СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ФОРМ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ТРИХОМОНАД
METHOD FOR IDENTIFYING FORMS OF UROGENITAL TRICHOMONADS

Изобретение относится к медицине, а именно венерологии, урологии, акушерству и гинекологии, паразитологии, медицинской микробиологии.
Известен способ выявления типичных форм трихомонад, в котором после получения патологического материала со слизистых оболочек мочеполовых органов проводят его посев способом инокуляции в жидкую питательную среду, с последующим инкубированием при температуре +37°C в течение 3-17 суток (Приложение №2 к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12 июля 1985 года №936 «Методические указания по применению унифицированных клинико-диагностических и бактериологических исследований в диагностике гонореи и трихомониаза», п.2.6).
Недостатком этого способа является то, что не представляется возможным выявить атипичные формы трихомонад, которые, проявляя низкую метаболическую активность, с трудом размножаются на питательных средах. Исследование длительное, не дающее возможность проведения экспресс-диагностики.
Известен способ выявления форм трихомонад, включающий посев крови в питательную среду Тераса с добавлением инактивированной в течение 5-10 мин при температуре 56°C сыворотки крови человека или лошади и антибиотиков в количестве 500 ЕД/мл. Осуществляют инкубацию культуры в течение 2 сут при температуре 37°C. Затем дважды повторяют эти циклы с различными питательными средами и режимами воздействия, после чего выявляют формы трихомонад (Патент РФ 2289813, МПК G01N 33/48, опубл. 2006).
Недостатками этого способа являются его сложность, длительность выполнения, высокий риск получения сомнительных или отрицательных результатов ввиду исследования патологического материала - крови, которая является несвойственной средой обитания для трихомонад. Режим центрифугирования 3000 об/мин в течение 20-30 мин является грубым стрессовым фактором, приводящим к разрушению простейших. При этом округлые и амебовидные формы трихомонад, а также возможные другие формы являются скорее не атипичными клетками, а вариантами адаптации простейших к изменению условий внешней среды.
Наиболее близким является способ выявления форм трихомонад (Патент РФ 2262104, МПК G01N 33/48, опубл. 2005), включающий взятие биологического материала, добавление к нему биологически активного вещества, выдержку полученной смеси в термостате при 37°C с последующей инкубацией в течение 24-48 ч, проведение микроскопического исследования для выявления форм трихомонад. В результате неоднократной обработки через каждые 12 ч  новой дозой биологически активного вещества (фермент) смеси происходит разрушение клеток крови, микроскопически проявляющееся в виде обломков клеточных элементов, среди которых заметны измененные и атипичные формы трихомонад.
Недостатками этого способа являются его сложность, длительность выполнения, высокий риск получения сомнительных и отрицательных результатов ввиду исследования патологического материала (кровь), не являющегося привычной средой обитания для трихомонад, и длительного неоднократного воздействия на смесь протеолитическим ферментом, а также неадекватный режим центрифугирования (3000 об/мин, 20-30 мин), что способствует разрушению и гибели клеток простейших.
Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, повышение достоверности выявления всех имеющихся в патологическом материале форм трихомонад, уменьшение времени, необходимого для получения результата, выявление измененных типичных и атипичных форм трихомонад за счет добавления нитрозогуанидина к осадку суточной культуры простейших с последующим отмыванием и добавлением питательной среды, что вызывает изменения в ядре (полиморфизм: округлые, удлиненные - 2/3 длины простейшего, изогнутые, уменьшенные в размере ядра); опорном аппарате (аксостиле) - укорочение, утолщение, изогнутый аксостиль, отсутствие шипика; потерю органов движения - жгутиков; изменение метаболизма простейшего - повреждение гидрогеносом (аналогов митохондрий), активацию пино- и фагоцитоза, образование гигантских вакуолей.
Для этого в способ выявления форм трихомонад, включающий взятие биологической ткани, введение в нее биологически активного вещества, выдержку полученной смеси в термостате при 37°C с последующей инкубацией, проведение микроскопического исследования для выявления атипичных форм трихомонад, предложено в качестве биологического материала использовать соскоб со слизистых оболочек мочеполовых органов. Эту биологическую ткань инкубируют в течение суток в питательной среде, отделяют полученный осадок и добавляют к нему в качестве биологически активного вещества нитрозогуанидин в количестве 500 мкг/мл, инкубируют 15 мин при температуре +37°C, добавляют подогретый до температуры +37°C фосфатный буфер с pH   5,6 с последующим двойным центрифугированием при 1000 об/мин по 10 мин, затем помещают в питательную среду для выращивания трихомонад, инкубируют не менее суток и при микроскопии выявляют атипичные безжгутиковые и типичные округлые и амебовидные формы трихомонад.
На фиг.1 представлена безжгутиковая форма трихомонады (пример 1); на фиг.2 - округлая форма трихомонады (пример 2); на фиг.3 - амебовидная форма трихомонады (пример 3).
Предлагаемый способ обеспечивает культуральную диагностику типичных измененных и атипичных форм трихомонад. Это происходит под действием нитрозогуанидина, который является химическим мутагеном (стрессовым фактором), что вызывает активацию пино- и фагоцитоза, активную фиксацию простейших к поверхности эпителиальных клеток и друг к другу, образование колоний простейших с целью самосохранения.
Способ осуществляется следующим образом.
Материал, взятый из сводов влагалища (у женщин) или уретры (у мужчин) стерильным ватным дакроновым тампоном, погружали в 5 мл питательной среды для выращивания трихомонад, тампон ополаскивали в среде. Инкубировали в течение 24 ч при температуре +37°C. При выращивании на жидких питательных средах урогенитальные трихомонады дают придонный рост в виде плотного белесоватого осадка.
Для приготовления питательной среды использовали «Основу питательной среды для выделения влагалищных трихомонад (сухую)» (производство ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ», кат. № C01). Состав основы в г/л: экстракт кормовых дрожжей, Д-мальтоза, натрия хлорид, калий хлористый, натрий углекислый (pH 6,3±0,3). Способ приготовления: 28,5 г препарата размешивали в 1 л дистиллированной воды, кипятили 1-2 минуты и разливали во флаконы. Среду стерилизовали автоклавированием при t +112°C в течение 20 мин. К охлажденной до t +45-50°C питательной среде добавляли 20% сыворотку крупного рогатого скота, тщательно перемешивали и разливали по 5 мл в стерильные пробирки. Поверхность среды в пробирках заливали стерильным вазелиновым маслом высотой слоя 3-5 мм. Пробирки с питательной средой выдерживали в термостате при t +36±1,0°C в течение 22-24 ч для контроля стерильности среды.
Для получения атипичных форм урогенитальных трихомонад осадок суточной культуры доводили физиологическим раствором до объема 1,0 мл и добавляли нитрозогуанидин в количестве 500 мкг/мл. Согласно данным литературы, о воздействии мутагена на простейших указывает их 50% гибель в культуре (Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г., Нетрусов А.И. Руководство к практическим занятиям по микробиологии/ Под ред. Егорова Н.С. - 3-е изд.; перераб. и доп. - М.: Изд-во ИГУ, 1995. - С. 173-179).
После окончания времени экспозиции (15 мин) при температуре +37°С добавляют 3 мл подогретого до температуры +37°С фосфатного буфера с рН  5,6 с последующим двойным центрифугированием при 1000 об/мин по 10 мин.
После отмывки к культуре простейших добавляли 5,0 мл питательной среды для выращивания трихомонад и инкубировали в течение 24 ч при +37°С. Такое выращивание мутированной культуры влагалищных трихомонад позволяет выявить различные типичные, измененные и атипичные (безжгутиковые) формы в виде придонного плотного белесоватого осадка.
Наличие вышеуказанных форм трихомонад позволяет подтвердить диагноз трихомониаз, а при их отсутствии исключить этот диагноз.
Пример 1
Больная М., 45 лет, поступила с диагнозом трихомониаз.
Исследован патологический материал из заднего и боковых сводов влагалища. Проведено исследование по предлагаемому способу.
После воздействия нитрозогуанидином на осадок суточной культуры трихомонад обнаружены безжгутиковые формы трихомонад.
Диагноз подтвержден - урогенитальный трихомониаз.
Проведено лечение: метронидазолом по известной схеме. После окончания лечения - полное выздоровление.
Пример 2
Больная О., 27 лет, поступила с диагнозом трихомониаз.
Исследован патологический материал из заднего и боковых сводов влагалища. После воздействия нитрозогуанидином на осадок суточной культуры трихомонад обнаружены округлые формы трихомонад.
Диагноз: урогенитальный трихомониаз.
Проведено лечение метронидазолом до полного излечения.
Пример 3
Больная Ф., 30 лет.
Исследован патологический материал из заднего и боковых сводов влагалища.
По вышеописанной методике осуществлено воздействие нитрозогуанидином на осадок суточной культуры трихомонад, обнаружены амебовидные формы трихомонад.
Диагноз: урогенитальный трихомониаз.
Проведено лечение метронидазолом.
Предлагаемый способ применен у 2245 пациентов, выявление форм позволило подобрать адекватную медикаментозную терапию и добиться полной этиологической излеченности пациентов.
Данный способ имеет большое значение для диагностики урогенитального трихомониаза, когда инфекция протекает асимптомно и латентно, а возбудитель имеет амастиготную (безжгутиковую) форму, которую трудно обнаружить при обычных культуральных способах диагностики. С помощью данной методики подтверждено существование атипичных (безжгутиковых) форм простейших, выявлен феномен сбрасывания жгутиков и превращения трихомонад в безжгутиковые формы (амастиготы).