Способ гистологической окраски эластических и коллагеновых волокон на одном препарате
METHOD FOR HISTOLOGICAL STAINING OF ELASTIC AND COLLAGEN FIBERS ON ONE PREPARATION

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, может быть применено в патологической анатомии и предназначено для выявления эластических и коллагеновых волокон на одном гистологическом препарате.
Способы гистологической окраски для выявления эластических и коллагеновых волокон на одном гистологическом препарате известны из ряда источников, а именно: известен способ окраски гистологических препаратов по Вейгерту-ван Гизону резорцин-фуксином с докрашиванием пикрофуксином, при котором эластические волокна окрашиваются в темно-синий цвет, а коллагеновые в красный [Bancroft J.D., Layton C., Suvarna S.K. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques. 7th (edn) // Churchill Livingstone, NY, USA. - 2013. - Р. 206-207]. Также известен способ окраски эластических волокон резорцин-фуксином с докрашиванием гистологических препаратов прочным зеленым FCF, который окрашивает коллагеновые волокна в светло-зеленый цвет [патент РФ №2761756]. Недостатком известных способов окраски гистологических препаратов является то, что приготовление раствора резорцин-фуксина трудоемко, затратно по времени и требует специального лабораторного оборудования. Также известен способ гистологической окраски эластических волокон орсеином по Тенцеру-Унна, но он не предполагает окрашивания коллагеновых волокон [Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники // Л.: Медицина. - 1969. - С. 189-190].
В качестве прототипа - наиболее близкого аналога - выбран способ окраски эластических и коллагеновых волокон на одном гистологическом препарате, описанный J.B.J.G. Valdiero и соавт. (2019) [Valdiero J. B. J. G., Dias da Cunha R.L., de Brito-Gitirana L. Combined staining of elastic and collagen fibers for histopathological and differential diagnosis in aorta pathologies // Journal of Histotechnology. - 2019. - Vol. 42. - №.2. - P. 87-91.]. Материал фиксируют в 10% растворе нейтрального забуференного формалина, обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле, заключают в парафин, из парафиновых блоков изготавливают срезы, депарафинированные срезы погружают в 1% раствор орсеина при температуре 60°C на 30 мин, для удаления избытка красителя проводят дифференцировку в солянокислом спирте 10 с, промывают в дистиллированной воде, окрашивают 1% раствором светового зеленого 2 мин, дегидратируют, просветляют и заключают в синтетическую монтирующую среду, в результате чего эластические волокна окрашиваются в коричневый цвет, коллагеновые волокна в светло-зеленый цвет.
Недостатком приведенного способа является использование труднодоступного красителя, раствора светового зеленого, для окраски коллагеновых волокон.
Проблема, на решение которой направлен патентуемый способ, состоит в упрощении процесса изготовления гистологических препаратов, на которых видны как эластические, так и коллагеновые волокна, за счет использования доступных и простых в приготовлении красителей.
Указанная проблема решается за счет того, что гистологические срезы после депарафинизации погружают в 1% раствор орсеина при температуре 60°C на 30 мин, после чего промывают в дистиллированной воде 2-3 с, затем дифференцируют в абсолютированном изопропиловом спирте в течение 10 мин. Осушают поверхность срезов фильтровальной бумагой и наносят на 20 мин 0,1% раствор прочного зеленого FCF, смешанный с насыщенным раствором пикриновой кислоты в соотношении 1:10 непосредственно перед окраской, далее промывают в дистиллированной воде 2-3 с, дегидратируют, просветляют и заключают в синтетическую монтирующую среду, на гистологических препаратах отчетливо видны эластические волокна, которые имеют красно-коричневый цвет и коллагеновые волокна, окрашенные в светло-зеленый цвет.
Способ поясняется фотографиями этапов окраски и гистологических препаратов:
На Фиг. 1 представлены этапы окраски гистологических препаратов.
1 - погружение в 1% орсеин при температуре 60°C на 30 минут;
2 - дифференцировка в абсолютированном изопропиловом спирте 10 минут;
3 - нанесение на поверхность среза смеси 0,1% раствора прочного зеленого FCF и насыщенного раствора пикриновой кислоты в соотношении 1:10, на 20 минут.
На Фиг. 2 представлен гистологический препарат участка передней межжелудочковой ветви левой венечной артерии взрослого человека. Ув. х40.
1 - эластические волокна;
2 - коллагеновые волокна.
На Фиг. 3 представлен гистологический препарат хорды митрального клапана взрослого человека. Ув. х400.
1 - эластические волокна;
2 - коллагеновые волокна.
Указанная проблема решается следующим образом.
Для изготовления гистологических препаратов берут материал, фиксированный в 10% растворе нейтрального забуференного формалина, обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле, затем пропитывают парафином. Из парафиновых блоков изготавливают срезы толщиной 3-5 мкм, которые помещают на предметные стекла. Стекла со срезами, далее гистологические препараты, после депарафинизации в ксилоле помещают в абсолютированный спирт, затем в 90% спирт. Из 90% спирта их переносят в 1% раствор орсеина при температуре 60°C на 30 мин. 1% раствор орсеина готовят заранее по общепринятой методике, для чего в 100 мл 70% этилового спирта растворяют 1 г орсеина и добавляют 1 мл концентрированной соляной кислоты [1]. После выдержки в 1% растворе орсеина гистологические препараты промывают в дистиллированной воде в течение 2-3 с, затем дифференцируют в абсолютированном изопропиловом спирте 10 мин. Осушают поверхность срезов фильтровальной бумагой и наносят на них 0,1% раствор прочного зеленого FCF, смешанный с насыщенным раствором пикриновой кислоты в соотношении 1:10 непосредственно перед окраской, время окрашивания составляет 20 мин. Приготовление растворов прочного зеленого FCF и насыщенного раствора пикриновой кислоты осуществляют предварительно. Приготовление раствора прочного зеленого FCF: 0,1 г прочного зеленого FCF смешивают с 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 100 мл дистиллированной воды. Приготовление насыщенного раствора пикриновой кислоты: 1,2 г пикриновой кислоты растворяют в 100 мл подогретой до 60-70°C дистиллированной воды, после охлаждения раствора наблюдается выпадение кристаллического осадка, что указывает на получение насыщенного раствора. Через 20 мин гистологические препараты промывают в дистиллированной воде в течении 2-3 с, дегидратируют, просветляют и заключают в синтетическую монтирующую среду. На гистологических препаратах отчетливо видны эластические волокна, которые имеют красно-коричневый цвет и коллагеновые волокна, окрашенные в светло-зеленый цвет.
Технический результат заключается в том, что при выполнении окраски гистологических препаратов по предлагаемому способу, за счет использования доступных и простых в приготовлении красителей достигается упрощение процесса изготовления гистологических препаратов, на которых видны как эластические, так и коллагеновые волокна.
Используемая литература
1. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники // Л.: Медицина. - 1969. - С. 189-190.
2. Патент RU 2761756 C1 11.01.2021 Дмитриева Е.Г., Хацко С.Л. Способ дифференцированной окраски эластических и коллагеновых волокон на гистологическом препарате, ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России.
3. Bancroft J.D., Layton C., Suvarna S.K. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques. 7th (edn) // Churchill Livingstone, NY, USA. - 2013. - Р. 206-207.
4. Valdiero J. B. J. G., Dias da Cunha R. L., de Brito-Gitirana L. Combined staining of elastic and collagen fibers for histopathological and differential diagnosis in aorta pathologies //Journal of Histotechnology. - 2019. - Vol. 42. - №.2. - P. 87-91.