Окислительный стресс как причина образования некультивируемых форм Vibrio cholerae

А.В.Соколенко, Е.А.Меньшикова, Л.Е.Асеева, А.В.Миронова, С.В.Титова

ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕСС КАК ПРИЧИНА ОБРАЗОВАНИЯ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ VIBRIO CHOLERAE

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Изучена динамика изменения активности ферментов антиоксидантной системы вегетативных и некультивируемых форм холерных вибрионов исходных штаммов и их субкультур, устойчивых к перекиси водорода. Активность каталазы незначительно снижалась в переходной популяции, в некультивируемом состоянии увеличилась в 1,5-8 раз. В ревертантах активность каталазы была близка значениям вегетативных культур. Активность пероксидазы в клетках, находящихся в некультивируемом состогчии, увеличилась в 3-80 раз, в поздние сроки (12 мес.) - не выявлена. Аналогично пероксидазной изменялась активность супероксидцисмутазы. Динамика изменения активности антиоксидантных ферментов в некультивируемых формах, снижение активности супер-оксиддисмутазы в присутствии таких антиоксидантов, как адреналин и арбидол, сопровождаемое интенсификацией роста холерных вибрионов, указывает на действие окислительного стресса в некультивируемых формах холерных вибрионов, который лежит в основе механизма их образования.

Ключевые слова: некультивируемые формы, холерный вибрион, антиоксидантные ферменты, каталаза, пе-роксидаза, супероксиддисмутаза, окислительный стресс.

В настоящее время некультивируемые формы (НФ) обнаружены более чем у 70 видов бактерий. Многие из них патогенны для человека, животных или растений. В основе образования НФ лежат нормальные физиологические [5, 13] или патологические процессы, в частности, накопление активных форм кислорода (АФК) [12]. Для оценки потенциальной значимости НФ в эпидемиологии инфекционных заболеваний представляет интерес изучение механизмов их образования.

О роли АФК в образовании НФ свидетельствуют данные литературы и собственных исследований. Под влиянием деструкторов перекиси водорода каталазы или пирувата натрия можно получить реверсию НФ Vibrio parahaemolyticus [14]. В НФ холерных вибрионов наблюдается увеличение активности флавиновых дегидрогеназ, изменяется активность ферментов цикла трикарбоновых кислот, что приводит| к увеличению концентрации АФК [6]. Аналогичные процессы наблюдаются в микробных клетках при окислительном стрессе [4]. В связи с вышеизложенным объектом наших исследований стали ферменты антиоксидантной системы холерных вибрионов: каталаза, пероксидаза и супероксиддисмутаза.

Цель [работы - изучение динамики изменения активности антиоксидантных ферментов вегетативных и НФ! холерных вибрионов, а также их субкультур, устойчивых к перекиси водорода.

Материалы и методы

В работе использованы штаммы холерных вибрионов из коллекции РостНИПЧИ: V. ско1егае еЫог 17551 с1х* и V. сШегае еког 13790 с1х~. НФ получали при 6|°С без перемешивания в 100 мл (микрокосмы) морской, речной, дистиллированной воды, в некоторые пробы добавляли 0,0001 % витамина Е («Уфавит»), Холерные вибрионы выращивали 18 ч

при 37 °С на агаре Мартена, pH 7,4. Бактериальную массу смывали с поверхности агара средой суспендирования и вносили в микрокосмы в конечной концентрации 107-10б кл/мл. Переход популяции в некультивируемое состояние контролировали мазками, обработанными акридиновым оранжевым (1:5000); высевами на агар Мартена, pH 7,6; ПЦР с праймерами к генам ctx, toxR, vet. Наличие в мазках подвижных флуоресцирующих зеленых цветом клеток, положительного ответа в ПЦР и отсутствие роста на питательной среде указывало на образование НФ. Переходными считали популяции, в которых на агаре Мартена вырастали 10-102 КОЕ /мл.

При изучении влияния адреналина и арбидола на рост холерных вибрионов арбидол (ОАО «Даль-химфарм») растворяли в 1 мл дистиллированной воды с добавлением 1-2 капель 99 % раствора ди-метилсульфоксида (Serva), фильтровали через мембранные фильтры Millipore с диаметром пор 0,22 мкм. Адреналина гидрохлорид (ФГУП Московский эндокринный завод) использовали в виде 0,1% раствора. Пробы содержали 2 мл микробной взвеси, 0,2 мл 1 % раствора пептона, 1,25 мкл/мл арбидола или 0,1 мкл/мл адреналина. Инкубировали 18 ч при 37 °С, учитывали изменение оптической плотности при 560 нм и КОЕ на агаре Мартена, pH 7,4. В опытах по изучению влияния антиоксидантов на активность СОД в реакционный раствор добавляли 100 мкл адреналина или арбидола.

Активность СОД (КФ 1.15.1.1.) изучали методом, основанным на люминесценции люминола [11]. Экзогенную СОД определяли непосредственно в образцах из микрокосмов или приготовленных взвесях исходных культур, в которых микробные клетки были удалены фильтрованием через фильтры Millipore с диаметром пор 0,22 мкм. Общую СОД определяли в пробах, предварительно обработанных ультразвуком на дезинтеграторе РУ-100MSE 150W (Англия), три цикла по 15 с при час-

тоте колебаний 20 кГц в амплитуде 10-12 мкм. Реакционная матричная смесь содержала 20 мМ трис-НС1 буфера (pH 7,8), 0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ люми-нола, приготовленного в 0,1 М NaOH, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1,0 мМ гипоксантина и 1,6-Ю"4 ксантиноксидазы. 0,9 мл данной смеси просчитывали с 15-минутными интервалами на 3Н-канале сцинтилляционного счетчика Mark II. Затем в 3 мл матричного раствора вносили 100 мкл бактериальной взвеси. Учитывали процент падения счета от базового уровня и выражали в условных единицах, которые рассчитывали по формуле:

А = Т % : (100 % - Т %),

где Т % - процент ингибирования. Результаты выражали в условных единицах на мкг белка. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6.) и пероксидазы (КФ 1.11.1.7.) бактерий определяли методом прямой спектрофотометрии раствора Н202 или этанола соответственно. Учитывали изменение поглощения при длине волны 240 нм (молярный коэффициент экстинкции перекиси водорода 36 М“'-см“ ). Пробы для определения активности каталазы содержали 100 мкл микробной взвеси, 14 мМ Н202 2,7 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера (KH2P04+Na2HP04), pH 7,2. В опытные образцы для определения пероксидазы вносили 100 мкл микробной взвеси, 0,8 М этанола, 2,85 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 7,4. Активность каталазы и пероксидазы выражали в условных единицах (количество фермента, которое катализирует расщепление 1 мМ субстрата за одну минуту) на 1 мкг белка. Условные единицы рассчитывали по формуле:

АКат/псрокс— (Ад/пйп X 3,1 X 0,06) . 0,1,

где Ад /„up = ОП/min; 3,1 - размер кюветы; 0,06 - коэффициент.

Источником ферментов служили взвеси агаровой культуры исходных вариантов, переходных форм и НФ из микрокосмов. Статистическую и графическую обработку результатов проводили на PC Pentium IV, графическим редактором Excel 8.0, про-

Активность каталазы и пероксидазы

граммой для статистической обработки Biostat 4.03. В таблицах приведены средние результаты трех независимых экспериментов. Разброс данных не превышал 10-15 %.

Результаты и обсуждение

Изучение активности каталазы и пероксидазы в исходных, переходных и НФ вибрионов разного возраста выявило количественные и качественные отличия (табл. 1). Активность каталазы в популяциях V. с hole гае 01 17551 была изначально несколько выше и в НФ возрастала в большей степени, чем у штамма V. cholerae 01 13790, в 3,2-8,5 раз. Исходные значения зарегистрированы на уровне

3,6 ед./мкг белка. Через 15 дней после перехода клеток в НС в морской воде активность данного фермента возросла до 11,6 ед./мкг белка, а через месяц- до 19,3 ед./мкг белка. Увеличение активности каталазы в клетках, находящихся в НС обнаружено и в микрокосмах с дистиллированной водой, но в большей степени: в одномесячных некультивируе-мых популяциях показатели составили 21,1 ед./мкг белка, в двухмесячных они возросли до 30,8 ед./мкг белка, а через 12 мес. пребывания клеток в НФ снизились до 19,1 ед./мкг белка. Активность пероксидазы в вегетативных культурах не имела выраженных нггаммовых отличий и в НФ существенно возросла, превысив первоначальный уровень в 3-87 раз. Максимальные значения активности указанного фермента отмечены в микрокосмах с морской водой в двухмесячной некультивируемой популяции. В микрокосмах с дистиллированной водой, возраст которых превышал 12 мес., активность пероксидазы не зарегистрирована.

В популяции ревертантов активность каталазы была близка таковой в исходных культурах V. cholerae 01 17551 2,9 ед./мкг белка (3,6 ед./мкг белка - в бактериальных культурах). Показатели активности пероксидазы значительно превышали исходный уровень и составили 8,3 ед./мкг белка.

В бактериальных культурах V. cholerae Ol 13790 активность каталазы составила 2,0 ед./мкг белка, пероксидазы - 0,32 ед./мкг белка. В переход-

Таблица I

[ вибрионов исходных, НФ и их ревертантов

Штамм Среда микрокосма Форма Возраст, мес. Активность ферментов, у.е./мкг белка

катапаза | пероксидаза

V. cholerae 01 17551 Физ. р-р Исходная - 3,6 0,4

V. cholerae 01 17551 Морская вода НФ 0,5 11,6 1,2

V. cholerae Ol 17551 Морская вода НФ 1 19,3 3,8

V. cholerae Ol 17551 Диет, вода НФ 1 21,1 30

V. cholerae Ol 17551 Диет, вода НФ 2 30,8 35

V. cholerae Ol 17551 Диет, вода НФ 12 19,1 Не обнаружена

V. cholerae 0\ 17551 Морская вода Ревертант - 2,9 8,3

V. cholerae Ol 13790 Физ. р-р Исходная - 2,0 0,32

V. cholerae Ol 13790 Морская вода Переходная - 1,5 0,6

V. cholerae Ol 13790 Морская вода НФ 1 9,2 2,9

V. cholerae Ol 13790 Морская вода НФ 2 12,0 9,4

V. cholerae Ol 13790 Морская вода НФ 12 1,0 Не обнаружена

V. cholerae Ol 13790 Речная вода НФ 2 3,3 1,6

V. cholerae 0\ 13790 Диет, вода НФ 2 2,7 10,2

V. cholerae Ol 13790 Витамин Е НФ 1 2,3 4,51

V. cholerae Ol 13790 Витамин Е Ревертант - 1,8 3,8

1 Активность экзогенной н общей СОД исходных, переходных и НФ холерных вибрионов разного возраста Таблица 2

( 1 Штамм Форма Среда микрокосма Возраст НФ, мес. Активность ферментов, у.е. х 1000

Экзогенная СОД | Общая СОД

V. скокгае 01 17551 Исходная Морская вода - . 4,2 5,7

V. сШегае 01 17551 Переходная - 3,5 4,5

V. скокгае р\ 17551 НФ 0,5 12,9 17,4

V. скокгае р1 17551 НФ 1 3,3 7,5 .

V. скокгае 01 17551 НФ . 4 6,7 18,9

V. сШегае р\ 17551 НФ 12 11,2 18,8

V. скокгае 0\ 17551 Ревертант - 2,2 2,5

V. скокгае 0\ 13790 Исходная - 4,4 5,2

V. скокгае 01 13790 Переходная - 3,6 11,4

V. скокгае 01 13790 НФ 0,5 14,3 18,8

V. скокгае 01 13790 НФ 1 4,8 5,9

V. сШегае'01 13790 НФ 4 5,5 8,1

V. скокгае 01 13790 НФ 12 8,8 9,1

V. скокгае 01 13790 Ревертант 3,2 5,4

ных популяциях показатели активности катал азы несколько снизились и составили 1,5 ед./мкг белка, а пероксидазы выросли до 0,6 ед./мкг белка. В НС культуры V. скокгае 01 13790 активность обоих ферментов возросла. Через месяц пребывания в морской воде активность каталазы увеличилась в

4,6 раз !(9,2 ед./мкг белка), пероксидазы - в 9 раз (2,9 ед./мкг белка). Через 2 мес. НС активность каталазы | превышала исходный уровень в 6 раз (12,0ед./мкг белка), а пероксидазы - в 29,4 раза. Через 12 мес. НС активность каталазы была ниже исходного уровня, составляя 1,0ед./мкг белка, активности пероксидазы не обнаружено.

В микрокосмах с речной, дистиллированной водой, с дистиллированной водой с витамином Е активность каталазы в двухмесячных НФ превышала исходный уровень в 1,2-1,5 раза. Активность пероксидазы при инкубации клеток в дистиллированной воде возросла в 31,9 раз (10,2 ед./мкг белка), в речной - в 5 раз (1,6ед./мкг белка). Активность каталазы в ревертантах составила 1,8 ед./мкг белка, что сопоставимо с исходными показателями. Активность пероксидазы в клетках ревентантов в значительной степени превышала исходный уровень и составила 3,8 ед./мкг белка (0,32 ед./мкг белка - в интактных клетках).

Изменение активности экзогенной и общей СОД изучали; в вегетативных культурах холерных вибрионов й их некультивируемых популяциях разного возраста| в микрокосмах с морской водой (табл: 2). Обнаружено, что в переходных культурах активность фермента незначительно снижалась. В клетках штамма с1го1егае 01 17551 активность экзогенной СОД составила 3,5 у.е., эндогенной - 4,5 у.е., против 4,2 и 5,7|у.е. в исходной культуре. Сходные значения получены в переходной популяции V. скокгае 01 13790: активность экзогенной СОД - 3,6 у.е. общей -

6,4 у.е. по сравнению с показателями 4,4 и 5,2 у.е в исходной соответственно.

Максимальные значения активности СОД в течение 12 мес. наблюдения зарегистрированы в 15-дневных; НФ. В НФ штамма V. с1го1егае 01 17551 активность экзогенной и общей СОД возросла почти в 3 раза, достигнув 12,9 и 17,4 у.е. соответственно. В популяции V. скокгае 01 13790 активность экзогенного фермента также возросла в 3 раза, об-

щей - приблизительно в 1,5 раза.

Дальнейшие измерения проводили через один, четыре и двенадцать месяцев НС. Общим для обоих штаммов было то, что через месяц НС произошло 2-3-кратное снижение активности экзогенной и общей СОД. Отличительной особенностью штамма V. скокгае 01 17551 была активизация фермента к 12 мес. НС, в результате чего активность в среднем в два раза превышала исходный уровень. При этом общая СОД была в 1,3-1,7 раз активнее, чем экзогенная.

Динамика изменения активности СОД в некультивируемых популяциях V. скокгае 01 13790 выглядела иначе. После существенного увеличения в 15-дневных НФ, через месяц наблюдали двукратное уменьшение активности, через 4 мес. она достигла уровня 5,5 и 8,1 у.е. К 12 мес. показатели превышали значения исходных вариантов в среднем в

1,5 раза, но активность экзогенной и эндогенной СОД была практически равной - 8,8 и 9,1 у.е.

Из некультивируемых популяций обоих штаммов при повышении температуры до 37 °С и добавлении пептонной воды в конечной концентрации 0,1 % получены ревертанты. Активность СОД в таких культурах была ниже, чем в НФ, но выше, чем в исходных бактериальных вариантах. Для ревертан-тов V. скокгае 01 17551 значения составили 2,2 у.е. экзогенной и 2,5 у.е. общей, а для V. скокгае 01 13790 - 3,2 и 5,4 у.е. соответственно.

Для выяснения влияния окислительного стресса на образование НФ определяли активность СОД в популяциях исходных вегетативных и устойчивых к перекиси водорода клонов холерных вибрионов, полученных в лабораторных условиях методом селекционного мутагенеза. Для получения устойчивых клонов холерные вибрионы выращивали в течение 18 ч. на агаре Мартена без добавок, готовили из них взвесь в 0,85 % растворе КаС1 в концентрации 109 м.кл./мл. Затем 0,1 мл полученной взвеси вносили в 5 мл бульона Мартена с добавлением Н202. Пробы инкубировали 3 ч при 37 °С, после чего делали высевы на агар Мартена, содержащий идентичное жидкой среде количество Н202. Постепенно концентрацию пероксида водорода увеличивали с 0,0033 до 0,065 %. V. скокгае еког 17551 Я Н202 растет при максимальной концентрации перекиси в среде 0,035 %, V. скокгае еког 13790 Я Н202 - при 0,065 %.

В предварительных экспериментах было обнаружено, что, помимо каталазы и пирувата натрия, эффектом, стимулирующим рост бактериальных культур, обладают арбидол и адреналин. Известно, что арбидол проявляет антиоксидантные свойства, предположительно являясь перехватчиком свободных радикалов [2]. Адреналин относится к низкомолекулярным соединениям антиоксидантной системы организма человека [3]. Учитывая положительное влияние на рост холерных вибрионов адреналина и арбидола, которое, вероятно, связано с их антиоксидантными свойствами, изучали активность СОД исходных бактериальных популяций и их субкультур, устойчивых к пероксиду в присутствии этих соединений.

Активность СОД устойчивой к пероксиду субкультуры V. сИо1егае 01 13790 (нехолерогенный штамм, выделенный из воды) почти в 2 раза выше, чем у исходной субкультуры (5,68 у.е. против 2,89 у.е. в исходной). При добавлении антиоксидантов в исходную бактериальную субкультуру изменения активности СОД не происходило: без добавок показатели составили 2,82 у.е., в присутствии арбидола - 3,02 у.е, адреналина - 2,7 у.е. В устойчивой субкультуре существенно снижалась активность фермента: с адреналином - в 2,1 раз (2,67 у.е./мкг белка), с арбидолом - в 2,9 раз (1,98 у.е./мкг белка) против 5,68 у.е. без добавок.

При тестировании субкультур штамма V. с1го1е-гае 01 17551, выделенного от холерного больного, наблюдали иную картину. Добавление адреналина и арбидола влияло на активность СОД как в исходной, так и в устойчивой субкультуре вибрионов, однако в последнем случае количественные изменения были менее выражены. В исходных субкультурах активность СОД составила 2,85 у.е., в присутствии адреналина активность снизилась в 7,9 раз (0,313 у.е.), при добавлении арбидола- в 2 раза (1,42 у.е). В устойчивых субкультурах V. с1го1егае 17551 без добавок показатели составили 1,23 у.е., при добавлении адреналина активность снижалась в 1,9 раз (0,65 у.е), арбидола - в 1,2 раза (1,0 у.е.).

Проведенные исследования позволили выявить ряд характерных особенностей в динамике изменения активности антиоксидантных ферментов в НС. Выявлено увеличение активности каталазы в клетках, пребывающих в НС в 1,5-8 раз после непродолжительного снижения в переходных культурах. Минимальные показатели обнаружены в микрокосмах с витамином Е, что связано с его антиоксидант-ным действием. По мере старения некультивируе-мой популяции активность каталазы возрастала. У ревертантов она была близка значениям вегетативных форм. Наблюдаемые изменения напрямую связаны с патологическими процессами, так как известно, что физиологическое состояние микробной клетки во многом зависит от концентрации в ней каталазы и ее активности [1], а повышенная активность указанных ферментов коррелирует с окислительным стрессом [7].

Аналогичная динамика изменений выявлена при изучении пероксидазы, за исключением отсутствия активности в поздние сроки нахождения кле-

ток в НС. Возможно, это связано с тем, что перок-сидаза функционирует при низких концентрациях субстрата. При высоких (например, вследствие накопления пероксида в результате анаэробного метаболизма в некультивируемой популяции) действует каталаза [6]. Значительное увеличение активности пероксидазы (в 3-80 раз) может быть следствием накопления субстрата в результате функционирования альтернативных метаболических путей. В пользу этого предположения свидетельствует изменение соотношения активности каталазы и пероксидазы у вегетативных форм и ревертантов: если у вегетативных клеток активнее каталаза, то у ревертантов значительнее выражена активность пероксидазы.

Активность СОД у переходных форм и ревертантов близка уровню вегетативных клеток. В НФ наблюдается существенный подъем активности, с последующим снижением по мере старения популяции. Выявленная динамика указывает на адаптивные перестройки, связанные с селективным отбором клонов, устойчивых к пероксиду водорода.

Активность антиоксидантных ферментов может изменяться под влиянием различных физических или химических факторов [10], в процессе морфологической дифференциации [9]. Есть предположение, что у фитопатогенных вибрионов экзогенная СОД защищает клетки от супероксильных радикалов, образующихся в процессе фотосинтеза. Но, несмотря на ключевую роль микробных СОД в устранении действия свободных радикалов, избыток активности нежелателен и может быть токсичен для клеток [15]. Так как холерные вибрионы в НФ длительное время сохраняются в клетках сине-зеленых водорослей, то высокий уровень активности СОД может выполнять протективную функцию. Снижение активности фермента по мере старения популяции указывает на разрушительное действие окислительного стресса.

Повышение активности антиоксидантных ферментов на фоне увеличения концентрации перекиси водорода в некультивируемых популяциях холерных вибрионов указывает на важную роль свободных радикалов в образовании НФ. С этим предположением согласуются данные, полученные при изучении активности СОД исходных и устойчивых к перекиси водорода субкультур и активности их СОД в присутствии арбидола и адреналина. Добавление в среду микрокосма антиоксидантов снижало активность СОД, наблюдалась интенсификация роста вегетативных популяций обоих штаммов, а также реверсия НФ, возраст которых не превышал 10 сут. Исключение составили исходные культуры, водного атоксигенного штамма V. ско1егае 01 13790, что указывает на действие у него иных механизмов регуляции уровня внутриклеточных радикалов.

Таким образом, выявленные изменения активности СОД, каталазы и пероксидазы у холерных вибрионов, находящихся в НС, снижение активности СОД в присутствии адреналина и арбидола свидетельствуют, что указанные процессы являются следствием окислительного стресса в некультивируемых популяциях холерных вибрионов и вносят определенный вклад в образование НФ.

! СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

I

1.Варвашевич Т.Н., Никифорова JI.C.; Богомазова Т.В, // Лаб. дело. - 1989. - № 2. - С. 61—63. - 2, Василь^ ева О.В)., Любицкий О.Б., Гуськова Т. А.: и др.//Вопр. мед. химии. - 1999. -№4. - С. 326-332. -3. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Обыночная Е.Г. // Педиатрия. - 2003. -Т. 5, №9,. - С. 322-326. - 4. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г. А. // Микробиол. - 2003. - Т. 72, № 5. -С. 600-608. - 5. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1993. - № 6. - С. 34-37. -6. Свободные радикалы в биологии / Под ред. Прайор У. -М.: Мир,! 1979. - Т. 1. - 318 с. - 7. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н., Октябрьский О.Н.//Биохимия. - 1^97. - Т. 62, вып. 5. - С. 563-568. - 8. Соколенко А.В. Морфология, ультраструктура, метаболизм некультиви-руемых форм холерных вибрионов: Автореф. дис.... канд. биол. наук. - Саратов, 2000. - 18 с. - 9. Allen R.Y., Newton R.K., Sohal Ri.S. III. Cell Physiol. - 1985. r- Vol. 125, N 3. - P. 413-419. - 10. Benov L., Fridovich I. // J. Bacteriol. - 1995. -P. 3344—3346. - 11. Bensinger R.E., Johnson C.M.//Anal. BiochemJ- 1981. - Vol. 116, N 1. - P. 142-145. - 12.Hochman A. // Crit: Rev. Microbiol. - 1997. - N 23. - P. 207-214. - 13. Liu Sh.V. H Logical Biology. - 2000. - Nl. - P. 17-20. -14. Mizunoi Y., Wai S.N., Ishikawa T.//FEMS Microbiol. Lett. - 2000. - Vol. 186, N 1. - P. 115-120. - 15.Tauati D. // Mol. Biol. Free. Radi. Scavering. Syst. - Cold Spring Harbor (N.Y.), 1992.-P. 231-261.

A.V.Sokolenko, E.A.Men'shikova, L.E.Aseyeva, A.V.Mironova, S.V.Titova

The Oxidation Stress as a Cause of Origination of Non-Culturable Vibrio cholerae Forms

Rostov-on Don Anti-Plague Research Institute

Alteration dynamics was studied in the enzymatic activity of the antioxidant systems of vegetative and non-culturable forms of the parent cholera vibrio strains and their subcultures resistant to hydrogen peroxide. In the transitional population catalase activity was slightly decreased while in the non-culturable state it grew 1.5 to 8.0 times as high as that at the initial stage. Catalase activity of the revertant strains was close to that of the vegetative cultures. Peroxidase activity in the non-culturable state cells increased 3 to 80-fold, being, however, not detectable at later terms (12 months). Superoxr ide dismutase activity varied analogously to that of peroxidase. The dynamics of activity variations of the antioxidant enzymes in the non-culturable vibrio forms, superoxide dismutase activity subsiding in the presence of some antioxidants such as adrenalin and arbidol, accompanied with the intensified growth of Vibrio cholerae, may be indicative of the influence of the oxidation stress involved in the formation mechanism of non-culturable cholera vibrios.

Key words: non-culturable forms, cholera vibrio, anioxidant enzymes, catalase, peroxidase, superoxide dismutase, oxidation stress.

Поступила 14.09.05.

УДК .616.981.452

Е.В.Чеботарев1, E.В.Пименов1, А.А.Бывалов2, М.К.Бакулин3, А.В.Кожемяко1 j АУТОРЕГУЛЯЦИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ YERSINIA PESTIS

'Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ, Киров;2Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар;3Вятский государственный университет, Киров

I . .

С использованием полярографического метода обоснована возможность моделирования in vitro у бактерий Yersinia pestis ауторегулируемой последовательности метаболических состояний (по аналогии с изолированными митохондриями) путем введения в среду инкубации микроколичеств глюкозы. Предложен рассчитываемый по полярограмме показатель степени энергозависимой ауторегуляции дыхательной активности Y. pestis - «метаболический дыхательный контроль» (МДК), численно равный отношению скорости дыхания бактерий в активном состоянии (состояние 3) к скорости дыхания в состоянии «отдыха» (состояние 4). На примере развивающейся и переживающей популяций Y. pestis показана возможность применения параметров , ауторегуляции дыхательной активности для оценки физиологического состояния бактерий.

! ‘

j Ключевые слова: чумной микроб (Yersinia pestis), окисление глюкозы, ауторегуляция дыхательной активности, дыхательный контроль, полярография.

В исследованиях физиологии патогенных микроорганизмов актуальным является изучение на клеточном и популяционном уровнях закономерностей регуляции биоэнергетических процессов, состояние которых во многом определяет функциональный статус бактерий на всех этапах их жизненного цикла [1, 9]. Несомненное преимущество в этих исследованиях имеют экспрессные высокочувствительные методы, позволяющие в адекватных условиях эксперимента получать кинетические характеристики ответных реакций изучаемого объекта на внейпше воздействия. К числу таких методов относится полярографическое исследование дыхательной активности бактерий [5, 10].

В то же время у микробиологов сформировалось критическое отношение к физиологической информативности такого параметра дыхания, , как абсолютная (валовая) скорость потребления кисло-

рода при окислении эндогенных или экзогенных субстратов [8, 12]. Однако попытки применения для исследования физиологического (функционального) состояния бактерий Yersinia pestis методических приемов, разработанных в митохондриологии, а именно, оценки степени ауторегуляции окислительной активности по величине дыхательного контроля (ДК) [13] путем добавления в среду инкубации клеток экзогенного аденозиндифосфата (АДФ) не имели успеха [2, 3,12,15].

Предложенные альтернативные варианты исследования ауторегулируемого дыхания факультативных анаэробов [12, 14, 15] не получили дальнейшего развития в микробиологической практике. Сложилось, таким образом, представление о слабом сопряжении дыхания и фосфорилирования у бактерий и о принципиальной невозможности моделирования у них ауторегулируемой последовательности