НОВЫЕ ВАРИАНТЫ ПОЛИПЕПТИДА PapM БАКТЕРИЙ РОДА Streptomyces
NOVEL VERSIONS OF POLYPEPTIDE PapM OF BACTERIA GENUS Streptomyces

Настоящее изобретение относится к новым вариантам полипептида PapM бактерий рода Streptomyces, обладающим улучшенной по отношению к полипептиду дикого типа субстратной селективностью и/или эффективностью. Оно также относится к кодирующим эти варианты нуклеиновым кислотам, к микроорганизмам, содержащим эти нуклеиновые кислоты, и к их применению для получения компонента В стрептограминов.
Microbiol. Rev.,
In Antibiotics,
Пристинамицин представляет собой антибиотик, принадлежащий к семейству стрептограминов, к которому также относятся виргиниамицин и микамицин. Стрептограмины составляют небольшую однородную и оригинальную группу антибиотиков, образованных ассоциацией двух типов очень разных в химическом отношении молекул: стрептограмины А представляют собой полиненасыщенные макролактоны, а стрептограмины В являются депсипептидами (Cocito C.G. (1979)  43:145-198) (Cocito C.G. (1983)  6 :(Ed. F.E. Hahn), 296-332). В случае пристинамицина соединения А и В называют, соответственно, пристинамицинами II (PII) и пристинамицинами I (PI), а их строение представлено на фигурах 1 и 2.
J. Antim. Chemother.,
Соединения А и В имеют синергическую антибактериальную и бактерицидную активность, в особенности направленную против грамположительных бактерий, таких как Стафилококки и Энтерококки (Cocito, 1979). Действие этих соединений связано с их фиксацией на субъединице 50S рибосом клеток-мишений, что приводит к ингибированию синтеза белка (Cocito, 1979); (Di Giambattista M., Chinali G. et Cocito C.G. (1989) 24:485-507).
Streptomyces pristinaespiralis
Стрептограмины в основном продуцируются актиномицетами. В частности, пристинамицин продуцируется нитевидной бактерией  в форме природной смеси, состоящей на 30% из PI и на 70% из PII (Blanc et al., (1995), J. Bacteriol. 177 (18):5206-14). Для каждого типа молекулы происходит со-продукция нескольких изоформ, как это часто наблюдается в отношении природных метаболитов.
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
В случае пристинамицинов PI(компонентов В пристинамицинов) мажоритарной продуцируемой формой является PIA, состоящий из 7 следующих остатков, связанных между собой амидными связями и сложноэфирной связью (Фиг. 2): 3-гидроксипиколиновая кислота, L-треонин, D-аминомасляная кислота, L-пролин, 4-диметиламино-L-фенилаланин, 4-оксо-L-пипеколиновая кислота и L-фенилглицин. Вместе с PIA со-продуцируются несколько природных изоформ, соответствующих структурным изменениям главным образом в следующих остатках: D-аминомасляная кислота, 4-диметиламино-L-фенилаланин (L-DMPAPA) и 4-оксо-L-пипеколиновая кислота (Thibaut et al., (1997) J. Bacteriol. 179(3):697-704). Эти миноритарные формы синтезируются в количествах, зависящих от штаммов , но в основном составляющих величину порядка нескольких процентов, в то время как PIA составляет от 90% до 95% от количества продуцируемых PI. В частности, следует отметить, что различные штаммы  синтезируют приблизительно 5% PIB, отличающегося от PIA наличием 4-метиламино-L-фенилаланина (L-MMPAPA) в положении 4 макроцикла (Фиг. 2). Несмотря на свое миноритарное положение, PIB оказался молекулой, представляющей особый интерес в силу своих различных фармакологических свойств (WO96/05219).
S. pristinaespiralis
.
Другой аналог PIA, PINH2, отличающийся наличием 4-амино-L-фенилаланина в положении 4 (см. Фиг. 2), представляет интерес для разработки оригинальных продуктов гемисинтеза. До настоящего времени PINH2 можно было получить только способом, в котором 4-амино-L-фенилаланин добавляют в культуральную среду  (WO96/01901)
Были рассмотрены различные подходы к улучшению продукции стрептограминов; первый подход состоит в изменении общей пропорции продуцируемых компонентов А (пристинамицины II) по отношению к продукции компонентов В (пристинамицины I); другой подход состоит в изменении пропорции различных изоформ в составе каждого из компонентов А и В. Тем не менее, ни один их подходов не позволил добиться достаточной продукции пристинамицина PIB, остающегося миноритарной формой компонентов В (пристинамицинов I) пристинамицина.
S. pristinaespiralis
Первый подход, описанный в заявке WO93/20182, заключается в селекции микроорганизмов, способных специфически осуществлять продукцию компонентов А или компонентов В стрептограминов. Эти микроорганизмы получают обычными методами селекции, включающими первую факультативную стадию мутагенеза, осуществляемую на микроорганизме-продуценте стрептограминов, и вторую стадию идентификации микроорганизмов, селективно продуцирующих тот или другой из компонентов А или В стрептограминов. Этот метод позволяет, в частности, получить штаммы , селективно продуцирующие пристинамицины PII (компонент А) или пристинамицины PI (компонент В). Тем не менее, в указанном документе не описаны штаммы, селективно продуцирующие пристинамицины PI с пропорцией изоформ, измененной в пользу формы PIB по отношению к PIA, остающейся мажоритарной.
snaA
snaB
snaC
snaD
papA
papM
samS
snbA
snbC
snbD
snbE
snbR
snaA
snaB
snaC
snaD
papA
papM
samS
snbA
snbC
snbD
snbE
snbR
S. pristinaespiralis
В заявке WO94/08014 описано выделение и идентификация генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза компонентов А и в пути биосинтеза компонентов В стрептограминов. В ней также описана экспрессия этих генов с целью повышения уровня продукции компонентов А или В и применение этих генов для конструирования мутантов, блокируемых на разных стадиях путей биосинтеза компонентов А или В, что приводит к накоплению некоторых промежуточных продуктов этих путей биосинтеза. В частности, в заявке WO94/08014 описаны выделение и охарактеризовывание двенадцати генов , , , , , , , , , ,  и , выделенных из банка геномных ДНК , и показано участие генов , , ,  в пути биосинтеза компонентов А, а также участие генов , , , , , ,  и  в пути биосинтеза компонентов В.
snaA
snaA
snaA
S. pristinaespiralis
• Так, инактивация гена  в штамме позволяет получить штамм, который не продуцирует PIIA (одну из изоформ компонентов А пристинамицинов), а продуцирует исключительно PIIB (другую изоформу компонентов А пристинамицинов) в количестве, эквивалентном сумме PIIA и PIIB, продуцируемых контрольным штаммом, несущим дикую форму гена . Продукция PI (совокупность изоформ компонентов В пристинамицина) остается одинаковой в штаммах, в которых ген  был инактивирован, и в контрольном штамме.
samS
• Инактивация гена  приводит к получению штамма, который продуцирует на 35% меньше PIA (одной из изоформ компонентов В пристинамицинов) и приблизительно в 10 раз больше PIB (другой изоформы компонентов В пристинамицинов) по сравнению с контрольным штаммом; уровень PIB достигает в этом случае 20% от общего количества продуцированных пристинамицинов типа I (PI). Несмотря на увеличение продукции PIB в этих штаммах, доля PIB не является мажоритарной и остается ниже доли PIA.
papa
snbA
• Инактивация гена  или гена  приводит к получению штаммов, продуцирующих только пристинамицины типа PII (компоненты А) и не продуцирующих пристинамицины типа PI (компоненты В).
snaD
• Инактивация гена  позволяет получить штаммы, которые, наоборот, продуцируют только пристинамицины типа PI и не продуцируют пристинамицины типа PII.
S. pristinaespiralis
papa
pipA
hpaA
В заявке WO96/01901 описан оригинальный способ получения новых соединений, родственных компонентам В стрептограминов, но отличающихся от компонентов В, естественным образом продуцируемых микроорганизмами-продуцентами стрептограминов. Согласно этому способу, используют штамм микроорганизма, мутированный таким образом, чтобы изменить биосинтез предшественников компонентов В стрептограминов. В качестве мутантного штамма можно использовать, в частности, штаммы , в которых путь биосинтеза предшественников компонентов В изменен путем разрушения генов  или  или . Эти штаммы уже не продуцируют пристинамицины PI (компоненты В), а продуцируют пристинамицины PII (компоненты А). Мутантный штамм культивируют в среде, дополненной оригинальным предшественником, отличным от предшественника, синтез которого изменен. Встраивание оригинальных предшественников в структуру депсипептида вместо природных предшественников приводит к получению новых соединений, родственных компонентам В стрептограминов и обладающих ценными терапевтическими свойствами.
Подход, описанный в вышеуказанной заявке WO96/01901, позволил получить штаммы микроорганизмов, продуцирующих в качестве мажоритарных изоформы компонентов В, которые естественным путем продуцируются как миноритарные формы. Тем не менее, в нем требуется дополнительно вводить в культуральную среду специфический предшественник, отсутствующий в естественном состоянии в штаммах микроорганизма.
Фундаментальные биохимические и генетические исследования путей биосинтеза пристинамицина позволили выявить источник многочисленных изоформ, наблюдаемых для PI. В частности, было показано, что PIB образуется в результате встраивания в макроцикл с помощью пептидсинтетазы SnbDE L-MMPAPA, являющегося предшественником биосинтеза L-DMPAPA и встраиваемого в макроцикл PIA (Blanc et al., Mol. Microbiol (1997), 23(2):191-202); Thibaut et al, J. Bacteriol. (1997), 179 (3):697-704). Были идентифицированы 4 гена, участвующие в биосинтезе L-MMPAPA и L-DMPAPA, исходя из хоризмата papa, papB, papC и papM (Blanc et al., 1997).
S. pristinaespiralis
Ген papM кодирует белок, катализирующий обе последовательные реакции метилирования, которые позволяют получить L-DMPAPA, исходя из 4-амино-L-фенилаланина через L-MMPAPA согласно схеме, представленной на фигуре 3. Эти реакции метилирования катализируются РарМ с очень схожими кинетическими параметрами (константой сродства и скоростью реакции) (Blanc et al., 1997). Последовательность гена рарМ  и соответствующего полипептида (4-амино-L-фенилаланин-(N-фенил)-метилтрансферазы) представлены в последовательности SEQ ID N°1.
Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что возможно улучшить продукцию некоторых миноритарных изоформ компонентов В стретограминов путем изменения ферментативной активности продукта гена рарМ.
В частности, изобретение основано на идентификации новых вариантов полипептида РарМ, обладающих улучшенной по сравнению с полипептидом дикого типа субстратной селективностью и/или эффективностью. Действительно, авторы смогли показать, что возможно осуществить мутагенез гена рарМ таким образом, что соответствующий белок оказывается неспособным катализировать вторую реакцию метилирования при сохранении активности, достаточной для первой реакции метилирования или, по меньшей мере, таким образом, что вторая реакция метилирования сильно ингибируется по сравнению с первой реакцией.
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
Присутствие таких ферментов в микроорганизмах-продуцентах стрептограминов, таких как штаммы , приводит к накоплению L-MMPAPA и, следовательно, к продукции в первую очередь PIB (Фиг. 3). И наоборот, также возможно осуществить мутагенез гена рарМ таким образом, чтобы соответствующий белок катализировал вторую реакцию метилирования с большей эффективностью по сравнению с первой реакцией метилирования, и присутствие таких ферментов в штаммахдолжна приводить к накоплению L-DMPAPA и, следовательно, к увеличению продукции PIA.
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
Изобретение также основано на открытии того факта, что микроорганизмы, продуцирующие неактивную форму полипептида РарМ, или мутанты, не экспрессирующие ген рарМ, позволяют накапливаться компонентам В стрептограминов, которые микроорганизмы дикого типа способны синтезировать естественным образом, но в слишком малых для выделения количествах. Таким образом, в настоящем изобретении дается описание конструирования рекомбинантных штаммов, продуцирующих главным образом соединение семейства PI, называемое PINH2, которое не синтезируется многочисленными дикими штаммами и которое соответствует включению 4-амино-L-фенилаланина в положении 4 макроцикла (Фиг. 2).
Первый объект изобретения относится к варианту полипептида РарМ, отличающемуся тем, что он имеет эффективность метилирования по отношению к субстратам метилирования, отличающуюся (в большую или меньшую сторону) от эффективности метилирования полипептида РарМ дикого типа по отношению к тем же субстратам.
1
1
2
2
PAPA
PAPA
MMPAPA
MMPAPA
Вариант полипептида РарМ отличается тем, что он имеет эффективность метилирования 1, определяемую по отношению Kcat/Km по отношению к субстрату метилирования 1 и/или эффективность метилирования 2, определяемую по отношению Kcat/Km по отношению к субстрату метилирования 2, отличающуюся от полипептида РарМ дикого типа. Предпочтительно, вариант РарМ по изобретению имеет эффективность метилирования 1 L-PAPA до L-MMPAPA, определяемую по отношению Kcat/Km и/или эффективность метилирования 2 L-MMPAPA до L-DMPAPA, определяемую по отношению Kcat/Km, отличающуюся от эффективности метилирования полипептида РарМ, представленного в виде SEQ ID N°1.
Согласно первому варианту осуществления, вариант РарМ по изобретению имеет эффективность метилирования 1 L-PAPA до L-MMPAPA, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз и, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз превышающую эффективность метилирования 2 L-MMPAPA до L-DMPAPA. Такой вариант является особо предпочтительным для получения PIB. Предпочтительно, вариант согласно изобретению получают из последовательности полипептида РарМ дикого типа заменой одной или более аминокислот, выбранных из: остатка Gly 249 (а), остатка Thr 192 (b) или остатка, эквивалентного (а) или (b) в гомологичном полипептиде.
Streptomyces olivaceus, Streptomyces ostreogriseus, Streptomyces mitakaensis, Streptomyces loïdensis, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces diastaticus
Под полипептидом, гомологичном РарМ, в рамках настоящего изобретения понимают полипептиды, происходящие или полученные из бактерий рода Streptomyces, таких как, в частности,  или других микроорганизмов, в которых аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID N°1, заменой, делецией и/или вставкой одной или более аминокислот и которые имеют биологическую функцию, схожую с функцией полипептида РарМ. Такая последовательность гомологичного полипептида может иметь сходство по меньшей мере на 60% с последовательностью SEQ ID N 1, предпочтительно, по меньшей мере на 70% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 80% с последовательностью SEQ ID N 1.
Согласно первому варианту осуществления вариант по изобретению происходит от полипептидной последовательности SEQ ID N 1 и имеет по меньшей мере одну замену в положении 249 глицина на серин.
Согласно другому варианту осуществления вариант по изобретению происходит от полипептидной последовательности SEQ ID N 1 и имеет по меньшей мере одну замену в положении 192 треонина на изолейцин.
Наконец, согласно еще одному варианту осуществления вариант по изобретению происходит от SEQ ID N 1 и имеет по меньшей мере одну замену в положении 249 глицина на серин и в положении 192 треонина на изолейцин.
Согласно другому варианту осуществления вариант РарМ по изобретению имеет эффективность метилирования 2 L-MMPAPA до L-DMPAPA, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз и, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз превышающую эффективность метилирования 1 L-PAPA до L-MMPAPA. Такой вариант является особо предпочтительным для получения PIA.
Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей определенный выше вариант полипептида. Нуклеиновой кислотой предпочтительно является нуклеиновая кислота, полученная в результате мутации нуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID N 1, или производных от нее последовательностей в силу вырожденности генетического кода. Предпочтительно, нуклеиновая кислота по изобретению включает по меньшей мере одну миссенс-мутацию выше звена NPPY, расположенного в положениях 193-196, и, предпочтительно, эта миссенс-мутация приводит к неконсервативному изменению аминокислот, например, замене цитозина в положении 658 тимином (С658Т) (мутантный аллель 66). Другая предпочтительная форма осуществления относится к нуклеиновой кислоте, отличающейся тем, что она включает по меньшей мере одну замену гуанина в положении 828 аденином (G828A) (мутантный аллель 49). Наконец, наиболее предпочтительная форма осуществления относится к нуклеиновой кислоте, отличающейся тем, что она включает по меньшей мере одну замену гуанина в положении 828 аденином (G828A) и по меньшей мере одну замену цитозина в положении 658 тимином (С658Т) (мутантный аллель 49/66).
Streptomyces olivaceus, Streptomyces ostreogriseus, Streptomyces mitakaensis, Streptomyces loïdensis, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces diastaticus
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
Объектом изобретения также является применение определенной выше нуклеиновой кислоты для изменения пропорции изоформ компонентов В в штамме-продуценте стрептограминов. В качестве штаммов-продуцентов стрептограминов, которые могут быть использованы в рамках изобретения, можно назвать, в частности, штаммы и пр. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант РарМ, имеющий эффективность метилирования 1 РАРА до ММРАРА по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз и, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз превышающую эффективность метилирования 2 MMPAPA до DMPAPA, в частности пригодны для получения PIB при их экспрессии в штамме . Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант РарМ, имеющий эффективность метилирования 2 MMPAPA до DMPAPA по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз и, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз превышающую эффективность метилирования 1 РАРА до ММРАРА, в частности пригодны для получения PIA при их экспрессии в штамме .
Также объектом изобретения является любая рекомбинантная ДНК, содержащая определенную выше нуклеиновую кислоту.
Изобретение также относится к любому вектору экспрессии, с автономной репликацией и/или интегративному, содержащему определенную выше нуклеиновую кислоту или рекомбинантную ДНК, такому как, в частности, вектор, включающий в себя вектор или часть вектора pVRC1306, представленного на фигуре 11.
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces
Hansenula
Micromonospora, Aspergillus ssp.
Trichoderma ssp
Actinomycetes
Streptomyces, E. coli
, Bacillus
Streptomyces olivaceus, Streptomyces ostreogriseus, Streptomyces mitakaensis, Streptomyces loïdensis, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces diastaticus
Объектом изобретения также являются клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, и/или рекомбинантную ДНК, и/или вектор экспрессии, как они определены выше. Клетки-хозяева по изобретению могут представлять собой как эукариотические, так и прокариотические клетки. Среди подходящих эукариотических клеток можно назвать животные клетки, дрожжи или грибы. В частности, в том, что касается дрожжей, можно назвать дрожжи рода  или . В отношении животных клеток можно назвать клетки COS, CHO, Cl127, икру шпорцевой лягушки и т.д. Среди грибов можно, в частности, назвать  или . В качестве прокариотических клеток предпочтительно используют следующие бактерии  и, в частности, (пример 7). Предпочтительно, рекомбинантные клетки по изобретению выбирают из клеток-продуцентов стрептограминов, в частности . Рекомбинантные клетки по изобретению могут быть получены любым способом, позволяющим ввести в клетку чужеродную нуклеотидную последовательность. Таким способом может быть, в частности, трансформация, электропорация, конъюгация, слияние протопластов или любой другой известный специалисту способ.
Объектом изобретения также является способ получения варианта полипептида РарМ по изобретению, отличающийся тем, что культивируют клетку-хозяина, как она определена выше, и получают продуцированный полипептид.
Изобретение также относится к применению клетки-хозяина, как она определена выше, экспрессирующей вариант полипептида РарМ по изобретению, в реакции биоконверсии. В частности, эти клетки могут позволить трансформировать ароматические амины в монометилированные амины, в частности. 4-амино-L-фенилаланин в 4-метиламино-L-фенилаланин. Эти биоконверсии могут осуществляться либо при помощи целых клеток, либо при помощи неклеточных экстрактов из указанных клеток.
Другой объект изобретения относится к способу получения компонента В стрептограминов, отличающемуся тем, что:
- инактивируют в штамме-продуценте стрептограминов или потенциальном продуценте стрептограминов ген рарМ и вводят одну или несколько копий нуклеиновой кислоты, кодирующей определенный выше вариант рарМ,
- культивируют указанный штамм в условиях продукции стрептограминов,
- получают продуцированный компонент В стрептограминов.
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
Streptomyces olivaceus
, Streptomyces ostreogriseus
, Streptomyces mitakaensis
, Streptomyces loïdensis
, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces diastaticus
Предпочтительно, штаммом-продуцентом стрептограминов является штамм-продуцент пристинамицинов, происходящий от , более предпочтительно, от штамма  SP92 или  АТСС25486. Он также может быть выбран из следующих штаммов: АТСС12019 АТСС27455 АТСС15297 АТСС11415.
S. osteogriseus
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
Предпочтительно, штаммом-продуцентом стрептограминов является штамм, продуцирующий уменьшенное или неопределяемое количество компонента А стрептограминов. В качестве штаммов, не продуцирующих компонентов А стрептограминов, можно, в частности, назвать штамм  Pr4Q031/CBS 142.93, описанный в заявке WO93/20182. Относительно примеров штаммов , которые не продуцируют компонентов А, можно назвать штамм SP213, полученный из SP92 (Blanc et al, 1994) после химического мутагенеза, или штамм Pr4R31 (депонированный как CBS182.92), описанный в заявке WO93/20182; штаммы SP213 и Pr4R31 специфически продуцируют пристинамицины PI и не продуцируют определяемых количеств PII (компонентов А).
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
Согласно предпочтительному варианту, введение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант РарМ по изобретению, происходит путем замещения дикой формы гена рарМ. В зависимости от варианта, экспрессируемого введенной нуклеиновой кислотой, возможно повысить продукцию различных компонентов В стрептограминов. Так, штамм , экспрессирующий вариант с отношением KcatPAPA.KmMMPAPA/KcatMMPAPA.KmPAPA, более высоким по сравнению с полипептидом дикого типа, приводит к предпочтительной продукции PIB. Наоборот, вариант, у которого это отношение уменьшено, должен позволить получить повышенную продукцию PIA. Предпочтительно, для получения PIB штамм  содержит ген рарМ, имеющий по меньшей мере мутацию (G828A), или мутацию (С658Т), или двойную мутацию (G828A)(С658Т).
рарМ
S. pristinaespiralis
Изобретение также относится к способу получения PINH2, отличающемуся тем, что используют штамм, в котором дикая форма гена инактивирована и/или заменена нуклеиновой кислотой, кодирующей неактивную форму РарМ.
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
S. pristinaespiralis
Также объектом изобретения является мутантный штамм , отличающийся тем, что он содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида РарМ по изобретению. Такой штамм может быть получен, в частности, трансформацией рекомбинантного штамма, в котором ген рарМ дикого типа разрушен и заменен кассетой Ω-Km (см. пример 8) с помощью суицидной плазмиды, обеспечивающей обмен этой кассеты с одним из мутантных аллелей рарМ. В качестве примера в настоящем изобретении описан штамм  SP217, содержащий нуклеиновую кислоту, несущую мутацию С658Т (мутантный аллель 66) или штамм  SP218, содержащий двойную мутацию С658Т и G828A (мутантный аллель 49/66). Эти мутации были введены в штамм SP213, в котором ген рарМ был предварительно разрушен и заменен кассетой Ω-Km. Идентичный подход позволил сконструировать штамм SP101 с введением мутантного аллеля 66 в штамм SP92. Штаммы SP101, SP218 и SP217, которые синтезируют вариант рарМ по изобретению, продуцируют главным образом PIB.
S. pristinaespiralis
Также объектом изобретения является применение штамма для получения PINH2. Примером такого штамма служит, в частности, штаммSP216, полученный из штамма SP213 путем инактивации гена рарМ и продуцирующий главным образом PINH2.
Изобретение также относится к способу отбора вариантов полипептида РарМ или полипептида, кодируемого гомологичным геном, согласно которому:
• осуществляют стадию химического мутагенеза гена рарМ или гомологичного гена, клонированного в плазмиде,
• получают банк, трансформируя штамм-реципиент с помощью мутагенизированных плазмид со стадии (а),
• отбирают клоны, имеющие такую активность метилирования, при которой отношение «r» трансформированных количеств субстрата метилирования на единицу времени в условиях начальной скорости, где r = Субстрат1 /(Субстрат 1 + Субстрат 2), по меньшей мере на 20% больше, чем у полипептида дикого типа, и предпочтительно равно или превышает 0,6.
in vitro
Escherichia coli
В этой связи настоящее изобретение показывает, каким образом можно осуществить  химический мутагенез с помощью гидроксиламина гена рарМ, клонированного в плазмиде, для создания банка мутантов и для отбора из этого банка с помощью миниатюризованного ферментативного скрининга клонов , которые экспрессируют мутированные гены рарМ, соответствующие которым белки имеют вышеописанные каталитические свойства, и для которых определенное выше отношение «r» равно или превышает 0,6.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, являющимися иллюстративными и неограничительными.
Чертежи
Фигура 1: пример структуры пристинамицинов II
Фигура 2: пример структуры пристинамицинов I
Фигура 3: путь биосинтеза ММРАРА и DMPAPA, предшественников, соответственно, PIB и PIA.
14
Фигура 4: принцип ферментативного теста, используемого для скрининга мутантов РарМ: маркировка одновременным метилированием ММРАРА и DMPAPA, исходя, соответственно, из РАРА и ММРАРА, в присутствии [С-Ме]-SAM.
Фигура 5: плазмида pVRC706
Фигура 6: плазмида pUC4K
Фигура 7: последовательность и трансляция гена рарМ дикого типа. Положения мутаций, идентифицированных для клонов 49 и 66.
Фигура 8: плазмида pVRC721
Фигура 9: стратегия конструирования плазмиды pVRC1303
S. pristinaespiralis
Фигура 10: двойной кроссинговер между плазмидой pVRC1303 и хромосомой . Структура хромосом рекомбинантных штаммов.
Фигура 11: стратегия конструирования pVRC1306
Фигура 12: простой направленный кроссинговер между плазмидой pVRC1306 и хромосомой рекомбинантного штамма SP216
Фигура 13: вторая рекомбинация, приводящая к рекомбинантному штамму, несущему один из мутантных аллелей гена рарМ
ЛИТЕРАТУРА
- Blanc et al., (1994) W094/08014.
- Blanc et al., (1995), J. Bacteriol. 177 (18): 5206-14.
- Blanc et al., Mol. Microbiol (1997), 23(2): 191-202.
- Chambers et al. (1988) Gene. Aug 15;68(1): 139-49.
Microbiol. Rev.,
- Cocito C. G. (1979)  43: 145-198.
In Antibiotics, 6
- Cocito С. G. (1983) : (Ed. F. E. Hahn), 296-332.
.
.,
mp. Appl. in Biosciences,
- Dessen PC Fondrat C., Valencien C. et Mugnier C. (1990) Co 6: 355-356.
J. Antim. Chemother.,
- Di Giambattista M., Chinali G. et Cocito C. G. (1989)  24: 485-507.
- Fellay et al., (1987) Gene. 52(2-3): 147-54.
- Hanahan et al. (1990) PNAS USA 87, pp 4645-4649 (1990).
Nucl. Acids Res.,
- Hillemann D., Pülher A. et Wohlleben W. (1991)  19: 727-731.
A laboratory manual.,
- Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F., Kieser Т., Bruton C. J., Kieser H. M., Lydiate D. J., Smith C. P., Ward J. M. et Scrempf H. (1985) The John Innes Fondation, Norwich, England.
- Humphreys et al. (1976) Mol Gen Genet. Apr 23;145(1): 101-8.
Cold Spring Harbor, N. Y.,
- Maniatis Т., Fritsh E. F. et Sambrook J. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual.
-
Nucleic Acids Res.,
Messing J., Crea R. et Seeburg P. H. (1981) 9: 309.
- Schluckebier et al. (1995) Gene. May 19;157(1-2): 131-4.
- Thibaut et al., (1997) J. Bacteriol. 179(3): 697-704.
- Veira et Messing, Gene. 1982 Oct;19(3): 259-68.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: методология и пропись ферментативного скрининга
Этот пример иллюстрирует скрининг мутантных форм фермента РарМ, имеющих новые кинетические характеристики, исходя из популяции ферментов, полученных мутагенной обработкой гидроксиламином (см. примеры 2 и 3). В частности, этот пример иллюстрирует получение мутантных форм РарМ, имеющих измененную селективность в отношении обоих естественных субстратов этого фермента.
Методология
Метилазу рарМ предварительно клонировали, очищали и охарактеризовывали (Blanc et al. 1994; Blanc et al. 1997). РарМ является бифункциональным ферментом, катализирующим как N-метилирование L-PAPA до L-MMPAPA, так и N-метилирование L-MMPAPA до L-DMPAPA (см. Фиг. 4).
L-PAPA и L-MMPAPA являются конкурентными субстратами РарМ, имеющими константу Михаэлиса (Km) соответственно 240 и 530 мкМ и в отношении которых максимальное быстродействие РарМ (Vmax) составляет соответственно 55 и 71 мкмоль/ч/мг РарМ (Blanc et al. 1997).
Отношение скоростей V1 и V2 метилирования, соответственно, L-PAPA и L-MMPAPA зависит от кинетических параметров РарМ (Km1 и Vmax1 для L-РАРА, Km2 и Vmax2 для L-ММРАРА), а также от концентраций S1 и S2 соответственно L-PAPA и L-MMPAPA согласно формуле:
V1/V2=(Vmax1/Km1)[S1]/(Vmax2/Km2)[S2]
Одновременное измерение обеих скоростей метилирования V1 и V2 при фиксированных концентрациях S1 и S2 позволяет определить отношение кинетических констант РарМ для L-PAPA и L-MMPAPA. Это отношение не зависит от количества использованного в исследовании РарМ. Когда селективность мутантного фермента РарМ повышается в отношении L-РАРА, отношение V1/V2 должно вырасти, и наоборот, это отношение должно уменьшиться, когда мутантный фермент РарМ метилирует главным образом L-ММРАРА.
Наконец, чтобы не допустить незначительных вариаций Km и, наоборот, получить либо сильные вариации Km, либо изменения Vmax, концентрации L-PAPA и L-MMPAPA установили на значениях приблизительно 6-кратного Km, чтобы обеспечить условия насыщения. В таких условиях с ферментом РарМ дикого типа скорости метилирования 1 и метилирования 2 практически равны.
Одновременное измерение обеих активностей метилирования РарМ описано в примере 7.1. Это измерение метилазных активностей РарМ осуществляют в присутствии 1,5 мМ L-РАРА, 3 мМ L-ММРАРА и 70 мкМ SAM.
Скрининг популяции мутантных ферментов
E. coli
14
96-луночные планшеты банка клонов , продуцирующих мутантные ферменты РарМ, полученные как описано в примере 3, размораживали при 27°С. Затем к 200 мкл культуры на среде LB, содержащейся в каждой лунке, добавляли 25 мкл смеси А. Смесь А получали, последовательно добавляя (1) 3 мл буфера 50мМ Bis-Tris-пропана рН 10, в котором растворяли 12 мг L-РАРА и 71 мг (DL)-MMPAPA в форме дигидрохлорида, полученного как описано в WO96/01901, (2) 0,7 мл SAM 4 мМ в воде, (3) 0,7 мл [C-Me]-SAM 25 мкCi/мл и 60 мCi/моль (AMERSHAM), (4) 0,6 мл буфера 100 мМ Bis-Tris-Пропана рН 6,8, (5) 56 мг ЭДТУ двунатриевой соли. Количества приведены для получения объема 5 мл смеси А. Планшет затем запечатывают клейкой пленкой, после чего инкубируют при 27°С в течение 2 часов. Реакцию останавливают с помощью 40 мкл останавливающего раствора. Останавливающий раствор (для объема 4 мл) получают смешиванием 2,2 мл раствора 24 мг/мл гептансульфоната натрия в воде с 1,8 мл концентрированной соляной кислоты. После центрифугирования планшетов при 3000 g в течение 5 мин. Около 100 мкл супернатанта из каждой лунки анализируют с помощью ВЭЖХ в системе, описанной в примере 7.1.
Для каждой лунки получают соответствующие зоны А1 и А2 пиков ММРАРА и DMPAPA, полученных в результате записи данных радиохимического анализа. Затем рассчитывают отношение r следующим образом:
r = A1/(A1+A2)
В случае метилазы РарМ дикого типа r=0,50±0,05.
Порог отношения r, установленного для мутантного фермента РарМ, существенно более активного в отношении метилирования 1 по сравнению с метилированием 2, составляет приблизительно 0,60.
ПРИМЕР 2: Мутагенез с помощью гидроксиламина гена рарМ
Streptomyces
E. coli
Этот пример иллюстрирует мутагенез гена рарМ из плазмидной ДНК , клонированной в плазмиде, которая может реплицироваться в .
2.1. Выбор мутагенного агента
2
Streptomyces
Химический мутагенез осуществляли, используя гидроксиламин (NHOH), который специфически связывается с остатками цитозина с образованием N4-гидроксицитозинов, которые становятся способны к образованию пар с остатками аденина. Таким образом, гидроксиламин вызывает переходы G:C > A:T. Выбор этого мутагенного агента представляет особый интерес для осуществления мутаций ДНК с высоким содержанием GC, таких как ДНК , которые содержат от 70 до 75% остатков GC.
2.2. Выбор плазмид для мутагенеза
Мутагенез был проведен одновременно на двух разных плазмидах, плазмиде pVRC706 и плазмиде pUC4K.
E. coli
Плазмида pVRC706 (фигура 5) происходит от pMTL23 (Chambers et al., 1988), в которой между уникальными сайтами MluI и BamHI (конец, разрезанный BamHI, затупляли действием фермента Кленова в соответствии с прописью Sambrook tu al. (1989)) был клонирован фрагмент MluI-StuI размером 1,7 т.п.н., полученный из плазмиды pVRC409, несущей ген рарМ, который должен быть подвергнут мутагенезу (Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997). Клонирование конца StuI в сайте BamHI pMTL23, заполненном с помощью фермента Кленова, позволяет восстановить сайт BamHI, который может быть использован при последующих клонированиях. Клонирование в сайте MluI позволяет получить слияние в фазе между 32 первыми аминокислотами β-галактозидазы, кодируемой геном lacZ плазмиды pMTL23, и 11 последними аминокислотами гена рарВ, расположенного выше гена рарМ, что защищает трансляционное соединение между этими двумя генами, существование которого можно предположить при изучении нуклеотидной последовательности (Blanc et al., 1994). В этой конструкции экспрессия гена рарМ контролируется промотором Plac гена lacZ, индуцируемым добавлением 1 мМ IPTG. Предварительно было показано, что такая система экспрессии позволяет продуцировать в  метилазу РарМ в форме активного растворимого белка, составляющего приблизительно 0,5% общего белка (Blanc et al., 1994).
Плазмида pUC4K (Фиг. 6) является производным вектора pUC4, несущего оба гена, придающих резистентность к ампициллину и к канамицину (Vieira et Messing, 1982). Эта плазмида была выбрана в качестве контрольной для мутагенеза по следующим причинам: (1) ее размер (3,9 т.п.н.) близок к плазмиде pVRC706 (4,4 т.п.н.), (2) обе плазмиды, pUC4K и pVRC706, имеют очень близкие строение и свойства, поскольку обе происходят от векторов серии pUC, и (3) присутствие обоих генов резистентности ampR и kanR, находящихся в pUC4K, позволяет легко рассчитать процент клонов, претерпевших мутагенез в одном из этих генов, путем подсчета клонов, чувствительных к выбранному антибиотику.
2.3. Пропись мутагенеза
Два мутагенеза с помощью гидроксиламина были проведены согласно протоколу Humprey et al (1976) с различной температурой инкубации: 80°С и 85°С: 5 мг плазмидной ДНК, очищенной на градиенте хлорида цезия, приводили в контакт с 0,4 М гидроксиламина (рН 6) в конечном объеме 100 мл в течение 35 минут при желаемой температуре (80°С или 85°С) в буфере, содержащем 0,05 М фосфата натрия и 0,5 мМ ЭДТУ. Реакцию мутагенеза останавливают добавлением 100 мл буфера, содержащего 0,1 М фосфата натрия и 1 мМ ЭДТУ и удаляют гидроксиламин с помощью 8 последовательных диализных бань против 2 литров буфера TES (10 мМ Tris рН 7,5, 1 мМ ЭДТУ и 100 мМ NaCl). Обработанную таким образом ДНК осаждают добавлением 1/10 объема ацетата натрия 3М (рН 8) и 2,5 объемов этанола 95%. Осадок ДНК промывают, высушивают, затем помещают в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ Tris-HCl и 1 мМ ЭДТУ, рН 7,5). Для каждой плазмиды осуществляют контроль реакции мутагенеза при используемой температуре в отсутствие гидроксиламина.
E. coli
2.4. Получение штамма  в качестве реципиента мутагенизированных плазмид
E. coli
Штамм  DH5α (supE44 DlacU169 (f80lacZDM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1), (Hanahan, 1990) использовали для оценки мутагенеза после трансформации плазмидами pVRC706 и pUCK4, мутагенизированных согласно вышеописанной прописи.
E. coli
9
Компетентные для трансформации элктропорацией клетки DH5α получали согласно следующей прописи: культивирование 1 литра в среде LB проводили при 37°С до получения оптической плотности (при 600 нм) от 0,5 до 0,8. Затем клетки помещали на лед на 30 мин для прекращения их роста, затем центрифугировали при 4°С и 4000 g в течение 15 мин. Осажденные клетки последовательно промывали 1 л стерильной холодной воды, 0,5 л холодной воды и 20 мл холодного раствора, содержащего 10% глицерина. После каждой промывки клетки центрифугировали при 4°С и 4000 g в течение 15 мин. В конце осажденные клетки помещали в 2 мл 10%-ного глицерина. Подготовленные таким образом клетки могут быть непосредственно подвернуты электропорации или могут быть заморожены и могут храниться при -80°С в форме аликвот по 40 мл для последующего использования. Эффективность трансформации электрокомпетентных клеток составляет величину порядка 10 колоний/мкг плазмидной ДНК pUC18.
E. coli
2
4
-1
-4
Полученные таким образом клетки  DH5α были подвергнуты электропорации с эквивалентом 5 нг тестируемой плазмиды. Для этого 40 мкл электрокомпетентных клеток приводили в контакт в течение 1 мин при 4°С с 1-2 мкл раствора, содержащего 5 нг плазмидной ДНК. Электропоратор (Bio-Rad) регулируют на импульс 25 мФ и 2500 В. Сопротивление устройства контроля импульса устанавливают на 200 Ω. Смесь клетки/ДНК помещают в кювету для электропорации шириной 0,2 см и прикладывают электрический импульс. Обычно получают длительность импульса от 4,5 до 5 мс. После импульса быстро добавляют к клеткам 1 мл среды SOC (2% бакто-агара, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl, 10 мМ MgSO, 20 мМ глюкозы) и помещают препарат в полипропиленовую пробирку емкостью 5 мл, которую инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Эта стадия позволяет клеткам восстановиться и начать экспрессию гена или генов резистентности, присутствующих в введенных в клетки плазмидах. По окончании инкубации культуру клеток разбавляют соответствующим образом (коэффициенты разведения обычно составляют от 10 до 10) и отбирают трансформированные колонии на твердой среде LB, содержащей селективные антибиотики (50 мкг/мл ампициллина или 50 мкг/мл канамицина).
2.5. Оценка мутагенеза и определение температурных условий
E. coli
E. coli
Оба исследованных температурных режима мутагенеза оценивали по следующим двум критериям: с одной стороны, способность мутагенизированных плазмид трансформировать штамм  и, с другой стороны, процентное содержание клонов , трансформированных мутагенизированными плазмидами pUC4K, утративших одну из двух резистентностей, кодируемых плазмидами.
E. coli
Для обеих плазмид, pVRC706 и pUCK4 была измерена способность плазмид, мутагенизированных гидроксиламином, трансформировать штамм DH5α. Эту способность сравнивали с аналогичной способность немутагенизированных плазмид, полученных в качестве контроля температуры инкубации в отсутствие гидроксиламина. Действительно, действие гидроксиламина должно вызывать летальные мутации в плазмидах, в частности, на уровне генов резистентности, что должно позволять осуществить отбор рекомбинантных клонов, а также в участках, содержащих сайты начала репликации. Таким образом, можно считать, что утрата плазмидой способности к трансформации будет тем выраженнее, чем выше эффективность мутагенной обработки. Показатели способности мутагенизированных плазмид к трансформации, выраженные в % от способности немутагенизированных контрольных плазмид, приведены таблице 1.
Таблица 1
pVRC706
pUC4K
80°С
85°С
80°С
85°С
Ампициллин
12,5
1,5
14
1,5
Канамицин
-
-
16
0,3
E. coli
R
R
Эти результаты ясно показывают, что мутагенез при 85°C заметно более эффективен для обеих плазмид pVRC706 и pUC4K, поскольку статистически в 10 раз сильнее повреждает целостность плазмиды, так что только 1,5% плазмид остаются способность трансформировать электрокомпетентные клетки  DH5α, реплицироваться и сообщать клонам резистентность к ампициллину. Более того, результаты, наблюдаемые в случае pUC4K, являются очень однородными вне зависимости от выбранного селективного антибиотика (Ampi) или (Kana), что свидетельствует о том, что действие гидроксиламина однородно проявляется в участках, необходимых для экспрессии этих двух резистентностей.
S
R
Вторым критерием оценки был подсчет, для мутагенизированных плазмид pUC4K, % клонов, чувствительных к канамицину (Kana) среди клонов, резистентных к ампициллину (Ampi) и наоборот. Эти количества отражают частоту полученных под действием гидроксиламина мутаций на уровне генов исследуемых резистентностей (ampR или kanR), нарушивших их экспрессию либо путем полной блокировки (остановка транскрипции или трансляции), либо приводя к синтезу урезанного и/или неактивного белка.
R
R
E. coli
Для оценки этих количеств 200 клонов (Kana) или (Ampi), выбранных из клонов, полученных после трансформации электрокомпетентных клеток штамма  DH5α плазмидами pUC4K, мутагенизированными или нет, реплицировали в твердой среде LB, содержащей, соответственно, ампициллин или канамицин. Клоны, чувствительные к одному из двух антибиотиков, подсчитывали после 24 ч роста. Процент клонов, чувствительных к ампициллину или канамицину, среди клонов, трансформированных плазмидами pUC4K, мутагенизированных или нет гидроксиламином, представлен в таблице 2.
Таблица 2
pUC4K + гидроксиламин
pUC4K не мутагинизированная
80°С
85°С
80°С
85°С
(Ampi<sup>S</sup>)/(Kana<sup>R</sup>)
1,3
3,2
0
0
(Kana<sup>S</sup>)/(Ampi<sup>R</sup>)
1,5
6
0
0
Эти результаты позволяют прийти к заключению, что только обработка гидроксиламином вызвала мутации, нарушающие экспрессию одного из двух генов резистентности pUC4K. Они также позволяют сделать вывод о том, что мутагенез, осуществленный при 85°С, является в 3-4 раза более эффективным в случае обоих генов резистентности плазмиды pUC4K по сравнению с мутагенезом при 80°С. Наконец, эти результаты показывают, что действие гидроксиламина было относительно равномерным в случае обоих генов резистентности ampR и KanR.
E. coli
Таким образом, есть все основания для предположения, что действие гидроксиламина распространяется на обе плазмиды pUC4K и pVRC706 и что мутагенез, осуществленный при 85°С, по-видимому, является наиболее эффективным в отношении генов рарМ, содержащихся в pVRC706. Это сравнение условий мутагенеза подвигло авторов к использованию в дальнейших исследованиях только клонов, полученных в результате трансформации электрокомпетентных клеток  DH5α плазмидами pVRC706, полученными в результате мутагенеза с помощью гидроксиламина при 85°С.
E. coli
Пример 3: составление и использование банка DH5α, содержащих плазмиды pVRC706.
E. coli
Этот пример иллюстрирует составление и использование банка из 6000 клонов штамма DH5α, содержащих плазмиды, подвергшиеся химическому мутагенезу гидроксиламином при 85°С.
E. coli
В случае мутагенеза при помощи гидроксиламина, осуществленного при 85°С на плазмидах pVRC706, несущих ген рарМ, как описано выше, можно предположить, исходя из гипотезы, что действие гидроксиламина распространяется на все плазмиды pVRC706 (см. пример 2), что банк из 6000 клонов , содержащих эти плазмиды, представляет собой банк мутантов, из которых определенное число клонов экспрессирует мутантный ген рарМ. Анализ всех 6000 клонов этого банка одновременным количественным определением обеих активностей метилирования, катализируемого соответствующими белками РарМ, подтверждает эту гипотезу (см. пример 4).
E. coli
Для составления этого банка 6000 клонов, отобранных на чашках со средой LB, содержащей 50 мг/мл ампициллина после трансформации электрокомптентных клеток штамма DH5α, индивидуально переносили в лунки планшетов для микротитрования с 96 лунками, содержащими 200 мл культуральной и консервирующей среды Hogness (Sambrook et al. 1989) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Такие маточные планшеты инкубировали при 37°С и при умеренном взбалтывании со скоростью 160 об./мин в течение 24 ч таким образом, чтобы произошло размножение клонов и образование насыщенной суспензии бактерий, достигших стационарной фазы роста. Затем проводят разделение на два экземпляра этих маточных планшетов, осуществляя индивидуальный засев каждой лунки двух 96-луночных планшетов, причем каждая лунка содержит 200 мл культуральной среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ IPTG, аликвотам культур из каждой лунки маточных планшетов. Эти планшеты, называемые планшетами для количественного определения, инкубируют в течение 24 ч (37°С, 160 об./мин) таким образом, чтобы произошло размножение клонов и образование насыщенной суспензии бактерий, достигших стационарной фазы роста. Присутствие плазмид pVRC706 в бактериальных клетках селекционируют ампициллином и индуцируют экспрессию генов метилазы рарМ, находящихся в этих плазмидах, добавлением IPTG в начале культивирования. Эти планшеты затем замораживают при -80°С перед количественным определением активностей метилирования, осуществляемым на сырых бактериальных суспензиях (см. пример 1).
Маточные планшеты, после пересеивания в двух экземплярах, сохраняют при -80°С в качестве формы долгосрочного хранения 6000 анализируемых клонов.
E. coli
Пример 4: результаты скрининга банка  DH5α, содержащего мутагенированные плазмиды pVRC706
Этот пример иллюстрирует быстрый анализ банка из 6000 клонов на основании миниатюризованного теста на активность для отборо клонов, содержащих мутантные гены, кодирующие ферменты, обладающие ценными свойствами.
4.1. Сырые результаты скрининга 6000 клонов
После первого скринига, проведенного как описано в примере 1 на 6000 клонов, полученных в примере 3, отбирают:
- 441 клон, обладающий нулевой или неопределяемой активностью метилирования, что составляет 7,3%.
- 9 клонов, для которых первая реакция метилирования превалирует над второй реакцией, т.е. клонов, имеющих отношение r (как определено в примере 1.2) выше 0,6. Частота появления такого мутанта является, таким образом, очень низкой и составляет 0,15%.
Эти первые результаты проверяли, как описано далее.
4.2. Методология подтверждения отобранных клонов
Активности метилиования всех клонов, отобранных в ходе первого скрининга, систематически подвергают повторному количественному анализу с использованием планшетов, полученных в примере 3, следуя той же прописи для подтверждения результатов первого измерения. Для подавляющего большинства клонов результаты измерения оказываются подтвержденными.
Так, было подтверждено, что:
- 360 клонов имеют нулевую активность метилирования, что составляет 6%.
- 8 клонов демонстрируют превалирование первой реакции метилирования над второй реакцией, т.е. эти клоны имеют отношение r (как определено в примере 1.2) выше 0,6. Частота появления таких мутаций является, следовательно, очень низкой и составляет 0,13%.
Для 8 клонов, имеющих такое отношение ферментативных эффективностей, при котором r > 0,60, были проведены две другие стадии подтверждения:
E. coli
(1) Выделяли с помощью стандартных методик (Sambrook et al., 1989) плазмидную ДНК из этих клонов и вводили в свежие электрокомпетентные клетки штамма DH5α. Эта стадия позволяет проверить, что изменение отношения r активностей метилирования, наблюдаемое у 8 клонов, не связано с хромосомным контекстом клонов, а зависит только от плазмид, происходящих от отобранных клонов.
(2) Следующая стадия проверки заключается в повторном клонировании в свежих векторах экспрессии pMTL23 генов рарМ, присутствующих в отобранных клонах. Для этого из плазмидной ДНК, экстрагированной из отобранных клонов выделяют фрагменты MluI-BamHI размером 1,7 т.п.н., содержащие гены рарМ, и клонируют между уникальными сайтами MluI и BamHI pMTL23. Стадии, необходимые для такого клонирования (выделение плазмидной ДНК, расщепление плазмидной ДНК рестрикционными ферментами, миграция и анализ ферментативного расщепления методом электрофореза на геле агарозы, получение фрагментов ДНК после миграции в электрофорезе, реакции лигирования) проводят согласно стандартным прописям, описанным Sambrook et al. (1989).
E. coli
Полученные плазмиды имеют строение, аналогичное pVRC706 (Фиг. 5) с той разницей, что они содержат один из 8 мутантных аллелей гена рарМ. Их обозначают как pVRC710-pVRC717, причем каждый номер присвоен одному из 8 мутантных аллелей, и вводят в свежие электрокомпетентные клетки штамма DH5α. Активности метилирования полученных клонов повторно измеряют как описано выше. Эта стадия позволяет проверить, что изменение отношения r активностей метилирования, наблюдаемое у этих клонов, не связано с мутацией (мутациями) во внешнем по отношению к гену рарМ участке pVRC706, а зависит только от мутации (мутаций), локализованной(ых) в гене рарМ.
Все эти стадии проверки позволяют подтвердить фенотип 7 из 8 ранее отобранных мутантов. Например, наблюдают, что отношение r обеих активностей метилирования, рассчитанное как описано в примере 1.2., составляет 0,63 для мутанта 49 (клон 49С9) и 0,67 для мутанта 66 (клон 66А9), тогда как для клона, экспрессирующего ген рарМ дикого типа, в том же эксперименте оно составило только 0,40.
Пример 5: генетическое охарактеризовывание мутантных генов рарМ, полученных в результате мутагенеза, проведенного с помощью гидроксиламина при 85°С на плазмиде pVRC706
Этот пример иллюстрирует генетическое охарактеризовывание генов, подвергнутых химическому мутагенезу. Генетическое охарактеризовывание проводят путем клонирования и секвенирования мутантных генов для сравнения их последовательности с последовательностью гена дикого типа и выявления мутации (мутаций) с учетом наблюдаемого фенотипа. Это генетическое охарактеризовывание проводят параллельно с биохимическим охарактеризовыванием белков, кодируемых мутантными генами (см. пример 7) для установления корреляции между наблюдаемым изменением (изменениями) в аминокислотах и изменениями каталитических свойств, установленными для этих ферментов.
5.1. Метод
В случае гена рарМ, полученного в результате мутагенеза, осуществленного с помощью гидроксиламина при 85°С на плазмиде pVRC706, осуществляют субклонирование и секвенирование генов рарМ 7 отобранных клонов. Часть участка MluI-BamHI размером 1,7 т.п.н. мутагенизированных плазмид pVRC706, несущую мутантные гены рарМ, субклонировали в виде двух субвставок в векторах, происходящих от фага М13 (Messing et al., 1981), адаптированных для сквенирования ДНК методом Sanger (Sambrook et al., 1989): фрагмент SmaI-AgeI размером 0,7 т.п.н., содержащий 3'-участок гена рарМ, клонировали в сайте SmaI вектора M13mp18, а фрагмент SalI-PstI размером 0,4 т.п.н., содержащий 5'-участок, клонировали между сайтами SalI и PstI векторов M13mp18 и M13mp19 (Фиг. 5). Стадии, необходимые для этих субклонирований, были проведены в соответствии со стандартными прописями, описанными Sambrook et al. (1989). Секвенирование этих двух вставок было осуществлено на двойной цепи методом терминации цепи, т.н. методом Sanger, с использованием флуоресцирующих дидезоксинуклеотидов системы PRISM ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, поставляемой Applied Biosystems. Реакции секвенирования проводили в аппарате для ПЦР на однонитевой ДНК, используя в качестве затравки для синтеза универсальный праймер (Sambrook et al., 1989) или олигонуклеотиды, комплементарные последовательности из 20 нуклеотидов секвенируемой вставки и синтезированные автоматическим синтезатором Bioseqrch 8600 (Blanc et al, 1995). Продукты этих реакций затем анализировали с помощью автомата для определения последовательностей Applied Biosystems 370A, который обеспечивает электрофорезную миграцию и считывание последовательностей. Последовательности затем обрабатывали с помощью программ сервера BISANCE центра Bioinformatique Infobiogen (Dessen et al., 1990), которые обеспечивают, помимо прочего, их запись, перевод в структуру белка, сравнение с последовательностью дикого типа.
5.2. Результаты
Сначала 7 следующих клонов секвенировали по одной цепи и выводили отношение r (в эксперименте, в котором отношение r фермента РарМ дикого типа составило 0,40)
Мутант
Отношение
Мутация
Мутация (нукл.)
45
0,52
Thr274>Ile
ACC>ATC
49
0,63
Gly249>Ser
GGC>AGC
52
0,66
Gly249>Asp
GGC>GAC
66
0,67
Thr192>Ile
ACC>ATC
69
0,51
Met226>Ile
ATG>ATA
74D4
0,63
Gly249>Ser
GGC>AGC
74D5
0,52
Met226>Ile
ATG>ATA
Результаты сравнения последовательностей белков, кодируемых мутантными генами рарМ, полученными в результате мутагенеза, осуществленного с помощью гитдроксиламина при 85°С на плазмидах pVRC706, с последовательностью белка, кодируемого геном дикого типа рарМ (Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997) показаны на фигуре 7 и в таблице 3, для 2 из 7 отобранных клонов, последовательность которых была проверена на двойной цепи.
Таблица 3
Мутант 49(клон 49С9)
Мутант 66(клон 66А9)
Нуклеотидная мутация в гене рарМ
GGC>AGG
ACC>ATC
Аминокислотная замена в белке РарМ
Gly<sub>249</sub>>Ser
Thr<sub>192</sub>>Ile
В таблице 3 указаны только мутации, вызывающие аминокислотную замену в соответствующем белке. Для некоторых клонов, в частности для клона 66А9, называемого «мутант 66», отмечены другие мутации, называемые молчаливыми, которые не приводят к замене в аминокислотной последовательности в силу вырожденности генетического кода.
Установлено, что для каждого из 7 отобранных и секвенированных клонов можно выявить точечную мутацию в гене рарМ, приводящую к замене одной аминокислоты и действительно соответствующую типам замены С > Т или G > А, ожидаемым после обработки гидроксиламином. В 7 проанализированных клонах неоднократно были выявлены некоторые из этих мутаций таким образом, что эти 7 клонов можно разбить на 4 класса мутантов в соответствие с затронутым положением. Вышеописанные клоны представляют 2 из составленных таким образом 4 классов.
Эффекты двух мутаций были более конкретно изучены в дальнейшей части настоящей работы; это, по отношению к SEQ ID N 1, с одной стороны, замена цитозина в положении 658 тимином (С658Т) (мутантный аллель 66) и, с другой стороны, замена гуанина в положении 828 аденином (G828A) (мутантный аллель 49).
Параллельно этому генетическому охарактеризовыванию биохимическое охарактеризовывание белков, кодируемых описанными в примере 7 мутантными генами, позволило обнаружить изменение каталитических свойств этих ферментов по сравнению с белком, кодируемым геном рарМ дикого типа.
Таким образом, возможно установить корреляцию между наблюдаемыми аминокислотными заменами и изменениями каталитических свойств, установленными для этих ферментов.
Следует отметить, таким образом, что для мутанта 66 измененной аминокислотой является треонин в положении 192 непосредственно перед звеном NPPY, расположенном в положениях 193-196 (Фиг. 7). Это звено сохраняется во всех N-метилазах и, в частности, в ДНК-N-метилазах (метилирующих положения 6 аденинов и 4 цитозинов) и, по-видимому, является частью каталитической области этих ферментов (Schluckebier et al., 1995). Замена остатка треонина, полярной аминокислоты, остатком изолейцина, являющегося гидрофобным, вероятно имеет важное значение с точки зрения каталитических свойств соответствующего белка. Действительно, было установлено существенное изменение каталитических свойств фермента, кодируемого мутантным геном 66, в частности, в том, что касается второй реакции метилирования (см. пример 7).
Пример 6: конструирование методами генной инженерии генов рарМ, имеющих двойную мутацию, исходя из мутантных генов рарМ, полученных в результате мутагенеза, осуществленного на плазмидах pVRC706
Этот пример иллюстрирует конструирование методами генной инженерии генов, имеющих двойную мутацию, исходя из генов, имеющих простую мутацию, полученных в результате мутагенеза, осуществленного с помощью гидроксиламина на плазмидной ДНК (см. пример 2), отобранных ферментативным скринингом (см. пример 4) и охарактеризованных секвенированием (см. пример 5). Неожиданно эта стратегия позволила получить более интересные мутантные гены, сочетающие в себе свойства, обнаруженные у простых мутантах.
Были проведены несколько комбинаций мутаций, скомбинированных пара на пару. В качестве примера, комбинация мутаций 49 и 66 подробно описана ниже. Для этого получали химерный ген, склеивая 5'-участок мутантного гена рарМ 66 с 3'-участком мутантного гена рарМ 49. Для этого выделяли следующие фрагменты ДНК:
- фрагмент MluI-XhoI размером 0,65 т.н.п. выделяли из плазмиды pVRC713, несущей мутантный ген рарМ 66 (см. пример 4). Этот фрагмент содержит начало аллеля 66, включая кодон АТС, который подвергся мутации и который кодирует изолейцин в положении 192 модифицированной метилазы 66 (см. Фиг. 7).
- фрагмент XhoI-BamHI размером 1,05 т.н.п. выделяли из плазмиды pVRC711, несущей мутантный ген рарМ 49 (см. пример 4). Этот фрагмент содержит конец аллеля 49, включая кодон AGC, который подвергся мутации и который кодирует серин в положении 249 модифицированной метилазы 49 (см. Фиг. 7).
E. coli
Эти два фрагмента совместно клонировали согласно стандартным прописям Sambrook et al. (1989) между уникальными сайтами MluI-BamHI плазмиды pMTL23 (Chambers et al., 1988) с получением плазмиды, имеющей структуру, аналогичную структуре pVRC706 (Фиг. 5), с той разницей, что она несет двойной мутантный аллель гена рарМ, кодирующий белок, модифицированный в положениях 192 и 249. Полученная плазмида получила название pVRC718; она позволяет осуществить экспрессию двойного мутантного гена 49/66 после трансформации электрокомпетентных клеток штамма DH5α и индуцирования промотора Plac добавлением 1 мМ IPTG.
E. coli
Двойной мутантный аллель 49/66 затем переносят во второй вектор экспрессии pET11c (Novagen), в котором используют сильный промотор РТ7, узнаваемый РНК-полимеразой фага Т7. Для этого из плазмиды pVRC718 выделяют фрагмент BglII-BamHI размером 1,8 т.п.н., несущий ген рарМ 49/66, который клонируют в уникальном сайте BamHI pET11c. Отбтрают рекомбинантную плазмиду, называемую pVRC721, описанную на фиг. 8, соответствующую направлению вставки таким образом, чтобы получить трансляционное слияние между геном 10 фага Т7 и геном рарВ, расположенным выше гена рарМ. Эту плазмиду затем вводят в экспрессионный штамм Bl21(DE3), позволяющий осуществить экспрессию РНК-полимеразы фага Т7 и, следовательно, гена рарМ 49/66, транскрибируемого начиная с промотора Т7.
С помощью схожей конструкции с использованием системы экспрессии фага Т7 наблюдали суперпродукцию белка РарМ дикого типа, которая в 10 раз превышала продукцию, полученную с помощью плазмиды pVRC706 (Blanc et al., 1997). Система, в которой используют фаг Т7, позволяет также сеперпродуцировать измененную метилазу, кодируемую двойным мутантным геном 49/66, для ее очистки и охарактеризовывания как описано в примере 7.
S. pristinaespiralis
E. coli
Пример 7: биохимическое охарактеризовывание продукта гена рарМ (дикого типа или мутантного) , экспрессируемого в штаммах .
Этот пример иллюстрирует определение кинетических констант реакций, катализируемых белком РарМ (мутантным или дикого типа). Белок РарМ катализирует две реакции, с одной стороны, метилирование 4-амино-L-фенилаланина (L-РАРА) до 4-метиламино-L-фенилаланина (L-ММРАРА) и, с другой стороны, метилирование 4-метиламино-L-фенилаланина до 4-диметиламино-L-фенилаланина (L-DMPAPA).
7.1. Количественное определение активности метилирования 4-амино-L-фенилаланина до 4-метиламино-L-фенилаланина и активности метилирования 4-метиламино-L-фенилаланина до 4-диметиламино-L-фенилаланина
Этот пример иллюстрирует количественное определение двух терминальных активностей биосинтеза 4-диметиламино-L-фенилаланина, являющегося компонентом пристинамицина IA. Этими активностями являются метилирование 4-амино-L-фенилаланина до 4-метиламино-L-фенилаланина (метилирование 1), с одной стороны, и метилирование 4-метиламино-L-фенилаланина до 4-диметиламино-L-фенилаланина (метилирование 2), с другой стороны; при этом обе активности используют SAM в качестве донора метильной группы (Фиг. 4).
Фракции исследуемых ферментов (от 1 до 20 единиц) инкубируют в течение 30 мин при 27°С в общем объеме 200 мкл буфера рН 6,8 bis-tris-пропана (50 мМ), содержащего SAM (200 мкМ), метильная группа которого радиоактивно мечена изотопом 14 атома углерода (2 Ci/моль), в присутствии 4-амино-L-фенилаланина (1 мМ) для измерения метилирования 1 или в присутствии 4-метиламино-L-фенилаланина (2,5 мМ) для измерения метилирования 2.
Реакцию останавливают добавлением 16 мкл 37% соляной кислоты, затем 20 мкл гептансульфоната натрия (240 г/л). После центрифугирования 150 мкл супернатанта инъецируют в систему ВЭЖХ в следующем градиенте:
- Мобильная фаза: элюент А = 1,2 г гептансульфоната + 2,5 мл ледяной уксусной кислоты + вода (qsp 1000 мл). Элюент В = 1,2 г гептансульфоната натрия + 2,5 мл ледяной уксусной кислоты + 300 мл ацетонитрила + вода (qsp 1000 мл). Градиент реализуют следующим образом: t = 0, 30% элюента В; t = 16 (мин), 30% элюента В; t = 17 (мин), 100% элюента В; t = 20 мин, 100% элюента В; t = 21 мин, 30% элюента В; t = 25 (мин), 30% элюента В.
- Стационарная фаза: колонка Nucléosil C18 5мкм 150 х 4,6 мм (Macherey-Nagel).
На выходе из колонки количество субстратов и продуктов ферментативной реакции измеряют поглощением при 254 нм. Это определение сочетают с линейным радиохимическим анализом при помощи детектора Berthold LB506, оборудованного твердой сцинтиллирующей капсулой типа GT400-U4. Это позволяет специфически проследить за включением радиоактивных метильных групп в продукты реакции.
Единицу ферментативной активности для метилирования 1 (а также для метилирования 2) определяют как количество фермента, необходимое для включения 1 нмоль метильной группы в 4-амино-L-фенилаланин (или в 4-метиламино-L-фенилаланин).
S. pristinatespiralis
7.2. Очистка рекомбинантных белков  (дикого типа и мутантных), обладающих активностями SAM-зависимой N-метилтрансферазы, катализирующей метилирование 4-амино-L-фенилаланина до 4-метиламино-L-фенилаланина и метилирование 4-метиламино-L-фенилаланина до 4-диметиламино-L-фенилаланина
S. pristinaespiralis
E. coli
рарМ
Этот пример иллюстрирует очистку фермента  SP92, участвующего в пути биосинтеза пристинамицина IA, экспрессируемого в  путем клонирования модифицированного гена .
7.2.а. Очистка фермента РарМ (мутант 49/66).
Используя данные количественного измерения, описанного выше в примере 7.1, очистку SAM-зависимой N-метилтрансферазы осуществляли, как описано ниже, в случае необходимости замораживая и сохраняя при -70°С активные фракции между стадиями.
E. coli
2
Осадок, полученный при центрифугировании культуры  BL21(DE3)::pVRC721 (см. пример 6), суперпродуцирующий вариант 49/66 РарМ после индукции с помощью IPTG, промывают фосфатным буфером 100 мМ с рН 7,2, 1 мМ PMSF, 5 мМ ЭДТУ, 5 мМ ЭГТУ, 0,5 М KCl, 10 об.% глицерина. 2 г промытого осадка помещают в 20 мл буфера рН 8 Tris-HCl 0,1 М, содержащего 4 мМ DTE, 5 мМ бензамидина, 0,2 мМ Пефаблока, 100 мкг/л Е-64, 2 мг/л лейпептина, 1 мМ ЭДТУ, 1 мМ ЭГТУ, 2 мг/л апротинина, 20% глицерина и 2 мг/мл лизоцима. Этот буфер поддерживают при +4°C. Полученную таким образом суспензию интенсивно перемешивают при +4°C. После 30 мин перемешивания добавляют 0,2 мг/мл дезоксирибонуклеазы I и 5 мМ MgCl. После 90 мин перемешивания экстракт центрифугируют в течение 1 часа при 50000 g. Супернатант обессоливают, аликвотами по 2,5 мл, гель-проникающей хроматографией на колонках PD-10 (Pharmacia), уравновешенных с помощью буфера рН 6,8 bis-tris 20 мМ, содержащего 4 мМ DTE, 5 мМ бензамидина, 0,2 мМ Пефаблока, 100 мкг/л Е-64, 2 мг/л лейпептина, 1 мМ ЭДТУ, 1 мМ ЭГТУ, 2 мг/л STI, 2 мг/л апротинина, 20 об.% глицерина. Часть белкового элюата хроматографируют (34 мг белка) на колонке MonoQ HR 10/10 с расходом 3 мл/мин с возрастающим линейным градиентом хлорида натрия (0-0,3 М) в буфере рН 6,8 bis-tris 20 мМ, содержащем 4 мМ DTE, 2 мМ бензамидина, 100 мкг/л Е-64, 2 мг/л лейпептина, 20 об.% глицерина. На выходе из колонки фракции дополняют 10 об.% буфера рН 6,8 bis-tris 20 мМ, содержащего 4 мМ DTE, 30 мМ бензамидина, 2 мМ Пефаблока, 100 мкг/л Е-64, 2 мг/л лейпептина, 5 мМ ЭДТУ, 5 мМ ЭГТУ, 10 мг/л STI, 10 мг/л апротинина, 20 об.% глицерина. В этих условиях обе активности метилирования (1 и 2) одинаковым образом детектируются в эксклюзионных фракциях и первых фракциях элюирования. Эти фракции объединяют, концентрируют ультрафильтрацией через Centriprep  10, затем через Centricon  10. К этому концентрату добавляют 0,85 М сульфата аммония, затем хроматографируют (20-80 мг в каждом цикле) на колонке Phényl-Superose HR  5/5 при расходе 0,5 мл/мин с убывающим линейным градиентом сульфата аммония (0,85-0 М) в буфере рН 6,8 bis-tris 50 мМ, содержащем 4 мМ DTE, 2 мМ бензамидина, 100 мкг/л Е-64, 2 мг/л лейпептина, 1 мМ ЭДТУ, 1 мМ ЭГТУ, 10 об.% глицерина. На выходе из колонки фракции дополняют 10 об.% буфера рН 6,8 bis-tris 50 мМ, содержащего 4 мМ DTE, 30 мМ бензамидина, 2 мМ Пефаблока, 100 мкг/л Е-64, 2 мг/л лейпептина, 1 мМ ЭДТУ, 1 мМ ЭГТУ, 10 мг/л STI, 10 мг/л апротинина, 10 об.% глицерина. В этих условиях обе активности метилирования (1 и 2) детектируются одинаковым образом во фракциях элюирования, соответствующих приблизительно 0,15 М сульфата аммония.
После этой стадии фермент является чистым. На электрофорезе SDS-PAGE он дает единственную дорожку, центрованную на молекулярную массу приблизительно 32000.
E. coli
Таблица 4: очистка фермента 4-амино-L-фенилаланин (N-фенил)-метилтрансферазы (мутант 49/66) из штамма  BL21(DE3)::pVRC721. Коэффициент очистки рассчитывают на основании повышения удельной активности фракций в ходе очистки.
Стадия очистки
об. (мл)
Белки (мг)
Уд. Акт. (ед.<sup>а</sup>/мг)
Выход (%)
Коэффициент очистки
Сырой экстракт
4,3
33,7
3400
-
-
PD10
6
31,5
3400
93,5
1
MonoQ HR10/10
17,5
3,0
19365
36,9
4,1
Phényl-Superose
1
0,145
28000
3,5
8,2
а
Данные относятся к единицам ферментативной активности для метилирования 1, определенным в примере 7.1.
7.2.b. Очистка ферментов РарМ дикого типа, мутанта 49 и мутанта 66.
E. coli
Ферменты РарМ wt, РарМ 49 и РарМ 66 очищали из культур  DH5α, трансформированных, соответственно, плазмидами pVRC706, pVRC711 и pVRC713 (см. пример 4) и индуцированных с помощью IPTG. Использовали ту же пропись очистки, что и в примере 7.2.а.
7.3. Измерение кинетических констант Km и V max очищенных метилаз РарМ (дикого типа и мутантных).
Условия количественного определения активности метилирования идентичны условиям, описанным в примере 7-1, за исключением концентрацмм SAM, составляющей 2 мМ, где метильная группа радиоактивно мечена изотопом 14 атома углерода (2 Ci/моль). Были приготовлены гаммы концентраций от 0,1 до 60 мМ для каждого из сбстратов 4-амино-L-фенилаланина для метилирования 1 и 4-метиламино-L-фенилаланина для метилирования 2. Для каждой концентрации каждого субстрата измеряли скорость реакции и выражали ее в нмоль, трансформированных в час на 1 мг белков.
Величины кинетических констант выведены из кривых Михаэлиса-Ментена, проведенных с помощью программы Enzfiter.
Величины, полученные для нативного фермента РарМ дикого типа и для мутантных форм РарМ 49, РарМ 66 и РарМ 49/66, сведены в таблице 5.
Таблица 5
Клон
РАРА
ММРАРА
ОтношениеKm2/Km1
ОтношениеVm2/Vm1
Km1(мМ)
Vm1(нмоль/ч/мг)
Km2(мМ)
Vm2(нмоль/ч/мг)
Wt
0,5
112600
0,55
114000
1,1
0,99
49
12
10600
30
2820
2,5
3,8
66
0,57
45200
2,2
19700
3,9
2,3
49/66
9
28000
22
9100
2,5
3,1
Эти результаты показывают, что с помощью этой методики возможно получить новый фермент, демонстрирующий новые каталитические свойства по сравнению с природным ферментом. Для каждой мутантной формы фермента была определена ферментативная эффективность каждой реакции метилирования (метилирование 1 и метилирование 2). Эту эффективность определяли по отношению Vm1/Km1 (метилирование 1) или Vm1/Km1 (метилирование 2).
Затем для каждой формы определяли соотношение ферментативных эффективностей (реакция метилирования 1/реакция метилирования 2). Это соотношение равно Vm1.Km2/Vm2.Km1.
Соотношение, полученное для фермента РарМ дикого типа, составляет 1,1.
Мутанты РарМ отбирали таким образом, чтобы соотношение ферментативных активностей превышало 2,5. Лучшие мутанты демонсрировали соотношения выше 7, предпочтительно, близкие к 10.
Таблица 7
Km1
Vm1
Km2
Vm2
Vm1/Km1
Vm2/Km2
<img file="00000001.tif" he="10" wi="19" img-content="undefined" img-format="tif" />
Wt
0,5
112600
0,55
114000
225200
207270
1,08
49
-12
10600
30
2820
880
94
9,36
66
0,57
45200
2,2
19700
79300
8950
8,86
49/66
9
28000
22
9100
3110
410
7,58
7.4. Тест на конкуренцию между двумя субстратами 4-амино-L-фенилаланином и 4-метиламино-L-фенилаланином
Этот пример иллюстрирует то, каким образом можно подавить действие метилазы, наиболее эффективной в продукции PIB, т.е. той, которая лучше катализирует первую реакцию метилирования п-амино-L-фенилаланина до п-метил-L-фенилаланина по сравнению со второй реакцией метилирования п-метил-L-аминофенилаланина до п-диметиламино-L-фенилаланина.
Отношение скоростей превращения обоих конкурентных субстратов выражается формулой
V1/V2=(Kcat1/Km1)[S1]/(Kcat2/Km2)[S2]
Kcat представляет собой “turn over” фермента, или число моль метилированного субстрата на число моль фермента и на единицу времени.
Эта формула действительна для любых концентраций S1 и S2.
Действительно, вне зависимости от концентраций S1 и S2 ферментативная реакция представляет собой сумму двух составляющих, как если бы она катализировалась двумя отдельными ферментами, один из которых действует на S1 и конкурентно ингибируется S2, а другой действует на S2 и конкурентно ингибируется S1.
Любое изменение Km и/или Vmax. Одного из двух субстратов отражается на степени превращения другого и влечет изменение отношения V1/V2.
Таким образом, количество субстрата и используемого фермента не имеет значения, при условии, что трансформируют не более 2% каждого из субстратов.
Используя те же условия количественного определения метилирования, как описано в примере 7-1, за исключением концентрации SAM, которая составляет 2 мМ, и где метильная группа радиоактивно мечена изотопом 14 атома углерода (2,5 Ci/моль) и в присутствии одновременно обоих субстратов в концентрациях 4-амино-L-фенилаланина 1 мМ и 4-метиламино-L-фенилаланина 2 мМ, можно определить скорость каждой реакции.
Тесты проводили одновременно на мутантах, описанных в примерах 4-6, и с использованием тех же растворов субстратов.
В этих условиях двойная мутантная метилаза 49/66 предстает как наиболее избирательная, катализируя первую реакцию метилирования в 7 раз лучше, чем вторую, тогда как нативный фермент схожим образом катализирует обе реакции.
S. pristinaespiralis
Пример 8: Конструирование рекомбинантных штаммов , в которых разрушен ген рарМ
S. pristinaespiralis
Этот пример иллюстрирует конструирование рекомбинантных штаммов , в которых разрушен ген рарМ. Такие штаммы представляют собой первую стадию конструирования рекомбинантных штаммов, в которых ген рарМ дикого типа заменен одним из мутантных аллелей, полученных и охарактеризованных, как описано в предыдущих примерах. Кроме того, эти штаммы в принципе продуцируют соединение семейства PI, PINH2 (Фиг. 3), которое не синтезируется естественным образом штаммами, содержащими ген рарМ дикого типа. Таким образом, эти штаммы дают путь к PINH2, которое невозможно было бы выделить из штаммов с неразрушенным геном рарМ.
8.1. Конструирование рекомбинантных штаммов, в которых разрушен ген рарМ
S. pristinaespiralis
Разрушение гена рарМ осуществляют в нескольких штаммах :
S. pristinaespiralis
- штамм  SP92, описанный выше, продуцирующий смесь PI и PII (Blanc et al, 1994).
- штамм SP213, являющийся производным от SP92 вследствие химического мутагенеза. Этот штамм специфически продуцирует PI.
Стратегия конструирования рекомбинантных штаммов, в которых разрушен ген рарМ, является одинаковой для обоих штаммов. Результаты, полученные для штамма SP213, детально описаны в продолжении этого примера.
E. coli
Streptomyces
Это конструирование было осуществлено с помощью плазмиды pVRC1303 (см. Фиг. 9), происходящей от суицидного вектора pDH5, способного реплицироваться исключительно в  и несущего ген резистентности, экспрессирующийся в  (Hillemann et al., 1991).
8.1.1 Конструирование плазмиды pVRC1303
Плазмиду pVRC1303 конструировали после 4 принципиальных стадий клонирования, описанных на Фиг. 9, исходя:
E. coli
E. coli
Streptomyces
- из вектора pDH5, несущего сайт начала репликации, являющийся функциональным в , ген резистентности к ампициллину, экспрессирующийся в , и ген резистентности к тиострептону и к нозигептиду, экспрессирующийся в  (Hillemann et al., 1991).
- из плазмиды pVRC409 (Blanc et al., 1994) для получения фрагмента BsiWI-PstI размером 2,5 т.п.н., содержащего часть генов кластера пристинамицина, расположенных ниже гена рарМ.
- из плазмиды pVRC900 (Blanc et al., 1994; Blan et al., 1997) для получения фрагмента PvuII-PvuII размером 3,3 т.п.н., содержащего часть генов кластера пристинамицина, расположенных выше гена рарМ.
E. coli
Streptomyces
- из плазмид pHP45Ω-Km (Fellay et al., 1987) и pIJ702 (Hopwood et al., 1985) для получения, после промежуточной стадии клонирования, фрагмента EcoRI-EcoRI размером 3,7 т.п.н., несущего в основном ген резистентности к канамицину, экспрессирующийся в и в . Эту кассета Ω-Km, несущую ген резистентности к канамицину, встраивают между участками, расположенными выше и ниже гена рарМ, клонированными в pVRC1303, вместо недостающего гена рарМ (Фиг. 9).
E. coli
Все стадии, необходимые для клонирования (выделение плазмидной ДНК, расщепление плазмидной ДНК рестрикционным ферментом, заполнение 5'-концов путем обработки ферментом Кленова, миграция и анализ ферментативных расщеплений электрофорезом на геле агарозы, получение фрагментов ДНК после миграции в электрофорезе, реакции лигирования, трансформация , отбор и анализ рекомбинантных клонов) были выполнены в соответствии со стандартными прописями, описанными Sambrook et al. (1989).
S. pristinaespiralis
8.1.2. Конструирование рекомбинантных штаммов , в которых разрушен ген рарМ, путем гомологичной рекомбинации с плазмидой pVRC1303.
Рекомбинантные штаммы были выделены после трансформации штамма SP213 плазмидой pVRC1303.
Получение протопластов этих штаммов и их трансформация с помощью метода, в котором используют ПЭГ, были осуществлены, как описано в Hopwood et al. (1985). После трансформации с помощью pVRC1303, 5 раз по 1 мкг, протопласты помещают на среду R2YE (Hopwood et al., 1985) и отбирают после регенерации в течение ночи путем нанесения слоя из 3 мл среды SNA, содержащей 10 мкг/мл канамицина.
За 5 осуществленных трансформаций были отобраны 37 клонов, резистентных к канамицину. Эти рекомбинанты могут происходить:
- либо из встраивания в хромосому плазмиды pVRC1303 вследствие простого события гомологичной рекомбинации между хромосомными и плазмидными участками, расположенными выше или ниже гена рарМ (случай простого кроссинговера),
- либо из обмена между плазмидной кассетой Ω-Km, несущей ген резистентности к канамицину, и хромосомным геном рарМ вследствие двойного события гомологичной рекомбинации между хромосомными и плазмидными участками, расположенными выше или ниже гена рарМ (случай двойного кроссинговера, представленный на Фиг. 10).
В обоих случаях кассета Ω-Km переносится на хромосому рекомбинантного штамма и придает ему резистентность к канамицину. Однако только в случае простого кроссинговера ген, пристутствующий в плазмиде pVRC1303 (Фиг. 9) переносится на хромосому рекомбинантного штамма и придает ему резистентность к тиострептону и к нозигептиду (Hillemann et al., 1991). Таким образом, эти два случая кроссинговера можно различить на основании анализа фенотипа по признаку резистентности или чувствительности к нозигептиду.
R
S
Для этого рекомбинантные клоны, полученные в результате 5 трансформаций с помощью pVRC1303 и отобранные на основании их резистентности к 10 мкг/мл канамицина, как было описано выше, пересеивали в форме бляшек на среду НТ (Hopwood et al., 1985), содержащую 10 мкг/мл канамицина, затем тестировали на среде НТ, содержащей 400 мкг/мл нозигептида. Отбирали только клоны, имеющие фенотип (Kana, Nosi), поскольку они соответствуют искомому случаю двойного кроссинговера. Эти рекомбинантные клоны затем очищали следующим образом: после помещения на среду НТ, содержащую 10 мкг/мл канамицина, и роста на ней готовили, согласно методу Hopwood et al. (1985), запас спор этих клонов, которые разводили, затем помещали на ту же среду для получения изолированных колоний. Эти колонии составляют чистые субклоны отобранных клонов. Таким образом анализировали 2 субклона, происходящих от 5 различных клонов.
32
Для проверки хромосомной структуры этих субклонов после их культивирования в жидкой среде YEME, содержащей 10 мкг/мл канамицина, их геномную ДНК экстрагировали согласно методике лизиса с помощью лизоцима и экстракции с помощью смеси фенол/хлороформ, описанной Hopwood et al. (1985). Готовили несколько Southern'ов общей ДНК этих различных клонов, расщепленной с помощью EcoRI и SphI, которую гибридизировали с плазмидой pVRC1303, линеаризированной с помощью EcoRI, и использовали в качестве зонда после мечения рандом-праймингом, полученным с использованием (α-Р)dCTP и набора для мечения (Random primed DNA labeling kit), выпускаемого компанией Amersham. Использовали методы, описанные Sambrook et al. (1989). Результаты гибридизации ясно показывают, что субклоны были получены в результате двойного кроссинговера между вектором pVRC1303 и хромосомой штамма SP213, описанного на фигуре 10. Проверяли, в частности, присутствие в этих субклонах фрагмента EcoRI размером 9,9 т.п.н., гибридизующегося с зондом, который отсутствует в штамме SP213 дикого типа, где размер гибридизующегося фрагмента EcoRI составляет 6,8 т.п.н.
Один из клонов, имеющих генотип SP213ΔрарМ :: Ω kanaR, был назван SP216. Этот клон был отобран для анализа его продукции и для продолжения генного конструирования с целью получить рекомбинантные штаммы, в которых ген рарМ дикого типа заменен одним из мутантных или двойных мутантных аллелей гена рарМ, описанных в предыдущих примерах.
8.2. Продукция пристинамицина мутантом SP216
S. pristinaespiralis
Этот пример иллюстрирует определение того, что мутант  SP216, в котором разрушен ген рарМ, продуцирует главным образом PI NH2 [4ξ-амино-дес(4ξ-диметиламино)пристинамицин IA] в стандартных условиях ферментации. Структура PINH2 показана на фигуре 2.
4
2
4
2
4
4
2
3
Мутант SP216, также как контрольный штамм дикого типа SP213, культивировали в жидкой среде для продуцирования. Ферментацию осуществляли следующим образом: 0,5 мл суспензии спор вышеуказанного штамма добавляли в стерильных условиях к 40 мл среды инокулум в гнутый эрлен емкостью 300 мл. Среда инокулум состоит из 10 г/л Corn Steep, 15 г/л сахарозы, 10 г/л (NH)SO, 1 г/л KHPO, 3 г/л NaCl, 0,2 г/л MgSO.7HO и 1,25 г/л CaCO. рН доводят до 6,9 с помощью гидроксида натрия, после чего вводят карбонат кальция. Эрлены взбалтывают в течение 44 ч при 27°С на ротационном взбалтывателе при скорости вращения 325 об./мин. Добавляют в стерильных условиях 2,5 мл вышеописанной культуры, прошедшей 44-часовое созревание, к 30 мл среды для продуцирования в эрлен емкостью 300 мл. Среда для продуцирования состоит из 25 г/л соевой муки, 7,5 г/л крахмала, 22,5 г/л глюкозы, 3,5 г/л фуражных дрожжей, 0,5 г/л сульфата цинка и 6 г/л карбоната кальция. рН доводят до 6,0 с помощью соляной кислоты, после чего вводят карбонат кальция.
2
4
3
4
Эрлены взбалтывают в течение 50 ч при 27°С. Сразу после завершения ферментации измеряют объем сусла и добавляют два объема мобильной фазы, состоящей из 34% ацетонитрила и 66% раствора 0,1 М KHPO (с рН 2,9, установленным с помощью концентрированной HPO), что позволяет осуществить экстракцию пристинамицинов. После взбалтывания среду фильтруют; пристинамицины при этом находятся в супернатанте. Их измеряют ВЭЖХ, вводя 150 мкл супернатанта, полученного при центрифугировании, в колонку Nucléosil 5-C8 размером 4,6 × 150 мм, используя в качестве элюента смесь 40% ацетонитрила и 60% фосфатного буфера 0,1 М рН 2,9. Пристинамицины детектируют по поглощению УФ при 206 нм и, в случае необходимости, по флуоресцентному испусканию (фильтр 370 нм, возбуждение при 306 нм). Продукция пристинамицинов представлена в таблице 8.
Таблица 8Уровень продукции (мг/л) PINH2 штаммами SP213 и SP216
Штамм
PINH2
SP213 (papM wt)
<0,1
SP216 (ΔpapM :: Ω kanaR)
7
Эти результаты показывают, что в использованных условиях ферментации мутант SP216 продуцирует в основном PINH2, в то время, как контрольный штамм SP213 продуцирует стандартные количества PI, где основным является PIA.
S. pristinaespiralis
Пример 9: конструирование рекомбинантных штаммов , содержащих ген рарМ аллель 49/66 или ген рарМ аллель 66.
S. pristinaespiralis
Этот пример иллюстрирует способность рекомбинантных штаммов , мутантных по гену рарМ, продуцировать соединение семейства PI, а именно PIB (Фиг. 2). PIB синтезируется естественным образом штаммами, имеющими ген рарМ дикого типа, но в очень малых количествах, составляющих приблизительно 5% максимум. Эти штаммы представляют собой, таким образом, путь доступа к PIB, продуцируемому в больших количествах и очень специфическим образом.
9.1. Конструирование рекомбинантных штаммов, мутантных по гену рарМ
S. pristinaespiralis
Мутантный ген рарМ 49/66 вводили в вышеописанный штамм  SP92, продуцирующий смесь PI и PII (Blanc et al, 1994) и в штамм SP213, происходящий от SP92 вследствие химического мутагенеза; штамм SP213 специфически продуцирует PI.
Мутантный ген рарМ 66 вводили в штамм SP213, являющийся производным штамма SP92.
Стратегия конструирования рекомбинантных штаммов, несущих один из мутантных аллелей гена рарМ, является одинаковой вне зависимости от типа мутации аллеля гена рарМ (49/66 или 66) и от выбранного штамма. Она состоит в трансформации рекомбинантных штаммов, в которых ген рарМ дикого типа был разрушен и заменен кассетой Ω-Km (см. пример 8), с помощью суицидной плазмиды, позволяющей осуществить замену этой кассеты на один из мутантных аллелей гена рарМ.
E. coli
Streptomyces
В качестве иллюстрации ниже представлено детальное описание введения мутантного аллеля 49/66 гена рарМ в штамм SP216 (получение штамма SP216 описано в примере 8). Эту конструкцию получают с помощью плазмиды pVRC1306 (см. фиг. 11), происходящей от суицидного вектораpDH5, способной реплицироваться только в  и несущей ген резистентности к тиострептону или к нозигептиду, экспрессируемый в (Hillemann et al., 1991).
В примере 9.2 указаны результаты продукции пристинамицинов, полученных с помощью нескольких рекомбинантных штаммов, являющихся производными штамма SP92 или SP213 и экспрессирующих либо мутантный ген рарМ 66, либо мутантный ген рарМ 49/66.
9.1.1. Конструирование плазмиды pVRC1306
Плазмиду pVRC1306, несущую ген рарМ аллель 49/66, сконструировали на основе плазмиды pVRC1303, имеющей делецию гена рарМ. Это конструирование осуществляют в три стадии, как описано на фигуре 11. Для этих клонирований были использованы следующие плазмиды:
E. coli
- плазмида pBR322 представляет собой вектор клонирования в , который был использован в качестве промежуточного вектора для переноса фрагмента EcoRI размером 8,9 т.п.н. плазмиды pVRC1303, описанного в примере 8.1.1 и содержащего, в числе прочего, ген рарМ, делетированный с помощью кассеты W-Km, несущей ген резистентности к канамицину. Клонирование осуществляли на уровне сайта EcoRI плазмиды pBR322; полученная плазмида получила наименование pVRC1304.
- плазмиду pVRC721, описанную в примере 6 (Фиг. 6), использовали для получения вставки MluI/AgeI размером 1 т.п.н., содержащего ген рарМ аллель 49/66. Эту вставку потом заменяли фрагментом MluI/AgeI размером 4 т.п.н. плазмиды pVRC1304, и полученная плазмида получила наименование pVRC1305.
- плазмида pVRC1303 позволила заменить фрагмент EcoRI размером 8,9 т.п.н. фрагментом EcoRI размером 5,83 т.п.н. плазмиды pVRC1305, содержащим ген рарМ аллель 49/66.
Конечная плазмида pVRC1306 (Фиг. 11) содержит, таким образом, ген рарМ аллель 49/66, а также участки выше и ниже этого гена, и всю эту комбинацию клонируют в векторе pDH5, описанном в примере 8.1.1.
S. pristinaespiralis
9.1.2. Конструирование рекомбинантных штаммов , мутантных по гену рарМ аллель 49/66, путем гомологичной рекомбинации с плазмидой pVRC1306
R
R
R
R
S
S
Рекомбинантные штаммы были изолированы после трансформации штамма SP216, описанного в примере 8, плазмидой pVRC1306. Для этого необходимы две стадии. Первая стадия заключается в отборе на основании анализа фенотипа (Kana, Nosi) штамма, полученного врезультате простой гомологичной рекомбинации между хромосомными и плазмидными участками, расположенными выше гена рарМ (Фиг. 12). Вторая стадия заключается в отборе из штамма (Kana, Nosi) второго случая гомологичной рекомбинации на основании анализа фенотипа (Kana, Nosi) полученных клонов (Фиг. 13).
Проведение этих двух стадий описано ниже.
Получение протопластов этих штаммов и их трансформация способом с использованием ПЭГ осуществляли как описано Hopwood et al. (1985). Проводили 10 независимых трансформаций, каждую с помощью 1 мкг pVRC1306. Протопласты помещают на среду R2YE (Hopwood et al., 1985) и после одной ночи регенерации проводят отбор путем нанесения сверху дополнительного слоя из 3 мл среды SNA, содержащей 400 мкг/мл нозигептида.
R
R
На 10 проведенных трансформаций были отобраны 7 клонов, резистентных к нозигептиду (Hillemqnn et al., 1991). Эти рекомбинанты получаются в результате встраивания в хромосому плазмиды pVRC1306 вследствие простого случая гомологичной рекомбинации между хромосомными и плазмидными участками, расположенными выше гена рарМ, что придает этим клонам двойную резистентность, одновременно к канамицину (в результате трансформации штамма) и к тиострептону (в результате рекомбинации с плазмидой). 7 рекомбинантных клонов пересеивают на среду НТ с 10 мкг/мл канамицина и на среду НТ с 400 мкг/мл нозигептида. Все клоны имеют ожидаемый фенотип (Kana, Nosi). Эти клоны дважды очищают согласно следующей методике: способом Hopwood et al. (1985) получают запас спор этих клонов и, после помещения различных разведений этого запаса на среде НТ, содержащей 400 мкг/мл нозигептида, получают изолированные колонии. Эти колонии составляют чистые субклоны отобранных клонов. Хромосомную структуру двух субклонов, полученных из двух клонов, анализирвовали методом Southern Blot.
После культивирования в жидкой среде YEME, содержащей 4 мкг/мл нозигептида, экстрагировали геномную ДНК. ДНК экстрагировали обработкой лизоцимом и экстракцией смесью фенол/хлороформ согласно технологии, описанной Hopwood et al. (1985). Несколько Southern'ов проводили с общей ДНК этих различных субклонов, расщепленной рестрикционными ферментами EcoRI и AseI. Фрагмент размером 8,9 т.п.н., полученный из pVRC1303, расщепленный EcoRI, использовали в качестве зонда после мечения рандом-праймингом, полученным с использованием (α -32Р) dCTP и набора для мечения (Random primed DNA labeling kit), выпускаемого компанией Amersham. Используют способы, описанные Sambrook et al. (1989). Результаты гибридизации (полосы, соответствующие 6,83, 3,42, 3,125 и 2,06 т.п.н.) ясно показывают, что субклоны были получены в результате простого кроссинговера между вектором pVRC1306 и хромосомой штамма SP216. ДНК штамма SP216 дает полосы, соответствующие 4,42, 3,125 и 2,06 т.п.н. но не дает полосу, соответствующую 6,83 т.п.н.
Один из этих клонов получил обозначение SP216::pVRC1306.
S
S
Вторая стадия заключается в отборе второго случая гомологичной рекомбинации между хромосомными и плазмидными участками, расположенными ниже гена рарМ из штамма SP216::pVRC1306 (Фиг. 13). Эта стадия приводит к отбору рекомбинантных клонов, в которых делетированный ген заменен с помощью кассеты Ω-Km на ген рарМ аллель 49/66; ожидаемым фенотипом рекомбинантных клонов является (Kana, Nosi).
Исходя из клона SP216::pVRC1306 2 цикла роста были осуществлены при 30°С на ротационном взбалтывателе при скорости вращения 325 об./мин для достижения второго случая рекомбинации. Первый цикл проводили с 200 мкл запаса спор SP216::pVRC1306 в 10 мл среды YEME (условия культивирования: 30°С, 280 об./мин, 72 ч), второй цикл проводили с 800 мкл суспензии из первого цикла в 40 мл среды YEME(условия культивирования: 30°С, 280 об./мин, 72 ч). Вторую культуру центрифугировали 15 минут при 3500 об./мин, осадок помещали в 600 мкл воды + Tween 0,01% и эту суспензию помещали на среду НТ для получения слоя спор. Для очистки рекомбинантных клонов, полученных из этой жидкой культуры, споры собирают и разведения суспензии этих спор помещают на среду НТ, в результате чего получают изолированные колонии.
S
S
S
S
S
Для отбора клонов, имеющих желаемый фенотип (Kana, Nosi), 1000 изолированных колоний пересеивают и подвергают скринигу. Эти колонии пересеивают автоматически на среду НТ без антибиотиков и на среду НТ с 10 мкг/мл канамицина. Эта первая стадия позволила отобрать 18 рекомбинантных клонов Kana. Из среды НТ без антибиотиков эти 18 клонов вручную пересеивали на среду НТ без антибиотиков, на среду НТ с 10 мкг/мл канамицина и на среду НТ с 400 мкг/мл нозигептида. Три рекомбинантных клона, имеющих фенотип (Kana, Nosi), были отобраны как потенциально полученные в результате двойного кроссинговера. Эти клоны очищали, из слоя спор создавали запас спор и проводили геномный анализ; использованные методы описаны выше.
Хромосомный анализ рекомбинантных субклонов проводили в две стадии: первая стадия заключается в проверке присутствия гена рарМ аллель 49/66 и отсутствия изменений в хромосомных участках выше и ниже этого гена. Вторая стадия заключается в проверке отсутствия фрагмента ДНК, соответствующего кассете W-Km и плазмиде pDH5.
Для проведения первой стадии получают описанными выше способами препараты геномной ДНК рекомбинантных клонов и проводят анализы общей ДНК методом Southern Blot. Общую ДНК расщепляют рестрикционными ферментами EcoRI и AseI. Плазмиду pVRC721 расщепляют с помощью MluI (вставка размером 1,7 т.п.н., содержащая ген рарМ аллель 49/66). Этот франмент метят и используют в качестве зонда, гибридизующегося с фрагментом, соответствующем полосе 6,83 т.п.н.
С другой стороны, общую ДНК расщепляют с помощью SalI. Меченые фрагменты, полученные из pVRC409 и pVRC803 (содержащие участки выше и ниже гена рарМ штамма SP213, Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997), используют в качестве зонда. Эти фрагменты позволили выявить, после гибридизации, 7 полос (2,45, 0,190, 2,150, 0,725, 1,55, 0,4 и 0,55 т.п.н.).
Вторая стадия заключается в проверке исчезновения фрагмента ДНК, соответствующего кассете Ω-Km или плазмиде pDH5. Общую ДНК расщепляют с помощью EcoRI и AseI. Фрагмент HindIII плазмиды pHP45 Ω-Km (Fellay et al., 1987) размером 2,2 т.п.н. (кассета Ω-Km), а также pDH5 используют в качестве зонда.
Все три рекомбинантных клона имеют хромосомный профиль (Фиг. 13), подтверждающий присутствие гена рарМ аллель 49/66 и отсутствие генарезистентности к канамицину, а также фрагмента, соответствующего плазмиде pDH5. Эти элементы указывают на то, что геномное окружение гена рарМ аллель 49/66 осталось интактным. Один клон был сохранен и получил обозначение SP217.
S. pristinaespiralis
Таким же образом были сконструированы другие штаммы , содержащие мутантные аллели 49/66 гена рарМ или аллель 66 гена рарМ. Этими штаммами были:
- SP101, полученный трансформацией штамма SP92 с помощью плазмиды pVRC1306, несущей мутантный аллель 49/66 гена рарМ;
- SP218, полученный трансформацией штамма SP216 с помощью плазмиды, эквивалентной плазмиде pVRC1306, но в которой мутантный аллель 49/66 гена рарМ был заменен мутантным аллелем 66 гена рарМ.
S. pristinaespiralis
9.2. Продукция пристинамицинов штаммами  SP213, SP217, SP218, SP100 и SP101
Этот пример показывает продукцию пристинамицинов различными мутантами. Он, в частности, иллюстрирует увеличение продукции PIB мутантами рарМ с мутантными аллелями 49/66 (штамм SP217) и мутантами рарМ с мутантными аллелями 66 (штамм SP218) по сравнению с контрольным штаммом рарМ wt (штамм SP213). Действие мутантного аллеля 49/66 гена рарМ (штамм SP101) также сравнивали с контрольным штаммом с геном рарМ wt (штамм SP92).
Методы продуцирования, экстракции и количественного измерения пристинамицинов идентичны использованным в примере 8.2.
Уровни продукции различных пристинамицинов, выраженные по отношению к уровню PIA контрольных штаммов (SP213 и SP92) представлены в таблице 9.
Таблица 9Продукция пристинамицинов PI в случае различных штаммов <i>S. pristinaespiralis</i>. Значения продуцированных PI представлены в мг/л.
Штамм
PIA
PIB
PINH2
Прочие PI
SP213 (papM wt)
474
39
0
25
SP217 (papM 49/66)
0
162
57
19
SP218 (papM 66)
19
271
14
32
Штамм
PIA
PIB
SP92 (papM wt)
100
3
SP101 (papM 66)
0
11
S. pristinaespiralis
Эти результаты подтверждают, что гены, экспрессирующие варианты полипептида рарМ согласно изобретению, сообщают штаммам  превосходную избирательность в отношении продукции PIB.