ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/CHICKEN/KURGAN/05/2005 СУБТИП H5N1 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЕЧЕБНЫХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА
STRAIN OF BIRD FLU VIRUS A/CHICKEN/KURGAN/05/2005 SUBTYPE H5N1 FOR STUDYING OF ACTIVITY OF MEDICAL AND PREVENTIVE PREPARATIONS AGAINST FLU VIRUS

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к получению нового штамма вируса гриппа, субтипа H5N1, для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа
Известен штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 субтип H5N1 вируса гриппа птиц (аналог), выделенный на территории Западной Сибири, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов на культурах клеток (Патент RU 2309983, МПК С12N 7/00, опубл. 27.05.2007 г.).
50
Однако указанный штамм имеет следующие недостатки: штамм имеет пониженную продуктивность при культивировании на клетках МДСК - максимальная концентрация вируса 6,5 lg ТЦД/мл. Штамм предназначен для производства профилактических и диагностических препаратов и, исходя из представленных данных о патогенности для культур клеток и отсутствия данных о патогенности для животных, в т.ч. мышей, может быть использован для оценки противовирусной активности различных соединений только на культуре клеток.
Наиболее близким штаммом (прототипом) является штамм А/БАК/РОССИЯ/05 (субтип H5N1) вируса гриппа птиц (Патент RU 2300564, МПК С12N 7/00, опубл. 10.06.2007 г.). Однако указанный штамм может быть использован только для получения антигена и создания вакцинных и диагностических препаратов. Данных о патогенных свойствах штамма для лабораторных животных, в т.ч. мышей, нет.
in vivo
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц (субтип H5N1) для моделирования инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц субтипа H5N1, на мышах в экспериментах по изучению активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин. Указанный технический результат достигается путем получения нового штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц (субтип H5N1) для использования в эксперименте по изучению специфической активности противовирусных (противогриппозных) препаратов и эффективности вакцин в экспериментах  на модели беспородных (б/п) белых мышей.
50
50
50
Штамм высокопродуктивен: при культивировании на культуре клеток MDCK титры составляют 8,7±0,6 lg ТЦД/мл. Штамм вызывает заболевание с летальным исходом у мышей при аэрозольном, интраназальном, внутримозговом, внутримышечном заражении. Штамм высокопатогенен для мышей: при аэрозольном или интраназальном заражении (ЛД для б/п мышей = 10-20 ЭИД/мышь) штамм вызывает у мышей заболевание, которое по клиническим признакам, патоморфологической картине и размножению вируса в органах-мишенях наиболее адекватно моделирует гриппозную инфекцию у птицы и человека.
Характеристика заявляемого штамма. Штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 относится к вирусу гриппа птиц род Innuenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Заявляемый штамм выделен от больной курицы при вспышке заболевания среди птиц в г.Кургане. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-349 (дата регистрации май 2005 г.).
50
50
Источник получения. Из клинического материала, полученного от погибшей птицы из частного хозяйства в Курганской области (трахея, гортань, легкое), был выделен изолят вируса гриппа птиц, который был назван A/Chicken/Kurgan/05/2005. Вирус был выделен при заражении гомогенатами органов погибшей курицы культуры клеток MDCK и куриных эмбрионов уже после первого пассажа. Штамм агглютинировал человеческие и куриные эритроциты: показатели гемагглютинирующей активности составляли 1:64-1:128 ГАЕ/0,2 мл (в культуре зараженных штаммом клеток MDCK). Инфекционная активность выделенного вируса составляла 7-8 lg ТЦД/0,2 мл в культуре клеток MDCK и 8-8,5 lg ЭИД/0,2 мл в куриных эмбрионах.
Подлинность штамма. Вирусная РНК была выделена из аллантоисной жидкости КЭ с помощью набора «РИБО-золь-А (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Ревертазную реакцию проводили с использованием фермента M-MuLV (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Для построения кДНК и определения нуклеотидной последовательности амплификационных фрагментов были использованы олигонуклеотидные праймеры, предложенными E.Hoffmann et at. Archives of Virology, 2001. - 146:2275-2289.
Условия проведения ПЦР: 95°С - 2 мин, затем 94°С - 10 с, 58°С - 30 с, с понижением температуры на 1°С за цикл, 72°С - 1 мин 6 циклов, затем 94°С - 10 с, 52°С - 15 с, 72°С - 40 сек 35 циклов и затем 72°С - 7 мин.
2
4
2
4
ПЦР проводили в присутствии 0,2 mM каждого из дезоксинуклеозидгрифосфатов, 1,5 mM MgCl, 30 mM Трис-НСl (рН 8,5 при +25°С), 16 mM (NH)SO, 0,1% Nonidet P40 ("Sigma"), no 0,15 μM олигонуклеотидных праймеров и 1,5 U/30 μl Hot Start Taq ДНК полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).
ПЦР фрагменты анализировали гель-электрофорезом в 2% агарозе и очищали для последующего определения нуклеотидной последовательности.
Определение нуклеотидной последовательности выделенных фрагментов проводили на приборе Beckman Coulter CEQ2000XL DNA Analysis System ("Beckman Coulter, Inc.") с использованием наборов "Beckman sequencing Kit". Полученные нуклеотидные последовательности и филогенетический анализ проводился с использованием прикладных программ VECTOR NTI 8.0 («InforMax») и Mega 2.1. Матрицу расстояний вычисляли по алгоритму Р-дистанции. Филогенетичекое дерево строили с использованием метода «ближайшего соседа» (neighbor-joining). Достоверность проверялась методом «бутстреп») (bootstrap), с 500 репликациями. Достоверным считали «бутстреп» индекс >75. Для построения филогенетических деревьев использовали нуклеотидные последовательности генов вируса гриппа А, депонированных в международной базе данных GenBank.
Все полученные первичные последовательности были депонированы в базу GenBank. Номера депонирования генов вируса гриппа штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 представлены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1.Номера депонирования генов вируса гриппа штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 в международной базе данных GenBank
Штамм вируса гриппа
Ген вируса гриппа и номера депонирования в GenBank
HA
NA
PB2
PB1
PA
NP
М
NS
A/chicken/Kurgan/05/2005
DQ449632
DQ449634
DQ449639
DQ449638
DQ449637
DQ449635
DQ449633
DQ449636
Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности генов показал принадлежность штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 к субтипу H5N1. Штамм наиболее близок к цинхайской группе субтипов H5N1 вируса гриппа.
2
50
Культуральные свойства. Штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 при культивировании на монослое клеток МДСК вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сут (температура культивирования 37°С, в атмосфере 5% СО). Максимальные титры вируса регистрировали на 4-6 сутки после заражения монослоя клеток МДСК их величина составляла 7,7±0,6 lg ТЦД/мл.
Патогенность для человека. Штаммы вируса гриппа птиц субтипа H5N1 являются патогенными для человека: летальность для человека составляет около 60%.
Патогенность для птицы. Штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 относится к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц: интравенозный индекс патогенности = 3.0.
Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение 2-х и более лет при температуре хранения -70°С.
Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ×2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.
Пример 1. Изучение патогенных свойств штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005
in vivo
Были сформированы стоки штаммов вируса гриппа птиц субтипа H5N1, выделенных на территории РФ, и в экспериментах  были изучены патогенные свойства штаммов для беспородных белых мышей, кур и куриных эмбрионов (КЭ). Результаты экспериментов приведены в таблице 2.
ТАБЛИЦА 2.Изучение патогенности штаммов вируса гриппа птиц в экспериментах in vivo
Штамм вируса гриппа птиц
Патагенные свойства (M±S<sub>m</sub>)
Для КЭ (lg ЭИД<sub>50</sub>/мл)
Для кур (ИВИИП*)
Для б/п белых мышей
ИД<sub>50</sub> (lg ЭИД<sub>50</sub>/мл)и/н**
ЛД<sub>50</sub> (lg ЭИД<sub>50</sub>)и/н**
ЛД<sub>50</sub> (lg ЭИД<sub>50</sub>)в/м***
A/Chicken/Kurgan/05/2005
8,5±0,5
3,0
1,0±0,9
1,1±0,4
2,3±0,6
A/Chicken/Crimea/04/2005
8,8±0,5
3,0
н.о.
1,3±0,3
2,8±0,5
A/Chicken/Omsk/06
9,2±0,3
3,0
н.о.
2,2±0,4
н.о.
A/Chicken/Dagestan/06
7,9±0,6
3,0
н.о.
2,7±0,6
н.о.
A/Chicken/Krasnodar/02/06
7,5±0,5
3,0
н.о.
3,0±0,6
н.о.
A/Duck/Kurgan/08/2005
9,0±0,3
н.о.
н.о.
4,7±0,6
н.о.
A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005
8,2±0,3
2.7
н.о.
6,6±0,7
>8,0
A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005
8,4±0,5
н.о.
н.о.
6,7±0,7
>8,0
* - интравенозный индекс патогенности (Capua,et al.,Avian Pathol.1999,28(5):455-460)** - при интраназальном заражении*** - при внутримышечном заражениин.о. - не определялось
Из результатов, приведенных в таблице 2 следует, что штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц является наиболее патогененным для б/п белых мышей среди изученных штаммов вируса гриппа птиц субтипа H5N1, которые были выделены при вспышках заболевания на территории Российской Федерации.
Пример 2. Изучение клинических проявлений заболевания у б/п белых мышей при интраназальном заражении штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005
По результатам изучения патогенности для мышей были выбраны 3 штамма вируса гриппа птиц (H5N1): A/Chicken/ Kurgan/05/2005 - высокопатогенный штамм, A/Duck/Kurgan/08/2005 - обладает средней патогенностью и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 - низкопатогенный (апатогенный) для мышей штамм.
50
50
Изучение патогенеза заболевания проводили на беспородных белых мышах весом 12-14 г при интраназальном заражении дозой 10 ЛД/мышь для штаммов A/Chicken/ Kurgan/05/2005 и A/Duck/Kurgan/08/2005, и дозой 6,0 lg ЭИД/мышь для штамма A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005. На 5-7 день после заражения у мышей, зараженных штаммами A/Chicken/Kurgan/05/2005 и A/Duck/Kurgan/08/2005, наблюдались следующая клиническая картина: признаки общей интоксикации (снижение активности, отказ от пищи и воды), выраженная дыхательная недостаточность. Смерть наступала на 7-8 сутки. У мышей, зараженных штаммом A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005, клиническая картина заболевания либо отсутствовала либо была стерта.
При изучении гистоморфологической картины поражения легких мышей, интраназально зараженных штаммом A/Chicken/ Kurgan/05/2005 выявлены патологические изменения во всех компартментах легкого. Для воздухопроводящего компартмента характерно поражение эпителиальной выстилки бронхов с развитием дистрофически-некротических изменений эпителиоцитов и их десквамации. В респираторном отделе легкого происходит развитие дис- и ателектазов, появляются интраальвеолярные кровоизлияния, наблюдаются выраженные нарушения микроциркуляции. Для сосудистого компартмента характерно развитие дистонии сосудов, альтерация всех слоев сосудистой стенки, внутрисосудистое тромбообразование. В целом, выявленные изменения (десквамация эпителия бронхов, расстройства гемодинамики) аналогичны таковым при повреждении легких людей вирусом гриппа, однако при инфекции данным штаммом эти изменение сопровождаются развитием респираторного дистресс-синдрома (расстройства кровообращения принимают более выраженный характер, развиваются ателектазы и отек легкого, появляются признаки ДВС-синдрома, формируется бронхолегочная дисплазия). В периферической крови мышей наблюдается выраженная относительная лейкопения и патологические изменения эритроцитов.
Примечания к таблице 3:
1
Синдром катарального воспаления включает в себя поражение слизистой оболочки верхних дыхательных путей, конъюнктивы глаз.
2
Под респираторным синдромом понимаются дыхательные расстройства разной степени выраженности (трахеиты, бронхиты, вирусная пневмония, отек легких) с развитием дыхательной недостаточности или без нее.
3
Проявлениями общей интоксикации являются: повышение температуры тела, озноб, адинамия, анорексия, вегетативно-сосудистые расстройства, снижение массы тела у животных.
4
Геморрагический синдром чаще развивается при тяжелой или гипертоксической форме гриппа и может проявляться геморрагической экзантемой, кровоизлияниями в головной мозг и паренхиматозные органы, кровотечениями. Грубые нарушения в системе гемостаза ведут к таким осложнениям, как ДВС-синдром и токсический геморрагический отек легких.
5
Абдоминальный синдром: рвота, диарея, тошнота и боли в животе (у людей).
6
Неврологические расстройства включают в себя признаки нейротоксикоза (судороги, адинамия или возбуждение, угнетение сознания вполоть до развития комы); у людей появление неврологической симптоматики связывают с действием провоспалительных цитокинов и циркуляторными расстройствами, у животных возможно развитие нейроинфекции.
Пример 3. Использование штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 для проверки противовирусной активности препарата «Тамифлю» в экспериментах in vivo на модели мыши и курицы
Из литературных данных известно, что использование мыши в качестве модельного животного для проверки противовирусной активности препаратов при гриппозной инфекции широко распространено в научной практике (Droebner К., et al Antiviral. Res. 2007; 76(1): 1-10.; Serkedjieva J. et al. Antivir. Chem. Chemother. 2007; 18(2):75-82.; Yen H.L. et al. J. Virol. 2007; 81(22):12418-26). В перечисленных работах используются штаммы, полученные из Китая, Индонезии и т.д. Испытание препаратов и вакцин, проведенное на отечественных штаммах, позволит более адекватно оценить готовность учреждений Минзрдравсоцразвития и Минсельхоза к профилактике и ликвидации вспышек заболевания, вызванных вирусом гриппа птиц.
50
Мышей и кур инфицировали интраназально штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц доза 1.0 ЛД/объект. При изучении лечебно-профилактического действия препарата Тамифлю первой опытной группе мышей (30 голов) ежедневно 2 раза в сутки (в день заражения ВГ и в течение 4 дней после заражения) интрагастрально вводили препарат в дозе 0,2 мг в объеме 0,2 мл на мышь. Контрольной группе животных (30 голов) по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду. Результаты исследований представлены в таблице 4.
ТАБЛИЦА 4.Лечебно-профилактическая активность препарата Тамифлю на модели гриппозной инфекции у мышей
Препарат для лечения
Противовирусный эффект
птица породы White High Sех
б/п белая мышь
СПЖ (сут)
коэффициент защиты (%)
СПЖ (сут)
коэффициент защиты (%)
Тамифлю
4,2±1,0
34
9,3±1,0
48
Физ. р-р.
3,2±1,0
0
7,8±1,0
0
Примечание: СПЖ - средняя продолжительность жизни; данные СПЖ представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение.
Таким образом, предлагаемый штамм вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 может быть успешно использован для изучения активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин против вируса гриппа птиц (субтип H5N1) на модели б/п белых мышей.