Антихеликобактерное средство и способ его применения
ANTI-HELICOBACTER AGENT AND METHOD FOR USE THEREOF

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована в качестве лекарственного средства, у пациентов, страдающих гастритом, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, вызванных Helicobacter pylori (pylori).
Хеликобактериоз - инфекционное заболевание с фекально-оральным механизмом передачи, вызываемое бактериями H. pylori, имеющими выраженную тропность к эпителию слизистой оболочки желудка. Н. pylori, это грамотрицательные, короткие извитые, S-образные бактерии средних размеров, подвижные, имеющие 4-5 жгутиков, лофотрохи, оксидазо - и каталазоположительные, проявляют выраженную уреазную активность, обладают фосфатазой, образуют сероводород, не свертывают молоко. Уреаза Н. pylori (мочевинная амидогидролаза) определяет основные звенья патогенеза хеликобактариоза, начиная от адгезии и колонизации слизистой оболочки желудка вплоть до формирования преканцероза желудка [1-5].
Еще в 1985 г. профессор B.J. Marshall, один из первооткрывателей Н. pylori - лауреат Нобелевской премии, наблюдая положительные результаты в лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, предлагал использовать висмутсодержащую тройную терапию, направленную на эрадикацию Н. pylori. В то же время он указывал, что не все пациенты с инфекцией Н. pylori могут получить соответствующее лечение, у многих ресурсы ограничены. Ключевым фактором при неэффективности эрадикации и рецидивировании Н. pilori - инфекции является резистентность к антибиотикам.
Антимикробные препараты, применяемые в качестве ингибитора в схемах антихеликобактерной терапии - метронидазол и амоксициллин представляют собой сильнодействующие лекарственные вещества, применение которых сопровождается нежелательными побочными эффектами. Кроме того, синтетические препараты обладают токсическим действием на печень. В связи с этим предлагаются средства, не оказывающие токсического действия.
Так, из патента РФ №2367458 известно применение хвойной хлорофиллокаротиновой пасты в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции для ингибирования бактерий рода Helicobacter pylori. Недостатком этого средства является то, что применение вышеуказанной пасты тестировалось только in vitro на чашках Петри с положительным эффектом при весьма высоких концентрациях пасты - 300 мг/мл (30%). Исследования на животных (in vivo) и на людях отсутствуют.
Из патента РФ №2315596, 2006 г. известна фармацевтическая композиция для лечения язвенной болезни желудка, включающая алюминийсодержащий антацид и пребиотик в эффективном количестве, при этом, в качестве алюминийсодержащего антацида композиция содержит сукральфат в разовой дозе от 0,25 до 1,0 г, или алюминия фосфат в разовой дозе от 3,8 до 16,0 г, а в качестве пребиотика - фруктоолигосахарид (ФОС) в разовой дозе от 2,5 до 16,0 г, которую принимают 1-3 раза в сутки. Согласно результатам исследования, эта фармкомпозиция показала высокую эффективность в лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Однако, в патенте отсутствуют сведения о непосредственной антихеликобактерной активности предлагаемой композиции.
Известно техническое решение, описанное в патенте РФ №2416414, согласно которому в качестве средства, обладающего антихеликобактерным действием, предложен низкоэтерифицированный некрахмальный полисахарид - пектат кальция, имеющий следующие физико-химические характеристики: степень этерификации - 1,2%, молекулярная масса - 39,3 кДа, содержание ангидрогалактуроновой кислоты - 67,3% и кальция - 38 мг/г образца. Вещество ранее было известно как пребиотик, и обладало профилактическим действием на развитие язвенных поражений желудка, вызванных приемом нестероидных противовоспалительных средств. Показано выраженное действие in vitro пектата кальция на культуру Helicobacter pylori.
Однако, авторы цитируемого патента не проводили исследование антихеликобактерной активности в условиях клиники. Практический же опыт и результаты исследований в разных лабораториях и клиниках, свидетельствуют о различии в эффективности антибактериальных препаратов против ряда возбудителей инфекционных заболеваний в условиях in vitro и in vivo.
В частности, применительно к возбудителю Н. pylori установлено, что большинство антибактериальных препаратов, проявляющих высокую эффективность in vitro, не эффективны in vivo из-за кислой среды желудка или невозможности проникнуть в подслизистый слой, где персистируют бактерии (Кудрявцева Л.В., Щербаков П.Л., Иваников И.О. Говорун В.М. Helicobacter pylori - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей) / НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Научно-производственная фирма «Литех», Научный Центр Здоровья Детей, Центральная Клиническая больница Больница МЦ УД).
Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявленному средству и способу его применения является техническое решение, описанное в патенте №2538697. В этом патенте описана Фармацевтическая композиция для лечения язвенной болезни желудка и/или двенадцатиперстной кишки, обладающая антихеликобактерным действием, содержит рекомбинантный интерферон, выбранный из группы: рекомбинантный интерферон-альфа, рекомбинантный интерферон-бета, рекомбинантный интерферон-гамма; антисептики; аминокислоты, выбранные из группы: аргинин, гистидин, лизин, цистеин, метионин, глютаминовая кислота; и антиоксиданты, выбранные из группы: бета-каротин, витамин С, витамин Е, при следующем соотношении компонентов в г на 1 г смеси:
рекомбинантный интерферон, ME
1000-10000000
антисептики
0,00001-0,5
аминокислоты
0,00001-0,5
антиоксиданты
0,00001-0,5
консистентнообразующая основа
остальное
Согласно формуле изобретения, средство содержит антисептик, каковым может быть одно из следующих соединений: лизоцим, биклотимол, фузафунгин, амбазон, бензилдиметил-миристоиламино-пропиламмоний, котримоксазол, амилметакризол, дихлорбензиловый спирт, цитилпиридиния хлорид, беноксония хлорид. Недостатком этого средства является то, что содержащиеся в нем антисептики представляют собой сильнодействующие лекарственные вещества, применение которых сопровождается нежелательными побочными эффектами. Кроме того, эти препараты обладают токсическим действием на печень.
Предпосылкой для создания предлагаемого изобретения явились наши работы в области лечения патологии желудочно-кишечного тракта, защищенные патентами РФ №2593584 и №2614730. Нами было показано, что лактат кальция обеспечивает восстановление кишечного микробиоценоза при дисбиозах, а также проявляет противоинфекционную активность при кишечных инфекциях в эффективной терапевтической суточной дозе за счет повышения колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника.
Это позволяет рекомендовать его для лечения инфекционных заболеваний кишечника как животных, так и человека. Однако, учитывая специфику персистенции Helicobacter pylori в слизистой оболочке желудка, агрессивность содержимого желудка, нельзя было с уверенностью считать, что лактат кальция окажется эффективным для лечения воспалительных заболеваний желудка, вызванных Helicobacter pylori.
Техническим результатом группы изобретений как в части средство, так и в части способ является устранение токсического влияния применяемых лечебных средств на организм при достижении высокой антихеликобактерной активности.
Этот технический результат в части средство достигается тем, что антихелибактерное средство представляет собой композицию, состоящую из пребиотического компонента в виде олигофруктозы и инулина, а также метабиотического компонента в виде лактата кальция, в эффективной терапевтической дозе, обеспечивающей колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка и эрадикацию Helicobacter pylori.
Антихеликобактерное средство может содержать 40-60% олигофруктозы, 20-30% инулина и 15-30% лактата кальция.
Антихеликобактерное средство может содержит 55,1% олигофруктозы, 23,7% и 21,2% лактата кальция.
Антихеликобактерное средство может иметь форму таблеток по 0,5-1,0 г.
Антихеликобактерное средство может иметь форму порошка.
Антихеликобактерное средство может иметь форму раствора.
Эффективная терапевтическая доза антихеликобактерного средства для взрослого человека и ребенка с 14 лет составляет 3,0-4,5 г/сутки.
Эффективная терапевтическая доза антихеликобактерного средства для ребенка с 0 до 3 лет составляет 1,0-1,5 г/сутки, с 3 до 14 лет 1,5-3,0 г/сутки.
Эффективная терапевтическая доза антихеликобактерного средства для животного - лабораторной мыши может составлять 10-20 мг/сутки.
Этот технический результат в части способ достигается тем, что способ применения антихеликобактерного средства включает пероральное введение его для лечения заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori в эффективной терапевтической дозе 1-3 раза в сутки.
Введение антихеликобактерного средства может применяться для лечения и профилактики язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, вызываемых Helicobacter pylori.
Введение антихеликобактерного средства может применяться для лечения и профилактики гастрита, вызванного Helicobacter pylori.
Введение антихеликобактерного средства может применяться для лечения и профилактики экспериментальных заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori.
Нами были исследованы различные дозы ингредиентов заявляемого средства. На основании полученных результатов мы пришли к выводу, что антихеликобактерным действием обладают композиции, содержащие преимущественно 40-60 г олигофруктозы, 20-30 г инулина и 15-30 г лактата кальция. Однако, оптимальным соотношением лечебный эффект/доза, по нашему мнению, обладает композиция, содержащая в 100 г смеси 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция.
Средство готовят следующим образом
1. Пример 1. Получение заявленного средства в форме порошка. Берут ингредиенты заявленной композиции, преимущественно из расчета того, чтобы 100 г композиции содержали 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция и смешивают.
2. Пример 2. Получение таблетированной формы. Берут ингредиенты заявленной композиции, преимущественно из расчета того, чтобы 100 г композиции содержали 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция смешивают и таблетируют известным способом для получения таблеток весом 0,5-1,0 г.
3. Пример 3. Получение средства в форме раствора. Берут ингредиенты заявленной композиции, преимущественно из расчета того, чтобы 100 г композиции содержали 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция смешивают и растворяют перед применением в кипяченой или дистиллированной воде из расчета того, чтобы вышеуказанная эффективная терапевтическая суточная доза для ребенка 0-3 лет содержалась в 15 мл жидкости (5 мл × 3 приема в сутки), для ребенка 3-14 лет содержалась в 60 мл (20 мл × 3 приема в сутки), для взрослого человека и ребенка с 14 лет содержалась в 90 мл (30 мл × 3 приема в сутки).
Способ осуществляют следующим образом.
Поскольку заявленное средство содержит пребиотики: фруктоолигосахарид + фруктополисахарид, а также лактат кальция (метабиотик) авторы отнесли заявленное средство к метапребиотикам.
Полученное вышеописанным способом средство в любой из 3 вышеописанных форм применяют перорально.
При этом, эффективная терапевтическая доза для взрослого человека и ребенка с 14 лет может составлять 3,0-4,5 г/сутки, а для ребенка с 0 до 3 лет эта доза может составлять 1,0-1,5 г/сутки, с 3 до 14 лет 1,5-3,0 г/сутки.
В случае применения заявляемого антихеликобактерного средства у лабораторных животных, например, у мышей, эффективная терапевтическая доза может составлять 10-20 мг/сутки. Препарат вводят в желудок, преимущественно в виде раствора с помощью зонда.
Изучение чувствительности бактерий Н. pylori к заявленному средству, комплексу фруктоолигосахарид + фруктополисахарид (ФОС + ФПС), Лактату Са
На плотную питательную среду высевали культуру Н. pylori, инкубацию проводили при температуре 37°С в микроаэрофильных условиях. Сверху накладывали диски, пропитанные антибиотиками Цефотаксимом и Пефлоксацином и бязевые тест-объекты, пропитанные растворами заявленного средства (100г композиции содержали 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция), Лактат Са (концентрация 2 мг в 1 мл дистиллированной воды).
На Фиг. 1 представлена фотография растущей культуры Н. pylori и сформировавшихся зон ингибирования роста вокруг дисков и тест объектов.
Расположение антибактериальных препаратов на поверхности плотной питательной среды в чашке Петри: слева вверху - метапребиотик в виде заявленного средства (100 г композиции содержали 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция), справа вверху - комплекс ФОС + ФПС, внизу справа - Лактат Са, внизу слева - пефлоксацин, в центре - цефотаксим.
Предлагаемый Метапребиотик обладает бактериостатическим и бактерицидным (диаметр зоны ингибирования роста бактерий H. pylori до 12 мм) действием; у комплекса ФОС + ФПС диаметр зоны ингибирования роста бактерий меньше и составляет до 10 мм, несколько меньше зона бактериостатического действия; Лактат Са в опыте in vitro проявляет только бактериостатический эффект.
Доказательство антихеликобактерной активности заявленного средства в эксперименте.
R
Для изучения различных аспектов взаимодействия бактерий штамма H. pylori 11 с организмом белых мышей был получен методом спонтанного мутагенеза штамм H. pylori КМ-11 (Rif), маркированный по признаку устойчивости к рифампицину, который можно было использовать для его дифференциации с другими видами микроорганизмов, описанным в руководстве [6, 7].
R
Формирование хеликобактериоза у белых мышей осуществляли путем перорального введения в течение 5 суток животным суспензии бактерий H. pylori KM-11 (Rif) на фоне иммуносупрессивного эффекта от внутримышечного введения Дексаметазона (производитель KRKA, Словения) в суточной дозе 40 мкг на одно животное см. Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Горшков А.С., Шабалина М.Р., Смирнова Д.Н., Богачева Н.В.
Экспериментальный хеликобактериоз у конвенциональных белых мышей при инфицировании возбудителем Helicobacter pylori. Инфекционные болезни. 2018; 16(2): 77-85.
Иммуносупрессивный эффект дексаметазона обусловлен вызываемой им инволюцией лимфоидной ткани, угнетением пролиферации лимфоцитов (особенно Т-лимфоцитов), подавлением миграции В-клеток и взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, торможением миграции цитокинов (интерлейкина 1, интерлейкина 2, интерферона гамма) из лимфоцитов и макрофагов, снижением образования антител.
R
Показателем, характеризующим размножение хеликобактера в желудке и его дальнейшее проникновение в кишечник, является выделение бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) из фекалий животных.
R
8
Выращивали культуру бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовили бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчета 2⋅10 микробных клеток в объеме 0,2 мл.
R
R
На фоне введения Дексаметазона (на вторые сутки после начала введения) животным вводили перорально один раз в сутки 0,2 мл суспензии бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) на изотоническом растворе хлорида натрия. Введение суспензии бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) продолжали в течение 4 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества хеликобактерий, выводимых их организма животных.
R
По окончании введения суспензии бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) животных разделили на 4 группы для ведения препаратов: 1 группа - лечение с помощью заявленного средства (100 г композиции содержали 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция); 2 группа - лечение ФОС + ФПС; 3 группа - лечение Лактатом Са; 4 группа - без лечения (контрольная группа животных). С началом лечения животных проводили отбор желудков для гомогенизции и определения уровня обсемененности хеликобактером.
R
R
R
Обрабатывали полученные результаты высева суспензий гомогенатов желудков белых мышей и суспензий фекалий на селективную питательную среду с рифампицином, основываясь на количестве выросших колоний, и выносили суждение о приживаемости бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) в стенке желудка, о начале бактериовыделения H. pylori КМ-11 (Rif) с фекалиями животных, интенсивности и продолжительности бактериовыделения H. pylori КМ-11 (Rif).
По результатам настоящих экспериментов можно сделать вывод о том, что бактерии H. pylori появляются в фекалиях подопытных животных (375 КОЕ/1г) на третий день на фоне внутримышечного введения дексаметазона и на второй день (тоже на фоне внутримышечного введения дексаметазона) после перорального введения бактерий и в дальнейшем высеваются из фекалий даже при отсутствии лечения животных вплоть до конца эксперимента, постепенно снижаясь численно до 13 КОЕ/1г в конце опыта (срока наблюдения).
Таким образом, продолжительность бактериовыделения хеликобактера с фекалиями, начиная с 30.01.2018 по 12.02.2018 гг. (по результатам определений в группе животных без введения препаратов с метапребиотическим действием) составляет 14 суток. Лечение животных препаратами снизило количество выделяемых с фекалиями бактерий до 2-6 КОЕ/1 г. По окончании введения животным препаратов с метапребиотическим действием снижение численности бактерий H. pylori в фекалиях продолжалось еще 5 суток.
Продолжительность бактериовыделения хеликобактера с фекалиями, начиная с 5.02.2018 по 12.02.2018 гг. (по результатам определений в группе животных без введения препаратов с метапребиотическим действием) составляет 8 суток.
На 5 день внутримышечного введения животным дексаметазона (и на 4 день перорального введения животным суспензии бактерии H. pylori) в гомогенатах желудков выявлялись 2,6 млн бактерий на 1 г ткани органа, что свидетельствует об адгезии и их приживаемости в слизистой оболочке желудка.
При введении препаратов с метапребиотическим действием в течение 4 суток к 13 суткам т.е. с 31.01.2018 по 13.02.2018 гг. произошло полное очищение от бактерий H. pylori.
Доказательство антихеликобактерной активности заявленного средства в условиях клиники.
R
Исследование было проведено на добровольцах, мужчинах, в возрасте от 27 до 69 лет. Выращивали культуру бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) на плотной питательной среде с рифампицином в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовили бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчета 10 млрд микробных клеток в объеме 30 мл.
R
Важным показателем, характеризующим размножение хеликобактера в желудке и его дальнейшее проникновение в кишечник, является выделение бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) из фекалий добровольцев.
R
R
R
R
На третий день эксперимента (т.е. через сутки после начала приема суспензии Н. pylori KM-11 (Rif)) в фекалиях всех добровольцев появились маркированные по Rif - признаку бактерии хеликобактера (таблица 1). Как следует их данных таблицы 1, на 5 день эксперимента содержание бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) в фекалиях добровольцев достигло максимальных значений, которые поддерживались практически на том же уровне вплоть до 7 дня эксперимента, после которого суспензия бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) добровольцами больше не принималась.
R
R
На высоком уровне содержание бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) в фекалиях добровольцев сохранялось еще на 7-е сутки, которые стали началом приема метапребиотика в виде заявленного средства (100 г композиции содержали 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция), что сопровождалось резким снижением численности бактерий хеликобактера в фекалиях вплоть до 11 дня эксперимента (пятого дня приема метапребиотика). Эти результаты представлены в таблице 1 «Результаты определения количества бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) в фекалиях добровольцев в течение всего периода наблюдений».
R
R
На 12 день эксперимента у всех добровольцев был зафиксирован довольно значительный подъем численности бактерий H. pylori КМ-11 (Rif) в образцах фекалий, отобранных для бактериологического изучения. Такое увеличение численности хеликобактера в фекалиях добровольцев на фоне приема метапребиотика в виде заявленного средства можно связать, по-видимому, с «выбросом» в просвет желудка отторгнутых микробных клеток H. pylori КМ-11 (Rif) вследствие повышения колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка и активизации индигенной микробиоты под влиянием метапребиотика.
Данное предположение следует признать правомерным, поскольку дальнейший прием добровольцами заявляемого метапребиотика сопровождался резким снижением численности хеликобактера в фекалиях вплоть до полного их исчезновения к 17 дню эксперимента (к 11 дню приема метапребиотика). По сути дела, мы наблюдали полную эрадикацию возбудителя хеликобактериоза в результате метапребиотикотерапии.
На 8 и 9 сутки эксперимента у трех добровольцев отмечалась изжога, которая прекратилась через сутки на фоне приема метапребиотика. На 12 день эксперимента исчезли неприятные ощущения в эпигастральной области. Следует отдельно отметить, что у четырех добровольцев на 12-14 дни эксперимента было зафиксировано учащением стула и изменение цвета фекалий: они приобрели красновато-коричневый цвет, как и надосадочная жидкость после центрифугирования образцов фекалий, что было расценено как проявление острого гастрита. Краткосрочное изменение цвета фекалий и учащение стула прекратились в последующие дни эксперимента на фоне продолжающегося приема метапребиотика в виде заявленного средства.
R
По завершении двухнедельного приема добровольцами данного метапребиотика и в последующем (через 2 недели и через 1 месяц) бактериологическим методом микробные клетки H. pylori КМ-11 (Rif) в фекалиях не выявлялись. В дальнейшем никаких изменений в самочувствии добровольцев и их работоспособности не отмечено.
Представленные положительные результаты дают основание для определенного оптимизма. И как в случае доказанного на подопытных животных полного очищения их желудков от возбудителя хеликобактериоза с использованием препаратов с пребиотическим действием - заявляемого средства - композиции, состоящей из пребиотического компонента в виде олигофруктозы и инулина, а также метабиотического компонента в виде лактата кальция, в эффективной терапевтической дозе, ФОС + ФПС, Лактата Са, так и в ходе экспериментального исследования по самозаражению добровольцев, мы близки к пониманию того, что мечта клиницистов может быть реализована.
В обоих случаях - и в экспериментах на конвенциональных белых мышах, и в эксперименте самозаражения добровольцев была испытана терапевтическая эффективность заявляемого средства, обеспечивающего колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка и эрадикацию Helicobacter pylori. Этот препарат можно считать довольно близким к «идеальному антимикробному агенту» по следующим своим терапевтическим свойствам:
- не является классическим антибиотиком и к нему не может вырабатываться устойчивость;
- обладает ограниченным спектром действия - угнетает рост бактерий H. pylori и в то же время стимулирует рост индигенной микробиоты (данные подкреплены экспериментально);
- характеризуется стабильной антагонистической активностью в отношении бактерий Н. pylori в кислой среде желудка как подопытных животных, так и добровольцев;
- способен проникать сквозь слой слизи, достигать мишени на поверхности бактерий H. pylori без утраты антимикробной активности, а также повышать колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка и содействовать деконтаминации ее от бактерий H. pylori.
Список цитируемой литературы
1. Morris F., Maher K., Thomsen L. et al. Distribution of Campylobacter pylori in the human stomach obtained at postmortem // Scand. J. Gastroenterol. - 1988. - Vol. 23. - P. 257-264.
2. Tsujii M., Kawano S., Tsujii S. et al. Ammonia: a possible promotor in Helicobacter pylori - related gastric carcinogenesis // Cancer Lett. - 1992. - Vol. 65. - P. 15-18.
3. Нижевич А.А., Хасанов Р.Ш. Helicobacter pylori: введение в патогенез и патобиохимию гастрита // Материалы VIII тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori, 18 мая 1999 г, Уфа. / www.Helicobacter.ru/index.php?i=59.
4. Helicobacter pylori - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей) / НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Научно-производственная фирма «Литех», Научный Центр Здоровья Детей, Центральная Клиническая Больница МЦ УД Президента РФ. - М.: - 2004. - 41 с.
5. Tsujii М., Kawano S., Tsujii S. et al. Cell kinetics of mucosal atrophy in rat stomach induced by long-term administration of ammonia // Gastroenterology. - 1933. - Vol. - 104. - P. 769-801; Tsujii M., Kawano S., Tsujii S. et al. Mechanism for ammonia-induced promotor of gastric carcinogenesis in rats // Carcinogenesis. - 1995. - Vol. 16. - P. 563-566).
6. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / Пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В.Г. Никифорова. - М.: Мир, 1976. - 436 с.
7. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Янов С.Н. Способ оценки выживаемости бифидо- и лактобактерий в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Патент №2528867. Российская Федерация, опубл. 20.09.2014. Бюл. №26. Номер охранного документа МПК C12Q 1/04, МПК C12Q 1/06.