закрывается сверху, то применяемый материал предпочтительно является прозрачным. Предпочтительно, чтобы только часть материала являлась прозрачным, обеспечивая возможность наблюдения только за соответствующим участком системы, а оставшийся материал непрозрачным, например белым. Мезомасштабная жидкостная система 1 согласно настоящему изобретению предпочтительно изготовлена главным образом из прозрачного материала с гидрофильными поверхностями, хотя могут также использоваться однозначно определенные области гидрофобных поверхностей. В некоторых вариантах осуществления мезомасштабная жидкостная система 1 может содержать участки сверхгидрофильных поверхностей, что обеспечивает возможность простого смачивания камеры для образца, камеры для анализа и каналов с водными растворами. Мезомасштабная жидкостная система 1 может также быть изготовлена из непрозрачных, например белых, материалов. Конструкционный материал представляет собой предпочтительно один или несколько термопластичных полимеров, хотя могут также применяться и другие материалы, такие как стекло, кремний, металл, эластомерные полимеры.
Камера 3 для образца может иметь любую подходящую форму, при условии, что камера 3 для образца может быть разделена на два отдельных отделения 7, 8. В типовом варианте осуществления камера 3 для образца образована вдавленной в основу 2 формой, при этом тело формы имеет по меньшей мере нижнее основание и по меньшей мере стенки, образующие полость камеры 3 для образца. Форма, вдавленная в основу 2, предпочтительно усекается таким образом, чтобы не проходить сквозь нижнюю часть основы 2. Форма камеры 3 для образца может быть, например, цилиндрической, в виде усеченного конуса, кубической, в виде прямоугольного параллелепипеда и т.д. В одном варианте осуществления настоящего изобретения камера 3 для образца образована цилиндрической формой, вдавленной в основу 2, при этом тело цилиндрической формы имеет параллельные круглые основания и стенку в основном с постоянным круглым поперечным сечением, причем круглые основания параллельны по меньшей мере нижней плоскости основы 2. Камера 3 для образца сверху может быть открытой или закрытой. В конкретном варианте осуществления камера 3 для образца открыта для окружающей среды, например, открыта сверху, обеспечивая возможность добавления сред и т.п. в отделение 8 для кондиционирующей среды; этот вариант осуществления может дополнительно содержать крышку для закрывания камеры 3 для образца. То же самое можно применить к камере 4 для анализа.
В одном варианте осуществления камера 3 для образца разделена на отделения 7, 8 посредством проницаемого для клеток фильтра 6, при этом проницаемый для клеток фильтр 6 имеет пластинчатое поперечное сечение, охватывающее поперек камеру 3 для образца, и при этом проницаемый для клеток фильтр 6 в основном параллелен по меньшей мере нижней плоскости основы. В определенном варианте осуществления, в котором камера 3 для образца образована цилиндрической формой, вдавленной в основу 2, камера 3 для образца разделена на отделения 7, 8 проницаемым для клеток фильтром 6, который имеет круглое поперечное сечение, параллельное по меньшей мере нижней плоскости таким образом, чтобы образовывать форму диска, разделяющего камеру 3 для образца на два отделения. В конкретном варианте осуществления расстояние от нижней части, например, "дна", камеры 3 для образца до проницаемого для клеток фильтра 6 составляет приблизительно от 100 мкм до приблизительно 5 мм, например, приблизительно 4 мм или приблизительно 2 мм, таким образом, определяя высоту отделения 7 для внесения образца. Данный вариант осуществления особенно подходит для анализа подвижных клеток; в варианте осуществления для препаративной очистки подвижных клеток это расстояние может быть больше, например, приблизительно 30 мм. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что отделение подвижных клеток от неподвижных клеток особенно эффективно, когда высота отделения 7 для внесения образца менее 5 мм. Считается, что высота менее 5 мм, например 2 мм, увеличивает вероятность сталкивания подвижных клеток с поверхностью проницаемого для клеток фильтра 6 и тем самым будут направляться для прохождения проницаемого для клеток фильтра 6 в отделение для кондиционирующей среды. В конкретном варианте осуществления отделение для внесения образца имеет глубину 4,4 мм, а отделение для кондиционирующей среды имеет глубину 13,2 мм; диаметр камеры для образца составляет 9,4 мм.
Отделение 7 для внесения образца находится ниже проницаемого для клеток фильтра 6, а отделение 8 кондиционирующей среды находится выше проницаемого для клеток фильтра 6. Настоящее изобретение следует рассматривать как охватывающее любой вариант осуществления, в котором предусмотрен общий принцип расположения отделения для внесения образца ниже отделения для кондиционирующей среды, где отделения разделены проницаемым для клеток фильтром. То есть, камера для образца может разделяться на отделения посредством проницаемого для клеток фильтра, который проходит через камеру 3 для образца под наклоном по отношению к нижней части устройства. Отсюда следует, что авторы настоящего изобретения предполагают, что проницаемый для клеток фильтр 6 может иметь, например, частично сферическую часть, которая является либо вогнутой, либо выпуклой по отношению к любому из отделений 7, 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения проницаемый для клеток фильтр 6 проходит через камеру 3 для образца главным образом горизонтально. Если расстояние от нижней части отделения 7 для внесения образца до проницаемого для клеток фильтра 6 равномерно, например, когда и нижняя часть, и проницаемый для клеток фильтр расположены горизонтально, то наблюдалось улучшенное отделение подвижных клеток от неподвижных клеток, особенно когда расстояние между отделением 7 для внесения образца и проницаемым для клеток фильтром 6 меньше 5 мм.
Камера 3 для образца должна иметь подходящий объем для удержания образца в отделении 7 для внесения образца и кондиционирующей среды в отделении 8 для кондиционирующей среды. Специалисту в данной области техники будет понятно, какие размеры должна иметь камера 3 для образца, чтобы вместить образец. Отделение 7 для внесения образца и отделение 8 для кондиционирующей среды могут иметь приблизительно равные объемы, хотя отделение для внесения образца, как правило, больше, например, от 2 до 5 раз больше, чем отделение для кондиционирующей среды. Эти соотношения особенно важны для анализа подвижных клеток. Для препаративной очистки подвижных клеток соотношение может быть даже больше.
Впускное отверстие 15 для образца следует истолковывать в широком смысле как средство для помещения образца в отделение 7 для внесения образца. Образец помещают ниже проницаемого для клеток фильтра б. В предпочтительном варианте впускное отверстие 15 для образца содержит канал, обеспечивающий жидкостное сообщение с внешней стороной и с отделением 7 для внесения образца камеры 3 для образца. Мезомасштабная жидкостная система 1 может предпочтительно также содержать приемное гнездо 12, находящееся в жидкостном сообщении с впускным отверстием 15 для образца. Изобретатели также предусматривают альтернативные средства для размещения образца внутри отделения 7 для внесения образца. В альтернативном варианте приемное гнездо 12 может быть в форме выдвижного ящика или тому подобного, имеющего место для внесения образца, обеспечивающего возможность жидкостного сообщения с окружающей средой, и место для анализа образца, обеспечивающего возможность жидкостного сообщения с отделением 7 для внесения образца. Например, когда приемное гнездо также находится в окружающей среде, образец может быть добавлен в приемное гнездо. Когда приемное гнездо, например, содержащее образец, перемещается к месту для анализа образца, приемное гнездо вступает в жидкостное сообщение с отделением 7 для внесения образца, а не с окружающей средой.
В предпочтительном варианте осуществления устройство 1 содержит приемное гнездо 12, находящееся в жидкостном сообщении с впускным отверстием 15 для образца. Приемное гнездо 12 будет обеспечивать место для добавления анализируемого образца.
В предпочтительном варианте осуществления расположение задерживающего клетки фильтра 13 по отношению к каналу, обеспечивающему жидкостное сообщение между отделением для кондиционирующей среды и камерой для анализа, обеспечивает возможность визуального наблюдения за верхней поверхностью и/или нижней поверхностью задерживающего клетки фильтра. Например, при применении основа 2 или крышка могут быть прозрачными, что означает, что содержимое камеры 4 для анализа можно наблюдать, например, невооруженным глазом или с помощью микроскопа или тому подобного. Тем не менее, в дополнение к тому прозрачная для видимого света основа 2 или крышка также может быть прозрачной для других длин волн, например, для ультрафиолетового света или инфракрасного света. Прозрачность для ультрафиолетового света обеспечивает возможность того, что определенные флуоресцентные молекулы, например, красители или метки, могут возбуждаться соответствующим источником света. Остальная часть основы 2 также может быть прозрачной. Основа 2 и крышка могут иметь одинаковые или разные характеристики в отношении прозрачности. Тем не менее, в некоторых вариантах осуществления основа 2 может содержать фильтры для диапазонов длин волн, способствующих возбуждению и наблюдению флуоресцентных красителей. Например, одна часть основы 2 может быть прозрачной для длины волны возбуждения, но не длины волны излучения, а другая часть в свою очередь может быть прозрачной для длины волны излучения, но не длины волны возбуждения. В определенных вариантах осуществления основа 2 или крышка выше камеры 4 для анализа содержит увеличительную линзу. Это обеспечивает возможность более удобного наблюдения за содержимым камеры 4 для анализа и предпочтительно также за задерживающим клетки фильтром 13. Увеличительные линзы хорошо известны специалистам в данной области техники.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мезомасштабная жидкостная система 1 дополнительно содержит средство для обеспечения движущей жидкость силы для перемещения жидкости из камеры 3 для образца, в частности, из отделения 8 для кондиционирующей среды, к камере 4 для анализа или из камеры 4 для анализа в камеру 3 для образца. Движущая жидкость сила может обеспечиваться посредством применения положительного относительного давления к впускному отверстию 11 для среды для подачи жидкости в камеру 4 для анализа из отделения 8 для кондиционирующей среды. Кроме того, отрицательное относительное давление, приложенное к выводящему каналу 5 из камеры 4 для анализа через выходное отверстие 10 будет создавать такой же эффект, то есть перемещать жидкость из отделения 8 для кондиционирующей среды камеры 3 для образца к камере 4 для анализа и далее удалять жидкость из камеры 4 для анализа через задерживающий клетки фильтр 13, если он присутствует. По существу вся жидкость может быть удалена из камеры 4 для анализа для обеспечения концентрации подвижных клеток, присутствующих в камере 4 для анализа, на поверхности задерживающего клетки фильтра 13, обеспечивая возможность обнаружения клеток. Средства для обеспечения движущей жидкость силы могут быть встроенными в мезомасштабную жидкостную систему 1 или присоединяемыми к ней.
В предпочтительном варианте осуществления средство для обеспечения движущей жидкость силы содержит шприц. Шприц облегчает эксплуатацию устройства 1 конечным пользователем, не требуя вспомогательных насосов или тому подобного. Шприц предпочтительно предназначается для приведения в действие вручную. Шприц может содержать поршень с предопределенными установленными положениями, чтобы помочь пользователю в эксплуатации устройства. Например, шприц может иметь два установленных положения с первым установленным положением, определяющим "начальное положение", и вторым установленным положением, определяющим "конечное положение". В одном варианте осуществления образец вносят в приемное гнездо 12 с отделением 8 для кондиционирующей среды, заполненным кондиционирующей средой; в этом случае поршень шприца находится в начальном положении; перемещение поршня в конечное положение создаст движущую силу для перемещения жидкости из отделения 8 для кондиционирующей среды через камеру 4 для анализа сквозь задерживающий клетки фильтр 13 в выводящий канал 5. В альтернативном варианте шприц может содержать кондиционирующую среду, и перемещение поршня из начального положения в конечное положение может наполнить отделение 8 для кондиционирующей среды. После внесения образца в приемное гнездо 12 или в отделение 7 для внесения образца, возвращение поршня из конечного положения в начальное положение создаст движущую жидкость силу из отделения 8 для кондиционирующей среды через камеру 4 для анализа сквозь задерживающий клетки фильтр 13 в выводящий канал 5. Поршень может также иметь более двух предопределенных установленных положений с промежуточным установленным положением между начальным и конечным положениями, соответствующих различным этапам работы устройства 1.
Также возможны другие средства обеспечения течения жидкости в устройстве. Например, в виде перистальтической функции, действующей на выводящий канал. В альтернативном варианте система может быть подключена к внешнему вспомогательному насосу или вакуумной камере.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения мезомасштабная жидкостная система 1 дополнительно содержит среду образца, кондиционирующую среду и/или маркирующее вещество. Соответственно, в конкретном варианте осуществления мезомасштабная жидкостная система 1 предварительно заполнена кондиционирующей средой. Кондиционирующая среда может присутствовать в камере 4 для анализа, камере 3 для образца, в том числе в отделении 8 для кондиционирующей среды и каналах 5, 14. Мезомасштабная жидкостная система 1 может также содержать отдельные резервуары для среды для кондиционирования образца и/или маркирующего вещества. Мезомасштабная жидкостная система 1 может также содержать несколько отдельных резервуаров, если требуются разные реагенты на разных этапах анализа подвижных клеток. Резервуары находятся в жидкостном сообщении с камерой 3 для образца, в частности, с отделением 8 для кондиционирующей среды, или в случае необходимости с камерой 4 для анализа, т.е. кондиционирующая среда может вноситься в систему 1 через обе камеры или отделения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения среда для кондиционирования образца поставляется в отдельной капсуле, шприце или тому подобном. В таком варианте осуществления мезомасштабная жидкостная система 1 может содержать отдельный канал с внешним отверстием для внесения жидкости, канал находится в прямом жидкостном сообщении с камерой 4 для анализа или камерой 3 для образца, в частности, с отделением 8 для кондиционирующей среды. Внешнее отверстие для внесения жидкости может, тем не менее, быть выходным отверстием 10 камеры 4 для анализа или впускным отверстием 11 для среды отделения 8 для кондиционирующей среды. Капсула и внешнее отверстие для внесения жидкости может оснащаться дополнительными соединительными средствами. Капсула может быть изготовлена из гибкого материала, допускающего регулирование, например, уменьшение, объема вводимого содержимого капсулы в отверстие для внесения жидкости. Если кондиционирующая среда содержится в резервуаре, она может находиться в жидкостном сообщении либо с отделением 8 для кондиционирующей среды камеры 3 для образца, либо с камерой 4 для анализа через канал или тому подобное. Такой канал может содержать клапан или мембрану или подобную конструкцию, предотвращающую течение в канале до тех пор, пока клапан или мембрана не приводятся в действие для обеспечения возможности течения. Это будет обеспечивать предотвращение преждевременного поступления кондиционирующей среды в камеры. Например, исполнительный механизм может позволить открывание канала для течения жидкости из резервуара в камеру 3 для образца, в частности, в отделение 8 для кондиционирующей среды. Таким образом, в одном варианте осуществления среда для кондиционирования образца изначально содержится в резервуаре, в то время как камера 3 для образца и камера 4 для анализа не содержат жидкость. После открывания канала для протекания, кондиционирующая среда будет течь из резервуара в камеру 3 для образца и камеру 4 для анализа. Поскольку отделение 8 для кондиционирующей среды камеры 3 для образца и камера 4 для анализа содержат жидкость, подвижные клетки могут перемещаться из отделения 7 для внесения образца в отделение 8 для кондиционирующей среды. В альтернативном варианте осуществления в камере 4 для анализа может быть предусмотрена жидкость, которая может быть той же жидкостью, которая присутствует в резервуаре, или другой жидкостью. В еще одном варианте осуществления в мезомасштабной жидкостной системе 1 жидкость не предусматривается, а добавляется в систему перед анализом образца.
Нижняя поверхность задерживающего клетки фильтра 13 может находиться в жидкостном сообщении с выводящим каналом 14. Мезомасштабная жидкостная система 1 предпочтительно содержит только один выводящий канал 14, обеспечивающий возможность применения одного средства для обеспечения движущей жидкость силы, например, для удаления жидкости из камеры для образца 3 и камеры 4 для анализа могут применяться насос или шприц. Выводящий канал 14 будет иметь мезомасштабные размеры, следовательно, течение жидкости в выводящем канале 14 будет ламинарным, как описано выше. Как правило, диаметр выводящего канала 14 будет составлять приблизительно от 500 мкм до приблизительно 3 мм, например, приблизительно 1 мм. В большинстве случаев желательно, чтобы диаметр выводящего канала 14 не вносил чрезмерного понижения давления в канале, чтобы жидкость из камеры 3 для образца и камеры 4 для анализа могла быть легко удалена посредством простых средств, например шприца.
В определенном варианте осуществления мезомасштабная жидкостная система 1 содержит средство для регулирования температуры, в частности, для повышения температуры выше обычной температуры окружающей среды. Соответствующее средство, регулирующее температуру, может, таким образом, содержать нагревательный элемент, такой как катушка из электропроводящего провода, элемент Пельтье, трубки для нагревающей и/или охлаждающей жидкости, или подобный. Следует отметить, что при необходимости элемент Пельтье может также использоваться для охлаждения системы.
Каналы, камеры, проходы и другие конструкции мезомасштабной жидкостной системы 1 согласно настоящему изобретению могут быть образованы посредством соединения первой основы, содержащей конструкции, соответствующие каналам и камерам, со второй основой. В дальнейшем, такие отличительные элементы обычно называют "каналы и камеры", хотя это не должно считаться ограничивающим. Таким образом, каналы и камеры могут быть образованы между двумя основами при соединении основ послойно. Мезомасштабные жидкостные системы не ограничиваются двумя слоями основы. В некоторых вариантах осуществления может применяться несколько слоев основы, где каждый из слоев основы может содержать конструкции для каналов и камер по мере необходимости. В частности, каждый из проницаемого для клеток фильтра 6 и задерживающего клетки фильтра 13 могут содержаться на одном слое, также и каналы 5, 14 могут быть сформированы между двумя слоями основы. Затем данные множественные слои основы соединяются с тем, чтобы быть собранными в качестве мезомасштабной жидкостной системы 1.
Конструкции, соответствующие каналам и камерам в основе, могут быть созданы с помощью любого подходящего способа. В предпочтительном варианте осуществления материалы основы представляют собой термопластичные полимеры, и соответствующие способы включают фрезерование, миркообработку, сверление, резку, лазерное выжигание, горячее тиснение, литье под давлением, микроинжекционное формование и 3D печать. Эти и другие методы хорошо известны в данной области техники. Каналы также могут быть созданы и из других материалов основы с применением подходящих способов, таких как литье, прессование, легкая литография и т.д. Кроме того, можно использовать различные типы материалов, например, термопластичные материалы, стекла, металлы и т.д., для обеспечения одной мезомасштабной жидкостной системы. Материалы основы могут быть соединены с помощью любого подходящего способа. В предпочтительном варианте осуществления материалы основы представляют собой термопластичные полимеры, а подходящие способы включают склеивание, соединение растворителем, сжатие, ультразвуковую сварку и лазерную сварку. В ходе других соответствующих способов осуществляют фиксацию посредством винтов или других крепежных средств.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения мезомасштабная жидкостная система содержит основу, содержащую камеру для образца и две или более камеры для анализа; камера для образца содержит проницаемой для клеток фильтр, образующий отделение для внесения образца и отделение для кондиционирующей среды; камера для образца содержит впускное отверстие для образца в отделении для внесения образца; две или более камеры для анализа, каждая из которых содержит входное отверстие и выходное отверстие; при этом отделение для внесения образца находится ниже проницаемого для клеток фильтра, а отделение для кондиционирующей среды находится выше проницаемого для клеток фильтра, и при этом отделение для кондиционирующей среды содержит один или несколько дополнительных проницаемых для клеток фильтров, образующих два или более суботделений отделения 8 для кондиционирующей среды, и при этом каждое из двух или более суботделений отделения 8 для кондиционирующей среды находится в жидкостном сообщении через канал с входным отверстием соответствующей камеры для анализа. В предпочтительном варианте осуществления один или несколько дополнительных проницаемых для клеток фильтров проходит через камеру для образца в плоскости, параллельной первому проницаемому для клеток фильтру 6, который образует отделение 7 для внесения образца и отделение 8 для кондиционирующей среды. Один или несколько дополнительных проницаемых для клеток фильтров образуют по меньшей мере два суботделения отделения 8 для кондиционирующей среды, таким образом, создавая ряд суботделений, расположенных поверх друг друга. Затем подвижные клетки могут перемещаться из отделения 7 для внесения образца в первое суботделение отделения 8 для кондиционирующей среды, последовательно соединенные суботделения дополнительно обеспечивают возможность перемещения подвижных клеток из первого суботделения во второе, третье и т.д. Подвижные клетки, имеющие самую высокую подвижность, будут перемещаться в дальние суботделения, и клетки, скопившиеся в каждом суботделении могут быть обнаружены в соответствующей камере для анализа, соединенной с соответствующими суботделениями. Подвижность популяции клеток может быть оценена по числу клеток в каждой камере для анализа. Соответственно, оценка подвижных клеток разбивается по дополнительным степеням подвижности. В некоторых вариантах осуществления мезомасштабная жидкостная система 1 может содержать более трех суботделений отделения 8 для кондиционирующей среды и соответствующее количество камер для анализа, например мезомасштабная жидкостная система 1 может иметь 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, или даже больше суботделений и камер для анализа.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения мезомасштабная жидкостная система содержит дополнительную камеру для анализа для параллельной оценки общего числа клеток. Дополнительная камера для анализа может быть выполнена подобно камере для анализа для анализа подвижных клеток. В одном варианте осуществления дополнительная камера для анализа содержит входное отверстие и выходное отверстие. Дополнительная камера для анализа может находиться в жидкостном сообщении через входное отверстие и канал с отделением для внесения образца. Дополнительная камера для анализа может альтернативно находится в жидкостном сообщении через входное отверстие и канал с дополнительной камерой для образца, при этом камера 3 для образца и дополнительная камера для образца могут факультативно находиться в жидкостном сообщении с одним и тем же приемным гнездом 12.
В одном варианте осуществления мезомасштабной жидкостной системы 1 приемное гнездо 12, камера 4 для анализа и каналы закрыты крышкой, и по меньшей мере часть крышки, которая накрывает камеру 4 для анализа, является прозрачной. В другом варианте осуществления мезомасштабной жидкостной системы прозрачная часть крышки представляет собой читаемый дисплей программного приложения смартфона.
В дополнительном аспекте изобретение относится к системе анализа подвижных клеток в образце, при этом система содержит мезомасштабную жидкостную систему в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения и внешнее детекторное устройство, содержащее: оптический детектор; машиночитаемый носитель, содержащий компьютерный программный код, выполненный с возможностью определения количества маркирующего вещества в камере для анализа или на задерживающем клетки фильтре мезомасштабной жидкостной системы, если он присутствует; процессор данных для выполнения компьютерного программного кода. Внешнее детекторное устройство может дополнительно содержать дисплей для количественного представления результатов оператору. Например, результаты могут представляться в виде таблицы с оцененным количеством клеток в каждой камере для анализа, представленным в виде абсолютной величины или в виде относительной величины, например, относительного распределения клеток в камере для анализа, или результат может представляться в виде общего результата для описания образца, например, образец может быть описан как "хороший", "нормальный", "средний", "неудовлетворительный" и т.д. Оптический детектор может представлять собой любой детектор, способный считывать результаты с мезомасштабной жидкостной системы, например, определяющий количество маркирующего вещества на задерживающем клетки фильтре. Особенно удобными оптическими детекторами являются те, которые применяются для сканирования штрих-кодов или тому подобного, и в определенном варианте осуществления выбирается оптический детектор из группы, состоящей из камеры, лазерного сканера, считывающего устройства CCD, фотодиодного сканера или тому подобного. В предпочтительном варианте осуществления внешнее детекторное устройство представляет собой мобильный терминал пользователя. Под "мобильным терминалом пользователя" следует понимать любое портативное вычислительное устройство, такое как мобильный телефон, смартфон, карманный персональный компьютер, портативный компьютер, планшетный компьютер или тому подобное. Мобильный терминал пользователя предпочтительно представляет собой вычислительное устройство, использующее операционную систему Apple iOS, Android, Symbian, Windows Phone или подобные операционные системы.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к мобильному терминалу пользователя, например, смартфону, содержащему компьютерный программный код, выполненный с возможностью определения количества маркирующего вещества на задерживающем клетки фильтре мезомасштабной жидкостной системы в соответствии с первым аспектом изобретения.
В одном из вариантов осуществления количественная оценка подвижных сперматозоидов выполняется с помощью смартфона в качестве внешнего детекторного устройства. В этом варианте осуществления получения приемное гнездо, камера для анализа и каналы закрыты крышкой, причем по меньшей мере часть крышки, закрывающей камеру для анализа является прозрачной и представляет собой считываемый дисплей смартфона. С помощью смартфона, снабженного цифровой камерой, и компьютерного программного кода, например, приложения, позволяющего смартфону продолжать рассмотрение данных, полученных посредством камеры, дисплей может быть считан и могут быть получены данные с целью количественной и качественной оценки (подвижности) подвижных сперматозоидов, и, таким образом, пользователю смартфона предоставляется ориентировочное значение результата, например, в единицах измерения концентрации и подвижности сперматозоидов. Данные могут сохраняться в смартфоне и использоваться для сравнения с данными предыдущих анализов. В конкретном варианте осуществления компьютерный программный код выполнен с возможностью загрузки результатов в базу данных для обеспечения возможности сравнения с результатами в базе данных, например, от других пользователей или от предыдущих анализов. Данные, загруженные в базу данных, могут храниться в базе данных для дальнейшего сравнения.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению мезомасштабной жидкостной системы, в которой загрузка образца спермы включает этапы: 1) сбора образца спермы в чашку для сбора спермы; 2) переноса образца спермы из чашки для образца в мезомасштабную жидкостную систему в соответствии с настоящим изобретением посредством соответствующих средств, таких как с использованием пипетки Пастера.
На фиг. 2 показано схематическое изображение устройства 220 определения значения измеримого показателя подвижности клеток для образца клеток в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Устройство 220 содержит блок 221 камеры для захвата изображения части камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра мезомасштабной жидкостной системы, блок 222 обработки для обработки захваченного изображения, дисплей 223 для отображения значения измеримого показателя подвижности клеток и блок 224 ввода данных пользователем. В ответ на приведение в действие устройства 224 ввода данных пользователем;
блок 221 камеры выполнен с возможностью захвата изображения части камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра мезомасштабной жидкостной системы; и
блок 222 обработки выполнен с возможностью обработки захваченного изображения для определения значения измеримого показателя клеточной подвижности с помощью отображающей функции 225, сконфигурированной для отображения захваченного изображения в значении измеримого показателя. Отображающая функция 225 калибруется для отображения данных изображения камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра конкретной мезомасштабной жидкостной системы согласно изобретению в значении измеримого показателя.
Дисплей 223 и блок 224 ввода данных пользователем могут быть объединены в единый блок, например, в сенсорный экран 226.
Чтобы определить значение измеряемого показателя клеточной подвижности для конкретного образца клеток, мезомасштабная жидкостная система согласно изобретению, содержащая образец, может располагаться вблизи от устройства 220. Это может быть достигнуто посредством размещения устройства 220 и мезомасштабной жидкостной системы в общем блоке выравнивания. Кроме того, устройство 220 может удерживаться вручную выше мезомасштабной жидкостной системы с блоком камеры, указывающим в направлении камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра мезомасштабной жидкостной системы. Далее, в ответ на активацию блока 224 ввода данных пользователем блок 221 камеры захватывает изображение части камеры для анализа и/или задерживающего клетки фильтра мезомасштабной жидкостной системы, и блок 222 обработки обрабатывает захваченное изображение для определения значения измеримого показателя клеточной подвижности.
Это обеспечивает возможность визуального вывода данных мезомасштабной жидкостной системы для автоматического анализа. Это может увеличить точность, особенно когда мезомасштабная жидкостная система применяется для самотестирования, то есть, когда пользователь не является профессиональным лицом, предоставляющим медицинские услуги.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения чашка для сбора спермы является комплектующей частью устройства. Чашка для сбора спермы может после эякуляции соединяться с устройством, таким образом загружают образец спермы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения отделение 7 для внесения образца содержит средство для обеспечения точного объема образца, которое предусмотрено в системе, для предоставления более точных результатов. В определенном варианте осуществления средство для обеспечения точного объема образца представляет собой поплавковый регулятор уровня.
Пример 1
Эксперименты проводили для сравнения эффекта наличия отделения для внесения образца, находящегося ниже проницаемого для клеток фильтра, и отделения для кондиционирующей среды, находящегося выше проницаемого для клеток фильтра, с предыдущими применениями проницаемых для клеток фильтров, где отделение для внесения образца находится, например, рядом или выше отделения для кондиционирующей среды.
Проводили сравнение между размещением отделения для внесения образца выше и ниже проницаемого для клеток фильтра.
Использовали образец спермы, содержащий только неподвижные клетки. Затем образец разделяли на два образца для испытания.
Отделение для внесения образца, расположенное выше проницаемого для клеток фильтра
Один образец вносили в систему, содержащую отделение для внесения образца, находящееся выше проницаемого для клеток фильтра, и отделение для кондиционирующей среды, находящееся ниже фильтра. Кондиционирующую среду пипетировали в отделение для кондиционирующей среды, а образец спермы пипетировали в отделение для внесения образца. Образец кондиционирующей среды извлекали и анализировали в диапазоне времени, представленном ниже в таблице 1.
Очевидно, что результаты показывают, что неподвижные клетки преодолели проницаемый для клеток фильтр, и авторы настоящего изобретения приписывают этот результат воздействию силы тяжести.
Отделение для внесения образца, расположенное ниже проницаемого для клеток фильтра
Вторую часть образца вносили в систему, содержащую отделение для внесения образца, находящееся ниже проницаемого для клеток фильтра, и отделение для кондиционирующей среды, находящееся выше фильтра. Кондиционирующую среду пипетировали в отделение для кондиционирующей среды, а образец спермы пипетировали в отделение для внесения образца. Образец кондиционирующей среды извлекали и анализировали в диапазоне времени, представленном ниже в таблице 2.
Авторы настоящего изобретения выявили, что клетки не преодолели проницаемый для клеток фильтр, когда образец был расположен ниже фильтра.
Пример 2
Динамический диапазон интенсивности цвета RGB-значений данных изображения для изображения из мезомасштабного жидкостного устройства согласно изобретению коррелировали с ручным подсчетом титрируемого образца спермы. Образец спермы, содержащий 185 млн. подвижных сперматозоидов на миллилитр, последовательно разбавляли 2 раза семенной плазмой. Образцы вносили в устройства для проведения испытаний с использованием стандартных параметров инкубации с использованием МТТ в концентрации 0,5 мг/мл в качестве маркирующего вещества. Фотографии результатов получали посредством цифровой камеры Microsoft life, и измеряли интенсивность окраски (RGB-значения). Мезомасштабное жидкостное устройство содержало задерживающий клетки фильтр, и для каждого изображения для анализа мезомасштабное жидкостное устройство помещали в световой короб для обеспечения одинаковых условий в любой момент времени. Световой короб состоял из коробки и содержал камеру, расположенную примерно в 55 мм от объекта, и галогенную лампу с напряжением 12 вольт. Параметры камеры контролировали посредством выполненной на заказ программы LabVIEW. Условия, при которых проводили испытание, включали: температура: 20°С±1,5°С, влажность: 38% относительной влажности.
Результаты показаны на фиг. 3, на которой изображен полученный динамический диапазон кривой титрования. Существует линейная зависимость между интенсивностью цвета и логарифмической концентрацией подвижных сперматозоидов в образцах. Интенсивность цвета пятен в устройстве для проведения испытаний сильно коррелирует с количеством подвижных сперматозоидов, присутствующих в образцах как измеренных посредством оптического анализа, так вручную на глаз.
Пример 3
Провели испытания возможных воздействий двух маркирующих веществ, МТТ и кристаллического фиолетового, на подвижность сперматозоидов. Получили основные растворы МТТ и кристаллического фиолетового - 5 мг/мл и 1 мг/мл соответственно, и их последовательно разбавляли два раза. Растворы маркирующих веществ смешивали с образцами спермы, содержащими 60 миллионов подвижных клеток на миллилитр и 72 миллионов клеток на миллилитр в общей сложности (обозначается 60/72) в соотношении 50:50, и смесь инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре перед анализом клеток под микроскопом.
Из таблицы 3 видно, что МТТ оказал воздействие на клеточную подвижность. Отношение подвижных к неподвижным клеткам (% подвижных) было снижено при более высоких концентрациях, в то время как отношение не зависело от кристаллического фиолетового. Тем не менее, при концентрации МТТ ниже 2,5 мг/мл не наблюдали никакого воздействия на подвижность (не показано). Таким образом, оба маркирующих вещества могут применяться, и в стандартных условиях, например, время инкубации менее 30 мин, МТТ 0,5 мг/мл, не наблюдается влияний на подвижность. Следует отметить, что эти воздействия являются значимыми только в тех вариантах осуществления, где маркирующее вещество смешивали с образцом до обеспечения возможности прохождения клеток через проницаемый для клеток фильтр.
Пример 4
Мезомасштабное жидкостное устройство согласно настоящему изобретению испытывали на образцах спермы. Система содержала проницаемый для клеток фильтр диаметром 13 мм и с размером пор 10 мкм. Толщина проницаемого для клеток фильтра составляла 10 мкм. Объем отделения для внесения образца составлял приблизительно 600 мкл, и расстояние от нижней части отделения для внесения образца до проницаемого для клеток фильтра составляло 4,25 мм. Чашка для образца находилась в жидкостном сообщении с отделением для внесения образца. Образец спермы вносили в чашку для образца, в результате чего объем образца 600 мкл поступил в отделение для внесения образца. После внесения образца вводили кондиционирующую среду (содержащую 0,5 мг/мл МТТ) с помощью шприца через выходное отверстие камеры для анализа сквозь задерживающий клетки фильтр в отделение для кондиционирующей среды (в объеме 300 мкл). Устройство инкубировали в течение 30 мин. После инкубации применяли шприц для извлечения жидкости, содержащей в тот момент подвижные клетки, из отделения для внесения образца для того, чтобы получить подвижные клетки на задерживающем клетки фильтре.
Испытания проводили с использованием образцов, полученных из образца спермы, где концентрация подвижных клеток определяли количественно под микроскопом и разбавляли до содержания клеток в диапазоне от 0,6 миллионов на миллилитр до 20 миллионов на миллилитр. Фотографии задерживающих клетки фильтров из устройств показаны на фиг. 4, на которой показано, что в пределах диапазона концентраций концентрацию 5 миллионов подвижных клеток на миллилитр можно легко отличить от более низких концентраций.
Пример 5
Мезомасштабное жидкостное устройство согласно изобретению испытывали в сравнении с коммерческой испытательной полоской, известной как SpermCheck. Утверждается, что SpermCheck может дифференцировать более или менее 20 млн общего количества сперматозоидов/мл, тогда как настоящее устройство имеет пороговое значение 5 млн прогрессивных сперматозоидов (критерии WHO 2010 года, руководство WHO по лабораторному исследованию и обработке человеческой спермы). В частности, цель испытания состоит в том, чтобы получить от непрофессиональных людей размещение результатов испытаний, формируемых мезомасштабным жидкостным устройством согласно изобретению в двух категориях "неудовлетворительный" или "нормальный". Перед применением всех образцов в мезомасштабном жидкостном устройстве согласно изобретению или на испытательных полосках SpermCheck получили и проанализировали под микроскопом 45 образцов спермы. После анализа все устройства и испытательные полоски сфотографировали, и фотографии включили в презентации 5 разных людей (2 студентов университета из SDU и 3 инженеров из инженерной компании 2С; ниже в таблице 4 и таблице 5 участники исследования называются А-Е), которые были проинструктированы в целях классификации фотографий по категориям "неудовлетворительный" и "нормальный". Такая же процедура была проведена посредством лица для внутренней проверки (обозначенного "Контроль"). В таблице 4 и таблице 5 показаны результаты эксперимента.
Результаты испытаний непрофессиональных пользователей были близки к результатам, полученным при проведении внутреннего испытания. Стоит отметить, что результаты испытаний, которые были неправильно установлены, были очень похожи у всех 5 непрофессиональных людей. Важно отметить, что 80% неправильно установленных результатов испытаний были очень близки к пороговому значению 5 млн прогрессивных подвижных сперматозоидов на мл. Чувствительность испытательной полоски SpermCheck является довольно низкой, т.е. испытание не может правильно определить мужчин с нормальным качеством спермы, a NPV является крайне низким, т.е. испытание не в состоянии сообщить пользователю об отрицательном результате испытания, если количество сперматозоидов в действительности является низким.