СПОСОБ МЕДИКАМЕНТОЗНОГО ЛЕЧЕНИЯ АДЕНОМИОЗА НА ОСНОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ У КРЫС ЛИНИИ WISTAR
METHOD FOR DRUG TREATMENT OF ADENOMYOSIS BASED ON EXPERIMENTAL MODEL IN WISTAR RATS

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для медикаментозного лечения аденомиоза на основании экспериментальной модели у крыс линии Wistar.
Аденомиоз характеризуется доброкачественной инвазией эндометрия в миометрий, которая приводит к диффузному увеличению матки и гистологически выражается в наличии эктопически расположенных желез и стромы эндометрия, окруженных гипертрофическим и гиперпластическим миометрием [Hodler J., Kubik-Huch R.A., Von Schulthess G.K. (ed.). Diseases of the Abdomen and Pelvis 2018-2021 // Springer International Publishing, 2018].
Единственным эффективным методом лечения аденомиоза является тотальная гистерэктомия. При наличии бесплодия у пациенток с узловой формой аденомиоза, сопровождающегося АМК возможно выполнение реконструктивно-пластической операции с максимальным удалением пораженной ткани, для уменьшения маточных кровотечений и повышения возможности реализации репродуктивной функции [Эндометриоз. Клинические рекомендации МЗ РФ. Адамян Л.В. и др. 2020. 60 с.].
Наиболее часто используемыми медикаментозными препаратами для лечения аденомиоза являются: прогестины, агонисты гонадотропин рилизинг гормона, левоноргестрелвыделяющая внутриматочная спираль, комбинированные оральные контрацептивы, нестероидные противовоспалительные препараты [Vannuccini S. et al. Role of medical therapy in the management of uterine adenomyosis // Fertility and sterility. 2018. Vol. 109. №. 3. P. 398-405.]. Однако применение каждого из них могут иметь недостатки и ограничения в связи с развитием побочных эффектов или наличием противопоказаний к применению. Кроме того, большинство препаратов невозможно использовать у пациенток, планирующих беременность, так как они обладают антигонадотропным эффектом.
В связи с указанными обстоятельствами, поиски новых методов эффективной терапии аденомиоза представляют научный и практический интерес. В настоящее время актуально изучение роли окситоцина в патогенезе аденомиоза, так как данный гормон является одним из наиболее важных модуляторов сократительной активности матки, играющей решающую роль в успешной имплантации и плацентации [Hunt S, Abdallah KS, Ng E, Rombauts L, Vollenhoven B, Mol BW. Impairment of Uterine Contractility Is Associated with Unexplained Infertility. Semin Reprod Med. 2020; 38(1): 61-73].
Существуют данные о том, что у пациенток с аденомиозом повышен уровень экспрессии окситоциновых рецепторов как в эутопическом эндометрии [Zhank Zh., Guan Z., Liu A. Distribution of oxytocin receptor in adenomyosis and its relationship with dysmenorrhea. Chinese Journal of Clinical Obstetrics and Gynecology. 2008], так и в пораженном аденомиозом миометрии по сравнению с контрольной группой [Guo SW, Мао X, Ma Q, Liu X. Dysmenorrhea and its severity are associated with increased uterine contractility and overexpression of oxytocin receptor (OTR) in women with symptomatic adenomyosis. Fertil Steril. 2013; 99(1): 231-240], при этом уровень экспрессии коррелирует с контрактильной активностью матки и тяжестью дисменореи [Nie J, Liu X, Guo SW. Immunoreactivity of oxytocin receptor and transient receptor potential vanilloid type 1 and its correlation with dysmenorrhea in adenomyosis. Am J Obstet Gynecol. 2010; 202(4): 346.e1-346.e3468].
Информации о медикаментозном лечении аденомиоза ингибиторами окситоциновых рецепторов в известном уровне техники не обнаружено.
Таким образом, изучение роли окситоцина представляет научный и практический интерес и может быть использовано в разработке альтернативных методов патогенетически обоснованного медикаментозного лечения.
Техническим результатом настоящего изобретения является расширение арсенала средств для медикаментозного лечения аденомиоза с возможностью использования в клинической практике, снижение частоты гистерэктомий у пациенток с аденомиозом.
Указанный технический результат достигается в способе медикаментозного лечения аденомиоза на основании экспериментальной модели у крыс линии Wistar, заключающемся в том, что на модели аденомиоза, полученной путем введения блокатора рецепторов эстрогенов тамоксифена из расчета 1 мг препарата/кг 1 раз в день со 2 по 5 день жизни животного, выполняют внутрибрюшинное введение антагониста окситоциновых рецепторов атозибана в дозировке 0,35 мг/кг 1 раз в день в течение 21 дня с 40 по 60 день после рождения.
Способ иллюстрируется фиг. 1-2, где:
на фиг. 1 - определение фазы эстрального цикла, эструс;
на фиг. 2 - железы эндометрия в мышечной оболочке.
Заявляемый способ основан на экспериментальных исследованиях на 29 самках линии Wistar. Все лабораторные животные были выведены в ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день/ночь»). Уход за животными и проведение экспериментов осуществлялись согласно основным морально-этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» (Good Laboratory Practice), утвержденные приказом Министерства здравоохранения и социального развития от 23.08.2010 №708н, и «Международные рекомендации по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятые Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г.
На первом этапе эксперимента была сформирована модель аденомиоза у новорожденных самок крыс линии Wistar согласно существующей методике [Ярмолинская М.И., Шалина М.А., Нетреба Е.А., Милютина Ю.П., Траль Т.Г. Создание экспериментальной модели аденомиоза на крысах линии Wistar, получен патент на изобретение №2761754 С1 от 13.12.21]. Новорожденные крысы были разделены на две группы: основную (n=21), животным из которой вводили блокатор рецепторов эстрогенов (тамоксифен 20 мг) из расчета 1 мг препарата / 1 кг веса животного 1 раз в день, и контрольную (n=8), которая получала воду.
На втором этапе эксперимента для оценки влияния ингибитора окситоциновых рецепторов на выраженность аденомиоза, крысы основной группы были разделены на две подгруппы: 1-ой подгруппе (n=15) было начато ежедневное внутрибрюшинное введение ингибитора окситоциновых рецепторов (препарат Атозибан (Atosiban), Фармидея ООО (Латвия) в дозировке 0,35 мг/кг/день с 40 по 60 день жизни Вторая экспериментальная подгруппа (n=6) получала внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора.
Для оценки болевого синдрома и выраженности общей гипералгезии перед выведением животных из эксперимента проводили тест с горячей пластиной дважды с интервалом в 24 часа с вычислением среднего значения. Для этого каждую крысу помещали на плиту, разогретую до 65°С, и фиксировали время, через которое крыса начинала выполнять умывательные движения. Полученный временной интервал называется латентность - чем выше латентность, тем меньше общая гипералгезия.
Выведение животных из эксперимента проводилось с 90 по 106 день жизни на одинаковой стадии полового цикла - эструс. Для осуществления поставленных задач всем животным, участвующим в эксперименте, выполняли забор мазков для подтверждения необходимой стадии эстрального цикла (фиг. 1). При этом у крыс из группы тамоксифена наблюдалась нерегулярная эстральная цикличность, что может быть связано как с приемом препарата, так и с наличием аденомиоза, и требует дальнейшего уточнения. На этапе вскрытия животных проводили визуальную оценку формирования аденомиоза, измеряли длину матки, проводили взвешивание удаленного препарата. Для микроскопического исследования материал (влагалище, матка и яичники) фиксировали в 10% формалине, осуществляли проводку материала и окрашивали гематоксилином и эозином для последующего гистологического исследования.
На основании результатов гистологического исследования в первой подгруппе, после применения ингибитора окситоциновых рецепторов, аденомиоз отмечен у 1 крысы из 15 (6,7%) с наличием единичных желез; во второй подгруппе аденомиоз наблюдался у всех 6 крыс (100%), при этом имелись статистически значимые различия по точному критерию Фишера. Аденомиоз гистологически характеризовался наличием желез эндометрия в миометрии, в отдельных случаях с небольшим количеством стромы эндометрия. Также наблюдалось нарушение концентрических и продольных полос гладких мышц миометрия: вместо регулярных концентрических слоев гладкомышечных клеток у крыс с аденомиозом были обнаружены переплетенные утолщенные полосы гладкомышечных клеток, перемежающиеся со слоями коллагена, во многих из этих измененных зон наблюдалось наличие полиморфно-ядерных лейкоцитов и эозинофилов (фиг. 2). Матки крыс контрольной группы (n=8) также были исследованы гистологически, эндометриальных желез в миометрии не выявлено.
Согласно данным, полученным во время эксперимента с горячей плитой, наименьшая латентность была во второй подгруппе (получавшей только тамоксифен, без лечения атозибаном: 40,1 (32,1; 50,1) сек. В подгруппе, получавшей лечение атозибаном, латентность была выше (58,4 (38,8; 75,4) сек), а в группе контроля - самая высокая (74,3 (52,5; 82,9) сек), при этом имелись статистически значимые различия (р=0,035 между группами по критерию Краскела-Уоллиса (рис. 3).
Таким образом, в основной подгруппе, получавшей ингибитор окситоциновых рецепторов атозибан для лечения заболевания, явления аденомиоза отмечены в 6,7% случаев, а общая гипералгезия была достоверно меньше по сравнению с группой крыс с индуцированным аденомиозом. В подгруппе животных, не получавших терапию ингибиторами окситоциновых рецепторов, внутренний эндометриоз выявлен в 100% случаев, а гипералгезия была достоверно выше, чем в подгруппе, получавшей атозибан и в контрольной группе.
Полученные результаты продемонстрировали высокую эффективность применения антагониста окситоциновых рецепторов в терапии аденомиоза у крыс линиии Wistar. Заявляемый способ расширяет арсенал средств для лечения аденомиоза, а также может уменьшить частоту гистерэктомии у пациенток с аденомиозом.
Пример осуществления способа.
Крысы №16 (метка 2LH) и №23 (метка 3A(A)R) с весом при рождении соответственно 8 и 9 граммов получали тамоксифен из расчета 1 мг препарата / 1 кг веса 1 раз в день со 2 по 5 день жизни (взвешивание проводилось каждый день перед введением препарата). Далее крыса №23 получала ежедневные внутрибрюшинные инъекции ингибитора окситоциновых рецепторов (атозибан) в дозировке 0,35 мг/кг с 40 по 60 день жизни, а крыса №16 получала внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора в тот же период. С 90 дня после рождения крысам проводился забор мазков из влагалища для определения изменений эстрального цикла. У крысы №16 наблюдалась нерегулярная эстральная цикличность, что следует отметить для всех животных из группы тамоксифена. Крыса №16 была выведена на 106 день от рождения, вес крысы при выведении - 225,7 г, вес матки - 0,478 г, длина матки - 37 мм. Крыса №23 была выведена на 98 день от рождения, вес крысы при выведении - 229,2 г, вес матки - 0,302 г, длина матки - 30 мм. При проведении теста с горячей пластиной среднее значение латентности крысы №16 составило 51,355 сек, а крысы №23 - 50,54 сек. По результатам гистологического исследования у крысы №16 обнаружены железы в мышечном слое и обилие эозинофилов в слизистом слое, у крысы №23 отмечено отсутствие желез в мышечном слое, обнаружено небольшое количество эозинофилов в слизистом слое.
Представленные данные являются основанием для дальнейшего продолжения экспериментальных исследований с целью оценки наиболее эффективных минимальных доз, длительности терапии и возможности применения антагониста окситоциновых рецепторов в клинической практике у больных аденомиозом.
Заявляемый способ расширяет арсенал средств для медикаментозного лечения аденомиоза, дает возможность применения в клинической практике, снижает частоту гистерэктомий у пациенток с аденомиозом.