СОСТАВ НА ОСНОВЕ КОМПОЗИЦИИ КРОВИ, КОТОРАЯ ЯВЛЯЕТСЯ ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ И/ИЛИ ФАКТОРАМИ РОСТА И СОДЕРЖИТ ГЕЛЕОБРАЗНЫЕ БЕЛКИ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
COMPOSITION BASED ON BLOOD COMPOSITION ENRICHED WITH THROMBOCYTES AND/OR GROWTH FACTORS AND CONTAINS GEL-LIKE PROTEINS, AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к составу с желательными биологическими или медицинскими свойствами, полученному из первоначальной обогащенной тромбоцитами и/или обогащенной факторами роста композиции крови. Изобретение также относится к способу получения указанного состава.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ex vivo
in vivo
in vivo
В предшествующем уровне описано получение композиций из крови человека или животных, где кровь обрабатывают таким образом, что получают обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) и/или плазму, обогащенную факторами роста (PRGF), представляющую полезные биологические и медицинские свойства. Указанные PRP или PRGF успешно использовали в применениях , например, в качестве культуральной среды для клеток, и , например, для выполнения процесса регенерации костной ткани у пациента, или для лечения пациента, страдающего от боли в суставах, посредством инфильтраций. В случае, когда указанные композиции предназначены для применений  для лечения пациента, технологию получения составов PRP и PRGF разрабатывали в направлении получения аутологических композиций, т.е. композиций, полученных из крови самого пациента. Примеры этих типов композиций и способов получения можно найти в патентах US6569204 и ES2221770.
В течение нескольких последних лет также развивалась технология с целью обеспечения того, чтобы такие композиции, обогащенные тромбоцитами и/или факторами роста, могли быть получены в форме галеновых композиций или фармацевтических составов. Галеновую композицию или фармацевтический состав понимают как индивидуальное обеспечение, к которому адаптированы лекарственные средства или основные активные вещества, независимо от того, имеют ли они химическое или биологическое происхождение (как в случае с белками в PRP или PRGF), чтобы способствовать их введению. Галеновая композиция или фармацевтический состав лекарственного средства имеют первоочередную важность, поскольку они определяет эффективность и безопасность лекарственного средства, так как они контролируют дозировку и прохождение молекул лекарственного средства к ткани. Кроме того, галеновая композиция или фармацевтический состав лекарственного средства являются определяющим фактором при обеспечении того, что получение лекарственного средства, его дозировка и его введение являются известными, управляемыми и выполняемыми с относительной простотой и повторяемым образом. Вкратце, галеновая композиция или фармацевтический состав направлены на то, чтобы способствовать операциям, консервации, транспорту, введению и, в целом, проявлению свойств любого лекарственного средства или вещества, применяемого с терапевтической целью.
Один из наиболее широко применяемых медицинских составов PRP или PRGF известен как фибриновый гель или фибриновая сетка, которая представляет собой состав с полутвердой консистенцией, который является очень полезным при некоторых применениях. Методика получения фибринового геля или фибриновой сетки обычно начинается с первой фазы, на которой PRP или PRGF получают посредством применимого способа, например, посредством центрифугирования крови, извлеченной из пациента, пока кровь не разделится на различные фракции, и извлечения верхней фракции, т.е. фракции обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) или плазмы, обогащенной факторами роста (PRGF). Затем, тромбоциты, содержащиеся в PRP или PRGF, активируют (активацию понимают как действие, вызывающее высвобождение тромбоцитами некоторых факторов роста, содержащихся в их внутренней среде), например посредством добавления хлорида кальция. В результате активациии, и, при условии, что проходит достаточное количество времени, в конечном счете, происходит полимеризация фибрина из фибриногена, содержащегося в плазме, таким образом, производя конечное соединение, состоящее из фибринового сгустка (который также известен как фибриновый гель или фибриновая сетка по причине его полутвердой консистенции, напоминающей тип биологической губки). Данный процесс обычно осуществляют, чтобы получить фибриновый гель из крови, модифицированной с использованием антикоагулянта, таким образом, как с помощью цитрата натрия. Кровь может быть также обработана без этого процесса, при предварительном смешивании с антикоагулянтом. В этом случае, когда кровь центрифугируют, плазму отделяют от эритроцитов, и фибриновый гель получают без необходимости добавления хлорида кальция или любого другого средства активации тромбоцитов. Фибриновый гель или фибриновую сетку можно использовать, например, в следующих областях применения: чтобы образовать биологический каркас для наполнения костных дефектов; для нанесения на раны или повреждения для постепенного высвобождения факторов роста; для использования в качестве матрикса для культивирования стволовых клеток; для использования в качестве мембраны для закрытия дефектов или язв; и его применение в производстве ткани, которое известно как тканевая инженерия, где в дополнение к клеткам и факторам роста особенно важно иметь матрикс или каркас, на котором клетки могут расти.
Фибриновый гель или фибриновая сетка имеют некоторые существенные ограничения. Основным ограничением фибринового геля или фибриновой сетки является тот факт, что они являются нестабильными и имеют тенденцию к сжатию. В результате, фибриновый гель или фибриновая сетка неспособны к поддержанию стабильного объема с течением времени или обеспечению стабильной поддержки ткани с течением времени. Несмотря на то, что эта тенденция к сжатию может быть желательной при некоторых применениях, она является нежелательной при других. Например, в методе хирургической стоматологии, известном как поднятие дна верхнечелюстной пазухи, биоматериал, который применяют для регенерации костного дефекта, должен иметь остеокондуктивные свойства, но он также должен обладать способностью к поддержанию физического пространства в течение длительного периода времени, пока не образуется костный матрикс; иначе, пространство будет деформироваться, оказывая неблагоприятное воздействие на вертикальную регенерацию альвеолярной кости. Еще одним примером является случай удаления молочной железы (мастэктомия), во время которого биоматериал или гель, который используют для наполнения пространства молочной железы, должен предоставлять подходящую механическую сопротивляемость и обеспечивать пространство и объем в течение длительного периода времени, чтобы гарантировать то, что указанное пространство не деформируется. Дополнительным примером является случай наполнителей или косметических наполняющих средств (например, гиалуроновой кислоты), которые являются наполнителями (обеспечивающими и поддерживающими объем), широко применяемыми в области эстетической медицины для увеличения объема в углах рта и морщинах и исправления указанных дефектов, обеспечивая более молодой внешний вид; Любое средство, которое разрабатывается для эксплуатации в качестве наполнителя или наполняющего средства, должно быть механически стабильным и не поддающимся сжатию, так, чтобы оно могло поддерживать объем ткани. Кроме того, тенденция фибринового геля или фибриновой сетки к сжатию затрудняет применение геля или сетки в качестве средства для высвобождения дополнительных внешних средств, лекарственных средств, белков и т.д. и даже препятствует такому применению.
Дополнительным ограничением фибринового геля или фибриновой сетки является его(ее) неспособность инфильтроваться или канюлироваться в его(ее) нормальном, полутвердом состоянии, которая препятствует его(ее) введению в качестве наполнителя на коже, в лечебной косметике, травматологии и в других областях, таких как биология или медицина.
Целью данного изобретения является предоставление состава, имеющего желательные биологические или медицинские свойства, полученного из первоначальной композиции крови, которая является обогащенной тромбоцитами и/или факторами роста, и, которая не имеет тенденции к ретракции, следовательно, обеспечивая поддержание стабильного объема с течением времени. Среди других применений, желательно, чтобы состав предоставлял альтернативу фибриновому гелю или фибриновой сетке в некоторых областях применения, где требуется стабильная композиция.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к составу с желательными биологическими или медицинскими свойствами, содержащему первоначальную композицию крови (человеческого или животного происхождения; аутологической, гомологической или гетерологической), или получаемому из нее, обогащенному тромбоцитами и/или факторами роста, и, который содержит белки, поступающие из первоначального состава крови. Состав представляет уникальный признак, состоящий в том, что указанные белки находятся в гелеобразном состоянии в результате термической обработки нагревом и охлаждением. В частности, гелеобразные белки предпочтительно представляют собой альбумин, гликопротеины, глобулины и/или фибриноген. Сосотав согласно настоящему изобретения может быть описан как “белковый гель” (с использованием терминологии, аналогичной терминологии, применяемой для обозначения фибринового геля), поскольку он представляет гелеобразную консистенцию, обеспечиваемую белками в гелеобразном состоянии. Состав является деформируемым. Композиция представляет новую морфологическую и биомеханическую конфигурацию в сравнении с другими наполняющими гелями, другими составами крови, обогащенными тромбоцитами и/или факторами роста, и другими аналогичными составами, известными в предшествующем уровне техники.
Также предложен способ получения вышеуказанного состава, причем способ включает стадии: получения первоначальной композиции крови, обогащенной тромбоцитами и/или факторами роста, основной состав которого может видоизменяться; нагрева первоначальной композиции крови при температуре между 60°C и 100°C в течение по меньшей мере одной минуты; охлаждения первоначальной композиции крови в течение по меньшей мере одной минуты. Данный способ согласно изобретению, который может рассматриваться как температурная последовательность, обеспечивает объем и жесткость композиции крови, обогащенной тромбоцитами и/или факторами роста, производя белковый гель или состав с консистенцией геля благодаря гелеобразному состоянию некоторых белков, содержащихся в первоначальной композиции крови.
Состав согласно настоящему изобретению является биосовместимым, биодеградируемым и представляет желательные биологические или медицинские свойства, обеспечиваемые присутствием тромбоцитов или факторов роста. В дополнение, он также имеет плотную или вязкую консистенцию вследствие гелеобразного состояния некоторых белков, содержащихся в первоначальной композиции крови, причем указанная плотная или вязкая консистенция является стабильной с течением времени. Состав согласно настоящему изобретению, следовательно, представляет собой преимущественную альтернативу фибриновому гелю или фибриновой сетке, в связи с тем, что состав не сжимается, и, таким образом, обеспечивает то, чтобы физическое пространство оставалось наполненным. Дополнительно, состав обеспечивает хорошее сопротивление сжатию, аналогично гиалуроновой кислоте или лучше, чем гиалуроновая кислота (обычно применяемая в качестве наполнителя или наполняющего средства), и удовлетворительно выдерживает сопротивление, которое может оказывать ткань. В результате, состав является в высокой степени подходящим для применения в качестве наполнителя или наполняющего средства. Кроме того, даже тогда, когда как фибриновая сетка, так и состав по изобретению являются полутвердыми по природе, только последний может быть инфильтрован или введен инъекционно вследствие того, что он является деформируемым. Дополнительным преимуществом состава является то, что он может быть высушен и позднее регидратирован.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Подробности изобретения можно видеть на сопроводительных неограничивающих чертежах:
- Фигура 1 показывает два электронномикроскопических изображения иллюстративной лекарственной формы в соответствии с изобретением.
- Фигура 2 показывает два электронномикроскопических изображения еще одной иллюстративной лекарственной формы в соответствии с изобретением.
- Фигура 3 показывает набухаемость различных лекарственных форм согласно изобретению, полученных из фибринового сгустка, обработанного при различных значениях температуры и времени.
- Фигура 4 показывает набухаемость различных лекарственных форм в соответствии с изобретением, полученных посредством обработки супернатанта при различных значениях температуры и времени.
- Фигура 5 показывает результаты цитосовместимости различных лекарственных форм в соответствии с изобретением, тестируемых с остеобласт-подобной клеточной линией MG 63.
- Фигура 6 показывает другие результаты цитосовместимости различных лекарственных форм в соответствии с изобретением, тестируемых с остеобласт-подобной клеточной линией MG 63.
- Фигуры 7 и 8 соответственно показывают содержание тромбоцитарного фактора роста (PDGF-AB) и трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) в двенадцати лекарственных формах в соответствии с изобретением.
- Фигура 9 показывает кинетику высвобождения фактора роста PDGF-AB в четырех изобретательских лекарственных формах, инкубированных в течение различных периодов времени.
- Фигура 10 показывает кинетику высвобождения фактора роста TGF-β в четырех лекарственных формах в соответствии с изобретением, при инкубации в течение двух дней.
- Фигура 11 показывает фотографию спины лабораторной крысы, в которую инъекционно вводили образцы четырех лекарственных форм в соответствии с изобретением.
- Фигура 12 показывает график, относящийся к тесту предшествующей фигуры, показывающий объем полуэллипса после инъекции лекарственных форм на внутрикожном уровне, измеренный через две недели после инъекции.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Чтобы преодолеть существующие проблемы предшествующего уровня техники, относящиеся к отсутствию стабильности фибриновых гелей и сеток, предлагается альтернативный состав с желательными биологическими или медицинскими свойствами и с увеличенной стабильностью с течением времени. Состав содержит первоначальную коипозицию крови или получен из нее. Композиция крови является обогащенным тромбоцитами и/или факторами роста и также содержит разнообразные белки. Следовательно, состав также является обогащенным тромбоцитами и/или факторами роста и содержит разнообразные белки. Среди указанных белков существуют некоторые белки в гелеобразном состоянии, что собственно означает, что они лишены природных свойств (денатурализованы), и образуют организованную белковую сеть, предпочтительно вследствие термической обработки нагревом и охлаждением. Белки в гелеобразном состоянии предпочтительно представляют собой альбумин, гликопротеины, глобулины и/или фибриноген. Было доказано, что белковый гель в соответствии с настоящим изобретением не сжимаются, может легко канюлироваться или инфильтроваться и поддерживает объем и пространственную структуру, в отличие от других гелей на основе только фибриновой сети.
Первоначальная композиция крови может, например, представлять собой обогащенную тромбоцитами плазму крови, т.е. плазму с высокой концентрацией тромбоцитов. Указанную плазму обычно получают методом центрифугирования крови (чтобы разделить кровь на фракцию эритроцитов, фракцию лейкоцитов и фракцию обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP)) с последующей стадией разделения всей фракции обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) или ее части.
Первоначальная композиция крови может также представлять собой супернатант обогащенной тромбоцитами плазмы крови (PRP). Супернатант является существенной жидкостью, которая появляется на сгустке, когда вызывают коагуляцию обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) и ее последующую ретракцию.
Первоначальная композиция крови может представлять собой плазму крови, обогащенную высвобожденными факторами роста (PRGF), т.е. обогащенную тромбоцитами плазму крови, которая была активирована (например, посредством добавления хлорида кальция, тромбина, комбинации хлорида кальция и тромбина, глюконата натрия, коллагена, или любого другого средства, которое действует посредством активации тромбоцитов и индуцирования образования фибрина) с тем результатом, что тромбоциты высвобождают некоторые факторы роста в их внутреннюю среду.
Аналогично, первоначальная композиция крови может представлять собой супернатант плазмы крови, обогащенной высвобожденными факторами роста (PRGF), т.е. супернатант, полученный после коагуляции и последующей ретракции обогащенной тромбоцитами плазмы, которая прежде была активирована (например, посредством добавления хлорида кальция, тромбина, комбинации хлорида кальция и тромбина, глюконата натрия, коллагена, или любого другого средства, которое действует посредством активации тромбоцитов и индуцирования образования фибрина). Активация вызывает высвобождение тромбоцитами некоторых факторов роста в их внутреннюю среду.
Первоначальная композиция крови может содержать или не содержать лейкоциты.
Первоначальная композиция может также представлять собой фибриновый гель, полученный непосредственно в результате обработки крови, которая не была модифицирована с использованием антикоагулянта.
Также предложен способ получения состава с желательными биологическими или медицинскими свойствами, где указанный способ включает стадии:
a) обеспечения первоначальной композиции крови, которая является обогащенным тромбоцитами и/или факторами роста, которая предпочтительно представляет собой обогащенную тромбоцитами плазму с лейкоцитами или без лейкоцитов, плазму, обогащенную факторами роста с лейкоцитами или без лейкоцитов, супернатант обогащенной тромбоцитами плазмы с лейкоцитами или без лейкоцитов, супернатант плазмы, обогащенной факторами роста, с лейкоцитами или без лейкоцитов, или фибриновый гель, полученный из крови, которая не была модифицирована с использованием антикоагулянта;
b) в том случае, когда композиция крови имеет тромбоциты, необязательно стадию активации тромбоцитов активирующим средством, таким как хлорид кальция, тромбин, глюконат кальция, коллаген или любое другое активирующее средство, или их комбинация, и ожидания образования предварительного фибрина;
c) нагрева первоначальной композиции крови при температуре в интервале между 60°C и 100°C в течение по меньшей мере одной минуты;
d) охлаждения или кондиционирования первоначальной композиции крови в течение по меньшей мере одной минуты.
Вышеуказанный способ развивает тепловой удар на первоначальный состав крови с результатом индуцирования белковой желатинизации некоторых белков в человеческой плазме; в числе этих белков находятся альбумин, гликопротеины, глобулины и/или фибриноген. Для целей данного изобретения, “желатинизация” является наименованием процесса, который претерпевают молекулы, и, при котором они полимеризуются или объединяются вместе с образованием организованной белковой сети. В итоге, в результате процесса теплового удара, создаются новые биосовместимые и биодеградируемые составы, в зависимости от первоначальной композиции крови, общим признаком для которых является желатинизация или полимеризация белков.
Дополнительно, было показано, что состав в соответствии с изобретением, обеспеченный гелеобразными белками, в основном поддерживает уровни факторов роста в первоначальной композиции крови. Другими словами, тепловой удар не вызывает массовое разрушение факторов роста в указанной первоначальной композиции крови.
Предпочтительно, первоначальную композицию крови нагревают при температуре в интервале между 70°C и 85°C.
Первоначальная композиция крови, которая является обогащенной тромбоцитами и/или факторами роста, имеет человеческое или животное происхождение. Она может также являться аутологической (принадлежащей пациенту, подлежащему лечению на более поздней стадии с использованием конечной лекарственной формы), гомологической (принадлежащей члену того же самого вида, что пациент, пациентам, клеткам или еще одному биологическому объекту, подлежащим лечению или обработке с использованием конечной лекарственной формы) или гетерологической (принадлежащей члену вида, отличающегося от вида пациента, пациентам, клеткам или еще одному биологическому объекту, подлежащим лечению или обработке с использованием конечного состава).
Данное изобретение предусматривает то, что первоначальная композиция крови может необязательно включать одно или несколько дополнительных веществ, добавленных перед заявленной тепловой обработкой. Указанные дополнительные вещества могут представлять собой:
- одно или несколько биоактивных средств, выбранных из белков, пептидов, нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов, небелковых органических веществ и неорганических веществ;
- один или несколько биодеградируемых полимеров, выбранных из: гиалуроновой кислоты, гиалуронатных солей, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, декстрана, силикагеля, альгината, гидроксипропилметилцеллюлозы, производных хитина – предпочтительно, хитозана - ксантановой камеди, агарозы, полиэтиленгликоля (ПЭГ), полигидроксиэтилметакрилата (PHEMA), синтетических или природных белков и коллагенов;
- один или несколько органических полимеров, выбранных из группы, образованной поликапролактоном, полигликолидом, полилактидом и их сополимерами;
- одно или несколько из следующих средств: антибиотиков, противомикробных средств, антиканцерогенов, анальгетиков, факторов роста, гормонов;
- один или несколько неорганических компонентов, выбранных из группы солей кальция, солей магния и/или солей стронция.
Данное изобретение также предусматривает, что любое из вышеуказанных веществ может быть добавлено к составу после проведения тепловой обработки.
Состав в соответствии с изобретением может представлять различные варианты осуществления в которых, в дополнение к заявленным техническим аспектам, состав может содержать дополнительные соединения, компоненты и молекулы и т.д., которые являются подходящими для конкретной области применения, для которой будет использоваться лекарственная форма. Т.е., изобретение рассматривается как семейство новых составов, основанных на белковых гелях, причем указанное семейство является образованным различными составами, в которых присутствуют гелеобразные белки, и, которые могут различаться по их дополнительной композиции.
Кроме того, с составом с гелеобразными белками могут проводиться дополнительные стадии, включая сушку с матрицами в качестве средства придания им большей разносторонности. Иначе говоря, составы по изобретению гелеобразных белков могут быть высушены (сухой жар) или лиофилизированы, чтобы образовать мембрану. Эту мембрану можно в последующем регидратировать посредством различных альтернатив, таких как добавление физиологического раствора, обогащенной тромбоцитами плазмы, супернатанта обогащенной тромбоцитами плазмы, плазмы, обогащенной факторами роста, супернатанта плазмы, обогащенной факторами роста, или любого другого раствора, который обеспечивает гидратацию мембраны.
Примеры
Пример 1
Способ начинают с образца крови объемом 9 мл, выделенной из пациента и хранимой в герметично закупоренной пробирке, не содержащей цитратный антикоагулянт. Кровь центрифугируют при скорости, равной 580 g в течение 8 минут и при температуре окружающей среды. В результате центрифугирования, кровь, содержащаяся в пробирке, разделяется на различные фракции. Верхнюю фракцию, или фракцию обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP), которая включает лейкоциты, отбирают в 5 мл шприц. Вследствие того, что первоначальная пробирка не содержала цитрат, PRP начинает коагулировать. Содержимое шприца нагревают при температуре 70°C в течение 10 минут. Контейнер затем охлаждают при температуре 4°C в течение 2 минут. В результате этой температурной последовательности нагрев-охлаждение, внутри шприца образуется полутвердая субстанция с консистенцией геля. Таким образом, получают активированный состав, причем активированный состав представляет гелеобразную консистенцию (как в результате фибрина, генерируемого вследствие коагуляции, так и в результате желатинизации белков, производимой посредством тепловой обработки) и не содержит цитрат и кальций. Присутствие фибрина обеспечивает состав с более высокой консистенцией и сопротивляемостью, в то время как гелеобразные белки обеспечивают постоянные стабильность и объем. Благодаря его свойствам и механической сопротивляемости, субстанция этого типа может быть применимой, например, при исправлении вертикальных дефектов в тканях лицевой области.
Пример 2
Способ начинают с образца крови объемом 9 мл, выделенной из пациента и хранимой в герметично закупоренной экстракционной пробирке, которая содержит 3,8% цитратного антикоагулянта в количестве 0,1 мл. Кровь центрифугируют при скорости, равной 580 g, в течение 8 минут и при температуре окружающей среды. В результате центрифугирования, кровь, содержащуюся в пробирке, разделяют на различные фракции. Верхнюю фракцию или фракцию обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP), отбирают в 5 мл шприц без включения лейкоцитов. Шприц нагревают при температуре 80°C в течение 3 минут. Шприц затем охлаждают при температуре 20°C в течение 10 минут. В результате этой температурной последовательности нагрев-охлаждение, полутвердая субстанция образуется внутри второго контейнера. Субстанция имеет гелеобразную консистенцию, и ее тромбоциты еще должны быть активированы. Субстанция не содержит фибрин, поскольку он не коагулировал прежде. Субстанция данного типа может применяться, например, в качестве наполнителя в пластической хирургии, чтобы достичь более молодого внешнего вида посредством устранения или уменьшения присутствия морщин; субстанция может применяться благодаря ее способности вводиться инъекционно (с использованием иглы меньшей, чем или равной 25G) и ее консистенции, которая обладает способностью к подтягиванию кожи. Этот биогель является стабильным с течением времени и также высвобождает факторы роста, которые стимулируют рост и пролиферацию клеток, что, следовательно, делает его очень преимущественным в сравнении с общепринятыми веществами, такими как гиалуроновая кислота. Гиалуроновая кислота, которая является наиболее широко применяемым наполнительным материалом в настоящее время, не имеет биологической активности, и, следовательно, не инициирует образования ткани или не позволяет достичь длительных улучшений с течением времени, что означает, что она должна вводиться на периодической основе, обычно каждые три-четыре месяца.
Пример 3
Способ начинают с извлечения образца крови объемом 9 мл из пациента и хранения крови в герметично закупоренной экстракционной пробирке, которая содержит 0,1 мл 3,8% цитратного антикоагулянта. Кровь центрифугируют при скорости, равной 580 g, в течение 8 минут и при температуре окружающей среды. В результате центрифугирования, кровь, содержащуюся в пробирке, разделяют на различные фракции. Верхнюю фракцию или фракцию обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP), отбирают в 5 мл шприц без включения лейкоцитов. Затем, 10% хлорид кальция добавляют при отношении 50 мкл на каждый 1 мл плазмы, вызывая активацию тромбоцитов, т.е. высвобождение факторов роста и коагуляцию плазмы. Шприц затем нагревают при температуре 75°C в течение 5 минут. Шприц затем охлаждают при температуре окружающей среды в течение 10 минут. В результате этой температурной последовательности нагрев-охлаждение, внутри шприца образуется полутвердая субстанция. Субстанция имеет гелеобразную консистенцию в результате как фибрина, генерированного вследствие коагуляции, так и желатинизации белков, производимой посредством тепловой обработки. Субстанция включает цитрат, кальций и высвобожденные факторы роста. Субстанция данного типа может применяться для наполнения дефекта костной ткани, такой как альвеола, остающаяся после удаления фрагмента зуба, чтобы стимулировать регенерацию альвеолы. Благодаря высвобождению факторов роста и способности геля действовать в качестве основы для роста клеток, гель способствует наполнению альвеолы костной тканью, таким образом, сокращая время ожидания для дополнительных операций, например, установки зубного имплантата в альвеоле вместо удаленного зуба.
Пример 4
Способ начинают с извлечения образца крови объемом 9 мл из пациента и хранения его в герметично закупоренной экстракционной пробирке, содержащей 0,1 мл раствора цитрата натрия с концентрацией, равной 3,8% (масса/объем), который действует в качестве антикоагулянта. Кровь центрифугируют при скорости, равной 580 g в течение 8 минут и при температуре окружающей среды. В результате центрифугирования, кровь, содержащаяся в пробирке, разделяют на различные фракции. Верхнюю фракцию, или фракцию обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP), отбирают в разделительную пробирку объемом 9 мл без лейкоцитов. Раствор хлорида кальция (с 10% концентрацией масса/объем) добавляют при отношении 50 мкл на каждый 1 мл плазмы. Пробирку затем помещают в сушильный шкаф при 37°C. Хлорид кальция вызывает активацию тромбоцитов (высвобождение фактора роста), коагуляцию плазмы и образование фибрина, причем указанное образование ускоряется тем обстоятельством, что пробирка подвергается воздействию температурных условий сушильного шкафа. В результате ретракции сгустка затем получают две фазы: твердую фазу, которая представляет собой трехмерную фибриновую структуру, и жидкую фазу супернатанта, которая содержит белки, тромбоцитарные факторы роста и плазменные факторы роста. Жидкую фазу или супернатант отделяют в 3 мл шприц. Шприц затем нагревают при температуре 80°C в течение 10 минут. Шприц затем охлаждают при температуре 22°C в течение 5 минут. В результате этой температурной последовательности нагрев-охлаждение, внутри шприца образуется полутвердая субстанция. Эта полутвердая субстанция имеет менее твердую консистенцию, чем составы в соответствии с изобретением, которые содержат фибрин. Вследствие ее менее твердой консистенции, субстанция данного типа может быть применимой, например, для наполнения пародонтальных внутрикостных дефектов с целью инициации регенерации пародонта. Она может также быть применимой для регенерации костной ткани посредством осуществления субпериостальной или супрапериостальной инфильтрации субстанции.
Пример 5
В еще одном примере способ начинается с фибринового сгустка (субстанции, полученной после центрифугирования крови при скорости, равной 580 g и температуры, равной 20°C, чтобы получить обогащенную тромбоцитами плазму, с добавлением хлорида кальция при соотношении 50 мкл хлорида кальция на каждый 1 мл плазмы, и ожидания в течение от 10 до 20 минут до полимеризации фибрина). Сгусток подвергают нагреву при 70°C в течение 10 минут, с последующим охлаждением при 20°C в течение 10 минут, с получением, таким образом, белкового геля. Фигура 1 показывает два электронномикроскопических изображения вышеуказанного белкового геля. Изображение слева показывает присутствие закругленных структур, которые представляют денатурализованный альбумин, и линейных структур, которые являются волокнами фибрина. Изображение справа показывает компактную (внешнюю) поверхность геля.
Пример 6
В еще одном примере, способ начинают с плазмы, обогащенной факторами роста (PRGF) (субстанции, полученной после центрифугирования крови при скорости, равной 580 g и температуре, равной 20°C с получением различных фракций, отделения фракции обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) и добавления хлорида кальция при соотношении 50 мкл хлорида кальция на каждый 1 мл плазмы, с целью вызвать высвобождение факторов роста, и начала коагуляции плазмы). Ретракция сгустка обеспечивала получение супернатанта. Указанный супернатант затем подвергали нагреву при 70°C в течение 10 минут, с последующим охлаждением при 20°C в течение 10 минут, с получением белкового геля. Фигура 2 показывает два электронномикроскопических изображения вышеуказанного белкового геля. Изображение слева показывает внутреннее строение геля и присутствие закругленных структур, которые представляют денатурализованный альбумин. Изображение справа показывает компактную (внешнюю) поверхность геля.
Пример 7
В еще одном примере, получали различные белковые гели, подвергая воздействию фибриновый сгусток (полученный, как описано в Примере 5) при различных значениях температуры и времени. Условия получения были следующими: нагрев сгустка при 70°C в течение 15 минут (квадрат), нагрев сгустка при 70°C в течение 30минут (круг), нагрев сгустка при 80°C в течение 15минут (треугольник); и охлаждение их всех при температуре 4°C в течение 10 минут. Эти гели высушивали при 37°C в течение 24 часов перед инкубацией в дистиллированной воде. Гели взвешивали с интервалами в 24 часа, чтобы рассчитать степень набухания, определяемую как: набухшая масса/первоначальная масса. Фигура 3 показывает степень набухания или набухаемость белковых гелей, полученных при различных значениях температур и времени. Как можно видеть, гели увеличивают в 2-3 раза их первоначальную массу вследствие поглощения воды и ее удерживания внутри структуры. Также можно видеть, что гели, полученные при 70°C в течение 15 минут (квадрат), набухают за 24 часа и их набухаемость существенно не изменяется в течение более длительного времени инкубации. Однако, гели, полученные при 70°C в течение 30 минут (круг), набухают приблизительно в 3 раза от их первоначальной массы через 24 часа, но, по мере того, как время инкубации увеличивается, наблюдается небольшое снижение набухаемости. В то же время, гелям, полученным при 80°C в течение 15 минут (треугольник), требуется больше времени, чем двум предыдущим гелям, для достижения максимального набухания, конкретно 48 часов. В любом случае, набухаемость гелей означает, что они могут применяться, например, в качестве матриц для местного высвобождения биоактивных веществ (белков или основных активных веществ). Данное применение обычно осуществляют посредством нанесения раствора, который содержит указанные биоактивные вещества на дегидратированные гели, что, таким образом, вызывает гидратацию гелей и, следовательно, включение биоактивных веществ.
Пример 8
В еще одном примере, различные белковые гели получали, подвергая воздействию супернатант (полученный в соответствии с Примером 6) при различных значениях температуры и времени. Условия получения были следующими: нагрев супернатанта при 70°C в течение 15 минут (квадрат), нагрев супернатанта при 70°C в течение 30 мнут (круг), нагрев супернатанта при 80°C в течение 15 минут (треугольник); и охлаждение их всех при температуре 4°C в течение 10 минут. Эти гели высушивали при 37°C в течение 24 часов перед проведением инкубации в дистиллированной воде. Гели взвешивали с интервалами в 24 часа, чтобы рассчитать степень набухания, определяемую как отношение: набухшая масса/первоначальная масса. Первоначальная масса представляет собой массу сухого геля перед его инкубацией в воде. Фигура 4 представляет степень набухания белковых гелей, полученных при различных значениях температуры и времени. Как можно видеть, первоначальная масса гелей увеличилась приблизительно в 3 раза вследствие поглощения воды и удерживания ее внутри их структуры. Также можно видеть, что гели, полученные при 70°C в течение 15 минут (квадрат) набухают за 24 часа и, что их набухаемость не изменяется существенно при больших значениях времени инкубации. Напротив, гели, полученные при 70°C в течение 30 минут (круг), набухают в 3 раза от их первоначальной массы через 48 часов, но небольшое снижение набухаемости наблюдают при большем времени инкубации. В то же время, гели, полученные при 80°C в течение 15 минут (треугольник), достигают указанной набухаемости, приблизительно равной 3, через 24 часа инкубации. В любом случае, набухаемость гелей позволяет применять их, например, в качестве матриц для местного высвобождения биоактивных веществ (белков или активных ингредиентов). Данное применение обычно осуществляют посредством нанесения раствора, который содержит указанные биоактивные вещества на дегидратированные гели, что, таким образом, вызывает гидратацию гелей и, следовательно, включение биоактивных веществ в их внутреннюю среду.
Пример 9
2
В еще одном примере, четыре белковых геля или состава получали в соответствии с изобретением из: супернатанта (указанного как “SN” на графике, относящемся к концу данного примера), фибринового сгустка (“Фибрин”), неактивированной обогащенной тромбоцитами плазмы (“Неактивированная”) и обогащенной тромбоцитами плазмы, активированной 10% CaCl без коагуляции (“Активированная-без коагуляции”), и, выполняя тепловую обработку вышеуказанных первоначальных субстанций, состоящую из нагрева субстанций при 70°C в течение 15 минут и охлаждения их при 21°C в течение 10 минут. Способы получения этих первоначальных субстанций объясняются в Примерах 2, 3 и 6. Каждый из этих четырех составов, полученных после тепловой обработки, инкубировали в течение 48 часов в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) без фетальной бычьей сыворотки в течение 48 часов. В дополнение, способ также применяли для обработки пятой субстанции или контрольной субстанции, состоящей из DMEM без фетальной бычьей сыворотки. Пять культуральных сред применяли для культивирования клеток MG 63, при обновлении каждые 2 (квадрат) дня, 4 (круг) и 7 (треугольник) дней. После каждого из этих периодов времени, пролиферацию клеток оценивали с использованием колориметрического реагента WST-1 и устройства для считывания планшетов. Процент пролиферации рассчитывали, используя следующую функцию: % пролиферации=(поглощение гелем WST-1/поглощение контрольной субстанцией WST-1)×100. Фигура 5 показывает результаты цитосовместимости белковых гелей, тестируемых с остеобласт-подобной клеточной линией MG 63. Как можно видеть, гели не являются токсичными, как показано по увеличению пролиферации клеток по отношению к контрольным образцам. После двух дней пролиферации (квадрат) гель, полученный из неактивированной обогащенной тромбоцитами плазмы, приводил к более высокой пролиферации клеток. Однако эти различия не возникали при более длительном времени пролиферации (круг, треугольник). Этот пример, следовательно, демонстрирует, что составы в соответствии с изобретением проявляют подходящее поведение для стимуляции роста клеток и являются биосовместимыми, обеспечивая их разработку, направленную на клиническое применение.
Пример10
2
Как в предшествующем примере, четыре белковых геля или состава получали в соответствии с изобретением из: супернатанта (квадрат), фибринового сгустка (круг), неактивированной обогащенной тромбоцитами плазмы (треугольник с центральной вершиной, указывающий вверх) и обогащенной тромбоцитами плазмы активированной 10% CaCl без коагуляции (треугольник с центральной вершиной, указывающей вниз). Все субстанции подвергали тепловой обработке, состоящей в нагреве вещества при 70°C в течение 15 минут и охлаждении их при 21°C в течение 10 минут. Способы получения этих первоначальных субстанций объясняются в Примерах 2, 3 и 6. Четыре полученных состава инкубировали в культуральной среде в течение 2, 4, 7 и 9 дней. В конце каждого периода времени, среды собирали, и к гелям добавляли новую среду. Собранные среды хранили для их применения при культивировании клеток MG 63. Клетки выращивались в этой среде в течение 48 часов. Пролиферацию клеток затем оценивали с использованием колориметрического реагента WST-1 и устройства для считывания планшетов. Процент пролиферации рассчитывали, используя следующую функцию: % пролиферации=(поглощение гелем WST-1/поглощение контрольной субстанцией WST-1)×100, где DMEM без сыворотки применяли в качестве контрольной субстанции. Фигура 6 показывает пролиферацию клеток в культуральной среде и при каждом интервале времени инкубации. Как можно видеть, более высокой пролиферации клеток достигали через 2 дня инкубации. При более длительном времени инкубации, культуральная среда инициировала меньшую пролиферацию клеток, что позволяет предположить, что высвобождение факторов роста было выше после 2 дней инкубации, и, что это содержание факторов роста было меньше, чем в средах с более длительным временем инкубации (4, 7 и 9 дней). Эти результаты, следовательно, показывают, что высвобождение веществ, стимулирующих пролиферацию клеток в гелях, снижается с течением времени, следуя профилю высвобождения, аналогичного профилям для других типов гелей, которые характеризуются высвобождением больших количеств биоактивных веществ во время первых нескольких часов инкубации (“взрывной” эффект), и тем, что с течением времени высвобожденное количество значительно снижается.
Пример 11
В еще одном примере, способ начинают с двух первоначальных субстанций. Первая субстанция представляла собой фибриновый гель, полученный после активации обогащенной тромбоцитами плазмы хлоридом кальция при отношении 50 мкл на каждый 1 мл плазмы (как в Примере 6). Вторая субстанция представляла собой супернатант, полученный после ретракции фибринового геля (как в Примере 6). Обе субстанции подвергали трем различным тепловым обработкам: нагреву при 70°C в течение 15 минут, нагреву при 70°C в течение 30 мнут и нагреву при 80°C в течение 15 минут. Во всех случаях, нагрев сопровождался охлаждением при температуре 4°C или при температуре 20°C, в течение 10 минут. Получали двенадцать белковых гелей. Двенадцать гелей затем центрифугировали при 14800 об/мин в течение 20 минут. Затем измеряли содержание тромбоцитарного фактора роста (PDGF-AB) и трансформирующего ростового фактора бета (TGF-β). Результаты этих измерений показаны на Фигурах 7 и 8, где двенадцать гелей показаны в шести группах по два, группах, имеющих название “1” (фибриновый гель при 70°C, 15 минут), “2” (фибриновый гель при 70°C, 30 минут), “3” (фибриновый гель при 80°C, 15 минут), “4” (гель супернатанта при 70°C, 15 минут), “5” (гель супернатанта при 70°C, 30 минут) и “6” (гель супернатанта при 80°C, 15 минут), и, где, в каждой группе, гель, охлажденный при 4°C, указан черным столбцом, а гель, охлажденный при 20°C указан белым столбцом. Фигура 7 показывает наблюдаемое содержание фактора PDGF-AB. Можно сделать вывод, что содержание этого фактора роста, в целом, было более высоким, в гелях, охлажденных при 20°C (белые столбцы), чем в гелях, охлажденных при 4°C (черные столбцы), исключая гели супернатантов, полученных при 70°C в течение 30 минут (“5”) и при 80°C (“6”), где почти никаких различий по содержанию PDGF-AB не наблюдали в зависимости от температуры охлаждения. Фигура 8 показывает наблюдаемое содержание фактора роста TGF-β. Можно сделать вывод, что, по отношению к этим гелям, полученным из фибрина (группы “1”, “2”, “3”), в случае охлаждения, выполняемого при 20°C (белые столбцы), содержание фактора TGF-β было аналогичным в трех группах, т.е. для различных тепловых обработок для получения гелей, в то время, как в случае охлаждения, выполняемого при 4°C (черные столбцы), содержание фактора TGF-β было выше в геле, полученном при 70°C в течение 15 минут (группа “1”). Напротив, по отношению к гелям, полученным из супернатанта (группы “4”, “5”, “6”), можно видеть, что только белковый гель, полученный из супернатанта при 70°C в течение 15 минут (группа “1”), высвобождал TGF-β, причем указанный фактор не высвобождался в других гелях, полученных из супернатанта. Таким образом, можно сделать вывод, что фибриновый гель поддерживает более высокое содержание фактора роста, чем супернатант при температурах, превышающих 70°C, и, что температура нагрева и температура охлаждения, следовательно, оказывает воздействие на содержание этого фактора роста, причем содержание является более высоким при более низких температурах нагрева и температуре охлаждения, равной 21°C. Можно также заключить, что PDGF-AB является более стабильным, чем TGF-β при высоких температурах, и, что белковый гель на основе фибрина содержит более высокое количество TGF-β, чем белковый гель на основе супернатанта.
Пример 12
2
В еще одном примере, четыре белковых геля или состава получали в соответствии с изобретением, применяя тепловую обработку, которая состояла в нагреве следующих первоначальных субстанций при 70°C в течение 15 минут и охлаждении их при 21°C в течение десяти минут: супернатанта (SN), фибринового сгустка (фибрин), неактивированной обогащенной тромбоцитами плазмы (неактивированная) и обогащенной тромбоцитами плазмы, активированной 10% CaClбез коагуляции (активированная без коагуляции). Получение этих первоначальных веществ объясняется в Примерах 2, 3 и 6. Четыре белковых геля инкубировали в DMEM в течение различных периодов времени (2, 4 и 7 дней). При каждом времени инкубации, среды экстрагировали, чтобы определить содержание PDGF-AB и TGF-β, с целью определения кинетики высвобождения этих факторов роста в четырех белковых гелях. Фигура 9 показывает кинетику высвобождения PDGF-AB в среде DMEM, при измерениях, соответствующих периодам времени инкубации, равным 2, 4 и 7 дням, указанных с помощью черных, белых и полосатых столбцов. Можно видеть, что высвобождение PDGF-AB было более высоким во время 2 и 4 дней инкубации для белкового геля, полученного из супернатанта. Другие гели не показывают каких-либо значительных различий между тремя значениями времени инкубации. В свою очередь, Фигура 10 показывает кинетику высвобождения TGF-β в среде DMEM через 2 дня инкубации. Можно видеть, что этот фактор присутствовал только в белковых гелях, полученных из супернатанта и фибрина, причем высвобождение TGF-β в белковом геле из супернатанта является более высоким. Можно сделать вывод, следовательно, что факторы роста высвобождаются более быстро из белковых гелей на основе супернатанта.
Пример 13
В еще одном примере, наполняющий эффект белковых гелей или составов в соответствии с изобретением тестировали на лабораторных крысах. С этой целью получали четыре состава по изобретению. Получение четырех составов начинали со следующих стадий. Сперва у пациентов забирали кровь в пробирки объемом 9 мл без антикоагулянта. Пробирки центрифугировали при 850 g в течение 8 минут для отделения плазмы от эритроцитов. Полный столбик плазмы, расположенный выше фракции эритроцитов, исключая лейкоциты, затем экстрагировали в новые пробирки объемом 9 мл. Эту плазму использовали, чтобы получить следующее: саму плазменную жидкость (B); фибриновый сгусток (C), причем с этой целью 10% хлорид кальция добавляли при отношении 50 мкл на каждый 1 мл плазмы, вызывая активацию плазмы и образование сгустка; и супернатант (A), причем с этой целью получали фибриновый сгусток с такими же характеристиками, как у вышеуказанного сгустка, и период, равный 60 минут при 37°C, продлевали, обеспечивая сжатие фибрина и получение супернатанта. У пациентов также забирали кровь в экстракционные пробирки объемом 9 мл с 0,1 мл 3,8% цитратa натрия в качестве антикоагулянта. Кровь центрифугировали при 850 g в течение восьми минут, с 2 мл плазмы, находящейся непосредственно выше слоя лейкоциты-тромбоциты, полученной и активированной 10% хлорида кальция при отношении 50 мкл на каждый 1 мл плазмы для получения фибринового сгустка (D). Эти четыре первоначальных субстанции (A, B, C, D) обрабатывали при 70°C в течение 10 минут и охлаждали при 20°C в течение 10 минут, чтобы получить гели. Дозу, равную 0,6 мл, каждого из гелевых составов вводили каждой крысе. Фотография, показанная на Фигуре 11, показывает образование увеличения объема, поддерживаемое белковыми гелями, указывая на улучшение их механических свойств.
Дополнительно, плазму, обогащенную факторами роста (которую будут называть “PRGF-Endoret”), получали посредством извлечения крови в пробирки объемом 9 мл с 0,1 мл 3,8% цитрата натрия, центрифугирования крови при 850 g в течение восьми минут, отделения фракции плазмы, обогащенной тромбоцитами (2 мл столбика плазмы непосредственно выше фракции эритроцитов, без включения лейкоцитов) и, в момент перед инъекцией крысе, активации плазмы (вызывающей высвобождение факторов роста тромбоцитов) посредством добавления 50 мкл хлорида кальция на каждый 1 мл.
Фигура 12 показывает изменения в объеме через 2 недели после инъекционного введения белковых гелей крысам и с использованием гиалуроновой кислоты и плазмы PRGF-Endoret, обогащенной факторами роста, описанной выше, в качестве контролей. Можно сделать вывод, что белковые гели были настолько же эффективными при поддержании объема полуэллипса, как гиалуроновая кислота, в то время как плазма PRGF-Endoret, обогащенная факторами роста, была неприменимой при поддержании объема полуэллипса.
Следует добавить, что, во время теста пытались также инъецировать общепринятый фибриновый гель (сгусток), с целью сравнения стабильности белковых гелей, в соответствии с изобретением, со стабильностью фибринового геля. Результатом было то, что невозможно инъецировать указанный фибриновый гель, поскольку происходило разделение фаз (причем фибрин отделялся от супернатанта), предотвращая введение собственно самого фибринового геля.
Пример 14
Обогащенную тромбоцитами плазму получают, как описано в Примере 2. Затем добавляли коллаген типа-I. Смесь затем нагревают при температуре 75°C в течение 10 минут и последовательно охлаждают при температуре 20°C в течение 3 минут. Результатом этого получения является белковый гель, который показывает более высокую консистенцию. Данный тип геля может применяться в качестве наполнителя для обработки морщин, так как он показывает более высокую стабильность и более медленную скорость разрушения, чем такой гель без коллагена. Эта модификация, таким образом, способствует замедлению разрушения состава даже в дальнейшем. Клинически, данное улучшение стабильности увеличивает период между первым и вторым введением геля. Данное обстоятельство представляет решение проблемы недостаточного лечения морщин с использованием гиалуроновой кислоты, которое включает в себя повтор ее введения каждые 3-4 месяца, иными словами, за более короткий период времени.
Пример 15
Обогащенную тромбоцитами плазму получают, как описано в Примере 2. Фосфат кальция, например, затем добавляют в гранулированной форме. Смесь затем нагревают при температуре 80°C в течение 10 минут и охлаждают при температуре 20°C в течение 3 минут. Гибридный материал, являющийся результатом этого получения, показывает лучшие механические свойства, чем гель, который не был модифицирован фосфатом кальция. Модификация геля фосфатом кальция увеличивает сопротивляемость геля сжатию и силам растяжения. Данный тип материала может применяться, чтобы регенерировать дефекты костной ткани, для чего от материала наполнителя требуется более высокая механическая стабильность вследствие отсутствия одной или нескольких стенок в дефекте.
Пример 16
Белковый гель в соответствии с изобретением получают, используя способ получения, описанный в любом из вышеуказанных примеров. Гель затем объединяют с гиалуроновой кислотой для получения гибридного материала. Данный материал показывает лучшие вязкоупругие свойства, которые увеличивают его стабильность в области введения, таким образом, предотвращая его миграцию. Данный гибридный материал является применимым для его применения на поверхностях, таких как вестибулярная стенка узкого альвеолярного отростка, чтобы вызвать рост горизонтальной кости и, таким образом, увеличить толщину альвеолярного отростка, для обеспечения введения зубных имплантатов с достаточным костным покрытием.
Пример 17
После получения и сушки геля, как описано в Примере 8 (любой из примеров белкового геля, описанный в данном документе, является пригодным), сухой материал инкубируют, в течение 24 часов и в темноте, в жидкости, которая содержит антибиотик доксициклина гиклат при концентрации, равной 15 мг/мл. Результатом является набухание геля, причем структура геля включает антибиотик для его последующего высвобождения в области применения. Этот гель может теперь, таким образом, применяться для контролируемого высвобождения антибиотика для лечения инфекции в области, где имеет место более низкое кровоснабжение - кости, например - и предотвращает системное введение антибиотика. Данная методика может повторяться с другими антибиотиками и другими медицинскими средствами, чтобы гарантировать их местное высвобождение.