Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты)
TEST SYSTEM AND METHOD FOR DETECTING RNA OF CORONAVIRUS SARS-COV-2, VIRUS-AGENT OF CORONAVIRUS DISEASE 2019 COVID-19, BY POLYMERASE CHAIN REACTION IN REAL TIME (EMBODIMENTS)

Область техники
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Изобретение может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии для выявления генетического материала (РНК) коронавируса SARS CoV-2, ассоциированного с респираторным заболеванием COVID-19, в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов. При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда возможно выявление генетического материала (РНК) коронавируса SARS CoV-2, ассоциированного с респираторным заболеванием COVID-19.
Предшествующий уровень техники
Вирус SARS-CoV-2 вызвал пандемию ранее не известного респираторного заболевания, угрожающего жизни человека, которому было присвоено название COVID-19, в 2019-2020 гг. В научных центрах мира ведется экстренная работа по созданию необходимых диагностических тест-систем и разработке вакцины для борьбы с новой болезнью.
Ниже приведены зарубежные аналоги, представляющие собой тест-системы с наборами специфических праймеров, способные обнаруживать генетический материал коронавирусов.
Известен патент Германии на изобретение №20315159, МПК C12Q 1/6886, C12Q 1/701, «Набор для обнаружения нового коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома». Набор реагентов для обнаружения тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) - ассоциированного вируса (коронавирус, связанный с пневмонией человека; HPAC) с помощью обратной транскрипции-ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Набор для обнаружения тяжелого острого респираторного синдрома, связанного с респираторным синдромом (коронавирус, связанный с пневмонией человека; НРАС) с помощью обратной транскрипции-ПЦР в реальном времени (RT-PCR) включает прямой праймер (FP) и обратный праймер (RP), оба из приблизительно 18-31 нуклеотидов (п.н.) и зонд (P), приблизительно 18-35 п.н., который помечен флуоресцентным репортерным красителем (FRD) и гасящим красителем (QD), по меньшей мере один из которых является флуоресцентным красителем. FP и RP связываются соответственно с областями 69-98 и 123-168 последовательности 300 пар оснований, в то время как (P) связывается с областью 89-132. олигонуклеотиды длиной 18-31 п.н., связываются с участками 69-98 и 123-168.Также заявлен аналогичный набор, содержащий FP и RP 18-35 п.н., при этом связывание происходит соответственно с областями 1-240 и 60-300 и зонд 12-40 п.н., который связывается с областью 21-279.
Известен патент WO 2006022459, МПК C12Q 1/68, «ПРАЙМЕР И ЗОНД ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КОРОНАВИРУСА SARS, НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПРАЙМЕР И/ИЛИ ЗОНД, И СПОСОБ ЕГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ». Патент включает:
1. праймер для обнаружения SARS (Тяжелый острый Респираторный Синдром), представленный как SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 Или SEQ ID NO: 9.
2. зонд для обнаружения коронавируса SARS (Тяжелый Острый респираторный Синдром), представленный В SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 10.
3. набор для обнаружения SARS (Тяжелый острый Респираторный Синдром)
4. Набор для обнаружения SARS (Тяжелый острый Респираторный Синдром) в котором он дополнительно включает ДНК-полимеразу или обратную транскриптазу.
5. Способ обнаружения Коронавируса SARS (Тяжелый Острый респираторный Синдром), включающий:
а) смешивание смеси ферментов, Содержащей ДНК-полимеразу и/или обратную транскриптазу, с реакционной смесью, содержащей олигонуклеотиды, указанные в п. 1 или 2;
b) добавление Образца РНК к смеси, полученной на стадии a);
c) амплификацию реакционного раствора, содержащего образец РНК, полученный на стадии b), используя RT-ПЦР-процесс.
Наиболее близким к заявляемому решению является патент РФ на изобретение №2504585, МПК C12Q 1/68, «Набор Олигодезоксирибонуклеотидных Праймеров И Флуоресцентно-Меченного Зонда Для Идентификации Рнк Коронавируса Человека, Ассоциированного С Тяжелым Острым Респираторным Синдромом». Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда для идентификации коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом, содержит пару внутренних и один внешний олигонуклеотиды, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченный ДНК-зонд, имеющие следующую структуру: внешний обратный праймер
NR: 5'-CTTTTGGCAATGTTGTK(G/T)CCTT-3'; внутренние прямой (F) и обратный (R) праймеры 5'→3' F: 5'-AAAATGTCTGATAATGGACCCC-3' и R: 5'-ACCACCACGAR(A/G)CTCGTCG-3'; флуоресцентно-меченный ДНК-зонд
Z: 5'-TY(C/T)CACCAAATGTAATGCGGGG-3'.
Набор праймеров и зонд позволяют идентифицировать коронавирус человека, ассоциированный с ТОРС, а также коронавирусы, подобные ТОРС-коронавирусу человека, выделенные от пальмовых циветт, енотовых собак и плодоядных летучих мышей методом ПЦР в реальном времени с получением более продолжительного амплифицированного фрагмента NP-гена коронавируса.
Известные тест-системы предназначены для обнаружения вирусов, родственных SARS-CoV-2, в частности, коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС), которому присвоено название SARS-CoV-1. Недостаток этих тест-систем состоит в том, что они не обладают специфичностью к геномному материалу SARS-CoV-2 и, следовательно, не могут быть использованы для дифференциальной диагностики SARS-CoV-2. Помимо детектирования разнообразных ранее известных коронавирусов вместо наиболее важного с медицинской точки зрения нового вируса SARS-CoV-2, к недостаткам приведенных решений можно отнести отсутствие контроля на экспрессию референсного гена человека, который указывает на эффективность выделения РНК из образца, синтеза кДНК и прохождения ПЦР.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является создание быстрого и надежного теста на вирус SARS-CoV-2 на основе синтеза кДНК с помощью MMLV-ревертазы (обратной транскрипции - ОТ) и классической ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), где обе реакции протекают в одной пробирке. Набор праймеров также может быть использован в обычной ПЦР в реальном времени без синтеза кДНК, если кДНК уже была синтезирована любым другим способом.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в детекции РНК вируса SARS-CoV-2 за счет специфического распознавания области гена 3CLpro (3CL протеиназы вируса), которая является ключевой в созревании репликазного комплекса вируса, ответственного за его размножение. Данный ген 3CLpro является очень консервативным, и он практически не может быть подвержен эволюционным изменениям, так как данные изменения могут привести к потере способности вируса размножаться. [Anand K., Ziebuhr J., Wadhwani P. et al. Coronavirus Main Proteinase (3CLpro) Structure: Basis for Design of Anti-SARS Drugs // Science, 2003, 300: 1763-7].
Поставленная задача решается за счет того, что создана тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 путем
проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая праймер SBT0017, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GCTGGCACAGACTTAGAAGGT-3', праймер SBT0018, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGCAGCGTACAACCAAGCTAA-3', и зонд SBT0019, имеющий последовательность 5'-GTTGACAGGCAAACAGCACAAGCAGCTG-3', а также для положительного контроля прохождения всех этапов анализа включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека GAPDH праймер SBT0014, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015, имеющий нуклеотидную последовательность 5'- TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', и зонд SBT0016, имеющий последовательность 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека ACTB праймер SBT0011, имеющий нуклеотидную последовательность
5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3',
и зонд SBT0013, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. (Вариант 1)
Также создана тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая праймер SBT003, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GTTCGCATTCAACCAGGACAG-3', праймер SBT004, имеющий нуклеотидную последовательность
5'-ACCTTCTAAGTCTGTGCCAGC-3', и зонд SBT0026, имеющий последовательность 5'-CTGGTGTTTACCAATGTGCTATGAGGCCC-3',
а также для положительного контроля прохождения всех этапов анализа включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека GAPDH праймер SBT0014, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015, имеющий нуклеотидную последовательность 5'- TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', и зонд SBT0016, имеющий последовательность 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека ACTB праймер SBT0011, имеющий нуклеотидную последовательность
5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3',
и зонд SBT0013, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. (Вариант 2).
Способ выявления РНК вируса SARS-CoV-2 по варианту 1 или 2 включает выделение РНК из биологического материала, синтез кДНК и проведение ПЦР-РВ, при этом синтез кДНК проводят при 45°С в течение 30 минут, после чего MMLV ревертазу инактивируют прогреванием при 95°С в течение от 2 до 5 минут, далее полученную кДНК амплифицируют в ПЦР-РВ с участием специфичной к вирусному гену 3CLpro пары праймеров и зонда по варианту 1 или 2, причем в качестве контроля в той же или параллельной, но с тем же образцом, реакции амплифицируется кДНК гена домашнего хозяйства GAPDH с участием пары праймеров и зонда, или кДНК гена домашнего хозяйства ACTB с участием пары праймеров и зонда, при этом температурный режим ПЦР-РВ включает следующие этапы: прогревание при 95°С в течение от 2 до 5 минут, совмещенное с инактивацией MMLV ревертазы, и от 45 до 49 циклов амплификации 95°С - от 5 до 15 сек, 55°С - от 20 сек до 1 мин, а детекцию флуоресценции проводят в ходе каждого цикла при температуре 55°С по каналам HEX/VIC для вирусной последовательности и FAM для последовательности гена домашнего хозяйства, при этом результаты интерпретируют на основании появления характерной кинетической кривой и ее пересечения с пороговой линией.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Карта плазмиды pAG110-3CLpro.
-9
-16
-9
-16
Фиг. 2. Кривые накопления флуоресценции, когда в качестве матрицы в ОТ-ПЦР-РВ используются 10-кратные серийные разведения плазмиды pAG110-3CLpro так, что количество плазмиды в каждой реакции составило от 1×10 грамма до 1×10 грамма, а в качестве набора праймеров и зонда - SBT0017, SBT0018 и SBT0019. Соответственно, крайняя левая кривая соответствует накоплению ПЦР-продукта в реакции с 1×10 грамма плазмиды, а крайняя правая - 1×10 грамма плазмиды. Горизонтальная линия обозначает выбранный порог, выше которого результат прохождения ПЦР считается положительным.
-9
-16
-9
-16
Фиг. 3. Кривые накопления флуоресценции, когда в качестве матрицы в ОТ-ПЦР-РВ используются 10-кратные серийные разведения плазмиды pAG110-3CLpro так, что количество плазмиды в каждой реакции составило от 1×10 грамма до 1×10 грамма, а в качестве набора праймеров и зонда - SBT003, SBT004 и SBT0026. Соответственно, крайняя левая кривая соответствует накоплению ПЦР-продукта в реакции с 1×10 грамма плазмиды, а крайняя правая - 1×10 грамма плазмиды. Горизонтальная линия обозначает выбранный порог, выше которого результат прохождения ПЦР считается положительным.
Реализация изобретения
Предложенная тест-система в любом из вариантов комплектации включает пару праймеров и флуоресцентный зонд, предназначенные соответственно для амплификации и детектирования высококонсервативного участка генома коронавируса SARS CoV-2 в ходе полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Разработаны две пары ДНК-олигонуклеотидов, специфичных к области гена 3CLpro. Каждая пара олигонуклеотидов обладает активностью прямого и обратного праймеров в ПЦР, и каждая из этих пар праймеров может быть использована как альтернатива другой. Кроме того, к каждой паре разработан флуоресцентно-меченный ДНК-зонд с красителем HEX и гасителем флуоресценции BHQ-1. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Таблица 1. Набор праймеров 1 к вирусному гену.
Название
Последовательность
Узнаваемый ген
Назначение
Длина
Температура плавления
Длина ампликона
SBT0017
GCTGGCACAGACTTAGAAGGT
3CLpro
Прямой праймер
21 н.о.
58°С
117н.о.
SBT0018
AGCAGCGTACAACCAAGCTAA
3CLpro
Обратный праймер
21 н.о.
58°С
SBT0019
GTTGACAGGCAAACAGCACAAGCAGCTG
3CLpro
Флуоресцентный зонд
28 н.о.
66°С
Таблица 2. Набор праймеров 2 к вирусному гену.
Название
Последовательность
Узнаваемый ген
Назначение
Длина
Температура плавления
Длина ампликона
SBT0003
GTTCGCATTCAACCAGGACAG
3CLpro
Прямой праймер
21 н.о.
58°С
228н.о.
SBT0004
ACCTTCTAAGTCTGTGCCAGC
3CLpro
Обратный праймер
21 н.о.
58°С
SBT0026
CTGGTGTTTACCAATGTGCTATGAGGCCC
3CLpro
Флуоресцентный зонд
29 н.о.
65°С
Кроме того, предложенная тест-система в любом из вариантов комплектации включает (табл. 3) пару праймеров и флуоресцентный зонд, который снабжен красителем FAM и гасителем флуоресценции BHQ-1, предназначенные соответственно для амплификации и детектирования участка гена домашнего хозяйства человека в качестве положительного контроля выделения РНК из каждого образца и прохождения с этой РНК реакции обратной транскрипции (ОТ) и впоследствии ПЦР-РВ. Также тест-система включает в качестве положительного контроля ПЦР-РВ плазмиду с клонированным участком гена 3CL протеиназы вируса SARS CoV-2.
Надежность теста, а именно снижение доли ложноотрицательных результатов, достигается за счет детектирования участков РНК, транскрибированной с геном домашнего хозяйства, постоянно присутствующей в клетках человека. Отсутствие такого контроля создает ситуацию, когда конечный пользователь может не понять, что в той или иной реакционной смеси либо отсутствует РНК, либо РНК испорчена, в результате чего она не может являться матрицей для синтеза кДНК и последующей ПЦР-РВ. Таким образом, возможно неосознанное получение ложноотрицательного результата, что является очень нежелательной практикой при анализе на присутствие вируса, представляющего собой чрезвычайную эпидемическую угрозу.
В качестве генов домашнего хозяйства были выбраны гены GAPDH и ACTB, первый из которых кодирует конститутивный метаболический фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу, а второй - необходимый компонент цитоскелета бета-актин. Чтобы обеспечить детекцию именно сплайсированной РНК, а не геномной ДНК человека, были подобраны референсные праймеры (табл. 3), комплементарные к разным экзонам выбранных генов, а именно для GAPDH 5'-фланкирующий праймер SBT0014 картируется на экзон 4, тогда как 3'-фланкирующий праймер SBT0015 картируется на экзон 5; для ACTB 5'-фланкирующий праймер SBT0011 картируется на экзон 1, тогда как 3'-фланкирующий праймер SBT0012 картируется на экзон 2.
Таблица 3. Наборы референсных праймеров
Название
Последовательность
Узнаваемый ген
Назначение
Длина
Температура плавления
Длина ампликона
SBT0014
TCCAAAATCAAGTGGGGCGA
GAPDH
Прямой праймер
20 н.о.
58°С
115н.о.
SBT0015
TGATGACCCTTTTGGCTCCC
GAPDH
Обратный праймер
20 н.о.
58°С
SBT0016
CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG
GAPDH
Флуоресцентный зонд
26 н.о.
65°С
SBT0011
CGTCTTCCCCTCCATCGTG
ACTB
Прямой праймер
19 н.о.
58°С
114н.о.
SBT0012
AGGGTGAGGATGCCTCTCTT
ACTB
Обратный праймер
20 н.о.
59°С
SBT0013
GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC
ACTB
Флуоресцентный зонд
27 н.о.
65°С
Изобретение подтверждается примерами.
Пример 1.
Выбор высококонсервативной нуклеотидной последовательности в геноме коронавируса SARS-CoV-2 и подбор последовательности праймеров и флуоресцентно-меченного зонда.
Оригинальная последовательность коронавируса SARS-CoV-2 «NCBI Reference Sequence: NC_045512.2» была проанализирована на поиск открытых рамок считывания с использованием программы ApE plasmid editor (https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/). Первая открытая рамка считывания (по литературным данным, соответствующая ORF1a и содержащая высококонсервативную кодирующую последовательность для 3CL протеиназы) была выбрана для проведения анализа кодируемых белков. Для этого методами компьютерного анализа была проведена трансляция ее первой рамки и установлена последовательность белка, которая представляет собой первичный полипептид ORF1a. Данная последовательность была подвергнута анализу на гомологии с использованием сервиса SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/). Анализ выявил консервативную последовательность 3CL протеиназы вируса SARS-CoV-2, которая была наиболее близка по гомологии к последовательности 3CL протеиназы коронавируса SARS-CoV-1 [Anand K., Ziebuhr J., Wadhwani P. et al. Coronavirus Main Proteinase (3CLpro) Structure: Basis for Design of Anti-SARS Drugs // Science, 2003, 300: 1763-7]. Была определена последовательность белка 3CLpro вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:1.
Согласно полученной аминокислотной последовательности была определена нуклеотидная последовательность 3CLpro SEQ ID NO:2
К этой последовательности были подобраны нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров и флуоресцентно-меченного зонда (два альтернативных набора праймеров и зонда). Температуры плавления разработанных олигонуклеотидов были получены с использованием программы ApE plasmid editor. Последовательности генов GAPDH и ACTB человека были найдены в общедоступной базе данных (www.ensembl.org), для каждого из этих генов были разработаны нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров и флуоресцентно-меченного зонда так, чтобы их температуры плавления приблизительно совпадали с температурами плавлениями соответственно праймеров и зондов для вирусной последовательности.
Пример 2.
Конструирование плазмиды, содержащей клонированный участок генома коронавируса SARS-CoV-2.
Нуклеотидная последовательность 3CLpro SEQ ID NO:2 была использована для создания экспрессионной рамки считывания 3CL протеиназы для ее последующей экспрессии. Для этого последовательность была модифицирована: на 5'-конец был добавлен старт-кодон (ATG), последовательность Козак (GCCACC), а также рестрикционный сайт EcoRI (GAATTC); на 3'-конец были добавлены 2 стоп-кодона (TAATAG) и рестрикционный сайт NheI (GCTAGC). Итоговая последовательность представлена SEQ ID NO:3. Итоговая последовательность используется для функциональной экспрессии белка с целью последующего поиска ингибиторов 3CL протеиназы.
Данная последовательность была синтезирована в компании TopGene (www.topgene.com) и клонирована в вектор pAG110. Карта созданной плазмиды представлена на фиг.1. В настоящей тест-системе итоговая последовательность в составе плазмиды используется как положительный контроль прохождения ПЦР, т.к. внесенные изменения не затрагивают участки, узнаваемые праймерами в составе настоящей тест-системы, и не меняют свойства ампликона. То, что полученная плазмида действительно содержит последовательность гена 3CLpro вируса SARS-CoV-2, узнаваемую патентуемыми праймерами, подтверждается успешным прохождением ПЦР-РВ с этими праймерами (фиг.2 и 3), когда плазмида использовалась в качестве матрицы.
Пример 3.
Проведение реакций для анализа пробы на присутствие РНК вируса SARS-CoV-2.
Выделение РНК из образца. В качестве положительных образцов использовались мазки из носоглотки и ротоглотки пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19. Выделение РНК проводили классическим методом с использованием тризола/триреагента (https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/tri-reagent.html) или методом, аналогичным используемому в наборе RNeasy Lipid Tissue Mini Kit от компании Qiagen (https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/rna-purification/total-rna/rneasy-lipid-tissue-mini-kit/).
Синтез кДНК и ПЦР-РВ. Синтез кДНК производился двумя альтернативными способами. В одном случае использовался набор MMLV RT kit («Евроген»), после чего полученная кДНК использовалась для постановки ПЦР-РВ с использованием набора qPCRmix-HS («Евроген») согласно инструкциям производителя. Однако было обнаружено, что кДНК, полученная таким образом, часто непригодна для постановки мультиплексной ПЦР (когда в одной пробирке кДНК смешивается и с праймерами, специфичными к последовательности вируса, и с праймерами, специфичными к последовательности гена домашнего хозяйства человека) - в таком формате реакции происходит ингибирование амплификации вирусных последовательностей. При этом участки и вирусного, и человеческого гена нормально амплифицируются и детектируются, когда один и тот же образец тестируется в одной пробирке с праймерами к вирусному гену, а в другой - к человеческому (формат стандартной, или синглплексной ПЦР-РВ), т.е. праймеры и зонды пригодны для постановки реакции.
Также использовался набор «БиоМастер» («Биолабмикс»), предназначенный для синтеза кДНК и постановки ПЦР-РВ в одной и той же пробирке. Этот набор оказался пригодным для постановки мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ. Набор использовался согласно инструкциям производителя (но с объемом реакционной смеси 20 мкл и пропорционально уменьшенными объемами всех реагентов - табл. 4). Для стандартной, или синглплексной ОТ-ПЦР-РВ набор использовался таким же образом, за исключением того, что для одного и того же образца бралась пара пробирок и в одной из них флуоресцентный микс С, а в другой флуоресцентный микс V заменялся на воду, и полученные в этой паре пробирок результаты интерпретировались в совокупности.
В соответствии с температурами плавления праймеров и зондов был выбран температурно-временной режим реакций (табл. 5). Синтез кДНК проводили при 45°С в течение 30 минут, после чего MMLV ревертазу инактивировали прогреванием при 95°С в течение от 2 до 5 минут. Далее полученную кДНК амплифицировали в ПЦР-РВ с участием специфичной к вирусному гену 3CLpro пары праймеров и зонда, причем в качестве контроля в той же или параллельной реакции амплифицировали кДНК гена домашнего хозяйства GAPDH с участием пары праймеров и зонда, либо кДНК гена домашнего хозяйства ACTB с участием пары праймеров и зонда. Температурный режим ПЦР-РВ включал следующие этапы: прогревание при 95°С в течение от 2 до 5 минут (совмещено с инактивацией MMLV ревертазы) и от 45 до 49 циклов амплификации (95°С - от 5 до 15 сек, 55°С - от 20 секунд до 1 мин), а детекцию флуоресценции проводили в ходе каждого цикла при температуре 55°С по каналам HEX/VIC (для вирусной последовательности) и FAM (для последовательности гена домашнего хозяйства).
При постановке реакций использовались амплификаторы для ПЦР-РВ зарегистрированных в России моделей Applied Biosystems “QuantStudio 5” и Bio-Rad “CFX96”. Сигнал от вирусной последовательности регистрировался по каналу HEX/VIC, от референсной человеческой - по каналу FAM. Результаты интерпретировали, как описано в примере 5.
Таблица 4. Смесь для мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ.
Компонент
Объем
2× буфер для ОТ-ПЦР-РВ
10 мкл
БиоМастер-микс
0.8 мкл
Флуоресцентный микс С, содержащий:Праймеры к человеческому гену в концентрации 3.077 мкМЗонд к человеческому гену в концентрации 1.923 мкМ
2.6 мкл
Флуоресцентный микс Vсодержащий:Праймеры к вирусному гену в концентрации 3.077 мкМЗонд к вирусному гену в концентрации 1.923 мкМ
2.6 мкл
РНК-матрица
Переменный
Вода, обработанная ДЭПК
До 20 мкл
Таблица 5. Температурно-временной режим амплификации.
№ п/п
Температурно-временной режим
Число циклов
1
45°С - 30 мин
1
2
95°С - от 2 до 5 мин
1
3
95°С - от 5 до 15 сек
От 45 до 49
4
55°С - от 20 сек до 1 мин Считывание сигнала флуоресценции
Таким образом, была показана принципиальная совместимость предложенных праймеров и зондов с широко используемыми наборами российского производства для синтеза кДНК и ПЦР, но предпочтение было отдано набору «БиоМастер», т.к. он позволяет проводить реакцию с патентуемыми праймерами в более удобном формате мультиплексной ПЦР, причем синтез кДНК и ее амплификация в ходе ПЦР-РВ проходят в одну стадию (в одной пробирке), что также удобнее.
Пример 4.
Демонстрация чувствительности ПЦР в реальном времени с использованием разведений плазмидной ДНК pAG110-3CLpro.
-9
-16
В условиях, указанных в примере 3 (табл. 4 и 5), была поставлена ОТ-ПЦР-РВ, где в качестве матрицы использовалась плазмида pAG110-3CLpro, сконструированная, как описано в примере 2. В реакцию вносилось количество матрицы, равное 1×10 грамма плазмиды pAG110-3CLpro, далее использовались последовательные 10-кратные разведения матрицы, вплоть до 1×10 грамма. Были получены характерные кривые накопления флуоресценции (фиг. 2 и 3).
4
Таким образом, был определен нижний порог чувствительности патентуемого способа определения РНК вируса SARS-CoV-2, который в абсолютном значении составил ~25 копий плазмидной ДНК, что соответствует ~2,5×10 копий на мл образца.
Пример 5.
Учет и интерпретация результатов амплификации. Интерпретация результатов анализа осуществляется в соответствии с таблицей 6, где ОКО обозначает отрицательный контрольный образец ОТ-ПЦР-РВ, а ОКО-В обозначает отрицательный контрольный образец выделения РНК. В качестве обоих контрольных образцов на соответствующих стадиях анализа вносят деионизованную воду, свободную от нуклеаз. Положительным сигналом считают наличие кривой накопления флуоресценции характерной сигмовидной формы и ее пересечение с установленной в соответствии с принципами постановки ПЦР-РВ, единообразно для всех образцов на соответствующем уровне пороговой линией (горизонтальная линия на фиг. 2 и 3). Отрицательным сигналом считают отсутствие такой кривой.
Таблица 6. Интерпретация результатов анализа проб с помощью набора реагентов «SBT-DX-SARS-CoV-2»
Наличие сигнала по каналу
Образец
Интерпретация
HEX
FAM
Результаты всего анализа не подлежат учету в любом из следующих случаев:
-
-
ПКО 3CL
Ложноотрицательный результат, ингибирование ОТ-ПЦР-РВ
+
любой
ОКО-В
Ложноположительный результат, контаминация в процессе выделения НК
+
ОКО
Ложноположительный результат, контаминация в ходе постановки ОТ-ПЦР-РВ
Результаты анализа не подлежат учету для конкретной пробы:
-
-
проба
Ложноотрицательный результат, ингибирование ОТ-ПЦР-РВ
Результаты анализа подлежат учету при получении следующих результатов:
+
любой
ПКО 3CL
Набор реагентов специфичен в отношении НК коронавируса SARS-CoV-2
-
+
проба
В пробе не обнаружена РНК коронавируса SARS-CoV-2
+
любой
В пробе присутствует РНК коронавируса SARS-CoV-2
Таким образом, приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно создание быстрого и надежного теста на вирус SARS-CoV-2 на основе синтеза кДНК с помощью MMLV-ревертазы и классической ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), где обе реакции протекают в одной пробирке.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают промышленную применимость данного изобретения. При этом набор праймеров также может быть использован в обычной ПЦР в реальном времени без синтеза кДНК, если кДНК уже была синтезирована любым другим способом.
Перечень сокращений
РНК -
рибонуклеиновая кислота
SARS-CoV-2 -
ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 2
COVID-19 -
коронавирусное заболевание 2019
ПЦР -
полимеразная цепная реакция
SARS -
тяжелый острый респираторный синдром
НРАС -
коронавирус, связанный с пневмонией человека
RT-PCR -
полимеразная цепная реакция c обратной транскрипцией
FP -
прямой праймер
RP -
обратный праймер
P -
зонд
FRD -
флуоресцентный репортерный краситель
QD -
гасящий краситель
RT-ПЦР -
полимеразная цепная реакция c обратной транскрипцией
ДНК -
дезоксирибонуклеиновая кислота
NP -
белок нуклеокапсида
SARS-CoV-1 -
ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 1
кДНК -
комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
MMLV -
вирус лейкоза мышей Молони
ОТ -
обратная транскрипция
ПЦР-РВ -
полимеразная цепная реакция в реальном времени
3CLpro -
3СL протеиназа, 3С-подобная протеиназа
GAPDH -
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ACTB -
бета-актин
ORF1a -
открытая рамка считывания 1а
ОТ-ПЦР-РВ -
полимеразная цепная реакция c обратной транскрипцией в реальном времени
мкМ -
микромолей на литр
мкл -
микролитров
ДЭПК -
диэтилпирокарбонат
мин -
минут
сек -
секунд
ОКО -
отрицательный контрольный образец полимеразной цепной реакции c обратной транскрипцией в реальном времени
ОКО-В -
отрицательный контрольный образец выделения рибонуклеиновой кислоты
ПКО -
положительный контрольный образец полимеразной цепной реакции c обратной транскрипцией в реальном времени
НК -
нуклеиновая кислота