КОНСОРЦИУМ ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ ДЛЯ ДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ В ГРУНТАХ И ВОДАХ В УСЛОВИЯХ ЖАРКОГО КЛИМАТА
THERMOTOLERANT BACTERIAL STRAINS CONSORTIUM FOR OIL AND OIL PRODUCTS DEGRADATION IN SOIL AND WATERS IN HOT CLIMATES

Изобретение относится к области экологической биотехнологии и биотехнологии защиты окружающей среды и может быть использовано при проведении мероприятий по очистке нефтезагрязненных грунтов и вод в условиях жаркого климата. Использование термотолерантных бактерий позволяет проводить очистку грунтов и вод при температурах от 20°C до 50°C, консорциум сохраняет жизнеспособность до 53°C.
4
5
4
5
Изобретение представляет собой консорциум термотолерантных непатогенных бактерий, способных эффективно утилизировать нефть и нефтепродукты в условиях повышенных температур. В состав консорциума входят три бактериальных штамма - Gordonia amicalis ВКМ Ас-2720 Д, Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2722 Д, Rhodococcus pyridinivorans ВКМ Ас-2721 Д. Возможно применение консорциума в засоленных (до 7% соли) грунтах и водах, в диапазоне рН 6-8, а также при низкой влажности грунта (порядка 10%). Препарат эффективен при уровне загрязнения грунта до 10% (100 г нефти на 1 кг грунта), в случае большего содержания нефти необходимо снизить ее концентрацию доступными способами. Для осуществления эффективной очистки численность микроорганизмов консорциума на обрабатываемом участке должна быть не менее 1×10-1×10 КОЕ/г грунта (1×10-1×10 КОЕ/мл) в зависимости от уровня загрязнения.
Оценка эффективности очистки грунта или воды с использованием консорциума осуществляется путем измерения остаточного содержания углеводородов в сравнении с контролем для оценки абиотической убыли. Технический результат заключается в снижении концентрации углеводородов нефти в грунте и воде в условиях повышенных температур. Реализация способа очистки грунтов и вод консорциумом термотолерантных бактерий является экологически безопасным и перспективным подходом к ликвидации последствий нефтеразливов в условиях жаркого климата и при повышенной солености почвы и воды.
Область техники
Изобретение относится к области экологической биотехнологии и может быть использовано при ликвидации последствий нефтеразливов и очистке нефтезагрязненных грунтов и вод in situ и ex situ в условиях жаркого климата.
Основному риску в связи с загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами подвержены регионы, где располагаются месторождения и ведется активная добыча и транспортировка нефти. Более половины мировых запасов нефти находится на территориях с жарким климатом, где специфика природных, в частности температурных условий, вынуждает более тщательно подходить к выбору адекватного метода ремедиации загрязненных земель.
Одной из главных проблем ремедиации территорий в условиях жаркого климата является тот факт, что высокие температуры снижают вязкость нефти и, таким образом, ускоряют ее диффузию вглубь грунта. Также, высокие скорости испарения легких фракций нефти при повышенных температурах приводят к загрязнению воздуха токсичными продуктами, в то время как оставшиеся нелетучие компоненты с высокой молекулярной массой формируют пленки, плохо подвергающиеся биодеструкции. Высокие скорости испарения воды при температурах выше 40°C приводят к засолению грунтов и вод. Буровые растворы, попадающие в грунт при нефтедобыче, также способствуют засолению территорий. Применение консорциума термотолерантных бактерий-нефтедеструкторов делает возможным удаление углеводородов из грунта и воды в таких условиях. Бактерии, входящие в состав консорциума, способны утилизировать нефть при температурах до 50°C, солености до 7%, рН 6-8 и влажности грунта 10%.
Уровень техники
Значительная часть нефтезагрязненных участков на территориях России и стран СНГ расположена в регионах с жарким климатом. Тем не менее, при патентном поиске не было обнаружено коммерческих биопрепаратов, предназначенных для очистки нефтезагрязненных территорий в условиях жаркого климата. Однако существуют препараты на основе как консорциумов, так и монокультур, с верхней границей рабочего температурного диапазона в пределах 40-50°C.
3
2
4
2
4
2
10
Известен биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти (патент РФ №2365438, Карасева Э.В. с соавт., КубГУ, 2006). В состав препарата входят микроорганизмы Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д; а также (мас. %): глицерин - 8-10, KNO - 0.360-0.367, KHPO - 0.054-0.055, NaHPO⋅12HO - 0.126-0.128. Численность жизнеспособных клеток в препарате предполагается не менее 3-10 кл/мл. Клетки микроорганизмов штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д выращивали совместно в условиях глубинного культивирования в жидкой минеральной среде с дизельным топливом в качестве источника углерода.
Недостатком препарата является неспособность бактерий, входящих в его состав, утилизировать нефть и продукты ее переработки при температуре выше 40°C. К тому же препарат вносят в виде культуральной жидкости, что требует большого расхода воды при ремедиации больших площадей.
8
3
Известен биопрепарат «Дестройл» и способ его использования на очистных сооружениях для утилизации нефтепродуктов (заявка 2008129964/13, Надеин А.Ф.). Препарат «Дестройл» содержит монокультуру Acinetobacter sp., численность жизнеспособных клеток составляет 1×10 КОЕ/мл. Условия работы препарата: рН 4,5-8,5 и температур - от +5 до +38°C, жизнеспособен до +42°C. В способе ремедиации, основанном на совместном использовании препарата и активного ила в аэротенках, температура сточных вод должна быть не выше 22°C. Расход препарата составляет 2 г на 1 м водно-иловой смеси, находящейся в аэротенке.
Недостатком препарата является использование монокультуры, что сужает спектр соединений, окисляемых в процессе ремедиации. Также, использование грамотрицательного штамма в качестве основного агента биоремедиации ограничивает максимальную температуру использования препарата.
Известен биопрепарат «Биоойл-Югра» (патент РФ №2337069, Алексеев А.Ю. с соавт., 2007), основанный на ассоциации дрожжевых и бактериальных штаммов: Saccharomyces sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» №Y-1036, Bacillus sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» №В-1040, Bacillus sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» №В-1039, Enterobacter sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» №В-1038. В состав также входят протекторы (сахароза, агароза и желатин). Рабочий диапазон препарата: температура - от +1°C до +41°C (оптимум 7-27 С); рН 4,5-9,0, соленость до 7%.
Микробная ассоциация подобрана для утилизации нефти в умеренном и холодном климате. Недостатком препарата при использовании его в жарком климате является малая эффективность при повышении температуры.
Известен препарат «Олеоворин» (Приказ Госкомэкологии РФ ОТ 02.04.97 №139 об утверждении заключения экспертной комиссии государственной экологической экспертизы материалов экологического обоснования технических условий (ТУ) на препарат бактериальный «Олеоворин»). Препарат «Олеоворин» разработан на основе выделенных из природного биоценоза бактериальных штаммов рода Acinetobacter oleovorum (штаммы ВСБ-712 и ВСБ-568), обладающих окислительной активностью по отношению к нефти и нефтепродуктам. В ТУ препарата указано, что «Олеоворин» активен при утилизации моно- и полиароматических углеводородов. Патент на препарат «Олеоворин» отсутствует.
Недостатком биопрепарата является его низкая активность в отношении алканов, которые составляют до 70% всех углеводородов нефти. Кроме того, использование в препарате двух близкородственных штаммов приближает его свойства к препаратам на основе монокультур.
4
2
4
2
4
4
2
4
3
4
4
4
В патенте на изобретение №2014286 (Биттеева М.Б. с соавт., 1994) предлагается использовать термотолерантные ассоциативные штаммы бактерий Mycococcus lactis ВСБ-574 и ВСБ-Д-5 для очистки водной поверхности и емкостей от нефтепродуктов, а также сточных вод, содержащих нефтепродукты. Штаммы культивировали при 40-42°C, рН среды 6.8-7.0, на минеральной среде N9 (состав, на 1 л: NHHPO - 10 г, KHPO - 10 г, MgSO - 0.7 г, микроэлементы Fe(SO) - 12.5 мг, ZnSO - 12.5 мг, MnSO - 12.5 мг, CuSO - 3 мг). В качестве источника углерода использовали моторное масло, нефтепродукт с осмоленным осадком в концентрации 0,5 об. %, депарафинизат дизельного топлива в концентрации 10 об. %.
Применение близкородственных штаммов приближает свойства препарата к монокультуре. Низкие используемые концентрации загрязнителей в испытаниях позволяют предположить, что эффективность такого препарата может снижаться при повышении содержания нефтепродуктов в среде культивирования.
Известен биопрепарат «Деворойл» (патент РФ №2023686, C02F 3/34, 1994.11.30), разработанный на основе консорциума штаммов микроорганизмов: Rhodococcus erytropolis 367-2, Rhodococcus maris 367-5, Rhodococcus erytropolis 367-6, Pseudomonas stutzeri 367-1, Candida lipolytica 367-3. Микроорганизмы, входящие в препарат, способны к росту и деструкции углеводородов в широком диапазоне солености (от 0,05% до 15%). Рабочий температурный диапазон составляет от +5°C до +40°C.
Недостатком препарата «Деворойл» является неспособность утилизации углеводородов микроорганизмами при температурах выше 40°C.
12
Наиболее близким аналогом предлагаемого микробного консорциума для ремедиации грунтов и вод в жарком климате является биопрепарат «Микрозим Петротрит», разработка РСЭ Трейдинг (Москва), санитарно-эпидемиологическое заключение №77.99.02.515.Д.001102.03.05 от 11.03.2005. Однако патент на препарат отсутствует. В состав «Микрозима» входит консорциум микроорганизмов родов Bacillus sp., Atherobacter sp., Nocardia sp., Rhodococcus sp., Pseudomonas sp., соли, носитель; количество жизнеспособных клеток в препарате предполагается 10 КОЕ/г. В качестве носителя используется кукурузная мука. «Микрозим» может быть использован вместе с подкормкой «Нутризим». Рабочий диапазон препарата: температура от +5°C до +50°C (оптимум от +10°C до +40°C), рН 4-10.
Недостатком препарата «Микрозим Петротрит» является большое количество (12 штаммов) используемых микроорганизмов, что существенно осложняет технологию его получения и повышает затраты на его производство и наработку биомассы.
Несмотря на присутствие на российском рынке биопрепаратов с рабочим температурным пределом около 50°C, по находящейся в открытом доступе информации, их применение в основном рассчитано на умеренный или даже холодный климат. Отсутствует информация об испытаниях этих препаратов в условиях повышенных температур.
Сущность изобретения
Задачей разработки является создание эффективного микробного консорциума для очистки от нефти грунтов и вод как при умеренных, так и при повышенных (до 50°C) температурах. Решение задачи достигается посредством использования термотолерантных бактерий, способных утилизировать нефть в диапазоне температур 20-50°C, что делает их перспективными агентами ремедиации нефтезагрязненных грунтов и вод в регионах с жарким климатом.
Принимая во внимание высокие скорости испарения воды при повышенных температурах и, как следствие, засоленность грунтов и водных экосистем, при разработке консорциума были использованы микроорганизмы, способные утилизировать углеводороды в присутствии соли в среде (до 7%) и при низком уровне влажности (около 10%).
В состав консорциума входят бактерии-деструкторы как алифатической, так и ароматической фракций нефти. Использование бактерий, способных к деградации широкого спектра субстратов, обеспечивает более эффективное удаление нефти из грунтов и водных экосистем. Эффективность разработанного консорциума бактерий при удалении углеводородов нефти в грунте и воде была подтверждена с помощью модельных экспериментов как при нормальной (24°C), так и при повышенной (45°C) температуре. При культивировании в жидкой среде с 2% нефти и 3% соли консорциум обеспечивает деструкцию 68% углеводородов при 24°C и 38% углеводородов при 45°C за 14 суток. В процессе деструкции нефти в грунте консорциумом было утилизировано 70% нефти при 24°C и 59% нефти при 45°C (исходная концентрация нефти 2%, соленость 3%, влажность грунта 10%) за 21 сутки.
Разработанный микробный консорциум может быть использован в ходе мероприятий по восстановлению нефтезагрязненных грунтов и вод, ликвидации последствий аварийных разливов нефти и нефтепродуктов в регионах с жарким климатом.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Изобретение представлено консорциумом термотолерантных микроорганизмов-нефтедеструкторов и может быть применено при ремедиации нефтезагрязненных грунтов и вод в регионах с жарким климатом. Консорциум составлен из одного штамма бактерий рода Gordonia и двух штаммов бактерий рода Rhodococcus, эффективен в диапазоне температур 20-50°C, максимальная рабочая температура консорциума составляет 53°C. Применение консорциума возможно также в засоленных (до 7%) грунтах и водах.
Эффективность изобретения при удалении углеводородов нефти в грунте и воде была подтверждена с помощью модельных экспериментов как при нормальной (24°C), так и при повышенной (45°C) температуре.
При моделировании водных и грунтовых сред показано, что консорциум трех штаммов утилизировал нефть более эффективно, чем индивидуальные культуры. Возможность использования и эффективность предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Контроль абиотической убыли нефти в водных системах.
В жидкую минеральную среду Эванса или стерильную водопроводную воду вносят морскую соль до конечной концентрации 3% и нефть до конечной концентрации 2%. Модельные системы закрывают для исключения попадания посторонней микрофлоры, однако негерметично, чтобы обеспечить испарение, непрерывно перемешивают в ходе всего эксперимента. Опыт проводят как при 24°C, так и при 45°C. По окончании 14 суток эксперимента измеряют остаточную концентрацию углеводородов в образцах методом ИК-спектроскопии с помощью анализатора нефтепродуктов АН-2 в соответствии с РД 52.24.476-2007 «Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометрическим методом», после чего и оценивают абиотическую убыль в системах без микроорганизмов.
Абиотическая убыль нефти в эксперименте при температурах 24°C и 45°C составила 6% и 11% соответственно через 14 суток.
Пример 2. Деструкция нефти микроорганизмами в водных системах.
Подготовку систем осуществляют по той же схеме, что и в Примере 1. Эксперимент проводят как с монокультурами микроорганизмов, так и с консорциумом:
а) клеточную суспензию штамма Gordonia amicalis ВКМ Ас-2720 Д;
б) клеточную суспензию штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2722 Д;
в) клеточную суспензию штамма Rhodococcus pyridinivorans ВКМ Ас-2721 Д;
г) консорциум трех штаммов в соотношении 1:1:1.
4
4
4
Численность микроорганизмов в опыте должна быть не менее 1×10 КОЕ/г грунта (1×10 КОЕ/мл воды). Для получения консорциума монокультуры выращивают отдельно, затем готовят суспензии монокультур с концентрацией клеток не менее 1×10 КОЕ/мл и смешивают их в равных соотношениях.
Опыт проводят параллельно при 24°C и 45°C. По окончании эксперимента измеряют остаточную концентрацию углеводородов в образцах и оценивают абиотическую убыль в системах без микроорганизмов.
На Фиг. 1 приведены результаты очистки - показана степень микробной деструкции нефти штаммами G. amicalis ВКМ Ас-2720 Д, R. erythropolis ВКМ Ас-2722 Д, R. pyridinivorans ВКМ Ас-2721 Д и консорциумом, составленным из этих трех штаммов, в водных модельных системах за вычетом абиотической убыли. Абиотическая убыль нефти через 14 суток при температурах 24°C и 45°C составила 6% и 11%, соответственно. В жидкой среде культивирования с 2% нефти и 3% соли консорциум обеспечивает 68% деструкции при 24°C и 38% деструкции при 45°C за 14 суток.
Пример 3. Контроль абиотической убыли нефти в грунтовых системах.
В стерильный песок вносят морскую соль до конечной концентрации 3%, нефть до конечной концентрации 2% и стерильную жидкую минеральную среду или водопроводную воду до конечной концентрации 10%. Системы с песком закрывают для исключения попадания посторонней микрофлоры, однако негерметично, чтобы обеспечить испарение, и рыхлят каждые 3-4 дня в ходе всего эксперимента. Опыт проводят как при 24°C, так и при 45°C. По окончании эксперимента измеряют остаточную концентрацию углеводородов методом ИК-спектроскопии с помощью анализатора нефтепродуктов АН-2 в соответствии с МУК 4.1.1956-05 «Определение концентрации нефти в почве методом инфракрасной спектрофотометрии», после чего оценивают абиотическую убыль в системах без микроорганизмов.
Пример 4. Деструкция нефти микроорганизмами в грунтовых системах
4
4
4
Подготовку систем проводят по той же схеме, что и в Примере 3. Эксперимент проводят как с монокультурами микроорганизмов, так и с консорциумом. Варианты систем описаны в Примере 2. Численность микроорганизмов в опыте должна быть не менее 1×10 КОЕ/г грунта (1×10 КОЕ/мл). Для получения консорциума монокультуры выращивают отдельно, затем готовят суспензии монокультур с концентрацией клеток 1×10 КОЕ/мл и смешивают их в равных соотношениях.
Опыт проводят параллельно при 24°C и 45°C. По окончании эксперимента измеряют остаточную концентрацию углеводородов в образцах и оценивают абиотическую убыль в системах без микроорганизмов.
На Фиг. 2 приведены результаты очистки - показана степень микробной деструкции нефти штаммами G. amicalis ВКМ Ас-2720 Д, R. erythropolis ВКМ Ас-2722 Д, R. pyridinivorans ВКМ Ас-2721 Д и консорциумом, составленным из этих трех штаммов, в грунте за вычетом абиотической убыли. Абиотическая убыль нефти через 21 сутки при температурах 24°C и 45°C составила 20% и 33%, соответственно. В процессе деструкции нефти в грунте консорциумом было утилизировано 70 и 59% нефти (при температурах 24°C и 45°C соответственно) при исходной концентрации нефти 2%, солености 3% и влажности 10% за 21 сутки.