БЕСФОРМАЛЬДЕГИДНЫЙ ФИКСАТОР БИОМАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
FORMALDEHYDE-FREE BIOMATERIAL FIXATOR FOR HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES

Изобретение относится к медицине и касается технологии фиксации биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента.
Первым этапом подготовки биоматериала к проведению гистологического и иммуногистохимического исследования является фиксация. При этом наибольшее распространение в медицинской практике получил 10% раствор формалина [Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969; Grigorev I.P., Korzhevskii D.E.  Current technologies for fixation of biological material for immunohistochemically analysis (review). Sovremennyetehnologiivmedicine 2018; 10(2): 156–165].
Недостатками формалина являются его летучесть, высокая токсичность и канцерогенность.
Вработе [Wicks LF, Suntzeff V. Glyoxal, a Non-Irritating Aldehyde Suggested as Substitute for Formalin in Histological Fixations. Science. 1943; 98(2539):204] было впервые предложено использовать 2% раствор щавелевого альдегида в качестве фиксатора тканей при гистологических исследованиях (окраска гематоксилин-эозином) взамен 10% раствора формалина. Вработе [Bussolati G, Annaratone L, Berrino E, Miglio U, Panero M, Cupo M, et al. (2017) Acid-free glyoxal as a substitute of formalin for structural and molecular preservation in tissue samples] былопредложеноиспользовать 2% растворщавелевогоальдегида, предварительноочищенныйоторганическихкислотспомощьюионообменныхсмолидоведённыйбуфернымрастворомдорН = 7,5. Бескислотный щавелевый альдегид был запатентован как фиксатор для гистологических препаратов (патент WO 2017/140596 Al, A01N 1/00, G01N 1/30, G01N 33/48, опубл. 24.08.2017 г.). Изобретение относится к композиции для фиксации гистологических препаратов, содержащей раствор щавелевого альдегида, из которого удалены кислоты, обычно присутствующие в коммерчески доступном щавелевом альдегиде.
Недостатком растворов щавелевого альдегида в качестве фиксатора является низкая скорость проникновения реагента на всю глубину ткани биоматериала и недостаточная фиксирующая способность.
В работе [Y.N. Wang, Histomorphometric comparison after fixation with formaldehyde or glyoxal, Biotechnic & Histochemistry Volume 86, 2011 - Issue 5] сообщается, что качество микропрепаратов мягких тканей, полученных с применением коммерческого фиксатора на основе щавелевого альдегида не уступает препаратам, зафиксированным в 10% растворе формалина. В работе [K.N. Richter and et. Glyoxalasanalternativefixativetoformaldehydeinimmunostainingandsuper‐resolutionmicroscopy, EMBOJ. 2018 Jan 4; 37(1): 139–159] так же сообщается об успешном опыте применения препаратов на основе щавелевого альдегида. Однако, врядеработсообщается [R. Buesa, Histology without formalin?, Annals of Diagnostic Pathology, Volume 12, Issue 6, 2008, Pages 387-396, ISSN 1092-9134; Umlas J, Tulecke M. The effects of glyoxal fixation on the histological evaluation of breast specimens. Hum Pathol. 2004;35(9):1058–62; Bussolati G, Annaratone L, Berrino E, Miglio U, Panero M, Cupo M, et al. (2017) Acid-free glyoxal as a substitute of formalin for structural and molecular preservation in tissue samples], чтокачествофиксацииобразцоввкоммерческихфиксаторахнаосновещавелевогоальдегидахуже, чемв 10% раствореформалина.
Известен способ изготовления и хранения музейных анатомических влажных макропрепаратов (патент RU 2566648, A01N 1/02, опубл. 27.10.2015 г.), выбранный в качестве прототипа. Способ включает промывание препарата водой с дальнейшей фиксацией препарата путем полного погружения в емкость с раствором химического реагента, с последующей заменой реагента на свежий. При приготовлении макропрепарата фиксацию осуществляют путем его погружения в 10% водный раствор щавелевого альдегида по объему, который превышает объем макропрепарата не менее, чем в 10 раз. Замена реагента производится трижды на 7, 14, 21 сутки, каждый раз промывая макропрепарат после удаления реагента проточной водой, для музейных экспонатов, фиксация которых осуществлялась 10% раствором формалина, формалин сливают, а перезаливку на 14, 28 и 42 сутки проводят 10% водным раствором щавелевого альдегида.
Недостатком указанного прототипа является низкая скорость проникновения реагента на всю глубину ткани биоматериала, низкая эластичность препарата после использования реагента.
Технический результат заявленного изобретения заключается в создании бесформальдегидного фиксатора, который обладает фиксирующими свойствами и сохраняет структуру тканей, что проявляется в сохранении гистоархитектоники органа, структуры клеток, их ядер и цитоплазмы, а также обеспечивает фиксацию кусочков тканей размером 5-7 мм на всю глубину.
Поставленная задача решается тем, что бесформальдегидный фиксатор биоматериала для гистологических и иммуногистохимических исследований, включает щавелевый альдегид и воду, но в отличие от прототипа, дополнительно содержит тетраметилолгликолурил для повышения качества фиксации, этиловый, изопропиловый или метиловый спирт для повышения проницающей способности, калия дигидрофосфат в качестве модификатора рН, при следующем соотношении масс%:
- щавелевый альдегид - 8-10%
- тетраметилолгликолурил - 1-3%
- спирт - 10-60%
- калия дигидрофосфат - 0,1 - 0,3%
- вода до 100%.
Пример конкретного осуществления изобретения.
Оценивали эффективность 10% раствора щавелевого альдегида в качестве фиксатора для гистологических микропрепаратов, в сравнении с 10% нейтральным забуференным формалином. В качестве объектов фиксации использовались фрагменты органов, полученных при аутопсии, размером не более 2,5 см 2,5 см, толщиной не более 5-7 мм. Для исследования фиксирующих свойств были взяты образцы тканей следующих органов: головной мозг (нервная ткань), печень, почки, поджелудочная железа, селезенка, легкие, миокард. Объем фиксирующей жидкости превышал объем фиксируемой ткани минимум в 10 раз. Общая продолжительность фиксации материала составляла 24 часа при комнатной температуре. Для получения гистологических препаратов материал проводился по стандартной методике и заливался в парафин.
На фиг. 1 представлена фотография кусочков органов, после фиксации в 10% растворе щавелевого альдегида в течении 24 часов. Видно, что фиксация прошла не полностью - внутри кусочки остаются непрофиксированными из-за неглубокого проникновения фиксатора вглубь ткани.
На фиг. 2 представлены фотографии микропрепаратов кусочков легкого, зафиксированных в 10% растворе щавелевого альдегида и 10% нейтральном забуференном формалине. Видно, что по сравнению с формалином, 10% раствор щавелевого альдегида обладает худшим качеством фиксации. На фиг. 2 отчетливо видно, что оболочки эритроцитов, при использовании 10% раствора щавелевого альдегида полностью разрушены. Это обусловлено относительно низким нативным рН раствора (~ 3,5), и недостаточной фиксирующей способностью. Полученные микропрепараты непригодны для гистологической и иммуногистохимической диагностики.
Для повышения качества фиксации, и увеличения проницающей способности был предложен состав, содержащий:
- щавелевый альдегид - 10%
- тетраметилолгликолурил - 2% в качества добавки, повышающей фиксирующие свойства и стабильность
- этанол - 50% для повышения проницающей способности
- калия дигидрофосфат до рН = 6,5
- вода до 100%.
На фиг. 3 представлены кусочки органов, фиксированные в разработанном составе в течении 24 часов. Визуально видно, что образцы профиксированы полностью на всю глубину.
На фиг. 4 и 5 приведено сравнение микропрепаратов, зафиксированных в течении 24 часов в предложенном составе и 10% нейтральным забуференном формалине, с различными окрасками.
Из фиг. 4 и 5 видно, что предложенный состав обладает фиксирующими свойствами и сохраняет структуру тканей, что проявляется в сохранении гистоархитектоники органа, структуры клеток, их ядер и цитоплазмы. Результаты гистохимического окрашивания исследуемых органов и тканей сопоставимы по восприятию тканями и клетками красителей сложных окрасок и не отличаются значимо от аналогичных тканевых образцов, фиксированных в растворе 10% нейтрального забуференного формалина.
На фиг. 6 представлены микрофотографии образцов тканей с иммуногистохимическим окрашиванием.
Результаты иммуногистохимического окрашивания показали, что разработанный фиксатор сохраняет антигенные (иментин, гладкомышечный актин, общий лейкоцитарный антиген) структуры в тканях, окрашивание не имеет существенных различий для предложенного состава и 10% раствора формалина.