СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ siRNA В КЛЕТКИ ФОТОХИМИЧЕСКОЙ ИНТЕРНАЛИЗАЦИЕЙ

1. Способ введения молекулы siRNA в цитозоль клетки, где указанный способ включает:
i) контактирование указанной клетки с молекулой siRNA, носителем и фотосенсибилизирующим веществом, и
ii) облучение клетки светом с длиной волны, эффективной для активации фотосенсибилизирующего вещества,
где указанный носитель содержит катионный полиамин, выбранный из
(a) липополиамина в нелипосомальном составе,
n
(b) полиэтиленимина (PEI), имеющего молекулярный вес менее чем 50 кДа, и предпочтительно величину M 500-20000 по GPC,
(c) полимера бетациклодекстринамина формулы
где X представляет собой целое число от 1 до 100, включительно, и n представляет собой целое число от 4 до 10, включительно,
(d) дендримера, содержащего группу амина, и
(e) катионного пептида.
2. Способ по п.1, где липополиамин содержит группы первичных или вторичных аминов, или их смесь.
3. Способ по п.1, где часть полиамина в липополиамине имеет по меньшей мере 2 атома азота и заряд по меньшей мере +1 при физиологических значениях pH.
4. Способ по п.1, где по меньшей мере одна содержащая азот группа указанного носителя является незаряженной при физиологических значениях pH.
5. Способ по п.4, где значение pKa, при котором последний амин липополиамина является протонированным, меньше или равно 5,5.
6. Способ по п.1, где часть полиамина в липополиамине имеет формулу (I)
в которой m представляет собой целое число, превышающее или равное 2, и n представляет собой целое число, превышающее или равное 1, где m может быть одинаковым или может отличаться, когда оно встречается в указанной формуле,
1
в каждом положении R представляет собой водород или соединительную группу для липо-части липополиамина, или саму липо-часть, и он может быть одинаковым или может отличаться в каждом атоме углерода,
2
1
2
1
2
R представляет собой водород или соединительную группу для липо-части липополиамина или саму липо-часть, где только один из R и R представляет собой соединительную группу для липо-части липополиамина или саму липо-часть, и где, когда R или R представляет собой соединительную группу, присоединенную к указанной липо-части, или саму липо-часть, формула (I) представляет собой указанный липополиамин.
7. Способ по п.6, где m составляет между 2 и 6, включительно, и n составляет между 1 и 5.
8. Способ по п.7, где n представляет собой 3.
2
9. Способ по п.6, где R представляет собой H.
10. Способ по п.6, где часть полиамина соответствует следующей формуле
1a
1j
1
где от R до R являются такими, как R, определенный в п.7.
1a
1
11. Способ по п.10, где R представляет собой соединительную группу и остальные группы R представляют собой водород.
1
2
12. Способ по п.6, где R или R представляют собой атом водорода или радикал общей формулы II:
3
4
p
2p+2
p
2p
p
2p-2
в которой каждый R и R, которые могут быть идентичными или могут отличаться, представляет собой насыщенный алифатический радикал C H или ненасыщенный алифатический радикал C H или C H, причем p представляет собой целое число между 12 и 22, включительно, и
5
R представляет собой атом водорода или алкильный радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, необязательно замещенных фенильным радикалом,
1
2
при условии, что только один из R и R может представлять собой радикал общей формулы (II).
1
2
13. Способ по п.6, где каждый R и R представляет собой атом водорода или радикал общей формулы III:
2
p'
2p'+2
p'
2p'
p'
2p'-2
6
7
в которой X представляет собой группу метилена (-CH-) или карбонильную группу (-CO-), и каждый R и R, которые могут быть идентичными или могут отличаться, представляет собой насыщенный алифатический радикал CH или ненасыщенный алифатический радикал CH или CH, и p' представляет собой целое число между 11 и 21, включительно,
1
2
при условии, что только один из R и R может представлять собой радикал общей формулы (III).
14. Способ по п.6, где n представляет собой целое число между 2 и 5, включительно, и значения m в различных фрагментах
являются идентичными.
15. Способ по п.6, где n составляет между 2 и 5, включительно, и значения m в различных фрагментах
отличаются.
16. Способ по п.6, где n равно 3 и значения m во фрагментах
1
2
являются идентичными или отличаются и составляют 3 или 4, и либо R, либо R представляет собой:
3
4
5
(i) радикал общей формулы (II), в котором каждый R и R представляет собой алкильный радикал, содержащий от 12 до 22 атомов углерода, и R представляет собой атом водорода, или
6
7
(ii) радикал общей формулы (III), в котором каждый R-X- и R-X- представляет собой алканоильный радикал, содержащий от 12 до 22 атомов углерода.
17. Способ по п.1, где липофильная часть указанного липополиамина представляет собой любую насыщенную или ненасыщенную углеводородную цепь, холестерин или другой стероид, природный липид или синтетический липид, способный образовывать ламеллярную или гексагональную фазы.
18. Способ по п.17, где длина углеводородной цепи составляет от 10 до 30 атомов углерода.
19. Способ по п.1, где липополиамин выбран из 5-карбоксиспермилглициндиоктадециламида (DOGS), 5-карбоксиспермиламида дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPES), трифторацетата 2,3-диолеилокси-N-[2-сперминкарбоксииламидо]этил-N,N-диметил-1-пропанаминия (DOS PA), 1,3-диолеилокси-2-(6-карбоксиспермина) (DOSPER) и RPR-120535.
20. Способ по п.1, где липополиамин выбран из 5-карбоксиспермилглициндиоктадециламида (DOGS) и 5-карбоксиспермиламида дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPES).
TM
TM
21. Способ по п.1, где носитель представляет собой JetSI или JetSI-ENDO или Transfectam.
22. Способ по п.1, где указанная молекула носителя представляет собой разветвленную молекулу PEI.
23. Способ по п.22, где молекулярная масса PEI составляет менее 50 кДа, предпочтительно менее 25 кДа.
24. Способ по п.1, где указанная молекула носителя представляет собой молекулу дендримера PAMAM, предпочтительно молекулу дендримера PAMAM поколения 2-6.
25. Способ по п.1, где указанная молекула носителя представляет собой поли-L-лизин, поли-D-лизин, полигистидин, полиаргинин, гистидинилированный полилизин и полиорнитин или сополимер L или D лизина, L или D аргинина, L или D гистидина и/или остатков орнитина с одной или несколькими другими аминокислотами.
26. Способ по п.1, где длина молекулы siRNA составляет 12-28 нуклеотидов.
27. Способ по п.1, где указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего.
4
2a
2a
2a
28. Способ по п.1, где фотосенсибилизирующее вещество выбрано из порфирина, фталоцианина, пурпурина, хлорина, бензопорфирина, лизосомотропного слабого основания, нафталоцианина, катионного красителя, тетрациклина, 5-аминолевулиновой кислоты и/или ее сложных эфиров, или производного любого из указанных веществ, предпочтительно TPPS, TPPS, AlPcS, TPCS, 5-аминолевулиновой кислоты или сложных эфиров 5-аминолевулиновых кислот, или их фармацевтически приемлемых солей.
29. Способ по п.1, далее включающий дополнительную стадию контактирования указанной siRNA с указанным носителем.
30. Способ по п.1, где молекула siRNA и молекула носителя контактируют друг с другом в течение 20-40 мин перед контактированием с клеткой.
31. Способ по п.1, где для трансфекции используют 10 нМ-200 нМ siRNA.
32. Способ по п.1, где, кроме того, присутствует носитель фотосенсибилизирующего вещества, выбранный из поликатиона, полиэтиленимина, дендримера, катионного липида и пептида.
33. Способ по п.1, где siRNA смешивают с носителем так, чтобы образовывался комплекс, который затем вводят в клетку одновременно или последовательно с фотосенсибилизирующим веществом.
34. Способ по п.1, где указанный способ проводят посредством контактирования указанной клетки с фотосенсибилизирующим веществом, контактирования указанной клетки с носителем и молекулой siRNA, подлежащей введению, и облучения указанной клетки светом с длиной волны, эффективной для активации фотосенсибилизирующего вещества, где указанное облучение проводят перед клеточным захватом указанной молекулы siRNA и указанного носителя во внутриклеточный компартмент, содержащий указанное фотосенсибилизирующее вещество, предпочтительно перед клеточным захватом указанной молекулы и указанного носителя в любой внутриклеточный компартмент.
35. Способ ингибирования экспрессии гена-мишени посредством введения молекулы siRNA в клетку, содержащую указанный ген-мишень, способом, как определено в любом из пп.1-34, где указанная молекула siRNA специфично ингибирует экспрессию указанного гена-мишени.
36. Клетка или популяция клеток, содержащая молекулу siRNA, которая интернализована в цитозоль указанной клетки, причем клетка получена способом по любому из пп.1-35.
37. Композиция, содержащая молекулу siRNA и молекулу носителя, как определено в любом из пп.1-25, и необязательно также отдельно фотосенсибилизирующее вещество, как определено в любом из пп.1-25 или 28.
38. Композиция по п.37, содержащая фотосенсибилизирующее вещество.
39. Композиция, содержащая клетку или популяцию клеток по п.36.
40. Композиция по любому из пп.37-39 для применения в терапии.
41. Набор, содержащий молекулу siRNA, молекулу носителя и необязательно фотосенсибилизирующее вещество, как определено в любом из пп.1-25 или 28.
42. Применение молекулы siRNA и носителя и необязательно фотосенсибилизирующего вещества, как определено в любом из пп.1-25 или 28, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, нарушения или инфекции посредством изменения экспрессии одного или нескольких генов-мишеней у указанного пациента.
43. Применение клетки или популяции клеток, как определено в п.36, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, нарушения или инфекции посредством изменения экспрессии одного или нескольких генов-мишеней у указанного пациента.
44. Применение по п.43, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения заболевания или нарушения, которое характеризуется аномальной экспрессией гена или в случае которого может быть полезным подавление одного или нескольких генов, предпочтительно злокачественной опухоли.
45. Способ лечения или профилактики заболевания, нарушения или инфекции у пациента, включающий введение молекулы siRNA и носителя в одну или несколько клеток in vitro, in vivo или ex vivo в соответствии со способами, как определено в любом из пп.1-35 и где необходимо введение указанных клеток указанному пациенту.
46. Способ лечения или профилактики заболевания, нарушения или инфекции у пациента, включающий введение клетки или популяции клеток, как определено в п.36, указанному пациенту.
47. Способ по п.45 или 46, который применяют для лечения заболевания, которое характеризуется аномальной экспрессией гена или в случае которого может быть полезным подавление одного или нескольких генов, предпочтительно злокачественной опухоли.
48. Продукт, содержащий:
молекулу siRNA и молекулу носителя, как определено в любом из пп.1-25, и фотосенсибилизирующее вещество, определенное в любом из пп.1-25 или 28, для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии.