Генетическое разнообразие микросимбионтов байкальских видов чины ( Lathyrus), горошка ( Vicia), остролодочника ( Oxytropis) и астрагала ( Astragalus)

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 3, с. 345-352

УДК 631.461.51:577.2 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.345rus

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОСИМБИОНТОВ БАЙКАЛЬСКИХ ВИДОВ ЧИНЫ {Lathyrus), ГОРОШКА (Vicia,), ОСТРОЛОДОЧНИКА (Oxytropis) И АСТРАГАЛА (Astragalus)*

И.Г. КУЗНЕЦОВА1, А.Л. САЗАНОВА1, В.И. САФРОНОВА1, А.Г. ПИНАЕВ1, А.В. ВЕРХОЗИНА2, Н.Ю. ТИХОМИРОВА1, Ю.С. ОСЛЕДКИН1, А.А. БЕЛИМОВ1

Клубеньковые бактерии (ризобии) — грамотрицательные почвенные микроорганизмы, вступающие во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и обеспечивающие фиксацию атмосферного азота. Для понимания эволюции специфических растительномикробных взаимодействий особое значение имеют симбиотические системы с участием эндемичных или реликтовых видов. Цель нашей работы состояла в создании представительной коллекции штаммов-микросимбионтов эндемичных бобовых растений Байкальского региона, а также в оценке их биоразнообразия. Мы изучили таксономическое положение 69 штаммов, выделенных из корневых клубеньков чины низкой (Lathyrus humilis), горошка байкальского (Vicia baicalensis), астрагала монгольского (Astragalus mongholicus) и остролодочника лесного (Oxytropis sylvatica). Для первичной оценки внутривидового разнообразия штаммов проводили RFLP-анализ последовательности между генами 16S- и 23S-рРНК (ITS-региона). По его результатам исследуемые изоляты были разделены на 33 группы с идентичным набором фрагментов ДНК. Видовую принадлежность штаммов определяли методом секвенирования гена WS-рРНК (ns). Анализ его последовательности показал, что 23 штамма принадлежали к родам Rhizobium и Mesorhizobium и формировали 3 статистически достоверно различающихся кластера с уровнем поддержки более 95 %. Для уточнения таксономического положения клубеньковых бактерий рода Bosea использовали метод секвенирования более вариабельного ITS-региона. Филогенетический анализ показал значительное генетическое разнообразие микросимбионтов изученных растений. Ризобиальные изоляты принадлежали к 5 родам: Rhizobium (сем. Rhizobiaceae), Mesorhizobium и Phyllobacterium (сем. Phyllobacteriaceae), Bosea и Tardiphaga (сем. Bradyrhizobiaceae). Кроме этого, были получены изоляты, не относящиеся к клубеньковым бактериям и принадлежащие родам Heibiconiux, Leifsonia, Burkholdeiia и Stenotrophomonas. Известно, что некоторые виды этих родов могут присутствовать в клубеньках бобовых растений, а также быть обитателями ризосферы и филосферы различных представителей флоры. Присутствие нетипичных ризобиальных микросимбионтов в клубеньках изученных растений может свидетельствовать об активно происходящих процессах формирования взаимоотношений между партнерами в бобово-ризобиальных системах Байкальского региона.

Ключевые слова: бобовые растения Байкальского региона, таксономия ризобий, се-квенирование генов рибосомальных РНК.

Клубеньковые бактерии (ризобии) — обширная генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и обеспечивать фиксацию атмосферного азота. Одна из актуальных задач современной биотехнологии — изучение механизмов взаимодействия бобовых растений с ризобиями, что необходимо для проведения научно обоснованной селекции высокоэффективных растительно-микробных систем (1).

Для понимания эволюции специфических растительно-микробных взаимодействий особое значение имеют симбиотические системы с участием эндемичных или реликтовых бобовых растений, служащих промежуточным звеном между исчезнувшими и современными видами. К таким уникальным объектам относятся бобовые растения Байкальского региона: чина низкая (Lathyrus humilis) — позднеплейстоценовый реликт южноси-бирско-североуральского ареала (2); астрагал монгольский (Astragalus mongholicus) — редкое лекарственное растение (3, 4); эндемики Забайка-

* Секвенирование гена rrs микросимбионтов Vicia baicalensis было выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (Соглашение № 14-26-00094).

345

лья горошек байкальский (Vicia baicalensis) и остролодочник лесной (Oxy-tropis sylvatica) (5).

Немногочисленные данные по микросимбионтам рода Astragalus свидетельствуют о большом разнообразии этих микроорганизмов, которые принадлежат к различным родам порядка Rhizobiales: Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium и Mesorhizobium (6-9). Виды чины и горошка нодулируются бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae (10-12), среди микросимбионтов остролодочника описаны ризобиальные и мезо-ризобиальные штаммы (7, 13). Однако микросимбионты байкальских представителей этих родов растений ранее изучены не были.

Цель нашей работы состояла в создании представительной коллекции штаммов-микросимбионтов эндемичных бобовых растений Забайкалья (чины низкой, астрагала монгольского, горошка байкальского и остролодочника лесного), а также в определении их таксономического положения с помощью метода секвенирования ^S-рДНК и ITS-региона.

Методика. Объектом исследования были 69 штаммов, изолированных согласно описанию (14) из корневых клубеньков чины низкой Lathy-rus humilis и горошка байкальского Vicia baicalensis (по две популяции), а также астрагала монгольского Astragalus mongholicus и остролодочника лесного Oxytropis sylvatica (по одной популяции), которые произрастали на побережье Чивыркуйского залива (Забайкалье). Штаммы выращивали на маннитно-дрожжевом агаре (YMA) при 28 °С (7).

Для первичной оценки внутривидового разнообразия штаммов был проведен RFLP-анализ последовательности между генами 16S- и 23S-рРНК (ITS-региона). Амплифицированную ДНК обрабатывали рестриктазой MspI, после чего проводили электрофорез рестрицированных ДНК-фрагментов в стандартном режиме (15). Видовую принадлежность штаммов определяли методом секвенирования гена ^S-рРНК (rrs). Для уточнения таксономического положения клубеньковых бактерий рода Bosea использовали метод секвенирования более вариабельного ITS-региона.

Для амплификации ^S-рДНК (около 1500 bp) использовали праймеры fD1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rD1 (5' -AAGGAGGTG-ATCCAGCC-3'), для амплификации ITS-региона (800 bp) — праймеры FGPS1490-72 (5'-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3') и FGPL-132 (5'-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3'). Полученный ПЦР-продукт очищали посредством выделения из геля (15) для последующего секвенирования.

Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью базы данных GenBank (программа BLAST). Конструирование филогенетического дерева осуществляли в программе MEGA v. 4.0.2 (метод NeighborJoining). Для сравнения пар последовательностей использовали число различающихся нуклеотидов.

Результаты. Штаммы, которые были исследованы в работе, представлены в таблице.

По скорости роста изоляты разделились на две группы: у 9 штаммов видимые колонии образовывались на 5-6-е сут роста на среде YMA, остальные штаммы образовывали колонии на 3-и-4-е сут. По результатам RFLP-анализа ITS-региона исследуемые изоляты были разделены на 33 группы с идентичным набором фрагментов ДНК. Один представитель из каждой группы был отобран для секвенирования гена rrs. Анализ его последовательности показал, что 23 штамма принадлежали к родам Rhizobium и Mesorhizobium и формировали 3 статистически достоверно различающихся кластера с уровнем поддержки более 95 % (рис. 1).

346

Таксономическая структура шгаммов-микросимбионтов, выделенных из корневых клубеньков у эндемичных бобовых растений Байкальского региона

Номер штамма-микросимбионта бобовых растений

Вид микросимбионта чины низкой Lathyrus humilis астрагала монгольского Astragalus mongholicus горошка байкальского Vicia baicalensis остролодочника лесного Oxytropis sylvatica

Rhizobium sp. 2/5(1), 2/12М - - -

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Mesorhizobium 1/10К, 2/10К 11/2, 11/3К, 11/4М, 11/7К, 11/12М, 11/19, 11/20, 11/21, 11/22, 11/23, 11/24К, 11/24М, 11/25, 11/33, 11/34К, 11/34М, 11/35, 11/36, 11/37К, 11/37М, 11/38, 11/39, 11/42К, 11/42М, 11/43К, 11/44К, 11/44М, 11/45К, 11/46, 11/47К, 11/47М, 11/48К, 11/48М, 13/3, 13/4, 13/6М, 13/7, 13/8К, 13/9М, 13/11 12/13М, 12/16К

metallidurans - 3/14С1, 3/14С2 - -

Mesorhizobium ciceri 2/13К - - -

Tardiphaga robiniae 1/11М 3/6М, 3/11С, 3/21

Bosea sp. 3/5М, 3/31К 12/22М

Bosea vaviloviae - 3/25 - -

Herbiconiux sp. 1/3М, 1/5М, 1/14М, 1/15М - - -

Burkholderia sp. - 3/8К 13/5 -

Leifsonia sp. - 3/23М, 3/27К -

Stenotrophomonas sp. - 3/17 11/7М -

Phvliobacterium sp. — Примечание. Прочерки означают отсутствие изолятов 13/12М

Кластер I включал 19 штаммов, изолированных из чины низкой, горошка байкальского и остролодочника лесного (соответственно 3, 14 и 2 штамма), а также два типовых штамма R. leguminosarum bv. trifolii ATCC14480Т и R. leguminosarum bv. viciae ATCC10004Т. На основании результатов секвенирования гена rrs (см. табл.) изоляты 1/10K, 2/10K, 11/3K, 11/4M, 11/7K, 11/12M, 11/21, 11/23, 11/24K, 11/34M, 11/37M, 12/13M, 12/16K, 13/3, 13/4, 13/6M, 13/7M, 13/8K были идентифицированы как R. leguminosarum bv. trifolii (степень сходства с типовым штаммом ATCC14480Т составляла 99,7-99,9 %).

Кластер II сформировали штамм 2/5(1), изолированный из чины низкой, и типовой штамм Ш52Т вида Rhizobium giardinii, который был описан для штаммов-микросимбионтов фасоли обыкновенной (16). Однако, поскольку сходство между этими штаммами по гену rrs составляло всего 99,0 %, штамм 2/5(1) был идентифицирован как Rhizobium sp. (см. табл.).

Три изолята были отнесены к роду Mesorhizobium (см. рис. 1, табл.). Штаммы 3/14С1 и 3/14С2 (кластер III), выделенные из астрагала монгольского, были идентифицированы как Mesorhizobium metallidurans и M ciceri (гомология с типовыми штаммами STM2683Т и NBRC100389Т по гену rrs составила соответственно 100 и 99,6 %).

На рисунке 2 представлена rs-филограмма, отражающая таксономическое положение 9 медленнорастущих ризобиальных изолятов в пределах семейства Bradyrhizobiaceae. Штаммы 1/11M, 3/6M, 3/11C, 3/21(2), 12/11(1), выделенные из разных растений, сформировали кластер IV с ти-

347

повым штаммом Tardiphaga robiniae LMG26467T и были отнесены к этому

49

2/10К 11/21 11/ЗК

Ehizobium leguminosarum bv trifolii ATCC14480T 11/37M 11/12M 13/7M 13/3 13/4 11/7K 11/34M 13/8K 13/6M 12/13M 12/16K 11/4M 11/23 11/24K 1/10K ---2/12M

---Ehizobium leguminosarum bv viciae ATCC10004T

I—Ehizobium leucaenae LMG9517T

1 I----Rhizobium tropici CIAT899T

97 'Rhizobium freirei PRF81T Ehizobium leguminosarum bv phaseoli ATCC14482T Rhizobium etli CFN42T

Ehizobium mesoamericanum CCGE501T Ehizobium grahamii CCGE502T

t Ehizobium alamii GBV016T —Rhizobium sullae IS123T ' -Ehizobium gallicum R602spT

991----Rhizobium mongolense USDA1844T

Ehizobium giardinii H152T 2/5

Rhizobium selenitireducens BIT Rhizobium vignae CCBAU05176T

Rhizobium undicola LMG11875T 56rMesorhizobium ciceri NBRC100389T mAj 2/13K

““J---Mesorhizobium australicum WSM2073T

Mesorhizobium loti ATCC33669T

Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-Mesorhizobium opportunistum WSM2075T Mesorhizobium amorphae ACCC19665T Mesorhizobium huakuii IF015243T Mesorhizobium plurifarium LMG11892T ,

Mesorhizobium mediterraneum LMG17148T ' 3/14C1

\Mesorhizobium metallidurans STM2683T 3/14C2 -

2T

III

0,005

Рис. 1. Лт-филограмма, отражающая таксономическое положение изолятов родов Rhizobium и Mesorhizobium. Исследуемые штаммы обозначены жирным шрифтом. Литерой «Т» отмечены типовые штаммы; I-III — статистически достоверно различающиеся кластеры.

виду (уровень сходства по гену rrs 99,8-99,9 %). Кластер V с уровнем статистической поддержки 99,0 % был образован четырьмя штаммами 3/5M, 3/31К, 12/22М, 3/25 и двумя типовыми штаммами рода Bosea (B. lathyri и B. vaviloviae). Сходство изолятов с типовыми штаммами B. lathyri LMG26379T и B. vaviloviae Vaf-^Т по гену rrs составило соответственно 98,4-99,4 и 99,4-100 %. Следует отметить, что вид B. vaviloviae был описан совсем недавно, в 2015 году, для трех штаммов-микросимбионтов реликтового бобового растения Vavilovia formosa, произрастающего в Северной Осетии (17). Поэтому байкальские изоляты, принадлежащие к роду Bosea и имеющие высокую степень сходства с видом B. vaviloviae, представляют большой интерес для дальнейшего изучения.

У штаммов 3/5M, 3/31К, 12/22М и 3/25 был проведен анализ по-

348

следовательностей ITS-региона, поскольку этот метод обладает большей разрешающей способностью при идентификации близкородственных штаммов,

64

57

56

81

Hj

40

44

98

83\Bradyrhizobium rifense CTAW71T Л Bradyrhizobium cytisi CTAW11T —Bradyrhizobium yuanmingense 100594T '-Bradyrhizobium arachidis CCBAU051107T Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU23303T Bradyrhizobium iriomotense NBRC102520T -Bradyrhizobium daqingense CCBAU15774T Bradyrhizobium betae LMG21987T

Bradyrhizobium japonicum USDA6T Bradyrhizobium canariense BTA-1T —Nitrobacter vulgaris DSM10236T Nitrobacter alkalicus AN IT Nitrobacter winogradskyi Nb-255T -Nitrobacter hamburgensis X14T

- Rhodopseudomonas rhenobacensis DSM12706T Bhodopseudomonas palustris 22| ATCC17001T

'Rhodopseudomonas faecalis JCM11668T

----Metalliresistens boonkerdii 106595T N

1/11M 12/11

3/21(2) у jv

100 3/11C

—Tardiphaga robiniae LMG26467 3/6M

-Bradyrhizobium retamae LMG 27393T

Bradyrhizobium lablabi CCBAU23086T Bradyrhizobium pachyrhizi PAC48T -Bradyrhizobium jicamae PAC68T Bosea lathyri LMG26379T 3/5M

___99 12/22

3/31 3/25

Bosea vaviloviae Vaf- 18T 951 Bosea minatitlanensis AMX51T 1 >61 'Bosea robiniae LMG26381T '—Bosea thiooxidans DSM9653T j Bosea massiliensis 63287T

67

99

45

100

> V

70

Bosea lupini LMG26383T Bosea eneae 34614T

59Ц

91'Bosea vestrisll 34635T

0,01

Рис. 2. .Rr—филограмма, отражающая таксономическое положение изолятов в пределах семейства Brndydiizobiaceae. Исследуемые штаммы обозначены жирным шрифтом. Литерой «Т» отмечены типовые штаммы; IV, V — статистически достоверно различающиеся кластеры.

чем секвенирование rrs гена (9). Дендрограмма, представленная на рисунке 3, демонстрирует корреляцию между результатами секвенирования гена rrs и ITS-региона. Все изоляты кластеризовались вместе с типовыми штаммами B. lathyri LMG26379X и B. vaviloviae Vaf-^Т при уровне статистической поддержки 99,0 %. Однако максимальные уровни гомологии по ITS-региону между этими изолятами и типовым штаммам B. lathyri и B. vaviloviae были низкими — соответственно 84,9 и 89,4 %. Исключением стал изолят 3/25, сходство ITS-региона которого с типовым штаммом B. vaviloviae Vaf-^Т составило 97,8 %. На основании секвенирования гена rrs и последовательности ITS-региона он был отнесен к виду B. vaviloviae. Таксономическое положение остальных изолятов рода Bosea остается неясным, поскольку считается, что штаммы клубеньковых бактерий одного

349

вида не могут иметь меньше 95 % гомологии по ITS-региону (9). Анализ последовательностей гена rrs у других байкальских изолятов показал их принадлежность к родам Herbiconiux (4 штамма), Leifsonia (2 штамма), Burkholderia (2 штамма), Stenotrophomonas (2 штамма) и Phyllobacterium (1 штамм). По данным литературы, представители этих родов могут присутствовать в клубеньках бобовых растений (18, 19), а также быть обитателями ризосферы и филосферы различных растений (20, 21).

%аг~Bmdyi-hizobiunt daqingense CCBAU15774T

Ч

93.

66

100

38

391

52

100

'—Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU23303T Bradyrhizobium yuanmingense CCBAU1007 IT Bradyrhizobium arachidis CCBAU051107T Bradyrhizobium Japonicum LMG6138T —Bradyrhizobium canariense BTA-1T I—Bradyrhizobium betae LMG21987T Y Bradyrhizobium cytisi CTAW11T jjj-Bradyrhizobium rifense CTAW71T Bradyrhizobium iriomotense NBRC102520T

---Bradyrhizobium pachyrhizi PAC48T

-Bradyrhizobium retamae Rol9T Bradyrhizobium jicamae PAC68T —Bradyrhizobium lablabi CCBAU23086T Nitrobacter hamburgensis DSM10229T

911-----Nitrobacter winogradskyi DSM10237T

-----Tardiphaga robiniae LMG26467T

—Rhodopseudomonas palustris ATCC17001T -----Bosea sp. ORS1414

92Ц

68f

43

99

-Bosea sp. STM358 — 12/12M

Bosea lathyri LMG26379T щЗ/31К 3/5M -3/25

Bosea vaviloviae Vaf-17 Bosea vaviloviae Naf-1ST Bosea vaviloviae Vaf-43

93 48 38 92 94

0,05

Рис. 3. ITS-филограмма, отражающая таксономическое положение изолятов рода Bosea, выделенных из клубеньков астрагала монгольского (Astragalus mongholicus) и остролодочника лесного (Oxytropis sylvatica). Исследуемые штаммы обозначены жирным шрифтом. Литерой «Т» отмечены типовые штаммы.

Таким образом, среди микросимбионтов чины низкой встречаются ризобиальные штаммы видов RhJzobium spp., Mesorhizobium ciceri, Tardiphaga robiniae, а также представители рода Herbiconiux (сем. Microbacteriaceae). В числе симбионтов астрагала монгольского обнаружены представители родов Mesorhizobium, Bosea, Tardiphaga, Leifsonia, Burkholderia и Stenotrophomonas. Из клубеньков остролодочника лесного были получены изоля-ты, относящиеся к видам R. leguminosarum bv. trifolii, T robiniae и Bosea sp. Из клубеньков горошка байкальского выделены 40 штаммов, принадлежащих к виду R. leguminosarum bv. trifolii и по одному представителю родов Phyllobacterium и Burkholderia. Следует отметить, что присутствие нетипичных ризобиальных микросимбионтов в клубеньках бобовых растений (M ciceri и T. robiniae у чины; Bosea spр. и T. robiniae у астрагала и остролодочника; Phyllobacterium sp. у горошка) может свидетельствовать об активных процессах формирования взаимоотношений между партнерами в бобово-ризобиальных системах Байкальского региона.

350

Авторы благодарят сотрудников СИФИБР СО РАН Л.Е. Макарову за помощь в организации экспедиции на побережье Чивыркуйского залива и А.А. Киселеву за проведение идентификации растений.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Тихонович И.А., Борисов А.Ю., Цыганов В.Е. Интеграция генетических систем растений и микроорганизмов при симбиозе. Успехи совр. биол., 2005, 125(3): 227-238.

2. Красная книга ХМАО — Югры. Встречи с животными и растениями, 2015 (http://ani-mals.ecougra.ru).

3. Choi I.-S., Choi B.-H. Isolation and characterization of ten microsatellite loci from Korean Astragalus mongholicus (Fabaceae). J. Genet., 2013, 92: 73-76 (http//www.ias.ac.in/jgenet/Onli-neResources/92/e7 3.pdf).

4. Кузьмина Е.А. Клональное микроразмножение астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.). М., 2012 (http://www.rusnauka.com/29_NIOXXI_2012/Biolo-gia/11_117925.doc.htm).

5. Положий В.А., Выдрина С.Н., Курбатский В.И., Никифорова О.Д. Флора Сибири. Том 9 Fabaceae (Leguminosae). Новосибирск, 1994.

6. Gao J., Terefework Z., Chen W., Lindstrom K. Genetic diversity of rhizobia isolated from Astragalus adsurgens growing in different geographical regions of China. J. Biotech-nol., 2001, 91: 155-168 (doi: 10.1016/S0168-1656(01)00337-6).

7. Laguerre G., van Berkum P., Amarger N., Prevost D. Genetic diversity of rhizobial symbionts isolated from legume species within the genera Astragalus, Oxytropis, and Onobiychis. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63(12): 4748-4758.

8. Wdowiak S., Malek W. Numerical analysis of Astragalus cicermicrosymbionts. Curr. Microbiol., 2000, 41: 142-148 (doi: 10.1007/s002840010108).

9. Сафронова В.И., Чижевская Е.П., Белимов А.А., Павлова Е.А. Определение таксономического положения микросимбионтов копеечника (Hedysarum) и астрагала (Astragalus) на основе анализа генов рибосомальных РНК. Сельскохозяйственная биология, 2011, 3: 61-64.

10. Drouin Р., Prevost D., Antoun H. Physiological adaptation to low temperatures of strains of Rhizobium leguminosarum bv. viciae associated with Lathyrus spp. FEMS Microbiol. Ecol., 2000, 32: 111-120 (doi: 10.1111/j.1574-6941.2000.tb00705.x).

11. Drouin Р., Prevost D., Antoun H. Classification of bacteria nodulating Lathyrus japonicus and Lathyrus pratensis in Northern Quebec as strains of Rhizobium leguminosarum biovar viciae. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46(4): 1016-1024 (doi: 10.1099/00207713-46-4-1016).

12. Van Cauwenberghe J., Verstraete B., Lemaire B., Lievens B., Michiels J., Honnay O. Population structure of root nodulating Rhizobium leguminosarum in Vicia cracca populations at local to regional geographic scales. Syst. Appl. Microbiol., 2014, 37(8): 613-621 (doi: 10.1016/j.syapm.2014.08.002).

13. Zhang R.J., Hou B.C., Wang E.T., Li Y. Jr., Zhang X.X., Chen W.X. Rhizobium tubonense sp. nov., isolated from root nodules of Oxytropis glabra. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2011, 61(3): 512-517 (doi: 10.1099/ijs.0.020156-0).

14. Novikova N., Safronova V. Transconjugants of Agrobacterium radiobacter harbouring sym genes of Rhizobium galegae can form an effective symbiosis with Medicago sativa. FEMS Microbiol. Lett., 1992, 93: 261-268 (doi: 10.1016/0378-1097(92)90472-Z).

15. Румянцева М.Л., Симаров Б.В., О нищ у к О.П. и др. Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценозах. Теоретические основы и методы. СПб, 2011.

16. Amarger N., Macheret V., Laguerre G. Rhizobium gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinri sp. nov. from Phaseolus vulgaris nodules. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47(4): 996-1006 (doi: 10.1099/00207713-47-4-996).

17. Safronova V.I., Kuznetsova I.G., Sazanova A.L., Kimeklis A.K., Beli-mov A.A., Andronov E.E., Pinaev A.G., Chizhevskaya E.P., Pukhaev A.R., Popov K.P., Willems A., Tikhonovich I.A. Bosea vaviloviae sp. nov. a new species of slow-growing rhizobia isolated from nodules of the relict species Vavilovia formosa (Stev.) Fed. Antonie van Leeuwenhoek, 2015, 107: 911-920 (doi: 10.1007/s10482-015-0383-9).

18. Сardoso J.D., Hungria M., Andrade D.S. Polyphasic approach for the characterization of rhizobial symbionts effective in fixing N2 with common bean (Phaseolus vulgaris L.). Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, 93: 2035-2049 (doi: 10.1007/s00253-011-3708-2).

19. Lei X., Wang E.T., Chen W.F., Sui X.H., Chen W.X. Diverse bacteria isolated from root nodules of wild Vicia species grown in temperate region of China. Microbiology, 2008, 190(6): 657-671 (doi: 10.1007/s00203-008-0418-y).

20. Qiu F., Huang Y., Sun L., Zhang X., Liu Z., Song W. Leifsonia ginsengi sp. nov., isolated from ginseng root. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2007, 57(2): 405-408

351

(doi: 10.1099/ijs.0.64487-0).

21. Behrendt U., Schumann P., Hamada M., Suzuki K., Sproer C., Ulrich A. Reclassification of Leifsonia ginsengi (Qiu et al. 2007) as Herbiconiux ginsengi gen. nov., comb. nov. and description of Herbiconiux solani sp. nov., an actinobacterium associated with the phyllosphere of Solanum tuberosum L. Int. J Syst. Evol. Microbiol., 2011, 61(5): 1039-1047 (doi: 10.1099/ijs.0.021352-0).

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию

микробиологии, 30 марта 2015 года

196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, е-mall: v.safronova@rambler.ru;

2ФГБНУ Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,

664033 Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 3, pp. 345-352

GENETIC DIVERSITY AMONG MICROSYMBIONTS OF Lathyrus, Vicia, Oxytropis AND Astragalus LEGUME SPECIES FROM BAIKAL REGION

I.G. Kuznetsova1, A.L. Sazanova1, V.I. Safronova1, A.G. Pinaev1, A.V. Verkhozina2,

N. Yu. Tikhomirova1, Yu.S. Osledkin1, A.A. Belimov1

1All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 3, sh. Podbel’skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail v.safronova@rambler.ru;

2Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Federal Agency of Scientific Organizations, 132, ul. Lermontova, Irkutsk, 664033 Russia

Supported in part by Russian Science Foundation

Received March 30, 2015 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.345eng

Abstract

Rhizobia are Gram-negative soil microorganisms that form intracellular nitrogen-fixing symbiosis with leguminous plants. Investigations of symbiotic systems with the participation of endemic or relict species have a particular importance for understanding of the evolution of plant-microbe interactions. The purpose of our work was to create a representative collection of microsymbionts of endemic Baikal legumes, as well as to estimate their biodiversity. The study of taxonomic positions of 69 isolates from root nodules Lathyrus humilis, Vicia baicalensis, Astragalus mongholicus and Oxytropis sylvatica was conducted. For primary identification of these isolates the methods of ITS-RFLP analysis was used that divided strains into 33 groups with identical DNA-profile. Then the taxonomy positions of isolates were determined by the 16S rRNA gene (rrs) and ITS region sequencing. Phylogenetic analysis revealed the considerable genetic diversity among microsymbionts of plants studied. Rhizobial isolates belonged to 5 genera: Rhizobium (family Rhizobiaceae), Mesorhizobium and Phyllobacterium (family Phyilobacteriaceae), Bosea and Tardiphaga (family Bradyrhizobiaceae). In addition, non-rhizobial isolates belonging to the genera Herbiconiux, Leifsonia, Burkholderia and Stenotrophomonas were obtained. It is known that some species of these genera may be present in the nodules of legumes, but also be inhabitants of rhizosphere or phyllosphere of different plants. The presence of atypical rhizobial microsymbionts in the studied plants was noted, which may indicate the active formation of relationships between partners in the legume-rhizobial systems of Baikal region.

Keywords: legumes of Baikal region, taxonomy of rhizobia, ribosomal genes sequencing.

Научные собрания

ПЕТЕРБУРГСКИЙ МЕЖДУНАРОДНЫЙ ФОРУМ ЗДОРОВЬЯ 14-1боктября 2015

Санкт-Петербург, конгрессно-выставочный центр «ЭКСПОФОРУМ»

В рамках форума проходит выставка-конференция «Биоиндустрия». Научное руководство конференции осуществляют Комитет по здравоохранению Санкт-Петербурга, СЗГМУ им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, Всероссийский НИИ cельскохозяйственной микробиологии.

Контакты и информация: http://bio.lenexpo.ru

352