СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СТАТУСА СПЕРМАТОЗОИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ IN VITRO ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛАЗЕРА НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ
METHOD OF INCREASING FUNCTIONAL-METABOLIC STATUS OF SPERM CELLS OBTAINED FROM SEMEN OF HEALTHY INDIVIDUAL IN VITRO UNDER EFFECT OF LOW-INTENSITY LASER

Способ повышения функционально-метаболического статуса сперматозоидов, полученных из семенной жидкости здорового человека в условиях in vitro, под действием лазера низкой интенсивности с переменной генерацией импульса, относится к медицине, в частности к урологии, андрологии, репродуктивной медицине, может быть использован для усиления функционально-метаболического статуса сперматозоидов перед проведением процедурой экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с целью повышения эффективности искусственной внутриматочной инсеминации.
Согласно данным медико-социологического мониторинга частота тех бесплодных пар, где лимитирующим является мужской фактор бесплодия в настоящее время колеблется от 9% до 16%, не имея тенденции к снижению на территории Российской Федерации [Пушкарь Д.Ю. и др. Эпидемиологическое исследование распространенности эректильной дисфункции в Российской Федерации // Урология. - 2012. - Т.6. - С.5-9]. Отдельной категорией следует выделить нарушения фертильности, связанные с нарушением/снижением подвижности сперматозоидов. Если между количеством/морфологией сперматозоидов и фертильностью не всегда существует строгая корреляция, то неподвижные сперматозоиды абсолютно неспособны к зачатию, поскольку вовремя (пик овуляции у женщины) не способны достигнуть до места встречи с яйцеклеткой. Коррекция и устранение данного фактора мужского бесплодия следует рассматривать как способ увеличения репродуктивного потенциала. В настоящее время регистрируется увеличение случаев мужского факторов бесплодия, связанного с нарушением кинетических возможностей сперматозоидов [Кучков И.Н. и соавт, 2005]. Высокотехнологичные методы и вспомогательные репродуктивные технологии, существующие на сегодняшний день, помогают лишь частично (в 15-22%) решить проблему преодоления мужского фактора бесплодия при астенозооспермии [Авраменко Н.В. Вспомогательные репродуктивные технологии//Запорожский медицинский журнал. - 2014. -№3(84)]. На сегодня отсутствует научно-ооснованный алгоритм, раскрывающий факторы патогенеза, в том числе иммунопатогенеза мужского бесплодия,и, как следствие, нет четко разработанных технологий, позволяющих достигать высокой терапевтической эффективности в лечении мужского бесплодия, связанного с нарушением функционально-метаболического статуса сперматозоидов. Поэтому перспективные направления восстановления и стимуляции двигательной активности сперматозоидов in vitro будут способствовать разработке новых схем вспомогательных репродуктивных технологий в репродуктологии.
Известен способ подготовки спермы для внутриматочной инсеминации [В.И. Грищенко, И.В. Черкашина, И.Н. Кучков, А.А. Гапон и др., 2001], заключающийся в отборе спермы с учетом требований преаналитического этапа лабораторной диагностики с добавлением к ней физиологического раствора и двукратного 10 минутного центрифугирования при 1500 оборотах в минуту с последующим добавлением в полученную массу сперматозоидов перфторана в соотношении 1:3, 3-5 минутной экспозицией с последующим введением полученной смеси в полость матки [Патент №380303А, Украина, МПК 7 A01N 1/02: «Cnociб гiпотермiчного збереження фрагментiв тканини печiнки» / Грищенко В.И., Мiкулiнський Ю.Ю., Гончарук O.I, Грубман C.O., Черкашина I.B. Iнститут проблем  i крiомедицини НАН . Заявл. 21.06.00 №2000063592. Публ. 15.05.01. Бюл. №4; Патент №68172А, Украина, МПК A61D 19/02, A01N 1/02: «Cпociб отримання сперми собак» / Грищенко B.I., , , Кучков I.M., Черкашина I.B. Iнститут Проблем  i Крiомедицини НАН . 15.07.2004. Бюл. №7. Способ обеспечивает увеличение подвижности и дыхательной способности сперматозоидов в сперме мужчин, страдающих азооспермией, и, как следствие, влияет на повышение вероятности наступления беременности после внутриматочной инсеминации обработанной перфтораном спермы. Недостатком использования способа при астенозооспермии является отсутствие данных лабораторной диагностики о влиянии перфорана на процессы ликвидации кинетических и локомоторных дисфункций сперматозоидов, введения в сперму дорогостоящего препарата Перфторан. Способ ограничен в применении хранением спермы и не позволяет применять его при астенозооспермии, поскольку перфторан не влияет на подвижность сперматозоидов.
Также известен способ повышения оплодотворяющей способности спермы [Заявка на изобретение №2000119029, МПК A61D 19/02; Деряженцев В.И., Бортникова A.M., Шлыгин А.Н., Шейко Е.И., заключающийся введением в среду синтетического аналога простагландина F2α-натриевой соли клопростенола в концентрации 200 мкг на 100 мл разбавленной спермы быков. Недостатком заявленного способа является то, что синтетический аналог простагландина F2α-натриевой соли - клопростенол имеет выраженную способность проникать через неповрежденную кожу, в связи с чем, лаборантам и исследователям следует соблюдать особую осторожность в работе с препаратом, поскольку простагландины F2-α способны вызывать бронхиоспазм у людей. Способ ограничен в применении и не позволяет его использование при астенозооспермии, поскольку мутагенные и тератогенные эффекты синтетического аналога простагландина F2α-натриевой соли - клопростенола окончательно не изучены.
Известен способ улучшения качества семенной жидкости при патоспермии путем воздействия лазерного излучения in vivo [Патент RU №2205047, М. кл. A61N 5/067; Гаврилов Ю.А., Кузьмичев Л.Н., Леонов Б.В., Левчук Т.Н., БИПМ №2205047, МПК A61N 5/067, БИМП №15, 27.05.03, с. 353], заключающийся в том, что больному бесплодием проводят в течение двух недель: 7-10 процедур лазерной стимуляции в импульсном режиме предстательной железы, лазерную стимуляцию проводят путем установления датчиков одновременно на промежность и надлобковую область с частотой 0,6 кГц, мощностью 3,5 Вт, длительностью 8-10 минут и яичек с частотой 0,3 кГц, мощностью 1,5 Вт, длительностью 7-9 минут, 5-7 процедур стимулирующего массажа простаты. Одновременно с процедурой лазерной стимуляции назначают аминокислотный хелат цинка по 22 мг и селен по 200 мкг 2 раза в сутки, пурегон по 50 ME внутримышечно ежедневно в течение месяца. Недостатком способа является то, что лазеротерапия, при применении in vivo имеет противопоказания при острых воспалительных процессах, новообразованиях предстательной железы (доброкачественных и злокачественных), туберкулезе, аутовоспалительной патологии [Божедомов А.А., Сухих А.Т. Этиопатогенез аутоиммунных реакций против сперматозоидов // Андрология и генитальная хирургия. - 2014. - №.4. - С. 45-53]. Назначение пурегона противопоказано при нарушениях функции печени и/или почек. Противопоказаниями хелата цинка являются: острый гломерулонефрит, обострение язвенной болезни, брадикардия. Вышеперечисленные обстоятельства являются препятствием по применению данного способа у значительного числа пациентов, страдающих различными видами патологий.
Известен способ подготовки спермы к внутриматочной инсеминации, включающий забор спермы, подготовку к оплодотворению по методике «swim up» [Кулаков В.И., Сухих Г.Т., Назаренко Т.А. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению: руководство для врачей. - ГЭОТАР-Медиа, 2010], заключающейся в последовательном отмывании сперматозоидов от семенной плазмы (семенная плазма содержит вещества, подавляющие активность сперматозоидов) в физиологическом растворе путем двукратного центрифугирования по 10 минут при 1500 оборотах в минуту. Проводят искусственную инсеминацию спермой мужа, которую вводят во влагалище женщины без полового акта. В результате весь объем спермы попадает в область зева шейки матки, а не его незначительная часть, как это происходит при половом акте, что является несомненным достоинством предложенного метода. Суть метода заключается в том, что в день овуляции обработанная физиологическим раствором отцентрифугированная и сконцентрированная сперма мужа в питательной среде через шейку матки вводится в полость матки. Процедура внутриматочной инсеминации безболезненна, так как сперма вводится с помощью специального катетера с очень маленьким диаметром, который беспрепятственно проходит через канал шейки матки. Продолжительность внутриматочной инсеминации занимает около 2 минут. После выполнения процедуры женщина находится в горизонтальном положении в течение 20-30 минут. Недостатком способа является его малоэффективность (10-15%), а также требования к качественному составу спермы: количество подвижных сперматозоидов должно составлять более 10 млн. на инсеминацию, поэтому данный способ совершенно неэффективен, если у мужчины есть двигательные дисфункции сперматозоидов.
Известен способ повышения подвижности и жизнеспособности сперматозоидов и устройство для его осуществления [Патент RU №2012150445, МПК A61B 17/425], заключающийся в том, что до полового акта во влагалище женщины вводят газовую смесь в соотношении углекислый газ 6%, азот 94% под давлением выше атмосферного. После введения газовой смеси таз женщины удерживают в приподнятом состоянии выше уровня тела, влагалище фиксируют воздухонепроницаемой прокладкой. Использование метода представляется проблематичным, в связи с необходимостью проведения манипуляций по удержанию газовой смеси, во влагалище, созданию, даже на короткий период времени во влагалище анаэробной среды, способствующей развитию анаэробных микроорганизмов, что нарушает естественную резистентность влагалища, наличие противопоказаний у женщины для введения газовых смесей в нижние отделы репродуктивного тракта и самое главное - полная неэффективность метода при астенозооспермии у мужчин.
Известен способ улучшения подвижности сперматозоидов [Патент RU №98104562, МПК G01N 33/48], заключающийся в воздействии на взвесь сперматозоидов раствором 2-микроглобулина, причем при возрастании активности сперматозоидов более чем в 3 раза от исходной, ее оценивают как высокую и достаточную для оплодотворения. Использование метода представляется проблематичным в связи с необходимостью приобретения дорогостоящего препарата-2-микроглобулина и возможности широкого использования данной методики в андрологических, перинатальных центрах и центрах репродукции в связи с экономической составляющей и ценой 2-микроглобулина на сегодняшний момент. Кроме того, мутагенные и тератогенные эффекты 2-микроглобулина окончательно не изучены.
Известен способ повышения двигательной активности сперматозоидов in vitro, предложенный в диссертационном исследовании Горюнова С.В. (1996) [Горюнов С.В. Влияние низкоэнергетического лазерного излучения на сперматозоиды человека (эксперементальное исследование) Автор, дисс. на соискание уч. ст. к.м.н. 1996], техническим результатом которого является повышение физиологической активности сперматозоидов, оцениваемыми по тестам утилизации фруктозы эякулята и восстановления метиленовой сини. Результаты физиологического статуса сперматозоидов, оцененные по общей фруктолизной активности, учитываются по скорости утилизации фруктозы, окислительная активность сперматозоидов оценивается тестом обесцвечивания раствора метиленовой сини. Для повышения энергопотребляющей активности сперматозоидов автор предлагает использовать красный и инфракрасный диапазон лазерного излучения (с длинами волн 632,8 и 890,0 нм) в дозе от 0.6 Дж до 1,2 Дж. Автор обосновывает выбор оптимальных параметров лазерного излучения по длине волны, мощности и экспозиции для использования лазеротерапии в комплексе процедур по лечению мужского бесплодия с целью улучшения свойств сперматозоидов путем повышения его физиологической активности. Расчет физиологической активности сперматозоидов, с точки зрения автора, является объективным для суждения о состоянии энергетических процессов и опосредованно двигательной активности, сперматозоидов.
У метода имеется ряд неоспоримых достоинств и позволяет взять его за прототип, так и спорные вопросы, которые можно рассматривать как недостатки. Во-первых, использование неотмытой физиологическим раствором спермы может не привести к желаемому повышению двигательной активности, поскольку семенная плазма содержит вещества, подавляющие активность сперматозоидов, хотя весьма возможно, что на скорость общего фруктолиза и на скорость окислительных процессов отмывка физиологическим раствором влияния не окажет. Во-вторых, для анализа результатов функционально метаболического потенциала сперматозоидов необходимо учитывать совокупность как клинико-лабораторных (подвижность и разновидности, жизнеспособность, агглютинацию сперматозоидов), так и биохимических параметров. Что не в полном объеме выполнено С.В. Горюновым. В-третьих, С.В. Горюновым не полностью указаны параметры воздействия и тип устройства, генерируемого лазерные воздействия. В частности, в выводах указан «коридор» доз, стимулирующих физиологический потенциал сперматозоидов от 0.6 Дж до 1,2 Дж. (Выводы по результатам диссертационного исследования. Практические рекомендации: вывод №4, практическая рекомендация №3, без указания на постоянное или переменное следование импульса, на частоту импульса, длительность следования импульса, т.е. на параметры, обязательные для учета лазерных действий на биологические объекты. Отсутствие ссылок на такой параметр, как непрерывный или импульсный параметр действия лазера, на наш взгляд является принципиальным моментом, поскольку при постоянном следовании импульса дозы необходимые для достижения энергетической стимуляции клетки должны быть ниже [Москвин С.В. Эффективность лазерной терапии. С.В. Москвин, М., 2014], автором не даны ссылки на измерение светового потока при проведении исследования, что ставит под сомнение вычисление погрешности производимых измерений.
2
В предлагаемом способе авторами, впервые, предлагается использовать метод повышения функционально-метаболического статуса сперматозоидов, полученных из семенной жидкости здорового человека, дважды отмытых физиологическим раствором для утилизации семенной плазмы (семенная плазма содержит вещества, подавляющие активность сперматозоидов) в условиях in vitro в условиях действия полупроводникового лазера с длиной волны 632 нм, переменной генерацией импульса, длительностью 2 нс, частотой следования импульса 100 Гц, энергетической плотности (дозой излучения) 0,56 Дж/см, временем экспозиции 1 мин. Выбранная доза 632 не отличается от 632,8 нм, предложенной СВ. Горюновым нет, если говорить о фотобиомодулирующем эффекте, а зависит от особенностей конструкции лазерного аппарата. В случае нашей заявки - это полупроводниковый лазер. В пользу выбора данного метода воздействий стали ранее проведенные исследования, выявившие усиление функциональной активности различных типов клеток, в том числе половых под воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения [Толстых П.И., Клебанов Г.И. Антиоксиданты и лазерное излучение в терапии ран и трофических язв // М.: Изд. дом «Эко». - 2002. - Т.239. - С.21. Козель А.И., Попов Г.К. Механизм действия лазерного облучения на тканевом и клеточном уровнях // Вестник РАМН. - 2000. - №.2. - С.41-43; Забирова М.Р., Францева О.В. Способ повышения функционально-метаболического статуса сперматозоидов с помощью низкоинтенсивного лазерного излучения в условиях in vitro и in vivo // Материалы 69-й межвузовской (IV Всероссийской) итоговой научной студенческой конференции М 45 с международным участием, посвященной 70-летию Победы в Великой Отечественной войне, г. Челябинск, 28 апреля 2015 г. - Челябинск: Издательство Южно-Уральского государственного медицинского университета, 2015. - 171, [1] с.2015. - С.46; Байбеков И.М., Асадов X.Д., Стрижков Н.А. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на семенные канальцы и сперматозоиды // Лазерная медицина. - 2007. - Т. 11. - №.1. - С.18-21; Мазо Е.Б., Силуянов К.А. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения в комплексном лечении мужчин с секреторным бесплодием // Фарматека. 2008. - №.9].
2
Для решения вышеуказанной задачи в эякуляте, полученном от 70 клинически здоровых мужчин - добровольцев в возрасте от 18 до 22 лет, собранном с учетом требований преаналитического этапа лабораторной диагностики путем мастурбации сперма собирается в специальные флаконы и  через 20-30 минут после разжижения начинается ее подготовка, путем отмывания от семенной плазмы, поскольку семенная плазма содержит вещества, подавляющие активность сперматозоидов. Для чего в сперму добавляли физиологический раствор, нагретый до 37°C, после чего проводили двукратное центрифугирование по 10 минут при 1500 оборотах в минуту. Неактивные сперматозоиды, семенная плазма, клеточный дебрис оседали, а активные сперматозоиды поднимались наверх. Среднее количество активных сперматозоидов в эякуляте составило 67,34±4,23 млн/мл. Для подтверждения у добровольцев отсутствия кинетических дисфункций сперматозоидов в семенной жидкости были определены следующие лабораторные показатели: изучение подвижности сперматозоидов (кинезиограмма); подсчет общего количества сперматозоидов; оценка жизнеспособности сперматозоидов, оценка дыхательного потенциала. Микроскопическое исследование эякулята было проведено в 2 этапа. На 1-м этапе была оценена концентрация, подвижность, агрегация и агглютинация сперматозоидов, а также наличие других клеточных элементов на неокрашенных нативных мазках с использованием световой микроскопии. Для оценки подвижности сперматозоидов нативный эякулят в количестве 20 мкл разводили в 400 мкл подогретого до 37°C физиологического раствора. Полученной смесью заполняли камеру Горяева и производили подсчет в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали (подсчитывали только сперматозоиды, головки которых лежали внутри квадрата). Количество сперматозоидов в 1 мл эякулята высчитывали по формуле X=(a·4000·20)·1000/80=a·1000000, где X - количество сперматозоидов в 1 мл эякулята, a - количество сперматозоидов, сосчитанных в 5 больших квадратах, 4000 - множитель, приводящий результат к объему 1 мкл, исходя из объема малого квадрата (1/4000), 20 - разведение эякулята, 80 - количество малых квадратов, 1000 - множитель, приводящий результат к объему 1 мл. Для исследования подвижности было подсчитано 100 сперматозоидов, из которых вычислены проценты активно подвижных, малоподвижных (сперматозоиды, совершающие поступательное, прямолинейное, но замедленное движение) и неподвижных сперматозоидов. Показатель плодовитости Фарриса определялся по формуле: 1=V×N×M/100, где V - это объем эякулята, мл; N - число сперматозоидов в 1 мл; М - процент подвижных сперматозоидов. Цифровой материал обрабатывался методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ «Statistica for Windows». О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали значимыми при p≤0,05. При исследовании эякулята у здоровых мужчин было установлено: нормакинезис - 60,1%, акинезис - 21,5%, гипокинезис - 18,4%, жизнеспособность сперматозоидов - 81,0%. Для оценки влияния лазерного излучения низкой интенсивности в условиях in vitro, на взвесь сперматозоидов подействовали лазерным излучением, генерируемым полупровониковым лазером с длиной волны 632 нм, модулирующий переменную генерацию импульса, длительностью 2 нс, частотой 100 Гц, дозой излучения 0,56 Дж/см. Пробы, содержащие сперматозоиды во время облучения, находились в специально оборудованных для проведения эксперимента термостатах и силиконизированных кюветах с затемненными стенками. Поле для воздействия лазера было конфигурировано таким образом, чтобы в любой точке действия потока квантов света отклонение его плотности составляло не более 10% от заданных параметров излучения, измерения произведены с использованием аппарата «Анод» (Россия). При исследовании кинезиограммы у здоровых мужчин после воздействия лазера низкой интенсивности было установлено: нормакинезис - 70,1%, акинезис - 21,5%, гипокинезис - 28.4%, жизнеспособность сперматозоидов - 93.0%, увеличение показателя Фарриса на 26%, что свидетельствует о стимулирующем влиянии лазера низкой интенсивности выбранных для исследования характеристик в отношении усиления кинетических возможностей сперматозоидов in vitro. Таким образом, лазерное воздействие низкой интенсивности с переменным следованием импульса в течение 1 минуты приводит к статистически значимому изменению функциональной активности сперматозоидов, выделенных из семенной жидкости здоровых добровольцев по сравнению с результатами до лазерного воздействия (табл. 1).
Поскольку в анализ функционально-метаболического статуса кроме, кинезиограммы, входит анализ биохимических параметров, то анализ биохимических показателей суспензии сперматозоидов включал исследование α-гликозидазы, лимонной кислоты и фруктозы до и после воздействия лазером низкой интенсивности (табл.2).
2
Результаты исследования биохимического потенциала показали, что во взвеси сперматозоидов происходит увеличение содержания лимонной кислоты на 17%, фруктозы на 12%, усиление дыхательной способности сперматозоидов по способности обесцвечивать раствор метиленовой сини на 25% по отношению к показателям биохимической активности сперматозоидов без воздействия лазера низкой интенсивности. Предлагаемый способ отличается от существующих тем, что экспериментальных условиях сперматозоиды, выделенные от здорового донора, отмытые дважды по 10 минут физиологическим раствором при 1500 оборотах в минуту подвергнутые действию полупроводникового лазера низкой интенсивности при длине волны 632 нм, в режиме переменной генерации импульса, длительностью импульса 2 нс и частотой 100 Гц, при энергетической плотности излучения излучения 0,56 Дж/см времени экспозиции 1 мин, демонстрируют повышение функционально метаболического статуса, выраженного в усилении двигательной и физиологической активности сперматозоидов, а именно в повышении двигательной активности (преобладанию нормакинезиса над гипокинезисом и акинезисом) на 35%, усиление дыхательной способности сперматозоидов по способности обесцвечивать раствор метиленовой сини на 25%, увеличение показателя Фарриса на 26%, увеличение содержания лимонной кислоты на 17%, фруктозы на 12% по отношению к показателям функционально-метаболической активности сперматозоидов здорового донора, без воздействия лазера низкой интенсивности. Ввиду дешевизны метода и простоты выполнения манипуляций указанный способ повышения функционально-метаболического статуса сперматозоидов с успехом может быть использован в большинстве лабораторий перинатальных, андрологических центров, имеющих специально оборудованные помещения и клинико-диагностические лаборатории. Заявляемый способ может найти широкое применение в гинекологической и андрологической практике, что свидетельствует о его соответствии критерию "промышленная применимость".
Литература
1. Гизингер О.А. Иммунологические аспекты физиотерапевтической иммунокоррекции в комплексной терапии воспалительных заболеваний урогенитального тракта / О.А. Гизингер, К.Г. Ишпахтина, И.И. Долгушин // Вести. ЮУрГУ. - 2010. - №6 (182). - С.85-91. - (Сер. «Образование, здравоохранение, физическая культура». Вып. 22).
2. Клебанов Г.И. Низкоинтенсивное лазерное облучение вызывает priming лейкоцитов / Г.И. Клебанов // Использование лазеров для диагностики и лечения заболеваний: сб. - М.: ЛАС, 1996. - С.11-14.
3. Козель А.И. Механизм действия лазерного излучения на тканевом и клеточном уровне / А.И. Козель, Г.К. Попов // Вестн. РАМН. - 2000. - №2. - С.41-43.
4. Кулаков В.И. Бесплодный брак. Методы вспомогательных репродуктивных технологий // Руководство для врачей под ред. В.И. Кулакова.- М., Геотар медиа 2005.- С.441-444.
5. Кучков И.Н. Функция криобанков спермы человека при современном развитии вспомогательных репродуктивных технологий/ И.Н. Кучков, В.Е. Чадаев, И.Ю. Кузьмина, И.В. Черкашина // Матерiали  конф. "Вiд фундаментальних дослiджень - до прогресу в медицинi". - Харкiв. - 2005. - С.183-184.
6. Махмутхджаев А.Ш. Метаболические особенности форменных элементов крови после облучения низкоэнергетическим гелий- неоновым лазером / А.Ш. Махмутхджаев // Вопросы медико-биологических наук: сб. ст. по материалам науч. конф. «XXXII Евсеевские чтения». - Саранск, 1999. - С.60-64.
7. Пушкарь Д.Ю. Эпидемиологическое исследование распространенности эректильной дисфункции в Российской Федерации / Д.Ю. Пушкарь, А.А. Камалов, С.Х. Аль-Шукри // Урология. 2012. №6. С.5-9.