СПОСОБ АНАЛИЗА ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПОСТНАТАЛЬНОЙ ДНК-ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА
METHOD OF GENETIC POLYMORPHISM ANALYSIS FOR CARRYING OUT POSTNATAL DNA-DIAGNOSTICS OF MUCOVISCIDOSIS

Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к молекулярной биологии, и связано с разработкой способа ранней диагностики различных заболеваний человека, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клетки.
Муковисцидоз (MB) (cystic fibrosis) - одна из довольно широко распространенных наследственных болезней. Ее причиной является мутации в гене трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза - CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). В результате мутации в данном гене происходят изменения в поджелудочной железе, органах дыхания, желудочно-кишечном тракте. Ген CFTR огромен и охватывает 250000 пар нуклеотидов. Белок, который кодируется этим геном, по последним данным является хлорным каналом и обеспечивает активный транспорт ионов хлора. В настоящее время в гене CFTR обнаружено огромное число различных типов мутаций. Одни мутации в гене CFTR ведут к снижению синтеза белка CFTR из-за незавершенности процессинга РНК, другие - к качественным изменениям мембранных хлорных каналов. Одна первичная биохимическая аномалия (нарушение транспорта хлоридов) обусловливает возникновение мультиорганного патологического процесса (прогрессирующее поражение дыхательных путей, хронические синуситы, недостаточность экзокринной секреторной функции поджелудочной железы).
Ранняя диагностика и своевременная профилактика муковисцидоза изучается ученым сообществом десятки лет. Согласно данным Консорциума по изучению генетики муковисцидоза уже идентифицировано более 1500 мутаций гена CFTR. Мутации, выбранные для осуществления мультиплексной амплификации с целью проведения постнатальной ДНК-диагностики в данной работе, являются наиболее распространенными и значимыми именно для России.
Известен стандартный способ обнаружения мутаций с помощью предварительной моноплексной амплификации (когда анализируется одна мутация) с последующим рестрикционным анализом (Miedzybrodzka Z.H., Yin Z., Kelly К.F., Haites N.Е. Evaluation of laboratory methods for cystic fibrosis carrier screening: reliability, sensitivity, specificity, and costs. J Med Genet 1994; 31:545-550).
Исследуемая геномная ДНК, выделенная из лимфоцитов периферической крови, подвергается моноплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которой удается скопировать нужный участок ДНК, в пределах которого находится одна мутация. В этих целях используют праймеры, участки ДНК, определяющие начало и конец амплифицированного участка ДНК. Для проведения анализа также нужны свободные нуклеотиды и фермент полимераза, катализирующий образование исследуемых и копируемых сегментов ДНК. Далее, для проведения самой ПЦР используют прибор, обеспечивающий нужный температурный режим. После копирования исследуемого сегмента его расщепляют с помощью соответствующей рестриктазы, она расщепляет специфическую последовательность ДНК или же этого не происходит. Затем проводят электрофорез в агарозном или в полиакриламидном геле.
Известен способ проведения мультиплексной ПЦР для экспресс-идентификации мутаций в гене CFTR (Cremonesi L., Belloni E., Magnani С., Seia M., Ferrari M. Multiplex PCR for Rapid Detection of three mutations in the cystic fibrosis gene. Genome research, PCR Methods Appl. 1992, 1:297-298).
Способ используется для диагностики мутаций delF508, 1717-1G~A и G542X, он осуществляется с использованием аллель-специфических праймеров следующим образом: амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы 3'-конец одного из праймеров непосредственно примыкал к мутантному сайту (месту, где находится мутация). Этот праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем изменяют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотидом «мутантного», а не «нормального» сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-либо из эндонуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих данную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два дополнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрицированным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два фрагмента.
Существенным недостатком этого способа является большая трудоемкость, диагностика всего по 3-м мутациям, а также дороговизна за счет использования эндонуклеаз рестрикции.
Известен способ идентификации гораздо большего числа мутаций в гене CFTR методом ARMS (Robertson N.H., Weston S.L., Kelly S.J., Duxbury N.J., Pearce S.R., Elsmore P., Webb M.B.T., Newton C.R., Little S. Development and validation of a screening test for 12 common mutations of the cystic fibrosis CFTR gene. Eur Respir J 1998; 12: 477-482). Тест ARMS (Amplification Refractory Mutation System) - амплификационная система рефракторных мутаций. В основе способа лежит неспособность термофильной полимеразы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигопраймеров. Способ заключается в одновременном проведении двух ПЦР, для каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфическая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последовательность, соответственно. При этом в качестве второго праймера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же олигонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяженности. Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах расположен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим из которых является концентрация ионов магния в растворе, наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области праймера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при наличии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные фрагменты образуются только в том случае, если в качестве аллель-специфического праймера выбирается мутантная последовательность, тогда как при использовании нормального олигонуклеотидного праймера ПЦР блокируется Продукт ARMS получается только в случае, если праймер комплементарен мишени по 3' концу. Эксперимент проводят в 2-х пробирках: в первую помимо амплификационной смеси добавляли праймеры для диагностики 1717-1G>А, G542X, W1282X, N1303K, ΔF508 и 3849+10kb C>Т мутаций, во вторую - праймеры для 621+1 G>T, R553X, G5-51D, R117H, R1162X и R334W мутаций. Таким образом, проводят мультиплексную ПЦР, затем электрофорез в агарозном геле и идентифицируют мутации.
Недостатком способа является то, что в силу многократного увеличения концентрации целевой ДНК во время ПЦР возрастает вероятность неправильной посадки праймеров.
Известен способ использования DOT-блоттинга с помощью Inno-LiPA CF2 kit (In-nogenetics) (Miedzybrodzka Z.H., Yin Z., Kelly K.F., Haites N.E. Evaluation of laboratory methods for cystic fibrosis carrier screening: reliability, sensitivity, specificity, and costs. J Med Genet 1994; 31:545-550). При его использовании идентифицируют 8 мутаций в одной пробирке методом мультиплексной ПЦР: delF508, AI507, G551D, G542X, N1303K, W1282X, 1717-1, С-А и Р553Х.
В качестве метки применяют биотин. После прохождения амплификации каждый ПЦР продукт инкубируется со специальной мембраной, с которой связываются олигонуклеотиды разной длины. Для определения мутации используются два олигонуклеотида: один для «нормальной», один для «мутантной» последовательности. Затем добавляется алкалиновая фосфатаза, помеченная стрептовидином, она связывается с ПЦР продуктом. Затем происходит инкубация с BCIP/NBT (bromochoro-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), после чего происходит прямая визуализация результатов.
Данный подход является достаточно инновационным, но его недостатком является большая дороговизна, а следовательно, невозможность проведения массового скрининга.
Известен способ идентификации последовательностей нуклеиновых кислот полуавтоматическим методом детекции состояния гена, основанные на дотировании синтетических олигонуклеотидных зондов с использованием мультиплексной ПЦР - Oligonucleotide ligation assay (OLA) (Grossman P.D., Bloch W., Brinson E., Chang C.C., Eggerding F.A., Fung S., lovannisci D.A., Woo S., Winn-Deen E.S. High-density multiplex detection of nucleic acid sequences: oligonucleotide ligation assay and sequence-coded separation. Nucleic Acids Research, 1994, Vol.22, No 21 4527-4534).
В данном случае происходит идентификация G542X, S549N, S549R2, G551D, R553X, R560T мутаций методом мультиплексной ПЦР в одной пробирке.
Специфические ДНК- или РНК-последовательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотидных зондов. Здесь это олигонуклеотиды с 5' oligomeric hexaethyleneoxide (HEO) хвостом. ДНК-зонды для дотирования подбирают таким образом, чтобы они были полностью комплементарны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную или флюоресцентную метку, а другой метят биотином. После гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из термофильных микроорганизмов. При наличии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие терминального неспаренного основания в смежно расположенных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лигирования, и при определенных условиях проведения реакции сшивки между зондами в этом случае не происходит. Способ включает несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также дотированные последовательности. В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов ДНК.
Недостатком способа является его трудоемкость, большая зависимость от стабильности работы фермента лигазы, а отсюда - высокая вероятность получения неспецифических результатов.
Известен способ анализа генетического полиморфизма, определяющего предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям (Патент №2304775, 2007 г. Глотов О.С., Глотов А.С., Демин Г.С., Баранов B.C., Иващенко Т.Э.).
Способ основан на выделении ДНК стандартным методом, проведении мультиплексной полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза, и заключительного синтеза, проведения гидролиза продуктов ПЦР эндонуклеазами рестрикции Msp1 и Hinf1, и электрофорез в полиакриламидном геле. Для его осуществления используют мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием n пар праймеров, где n≥4, и диагностического набора, включающего в себя компоненты для проведения мультиплексной ПЦР и компоненты для проведения энзиматической рестрикции. Наличие смеси компонентов, введение крезола, набора из ДНК, являющегося положительным контролем для проведения ПЦР и энзиматической рестрикции, ампулированной воды и олигопраймеров позволяют значительно ускорить процесс анализа, удешевить процедуру диагностики, сделать ее более доступной независимо от условий проведения.
Недостатками данного способа является непременимость конкретного метода для амплификации и диагностики мутаций муковисцидоза, а также невозможность одновременной и быстрой диагностики большого количества мутаций для одного или разных генов.
Известен способ анализа генетического полиморфизма, определяющего предрасположенность к онкологическим заболеваниям и индивидуальную чувствительность к фармацевтическим препаратам, с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) (Патент №2303634, 2007 г., Глотов А.С., Наседкина Т.В., Заседателев А.С.).
Способ основан на проведении мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в две стадии с последующей гибридизацией флуоресцентно меченного фрагмента ДНК на биологическом микрочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов. Способ включает верификацию полиморфных вариантов последовательности в клиническом образце ДНК и предусматривает следующие стадии: амплификацию полиморфных фрагментов генов «гнездовой» двухэтапной полимеразной цепной реакцией (ПЦР), где в качестве матрицы для амплификации используют клинический образец ДНК, амплификацию проводят в два этапа, причем на втором этапе получают меченный ПЦР-продукт, который в последствии может быть использован для выявления мутаций известными методами (биочип и др.).
Способ не является диагностической системой для диагностики муковисцидоза, но по совокупности существенных признаков выбран нами в качестве прототипа.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа анализа генетического полиморфизма для проведения постнатальной ДНК-диагностики муковисцидоза.
Техническим результатом заявленного изобретения является более высокая точность диагностики муковисцидоза за счет одновременного анализа сразу нескольких мутаций.
Поставленная задача решается путем проведения двухэтапной мультиплексной амплификации популяций мутаций гена в клиническом образце ДНК «гнездовой» двухэтапной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использование набора праймеров с различными последовательностями, причем мультиплексную амплификацию проводят в гене муковисцидоза CFTR и анализируют 14 наиболее значимых мутаций 1677delTA, W1282X (R), 2143delT, G542X, R553X, G551D, 2184InsA, N1303K, 394DelTT, R334W, R347P, CFTR del21kb, delF508, а двухэтапную ПЦР проводят с использованием набора праймеров, при этом на первом этапе для первого блока используют праймеры SEG ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, для второго блока используют праймеры SEG ID NO:19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, на втором этапе для первого блока используют праймеры SEG ID NO:2, 3, 12, 13, 14, 15, 16, 17, для второго - SEG ID NO:19, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33, причем праймеры группируют в два блока, включающие от 6-ти: Del21kb, 394DelTT, R334W, R347P, 1677delTA, delF508 до 8-ми мутаций: G542X, G551D, R553X, 2143delT, 2184InsA, W1282R, W1282X, N1303K.
Для детекции наличия полученных продуктов ПЦР применяют метод электрофореза в полиакриамидном геле, интерпретацию результатов проводят визуально.
Кроме того, способ подразумевает, что в одну реакционную пробирку объединяют в виде блочной группировки до 4-х пар праймеров, для которых используют условия амплификации, обеспечивающие высокую степень дифференциации между праймерами, причем амплификацию первого этапа проводят со средней температурой плавления олигонуклеотидов 58-59°С в 50 мМ формамиде, а второго этапа - с температурой 58-61°С.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве клинического образца используют образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови, клеток буккального эпителия и других материалов, полученных от обследуемого пациента. Образец ДНК служит матрицей для дальнейшего осуществления способа.
Для получения специфических продуктов ПЦР подбирают праймеры.
Их разрабатывают согласно следующим критериям:
- отсутствие внутренней вторичной структуры;
- отсутствие комплементарности между 3'-концами, что может быть причиной образования димеров праймеров;
- наличие единой температуры плавления (разброс температур плавления праймеров не более 1°С от среднего значения);
- отсутствие комплементарности последовательностей праймеров для 1-го раунда с последовательностями других генов в геноме человека;
- способность амлифицировать фрагменты гена, содержащие участки, позволяющие идентифицировать в дальнейшем 14 мутаций в гене CFTR: 677delTA, W1282X (R), 2143delT, G542X, R553X, G551D, 2184InsA, N1303K, 394DelTT, R334W, R347P, CFTR del21kb, delF508.
С целью повышения выхода конечного продукта праймеры подбирают так, чтобы ПЦР проходила в два этапа.
В качестве праймеров для проведения мультиплексной двухстадийной полимераз-ной цепной реакции используют последовательности, приведенные в Таблице 1.
Для эффективного прохождения мультиплексной ПЦР праймеры не объединяют в одну смесь, а группируют поблочно (в два блока, включающих от 6-ти до 8-ми мутаций) согласно типу мутации, указанному в Таблице 2.
После подбора праймеров проводят мультиплексную амплификацию (в два этапа). Причем температура отжига праймеров одинакова для всех обоих мультиплексных ПЦР-первого и второго блоков (но для первого этапа она составляет 58-60°С, а для второго - 58-61°С).
Для надежной воспроизводимости результатов в реакции использют не более 4-х пар праймеров в одной мультиплексной смеси.
При этом на первом этапе для первого блока используются праймеры с номерами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, для второго блока используются праймеры с номерами 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. На втором этапе для первого блока используются праймеры с номерами 2, 3, 12, 13, 14, 15, 16, 17, для второго - с номерами 19, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33.
Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидных праймеров, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, (без ограничения) производства фирмы Applied Biosystems (США).
Важной особенностью изобретения является то, что последовательности праймеров 1-го этапа подобраны как в интронах, так и в экзонах для того, чтобы избежать амплификации других возможных гомологичных последовательностей в геноме человека. Праймеры под номерами 1, 2 и 3 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию del21kb.
Праймеры под номерами 3, 4 и 12, 13 для амлификации участка гена, содержащего мутацию 394DelTT.
Праймеры под номерами 5, 6 и 14, 15 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию R334W и R347P.
Праймеры под номерами 8, 10 и 16, 17 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию delF508 Hl677delTA.
Праймеры под номерами 19, 20 и 19, 27 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию - G542X, G551D и R553X.
Праймеры под номерами 21, 22 и 28, 29 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию 2143delT и 2184InsA.
Праймеры под номерами 23, 24 и 30, 31 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию, содержащего мутацию W1282R и W1282X. Праймеры под номерами 25, 26 и 25, 33 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию N1303K.
Непосредственно мультиплексная полимеразная цепная реакция как 1-го, так и второго этапа может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы, работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, но вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров.
Существенным фактором изобретения является набор уникальных праймеров для амплификации участков фрагментов, содержащих значимые для Российской популяции мутации гена CFTR.
Проведение реакции позволяет наработать достаточное количество ПЦР-продукта для дальнейшего анализа либо рестрикцией и гетеродуплексным анализом, либо гибридизацией на биочипе.
Пример использования предложенного способа для анализа генетического полиморфизма с целью проведения постнатальной ДНК-диагностики муковисцидоза.
У новорожденных детей берут венозную кровь в количестве 2-5 мл, которую добавляют в пробирки с ЭДТА. Далее, из лейкоцитов периферической крови стандартным методом выделяют ДНК.
4
2
4
2
Для каждого из образцов ДНК готовят две ПЦР смеси в пробирках объемом 25 мкл (соответствующие двум блокам). Состав смеси следующим: 67 мМ трис-HCI, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH)SO; 6,7 мМ MgCl; 6,7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,8 мМ каждого, термостабильная ДНК-полимераза 0,5 ед/мкл, краситель Cresol red (Sigma) в концентрации 10 мг/мл и праймеры первого раунда по 10 пмоль каждого. В каждую пробирку вносят по 2 мкл ДНК. Всю смесь нагревают при 95°С в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов амплификации с использованием любого отечественного и зарубежного термоциклера по следующей схеме: 95°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 1 мин. Завершающая инкубация: 72°С - 5 мин.
Далее выполняют идентификацию продуктов первого этапа, используя электрофоретическое разделение продуктов ПЦР в 6% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном на десятикратном трис-боратном буфере в аппарате для вертикального электрофореза с длиной стекла 20-22 см. Для приготовления 40 мл 6% геля смешивают: 8 мл 30% р-р акриламида (29 г акриламида; 1 г N,N метилен-бисакриламида на 100 мл водного раствора), 4 мл 10х ТБЕ (89 мМ трис-борат (рН 8,3-8,6), 2 мМ ЭДТА), 28 мл дистиллированной воды, 40 мкл тетраэтилендиамина (TEMED), 400 мкл персульфата аммония (PSA). Перед заливкой раствор тщательно перемешивают. После амплификации непосредственно к аликвотам реакционной смеси (~10 мкл) добавляют буфер для нанесения проб (~2 мкл) и проводят электрофорез (шестикратный буфер для нанесения проб состоит из 0,25% бромфенола, 0,25% ксилен-цианола и 15% фикола). Электрофорез проводят при напряжении 100В до тех пор, пока образец не входит в гель и не проходит около 1 см от начала лунок. В дальнейшем напряжение увеличивают до 300В. Остановку электрофореза проводят за 1 см до выхода бромфенола из геля. Затем гель окрашивают в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл), а визуализация результатов проводят в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Macrovue (LKB, Великобритания).
На фиг.1 представлена электрофореграмма 1-го этапа ПЦР 1-го блока, на которой видны ПЦР продукты, содержащие мутации в 3, 7, 10 экзонах гена CFTR, а также отсутствие ПЦР продукта, соответствующего наличию мутации del21kb (амплификация фрагмента благодаря праймерам 1, 2 и 3 происходит только при наличии этой мутации как минимум в гетерозиготном состоянии).
Слева указан экзон, которому принадлежит данный амплифицированный участок. Справа указаны размеры амплифицированного участка в нуклеотидных парах. Снизу указаны номера дорожек на электрофорезе.
Дорожка 1 - помимо всех праймеров 1-го блока вместо матрицы (ДНК) в амплификацию добавлена вода (на электрофорезе не должно быть никаких полос).
Дорожка 2 - моноплексная ПЦР с использованием праймеров под номерами 3, 4 для амлификации участка гена, содержащего мутацию 394DelTT.
Дорожка 3 - моноплексная ПЦР с использованием праймеров под номерами 5, 6 для амлификации участка гена, содержащего мутацию R334W и R347P.
Дорожка 4 - моноплексная ПЦР с использованием праймеров под номерами 8, 10 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию delF508 и 1677dеlТА.
Дорожка 5 - мультиплексная ПЦР с использованием всех вышеуказанных праймеров.
На фиг.2 представлена электрофореграмма 1-го этапа ПЦР 2-го блока, на которой видны ПЦР продукты, содержащие мутации в 11, 13, 20, 21 экзонах гена CFTR.
Слева указан экзон, которому принадлежит данный амплифицированный участок. Справа указаны размеры амплифицированного участка в нуклеотидных парах. Снизу указаны номера дорожек на электрофорезе.
Дорожка 1 - моноплексная ПЦР с использованием праймеров под номерами 19, 20 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию - G542X, G551D и R553X.
Дорожка 2 - моноплексная ПЦР с использованием праймеров под 21, 22 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию 2143delT и 2184InsA.
Дорожка 3 - моноплексная ПЦР с использованием праймеров под номерами 23, 24 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию, содержащего мутацию W1282R и W1282X.
Дорожка 4 - моноплексная ПЦР с использованием праймеров под номерами 25, 26 используются для амлификации участка гена, содержащего мутацию N1303К.
Дорожка 5 - мультиплексная ПЦР с использованием всех вышеуказанных праймеров.
После успешного проведения первого этапа аналогично (по условиям реакции и компонентам ПЦР смеси) проводят второй этап мультиплексной ПЦР (применяя уже другие праймеры). В пробирку 2-го этапа первого блока добавляют ПЦР продукт (2 мкл) 1-го этапа соответствующего блока (аналогично для второго блока).
Идентификацию и визуализацию продуктов второго этапа проводят, используя электрофоретическое разделение продуктов ПЦР в 6% полиакриламидном геле (ПААГ).
На фиг.3 представлена электрофореграмма 2-го этапа ПЦР 1-го блока, на которой видны ПЦР продукты, содержащие мутации в 3, 7, 10 экзонах гена CFTR.
Слева указан экзон, которому принадлежит данный амплифицированный участок. Сверху указана мутация, которая может идентифицироваться. Справа указаны размеры амплифицированного участка в нуклеотидных парах. Снизу указаны номера дорожек на электрофорезе.
На фиг.4 представлена электрофореграмма 2-го этапа ПЦР 2-го блока, на которой видны ПЦР продукты, содержащие мутации в 11, 13, 20, 21 экзонах гена CFTR.
Слева указан экзон, которому принадлежит данный амплифицированный участок. Сверху указана мутация, которая может идентифицироваться. Справа указаны размеры амплифицированного участка в нуклеотидных парах. Снизу указаны номера дорожек на электрофорезе.
Подтверждением достижения технического результата является электрофоретическое разделение получившихся ПЦР-продуктов (на фиг.1-4 представлены электрофореграммы, иллюстрирующие амплификацию соответствующих фрагментов гена CFTR в первом и втором этапе ПЦР первого и второго блоков, затем следуют этапы регистрации, визуализации и идентификации данных.
Способ экономичен, не требует дорогостоящего оборудования и может быть введен в повсеместную клиническую практику как способ подготовки материала. Данные, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы для выявления носительства 14-ти значимых мутаций в гене CFTR, а следовательно, могут предупредить развитие такой болезни, как муковисцидоз, ведь оно является наиболее распространенным, тяжелым моногенным заболеванием, наследуемым по аутосомно-рецессивному типу.
Способ позволяет проводить экспресс амплификацию 14-ти диагностически значимых мутаций в гене муковисцидоза CFTR, что уже сейчас может использоваться для идентификации некоторых из этих мутаций, что позволит в ряде случаев своевременно проводить профилактические мероприятия, направленные на снижение частоты такого социально-значимого заболевания, как муковисцидоз.
Способ можно использовать для целей медицинской диагностики, направленных на выявление носительства мутаций в гене муковисцидоза и пренатальную диагностику.