Кристаллизационная оценка изменения конформационных свойств сыворотки крови под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения

УДК: 619:591.111.1:615.8

Ключевые слова: низкоинтенсивное лазерное излучение, сыворотка крови, кристаллизация, фация

Key words: low-intensity laser radiation, blood serum, crystallization, facies

Голубцов А. В.

КРИСТАЛЛИЗАЦИОННАЯ ОЦЕНКА ИЗМЕНЕНИЯ КОНФОРМАЦИОННЫХ

свойств сыворотки крови под влиянием низкоинтенсивного

ЛАЗЕРНОГО излучения

crystal evaluation of conformational property changes in blood serum being exposed to low intensity laser radiation

ФГОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет им. императора Петра 1» Адрес: 394087, Россия, Воронеж, ул. Ломоносова, 114-а

Emperor Peter I voronezh state Agricultural university Address: 394087, Russia, voronezh, Lomonosov street, 114-a

Голубцов Андрей Васильевич, к. в. н., доцент

Golubtsov Andrey v., Ph.D. in veterinary science, Associate Professor

Аннотация. Показано влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на конформационную структуру белков сыворотки крови in vitro. Оценку влияния низкоинтенсивного лазерного излучения проводили, исследуя кристаллизационную структуру фации сыворотки крови.

Summary. The paper shows the effect of low intensity laser radiation on the conformational structure of the blood serum proteins in vitro. Evaluation of the effect of low intensity laser radiation was performed by examining of the crystal structure of blood serum facies.

Введение

Реальные молекулы находятся в непрерывной динамике в силу того, что в наименьшей их структурной единице - атоме -происходит постоянное перемещение электронов. Атомы в молекуле движутся, соударяются друг с другом и обмениваются при этом энергией. Постоянный обмен энергией внутри молекулы и между соседними молекулами обеспечивает поддержание их определенной пространственной организации с устойчивыми свойствами. Вся молекула движется как единое целое (поступательное и вращательное движение), а отдельные ее части совершают вращательные и колебательные движения относительно друг друга (внутримолекулярные движения). Если движение молекулы как единого целого не изменяет ее форму, то внутримолекулярные движения непрерывно воспроизводят новые формы. Такие перестройки в молекуле называют конформационными переходами [7].

Конформациями молекулы являются ее различные пространственные структуры, возникающие за счет вращения ее отдельных компонентов вокруг простых связей без их

разрыва. В каждый момент времени конфигурация макромолекулы как форма может быть описана пространственным распределением атомов и атомных групп, постоянными значениями валентных углов и переменными ориентациями валентных связей. Таким образом, молекула может принимать различные конформации вследствие способности ее составных частей свободно вращаться вокруг одинарных (углерод-углеродных) связей. При этом формируются конформа-ционные изомеры молекул, которые имеют ту же химическую структуру, но несколько отличные свойства. Таким образом, поверхность каждой белковой молекулы обладает уникальными химическими свойствами, зависящими не только от природы аминокислот, входящих в ее состав, но и от точной их взаимной ориентации.

Для организма, находящегося в физиологическом и биохимическом равновесии характерна определенная стабильность пространственной организации биологических молекул. Молекулы органических соединений в цитоплазме клеток и плазме крови обычно существуют в виде смеси находя-

щихся в равновесии конформеров, среди которых преобладают энергетически наиболее выгодные. Общепризнанна теория о том, что в результате эволюции стабильная конфор-мация любых белковых молекул обладает минимальной свободной энергией по сравнению с другими возможными конформаци-ями этого полипептида [9].

В настоящее время не вызывает сомнений, что не только основные химические и физические свойства органических соединений, но и биологические свойства, в том числе малых молекул, в значительной степени определяются детальной пространственной организацией этих молекул.

Альбумин, являясь одним из основных белков плазмы крови, выполняет различные функции. Одна из важнейших функций альбуминов - транспортная. Эти белки участвуют в переносе различных плохо растворимых в воде соединений, в том числе свободных жирных кислот, холестерина, билирубина и различных биологически активных веществ. Значительная часть кальция в сыворотке также связана с альбуминами. По-видимому, они способны связывать любые гидрофобные и амфифильные лиганды малой молекулярной массы (до 1000 Да). Если альбумин свободен от лигандов, то его связывающая способность равна 100±2,35 % [2, 5, 6].

Не так давно был выявлен новый вид патологических изменений в молекулах белков: их первичная структура нормальна, однако нарушена их вторичная и/или третичная структура (конформация) [4].

При внедрении в организм и появлении в плазме крови сторонних частиц аутологи-ческого происхождения внутренняя среда организма реагирует на это изменениями пространственного порядка своих химических связей. Такие изменения носят специфический качественный характер, они имеют определенные количественные пределы. При этом любое изменение физико-химического состояния внутренней среды организма находит свое отражение в специфическом изменении формообразования ее структур. Анализ формы образующихся при кристаллизации структур используют для определения патологических отклонений в системе

устойчивости физиологических процессов организма [3].

Различные внешние воздействия, приводящие к развитию в организме патологических состояний могут вызывать потерю молекулой энергии и переход ее в новую конформацию. Таким образом, патологические процессы сопровождаются изменением конформационного состояния молекул белков плазмы крови. Белок с измененной кон-формацией не может эффективно выполнять свою транспортную функцию, что приводит к расстройству обменных процессов.

В опытах, проведенных Л. М. Беловой и Ю. П. Потехиной (2003), была доказана связь между изменением структуры фации сыворотки крови и конформационны-ми изменениями молекул альбумина в ней. Установлено изменение конформационных свойств альбуминов при изменении кислотности среды сыворотки крови, добавлении к ней мочевины, а также при старении образца сыворотки. Таким образом, изменения свойств окружающей среды, ее температуры, ионного состава, рН и других характеристик может изменить баланс сил, определяющих данную конформацию молекулы, и вызвать переход ее в новую конформацию, стабильную для создавшихся условий [1]. Воздействие физических факторов также вызывает изменение конформации различных биополимеров, и прежде всего белков, что ведет к разветвленной цепи изменений в процессах, протекающих с участием изменивших свою конформацию молекул. Конформационные изменения, как показывают экспериментальные исследования В. С. Улащика (1992), возникают под влиянием ультрафиолетовых лучей, ультразвука, электромагнитных полей и других воздействий.

Цель исследований - изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения красного спектра (630 нм) на конформационную структуру плазмы крови, которую оценивали по ее кристаллизации после дегидратации.

Материалы и методы

В опыте были задействованы образцы сыворотки крови (по 2,5 мл) от коров (п=10), основные биохимические показатели кото-

рых находились в пределах физиологической нормы, характерной для данного вида животных.

Облучение проводили с помощью лазерного терапевтического аппарата «Матрикс» и лазерной излучающей головки ВЛОК (630 нм, красный спектр), с максимальной мощностью излучения 2,5 мВт.

Для наблюдения за фацией использовали микроскоп Микромед-3 с подключенной к нему цифровой камерой-окуляром DSM 500.

Обработку полученных фотографий осуществляли с помощью программного обеспечения для обработки изображения ScopePhoto.

Функциональное состояние сыворотки крови можно исследовать с помощью метода клиновидной дегидратации. Этот метод исследования жидкостных сред организма был разработан и запатентован академиком Шабалиным В. Н. и д. м. н. Шатохиной С. Н. Метод позволяет визуально проводить наблюдение архитектоники жидких сред организма после их кристаллизации и, опираясь на полученные данные, оценивать функциональное состояние внутренней среды организма. Фотосъемка с последующей статистической обработкой дает возможность сравнивать и визуально определять изменения, происходящие во внутренней среде организма под влиянием патологического процесса или проводимой терапии [8].

Метод клиновидной дегидратации выполняли по общепринятой методике. Для этого на предметное стекло, расположенное строго горизонтально, автоматическим дозатором наносится капля сыворотки крови. Объем капли составляет 0,01 мл. На каждом стекле делают 3 повтора для проверки достоверности и взаимной идентичности между собой высохших капель. Диаметр капли на предметном стекле 5 мм. Средняя толщина около 1 мм. Угол наклона поверхности капли 2530°. При температуре 30 °С и относительной влажности 65-70 % образец высушивается. Процесс сушки продолжается 18-24 часа.

Полученная с помощью дегидратации капли биологической жидкости сухая пленка называется «фация». Она представляет собой фиксированный тонкий

«срез» исследуемой жидкости. Структура фации биологической жидкости является интегрированным образом всех имеющихся в ней многосложных молекулярных взаимосвязей, которые особым способом упорядочены и трансформированы на макроскопическом уровне. Любое изменение физико-химического состояния внутренней среды организма находит свое отражение в специфическом формообразовании структуры биологической жидкости и предоставляет нам суммарную, сжатую информацию о состоянии организма. При различных патологических сдвигах в фациях биологических жидкостей больного формируется адекватный рисунок, который объективно отражает интегрированную картину нарушений.

Из сывороток крови коров готовили фации п=10 и оценивали их структуру с помощью микроскопии (контроль 1). Затем образцы сывороток для моделирования старения хранили в холодильнике при 4 °С 7 дней. После хранения вновь готовили фации п=10 и исследовали их с помощью микроскопии (контроль 2).

После фонового исследования образцы хранившейся сыворотки крови подвергали облучению низкоинтенсивным лазерным излучением мощностью 2,5 мВт в течение 10 минут. Через каждую минуту облучение останавливали и из сыворотки готовили фации п=10. Таким образом, из одного образца сыворотки крови было приготовлено 10 фаций. Общее количество изготовленных препаратов из образцов сыворотки равно 110.

Через сутки производили снимки приготовленных фаций через микроскоп с помощью цифровой камеры. В последующем осуществлялась качественная и количественная оценка морфологических элементов полученной фации с помощью программного обеспечения для обработки изображения ScopePhoto.

При этом учитывались следующие характеристики фаций: форма, количество и размеры радиальных и поперечных трещин, отдельностей и конкреций, краевой волновой ритм.

Результаты исследований

Отмечено, что фация сыворотки крови (контроль 1) имеет четко выраженную симметрию. В образцах фации наблюдаются радиально расположенные симметричные трещины. При этом поперечные трещины встречаются крайне редко. Видна небольшая амплитуда краевого волнового ритма. Сами волны ровные без обрывающихся гребней (фото 1).

Фото 1. Фация сыворотки крови (контроль 1). Четко выраженная симметрия.

После хранения сыворотки крови при 4 °С наблюдали изменение структуры приготовленной из нее фации (контроль 2). Фация имеет нарушенную симметрию, отличающуюся по структуре кристаллизации от контроля 1. Наблюдается увеличение числа поперечных трещин, разделяющих радиальные лучи. Увеличена амплитуда краевого волнового ритма. Гребни волн краевого ритма смещены и резко обрываются (фото 2). Отмечается нарушение структуры центральной зоны фации (фото 3). Выше описанные феномены указывают на процессы старения, протекающие в образцах сыворотки, связанные с изменением конформационных свойств белков сыворотки. Это находит свое отражение в изменении характера кристаллизации.

Отмечено, что структура фации сыворотки крови изменяется уже в течение первой минуты при низкоинтенсивном лазерном облучении образца объемом 2,5 мл. Во всех случаях установлена тенденция к увеличению симметричности структурной организа-

Фото 2. Фация (контроль 2) имеет нарушенную симметрию.

Фото 3. Нарушение структуры центральной зоны фации.

Фото 4. Кристаллизационная структура становится аналогичной исходной.

ции фации. Кристаллизационная структура становится аналогичной исходной (фото 4).

Затем, начиная со второй минуты, в сыворотке крови начинают происходить нега-

тивные регрессивные изменения, такие как увеличение краевого волнового ритма, появление значительного количества поперечных трещин, разрушение рисунка центральной зоны (фото 5, 6).

Фото 5. Негативные регрессивные изменения.

Фото 6. Разрушение рисунка центральной зоны.

Обсуждение результатов исследований

По нашему мнению, энергия, поступающая в сыворотку крови при ее лазерном облучении, позволяет альбуминам восстанавливать свою структуру, нарушенную в результате старения, наступающего при хранении образца. Когда ассимилированная сывороткой энергия переходит критическую отметку, позитивное действие сменяется негативным. Узкий временной интервал между положительным и деструктивным эффектом, полученный нами в ходе эксперимента, очевидно, связан с небольшим объемом сыворотки крови, облучаемой низкоинтенсивным лазерным излучением.

Выводы

По результатам наших исследований установлено:

1. Воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения способствует восстановлению конформационной структуры альбуминов сыворотки крови до исходной.

2. Изменение функциональных свойств сыворотки крови можно анализировать по характеру ее кристаллизации.

Список литературы

1. Белова, Л. М. Исследование конформационных изменений молекулы альбумина в различных условиях методом клиновидной дегидратации / Л. М. Белова, Ю. П. Потехина // Нижегородский медицинский журнал. - 2003. - № 3-4. - С. 89-90.

2. Добрецов, Г. Е. Биохимия и физико-химия сывороточного альбумина. Центры связывания органических молекул / Г. Е. Добрецов, Ю. И. Миллер // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / под ред. Ю. А. Грызунова и Г. Е. Добрецова. - М., 1994. - С. 13-28.

3. Кидалов, В. Н. Способ определения индивидуальной магниточувствительности человека. / В. Н. Кидалов, Б. Л. Макеев // Усовершенствование методов, аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике: сб. изобретений и рац. предложений. -Л. - Вып. 26. - 1995. - С. 42.

4. Лопухин, Ю. М. Конформационные изменения молекулы альбумина: новый тип реакции на патологический процесс / Ю. М. Лопухин, Г. Е. Добрецов, Ю. А. Грызунов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - № 7. - С. 4-9.

5. Пат. 2262106 Российская Федерация, МПК7 G01N33/52. Способ подбора индивидуального курса лазеротерапии для детей [Текст] / В. М. Воинова, Р. В. Амбарцумян, В. Ю. Улас, Н. Д. Степина, Э. А. Юрьева, П. В. Новиков; заявитель и патентообладатель Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации (государственное учреждение науки). - № 2003119036/14; заявл. 27.06.2003; опубл. 10.10.2005, бюл. № 28. - 10 с.: ил.

6. Степанов, В. М. Структуры и функции белков / В.М. Степанов // Молекулярная биология / В. М. Степанов. - М., 1996. - 335 с.

7. Флорентьев, В. Л. Конформация органических молекул / В. Л. Флорентьев // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - № 7. - С. 37-43.

8. Шатохина, С. Н. Диагностическое значение профильной дегидратации сыворотки крови: структурная форма информации / С. Н. Шатохина, В. Н. Шабалин // Лаборатория. - 1999. - № 4. - С. 3-5.

9. Anfinsen, C. Principles that Govern the Folding of Protein Chains / C. Anfinsen // Science. 1973. - V. 181. -P. 223-229.