Реакция тканей гиподермы на конструкционные материалы, применяемые в стоматологии в интересах тканевой инженерии

I I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

Реакция тканей гиподермы на конструкционные материалы, применяемые в стоматологии в интересах тканевой инженерии

АС. Гусева, Л.М. Рысева, АС. Гук, В.П. Румакин Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Hypaderm reaction to material used in stomatology for tissue engineering

AS. Guseva. L.M. Ryseva. AS. Guk. VP. Rumakin Kirov Military Medical Academy, Saint-Petersburg

В статье представлены результаты морфологического исследования реакции тканей гиподермы на имплантацию различных материалов. которые потенциально могут использоваться в качестве носителей при разработке различных технологий тканевой инженерии. Эксперимент выполнен на 78 лабораторных крысах. Изучалась реакция тканей на имплантацию образцов металлов - золота, нержавеющей стали, нержавеющей стали с напылением нитрида титана; различных пластмасс - этакрила, фторакса и бесцветной пластмассы. Установлено, что наименьшей реактогенностью обладают: из металлов - золото; из пластмасс - фторакс.

Ключевые слова: имплантация, тканевая инженерия, гиподерма.

Morphologic investigations of hypoderm tissues reaction to implantation of different material which might be potentially used as scaffolds were held. 78 lab rats were used in the experiment. Several materials were tested in the experiment, such as gold, stainless steel, stainless steel covered with nitrid titanium, different plastics - ethacril, phtorax, and colorless plastic. According to the experimental results gold and phtorax are less reactogenic.

Key words: transplantation, tissue engineering, hypoderm.

В последнее время в практике стоматологии и челюстно лицевой хирургии применяются синтетические материалы. В значительной степени результат лечения зависит от ре акции тканей реципиентного ложа (пародонта) на используе мый материал. Реактогенность, определяемая в современном биоматериаловедении как присущая биоматериалу способ ность вызывать определенную реакцию со стороны соприка сающихся с ним клеток и тканей [1 ], большей части материа лов, используемых в стоматологии проверена рядом тестов, включая эксперименты in vitro. Однако, именно это свойство подлежит интегральной оценке и является основным кри терием характеристики биоматериалов [1].

Разрабатываемые технологии тканевой инженерии ос нованы на сочетанной имплантации (графтинге) синтети ческого или природного носителя с различными клетками. Зачастую материалы из стоматологической имплантологии механически переносятся в практику тканевой инженерии. Описаны результаты экспериментов по использованию в качестве носителей скаффолдов золота [2], нержавею щей стали [3], различных сплавов титана [4 6], пластмасс [7 10], как в виде монолитных имплантатов, так и в виде наноносителей, губок и волокон [6]. Вместе с тем, на сегод няшний день недостаточно морфологических данных, де монстрирующих реакцию тканей живого организма на данные материалы в «чистом виде», то есть об их реакто генности. Кроме того, разрабатываемые технологии по вышения гистоинтегративных свойств материалов путем нанесения на их поверхность культур различных клеток [11] также нуждаются в подобного рода данных, так как культу pa in vitro не может в полной мере имитировать тканевые реакции.

Цель настоящего исследования состояла в описании реакции тканей лабораторных животных - белых крыс на имплантацию материалов, которые могут быть использо ваны в дальнейшем как носители для клеток в тканевой ин женерии.

Материал и методы

Исследование проведено на белых беспородных крысах (Rattus) массой 150 200 гр. Всего в эксперименте было ис пользовано 78 беспородных крыс, которые были разделены на 6 групп (по количеству изученных видов металлов и пласт масс), а также на 2 группы контроля (отбираемых методикой случайной выборки). В первой контрольной группе животным под наркозом проводили разрез кожи и подкожной соедини тельной ткани, который затем ушивали. Вторая группа ин тактные крысы. Образцы тестируемых материалов помещали в подкожную соединительную ткань поясничной области. Жи вотных выводили из опыта с помощью ингаляции хлорофор ма, в сроки 7, 14, 21 е сутки и 1 месяц после имплантации.

Для исследования забирали тканевый материал, окру жавший образец. Для светооптического исследования ма териал маркировали и фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, изготавливали срезы тол щиной 7 10 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, по методам Ван Гизона, Маллори.

Для электронномикроскопического исследования (трансмиссионная электронная микроскопия, ТЭМ) матери ал забирался у одной из крыс в каждой группе на всех сро ках исследования. Кусочки помещали в 2,5% глютаровый диальдегид при рН=7,4. После промывки буфером, дофик сировали в 1% растворе четырехокиси осмия на 0,1 М како дилатном буфере 1,5 часа. После обезвоживания в спиртах, контрастирования 1,5% уранил ацетатом, материал пропи тывали в смоле и заливали в аралдит по обычной схеме. Для предварительной оценки повреждений и выбора необходи мого участка использовались полутонкие срезы толщиной 1 мкм, которые окрашивали 1 % раствором толуидинового синего, а также трехцветной окраской. Ультратонкие срезы толщиной 20 40 нм получали на ультратомах LKB 4 и LKB 5, контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца. Просмотр и фотосъемку ультратонких срезов проводили на электронном микроскопе JEM 100 СХ.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

11111

III

Оригинальные исследования

Результаты исследования и их обсуждение

Реакция тканей на имплантацию металлов

Золото

При макроскопическом исследовании на 7 е сутки после установки имплантатов вокруг образцов из золота опреде лялась тонкая и нежная соединительнотканная капсула. Микроскопическое исследование материала, окружающе го образцы в первой группе, показало, что через 1 неделю проба золота была окружена тонким слоем фибрина, к ко торому прилежит волокнистая соединительная ткань без признаков воспаления (рис. 1 А). Через две недели фибрин практически отсутствовал, к образцу непосредственно при легали волокна рыхлой соединительной ткани с единичными макрофагами, располагавшимися среди волокон.

Через 3 недели проба золота была окружена тонким ело ем волокнистой соединительной ткани, представленной пре имущественно коллагеновыми волокнами без признаков воспаления. К концу месяца пробы золота окружала тонкая капсула из зрелой волокнистой соединительной ткани без признаков воспалительной инфильтрации.

Сталь

Через неделю вокруг пробы из нержавеющей стали на блюдался значительный слой фибрина с умеренно выражен ной лейкоцитарной и макрофагальной инфильтрацией, а так же небольшими включениями окислов металла. В отличие от этих проб, образцы из стали, покрытой нитридом титана, были

окружены массивным слоем фибрина, инфильтрированно го лимфоцитами и макрофагами (рис. 1 В, 2А). В окружаю щей молодой соединительной ткани с большим количеством мелких новообразованных сосудов имела место значитель ная воспалительная инфильтрация.

Через две недели вокруг пробы сохранялся небольшой слой фибрина с некоторой воспалительной, но уже преиму щественно макрофагальной инфильтрацией и присоеди нялась значительная воспалительная реакция сосудов, про являвшаяся пролиферацией эндотелия, периваскулярной мононуклеарной инфильтрацией (рис. 2В). Спустя 3 недели проба из нержавеющей стали была окружена небольшим слоем созревающей грануляционной ткани с незначитель ной лимфоцитарной инфильтрацией.

Через месяц пробы металла были окружены зрелой во локнистой соединительной тканью с небольшим количеством макрофагов, часть которых содержала окислы железа и лим фоциты.

Имплантат из нержавеющей стали, с покрытием нитрида титана через неделю был окружён массивным слоем фибри на с выраженной макрофагальной и очаговой сегментоядер ной инфильтрацией. Вокруг проб из нержавеющей стали с покрытием нитридом титана через 7 дней образовывалась капсула из фибрина, окруженная молодой соединительной тканью, содержащей макрофаги с окислами металлов, при чем как слой фибрина, так и представительство макрофагов были выражены сильнее, чем вокруг пробы стали без покры тия (см. рис. 1 В).

Рис. 1. Реакция тканей гиподермы на имплантацию металлов через 7 сутки:

А - имплантат из золота. Место имплантата окружено тонким слоем фибрина.

Рыхлая соединительная ткань включает коллагеновые волокна и единичные эритроциты; В - имплантат из нержавеющей стали, с покрытием нитридом титана. Место имплантата окружено массивным слоем фибрина.

В толще фибрина - выраженная макрофагальная инфильтрация.

Полутонкий срез. Трёхцветная окраска. хбЗО

Рис. 2. Реакция тканей гиподермы на имплантацию нержавеющей стали:

А - активный макрофаг, 7 суток после имплантации. Цитоплазма переполнена гранулами, содержащими продукты переработки фагоцитированного материала. ТЭМ. х15000;

В - сосуд из прилегающей соединительной ткани: пролиферация и набухание эндотелия сосудов. В просвете сосуда - склеенные между собой эритроциты. Вокруг сосуда - клетки мононуклеарного ряда. Полутонкий срез. Трёхцветная окраска. хЮОО

Рис. 3. Соединительнотканная капсула, окружающая имплантат из нержавеющей стали, с покрытием нитридом титана.

Отдельные макрофаги содержат незначительное количество пигмента.

Окраска по Ван-Гизону. х400

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007

И I II II

_

Оригинальные исследования

Через две недели вокруг пробы сохранялся массивный слой фибрина, а в окружающей соединительной ткани наблю далась значительная лейкоцитарная инфильтрация и появля лись макрофаги, содержащие окислы металла. Через 21 день проба была окружена рыхлой волокнистой соединительной тканью с небольшим количеством тонкостенных сосудов, заполненных эритроцитами и единичными сегментоядерны ми лейкоцитами (рис. 3). На некотором расстоянии от пробы среди волокнистой соединительной ткани располагается большое количество макрофагов, некоторые из них загру жены окислами металлов.

Через месяц проба была окружена зрелой волокнистой соединительной тканью со значительным количеством мо нонуклеарных клеток, содержащих окислы металла (рис. 4) и толстыми пучками коллагеновых волокон, идущих в раз личных направлениях.

Реакция тканей на имплантацию

пластмасс

На 14 е сутки во всех наблюдениях с имплантацией этак рила проба была окружена созревающей грануляционной тканью. Непосредственно к пластмассе прилежала лишь уз кая полоска ткани с массивной лимфо макрофагальной ин фильтрацией. За ней располагалась молодая соединитель ная ткань с очаговыми воспалительными инфильтратами и гранулемами «инородных тел» с гигантскими многоядерны ми клетками вокруг мелких фрагментов пластмассы.

Пробы фторакса через неделю были окружены капсулой, состоящей из соединительной ткани с большим количеством

сосудов со склерозированной стенкой, созревающей грануляционной тканью, а также волокнистой соединитель ной тканью. В составе молодой соединительной ткани харак терно наличие значительного количества фибробластов раз личной степени зрелости, находящихся на близком расстоянии друг от друга (рис. 5), что не типично для зрелой рыхлой соеди нительной ткани, в которой дифференцированные фиброб ласты разделены значительным количеством аморфного межклеточного вещества и коллагеновых волокон.

В большинстве своем такие фибробласты имели удли ненную форму клеточного тела, характерную для фибро цитов. Формирующиеся отростки содержали значительное количество белоксинтезирующих структур (грануляционного эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи), од нако мембраны ретикулума были несколько расширены и на них еще не было достаточного количества рибосом. Ядра имели мелкозубчатые инвагинации кариолеммы, количество гетерох роматина в них еще весьма незначительно и сконцентриро вано тонкой полосой у ядерной мембраны. Довольно часто встречаются на этом сроке гибнущие в результате воспали тельного процесса фибробласты. Причем некоторые из них погибали путем некроза. Но встречались и фибробласты, гиб нущие путем апоптоза. На ранних стадиях этого процесса из менения касаюлись сключительно ядра. Резко изменялись его форма, ядро сморщивалось, появлялись угловатые рез кие инвагинации, плотные темные массы гетерохроматина конденсировались у ядерной мембраны (рис. 6). На более поздней стадии гибели ядро становиось сильно сморщенным электронно плотным, внутренняя структура в нем практически

Рис. 4. Макрофаг, переполненный продуктами распада фагоцитированного материала из соединительной ткани, окружающей имплантат из нержавеющей стали с покрытием нитридом титана. 1 месяц. ТЭМ. Г15 ООО

Рис. 5. Группа фибробластов из соединительнотканной капсулы, сформированной вокруг имплантата из фторакса, 7-е сутки. ТЭМ. Г7000

Рис. 6. Признаки апоптоза у фибробластов соединительнотканной капсулы, образованной вокруг имплантата из фторакса, 7 сутки: А - фибробласт с начальными признаками гибели по типу апоптоза. Ядро характерным образом изменено; В - ядро сильно сморщено, в его структуре преобладает гетерохроматин; С - финальная стадия апоптоза фибробласта. Распад ядра и цитоплазмы на множественные апоптозные тельца. ТЭМ. хЮООО

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007

И I II II

тп

Оригинальные исследования

не различима. Но цитоплазма и содержащиеся в ней орга неллы не имели выраженных патологических признаков. Затем происходил очень быстрый распад ядра на ядерные тельца, распадалась цитоплазма и образовавшиеся фраг менты тут же фагоцитировались макрофагами.

Клеточная гибель по типу апоптоза в данном случае, оче видно, следует рассматривать как адаптивную реакцию, свя занную с молниеносной трансклеточной передачей физио логически активных веществ. В цитоплазме макрофагов в этот период встречались фагоцитированные фрагменты пла стмассы, но они были мелкие и их присутствие не приводило к образованию гранулем «инородных тел». По прежнему от мечалась активация тканевых макрофагов гистиоцитов.

Коллагеновые волокна в очень большом количестве про низывали матрикс соединительной ткани. Однако они еще не образуют плотных пучков.

Имплантаты бесцветной пластмассы через неделю были окружены капсулой, состоящей из молодой соединительной ткани, содержащей как клеточные, так и волокнистые эле менты, с умеренно выраженной диффузной макрофагальной инфильтрацией.

На седьмые сутки различия между реакцией на виды пла стмасс проявляются несколько большим валом грануляци онной ткани, окружающей этакрил, и многочисленными включениями фрагментов пластмассы как непосредствен но в грануляционную ткань, таки гранулемы «инородных тел». Вокруг проб фторакса лейко макрофагальная инфильтра ция выражена незначительно, гранулемы инородных тел от сутствовали, но в макрофагах имели место небольшие фраг менты пластмассы. Непосредственно к образцам бесцветной пластмассы прилежала созревающая грануляционная ткань с умеренно выраженной инфильтрацией лейкоцитами моно нуклеарного ряда. Гранулемы «инородных тел» и фрагменты пластмассы в макрофагах не найдены.

Таким образом, к 7 суткам заканчивается (или ослабева ет) первая фаза воспаления (за счет скопления сегментоя дерных лейкоцитов), достаточно выраженной является 2 я фаза (макрофагальная), но она уже сочетается с признака ми 3 й фазы (фибробластической). Активация гистиоцитов, достигающая максимального развития в этот период, сви детельствует о попытках организма бороться с развитием фибросклероза. Гистиоциты пытаются «сдержать» интен сивный синтез коллагена, выделяя фермент коллагеназу, разрушающий коллагеновые волокна.

На 14 е сутки во всех наблюдениях с имплантацией этакрила проба была окружена созревающей грануляцион ной тканью. Непосредственно к пластмассе прилежала лишь узкая полоска ткани с массивной лимфо макрофагальной инфильтрацией.

Через 14 суток наблюдались признаки относительной стабилизации процесса, происходит дальнейшее созрева ние грануляционной ткани у всех животных. Этакриловый имплантат был окружен зрелой соединительной тканью, сре ди волокон которой располагались гранулемы «инородных тел», содержащие гигантские многоядерные клетки вокруг фрагментов пластмассы, инфильтрация макрофагами была выражена слабо. В этот период еще происходит процесс рассасывания пластмассы, что подтверждается не только наличием гранулем «инородных тел», но и образованием в полированных образцах пластмассы пор, в которые прони кали коллагеновые волокна.

Вокруг имплантата из фторакса сформировалась соеди нительнотканная капсула со слабо выраженной макрофа гальной инфильтрацией.

В окружающей жировой клетчатке имел место умеренно выраженный склероз за счет разрастания аргирофильных волокон.

На 14 е сутки пробы бесцветной пластмассы были окру жены зрелой волокнистой соединительной тканью, количе ство сосудов уменьшалось, воспалительная инфильтрация стромы была незначительна и представлена только клетками мононуклеарного ряда.

Период активной пролиферации фибробластов в основ ном заканчивался, так как молодые малодифференцирован ные клетки встречались редко. Основным клеточным компо нентом уже заметно более плотнй соединительнотканной капсулы являются типичные зрелые фибробласты с хорошо сформированными отростками, активно синтезирующие коллаген, который теперь, наряду с диффузным расположе нием отдельных волокон, имеет вид плотных пучков. В строме соединительной ткани становятся заметны ретикулярные и эластические волокна.

В соединительнотканную капсулу к этому времени про растают сосуды, осуществляющие питание развивающейся и созревающей соединительной ткани. Стенки большинства сосудов склерозированы в большей или меньшей степени.

Три недели спустя проба пластмасс была окружена зрелой волокнистой соединительной тканью с небольшим количе ством сосудов и единичными макрофагами и лимфоцитами.

Морфологически «ложе» вокруг имплантата образовано нормальной соединительной тканью. Признаков воспале ния практически нет (т.е. лейкоцитарная фаза закончилась полностью). Следы макрофагальной реакции еще обна руживаются. В соединительной ткани встречаются крупные многоядерные клетки, однако они уже единичны.

Выраженной фагоцитарной реакции со стороны гистио цитов и плазматических клеток, имеющихся в очень незна чительном количестве, нет. Весьма характерно для этого пе риода наличие очень крупных плотных пучков коллагеновых волокон. Фибробласты представлены преимущественно зрелыми формами.

Патологические изменения выявляются в них редко, од нако в целом для них характерны признаки функциональ ного напряжения. Среди них много гиперхромных клеток с более темной цитоплазмой, чем у контрольных животных. Ядра, занимающие обычно центральное положение, очень часто сдвинуты на периферию клеточного тела, цитоплазма может выглядеть вакуолизированной за счет гипертрофи ческого расширения цистерн гранулярного эндоплазма™ ческого ретикулума. Все эти изменения обратимы и с тече нием времени должны исчезнуть (хотя могут сохраняться месяцами). Фибробласты находились все еще на более близ ком расстоянии друг к другу, чем обычно. Они разделены аморфным межклеточным матриксом с рыхлыми пучками коллагеновых волокон.

В группе животных, проживших месяц после операции, имплантаты из пластмассы были обнаружены только у 5 крыс из 21 й. В остальных случаях произошло самопроиз вольное отторжение пластмассы. Макро и микроскопичес кая картины послеоперационного рубца были аналогичны тем, что наблюдались на 21 е сутки эксперимента, то есть имел место склероз стенок сосудов и стромы окружающей жировой клетчатки. У животных, которым подшивалась про ба фторакса, этот процесс был более выраженным. На этом сроке отметить какие либо другие особенности в группах, где использовались различные виды пластмассы, нам не удалось.

Таким образом, нами проведено морфологическое изу чение реакции гиподермы на материалы, используемые в современной стоматологии. В целом его результаты сопо ставимы с данными, полученными другими авторами. Ис следователи указывают на преимущества искусственных материалов для носителей - отсутствие иммуногенных свойств, сниженный риск переноса инфекции и большая

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

ИМИ!

Оригинальные исследования

доступность. Вместе с тем, отмечается и их недостаток от сутствие факторов, способствующих органотипической про лиферации и дифференцировке клеток реципиентного ложа [12] или клеток, нанесенных in vitro на их поверхность.

Если считать, что биоматериал не должен вызывать непри емлемых для клинического использования воспалительных и

дистрофических изменений в тканях, то наименьшей реак тогенностью из металлов обладает золото. Реактогенность пластмасс практически сопоставима друг с другом по вы раженности, но в наименьшей степени выражена у фто ракса, что соответствует экспериментальным данным других исследователей [13, 14].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Слуцкий П., Ветра Я. Биологические вопросы материаловедения [к проблеме реактогенности биоматериалов). 2001. Рига: Латвийская мед. академия: 150.

2. Gu H.Y., Chen Z., Sa X. et al. The immobilization of hepatocytes on 24 nm sized gold colloid for enhanced hepatocytes proliferation. Artif. Organs 1997; 21(11): 1177 81.

3. Van Cleynenbreugel T., Schrooten J., Van Oosterwyck H., Vander Sloten J. Micro CT based screening of biomechanical and structural properties of bone tissue engineering scaffolds. Med. Biol. Eng. Comput. 2006; 44(7): 517 25.

4. Spoerke E.D., Murray N.G., Li H. et al. A bioactive titanium foam scaffold for bone repair. Acta Biomater. 2005; 1 (5): 523 33.

5. Li J.P., de Wijn J.R., Van Blitterswijk C.A., de Groot K. Porous Ti6AI4V scaffold directly fabricating by rapid prototyping: preparation and in vitro experiment. Biomaterials 2006; 27(8): 1223 35.

6. Hollister S.J., Lin C.Y., Saito E. et al. Engineering craniofacial scaffolds. Orthod. Craniofac. Res. 2005; 8(3): 162 73.

7. Fisher J.P., Holland T.A., Dean D. et al. Synthesis and properties of photocross linked polypropylene fumarate) scaffolds. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2001; 12(6): 673 87.

8. Arevalo Silva C.A., Eavey R.D., Cao Y. et al. Internal support of tissue engineered cartilage. Arch. Otolaryngol. Head. Neck. Surg. 2000; 126(12): 1448 52.

9. Pattison M.A., Webster T.J., Haberstroh K.M. Select bladder smooth

muscle cell functions were enhanced on three dimensional, nano structured poly[ether urethane) scaffolds. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2006; 17(11): 1317 32.

10. Fromstein J.D., Woodhouse K.A. Elastomeric biodegradable polyurethane blends for soft tissue applications. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2002; 13(4): 391 406.

11. Пестин P.C., Докторов A.A., Воложин А.И. и др. Реакция костной ткани на имплантацию композиции полиметилметакрилат гидроксиапатит с нанесенной на ее поверхность культурой клеток костного мозга в эксперименте. Биомедицинские технологии (Репродукция тканей и биопротезирование) 2001; 17: 55 63.

12. Панин А.М., Иванов С.Ю., Нури Фарзин и др. Морфологическое изучение тканевой реакции на подкожную имплантацию биоматериалов. Биомедицинские технологии (Репродукция тканей и биопротезирование) 2002; 1 8: 64 75.

13. Аззам Омар Башир, Воложин А.И., Бабахин A.A., Марков Б.П. Способность акриловых пластмасс, полимеризованных на водяной бане и с помощью энергии сверхвысокой частоты, вызывать иммунный ответ к аллергену в эксперименте. Биомедицинские технологии (Репродукция тканей и биопротезирование) 2002; 18: 76 83.

14. Воложин А.И., Григорян АС., Виноградова О.Д., Бабахин А.А. Tканевая реакция на подкожное введение стоматологических акриловых пластмасс при атопической аллергии в эксперименте. Биомедицинские технологии (Репродукция тканей и биопротезирование) 2004; 23: 34 46.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

А