Кислые и щелочные протеазы головастиков озерной лягушки (Rana ridibunda) на разных стадиях метаморфоза

Выпуск 1

Сотрементя герпетология

2000

И.В.Фиц, Т.И.Жукова, М.Т.Проскуряков

КИСЛЫЕ И ЩЕЛОЧНЫЕ ПРОТЕАЗЫ ГОЛОВАСТИКОВ ОЗЕРНОЙ ЛЯГУШКИ (RANA RIDIBUNDA) НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ МЕТАМОРФОЗА

В литературе имеются противоречивые сведения о протеолитиче-ской активности желудочно-кишечного тракта головастиков некоторых видов бесхвостых амфибий.

M.H.Dood и J.M.Dood (1976) показали, что в период метаморфоза у головастиков бесхвостых амфибий активность кислых протеаз отсутствует. По мнению W.G.Reder (1964), W.E.Duellman и L.Trueb (1986), желудок головастиков, обнаруживаемый на завершающих стадиях метаморфоза, является только органом накопления пищи. Как орган пищеварения желудок головастиков функционирует лишь с момента перехода на плотоядный тип питания. R.Kujat (1981) определил активность пепсина и трипсина у головастиков Xenopus laevis уже на ранних стадиях метаморфоза. J.Edward (1991) обнаружил активность кислых протеаз у головастиков рода Lepidobatrachus.

Нами было определено содержание кислых и щелочных протеаз в кишечнике головастиков озерной лягушки (Rana ridibunda) на разных стадиях метаморфоза и описаны его морфологические изменения.

Протеолитическую активность определяли в исходном водном экстракте кишечника головастиков озерной лягушки, а также в активированном (в течение 20 мин при рН оптимума активности и температуре 35°С) экстракте. Активность кислых протеаз определяли методом M.LAnson (1938) по гемоглобину (рН 1.8) и методом Н.П.Пятницкого (1969) по молочно-ацетатной смеси; активность щелочных протеаз -методом Кунитца [Нортроп и др., 1950] по казеину (рН 7.6); активность трипсина и лейцинаминопептидазы - методом Tuppy [Tuppy et. al., 1962] по N-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилиду и лейцин-n-нитроанилиду; химотрипсина - по молочно-ацетатной смеси. Субстратом для определения коллагеназы служил азоколлаген, эластазы - эластин [Grant, Robbins, 1957]. Белок определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Головастиков озерной лягушки выращивали в лабораторных условиях. Стадии метаморфоза устанавливали по внешним признакам, используя таблицу, предложенную Н.В.Дабагян и Л.А.Слепцовой (1975).

Экология и распространение

Протеолитическую активность определяли в экстракте кишечника 20-25 головастиков каждой стадии. Исследовано 25 стадий метаморфоза (от стадии вылупления 30 и до последней стадии метаморфоза 54). Все цифровые результаты обработаны стандартными статистическими методами [Лакин, 1990].

Результаты исследований показали, что в исходном экстракте кишечника головастиков озерной лягушки протеолитическая активность ни на одной стадии метаморфоза нами не обнаружена. После воздействия активность кислых и щелочных протеаз обнаружена уже на ранних стадиях метаморфоза.

Максимальная активность кислых протеаз передней части кишечника головастиков обнаружена на 50-54 стадиях (таблица), когда желудок уже хорошо различим, стенки его достаточно утолщены. Активность кислых протеаз обнаружена нами и в оплодотворенной икре лягушек, но до вылупления (30 стадия) она была минимальной. Молокос-вертывающая активность кислых протеаз головастиков озерной лягушки обнаружена лишь на последней стадии метаморфоза (0.005±0.001ед./ед.).

Удельная активность кислых и щелочных протеаз кишечника головастиков озерной лягушки на разных стадиях метаморфоза

Стадии метаморфоза Активность кислых протеаз по гемоглобину, ед./ ед. Активность щелочных протеаз по казеину, ед./ ед. Активность трипсина по БапНА, ед./ ед.

30 0.20±0.001 0.04±0.005 0

32-34 0.060±0.002 0.08±0.005 0

35-38 0.060±0.002 0.08±0.005 0

39 0.060±0.003 0.09±0.006 0

40-42 0.085±0.004 0.09±0.005 0

43-45 0.085±0.003 0.09±0.004 0.05±0.002

46-47 0.095±0.003 0.09±0.004 0.05±0.002

48-49 0.095±0.004 0.10±0.009 0.08±0.002

50 0.110±0.02 0.10±0.02 0.09±0.004

51 0.110±0.04 0.11±0.02 0.09±0.003

52 0.110±0.05 0.14±0.009 0.09±0.003

53 0.115±0.04 0.18±0.03 0.11±0.02

54 0.115±0.04 0.20±0.03 0.12±0.02

Область оптимума рН активности для кислых протеаз головастиков на 50-54 стадиях находится в интервале рН 3.5-5.5. Ранее нами была определена область оптимума рН активности для кислых протеаз же-

Выпуск 1

Современная герпетология

2000

лудка и пищевода у сеголеток озерной лягушки (рН 1.5-2.5 - для кислых протеаз желудка, рН 2.0-3.0 - для кислых протеаз пищевода) [Фиц, Проскуряков, 1998].

Таким образом, обнаруженные в кишечнике головастиков озерной лягушки кислые протеазы отличаются от кислых протеаз желудка и пищевода сеголеток озерной лягушки.

Исследование кишечника головастиков озерной лягушки показало, что общая казеинолитическая активность обнаружена уже на первых стадиях метаморфоза и максимальна на конечных 53-54 стадиях (см. таблицу). В оплодотворенной икре лягушек удельная активность щелочных протеаз по казеину в 2 раза выше, чем на стадии вылупления (0.08±0.003, 0.04±0.005 ед./ед.).

На 43-45 стадиях, когда поджелудочная железа визуально еще не видна, обнаружена активность трипсина. Удельная активность трипсина увеличивается по мере развития головастиков и максимальна на 53-54 стадиях, когда поджелудочная железа уже различима и имеет лопастную форму. По нашим данным, на долю трипсина приходится большая часть всей протеолитической активности, она максимальна на 50-52 стадиях - 90%. На 53-54 стадиях доля активности трипсина несколько снижается (до 60%) за счет появления других протеолитических ферментов.

Область оптимума рН активности трипсина головастиков озерной лягушки на 52-54 стадиях находится в интервале рН 8.5-10.0, которая несколько отличается у сеголеток (рН 8.0-9.5).

Активность химотрипсина, эластазы и коллагеназы обнаружена лишь на последней стадии метаморфоза (0.006±0.002, 0.05±0.003, 0.05±0.003 ед./ед. соответственно). Лейцинаминопептидаза в экстрактах кишечника головастиков озерной лягушки нами не обнаружена. Активность этого фермента определяется лишь в экстрактах кишечника сеголеток и взрослых особей озерной лягушки.

Наши результаты подтверждают мнение, что в кишечнике головастиков некоторых видов бесхвостых амфибий присутствуют и кислые, и щелочные протеазы, но представлены они иными изоформами по сравнению с сеголетками и взрослыми особями. Различия протеолитических ферментов обусловлены разными типами питания головастиков и взрослых лягушек.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Дабагян Н.В., Слепцова Л.А. Травяная лягушка (Rana temporaria) // Объекты биологического развития. М., 1975. С. 495-507.

Э_ология и распространение

Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990.

Нортроп Д., Кунитц М., Херриот Р. Кристаллические ферменты. М., 1950. С.1-346.

Пятницкий Н.П. Определение активности химотрипсина по скорости створаживания молочно-ацетатной смеси // Материалы 17-й науч. конф. физиологов юга РСФСР. Ставрополь, 1969. Т. 2. С. 80-82.

Фиц И.В., Проскуряков М.Т. Кислые протеазы пищевода и желудка озерной лягушки (Rana ridibunda) // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий: Материалы ХП межресп. науч.-практ. конф. Краснодар, 1999. С. 147, 148.

Anson M.L. The estimation of pepsin, trypsin, pepsin and catepsin with hemoglo-bin//J.General Physiological. 1938. Vol. 22. P. 79-89.

Dood M.H., Dood J.M. The biology of metamorphosis // In Physiology of the Amphibia. 1976. Vol. 3. P. 467-599.

Duellman W.E., Mrueb L. Trueb. Biology of amphibians. N.Y., 1986.

Edward J. Milinda Seneviratne, Rodolfo Ruibal. Gastric Pepsin in a Anuran Larva // Development. Growth and Differentiation. Department Universite California. 1991. Vol. 33, № 5. P.499-507.

Grant N.H., Robbins K.S. Studies of Porcine Elastase and Proelastase // Arch. Biochem. biophysical. 1957. Vol. 66. P. 396-403.

Kujat R. Pepsin and Trypsin Activity in the Fore Gut of Metamorphosing Xenopus laevis Larvae // Folia Biological. 1981. Vol. 29, № 3-4. P. 274-278. Р. 211-213.

Redeer W.G. The degestive system // Physiology of the Amphibia. Academic Press. 1964. P. 99-149.

Tuppy H., Wiesbauer U., Winterberger E. Aminosaure-p-nitroanilide als Substrat fur Aminopeptidasen und andere Proteolytische Fermente // Z.Physiology Chemestry. 1962. Bd.329, h.3-6. S. 278-288.

ACID AND ALKALINE PROTEINASES OF MARSH FROG (RANA RIDIBUNDA) TADPOLES IN DIFFERENT STAGES OF METAMORPHOSIS

I.V.Fits, T.I.Zhukova, M.T.Proskuryakov

Acid proteinases and trypsin were found active in the developing foregut of a Rana ridibunda tadpole. The activity of proteinases in the tadpole foregut grew in the course of metamorphosis. Chymotrypsin, elastase and collagenase were also active at the last, namely 54th, stage of metamorphosis. However, the activity of leucinaminopeptidase was not revealed in foreguts of R.ridibunda tadpoles.

Россия (Russia).

350040, г.Краснодар, ул.Ставропольская, 224/1, 49, Т.ИЖукова