НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГЛОБУЛЯРНЫЕ БЕЛКИ, ДЛЯ КАЛИБРОВКИ ИЛИ ВЕРИФИКАЦИИ ПРИБОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ РАЗМЕР ЧАСТИЦ В ДИАПАЗОНЕ МЕНЕЕ 20 нм

Настоящая полезная модель относится к области измерения размера наночастиц, в частности, наночастиц размером 20 нм и менее.
При определении размера частиц в нанодиапазоне встает вопрос о верификации/калибровки используемого оборудования. Сертифицированные стандарты для определения размеров частиц должны быть сопоставлены с размером стандартного метра соответствующей Измерительной Лаборатории (например, авторы проводили сопоставление со стандартным метром Палаты мер и весов). В США таким учреждением является National Institute of Standards and Technology (NIST).
Примером фирм, продающих такие сертифицированные стандартизованные по размеру частицы, являются компании Thermo Scientific (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) и Brookhaven Instruments Corporation (Holtsville, NY, USA). Продукция этих фирм может быть использована для калибровки электронных микроскопов, атомно-силовых микроскопов, приборов, определяющих размеры частиц на основании результатов измерения рассеяния света, а также других устройств, предназначенных для определения размеров наночастиц.
Стандарты размеров сферических наночастиц Серия 3000 фирмы Thermo Scientific представляют собой высокооднородные калиброванные по размеру полистироловые сферы диаметром от 20 до 900 нм, форма выпуска - водная суспензия в склянке объемом 15 мл, снабженной капельницей, содержание твердых частиц в упаковке - 1%. Стандартное отклонение от номинального диаметра для всех размеров составляет 5-9%, причем для частиц с номинальным диаметром 20, 30 и 40 нм эта величина не приводится. Таким образом, предлагаемый минимальный размер частиц для калибровки - 20 нм.
Авторы настоящей полезной модели в качестве стандартов для калибровки или проверки работоспособности приборов, измеряющих размеры частиц в диапазоне менее 20 нм, предлагают использовать глобулярные белки с известным гидродинамическим диаметром, входящие в состав калибровочных наборов для электрофореза и гель-хроматографии.
В настоящее время для определения размеров наночастиц и биологических объектов в водных растворах и в органических растворителях широко используется метод протонной корреляционной спектроскопии. Принцип метода состоит в следующем. Наночастицы в растворе находятся в постоянном движении, которое обусловлено тепловыми флуктуациями, возникает за счет столкновения наночастиц в растворе с молекулами растворителя и носит случайный характер, т.е. частицы, суспендированные в растворителе, подвержены постоянной диффузии. В растворе с известной вязкостью при постоянной температуре скорость диффузии (коэффициент диффузии D) обратно пропорциональна размеру частицы и определяется уравнением Стокса-Эйнштейна:
B
-16
где k=1,38×10 эрг/К - константа Больцмана, Т = температура в кельвинах (К), η = вязкость растворителя (в пуазах), d = диаметр частицы в сантиметрах, для которой определяется коэффициент диффузии D. Таким образом, определение D несет информацию о размере частиц.
На фиг.1 представлена схема, объясняющая процесс рассеяния света в месте возникновения неоднородности среды за счет флуктуации локальной концентрации исследуемых наночастиц.
Интенсивность рассеянного света суммируется и детектируется фотоумножителем. Вследствие того, что движение частиц в растворе носит случайный характер, их взаимное расположение меняется, вызывая изменение в интенсивности детектируемого светового потока. Изменения (или флуктуации) интенсивности, причиной которых является броуновское движение частиц, носит случайный характер: большие, относительно медленно движущиеся частицы, медленно меняют свое положение и вызывают медленные флуктуации интенсивности, частицы малого размера наоборот - двигаются быстро, флуктуации интенсивности происходят с большей частотой. Метод фотонной корреляционной спектроскопии основан на измерении флуктуации в числе фотонов рассеянного света.
Флуктуации интенсивности рассеянного света будут соответствовать флуктуациям локальной концентрации наночастиц. Информация о коэффициенте диффузии частиц содержится в зависящей от времени корреляционной функции флуктуации интенсивности. Временная автокорреляционная функция согласно определению имеет следующий вид:
m
2
где интенсивность I имеет различные значения во время t и (t+τ). t - время накопления корреляционной функции. Очевидно, что при τ=0, автокорреляционная функция равна среднеквадратичной интенсивности <I>. Для больших значений времени корреляция отсутствует, и автокорреляционная функция равна квадрату средней интенсивности рассеяния:
Релаксация микроскопических флуктуации концентрации к равновесному состоянию может быть описана первым законом Фика (уравнением диффузии):
где с (r, t) - концентрация, a D - коэффициент диффузии частиц. Теоретическое рассмотрение показывает, что автокорреляционная функция интенсивности экспоненциально затухает во времени и характерное время релаксации однозначно связано с D. Для монодисперсного образца корреляционная функция интенсивности рассеянного света имеет вид:
где в соответствии с решением уравнения диффузии обратное время корреляции равно:
Волновой вектор флуктуации концентрации описывается выражением:
а
Величины  и b - экспериментальные константы, n - показатель преломления жидкости, в которой взвешены дисперсные частицы, λ - длина волны лазерного света, а ϑ - угол рассеяния.
На фиг.2 графически представлена автокорреляционная функция рассеянного света.
c
а
Константы t,  и b могут быть найдены путем аппроксимации измеренной корреляционной функции теоретической экспоненциальной функцией. Если форма частиц известна или задана, их размер может быть рассчитан с использованием соответствующей формулы. Например, для сферических частиц можно использовать формулу Стокса-Эйнштейна:
B
где k - константа Больцмана, T - абсолютная температура, а η - сдвиговая вязкость среды, в которой взвешены частицы радиуса R.
Проблема аппроксимации экспериментальных данных проста при анализе рассеяния света монодисперсными сферическими частицами. Для полидисперсных образцов интерпретация экспериментальных данных усложняется. Для реально достижимой точности измерений могут быть получены два-три параметра полидисперсного распределения: средний размер частиц, ширина распределения и асимметрия распределения.
В настоящее время в лабораторной практике метод фотонной корреляционной спектроскопии используется для определения размеров белков и их комплексов, процессов агрегации (Berland K.M. et al., Biophys. J., 1996, v.71, р.410-420; Boulton I.C. et al., FEBS Letters, 1997, v.414, p.409-413, Petsev D.N. et al., Biophys. J., 2000, v.78, p.2060-2069), для характеристики липосом при ковалентном присоединении белков (Hutchinson F.J. et al., ВВА, 1989, v.978 (1), р.17-24), для анализа липосом по размеру (Hupfeld S. et al., J.Nanosci. Nanotechnol., 2006, v.6 (9-10), p.3025-31), для характеристики нанокомпозитов на основе квантовых точек (Wei Liu et al., J.Biomed. Mater. Res., A, 2007), для изменения размера частиц липопротеидов низкой плотности при взаимодействии с фосфолипидными частицами (Schnitzer E. et al., Chem. Phys. Lipids, 2000, v.104 (2), p.149-160) и модельных липопротеидов при нагрузке лекарствами (Gerke A. et al., Pharmaceutical Res. 1996, v.13 (1), p.44-51).
Итак, настоящая полезная модель относится к набору для калибровки или верификации приборов, определяющих размер частиц в диапазоне менее 20 нм, содержащему флаконы с глобулярными белками с известными значениями гидродинамического диаметра в качестве стандартов и инструкцию по применению.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящей полезной модели приготовление стандартизующего раствора осуществляют в соответствии с инструкцией к набору растворением половины содержимого флаконов в деионизованной либо бидистиллированной воде, пропущенной через поликарбонатные (либо аналогичные) фильтры с размером пор не более 220 нм. Объем добавляемой воды выбирают в соответствии с объемом, необходимым для заполнения измерительной ячейки прибора. При необходимости в зависимости от чувствительности и требований к прибору концентрация в стандартизующем образце может быть либо повышена (добавлением вещества-стандарта), либо понижена (добавлением деионизованной воды).
В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящей полезной модели в состав набора входит несколько образцов, например, 4-8, различной молекулярной массы, имеющих различные гидродинамические диаметры, например, указанных в таблице 1.
Таблица 1.
Белок
Диаметр, нм (данные литературы)
Молекулярная масса, Да
Цитохром с
3,1
11700
Миоглобин
3,5
17200
Гемоглобин
5×5,5×6,4
66000-68000
Альбумин бычий
6,0
66000
Ферритин
12,2
440000
Лизоцим
4,5
14300
Овальбумин
6,2
45000
Химотрипсиноген
5,0
25700
Рибонуклеаза А
4,4
13700
Общее количество флаконов в составе набора зависит от количества образцов с различными гидродинамическими диаметрами и количеством желаемых определений для данного размера (растворы, приготовленные для измерения не хранятся). Для обеспечения возможности проведения повторных верификационных измерений флаконы с навесками каждого вещества-стандарта могут содержаться в составе набора, по меньшей мере, в количестве двух.
В соответствии с альтернативными конкретными вариантами осуществления настоящей полезной модели в состав набора может входить 4-8 флаконов с точными навесками для растворения в определенном объеме воды и необязательно 4-8 флаконов с теми же веществами для коррекции интенсивности рассеяния в зависимости от чувствительности.
Флаконы, входящие в состав набора могут быть проиндексированы цифрами либо буквами.
Конкретные навески веществ-стандартов в каждом флаконе набора будут соответствовать такому их количеству, которое сможет обеспечить создание в измерительной ячейке прибора концентрации вещества-стандарта, достаточной для проведения измерения диаметра наночастиц. Например, в соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящей полезной модели каждый флакон может содержать 50 мг белка-стандарта в виде порошка.
Набор может быть упакован в блистер или коробку.
Далее приведено описание конкретной процедуры определения диаметра наночастиц в соответствии с настоящей полезной моделью.
Определение размера частиц в образце с использованием субмикронного анализатора размеров частиц N5 Beckman Coulter основано на описанной выше регистрации скорости диффузии частиц в жидкости. В N5 Beckman Coulter определение размера частиц основано на технологии фотонной корреляционной спектроскопии с использованием Contin-программ. В качестве источника света используется лазер с длиной волны 632,8 нм, воспроизводимость не хуже 3%, область измерений 3-3000 нм. Для достоверности получаемых результатов необходимо, чтобы интенсивность рассеянного образцом света удовлетворяла условиям, изложенным в руководстве. Следует отметить, что чем меньше размер анализируемых частиц, тем больше должна быть их концентрация в образце. Из изложенного выше рассмотрения принципа метода фотонной корреляционной спектроскопии ясно, что этот метод не требует калибровки, однако для подтверждения корректности проводимых измерений авторы настоящей полезной модели использовали прилагаемые к прибору латексные частицы размером 100 нм и глобулярные белки из калибровочного тест-набора, размер которых достоверно известен из данных литературы.
Протокол определения размера частиц:
1. В экспериментах использовали дистиллированную воду, профильтрованную через фильтр с диаметром пор 0,22 нм.
2. Растворы белков готовили в концентрации 10 мг/мл на профильтрованной дистиллированной воде.
4
6
3. Разведение образцов для анализа размера белковых молекул готовили согласно требованиям инструкций к прибору: интенсивность рассеянного света в пределах 5×10÷1×10 импульсов в секунду).
4. Измерения проводили в стеклянной кювете объемом 3 мл.
5. Эксперименты, в которых не выполнялись условия Инструкции (превышение отклонения базовой линии более 0,5, параметр «пыль» хуже 5%), к рассмотрению не принимались.
В таблице 2 приведены данные литературы по диаметру наночастиц и результаты определения диаметра наночастиц с помощью N5 Beckman Coulter.
Таблица 2.
Белок
Диаметр, нм (данные  литературы)
Диаметр, нм (измерен N5 Beckman Coulter)
Цитохром с
3,1
3,0±0,2
Миоглобин
3,5
3,1±0,2
Альбумин бычий
6,0
5,8±1,8
Ферритин
12,2
10,2±3,3
Латексные частицы
100
99,5±3,2
Примечание: В воде, используемой для разведения, не обнаружено частиц с размером в измеряемом диапазоне, а также в диапазоне до 3000 нм.
Таким образом, авторы настоящей полезной модели продемонстрировали, что глобулярные белки, входящие в состав калибровочных наборов для электрофореза и гель-хроматографии, например, цитохром с, миоглобин, бычий альбумин и ферритин, могут быть использованы как для калибровки, так и для подтверждения работоспособности (верификации) приборов для измерения размеров частиц биологического происхождения (бактерии, вирусы, рибосомы, субклеточные компоненты), а также в научных исследованиях для определения размеров различного рода наночастиц органического и неорганического происхождения.