Способ прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных раком молочной железы
METHOD OF FORECASTING PERSONSIVE SURVIVABILITY IN PATIENTS WITH BREAST CANCER

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования безрецидивной выживаемости при раке молочной железы.
Одним из наиболее важных вопросов в онкологии на протяжении многих лет является проблема прогнозирования течения злокачественных новообразований с целью возможного предсказания развития разных форм прогрессии заболевания. В этой связи актуальным и на сегодняшний день остается поиск дополнительных маркеров, позволяющих оценить риск развития рецидива опухоли, а также разных форм метастазирования, в особенности гематогенной диссеминации [1, 2].
Установлено, что при раке молочной железы одним из факторов, влияющих на вероятность отдаленного метастазирования, является взаимодействие опухоли с компонентами микроокружения [3, 4, 5, 6, 8]. При этом одним из ключевых компонентов микроокружения выступают макрофаги, которые могут способствовать или препятствовать формированию гематогенных метастазов. Такая возможность определяется свойствами, которыми обладают данные клетки окружающего внеклеточного матрикса. Макрофаги подразделяются на субпопуляции, имеющие разные поверхностные и секретируемые белки. Особенности таких белков и определяют свойства и возможности макрофагальных клеток к созданию условий для формирования отдаленных гематогенных метастазов [7, 9, 10].
Одним из таких белков является YKL-39 - хитиназоподобный протеин макрофагов, относящийся к новому классу внеклеточных медиаторов, которые сочетают в себе свойства цитокинов и факторов роста. Уже известно, что большая часть YKL-39 локализуется не в цитоплазматических везикулах, а в ядерных гранулах, это обстоятельство позволяет предположить не только внеклеточную роль YKL-39 как белка, секретируемого макрофагами, но и его регуляторную функцию для «программирования» самих макрофагов. CD68 имеет важное значение в фагоцитарной активности тканевых макрофагов, участвует во внутриклеточном лизосомальном метаболизме и во внеклеточных взаимодействиях «клетка-клетка» и «клетка-патоген», также он может связываться с лектинами и селектинами, что позволяет макрофагу «заякориваться» в определенном участке ткани. Изменение уровня хитиназоподобных белков в тканях и в кровотоке является ценным диагностическим критерием для мониторинга разных типов активации иммунной системы при различных заболеваниях, в том числе при развитии злокачественных новообразований [11, 14].
Наиболее близким к настоящему способу является способ прогнозирования отдаленной безрецидивной выживаемости пациентов при раке молочной железы, предложенный Cobleigh M.A. с соав. [12]. Известный способ предназначен для пациенток, больных инвазивным раком молочной железы, у которых диагностирован эстроген-позитивный рецепторный статус (RE+). Способ включает в себя определение уровня экспрессии РНК-транскрипта CD68. CD68 (кластер дифференцировки 68, макросиалин) - это гликопротеин, являющийся интегральным трансмембранным белком, который экспрессируется на поверхности моноцитов и макрофагов. Данный белок широко используют как маркер макрофагов и опухолевых клеток макрофагального происхождения. Способ прогноза безрецидивной выживаемости Cobleigh M.A. заключается в следующем. Из биопсийных образцов ткани опухоли молочной железы выделяют РНК. Уровень РНК-транскриптов CD68 определяется с помощью количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR). Экспрессию указанного продукта оценивают иммуногистохимически или с использованием протеомных технологий. Далее производят сравнение нормализованного уровня экспрессии CD68 с нормализованным уровнем экспрессии CD68 в референсных образцах рака молочной железы. Увеличенный нормализованный уровень экспрессии CD68 является индикатором низкой вероятности длительного периода безрецидивной выживаемости.
Одним из недостатков указанного способа является то, что объектом исследования является поверхностный маркер макрофагов, ответственный за их связывание с лектинами и селектинами и фагоцитарную активность макрофагов, не способный оказывать дистантное регуляторное действие на опухолевые клетки. Другим недостатком этого способа является ограниченная область применения, обусловленная тем, что он предназначен только для тех больных раком молочной железы, у которых на клетках опухоли обнаружены рецепторы к эстрогенам (эстроген-позитивный рецепторный статус).
Новый технический результат – повышение точности способа за счет  использования новых маркеров и их конкретных числовых показателей, а также расширение показаний для применения способа.
Для достижения нового технического результата в способ прогнозирования вероятности безметастатической выживаемости при раке молочной железы путем исследования биопсийных образцов ткани опухоли молочной железы, полученных перед проведением неоадъювантной терапии с последующим выделением РНК и определением уровня гена, экспрессируемого макрофагами с помощью количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции  в режиме реального времени RT-qPCR, определяют уровень экспрессии YKL-39 по технологии ТaqMan с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5’-aacaacaaggttatcatcaaggac-3’, AntiSense 5’-tttgggattcttggttttgag-3’, Probe FAM-5’-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3’-BHQ1, далее проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39, оценивают относительную экспрессию гена белка YKL-39 с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH, причем в качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой при проведении исследования аналогичным вышеописанному способом уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1 (1 УЕ), и при уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют высокую, а при уровне экспрессии гена белка YKL-39 менее 1 УЕ - низкую вероятность длительного периода безметастатической выживаемости.
Способ осуществляют следующим образом.
3
Для молекулярно-генетических исследований используют биопсийные образцы опухолевой ткани в объеме ~10 мм, которые берут у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии. Образцы ткани опухоли помещают в раствор RNALater (Ambion, USA) и после 24-часовой инкубации при температуре +4°С сохраняют при температуре 80°С.
На следующих этапах  выделяют РНК и ДНК.
РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяют с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивают концентрацию и чистоту выделения РНК. Целостность РНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). С полученной РНК осуществляют синтез ДНК. Уровень экспрессии гена белка YKL-39 оценивают при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia) с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5’-aacaacaaggttatcatcaaggac-3’, AntiSense 5’-tttgggattcttggttttgag-3’, Probe FAM-5’-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3’-BHQ1. Далее с полученной ДНК проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39. Относительную экспрессию гена белка YKL-39 оценивают с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1.
Уровень экспрессии YKL-39 в биопсийных образцах ткани опухоли у больных раком молочной железы более 1 УЕ (YKL-39>1) рассматривают как гиперэкспрессию и оценивают как благоприятный критерий, указывающий на низкий риск развития рецидива и гематогенных метастазов, а значит, на высокую вероятность длительного периода безрецидивной выживаемости. Наоборот, уровень экспрессии гена белка YKL-39 ниже 1 УЕ (YKL-39<1) рассматривают как гипоэкспрессию и оценивают как неблагоприятный показатель, указывающий на высокий риск развития рецидива и возникновения гематогенных метастазов и, соответственно, на низкую вероятность длительного периода безрецидивной выживаемости.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Больная Л., 40 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Мультицентрический рост опухоли, трижды негативный молекулярно-генетический тип. Размер первичного опухолевого узла составляет 2,5 см. В 8 исследованных лимфатических узлах аксиллярной клетчатки лимфогенных метастазов обнаружено не было. Стадия заболевания Т2N0M0. Проведено 2 курса неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) по схеме монотерапией таксотером. Эффект НАХТ по шкале RECIST – прогрессирование (149%). При проведении молекулярно-генетического исследования образцов ткани опухоли молочной железы, взятых до проведения НАХТ, согласно предлагаемому способу, значение уровня экспрессии гена белка YKL-39 составило 19,84. Через 60 месяцев динамического наблюдения у пациентки не было зарегистрировано гематогенных метастазов.
Пример 2. Больная Н., 47 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Уницентрический рост опухоли, люминальный В молекулярно-генетический тип. Размер первичного опухолевого узла составляет 2,5 см. В 10 исследованных лимфатических узлах аксиллярной клетчатки лимфогенных метастазов обнаружено не было. Стадия заболевания Т2N0M0. Проведено 2 курса (НАХТ) по схеме монотерапией таксотером. Эффект НАХТ по шкале RECIST – частичная регрессия (84%). При проведении молекулярно-генетического исследования образцов ткани опухоли молочной железы, взятых до проведения НАХТ, согласно предлагаемому способу, значение уровня экспрессии гена белка YKL-39 составило 0,05. Через 37 месяцев динамического наблюдения у пациентки были зарегистрированы гематогенные метастазы в кости и легких.
Предлагаемый способ основан на анализе данных морфологического и молекулярно-генетического исследования биопсийного и операционного материала, анализе амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного. Изучался биопсийный материал от 91 пациентки больных раком молочной железы стадии IIA-IIIC (T1-4N0-3M0) в возрасте от 28 до 68 лет (средний возраст больных составил 47,4±0,8 лет). Все пациентки проходили лечение в отделении общей онкологии Томского НИИ онкологии в период с 2006 по 2010 г. Исследование проходило в соответствии с Хельсинской Декларацией 1964 г. (исправленной в 1975 и 1983 годах), а также с разрешения локального этического комитета института, все пациенты подписали информированное согласие на исследование. Гистологический тип опухоли молочной железы устанавливался согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012 г.).
2
2
2
2
2
2
2
В плане комбинированного лечения все пациентки на предоперационном этапе получили 2-4 курса полихимиотерапии по схеме FAC (5-фторурацил 500 мг/м в 1-й день, адриамицин 50 мг/м в 1-й день, циклофосфамид 500 мг/м в 1-й день, внутривенно; проведение курсов через 21 день), по схеме CAX (циклофосфан 100 мг/м внутримышечно в течение 14 дней, адриамицин 30 мг/м внутривенно в 1-й и   8-й дни, кселода 1000 мг/м 2 раза в день, per os, в течение 14 дней; проведение курсов через 21 день) или монотерапию таксотером (100 мг/м внутривенно, часовая инфузия в день). Оценку эффективности неоадъювантной химиотерапии проводили по шкале RECIST (Response Evaluation Criteriain Solid Tumors от 2000 г.) спустя 14 дней после второго и четвертого курсов химиотерапии на основании результатов клинического осмотра, УЗИ молочных желез и маммографии. Оперативный этап осуществляли через 14-21 день после завершения курсов неоадъювантной химиотерапии. Операцию выполняли в объеме радикальной мастэктомии, радикальной или секторальной резекции молочной железы. В послеоперационном периоде пациенткам по показаниям проводили адъювантную химиотерапию, гормональную и/или лучевую терапию. Сроки наблюдения за больными составили 5 лет (60 месяцев), по истечении которых у 21 пациентки были диагностированы гематогенные метастазы. Наличие гематогенных метастазов у пациенток регистрировали на основании результатов анализа амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного.
Для морфологического исследования в течение первого часа после выполнения оперативного вмешательства в операционном материале осуществляли взятие образцов опухолевой ткани. Производили вырезку фрагментов ткани новообразования размером 1×0,5×0,5 см. Материал фиксировали в 10-12% растворе рН-нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили верификацию диагноза, гистологический тип опухоли молочной железы устанавливали согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012 г.). Среди гистологических типов рака молочной железы в исследование были включены инвазивная карцинома неспецифического типа, инвазивный дольковый рак, медуллярный рак, а также другие редкие типы опухоли.
3
Для молекулярно-генетических исследований были использованы биопсийные образцы опухолевой ткани (~10 мм), которые были взяты у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ). Образцы ткани опухоли помещали в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре 80°С (после 24-часовой инкубации при температуре +4°С) для дальнейшего выделения РНК и ДНК.
260
280
260
230
РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяли с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составляла от 80 до 250 нг/мкл, А/А = 1,95-2,05; А/А = 1,90-2,31. Целостность РНК оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). RIN составил 5,6-7,8. С полученной РНК осуществляли синтез ДНК. Уровень экспрессии гена белка YKL-39 оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia) с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5’-aacaacaaggttatcatcaaggac-3’, AntiSense 5’-tttgggattcttggttttgag-3’, Probe FAM-5’-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3’-BHQ1. С полученной ДНК проводили ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39. Относительная экспрессия гена белка YKL-39 оценивалась с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора использовали нормальную ткань молочной железы, взятую от 10 пациенток, у которых при морфологическом исследовании материала каких-либо патологических изменений обнаружено не было. Исследование уровня экспрессии гена белка YKL-39 в данных образцах нормальной ткани молочной железы было проведено аналогичным вышеописанному способом. При этом уровень экспрессии гена белка YKL-39 в образцах нормальной ткани молочной железы составил 1.
Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью пакета программ «STATISTICA 8.0» (StatSoft Inc., США) с применением метода Каплан-Майера, критерия Фишера. Сравнение достоверности различий между группами производили с помощью log-rank теста.
Таким образом, при исследовании частоты встречаемости гематогенных метастазов у пациенток, больных раком молочной железы, в зависимости от уровня экспрессии гена белка YKL-39 в опухолевой ткани были получены следующие результаты. Исследование показало, что наибольшая частота развития, а соответственно, более высокий риск возникновения рецидива гематогенных метастазов (более короткий период безрецидивной выживаемости) у пациенток с раком молочной железы сопряжены с низким уровнем экспрессии гена белка YKL-39 (уровень экспрессии YKL-39<1) в ткани новообразования (р=0,0025) (табл. 1).
Таблица 1. Связь гематогенного метастазирования с уровнем экспрессии гена белка YKL-39 у пациенток, больных раком молочной железы
Для оценки значимости показателя экспрессии гена белка YKL-39 как прогностического маркера высокого риска рецидива и вероятности развития гематогенных метастазов определяли значение отношения шансов (ОR), доверительный интервал, отношения рисков (RR) [15].
Достоинством предлагаемого нами способа прогнозирования является использование маркера, секретируемого макрофагами (YKL-39), который способен осуществлять как внеклеточную регуляцию, в том числе в отношении опухолевых клеток, так и регулировать функции самих макрофагов. Кроме того, данный способ прогнозирования можно применять у пациенток, больных раком молочной железы, с любым гистологическим типом и рецепторным статусом).
Источники информации
1. Page D.L. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favourable prognostic types / D.L. Page // Am. J. Surg. Pathol. – 1991. – Vol. 15. – P. 334–349.
2. Телегина Н.С. Связь гематогенной диссеминации с лимфогенным метастазированием при различных молекулярно-генетических вариантах рака молочной железы / Н.С. Телегина, О.Д. Брагина, К.Ю. Христенко, М.В. Завьялова, С.В. Вторушин, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, Е.В. Денисов, Н.В. Чердынцева // Бюллетень сибирской медицины. – 2013. – Том 12, №6. – С. 62-66.
3. Осинский С.П. Микроокружение опухолевых клеток и опухолевая прогрессия. Факторы стромального микроокружения / С.П. Осинский // Онкология. Здоровье Украины. - Червень. - 2013. – Тематический номер. – С. 36-39.
4. Sleeman J.P. Concept of metastasis in flux: the stromal progression model / J.P. Sleeman, G. Christofori, R. Fodde [et al.] // Seminar in Cancer Biology. – 2012. – Vol. 22. – P. 174-186.
Smith5.  H.A. The metastasis-promoting roles of tumor-associated immune cells / H. A. Smith, Y. Kang // J. Mol. Med. (Berl). – 2013. – Vol. 91(4). - P. 411–429.
6. Quail D.F. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis / D.F. Quail, J.A. Joyce // Nat. Med. – 2013. – Vol. 19(11). – P. 1423-1437.
Mao7.  Y. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer / Y. Mao, E.T. Keller, D.H. Garfield et al. // Cancer Metastasis Rev. – 2013. – Vol. 32(1-2). – P. 303-315.
8. Kerkar S. P. Cellular Constituents of Immune Escape within the Tumor Microenvironment / S.P. Kerkar, N.P. Restifo // Cancer Research Reviews. – 2012. – Vol. 72(13). – P. 3125-3130.
9. Finger E.C. Hypoxia, inflammation, and the tumor microenvironment in metastatic disease / E.C. Finger, A.J. Giaccia // Cancer metastasis reviews. – 2010. – Vol. 29. - P. 285–293.
10. Galli S.J. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils / S.J. Galli, N. Borregaard, T.A. Wynn // Nature immunology. – 2011. – Vol. 12. – P. 1035-1044.
11. Areshkov P.A., Kavsan V.M. Chitinase 3-like protein 2 (CHI3L2, YKL-39) activates phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases ERK1/ERK2 in human embryonic kidney (hek293) and human glioblastoma (U87 MG) cells // Цитология и генетика. – 2010. – Vol. 44, No 1. – С. 3-9.
12. Cobleigh M.A. Gene expression markers for breast cancer prognosis / Cobleigh M.A., S. Shak, J.B. Baker, M.T. Cronin // Patent Application Publication. Pub. No: US 2011/0312532 A1. Pub. Date: Dec. 22, 2011.
13. Litviakov N.V. Changing the expression vector of multidrug  resistance genes is related to neoadjuvant chemotherapy response / Litviakov N.V. et al. // Cancer Chemotherapy and Pharmacology. – 2013. – Vol.71, N. 1. – P. 153-163.
14. Holness C.L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins / Holness C.L., Simmons D.L. // Blood. – 1993. – Vol. 81, N. 6. – P.1607–13.
15. Реброва О.Ю.  Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / О.Ю. Реброва // Медиа Сфера. – Москва. – 2006. – 312 с.