Инновационные методы молекулярной диагностики в медицине

Инновационные методы молекулярной диагностики в медицине

Э.М.Агаева, Ш.К.Зейналова, В.А.Нариманов

Азербайджанский медицинский университет, г.Баку

В третьем тысячелетии в молекулярной биологии произошел научный переворот, обусловленный рядом открытий, в результате которых сформировалось новое направление в научном мире-молекулярная микробиология, молекулярная патология, молекулярная эпидемиология, технология рекомбинатной ДНК или рек ДНК, возможность анализа и выделения генов, прямо или косвенно отвественных за развития наследственных, онкологических и инфекционных болезней [18, 21, 22, 26].

Сущность этой методологии заключается в идентификации и анализе нуклеиновых кислот и кодируемых ими белковых молекул. Идентификация трудно диагностируемых инфекционных болезней стала возможной благодаря развитию молекулярных технологий.

Использование ранее применяемых методов лабораторной диагностики имеет ряд недостатков, однако точное определение возбудителя болезни возможно лишь определением и анализом его генома (ДНК или РНК), что обусловленно уникальными особеностями нуклеиновых кислот.

В настоящее время в молекулярной диагностике применяются ПЦР, молекулярная гибридизация, секвенирование, фагоплазмидное типиро-вание, многочисленные биоинформатичные методы, позволяющие проводить классический анализ результатов исследований, дизайн прайме-ров, плазмидных векторов.

Основу современных методов молекулярной диагностики составляет полимеразная цепная реакция (ПЦР), изобретенная, американским ученым Кери Мюлисс и позволяющая клонировать в условиях in vitro любой участок ДНК любого организма [1, 3, 5]. В 1983 г американский журнал "Science" назвал это открытие самым выдающимся открытием последних лет. Научное сообщество за разработку ПЦР присудило Керри Мю-лиссу Нобелевскую премию (1991) [3, 14, 27].

В настоящее время эта реакция широко применяется во всех направлениях биологии. Диагностика инфекционных заболеваний, генодиаг-

ностика и генотипирование микроорганизмов, определение их вирулентности, устойчивости к антибиотикам, пренатальная диагностика, идентификация и анализ ДНК, РНК, белковых молекул, прогнозирование и определение мутаций, рекомбинаций [1, 2, 3, 8, 9, 17, 23].

С помощью ПЦР за сутки можно получить 100 млрд. одинаковых по структуре молекул. Сущность ПЦР состоит в многократном копировании фрагмента генома возбудителя, определяющего его индивидуальность.

Фрагмент ДНК (нуклеотидная последовательность) можно выделить in vitro, нарастить и с помощью, праймеров идентифицировать все микроорганизмы, принадлежащие к данному виду. ПЦР характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, высокой специфичностью, прямым определением наличия возбудителя, возможностью диагностики хронических и латентных инфекций, контролированием степени выздоровления и высокой скоростью получения результатов анализа.

В ПЦР можно идентифицировать микроорганизмы, присутствующие в пробе в очень низких концентрациях возбудителя [5, 6, 8, 20].

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимера-зы.

В настоящее время практически к каждому микроорганизму сконструированы специфические праймеры [12, 13, 15].

В ПЦР применяют термостабильную ДНК-полимеразу, получившую название tag-полиме-разы, обнаруженную у термофильных бактерий Termus auaticus, обитающих в термальных источниках. Оптимум работы tag-полимеразы находится в диапазоне 70-75°С и она благополучно переносит нагревание до 95°С. Taq-полимераза неспособна катализировать процесс обратной транскрипции, то есть синтез однонитевой ДНК на РНК матрице. В 1991 году Маерсом и Гель-фандом описан фермент ДНК-зависимой ДНК полимеразы, выделенной из другого термофила

Termus thermophilusm (Tth-полимераза), который в присутствии ионов магния и хелаторов марганца позволяет ферменту катализировать обычную ДНК-зависимую ДНК-полимеразную реакцию. Этот фермент может быть использован для одновременного синтеза комплементарных однони-тевых фрагментов ДНК и их амплификации [23, 24, 28].

Обязательным компонентом, необходимым для работы ДНК-полимеразы, является праймер. Создание праймера для ПЦР стало возможным после расшифровки нуклеотидной последовательности ДНК тех или иных организмов.

Геном каждого организма содержит уникальные последовательности нуклеотидов, не повторяющиеся больше ни у каких других видов организмов. Сейчас во всем мире идет активная работа по расшифровке нуклеотидных последовательностей геномов различных микро и макроорганизмов. В настоящее время уже расшифрованы геном человека, нуклеотидные последовательности многих вирусов и бактерий . Существуют компьютерные банки данных, где можно получить информацию о нуклеотидной последовательности практически всех известных возбудителей инфекционных заболеваний. Данные по нуклеотидной последовательности всех видов нуклеиновых кислот опубликованы в форме веб страницы на серверах баз данных таких, как Gen Bank (www.ncbi.nlm.mih.gov), EMBL (база данных Европейской лаборатории молекулярной биологии www.ebi.ac.uk/embl), DDBJ(японская база данных нуклеотидных и аминокислотной последовательности, www.sddbj.nig.ac) [2, 21, 22].

При разработке праймера требуется найти фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал только у интересующего нас вида микроорганизмов, при этом длина фрагмента должна составлять примерно 20 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы. На компьютере обычно проводится множественное выравнивание последовательностей. Наиболее распространенным модулем выравнивания является ClustalW. Он может быть установлен как самостоятельная программа или быть встроенным в состав более современных программ для анализа первичных структур нуклеиновых кислот и белков (BioEdit, Oligo, Vector NTI, Primer и других). Множественное выравнивание является очень важным этапом исследований, так как опубликованные различными исследователями последовательности секвинирования генов-мишеней имеют различия по длине локу-

сам начала и конца распознавания. т.д. В соотве-ствии с найденной последовательностью нуклеотидов и синтезируется праймер. Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера. Ренату-рация (присоеденение праймеров) происходит при снижении температуры до 60°С. Пары олиго-нуклеотидов подбирают таким образом, чтобы их температура плавления отличались не более чем на 3°С. Необходимо заметить, что теоретически расчитанная температура отжига праймеров не всегда позволяет получить высококачественный практический результат, поэтому в практических исследованиях следует оптимизировать этот параметр [1, 8, 10, 19, 22].

Итак, для создания и теоретического исследования качества праймеров, зондов и их систем предложено немало методических и методологических подходов, основанных на термокинетических показателях и изучения гомологии олиго-нуклеотидов к матрице. Учитывая разнобразие подходов и способов конструирования, а также программного обеспечения, применяемого для этой цели, существует необходимость оценки и обобщения данных по разработке праймерных и других олигонуклеотидных систем, а также оценки параметров их качества. Недостаток отечественных и зарубежных публикаций по этому вопросу стал причиной для теоретической разработки и экспрементального обоснования параметров расчета праймерных систем для создания реком-бинантных конструкций и диагностических наборов на основе полимеразной цепной реакции. Фактически, праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, кторый будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифициро-ван. Такие фрагменты ДНК называются амплико-нами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого [2, 16, 18, 24].

Чтобы понять, как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в ходе ПЦР, нужно четко представлять положение всех праймеров и комплементарных им последовательностей в амплифицируемых цепях в каждом цикле. В первом цикле каждая из новосинтезиро-ванных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 31-гидроксильной группы "ее" праймера до концевого нуклеотида последова-

тельности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют "длинными матрицами", именно на них будет идти дальнейший синтез.

При идентификации в образцах РНК у РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует стадия обратной транскрипции при которой РНК переводят в форму ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы, открытой лауреатом Ноболевской премии-Девидом Балтимором и Говардом Теминным. Далее проводят электро-форетическую детекцию продуктов ПЦР-ампли-конов.

Продукты ПЦР помещают в лунки агорозно-го геля и подвергают действию постоянного электрического тока, в результате чего отрицательно заряженная молекула ДНК движется к положительному электроду. В состав геля входит бромистый этидий, образующий устойчивый комплекс с ДНК и способствующий лучшему просмотру появившихся полос под ультрафиолетовым облучением [22, 23, 28].

Другие методы детекции основаны на идентификации меченых компонентов реакции. В частности, в отдельных тест-системах (фирмы "Хофман Ля Рош") используются праймеры, меченные биотином. В процессе детекции ампли-кон, меченный биотином, гибридизуется со специфическим ДНК-зондом, иммобилизованным на микропланшете. На следующей стадии био-тин связывается с конъюгатом авидин-перокси-даза хрена. Активность фермента, входящего в комплекс ампликон-биотин-авидин-пероксидаза хрена, выявляют приёмом, используемым при стандартном иммуноферментном анализе. Интенсивность окраски определяют на планшетном фотометре при 450 нм. Данный подход позволяет проводить объективную оценку результатов реакции в виде показателей оптической плотности и следовательно, количественно определять концентрацию ДНК или РНК в пробе.

В настоящее время разработан ряд подходов, повышающих специфичность реакций. Применяется так называемая Nested PCR (гнездовая ПЦР). Принцип данного метода заключается в использовании двух пар праймеров, одна из которых способна амплифицировать внутренний участок ампликона, полученного после первого цикла, с внешней парой праймеров. Применение гнездовой ПЦР имеет преимущества: высокая чувствительность методики, отсутствие необходимости использовать другие методы. К недостаткам относят перенос продуктов реакции из одной пробирки в другую, что существенно снижа-

ет концентрацию ингибиторов, а также приводит к появлению большого коичества ложноположи-тельных результатов вследствие перекрёстной контаминации проб продуктами амплификации. Также для повышения чувствительности и специфичности реакции используется "горячий старт". Суть его заключается в том, что прежде чем добавлять Taq-полимеразу, реакционная смесь прогревается предварительно до 95°С. Это исключает возможность образования неспецифических фрагментов вследствие неспецифического отжига праймеров при температуре ниже оптимальной. Индикацию, идентификацию и гено-типирование микроорганизмов проводят с пред-ворительным приготовлением положительных образцов, созданием праймеров, зондов буферных систем и микрочипов [7, 9, 11, 20].

При применении методов, предусматривающих использование микрогибридизационных планшетов и микрочипов, в технологических этапах производства приобщаются к изготовлению и иммобилизации подложек .

ПЦР - диагностикумы распределяют по методикам на основе классической ПЦР: моносту-пенчетая (индикация одного вида микроорганизма по одному гену в одноцикловой реакции), duplex - ПЦР (индикация одного возбудителя с двумя генами с целью повышения специфичности детекции), multiplex (индикация одного возбудителя с несколькими (более двух ) генами, или индикация нескольких различных возбудителей) и nested-ПЦР (индикация одного возбудителя в двухстадийном реакции с целью повышения чувствительности детекции, или индикация с последующим типированием) и ПЦР в реальном времени (простая ПЦР, multiplex и количественные варианты). Указанные диагностикумы обеспечивают быструю, высокочувствительную и высокоспецифичную детекцию патогенов за обнаружением нуклеиновых кислот [2, 17, 18, 25].

Исходя из вышеизложенного высокая специфичность и чувствительность ПЦР-метода позволяет быстро обнаружить возбудитель в образцах даже в случае нахождении его в единичных количествах за короткий промежуток времени и таким образом поставить точный диагноз, провести своевременное лечение и разработать профилактические мероприятия [21, 22, 28].

Таким образом, разработка и широкое внедрение в диагностику инфекционных заболеваний, иновационных методов молекулярной диагностики, является приоритентным в совершенствовании медицины и ветеринарии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Агаева Э.М., Зейналова Ш.К. Молекулярно-биологические и генетические исследования при Ньюкаслской болезни // Актуальные проблемы биологической и химической науки. Сборник материалов международной научно-практической конференции, 2012, с. 207-208.

2. Герилович, А. П. Обоснование практических подходов к разработке методик индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний животных вирусной этиологии на основе ПЦР-анализа // Вет. Патология, 2007, № 4, с. 107-111.

3. Гусева Е.В. и Сатина Т. А. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционной заболеваний животных. Владимир// 1995, с. 59

4. Aymard M., Neuraminidase assays//Dev Biol (Basel), 2003, Vol. 115, pp. 75-183.

5. Aldous E.W., A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates by phylo-genetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene // Avian Pathol., 2003, Vol. 32, № 3, pp. 239-256.

6. Alexander, D.J. Newcastle Disease, Other Avian Paramyxoviruses, and Pneumovirus Infections [Text] / D.J. Alexander [et al.] // Saif, YM. Diseases of Poultry / YM. Saif. - Iowa State Press, Ames, Iowa, 1993, Vol.11, pp. 63-80.

7. Bartlett J.M.S, Stirling D., PCR Protocols, Second Edition. Methods in Molecular Biology // Humana Press, 2003, Vol. 226, pp. 556.

8. Becker-Andre M., Hahlbrock K., Absolute mRNA quantification using the polymerase chain reaction (PCR). A novel approach by a PCR aided transcript titration assay (PATTY) // Nucleic Acids Res.,1989, Vol. 17, № 22, pp. 9437-9446.

9. Clin J., Stark D., Comparison of stool antigen detection kits to PCR for diagnosis of amebiasis //Microbiol., 2008, Vol. 46, № 5, pp. 1678-1681.

10. Collins M.S., Bashiruddin B.J. and Alexander D.J. Deduced amino acid sequences at the fusion protein cleavage site of Newcastle disease virusesshowing variation in antigenicity and path-ogenicity // Arch. Virol., 1993, Vol. 128, pp. 363-370.

11. Creelan, J.L., McCullough S.J., Detection and differentiation of pathogenicity of avian paramyxovirus serotype 1 (APMV-1) from field cases using one-step real-time RT-PCR // Dev Biol (Basel), 2006, Vol. 126, pp. 149-157.

12. Crossley B.M, High-throughput real-time RT-PCR assay to detect the exotic Newcastle Disease Virus during the California 2002--2003 outbreak // J Vet Diagn Invest., 2005, Vol. 17, № 2, p. 124-132.

13. Hemmatzadeh, F. Sequencing and phylogenetic analysis of gp51 gene of bovine leukaemia virus in Iranian isolates // Vet Res Commun., 2007, Vol. 31, № 6, pp. 783-789.

14. Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses [Text] / P.R. Heaton [et al.] // J Clin Microbiol. - 1997. - Vol.35, N 11. - P. 2762-2766.

15. Ishii, K., M. Fukui Optimization of annealing temperature to reduce bias caused by a primer mismatch in multitemplate PCR // Applied and Environmental Microbiology, 2001, Vol. 67., pp. 37533755.

16. Kim, O. Optimization of in situ hybridization assay using non-radioactive DNA probes for the detection of canine herpesvirus (CHV) in paraffin-embedded sections // J Vet Sci., 2004, Vol.5, № 1, pp. 71-73.

17. Kumar S.MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software // Bioinformatics, 2001, Vol. 7, p.1244-1245.

18. Lamb, R. A. D. Kolakofsky Paramyxoviridae: The Viruses and their Replication // Fourth Edition. Lippincott Williams and Wilkins, Philidelphia, 2001, pp. 1305-1334.

19. Malik YS., Patnayak D.P., Goyal S.M., Detection of three avia n respiratory viruses by single-tube multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction assay// J Vet Diagn Invest., 2004,Vol. 16, № 3, pp. 244-248.

20. Mardis, E.R. Next-generation DNA sequencing methods [Text] / E.R. Mardis // Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. - 2008. - Vol. 9. -P. 387-402.

21. Molecular genetics: piecing it together [Electronic source] / Спомб доступу URL: //www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/ genetics_ molecular.html - Title from the screen.

22. Молекулярная генетика [Эл. ресурс] / Режим доступа: URL: http://www.bse.sci-lib.com/article077555.html - Заголовок с экрана.

23. Niessen, L. PCR-based diagnosis and quantification of myco-toxin-producing fungi // Adv Food Nutr Res., 2008, Vol. 54, pp. 81138.

24. Saif, Y Disease of Poultry. [Text] / Y. Saif. - 11th edition - Totowa Press, 2002, pp- 1352.

25. Soares P.B., Standardization of a duplex RT-PCR for the detection of Influenza A and Newcastle disease viruses in migratory birds] // Virol Methods, 2005, Vol. 123, № 2, pp. 125-130.

26. Triche, T.J. Molecular Genetic Techniques in Surgical Pathology [Text] / T.J. Triche // Clinical Biochemistry. - 1995. - Vol. 28, N 3. -P. 352.

27. Viljoen, G. J., Molecular Diagnostic PCR Handbook // Methods in Molecular Biology, 2005, Vol. 92, p.345.

28. Wang C.H., Hsiech M.C., Chang P. C. Isolation pathogenicity and H120 protection efficacy of infectious bronchitis viruses isolated in Taiwan. Avian Dis. //1996, Vol.40, p.620-625.

SUMMARY

Innovative methods of molecular

diagnostics in medicine

E.Agayeva, Sh.Zeynalova, V.Narimanov

Azerbaijan Medical University, Baku

In the article authors presented main information dedicated to one of the innovative diagnostic methods in molecular biology - polymerase chain reaction and shown importance of it's wide usage in modern medicine.

Поступила 29.03.2015