СПОСОБ И СОСТАВ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, СВОБОДНЫХ ОТ КЛЕТОК, И КЛЕТОК
METHOD AND COMPOSITION FOR STABILISING CELL-FREE NUCLEIC ACIDS AND CELLS

Настоящее изобретение относится к способу и композиции для стабилизации нуклеиновых кислот, свободных от клеток, в частности, бесклеточной ДНК и/или РНК, а также (в качестве альтернативы или дополнения) для стабилизации клеток из биологических образцов, в частности, цельной крови или плазмы или мочи, и к применению указанной композиции в качестве стабилизатора нуклеиновых кислот, свободных от клеток, и/или клеток в биологическом образце. Композицию можно подмешивать к бесклеточному или содержащему клетки образцу, например, с помощью трубки для забора крови, в которую непосредственно забрана цельная кровь и в которую внесена композиция, например, в количестве до 20% максимального объёма крови, на который рассчитана трубка для забора крови. В случае мочи как биологического образца композицию можно вносить в контейнер для образца или подмешивать к заполняющему контейнер образцу, причём в каждом случае предпочтительно вносить или подмешивать композицию в заданном объёмном соотношении к образцу или к заданному объёму образца.
Преимуществом способа и композиции является то, что они стабилизируют содержащиеся в биологическом образце бесклеточные нуклеиновые кислоты, в частности, для их последующего анализа, например, посредством гибридизации, секвенирования или амплификации, необязательно с предварительным выделением этих кислот, например, путём адсорбции на адсорбенте для нуклеиновых кислот и последующей элюции. Стабилизация нуклеиновых кислот, свободных от клеток, означает, в частности, сохранение количества и структуры нуклеиновых кислот, свободных от клеток, что можно назвать также сохранением их целостности.
Композиция и способ предпочтительно оказывают также стабилизирующее действие на содержащиеся в образце клетки, например, против спонтанного лизиса, так что, с одной стороны, во взятом образце содержащиеся в клетках нуклеиновые кислоты вообще не высвобождаются или высвобождаются лишь в незначительной степени и не смешиваются с бесклеточными нуклеиновыми кислотами образца, а, с другой стороны, клетки можно выделить из образца с тем, чтобы иметь, по существу, возможность анализировать их без вмешательства лизиса и, например, внеклеточных нуклеиновых кислот. При этом клетки могут быть клетками донора образца, то есть собственными клетками организма, например, эпителиальными клетками и/или опухолевыми клетками, и клетки могут быть чужеродными для организма клетками, например, бактериями, грибами или дрожжами либо вирусами.
Анализ клеток, выделенных из смеси композиции с биологическим образцом, может включать анализ внутриклеточных и/или связанных с клеточной поверхностью белков, например, иммунологический анализ. Композиция предпочтительно приводит к стабилизации связанных с поверхностью белков на клетках.
Уровень техники
WO 2013/123030 A2 с целью стабилизации цельной крови для последующего анализа бесклеточной ДНК описывает добавление соединения, высвобождающего формальдегид, в частности, диазолидинилмочевины или имидазолидинилмочевины в комбинации с улавливателем свободного формальдегида для удаления последнего, например, с аминокислотами, в частности, глицином, алкиламинами, полиаминами, причём в каждом отдельном случае в сочетании с ЭДТА в качестве антикоагулянта.
Umetani et al., Clinical Chemistry 52:6, 1062-1069 (2006) описывает анализ стабильности бесклеточной ДНК в сыворотке крови с помощью количественной ПЦР-амплификации двух участков из повторяющихся ALU-последовательностей, из которых один участок 115 п.о. (ALU115) лежит внутри другого участка 247 п.о. (ALU247). Отношение количеств амплификатов служит мерой качества ДНК.
Показатель отношения ПЦР-амплификатов ALU 247/ALU 115, равный 1, то есть одинаковых количеств ALU 247 и ALU 115, рассматривается как типичный для геномной ДНК (gDNA), поскольку такой образец, наряду с мелкими фрагментами, содержит удлинённые фрагменты. Для бесклеточной ДНК (cfDNA) в Hao, T.B., Shi, W., Shen, X.J., Qi, J., Wu, X.H., Wu, Y., Tang, Y.Y., Ju, S.Q. “Circulating cell-free DNA in Serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal Cancer”, British Journal of Cancer 111, 1482-1489 (2014), приводят показатель отношения ALU 247/ALU 115, составляющий примерно 0,3.
WO 2013/045458 описывает смесь для стабилизации цельной крови, состоящую из дигидроксиацетона в качестве гипертонической добавки, N,N-диметилформамида, N,N-диэтилформамида, N,N-диметилацетамида или N,N-диэтилацетамида в качестве стабилизатора внеклеточных нуклеиновых кислот, предпочтительно одного хелатообразователя в качестве антикоагулянта и одного ингибитора апоптоза, который является, в частности, ингибитором каспазы.
WO 2007/073397 A1 описывает фармацевтическую композицию для лечения заболеваний мочевого пузыря анионным полисахаридом и обезболивающим средством в буфере, который может содержать метенамин (соответствует уротропину) в качестве антибактериального препарата.
Задача изобретения
Задача изобретения заключается в том, чтобы предложить альтернативную композицию и альтернативный способ для стабилизации нуклеиновых кислот, свободных от клеток, например, ДНК, или клеток в биологических образцах, в частности, в цельной крови или моче, для последующего анализа, причём композиция предпочтительно является стабильной в хранении, более предпочтительно – содержит меньшее количество различных ингредиентов, чем известные средства.
Описание изобретения
Изобретение решает задачу посредством отличительных признаков, изложенных в пунктах формулы, в частности, посредством композиции для применения в качестве стабилизатора и посредством способа стабилизации биологических образцов, прежде всего, цельной крови или мочи, в частности, стабилизации содержания и целостности нуклеиновых кислот, свободных от клеток, и/или стабилизации содержания и целостности клеток. Композиция содержит в водном растворе по меньшей мере одно буферное вещество, которое забуферивает до значения pH 7 или ниже, предпочтительно – от 3,5 до 7,0, и предназначено, в частности, для забуферивания смеси из композиции и биологического образца до указанного значения pH, по меньшей мере один ингибитор свёртывания и/или по меньшей мере один хелатообразователь, в частности, по меньшей мере один хелатообразователь для двухвалентных катионов, предпочтительно для ионов кальция, и уротропин, необязательно ПЭГ, либо состоит из перечисленного, в частности, для применения в качестве стабилизатора цельной крови. Так как хелатообразователи, в частности ЭДТА, являются также ингибиторами свёртывания, то для целей изобретения ингибиторы свёртывания могут состоять из хелатообразователей. Для применения в качестве стабилизатора для мочи как биологического образца композиция может содержать буферное вещество и уротропин в виде сухой смеси, например, в виде порошка или, предпочтительно, в водном растворе, необязательно вместе по меньшей мере с одним ингибитором свёртывания и/или хелатообразователем либо состоять из перечисленного. В особенно предпочтительном варианте биологический образец представляет собой образец ткани или биологической жидкости животного или человека.
По меньшей мере одно буферное вещество может выбираться или состоять из цитратного буфера, ацетатного буфера, MES (2-N-морфолиноэтансульфоновой кислоты), PIPES (пиперазин-N,N’-бис-2-этансульфоновой кислоты), MOPS (3-N-морфолинопропансульфоновой кислоты), фосфатного буфера и смесей из по меньшей мере двух компонентов из перечисленных. По меньшей мере один ингибитор свёртывания может быть, например, гирудином, необязательно в смеси с хелатообразователем. Предпочтительно ингибитор свёртывания является хелатообразователем, который, например, может выбираться или состоять из цитрата, ЭДТА и их смесей.
Композиция может быть и без соединения, добавляемого в качестве улавливателя свободного или растворённого в воде формальдегида, в частности, без глицина и/или без дополнительного хелатообразователя, в частности, без ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), например, если композиция содержит цитрат. Особенно предпочтительная композиция состоит из раствора цитратного буфера и уротропина в воде. Для применения в качестве стабилизатора нуклеиновых кислот, свободных от клеток, и/или клеток в моче либо в способе стабилизации нуклеиновых кислот, свободных от клеток, и/или клеток в моче композиция может состоять из сухой смеси цитратного буфера и уротропина, необязательно вкупе с ингибитором свёртывания и/или хелатообразователем, причем в этой смеси цитратный буфер предназначен для забуферивания образца до значения pH 7 или ниже, предпочтительно – от 3,5 до 7,0, в частности, для заданного объёма образца.
Буферное вещество предпочтительно имеет буферную емкость раствора цитратного буфера, который имеет концентрацию от 0,3 до 1 M, более предпочтительно от 0,4 до 0,7 M, например, 0,5 M, и значение pH от 3,5 до 7, предпочтительно от 4 до 6,5, для цельной крови как биологического образца, например, pH от 4 до 4,5, более предпочтительно pH 4,5 или 4,2, и предназначен, например, для забуферивания смеси из биологического образца и композиции до указанного значения pH. Содержание уротропина (гексаметилентетрамина) в буферном растворе предпочтительно составляет от 1 до 30 мас./об.%, предпочтительно от 2 или 5 до 25 мас./об.% или до 20 мас./об.%, например, от 5 до 19 или до 8 мас./об.%. Буферное вещество предпочтительно представляет собой цитратный буфер, имеющий концентрацию от 0,3 до 1 M, более предпочтительно от 0,4 до 0,7 M, например, 0,5 M, и имеющий pH от 3,5 до 7, предпочтительно pH от 4 до 6,0, для цельной крови как биологического образца, например, pH от 4 до 4,5, более предпочтительно pH 4,5 или 4,2, и предпочтительно предназначен, например, для забуферивания смеси из биологического образца и композиции до указанного значения pH.
Установлено, что цитратный буфер в достаточной степени ингибирует свёртывание цельной крови, даже если он не содержит ЭДТА. Поэтому из цитратного буфера может состоять по меньшей мере одно буферное вещество и по меньшей мере один хелатообразователь.
Предпочтительно, в частности, если биологический образец - цельная кровь, композицию по изобретению получают путём приготовления буфера, который предпочтительно является цитратным буфером, в воде, доведения значения pH и последующего добавления и растворения уротропина. Предпочтителен буфер, полученный смешиванием буферного вещества, например, лимонной или уксусной кислоты в воде с солью буферного вещества, например, цитратом натрия или ацетатом натрия, в концентрации, желаемой в каждом отдельном случае. Альтернативно, кислота и соль кислоты смешивают в сухом виде в таком соотношении, чтобы при добавлении жидкости достигалось желательное значение pH.
Композиция по изобретению пригодна для применения в качестве стабилизатора для биологических образцов, в частности, цельной крови или мочи, в частности, для содержащейся в биологическом образце бесклеточной нуклеиновой кислоты – ДНК и/или РНК, с последующим выделением клеток или бесклеточной фракции, например, бесклеточной плазмы. Бесклеточные нуклеиновые кислоты из бесклеточной фракции могут, в частности, подвергаться анализу. При этом было установлено, что композиция пригодна для стабилизации в биологических образцах, в частности, в цельной крови, и существенным образом препятствует изменению количества или структуры этих нуклеиновых кислот, так что применение композиции не вызывает по существу никаких изменений в количестве или структуре указанных нуклеиновых кислот, которые могли бы помешать последующему анализу нуклеиновых кислот. Последующий анализ нуклеиновых кислот может проводиться, например, с проведением гибридизации, секвенирования или амплификации, например, с помощью ПЦР.
Необязательное добавление ПЭГ, например, одного или смеси различных ПЭГ от ПЭГ 6000 до ПЭГ 20000, противодействует гемолизу. Композиция не содержит ПЭГ, в частности, при применении его для последующего анализа нуклеиновых кислот, свободных от клеток, предпочтительно с выделением нуклеиновых кислот адсорбцией на адсорбенте для нуклеиновых кислот.
Клетки биологического образца, которые были смешаны с композицией по изобретению, отличаются тем, что содержание в них нуклеиновых кислот, в частности, ДНК и РНК остаётся, по существу, неизменным и не влияет на содержание нуклеиновых кислот в бесклеточной фракции.
Преимуществом композиции по изобретению является то, что она стабильна при хранении, например, в течение по меньшей мере одного месяца, более предпочтительно в течение по меньшей мере двух месяцев, например, в течение до восьми месяцев или до шести месяцев при температуре от 0 до 30°C, более предпочтительно при температуре от 5 до 20°C, с сохранением стабилизирующей активности. Более того, композиция также является стабильной при хранении, если она содержится в трубке для забора крови и присутствует в ней в процессе забора крови либо содержится в сосуде для отбора пробы мочи и присутствует в нём в процессе отбора мочи. Соответственно, изобретение относится также к трубке для забора крови и её применению при стабилизации нуклеиновых кислот, свободных от клеток, и/или клеток биологического образца, который представляет собой образец цельной крови, причём композиция содержится в трубке для забора крови. Соответственно, изобретение относится также к сосуду для отбора пробы мочи и его применению при стабилизации нуклеиновых кислот, свободных от клеток, и/или клеток биологического образца, который представляет собой образец мочи, причём композиция содержится в сосуде для отбора пробы мочи.
Установлено, что композиция пригодна для стабилизации нуклеиновых кислот и/или клеток, даже если она не содержит соединение, улавливающее свободный или растворённый в воде формальдегид, и не содержит дополнительно антикоагулянта, такого как, например, ЭДТА. В этом случае стабильность композиции при хранении и ее стабилизирующее воздействие на биологические образцы можно объяснить тем, что уротропин как в самой композиции, так и в смеси ее с образцом присутствует в равновесии со свободным формальдегидом, причем его концентрация является достаточной для стабилизации или инактивирования белков.
Композиция предпочтительно содержится в трубке для забора крови, например, в объёмной доле максимум 20%, по меньшей мере 2%, предпочтительно от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12%, например, до 10% объёма цельной крови, который может отбираться в трубку для забора крови либо на который максимально рассчитана трубка для забора крови. Композиция предпочтительно содержится в сосуде для отбора пробы мочи, например, в объёмной доле максимум 20%, по меньшей мере 2%, предпочтительно от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12%, например, до 10% объёма мочи, который может заполнять сосуд для отбора пробы мочи либо на который максимально рассчитан сосуд для отбора пробы мочи.
Способ стабилизации биологического образца, представляющего собой, в частности, цельную кровь, включает стадии
- контактирования образца с композицией, которая предпочтительно представлена в водном растворе, с получением смеси из образца и композиции, предпочтительно составляющей по объему от образца максимум 20%, предпочтительно от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12%;
- необязательного хранения смеси из образца и композиции при температуре выше 0°C, например, при температуре от 0 до 37°C, например, при температуре от 0 до 30°C, более предпочтительно – при температуре от 5 до 20°C или при 22,5°C, например, в течение от 1 часа до 14 суток, предпочтительно от 5 ч до 5 суток или до 3 суток либо до 2 суток;
- необязательно с последующим разделением смеси на фракцию, содержащую клетки, и бесклеточную фракцию;
- предпочтительно добавления протеиназы, например, протеиназы K, после разделения смеси с получением бесклеточной фракции; и
- анализа нуклеиновых кислот смеси из бесклеточной фракции и/или анализа клеток из фракции, содержащей клетки.
Способ стабилизации и анализа нуклеиновых кислот, свободных от клеток, биологического образца включает или состоит из, например, стадии: контактирования образца с композицией для применения в качестве стабилизатора содержащихся в образце нуклеиновых кислот, свободных от клеток, с получением смеси из образца и композиции и последующего хранения смеси из образца и композиции при температуре от 0 до 30°C в течение по меньшей мере от 1 часа до 14 суток, предпочтительно с последующим разделением смеси на фракцию, содержащую клетки, и бесклеточную фракцию; предпочтительно добавления протеиназы, например, протеиназы K после разделения смеси с получением бесклеточной фракции; анализа нуклеиновых кислот смеси из этой бесклеточной фракции и/или анализа клеток из фракции, содержащей клетки.
Анализ смеси необязательно предусматривает выделение нуклеиновых кислот предпочтительно контактированием с адсорбентом для нуклеиновых кислот, последующей промывкой адсорбента и элюцией связанных нуклеиновых кислот из адсорбента. Соответствующие адсорбенты, например, ионообменные материалы содержатся, например, в коммерческих наборах для выделения ДНК от компании Macherey-Nagel (NucleoSnap DNA Plasma) или Qiagen (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit).
Разделение смеси на содержащую клетки фракцию и бесклеточную фракцию в большинстве случаев может проводиться, например, фильтрацией или центрифугированием и/или адсорбцией.
Обычно, особенно если биологический образец - моча, способ может включать, в частности, в случае бесклеточной фракции по меньшей мере одну стадию обогащения свободных нуклеиновых кислот, например, путём осаждения нуклеиновых кислот и/или путём адсорбции нуклеиновых кислот на адсорбенте, например, на парамагнитных частицах, покрытых адсорбентом. Анализ фракции, содержащей клетки, может необязательно включать обогащение клеток из этой фракции, например, адсорбцией клеток на адсорбенте, например, на парамагнитных частицах, покрытых адсорбентом, например, покрытых антителом.
Необязательно фракцию, содержащую клетки, полученную при отделении от смеси биологического образца с композицией по изобретению бесклеточной фракции, может быть суспендирована в водном растворе композиции, которая, как она описано в данном документе, используется в качестве стабилизатора, и разрушена.
Ниже изобретение описывается более подробно с помощью примеров со ссылкой на чертежи, из которых
фиг. 1 показывает результат ПЦР-амплификации бесклеточной ДНК из образца в разные периоды хранения;
фиг. 2 показывает результат ПЦР-амплификации второго ДНК-участка как отношение концентраций амплификатов в разные периоды хранения.
Пример 1. Выделение и анализ бесклеточной ДНК из цельной крови
Композицию готовили смешиванием 0,5 М лимонной кислоты (моногидрат) в воде с 0,5 М тринатрийцитрата (дигидрат) в воде до достижения pH 4,2 и последующим добавлением и растворением 18 мас./об.% уротропина.
В качестве примера биологического образца использовали цельную кровь от 3 доноров в каждом отдельном случае в 4 идентичных трубках для забора крови, каждая из которых содержала 0,49 мл композиции (10 об.% цельной крови). Смесь в каждой из этих трубок для взятия крови, которые содержали указанную смесь из цельной крови и композиции и которые хранили при 22,5°C, обрабатывали в день 0 (T0), день 3 (T3), день 7 (T7) и день 14 (T14) хранения, выделяли бесклеточную ДНК и анализировали. С этой целью из каждой трубки для забора крови получали бесклеточную фракцию с помощью процесса двухступенчатого центрифугирования (10 мин при 2000g; 15 мин при 15000g).
Из полученной таким образом бесклеточной плазмы, которая содержала композицию для стабилизации, выделяли бесклеточную ДНК с использованием коммерческого набора реагентов NucleoSnap DNA Plasma Kit (полученного от Macherey-Nagel). В противовес рекомендациям руководства по применению набора вместо рекомендуемых 3,0 мл использовали 1,7 мл бесклеточной плазмы, а количество буфера для лизиса VL и этанола уменьшили с 3 мл до 1,7 мл. Сверх того, увеличили продолжительность инкубации бесклеточной плазмы с протеиназой K при комнатной температуре и при температуре 56°C с 5 мин до 15 мин.
Анализ бесклеточной ДНК проводили путём амплификации участков 115 п.о. (ALU115) и 247п.о. (ALU247) с помощью количественной ПЦР, как описано Umetani et al. (2006).
Фиг. 1 показывает среднее значение отношения концентрации ALU115 в заданный момент времени на день 0 (T0), день 3 (T3 = Tx), день 7 (T7 = Tx) и день 14 (T14 = Tx) в аликвотах к концентрации ALU115 в день 0 (T0). Отношение (Tx/T0), равное 1, указывает на то, что концентрация бесклеточной ДНК в смеси остаётся неизменной или стабильной, а также на то, что бесклеточная ДНК смеси можно амплифицировать с помощью ПЦР без изменения. Этот результат показывает, что бесклеточная ДНК смеси из цельной крови и композиции имеет храниться в течение периода из по меньшей мере 14 дней при 22,5°C, будучи стабилизированной в части концентрации и структуры для последующего анализа.
Фиг. 2 показывает соотношение абсолютных количеств бесклеточной (cf) ДНК (cfDNA) на примере ALU 247 и ALU 115 в заданные моменты периода хранения при 25°C (день 0 (T0), день 3 (T3), день 7 (T7), день 10 (T10) и день 14 (T14)) для композиции по изобретению (cfDNA Exact) и для образцов с ЭДТА (EDTA) в день 0 (T0) и день 7 (T7). Результат показывает стабилизацию при постоянном соотношении в течение всего инкубационного периода при использовании композиции по изобретению (Exact). В нестабилизированных образцах с антикоагулянтом ЭДТА отношение ALU 247/ALU 115 повышается с увеличением продолжительности хранения. Недостаточная стабилизация образцов крови/биологических образцов приводит к лизису клеток и, тем самым, к высвобождению геномной (g) ДНК (gDNA). Отношение ALU 247/ALU 115, составляющее 1, т.е. равные количества ALU 247 и ALU 115, характерны для геномной ДНК.
Эти результаты свидетельствуют также о том, что композиция пригодна для последующего выделения нуклеиновых кислот, свободных от клеток, из бесклеточной смеси композиции с плазмой путём адсорбции нуклеиновых кислот на адсорбенте или не препятствует этому выделению.
Пример 2. Выделение и анализ клеток из цельной крови
Смесь из композиции и цельной крови готовили в соответствии с примером 1 и хранили при 22,5°C. Второй образец цельной крови содержал вместо композиции по изобретению физиологический раствор (раствор поваренной соли) и ЭДТА (1,6 мг/мл крови) для предотвращения свёртывания. В 5 мл каждого из обоих видов образцов цельной крови в день 0, день 1, день 3 и день 5 проводили лизис эритроцитов, и циркулирующие эндотелиальные клетки (cEC) обогащали и анализировали с помощью готового набора для обогащения и подсчёта cEC (cEC Enrichment and Enumeration Kit) от фирмы Miltenyi Biotech. У здоровых людей количество циркулирующих эндотелиальных клеток составляет примерно от 1 до 20 клеток/мл. При различных заболеваниях количество cEC частично значительно увеличивается. Стабилизирующие препараты должны гарантировать, что число cEC в образцах крови после хранения является стабильным. После анализа, описанного в руководстве к набору, оказалось, что количество обнаруженных cEC оставалось стабильным только в образцах, стабилизированных согласно изобретению.
Пример 3. Выделение и анализ бесклеточной ДНК из мочи
Композицию готовили путём смешивания 0,5 М лимонной кислоты (моногидрат) в воде и 0,5 М тринатрийцитрата (дигидрат) в воде до достижения pH 4,2 и последующего добавления и растворения 15 мас./об.% уротропина.
Используемые в качестве примера биологического образца 90 мл мочи сразу после отбора пробы смешивали с 1/10 объёма композиции. Из этой смеси, которая хранилась при 22,5°C, аликвоту в каждом случае обрабатывали в день 0, день 3, день 7 и день 14, выделяли из неё бесклеточную ДНК и анализировали. С этой целью из аликвоты в каждом случае получали бесклеточную фракцию путём центрифугирования при 15000g в течение 15 мин и отделения фракции, содержащей клетки. Из полученной бесклеточной фракции, которая содержит композицию для стабилизации, выделяли бесклеточную ДНК с помощью готового набора NucleoSnap DNA Plasma Kit (полученного от Macherey-Nagel).
Сравнительная оценка образцов мочи, не обработанных или обработанных добавлением равного объёма физиологического раствора (раствора поваренной соли) или смешанных только с буферным веществом и хранившихся в идентичных условиях, показала, что бесклеточная ДНК стабилизировалась композицией по изобретению.
Пример 4. Анализ стабилизированных клеток в моче
В соответствии с примером 3 мочу смешивали с клетками карциномы простаты (LnCap) и для стабилизации с указанной композицией или, для сравнения, с физиологическим раствором поваренной соли и хранили.
Анализ проводили после того же периода хранения сравниваемых образцов на осаждённых центрифугированием клетках. Установлено, что только композиция по изобретению позволила обнаружить добавленные клетки проточной цитометрией.
Сравнительная оценка образцов мочи, не обработанных или обработанных добавлением равного объёма физиологического раствора или смешанных только с растворённым буферным веществом и хранившихся в идентичных условиях, показала, что композиция стабилизировала поверхностные маркёры клеток в процессе хранения.