Токсикологическая характеристика нового противоопухолевого мультитаргетного препарата антрафуран

токсикологическая характеристика нового противоопухолевого мультитаргетного

препарата антрафуран

Э.р. Переверзева, м.и. трещалин, н.в. Еремкин, А.Е. Щекотихин, и.д. трещалин

ФГБНУ«Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе»; Россия, 119021 Москва, ул. Большая Пироговская, 11, стр. 1

Контакты: Иван Дмитриевич Трещалин idtivan@yandex.ru

Введение. Один из современных подходов к созданию противоопухолевых лекарств основан на направленном поиске ингибиторов молекулярных мишеней, специфических для опухолевых клеток. Использование таких лечебных средств позволит повысить избирательность действия и снизить побочное действие лекарственной терапии. В ФГБНУ НИИНА разработан оригинальный мультитаргетный противоопухолевый препарат антрафуран (ЛХТА-2034), представляющий собой производное антра [2,3-b] фуран-3-карбоксамида. Препарат проявил высокую противоопухолевую активность in vivo. Цель исследования — доклиническое токсикологическое изучение противоопухолевого препарата антрафуран (ЛХТА-2034). Материалы и методы. Исследование проведено на 30 беспородных крысах самцах. Препарат вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 14 дней в разовых дозах 3 и 4,5 мг/кг, суммарно составляющих максимально переносимую (МПД) и расчетную дозу, вызывающую гибель 50 % животных ('ЛД0). В ходе исследования определяли массу тела, проводили клинический и биохимический анализ крови, анализ мочи, снимали электрокардиограмму. На 1-е и 30-е сутки по окончании курса по 5жи-вотных из каждой группы подвергали эвтаназии, определяли массовые коэффициенты сердца, печени, почек, селезенки и тимуса, проводили патоморфологическое исследование внутренних органов.

Результаты. Показано, что внутрибрюшинное введение ЛХТА-2034 не оказывает влияния на изученные клинико-лабораторные показатели состояния животных. Применение ЛХТА-2034 в дозе, суммарно составляющей МПД, не вызывает повреждений структуры органов и тканей крыс. При патоморфологическом исследовании печени, почек и тонкой кишки у животных, получавших высокую дозу препарата, были выявлены обратимые повреждения структуры. Морфологические признаки кардиоток-сичности ЛХТА-2034 были зарегистрированы у отдельных животных через 30 дней после окончания курса введений препарата. Заключение. Токсические эффекты, возникающие под действием антрафурана, зависят от величины примененной дозы и являются обратимыми. Это позволяет рекомендовать его для дальнейшего изучения.

Ключевые слова: антрафуран, ЛХТА-2034, хроническая токсичность, кардиотоксичность, крысы

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-4-80-84

toxicological characteristic of novel antitumor multitargeted agent anthrafuran

E. R. Pereverzeva, M. I. Treschalin, N. V Eremkin, A. E. Shchekotikhin, I. D. Treschalin

Gause Institute of new antibiotics; 11 Bldg. 1 Bol'shaya Pirogovskaya St., Moscow, 119021, Russia

Introduction. One of the modern approaches to development of antitumor drugs is based on oriented search of specific tumor cells molecular targets inhibitors. The application of such therapeutic agents will improve selectivity of action and decrease side effects of antineoplastic therapy. Novel antitumor multitargeted drug anthrafuran (LCTA-2034), obtained in Gause Institute of new antibiotics, represents a derivative of anthra[2,3-b]furan-3-carboxamide. Compound exhibits pronounced antitumor activity in vivo. Objective. The objective of the present study was to investigate the toxicity of LCTA-2034.

Materials and methods. Toxicological study was performed in male outbred rats. The drug was administrated intraperitoneal at the total doses of MTD and LD0g (14* 3 mg/kg or 14x 4.5 mg/kg with 24-h interval). Dynamics of body weight, hematological parameters, blood biochemical parameters, electrocardiography and urinalysis were performed for all animals. 5 animals in each group were sacrificed 1 and 30 days post treatment. The mass coefficients of heart, kidneys, liver, spleen and thymus were calculated. The internal organs were subjected to histological evaluation. Results. The results of the study demonstrate that the intraperitoneal injections of LCTA-2034 don't produce any changes in examined clinical-laboratory parameters. The treatment with LCTA-2034 in total dose of MTD had no effect on morphological structure of the internal organs of rats. The reversible structural damages in liver, kidneys and small intestine were found in group of rats, treated with high dose of the drug. Signs of cardiotoxicity were documented by microscopic pathology observation on day 30post treatment in individual animals. Conclusion. Dose dependence and reversibility of toxic effects of LCTA-2034 allows us to recommend it to further advance.

Key words: anthrafuran, LCTA-2034, chronic toxicity, cardiotoxicity, rats

Оригинальные статьи 81

Введение животных, используемых для исследовательских Антрациклиновые антибиотики используются и иных научных целей [11]. Оценка токсического в химиотерапии для лечения широкого спектра воздействия препарата на организм животных про-онкологических заболеваний, но их значение водилась по правилам экспериментального изучения для противоопухолевой терапии ограничено ри- оригинальных фармакологических веществ, изло-ском развития тяжелой кардиомиопатии [1—3]. женным в «Руководстве по проведению доклиниче-Многочисленные исследования связи между струк- ских исследований лекарственных средств» [12]. турой и активностью производных антрациклино- Исследование проведено на 30 беспородных кры-вых антибиотиков позволили определить влияние сах-самцах массой тела 170—190 г, полученных из Цен-различных элементов их молекул на терапевтиче- трального питомника «Андреевка». Животные были ские и токсические эффекты этих соединений, разделены на 3 группы по 10 голов в каждой. Лиофи-что открыло возможности направленного синтеза лизированную лекарственную форму антрафурана веществ с определенными свойствами [4]. При соз- ЛХТА-2034 [10] растворяли в 5 % растворе глюкозы дании нового поколения антрациклинов удалось в 0,2 % концентрации и вводили крысам эксперимен-получить препараты с высоким терапевтическим тальных групп внутрибрюшинно в разовых дозах 4,5 индексом (идарубицин, эпирубицин, амрубицин и 3 мг/кг ежедневно в течение 14 дней с интервалом 24 и др.), кардиотоксичность которых была значитель- ч, что суммарно составило расчетную дозу, вызываю-но снижена [5]. Эффективные противоопухолевые щую гибель 50 % животных (ЛД50), и максимально пе-соединения с пониженной кардиотоксичностью реносимую дозу (МПД) соответственно. Перед нача-были найдены и среди антрацендионов — синтети- лом введения определяли фоновые показатели (массу ческих препаратов, близких к антрациклиновым тела, клинический анализ крови). На протяжении антибиотикам по структуре, механизму действия всего эксперимента наблюдали за состоянием и пове-и спектру противоопухолевой активности [6, 7]. дением животных, регистрировали изменения массы Однако развитие множественной лекарственной тела, проводили гематологическое исследование. Кли-устойчивости опухолевых клеток в ответ на тера- нический анализ крови (лейкоциты и лейкоформула, пию антрациклинами и антрацендионами опреде- эритроциты, гемоглобин, тромбоциты, гематокрит) ляет необходимость дальнейших исследований проводили при помощи автоматического гематологи-в этом направлении. ческого анализатора Abacus Junior Vt (Diatron, Ав-В ФГБНУ НИИНА было получено производное стрия). На 1-й и 30-й дни по окончании курса введений антрацендиона, на основе которого был разработан в сыворотке крови определяли уровни аланинами-противоопухолевый мультитаргетный препарат ан- нотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелоч-трафуран (ЛХТА-2034) (рис. 1), действующий на не- ной фосфатазы, креатинина, мочевины, билирубина сколько важных для опухолевого роста мишеней (прямого и общего), общего белка, альбумина, глюко-и обладающий высокой активностью в отношении зы (автоматический биохимический анализатор опухолевых клеток с фенотипами множественной ChemWell, Awareness Technology Inc, США). На 1-й лекарственной устойчивости [8]. и 30-й дни после курса введений, используя электроЦель исследования — изучение токсических кардиограф ЭК1Т-07 (Аксион, Россия), регистрирова-свойств разработанного прототипа лиофилизирован- ли электрокардиограмму во 2-м стандартном отведе-ной дозированной лекарственной формы антрафу- нии. На эти же сроки определяли суточный диурез рана для парентерального применения ЛХТА-2034 и осуществляли клинический анализ мочи (рН, лейко-[9, 10] в хроническом эксперименте на крысах. циты, эритроциты, кетоновые тела, белок, уробилино- ген, удельный вес, глюкоза, нитраты) (автоматический Материалы и методы анализатор мочи Laura Smart, Лахема, Чехия). Работа выполнена в соответствии с этическими Половину животных из каждой группы подвер-нормами обращения с животными, принятыми Ев- гали эвтаназии на 1-е сутки после окончания курса, ропейской конвенцией по защите позвоночных остальных — спустя 30 сут после курса. Животных о /---.^ обследовали на предмет внешних патологических ° °H /—N J признаков. На вскрытии проводили макроскопиче-^^^'''nh ское исследование состояния органов грудной Г |Т || | ^—ch3 2 и брюшной полости. Сердце, печень, почку, селезен-о ку, тимус взвешивали при помощи весов «СЕ153-С» II 1 *Ms°H (Сартогосм, Россия) и определяли их массовые коэффициенты. Антрафуран (ЛХТА-2034) Все полученные количественные данные подвер-Рис. 1. Структура антрафурана ЛХТА-2034 гались статистической обработке при помощи

4'2017 том 16 | vol. 16 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY

компьютерных программ StatPlus 2006 и Microsoft Excel с использованием t-критерия Фишера-Стью-дента. Различия считали достоверными приp <0,05.

Для патоморфологического исследования брали участки различных органов и тканей, фиксировали в 10 % нейтральном формалине, по стандартной методике заливали в парафин. Короткие серии срезов окрашивали гематоксилин-эозином.

Результаты

В результате проведенных исследований показано, что лекарственная форма антрафурана ЛХТА-2034 при 14-кратном ежедневном внутрибрюшинном введении в разовых дозах, составляющих 1/14 от МПД (3 мг/кг) и 1/14 от ЛД50 (4,5 мг/кг), хорошо переносится животными, изменений в состоянии и поведении не вызывает. Прирост массы тела подопытных животных не отличается от контроля. При применении ЛХТА-2034 в обеих исследуемых дозах не было выявлено влияния на клинический анализ периферической крови (общее количество и морфологический состав лейкоцитов, количество эритроцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина), биохимические показатели сыворотки крови, ЭКГ, суточный диурез и клинический анализ мочи.

Изучение патологических изменений внутренних органов крыс под действием ЛХТА-2034 показало, что применение ежедневно в течение 14 дней в дозе, суммарно составляющей МПД, не оказывает повреждающего действия на структуру большинства изученных органов и тканей экспериментальных животных. Умеренные патологические изменения в виде периваскулярного отека, который со временем ослаблялся, были найдены лишь в почках.

Введение препарата в высокой дозе приводило к повреждению структуры печени, почки, сердца, двенадцатиперстной и тощей кишки.

В печени изменения в виде единичных микронекрозов, расположенных перипортально, были найдены у 2 из 10 крыс (рис. 2а, б). Через месяц после курса введений очаги некроза в состоянии организации были обнаружены только у 1 животного (рис. 2в).

Повреждающее действие ЛХТА-2034 на миокард также было зарегистрировано у отдельных животных только через 30 дней по окончании введений. В циркулярном мышечном слое были найдены очаги отека мышечных волокон и стромы миокарда, единичные мелкие очаги деструкции кардиомиоцитов, инфильтрированные лимфоцитами и макрофагами (рис. 3).

б

рис. 2. Печень: а — интактный контроль. х 20; б — ЛХТА-2034. 4,5мг/кг х 14. 1-е сутки после курса. Очаг микронекроза вблизи портального тракта. Умеренный отек вокруг центральной вены. х 20; в — ЛХТА-2034. 4,5мг/кг х 14. 30-е сутки после курса. Очаг микронекроза с признаками организации вблизи портального тракта. х 20

б

рис. 3. Сердце: а — интактный контроль. х 20: б — ЛХТА-2034. 4,5мг/кг х 14. 30-е сутки после курса. Очаг деструкции кардиомиоцитов, инфильтрированный лимфоцитами и макрофагами. х 20

Оригинальные статьи

83

Рис. 4. Почка: а — интактный контроль. Корковая зона. х 20; б — ЛХТА-2034. 4,5мг/кг х 14. 1-е сутки после курса. Корковая зона. Сильный периваскулярньш отек. Очаговая деструкция капиллярной сети клубочка. Деструкция эпителия в части извитых канальцев. х 20; в — ЛХТА-2034. 4,5мг/кг х 14. 30-е сутки после курса. Корковая зона. Очаг некроза в состоянии организации. Кисты на месте деструкции канальцев и клубочков. х 20

Рис. 5. Двенадцатиперстная кишка: а — интактный контроль. х 20; б — 4,5мг/кг х 14. 1-е сутки после курса. Деструкция эпителия крипт и ворсин. В просвете кишки клеточный детрит и слущенный цилиндрический эпителий. х 20

Применение ЛХТА-2034 в высокой дозе позволило выявить его нефротоксические свойства. Они проявились в виде резкого периваскулярного отека, очаговых повреждений эпителия извитых канальцев и эндотелия капилляров клубочков в корковой и юк-стамедуллярной зонах (рис. 4а, б). У части животных эти изменения оказались стойкими и сохранялись до конца наблюдения, хотя очаги некроза в течение месяца подвергались организации (рис. 4в).

Применение препарата в высокой дозе привело к возникновению очаговых повреждений структуры слизистой оболочки двенадцатиперстной и тощей кишки, которая полностью восстанавливалась к концу эксперимента (рис. 5).

Обсуждение

Среди антрацендионов, полученных синтетическим путем, было обнаружено большое количество производных, обладающих противоопухолевой активностью. Наибольшая эффективность, подтвержденная клиническими испытаниями, отмечена у препаратов митоксантрон и аметантрон. Митоксантрон был внедрен в клиническую практику в начале 1980-х годов и в настоящее время используется для лечения лейкозов и солидных опухолей [13, 14]. Аметантрон

при клинических испытаниях продемонстрировал высокую противоопухолевую эффективность и сла-бовыраженную кардиотоксичность [15].

Хотя в исследованиях, проведенных на животных, было показано значительное снижение карди-отоксичности митоксантрона по сравнению с доксо-рубицином, в клинике она все же была выявлена наряду с другими видами токсичности [13]. Было установлено, что препарат в высоких дозах вызывает лейкоцито-, гранулоцито-, тромбоцито- и эритроци-топению, нарушения функции печени (повышение уровня билирубина, изменение активности аспарта-таминотрансферазы, аланинаминотрансферазы) [7].

В результате целенаправленных исследований связи структура—активность, проведенных в ФГБНУ НИИНА, было показано, что антра [2,3-Ь] фу-ран-3-карбоксамиды являются перспективным классом соединений для дальнейшего поиска химиотера-певтических средств [16, 17]. Соединение-лидер этого ряда антрафуран ЛХТА-2034 обладает способностью ингибировать активность нескольких внутриклеточных мишеней, важных для опухолевого роста, включая топоизомеразы I, II и протеинкиназы, и проявляет высокую противоопухолевую активность в экспериментах на животных [8]. Изучение его токсикологи-

ческого профиля, проведенное в данном исследовании, показало, что в переносимых дозах ЛХТА-2034 не оказывает повреждающего действия на структуру и функцию органов и тканей экспериментальных животных. В отличие от митоксантрона даже при применении в дозе, суммарно составляющей ЛД50, препарат не вызывает изменений клинико-лабораторных показателей, характеризующих функцию кроветворной, мочевыделительной, сердечно-сосудистой, пищеварительной систем организма крыс. Обратимые проявления нефро-, гепато- и гастроинтестинальной

токсичности были выявлены только при патоморфо-логическом исследовании. Умеренно выраженные признаки кардиотоксичности проявились лишь у отдельных животных.

Заключение

Изменения структуры внутренних органов крыс, возникающие под действием антрафурана ЛХТА-2034, зависят от величины примененной дозы и в основном являются обратимыми. Это позволяет рекомендовать его для дальнейшего изучения.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под ред.

Н.И. Переводчиковой. М.: Практическая медицина, 2015. 686 с.

2. Nadas J., Sun D. Anthracyclines

as effective anticancer drugs. Expert Opin Drug Discov 2006;1:549-568. PMID: 23506066. DOI: 10.1517/17460441.1.6.549.

3. Raj S., Franco V.I., Lipshultz S.E. Anthracycline-induced cardiotoxicity: a review of pathophysiology, diagnosis, and treatment. Curr Treat Options Cardiovasc Med 2014;16:315. PMID: 24748018.

4. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. М.: Практическая медицина, 2006. 503 с.

5. Переводчикова Н.И. Новые препараты группы антрациклинов. В кн.: Новые цитостатики в лечении злокачественных опухолей. Под ред. В.А. Горбуновой. М.: Медицина, 1998. С. 61-73.

6. Johnson R.K., Zee-Cheng R.K., Lee WW et al. Experimental antitumor activity

of aminoantraquinones. Cancer Treat Rep 1979;63:425-39. PMID: 427824.

7. Von Hoff D.D., Pollard E., Kuhn J. et al. Phase I clinical investigation of 1,4-dihy-droxy-5,8-bis(2-(2-hydroxyethyl)-ami-no)-9,10-anthracenedione dihydrochlo-

ride, a new antracenedione. Cancer Res 1980;40:83-7. PMID: 7370989.

8. Shchekotikhin A.E., Dezhenkova L.G., Tsvetkov V.B. et al. Discovery of antitumor anthra[2,3-b]furan-3-carboxamides: Optimization of synthesis and evaluation of antitumor properties. Eur J Med Chem 2016;112:114-29.

PMID: 26890118.

DOI: 10.1016/j.ejmech.2016.01.050.

9. Щекотихин А.Е., Сенкевич Ю.Б., Де-женкова Л.Г. и др. Противоопухолевый антрафурандион и фармацевтические композиции на его основе. Патент РФ № 2554939 от 03.06.15.

10. Treshalina H.M. , Romanenko V.I., Kaluzhny D.N. et al. Development and pharmaceutical evaluation of the anticancer Anthrafuran - Cavitron complex, a prototypic parenteral drug formulation. Eur J Pharm Sci 2017;109:631-7.

11. Council of Europe. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. ETS. 1986:123.

12. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К., 2012. Ч. 1. С. 13-24.

13. Zee-Cheng K.Y., Cheg C.C. Antineoplastic agents. Structure-activity relationship study of bis (substituted amino-alkyl-amino) antraquinnes. J Med Chem 1978;21:291-4. PMID: 628005.

14. Xiao P., Dumur F., Graff B. et al. Catio-nic and thiol-ene photopolymerization upon red lights using anthraquinone derivatives as photoinitiators. Macromole-cules 2013;46:6744-6750.

DOI: 10.1021/ma401513b.

15. Novak R.F. Anthracycline and anthracenedione-based anticancer agents (Bioactive molecules). Elsevier Science Pub. B.V., Amsterdam, 1988. V.6. 519 p.

16. Shchekotikhin A.E., Glazunova V.A., Dezhenkova L.G. et al. Synthesis and evaluation of new antitumor 3-amino-methyl-4,11-dihydroxynaphtho[2,3-f] indole-5,10-diones. Eur J Med Chem 2014;86:797-805. PMID: 25244612. DOI: 10.1016/j.ejmech.2014.09.021.

17. Tikhomirov A.S., Shchekotikhin A.E., Lee Y.H et al. Synthesis and characterization of 4,11-diaminoanthra[2,3-b]fu-ran-5,10-diones: tumor cell apoptosis through tNOX-modulated NAD+/ NADH ratio and SIRT1. J Med Chem 2015;58:9522-34. PMID: 26633734. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5b00859.