Проблемы масштабирования при производстве рекомбинантного белка капсида ЦВС-2

Рисунок - Схема синтетической последовательности:

последовательность Козак (ACCATGG); старт-кодон (ATG); Ii - сигнал лизосом-ной локализации инвариантной цепи главного комплекса гистосовместимости класса II; M - мембранный белок вируса (522 п.о.); Gp5 - гликопротеин оболочки вируса (606 п.о.); стоп-кодон (TAG); Nhel, XhoI - сайты рестрикции, использованные для клонирования.

Полученная последовательность была клонирована в коммерческий плазмидный вектор pVAX1(«Thermo Fisher Scientific», США), предназначенный для экспрессии встраиваемых генов в клетках млекопитающих. Затем данным вектором трансформировали клетки E. coli XL-1 Blue, в которых происходила его наработка. Наличие нужной области в плазмидах, выделенных из трансформированных клеток бактерий, подтверждено с помощью ПЦР-анализа с использованием соответствующих праймеров. На электрофореграмме образцов после ПЦР были идентифицированы фрагменты ДНК размером около 1300 пар оснований, что соответствует размеру клонированной синтетической последовательности.

В результате проведенной работы был получен штамм E. coli XL-1 Blue, содержащий плазмидный вектор с нуклеотидной последовательностью, кодирующей два белка вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и сигнал лизосомной локализации. В ходе дальнейшей работы планируется оценить эффективность экспрессии целевых генов в составе ДНК-вакцинной конструкции на культуре клеток животных.

Список литературы:

1. Стародубова, Е. С. Встраивание сигнала направления в лизосомы инвариантной цепи изменяет деградацию обратной транскриптазы ВИЧ-1, повышая ее иммуногенность / Е. С. Стародубова, М. Г Исагулянц, Ю. В. Кузьменко, О. А. Кротова, В. Л. Карпов // Acta Naturae - 2014. - Т. 6. - № 1 (20). - 66-73.

2. Coban, C. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines / C. Coban [et. al.] // Human Vaccines. - 2008. - № 4. - Р 453-456.

3. Li, J. Dissociation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus neutralization from antibodies specific to major envelope protein surface epitopes / J. Li, M. Murtaugh // Virology. - 2012. - V. 433. - P. 367-376.

4. Nam, H. Immune responses in mice vaccinated with virus-like particle composed of the GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / H. Nam [et. al.] // Arch Virol. - 2013. - V. 158(6). - P. 1275-1285.

УДК 579.6:663.18

ПРОБЛЕМЫ МАСШТАБИРОВАНИЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА КАПСИДА ЦВС-2

К.В. Кудин, магистр биол. наук В.А. Прокулевич, д-р биол. наук, про фессор

Белорусский Государственный Университет, биологический факультет

kiryl.kudin@gmail.com

UDC 579.6:663.18

SCALING ISSUES OF PRODUCTION OF THE RECOMBINANT PCV2 CAPSID PROTEIN

Kudin K.V/, Prokulevich V.A.

Belarusian State University, the faculty of

biology

Цирковирус свиней типа 2 является первичным этиологическим агентом цирковирусных болезней свиней и считается одним из наиболее экономически значимых патогенов в промышленном свиноводстве. В связи с

Porcine circovirus of type 2 is the primary etiological agent of porcine circovirus diseases and is considered to be one of the most significant pathogens in pork industry. Because of this, it has become an important object of studies aimed

этим он стал важным объектом исследований, направленных на разработку средств диагностики и профилактики на основе генно-инженерных технологий. В данной работе рассматриваются некоторые проблемы, связанные с масштабированием процесса выращивания бактериального продуцента рекомбинантного белка капсида ЦВС-2, и описан ряд технологических приемов, позволивших довести концентрацию сырой биомассы до 297 г/л в лабораторном ферментере. Ключевые слова: ЦВС-2, рекомби-нантный белок капсида, ферментация

at the development of prevention and diagnosis facilities based on recombinant DNA technologies. In the given research some problems concerning scaling of the process of growth of the bacterial strain producing recombinant PCV2 capsid protein are considered. Also a number of techniques are described that enabled the culture to grow to the wet cell weight of 297 g/L in the laboratory fermenter.

Key words: PCV2, capsid recombinant protein, fermentation

Введение

Одним из наиболее значимых патогенов в промышленном свиноводстве считается цирковирус свиней типа 2 (ЦВС-2) [1]. Из-за чрезвычайно широкого распространения и вызываемых системных заболеваний, трудно поддающихся лечению, ЦВС-2 приносит огромные экономические убытки [2-4]. Эффективные меры контроля включают регулярный мониторинг и предупреждение цирковироов [4], в том числе вакцинацию поголовья. В связи с этим со стороны индустрии свиноводства наблюдается постоянный интерес к разработке и производству доступных, эффективных и дешевых средств диагностики и профилактики цирковирусной инфекции. Ранее в НИЛ биотехнологии БГУ был получен бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного белка капсида ЦВС-2 [5, 6]. Накопление данного белка в клетках продуцента происходит в растворимой форме и составляет около 18 % от общей массы клеточных белков [6, 7]. Увеличение массовой доли рекомбинантного белка для повышения выхода на этапе очистки в данный момент не представляется возможным [7], однако для проведения исследований, осуществления производства и компенсации потерь на различных этапах биотехнологического процесса [8] требуется значительное количество рекомбинантного белка. Решением этой проблемы может стать увеличение биомассы продуцента на этапе культивирования, поэтому целью работы являлось масштабирование процесса наработки рекомбинантного белка капсида ЦВС-2 в штамме-продуценте в условиях ферментера.

Материалы и методы

Для культивирования продуцента рекомбинантного белка капсида использовали 15-литровый ферментер фирмы ВЫес1то (Корея) с программным обеспечением С-В10 D (Франция) и ферментер (INFORS НТ, Швейцария) объемом 30

л (с использованием встроенного программного обеспечения). Инокулят засевали накануне в среде ZYM-505 [9] и растили в плоскодонных колбах при температуре 30 °С на качалке (180 об/мин) до поздней экспоненциальной фазы. Объем иноку-лята составлял 5-10% от объема ферметационной среды. Концентрацию сырой биомассы определяли путем измерения массы осажденных центрифугированием клеток (10 000 д, 30 мин) в образцах объемом 50 мл, взятых на различных этапах культивирования. Остаточную массу солей и субстрата в осадке клеток при взвешивании не учитывали. Аэрация обеспечивалась путем регулировки скорости враще-

ния механической мешалки (до 1000 об/мин), скорости подачи воздуха (до 30 л/ч) и давления в колбе ферментера (до 2 бар). Денситометрический анализ окрашенных гелей (Кумасси) проводили с ПО ImageJ (v. 1.50e).

Результаты

Периодическая бактериальная культура имеет ряд недостатков, наиболее заметным из которых является ограничение ее питательной емкости некоторой максимально допустимой концентрацией субстрата. Использование различных модификаций тщательно сбалансированных питательных сред [9] не позволяло нам добиться концентрации сырой биомассы более 70 г/л [7]. Поэтому для достижения поставленной цели мы использовали ряд технологических приемов, первым из которых стало введение подпитки. Из возможных источников углерода и энергии выбор был сделан в пользу глицерина по причинам, описанным в [9], а также из-за ограничений, которые накладывает конечный объем ферментера на количество добавляемого субстрата. Использование ежечасной подпитки по уравнению, приведенному в [10], при периодическом культивировании в течение 12-14 часов, позволило поднять концентрацию сырой биомассы до 156 г/л. Удельная скорость роста (|j) и экономический коэффициент (YX/S) для уравнения [10] были приняты равными 0,29 ч-1 и 0,2 соответственно по результатам предварительных экспериментов. Состав солей использовали из [9]. Дальнейшие ограничения в росте культуры были обусловлены рабочим временем ферментации и количеством растворенного кислорода.

Дальнейшего роста биомассы удалось достигнуть за счет увеличения времени ферментации путем разделения процесса на два рабочих дня. Через 10-12 часов после начала ферментации культура охлаждалась до температуры 10-11 °C, когда метаболизм клеток значительно замедлялся, и инкубировалась ночь при минимальном перемешивании (100-150 об/мин) и барботаже (1 л/ч). Данный прием позволяет сохранить свойства культуры, поэтому при возвращении к нормальной температуре она продолжает экспоненциальный рост без выраженной лаг-фазы (рисунок 1А, точки непосредственно перед началом охлаждения и после нагревания совмещены на графике).

Из-за сложностей периодического внесения субстрата, обусловленных повышенным давлением воздуха в колбе ферментера на поздних этапах роста, глицерин добавляли порциями по окончании его утилизации (без использования уравнения), не превышая концентрацию 2%, для исключения возможного влияния постепенно растущих концентраций глицерина на рост культуры. Время для внесения очередной порции определяли по изменению газового состава среды, которое сопровождалось резким повышением концентрации растворенного кислорода. После достижения отметки 10 % уровень кислорода поддерживали путем постепенного снижения температуры культуры (до 28 °C). Соли и микроэлементы использовали из [9] и добавляли порциями, делая перерасчет на элементарный состав клеток E. coli B [11]. Из-за высокой интенсивности подкисления среды при высокой концентрации клеток для контроля рН гидроксид натрия заменили на 25 %-ный раствор аммония, который также выступал источником азота. Это позволило избежать чрезмерного и нежелательного повышения ионной силы культуральной жидкости. В общей сложности за 19 часов такой ферментации концентрация сырой биомассы достигала значения 297 г/л.

При такой плотности культуры стандартные методы индукции для системы экспрессии на основе фага Т7 оказались неэффективны, и рекомбинантный белок отсутствовал при концентрациях ИПТГ до 1 мМ, при концентрации 1,2 мМ его массовая доля возросла до 5% (рисунок 1Б, доля целевого белка в положительном

контроле 17 %). Вероятнее всего, используемый диапазон концентраций индуктора оказывается недостаточным при такой плотности клеток.

Экспоненциальная фаза роста продолжалась в течение 12 часов (средняя удельная скорость роста составила 0,4 ч-1). Замедление роста началось при понижении уровня кислорода до 10 % и продолжалось при снижении температуры и добавлении ИПТГ. После внесения индуктора подпитка продолжалась, однако экспрессия началась лишь после окончания подпитки и снижения пороговой концентрации глицерина.

Время, ч

—^-Мутность —«—Сырая биомасса

—г- удельная скорость роста • Температура

Рис. 1 - А. - Параметры роста культуры продуцента рекомбинантного белка капсида. Б. - ДСН-ПААГ электрофорез проб культуры продуцента (точки отбора проб Ф, и Ф2 обозначены на рисунке А), О - отрицательный контроль, П - положительный контроль. Выводы

Таким образом, ряд технологических приемов позволил довести концентрацию сырой биомассы культуры продуцента рекомбинантного белка капсида ЦВС-2 до 297 г/л. Однако при такой плотности клеток не удалось максимизировать продукцию рекомбинантного белка. Вероятной причиной этого является недостаточное количество индуктора, используемое в стандартных протоколах экспрессии системы Т7.

Список литературы:

1. Кудин К.В. Клонирование гена белка капсида белорусского штамма цирковируса свиней 2 типа/ К.В. Кудин, В.А. Прокулевич // Вестник БГУ. - 2011. - Сер. 2. - № 2. - С. 37-41.

2. Кудин К.В. Продукция рекомбинантного укороченного белка капсида цирковируса свиней типа 2 в бактериальных клетках/ К.В. Кудин, В.А. Прокулевич // Вестник БГУ - 2014. - Сер. 2. - № 2. - С. 60-65.

3. Кудин К.В. Очистка рекомбинантного белка капсида ЦВС-2 для разработки иммуноферментного анализа/ К.В. Кудин, В.А. Прокулевич // Труды БГУ - 2014. - Том 9, Ч. 1. - С. 199-207.

4. Прокулевич В.А. Экспрессия открытой рамки трансляции белка капсида ЦВС-2 в клетках E. coli / В.А. Прокулевич, К.В. Кудин // Микробные биотехнологии. - 2013. - Том 5. - С. 131-141.

5. Bauer S., Ziv E. Dense growth of aerobic bacteria in a bench-scale fermentor // Biotechnol. Bioeng. 1976. Vol. 18, № 1. P. 81-94.

6. Firth C. et al. Insights into the evolutionary history of an emerging livestock pathogen: porcine circovirus 2. // J. Virol. 2009. Vol. 83, № 24. P. 12813-12821.

7. Gillespie J. et al. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease // J. Vet. Intern. Med. 2009. Vol. 23, № 6. P. 1151-1163.

8. Lee S.Y. High cell density culture of Escherichia coli // Trends Biotechnol. 1996. Vol. 14, № 3. P. 98-105.

9. Madson D.M., Opriessnig T. Effect of porcine circovirus type 2 (PCV2) infection on reproduction: disease,

vertical transmission, diagnostics and vaccination // Anim. Health Res. Rev. 2011. Vol. 12, № 1. P. 47-65.

10. Ramamoorthy S., Meng X.-J. Porcine circoviruses: a minuscule yet mammoth paradox // Anim. Health Res. Rev. 2009. Vol. 10, № 1. P. 1-20.

11. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures // Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 41, № 1. P. 207-234.

УДК 636.084.42

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА КОРМОВОГО ПРОДУКТА С СОДЕРЖАНИЕМ РЖИ

А.Н. Лазаревич, кандидат с.-х. наук ФГБНУ Красноярский НИИЖ

UDC 636.084.42

TECHNOLOGY OF PRODUCTION OF

FEED PRODUCT

WITH A CONTENT OF RYE

Lazarevic A. N., Cand. Agr. Sci FSBSI Krasnoyarsk RIAH

aleksand.lazarevic@yandex.ru

Автором статьи предложена новая технология получения кормового продукта на основе биоферментации кормосмеси, которая имеет в своем составе до 50% ржи. Определен его химический состав и питательность. Предложенная технология получения кормового продукта является инновационным решением и высокоэффективным методом приготовления высококачественного кормового средства с низкой стоимостью.

Ключевые слова: рожь, закваска, Key words: rye, sour, fermentation,

ферментация, корм, рацион, белок, food, diet, protein, fiber

клетчатка

The author proposed a new technology of feed product on the basis of feed, bio-enzymatic, which incorporates up to 50% of rye. It is determined its chemical composition and nutritional value. The proposed technology of fodder product obtaining is an innovative solution and highly effective method of making high-quality feed with low cost.

Несмотря на высокую энергетическую питательность, сходную с другими видами зерна, рожь не находит широкого применения как кормовая культура в силу определённых специфических особенностей её химического состава, хотя имеет низкую стоимость. Исследованиями установлено, что желудочно-кишечный тракт свиньи не усваивает рожь, если в кормовых смесях ее содержится более 10%. Пониженная кормовая ценность зерна ржи обусловлена высоким содержанием в ней пентозанов и алколоидных производных резорцина, вызывающих уменьшение поедаемости и перевариваемости корма. Повысить переваримость некрахмалистых полисахаридов и протеина, содержащихся в зерне ржи, можно путем биоферментации [1- 4].

Цель исследований Разработать технологию получения кормового продукта, который имеет в своем составе до 50% ржи с помощью закваски Леснова. Определить его химический состав, питательность и себестоимость.

Объекты и методы исследований В соответствии с целью и задачами исследования объектами стали рожь, кормовой продукт и комбикорм СК-6. Эксперимент был проведен на предприятии ООО «СИБАГРО» г. Красноярска в 2014 г. Исследования химического состава и питательности кормового продукта проводились в КГКУ «Краевая ветеринарная лаборатория» г. Красноярска.

Результаты исследований и их обсуждение

Технология приготовления кормового продукта основана на близком по физио-