Способ ранней доклинической диагностики болезни Паркинсона по концентрации катехоламинов в слезной жидкости пациента
METHOD FOR EARLY PRECLINICAL DIAGNOSTICS OF PARKINSON'S DISEASE BY CONCENTRATION OF CATECHOLAMINES IN PATIENT'S LACRIMAL FLUID

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, диагностики болезни Паркинсона на досимптомной (доклинической, или продромальной) стадии.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным системным нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся, в частности, гибелью дофаминергических нейронов нигростриатной системы мозга. БП клинически проявляется через много лет после начала патологического процесса при гибели большей части дофаминергических нейронов черной субстанции, что объясняет существующие ограничения фармакотерапии заболевания [Угрюмов М.В. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2015. Т. 11. С. 4-14.]. Отсюда следует, что важнейшей задачей в этой области техники является разработка ранней (доклинической) диагностики БП, которая позволила бы выявить заболевание до появления первых двигательных симптомов и использовать превентивную нейропротекторную терапию, замедляющую гибель нейронов [Угрюмов М.В. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2015. Т. 11. С. 4-14.].
В последнее время все большее внимание уделяется изучению изменений зрения при БП и приводящих к этому патологических процессов в глазу и вспомогательном аппарате глаза как потенциальных источников периферических биомаркеров БП [Чеснокова Н.Б., Павленко Т.А., Угрюмов М.В. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017. Т. 117. С. 124-131]. Важную роль при этом играет нарушение метаболизма катехоламинов, которые обеспечивают передачу зрительной информации в сетчатке, регулируют скорость аккомодации и внутриглазное давление [Чеснокова Н.Б., Павленко Т.А., Угрюмов М.В. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017. Т. 117. С.124-131]. Кроме того, при БП претерпевают изменения и ткань век, содержащая многочисленные железы, секреторный продукт которых входит в состав слезной жидкости. Конъюнктива, выстилающая внутреннюю поверхность век, и находящиеся в ней железы имеют симпатическую иннервацию [Diebold Y., Rios J.D., Hodges R.R., Rawe I., Dartt D.A. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001. V. 42. P. 2270-2282], дисфункция которой отмечается при БП в рамках мультиситемной дегенерации, затрагивающей как центральные, так и периферические отделы автономной нервной системы [Goldstein D.S. // Compr Physiol. 2013. V. 3. P. 1569-1610].
Метаболические изменения в процессе развития БП отражаются в виде изменения состава биологических жидкостей, в частности, слезы. Сбор слезной жидкости - это несложная неинвазивная процедура, в отличие от взятия крови или ликвора, которые традиционно используются для поиска периферических биомаркеров [Börger M., Funke S., Bähr M., Grus F., Lingor P. // Basal Ganglia. 2015. V. 5. P. 63-69]. Тем не менее, существуют лишь единичные работы, посвященные поиску биомаркеров БП в слезе, причем в них анализируется только ее белковый состав. Так, было показано, что в слезной жидкости больных с БП повышается концентрация фактора некроза опухоли [Çomoğlu S.S., Güven Н., Acar М., Öztürk G., Koçer B. // Neurosci Lett. 2013. V. 553. P. 65-67], увеличивается концентрация олигомерного α-синуклеина [Hamm-Alvarez S.F., Okamoto С.Т., Janga S.R., Feigenbaum D., Edman M.C., Freire D., Shah M., Ghanshani R., Mack W.J., Lew M.F. // Biomark Med. 2019. V. 13. P. 941-952] и, в целом, меняется протеомный профиль [Börger M., Funke S., Leha A., Roser А.Е., Wuestemann А.K., Maass F., Bähr M., Grus F., Lingor P. // Parkinsonism Relat Disord. 2019. V. 63. P. 3-9]. Эти исследования указывают на перспективность поиска биомаркеров БП в слезе. При этом авторы настоящего изобретения предположили, что есть смысл анализировать не только белки, но и низкомолекулярные вещества, вовлеченные в патогенез БП, в частности катехоламины, которые также активно исследуются как потенциальные биомаркеры БП в крови и ликворе [Kim A., Nigmatullina R., Zalyalova Z., Soshnikova N., Krasnov A., Vorobyeva N., Georgieva S., Kudrin V., Narkevich V., Ugrumov M. // Mol Neurobiol. 2019. V. 56. P. 3437-3450].
Данные о том, что биомаркеры, обнаруженные у пациентов после диагностирования БП - на клинической стадии, также характерны для доклинической стадии, до сих пор отсутствовали.
Таким образом, в настоящей области техники существует большая потребность в дешевом, быстром и неинвазивном способе ранней доклинической диагностики БП.
Поэтому авторы настоящего изобретения провели сравнительный анализ изменения концентрации катехоламинов в слезной жидкости у нелеченых больных на ранней стадии БП и у животных на моделях доклинической и клинической стадий этого заболевания.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Учитывая отсутствие доклинической диагностики БП, для ее разработки широко используется поиск биомаркеров в биологических жидкостях у нелеченых больных на ранней клинической стадии. Целью данной работы явился поиск у таких больных маркеров в виде изменения концентрации катехоламинов в слезной жидкости.
Обнаружено, что у нелеченых больных на ранней клинической стадии БП концентрация норадреналина и дофамина увеличена по сравнению с возрастным контролем, что более выражено на стороне появления двигательных симптомов. Напротив, концентрация адреналина в слезной жидкости больных снижена с обеих сторон. Поскольку нет оснований считать, что маркеры, обнаруженные у больных на клинической стадии, характерны также и для доклинической стадии, авторы настоящего изобретения также изучили состав слезной жидкости у мышей на нейротоксических моделях доклинической и клинической стадий БП. В результате исследований было обнаружено, что концентрация норадреналина в слезной жидкости у мышей на модели клинической стадии выше, чем в контроле, а на модели доклинической стадии обнаружена значимая тенденция к ее увеличению. Таким образом, у больных при БП и у мышей при моделировании БП на доклинической и клинической стадиях наблюдаются однонаправленные изменения в составе слезной жидкости, которые могут использоваться как перспективные биомаркеры для разработки ранней доклинической диагностики.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Концентрация катехоламинов в слезной жидкости больных с БП, взятой из глаза на стороне проявления моторных симптомов (ипсилатеральной) и на противоположной (контралатеральной) стороне. * р<0,05, # р<0,15 относительно контрольной группы.
Фиг. 2. Схема методологии проверки биомаркеров.
Фиг. 3. Пройденный путь в тесте «открытое поле» (А) и концентрация дофамина в стриатуме (Б) у контрольных мышей и мышей на моделях доклинической и клинической стадий БП. * р<0,05 относительно контрольной группы, пунктир - порог проявления нарушений моторики.
Фиг. 4. Концентрация норадреналина в слезной жидкости у контрольных мышей и у мышей на моделях доклинической и клинической стадий БП. # р<0,15 относительно контрольной группы.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
При создании настоящего изобретения впервые была измерена концентрация катехоламинов в слезной жидкости у пациентов с БП до начала лечения, и было показано, что концентрация норадреналина и дофамина в слезной жидкости значительно увеличивается у больных по сравнению с контролем того же возраста (фиг. 1). При этом, обнаружена отчетливая асимметрия: повышение концентрации норадреналина и дофамина выражено в большей степени на ипсилатеральной стороне, т.е. на стороне большей выраженности моторных симптомов, по сравнению с контралатеральной стороной. Поскольку статистически достоверные различия в объеме собранных проб отсутствовали, выявленную асимметрию в концентрации дофамина и норадреналина у пациентов с БП нельзя объяснить асимметричной гипокинезией мышц глаз с нарушением оттока слезной жидкости. Тем не менее, обнаруженная авторами настоящего изобретения ассиметрия в изменении концентрации маркеров в слезе хорошо согласуется с представлениями об ассиметричном характере развития БП. Так, при диагностировании БП на ранней клинической стадии пороговая деградация нигростриатной дофаминергической системы и моторные нарушения проявляются только с одной стороны [Djaldetti R., Ziv I., Melamed E. // Lancet Neurol. 2006. V. 5. P. 796-802]. Следует подчеркнуть, что ассиметрия в составе слезы является первым наблюдением проявления ассиметричности развития БП за пределами нигростриатной системы [Djaldetti R., Ziv I., Melamed E. // Lancet Neurol. 2006. V. 5. P. 796-802].
В отличие от норадреналина и дофамина, концентрация адреналина в слезной жидкости у нелеченых больных на ранней клинической стадии БП снижалась как на ипси-, так и на контралатеральной стороне (фиг. 1). Такая реакция похожа на ранее показанное снижение адреналина в плазме крови у больных с БП [Kim A., Nigmatullina R., Zalyalova Z., Soshnikova N., Krasnov A., Vorobyeva N., Georgieva S., Kudrin V., Narkevich V., Ugrumov M. // Mol Neurobiol. 2019. V. 56. P. 3437-3450]. Следует отметить, что источник катехоламинов в слезной жидкости точно не установлен. При этом, известно, что в кровь адреналин попадает из надпочечников, а норадреналин и дофамин - преимущественно из окончаний симпатических норадренергических нейронов [Goldstein D.S., Eisenhofer G., Kopin I.J. // J Pharmacol Exp Ther. 2003. V. 305. P. 800-811]. Вероятно, обнаруженные в слезе катехоламины, имеют такое же происхождение.
Обнаруженные изменения в концентрации катехоламинов в слезной жидкости у больных не могли быть использованы для разработки ранней диагностики, поскольку всегда существует риск того, что выявленные у больных на клинической стадии биомаркеры отсутствуют на доклинической стадии заболевания. В связи с этим, особую ценность приобретает экспериментальное моделирование БП, поскольку с его помощью можно воспроизвести обе стадии заболевания [Угрюмов М.В. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2015. Т. 11. С. 4-14; Ugrumov M.V., Khaindrava V.G., Kozina Е.А., Kucheryanu V.G., Bocharov E.V., Kryzhanovsky G.N., Kudrin V.S., Narkevich V.B., Klodt P.M., Rayevsky K.S., Pronina T.S. // Neuroscience. 2011. V. 181. P. 175-188]. Так, исходя из созданной нами общей методологии совпадение биомаркеров, обнаруженных у больных и у животных на модели клинической стадии БП, свидетельствует о корректном воспроизведении патогенеза этого заболевания по соответствующим метаболическим путям (фиг. 2). Некоторые из них можно считать биомаркерами доклинической стадии БП, если они выявляются и у животных на модели доклинической стадии [Kim А., Nigmatullina R., Zalyalova Z., Soshnikova N., Krasnov A., Vorobyeva N., Georgieva S., Kudrin V., Narkevich V., Ugrumov M. // Mol Neurobiol. 2019. V. 56. P. 3437-3450].
Важной особенностью БП является то, что для нее точно определен пороговый уровень нейродегенерации, после которого возникают двигательные симптомы: это гибель 50-60% тел дофаминергических нейронов в черной субстанции, потеря 70-80% аксонов дофаминергических нейронов в стриатуме и, соответственно, снижение концентрации дофамина в стриатуме на 70-80% по сравнению с контролем [Угрюмов М.В. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2015. Т. 11. С. 4-14].
Как следует из представленных результатов, у мышей через 2 недели после двукратного введения 8 мг/кг МФТП не были обнаружены изменения в тесте «открытое поле», а концентрация дофамина в стриатуме снизилась на 65,6% (фиг. 3). В свою очередь, у животных, получавших четыре инъекции по 10 мг/кг МФТП, показатель пройденного пути снизился почти в два раза, а концентрация дофамина в стриатуме упала на 83,3% (фиг. 3). Таким образом, воспроизведенные в данной работе модели доклинической и ранней клинической стадии БП у мышей полностью соответствуют ключевым параметрам патогенеза БП.
Концентрация норадреналина в слезной жидкости мышей проявляла тенденцию (р<0,15) к повышению на 57,6% на модели доклинической стадии БП и на 111% - на модели клинической стадии БП по сравнению с контролем (фиг. 4). Концентрация адреналина и дофамина была ниже предела обнаружения метода, что скорее всего связано с ограниченным объемом собранных проб (1-2 мкл). Существуют способы стимулировать слезотечение у животных с помощью холиномиметиков [Karn R.C., Laukaitis С.М. // Proteomes. 2015. V. 3. Р. 283-297], однако известно, что состав слезной жидкости при стимуляции значительно меняется [Stuchell R.N., Feldman J.J., Farris R.L., Mandel I.D. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984. V. 25. P. 374-377]. Соответственно, авторы настоящего изобретения установили, что снижение концентрации адреналина и повышение концентрации дофамина в слезной жидкости пациентов на ранней стадии БП достоверно являются специфичными биомаркерами для ранней диагностики БП, хотя до установления корреляции результатов, полученных по этим маркерам на людях и на мышах, авторы предложили бы считать их вспомогательными.
Сравнение изменений, обнаруженных в слезной жидкости у больных при БП и у мышей на экспериментальных моделях БП, показало, что во всех трех случаях наблюдается повышение концентрации норадреналина в сравнении с контролем (табл. 1).
Таким образом, у больных при БП и у мышей при моделировании БП на доклинической и клинической стадиях обнаружено повышение концентрации норадреналина в слезной жидкости, которое оказалось наиболее перспективным и специфичным биомаркером для ранней доклинической диагностики БП.
Итак, настоящее изобретение относится к способу ранней доклинической диагностики болезни Паркинсона, предусматривающему следующие стадии:
а) измерение в слезной жидкости у пациента без нарушения двигательной функции концентрации одного или нескольких биомаркеров, выбранных из норадреналина, адреналина и дофамина, и
б) сравнение измеренной концентрации одного или нескольких биомаркеров с соответствующим пациенту возрастным контролем,
причем значимое повышение концентрации норадреналина и/или снижение концентрации адреналина и/или повышение концентрации дофамина в слезной жидкости пациента по сравнению с контролем позволяет диагносцировать у пациента раннюю доклиническую стадию болезни Паркинсона.
Таким образом, техническим результатом создания настоящего изобретения является удовлетворение существующей в современной медицине потребности в дешевом, быстром и неинвазивном способе ранней доклинической диагностики болезни Паркинсона до развития двигательных симптомов в результате декомпенсированной гибели дофаминергических нейронов в головном мозге. При постановке такого диагноза указанным способом пациент может быть направлен для подтверждения диагноза на дополнительное обследование более времязатратными, дорогими и сложными методами, такими как позитронно-эмиссионная томография.
Примеры
Пациенты с БП и контрольная группа
Для анализа были использованы пробы слезной жидкости, взятые у 26 пациентов с диагнозом БП на 1-2 стадиях по Hoehn-Yahr до начала противопаркинсонической терапии и у людей соответствующего возраста без двигательных нарушений. Все пациенты дали письменное согласие на проведение исследования.
Диагноз БП был поставлен в соответствии с клиническими диагностическими критериями Международного общества изучения двигательных расстройств 2015 года (MDS-2015). В контрольную группу отбирались люди того же возраста без неврологических болезней. В исследование не включались пациенты с офтальмологическими заболеваниями. Ключевые клинические характеристики когорт представлены в табл. 2.
4
Сбор слезной жидкости у пациентов проводили утром с помощью стерильной фильтровальной бумаги (шириной 5 мм), которую закладывали за нижнее веко - как при проведении теста Ширмера. Слезная жидкость собиралась путем естественной сорбции на тест-полоску в отсутствии стимуляции слезотечения в течение 5 мин. Длину намокшей части полоски измеряли для расчета объема собранной пробы, после чего помещали полоски в пробирки с 0,1н HClO, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.
Животные
В работе использовали 30 самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяцев и массой 22-26 г (питомник «Пущино»). Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. Для моделирования БП на доклинической стадии проводили двукратное подкожное введение 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) (Sigma, США) в разовой дозе 8 мг/кг, для моделирования БП на клинической стадии - четырехкратное подкожное введение МФТП в разовой дозе 10 мг/кг. Интервал между инъекциями в обоих случаях составлял 2 часа [Ugrumov M.V., Khaindrava V.G., Kozina Е.А., Kucheryanu V.G., Bocharov E.V., Kryzhanovsky G.N., Kudrin V.S., Narkevich V.B., Klodt P.M., Rayevsky K.S., Pronina T.S. // Neuroscience. 2011. V. 181. P. 175-188]. Контрольная группа получала 0,9% NaCl по аналогичной схеме.
Через 2 недели после введения МФТП или 0,9% NaCl мышей оценивали по показателю пройденного пути в тесте «открытое поле» с помощью установки для анализа поведения животных PhenoMaster (TSE Systems, Германия). Далее у животных, находящихся под изофлурановым наркозом, собирали слезную жидкость с помощью полосок из фильтровальной бумаги шириной 2,5 мм, аналогичных полоскам Ширмера.
После сбора слезной жидкости анестезированных мышей декапитировали и из мозга выделяли дорсальный стриатум согласно ранее описанной методике [Ugrumov M.V., Khaindrava V.G., Kozina Е.А., Kucheryanu V.G., Bocharov E.V., Kryzhanovsky G.N., Kudrin V.S., Narkevich V.B., Klodt P.M., Rayevsky K.S., Pronina T.S. // Neuroscience. 2011. V. 181. P. 175-188]. Пробы стриатума взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ-анализ)
4
Измерение концентрации катехоламинов (норадреналина, адреналина и дофамина) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД). Пробы гомогенизировали с помощью ультразвукового гомогенизатора Labsonic М (Sartorius, Франция) в 200 мкл 0,1н HClO (Sigma, США), содержащих внутренний стандарт 3,4-дигидроксибензиламин (ДГБА, Sigma) в концентрации 25 пмоль/мл, после чего центрифугировали 20 мин при 2000g.
ВЭЖХ-разделение осуществляли на обращенно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4×100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, Германия) при температуре +30°С и скорости подвижной фазы 1,2 мл/мин, поддерживаемой жидкостным хроматографом LC-20ADsp (Shimadzu, Япония), согласно описанной ранее методике [Ким А.Р., Павленко Т.А., Катаргина Л.А., Чеснокова Н.Б., Угрюмов М.В. // Acta Naturae. 2018. Т. 10. С. 67-72].
Статистика
Данные ВЭЖХ представлены в виде среднего в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего. Поскольку БП у людей развивается асимметрично, в группе больных данные были перегруппированы на соответствующие ипсилатеральной стороне (пробы слезной жидкости, собранной из глаза на стороне начала и большей тяжести двигательных симптомов) и контралатеральной стороне (пробы, собранные из глаза на стороне, где двигательные симптомы отсутствовали или были выражены минимально). В контрольной группе и у экспериментальных животных данные, полученные при анализе слезной жидкости правого и левого глаза, усредняли.
Нормальность полученных данных проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистический анализ результатов проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента или непараметрического критерия Манна-Уитни в программном пакете GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США). Критерием значимости было р≤0,05.