СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
METHOD OF TREATING ONCOLOGICAL DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области иммунологии, медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для лечения злокачественных новообразований сочетанием иммунотерапевтического и адъювантного методов, в частности сочетанным использованием аутологичных вакцин на основе белков теплового шока и авирулентных штаммов вируса болезни Ньюкасла.
Уровень техники
Одним из наиболее перспективных направлений является использование аутологичных вакцин, среди которых наибольшей эффективностью, по данным многочисленных авторов, являются вакцины на основе белков теплового шока (heat shock proteins - HSP).
Известен способ применения вакцин для формирования специфического противоопухолевого иммунитета на основе HSP (US Patent 5837251, US Patent 5935576, US Patent 5750119, US Patent 5948646, US Patent 5961979, US Patent 5985270, US Patent 6475490, US Patent 6468540, US Patent 6461615, US Patent 6455503, US Patent 6447781, US Patent 6410028, US Patent 6403095, US Patent 6399070, US Patent 6322790, US Patent 6162436, US Patent 5830464). Недостатком предложенных методов иммунотерапевтического воздействия на опухоли является необходимость в повышении иммуногенности опухолевых клеток, против которых предложенные HSP-вакцины развивают специфический иммунитет. Зачастую формирования пула цитотоксических лимфоцитов (CD8+ CTL) может быть недостаточно, поэтому необходим поиск путей, при которых опухоли-мишени могут быть доступны для атаки и последующего апоптоза, т.е. поиск способов, направленных на повышение иммуногенности опухолей и более специфичное воздействие со стороны иммунной системы.
Применение адъювантов является популярным методом, применяемым для усиления иммунологической составляющей противоопухолевых вакцин. Одним из наиболее перспективных в этом направлении является использование онколитических вирусов, - а именно вируса болезни Ньюкасла (ВБН). Известен способ использования адъюванта, - инактивированного антигена ВБН, в орнитологии, для защиты от чумы птиц (Патент США №6,340,464).
Известен способ лечения онкологических заболеваний, заключающийся в применении ВБН в составе композиции, обладающей противоопухолевым эффектом, осуществляющимся за счет лизиса опухолевых клеток (Патент США №7,223,389, прототип). Недостатком данного способа является то, что данная терапия предусматривает использование только цитолитического потенциала ВБН и не предусматривает создание прецедента для формирования специфического иммунитета, крайне необходимого для противоопухолевого лечения.
Известен способ применения ВБН в качестве адъюванта у пациентов с колоноректальной карциномой, однако в качестве самой вакцины использовались аутологичные опухолевые клетки (Schlag et al., 2003; Liang et al., 2003; Mosolits et al., 2005). Недостатком этого способа вакцинирования является необходимость в наращивании аутологичного опухолевого материала, в противном случае можно ожидать проявления недостаточного для противоопухолевой защиты уровня специфического иммунного ответа. Немаловажным является также тот факт, что этап создания культуры опухолевых клеток представляет собой сложный и неоднозначный процесс. По мнению абсолютного большинства исследователей, существуют значительные трудности и особенности в создании условий, благоприятных для индивидуальных первичных культур опухолевых клеток. Выживание клеток и их пролиферация возможны только лишь при воссоздании всех внешних условий, которые клетки имели in vivo.
Таким образом, применение сочетанного использования ВБН с аутологичными вакцинами на основе белков теплового шока не было известно и предложено заявителями впервые.
Сущность изобретения
Сущностью настоящего изобретения является разработка комплексного метода лечения новообразований различного рода, который обеспечивает, с одной стороны, формирование специфического иммунного ответа против опухоли, а с другой - формирует дополнительную стимуляцию неспецифического иммунитета, а также вносит дополнительный вклад в цитолитическую активность проводимой терапии.
Поставленная задача решается описываемым способом лечения злокачественных новообразований, включающим введение вакцины, представляющей собой комплекс "белки теплового шока-опухолевый пептид", выделенные из опухолевой ткани пациента, в комбинации с введением авирулентных штаммов вируса болезни Ньюкасла в эффективных количествах как в течение курса вакцинации, а также после вакцинации на рекомендованный врачом период.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Одним из необходимых терапевтических методов лечения опухолей является поддержание иммунной системы пациента на уровне, необходимом для защиты от роста и пролиферации опухолевых клеток. Известно, что иммунная система обладает возможностями проявлять как неспецифическую иммунную защиту, так и развивать специфический иммунный ответ против конкретного вида опухоли. В связи с этим одним из важнейших направлений терапии онкологических заболеваний является поиск возможностей для формирования как специфического противоопухолевого иммунитета, так и поддержания адекватного уровня неспецифического иммунитета в организме больного.
Современная терапия опухолей основана на применении аутологичных вакцин, способных стимулировать специфический противоопухолевый иммунный ответ. Согласно многочисленным данным, наибольшей противоопухолевой, иммуномодулирующей эффективностью обладают аутологичные вакцины на основе белков теплового шока (HSP) (Gordon et al., 2004; Casey et al., 2003;. Mazzaferro et al., 2003; Janetzki et al., 2000; Manjili et al., 2002). Использование HSP-вакцин обладает огромным преимуществом перед другими противоопухолевыми вакцинами. HSP являются белками, отвечающими за структуру других белков, в том числе и тех, которые отвечают за выживание клеток. В опухолях HSP никогда не мутируют, так как отвечают за сохранение структуры других белков, - многочисленных антиапоптотических факторов, необходимых опухоли для выживания. Они стабилизируют их структуру, формируя с ними комплексы. Среди таких белков многие обладают антигенными свойствами. Выделение этих комплексов из опухолевой ткани и введение назад пациенту формирует специфический иммунитет против того вида опухоли, из которых комплексы были выделены (Binder, 2008; Strbo & Podack, 2008). В этом и состоит смысл аутологичной вакцинации. По данным клинических испытаний, эффективность от аутологичных вакцин превышает остальные виды вакцинации и составляет около 75% удачных эпизодов (http://www.brucerobinson.com.au). Объяснение такой высокой эффективности довольно простое: опухолевые антигены, образующие комплексы с HSP, представляют собой широкий спектр антигенного состава. Поэтому и сила иммунного ответа, индуцируемая такими комплексами, довольно высока.
Таким образом, применение аутологичных вакцин обладает огромным преимуществом по сравнению с другими противоопухолевыми вакцинами. Однако этот подход имеет определенные ограничения, поскольку аутологичная вакцинация а priori предполагает наличие у пациента определенного уровня активности иммунной системы. Зачастую иммунитет у онкологических пациентов довольно слабый, что является ограничением для применения к таким пациентам противоопухолевой иммунотерапии.
Указанные недостатки, которые наблюдаются при использовании аутологичных вакцин как монопрепаратов, можно решить, используя дополнительные факторы, обладающие стимуляцией неспецифического иммунного ответа, повышающие уровень HSP в опухолевых клетках, а также обеспечивающие дополнительную, цитолитическую активность в отношении опухолей. Это достигается использованием т.н. адъювантов, среди которых наибольший интерес вызывают онколитические вирусы, успешно сочетающие в себе эти три функции.
Применение вирусов, обладающих онколитическим потенциалом в отношении опухолевых клеток, известно давно (Shoham et al., 1990; Ring, 2002). Данные, описывающие онколитический потенциал вирусов, получены как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Довольно безопасным для организма человека и в то же время наиболее активным с точки зрения онколитического потенциала в отношении опухолей является вирус болезни Ньюкасла (ВБН). Данный вирус принадлежит к семейству Rubulavirus (Paramyxoviridae). ВБН является довольно сильным патогеном, серьезно поражающим респираторный тракт и нервную систему. Однако существуют штаммы вируса, «адаптированные» к тканевым культурам, которые обладают низкой вирулентностью и одновременно с этим сильным онколитическим потенциалом, что подтверждено в ряде работ (Von Hoegen et al., 1988; Lorence et al., 1988).
Наиболее важная характеристика онколитических вирусов - это тот факт, что вирус более активно размножается в опухолевых клетках, чем в нормальных. Интегрирование вируса в опухолевую клетку стимулирует формирование двухспиральной РНК, - потенциального стимулятора PKR, - протеинкиназы, которая ингибирует синтез белка и коммитирует клетку к апоптозу. Если вирус интегрируется в нормальную клетку - PKR стимулирует в ней экспрессию интерферонов, что защищает нормальные клетки от вирусной репликации. Опухолевые клетки зачастую имеют дефектный механизм PKR-активности, что создает благоприятные условия для размножения РНК-содержащих вирусов (Russell SJ, Peng, 2007).
Кроме вышеописанных особенностей, вирусы, обладающие онколитическим потенциалом, имеют на своей поверхности специфический набор белков, которые могут повышать аффинность взаимодействия с опухолевыми рецепторами, что также облегчает проникновение вируса в опухолевую клетку. Все указанные особенности присущи ВБН, что делает его привлекательным как в плане стимулятора иммунитета, так и дополнительного цитолитического фактора. Кроме того, ВБН обладает способностью выступать в качестве иммуноадъюванта, поскольку стимулирует активность Т-лимфоцитов, индукцию цитокинов, RANTES, IL-10, а также TNF-a. Последний является фактором, стимулирующим Т-хелперную активность, что, с одной стороны, способствует повышению неспецифического иммунитета, а с другой - формирует прецедент для специфической иммунной защиты.
Существенным недостатком аутологичной вакцинации, связанной с использованием собственных опухолевых тканей пациента, является ограничение, связанное с количеством опухолевой ткани, которая используется как «сырье» для изготовления вакцины. Поэтому этот недостаток необходимо свести к минимуму. Показано, что вирус болезни Ньюкасла, попадая в опухоль, стимулирует экспрессию стрессовых белков, в частности HSP70 (Collins & Hightower, 1982). Это обстоятельство способствует решению проблемы, связанной с ограничением опухолевого материала для приготовления аутологичной вакцины: дооперационная стимуляция организма пациента вирусом болезни Ньюкасла способствует повышению экспрессии HSP в опухоли, что повышает их уровень, а значит, позволяет получить большее количество комплексов «HSP-опухолевый пептид» из того же количества опухолевой ткани.
Таким образом, выбор ВБН в качестве адъюванта при иммунотерапевтическом лечении опухолей, в том числе и на фоне аутологичной вакцинации, представляется вполне оправданным.
Краткое описание фигур чертежей
Фиг 1 - результаты клинических исследований эффективности использования аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.
Фиг 2 - результаты клинических исследований эффективности использования онколитического вируса болезни Ньюкасла.
Фиг.3 - сравнительная характеристика эффективности лечения противоопухолевой терапии на основе ВБН и его сочетания с аутологичной вакциной.
Фиг 4 - иммунологическая характеристика терапевтической эффективности сочетанного использования аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.
Примеры осуществления изобретения
Ниже приведены примеры активации специфического противоопухолевого иммунитета, не ограничивающие объема изобретения.
Пример 1. Оценка использования аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.
Применяемый препарат вируса болезни Ньюкасла изготавливался из живого вируса апатогенного штамма La-Sota (серия номер 41, контроль номер 41, сертификат соответствия: № РОСС RU. ФВ. В16890 7521468), выращиваемого в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Для инъекций пациентам вирус очищали ультрацентрифугированием и проверяли на стерильность и безвредность. Оценка токсичности препарата (вакцины) проводилась в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ.
Аутологичную вакцину на основе белков теплового шока получали, используя обогащенную фракцию белков теплового шока, полученную из опухолевой ткани пациента до операции.
Цель данного исследования: оценить объективный непосредственный эффект и его продолжительность, время до прогрессирования, выживаемость, качество жизни больных с различными злокачественными заболеваниями при использовании аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.
При проведении комбинированного лечения с включением курсов адъювантной химиотерапии и при показаниях лучевой терапии в течение 6 месяцев лечения 36 больных получили аутологичную вакцину на фоне предварительной стимуляции ВБН (от 8 до 16 внутрикожных введений).
Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии.
Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной вакцины в комплексе с престимуляцией вирусом болезни Ньюкасла вакцины приведены на Фиг 1. Исчезновение всех опухолевых очагов получено у 7 больных (19,4%), из них пациентов с раком молочной железы - 2, толстой кишки - 2, меланома влагалища - 1, рак яичников - 2. Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из раннее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями, включающими компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печени, легких, костях и в лимфатических узлах намечалась после второго курса комплексного лечения и завершалась полным их исчезновением на 5-6 курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта составляет 11 месяцев (от 4 до 26 мес).
Частичный ответ (уменьшение измеряемых очагов на 30 % и более) получен у 13 больных (36 %). Это пациенты с меланомой кожи (2), рак молочной железы (6), увеальная меланома (2), яичников (1) и рак толстой кишки (2). Стабилизация процесса наблюдалась у 13 пациентов (36%) (меланома кожи - 5, увеальная меланома - 2, рак молочной железы - 4, рак толстой кишки - 1, рак яичников - 1). Прогрессирование процесса (увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага) наблюдалось у 3 больных (8,3%). Это пациенты с раком молочной железы (1) и меланомой кожи (2). Средняя продолжительность эффекта составила 11,7 месяцев.
Пример 2. Оценка противоопухолевого эффекта от применения ВБН.
Применяемый препарат вируса болезни Ньюкасла изготавливался, как описано в предыдущем примере. Полный ответ получен у 19 (28,3%) больных: рак молочной железы (7) и толстой кишки (2), рак яичников (2) и шейки матки (2) и 6 больных с увеальной меланомой. Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из раннее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями, включающими компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печени, легких, костях и в лимфатических узлах намечалась после второго курса комплексного лечения и завершалась полным их исчезновением на 5-6 курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта составляет 11 месяцев (от 4 до 26 мес).
Частичный ответ от терапии наблюдался у 18 (26,8%). Из них пациентов раком молочной железы было 9, меланомы кожи - 6, шейки матки -1 и яичников - 2. Средняя продолжительность эффекта составила 11,7 месяцев.
Стабилизация процесса наблюдалась у 16 пациентов (23.8%). Это пациенты с меланомой кожи - 3, увеальная меланома - 1, рак молочной железы - 6, рак толстой кишки - 2, рак яичников - 1, рак шейки матки - 1.
Прогрессирование процесса наблюдалось у 14 больных: меланома кожи - 3 пациента, увеальная меланома - 1, рак молочной железы - 6, толстой кишки - 1, шейки матки - 1, яичников - 1.
Необходимо учитывать тот факт, что большинство больных имели диссеминированные формы опухолей, резистентные к лучевой и химиотерапии при наличии растущих множественных метастазов, поражающих не один орган.
Пример 3. Сравнительная характеристика эффективности лечения противоопухолевой терапии на основе ВБН и его сочетания с аутологичной вакциной.
Эффект, направленный на улучшение показателей противоопухолевой терапии, проведенный с использованием сочетанного иммунотерапевтического подхода на основе HSP-вакцины и ВБН, в сравнении с применением одного ВБН, представлен на диаграммах (Фиг.3А, Фиг 3Б). Показано, что применение аутологичной вакцины в сочетании с ВБН способно инициировать специфический противоопухолевый эффект (стабилизация, частичный регресс, полный регресс) в сравнении с онколитическим ВБН в чистом виде, что делает сочетанный метод лечения наиболее предпочтительным.
Пример 4. Оценка специфического иммунного ответа, индуцированного под действием сочетанного использования HSP-вакцины и ВБН.
Показателем эффективности иммунотерапевтического воздействия на организм является образование особого пула иммунокомпетентных клеток, относящихся к цитотоксическим Т-лимфоцитам (фенотип CD3+CD8+). Данный фенотип клеток появляется в сыворотке пациента только при воздействии специфического антигена. Повышение уровня CD8+ Т-лимфоцитов после введения вакцины на основе HSP пациенту, предварительно престимулированному ВБН, свидетельствует о формировании специфического противоопухолевого иммунитета.
Сочетанное использование HSP-вакцины и ВБН проведено на 8 пациентах (средний возраст 50 лет) с диагнозом рак молочной железы. Во всех случаях, кроме одного, получена стимуляция специфического иммунного ответа, показателем которого является повышение уровня CD3+CD8+ Т-лимфоцитов (Фиг4). Только у одной пациентки (П5) уровень CD3+CD8+ Т-лимфоцитов практически не изменился.
На фоне увеличения уровня цитотоксических лимфоцитов у пациентов отмечалось улучшение общего самочувствия, а также основных клинических показателей. Полученные данные позволяют заключить, что проведенное иммунотерапевтическое лечение является необходимой составляющей противоопухолевой терапии, а сочетание иммуностимулирующего, онколитического, HSP-стимулирующего действия введенного сочетания вакцины и адъюванта позволяет формировать стойкий противоопухолевый иммунитет.
Литература
Binder RJ. Heat-shock protein-based vaccines for cancer and infectious disease. Expert Rev Vaccines. 2008 Apr; 7(3):383-393.
Casey DG, Lysaght J, James T, Bateman A, Melcher AA, Todryk SM. Heat shock protein derived from a non-autologous tumour can be used as an anti-tumour vaccine. Immunology. 2003 Sep; 110(1):105-ll.
Collins PL, Hightower LE. Newcastle disease virus stimulates the cellular accumulation of stress (heat shock) mRNAs and proteins. J Virol. 1982 Nov; 44(2):703-7.
Gordon NF, Clark BL. The challenges of bringing autologous HSP-based vaccines to commercial reality. Methods. 2004 Jan; 32(1):63-9.
http://www.brucerobinson.com.au/detailed%20protocol-HSP.htm
Janetzki S, Palla D, Rosenhauer V, Lochs H, Lewis JJ, Srivastava PK. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96 preparations: a pilot study. Int J Cancer. 2000 Oct 15; 88(2):232-8.
Liang W, Wang H, Sun TM, Yao WQ, Chen LL, Jin Y, Li CL, Meng FJ. Application of autologous tumor cell vaccine and NDV vaccine in treatment of tumors of digestive tract. World J Gastroenterol. 2003 Mar; 9(3):495-8.
Lorence RM, Rood PA, Kelley KW. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent: induction of tumor necrosis factor-alpha and augmentation of its cytotoxicity. J Natl Cancer Inst. 1988 Oct 19; 80(16):1305-12.
Manjili MH, Wang XY, Park J, Facciponte JG, Repasky EA, Subjeck JR. Immunotherapy of cancer using heat shock proteins. Front Biosci. 2002 Jan 1; 7:d43-52
Mazzaferro V, Coppa J, Carrabba MG, Rivoltini L, Schiavo M, Regalia E, Mariani L, Camerini T, Marchiano A, Andreola S, Camerini R, Corsi M, Lewis JJ, Srivastava PK, Parmiani G. Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2003 Aug 15; 9(9):3235-45.
Mosolits S, Nilsson B, Mellstedt H. Towards therapeutic vaccines for colorectal carcinoma: a review of clinical trials. Expert Rev Vaccines. 2005 Jun; 4(3):329-50.
Ring CJ. Cytolytic viruses as potential anticancer agents. J Gen Virol. 2002 Mar; 83(Pt 3):491-502.
Russell SJ, Peng KW. Viruses as anticancer drugs. Trends Pharmacol Sci. 2007 Jul; 28(7):326-33.
Schlag P, Manasterski M, Gerneth T, Hohenberger P, Dueck M, Herfarth C, Liebrich W, Schirrmacher V. Active specific immunotherapy with Newcastle-disease-virus-modified autologous tumor cells following resection of liver metastases in colorectal cancer. First evaluation of clinical response of a phase II-trial. Cancer Immunol Immunother. 1992; 35(5):325-30.
Shoham J, Hirsch R, Zakay-Rones Z, Osband ME, Brennert HJ. Augmentation of tumor cell immunogenicity by viruses-an approach to specific immunotherapy of cancer. Nat Immun Cell Growth Regul. 1990; 9(3):165-72.
Strbo N, Podack ER. Secreted Heat Shock Protein gp96-Ig: An Innovative Vaccine Approach. Am J Reprod Immunol. 2008 May; 59(5):407-16.
Von Hoegen P, Weber E, Schirrmacher V. Modification of tumor cells by a low dose of Newcastle disease virus. Augmentation of the tumor-specific T cell response in the absence of an antiviral response. Eur J Immunol. 1988 Aug; 18(8):1159-66.