СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БРОМЕЛАЙНА, ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИСАХАРИДОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВИНИЛОВЫМИ МОНОМЕРАМИ
METHOD FOR PRODUCING IMMOBILIZED ENZYME PREPARATION BASED ON BROMELAIN, HYALURONIC ACID AND POLYSACCHARIDES MODIFIED WITH VINYL MONOMERS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу стабилизации бромелайна растворами гиалуроновой кислоты и графт-сополимерами с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА). Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии.
Бромелайн (КФ 3.4.22.4) - протеолитический фермент, найденный в различных растениях семейства бромелиевые (Bromeliaceae). Энзим, выделенный из Ananas comosus, является наиболее изученным. Молекула бромелайна из стебля этого растения содержит 285 аминокислотных остатков и представляет собой полипептидную цепь, скрепленную пятью дисульфидными связями и несущую одну сульфгидрильную группу. Оптимум каталитической активности фермента лежит при рН 7-10 в зависимости от субстрата, изоэлектрическая точка - 9.55. Константа Михаэлиса у бромелайна из разных источников имеет величину от 0.007 до 6.6 мМ. Температурный оптимум составляет 62°С.
Бромелайн широко распространен в медицинской практике, косметологии, кроме того, этот энзим используется в пищевой промышленности в тендеризации (размягчении) мясной продукции, для улучшения ее качества и свойств. Бромелайн применяется при косметическим лечении для уничтожения пигментации и рубцовой ткани [Патент RU 2429028 С2, МПК А61М 35/00, A61K 31/60, А61Р 17/02, А61Р 17/12, опубл. 20.09.2011, Бюл. №26], используется для изготовления лекарства для лечения и/или профилактики глазных болезней, которое обеспечивает уменьшение ангиогенеза [Патент RU 2472523 С2, МПК A61K 38/48, А61Р 27/02, опубл. 20.01.2013, Бюл. №2], входит в состав средств для профилактики заболеваний полости рта [Патент RU 2293551 C1, A61K 8/19, A61K 8/34, A61K 8/36, A61K 8/37, A61K 8/40, A61K 8/55, A61K 8/99, A61Q 11/00, опубл. 20.02.2007, Бюл. №5], профилактики распространения морщин, мимических морщинок, гиперпигментации, вялости и сухости кожи [Патент RU 2558848 С1, МПК A61K 8/98, A61Q 19/08, опубл. 10.08.2015, Бюл. №22]. Бромелайн используется в композиции, включающей гидролизованные белки дрожжей для обеспечения косметической активности и стабильности с течением времени [Патент RU 2491910 С2, МПК A61K 8/02, A61K 8/99, A61Q 5/12, A61Q 7/00, A61K 36/064, А61Р 17/06, А61Р 17/08, А61Р 17/10, опубл. 10.09. 2013, Бюл. №25].
Гиалуроновая кислота - природный линейный несульфатированный гликозаминогликан, представляющий собой крупные полисахаридные молекулы, состоящие из остатков D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, соединенных поочередно β-1,4- и β-1,3-гликозидными связями.
Существует множество препаратов в медицинской практике, косметологии, фармацевтической промышленности, которые включают гиалуроновую кислоту. Описана композиция на основе гиалуроновой кислоты, которая относится к наполнителям мягких тканей, например, кожным и подкожным наполнителям [Патент RU 2496473 С2, A61K 8/73, A61L 27/20, A61K 47/36, опубл. 27.10.13, Бюл. №30]. Гиалуроновая кислота используется для лечения глазных болезней, входит в состав имплантата, предназначенного для лечения глаукомы [Патент RU 2532333 С2, A61K 31/5575, А61Р 27/06, опубл. 10.11.2014, Бюл. №31]. В офтальмологии высокомолекулярная гиалуроновая кислота входит в состав мази для лечения повреждений переднего отрезка глазного яблока, которая обеспечивает усиление ранозаживляющего эффекта [Патент RU 2173136 C1, A61K 9/06, 31/728, А61Р 27/00, опубл. 10.09.2001]. Описан способ получения стерильного вязкоэластичного биополимера на основе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты для применения в медицине [Патент RU 2501811 С2, С08В 37/00, опубл. 20.12.2013, Бюл. №35]. Гиалуроновая кислота используется как средство, обладающее анаболическим действием и применяемое при патологических состояниях, связанных с мышечной дистрофией [Патент RU 2378007 C1, A61K 38/51, А61Р 21/06, опубл. 10.01.2010, Бюл. №1]. В косметологии известна композиция с омолаживающим действием и лифтинг-эффектом на основе гиалуроновой кислоты, которая позволяет достичь выраженный эстетический результат за счет физиологического механизма стимуляции выработки собственной гиалуроновой кислоты в коже [Патент RU 2543651 C1, A61K 8/44, A61K 8/64, A61Q 19/00, опубл. 10.03.2015, Бюл. №7].
Графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из N-винилимидазола или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата являются водорастворимыми в широкой области составов, кроме того водные растворы сополимеров, содержащих в боковых цепях звенья Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата являются термо- и рН-чувствительными и характеризуются наличием нижней критической температуры растворения (НКТР) [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and Ν,Ν-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z]. При содержании звеньев Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата от 45% выше и близком к нейтральному значению рН величина НКТР находится в области физиологических температур, что позволяет применять такие графт-сополимеры в качестве носителей для целевой доставки лекарственных средств [V.A. Kuznetsov, А.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol.76. P. 4929-4949; V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, M.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
На данный момент нет сведений о комплексах растительного фермента бромелайна с гиалуроновой кислотой и полисахаридами, модифицированными виниловыми мономерами, такими как графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА).
Известен способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2677343 С2, МПК A61L 15/38, A61K 38/56, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 16.01.2019, Бюл. №3], который включает иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрице ионообменных волокон ВИОН КН-1 или ВИОН АН-1 в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон; в качестве буферного раствора для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0.05 Μ глициновый буфер с рН 9.0-10,5 или 0.05 Μ боратный буфер с рН 8.0 без добавления KCl, а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0.2 Μ ацетатный буфер с рН 5.0; инкубация проводится в течение 24 часов при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Недостатком способа является получение ферментного препарата в твердой фазе, не позволяющей проникать молекулам бромелайна в глубокие слои кожи.
Запатентован способ стабилизации ферментов - пепсина, химотрипсина, трипсина, панкреатина, папаина и других протеаз, путем добавления в их растворы полисахаридов - гуаровой камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, крахмала, декстрана, пуллулана, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, каррагинана, пектина, хитозана и прочих полисахаридов, а также производных целлюлозы: карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы [JPH034791A].
Известен способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана, который включает иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; инкубирование при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 Μ глициновый буфер с рН 8,6 для пищевого хитозана или с рН 9,0-9,5 для сукцината хитозана; либо 0,05 Μ ацетатный буфер с рН 5,5 для пищевого хитозана или 5,0 для сукцината хитозана; инкубирование проводится в течение 2 часов. Изобретение позволяет увеличить скорость ферментативной реакции и повысить эффективность использования полученного препарата, в том числе при осуществлении реакции на твердых поверхностях [Патент RU 2691611, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 14.06.2019 Бюл. №17].
В отличие от этих двух способов предложенное нами использование полисахаридов (карбоксиметилцеллюлозы и хитозана), модифицированных виниловыми мономерами (N-винилимидазолом или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом) обеспечивает большее количество связей между полисахаридом и ферментом в ходе иммобилизации, что увеличивает прочность образуемого комплекса и пролонгирует процесс высвобождения фермента в область поврежденных тканей. Кроме того, добавление в препарат гиалуроновой кислоты, которая обладает свойством глубокого проникновения в различные слои кожи, будет способствовать более качественному очищению бромелайном поверхностных слоев кожи и слизистых оболочек от белковых загрязнений.
Известно, что полимеры на основе поли-β-гликозидов (целлюлозы и ее производных, хитозана, гиалуроновой кислоты и т.д.) склонны к образованию пленок, которые могут защитить кожу от пересыхания или обеспечить дополнительную защиту на поверхности раневого повреждения. Однако способность образовывать конъюгаты у таких полимеров несколько ограничена рядом факторов: поверхностным зарядом, типом функциональной группы и т.д. Поэтому для придания ряда новых свойств целесообразно проводить химическую модификацию природных полисахаридов. Так, например, введение азольных заместителей повышает комплексообразующую способность полисахаридов и снижает поверхностный отрицательный заряд карбоксиметилцеллюлозы [V.А. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949], а введение звеньев Ν,Ν-диметиаминоэтилметакрилата не только снижает поверхностный заряд, но придает водному раствору модифицированного полисахарида стимулочувствительные свойства [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
В качестве прототипа служила топическая противомикробная дерматологическая композиция [Патент RU 2668827 С2, МПК A61K 38/08, A61K 31/728, А61Р 31/00, А61Р 17/00, A61K 31/722, опубл. 02.10.2018, Бюл. №28], предложенная в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.
В отличие от прототипа в качестве действующего вещества мы используем не противомикробный пептид, а фермент бромелайн, который кроме антимикробных свойств обладает иммуномодулирующим действием, ускоряет процессы репарации тканей в результате деполимеризации межклеточных структур и модификации проницаемости сосудов, применяется для облегчения воспалительных процессов при травмах, снятия отека мягких тканей, а также для ускорения их восстановления после повреждений, обладает противораковыми свойствами и способностью предотвращать образование тромбов.
Кроме того, добавление нами в раствор графт-сополимеров карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) позволяет путем включения в полисахаридный гель (один из способов физической иммобилизации ферментов) дополнительно стабилизировать бромелайн и обеспечить ему пролонгированное действие.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе бромелайна, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы бромелайна можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи, при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение бромелайна, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.
Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающем растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Фиг. 1. Диаграмма значений каталитической активности (А) бромелайна в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 4°С.
Фиг. 2. Диаграмма значений каталитической активности (А) бромелайна в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 25°С.
Фиг. 3. Таблица 1. Вязкость препаратов, содержащих бромелайн, гиалуроновую кислоту и полисахариды, модифицированные виниловыми мономерами.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве стабилизирующих агентов применяли три вида гиалуроновой кислоты (ООО «Лаборатория Гиалика») с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) и 800 (ВМГК) кДа. В качестве матрицы для иммобилизации бромелайна применяли графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) с молекулярной массой 50-100 кДа.
Стабилизацию бромелайна осуществляли путем растворения его навески массой 10 мг в 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) или 800 (ВМГК) кДа в концентрации 1.5% с последующим перемешиванием при комнатной температуре до полного растворения. Затем к полученной смеси добавляли для иммобилизации бромелайна графт-сополимер карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) (при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля (табл. 1).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Измерение уровня протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине [ F. L. The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial characterization and the effect of feed on their composition // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry - 1992. - V. 103. - P. 575-578]. К 200 мкл образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера (рН 7.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при минус 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 200 мкл трис-HCl буфера и 200 мкл образца, который вносили после инкубации смеси в течение 2 часов при 37°С. За единицу каталитической активности бромелайна принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность бромелайна рассчитывали по формуле:
ПА=D*1000/120/200/C,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность пробы при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, в мкл,
1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Были проведены исследования стабильности бромелайна в растворах гиалуроновой кислоты (300, 500 и 800 кДа) по сравнению с нативным энзимом. Препараты инкубировали при 4 и 25°С в течение 0, 1, 2, 3, 7, 14 и 21 суток с дальнейшим измерением протеолитической активности. Полученные результаты отражены на фиг. 1, 2.
В ходе наших экспериментов было выявлено, что гиалуроновая кислота не ингибирует бромелайн. На фиг. 1 представлена диаграмма зависимости каталитической активности энзима от времени его хранения при 4°С. Установлено, что протеолитическая активность нативного бромелайна снижается с 1 до 7 дня инкубации с 80% до 35%. После 21 суток при температуре 4°С фермент сохраняет 32% своей активности. Бромелайн в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты после инкубации при 4°С на 1, 2 и 3 сутки проявляет 95, 87, 65% от исходной протеолитической активности. Энзим, находящийся в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты при 4°С, на 21 день имеет активность 37%. Установлено, что бромелайн в растворе среднемолекулярной гиалуроновой кислоты через 21 день сохраняет 59% своей активности при 4°С. Снижение каталитической способности в данном случае происходит постепенно без резких скачков. Активность бромелайна в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты после инкубации в холодильнике на 21 день составляет 76%.
На фиг. 2 изображена диаграмма изменения каталитической активности бромелайна после его хранения при 25°С. При 25°С нативный фермент снижает активность с 77% до 37% с 1 по 7 день инкубации, после 21 дня активность бромелайна составляет 34%. Энзим в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты после инкубации при 25°С на 1, 2 и 3 сутки сохраняет каталитическую способность на 88, 77, 57% от исходной протеолитической активности, на 21 день препарат бромелайна имеет 36% ферментативной способности. Бромелайн в растворе среднемолекулярной гиалуроновой кислоты через 21 день сохраняет 57% своей активности при 25°С. Показано, что активность бромелайна в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты после его хранения при 25°С на 21 день инкубации снижается до 44%.
Таким образом, был разработан способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) и высокомолекулярной (800 кДа) гиалуроновой кислоты с последующим добавлением графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) для иммобилизации бромелайна.
При этом полученный предложенным способом препарат можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а бромелайн при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи. Внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение бромелайна, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.