Ниша гемопоэтических стволовых клеток in vivo: «Увидеть своими глазами»

И I II II

тп

Новости клеточных технологий

12. Scotto L., Narayan G., Nandula S.V. et al. Identification of copy number gain and overexpressed genes on chromosome arm 20q by an integrative genomic approach in cervical cancer: potential role in progression. Genes Chromosomes Cancer 2008; 47C9); 755—65.

13. Koynova D.K., Jordanova E.S., Milev A.D. et al. Gene-specific fluorescence in-situ hybridization analysis on tissue microarray to refine the region of chromosome 20q amplification in melanoma. Melanoma Res. 2007; 17 [11: 37-41.

14. Calin G.A., Sevignani C., Dumitru C.D. et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS 2004; 101 [91: 2999-3004.

15. Pfeiffer P., Goedecke W., Obe G. Mechanisms of DIMA doublestrand break repair and their potential to induce chromosomal aberrations. Mutagenesis 2000; 15C4]: 289—302.

16. LukusaT., Fryns J.P. Human chromosome fragility. Biochim. Biophys. Acta. 2008; 1779C1]; 3-16.

Подготовила А.С. Григорян

По материалам: Spits С., Mateizel I., Geens M. et al. Recurrent chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells.

Nature Biotechnology 2008; 26(12): 1361 -3. Lefort N„ Feyeux M„ Bas C. et al. Human embryonic stem cells reveal recurrent genomic instability at 20q11.21. Nature Biotechnology 2008; 26(12): 1364-6

Ниша гемопоэтических стволовых клеток in vivo: «увидеть своими глазами»

Функциональное состояние гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) регулируется совокупностью внешних сигналов от специфического микроокружения, называемого «нишей» стволовых клеток [1]. Полагают, что терапевтические манипуляции на уровне ниши ГСК могли бы стать весомой альтернативой трансплантационным подходам в клинике. Однако до сих пор нет единого мнения о том, какова молекулярная природа регуляторных сигналов в нише и какие клетки отвечают за их продукцию. В последние годы был обнаружен ряд молекул (ангиопоэтин, тромбопоэтин, хемокин CXCL12, остео-понтин и др.), нарушение экспрессии которых существенно сказывается на взаимодействии ГСК со своей микросредой. Иммуногистохимические исследования, в свою очередь, показали, что ГСК локализуются вблизи эндоста — гетерогенного слоя клеток, выстилающего костномозговую полость (так наз. «эндостальная» ниша ГСК). Эндостальная выстилка образована остеобластами, остеогенными клетками-предшественниками (часто обозначаемыми как «клетки костной выстилки» — bone-lining cells) и остеокластами; при этом остеобласты рассматриваются как главный клеточный компонент эндоста, отвечающий за регуляцию ГСК [2, 3].

В дополнение, исследовательская группа S.J. Morrison обнаружила в образцах костного мозга и селезенки мышей устойчивые ассоциации CD150+ ГСК с эндотелием сосудов, что указало на возможное существование еще одной, «сосудистой» ниши ГСК [4]. Действительно, через сосудистый эндотелий поступают эндокринные сигналы от циркулирующих гормонов, цитокинов и факторов роста, поэтому контакт стволовых клеток с эндотелием позволяет ускорить их функциональный ответ на внешний стимул. Например, как уже обсуждалось [5], нейральные стволовые клетки своими отростками тесно контактируют с эндотелием сосудов в специфических зонах, где повышена проницаемость ге-матоэнцефалического барьера. Более того, взаимодействие ГСК с клетками сосудов представляется особо важным в очагах экстрамедуллярного гемопоэза (печень, селезенка), где нет костной ткани [1].

С другой стороны, разделение микроокружения ГСК на «эндостальную» и «сосудистую» нишу весьма условно по следующим причинам [1]. Во-первых, эндост

характеризуется высокой степенью васкуляризации и поэтому ГСК, взаимодействующие с эндостом, так или иначе, оказываются в непосредственной близости от сосудов. Во-вторых, контакт ГСК с окружающими клетками может служить для их закрепления в костном мозге, и регуляция функциональной активности ГСК тогда осуществляется за счет продукции растворимых факторов. В этом случае локализация ГСК в костном мозге утрачивает свое первостепенное значение. В-третьих, данные анализа фиксированных иммуногистохимичес-ких препаратов не позволяют отличить устойчивые, функционально значимые ассоциации ГСК с окружающими клетками от кратковременных и случайных и поэтому не могут в полной мере отразить естественное распределение ГСК in vivo. Таким образом, информация, полученная путем текущего наблюдения за стволовыми клетками в их естественном окружении, позволила бы ответить на вопрос о действительном распределении ГСК в костном мозге и о том, где на самом деле происходит их самообновление.

В декабре на сайте журнала Nature появились две публикации, посвященные структуре и формированию ниши ГСК во взрослом организме мышей. Так, Y. Xie с соавт. (совместное исследование групп Ricardo A. Feldman и Linheng Li) и С. Lo Celso с соавт. (группа D.T. Scadden) удалось в реальном времени проследить за поведением трансплантированных ГСК в костном мозге животных.

Отсутствие уникального маркера создает существенное препятствие для визуализации живых ГСК in vivo или ex vivo. Действительно, в случае изучения стволовых клеток с комплексным фенотипом не подходят трансгенные животные, несущие ген-репортер под контролем промотора специфического маркерного гена. Поэтому одним из решений может быть трансплантация предварительно обогащенной и отсортированной популяции меченых клеток. Y. Xie с соавт. выделяли популяцию клеток с фенотипом Flk2~/Lin~/Sca-1 +/c-Kit+ (Flk2— LSK) у трансгенных мышей с GFP-репортером, контролируемым промотором повсеместно экспрессируемого гена актина. С. Lo Celso с соавт. использовали в работе ГСК с различными, частично перекрывающимися фенотипами (LSK CD34~/Flk2~, LSK CD150+/CD48, LSK Flk2~/CD48~), при этом сортированные клетки

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009

ИМИ!

Новости клеточных технологий

окрашивали липофильными цианиновыми красителями (Vybrant DiD и Dili. Для визуализации костной ткани авторы применяли SHG-микроскопию (коллаген способен генерировать SHG-сигнал); остеобласты выявляли по экспрессии GFP у трансгенных Col2.3-GFP мышей (коллаген 1а является маркером остеобластов); для микроскопии сосудов использовали «квантовые точки» (Qdot 655 и 800), которые вводили мышам в ретроор-витальный синус непосредственно перед анализом.

Для наблюдения за взаимодействием ГСК с компонентами ниши Y. Xie с соавт. разработали уникальный метод визуализации стволовых клеток ex vivo (ex vivo imaging stem cells, EVISC). EVISC предполагает наблюдение за мечеными ГСК в костном мозге с помощью чувствительной двухфотонной микроскопии после их трансплантации экспериментальным животным. Для этого толстые (2^3 мм) срезы бедренной или большеберцовой костей помещали в культуральную чашку с полуплотной средой, после чего проводили детекцию клеток в реальном времени на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Исследовательская группа D.T. Scadden пошла дальше, решив изучить распределение меченых ГСК в костном мозге живых животных. Для этого авторы использовали свою модификацию метода интравитальной конфокальной микроскопии, с помощью которой изучали ГСК в костях свода черепа [6]. Таким образом, предложенные авторами подходы позволили наблюдать в реальном времени за миграцией, распределением и пролиферацией трансплантированных ГСК в костном мозге мышей, а также изучать взаимодействие этих клеток с микроокружением.

Прежде всего, Y. Xie с соавт. подтвердили, что трансплантированные ГСК мигрируют преимущественно в костный мозг, но не заселяют другие органы (например, печень и селезенку), для чего проследили за распределением Sd-экспрессирующих клеток с помощью биолюминесцентного мечения in vivo.

Далее, Y. Xie с коллегами обнаружили, что эндостальная поверхность костной ткани в большей степени покрыта сосудистой сетью (CD31+), нежели остеобластоподобными клетками (1М-кадгерин+). При этом, как и предполагалось, сосуды локализуются рядом с остеобластами, что не позволяет четко разделить «эндо-стальную» и «сосудистую» ниши ГСК. Для маркирования остеобластов авторы использовали антитела к двум маркерам — N-кадгерину и транскрипционному фактору Osterix (Osx), — а также трансгенных Col2.3-GFP мышей. Оказалось, что N-кадгерин экспрессировался как Osx+, так и Osx- клетками, причем N-кадгерин + клетки были локализованы рядом с Osx+ остеобластами. Авторы полагают, что N-кадгерин + клетки, по всей видимости, представляют собой дифференцирующиеся остеогенные клетки, поскольку N-кадгерин экспрессируется на разных стадиях дифференцировки остеобластов [7], в то время как Osterix в постнатальный период активен в зрелых остеобластах, синтезирующих костный матрикс [8].

Авторы обеих публикаций показали, что ГСК заселяют костный мозг только облученных животных, причем стволовые клетки накапливаются вблизи эндоста. Так, Y. Xie с соавт. сравнивали распределение GFP+ ГСК в костном мозге через 5^8 ч после трансплантации облученным и интактным мышам-реципиентам. Повреждение костного мозга в результате облучения способствовало накоплению GFP+ ГСК около эндостальной поверхности, а у необлученных мышей трансплантированные клетки скапливались преимущественно в просвете костномоз-

говой полости: у облученных мышей 58,1 % (47 % — у группы D. Т. Scadden) меченых клеток располагались в пределах 12—16 мкм от эндоста, у необлученных животных — только 12,5 %. По данным С. Lo Celso с соавт., у необлученных мышей введенные ГСК располагались близко к сосудам (0—16 мкм) и были функционально некомпетентными, о чем свидетельствовали результаты долговременных (4 мес.) трансплантационных тестов. Это подтверждает тот факт, что ГСК не способны к приживлению в необлученном костном мозге. Интересно также отметить, что у облученных мышей GFP+ ГСК в основном мигрировали в зону губчатого вещества кости (83,8 %) по сравнению с компактным веществом (16,2 %), чего, однако, не наблюдалось у интактных животных. Выяснилось, что избирательная миграция ГСК связана с повышенной экспрессией хемокина CXCL12 (SDF-1) в губчатом веществе кости после облучения.

С какими же клетками эндоста взаимодействуют трансплантированные ГСК? По данным Y. Xie с соавт., в 10 из 17 случаев (59 %) GFP+ ГСК прикреплялись либо находились вблизи эндостальных N-кадгерин+ клеток. Важно отметить, что ГСК тоже экспрессировали N-кад-герин, хотя и в значительно меньшем количестве; при этом молекулы N-кадгерина располагались в зоне контакта мембран ГСК и клеток эндоста, что свидетельствует о функциональной значимости такой экспрессии. Схожие результаты были получены авторами и ранее

[3]. С другой стороны, роль N-кадгерин-зависимых взаимодействий между ГСК и эндостальными клетками достаточно сомнительна. Например, группа S. Morrison не смогла выявить экспрессию N-кадгерина в ГСК (хотя использовала тот же клон моноклональных антител, что и группа L. Li) [9], а также не обнаружила каких-либо значимых изменений в гомеостазе ГСК и кроветворении у мышей, гемопоэтические клетки которых были дефицитны по гену N-кадгерина [10]. Конечно, нельзя исключить, что ГСК используют другие молекулы адгезии для закрепления в нише.

При трансплантации меченых ГСК облученным животным пролиферирующие GFP+ клетки (Ю67-позитив-ные) обнаруживались вблизи эндоста, при этом число Ki-67+/GFP+ ГСК у облученных мышей было в пять раз больше, чем у необлученных животных (соответственно 35% и 7%). Кроме окраски маркера пролиферации Ki-67, Y. Xie с коллегами удалось проследить за делениями отдельных GFP+ клеток с помощью EVISC. Расчеты показали, что в результате пролиферации в организме облученных животных трансплантированные GFP+ ГСК увеличивают свое количество более чем в 6 раз за 2 нед. (от 2000 до —13 ООО клеток), причем более активная пролиферация отмечается в губчатом веществе кости. Аналогично, С. Lo Celso с соавт. наблюдали за пролиферацией DiD+ клеток in vivo: меченые ГСК образовывали кластеры из нескольких клеток, причем интенсивность флуоресцентного сигнала у дочерних клеток была снижена как результат распределения мембра-нотропной метки; кроме того, ГСК накапливали 5-бром-дезоксиуридин (BrdU). Таким образом, трансплантированные ГСК способны активно пролиферировать in vivo в ответ на повреждение.

В заключение, группа D.T. Scadden обнаружила, что расположение ГСК по отношению к эндосту зависит от функционального состояния как самих клеток, так и их микроокружения. Во-первых, положение гемопоэтических клеток относительно костномозгового микроокружения определяется их дифференцировочным статусом. Так, истинные «долгосрочные» ГСК (LSK CD34~/Flk2~), а

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

также непролиферирующие клетки, располагаются ближе к остеобластам и эндосту, нежели мультипотентные (LSK CD34+/Flk2+) или коммитированные (Linlow Sea-1 +/c-Kit+) клетки-предшественники.

Во-вторых, на локализацию ГСК влияет состояние самой ниши. Трансгенные PPR мыши, у которых конститутивно активный ген рецептора к паратиреоидному гормону (ПТП и ПТГ-подобному белку (РТН/РТНгР) контролируется промотором остеобласт-специфичного гена Col12.3kb, содержат повышенное количество остеобластов и ГСК, а также увеличенный объем трабекулярной костной ткани [2]. DiD+ ГСК, введенные таким мышам, располагались значительно ближе к эндостальной поверхности по сравнению с мышами дикого типа. Таким образом, изменения локализации ГСК могут быть одним из объяснений противоречивых данных о роли отдельных клеток в формировании ниши. К примеру, у PPR мышей увеличение количества остеобластов согласует-

ся с повышенным содержанием ГСК [2], в то время как выраженная деплеция остеобластов у Ыд1усап-дефицит-ных мышей не отражается на количестве и функциональных свойствах кроветворных клеток [9].

Итак, авторами работ были предложены два мощных и многообещающих подхода для анализа кроветворных стволовых клеток в условиях, наиболее приближенных к естественным. Эти предварительные результаты показали, что пока нет достаточных оснований разделять микроокружение ГСК на отдельные «ниши», поскольку эндостальный и сосудистый компоненты находятся в тесной функциональной и структурной взаимосвязи (рис.). Скорее, имеет место «эндостально-сосудистая» ниша ГСК, объединяющая сигналы от разных клеток костного мозга [1]. Кроме того, недостаточно изучено влияние остальных костномозговых клеток (остеокластов, мегакариоцитов, ретикулярных клеток стромы и др.) на гомеостаз ГСК.

Предполагаемые варианты организации «эндостальной» и «сосудистой» ниши ГСК: А — ниши имеют различную локализацию, но функционально сходны; Б — ниши имеют различную локализацию и функцию; В — единая ниша, образованная эндостальными и периваскулярными клетками; Г — «диффузная» ниша: ГСК регулируются паракринными сигналами от костномозговых клеток разных типов. По рисунку М. Kiel и S. Morrison с изменениями [1]

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009

ИМИ!

Новости клеточных технологий

Комплексная структура ниши ГСК была особенно хорошо продемонстрирована в декабрьской публикации группы знаменитого Irving L. Weissman. С. К. F. Chan с соавт. разработали трансплантационный тест, позволивший воссоздать нишу ГСК in vivo в неестественном для нее месте — под почечной капсулой. Авторы выделяли клетки из костной ткани 14,5-дневных эмбрионов, еще не заселенной ГСК, и трансплантировали их взрослым мышам под капсулу почки, в результате чего происходила васкуляризация трансплантата и его превращение в гетеротопическую нишу для ГСК реципиента. Колонизация гетеротопической ниши клетками реципиентного животного проходила в следующем порядке. На 16-й день после трансплантации появлялись эритроидные клетки и формировалась сосудистая сеть; на 24-й день выявлялись c-Kit+ кроветворные клетки-предшественники; ГСК заселяли трансплантат не раньше 32-го дня.

Было обнаружено, что только С0105+/ТИу1~ клетки образуют костный мозг, заселенный ГСК. CD105+/Thy1 + клетки дают начало только костной ткани, без костного мозга, а клетки, негативные по обоим маркерам, не формируют ни кости, ни костного мозга. Таким образом, ни остеобласты, ни их предшественники сами по себе не способны обеспечить формирование функциональной ниши ГСК.

Как выяснилось, С0105+/ТИу1~ клетки-предшественники образуют кость по механизму энхондраль-ного остеогенеза, т. е. через стадию хряща, а Сй105+/ ТИу1 + клетки утратили хондрогенный потенциал и могут дифференцироваться только в остеобласты. Генетическое ингибирование факторов, играющих центральную роль в энхондральном остеогенезе (ОвЬепх) и васкуляризации (УЕВП, нарушает формирование в трансплантате костного мозга, пригодного для заселения ГСК. Более того, трансплантация С0105+/ТИу1~ клеток из фетальных костей, формирующихся путем внутримембранного остеогенеза (без этапа замещения хрящевой ткани костной — например, кости свода черепа), также приводит к образованию кости без костного мозга. В дальнейшем предстоит выяснить, каково истинное значение энхондрального остеогенеза в формировании костномозгового микроокружения ГСК и почему ГСК, как показали С. Ьо Се1зо с соавт., всё же заселяют кости свода черепа. Очевидно, что комбинации методических подходов, предложенных исследовательскими группами И.А. ГеИтап, I. У, О.Т. БсасШеп и М. \А/е1ззтап, с технологиями направленного мутагенеза помогут ответить на эти и многие другие вопросы касательно тонкой структуры гемопоэтической «ниши».

ЛИТЕРАТУРА:

1. Kiel M.J., Morrison S.J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat. Rev. Immunol. 2008; 8t4): 290—301.

2. Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W. et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 2DD3; 425Ш960]: 841-846.

3. Zhang J., Niu C., Ye L., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 2DD3; 425C6960): 836—841.

4. Kiel M.J., Yilmaz O.H., Iwashita T. et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 2DD5; 121 [7): 1109—1121.

5. Лелявский А.А. Уникальная микроархитектоника ниши нейральных стволовых клеток млекопитающих. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2DD8; 4 [3].

6. Sipkins D.A., Wei X., Wu J.W. et al. In vivo imaging of specialized

bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature 2005; 435(70441: 969-973.

7. Kawaguchi J., Kii I., Sugiyama Y., Takeshita S., Kudo A. The transition of cadherin expression in osteoblast differentiation from mesenchymal cells: consistent expression of cadherin-11 in osteoblast lineage. J. Bone Miner. Res. 2001; 16C2]: 260-269.

8. Baek W.Y., Lee M.A., Jung J.W. et al. Positive Regulation of Adult Bone Formation by Osteoblast-Specific Transcription Factor Osterix. J. Bone Miner. Res. 2008 Dec 29. PMID: 19113927

9. Kiel M.J., Radice G.L., Morrison S.J. Lack of evidence that hematopoietic stem cells depend on N-cadherin-mediated adhesion to osteoblasts for their maintenance. Cell Stem Cell 2007; 1 [21: 204—217.

10. Kiel M.J., Acar M., Radice G.L., Morrison S.J. Hematopoietic stem cells do not depend on N-Cadherin to regulate their maintenance. Cell Stem Cell 2008 Dec 30.

Подготовил А А. Лелявский

По материалам: Xie Y„ Yin T„ Wiegraebe W. et al. Detection of functional haematopoietic stem cell niche using real-time imaging. Nature 2009:457(7225): 97-101. Lo Celso C„ Fleming FIE., Wu J.W. et al. Live-animal tracking of individual

haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature 2009:457(7225): 92-96.

Chan C.K., Chen C.C., Luppen C.A. et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature 2009; 457:490-4

Мембранный потенциал играет важную роль в дифференцировке ММСК

Во время эмбрионального развития и регенерации тканей ключевую роль в процессах пролиферации и дифференцировки различных типов стволовых клеток и клеток-предшественниц играет не только молекулярная, но и биофизическая сигнализация, то есть биоэлектрические сигналы, генерируемые при участии ионных каналов, имеющихся в клеточной мембране [1, 2]. Например, на модели дифференцировки клеток нейробла-стомы было продемонстрировано, что дифференцировка сопровождается деполяризацией мембраны, вызываемой работой калиевых и натриевых ионных каналов [3].

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009

На модели заживления раны роговицы также было показано, что колебания мембранного потенциала, создающие в ткани электрические поля, регулируют миграцию клеток

[4], их поляризацию и частоту делений [5]. На данный момент, к сожалению, о биоэлектрических сигналах и их роли в развитии и регенерации известно удручающе мало.

Одним из самых интересных направлений в изучении биоэлектрических сигнальных систем является контроль поведения стволовых клеток. Исследования показывают, что стволовые клетки в недифференцированном

А