Генетические предикторы гипергомоцистеинемии у больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей

СРОЧНО В НОМЕР

УДК 616.12 - 008.1

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ У БОЛЬНЫХ С АТЕРОСКЛЕРОЗОМ АРТЕРИЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

4

H.A. Кленкова , С.И. Капустин, Н.Б. Салтыкова, В.М. Шмелева, М.Н. Блинов, Л.П. Папаян

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии федерального агентства

по высокотехнологичной медицинской помощи, Санкт-Петербург

Изучена ассоциация между аллельным полиморфизмом генов мети-лентетрагидрофолатредуктазы (МТИРИ С677Т и А1298С), метио-нинсинтазы (М8 А27560), редуктазы метионинсинтазы (МТИИ А660), метилентетрагидрофолат-дегидрогеназы (МТИРБ 01958А) с риском развития гипергомоцистеинемии и атеросклероза артерий нижних конечностей. Выявлена связь между рядом аллельных вариантов генов МТИРИ и М8, а также их сочетаний и наличием гипергомоцистеинемии у больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей. Показано, что генотип МТИИ 66СС/МТИРБ 19580А является фактором риска развития этой патологии.

Ключевые слова: атеросклероз, гипергомоцистеинемии, полиморфизм генов

Key words: atherosclerosis, hyperhomocysteinemia, genetic polymorphisms

Сердечно-сосудистая патология, обусловленная атеросклеротическим поражением артерий, входит в число ведущих причин инвалидизации и смертности населения в развитых странах. Атеросклероз в значительной мере является ге-

1 Кленкова Наталия Александровна, мадшнй на-учн. Сотрудник. Тел.: +7(812) 717-19-37. E-mail: neklen@front .ru.

2 Папаян Людмила Петровна, руководитель лаборатории, д-р мед. наук. Тел.: +7(812) 717-35-82. E-mail: papayan@mail.ru.

риатрической проблемой, поскольку именно пожилые люди составляют большинство лиц с ате-росклеротическим поражением сосудов различный органов. Атеросклероз артерий нижних конечностей — одна из наиболее частых локализаций системного атеросклероза [1]. Многочисленные исследования свидетельствуют о многофакторном генезе заболевания и существенном значении генетической компоненты в его риске [14]. Установлено, что независимым фактором риска атеросклеротического поражения артерий является повышенное содержание в плазме кро-

ви гомоцистеина — высокореактивнои серосодержащей аминокислоты — промежуточного продукта в метаболизме метионина [13]. Согласно имеющимся данным, гипергомоцистеинемия может быть обусловлена экзогенными факторами (курение, чрезмерное употребление кофе, сниженное потребление витаминов В6, В9 (фо-латы) и В12, прием некоторых лекарственных препаратов), сопутствующими заболеваниями (сахарный диабет, гиперлипидемия, нарушения функции почек, некоторые солидные опухоли, заболевания желудочно-кишечного тракта). В ряде широкомасштабных исследований установлена также существенная роль наследственной компоненты в риск гипергомоцистеине-мии. В связи с этим поиск аллельных вариантов генов, предрасполагающих к повышенному уровню гомоцистеина в плазме крови, представляет большой интерес. Этими «генами-кандидатами» могут быть гены, продукты которых непосредственно вовлечены в метаболизм гомоцистеина и фолатов.

Метилентетрагидрофолатредуктаза катализирует реакцию восстановления 5,10-метилентет-рагидрофолата (5,10-МТНРК) до 5-метилтет-рагидрофолата — донора одноуглеродной группы в реакции реметилирования гомоцистеина в метионин. Необходимый пул 5,10-МТНРК поддерживается благодаря метилентетрагидрофо-лат-дегидрогеназе — ключевому ферменту в метаболизме фолатов. Метионинсинтаза выступает катализатором реакции переноса метильной группы от 5-метилтетрагидрофолата к гомо-цистеину, в результате синтезируются метионин и тетрагидрофолат. Наконец, редуктаза метио-нинсинтазы необходима для поддержания мети-онинсинтазы в активном состоянии. Аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в метаболизм гомоцистеина и фолатов, изучался различными авторами в связи с оценкой риска гипергомоцис-теинемии и сердечно-сосудистых заболеваний. Среди возможных генетических предикторов уровня гомоцистеина наиболее часто рассматриваются полиморфизмы С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы (МТИРБ) А27560 гена метионинсинтазы (МБ), А660 гена редуктазы метионинсинтазы (МТКК), 01958А — гена метилентетрагидрофолат-дегид-рогеназы (МТИРБ). Однако литературные данные об их влиянии на уровень гомоцистеина противоречивы. Так, в исследовании [5] уста-

новлено, что генотип МТИРК 677ТТ ассоциирован с повышением концентрации гомоцистеина, в то время как авторами работы [11] отмечена лишь тенденция (без статистической достоверности) к ассоциации между полиморфизмом С677Т и гипергомоцистеинемией. Согласно публикации [12], полиморфизм А1298С по гену МТИРК не влияет на содержание гомоцистеина в плазме, а исследования [6] свидетельствуют об обратном. Вопрос об ассоциации полиморфизма А660 гена МТИЛ с уровнем го-моцистеина в плазме крови также является дискуссионным: авторы работы [7] связывают с повышением уровня гомоцистеина генотип 66АА, другие исследователи [10] — генотип 6600, а в работе [4] ассоциации между аллельным полиморфизмом А660 и концентрацией гомоцисте-ина в плазме крови не выявлено. Аналогичная картина наблюдается и для полиморфизма МБ А27560 [8,9]. Что касается полиморфизма 01958А (Я6530) гена МТИРБ, то важно отметить, что, несмотря на большое количество исследований его роли в патогенезе злокачественных новообразований, врожденных пороков развития и др., практически отсутствуют работы, посвященные анализу влияния полиморфизма 01958А на уровень гомоцистеина в плазме крови и риск сердечно-сосудистых заболеваний.

Цель исследования: изучить связь между ал-лельным полиморфизмом генов, вовлеченных в метаболизм гомоцистеина (МБ А27560, МТКК А660) и фолатов (МТИРК С677Т и А1298С, МТИРБ 01958А), и риском гипергомоцистеи-немии и атеросклероза артерий нижних конечностей.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследовано 126 больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей (102 мужчины, 24 женщины), проходивших лечение в клиническом отделении «Хирургия» ФГУ «РосНИИГТ Росмедтехно-логии». Средний возраст пациентов 60,5 ± 1,5 лет. Клинический диагноз подтверждался данными ангиографии и/или ультразвукового дуплексного сканирования. Критерием отбора больных в исследуемую группу было отсутствие в анамнезе заболеваний с повышенным уровнем гомоцистеина в плазме (сахарный диабет, злокачественные новообразования и др.). Контрольная группа, сопоставимая по полу и возрасту с группой больных, состояла из 121 человека — доноров крови и сотрудников ФГУ

«РосНИИГТ», не имевших в анамнезе артериальной патологии и проживающих в Северо-Западном регионе России. Материал для идентификации аллель-ных вариантов MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MS A2756G, MTRR A66G, MTHFD G1958A составляли лейкоциты, выделенные из 3—5 мл венозной крови. Молекулярно-генетические исследования были выполнены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ПЦР-про-дукта. Уровень гомоцистеина определяли методом жидкостной хроматографии под высоким давлением [3]. В качестве верхней границы «нормы» ба-зального уровня гомоцистеина было принято значение 13,5 мкмоль/л [2].

Статистический анализ полученных данных выполнялся с использованием программ GraphPad Prism4 и StatGraphics Plus 5.1. Показатель «отношение шансов» («odds ratio» — (OR)) определялся при двустороннем доверительном интервале (CI), равном 95%. Статистическая значимость различий устанавливалась при значениях p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В зависимости от уровня гомоцистеина больные были разделены на 2 группы — с повышенным (>13,5 мкмоль/л) и нормальным (<13,5 мкмоль/л) его содержанием. Лица с повышенным уровнем гомоцистеина составили 31,8%, с нормальным — 68,2% общей выборки. Средняя концентрация гомоцистеина в плазме больных с его повышенным и нормальным уровнем равнялась 19,9 мкмоль/л и 9,8 мкмоль/л соответственно (p < 0,0001).

В табл. 1 представлены данные о распределении частот генотипов в группах больных с повышенной и нормальной концентрацией гомоцистеина и в контрольной. Из таблицы следует, что у пациентов с гипергомоцистеинемии частота аллеля T (генотипы CT и TT) по полиморфизму C677T выше, чем у больных без нее и в контрольной группе.

Соответственно частота нормального генотипа CC по полиморфизму C677T в группе лиц с гипергомоцистеинемией достоверно ниже и составляет 32,5 против 53,5% в группе больных без нее (p = 0,03; OR = 0,41; 95% CI: 0,19—0,9) и против 52,1% в группе контроля (p = 0,03; OR = 0,44; 95% CI: 0,2-0,93). У больных с гипергомоцистеинемией также повышена частота генотипа AA по полиморфизму А1298С-гена MTHFR (55%) по сравнению с па-

Таблица 1

Частота генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR и MTHFD в группах

Ген/ Гено- Генотип, %, n

полиморфизм тип БП БН КГ

CC 32,5

MTHFR/ C677T CT TT 55,0

AA 55,0

MTHFR/ A1298C AC CC 42,5

MS/ A2756G AA 75,0

AG GG 22,5

MTRR/ A66G AA 17,5

AG 42,5

GG 40,0

GG 32,5

MTHFD/ G1958A GA AA 50,0

Примечание. В табл. 1, 2 МТИИ — метилентетрагидрофолатре-дуктаза. МБ — метионинсинтаза. MTQR — редуктаза метионин-синтазы. МТИРБ — метилентетрагидрофолат-дегидрогеназа. п — число обследованныгх человек в группе. БП — больные с повышенным уровнем гомоцистеина. БН — больные с нормальным его уровнем. КГ — контрольная группа. * р < 0,05 (сравнение с КГ). ** р < 0,05 (сравнение с группой больных без гиперго-моцистеинемии и КГ). хр < 0,05 (сравнение с группой больныгх без гипергомоцистеинемии).

циентами без гипергомоцистеинемии (44,2%) и лицами контрольной группы (43,8%). Соответственно, частота генотипа 1298СС по данному полиморфизму у лиц с гипергомоцистеинемией ниже, чем у больных с нормальным содержанием гомоцистеина (2,5 против 17,4%; р = 0,02; ОН = 0,12; 95% С1: 0,01-0,95) и лиц контрольной группы (2,5 против 12,4%; р = 0,12; ОН = 0,18; 95% С1: 0,02-1,41). При анализе полиморфизма А27560-гена МБ установлено, что у пациентов с гипергомоцистеинемией частота генотипа 2756АА выше, чем в группе больных без нее (75 против 58,1%; р = 0,06; ОН = 2,2; 95% С1: 0,94-4,98) и в контроле (75 против 60,3%; р = 0,12; ОН = 1,97; 95% С1: 0,88-4,41). Тот факт, что распределение частоты генотипов по полиморфизму МТНРК С677Т и А1298С, а также МБ А27560 у пациентов с гипергомоцистеинемией существенно различа-

ется по сравнению с больными без нее и группой контроля, а в двух последних группах частота генотипов близка, позволяет предположить влияние вышеназванных аллельных вариантов генов МТНРИ и МБ на уровень гомоцистеина.

Частота генотипа 6600 по полиморфизму Л660 гена МТИИ в группе больных с гипер-гомоцистеинемией несколько выше, чем в группе с нормальным содержанием гомоцистеина (40 против 27,9%; р = 0,22; ОИ = 1,72; 95% С1: 0,78—3,79) и достоверно выше, чем в группе контроля (40 против 23,1%; р = 0,04; ОИ = 2,21; 95% С1: 1,03-4,73). В то же время обращает на себя внимание факт, что, в отличие от рассмотренных выше особенностей распределения частот генотипов по полиморфизму генов МТНРИ и МБ, частота генотипа 6600 гена МТИИ в группе с нормальным уровнем гомоцистеина и в контроле отличаются. Что касается полиморфизма Л19580 гена МТНРБ, то статистически значимых различий в распределении частота генотипов в группах больных с повышенным и нормальным уровнем гомоцистеина и группой контроля не выявлено.

Для изучения синергетического влияния ал-лельных вариантов различных генов проведен анализ так называемых ген-генных взаимодействий (проанализированы 10 возможных по-

парных генетических сочетаний во всех группах). В табл. 2 представлены данные о частоте генетических сочетаний со статистически значимым различием между группами.

Как и следовало ожидать, генетические сочетания, в которых каждый из полиморфных вариантов ассоциирован с повышенным уровнем гомоцистеина, также предрасполагает к гипер-гомоцистеинемии. К этим сочетаниям относятся сочетания МТНРИ 677СТ/МТНРК 1298ЛЛ; МТНРИ 677СТ/МБ 2756ЛЛ; МТНРИ 677ТТ/МБ 2756ЛЛ; МТНРИ 1298ЛЛ/МБ 2756ЛЛ. Для всех перечисленных генотипов наблюдаются статистически значимые отличия частоты в группе больных с гипергомоцистеинемией от группы с нормальным содержанием гомоцистеина и в контроле. В двух последних группах частота генотипов близка.

Для сочетаний МТНРИ 677ТТ/МТКК 6600; МТНРИ 1298ЛЛ/ МТИИ 6600; МБ 2756ЛЛ/ МТИИ 6600, как и в случае одиночного рассмотрения генотипа МТИИ 6600, характерна повышенная частота у лиц с гипергомоцистеи-немией по сравнению с больными с нормальным содержанием гомоцистеина. В свою очередь, частота этих генотипов в группе с нормальным уровнем гомоцистеина выше, чем у лиц в контрольной группе.

Таблица 2

Частота генетических сочетаний ио генам МТИРК, МБ, МТКК и МТИРБ в группах

Генотип Частота генотипа, % р/ОИ/95% С1

БП БН КГ БП и БН БП и КГ БН и КГ

МТИГИ 677СТ/ 35,0 18,6 18,2 МТИГИ 1298АЛ

МТИГИ 677СТ/ 42,5 23,3 25,6 МБ 2756АА

МТИГИ 677ТТ/ 12,5 6,9 4,1 МБ 2756АА

МТИГИ 1298АА/ 45,0 27,9 24,8 МБ 2756АА

МТИГИ 677ТТ/ 7,5 4,6 0,8 МТИИ 6600

МТИГИ 1298АА/ 20 14,0 6,6 МТИИ 6600

МБ 2756АА/ МТИИ 6600

МТИИ 6600/ МТИРБ 19580А

30 18,6 11,6 22,5 19,8 9,3

0,04/2,36/ С1: 1,01-5,49 0,03/2,43/ С1: 1,09-5,44 0,32/1,91/ С1: 0,55-6,66 0,06/2,11/ С1: 0,96-4,61 0,67/1,66/ С1: 0,35-7,81 0,43/1,54/ С1: 0,57-4,13 0,17/1,87/ С1: 0,78-4,46 0,82/1,16/ С1: 0,46-2,89

0,03/2,42/ С1: 1,09-5,37 0,04/2,14/ С1: 1,01-4,53 0,12/3,31/ С1: 0,90-12,12 0,02/2,48/ С1: 1,17-5,24 0,04/9,73/ С1: 1,01-9,64 0,02/3,53/ С1: 1,22-10,15 0,01/3,27/ С1: 1,36-7,86 0,02/2,64/ С1: 1,02-6,83

1/1,02/ С1: 0,50-2,09 0,74/0,87/ С1: 0,46-1,67 0,53/1,74/ С1: 0,51-5,89 0,63/1,17/ С1: 0,62-2,19 0,16/5,85 С1: 0,64-5,33 0,09/2,29/ С1: 0,89-5,87 0,16/1,75/ С1: 0,80-3,81 0,03/2,24/ С1: 1,01-4,97

У больных с гипергомоцистеинемией и нормальным содержанием гомоцистеина одинаково часто встречалось сочетание генотипа MTRR 66GG c генотипом MTHFD 1958GA, не ассоциированным с гипергомоцистеинемией, частота которого существенно превышала таковую в группе контроля. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что с генотипом MTRR 66GG/MTHFD 1958GA, вероятно, ассоциирован риск атеросклероза артерий нижних конечностей, но не повышенный уровень гомоцистеина.

В настоящей работе выявлена достоверная ассоциация между полиморфизмами C677T и A1298C гена MTHFR и A2756G гена MS, а также рядом их попарных сочетаний и уровнем го-моцистеина в плазме крови. Поскольку сама ги-пергомоцистеинемия может рассматриваться как независимый фактор риска атеросклеротичес-кого поражения артерий, полученные данные могут быть косвенным свидетельством роли этих генов в риске атеросклероза артерий нижних конечностей. Наши данные показали также, что полиморфизм G1958A гена MTHFD при одиночном рассмотрении не имеет существенного значения для риска гипергомоцистеинемии. Однако тот факт, что генотип MTRR 66GG/MTHFD 1958GA достоверно чаще встречается в группе больных, чем в контрольной, может свидетельствовать о том, что он является «неблагоприятным» c точки зрения риска атеросклероза артерий нижних конечностей, но не гипергомоцис-теинемии.

ВЫВОДЫ

Генотипы CT и TT (полиморфизм C677T) и AA (полиморфизм A1298C) по гену MTHFR и AA (полиморфизм A2756G) по гену MS, а также их сочетания MTHFR 677CT/MTHFR 1298AA; MTHFR 677CT/MS 2756AA; MTHFR 677TT/MS 2756AA; MTHFR 1298AA/MS 2756AA ассоциированы с повышенным риском гипергомоцисте-инемии.

Полиморфизм G1958A гена MTHFD не вносит существенного вклада в риск гипергомоцисте-инемии. Генотип MTRR 66GG/MTHFD 1958GA ассоциирован с риском атеросклероза артерий нижних конечностей, но не с гипергомоцистеи-немией.

ЛИТЕРАТУРА

1. Климов А. Н. Атеросклероз. В кн.: Косицкий Г. И. (ред.) Превентивная кардиология. М.: Медицина, 1987. С. 239-316

2. Смирнова О.А., Шмелева В.М., Капустин С.И. и др. Гипергомоцистеинемия и аллельный полиморфизм генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у пациентов с ишемической болезнью сердца // Тромбоз, гемостаз и реология. 2008. Том 2. № 34. С. 48-52.

3. Шмелева В.М., Капустин С. И., Блинов М.Н., Папа-ян Л.П. Гипергомоцистеинемия — значимый фактор риска развития артериальных и венозных тромбозов // Медицинский академический журнал. 2003. Том 3. № 4. С. 28-34.

4. Brown C.A., McKinney K.Q., Kaufman J.S. et al. Common polymorphism in теШом^ synthase reductase increases risk of premature coronary artery disease // J. Cardiovasc. Risk. 2000. № 7. P. 197-200.

5. De Bree A., Verschuren W.M., Bjorke-Monsen A.L. et al. Effect of the methylenetetrahydrofolate reductase 677C->T mutation on the relations among folate intake and plasma folate and homocysteine concentrations in a general population sample // Am. J. Clin. Nutr. 2003. № 77. P. 687-93.

6. Friedman G., Golsschmidt N., Friedlander Y. et al. A common mutation A1298C in human methylenetet-rahydrofolate reductase gene: association with plasma homocysteine and folate concentrations // J. Nutr. 1999. № 129. P. 1656-1661.

7. Gaughan D.J., Kluijtmans A.J., Barbaux S. et al. The methionine syntase reductase (MTRR) A66G polymorphism is a novel genetic determinant of plasma homo-cysteine concentrations // Atherosclerosis. 2001. № 157. P. 451-456.

8. Harmon D.L., Shields D.C., Woodside J.V. et al. Methionine synthase D919G polymorphism is a significant but modest determinant of circulating homocysteine concentrations // Genet. Epidemiol. 1999. № 17. P. 298309.

9. Klerk M., Lievers K.J., Kluijtmans L.A. et al. The 2756A>G variant in the gene encoding methionine syn-thase: its relation with plasma homocysteine levels and risk of coronary heart disease in a Dutch case-control study // Thromb. Res. 2003. № 110. P. 87-91.

10. Kluijtmans L.A., Young I.S., Boreham C.A. et al. Genetic and nutritional factors contributing to hyperhomo-cysteinemia in young adults // Blood. 2003. № 101. P. 2483-2488.

11. Lewis S.J., Ebraham S., Davey S.G. Meta-analysis of MTHFR 677C->T polymorphism and coronary heart disease: does totality of evidence support causal role for homocysteine and preventive potential of folate? // BMJ. 2005. № 331. P. 1053.

12. Lievers K.J., Godfried H.J., Boers P.V. et al. A second common variant in the methylenetetrahydrofolate re-ductase (MTHFR) gene and its relation to MTHFR enzyme activity, homocysteine, and cardiovascular disease risk // J. Mol. Med. 2001. № 79. P. 522-528.

13. Lievers K.J., Kluijtmans L.A., Blom H.J. Genetics of hyperhomocysteinemia in cardiovascular disease // Ann. Clin. Biochem. 2003. № 40. P. 46-59.

14. Valentine R.J., Guerra R., Stephan P. et al. Family history is a major determinant of subclinical peripheral arterial disease in young adults // J. Vasc. Surg. 2004. № 39. P. 351-356.

Поступила 15.09.2009