Способ трансплантации ретинального пигментного эпителия в форме многоклеточных 3D сфероидов в эксперименте
METHOD OF TRANSPLANTATION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM IN THE FORM OF MULTICELLULAR 3D SPHEROIDS IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано с целью проведения трансплантации ретинального пигментного эпителия (РПЭ) в эксперименте на кроликах на доклиническом этапе для разработки новых методик хирургического лечения возрастной макулярной дегенерации (ВМД).
ВМД - это хроническое прогрессирующее дистрофическое заболевание центральной зоны сетчатки, приводящее к постепенному снижению центрального зрения.
Традиционные методики лечения ВМД (терапия биодобавками и поливитаминными комплексами, интравитреальное введение ингибиторов ангиогенеза, фотодинамическая терапия и хирургическое удаление фибро-васкулярных мембран) не всегда приводят к значимому улучшению зрения, являются дорогостоящими, не исключают риск рецидивирования процесса, а иногда и вовсе направлены на сохранение остаточных зрительных функций.
Новым патогенетически ориентированным способом лечения возрастной макулярной дегенерации является трансплантация РПЭ.
Известен способ трансплантации РПЭ, заключающийся в проведении микроинвазивной субтотальной витрэктомии, ретинотомиии в парацентральных отделах сетчатки и субретинальном введении аллогенного РПЭ в форме суспензии клеток (DelPriore LV, Kaplan HJ, Tezel TH, Hayashi N, Berger AS, Green WR. Retinal pigment epithelial cell transplantation after subfoveal membranectomy in age-related macular degeneration: clinicopathologic correlation // Am J Ophthalmol. - 2001. - №131(4). - P. 472-480.).
Недостатками данного способа являются: диссеминация суспензии клеток РПЭ по субретинальному пространству, что приводит к формированию неоднородного слоя РПЭ под сетчаткой, и миграцией трансплантируемых клеток в витреальную полость через ретинотомическое отверстие, что может приводить к развитию пролиферативной витреоретинопатии (ПВР), эпиретинальному фиброзу (ЭРФ) и отслойке сетчатки в послеоперационном период. Также использование суспензии донорского РПЭ предполагает удаление клеток с мембраны Бруха, что может приводить к их трансформации в мезенхимальную ткань с последующим развитием субретинального фиброза.
Известен способ трансплантации РПЭ, заключающийся в проведении микроинвазивной субтотальной витрэктомии, индукции отслойки сетчатки, выкраивании лоскута хориоидеи с РПЭ с периферических отделов глазного яблока с последующей его субретинальной трансплантацией в центральную зону (Heussen FM, Fawzy NF, Joeres S, Lux A, Maaijwee K, Meurs JC, Kirchhof B, Joussen AM. Autologous translocation of the choroid and RPE in age-related macular degeneration: l-year follow-up in 30 patients and recommendations for patient selection // Eye (Lond). - 2008. - №22(6). - P. 799-807).
Недостатком данного способа является высокая травматичность вмешательства, и в послеоперационном периоде существует высокий риск таких осложнений, как: отслойка сетчатки, гемофтальм и ПВР. Также после индукции отслойки сетчатки необходимо проведение тампонады витреальной полости силиконовым маслом, что подразумевает проведение второго этапа операции по поводу его удаления.
Известен способ трансплантации РПЭ, заключающийся в проведении микроинвазивной субтотальной витрэктомии, ретинотомиии в парацентральных отделах сетчатки и трансплантации аллогенного РПЭ, адгезированного к мембране Бруха, диаметр трансплантата 1-2 мм (патент US 6045791 А). Такая форма трансплантата позволяет избежать диссеминации клеток РПЭ и сохранить их фенотип.
Недостатками данного способа является необходимость в проведении ретинотомии не менее 1-2 мм (в зависимости от диаметра трансплантируемого лоскута) и необходимость в проведении эндолазеркоагуляции ретинотомического отверстия в парацентральных отделах сетчатки. Также данный способ требует совершенствования хирургического инструментария для введения трансплантируемого лоскута.
Авторам не известны способы трансплантации РПЭ в форме сфероидов в эксперименте.
Сфероид - это форма 3D клеточной культуры, в которой клетки, объединенные межклеточными связями, приближены к условиям нативной ткани. Сфероиды быстро адгезируются к плоской поверхности за счет высокой массы, что способствует снижению риска их диссеминации, и проявляют спрединг - распластывание с образованием клеточного слоя. Также культивирование РПЭ в форме сфероидов позволяет преодолеть явление эпителиально-мезенхимальной трансформации. Сфероиды РПЭ имеют средний диаметр 90 мкм, что позволяет трансплантировать их в субретинальное пространство при помощи современного микроинвазивного хирургического инструментария.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа, обеспечивающего возможность создания нового клеточного слоя РПЭ в эксперименте с минимальным риском послеоперационных осложнений.
Техническим результатом, достигаемым в результате использования данного изобретения, является создание нового клеточного слоя РПЭ путем доставки клеточных трансплантатов в необходимую зону под сетчаткой с последующей быстрой адгезией и спредингом. Способ является микроинвазивным, и соответственно, малотравматичным, не требует проведения эндолазеркоагуляции сетчатки в парацентральных отделах и тампонады витреальной полости силиконовым маслом.
Технический результат достигается тем, что в способе трансплантации РПЭ в форме 3D клеточных сфероидов в эксперименте, заключающемся в том, что кроликам проводят микроинвазивную трехпортовую 25 G витрэктомию в центральных и задних отделах стекловидного тела, после чего проводят ретинотомию в месте на 3 мм выше центральной зоны сетчатки при помощи острой канюли калибра 39G, затем субретинально однократно трансплантируют 81 или 162 3D клеточных сфероида РПЭ при помощи шприца, подключенного к аппарату для витреоретинальной хирургии, при этом каждый из сфероидов содержит 1000 клеток, сфероиды находятся в 0,05 мл стерильного физиологического раствора, операцию завершают тампонадой витреальной полости стерильным воздухом и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву.
Между совокупностью существенных признаков и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь.
Субретинальная трансплантация РПЭ в форме 3D клеточных сфероидов способствует образованию нового клеточного слоя, поскольку предложенная хирургическая техника является микроинвазивной и малотравматичной, не требует проведения эндолазеркоагуляции сетчатки в парацентральных отделах и тампонады витреальной полости силиконовым маслом.
2
Для получения трехмерной культуры РПЭ из кадаверных глазных яблок кроликов породы «шиншилла» выделяют хориоидально-пигментный комплекс (ХПК) по патенту РФ на изобретение №2569481, переносят в культуральные флаконы и культивируют при стандартных условиях (5% СО, 37°С), смену питательной среды проводят каждые 3 дня. Сфероиды создают из культуры РПЭ первого пассажа с использованием 81 и 162-луночных агарозных планшетов (3D PetriDishes, Microtissue, США), посевная концентрация - 1000 клеток в лунке. Культивирование сфероидов осуществляют в течение 7 дней, что способствует их окончательному формированию. Количество клеток в сфероиде не может быть больше 1000 клеток, так как известно, что сфероиды из большего количества клеток имеют низкую жизнеспособность. Также, количество клеток в сфероиде не может быть менее 1000 из-за незначительного терапевтического эффекта.
Способ трансплантации 3D сфероидов РПЭ в эксперименте на кроликах осуществляется следующим образом.
Проводят общий наркоз - 1% раствор Гексанала (0.5 мл на 1 кг веса внутримышечно). Обезболивание дополняют 3-х кратной инсталляцией 0,5% раствора Проксиметакаина в конъюнктивальную полость.
Конъюнктивальная полость промывается раствором Пиклоксидина 0,05%.
Проводят лимбальную перитомию, далее выполняют три сквозных прокола оболочек копьевидным ножом в 2 мм от лимба в верхне-наружном, верхне-внутреннем и нижне-наружном квадрантах. Устанавливают инфузионную систему. Через проколы вводят световод и витреотом.
Производят трехпортовую 25 G витрэктомию в центральных и задних отделах стекловидного тела. Далее выполняют ретинотомию канюлей 39 G в месте выше центральной зоны сетчатки на 3 мм и субретинально однократновводят 3D сфероиды РПЭ в концентрации от 81 до 162, что обусловлено технологией создания сфероидов (81 и 162 лунки в агарозном планшете). Более высокая концентрация сфероидов является нежелательной ввиду возможной индукции отслойки сетчатки. Сфероиды, находящиеся в 0,05 мл стерильного физиологического раствора, трансплантируют при помощи шприца (MicroDose injection kit 1 ml, MedOne, США), подключаемому к аппарату для витреоретинальной хирургии. Перед трансплантацией сфероиды РПЭ отмываются в стерильном физиологическом растворе. Эндолазеркоагуляция сетчатки вокруг ретинотомического отверстия не проводится. Операция завершается тампонадой витреальной полости стерильным воздухом и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву.
Пример 1.
Кролику проводили трехпортовую 25 G витрэктомию в центральных и задних отделах стекловидного тела. Далее выполняли ретинотомию канюлей 39 G в месте выше центральной зоны сетчатки на 3 м и субретинально вводили 81 сфероид РПЭ, 1000 клеток в 1 сфероиде, находящиеся в 0,05 мл стерильного физиологического раствора, при помощи шприца, подключаемому к аппарату для комбинированной хирургии. Операция завершалась тампонадой витреальной полости стерильным воздухом и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву.
Пример 2.
Кролику проводили трехпортовую 25 G витрэктомию в центральных и задних отделах стекловидного тела. Далее выполняли микроретинотомию канюлей 39 G в месте выше центральной зоны сетчатки на 3 м и субретинально вводили 3D сфероиды РПЭ (162 сфероида, 1000 клеток в 1 сфероиде), находящиеся в 0,05 мл стерильного физиологического раствора, при помощи шприца, подключаемому к аппарату для комбинированной хирургии. Эндолазеркоагуляция сетчатки вокруг ретинотомического отверстия не проводилась. Операция завершалась тампонадой витреальной полости стерильным воздухом и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву.
Эксперимент проводили согласно изобретению на 20 кроликах породы «шиншилла» (20 глаз), при этом каждому из 10 кроликов трансплантировали 81 сфероид, каждому из оставшихся 10 кроликов трансплантировали 162 сфероида.
После трансплантации 3D сфероидов, согласно вышеописанному способу, экспериментальным животным в послеоперационном периоде проводили ультразвуковое В-сканирование внутриглазных оболочек - 1 сутки и оптическую когерентную томографию (ОКТ) - 3, 7, 10, 14, 20 сутки. Животные выводились из эксперимента на 7, 10, 14 и 20 сутки наблюдения путем воздушной эмболии. Глазные яблоки энуклеировались и фиксировались в 10% растворе формалина для последующего гистологического исследования.
При проведении ультразвукового В-сканирования на 1-е сутки у 12 кроликов отмечалась плоская отслойка сетчатки в зоне оперативного вмешательства высотой до 1 мм, у 8 кроликов отмечалось прилегание оболочек, отслойка сетчатки не визуализировалась. Уровень воздуха составлял менее 1/2 объема витреальной полости.
ОКТ картина морфологического состояния сетчатки была схожей у всех экспериментальных животных: в зоне оперативного вмешательства отмечался кистозный отек и плоская отслойка сетчатки. Данные изменения отмечались в течение первых 7 суток после хирургии. По мере наблюдения сетчатка прилегала и отек сетчатки уменьшался. Также, на 3, 7 и 10 сутки субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром от 60 до 80 мкм - предположительно 3D сфероиды РПЭ. При проведении ОКТ на 14 и 20 сутки значимых изменений морфологического состояния сетчатки не наблюдалось.
По данным гистологического исследования отмечалась адгезия сфероидов РПЭ к сосудистой оболочке с последующим распластыванием и образованием нового клеточного слоя по мере увеличения сроков наблюдения.
В ходе проведения инструментальных и гистологических методов исследования в послеоперационном периоде было показано, что 3D клеточные сфероиды РПЭ, трансплантируемые по предложенному способу в эксперименте, попадают в субретинальное пространство, адгезируются к сосудистой оболочке, распластываются и способствуют образованию нового клеточного монослоя РПЭ. Осложнения (плоская локальная отслойка сетчатки, кистозный отек сетчатки), вызываемые предложенной хирургической техникой, являются неопасными и обратимыми.