Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенному спейсеру для детекции патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus
SET OF OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDE PRIMERS AND A FLUORESCENTLY LABELED PROBE FOR THE 5.8S-25S RIBOSOMAL RNA GENE FRAGMENT AND AN INTERGENIC SPACER FOR THE DETECTION OF PATHOGENIC FUNGI OF CATS AND DOGS OF THE GENUS CRYPTOCOCCUS

Область техники, к которой относится изобретение:
Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора праймеров для выявления генетического материала (ДНК) фрагментов генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера для детекции патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала (ДНК) фрагментов генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера для детекции патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагменты генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера для детекции патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus, что позволяет выявлять животных, инфицированных любым видом грибков рода Cryptococcus на любых стадиях заболевания.
Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала (ДНК) фрагментов генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера для детекции патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств патогенных патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus, и может быть использовано в ветеринарии.
Криптококкоз - системная грибковая инфекция, встречающаяся во всем мире. Обычно поражает носовую полость, ткани вокруг носа или легкие. Она может распространяться на другие органы, чаще всего на кожу, глаза или центральную нервную систему.
Этой болезнью страдают самые разнообразные виды млекопитающих. Среди домашних животных чаще всего заболевают кошки, у которых это самая распространенная системная грибковая инфекция.
Криптококкоз вызывается преимущественно Cryptococcus neoformans и Cryptococcus gattii - сапрофитными круглыми дрожжеподобными микроорганизмами. Источниками инфицирования этими дрожжами могут стать выделения птиц, почва и фрукты. Виды рода Cryptococcus сохраняют жизнеспособность в фекалиях до двух лет.
Инфекция не передается при прямом контакте, а только при вдыхании микроорганизма из почвы или фекалий. Cryptococcus neoformans var. gattii обнаруживается преимущественно в тропических и субтропических областях из-за очень специфического местообитания на эвкалиптовых деревьях.
Болезнь поражает четыре группы органов: дыхательный тракт, центральную нервную систему, глаза и кожу. Следовательно, клинические признаки зависят от пораженных систем.
Инфекции органов дыхания (более чем в 80% случаев) характеризуются чиханием, истечениями из носа (гнойными, кровянистыми или прозрачными), припухлостью под кожей в области носа, поражениями ротовой полости и увеличением лимфатических узлов.
Неврологические симптомы варьируют в зависимости от локализации поражения и могут включать угнетение, плохую координацию движений, судороги, частичный паралич и слепоту.
При поражении глаз страдают преимущественно сетчатка, сосудистая оболочка и зрительный нерв. Клинические признаки варьируют от расширенных не реагирующих на свет зрачков и слепоты до хориоретинита, переднего увеита и повреждения сетчатки. Прогноз выживания при глазной форме криптококкоза при лечении триазоловыми противогрибковыми препаратами от удовлетворительного до хорошего. Однако прогноз восстановления зрения (из-за повреждения сетчатки) может варьировать от осторожного до неблагоприятного.
Повреждения кожи отмечаются приблизительно у 45% инфицированных животных и часто возникают одновременно с инфицированием других органов. Более вероятно, что поражения кожи обусловлены распространением инфекции на кожу. К более редким симптомам криптококкоза относятся разрушение костей, хронический кашель и почечная недостаточность.
Собаки инфицируются C. neoformans гораздо реже кошек (вероятность инфицирования ниже в 7 - 10 раз). Средний возраст инфицированных собак составляет 3,5 года и, в отличие от кошек, у них нет половой предрасположенности. Чаще всего заболевают такие породы, как американский кокер-спаниель и лабрадор-ретривер (в Северной Америке), доберман-пинчер и дог (в Австралии). У собак криптококкозом поражаются те же четыре системы органов, что и у кошек, однако у собак чаще страдает ЦНС и глаза. Клинические признаки сходны с таковыми у кошек, кроме лихорадки (39,4 - 40,5°С), которая у собак встречается чаще (25% случаев).
Криптококкоз - заболевание, сложно поддающееся лечению как у собак, так и у кошек. Обычно оно требует длительной терапии и последующего наблюдения. Дифференциальную диагностику у кошек проводят с хроническим ринитом, лимфосаркомой, токсоплазмозом, инфекционным перитонитом, гранулематозным менингоэнцефалитом, внутричерепными новообразованиями и другими системными микозами. Поражения кожи дифференцируют с абсцессами и другими бактериальными болезнями. Гемограмма и биохимический состав сыворотки крови при криптококкозе обычно нормальные. В моче может обнаруживаться криптококк, если он диссеминирован и в процесс вовлечены почки.
Предварительный диагноз можно установить в случае положительного результата реакции агглютинации с капсульным антигеном криптококка в крови, спинномозговой жидкости или моче. Отрицательный результат реакции не снимает диагноз криптококкоза, особенно в случае локализованного заболевания.
При цитологическом исследовании можно выявить клетки криптококка в мазках отделяемого из носа, соскобах изъязвлений кожи или биоптате. При микроскопировании пользуются тушью, метиленовым синим, окраской по Граму. Для установления диагноза достаточно обнаружения характерных дрожжеподобных почкующихся клеток с крупными капсулами.
Самым быстрым и практичным способом диагностики инфекции Cryptococcus spp. являются лабораторные ПЦР исследования истечений из носа и мочи.
Уровень техники:
При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для диагностики ДНК фрагментов генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus был проведен сравнительный анализ структуры сиквенсов фрагментов генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus, размещенных на web-ресурсе NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).
Амплифицируемый участок ДНК, являясь маркерным, позволяет выявить возбудителя в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к ДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.
При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.
Раскрытие сущности изобретения:
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени ДНК фрагментов генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера для детекции патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время патогенным грибкам кошек и собак рода Cryptococcus, что повышает достоверность и надежность анализов.
Указанный технический результат достигается разработкой набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции ДНК фрагментов генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus, содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Последовательности олигонуклеотидов к фрагментам генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus.
Прямой праймер (Forward primer)
VT-CС-F 5'- CCTGTTGGACTTGGATTTGG -3'
Обратный (Reverse primer)
'
VT-CС-R 5'- CAGGCASATCATTTAATG -3
Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'
VT-CС-P 5'- (R6G)-CGCGATCATTACGCCGGGCTGACAGGT- (BHQ2) -3'
Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда
Показатель
VT-CС-F
VT-CС-R
Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CС-P
Структура от 5' к 3’
CCTGTTGGACTTGGATTTGG
CAGGCASATCATTTAATG
(R6G)-CGCGATCATTACGCCGGGCTGACAGGT-(BHQ2)
Длина, нуклеотиды
20
18
27
Т отжига с учетом Т плавления, °C
58
58
74
GC состав, %
50
39
63
Т работы фермента, °C
56,2
56,1
61,7
Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus, по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время патогенным грибкам кошек и собак рода Cryptococcus, что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus.
Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуорсцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце ДНК фргаменты генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств вируса. Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.
Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.
Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущими типоспецифические фргаменты генов 5.8S-25S рибосомальной РНК и межгенного спейсера патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus.
Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.
Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.
Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.
2
Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).
Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку):
Компонент
Объем на 1 реакцию (20 мкл), мкл
ПЦР-буфер ×10
2,5
дНТФ (25 мМ)
0,2
MgCl<sub>2</sub> (50 мМ)
1
Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл)
0.5
Прямой праймер - VT-CC-F (10 пмоль/мкл)
1
Обратный праймер - VT-CC-R (10 пмоль/мкл)
1
Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CC-P (5 пмоль/мкл)
1
Образец (проба с ДНК)
5
diH<sub>2</sub>O (бидистилированная)
6
Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦР
Этап
Т, °С
Время, сек.
Количество повторов
Амплификатор планшетного типа
Амплификатор роторного типа
Начальная денатурация
95
300
300
1
Денатурация
95
10
10
45 циклов с флуоресцентной детекцией
Отжиг
58
25 измерение
25 измерение
Элонгация
72
25
40
Хранение
4
∞
∞
Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «Rotor Gene Q» (QIAGEN, ФРГ).
-1
-5
Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10 до 10. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.
Специфичность разработанного способа проверяли на образцах патогенных грибков кошек и собак рода Cryptococcus, а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении представителей рода Cryptococcus.