Вибриостатический тест с никлозамидом для идентификации бактерий рода Vibrio

ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ СЛУЖБЫ

© СИВОЛОДСКИЙ Е.П., 2014 УДК 579.843.1.083.18

Сиволодский Е.П.

вибриостатический тест с никлозамидом для идентификации бактерий рода

VIBRIO

ФГБВОУ ВПО "Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова" Минобороны РФ, Санкт-Петербург

Выявлен новый вибриостатик никлозамид (CAS № 50-65-7) и разработан вибриостатический тест с никлозамидом (10 мкг/диск) для идентификации бактерий рода Vibrio. По диагностической чувствительности он превосходит вибриостатический тест с вибриостатиком О129, так как подавляет рост вибрионов,имеющих перекрестную устойчивость к О129 и ко-тримоксазолу. Вибриостатический тест с никлозамидом позволил идентифицировать все изученные штаммы V. metschnikovii, V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. cholerae non O1/non O139.

Ключевые слова: вибриостатический тест; никлозамид; вибриостатик О129; ко-тримоксазол; диагностическая чувствительность; V. cholerae; V. metschnikovii; V. parahaemolyticus; V. vulnificus.

E.P. Sivolodskiy

THE VIBRIO-STATIC TEST WITH NICLOSAMIDE TO IDENTIFY BACTERIA OF GENUS VIBRIO The S.M. Kirov military medical academy of Minoborona of Russia, St. Petersburg, Russia

The new vibrio-static niclosamide (CAS № 50-65-7) is revealed. The vibrio-static test with niclosamide (10 mkg/disc) to identify bacteria of genus Vibrio is developed. This test by its diagnostic sensitivity surpasses the vibrio-static test with vibrio-static O129 since it suppresses growth of vibrios having cross resistance to O129 and co-trimoxazole. The vibrio-static test with niclosamide made it possible to identify all examined strains of V. metschnikovii, V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. cholerae non O1/non O139.

Keywords: vibrio-static test, niclosamide, vibrio-static O129, co-trimoxazole, diagnostic sensitivity, V. metschnikovii, V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. cholerae

Вибриостатический тест с препаратом О129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine phosphate sait; CAS № 84176-65-8 ) предложен в 1954 г. [8]. Его применение регламентируется стандартом Великобритании по идентификации вибрионов [5] и методическими указаниями Минздрава РФ по лабораторной диагностике заболеваний человека, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами [1]. Диагностические диски с препаратом О129 производят фирмы Oxoid, Dalyn Biologicals, HiMedia. В связи с выявлением перекрестной резистентности вибрионов к препарату О129 и триметоприму, входящему в состав антимикробного препарата ко-тримоксазол, ситуация изменилась. Уже в 1992 г. 82,7% штаммов возбудителей холеры, выделенных у больных холерой в Индии, устойчивы к О129 и ко-тримоксазолу [7]. В этот же период в Бангладеш выделены из внешней среды и у больных холерой 62,7% штаммов холерных вибрионов с перекрестной устойчивостью к О129 и ко-тримоксазолу [6]. Штамм V. cholerae non 01, устойчивый к О129 и ко-тримоксазолу, выделен у больного диареей в США [3]. Гены, контролирующие устойчивость к тримето-приму, имеют плазмидную локализацию, что определяет быстрое распространение резистентности к О129 у вибрионов и снижение диагностической чувствительности вибриоста-тического теста с О129.

Целью данного исследования стали поиск препарата с избирательной вибриостатической активностью, в том числе подавляющего штаммы вибрионов с устойчивостью к О129 и триметоприму, и разработка на его основе вибриостатиче-ского теста с высокой диагностической чувствительностью.

Материалы и методы. Объектом исследования были 28 штаммов V. metschnikovii (1H-28H), выделенных в 2012 г из

Для корреспонденции:

Сиволодский Евгений Петрович, д-р мед. наук, проф. каф. микробиологии

Адрес: 194044, Санкт-Петербург, ул. акад. Лебедева, 6 E-mail: es279@yandex.ru

реки Невы, типовые штаммы V. parahaemolyticus РПЧИ 13580 (АТСС 17802) и V. vulnificus РПЧИ 13344 (АТСС 27562), полученные из Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института; штамм V. cholerae non Ol/non O139 ctxA- 9741, полученный из Северо-Западной противочумной станции в г Санкт-Петербурге; 25 штаммов бактерий рода Aeromonas пяти видов (A. caviae, A. popoffii, A. salmoni-cida, A. hydrophila, A. bestiarum), выделенных из реки Невы; 36 штаммов энтеробактерий, выделенных из клинического материала (по 3 штамма видов Escherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella Enteritidis, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella mobilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Yersinia enterocolitica). Все указанные штаммы бактерий находятся в рабочей коллекции культур автора на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (г. Санкт-Петербург). Штаммы бактерий идентифицировали по методикам и критериям руководств [4, 5].

Для культивирования исследуемых бактерий, определения их чувствительности к никлозамиду, постановки вибри-остатического теста с никлозамидом и О129 применяли питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар) производства ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (г. Обо-ленск). Его состав в 1 г/л среды: панкреатический гидролизат рыбной муки 12; пептон ферментативный 12; натрия хлорид 6; агар микробиологический 10 ± 2; рН 7,1-7,5. Для создания необходимой конечной концентрации натрия хлорида 1% дополнительно вносили в питательную среду 4 г/л натрия хлорида. ГРМ-агар с 1% натрия хлорида позволял культивировать все исследуемые галофильные и негалофильные вибрионы. Агар Мюллера-Хинтона оказался не пригоден для проведения вибриостатического теста.

В исследованиях применяли никлозамид (2,5-dichloro-4-nitrosalicylanilide) CAS № 50-65-7 (Mainland, Китай); диагностические диски с вибриостатиком О129 10 и 150 мкг/ диск (oxoid, Великобритания); диски с ко-тримоксазолом

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № S, 2014

(триметоприм/сульфаметоксазол 1,25/23,75 мкг) (НИИЭМ им. Пастера, г Санкт-Петербург); диагностические диски с никлозамидом 10 мкг/диск собственного изготовления.

Методика исследования чувствительности бактерий к никлозамиду. Из основного раствора никлозамида 1000 мкг/ мл, растворенного в диметилсульфоксиде, готовили двукратные разведения от 0,5 до 64 мкг/мл в расплавленном ГРМ-агаре с 1% натрия хлорида. Из каждого разведения питательную среду вносили в стерильные чашки Петри. Ино-кулятом стали культуры исследуемых бактерий, выросшие в ГРМ-бульоне при 35°С в течение 18-24 ч, которые вносили по полной петле (d-2 мм) на секторы чашек с различной концентрацией никлозамида и в контрольную среду без никлозамида. Посевы инкубировали в течение 24 ч при 35°С, после чего определяли МПК (в мкг/мл) никлозамида.

Методика изготовления диагностических дисков с никлозамидом (10 мкг/диск). Используют диски диаметром 6 мм из картона фильтровального (ГОСТ 6722-75 ), растворитель диметилсульфоксид (CAS № 67-68-5), никлозамид (фенасал) CAS № 50-65-7. Навеску никлозамида 10 мг помещают в стерильную ступку, добавляют 10 мл диметилсульфоксида и растворяют при растирании препарата. Полученный раствор прозрачный, желтой окраски, содержит 1000 мкг/мл никлозамида. Вносят микропипеткой 10 мкл раствора никлозамида на один диск, т. е. диск содержит 10 мкг никлозамида. На контрольные диски вносят по 10 мкл только растворителя диметилсульфоксида. Диски высушивают в термостате в течение 24 ч при 37°С, затем помещают во флаконы с силикагелем, хранят в сухом, темном месте при 4-8°С. Срок годности дисков 12 мес. Контроль дисков с никлозамидом при изготовлении: Vibrio metschnikovii 5Н (положительный контроль) - наличие зоны подавления роста бактерий вокруг диска; Aeromonas caviae 12Н (отрицательный контроль) - отсутствие зоны подавления роста бактерий вокруг диска); оба контрольных штамма не имеют зон подавления роста бактерий вокруг контрольного диска, содержащего только диметилсульфоксид.

Методика проведения вибриостатического теста дисками с никлозамидом (10 мкг/мл). Для исследования используют чистые культуры бактерий с предварительно установленными признаками: грамотрицательные, палочковидные, ферментирующие углеводы, оксидазоположительные или оксидазоотрицательные. Инокулят готовят из 18-24-часовой бульонной культуры или 18-24-часовой, выросшей на ГРМ-агаре и суспендированной в 0,85% растворе натрия хлорида. Устанавливают концентрацию инокулята по стандарту мутности: 0,5 МакФарланда (1,5Ч08 КОЕ/мл). Для посева инокулята применяют ГРМ-агар с 1% NaCl в чашках Петри диаметром 40 или 50 мм. Стерильный ватный тампон смачивают в иноку-ляте, отжимают о стенки пробирки и наносят им бактерии на всю поверхность питательной среды. Чашки оставляют при комнатной температуре на 5 мин для абсорбции инокулята. Асептично с помощью пинцета накладывают на поверхность засеянной питательной среды диск с никлозамидом (10 мкг/мл ). Инкубируют чашки в термостате при 35 или 26°С в течение 24 ч. После инкубации просматривают чашки в проходящем свете и на темном фоне. Наличие у исследуемого штамма бактерий прозрачной зоны задержки роста бактерий любого диаметра вокруг диска с никлозамидом указывает на принадлежность его к роду Vibrio. Контроли: штамм V. metschnikovii 5Н должен иметь прозрачную зону задержки роста бактерий вокруг диска с никлозамидом (положительный контроль); штамм A. caviae 12Н не должен иметь зоны задержки роста бактерий вокруг диска с ни-клозамидом (отрицательный контроль).

При сравнительном изучении чувствительности бактерий к препаратам 0129

Таблица 1

уровень чувствительности к никлозамиду (2,5-dichlo™-4-nitrosalicylanilide ) на ГрМ-агаре с 1% хлорида натрия бактерий рода Vibrio и других родов грамотрицательных, ферментирующих углеводов, оксидазоположительных или оксидазоотри-цательных бактерий

Род, вид бактерий Количество изученных штаммов МПК, мкг/мл

Vibrio metschnikovii 28 1-6

Vibrio vulnificus* l 6

Vibrio parahaemolyticus* l 6

Vibrio cholerae non Ol/non O139 l 8

Aeromonas caviae l7 64 - более 64

Aeromonas popoffii 4 32-64

Aeromonas salmonicida 2 64

Aeromonas hydrophila l 32

Aeromonas bestiarum l 32

Escherichia coli З Более 64

Shigella sonnei З Более 64

Salmonella Enteritidis З Более 64

Klebsiella pneumoniae З Более 64

Klebsiella mobilis* З Более 64

Enterobacter cloacae З Более 64

Serratia marcescens* З Более 64

Hafnia alvei* З Более 64

Citrobacter freundii З Более 64

Proteus mirabilis З Более 64

Morganella morganii З Более 64

Yersinia enterocolitica 3 Более 64

Примечание. Здесь и в табл. 2: штамм.

- в том числе типовой

(150 мкг/диск), никлозамиду (10 мкг/диск) и ко-тримоксазолу (1,25/23,75 мкг/диск) использовали для каждого штамма все три диска в одной чашке диаметром 90 мм.

Результаты и обсуждение. Никлозамид (лекарственный препарат фенасал) известен как антигельминтный препарат, который применяют в медицинской и ветеринарной практи-

Таблица 2

сравнительная диагностическая чувствительность идентификации вибрионов ви-бриостатиками никлозамид (2,5-dichlorо-4-nitrosalicylanilide) и О129 на ГрМ-агаре с 1% хлорида натрия

Вид бактерий рода Vibrio Количе- Вибрио статики

ство изученных штаммов Ol29

из них чувстви- из них чувстви-

чувстви- тельность чувстви- тельность

тельных

V. metschnikovii 28 25** 89,2 ± 5,8 28 lGG

V. parahaemolyticus* l l l

V. vulnificus* l l l

V. cholerae non Ol/non O139 l l l

Всего... 3l 28 9G,3 ± 5,3 3l lGG

Примечание. тримоксазолу.

- три штамма имеют перекрестную устойчивость к Ol29 и ко-

ЛАБОРАТОРНАЯ МЕДИЦИНА ЗА РУБЕЖОМ

ке для лечения кишечных цестодозов. Его антибактериальная активность впервые выявлена нами в 1985 г Препарат оказывал избирательное антимикробное действие на грампо-ложительные микроорганизмы, на основе чего создано изобретение по использованию фенасала в составе питательных сред для выделения энтеробактерий [2]. Чувствительность вибрионов к этому препарату не изучалась.

Результаты изучения чувствительности к никлозамиду вибрионов, имеющих медицинскую значимость, представлены в данном исследовании. Изучали также чувствительность к никлозамиду группы грамотрицательных бактерий, имеющих общие с вибрионами таксономические характеристики (палочковидные, ферментирующие углеводы, оксидазопо-ложительные или оксидазоотрицательные), - бактерий рода Aeromonas, различных родов энтеробактерий.

МПК (в мкг/мл) никлозамида для бактерий рода Vibrio (V. metschnikovii, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae non O1/non O139) составляет 1-8 мкг/мл; для бактерий рода Aeromonas (A. caviae, A. popoffii, A. salmonicida, A. hydrophila, A. bestiarum) - 32-64 мкг/мл, для энтеробактерий (11 родов) - более 64 мкг/мл (табл. 1). Полученные данные указывают на избирательную чувствительность к никлозамиду бактерий рода Vibrio и возможность дифференциации их по этому признаку от бактерий Aeromonas и энтеробактерий.

На основе нового вибриостатического агента созданы диагностические диски с никлозамидом (10 мкг/диск) и методика вибриостатического теста для идентификации вибрионов, которые представлены в разделе «Материалы и методы». Результаты изучения сравнительной диагностической чувствительности вибриостатических тестов с вибриоста-тиками О129 (150 мкг/диск) и никлозамидом (10 мкг/диск) представлены в табл. 2.

Диагностическая чувствительность вибриостатического теста с вибриостатиком О129 составила 90,3 ± 5,3%. Среди штаммов V. metschnikovii, выделенных из реки Невы, впервые выявлены штаммы с перекрестной устойчивостью к О129 и ко-тримоксазолу (3 штамма). Вибриостатик никлозамид обеспечил более высокую диагностическую чувствительность вибриостатического теста - 100%, в том числе подавлял рост вибрионов с перекрестной устойчивостью к О129 и ко-тримоксазолу, а также видов V. metschnikovii, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae non O1/non O139.

Оба вибриостатика имели 100% специфичность, так как вибриостатический тест был отрицательным у всех изученных штаммов бактерий рода Aeromonas и энтеробактерий.

Предварительный отбор штаммов, подлежащих исследованию вибриостатическим тестом с никлозамидом, по таксономическим признакам (грамотрицательные, палочковидные, ферментирующие углеводы, оксидазоположи-тельные или оксидазоотрицательные бактерии) ограничивает диапозон исследуемых родов бактерий и включает все виды вибрионов, что позволяет при положительном результате вибриостатического теста идентифицировать принадлежность исследуемого штамма бактерий к роду Vibrio.

Заключение. Выявлен новый вибриостатик никлозамид (CAS № 50-65-7). Разработан вибриостатический тест с ни-клозамидом (10 мкг/диск) для идентификации бактерий рода Vibrio, отличающийся высокой диагностической чувствительностью и специфичностью. По диагностической чувствительности он превосходит вибриостатический тест с О129, так как подавляет рост вибрионов, имеющих перекрестную рези-стентнось к О129 и ко-тримоксазолу. Вибриостатик никлоза-мид реабилитирует вибриостатический тест и позволяет более широко использовать его в лабораторной практике. На данный

способ получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение по заявке № 2012146802. Диагностические диски с никлозамидом и набор для постановки вибрио-статического теста производит ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт им. Пастера».

ЛИТЕРАТУРА

1. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемо-литическими и другими патогенными для человека вибрионами. Методические указания. МУК 4.2.1793-03. МЗ РФ. М.; 2003.

2. Сиволодский Е.П. Авторское свидетельство СССР № 1386660 на изобретение «Способ выделения бактерий семейства Enterobacte-riaceae". Заявлено 24.12.1985. Опубл. 07.04.1988. Бюл. 13: 124.

3. Abbot S.L.,Cheung .W.K., Portoni B.A., Janda J.M. Isolations of vibriostatic agent O129-resistant Vibrio cholerae non-O1 from a patient with gastroenteritis. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(6): 1598-9.

4. Farmer J.J.III, Janda J.M., Brenner F.W., Cameron D.N., Birkhead K.M., Genus 1. Vibrio Pacini 1854. In: Garriti G.M., Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., eds. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2 nd ed. New York: Springer; 2005: 2, B: 494-5.

5. Health Protection Agency. Identification of Vibrio species. UK Standards for Microbiology Investigations. 2011; ID 19(2.1): 4.

6. Huq A., Alam M., Parveen S., Colwell R. Occurrence of resistance to vibriostatic compound O129 in Vibrio cholerae O1 isolated from clinical and environmental sfmples in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(1): 219-21.

7. Ramamurthy T., Pal A., Pal S.C., Nair G.B. Taxonomic implications of the emergenct of high frequency of occurrence of 2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine-resistant strains of Vibrio cholerae from clinical of cholera in Calcuta, India. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(3): 742-3.

8. Sherman J.M., Hodgkiss W. A method for the rapid differentiation of certain nonpathogenic, asporogenous bacilli. Nature. 1954; 173(4396): 208-9.

REFERENCES

1. Laboratory diagnosis of diseases caused paragemoliticheskimi and other human pathogenic vibrios. Metodicheskie ukasaniya. MUK 4.2.1793-03. MZ RF. М.; 2003 (in Russian).

2. Sivolodskiy E.P. Avtorskoe svidetelstvo SSSR N 1386660 na izo-bretenie «Method for isolating bacteria of the family Enterobacte-riaceae». Zayavleno 24.12.1985. Opublikovano 07.04.1988. Byull. Izobret.; 13: 124 (in Russian).

3. Abbot S.L.,Cheung .W.K., Portoni B.A., Janda J.M. Isolations of vibriostatic agent O129-resistant Vibrio cholerae non-O1 from a patient with gastroenteritis. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(6): 1598-9.

4. Farmer J.J.III, Janda J.M., Brenner F.W., Cameron D.N., Birkhead K.M., Genus 1. Vibrio Pacini 1854. In: Garriti G.M., Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., eds. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2 nd ed. New York: Springer; 2005: 2, B: 494-5.

5. Health Protection Agency. Identification of Vibrio species. UK Standards for Microbiology Investigations. 2011; ID 19(2.1): 4.

6. Huq A., Alam M., Parveen S., Colwell R. Occurrence of resistance to vibriostatic compound O129 in Vibrio cholerae O1 isolated from clinical and environmental sfmples in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(1): 219-21.

7. Ramamurthy T., Pal A., Pal S.C., Nair G.B. Taxonomic implications of the emergenct of high frequency of occurrence of 2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine-resistant strains of Vibrio cholerae from clinical of cholera in Calcuta, India. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(3): 742-3.

8. Sherman J.M., Hodgkiss W. A method for the rapid differentiation of certain nonpathogenic, asporogenous bacilli. Nature. 1954; 173(4396): 208-9.

Поступила 09.01.14