ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ р53 И с-erbB-2 ОНКОПРОТЕИНОВ ПРИ РАКЕ ЯИЧНИКОВ

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ р53 И c-erbB-2 ОНКОПРОТЕИНОВ ПРИ РАКЕ ЯИЧНИКОВ

ШУЛЬГА А.В.. БАСИНСКИЙ В.А.. САВИЦКИЙ С.Э.

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

УОЗ «Гродненская областная клиническая больница»

Резюме. В 69 случаях первичного рака яичников с помощью иммуногистохимического метода изучена экспрессия p53 и c-erbB-2 онкопротеинов. При серозном гистологическом типе выявлена зависимость экспрессии p53 от клинической стадии. наличия метастазов и общей пятилетней выживаемости больных. Гиперэкспрессия c-erbB-2 была связана со снижением пятилетней общей и безрецидивной выживаемости. При эндометриоидном и светлоклеточном гистологических типах новообразования данные маркеры не имели прогностической ценности.

Ключевые слова: рак яичников. иммуногистохимия. p53, c-erbB-2, прогноз

Abstract. Expression of p53. c-erbB-2 oncoproteins was investigated with immunohistochemical method in 69 cases of primary ovarian carcinoma. In serous histological type p53 expression dependence on clinical stage. presence of metastases and general five-year survival period of patients was revealed. Overexpression of c-erbB-2 was associated with decreased general five-year and disease-free survival periods. In endometrioid and clear cell histological types of cancer these markers were of no prognostic value.

Key words: ovarian cancer. immunohistochemistry. p53. c-erbB-2. prognosis

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. 230015. Гродно. ул. Горького . 80. УО «Гродненский государственный

медицинский университет» кафедры патологической анатомии. тел. 8(0152) 4334-57 - Шульга А. В.

Введение. Рост заболеваемости и высокая частота смертельных случаев предопределяет необходимость поиска дополнительных прогностических маркеров рака яичников (РЯ) и внедрения их в практическое здравоохранение для оптимизации и индивидуализации лечения больных.

Ген р53 - наиболее известный супрессор опухолей. играющий ключевую роль в клеточном цикле и развитии апоптоза, получивший символичное название «хранитель генома». При мутации р53 клетки вынуждены входить в клеточный цикл с поврежденной и нерепарированной ДНК. поэтому их деление становится неуправляемым процессом [1]. В норме белок р53, кодируемый одноименным геном, живет приблизительно 20 минут, так как быстро деградирует в протеосомах и поэтому в клетках большинства тканей находится на пороге детекции. Мутантный тип р53 (ш1 р53) существует от нескольких часов до дней и накапливается в ядрах опухолевых клеток [2]. Считается, что иммуногистохимическая (ИГХ) положительная реакция практически полностью зависит от наличия именно ш1 р53. Высокая частота поломок гена р53 при онкологических заболеваниях предопределяет повышенный интерес к данной проблеме и в настоящее время. Известно, что приблизительно в 50% первичных новообразований человека отмечаются мутации р53, а в злокачественных опухолях яичников мутации данного гена могут достигать 7580% [1, 3].

Нег-2/пеи (с-егЬВ-2) входит в семейство тирозинкиназных рецепторов, состоящее из 4 функционально взаимосвязанных рецепторных молекул, играющих важную роль в пролиферации, апоптозе и дифференцировке клеток, а также влияющих на работу ряда сигнальных каскадов [2].

В настоящее время определение НБК2-статуса широко используется при раке молочной железы, где гиперэкспрессию указанного маркера определяют с помощью ИГХ метода и при ее наличии для лечения с успехом используется моноклональное антитело - трастузамаб. При неопределенном ИГХ НБЯ2-статусе требуются исследования, выявляющие наличие амплификации гена:

хромогенная in situ гибридизация гена (CISH) или дорогостоящий. но более чувствительный метод флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) [4].

Публикации. посвященные изучению p53 и c-erbB-2 в РЯ. часто носят противоречивый характер. Большинство исследователей отмечают гиперэкспрессию указанных маркеров в РЯ по сравнению с доброкачественными. пограничными опухолями [5]. Некоторые авторы отмечают связь экспрессии р53 со степенью дифференцировки [3]. клинической стадией [6]. гистологическим типом [7]. выживаемостью [6]. а также чувствительностью к химиотерапии [8]. В других работах отрицается связь с данными клинико-морфологическими параметрами [9. 10. 11].

Наличие положительной реакции с антителами к c-erbB-2 в новообразованиях яичников по данным различных авторов регистрируется до 70% случаев [10]. Большинство исследователей связывают гиперэкспрессию с-erbB-2 с более агрессивным поведением опухоли. наличием метастазов. низкой степенью дифференцировки. снижением общей и безрецидивной выживаемости [8. 11. 12]. тогда как в других работах не находят связь данного маркера с продолжительностью жизни у больных РЯ. а также основными клиническими и морфологическими признаками [13]. Только в единичных публикациях проведена сравнительная характеристика экспрессии c-erbB-2 в РЯ разных гистологических типов. где данные носят разрозненный характер [9.14].

Цель исследования: провести сравнительный анализ экспрессии p53 и с-erbB-2 опухолевыми клетками в РЯ разных гистологических типов. степени дифференцировки и клинической стадии.

Материал и методы Исследование выполнено на архивном гистологическом материале 69 больных. оперированных по поводу РЯ в Гродненском областном онкологическом диспансере в период с 1999 по 2002 г. Анализ гистологических срезов. окрашенных гематоксилином и эозином. проводился согласно классификации ВОЗ (2003). Средний возраст в исследуемой группе составил

56,9±1,2 года. В послеоперационном периоде у большинства женщин (87%) были проведены стандартные режимы комбинированной химиотерапии.

Наиболее частым гистологическим типом РЯ был серозный (49). в 8 наблюдениях выявлена эндометриоидная аденокарцинома. в 7 случаях -светлоклеточный рак. ав 5 - муцинозный вариант новообразования. При этом в 14 наблюдениях степень дифференцировки рака была отнесена к G1. в 35 - к G2. а в 20 - к G3. Первая стадия. согласно классификации FIGO. была установлена у 15 женщин. вторая - у 12. а генерализация процесса наблюдалась в 42 случаях (третья стадия - 37. четвертая - 5). Общая пятилетняя выживаемость в исследуемой группе составила 27.5%.

ИГХ исследование материала проводили на серийных парафиновых срезах по стандартной методике с использованием мышиных моноклональных антител к р53 (клон D0-7. разведение 1:100. "Dako") и поликлональных кроличьих антител к c-erbB-2 (разведение 1:300. "Dako". А0485). Демаскировку антигенов осуществляли при 98°С в водяной бане в течение 40 мин.. применяя цитратный буфер (pH 6.0). В качестве детекционной системы использовали EnVision. Проводили положительные и отрицательные контрольные реакции.

Для оценки ядерной экспрессии р53 использовали индекс метки (ИМ). высчитывая процент позитивно окрашенных опухолевых клеток от общего количества в зонах с наибольшим их содержанием (позитивной считали реакцию при коричневой окраске более 10% ядер опухолевых клеток). Подсчет мембранной экспрессии c-erbB-2 проводили согласно общепринятой балльной системе Herceptest™ (0. 1+. 2+. 3+). Для оценки количества и степени окрашивания клеток использовали программы WCIF ImageJ и Aperio Image Scope. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Анализ данных ИГХ исследований показал. что положительная реакция с антителами к c-erbB-2 была выявлена в 24 (34.7%) случаях РЯ и проявлялась мембранным и цитоплазматическим окрашиванием различной степени

интенсивности, при этом выраженная реакция была более характерна для папиллярных структур, чем для солидного компонента опухоли. Оценивалась только мембранная локализация продуктов реакции: в 10 (14,5%) наблюдениях отмечалась экспрессия 1+, в 11 (15,9%) новообразованиях - 2+, а 3+ регистрировалась только в 3 (4,3%) опухолях. Таким образом, гиперэкспрессия (2/3+) указанного маркера была выявлена в 20,3% случаев. Экспрессия ш1 р53 была обнаружена в 62,3% (43 из 69) случаев РЯ. Окрашивание наблюдалось в ядрах опухолевых клеток, при этом реакция с антителами к данному онкопротеину отсутствовала в других клетках (стромальных, эндотелиальных, лимфоцитах). Следует отметить, что гиперэкспрессия ш1 р53 чаще всего наблюдалась в серозных опухолях поздних клинических стадий (78,4%, ИМ = 45,2±5,7%), а отсутствие данного маркера - в эндометриоидном и светлоклеточном гистологических типах РЯ (62,5% и 57,1%, соответственно). Гиперэкспрессия с-егЬБ-2 в большем проценте случаев по сравнению с общей группой была характерна для светлоклеточного рака (42,9%), а при эндометриоидном варианте - не наблюдалась (табл. 1).

Таблица 1

Экспрессия биомолекулярных маркеров в зависимости от гистологического типа и клинической стадии рака яичников______________

Гистологический тип, стадия (ст.) Маркер

Р53 СегБ-2

< 10% > 10% ИМ, % М±ш 0 1+ 2/3+

Серозный, 1-2 ст. 7

Серозный, 3-4 ст. 8

Эндометриоидный 5 (62,5) 3 (37,5) 13,6±5,9 7 (87,5) 1 (12,5) 0

Светлоклеточный 4

Муцинозный 2

Общая группа 26

Примечание: * - здесь и далее в таблице: первая цифра - абсолютная, вторая - %

Учитывая гетерогенность экспрессии изучаемых биомолекулярных маркеров в РЯ. мы проанализировали их как в общей группе. так и отдельно для каждого гистологического типа. Гиперэкспрессия с-егЬБ-2 онкопротеина в общей группе не зависела от гистологического типа (р=0,24), клинической стадии (р=0,08), наличия метастазов (р=0,21), но прослеживалась взаимосвязь со степенью дифференцировки: в низко дифференцированных

новообразованиях чаще наблюдалась гиперэкспрессия указанного маркера (Н =

6.2. р<0,05). Результаты теста Крускала-Уоллиса свидетельствовали о наличии статистически значимой связи между экспрессией ш1 р53 и клинической стадией (Н = 10,1, р<0,05), а также наличием метастазов (Н = 6.3. р<0,05). К тому же. ИМ при РЯ ранних клинических стадий составил 19±4,3%, а при поздних - 43,8±5,3%.

При серозном гистологическом типе РЯ экспрессия с-егЬБ-2 онкопротеина не была связана со степенью дифференцировки, клинической стадией, возрастом, развитием метастазов. М1 р53 был связан с клинической стадией (тест Крускала-Уоллиса: Н = 10. р=0,02) и наличием метастазов (Н =

6.3. р=0,01) (рис.1).

0 1 Метастазы: 0- отсуствие, 1 - наличие

Median 25%-75% Min-Max

Рис. 1 - Взаимосвязь гиперэкспрессии ш1 р53 в раковых клетках с клинической стадией новообразования

На рис. 1А видно, что все серозные аденокарциномы IV клинической

стадии имели гиперэкспрессию ш1 р53, а при III стадии такая же картина

наблюдалась в 75% случаев. Несмотря на то. что при эндометриоидном и светлоклеточном гистологических вариантах, чаще наблюдалось отсутствие экспрессии ш1 р53, не было найдено статистической зависимости от гистологического типа (р=0,09), а также от степени дифференцировки (р=0,14).

К тому же. ИМ при серозном РЯ ранних клинических стадий составил 25,4±8,3%, а при поздних - 45,2±5,7%. При отсутствии метастазов РЯ в клетках первичной опухоли в 75% случаев не наблюдалась гиперэкспрессия изучаемого маркера (рис. 1Б).

Все это, в совокупности, говорит об агрессивном фенотипе новообразований с наличием гиперэкспрессии изучаемого маркера.

В муцинозном раке положительная реакция с антителами к ш1 р53 отмечалась в 60% наблюдений, а ИМ был относительно низким и составил 19,6±7,2.

Подобные результаты получены авторами ряда работ [15]. но в нашем исследовании гиперэкспрессия данного онкопротеина наблюдалась только в группе с наличием метастазов (Н = 4. р=0,05). Полученные данные, прежде всего в связи с малым количеством наблюдений, требуют подтверждения на большем количестве случаев.

При эндометриоидном и светлоклеточном РЯ статистически значимой связи экспрессии изучаемых маркеров с клинико-морфологическими параметрами в нашей работе не наблюдалось.

Подобные результаты получены рядом исследователей, которые изучали р53 и с-егЬБ-2 при данных гистологических типах[15], но публикации, посвященные изучению этой проблемы, носят противоречивый характер.

В одних работах указывается на повышение уровня экспрессии с-егЬБ-2 онкопротеина при светлоклеточном РЯ [9]. в других - на незначительное количество таких случаев [14]. В нашем исследовании гиперэкспрессия этого маркера была выявлена в 42,9% случаев, что может свидетельствовать о худшем прогнозе при данном гистологическом типе.

Некоторые исследователи подчеркивают. что при эндометриоидном раке в сочетании с эндометриозом, характерен сравнительно больший уровень экспрессии изучаемых онкопротеинов [16]. но в нашей работе оценить эти данные не представлялось возможным.

о Complete Censored

А

Длительность жизни в месяцах

Длительность жизни в месяцах

Исследование общей и безрецидивной пятилетней выживаемости больных РЯ с помощью метода Каплана-Мейера (рис. 2) показало, что в группе пациентов с гиперэкспрессией с-егЬБ-2 и ш1 р53 отмечалось менее благоприятное течение заболевания, чем в группе с отсутствием реакции с данными антителами. Достоверные значения наблюдались при серозном РЯ, причем с-егЬБ-2 онкопротеин был связан как с общей пятилетней (р=0,023), так и с безрецидивной выживаемостью (р=0,03), а ш1 р53 имел прогностическое значение только для общей выживаемости больных (р=0,02).

Результаты проведенного исследования подчеркивают связь изученных маркеров с некоторыми клинико-морфологическими параметрами РЯ и прогнозом. Такое отличие в оценке прогностического значения р53 и с-егЬБ-2 при опухолях яичников в различных работах, по нашему мнению, можно объяснить различием контингентов больных, использованием разных систем оценки степени дифференцировки РЯ, определением критериев позитивности антител (в доступной нам литературе мы нашли 5 способов оценки

гиперэкспрессии антител к mt р53), а также применяемых методов статистической обработки полученных данных.

Заключение

Таким образом. определение уровня экспрессии таких биомолекулярных маркеров как р53 и c-erbB-2 в РЯ имеет несомненное практическое значение. Однако полученные данные свидетельствуют о необходимости оценки характера экспрессии данных онкопротеинов с обязательным учетом гистологического варианта новообразования. а не в общей группе. что приводит многих исследователей к противоречивым данным. В частности. если для серозного РЯ уровень экспрессии изучаемых маркеров связан с агрессивным фенотипом и снижением выживаемости. то при эндометриоидном и светлоклеточном гистологических типах это не имело прогностического значения.

Гетерогенность характера экспрессии р53 и c-erbB-2. а также противоречивость имеющихся литературных данных об их роли в оценке прогноза новообразования. свидетельствует о необходимости стандартизации проведения иммуногистохимических исследований и оценки их результатов.

Литература

1. Копнин. Б. П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза / Б. П. Копнин // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - № 1. - C. 5-33.

2. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза: учеб. пособие / А. А. Новик [и др.]; под ред. Ю. Л. Шевченко. - М.: ГЭОТАР-МЕД. 2004. - 224 с.

3. Prognostic significance of p53 mutation and p53 overexpression in advanced epithelial ovarian cancer: a gynecologic oncology group study / L. Havrilesky [et al.] // Journal of Clinical Oncology. - 2003. - Vol. 21. N 20. - P. 3814-3825.

4. Сравнительное иммуногистохимическое исследование HER-2 -статуса рака молочной железы с помощью стандартного набора "HercepTest" и

антител к c-erbB-2 / Л. Э. Завалишина [и др.] // Архив патологии. - 2008. - № 2. - С. 25-28.

5. Clinical and molecular comparison between borderline serous ovarian tumors and advanced serous papillary ovarian carcinomas / R. Halperin [et al.] // Eur. J. Gynaecol. Oncol. - 2001. - Vol. 22. N 4. - P. 292-296.

6. Distribution of p53 expression in tissue from 774 Danish ovarian tumour patients and its prognostic significance in ovarian carcinomas / E. V. Hogdall [et al.] // APMIS. - 2008 - Vol. 116. N 5. - P. 400-409.

7. Mutation and expression of the TP53 gene in early stage epithelial ovarian carcinoma / M. M. Leitao [et al.] // Gynecol. Oncol. - 2004. - Vol. 93. N 2. - P. 301306.

8. TP53 status determines clinical significance of ERBB2 expression in ovarian cancer / J. Kupryjanczyk [et al.] // British Journal of Cancer - 2004. - Vol. 91. - P. 1916-1923.

9. In vitro chemoresistance and biomarker profiles are unique for histologic subtypes of epithelial ovarian cancer / N. G. Cloven [et al.] // Gynecol. Oncol. -2004. - Vol. 92. N 1. - P. 160-166.

10.Relationship between expressions of p53. c-erbB2 genes. proliferating cell nuclear antigen and prognosis of patients with ovarian epithelial carcinoma / J. D. Li [et al.] // Chinese J. of Cancer. - 2002. - Vol. 21. N 3. - P. 292-296.

11.C-erbB-2. p53. and nm23 proteins as prognostic factors in patients with epithelial ovarian carcinoma / S. Tomic [et al.] // Croat Med. J. - 2003. - Vol. 44 - P. 429-434.

12. HER2/neu oncoprotein overexpression in epithelial ovarian cancer: evaluation of its prevalence and prognostic significance. Clinical study / E. Verri [et al.] // Oncology. - 2005. - Vol. 68. - P. 154-161.

13.Topoisomerase 1A. HER/2neu and Ki67 expression in paired primary and relapse ovarian cancer tissue samples / P. Surowiak [et al.] // Histol. Histopathol. -2006. - Vol. 21. - P. 713-720.

14.HER-2/neu expression in ovarian clear cell carcinomas / H. Iwamoto [et al.] // Int. J. Gynecol. Cancer. - 2003. - Vol. 13. N 1. - P. 28-31.

15.Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies / M. Kobel [et al.] // PLoS Med. - 2008. - Vol. 5. N 12. - P. 17491760.

16.Prefumo. F. Analysis of p53 and c-erbB-2 expression in ovarian endometrioid carcinomas arising in endometriosis / F. Prefumo. P. L. Venturini. E. Fulcheri // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2003. - Vol. 22. N 1. - P. 83-88.