КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ БРОМЕЛАИНА И ЛИЗАТА БАКТЕРИЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЛОСТИ РТА
COMPOSITION BASED ON BROMELAIN AND BACTERIAL LYSATE FOR PREVENTION OF ORAL DISEASES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к инновационному иммуномодулирующему комплексу для применения в полости рта, представляющему собой композицию для применения в полости рта, содержащую комбинацию протеолитического фермента бромелаина и лизат бактерий. Изобретение может быть использовано при уходе за полостью рта, а также для профилактики заболеваний зубов, десен и/или полости рта.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Здоровье полости рта обеспечивается рядом физиологических систем, обеспечивающих гомеостаз; важными составляющими этих систем являются иммунная система слизистой оболочки и взаимодействующая с ней микробиота различных компартментов ротовой полости. При неблагоприятных условиях (особенности диеты, соматические заболевания, курение и т.п.) нарушается нормальное физиологическое состояние этих систем, что провоцирует развитие различных заболеваний полости рта: гингивита, пародонтита, стоматита, ксеростомии, кариеса (Kinane DF, 2017; Acharya А, 2017). Эти заболевания осуществляют огромную нагрузку на системы здравоохранения всего мира, являясь во многом контролируемыми (Petersen РЕ, 2005). По данным ВОЗ, в мире 60-90% детей школьного возраста и до 100% взрослых имеют кариотические поражения, которые предотвратимы. Тяжелые поражения пародонта встречаются у 15-20% людей возраста 35-44 лет (Oral health. Fact sheet . April 2012. Статья он-лайн. URL: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs318/en/>). Заболевания ротовой полости отражаются не только в косметическом эффекте; они в значительной мере влияют на качество жизни, социальные аспекты жизни человека, а также обусловливают развитие системных патологий - атеросклероза, болезни Альцгеймера и др. Наиболее сильная ассоциация в этой группе состояний выявлена между гингивитом и атеросклерозом. Обнаружено, что при гингивите часть дисбиотической флоры попадает в кровь и вызывает бактериемию, а кроме того вследствие незавершенного фагоцитоза бактерии могут мигрировать в атеросклеротический очаг внутри фагоцитов. Выделение провоспалительных цитокинов в зоне пародонтита может спровоцировать системный воспалительный ответ, тем самым создав предпосылки к развитию воспаления сосудов. Также отмечено, что пародонтит сильно меняет состав кишечной микрофлоры, снижая ее противовоспалительные способности и вызывая системное воспаление.
Увеличение риска аутоиммунных заболеваний возникает за счет ферментов Р. gingivalis, модифицирующих аргинин в белках и превращающих его в цитруллин, не меняя сам белок. Цитрулиннированные белки собственного организма способны вызвать иммунный ответ: в случае ревматоидного артрита у пациентов обнаруживаются антитела к цитруллинированным белкам.
Присутствие ключевых патогенов - P. gingivalis и Fusobacterium nucleatum - также связано с риском возникновения плоскоклеточной орофарингеальной карциномы, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки.
Заболевания полости рта также неблагоприятно влияют на плод при беременности. Отмечено снижение массы новорожденного, повышение риска преждевременных родов, выкидыша и мертворождения вследствие проникновения микроорганизмов через плаценту и возникновения в организме матери провоспалительного фона.
Наиболее распространенными заболеваниями являются кариес и пародонтит. Кариес характеризуется деминерализацией неорганической части эмали и разрушением ее органического матрикса, что приводит к деструкции твердых тканей зуба и к возникновению воспалительных осложнений со стороны пульпы и периодонта. Поступление с диетой простых углеводов приводит к снижению рН, вследствие чего выживают кислотоустойчивые виды - S. mutans, лактобактерий, бифидобактерий. Помимо S. mutans в развитии детского кариеса играют роль бактерии и других типов - Granulicatella, Actinomyces, Actinobaculum, Scardovia, Atopobium, Aggregatibacter, Slackia, Bifidobacteria, Prevotella (Tanner A.C., 2016; Marsh PD, 2015; Arweiler NB, 2016). Роль лактобактерий при этом остается двоякой - с одной стороны, на ранних сроках они обеспечивают конкуренцию с S. mutans, а с другой стороны - являются предиктором развития кариеса и являются доминирующим видом в глубоких поражениях при тяжелом кариесе у детей. В связи с этим использование некоторых видов живых лактобактерий в составе средств гигиены для полости рта нежелательно. С появлением новых методов исследования, становится понятно, что в развитии заболевания имеет значение не один микроорганизм, а целое сообщество. В частности, микробиота слюны у детей 6-8 лет, страдающих кариесом, отличается большим разнообразием по сравнению со здоровыми детьми (Gomez А, 2017; Huang R, 2011; Mark Welch J.L. 2016).
Гингивит - воспаление десен без нарушения целостности зубодесневого соединения. Наиболее часто возникает из-за скопления микробного налета на зубах, в результате несоблюдения гигиены полости рта. Бактерии (реже - вирусы, грибы) являются непосредственной причиной воспаления десен (Fusobacterium nucleatum, Lachnospiraceae, Lautropia, Prevotella oulorum). Гингивит является обратимым состоянием, которое можно устранить при установлении адекватного гигиенического режима. При отсутствии лечения гингивит может прогрессировать в деструктивную форму заболеваний пародонта - пародонтит. Пародонтит - воспалительное заболевание тканей пародонта, характеризующееся прогрессирующим разрушением нормальной структуры альвеолярного отростка челюсти. При тяжелом течении пародонтита чаще всего обнаруживаются Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Treponema denticola. Другая причина - травматическая, что, помимо анатомических особенностей и наличия ортодонтических конструкций, включает в себя неправильное использование зубной щетки. Для профилактики пародонтита необходимо соблюдение адекватного гигиенического режима. Как и в случае кариеса, пародонтит следует рассматривать не как инфекционный процесс, но как дисбиотический. Состояние пародонта в норме и пародонтите во многом зависит от функционирования нейтрофилов. Уничтожение бактерий нейтрофилами в норме происходит без развития активной фазы воспаления. Курение, плохая диета, физическое повреждение приводит к увеличению колонизации микробного сообщества бактерией P. gingivalis, в результате нейтрофилы выходят в соединительную ткань, но не мигрируют в очаг инфекции, что ведет к усилению воспаления. В результате происходит дополнительное привлечение нейтрофилов в ткани и разрушение тканей (Uriarte SM, 2016; Olsen I, 2017)
Таким образом, современные представления о патогенезе пародонтита описываются моделью «полимикробной синергии и дисбиоза»: ключевые микроорганизмы изменяют иммунный ответ в области пародонта, дополнительные патогены колонизируют ее, приводя к усилению воспаления. Здоровая микробиота околодесневой области обладает меньшим разнообразием по сравнению с пораженной пародонтитом. Сложные экологические отношения микробиоты полости рта не предполагают простых решений с заболеваемостью пародонтитом и требуют комплексного подхода (Diaz P.I., 2016; Arweiler NB, 2016; Abiko Y, 2003; Campbell EL, 2011).
Менее распространенными заболеваниями являются ксеростомия и стоматит. Ксеростомия - это сухость в ротовой полости, вызванная уменьшенным или полностью прекращенным слюноотделением. При ксеростомии возрастает риск возникновения инфекционных заболеваний полости рта, в том числе грибковых болезней. Стоматит -язвенное поражение слизистой оболочки полости рта, обусловленное реакцией иммунной системы на раздражители. Причиной его возникновения также считают местные факторы: несоблюдение гигиены полости рта. Заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как гастрит, дуоденит, колит, а также глистная инвазия, могут быть причиной катарального стоматита. При этом заболевании слизистая оболочка рта становится отечной, болезненной, гиперемированной, она может быть покрыта белым или желтым налетом.
Для профилактики описанных патологий необходимо исключение вредных внешних факторов: нормализация диеты, отказ от курения, соблюдение принципов здорового образа жизни в целом и применение продуктов гигиены, обладающих комплексным воздействием - зубных паст, ополаскивателей, и др. К этим средствам предъявляются следующие требования: очищение поверхности зубов от налета, профилактика кариеса, профилактика гингивита и пародонтита (противовоспалительное действие).
Таким образом, у населения есть потребность в комплексном средстве, которое обеспечивало бы очищающий, осветляющий, противокариесный, противовоспалительный, десенситивный, иммуномодулирующий эффект и способствовало бы нормализации баланса микробиоты полости рта.
Авторы настоящего изобретения видят необходимость и возможность решения данной проблемы через создание инновационного комплекса «SP.WHITE SYSTEM» (альтернативное название «BIO SP.WHITE SYSTEM») для полости рта, состоящего из следующих компонентов:
Гидроксиапатит представляет собой минерал, позволяющий добиться реминерализации тканей зуба. Кроме того, ГАП способен закрывать дентинные канальцы в обнаженном дентине.
Усилитель очищающей способности представляет собой частицы, обеспечивающие мягкое очищение и полирующие эмаль зуба. В настоящем изобретении усилитель очищающей способности может быть представлен в виде силики (диоксида кремния), карбоната кальция, дикальция фосфата дигидрата, кальция пирофосфата, оксида алюминия, перлита, бикарбоната натрия, древесного угля, перекиси водорода, кальция пероксида, цитрата натрия, пирофосфата натрия, триполифосфата натрия, гексаметафосфата натрия, кальция пероксида.
Пленкообразователь представляет собой вещество, предотвращающее образование налета и окраски зубной эмали, а также удаляющее налет.
Бромелаин является смесью протеолитических ферментов, представляющих собой сульфгидрильные протеазы. Бромелаин расщепляет белки, входящие в состав зубного налета и в состав лизатов.
Лизаты микроорганизмов, ассоциированных со здоровым состоянием полости рта, выбранных из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis и Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans и Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus представляют собой фрагменты клеточных стенок и органелл бактерий и грибков, полученные путем химического, физического или биологического воздействия на эти микроорганизмы. Согласно исследованиям, проведенным авторами настоящего изобретения, указанные лизаты воздействуют на клетки иммунной системы через TLR-рецепторы, а также служат пребиотическим субстратом для благотворных микроорганизмов.
Синергия компонентов данного комплекса приводит к мощному усилению очищающего действия, а путем воздействия на микробиоту полости рта и восстановления гомеостаза иммунной системы обеспечивается профилактика заболеваний полости рта и поддержание субвоспалительного, то есть нормального статуса активации нейтрофилов. Все вышеперечисленное позволяет значительно улучшить свойства средств гигиены полости рта.
Композиции для полости рта, такие как зубные пасты, гели, эликсиры, бальзамы, мази, ополаскиватели, пенки, жевательные резинки, спреи предназначены для удаления зубного налета и/или предупреждения его образования.
В уровне техники раскрыто, что зубной налет представляет собой многокомпонентный, постоянно формирующийся биотоп полости рта, основу которого составляют практически все представители микрофлоры полости рта в конгломерате с протеинами и полисахаридами. Антигены этих микроорганизмов стимулируют активность факторов иммунобиологической резистентности организма. В процессе образования зубного налета происходит выраженное изменение состава микрофлоры. В первой фазе длительностью 2-4 часа образуется ранний зубной налет с преобладанием аэробных и факультативно-анаэробных бактерий: стрептококков, стафилококков, нейссерий и лактобактерий. Общее содержание бактерий составляет не более 100-1000 в 1 г. Во второй фазе (4-5-е сутки) происходит сдвиг аэробной и факультативно-анаэробной микрофлоры в сторону анаэробных лептотрихий и фузобактерий. Общее содержание бактерий увеличивается до 1-10 млн/г.В третьей фазе (6-7-е сутки и далее) заканчивается формирование качественного состава зубного налета, резко снижается содержание аэробов и факультативных анаэробов и преобладают облигатные анаэробы (бактероиды, фузобактерий, вейлонеллы, актиномицеты, пептострептококки), выделяющие комплекс токсических веществ, вызывающих разрушение IgA и IgG, резкий сдвиг рН в кислую сторону, что приводит к прогрессированию микробной инвазии, развитию кариеса и заболеваний пародонта.
Лечебно-профилактическая зубная паста, используемая для профилактики воспалительных заболеваний пародонта, известна из RU 2494724 C2 (опубл. 10.10.2013). Предлагаемая зубная паста содержит в качестве активных ингредиентов 0,001-5,0 мас. % лиофилизированной массы живых бифидобактерий, 0,01-5,0 мас. % лизоцима; 0,01-5,0 мас. % папаина; 2,00-20,00 мас. % абразивного компонента; 5,00-20,88 мас. % увлажнителя; 0,05-5,0 мас. % гидроколлоида; 0,10-2,00 мас. % ПАВ; 0,10-0,32 мас. % натрия фторида; 0,50-5,00 мас. % тетракалия пирофосфата; 0,15-0,40 мас. % консерванта; 0,05-1,50 мас. % ароматизатора; 30,00-87,029 мас. % воды.
Недостаток данной зубной пасты состоит в том, что живые бифидобактерий в составе зубной пасты нежизнеспособны, в том числе, по причине наличия в композиции консерванта. Следовательно, заявленный эффект не может быть реализован в коммерческих образцах средств гигиены, предназначенных для широкого потребления. Даже при условии жизнеспособности, бифидобактерий являются кислотопродуцирующими бактериями, что влечет риск деминерализации и появления кариотических изменений зубов. Кроме того, папаин, содержащийся в составе RU 2494724 C2, разрушает иммуноглобулины (один из ключевых факторов противоинфекционной защиты в полости рта) до менее крупных молекул, не обладающих полезным функционалом, что нарушает иммунитет полости рта.
Заявленный авторами настоящего изобретения комплекс отличается от RU 2494724 C2 тем, что содержит не лиофилизированную массу живых бифидобактерий, жизнеспособность которых в готовой композиции крайне мала, а лизат бактерий, который содержит антигены, уже подготовленные к распознаванию иммунной системой. В отличие от папаина, бромелаин, содержащийся в составе RU 2494724 C2, не разрушает молекулы иммуноглобулинов до мелких нефункциональных фрагментов (Matharu Z, 2012). Также заявленный комплекс содержит усилитель очищающей способности, CaMgZn-ГАП и ПВП, в значительной мере увеличивающей полезные эффекты.
Из DE 202009011379 U1 (опубл. 30.12.2010) известно содержащее пробиотик средство для ухода за полостью рта, характеризующееся включением пробиотических культур из группы: Bacilli, Actinobacteria, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasej, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salvarius, Bifidobacterium anolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Leuc. Mesenteroides, Ped. Acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Bacilus cereus, Escherichia coli, Propionibacterium freudenreichii и Saccharomyces cerevisiae.
Раскрыто, что запах изо рта, не характерный для здорового состояния ротовой полости, вызван, в том числе, летучими соединениями серы, которые смешиваются с выдыхаемым воздухом. К ним относятся сероводород, 1,5-диаминопентан и метантиол. Эти вещества образуются, например, при бактериальном разложении пищевых остатков или в мертвых тканях. В качестве триггера запаха изо рта можно рассматривать локальные или системные факторы. В 80-90% случаев запах обусловлен локальными факторами, действующими либо в полости рта, либо в области носоглотки.
Среди патогенных бактерий ротовой полости особое значение имеет Streptococcus mutans.
Существуют различные способы борьбы с запахом изо рта. Для этой цели в препаратах для стоматологического ухода используются различные средства. Наиболее распространенными являются антибактериальные агенты (напр., триклозан, хлоргексидин). Стоматологические чистящие средства, доступные на рынке в различных формах, в первую очередь служат для очистки поверхности зубов и предотвращения их разрушения. Они обычно содержат комбинацию полирующих веществ, поверхностно-активных веществ, связующих веществ, ароматизаторов и активных антимикробных ингредиентов. Однако использование таких агентов может иметь недостатки в отдельных случаях из-за вкусовых характеристик, эстетической природы, проблем с устойчивостью терапии, нарушением естественной флоры полости рта. Раскрытое средство для ухода за полостью рта эффективно борется с запахом изо рта и не имеет таких недостатков.
Однако пробиотические культуры в составе обозначенного выше средства обладают очень коротким временем жизнеспособности, следовательно, заявленный эффект не может быть реализован в коммерческих образцах средств гигиены, предназначенных для широкого потребления, в частности, поскольку требуются особые условий хранения коммерческого продукта. Также, обозначенный комплекс не обладает очищающим эффектом.
Заявленный авторами комплекс отличается от DE202009011379U1 тем, что содержит не пробиотические культуры, жизнеспособность которых в готовой композиции крайне мала, а лизат бифидобактерий, который содержит антигены, уже подготовленные к распознаванию иммунной системой. Кроме того, заявленный комплекс содержит бромелаин, усилитель очищающей способности, CaMgZn-ГАП и ПВП, дополняющие свойства лизатов с целью эффективного очищения и реминерализации эмали зуба и усиления активности лизатов.
Из RU 2496468 C2 (опубл. 27.10.2013) известна зубная паста, содержащая лизат бактерий, изготовленная из следующих компонентов: 0,001-5,0% мас. лизата бактерий Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus, 0,01-5,0% мас. лизоцима, 0,01-5,0% мас. папаина, 2,00-20,00% мас. абразивного компонента, 5,00-20,88% мас. увлажнителя, 0,05-5,0% мас. гидроколлоида, 0,10-2,00% мас. поверхностно-активного вещества, 0,05-0,32% мас. натрия фторида, 0,50-5,00% мас. тетракалия пирофосфата, 0,15-0,40% мас. консерванта, 0,05-1,50% мас. ароматизатора, 30,00-87,029% мас. воды. Использование предлагаемой зубной пасты позволяет активировать фагоцитоз, увеличить содержание лизоцима слюны, способствует увеличению количества иммунокомпетентных клеток, обладает выраженным очищающим, противовоспалительным и кровоостанавливающим действием.
К отрицательным свойствам данной зубной пасты относится то, что лизаты бактерий, содержащиеся в ней, не ассоциированы со здоровым состоянием полости рта, а, следовательно, могут быть распознаны иммунной системой как чужеродные, что может усугубить имеющийся воспалительный процесс или привести к развитию воспаления. Это подтверждается эффектом данного состава - он увеличивает количество иммунокомпетентных клеток, что напрямую свидетельствует об усилении их миграции и реализации активного воспалительного процесса: увеличение «клеточности», то есть количества иммунокомпетентных клеток является надежным признаком развития воспаления.
Заявленный авторами комплекс отличается от RU 2496468 C2 тем, что содержит лизаты бактерий, целенаправленно модулирующих иммунный ответ в целях предотвращения развития воспалительного статуса, характерного для гингивита и пародонтита, а не для активации фагоцитоза. Также заявленный комплекс не увеличивает количество иммунокомпетентных клеток (что говорило бы об усилении воспаления), а способствует формированию адекватного баланса субпопуляций этих клеток. Кроме того, заявленный комплекс содержит бромелаин, усилитель очищающей способности, CaMgZn-ГАП и ПВП, обладающие синергическим эффектом.
Из JP 2004250374 A (опубл. 27.10.2013) известна композиция, которая эффективна в отношении удаления налета и безопасна для человеческого организма. Такая композиция содержит молочнокислые бактерии или ферментационный раствор молочной кислоты и глюконат и/или олигосахарид. Могут быть использованы любые формы молочнокислых бактерий, например, порошкообразные лиофилизированные продукты. Примерами используемых молочнокислых бактерий являются Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus brandarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buffner, Lactobacillus - Cellobios, Streptococcus thermophilus, Streptococcus faecalis, Bifidobacterium longum, Bacillus coagulans и т.д. Ферментационный раствор молочной кислоты предпочтительно представляет собой ферментационный раствор, полученный ферментацией молочной кислоты с использованием молочнокислых бактерий в среде, содержащей лактозу или глюкозу в качестве основного компонента. Молочнокислые бактерии, используемые для ферментации молочной кислоты, могут быть любыми из молочнокислых бактерий, обычно используемых при производстве обычных молочнокислых напитков, ферментированного молока и т.п., а их примеры включают Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus Brantaram, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buffner, Lactobacillus cellobios, Streptococcus thermophilus и тому подобное.
Недостаток данной композиции в том, что живые бактерии в составе зубной пасты нежизнеспособны и, следовательно, заявленный эффект не может быть реализован в коммерческих образцах средств гигиены, предназначенных для широкого потребления. Кроме того, даже при достижении жизнеспособности, данные молочнокислые бактерии будут создавать кислую среду вблизи поверхности зуба, что приведет к деминерализации и спровоцирует развитие кариотических изменений.
Заявленный комплекс отличается от JP 2004250374 A тем, что содержит не пробиотические культуры кислотопродуцирующих бактерий, жизнеспособность которых, к тому же, в готовой композиции крайне мала, а лизат бифидобактерий, который содержит антигены, уже подготовленные к распознаванию иммунной системой. Необходимо отметить, что бромелаин, усиливающий активность лизатов, а также реминерализующий эмаль CaMgZn-ГАП и ПВП с усилителем очищающей способности улучшают полезные свойства данного комплекса.
Из ЕА 001741 В1 (опубл. 27.08.2001) известна зубная паста или жидкость для полоскания рта, содержащая сфингомиелиназу для повышения уровней церамидов в коже и слизистых оболочках, причем используют сфингомиелиназу грам-положительных бактерий, грам-отрицательных бактерий, лактобактерий или их смесей. Лактобактерий выбирают из группы, включающей Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmanii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactus и Streptococcus thermophilus.
Тем не менее, данная зубная паста или жидкость не лишена недостатков. Так, сфингомиелиназа не обладает положительными эффектами в отношении слизистой, отражающимися в улучшении состояния полости рта, снижении риска кариеса, пародонтита и других заболеваний. Повышение количества церамидов может быть полезным в кожных покровах, где они участвуют в поддержании адекватного уровня гидратации эпидермиса, но не в слизистой.
Заявленный комплекс отличается от JP 2004250374 A тем, что содержит не сфингомиелиназу, которая не обладает положительными эффектами в отношении иммунной системы полости рта, а лизат бифидобактерий, включающий антигены, уже подготовленные к распознаванию иммунной системой. Кроме того, заявленный комплекс содержит бромелаин, усиливающий активность лизатов, а также обладающие синергизмом ПВП, усилитель очищающей способности и CaMgZn-ГАП.
Помимо композиций зубных паст, раскрытых в указанных выше патентных документах, некоторые пасты, содержащие лактобактерий, присутствуют на рынке.
Так, известна зубная паста N-Zim Prebio производства АртЛайф («Зубная паста N-Zim Prebio». Статья он-лайн. URL:<http://artlife-msk.ru/zubnaja-pasta-n-zim-prebio-100-gr>), содержащая сорбитол 70%, кремния диоксид Tixosil 73, кремния диоксид Tixosil 43, дикальций фосфат дигидрат, полиэтиленгликоль ПЭГ-400, натрия лаурилсаркозинат Amin LS 30, натрия карбоксиметилцеллюлозу, CEKOL 2000, ароматизатор Тусминт ВВМ 230, Д-пантенол, натрия лаурилсульфат, лизин, титана диоксид, папаин, натрия фторид, аминофторид Rona Care olaflur, аллантоин, натрия сахаринат, лизат лактобактерий, натрия метилпарабен, натрия пропилпарабен, стевиозид, горофит алоэ, воду деминерализованную.
Однако, данная зубная паста содержит папаин, который разрушает иммуноглобулины (один из ключевых факторов противоинфекционной защиты в полости рта) до менее крупных молекул, не обладающих полезным функционалом, что нарушает иммунитет полости рта. Лизаты бактерий, содержащиеся в ней, не ассоциированы со здоровым состоянием полости рта.
Заявленный комплекс отличается от данной зубной пасты тем, что содержит лизаты бактерий, целенаправленно модулирующих иммунный ответ в целях предотвращения развития воспалительного статуса, характерного для гингивита и пародонтита. Кроме того усиление эффектов заявленного комплекса достигается наличием в его составе усилителя очищающей способности, CaMgZn-ГАП и ПВП, а также бромелаина, не разрушающего иммуноглобулины до мелких фрагментов.
Известна зубная паста PerioBiotic Toothpaste производства Designs For Health Inc. («Designs For Health PerioBiotic Toothpaste - Spearmint Flavor». Статья он-лайн. <URL: http://https://www.needs.com/product/Designs_For_Health_PerioBiotic_Toothpaste_Spearmint_Flavor_118/pc_Toothpaste>), содержащая воду, карбонат кальция, глицерофосфат кальция, глицерин, ксилит, бикарбонат натрия, масло мяты (Foeniculum Vulgare), каррагенан, мальтодекстрин, Dental-Lac™ (Lactobacillus paracasei), сорбат калия, порошок юкки (Y. filamentosa), экстракт листьев стевии (Eupatorium rebaudianum bertoni), хлорид цинка. Раскрыто, что Dental-Lac конкурирует с нежелательными штаммами бактерий в полости рта, включая S. mutans, тем самым помогая поддерживать здоровье зубов и десен.
Недостаток данной зубной пасты в том, что живые бактерии Dental-Lac™ (Lactobacillus paracasei) в составе зубной пасты не могут быть жизнеспособны и, следовательно, заявленный эффект не может быть реализован в коммерческих образцах средств гигиены, предназначенных для широкого потребления.
Заявленный комплекс отличается тем, что содержит не пробиотические культуры, а лизат бифидобактерий, который содержит антигены, уже подготовленные к распознаванию иммунной системой. Активность лизатов интенсифицируется бромелаином, усилителем очищающей способности, CaMgZn-гидроксиапатитом и ПВП.
Таким образом, в уровне техники отсутствуют решения сведения о комбинированном средстве на основе протеолитического фермента бромелаина, лизата бактерий, усилителя очищающей способности, ПВП и CaMgZn-ГАП, позволяющих добиться значительного синергического действия, заключающегося в усилении очищения, противовоспалительного, противокариесного, иммуномодулирующего эффекта и коррекции микробиоты полости рта.
Компоненты, входящие в состав заявленного комбинированного средства, проявляют синергетическое действие, что подтверждается далее.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, в целом, относится к композиции для применения в полости рта, содержащей комбинацию протеолитического фермента бромелаина и лизата бактерий.
В одном воплощении изобретение представляет собой композицию для применения в полости рта, содержащую комбинацию протеолитического фермента бромелаина и лизата бактерий.
В другом воплощении лизат бактерий может представлять собой лизат бифидобактерий.
В дополнительном воплощении лизат бифидобактерий может представлять собой лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis.
В другом воплощении лизат бактерий может представлять собой лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans.
В другом воплощении лизат бактерий может представлять собой лизат Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus bulgaricus и Str. Thermophilus.
В другом воплощении композиция по изобретению может содержать 0,005-0,2% мас. протеолитического фермента бромелаина.
В другом воплощении композиция по изобретению может содержать 0,05-1,5% мас. лизата бактерий.
В другом воплощении композиция по изобретению может дополнительно содержать усилитель очищающей способности, который может быть выбран из группы: силика (диоксид кремния), карбонат кальция, дикальция фосфат дигидрат, кальция пирофосфат, оксид алюминия, перлит, бикарбонат натрия, древесный уголь, перекись водорода, кальция пероксид, цитрат натрия, пирофосфат натрия, триполифосфат натрия, гексаметафосфат натрия, кальция пероксид и их смеси.
В другом воплощении композиция по изобретению может дополнительно содержать гидроксиапатит, который может быть выбран из группы: гидроксиапатит, обогащенный кальцием, магнием и цинком.
В другом воплощении композиция по изобретению может дополнительно содержать пленкообразующий компонент (пленкообразователь), который может быть выбран из группы: поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, воскоподобные вещества и их смеси.
В другом воплощении композиция по изобретению может дополнительно содержать пленкообразователь, усилитель очищающей способности, гидроксиапатит и вспомогательные вещества, % мас.:
протеолитический фермент бромелаин
0,005-0,2,
лизат бактерий
0,05-1,5,
пленкообразователь
0,3-1,0,
усилитель очищающей способности
2,5-5,0,
гидроксиапатит
0,1-10,0,
вспомогательные вещества
до 100.
В другом воплощении композицию применяется в полости рта для лечения заболеваний зубов, десен и/или полости рта, которые выбраны из гингивита, глоссита, кариеса и ксеростомии, посттравматических воспалений, вызванных ортодонтическими конструкциями
В другом воплощении композиция может находиться в форме зубной пасты, геля, эликсира, бальзама, спрея, пенки, жевательных резинок, или ополаскивателя.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1. представлены данные о разнообразии микробиоты десневой жидкости.
На Фиг. 2. представлены данные о различных видах микроорганизмов по окончании исследования в экспериментальных группах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данной области техники существует потребность в предоставлении альтернатив имеющимся на рынке средствам для ухода за полостью рта, для использования в полости рта, таким как зубные пасты и другие формы. Расширение арсенала таких средств за счет заявленного средства позволит преодолеть существующие трудности и недостатки, известные специалистам в данной области техники, и выйти на новый уровень очистки зубов, профилактики и лечения воспалительных состояний.
Авторы неожиданно обнаружили, что вещества, входящие в состав лизатов бактерий Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans и Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus обладают противовоспалительными свойствами. Этот эффект достигается за счет индукции противовоспалительного иммунного ответа (Bifidobacterium longum, Veillonella parvula, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus), формирования иммунного ответа к кариесогенным и другим патогенным видам микроорганизмов (Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Candida albicans, Lactobacillus acidophilus) и действия бактериоцинов, содержащихся в составе лизатов пробиотических бактерий (Bifidobacterium adolescentis, Streptococcus sanguinis, Lactobacillus fermentum).
Обнаружено влияние бифидобактерий на иммунитет слизистых. Однако, некоторые виды бифидобактерий являются так называемой аллохтонной, или «транзитной» микрофлорой, т.е. не колонизируют слизистые оболочки, в то же время успевая оказывать регулирующее действие на иммунную систему во время прохождения. В ротовой полости присутствие живых бифидобактерий также нежелательно, поскольку этот род относится к кислотоустойчивым видам, ассоциированным с кариесом. Поскольку положительная роль бифидобактерий в любом случае опосредована компонентами их клеточной стенки (мембраны) и внутриклеточных структур, рациональным является применение не живых бактерий, а их лизатов. Все вышеперечисленное также обуславливает необходимость постоянного или длительного применения продуктов, содержащих бактериальные лизаты.
Механизм противовоспалительного действия лизатов на слизистых связывают с расширением популяции регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), в частности, это было продемонстрировано для В. longum на клетках кишечника. Изменение состава субпопуляций лимфоцитов сопровождалось подавлением синтеза провоспалительных цитокинов TNFα и МСР-1, IL-12 и IFNγ, увеличением «противовоспалительного» цитокина IL-10. В культурах клеток В. longum subsp. infantis JCM 1222T также подавлял продукцию IL-17A.
Противовоспалительный эффект лизатов первоначально реализуется при распознавании их мембранных структур TLR2 и TLR9-рецепторами иммунных клеток и Nod-рецепторами. Одним из следствий этого является сохранение плотных контактов между клетками (вероятно, за счет ингибирования синтеза TNFα) и противодействие апоптозу клеток слизистой за счет увеличения синтеза циклооксигеназы СОХ-2 и простагландина PGE(2).
Помимо компонентов клеточной стенки противовоспалительное действие было продемонстрировано и для секретируемых компонентов Bifidobacterium longum, Veillonella parvula, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus, отчасти за счет регуляции состава микробиоты и снижения степени перекисного окисления липидов.
Исследований в данной области техники, посвященных действию лизатов на слизистую оболочку полости рта, крайне мало. Установлено, что В. bifidum может подавлять воспаление, вызванное механической травмой слизистой полости рта, а также снижать риск колонизации С.albicans при использовании зубных протезов.
Таким образом, использование лизатов бактерий для профилактики и коррекции состояний, связанных с воспалительными процессами в слизистой оболочке ротовой полости, представляется целесообразным.
Авторы неожиданно обнаружили, что вещества, входящие в состав лизатов (смеси) бактерий Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus также обладают противовоспалительными свойствами. Этот эффект также достигается за счет индукции противовоспалительного иммунного ответа.
Таким образом, использование лизатов бактерий Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus для профилактики и коррекции состояний, связанных с воспалительными процессами в слизистой оболочке ротовой полости, также представляется целесообразным.
Авторы также неожиданно обнаружили, что комбинации лизатов бактерий Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis и Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans или Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus и протеолитического фермента бромелаина обладают синергетическим действием, что подтверждается далее в неограничивающих примерах.
Авторы также неожиданно обнаружили, что комбинации лизатов бактерий Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis и Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans или Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans, и протеолитического фермента бромелаина, и пленкообразователя обладают синергетическим действием, что подтверждается далее в неограничивающих примерах.
Авторы также неожиданно обнаружили, что сочетание бромелаина и лизата таких бактерий потенцирует их совместное действие, приводя к синергетическому взаимодействию и противовоспалительному действию, а также способствует установлению баланса микробиоты полости рта, характерного для здорового состояния, что подтверждается далее в неограничивающих примерах.
Некоторые воплощения заявленного изобретения раскрыты далее.
В одном воплощении заявленное изобретение представляет собой композицию для применения в полости рта, содержащую комбинацию протеолитического фермента бромелаина и лизата бактерий.
В другом воплощении лизат бактерий может представлять собой лизат бифидобактерий.
В дополнительном воплощении лизат бифидобактерий может представлять собой лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis.
В другом воплощении лизат бактерий может представлять собой лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans.
В другом воплощении лизат бактерий может представлять собой лизат Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus bulgaricus, Str. Thermophilus.
В другом воплощении композиция по изобретению может содержать 0,005-0,2% мас. протеолитического фермента бромелаина, предпочтительно 0,05-0,20% мас., более предпочтительно 0,1% мас.
В другом воплощении композиция по изобретению может содержать 0,05-1,5% мас. лизата бактерий, предпочтительно 0,5-1,0% мас., более предпочтительно 0,7% мас.
В другом воплощении композиция по изобретению может дополнительно содержать усилитель очищающей способности, представляющие собой силику (диоксид кремния), карбонат кальция, дикальция фосфат дигидрат, кальция пирофосфат, оксид алюминия, перлит, бикарбонат натрия, древесный уголь, перекись водорода, кальция пероксид, цитрат натрия, пирофосфат натрия, триполифосфат натрия, гексаметафосфат натрия, кальция пероксид.
Указанные ингредиенты являются традиционно используемыми в зубных пастах. Композиция по изобретению может содержать усилитель очищающей способности в количестве 2,5-5,0% мас., предпочтительно 3,5-4,0% мас., более предпочтительно 3,7% мас.
В другом воплощении композиция по изобретению может дополнительно содержать гидроксиапатит. Указанный ингредиент является традиционно используемым в зубных пастах. Композиция по изобретению может содержать гидроксиапатит, обогащенный кальцием, магнием и цинком CaMgZn в количестве 0,1-10,0% мас., предпочтительно 1,0-8,0% мас., более предпочтительно 3,0-6,0% мас., наиболее предпочтительно 5,0% мае
В другом воплощении композиция по изобретению может дополнительно содержать пленкообразователь, предпочтительно поливинилпирролидон. Указанный ингредиент является традиционно используемым в зубных пастах. Композиция по изобретению может содержать пленкообразователь в количестве 0,3-1,0% мас., предпочтительно 0,5-0,8% мас., более предпочтительно 0,7% мас.
В другом воплощении композиция по изобретению может содержать:
протеолитический фермент бромелаин
0,005-0,2,
лизат бактерий
0,05-1,5,
пленкообразователь
0,3-1,0,
усилитель очищающей способности
2,5-5,0,
гидроксиапатит
0,1-10,0,
вспомогательные вещества
до 100.
Указанные вспомогательные вещества являются традиционно используемыми в данной области, например, нейтральными носителями, целевыми добавками, фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, веществами для создания базы или основы композиции или готовой формы.
В другом воплощении композицию применяют в полости рта для лечения заболеваний зубов, десен и/или полости рта, которые могут быть выбраны из гингивита, кариеса и ксеростомии.
В другом воплощении композиция по изобретению может быть включена в зубную пасту. Такая зубная паста может применяться для профилактики и лечения воспалительных состояний в полости рта, таких как, но без ограничения, гингивит, глоссит, кариес, ксеростомия, постравматические воспаления, вызванных ортодонтическими конструкциями.
В другом воплощении изобретение может относиться к применению композиции в способе профилактики и/или лечения заболеваний зубов, десен и/или полости рта.
В другом воплощении изобретение может представлять собой способ профилактики и/или лечения заболеваний зубов, десен и/или полости рта, включающий применение такой зубной пасты.
Использование лизата Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis или Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans позволяет нормализовать воспалительный статус тканей ротовой полости и восстановить соотношение микроорганизмов, характерное для здоровой ротовой полости. Целенаправленное введение бактериального лизата Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis или Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans в состав комплекса позволяет производить эффективную профилактику одновременно гингивита, пародонтита, ксеростомии, кариеса, бактериальных, грибковых и вирусных инфекций слизистой ротовой полости, языка, верхних дыхательных путей, галитоза, глоссита, посттравматических воспалений, вызванных ортодонтическими конструкциями и других заболеваний, вовлекающих иммунную систему и микробиоту ротовой полости и верхних дыхательных путей.
ПРИМЕРЫ
Включенные в настоящее описание примеры не являются ограничивающими заявленное изобретение и приведены лишь с целью иллюстрации и подтверждения достижения ожидаемых технических результатов. Эти примеры являются одними из многих экспериментальных данных, полученных авторами изобретения, которые подтверждают эффективность средств, находящихся в пределах объема изобретения.
Были проведены клинические исследования по оценке эффективности.
Пример 1.
В экспериментальных группах пациенты использовали следующие композиции, которые в качестве активных компонентов включали заявленный комплекс, содержащий бромелаин и бактериальные лизаты в процентном содержании 0,005 и 0,05% мае (Таблица №1), а также пленкообразователь (поливинилпирролидон) - 0,3% мас., усилитель очищающей способности (диоксид кремния) - 2,5% мас., гидроксиапатит (гидроксиапатит, обогащенный кальцием, магнием и цинком) в виде 10% суспензии - 0,1% мас.
В качестве базы для включения компонентов применялась зубная паста с составом, приведенным в Таблице №2.
Проведено проспективное рандомизированное двойное слепое исследование на 200 субъектах (107 мужчин и 93 женщины), рандомизированных в четыре равные половозрастные группы. Пациенты применяли композиции в виде зубной пасты 2 раза в день на протяжении 6 недель.
Параметром для оценки эффективности действия препаратов выступал средний индекс кровоточивости десен (GBI), определяемый врачом-стоматологом. Также определяли изменения локального иммунитета, оценивая количество дефензинов hBD-1 и hBD-2 в десневой жидкости, отобранной в течение 30 секунд.
Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М), медиану (Me), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (SEM), интерквартильные размахи, 90%ДИ. Полученные результаты обрабатывали с помощью ПО IBM SPSS Statistics 22.0 (StatSoft, Россия). Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты.
Через 6 недель после начала исследования наблюдали выраженные изменения оцениваемых показателей в группах исследования. В группе 1, применявшей композицию с комплексом, содержащим лизат бифидобактерий и бромелаин, значение GBI на конец исследования его значение составило 0,04±0,02, что меньше по сравнению с начальными показателями (0,16±0,03; Р=0,014). В группе 2 и 3, применявшей композицию с лизатом бифидобактерий и лактобактерий соответственно, было отмечено менее выраженное изменение GBI, на конец исследования его значение составило 0,10±0,03 и 0,09±0,04 по сравнению с начальными показателями (0,15±0,03; Р=0,023), в то время как в группе 4, применявшей композицию с бромелаином, подобных изменений не наблюдалось - GBI на начало исследования составлял 0,16±0,02, по завершении исследования - 0,12±0,04; Р=0,43.
Таким образом, использование пасты с комплексом, содержащим бромелаин и лизат бифидобактерий или бромелаин и лизат Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus bulgaricus и Str. Thermophilus привело к уменьшению выраженности гингивита, причем данный эффект был более выражен, чем при использовании лизата бифидобактерий и бромелаина по отдельности, что говорит о синергизме действия обоих компонентов.
Применение пасты с заявленным комплексом также привело к снижению концентраций дефензинов в десневой жидкости, что свидетельствует о нормализации локального иммунного ответа.
Поскольку бромелаин является протеазой, полученный эффект можно объяснить тем, что под его действием становятся доступными новые эпитопы белковых антигенов, входящих в состав лизата бифидобактерий, лизата Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus bulgaricus и Str. Thermophilus или лизата Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans, что позволяет дополнительно стимулировать иммунные клетки, осуществляющие регуляторные реакции в отношении воспалительного процесса.
Пример 2.
В экспериментальных группах пациенты использовали следующие композиции, которые в качестве активных компонентов включали бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans в процентном содержании 0,005 и 0,05% (Таблица №5).
В качестве базы для включения компонентов применялась зубная паста с составом, приведенным в Таблице №2 (Пример 1).
Проведено проспективное рандомизированное двойное слепое исследование на 150 субъектах (74 мужчины и 76 женщин), рандомизированных в три равные половозрастные группы. Пациенты применяли композиции в виде зубной пасты 2 раза в день на протяжении 6 недель.
Параметром для оценки эффективности действия препаратов выступал средний индекс кровоточивости десен (GBI), определяемый врачом-стоматологом. Кроме этого, определялся состав микробиоты в десневом кармане.
Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М), медиану (Me), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (SEM), интерквартильные размахи, 90%ДИ. Полученные результаты обрабатывали с помощью ПО IBM SPSS Statistics 22.0 (StatSoft, Россия). Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты.
Через 6 недель после начала исследования наблюдали выраженные изменения оцениваемых показателей в группах исследования. В группе 1, применявшей композицию с комплексом лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans и бромелаин, значение GBI на конец исследования его значение составило 0,03±0,02, что меньше по сравнению с начальными показателями (0,17±0,03; Р=0,01). В группе 2, применявшей композицию с лизатом Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans, было отмечено менее выраженное изменение GBI, на конец исследования его значение составило 0,09±0,03 по сравнению с начальными показателями (0,17±0,03; Р=0,03), в то время как в группе 3, применявшей композицию с бромелаином, подобных изменений не наблюдалось - GBI на начало исследования составлял 0,16±0,04, по завершении исследования - 0,13±0,02; Р=0,18.
Таким образом, использование пасты с комплексом бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans привело к уменьшению выраженности гингивита, причем данный эффект был более выражен, чем при использовании лизата бифидобактерий и бромелаина по отдельности, что говорит о синергизме действия обоих компонентов.
При анализе состава микробиоты были выявлены следующие особенности.
После применения зубной пасты с комплексом бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans было отмечено снижение разнообразия микробиоты в десневой жидкости. Это свидетельствует об улучшении сдерживающих факторов иммунитета и установлении микроокружения, неблагоприятного для колонизации патогенными микроорганизмами. В частности, уменьшилась представленность родов Anaeroglobus, Bulleidia, Desulfobulbus, Filifactor, Mogibacterium, Phocaeicola, Schwartzia или TM7, ассоциируемых с развитием гингивита и пародонтита (Фиг. 1).
В сравнении с группами 2 и 3, у группы 1, применявшей композицию с комплексом бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans, по завершении исследования выявлено увеличение представленности родов Capnocytophaga, Corynebacterium, Gemella, Haemophilus, Leptotrichia, Streptococcus и Veillonella, ассоциируемых со здоровым состоянием полости рта, в частности, видов Capnocytophaga ochracea, Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus egyptius, Haemophilus infuenzae, Kingella oralis, Mogibacterium vescum, Mycoplasma salivarium, Neisseria canis, Porphyromonas catoniae, Prevotella oris, Propionibacterium acnes, Propionivibrio pelophilus, Rothia dentocariosa, Streptococcus sanguinis, Treponema socranskii, про которые известно, что представленность их на 20% выше у здоровых лиц, чем у страдающих периодонтитами (Фиг. 2).
Таким образом, применение комплекса бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и Candida albicans позволяет добиться нормализации состава микробиоты ротовой полости со смещением представленности видов в направлении, характерном для здорового состояния ротовой полости. Особую важность это представляет в связи с тем, что под действием комплекса снижается представленность видов, наличие которых при воспалительном процессе в ротовой полости (гингивит, пародонтит) ассоциировано с развитием патологии сердечнососудистой системы (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, острый коронарный синдром), что позволяет предполагать потенциальное уменьшение риска развития данных заболеваний при применении комплекса.
Пример 3.
Проведено проспективное рандомизированное двойное слепое исследование на 100 детях 6-9 лет (57 мальчиков и 43 девочки), рандомизированных в две равные половозрастные группы. На протяжении 52 недель группа А чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis по изобретению. Группа Б чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans по изобретению. Группа В чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans по изобретению. Группа Г чистила зубы дважды в день зубной пастой, аналогичной по составу применяемой группой А, Б, В, но не содержащей лизата и бромелаина. Оценивали риск увеличения количества кариозных изменений в группах до и после использования зубных паст. В группе А было отмечено снижение относительного риска увеличения кариозных поражений до значения 0,87 по сравнению с группой Г. В группе Б было отмечено снижение относительного риска увеличения кариозных поражений до значения 0,79 по сравнению с группой Г. В группе В было отмечено снижение относительного риска увеличения кариозных поражений до значения 0,83 по сравнению с группой Г. Таким образом, использование пасты с лизатом и бромелаином привело к уменьшению риска развития кариеса.
Пример 4.
Проведено проспективное рандомизированное двойное слепое исследование на 75 субъектах старшего возраста, страдающих ксеростомией. На протяжении 4 недель группа А (25 человек) чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis no изобретению. Группа Б (25 человек) чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans по изобретению. Группа В (25 человек) чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans no изобретению. Группа Г (25 человек) чистила зубы дважды в день зубной пастой, аналогичной по составу применяемой группой А, Б, В, но не содержащей лизата и бромелаина. Результаты фиксировались по стандартному опроснику для лиц, страдающих ксеростомией. В конце периода исследования улучшение состояния ротовой полости отметили 13 человек из группы А, 14 человек из группы Б, и 13 человек из группы В, по сравнению с 6 исследуемыми из группы Г. Таким образом, использование пасты с лизатами способствовало снижению симптомов, ассоциированных с ксеростомией.
Пример 5.
Проведено проспективное рандомизированное двойное слепое исследование на 60 субъектах (33 мужчины и 27 женщин), рандомизированных в три равные половозрастные группы. На протяжении шести недель группа А чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis по изобретению. Группа Б чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans по изобретению. Группа В чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин. Группа Г чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis. Группа Д чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Candida albicans по изобретению. Оценивали средний индекс кровоточивости десен (GBI) в группах до и после использования зубных паст. Использование всех паст привело к уменьшению выраженности гингивита, однако эффективность в группах А, Б и Д была значительно выше, чем в группах В и Г.
Пример 6.
Проведено проспективное рандомизированное двойное слепое исследование на 100 субъектах (52 мужчины и 48 женщин), рандомизированных в три равные половозрастные группы. На протяжении шести недель группа А чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин, лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и поливинилпирролидон по изобретению. Группа Б чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и поливинилпирролидон. Группа В чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и поливинилпирролидон. Группа Г чистила зубы дважды в день зубной пастой, содержащей бромелаин и лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis no изобретению. Оценивали средний индекс кровоточивости десен (GBI) в группах до и после использования зубных паст. Использование всех паст привело к уменьшению выраженности гингивита, однако эффективность в группе А была выше, чем в группе Г, и в общем выше, чем в группах Б и В.
Пример 7.
Проведено проспективное рандомизированное двойное слепое исследование на 60 субъектах (30 мужчины и 30 женщин), рандомизированных в три равные половозрастные группы. На протяжении шести недель группа А ежедневно после каждого приема пищи и чистки зубов применяла ополаскиватель, содержащий комплекс, включающий в состав лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis. Группа Б применяла ополаскиватель, содержащий бромелаин и поливинилпирролидон. Группа В применяла ополаскиватель, содержащий лизат Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и поливинилпирролидон. Оценивали средний индекс кровоточивости десен (GBI) в группах до и после использования ополаскивателя. Использование всех ополаскивателей привело к уменьшению выраженности гингивита, однако эффективность в группе А была выше, чем в группах Б и В.
Пример 8
Способ получения композиции по изобретению включает следующие этапы.
1) Получение бромелаина:
К двум образцам по 250 г измельченной массы верхушек ананаса добавляют по 500 мл воды или 0,05 М раствора бикарбоната аммония и проводят дальнейшее измельчение и экстракцию в гомогенизаторе. Полученную массу отжимают через несколько слоев марли, центрифугируют при 5500 об/мин и супернатант лиофильно высушивают. Получают по 4 г препарата бромелаина с активностью 1,1 и 1,2 ед/мг белка при использовании в качестве экстрагента воды и 0,05М раствора бикарбоната аммония соответственно.
2) Получение лизатов:
Бактерии Lactobacillus casei, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula и грибок Candida albicans культивируют в стандартных условиях до получения концентрации  КОЕ/мл. Культуры отмывают трехкратно центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут и концентрируют в 10 раз. Проводят термоинактивацию микроорганизмов проводят при 80°С в течение 30 минут. Для дезинтеграции и получения компонентов клеточной стенки и органелл микроорганизмы разрушают с помощью ультразвука (четырехкратное озвучивание, время озвучивания - 5 мин, время паузы между импульсами - 60 с, амплитуда - 9 мкм). После разрушения лизат осветляют центрифугированием в течение 20 минут при 3000 об/мин на холоде, компоненты бактериальных клеток осаждают центрифугированием при 20000 g в течение 1 часа при охлаждении. Осадок промывают в том же режиме и ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе.
Полученные бромелаин и лизаты вводят в состав композиции в соответствии с технологической картой производства.
Таким образом в материалах заявки было подтверждено достижение всех ожидаемых результатов, продемонстрирована высокая эффективность заявленного средства и его промышленная применимость.
Список литературы:
1. Abiko Y, Nishimura М, Kaku Т. Defensins in saliva and the salivary glands. Med Electron Microsc. 2003; 36(4):247-52.
2. Acharya A, Chan Y, Kheur S et al. Salivary microbiome in non-oral disease: A summary of evidence and commentary. Arch Oral Biol. 2017; 83:169-173.
3. Arweiler NB, Netuschil L. The Oral Microbiota. Microbiota Hum. body, Springer International Publishing; 2016, p. 45-60.
4. Campbell EL, Serhan CN, Colgan SP. Antimicrobial aspects of inflammatory resolution in the mucosa: a role for proresolving mediators. J Immunol. 2011; 187(7):3475-81.
5. Diaz P.I., Hoare A., Hong B.Y. Subgingival Microbiome Shifts and Community Dynamics in Periodontal Diseases. Journal of the California Dental Association, 2016; 44(7):421-435.
6. Gomez A, Nelson KE. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 2017; 73(2):492-503.
7. Huang R, Li M, Gregory RL. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2011; 2(5): 435-444.
8. Kinane DF, Stathopoulou PG, Papapanou PN. Periodontal diseases. Nat Rev Dis Primers. 2017; 3:17038.
9. Mark Welch J.L. et al. Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. PNAS 2016, 113(6): E791-E800.
10. Marsh PD, Head DA, Devine DA. Ecological approaches to oral biofilms: control without killing. Caries Res 2015; 49(suppl 1):46-54.
11. Matharu Z, Bandodkar AJ, Gupta V. Fundamentals and application of ordered molecular assemblies to affinity biosensing. Chem Soc Rev. 2012 Feb 7; 41(3):1363-402.
12. Olsen I, Lambris JD, Hajishengallisc G. Porphyromonas gingivalis disturbs host-commensal homeostasis by changing complement function. J Oral Microbiol. 2017; 9(1): 1340085.
13. Petersen PE, Bourgeois D, Ogawa Д et al. The global burden of oral diseases and risks to oral health. Bull World Health Organ. 2005;83(9):661-9.
14. Tanner A.C., Kressirer C.A., Faller L.L. Understanding Caries From the Oral Microbiome Perspective. Journal of the California Dental Association, 2016; 44(7):437-446.
15. Uriarte SM, Edmisson JS, Jimenez-Florez E. Human neutrophils and oral microbiota: a constant tug-of-war between a harmonious and a discordant coexistence. Immunological Reviews 2016; 273: 282-298.