Фармацевтическая композиция на основе альфа-метил-п-тирозина и способ ранней диагностики болезни Паркинсона
PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED ON ALPHA-METHYL-P-TYROSINE AND A METHOD FOR EARLY DIAGNOSIS OF PARKINSON'S DISEASE

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, диагностики нейродегенеративных заболеваний, и может использоваться для диагностики болезни Паркинсона, на досимптомной (доклинической или продромальной) стадии.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Нейродегенеративные заболевания представляют собой группу хронических заболеваний, при которых погибают специфические нейроны центральной нервной системы. К таким заболеваниям относятся болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона, гиперпролактинемия и ряд других нервных и психических болезней. Со временем число больных, страдающих нейродегенеративными заболеваниями вообще и болезнью Паркинсона, в частности, быстро увеличивается, что обусловлено увеличением продолжительности жизни населения в развитых странах, повышением загрязнения окружающей среды и, по пока неясным причинам, «омоложением заболеваний». Так, если в настоящее время болезнью Паркинсона в мире страдают 16 млн. человек, причем 5 млн. из них приходится на европейские страны и Россию, то к 2040 году, по данным Всемирной организации здравоохранения, число больных болезнью Паркинсона удвоится. В России число больных, страдающих болезнью Паркинсона, достигает 200 человек на 100 тысяч населения.
При болезни Паркинсона нарушается двигательная функция, в первую очередь произвольные движения конечностей, за счет появления непроизвольных движений - тремора (дрожания) и/или ригидности (скованности). Лечение и реабилитация больных ложатся тяжелым морально-психологическим и финансовым бременем не только на самих больных, но и на их ближайшее окружение и общество в целом. Так, в США только прямые затраты на лечение и реабилитацию одного больного, страдающего БП, достигают 25 тыс. долларов в год, а ежегодные затраты на всех больных превышают 60 млрд. долларов. Аналогичные исследования были проведены в Европе, Китае и других странах мира. Несмотря на огромные инвестиции в разработку новых способов лечения и реабилитацию больных, нейродегенеративные заболевания относятся к категории неизлечимых болезней мозга, и до сих пор в мире ни одного больного не было вылечено.
Болезнь Паркинсона диагностируется только через много лет после начала патологического процесса при гибели большей части нигростриатных дофаминергических нейронов и истощении компенсаторных резервов мозга, т.е. на фоне почти полного отсутствия мишеней к фармакотерапии. Этим и объясняют низкую эффективность существующего лечения. Поэтому в последние годы внимание ученых, как в России, так и в других развитых странах сосредоточено на разработке ранней диагностики болезни Паркинсона - задолго до появления моторных симптомов - на так называемой досимптомной стадии, условно объединяющей доклиническую и продромальную стадии заболевания. Успешная разработка ранней диагностики болезни Паркинсона, как и других нейродегенеративных заболеваний, позволила бы начать лечение больных с помощью нейропротекторов на ранней стадии заболевания, что приведет, если не к остановке, то к замедлению гибели специфических нейронов и к значительному продлению бессимптомной стадии, возможно, до конца жизни больного.
В настоящее время разработаны методы диагностирования нейродегенеративных заболеваний на досимптомной стадии с помощью не инвазивных нейровизуализационных методов - позитронно-эмиссионной томографии и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии. Эти методы позволяют оценить функциональное состояние специфических нейронов и уровень нейротоксинов в строго определенных отделах мозга, деградация которых приводит к развитию нейродегенеративных заболеваний (De Kosky, S.T. Looking backward to move forward: early detection of neurodegenerative disorders / S.T. De Kosky, K. Marek // Science. - 2003. - Vol. 302. - P. 830-834). Для этого используют специфичные или относительно специфичные коротко живущие радиоактивно меченные молекулярные маркеры. К специфичным маркерам болезни Паркинсона относятся: предшественник синтеза дофамина, лиганды дофаминового транспортера и рецепторы к дофамину. Постепенное снижение функциональной активности нейронов, регистрируемое по специфичным маркерам, и накопление патологических белков, регистрируемое по относительно специфичным маркерам, могут рассматриваться как убедительное доказательство развития нейродегенеративного заболевания.
Однако учитывая необходимость больших финансовых затрат на приобретение и эксплуатацию оборудования для позитронно-эмиссионной томографии и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии, создания специальных технических условий для их использования (радиохимическая лаборатория, циклотрон и др.), очевидно, что неинвазивные нейровизуализационные методы даже в самых развитых и богатых странах не могут быть использованы при диспансеризации здорового населения, а доступны для обследования лишь ограниченного числа людей.
Из вышеизложенного следует необходимость разработки альтернативной методологии диагностики нейродегенеративных заболеваний на досимптомной стадии - специфической и легкодоступной по организационным и финансовым показателям.
Последнее время в лаборатории авторов ведутся работы по адаптации методологии так называемых провокационных или нагрузочных тестов для разработки доклинической диагностики хронических заболеваний мозга. Такие провокационные тесты (фармакологические и т.п.) давно и широко применяются во всех ветвях терапии для диагностирования хронических заболеваний внутренних органов (Witek, P. The role of combined low-dose dexamethasone suppression test and desmopressin stimulation test in the diagnosis of persistent Cushing's disease. Case report / P. Witek [et al.] // Endokrynol Pol. - 2010. - Vol. 61. - N 3. - P. 312-317; Gasco, V. Acylated ghrelin as a provocative test for the diagnosis of GH deficiency in adults / V. Gasco [et al.] // Eur J Endocrinol. - 2012. - Vol. 168. - N 1. - P. 23-30; Hermann, S. Preclinical research. Seal of approval translational medicine / S. Herman, B. Pichler, J. Kotzerke // Nuklearmedizin. - 2013. - Vol. 52. - N 6. - P. 53-54).
Методы с использованием провокационного или нагрузочного теста позволяют выявить скрытую патологию органа за счет обратимого кратковременного повышения его функциональной недостаточности. Это приводит к кратковременному проявлению характерных симптомов у людей с патологией, но никак не влияет на людей в норме.
Один из таких методов раскрывается в патенте Российской Федерации №2318437, который является наиболее близким аналогом настоящего изобретения. В указанном патенте заявляется способ доклинической диагностики болезни Паркинсона, суть которого заключается в том, что при проведении провокационного теста пациенту вводят в кровь α-метил-п-тирозин (аМПТ), а затем определяют у него наличие/отсутствие тремора и/или мышечной ригидности. Однако недостатком данного способа является большое количество противопоказаний, поскольку системное введение α-метил-п-тирозина в высокой дозе имитирует десимпатизацию внутренних органов, вызывая нарушение функций сердечно-сосудистой и других систем органов.
Следовательно, в неврологии сохраняется потребность в новых более безопасных, эффективных и универсальных способах ранней диагностики болезни Паркинсона.
Раскрытие настоящего изобретения
Таким образом, настоящее изобретение направлено на создание лекарственного средства на основе производного тирозина для интраназального введения, которое можно безопасно использовать для провокационного теста у подавляющего большинства пациентов, а также на создание способа ранней диагностики болезни Паркинсона с применением провокационного теста на основе указанного лекарственного средства.
Болезнь Паркинсона длительное время развивается в скрытой, асимптомной форме, характеризующейся частичной деградацией нигростриатной системы - ключевого отдела мозга, регулирующего моторную функцию. Происходит сильное снижение уровня нейромедиатора дофамина, при котором, однако, уровень дофамина еще не достигает порога, при котором возникает моторная симптоматика - 20-30% от нормы. Альфа-метил-п-тирозин является обратимым неметаболизируемым ингибитором синтеза дофамина, поэтому его введение вызывает кратковременное усугубление функциональной недостаточности деградирующей нигростриатной системы, т.е. еще более сильное падение уровня дофамина в стриатуме. У людей со скрытой формой болезни Паркинсона это провоцирует кратковременное появление характерной моторной симптоматики, позволяющее поставить диагноз. Таким образом, суть предлагаемого способа для ранней диагностики болезни Паркинсона состоит в обратимом кратковременном усилении функциональной недостаточности деградирующей регуляторной системы до порога, при котором кратковременно проявляется специфическая симптоматика у людей в латентной фазе заболевания, но не у испытуемых в контроле, т.е. людей с нормальным содержанием дофамина в стриатуме.
В соответствии с настоящим изобретением в качестве провокационного средства используют лекарственное средство, представляющее собой производное тирозина - альфа-метил-п-тирозина в форме, пригодной для интраназального введения, например, в виде гидрохлорида метилового эфира, иммобилизованного в объеме гидрогелевой полимерной системы в качестве мукоадгезивного носителя на основе синтетических полимерных гелей. Таким образом, особенностью предлагаемого провокационного средства является строго дозированное и локализованное интраназальное введение данного лекарственного средства, обеспечивающее направленное воздействие на нигростриатную систему с минимальными системными эффектами.
Гидрогель хорошо известен как вещество, подходящее для использования в качестве матрицы для регулируемого высвобождения лекарственных средств (N.A. Pappas Ed., "Hydrogels in Medicine and Pharmacy, Vol. 11; Polymers", CRC Press, Inc., 1987).
Также в соответствии с настоящим изобретением для приготовления фармацевтической композиции может быть использован любой другой фармацевтически приемлемый носитель. Для интраназального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты. Одним из наиболее распространенных и часто используемых носителей является физиологический раствор.
Гелевый носитель может обладать некоторым дополнительным преимуществом перед прочими вариантами, поскольку нанесение аМПТ в геле на слизистую оболочку носовой полости способно предотвратить стекание части введенного средства, обеспечивая тем самым повышенную точность дозирования и избирательность доставки аМПТ в головной мозг.
На предварительном этапе работы была получена нейротоксическая модель досимптомного паркинсонизма у мышей, воспроизводящая доклиническую продромальную стадию болезни Паркинсона. Адекватность использованной животной модели патогенезу этого заболевания у людей была ранее проверена по ряду ключевых параметров: наличию/отсутствию моторных нарушений, степени нейродегенерации в нигростриатной системе, уровню снижения дофамина в стриатуме, изменению экспрессии ключевых генов метаболизма дофамина, соответствию периферических изменений и т.д. (Ugrumov, M.V. Modeling of presymptomatic and symptomatic stages of parkinsonism in mice / M.V. Ugrumov [et al.] // Neuroscience. - 2011. - Vol. 181. - P. 175-188; Kozina, E.A. Tyrosine hydroxylase expression and activity in nigrostriatal dopaminergic neurons of MPTP-treated mice at the presymptomatic and symptomatic stages of parkinsonism / E.A. Kozina [et al.] // J Neurol Sci. - 2014. - Vol. 340. - P. 198-207; Mingazov, E.R. MPTP mouse model of preclinical and clinical Parkinson's disease as an instrument for translational medicine / E.R. Mingazov [et al.] // Mol Neurobiol. - 2018. - Vol. 55. - P. 2991-3006; Kim, A.R. Upgraded methodology for the development of early diagnosis of Parkinson's disease based on searching blood markers in patients and experimental models / A.R. Kim [et al.] // Mol Neurobiol. - 2018. - doi: 10.1007/s 12035-018-1315-2).
Описанный альфа-метил-п-тирозин в форме, пригодной для интраназального введения, используют в заявленном способе ранней диагностики болезни Паркинсона в качестве провокационного средства, действие которого направлено на кратковременное снижение уровня дофамина в стриатуме на досимптомной стадии, т.е. при отсутствии нарушений двигательной функции, до порога, при котором эти нарушения кратковременно проявляются.
Для этого пациента предварительно обследуют на предмет отсутствия моторных нарушений и наличия немоторных предвестников болезни Паркинсона. При этом учитывают следующие такие признаки-предвестники, как замедленная походка, сгорбленность, тихая речь, бедная мимика, ухудшение почерка, депрессия, чувство тревоги, утомляемость, запоры, нарушения сна, обоняния и терморегуляции, ортостатическая гипотония, ослабление потенции и, наконец, болевая симптоматика, которая обычно ошибочно принимается за дисфункционально-болевой мышечно-лицевой синдром, радикулопатии или периферические нейропатии и т.п.
Затем пациенту вводят от 1 до 4 граммов препарата альфа-метил-п-тирозина. Максимально эффективную адресную доставку в головной мозг обеспечивают путем интраназального введения этого препарата на слизистую оболочку носовой полости в проекции решетчатой кости, откуда возможна его диффузия вдоль черепно-мозговых нервов в головной мозг.
После введения альфа-метил-п-тирозина осуществляют мониторинг изменения состояния пациента, которое может иметь место в результате снижения содержания дофамина в стриатуме. Оценка состояния пациента производится квалифицированным врачом-неврологом, а весь мониторинг может осуществляться в течение 3-12 часов.
При обнаружении симптомов моторных нарушений у испытуемого ставят диагноз ранней стадии болезни Паркинсона.
Итак, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей альфа-метил-п-тирозин или его фармацевтически приемлемое производное и фармацевтически приемлемый носитель, предназначенной для интраназального введения в качестве провокационного средства для проведения ранней диагностики болезни Паркинсона.
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемое производное» относится к фармацевтическим солям, эфирам и другим производным, которые с медицинской точки зрения подходят для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения и аллергической реакции и с соблюдением разумного соотношения пользы и риска. Фармацевтически приемлемые производные хорошо известны в уровне техники.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемое производное альфа-метил-п-тирозина представляет собой соль и/или эфир.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемое производное альфа-метил-п-тирозина представляет собой гидрохлорид метилового эфира альфа-метил-п-тирозина.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой гель.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый гелевый носитель представляет собой гидрогель.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой физиологический раствор или стерильную воду.
Также настоящее изобретение относится к способу ранней диагностики болезни Паркинсона, предусматривающему
а) предварительное обследование пациента на предмет отсутствия моторных нарушений и наличия немоторных предвестников болезни Паркинсона;
б) интраназальное введение пациенту указанной выше фармацевтической композиции; и
в) осуществление мониторинга состояния пациента;
причем при обнаружении у пациента симптомов моторных нарушений на стадии в) ставят диагноз ранней стадии болезни Паркинсона.
Далее настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами осуществления.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 проиллюстрированы двигательная активность и уровень дофамина в стриатуме у контрольных мышей, получавших чистый гель интраназально (NaCl-гель), контрольных мышей, получавших 1 мг гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, иммобилизованного в 16 мкл гидрогеля (NaCl-аМПТ), мышей с моделью досимптомной стадии паркинсонизма, получавших чистый гель (МФТП-гель) и мышей с моделью досимптомной стадии паркинсонизма, получавших 1 мг гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина. иммобилизованного в 16 мкл гидрогеля (МФТП-аМПТ). Данные представлены в процентах от значений группы NaCl-гель. * р<0,05 по сравнению с NaCl-гель или между выбранными группами. Пунктиром обозначен пороговый уровень дофамина, при котором проявляются моторные нарушения.
На фиг. 2 показана концентрация гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина (аМПТ) в плазме крови мышей через 5, 10, 15 и 30 минут, а также 1, 3, 5 и 7 часов после внутривенного введения 1 мг гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина и интраназального введения 1 мг гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, иммобилизованного в 16 мкл гидрогеля.
На фиг. 3 показан уровень дофамина в стриатуме у мышей, получавших интраназально 0,8 мг альфа-метил-п-тирозина (аМПТ) в виде раствора гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина или 1 мг в виде гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, иммобилизованного в 16 мкл гидрогеля. Данные представлены в процентах от контроля. * р<0,05 по сравнению с контролем.
Примеры осуществления настоящего изобретения
Пример 1. Приготовление фармацевтической композиции согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения.
Гидрогелевый полимерный носитель представляет собой способный к обратимой сорбции различных, в том числе и биологически активных соединений, набухший в воде для инъекций слабо-сшитый полимер акриламида. Иммобилизация субстанции носителем осуществляется физически, то есть без образования химических связей.
Процесс получения провокационной фармацевтической композиции предусматривал следующие стадии:
1) осуществление полимеризации;
2) промывание геля; и
3) получение гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина в гидрогелевой полимерной системе.
На первой стадии осуществляли синтез полимерного геля путем радикальной полимеризации гидрофильного мономера акриламида, при этом в качестве сшивающего агента использовали N,N-метилен-бис-акриламид в соответствии с представленной ниже схемой.
Схема синтеза полимерного геля
В качестве инициатора использовали окислительно-восстановительную систему персульфат аммония - N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин. Реакцию полимеризации проводили при температуре 25-30°С и атмосферном давлении.
Для промывания полученный полимер помещали в диализные мешки и очищали до полного удаления непрореагировавших мономеров диализом до тех пор, пока значение оптической плотности промывных вод, измеренное при 200 нм, не станет ниже 0,002. Осуществляли дополнительный контроль полноты отмывки гелей методом ИК-Фурье спектроскопии. Гравиметрически определяли содержание полимера. Гравиметрический метод анализа основан на точном измерении массы вещества, выделенного в виде соединения известного состава. Пробу гидрогеля (1±0,001) г взвешивали на аналитических весах, высушивали до постоянной массы в сушильном шкафу и определяли содержание полимера в навеске по формуле:
2
1
(m/m) × 100%,
1
2
где m - масса исходной навески; m - масса высушенной навески.
Гидрохлорид метилового эфира альфа-метил-п-тирозина в гидрогелевой полимерной системе получали смешиванием отмытого полимерного геля с заданной массой гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, после чего смесь обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 10 минут. Полученное средство разливали в стеклянные флаконы, которые закупоривали металлическими крышками.
Пример 2. Альфа-метил-п-тирозин провоцирует моторные нарушения на модели досимптомного паркинсонизма, но не у контрольных мышей.
Было получено экспериментальное подтверждение, что альфа-метил-п-тирозин в виде раствора гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, иммобилизованного в гидрогелевом полимерном носителе, будет провоцировать моторные нарушения на модели досимптомного паркинсонизма, но не у контрольных мышей. В работе использовали самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяцев и массой 22-26 г, которых содержали в стандартных условиях вивария (22±1°С, свет с 8.00 часов до 20.00 часов) со свободным доступом к пище и воде. Модель досимптомного паркинсонизма воспроизводили однократным подкожным введением 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) (Sigma, США) в разовой дозе 18 мг/кг. Животные контрольных групп получали 0,9% NaCl.
Через 1 неделю после введения МФТП, животных с моделью досимптомного паркинсонизма делили на 2 группы, одна из которых получала интраназально 1 мг гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, иммобилизованного в 16 мкл гидрогеля, а вторая - аналогичный объем чистого гидрогеля. Животным контрольных (NaCl) групп также осуществляли аналогичное интраназальное введение гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина и чистого гидрогеля, соответственно. Через 5 часов после интраназального введения оценивали двигательную активность мышей по общему пройденному пути в тесте «Открытое поле». Далее животных декапитировали, выделяли стриатум и оценивали в нем содержание дофамина с помощью высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимической детекцией. Результаты поведенческого теста и биохимического анализа представлены на фиг. 1.
Таким образом, было показано, что интраназальное введение 1 мг альфа-метил-п-тирозина в виде гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, иммобилизованного в гидрогелевом полимерном носителе, вызывает моторные нарушения у мышей с моделью досимптомной стадии паркинсонизма, но не у контрольных мышей. При этом, наблюдаемые моторные нарушения связаны со снижением концентрации дофамина в стриатуме мышей с паркинсонизмом ниже порога в 30% от контрольного уровня.
Пример 3. Сравнение интраназального и внутривенного способов введения провокационного агента.
Интактные мыши получали инъекцию 1 мг альфа-метил-п-тирозина в растворимой форме гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина в хвостовую вену, либо 1 мг гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина. иммобилизованного в 16 мкл гидрогеля, интраназально. Препарат для интраназального введения приготавливали согласно способу, описанному в примере 1.
Через 5, 10, 15 и 30 минут, а также 1, 3, 5 и 7 часов после внутривенного или интраназального введения препарата животных декапитировали, собирали плазму крови и оценивали в ней концентрацию гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина с помощью ВЭЖХ с детекцией нативной флуоресценции. Результаты анализа представлены на фиг. 2.
Таким образом, в этом эксперименте было показано, что при интраназальном введении провокационного агента, в отличие от внутривенного, концентрация гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина в плазме крови находится на неопределяемом уровне, т.е. практически отсутствует его поступление в общую систему циркуляции. Соответственно, заявленный интраназальный способ введения является более безопасным по сравнению с системным введением, с точки зрения развития нежелательных побочных эффектов, связанных с ингибированием синтеза дофамина на периферии.
Пример 4. Сравнение различных способов интраназального введения альфа-метил-п-тирозина.
Интактные мыши получали интраназально 0,8 мг альфа-метил-п-тирозина в виде раствора гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина или 1 мг в виде гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, иммобилизованного в 16 мкл гидрогеля. Гидрогель для интраназального введения приготавливался согласно способу, описанному в примере 1.
Через 5 после интраназального введения препарата животных декапитировали, выделяли стриатум и оценивали в нем концентрацию дофамина с помощью ВЭЖХ с электрохимической детекцией. Результаты анализа представлены на фиг. 3.
Итак, было показано, что альфа-метил-п-тирозин при интраназальном введении снижает уровень дофамина в стриатуме как при введении в виде раствора гидрохлорида метилового эфира альфа-метил-п-тирозина, так и при использовании гидрогеля-носителя.
Таким образом, предложенные композиция и способ обеспечивают эффективное и безопасное проведение провокационного теста для ранней диагностики болезни Паркинсона в самых широких слоях населения, позволяют минимизировать поступление провокационного средства в общую систему циркуляции и воздействие на периферическую нервную систему и внутренние органы, что сводит к минимуму риски побочных эффектов. Кроме того, важными преимуществами предложенного средства и способа являются их высокая специфичность и низкая себестоимость.