Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья часть 2

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICO-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY

Обзорная статья / Review

УДК 664.162.036.4:577.15

DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-26-35

БИОКОНВЕРСИЯ НЕПИЩЕВОГО ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ ЧАСТЬ 2

© Е.И. Макарова, В.В. Будаева

Институт проблем химико-энергетических технологий CO РАН

Целью обзора является описание механизма ферментативного гидролиза целлюлозной и геми-целлюлозной составляющих сырья, обобщение опубликованных материалов и краткое изложение обоснования зависимости эффективности ферментативного гидролиза субстратов от ряда факторов с включением результатов собственных исследований. Представленные результаты получены авторами при исследовании исключительно непищевых недревесных целлюлозосодер-жащих видов сырья. Обзор сведений по биоконверсии сырья в доброкачественные глюкозные гид-ролизаты включает ряд обязательных положений для получения перспективных питательных сред для микробиологического синтеза. Поэтапно описан сложный механизм ферментативного гидролиза целлюлозной и гемицеллюлозной частей сырья. Рассмотрены факторы, оказывающие влияние на эффективность протекания ферментативного гидролиза: характеристики субстратов, условия проведения реакции (температура и кислотность среды), дозировка используемого целлюлазного комплекса и использование поверхностно активных веществ. В заключительной части представлена разработанная авторами технология биоконверсии перспективных видов (российского мискантуса и плодовых оболочек овса) в глюкозные гидролизаты. Технология включает в себя обработку сырья в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты или гид-роксида натрия и ферментативный гидролиз полученного субстрата при оптимальных параметрах процесса с использованием высокоэффективной мультиэнзимной композиции. Показано, что полученные таким образом водные гидролизаты - растворы сахаров с преимущественным содержанием глюкозы - путем микробиологического синтеза могут быть преобразованы в этанол и бактериальную целлюлозу. Установлено, что, несмотря на многообразие научно обоснованных подходов к эффективной биоконверсии недревесного сырья, предложенная авторами технология обладает рядом преимуществ.

Ключевые слова: целлюлозосодержащее сырье, ферментативный гидролиз, характеристики субстрата, параметры гидролиза, целлюлазный комплекс.

Формат цитирования: Макарова Е.И., Будаева В.В. Биоконверсия непищевого целлюлозосодержа-щего сырья. Часть 2 // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6, N 3. С. 26-35. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-26-35

BIOCONVERSION OF NON-FOOD CELLULOSIC BIOMASS. PART 2

E.I. Makarova, V.V. Budaeva

Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies SB RAS

This review aims to describe the mechanism of enzymatic hydrolysis of the cellulosic and hemicellulosic fractions of biomass, generalize published materials, and briefly substantiate the efficacy of enzymatic hydrolysis of substrates subject to a number of factors; the results of our own research are also given. Our findings presented herein have been obtained by investigating exclusively non-food, non-woody cellulosic feedstocks. The overview of data on the biorefining of biomass into good quality glucose hydrolyzates encompasses a spectrum of mandatory engineering aspects for the production of promising nutrient broths to be used for microbiological synthesis. The complex mechanism of enzymatic hydrolysis of the cellulosic and hemicellulosic fractions of biomass is described stepwise. The following factors that affect the enzymatic hydrolysis efficacy are discussed: substrate characteristics, reaction conditions (temperature and broth acidity), dosage of the cellulase cocktail used, and application of surfactants. The conclusion section introduces a proprietary

technology for the biorefining of the promising feedstocks, Russian Miscanthus and oat hulls, into glucose hydrolyzates. The technology involves a one-stage processing of the feedstocks with dilute nitric acid or sodium hydroxide and enzymatic hydrolysis of the resultant substrate under optimum process conditions by using a high-performance enzyme cocktail. It is shown that the aqueous hydrolyzates (sugar solutions containing chiefly glucose) thus obtained can be converted into ethanol and bacterial cellulose via microbiological synthesis. Despite a diversity of scientifically substantiated approaches to the efficient biorefining of nonwoody raw materials, the technology suggested herein offers a range of advantages. Keywords: cellulosic biomass, enzymatic hydrolysis, substrate characteristics, hydrolysis conditions, cellu-lase complex

For citation: Makarova E.I., Budaeva V.V. Bioconversion of non-food cellulosic biomass. Part 2. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no 3, pp. 26-35. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-26-35

Целью второй части обзора является описание механизма ферментативного гидролиза целлюлозной и гемицеллюлозной частей сырья, обобщение опубликованных материалов и краткое изложение обоснования зависимости эффективности ферментативного гидролиза субстратов от факторов (характеристики субстрата, параметры процесса, характеристики целлюлазного комплекса) с включением результатов собственных исследований.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ

КОМПОНЕНТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО

СЫРЬЯ

Гидролиз целлюлозы. Ферментативная деструкция целлюлозы происходит под действием целлюлолитических ферментов - целлюлаз [1, 2]. Целлюлоза является сложным субстратом для действия ферментов, и в мире нет пока продуцентов, которые бы в полной мере были экономически рентабельными и удовлетворяли потребности отраслей, применяющих целлюлазы [3]. Целлюлоза разрушается представителями многих родов микроорганизмов - Alternaria tenuis, Aspergillus amstelodamy, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Fusarium culmorum и др. [4, 5].

В состав целлюлазного комплекса входят, по меньшей мере, четыре фермента. Эти ферменты прочно адсорбируются на целлюлозе и остаются адсорбированными с ней в ходе постепенной деградации субстрата, так что данный процесс фактически представляет собой реакцию под действием иммобилизованных (точнее автоиммобилизованных) ферментов. Продуктом реакции может быть или глюкоза, или смесь оли-госахаридов (главным образом глюкозы и цел-лобиозы). Состав продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы зависит от состава целлюлозного комплекса ферментов и от вида цел-люлозосодержащего сырья1 [6].

Общая схема ферментативного гидролиза целлюлозы представлена на рис. 1. Эндоглю-

1 Березин И.В., Мартинек К. Введение в прикладную энзимологию. М.: Изд-во Московского университета, 1982. 384 с.

каназам принадлежит важнейшая роль в действии полиферментных систем, поскольку они первыми «атакуют» целлюлозу. К эндоглюкана-зам следует отнести два фермента: экзо-1,4-глюкозидазу и целлобиогидролазу, которые могут с нередуцирующего конца поли- и олигомерных производных целлюлозы отщеплять, соответственно, глюкозу и целлобиозу. Эти ферменты действуют на аморфную целлюлозу и растворимые р-олигосахариды. Характерными особенностями целлобиогидролазы является способность гидролизовать нерастворимую целлюлозу с образованием целлобиозы.

Экзоглюканазы катализируют выделение целлобиозы либо из восстанавливающего конца (CBHI), либо из невосстанавливающего конца (CBHII) целлюлозы в зависимости от своего типа. При этом происходит отщепление целлобиозы (основной продукт) и глюкозы (минорный продукт) в процессе гидролиза целлюлозы или целлоолигосахаридов.

р-глюкозидаза (или целлобиаза) действует на растворимые целлоолигосахариды, включая целлобиозу. При этом гидролитически отщепляет концевые нередуцирующие остатки р^-глюкозы по механизму двойного замещения с освобождением молекулы глюкозы. Фермент может гидро-лизовать р^-глюкозиды и целлобиозу. р-глюкозидазы могут гидролизовать 1-2, 1-3, 1-4 и 16 гликозидные связи2 [6, 8].

Концентрация фермента в реакционной смеси может снижаться в процессе гидролиза по следующим причинам: часть фермента прочно адсорбируется на негидролизуемой фракции целлюлозы; часть остается в растворе, содержащем глюкозу; и часть инактивируется в ходе гидролиза (в результате теплового воздействия или эффекта истирания при перемешивании) [5].

Гидролиз гемицеллюлоз. К числу наиболее распространенных видов гемицеллюлозы высших растений относятся ксилоглюканы, кси-ланы, тюканы, галактаны, маннаны [6]. При

2 Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.

^ эндоглюканаза р-глюкозидаза

Рис. 1. Механизм действия целлюлазного комплекса на целлюлозу [7]

ферментативном гидролизе ксилоглюкана лимитирующей стадией реакции является отщепление боковых цепочек от глюкановой цепи. Гидролиз а-1,6-связи, соединяющей кси-лозные остатки с глюканом, катализирует фермент ксилозидаза. После полного отщепления боковых цепочек ксилоглюкан превращается в р-1,4-глюкан, который может быть гидролизован с помощью целлюлолитических ферментов.

Ксилозидаза входит в состав ферментных комплексов целлюлозных препаратов в качестве сопутствующего фермента. Препараты ксилозидазы отдельно не производятся. Кроме того, в ксиланолитических комплексах находят фермент экзодействия, отщепляющий от кси-ланов ксилобиозу, а также фермент ксилобиа-зу, гидролизующий ксилобиозу (аналоги цел-лобиогидролазы и целлобиазы в целлюлазных комплексах).

Примеры гидролиза других представителей гемицеллюлоз (ксиланов, арабиноксила-нов, глюканов) описаны в работах [9, 10].

Ферментативный гидролиз гемицеллюлоз [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://tweetbot.ru/pi-

schevaya-biotehnologiya/96-gemicellyulozy-chast-3.html.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА

К факторам, оказывающим влияние на эффективность протекания ферментативного гидролиза целлюлозных субстратов, относятся характеристики субстратов, условия проведения реакции (температура и кислотность среды), активность используемого целлюлазного комплекса [11].

Характеристики субстрата Концентрация субстрата. Концентрация субстрата - один из главных факторов, оказывающих влияние на выход и начальную скорость ферментативного гидролиза.

При пониженной начальной концентрации субстрата, концентрация сахаров в гидролиза-те, и, соответственно, концентрация полученных из них биопродуктов не может быть высокой. Исследование ферментативного гидролиза при повышенной начальной концентрации субстрата является важным этапом для масштабирования этого процесса до пилотного промышленного производства [12]. Проведение гидролиза при повышенных начальных концентрациях субстрата позволяет не только получить высокую концентрацию сахаров и

биопродуктов, но и исключить дополнительные операции для концентрирования гидролизатов (упаривания и других технологических процессов) [13, 14]. Однако при ферментолизе цел-люлозосодержащих субстратов при повышенных исходных концентрациях возникает ряд проблем. В частности, авторами показано, что повышение концентрации субстрата выше определенного оптимального значения, что приводит к снижению скорости реакции и выхода сахаров по причине субстратного ингибиро-вания ферментов, степень которого пропорционально зависит от отношения количества субстрата к ферменту [7, 8]. Кроме того, при повышении концентрации субстрата возрастает вязкость системы, следовательно, возникают трудности массопереноса ферментов [15, 16].

Степень кристалличности целлюлозы. По мнению многих авторов, степень кристалличности целлюлозы считается важнейшим структурным параметром, оказывающим влияние на успешность ферментативного гидролиза [17-19].

Авторы4 полагают, что между показателем степени кристалличности субстратов, не содержащих лигнин, и их реакционной способностью наблюдается четкая отрицательная линейная зависимость: чем больше степень кристалличности субстрата, тем меньше начальная скорость его гидролиза. Эта корреляция наблюдалась и для глубокого гидролиза целлюлозы. Однако для лигнинсодержащих видов целлюлозы изменение степени кристалличности не влияет на скорость ферментативного гидролиза. Делигнификация таких видов целлюлозы, как правило, изменяет степень кристалличности незначительно, но, тем не менее, увеличивает реакционную способность. Это происходит только за счет увеличения удельной площади поверхности делигнифици-рованной целлюлозы.

Некоторые исследователи придерживаются мнения, что степень кристалличности не является ключевым фактором, обуславливающим эффективность ферментативного гидролиза [20, 21].

Степень полимеризации целлюлозы. Зависимость между начальной скоростью гидролиза целлюлозы и значением степени полимеризации практически отсутствует [8]. Аналогично отсутствует значимая линейная зависимость между степенью полимеризации и выходом продуктов гидролиза через 24-48 ч. Субстраты, имеющие большую степень полимеризации (хлопковый линт - 950-1200, регенири-рованная целлюлоза - 800-980), отличаются

4 Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.

друг от друга по реакционной способности на порядок (начальные скорости гидролиза равны 0,09-0,12 г/(лч) для нативного линта; 0,84 и 1,05 г/(л ч) для регенирированной целлюлозы), перекрываясь по скорости гидролиза с целлюлозой, которая имеет маленькое значение степени полимеризации (280-320 для измельченного линта, 160-170 для микрокристаллической целлюлозы) при начальных скоростях гидролиза 0,4-0,6 г/(лч)5.

Очевидно, что степень полимеризации целлюлозы служит индикатором структурных изменений целлюлозы, но не является решающим фактором, влияющим на реакционную способность при ферментативном гидролизе. Степень полимеризации изменяется одновременно со степенью кристалличности и площадью поверхности целлюлозы. Однако если степень полимеризации целлюлозы является основным и единственным физико-химическим параметром, который подвергается изменению, он может оказывать влияние на степень гидролиза [22].

Удельная площадь поверхности. Адсорбция ферментов на поверхности субстрата является первым этапом в осуществлении ферментативного гидролиза, следовательно, влияние удельной площади поверхности на эффективность процесса должно быть значительным.

Исследователями ферментолиза достаточно подробно обсуждалась взаимосвязь доступной площади поверхности пор и гидроли-зуемостью субстрата, и установлено, что доступная площадь поверхности не является основным фактором, влияющим на степень гидролиза целлюлозы. Как известно, набухшие целлюлозные материалы могут содержать межфибрильные поры и капилляры с радиусом более 10 нм, поэтому нет проблемы для проникновения целлюлаз со средним радиусом 45 нм [23] в развитую пористую структуру таких субстратов.

Массовая доля влаги. В работе [23] показано, что высушивание влажных образцов привело к снижению степени конверсии целлюлозы вследствие необратимого разрушения объема пор. Содержание некристаллических областей (Ах) в целлюлозе оказало самое большое влияние на скорость ферментативного гидролиза и среднюю степень конверсии (аа) целлюлозы в глюкозу. Установлена линейная зависимость аа = ^Ах) для высушенных и влажных образцов целлюлозы.

Массовая доля лигнина. Лигнин препятствует протеканию гидролиза, блокируя доступ целлюлаз к целлюлозе и необратимо связывая гидролитические ферменты. Следовательно,

5 Там же.

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ 29

удаление лигнина может заметно повысить скорость гидролиза [11, 24].

В работе [19] показано, что обработка де-лигнификацией улучшает начальный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз путем увеличения количества центров субстрата, доступных ферментам на этих полисахаридах, поэтому увеличение начальной скорости гидролиза целлюлозы и гемицеллюлоз частично является следствием снижения количества неспецифических связующих центров на лигнине, делая субстрат более доступным для гидролиза.

Параметры процесса

Температура. Влияние температуры на активность ферментов показано на рис. 2. В пределах физиологических условий и близких к ним скорость реакции растет с увеличением температуры (кривая 1), но выше 100 оС начинается тепловая денатурация белковой молекулы - инактивация фермента (кривая 2). Эти два явления объясняют форму кривой, близкую к колоколообразной, и появление температурного оптимума реакции [4, 25]. Не все ферменты одинаково меняют свою активность с изменением температуры. Максимальная активность ферментов колеблется в зоне температур 30-50 оС. Вполне отчетливо наблюдается снижение активности при 60-70 оС; при 100 оС каталитическое действие большинства ферментов прекращается практически мгновенно.

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции чрезвычайно многообразно. Оно проявляется в действии фермента на белковую структуру, изменении скорости образования фермент-субстратного комплекса и комплекса фермент-продукт и расщеплении последнего. Температура также влияет на число столкновений молекул субстрата с молекулами фермента6 [5].

Кислотность среды. рН среды - второй важный фактор, влияющий на активность ферментов. Каждый фермент проявляет свое действие в пределах довольно узкой зоны рН. Оптимальное значение рН для различных ферментов неодинаковое. Большое число ферментов в клетках имеет оптимум рН, близкий к нейтральному, т.е. совпадающий с физиологическими значениями рН живой клетки [5].

Ферментный комплекс

Дозировка фермента. Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от дозировки фермента. Существующая ли-

нейная зависимость между этими величинами, когда скорость реакции прямо пропорциональна количеству присутствующего фермента, справедлива только в определенных условиях, например в начальный период ферментативной реакции, так как в этот период практически не происходит обратной реакции, а концентрация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции. Именно в этом случае начальная скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента8. Повышение дозировки целлюлаз до определенной степени в процессе ферментативного гидролиза может повысить скорость и выход гидролиза, но существенно увеличивает стоимость процесса. Для лабораторных исследований часто используется дозировка целлюлазы 10 FPU/г целлюлозы, поскольку при этом обеспечивается высокий выход глюкозы за короткий промежуток времени. Дозировка целлюлазы может варьироваться от 7 FPU/г до 33 FPU/г субстрата, в зависимости от вида и концентрации субстрата [11].

Использование поверхностно-активных веществ. Ферментативный гидролиз целлюлозы состоит из трех этапов: адсорбция цел-люлазных ферментов на поверхности целлюлозы, биоразрушение целлюлозы до сбраживаемых сахаров и десорбция целлюлазы. Активность целлюлазы снижается в процессе гидролиза. Часть целлюлазы необратимо адсорбируется на целлюлозе и происходит ее частичная деактивация.

Добавление поверхностно-активных веществ в процессе гидролиза способствуют сохранению развитой поверхности субстрата и минимизации необратимого связывания цел-люлазы на целлюлозе [26, 27]. Следовательно, добавление поверхностно-активных веществ способствует повышению эффективности фер-

Рис. 2. График зависимости активности ферментов от температуры

Березин И.В., Мартинек К. Введение в прикладную энзимологию. М.: Изд-во Московского университета, 1982. 384 с.

7 Там же.

Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.xumuk.ru/biolog-Мт/052.Мт1.

ментолиза. По мнению авторов работы [11] добавление органических добавок позволяет ускорить процесс ферментативного расщепления субстрата, увеличить выход целевого продукта и снизить расход ферментных препаратов. Могут использоваться поверхностно-активные вещества «Тшееп 20», «Тшееп 80», «Ети1деп 147» и др. [26].

НОВЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА СУБСТРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РОССИЙСКОГО МИСКАНТУСА И ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА На основании проведенного литературного поиска было установлено, что отсутствует информация по ферментативному гидролизу перспективных видов непищевого целлюлозо-содержащего сырья: российского мискантуса и плодовых оболочек овса. В связи с вышеизложенным были проведены исследования и разработана технология биоконверсии приведенных видов сырья в глюкозные гидролизаты. Технология включает в себя обработку сырья в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты или щелочи и ферментолиз полученного субстрата при оптимальных параметрах процесса с использованием высокоэффективной мультиэнзимной композиции.

Мультиэнзимная композиция состоит из комплекса целлюлазных, ксиланазных и р-глюканазных ферментов и по сравнению с индивидуальными препаратами приводит к увеличению выхода редуцирующих веществ при гидролизе исследуемых субстратов на 7-24%.

Рассчитаны оптимальные параметры ферментативного гидролиза разработанной муль-тиэнзимной композицией, которые позволяют получить максимальный выход редуцирующих веществ: температура (45 ± 2) оС, рН (4,6 ± 0,3) и концентрация субстрата 30 г/л. Продолжительность процесса - для каждого вида суб-

9

страта отдельно .

На модели продуктов химической переработки мискантуса установлено отсутствие корреляции между реакционной способностью к ферментативному гидролизу и физико-химическими характеристиками субстратов: продукты с высокими значениями степени полимеризации (1000) и степени кристалличности (6572%) целлюлозы при гидролизе обеспечивают выход редуцирующих веществ от массового содержания гидролизуемых компонентов 9193%. Обнаружено отсутствие ингибирующего действия кислотонерастворимого лигнина в со-

9 Макарова Е.И. Биоконверсия непищевого целлюло-зосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК: дис. ... канд. техн. наук: 03.01.06. Щелково, 2015. 161 с.

ставе лигноцеллюлозного материала на ферментные препараты: субстраты с массовой долей лигнина 9-12% обеспечивают выход редуцирующих веществ от массового содержания гидролизуемых компонентов 92-98%.

Сравнительная оценка различных способов предварительной обработки (гидротермо-барической обработки [28, 29], гидротропной варки [30], обработки разбавленным раствором кислоты [31] или щелочи) показала, что максимальный выход редуцирующих веществ (92-100%) достигается при обработке разбавленным раствором кислоты или щелочи, независимо от вида сырья.

Первые результаты по получению спирта из предварительно обработанного российского мискантуса и плодовых оболочек овса (образцов целлюлозы) представлены в 2012-2014 гг. [32, 33].

Разработанная технология была интегрирована в комплексную схему переработки недревесного сырья в полезные продукты и внедрена на опытно-промышленном производстве ИПХЭТ СО РАН [34]. Произведена наработка укрупненных партий опытных образцов субстратов, которые затем были использованы при ферментативном гидролизе в водной среде в ферментере емкостью 11 л и реакторе объемом 63 л. Полученные водные гидролиза-ты - растворы сахаров с преимущественным содержанием глюкозы - путем микробиологического синтеза преобразуются в этанол (культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae) [32], бактериальную целлюлозу (культура Miduso-myces gisevii J. Lindau) [35].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе представлен сложный механизм ферментативного гидролиза целлюлозной и гемицеллюлозной частей сырья, обобщена информация, кратко изложено обоснование зависимости эффективности процесса от ряда факторов, а также описана авторская технология биоконверсии перспективных видов непищевого целлюлозосодержащего сырья (российского мискантуса и плодовых оболочек овса) в глюкозные гидролизаты - перспективные питательные среды для микробиологического синтеза этанола и бактериальной целлюлозы.

1. Никитин В.М., Оболенская А.В., Щеголев В.П. Химия древесины и целлюлозы. М.: Лесная промышленность, 1978. 370 с.

2. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимоло-гия. М.: Академия, 2005. 472 с.

3. Kalia S., Kaith B.S., Kaur I. Cellulose fibers: bio- and nanopolymer composites. Berlin: Springer,

2011. 758 p.

4. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

5. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар, 2000. 512 с.

6. Jordan D.B., Bowman M.J., Braker J.D., Dien B.S., Hector R.E., Lee C.C., Mertens J.A., Wagschal K. Plant cell walls to ethanol // Biochemical Journal.

2012. N 442. P. 241-252. D0l:10.1042/BJ20111 922.

7. Lynd L.R., Weimer P.J., Van Zyl W.H., Preto-rius I.S. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2002. Vol. 66, N 3. Р. 506-577. DOI: 0.1128/MMBR.66.3.506-577.2002.

8. Клесов А.А., Рабинович М.Л. Ферментативный гидролиз целлюлозы // Биоорганическая химия. 1980.Т. 6, N 8. С. 1225-1242.

9. Selig M.J., Knoshaug E.P., Adney W.S., Himmel M.E., Decker S.R. Synergistic enhancement of cellobiohydrolase performance on pretreated corn stover by addition of xylanase and esterase activities // Bioresource Technology. 2008. N 99. 4997-5005. D0I:10.1016/j.biortech.2007.09.064.

10. Yu P., McKinnon J.J., Maenz D.D., Olkow-ski A.A., Racz V.J., Christensen D.A. Enzymic release of reducing sugars from oat hulls by cellulase, as influenced by Aspergillus ferulic acid esterase and Trichoderma xylanase // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003. N 51. Р. 218-223. DOI: 10.1021/jf010984r.

11. Sun Y., Chehg J. Hydrolysis of lignocellulo-sic materials for ethanol production: a review // Biore-sourse Technology. 2002. N 83. Р. 1-11. DOI: 10.1007/s00253-009-1883-1.

12. Ioelovich M., Morag E. Study of enzymatic hydrolysis of pretreated biomass at increased solids loading // Bioresources. 2012. N 7. Р. 4672-4682. DOI: 10.15376/biores.7.4.4672-4682.

13. Modenbach A.A., Nokes S.E. The use of high-solids loadings in biomass pretreatment - A review // Biotechnology and Bioengineering. 2012. N 109. Р. 1-13. DOI: 10.1002/bit.24464.

14. Wingren A., Galbe M., Zacchi G. Techno-economic evaluation of producing ethanol from softwood: Comparison of SSF and SHF and identification of bottlenecks // Biotechnology Progress. 2003. N 19. Р. 1109-1117. DOI: 10.1021 /bp0340180.

15. Hodge D.B., Karim M.N., Schell D.J., McMillan J.D. Soluble and insoluble solids contributions to high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellu-lose // Bioresource Technology. 2008. N 99. Р. 8940-

КИЙ СПИСОК

8948. DOI: 10.1016/j.biortech.2008.05.015.

16. Jorgensen H., Vibe-Pedersen J., Larsen J., Felby C. Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations // Biotechnology and Bioengineering. 2007. V. 96, № 5. Р. 862-870. DOI: 10.1002/bit.21115.

17. Hall M., Bansal P., Lee J., Realff M., Bom-marius A. Cellulose crystallinity - A key predictor of the enzymatic hydrolysis rate // FEBS Journal. 2010. Vol. 277, N 6. Р. 1571-1582. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2010.07585.x.

18. Li L., Zhou W., Wu H., Yu Y., Liu F., Zhu D. Relationship between crystallinity index and enzymatic hydrolysis performance of celluloses separated from aquatic and terrestrial plant materials // BioRe-sourses. 2014. Vol. 9, N 3. Р. 3993-4005. DOI: 10.15376/biores.9.3.3993-4005.

19. Yoshida M., Liu Yu., Uchida S., Kawarada K., Ukagami Yu., Ichinose H., Kaneko S., Fukuda K. Effects of cellulose crystallinity, hemicellulose, and lignin on the enzymatic hydrolysis of Miscanthus sinensis to monosaccharides // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 2008. Vol. 72, N 3. Р. 805810. DOI: 10.1271/bbb.70689.

20. Chen Y., Stipanovic A.J., Winter W.T., Wilson D.B., Kim Y.J. Effect of digestion by pure cellu-lases on crystallinity and average chain length for bacterial and microcrystalline celluloses // Cellulose. 2007. N 14. Р. 283-293. DOI: 0.1007/s10570-007-9115-2.

21. Mansfield S.D., Mooney C., Saddler J.N. Substrates and enzyme characteristics that limit cellulose hydrolysis // Biotechnology Progress. 1999. N 15. Р. 804-816. DOI:10.1021/bp9900864.

22. Hallac B.B., Ragauskas A.J. Analyzing cellulose degree of polymerization and its relevancy to cellulosic ethanol // Biofuels, Bioproducts and Biore-fining. 2010. N 5. Р. 215-225. DOI: 10.1002/bbb.269.

23. Ioelovich M., Morag E. Effect of cellulose structure on enzymatic hydrolysis // BioResources. 2011. Vol. 6, № 3. P. 2818-2834. DOI: 10.15376/bio-res.6.3.2818_2835.

24. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and lig-nocellulosic chemistry // Bioenergy Research. 2012. N 5. Р. 1043-1066. DOI: 10.1007/s12155-012-9208-0.

25. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ: новый справочник химика и технолога. СПб.: НПО «Профессионал», 2006. 916 c.

26. Зиновьева М.Е., Гамаюрова В.С., Бур-масова М.А. Интенсификация процесса гидролиза целлюлозы ферментным препаратом DENYCEL 100 CG при добавлении некоторых органических соединений // Вестник Казанского технологического университета. 2009. N 6. С. 130-135.

27. Taherzadeh M., Karimi K. Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review // Bioresources. 2007. Vol. 2, N 4. Р. 707-738.

28. Budaeva V.V., Makarova E.I., Skiba E.A.,

Sakovich G.V. Enzymatic hydrolysis of the products of hydro-thermobaric processing of Miscanthus and oat hulls // Catalysis in Industry. 2013. Vol. 5, N 4. P. 335-341. DOI: 10.1134/S207005041304003X.

29. Makarova E.I., Budaeva V.V., Skiba E.A., Sakovich G.V. Enzymatic hydrolysis of celluloses obtained via the hydrothermal processing of Miscanthus and oat hulls // Catalysis in Industry. 2014. Vol. 6, N 1. P. 67-71. DOI: 10.1134/S2070050414010061.

30. Pavlov I.N., Denisova M.N., Makarova E.I., Budaeva V.V., Sakovich G.V. Versatile thermobaric plant and producion of hydrotropic cellulose therein // Cellulose Chemistry and Technology. 2015. Vol. 49, N (9-10). P. 847-852.

31. Budaeva V.V., Skiba E.A., Baibakova O.V., Makarova E.I., Orlov S.E., Kukhlenko A.A., Udoratina E.V., Shcherbakova T.P., Kuchin A.V., Sakovich G.V. Kinetics of the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials at different concentrations of the substrate // Catalysis in industry. 2016. Vol. 8, N 1. P. 81-87.

DOI: 10.1134/S2070050416010025.

32. Baibakova O.V., Skiba E.A. Biotechnologi-cal aspects of ethanol biosynthesis from Miscanthus // Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2015. Vol. 5, N 1. Р. 69-74. DOI: 10.1134/S2079059 715010025.

33. Skiba E.A., Budaeva V.V., Pavlov I.N., Makarova E.I., Zolotukhin V.N., Sakovich G.V. Producing of enzymaqtic hydrolysates from Miscanthus pulps and their alcoholic fermentation // Biotechnology in Russia. 2012. N 6. Р. 42-52.

34. Budaeva V.V., Makarova E.I., Gismatulina Yu.A. Integrated flowsheet for conversion of nonwoody biomass into polyfunctional materials // Key Engineering Materials. 2016. Vol. 670. Р. 202-206. D0I:10.4028/www.scientific.net/KEM.670.202.

35. Гладышева Е.К., Скиба Е.А. Биосинтез бактериальной целлюлозы культурой Medusomy-ces gisevii // Вестник ВГУИТ. 2015. N 3. С. 149-156.

1. Nikitin V.M., Obolenskaya A.V., Shchegolev V.P. Khimiya drevesiny i tsellyulozy [Wood and cellulose chemistry]. Moscow, Lesnaya promyshlennost' Publ., 1978, 370 p.

2. Varfolomeev S.D. Khimicheskaya enzimolo-giya [Chemical enzymology]. Moscow, Akademiya Publ., 2005, 472 p.

3. Kalia S., Kaith B.S., Kaur I. Cellulose fibers: bio- and nanopolymer composites. Berlin, Springer Publ., 2011, 758 p.

4. Varfolomeev S.D., Gurevich K.G. Biokinetika: Prakticheskii kurs [Biokinetics: Practical course]. Moscow, FAIR-PRESS Publ., 1999, 720 p.

5. Gracheva I.M., Krivova A.Yu. Tekhnologiya fermentnykh preparatov [Technology of enzyme preparations]. Moscow, Elevar Publ., 2000, 512 p.

6. Jordan D.B., Bowman M.J., Braker J.D., Dien B.S., Hector R.E., Lee C.C., Mertens J.A., Wagschal K. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 2012, no. 442, pp. 241-252. D0I:10. 1042/BJ20111922.

7. Lynd L.R., Weimer P.J., Van Zyl W.H., Preto-rius I.S. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2002, vol. 66, no. 3, pp. 506-577. DOI: 0.1128/MMBR.66.3.506-577. 2002.

8. Klesov A.A., Rabinovich M.L. Enzymatic hydrolysis of cellulose. Bioorganicheskaya khimiya [Bioorganic chemistry]. 1980, vol. 6, no. 8, pp. 12251242.

9. Selig M.J., Knoshaug E.P., Adney W.S., Himmel M.E., Decker S.R. Synergistic enhancement of cellobiohydrolase performance on pretreated corn stover by addition of xylanase and esterase activities. Bioresource Technology. 2008, no. 99, pp. 49975005. D0I:10.1016/ j.biortech.2007.09.064.

10. Yu P., McKinnon J.J., Maenz D.D., Olkowski A.A., Racz V.J., Christensen D.A. Enzymic release of

reducing sugars from oat hulls by cellulase, as influenced by Aspergillus ferulic acid esterase and Trichoderma xylanas. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003, no. 51, pp. 218-223. DOI: 10.1021/jf010984r.

11. Sun Y., Chehg J. Hydrolysis of lignocellulo-sic materials for ethanol production: a review. Biore-sourse Technology. 2002, no. 83, pp. 1-11. DOI: 10.1007/s00253-009-1883-1.

12. loelovich M., Morag E. Study of enzymatic hydrolysis of pretreated biomass at increased solids loading. Bioresources. 2012, no. 7, pp. 4672-4682. DOI: 10.15376/biores.7.4.4672-4682.

13. Modenbach A.A., Nokes S.E. The use of high-solids loadings in biomass pretreatment - A review. Biotechnology and Bioengineering. 2012, no. 109, pp. 1-13. DOI: 10.1002/bit.24464.

14. Wingren A., Galbe M., Zacchi G. Techno-economic evaluation of producing ethanol from softwood: Comparison of SSF and SHF and identification of bottlenecks. Biotechnology Progress. 2003, no. 19, pp. 1109-1117. DOI: 10.1021/ bp03 40180.

15. Hodge D.B., Karim M.N., Schell D.J., McMillan J.D. Soluble and insoluble solids contributions to high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Bioresource Technology. 2008, no. 99, pp. 89408948. DOI: 10.1016/j.biortech.2008. 05.015.

16. Jorgensen H., Vibe-Pedersen J., Larsen J., Felby C. Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations. Biotechnology and Bioengineering. 2007, vol. 96, no. 5, pp. 862-870. DOI: 10.1002/bit.21115.

17. Hall M., Bansal P., Lee J., Realff M., Bom-marius A. Cellulose crystallinity - A key predictor of the enzymatic hydrolysis rate. FEBS Journal. 2010, vol. 277, no. 6, pp. 1571-1582. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2010.07585.x.

18. Li L., Zhou W., Wu H., Yu Y., Liu F., Zhu D.

Relationship between crystallinity index and enzymatic hydrolysis performance of celluloses separated from aquatic and terrestrial plant materials. BioRe-sourses. 2014, vol. 9, no. 3, pp. 3993-4005. DOI: 10.15376/biores.9.3.3993-4005.

19. Yoshida M., Liu Yu., Uchida S., Kawarada K., Ukagami Yu., Ichinose H., Kaneko S., Fukuda K. Effects of cellulose crystallinity, hemicellulose, and lignin on the enzymatic hydrolysis of Miscanthus sinensis to monosaccharides. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2008, vol. 72, no. 3, pp. 805-810. DOI: 10.1271/bbb.70689.

20. Chen Y., Stipanovic A.J., Winter W.T., Wilson D.B., Kim Y.J. Effect of digestion by pure cellu-lases on crystallinity and average chain length for bacterial and microcrystalline celluloses. Cellulose. 2007, no. 14, pp. 283-293. DOI: 0.1007/s10570-007-9115-2.

21. Mansfield S.D., Mooney C., Saddler J.N. Substrates and enzyme characteristics that limit cellulose hydrolysis. Biotechnology Progress. 1999, no. 15, pp. 804-816. D0I:10.1021/ bp9900 864.

22. Hallac B.B., Ragauskas A.J. Analyzing cellulose degree of polymerization and its relevancy to cellulosic ethano. Biofuels, Bioproducts and Biorefin-ing. 2010, no. 5, pp. 215-225. DOI: 10.1002/bbb.269.

23. Ioelovich M., Morag E. Effect of cellulose structure on enzymatic hydrolysis. BioResources. 2011, vol. 6, no. 3, pp. 2818-2834. DOI: 10.15376/biores.6.3.2818_2835.

24. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and lig-nocellulosic chemistry. Bioenergy Research. 2012, no. 5, pp. 1043-1066. DOI:10.1007/ s1215 5-0129208-0.

25. Novyi spravochnik khimika i tekhnologa. Syr'e i produkty promyshlennosti organicheskikh i neorganicheskikh veshchestv [New handbook of Chemist and Engineer. Raw Materials and products of organic and inorganic industry]. St. Petersburg, NPO Professional Publ., 2006, 916 p.

26. Zinov'eva M.E., Gamayurova V.S., Bur-masova M.A. Intensification of cellulose hydrolysis with enzyme preparation DENYCEL 100 CG upon addition of some organic chemicals. Vestnik Ka-zanskogo tekhnologicheskogo universiteta [Bulletin of Kazan Technologic University]. 2009, no. 6, pp. 130135.

27. Taherzadeh M., Karimi K. Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review. Bioresources. 2007, vol. 2, no. 4, pp. 707-738.

28. Budaeva V.V., Makarova E.I., Skiba E.A., Sakovich G.V. Enzymatic hydrolysis of the products of hydro-thermobaric processing of Miscanthus and oat hulls. Catalysis in Industry. 2013, vol. 5, no. 4, pp. 335-341. DOI: 10.1134/S20700504 1304003X.

29. Makarova E.I., Budaeva V.V., Skiba E.A., Sakovich G.V. Enzymatic hydrolysis of celluloses obtained via the hydrothermal processing of Miscanthus and oat hulls. Catalysis in Industry. 2014, vol. 6, no. 1, pp. 67-71. DOI: 10.1134/S2070050 414010061.

30. Pavlov I.N., Denisova M.N., Makarova E.I., Budaeva V.V., Sakovich G.V. Versatile thermobaric plant and producion of hydrotropic cellulose therein. Cellulose Chemistry and Technology. 2015, vol. 49, no. (9-10), pp. 847-852.

31. Budaeva V.V., Skiba E.A., Baibakova O.V., Makarova E.I., Orlov S.E., Kukhlenko A.A., Udoratina E.V., Shcherbakova T.P., Kuchin A.V., Sakovich G.V. Kinetics of the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials at different concentrations of the substrate. Catalysis in Industry. 2016, vol. 8, no. 1, pp. 81-87. DOI: 10.1134/S20 70050416010025.

32. Baibakova O.V., Skiba E.A. Biotechnological aspects of ethanol biosynthesis from Miscanthus. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2015, vol. 5, no. 1, pp. 69-74. DOI: 10.1134/S2079059715010025.

33. Skiba E.A., Budaeva V.V., Pavlov I.N., Makarova E.I., Zolotukhin V.N., Sakovich G.V. Producing of enzymaqtic hydrolysates from Miscanthus pulps and their alcoholic fermentation. Biotechnology in Russia. 2012, no. 6, pp. 42-52.

34. Budaeva V.V., Makarova E.I., Gismatulina Yu.A. Integrated flowsheet for conversion of nonwoody biomass into polyfunctional materials. Key Engineering Materials. 2016, vol. 670, pp. 202-206. DOI:10.4028/www.scientific.net/KEM. 670.202.

35. Gladysheva E.K., Skiba E.A. Biosynthesis of bacterial cellulose by Medusomyces gisevii culture. Vestnik VGUIT [Bulletin of Voronezh State University of Engineering Technologies]. 2015, no. 3, pp. 149156.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации

Екатерина И. Макарова

Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН

659322, Россия, Алтайский край, г. Бийск, ул. Социалистическая, 1 К.т.н., мл.н.с. massl@mail.ru

AUTHORS' INDEX Affiliations

Ekaterina I. Makarova

Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies, SB RAS 1, Sotsialisticheskaya St., Biysk, Altai Krai, 659322, Russia

PhD of Engineering, Junior researcher massl@mail.ru

Вера В. Будаева

Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН

659322, Россия, Алтайский край, г. Бийск, ул. Социалистическая, 1 К.х.н., доцент budaeva@ipcet.ru

Поступила 14.01.2016

Vera V. Budaeva

Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies, SB RAS 1, Sotsialisticheskaya St., Biysk, Altai Krai, 659322, Russia

PhD of Chemistry, Associated professor budaeva@ipcet.ru

Received 14.01.2016