КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ КАЛЬЦИФИКАЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PATHOLOGICAL CONDITIONS OF CALCIFICATION AND THEIR APPLICATION METHODS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке по 35 U.S.C. 119(e) испрашивается приоритет Предварительной патентной заявки США No. 62/163500, поданной 19 мая 2015 г., полное содержание которой, таким образом, приведено путем ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Генерализованная инфантильная артериальная кальцификация (GACI) представляет собой крайне редкое неонатальное заболевание, характеризующееся началом у грудных детей распространенной артериальной кальцификации в сосудах большого и среднего размера, приводящей к сердечно-сосудистой недостаточности и гибели в неонатальном периоде. Заболевание проявляется клинически сердечной недостаточностью, дыхательной недостаточностью, гипертензией, цианозом и кардиомегалией. Прогноз является неблагоприятным, с более ранними сообщениями об уровне смертности 85% в течение шести месяцев, в то время как с недавнего времени интенсивное лечение бисфосфонатами снизило смертность до 55% в течение шести месяцев. Сдерживающими этот очевидный прогресс являются тяжелая токсичность для скелета, ассоциированная с длительным применением этидроната у пациентов с GACI, наблюдение, что ограниченность доступных данных затрудняет определение того, является ли лечение бисфосфонатом действительно защитным или отражает естественное течение заболевания у менее пораженных пациентов, и неэффективность бисфосфонатов для предотвращения смертности у некоторых пациентов даже при раннем введении.
abcc6
abcc6
Общая заболеваемость GACI является редкой, с 200 опубликованными случаями в медицинской литературе и частотой заболевания один на 391000. Хотя заболевание впервые описано Bryant and White в 1901 г., не было отмечено до 2000 г., когда это отметили Rutsch и соавторы, что уровни PPi в сыворотке и ферментативная активность ENPP1 значительно уменьшены у пациентов с GACI. ENPP1 (известная также как NPP1 или PC-1) является членом семейства ферментов пирофосфатаз/фосфодиэстераз эктонуклеотидов (известных также как ENPP или NPP), которые характеризуются фосфодиэстеразной активностью, и представляют собой связанный с мембраной внеклеточный гликопротеин типа II, локализованный на везикулах накапливающего минералы матрикса остеобластов и хондроцитов, так же, как на поверхности сосудов капилляров головного мозга. ENPP1 катаболизирует деградацию внеклеточного АТФ до АМФ и PPi. PPi ингибирует эктопическую минерализацию тканей, предположительно, посредством занятия некоторых из участков Pi на поверхности возникающих или растущих кристаллов гидроксиапатита (HA), таким образом, создавая неоднородности, замедляющие или прекращающие распространение роста кристаллов. Инактивирующие мутации в ENPP1 насчитываются у 75% пациентов с GACI, и значительная доля оставшихся пациентов заболевает в результате инактивирующих мутаций в АТФ-зависимом мембранном транспортере MRP6, кодируемом геном . Мутации в  связаны с уменьшенными внеклеточными концентрациями нуклеозидтрифосфатов, таким образом, ограничивая осуществляемый ENPP1 метаболизм АТФ до внеклеточного PPi.
Почки являются неотъемлемой составляющей поддержания нормального метаболизма костей и минеральных веществ, включая выведение фосфата. Пациенты с почечной недостаточностью являются неспособными правильно регулировать равновесие минеральных веществ в сыворотке и проявляют тенденцию сохранять фосфат, абсорбированный из различных компонентов диеты. Высокий уровень фосфата в сыворотке ассоциирован с избыточной секрецией паратиреоидного гормона и тенденцией к кальцификации мягких тканей, включая кровеносные сосуды.
У пациентов с почечной недостаточностью может происходить избыточное удаление анионов фосфата и пирофосфата в ходе гемодиализа или перитонеального диализа. Истощение этих анионов в тканях и плазме приводит к нарушению метаболизма костей и минеральных веществ, включая остеомаляцию и кальцификацию мягких тканей и заболевания костей. Недостаточность пирофосфата может являться фактором риска для отложения кальция в малых сосудах кожи, вызывающего воспалительный васкулит, называемый кальцифилаксией, который может приводить к гангрене кожи и нижележащих тканей, приводящим к тяжелой, хронической боли. Кальцифилаксия может требовать ампутации пораженной конечности и обычно является смертельной, при отсутствии лечения для такого состояния. Эктопическая кальцификация, если ее оставлять без лечения, приводит к увеличению заболеваемости и смертности. Являются важными регуляция количества пирофосфата в системе и уменьшение встречаемости кальцифилаксии у пациентов.
В 2003 г., 19,5 миллионов взрослых в США страдали хронической почечной недостаточностью (CKD), и 13,6 миллионов имели стадию 2-5 CKD, как определено Национальным почечным фондом США /Инициативной группой по качеству лечения и исходам заболеваний почек (NKFK/DOQI). Неблагоприятные исходы хронической почечной недостаточности часто можно предотвращать или задерживать посредством ранней детекции и лечения.
Преобладание почечной недостаточности на конечной стадии (ESRD) увеличивается с пугающей скоростью. В 2000 г. заболевание почек на конечной стадии развилось у более 90000 людей в США. Популяция пациентов на диализной терапии или с необходимостью трансплантации составляла 380000 в 2003 г. и стала составлять 651000 пациентов в 2010 г. На уход за пациентами с ESRD уже затрачено более $18 миллиардов в год в США, значительная нагрузка на систему здравоохранения.
Кальцифицирующая уремическая артериолопатия (известная также как CUA) представляет собой смертельное заболевание, наблюдаемое у пациентов с хронической почечной недостаточностью (CKD), подвергаемых диализу. Кальцификация малых артерий приводит к ишемии ткани и кожи, инфаркту и тромбозу, со смертностью пациента, близкой к 80%. В настоящее время существует 450000 пациентов, подвергаемых диализу в США, подверженных риску получения CUA, и не существует одобренных FDA видов лечения этого заболевания. CUA обладает отличительными признаками, напоминающими GACI и другие кальцификационные нарушения, обладающие низкими уровнями PPi и высокими уровнями фактора роста фибробластов 23 (или FGF23). У пациентов с ESRD, требующих диализа, этот процесс кальцификации дополнительно усиливается, со средней ожидаемой продолжительностью жизни 5-6 лет.
abcc6
Эластическая псевдоксантома (PXE) представляет собой наследственное нарушение, характеризуемое минерализацией эластических волокон в коже, артериях и в сетчатке, что приводит к очагам в коже с ассоциированной дряблостью и потерей эластичности, артериальной недостаточности, сердечно-сосудистым заболеваниям и ретинальным кровоизлияниям, приводящим к дегенерации желтого пятна. Мутации, ассоциированные с PXE, также локализованы в гене . Проявления на коже присутствуют среди наиболее общих характеристик PXE, однако, глазные и сердечно-сосудистые симптомы являются ответственными за тяжесть заболевания. Характерные повреждения кожи (желтоватые пузырьки и бляшки, и дряблость с потерей эластичности, как правило, наблюдаемые на лице, шее, в подмышечных впадинах, локтевых ямках, подколенных ямках, в паховой и околопупочной областях), как правило, являются ранним признаком PXE и возникают в результате минерализованных эластических волокон в средних слоях кожи и. Их обычно детектируют в детском или подростковом возрасте, и они прогрессируют медленно и часто непредсказуемо. Диагноз PXE можно подтверждать посредством биопсии кожи, который показывает кальцификацию фрагментированных эластических волокон в средних и нижних слоях кожи.
Общераспространенные сердечно-сосудистые осложнения PXE обусловлены присутствием аномальных кальцифицированных эластических волокон во внутренней эластической оболочке артерий среднего размера. Широкий спектр фенотипов включают преждевременные атеросклеротические изменения, фиброплазию интимы, вызывающую стенокардию или перемежающуюся хромоту, или и то, и другое, ранний инфаркт миокарда и гипертензию. Фиброзное утолщение эндокарда и атриовентрикулярных клапанов может также приводить к рестриктивной кардиомиопатии. Приблизительно у 10% пациентов с PXE развивается также желудочно-кишечное кровотечение и осложнения центральной нервной системы (такие как инсульт и деменция), как последствие системной минерализации стенок артерий. Кроме того, реноваскулярную гипертензию и аневризму межпредсердной перегородки можно наблюдать у пациентов с PXE.
Состояния, при которых уровни фосфата в сыворотке уменьшены или увеличены, обозначают как гипофосфатемию и гиперфосфатемию, соответственно. Гипофосфатемия, которая часто возникает в результате потери фосфата через почки, вызвана рядом генетических нарушений, включая X-сцепленный гипофосфатемический рахит (XLH), наследственный гипофосфатемический рахит с гиперкальциурией (HHRH), гипофосфатемическое заболевание костей (HBD) и аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR). Точные молекулярные механизмы, посредством которых поддерживаются надлежащие концентрации фосфата в сыворотке, плохо понятны, но является критическим поддержание уровней фосфата в сыворотке для облегчения симптомов вышеуказанных заболеваний.
Таким образом, в данной области существует необходимость в новых композициях и способах лечения заболеваний и нарушений, ассоциированных с патологической кальцификацией и/или патологическим окостенением. Такие композиции и способы не должны нежелательным образом затрагивать другие физиологические процессы. Настоящее изобретение удовлетворяет эту необходимость.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к соединению формулы (I), или его соли или сольвату. Изобретение, кроме того, относится к способу лечения или предотвращения заболевания или нарушения, ассоциированного с патологической кальцификацией или патологическим окостенением, у нуждающегося в этом субъекта. Изобретение, кроме того, относится к способу уменьшения или предотвращения кальцификации сердца, артериальной кальцификации и/или минерализации эластических волокон у грудного ребенка, пораженного по меньшей мере одним заболеванием или нарушением, выбранным из группы, состоящей из GACI и PXE.
n
n
n
n
m
m
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) представляет собой БЕЛОК-Z-ДОМЕН-X-Y (I), где в (I): БЕЛОК выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, и SEQ ID NO:24; ДОМЕН выбран из группы, состоящей домена Fc IgG человека (обозначаемого также как Fc), белка сывороточного альбумина человека (обозначаемого также как ALB) и его фрагмента; X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-20 аминокислот; и Y отсутствует или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (DSS)(SEQ ID NO:4), (ESS) (SEQ ID NO:5), (RQQ) (SEQ ID NO:6), (KR) (SEQ ID NO:7), R (SEQ ID NO:8), DSSSEEKFLRRIGRFG (SEQ ID NO:9), EEEEEEEPRGDT (SEQ ID NO:10), APWHLSSQYSRT (SEQ ID NO:11), STLPIPHEFSRE (SEQ ID NO:12), VTKHLNQISQSY (SEQ ID NO:13) и E (SEQ ID NO:14), где m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 15, и где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10.
В конкретных вариантах осуществления, ДОМЕН представляет собой Fc или его фрагмент. В других вариантах осуществления, ДОМЕН представляет собой ALB или его фрагмент.
В конкретных вариантах осуществления, Y отсутствует, и соединение лишено отрицательно заряженной нацеленной на кость последовательности.
В конкретных вариантах осуществления, БЕЛОК обладает мутацией по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, нуклеазный домен БЕЛКА или его мутанта отсутствует. В других вариантах осуществления, нуклеазный домен от приблизительно остатка 524 до приблизительно остатка 885, относительно SEQ ID NO:1, отсутствует в БЕЛКЕ или его мутанте. В других вариантах осуществления, фрагмент внеклеточной области NNP2, содержащий участок расщепления фурином или участок отщепления сигнального пептида, заменен или не заменен в БЕЛКЕ или его мутанте.
В конкретных вариантах осуществления, ДОМЕН представляет собой Fc или его фрагмент, и где БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:15)-Z-(Fc или его фрагмент), (SEQ ID NO:17)-Z-(Fc или его фрагмент), (SEQ ID NO:19)-Z-(Fc или его фрагмент), (SEQ ID NO:24)-Z-(Fc или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, (SEQ ID NO:24)-Z-(SEQ ID NO:26), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, ДОМЕН представляет собой ALB или его фрагмент, и где БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:15)-Z-(ALB или его фрагмент), (SEQ ID NO:17)-Z-(ALB или его фрагмент), (SEQ ID NO:19)-Z-(ALB или его фрагмент), (SEQ ID NO:24)-Z-(ALB или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:21, (SEQ ID N:17)-Z-(SEQ ID NO:27), SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:25, или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
k
k
кат.
кат.
-1
-1
В конкретных вариантах осуществления, соединение обладает значением , большим или равным приблизительно 3,4 (±0,4) с фермент, где  определяют посредством измерения скорости гидролиза АТФ соединением.
K
K
M
M
В конкретных вариантах осуществления, соединение обладает значением , меньшим или равным приблизительно 2 мкМ, где the  определяют посредством измерения скорости гидролиза АТФ соединением.
В конкретных вариантах осуществления, полипептид NPP1 представляет собой продукт расщепления предшественника полипептида NPP1, содержащего трансмембранный домен пирофосфат/фосфодиэстеразы-2 эктонуклеотидов (NPP2).
В конкретных вариантах осуществления, трансмембранный домен NPP2 представляет собой остатки 12-30 из номера доступа в NCBI NP_001124335 (SEQ ID NO:2), что соответствует SEQ ID NO:23.
В конкретных вариантах осуществления, способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения по изобретению.
В конкретных вариантах осуществления, заболевание включает по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из генерализованной инфантильной артериальной кальцификации (GACI), идиопатической инфантильной артериальной кальцификации (IIAC), окостенения задней продольной связки (OPLL), гипофосфатемического рахита, остеоартрита и кальцификации атеросклеротических бляшек.
В конкретных вариантах осуществления, заболевание включает по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из PXE, наследственных и ненаследственных форм остеоартрита, анкилозирующего спондилита, уплотнения артерий, возникающего с возрастом, кальцифилаксии в результате почечной недостаточности на конечной стадии и прогерии.
В конкретных вариантах осуществления, Y отсутствует, и соединение лишено отрицательно заряженной нацеленной на кость последовательности.
В конкретных вариантах осуществления, способ включает введение грудному ребенку терапевтически эффективного количества данного полипептида, содержащего полипептид пирофосфатазы/фосфодиэстеразы-1 эктонуклеотидов (NPP1) и домен Fc IgG, где данный полипептид лишен домена полиаспарагиновой кислоты, в результате чего введение данного полипептида увеличивает внеклеточные концентрации пирофосфата (PPi) у грудного ребенка.
В конкретных вариантах осуществления, способ включает введение грудному ребенку терапевтически эффективного количества данного полипептида, содержащего полипептид пирофосфатазы/фосфодиэстеразы-1 эктонуклеотидов (NPP1) и ALB, где данный полипептид лишен домена полиаспарагиновой кислоты, в результате чего введение данного полипептида увеличивает внеклеточные концентрации пирофосфата (PPi) у грудного ребенка.
В конкретных вариантах осуществления, введение представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из ингаляционного, перорального, назального, ректального, парентерального, подъязычного, чрескожного, трансмукозального (например, подъязычного, лингвального, (транс)буккального, (транс)уретрального, вагинального (например, транс- и перивагинального), (интра)назального, и (транс)ректального), внутрипузырного, внутрилегочного, интрадуоденального, внутрижелудочного, интратекального, подкожного, внутримышечного, внутрикожного, внутриартериального, внутривенного, внутрибронхиального, ингаляционного и местного. В других вариантах осуществления, введение является подкожным.
В конкретных вариантах осуществления, введение восстанавливает внеклеточные концентрации пирофосфата у грудного ребенка до уровня в пределах диапазона, обнаруженного у грудного ребенка, не пораженного GACI и/или PXE.
В конкретных вариантах осуществления, у грудного ребенка присутствуют проявления и/или диагноз «отсутствия прибавки массы тела» перед введением.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Следующее подробное описание иллюстративных вариантов осуществления изобретения будет более понятно при прочтении в совокупности с прилагаемыми чертежами. С целью иллюстрации изобретения, на чертежах показаны конкретные варианты осуществления. Следует понимать, однако, что это изобретение не является ограниченным точными компоновкой и техническими средствами из вариантов осуществления, показанных на чертежах.
ФИГ. 1A-1G содержат набор изображений и графиков, иллюстрирующих исследование естественного течения заболевания. ФИГ. 1A: Средняя ежесуточная масса пар сибсов ENPP1-asj/asj и ENPP1-WT с кормлением для ускорения роста. Ежесуточные массы мышей ENPP1-WT (бирюзовые квадраты) и ENPP1-asj/asj (зеленые круги) с кормлением для ускорения роста в течение периода 70 суток. Точка отсутствия прибавки массы тела отмечена в когорте ENPP1-asj/asj на сутки 26, когда массы стали отклоняться от ENPP1-WT. Смертельные события отмечены красными стрелками. ФИГ. 1B: Кривые выживаемости, исследование естественного течения заболевания. Средняя выживаемость ENPP1-asj/asj составляла 58 суток. Случаев смерти не наблюдали в когорте ENPP1-WT. ФИГ. 1C: Репрезентативные микро-CT и гистология, исследование естественного течения заболевания. Для некоторых животных asj/asj показана очень сильная кальцификация в сердце и аорте видимая на E). Все аорты мышей ENPP1-asj/asj обладали почти кольцевой кальцификацией, распространенной по стенкам сосудов, как проиллюстрировано по окрашиванию аорт ализариновым красным. ФИГ. 1F: Гистология мышей asj/asj, левый желудочек (40x). Обширная кальцификация, окруженная рубцовой тканью, выявляющая присутствие повторяющихся, старых, заживших инфарктов миокарда. ФИГ. 1G: Гистология мышей asj/asj, перегородка (100X). Более конкретно, для мышей asj показаны небольшие очаги кальцификации с окружающей рубцовой тканью, как наблюдали в настоящей работе в миокардиальной перегородке, также диагностические для предшествующих инфарктов миокарда.
abcc6
k
k
K
кат.
кат.
M
-1
-1
ФИГ. 2A-2E содержат набор изображений и графиков, иллюстрирующих метаболический путь, так же, как дизайн, стабильность и кинетические свойства терапевтического белка по изобретению. ФИГ. 2A: Схема метаболического пути пуринергического метаболизма, связанного с эктопической кальцификацией. ENPP1 превращает внеклеточный АТФ в АМФ и PPi, TNAP превращает PPi в Pi, и CD73 превращает АМФ в аденозин и Pi. Ген  кодирует MRP6, мембранный транспортер, который увеличивает внеклеточную концентрацию АТФ. Мутации в TNAP с потерей функции приводят к семейной гипофосфатазии. Мутации в ENPP1 с потерей функции приводят к GACI, мутации в MRP6 с потерей функции приводят к PXE, и мутации в CD73 с потерей функции приводят к заболеванию кальцификации артерий и суставов, называемому «ACDC». ФИГ. 2B: Дизайн терапевтического белка ENPP1. Для получения растворимого рекомбинантного белка, фрагмент внеклеточной области NPP2, содержащий участок расщепления фурином, заменяли на ENPP1, как описано ранее, и белок с C-конца сливали с доменом Fc иммуноглобулина 1 человека (IgG1). ФИГ. 2C: Стабильность терапевтического ENPP1. Наблюдали, что активность ENPP1-Fc по отношению к Ap3A является устойчивой к циклам замораживания-размораживания в PBS после хранения при -80° C. ФИГ. 2D-2E: стационарная кинетика hENPP1-Fc. ФИГ. 2D: Зависимость образования АМФ от времени, измеренная посредством анализа HPLC после добавления 10 нМ hNPP1-Fc к (снизу вверх) 1,0, 2,0, 7,8, 125 и 250 мкМ АТФ. Сглаженные кривые для данных соответствуют анализу зависимости от времени, проведенному посредством нелинейной кинетики. Вставка показывает зависимость от времени для более низких [АТФ] на панели A, (снизу вверх) 1,0, 2,0, 7,8 мкМ АТФ. Зависимость от времени для 1,0 мкМ АТФ показывает, что АТФ полностью истощался через 1 мин, и таким образом, скорость невозможно было определить. ФИГ. 2E: Зависимая от концентрации АТФ начальная скорость гидролиза АТФ на фермент. Начальные скорости после 7,8 мкМ являлись по существу одинаковыми с  (средней)=3,4 (±0,4) с фермент. Начальная скорость при концентрации АТФ 2,0 мкМ составляет приблизительно половину значения , и таким образом, оценена  ~2 мкМ для гидролиза АТФ посредством белка hNPP1-Fc.
ФИГ. 3A-3D содержат набор изображений и графиков, иллюстрирующих исследование с целью подтверждения правильности концепции. ФИГ. 3A: Ежесуточные массы животных. Средняя ежесуточная масса пар сибсов ENPP1-WT и ENPP1-asj/asj, подвергнутых введению доз носителя (ежесуточным инъекциям PBS, дополненных ежесуточным GK 1,5), по сравнению с парами сибсов ENPP1-asj/asj, подвергнутых ежесуточному введению доз ENPP1-Fc мыши (mENPPI-Fc) и 500 е.а./кг qD в PBS и еженедельной иммуносупрессии GK1.5. Дозирование и взвешивание начинали на сутки 14. Случаи смерти в когорте ENPP1-asj/asj+носитель отмечены красными стрелками на сутки смерти. Случаев смерти не наблюдали в когорте ENPP1-WT+носитель или ENPP1-asj/asj+ENPP1-Fc. ФИГ. 3B: Кривые выживаемости, Исследование с целью подтверждения правильности концепции. ФИГ. 3C: Гистология левого желудочка, (40x, H&E), для мышей asj/asj без лечения показан большой очаг кальцификации и микроинфаркты на свободной стенке. ФИГ. 3D: Гистология левого желудочка, (40x, H&E), мыши asj/asj после лечения. Ни для одной из мышей ENPP1-asj после лечения не показано аномальной гистологии левого желудочка.
ФИГ. 4A-4G содержат набор изображений, иллюстрирующих репрезентативную гистологию и исследование с целью подтверждения правильности концепции. Фиг. 4A-4B: Аорта (40x, ализариновый красный). Для мышей ENPP1-asj без лечения (ФИГ. 4A) показана почти кольцевая кальцификация аорты, в то время как для мышей ENPP1-asj после лечения (ФИГ. 4B) не показана. ФИГ. 4C: Мыши ENPP1-asj/asj без лечения, Правый желудочек (40x, H&E). Две мыши ENPP1-asj без лечения обладали обширными, сливающимися инфарктами миокарда на свободной стенке правого желудочка. ФИГ. 4D: Мыши ENPP1-asj/asj после лечения, правый желудочек (40x, H&E). Для всех мышей ENPP1-asj после лечения показан нормальный миокард правого желудочка. ФИГ. 4E: Мыши ENPP1-asj/asj без лечения, коронарные артерии (100x, H&E). Все мыши ENPP1-asj/asj без лечения обладали коронарными кальцификациями, где для большинства показана кольцевая кальцификация в коронарных артериях, окруженная рубцовой тканью, диагностической для ишемии и инфаркта миокарда. ФИГ. 4F: Мыши ENPP1-asj/asj без лечения, миокардиальная перегородка (100x, H&E). Почти для всех животных (77%) показана кальцификация внутри сердца, окруженная рубцовой тканью, как показано у этого животного в миокардиальной перегородке. ФИГ. 4G: Фенотипическое сравнение, мыши ENPP1-asj/asj после лечения и без лечения. Присутствует очень сильное различие размера у животных после лечения и без лечения, и заметное различие подвижности и состояния здоровья животных, лучше заметное в видеофильме, поданном в дополнительных данных.
99m
99m
99m
99m
99m
99m
ФИГ. 5A-5F содержат набор изображений и графиков, иллюстрирующих биомаркеры ответа заболевания. ФИГ. 5A: Посмертные сканирования миро-CT с высоким разрешением выявили обширную кальцификацию у мышей ENPP1-asj/asj без лечения в сердце, коронарных артериях, и восходящем и нисходящем отделе аорты, но абсолютное отсутствие кальцификации в этих органах в когорте ENPP1-asj/asj после лечения или у мышей ENPP1-WT. ФИГ. 5B: [PPi] в плазме у животных ENPP1-WT и ENPP1-asj/asj после лечения и без лечения выявила, что лечение с использованием ENPP1-FC увеличивало [PPi] у мышей ENPP1-asj/asj выше уровней WT, и намного выше почти не поддающихся детекции уровней, присутствующих у мышей ENPP1-asj/asj без лечения. ФИГ. 5C-5D: Процент поглощения инъецированного PYP в головах животных WT и asj/asj. % поглощения PYP в головах животных при исследовании естественного течения заболевания регистрировали еженедельно у животных WT и asj/asj с кормлением для ускорения роста, показывая, что поглощение PYP остается почти постоянным в течение периода 80 суток после рождения, но заметно отличается между двумя экспериментальными группами. ФИГ. 5D: В исследовании естественного течения заболевания, среднее поглощение PYP в головах животных WT составляло 15% от инъецированной дозы в течение периода 80 суток, в то время как поглощение PYP у животных asj/asj составляло приблизительно 20% (p<0,001, 2-сторонний t-критерий Стьюдента). ФИГ. 5E-5F: Процент поглощения инъецированной дозы PYP в головах мышей WT и мышей asj/asj после лечения и без лечения. Поглощение PYP регистрировали в середине исследования (сутки 30-35, (ФИГ. 5E)) и в конце исследования (сутки 50-65, ФИГ. 5F) в экспериментальных группах. Животные WT и животные asj/asj после лечения обладали процентом поглощения в черепах приблизительно 15%, в то время как в когорте ENPP1-asj/asj без лечения он составлял или превышал 20%. Различие между мышами ENPP1-asj после лечения и без лечения являлось статистически значимым (p<0,001, 2-сторонний t-критерий Стьюдента), в то время как различие между мышами WT и мышами ENPP1-asj после лечения не являлось статистически значимым.
На ФИГ. 6, содержащей панели a-h, проиллюстрированы конкретные неограничивающие конструкции слитых белков NPP1. X и Y представляют собой необязательные пептиды в некоторых вариантах осуществления. Z представляет собой необязательный линкер, который соединяет либо домен Fc, либо домен HSA, с C-концом белка NPP1. N- и C-концевые области белка NPP1 изображены как N и C на ФИГ. 6. На панелях a-d проиллюстрированы слитые белки, содержащие трансмембранный домен NPP2 (отмечен как «*») и NPP1 (отмечен как «**») вместе с ферментативным доменом NPP1. Ферментативный домен NPP1 начинается с аминокислотной последовательности PSCAKE и оканчивается аминокислотной последовательностью QED. На панелях e-h проиллюстрированы слитые белки, содержащие сигнальный пептид NPP2 (отмечен как «*») и трансмембранный домен NPP1 (отмечен как «**») вместе с ферментативным доменом NPP1.
ФИГ. 7 представляет собой график, иллюстрирующий измеренные уровни PPi в плазме у мышей после лечения ENPP1-Fc, как описано в примере 1.
ФИГ. 8 представляет собой схематическую иллюстрацию плазмиды, используемой для экспрессии SEQ ID NO:22.
ФИГ. 9 представляет собой схематическую иллюстрацию плазмиды, используемой для экспрессии SEQ ID NO:25.
ФИГ. 10 представляет собой изображение, иллюстрирующее изображение окрашивания серебром для очищенных конструкций человеческого и мышиного NPP1-Fc.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к открытию, что конкретные содержащие NPP1 полипептиды, их мутанты или мутантные фрагменты можно использовать для лечения заболеваний и нарушений, включающих нарушение равновесия пирофосфата в плазме, патологическую кальцификацию и/или патологическое окостенение. Заболевания и нарушения, включающие патологическую кальцификацию и/или патологическое окостенение, которые можно лечить посредством композиций и способов по изобретению, включают, но без ограничения, генерализованную инфантильную артериальную кальцификацию (GACI), хроническую почечную недостаточность (CKD), почечную недостаточность на конечной стадии (ESRD), идиопатическую инфантильную артериальную кальцификацию (IIAC), окостенение задней продольной связки (OPLL), гипофосфатемический рахит, кальцификацию атеросклеротических бляшек, эластическую псевдоксантому (PXE), наследственные и ненаследственные формы остеоартрита, анкилозирующий спондилит, уплотнение артерий, возникающее с возрастом, кальцифилаксию (такую как возникающая в результате почечной недостаточности на конечной стадии) и прогерию.
Такие заболевания являются результатом огромного количества причин: некоторые представляют собой генетические мутации, и некоторые представляют собой осложнения в результате диабета, сердечной недостаточности или интенсивного диализа. Тем не менее, в конкретных вариантах осуществления, они разделяют общие симптомы нарушения равновесия пирофосфата в плазме и/или обширной кальцификации.
Определения
Если не определено иначе, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, обладают таким же значением, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем документе, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, описаны иллюстративные способы и материалы.
Как применяют в настоящем документе, каждый из следующих терминов обладает значением, ассоциированным с ним в этом разделе.
Определения единственного числа с артиклем «a» и «an» применяют в настоящем документе, для обозначения одного или более одного (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта определения. Например, «элемент» обозначает один элемент или более одного элемента.
«Приблизительно», как применяют в настоящем документе, когда это относится к поддающемуся измерению значению, такому как количество, временная продолжительность и т.п., понимают как включающее варианты±20% или ±10%, в конкретных вариантах осуществления±5%, в конкретных вариантах осуществления±1%, в конкретных вариантах осуществления±0,1% от указанного значения, поскольку такие варианты являются подходящими для осуществления описанных способов.
Термин «аномальный» при применении в контексте организмов, тканей, клеток или их компонентов, относится к тем организмам, тканям, клеткам или их компонентам, которые отличаются по меньшей мере одной поддающейся наблюдению или детекции характеристикой (например, возрастом, обработкой, временем суток и т.д.) от тех организмов, тканей, клеток или их компонентов, которые обладают «нормальной» (ожидаемой) соответствующей характеристикой. Характеристики, которые являются нормальными или ожидаемыми для одного типа клетки или ткани, могут являться аномальными для другого типа клетки или ткани.
Как применяют в настоящем документе, термин «ALB» относится к белку человеческому сывороточному альбумину.
Заболевание или нарушение «облегчают», если тяжесть симптома заболевания или нарушения, частота, с которой симптом испытывает пациент, или и то, и другое, уменьшают.
Как применяют в настоящем документе, термины «изменение», «дефект», «вариант» или «мутация» относятся к мутации в гене в клетке, которая влияет на функцию, активность, экспрессию (транскрипцию или трансляцию) или конформацию полипептида, который он кодирует. Мутации, охваченные настоящим изобретением, могут представлять собой любую мутацию гена в клетке, которая приводит к усилению или нарушению функции, активности, экспрессии или конформации кодированного полипептида, включая полное отсутствие экспрессии кодированного белка, и может включать, например, миссенс и нонсенс-мутации, вставки, делеции, сдвиги рамки считывания и преждевременную терминацию. Без такого ограничения, мутации, охваченные настоящим изобретением, могут изменять сплайсинг мРНК (мутация участка сплайсинга) или вызывать сдвиг рамки считывания (сдвиг рамки).
Термин «вариант аминокислотной последовательности» относится к полипептидам, обладающим аминокислотными последовательностями, отличающимися до некоторой степени от нативной последовательности полипептида. Обычно варианты аминокислотной последовательности обладают по меньшей мере приблизительно 70% гомологией, по меньшей мере приблизительно 80% гомологией, по меньшей мере приблизительно 90% гомологией, или по меньшей мере приблизительно 95% гомологией с нативным полипептидом. Варианты аминокислотной последовательности обладают заменами, делециями и/или вставками в конкретных положениях внутри аминокислотной последовательности нативной аминокислотной последовательности.
et al.
et al.
et al.
et al.
Термин «антитело», как применяют в настоящем документе, относится к молекуле иммуноглобулина, способной специфически связываться со специфическим эпитопом на антигене. Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины, полученные из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут представлять собой иммунореактивные части интактных иммуноглобулинов. Антитела по настоящему изобретению могут существовать во множестве форм, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, внутриклеточные антитела («интраантитела»), Fv, Fab и F(ab)2, так же как одноцепочечные антитела (scFv), антитела из тяжелой цепи, такие как антитела верблюдовых, синтетические антитела, химерные антитела и гуманизированные антитела (Harlow, , 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow, , 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston, , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird, , 1988, Science 242:423-426).
Как применяют в настоящем документе, термин «Ap3P» относится к аденозин-(5')-трифосфо-(5')-аденозину или его соли.
Как применяют в настоящем документе, термины «ребенок» и «грудной ребенок» используют взаимозаменяемо.
in vivo
Термин «кодирующая последовательность», как применяют в настоящем документе, обозначает последовательность нуклеиновой кислоты или комплементарную ей последовательность, или ее часть, которую можно транскрибировать и/или транслировать для получения мРНК и/или полипептида, или их фрагмента. Кодирующие последовательности включают экзоны в геномной ДНК или незрелые первичные транскрипты РНК, которые соединяют вместе посредством биохимического аппарата клетки для получения зрелой мРНК. Антисмысловая цепь является комплементарной такой нуклеиновой кислоте, и из нее можно вывести кодирующую последовательность. В отличие от этого, термин «некодирующая последовательность», как применяют в настоящем документе, обозначает последовательность нуклеиновой кислоты или комплементарную ей последовательность, или ее часть, которая не транслируется в аминокислоту , или с которой тРНК не взаимодействует для размещения или попытки размещения аминокислоты. Некодирующие последовательности включают как интронные последовательности в геномной ДНК или в незрелых первичных транскриптах РНК, так и ассоциированные с генами последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сайленсеры и т.п.
Как применяют в настоящем документе, термины «комплементарный» или «комплементарность» используют по отношению к полинуклеотидам (т.е. последовательности нуклеотидов), связанным по правилам спаривания оснований. Например, последовательность «A-G-T», является комплементарной последовательности «T-C-A». Комплементарность может являться «частичной», при которой только некоторые из оснований нуклеиновой кислоты совпадают в соответствии с правилами спаривания оснований. Или, может присутствовать «завершенная» или «полная» комплементарность между нуклеиновыми кислотами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительные эффекты на эффективность и силу гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Это является особенно важным в реакциях амплификации, так же, как в способах детекции, зависящих от связывания между нуклеиновыми кислотами.
Как применяют в настоящем документе, термины «консервативный вариант» или «консервативная замена», как применяют в настоящем документе, относится к замене аминокислотного остатка на другой, биологически сходный остаток. Консервативные варианты или замены с небольшой вероятностью изменяют форму пептидной цепи. Примеры консервативных вариантов или замен включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой, или замену одного полярного остатка на другой, такую как замена аргинином лизина, глутаминовой кислотой аспарагиновой кислоты, или глутамином аспарагина.
«Заболевание» представляет собой состояние здоровья животного, где животное не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не облегчают, тогда здоровье животного продолжает ухудшаться.
«Нарушение» у животного представляет собой состояние здоровья, при котором животное может поддерживать гомеостаз, но при котором состояние здоровья животного является менее благоприятным, чем оно могло бы быть в отсутствие нарушения. При оставлении без лечения, нарушение не обязательно вызывает дальнейшее ухудшение состояния здоровья животного.
Как применяют в настоящем документе, термин «домен» относится к части молекулы или структуры, разделяющей общие физико-химические свойства, такие как, но без ограничения, гидрофобные, полярные, глобулярные и спиральные домены или свойства. Конкретные примеры связывающих доменов включают, но без ограничения, связывающие ДНК домены и связывающие АТФ домены.
Как применяют в настоящем документе, термины «эффективное количество», «фармацевтически эффективное количество» и «терапевтически эффективное количество» относятся к нетоксичному, но достаточному количеству средства для достижения желательного биологического результата. Этот результат может представлять собой уменьшение и/или облегчение признаков, симптомов или причин заболевания, или любое другое желательное изменение биологической системы. Специалист в данной области может в любом индивидуальном случае определить соответствующее терапевтическое количество с использованием общепринятых экспериментов.
«Кодирующий» относится к присущему конкретным последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК, или мРНК, свойству служить матрицами для синтеза в биологически процессах других полимеров и макромолекул, обладающих либо определенной последовательностью нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенной последовательностью аминокислот, и биологическими свойствами в результате этого. Таким образом, ген кодирует белок, если при транскрипции и трансляции мРНК, соответствующей этому гену, образуется белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующую цепь, нуклеотидная последовательность, которая является идентичной последовательности мРНК и, как правило, представлена в списке последовательностей, так и некодирующую цепь, используемую в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, можно обозначать как кодирующую белок или другой продукт этого гена или кДНК.
Как применяют в настоящем документе, термин «Fc» относится к домену Fc IgG человека.
Как применяют в настоящем документе, термин «отсутствие прибавки массы тела» относится к ребенку или грудному ребенку, текущая масса тела или скорость прибавки массы тела которого ниже, чем у других детей сходного возраста и пола. Ситуацию, когда у ребенка или грудного ребенка «отсутствует прибавка массы тела», можно идентифицировать посредством консультирования со специалистом в области медицины, и/или посредством сравнения массы тела или прибавки массы тела ребенка или грудного ребенка с известными данными средней специфической для возраста массы или скорости прибавки массы тела.
Как применяют в настоящем документе, термин «фрагмент», как применяют к нуклеиновой кислоте, относится к подпоследовательности более крупной нуклеиновой кислоты. «Фрагмент» нуклеиновой кислоты может иметь длину по меньшей мере приблизительно 15 нуклеотидов; например, по меньшей мере от приблизительно 50 нуклеотидов до приблизительно 100 нуклеотидов; по меньшей мере от приблизительно 100 до приблизительно 500 нуклеотидов, по меньшей мере от приблизительно 500 до приблизительно 1000 нуклеотидов; по меньшей мере от приблизительно 1000 нуклеотидов до приблизительно 1500 нуклеотидов; от приблизительно 1500 нуклеотидов до приблизительно 2500 нуклеотидов; или приблизительно 2500 нуклеотидов (и любое целое значение между ними). Как применяют в настоящем документе, термин «фрагмент», как применяют к белку или пептиду, относится к относится к подпоследовательности более крупного белка или пептида. «Фрагмент» белка или пептида может иметь длину по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот; например, длину по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот; длину по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот; длину по меньшей мере приблизительно 200 аминокислот; длину по меньшей мере приблизительно 300 аминокислот; длину или длину по меньшей мере приблизительно 400 аминокислот (и любое целое значение между ними).
«Гомологичный» относится к сходству последовательности или идентичности последовательности между двумя полипептидами или между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же субъединицей основания или мономера аминокислоты, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, тогда молекулы являются гомологичными в этом положении. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией количества совпадающих или гомологичных положений, общих для двух последовательностей, деленного на количество сравниваемых положений X 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются совпадающими или гомологичными, тогда две последовательности являются на 60% гомологичными. Например, последовательности ДНК ATTGCC и TATGGC разделяют 50% гомологии. Как правило, сравнение проводят, когда две последовательности выровнены для получения максимальной гомологии.
Как применяют в настоящем документе, «иммуноанализ» относится к любому анализу связывания, в котором используют антитело, способное к специфическому связыванию с молекулой-мишенью для детекции и количественной оценки молекулы-мишени.
Термин «иммуноглобулин» или «Ig», как применяют в настоящем документе, определяют как класс белков, которые функционируют в качестве антител. Антитела, экспрессируемые B-клетками, иногда обозначают как BCR (B-клеточный рецептор) или рецептор антигена. Пять членов, включенные в этот класс белков, представляют собой IgA, IgG, IgM, IgD и IgE. IgA представляет собой первичное антитело, присутствующее в выделениях организма, таких как слюна, слезы, грудное молоко, выделения желудочно-кишечного тракта и выделения слизи респираторного и мочеполового тракта. IgG представляет собой наиболее распространенное в кровотоке антитело. IgM представляет собой основной иммуноглобулин, продуцируемый при первичном иммунном ответе у большинства субъектов. Он является наиболее эффективным иммуноглобулином при агглютинации, связывании комплемента и других ответов антител, и является важным для защиты против бактерий и вирусов. IgD представляет собой иммуноглобулин, который не обладает известными функциями антитела, но может служить рецептором антигена. IgE представляет собой иммуноглобулин, опосредующий гиперчувствительность, вызывая высвобождение медиаторов из тучных клеток и базофилов при воздействии аллергена.
«Инструкционный материал», как этот термин применяют в настоящем документе, включает публикацию, запись, диаграмму или любую другую среду выражения, которую можно использовать для сообщения о полезности нуклеиновой кислоты, пептида и/или соединения по изобретению в наборе для идентификации или облегчения, или лечения различных заболеваний или нарушений, перечисленных в настоящем документе. Необязательно, или альтернативно, в инструкционном материале может быть описан один или несколько способов идентификации или облегчения заболевания или нарушения в клетке или ткани субъекта. Инструкционный материал для набора можно, например, прикреплять к контейнеру, содержащему нуклеиновую кислоту, полипептид и/или соединение по изобретению, или можно доставлять вместе с контейнером, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид и/или соединение. Альтернативно, инструкционный материал можно доставлять отдельно от контейнера с целью совместного использования получателем инструкционного материала и соединения.
«Выделенный» обозначает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или полипептид, естественным образом присутствующие в живом животном, не являются «выделенными», но та же самая нуклеиновая кислота или полипептид, частично или полностью отделенные от материалов, сосуществующих с ними в их природном состоянии, являются «выделенными». Выделенные нуклеиновая кислота или белок могут существовать в по существу очищенной форме, или могут существовать в неприродном окружении, например, таком как клетка-хозяин.
«Выделенная нуклеиновая кислота» относится к отрезку или фрагменту нуклеиновой кислоты, отделенному от последовательностей, фланкирующих ее в природном состоянии, например, фрагменту ДНК, отделенному от последовательностей, в норме являющихся смежными с фрагментом, например, последовательностей, смежных с фрагментом в геноме, в котором он встречается в природе. Термин применяют также к нуклеиновым кислотам, в основном очищенным от других компонентов, естественным образом сопровождающим нуклеиновую кислоту, например, РНК или ДНК, или белков, естественным образом сопровождающим ее в клетке. Термин, таким образом, включает, например, рекомбинантную ДНК, вставленную в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариоты или эукариоты, или существующую в форме отдельной молекулы (например, в форме кДНК или фрагмента геномной или кДНК, полученного посредством ПЦР или расщеплением рестрикционным ферментом), независимо от других последовательностей. Он включает также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность.
Как применяют в настоящем документе, термин «NPP» или «ENPP» относится к пирофосфатазе/фосфодиэстеразе эктонуклеотидов.
«Нуклеиновая кислота» относится к полинуклеотиду и включает полирибонуклеотиды и полидезоксирибонуклеотиды. Нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут включать любой полимер или олигомер из пиримидиновых и пуриновых оснований, предпочтительно, цитозина, тимина и урацила, и аденина и гуанина, соответственно. См. Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800 (Сус. Pub. 1982) полное содержание которого приведено в настоящем документе для всех целей. Действительно, настоящее изобретение относится к любому компоненту дезоксирибонуклеотидной, рибонуклеотидной или пептидной нуклеиновой кислоты, и к любым их химическим вариантам, таким как метилированные, гидроксиметилированные или глюкозилированные формы этих оснований, и т.п. Полимеры или олигомеры могут являться гетерогенными или гомогенными в композиции, и могут являться выделенными из природных источников или могут являться искусственно или синтетически полученными. Кроме того, нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК, или их смесь, и могут существовать постоянно или временно в одноцепочечной или двухцепочечной форме, включая гомодуплекс, гетеродуплекс и гибридные состояния.
«Олигонуклеотид» или «полинуклеотид» представляет собой нуклеиновую кислоту, которая имеет длину в диапазоне от по меньшей мере 2, в конкретных вариантах осуществления, по меньшей мере 8, 15 или 25 нуклеотидов, но может иметь длину вплоть до 50, 100, 1000, или 5000 нуклеотидов, или соединение, которое специфически гибридизуется с полинуклеотидом. Полинуклеотиды включают последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) или их миметики, которые могут являться выделенными из природных источников, рекомбинантно полученными или искусственно синтезированными. Дополнительным примером полинуклеотида по настоящему изобретению может являться пептидная нуклеиновая кислота (ПНК). (См. Патент США No. 6156501 полное содержание которого, таким образом, приведено в качестве ссылки). Изобретение относится также к ситуациям, в которых присутствует нетрадиционное спаривание оснований, такое как спаривание оснований по Хугстену, которое идентифицировано в конкретных молекулах тРНК и предположительно существующее в тройной спирали. «Полинуклеотид» и «олигонуклеотид» применяют в настоящем документе взаимозаменяемо. Понятно, что когда нуклеотидная последовательность представлена в настоящем документе посредством последовательности ДНК (например, A, T, G, и C), это включает также соответствующую последовательность РНК (например, A, U, G, C), в которой «U» заменяет «T».
Как применяют в настоящем документе, термин «пациент», «индивидуум» или «субъект» относится к человеку или не относящемуся к человеку животному. Не относящиеся к человеку млекопитающие включают, например, скот и домашних животных, таких как овечьи, бычьи, свиные, собачьи, кошачьи и мышиные млекопитающие. В конкретных вариантах осуществления, пациент, индивидуум или субъект представляет собой человека.
Как применяют в настоящем документе, термин «предотвращать» или «предотвращение» обозначает отсутствие развития нарушения или заболевания, если оно не возникало, или отсутствие дальнейшего развития нарушения или заболевания, если уже произошло развитие нарушения или заболевание. Также предусматривают возможность предотвращения некоторых или всех симптомов, ассоциированных с нарушением или заболеванием.
Как применяют в настоящем документе, термин «фармацевтическая композиция» или «композиция» относится к смеси по меньшей мере одного соединения, которое можно использовать по изобретению, с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция облегчает введение соединения пациенту. В данной области существует множество способов введения соединения, включая, но без ограничения, внутривенное, пероральное, аэрозольное, ингаляционное, ректальное, вагинальное, чрескожное, интраназальное, буккальное, подъязычное, парентеральное, интратекальное, внутрижелудочное, глазное, внутрилегочное и местное введение.
Как применяют в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый» относится к материалу, такому как носитель или разбавитель, который не подавляет биологическую активность или свойства соединения, и является относительно нетоксичным, т.е. материал можно вводить индивидууму без вызова нежелательных биологических эффектов или взаимодействия неблагоприятным образом с любыми компонентами композиции, в которой он содержится.
Как применяют в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такие как жидкий или твердый наполнитель, стабилизатор, диспергирующее средство, суспендирующее средство, разбавитель, наполнитель, загуститель, растворитель или инкапсулирующий материал, вовлеченный в переноску или транспорт соединения, которое можно использовать по изобретению, внутри организма пациента или к пациенту, так что оно может осуществлять предназначенную для него функцию. Как правило, такие конструкции переносят или транспортируют от одного органа или части организма, к другому органу или части организма. Каждый носитель должен являться «приемлемым» в том смысле, что является совместимым с другими ингредиентами состава, включая соединение, которое можно использовать по изобретению, и не является вредным для пациента. Некоторые примеры материалов, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают: сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; наполнители, такие как масло какао и воски для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; забуферивающие средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; поверхостно-активные вещества; альгиновая кислота; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт; фосфатные буферные растворы; и другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах. Как применяют в настоящем документе, «фармацевтически приемлемый носитель» включает также все без исключения покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, и замедляющие абсорбцию средства, и т.п., которые являются совместимыми с активностью соединения, которое можно использовать по изобретению, и являются физиологически приемлемыми для пациента. Дополнительные активные соединения можно также включать в композиции. «Фармацевтически приемлемый носитель» может, кроме того, включать фармацевтически приемлемую соль соединения, которую можно использовать по изобретению. Другие дополнительные ингредиенты, которые можно включать в фармацевтические композиции, используемые в практическом осуществлении изобретения, известны в данной области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA), содержание которого приведено в настоящем документе путем ссылки.
Как применяют в настоящем документе, выражение «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли вводимого соединения, полученной из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот и оснований, включая неорганические кислоты, неорганические основания, органические кислоты, их неорганические основания, сольваты, гидраты и клатраты. Пригодные фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли можно получать из неорганической кислоты или из органической кислоты. Примеры неорганических кислот включают сульфат, сульфат водорода, соляную, бромистоводородную, иодистоводородную, азотную, карбоновую, серную и фосфорную кислоты (включая гидрофосфат и дигидрофосфат). Подходящие органические кислоты можно выбирать из алифатических, циклоалифатических, ароматических, аралифатических, гетероциклических, карбоновых и сульфоновых классов органических кислот, примеры которых включают муравьиную, уксусную, пропионовую, янтарную, гликолевую, глюконовую, молочную, яблочную, виннокаменную, лимонную, аскорбиновую, глюкуроновую, малеиновую, фумаровую, пировиноградную, аспарагиновую, глутаминовую, бензойую, ортоаминобензойную, 4-гидроксибензойную, фенилуксусную, миндальную, эмбоновую (памовую), метансульфоновую, этансульфоновую, бензолсульфоновую, пантотеновую, трифторметансульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, п-толуолсульфоновую, сульфаниловую, циклогексиламиносульфоновую, стеариновую, альгиновую, β-гидроксимасляную, салициловую, галактаровую и галактуроновую кислоту. Пригодные фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли соединения по изобретению включают, например, соли металлов, включая щелочной, щелочноземельный металл, и соли переходных металлов, например, такие как соли кальция, магния, калия, натрия и цинка. Фармацевтически приемлемые основно-аддитивые соли включают также органические соли, полученные из основных аминов, например, таких как N,N'-дибензилэтилен-диамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, меглумин (N-метилглюкамин) и прокаин. Все из этих солей можно получать из соответствующего соединения посредством проведения реакций, например, соответствующей кислоты или основания с соединением.
Как применяют в настоящем документе, «полинуклеотид» представляет собой кДНК, РНК, гибрид ДНК/РНК, антисмысловую РНК, рибозим, геномную ДНК, синтетические формы и смешанные полимеры, как смысловые, так и антисмысловые цепи, и может являться химически или биохимически модифицированным, чтобы содержать неприродные или дериватизированные, синтетические или полусинтетические нуклеотидные основания. Предусмотрены также изменения гена дикого типа или синтетического гена, включая, но без ограничения, делецию, вставку, замену одного или нескольких нуклеотидов, или слияние с другими полинуклеотидными последовательностями.
Как применяют в настоящем документе, термин «полипептид» относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, его родственным природным структурным вариантам, и синтетическим неприродным аналогам, связанным пептидными связями. Синтетические полипептиды можно синтезировать, например, с использованием автоматического полипептидного синтезатора. Как применяют в настоящем документе, термин «белок», как правило, относится к большим полипептидам. Как применяют в настоящем документе, термин «пептид», как правило, относится к коротким полипептидам. Общепринятое обозначение применяют в настоящем документе для представления полипептидных последовательностей: левый конец полипептидной последовательности представляет собой амино-конец, и правый конец полипептидной последовательности представляет собой карбокси-конец.
Как применяют в настоящем документе, аминокислоты представлены посредством их полного наименования, посредством соответствующего этому трехбуквенного кода или посредством соответствующего этому однобуквенного кода, как указано ниже: аспарагиновая кислота (Asp/D); глутаминовая кислота (Glu/E); лизин (Lys/K); аргинин (Arg/R); гистидин (His/H); тирозин (Tyr/Y); цистеин (Cys/C); аспарагин (Asn/N); глутамин (Gln/Q); серин (Ser/S); треонин (Thr/T); глицин (Gly/G); аланин (Ala/A); валин (Val/V); лейцин (Leu/L); изолейцин (Ile/I); метионин (Met/M); пролин (Pro/P); фенилаланин (Phe/F); триптофан (Trp/W).
«Образец» или «биологический образец», как применяют в настоящем документе, обозначает биологический материал, выделенный от субъекта. Биологический образец может содержать любой биологический материал, пригодный для детекции мРНК, полипептида или другого маркера физиологического или патологического процесса у субъекта, и может содержать жидкость, ткань, клеточный и/или внеклеточный материал, полученный от индивидуума.
Под термином «специфически связывается», как применяют в настоящем документе по отношению к антителу, понимают антитело, которое узнает специфический антиген, но в основном не узнает или не связывает другие молекулы в образце. Например, антитело, которое специфически связывает антиген из одного вида, может также связываться с этим антигеном из одного или нескольких видов. Но такая перекрестная реакционная способность сама по себе не изменяет классификацию антитела как специфического. В другом примере, антитело, которое специфически связывает антиген, может также связываться с другими аллельными формами этого антигена. Однако такая перекрестная реакционная способность сама по себе не изменяет классификацию антитела как специфического. В некоторых случаях, термины «специфическое связывание» или «специфически связывает» можно использовать по отношению к взаимодействию антитела, белка или пептида с второй химической молекулой, для обозначения того, что связывание зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на химической молекуле; например, антитело узнает и связывает специфическую структуру белка, а не белки в общем. Если антитело является специфическим для эпитопа «A», присутствие молекулы, содержащей эпитоп A (или свободный, немеченный A), в реакционной смеси, содержащей меченнный «A» и антитело, может уменьшать количество меченного A, связанного с антителом.
Как применяют в настоящем документе, «в основном очищенный» относится к в основном свободному от других компонентов. Например, в основном очищенный полипептид представляет собой полипептид, отделенный от других компонентов, с которыми он в норме ассоциирован в его природном состоянии.
ex vivo
Как применяют в настоящем документе, термин «обработка» или «лечение» определяют как применение или введение лекарственного средства, т.е. соединения, которое можно использовать по изобретению (отдельно или в комбинации с другим лекарственным средством), пациенту, или применение или введение лекарственного средства в выделенную ткань или линию клеток от пациента (например, для диагностики или применений ), обладающего заболеванием или нарушением, симптомом заболевания или нарушения или потенциалом для развития заболевания или нарушения, с целью излечения, лечения, облегчения, ослабления, изменения, устранения, смягчения, улучшения или подвергания воздействию заболевания или нарушения, симптомов заболевания или нарушения, или потенциала развития заболевания или нарушения. Такие виды лечения можно специфически корректировать или модифицировать, на основании знаний, полученных из области фармакогеномики.
Как применяют в настоящем документе, термин «дикий тип» относится к гену или продукту гена, выделенному из природного источника. Ген дикого типа представляет собой ген, который наиболее часто наблюдают в популяции, и который, таким образом, условно обозначают как «нормальную» форму гена или форму гена «дикого типа». В отличие от этого, термин «модифицированный» или «мутантный» относится к гену или продукту гена, для которого показаны модификации последовательности и/или функциональных свойств (т.е. измененные характеристики) при сравнении с геном или продуктом гена дикого типа. Природные мутанты можно выделять; их идентифицируют посредством того факта, что они обладают измененными характеристиками (включая измененные последовательности нуклеиновой кислоты) при сравнении с геном или продуктом гена дикого типа.
Диапазоны: на протяжении этого описания, различные аспекты по изобретению можно представлять в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона присутствует только для удобства и краткости, и его не следует рассматривать в качестве жесткого ограничения объема изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как включающее конкретно описанные все возможные поддиапазоны, так же как индивидуальные числовые значения внутри этого диапазона. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать, как включающее конкретно описанные поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., так же как индивидуальные числа внутри этого диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо вне зависимости от ширины диапазона.
Описание
ENPP1 является первичным источником внеклеточного PPi в организме. Несмотря на множественную генетическую этиологию и многофакторную природу экспрессии, прогрессирования и тяжести GACI, настоящие результаты показывают, что нарушение внеклеточного пуринергического метаболизма NPP1 ответственно за патологические последствия и смертность, ассоциированные с GACI, и что заместительная терапия ферментом ENPP1 является легко управляемым способом терапии. Это показано с использованием модели GACI на мышах ENPP1-asj на «диете для ускорения роста».
Заболевания эктопической кальцификации тканей лежат в диапазоне от крайне редких заболеваний, таких как GACI, до почти повсеместно распространенных заболеваний в стареющей популяции, таких как уплотнение артерий и остеоартрит. Генетическая этиология GACI человека позволяет предполагать, что летальная артериальная кальцификация возникает в результате нарушения внеклеточного пуринергического метаболизма, посредством либо мутаций в ENPP1 с потерей функции, либо вышестоящего уменьшения количества нуклеотидтрифосфатов, подвергающихся метаболизму посредством ENPP1 в внеклеточный PPi. Как показано в настоящем документе, подкожное дополнение ненацеленной ENPP1 или ненацеленной ENPP1-Fc увеличивает внеклеточные концентрации PPi достаточно для прекращения смертности, так же как кальцификации сердца и артерий в моделях GACI на животных. Эти результаты показывают, что ненацеленная заместительная терапия ферментом может являться эффективной при GACI и других заболеваниях, приводящих к неконтролируемой кальцификации сосудов.
et al.
et al.
et al.
et al.
et al.
in vitro
et al
in vivo
Настоящие результаты являются неожиданными в свете предшествующих исследований лечения наследственной гипофосфатазии (HPP), в которых заявлено о необходимости нацеливающего на кости мотива для эффективности. HPP представляет собой подобное рахиту заболевание уменьшенной/отсутствующей минерализации костей, и лечение с использованием рекомбинантного TNAP требует обязательного нацеливания на кости для достижения клинического эффекта (Millan, , 2008, J. Bone Mineral Res. 23:777-787; Whyte, , 2012, New Engl. J. Med. 366:904-913). Клинические исследования попытки лечения HPP с использованием сыворотки, обогащенной ненацеленным TNAP, не имели успеха (Whyte, , 1982, J. Pediatrics 101:379-386; Whyte, , 1984, J. Pediatrics 105:926-933; Weninger, , 1989, Acta Paediatrica Scandinavica Suppl. 360:154-160). Кроме того, в литературе на время изобретения указано, что для ненацеленного NPP1 не показано эффективности в анализах кальцификации  (WO 2012/125182 от Quinn, ., например, таких как на фигуре 23 в том документе), таким образом, указывая на то, что нацеливание на кости являлось необходимым для биологической активности содержащих NPP1 биологических средств . Однако в конкретных вариантах осуществления настоящие результаты показывают, что нацеливание на кости не является необходимым для терапевтической эффективности.
abcc6
in vitro
in vivo
Артериальная кальцификация при GACI может сопровождаться внесосудистой кальцификацией в коже и сетчатке, типичной для второго редкого заболевания, PXE. PXE является близко родственным GACI, но вместо этого приводит к эктопической минерализации тканей эластических волокон, поражающей кожу, глаза и сердечно-сосудистую систему. PXE обладает более поздним началом, более медленным прогрессированием, и является относительно более распространенным, чем GACI, с заболеваемостью 1/25000-1/75000. Клинические проявления начинаются на коже с развитием небольших желтоватых пузырьков, которые сливаются в более крупные бляшки с кожистой оболочкой, с последующими ангиоидными полосами сетчатки в глазу, приводящими к кровотечению, рубцеванию, неоваскуляризации, прогрессирующей потере остроты зрения и слепоте. Сердечно-сосудистая система может быть также поражена прогрессирующей минерализацией артериальных кровеносных сосудов среднего размера, приводящей к гипертензии, нарушению кровообращения, нерегулярному кровотечению из кишечных артерий, и (редко) преждевременному инфаркту миокарда. Генетической основой PXE являются мутации в гене  с потерей функции, приводящие к нарушенной функции белка MRP6, что уменьшает внеклеточные концентрации нуклеотрифосфата (NTP)  и . Это уменьшает концентрации субстрата ENPP1 и, таким образом, ограничивает внеклеточную продукцию PPi.
ttw/ttw
+2
+2
Модель GACI на мышах NPP1-asj обладает как генетической этиологией, так и патологическими свойствами GACI человека, но у мышей развиваются также конкретные виды кальцификации, не характерные для GACI, но напоминающие заболевания человека с нерегулируемой вокругсуставной кальцификацией, такие как остеоартрит и окостенение задней продольной связки (OPLL). Мышей, обладающих миссенс-мутацией в ENPP1 (V246D), первоначально описали как мышей «asj» от «ассоциированный с жесткими суставами (associated with stiffened joints)», что отражает развитие прогрессирующей вокругсуставной кальцификации передних лап мышей. Мутации ENPP1 у мышей используют для моделирования параспинальной кальцификации у мышей  для понимания OPLL, но идентификация мутаций ENPP1 при GACI привела к переоценке присутствия кальцификации сосудов у этих животных, и Uitto и соавторы отметили, что мыши NPP1-asj, при кормлении на специальной диете с высоким содержанием Ca и низким - Мg, повторяли многие из существенных признаков GACI человека. Уровни белка ENPP1 обратно коррелируют с тяжестью кальцификации хряща и остеоартритом у человека, и генетические варианты ENPP1 ответственны за значительную долю остеоартрита кистей рук в популяциях пациентов, предрасположенных к наследственным формам заболевания. В конкретных вариантах осуществления, заместительная терапия ферментом ENPP1 является целесообразным способом лечения для форм остеоартрита, возникающих в результате недостаточности ENPP1 и/или уменьшения внеклеточной концентрации PPi. Такие состояния включают, но без ограничения, PXE, наследственные и ненаследственные формы остеоартрита, анкилозирующего спондилита, уплотнения артерий, возникающего с возрастом, и кальцифилаксии в результате почечной недостаточности на конечной стадии.
Композиции
В конкретных вариантах осуществления, композиция по изобретению содержит по меньшей мере один соединение формулы (I), или его сольват или соль (например, фармацевтически приемлемую соль):
БЕЛОК-Z-ДОМЕН-X-Y (I), где в (I)
БЕЛОК представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из NPP121 (SEQ ID NO:15), NPP71 (SEQ ID NO:17), NPP71, лишенного N-концевых GLK NPP1 (SEQ ID NO:19), и NPP51 (SEQ ID NO:24);
ДОМЕН представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из домена Fc IgG человека (Fc), белка человеческого сывороточного альбумина (ALB) и их фрагмента;
X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-20 аминокислот; и,
n
n
n
n
m
m
Y отсутствует или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (DSS)(SEQ ID NO:4), (ESS) (SEQ ID NO:5), (RQQ) (SEQ ID NO:6), (KR) (SEQ ID NO:7), R (SEQ ID NO:8), DSSSEEKFLRRIGRFG (SEQ ID NO:9), EEEEEEEPRGDT (SEQ ID NO:10), APWHLSSQYSRT (SEQ ID NO:11), STLPIPHEFSRE (SEQ ID NO:12), VTKHLNQISQSY (SEQ ID NO:13) и E (SEQ ID NO:14), где m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 15, и где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10.
В конкретных вариантах осуществления, композиция по изобретению содержит по меньшей мере одно соединение формулы (II) или его фармацевтическую соль:
БЕЛОК-Z-ДОМЕН-X-Y (II), где в (II)
БЕЛОК представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из NPP121 (SEQ ID NO:15), NPP71 (SEQ ID NO:17), NPP71, лишенного N-концевых GLK NPP1 (SEQ ID NO:19), и NPP51 (SEQ ID NO:24);
ДОМЕН представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из домена Fc IgG человека (Fc), белка человеческого сывороточного альбумина (ALB) и их фрагмента;
X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-20 аминокислот; и,
n
n
n
n
m
m
Y представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (DSS)(SEQ ID NO:4), (ESS) (SEQ ID NO:5), (RQQ) (SEQ ID NO:6), (KR) (SEQ ID NO:7), R (SEQ ID NO:8), DSSSEEKFLRRIGRFG (SEQ ID NO:9), EEEEEEEPRGDT (SEQ ID NO:10), APWHLSSQYSRT (SEQ ID NO:11), STLPIPHEFSRE (SEQ ID NO:12), VTKHLNQISQSY (SEQ ID NO:13) и E (SEQ ID NO:14), где m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 15, и где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10.
В конкретных вариантах осуществления, ДОМЕН содержит домен Fc IgG человека или его фрагмент. В других вариантах осуществления, ДОМЕН в основном состоит из домена Fc IgG человека или его фрагмента. В других вариантах осуществления, ДОМЕН состоит из домена Fc IgG человека или его фрагмента.
В конкретных вариантах осуществления, ДОМЕН содержит белок человеческий сывороточный альбумин или его фрагмент. В других вариантах осуществления, ДОМЕН в основном состоит из белка человеческого сывороточного альбумина или его фрагмента. В других вариантах осуществления, ДОМЕН состоит из белка человеческого сывороточного альбумина или его фрагмента.
В конкретных вариантах осуществления, Y представляет собой отрицательно заряженную нацеленную на кость последовательность. В конкретных вариантах осуществления, Y отсутствует. В конкретных вариантах осуществления, Y отсутствует, и соединение формулы (I) или (II) лишено отрицательно заряженной нацеленной на кость последовательности. В других вариантах осуществления, домен полиаспарагиновой кислоты и SEQ ID NO:4-14 представляют собой неограничивающие примеры отрицательно заряженной нацеленной на кость последовательности.
В конкретных вариантах осуществления, БЕЛОК обладает мутацией по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, БЕЛОК или его мутант укорачивают для удаления нуклеазного домена. В других вариантах осуществления, БЕЛОК или его мутант укорачивают для удаления нуклеазного домена от приблизительно остатка 524 до приблизительно остатка 885, относительно SEQ ID NO:1, оставляя только каталитический домен от приблизительно остатка 186 до приблизительно остатка 586 относительно SEQ ID NO:1, что служит для сохранения каталитической активности белка.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:15)-Z-(Fc или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z представляет собой L I N. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:16, или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:17)-Z-(Fc или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z представляет собой L I N. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:18, или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:19)-Z-(Fc или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z представляет собой L I N. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:20, или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:24)-Z-(Fc или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z представляет собой L I N. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:24)-Z-(SEQ ID NO:26), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:15)-Z-(ALB или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z является выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:28-30. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:21, или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:17)-Z-(ALB или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z является выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:28-30. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:17)-Z-(SEQ ID NO:27), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1, где Z является выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:28-30.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:19)-Z-(ALB или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z является выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NOs:28-30. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:22, или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит (SEQ ID NO:24)-Z-(ALB или его фрагмент), или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, Z представляет собой трипептид. В других вариантах осуществления, Z является выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:28-30. В других вариантах осуществления, в (I) или (II) БЕЛОК-Z-ДОМЕН содержит SEQ ID NO:25, или его мутант, содержащий по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из Ser 532, Tyr 529, Tyr 451, Ile 450, Ser 381, Tyr 382, Ser 377, Phe 346, Gly 531, Ser 289, Ser 287, Ala 454, Gly 452, Gln 519, Glu 526, Lys 448, Glu 508, Arg 456, Asp 276, Tyr 434, Gln 519, Ser 525, Gly 342, Ser 343 и Gly 536, относительно SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-18 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-16 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-14 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-12 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-10 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-8 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-6 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-5 аминокислот. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-4 аминокислоты. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-3 аминокислоты. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой полипептид, содержащий 1-2 аминокислоты. В других вариантах осуществления, X и Z независимо отсутствуют или представляют собой одиночную аминокислоту.
В конкретных вариантах осуществления, m представляет собой 1. В других вариантах осуществления, m представляет собой 2. В других вариантах осуществления, m представляет собой 3. В других вариантах осуществления, m представляет собой 4. В других вариантах осуществления, m представляет собой 5. В других вариантах осуществления, m представляет собой 6. В других вариантах осуществления, m представляет собой 7. В других вариантах осуществления, m представляет собой 8. В других вариантах осуществления, m представляет собой 9. В других вариантах осуществления, m представляет собой 10. В других вариантах осуществления, m представляет собой 11. В других вариантах осуществления, m представляет собой 12. В других вариантах осуществления, m представляет собой 13. В других вариантах осуществления, m представляет собой 14. В других вариантах осуществления, m представляет собой 15. В других вариантах осуществления, каждый раз m независимо выбран из группы, состоящей из целого числа в диапазоне от 1 до 15, от 2 до 15, от 3 до 15, от 4 до 15, от 5 до 15, от 6 до 15, от 7 до 15, от 8 до 15, от 9 до 15, от 10 до 15, от 11 до 15, от 12 до 15, от 13 до 15, от 14 до 15, от 1 до 14, от 2 до 14, от 3 до 14, от 4 до 14, от 5 до 14, от 6 до 14, от 7 до 14, от 8 до 14, от 9 до 14, от 10 до 14, от 11 до 14, от 12 до 14, от 13 до 14, от 1 до 13, от 2 до 13, от 3 до 13, от 4 до 13, от 5 до 13, от 6 до 13, от 7 до 13, от 8 до 13, от 9 до 13, от 10 до 13, от 11 до 13, от 12 до 13, от 1 до 12, от 2 до 12, от 3 до 12, от 4 до 12, от 5 до 12, от 6 до 12, от 7 до 12, от 8 до 12, от 9 до 12, от 10 до 12, от 11 до 12, от 1 до 11, от 2 до 11, от 3 до 11, от 4 до 11, от 5 до 11, от 6 до 11, от 7 до 11, от 8 до 11, от 9 до 11, от 10 до 11, от 1 до 10, от 2 до 10, от 3 до 10, от 4 до 10, от 5 до 10, от 6 до 10, от 7 до 10, от 8 до 10, от 9 до 10, от 1 до 9, от 2 до 9, от 3 до 9, от 4 до 9, от 5 до 9, от 6 до 9, от 7 до 9, от 8 до 9, от 1 до 8, от 2 до 8, от 3 до 8, от 4 до 8, от 5 до 8, от 6 до 8, от 7 до 8, от 1 до 7, от 2 до 7, от 3 до 7, от 4 до 7, от 5 до 7, от 6 до 7, от 1 до 6, от 2 до 6, от 3 до 6, от 4 до 6, от 5 до 6, от 1 до 5, от 2 до 5, от 3 до 5, от 4 до 5, от 1 до 4, от 2 до 4, от 3 до 4, от 1 до 3, от 2 до 3 и от 1 до 2.
В конкретных вариантах осуществления, n представляет собой 1. В других вариантах осуществления, n представляет собой 2. В других вариантах осуществления, n представляет собой 3. В других вариантах осуществления, n представляет собой 4. В других вариантах осуществления, n представляет собой 5. В других вариантах осуществления, n представляет собой 6. В других вариантах осуществления, n представляет собой 7. В других вариантах осуществления, n представляет собой 8. В других вариантах осуществления, n представляет собой 9. В других вариантах осуществления, n представляет собой 10. В других вариантах осуществления, каждый раз n независимо выбран из группы, состоящей из целого числа в диапазоне от 1 до 10, от 2 до 10, от 3 до 10, от 4 до 10, от 5 до 10, от 6 до 10, от 7 до 10, от 8 до 10, от 9 до 10, от 1 до 9, от 2 до 9, от 3 до 9, от 4 до 9, от 5 до 9, от 6 до 9, от 7 до 9, от 8 до 9, от 1 до 8, от 2 до 8, от 3 до 8, от 4 до 8, от 5 до 8, от 6 до 8, от 7 до 8, от 1 до 7, от 2 до 7, от 3 до 7, от 4 до 7, от 5 до 7, от 6 до 7, от 1 до 6, от 2 до 6, от 3 до 6, от 4 до 6, от 5 до 6, от 1 до 5, от 2 до 5, от 3 до 5, от 4 до 5, от 1 до 4, от 2 до 4, от 3 до 4, от 1 до 3, от 2 до 3 и от 1 до 2.
В конкретных вариантах осуществления, БЕЛОК или его мутант модифицирован с использованием фрагмента внеклеточной области NPP2, содержащего участок расщепления фурином, по сравнению с SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления, БЕЛОК или его мутант не модифицирован с использованием фрагмента внеклеточной области NPP2, содержащего участок расщепления фурином, по сравнению с SEQ ID NO:1.
В конкретных вариантах осуществления, БЕЛОК или его мутант модифицирован с использованием фрагмента внеклеточной области NPP2, содержащего участок расщепления сигнальной пептидазой, по сравнению с SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления, БЕЛОК или его мутант не модифицирован с использованием фрагмента внеклеточной области NPP2, содержащего участок расщепления сигнальной пептидазой, по сравнению с SEQ ID NO: 1.
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) является растворимым. В других вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) представляет собой рекомбинантный полипептид. В других вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) содержит полипептид NPP1 или его мутант, лишенный трансмембранного домена NPP1. В других вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) содержит полипептид NPP1 или его мутант, где трансмембранный домен NPP1 или его мутант удален (и/или укорочен) и заменен на трансмембранный домен из другого полипептида, такого как, в качестве неограничивающего примера, NPP2.
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) содержит полипептид NPP1 или его мутант, дополнительно содержащий более одного трансмембранного домена.
В конкретных вариантах осуществления, NPP1 является слитым с C-конца с доменом Fc иммуноглобулина 1 человека (IgG1).
В конкретных вариантах осуществления, NPP1 является слитым с C-конца с человеческим сывороточным альбумином.
В конкретных вариантах осуществления, фрагмент и/или вариант NPP1 является слитым с человеческим сывороточным альбумином или его вариантами и/или фрагментами. Человеческий сывороточный альбумин можно конъюгировать с белком NPP1 посредством химического линкера, включая, но без ограничения, природные или сконструированные дисульфидные связи, или посредством генетического слияния с NPP1, или его фрагментом и/или вариантом.
В конкретном варианте осуществления, соединение формулы (I) или (II) содержит полипептид NPP1 или его мутант, содержащий трансмембранные домены из NPP1 и другого полипептида, такого как, в качестве неограничивающего примера, NPP2.
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) обладает последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:21, 22 и 25.
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) обладает последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 22, 25 и (SEQ ID NO:17)-Z-(SEQ ID NO:27).
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) обладает последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 18, 20 и (SEQ ID NO:24)-Z-(SEQ ID NO:26).
В конкретных вариантах осуществления, соединения по изобретению имеют более одного трансмембранного домена. В других вариантах осуществления, соединения по изобретению являются дополнительно пэгилированными. В других вариантах осуществления, соединения по изобретению имеют более одного трансмембранного домена и являются дополнительно пэгилированными.
k
k
кат.
кат.
-1
-1
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) обладает значением , большим или равным приблизительно 3,4 (±0,4) с фермент, где  определяют посредством измерения скорости гидролиза АТФ соединением.
K
K
M
M
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) обладает значением , меньшим или равным приблизительно 2 мкМ, где  определяют посредством измерения скорости гидролиза АТФ соединением.
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II) составлено в форме жидкого состава.
Изобретение, кроме того, относится к форме сухого продукта фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое количество соединения формулы (I) или (II), в результате чего сухой продукт можно разводить до раствора соединения в жидкой форме.
Способы
Изобретение относится к способам лечения или предотвращения нарушений и заболеваний у субъекта, где увеличенная активность или уровень полипептида NPP1, его фрагмента, производного, мутанта или мутантного фрагмента является желательным. В конкретных вариантах осуществления, субъекту вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного соединения по изобретению.
Изобретение, кроме того относится к способу лечения или предотвращения заболевания или нарушения, ассоциированного с патологической кальцификацией или патологическим окостенением, у нуждающегося в этом субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (I) или (II), где заболевание включает GACI, IIAC, OPLL, гипофосфатемический рахит, остеоартрит и кальцификацию атеросклеротических бляшек.
Изобретение, кроме того относится к способу лечения или предотвращения заболевания или нарушения, ассоциированного с патологической кальцификацией или патологическим окостенением, у нуждающегося в этом субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (I) или (II), где заболевание включает PXE, наследственные и ненаследственные формы остеоартрита, анкилозирующего спондилита, уплотнения артерий, возникающего с возрастом, или кальцифилаксии в результате почечной недостаточности на конечной стадии.
Изобретение, кроме того относится к способу уменьшения или предотвращения кальцификации сердца и/или артерий у грудного ребенка, пораженного генерализованной инфантильной артериальной кальцификацией (GACI). В конкретных вариантах осуществления, способ включает введение грудному ребенку терапевтически эффективного количества соединения, содержащего (или состоящего из) полипептида пирофосфатазы/фосфодиэстеразы-1 эктонуклеотидов (NPP1), содержащего домен Fc IgG (или слитого с ним), где соединение лишено домена полиаспарагиновой кислоты, в результате чего введение соединения увеличивает внеклеточные концентрации пирофосфата (PPi), таким образом, уменьшая или предотвращая кальцификации сердца и/или артерий у грудного ребенка.
Изобретение, кроме того относится к способу уменьшения или предотвращения кальцификации сердца и/или артерий у грудного ребенка, пораженного генерализованной инфантильной артериальной кальцификацией (GACI). В конкретных вариантах осуществления, способ включает введение грудному ребенку терапевтически эффективного количества соединения, содержащего (или состоящего из) полипептида пирофосфатазы/фосфодиэстеразы-1 эктонуклеотидов (NPP1), содержащего домен человеческого сывороточного альбумина или его фрагмент (или слитого с ним), где соединение лишено домена полиаспарагиновой кислоты, в результате чего введение увеличивает внеклеточные концентрации пирофосфата (PPi), таким образом, уменьшая или предотвращая кальцификации сердца и/или артерий у грудного ребенка.
В конкретных вариантах осуществления, нарушения и заболевания включает по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из GACI, IIAC, OPLL, гипофосфатемического рахита, остеоартрита, прогерии и кальцификации атеросклеротических бляшек. В других вариантах осуществления, нарушения или заболевания включают по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из PXE, наследственных и ненаследственных форм остеоартрита, анкилозирующего спондилита, уплотнения артерий, возникающего с возрастом, прогерии и кальцифилаксии в результате почечной недостаточности на конечной стадии.
В конкретных вариантах осуществления, соединение вводят субъекту краткосрочно или постоянно. В других вариантах осуществления, соединение вводят субъекту местно, регионально или системно. В других вариантах осуществления, введение является подкожным. В других вариантах осуществления, субъект представляет собой млекопитающее. В других вариантах осуществления, млекопитающее представляет собой человека.
В конкретных вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II), его фрагмент или мутант обладает более низкой активностью гидролиза Ap3A по сравнению с соответствующим полипептидом NPP1 дикого типа или его фрагментом. В других вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II), его фрагмент или мутант обладает по существу такой же активностью гидролиза АТФ по сравнению с соответствующим полипептидом NPP1 дикого типа или его фрагментом. В других вариантах осуществления, соединение формулы (I) или (II), его фрагмент или мутант обладает более низкой активностью гидролиза Ap3A и по существу такой же активностью гидролиза АТФ по сравнению с соответствующим полипептидом NPP1 дикого типа или его фрагментом.
В конкретных вариантах осуществления, полипептид NPP1 содержит продукт расщепления предшественника полипептида NPP1, содержащего трансмембранный домен NPP2.
В конкретных вариантах осуществления, трансмембранный домен NPP2 содержит остатки 12-30 из номера доступа в NCBI NP_001124335 (SEQ ID NO:2), которые соответствуют IISLFTFAVGVNICLGFTA (SEQ ID NO:23).
В конкретных вариантах осуществления, введение терапевтически эффективного количества включает приблизительно 3-15 мг/кг qd полипептида NPP1-Fc.
В конкретных вариантах осуществления, введение приводит к восстановлению внеклеточных концентраций пирофосфата у грудного ребенка до уровня в пределах диапазона, обнаруженного у грудного ребенка, не пораженного GACI. В конкретных вариантах осуществления, у грудного ребенка присутствуют проявления и/или диагноз «отсутствия прибавки массы тела» перед введением.
Специалисту в данной области, на основании описания, представленного в настоящем документе, понятно, что изобретение является полезным для субъектов, которых в целом (например, системно) или частично (например, местно, в ткани, органе), подвергают или будут подвергать лечению против патологической кальцификации или окостенения. В конкретных вариантах осуществления, изобретение является полезным для лечения или предотвращения патологической кальцификации или окостенения. Специалисту в данной области понятно, на основании объяснений, представленных в настоящем документе, что заболевания и нарушения, которые можно лечить посредством композиций и способов, описанных в настоящем документе, включают любое заболевание или нарушение, где уменьшение кальцификации или окостенения может способствовать положительному терапевтическому исходу.
Специалисту в данной области, снабженному настоящим описанием, включая способы, подробно описанные в настоящем документе, понятно, что изобретение не ограничено лечением заболевания или нарушения после его развития. В частности, симптомы заболевания или нарушения не обязательно должны проявляться до степени нанесения ущерба субъекту; действительно, заболевание или нарушение не обязательно должно быть детектировано у субъекта перед проведением лечения. То есть, значительная патология из-за заболевания или нарушения не обязательно должна возникать, прежде чем настоящее изобретение может обеспечивать преимущество. Таким образом, настоящее изобретение, как более полно описано в настоящем документе, включает предотвращения заболеваний и нарушений у субъекта, то есть соединение формулы (I) или (II), или его мутант, как обсуждают в другом месте настоящего документа, можно вводить субъекту до начала заболевания или нарушения, таким образом, предотвращая развитие заболевания или нарушения.
Специалисту в данной области, снабженному описанием в настоящем документе, понятно, что предотвращение заболевания или нарушения у субъекта включает введение субъекту соединения формулы (I) или (II), или его мутанта в качестве профилактической меры против заболевания или нарушения.
Изобретение относится к введению соединения формулы (I) или (II), или его мутанта для осуществления на практике способов по изобретению; специалисту в данной области понятно, на основании описания, представленного в настоящем документе, как составлять и вводить соединение формулы (I) или (II), или его мутант субъекту. Однако, настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным способом введения или режимом лечения. Это особенно справедливо, когда специалисту в данной области, снабженному описанием, представленным в настоящем документе, включая осуществление на практике с использованием известной в данной области модели патологической кальцификации или окостенения, понятно, что способы введения соединения по изобретению может определить специалист в области фармакологии.
Фармацевтические композиции и составы
Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы (I) или (II), в способах по изобретению.
Такая фармацевтическая композиция находится в форме, пригодной для введения субъекту, или фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, один или несколько дополнительных ингредиентов, или некоторые их комбинации. Различные компоненты фармацевтической композиции могут присутствовать в форме физиологически приемлемой соли, например, в комбинации с физиологически приемлемым катионом или анионом, как хорошо известно в данной области.
В одном варианте осуществления, фармацевтические композиции, которые можно использовать для осуществления на практике способа по изобретению, можно вводить для доставки дозы между 1 нг/кг/сутки и 100 мг/кг/сутки. В других вариантах осуществления, фармацевтические композиции, которые можно использовать для осуществления на практике способа по изобретению, можно вводить для доставки дозы между 1 нг/кг/сутки и 500 мг/кг/сутки.
Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого носителя и любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции по изобретению можно менять, в зависимости от идентичности, размера и состояния подвергаемого лечению субъекта, и кроме того, в зависимости от способа, которым следует вводить композицию. Например, композиция может содержать между приблизительно 0,1% и приблизительно 100% (масс./масс.) активного ингредиента.
Фармацевтический композиции, которые можно использовать в способах по изобретению, можно соответствующим образом разрабатывать для ингаляционного, перорального, ректального, вагинального, парентерального, местного, чрескожного, внутрилегочного, интраназального, буккального, глазного, интратекального, внутривенного или другого способа введения. Другие предусмотренные составы включают испускаемые наночастицы, липосомные препараты, повторно упакованные эритроциты, содержащие активный ингредиент и иммунологические составы. Способ(ы) введения ясно очевидны специалисту в данной области и зависят от любого количества факторов, включая тип и тяжесть заболевания, подвергаемого лечению, тип и возраст ветеринарного пациента или пациента-человека, подвергаемого лечению, и т.п.
Составы фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, можно получать любым способом, известным или впоследствии разработанным в области фармакологии. Как правило, такие способы получения включают стадию объединения активного ингредиента с носителем или одним или несколькими другими дополнительными ингредиентами, и затем, если это необходимо или желательно, формование или упаковку продукта в желательную единичную однократную или множественную дозу.
Как применяют в настоящем документе, «единичная дозированная форма» представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей предопределенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента, как правило, является равным дозе активного ингредиента, которую будут вводить субъекту, или удобная часть такой дозы, например, такая как, половина или треть такой дозы. Единичная дозированная форма может быть предназначена для однократной ежесуточной дозы или для одной из множества ежесуточных доз (например, для приблизительно 1-4 или более раз в сутки). При использовании множества ежесуточных доз, единичная дозированная форма может являться одинаковой или различной для каждой дозы.
Несмотря на то, что описания фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, принципиально относятся к фармацевтическим композициям, пригодным для этичного введения человеку, специалисту в данной области понятно, что такие композиции в общем являются пригодными для введения животным всех видов. Модификация фармацевтических композиций, пригодных для введения человеку, чтобы сделать композиции пригодными для введения различным животным, хорошо понятна, и специалист в области ветеринарной фармакологии может разрабатывать и осуществлять такую модификацию с использованием только обычных экспериментов, если они потребуются. Субъекты, для которых предусмотрено введение фармацевтических композиций по изобретению, включают, но без ограничения, человека и других приматов, млекопитающих, включая коммерчески значимых млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки и собаки.
В конкретных вариантах осуществления, композиции составляют с использованием одного или нескольких фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей. В конкретных вариантах осуществления, фармацевтические композиции содержат терапевтически эффективное количество действующего вещества и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители, который можно использовать, включают, но без ограничения, глицерин, воду, солевой раствор, этанол и другие фармацевтически приемлемые солевые растворы, такие как фосфаты и соли органических кислот. Примеры этих и других фармацевтически приемлемых носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 1991, Mack Publication Co., New Jersey.
Носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, использовать использования покрытий, таких как лецитин, посредством поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии, и посредством применения поверхностно-активных веществ. Предотвращения действия микроорганизмов можно достигать посредством различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях, изотонические средства, например, сахара, хлорид натрия, или полиспирты, такие как маннит и сорбит, используют в композиции. Длительной абсорбции пригодных для инъекции композиций можно достигать посредством включения в композицию средства, замедляющего абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.
Составы можно использовать в смесях с общепринятыми наполнителями, т.е. фармацевтически приемлемыми органическими или неорганическими веществами-носителями, пригодными для перорального, парентерального, назального, внутривенного, подкожного, энтерального или любого другого пригодного способа введения, известного в данной области. Фармацевтические препараты можно стерилизовать и, если желательно, смешивать с вспомогательными средствами, например, смазывающими средствами, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими средствами, эмульгаторами, солями для влияния на осмотическое давление, буферами, красителями, вкусовыми и/или ароматическими веществами и т.п. Их можно также объединять, если желательно, с другими действующими веществами, например, другими анальгетическими средствами.
Как применяют в настоящем документе, «дополнительные ингредиенты» включают, но без ограничения, одно или несколько из следующего: наполнители; поверхностно-активные вещества; диспергирующие средства; инертные разбавители; гранулирующие и дезинтегрирующие средства; связующие вещества; смазывающие средства; подсластители; придающие вкус средства; окрашивающие средства; консерванты; физиологически разлагаемые композиции, такие как желатин; водные носители и растворители; масляные носители и растворители; суспендирующие средства; диспергирующие или увлажняющие средства; эмульгаторы, смягчающие средства; буферы; соли; загустители; наполнители; эмульгаторы; антиоксиданты; антибиотики; противогрибковые средства; стабилизаторы; и фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы. Другие «дополнительные ингредиенты», которые можно включать в фармацевтические композиции по изобретению, известны в данной области и описаны, например, в Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, содержание которого приведено в настоящем документе путем ссылки.
Композиция по изобретению может содержать консервант от приблизительно 0,005% до 2,0% от общей массы композиции. Консервант используют для предотвращения порчи в случае воздействия загрязняющих примесей из окружающей среды. Примеры консервантов, которые можно использовать по изобретению, включают, но без ограничения, выбранные из группы, состоящей из бензилового спирта, сорбиновой кислоты, парабенов, имидомочевины и их комбинаций. Конкретный консервант представляет собой комбинацию приблизительно 0,5%-2,0% бензилового спирта и 0,05%-0,5% сорбиновой кислоты.
Композиция может включать антиоксидант и хелатирующий агент, ингибирующие деградацию соединения. Иллюстративные антиоксиданты для некоторых соединений представляют собой BHT, BHA, альфа-токоферол и аскорбиновую кислоту в иллюстративном диапазоне приблизительно 0,01% - 0,3%, например, BHT в диапазоне 0,03% - 0,1% по массе от общей массы композиции. Хелатирующий агент может присутствовать в количестве в диапазоне от 0,01% до 0,5% по массе от общей массы композиции. Иллюстративные хелатирующие агенты включают соли эдетаты (например,диэдетат натрия) и лимонную кислоту в диапазоне по массе приблизительно 0,01% - 0,20%, например, в диапазоне 0,02% - 0,10% по массе от общей массы композиции. Хелатирующий агент можно использовать для образования хелатов с ионами металла в композиции, которые могут являться неблагоприятными для срока хранения состава. В то время как BHT и диэдетат натрия представляют собой иллюстративный антиоксидант и хелатирующий агент, соответственно, для некоторых соединений, их можно заменять другими пригодными и эквивалентными антиоксидантами и хелатирующими агентами, как известно специалистам в данной области.
Жидкие суспензии можно получать с использованием общепринятых способов получения суспензии активного ингредиента в водном или масляном носителе. Водные носители включают, например, воду и изотонический солевой раствор. Масляные носители включают, например, миндальное масло, жирные сложные эфиры, этиловый спирт, растительные масла, такие как арахисовое, оливковое, кунжутное или кокосовое масло, фракционированные растительные масла, и минеральные масла, такие как вазелиновое масло. Жидкие суспензии могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая, но без ограничения, суспендирующие средства, диспергирующие или увлажняющие средства, эмульгаторы, смягчающие средства, консерванты, буферы, соли, придающие вкус средства, окрашивающие средства и подсластители. Масляные суспензии могут дополнительно включать загуститель. Известные суспендирующие средства включают, но без ограничения, сорбитовый сироп, гидрогенизированные пищевые жиры, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь, гуммиарабик, и производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, гидроксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу). Известные диспергирующие или увлажняющие средства включают, но без ограничения, природные фосфатиды, такие как лецитин, продукты конденсации алкиленоксида с жирной кислотой, с алифатическим спиртом с длинной цепью, с неполным сложным эфиром, являющимся производным жирной кислоты и гексита, или с неполным сложным эфиром, являющимся производным жирной кислоты и гекситангидрида (например, полиоксиэтиленстеарат, гептадекаэтиленоксицетанол, моноолеат полиоксиэтиленсорбита и моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, соответственно). Известные эмульгаторы включают, но без ограничения, лецитин и гуммиарабик. Известные консерванты включают, но без ограничения, метил-, этил- или н-пропил-пара-гидроксибензоаты, аскорбиновую кислоту и сорбиновую кислоту. Известные подсластители включают, например, глицерин, пропиленгликоль, сорбит, сахарозу и сахарин. Известные загустители для масляных суспензий включают, например, пчелиный воск, твердый парафин и цетиловый спирт.
Жидкие растворы активного ингредиента в водных или масляных растворителях можно получать в основном таким же способом, что и жидкие суспензии, где первичное отличие заключается в том, что активный ингредиент растворяют, а не суспендируют, в растворителе. Как применяют в настоящем документе, «масляная» жидкость представляет собой жидкость, которая содержит жидкую молекулу, содержащую углерод, и которая обладает менее полярным характером, чем вода. Жидкие растворы фармацевтической композиции по изобретению могут содержать каждый из компонентов, описанных по отношению к жидким суспензиям, понятно, что суспендирующие средства не обязательно способствуют растворению активного ингредиента в растворителе. Водные растворители включают, например, воду и изотонический солевой раствор. Масляные растворители включают, например, миндальное масло, жирные сложные эфиры, этиловый спирт, растительные масла, такие как арахисовое, оливковое, кунжутное или кокосовое масло, фракционированные растительные масла и минеральные масла, такие как вазелиновое масло.
Порошкообразные и гранулированные составы фармацевтического препарата по изобретению можно получать с использованием известных способов. Такие составы можно вводить непосредственно субъекту, используя, например, для формования таблеток, для заполнения капсул или для получения водных или масляных суспензий или растворов посредством добавления к ним водного или масляного носителя. Каждый из этих составов может дополнительно содержать одно или несколько из диспергирующего или увлажняющего средства, суспендирующего средства и консерванта. Дополнительные наполнители, такие как средства для наполнения и подсластители, придающие вкус или окрашивающие средства, также можно включать в эти составы.
Фармацевтическую композицию по изобретению можно также получать, упаковывать или продавать в форме эмульсии масло-в-воде или эмульсии вода-в-масле. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, такое как оливковое или арахисовое масло, минеральное масло, такое как вазелиновое масло, или их комбинацию. Такие композиции могут дополнительно содержать один или несколько эмульгаторов, таких как природные камеди, такие как гуммиарабик или трагакантовая камедь, природные фосфатиды, такие как фосфатид соевый лецитин или лецитин, сложные эфиры или неполные сложные эфиры, являющиеся производными жирных кислот и гекситангидридов, например, моноолеат сорбитана, и продукты конденсации таких неполных сложных эфиров с этиленоксидом, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Эти эмульсии могут также содержать дополнительные ингредиенты, включая, например, подсластители или придающие вкус средства.
Способы пропитывания или покрытия материала химической композицией известны в данной области, и включают, но без ограничения, способы расположения или связывания химической композиции на поверхности, способы включения химической композиции в структуру материала в ходе синтеза материала (т.е. такого как физиологически деградируемый материал), и способы абсорбции водного или масляного раствора или суспензии на абсорбирующем материале, с последующим высушиванием или без него.
Введение/Дозирование
На режим введения может влиять то, что составляет эффективное количество. Например, несколько дробных доз, так же как отсроченных доз, можно вводить ежесуточно или последовательно, или дозу можно вводить посредством постоянной инфузии, или можно проводить болюсную инъекцию. Кроме того, дозы терапевтических составов можно пропорционально увеличивать или уменьшать, как показано по требованиям терапевтической или профилактической ситуации.
Введение композиций по настоящему изобретению пациенту, такому как млекопитающее, такое как человек, можно проводить с использованием известных способов, в дозах и в течение периодов времени, эффективных для лечения заболевания или нарушения у пациента. Эффективное количество терапевтического соединения, необходимое для достижения терапевтического эффекта, можно менять в зависимости от таких факторов, как активность конкретного применяемого соединения; время введения; скорость выведения соединения; длительность лечения; другие лекарственные средства, соединения или материалы, используемые в комбинации с соединением; состояние заболевания или нарушения, возраст, пол, масса, состояние, общее состояние здоровья и предшествующий анамнез пациента, подвергаемого лечению, и подобных факторов, хорошо известных в области медицины. Режимы дозирования можно корректировать для получения оптимального терапевтического ответа. Например, несколько дробных доз можно вводить ежесуточно, или дозу можно пропорционально уменьшать, как показано по требованиям терапевтической ситуации. Неограничивающий пример эффективного диапазона дозирования для терапевтического соединения по изобретению составляет от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг массы тела/в сутки. Специалист в данной области способен исследовать соответствующие факторы и провести определение эффективного количества терапевтического соединения без излишних экспериментов.
Соединение можно вводить животному настолько часто, как несколько раз ежесуточно, или его можно вводить менее часто, например, один раз в сутки, один раз в неделю, один раз в каждые две недели, один раз в месяц или даже менее часто, например, один раз в каждые несколько месяцев или даже один раз в год, или менее. Понятно, что количество соединения, дозированного на сутки, можно вводить, в неограничивающих примерах, каждые сутки, через сутки, каждые 2 суток, каждые 3 суток, каждые 4 суток или каждые 5 суток. Например, при введении через сутки, введение дозы 5 мг в сутки можно начать в понедельник, с введением первой последующей дозы 5 мг в сутки в среду, с введением второй последующей дозы 5 мг в сутки в пятницу, и так далее. Частота дозирования ясно очевидна специалисту в данной области и зависит от любого количества факторов, например, но без ограничения, типа и тяжести заболевания, подвергаемого лечению, и типа и возраста животного.
Фактические уровни дозирования активных ингредиентов в фармацевтических композициях по этому изобретению можно менять, так чтобы получать количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желательного терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсичности для пациента.
Лечащий врач, например, терапевт или ветеринар, являясь обычным специалистом в данной области, может легко определять и назначать необходимое эффективное количество фармацевтической композиции. Например, терапевт или ветеринар может начинать дозирование соединения по изобретению, применяемого в фармацевтической композиции, с уровней, более низких, чем необходимо для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до достижения желательного эффекта.
В конкретных вариантах осуществления, является особенно преимущественным составлять соединение в единичной дозированной форме для простоты введения и равномерности дозирования. Единичная дозированная форма, как применяют в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных дозированных форм для пациентов, подлежащих лечению; где каждая единица содержит предопределенное количество терапевтического соединения, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в объединении с необходимым фармацевтическим носителем. Единичные дозированные формы по изобретению вызваны необходимостью и напрямую зависят от (a) уникальных характеристик терапевтического соединения и конкретного терапевтического эффекта, подлежащего достижению, и (b) ограничений, присущих области получения/составления такого терапевтического соединения для лечения заболевания или нарушения у пациента.
В конкретных вариантах осуществления, композиции по изобретению вводят пациенту в дозах, лежащих в диапазоне от одного до пяти раз в сутки, или более. В других вариантах осуществления, композиции по изобретению вводят пациенту в диапазонах дозирования, которые включают, но без ограничения, от одного раза в каждые сутки, каждые двое суток, каждые трое суток, до одного раза в неделю, и одного раза в каждые две недели. Специалисту в данной области ясно очевидно, что частота введения различных комбинаций композиций по изобретению меняется от субъекта к субъекту в зависимости от множества факторов, включая, но без ограничения, возраст, заболевание или нарушение, подлежащее лечению, пол, общее состояние здоровья и другие факторы. Таким образом, изобретение не следует рассматривать как ограниченное каким-либо конкретным режимом дозирования, и точную дозу и композицию, подлежащую введению любому пациенту, определяет лечащий терапевт, принимая во внимание все другие факторы относительно пациента.
Соединения по изобретению для введения могут присутствовать в диапазоне от приблизительно 1 мкг до приблизительно 7500 мг, от приблизительно 20 мкг до приблизительно 7000 мг, от приблизительно 40 мкг до приблизительно 6500 мг, от приблизительно 80 мкг до приблизительно 6000 мг, от приблизительно 100 мкг до приблизительно 5500 мг, от приблизительно 200 мкг до приблизительно 5000 мг, от приблизительно 400 мкг до приблизительно 4000 мг, от приблизительно 800 мкг до приблизительно 3000 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 2500 мг, от приблизительно 2 мг до приблизительно 2000 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 10 мг до приблизительно 750 мг, от приблизительно 20 мг до приблизительно 600 мг, от приблизительно 30 мг до приблизительно 500 мг, от приблизительно 40 мг до приблизительно 400 мг, от приблизительно 50 мг до приблизительно 300 мг, от приблизительно 60 мг до приблизительно 250 мг, от приблизительно 70 мг до приблизительно 200 мг, от приблизительно 80 мг до приблизительно 150 мг, и включая все без исключения целые или дробные шаги между ними.
.
В некоторых вариантах осуществления, доза соединения по изобретению составляет от приблизительно 0,5 мкг и до приблизительно 5000 мгВ некоторых вариантах осуществления, доза соединения по изобретению, используемая в композициях, описанных в настоящем документе, составляет менее приблизительно 5000 мг, или менее приблизительно 4000 мг, или менее приблизительно 3000 мг, или менее приблизительно 2000 мг, или менее приблизительно 1000 мг, или менее приблизительно 800 мг, или менее приблизительно 600 мг, или менее приблизительно 500 мг, или менее приблизительно 200 мг, или менее приблизительно 50 мг. Подобным образом, в некоторых вариантах осуществления, доза второго соединения, как описано в настоящем документе, составляет менее приблизительно 1000 мг, или менее приблизительно 800 мг, или менее приблизительно 600 мг, или менее приблизительно 500 мг, или менее приблизительно 400 мг, или менее приблизительно 300 мг, или менее приблизительно 200 мг, или менее приблизительно 100 мг, или менее приблизительно 50 мг, или менее приблизительно 40 мг, или менее приблизительно 30 мг, или менее приблизительно 25 мг, или менее приблизительно 20 мг, или менее приблизительно 15 мг, или менее приблизительно 10 мг, или менее приблизительно 5 мг, или менее приблизительно 2 мг, или менее приблизительно 1 мг, или менее приблизительно 0,5 мг, и включая все без исключения целые или дробные шаги между ними.
В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к упакованной фармацевтической композиции, содержащей контейнер, содержащий терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, отдельно или в комбинации с вторым лекарственным средством; и инструкции для использования соединения для лечения, предотвращения или уменьшения одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения у пациента.
Термин «контейнер» включает любой резервуар для содержания фармацевтической композиции. Например, в конкретных вариантах осуществления, контейнер представляет собой упаковку, содержащую фармацевтическую композицию. В других вариантах осуществления, контейнер не представляет собой упаковку, содержащую фармацевтическую композицию, т.е. контейнер представляет собой резервуар, такой как коробка или флакон, содержащий упакованную фармацевтическую композицию или не упакованную фармацевтическую композицию и инструкции для применения фармацевтической композиции. Кроме того, способы упаковки хорошо известны в данной области. Следует понимать, что инструкции для применения фармацевтической композиции могут содержаться в упаковке, содержащей фармацевтическую композицию, и таким образом, инструкции находятся в тесной функциональной взаимосвязи с упакованным продуктом. Однако следует понимать, что инструкции могут содержать информацию относительно способности соединения осуществлять намеченную для него функцию, например, лечение, предотвращение или уменьшение заболевания или нарушения у пациента.
Способы введения
Способы введения любой из композиций по изобретению включают ингаляционное, пероральное, назальное, ректальное, парентеральное, подъязычное, чрескожное, трансмукозальное (например, подъязычное, лингвальное, (транс) буккальное, (транс)уретральное, вагинальное (например, транс- и перивагинальное), (интра)назальное, и (транс)ректальное), внутрипузырное, внутрилегочное, интрадуоденальное, внутрижелудочное, интратекальное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, внутриартериальное, внутривенное, внутрибронхиальное, ингаляционное и местное введение.
Пригодные композиции и лекарственные формы включают, например, таблетки, капсулы, каплеты, пилюли, желатиновые капсулы, лепешки, дисперсии, суспензии, растворы, сиропы, гранулы, бусины, чрескожные пластыри, гели, порошки, пеллеты, мягкие массы, пастилки, кремы, пасты, пластыри, лосьоны, диски, суппозитории, жидкие спреи для назального или перорального введения, сухие порошкообразные или аэрозольные составы для ингаляции, композиции и составы для внутрипузырного введения и т.п. Следует понимать, что составы и композиции, которые можно использовать по настоящему изобретению, не ограничены конкретными составами и композициями, описанными в настоящем документе.
Пероральное введение
Для перорального введения, особенно подходящими являются таблетки, драже, жидкости, капли, суппозитории, или капсулы, каплеты и желатиновые капсулы. Другие составы, пригодные для перорального введения, включают, но без ограничения, порошкообразные или гранулированные составы, водную или масляную суспензию, водный или масляный раствор, пасту, гель, зубную пасту, ополаскиватель для полости рта, покрытие, жидкость для полоскания полости рта или эмульсию. Композиции, предназначенные для перорального применения, можно получать любым способом, известным в данной области, и такие композиции могут содержать одно или несколько средств, выбранных из группы, состоящей из инертных, нетоксичных фармацевтических наполнителей, пригодных для изготовления таблеток. Такие наполнители включают, например, инертный разбавитель, такой как лактоза; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, такие как кукурузный крахмал; связующие вещества, такие как крахмал; и смазывающие средства, такие как стеарат магния.
Таблетки могут являться непокрытыми, или их можно покрывать с использованием известных способов для достижения замедленной дезинтеграции в желудочно-кишечном тракте субъекта, таким образом, обеспечивая замедленное высвобождение и абсорбцию активного ингредиента. В качестве примера, такой материал, как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, можно использовать для покрытия таблеток. В качестве дополнительного примера, таблетки можно покрывать с использованием способов, описанных в Патентах США No. 4256108; 4160452; и 4265874 для формирования таблеток с осмотически контролируемым высвобождением. Таблетки могут дополнительно содержать подсластитель, придающее вкус средство, окрашивающее средство, консервант или какую-либо их комбинацию для предоставления фармацевтически хорошо разработанного и приятного на вкус препарата.
Твердые капсулы, содержащие активный ингредиент, можно получать с использованием физиологически деградируемой композиции, такой как желатин. Такие твердые капсулы содержат активный ингредиент, и могут, кроме того, содержать дополнительные ингредиенты, включая, например, инертный твердый разбавитель, такой как карбонат кальция, фосфат кальция или каолин.
Мягкие желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент, можно получать с использованием физиологически деградируемой композиции, такой как желатин. Такие мягкие капсулы содержат активный ингредиент, который может быть смешан с водной или масляной средой, такой как арахисовое масло, вазелиновое масло или оливковое масло.
Для перорального введения, соединения по изобретению могут находиться в форме таблеток или капсул, полученных общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как связующие вещества; наполнители; смазывающие средства; дезинтегрирующие средства; или увлажняющие средства. Если желательно, таблетки можно покрывать с использованием пригодных способов и покрывающих материалов, таких как системы покрывающих пленок OPADRY™, доступные от Colorcon, West Point, Pa. (например, OPADRY™ типа OY, типа OYC, органического растворимого в кишечнике типа OY-P, водного растворимого в кишечнике типа OY-A, типа OY-PM и белый OPADRY™, 32K18400).
Жидкий препарат для перорального введения может находиться в форме растворов, сиропов или суспензий. Жидкие препараты можно получать общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитовый сироп, метилцеллюлоза или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгатор (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры или этиловый спирт); и консерванты (например, метил- или пропил-пара-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Жидкие составы фармацевтической композиции по изобретению, пригодные для перорального введения, можно получать, упаковывать или продавать либо в жидкой форме, либо в форме сухого продукта, предназначенного для разведения водой или другим пригодным носителем перед использованием.
Таблетку, содержащую активный ингредиент, можно, например, получать посредством прессования или формования активного ингредиента, необязательно, с одним или несколькими дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получать посредством прессования, в подходящем устройстве, активного ингредиента в свободно текучей форме, такого как порошкообразный или гранулированный препарат, необязательно, смешанного с одним или несколькими из связывающего вещества, смазывающего вещества, наполнителя, поверхностно-активного вещества и дезинтегрирующего средства. Формованные таблетки можно получать посредством формования, в подходящем устройстве, смеси активного ингредиента, фармацевтически приемлемого носителя, и по меньшей мере достаточного количества жидкости для увлажнения смеси. Фармацевтически приемлемые наполнители, используемые при изготовлении таблеток, включают, но без ограничения, инертные разбавители, гранулирующие и дезинтегрирующие средства, связующие вещества и смазывающие средства. Известные диспергирующие средства включают, но без ограничения, картофельный крахмал и гликолят натрия крахмала. Известные поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения, лаурилсульфат натрия. Известные разбавители включают, но без ограничения, карбонат кальция, карбонат натрия, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, фосфат кальция, гидрофосфат кальция и фосфат натрия. Известные гранулирующие и дезинтегрирующие средства включают, но без ограничения, кукурузный крахмал и альгиновую кислоту. Известные связующие вещества включают, но без ограничения, желатин, гуммиарабик, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон и гидроксипропилметилцеллюлозу. Известные смазывающие средства включают, но без ограничения, стеарат магния, стеариновую кислоту, диоксид кремния и тальк.
Способы грануляции хорошо известны в области фармацевтики для модификации исходных порошков или других материалов в форме частиц активного ингредиента. Порошки, как правило, смешивают с связующим материалом в более крупные постоянные свободно текучие агломераты или гранулы, что обозначают как «грануляцию». Например, способы «влажной» грануляции с использованием растворителя, как правило, отличаются тем, что порошки объединяют со связующим материалом и увлажняют водой или органическим растворителем в условиях, приводящих к формированию влажной гранулированной массы, из которой необходимо выпаривать растворитель.
Грануляция из расплава, как правило, состоит в использовании материалов, которые являются твердыми или полутвердыми при комнатной температуре (т.е. обладающими относительно низким диапазоном температуры размягчения или плавления), чтобы способствовать грануляции порошкообразных или других материалов, в основном в отсутствие добавленной воды или других жидких растворителей. Твердые вещества с низкой температурой плавления, при нагревании до температуры в диапазоне температуры плавления, разжижаются, чтобы действовать в качестве связующего или среды для грануляции. Разжиженное твердое вещество распределяется по поверхности порошкообразных материалов, с которыми оно контактирует, и при охлаждении, формирует твердую гранулированную массу, в которой исходные материалы связаны вместе. Затем полученный гранулированный расплав можно подвергать прессованию в таблетки или инкапсулировать для получения пероральной лекарственной формы. Грануляция из расплава улучшает скорость растворения и биодоступность активного (т.е. лекарственного средства) посредством формирования твердой дисперсии или твердого раствора.
В Патенте США No. 5169645 описаны поддающиеся прямому прессованию воскосодержащие гранулы, обладающие улучшенными свойствами текучести. Гранулы получают, когда воски смешивают в расплаве с конкретными улучшающими текучесть добавками, с последующим охлаждением и грануляцией смеси. В конкретных вариантах осуществления, только собственно воск плавится в расплавленной комбинации воска (восков) и добавки (добавок), и в других случаях, как воск(и), так и добавка (добавки), плавятся.
Настоящее изобретение относится также к многослойной таблетке, содержащей слой, обеспечивающий замедленное высвобождение одного или нескольких соединений, которое можно использовать в способах по изобретению, и дополнительный слой, обеспечивающий немедленное высвобождение одного или нескольких соединений, которые можно использовать в способах по изобретению. С использованием смеси воска/pH-чувствительного полимера, можно получать нерастворимую в желудке композицию, в которой заключен активный ингредиент, обеспечивающую его замедленное высвобождение.
Парентеральное введение
Как применяют в настоящем документе, «парентеральное введение» фармацевтической композиции включает любой способ введения, характеризующийся физическим прокалыванием ткани субъекта и введением фармацевтической композиции через прокол в ткань. Парентеральное введение, таким образом, включает, но без ограничения, введение фармацевтической композиции посредством инъекции композиции, посредством введения композиции через хирургический разрез, посредством введения композиции через проникающую в ткань не хирургическую рану, и т.п. В частности, предусматривают, что парентеральное введение включает, но без ограничения, подкожную, внутривенную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутригрудинную инъекции и способы диалитической инфузии почек.
Составы фармацевтической композиции, пригодные для парентерального введения, содержат активный ингредиент в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная вода или стерильный изотонический солевой раствор. Такие составы можно получать, упаковывать или продавать в форме, пригодной для болюсного введения или для непрерывного введения. Пригодные для инъекции составы можно получать, упаковывать или продавать в единичной дозированной форме, например, в ампулах или в контейнерах для множественных доз, содержащих консервант. Составы для парентерального введения включают, но без ограничения, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных носителях, пасты, и имплантируемые составы с замедленным высвобождением или биоразлагаемые составы. Такие составы могут, кроме того, содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая, но без ограничения, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие средства. В одном варианте осуществления состава для парентерального введения, активный ингредиент представлен в сухой (т.е. порошкообразной или гранулированной) форме для разведения пригодным носителем (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением разведенной композиции.
фармацевтические композиции можно получать, упаковывать или продавать в форме стерильных пригодных для инъекции водных или масляных суспензии или раствора. Эти суспензию или раствор можно составлять в соответствии с известным уровнем техники, и они могут содержать, в дополнение к активному ингредиенту, дополнительные ингредиенты, такие как диспергирующие средства, увлажняющие средства, или суспендирующие средства, описанные в настоящем документе. Такие стерильные пригодные для инъекции растворы можно получать с использованием нетоксичного пригодного для парентерального введения разбавителя или растворителя, например, такого как вода или 1,3-бутандиол. Другие пригодные разбавители и растворители включают, но без ограничения, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и жирные масла, такие как синтетические моно- или диглицериды. Другие пригодные для парентерального введения составы, которые можно использовать, включают составы, содержащие активный ингредиент в микрокристаллической форме, в липосомном препарате, или в качестве компонента биоразлагаемой полимерной системы. Композиции для замедленного высвобождения или имплантации могут содержать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсия, ионообменная смола, умеренно растворимый полимер или умеренно растворимая соль.
Дополнительные формы для введения
Дополнительные лекарственные формы по этому изобретению включают лекарственные формы, как описано в Патентах США No. 6340475, 6488962, 6451808, 5972389, 5582837 и 5007790. Дополнительные лекарственные формы по этому изобретению включают также лекарственные формы, как описано в Патентных заявках США No. 20030147952, 20030104062, 20030104053, 20030044466, 20030039688 и 20020051820. Дополнительные лекарственные формы по этому изобретению включают также лекарственные формы, как описано в Заявках PCT No. WO 03/35041, WO 03/35040, WO 03/35029, WO 03/35177, WO 03/35039, WO 02/96404, WO 02/32416, WO 01/97783, WO 01/56544, WO 01/32217, WO 98/55107, WO 98/11879, WO 97/47285, WO 93/18755 и WO 90/11757.
Составы и системы для доставки лекарственных средств с контролируемым высвобождением
Составы фармацевтической композиции по изобретению с контролируемым или замедленным высвобождением можно получать с использованием общепринятых способов. В некоторых случаях, лекарственные формы, подлежащие использованию, можно предоставлять с замедленным или контролируемым высвобождением одного или нескольких их активных ингредиентов с использованием, например, гидропропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем, многослойных покрытий, микрочастиц, липосом или микросфер, или их комбинаций, для обеспечения желательного профиля высвобождения в различных соотношениях. Пригодные составы с контролируемым высвобождением, известные специалистам в данной области, включая описанные в настоящем документе, можно легко выбирать для использования с фармацевтическими композициями по изобретению. Таким образом, однократные единичные дозированные формы, пригодные для перорального введения, такие как таблетки, капсулы, желатиновые капсулы и каплеты, адаптированные для контролируемого высвобождения, охвачены настоящим изобретением.
Большинство фармацевтических продуктов с контролируемым высвобождением имеют общей целью улучшение терапии лекарственным средством по сравнению с тем, чего достигают посредством ее неконтролируемых эквивалентов. В идеале, применение оптимально разработанного препарата с контролируемым высвобождением для медицинской помощи характеризуется минимальным количеством лекарственного средства, применяемым для лечения или контроля состояния за минимальное количество времени. Преимущества составов с контролируемым высвобождением включают продленную активность лекарственного средства, уменьшенную частоту дозирования и улучшенное соблюдение режима пациентом. Кроме того, составы с контролируемым высвобождением можно использовать, чтобы влиять на время начала действия или другие характеристики, такие как уровень лекарственного средства в крови, и таким образом, можно влиять на возникновение побочных эффектов.
Большинство составов с контролируемым высвобождением разработано для первоначального высвобождения количества лекарственного средства, которое незамедлительно оказывает желательный терапевтический эффект, и постепенного и непрерывного высвобождения других количеств лекарственного средства для поддержания этого уровня терапевтического эффекта в течение длительного периода времени. Для поддержания этого постоянного уровня лекарственного средства в организме, лекарственное средство должно высвобождаться из лекарственной формы с такой скоростью, чтобы заменять количество лекарственного средства, подвергаемое метаболизму и выведению из организма.
Контролируемое высвобождение активного ингредиента можно стимулировать посредством различных индукторов, например, pH, температуры, ферментов, воды или других физиологических состояний или соединений. Термин «компонент с контролируемым высвобождением» в контексте настоящего изобретения определяют в настоящем документе как соединение или соединения, включая, но без ограничения, полимеры, полимерные матрицы, гели, проницаемые мембраны, липосомы или микросферы, или их комбинацию, облегчающие контролируемое высвобождение активного ингредиента.
В конкретных вариантах осуществления, составы по настоящему изобретению могут представлять собой, но без ограничения, составы с краткосрочным, быстро прекращаемым, так же, как с контролируемым, например, замедленным высвобождением, отсроченным высвобождением и пульсирующим высвобождением.
Термин замедленное высвобождение применяют в его общепринятом смысле для обозначения состава лекарственного средства, обеспечивающего постепенное высвобождение лекарственного средства в течение продолжительного периода времени, и это может, хотя и необязательно, приводить к по существу постоянным уровням лекарственного средства в крови в течение продолжительного периода времени. Период времени может являться настолько длительным, как месяц или более, и должен представлять собой высвобождение, более длительное, чем для такого же количества средства, введенного в болюсной форме. Для замедленного высвобождения, соединения можно составлять с пригодным полимерным или гидрофобным материалом, придающим соединениям свойства замедленного высвобождения. Таким образом, соединения для применения в способе по изобретению, можно вводить в форме микрочастиц, например, посредством инъекции или в форме облаток или дисков посредством имплантации. В конкретных вариантах осуществления изобретения, соединения по изобретению вводят пациенту, отдельно или в комбинации с другим лекарственным средством, с использованием состава с замедленным высвобождением.
Термин «отсроченное высвобождение» применяют в настоящем документе в его общепринятом смысле для обозначения состава лекарственного средства, обеспечивающего первоначальное высвобождение лекарственного средства после некоторой задержки после введения лекарственного средства и это может, хотя и необязательно, включать задержку от приблизительно 10 минут вплоть до приблизительно 12 часов. Термин «пульсирующее высвобождение» применяют в настоящем документе в его общепринятом смысле для обозначения состава лекарственного средства, обеспечивающего высвобождение лекарственного средства таким образом, чтобы обеспечивать пульсирующие профили лекарственного средства в плазме после введения лекарственного средства. Термин «немедленное высвобождение» применяют в его общепринятом смысле для обозначения состава лекарственного средства, обеспечивающего высвобождение лекарственного средства немедленно после введения лекарственного средства.
Как применяют в настоящем документе, краткосрочный относится к любому периоду времени вплоть до и включая приблизительно 8 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 4 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 2 часа, приблизительно 1 час, приблизительно 40 минут, приблизительно 20 минут или приблизительно 10 минут, и любой или все без исключения целые или дробные шаги между ними, после введения лекарственного средства.
Как применяют в настоящем документе, быстро прекращаемый относится к любому периоду времени вплоть до и включая приблизительно 8 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 4 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 2 часа, приблизительно 1 час, приблизительно 40 минут, приблизительно 20 минут или приблизительно 10 минут, и любой или все без исключения целые или дробные шаги между ними, после введения лекарственного средства.
Специалисту в данной области известны, или он может установить с использованием не более чем общепринятых экспериментов, многочисленные эквиваленты конкретных способов, вариантов осуществления, пунктов формулы изобретения и примеров, описанных в настоящем документе. Такие эквиваленты рассматривают как входящие в объем этого изобретения и защищенные пунктами прилагаемой к нему формулы изобретения. Например, следует понимать, что модификации в условиях реакций, включая, но без ограничения, периоды времени реакции, размер/объем реакционной смеси и экспериментальные реагенты, такие как растворители, катализаторы, давление, атмосферные условия, например, атмосферу азота и восстанавливающие/окисляющие средства, с использованием известных в данной области альтернатив и с использованием не более, чем общепринятых экспериментов, включены в объем настоящей заявки.
Следует понимать, что где бы ни были в настоящем документе представлены значения и диапазоны, все значения и диапазоны, охваченные этими значениями и диапазонами, понимают как включенные в объем настоящего изобретения. Более того, все значения, которые попадают в эти диапазоны, так же, как верхние или нижние пределы диапазона значений, также предусмотрены по настоящей заявке.
В следующих примерах дополнительно проиллюстрированы аспекты настоящего изобретения. Однако, они никаким образом не являются ограничением объяснений или описания настоящего изобретения, как указано в настоящем документе.
Примеры
Изобретение в настоящее время описано по отношению к следующим примерам. Эти примеры представлены только с целью иллюстрации, и изобретение не является ограниченным этими примерами, но вместо этого включает все варианты, которые становятся очевидными в результате объяснений, представленных в настоящем документе.
Способы и материалы:
Модель GACI на мышах ENPP1-asj:
in utero
Гетерозиготные племенные пары ENPP1-asj/+ поддерживали на «корме для ускорения роста» (TD00.442, Harlan Laboratories, Madison WI) на протяжении всего эксперимента для получения пар сибсов ENPP1-WT и ENPP1-asj/asj, подвергаемых воздействию корма для ускорения роста . Детенышей генотипировали на сутки 8 и отлучали от матери на сутки 21. После отлучения от матери, пары сибсов разделяли по экспериментальным когортам, и всех экспериментальных животных поддерживали на корме для ускорения роста до завершения исследования.
Дизайн ENPP1-Fc:
Модифицированные NPP1 человека и мыши (человек: номер доступа в NCBI NP_006199; мышь: номер доступа в NCBI NP_03839), модифицированные для экспрессии растворимого, рекомбинантного белка, сливали с IgG1 посредством субклонирования в плазмиды pFUSE-hIgG1-Fc1 или pFUSE-mIgG1-Fc1 (InvivoGen, San Diego CA), соответственно.
Продукция белка:
Встряхиваемые колбы:
2
Проводилистабильные трансфекции посредством ENPP1-Fc клеток HEK293 с отбором под действием зеоцина, и адгерентные клетки HEK293 адаптировали для роста в суспензии. Адаптированные клетки использовали для засева жидких культур для роста в среде FreeStyle (Gibco #12338-018) в встряхиваемых колбах при 37°C и 5% CO, встряхиваемых при 120 об/мин при высокой влажности. Культуру постепенно размножали до желательного намеченного объема, и затем поддерживали в течение других 12 суток для накопления внеклеточного белка. Во время фазы поддержания, культуры дополняли CD EfficientFeed C AGT (Gibco #A13275-05) для усиления продукции белка.
Биореактор:
2
Клетки размножали в 10-литровом биореакторе с оборудованием для подачи растворенного кислорода и контроля pH. Растворенный кислород поддерживали при 40% насыщения воздуха посредством подачи в культуру смеси воздуха и кислорода, не превышающей 3 литров в минуту, при скорости перемешивания 80 об/мин. pH контролировали при 7,4 посредством барботирования CO, когда pH превышал 7,4. За выращиванием культуры следили посредством измерения количества клеток, жизнеспособности клеток, концентраций глюкозы и лактата. Конечные выходы для обоих способов продукции составляли приблизительно 5 мг очищенного ENPP1-Fc на литр культуры.
Очистка белка:
2
Жидкие культуры центрифугировали при 4300 x g в течение 15 мин, и супернатанты фильтровали через мембрану 0,2 мкм и концентрировали в тангенциальном потоке с использованием кассеты Pellicon3 0,11 м Ultracell 30 кДа (Millipore, Billerica MA). Затем концентрированный супернатант очищали посредством комбинации хроматографических способов в многостадийном процессе. Эти способы осуществляют последовательно, и они могут включать любое из следующего: аффинная хроматография с белком A или белком G, катионообменная хроматография, анионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, хроматография гидрофобного обмена, жидкостная хроматография под высоким давлением (HPLC), стадии преципитации, стадии экстракции, стадии лиофилизации и/или стадии кристаллизации. С использованием любых из этих стадий в сериях, специалист в области химии белка может очищать описанные химические соединения до такой гомогенности, чтобы не присутствовало полос загрязняющих белков в окрашенном серебром геле (в качестве неограничивающего примера, ФИГ. 10). Затем полученные образцы белка тестировали с использованием набора для количественного хромогенного определения эндотоксинов Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (cat. 88282) для подтверждения того, что они все свободны от эндотоксина.
Энзимология:
2
2
2
Стационарный гидролиз АТФ посредством NPP1 человека определяли посредством HPLC. Кратко, ферментативные реакции запускали посредством добавления 10 нМ NPP1 к различным концентрациям АТФ в реакционном буфере, содержащем 20 мМ Tris, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 4,5 мМ KCl, 14 мкМ ZnCl, 1 мМ MgCl и 1 мМ CaCl. В различных временных точках, 50 мкл реакционного раствора отбирали, и реакцию останавливали равным объемом 3M муравьиной кислоты. Раствор после остановки реакции наносили на колонку C-18 (5 мкм 250 X 4,6 мм) (Higgins Analytical), уравновешенную раствором 15 мМ ацетата аммония (pH 6,0), и элюировали градиентом от 0% до 20% метанола. Субстрат и продукты мониторировали посредством поглощения УФ при 259 нм и оценивали количественно в соответствии с интегрированием соответствующих им пиков и стандартных кривых.
Носитель:
2
2
mENPP1-Fc составляли с носителем, так чтобы объем доставляемого носителя составлял 16 мкл носителя/грамм массы тела. Носитель состоял из 10X PBS americanBio (исходный раствор# AB11072), разведенного до 1× свободной от эндотоксинов водой и дополненного 14 мкМ CaCl и 14 мкМ ZnCl.
Дозирование:
Животным вводили дозы либо носителя, либо ENPP1-Fc мыши (mENPP1-Fc), составленные в носителе. Мышам вводили ежесуточные дозы с использованием подкожных инъекций, начиная на сутки 14 при уровнях дозирования 500 е.а./кг mENPP1-Fc.
Активность фермента
:
et al.
K
k
M
кат.
-1
В конкретных вариантах осуществления, ферменты, которые можно использовать по изобретению, обладают ферментативной активностью с константами Михаэлиса-Ментен, как описано в Albright, , 2015, Nature Comm. 6:10006 ( ~2 мкМ для гидролиза АТФ;  3,46 (±0,44)с).
Количественная оценка PPi в плазме:
Животных ENPP1-WT и животных, подвергнутых введению дозы ENPP1-asj/asj, подвергали смертельному забору крови из ретроорбитальной области с использованием гепаринизированных микропипеток, и кровь немедленно переносили в обработанные гепарином пробирки eppendorf и помещали на влажный лед. Образцы центрифугировали при 4°C в предварительно охлажденной микроцентрифуге при 4000 об/мин в течение 5 минут, и плазму собирали и разводили в одном объеме 50 мМ Tris-ацетата pH=8,0 и замораживали при -80°C. Количественную оценку PPi в сыворотке проводили, как описано ранее (Cheung & Suhadolnik, 1977, Anal Biochem 83:61-63).
Сканирование микро-CT:
Получение изображений in vivo с
PYP:
99
m
99m
Средство для визуализации костей Tc-пирофосфат (Pharmalucence, Inc) оценивали в когортах животных с использованием гибридной системы для получения изображений доклинических микроSPECT/CT с двойными точечными коллиматорами 1 мм (X-SPECT, Gamma Medica-Ideas). Каждому животному инъецировали ip 2-5 мКи (74-185 МБк) радиоактивно меченного индикатора и визуализировали через 1-1,5 час после инъекции. Сканы CT (512 проекций при 50 кВп, 800 мкА и кратность увеличения 1,25) получали для анатомической совместной локализации с изображением SPECT. Изображения SPECT получали при 180° с вращением головки коллиматора против часовой стрелки, 32 проекции, 60 секунд на проекцию с ROR 7,0 см, FOV 8,95 см и энергетическое окно 140 кэВ±20. Изображения CT реконструировали с использованием программного обеспечения FLEX X-O CT (Gamma Medica-Ideas) с использованием алгоритма обратной проекции с фильтрацией. Изображения SPECT реконструировали с использованием программного обеспечения FLEX SPECT (5 итераций, 4 подгруппы) и затем сливали с изображениями CT и анализировали с использованием программного обеспечения AMIRA и собственного скрипта вне сети Интернет. Данные корректировали по распаду и инъецированной дозе для получения % инъецированной дозы (%ID).
Количественная оценка поглощения
PYP
:
99
m
99m
Для сканирования мышей с PYP, животных визуализировали через два часа после инъекции. Полученные сканы SPECT импортировали в программное обеспечение для обработки изображений ImageJ от NIH, и ROI очерчивали вокруг головы каждого животного (органа-мишени) и всего организма. Процент инъецированной активности (PIA), часто обозначаемый как «процент инъецированной дозы» (%ID), рассчитывали посредством сравнения отношения счета в голове к счету во всем организме, и выражали как %ID для получения такого показателя, как аффинность, с которой радиоактивный индикатор поглощается в ROI (голове). Общий счет в каждом скане принимали за показатель инъецированной дозы во всем организме.
Последовательности:
Аминокислотная последовательность NPP1 (номер доступа в NCBI NP_006199) (SEQ ID NO:1)
MERDGCAGGGSRGGEGGRAPREGPAGNGRDRGRSHAAEAPGDPQAAASLLAPMDVGEEPLEKAARARTAKDPNTYKVLSLVLSVCVLTTILGCIFGLKPSCAKEVKSCKGRCFERTFGNCRCDAACVELGNCCLDYQETCIEPEHIWTCNKFRCGEKRLTRSLCACSDDCKDKGDCCINYSSVCQGEKSWVEEPCESINEPQCPAGFETPPTLLFSLDGFRAEYLHTWGGLLPVISKLKKCGTYTKNMRPVYPTKTFPNHYSIVTGLYPESHGIIDNKMYDPKMNASFSLKSKEKFNPEWYKGEPIWVTAKYQGLKSGTFFWPGSDVEINGIFPDIYKMYNGSVPFEERILAVLQWLQLPKDERPHFYTLYLEEPDSSGHSYGPVSSEVIKALQRVDGMVGMLMDGLKELNLHRCLNLILISDHGMEQGSCKKYIYLNKYLGDVKNIKVIYGPAARLRPSDVPDKYYSFNYEGIARNLSCREPNQHFKPYLKHFLPKRLHFAKSDRIEPLTFYLDPQWQLALNPSERKYCGSGFHGSDNVFSNMQALFVGYGPGFKHGIEADTFENIEVYNLMCDLLNLTPAPNNGTHGSLNHLLKNPVYTPKHPKEVHPLVQCPFTRNPRDNLGCSCNPSILPIEDFQTQFNLTVAEEKIIKHETLPYGRPRVLQKENTICLLSQHQFMSGYSQDILMPLWTSYTVDRNDSFSTEDFSNCLYQDFRIPLSPVHKCSFYKNNTKVSYGFLSPPQLNKNSSGIYSEALLTTNIVPMYQSFQVIWRYFHDTLLRKYAEERNGVNVVSGPVFDFDYDGRCDSLENLRQKRRVIRNQEILIPTHFFIVLTSCKDTSQTPLHCENLDTLAFILPHRTDNSESCVHGKHDSSWVEELLMLHRARITDVEHITGLSFYQQRKEPVSDILKLKTHLPTFSQED
Аминокислотная последовательность NPP2 (номер доступа в NCBI NP_001124335) (SEQ ID NO:2)
MARRSSFQSCQIISLFTFAVGVNICLGFTAHRIKRAEGWEEGPPTVLSDSPWTNISGSCKGRCFELQEAGPPDCRCDNLCKSYTSCCHDFDELCLKTARGWECTKDRCGEVRNEENACHCSEDCLARGDCCTNYQVVCKGESHWVDDDCEEIKAAECPAGFVRPPLIIFSVDGFRASYMKKGSKVMPNIEKLRSCGTHSPYMRPVYPTKTFPNLYTLATGLYPESHGIVGNSMYDPVFDATFHLRGREKFNHRWWGGQPLWITATKQGVKAGTFFWSVVIPHERRILTILQWLTLPDHERPSVYAFYSEQPDFSGHKYGPFGPEMTNPLREIDKIVGQLMDGLKQLKLHRCVNVIFVGDHGMEDVTCDRTEFLSNYLTNVDDITLVPGTLGRIRSKFSNNAKYDPKAIIANLTCKKPDQHFKPYLKQHLPKRLHYANNRRIEDIHLLVERRWHVARKPLDVYKKPSGKCFFQGDHGFDNKVNSMQTVFVGYGSTFKYKTKVPPFENIELYNVMCDLLGLKPAPNNGTHGSLNHLLRTNTFRPTMPEEVTRPNYPGIMYLQSDFDLGCTCDDKVEPKNKLDELNKRLHTKGSTEAETRKFRGSRNENKENINGNFEPRKERHLLYGRPAVLYRTRYDILYHTDFESGYSEIFLMPLWTSYTVSKQAEVSSVPDHLTSCVRPDVRVSPSFSQNCLAYKNDKQMSYGFLFPPYLSSSPEAKYDAFLVTNMVPMYPAFKRVWNYFQRVLVKKYASERNGVNVISGPIFDYDYDGLHDTEDKIKQYVEGSSIPVPTHYYSIITSCLDFTQPADKCDGPLSVSSFILPHRPDNEESCNSSEDESKWVEELMKMHTARVRDIEHLTSLDFFRKTSRSYPEILTLKTYLHTYESEI
Аминокислотная последовательность NPP4 (номер доступа в NCBI AAH18054.1) (SEQ ID NO:3)
mkllvillfsglitgfrsdsssslppklllvsfdgfradylknyefphlqnfikegvlvehvknvfitktfpnhysivtglyeeshgivansmydavtkkhfsdsndkdpfwwneavpiwvtnqlqenrssaaamwpgtdvpihdtissyfmnynssvsfeerlnnitmwlnnsnppvtfatlyweepdasghkygpedkenmsrvlkkiddligdlvqrlkmlglwenlnviitsdhgmtqcsqdrlinldscidhsyytlidlspvaailpkinrtevynklkncsphmnvylkedipnrfyyqhndriqpiilvadegwtivlnessqklgdhgydnslpsmhpflaahgpafhkgykhstinivdiypmmchilglkphpnngtfghtkcllvdqwcinlpeaiaivigsllvltmltcliiimqnrlsvprpfsrlqlqeddddplig
(DSS)
(SEQ ID NO:4),
n
где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10
(ESS)
(SEQ ID NO:5),
n
где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10
(RQQ)
(SEQ ID NO:6),
n
где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10
(KR)
(SEQ ID NO:7),
n
где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10
R
(SEQ ID NO:8),
m
где m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 15
DSSSEEKFLRRIGRFG (SEQ ID NO:9)
EEEEEEEPRGDT (SEQ ID NO:10)
APWHLSSQYSRT (SEQ ID NO:11)
STLPIPHEFSRE (SEQ ID NO:12)
VTKHLNQISQSY (SEQ ID NO:13)
E
(SEQ ID NO:14),
m
где m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 15
Аминокислотная последовательность NPP121 (SEQ ID NO:15)
1 M E R D G C A G G G S R G G E G G R A P
21 R E G P A G N G R D R G R S H A A E A P
41 G D P Q A A A S L L A P M D V G E E P L
L
61 E K A A R A R T A K D P N T Y K I I S
F T F A V G V N I C L G**F T A
G L K
81  P S
101 C A K E V K S C K G R C F E R T F G N C
121 R C D A A C V E L G N C C L D Y Q E T C
141 I E P E H I W T C N K F R C G E K R L T
161 R S L C A C S D D C K D K G D C C I N Y
181 S S V C Q G E K S W V E E P C E S I N E
201 P Q C P A G F E T P P T L L F S L D G F
221 R A E Y L H T W G G L L P V I S K L K K
241 C G T Y T K N M R P V Y P T K T F P N H
261 Y S I V T G L Y P E S H G I I D N K M Y
281 D P K M N A S F S L K S K E K F N P E W
301 Y K G E P I W V T A K Y Q G L K S G T F
321 F W P G S D V E I N G I F P D I Y K M Y
341 N G S V P F E E R I L A V L Q W L Q L P
361 K D E R P H F Y T L Y L E E P D S S G H
381 S Y G P V S S E V I K A L Q R V D G M V
401 G M L M D G L K E L N L H R C L N L I L
421 I S D H G M E Q G S C K K Y I Y L N K Y
441 L G D V K N I K V I Y G P A A R L R P S
461 D V P D K Y Y S F N Y E G I A R N L S C
481 R E P N Q H F K P Y L K H F L P K R L H
501 F A K S D R I E P L T F Y L D P Q W Q L
521 A L N P S E R K Y C G S G F H G S D N V
541 F S N M Q A L F V G Y G P G F K H G I E
561 A D T F E N I E V Y N L M C D L L N L T
581 P A P N N G T H G S L N H L L K N P V Y
601 T P K H P K E V H P L V Q C P F T R N P
621 R D N L G C S C N P S I L P I E D F Q T
641 Q F N L T V A E E K I I K H E T L P Y G
661 R P R V L Q K E N T I C L L S Q H Q F M
681 S G Y S Q D I L M P L W T S Y T V D R N
701 D S F S T E D F S N C L Y Q D F R I P L
721 S P V H K C S F Y K N N T K V S Y G F L
741 S P P Q L N K N S S G I Y S E A L L T T
761 N I V P M Y Q S F Q V I W R Y F H D T L
781 L R K Y A E E R N G V N V V S G P V F D
801 F D Y D G R C D S L E N L R Q K R R V I
821 R N Q E I L I P T H F F I V L T S C K D
841 T S Q T P L H C E N L D T L A F I L P H
861 R T D N S E S C V H G K H D S S W V E E
881 L L M L H R A R I T D V E H I T G L S F
901 Y Q Q R K E P V S D I L K L K T H L P T
Q E D
921 F S
Одиночное подчеркивание
Двойное подчеркивание
: остатки, замененные на остатки 1-27 NPP2, чтобы обеспечить расщепление в перемещенном положении (**); : белок NPP1 (начало и конец).
Аминокислотная последовательность NPP121-Fc (SEQ ID NO:16)
1 M E R D G C A G G G S R G G E G G R A P
21 R E G P A G N G R D R G R S H A A E A P
41 G D P Q A A A S L L A P M D V G E E P L
L
61 E K A A R A R T A K D P N T Y K I I S
F T F A V G V N I C L G**F T A
G L K
81  P S
101 C A K E V K S C K G R C F E R T F G N C
121 R C D A A C V E L G N C C L D Y Q E T C
141 I E P E H I W T C N K F R C G E K R L T
161 R S L C A C S D D C K D K G D C C I N Y
181 S S V C Q G E K S W V E E P C E S I N E
201 P Q C P A G F E T P P T L L F S L D G F
221 R A E Y L H T W G G L L P V I S K L K K
241 C G T Y T K N M R P V Y P T K T F P N H
261 Y S I V T G L Y P E S H G I I D N K M Y
281 D P K M N A S F S L K S K E K F N P E W
301 Y K G E P I W V T A K Y Q G L K S G T F
321 F W P G S D V E I N G I F P D I Y K M Y
341 N G S V P F E E R I L A V L Q W L Q L P
361 K D E R P H F Y T L Y L E E P D S S G H
381 S Y G P V S S E V I K A L Q R V D G M V
401 G M L M D G L K E L N L H R C L N L I L
421 I S D H G M E Q G S C K K Y I Y L N K Y
441 L G D V K N I K V I Y G P A A R L R P S
461 D V P D K Y Y S F N Y E G I A R N L S C
481 R E P N Q H F K P Y L K H F L P K R L H
501 F A K S D R I E P L T F Y L D P Q W Q L
521 A L N P S E R K Y C G S G F H G S D N V
541 F S N M Q A L F V G Y G P G F K H G I E
561 A D T F E N I E V Y N L M C D L L N L T
581 P A P N N G T H G S L N H L L K N P V Y
601 T P K H P K E V H P L V Q C P F T R N P
621 R D N L G C S C N P S I L P I E D F Q T
641 Q F N L T V A E E K I I K H E T L P Y G
661 R P R V L Q K E N T I C L L S Q H Q F M
681 S G Y S Q D I L M P L W T S Y T V D R N
701 D S F S T E D F S N C L Y Q D F R I P L
721 S P V H K C S F Y K N N T K V S Y G F L
741 S P P Q L N K N S S G I Y S E A L L T T
761 N I V P M Y Q S F Q V I W R Y F H D T L
781 L R K Y A E E R N G V N V V S G P V F D
801 F D Y D G R C D S L E N L R Q K R R V I
821 R N Q E I L I P T H F F I V L T S C K D
841 T S Q T P L H C E N L D T L A F I L P H
861 R T D N S E S C V H G K H D S S W V E E
881 L L M L H R A R I T D V E H I T G L S F
901 Y Q Q R K E P V S D I L K L K T H L P T
Q E D
D K T H T C P P C P A P
921 F S  L I N
941 E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M
961 I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E
981 V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R
1001 E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D
1021 W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I
1041 E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P
1061 P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F
1081 Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K
1101 T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V
1121 D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L
1141 H N H Y T Q K S L S L S P G K
Одиночное подчеркивание
Двойное подчеркивание
Жирный шрифт
: остатки, замененные на остатки 1-27 NPP2, чтобы обеспечить расщепление в перемещенном положении (**); : белок NPP1 (начало и конец); : hIgG1 (Fc).
Аминокислотная последовательность NPP71 (SEQ ID NO:17)
MRGPAVLLTV ALATLLAPGA GAGLK
1 PSCAK EVKSCKGRCF ERTFGNCRCD
51 AACVELGNCC LDYQETCIEP EHIWTCNKFR CGEKRLTRSL CACSDDCKDK
101 GDCCINYSSV CQGEKSWVEE PCESINEPQC PAGFETPPTL LFSLDGFRAE
151 YLHTWGGLLP VISKLKKCGT YTKNMRPVYP TKTFPNHYSI VTGLYPESHG
201 IIDNKMYDPK MNASFSLKSK EKFNPEWYKG EPIWVTAKYQ GLKSGTFFWP
251 GSDVEINGIF PDIYKMYNGS VPFEERILAV LQWLQLPKDE RPHFYTLYLE
301 EPDSSGHSYG PVSSEVIKAL QRVDGMVGML MDGLKELNLH RCLNLILISD
351 HGMEQGSCKK YIYLNKYLGD VKNIKVIYGP AARLRPSDVP DKYYSFNYEG
401 IARNLSCREP NQHFKPYLKH FLPKRLHFAK SDRIEPLTFY LDPQWQLALN
451 PSERKYCGSG FHGSDNVFSN MQALFVGYGP GFKHGIEADT FENIEVYNLM
501 CDLLNLTPAP NNGTHGSLNH LLKNPVYTPK HPKEVHPLVQ CPFTRNPRDN
551 LGCSCNPSIL PIEDFQTQFN LTVAEEKIIK HETLPYGRPR VLQKENTICL
601 LSQHQFMSGY SQDILMPLWT SYTVDRNDSF STEDFSNCLY QDFRIPLSPV
651 HKCSFYKNNT KVSYGFLSPP QLNKNSSGIY SEALLTTNIV PMYQSFQVIW
701 RYFHDTLLRK YAEERNGVNV VSGPVFDFDY DGRCDSLENL RQKRRVIRNQ
751 EILIPTHFFI VLTSCKDTSQ TPLHCENLDT LAFILPHRTD NSESCVHGKH
Q
801 DSSWVEELLM LHRARITDVE HITGLSFYQQ RKEPVSDILK LKTHLPTFS
ED
851
Одиночное подчеркивание
Двойное подчеркивание
: NPP7; : белок NPP1 (начало и конец).
Аминокислотная последовательность NPP71-Fc (SEQ ID NO:18)
MRGPAVLLTV ALATLLAPGA GAGLK
1 PSCAK EVKSCKGRCF ERTFGNCRCD
51 AACVELGNCC LDYQETCIEP EHIWTCNKFR CGEKRLTRSL CACSDDCKDK
101 GDCCINYSSV CQGEKSWVEE PCESINEPQC PAGFETPPTL LFSLDGFRAE
151 YLHTWGGLLP VISKLKKCGT YTKNMRPVYP TKTFPNHYSI VTGLYPESHG
201 IIDNKMYDPK MNASFSLKSK EKFNPEWYKG EPIWVTAKYQ GLKSGTFFWP
251 GSDVEINGIF PDIYKMYNGS VPFEERILAV LQWLQLPKDE RPHFYTLYLE
301 EPDSSGHSYG PVSSEVIKAL QRVDGMVGML MDGLKELNLH RCLNLILISD
351 HGMEQGSCKK YIYLNKYLGD VKNIKVIYGP AARLRPSDVP DKYYSFNYEG
401 IARNLSCREP NQHFKPYLKH FLPKRLHFAK SDRIEPLTFY LDPQWQLALN
451 PSERKYCGSG FHGSDNVFSN MQALFVGYGP GFKHGIEADT FENIEVYNLM
501 CDLLNLTPAP NNGTHGSLNH LLKNPVYTPK HPKEVHPLVQ CPFTRNPRDN
551 LGCSCNPSIL PIEDFQTQFN LTVAEEKIIK HETLPYGRPR VLQKENTICL
601 LSQHQFMSGY SQDILMPLWT SYTVDRNDSF STEDFSNCLY QDFRIPLSPV
651 HKCSFYKNNT KVSYGFLSPP QLNKNSSGIY SEALLTTNIV PMYQSFQVIW
701 RYFHDTLLRK YAEERNGVNV VSGPVFDFDY DGRCDSLENL RQKRRVIRNQ
751 EILIPTHFFI VLTSCKDTSQ TPLHCENLDT LAFILPHRTD NSESCVHGKH
Q
801 DSSWVEELLM LHRARITDVE HITGLSFYQQ RKEPVSDILK LKTHLPTFS
ED
DKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
851 LIN
901 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
951 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
1001 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
1051 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
Одиночное подчеркивание
Двойное подчеркивание
Жирный шрифт
: NPP7; : белок NPP1 (начало и конец); : hIgG1 (Fc).
Аминокислотная последовательность (NPP71, лишенный N-концевых GLK NPP1) (SEQ ID NO:19)
MRGPAVLLTV ALATLLAPGA GA
1  PSCAK EVKSCKGRCF ERTFGNCRCD
51 AACVELGNCC LDYQETCIEP EHIWTCNKFR CGEKRLTRSL CACSDDCKDK
101 GDCCINYSSV CQGEKSWVEE PCESINEPQC PAGFETPPTL LFSLDGFRAE
151 YLHTWGGLLP VISKLKKCGT YTKNMRPVYP TKTFPNHYSI VTGLYPESHG
201 IIDNKMYDPK MNASFSLKSK EKFNPEWYKG EPIWVTAKYQ GLKSGTFFWP
251 GSDVEINGIF PDIYKMYNGS VPFEERILAV LQWLQLPKDE RPHFYTLYLE
301 EPDSSGHSYG PVSSEVIKAL QRVDGMVGML MDGLKELNLH RCLNLILISD
351 HGMEQGSCKK YIYLNKYLGD VKNIKVIYGP AARLRPSDVP DKYYSFNYEG
401 IARNLSCREP NQHFKPYLKH FLPKRLHFAK SDRIEPLTFY LDPQWQLALN
451 PSERKYCGSG FHGSDNVFSN MQALFVGYGP GFKHGIEADT FENIEVYNLM
501 CDLLNLTPAP NNGTHGSLNH LLKNPVYTPK HPKEVHPLVQ CPFTRNPRDN
551 LGCSCNPSIL PIEDFQTQFN LTVAEEKIIK HETLPYGRPR VLQKENTICL
601 LSQHQFMSGY SQDILMPLWT SYTVDRNDSF STEDFSNCLY QDFRIPLSPV
651 HKCSFYKNNT KVSYGFLSPP QLNKNSSGIY SEALLTTNIV PMYQSFQVIW
701 RYFHDTLLRK YAEERNGVNV VSGPVFDFDY DGRCDSLENL RQKRRVIRNQ
751 EILIPTHFFI VLTSCKDTSQ TPLHCENLDT LAFILPHRTD NSESCVHGKH
Q
801 DSSWVEELLM LHRARITDVE HITGLSFYQQ RKEPVSDILK LKTHLPTFS
E
851 D
Одиночное подчеркивание
Двойное подчеркивание
: NPP7; : белок NPP1 (начало и конец) (первые 3-аминокислоты на N-конце NPP1, GLK, исключены).
Аминокислотная последовательность (NPP71, лишенный N-концевых GLK NPP1)-Fc (SEQ ID NO:20)
MRGPAVLLTV ALATLLAPGA GA
1  PSCAK EVKSCKGRCF ERTFGNCRCD
51 AACVELGNCC LDYQETCIEP EHIWTCNKFR CGEKRLTRSL CACSDDCKDK
101 GDCCINYSSV CQGEKSWVEE PCESINEPQC PAGFETPPTL LFSLDGFRAE
151 YLHTWGGLLP VISKLKKCGT YTKNMRPVYP TKTFPNHYSI VTGLYPESHG
201 IIDNKMYDPK MNASFSLKSK EKFNPEWYKG EPIWVTAKYQ GLKSGTFFWP
251 GSDVEINGIF PDIYKMYNGS VPFEERILAV LQWLQLPKDE RPHFYTLYLE
301 EPDSSGHSYG PVSSEVIKAL QRVDGMVGML MDGLKELNLH RCLNLILISD
351 HGMEQGSCKK YIYLNKYLGD VKNIKVIYGP AARLRPSDVP DKYYSFNYEG
401 IARNLSCREP NQHFKPYLKH FLPKRLHFAK SDRIEPLTFY LDPQWQLALN
451 PSERKYCGSG FHGSDNVFSN MQALFVGYGP GFKHGIEADT FENIEVYNLM
501 CDLLNLTPAP NNGTHGSLNH LLKNPVYTPK HPKEVHPLVQ CPFTRNPRDN
551 LGCSCNPSIL PIEDFQTQFN LTVAEEKIIK HETLPYGRPR VLQKENTICL
601 LSQHQFMSGY SQDILMPLWT SYTVDRNDSF STEDFSNCLY QDFRIPLSPV
651 HKCSFYKNNT KVSYGFLSPP QLNKNSSGIY SEALLTTNIV PMYQSFQVIW
701 RYFHDTLLRK YAEERNGVNV VSGPVFDFDY DGRCDSLENL RQKRRVIRNQ
751 EILIPTHFFI VLTSCKDTSQ TPLHCENLDT LAFILPHRTD NSESCVHGKH
Q
801 DSSWVEELLM LHRARITDVE HITGLSFYQQ RKEPVSDILK LKTHLPTFS
ED
DKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
851 LIN
901 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
951 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
1001 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
1051 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
Одиночное подчеркивание
Двойное подчеркивание
Жирный шрифт
: NPP7; : белок NPP1 (начало и конец) (первые 3-аминокислоты на N-конце NPP1 исключены); : hIgG1 (Fc).
Аминокислотная последовательность NPP121-ALB (SEQ ID NO:21)
MERDGCAGGGSRGGEGGRAPREGPAGNGRDRGRSHAAEAPGDPQAAASLLAPMDVGEEPLEKAARARTAKDPNTYKIIS
RSGSGGS
MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALARSWSHPQFEK
LFTFAVGVNICLG
FTAGLK
**PSCAKEVKSCKGRCFERTFGNCRCDAACVELGNCCLDYQETCIEPEHIWTCNKFRCGEKRLTRSLCACSDDCKDKGDCCINYSSVCQGEKSWVEEPCESINEPQCPAGFETPPTLLFSLDGFRAEYLHTWGGLLPVISKLKKCGTYTKNMRPVYPTKTFPNHYSIVTGLYPESHGIIDNKMYDPKMNASFSLKSKEKFNPEWYKGEPIWVTAKYQGLKSGTFFWPGSDVEINGIFPDIYKMYNGSVPFEERILAVLQWLQLPKDERPHFYTLYLEEPDSSGHSYGPVSSEVIKALQRVDGMVGMLMDGLKELNLHRCLNLILISDHGMEQGSCKKYIYLNKYLGDVKNIKVIYGPAARLRPSDVPDKYYSFNYEGIARNLSCREPNQHFKPYLKHFLPKRLHFAKSDRIEPLTFYLDPQWQLALNPSERKYCGSGFHGSDNVFSNMQALFVGYGPGFKHGIEADTFENIEVYNLMCDLLNLTPAPNNGTHGSLNHLLKNPVYTPKHPKEVHPLVQCPFTRNPRDNLGCSCNPSILPIEDFQTQFNLTVAEEKIIKHETLPYGRPRVLQKENTICLLSQHQFMSGYSQDILMPLWTSYTVDRNDSFSTEDFSNCLYQDFRIPLSPVHKCSFYKNNTKVSYGFLSPPQLNKNSSGIYSEALLTTNIVPMYQSFQVIWRYFHDTLLRKYAEERNGVNVVSGPVFDFDYDGRCDSLENLRQKRRVIRNQEILIPTHFFIVLTSCKDTSQTPLHCENLDTLAFILPHRTDNSESCVHGKHDSSWVEELLMLHRARITDVEHITGLSFYQQRKEPVSDILKLKTHLPTFSQED
Жирный курсив
Жирный подчеркнутый шрифт
Жирный шрифт
Одиночное подчеркивание
Двойное подчеркивание
: цитоплазматический и трансмембранный NPP1; : остатки, замененные на остатки 1-27 NPP2, чтобы получить расщепление в перемещенном положении (**); : трансмембранный NPP1; Обычный шрифт: Внеклеточный домен NPP1; : Линкер; : Альбумин
Аминокислотная последовательность (NPP71, лишенный N-концевых GLK NPP1)-ALB (SEQ ID NO:22)
MRGPAVLLTVALATLLAPGAGA
MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALARSWSHPQFEK
RSGSGGS
PSCAKEVKSCKGRCFERTFGNCRCDAACVELGNCCLDYQETCIEPEHIWTCNKFRCGEKRLTRSLCACSDDCKDKGDCCINYSSVCQGEKSWVEEPCESINEPQCPAGFETPPTLLFSLDGFRAEYLHTWGGLLPVISKLKKCGTYTKNMRPVYPTKTFPNHYSIVTGLYPESHGIIDNKMYDPKMNASFSLKSKEKFNPEWYKGEPIWVTAKYQGLKSGTFFWPGSDVEINGIFPDIYKMYNGSVPFEERILAVLQWLQLPKDERPHFYTLYLEEPDSSGHSYGPVSSEVIKALQRVDGMVGMLMDGLKELNLHRCLNLILISDHGMEQGSCKKYIYLNKYLGDVKNIKVIYGPAARLRPSDVPDKYYSFNYEGIARNLSCREPNQHFKPYLKHFLPKRLHFAKSDRIEPLTFYLDPQWQLALNPSERKYCGSGFHGSDNVFSNMQALFVGYGPGFKHGIEADTFENIEVYNLMCDLLNLTPAPNNGTHGSLNHLLKNPVYTPKHPKEVHPLVQCPFTRNPRDNLGCSCNPSILPIEDFQTQFNLTVAEEKIIKHETLPYGRPRVLQKENTICLLSQHQFMSGYSQDILMPLWTSYTVDRNDSFSTEDFSNCLYQDFRIPLSPVHKCSFYKNNTKVSYGFLSPPQLNKNSSGIYSEALLTTNIVPMYQSFQVIWRYFHDTLLRKYAEERNGVNVVSGPVFDFDYDGRCDSLENLRQKRRVIRNQEILIPTHFFIVLTSCKDTSQTPLHCENLDTLAFILPHRTDNSESCVHGKHDSSWVEELLMLHRARITDVEHITGLSFYQQRKEPVSDILKLKTHLPTFSQED
Двойное подчеркивание
Одиночное подчеркивание
Жирный шрифт
: NPP7; Обычный текст: NPP1; : последовательность спейсера; : альбумин
IISLFTFAVGVNICLGFTA (SEQ ID NO:23)
NPP51 Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:24)
MTSKFLLVSFILAALSLSTTFSLQ
PSCAKEVKSCKGRCFERTFSNCRCDAACVSLGNCCLDFQETCVEPTHIWTCNKFRCGEKRLSRFVCSCADDCKTHNDCCINYSSVCQDKKSWVEETCESIDTPECPAEFESPPTLLFSLDGFRAEYLHTWGGLLPVISKLKNCGTYTKNMRPMYPTKTFPNHYSIVTGLYPESHGIIDNKMYDPKMNASFSLKSKEKFNPLWYKGQPIWVTANHQEVKSGTYFWPGSDVEIDGILPDIYKVYNGSVPFEERILAVLEWLQLPSHERPHFYTLYLEEPDSSGHSHGPVSSEVIKALQKVDRLVGMLMDGLKDLGLDKCLNLILISDHGMEQGSCKKYVYLNKYLGDVNNVKVVYGPAARLRPTDVPETYYSFNYEALAKNLSCREPNQHFRPYLKPFLPKRLHFAKSDRIEPLTFYLDPQWQLALNPSERKYCGSGFHGSDNLFSNMQALFIGYGPAFKHGAEVDSFENIEVYNLMCDLLGLIPAPNNGSHGSLNHLLKKPIYNPSHPKEEGFLSQCPIKSTSNDLGCTCDPWIVPIKDFEKQLNLTTEDVDDIYHMTVPYGRPRILLKQHRVCLLQQQQFLTGYSLDLLMPLWASYTFLSNDQFSRDDFSNCLYQDLRIPLSPVHKCSYYKSNSKLSYGFLTPPRLNRVSNHIYSEALLTSNIVPMYQSFQVIWHYLHDTLLQRYAHERNGINVVSGPVFDFDYDGRYDSLEILKQNSRVIRSQEILIPTHFFIVLTSCKQLSETPLECSALESSAYILPHRPDNIESCTHGKRESSWVEELLTLHRARVTDVELITGLSFYQDRQESVSELLRLKTHLPIFSQED
Подчеркивание
: NPP5; Обычный текст: NPP1
Аминокислотная последовательность NPP51-ALB (SEQ ID NO:25)
MTSKFLLVSFILAALSLSTTFSLQ
MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALARSWSHPQFEK
GGSGGS
PSCAKEVKSCKGRCFERTFSNCRCDAACVSLGNCCLDFQETCVEPTHIWTCNKFRCGEKRLSRFVCSCADDCKTHNDCCINYSSVCQDKKSWVEETCESIDTPECPAEFESPPTLLFSLDGFRAEYLHTWGGLLPVISKLKNCGTYTKNMRPMYPTKTFPNHYSIVTGLYPESHGIIDNKMYDPKMNASFSLKSKEKFNPLWYKGQPIWVTANHQEVKSGTYFWPGSDVEIDGILPDIYKVYNGSVPFEERILAVLEWLQLPSHERPHFYTLYLEEPDSSGHSHGPVSSEVIKALQKVDRLVGMLMDGLKDLGLDKCLNLILISDHGMEQGSCKKYVYLNKYLGDVNNVKVVYGPAARLRPTDVPETYYSFNYEALAKNLSCREPNQHFRPYLKPFLPKRLHFAKSDRIEPLTFYLDPQWQLALNPSERKYCGSGFHGSDNLFSNMQALFIGYGPAFKHGAEVDSFENIEVYNLMCDLLGLIPAPNNGSHGSLNHLLKKPIYNPSHPKEEGFLSQCPIKSTSNDLGCTCDPWIVPIKDFEKQLNLTTEDVDDIYHMTVPYGRPRILLKQHRVCLLQQQQFLTGYSLDLLMPLWASYTFLSNDQFSRDDFSNCLYQDLRIPLSPVHKCSYYKSNSKLSYGFLTPPRLNRVSNHIYSEALLTSNIVPMYQSFQVIWHYLHDTLLQRYAHERNGINVVSGPVFDFDYDGRYDSLEILKQNSRVIRSQEILIPTHFFIVLTSCKQLSETPLECSALESSAYILPHRPDNIESCTHGKRESSWVEELLTLHRARVTDVELITGLSFYQDRQESVSELLRLKTHLPIFSQED
Двойное подчеркивание
Одиночное подчеркивание
Жирный шрифт
: NPP5; Обычный текст: NPP1; : Спейсер; : Альбумин
Домен Fc IgG человека, Fc (SEQ ID NO:26)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ALB (SEQ ID NO:27)
MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFПНКDFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALARSWSHPQFEK
LIN (SEQ ID NO:28)
GGSGGS (SEQ ID NO:29)
RSGSGGS (SEQ ID NO:30)
Пример 1: Модель PXE на мышах ENPP1-asj
Конкретные полипептиды по изобретению (такие как ENPP1-Fc) тестировали в моделях PXE и остеоартрита (OA) на мышах. У мышей PXE присутствует мутация с потерей функции в несколько раз пересекающем мембрану транспортере ABCC6, сходным образом с людьми с PXE. Мышей ANK использовали в качестве модели OA на млекопитающих.
in utero
Гетерозиготные племенные пары ENPP1-asj/+ поддерживали на «корме для ускорения роста» (TD00.442, Harlan Laboratories, Madison WI) на протяжении всего эксперимента для получения пар сибсов ENPP1-WT и ENPP1-asj/asj, подвергаемых воздействию корма для ускорения роста . Детенышей генотипировали на сутки 8 и отлучали от матери на сутки 21. После отлучения от матери, пары сибсов разделяли по экспериментальным когортам, и всех экспериментальных животных поддерживали на корме для ускорения роста до завершения исследования. Избранные полипептиды по изобретению вводили исследуемым животным, как описано в настоящем документе, и кости анализировали.
et al.
Как проиллюстрировано на ФИГ. 7, мыши как PXE, так и ANK, первоначально обладали низким уровнем PPi, биомаркера, который, как опубликовано в литературе, ответственен за патогенез PXE (Jansen, , 2014, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34:1985-1989).
Двум мышам с PXE вводили дозы ENPP1-Fc в течение одной недели, и средний уровень PPi в плазме у этих животных увеличивался до приблизительно 4 мкМ. Это показывает, что введение полипептидов по изобретению млекопитающим повышает их внеклеточные уровни PPi и излечивает PXE.
et al.
et al.
Способность полипептида повышать уровень PPi являлась неожиданной, поскольку считали, что биологический механизм для низкого уровня PPi ассоциирован с низкими концентрациями АТФ (Jansen, , 2013, PNAS USA 110(50):20206-20211). Фактически, в предшествующей области техники предположили, что коррекция уровня PPi в плазме при PXE является достаточной для лечения заболевания (Jansen, , 2013, PNAS USA 110(50):20206-20211). На основании предшествующей области техники на время изобретения, специалисту в данной области понятно, что фермент ENPP1 неспособен производить PPi в условиях PXE из-за отсутствия достаточного количества субстрата во внеклеточном пространстве. Как показано в настоящем документе, это явно не тот случай.
Пример 2:
При кормлении кормом для ускорения роста, ежесуточные массы мышей ENPP1-asj/asj стали отклоняться от пар сибсов WT на сутки 26, когда мыши ENPP1-asj/asj испытывали событие «отсутствия прибавки массы тела» и начинали терять массу (ФИГ. 1A). После суток 26 у животных ENPP1-asj/asj показана прогрессирующая скованность и уменьшение физической активности. Все животные ENPP1-asj/asj погибли между сутками 35-71, со средней продолжительностью жизни 58 суток (ФИГ. 1G). Присутствие кальцификации у мышей ENPP1-asj/asj и ENPP1-WT оценивали посмертно посредством сканирований микро-CT и гистологических срезов, полученных из сердца, аорты и почек. Приблизительно одна треть мышей ENPP1-asj/asj обладала видимой кальцификацией в их сердцах, и две трети обладали видимой кальцификацией в их аортах, по получению изображений микро-CT (Таблица 2). Эти проценты увеличивались до 100% после гистологического исследования, которое показало также, что многие животные обладали очень сильной почти кольцевой кальцификацией в стенках их аорты (ФИГ. 1D-1E). Гистологическое исследование также выявило, что 100% коронарных артерий обладало кальцификацией артериальной стенки, и что 70% животных обладали очаговыми или сливающимися областями некроза миокарда, соответствующего инфаркту миокарда (ФИГ. 1F-1G). В отличие от этого, у мышей ENPP1-WT не показано ни одной их этих аномалий. Эти обнаружения показывают, что модель на животных воспроизводит GACI у человека, который характеризуется значительной кальцификацией артерий большого и среднего размера и отказом сердца.
in vivo
кат.
Для получения растворимого рекомбинантного ENPP1 для применения , ENPP1 сливали с доменом Fc IgG1 (в дальнейшем в настоящем документе обозначено как ENPP1-Fc, ФИГ. 2B), и слитый белок экспрессировали в стабильной линии клеток млекопитающих (HEK293). Объединенный эффект перевода экспрессии белка из клеток насекомых в клетки млекопитающих и слияние ENPP1 с доменом Fc IgG1 изменяло кинетику Михаэлиса-Ментен посредством увеличения аффинности ENPP1 к субстрату АТФ на более, чем два порядка величины, в то же время уменьшая также K в 3-4 раза (ФИГ. 2C-2E). Отмечено, что активность ENPP1-Fc уменьшается в течение периода 30 суток при хранении при 4°C, но фермент можно замораживать при -80°C, и он сохраняет почти полную активность после размораживания (ФИГ. 2C). Фермент, таким образом, сохраняли в форме замороженного исходного раствора после очистки до необходимости.
плюс
плюс
После очистки, ENPP1-Fc подвергали диализу в PBS, дополненном Zn и Мg (PBS), концентрируя до 5-7 мг/мл, и замораживали при -80°C в аликвотах 200-500 мкл. Аликвоты размораживали непосредственно перед использованием, и специфическую активность раствора доводили до 31,25 е.а./мл (или приблизительно 0,7 мг/мл, в зависимости от препарата) посредством разведения в PBS.
е
Дозирование проводили в соответствии с единицами активности (е.а.) на кг массы животного для учета специфической активности в различных препаратах белка. Специфическая активность фермента менялась для каждого препарата белка, и поскольку отмечено, что клинический ответ очень сильно зависел от специфической активности фермента, препараты белка со специфической активностью менее 40 е.а./мг отбрасывали. Для установления начальных уровней дозирования для исследования с целью подтверждения правильности концепции, проводили исследования с повышением дозы для ограниченного количества животных (1-2 на уровень дозы). В то время как оба человеческий и мышиный вариант ENPP1 использовали в исследованиях с повышением дозы, исследование с целью подтверждения правильности концепции проводили с мышиной изоформой ENPP1-Fc (mENPP1-Fc). Дозирование мышам ENPP1-asj/asj проводили ежесуточно на 14 сутки жизни с использованием подкожных инъекций mENPP1-Fc и еженедельно с использованием внутрибрюшинных (I.P.) инъекций GK 1.5, где последние добавляли, чтобы минимизировать иммунное отторжение рекомбинантного белка. Для подкожного дозирования mEnpp1-Fc при 500 е.а./кг qD показан сильный ранний ответ массы с отсутствием наблюдения кризиса «отсутствия прибавки массы тела», наблюдаемого для животных ENPP1-asj/asj в отсутствие дозирования.
На основании результатов исследований с повышением дозы, в когорте из 8 животных NPP1-asj/asj вводили дозы mNPP1-Fc при 500 е.а./кг qD и еженедельные IP инъекции GK1.5 (ФИГ. 3). В контрольных группах (NPP1-WT+носитель и NPP1-asj/asj+носитель) ежесуточно вводили дозы носителя и еженедельно GK1.5 идентичным способом, как для когорты дозирования, и продолжительность исследования сократили до 55 суток. Все 8 подвергаемых лечению животных ENPP1-asj/asj выжили на полные 55 суток исследования, с очень сильным клиническим ответом у подвергнутых лечению, в то время как медианная продолжительность жизни для не подвергаемых лечению животных NPP1 asj/asj уменьшалась от 58 суток до 37 суток в терапевтическом исследовании, возможно, в результате еженедельных IP инъекций иммуносупрессора GK1.5. Не подвергаемые лечению животные ENPP1-asj/asj также все испытывали кризис отсутствия прибавки массы тела на сутки 26, характеризовались потерей массы и ограничением подвижности, с различным прогрессированием до паралича и смерти в течение следующих 30 суток. Все, кроме одного из не подвергаемых лечению животных ENPP1-asj/asj погибли на протяжении 55-суточного исследования, в то время как все подвергаемые лечению мыши ENPP1-asj/asj, напротив, набирали массу, сравнимую с мышами ENPP1-WT и не проявляли признаки уменьшенной подвижности или скованности.
При завершении исследования, для 100% мышей ENPP1-asj/asj, обрабатываемых носителем, показана кальцификация в их сердцах, аортах и коронарных артериях, и для 77% животных показано гистологическое доказательство инфаркта миокарда (таблица 1). В большинстве случаев это принимало форму небольших областей некроза клеток миокарда и уменьшалось поблизости от области кальцификации сердца (ФИГ. 3C-3D, ФИГ. 4C-4E), но у двух животных (22%) присутствовал обширный инфаркт миокарда по всей толщине свободной стенки правого желудочка (ФИГ. 4C-4D). Миокардиальный фиброз в ткани миокарда, соседней с областями кальцификации коронарных артерий, являлся распространенным обнаружением (ФИГ. 4E), иллюстрирующим то, что ишемия из-за кальцификации коронарных артерий, по-видимому, ответственна за заболевание миокарда. В отличие от этого, ни для одного из животных ENPP1-asj/asj, подвергаемых лечению с использованием ENPP1-Fc, не показано кальцификации сердца, аретрий или аорты по гистологии или посмертной микро-CT (таблица 1, и ФИГ. 3D и 4D).
99m
В дополнение к выживаемости, ежесуточной массе животных и конечной гистологии, ответ на лечение оценивали также посредством посмертных сканирований микро-CT с высоким разрешением для визуализации кальцификации сосудов, концентраций [PPi] в плазме и поглощения Tc99 PPi (PYP) (ФИГ. 5 и таблица 1). Биохимический и физиологический ответ являлся полным, как измерено по всем этим параметрам. Ни для одного из животных WT или животных после лечения ENPP1-asj/asj не отмечено наличие какой-либо кальцификации сосудов по микро-CT, в отличие от очень сильной кальцификации, отмеченной в аортах, коронарных артериях и сердцах из когорты ENPP1-asj/asj без лечения (ФИГ. 5A. Кроме того, концентрации PPi в сыворотке подвергаемых лечению животных ENPP1-asj/asj увеличивались выше, чем у животных WT (приблизительно 30 мкМ у ENPP1-asj/asj после лечения по сравнению с приблизительно 10 мкМ у WT), и намного выше уровней у ENPP1-asj/asj без лечения (< 0,5 мкМ) (ФИГ. 5B). Кроме того, концентрации PPi в сыворотке животных ENPP1-asj/asj после лечения (приблизительно 30 мкМ) увеличивались намного выше, чем уровни у ENPP1-asj/asj без лечения (<0,5 мкМ), и выше, чем у животных WT (about 10 мкМ) (ФИГ. 5B).
99m
99m
99m
99m
99m
in vivo
PYP, средство для визуализации, как правило, применяемое для получения изображений сердца и ремоделирования костной ткани, использовали в качестве маркера ответа на лечение, поскольку можно ожидать, что поглощение PYP у животных, лишенных функционального ENPP1, должно увеличиваться, поскольку у них ожидают наличие уменьшенной [PPi] в плазме и большего количества «открытых» участков связывания PPi в участках эктопической минерализации. Для тестирования этой гипотезы, получение изображений с PYP  проводили еженедельно у животных ENPP1-WT и у животных ENPP1-asj/asj без введения доз, для детекции различий поглощения PYP в парах сибсов (ФИГ. 5C-5D). Анализ поглощения PYP ограничивали головой, содержащей как внутрихрящевые кости (черепа), так и мягкую ткань (вибриссы), которые являются известными участками эктопической кальцификации в моделях этого GACI на мышах. Кроме того, анализ ограничивали головой для упрощения сбора данных, поскольку голова не перекрывается с внутренними органами, для которых показано временное поглощение PYP (такими как мочевой пузырь, сердце и диафрагма) в ходе вращения камеры на 180°, происходящего во время сбора данных.
99m
99m
99m
99m
Еженедельное получение серийных изображений животных ENPP1-WT и животных ENPP1-asj/asj без лечения показало, что процент поглощения инъецированной дозы PYP в черепах был больше у животных ENPP1-asj/asj, чем у животных ENPP1-WT, и изменения поглощения PYP внутри экспериментальных групп значительно не менялись на протяжении хода исследования (ФИГ. 5C-5D). Поглощение PYP у подвергаемых и не подвергаемых лечению животных ENPP1-asj/asj сравнивали в двух временных точках - на сутки 30-35 и при завершении исследования (сутки 50-65). Сравнение этих экспериментальных групп показало, что лечение ENPP1-Fc возвращало поглощение PYP у мышей GACI к уровням WT (ФИГ. 5E-5F), что позволяет предполагать, что лечение ENPP1-Fc является способным прекращать нерегулируемую минерализацию тканей и черепа у мышей ENPP1-asj/asj посредством насыщения открытых участков связывания PPi «холодным» PPi, предположительно, возникающим в результате увеличения концентраций PPi в плазме, индуцированного лекарственным средством.
Таблица 1: Сердечно-сосудистая патология, исследование с целью подтверждения правильности концепции
WT+носитель
asj/asj+носитель
asj/asj+mENPP1-Fc
Кальцификация сердца (CT/гистология)
0/0
55%/100%
0/0
Кальцификация аорты (CT/гистология)
0/0
66%/100%
0/0
Кальцификация коронарных артерий (CT/гистология)
0/0
43%/100%
0/0
% инфаркта миокарда (гистология)
0/0
77%
0
Таблица 2: Сердечно-сосудистая патология, исследование естественного течения заболевания
WT
asj/asj
% кальцификации в сердце (CT/гистология)
0/0
37%/100%
Кальцификация в аорте (CT/гистология)
0/0
62%/ 100%
Кальцификация в коронарных артериях (гистология)
0/0
100%
% инфаркта миокарда (гистология)
0
70%
Пример 3: Экспрессия слитого с альбумином белка
Человеческий сывороточный альбумин (HSA), белок из 585 аминокислот, является ответственным за значительную часть осмотического давления в сыворотке, а также функционирует в качестве носителя эндогенных и экзогенных лигандов. В настоящее время, HSA для клинического применения получают посредством выделения из крови человека. Продукция рекомбинантного HSA (рHSA) в микроорганизмах описана в EP 0 330 451 и EP 0 361 991.
et al.
S. cerevisae
Роль альбумина в качестве молекулы-носителя и его инертный характер являются желательными свойствами для применения в качестве стабилизатора и транспортера полипептидов. Применение альбумина в качестве компонента слитого белка для стабилизации других белков описано в WO 93/15199, WO 93/15200, и EP 0 413 622. Применение N-концевых фрагментов HSA для слияния с полипептидами также описано (EP 0 399 666). Слияния с полипептидом достигают посредством генетической манипуляции, такой как соединение ДНК, кодирующей HSA или его фрагмент, с ДНК, кодирующей полипептид. Подходящего хозяина затем трансформируют или трансфицируют слитыми нуклеотидными последовательностями, аранжированными таким образом в подходящей плазмиде, чтобы экспрессировать слитый полипептид. Nomura, , 1995, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59(3):532-4 предпринимали попытки экспрессии человеческого аполипопротеина E в  в форме белка, слитого с HSA или фрагментами HSA, с использованием пре-последовательности HSA для управления секрецией. В то время как слияние с полноразмерным HSA приводило к секреции низких уровней белка в среду (максимальный выход 6,3 мг на литр), слияние с HSA (1-198) или HSA (1-390) не приводило к секреции в среду.
Человеческий сывороточный альбумин может представлять собой вариант нормального HSA (названного далее в настоящем документе «HSA»). Как применяют в настоящем документе, «варианты» включают вставки, делеции и замены, либо консервативные, либо неконсервативные, где такие изменения по существу не изменяют одно или несколько из онкотических, полезных свойств альбумина связывания лиганда и неиммуногенности. В частности, «варианты» включают природные полиморфные варианты человеческого альбумина и фрагменты человеческого альбумина, например, фрагменты, описанные в EP 0 322 094 (а именно, HA (1-n), где n представляет собой 369-419). Альбумин или гормон роста (GH) может происходить из любого позвоночного, особенно, любого млекопитающего, например, человека, коровы, овцы, свиньи, курицы, или лосося. Части альбумина и GH из слитого белка могут происходить из различных животных.
Под «консервативными заменами» понимают замены внутри таких групп, как Gly/Ala; Val/Ile/Leu; Asp/Glu; Asn/Gln; Ser/Thr; Lys/Arg; и Phe/Tyr. Вариант обычно обладает по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 99%) идентичностью последовательности по длине нормального HSA, имеющего такую же длину, как вариант, и является более идентичным с ним, чем с нормальным HSA любой другой длины, при допущении делеций и вставок, как является общепринятым в данной области. В общем виде, вариант HSA имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот, в некоторых вариантах осуществления имеет длину по меньшей мере 150 аминокислот. Вариант HSA может состоять по меньшей мере из одного полного домена HSA, например, доменов 1 (1-194), 2 (195-387), 3 (388-585), 1+2 (1-387), 2+3 (195-585) или 1+3 (1-194,+388-585), или содержать их. Каждый домен сам состоит из двух гомологичных субдоменов, а именно, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 и 512-585, с гибкими линкерными областями между субдоменами, содержащими остатки Lys106 - Glu199, Glu292 - Val315 и Glu492 - Ala511. В некоторых вариантах осуществления, часть HSA из слитого с NPP1 белка содержит по меньшей мере один субдомен или домен HA или его консервативные модификации.
E. coli
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
Kluyveronmyces lactis
Pichia pastoris
Aspergillus
Известно множество систем для экспрессии, включая бактерии (например,  и ), дрожжи (например, ,  и ), мицелиальные грибы (например, ), клетки растений, клетки животных и клетки насекомых.
Желательный белок можно получать общепринятыми способами, например, с кодирующей последовательности, вставленной в хромосому хозяина, или на свободной плазмиде.
et al
Дрожжи можно трансформировать кодирующей последовательностью желательного белка любым из обычных способов, например, электропорацией. Способы трансформации дрожжей посредством электропорации описаны в Becker & Guarente, 1990, Methods Enzymol. 194:182. Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, содержащие конструкцию ДНК по настоящему изобретению, можно идентифицировать хорошо известными способами. Например, клетки, полученные в результате введения экспрессирующей конструкции, можно выращивать для продукции желательного полипептида. Клетки можно собирать и лизировать, и проверять содержимое их ДНК по присутствию этой ДНК с использованием такого способа, как описанные в Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503 и/или Berent, ., 1985, Biotech 3:208. Альтернативно, присутствие белка в супернатанте можно детектировать с использованием антител.
Полезные плазмидные векторы для дрожжей включают pRS403-406 и pRS413-416, и, как правило, доступны из Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA. Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 представляют собой интегрирующие в дрожжи плазмиды (YIp) и содержат селективные маркеры для дрожжей HIS3, TRP1, LEU2 и URA3. Плазмиды pRS413-416 представляют собой центромерные плазмиды дрожжей (YCp).
Множество способов разработано для функционального соединения ДНК с векторами посредством комплементарных липких концов. Например, комплементарные гомополимерные отрезки моно добавлять к фрагменту ДНК, подлежащему вставке в ДНК вектора. Затем вектор и фрагмент ДНК соединяют посредством водородных связей между комплементарными гомополимерными хвостами для формирования рекомбинантных молекул ДНК.
E. coli
Синтетические линкеры, содержащие один или несколько участков рестрикции, обеспечивают альтернативный способ соединения фрагмента ДНК с вектором. Фрагмент ДНК, полученный посредством расщепления рестрикционными эндонуклеазами, обрабатывают ДНК-полимеразой бактериофага T4 или ДНК-полимеразой I , представляющими собой ферменты, удаляющие выступающие, 3'-одноцепочечные концы с использованием их 3'-5'- экзонуклеолитической активности, и заполняющие отодвинутые 3'-концы с использованием их полимеризующей активности.
Комбинация этих видов активности, таким образом, образует фрагменты ДНК с тупыми концами. Затем фрагменты с тупыми концами инкубируют с большим молярным избытком линкерных молекул в присутствии фермента, способного катализировать лигирование молекул ДНК с тупыми концами, такого как ДНК-лигаза бактериофага T4. Таким образом, продуктами реакции являются фрагменты ДНК, несущие полимерные линкерные последовательности на концах. Затем эти фрагменты ДНК расщепляют с использованием подходящего рестрикционного фермента и лигируют в экспрессирующий вектор, расщепленный ферментом, образующим концы, совместимые с концами фрагмента ДНК.
Синтетические линкеры, содержащие множество участков для рестрикционных эндонуклеаз, являются коммерчески доступными из ряда источников, включая International Biotechnologies Inc, New Haven, CT, USA.
et al.
Желательным способом модификации ДНК в соответствии с изобретением, если, например, необходимо получить варианты HA, является применение полимеразной цепной реакции, как описано в Saiki, , 1988, Science 239:487-491. В этом способе ДНК, подлежащую ферментативной амплификации, фланкируют двумя специфическими олигонуклеотидными праймерами, которые сами встраиваются в амплифицированную ДНК. Специфические праймеры могут содержать участки узнавания рестрикционных эндонуклеаз, которые можно использовать для клонирования в экспрессирующие векторы с использованием способов, известных в данной области.
Дизайн ENPP1-ALB:
Модифицированные NPP1 человека и мыши (человек: номер доступа в NCBI NP_006199; мышь: номер доступа в NCBI NP_03839), модифицированные для экспрессии растворимого, рекомбинантного белка, сливали с человеческим сывороточным альбумином (HSA) посредством субклонирования в плазмиды pFUSE (InvivoGen, San Diego CA), соответственно.
Продукция белка:
Встряхиваемые колбы
2
: Проводилистабильные трансфекции посредством ENPP1-ALB клеток HEK293 с отбором под действием зеоцина, и адгерентные клетки HEK293 можно было адаптировать для роста в суспензии. Адаптированные клетки использовали для засева жидких культур для роста в среде FreeStyle (Gibco #12338-018) в встряхиваемых колбах при 37°C и 5% CO, встряхиваемых при 120 об/мин при высокой влажности. Культуру постепенно размножали до желательного намеченного объема, и затем поддерживали в течение других 12 суток для накопления внеклеточного белка. Во время фазы поддержания, культуры дополняли CD EfficientFeed C AGT (Gibco #A13275-05) для усиления продукции белка.
Биореактор
2
: Клетки размножали в 10-литровом биореакторе с оборудованием для подачи растворенного кислорода и контроля pH. Растворенный кислород поддерживали при 40% насыщения воздуха посредством подачи в культуру смеси воздуха и кислорода, не превышающей 3 литров в минуту, при скорости перемешивания 80 об/мин. pH контролировали при 7,4 посредством барботирования CO, когда pH превышал 7,4. За выращиванием культуры следили посредством измерения количества клеток, жизнеспособности клеток, концентраций глюкозы и лактата.
Очистка белка:
2
2
2
2
2
Жидкие культуры центрифугировали при 4300x g в течение 15 мин, и супернатанты фильтровали через мембрану 0,2 мкм и концентрировали в тангенциальном потоке с использованием кассеты Pellicon3 0,11 м Ultracell 30 кДа (Millipore, Billerica MA). Концентрированный супернатант наносили на колонку с белком-AG, и можно было проводить элюцию с использованием буфера, содержащего 50 мМ цитрат натрия, 150 мМ NaCl, 3 мМ ZnCl, 3 мМ CaCl, pH=3,5. Фракции, обладающие ферментативной активностью, объединяли и подвергали диализу против 1X буфера PBS pH 7,4, 11 мкМ ZnCl, 20 мкМ CaCl, затем концентрировали до 6 мг/мл, распределяли по небольшим аликвотам и хранили при -80°C.
Полученные образцы белка тестировали с использованием набора для количественного хромогенного определения эндотоксинов Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (cat. 88282) для подтверждения того, что они все свободны от эндотоксина.
Энзимология
Слитый белок NPP1-альбумин после очистки характеризовали, следуя экспериментальным протоколам, обсуждаемым в Примерах 1 и 2, описанных в другом месте в настоящем документе.
Полное содержание всех без исключения патентов, патентных заявок, и публикаций, процитированных в настоящем документе, таким образом, приведено в настоящем документе в качестве ссылки. В то время как это изобретение обсуждают по отношению к конкретным вариантам осуществления, очевидно, что специалисты в данной области могут разрабатывать другие варианты осуществления и изменения этого изобретения без отклонения от действительного содержания и объема изобретения. Прилагаемую формулу изобретения следует рассматривать как включающую все такие варианты осуществления и эквивалентные изменения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Yale University
Braddock, Demetrios
Albright, Ronald
<120>  Композиции для лечения патологических состояний кальцификации
и способы их применения
<130>  047162-7065WO1(00401)
<150>  US 62/163,500
<151>  2015-05-19
<160>  30
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  925
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly
20                  25                  30
Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser
35                  40                  45
Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala
50                  55                  60
Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Val Leu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly
85                  90                  95
Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys
100                 105                 110
Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu
115                 120                 125
Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu
130                 135                 140
His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys
165                 170                 175
Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu
180                 185                 190
Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu
195                 200                 205
Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr
210                 215                 220
Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys
225                 230                 235                 240
Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr
245                 250                 255
Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His
260                 265                 270
Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe
275                 280                 285
Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu
290                 295                 300
Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe
305                 310                 315                 320
Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile
325                 330                 335
Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala
340                 345                 350
Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr
355                 360                 365
Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro
370                 375                 380
Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val
385                 390                 395                 400
Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu
405                 410                 415
Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys
420                 425                 430
Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys
435                 440                 445
Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp
450                 455                 460
Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys
465                 470                 475                 480
Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro
485                 490                 495
Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe
500                 505                 510
Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys
515                 520                 525
Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met
530                 535                 540
Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu
545                 550                 555                 560
Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu
565                 570                 575
Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn
580                 585                 590
His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val
595                 600                 605
His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu
610                 615                 620
Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr
625                 630                 635                 640
Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr
645                 650                 655
Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys
660                 665                 670
Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu
675                 680                 685
Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser
690                 695                 700
Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu
705                 710                 715                 720
Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser
725                 730                 735
Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile
740                 745                 750
Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser
755                 760                 765
Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr
770                 775                 780
Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp
785                 790                 795                 800
Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys
805                 810                 815
Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe
820                 825                 830
Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys
835                 840                 845
Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn
850                 855                 860
Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu
865                 870                 875                 880
Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr
885                 890                 895
Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu
900                 905                 910
Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
915                 920                 925
<210>  2
<211>  888
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Ala Arg Arg Ser Ser Phe Gln Ser Cys Gln Ile Ile Ser Leu Phe
1               5                   10                  15
Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly Phe Thr Ala His Arg
20                  25                  30
Ile Lys Arg Ala Glu Gly Trp Glu Glu Gly Pro Pro Thr Val Leu Ser
35                  40                  45
Asp Ser Pro Trp Thr Asn Ile Ser Gly Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe
50                  55                  60
Glu Leu Gln Glu Ala Gly Pro Pro Asp Cys Arg Cys Asp Asn Leu Cys
65                  70                  75                  80
Lys Ser Tyr Thr Ser Cys Cys His Asp Phe Asp Glu Leu Cys Leu Lys
85                  90                  95
Thr Ala Arg Gly Trp Glu Cys Thr Lys Asp Arg Cys Gly Glu Val Arg
100                 105                 110
Asn Glu Glu Asn Ala Cys His Cys Ser Glu Asp Cys Leu Ala Arg Gly
115                 120                 125
Asp Cys Cys Thr Asn Tyr Gln Val Val Cys Lys Gly Glu Ser His Trp
130                 135                 140
Val Asp Asp Asp Cys Glu Glu Ile Lys Ala Ala Glu Cys Pro Ala Gly
145                 150                 155                 160
Phe Val Arg Pro Pro Leu Ile Ile Phe Ser Val Asp Gly Phe Arg Ala
165                 170                 175
Ser Tyr Met Lys Lys Gly Ser Lys Val Met Pro Asn Ile Glu Lys Leu
180                 185                 190
Arg Ser Cys Gly Thr His Ser Pro Tyr Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr
195                 200                 205
Lys Thr Phe Pro Asn Leu Tyr Thr Leu Ala Thr Gly Leu Tyr Pro Glu
210                 215                 220
Ser His Gly Ile Val Gly Asn Ser Met Tyr Asp Pro Val Phe Asp Ala
225                 230                 235                 240
Thr Phe His Leu Arg Gly Arg Glu Lys Phe Asn His Arg Trp Trp Gly
245                 250                 255
Gly Gln Pro Leu Trp Ile Thr Ala Thr Lys Gln Gly Val Lys Ala Gly
260                 265                 270
Thr Phe Phe Trp Ser Val Val Ile Pro His Glu Arg Arg Ile Leu Thr
275                 280                 285
Ile Leu Gln Trp Leu Thr Leu Pro Asp His Glu Arg Pro Ser Val Tyr
290                 295                 300
Ala Phe Tyr Ser Glu Gln Pro Asp Phe Ser Gly His Lys Tyr Gly Pro
305                 310                 315                 320
Phe Gly Pro Glu Met Thr Asn Pro Leu Arg Glu Ile Asp Lys Ile Val
325                 330                 335
Gly Gln Leu Met Asp Gly Leu Lys Gln Leu Lys Leu His Arg Cys Val
340                 345                 350
Asn Val Ile Phe Val Gly Asp His Gly Met Glu Asp Val Thr Cys Asp
355                 360                 365
Arg Thr Glu Phe Leu Ser Asn Tyr Leu Thr Asn Val Asp Asp Ile Thr
370                 375                 380
Leu Val Pro Gly Thr Leu Gly Arg Ile Arg Ser Lys Phe Ser Asn Asn
385                 390                 395                 400
Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Ala Ile Ile Ala Asn Leu Thr Cys Lys Lys
405                 410                 415
Pro Asp Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys Gln His Leu Pro Lys Arg
420                 425                 430
Leu His Tyr Ala Asn Asn Arg Arg Ile Glu Asp Ile His Leu Leu Val
435                 440                 445
Glu Arg Arg Trp His Val Ala Arg Lys Pro Leu Asp Val Tyr Lys Lys
450                 455                 460
Pro Ser Gly Lys Cys Phe Phe Gln Gly Asp His Gly Phe Asp Asn Lys
465                 470                 475                 480
Val Asn Ser Met Gln Thr Val Phe Val Gly Tyr Gly Ser Thr Phe Lys
485                 490                 495
Tyr Lys Thr Lys Val Pro Pro Phe Glu Asn Ile Glu Leu Tyr Asn Val
500                 505                 510
Met Cys Asp Leu Leu Gly Leu Lys Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His
515                 520                 525
Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Arg Thr Asn Thr Phe Arg Pro Thr Met
530                 535                 540
Pro Glu Glu Val Thr Arg Pro Asn Tyr Pro Gly Ile Met Tyr Leu Gln
545                 550                 555                 560
Ser Asp Phe Asp Leu Gly Cys Thr Cys Asp Asp Lys Val Glu Pro Lys
565                 570                 575
Asn Lys Leu Asp Glu Leu Asn Lys Arg Leu His Thr Lys Gly Ser Thr
580                 585                 590
Glu Ala Glu Thr Arg Lys Phe Arg Gly Ser Arg Asn Glu Asn Lys Glu
595                 600                 605
Asn Ile Asn Gly Asn Phe Glu Pro Arg Lys Glu Arg His Leu Leu Tyr
610                 615                 620
Gly Arg Pro Ala Val Leu Tyr Arg Thr Arg Tyr Asp Ile Leu Tyr His
625                 630                 635                 640
Thr Asp Phe Glu Ser Gly Tyr Ser Glu Ile Phe Leu Met Pro Leu Trp
645                 650                 655
Thr Ser Tyr Thr Val Ser Lys Gln Ala Glu Val Ser Ser Val Pro Asp
660                 665                 670
His Leu Thr Ser Cys Val Arg Pro Asp Val Arg Val Ser Pro Ser Phe
675                 680                 685
Ser Gln Asn Cys Leu Ala Tyr Lys Asn Asp Lys Gln Met Ser Tyr Gly
690                 695                 700
Phe Leu Phe Pro Pro Tyr Leu Ser Ser Ser Pro Glu Ala Lys Tyr Asp
705                 710                 715                 720
Ala Phe Leu Val Thr Asn Met Val Pro Met Tyr Pro Ala Phe Lys Arg
725                 730                 735
Val Trp Asn Tyr Phe Gln Arg Val Leu Val Lys Lys Tyr Ala Ser Glu
740                 745                 750
Arg Asn Gly Val Asn Val Ile Ser Gly Pro Ile Phe Asp Tyr Asp Tyr
755                 760                 765
Asp Gly Leu His Asp Thr Glu Asp Lys Ile Lys Gln Tyr Val Glu Gly
770                 775                 780
Ser Ser Ile Pro Val Pro Thr His Tyr Tyr Ser Ile Ile Thr Ser Cys
785                 790                 795                 800
Leu Asp Phe Thr Gln Pro Ala Asp Lys Cys Asp Gly Pro Leu Ser Val
805                 810                 815
Ser Ser Phe Ile Leu Pro His Arg Pro Asp Asn Glu Glu Ser Cys Asn
820                 825                 830
Ser Ser Glu Asp Glu Ser Lys Trp Val Glu Glu Leu Met Lys Met His
835                 840                 845
Thr Ala Arg Val Arg Asp Ile Glu His Leu Thr Ser Leu Asp Phe Phe
850                 855                 860
Arg Lys Thr Ser Arg Ser Tyr Pro Glu Ile Leu Thr Leu Lys Thr Tyr
865                 870                 875                 880
Leu His Thr Tyr Glu Ser Glu Ile
885
<210>  3
<211>  453
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Lys Leu Leu Val Ile Leu Leu Phe Ser Gly Leu Ile Thr Gly Phe
1               5                   10                  15
Arg Ser Asp Ser Ser Ser Ser Leu Pro Pro Lys Leu Leu Leu Val Ser
20                  25                  30
Phe Asp Gly Phe Arg Ala Asp Tyr Leu Lys Asn Tyr Glu Phe Pro His
35                  40                  45
Leu Gln Asn Phe Ile Lys Glu Gly Val Leu Val Glu His Val Lys Asn
50                  55                  60
Val Phe Ile Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Glu Glu Ser His Gly Ile Val Ala Asn Ser Met Tyr Asp Ala
85                  90                  95
Val Thr Lys Lys His Phe Ser Asp Ser Asn Asp Lys Asp Pro Phe Trp
100                 105                 110
Trp Asn Glu Ala Val Pro Ile Trp Val Thr Asn Gln Leu Gln Glu Asn
115                 120                 125
Arg Ser Ser Ala Ala Ala Met Trp Pro Gly Thr Asp Val Pro Ile His
130                 135                 140
Asp Thr Ile Ser Ser Tyr Phe Met Asn Tyr Asn Ser Ser Val Ser Phe
145                 150                 155                 160
Glu Glu Arg Leu Asn Asn Ile Thr Met Trp Leu Asn Asn Ser Asn Pro
165                 170                 175
Pro Val Thr Phe Ala Thr Leu Tyr Trp Glu Glu Pro Asp Ala Ser Gly
180                 185                 190
His Lys Tyr Gly Pro Glu Asp Lys Glu Asn Met Ser Arg Val Leu Lys
195                 200                 205
Lys Ile Asp Asp Leu Ile Gly Asp Leu Val Gln Arg Leu Lys Met Leu
210                 215                 220
Gly Leu Trp Glu Asn Leu Asn Val Ile Ile Thr Ser Asp His Gly Met
225                 230                 235                 240
Thr Gln Cys Ser Gln Asp Arg Leu Ile Asn Leu Asp Ser Cys Ile Asp
245                 250                 255
His Ser Tyr Tyr Thr Leu Ile Asp Leu Ser Pro Val Ala Ala Ile Leu
260                 265                 270
Pro Lys Ile Asn Arg Thr Glu Val Tyr Asn Lys Leu Lys Asn Cys Ser
275                 280                 285
Pro His Met Asn Val Tyr Leu Lys Glu Asp Ile Pro Asn Arg Phe Tyr
290                 295                 300
Tyr Gln His Asn Asp Arg Ile Gln Pro Ile Ile Leu Val Ala Asp Glu
305                 310                 315                 320
Gly Trp Thr Ile Val Leu Asn Glu Ser Ser Gln Lys Leu Gly Asp His
325                 330                 335
Gly Tyr Asp Asn Ser Leu Pro Ser Met His Pro Phe Leu Ala Ala His
340                 345                 350
Gly Pro Ala Phe His Lys Gly Tyr Lys His Ser Thr Ile Asn Ile Val
355                 360                 365
Asp Ile Tyr Pro Met Met Cys His Ile Leu Gly Leu Lys Pro His Pro
370                 375                 380
Asn Asn Gly Thr Phe Gly His Thr Lys Cys Leu Leu Val Asp Gln Trp
385                 390                 395                 400
Cys Ile Asn Leu Pro Glu Ala Ile Ala Ile Val Ile Gly Ser Leu Leu
405                 410                 415
Val Leu Thr Met Leu Thr Cys Leu Ile Ile Ile Met Gln Asn Arg Leu
420                 425                 430
Ser Val Pro Arg Pro Phe Ser Arg Leu Gln Leu Gln Glu Asp Asp Asp
435                 440                 445
Asp Pro Leu Ile Gly
450
<210>  4
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(3)
<223>  трипептид присутствует n раз, где n представляет собой целое число
в диапазоне от 1 до 10
<400>  4
Asp Ser Ser
1
<210>  5
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(3)
<223>  трипептид присутствует n раз, где n представляет собой целое число
в диапазоне от 1 до 10
<400>  5
Glu Ser Ser
1
<210>  6
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(3)
<223>  трипептид присутствует n раз, где n представляет собой целое число
в диапазоне от 1 до 10
<400>  6
Arg Gln Gln
1
<210>  7
<211>  2
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(2)
<223>  дипептид присутствует n раз, где n представляет собой целое число
в диапазоне от 1 до 10
<400>  7
Lys Arg
1
<210>  8
<211>  1
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(1)
<223>  аминокислота присутствует n раз, где n представляет собой целое число
в диапазоне от 1 до 10
<400>  8
Arg
1
<210>  9
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  9
Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Phe Leu Arg Arg Ile Gly Arg Phe Gly
1               5                   10                  15
<210>  10
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  10
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Arg Gly Asp Thr
1               5                   10
<210>  11
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  11
Ala Pro Trp His Leu Ser Ser Gln Tyr Ser Arg Thr
1               5                   10
<210>  12
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  12
Ser Thr Leu Pro Ile Pro His Glu Phe Ser Arg Glu
1               5                   10
<210>  13
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  13
Val Thr Lys His Leu Asn Gln Ile Ser Gln Ser Tyr
1               5                   10
<210>  14
<211>  1
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(1)
<223>  аминокислота присутствует m раз, где m представляет собой целое число
в диапазоне от 1 до 15
<400>  14
Glu
1
<210>  15
<211>  925
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  15
Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly
20                  25                  30
Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser
35                  40                  45
Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala
50                  55                  60
Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Ile Ile Ser Leu
65                  70                  75                  80
Phe Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly Phe Thr Ala Gly
85                  90                  95
Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys
100                 105                 110
Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu
115                 120                 125
Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu
130                 135                 140
His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys
165                 170                 175
Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu
180                 185                 190
Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu
195                 200                 205
Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr
210                 215                 220
Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys
225                 230                 235                 240
Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr
245                 250                 255
Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His
260                 265                 270
Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe
275                 280                 285
Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu
290                 295                 300
Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe
305                 310                 315                 320
Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile
325                 330                 335
Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala
340                 345                 350
Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr
355                 360                 365
Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro
370                 375                 380
Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val
385                 390                 395                 400
Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu
405                 410                 415
Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys
420                 425                 430
Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys
435                 440                 445
Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp
450                 455                 460
Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys
465                 470                 475                 480
Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro
485                 490                 495
Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe
500                 505                 510
Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys
515                 520                 525
Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met
530                 535                 540
Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu
545                 550                 555                 560
Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu
565                 570                 575
Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn
580                 585                 590
His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val
595                 600                 605
His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu
610                 615                 620
Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr
625                 630                 635                 640
Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr
645                 650                 655
Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys
660                 665                 670
Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu
675                 680                 685
Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser
690                 695                 700
Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu
705                 710                 715                 720
Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser
725                 730                 735
Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile
740                 745                 750
Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser
755                 760                 765
Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr
770                 775                 780
Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp
785                 790                 795                 800
Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys
805                 810                 815
Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe
820                 825                 830
Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys
835                 840                 845
Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn
850                 855                 860
Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu
865                 870                 875                 880
Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr
885                 890                 895
Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu
900                 905                 910
Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
915                 920                 925
<210>  16
<211>  1155
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  16
Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly
20                  25                  30
Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser
35                  40                  45
Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala
50                  55                  60
Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Ile Ile Ser Leu
65                  70                  75                  80
Phe Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly Phe Thr Ala Gly
85                  90                  95
Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys
100                 105                 110
Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu
115                 120                 125
Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu
130                 135                 140
His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys
165                 170                 175
Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu
180                 185                 190
Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu
195                 200                 205
Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr
210                 215                 220
Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys
225                 230                 235                 240
Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr
245                 250                 255
Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His
260                 265                 270
Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe
275                 280                 285
Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu
290                 295                 300
Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe
305                 310                 315                 320
Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile
325                 330                 335
Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala
340                 345                 350
Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr
355                 360                 365
Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro
370                 375                 380
Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val
385                 390                 395                 400
Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu
405                 410                 415
Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys
420                 425                 430
Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys
435                 440                 445
Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp
450                 455                 460
Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys
465                 470                 475                 480
Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro
485                 490                 495
Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe
500                 505                 510
Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys
515                 520                 525
Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met
530                 535                 540
Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu
545                 550                 555                 560
Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu
565                 570                 575
Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn
580                 585                 590
His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val
595                 600                 605
His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu
610                 615                 620
Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr
625                 630                 635                 640
Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr
645                 650                 655
Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys
660                 665                 670
Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu
675                 680                 685
Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser
690                 695                 700
Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu
705                 710                 715                 720
Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser
725                 730                 735
Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile
740                 745                 750
Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser
755                 760                 765
Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr
770                 775                 780
Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp
785                 790                 795                 800
Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys
805                 810                 815
Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe
820                 825                 830
Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys
835                 840                 845
Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn
850                 855                 860
Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu
865                 870                 875                 880
Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr
885                 890                 895
Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu
900                 905                 910
Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asn
915                 920                 925
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
930                 935                 940
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
945                 950                 955                 960
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
965                 970                 975
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
980                 985                 990
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg  Glu Glu Gln Tyr Asn  Ser Thr Tyr
995                 1000                 1005
Arg Val  Val Ser Val Leu Thr  Val Leu His Gln Asp  Trp Leu Asn
1010                 1015                 1020
Gly Lys  Glu Tyr Lys Cys Lys  Val Ser Asn Lys Ala  Leu Pro Ala
1025                 1030                 1035
Pro Ile  Glu Lys Thr Ile Ser  Lys Ala Lys Gly Gln  Pro Arg Glu
1040                 1045                 1050
Pro Gln  Val Tyr Thr Leu Pro  Pro Ser Arg Glu Glu  Met Thr Lys
1055                 1060                 1065
Asn Gln  Val Ser Leu Thr Cys  Leu Val Lys Gly Phe  Tyr Pro Ser
1070                 1075                 1080
Asp Ile  Ala Val Glu Trp Glu  Ser Asn Gly Gln Pro  Glu Asn Asn
1085                 1090                 1095
Tyr Lys  Thr Thr Pro Pro Val  Leu Asp Ser Asp Gly  Ser Phe Phe
1100                 1105                 1110
Leu Tyr  Ser Lys Leu Thr Val  Asp Lys Ser Arg Trp  Gln Gln Gly
1115                 1120                 1125
Asn Val  Phe Ser Cys Ser Val  Met His Glu Ala Leu  His Asn His
1130                 1135                 1140
Tyr Thr  Gln Lys Ser Leu Ser  Leu Ser Pro Gly Lys
1145                 1150                 1155
<210>  17
<211>  852
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  17
Met Arg Gly Pro Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Leu Ala Thr Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Gly Ala Gly Ala Gly Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val
20                  25                  30
Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg
35                  40                  45
Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln
50                  55                  60
Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg
65                  70                  75                  80
Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp
85                  90                  95
Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln
100                 105                 110
Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro
115                 120                 125
Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu
130                 135                 140
Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro
145                 150                 155                 160
Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg
165                 170                 175
Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr
180                 185                 190
Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp
195                 200                 205
Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn
210                 215                 220
Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln
225                 230                 235                 240
Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile
245                 250                 255
Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro
260                 265                 270
Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys
275                 280                 285
Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser
290                 295                 300
Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu
305                 310                 315                 320
Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu
325                 330                 335
Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly
340                 345                 350
Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu
355                 360                 365
Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu
370                 375                 380
Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly
385                 390                 395                 400
Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro
405                 410                 415
Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp
420                 425                 430
Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala
435                 440                 445
Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser
450                 455                 460
Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro
465                 470                 475                 480
Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val
485                 490                 495
Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn
500                 505                 510
Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr
515                 520                 525
Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr
530                 535                 540
Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu
545                 550                 555                 560
Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu
565                 570                 575
Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu
580                 585                 590
Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser
595                 600                 605
Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val
610                 615                 620
Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr
625                 630                 635                 640
Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr
645                 650                 655
Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu
660                 665                 670
Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn
675                 680                 685
Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His
690                 695                 700
Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser
725                 730                 735
Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile
740                 745                 750
Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr
755                 760                 765
Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile
770                 775                 780
Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His
785                 790                 795                 800
Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile
805                 810                 815
Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys
820                 825                 830
Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe
835                 840                 845
Ser Gln Glu Asp
850
<210>  18
<211>  1082
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  18
Met Arg Gly Pro Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Leu Ala Thr Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Gly Ala Gly Ala Gly Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val
20                  25                  30
Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg
35                  40                  45
Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln
50                  55                  60
Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg
65                  70                  75                  80
Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp
85                  90                  95
Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln
100                 105                 110
Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro
115                 120                 125
Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu
130                 135                 140
Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro
145                 150                 155                 160
Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg
165                 170                 175
Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr
180                 185                 190
Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp
195                 200                 205
Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn
210                 215                 220
Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln
225                 230                 235                 240
Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile
245                 250                 255
Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro
260                 265                 270
Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys
275                 280                 285
Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser
290                 295                 300
Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu
305                 310                 315                 320
Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu
325                 330                 335
Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly
340                 345                 350
Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu
355                 360                 365
Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu
370                 375                 380
Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly
385                 390                 395                 400
Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro
405                 410                 415
Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp
420                 425                 430
Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala
435                 440                 445
Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser
450                 455                 460
Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro
465                 470                 475                 480
Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val
485                 490                 495
Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn
500                 505                 510
Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr
515                 520                 525
Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr
530                 535                 540
Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu
545                 550                 555                 560
Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu
565                 570                 575
Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu
580                 585                 590
Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser
595                 600                 605
Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val
610                 615                 620
Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr
625                 630                 635                 640
Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr
645                 650                 655
Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu
660                 665                 670
Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn
675                 680                 685
Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His
690                 695                 700
Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser
725                 730                 735
Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile
740                 745                 750
Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr
755                 760                 765
Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile
770                 775                 780
Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His
785                 790                 795                 800
Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile
805                 810                 815
Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys
820                 825                 830
Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe
835                 840                 845
Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
850                 855                 860
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
865                 870                 875                 880
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
885                 890                 895
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
900                 905                 910
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
915                 920                 925
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
930                 935                 940
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
945                 950                 955                 960
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
965                 970                 975
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
980                 985                 990
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu  Thr Cys Leu Val Lys  Gly Phe Tyr
995                 1000                 1005
Pro Ser  Asp Ile Ala Val Glu  Trp Glu Ser Asn Gly  Gln Pro Glu
1010                 1015                 1020
Asn Asn  Tyr Lys Thr Thr Pro  Pro Val Leu Asp Ser  Asp Gly Ser
1025                 1030                 1035
Phe Phe  Leu Tyr Ser Lys Leu  Thr Val Asp Lys Ser  Arg Trp Gln
1040                 1045                 1050
Gln Gly  Asn Val Phe Ser Cys  Ser Val Met His Glu  Ala Leu His
1055                 1060                 1065
Asn His  Tyr Thr Gln Lys Ser  Leu Ser Leu Ser Pro  Gly Lys
1070                 1075                 1080
<210>  19
<211>  849
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  19
Met Arg Gly Pro Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Leu Ala Thr Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Gly Ala Gly Ala Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys
20                  25                  30
Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala
35                  40                  45
Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys
50                  55                  60
Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu
65                  70                  75                  80
Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp
85                  90                  95
Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys
100                 105                 110
Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro
115                 120                 125
Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe
130                 135                 140
Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser
145                 150                 155                 160
Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr
165                 170                 175
Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met
195                 200                 205
Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp
210                 215                 220
Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys
225                 230                 235                 240
Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile
245                 250                 255
Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu
260                 265                 270
Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg
275                 280                 285
Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His
290                 295                 300
Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val
305                 310                 315                 320
Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu
325                 330                 335
His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln
340                 345                 350
Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val
355                 360                 365
Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser
370                 375                 380
Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg
385                 390                 395                 400
Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys
405                 410                 415
His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu
420                 425                 430
Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro
435                 440                 445
Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val
450                 455                 460
Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys
465                 470                 475                 480
His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu
485                 490                 495
Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His
500                 505                 510
Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His
515                 520                 525
Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro
530                 535                 540
Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu
545                 550                 555                 560
Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile
565                 570                 575
Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu
580                 585                 590
Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser
595                 600                 605
Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn
610                 615                 620
Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe
625                 630                 635                 640
Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn
645                 650                 655
Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn
660                 665                 670
Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro
675                 680                 685
Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu
690                 695                 700
Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly
705                 710                 715                 720
Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn
725                 730                 735
Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro
740                 745                 750
Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr
755                 760                 765
Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His
770                 775                 780
Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser
785                 790                 795                 800
Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val
805                 810                 815
Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val
820                 825                 830
Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu
835                 840                 845
Asp
<210>  20
<211>  1079
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  20
Met Arg Gly Pro Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Leu Ala Thr Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Gly Ala Gly Ala Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys
20                  25                  30
Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala
35                  40                  45
Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys
50                  55                  60
Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu
65                  70                  75                  80
Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp
85                  90                  95
Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys
100                 105                 110
Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro
115                 120                 125
Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe
130                 135                 140
Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser
145                 150                 155                 160
Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr
165                 170                 175
Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met
195                 200                 205
Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp
210                 215                 220
Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys
225                 230                 235                 240
Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile
245                 250                 255
Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu
260                 265                 270
Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg
275                 280                 285
Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His
290                 295                 300
Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val
305                 310                 315                 320
Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu
325                 330                 335
His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln
340                 345                 350
Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val
355                 360                 365
Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser
370                 375                 380
Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg
385                 390                 395                 400
Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys
405                 410                 415
His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu
420                 425                 430
Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro
435                 440                 445
Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val
450                 455                 460
Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys
465                 470                 475                 480
His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu
485                 490                 495
Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His
500                 505                 510
Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His
515                 520                 525
Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro
530                 535                 540
Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu
545                 550                 555                 560
Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile
565                 570                 575
Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu
580                 585                 590
Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser
595                 600                 605
Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn
610                 615                 620
Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe
625                 630                 635                 640
Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn
645                 650                 655
Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn
660                 665                 670
Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro
675                 680                 685
Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu
690                 695                 700
Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly
705                 710                 715                 720
Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn
725                 730                 735
Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro
740                 745                 750
Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr
755                 760                 765
Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His
770                 775                 780
Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser
785                 790                 795                 800
Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val
805                 810                 815
Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val
820                 825                 830
Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu
835                 840                 845
Asp Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
850                 855                 860
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
865                 870                 875                 880
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
885                 890                 895
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
900                 905                 910
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
915                 920                 925
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
930                 935                 940
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
945                 950                 955                 960
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
965                 970                 975
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
980                 985                 990
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu  Val Lys Gly Phe Tyr  Pro Ser Asp
995                 1000                 1005
Ile Ala  Val Glu Trp Glu Ser  Asn Gly Gln Pro Glu  Asn Asn Tyr
1010                 1015                 1020
Lys Thr  Thr Pro Pro Val Leu  Asp Ser Asp Gly Ser  Phe Phe Leu
1025                 1030                 1035
Tyr Ser  Lys Leu Thr Val Asp  Lys Ser Arg Trp Gln  Gln Gly Asn
1040                 1045                 1050
Val Phe  Ser Cys Ser Val Met  His Glu Ala Leu His  Asn His Tyr
1055                 1060                 1065
Thr Gln  Lys Ser Leu Ser Leu  Ser Pro Gly Lys
1070                 1075
<210>  21
<211>  1550
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  21
Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly
20                  25                  30
Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser
35                  40                  45
Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala
50                  55                  60
Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Ile Ile Ser Leu
65                  70                  75                  80
Phe Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly Phe Thr Ala Gly
85                  90                  95
Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys
100                 105                 110
Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu
115                 120                 125
Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu
130                 135                 140
His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys
165                 170                 175
Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu
180                 185                 190
Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu
195                 200                 205
Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr
210                 215                 220
Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys
225                 230                 235                 240
Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr
245                 250                 255
Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His
260                 265                 270
Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe
275                 280                 285
Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu
290                 295                 300
Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe
305                 310                 315                 320
Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile
325                 330                 335
Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala
340                 345                 350
Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr
355                 360                 365
Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro
370                 375                 380
Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val
385                 390                 395                 400
Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu
405                 410                 415
Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys
420                 425                 430
Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys
435                 440                 445
Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp
450                 455                 460
Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys
465                 470                 475                 480
Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro
485                 490                 495
Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe
500                 505                 510
Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys
515                 520                 525
Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met
530                 535                 540
Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu
545                 550                 555                 560
Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu
565                 570                 575
Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn
580                 585                 590
His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val
595                 600                 605
His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu
610                 615                 620
Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr
625                 630                 635                 640
Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr
645                 650                 655
Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys
660                 665                 670
Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu
675                 680                 685
Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser
690                 695                 700
Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu
705                 710                 715                 720
Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser
725                 730                 735
Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile
740                 745                 750
Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser
755                 760                 765
Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr
770                 775                 780
Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp
785                 790                 795                 800
Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys
805                 810                 815
Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe
820                 825                 830
Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys
835                 840                 845
Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn
850                 855                 860
Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu
865                 870                 875                 880
Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr
885                 890                 895
Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu
900                 905                 910
Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Arg Ser Gly
915                 920                 925
Ser Gly Gly Ser Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val
930                 935                 940
Ser Gly Ser Ala Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys
945                 950                 955                 960
Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys
965                 970                 975
Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Ser Tyr
980                 985                 990
Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln  Glu Val Thr Asp Phe  Ala Lys Thr
995                 1000                 1005
Cys Val  Ala Asp Glu Ser Ala  Ala Asn Cys Asp Lys  Ser Leu His
1010                 1015                 1020
Thr Leu  Phe Gly Asp Lys Leu  Cys Ala Ile Pro Asn  Leu Arg Glu
1025                 1030                 1035
Asn Tyr  Gly Glu Leu Ala Asp  Cys Cys Thr Lys Gln  Glu Pro Glu
1040                 1045                 1050
Arg Asn  Glu Cys Phe Leu Gln  His Lys Asp Asp Asn  Pro Ser Leu
1055                 1060                 1065
Pro Pro  Phe Glu Arg Pro Glu  Ala Glu Ala Met Cys  Thr Ser Phe
1070                 1075                 1080
Lys Glu  Asn Pro Thr Thr Phe  Met Gly His Tyr Leu  His Glu Val
1085                 1090                 1095
Ala Arg  Arg His Pro Tyr Phe  Tyr Ala Pro Glu Leu  Leu Tyr Tyr
1100                 1105                 1110
Ala Glu  Gln Tyr Asn Glu Ile  Leu Thr Gln Cys Cys  Ala Glu Ala
1115                 1120                 1125
Asp Lys  Glu Ser Cys Leu Thr  Pro Lys Leu Asp Gly  Val Lys Glu
1130                 1135                 1140
Lys Ala  Leu Val Ser Ser Val  Arg Gln Arg Met Lys  Cys Ser Ser
1145                 1150                 1155
Met Gln  Lys Phe Gly Glu Arg  Ala Phe Lys Ala Trp  Ala Val Ala
1160                 1165                 1170
Arg Leu  Ser Gln Thr Phe Pro  Asn Ala Asp Phe Ala  Glu Ile Thr
1175                 1180                 1185
Lys Leu  Ala Thr Asp Leu Thr  Lys Val Asn Lys Glu  Cys Cys His
1190                 1195                 1200
Gly Asp  Leu Leu Glu Cys Ala  Asp Asp Arg Ala Glu  Leu Ala Lys
1205                 1210                 1215
Tyr Met  Cys Glu Asn Gln Ala  Thr Ile Ser Ser Lys  Leu Gln Thr
1220                 1225                 1230
Cys Cys  Asp Lys Pro Leu Leu  Lys Lys Ala His Cys  Leu Ser Glu
1235                 1240                 1245
Val Glu  His Asp Thr Met Pro  Ala Asp Leu Pro Ala  Ile Ala Ala
1250                 1255                 1260
Asp Phe  Val Glu Asp Gln Glu  Val Cys Lys Asn Tyr  Ala Glu Ala
1265                 1270                 1275
Lys Asp  Val Phe Leu Gly Thr  Phe Leu Tyr Glu Tyr  Ser Arg Arg
1280                 1285                 1290
His Pro  Asp Tyr Ser Val Ser  Leu Leu Leu Arg Leu  Ala Lys Lys
1295                 1300                 1305
Tyr Glu  Ala Thr Leu Glu Lys  Cys Cys Ala Glu Ala  Asn Pro Pro
1310                 1315                 1320
Ala Cys  Tyr Gly Thr Val Leu  Ala Glu Phe Gln Pro  Leu Val Glu
1325                 1330                 1335
Glu Pro  Lys Asn Leu Val Lys  Thr Asn Cys Asp Leu  Tyr Glu Lys
1340                 1345                 1350
Leu Gly  Glu Tyr Gly Phe Gln  Asn Ala Ile Leu Val  Arg Tyr Thr
1355                 1360                 1365
Gln Lys  Ala Pro Gln Val Ser  Thr Pro Thr Leu Val  Glu Ala Ala
1370                 1375                 1380
Arg Asn  Leu Gly Arg Val Gly  Thr Lys Cys Cys Thr  Leu Pro Glu
1385                 1390                 1395
Asp Gln  Arg Leu Pro Cys Val  Glu Asp Tyr Leu Ser  Ala Ile Leu
1400                 1405                 1410
Asn Arg  Val Cys Leu Leu His  Glu Lys Thr Pro Val  Ser Glu His
1415                 1420                 1425
Val Thr  Lys Cys Cys Ser Gly  Ser Leu Val Glu Arg  Arg Pro Cys
1430                 1435                 1440
Phe Ser  Ala Leu Thr Val Asp  Glu Thr Tyr Val Pro  Lys Glu Phe
1445                 1450                 1455
Lys Ala  Glu Thr Phe Thr Phe  His Ser Asp Ile Cys  Thr Leu Pro
1460                 1465                 1470
Glu Lys  Glu Lys Gln Ile Lys  Lys Gln Thr Ala Leu  Ala Glu Leu
1475                 1480                 1485
Val Lys  His Lys Pro Lys Ala  Thr Ala Glu Gln Leu  Lys Thr Val
1490                 1495                 1500
Met Asp  Asp Phe Ala Gln Phe  Leu Asp Thr Cys Cys  Lys Ala Ala
1505                 1510                 1515
Asp Lys  Asp Thr Cys Phe Ser  Thr Glu Gly Pro Asn  Leu Val Thr
1520                 1525                 1530
Arg Cys  Lys Asp Ala Leu Ala  Arg Ser Trp Ser His  Pro Gln Phe
1535                 1540                 1545
Glu Lys
1550
<210>  22
<211>  1474
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  22
Met Arg Gly Pro Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Leu Ala Thr Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Gly Ala Gly Ala Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys
20                  25                  30
Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala
35                  40                  45
Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys
50                  55                  60
Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu
65                  70                  75                  80
Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp
85                  90                  95
Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys
100                 105                 110
Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro
115                 120                 125
Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe
130                 135                 140
Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser
145                 150                 155                 160
Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr
165                 170                 175
Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met
195                 200                 205
Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp
210                 215                 220
Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys
225                 230                 235                 240
Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile
245                 250                 255
Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu
260                 265                 270
Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg
275                 280                 285
Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His
290                 295                 300
Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val
305                 310                 315                 320
Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu
325                 330                 335
His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln
340                 345                 350
Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val
355                 360                 365
Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser
370                 375                 380
Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg
385                 390                 395                 400
Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys
405                 410                 415
His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu
420                 425                 430
Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro
435                 440                 445
Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val
450                 455                 460
Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys
465                 470                 475                 480
His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu
485                 490                 495
Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His
500                 505                 510
Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His
515                 520                 525
Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro
530                 535                 540
Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu
545                 550                 555                 560
Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile
565                 570                 575
Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu
580                 585                 590
Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser
595                 600                 605
Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn
610                 615                 620
Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe
625                 630                 635                 640
Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn
645                 650                 655
Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn
660                 665                 670
Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro
675                 680                 685
Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu
690                 695                 700
Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly
705                 710                 715                 720
Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn
725                 730                 735
Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro
740                 745                 750
Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr
755                 760                 765
Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His
770                 775                 780
Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser
785                 790                 795                 800
Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val
805                 810                 815
Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val
820                 825                 830
Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu
835                 840                 845
Asp Arg Ser Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu
850                 855                 860
Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg
865                 870                 875                 880
Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu
885                 890                 895
Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln
900                 905                 910
Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp
915                 920                 925
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys
930                 935                 940
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu
945                 950                 955                 960
Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro
965                 970                 975
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu
980                 985                 990
Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala  Glu Ala Met Cys Thr  Ser Phe Lys
995                 1000                 1005
Glu Asn  Pro Thr Thr Phe Met  Gly His Tyr Leu His  Glu Val Ala
1010                 1015                 1020
Arg Arg  His Pro Tyr Phe Tyr  Ala Pro Glu Leu Leu  Tyr Tyr Ala
1025                 1030                 1035
Glu Gln  Tyr Asn Glu Ile Leu  Thr Gln Cys Cys Ala  Glu Ala Asp
1040                 1045                 1050
Lys Glu  Ser Cys Leu Thr Pro  Lys Leu Asp Gly Val  Lys Glu Lys
1055                 1060                 1065
Ala Leu  Val Ser Ser Val Arg  Gln Arg Met Lys Cys  Ser Ser Met
1070                 1075                 1080
Gln Lys  Phe Gly Glu Arg Ala  Phe Lys Ala Trp Ala  Val Ala Arg
1085                 1090                 1095
Leu Ser  Gln Thr Phe Pro Asn  Ala Asp Phe Ala Glu  Ile Thr Lys
1100                 1105                 1110
Leu Ala  Thr Asp Leu Thr Lys  Val Asn Lys Glu Cys  Cys His Gly
1115                 1120                 1125
Asp Leu  Leu Glu Cys Ala Asp  Asp Arg Ala Glu Leu  Ala Lys Tyr
1130                 1135                 1140
Met Cys  Glu Asn Gln Ala Thr  Ile Ser Ser Lys Leu  Gln Thr Cys
1145                 1150                 1155
Cys Asp  Lys Pro Leu Leu Lys  Lys Ala His Cys Leu  Ser Glu Val
1160                 1165                 1170
Glu His  Asp Thr Met Pro Ala  Asp Leu Pro Ala Ile  Ala Ala Asp
1175                 1180                 1185
Phe Val  Glu Asp Gln Glu Val  Cys Lys Asn Tyr Ala  Glu Ala Lys
1190                 1195                 1200
Asp Val  Phe Leu Gly Thr Phe  Leu Tyr Glu Tyr Ser  Arg Arg His
1205                 1210                 1215
Pro Asp  Tyr Ser Val Ser Leu  Leu Leu Arg Leu Ala  Lys Lys Tyr
1220                 1225                 1230
Glu Ala  Thr Leu Glu Lys Cys  Cys Ala Glu Ala Asn  Pro Pro Ala
1235                 1240                 1245
Cys Tyr  Gly Thr Val Leu Ala  Glu Phe Gln Pro Leu  Val Glu Glu
1250                 1255                 1260
Pro Lys  Asn Leu Val Lys Thr  Asn Cys Asp Leu Tyr  Glu Lys Leu
1265                 1270                 1275
Gly Glu  Tyr Gly Phe Gln Asn  Ala Ile Leu Val Arg  Tyr Thr Gln
1280                 1285                 1290
Lys Ala  Pro Gln Val Ser Thr  Pro Thr Leu Val Glu  Ala Ala Arg
1295                 1300                 1305
Asn Leu  Gly Arg Val Gly Thr  Lys Cys Cys Thr Leu  Pro Glu Asp
1310                 1315                 1320
Gln Arg  Leu Pro Cys Val Glu  Asp Tyr Leu Ser Ala  Ile Leu Asn
1325                 1330                 1335
Arg Val  Cys Leu Leu His Glu  Lys Thr Pro Val Ser  Glu His Val
1340                 1345                 1350
Thr Lys  Cys Cys Ser Gly Ser  Leu Val Glu Arg Arg  Pro Cys Phe
1355                 1360                 1365
Ser Ala  Leu Thr Val Asp Glu  Thr Tyr Val Pro Lys  Glu Phe Lys
1370                 1375                 1380
Ala Glu  Thr Phe Thr Phe His  Ser Asp Ile Cys Thr  Leu Pro Glu
1385                 1390                 1395
Lys Glu  Lys Gln Ile Lys Lys  Gln Thr Ala Leu Ala  Glu Leu Val
1400                 1405                 1410
Lys His  Lys Pro Lys Ala Thr  Ala Glu Gln Leu Lys  Thr Val Met
1415                 1420                 1425
Asp Asp  Phe Ala Gln Phe Leu  Asp Thr Cys Cys Lys  Ala Ala Asp
1430                 1435                 1440
Lys Asp  Thr Cys Phe Ser Thr  Glu Gly Pro Asn Leu  Val Thr Arg
1445                 1450                 1455
Cys Lys  Asp Ala Leu Ala Arg  Ser Trp Ser His Pro  Gln Phe Glu
1460                 1465                 1470
Lys
<210>  23
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  23
Ile Ile Ser Leu Phe Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly
1               5                   10                  15
Phe Thr Ala
<210>  24
<211>  850
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  24
Met Thr Ser Lys Phe Leu Leu Val Ser Phe Ile Leu Ala Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys
20                  25                  30
Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Ser Asn Cys Arg Cys
35                  40                  45
Asp Ala Ala Cys Val Ser Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Phe Gln Glu
50                  55                  60
Thr Cys Val Glu Pro Thr His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys
65                  70                  75                  80
Gly Glu Lys Arg Leu Ser Arg Phe Val Cys Ser Cys Ala Asp Asp Cys
85                  90                  95
Lys Thr His Asn Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Asp
100                 105                 110
Lys Lys Ser Trp Val Glu Glu Thr Cys Glu Ser Ile Asp Thr Pro Glu
115                 120                 125
Cys Pro Ala Glu Phe Glu Ser Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
130                 135                 140
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
145                 150                 155                 160
Ile Ser Lys Leu Lys Asn Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
165                 170                 175
Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
180                 185                 190
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
195                 200                 205
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
210                 215                 220
Leu Trp Tyr Lys Gly Gln Pro Ile Trp Val Thr Ala Asn His Gln Glu
225                 230                 235                 240
Val Lys Ser Gly Thr Tyr Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asp
245                 250                 255
Gly Ile Leu Pro Asp Ile Tyr Lys Val Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
260                 265                 270
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Pro Ser His
275                 280                 285
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
290                 295                 300
Gly His Ser His Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
305                 310                 315                 320
Lys Val Asp Arg Leu Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Asp Leu
325                 330                 335
Gly Leu Asp Lys Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
340                 345                 350
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
355                 360                 365
Asp Val Asn Asn Val Lys Val Val Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
370                 375                 380
Pro Thr Asp Val Pro Glu Thr Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Ala Leu
385                 390                 395                 400
Ala Lys Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Arg Pro Tyr
405                 410                 415
Leu Lys Pro Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
420                 425                 430
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
435                 440                 445
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
450                 455                 460
Asn Leu Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Ile Gly Tyr Gly Pro Ala
465                 470                 475                 480
Phe Lys His Gly Ala Glu Val Asp Ser Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
485                 490                 495
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Gly Leu Ile Pro Ala Pro Asn Asn Gly
500                 505                 510
Ser His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Lys Pro Ile Tyr Asn Pro
515                 520                 525
Ser His Pro Lys Glu Glu Gly Phe Leu Ser Gln Cys Pro Ile Lys Ser
530                 535                 540
Thr Ser Asn Asp Leu Gly Cys Thr Cys Asp Pro Trp Ile Val Pro Ile
545                 550                 555                 560
Lys Asp Phe Glu Lys Gln Leu Asn Leu Thr Thr Glu Asp Val Asp Asp
565                 570                 575
Ile Tyr His Met Thr Val Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Ile Leu Leu Lys
580                 585                 590
Gln His Arg Val Cys Leu Leu Gln Gln Gln Gln Phe Leu Thr Gly Tyr
595                 600                 605
Ser Leu Asp Leu Leu Met Pro Leu Trp Ala Ser Tyr Thr Phe Leu Ser
610                 615                 620
Asn Asp Gln Phe Ser Arg Asp Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp
625                 630                 635                 640
Leu Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Tyr Tyr Lys Ser
645                 650                 655
Asn Ser Lys Leu Ser Tyr Gly Phe Leu Thr Pro Pro Arg Leu Asn Arg
660                 665                 670
Val Ser Asn His Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Val
675                 680                 685
Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp His Tyr Leu His Asp Thr
690                 695                 700
Leu Leu Gln Arg Tyr Ala His Glu Arg Asn Gly Ile Asn Val Val Ser
705                 710                 715                 720
Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu
725                 730                 735
Ile Leu Lys Gln Asn Ser Arg Val Ile Arg Ser Gln Glu Ile Leu Ile
740                 745                 750
Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Gln Leu Ser Glu
755                 760                 765
Thr Pro Leu Glu Cys Ser Ala Leu Glu Ser Ser Ala Tyr Ile Leu Pro
770                 775                 780
His Arg Pro Asp Asn Ile Glu Ser Cys Thr His Gly Lys Arg Glu Ser
785                 790                 795                 800
Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Thr Leu His Arg Ala Arg Val Thr Asp
805                 810                 815
Val Glu Leu Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Asp Arg Gln Glu Ser
820                 825                 830
Val Ser Glu Leu Leu Arg Leu Lys Thr His Leu Pro Ile Phe Ser Gln
835                 840                 845
Glu Asp
850
<210>  25
<211>  1474
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  25
Met Thr Ser Lys Phe Leu Leu Val Ser Phe Ile Leu Ala Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys
20                  25                  30
Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Ser Asn Cys Arg Cys
35                  40                  45
Asp Ala Ala Cys Val Ser Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Phe Gln Glu
50                  55                  60
Thr Cys Val Glu Pro Thr His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys
65                  70                  75                  80
Gly Glu Lys Arg Leu Ser Arg Phe Val Cys Ser Cys Ala Asp Asp Cys
85                  90                  95
Lys Thr His Asn Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Asp
100                 105                 110
Lys Lys Ser Trp Val Glu Glu Thr Cys Glu Ser Ile Asp Thr Pro Glu
115                 120                 125
Cys Pro Ala Glu Phe Glu Ser Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
130                 135                 140
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
145                 150                 155                 160
Ile Ser Lys Leu Lys Asn Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
165                 170                 175
Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
180                 185                 190
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
195                 200                 205
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
210                 215                 220
Leu Trp Tyr Lys Gly Gln Pro Ile Trp Val Thr Ala Asn His Gln Glu
225                 230                 235                 240
Val Lys Ser Gly Thr Tyr Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asp
245                 250                 255
Gly Ile Leu Pro Asp Ile Tyr Lys Val Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
260                 265                 270
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Pro Ser His
275                 280                 285
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
290                 295                 300
Gly His Ser His Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
305                 310                 315                 320
Lys Val Asp Arg Leu Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Asp Leu
325                 330                 335
Gly Leu Asp Lys Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
340                 345                 350
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
355                 360                 365
Asp Val Asn Asn Val Lys Val Val Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
370                 375                 380
Pro Thr Asp Val Pro Glu Thr Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Ala Leu
385                 390                 395                 400
Ala Lys Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Arg Pro Tyr
405                 410                 415
Leu Lys Pro Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
420                 425                 430
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
435                 440                 445
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
450                 455                 460
Asn Leu Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Ile Gly Tyr Gly Pro Ala
465                 470                 475                 480
Phe Lys His Gly Ala Glu Val Asp Ser Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
485                 490                 495
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Gly Leu Ile Pro Ala Pro Asn Asn Gly
500                 505                 510
Ser His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Lys Pro Ile Tyr Asn Pro
515                 520                 525
Ser His Pro Lys Glu Glu Gly Phe Leu Ser Gln Cys Pro Ile Lys Ser
530                 535                 540
Thr Ser Asn Asp Leu Gly Cys Thr Cys Asp Pro Trp Ile Val Pro Ile
545                 550                 555                 560
Lys Asp Phe Glu Lys Gln Leu Asn Leu Thr Thr Glu Asp Val Asp Asp
565                 570                 575
Ile Tyr His Met Thr Val Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Ile Leu Leu Lys
580                 585                 590
Gln His Arg Val Cys Leu Leu Gln Gln Gln Gln Phe Leu Thr Gly Tyr
595                 600                 605
Ser Leu Asp Leu Leu Met Pro Leu Trp Ala Ser Tyr Thr Phe Leu Ser
610                 615                 620
Asn Asp Gln Phe Ser Arg Asp Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp
625                 630                 635                 640
Leu Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Tyr Tyr Lys Ser
645                 650                 655
Asn Ser Lys Leu Ser Tyr Gly Phe Leu Thr Pro Pro Arg Leu Asn Arg
660                 665                 670
Val Ser Asn His Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Val
675                 680                 685
Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp His Tyr Leu His Asp Thr
690                 695                 700
Leu Leu Gln Arg Tyr Ala His Glu Arg Asn Gly Ile Asn Val Val Ser
705                 710                 715                 720
Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu
725                 730                 735
Ile Leu Lys Gln Asn Ser Arg Val Ile Arg Ser Gln Glu Ile Leu Ile
740                 745                 750
Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Gln Leu Ser Glu
755                 760                 765
Thr Pro Leu Glu Cys Ser Ala Leu Glu Ser Ser Ala Tyr Ile Leu Pro
770                 775                 780
His Arg Pro Asp Asn Ile Glu Ser Cys Thr His Gly Lys Arg Glu Ser
785                 790                 795                 800
Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Thr Leu His Arg Ala Arg Val Thr Asp
805                 810                 815
Val Glu Leu Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Asp Arg Gln Glu Ser
820                 825                 830
Val Ser Glu Leu Leu Arg Leu Lys Thr His Leu Pro Ile Phe Ser Gln
835                 840                 845
Glu Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu
850                 855                 860
Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg
865                 870                 875                 880
Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu
885                 890                 895
Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln
900                 905                 910
Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp
915                 920                 925
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys
930                 935                 940
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu
945                 950                 955                 960
Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro
965                 970                 975
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu
980                 985                 990
Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala  Glu Ala Met Cys Thr  Ser Phe Lys
995                 1000                 1005
Glu Asn  Pro Thr Thr Phe Met  Gly His Tyr Leu His  Glu Val Ala
1010                 1015                 1020
Arg Arg  His Pro Tyr Phe Tyr  Ala Pro Glu Leu Leu  Tyr Tyr Ala
1025                 1030                 1035
Glu Gln  Tyr Asn Glu Ile Leu  Thr Gln Cys Cys Ala  Glu Ala Asp
1040                 1045                 1050
Lys Glu  Ser Cys Leu Thr Pro  Lys Leu Asp Gly Val  Lys Glu Lys
1055                 1060                 1065
Ala Leu  Val Ser Ser Val Arg  Gln Arg Met Lys Cys  Ser Ser Met
1070                 1075                 1080
Gln Lys  Phe Gly Glu Arg Ala  Phe Lys Ala Trp Ala  Val Ala Arg
1085                 1090                 1095
Leu Ser  Gln Thr Phe Pro Asn  Ala Asp Phe Ala Glu  Ile Thr Lys
1100                 1105                 1110
Leu Ala  Thr Asp Leu Thr Lys  Val Asn Lys Glu Cys  Cys His Gly
1115                 1120                 1125
Asp Leu  Leu Glu Cys Ala Asp  Asp Arg Ala Glu Leu  Ala Lys Tyr
1130                 1135                 1140
Met Cys  Glu Asn Gln Ala Thr  Ile Ser Ser Lys Leu  Gln Thr Cys
1145                 1150                 1155
Cys Asp  Lys Pro Leu Leu Lys  Lys Ala His Cys Leu  Ser Glu Val
1160                 1165                 1170
Glu His  Asp Thr Met Pro Ala  Asp Leu Pro Ala Ile  Ala Ala Asp
1175                 1180                 1185
Phe Val  Glu Asp Gln Glu Val  Cys Lys Asn Tyr Ala  Glu Ala Lys
1190                 1195                 1200
Asp Val  Phe Leu Gly Thr Phe  Leu Tyr Glu Tyr Ser  Arg Arg His
1205                 1210                 1215
Pro Asp  Tyr Ser Val Ser Leu  Leu Leu Arg Leu Ala  Lys Lys Tyr
1220                 1225                 1230
Glu Ala  Thr Leu Glu Lys Cys  Cys Ala Glu Ala Asn  Pro Pro Ala
1235                 1240                 1245
Cys Tyr  Gly Thr Val Leu Ala  Glu Phe Gln Pro Leu  Val Glu Glu
1250                 1255                 1260
Pro Lys  Asn Leu Val Lys Thr  Asn Cys Asp Leu Tyr  Glu Lys Leu
1265                 1270                 1275
Gly Glu  Tyr Gly Phe Gln Asn  Ala Ile Leu Val Arg  Tyr Thr Gln
1280                 1285                 1290
Lys Ala  Pro Gln Val Ser Thr  Pro Thr Leu Val Glu  Ala Ala Arg
1295                 1300                 1305
Asn Leu  Gly Arg Val Gly Thr  Lys Cys Cys Thr Leu  Pro Glu Asp
1310                 1315                 1320
Gln Arg  Leu Pro Cys Val Glu  Asp Tyr Leu Ser Ala  Ile Leu Asn
1325                 1330                 1335
Arg Val  Cys Leu Leu His Glu  Lys Thr Pro Val Ser  Glu His Val
1340                 1345                 1350
Thr Lys  Cys Cys Ser Gly Ser  Leu Val Glu Arg Arg  Pro Cys Phe
1355                 1360                 1365
Ser Ala  Leu Thr Val Asp Glu  Thr Tyr Val Pro Lys  Glu Phe Lys
1370                 1375                 1380
Ala Glu  Thr Phe Thr Phe His  Ser Asp Ile Cys Thr  Leu Pro Glu
1385                 1390                 1395
Lys Glu  Lys Gln Ile Lys Lys  Gln Thr Ala Leu Ala  Glu Leu Val
1400                 1405                 1410
Lys His  Lys Pro Lys Ala Thr  Ala Glu Gln Leu Lys  Thr Val Met
1415                 1420                 1425
Asp Asp  Phe Ala Gln Phe Leu  Asp Thr Cys Cys Lys  Ala Ala Asp
1430                 1435                 1440
Lys Asp  Thr Cys Phe Ser Thr  Glu Gly Pro Asn Leu  Val Thr Arg
1445                 1450                 1455
Cys Lys  Asp Ala Leu Ala Arg  Ser Trp Ser His Pro  Gln Phe Glu
1460                 1465                 1470
Lys
<210>  26
<211>  227
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  26
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys
225
<210>  27
<211>  618
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  27
Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala
1               5                   10                  15
Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala
20                  25                  30
His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu
35                  40                  45
Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala
50                  55                  60
Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65                  70                  75                  80
Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85                  90                  95
Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala
100                 105                 110
Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115                 120                 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala
130                 135                 140
Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly
145                 150                 155                 160
His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165                 170                 175
Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys
180                 185                 190
Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly
195                 200                 205
Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys
210                 215                 220
Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225                 230                 235                 240
Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr
245                 250                 255
Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly
260                 265                 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met
275                 280                 285
Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp
290                 295                 300
Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp
305                 310                 315                 320
Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp
325                 330                 335
Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340                 345                 350
Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser
355                 360                 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys
370                 375                 380
Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu
385                 390                 395                 400
Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys
405                 410                 415
Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu
420                 425                 430
Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435                 440                 445
Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu
450                 455                 460
Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile
465                 470                 475                 480
Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His
485                 490                 495
Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe
500                 505                 510
Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala
515                 520                 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu
530                 535                 540
Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys
545                 550                 555                 560
Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala
565                 570                 575
Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe
580                 585                 590
Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala
595                 600                 605
Arg Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
610                 615
<210>  28
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  28
Leu Ile Asn
1
<210>  29
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  29
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<210>  30
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  химически синтезированная
<400>  30
Arg Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<---