Способ морфологической диагностики гестационной зрелости миокарда у недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель
METHOD FOR MORPHOLOGICAL DIAGNOSIS OF GESTATIONAL MYOCARDIAL MATURITY IN PREMATURE INFANTS BORN AT 22-27 WEEKS GESTATION

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и может быть использовано для диагностики гестационной зрелости миокарда недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель.
Гестационная зрелость миокарда у недоношенных новорожденных играет важную роль в постнатальной адаптации, а также составляет структурную основу развития сердечно-сосудистых заболеваний в неонатальном периоде. Так, тканевая незрелость миокарда является одним из основных звеньев патогенеза морфогенетических кардиомиопатий, развитие которых связано с внутриутробными и постнатальными нарушениями кардиогенеза. Функциональная и структурная незрелость сердца приводит к различным нарушениям гемодинамики, сердечного ритма, сохраняющимися у детей на протяжении раннего возраста [Состояние сердца у новорожденных детей с постгипоксической ишемией миокарда на фоне кардиотропной терапии / А.А. Тарасова, Ю.Н. Белова, И.Ф. Острейков, В.Н. Подкопаев // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2013. - Т. 58, №2. - С. 24-29].
В доступной литературе в минимальном объеме освещены вопросы структурной перестройки миокарда у доношенных и недоношенных новорожденных. В единичных отечественных и иностранных источниках представлены данные о структурных особенностях миокарда у новорожденных с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении. Так, в работах Виноградовой И.В. и соавторов (2010) показано, что миокард у данной категории детей имеет губчатое строение с преимущественным расположением миофибрилл на периферии кардиомиоцитов [Виноградова И.В., Краснов М.В. Постнатальная адаптация сердечно-сосудистой системы у новорожденных с экстремально низкой массой тела // Вестник Чувашского университета. - 2010. - №3. - С. 63-69]. Объемное соотношение кардиомиоцитов и соединительнотканного компонента в миокарде колеблется от 75% и 25% до 80% и 20% [Непомнящих Л.М., Колесникова Л.В. Количественное взаимоотношение паренхимы и стромы миокарда кроликов при атеросклеротическом кардиосклерозе // Бюллетень экспериментальной биологии. - 1977. - №8. - С. 247-250; Морфометрия сердца в норме / Г.С. Кирьякулов, Н.И. Яблучанский, В.Е. Шляховер и др. - Киев: Вища школа, 1990. - 152 с.; Morphometry of human myocardium in senile individuals / J.A. Cardoso, A.E. Toscano, T. Tashiro et al. // Arq Bras Cardiol. - 2006. - Vol. 86, №5. - P. 374-377]. Соединительнотканный межклеточный матрикс у глубоконедоношенных новорожденных содержит сеть макромолекулярных волокон, поддерживающих кардиомиоциты. Он имеет сложную пространственную организацию, которая в значительной степени определяет структурную и функциональную целостность сердечной мышцы [Горбунов А.А. Соединительнотканный компонент миокарда: новый этап изучения давней проблемы // Морфологiя. - 2007. - №4(1). - С. 6-12]. Соединительнотканная строма, жировая ткань у плодов и новорожденных 22-27 недельного гестационного возраста развиты очень слабо [Волкова О.В., Пекарский М.И. Эмбриогенез и возрастная гистология внутренних органов человека. - М.: Медицина, 1976. - 462 с.; Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. Гистология, эмбриология, цитология: учебник. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 800 с.; Виноградова И.В., Краснов М.В. Постнатальная адаптация сердечно-сосудистой системы у новорожденных с экстремально низкой массой тела // Вестник Чувашского университета. - 2010. - №3. - С. 63-69.] Изложенные выше структурные особенности миокарда носят описательный характер, не содержат количественных и качественных характеристик, позволяющих оценить гестационную зрелость миокарда у недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель.
Техническим решением заявляемого способа является морфологическая диагностика гестационной зрелости миокарда у недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель.
Технический результат достигается путем определения индекса экспрессии сердечного тропонина Т в миокарде левого желудочка недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель, и при его значении в пределах от 0,93 до 1,62 условных единиц структура миокарда соответствует 22-24 неделям гестации, а при значении в пределах от 1,63 до 1,71 условных единиц - 25-27 неделям гестации.
Проведено морфологическое исследование 30 сердец недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель. Физическое развитие новорожденных соответствовало сроку гестации, у всех новорожденных определялся нормотрофический тип соматического развития. Все новорожденные умерли в раннем неонатальном периоде. В качестве основной причины смерти у них диагностирована асфиксия новорожденного, обусловленная острым нарушением маточно-плацентарного кровообращения. В единичных случаях причиной смерти были внутрижелудочковые кровоизлияния II степени и врожденная пневмония. Из обследования исключались дети с врожденными пороками сердца и сосудов, миокардитом, хронической внутриутробной гипоксией. В результате проведенного иммуногистохимического исследования с количественной оценкой экспрессии сердечного тропонина Т определены нормативные значения индекса экспрессии сердечного тропонина Т: от 0,93 до 1,62 условных единиц у новорожденных со сроком гестации 22-24 недели, и от 1,63 до 1,71 условных единиц у новорожденных со сроком гестации 25-27 недель.
Способ осуществляется следующим образом: после макроскопического исследования сердца, из средней трети передней стенки левого желудочка иссекается фрагмент миокарда размерами 10,0×6,0×3,0 мм. Материал забирают не позднее 30 минут от момента констатации биологической смерти и фиксируют в 10% забуференном формалине в течение 12-24 часов [Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань: Титул, 2004. - 456 с.]. Иммуногистохимическое исследование проводят на парафиновых срезах, толщиной 4-5 микрон. После депарафинации микропрепаратов осуществляют демаскировку антигена путем двукратного кипячения в цитратном буфере по 5 минут в СВЧ-печи при мощности 650 вт. Эндогенную пероксидазу блокируют 1% раствором перекиси водорода с последовательной инкубацией во влажной камере с первичными и биотинилированными вторичными антителами. В промежутках между инкубацией срезы промывают в трех сменах фосфатного буфера, в качестве первичных антител используют кроличьи моноклональные антитела к сердечному тропонину Т фирмы «Biorbyt» в рабочем разведении 1:800.
Визуализация комплексов антиген-антитело осуществляется при помощи системы детекции Ultra Vision Quanto Detection System HRP («Thermo scientific», USA). Далее срезы окрашивают DAB-хромогеном, докрашивают гематоксилином Майера. С целью исключения вероятности получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов каждое иммуногистохимическое исследование проводят с постановкой положительного и отрицательного контроля. Отрицательный контроль исключал специфическое окрашивание препаратов. Положительный контроль подтверждал специфичность поставленной иммуногистохимической реакции с данными антителами.
Результаты иммуногистохимической реакции оценивают в 10 полях зрения микроскопа, в 100 клетках препарата при увеличении ×400. Для количественной оценки экспрессии сердечного тропонина Т определялся индекс экспрессии данного белка по формуле
Индекс экспрессии = ∑P(i)⋅i/100 условные единицы,
где i - интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3;
P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.
[Pathology of the Breast / F.A. Tavassoli et al. - Stamford: Appleton-Lange, 1999].
Результат рассчитывают в условных единицах.
Новизна изобретения заключается в том, что впервые предлагается диагностика гестационной зрелости миокарда у недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недели, по определению содержания в миокарде сердечного тропонина Т. Сердечный тропонин Т входит в состав тропонинового комплекса, являющегося одним из ключевых белков-регуляторов сердечных сокращений. В сердечной мышце взрослого человека тропонин Т представлен уникальными изоформами, которые не экспрессируются в других тканях. Доказано, что в кардиомиоцитах экспрессируется исключительно сердечная форма тропонина Т. [Troponin Т isoform expression in humans. A comparison among normal and failing adult heart, fetal heart, and adult and fetal skeletal muscle / P.A. Anderson, N.N. Malouf, A.E. Oakeley et al. // Circ Res. - 1991. - Vol. 69, №5. - P. 1226-1233]. Экспрессия эмбриональной изоформы тропонина Т усиливает максимальную силу сокращений миофибрилл и чувствительность миоцитов к ионам кальцияа [Cardiac troponin Т isoforms affect the Ca(2+) sensitivity of force development in the presence of slow skeletal troponin I: insights into the role of troponin T isoforms in the fetal heart / A.V. Gomes, G. Venkatraman, J.P. Davis et al. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279, №48. - P. 49579-49587].
По результатам ранее проведенных исследований доказано, что сердечный тропонин Т является специфичным и чувствительным маркером ишемического повреждения клеток миокарда как у взрослых, так и у детей [Revision of the troponin T release mechanism from damaged human myocardium / K. Starnberg, A. Jeppsson, B. Lindahl, O. Hammarsten // Clin Chem. - 2014. - Vol. 60, №8. - P. 1098-1104; Cardiac troponin in ischemic cardiomyocytes: intracellular decrease before onset of cell death / A.S. Streng, L.H. Jacobs, R.W. Schwenk et al. // Exp. Mol. Pathol. - 2014. - Vol. 96, №3. - P. 339-345]. Так, изоформы сердечного тропонина Т используют для диагностики патологии сердца, связанной с некрозом кардиомиоцитов. При инфаркте миокарда, внезапной сердечной смерти и травматических повреждениях миокарда диагностируется увеличение данного белка в крови [Картуха И.А. Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции // Успехи биологической химии. - 2013. - Т. 53. - С. 149-194].
В доступной литературе отсутствуют данные о гестационной динамике изменения содержания сердечного тропонина Т и об использовании данного белка в качестве диагностического маркера гестационной зрелости миокарда у новорожденных, в том числе у недоношенных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель.
Отличительные признаки способа.
У недоношенных новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель, определяют индекс экспрессии сердечного тропонина Т  в биоматериале, представляющем собой миокард левого желудочка, по формуле:
Индекс экспрессии = ΣP(i)•i/100 условные единицы,
где i - интенсивность окрашивания иммуногистохимической реакции срезов миокарда  из средней трети передней стенки левого желудочка, оцененной в 10 полях зрения микроскопа в 100 клетках препарата при увеличении 400, выражена в баллах от 0 до 3;
P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью,
и при значении индекса экспрессии сердечного тропонина Т в миокарде левого желудочка в пределах от 0,93 до 1,62 условных единиц структура миокарда соответствует 22-24 неделям гестации, а при значении в пределах от 1,63 до 1,71 условных единиц - 25-27 неделям гестации, причем биоматериал забирают не позднее 30 минут от момента констатации биологической смерти
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Новорожденный мальчик от III беременности, III оперативных родов в сроке 24 недели. Беременность осложнилась преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты. Новорожденный по антропометрическим параметрам (масса - 655 г, теменно-пяточная длина - 34 см, теменно-копчиковая длина - 22,3 см и длина стопы - 4,7 см) соответствовал 24 неделям гестации. Через 18 часов после рождения ребенок умер. Основной причиной смерти явилась тяжелая асфиксия, которая развилась в результате острого нарушения маточно-плацентарного кровообращения. Согласно предложенному способу, после смерти новорожденного на гистологических срезах миокарда при иммуногистохимическом исследовании определен индекс экспрессии сердечного тропонина Т, который составил 1,38 условных единиц, что по заявленному способу соответствует 22-24 недели гестации.
Заключение: соответствие структуры миокарда гестационному возрасту.
Пример 2.
Новорожденная девочка от II беременности I преждевременных родов в сроке 27 недель по антропометрическим параметрам (масса - 980,0 г, теменно-пяточная длина - 35 см и длина стопы - 5,7 см) соответствовала 27 неделям гестации. Ребенок умер на 3 сутки жизни. Основной причиной смерти явилась двусторонняя интерстициальная пневмония смешанной вирусно-бактериальной этиологии. Согласно предложенному способу был определен индекс экспрессии сердечного тропонина Т, который составил 1,57 условных единиц, что по заявленному способу соответствует 22-24 неделям гестации.
Заключение: задержка тканевой дифференцировки миокарда.
Пример 3.
Новорожденный мальчик от I беременности, I преждевременных родов в сроке 25 недель. Беременность осложнилась дородовым излитием околоплодных вод. Новорожденный по весовым параметрам (масса - 597,3 г) соответствовал 23 неделям гестации, а по линейным показателям (теменно-пяточная длина - 34,9 см, теменно-копчиковый размер - 23,2 см и длина стопы - 5,6 см) - 26 неделям гестации. Смерть ребенка наступила на 5 сутки жизни. Основной причиной смерти явилось двухстороннее внутрижелудочковое кровоизлияние II степени.
Согласно предложенному способу был определен индекс экспрессии сердечного тропонина Т, составивший 1,64 условных единиц, что соответствует 25-27 неделям гестации.
Заключение: соответствие структуры миокарда гестационному возрасту.
Преимущества предлагаемого способа.
1. Является объективным, высокоинформативным и достоверным методом морфологической диагностики, позволяющим оценить на молекулярном уровне гестационную зрелость миокарда у новорожденных, родившихся в сроке гестации 22-27 недель.
2. Способ повышает качество гистологического заключения при морфологическом исследовании сердца.
3. Способ прост в оценке результатов, для его осуществления не требуется дорогостоящего оборудования.