ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ Lawsonia И СПОСОБЫ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
Lawsonia-BASED VACCINE AND METHODS OF ITS APPLICATION

Ссылка на родственную заявку
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США серийный номер 60/699946, зарегистрированной 15 июля 2005 г., сущность и содержание которой включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в широком смысле относится к улучшенным способам вакцинации с целью иммунизации против пролиферативного энтерита свиней, известного как илеит, который вызывается облигатной внутриклеточной бактерией Lawsonia intracellularis (Lawsonia или L. intracellularis). Конкретно изобретение относится к способам, которые обеспечивают повышенную защиту против L. intracellularis, заключающимся в вакцинации беременных свиноматок; вакцинации беременных свиноматок и затем последующей вакцинации рожденных ими молодых поросят в течение примерно трехнедельного периода времени после рождения; и вакцинации молодых поросят в течение периода времени, составляющего до 25 или 26 дней после рождения соответственно.
Описание существующего уровня техники
Пролиферативный энтерит свиней (ПЭС) представляет собой встречающееся в естественных условиях заболевание, которое может поражать свиней в возрасте от отъема до стадии молодого взрослого животного. Было установлено, что возбудителем этого заболевания является Lawsonia intracellularis, представляющая собой облигатную внутриклеточную грамотрицательную бактерию, которую нельзя культивировать с помощью обычных бактериологических методов на стандартных бесклеточных средах, и предполагается, что для своего роста ей необходимы клетки. У S. McOrist и др., Infection и Immunity, том 61 (19), 1993, cc.4286-4292 и G. Lawson и др., J. of Clinical Microbiology, том 31 (5), 1993, cc.1136-1142 описано культивирование L. intracellularis с использованием монослоев крысиных эпителиальных клеток кишечника линии IEC-18 в стандартных колбах для культуры ткани. В US 5714375 и US 5885823, которые оба включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте, описано культивирование L. intracellularis в суспендированных клетках-хозяевах.
Из существующего уровня техники хорошо известны патогенные и непатогенные ослабленные штаммы бактерии L. intracellularis. Например, в WO 96/39629 и WO 05/011731 описаны непатогенные ослабленные штаммы L. intracellularis. Другие ослабленные штаммы бактерии L. intracellularis описаны в WO 02/26250 и WO 03/00665. Сущность и содержание каждого из этих документов включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Заболевание отличается, прежде всего, своей макроскопической и микроскопической патологией, а позднее проявляется в присутствии внутриклеточных бактерий в пораженных клетках. Отличительным патологическим признаком заболевания является пролиферация незрелых эпителиальных клеток в криптах подвздошной кишки (концевая область тонкого кишечника), толстого кишечника или их обоих. Срезы инфицированной ткани характеризуются покрасневшей утолщенной слизистой оболочкой, напоминающей «садовый шланг», и энтеральными повреждениями. Утолщение кишки, в конце концов, препятствует нормальной функции кишки, абсорбционной способности и транспорту питательных веществ. Клиническими признаками заболевания являются хроническая потеря веса, плохое развитие, диарея, в результате чего наступает смерть. Заболевание имеет важное экономическое значение, поскольку приводит к потерям поголовья вследствие гибели, повышенным расходам на лечение, слабому приросту массы и пониженному превращению корма у пораженных животных. Клинические случаи илеита проявляются наиболее заметно у свиней 6-20-недельного возраста. Однако присутствие L. intracellularis было подтверждено (с помощью ПЦР) у свиней сразу после отъема (в 3-4-недельном возрасте), это позволяет предположить что контакт с L. intracellularis происходит в питомнике и, по-видимому, обусловлен Lawsonia-положительными свиноматками (Mauch и Bilkei, Vet Rec 155, 2004, с.532; Marsteller и др., Swine Health Prod 11, 2003, cc.127-130; Stege и др., Vet Micro 104, 2004, cc.197-206). Эти данные подчеркивают важность использования в системе производства стратегий профилактики, таких как вакцинация на более ранних стадиях.
Существующие в настоящее время стратегии вакцинации для иммунизации против илеита включают оральное введение вакцины незараженным Lawsonia свиньям в возрасте только от трех недель и старше, поскольку более молодые поросята могут иметь материнские антитела к L. intracellularis благодаря тому, что свиноматки подвергались ранее воздействию этой бактерии или были вакцинированы. До создания способа, предлагаемого в настоящем изобретении, существовало мнение, что присутствие материнских антител или других лактогенных факторов может оказывать негативное влияние (имеет место интерференция) на эффективность вакцинации таких поросят, поскольку материнские антитела обладают способностью нейтрализовать вакцину до того, как иммунная система поросенка сможет распознать ее и начать секретировать свои собственные антитела. Поэтому, принимая во внимание материнский иммунитет, ранее не применяли вакцинацию молодых поросят.
Краткое изложение сущности изобретения
При создании настоящего изобретения были преодолены недостатки существующего уровня техники и разработаны новые способы, обеспечивающие улучшенную защиту свиней от илеита. В частности, в настоящем изобретении предложен способ введения в иммунологически эффективном количестве вакцины свиноматкам и/или молодым поросятам в течение нескольких недель после рождения для того, чтобы иммунизировать их против илеита. Было установлено, что передача материнского иммунитета от вакцинированных против Lawsonia или подвергнутых воздействию этой бактерии свиноматок поросятам обеспечивает определенный уровень защиты от илеита в течение по меньшей мере 6 недель после рождения. Однако без вакцинации они быстро становятся чувствительными к заболеванию. С помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, неожиданно было продемонстрировано, что введение вакцины беременным животным в высоких дозах, повторное введение доз и даже когда введение осуществляют на второй или третьей стадиях беременности, является безопасным и эффективным в отношении создания материнского иммунитета.
Таким образом, настоящее изобретение в целом относится к способу вакцинации беременных животных (предпочтительно свиней) против инфекций, вызываемых L. intracellularis, заключающемуся в том, что беременных животных вакцинируют с помощью антигена L. intracellularis. Согласно следующему объекту изобретения вакцинацию осуществляют с использованием высоких доз и/или повторных доз антигена L. intracellularis. Еще один объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации беременных животных (предпочтительно свиней) против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что беременных животных вакцинируют на второй или третьей стадиях беременности, предпочтительно этих беременных животных вакцинируют с использованием высоких доз и/или повторных доз антигена L. intracellularis.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ вакцинации свиней против илеита, заключающийся в том, что беременной вводят вакцину на основе Lawsonia свиноматке по меньшей мере один раз перед опоросом и наиболее предпочтительно три раза перед опоросом («повторные дозы»). В некоторых вариантах осуществления изобретения беременных свиноматок вакцинируют с использованием высоких доз антигена L. intracellularis. Когда вакцину вводят свиноматке три раза, то первое введение следует осуществлять за 50-60 дней до опороса, предпочтительно за 52-58 дней до опороса, и наиболее предпочтительно за 54-56 дней до опороса. Второе введение следует осуществлять за 30-40 дней до опороса, предпочтительно за 32-38 дней до опороса, и наиболее предпочтительно за 34-36 дней до опороса. Последнее введение следует осуществлять за 10-20 дней до опороса, предпочтительно за 12-18 дней до опороса, и наиболее предпочтительно за 14-16 дней до опороса. Затем после того, как свиноматка дала потомство, вакцину вводят каждому поросенку в период времени от отъема до забоя, но предпочтительно до того, как они достигнут трехнедельного возраста, в любом случае в возрасте по меньшей мере от 10 до 25-26 дней соответственно (предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней), более предпочтительно в возрасте от 10 до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 до 21 дня. В другом варианте осуществления данного способа вакцину вводят каждому поросенку до 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня.
Таким образом, еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу вакцинации беременных свиноматок, а также родившихся поросят. Предпочтительно беременных свиноматок и родившихся поросят вакцинируют, как описано выше.
Кроме того, неожиданно было установлено, что материнский иммунитет не оказывает негативного влияния на успешную вакцинацию поросят сразу после рождения, и фактически у поросят, вакцинированных в течение трех недель после рождения согласно описанному выше способу, макроскопическая патология, связанная с заболеванием, проявляется в меньшей степени, чем у невакцинированных поросят.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу вакцинации молодых животных (предпочтительно молодых поросят) в течение трех недель после рождения против инфекции, вызываемой L. intracellularis. Предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте 21±5 дней. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 10 до 25 и 26 дней соответственно. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 10 до 21 дня. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 12 до 21 дня соответственно. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 15 до 21 дня, наиболее предпочтительно в возрасте от 19 до 21 дня. В другом варианте осуществления этого способа вакцину вводят каждому поросенку до достижения 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня. Вакцина, применяемая согласно настоящему изобретению, может представлять собой любую вакцину, которая обеспечивает защиту от L. intracellularis. Предпочтительно вакцина представляет собой вакцину на основе живого вируса L. intracellularis. Более предпочтительно вакцина представляет собой Enterisol Ileitis B3903 (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).
Вакцину вводят животным, предпочтительно млекопитающим, и еще более предпочтительно свиньям, любым обычным методом, наиболее предпочтительно с помощью прибора для вливания лекарства в ротовую полость животного.
Предназначенная для введения доза должна варьироваться в зависимости от конкретной ситуации, но в любом случае она должна представлять собой количество, достаточное для индукции защитного гуморального иммунного ответа и/или клеточно-опосредованного иммунного ответа против илеита. Правильную дозу можно определять методами, известными в данной области без излишних экспериментов, и она должна в большинстве случаев зависеть от применяемой вакцины. Во многих случаях пригодная суточная доза составляет от 0,1 до 10 мл, предпочтительно примерно от 1 до 5 мл. В случае Enterisol Ileitis доза предпочтительно составляет по меньшей мере 2 мл на свинью. Для неводных вакцин дозы можно рассчитывать также на основе соотношения сухой массы вакцины и массы свиньи.
Опыты, результаты которых приведены ниже в примерах, были проведены для оценки эффективности вакцины для свиней, родившихся от свиноматок, подвергнутых воздействию Lawsonia intracellularis, и Lawsonia-отрицательных свиноматок. Кроме того, в исследованиях оценивали, имелось ли какое-либо негативное материнское влияние на вакцинацию поросят в трехнедельном возрасте.
Подробное описание изобретения
Понятие «вакцинация» или «вакцинирование» в контексте настоящего описания означает (но, не ограничиваясь им) процесс, который заключается во введении антигена L. intracellularis животному, где антиген L. intracellularis, будучи введенным животному, вызывает или может вызывать иммунный ответ у животного против L. intracellularis.
Понятие «животное» в контексте настоящего описания относится (но, не ограничиваясь ими) к птицам, рыбе и млекопитающим, таким как крупный рогатый скот, свиньи, лошади и приматы. Однако, согласно одному из наиболее предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения животное представляет собой свинью, предпочтительно поросенка возрастом от 10 до 25 и 26 дней соответственно, предпочтительно возрастом от 10 до 21 дня, еще более предпочтительно возрастом от 15 до 21 дня, и наиболее предпочтительно возрастом от 19 до 21 дня. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения возраст поросенка составляет менее 26 дней, предпочтительно возраст составляет от 16 до 26 дней, более предпочтительно возраст составляет от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно возраст составляет от 19 до 22 дней и наиболее предпочтительно возраст составляет 21 день.
Понятие «эффективная доза» или «обладающая эффективностью доза» в контексте настоящего описания означает (но, не ограничиваясь этим) количество антигена, которое вызывает или может вызывать иммунный ответ у животного, которому вводят антиген L. intracellularis в указанной эффективной дозе.
«Иммунологический или иммунный ответ» на композицию или вакцину представляет собой формирование в хозяине клеточного- и/или антитело опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Таким образом, понятие «вызывает или может вызывать иммунный ответ» означает (но, не ограничиваясь этим) иммунологический процесс в организме-хозяине, характеризующийся тем, что у хозяина вырабатывается клеточною- и/или антитело опосредованный иммунный ответ на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунный ответ» включает (но, не ограничиваясь ими) одну или несколько из следующих реакций: производство или активацию антител, В-клеток, Т-клеток-хелперов, Т-клеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток и/или yd-T-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно организм-хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания. Такое защитное действие можно выявлять либо по уменьшению, включая уменьшение серьезности, либо по отсутствию описанных выше симптомов, связанных с заражением хозяина.
3
9
4
8
5
6
Количество антигена, являющееся эффективным в отношении вызывания иммунного ответа у животного, зависит от ингредиентов вакцины и от графика введения. Как правило, когда в вакцине используют убитый бактериальный антиген, то вакцина содержит от примерно 10 до примерно 10 бактерий на дозу, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 бактерий на дозу, и еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 бактерий на дозу.
50
0
50
50
В частности, когда в комбинированных вакцинах используют модифицированные живые бактерии L. intracellularis, например, изоляты бактерий, обозначенные как изолят В3903, регистрационный номер АТСС РТА-4926, и изолят N34NP40wk, регистрационный номер АТСС 55783 (оба изолята описаны в WO 96/39629 и WO 05/011731), то рекомендованная доза, подлежащая введению чувствительному животному, предпочтительно содержит от примерно 3,0 до примерно 6,0 TCID (конечная средняя цитопатогенная доза для культуры ткани)/дозу и более предпочтительно от примерно 4,0 до примерно 5,0 TCID/дозу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения титр вакцины составляет примерно 4,9 TCID/дозу при определении конечной средней цитопатогенной дозы для культуры ткани методом разведении (TCID).
Субъединицы вакцин, как правило, вводят с уровнем включения антигена, составляющим по меньшей мере 0,2 мкг антигена на дозу, предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу.
2,0
9,0
3,0
6,0
4,0
5,0
50
50
50
Как правило, когда используют очищенные бактерии, то количество антигена должно составлять от 5 до 5000 мкг, и от 10 до 10 TCID, предпочтительно от 10 до 10 TCID, и более предпочтительно от 10 до 10 TCID.
3,0
9,0
4,5
6,0
4,0
9,0
6,0
8,0
50
50
В контексте настоящего описания понятие «высокие дозы», как правило, обозначает по меньшей мере трехкратное количество антигена по сравнению с количеством, которое содержится в одной дозе, обычно применяемой для вакцинации взрослых животных. В частности, понятие «высокие дозы» применительно к живым модифицированным бактериям L. intracellularis обозначает количество, составляющее от по меньшей мере 3×10 до 3×10TCID, предпочтительно примерно от 3×10 до 3×10 TCID. В частности, применительно к убитому антигену L. intracellularis понятие «высокие дозы» обозначает количество, составляющее по меньшей мере от 3×10 до 3×10организмов или бактерий, предпочтительно примерно от 3×10 до 3×10организмов или бактерий. В частности, применительно к любой субъединице антигена L. intracellularis понятие «высокие дозы» обозначает количество, составляющее по меньшей мере от 3×0,2 до примерно 3×400 (от 0,6 до примерно 1200) мкг/дозу. При создании настоящего изобретения антиген L. intracellularis в высоких дозах вводили беременным свиноматкам с целью индукции повышенного иммунологического ответа у беременной свиноматки, который должен передаваться потомству и обеспечивать определенный уровень иммунитета у родившихся поросят.
В контексте настоящего описания понятие «повторные дозы» означает введение антигена L. intracellularis по меньшей мере дважды, предпочтительно трижды. Примеры режимов вакцинации беременных свиноматок с использованием «повторных доз» приведены выше.
В контексте настоящего описания понятие «повышенная защита» означает (но, не ограничиваясь этим) статистически достоверное уменьшение степени серьезности или частоты встречаемости одного или нескольких клинических симптомов и/или развития повреждений, связанных с инфекциями, вызываемыми L. intracellularis (например, частоты встречаемости макроскопических повреждений, которые определяют согласно методам и критериям, указанным в примере 1, и т.д.) в группе вакцинированных животных, по сравнению с контрольной группой невакцинированных животных. Понятие «статистически достоверное уменьшение клинических симптомов» означает (но, не ограничиваясь этим), что частота встречаемости по меньшей мере одного клинического симптома и/или развития повреждения после контрольного заражения инфекционными бактериями L. intracellularis в группе вакцинированных животных по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 30%, еще более предпочтительно на 40%, еще более предпочтительно на 50%, еще более предпочтительно на 60%, еще более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 90%, и наиболее предпочтительно на 95% меньше, чем в контрольной группе невакцинированных животных.
В контексте настоящего описания понятие «L. intracellularis» или «Lawsonia» относится к внутриклеточным искривленным грамотрицательным бактериям, подробно описанным у С.Gebhart и др., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, том 43, №3, 1993, cc.533-538 и S. McOrist и др., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, том 45, №4, 1995, cc.820-825, каждая публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте и включает (но, не ограничиваясь ими) изоляты, описанные в WO 96/39629 и WO 05/011731. В частности, понятие «L. intracellularis» относится также (но, не ограничиваясь ими) к изолятам, депонированным в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, под регистрационным номером АТСС РТА 4926 или под регистрационным номером АТСС РТА 55783. Оба изолята описаны в WO 96/39629 и WO 05/011731 соответственно. Понятие «L. intracellularis» относится также (но, не ограничиваясь ими) к любому другому штамму или изоляту бактерии, который предпочтительно обладает иммуногенными свойствами по меньшей мере одного из штаммов L. intracellularis, описанных в WO 96/39629 и WO 05/011731, в частности, иммуногенными свойствами по меньшей мере одного из изолятов, депонированных в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, под регистрационным номером АТСС РТА 4926 или под регистрационным номером АТСС РТА 55783.
Штамм или изолят обладает «иммуногенными свойствами» по меньшей мере одного из штаммов L. intracellularis, описанных в WO 96/39629 и WO 05/011731, в частности, изолятов, депонированных под регистрационным номером АТСС РТА 4926 или регистрационным номером АТСС 55783, если его можно обнаруживать с использованием по меньшей мере одного из специфических к L. intracellularis антител, описанных в WO 06/01294, с помощью метода обнаружения, также описанного в WO 06/01294. Предпочтительно эти антитела выбирают из антител, имеющих ссылочные номера 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 и 268:18. Предпочтительно метод обнаружения представляет собой сэндвич-ELISA, описанный в примерах 2 и 3 WO 06/12949, в котором антитело 110:9 используют в качестве иммобилизованного антитела и антитело 268:29 используют в качестве конъюгированного антитела. Все антитела, описанные в WO 06/12949, получают с использованием клеток гибридомы, депонированных в Центре прикладной микробиологии и научных исследований (Centre for Applied Microbiology и Research (CAMR)) и в Европейской коллекции клеточных культур (European Collection of Cell Cultures (ЕСАСС)), Солсбери, Уилтшир SP4 OJG, Великобритания, в качестве патентного депозита в соответствии с Будапештским договором. Дата депонирования: 11 мая 2004 г. Линия клеток гибридомы 110:9 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092204. Линия клеток гибридомы 113:2 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092201. Линия клеток гибридомы 268:18 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092202. Линия клеток гибридомы 268:29 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092206. Линия клеток гибридомы 287:6 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092203. Линия клеток гибридомы 301:39 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092205.
Понятие «антиген L. intracellularis» в контексте настоящего описания относится (но, не ограничиваясь ими) к любой заявляемой композиции, содержащей по меньшей мере один антиген, который при введении в организм животного обладает способностью индуцировать, стимулировать или усиливать иммунный ответ на вызываемую L. intracellularis инфекцию. Предпочтительно антиген L. intracellularis представляет собой полную бактерию L. intracellularis, прежде всего в неактивированной форме (так называемую убитую бактерию), модифицированную живую или ослабленную бактерию L. intracellularis (так называемую MLB), любую субъединицу, полипептид или компонент L. intracellularis, или любой химерный вектор, который содержит по меньшей мере одну иммуногенную аминокислотную последовательность L. intracellularis. Понятия «иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенная аминокислотная последовательность» в контексте настоящего описания относятся к любой аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунный ответ у хозяина против патогена, содержащего иммуногенный белок, иммуногенный полипептид или иммуногенную аминокислотную последовательность. В частности, понятие «иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенная аминокислотная последовательность» L. intracellularis относится к любой аминокислотной последовательности, кодирующей антиген, который вызывает иммунологический ответ против L. intracellularis у хозяина, которому вводят «иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенную аминокислотную последовательность».
«Иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенная аминокислотная последовательность» в контексте настоящего описания включают (но, не ограничиваясь ими) полноразмерную последовательность любых белков, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Понятие «иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и в результате этого вызывает иммунологический ответ против соответствующего патогена. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из многочисленных методов картирования эпитопов, известных в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, под ред. Glenn E. Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Сущность и содержание этих публикаций включены в настоящее описание в качестве ссылки. Линейные эпитопы можно выявлять, например, осуществляя конкурентный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют фрагментам молекулы белка, и, подвергая пептиды взаимодействию с антителами, причем пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например, в US 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 3998-4002; Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, cc. 709-715. Сущность и содержание этих документов включены в настоящее описание в качестве ссылки. Конформационные эпитопы также легко можно идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше). Понятие включает также синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие, полученные рекомбинантными или синтетическими методами антигены (см., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, cc. 2777-2781; Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, cc. 3242-3249; Suhrbier A., Immunol, и Cell Biol. 75, 1997, cc. 402-408; Gardner и др., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 июня-3 июля 1998 г.). Сущность и содержание этих документов включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Пригодные антигены L. intracellularis включают (но, не ограничиваясь ими) антигены, описанные в ЕР 1219711; US 6605696; WO 96/39629; WO 97/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906; WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631; WO 05/026200 и WO 05/011731.
Таким образом, вакцина, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит любой описанный выше антиген L. intracellularis, который вызывает или может вызывать иммунный ответ против L. intracellularis. Предпочтительно указанная вакцина обеспечивает по меньшей мере повышенную защиту против L. intracellularis.
Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации молодого животного против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что молодому животному в возрасте примерно до 3 недель вводят антиген L. intracellularis в эффективной дозе, где антиген L. intracellularis выбирают из группы, включающей живые модифицированные бактерии L. intracellularis, убитые бактерии L. intracellularis или одну, или несколько субъединиц бактерий L. intracellularis. Как указано выше, в одном из вариантов осуществления изобретения вакцинацию предпочтительно осуществляют в возрасте от 10 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня. В другом варианте осуществления изобретения вакцинацию предпочтительно осуществляют до достижения 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня.
Предпочтительно вакцина содержит модифицированные живые бактерии L. intracellularis. Более предпочтительно вакцина представляет собой Enterisol Ileitis B3903 (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).
50
50
Следующий объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации молодого животного, предпочтительно молодого поросенка против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что молодому животному в возрасте от 10 дней включительно и до 26-дневного возраста, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня, или молодому животному в возрасте до 26 дней, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня, вводят живые модифицированные бактерии L. intracellularis в дозе от примерно 3,0 TCID до примерно 6,0 TCID. Предпочтительно указанные бактерии представляют собой бактерии, содержащиеся в вакцине Enterisol Ileitis B3903 (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).
Еще один объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации молодого животного, предпочтительно молодого поросенка, против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что молодому животному в возрасте от 10 дней включительно до 26-дневного возраста, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня, или до достижения 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня, вводят антиген L. intracellularis в эффективной дозе, где молодое животное является L. intracellularis - отрицательным, и присутствия материнского антитела к L. intracellularis.
Следующий объект настоящего изобретения относится также к новому медицинскому применению антигена L. intracellularis, взятому в эффективном количестве, для приготовления лекарственного средства, предпочтительно композиции вакцины, предназначенной для вакцинации молодого животного, предпочтительно молодого поросенка, в возрасте от 10 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня, или в возрасте до 26 дней, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня.
50
50
Согласно еще одному варианту указанного выше медицинского применения антиген L. intracellularis выбирают из группы, включающей живые модифицированные бактерии L. intracellularis, убитые бактерии L. intracellularis или одну, или несколько субъединиц бактерий L. intracellularis. Предпочтительно антиген L. intracellularis представляет собой живые модифицированные бактерии L. intracellularis. Более предпочтительно молодому животному вводят живые модифицированные бактерии L. intracellularis в дозе, составляющей от примерно 3,0 TCID до примерно 6,0 TCID. Получение композиций вакцин, содержащих антиген L. intracellularis, осуществляют общепринятым в данной области методом, известным специалисту в данной области. Специалисту в данной области должны быть известны, например, дополнительные компоненты, которые можно включать в указанную композицию (см. также Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Publ., Easton, 1990). Специалист может применять известные инъекционные физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии легко можно получать водные изотонические растворы, такие, например, как физиологический раствор или растворы, соответствующие белкам плазмы. Композиции вакцины могут находиться в форме лиофилизатов или безводных препаратов, которые можно восстанавливать с помощью известного инъекционного раствора непосредственно перед применением в стерильных условиях, например, они могут представлять собой набор компонентов.
Кроме того, иммуногенные и используемые в качестве вакцин композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать один или несколько приемлемых для ветеринарии носителей. В контексте настоящего описания понятие «приемлемый для ветеринарии» относится к любому и ко всем растворителям, диспергирующим средам, покрытиям, адъювантам, стабилизаторам, разбавителям, консервантам, антибактериальным и противогрибковым агентам, агентам для придания изотоничности, замедляющим адсорбцию агентам и т.п.
Понятие «разбавитель» может обозначать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Агенты для придания изотоничности могут представлять собой среди прочего хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. К стабилизаторам относятся среди прочего альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты.
В контексте настоящего описания понятие «адъюванты» может обозначать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кэмбридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт. Алабама), эмульсию типа вода в масле, эмульсию типа масло в воде, эмульсию типа вода в масле в воде. Эмульсия, в частности, может быть приготовлена на основе легкого жидкого парафинового масла (удовлетворяющего требованиям Европейской фармакопеи); изопреноидного масла, такого как сквалан или сквален; масла, полученного олигомеризацией алкенов, прежде всего изобутена или децена; эфиров кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, более предпочтительно на основе растительных масел, этилолеата, ди(каприлата/капрата) пропиленгликоля, три(каприлата/капрата) глицерина или диолеата пропиленгликоля; эфиров разветвленных жирных кислот или спиртов, прежде всего эфиров изостеариновой кислоты. Для образования эмульсии масло применяют в сочетании с эмульгаторами. Эмульгаторами предпочтительно являются неионогенные поверхностно-активные вещества, прежде всего сложные эфиры сорбитана, маннида (например, безводный маннитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рициноловой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности, продукты типа плуроник, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory и Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull, D.E.S., изд-во JohnWiley и Sons, NY, 1995, cc.51-94 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, cc.564-570). Сущность и содержание указанных публикаций включены в настоящее описание в качестве ссылки. Например, можно применять эмульсию SPT, описанную на с.147 «Vaccine Design, The Subunit и Adjuvant Approach», под ред. M. Powell и M. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 этой же самой книги. Сущность и содержание указанных публикаций включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, сшитые, прежде всего, с простыми полиалкениловыми эфирами сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под названием карбомеры (Phameuropa, том 8, No. 2, июнь 1996 г.). Специалисты в данной области могут найти соответствующие сведения также в US 2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, которое имеет по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере в трех гидроксилах замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, содержащими по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие группы с этиленовой ненасыщенной связью. Ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил. Наиболее пригодными являются продукты, поступающие в продажу под названием карбопол (Carbopol) (фирма BF Goodrich, шт.Огайо, США). Они являются сшитыми с аллилсахарозой или аллилпентаэритритолом. Среди них следует отметить Carbopol 974P, 934Р и 97/1P. Наиболее предпочтительным для применения является Carbopol 97/1P. Среди сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных следует отметить сополимеры ЕМА (фирма Monsanto), представляющие собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена. При растворении этих полимеров в воде образуется кислый раствор, который необходимо нейтрализовать, предпочтительно до достижения физиологического значения рН, для того, чтобы получить раствор адъюванта, в который можно вносить иммуногенную, иммунологическую или саму представляющую собой вакцину композицию. Другими пригодными адъювантами являются среди прочего также (но, не ограничиваясь ими) адъювантная система RIBI (фирма Ribi Inc.), блок-сополимер (фирма CytRx, Атланта, шт.Джорджия), SAF-M (фирма Chiron, Эмервилл, шт.Калифорния), монофосфорил липид А, авридин липид-аминовый адъювант, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или полученный другим путем), холерный энтеротоксин, IMS 1314 или мурамилдипептид.
Предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Более предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем примерно 1 мг на дозу.
Кроме того, композиция вакцины может содержать один или несколько других иммуномодуляторов, таких, например, как интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Композиции вакцин могут содержать также гентамицин и мертиолат. Хотя специалист в данной области легко может определять количества и концентрации адъювантов и добавок, которые можно применять согласно настоящему изобретению, в настоящем изобретении предложены композиции, содержащие от примерно 50 до примерно 2000 мкг адъюванта и предпочтительно примерно 250 мкг адъюванта/мл дозы композиции вакцины. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложены композиции вакцин, содержащие от примерно 1 до примерно 60 мкг/мл антибиотиков и более предпочтительно менее чем примерно 30 мкг/мл антибиотиков.
Вакцину вводят животным, предпочтительно млекопитающим, и еще более предпочтительно свиньям, любым общепринятым методом, наиболее предпочтительно с помощью прибора для вливания лекарства в ротовую полость животного. Доза, подлежащая введению, должна зависеть от конкретной ситуации, но в любом случае она должна представлять собой количество, достаточное для индукции защитного гуморального иммунного ответа или клеточно-опосредованного иммунного ответа против илеита.
Согласно другому объекту изобретения вакцины на основе L. intracellularis, применяемые для вакцинации молодых животных (предпочтительно молодых поросят), вводят в виде одной или повторных доз. Живую или убитую вакцину можно вводить 1 или 2 раза с 2-4-недельными интервалами после первой вакцинации. В случае ослабленных живых вакцин предпочтительно использовать одну дозу. Предпочтительно первое или единственное введение осуществляют в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней и наиболее предпочтительно в возрасте 21 день, как описано выше, или начиная в возрасте от 10 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня.
Если желательно или необходимо второе введение, то второе введение осуществляют через промежуток времени, составляющий от примерно 1 до примерно 4 недель после первого введения вакцины. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения повторную вакцинацию осуществляют через промежуток времени, составляющий от 3 до 12 месяцев после любого предыдущего введения вакцины. Введение последующих доз вакцины предпочтительно осуществляют с интервалами, составляющими от 6 месяцев до 1 года.
Примеры
В приведенных ниже примерах представлены репрезентативные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Подразумевается, что они не должны рассматриваться как ограничивающие общий объем изобретения.
Пример 1
В этом примере оценивали эффективность вакцины на основе Lawsonia на трехнедельных поросятах, родившихся от свиноматок, вакцинированных с помощью вакцины на основе Lawsonia, и невакцинированных свиноматок и определяли, имела ли место интерференция обусловленного вакцинацией свиноматок материнского иммунитета, препятствующая вырабатыванию иммунного ответа на вакцинацию поросят, что оценивали по снижению индукции заболевания после контрольного заражения вирулентной чистой культурой как вакцинированных, так и невакцинированных поросят. Основными исследуемыми параметрами, которые использовали для оценки эффективности, были макроскопические и микроскопические повреждения подвздошной кишки и ободочной кишки. Кроме того, в этом примере оценивали вакцину Lawsonia в отношении безопасности при введении однократной и повторных доз беременным свиноматкам, находящимся на второй и третьей стадиях беременности.
Материалы и методы
Для проведения опыта получали шестнадцать здоровых беременных свиноматок, у которых не было обнаружено присутствия Lawsonia в сыворотке (сероотрицательные в отношении Lawsonia свиноматки), и разделяли произвольным образом на 2 группы, А и Б, по 8 свиноматок в каждой. Животным в группе А вводили 3 дозы Enterisol Ileitis B3903 с помощью прибора для вливания лекарства в ротовую полость животного в дни -55, -35 и -14 для того, чтобы индуцировать высокий уровень материнского иммунитета перед опоросом. Свиноматкам в группе Б вводили плацебо перед опоросом, и они служили в качестве отрицательных контролей. Свиноматок сначала содержали на нелечебном поступающем в продажу рационе для беременных животных, после чего переводили на нелечебную стимулирующую лактацию диету. Были созданы условия для одинакового осеменения и опороса всех свиноматок, однако имелись определенные вариации (10 дней) в сроках опороса. Для того чтобы избежать проблем, связанных с вариабельностью, которые могли возникать при проведении вакцинации и контрольного заражения в несколько различных дней, в качестве дня 0 опыта был выбран день, приходящийся на середину периода, в течение которого проходили опоросы. Все поросята, которые участвовали на стадии введения вакцины и контрольного заражения, в момент проведения вакцинации (день 21) имели возраст 21±5 дней. Поросят сначала содержали на нелечебном стартере, после чего переводили на нелечебный рацион для питомников, а затем на нелечебный рацион для завершающего периода откорма. Образцы для серологического анализа брали у свиней в истинный день рождения, в возрасте 7 дней и в возрасте 14 дней для обеспечения точной оценки материнского антитела, если оно присутствует. Образцы для серологического анализа брали у свиноматок перед опоросом. Затем в день 22 свиноматок подвергали аутопсии, проводили макроскопическое обследование тканей их подвздошной кишки и ободочной кишки, проводили анализ с помощью ПЦР подвздошной кишки, ободочной кишки, брыжеечных лимфатических узлов и миндалин, мертворожденных свиней анализировали с помощью ПЦР, а репродуктивную способность свиноматок оценивали путем регистрации живорожденных, мертворожденных или мумифицированных свиней в день опороса.
5,0
10
50
После опороса (в день 21 опыта) 100 здоровых поросят отбирали из помета и затем распределяли произвольным образом по шести группам обработки, каждую из которых содержали отдельно в процессе опыта. Поросят, полученных от вакцинированных свиноматок (группа А) произвольно разделяли на группы обработки 1-3. Поросят, полученных от невакцинированных свиноматок (группа Б) произвольным образом разделяли на группы обработки 4-6. В день 21 животным в группах обработки 1 и 4, по 20 поросят в каждой, вводили дозу вакцины Enterisol Ileitis В3903 объемом 2 мл (1×10 log TCID/дозу) путем непосредственного вливания через прибор для вливания лекарства в ротовую полость животного. Животным в группах 2 и 5, по 20 поросят в каждой группе, вводили по 2 мл плацебо путем непосредственного вливания через прибор для вливания лекарства в ротовую полость животного. Животных в группах 3 и 6, по 10 поросят в каждой группе, не подвергали обработке, и они служили в качестве строгих контролей для подтверждения чувствительности источника свиней к инфекции, вызываемой Lawsonia.
7,3
10
50
Через три недели после вакцинации (день 42 исследования) подопытных поросят в группах обработки 1, 2, 4 и 5 подвергали контрольному заражению путем введения с помощью желудочного зонда одной дозы объемом 10 мл (1×10 log TCID/Дозу) вирулентной полученной в результате небольшого количества пассажей чистой культуры гетерологичного изолята Lawsonia N101494. Однако в качестве бактерий для контрольного заражения можно использовать любой другой изолят Lawsonia дикого типа или полученный после небольшого количества пассажей. В день 63 исследования (через три недели после контрольного заражения) животных во всех группах обработки (1-6) умерщвляли и производили аутопсию для анализа макроскопических и микроскопических повреждений, вызванных ПЭС.
Основным критерием, который использовали для оценки на поросятах эффективности вакцины Enterisol Ileitis B3903 против контрольного заражения гетерологичной вирулентной чистой культурой, служило выявление образования повреждений на основе макроскопических и микроскопических методов обнаружения повреждений в подвздошной кишке и ободочной кишке. Макроскопические повреждения оценивали в срезах подвздошной кишки, в области стыка подвздошной кишки и слепой кишки и в ободочной кишке в момент окончания исследования. Повреждения кишечника оценивали в баллах по степени их серьезности и из каждой инфицированной области ткани брали дополнительные образцы для ПЦР-, ИГХ- (иммуногистохимический анализ) и Н&Е- (окрашивание гематоксилином и эозином) анализов. Серьезность повреждений оценивали по степени утолщения слизистой оболочки, выявленного в слизистой выстилке подвздошной кишки. Балл повреждений 0 означал отсутствие утолщения слизистой оболочки, отека, рубцов/складок на слизистой оболочке или выступов, обусловленных серозной ретикуляцией. Балл повреждений 1 означал наличие слабого утолщения, включая небольшие рубцы/складки в слизистой оболочке, слабого отека поверхности слизистой оболочки и в некоторых случаях гиперемии. Баллом повреждений 2 оценивали наличие утолщения и/или воспаления средней степени. Это проявлялось в наличии значительных рубцов/складок в слизистой оболочке, отека поверхности слизистой оболочки средней степени, ретикуляции серозных оболочек и в некоторых случаях гиперемии. Балл повреждений 3 означал присутствие серьезного утолщения и/или воспаления, проявляющихся в наличии серьезных и глубоких рубцов/складок в слизистой оболочке, отека поверхности слизистой оболочки средней степени, ретикуляции серозных оболочек и в некоторых случаях гиперемии. Балл повреждений 4 означал наличие серьезного утолщения и/или воспаления, и/или присутствие крови. Повреждение, оцениваемое этим баллом, проявлялось в виде серьезных и глубоких рубцов/складок в слизистой оболочке, отека поверхности слизистой оболочки средней степени, ретикуляции серозных оболочек, присутствии также в некоторых случаях гиперемии и/или сгустков крови. И, наконец, балл повреждений 5 свидетельствовал о некрозе, что проявлялось в наличии серьезных повреждений слизистой оболочки, так что присутствовал некроз или в некоторых случаях имело место отслоение или отделение всей поверхности слизистой оболочки вследствие серьезности повреждения.
Микроскопические повреждения, вызываемые Lawsonia, являются патогномоничными для ПЭС. Гистопатологические повреждения, вызываемые заболеванием, включают эпителиальную гиперплазию, прежде всего в криптах слизистой оболочки с явным отсутствием бокаловидных клеток. Lawsonia, как правило, присутствует в пролиферирующих эпителиальных клетках крипт слизистой оболочки. Срезы подвздошной кишки длиной примерно 2-4 см помещали в забуференный формалин для гистологического анализа с использованием методов окрашивания гематоксилином и эозином (Н&Е) и ИГХ-окрашивания. Н&Е-окрашивание позволяет выявлять присутствие гиперплазии крипт, обусловленной инфекцией, вызываемой Lawsonia, в то время как метод ИГХ-окрашивания основан на использовании специфичности моноклонального антитела к Lawsonia для подтверждения присутствия организма и образования микроскопического повреждения в пораженных тканях. Моноклональное антитело к Lawsonia специфически распознает целую клетку Lawsonia в результате направленного переноса к белку внешней мембраны, присутствующему во всех изолятах Lawsonia. Это моноклональное антитело было получено из линии клеток гидридомы VPM53, созданной исследователями Университета Эдинбурга, Шотландия. Присутствие организмов Lawsonia и степень серьезности микроскопических повреждений, обнаруживаемых с помощью ИГХ-окрашивания срезов подвздошной кишки, оценивали в баллах с использованием шкалы, где балл 0 означал отсутствие пролиферативных энтероцитов (повреждений), балл 1 означал наличие небольших очаговых повреждений, балл 2 означал наличие средних диффузных повреждений и балл 3 означал наличие серьезных диффузных повреждений. Касательно присутствия организмов использовали балльную систему оценки на основе ИГХ, в которой отсутствию организмов соответствовал балл 0, присутствию небольшого количества организмов, локализованных в виде очагов, - балл 1, присутствию среднего количества диффузно распространенных организмов - балл 2, и присутствию большого количества диффузно распространенных организмов - балл 3.
Вторичным критерием при исследованиях было выявление клинических симптомов, обнаружение присутствия Lawsonia во взятых с помощью тампона пробах фекалий и в тканях с помощью ПЦР, оценка ADWG (средний суточный прирост массы) и сероконверсии (метод непрямой иммунофлуоресценции (IFAT)), обусловленных воздействием Lawsonia на поросенка.
Обследования состояния здоровья проводили ежедневно со дня начала опыта до дня контрольного заражения каждого тестируемого животного. Клинические параметры здоровья, включая диарею, поведение и состояние тела, оценивали в баллах, ежедневно начиная со дня контрольного заражения (день 42) до дня, предшествующего окончанию опыта (день 62). Баллы отражали степень серьезности заболевания. Применительно к диарее балл 1 соответствовал нормальным фекалиям, балл 2 соответствовал полутвердым фекалиям без признаков крови, балл 3 соответствовал водянистым фекалиям, но без присутствия крови или фекалий темного цвета, и балл 4 соответствовал окрашенным кровью фекалиям, которые могли быть жидкими или сформированными. Применительно к поведению балл 1 соответствовал нормальному поведению, балл 2 соответствовал подавленному в небольшой или средней степени поведению (животное хочет стоять отдельно от других) и балл 3 соответствовал состоянию сильной депрессии или тому, что животное хочет находиться в лежачем положении. Применительно к состоянию тела балл 1 соответствовал нормальному состоянию тела, балл 2 соответствовал состоянию исхудания тела от слабой до средней степени, и балл 3 соответствовал сильному исхуданию тела.
Выделения Lawsonia с фекалиями оценивали с помощью ПЦР для выявления илеита (илеит-ПЦР) путем анализа взятых с помощью тампона проб фекалий (f-ПЦР) в дни -55, -35, -14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 и 63 опыта. Взятые с помощью тампона пробы фекалий анализировали с помощью ПЦР в отношении присутствия ДНК Lawsonia в фекалиях. По окончании опыта в день 63 брали свежие срезы ткани от каждого животного. В день 63 опыта проводили качественный анализ бактериального содержания в тканях с помощью илеит-ПЦР (t-ПЦР), а также гистологическую оценку присутствия Lawsonia в подвздошной кишке, ободочной кишке, миндалинах и брыжеечном лимфатическом узле. ПЦР-анализ был разработан Jones с соавторами, и он основан на использовании специфичности двух олигонуклеотидных праймеров (каждый длиной 20 пар оснований) для получения фрагмента геномной ДНК Lawsonia длиной 319 пар оснований. Мишенью для этих праймеров является ранее определенная последовательность геномной ДНК, специфическая для Lawsonia. Полученные в результате ПЦР фрагменты ДНК сравнивали с илеит-положительными и илеит-отрицательными контролями, полученными с помощью экстракции ДНК и осуществления ПЦР, для подтверждения «положительного» или «неположительного» (отрицательного) результата. Положительный контроль, полученный путем экстракции ДНК, представлял собой целые клетки Lawsonia вместе с инфицированными клетками линии МсСоу в 1-кратном забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР) (200 мкл/пробирку). Отрицательный контроль, полученный путем экстракции ДНК, представлял собой неинфицированные клетки линии МсСоу в 1 хЗФР (200 мкл/пробирку). Положительные контроли, используемые в илеит-ПЦР, представляли собой геномную ДНК Lawsonia, очищенную из собранного материала клеточной культуры (Lawsonia + клетки линии МсСоу), в то время как отрицательный контроль представлял собой свободную от РНКазы воду (фирма Amresco, Солон, шт.Огайо). Положительный в отношении ДНК Lawsonia тест-образец должен приводить к получению фрагмента ДНК такого же размера (319 пар оснований), что и оба контроля (полученные путем экстракции и в результате реакции), дающие положительные результаты при осуществлении илеит-ПЦР, в то время как отрицательные образцы не должны приводить к получению фрагмента такого размера. Препараты экстрагированной ДНК из каждого тестируемого образца получали с помощью наборов для экстракции ДНК типа ISO-QUICK (фирма ORCA Research, Inc., Болелл, шт. Вашингтон). Результаты, полученные с помощью ПЦР, использовали для выявления выделения Lawsonia в организме поросят, вакцинированных Enterisol Ileitis В3903 и/или подвергнутых контрольному заражению гетерологичным изолятом Lawsonia N101494.
Вес животных определяли в день осуществления вакцинации (день 21), в день контрольного заражения (день 42) и в день окончания опыта (день 63) для того, чтобы рассчитывать средний суточный прирост массы (ADWG) в каждой группе обработки. ADWG для каждой группы сравнивали со всеми другими для определения ADWG после вакцинация и после контрольного заражения. Вес тела определяли с помощью электронной системы со шкалой, калибруемой с помощью гирь в виде стержней, типа Weigh-Tronix™ модель 615XL, (фирма Weigh-Tronix Inc., Фэрмонт, шт.Миннесота), которую калибровали с использованием сертифицированных стандартных гирь до и после каждого измерения.
Сыворотку анализировали с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции (IFAT) для обнаружения антител к Lawsonia в организме животных. Брали образцы венозной цельной крови в вакуумные пробирки у свиноматок в дни -55, -35 и -14 и у всех подопытных животных в возрасте 0,7 и 14 дней и в дни 21, 28, 35, 42, 49, 56 и 63 исследования. Крови давали свернуться, после чего ее центрифугировали и сыворотку собирали и замораживали. Затем осуществляли с помощью IFAT скрининг свиной сыворотки в отношении молекул IgG к Lawsonia. Антитела к Lawsonia присоединяются к антигенам внешней мембраны цельной клетки Lawsonia, полностью покрывая организм, который прикреплен к дну каждой лунки 96-луночного титрационного микропланшета. В каждую лунку вносили конъюгат антитело типа IgG - меченное с помощью FITC вторичное антитело для связывания любых комплексов IgG-антиген. Эти связанные с FITC комплексы в ультрафиолетовом свете испускают флуоресцентный зеленый свет. В положительном тестируемом образце обнаруживают большое количество ярко-зеленых небольших изогнутых палочек, напоминающих Lawsonia, или инфицированных клеток линии МсСоу, содержащих многочисленные бактерии Lawsonia. На IFAT-отрицательном тестируемом образце виден тусклый (бледный) зеленый фон, соответствующий клеткам линии МсСоу. Результаты оценки с помощью IFAT использовали для получения схемы сероконверсии в группах, подвергнутых вакцинации и/или вирулентному контрольному заражению, свидетельствующему о воздействии Lawsonia на подопытное животное.
50
10
50
-1
-6
Конечное определение величин TCID проводили с использованием репрезентативных образцов каждой дозы вакцины, которую вводили подопытным поросятам в день 21 настоящего исследования. Пять копий репрезентативных тестируемых образцов, полученных десятикратным разведением (от 10 до 10), вводили до и после осуществления вакцинации и контрольного заражения в модифицированной по способу Дульбекко минимальной незаменимой среде, усиленной средой Хама F12 (DMEM F12) и 5% инактивированной тепловой обработкой сыворотки новорожденных телят (NBS) (фирма JRH Biosciences, Ленекса, шт.Канзас). Разбавленные образцы анализировали для определения количества живых бактерий Lawsonia в каждом тестируемом образце. Рассчитывали средние титры по 5 повторностям до и после введения вакцины и до и после осуществления контрольного заражения и умножали на объем тестируемого материала, который вводили каждому поросенку для определения величины, представляющей собой log 10 общего количества Lawsonia на дозу. Общие средние титры (log TCID/дозу) для вакцинации или контрольного заражения определяли на основе средних результатов определения титров до и после (2 титра) вакцинации или контрольного заражения.
Сравнения групп обработки проводили на основе анализа результатов оценки ADWG, как после вакцинации, так и после контрольного заражения, клинических баллов, уровней сероконверсии (IFAT), колонизации (t-ПЦР), выделений с фекалиями (f-ПЦР), образования макроскопических повреждений и микроскопических повреждений, определяемых с помощью иммуногистохимического анализа (ИГХ).
Три поросенка (один из группы 1 и два из группы 5) умерли после вакцинации, но до окончания опыта. Было проведено обследование поросенка из группы 1 с целью выявления инфекции, вызываемой Lawsonia, однако было установлено, что причиной смерти являлся(ась) шок/септицемия, вызванный(ая) высокими уровнями E.coli. У двух умерших поросят из группы 5 были выявлены большие макроскопические и микроскопические повреждения, типичные для инфекции, вызываемой Lawsonia, поэтому было признано, что причиной смерти предположительно является Lawsonia.
Результаты
Результаты анализов образцов фекалий и сыворотки, собранных в настоящем опыте, показали, что ни у одной свиноматки как в группе А, так и в группе Б не было обнаружено выявляемых количеств Lawsonia в фекалиях или в подвздошной кишке или ободочной кишке. В группе свиноматок А у 5 из 8 животных имелись обнаруживаемые с помощью IFAT титры по меньшей мере в один момент времени в ходе опыта. В течение этого же периода времени ни одна из свиноматок из группы Б не имела обнаруживаемого с помощью IFAT титра. Эти данные обобщены в приведенной ниже таблице 1.
Таблица 1
Результаты обследования свиноматок
Обработка свиноматок
Макроскопические повреждения подвздошной кишки
Макроскопические повреждения ободочной кишки
Анализ ткани с помощью ПЦР (подвздошная кишка/ободочная кишка/брыжеечные лимфатические узлы/миндалины)
Иммунофлуоресцентный анализ (IFA)
Среднее количество живорожденных поросят/ помет
А - вакцинированные
0/8
0/8
0/8
5/8
9,4
Б - невакцинированные
0/8
0/8
0/8
0/8
7,6
Всех свиноматок подвергали аутопсии и обследовали с целью выявления макроскопических повреждений, типичных для инфекции, вызываемой Lawsonia. Однако не было выявлено свиноматок, для которых были бы получены положительные результаты при оценке макроскопических повреждений или в анализе с помощью t-ПЦР.
Несмотря на то что вакцину вводили как в течение 2-го, так и 3-го триместра беременности, ни для одной свиноматки в процессе клинического опыта не было выявлено никаких патологий общего состояния здоровья.
Результаты опороса свиноматок в группе А и в группе Б также были очень близкими, в среднем в этих группах рождалось живыми по 9,4 и 7,6 поросят соответственно. У свиноматок в группе А были случаи мертворождений, количество мертворожденных поросят на помет в среднем составляло 1,8, при этом не было выявлено мумифицированных поросят или смертельных случаев при опоросе. У свиноматок в группе Б среднее количество мертворожденных поросят составляло 0,9, мумифицированных поросят - 0,1 и погибших при опоросе поросят - 0,1 на помет. В результате диагностического обследования этих мертворожденных поросят было установлено, что все они были Lawsonia-отрицательными и количество этих случаев находится в пределах обычных потерь, связанных с репродукцией. Результаты серологического анализа у невакцинированных свиноматок, как и ожидалось, оставались сероотрицательными, а в группе А было выявлено несколько сероположительных животных. У свиноматок в группе А были более высокие значения параметра количество поросят/помет по сравнению с невакцинированными контролями. Этот результат свидетельствует о том, что способы вакцинации или количество вакцины не оказывают отрицательного воздействия. Эти данные обобщены в приведенной выше таблице 1.
Образование макроскопического повреждения в организме поросенка определяли путем обследования и балльной оценки подвздошной кишки и ободочной кишки каждого подопытного животного в отношении макроскопических повреждений, связанных с ПЭС, в момент окончания опыта. Для поросят из групп 1 и 4 при обследовании подвздошной кишки были выставлены наименьшие баллы, составлявшие 0,16 и 0,15 соответственно. Эти оценки не являются статистически достоверно различными, но свидетельствуют об эффективности вакцины для поросят, полученных как от вакцинированных, так и невакцинированных свиноматок. Для групп 2 и 5 баллы повреждений подвздошной кишки составляли 0,85 и 2,35 соответственно. Эти данные являются статистически достоверно различными (Р<0,05) и свидетельствуют о том, что вакцинация свиноматок обеспечивает определенный уровень материнской защиты (группа 2) и что невакцинированные животные являлись чувствительными к вирулентному контрольному заражению (группа 5). Для групп 4 и 5 баллы повреждений подвздошной кишки также были статистически достоверно различными (Р<0,05), что подтверждает эффективность вакцины для поросят, полученных от невакцинированных свиноматок. Для групп 1 и 2 баллы повреждений подвздошной кишки были также статистически достоверно различными (Р<0,05), это подтверждает, что вакцинация свиней, полученных от Lawsonia-положительных свиноматок, приводит к статистически достоверному повышению иммунитета (Р<0,05) до уровня, превышающего материнский иммунитет. Такие же тенденции и статистически достоверные результаты были получены при определении процента положительных животных (количество положительных животных/общее количество животных в группе). Повреждения подвздошной кишки были обнаружены у 80% свиней в группе 5. В отличие от этого, в обеих группах 1 и 4 повреждения подвздошной кишки были обнаружены у менее чем 16% животных.
Было выявлено статистически достоверное различие (Р<0,05) баллов макроскопических повреждений ободочной кишки и процента положительных животных в группе 4 и группе 5. Между группами обработки не было выявлено других статистически достоверных различий. Строгие контроли (группы 3 и 6) были отрицательными в отношении макроскопических повреждений подвздошной кишки и ободочной кишки, что подтверждает обоснованность опыта. Результаты этого тестирования приведены в представленной ниже таблице 2.
Таблица 2
Обобщение результатов балльных оценок макроскопических повреждений у свиней в группах обработки
Группа
Обработка группы
Подвздошная кишка (кол-во позитивн./общее кол-во в группе)
Балл макроскопических повреждений подвздошной кишки
Ободочная кишка (кол-во позитивн./общее кол-во в группе)
Балл макроскопических повреждений ободочной кишки
1
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А
3/19<sup>б</sup>
0,16<sup>б</sup>
2/19
0,26
2
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы А
9/20<sup>б, г</sup>
0,85<sup>б, г</sup>
4/20
0,45
3
поросята, полученные от свиноматок из группы А - строгий контроль
0/10<sup>е</sup>
0,00<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
0,00<sup>е</sup>
4
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы Б
3/20<sup>д</sup>
0,15<sup>д</sup>
1/20<sup>д</sup>
0,05<sup>д</sup>
5
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы Б
16/20<sup>г, д</sup>
2,35<sup>г, д</sup>
6/20<sup>д</sup>
0,80<sup>д</sup>
6
поросята, полученные от свиноматок из группы Б - строгий контроль
0/10<sup>е</sup>
0,00<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
0,00<sup>е</sup>
<sup>б</sup> Различие между группами 1 и 2 статистически достоверно (Р<0,05).
<sup>в</sup> Различие между группами 1 и 4 статистически достоверно (Р<0,05).
<sup>г</sup> Различие между группами 2 и 5 статистически достоверно (Р<0,05).
<sup>д</sup> Различие между группами 4 и 5 статистически достоверно (Р<0,05).
<sup>с</sup> Группу не включали в статистический анализ, как указано в протоколе.
Для оценки развития микроскопических повреждений организма поросенка применяли ИГХ- и Н&Е-методы. В день окончания опыта (день 63) получали срезы длиной 2-4 см миндалин, брыжеечных лимфатических узлов, концевого отдела подвздошной кишки и ободочной кишки и помещали в 10%-ный забуференный формалин для ИГХ-анализа. Lawsonia не была обнаружена с помощью ИГХ-окрашивания срезов миндалин у животных во всех группах обработки в момент окончания опыта. Lawsonia была обнаружена в 2/20 образцах брыжеечных лимфатических узлов у животных из группы 5. Все другие образцы брыжеечных лимфатических узлов во всех других группах обработки были отрицательными и при анализе брыжеечных лимфатических узлов не было установлено статистически достоверного различия между группами обработки.
Баллы микроскопических повреждений подвздошной кишки в группах 1 и 4 составляли 0,35 и 0,15 соответственно, и они не были статистически достоверно различными. В группе 5 балл микроскопических повреждений подвздошной кишки составлял 2,42 и был наиболее высоким, и статистически достоверно (Р<0,05) отличался от обеих групп обработки 2 и 4. Это свидетельствует о том, что у животных в группе 2 имелся определенный уровень материнского иммунитета и что вакцина обладает эффективностью для поросят, полученных от невакцинированных свиноматок. При определении процента образцов, взятых из подвздошной кишки, которые имели микроскопические повреждения, было установлено, что микроскопические повреждения присутствовали у 95% поросят в группе 5 и что указанная группа также и с этой точки зрения статистически достоверно (Р<0,05) отличалась от групп 2 и 4. В группе 5 средний балл микроскопических повреждений ободочной кишки составлял 1,35 и 60% животных в этой группе обработки были положительными в отношении выявленных повреждений, которые вызваны Lawsonia. Это статистически достоверно (Р<0,05) превышало соответствующие величины, полученные для обеих групп обработки 2 и 4. Результаты анализа микроскопических повреждений обобщены в таблице 3.
Таблица 3
Обобщение результатов анализа микроскопических повреждений в тканях свиней в момент окончания исследования
Группа
Обработка группы
Средние баллы микроскопических повреждений подвздошной кишки (ИГХ)
Кол-во поросят, положительных по данным ИГХ в отношении микроскопических повреждений подвздошной кишки (серьезность) /общее кол-во животных в группе
Средние баллы микроскопических повреждений ободочной кишки (ИГХ)
Кол-во поросят, положительных по данным ИГХ в отношении микроскопических повреждений ободочной кишки (серьезность) /общее кол-во животных в группе
1
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А
0,35
3/20
0,15
2/20
2
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы А
0,70<sup>г</sup>
6/20<sup>г</sup>
0,55<sup>г</sup>
5/20<sup>г</sup>
3
поросята, полученные от свиноматок из группы А - строгий контроль
0,00<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
0,00<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
4
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы Б
0,15<sup>д</sup>
2/20<sup>д</sup>
0,05<sup>д</sup>
1/20<sup>д</sup>
5
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы Б
2,42<sup>г, д</sup>
18/19<sup>г, д,*</sup>
1,35<sup>г, д</sup>
12/20<sup>г,д</sup>
6
свиноматки из группы Б - строгий контроль
0,20<sup>е</sup>
1/10<sup>е</sup>
0,00<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
<sup>г</sup> Различие между группами 2 и 5 статистически достоверно (Р<0,05).
<sup>д</sup> Различие между группами 4 и 5 статистически достоверно (Р<0,05).
<sup>е</sup> Группу не включали в статистический анализ, как указано в протоколе.
* В 1 образце был выявлен серьезный некроз и отслоение, и он не мог быть использован для ИГХ.
Для оценки с помощью f-ПЦР выделений Lawsonia с фекалиями поросенка еженедельно в дни 21, 28, 35, 42, 49, 56 и 63 опыта брали с помощью тампона пробы фекалий у всех подопытных животных в каждой группе обработки и анализировали в отношении присутствия L. intracellularis с помощью илеит-ПЦР. Было установлено, что в дни 21, 28 и 35 поросята во всех группах обработки при анализе с помощью f-ПЦР давали отрицательную реакцию в отношении присутствия L. intracellularis (были f-ПЦР-отрицательными). В группе 1 в день 42 были выявлены f-ПЦР-положительные поросята, которые оставались положительными вплоть до дня 63, при этом в течение указанного периода времени положительную реакцию давало 11-16% поросят. В группе 2 в день 49 были выявлены f-ПЦР-положительные поросята, которые оставались положительными вплоть до дня 63, при этом в течение указанного периода времени положительную реакцию давало 5-25% поросят. В группе 4 в день 42 были выявлены f-ПЦР-положительные поросята, которые оставались положительными вплоть до дня 63, при этом в течение указанного периода времени положительную реакцию давало 5-25% поросят соответственно. В группе 5 в день 49 были выявлены f-ПЦР-положительные поросята, которые оставались положительными вплоть до дня 63, при этом в течение указанного периода времени положительную реакцию давало 15-72% поросят. В группах 3 и 6 поросята оставались f-ПЦР-отрицательными в течение опыта. Анализ данных с использованием критерия χ2 позволил выявить достоверное (Р<0,05) различие между группами 4 и 5 в день 42, группами 2 и 5 в день 63 и группами 4 и 5 в день 63. Результаты анализа выделений с фекалиями обобщены в таблице 4.
Таблица 4
Обобщение результатов анализа выделений L. intracellularis с фекалиями свиней в группах обработки
Группы
1
2
3
4
5
6
Обработка групп
Вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А
Обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы А
Поросята, полученные от свиноматок из группы А - строгий контроль
Вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы Б
Обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы Б
Поросята, полученные от свиноматок из группы Б - строгий контроль
День 21
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
День 28
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
День 35
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
0/20<sup>е</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
День 42
3/20
0/20
0/10<sup>е</sup>
5/20<sup>е</sup>
0/20<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
День 49
2/19<sup>а</sup>
1/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
2/20<sup>а</sup>
3/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
День 56
2/19<sup>а</sup>
3/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
1/20<sup>е</sup>
8/19<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
День 63
3/19
5/20<sup>г</sup>
0/10<sup>е</sup>
2/20<sup>е</sup>
13/18<sup>г, д</sup>
0/10<sup>е</sup>
<sup>а</sup> Различие общих результатов сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> не является статистически достоверным.
<sup>г</sup> Различие между группами 2 и 5 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>д</sup> Различие между группами 4 и 5 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>е</sup> Группу не включали в статистический анализ, как указано в протоколе.
2
Колонизацию ткани свиней бактериями Lawsonia оценивали (t-ПЦР) по окончании опыта (день 63) с помощью ПЦР-анализа срезов ткани концевого отдела подвздошной кишки, ободочной кишки, миндалины и брыжеечного лимфатического узла. Строгие контроли (группы 3 и 6) были Lawsonia-отрицательными по данным t-ПЦР, что обоснованность применения источника свиней и метода исследования. Все образцы, взятые из миндалин, были отрицательными по данным t-ПЦР. Только в группе 5 имелись положительные образцы, взятые из ободочной кишки и брыжеечных лимфатических узлов, при этом положительными были результаты анализа для 5-10% поросят. В группах 1 и 2 у 20 и 25% поросят соответственно были получены по данным t-ПЦР положительные результаты при анализе образцов, взятых из подвздошной кишки. Для сравнения, в группах 4 и 5 положительные результаты t-ПЦР были получены у 5 и 45% поросят соответственно. В группах 3 и 6 все образцы, взятые из подвздошной кишки, были отрицательными по данным t-ПЦР. Анализ с использованием критерия χ показал отсутствие статистически достоверных различий между группами обработки при исследовании образцов, взятых из миндалины, брыжеечного лимфатического узла или ободочной кишки. Было выявлено статистически достоверное различие (Р<0,05) между группами 4 и 5 по результатам t-ПЦП-анализа подвздошной кишки, при этом в группе 5 в исследовании был получен наиболее высокий процент положительных результатов. Данные этого исследования обобщены в таблице 5.
Таблица 5
Обобщение результатов анализа колонизации тканей бактериями L. intracellularis у свиней в группах обработки (количество положительных/общее количество)
Группа
Обработкагрупп
МиндалиныКол-во положительных по данным t-ПЦР образцов
Брыжеечные лимфатические узлыКол-во положительных по данным t-ПЦР образцов
Подвздошная кишкаКол-во положительных по данным t-ПЦР образцов
Ободочная кишкаКол-во положительных по данным t-ПЦР образцов
1
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
4/20
0/20<sup>а</sup>
2
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы А
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
5/20
0/20<sup>а</sup>
3
поросята, полученные от свиноматок из группы А - строгий контроль
0/10<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
4
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы Б
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
1/20<sup>д</sup>
0/20<sup>а</sup>
5
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы Б
0/20<sup>а</sup>
2/20<sup>а</sup>
9/20<sup>д</sup>
1/20<sup>а</sup>
6
поросята, полученные от свиноматок из группы Б - строгий контроль
0/10<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
0/10<sup>е</sup>
<sup>а</sup> Различие общих результатов сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> не является статистически достоверным.
<sup>д</sup> Различие между группами 4 и 5 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>е</sup> Группу не включали в статистический анализ, как указано в протоколе.
2
ADWG рассчитывали от момента вакцинации (день 21) до осуществления контрольного заражения (день 42), до дня окончания опыта (день 63), и от контрольного заражения (день 42) до дня окончания исследования (день 63). В день вакцинации (день 21) не было обнаружено статистически достоверных различий между группами обработки. Аналогично этому не было выявлено статистически достоверных различий в период после вакцинации (со дня 21 до дня 42). Этот результат подтверждает то, что вакцина является безопасной и не ухудшает продуктивность, которую оценивают по приросту массы. После вирулентного контрольного заражения были выявлены статистически достоверные различия (Р<0,05) ADWG между группами 1 и 4, группами 2 и 5 и группами 4 и 5. Животные в группе 5 имели наименьший ADWG в данном опыте, составляющий 0,88 фунтов/день. Оценка с использованием критерия χ для периода времени от вакцинации до контрольного заражения и до момента окончания опыта также позволила выявить статистически достоверное различие (Р<0,05) между группами 1 и 4 и группами 4 и 5. Эти данные обобщены в приведенной ниже таблице 6.
Таблица 6
Средние суточные приросты массы (ADWG) свиней
Группа
Обработка групп
Средний исходный вес (фунты) в день 21
ADWG(дни 21-42) (фунты) после вакцинации
ADWG (дни 42-63) (фунты) после контрольного заражения
Общий ADWG (со дня 21 по день 63) (фунты) со дня вакцинации, включая дни после контрольного заражения
1
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А
14,4<sup>а</sup>
0,90<sup>а</sup>
0,99<sup>в</sup>
0,94<sup>в</sup>
2
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы А
14,0<sup>а</sup>
0,88<sup>а</sup>
1,01<sup>г</sup>
0,94
3
поросята, полученные от свиноматок из группы А - строгий контроль
14,8<sup>е</sup>
1,01<sup>е</sup>
1,14<sup>е</sup>
1,08<sup>е</sup>
4
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы Б
14,2<sup>а</sup>
0,97<sup>а</sup>
1,12<sup>в, д</sup>
1,05<sup>в, д</sup>
5
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы Б
13,4<sup>а</sup>
0,90<sup>а</sup>
0,088<sup>г, д</sup>
0,88<sup>д</sup>
6
поросята, полученные от свиноматок из группы Б - строгий контроль
14,0<sup>е</sup>
1,00<sup>е</sup>
1,10<sup>е</sup>
1,05<sup>е</sup>
<sup>а</sup> Различие общих результатов сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> не является статистически достоверным.
<sup>в</sup> Различие между группами 1 и 4 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>г</sup> Различие между группами 2 и 5 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>д</sup> Различие между группами 4 и 5 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>е</sup> Группу не включали в статистический анализ, как указано в протоколе.
Результаты клинических обследований поросят регистрировали ежедневно, для каждого животного, начиная со дня контрольного заражения (день 42) до окончания опыта (день 63). Рассчитывали клинические баллы для получения среднего суточного клинического балла, отражающего серьезность и продолжительность заболевания в группах обработки, вызванного контрольным заражением вирулентным изолятом Lawsonia. Балл 3 соответствовал нормальному здоровому животному. Во всех группах после вирулентного контрольного заражения было выставлено мало клинических баллов, отличных от «3», при этом не было выявлено статистически достоверного различия между любыми группами обработки. Средние клинические баллы для каждой группы обработки обобщены в представленной ниже таблице 7.
Таблица 7
Средние клинические баллы для свиней
Группа обработки
Характеристика группы
Средний клинический балл
1
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А
3,01<sup>а</sup>
2
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы А
3,00<sup>а</sup>
3
поросята, полученные от свиноматок из группы А - строгий контроль
3,00<sup>е</sup>
4
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы Б
3,01<sup>а</sup>
5
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы Б
3,02<sup>а</sup>
6
поросята, полученные от свиноматок из группы Б
3,00<sup>е</sup>
<sup>а</sup> Различие общих результатов сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> не является статистически достоверным.
<sup>е</sup> Группу не включали в статистический анализ, как указано в протоколе.
Серологическую оценку поросят с помощью IFAT-анализа на присутствие антител типа IgG к Lawsonia осуществляли на образцах сыворотки, которые брали еженедельно у всех подопытных животных. Образцы сыворотки брали в дни 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 и 63. До контрольного заражения некоторые поросята в группах 1-3 были сероположительными в отношении присутствия Lawsonia, это подтверждает то, что в результате вакцинации свиноматок у поросят индуцировался определенный уровень материнского иммунитета. В отличие от этого все поросята в группах 4-6 были сероотрицательными в отношении Lawsonia. В день опороса и в дни 7 и 14 среди поросят группы 1 было статистически достоверно (Р<0,05) больше сероположительных животных, чем в группе 4. Поросята в группе 1 статистически достоверно (Р<0,05) отличались также от поросят в группе 2 в день 63 опыта. В дни 7, 14 и 28 в группе 2 было статистически достоверно (Р<0,05) больше сероположительных животных, чем в группе 5. В группах 1-3 выявляли материнские антитела вплоть до дня 28. В день 35 все животные в группах 1-3 были сероотрицательными. После вирулентного контрольного заражения в группах 1, 2, 4 и 5 было выявлено несколько случаев сероконверсии. В день 56 исследования было выявлено статистически достоверное различие (Р<0,05) между группами 1 и 4. Уровни сероконверсии для каждой группы обобщены в приведенной ниже таблице 8.
Таблица 8
Обобщение данных об уровнях сероконверсии у свиней в группах обработки
Группы
1
2
3
4
5
6
Дни обработки группы
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы А
поросята, полученные от свиноматок из группы А - строгий контроль
вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы Б
обработанные плацебо поросята, полученные от свиноматок из группы Б
поросята, полученные от свиноматок из группы Б - строгий контроль
день опороса
5/20<sup>в</sup>
3/20
1/10<sup>е</sup>
0/20<sup>в</sup>
0/20
0/10<sup>е</sup>
день 7
7/20<sup>в</sup>
4/20<sup>г</sup>
3/10<sup>е</sup>
0/20<sup>в</sup>
0/20<sup>г</sup>
0/10<sup>е</sup>
день 14
5/20<sup>в</sup>
4/20<sup>г</sup>
3/10<sup>е</sup>
0/20<sup>в</sup>
0/20<sup>г</sup>
0/10<sup>е</sup>
день 21
2/20<sup>а</sup>
3/20<sup>а</sup>
2/10<sup>е</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
день 28
3/20
4/20<sup>г</sup>
3/10<sup>е</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
день 35
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10
0/20<sup>а</sup>
0/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
день 42
0/20<sup>а</sup>
0/20
0/10
1/20<sup>а</sup>
0/20
0/10<sup>е</sup>
день 49
0/19
0/20
0/10<sup>е</sup>
2/20<sup>а</sup>
1/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
день 56
0/19<sup>а, в, *</sup>
1/20<sup>а</sup>
0/10<sup>е</sup>
4/20<sup>а, в</sup>
2/19<sup>а, *</sup>
0/10<sup>е</sup>
день 63
0/19<sup>а, б, в, *</sup>
8/20<sup>б</sup>
0/10<sup>е</sup>
5/20
9/18<sup>*</sup>
0/10<sup>е</sup>
<sup>а</sup> Различие общих результатов сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> не является статистически достоверным.
<sup>б</sup> Различие между группами 1 и 2 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>в</sup> Различие между группами 1 и 4 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>г</sup> Различие между группами 2 и 5 по данным сравнительного анализа с использованием критерия χ<sup>2</sup> является статистически достоверным (Р<0,05).
<sup>е</sup> Группу не включали в статистический анализ, как указано в протоколе.
<sup>*</sup> В этой группе обработки одно животное погибло.
Обсуждение
В настоящем опыте проводили оценку безопасности вакцины Lawsonia для свиноматок при ее введении в виде повторных доз с высокими титрами на второй и третьей стадиях беременности с целью индукции ответа в виде высокого уровня материнского гуморального иммунного ответа. Ни у одной из вакцинированных свиноматок не было обнаружено присутствия Lawsonia в тканях с помощью ИГХ, t-ПЦР или признаков инфекции, вызываемой Lawsonia, которые оценивали по макроскопической патологии. Кроме того, ни у одной из вакцинированных свиноматок не было обнаружено выделений Lawsonia с фекалиями. И, наконец, вакцинированные свиноматки рождали большее количество живых здоровых поросят. Таким образом, все данные свидетельствуют о том, что вакцина является безопасной для беременных животных.
Данный комплексный опыт проводили как на Lawsonia-положтелъных (группа А), так и на Lawsonia-отрицательных свиноматках (группа Б), поросят от которых затем вакцинировали (группы 1 и 4) или не вакцинировали (группы 2 и 5). Поросята в группах 3 и 6 служили в качестве строгих контролей, и их не подвергали ни обработке, ни контрольному заражению. Проводили анализ данных и на основе сравнения групп обработки, которые различались только одной переменной (вакцинация поросенка или вакцинация свиноматки), делали последующие выводы.
Тот факт, что вакцина была эффективной для необработанных поросят, подтверждает то, что используемый в опыте источник свиней был чувствительным и что вакцинация таких поросят является эффективной против вирулентного гетерологичного контрольного заражения. Это требует сравнения группы 4 (вакцинированная) и группы 5 (невакцинированная), в каждой из которых животные были получены от Lawsonia-отрицательных свиноматок. Результаты свидетельствуют о том, что группа 4 статистически достоверно (Р<0,05) отличалась от группы 5 по средним баллам макроскопических повреждений подвздошной кишки, средним баллам макроскопических повреждений ободочной кишки, выделениям с фекалиями (f-ПЦР), колонизации ткани подвздошной кишки (t-ПЦР) и ADWG. Попутно результаты настоящего исследования подтвердили также, что Enterisol Ileitis B3903 обеспечивает эффективную защиту после однократного введения. Кроме того, они подтвердили и обосновали, что источник свиней, использованных в исследовании, был чувствительным к гетерологичному вирулентному контрольному заражению.
Сравнение группы 2 (поросята от свиноматок из группы А) и группы 5 (поросята от свиноматок из группы Б) позволило оценить уровень потенциальной материнской защиты, обеспечиваемой вакцинацией свиноматок. Данные свидетельствуют о наличии статистически достоверных различий (Р<0,05) между группами 2 и 5 с точки зрения средних баллов макроскопических повреждений подвздошной кишки, средних баллов микроскопических повреждений подвздошной кишки и ободочной кишки, выделений с фекалиями (f-ПЦР), ADWG и серологии. Эти данные свидетельствуют также о наличии определенной формы материнского иммунитета, который обеспечивает защиту от вирулентного контрольного заражения в течение по меньшей мере шести недель после рождения. Кроме того, в опыте проводили серологический анализ (IFA), который позволил установить, что в группах 1-3 можно обнаруживать серопозитивных поросят, начиная со дня опороса до дня 28. Интересно отметить, что в день контрольного заражения все поросята во всех группах были сероотрицательными по данным IFA, это может означать, что примененный в данном исследовании анализ не является точным индикатором наличия иммунитета против заражения вирулентными бактериями Lawsonia. Учитывая природу этиологического агента, являющегося патогеном слизистой оболочки, и то, что применяли авирулентную живую вакцину, можно предположить, что имеет место такой фактор, как определенная форма клеточного иммунитета.
Другая цель данного опыта заключалась в том, чтобы определить, можно ли на фоне материнского иммунитета осуществлять эффективную вакцинацию путем вакцинации поросят в более раннем возрасте по сравнению с тем, который обычно рекомендуют или в котором ее осуществляют. В этом опыте была подтверждена эффективность вакцинации поросят в возрасте 16-26 дней. Этот вывод был сделан на основе сравнения группы 1 (вакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А) и группы 2 (невакцинированные поросята, полученные от свиноматок из группы А). Первичными параметрами, которые использовали при сравнении, были макроскопические (обширные) и микоскопические повреждения подвздошной кишки и ободочной кишки. Средние баллы повреждений подвздошной кишки составляли 0,16 и 0,85 для групп 1 и 2 соответственно, причем различие этих данных было статистически достоверным (Р<0,05). Процент образцов, взятых из подвздошной кишки, в которых обнаружены макроскопические повреждения, составлял 16% и 45% для групп 1 и 2 соответственно, причем различие этих данных также было статистически достоверным (Р<0,05). У поросят в группе 1 были количественно меньшие баллы макроскопических повреждений подвздошной кишки, меньшие баллы микроскопических повреждений подвздошной кишки и ободочной кишки и меньший уровень колонизации ткани (t-ПЦР), хотя различие не было статистически достоверным. В целом эти результаты подтверждают, что вакцинация обеспечивает эффективную защиту, которая превышает защиту, обеспечиваемую только материнским иммунитетом, и продолжается после его прекращения.
Все за исключением одного сравнения одной группы с другими, обсужденные выше, были основаны на учете влияния только одной исследуемой переменной, либо вакцинации свиноматки, либо вакцинации поросенка, но не обоих вместе. Сравнение групп 1 и 5 требует учета двух исследуемых переменных при оценке данных (вакцинации свиноматок и вакцинации поросенка). Следует отметить, что некоторые параметры для групп 2 и 5 различались статистически достоверно (Р<0,05), а некоторые другие имели более низкие численные значения. Разумно предположить, что большинство исследуемых параметров для групп 1 и 5 должны иметь статистически достоверные различия, как и для групп 2 и 5. В целом, было установлено, что группы 1 и 5 имели статистически достоверные различия (Р<0,05) по многим параметрам, включая основные исследуемые параметры, такие как баллы макроскопических повреждений подвздошной кишки, баллы микроскопических повреждений подвздошной кишки и баллы микроскопических повреждений ободочной кишки.
И, наконец, данные, полученные для групп 3 и 6 (группы строгих контролей), позволили подтвердить статус свиней касательно Lawsonia и обоснованность используемых источников свиней. Эти группы не были включены в статистический анализ. Все измеренные и оцененные параметры за исключением баллов микроскопических повреждений для одного поросенка из группы 6, на основе которых он был признан Lawsonia-положительным, подтвердили, что эти животные являлись Lawsonia-отрицательными. С учетом общего объема данных, полученных для всех других параметров, можно считать, что указанный результат был ошибочным.