Способ определения модифицированного окислением фибриногена
METHOD FOR OXIDATION-MODIFIED FIBRINOGEN

Фибриноген - основной гликопротеин плазмы крови, который необходим для свертывания крови. Количество фибриногена, присутствующего в крови, прямо пропорционально способности крови образовывать тромбы. Фибриноген в крови трансформируется в фибрин в процессе образования тромба, таким образом, дефицит фибриногена будет выражаться в неадекватном образовании фибрина и неадекватном свертывании.
В настоящее время накоплены многочисленные данные о важной патогенетической роли перекисного окисления липидов, являющегося неотъемлемой составляющей окислительного стресса, в инициации и развитии многих острых и хронических заболеваний. Однако активные кислородные метаболиты, наряду с окислительной модификацией липидов, вызывают также и одновременную окислительную модификацию белков, приводящую к патологическим изменениям их свойств и функций, к фрагменации и агрегации. Применительно к процессам окислительной модификации белков при патологии сердечно-сосудистой системы атеросклеротического генеза большой интерес представляет окисление фибриногена крови. Поскольку повышенный уровень ФГ является диагностически и прогностически значимым маркером не только атеросклероза, но многих других хронических воспалительных заболеваний, и его окислительная модификация еще более значительно потенцирует нарушения системы гемостаза, сопряженные с эндотелиальной дисфункцией, что в конечном итоге приводит к нарушению агрегации тромбоцитов и эритроцитов и к повышенной секреции цитокинов [Ройтман Е.В., Азизова О.А., Морозов Ю.А., Асейчев А.В. Влияние окисленного фибриногена на свертывающую систему крови // Бюлл. экспер. биологии и медицины, 2004, 138, 5: 467-469.].
Известны способы определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови [Рагино Ю.И., Баум В.А., Полонская Я.В. Патент РФ №2298189. Опубликовано 27.04.2007. Бюл, №12; Швачко А.Г., Пирязев А.П., Азизова О.А., Сергиенко В.И., Быкова А.А. Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке // Патент РФ №2595806. Опубликовано 27.08.2016. Бюл. №24]. Суть обоих методов заключается в предварительном приготовлении фибринового сгустка по Рутбергу, определении его массы. Затем к сгустку добавляют равные объемы физраствора и 20% ТХУ для денатурации и осаждения ФГ. Далее определяют окислительную модификацию фибрина с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ), как описано в работе Дубининой и соавт., 1995 [Дубинина Е.Е., Бурмистров C.O., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии, 1995, 41,1:24-26.].
Недостатком описанных способов является необходимость выделения фибринового сгустка, причем инкубация в течение 10 мин недостаточна для коагуляции окисленного фибриногена. Метод трудно выполним в условиях рутинных исследований.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала лабораторных тестов для определения модифицированного окислением фибриногена (моФГ).
Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении производительности, доступности теста определения моФГ для рутинных исследований, повышении точности за счет полной коагуляции плазменного фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы крови человека.
Технический результат достигается тем, что для повышения производительности определение окФГ анализ проводят в 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшетах, определение коагуляции цитратной плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0, 30 и 60 мин, определяют фибриноген (ФГ) по методу Клаусса, рассчитывают индивидуальный коэффициент (ИК) перевода изменений оптической плотности (ΔА450) проб после 60 мин инкубации как отношение ФГ, определенного по методу Клаусса, к ΔА450 на 60 мин инкубации, определяют ΔА450 на 30 мин инкубации, рассчитывают ФГ, коагулированный на 30 мин инкубации, по формуле:
ФГ(30) (г/л) = ΔА450 (30 мин) × ИК,
где ΔА450 (30) - изменение оптической плотности пробы при коагуляции цитратной плазмы на 30 мин инкубации, рассчитанный как А450(опыт) - А450(бланк);
ИК - индивидуальный коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции цитратной плазмы в г/л.
Рассчитывают содержание моФГ как разность между ФГ, определенным по методу Клаусса и ФГ, коагулированным на 30 мин инкубации, определяют % содержания моФГ, при содержании более 10% констатируют повышенный уровень моФГ и наличие окислительного стресса в организме человека.
Высокая точность определения окФГ обеспечивается использованием индивидуального коэффициента перевода изменений оптической плотности фибринового сгустка при рекальцификации цитратной плазмы.
450
450
450
450
Способ осуществляют следующим образом: проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1, готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем в лунки 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшет вносят последовательно 50 мкл цитратной плазмы, 100 мкл вероналового буфера с рН 7,4 и хлорида кальция. Тщательно перемешивают пробы и измеряют поглощение при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (бланк А), далее пробы инкубируют в течение 90 мин при 37°С и измеряют степень коагуляции турбидиметрически при 450 нм с интервалами 0, 30 и 60 минут. Параллельно определяют фибриноген по Клауссу. Рассчитывают индивидуальный коэффициент (ИК) перевода изменений оптической плотности (ΔА) проб после 60 минут как отношение ФГ, определенного по методу по Клаусса к ΔА на 60 мин инкубации. Далее определяют ΔА на 30 мин инкубации, рассчитывают количество ФГ, коагулированного в течение 30 мин по формуле:
450
ФГ (30), г/л = ΔА (30 мин) × ИК
где:
450
450(опыт)
450(бланк)
ΔА (30 мин) - изменение оптической плотности пробы при коагуляции плазмы на 30 минут инкубации, рассчитанный как А - А;
ИК - индивидуальный коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции цитратной плазмы в г/л.
Содержание моФГ рассчитывают, как разность между ФГ, определенным по методу Клаусса и расчетным ФГ, коагулированным в течение 30 мин инкубации. Определяют % содержания моФГ, при содержании более 10% констатируют повышенный уровень моФГ и наличие окислительного стресса в организме человека.
2+
450
450
Расчет коэффициента для перевода изменений оптической плотности при коагуляции индивидуальных проб цитратной плазмы в количество фибриногена в г/л. В 96-ти луночные плоскодонные планшеты, в лунки опытных проб последовательно вносят по 50 мкл цитратной плазмы, 100 буфера вероналового буфера (VBS) и 50 мкл 25 мМ Са. Пробы тщательно перемешивают, измеряют поглощение при 450 нм и проводят первую инкубацию в течение 30 мин. Определяют коагуляцию плазмы турбидиметрически по изменению поглощения в пробах (ΔА). Параллельно в исходных пробах цитратной плазмы определяют фибриноген по Клауссу с использованием коммерческих наборов «Фибриноген» (Hemosil, Италия) на автоматическом гематологическом анализаторе ACL8/9/1000 System (Instrum. Lab. Comp., США). Рассчитывают коэффициент перевода ΔА в г/л ФГ. Полученные результаты представлены в таблице.
Как видно из данных, представленных в таблице, фактор для перевода изменений оптической плотности плазмы при коагуляции (при рекальцификации), который рассчитывали как отношение фибриногена, определенному по методу Клаусса к изменению оптической плотности проб при инкубации в течение 60 мин колебался от 6,3 до 10. Для более точного определения ФГ при коагуляции цитратных плазм при рекальцификации использовали не среднее значение коэффициента при переводе изменений оптической плотности при инкубации в течение 30 мин, а индивидуальные коэффициенты, полученные для каждой пробы. Полученные данные представлены в таблице.
Как видно из данных, представленных в таблице, только в 8 пробах (21%) коагуляция ФГ в течение 30 мин была полной, в остальных же 31 пробах (79%) фибриноген не коагулировал полностью в течение 30 мин и поэтому дальнейшая 30 мин инкубация требовалась для завершения реакции. Учитывая разницу исходного уровня содержания ФГ, более информативным является расчет % моФГ к общему ФГ, определенному по Клауссу.
Содержание моФГ рассчитывают, как разность между ФГ, определенным по методу Клаусса и расчетным ФГ, коагулированным в течение 30 мин инкубации. Определяют % содержания моФГ, при содержании более 10% констатируют повышенный уровень моФГ и наличие окислительного стресса в организме человека.
Таким образом, определение содержания моФГ расширяет общее представление о состоянии окислительного стресса в организме человека. При высоком содержании моФГ требуется дополнительные вмешательства для коррекции уровня моФГ путем назначения противовоспалительной терапии. Разработанный метод определения моФГ может быть удобным маркером для контроля эффективности терапии.