РЕКОМБИНАНТНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАЮЩИХ ГЕПАРИН БЕЛКОВ

1. Способ выделения связывающего гепарин белка из культуры прокариотических клеток, причем способ включает в себя стадии
(a) выделения указанного связывающего гепарин белка из периплазмы указанной культуры прокариотических клеток;
(b) денатурации указанного выделенного связывающего гепарин белка в первом буферном растворе, содержащем хаотропное средство и восстанавливающее средство;
(c) инкубации указанного выделенного денатурированного связывающего гепарин белка во втором буферном растворе, содержащем хаотропное средство и сульфатированное полианионное средство, в течение такого времени и при таких условиях, что происходит повторная укладка связывающего гепарин белка; и
(d) выделения указанного повторно уложенного связывающего гепарин белка, где имеет место приблизительно 2-5-кратное увеличение количества выделенного повторно уложенного связывающего гепарин белка по сравнению с инкубацией без сульфатированного полианионного средства.
2. Способ по п.1, где связывающий гепарин белок представляет собой связывающий гепарин фактор роста.
3. Способ по п.2, где связывающий гепарин фактор роста представляет собой фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).
165
4. Способ по п.3, где VEGF представляет собой VEGF.
5. Способ по п.1, где сульфатированное полианионное средство составляет приблизительно между 3000 и 10000 дальтон.
6. Способ по п.3, где указанный второй буферный раствор содержит декстрансульфат.
7. Способ по п.3, где указанный второй буферный раствор содержит сульфат натрия.
8. Способ по п.3, где указанный второй буферный раствор содержит гепарин.
9. Способ по п.6, где декстрансульфат составляет приблизительно между 8000 и 10000 дальтон.
10. Способ по п.3, где указанные первый и второй буферные растворы содержат HEPPS рН 8,0.
11. Способ по п.1, где указанный второй буферный раствор дополнительно содержит восстанавливающее средство.
12. Способ по п.11, где восстанавливающее средство из второго буферного раствора содержит сочетание цистеина и DTT.
13. Способ по п.1, где указанный второй буферный раствор дополнительно содержит неионный детергент.
14. Способ по п.1, где указанный второй буферный раствор дополнительно содержит аргинин и/или лизин.
15. Способ по п.1, где указанная стадия выделения (d) включает в себя последовательное контактирование указанного повторно уложенного связывающего гепарин белка с подложкой для хроматографии на гидроксиапатите, первой подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия; с подложкой для катионной хроматографии и второй подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия, и избирательную элюцию связывающего гепарин белка с каждой подложки.
16. Способ по п.15, где указанные первая и вторая подложки для хроматографии гидрофобного взаимодействия выбраны из группы, состоящей из бутил-, пропил-, октил- и арил-агарозных смол.
17. Способ по п.15, где указанная первая подложка для хроматографии гидрофобного взаимодействия представляет собой бутил-агарозную подложку, и указанная вторая подложка для хроматографии гидрофобного взаимодействия представляет собой подложку из фенил-агарозной смолы.
18. Способ по п.1, где указанная стадия выделения (d) включает в себя последовательное контактирование указанного повторно уложенного связывающего гепарин белка с катионообменной подложкой; с подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия и с подложкой для ионообменной хроматографии, и избирательную элюцию связывающего гепарин белка с каждой подложки.
19. Способ выделения связывающего гепарин белка из культуры прокариотических клеток, причем способ включает в себя стадии
(a) выделения указанного связывающего гепарин белка из периплазмы указанной культуры прокариотических клеток;
(b) денатурации указанного выделенного связывающего гепарин белка в первом буферном растворе, содержащем хаотропное средство и восстанавливающее средство;
(c) инкубации указанного денатурированного связывающего гепарин белка во втором буферном растворе, содержащем хаотропное средство и сульфатированное полианионное средство, в течение такого времени и при таких условиях, что происходит повторная укладка связывающего гепарин белка, где имеет место приблизительно 2-5-кратное увеличение количества выделенного повторно уложенного связывающего гепарин белка по сравнению с инкубацией без сульфатированного полианионного средства; и
(d) последовательного контактирования указанного повторно уложенного связывающего гепарин белка с подложкой для хроматографии на гидроксиапатите, первой подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия, подложкой для катионной хроматографии и второй подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия, и избирательной элюции связывающего гепарин белка с каждой подложки.
20. Способ очистки связывающего гепарин белка, причем способ включает в себя стадии последовательного контактирования повторно уложенного связывающего гепарин белка с подложкой для хроматографии на гидроксиапатите, первой подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия, с подложкой для катионной хроматографии и второй подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия, и избирательной элюции связывающего гепарин белка с каждой подложки.
21. Способ выделения связывающего гепарин белка из культуры прокариотических клеток, причем способ включает в себя стадии
(a) выделения указанного связывающего гепарин белка из периплазмы указанной культуры прокариотических клеток;
(b) денатурации указанного выделенного связывающего гепарин белка в первом буферном растворе, содержащем хаотропное средство и восстанавливающее средство;
(c) инкубации указанного денатурированного связывающего гепарин белка во втором буферном растворе, содержащем хаотропное средство и сульфатированное полианионное средство, в течение такого времени и при таких условиях, что происходит повторная укладка связывающего гепарин белка, где имеет место приблизительно 2-3-кратное увеличение количества выделенного повторно уложенного связывающего гепарин белка по сравнению с инкубацией без сульфатированного полианионного средства; и
(d) последовательного контактирования указанного повторно уложенного связывающего гепарин белка с катионообменной подложкой; с подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия и с подложкой для ионообменной хроматографии, и избирательной элюции связывающего гепарин белка с каждой подложки.
22. Способ по п.19 или 21, где полианионное средство составляет между приблизительно 3000 и 10000 дальтон.
23. Способ очистки связывающего гепарин белка, причем способ включает в себя стадии последовательного контактирования повторно уложенного связывающего гепарин белка с катионообменной подложкой; с подложкой для хроматографии гидрофобного взаимодействия и подложкой для ионообменной хроматографии, и избирательной элюции связывающего гепарин белка с каждой подложки.