МУТАНТНЫЙ ТОМАТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ УВЕЛИЧЕНИЯ МАССЫ ТЕЛА И/ИЛИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ, СВЯЗАННОГО С ОЖИРЕНИЕМ
MUTANT TOMATO AND ITS APPLICATION FOR PREVENTION OF WEIGHT GAIN AND/OR FOR TREATMENT OF THE PATHOLOGICAL STATE COMING FROM OBESITY

Настоящее изобретение относится к применению томатов для предотвращения увеличения массы тела и/или для лечения патологических состояний, связанных с ожирением, таких как ожирение, нарушение липидного обмена и гиперлипидемия. Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предотвращения заболеваний, сопровождающихся адипогенезом, у млекопитающих с применением композиций согласно настоящему изобретению.
Ожирение представляет собой превышение массы тела у субъекта определенного возраста, пола и роста вследствие дисбаланса между потреблением и расходом энергии. Основными причинами ожирения являются переедание, недостаточная физическая нагрузка или нарушение пищевого поведения, некоторые наследственные заболевания, сопутствующее патологическое состояние (например, гипотиреоз), некоторые лекарственные средства, малоподвижный образ жизни, рацион питания, включающий продукты с высоким гликемическим индексом (то есть, рацион, который состоит из блюд, которые обеспечивают высокий уровень сахара в крови после приема пищи), циклическое увеличение и уменьшение массы тела (что вызвано неоднократными попытками похудеть посредством соблюдения диеты, нарушениями пищевого поведения), стресс и недостаточная продолжительность сна.
Ожирение возникает в результате действия нескольких механизмов. Ожирение характеризуется неконтролируемым увеличением массы жировой ткани в организме и признано наиболее быстро распространяющимся нарушением обмена веществ в мире. Увеличение массы жировой ткани может быть результатом образования новых клеток жировой ткани (адипоцитов) посредством процесса адипогенеза и/или накопления увеличенного количества цитоплазматических гранул триглицеридов или липидов в каждой клетке. Адипогенез представляет собой процесс дифференцировки клеток, посредством которого преадипоциты превращаются в адипоциты. В процессе адипогенеза пролиферация преадипоцитов или клеток-предшественников адипоцитов должна сопровождаться последующей дифференцировкой указанных клеток, в результате чего они приобретают фенотип зрелых адипоцитов. Увеличенное накопление липидов в клетках, представляющих собой зрелые адипоциты, является наиболее важным признаком ожирения.
Жир запасается в жировой ткани в форме триглицеридов. Процесс расщепления указанного жира на глицерин и жирные кислоты в адипоцитах известен как липолиз. В ходе указанного процесса свободные жирные кислоты выделяются в кровоток и циркулируют по всему организму. Липолиз индуцируют гормоны, такие как эпинефрин, норэпинефрин, глюкагон и адренокортикотропный гормон. Указанные гормоны индуцируют 7ТМ-рецепторы, которые в свою очередь активируют аденилатциклазу. Это приводит к образованию большего количества сАМР, который активирует протеинкиназу А. Далее протеинкиназа А активирует липазы, находящиеся в жировой ткани.
Уменьшение образования новой жировой ткани и формирования жировых запасов посредством ингибирования дифференцировки преадипоцитов в зрелые адипоциты может оказаться оптимальной стратегией борьбы с заболеваниями, обусловленными адипогенезом, в частности ожирением. Следовательно, модуляция активности адипогенеза и липолиза у людей может привести к уменьшению тяжести ожирения.
Диеты с низким потреблением калорий в сочетании с физической нагрузкой или без нее могут способствовать временной потере массы тела, однако диета и физическая нагрузка сами по себе оказались неэффективными при коррекции массы тела в долгосрочной перспективе. Кроме того, дополнительное применение лекарственных средств, которые подавляют аппетит, снижают потребление пищи, снижают всасывание жира, входящего в рацион, увеличивают расход энергии и вызывают распределение или метаболизм питательных веществ, хоть и потенциально эффективно, но, к сожалению, сопровождается неблагоприятными побочными эффектами (С.A. Haller и N.L. Benowitz., New England J. Medicine, 2000, 343, 1833-1838). Лекарственное средство, такое как фентермин (Fastin, Adipex Р), назначают для контроля массы тела, но указанное лекарственное средство обладает побочными эффектами, такими как высокое кровяное давление, головная боль, бессонница, раздражительность и повышенная возбудимость. Другими важными лекарственными средствами для контроля массы тела являются ксеникал (Xenical, Roche Pharm. Co. Ltd., Швейцария) и редуктил (Reductil, Abbot Co. Ltd., США), которые вызывают образование газов, судороги, диарею и повышенное кровяное давление, представляющие собой частые побочные эффекты. Все указанные способы терапии основаны на активных ингредиентах, которые имеют синтетическое происхождение.
Необходимость в эффективных способах терапии ожирения с надлежащей эффективностью и приемлемой безопасностью существует давно. Что еще более важно, средства против ожирения природного происхождения с доказанной безопасностью крайне необходимы для борьбы с этой растущей проблемой. Известно, что многие растительные и природные продукты, например содержащие экстракт гимнемы, экстракт гарцинии или карнитин, предотвращают накопление жира посредством ингибирования всасывания жира, усиления расщепления жира и усиления потребления жира организмом. В частности, для ингибирования, уменьшения и предотвращения ожирения особенно предпочтительно придать указанные свойства пищевому продукту, который обычно потребляет млекопитающее, в частности человек. Предпочтительно пищевой продукт против ожирения также удовлетворяет одному или более из следующих критериев: (i) указанный продукт является низкокалорийным, (ii) имеет природное происхождение, (iii) не является трансгенным, (iv) прост в получении, (v) является экономически привлекательным.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что томаты, созревание которых нарушено, например мутанты с нарушенным созреванием rin, nor и Nr, обладают антиадипогенным эффектом. Например, плоды томатов, которые являются носителями мутации гена «ripening inhibitor» (rin), оценивали в рамках анализа дифференцировки адипоцитов, процесса, в ходе которого относительно неспециализированная клетка приобретает специализированные признаки адипоцита - клетки соединительной ткани животных, специализирующейся на синтезе и запасании жира. Неожиданно было обнаружено, что то, в какой степени нарушено созревание томата, например содержание rin, положительно коррелирует с его способностью ингибировать накопление липидов.
Соответственно, в одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено растение томата, плод, часть или их экстракты для применения в способе предотвращения увеличения массы тела и/или для лечения патологических состояний, связанных с ожирением, у млекопитающего, при этом указанный томат представляет собой мутант с нарушенным созреванием. Мутантные томаты с нарушенным созреванием известны в данной области техники. Например, мутантный томат с нарушенным созреванием является носителем гена ripening inhibitor (ингибитор созревания, rin), nonripening (не созревающий, nor) и/или never ripe (никогда не созревающий, Nr). Кроме того, можно создавать новые мутантные формы с нарушенным созреванием, например, подвергая растение томата воздействию гамма-излучения и отбирая потомство указанного растения, обладающее фенотипом, включающим нарушенное созревание.
Томат (Lycopersicon esculentum) представляет собой растение из семейства пасленовых (Solanaceae), происходящее из Америки и выращиваемое по всему миру ради съедобных плодов. Указанный плод представляет собой ярко окрашенную ягоду с оттенками, которые обычно варьируют от желтоватого до красного из-за присутствия пигментов ликопина и каротина. Указанная ягода обладает кисловатым вкусом, имеет диаметр от 1 до 2 см в случае дикорастущих видов и намного больший размер в случае культурных сортов. Томат производят и потребляют во всем мире как в свежем виде, так и обработанным различными способами, например в виде соуса, пюре, сока, в сушеном или консервированном виде. Томат представляет собой пищевой продукт, содержащий небольшое количество калорий. Фактически, в 100 граммах томата содержится всего лишь 18 ккал. Большую часть массы указанного плода составляет вода, а второй по значимости составляющей являются углеводы. Томат содержит простые сахара, которые придают ему слабый сладкий вкус, и некоторые органические кислоты, которые обеспечивают характерный кислый вкус. Томат является важным источником некоторых минералов, таких как калий и магний. Из содержащихся в нем витаминов можно отметить В1, В2, В5 и витамин С.
В одном из аспектов мутантный томат является носителем гена rin, nor и/или Nr. Например, томат гетерозиготен по rin, nor и/или Nr. Например, томат гетерозиготен или гомозиготен по nor. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения томат имеет содержание nor по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно 70-100%. В другом варианте реализации настоящего изобретения томат гетерозиготен или гомозиготен по Nr. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения томат имеет содержание Nr по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно 70-100%.
В другом варианте реализации настоящего изобретения томат гомозиготен по rin, nor и/или Nr. Rin и/или nor являются предпочтительными. Например, настоящее изобретение реализуют на практике с применением томата, содержащего мутантные гены rin в гомозиготном состоянии, мутантные гены nor в гомозиготном состоянии, или томатов, гетерозиготных по обоим генам rin и nor.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения мутантный томат представляет собой томат с геном rin, поскольку указанный такие растения могут давать плоды, которые подходят для употребления в пищу человеком. Однако растения томата с геном nonripening (nor) и/или never ripe (Nr) также применяют подходящим образом, в частности в переработанном виде, таком как экстракт плода или корня.
Ген «ripening inhibitor» (rin) представляет собой полудоминантный ген томата, который был впервые описан в 1968 году Robinson и Tomes в «Ripening Inhibitor: A Gene with Multiple Effects on Ripening», Rpt. Tomato Genetics Cooperative, 18:36-37. Ген rin доступен из нескольких источников, включая Центр генетических ресурсов томатов Ч.М. Рика (С.М. Rick Tomato Genetic Resource Center, TGRC) при Калифорнийском университете, Дэвис. Ген rin описан в опубликованных источниках, например в Davies et al., упомянутом выше.
Растения томата, несущие мутацию rin, дают плоды, которые не созревают. В плодах rin мутантов томата ингибированы размягчение ткани и синтез пигмента, которые происходят в плодах обычных томатов (Davies et al., 1981, «The Constituents of Tomato Fruit-The Influence of Environment, Nutrition and Gene Туре», CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 15:205-280), что свидетельствует о том, что вредное воздействие генов «ripening inhibitor» в гетерозиготном состоянии, возможно, может быть преодолено посредством введения генов, которые усилят цвет, таких как гены high pigment («повышенная пигментация») и crimson («малиновый»).
Кроме того, растения с геном rin обладают увеличенными чашелистиками и теряют детерминированность соцветий. Позиционное клонирование локуса rin выявило два тандемных гена MADS-box (LeMADS-RIN и LeMADS-MC), профили экспрессии которых свидетельствовали о роли указанных генов в созревании плодов и развитии чашелистиков, соответственно. Мутация rin влияет на экспрессию обоих генов. Данные по репрессии генов и их комплементации у мутантных растений демонстрируют, что LeMADS-RIN регулирует созревание, в то время как LeMADS-MC влияет на развитие чашелистиков и детерменированность соцветий. LeMADS-RIN демонстрирует важную с точки зрения сельского хозяйства функцию MADS-box генов растений и дает представление о молекулярном механизме негормонального регулирования созревания в процесс развития (Vrebalov et al., Science, 12 апреля 2002, Vol. 296, no. 5566, pp. 343-346).
Патент США №4843186 относится к гетерозиготному растению томата, полученному в результате скрещивания мужской особи, содержащей ген Rin/Rin, с женской особью, при этом указанное растение томата являясь гетерозиготным содержит ген rin, полученный от мужской особи, и характеризуется очень твердым плодом с превосходным, присущим томату вкусом, имеющим срок хранения по меньшей мере две недели без значительного ухудшения вкуса или уменьшения твердости и приобретающим насыщенный красный цвет.
В патенте США №2003/0134026 раскрыто применение гомозиготных томатов с rin и/или nor или томатов, гетерозиготных по обоим генам rin и nor, для получения томатной пасты, сока или соуса, имеющего хорошую вязкость, а также надлежащий цвет.
В патенте США №2003/0129292 раскрыто применение гомозиготных томатов с rin, и/или nor, и/или alc или томатов, гетерозиготных по всем rin и nor и/или alc, для получения томатной пасты, сока или соуса, имеющего хорошую вязкость, а также надлежащий цвет.
Патент WO 2004/017760 относится к подвергнутому обработке продукту томата, содержащему по меньшей мере 10% томатов, которые гомозиготны по rin, гомозиготны по nor, гомозиготны по Nr, гомозиготны по alc, гетерозиготны по комбинациям двух из генов rin, nor, Nr или alc, или комбинаций указанных томатов.
Из публикации Horiba et al. (Mol Cell Endocrinol., 29 июля 2010, 323(2):208-14) известно, что халкон нарингенин (naringenin chalcone) является высокоактивным флавоноидом томата, обнаруженным в кожуре, который улучшает метаболическую функцию адипоцитов и оказывает инсулин-сенсибилизирующее действие посредством активации адипонектин-зависимого пути. Не известно о существовании связи между содержанием гена rin и халкона нарингенина. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что антиадипогенный потенциал томатов с rin не ограничен кожурой.
Таким образом, из уровня техники не известна или в нем не раскрыта антиадипогенная активность или активность, направленная на ингибирование накопления липидов, мутантного томата с нарушенным созреванием, его экстрактов или очищенных фракций. Более конкретно, применение указанных продуктов для предотвращения или подавления нарушений, обусловленных адипогенезом, не было описано в источниках.
При использовании в настоящей заявке термин мутантный томат с ингибитором созревания (ripening inhibitor, rin) относится к Lycopersicon esculentum, экспрессирующему мутантный ген томата ripening inhibitor (rin), таким образом, охватывая любой сорт в спектре от гетерозиготных по rin до гомозиготных по rin растений томатов. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения томат является гетерозиготным по rin. В другом варианте реализации настоящего изобретения томат представляет собой гомозиготный по rin томат. Посредством применения методов культуры тканей авторы настоящего изобретения добились успеха в создании сортов томата, имеющих содержание rin от 50 до 100%.
В настоящей заявке термин «содержание rim определяется как количество мРНК rin томата по отношению к количеству rin, присутствующему в rin/rin гомозиготном томате, принятому за 100%. Содержание rin у гетерозиготного растения, содержащего rin, составляет 50%. Содержание rin у гомозиготы RIN составляет 0%.
Содержание rin подходящим образом определяют с применением способов, известных в данной области техники, на основе известной последовательности гена rin. Например, можно применять стандартную методику Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) на основе набора праймеров, разработанных специально для обнаружения мутации rin. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) является предпочтительной. В настоящее время ПЦР-РВ представляет собой стандартный способ точного определения профиля экспрессии небольшого числа выбранных генов, основными преимуществами указанного метода являются высокая чувствительность и специфичность, а также широкий диапазон количественного определения. Протоколы для постановки ПЦР-РВ хорошо известны в данной области техники. См., например, Derveaux et al., Methods, 50 (2010), 227-230. Независимо от примененной методики проведения эксперимента для получения точного и достоверного количественного определения уровней экспрессии гена необходима соответствующая нормализация. Цель нормализации заключается во введении поправки на вариабельность, связанную с различными этапами экспериментальной процедуры, такую как различия в начальном количестве образца, восстановление РНК, целостность РНК, эффективность синтеза кДНК и различия в общей транскрипционной активности тканей или клеток, подвергнутых анализу. Предпочтительно ПЦР-анализ также включает обнаружение одного или более генов «домашнего хозяйства» томата или конститутивно экспрессирующихся генов, таких как GAPDH, EFα1, ТВР, RPL8, APT, DNAJ, TUA, TIP41, SAND, САС и SGN-U346908SGN (Exposito-Rodriquez et al., ВМС Plant Biology, 2008, 8:131). Кроме того, для обнаружения гена rin можно определить относительный уровень экспрессии одного или более генов-мишеней rin. Например, было обнаружено, что в мутанте с rin/rin не экспрессируются LeACS2, LeACS4, TBG4, LeEXPI, LeMAN4 и PSY1, и указанный мутант демонстрирует пониженные уровни экспрессии LeACO1, ETR3, PG и INV, в то время как экспрессия указанных генов в плоде дикого типа увеличена, что свидетельствует о том, что все указанные гены прямо или косвенно регулирует ген rin (Fujisawa et al., BMC Plant Biology, 2011, 11:26). Следовательно, в одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено растение томата, его плод, часть или их экстракты для применения в способе ингибирования, предотвращения или улучшения болезненных состояний, связанных с адипогенезом, у млекопитающего, при этом в томате не экспрессируются LeACS2, LeACS4, TBG4, LeEXP1, LeMAN4 и/или PSY1, и/или указанный томат демонстрирует пониженные уровни экспрессии LeACO1, ETR3, PG и/или INV. Предпочтительно уровни экспрессии LeACS2, LeACS4, TBG4, LeEXP1, LeMAN4, PSY1, LeACO1, ETR3, PG и/или INV соответствуют тем, которые обнаружены в томате с rin.
Уровень экспрессии может быть соответствующим образом выражен как относительная экспрессия в сравнении с сигналом ген-специфичной экспрессии гена 18S. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения применяют пониженную относительную экспрессию гена-мишени TDR-4, который связан с процессом созревания плодов.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения томат имеет содержание rin по меньшей мере 53%, например по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%. Очень хорошие результаты получены с применением томатов, имеющих содержание rin 75-100%.
В конкретном аспекте томат выбран из группы, состоящей из сортов «Slimmy» (содержание rin 53%), «Mr. Slimmy» (содержание rin 53%), «Gusto Delight (содержание rin 75%), «Snoepboompje» (содержание rin 75%) и «Tomango» (содержание rin 100%).
До настоящего изобретения гомозиготные томаты с rin (rin/rin), в основном, применяли для скрещивания с растениями равномерно созревающих сортов (u/u) для выведения гетерозиготных (u/rin) томатов, имеющих длительный срок хранения (медленное созревание). При обычной селекции растений полученное содержание rin обычно составляет не более 50%, поскольку скрещивание двух родительских линий rin/rin дает плоды, которые созревают не полностью и, следовательно, не могут быть использованы в традиционных программах селекции томата. Авторы настоящего изобретения, понимая важность высокого содрежания rin для достижения антиадипогенного эффекта, нашли решение для указанной проблемы посредством осуществления селекции F2 или F3 растений, которые высоко гетерозиготны по rin, и применения культивирования меристем с получением одинаковых растений, имеющих содержание rin выше 50%, например, по меньшей мере 53%, в частности 60-100%.
Мутантный томат с нарушенным созреванием, подходящий для применения в настоящем изобретении, может быть получен в результате применения стандартного для растений способа, в частности культивирования растительных тканей. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения указанный способ включают меристемную культуру, которая, в частности, подходит для хранения генетических ресурсов гетерозиготных растений, образующих семена. Меристема представляет собой группу недифференцированных клеток растений (находящихся на растущих кончиках), которые могут делиться, образуя всех виды тканей растения. Как правило, применяемый эксплант представляет собой глянцевую структуру полусферической формы (shiny dome shaped structure) длиной менее 0,1 мм с одной или двумя парами наиболее молодых зачатков листьев. Меристематические ткани отделяют и культивируют на подходящей питательной среде в асептических условиях. На срезанном конце меристема образует каллус, на котором возникает большое количество зачатков побегов. Указанные зачатки превращаются во множество побегов, из которых после укоренения образуются небольшие растения, имеющие 5 или 6 листьев. Побеги вырастают непосредственно из отрезанного кончика побега, подвергнутого культивированию. В культуре кончиков побегов (культуре апикальных клеток, shoot tip culture) применяемый эксплант представляет собой меристему в сочетании с зачаточными и развивающимися листьями и прилегающими тканями стебля.
Настоящее изобретение может быть реализовано на практике с применением мутантного томата с нарушенным созреванием, например растения томата с rin, его плода, части или их экстрактов. В настоящей заявке «часть» относится к части растения, такой как лист, стебель, корень, или часть плода. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения применяют корень или плод. Предпочтительно применяют плод или экстракт плода. Было обнаружено, что антиадипогенный эффект не ограничивается кожурой плода, но присущ также околоплоднику. Следовательно, можно применять томаты целиком или только околоплодник. Для удобства потребления и для одобрения и признания потребителем особенно предпочтительным является применение плодов томата целиком. Например, предполагается, что томат с мутацией rin, обладающий антиадипогенным эффектом, потребляют как часть обычного рациона питания человека, например в виде свежих плодов или переработанного продукта из указанных плодов, такого как паста или соус, таким образом, заменяя традиционный томат, получая тем самым преимущество снижения накопления жира.
Мутантные томаты могут быть различными по размеру: от томатов разновидности «Tomberry» размером примерно 5 мм в диаметре, до томатов черри, размер которых аналогично плодам дикорастущего томата составляет примерно 1-2 сантиметра (0,4-0,8 дюйма), и далее до томатов сорта «Бычье сердце» размером 10 сантиметров (4 дюйма) или более в диаметре. Наиболее распространенные выращиваемые с коммерческой целью томаты, как правило, имеют размер 5-6 сантиметров (2,0-2,4 дюйма) в диаметре. Томаты, выращиваемые для консервирования и приготовления соусов, часто имеют продолговатую форму, составляют 7-9 сантиметров (3-4 дюйма) в длину и 4-5 сантиметров (1,6-2,0 дюйма) в диаметре, указанные томаты известны как сливовидные томаты и имеют более низкое содержание воды.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен экстракт, паста, соус или сок мутантного томата с нарушенным созреванием, а также применение указанных продуктов для снижения образования новой жировой ткани и формирования жировых запасов у млекопитающего, в частности для обеспечения коррекции массы тела, содействия потере массы тела и/или лечения ожирения. Экстракт томата может быть получен, например, посредством экстракции сырья, представляющего собой томаты, подходящим растворителем. В другом варианте реализации настоящего изобретения плод томата применяют в виде пасты или в сушеном виде.
Сырье томата, подвергаемое экстракции, может представлять собой растение томата целиком, а также плод, околоплодник, сок или любые другие произвольные части. Особенно предпочтительной частью является околоплодник, поскольку он содержит большое количество компонентов, обладающих антиадипогенной активностью (в дальнейшем именуемых как «компоненты с антиадипогенной активностью»). Кроме того, сырье томата также может представлять собой остатки, полученные в результате прессования плода томата. Выжатые остатки являются особенно предпочтительными, поскольку содержат большое количество околоплодника. Другой особенно предпочтительной частью является корень, поскольку он имеет относительно нейтральный вкус и в виде порошка содержит меньше гигроскопических компонентов по сравнению с измельченным в порошок плодом. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено растение томата, корень или их экстракты для применения в способе ингибирования, предотвращения или улучшения болезненных состояний, связанных с адипогенезом, у млекопитающего, при этом томат представляет собой мутант с нарушенным созреванием, предпочтительно мутантный томат с ripening inhibitor (rin).
В случае если сырье томата содержит большое количество влаги, указанное сырье предпочтительно используют после сушки, для того чтобы повысить эффективность. В частности, содержание влаги предпочтительно снижают, например, посредством сушки естественным путем или с применением горячего воздуха в течение периода от 1 до 24 часов при температуре от 50 до 150°C. Хорошие результаты получают, когда сырье перед экстракцией подвергают сублимационной сушке. Кроме того, для увеличения эффективности экстракции сырье томата предпочтительно используют после тонкого измельчения. Не существует конкретных ограничений на способы измельчения, и примеры таких способов включают способ с применением ступки и способы с применением измельчителя (crushing machine), такого как вихревой измельчитель или гомогенизатор. Сырье томата предпочтительно измельчают до размера 16 меш или мельче.
Сырье томата, подходящее для экстракции компонентов с антиадипогенной активностью в высоких концентрациях, получают посредством сушки плодов томата целиком, их околоплодников или выжатых остатков томата с последующим их измельчением.
Не существует конкретных ограничений на растворитель, применяемый для экстракции, при условии, что он способен экстрагировать компоненты с антиадипогенной активностью, и можно использовать обычные полярные растворители или амфипротонный растворитель и т.д. Примеры растворителей, которые можно применять, включают органические растворители, растворители, содержащие органические растворители, или смешанные растворители воды и органического растворителя. Конкретные примеры органических растворителей включают низшие спирты (в частности, этанол, метанол, пропанол и бутанол), простые эфиры (в частности, диэтиловый эфир), галогензамещенные углеводороды (в частности, хлороформ), нитрилы (в частности, ацетонитрил), сложные эфиры (в частности, этилацетат) и кетоны (в частности, ацетон), а также гексан, диметилсульфоксид и диметилформамид. С точки зрения эффективности действия в качестве органических растворителей предпочтительно применяют этанол, метанол и этилацетат. Два или более видов органических растворителей могут быть применены в комбинации.
С учетом эффективности экстракции компонентов с антиадипогенной активностью низшие спирты, в частности этанол, метанол, пропанол и бутанол, предпочтительно метанол или этанол, являются особенно предпочтительными в качестве растворителя. Несмотря на то, что не существует конкретных ограничений на соотношения воды и органического растворителя в смеси, органический растворитель предпочтительно содержится в количестве 20% или более, и особенно предпочтительно в количестве от 50 до 99%. Хорошие результаты получали, когда растворитель представлял собой спиртовой растворитель, предпочтительно метанольный растворитель, более предпочтительно смесь МеОН/вода в диапазоне от 70:30 до 95:5 (об./об.), например 80:20 об./об.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения антиадипогенного агента, включающему осуществление экстракции сырья, представляющего собой растение томата, плод или часть указанного растения, растворителем, при этом указанный томат представляет собой мутантный томат с нарушенным созреванием, например имеющий содержание rin по меньшей мере 50%. Если учесть, что экстракт томата в конечном итоге будет добавлен к пищевым продуктам или косметическим средствам и т.п., этанол является особенно предпочтительным. В указанном случае наряду со 100% метанолом можно применять водный раствор спирта, предпочтительно от 40 до 90% раствор метанола и особенно предпочтительно от 60 до 90% раствор этанола.
Не существует конкретных ограничений на соотношения сырья томата и растворителя в смеси в процессе экстракции, однако растворитель предпочтительно применяют в количестве от 2 до 20 раз по массе в расчете на массу сырья томата, предпочтительно 5-15 раз по массе. Например, применяют 2-20 мл растворителя на грамм лиофилизированного экстракта плода томата. При применении метанола в качестве растворителя температура экстракции предпочтительно примерно равна комнатной температуре (18-23°C), и время экстракции предпочтительно находится в диапазоне от 30 минут до 24 часов. Выполнение процесса экстракции (частичное) при обработке ультразвуком и/или энергичном встряхивании может быть предпочтительным.
Кроме того, перед экстракцией растворителем, содержащим органический растворитель, примеси, которые растворимы в воде, могут быть удалены посредством экстракции сырья томата холодной водой или горячей водой. В указанном случае остатки выделяют после экстракции водой и подвергают экстракции растворителем.
В процессе экстракции компоненты с антиадипогенной активностью элюируют в растворитель. Поскольку компоненты с антиадипогенной активностью эффективно экстрагируются органическими растворителями, и в частности спиртосодержащими растворителями, предполагается, что указанные компоненты присутствуют в большом количестве, в частности в спирторастворимых компонентах томата.
Чтобы повысить эффективность экстракции, желательно повторить этап экстракции несколько раз. После экстракции растворитель, который содержит экстракт томата, выделяют посредством выполнения фильтрования с отсасыванием и т.п. В результате вышеуказанной процедуры может быть получен жидкий экстракт томата. В качестве альтернативы, растворитель удаляют частично или полностью (например, под вакуумом) с получением концентрированного жидкого экстракта томата или сухого экстракта томата. Кроме того, полученная фракция при необходимости может быть подвергнута дополнительной очистке с помощью синтетического адсорбента или ионообменной смолы и т.п.
Для определения антиадипогенной активности сухого экстракта его подходящим образом растворяют в небольшом объеме подходящего растворителя, например ДМСО.
Полученный экстракт томата можно применять в качестве антиадипогенного средства независимо от его состояния, от того, находится ли указанный экстракт в состоянии, в котором содержит растворитель или концентрирован, или представляет собой сухой продукт, в котором растворитель был удален из экстракта. Однако с учетом стабильности при хранении и безопасности органического растворителя экстракт томата предпочтительно получают в сухом состоянии. Антиадипогенный агент согласно настоящему изобретению может характеризоваться тем, что содержит в качестве активного ингредиента плод, корень, часть или экстракт мутантного томата с нарушенным созреванием.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением также предложен антиадипогенный агент, содержащий экстракт растения томата, его плода или части в качестве активного ингредиента, при этом указанный томат представляет собой мутантный томат с нарушенным созреванием. Растение томата, его плод, часть томата или их экстракты подходящим образом получают из мутантного томата, несущего ген rin, nor и/или Nr. Например, томат гетерозиготен или гомозиготен по rin, nor и/или Nr. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения томат имеет содержание rin, nor и/или Nr по меньшей мере 53%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно 70-100%. В одном из конкретных вариантов реализации настоящего изобретения томат имеет содержание rin по меньшей мере 53%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно 70-100%. Предпочтительно томат представляет собой rin гомозиготу.
Применение плодов и/или корней является особенно предпочтительным для экстракции. Экстракт может представлять собой жидкий или сухой экстракт. Экстракт может содержать одну или более добавок или вспомогательных компонентов, которые могут быть применены для улучшения цвета, запаха, внешнего вида, вкуса, текстуры и/или стабильности при хранении. Иллюстративные компоненты включают наполнители, консерванты, антиоксиданты, ароматизаторы, подсластители и регуляторы кислотности.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения экстракт представляет собой спиртовой экстракт, предпочтительно метанольный экстракт, более предпочтительно экстракт, полученный посредством применения МеОН/воды в диапазоне от 70:30 до 95:5 (об./об.), более предпочтительно 80:20 (об./об.). Антиадипогенный агент способен ингибировать инсулин-индуцированный адипогенез в культивированных мышиных фибробластах 3Т3. Предпочтительно адипогенез in vitro, вызванный 10-дневной обработкой 10 мкг/мл инсулина, ингибируется агентом, или восстановленным агентом, или разбавленным раствором указанного агента (например, от 1:1000 до 1:200000 в ДМСО) на по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%. Предпочтительно, адипогенез определяют посредством окрашивания липидных капель, например с применением красителя Oil Red О.
В настоящем изобретении также предложено применение мутантного томата с нарушенным созреванием, предпочтительно rin томата, его растения, плода, части или экстракта, в способе предотвращения увеличения массы тела и/или лечения патологического состояния, связанного с ожирением, у млекопитающего. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения указанное применение включает ингибирование, предотвращение или улучшение болезненного состояния, связанного с адипогенезом, при этом млекопитающее представляет собой человека или животное. Предпочтительно человек или животное имеет избыточную массу тела или страдает ожирением. Ожирение у домашних животных широко распространено во многих странах. В США показатели избыточной массы тела и ожирения у собак находятся в диапазоне от 23% до 41%, при этом примерно 5,1% собак страдает от ожирения. Показатели ожирения у кошек были немного выше, составляя 6,4%. Было обнаружено, что в Австралии показатель ожирения среди собак, побывавших у ветеринара, составляет 7,6%. Таким образом, также предусмотрено применение мутантного томата в ветеринарии. Экстракт томатов являются особенно предпочтительными для применения в ветеринарии, поскольку указанные экстракты могут быть легко включены в рацион. В одном из аспектов млекопитающее представляет собой домашнее животное, такое как кошка или собака.
Однако предпочтительно, что млекопитающее представляет собой человеческого индивидуума, в частности человеческого индивидуума, который имеет повышенный риск увеличения массы тела и/или приобретения патологического состояния, связанного с ожирением, в частности болезненного состояния, связанного с адипогенезом. Например, человеческий индивидуум страдает от или предрасположен к развитию ожирения, нарушения липидного обмена, гиперлипидемии, диабета 2-го типа, заболевания сердца, инсульта, гипертонии, рака, метаболического синдрома, заболевания желчного пузыря, подагры, апноэ во сне, астмы или детского ожирения. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения человек представляет собой человека в возрасте по меньшей мере 16 лет и предпочтительно взрослого человека.
В настоящем изобретении также предложен способ индуцирования потери массы тела и/или предотвращения увеличения массы тела субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтического состава, содержащего растение томата с нарушенным созреванием, его плод, часть или их экстракты и фармацевтически приемлемый носитель. Субъект предпочтительно представляет собой человека. Состав предпочтительно вводят субъекту 1-4 раза в сутки. Состав обычно вводят в течение по меньшей мере 2 недель, предпочтительно по меньшей мере одного месяца.
Согласно настоящему изобретению плоды томата или их экстракты могут быть предложены в качестве пищевой добавки, функциональных пищевых ингредиентов или в качестве фармацевтических ингредиентов для получения композиции для перорального введения для предотвращения и/или лечения патологического состояния, связанного с ожирением, у млекопитающего. Следовательно, еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической или нутрицевтической композиции, содержащей растение томата, его плод, часть или их экстракты, при этом указанный томат представляет собой мутантный томат с нарушенным созреванием. Предпочтительно композиция содержит экстракт плода или корня мутантного томата с нарушенным созреванием. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения томат представляет собой мутантный томат с геном rin. Например, композиция содержит плод, корень гетерозиготного или гомозиготного по rin томата или их экстракты (спиртовые). Предпочтительно содержание rin составляет по меньшей мере 65%, предпочтительно 70-100%. Например, томат выбран из группы, состоящей из сортов «Slimmy», «Mr Tasty», «Gusto Delight» и «Tomango».
Количество растения томата, его плода, части или их экстрактов можно варьировать в зависимости от конкретных потребностей или требуемых эффектов. Было обнаружено, что ежедневного потребления примерно 1-4 томатов среднего размера (то есть, примерно 20-100 граммов), гомозиготных по rin, было достаточно для оказания адипогенного воздействия на человека примерно 70 кг. Следовательно, в одном из вариантов реализации настоящего изобретения композиция содержит эквивалент по меньшей мере 0,25 грамма, предпочтительно по меньшей мере 0,5, более предпочтительно по меньшей мере 1 грамма плода томата на кг массы тела в случае, если композиция находится в форме для ежесуточного дозирования или потребления. Разумеется, эквивалентное количество может быть соответствующим образом адаптировано в случае, если предполагается дозировка, предусматривающая менее или более частый прием. Разумеется, эквивалентное количество также может относиться к композиции, находящейся в форме экстракта, предпочтительно спиртового экстракта.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения композиция предназначена для применения у людей, например в качестве составляющей антиадипогенного рациона питания или для поддержания антиадипогенного рациона питания. Композиция предпочтительно содержит один или более дополнительных полезных ингредиентов. Предпочтительно указанная композиция содержит пробиотики и/или пребиотики, предпочтительно пищевые волокна.
Было установлено, что микробиота кишечника играет сложную роль в регулировании массы тела (P.J. Turnbaugh, F. Backhed, L. Fulton, J.I. Gordon, Cell Host Microbe, 3, 213 (2008)). Эксперименты по пересадке микробиоты от страдающих ожирением и «худых» мышей мышам без микробов также продемонстрировали, что изменение состава микробиоты в желудочно-кишечном (ЖК) тракте приводило к различиям в эффективности выделения энергии в процессе переваривания пищи, в конечном итоге приводя к различным значениям массы тела. Указанные результаты свидетельствуют о том, что небольшие изменения выделения энергии в ЖК тракте с помощью кишечных бактерий, регулируемых посредством ксенобиотиков, может привести к значительному снижению массы тела. Следовательно, в одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая растение томата, плод, часть или их экстракты, при этом указанный томат представляет собой мутантный томат с нарушенным созреванием, и по меньшей мере один пробиотик, способный содействовать потере массы тела млекопитающего. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения указанный пробиотик представляет собой лактобактерию (Lactobacillus), например выбранную из группы, состоящей из Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513ВР, Lactobacillus acidophilus FARM2 KCTC 11514BP и Lactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP, Lactobacillus helveticus CNCM I-4095, Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4096 и Lactobacillus gasseri SBT2055 (LG2055).
В качестве альтернативы, или кроме того, композиция может содержать пребиотик, такой как пищевые волокна. Пищевые волокна являются важной частью здорового и сбалансированного питания и имеют большое значение для его роли в жизнеспособности клеток толстого и тонкого кишечника, то есть колоноцитов и энтероцитов. Пищевые волокна могут предотвращать их разрушение. Пищевые волокна обычно рассматриваются как неперевариваемые части растений или овощей. Они представляют собой углеводы, более конкретно поли- и олигосахариды, отличные от крахмала, и лигнин, главным образом полученные из клеточных стенок растений, которые не могут быть гидролизованы пищеварительными ферментами человека. Однако они часто могут ферментироваться кишечными бактериями с получением водорода, метана, диоксида углерода, воды и короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК). Функция пищевых волокон в тонком и толстом кишечнике различна. В тонком кишечнике их основной функцией является увеличение вязкости, в то время как в толстом кишечнике указанная функция заключается в выполнении роли субстрата для кишечной флоры для получения короткоцепочечных жирных кислот.
В настоящем изобретении растворимые пищевые волокна предпочтительно применяют как в виде длинных цепей, то есть полисахаридов, так и в виде коротких цепей, то есть олигосахаридов. При потреблении растворимых волокон непереваренная часть выступает в качестве субстрата для кишечной флоры. В зависимости от вида растворимого волокна стимулируются различные группы бактерий. Таким образом, для получения оптимального результата в настоящем изобретении предложено предпочтительное применение по меньшей мере двух видов волокна. Ряд клинических исследований продемонстрировал, что введение олигосахаридов, таких как фруктоолигосахариды (ФОС), галактоолигосахариды (ГОС или GaOS), глюкоолигосахариды (ГОС или GluOS) или ксилоолигосахариды (KOC), может увеличить количество «дружественных» или полезных бактерий, при этом уменьшая популяцию вредных бактерий.
Некоторые пищевые волокна, такие как описанные олигосахариды, также были определены как пребиотики. Для того чтобы считаться пребиотиком, пищевой ингредиент должен соответствовать следующим критериям: (i) не подвергаться ни гидролизу, ни всасыванию в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, (ii) селективно ферментироваться одним видом или ограниченным числом видов бактерий, потенциально полезных для толстого кишечника и (iii) быть в состоянии изменить микрофлору толстого кишечника в сторону более полезного для здоровья состава посредством увеличения количества «дружественных» бактерий и уменьшения количества вредных или гнилостных бактерий. Поскольку пищевые волокна обеспечивают столь широкий спектр преимуществ для питания и здоровья, указанные волокна добавляют ко многим пищевым продуктам и предоставляют в виде отдельных пищевых добавок или пребиотических композиций.
Например, композиция представляет собой съедобный пищевой продукт на основе томатов, содержащий переработанные плоды мутантного томата с нарушенным созреванием и по меньшей мере один пребиотик и/или по меньшей мере один пробиотик. Иллюстративные пищевые продукты включают томатный сок, томатный кетчуп, сушеные томаты, маринованные томаты, томатную пасту, томатное пюре, соусы на томатной основе, супы, напитки и спреды на томатной основе. Переработанные продукты томатов, такие как томатный сок, томатное пюре, томатные пасты и томатный кетчуп, обычно получают посредством мытья плода томата, предварительного нагревания (главным образом для дезактивации ферментов) вымытого плода томата, экстракции сока из предварительно нагретого вымытого материала, нагревания (главным образом для стерилизации) или дополнительного сгущения и аналогичного нагревания такого экстрагированного сока после смешивания.
В другом варианте реализации настоящего изобретения предложена пищевая композиция для животных, содержащая растение томата, плод, часть или их экстракты, при этом указанный томат представляет собой мутантный томат с нарушенным созреванием, предпочтительно мутантный томат с геном ripening inhibitor (rin). Например, указанная композиция представляет собой «легкую» смесь для домашних животных, подходящим образом применяемую для регулирования массы тела домашнего животного.
Описание чертежей
Фигура 1: Ингибирование адипогенеза in vitro посредством экстрактов томата с геном rin с применением установленной модельной системы мышиных фибробластов 3T3-L1. ФНО-α (TNF-alpha) применяли в качестве положительного контроля для ингибирования инсулин-индуцированного накопления жира. Отрицательный контроль: инсулин-индуцированные клетки. Контроль с применением растворителя: инсулин-индуцированные клетки с 0,1% ДМСО. Elegance: инсулин-индуцированные клетки с экстрактом контрольного томата сорта «Elegance», 0% rin. Gusto Delight: инсулин-индуцированные клетки с экстрактом томата с rin сорта «Gusto Delighb (75% rin). Tomango: инсулин-индуцированные клетки с экстрактом томата с rin сорта «Tomango» (rin гомозигота; 100% rin).
Экспериментальный раздел
Определение содержания rin
Тотальную РНК экстрагировали и выделяли из плодов томата сортов, имеющих различные содержания rin, включая нормальное растение (генотип RIN/RIN) (в стадиях спелости с зеленой, розовой и красной окраской) и rin мутантное растение (rin/rin) в периоды, соответствующие указанным стадиям, как описано ранее (Kitagawa et al., Characterization of tomato fruit ripening and analysis of gen expression in F1 - Hybrids of the ripening inhibitor (rin) Mutant, Physiol. Plantarium, 2005, 123 (3): 331-338) сприменением набора реактивов RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия). Комплементарную ДНК синтезировали на основе тотальной РНК с применением набора реактивов для синтеза первой цепи кДНК PrimeScript II (Takara Biotech), а затем применяли в качестве матрицы в ПЦР в реальном времени. Уровни экспрессии генов rin анализировали посредством количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (кПЦР-РВ) с применением олигонуклеотидных праймеров, специфичных для rin (номер доступа в GenBank AF 448522).
Получение экстракта томата
Свежие плоды томата разрезали на части размером примерно 1×1×1 см. Плоды применяли целиком. После сублимационной сушки указанных частей подвергнутый сублимационной сушке материал измельчали до получения однородного порошка с применением пестика и ступки. Порошок подвергали экстракции растворителем (метанолом или смесью метанол/вода 80:20 об./об.). Как правило, для экстракции 1 грамма порошка применяли 13 мл растворителя. Экстракцию проводили при комнатной температуре (при обработке ультразвуком в течение 30 мин с последующим энергичным встряхиванием в течение 30 мин). Экстракционную смесь центрифугировали и надосадочную жидкость сушили в вакууме. Высушенный экстракт повторно растворяли в ДМСО (Кол-во: объем) перед применением в анализах на адипогенез. Концентрация экстракта соответствует 375 мг исходного порошка/мл.
Анализ на адипогенез in vitro
Анализ проводили согласно протоколу, ранее описанному Niwano et al. (Niwano et al., Extensive screening for plant foodstuffs in Okinawa, Japan with anti-obese activity on adipocytes in vitro; Plant Foods Hum. Nutr., 2009 Mar; 64(1):6-10).
Конечная концентрация экстрактов томата, применяемых в анализе, составляла 1:10000 по сравнению с экстрактом в ДМСО (то есть, соответствуя 37,5 мкг исходного порошка на мл). Конечная концентрация ДМСО составляла 0,1%. ФНО-α (10 нг/мл) применяли в качестве положительного контроля при ингибировании адипогенеза.
2
Концентрацию мышиных фибробластов 3T3-L1 (Dainippon Pharma Co., Ltd., Осака, Япония) доводили до 30000 клеток/мл в DMEM (модифицированной по способу Дульбекко среде Игла) с добавлением 10% CS, и 200 мкл суспензии клеток высевали на 96-луночный культуральный планшет и инкубировали при 37°C в увлажненном инкубаторе при 5% CO в течение 2 суток. Среду заменяли на DMEM с добавлением 10% FCS, 0,5 мМ IBMX и 1 мкМ DEX и дополнительно инкубировали в течение 2 суток (начало дифференцировки). Среду заменяли на DMEM с добавлением 10% FCS и 10 мкг/мл инсулина и дополнительно инкубировали в течение 2 суток. Затем среду заменяли на обычную питательную среду (DMEM с добавлением 10% FCS) и меняли на свежую каждые 24 ч. Каждый анализируемый раствор (экстракт томата или контроль) добавляли в течение периода от начала дифференцировки (0 сутки) до 10 суток.