Ингибирование экспрессии активирующего рецептора NK-клеток NKG2D рекомбинантным белком mica

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

Пригодность и надежность аналитической методики, используемой при оценке качества лекарственных средств, подтверждается ее специфичностью, чувствительностью, диапазоном аналитической области, устойчивостью, линейностью, достоверностью и прецизионностью. Устойчивость аналитической методики определяется как способность сохранять найденные для нее в оптимальных условиях характеристики при вероятных небольших отклонениях от этих условий проведения анализа. Согласно положениям ГФ XIII, устойчивость должна изучаться в тех случаях, когда методика основана на использовании особо чувствительных к внешним условиям методов анализа, однако не является обязательной характеристикой для всех методик количественного определения. Методики определения биологической (специфической) активности характеризуются особой чувствительностью к изменению внешних условий, что обусловлено участием в испытаниях различных биологических объектов, таких как культуры клеток, экспериментальные животные и др. Анализ факторов, влияющих на устойчивость аналитических методик определения биологической (специфической) активности биотехнологических лекарственных препаратов, показал, что результаты количественного определения при проведении испытаний на культурах клеток зависят от условий восстановления клеточной культуры, жизнеспособности клеток, концентрации клеточной суспензии, числа пассажей культуры клеток, условий и продолжительности хранения клеточной суспензии до момента использования в испытании, условий и продолжительности хранения питательных сред и растворов, продолжительности и условий инкубации на разных этапах проведения испытания, диапазона и шага разведения образцов, критериев пригодности, качества реактивов и материалов. Для указанных факторов должны быть определены диапазоны значений, в пределах которых их влияние на результаты анализа исключено, а также установлены критические условия и параметры, отклонение от которых недопустимо. При проведении испытаний in vivo важен выбор вида и линии животных, возраста, пола, массы тела, условий содержания, поставщика лабораторных животных и др. Особое внимание следует уделять установлению четких критериев приемлемости результатов испытания, а также использованию аттестованных стандартных образцов, положительного и отрицательного контроля. Все условия выполнения методики должны быть четко отражены в документах, регламентирующих проведение испытаний по оценке качества лекарственных препаратов по показателю «Специфическая (биологическая) активность».

Учитывая особую чувствительность биологических объектов, изучение устойчивости должно быть обязательным при подтверждении пригодности методов оценки специфической активности биотехнологических лекарственных средств. Это особенно важно на этапе разработки препаратов, оценки их качества, выбора метода для обоснования включения в спецификацию, что в конечном итоге должно обеспечить высокий уровень качества указанной группы препаратов при их внедрении и дальнейшем использовании в практической медицине.

ИНГИБИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ АКТИВИРУЮЩЕГО РЕЦЕПТОРА NK-КЛЕТОК NKG2D РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКОМ MICA

Лысюк Е.Ю.1' 2, Шуленина Е.А.3, Посвятенко А.В.1, 2 4, Кибардин А.В.1, 2, Абакушина Е.В.5

1 Институт биологии гена РАН, Москва, Россия

2 Национальный научно-практический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, Москва, Россия

3 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва, Россия

4 ФГБОУ«Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия

5 Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения РФ, Обнинск, Россия

Одним из важных активирующих рецепторов NK-клеток является рецептор NKG2D, необходимый для обнаружения и уничтожения трансформированных и инфицированных клеток. Лигандами для NKG2D являются, в том числе, стресс-индуцируемые неканонические молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса MICA/B. Эти белки отсутствуют или слабо экспрес-сируются в большинстве нормальных клеток, в то время как в опухолевых и инфицированных вирусами клетках их количество существенно повышено. Взаимодействие NKG2D с молекулами MIC играет важную роль в регуляции противоопухолевых иммунных реакций и может способствовать ускользанию опухолевых клеток от иммунного надзора.

Цель. Оценка блокирующего эффекта растворимого рекомбинантного человеческого белка MICA (rhsMICA) на активирующий рецептор цитотоксических лимфоцитов человека NKG2D. Для этого оценивали фенотипиче-ские изменения лимфоцитов крови человека при кратковременном воздействии на них различных концентраций rhsMICA.

Материалы и методы. Исследование проводили на лимфоцитах периферической крови 12 здоровых доноров. Периферическую кровь выделяли в градиенте плотности фиколла (r = 1,077, GE Healthcare) фракцию мононукле-арных клеток (ПМК) обрабатывали различными концентрациями рекомбинантного MICA человека (rhsMICA, ЗАО «Протеинсинтез», Россия) в течение 30 минут, в качестве контроля использовали ПМК, инкубировавшиеся в тех же условиях, но без добавления rhsMICA. В обработанных и контрольных ПМК оценивали субпопуляци-онный состав T- и NK-лимфоцитов, для чего проводили цитофлуориметрический анализ клеток, окрашенных антителами к CD3, CD56, CD16, CD314 (NKG2D), CD25, CD69, анализ проводили на проточном цитофлуориметре FC 500 MPL (Beckman Coulter).

Результаты. Обработка ПМК различными концентрациями MICA (5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 нг/мл и 100 пг/мл) не влияла на количество CD3-CD56+ NK-клеток (8,2±7,2%, 9,0±4,7%, 11,2±6,9 и 14,2±6,4% соответственно против 11,2±5,6% в контроле). В то же время инкубация с MICA 5 мкг/мл существенно снижала долю NKG2D+NK-клеток (33,7±20,7% по сравнению с 51,9±19,5% в контроле, p < 0,05). Количество NKG2D+ NK-клеток при инкубации

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Иммуномодуляторы эндогенной и экзогенной природы Immunomodulators of endogenous and exogenous nature

с меньшими концентрациями MICA не отличалось от таковых в контроле (48,1±10,5%, 60,3±19,3% и 58,7±19,2% для MICA 1 мкг/мл, 10 нг/мл и 100 пг/мл соответственно), хотя во всех случаях достоверно (p < 0,05) отличалось от лимфоцитов, инкубировавшихся с MICA 5 мкг/мл. Кроме донорских ПМК, оценивали экспрессию этих маркеров в ПМК, активированных in vitro коктейлем ци-токинов (IL-2, IL-15) в течение 3 дней. В этом случае доля NKG2D+ NK-клеток составляла 84% и не наблюдалось снижения их количества при кратковременной обработке различными концентрациями MICA. При оценке ак-тивационного статуса ПМК доноров было обнаружено, что обработка MICA 5 мкг/мл вдвое увеличивала количество NK-клеток, несущих одновременно маркеры ранней и поздней активации (CD16+CD69+CD25+): 35,7±22,2% по сравнению с 17,1±16,4% в контроле. Обработка более низкими концентрациями MICA также увеличивала количество активированных NK-клеток, хотя и в меньшей степени.

Заключение. Показано, что кратковременная обработка лимфоцитов rhsMICA приводит к активации цито-токсических лимфоцитов и одновременно значительно снижает экспрессию на них рецептора NKG2D, при этом изменения носят дозозависимый характер. В то же время после активации цитокинами лимфоциты становятся, по всей видимости, более устойчивыми к ингибирующе-му воздействию rhsMICA, в результате чего значимого снижения экспрессии NKG2D на активированных NK-клетках не происходит. Данный факт дает предпосылки к использованию активированных NK- клеток для адоптивной иммунотерапии онкологических больных с MICA-позитивными опухолями.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации №НШ-9069.2016.4.

КОРРЕКЦИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ВАКЦИНАЦИИ

Медуницын Н.В., Олефир Ю.В., Меркулов В.А.

Научный центр экспертизы средств медицинского применения Министерства здравоохранения РФ. Москва, Россия

Предполагается, что со временем иммунная система людей стала слабее реагировать на разные патогенны. Причинами такой слабости иммунной системы являются неблагоприятные условия жизни населения, урбанизация, широкое применение антибиотиков, ослабление естественной иммунизации людей циркулирующими в среде микроорганизмами, частые случаи врожденной и приобретенной иммунологической недостаточности. Иммунная система ребенка недостаточно развита, хотя в течение первого года жизни ему вводят до двух десятков доз разных вакцин. Это мера вынужденная, учитывая высокую инфекционную заболеваемость в раннем детском возрасте.

Существующий порядок вакцинации с усредненными дозами вакцин и жесткими схемами их введения уравнивают условия иммунизации граждан и рассчитаны на среднего по иммунологической активности человека. Иммунологические особенности отдельных лиц и наличие у людей многочисленных вариантов иммунного ответа на одну и ту же вакцину свидетельствуют о необходи-

мости разработки принципов и методов персонализации вакцинации.

Среди вакцинированных всегда имеются группа лиц, не отвечающих на вакцину или слабо реагирующих на нее. Эта группа требует особого внимания, во многих случаях она является источником формирования бактерионосительства (вирусоносительства) и поддержания инфекционной заболеваемости. В первую очередь индивидуальную вакцинацию следует распространить на группы лиц повышенного риска, иммунитет которых после вакцинации в большом проценте случаев не достигает защитного уровня.

Коррекцию вакцинации можно проводить с помощью подбора вакцин (живые, убитые, расщепленные, субъединичные), выбора доз и схем введения вакцин или дополнительной стимуляции иммунного ответа. Для повышения иммуногенности вакцин применяют адъюван-ты, средства доставки вакцин и носители, конъюгирован-ные с антигеном.

Вторую группу составляют лица с очень высокой иммунологической реакцией на конкретную вакцину, такие лица не нуждаются в повторном введении того же антигена, так как гипериммунизация имеет свои отрицательные стороны.

В идеале иммунологическая коррекция вакцинации может обеспечить формирование достаточного иммунитета у каждого прививаемого человека. Благодаря внедрению методов иммунологической коррекции лица, не отвечающие на вакцины, и слабо реагирующие лица, будут защищены от инфекций, а другая часть населения будет избавлена от излишней иммунизации.

Персонализация вакцинации ускорит развитие коллективного иммунитета, повысит эффективность проводимых мероприятий по вакцинопрофилактике и решит многие вопросы медицинской этики, связанные с вакцинацией. Все изменения порядка вакцинации в связи с ее индивидуализацией должны быть обоснованы и утверждены в установленном порядке.

ОТНОСИТЕЛЬНОСТЬ УСПЕХА ПРИ ИММУНОТЕРАПИИ IL-2 В СПОНТАННОЙ МОДЕЛИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ IN VIVO

Моисеева Е.В., Семушина С.Г., Аронов Д.А.

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия

Введение. Результаты иммунотерапии интерлей-кином-2 (ИТ-Ш-2) являются противоречивыми как в клинике рака молочной железы (РМЖ), так и в эксперименте. Ранее мы показали, что после однократного локально применения IL-2 (2,5 х 106 ME, высокая доза, ВД) улучшалось выживание мышей в различных перевиваемых мышиных моделях РМЖ с коротким латентным периодом (видимое проявление в течение 2-х нед. после перевивки). Далее мы разработали критерии оценки эффективности ИТ-Ш-2 в спонтанной модели РМЖ BLRB, выделяя субклиническую (пальпируемые опухоли до 4 мм в диаметре) и клиническую (более 4 мм) стадии прогрессии индивидуальной спонтанной опухоли. Момент перехода считали точкой клинического проявления опухоли (КПО), после КПО различали быстрый и медленный рост. Опухоли, которые в течение 2-х нед. и дольше находились на субклинической стадии роста,