ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДНЫХ СЕМЯН ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР
PRODUCTION OF HYBRID SEEDS OF CEREAL CROPS

Настоящее изобретение относится к способу получения гибридных семян, в частности гибридных семян зерновых культур, и к новому применению инструментов и/или химических веществ, в частности, гербицидов, в данном контексте.
Предпосылки создания изобретения
Получение гибридных семян зерновых культур является основной проблемой для компаний по производству семян, в частности, для всех типов пшеницы, ячменя и риса, однако для любых других сельскохозяйственных культур, размножающихся семенами, в том числе сельскохозяйственных культур, например, тритикале, видов овса, проса или ржи, из настоящего изобретения также может быть извлечена польза.
Гибридную пшеницу можно получить при помощи химического средства для гибридизации (СНА). Мужские и женские растения высевают полосами, при этом часто, но не всегда, мужские растения являются более высокими, чем женские растения, для обеспечения лучшего распространения пыльцы. СНА применяют для предотвращения образования пыльцы на женских растениях. Единственным коммерчески применяемым СНА является CROISOR 100 от SAATEN-UNION.
Ту же самую производственную систему высевания полосами или рядами можно применять по отношению к растениям с мужской стерильностью (женским), полученным в результате применения генетических признаков ядерной мужской стерильности или цитоплазматической мужской стерильности совместно с применением восстановителя(восстановителей) для получения фертильных гибридных семян. Эти признаки могут проистекать из естественных технологий или технологий GMO и из одного или нескольких генов.
Оба из этих типов систем подразумевают применение высевания мужских и женских растений полосами или рядами. Можно применять различные доли, и даже в случае, если площадь полос или рядов мужских растений меньше, чем для полос или рядов женских растений, доля женских растений обычно не будет превосходить две трети от всех растений. Кроме того, распространение пыльцы можно не оптимизировать, а урожай необходимо убирать таким образом, чтобы предотвратить сбор донора пыльцы вместе с гибридными семенами.
У ячменя система получения гибридов была описана Syngenta, при этом высевали простую смесь из 95% семян женских растений и 5% семян мужских растений. Урожай содержит достаточно гибридных семян для того, чтобы соответствовать требованиям к коммерциализации гибридов. Кроме того, высевание более высокой процентной доли мужских растений должно повышать выход гибридных семян, однако при этом также будет увеличиваться доля семян мужских растений в собранных семенах. Кроме того, выращивание гибридных семян при помощи данной системы смешанного насаждения, где 95% семян являются семенами женских растений, в противоположность системе выращивания в полосах, где, например, лишь две трети являются семенами женских растений, должно повышать эффективность производства гибридных семян на единицу площади.
Если мужские и женские растения высевают по типу смешанного насаждения, то урожай содержит семена, образующиеся на стерильных женских растениях, опыляемых мужскими растениями, и семена самоопыляемых мужских растений. Удаление семян с мужской родительской особи при получении гибридов можно достичь несколькими путями. Можно применять фенотипический маркер для удаления всех или части семян самоопыляемых мужских растений. Применение маркера окраски при получении гибридных семян с применением цитоплазматической мужской стерильности описано в US 3842538. Применение маркера синей окраски семян описано у Zong-Jun Pu et al (2005). Исследования по скрещиванию линий с доминантной карликовостью и ядерной мужской стерильностью с маркером синей окраски семян у мягкой пшеницы описаны в Wheat Information Services Number 99: 46-50. В WO 2012/038350 описано применение света ближней инфракрасной области спектра для проведения отбора между семенами гибридов и гомозиготных растений на основании фенотипических различий. Применение системы, такой как эти маркеры семян, подразумевает интрогрессию гена(генов) соответствующего фенотипического маркера в применяемый генетический материал.
th
Карликовые растения пшеницы с мужской стерильностью, а также их применение в рекуррентной селекции пшеницы описаны в работе Yang et al., (2009): A revolutionary Breeding Approach to wheat, Q.Y. Shu (ed), Induced Mutation in the Genomics Era. Food and agriculture organization of the United Nations, Rome, p370-372. Этот способ имеет название "техническая система применения карликовых растений пшеницы с мужской стерильностью". Согласно данному способу смесь карликовых растений с мужской стерильностью и высокорослых мужских растений высевают с целью улучшения опыления. Подобные подходы представлены в другой работе, Cao W. et al., 2008, А molecular marker closely linked to the male sterile Ms2 gene in common wheat (Triticum aestivum), 11 international wheat genetic symposium proceeding, p1-3, в которой говорится, что если ген мужской стерильности Ms2 Taigu был клонирован и сцеплен с геном устойчивости к гербицидам, то его можно было применять для получения коммерческих сортов гибридной пшеницы в случае, когда восстановитель фертильности становился доступным.
Цели изобретения
До сих пор существует потребность в способе эффективного получения гибридных семян, в частности, зерновых культур, в том числе пшеницы и ячменя.
Таким образом, целью настоящего изобретения является представление нового способа, обеспечивающего эффективное и экономически выгодное получение гибридных семян.
Другой целью является представление такого способа, который позволяет получать гибридные семена, которые соответствуют нормативным требованиям, в частности, таковым Европейской системы сертификации, к уровню гибридности, который в настоящее время определен на уровне 90% для пшеницы, ячменя, рапса, тритикале и риса.
Другой целью является представление такого способа, который позволяет эффективно получать гибридные семена с надлежащей или повышенной урожайностью на единицу площади используемой земли.
Другой целью является представление такого способа, который позволяет получать гибридные семена с использованием повышенной доли семян мужских растений, в частности, доли, превышающей 5% относительно семян с мужской стерильностью от всех семян родительских растений.
Еще одной целью является представление такого способа, который позволяет получать в урожае меньше семян мужских растений, чем было посеяно, то есть снижать долю семян мужских растений в урожае по сравнению с тем, что было высеяно.
Краткое описание изобретения
Способ согласно настоящему изобретению основан на применении растений с мужской фертильностью (образующих пыльцу для опыления женских растений (с мужской стерильностью)), являющихся более высокорослыми, чем женские растения (с мужской стерильностью), которое обеспечивает возможность крупномасштабного уничтожения более высокорослых фертильных мужских растений после опыления женских растений при помощи легкого в осуществлении способа, основанного на применении механических и/или химических средств. Кроме того, способ воздействует на основной побег и более высокорослые вторичные побеги мужских растений, которые являются более высокорослыми, чем женские растения, однако более низкорослые или вторичные побеги также могут подвергаться воздействию химической обработки мужских растений, даже если эти побеги не находились в непосредственном контакте с химическим веществом.
Способ основан на использовании различия в высоте между фертильными мужскими и женскими растениями путем отбора мужских растений, которые являются более высокорослыми, чем соответствующие женские растения, в том числе, например, при применении пшеницы с одной мутацией или несколькими мутациями гена rht, при этом женское растение является более низкорослым, чем мужское растение. Мужские и женские растения можно высевать в виде смеси или сеять близко расположенными рядами или бороздами, и после цветения мужские растения можно избирательно уничтожать, например, путем применения машины для уборки сорняков или эквивалентного физического/механического устройства, связанного или не связанного с применением гербицида. Дополнительный отбор семян можно выполнять для устранения нежелательных семян мужских растений из получаемого семенного фонда. Под "семенным фондом" в контексте настоящего изобретения подразумевают число собранных семян.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения гибридных семян, в частности, гибридных семян зерновых культур, включающий скрещивание насаждения более низкорослых женских растений (с мужской стерильностью) (более низкорослых, чем фертильные растения) с насаждением более высокорослых фертильных растений (более высокорослых, чем женские растения). Способ включает ограничение доли семян самооплодотворяемых мужских растений в конечном получаемом семенном фонде. Ограничение доли семян самооплодотворяемых мужских растений включает по меньшей мере однократное пропускание инструмента, проходящего выше высоты более низкорослых женских растений, но ниже уровня высоты более высокорослых растений с мужской фертильностью, между периодом цветения, предпочтительно окончанием периода цветения, и сбором урожая. Инструмент предназначен для предотвращения или ослабления нормального развития этих растений с мужской фертильностью, превышающих эту высоту. Инструмент приходит в контакт с такими растениями с мужской фертильностью, которые превышают эту высоту, и обуславливает предотвращение или ослабление их нормального развития.
Настоящее изобретение также относится к способу получения гибридных семян зерновых культур с поля, содержащего насаждение более низкорослых женских опыленных растений (с мужской стерильностью) и насаждение более высокорослых растений с мужской фертильностью, при этом способ включает пропускание инструмента, проходящего выше высоты более низкорослых женских растений, между периодом цветения, предпочтительно окончанием периода цветения, и сбором урожая, при этом при помощи инструмента в отношении более высокорослых растений с мужской фертильностью применяют механическое действие и/или химическое вещество, посредством чего развитие растений с мужской фертильностью, превышающих эту высоту, предотвращают или ослабляют.
С помощью способа эту долю семян самооплодотворяемых мужских растений в конечном получаемом семенном фонде ограничивают пороговой величиной, предпочтительно величиной, соответствующей нормативному уровню гибридности.
В частности, с помощью способа ограничивают развитие семян на мужских растениях после опыления женских растений с целью снижения или устранения доли семян самооплодотворяемых мужских растений в конечном получаемом семенном фонде. Семена самооплодотворяемых мужских растений, которые могут быть получены, можно дополнительно устранять или подвергать снижению количества во время сбора урожая. Кроме того, долю мужских растений можно устранять с соломой во время сбора урожая, например, при использовании уборочной машины.
Настоящее изобретение также относится к применению инструмента, такого как машина для уборки сорняков, с помощью которого применяют химическое вещество, предпочтительно гербицид, и/или к применению химического вещества, например гербицида, предпочтительно гербицида, который является системным, для предотвращения или ослабления нормального развития более высокорослых фертильных растений между периодом цветения, предпочтительно окончанием периода цветения, и сбором урожая на поле, содержащем более низкорослые женские растения (с мужской стерильностью) и более высокорослые фертильные растения, для получения гибридных семян, в частности, гибридных семян зерновых культур, где химическое вещество, например гербицид, применяют по меньшей мере однократно в отношении более высокорослых фертильных растений, выступающих по высоте над более низкорослыми женскими растениями, между периодом цветения и сбором урожая. Инструмент применяют после опыления.
Настоящее изобретение также относится к применению инструмента, такого как машина для уборки сорняков, с помощью которого применяют химическое вещество, предпочтительно гербицид, и/или к применению химического вещества, например гербицида, предпочтительно гербицида, который является системным, для предотвращения или ослабления образования семян самооплодотворяемых растений фертильными растениями между периодом цветения, предпочтительно окончанием периода цветения, и сбором урожая на поле, содержащем более низкорослые женские растения (с мужской стерильностью) и более высокорослые фертильные растения, для получения гибридных семян зерновых культур, в частности, гибридных семян зерновых культур, где химическое вещество, например гербицид, применяют по меньшей мере однократно в отношении более высокорослых фертильных растений, выступающих по высоте над более низкорослыми женскими растениями, между периодом цветения и сбором урожая. Инструмент применяют после опыления.
Эти пути применения предназначены для ограничения доли семян самооплодотворяемых мужских растений в конечном получаемом семенном фонде, в частности, пороговой величиной, предпочтительно величиной, соответствующей нормативному уровню гибридности.
Способ относится к получению гибридной пшеницы, но не ограничен получением гибрида из двух инбредных родительских линий, при этом данный способ также следует применять для получения сложных гибридов: трехлинейных гибридов, двойных гибридов и т.п.
Подробное описание изобретения
Скрещивание женских растений (с мужской стерильностью) и растений с мужской фертильностью включает первоначальное высевание семян обоих популяций в непосредственной близости для обеспечения высокого уровня перекрестного опыления. Одним из преимуществ настоящего изобретения является обеспечение возможности смешанного высевания или высевания в близко расположенных рядах или другого способа высевания, "близкого к смешанному высеванию", при этом обеспечивается ограничение количества нежелательных семян в конечном урожае, при этом даже повышается относительное число фертильных растений и доступность пыльцы во время скрещивания.
Согласно первому варианту осуществления скрещивание женских растений (с мужской стерильностью) и растений с мужской фертильностью включает высевание семян в виде смеси. Согласно этому варианту осуществления смесь семян женских растений (с мужской стерильностью) и растений с мужской фертильностью высевают в соответствующем соотношении.
Согласно второму варианту осуществления скрещивание женских растений (с мужской стерильностью) и растений с мужской фертильностью включает посев семян женских растений (с мужской стерильностью) и семян растений с мужской фертильностью в отдельных рядах или бороздах. Предпочтительно, семена женских растений (с мужской стерильностью) и семена растений с мужской фертильностью сеют параллельно. В качестве альтернативы, семена мужских и женских растений высевают последовательно в одном и том же или "общем" ряду. Также возможно высевать мужские и женские растения с использованием нескольких рядов или борозд одного сорта, затем нескольких рядов или борозд другого сорта и т.д., при этом "несколько" предпочтительно сохраняется на низком уровне для обеспечения "близкого расположения", в частности, состоит из 2 или более борозд одного и того же сорта семян.
Ограничение количества мужских растений в семенном фонде включает пропускание инструмента, проходящего выше высоты более низкорослых женских растений, но ниже уровня высоты более высокорослых растений с мужской фертильностью.
Согласно предпочтительному варианту осуществления в инструменте применяется химическое вещество, предпочтительно гербицид, или имеется средство для его применения по отношению к более высокорослым мужским растениям, предпочтительно при вступлении в контакт с растениями, выступающими по высоте над более низкорослыми женскими растениями. Согласно другому варианту осуществления инструмент срезает более высокорослые мужские растения выше высоты более низкорослых женских растений. В качестве примера используют "машину для уборки сорняков", которая представляет собой устройство, содержащее горизонтальную полосу или опору, которое является подвижным, предпочтительно приводится в движение двигателем или закреплен на средстве передвижения, приводимом в движение двигателем. Высота, на которой расположена полоса, предпочтительно является регулируемой для того, чтобы пользователь регулировал ее высоту по отношению к высоте растений, предпочтительно мог ее изменять при прохождении по сельскохозяйственной культуре. Полоса или опора предпочтительно предназначена для доставки химического вещества, предпочтительно гербицида, растениям, вступающим в контакт в полосой или опорой. Например, полоса или устройство содержит валик, или кисть, или трос, или губку, или лезвие и/или им подобные и химическое вещество, предпочтительно гербицид, который вытекает из них струйкой или пропитывает их. Машины для уборки сорняков, применимые в настоящем изобретении или приспосабливаемые к настоящему изобретению, описаны в литературе, например: СА 2313068, GB 2305590, US 4485588, WO 95/21524, WO 83/00601, ЕР 058612, US 4332107, US 4208835, AU 2006203431.
Альтернативой может быть применение режущего инструмента, например, жатвенной машины с очень высоким уровнем подрезания для удаления исключительно более высокорослых мужских растений, или, например, наряду с применением устройства для удаления метелок кукурузы. Инструмент является подвижным, предпочтительно приводится в движение двигателем или закреплен на средстве передвижения, приводимом в движение двигателем. Высота, на которой расположен режущий инструмент, предпочтительно является регулируемой для того, чтобы пользователь регулировал ее высоту по отношению к высоте растений, предпочтительно мог ее изменять при прохождении по сельскохозяйственной культуре.
Согласно одному варианту осуществления инструмент, такой как машина для уборки сорняков или режущий инструмент, приводится в движение двигателем и имеет средство для автоматической регулировки своей высоты по отношению к высоте растений при прохождении по сельскохозяйственной культуре. Такое средство содержит датчики для выявления высоты женских и/или мужских растений и для регулировки своей высоты в зависимости от данных, получаемых при помощи датчиков.
Семена согласно настоящему изобретению можно высевать в виде смеси с 5% или более, предпочтительно приблизительно 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% или 5%, семян мужских растений. Также их можно сеять рядами или бороздами при соблюдении этой доли.
Это соотношение при высевании или скрещивании семян или растений с мужской фертильностью по отношению к семенам женских растений или женским растениям (с мужской стерильностью) может варьировать от приблизительно 5%/приблизительно 95% до приблизительно 50%/приблизительно 50%. При применении точных сельскохозяйственных инструментов это соотношение и другие параметры, например, плотность высевания, можно непрерывно регулировать на поле для получения гибридов для обеспечения наилучшего выхода гибридных семян согласно почвенным и другим данным об окружающей среде.
Настоящее изобретение можно применять, в частности, к зерновым культурам, в частности, к видам овса, пшенице, ячменю, рису, спелые, тритикале, просу, ржи или рапсу. Настоящее изобретение охватывает гибридные автогамные зерновые культуры: овес (Avena sativa, включающий византийский; Avena nuda; Avena strigosa), ячмень (Hordeum vulgare), рис (Oryza sativa), пшеницу (Triticum aestivum), твердую пшеницу (Triticum durum), спельту (Triticum spelta) и тритикале (Triticosecale). Настоящее изобретение также может охватывать частично автогамные растения, например, рапс (Brassica spp.).
Инструмент можно применять сразу после достаточного опыления женских растений или сразу после завершения цветения женских растений. Таким образом, инструмент можно применять после наступления или, предпочтительно, в конце периода цветения или после периода цветения растений с мужской стерильностью. Его можно применять в любое время между периодом цветения и сбором семян. Механическое устранение можно выполнять, например, при помощи режущего инструмента, и его эффект является незамедлительным, устранение можно выполнять в любое время между периодом цветения и уборкой урожая, однако, предпочтительно выполнять его как можно раньше после периода цветения для оптимизации развития женских растений (с мужской стерильностью) в сельскохозяйственной культуре. Химическая, например, гербицидная, обработка требует некоторого времени для воздействия на растения, поэтому время применения определяют так, чтобы оно было эффективным до сбора урожая, в зависимости от скорости действия химического вещества, например, гербицида, количества применений химического вещества, например, гербицида, погодных условий и т.д., и опять-таки предпочтительно выполнять ее как можно раньше после периода цветения для оптимизации развития растений с мужской стерильностью в сельскохозяйственной культуре. В целом, устранение (механическое и/или химическое) будут предпочтительно применять между периодом цветения и 30, 20 или 10 днями после периода цветения включительно.
Применяемым гербицидом является любой гербицид или любое другое химическое вещество, способное нарушать или останавливать рост растений и развитие семян зерновых культур при применении, производимом или эффективном после наступления периода цветения или после периода цветения и при вышеуказанных условиях. Гербицидом предпочтительно является системный гербицид, поступающий в растение при контактном действии на растение. Данный гербицид предпочтительно способен уничтожать растения на этой стадии развития. В качестве примера, гербицидом является глифосат или глюфосинат, предпочтительно им является глифосат. Гербицид можно применять однократно или за несколько применений (по меньшей мере два, например, 2 или 3). К гербициду можно добавлять вспомогательное средство для повышения его эффективности, например, улучшения контакта гербицида с растением, и оно может быть благоприятным. Таким образом, можно добавлять компонент для повышения проницаемости и диффузии гербицида в растение для оказания более эффективного системного действия.
Можно применять другие компоненты, способные уничтожать более высокорослые растения, например, десиканты. При применении инструмента один раз или несколько раз можно выполнять дополнительное удаление выживших мужских растений вручную.
Согласно отличительному признаку, ограничение доли семян самооплодотворяемых мужских растений включает дополнительный, после сбора семян, отбор семян для удаления семян самооплодотворяемых мужских растений, например, отбор с использованием морфологических критериев или признака, такого как размер, или плотность, или форма, или состав, и/или некоторый другой аспект семян (в частности, преждевременно засохшие или сморщенные семена), и/или с использованием фенотипического признака, например, окраски. Такие преждевременно засохшие или сморщенные семена могут появляться в результате действия гербицида, в частности, без ограничения, из колосьев, получаемых из побегов, подвергнутых воздействию гербицида, но полностью не уничтоженных. Вторичные побеги мужских растений также могут давать семена, если их созревание в достаточной степени задержано по отношению к основному побегу, однако, эти семена должны быть незрелыми при сборе урожая: более мелкими и/или более зелеными. Это устранение семян мужских растений можно выполнять с помощью любого известного способа. Наиболее легким способом может быть сортировка по размеру или плотности, если существует значительная разница в размере, или другой аспект, и она может позволять устранить мелкие семена или сморщенные семена.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления после сбора урожая выполняют отбор семян по их размеру или плотности для отбора наиболее крупных семян по их размеру или более плотных семян по их плотности. Это обеспечивает повышение доли гибридных семян среди собранных семян по сравнению с совокупностью семян в сельскохозяйственной культуре.
Согласно отличительному признаку, ограничение количества семян самооплодотворяемых мужских растений также включает применение фенотипического маркера, ассоциированного с совокупностью мужских растений и/или с совокупностью женских растений, и этот маркер соответственно применяют в отдельности либо вместе с размером или другим аспектом для отделения семян, получаемых в результате самооплодотворения совокупности мужских растений, от гибридных семян, получаемых в совокупности растений с мужской стерильностью, или их сохранения.
Фенотипический маркер предпочтительно ассоциирован с совокупностью растений с мужской стерильностью, и этот маркер применяют для дополнительного отделения семян, получаемых от совокупности самооплодотворяемых опыляемых мужских растений, от гибридных семян.
Согласно определенному отличительному признаку изобретения скрещивание выполняют с мужским растением, которое является гибридным растением, выбранным по лучшей способности к перекрестному оплодотворению.
Для сертификации гибридных семян требуется, чтобы по меньшей мере определенная процентная доля собранных семян была получена в результате перекрестного оплодотворения, а не в результате самооплодотворения. Таким образом, предел гибридности при коммерциализации гибридов для Европейской сертификации в настоящее время составляет 90% для пшеницы, ячменя, рапса, тритикале и риса. Если предположить, что в классической производственной системе смешанного насаждения самооплодотворение мужских растений происходит вдвое чаще, чем перекрестное опыление женских растений, то количество семян мужских растений не должно превышать некоторый уровень в 5% от всех высеянных семян родительских растений для того, чтобы в собранных семенах сохранялся порог гибридности выше 90%. Эта доля высеянных семян мужских растений относительно семян женских растений может повышаться вследствие устранения мужских растений после периода цветения и до сбора урожая и возможного устранения семян, получаемых вот совокупности самооплодотворяемых опыляемых мужских растений. Настоящий способ является универсальным и позволяет получать урожай с желаемой процентной долей нежелательных семян мужских растений, и эта величина может составлять, например, приблизительно 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1% относительно всех собранных семян после обработки собранных семян согласно настоящему изобретению.
Способ по настоящему изобретению представляет основное преимущество оптимизации соотношения высеянных мужских/женских растений для такого получения гибридов в конкретной комбинации мужских и женских инбредных линий в конкретной сельскохозяйственной культуре, в конкретном регионе или, в более общем смысле, с ожидаемыми последствиями в отношении оплодотворения и получения и выхода гибридных семян. Способ позволяет получить лучшую совокупность семян вследствие непосредственной близости мужских и женских растений и надлежащего распространения пыльцы ввиду более благоприятного соотношения между мужскими и женскими растениями. Плотность пыльцы на любой сельскохозяйственной культуре необходимо повышать с учетом положительного эффекта предотвращения случайного опыления чужеродной пыльцой и последствий в отношении чистоты собранного семенного фонда. Другим преимуществом, которое должно быть получено, является более легкий протокол высевания, поскольку становится возможным высевание смеси семян мужских и женских растений, и это является более легким и экономически более выгодным, чем посев полосами. Другим преимуществом является то, что получаемые гибриды будут давать больший выход, поскольку они содержат больше гибридных семян, которые обладают лучшими характеристиками, чем семена мужских растений.
Линии зерновых культур, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут преимущественно быть карликовыми, полукарликовыми или двойными карликовыми растениями или иным образом находиться под каким-либо генетическим контролем пониженной или повышенной длины стебля.
Разница в высоте между двумя совокупностями растений обеспечивает оптимизацию распространения пыльцы от более высокорослых растений к совокупности более низкорослых растений, при этом женские растения могут быть более низкорослыми; однако можно применять стандартные женские и более высокорослые мужские растения наряду с более низкорослыми мужскими растениями и даже более низкорослыми женскими растениями или любую другую комбинацию, которая создает большую разницу и желательный выход гибридов. Кроме того, высевание в виде смеси предотвращает чрезмерное обогащение более высокорослыми мужскими растениями.
В целом, разница в высоте должна соответствовать техническим требованиям самого применения, и ее можно оценивать как потенциально составляющую от 1 метра до 10 или 20 сантиметров или даже менее. Чем более однородной является высота растений или сельскохозяйственной культуры, тем меньшей может быть необходимая разница в высоте. Поэтому разница в высоте от 5 до 20 см или даже менее также должна соответствовать настоящему изобретению. С другой стороны, может быть неблагоприятным создание большой разницы в высоте и применение слишком высокорослых мужских растений в связи с риском полегания. Таким образом, средняя разница в высоте может находиться в диапазоне от приблизительно 5 см до приблизительно 1 м, в частности, от приблизительно 10 см до приблизительно 60 см, предпочтительно от приблизительно 20 см до приблизительно 50 см.
Создание и применение разницы в высоте между мужскими и женскими растениями может быть достигнуто многими различными способами, которые известны от специалиста в данной области. Например, у пшеницы известно много генов карликовости и полукарликовости:
Rht1, обозначаемый в данном документе как Rht-B1b (4BS), и Rht2, обозначаемый в данном документе как RHT-D1b (4DS), из японского сорта "Norin 10", Rht1 Pearce Stephen (2011), Molecular Characterization of Rht-1 Dwarfing Genes in Hexaploid Wheat. Plant Physiol, Vol 157, p 1820-1831;
Rht1 (Rht-B1d) из Saitama 27 Worland AJ and Petrovic S (1988), The gibberellic acid insensitive dwarfing gene from the variety Saitama 27. Euphytica 38:55-63 (аллельный Rht1);
Rht3, обозначаемый как Rht-B1c (4BS - аллельный Rht-B1b), из Tom Thumb (см. Kleijer et al. (1984), Euphytica 33 107-112);
Rht8 (2DS) из сорта "Akakomugi", Gasperini et al. (2012), Genetic and physiological analysis of Rht8 in bread wheat an alternative source of semi-dwarfism with a reduced sensitivity to brassinosteroids. Journal of Experimental Botany. Vol 63 N°12 p4419-4436;
Rht9 (7BS) из сорта "Akakomugi", Ellis M.H. et al., (2005) Molecular mapping of gibberellin-responsive dwarfing genes in bread wheat., Theoretical and Applied Genetics, 111:423-430;
Rht10, обозначаемый как Rht-D1c (4DS), из сорта "Taigu" Izumi N et al., Genetic analysis of dwarfhess in Triticum aestivum L. Ai_Bian 1, 31, 38-48 (1983);
и другие RHT4 (2BL), RHT5, RHT7 (2A), RHT12 (5AL), RHT13 (7BS), RHT14, Rht12.
Однако карликовые растения также могут быть получены в результате простого отбора путем выбора низкорослых растений в популяциях растений-производителей или благодаря созданию пирамид QTL (локусов количественных признаков) высоты или применению стратегий на основе GMO (генетически модифицированных организмов).
У ячменя также известны многие мутации, воздействующие на высоту растения, см. Franckowiak et al., (1987), Coordinator's report on the semi-dwarf barley collection, Barley Genet News 17:114-115. Наиболее часто применяемыми генами карликовости являются:
Ari-e GP; Uzu, Sdw1, Sdw3 (2HS) Gottwald et al., (2004) The gibberellic-acid insensitive dwarfing gene sdw3 of barley is located on chromosome 2HS in a region that shows high colinearity with rice chromosome 7L, Mol Gen Genomics N°4, 271: 426-436.
Карликовые растения также могут быть получены в результате простого отбора путем выбора низкорослых растений в популяциях растений-производителей или благодаря созданию пирамид QTL (локусов количественных признаков) высоты или применению стратегий на основе GMO (генетически модифицированных организмов).
Линии, применяемые для данного протокола, могут быть низкорослыми или высокорослыми или карликовыми или двойными карликовыми растениями, полученными любым способом и находящиеся под любым видом генетического контроля. Настоящее изобретение можно начинать с создания стерильной низкорослой линии.
В основном, для способа требуется женское растение (с мужской стерильностью). Несколько способов получения таких растений были описаны и известны от специалистов в данной области.
Некоторые схемы применения цитоплазматической мужской стерильности (CMS) у пшеницы описаны в Maan and Lucken (1972), Interacting male sterility restoration Systems for hybrid wheat Research, Crop Science Vol 12, Franckowiak et al.., (1976), A proposal for Hybrid Wheat Utilizing Aegilops squarrosa L. Cytoplasm, Crop Science, Vol. 16, p725-728. Для обзора см. Whitford et al., (2013), Hybrid breeding in wheat: technologies to improve hybrid wheat seed production, Journal of experimental Botany, опубликовано в режиме онлайн 31 октября 2013 г.
a
Применение CMS использовали для получения гибридов у ячменя: Ahokas Н. (1998), Barley, Hybrid Cultivar development, в: BANGA, S.S.-BANGA, S.K. (eds), Narosa New Delhi, India., p316-331. В данной системе применяют две цитоплазматические системы CMS, известные как msm1 и msm2. Известно восстановление фертильности для обоих генов стерильности Rfm1 (6Н). См. соответственно Ahoras Н. (1979) Cytoplasmic male sterility in barley. III maintenance of sterility and restoration of fertility in the msm1 cytoplasm, Euphytica 28, 409-419; Ahoras H. (1982), Cytoplasmic male sterility in barley XI the msm2 cytoplasm, Genetics 102:285-295; Matsui K. (2001) Molecular mapping of a fertility restoration locus (Rfm1) for cytoplasmic male sterility in barley (Hordeum vulgare L.), Theor Appl Genet, 102:477-482.
Получение гибридных зерновых культур может быть основано на генетической мужской стерильности (GMS) и требует скрещивания мужского стерильного растения, гомозиготного по рецессивному аллелю gms, и мужской фертильной линии, гомозиготной по доминантному аллелю GMS (т.е. дикого типа, нормальному, фертильному) того же самого гена.
Для зерновых культур существуют другие способы получения растений с мужской стерильностью при помощи систем GMS. Большинство из этих стратегий основаны на применении так называемой линии-закрепителя, которая при самоопылении дает процентную долю женских растений (с мужской стерильностью), применяемых для получения гибридов, и процентную долю растений-закрепителей, которые можно применять для дальнейшего получения стерильных растений.
Применение GMS у пшеницы может предусматривать:
рецессивный ms1 (4BS),
ms1a из сорта Pugsley, Suneson et al., Use of Pugsley's Sterile wheat in Cross breeding, Crop Science 2(6): 534-535,
ms1b из мутанта Probus (мутанта, полученного в результате воздействия ионизирующего излучения), Driscoll CJ (1975) Cytogenetic analysis of two chromosomal male-sterility mutants in hexaploid wheat. Australian Journal of Biological Sciences 28:413-416,
ms1c из Cornerstone (мутанта, полученного в результате воздействия ионизирующего излучения), Barlow KK and Driscoll CJ (1981) Linkage studies involving two chromosomal male-sterility mutants in hexaploid wheat. Genetics 98:791-799,
ms1d (FS2, EMS-мутант), EMS-мутанты ms1e (FS3), ms1f (FS24) из Klindworth et al.., Chromosomal location of genetic male sterility genes in four mutants of hexaploid wheat, CROP SCIENCE, 2002, 42(5): 1447-1450,
ms1g из Lanzhou (Zhou KJ et al., (2008,) A new male sterile mutant LZ in wheat (Triticum aestivum L. Euphytica 159(3): 403-410).
Компенсация эффектов ms1 в отношении мужской стерильности может предусматривать:
- 5 г из Secale cereale L. (с доминантным визуальным маркером (опушенная цветоножка, hp),
- 2RS, Fertility compensation of Cornerstone male sterility of wheat by rye. Hossain MA and Driscoll CJ Genetics. 1983 May; 104(1): 181-189.,
- 4E, см. публикацию Zhou KJ (2006), The 4E-ms system of producing hybrid wheat. Crop Science 46, 250-255.
Доминантный Ms2 (4DS) Ta1, Deng and Gao, The use of a dominant male sterile gene in wheat breeding. Acta Agrom Sinica 6: 85-98 (1980); Liu B. et al., A dominant gene for male sterility in wheat. Plant Breed 97: 204-209 (1986), доминантный Ms3 (5AS) (EMS-мутант KS87UP9 с мужской стерильностью) Maan SS et al., Chromosome arm location and gene centromere distance of a dominant gene for male sterility in wheat. Crop Sci. 27 494-500 (1987);
доминантный Ms4 (4DS), третий доминантный ген мужской стерильности у мягкой пшеницы, Maan SS, Kianian SF, Wheat Information Service, 93: 27-31;
рецессивный ms5 (3AL) (FS20, EMS-мутант) из Klindworth et al.., Chromosomal location of genetic male sterility genes in four mutants of hexaploid wheat, CROP SCIENCE, 2002, 42(5): 1447-1450.
Существуют другие системы мужской стерильности, однако стерильность основана на внешних условиях: wptms1 (5В) и wptms2 (5В) из Guo et al.., 2006 (Theor Appl Genet 112:1271-1276) и Wptms3 (1BS) из Chen et al.., (Biomed & Biotechnol) являются термочувствительными и чувствительными к фотопериоду.
У ячменя были идентифицированы многие гены генной или генетической мужской стерильности msg, см. Ahokas Н. (1998) Barley, Hybrid Cultivar development, в: BANGA, S.S.-BANGA, S.K. (eds), Narosa New Delhi, India., p316-331.
Генетические ДНК-маркеры доступны для большинства, если не для всех этих мутаций, однако, фенотипические (т.е. видимые) маркеры также можно применять для отслеживания, например, аллелей, которые компенсируют наличие гена gms. Существуют некоторые маркеры, ассоциированные с синей или красной окраской околоплодника, и их можно применять для облегчения извлечения, например, стерильных или фертильных семян.
а- Применение хромосомных добавочных линий для компенсации генной мужской стерильности
Этот способ получения гибридов впервые был разработан у ячменя - Ramage R.Т. (1965, 1991), Balanced tertiary trisomies for use in hybrid seed production, Crop. Sci. 5: 177-178. Chromosome manipulation in barley breeding, Chap 18, Chromosome Engineering in Plants: Genetics, Breeding, Evolution, опубликовано по P.K. Gupta, T. Tsuchiya, p 385-400.
У пшеницы первый пример применения добавочных линий описан в системе XYZ Discroll (1972, 1985, 1986), XYZ system of producing hybrid wheat, Crop Sci. 12: 516-517 (1972), Modified XYZ system of producing hybrid wheat; Crop Science Vol. 25 pi 115-1116 (1985), Nuclear male sterility systems in seed production of hybrid varieties, CRC Critical Reviews in Plant Sciences, Vol. 3, Issue 3 p227-256, и Driscoll (1986). Эта система основана на применении гомологичной рецессивной мутации мужской стерильности и применении линии-"восстановителя", содержащей добавочную хромосому, несущую ген "восстановителя" в одной или двух копиях согласно варианту системы XYZ.
Компенсирующая хромосома может также содержать фенотипический маркер, например, маркер опушенной шейки хромосомы 5R из Secale cereale L. Discroll (1972), Hossain and Discroll (1983), Fertility compensation of Coraestone male sterility of wheat by rye, Genetics 104:181-189. Другие источники восстановителя фертильности тестировали в Driscoll (1985)., The alpha-arm isochromosome of Triticum urartu, Jakubz, Chromosome 4 or the long arm isochromosome of a modified barley chromosome 4HmL.
Генетический маркер фенотипической окраски может быть добавлен к ранее описанной системе для отслеживания компенсирующего гена в потомстве; маркер может обеспечивать разделение семян в потомстве, как описано в WO 92/01366. Маркером фенотипической окраски может быть синий алейрон из 4 хромосомы Agropyron elongatum (4g), см. Zeller et al., (1991)., Theor Appl Genet. 81(4):551-8, и Zeven A.C., (1991)., Wheats with purple and blue grains: a review, Euphytica 56: 243-258. Этот синий маркер транслоцируется на хромосому с 4 доминантными аллелями от Triticum thaoudar, Triticum топососсит или Triticum urartu. Такую транслоцированную хромосому дополнительно применяют в качестве добавочной хромосомы в системе XYZ.
В системе 4E/MS, описанной в Zhou KJ et al. (2006), The 4E-ms system of producing hybrid wheat. Crop Science 46, 250-255, применяется добавочная линия: 4E (Agropyron elongatum), несущая ген Ba синей окраски алейрона из Agropyron spp. (Bolton EF (1968) Inheritance of blue aleurone and purple pericarp in hexaploid wheat. PhD diss. Colorado Stat Univ. Fort Colins CO) с "эффектом дозы гена", и доминантный аналог дикого типа, MS1, который компенсирует наличие аллеля мужской стерильности ms1.
Аналогичная система была разработана Huang S.S. et al. (1991)., The development of a blue marked nucleus male sterile line and its maintainer in bread wheat, Acta Agronomica Sinica. 17:81-87.
Фенотипический маркер, ассоциированный со стерильностью, также может быть сцеплен с геном, отвечающим за размер растения, таким как мутант rht. Например, маркер синей окраски семян может быть добавлен в хромосому, содержащую доминантный ген Ms2 мужской стерильности и Rht-D1c (ген карликовости). Tian and Liu (2001). Development of dominant nuclear male-sterile lines with a blue seed marker in durum and common wheat, Plant Breeding 120, 79-81. Потенциальное применение этой добавочной линии описано в Zong-Jun Pu et al. (2005). Studies on breeding of dominant nuclear dwarf male sterile lines with a blue seed marker in common wheat, Wheat Information Services Number 99: 46-50.
b- Применение добавочной замещенной линии
Другой способ получения гибридных зерновых культур описан в WO 92/01366. Линию-восстановителя, гомогенную по 4В, содержащую рецессивную мутацию стерильности и добавочную транслоцированную 4 хромосому, содержащую маркер синей окраски и ген-восстановитель, самоопыляют с получением замещенной линии 2n, гетерологичной по 4В, содержащей хромосому, несущую рецессивную мутацию и не имеющую маркера окраски, а также хромосому, содержащую транслокацию.
Производный протокол описан King et al., (1991)., Induction of a mutation in the male fertility gene of the preferentially transmitted Aegilops sharonensis chromosome 4S and its application for hybrid wheat production, Euphytica 54: 33-39.
В WO 93/13649 описана другая линия-восстановитель фертильности, происходящая из предыдущей линии в результате кроссинговера между двумя хромосомами 4S. Такую транслокацию следует получать с применением мутантной пшеницы с измененным спариванием гомологичных хромосом, например: (ph1 или ph2), Sutton Т. (2003)., The Plant Journal 36, 443-456 Able J. (2006). Trends in Plant Science, Vol. 11 N°6, и Choon-Lin Tiang et al. (2012)., Plant Physiol, Vol. 158, p 26-34.
Другие различные способы получения гибридов пшеницы описаны в WO 03/057848.
Некоторые стратегии на основе GMO для получения обладающих мужской стерильностью или женских растений описаны, например, в WO 2005/005641 (см. также Whitford et al., (2013) Hybrid breeding in wheat: technologies to improve hybrid wheat seed production, Journal of Experimental Botany, предварительная электронная публикация опубликована 31 октября).
Настоящее изобретение также можно реализовать, используя мужское растение, которое является более жизнеспособным, для того чтобы гибрид мог получать лучшее опыление. Гибридное мужское растение должно быть полным восстановителем для стерильного женского растения. Например, если женская стерильность основана на гомозиготном рецессивном состоянии ms (как в 4E-ms), то мужское растение должно быть гомозиготой дикого типа.
Как объяснялось ранее, мужские растения могут все еще присутствовать во время сбора урожая, и собранный семенной фонд может все еще содержать семена самооплодотворяемых мужских растений. Можно применять фенотипические маркеры или обработку семян для содействия удалению таких нежелательных семян после сбора урожая и для повышения уровня гибридных семян в коммерческом продукте.
Например, можно применять оборудование для очистки семян, просеиватель семян, сортировщик семян, пневмостол, аспирационное оборудование, ячеистый сортировщик, оптический сортировщик семян. Например, можно применять родительские линии с заметной разницей в TGW (массе тысячи зерен), и отбор можно проводить на сепарационном устройстве "Petkus" (US 8502019).
Другим примером является применение генов красной/белой окраски зерна (Sherman J.D. et al. (2008): Microsatellite markers for kernel colour genes in wheat. Crop Science, 48: 1419-1424). Красная окраска семян пшеницы контролируется доминантными аллелями одного или нескольких из трех генов, а именно R-A1b (на хромосоме 3AL), R-B1b (на 3BL) и R-D1b (на 3DL) (Sherman et al., 2008). Существует "эффект дозы" этих аллелей красной окраски: чем больше аллелей красной окраски несет семя, тем более интенсивной является красная окраска. Белую окраску можно получить в отсутствие аллелей красной окраски в локусе 3 (r-a1b, r-b1b и r-d1b).
Красная окраска экспрессируется по материнской линии с окрашиванием диплоидных тканей околоплодника. Это означает, что, каким бы ни было скрещивание, семена F1 будут иметь ту же окраску, что и женское родительское растение. В зависимости от окраски семени и твердости зерна образующиеся зерна пшеницы и получаемая в результате их помола мука могут быть отнесены к различным рыночным классам: пшеница с красными и белыми зернами является предпочтительной для определенных рынков.
Таким образом, можно отсортировать если не все, то большую часть семян мужских растений от партии гибридных семян при помощи разницы в окраске семян между семенами мужских растений и гибридными семенами, например:
• в случае мужской линии с белыми семенами (гомозиготной r-a1b, r-b1b и r-d1b) и женской линии с красными семенами (гомозиготной R-A1b, r-b1b и r-d1b / r-a1b, R-B1b и r-d1b / r-a1b, r-b1b и R-D1b / R-A1b, R-B1b и r-d1b / R-A1b, r-b1b и R-D1b / r-a1b, R-B1b и R-D1b или R-A1b, R-B1b и R-D1b) гибридные семена будут красными, а семена мужских растений, полученные в результате самоопыления, будут белыми;
• в случае мужской линии с красными семенами (гомозиготной R-A1b, r-b1b и r-d1b / r-a1b, R-B1b и r-d1b / r-a1b, r-b1b и R-D1b / R-A1b, R-B1b и r-d1b / R-A1b, r-b1b и R-D1b / r-a1b, R-B1b и R-D1b или R-A1b, R-B1b и R-D1b) и женской линии с белыми семенами (гомозиготной r-a1b, r-b1b и r-d1b) гибридные семена будут белыми, а семена мужских растений, полученные в результате самоопыления, будут красными;
• в случае мужской линии со светло-красными семенами (гомозиготной R-A1b, r-b1b и r-d1b / r-a1b, R-B1b и r-d1b / r-a1b, r-b1b и R-D1b) и женской линии с темно-красными семенами (гомозиготной R-A1b, R-B1b и R-D1b) гибридные семена будут темно-красными, а семена мужских растений, полученные в результате самоопыления, будут светло-красными;
• в случае мужской линии с темно-красными семенами (гомозиготной R-A1b, R-B1b и R-D1b) и женской линии со светло-красными семенами (гомозиготной R-A1b, r-b1b и r-d1b / r-a1b, R-B1b и r-d1b / r-a1b, r-b1b и R-D1b) гибридные семена будут светло-красными, а семена мужских растений, полученные в результате самоопыления, будут темно-красными.
Семена следующего поколения (F2) первого гибрида будут красными в любом случае, поскольку гибридные растения будут гомозиготными по одному из трех генов красной окраски.
Сортировку семян можно выполнять при помощи любой традиционной оптической сортировочной машины, способной отделять белые семена от красных семян или светло-красные семена от темно-красных семян. Сортировка семян по этим типам окраски с использованием NIR описана в Wang et al., (1999)., Single Wheat Kernel Colour Classification by Using Near-Infrared reflectance Spectra Cereal Chemistry, Vol. 76, No 1.
Семена также можно отсортировать по их размеру на специфическом сите (например, 2,8 мм) для удаления наиболее мелких или сморщенных семян, которые, как правило, имеют меньший размер, чем гибриды.
Настоящее изобретение далее будет описано при помощи неограничивающих примеров.
На фигуре 1 представлена схема полевого эксперимента.
Пример 1. Пшеница
Для создания желательной разницы в высоте применяли доступные у пшеницы гены карликовости. Применяли двойное карликовое женское растение Rht-B1b/Rht-B1b, Rht-D1b/Rht-D1b (аллели с аддитивными эффектами) совместно с мужским растением дикого типа Rht-B1a/Rht-B1a, Rht-D1a/Rht-D1a. Мужское растение дикого типа предпочтительно не является восприимчивым к полеганию. Предпочтительно выбирали гибрид Rht-B1b/Rht-B1a, Rht-D1b/Rht-D1a, который имел промежуточную высоту, близкую к таковой у коммерческой линии (чаще всего Rht-B1b/Rht-B1b, Rht-D1a/Rht-D1a либо Rht-B1a/Rht-B1a, Rht-D1b/Rht-D1b).
Определение уменьшения семенного фонда при применении глифосата после периода цветения
• Полевой тест для различных генотипов
После периода цветения растения 5 элитных линий европейской озимой пшеницы обрабатывали путем ручного применения в отношении колосьев кисти, пропитанной раствором глифосата при 120 г/л (что рекомендуется для уборки сорняков в Великобритании). При полном созревании собирали колосья обработанных и необработанных растений с основного стебля, а также с побегов, и их фертильность определяли и выражали в виде величины соотношения семена/вторичный колосок. Для каждой из 5 элитных линий собирали 7-12 повторностей от необработанных растений и 20-24 повторности от обработанных растений.
Как можно заключить из приведенной выше таблицы, среднее число семян во вторичных колосках (средняя величина) у необработанных растений составляло 1,93 (стандартное отклонение 0,66), а фертильность колосков у необработанных растений составляла 2,13 (стандартное отклонение 0,58). Совокупности семян необработанных и обработанных растений статистически не различались. В таком эксперименте с обработкой гербицидом число семян на собранный колос значительно не снижалось.
Однако, семена обработанных колосьев были сморщенными по сравнению с семенами необработанных колосьев. Эти сморщенные семена имели меньший размер, и их было сравнительно легко удалить во время обработки семян после сбора урожая. Развитие нормального растения из сморщенного семени маловероятно. В среднем 78,2% семян из обработанных колосьев (120 тестируемых семян на борозду) были нежизнеспособными (не прорастали) по сравнению с 15,0% семян из необработанных колосьев (60 тестируемых семян на борозду).
• Тест сроков применения гербицида в условиях теплицы
Эксперимент проводили в теплице путем применения раствора глифосата при 120 г/л в отношении основного колоса растений сорта Apache при помощи пропитанной кисти с противокапельной системой на 4 следующих стадиях развития:
• основной колос в период цветения (обработка 1),
• основной колос после периода цветения, вторичные побеги в период цветения еще отсутствуют (обработка 2),
• основной колос после периода цветения, вторичный(вторичные) побег(побеги) в период цветения (обработка 3),
• основной колос после периода цветения, вторичный(вторичные) побег(побеги) после периода цветения (обработка 4).
Глифосатом обрабатывали по меньшей мере 10 колосьев за одну обработку. Основные колосья (далее называемые "колосья основного стебля"), а также колосья побегов (далее называемые "колосья вторичных стеблей") собирали и молотили для определения совокупности семян/колос.
Как можно заметить из вышеприведенной таблицы 2, для необработанных колосьев (контроль) среднее число семян в совокупности/колос в 19 колосьях составляло 34,2 на основных стеблях и 25,9 в 28 колосьях на вторичных стеблях.
Что касается колосьев, обработанных согласно обработке 1, то семена в колосьях основных стеблей не образовывались, а совокупность семян в колосьях вторичных стеблей значительно уменьшалась по сравнению с контрольной обработкой "без обработки" (в среднем 10,8 против 25,9).
Что касается колосьев, обработанных согласно обработке 2, т.е. обработанных сразу после периода цветения, то колосья основных стеблей давали в среднем лишь 19,6% от числа семян в совокупности, образуемой необработанными колосьями. Большинство этих семян были сморщенными (60%). Колосья на вторичных побегах давали далеко не нормальные совокупности семян (14,2).
Что касается колосьев, обработанных согласно обработке 3, то совокупности семян обработанных основных колосьев характеризовались фертильностью, близкой к нормальной, однако в них были получены лишь сморщенные семена. Колосья на вторичных побегах характеризовались относительно нормальной фертильностью, однако 42,3% образовавшихся семян были сморщенными.
Что касается колосьев, обработанных согласно обработке 4, то обработка глифосатом, проведенная после периода цветения на уровне растений, не нарушала плодовитость, однако, на обработанном основном колосе большинство семян были сморщенными (67,4%). Большая совокупность семян на необработанных побегах могла быть обусловлена перераспределением питательных веществ внутри растения.
Вывод по данному эксперименту заключался в том, что каждый колос, обработанный после периода цветения, мог давать семена, однако, большинство (67,4%) таких семян были сморщенными и были бы устранены во время обработки семян. По-видимому, диффузия глифосата внутрь растения влияла на фертильность необработанного колоса на том же самом растении, если только необработанные колосья не достигали периода цветения. Поскольку обработку глифосатом проводили только тогда, когда все растение завершало цветение, каждый колос, непосредственно не охваченный обработкой, мог образовывать большинство жизнеспособных семян, однако, эти семена были большей частью сморщенными. Даже при необеспечении полного устранения семян мужских растений обработка глифосатом после периода цветения значительно уменьшала фонд семян мужских растений, способствуя повышению соотношения женских/мужских растений в производственной системе смешанного насаждения.
Способность давать жизнеспособные проростки тестировали на подсовокупности семян, подвергнутых обработкам "без обработки" и "обработка 4".
Тот же самый эксперимент повторяли на элитной линии Alixan.
Полевой тест в имитационной производственной системе смешанного насаждения
Проводили имитационный тест получения гибридов. Фертильная карликовая линия низкорослого коммерческого сорта (Courtot, гомозиготный Rht-B1b - Rht-D1b) имитировала «женское растение», а фертильная среднерослая линия высокорослого коммерческого сорта дикого типа (Alhambra, гомозиготный Rht-B1a - Rht-D1a) имитировала «мужское растение». Эти две линии характеризовались сходным ранним созреванием, и их смешивали при высеивании в следующих соотношениях:
• 95% Courtot смешивали с 5% Alhambra,
• 90% Courtot смешивали с 10% Alhambra,
• 85% Courtot смешивали с 15% Alhambra,
• 80% Courtot смешивали с 20% Alhambra.
Были включены два контроля соответственно с 100% Courtot и 100% Alhambra.
На фиг. 1 представлена схема полевого эксперимента, при этом каждый прямоугольник представляет собой блок или участок размером 1,5 м × 6 м с описанием высеянных видов: Courtot (высеивание только семян Courtot), Alhambra (высеивание только семян Alhambra), Courtot-AL-95/5 (высеивание смеси 95% Courtot и 5% Alhambra), Courtot-AL-90/10 (высеивание смеси 90% Courtot и 10% Alhambra), Courtot-AL-85/15 (высеивание смеси 85% Courtot и 15% Alhambra), Courtot-AL-80/20 (высеивание смеси 80% Courtot и 20% Alhambra).
Обозначения: расположение на поле приведено по пересечению номеров участков слева на фигуре 1 и номеров внизу на фигуре 1.
- Участки, расположенные на 13-18/2, 13-18/5, 7-12/3 и 1-6/4: без обработки
- Участки, расположенные на 13-18/3, 7-12/4, 1-6/2 и 1-6/5: 1 обработка
- Участки, расположенные на 13-18/4, 7-12/2, 7-12/5 и 1-6/3 (участки не учитывали в результатах) и 1-6/3: 2 обработки.
При сборе урожая совокупность семян женского растения рассматривали в качестве смоделированных гибридных семян. Следовательно, эксперимент имел небольшую погрешность, поскольку эта смоделированная совокупность гибридных семян была достаточно оптимальной. Глифосат при 120 г/л применяли после периода цветения в отношении «мужских» растений с помощью пропитанной губки путем применения в одном направлении (1 обработка) или применения в двух (противоположных) направлениях (2 обработки). Для каждого условия проводили четыре повторности согласно полевому эксперименту, описанному на фиг. 1.
Результаты представлены в таблице 3. На участках только с Alhambra наблюдали полегание от умеренного до сильного, объясняющее сниженную урожайность. В противоположность, на участках с Courtot-Alhambra полегания Alhambra не наблюдали: Courtot выступал в качестве опоры. Восприимчивость к полеганию мужских растений впоследствии можно было значительно снизить в производственной системе смешанного насаждения. Обработка колосьев Alhambra, следствием которой было уменьшение совокупностей семян в них, ограничивала урожайность на смешанных участках на величину до 51,8% (смесь Courtot-AL-80/20, 2 обработки). Этот результат указывал на то, что процентную долю мужских растений при получении гибридов приходилось сокращать для ограничения влияния на урожайность женских растений.
Применяли молекулярные маркеры генов Rht-B1b и Rht-D1b для идентификации семян Courtot (представляющих гибридные семена в данной модели) и семян Alhambra, представляющих семена мужских растений в данной модели. Анализировали 24 семени с каждого отдельного участка, и результаты представлены в таблице 4.
Благодаря конкурентному преимуществу высокорослых мужских растений по отношению к низкорослым женским растениям количество семян мужских растений по сравнению с количеством семян женских растений примерно удваивалось при сборе урожая по сравнению с количеством при высевании в условиях без обработки. Например, в смеси "Courtot-Alhambra-90%/10%" Alhambra давала 10% семян при высевании, однако их доля возрастала до 19,7% при сборе урожая. Без частичного повреждения или устранения мужских растений производство в смешанном насаждении с применением высокорослых мужских растений было бы невыполнимым. Двойное/двунаправленное применение, по-видимому, было более эффективным, чем однократное применение. Например, в смеси "Courtot-Alhambra-90%/10%" и при обработке в двух направлениях доля семян Alhambra при сборе урожая снижалась до 2,2%, что приводило к гибридности 97,8%. При двойном/двунаправленном применении «гибридность» собранных партий всегда превышала 90%.
Пример 2. Ячмень
Предварительные тесты применения гербицидов проводили летом 2013 г., когда в отношении высокорослых растений ячменя на участках более низкорослого ячменя при помощи машины для уборки сорняков применяли глифосат в норме, рекомендованной поставщиком. Наблюдали, что высокорослый ячмень можно было уничтожить без повреждения полукарликовых растений ячменя, находящихся на тех же самых участках.
Такой же эксперимент проводили при помощи режущего инструмента в отношении смеси высокорослых и более низкорослых растений, и высокорослые растения можно было избирательно срезать.
Также проводили получение гибридов с двумя линиями ячменя, генотипы которых обозначали как А и В. Собранную совокупность семян просеивали при помощи устройства для калибровки семян. Получали три различных класса семян с крупными размерами семян: более 2,8 мм, средние, т.е. более 2,5 мм, и мелкие, т.е. менее 2,5 мм. Молекулярный анализ этих партий семян показал, что гибридные семена находились преимущественно в первой партии с более крупным размером семян. Доля гибридных семян, которые не были откалиброваны, составляла 72%, тогда как доля гибридных семян в подвыборке с размером более 2,8 мм составляла 96%.
Данный эксперимент показал, что применение сортировочного устройства для семян может повышать долю гибридных семян в собранных партиях семян.