БИС(5-АМИНО-1,4-ДИОКСО-1,2,3,4-ТЕТРАГИДРОФТАЛАЗИН-2-ИЛ)ЦИНК, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ, ЛЕЧЕБНЫЕ СРЕДСТВА НА ЕГО ОСНОВЕ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГАСТРИТА
BIS(5-AMINO-1,4-DIOXO-1,2,3,4-TETRAHYDROPHTHALAZIN-2-YL)ZINC, METHOD FOR PRODUCING IT, BASED PHARMACEUTICAL COMPOSITION, BASED THERAPEUTIC AGENTS, METHOD OF TREATING SKIN DISEASES AND METHOD OF TREATING GASTRITIS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к медицине, в частности, но, не ограничиваясь, к соединениям, обладающим ранозаживляющей и/или репарационной активностью.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Из описания к патентам на изобретение РФ №№2155043, 2222327, 2302863, 2169139, 2439063 известны способы получения солей люминола с щелочными и щелочноземельными металлами и соли люминола с щелочными и щелочноземельными металлами, полученные этими способами.
Из других источников известно большое количество способов получения координационных соединений с цинком, в которых лиганд отличается от люминола и соединения, полученные такими способами.
В частности, из описания к опубликованной заявке США №2012/00116082 известен способ получения цинковой соли лекарственного препарата розувастатина (Е)-7-[4-(4-фторфенил)-6-изопропил-2-[метил(метилсульфонил)амино]пиримидин-5-ил](3R,5S)-3,5-дигидроксигепт-6-еновой кислоты, включающий взаимодействие трет-бутиламмониевой соли розувастатина с двухвалентным катионом, предпочтительно с ионом кальция или цинка, в смеси воды и не смешивающегося с водой или слабо смешивающегося с водой органического растворителя и выделения полученных солей в чистом виде.
Из описания международной заявки, опубликованной под номером WO 2010/053233, известен способ получения цинковой соли 4'-[2-н-пропил-4-метил-6-(1-метилбензимидазол-2- ил)бензимидазол-1-илметил]бифенил-2-карбоновой кислоты (телмисартана), включающий взаимодействие телмисартана с соединением цинка (гидроксида, ацетата, хлорида, бромида или иодида) в присутствии органического растворителя, выбранного: из группы низших спиртов, таких, как метанол, этанол, изопропанол, бутанол; из группы эфиров, таких, как 1,4-диоксан, тетрагидрофуран; из группы эфиров, таких, как диэтиловый эфир, изопропиловый эфир; из группы амидов, таких, как диметилфорамид, диэтилацетамид; из группы кетонов, таких, как ацетон, метил этил кетон; из группы галогенпроизводных углеводородов, таких, как хлороформ и метиленхлорид; из группы низших углеводородов, таких, как гексан, гептан, октан; из диметилсульфоксида, воды и любой их смеси.
Из описания к патенту РФ №2281952 известен способ получения фталоцианина цинка высокой степени чистоты, который может быть использован в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии, в соответствии с которым осуществляют взаимодействием фталонитрила с солью цинка при нагревании в присутствии третичного амина N,N-диалкиланилина, N,N-диалкилэтаноламина или триалкиламина в среде апротонного биполярного растворителя, например, диметилформамида.
Однако до настоящего времени не были известны способы получения координационных соединений цинка и люминола, не исследовалась их биологическая активность и возможность приготовления на их основе стабильных фармацевтических композиций.
При этом из уровня техники известны препараты на основе люминолатов щелочных или щелочноземельных металлов. Также из предшествующего уровня техники известны лекарственные препараты, содержащие цинковые соли органических и неорганических кислот, используемые для лечения широкого спектра заболеваний человека и животных, например: дерматиты, угревая сыпь, аллопеция, анорексия, артрит, диарея, вирусные и грибковые заболевания, рак, расстройства иммунной системы, сердечно-сосудистые заболевания, диабет, малярия и многие другие болезни.
В частности, из патента РФ на изобретение №2277419 известен водный препарат для местного применения при лечении дерматозов, включающий клиндамицинфосфат и растворимую в воде соль цинка (подходят соли органических и неорганических кислот) в молярном соотношении от 1,2:1 до 1:2. Известный препарат в форме геля может применяться при местном лечении вульгарных и розовых угрей, сохраняя очень низкий системный уровень клиндамицина. Предпочтительно используют кислоты с небольшим, легко диссоциируемым анионом, таким как ацетат, пропионат или насыщенный пируват, причем предпочтительны низшие алкановые кислоты и их гидратированные формы, особенно ацетат цинка и, в частности, дигидрат ацетата цинка.
Лекарственные средства на основе вышеуказанных солей или их смесей известны из патентов РФ на изобретения №№2266118, 2266119, 2302863, 2245138, 2163122, 2238730 и 2211036, а также из опубликованной заявки США №2011/0275642, патента США №5512573 и 5543410 и международной публикации WO 2011/107295.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Термины и выражения, используемые в настоящем тексте, имеют следующие значения.
EGF - эпидермальный ростовой фактор.
FGFb - фактор роста фибробластов.
HMGB-1 - ядерный белок.
IL-10 - интерлейкин-10.
IL-6 - интерлейкин-6.
IL-8 - интерлейкин-8.
RT-PCR - полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени.
TGF-B1 - трансформирующий ростовой фактор.
TNF - фактор некроза опухолей.
VEGF - фактор роста эндотелия сосудов.
ДМСО - диметилсульфоксид.
ДМФА - диметилформамид.
ИК - инфракрасный.
ЛН - люминолат натрия, Na-люминол.
ЛН-АЦ - смесь люминолата натрия и ацетата цинка, Na-люминола+Zn-Ас.
ЛПС - липополисахарид.
2
ЛЦ (альтернативно - ZnL) - люминолат цинка (II), Zn-люминол, цинковая соль люминола.
ЛЦД - люминолата цинка (II) дигидрат.
МНК - мононуклеарные клетки крови.
РСА - рентгеноструктурный анализ.
ТНБСК - 2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота.
ЭД - эпидермальный.
ЯМР - ядерный магнитный резонанс (ЯМР-спектроскопия).
«Соединение» означает химическое вещество, которое включает молекулы одной и той же химической структуры.
«Действующее вещество» означает ЛЦ, а во множественном числе - комбинацию ЛЦ и других веществ, обладающих самостоятельной биологической активностью, или как-либо влияющих на биологическую активность ЛЦ.
«Фармацевтическая композиция» означает комбинацию действующего(-их) веществ(а) и вспомогательных веществ, соответствующую способу ее введения и в организм человека или животного или способу ее применения и, эффективное количество которой обеспечивает достижение необходимого лечебного эффекта. Фармацевтическая композиция может применяться непосредственно для достижения лечебного эффекта или опосредованно - для производства готовой лекарственной формы.
«Готовая лекарственная форма» означает фармацевтическую композицию в форме, подготовленной для непосредственного применения, в частности, дозированную лекарственную форму.
«Вспомогательные вещества» - вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления фармацевтических композиций или готовых лекарственных форм для придания им необходимых физико-химических свойств.
«Лекарственное средство» означает фармацевтическую композицию или готовую лекарственную форму, которые, вступая в контакт с организмом человека или животного, обеспечивают проникновение действующего(-их) веществ(а) в органы, ткани организма человека или животного с целью профилактики, диагностики, лечения заболевания, реабилитации.
«Фармацевтически приемлемый» указывает на пригодность чего-либо для приготовления фармацевтической композиции, отсутствие токсичности при обычном применении, приемлемость для применения в ветеринарии и/или фармацевтике.
«Терапевтически эффективное количество» означает количество действующего(-их) веществ(а), которое при введении для лечения или предупреждения заболевания достаточно для такого лечения или предупреждения заболевания. «Терапевтически эффективное количество» будет меняться в зависимости от действующего(-их) веществ(а), заболевания и его тяжести и возраста, массы и т.п. характеристик подвергающегося лечению пациента.
Термин «аморфный» означает материал, который практически не содержит кристаллические примеси.
В тех случаях, когда в настоящем тексте говорится о лечении какого-либо заболевания, имеется в виду, что лечение включает в себя, в том числе, профилактику, облегчение симптомов или предупреждение данного заболевания.
В тех случаях, когда в настоящем тексте говорится о применении лекарственного средства, готовой лекарственной формы, фармацевтической композиции или вещества для лечения какого-либо заболевания, имеется в виду, что применение включает в себя непосредственное применение по указанному назначению или предложение лекарственного средства, готовой лекарственной формы, фармацевтической композиции или вещества к применению по определенному назначению.
Остальные термины и выражения употребляются в обычном смысле, известном специалисту в данной области техники.
Задача настоящего изобретения состоит в расширении ассортимента биологически активных веществ, содержащих цинк (II) и/или люминол, в создании способов получения данных веществ, в получения лекарственных средств и готовых лекарственных форм на их основе, в разработке способов лечения заболеваний с их помощью, в отыскании новых областей терапевтического применения данных веществ.
В основу настоящего изобретения положено обнаружение у ЛЦ и ЛЦД нового свойства, а именно способности активизировать регенеративные процессы в тканях кожи и других тканях, причем эта способность превосходит ожидаемый суммарный эффект от действия того же количества цинка (II) и люминола в соотношении (1:2).
Процесс регенерации кожной ткани после травм или ожоговых поражений является одним из самых сложных биологических процессов, которые происходят в организме животных и человека. Поражение кожного покрова влечет за собой активацию множества факторов, участвующих в процессе регенерации ткани, а также выработку большого количества различных цитокинов. При этом, регенерация ран может заканчиваться образованием на месте поражения рубцовой ткани. Таким образом, было бы желательно, если бы ранозаживляющая терапия не только интенсифицировала регенеративные процессы в ране, но и обеспечивала бы минимальный риск образования рубцовой ткани.
Важными факторами, участвующими в процессе регенерации являются фактор роста фибробластов (FGFb), эпидермальный ростовой фактор (EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и трансформирующий ростовой фактор (TGF-B1). Кроме того, важна экспрессия таких медиаторов воспаления, как интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-8 (IL-8), фактор некроза опухолей (TNF) и ядерный белок HMGB-1, а также противовоспалительный цитокин (интерлейкин-10). Основной фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелия сосудов и эпидермальный ростовой фактор играют ключевую роль в регенерации тканей. В частности, VEGF участвует в процессе ангиогенеза, влияя на процесс развития и восстановления кровеносных сосудов. Мощным стимулятором ангиогенеза является FGFb, который также участвует в регенерации соединительной ткани и способствует формированию грануляционной ткани [5]. Фактор EGF участвует в регенерации эпителия, стимулируя рост кератиноцитов [12].
Важными медиаторами воспаления являются интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-8 (IL-8), фактор некроза опухолей (TNF) и HMGB-1. Известно, что IL-6 обладает системным действием, в частности усиливает синтез белков острой фазы в печени [13]. TNF отвечает за локальные проявления воспаления, в частности вызывает активацию эндотелия, что приводит к местным изменениям гемодинамики, экстравазации лейкоцитов и компонентов плазмы в очаге воспаления. Оба цитокина активируют различные типы лейкоцитов, участвующих в воспалении, в частности дендритные клетки, макрофаги, Т- и В-клетки [1, 11, 17]. Гиперпродукция TNF может вести к развитию септического шока как крайнего проявления воспалительного ответа [3]. IL-8 является хемоаттрактантом и участвует в привлечении различных типов лейкоцитов, в частности нейтрофилов, в очаг воспаления [24]. Индукция синтеза TNF, IL-6, IL-8 является частью защитной реакции врожденной иммунной системы, направленной на элиминацию патогена. Выработка указанных цитокинов происходит обычно на ранних этапах воспаления. Ключевым противовоспалительным цитокином является интерлейкин-10 (IL-10), который подавляет активацию клеток иммунной системы, вызванную провоспалительными медиаторами [5].
Одним из регуляторов процесса регенерации является HMGB-1 - негистоновый ядерный белок, который секретируется лейкоцитами при провоспалительной стимуляции [16]. В отличие от TNF и IL-6, которые секретируются практически немедленно, HMGB-1 вырабатывается в относительно поздние сроки и отвечает за поддержание воспалительной реакции. При этом HMGB-1 нарушает синтез коллагена, предотвращая образование рубцовой ткани.
Таким образом, терапевтическая эффективность и результаты применения ранозаживляющих средств будут во многом определяться тем, как именно они влияют на экспрессию генов цитокинов, вовлеченных в патогенез раневого воспаления. Как показало изучение регенерирующих свойств препаратов ЛЦ на экспериментальных моделях характер изменения экспрессии генов цитокинов в очаге раневого воспаления свидетельствует о влиянии препаратов ЛЦ на этиопатогенез заболеваний, связанных с повреждением кожи или слизистых покровов различного происхождения, в том числе, воспалительного, аллергического, травматического поражения, связанного с лучевыми, химическими или термическими ожогами, вирусными заболеваниями, трофическими поражениями и др.
Технический результат состоит в том, что введение ЛЦ в контакт с организмом человека или животного влияет на выработку цитокинов и других белковых факторов таким образом, что обеспечивается облегчение или устранение негативных последствий повреждения кожных и слизистых покровов, которое превосходит суммарный эффект от действия цинка (II) (в составе известной соли, например) и люминола в соотношении (1:2), взятых в том же количестве.
Вышеуказанная задача решена, в частности, благодаря синтезу и выделению соединения, представляющего собой бис(5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-2-ил)цинк (I) (ЛЦ) (первый аспект изобретения), описываемый следующей структурной формулой:
В одной из предпочтительных форм воплощения первого аспекта изобретения, ЛЦ представляет собой дигидрат соединения (I).
В еще одной предпочтительной форме воплощения первого аспекта изобретения ЛЦ представляет собой твердое аморфное вещество в виде порошка белого цвета с серым оттенком.
В альтернативной форме воплощения первого аспекта изобретения ЛЦ представляет собой кристаллическое вещество.
В одной из особенно предпочтительных форм воплощения первого аспекта изобретения ЛЦ предлагается в качестве средства для лечения заболеваний кожи.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм ЛЦ для изготовления фармацевтической композиции для лечения заболеваний кожи.
В предпочтительном варианте применения упомянутая композиция предназначена для местного применения.
В еще одном предпочтительном варианте применения упомянутая композиция предназначена для ректального введения.
В другом предпочтительном варианте применения упомянутая композиция предназначена для вагинального введения.
В предпочтительном варианте применения упомянутая композиция предназначена для перорального введения.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения травматического поражения кожи.
В одной из предпочтительных форм применения упомянутое травматическое поражение кожи представляет собой глубокие раны, поверхностные раны и/или царапины.
В еще одной предпочтительной форме применения упомянутое лечение осуществляется посредством стимуляции регенерации и за счет противовоспалительного действия.
В четвертом аспекте изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения раневой инфекции кожи.
В одной из предпочтительных форм применения упомянутое лечение осуществляется посредством стимуляции регенерации.
В еще одной предпочтительной форме применения предлагается использовать вышеописанные формы ЛЦ для лечения термического ожога или химического ожога кожи.
В еще более предпочтительной форме применения, упомянутое лечение осуществляется посредством стимуляции регенерации.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм ЛЦ для лечения солнечного ожога кожных покровов.
В предпочтительной форме применения предлагается использовать ЛЦ для лечения воспалительных заболеваний кожи.
В еще более предпочтительной форме применения упомянутое воспалительное заболевание кожи представляет собой воспаление аллергического генеза, иммунологического генеза и/или идиопатическое воспаление.
В даже еще более предпочтительной форме применения упомянутое воспаление представляет собой дерматоз.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения акне.
В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения аллопеции.
В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения трофического поражения кожи.
В предпочтительной форме применения упомянутое трофическое поражение кожи связано с варикозной болезнью нижних конечностей или диабетической ангиопатией.
В девятом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения болезней губ, а именно трещин и/или спаек (заедов).
В десятом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения трещин сосков.
В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения геморроя или трещин заднего прохода.
В двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для местного лечения смешанных и/или неспецифических вагинитов и вульвовагинитов.
В тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения герпетических высыпаний.
В предпочтительной форме применения упомянутые герпетические высыпания представляют собой Herpes labialis, герпетические высыпания на слизи полости носа, генитальный герпес и/или опоясывающий герпес (Herpeszoster).
В четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения для лечения острого и хронического гастрита per os.
В пятнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных форм соединения в качестве антиагреганта per os.
В шестнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для изготовления готовой лекарственной формы, включающей вышеописанное соединение и/или его формы, а также вспомогательные вещества в эффективном соотношении.
В одной из предпочтительных форм композиции, она содержит в себе вышеописанное соединение и/или его форму в количестве 0,05÷5 масс.%, предпочтительно, в количестве 0,8÷0,125 масс.%, особенно предпочтительно в количестве, примерно, 0,1 масс.%.
В еще одной предпочтительной форме композиции, она предназначена для изготовления готовой лекарственной формы для местного применения.
В другой предпочтительной форме композиции, она дополнительно включает в себя хлоргексидин.
В одной из предпочтительных форм композиции, она дополнительно включает в себя нестероидный противовоспалительный агент.
В еще одной предпочтительной форме композиции, она дополнительно включает в себя стероидный противовоспалительный агент.
В другой предпочтительной форме композиции, упомянутая готовая лекарственная форма представляет собой гель, пену, мазь или крем.
В одной из предпочтительных форм композиции, упомянутые вспомогательные вещества выбраны из карбомера и пропиленгликоля и, необязательно, включают в себя, полиэтиленоксид, метилпарагидроксибензоат, глицерин и/или низший спирт.
В еще одной предпочтительной форме композиции, упомянутая готовая лекарственная форма представляет собой присыпку.
В другой предпочтительной форме композиции, упомянутая готовая лекарственная форма представляет собой фармацевтический пластырь.
В одной из предпочтительных форм композиции, упомянутая готовая лекарственная форма представляет собой фармацевтический карандаш.
В еще оной предпочтительной форме композиции, она предназначена для изготовления упомянутой готовой лекарственной формы для применения per os.
В другой предпочтительной форме композиции, упомянутая готовая лекарственная форма представляет собой гранулы, таблетки, пилюли, драже, пастилки, сироп, микстуру и/или капсулы.
Упомянутая готовая лекарственная форма композиции или любой ее предпочтительной формы может быть предназначена для лечения заболеваний кожи.
В одной из предпочтительных форм композиции, упомянутая готовая лекарственная форма предназначена для ректального введения.
В еще одной предпочтительной форме композиции, упомянутая готовая лекарственная форма представляет собой суппозиторий.
В даже еще более предпочтительной форме композиции, упомянутая готовая лекарственная форма предназначена для лечения анальных трещин и/или геморроя.
В семнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения бис(5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-2-ил)цинка, включающему в себя следующие стадии:
(i) готовят раствор 5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-2-ила щелочного металла,
(ii) к раствору, полученному на стадии (i), добавляют водорастворимую фармацевтически приемлемую соль цинка (II) и позволяют смеси прореагировать,
(iii) осадок отфильтровывают.
В предпочтительном варианте осуществления упомянутый раствор 5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-2-ила щелочного металла готовят прибавлением гидроксида щелочного металла или его водного раствора к суспензии 5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазина в воде и перемешивают до практически полного растворения, полученный раствор фильтруют, при наличии твердых примесей.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления в качестве упомянутого гидроксида щелочного металла используют гидроксид натрия и/или калия.
В другом предпочтительном варианте осуществления позволяют упомянутой смеси прореагировать в течение 0,5÷24 часов.
В предпочтительном варианте осуществления после осуществления стадии (iii) упомянутый осадок промывают.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления упомянутый осадок промывают водой, этанолом и/или изопропанолом.
В предпочтительном варианте осуществления упомянутый осадок сушат.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления дополнительно осуществляют перекристаллизацию упомянутого осадка в фармацевтически приемлемом полярном апротонном растворителе.
Упомянутый фармацевтически приемлемый полярный апротонный растворитель может представлять собой (не ограничиваясь приведенными вариантами) диметилформамид и/или диметилсульфоксид.
В предпочтительном варианте осуществления упомянутая фармацевтически приемлемая соль цинка (II) представляет собой ацетат цинка (II).
В восемнадцатом аспекте изобретение относится к способу лечения кожного заболевания, предусматривающий введение эффективного количества вышеописанного соединения или его формы нуждающемуся в этом индивидууму.
В частной форме осуществления вышеупомянутого способа соединение вводят в составе одной из описанных выше композиций.
В девятнадцатом аспекте изобретение относится к способу лечения острого и хронического гастрита, предусматривающему введение эффективного количества вышеописанного соединения, нуждающемуся в этом человеку или животному per os.
В частной форме осуществления вышеупомянутого способа соединение вводят в виде одной из вышеописанных композиций, пригодных для введения per os.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг.1 - независимая часть элементарной ячейки безводного кристаллического ЛЦ.
Фиг.2 - схема, поясняющая строение координационного полимера безводного ЛЦ.
Фиг.3 - итоговая структура координационного полимера безводного ЛЦ.
Фиг.4 - ЯМР-спектр ЛЦ.
Фиг.5 - описание групп экспериментальных животных с моделью кожного ожога.
Фиг.6 - описание групп экспериментальных животных с иссечением кожного покрова.
Фиг.7 - критерии терапевтической эффективности.
Фиг.8 - индукция выработки провоспалительных цитокинов под влиянием ЛЦ, ЛН и ЛН-АЦ.
Фиг.9 - модуляция ЛПС-стимулированной выработки провоспалительных цитокинов под влиянием ЛЦ, ЛН и ЛН-АЦ.
Фиг.10 - индукция выработки IL-10 и EGF под влиянием ЛЦ, ЛН и ЛН-АЦ.
Фиг.11 - модуляция ЛПС-стимулированной выработки IL-10 и EGF под влиянием ЛЦ, ЛН и ЛН-АЦ.
Фиг.12 - степень поражения кожного покрова до и после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами
Фиг.13 - степень остаточного поражения кожного покрова (%).
Фиг.14 - оценка степени заживления кожного покрова мышей по патоморфологическим изменениям после лечения ожогового поражения.
Фиг.15 - концентрация мРНК VEGF в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы «интактные», ** - достоверно отличается от группы «самозаживления». Группа «Гель 1» достоверно отличается от всех групп.
Фиг.16 - количество копий мРНК FGFb в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы самозаживления ** - достоверно отличается от группы «Гель 2».
Фиг.17 - количество копий мРНК TGF-β1 в кожной ткани мышей. * - достоверно отличается от группы «интактные». Группа «Гель 1» достоверно отличается от группы «самозаживление», «Гель 2» и «интактные».
Фиг.18 - количество копий мРНК EGF в кожной ткани мышей. * - достоверно отличается от группы «интактные».
Фиг.19 - количество копий мРНК HMGB1 в кожной ткани мышей. Группы «Гель 1» и «интактные» достоверно отличаются друг от друга и от всех остальных групп.
Фиг.20 - количество копий мРНК IL-6 в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы «интактные» и группы «самозаживления». Группа «Гель 1» достоверно отличается от всех групп, кроме «Бепантен плюс». Группа «Бепантен плюс» достоверно отличается от всех групп, кроме «Гель 1» и «Гель 2».
Фиг.21 - степень остаточного поражения кожного покрова (%).
Фиг.22 - концентрация мРНК VEGF в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы «самозаживление». Все группы достоверно отличаются от группы «интактные». Группа «Гель 1» достоверно отличается от всех групп, кроме «Цинковая мазь».
Фиг.23 - количество копий мРНК FGFb в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы «самозаживление», x - Достоверно отличается от группы «интактные».
Фиг.24 - количество копий мРНК TGF-B1 в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы «самозаживление», x - достоверно отличается от групп «Гель 1», «Гель 2», «Цинковая мазь». Все группы достоверно отличаются от группы «интактные».
Фиг.25 - количество копий мРНК EGF в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы «самозаживление». Группа «интактные» достоверно отличается от всех групп, кроме группы «самозаживление».
Фиг.26 - количество копий мРНК HMGB1 в кожной ткани мышей. * - Достоверно отличается от группы «самозаживление». Все группы достоверно отличаются от группы «интактные».
Фиг.27 - количество копий мРНК IL-6 в кожной ткани мышей, x - Достоверно отличается от группы «интактные». # - достоверно отличается от группы «Гель 2».
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРИМЕР 1
Схема синтеза ЛЦ (3).
Синтез ЛЦ (3) проводят в 1 стадию без выделения натриевой соли люминола по следующей схеме.
К суспензии люминола (1) в воде прибавляют эквимолярное количество NaOH, растворенного в воде и перемешивают до полного растворения. При наличии твердых примесей раствор фильтруют. К полученному раствору (фильтрату) натриевой соли люминола (2) прибавляют раствор ацетата цинка (II) в воде в соотношении 2:1.
Синтез препаративного количества ЛЦ (3)
К суспензии 100 г (0,5645 моль) люминола (1) в 700 мл воды прибавляют при перемешивании раствор 22,58 г (0,5645 моль) NaOH в 100 мл воды. Реакционную смесь перемешивают до растворения люминола. При наличии нерастворившихся твердых примесей полученный раствор фильтруют. Полученный раствор (фильтрат) нагревают до 50÷60°C и при перемешивании прибавляют раствор 63,8 г (0,2823 моль) дигидрата ацетата цинка (II) (97%) в 200 мл воды. Продолжают перемешивание до прекращения осадкообразования 25÷30 мин. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, а затем отфильтровывают рыхлый осадок на фильтре Шотта, тщательно отжимая. Промывают дважды водой (по 50 мл) и один раз 50 мл 50% об./об. водным раствором этанола. Полученный осадок выгружают, разрыхляют и сушат при температуре 50÷60°C до постоянного веса.
Получают 126,64 г (98,88%) дигидрата соединения (3) в виде порошка с серым оттенком. Вещество обладает высокой температурой плавления, малорастворимо как в полярных (вода, метиловый спирт, ацетонитрил), так и в неполярных растворителях.
В связи с плохой растворимостью (и летучестью) не удавалось получить массспектры с химической ионизацией и электронным ударом.
Состав вещества определяют посредством элементного анализа (данные приводятся ниже).
Брутто-формула
С
Н
N
Zn
MW
Найдено, %
42.45
3.84
18.32
14.30
Вычислено, %: Zn(Lummmol)<sub>2</sub>′
C<sub>16</sub>H<sub>12</sub>N<sub>6</sub>O<sub>4</sub>Zn
46.01
2.90
20.12
15.66
417.71
Вычислено, %: Zn(Lumminol)<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
C<sub>16</sub>H<sub>16</sub>N<sub>6</sub>O<sub>6</sub>Zn
42.36
3.55
18.52
14.41
453.71
Структуру соединения устанавливали посредством РСА, ЯМР и ИК-спектроскопии и данных элементного анализа (в следующих примерах).
ПРИМЕР 2
Приготовление кристаллической формы ЛЦ
Кристаллы ЛЦ получают различными способами:
(1) посредством медленной кристаллизации из разбавленных растворов воды, ДМСО, ДМФА, а также
(2) посредством реакции ацетата цинка и натриевой соли люминола в разбавленных растворах воды и ДМСО.
Кристаллическая форма ЛЦ, полученная из водных растворов способом (1) после сушки в умеренных условиях содержит до двух молекул кристаллизационной воды.
Наилучший результат получен способом (2) - блестящий мелкий твердый осадок, не содержащий ни молекул воды, ни молекул ДМСО.
Указанный порошок анализировали посредством РСА, ЯМР и ИК-спектроскопии в ПРИМЕРЕ 4.
Данные ЯМР и ИК-спектроскопии для кристаллических форм ЛЦ, полученных из водной и неводной среды, практически не отличались.
ПРИМЕР 3
Установление строения кристаллической формы ЛЦ методами РСА, ЯМР-спектроскопии и ИК-спектроскопии
Решение из данных порошковой рентгеновской дифракции и уточнение методом Ритвельда показало, что образец ЛЦ представляет собой бис(5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-2-ил)цинк.
На фиг.1 показана независимая часть элементарной ячейки безводного ЛЦ; атомы представлены сферами, отвечающими изотропным тепловым параметрам (p=50%); дополнительная координационная связь Znl-O1B обозначена пунктиром.
Соединение ЛЦ представляет собой координационный полимер, в котором один лиганд выступает в качестве мостикового, образуя три связи с различными атомами цинка, а второй лиганд координируется двумя атомами амидной группы на один атом цинка (Рисунок 2). Полимерные цепи связаны между собой за счет водородных связей N3B-H…02B(N…0 2,760(11)Å, N-H…O 169°). На фиг.2 представлена схема, поясняющая строение координационного полимера (подписаны только атомы, участвующие в координации, операции симметрии обозначены верхними индексами: #1 [+X,-1+Y,+Z], #2 [1/2-X,3/2-Y,-Z], #3 [1/2-X,5/2-Y,-Z]).
Итоговая структура координационного полимера показана на фиг.3.
Координационный полиэдр цинка представляет собой искаженный тетраэдр, искажение в котором обусловлено дополнительной координацией с амидным атомом кислорода Znl-O1B (Таблица 1). Искаженный координационный полиэдр дополнительно стабилизируется водородной связью 01B…H-N3 (O…N 2,803(10) A, O…H-N 140,7° (фиг.1).
Таблица 1
Длины связей и валентные углы в координационном полиэдре цинка
Длина, Å
Угол, °
Znl
O1B
2.682(7)
O1B
Znl
N2
83.0(3)
Znl
N2
2.028(6)
O1B
Znl
N2B
53.9(3)
Znl
N2B
2.082(7)
O1B
Znl
N9<sup>1</sup>
87.5(4)
Znl
N9<sup>1</sup>
2.096(17)
O1<sup>2</sup>
Znl
O1B
147.1(4)
Znl
O1<sup>2</sup>
2.000(11)
N2
Znl
N2B
108.3(4)
N2
Znl
N9<sup>1</sup>
98.2(5)
O1<sup>2</sup>
Znl
N2
121.0(4)
N2B
Znl
N9<sup>1</sup>
128.0(4)
O1<sup>2</sup>
Znl
N2B
94.9(4)
O1<sup>2</sup>
Znl
N9<sup>1</sup>
108.7(4)
<sup>1</sup>+X, -1+Y, +Z; <sup>2</sup>1/2-X, 3/2-Y, -Z;
1
Съемку образца проводили на порошковом рентгеновском дифрактометре Bruker D8 Advance Vario, оснащенном Ge(lll) монохроматором и позиционно-чувствительным детектором LynxEye. Длина волны 1,540596 Å (Cu Кα, шаг съемки 0,01048° 2θ), съемку проводят в угловом диапазоне 5-80° 2θ, образец помещают между пленками каптона для минимизации преимущественной ориентации.
1
3
3
3
2
При индицировании порошковой дифрактограммы образца 2 в программе TOPAS были получены пространственная группа (С2/с) и параметры элементарной ячейки, которые были далее уточнены методом Паули (а=27,3375(4), b=7,78210(11), с=18,2752(3)Å, β=129.7558(7)°, V=2988.94(8)Å). Объем независимой части в 419Å, с учетом среднего значения объема неводородного атома в 18Å, указывал на присутствие одного независимого фрагмента ЛЦ (Z′=1) в элементарной ячейке. Положение лигандов и атома цинка установливают методом симуляции отжига (Parallel Tempering), реализованным в программе FOX. В результате первых 50 проходов уточнения методом Ритвельда было установлено положение атома цинка, поиск положения лигандов с зафиксированным атомом цинка привел к итоговой структурной модели. Уточнение проводят с ограничениями на значения длин связей и валентных углов в лигандах, координаты атома цинка уточнялись свободно, положения атомов водорода определяют из геометрических соображений и уточняют в модели наездника. В ходе уточнения относительный вес ограничений плавно снижают. В итоговой структуре среднеквадратичное отклонение длин связей от теоретических составляет 0,029 Å, разностная кривая не содержит значительных выбросов. Итоговые факторы расходимости приведены в Таблице 2.
Таблица 2
Факторы расходимости для уточнения параметров ячейки без структурной модели (метод Паули) и для уточнения структуры ZnL<sub>2</sub> методом Ритвельда
метод Паули
ZnL<sub>2</sub>
R<sub>wp</sub>
3.32
4.29
R<sub>wp</sub>′
6.08
7.85
R<sub>p</sub>
2.29
3.22
R<sub>p</sub>′
5.04
7.02
R<sub>bragg</sub>
0.13
1.26
χ<sup>2</sup>
3.41
4.14
3
4
Модель лиганда для решения структуры и ограничений при последующем уточнении была получена из квантовохимического расчета нейтральной молекулы в программе PRIRODA методом PBE/L2.
1
2
6
Данные ЯМР Н спектра ЛЦ (фиг.4) указывают на наличие ароматических протонов (д, 1Н, 6.86 м.д.; м, 1Н, 6.97 м. д; т, 1Н, 7.45 м.д.), NH протонов (6.8-7.6 м. д.) и протона NH (11.15 мд), большие величины сдвига NH2 протонов можно объяснить координацией амино-группы к атому цинка и водородной связью с атомом кислорода. Спектр снимали при нагревании образца в ДМСО d до 70°C до полного его растворения.
-1
2
-1
-1
ИК-спектр был получен на Фурье-ИК спектрометре (Bruker), прессовка с КВг. В ИК-спектре полученной цинковой соли присутствуют полосы поглощения: N-H групп в области 3500-3350 см, sp С-Н в области 3100-3000 см, С=0, C(0)NH групп в области 1600-1640 см, а также характерные полосы поглощения других функциональных групп ЛЦ.
Таким образом, в отличие от солей люминола с щелочными металлами (натриевая соль люминола представляет собой кристаллическую структуру соли, состоящей из катионов натрия координированных с молекулами воды и анионов люминола), в ЛЦ атом цинка связан с атомами азота люминола и координирован с атомами кислорода и атомом азота амино группы люминола, образуя «координационный» полимер, в котором один лиганд выступает в качестве мостикового, образуя три связи с различными атомами цинка, а второй лиганд координируется двумя атомами амидной группы на один атом цинка.
ПРИМЕР 4
Получение 0,1% раствора ЛЦ для определения билогической активности
Поскольку попытки приготовления 0,1% водного или водно-органического раствора ЛЦ при различных pH (использовали дважды дистиллированную деионизированную воду, водный раствор этанола и водный раствор ДМСО различной концентрации) оказались неуспешными (в течение 10÷30 мин выпадал осадок), для получения раствора используют чистый ДМСО. Для этого навеску 50 мг ЛЦ при комнатной температуре всыпают в 50 мл ДМСО и перемешивают 10÷15 мин. При наличии незначительных видимых нерастворимых примесей (ворсовые частички бумажного фильтра, ZnO) отфильтровывают через фильтр Шотта.
ПРИМЕР 5
Определение биологической активности
Биологическую активность ЛЦ определяют посредством сравнения с различными ранозаживляющими лекарственными средствами и противовоспалительными препаратами, стимулирующих экспрессию генов цитокинов, или вовлеченных в патогенез раневого воспаления.
Проводят исследования in vitro на мононуклеарных клетках крови здоровых доноров, и in vivo - на моделях ожогового и раневого воспаления у мышей.
Эффективность исследуемых препаратов оценивают по уровню экспрессии ряда цитокинов, участвующих в процессе регенерации раны. Определяют экспрессию таких медиаторов воспаления, как интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-8 (IL-8), фактор некроза опухолей (TNF) и ядерный белок HMGB-1, а также противовоспалительного цитокина (интерлейкина-10 [IL-10]).
Кроме того, изучают экспрессию фактора роста фибробластов (FGFb), эпидермального ростового фактора (EGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A) и трансформирующего ростового фактора (TGF-B1).
В качестве исследуемых препаратов в экспериментах in vitro используют ЛЦД (М=455 г/моль), люминолат натрия (М=200 г/моль) и диацетата цинка дигидрат (М=218 г/моль).
В качестве исследуемых лекарственных средств в экспериментах in vivo используют «Гель 1», содержащий ЛЦД 1%, «Гель 2», содержащий ЛЦД 1% и хлоргексидин-биглюконат 1%, а также препарат «Цинковая соль», представляющий собой ЛЦД.
В качестве контрольных лекарственных средств используют крем «Бепантен плюс» и «Цинковую мазь». Контролем естественной регенерации являлась группа мышей, которым на пораженный участок кожи не наносили никаких лекарственных средств (группа «самозаживление»). Отрицательным контролем являлась группа мышей без поражений кожного покрова (группа «интактные»).
Приготовление растворов препаратов для экспериментов in vitro
ЛЦД удалось растворить только в ДМСО в концентрации 5 мг/мл, что соответствует концентрации ЛЦ 4,6 мкг/мл. Полученный маточный раствор разводят на полной культуральной среде (ПКС) до концентраций 200, 20 и 2 мкг/мл по Zn-люминолу. Содержание ДМСО в этих растворах составляет 4%, 0,4% и 0,04% соответственно.
Люминолат натрия растворяют в стерильной воде в концентрации 10 мг/мл, после чего разводят на ПКС до 200 мкг/мл. В этот же раствор добавляют ДМСО до концентрации 4% (для корректного сравнения с ЛЦ). Затем приготовленный раствор разводят на ПКС до 20 и 2 мкг/мл по люминолату натрия.
При приготовлении смеси люминолата натрия с ацетатом цинка исходят из того, что массовое отношение люминола к цинку в ЛЦ составляет примерно 5,4:1. Поэтому раствор ЛЦ с концентрацией 200 мкг/мл содержит цинк в концентрации примерно 31 мкг/мл, а люминол - в концентрации 169 мкг/мл. Раствор люминолата натрия с концентрацией 200 мкг/мл содержит люминол в концентрации 177 мкг/мл (т.е. примерно столько же, сколько и раствор ЛЦ). Поэтому люминолат натрия разводят до 200 мкг/мл на ПКС и добавляют ДМСО до 4%, как описано выше, а затем к этому раствору добавляют раствор ацетата цинка до концентрации 31 мкг/мл по цинку. Затем этот раствор разводят на ПКС до 20 и 2 мкг/мл по люминолату натрия.
Поскольку растворы препаратов с концентрацией 200 и 20 мкг/мл содержат значительное количество ДМСО, то в качестве дополнительного контроля при исследовании продукции цитокинов используют ДМСО в таких же разведениях. Для концентрации 2 мкг/мл отдельный ДМСО-контроль не делают, т.к. концентрацией ДМСО в этом растворе (0,04%), вероятно, можно пренебречь.
Выделение и стимуляция мононуклеарных клеток крови для экспериментов in vitro
Венозную кровь получают от 4 здоровых доноров. МНК выделяли из крови путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографин (Панэко, Россия), трижды отмывают в среде 199 и ресуспендируют в полной культуральной среде (RPMI - 1640 с 2-мМ L-глутамином и 10% фетальной телячьей сывороткой, все Панэко). Клетки подсчитывают с трипановым синим, при этом их жизнеспособность превышает 95%. Клетки разводят на ПКС до 2 млн/мл и вносят в 96-луночные плоскодонные планшеты по 100 мкл (200 тыс) на лунку. Затем в лунки добавляют по 100 мкл растворов препаратов или ДМСО. Поскольку препараты и ДМСО разводятся при этом в 2 раза, то конечные концентрации препаратов составляют 100, 10 и 1 мкг/мл, ДМСО - 2%, 0,2% и 0,02%. В лунки отрицательного контроля вместо препаратов и ДМСО добавляют равный объем ПКС (для определения спонтанной продукции цитокинов).
2
Когда исследуют модулирующее влияние препаратов на ЛПС-стимулированную продукцию цитокинов, в лунки перед внесением препаратов или ПКС добавляют ЛПС E.coli O111:В4. Конечная концентрация ЛПС после внесения препаратов составляет 100 нг/мл. Планшеты инкубируют в CO-инкубаторе 24 ч, после чего собирают супернатант для анализа уровня цитокинов. Супернатант хранят при -70°C.
Анализ уровней цитокинов в экспериментах in vitro
Уровни всех цитокинов и ростовых факторов определяют посредством сэндвич-ИФА. Для определения TNF, IL-6, IL-8 и IL-10 используют наборы реагентов производства «Цитокин» (Россия), FGFb - R&D Systems (США), EGF - eBioscience (США), HMGB-1 - IBL (Германия). Во всех случаях следуют инструкции производителя набора.
Лабораторные животные и компоненты для моделирования воспалений кожного покрова
Моделирование раневого воспаления проводят с использованием самок мышей линии BALB/c весом 20÷25 г. из питомника ГУ НЦБМТ РАМН. Работу с лабораторными животными проводят в соответствии с приказом МЗ РФ от 23 августа 2010 года №708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Положением об этическом отношении к лабораторным животным ГНЦ «Института иммунологии» ФМБА России».
Для моделирования химического ожогового воспаления кожного покрова используют 2% раствор ТНБСК.
Для моделирования раневого воспаления кожного покрова у мышей, иссекают участок кожи размером 1×1 см под эфирным наркозом.
Схема проведения эксперимента по изучению регенерирующих свойств исследуемых препаратов на модели химического ожогового воспаления у мышей
Схема проведения эксперимента по изучению заживляющих свойств лекарственных препаратов на модели химического ожогового поражения у мышей представлена на фиг.5.
Мыши I-V групп получают эпидермально 2% ТНБСК ежедневно 10 дней. Затем аппликации ТНБСК прекращают и на пораженный участок спины мышам II и III групп в виде аппликаций наносят исследуемые «Гель 1» и «Гель 2», а мышам IV и V контрольных групп крем «Бепантен плюс» и «Цинковую мазь», соответственно. Мышам I группы (группа «самозаживление») аппликации лекарственных средств не делают.
На 17-ый день эксперимента у мышей всех групп производят забор кожи для гистологического и ПЦР исследований.
Перед убоем животных проводят оценку области остаточного поражения кожного покрова.
Схема проведения эксперимента по изучению регенеративных свойств исследуемых препаратов на модели раневого воспаления у мышей
Для реализации поставленной задачи формируют 7 групп мышей. Схема разбиения на группы представлена на фиг.6.
У мышей I-VI групп иссекают кожный покров на спине, размер иссечения - 1×1 см. На пораженный участок спины мышам исследуемых групп наносят «Гель 1», «Гель 2» и препарат «Цинковая соль», мышам контрольных групп - крем «Бепантен плюс» и «Цинковую мазь». Мышам I группы (группа «самозаживление») аппликации лекарственными средствами не делают.
На 12-ый день эксперимента у мышей всех групп производят забор кожи для гистологического и ПЦР исследований.
Перед убоем животных проводят оценку области остаточного поражения кожного покрова.
Оценка степени заживления раны
При изучении регенеративных свойств исследуемых препаратов на модели химического ожогового воспаления у мышей оценивают степень поражения кожного покрова до и после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами (фиг.7).
При изучении регенерирующих свойств исследуемых препаратов на модели раневого воспаления у мышей степень остаточного поражения кожного покрова после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами оценивают по изменению продольного и поперечного размера раны.
Гистологический анализ изменений кожного покрова
Образцы для гистологического анализа готовят по общепринятой методике. Образцы кожи фиксируют в 10% нейтральном формалине, обезвоживают и уплотняют в спиртах восходящей концентрации, хлороформе и парафине при помощи гистопроцессора SLEE Mainz (Германия). Срезы готовят на роторном микротоме Finesse Е+, Thermo Fisher Scientific (Финляндия). Срезы окрашивают по стандартной методике гематоксилином и эозином, а также методом по ван Гизону с целью визуализации соединительной ткани. Просмотр гистологических препаратов осуществляют на микроскопе Leica DM 2000 (Германия) при увеличении 50, 100 и 400.
Выделение мРНК
Общую РНК выделяют из гомогенизированной кожной ткани мышей с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя. Перед выделением РНК образцы кожи гомогенизируют в тризоле.
Проведение обратной транскрипции и постановка RT-PCR
Уровень экспрессии мРНК определяют метод полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (RT-PCR). Для этого, сначала, в реакции обратной транскрипции (ОТ) получают кДНК на матрице РНК со «случайными» праймерами. При постановке реакции ОТ используют комплект реагентов «PEBEPTA-L» («Интрелабсервис», Россия), следуя инструкции производителя. Затем, проводят реакцию ПЦР-РВ, используя реагент «2,5х реакционная смесь для проведения RT-PCR» («Синтол», Россия), а также праймеры и флуоресцентно-меченные зонды, синтезированные в «Синтол». Реакцию проводят в амплификаторе IQ5 BioRad. Программа RT-PCR: 95°C - 2 минуты, 95°C - 20 секунд 58°C - 40 секунд, всего 45 циклов.
Учет и анализ результатов проводят при помощи программного обеспечения к прибору IQ5 Bio-Rad согласно инструкциям производителя.
8
Для проведения количественного анализа уровня экспрессии мРНК используют калибраторы - ПЦР-продукты тех или иных генов, вырезанные из агарозного геля и очищенные. После очистки оценивают концентрацию ПЦР-продуктов и готовят их серийные разведения (от 10 до 10), с которыми проводят RT-PCR по вышеуказанной схеме.
На основе полученных данных строят калибровочные кривые, которые затем используют для перерасчета полученных данных в количество копий РНК на 1 грамм кожной ткани.
Статистический анализ
Для статистической обработки результатов применяли программу Statistica 8.0. Статистическую значимость различий устанавливали при помощи t-критерия Стьюдента. Достоверными считались различия при ρ<0,05.
Влияние натриевой и цинковой солей люминола на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками крови здоровых доноров
Изучают индукцию выработки провоспалительных цитокинов (TNF, IL-6, IL-10, IL-8, HMGB-1) и ростовых факторов FGFb и EGF мононуклеарными клетками крови здоровых доноров под влиянием ЛЦ, в сравнении с ЛН и ЛН-АЦ индуцировать продукцию цитокинов. Также изучают способность этих веществ модулировать продукцию указанных выше цитокинов и ростовых факторов, индуцированную липополисахаридом.
Проводят анализ индукции провоспалительных цитокинов TNF, IL-6, IL-8 и HMGB-1 в ответ на ЛЦ, ЛН и ЛН-АЦ. В качестве отрицательного контроля используют 0,2% и 2% ДМСО.
Показано, что ЛЦ и ЛН-АЦ в концентрации 100 мкг/мл усиливает продукцию IL-6, IL-8 и TNF, причем, как по сравнению с отрицательным контролем, так и с соответствующим ДМСО-контролем (2%) (фиг.8).
Эффект усиления продукции IL-6, IL-8 и TNF наблюдают также при стимуляции смесью ЛН-АЦ в концентрации 10 мкг/мл. Продукция HMGB-1 усиливалась под воздействием ЛЦ в концентрации 100 мкг/мл, однако по сравнению с продукцией IL-6 и IL-8 эффект был менее существенный. ЛН не оказывает воспроизводимого эффекта стимуляции выработки провоспалительных цитокинов. ДМСО в концентрации 0,2% и особенно 2% подавляет спонтанную продукцию IL-6 и IL-8.
Далее проводят анализ индукции выработки цитокинов мононуклеарными клетками крови в ответ на ЛПС-стимуляцию (фиг.9).
Показано, что ЛПС индуцировал мощную выработку TNF, IL-6 и IL-8, однако явного влияния на выработку HMGB-1 не оказывал. ДМСО в концентрации 2% подавлял ЛПС-стимулированную продукцию TNF, IL-6 и IL-8. При этом продукция IL-6 подавляется до уровня спонтанной. Однако в присутствии всех трех препаратов в концентрации 100 мкг/мл ЛПС-стимулированная продукция IL-6 была в 6÷10 раз выше, чем в соответствующем ДМСО-контроле. Таким образом, все три препарата в концентрации 100 мкг/мл частично восстанавливают ЛПС-стимулированную продукцию IL-6, подавленную ДМСО. Аналогичный эффект наблюдают также для IL-8, но он менее выражен. Для TNF данный эффект практически отсутствует.
Кроме того, ЛЦ (100 мкг/мл) и ЛН-АЦ (100 мкг/мл) в присутствии ЛПС усиливает продукцию HMGB-1. Этот эффект наблюдают и в отсутствие ЛПС (фиг.8), но в присутствии ЛПС он был более выражен.
Таким образом, ЛЦ и ЛН-АЦ индуцируют продукцию провоспалительных цитокинов TNF, IL-6, IL-8 и HMGB-1 мононуклеарными клетками крови здоровых доноров, в основном, при концентрации препаратов 100 мкг/мл (по люминолу). ЛН такой способностью не обладает. Кроме того, ЛЦ, ЛН и смесь ЛН-АЦ усиливают продукцию TNF, IL-6, IL-8 и HMGB-1, индуцированную ЛПС, и тоже при концентрации препаратов 100 мкг/мл (по люминолу).
Таким образом, все три препарата обладают умеренным провоспалительным действием, которое наиболее выражено у ЛЦ и ЛН-АЦ.
Индукция выработки противовоспалительного цитокина IL-10 под влиянием препаратов
Показано, что при воздействии исследуемыми препаратами ЛЦ, ЛН и ЛН-АЦ на МНК не наблюдается какой-либо индукции выработки IL-10 (фиг.10). Продукция IL-10 увеличивается только при добавлении ЛПС (фиг.11).
ДМСО в концентрации 2% подавляет ЛПС-стимулированную продукцию IL-10 до фоновых значений, а в концентрации 0,2% эффекта не оказывает.
Модулирующего влияния на ЛПС-стимулированную продукцию IL-10 не оказывает ни один из исследуемых препаратов.
Индукция выработки ростовых факторов EGF и FGFb
Показано, что МНК спонтанно вырабатывают невысокие уровни EGF (фиг.10).
ДМСО в концентрации 0,2% и особенно 2% подавляет спонтанную продукцию EGF.
Ни один из препаратов значимого влияния на выработку EGF не оказывает.
ЛПС незначительно усиливает продукцию EGF МНК, тогда как ДМСО дозозависимо ее подавляет (фиг.11).
Ни один из препаратов не оказывает значимого модулирующего влияния на выработку EGF.
Уровни FGFb во всех супернатантах ниже нижнего предела детекции (данные не показаны).
Изучение заживляющих свойств лекарственных средств на модели химического ожогового воспаления у мышей
Оценка степени заживления раны
По фиг.7 определяют степень поражения кожного покрова до и после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами (фиг.12).
Степень остаточного поражения (заживления) кожного покрова после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами выражают в процентах (фиг.13).
Хотя, оценка степени поражения кожного покрова у мышей является субъективным показателем, тем не менее, можно сделать вывод о том, что наименьшее остаточное поражение имеется у группы «Цинковая мазь», а наибольшее - у группы «Бепантен плюс».
Оценка гистологических изменений кожного покрова
Степень заживления ран кожного покрова мышей после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами определяют по ряду патоморфологических изменений, а именно: по степени утолщения эпидермиса, наличию стратификации кератиноцитов и регенерации, степени пролиферации соединительно-тканных элементов и лейкоцитарной инфильтрации дермы и подкожной жировой клетчатки, а также наличию некроза (фиг.14).
Степень проявления вышеперечисленных гистологических изменений оценивают по бальной системе индивидуально по каждой мыши в группе, затем подсчитывают средний балл. Степень заживления выражают в процентах от интактной группы, балл которой был принят за 100%.
Показано, что патоморфологические изменения кожного покрова присутствуют в разной степени у всех мышей опытных групп.
На фиг.14 видно, что наибольшая степень заживления (около 80%) наблюдается в контрольной группе «Цинковая мазь». Однако, в группе «Гель 1» степень заживления соответствует контрольной группе «Бепантен плюс».
Оценка способности исследуемых лекарственных препаратов оказывать стимулирующий эффект на процесс заживления химического ожогового поражение кожного покрова
Оценку стимулирующего эффекта исследуемых препаратов на процесс заживления ран проводят путем количественного определения мРНК цитокинов, вовлеченных в процесс регенерации раны.
Количественное определение мРНК проводят методом ПЦР в реальном времени.
На фиг.15 отражено количество мРНК фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A или VEGF).
VEGF участвует в процессе ангиогенеза, влияя на развитие новых кровеносных сосудов и выживание незрелых кровеносных сосудов. Механизм действия VEGF заключается в том, что он связывается с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF) и активирует их. Эти рецепторы экспрессируются клетками эндотелия стенки кровеносных сосудов. Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию [4, 6, 7, 14].
Кроме того, VEGF обеспечивает выход из сосудов плазменных белков (фибронектин, витронектин, фибриноген, факторы коагуляции) и активирует экспрессию тканевого фактора (клеточный инициатор коагуляции крови), что ведет к формированию пути мигрирации эндотелиальных и гладкомышечных клеток. После образования новых сосудов фактор VEGF выступает как фактор выживаемости и подавляет апоптоз эндотелиоцитов.
Синергетическое действие на индукцию ангиогенеза наблюдается между VEGF и фактором роста фибробластов (FGFb) [4, 6, 7, 14]. Фиг.16 отражает количество копий мРНК FGFb в кожной ткани мышей. Считается, что FGFb является более мощным ангиогенным фактором, нежели VEGF или фактор роста тромбоцитов (PDGF) [22]. Кроме того, FGFb стимулирует пролиферацию кератиноцитов и их миграцию.
На фиг.16 видно, что уровень FGFb в группе «Гель 1» и в контрольных группах выше, чем в группе «самозаживление». Это свидетельствует о том, что в этих группах наиболее интенсивно идет процесс регенерации и ангиогенеза. Из литературы известно, что уже через день после травмы уровень FGFb резко снижается [10]. Таким образом, вполне логичными выглядят отраженные на графике уровни FGFb в группе «самозаживление» и «интактные».
Для того, чтобы глубже оценить степень влияния исследуемых лекарственных средств на регенеративные процессы, происходящие в очаге ожогового поражения кожного покрова, нами был определен уровень мРНК трансформирующего ростового фактора (TGF-β1) и эпидермального фактора роста (EGF) (фиг.15 и 16 соответственно).
TGF-β1, контролируя пролиферацию кератиноцитов и регулируя процесс эпителизации раны, играет важную роль в процессе регенерации раны. В лимфоидных, миелоидных, эпителиальных и эндотелиальных клетках он является ингибитором роста [2]. Ингибиторный эффект TGF-β1 можно наблюдать на фоне стимуляции покоящихся кератиноцитов с помощью EGF, поскольку TGF-β1 структурно похож на EGF, и оба эти фактора связываются с одним рецептором [19, 20]. Трансформирующий фактор роста является мощным стимулятором выработки коллагена. Таким образом, увеличение этого фактора может приводить к образованию на месте травмы рубцовой ткани. Кроме того, повышенный уровень TGF-β1 свидетельствует об активных регенеративных процессах в ране.
Что касается, фактора EGF, то на графике видно, что уровень соответствующего мРНК в контрольных группах приближается к уровню группы «интактные», а в группе «Гель 1» количество EGF достоверно ниже. По-видимому, это связано с ингибированием EGF трансформирующим ростовым фактором (TGF-β1), количество которого в группе «Гель 1» заметно выше, чем в остальных группах. В связи с тем, что эти факторы конкурируют за один рецептор, мы наблюдаем обратную пропорциональность количеств мРНК.
Известно, что фактор EGF стимулирует пролиферацию кератиноцитов и их миграцию. Этот фактор показал себя как эффективный ранозаживляющий агент и используется в косметологии как стимулятор роста кератиноцитов. Таким образом, его присутствие в очаге ожогового поражения значительно снижает риск образования рубцовой ткани и стимулирует процесс нормальной регенерации.
Еще одним компонентом регенеративного процесса в ткани является белок из группы ядерных негистоновых белков HMG (HMGB1). Уровень мРНК представлен на фиг.19.
На рисунке видно, что достоверно наибольшее количество HMGB1 выявлено в группе «Гель 1». Это свидетельствует о том, что в данной группе идет интенсивный процесс регенерации ткани. Важно отметить, что HMGB1 нарушает синтез коллагена, что в свою очередь, значительно снижает риск образования на месте ожогового поражения образования рубцовой ткани [23].
Важную роль в процессе заживления раны играет интерлейкин-6 (IL-6), который является провоспалительным цитокином и синтезируется активированными макрофагами и Т-клетками, стимулируя иммунный ответ (фиг.20).
На фиг.20 показано, что наибольшее количество мРНК IL-6 выявлено в группе «Гель 1» и контрольной группе «Бепантен плюс». Повышение этого цитокина свидетельствует об интенсивном нормальном регенеративном процессе. Показано, что при использовании в качестве лечебного средства «Dexpanthenol», уровень IL-6 увеличивался в 7 раз по сравнению с интактными мышами [21].
Таким образом, в ходе проведенных исследований было установлено, что применение «Геля 1» на модели химического ожога у мышей ускоряет процесс заживления и эпителизации раны, снижает вероятность образования рубцов.
Изучение заживляющих свойств лекарственных средств на модели раневого воспаления у мышей
Оценка степени заживления раны
Степень остаточного поражения кожного покрова после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами оценивают по изменению продольного и поперечного размера раны (фиг.21).
Хотя оценка степени поражения кожного покрова у мышей является субъективным показателем, тем не менее, следует отметить, что наибольшее остаточное поражение выявлено у группы «плацебо», а наименьшее - у групп «Гель 2» и ЛЦ.
Оценка гистологических изменений кожного покрова
Степень заживления ран кожного покрова мышей после проведения цикла аппликаций с лекарственными средствами определяют по ряду патоморфологических изменений, а именно: по степени утолщения эпидермиса, наличию стратификации кератиноцитов и регенерации, степени пролиферации соединительно-тканных элементов и лейкоцитарной инфильтрации дермы и подкожной жировой клетчатки, а также наличию некроза (фиг.22).
Оценка способности исследуемых лекарственных препаратов оказывать стимулирующий эффект на процесс заживления раневого поражения кожного покрова
Оценку стимулирующего эффекта исследуемых препаратов на процесс заживления ран проводят путем количественного определения мРНК ряда цитокинов, вовлеченных в процесс заживления раневого поражения.
На фиг.22 отражено количество мРНК фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).
Показано, что максимальная экспрессия фактора роста эндотелия сосудов наблюдается в группе «Бепантен плюс», а минимальная - в группах «самозаживление», «Гель 2» и «Цинковая соль». На графике видно, что в контрольных группах, а также в группе «Гель 1» VEGF повышен, а значит можно сделать вывод о том, что интенсивно идет процесс ангиогенеза и роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов.
Определяют уровень фактора роста фибробластов, который является более мощным, чем VEGF ангиогенным фактором, а также стимулирует пролиферацию кератиноцитов и их миграцию (фиг.23).
На фиг.23 видно, что в группе, получавшей ЛЦ FGFb достоверно больше, чем в группе «интактные».
Известно, что после травмы уровень FGFb резко снижается [10]. Таким образом, вполне логичным выглядит отраженный на графике повышенный уровень FGFb в группе «интактные». Важно отметить, что в контрольных группах количество FGFb повышено и стремится к уровню группы «интактные». И принимая во внимание то, что FGFb стимулирует пролиферацию кератиноцитов, описанные результаты свидетельствуют о том, что в контрольных группах и в группе, получавшей ЛЦ идет интенсивный процесс нормальной регенерации.
Далее изучают такие важные факторы, влияющие на регенеративные процессы, происходящие в очаге раневого поражения кожного покрова, как трансформирующий ростовой фактор (TGF-β1) и эпидермальный фактор роста (EGF).
На фиг.24 видно, что наибольшая экспрессия TGF-B1 наблюдалась в группе «Цинковая соль». Важно отметить, что в группах «Гель 1» и «Гель 2» уровень экспрессии TGF-B1 был повышен и соответствовал уровню контрольных групп.
Таким образом, в группе «Цинковая соль» повышенный уровень TGF-B1 свидетельствует об интенсивности процесса эпителизации. Кроме того, увеличение TGF-P1 свидетельствует об активных регенеративных процессах в ране.
Что касается, фактора EGF, то на фиг.25 видно, что уровень соответствующего мРНК в группе «Цинковая соль» стремится к уровню группы «интактные», а в остальных группах количество мРНК EGF ниже. По-видимому, это связано с ингибированием EGF трансформирующим ростовым фактором (TGF-B1). В связи с тем, что эти факторы конкурируют за один рецептор, мы наблюдаем обратную пропорциональность количеств мРНК.
Присутствие EGF в очаге раневого поражения значительно снижает риск образования рубцовой ткани и стимулирует процесс нормальной регенерации, поскольку известно, что данный фактор является мощным стимулятором роста кератиноцитов.
Еще одним компонентом регенеративного процесса в ткани является белок из группы ядерных негистоновых белков HMG (HMGB1). Уровень мРНК представлен на фиг.26.
На фиг.26 видно, что достоверно наибольшее количество HMGB1 выявлено в группе «Гель 1» и контрольных группах. Это свидетельствует о том, что в указанных группах идет интенсивный процесс регенерации ткани. Важно отметить, что HMGB1 нарушает синтез коллагена, что в свою очередь, значительно снижает риск образования на месте раневого поражения образования рубцовой ткани [23].
Важную роль в процессе заживления раны играет провоспалительный цитокин интерлейкин-6 (IL-6) (фиг.27).
На фиг.27 видно, что наибольшее количество мРНК IL-6 выявлено в группе ЛЦ и контрольной группе «Бепантен плюс». Повышение этого цитокина свидетельствует об интенсивном нормальном регенеративном процессе.
Таким образом эксперименты, проведенные in vitro, обнаружили способность ЛЦ и ЛН-АЦ вызывать умеренный синтез провоспалительных цитокинов (TNF, IL-6, IL-8) мононуклеарными клетками. Данный вид активности характерен для различных иммуностимуляторов, например для мурамилпептидов и CpG-олигодезоксинуклеотиды [15, 18]. Индукция указанных цитокинов свидетельствует об активации врожденного иммунитета и коррелирует с повышением резистентности организма против бактериальных инфекций [25]. Это свойство ЛЦ может быть полезным с точки зрения предотвращения раневой инфекции.
В опытах на МНК не получено данных о способности препаратов индуцировать экспрессию факторов, участвующих в регенерации тканей. Однако эти данные не исключают, что эти факторы могут быть индуцированы препаратами в других типах клеток, в частности в эпителиоцитах, фибробластах и т.д.
Эксперименты, проведенные в формате in vivo, на моделях химического ожогового и раневого поражений показали, что исследуемые препараты индуцируют выработку ряда цитокинов, играющих важную роль в процессе заживления кожного покрова.
Было показано, что у мышей, получавших «Гель 1» в качестве лечебного препарата против химического ожогового воспаления, наблюдалась достоверное увеличение экспрессии таких факторов, как VEGF, TGF-β1, FGFb, HMGB1 и IL-6. Это свидетельствует об интенсификации ряда регенеративных процессов. Так, например, увеличение VEGF и FGFb говорит не только о ходе процесса ангиогенеза, но и о стимуляции пролиферации кератиноцитов, что является необходимым для нормального регенеративного процесса. Фактор HMGB1 регулирует выработку коллагена, работая как антагонист TGF-βi, который в свою очередь стимулирует данный процесс. В целом полученные данные позволяют сделать вывод о том, что применение «Геля 1» на модели химического ожога у мышей ускоряет процесс нормальной регенерации и эпителизации раны, снижает вероятность образования рубцов.
Что касается исследований препаратов на модели раневого поражения у мышей, то наиболее перспективным ранозаживляющим средством оказалась «Цинковая соль». У мышей, получавших этот препарат, наблюдался повышенный уровень экспрессии таких цитокинов, как FGF, TGF-β1, EGF и IL-6. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что применение «Цинковой соли» на модели раневого воспаления у мышей стимулирует процесс ангиогенеза и пролиферацию кератиноцитов, ускоряя процесс заживления и эпителизации раны.
ПРИМЕР 6
Фармацевтические композиции по изобретению
Композиция 1, а именно гель цинковой соли люминола 1%, имеет следующий состав (в расчете на 100 г):
Люминолат цинка
1 г
Карбопол
1 г
Триэтаноламин
1 г
Нипагин
1 г
Вода
96 г
Композиция 2, а именно гель цинковой соли люминола 1%, имеет следующий состав (в расчете на 100 г):
Люминолат цинка
1 г
Карбопол
1 г
Триэтаноламин
1 г
Спирт этиловый
10 г
Нипагин
1 г
Вода
86 г
Композиция 3, а именно гель цинковой соли люминола 5% имеет следующий состав (в расчете на 100 г):
Люминолат цинка
5 г
Карбопол
1 г
Триэтаноламин
1 г
Спирт этиловый
20 г
Нипазол
1 г
Вода
72 г
Композиция 4, а именно гель цинковой соли люминола 1% и хлоргексидина 1% (комбинированный) имеет следующий состав (в расчете на 100 г):
Люминолат цинка
1 г
Хлоргексидинбиглюконат
1 г
Карбопол
1 г
Триэтаноламин
1 г
Нипагин
1 г
Вода
95 г
Композиция 5, а именно мазь, имеет следующий состав (массовая доля):
Люминолат цинка
0,05
Пропиленгликоль
0,4
Нипагин
0,02
Твин-80
0,0002
Трилон Б
0,0002
Полиэтиленоксид-400
0,5296
Композиция 6, а именно мазь, имеет следующий состав (массовая доля):
Люминолат цинка
0,2
Нипагин
0,05
Нипазол
0,05
Вазелин
0,7
Композиция 7, а именно мазь, имеет следующий состав (массовая доля):
Люминолат цинка
0,1
Нипазол
0,05
Полиэтиленоксид-400
0,5
Полиэтиленоксид-1500
0,35
Композиция 8, а именно крем, имеет следующий состав (массовая доля):
Люминолат цинка
0,05
Полиэтиленоксид 400
0,4
Вазелин
0,2
Персиковое масло
0,1
Эмульгатор №1
0,05
Нипагин
0,01
Вода
0,19
Композиция 9, а именно крем, имеет следующий состав (массовая доля):
Люминолат цинка
0,1
Вазелиновое масло
0,2
Витепсол
0,68
Твин-80
0,01
Нипагин
0,01
Композиция 10, а именно крем, имеет следующий состав (массовая доля):
Люминолат цинка
0,01
Ланолин
0,1
Вазелиновое масло
0,1
Полиэтиленоксид 600
0,77
Твин-80
0,01
Нипагин
0,01
ПРИМЕР 7
Определение токсичности
Исследование острой и хронической токсичности выполняют согласно следующим стандартам и методическим документам [26, 27, 28].
Пример 7.1 Изучение острой токсичности
Острую токсичность ЛЦ изучали при однократном внутрижелудочном введении мышам и крысам.
Испытаны дозы ЛЦ в диапазоне от 625 мг/кг до 5000 мг/кг при введении крысам линии Вистар.
При внутрижелудочном введении аутбредным мышам дозы составили от 1250 мг/кг до 7500 мг/кг.
Продолжительность наблюдения за животными составила 15 дней.
Результаты по выживаемости крыс и мышей в эксперименте приведены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Показатели выживаемости крыс после внутрижелудочного введения цинковой соли люминола
Доза (мг/кг)
Пол
Кол-во животных
Количество павших животных в день исследования
Кол-во павших за весь срок наблюдения
Самцы
1-й день
2-й день
6
-
-
0
25
6
-
-
0
Доза (мг/кг)
Пол
Кол-во животных
Количество павших животных в день исследования
Кол-во павших за весь срок наблюдения
1-й день
2-й день
1250
6
-
-
0
2500
6
-
-
0
5000
6
2
1
3
0
Самки
6
-
-
0
625
6
-
-
0
1250
6
-
-
0
2500
6
-
-
0
5000
6
2
1
3
Таблица 4
Показатели выживаемости мышей после внутрижелудочного введения цинковой соли люминола
Доза (мг/кг)
Пол
Кол-во животных
Количество павших животных в день исследования
Кол-во павших за весь срок наблюдения
1-й день
2-й день
0
Самцы
6
-
-
0
1250
6
-
-
0
2500
6
-
-
0
5000
6
4
2
6
7500
6
6
-
6
0
Самки
6
-
-
0
1250
6
-
-
0
2500
6
2
-
2
5000
6
5
-
5
7500
6
6
-
6
В результате проведенного исследования установлены параметры острой токсичности цинковой соли люминола:
50
ЛД для крыс (самцов и самок) - 5612 мг/кг массы тела.
50
ЛД для мышей: для самцов - 3290 мг/кг, для самок - 3085 мг/кг.
Максимальная переносимая доза для крыс (самцов и самок) - 2500 мг/кг.
Максимальная переносимая доза для мышей: для самцов - 2500 мг/кг, для самок - 1250 мг/кг.
Пример 7.2 Изучение хронической токсичности цинковой соли люминола при внутрижелудочном введении крысам
Проведены исследования хронической токсичности цинковой соли люминола при введении в желудок крысам в течение месяца.
Белым аутбредным крысам ежедневно в течение 1 месяца вводили в желудок дозы ЛЦ 1,4, 14,3 и 42,9 мг/кг. На протяжении всего периода введения ЛЦ крысам, а также во время восстановительного периода на всех дозах клинические симптомы отравления отсутствовали, общее состояние животных опытных и контрольных групп не различалось, не было отмечено признаков изменения клинического состояния животных. Введение препарата не сказывалось на поведении, состоянии шерстного покрова, видимых слизистых оболочек и приросте массы тела подопытных животных.
По окончании месяца введения цинковой соли люминола у самцов крыс на максимальной испытанной дозе 42,9 мг/кг отмечено достоверное увеличение уровня билирубина, повышение активности аспартатаминотрансферазы и снижение активности щелочной фосфатазы. Результаты изучения биохимических показателей представлены в таблице 1
Таблица 5
Биохимические показатели сыворотки крови крыс по окончании введения цинковой соли люминола
Параметр, ед. измерения
Препарат цинковая соль люминола, доза мг/кг
Контроль
1,4
14,3
42,9
Самцы (М±σ)
Общий белок, г/л
76,36±15,09
86,24±5,93
81,64±7,36
74,50±14,06
Глюкоза, ммоль/л
5,98±0,72
6,90±1,18
6,50±1,25
6,42±0,86
Мочевина, ммоль/л
7,72±0,49
7,70±1,42
6,94±0,91
7,84±1,18
Холестерин, ммоль/л
4,69±1,04
5,03±0,32
5,73±0,78
4,94±0,85
Билирубин, мкмоль/л
14,10±4,03
14,66±1,50
18,10±6,62
27,74±6,48*
Креатинин, мкмоль/л
79,10±19,02
65,82±12,60
68,60±14,98
61,08±9,60
Параметр, ед. измерения
Препарат цинковая соль люминола, доза мг/кг
Контроль
1,4
14,3
42,9
АлАТ, Е/л
31,84±5,01
24,88±6,13
24,98±6,25
26,58±5,93
АсАТ, Е/л
11,22±2,46
15,79±4,97
14,14±4,05
18,16±2,63*
Щелочная фосфатаза, Е/л
396,98±55,37
342,10±37,29
194,32±37,04*
208,72±87,48*
Самки (М±σ)
Общий белок, г/л
76,52±10,77
75,20±9,40
81,78±7,21
65,85±1,75
Глюкоза, ммоль/л
8,64±2,37
10,22±2,37
9,68±1,22
8,53±1,42
Мочевина, ммоль/л
7,10±1,20
8,86±1,21
7,64±0,70
7,93±0,63
Холестерин, ммоль/л
5,51±0,97
5,92±0,80
5,33±0,65
5,74±1,20
Билирубин, мкмоль/л
22,60±8,00
23,52±5,24
23,76±3,98
26,08±4,20
Креатинин, мкмоль/л
70,26±12,03
62,12±11,69
58,52±11,99
60,68±9,00
АлАТ, Е/л
19,88±7,42
22,38±3,61
24,36±3,07
19,08±3,86
АсАТ, Е/л
19,74±4,52
13,70±5,33
16,84±1,73
15,57±2,73
Щелочная фосфатаза, Е/л
295,70±45,44
346,98±127,47
246,84±101,25
289,93±69,37
По окончании 14 суток после отмены ЛЦ отмечены незначительные изменения уровня мочевины, холестерина и активности щелочной фосфатазы у самцов крыс. Выявленные изменения не связаны с дозой ЛЦ, носят случайный характер. Понижение уровня мочевины во всех экспериментальных группах слишком мало и достоверно отличается от контрольной группы, вероятно, только из-за очень незначительного разброса данных к контрольной группе.
Биохимические показатели сыворотки крови самок крыс по окончании восстановительного периода не отличались от контроля (табл.6).
Таблица 6.
Биохимические показатели сыворотки крови крыс после восстановительного периода
Параметр, ед. измерения
Препарат цинковая соль люминола, доза мг/кг
Контроль
1,4
14,3
42,9
Самцы (М±σ)
Общий белок, г/л
84,82±12,91
96,30±12,87
98,76±7,37
94,80±5,48
Глюкоза, ммоль/л
7,78±1,22
7,92±1,25
8,62±1,19
7,76±0,95
Мочевина, ммоль/л
9,16±0,50
7,88±1,08*
8,74±0,62*
7,78±1,07*
Холестерин, ммоль/л
8,31±1,40
4,15±1,35*
5,56±1,86
5,33±0,90*
Билирубин, мкмоль/л
14,48±4,43
11,64±2,85
10,42±2,38
14,12±3,91
Креатинин, мкмоль/л
67,54±26,53
60,88±6,66
61,16±16,09
54,68±7,84
АлАТ, Е/л
20,56±5,83
16,76±3,03
23,32±7,92
24,94±5,04
АсАТ, Е/л
13,58±2,45
12,19±1,21
10,85±4,80
14,40±3,25
Щелочная фосфатаза, Е/л
238,66±46,81
280,46±81,57
377,66±122,08*
243,96±74,35
Самки (М±σ)
Общий белок, г/л
110,06±12,30
102,06±21,63
112,04±19,03
120,62±23,87
Глюкоза, ммоль/л
8,00±1,71
9,84±2,71
10,22±2,56
10,62±3,13
Мочевина, ммоль/л
9,44±0,94
8,58±1,44
9,36±0,22
8,14±1,18
Холестерин, ммоль/л
5,78±0,96
5,36±0,76
7,19±1,66
6,71±0,82
Билирубин, мкмоль/л
18,50±8,42
23,04±6,91
22,30±7,69
10,08±3,75
Креатинин, мкмоль/л
64,16±14,17
52,12±6,65
47,30±9,06
54,58±8,72
АлАТ, Е/л
22,32±6,65
17,50±2,65
25,66±4,99
28,20±6,61
АсАТ, Е/л
13,07±2,85
11,96±0,73
12,47±3,24
15,66±2,18
Щелочная фосфатаза, Е/л
219,70±52,70
257,04±109,35
236,94±123,16
194,46±76,77
Показанные в таблицах 5 и 6 изменения биохимических показателей сыворотки крови крыс на дозе ЛЦ 42,9 мг/кг не выходят за пределы физиологической нормы, но связаны с введением 30-кратной дозы исследуемой субстанции.
Гематологические исследования, выполненные по окончании введения ЛЦ и после восстановительного периода, также не выявили различий между животными из экспериментальных и контрольных групп.
По окончании 30 дней введения цинковой соли люминола отмечен незначительный в пределах физиологической нормы сдвиг pH мочи у самок крыс на максимальной испытанной дозе. Через 2 недели после отмены ЛЦ аналогичные изменения отмечены у самцов крыс, при этом также показано некоторое снижение относительной плотности мочи. Описанные изменения в клинических анализах мочи не выходят за пределы физиологической нормы, но связаны с введением 30-кратной дозы ЛЦ.
В результате проведенного патологоанатомического исследования не установлено признаков повреждающего действия ЛЦ на организм крыс в дозах до 42,9 мг/кг после одного месяца введения субстанции в желудок.
ПРИМЕР 8
Определение эффективности
Пример 8.1. Больная Н. 37 лет.
После комплексного обследования поставлен диагноз: «хронический гастрит антрума желудка с повышенной секреторной функцией в фазе обострения; хеликобактериоз.
При опросе пациентка предъявляла жалобы на постоянные тупые, ноющие боли в эпигастральной области без иррадиации, усиливающиеся после приема пищи. Отмечает резко выраженную тяжесть после приема пищи, отрыжку воздухом, снижение аппетита. Через 1-1,5 ч после приема пищи чувствует вздутие живота.
При фиброгастроскопическом обследовании - выраженная очаговая гиперемия, преимущественно в антральном отделе. Гистологически - обсемененность Helicobacter pylori (+++).
Лечение: Гастал по 1 таблетка 3-4 раза/день, фамотидин по 1 таблетке 2 раза/день, курс 4 недели; омепразол по 1 таблетке 1 раз/день в течение 4 недель; амоксициллин - 2000 мг в сутки, де-нол по 1 таблетке за 30 мин перед вечерним приемом пищи; ЛЦ по 100 мг 1 раз в сутки в течение 5 дней, далее по 100 мг/сутки с интервалом 48 часов, 10 приемов.
Значительное ослабление болей на 2-ой день лечения, полное исчезновение болей на 7-ой день. На 10 день эндоскопически умеренная гиперемия слизистой антрального отдела желудка, на 15 день - нормализация слизистой желудка, нормализация секреторной функции.
Пример 8.2. Больной Ж., 46 лет.
После комплексного обследования установлен диагноз: «острый эрозивно-язвенный гастрит.
При поступлении пациент предъявлял жалобы на острые боли в животе в области эпигастрия, усиливающиеся после приема пищи и физической нагрузки, чувство жжения за грудиной, изжогу.
Объективно: язык отечен, обложен белым налетом, пальпация живота болезненна в области эпигастрия.
Результаты фиброгастродуоденосокпии: слизистая желудка выраженно гиперемирована, множественные эрозии в области антрума и большой кривизны желудка.
Лечение: альмагель по 10 мл 3 раза/день, ранитидин по 1 таблетке 2 раза/день, курс 4 недели; омепразол по 1 таблетке 1 раза/день в течение 4 недель; амоксициллин - 2000 мг в сутки, де-нол по 1 таблетке за 30 мин перед вечерним приемом пищи; ЛЦ по 100 мг 1 раз в сутки в течение 5 дней, далее по 100 мг/сутки с интервалом 48 часов, 15 приемов. За курс лечения пациент получил 2000 мг ЛЦ.
На третий день снижение болей в области эпигастрия, исчезла тошнота и тяжесть в животе после приема пищи. На 12-й день по данным ФГДС умеренная гиперемия слизистой желудка, признаки эпителизации эрозий, на 15-й день слабо выраженная гиперемия слизистой желудка, эпителизация эрозий.
Пример 8.3. Больной М., 27 лет.
Диагноз: острый контактный дерматит.
Объективно: при осмотре кистей рук определяется выраженная гиперемия кожи кистей рук, на тыльной поверхности кистей множественные эрозии с прозрачным отделяемым.
Лечение: местно 1% гель ЛЦ 2 раза в день тонким слоем на пораженную поверхность в течение 7 дней.
На 3 день слабо выраженная гиперемия кистей рук, единичные эрозии в стадии эпителизации. На 5-й день слабо выраженная гиперемия кожи кистей рук. На 7-й день единичные пигментные пятна, полное отсутствие эрозий, полная эпителизация пораженной поверхности.
Пример 8.4. Больная В., 42 года.
Диагноз: термический ожог (пламенем) II-IIIa степени левой нижней конечности общей площадью 15% поверхности тела. Ожоговый шок легкой степени.
9
Из анамнеза: находилась на отдыхе возле открытого огня, из-за неосторожного обращения с огнем получила ожог левой нижней конечности. С места происшествия была доставлена через 40 минут. При поступлении пострадавшая жаловалась на жгучие боли в области ожогов кожи, сухость во рту. Объективно: больная находилась в психомоторном возбуждении, одышка (число дыхания 25 в 1 минуту). Температура тела 36,1°C, количество лейкоцитов 11,3×10, гематокрит - 60%, гемоглобин - 172 грамм/литр. При поступлении начата противошоковая терапия. Ожоговый шок купирован в течение первых суток.
Лечение: на пораженную поверхность накладывали повязки с гелем, содержащим 1% ЛЦ и 1% хлоргексидин-биглюконат.
На 4-е сутки все раны очистились от раневого струпа, покрылись яркими сочными гранулятами. К 6-м суткам после ожога ожоговые раны практически зажили, остались небольшие участки красного цвета.
Пример 8.5. Наблюдательное исследовании клинической эффективности ЛЦ гель 1% в лечении аллопеции
Целью исследования являлось изучение целесообразности и эффективности применения ЛЦ гель 1% в лечении пациентов, страдающих андрогенной или гнездовой аллопецией.
В исследовании приняли участие 15 пациентов в возрасте 23-65 лет, из которых 9 (60%) - мужчины и 6 (40%) - женщины.
При обследовании пациентов проводили сбор анамнеза (в том числе семейного), использовали методы клинического мониторинга, а также фотодокументирование.
Критерии включения в исследование:
- подтвержденный диагноз андрогенной или гнездовой аллопеции;
- сохраненные волосяные фолликулы в лобнотеменной и височных областях (до IV-V стадии по Гамильтону-Норвуду у мужчин; до II стадии по Людвигу у женщин);
- резистентность к ранее проводимой местной терапии.
Критерии исключения были стандартными, и включали пероральный прием антиандрогенных препаратов (финастерид) мужчинами и препаратов заместительной гормональной терапии женщинами.
Перед включением в исследование все пациенты подписывали протокол добровольного информированного согласия.
Оценку эффективности терапии проводили через 1 неделю, 3 месяца и 6 месяцев после окончания курса лечения.
Во внимание принимали 4 критерия:
- прекращение выпадения волос;
- восстановление кожного покрова головы (исчезновение эритематозных пятен, нормализация выработки кожного сала и др.);
- восстановление роста - появление новых волос;
- увеличение плотности волос и объема прически;
- улучшение качества волос (эластичность, блеск, цвет).
Удовлетворенность пациентов и врачей результатами курса лечения оценивали по 5-балльной интегральной шкале:
- «1» - недоволен;
- «2» - слабая степень удовлетворенности;
- «3» - удовлетворен в средней степени;
- «4» - доволен результатом;
- «5» - высокая степень удовлетворенности.
Лечение проводили следующим образом: на пораженную поверхность наносили ЛЦ 1% гель два раза в день в течение 1 месяца.
Полученные результаты свидетельствуют о хорошей переносимости лечения андрогенной аллопеции у мужчин и женщин.
Аллергических реакций в ходе проведения курса процедур не наблюдали.
Все пациенты (100%), получавшие лечение по предложенной схеме, отметили прекращение выпадения волос:
- после 2 недель лечения (20%),
- по окончании лечения (45%),
- через 1 месяц после лечения (75%),
- через 3 месяца после окончания лечения (100%).
Заметное восстановление и улучшение качества волос после курса лечения (1 месяц) отмечалось у 90,6% пациентов. Через 1 месяц после окончания курс лечения у 98,9% пациентов. У 92,6% пациентов через 3 месяца после окончания курса лечения отмечалось заметное усиление роста волос.
Ранжированная оценка клинической эффективности 6 месяцев после окончания лечения показала, что:
- активное выпадение волос прекратилось у 100% пациентов;
- восстановление роста волос наблюдалось у 92,6% пациентов;
- улучшение качества волос (эластичность, блеск, частичное восстановление цвета) наблюдалось у 98,9% пациентов.
Удовлетворенность результатами лечения по 5-балльной интегральной шкале составила 4,3 для пациентов и 4,7 баллов для врачей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Banchereau J. et al. Immunobiology of dendritic cells // Annu Rev Immunol. 2000. 18: 767-811.
2. Bascom C.C. et al. Regulation of epithelial cell proliferation by transforming growth factors. // J. Cell Biochem. 1989. 39 (1): 25-32.
3. Cerami A., Beutler B. The role of cachectin/TNF in endotoxic shock and cachexia // Immunol. Today. 1988. 9: 28-31.
4. Christer S. Angiogenic Gene Therapy. // Drugs of Today. 2002. 38 (12): 819-27.
5. de Waal M. R. et al. Interleukin-10 // Curr Opin Immunol. 1992. 4: 314-20.
6. Ferrara N. Role of vascular enthelial growth factor in the regulation of angiogenesis. // Kidney International. 1999, 56: 794-814.
7. Freedman S.B., Isner J.M. Therapeutic Angiogenesis for Coronary Artery Disease. // Review. Ann. Intern. Med. 2002. 132: 54-71.
8. Fritz J.H. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1 - and NOD2 - activating agonists // Eur J Immunol. 2005. 35: 2459-70.
9. Gene and Cell Therapy. Therapeutic Mechanisms and Strategies. Second Edition, Revised and Expanded. Edited by Nancy Smyth Templeton // Baylor College of Medicine Houston, Texas, U.S.A. NEW YORK - BASEL, 2004.
10. Gillian S. et al. The effects of ageing on wound healing: immunolocalisation of growth factors and their receptors in a murine incisional model // J. Anat. 1997. 190: 351-65.
11. Gordon S., Taylor P.R. Monocyte and macrophage heterogeneity // Nat Rev Immunol. 2005. 5: 953-64.
12. Herbst R.S. Review of epidermal growth factor receptor biology // Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2004. 59: 21-6.
13. Janeway C.A. et al. Immunobiology: The immune system in health and disease, 4th ed. // 1999. P. 405.
14. Isner J.M. et al. Angiogenesis and cardiovascular disease. // Dialogues in Cardiovascular Medicine. 2001. 6 (3).
15. Krieg A.M. et al. Induction of systemic TH1-like innate immunity in normal volunteers following subcutaneous but not intravenous administration of CPG 7909, a synthetic B-class CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonist // J Immunother. 2004. 27: 460-71.
16. Mantell L.L. et al. Hmgb-1 as a therapeutic target for infectious and inflammatory disorders // Shock. 2006. 25: 4-11.
17. Pasare С, Medzhitov R. Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+T cell - mediated suppression by dendritic cells // Science. 2003. 299: 1033-36.
18. Pashenkov M.V. et al. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells // Int Immunopharmacol. 2010. 10: 875-82.
19. Pietcnpol J.A. et al. TGFbl suppression of c-myc gene transcription: role in inhibition of keratinocyte proliferation. // PNAS. 1990. 87 (12): 3758-62.
20. Pietenpol J.A. et al. TGFb1 Inhibition of c-myc transcription and growth in keratiocytes is abrogated by viral transforming proteins with pRB binding domains. // Cell. 1990. 61 (5): 777-85.
21. R. Heise C. et al. Dexpanthenol Modulates Gene Expression in Skin Wound Healing in vivo Skin. // Pharmacol. Physiol. 2012. 25: 241-48.
22. Vlodavsky Cao R. et al. (2003). Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2. // Nature Med. 9 (5): 604-13.
23. Zhang Q. et al. Role of high mobility group box 1 (HMGB1) in wound healing. // J Surg Res. 2012. 176 (1): 343-7.
24. Zlotnik A., Yoshie O. Chemokines: a new classification system and their role in immunity // Immunity. 2000. 12: 121-7.
25. Пащенков M.В. и др. Иммунобиологические свойства мурамилпептидных фрагментов пептидогликана грамотрицательных бактерий // Иммунология. 2010. 31: 119-25.
26. «Правила лабораторной практики» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации №267 от 19.06.2003).
27. «Правила лабораторной практики» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации №707 н от 23.08.2010).
28. «Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. / Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. проф. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С. 41-54.