СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ТВЕРДОФАЗНОГО БИОПРЕПАРАТА АНТИБИОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЯГЕЛЬ ИЗ СЛОЕВИЩ ЛИШАЙНИКОВ
METHOD OF PRODUCING HIGHLY ACTIVE SOLID-PHASE ANTIBIOTIC BIOPREPARATION OF REINDEER MOSS FROM LICHEN FRONDS

Изобретение относится к биотехнологической (биофармацевтической) отрасли промышленности, а именно к производству биопрепаратов медицинского назначения (бактерицидного действия). Использование механохимических технологий в производстве антибиотического препарата из слоевищ лишайников без участия растворителей в одну технологическую стадию из сухого сырья позволяет проводить образование β-олигосахаридов (активного наполнителя) за счет расщепления части β-гликозидных связей в лишайниковых β-полисахаридах, и комплекса между активным наполнителем и фармаконом (лишайниковыми кислотами, содержащимися в слоевищах лишайников, либо известным фармпрепаратом антибиотического действия), что повышает биодоступность фармакона и антибиотическую активность препарата в 5-10 раз. Это выгодно отличает технологичность предлагаемого подхода и свойства полученных биокомплексов от аналогов, произведенных с использованием классических технологий.
Лишайники из рода кладонии (Cladonia) и цетрарии (Cetraria) - лекарственные растения, используемые в народной медицине для лечения многих заболеваний. В слоевищах лишайников содержится до 80% углеводов, половина которых представлена β-гомополисахаридом лихенином, а также изолехинином, обладающими как иммуномодулирующими, противоопухолевыми, так и гепатопротекторными свойствами.
Известно об использовании лишайников в качестве антибиотического средства. Так, противомикробная активность в отношении стафилококков, стрептококков, кислоустойчивых микроорганизмов, грибов, простейших и вирусов обусловлена наличием в слоевищах лишайниковых кислот (Галицкий Л.А. и др. // Проблемы туберкулеза. 1997, №4. С.35-38). Высокая антибиотическая активность связана, прежде всего, с присутствием в лишайниках усниновой кислоты и ее производных (фиг.1), относящихся также к лишайниковым кислотам (Горшкова Р.П. и др. // Биоорган., химия. 1997. Т.23, №2. С.1324-1328). Антибиотическая активность усниновой кислоты сильно зависит от характера оптического вращения, причем D(+) изомер, как правило, более активен. Все три формы усниновой кислоты были ранее изучены на антимикробную активность, установлена их преобладающая активность против грамположительных и кислотостойких микроорганизмов. Механизм антибиотического действия усниновой кислоты связан с разрывом процесса окислительного фосфорилирования у микроорганизмов (Крамаренко и др., 2003).
Полученная из лишайников усниновая кислота в виде уснината натрия была предложена под названием «Бинан» для медицинского использования и применялась в качестве наружного средства для лечения ран, ожогов, трещин и в гинекологии. С появлением синтетических и полусинтетических антибиотиков препарат был снят с производства (Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири. Иркутск. 1987. С.21-22).
Препараты усниновой кислоты удачно применялись для лечения и профилактики кариеса, в то время как использование в оральной терапии известных сильных антибиотиков (эритромицин, цикфалоридин, цефуроксим и др.) нарушало баланс микрофлоры в полости рта и вызывало стойкие стоматиты (Литвинов, Рассадина, 1958). Несмотря на положительный опыт использования лишайников во многих разделах клинической медицины, в доступной литературе имеются немногочисленные сообщения о применении данного растения. Это связано с тем, что известные методы выделения биоактивных веществ из слоевищ лишайников не дают желаемого результата.
Аналогом, с точки зрения самого метода гликозидного клатрирования фармаконов является цикл работ под руководством академика Г.А. Толстикова (Толстикова Т.Г., Брызгалова О.А., Сорокина И.В. и др. О природе эффекта гликозидного клатрирования фармаконов // ДАН. 2007. Т.416, №1. С.133-134. Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г., Толстиков Г.А. На пути к низкодозовым лекарствам // Вестник РАН. 2007. Т.77. №10. С.867-874).
Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению (прототипом) является противотуберкулезный препарат «ЯГЕЛЬ-М» для профилактики и лечения туберкулеза и способ его получения (Кершенгольц Б.М., Филиппова Г.В., Шашурин М.М. и др. Способ получения препарата ЯГЕЛЬ-М для профилактики и лечения туберкулеза // Патент РФ на изобретение №2385159, 27.03.2010; Филиппова Г.В., Павлов Н.Г., Шашурин М.М. и др. Влияние биологически активных веществ из слоевищ северных лишайников, экстрагированных различными методами, на биологические свойства микобактерий туберкулеза // Сибирский медицинский журнал. 2008. №3. С.99-103).
Техническим эффектом изобретения является экологическая чистота предлагаемого способа получения, так как в нем нет ни экстракционных, ни гидролизных стадий обработки биосырья, процесс проходит без участия растворителей в одну технологическую стадию, что обеспечивает сокращение ресурсо- и энергоемкости технологического процесса. Антибактериальное действие полученного препарата ЯГЕЛЬ характеризуется в 5-10 раз повышенной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с антибиотическими препаратами, получаемыми стандартными способами, без механоактивации. Минимальная ингибирующая концентрация препарата ЯГЕЛЬ в 2 раза меньше чем у 40% спиртового экстракта ягеля механоактивированного (Ягель-М), взятого за прототип.
Эффект достигается тем, что использование механохимической обработки лишайникового сырья приводит в одну технологическую стадию к образованию β-олигосахаридов (активного наполнителя) за счет расщепления части β-гликозидных связей в лишайниковых β-полисахаридах, и комплекса между активным наполнителем и фармаконом (лишайниковыми кислотами, содержащимися в слоевищах лишайников, либо известным фармпрепаратом антибиотического действия). При этом β-олигосахариды проявляют себя как синергетная компонента в комплексе с природными веществами антибиотического действия - с лишайниковыми кислотами, либо с активными вещества известных фармпреператов антибиотического действия. Таковые слабые межмолекулярные взаимодействия приводят к образованию комплекса дифильного характера, создавая тем самым оптимальные условия для диффузионного процесса, повышая в 5-10 раз биодоступность фармакона, что и способствует увеличению его биоактивности.
Сущность изобретения состоит в том, что ударно-истирающее воздействие с добавкой твердофазного реагента бикарбоната натрия 0,5% по массе сопровождается, наряду с разрушением клеточных стенок, изменением химического состава компонентов растительного сырья и переходом их в биодоступную форму в результате разрыва ряда химических связей (даже таких прочных как β-гликозидных) и протеканием механохимических, твердофазных реакций перехода фенольных групп лишайниковых кислот в фенолятные, с последующим их синергетным межмолекулярным взаимодействием (фиг.2).
Изобретение может быть реализовано следующим образом.
Порошок грубоизмельченных слоевищ лишайников помещается в камеру шаровой мельницы (например, АГО-2 или ЦЭМ-7-80) и подвергается механохимической активации в течение 3 минут при 1500 об/мин. Образующийся препарат ЯГЕЛЬ подвергается тестированию на антибактериальную активность по отношению к условно-патогенным и патогенным штаммам микроорганизмов.
Способ имеет варианты реализации, заключающиеся в том, что в камеру шаровой мельницы в порошковую смесь добавляют известный антибиотический фармпрепарат (фармакон), например цефазолин, в массовом соотношении лишайник: фармакон 10:1. При этом активность фармакона также возрастала в 5-10 раз.
Антибактериальные свойства препарата ЯГЕЛЬ определяли in vitro на культурах бактериальных штаммов четырех условно-патогенных и патогенных микроорганизмов по стандартным и модифицированным методикам.
Проведены сравнительные исследования антибактериального действия слоевищ лишайников грубого помола без механохимической обработки (порошок №1) и механоактивированного препарата ЯГЕЛЬ на следующих культурах по стандартам мутности культур на 5 и 10 единиц:
1. Staphylococcus aureus - 6538-p
2. Escherichia coli - H-257
3. Pseudomonas aeruginosa - 33105
4. Klebsiella pneumoniae
Использовались стандартные питательные среды: среда Эндо, молочно-желточно-солевой агар, среда Плоскирева, мясопептонный агар (МПА), которые были приготовлены по стандартной прописи (МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания, утвержденные главным государственным санитарным врачом РФ, 04.03.2004) с добавлением в питательную среду контрольного и исследуемого образца количеством 5,0 mg/ml. Газонным методом был произведен посев культур микроорганизмов и после культивации в термостате при 37,0°C оценивалась интенсивность их роста. Результаты оценки приведены в таблице 1.
Порошок №1 показал либо едва заметную попытку к лизису, либо микроорганизмы лизировались частично.
Таким образом, продемонстрирована очень высокая эффективность препарата ЯГЕЛЬ в отношении условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов, включая Staphylococus aureus, Klebsiella pneumonia и др.
Проведены сравнительные исследования антибактериального действия комплексного препарата №2, состоящего из слоевищ лишайника и цефазолина в массовых отношениях 10:1, подвергшихся совместной механохимической обработке, и препарата №3, состоящего из смеси слоевищ лишайника и цефазолина в таких же массовых отношениях 10:1, но без механохимической активации, полученного грубым помолом на бытовой мельнице.
Определение активности антибактериального действия испытуемого комплексного препарата (№2) и грубоизмельченной смеси (№3) проводили методом серийных разведений на плотных питательных средах. В качестве питательной среды применяли традиционные питательные агаровые среды для выращивания E.colli. Эффективность антибактериального действия препаратов определяли сроками появления лизиса клеток бактериальной культуры. Сравнения исследуемых образцов проводили из расчета на концентрацию цефазолина.
При действии комплексного препарата №2 на штамм E.colli M17 отмечалось умеренное бактериостатическое действие в области концентраций цефазолина 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл и бактерицидное действие с концентрацией цефазолина свыше 2,0 мкг/мл (таблица 2).
Цефазолин в составе препарата №3 (контроль) не проявлял бактерицидного и бактериостатического действия в области указанных концентраций. Следовательно, цефазолин с концентрацией свыше 2,0 мкг/мл, прошедший совместную механоактивацию с ягелем, оказывает выраженное бактериостатическое действие на штамм E.colli, в отличие от цефазолина, входящего в состав композита ягеля грубоизмельченного без механоактивации.
Нами определена сравнительная антибактериальная активность твердофазного препарата ЯГЕЛЬ и прототипа, представляющего 40% водно-спиртовый экстракт ЯГЕЛЬ-М т vitro, в отношении штамма Staphylococcus aureus - 6538-р посредством определения их минимальной ингибирующей концентрации (МИК).
Прототип нами был получен и тестирован в строгом соответствии указанному изобретению (см. Патент РФ на изобретение №2385159, 27.03.2010), т.е. в виде водно-спиртового экстракта сухих слоевищ лишайников, предварительно механоактивированных с твердой щелочью. Прототип (экстракт ЯГЕЛЬ-М) получают последовательностью следующих технологических стадий: слоевища лишайников подвергают механохимической активации в присутствии твердой щелочи для перевода лишайниковых кислот водонерастворимой фенольной природы в водорастворимую фенолятную форму. Далее полученный порошок, который не является конечным продуктом, подвергают водной экстракции, нерастворимый остаток отделяют фильтрацией. Из полученного раствора феноляты осаждают подкислением. Полученный осадок, содержащий лишайниковые кислоты антибактериального действия, растворяют в 40% водно-этанольной смеси.
Для достоверных результатов при сравнении антибактериальной активности исследуемого препарата и аналога показатели концентрации приведены к единой размерности (см. таблицу 3).
Для определения МИК использовались стандартные методики (МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания) определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а именно метод приготовления серийных разведении антибактериального препарата в агаре. Твердофазный препарат ЯГЕЛЬ при внесении его в питательную среду для равномерного распределения использовали в виде 40% водно-спиртовой взвеси. Затем после двух суток культивации в термостате при 37,0°C оценивалась интенсивность роста в зависимости от содержания препарата. Результаты оценки приведены в таблице 3. Результаты учитывали визуально, путем подсчета выросших колоний на чашке. Полученные данные интерпретировали следующим образом: отсутствие роста микроба (-) указывает на его чувствительность к препарату. При росте тест-культуры в количестве от 0 до 25 колоний результат оценивали как 1+, от 25 до 50 колоний как 2+, от 50 до 100 как 3+. В случае образования на чашке 100 и более колоний микроорганизм считали резистентным (4+).
Таким образом, достоверные данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что минимальная ингибирующая концентрация препарата ЯГЕЛЬ в отношении чистой культуры штамма St. aureus составила 2,5 mg/ml, a экстракта «ЯГЕЛЬ-М» - 5,0 мг/мл. Отсутствие достоверных различий между образцами, обозначенными как «Контроль 1» и «Контроль 2», свидетельствует о неспособности полученных концентраций этилового спирта повлиять на интенсивность роста вышеуказанного штамма микроорганизмов на питательной среде «МЖСА» при стандартных условиях культивирования.
Для физико-химического исследования эффекта повышенной антибактериальной активности полученных межмолекулярных комплексов активного наполнителя (лишайниковых β-олигосахаридов) с фармаконом (лишайниковыми кислотами) использовали методы ИК-спектроскопии, комбинационного (рамановского) рассеивания и атомно-силовой микроскопии.
-1
Методом ИК-спектроскопии показано, что характер ИК-спектров в случае всех образцов ягеля идентичен (фиг.3). Вместе с тем, интенсивность всех наблюдаемых полос поглощения зависит от способа получения образца биопрепарата. Увеличение интенсивности поглощения в области валентных колебаний OH-группы (3450-3350 см) ягеля механохимического (ЯГЕЛЬ) свидетельствует о разрыве части прочных β-гликозидных связей в исходных нерастворимых полисахаридах, входящих в состав лишайникового сырья, и как следствие, об образовании более биодоступных β-олигосахаридов.
-1
-1
-1
-1
Наличие в ИК-спектре ряда полос (1670-1630 см - C=C связи сопряженных систем; 1200-1270 см -C-O-C- группы атомов; 1100-1000 см - как пиранозные циклы, так и -C-OC- группы атомов; 900 см - деформационные колебания C-H.), характерных для образца усниновой кислоты свидетельствует о большем ее количестве в исследуемом механохимическом образце. Наличие усниновой кислоты в исследуемом препарате ЯГЕЛЬ подтверждают и результаты спектроскопии комбинационного (рамановского) рассеивания.
Измерения рамановского рассеивания проводились на системе NTegra Spectra. Близость частотных диапазонов характерных линий поглощения спектров комбинационного (рамановского) рассеивания для усниновой кислоты и механоактивированного ягеля (фиг.4а и 4б), также преимущественная флуоресценция в области 570 нм и 720 нм в отличие от спектров ягеля грубого помола (фиг.4в), где можно заметить более низкую интенсивность излучения рамановских пиков, свидетельствует о более высоком содержании усниновой кислоты в препарате ЯГЕЛЬ, в отличие от ягеля грубого помола.
Образование новых структур было зафиксировано методом атомно-силовой микроскопии (фиг.5б), в то время как неструктурированная поверхность порошка ягеля грубого помола отличалась отсутствием таковых и наличием более гладкого рельефа (фиг.5а).
Таблица 1
Антибактериальное действие порошка №1 и препарата ЯГЕЛЬ на культуры условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов
Название видов бактериальных штаммов
Антибактериальное действие порошка №1 (контроль)
Антибактериальное действие препарата ЯГЕЛЬ
Staphylococcus aureus - 6538-р
+<sup>∗</sup>
++++
Escherichia coli - H-257
+
+++
Pseudomonas aeruginosa - 33105
+
++++
Klebsiella pneumoniae
+
++++
Прим.: <sup>*)</sup> + - слабый лизис; ++ - частичное лизирование;
+++ - почти полный лизис; ++++ - полный лизис
Таблица 2
Антибактериальное действие комплексного препарата ЯГЕЛЬ с цефазолином на штамм E.colli M17
№№ п/п
Концентрация цефазолина, мкг/мл
Антибактериальное действие
Комплексный препарат №2
Комплексный препарат №3 (контроль)
1
0,25
++<sup>∗</sup>
-
2
0,5
++
-
3
1,0
++
+
4
2,0
+++
+
5
4,0
++++
++
6
контроль
-
-
Прим.: <sup>*)</sup> + - слабый лизис; ++ - частичное лизирование;
+++ - почти полный лизис; ++++ - полный лизис;
- полное отсутствие лизиса
Таблица 3
Зависимость интенсивности роста культуры St. aureus от концентрации препаратов
№№ проб
Концентрация препарата (mg/ml)
Интенсивности роста культуры
ЯГЕЛЬ-М (водно-спиртовая экстракция)
ЯГЕЛЬ
1
15,0 mg/ml
-
-
2
12,5 mg/ml
-
-
3
10,0 mg/ml
-
-
4
7,5 mg/ml
-
-
5
5,0 mg/ml
-
-
6
2,5 mg/ml
+
-
7
1,25 mg/ml
+++
+
8
0,63 mg/ml
++++
++
9
0,32 mg/ml
++++
++++
10
Контроль 1 (МЖСА + 1 ml - 96% этилового спирта)
++++
++++
11
Контроль 2 (МЖСА без добавок)
++++
++++
Прим.: (-) - отсутствие колоний культуры St. Aureus
(+)÷(++++) - наличие колоний культуры St. Aureus в количестве от 25 до 100 и более колоний на чашку