Изучение антибактериальных свойств лактоферрина из различных источников в системе in vitro

e

Изучение антибактериальных свойств лактоферрина из различных источников в системе in vitro

Н. Э. ГРАММАТИКОВА1, С. П. РЕЗВАН1, Е. Р. НЕМЦОВА2,

О. А. БЕЗБОРОДОВА2, И. Л. ТУТЫХИНА3, Б. С. НАРОДИЦКИЙ3, Р. И. ЯКУБОВСКАЯ2

' Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

2 Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена Росздрава,

3 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи, Москва

In Vitro Study of Antimicrobial Activity of Lactoferrins from Various Sources

N. E. GRAMMATIKOVA, S. P. REZVAN, E. R. NEMTSOVA,

0. A. BEZBORODOVA, I. L. TUTYKHINA, B. S. NARODITSKY, R. I. YAKUBOVSKY

1. M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow

P. A. Gerzen Moscow Research Oncologic Institute, Moscow

N. F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Academy of Medical Sciences, Moscow

Проведена сравнительная оценка антимикробной активности лактоферринов из различных источников (нативного лактоферрина женского молока в составе препарата Лапрот, хололактоферрина человека, рекомбинантного лактоферрина человека, выделенного из культуральной жидкости после трансфекции пермиссивной культуры псевдоаденовирусной наноструктурой с геном лактоферрина человека) для обоснования возможности использования их в качестве основы антимикробных лекарственных средств. Показано, что все изученные субстанции лактоферрина человека и лактоферрин коровы проявляют активность в отношении стандартных штаммов микроорганизмов рода Bacillus. Антибактериальная активность лактоферрина человека практически не зависит от степени насыщения молекулы ионами, однако активность нативного лактоферрина в отношении грибов рода Candida значительно выше, чем хололактоферрина, при оценке по МПК. Рекомбинантный лактоферрин человека, не насыщенный специально ионами железа, проявляет антимикробную активность (по МПК), сходную с нативным лактоферрином человека. Полученные данные свидетельствуют, что нативный и рекомбинантный лактоферрин человека могут являться основой активных лекарственных препаратов с антимикробными свойствами для внутривенного и внутриполостного введения, а лактоферрин коровы — основой пероральных антибактериальных лекарственных средств.

Ключевые слова: лактоферрин, антибактериальная активность.

-Q-

Comparative antimicrobial activity of lactoferrins from various sources (native lactoferrin from Laprot, human hololactoferrin, recombinant human lactoferrin isolated from the cultural medium of permissive cell culture transfected using pseudoadenovirus nanostructure with the human lactoferrin gene, and native bovine lactoferrin) was studied to prove the possibility of their use for development of antimicrobial drugs. It was shown that all the substances were active against the Bacillus standard strains. The antibacterial activity was almost independent of the degree of saturation the lactoferrin molecules with Fe3+. The native human lactoferrin was more active than hololactoferrin against Candida when evaluated by the minimum inhibitory concentration (MIC). Fe3+-Non aturated recombinant human lactoferrin demonstrated the antimicrobial activity (by MIC) similar to that of the native human lactoferrin. The results showed that native and recombinant human lactoferrins might be used for the development of intravenous and intracavitary dosage forms, while the native bovine lactoferrin could be useful in development of oral drugs.

Key words: lactoferin, antibacterial activity.

Лактоферрин (ЛФ) — железосвязывающий многофункциональный гликопротеин, проявляющий в организме человека (и других млекопитающих) антиоксидантные, антибактериальные, противовирусные, иммуномодулирующие свойства, которые обусловливают его детоксицирующее и противовоспалительное действие [1]. Лак-тоферрины различных видов млекопитающих имеют высокую степень гомологии по первичной структуре (до 60—70%) [2]. На основании результатов структурного анализа установлено, что

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2. ММА им. И. М. Сеченова

молекула лактоферрина состоит из двух доменов, каждый из которых связывает один атом железа, один анион карбоната и содержит один гликози-лированный участок, к которому присоединен N-кольцевой гликановый остаток [3—5].

Антибактериальная активность лактоферрина показана в системах in vitro [6—9] и in vivo [10—12]. По данным литературы, существуют два различных механизма антибактериальной активности лактоферрина, вовлекающие различные области молекулы белка [13].

Один механизм — неспецифический — обусловливает бактериостатический эффект за счёт способности молекулы лактоферрина связывать ион железа. В результате бактериальные клетки

О

О

лишаются жизненно важного компонента, что приводит к торможению их роста [7, 14, 15]. Этот механизм лежит в основе бактериостатического эффекта лактоферрина в отношении широкого диапазона микроорганизмов, включая грамотри-цательные и грамположительные бактерии и некоторые дрожжи [14, 16]. Нативный лактофер-рин, содержащийся в молоке и других секретах (слюне, слезах, бронхиальном секрете и др.), в норме только на 5—8% насыщен железом и поэтому может функционировать как эффективный бактериостатический агент.

Однако этот эффект временный, так как ряд грамотрицательных бактерий приспосабливается к условиям ограниченного доступа железа. Кроме того, эффективность этого механизма зависит от насыщенности молекулы ионами железа [17, 18].

Другой механизм — специфический — обусловливает прямое бактерицидное действие. Белок вызывает быструю потерю жизнеспособности ряда микроорганизмов, которая не может быть восстановлена введением экзогенного железа в среду роста [19—21]. При физиологических концентрациях лактоферрин непосредственно повреждает внешнюю мембрану грамотрицатель-ных бактерий, вызывая высвобождение липополисахарида (ЛПС) [16, 22, 23]. Исследования показывают, что за бактерицидные свойства лактоферрина ответственна катионная область в М-концевом участке молекулы (пептид, получивший название лактоферрицин) [20, 21, 24]. Пептида:, содержащие эту катионную область лакто-феррина человека (остатки аминокислот 18—40), проявляют более сильный бактерицидный эффект и вызывают больший выброс ЛПС, чем природный лактоферрин [9, 25]. Подобные результаты получены и в отношении лактоферрина коровы [20, 26].

Помимо антибактериального действия лактоферрин обладает также иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами, которые обеспечивают его противовоспалительный и детоксицирующий эффекты. Широкий спектр физиологического действия лак-тоферрина обусловливает перспективность его использования в качестве основы лекарственных средств антиоксидантного, детоксицирующего, антибактериального и иммуномодулирующего действия.

К настоящему моменту в мире разработано два препарата на основе лактоферрина человека: Талактоферрин — на основе рекомбинантного лактоферрина человека, полученного с использованием культуры ЛзрггфЫз niger (^ептх, иБА), и Лапрот — на основе нативного лактоферрина, выделенного из женского молока (Россия). Препарат Талактоферрин позиционируется как иммуномодулирующее лекарственное средство и

проходит в настоящее время 3-ю фазу клинических испытаний.

Препарат Лапрот зарегистрирован в России (рег. № ЛС-002374) как детоксицирующее лекарственное средство, но в процессе клинических испытаний и дальнейшего клинического применения было выявлено его иммуномодулирующее, антибактериальное и противовоспалительное действие [27—31]. Многогранные терапевтические эффекты Лапрота свидетельствовали о перспективности расширения показаний к его применению, в частности как антибактериального средства. Однако основой препарата Лапрот является природный гликопротеин, выделенный из женского молока, что обусловливает ограниченность сырьевой базы для производства препарата и, соответственно, необходимость поиска альтернативных источников лактоферрина человека (для внутривенной и внутриполостной лекарственных форм) и других млекопитающих (для пе-роральной и наружной лекарственных форм). Для выбора субстанций, перспективных для дальнейшей разработки антибактериальных лекарственных препаратов, актуальным являлось изучение на широком спектре стандартных штаммов микроорганизмов антимикробной активности лакто-ферринов, полученных из различных источников (нативного лактоферрина человека из женского молока, нативного лактоферрина из молока коровы, рекомбинантного лактоферрина, выделенного из культуральной жидкости после трансфекции пермиссивной культуры псевдоаденовирусной наноструктурой с геном лактоферрина человека) и природного лактоферрина человека с различной степенью насыщения молекул ионами трехвалентного железа (Бе3+).

Цель настоящего исследования — сравнительная оценка антимикробной активности лак-тоферринов из различных источников для обоснования возможности использования их в качестве основы антимикробных лекарственных средств.

Материал и методы

Лактоферрин. Препарат Лапрот (рег. № ЛС-002374). Субстанция для получения препарата — нативный лактоферрин человека, выделенный из женского молока по методу [32]. Содержание лактоферрина в субстанции — 97%, степень насыщения ионами Бе3+ — 5—7%.

Хололактоферрин — лактоферрин человека, выделенный из женского молока по методу [32] и насыщенный ионами Бе3+ на 95—100%.

Рекомбинантный лактоферрин человека, полученный с использованием псевдоаденовирусной наноструктуры с геном лактоферрина человека, которая обеспечивает эффективную экспрессию гена ЛФ в пермиссивной клеточной системе с высокой продукцией рекомбинантного белка [33, 34]. Рекомбинантный лактоферрин человека выделен из культуральной жидкости, содержание его в субстанции — 97%.

Нативный лактоферрин коровы, выделенный из молока коровы по модифицированному методу [32]. Содержание лак-

e

Таблица 1. Сравнительная антимикробная активность субстанций лактоферрина, полученных из различного биологического материала

TecT-rnTaMM Минимальная подавляющая рост концентрация (МПК), мг/мл

Нативный ЛФ человека Хололактоферрин человека Рекомбинантный лактоферрнн человека Лактоферрин коровы

Candida albicans CBS 8837 1,25 >5,0 2,5 >5,0

Candida parapsilosis ATCC 22019 0,6 >5,0 2,5 >5,0

Staphylococcus aureus ATCC 29213 2,5 5,0 2,5 >5,0

Staphylococcus aureus ATCC 25923 5,0 5,0 1,25 >5,0

Escherichia coli ATCC 25922 5,0 5,0 5,0 >5,0

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 5,0 5,0 >5,0 >5,0

Bacillus subtilis 6633 0,15 0,3 0,3 0,3

Bacillus subtilis L 0,02 0,01 0,04 0,04

Bacillus cereus var. mycoides HB 0,6 0,15 0,3 0,3

Bacillus cereus var. mycoides 537 0,15 0,3 0,3 0,4

Bacillus pumilus NCT C 8241 0,3 0,15 0,15 0,3

Micrococcus luteus ATCC 9341 0,3 0,6 1,25 1,25

Enterococcus faecalis ATCC 29212 0,3 0,3 н/о н/о

Rhodococcus rhodochrous ATCC 15096 0,3 н/о н/о 5,0

тоферрина коровы в субстанции — 93%, специальную процедуру насыщения молекул ионами Fe3+ не проводили.

Все субстанции охарактеризованы по физико-химическим и биологическим свойствам. Показано, что рекомбинантный лактоферрин человека соответствует природному лактоферрину человека по изученным свойствам, лактофер-рин коровы отличается от лактоферрина человека по иммуно-химическим свойствам, но сходен по антиоксидантной активности и детоксицирующему действию.

Тест-микроорганизмы. Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus subtilis 6633; Bacillus subtilis var. mycoides L2, Bacillus cereus var. mycoides 537, Bacillus cereus var. mycoides HB; Bacilluspumilus NCT C 8241; Micrococcus luteus ATCC 9341, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae 911, Rhodococcus rhodochrous ATCC 15096, Candida albicans CBS 8837, Candidaparapsilosis ATCC 22019.

Методика исследования. Определение антимикробной активности образцов лактоферрина из различного биологического материала проводили микрометодом в жидкой питательной среде Мюллера-Хинтон (М/Х) (BioMerieux S. A.) в отношении стандартных тест-микроорганизмов.

В лунки вносили по 50 мкл среды, заражённой суточными тест-культурами с титром микробной суспензии 3—5Х105 КОЕ/мл. Субстанции предварительно растворяли в стерильной питательной среде и вносили с микробной суспензией. Максимальная концентрация образцов лактоферрина составляла 5 мг/мл, далее последовательно производили двукратное серийное разведение образцов до конечной концентрации белка 0,005 мг/мл. Контролями для каждого микроорганизма служили: стерильная питательная среда (контроль среды), суспензия тест-культур в питательном бульоне без препарата (контроль роста).

Результаты оценивали визуально, определяя минимальную подавляющую концентрацию (МПК) белка, и по изменению оптической плотности при Я=600нм на приборе Labsystems Bioscreen (Финляндия).

Результаты и обсуждение

Спектр антибактериальной активности субстанций лактоферрина человека (нативного — в составе препарата Лапрот, хололактоферрина и рекомбинантного) и коровы (нативного) был изучен на стандартных штаммах грамотрицатель-ных и грамположительных бактерий и грибов рода Candida с использованием визуальной и спектроскопической оценки.

Результаты визуальной оценки бактерицидной активности лактоферрина из различных источников по минимальной подавляющей концентрации (МПК) представлены в табл. 1.

Как видно из представленных данных, все субстанции проявляли высокое антимикробное действие в отношении грамположительных спорообразующих микроорганизмов. Различия в активности всех образцов в отношении микроорганизмов рода Bacillus являлись несущественными.

При анализе результатов антимикробной активности испытуемых субстанций в отношении P.aerugi-nosa ATCC 27853, S.aureus ATCC 29213, E.coli ATCC 25922 выявлено, что лактоферрин человека (все образцы) в максимальной концентрации 5 мг/мл полностью подавлял рост этих тест-культур, лактоферрин коровьего молока в этой концентрации не оказывал бактерицидного действия.

В отношении M.luteus ATCC 9341 активность нативного лактоферрина человека в составе препарата Лапрот достоверно не отличалась от активности железонасыщенного гликопротеина, но их активность в 4 раза превышала таковую рекомбинантного лактоферрина человека и лактоферрина, выделенного из молока коровы. Нативный лактоферрин и хололактоферрин активно подавляли рост E.faecalis и R.rhodochrous в концентрации 0,3 мг/мл (см. табл. 1).

Существенные различия между лактоферри-ном человека и коровы наблюдались в отношении подавления роста грибов рода Candida (см. табл. 1): наибольшую активность проявлял нативный лактоферрин человека (МПК 1,25—0,6 мг/мл), хололактоферрин человека и лактоферрин коровы не обладали противогрибковым действием в максимальной использованной концентрации (5 мг/мл), рекомбинантный лактоферрин человека занимал промежуточное положение (МПК 2,5 мг/мл).

Для выяснения влияния степени насыщения молекулы лактоферрина ионами железа на прояв-

e

ГО

*

ф

CQ

0 с ф у го

1 S

а

а

ф

а

о

н

*

го

0 а ф s

1 ф с

CQ

ГО

*

0 с

N

П5

1

fej

aa

©

ти Л

© ти Л

©

ти Л

© ти Л

^C-^OUOOO

OOUO^CNCNCN

К К

к к

Г'^'ООООО'ЛО

Ю'О'-ОЮЬЬ

оооо

ление антимикробного действия (в отношении микроорганизмов рода Bacillus, E.coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 27853, S.aureus ATCC 29213) изучили подавление роста в присутствии различных концентраций нативного и железонасыщенного лактоферрина человека. Результаты, оцененные по изменению оптической плотности при длине волны 600 нм, представлены в табл. 2.

Как видно из представленных данных, наибольшее ингибирующее влияние лактоферрин человека оказал на рост тест-культур рода Bacillus, причем активность нативного и хололактоферрина была сходной при всех концентрациях белка. Наибольшую активность обе субстанции проявили в отношении B.subtilis var. mycoides L2 — процент подавления роста достигал 70—75% при концентрации 0,08 мг/мл.

В отношении E.coli хололактоферрин в высоких концентрациях (5,0—1,25 мг/мл) проявлял несколько большую антимикробную активность, чем нативный лактоферрин (84—40% и 63—30% соответственно), однако эти различия нивелировались по мере снижения концентраций (см. табл. 2).

Изучение антимикробной активности в отношении Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 выявило незначительное подавление роста и нарушение пигментации тест-культуры под влиянием обеих субстанций: только при максимальной концентрации 5 мг/мл ингибирование достигало 71—73%, однако уже при концентрации 2,5 мг/мл снижалось до 40%, а при концентрации 1,25 мг/мл — до 20%.

Таким образом, все изученные субстанции, как лактоферрин человека, так и лактоферрин коровы, проявляли активность в отношении стандартных штаммов микроорганизмов рода Bacillus. В отношении других использованных в исследовании бактериальных штаммов изученные субстанции (нативный лактоферрин человека, рекомбинантный лактофер-рин человека и нативный лактоферрин коровы без специального насыщения молекул ионами Fe3+, а также хололактоферрин человека, насыщенный ионами Fe3+ на 95—100%), проявляли сходную антибактериальную активность, которая не зависела от степени насыщения молекулы ионами железа (небольшие различия в МПК для некоторых штаммов микроорганизмов не являются существенными).

Эти данные свидетельствуют о преимущественной реализации специфического бактерицидного механизма действия лактоферрина, а не бактериостатичес-кого — неспецифического — за счёт связывания ионов железа. Высокие концентрации, в которых лактофер-рин подавляет рост стандартных микроорганизмов в модельных исследованиях, соответствуют концентрации лактоферрина, которая создается в организме локально в зоне воспаления и обусловлена рекрутингом нейтрофилов и их дегрануляцией в этой зоне.

Представленные данные подтверждают антимикробное действие препарата Лапрот на основе нативного лактоферрина человека. Выявленная ан-

тимикробная активность рекомбинантного лак-тоферрина человека, полученного с применением псевдоаденовирусной наноконструкции с геном лактоферрина человека, свидетельствует о перспективности его использования для разработки антибактериальных средств, что существенно расширит сырьевую базу для производства препаратов на основе лактоферрина человека.

Данные сравнительного анализа антимикробной активности нативного и хололактоферрина коррелируют с результатами оценки другого вида активности лактоферрина — антиоксидантной. Методом ингибирования перекисного окисления липидов в гомогенате печени мышей нами ранее показано, что субстанции апо-, холо- и нативного лактоферрина обладают сходной антиоксидант-ной активностью, существенно не зависящей от степени насыщения молекулы ионами железа. В экспериментах in vivo на животных с токсикозом различного генеза их детоксицирующее действие было также сопоставимо, что обусловлено быстрым связыванием иона железа молекулой апо-лактоферрина в физиологических условиях. Совокупность полученных результатов о различных видах биологических эффектов лактоферрина в системах in vitro и in vivo свидетельствует, что для достижения высокого терапевтического эффекта лекарственные средства с антиоксидантными, детоксицирующими и антибактериальными свойствами могут быть созданы на основе нативного лактоферрина, не освобождённого специальной обработкой от ионов железа. Этот вывод имеет принципиальное значение для разработки препаратов, поскольку получение аполактоферрина (лишённого ионов железа) возможно только путем жёсткой кислотной обработки, что неизбежно приводит к конформационным изменениям молекулы. Такая субстанция лактоферрина менее пригодна для включения в препарат для внутри-

ЛИТЕРАТУРА

1. Legrand D., Pierce A., Elass E. et al. Lactoferrin structure and functions. Adv Exp Med Biol 2008; 606: 163—194.

2. Weinberg E. D. Antibiotic properties and applications of lactoferrin. Curr Pharm Des 2007; 13: 8: 801—811.

3. Anderson B. F., Baker H. M., Norris G. E. et al. Structure of human lactoferrin: crystallographic structure analysis and refinement at 2.8 A resolution. J Mol Biol 1989; 209: 711.

4. Anderson B. F., Baker H. M., Norris G. E. et al. Apolactoferrin structure demonstrates ligand-induced conformational change in transferrins [see comments]. Nature 1990; 344: 784.

5. Spik G., Coddeville B., Montreuil J. Comparative study of the primary structures of sero-, lacto- and ovotransferrin glycans from different species. Biochimie 1988; 70: 1459.

6. Arnold R. R., Brewer M., Gauthier J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: sensitivity of a variety of microorganisms. Infect Immun 1980; 28: 893.

7. Gonzalez-Chavez S. A., Arevalo-Gallegos S., Rascon-Cruz Q. Lactoferrin: structure, function and applications. Int J Antimicrob Agents 2009; 33: 4: 301—308.

8. Kutila T, Pyorala S., Saloniemi H., Kaartinen L. Antibacterial effect of bovine lactoferrin agains udder pathogens. Acta Vet Scand 2003; 44: 35—42.

венного и внутриполостного введения, поскольку может привести к развитию иммунного ответа у больного вплоть до анафилаксии.

Выводы

1. Все изученные субстанции лактоферрина человека — нативный лактоферрин в составе препарата Лапрот, хололактоферрин и рекомбинантный лактоферрин — проявляли активность в отношении стандартных штаммов микроорганизмов рода Bacillus.

2. Антимикробная активность лактоферри-на человека практически не зависела от степени насыщения молекулы ионами железа — нативный лактоферрин в составе препарата Лапрот и хололактоферрин проявляли сходную активность в отношении всех использованных штаммов за исключением грибов рода Candida — нативный лактоферрин проявлял значительно большую активность при оценке по МПК.

3. Рекомбинантный лактоферрин человека, полученный с использованием псевдоаденовирус-ной наноконструкции с геном лактоферрина человека и не насыщенный специально ионами железа, проявлял антимикробную активность (по МПК), сходную с нативным лактоферрином человека, выделенным из женского молока, в отношении изученных стандартных штаммов микроорганизмов.

4. Нативный и рекомбинантный лактофер-рин человека могут являться основой активных лекарственных препаратов с антимикробными свойствами для внутривенного и внутриполост-ного введения.

5. Лактоферрин коровы может явиться основой пероральных антибактериальных лекарственных средств с учётом спектра микроорганизмов, в отношении которых он проявлял высокую бактерицидную активность (микроорганизмы рода Bacillus и ряд кокковых форм).

9. Yamauchi K., Tomita M., Giehl T. J., Ellison R. T. Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment. Infect Immun 1993; 61: 2: 719—728.

10. Lee H. Y., Park J. H., Seok S. H. et al. Potential antimicrobial effects of human lactoferrin against oral infection with Listeria monocytogenes in mice. J Med Microbiol 2005; 54: 1049-1054.

11. Trumpler U., Straub P. W., Rosenmund A. Antibacterial prophylaxis with lactoferrin in neutropenic patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1989; 8: 310.

12. Vorland L. Lactoferrin: A multifunctional glycoprotein. APMIS 1999; 107: 971—981.

13. Antonio Aguila La , Ana G Herrera Puert et al. Isolation and Structure-functional Characterization of Human Colostral Lactoferrin. Biotecnología Aplicada, Volume 17, July-September 2000, 177—182.

14. Bullen J.J., Rogers H. J., Griffiths E. Role of iron in bacterial infection. Curr Top Microbiol Immunol 1978; 80: 1.

15. Lacasse P., Lauzon K., Diarra M. S., Petitcierc D. Utilization of lacto-ferrin to fight antibiotic-resistant mammary gland pathogens. J Anim Sci 2008; 86: 13: Suppl: 66—71.

16. Valenti P., Antonini G. Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack. Cell Mol Life Sci 2005; 62: 22: 2576—2587.

О

e

17. Arnold R. R., Russell J. E. Champion W. J. Gauthier J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: influence of physical conditions and metabolic state of the target microorganism. Infect Immun 1981; 32: 655.

18. Griffiths E., Humphreys J. Bacteriostatic effect of human milk and bovine colostrum on Escherichia coli: importance of bicarbonate. Infect Immun 1977; 15: 396.

19. Clarke S. R., Foster S. J. IsdA protects Staphylococcus aureus against the bactericidal protease activity of apolactoferrin. Inf Immun 2008; 76: 4: 1518-1526.

20. Flores-Villasenor H., Canizalez-Roman A., Reyes-Lopez M. et al. Bactericidal effect of bovine lactoferrin, LFcin, LFampin and LFchimera on antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Biometals 2010; 3.

21. Manzoni P., Decembrino L., Stolfi I. et al. Lactoferrin and prevention of late-onset sepsis in preterm neonate in the NICU. Early Hum Dev 2010; 2.

22. Ellison R. T. D., Giehl T. J., LaForce F. M. Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin. Infect Immun 1988; 56: 2774.

23. Ling J. M., Schryvers A. B. Perspectives on interactions between lacto-ferrin and bacteria. Biochem Cell Biol 2006; 84: 3: 275—281.

24. Gifford J. L., Hunter H. N., Vogel H. J. Lactoferricin: a lactoferrin — a lactoferrin-derived peptide with antimicrobial, antiviral, antitumor and immunological properties. Cell Mol Life Sci 2005; 62: 22: 2588—2598.

25. Bellamy W., Takase M., Yamauchi K. et al. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochim Biophys Acta 1992; 1121: 130.

26. Di Biase A. M., Tinari A., Pietrantoni A. et al. Effect of bovine lactoferricin on enteropathogenic Yersinia adhesion and invasion in HEp-2 cells. J Med Microbiol 2004; 53: 407—412.

27. Немцова E. P., Эделева Н. В., Осипова Н. A. и др. «Лaпрoт» — довый прeпaрaт дeтoкcицирyющeгo, прoтивoвocпaлитeльнoгo и имму-нoмoдyлирyющeгo дєйствия. Pocc Oнкoлoг Журн 2006; 4: 29—33.

28. Чиссов В. И., Якубовская P. И., Немцова E. P. и др. Лєчєниє тяжє-льш пocлeoпeрaциoнныx гнoйнo-вocпaлитeльныx и ce^^ec^x oc^o:^eKM c иcпoльзoвaниeм aнтиoкcидaнтныx прeпaрaтoв, Хирургия. Жyрнaл им. H. И. Пирoгoвa 2008; 11.

29. Эделева Н. В., Немцова E. P., Якубовская P. И., Осипова Н. A. Прє-пaрaты Цeрyлoплaзмин и Лaпрoт в кoмплeкce лєчєния тяжeлыx пocлeoпeрaциoнныx гнoйнo-ceптичecкиx ocлoжнeний в on^xn-рургии. Pocc oraon журн 2005; 6: 25—28.

30. Lyons T. E., Miller M. S., Serena T. et al. Talactoferrin alfa, a recombinant human lactoferrin promotes healing of diabetic neuropathic ulcers: a phase 1/2 clinical study. Am J Surg 2007; 193: 1: 49—54.

31. Weber-Dabrowska B., Zimecki M., Kruzel M. et al. Alternative therapies in antibiotic-resistant infection. Adv Med Sci 2006; 51: 242—244.

32. Якубовская P. И., Немцова E. P., Коханова И. Д. и др. Лaктoфeррин чeлoвeкa: пoлyчeниe выcoкooчищeнныx прeпaрaтoв из мoлoкa жєн-щин, нeкoтoрыe физикo-xимичecкиe cвoйcтвa и рacпрeдeлeниe в нoрмaльныx и oпyxoлeвыx ^arax. Boпр мєд xимии 1986; 6: 75—79.

33. Тутыхина И. Л., Безбородова О. A., Верховская Л. В. и др. Peкoмби-нaнтнaя пceвдoaцeнoвирycнaя нaнocтрyктyрa c гeнoм лaктoфeр-рита чeлoвeкa: ^лучєниє, изучєниє экcпрeccии и cвoйcтв лaктo-фєрри^ при ee примєнєнии in vivo. Moл гєнєт микрoбиoл вирушл 2009; 1: 27—31.

34. Tutykhina I. L., Bezborodova O. A., Shmarov M. M. et al. Production of Recombinant Human Lactoferrin in Allantoic Fluid of Embryonated Chicken Eggs and its Characteristics. Protein expression purification 2009; 65; 100—107.

-Q-