Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях
METHOD FOR ESTIMATING EFFICIENCY OF ENDOTHELIOTROPIC THERAPY AFTER RECONSTRUCTIVE OPERATIONS ON ARTERIES

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использовано при лечении облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей (ОААНК).
По данным отечественных авторов более 60% больных, которые обращаются к сосудистому хирургу по поводу перемежающей хромоты, имеют IIб стадию заболевания по классификации Фонтейна-Покровского [1]. Это пациенты, которым чаще всего выполняют реконструктивные операции. Однако в течение 5 лет до 40% протезов перестают функционировать [1]. Основной причиной тромбозов шунтов является рестеноз зоны реконструкции, вследствие гиперплазии неоинтимы, обусловленной эндотелиальной дисфункцией (ЭД) [2].
Применение спектра современных гипохолестеринемических препаратов не решает проблему коррекции эндотелиальной дисфункции, а тропные средства коррекции ЭД пока не вошли в арсенал сосудистых хирургов. Это обусловлено во многом отсутствием системных исследований и малым вниманием к возможностям медикаментозной коррекции ЭД и традиционному акценту на хирургию гемодинамически значимых результатов рестеноза.
Роль же дисфункции эндотелия в прогрессировании атеросклероза и развитии гиперплазии интимы сомнений не вызывает [2].
Существует целый ряд биохимических маркеров функционального состояния эндотелия (ФСЭ), определение уровня которых может не только дать ответ о тяжести эндотелиальной дисфункции, но и показать эффективность проводимой терапии [2, 10].
Перспективным направлением является оценка иммуногистохимических тестов для определения активности внутриклеточных структур [3].
В качестве прототипа использован патент на изобретение №2503961 от 09.04.2012 [4]. Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что оценку эффективности эндотелиотропной терапии осуществляют на основании уровня биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции, динамика которых зависит от активности экспрессии внутриклеточных белков (актин, CD34 и трансформирующий фактор роста β). Это позволяет корректно интерпретировать биохимические изменения до наступления гиперплазии неоинтимы и выявить связь между уровнем биохимических маркеров и активностью внутриклеточных структур.
Анализ полученных данных позволит оценить эффективность проводимой эндотелиотропной терапии, проводить коррекцию терапии до развития гиперплазии неоинтимы.
Цель изобретения - оценка эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях и прогнозирование развития гиперплазии неоинтимы до наступления морфологических изменений.
Способ заключается в следующем: экспериментальным животным проводилось моделирование L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции, затем выполнялась операция аллопластика инфраренального отдела брюшной аорты, назначалась эндотелиотропная терапия, наблюдение составляло 1 месяц, с последующим выводом животных из эксперимента, забором зоны пластики и выполнением трансмиссионной электронной микроскопии, иммуногистохимических и биохимических тестов.
Животные были разделены на 2 равнозначные группы. В первой (контрольной) группе животные в послеоперационном периоде не получали эндотелиотропной терапии. Во второй группе животные в послеоперационном периоде с целью коррекции эндотелиальной дисфункции получали L-аргинин в дозе 200 мг/кг в сутки.
В первый день эксперимента осуществляли забор крови из подкожной вены правой передней конечности животного в количестве 4-5 мл в стерильные пробирки для определения следующих показателей: малоновый диальдегид (МДА), супероксиддисмутаза (СОД), оксид азота (II) (NO).
Через 3 дня от начала эксперимента под наркозом выполнялась операция - аллопластика брюшного отдела аорты.
Моделирование L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции осуществлялось путем введения в течение 7 дней N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. Для подтверждения получения модели повторно проводился забор крови и определение биохимических показателей.
В процессе наблюдения в различные сроки (до операции и через 1 месяц после вмешательства) проводится лабораторный контроль биохимических показателей с целью оценки функционального состояния эндотелия (определение малонового диальдегида колориметрическим методом по реакции 2-тиобарбитуровой кислотой [5]; определение активности супероксиддисмутазы спектрофотометрическим (кверцитиновым) методом (Бурмистров C.O., 1997) в модификации [5]; количественное определение стабильных конечных метаболитов оксида азота (II) [6].
β
Через 1 месяц наблюдения животные наркотизируются и выводятся из исследования, зона пластики изучается с помощью трансмисионной электронной микроскопии и определения экспрессии иммуногистохимических (ИГХ) маркеров: актин, CD34 и TGF на тканевых срезах [6].
Материал для исследования ИГХ методами фиксировали в 10% нейтральном формалине течение 24 ч заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 часов. Восстановление антигенной активности проводили в миниавтоклаве «2100Retrieval» («Pick Cell») при температуре 121°С в течение 20 мин с последующим остыванием на протяжении 90 мин. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 мин с 3% раствором перекиси водорода. Восстановление проводили в нитратном буфере с рН 6,0. В качестве детекционной системы применяли систему «EnVision» («Dako Cytomation»), в качестве хромогена - диаминобензидин (LSAB, Dako Cytomation) и АБС (LSAB, Dako Cytomation). Для получения результатов, пригодных для количественной обработки реакции, проводили с помощью автоматического иммуногистостейнера «Autosteiner Dako».
Для ИГХ-реакций ставили положительные (в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя) и отрицательные (без первичных антител) контроли. Оценка результатов ИГХ-исследования проводилась следующим способом: интенсивность реакций с цитоплазматической экспрессией оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 (0 - отсутсвие экспрессии, 1 - слабая экспрессия - менее 20% клеток экспрессируют искомый антиген, 2 - умеренная экспрессия - 50% экспрессируют искомый антиген, 3 - сильная экспрессия - 70% клеток экспрессируют искомый антиген).
Результаты, полученные в ходе исследования, представлены в таблицах 1 и 2.
β
β
Из таблицы 1 наглядно видно, что на фоне введения L-NAME до операции наблюдается снижение секреции оксида азота (II) и высокое содержание СОД и МДА, что является убедительным признаком развития нарушения функционального состояния эндотелия. При этом наблюдается изменение экспрессии искомых антигенов, проявляющееся в усилении экспрессии а-ГМА, TGF и снижении экспрессии CD34. Дальнейшее колебание изучаемых биохимических показателей отражает тот факт, что на протяжении 1 месяца секреция оксида азота, как основного маркера эндотелиальной дисфункции, остается подавленной, активность МДА высокой. Также наблюдается усиление экспрессии а-ГМА, TGF и снижение экспрессии CD34.
2
2
Уровень СОД сохраняется высоким на протяжении всего периода наблюдения. СОД катализирует реакцию превращения супероксида в HO. Оксид азота (II) и СОД конкурируют за супероксид-анион. Высокая концентрация СОД в сыворотке крови животных говорит об активности антиоксидантной системы.
Малоновый диальдегид является конечным продуктом перекисного окисления липидов. Повышение активности ПОЛ ведет к угнетению секреции NO и его повышенному разрушению, что создает благоприятные условия для прогрессирования атеросклероза и развития рестеноза.
Решающая роль в патологических изменениях сосудов при различной патологии отводится факторам роста - полипептидным химическим агентам, продуцируемым in situ клетками стенки сосуда (эндотелиальными, гладкомышечными клетками) и клетками крови (тромбоцитами, лейкоцитами). Семейство фактора роста фибробластов (FGF) представлено 22 сходными по структуре полипептидными соединениями, играющими важную роль в процессах эмбрионального развития, ангиогенеза, васкулогенеза и заживления ран. Все представители семейства FGF воздействуют на клетку путем активации специфических трансмембранных тирозинкиназных рецепторов.
β
Трансформирующий фактор роста β (TGF) - фактор роста тромбоцитов в совокупности с другими факторами роста способны действовать как агенты "компетентности", повышая пролиферативную активность клеток-мишеней, или как агенты "прогрессии", стимулируя синтетическую деятельность компетентных клеток. Процессы клеточной миграции, пролиферации и биосинтеза или распада межклеточного вещества приводят к структурным изменениям стенки сосуда [7-8].
CD 34 - это мембранный белок, играющий роль на ранних этапах гемопоэза. Максимальная экспрессия данного маркера осуществляется пролиферирующими эндотелиальными клетками [8].
Существование гладкомышечных клеток (ГМК) сосудистой стенки поддерживается путем их постоянного развития из малодифференцированных, но способных к усиленной пролиферации форм, до высокодифференцированных сократительных элементов. Поскольку высокодифференцированные ГМК синтезируют большое количество α-актина - белка, отвечающего за их сократительную функцию, - снижение содержания этого белка непосредственно коррелирует с дедифференцировкой ГМК и их переходом в более пролиферирующее состояние. Было показано, что при развитии гиперплазии неоинтимы происходит активировация дифференцировки ГМК и их переход в стабильное состояние путем воздействия на ФИ-3-киназный путь, а также значительно повышается экспрессия α-актина - маркера дифференцировки ГМК сосудов [8].
β
Исходя из этого, выявленное в контрольной группе усиление экспрессии α-ГМА, TGF и снижение экспрессии CD34 в послеоперационном периоде является предиктором развития гиперплазии интимы до наступления морфологических изменений.
Из таблицы 2 видно, что прием L-аргинина ведет к коррекции эндотелиальной дисфункции. Отмечается повышение секреции оксида азота (II) и уровня супероксиддисмутазы, снижение уровня малонового диальдегида. Отмеченная тенденция характеризует нормализацию функционального состояния эндотелия и является прогностически благоприятным эффектом эндотелиотропной терапии.
β
На фоне приема L-аргинина снижается активность экспрессии а-ГМА, усиление экспрессии CD34 при низкой экспрессии TGF.
β
Между результатами биохимических анализов через 1 месяц от выполнения операции и показателями иммуногистохимических тестов проводился корреляционный анализ. Изучалась корреляционная связь между изучаемыми биохимическими показателями (МДА, СОД, NO) и экспрессией внутриклеточных белков (а-ГМА, CD34, TGF) (табл. 3).
β
β
Полученные результаты свидетельствуют об обратной зависимости между уровнем NO и а-ГМА, TGF, прямой зависимости между NO и CD34, обратной зависимости между уровнем МДА, СОД и CD34 и прямой зависимости между МДА, СОД и а-ГМА, TGF. Корреляция значима.
Таким образом, в случае высокого уровня метаболитов NO, наблюдается низкая активность гладкомышечных клеток, о чем свидетельствует его низкая экспрессия в ткани, высокая экспрессия CD34, при отсутствии экспрессии трансформирующего фактора роста. Представленный способ позволяет оценить экспрессию в стенке сосуда белков, ответственных за запуск процессов формирования неоинтимы, на основании уровня биохимических маркеров, отражающих ФСЭ, до наступления морфологических изменений и признаков, характерных для гиперплазий неоинтимы.
Приводим экспериментальное наблюдение.
До операции проводился забор крови из вен тыльной поверхности передней лапы. Были получены следующие результаты: NO=10,1 уе; СОД=0,173 (уе) на мg Hb, МДА=14,2 (уе) на мg Hb. Через 2 дня выполнялось оперативное вмешательство.
Под наркозом выполнялась полная срединная лапаротомия, выделялась брюшная аорта, продольная аортотомия, аллопластика брюшной аорты (рис. 1-3). Послойное ушивание раны.
Животные содержались в виварии с соблюдением необходимых условий содержания и пищевого рациона. С целью коррекции дисфункции эндотелия принимали L-аргинин в дозе 200 мг/кг в сутки.
Через 1 месяц проводился забор крови с целью оценки уровня биохимических показателей: NO=28,34 уе; СОД=2,69 (уе) на мg Hb, МДА=9,85 (уе) на мg Hb.
β
Затем животное наркотизировалось и выводилось из исследования, зона пластики изучалась с помощью трансмисионной электронной микроскопии и определялась экспрессия иммуногистохимических маркеров: актин, CD34 и TGF на тканевых срезах.
β
Были получены следующие результаты (рис. 4): низкая экспрессии а-ГМА (1 балл), выраженная экспрессия CD34 (3 балла) и отсутствие экспрессии TGF (0 баллов).
β
Согласно полученным данным, на фоне приема L-аргинина отмечается улучшение функционального состояния эндотелия, проявляющееся высоким уровнем секреции NO и СОД и низким уровнем МДА. По данным иммуногистохимического исследования также наблюдается низкая экспрессия а-ГМА, отсутствие экспрессии TGF и выраженная экспрессия CD34, что говорит об отсутствии предпосылок для развития гиперплазии интимы и эффективности проводимой эндотелиотропной терапии.
Источники информации, принятые во внимание
1) Клиническая ангиология: Руководство / Под ред. А.В. Покровского. В двух томах. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2004. - 1400 с.: ил.
2) Киричук В.Ф., Глыбочко П.В., Пономарева А.И. Дисфункция эндотелия. - Саратов: Изд-во Саратовского мед. ун-та, 2008, - 129 с.
3) Значение сосудистых факторов роста в развитии рестеноза коронарных артерий у больных ИБС после интервенционных вмешательств / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Асымбековой Э.У., Мацкеплишвили С.Т., Ариповым М.А. // Материалы Международной конференции «Неинвазивная диагностика ишемической болезни сердца: настоящее и будущее». - Москва, 2001 (25-26 октября). - С. 53.
4) Патент на изобретение №2503961 от 09.04.2012 / Способ оценки функционального состояния эндотелия экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшной аорте / Калинин Р.Е., Сучков И.А., Мнихович М.В. / Опубликовано 10.01.2014 бюл. №1.
5) Коробойникова Э.Н. Модификация определения продуктов ПОЛ в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело - 1989 - №7.- С. 8-9.
6) Звягина В.И., Калинин Р.Е., Пшенников А.С., Сучков И.А., Матвеева И.В. Фотоколориметрический метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови. // Астраханский медицинский журнал. Астрахань - 2010. Т. 5, №1. С. 188-189.
7) Петрова С.В., Райхлин Н.Т. под ред. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Издание 3-е, дополненное и переработанное. - Казань, 2004. - 456 с., ил.
8) Хайтлина С.Ю. Механизмы сегрегации изоформ актина в клетке // Цитология. - 2007. - Т. 49, №5. - С. 345-354.
9) Федорченко Н.П., Федорченко Н.Н. Теоретические и морфологические закономерности патогенеза атеросклероза и основных его осложнений. Новые подходы к их профилактике и лечению // Морфология - 2009 - Т. 3 - №1 - С. 14-21.
10) Эндотелиальная дисфункция и способы ее коррекции при облитерирующем атеросклерозе / Калинин Р.Е., Сучков И.А., Пшенников А.С. // Москва, изд. Дом «ГЕОТАР-МЕД», 2014, 151 с.