ПРОИЗВОДСТВО ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ

1. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий:
a. обеспечение подпитываемого периодического биореактора объемом от 100 л до 25000 л, содержащего
i. клетки, способные экспрессировать рекомбинантный полипептид асфотазы альфа (SEQ ID NO: 1), и
ii. культуральную среду, подходящую для проведения такой экспрессии, при этом культуральная среда содержит от около 25 мкМ до около 300 мкМ цинка;
b. культивирование клеток в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантной асфотазы альфа; причем рН культуральной среды составляет от около 6,7 до около 7,1, и причем цинк добавляют в указанную культуральную среду, так что концентрация цинка в культуральной среде поддерживается в концентрации от около 25 мкМ до около 300 мкМ цинка.
2. Способ по предшествующему пункту, отличающийся тем, что концентрацию цинка в культуральной среде поддерживают в концентрации от около 25 мкМ до около 150 мкМ цинка.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что концентрация цинка в культуральной среде поддерживается в концентрации от около 60 мкМ до около 150 мкМ цинка.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что концентрация цинка в культуральной среде поддерживается в концентрации около 28 мкМ цинка.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что рН указанной культуральной среды поддерживается от около 6,8 до около 7,0.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что рН указанной культуральной среды поддерживается около 6,9.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что цинк добавляют в указанную культуральную среду по меньшей мере в одном болюсе, непрерывно или полунепрерывно.
8. Способ по любому из пп. 1-6, дополнительно включающий добавление по меньшей мере одного, двух, трех или четырех болюса(ов) подпиток к культуральной среде во время культивирования.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что по меньшей мере четыре болюса подпитки добавляются к культуральной среде.
10. Способ по п. 8 или п. 9, отличающийся тем, что добавление болюса подпитки улучшает специфическую активность рекомбинантного полипептида.
6
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий культивирование клеток при первой температуре до достижения плотности клеток по меньшей мере около 2,5 × 10 жизнеспособных клеток, и переход на вторую температуру, которая ниже первой температуры для экспрессии рекомбинантного полипептида.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что первая температура составляет от около 35°С до около 37,5°С.
13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что вторая температура составляет от около 29°C до около 35°C.
14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что первая температура составляет около 37°С, а вторая температура составляет около 30°С.
15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что первая температура составляет около 36,5°С, а вторая температура составляет около 33°С.
16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что клетки выбраны из группы, состоящей из CHO, NS0/1, PER.C6, COS-7, эмбриональной линии почки человека (293 или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензионной культуре), BHK, TM4, CVl, VERO -76, HeLa, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, MMT 060562, TRI, MRC 5, клетки FS4 и клетки Hep G2.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что клетки представляют собой СНО клетки.
18. Рекомбинантный полипептид, полученный по любому из предшествующих пунктов.
19. Рекомбинантный полипептид, полученный в культуре клеток млекопитающих, причем рекомбинантный полипептид содержит асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) и имеет по меньшей мере одну характеристику, выбранную из группы, включающей:
a. общее содержание сиаловой кислоты (TSAC) между около 0,9 до около 3,5 моль сиаловой кислоты/моль мономера белка;
b. изоэлектрическую фокусировку (IEF) между около 5,2 и около 6,7;
c. крупную гликановую структуру, как показано на фиг. 41 или фиг. 42;
d. профиль хроматограммы 2-AB-меченного олигосахарида, как показано на фиг. 38 или фиг. 39;
e. MALDI-ToF фингерпринтный профиль гликопептида, показанный на фиг. 40 или фиг. 44-49;
f. основную полосу на SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, имеющую молекулярную массу около 88-108 кДа и не менее чем около 85% от общего количества полученного рекомбинантного полипептида;
g. основную полосу на SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, имеющую молекулярную массу около 194 кДа до около 273 кДа и не менее чем около 85% от общего количества полученного рекомбинантного полипептида;
h. не менее чем около 95,0% для димеров рекомбинантного полипептида и не более чем около 5,0% для агрегатов как определено с помощью высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии (ВЭЖХ);
i. чистоту не менее чем около 95,0% как определено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC);
j. не менее чем около 90,0% для главного пика, не более чем около 6,0% для кислотных пиков и не более чем около 4,0% для основных пиков как определено с помощью анион-обменной хроматографии (AEX);
k. процент связывания гидроксиапатита (НА) от около 75 до около 125%;
l. специфическую активность продукта (pNPP) от около 620 единиц/мг до около 1250 единиц/мг;
m
m. Kот около 13 мкМ до около 69 мкМ в анализе гидролиза неорганического пирофосфата (PPi);
cat
-1
-1
n. Kот около 65 с до около 165 св анализе гидролиза неорганического пирофосфата (PPi);
o. диапазон pI от около 6,45 до около 6,95 для всех пиков при капиллярном электрофорезе;
p. пики на масс-спектре MALDI-TOF, как показано на фиг. 34A после дегликозилирования;
q. пики на масс-спектре MALDI-TOF, как показано на фиг. 34B, после восстановления и дегликозилирования;
r. пики на масс-спектре MALDI-TоF, как показано на фиг. 35;
s. профиль фосфорилирования, как показано на фиг. 36;
t. профиль сиалированного гликана на отрицательном масс-спектре MALDI-TоF, как показано на фиг. 37A;
u. профиль нейтральных гликанов на положительном масс-спектре MALDI-TоF, как показано на фиг. 37B;
v. молярное отношение магния на моль рекомбинантного полипептида от около 0,03 до около 0,15;
w. молярное отношение кальция на моль рекомбинантного полипептида от около 0,5 до около 1,5; и
x. молярное отношение цинка на моль рекомбинантного полипептида от около 0,5 до около 3,0.
20. Рекомбинантный полипептид по п. 18 или п. 19, имеющий от около 0,7 до около 1,19 свободного цистеина на половину молекулы.
21. Рекомбинантный полипептид по любому из п. 18, п. 19 или п. 20, имеющий фосфорилирование на Ser 93 в процентах от около 13,5% до около 35,7%.
22. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 14-21, имеющий не менее чем около 90,0% главного пика, не более чем около 6,0% для кислотных пиков и не более чем около 4,0% для основных пиков на хроматограмме AEX.
23. Рекомбинантный полипептид по п. 22, имеющий главный пик не менее чем около 93,7%, не более чем около 4,9% для кислотных пиков и не более чем около 3,4% для основных пиков на хроматограмме AEX.
24. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-23, имеющий общее содержание сиаловой кислоты (TSAC) между около 0,9 до около 3,5 моль сиаловой кислоты/моль мономера белка.
25. Рекомбинантный полипептид по п. 24, имеющий среднее значение общего содержания сиаловой кислоты (TSAC) от около 1,2 до около 3,0 моль сиаловой кислоты/моль на мономер.
26. Рекомбинантный полипептид по п. 25, имеющий среднее значение общего содержания сиаловой кислоты (TSAC) от около 1,9 до около 2,7 моль сиаловой кислоты/моль на мономер.
27. Рекомбинантный полипептид по п. 26, имеющий среднее значение общего содержания сиаловой кислоты (TSAC) от около 1,85 до около 2,28 моль сиаловой кислоты/моль на мономер.
28. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-27, имеющий молярное отношение магния менее чем около 0,15.
29. Рекомбинантный полипептид по п. 28, имеющий молярное отношение магния от около 0,05 до около 0,10.
30. Рекомбинантный полипептид по п. 28, имеющий молярное отношение магния около 0,12.
31. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-30, содержащий по меньшей мере около 95,0% димеров рекомбинантного полипептида и около 5,0% или менее полипептидных агрегатов, как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ.
32. Рекомбинантный полипептид по п. 31, содержащий по меньшей мере около 96,8% димеров рекомбинантного полипептида и около 3,2% или менее полипептидных агрегатов, в частности, как определено методом эксклюзионной ВЭЖХ.
33. Рекомбинантный полипептид по п. 32, содержащий по меньшей мере около 97,6% димеров рекомбинантного полипептида и около 2,4% или менее агрегатов, в частности, как определено методом эксклюзионной ВЭЖХ.
34. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-33, имеющий по меньшей мере около 95,0% чистоту, в частности, как определено с помощью RP-HPLC.
35. Рекомбинантный полипептид по п. 34, имеющий по меньшей мере около 97,6% чистоту, как определено с помощью RP-HPLC.
36. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-35, имеющий процент связывания гидроксиапатита (НА) от около 75% до около 125%.
37. Рекомбинантный полипептид по п. 36, имеющий средний % связывания гидроксиапатита от около 85% до около 97%.
38. Рекомбинантный полипептид по п. 37, имеющий средний % связывания гидроксиапатита от около 90% до около 91%.
39. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-38, имеющий специфическую активность (pNPP) от около 620 до около 1250 единиц/мг.
40. Рекомбинантный полипептид по п. 39, имеющий среднюю специфическую активность (pNPP) от около 904,0 до около 907,7 Ед/мг.
41. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-40, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид кодируется полинуклеотидом, кодирующим полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, или последовательность, полностью комплементарную SEQ ID NO: 1.
42. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-41, отличающийся тем, что подпитываемый периодический реактор имеет объем от 200 л до 20000 л.
43. Рекомбинантный полипептид по п. 42, отличающийся тем, что подпитываемый периодический реактор имеет объем от 2000 л до 20000 л.
44. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию, содержащую рекомбинантный полипептид по любому из пп. 18-43, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
45. Способ использования рекомбинантного полипептида по любому из пп. 18-43 или фармацевтической композиции по п. 44 для увеличения расщепления неорганического пирофосфата (PPi) у субъекта.
46. Способ лечения субъекта, страдающего от состояния, связанного с дефицитом щелочной фосфатазы, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества рекомбинантного полипептида по любому из пп. 18-43 или фармацевтической композиции по п. 44.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что условием, связанным с дефицитом щелочной фосфатазы, является гипофосфатазия (ГФФ) или нейрофиброматоз типа I (NF1).
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что гипофосфатазия (ГФФ) является перинатальной, инфантильной, ювенильной или взрослой ГФФ.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что состояние, связанное с недостаточностью щелочной фосфатазы, характеризуется неминерализованным костным матриксом и/или гипо-минерализацией костей и зубов.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что неминерализованный костный матрикс приводит к рахиту и/или остеомаляции.
51. Способ по любому из пп. 45-50, отличающийся тем, что субъект представляет собой человека.