Способ пробоподготовки клеточно-инженерной конструкции на основе полимолочной кислоты и культуры эукариотических клеток для гистологического анализа
METHOD OF CELL-ENGINEERING CONSTRUCT SAMPLE PREPARATION BASED ON POLYLACTIC ACID AND EUKARYOTIC CELL CULTURE FOR HISTOLOGICAL ANALYSIS

in vitro
in vivo
Изобретение относится к биологии, а именно к гистологии и может быть использовано в регенеративной медицине при разработке клеточно-инженерных конструкций (КИК) на основе полимерного скаффолда из полимолочной кислоты (ПМК) и культуры эукариотических клеток при проведении экспериментов  и .
В настоящее время для замещения дефектов тканей и органов активно развивается тканевая инженерия, которая позволяет заместить поврежденный участок клеточно-инженерной конструкцией на основе биодеградируемого полимерного скаффолда и клеточной культуры, тем самым восстановить функциональность этой области. В качестве полимерного носителя часто используется биодеградируемый полилактид, который в настоящее время считается «золотым стандартом» скаффолда из-за своей безопасности для организма реципиента, биодеградируемости, а также возможности воспроизведения заданных характеристик 3D внутренней структуры, что обеспечивает поддержание жизнеспособности и пролиферации клеточной культуры. Одним из достоинств полилактида является его экономическая доступность.
in vivo
in vivo
Клеточно-инженерные конструкции (КИК) используются в ограниченной клинической практике. Для улучшения характеристик КИК в настоящее время проводятся широкие экспериментальные исследования  на лабораторных животных, что описано в работах Fioretta E., von Boehmer L., Motta S., Lintas V., Hoerstrup S., Emmert M. [1] и Li Ming, Yuan Zhipeng, Yu Fei, Rao Feng, Weng Jian, Jiang Baoguo, Wen Yongqiang , Zhang Peixun. [2]. Основной целью экспериментов  является оценка реакций перифокальных тканей на имплантацию КИК и процесс биодеградации скаффолда. Для этого используют клинические (оценка подвижности в суставе), лучевые (магнитно-резонансная томография) и микроскопические методы исследований (сканирующая электронная микроскопия, гистология).
Наиболее широко используемым является классическое гистологическое исследование с проводкой исследуемых блоков тканей по различным реагентам, изготовлением парафиновых блоков и последующей депарафинизацией перед окраской, в том числе с применением гистохимических методик. Исследования области дефекта с помощью гистологических методов позволяют оценить биосовместимость разрабатываемой КИК с окружающими тканями и изучить динамику перифокальных реакций тканей.
in vitrо.
in vitro
in vivo
Перед проведением эксперимента на лабораторных животных, проводят исследования Микроскопия препаратов КИК позволяет оценить характеристики получившегося биомедицинского клеточного продукта, в том числе изучить глубину заселенности скаффолда, количество и жизнеспособность клеток. Однако известные классические гистологические методы в некоторых случаях не подходят для анализа КИК на основе полимерных носителей - как , так и , так как в процессе гистологической пробоподготовки полимерный носитель может деградировать и растворяться, что описано в методах Teixeira, S., Eblagon, K.M., Miranda, F., Pereira, M.F.R., Figueiredo [3] и I. -Franco, F., Auras, R., Burgess, G., Holmes, D., Fang, X., Rubino, M., Soto-Valdez H. [4].
Помимо классического гистологического подхода, связанного с процессом изготовления парафиновых блоков и последующей депарафинизации, применяется методика, основанная на получении криосрезов при низких температурах. В настоящее время метод криосрезов широко применяется для изучения КИК.
Одним из важных свойств для успешного получения криосрезов является адгезионная способность предметного стекла. Это связано с тем, что в процессе окраски гистологического криосреза необходимо исключить отслоение образца от поверхности стекла. Для этих целей применяются специализированные предметные стекла с покрытием из полилизина. Однако даже в этом случае работа по изготовлению криосрезов КИК требует особых навыков, подбора параметров и специализированных стекол.
Аналогом нашей методики является последовательность действий, описанная в патенте Brekke, John H. (Duluth, MN) [5]. Эта методика использует только сканирующую электронную микроскопию и не позволяет получать данные о внутренних слоях области регенерата и созданной КИК. Несмотря на простоту использования и гарантированную результативность получения объектов исследования, данный метод имеет существенные ограничения. Представленная методика не может ответить на вопрос о принадлежности отдельных клеточных элементов. Методика, описанная в патенте, не может применяться для анализа эффективности применения КИК, так как в ней не представлена методология приготовления гистологических препаратов, а указан только метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
Принципиально другой является методика, описанная в патенте (Estes, Bradley T. (Durham, NC, US) Moutos, Franklin Thomas (Raleigh, NC, US) Guilak, Farshid (Durham, NC, US), [6]. В патенте приведено описание приготовления классических гистологических препаратов. Представленный способ позволяет получать гистологические срезы области регенерата и созданной КИК путем создания классических парафиновых блоков, последующей депарафинизации и гистологической проводки срезов. Однако, последовательность действий, описанная в данном методе, не приводит конкретных параметров приготовления гистологических препаратов, изготовления блоков и методики окраски.
Известен способ, включающий в себя классическую гистологию и описывающий конкретные этапы приготовления гистологических срезов, который был разработан в 2013 году. В этой методике, предложенной группой исследователей под руководством James W Edinger [7], также используют последовательное приготовление гистологических препаратов с изготовлением парафиновых блоков и последующей депарафинизацией, нарезкой и окраской гистологических срезов. Преимуществом этой методики является возможность гистохимической окраски среза ткани с КИК. Существенными недостатками данной методики являются: возможность деградация носителя в процессе депарафинизации и отсутствие точного описания полимерного скаффолда; не показана возможность получения микропрепаратов срезов КИК до имплантации и после нее.
Часть недостатков вышеописанных методов была устранена в работе Pathak, Chandrashekhar P. и Thigle, Sanjay M. [6]. В предложеннойой авторами методике подробно описан принципиально похожий метод стандартной гистологической проводки и одновременно указана теоретическая возможность частичной деградации полимерного носителя. Дополнительным преимуществом этой методики является одновременная шоковая заморозка скаффолда. Однако предложенная методика также имеет существенные недостатки. Например, авторы не указали на возможность получения микропрепаратов срезов нативного скаффолда или готовой КИК без имплантации животным. Дополнительным недостатком является использование спиртов при гистологической проводке, которые нарушают структуру полимера и (или) целой КИК. Отдельно следует отметить сложность фиксации среза полимера с клетками на поверхности предметного стекла, что создает трудности на этапе окраски гистологического среза.
В ряду методик для анализа КИК можно выделить группу методов, отличающихся важной особенностью, что было описано в работе Morille, Marie , Tran, Van-thanh, Garric, Xavier , Coudane, Jean , Venier-julienne, Marie-claire, Montero-menei, Claudia [9] и работе Sehl, Louis C., Trollsas, Olof Mikael , Mallace, Donald G., Toman, David, Delustro, Frank A., Schroeder, Jacqueline A., Chu, George H [10]. Данные методики включают в себя применение однослойного адгезирующего основания (полилизина) для улучшения фиксации гистологического среза на предметном стекле при окраске. Другой важной особенностью этой методики является частичное применение заморозки скаффолда для дальнейшего анализа. Однако, несмотря на эти достоинства, методы также имеют существенные недостатки. Главным из них является необходимость получения классических парафиновых блоков с последующей депарафинизацией и окраской, что может приводить к деградации полимерного носителя. Также неясна возможность оценки структуры КИК без имплантации и сложность визуализации неконтрастного образца КИК в геле для замораживания при последующем изготовлении криосреза.
В ряду аналогов нашей методики особого внимания заслуживает разработка, описанная в работах Caroline D. Hoemann Michael D. Buschmann Marc D. McKee [11], Angros, Lee H [12], а также Kang, Yujian James [13]. Эта группа методов подробно описывает процесс приготовления классических гистологических препаратов. В ней присутствует специальный адгезивный полилизиновый слой на предметных стеклах или внешний ограничитель, который фиксирует гистологический срез на поверхности стекла. Методы описывают процесс приготовления и гистологического анализа КИК как перед имплантацией модельному животному, так и после него в составе блоков тканей. Указанные методики демонстрируют возможность специализированной окраски гистологического среза для дальнейшей конфокальной микроскопии. Также в методе Kang, Yujian James [13] указана принципиальная возможность осуществления криосреза КИК без уточнения методики. Однако, все указанные методы включают процесс создания парафиновых блоков и обратной депарафинизации образца, что может приводить к деградации образца КИК, кроме того, отсутствуют рекомендации по формированию полилизинового слоя, недостаточная толщина которого может нарушать фиксацию среза изучаемого образца к предметному стеклу.
В работе Teixeira, S., Eblagon, K.M., Miranda, F., Pereira, M.F.R., Figueiredo, J.L. [3] было показано, что классическая гистологическая проводка, парафинизация и депарафинизация приводит к деградации компонентов полилактида в общем и КИК на его основе в частности. Также к деградации приводит процесс окраски в присутствии спирта и ксилола. Эти данные позволяют сформировать один из главных недостатков существующих методов пробоподготовки исследуемых образцов для гистологического исследования - деградация полимерного носителя в составе КИК конструкции. Однако авторы данной работы не предлагают способов решения, позволяющих исключить деградацию скаффолда или готовой КИК в процессе изготовления гистологического препарата.
Наиболее близким изобретением (прототипом) к нашей методике является метод, описанный в работе Prien, Samuel D., Blanton, John, Wood, Brian, Cassell, Allan J.[14]. В нем используется не стандартная гистологическая проводка, а заморозка образцов при температуре от -20 до -30°С с последующей вырезкой. Такая методика предохраняет образцы от частичной деградации, позволяет осуществлять специфическую окраску криообразцов. Однако методика не предполагает возможность изучения КИК на этапе разработки и до имплантации экспериментальному животному, то есть вне блока тканей. Также нет указания на возможность подготовки микропрепаратов для последующего анализа на конфокальном микроскопе, при этом недостаточно быстрая заморозка КИК, заселенной эукариотическими клетками, при температуре от -20 до -30°С сопровождается формированием микрокристаллов льда и приводит к повреждению внутриклеточных структур эукариотических клеток, а также делает невозможным их последующую окраску и проведение конфокальной микроскопии. Кроме того, недостаточная фиксация к предметному стеклу при микротомии нативного или уже заселенного скаффолда может приводить к повреждению (сминанию) его структуры.
Следует отметить, что практическое использование известных методов связано с деградацией полимерного носителя и КИК на основе полилактида в процессе депарафинизации и последующей окраски, слабой адгезией криосреза к предметному стеклу, медленной заморозкой образца, что приводит к неоднородной заморозке и отсутствию оценок возможной деградации полимерного скаффолда при депарафинизации и проводки по спиртам.
Таким образом, общими недостатками как перечисленных аналогов, так и прототипа являются: использование спиртов и ксилола для депарафинизации, что приводит к частичной деградации полимерного носителя и ухудшает анализ образцов КИК, как до имплантации, так и в составе тканевых блоков; наличие тонкого слоя полилизина на предметных стеклах, является причиной слабой адгезии и возможного повреждения структуры скаффолда при его недостаточной фиксации; медленная заморозка образца при температуре (-20-30°С) сопровождается формированием микрокристаллов льда и повреждением внутриклеточных структур эукариотических клеток, что не позволяет проводить конфокальную микроскопию; сложность визуализации образца светлой КИК при фиксации в крио-геле для дальнейшего изготовления криосреза.
Задача изобретения состоит в разработке способа приготовления гистологического среза КИК, позволяющего сохранить ее структуру, а также скаффолда на основе полилактида для дальнейшего гистологического анализа клеточно-инженерной конструкции и процессов клеточной пролиферации в ней.
Для решения поставленной задачи были проведены следующие эксперименты:
1. Повышение адгезивной способности предметного стекла за счет дополнительного покрытием полилизина.
На поверхность предметного стекла наносили и равномерно распределяли дополнительный адгезивный слой полилизина, после чего стекла помещали в термостат при температуре +37°С на 24 часа. Для одного предметного стекла использовали 250 мкл полилизина в концентрации 1 мг/ мл. Таким образом, создавали дополнительный адгезивный (полилизиновый) слой на поверхности предметного стекла для надежной фиксации будущего криосреза и последующей его окраски. При отсутствии дополнительного слоя криосрез КИК не адгезировался надежно с предметным стеклом и происходило отклеивания среза в процессе последующей окраски
2. Создание и предварительная окраска КИК для усиления ее контрастности в фиксирующем геле для заморозки.
Вторым этапом изготовливали клеточно-инженерные конструкции. За основу был взят полимерный каркас из полилактида (Фигура 1). Клеточным компонентом выступала культура мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга, полученных из костного мозга половозрелой крысы. Клетки были получены в Центре коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных» ИНЦ РАН [16]. Клеточную культуру совмещали с полимерным носителем динамическим способом с помощью ранее разработанного для этого устройства [15]. Культивирование КИК производили в стандартных условиях в течение 21 суток в среде Dulbecco's Modified Eagle Medium с добавлением смеси антибиотиков пенициллин-стрептомицин (конечная концентрация 50 мкг/мл) и сыворотки Fetal Bovine Serum (конечная концентрация 10%). Изготовление гистологических срезов для анализа пролиферации клеток внутри КИК проводили на 14 и 21 сутки наблюдения. Образцы КИК в указанные сроки для увеличения контрастности и лучшей визуализации скаффолда подкрашивали водным раствором 1% эозина в течение 20 минут, что способствовало более точному позиционированию тестируемых образцов КИК в геле для фиксации (Фигура 2). Без окрашивания криосреза КИК не удается визуализировать КИК в заливаемом компаунде и осуществить первоначальную подрезку без риска потерять часть образца.
3. Изготовление криосреза КИК и его гистологическое исследование с применением световой и конфокальной микроскопии.
Образец КИК фиксировали на предметном столике и заливали гелем-компаундом для криомикроскопии TissueTek (Leica Biosystems, Германия) до полного покрытия образца. После этого образец КИК с гелем помещали в жидкий азот для шокового охлаждения. Через 1 минуту после полного охлаждения образец помещали в криомикротом, где при температуре -20°С выполняли нарезку образца. Толщина среза составляла от 10 до 20 мкм. Первоначальную подрезку осуществляли до основы КИК, окрашенной эозином, которая контрастировала на фоне светлого фона геля. Далее проводили нарезку зоны интереса и фиксацию полученных срезов на предварительно модифицированном полилизином предметном стекле. Полученные срезы окрашивали различными красителями (гематоксилин и эозин, альциановый синий) и закрывали покровными стеклами для последующей микроскопии. В ходе приготовления гистологических препаратов исключили использование спирта и ксилола. Установили, что получившиеся срезы дают информативную картину процессов пролиферации клеточной культуры ММСК внутри биодеградируемого носителя (Фигура 5). Также показали, что культура клеток заполняет все полости пористого носителя уже к 14 суткам наблюдения. На сроках 14 и 21 сутки при окраске альциановым синим отмечали наличие синтезированных белков внеклеточного матрикса гиалинового хряща. При проведении флуоресцентной и конфокальной микроскопии криосрезов, окрашенных DAPI, получили четкую визуализацию ядерных элементов клеток. Были получены данные о трехмерном распределении клеточной культуры внутри КИК, а также о характере заполнения скаффолда ММСК. Признаков деградации криосрезов при их получении и окраске нами выявлено не было (Фигура 6,7). Без шокового охлаждения нам не удалось добиться стабильного получения крисреза КИК.
4. В качестве методик сравнения были использованы СЭМ анализ КИК и гистологическое исследование КИК с применением методики парафиновых блоков.
Методами сравнения были классическая гистологическая пробоподготовка и СЭМ (Фигура 5). При стандартной гистологической проводке парафинизации и депарафинизации в ксилоле и восходящей концентрации спиртов были получены данные. Установили, что спирты и ксилол приводят к гидролизу скаффолда из полимолочной кислоты (Фигура 3,4), что согласуется с данными из научной литературы.
СЭМ проводили на аппаратном комплексе Jeol JSM6390LA (Jeol, Japan) совместно с ФГБУН «Ботанический институт им. В.Л. Комарова». Тестируемые образцы КИК размерами не более 8 Х8 Х 8 мм обезвоживали и сушили в условиях вакуума. Далее на препарат напыляли слой палладия и золота толщиной 5 нм, а затем проводили анализ поверхности КИК (Фигура 5). Результат позволил получить численные значения исследуемых образцов, поверхностную структуру и оценить перифокальную область интереса.
Таким образом, в проведенном исследованиибыл выявлен новый способ пробоподготовки КИК на основе полимолочной кислоты и культуры эукариотических клеток для проведения гистологического анализа КИК и процессов клеточной пролиферации в ней, в результате чего получены качественные гистологические криопрепараты с сохранением структуры скаффолда, анализируемые на флюоресцентном и конфокальном микроскопе без признаков деградации и использовании спиртов и ксилола, а также депарафинизации.
Технический результат состоит в обеспечении изготовления качественных гистологических препаратов КИК, а именно сохранении строения скаффолда и целостности внутриклеточных структур, что позволяет оценить взаимодействие полимерного носителя и клеточной культуры, а также пролиферацию последней.
Технический результат достигается за счет того, что для исследования образца предварительно готовят стекла с дополнительным полилизиновым слоем из 250 мкл полилизина, равномерно нанесенным сверху на каждое предметное стекло в концентрации 1 мг\мл, затем стекла подсушивают в течение 24 часов при температуре 37°С; образец клеточно-инженерной конструкции предварительно контрастно подкрашивают 1% раствором эозина, после чего выполняют его шоковую заморозку в жидком азоте при температуре минус 196 °С, фиксируют в криомикротоме с использованием криогеля, затем осуществляют криомикроскопическую вырезку области клеточно-инженерной конструкции с фиксацией ее на подготовленном адгезивном предметном стекле.
Нанесение дополнительного адгезивного слоя на поверхность предметного стекла, контрастная подкраска КИК эозином, а также шоковая (экстренная) заморозка в жидком азоте позволяет избежать использования спиртов, ксилола и депарафинизации, использование которых приводит к деградации полимерного носителя и не позволяет эффективно оценить происходящие процессы.
Одновременное использование шоковой заморозки образца КИК в жидком азоте и предварительно нанесенного дополнительного адгезирующего полилизинового слоя на предметном стекле исключает деградацию образца полилактидного носителя с клеточной культуры, а также позволяет осуществить специфическую гистохимическую окраску и анализ изображений на конфокальном микроскопе как до, так и после имплантации КИК в организм экспериментальных животных (крыс).
На фигурах изображено:
Фигура 1. Фотография скаффолда из полимолочной кислоты заготовки для создания КИК.
Фигура 2. Фото КИК после контрастной подкраски эозином. Динамическое заселение культурой клеток биодеградируемого полилактидного носителя.
Фигура 3. Гистологический препарат КИК на основе полилактида и клеточной культуры. На фигуре изображена КИК после стандартной гистологической проводки, включая депарафинизацию, обработки ксилолом и спиртами. Выделены участки деградации скаффолда из полимолочной кислоты.
Фигура 4. Гистологический препарат КИК на основе полилактида и клеточной культуры. На фигуре изображена КИК после стандартной гистологической проводки, включая депарафинизацию, обработки ксилолом и спиртами. Выделены участки деградации скаффолда из полимолочной кислоты.
Фигура 5. СЭМ изображение КИК сразу после заселения клетками. На фигуре изображена поверхность КИК. Вид сверху. Контрольный штрих указан на рисунке.
Фигура 6. Гистологический срез КИК после культивирования. На фигуре изображены гистологические снимки криосрезов, окрашенных гистологическими красителями. А, В - 7 суток после заселения. Рисунок В соответствует выделенной области рисунка А. Рисунок С - после 14 суток после заселения и культивирования. Окраска альциановый синий. Контрольный штрих указан на рисунке.
Фигура 7. Криосрез КИК. На фигуре изображены гистологические снимки криосрезов, полученные на флуоресцентном (А, В) и конфокальном (С) микроскопе. Контрольный штрих указан на рисунке.
Фигура 8. Визуализация расположение клеток внутри биодеградируемого скаффолда в трехмерном пространстве полученная с помощью изготовления криосрезов и последующей конфокальной микроскопии.
Фигура 9. Расположение клеток граничного слоя при динамическом заселении скаффолда. Криосрез и конфокальная микроскопия. Контрольный штрих указан на рисунке.
Способ осуществляется следующим образом:клеточную культуру мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга выделяют у половозрелой крысы. Культуру пассируют до 3 пассажа и проверяют на проточном цитометре на наличие поверхностных маркеров экспрессии CD90 и отсутствие маркеров CD45.
6
Затем создают клеточно-инженерную конструкцию. Сначала подготавливают полимерный носитель на основе полимолочной кислоты (ПМК), далее его стерилизуют и осуществляют предварительную обработку формы полилактида для будущего совмещения его с клеточной культурой динамическим способом в разработанном биореакторе. После этой процедуры цилиндрические формы стерилизуют и помещают в биореактор для динамического заселения клеточной культуры. Клеточную культуру объемом 5 мл и концентрацией 10 жизнеспособных клеток на 1 мл дважды прокачивают через биодеградируемый скаффолд из полилактида. Таким образом происходит заселение скаффолда клетками на всю глубину и по всей поверхности.
Далее КИК культивируют в течение 21 дня с добавление необходимого количества питательной среды для клеточной культуры, сыворотки и антибиотика.
Перед приготовлением криосреза подготавливают предметные стекла для придания их поверхности больше адгезивности. Для этого поверхность стекла дополнительно обрабатывают полилизином (поверх штатного полилизинового слоя, который уже был нанесен компанией-производителем данных стекол). Стекла инкубируют в термостате при +37°С в течении часа, после чего они готовы к применению.
Образцы полученных КИК на основе полилактида имеют светлый цвет, чтобы контрастировать их на фоне заливающего и фиксирующего геля TissueTek (Leica Biosystem, Германия), их предварительно окрашивают эозином. Окрашенные КИК заливают фиксирующим гелем на платформе для криосреза, затем конструкцию помещают в жидкий азот для шоковой заморозки при температуре -196°С.
Подрезка замороженного геля происходит при температуре -20°С до окрашенной области КИК. Криосрезы изготавливают толщиной 10-20 мкм и фиксируют на адгезивной поверхности предметного стекла с полилизином, который предварительно наносят в концентрации 1 мг на мл в количестве 250 мкл на одно стекло и распределяют равномерно. После нанесения слоя полилизина стекло сушат при температуре +37°С в течении 24 часов. Полученные КИК используют для оценки пролиферации клеточной культуры внутри биодеградируемого полимерного скаффолда заполнением и распределением клеток внутри полимера. По анализу свободных от клеточной культуры зон в полимере на разных сроках наблюдения оценивают степень и направление пролиферации и заполнения свободного пространства внутри пористого полилактидного носителя, а также динамику заполнения клеточной культурой свободных пространств.
Пример.
Для эксперимента из коллекции культур клеток позвоночных Центра коллективного пользования Института Цитологии РАН была взята культура клеток и была создана клеточно-инженерная конструкция из полимера на основе полимолочной кислоты. Из образцов КИК были получены криосрезы, для дальнейшего анализа. На основании полученных криосрезов КИК с помощью послойной конфокальной микроскопии с окраской на ядра клеток (DAPI) в экспериментах были получены качественные гистологические криосрезы, а также оценена целостность полимерного скаффолда, жизнеспособность и расположение клеток в центральных и пограничных областях полимерного скаффолда, а также равномерность, направление и динамика их пролиферации при использовании разных сроков наблюдения. Так было отмечено, что клеточная культура пролиферирует и заполняет свободные площади полимера, причем степень заполнения увеличивается со сроком наблюдения. С помощью 3 D визуализации оценили целостность клеточных структур, пролиферацию клеток в разных слоях и областях в одном анализируемом образце. Было обнаружено, что максимальная концентрация клеток после динамического заселения клеточной культурой полимерного скаффолда образуется в центральной области и в пограничном слое. Расположение клеток внутри трехмерного биодеградируемого носителя показано с помощью методики изготовления криосрезов и конфокальной микроскопии (Фигура 8, Фигура 9). С помощью конфокальной микроскопии и специфической окраски DAPI было установлено, что в поперечном срезе клеточно инженерной конструкции распределение клеток одинаково от слоя к слою. Таким образом, можно сделать вывод о том, что результат достигнут.
Список литературы.
Exp. Gerontol.
1. Fioretta E., von Boehmer L., Motta S., Lintas V., Hoerstrup S., Emmert M. Cardiovascular tissue engineering: from basic science to clinical application. 2019;117:1-12.
2. Li Ming, Yuan Zhipeng, Yu Fei, Rao Feng, Weng Jian, Jiang Baoguo, Wen Yongqiang, Zhang Peixun. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018;46(sup1):336-346. doi: 10.1080/21691401.2017.1423498. Epub 2018 Mar 26. Microfluidic-based screening of resveratrol and drug-loading PLA/Gelatine nano-scaffold for the repair of cartilage defect.
3. Teixeira, S.; Eblagon, K.M.; Miranda, F.; Pereira, M.F.R.; Figueiredo, J.L. Towards controlled degradation of poly(lactic) acid intechnical applications. J. Carbon Res. 2021, 7, 42.
4.  F.; Auras, R.; Burgess, G.; Holmes, D.; Fang, X.; Rubino, M.; Soto-Valdez, H. Concurrent solvent induced crystallization and hydrolytic degradation of PLA by water-ethanol solutions. Polymer 2016, 99, 315-323.
5. Device and methods for in vivo culturing of diverse tissue cells. United States Patent 5981825. 1999.
6. Articular cartilage repair, United States Patent 11109975, 2015, Estes, Bradley T. (Durham, NC, US) Moutos, Franklin Thomas (Raleigh, NC, US) Guilak, Farshid (Durham, NC, US).
7. Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations. United States Patent 8562972. 2013. Edinger, James W. (Belford, NJ, US) Hariri, Robert J., Wang, Jia-lun, Ye, Qian, Labazzo, Kristen S., Pereira, Marian, Abramson, Sascha Dawn.
8. Biodegradable tissue compositions with biodegradable cross-linkers. United States Patent 9072814. 2015. Pathak, Chandrashekhar P. Thigle, Sanjay M.
9. M Microsphere compositions, preparation method and applications thereof. United States Patent 9629811. 2017. Morille, Marie , Tran, Van-thanh, Garric, Xavier , Coudane, Jean , Venier-julienne, Marie-claire, Montero-menei, Claudia.
10. Adhesive tissue repair patch and collagen sheets, United States Patent 8617584, 2013, Sehl, Louis C., Trollsas, Olof Mikael , Mallace, Donald G., Toman, David, Delustro, Frank A., Schroeder, Jacqueline A., Chu, George H.
11. Composition and method for the repair and regeneration of cartilage and other tissues ,United States, US8258117B2, 2006, Caroline D. Hoemann Michael D. Buschmann Marc D. McKee.
12. Method of applying a biological specimen to an analytic plate, United States Patent 9176029, 2015, Angros, Lee H.
13. Methods of tissue repair and regeneration, United States Patent 11077138, 2021, Kang, Yujian James.
14. Method and system for preparing tissue samples for histological and pathological examination, United States Patent 6615592, Prien, Samuel D., Blanton, John, Wood, Brian, Cassell, Allan J.
15. Божокин М.С., Божкова С.А., Литвинов Е.М., Косьмин В.Л. Устройство для совмещения клеточной культуры и биодеградируемого носителя Патент на полезную модель RU 190863 U1, 15.07.2019. Заявка № 2019104311 от 15.02.2019.
16. Клеточная культура получена в Центре коллективного пользования в коллекции культур клеток позвоночных в Институте Цитологии РАН.