Биофармацевтические исследования липосомального лизомустина

УДК 616.155.392+616.24-006.6]-089.843-092.4/.9:577.115

А. V. Shadrina, N.M. Peretolchina, А.P. Polozkova, Z.S. Shprakh, N.A. Oborotova,

A. Yu.Baryshnikov

BIOPHARMACEUTICAL INVESTIGATION OF LYSOMUSTINE LIPOSOMES

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

Lysomustine is an original antitumor preparation based on chloroethylic derivative of nitrosourea on L-homocitrulline basis. Earlier lysomustine had been shown to be effective against both solid tumors (e.g. Lewis lung carcinoma (LLC), carcinoma Ca-755, melanoma B-16) and leucoses (L-1210, P 388 etc.). However, clinical use of lysomustine was limited due to significant common toxicity. The purpose of this investigation was to carry out the liposome-encapsulated form of lysomustine(LEL) as well as to characterize its pharmaceutical properties and antitumor efficiency. In technological stage of the investigation we have tested liposomal formulations of lysomustine using different lipid compositions. The choice of the optimal lipid composition was based on the criteria of the liposomal dispersion aggregative stability. The antitumor efficiency of new pharmaceutical formulation was investigated on two experimental tumor models - lymphoblastic leucosis L-1210 and Lewis lung carcinoma (LLC). On lymphoblastic leucosis L-1210 LEL had shown optimal therapeutic effect at doses of 125 and 150 mg/kg, resulting in 100 % recovery of treated animals. On Lewis lung carcinoma antitumor effect of LEL was maximally pronounced at doses of 175 and 200 mg/kg. Comparative investigation of lysomustine different drug formulations has shown that allowed to widen the range of therapeutic doses from 100 to 200 mg/kg and to increase LEL reparation antitumour efficiency on animals bearing leucosis or solid tumors, achieving up to 100% recovery of treated animals without toxicity LEL noticeable increase.

Key words: lysomustine, liposomal form; lymphoblastic leucosis, Lewis lung carcinoma, transplantation of tumor

A.B. Шадрина, H.M. Перетолчина, А.П. Полозкова, З.С. Шпрах, Н.А. Оборотова,

А.Ю. Барышников

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ЛИЗОМУСТИНА

ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Лизомустин - оригинальный отечественный противоопухолевый препарат, хлорэтильное производное нитрозомочевины на основе L-гомоцитруллина. В ранее проведенных экспериментальных исследованиях показана высокая противоопухолевая активность препарата в отношении широкого спектра как солидных опухолей животных (рак легкого LLC, карцинома Са-755, меланома В-16), так и лейкозов (L-1210, Р-388 и др.). Однако, в ходе доклинических и клинических испытаний лизомустина установлено, что основным недостатком препарата является низкая избирательность его действия на опухолевые клетки, следствием которой является общая токсичность. Данная работа посвящена созданию новой лекарственной формы лизомустина в виде липосом, определению ее химико-фармацевтических характеристик и оценке противоопухолевой активности. В технологической части эксперимента исследованы липосомы лизомустина различного состава. Критерием выбора липидной композиции и соотношения лизомустина и липидов являлась агрегатная стабильность липосомальной дисперсии. Противоопухолевую активность новой лекарственной формы изучили на двух моделях экспериментальных опухолей: лимфобластном лейкозе L-1210 и карциноме легкого Льюис (LLC). В отношение лейкоза L-1210 показано, что лизомустин в липосомальной лекарственной форме в дозах 125 и 150 мг/кг проявил максимальный противоопухолевый эффект, при этом излечение животных составило 100 %. На аденокарциноме легкого Льюис противоопухолевый эффект липосомальной лекарственной формы лизомустина наиболее выражен в дозах 175 и 200 мг/кг. Таким образом, показано, что с липосомальной лекарственной формой лизомустина можно добиться расширения диапазона терапевтических доз (100-200 мг/кг) и достигнуть максимального противоопухолевого эффекта без усиления токсического действия как на лейкозах, так и на солидных опухолях.

Ключевые слова: лизомустин, липосомальная форма, лимфобластный лейкоз, карцинома легкого Льюис, трансплантация опухоли

ВВЕДЕНИЕ

Лизомустин - оригинальный отечественный противоопухолевый препарат, хлорэтильное производное нитрозомочевины на основе L-гомоцитрул-лина. Препарат представляет собой смесь двух изомеров, отличающихся положением нитрозогруппы: 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-Ь-гомоцитруллин (1) и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-Ь-гомоцитруллин (2). Соотношение изомеров 1 и 2 составляет 75 % : 25 % [4]. Изучение противоопухолевой активности и клиническое исследование лизомустина в лиофилизиро-ванной лекарственной форме для инъекций проведено в ГУ Российском Онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (ГУ РОНЦ РАМН).

В экспериментальных исследованиях показана высокая противоопухолевая активность препарата в отношении широкого спектра как солидных опухолей животных (рак легкого LLC, карцинома Са-755, меланома В-16), так и лейкозов (L-1210, Р-388 и др.) [2; 3]. Клинические испытания препарата по I - II фазе показали эффективность лизомустина у больных меланомой, немелкоклеточным раком легкого, мезотелиомой плевры и раком щитовидной железы [1]. Однако в ходе доклинических и клинических испытаний лизомустина установлено, что основным недостатком препарата является низкая избирательность его действия на опухолевые клетки, следствием которой является общая токсичность.

Целью настоящего исследования была разработка новой лекарственной формы лизомустина в виде липосом, определение ее химико-фармацевти-ческих характеристик и оценка противоопухолевой активности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лизомустин синтезирован в Институте химии Уральского отделения Академии наук России, отвечает требованиям фармакопейной статьи. Лецитин, холестерин и кардиолипин получены от фирмы “Lipoid”, Германия. Лиофилизированная лекарственная форма лизомустина создана в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Получение липосомального лизомустина

Малые однослойные липосомы получали гидратацией липидной пленки, образующейся после упаривания в вакууме спиртовых растворов липидов, с последующей экструзией липосомальной дисперсии через поликарбонатные мембраны и озвучиванием. В качестве липидной основы использовали лецитин (фосфатидилхолин), для стабилизации липидного бислоя и уменьшения “вытекания” включенного в липосомы препарата в липидную оболочку вводили холестерин и кардиолипин. Размер липосом, полученных указанными выше методами, определяли на спектрометре Nano-Sizer (“Cultronics”, США).

Определение эффективности включения лизомустина в липосомы

Не включенный в липосомы лизомустин отделяли методом равновесного диализа. Количествен-

ное определение включенного в липосомы препарата проводили методом прямой УФ-спектрофотомет-рии по специально разработанной методике.

Определение противоопухолевой активности липосомального лизомустина

Противоопухолевую активность новой лекарственной формы изучали на 2 моделях экспериментальных опухолей: лимфобластном лейкозе L-1210 и карциноме легкого Льюис (LLC). Экспериментальное изучение липосомального лизомустина проводили на мышах-гибридах BDF1, самцах, в сравнении с субстанцией лизомустина и стандартной лио-фильно высушенной лекарственной формой. Кроме того, введен дополнительный контроль, где мыши получали пустые липосомы в объеме, соответствующем объему липосом с препаратом.

Лейкоз L-1210

Лейкоз прививали внутрибрюшинно по 1,0-1,2x106 клеток/мышь в 0,3 мл среды 199 (клетки подсчитывали в камере Горяева). Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухоли. Препарат вводили внутрибрюшинно, однократно.

Липосомальную лекарственную форму лизомустина вводили животным в дозах 100; 125; 150; 175 и 200 мг/кг, лизомустин в виде субстанции и в лиофи-лизированной лекарственной форме - в дозах - 150; 175 и 200 мг/кг. Концентрация препарата во всех случаях была одинаковой и соответствовала 10 мг/мл.

Терапевтический эффект оценивали по двум критериям: увеличению продолжительности жизни леченых животных (УПЖ, %) и их излечению.

1. УПЖ вычисляли по формуле:

УПЖ = ------------- хЮО %,

дах

где ПЖ0 и ПЖк - продолжительность жизни испытуемых мышей в опытных и контрольных группах соответственно.

2. Излечение животных: п/пр где п/n,- число излеченных мышей к общему числу животных в группе. Излеченными считали животных, не имеющих рецидивов заболевания после окончания лечения в течение 2 мес и более.

Аденокарцинома легкого Льюис

В асептических условиях у животного-донора выделяли растущую внутримышечно опухоль - карциному легких Льюис. Опухолевую ткань тщательно промывали средой 199 (струйно из шприца), разрезали на несколько кусочков, удаляя при этом остатки неопухолевых тканей (мышцы, кости, сухожилия, капсулу, сгустки крови) и участки с некрозом. Затем опухоль взвешивали, тщательно измельчали ножницами до гомогенной консистенции и разводили питательной средой 199 в соотношении 1:10. Полученную суспензию тщательно перемешивали шприцем с последовательно уменьшающимся диаметром иглы. После этого взвесь опухолевых клеток трансплантировали по 1,0 -1,5 х 106 клеток в 0,5

мл среды 199 мышам-реципиентам подкожно в область подмышечной впадины. Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухоли. Препарат вводили внутрибрюшинно, однократно. Липо-сомальную и лиофилизированную лекарственные формы лизомустина вводили животным в дозах 125; 150; 175 и 200 мг/кг, лизомустин в виде субстанции

- 150; 175 и 200 мг/кг.

Противоопухолевый эффект препарата оценивали сопоставлением среднего объема первичного подкожного узла контрольных и леченых животных, начиная с 7-х сут опыта, а затем в динамике с интервалом 5-7 дней вплоть до окончания эксперимента. При этом вычисляли показатель торможения роста первичной опухоли в процентах (ТРО, %) в каждой из групп, получавших препарат, по отношению к контрольной группе. Расчет проводили по формуле:

У0 - Ук

ТРО = —2-------х 100 %,

Ук

где У0 и Ук- средний объем опухоли в опытной и контрольных группах соответственно.

Для леченых мышей вычисляли увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %), а также степень излечения.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по критериям Стьюдента (параметрический) и Колмогорова-Смирнова (непараметрический).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В технологической части эксперимента исследованы липосомы лизомустина различного состава. Критерием выбора липидной композиции и соотношения лизомустина и липидов являлась агрегатная стабильность липосомальной дисперсии.

Для исследования отобрана композиция, в которой молярное отношение лизомустина (10 мг/мл) к лейцитину составляло 1:15, а соотношение между липидами - лейцитин : холестерин : кардиолипин соответствовало 33 : 3 : 1. Малые однослойные липосомы получали методом экструзии и озвучиванием. Для оценки качества полученных липосомаль-ных дисперсий изучали следующие параметры:

• размер полученных малых однослойных липосом;

• эффективность включения лизомустина в липосомы;

• коэффициент распределения лизомустина в ли-посомах.

Проведенные исследования показали, что размер малых однослойных липосом лизомустина составил 107 ± 30 нм и 248 ± 33 нм для липосом, полученных методом экструзии и озвучиванием соответственно. Эффективность включения лизомустина в липосомы, полученные экструзионным методом, составила 63,4 ± 0,3 %, тогда как в озвученные липосомы - 57,9 ± 0,7 %. Коэффициент распределения, который характеризует взаимодействие вещества с липосомами, составляет для ли-посомальных дисперсий, полученных экструзионным методом, 1,74 ± 0,03, а для озвученных липосом - 1,38 ± 0,012. Статистически значимая разница этих параметров свидетельствует в пользу лучших качеств экструзионных липосом (р < 0,05). В дальнейшем, учитывая результаты химико-фармацевтических исследований, биологические испытания проводили с липосомальной дисперсией лизомустина, полученной методом экструзии.

В табл.1 представлены результаты изучения противоопухолевой активности липосомального лизомустина в отношении лимфобластного лейкоза мышей Ь-1210.

Как видно из нее, лизомустин на мышах с лейкозом Ь-1210 в липосомальной лекарственной форме в

Таблица 1

Противоопухолевая активность липосомального лизомустина у мышей с лейкозом Ь-1210

Группа опыта Доза мг/кг, в/бХ 1 раз ПЖ,% Излечение ЖИВОТНЫХ, П/П]

150 - 6/6

Лизомустин субстанция 175 - 5/6*

200 205 (1/6) 5/6

Лиофилизированная 150 - 6/6

лекарственная форма 175 - 6/6

лизомустина 200 156 (1/6) 5/6

100 255 (1/6) 5/6

Липосомальная 125 - 6/6

лекарственная форма 150 - 5/5

лизомустина 175 189 (1/6) 5/6

200 268 (1/6) 5/6

Примечания. Контроль 1 - нелеченые мыши, средняя продолжительность жизни мышей 8,2 дня;

Контроль 2 - мышам вводили пустые липосомы, средняя продолжительность жизни 7,6 дня;

*В данной группе 1/6 мышей пала от токсичности \

дозе 100 мг/кг излечивал 83 % животных; в дозах 125 и 150 мг/кг препарат проявил оптимальный терапевтический эффект, и излечение животных в этих группах составило 100 %. Ранее проведенными исследованиями установлено, что лизомустин в виде субстанции и лиофилизированной лекарственной формы, примененный в дозах 100 и 125 мг/кг, излечивал лишь 20-40 % животных. Для единичных мышей, погибших от лейкоза, увеличение продолжительности жизни при использовании липосомального лизомустина было выше по сравнению с субстанцией и лиофилизированной лекарственной формой. Средняя продолжительность жизни мышей, получавших лечение пустыми липосомами, близка к показателю нелеченого контроля и составила 7,6±1,0 день.

В табл.2 представлены результаты изучения противоопухолевой активности липосомального лизомустина на мышах с карциномой легкого Льюис.

В ней показано, что на карциноме легкого Льюис липосомальная лекарственная форма лизомустина проявила максимальный противоопухолевый эффект - 100 %; излечение животных наблюдалось при дозах 175 мг/кг и 200 мг/кг. В случае использования лиофилизированной лекарственной формы препарата такой же эффект по излечению мышей наблюдался только в максимально переносимой дозе (200 мг/ кг), в дозе 175 мг/кг излечение животных было ниже и составляло 62,5 %. При введении лизомустина в виде субстанции в дозе 200 мг/кг наблюдалось гибель 1/8 животных, при этом максимальный эффект -100%-ное излечение отмечено в группе, получавшей препарат в дозе 175 мг/кг. Лизомустин в дозах 125 и 150

мг/кг в обеих лекарственных формах проявил более низкий в соответствии с величиной дозы и практически равный эффект как по излечению животных, так и по УПЖ мышей, погибших от опухоли.

В ходе эксперимента с карциномой легкого Льюис по окончании лечения визуально наблюдали изменения массы тела животных, поэтому провели дополнительное взвешивание животных на 16-е сутки после курса лечения. Введение лизомустина в виде субстанции и лиофилизированной лекарственной форме в дозах 175 и 200 мг/кг приводило к снижению массы тела у мышей по сравнению с исходной. Это уменьшение варьировало от 1 до 2,6 г и от 1 до 1,4 г соответственно. При лечении липосомальной лекарственной формой в адекватных дозах уменьшения массы тела не наблюдали. Это указывает на определенные преимущества препарата в липосомальной лекарственной форме по сравнению с субстанцией и лиофилизированной лекарственной формой.

ВЫВОДЫ

1. Липосомальная лекарственная форма лизомустина эффективна при лейкозе Ь-1210, при внутри-брюшинном введении достигнут максимальный противоопухолевый эффект в дозах 125 и 150 мг/кг с 100 %-ным излечением животных.

2. При аденокарциноме легкого Льюис -100 %-ное излечение животных наблюдали в дозах 175 и 200 мг/кг.

3. Применение липосомальной лекарственной формы лизомустина позволяет расширить диапазон

Таблица 2

Противоопухолевая активность липосомального лизомустина у мышей с карциномой легкого Льюис

Группа опыта Доза мг/кг, ТРО, (%) дни после перевивки опыта УПЖ, % Излечение животных п/щ

в/б X 1р 7 16 30

Контроль №1' 591,4± 163 8004+ 934 22332+ 1905 - -

Лизомустин, субстанция 150 175 200 90,9 91,5 92,3 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 100 - 7/7 8/8 7/82

Лиофилизированная лекарственная форма лизомустина. 125 150 175 200 93,6 90,5 95,4 92,8 99,9 99.8 99.9 99.9 99.9 95.9 99,8 100 25,7(2/7) 50,8(3/7) 64,2(2/8) 5/7 4/7 6/8 8/8

Контроль №23 755+ 195 8734+ 1771 24075+ 1793 - -

Липосомальная лекарственная форма лизомустина 125 150 175 200 93,9 92,3 96,5 96,7 91 99,6 99.9 99.9 79,4 96,3 100 100 31,3(4/7) 48(3/7) 3/7 4/7 8/8 8/8

1 нелеченные мыши;

в данной группе 1/8 мышей пала от токсичности на 24-е сут;

мыши, которым вводили пустые липосомы; для контрольных мышей дан средний объем опухоли в мм

терапевтических доз (100-200 мг/кг) и достигнуть максимального противоопухолевого эффекта без усиления токсического действия как на лейкозах, так и на солидных опухолях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Горбачева Л.Б., Веровский В.Н., Соколова И.С. Ингибирование и восстановление синтеза ДНК и РНК в

нормальных и опухолевых клетках после воздействия нитрозомочевин in vivo // Экспериментальная онкологии,-М.,1982. - Т. 4, № 4. - С. 15-18.

2. Гудцова К.В., Кукушкина Г.В., Горбачева Л.Б. и соавт. // Хим-фарм. журнал. - М., 1991. - №9. - С.10-15.

3. Перетолчина Н.М. I/ Химиотерапия опухолей в СССР.

- М., 1982. - вып.36. - С. 228-231.

4. Радина Л.Б., Беляев А.А., Краснов В.П. и соавт. Патент РФ 1744946. - Приоритет 1989 г. - 26.05.1998. // Бюлл. Изобрет. - 1998. -№ 31.