ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ СИНДРОМА ПАДЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ (EDS)
PREVENTIVE VACCINE AGAINST FALLOW EGG SYNDROME (EDS)

Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к вакцинам для профилактики EDS домашней птицы. Более конкретно, изобретение относится к вакцине, содержащей активный ингредиент, рекомбинантный белок и/или его мультимер, в котором "область головки" в фибриллярном белке вызывающего EDS вируса EDS (EDSV) слита с "полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу". Инокуляция слитого белка и/или его мультимера курам индуцирует высокий титр подавляющих гемагглютинацию (HI) антител и обеспечивает профилактику возникновения EDS.
Предшествующий уровень техники
[0002] EDS представляет собой заболевание домашней птицы, преимущественно характеризуемое низкой яйценоскостью и продукцией аномальных яиц у инфицированных EDSV кур (NPL1 и NPL 2). EDSV классифицируют как представителя группы III аденовирусов птиц, и он обладает гемагглютинирующей активностью. Вирус характеризуется пролиферацией в маточных трубах кур. EDS обнаруживает только незначительные клинические симптомы, такие как умеренная диарея, если они вообще присутствуют. Заболевание часто происходит в возрасте от 30 до 40 недель, когда яйценоскость находится на пике, и вызывает в инфицированной стае продукцию яиц с аномальными оболочками или низкую яйценоскость в течение периода от 3 до 8 недель. Это приводит к серьезному экономическому ущербу. Для профилактики EDS эффективны вакцины (NPL 3), и инактивированные вакцины включены в широкий диапазон программ вакцинации для яйценоских птиц.
[0003] В настоящее время основным направлением являются инактивированные вакцины против EDS, получаемые из инактивируемых вирусов, размножающихся в оплодотворенных яйца домашних уток, и посредством смешивания инактивированных вирусов с адъювантов. Хотя амплификация EDSV в оплодотворенных яйцах домашней утки желательна (NPL4 и NPL 5), появление птичьего гриппа и других инфекций поставило под вопрос о том, что будущие поставки оплодотворенных яиц домашней утки могут столкнуться со сложностями. Таким образом, существует необходимость в средствах для поставки вакцинных антигенов, которые не зависят от яиц домашней утки.
[0004] EDSV обладает двухцепочечной геномной ДНК длиной приблизительно 33 т.п.н. (NPL6), и ввиду одного и того же серотипа почти не существует различий антигенности между штаммами (NPL 7). Вирусные частицы состоят из различных структурных белков, включая коровый белок, белок, составляющий гексоны капсида, белок тримерных фибрилл, выступающих из капсида в виде нитчатых стержней, и белок базальной части, такой как основа пентона, обеспечивающая основу для фибриллы (NPL 1 и NPL 6). Нейтрализующий эпитоп находится в гексоне (NPL 8), фибрилле и в основе пентона (NPL 9). В частности, фибриллу изучали во многих исследованиях (NPL 11), так как она вовлечена в проникновение в клетки-хозяева (NPL 10). Фибриллярный белок по функциям разделен на три области (NPL 12). N-концевую часть, участвующую в связывании с основой пентона (NPL 13), называют хвост, а область в середине называют стебель. Опубликовано, что головка на C-конце обладает гемагглютинирующей активностью и участвует в связывании с клеточным рецептором (NPL 11). У аденовируса человека 5 нейтрализующий эпитоп находится в головке, одной из трех областей фибриллярного белка. Существует публикация о том, что для осуществления функции важна конформация, и что активность связывания рецептора наблюдали при экспрессии с частью прилежащей области стебля (NPL 14).
[0005] Область стебля, составляющая стебель фибриллярного белка, обладает повторяющейся структурой с рядом из нескольких β-спиральных структур (1 повтор), включающих гидрофобные области, разделенные пролином или глицином (NPL 12, и NPL 15), и три молекулы собраны вместе с формированием тройной β-спиральной структуры (NPL 15 и NPL 16). Головка, следующая за стеблем, также обладает тримерной структурой (NPL 17). Как правило, стеблевой повтор состоит из 15 аминокислот (NPL 12). Однако в EDSV большинство повторов состоят из большего количества аминокислот (NPL 6). Опубликовано, что у аденовируса человека уменьшенная длина стебля приводит к более слабому связыванию с рецептором и сниженной инфективности для культур клеток (NPL 18).
Escherichia coli
[0006] В отношении EDSV, существуют публикации о том, что у кур, которым в виде масляной вакцины после экспрессии в  вводили 34 аминокислоты из C-концевой части области стебля, прилежащей к головке, получены нейтрализующие антитела (NPL 19 и NPL 20 и PTL 1).
Список цитируемых документов
Патентная литература
[0007] PTL 1: WO2004/078977
Непатентная литература
[0008] NPL 1: Adair, B.M. & Fitzgerald, S.D.: Egg Drop Syndrome. In Diseases of Poultry, 12th ed. (Saif, YM et al. ed.), p266-276, Blackwell Publishing, Ames. 2008
NPL 2: Shigeo Yamaguchi: Egg Drop Syndrome, Disease of Birds, 7th Edition, Edited by The Japanese Society on Poultry Diseases, p50-53, The Japanese Society on Poultry Diseases, Tokyo, 2010
NPL 3: Baxendale, W., Lutticken, D., Hein, R. & McPherson, I.: The results of field trials conducted with an inactivated vaccine against the egg drop syndrome 76 (EDS 76). Avian Pathol., 9: 77-91, 1980
NPL 4: Fujio Nonaka, Kazuo Matsuo, Shinji Yamada: Proliferation and Pathogenicity of Egg Drop Syndrome-1976 (EDS-76) Virus in Cultured Cells and Embryonated Chicken Eggs, Japan Veterinary Medical Association Journal, 37:510-515, 1984
NPL 5: Minoru Higashihara, Shinji Takai, Atsuko Hidaka, Tsutomu Houdatsu, Masami Hiruma, Yoshikazu Watanabe, Minoru Matsumoto: Isolation of the Virus of Egg Drop Syndrome 1976 (EDS-76), Jpn. J. Vet. Sci.,45: 603-612, 1983
NPL 6: Hess, M., Blocker, H. & Brandt, P.: The complete nucleotide sequence of egg drop syndrome virus: an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses. Virology, 238: 145-156, 1997
NPL 7: Tsukamoto, K., Kuwabara, M., Kaneko, M., Mase, M. & Imai, K.: No evidence for adaptation of current egg drop syndrome 1976 viruses to chickens. Avian Dis., 48: 220-223, 2004
NPL 8: Toogood, C.I., Crompton, J. & Hay, R.T.: Antipeptide antisera define neutralizing epitopes on the adenovirus hexon. J. Gen. Virol., 73: 1429-1435, 1992
NPL 9: Gahery-Segard, H., Farace, F., Godfrin, D., Gaston, J., Lengagne, R., Tursz, T., Boulanger, P. & Guillet, J.G.: Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. J. Virol., 72: 2388-2397, 1998
NPL 10: Louis, N., Fender, P., Barge, A., Kitts, P. & Chroboczek, J.: Cell-binding domain of adenovirus serotype 2 fiber. J. Virol., 68: 4104-4106. 1994
NPL 11: Horwitz, M.S.: Adenovirus. In Fields Virology, 4th ed., (Knipe DM et al. ed) p2301-2326, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 2001
NPL 12: Green, N.M., Wrigley, N.G., Russell, W.C., Martin, S.R. & McLachlan, A.D.: Evidence for a repeating cross-beta sheet structure in the adenovirus fibre. EMBO J., 2: 1357-1365, 1983
NPL 13: Hong, S.S. & Boulanger, P.: Protein ligands of the human adenovirus type 2 outer capsid identified by biopanning of a phage-displayed peptide library on separate domains of wild-type and mutant penton capsomers. EMBO J., 14: 4714-4727, 1995
NPL 14: Henry, L.J., Xia, D., Wilke, M.E., Deisenhofer, J. & Gerard, R.D.: Characterization of the knob domain of the adenovirus type 5 fiber protein expressed in Escherichia coli. J. Virol., 68: 5239-5246, 1994
NPL 15: van Raaij, M.J., Mitraki, A., Lavigne, G. & Cusack, S.: A triple beta-spiral in the adenovirus fibre shaft reveals a new structural motif for a fibrous protein. Nature, 401: 935-938, 1999
NPL 16: Stouten, P.F., Sander, C., Ruigrok, R.W. & Cusack, S.: New triple-helical model for the shaft of the adenovirus fibre. J. Mol. Biol., 226: 1073-1084, 1992
NPL 17: Xia, D., Henry, L., Gerard, R.D. & Deisenhofer, J.: Structure of the receptor binding domain of adenovirus type 5 fiber protein. Curr. Top Microbiol. Immunol., 199: 39-46, 1995
NPL 18: Shayakhmetov, D.M. & Lieber, A.: Dependence of adenovirus infectivity on length of the fiber shaft domain. J. Virol., 74: 10274-10286, 2000
NPL 19: Gutter, B., Fingerut, E., Gallili, G., Eliahu, D., Perelman, B., Finger, A. & Pitcovski, J.: Recombinant egg drop syndrome subunit vaccine offers an alternative to virus propagation in duck eggs. Avian Pathol., 37: 33-37, 2008
NPL 20: Fingerut, E., Gutter, B., Gallili, G., Michael, A. & Pitcovski, J.: A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its fiber protein. Vaccine, 21: 2761-2766, 2003
NPL 21: Adv. Protein Chem. 2005, 70, 37-78
Сущность изобретения
Техническая задача
[0009] Настоящее изобретение относится к рекомбинантной вакцине против EDS, способной эффективно предотвращать EDS, предназначенной для ферм с потенциальным риском EDS.
Решение задачи
[0010] В поисках решения указанных выше задач авторы настоящего изобретения исследовали структуру фибриллярного белка EDSV с использованием модели прогнозирования структуры и выявили, что граница между областью головки и областью стебля находится ближе к N-концу, чем традиционно полагают. Также выявлено, что рекомбинантный белок и/или его мультимер, в котором область головки с установленной границей так, чтобы не содержать область стебля, сливали с полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу, при инокуляции курам в качестве вакцины индуцировал высокий титр HI антител. Настоящее изобретение осуществлено на основании этих изысканий.
[0011] В частности, настоящее изобретение относится к приведенному ниже.
Слитый белок, в котором с областью головки фибриллярного белка EDSV связан полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу.
[0012] Слитый белок, в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, представляет собой GCN4 или белок матрикса хряща (CMP).
[0013] Слитый белковый мультимер слитого белка.
[0014] Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность ДНК, кодирующую слитый белок.
[0015] Рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты.
[0016] Трансформант, содержащий введенный в него фрагмент нуклеиновой кислоты.
[0017] Трансформант, содержащий введенный в него рекомбинантный экспрессирующий вектор.
[0018] Антитело, связывающееся со слитым белком или с его мультимером.
[0019] Вакцина против EDS, содержащая в качестве активного ингредиента слитый белок.
[0020] Терапевтическое средство против EDS, содержащее в качестве активного ингредиента антитело.
[0021] ДНК-вакцина против EDS, содержащая в качестве активного ингредиента фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор.
[0022] Набор, содержащий слитый белок или его мультимер, где набор предназначен для измерения уровня антител в зависимости от содержания области головки EDSV в тестируемом образце.
[0023] Набор, содержащий антитело, где набор предназначен для измерения содержания области головки EDSV в тестируемом образце.
[0024] Способ профилактики EDS, где способ включает введение курам слитого белка, его мультимера, фрагмента нуклеиновой кислоты или рекомбинантного экспрессирующего вектора.
[0025] Способ лечения EDS, где способ включает введение курам антител.
Полезные эффекты изобретения
[0026] Вакцина по настоящему изобретению, содержащая рекомбинантный белок и/или его мультимер, содержащийся в качестве активных ингредиентов и в котором область головки EDSV слита с полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу, при инокуляции курам индуцирует высокий титр HI антител и может предотвращать заболевание EDS у домашней птицы.
Краткое описание чертежей
[0027] Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение слитых белков, получаемых в примерах 1 до 4 и сравнительном примере 1.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, представляющую анализ SDS-PAGE, подтверждающий формирование мультимеров слитых белков, получаемых в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1.
Фиг. 3 представляет собой диаграмму, представляющую анализ молекулярно-массового распределения слитых белков, получаемых в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, посредством гель-фильтрации.
Фиг. 4 представляет собой диаграмму, представляющую результаты тестирования HI сыворотки кур, иммунизированных слитыми белками, получаемыми в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1 в примере тестирования 3.
Фиг. 5 представляет собой диаграмму, представляющую результаты тестирования для подтверждения эффективных уровней антигена головки-GCN4 в примере тестирования 4.
Фиг. 6 представляет собой диаграмму, представляющую результаты тестирования для подтверждения эффективных уровней антигена CMP-головки в примере тестирования 4.
Фиг. 7 представляет собой диаграмму, представляющую изменения титров HI антител к EDSV после иммунизации (средние значения) в примере тестирования 5.
Фиг. 8 представляет собой диаграмму, представляющую изменения количества нормальных яиц после летальной инфекции EDSV в примере тестирования 5.
Описание вариантов осуществления
[0028] Настоящее изобретение относится к слитому белку, в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, связан с областью головки фибриллярного белка EDSV кур.
[0029] Фибриллярный белок EDSV, начиная от N-конца, функционально делится на три области: хвост, стебель и головка. Предпочтительно, область головки EDSV, являющаяся составляющей слитого белка по настоящему изобретению, не содержит область стебля, так как при этом существует риск снижения растворимости. С другой стороны, предпочтительно, чтобы область головки содержалась полностью во избежание риска потери нативной высокоуровневой структуры области головки. Примеры такой области головки EDSV включают полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 11. Эта аминокислотная последовательность включает часть с девятью N-концевыми аминокислотами, которые, как полагали, содержатся в области стебля (NPL 20). Однако исследования авторов настоящего изобретения на основе модели прогнозирования структуры позволили теоретически определить, что область головки продолжается до этого положения. Область головки EDSV, являющаяся составляющей слитого белка по настоящему изобретению, относится к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 11, и к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 с делециями, заменами или добавлением одной или нескольких аминокислот. Как используют в настоящем документе, "несколько аминокислот", как правило, означает от 2 до 9, предпочтительно от 2 до 5, более предпочтительно от 2 до 3 аминокислот. Область головки также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанной выше аминокислотной последовательности.
Escherichia coli
[0030] Ген, кодирующий область головки EDSV, содержит последовательность ДНК SEQ ID NO: 12, последовательность ДНК, у которой кодоны оптимизированы для экспрессии в  или дрожжах, последовательность ДНК, получаемую посредством добавления в эти последовательности ДНК подходящего участка расщепления рестрикционного фермента, и последовательность ДНК, получаемую после делеции, замены или добавления в указанные выше последовательности ДНК одного или нескольких оснований. Как используют в настоящем документе, "несколько оснований", как правило, означает от 2 до 9, предпочтительно от 2 до 5, более предпочтительно от 2 до 3 оснований. Кодирующий ген также включает последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше последовательностям ДНК.
[0031] Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, который связан с головкой, составляя слитый белок по настоящему изобретению, конкретно не ограничен, при условии, что он способен формировать структуру суперспирали. Предпочтительно, полипептид представляет собой полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, происходящий из белка, формирующего природный мультимер (формирующий мультимеры белок). Примерами таких белков являются формирующие мультимеры белки, описанные в NPL 21 (Adv. Protein Chem. 2005, 70, 37-78). Предпочтительно, полипептид представляет собой полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, например, происходящий из GCN4, получаемого у кур CMP или получаемого у бактериофага T4 фибритина, более предпочтительно GCN4 и CMP, особенно предпочтительно CMP, так как слитый белок головки с такими полипептидами можно получать в виде растворимого белка с большим выходом, и он обладает желаемым действием индукции антител, блокирующих.
[0032] Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, включает димерный полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, тримерный полипептид, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 28-30, и полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, получаемой после делеции, замены или добавления в этих аминокислотных последовательностях одной или нескольких аминокислот. Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям. Предпочтительна тримерная форма, а особенно предпочтителен полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30.
[0033] Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот. Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям.
Escherichia coli
[0034] Последовательность ДНК, кодирующая полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, включает последовательность ДНК SEQ ID NO: 32, последовательность ДНК, например, SEQ ID NO: 33, у которой кодоны оптимизированы для экспрессии в , последовательность ДНК, получаемую посредством добавления в эти последовательности ДНК подходящего участка расщепления рестрикционного фермента, и последовательность ДНК, получаемую после делеции, замены или добавления в указанные выше последовательности ДНК одного или нескольких оснований. Последовательность ДНК, кодирующая полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, также включает последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше последовательностям ДНК.
2
4
4
4
1
4
4
2
6
6
4
1
4
2
4
2
6
4
2
4
2
6
4
1
3
1
[0035] В слитом белке по настоящему изобретению полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, например, GCN4 и CMP, может быть связан или с N-концом, или с C-концом головки. Например, когда формирующая суперспираль единица представляет собой CMP, индуцирующего HI антитело действия можно добиваться вне зависимости от того связан ли полипептид с N-коном или с C-концом головки. С другой стороны, когда используют GCN4, более активного индуцирующего HI антитело действия добиваются, когда полипептид связан с N-концом головки. Пептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, и головка можно связывать непосредственно друг с другом. Однако между ними можно встраивать спейсер, такой как линкерная последовательность, с такими целями, как уменьшение межмолекулярного взаимодействие между этими областями. Такая линкерная последовательность конкретно не ограничена, и можно использовать, например, комбинацию последовательностей GPGP(GP) или GGGGS(GS). Также в качестве линкерной последовательности можно использовать последовательность с одним-четырьмя повторами (GS) (от (GS) до (GS)), необязательно в комбинации с (GP). Последовательность может представлять собой последовательность-метку Hisx (H). Предпочтительные примеры линкерной последовательности или комбинации последовательность-метка и линкерная последовательность, включают (GS), (GS), (GS)H(GS) и (GS)H(GS)(GS). Последовательность-метку можно добавлять на N-конец или на C-конец слитого белка.
4
2
6
4
1
6
[0036] Примером слитого белка по настоящему изобретению является слитый белок головка-GCN4 (например, SEQ ID NO: 13 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 14 (последовательность ДНК)), в котором на C-конец головки добавляют полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, с линкерной последовательностью ((GS)), встраиваемой между ними, и последовательностью-меткой (H), присоединенной к C-концу. Другим примером является слитый белок GCN4-головкаа (например, SEQ ID NO: 21 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 22 (последовательность ДНК)), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, расположен на N-конце головки с линкерной последовательностью ((GS)), встраиваемой между ними, и последовательностью-меткой (H), связанной с C-концом. Слитый белок по настоящему изобретению относится не только к белку, представляемому аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 13 или 21, но и к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, получаемой после делеции, замены или добавления в эти аминокислотные последовательности одной или нескольких аминокислот. Слитый белок также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям.
6
4
2
4
2
6
4
1
3
1
[0037] Другие примеры слитого белка по настоящему изобретению включают слитый белок (например, SEQ ID NO: 23 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 24 (последовательность ДНК)), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, связан с C-концом головки с последовательностью-меткой (H) и линкерной последовательностью ((GS)), встраиваемой между ними, и слитый белок (например, SEQ ID NO: 25 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 26 (последовательность ДНК)), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, связан с N-концом головки с последовательностью-меткой и комбинацией линкерных последовательностей ((GS)H(GS)(GS)), встраиваемой между ними. Слитый белок по настоящему изобретению относится не только к белку, представляемому аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 23 или 25, но и к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, получаемой после делеции, замены или добавления в эти аминокислотные последовательности одной или нескольких аминокислот. Слитый белок по настоящему изобретению также относится к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям.
[0038] Для связывания полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу, и головки их можно экспрессировать после связывания друг с другом посредством генетической инженерии. В иллюстративном способе получают экспрессирующий вектор, в котором последовательности ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательность ДНК головки помещают рядом друг с другом и экспрессирующий вектор вводят подходящему хозяину с экспрессией слитого белка. Последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы может находиться на 5'-конце или на 3'-конце последовательности ДНК головки. При получении экспрессирующего вектора последовательности ДНК линкерной последовательности и/или последовательности-метка можно встраивать между последовательностью ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательностью ДНК головки или можно добавлять на 5'-конец или 3'-конец последовательности ДНК. В иллюстративном способе можно получать экспрессирующий вектор, в котором, начиная 5'-конца, расположены последовательность ДНК головки, последовательности ДНК последовательности-метки и/или линкерной последовательности и последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы.
[0039] Последовательности ДНК можно получать посредством химического синтеза и можно использовать в качестве матриц для амплификации известными способами амплификации генов. Затем последовательности ДНК можно встраивать в экспрессирующий вектор с использованием различных рестрикционных ферментов с получением рекомбинантного экспрессирующего вектора. Предпочтительно, олигонуклеотид, используемый для амплификации гена, конструируют так, чтобы он гибридизовался на 5'-конце или 3'-конце последовательности матричной ДНК, и чтобы происходило добавление участков расщепления рестрикционных ферментов. Матричную ДНК можно амплифицировать известными способами амплификации генов с использованием, например, олигонуклеотидов, матричной ДНК и ДНК-полимеразы. После обработки амплифицированной последовательности ДНК и экспрессирующего вектора рестрикционными ферментами их можно лигировать друг с другом подходящей ДНК-лигазой с конструированием рекомбинантного экспрессирующего вектора, в который встроена последовательность ДНК-мишени. Настоящее изобретение также относится к такому рекомбинантному экспрессирующему вектору.
Escherichia coli
[0040] Примеры экспрессирующего вектора включают плазмидные векторы, фаговые векторы, вирусные векторы и векторы в виде искусственных хромосом. С точки зрения простоты обработки и стоимости предпочтительны плазмидные векторы. Например, когда хозяином является , экспрессирующий вектор может представлять собой, например, вектор Flexi pFN6A (HQ) (Promega), вектор Flexi (HQ) (Promega), вектор Flexi pFN2A (GST) (Promega), pET-15b (MERCK), pET-21d (MERCK), pUC57 (GenScript), pET-22b (MERCK), pET-21d (MERCK) или вектор pCold (Takara Bio). В случае млекопитающих экспрессирующий вектор может представлять собой, например, вектор Flexi pF4A CMV (Promega), вектор Flexi pF5A CMV-neo (Promega), вектор Flexi pF9A CMV hRluc-neo (Promega) или экспрессирующий вектор млекопитающих pCI-neo (Promega). Экспрессирующий вектор может содержать участок начала репликации, последовательность промотора, играющую регуляторную роль в экспрессии гена, регуляторную последовательность, такую как энхансерная последовательность и последовательность селективного маркера.
E. coli
[0041] Примеры последовательностей промоторов включают промоторы бактерий, включая промоторы lacI и lacZ , промоторы T3 и T7, промотор gpt, промоторы PR и PL, промотор tac и промоторы trp и trc. В отношении последовательности промотора, примеры известных подходящих для эукариотических клеток промоторов включают немедленный промотор цитомегаловируса (CMV), промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV), ранний и поздний промоторы вируса обезьяны (SV) 40 и промотор длинных концевых повторов (LTR) ретровирусов, включая, например, промотор вируса саркомы Рауса (RoSV) и промоторы металлотионеинов, такие как промотор металлотионеина-I.
[0042] Для экспрессии слитого белка с использованием клеток высших эукариот в качестве хозяев, в экспрессирующий вектор для увеличения транскрипционной активности можно встраивать энхансерную последовательность. Энхансерная последовательность действует, увеличивая транскрипционную активность промотора в предопределенном типе клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, энхансер раннего промотора CMV, энхансер полиомы в поздней части участка начала репликации, энхансер β-актина и энхансер аденовирусов.
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
[0043] Примеры селективных маркеров включают ген устойчивости к ампициллину , ген trp1  и ген устойчивости к неомицину клеток млекопитающих.
[0044] Настоящее изобретение относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательность ДНК головки и кодирует слитый белок по настоящему изобретению. Фрагмент нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, в котором последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательность ДНК головки расположены рядом друг с другом, и к фрагменту нуклеиновой кислоты, в котором между последовательностью ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательностью ДНК головки встроены последовательности ДНК последовательности-метки и/или линкерной последовательности. Например, фрагмент нуклеиновой кислоты содержит фрагменты нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 14, 24, 26 или 28.
[0045] Полные последовательности фрагментов нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно получать посредством химического синтеза. Фрагмент нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также можно получать, объединяя фрагмент части нуклеиновой кислоты и фрагмент остатка нуклеиновой кислоты известным способом рекомбинации генов после получения этих частичных фрагментов нуклеиновой кислоты посредством химического синтеза. Например, после химического синтеза последовательностей ДНК головки или формирующей суперспираль единицы их амплифицируют известным способом амплификации генов и встраивают в отдельные клонирующие векторы. Затем последовательность ДНК головки или последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы выщепляют из клонирующего вектора рестрикционным ферментом и встраивают в экспрессирующий вектор, который таким же образом обрабатывают рестрикционным ферментом с получением рекомбинантного экспрессирующего вектора. Вектор конструируют так, чтобы эти фрагменты после встраивания располагались рядом друг с другом. Затем рекомбинантный экспрессирующий вектор можно расщеплять рестрикционным ферментом или т.п. с получением фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего объединенную последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы и головки. Для получения фрагмента нуклеиновой кислоты этим способом между последовательностями ДНК формирующей суперспираль единицы и головки можно встраивать последовательности ДНК последовательности-метки или линкерной последовательности с получением экспрессирующего вектора и получать фрагмент нуклеиновой кислоты.
Escherichia coli
Escherichia coli
Pichia pastoris
Saccharomyces cerevisiae
[0046] Экспрессирующий вектор, получаемый описанным выше способом, можно использовать для трансформации хозяина и получения трансформанта, содержащего экспрессирующий вектор. Настоящее изобретение относится к таким трансформантам. Хозяин может представлять собой известного хозяина, например, такого как , дрожжи, линии клеток млекопитающих, клетки насекомых и растений. Примеры  включают штаммы BL21 и DH5α. Примеры дрожжей включают  и . Примеры клеток млекопитающих включают клетки CHO, клетки HEK293 и клетки COS-1/-7.
[0047] Экспрессирующий вектор можно вводить хозяину известным способом, который можно выбирать в соответствии с хозяином. Примеры таких способов включают способ с использованием фосфата кальция, электропорацию и липофекцию. После трансфекции хозяина можно культивировать в среде, содержащей селективный маркер, с отбором трансформантов, у которых в клетку-хозяина встроен экспрессирующий вектор.
[0048] После пролиферации трансформантов в подходящих условиях можно в подходящих условиях (pH, температура, добавление соединений) индуцировать выбранный промотор с получением слитого белка. Экспрессированный слитый белок накапливается в клетках или клетки его секретируют.
Escherichia coli
Escherichia coli
Для экспрессии с использованием хозяина  слитый белок можно экспрессировать во фракцию телец включения. Тельца включения можно получать из  таким способом, как, например, разрушение ультразвуком, гомогенизация под высоким давлением, и способом с использованием BugBuster (Merck).
[0049] Слитый белок по настоящему изобретению, получаемый описываемым выше способом, можно использовать в виде мономера. Однако более предпочтительно использовать слитый белок по настоящему изобретению в виде мультимера, так как это обеспечивает индукцию высоких титров HI антител. Такие мультимеры слитого белка представляют собой, например, димеры, тримеры и мультимеры более высоких порядков, и включают смесь таких мультимеров. Например, слитый белок получают в виде мультимера, когда слитый белок экспрессируют, например, с использованием в качестве полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу, GCN4 или CMP. Однако, при необходимости, мультимер можно подвергать известным способам рефолдинга.
[0050] Слитый белок по настоящему изобретению представляет собой белок, в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, связан с головкой. Они могут быть связаны друг с другом химически. В качестве примера такого способа, полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, и головка могут быть связаны друг с другом с использованием кросслинкера после раздельной экспрессии.
[0051] При раздельной экспрессии полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу и головку, последовательности ДНК этих областей можно получать посредством химического синтеза, и последовательности можно амплифицировать известным способом амплификации генов с использованием ДНК в качестве матрицы с конструированием каждой из экспрессирующих плазмид описанным выше способом. Затем экспрессирующие плазмиды можно встраивать хозяину с получением представляющего интерес белка, как описано выше.
[0052] Для связывания с использованием кросслинкера можно использовать, например, аминогруппу или тиольную группу (группу SH), присутствующую в белке, или альдегидную группу сахарной цепи, присутствующей в белке. Однако используемые функциональные группы конкретно не ограничены. Например, можно использовать способ, в котором группу SH полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу, подвергают реакции с аминогруппой головки. Конкретно, полипептид и головку можно связывать друг с другом посредством инкубации после подвергания полипептида восстановительному процессу с восстановителем, таким как дитиотреитол (DTT), и после введения пиридилдисульфидной группы в головку с использованием N-сукцинил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (SPDP). Также полипептид и головку можно химически связывать, используя связывание на основе взаимодействия биомолекул, таких как биотин и авидин.
[0053] Слитый белок и его мультимер, полученный описанным выше способом, можно выделять и очищать стандартными способами очистки. Примеры таких способов очистки включают различные способы очистки, включая аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий и гельфильтрационную хроматографию.
[0054] Настоящее изобретение относится к вакцине против EDS, в которой в качестве активных ингредиентов содержатся слитый белок по настоящему изобретению и/или мультимер этого слитого белка. Предпочтительно, вакцина по настоящему изобретению содержит мультимер этого слитого белка. Предпочтительно, мультимер представляет собой димер, тример или мультимер более высокого порядка или смесь таких мультимеров.
[0055] Предпочтительно, вакцина против EDS содержит слитый белок и/или мультимер этого слитого белка в количестве от 0,3 до 10 мкг на дозу.
[0056] Вакцина по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры таких носителей включают насыщенный солевой раствор, забуференный насыщенный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, изотонический водный буфер и их комбинации. Их можно соответствующим образом смешивать с добавками, например, такими как адъюванты, эмульгаторы, консерванты, средства придания тоничности и регуляторы pH.
[0057] Примеры адъювантов включают масляные адъюванты, ацетат токоферола, квасцы, сапонины (QS21, ISCOM) и олиго-CpG.
[0058] В дополнение к содержащемуся слитому белу вакцину по настоящему изобретению можно смешивать с антигеном для профилактики инфекций кур. Примеры таких инфекций включают болезнь Ньюкасла, инфекционный бронхит кур, инфекционный ринит, инфекционную бурсальную болезнь кур, реофирусную инфекцию, микоплазмозная инфекция и сальмонеллезную инфекцию.
[0059] Вакцина по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, включая трансдермальное введение, сублингвальное введение, глазное введение, интрадермальное введение, внутримышечное введение, пероральное введение, энтеральное введение, трансназальное введение, внутривенное введение, подкожное введение, интраперитонеальное введение и посредством ингаляции изо рта в легкие.
[0060] В отношении связи между титром антител и защитой в общепринятых вакцинах против EDS полагают, что защита возможна, когда титр ингибирующих гемагглютинацию антител (титр HI антител) является по меньшей мере 16-кратным. Однако подтверждено, что вакцина по настоящему изобретению при введении курам может значимо больше увеличивать титр HI антител по сравнению с этим значением и эффективно предотвращать возникновение EDS.
[0061] Настоящее изобретение относится к набору, содержащему слитый белок и/или мультимер этого слитого белка и предназначенному для определения уровня антител к области головки EDSV в тестируемом образце. Набор, содержащий слитый белок по настоящему изобретению может представлять собой планшет с иммобилизованным на нем слитым белком. Тестируемый образец наносят на планшет, и слитый белок на планшете реагирует с антителами, содержащимися в тестируемом образце. Добавляют вторичные антитела, меченные ферментом или флуоресцентным веществом, и они реагируют с первичными антителами. При необходимости можно добавлять субстрат фермента и можно детектировать продукт ферментативной реакции или количество флуоресценции с определением количества антител содержащихся в тестируемом образце. Набор по настоящему изобретению можно использовать для оценки эффективности вакцины при иммунизации кур, где вакцина в качестве активных ингредиентов содержит слитый белок и/или мультимер этого слитого белка, и для детекции наличия или отсутствия антител, индуцируемых вакциной.
[0062] Настоящее изобретение относится к ДНК-вакцине против EDS, содержащей в качестве активного ингредиента фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор, как указано выше. В ДНК-вакцине по настоящему изобретению фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор предпочтительно содержат промоторную последовательность для экспрессии слитого белка после иммунизации кур.
[0063] После тестового инфицирования кур, проводимого у птиц с использованием EDSV, до и после инокуляции ДНК-вакцины по настоящему изобретению, фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор, которые значимо снижали симптомы, ассоциированные с EDS, можно подвергать скринингу на активный ингредиент терапевтическое средство против EDS, и на основе дозы можно точно определять количество активного ингредиента.
[0064] ДНК-вакцина по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры таких носителей включают насыщенный солевой раствор, забуференный насыщенный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, изотонический водный буфер и их комбинации. Их можно соответствующим образом смешивать с добавками, например, такими как адъюванты, эмульгаторы, консерванты, средства придания тоничности и регуляторы pH.
[0065] ДНК-вакцину по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, включая трансдермальное введение, сублингвальное введение, глазное введение, интрадермальное введение, внутримышечное введение, пероральное введение, энтеральное введение, трансназальное введение, внутривенное введение, подкожное введение, интраперитонеальное введение и посредством ингаляции изо рта в легкие.
[0066] Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается со слитым белком и/или мультимером этого слитого белка. Продукция антител, включая моноклональные антитела и поликлональные антитела или их аналогов у человека, становится возможной, когда слитый белок по настоящему изобретению и/или мультимер этого слитого белка используют в качестве антигенов в соответствии со стандартным способом иммунизации (Current Protocols in Molecular Biology, Antibody Engineering: A Practical Approach, Edited by J. McCafferty et al., or Antibody Engineering, Second Edition, Edited by Carl A.K. Borrebaeck). Антитела, связывающиеся со слитым белком и/или с его мультимером, также можно получать способом продукции антител на основе способа фагового дисплея (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Edited by Brian K. Kay et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, Edited by J. McCafferty et al., or Antibody Engineering, Second Edition, Edited by Carl A. K. Borrebaeck). Антитело по настоящему изобретению потенциально можно применять в качестве терапевтического средства против EDS, набора или носителя для аффинной хроматографии, как описано ниже.
[0067] Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству против EDS, содержащему в качестве активного ингредиента антитело. Терапевтическое средство против EDS по настоящему изобретению, содержащее в качестве активного ингредиента антитело, может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры таких носителей включают насыщенный солевой раствор, забуференный насыщенный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, изотонический водный буфер и их комбинации. Их можно соответствующим образом смешивать с добавками, например, такими как адъюванты, эмульгаторы, консерванты, средства придания тоничности и регуляторы pH.
[0068] Терапевтическое средство против EDS по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, включая трансдермальное введение, сублингвальное введение, глазное введение, интрадермальное введение, внутримышечное введение, пероральное введение, энтеральное введение, трансназальное введение, внутривенное введение, подкожное введение, интраперитонеальное введение и посредством ингаляции изо рта в легкие.
[0069] Настоящее изобретение относится к набору, содержащему антитело, которое связывается со слитым белком и/или с мультимером этого слитого белка и предназначенному для определения содержания области головки EDSV в тестируемом образце. Набор включает набор, в котором антитело, которое связывается со слитым белком иммобилизовано, например, на планшете. Набор, содержащий антитело по настоящему изобретению, можно использовать для оценки наличия или отсутствия инфекции EDSV с использованием содержания головки в качестве показателя. Например, тестируемый образец вносят в планшет, содержащий иммобилизованное на нем антитело, и добавляют антитела, меченные ферментом или флуоресцентным красителем. После инкубации, планшет отмывают и добавляют хромогенный субстрат, как необходимо. Затем определяют количество флуоресценции с оценкой содержания головки в тестируемом образце.
[0070] Примеры планшета включают иммунопланшет Nunc MaxiSorp (Thermo Scientific), планшет для ELISA (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), ELISPOT (MERCK), иммунопланшет (Cosmo Bio Co., Ltd.), планшет для ELISA (IWAKI) и планшет для ELISA (ExtraGene). Антитело можно связывать с планшетом любыми способами, как правило практикуемыми специалистами в данной области.
Примеры способов, используемых для мечения антитела ферментом или флуоресцентным красителем, включают наборы для конъюгации антител EasyLink (Abcam), систему быстрой конъюгации Lightning-Link (Innova Biosciences Ltd), набор для мечения антител Oyster (Luminartis GmbH), набор для ферментного мечения EZ-Link (PIERCE Biotechnology), набор для мечения белков Platinum Link Protein Labeling Kit (Kreatech Biotechnology BV) и набор для мечения антител DyLight (PIERCE Biotechnology).
[0071] Настоящее изобретение относится к носителю для аффинной хроматографии, в котором с этим носителем связано антитело к слитому белку и/или мультимеру этого слитого белка. Слитый белок по настоящему изобретению и/или мультимер этого слитого белка экспрессируют в хозяине и вне хозяина. При экспрессии в хозяине слитый белок и/или мультимер этого слитого белка собирают посредством разрушения хозяина. При экспрессии вне хозяина слитый белок и/или мультимер этого слитого белка собирают из окружающей культуру среды. Носитель по настоящему изобретению можно потенциально использовать, например, для получения слитого белка и/или мультимера этого слитого белка из таких смешанных фракций.
[0072] Примеры носителя включают активированный NHS HP HiTrap (GE Healthcare), активированную NHS сефарозу 4 Fast Flow (GE Healthcare), активированную CNBr сефарозу 4B (GE Healthcare), активированную CNBr сефарозу 4 Fast Flow (GE Healthcare), сефарозу 4B EAH (GE Healthcare), сефарозу 4B ECH (GE Healthcare), эпоксидную смолу Profinity (BIORAD), гидразидный гель Affi-Gel Hz (BIORAD). Антитело можно связывать любыми способами, как правило практикуемыми специалистами в данной области.
Примеры
[0073] Приведенные ниже разделы описывают настоящее изобретение более подробно, со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение никаким способом не ограничено приводимым ниже описанием.
[0074] Пример 1
Получение белка головки-GCN4 и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора головка-GCN4
Из штамма EDSV KE-80 экстрагировали геномную ДНК как указано далее. После инокуляции вируса в полость аллантоиса оплодотворенного яйца утки со сроком 9 суток, аллантоисную жидкость, собранную на сутки 6 после инокуляции, добавляли в раствор проназы, в который добавляли протеиназу K (1 мг/мл). Затем смесь перемешивали при 50°C в течение 1 часа, а затем перемешивали в течение ночи при 37°C. Затем после удаления белка посредством фенола/хлороформа, осаждения этанолом и обработкой РНКазой A (Qiagen) экстрагировали геномную ДНК вируса.
Nco
Xho
Nco
Xho
Escherichia coli
Используя экстрагированную геномную ДНК вируса в качестве матрицы, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 6), кодирующий область головки фибриллярного белка, и часть из 8 повторов области стебля (SEQ ID NO: 5), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 3) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 4). Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмиду pET-15b (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами I и I и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α  и образующую плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 1.
4
2
4
2
Escherichia coli
Nco
Xho
Nco
Xho
Escherichia coli
Для экспрессии полипептида с линкерной последовательностью (GS), добавляемой к трехвалентной формирующей суперспираль единице (далее в настоящем документе "GCN4") модифицированного белка GCN4 (NCBI#: 1CZQ_A) (далее в настоящем документе полипептида, обозначаемого как "(GS)-GCN4)"; SEQ ID NO: 7) в , кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 8), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания I на 5'-конце и последовательность распознавания I на 3'-конце для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pET-21d (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами I и I, и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 2.
Nco
Nco
Nco
Escherichia coli
Escherichia coli
E. coli
4
2
6
Используя промежуточный вектор 1 в качестве матрицы, посредством ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 12), кодирующий головку (SEQ ID NO: 11), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 9) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 10). Амплифицированный фрагмент ДНК и промежуточный вектор 2 расщепляли рестрикционным ферментом I и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB2. pKNOB2 содержит последовательность ДНК (SEQ ID NO: 14), кодирующую полипептид (далее в настоящем документе "головка-GCN4"; SEQ ID NO: 13; фиг. 1), состоящий из головки, линкерной последовательности (GS) и GCN4 и последовательности-метки Hisx6 (H). pKNOB2 вносили в  BL21 (DE3) (Merck) с получением штамма  KNOB2, экспрессирующего головку-GCN4.
Escherichia coli
[0075] (2) Культивирование рекомбинантной  и очистка экспрессируемого белка
E. coli
590
590
В 200 мл колбу Эрленмейера добавляли 10 мл среды LB и раствора ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл), и инокулировали экспрессирующий головку-GCN4 штамм  KNOB2, и культивировали с перемешиванием при 37°C в течение приблизительно 14 часов (предварительная культура). В 2 л колбу Эрленмейера добавляли 250 мл среды LB и раствора ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл), и инокулировали 5 мл раствора предварительной культуры бактерий, и культивировали с перемешиванием при 37°C до превышения OD 0,6. После превышения OD основной культуры 0,6, добавляли изопропил-β-D-галактопиранозид (IPTG) с получением конечной концентрации 1 мМ, и клетки культивировали с перемешиванием при 37°C в течение 4 часов. Раствор основной культуры переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 8000 об./мин. при 4°C в течение 30 минут. Затем собирали полученный бактериальный осадок.
В 50 мл готовой смеси BugBuster (Novagen) добавляли две таблетки полной смеси ингибиторов протеаз (Roche) с получением разрушающего клетки раствора. Бактериальный осадок суспендировали в разрушающем клетки растворе, инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут и разрушали посредством ультразвука (на льду, выход 4, мощность 70%, 10 минут × 3 раза). Раствор разрушенных клеток центрифугировали (15000 об./мин., 4°C, 30 минут) и собирали супернатант (растворимую фракцию).
Рекомбинантный антигенный белок, содержащийся в растворимой фракции, очищали с использованием 5 мл колонки HisTrap HP, (GE Healthcare) по протоколу производителя, прилагаемому к колонке. После добавления к раствору 20 мМ (конечная концентрация) имидазола растворимую фракцию вносили в колонку и колонку после отмывки колонки буфером, содержащим 20 мМ (конечная концентрация) имидазола элюировали буфером, содержащим 500 мМ (конечная концентрация) имидазола. Полученную элюированную фракцию концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 10K (Millipore) и компонент буфера замещали PBS посредством диализа с получением антигенов головка-GCN4.
[0076] Пример 2
Получение белка GCN4-головка и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора GCN4-головка
4
1
4
1
Nco
Xho
Nco
Xho
Escherichia coli
Используя промежуточный вектор 2 в качестве матрицы, посредством ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 18), кодирующий полипептид, содержащий GCN4 и добавленную к нему линкерную последовательность (GS) (далее в настоящем документе полипептид обозначен как "GCN4-(GS)"; SEQ ID NO: 17), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 15) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 16). Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмиду pET-21d (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами I и I и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 3.
Xho
Xho
Xho
Escherichia coli
Escherichia coli
E. coli
4
1
Используя промежуточный вектор 1 в качестве матрицы, посредством ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 12), кодирующий головку (SEQ ID NO: 11), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 19) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания I (SEQ ID NO: 20). Амплифицированный фрагмент ДНК и промежуточный вектор 3 расщепляли рестрикционным ферментом I и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB3. pKNOB3 содержит последовательность ДНК (SEQ ID NO: 22), кодирующую полипептид, состоящий из GCN4, линкерной последовательности (GS), головки и последовательности-метки гистидинового гексамера (полипептид, обозначаемый как "GCN4-головка"; SEQ ID NO: 21; фиг. 1). pKNOB3 вносили в BL21  (DE3) (Merck) с получением экспрессирующего GCN4-головку штамм  KNOB3.
Escherichia coli
(2) Рекомбинантную  культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1 с получением антигена GCN4-головка.
[0077] Пример 3
Получение белка головки-CMP и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора головки-CMP
4
2
6
4
2
Escherichia coli
Nde
BamH
EcoR
Escherichia coli
Для экспрессии полипептида, содержащего головку, линкерную последовательность (GS)H(GS) и трехвалентную формирующую суперспираль единицу белка CMP (NCBI#: NP_001025546) (далее в настоящем документе полипептида, обозначаемого как "головка-CMP"; SEQ ID NO: 23; фиг. 1), в  кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 24), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания I на 5'-конце, последовательность распознавания I на 3'-конце и 5'- и 3'-защитные основания для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pUC57 (GenScript Inc.) расщепляли рестрикционным ферментом V лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 4.
Nde
BamH
Nde
BamH
Escherichia coli
Escherichia coli
E. coli
Промежуточный вектор 4 расщепляли рестрикционными ферментами I и I с получением фрагмента ДНК, кодирующего головку-CMP. Фрагмент ДНК и плазмиду pET-11a (Merck), расщепленные рестрикционными ферментами I и I, лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB4. Затем pKNOB4 вносили в BL21 (DE3)  (Merck) с получением экспрессирующего головку-CMP штамма  KNOB4.
Escherichia coli
(2) Рекомбинантную  культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1 с получением антигенов головки-CMP.
[0078] Пример 4
Получение белка MP-головки и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора CMP-Knob9
4
2
6
4
1
3
1
Escherichia coli
Nde
BamH
EcoR
Escherichia coli
Для экспрессии полипептида, состоящего из CMP, линкерной последовательности (GS)H(GS)(GS) и головки (далее в настоящем документе, полипептида, обозначаемого как "CMP-головка "; SEQ ID NO: 25; фиг. 1) в , кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 26), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания I на 5'-конце, последовательность распознавания I на 3'-конце и 5'- и 3'-защитные основания для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pUC57 (GenScript Inc.), расщепленные рестрикционным ферментом V, лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 5.
Nde
BamH
Nde
BamH
Escherichia coli
Escherichia coli
E. coli
Промежуточный вектор 5 расщепляли рестрикционными ферментами I и I с получением фрагмента ДНК, кодирующего CMP-головку. Фрагмент ДНК и плазмиду pET-11a(Merck), расщепленные рестрикционными ферментами I и I, лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB5. Затем pKNOB5 вносили в BL21 (DE3)  (Merck) с получением экспрессирующего CMP-головку штамма  KNOB5.
Escherichia coli
(2) Рекомбинантную  культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1, с получением антигенов CMP-головки.
[0079] Сравнительный пример 1
Получение белка головки и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора головки
Escherichia coli
Nde
BamH
BamH
Nde
BamH
Escherichia coli
Escherichia coli
E. coli
Для экспрессии полипептида (SEQ ID NO: 1; фиг. 1), содержащего последовательность-метку гистидинового гексамера, добавленного к области головки фибриллярного белка EDSV, в , кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 2), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания I на 5'-конце и последовательность распознавания I I на 3'-конце для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pET-11a (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами I и I и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α  и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB1. Затем pKNOB1 вносили в BL21 (DE3)  (Merck) с получением экспрессирующего головку штамма  KNOB1.
Escherichia coli
(2) Рекомбинантную  культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1 с получением антигенов головки.
[0080] Пример тестирования 1
Пять рекомбинантных антигенных белков (головка, GCN4-головка, головка-GCN4, CMP-головка и головка-CMP), очищенных в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, количественно определяли с использованием набора анализа белков BCA (Pierce). Результаты предоставлены в таблице 1.
[0081] [Таблица 1]
Антигенный белок
Количество, собранное на литр культуры <i>E. coli</i>
Головка
77 мг
Головка-GCN4
21 мг
GCN4-головка
37 мг
Головка-CMP
15 мг
CMP-головка
44 мг
[0082] Пример тестирования 2
Анализ свойств рекомбинантных белков
Пять рекомбинантных антигенных белков (головка, GCN4-головка, головка-GCN4, CMP-головка и головка-CMP), очищенных в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, анализировали посредством SDS-PAGE. Каждый из рекомбинантных антигенных белков смешивали с буфером для образца, не содержащем восстановителя, и образцы белков подвергали тепловой денатурации при 100°C в течение 5 мин, и образцы белков без тепловой денатурации вносили в трис-глициновый гель с равномерной концентрацией 12,5% (Atto, E-R12,5 л) по 2 мкг/полосу, и подвергали электрофорезу при 10 мА в течение 130 мин. Проводили окрашивание CBB с Ez Stain Aqua (Atto, AE-1340). Для вестерн-блоттинга образцы белков переносили на PVDF мембрану обычным способом. Реакцию с первичным антителом проводили с разведением антисыворотки курицы к белку головки 1:100. Реакцию со вторичным антителом проводили с разведением конъюгата антитела к IgG курицы с HRP (антитело к тяжелым и легким цепям IgG курицы (IgY), Bethyl Laboratories) 1:4000. После реакции со вторичным антителом проводили реакцию хемилюминесценции с использованием Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer Life и Analytical Science) и получаемое люминесцентное изображение регистрировали с использованием Image Quant LAS4000 mini (GE Healthcare). Подтверждено, что все пять рекомбинантных антигенных белков формировали молекулы, которые, полагают, представляют собой тримеры (фиг. 2).
Анализ посредством гель-фильтрации проводили с использованием колонки HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare), присоединенной к AKTA Prime Plus (GE Healthcare). Скорость потока устанавливали на 0,8 мл/мин и использовали PBS буфер. В качестве маркеров молекулярных масс использовали наборы для калибровки гель-фильтрации LMW и HMW (GE Healthcare). Анализ подтвердил, что все пять рекомбинантных антигенных белков формировали молекулы, которые, полагают, представляют собой тримеры (фиг. 3).
[0083] Пример тестирования 3
Оценка иммуногенности рекомбинантных антигенов (тест подавления гемагглютинации (тест HI))
6,7
50
Пять рекомбинантных антигенных белков (головка, GCN4-головка, головка-GCN4, CMP-головка и головка-CMP), очищенных в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, использовали для иммунизации кур и измеряли индуцированные HI антитела. Вакцины получали, смешивая рекомбинантные антигенные белки с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) в количестве 10 мкг/0,5 мл относительно головки. В качестве контрольной вакцины использовали коммерчески доступный антиген EDSV из вакцины против EDS (EB66), поставляемый Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute. Для получения вакцины EDSV, культивируемый в клетках EB66, смешивали с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) при 10 TCID/0,5 мл или более. Вакцины вводили курам SPF, в возрасте 29 суток посредством внутримышечной инъекции 0,5 мл вакцины в бедренную мышцу птиц. Через 7 недель после иммунизации, у кур собирали кровь и собранную сыворотку подвергали тесту HI. В тесте HI тестируемую сыворотку смешивали с 25% каолином, используемым в объеме в 3 раза большем, чем сыворотка (= разведение 4×) и смесь обрабатывали в течение 20 мин при комнатной температуре с перемешиванием каждые 5 мин. Образец, получаемый после центрифугирования, проводимого при 2000 об./мин. в течение 5 мин, использовали в качестве образца для измерения. Образец для измерения серийно разводили два раза PBS(-) и к 0,025 мл разведенного образца добавляли 0,025 мл HA антигенов, получаемых в концентрации 4 единицы/0,025 мл. Образец сенсибилизировали при комнатной температуре в течение периода от 10 до 20 мин. Затем добавляли 0,05 мл 0,5% эритроцитов курицы, суспендированных в PBS, и смесь выдерживали для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем определяли титр HI антител на основании изображения гемагглютинации. Тест подтвердил, что при использовании рекомбинантных антигенных белков с формирующей мультимеры единицей, в частности таких 3 типов рекомбинантных антигенных белков, как GCN4-головка, CMP-головка и головка-CMP, титр индуцируемых HI антител был выше (фиг. 4).
[0084] Пример тестирования 4
Тест для подтверждения эффективного уровня антигенов
Рекомбинантные антигенные белки (головка-GCN4 и CMP-головка), очищенные в примерах 1 и 4, тестировали для подтверждения эффективных уровней антигенов у кур. Вакцины получали, смешивая рекомбинантные антигенные белки (головка-GCN4 и CMP-головка) с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) в количествах 10 мкг/0,5 мл, 3 мкг/0,5 мл, 1 мкг/0,5 мл и 0,3 мкг/0,5 мл относительно головки и вводили курам SPF, в возрасте 29 суток посредством внутримышечной инъекции 0,5 мл вакцин в бедренную мышцу птиц. Через 7 недель после иммунизации у кур собирали кровь и собранную сыворотку подвергали тесту HI. В тесте HI тестируемую сыворотку смешивали с 25% каолином, используемым в объеме в 3 раза большем, чем сыворотка (= разведение 4×) и смесь обрабатывали в течение 20 мин при комнатной температуре с перемешиванием каждые 5 мин. Образец, получаемый после центрифугирования, проводимого при 2000 об./мин. в течение 5 мин, использовали в качестве образца для измерения. Образец для измерения серийно разводили два раза PBS(-) и к 0,025 мл разведенного образца добавляли 0,025 мл HA антигенов, получаемых в концентрации 4 единицы/0,025 мл. Образец сенсибилизировали при комнатной температуре в течение периода от 10 до 20 мин. Затем добавляли 0,05 мл 0,5% эритроцитов курицы, суспендированных в PBS, и смесь выдерживали для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем определяли титр HI антител на основании изображения гемагглютинации. Тест подтвердил, что рекомбинантные антигенные белки головка-GCN4 и CMP-головка демонстрируют желаемое индуцирующее HI антитело действие при использовании в концентрациях 1 мкг/0,5 мл или более и 0,3 мкг/0,5 мл или более, соответственно (фиг. 5 и 6).
[0085] Пример тестирования 5
Тест для подтверждения защитного действия против летальной инфекции EDSV
6,7
6,5
50
50
Рекомбинантный антигенный белок (CMP-головка), очищенный в примере 4, тестировали для подтверждения его действия для защиты против начала летальной инфекции EDSV у кур, иммунизированных белком. Вакцину получали, смешивая рекомбинантный антигенный белок (CMP-головка) с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) в количестве 10 мкг/0,5 мл относительно головки. В качестве контрольной вакцины использовали коммерчески доступный антиген EDSV из вакцины против EDS (EB66), поставляемый Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute. Для получения вакцины EDSV, культивируемый в клетках EB66, смешивали с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) при 10 TCID/0,5 мл или более. Вакцины вводили коммерчески доступным курам (яйценоские птицы) в возрасте приблизительно 210 суток посредством внутримышечной инъекции 0,5 мл вакцины в бедро птиц. Кровь собирали через 4, 6, 9, 12 и 16 недель после иммунизации, и собранную сыворотку подвергали тесту HI. В тесте HI тестируемую сыворотку смешивали с 25% каолином, используемым в объеме в 3 раза большем, чем сыворотка (= разведение 4×) и смесь обрабатывали в течение 20 мин при комнатной температуре с перемешиванием каждые 5 мин. Образец, получаемый после центрифугирования, проводимого при 2000 об./мин. в течение 5 мин, использовали в качестве образца для измерения. Образец для измерения серийно разводили два раза PBS(-) и к 0,025 мл разведенного образца добавляли 0,025 мл HA антигенов, получаемых в концентрации 4 единицы/0,025 мл. Образец сенсибилизировали при комнатной температуре в течение периода от 10 до 20 мин. Затем добавляли 0,05 мл 0,5% эритроцитов курицы, суспендированных в PBS, и смесь выдерживали для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем определяли титр HI антител на основании изображения гемагглютинации. Через 16 недель после иммунизации кур инфицировали посредством перорального введения летального штамма EDSV KE-80 при 10 TCID/птицу. В течение 4 недель после инфицирования у кур контролировали яйценоскость. Тест подтвердил, что при использовании в концентрации 10 мкг/0,5 мл рекомбинантный антигенный белок (CMP-головка) через 16 недель после иммунизации поддерживал высокий титр подавляющих HI антител (фиг. 7). Также подтверждено, что у кур, иммунизированных рекомбинантным антигенным белком (CMP-головка), через 16 недель после иммунизации можно сильно снижать клинические симптомы, такие как потеря яйценоскости и продукция аномальных яиц, даже когда курам инъецировали летальный EDSV (фиг. 8).
Промышленная применимость
[0086] Вакцина по настоящему изобретению, которая в качестве активного ингредиента содержит рекомбинантный белок и/или его мультимер, содержащий область головки EDSV, слитую с полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу, после инокуляции курам может индуцировать высокий титр HI антител и может предотвращать возникновение EDS кур. Изобретение обеспечивает профилактику возникновение EDS на фермах с потенциальным риском EDS. Вакцину по настоящему изобретению можно получать без использования яиц домашних уток и можно стабильно поставлять.