Фармакологическая коррекция цитофлавином циклофосфан-индуцированного токсического поражения тканей печени и почек в эксперименте

Є

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Фармакологическая коррекция цитофлавином циклофосфан-индуцированного токсического поражения тканей печени и почек в эксперименте

В. А. КАШУРО1, С. И. ГЛУШКОВ1, Л. В. МИНАЕВА2, Т. М. НОВИКОВА1

' Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург 2 В/ч 20533, Мурманск

Experimental Study on Cytoflavin Pharmacological Correction of Cyclophosphamide-Induced Toxic Affections of the Liver and Kidneys

V. A. KASHURO, S. I. GLUSHKOV, L. V. MINAEVA, T. M. NOVIKOVA

Military Medical Academy, St.Petersburg Military Unit No. 20533, Murmansk

В статье представлены экспериментальные данные о воздействии на обмен глутатиона и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях печени и почек белых беспородных крыс повторного введения циклофосфана в суммарной дозе 200 мг/кг. Показана возможность коррекции нарушений состояния естественной системы цитопротекции в тканях, возникающих при введении цитостатика, путем использования комбинированного препарата цитофлавин. Обсуждаются механизмы цитопротекторного действия фармакологического препарата.

Ключевые слова: циклофосфан, глутатион, перекисное окисление липидов, цитофлавин.

The experimental data concerning the influence of repeated administration of cyclophosphamide in a total dose of 200 mg/kg on the glutathione metabolism and lipide peroxidation in the liver and kidneys of albino noninbred rats are presented. The possibility of the natural cytoprotection system correction by the use of cycloflavin was shown. The cytoprotection action mechanisms of the pharmacological agent are discussed.

Key words: cyclophosphamide, glutathione, lipide peroxidation, cytoflavin.

Введение

Циклофосфан (ЦФ) — алкилирующий цито-статический препарат, широко используемый для лечения различных онкологических заболеваний [1, 2]. При высокой кумулятивной способности и низкой обратимости токсического действия, циклофосфан обладает рядом побочных эффектов, таких как нефротоксичность и гепатотоксич-ность, что является одним из главных факторов, ограничивающих применение цитостатика в клинике [3].

Активация ЦФ происходит в печени под действием микросомальных монооксигеназ, приводя к повреждениям различных макромолекуляр-ных структур клетки (нуклеиновых кислот, ферментов, липидов биомембран) за счёт их ал-килирования реакционно-способными метаболитами цитостатика. Метаболизм ЦФ сопровождается повышенной наработкой активных форм кислорода, что приводит к запуску процессов

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 194044 Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6. Военно-медицинская академия

свободнорадикального окисления (СРО) [4]. Главную роль в детоксикации ЦФ путем конъюгации некоторых его метаболитов и защиты клеток от повреждающего действия свободных радикалов играет система глутатиона [5].

В настоящее время для профилактики и лечения цитотоксических повреждений тканей и органов в условиях проведения полихимиотерапии активно используются препараты различных фармакологических групп [6]. Существенный интерес для клинической практики может представлять цитофлавин — метаболическое средство, в состав которого входят сукцинат натрия, инозин, рибофлавин и никотинамид. Установлено, что препарат обладает цитопротек-торным, антигипоксантным и антиоксидантным действием. Цитофлавин оказывает положительный эффект на процессы биоэнергетики клетки, восстанавливает активность ферментов антиок-сидантной защиты и уменьшает продукцию свободных радикалов [7].

Цель работы — исследование влияния цитоф-лавина на динамику изменений показателей системы глутатиона и интенсивность процессов пе-

-е-

Є

Динамика изменений показателей обмена глутатиона и процессов ПОЛ в тканях печени и почек экспериментальных животных

Исследуемые органы Контроль ЦФ ЦФ + цитофлавин

Восстановленный глутатион, ммоль/г ткани Печень 13,68+0,62 9,61+0,02* 11,60+0,80**

Почки 4,04+0,06 3,23+0,05* 3,40+0,07*

Малоновый диальдегид, нмоль/г ткани Печень 99,90+4,46 169,77+1,63* 121,17+4,54**

Почки 241,59+11,04 322,78+16,33* 292,26+31,15

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, мкмоль/(мин • г белка) Печень 181,66+12,92 86,23+7,78* 98,76+6,92

Почки 28,38+0,70 22,25 + 1,24* 27,11+2,12**

Глутатионредуктаза, мкмоль/(мин • г белка) Печень 271,30+15,84 175,32+11,07* 291,64+29,74**

Почки 180,50+2,55 109,99+9,21* 147,56+11,57*,**

Примечание. * - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля; ** - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой отравленных животных без коррекции.

рекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях печени и почек при повторном введении циклофос-фана в суточной дозе 20 мг/кг в течение 10 суток.

Материал и методы

Исследование проведено на 60 белых беспородных кры-сах-самцах массой 180—200 г из питомника Рапполово РАМН.

Повторная интоксикация ЦФ, моделирующая условия применения цитостатика в клинике онкологических заболеваний, проводилась путём ежедневного внутрибрюшин-ного введения препарата в течение 10 суток в суточной дозе 20 мг/кг массы животного. Для проведения фармакологической коррекции цитотоксического действия ЦФ через 30 мин после введения препарата животным внутрибрюшинно ежедневно вводили цитофлавин в виде 10 % водного раствора в дозе 100 мг/кг массы тела. Контрольным (интактным) животным в те же сроки внутрибрюшинно вводили физиологический раствор хлорида натрия в дозе 10 мл/кг массы. Эвтаназию животных проводили через сутки после последнего введения ЦФ. Количество животных в каждой группе составляло 20 особей.

В гомогенатах тканей печени и почек определяли концентрации восстановленного глутатиона (ВГ) и малонового диальдегида (МДА); общую активность глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы (Г-6-ФДГ) и глутатионредуктазы (ГР) определяли в цитозольной фракции, полученной методом дифференциального центрифугирования. Концентрацию ВГ определяли методом G. L. Ellman [8] в модификации, заключавшейся в осаждении белка 20% раствором сульфосалицило-вой кислоты; содержание МДА — по методу M. Uchiyama [9]. Активность Г-6-Ф-ДГ определяли по методу A. Kornberg [10], а ГР — по I. Carlberg, B. Mannervik [11]. Расчёт активности ферментов производили на 1 г белка. Концентрацию белка определяли методом Лоури в модификации G. L. Peterson [12].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Microsoft Excel» с использованием ¿-критерия Стьюдента для двух несвязанных величин.

Результаты и обсуждение

Проведённое исследование позволило установить, что повторные введения ЦФ сопровождались существенными нарушениями обмена глутатиона в тканях печени и почек экспериментальных животных, а использование цитофлави-на позволяло в той или иной степени уменьшить выраженность проявлений этих патологических изменений.

В тканях отравленных животных, не получавших фармакологической коррекции, отмечалось достоверное (^<0,05) снижение уровня ВГ, более глубокое — в 1,43 раза ниже контрольных значений в печени и умеренное — в 1,25 раза соответственно в почках (таблица). Использование цитоф-лавина позволило достоверно увеличить уровень восстановленной формы трипептида в тканях печени до значений лишь на 15,2% ниже уровня ин-тактного контроля (р<0,05). В тканях почек, где влияние цитостатика на уровень ВГ было менее выраженным, применение цитофлавина позволило незначительно повысить содержание трипеп-тида. Следует отметить, что даже умеренное (на примере почек) повышение концентрации ВГ в тканях экспериментальных животных, получавших цитофлавин, приводило к нормализации тканевых показателей тиол-дисульфидного обмена, увеличивая содержание СГ на 18,3% (р<0,05) в печени и на 25,6% (р<0,05) в почках.

Механизм повышения уровня ВГ при использовании цитофлавина, во-первых, связан с входящей в состав данного препарата янтарной кислотой, которая принимает участие в восстановлении антиоксидантов липидной фазы — а-токоферола и убихинона. За счёт этих низкомолекулярных антиоксидантов может быть компенсирована часть приходящейся на ВГ антиоксидантной нагрузки [13].

Во-вторых, другие составляющие препарата — метионин и инозин также могут участвовать в поддержании на достаточно высоком уровне восстановленной формы глутатиона. Так, метионин может выступать не только в качестве донора восстановленных валентностей и регулятора тиол-дисульфидного равновесия, но и является наиболее эффективным источником синтеза восстановленного глутатиона de novo [14]. А инозин, проявляя свойства стимулятора белкового синтеза, оказывает свое воздействие на систему глутатиона, активируя синтез ферментов его обмена.

-о-

e

Рис. 1. Морфологическая картина ткани печени в группе животных при повторном введении ЦФ в дозе 20 мг/кг в течение 10 дней без фармакологической коррекции. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. Х250.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Рис. 2. Морфологическая картина ткани печени в группе животных при повторном введении ЦФ на фоне применения цитофлавина. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. Х250.

Восстановление уровня ВГ под воздействием цитофлавина также оказывает существенное влияние и на сохранение редокс-статуса клетки в условиях интоксикации ЦФ, что может являться одним из механизмов реализации цитопротекторных свойств препарата [15]. Как следствие, эти механизмы сопровождаются повышением активности ферментативного звена системы глутатиона и снижением интенсивности процессов СРО.

Выраженный рост активности ГР при сравнении с отравленными животными, не получавшими цитофлавин, в 1,66 раза был отмечен в тканях печени и в 1,35 раза — в тканях почек (р<0,05). Кроме того, отмечалась умеренная тенденция к росту активности Г- 6-ФДГ в ткани печени, а в почечной ткани активность данного фермента превысила показатели группы отравленных животных без лечения в 1,22 раза (р<0,05).

Вопрос влияния цитофлавина на ферменты антирадикальной защиты и конъюгирующей системы требует отдельного, более детального рассмотрения. Но, следует отметить, что глутатионпероксидазная и глутатионтран-сферазная активность в тканях печени и почек отравленных животных на фоне применения препарата в течение всего периода исследования не только существенно не снижалась, но и отмечалась умеренная тенденция к росту данных показателей.

Повторное введение ЦФ приводит к выраженной активации процессов ПОЛ в тканях печени и почек лабораторных животных (см. таблицу). Содержание МДА было выше (р<0,05) уровня интактного контроля в 1,71 раза в тканях печени, в 1,34 раза — в тканях почек. Применение цитофлавина позволяло снизить степень активации ПОЛ в тканях животных, получавших цитостатик. Так, в тканях печени уровень МДА был на 28,4% (р<0,05) ниже показателей особей, получавших только ЦФ.

Проведённое морфологическое исследование тканей печени экспериментальных животных при повторном введении ЦФ показало, что использование цитофлавина приводило к существенному снижению выраженности гистологических признаков токсического воздействия цитостатика — в гепатоцитах определялась мелкокапельная жировая и зернистая дистрофии, пространства Диссе несколько были расширены. В группе животных, не получавших фармакологической коррекции, во всех гепатоцитах определялась выраженная среднекапельная жировая дистрофия, пространства Диссе были резко расширены, а в синусоидах наблюдалось большое количество эритроцитов, с явлениями стаза (рис. 1, 2).

В связи с тем, что использование цитофлави-на в условиях повторных введений ЦФ позволило существенно снизить интенсивность наработки продуктов ПОЛ, препарат может оказывать стабилизирующее воздействие на состояние мембран и, следовательно, повысить эффективность выполнения ряда мембранных функций клетками исследуемых органов.

Таким образом, исследуемый комбинированный препарат цитофлавин оказывает существенное цитопротекторное действие, благодаря:

1) повышению концентрации ВТ, как за счёт его синтеза de novo, так и за счёт компенсации приходящейся на него антиоксидантной нагрузки;

2) индуцирующему воздействию на ферменты, принимающие участие в восстановлении глу-татиона из окисленной формы — глутатионре-дуктазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу;

3) восстановлению редокс-статуса в клетке и повышению активности тиол-зависимых ферментов;

4) повышению активности ферментов анти-перекисной защиты и глутатионовой конъюгации — глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы;

О

Є

5) снижению интенсивности протекания процессов ПОЛ.

Данные свойства цитофлавина, исследованные при повторных введениях широко применя-

ЛИТЕРАТУРА

1. ГанцевШ. X. Онкология. М.: Мед. информ. агенство, 2004; 487.

2. КорманД. В. Основы противоопухолевой химиотерапии. М.: 2006; 503.

3. Гершанович М. Л. Осложнения при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. М.: 1982; 223.

4. Фармакокинетика химиотерапевтических препаратов / Г. Я. Кив-ман, Э. А. Рудзит, В. П. Яковлев. М.: 1982; 255.

5. Тиунов Л. А. Механизмы естественной детоксикации и антиокси-дантной защиты. Вестник РАМН. 1995. №3. 9—13.

6. Коваленко А. Л. Применение цитофлавина при токсической и постгипоксической энцефалопатии (пособие для врачей и студентов). СПб.: 2004; 44.

7. Ливанов Г. А., Батоцыренова X. В., Лодягин А. Н. и др. Использование цитофлавина в интенсивной терапии больных с тяжёлыми формами острых отравлений. Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты. СПб.: 2004; 361— 362.

емого в онкологической практике цитостатика — циклофосфана, позволяют рассматривать его как перспективный цитопротекторный препарат сопровождения противоопухолевой терапии.

8. Ellman G. L. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys 1959; 82: 1: 70—77.

9. Uchiyama M., Michara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem 1978; 86: 1: 271—278.

10. KornbergA., Horecker B. L., SmyrniotP. Z. Glucose-6-phosphate dehydrogenase — 6-phosphogluconic dehydrogenase. Meth Enzymol 1955; 1: 323—327.

11. Carlberg I., Mannervik B. Glutathione reductase. Meth Enzymol 1985; 113: 484—490.

12. Peterson G. L. Simplification of protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal Biochem 1977; 83: 2: 346—356.

13. Ивницкий Ю. Ю., Головко А. И., Софронов Г. А. Янтарная кислота в системе средств метаболической коррекции функционального состояния и резистентности организма. СПб.: Воен.-мед. Акад., 1998; 82.

14. Reed D. J. Regulation of reductive processes by glutathione. Biochem Pharmacol 1986; 35: 1: 7—13.

15. Октябрьский О. H., Смирнова Г. В. Редокс-регуляция клеточных функций (обзор). Биохимия. 2007; 72: 2: 158—175.