АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К ММР9
ANTIBODIES SPECIFIC TO MMP9

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается антител и их фрагментов, которые специфически связываются и нейтрализуют активность данного белка, а также их применения в качестве терапевтических или диагностических средств.
Уровень техники
Семейство матриксных металлопротеиназ (ММР) состоит по меньшей мере из 23 родственных по структуре, растворимых или мембраносвязанных цинк-зависимых эндопептидаз, которые в широком смысле участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса (ЕСМ) и в функциональной регуляции различных биологически активных молекул.
Все MMPs имеют структуру прототипа, которая включает пропептидный домен, поддерживающий ММР в неактивной форме, и каталитический домен, который действует на целый ряд компонентов внеклеточного матрикса.
Матриксная металлопротеиназа 9 (ММР9), также известная как коллагеназа типа IV в 92 кД или желатиназа В (GELB), является представителем семейства ферментов ММР, ответственных за деградацию денатурированных коллагенов и коллагенов базальной мембраны (Agrawal et al., 2006 J. Exp. Med. 203, 1007-1019), а также за активацию воспаления путем процессинга растворимых белков, в том числе ингибиторов протеаз (Liu et al., 2000, J. Exp. Med. 188, 475-482), хемокинов (Van den Steen et al., 2000, Lancet Neurol. 2, 747-756) и цитокинов (Nelissen et al., 2003, Brain 126, 1371-1381). MMP9 также контролирует миграцию, инвазию и метастазирование раковых клеток путем протеолиза мембраносвязанных молекул типа предшественников и рецепторов факторов роста, рецепторов тирозинкиназы (TKRs), молекул клеточной адгезии (Bauvois, 2012, Biochim Biophys Acta 1825(1): 29-36). При заболеваниях ММР9 секретируется многими типами клеток, включая лейкоциты, например нейтрофилы, моноциты/макрофаги и лимфоциты, а также фибробластами, миофибробластами, эпителиальными клетками, гладкомышечными клетками, эндотелиальными клетками, остеокластами и раковыми клетками (Vandooren et al., 2013, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 48(3): 222-72).
Общая структура доменов MMP9 включает последовательность лидера секреции, ингибиторный пропептидный домен (pro-domain), необходимый для сдерживания каталитической активности, "расщепленный" каталитический домен, содержащий три подобные фибронектину II типа повторяющиеся петли, которые вместе образуют коллаген-связывающий домен (CBD), гипергликозилированный обогащенный пролином линкер (который также называют доменом OG) и С-концевой гемопексиновый домен (РЕХ).
Матриксная металлопротеиназа 2 (ММР2), также известная как коллагеназа типа IV в 72 кДа или желатиназа A (GELA), это фермент, который принадлежит к тому же семейству, что и ММР9. ММР2 и ММР9 проявляют высокую идентичность аминокислотных последовательностей (45,9% по полноразмерным белкам и 63,2% по каталитическому домену) и имеют очень похожие 3D-структуры, особенно в каталитических доменах. Поэтому очень трудно идентифицировать ингибиторные антитела против ММР9 человека, избирательные в отношении ММР2 человека, вследствие такой высокой гомологичности по структуре и аминокислотной последовательности (Morgunova et al., 1999, Science, 284: 1667-1670).
Многие острые воспалительные и аутоиммунные заболевания, фиброзные заболевания и инвазивный рак связаны с наличием избыточного ММР9 (Hu et al, 2007, Nature Reviews Drug Discovery, 6, 480-498; Ram et al, 2006, J. Clin. Immunol, (26)4: 299-307; Ai Zheng, 2003, Chinese Journal of Cancer, 22(2): 178-84; Baugh et al, 1999, Gastroenterology, 117: 814-822; Santos et al, 2013, Biochem Biophys Res Commun., 438(4): 760-4;  et al, 2012, Int. J. Mol. Sci., 13, 13240-13263; Lijnen, 2001, Thromb Haemost, 86: 324-33; Rosell et al., 2005, Stroke 36: 1415-20; Whatling et al., 2004, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 24: 10-11; Yasmin et al., 2005, Arterioscler Thromb Vasc Biol., 25:372-8; Vassiliadis et al., 2011, BMC Dermatol., 11: 6), поэтому этот фермент удостоился значительного внимания в качестве перспективной мишени для терапевтического вмешательства.
Убедительные клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о связи повышенного уровня ММР9 с прогрессированием, метастазированием рака и сокращением продолжительности жизни пациентов, так как он играет ключевую роль в инвазии и метастазировании опухолевых клеток путем расщепления базальной мембраны и компонентов внеклеточного матрикса. Связанный с желатиназой нейтрофилов липокалин (NGAL), который ковалентно связан с ММР9 в нейтрофилах человека (Triebel et al., 1992, FEBS Lett., 314, 386-388), защищает MMP9 от протеолитической деградации и повышает ферментативную активность ММР9, поэтому он усиливает инвазивность и диффузию опухолей (Yan et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 37258-37265). Высокие концентрации комплекса MMP9/NGAL в сыворотке крови связывали с более короткой выживаемостью без прогрессирования и слабой общей выживаемостью при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме (Perrin et al., 2011, Prog, en Urol. J. Assoc. Fr. Urol.  Fr. Urol., 21, 851-858).
В частности, роль ММР-9 связывали с колоректальным раком ( et al., 2012, Int J Mol Sci., 13(10): 13240-63), раком поджелудочной железы (Gao et al., 2015, Med Oncol. 32(1): 418), раком молочной железы (Gao et al., 2015, Med Oncol. 32(1): 418), раком легких (Ruiz-Morales et al., Tumour Biol. 36(5): 3601-10), раком яичников (Naylor et al., 1994, Int J Cancer, 58: 50-6), раком мочевого пузыря (Szarvas et al., 2011, Nat Rev Urol., 8(5): 241-54) и раком желудка (Chen et al., 2015, Int J Clin Exp Med. 8(1): 546-57).
Была показана роль MMP9 при иммунных патологиях, в частности, при воспалительной болезни кишечника (IBD), где ММР9 отмечается как наиболее сильно экспрессируемая ММР в слизистой кишечника при активном воспалении, а ее экспрессия коррелирует с активностью болезни (Naito and Yoshikawa, 2005, 26: 379-390). При IBD, как полагают, ММР9 играет ключевую роль в неадекватном ремоделировании ткани и активации провоспалительных цитокинов и хемокинов, тем самым способствуя рекрутингу активированных лейкоцитов (Nuala et al., 2014, Inflamm. Bowel 0: 1-15). В частности, отмечалось усиление экспрессии ММР9 вдоль фистульных участков перианальных свищей и повышение активности ММР9 в биоптатах свищей у пациентов с болезнью Крона (CD), что подтверждает гипотезу о том, что ММР9 может способствовать образованию свищей, представляющих тяжелое осложнение при CD (Efsen et al., 2011, Basic Clin Pharmacol Toxicol. 109(3): 208-16). Кроме того, снижение уровня NGAL/MMP9 в сыворотке также коррелирует с заживлением слизистой у пациентов с язвенным колитом при лечении инфликсимабом (de Bruyn et al., 2014, Inflamm. Bowel Dis., 20, 1198-1207).
Роль MMP9 связывали с различными неврологическими заболеваниями, к примеру, с болезнью Альцгеймера (Mroczko et al., 2013, J. Alzheimers Dis., 37(2): 273-278), рассеянным склерозом (Mirshafiey et al., 2014, Sultan Qaboos Univ Med J., 14(1), 13-25), нейровоспалением или церебральной ишемией (Candelario-Jalil et al., 2009, Neuroscience 158(3):983-94). При болезни Альцгеймера потенциальным нейротоксическим побочным эффектом ММР9 может быть проагрегационное влияние на формирование олигомеров тау в стратегических участках мозга (Wang et al., 2014 BioMed Res. Int., 2014, ID 908636: 1-8). Высказывалось предположение, что снижение уровня зрелого фактора роста нервов (mNGF) вследствие усиления опосредованной ММР9 деградации mNGF во внеклеточном пространстве может частично лежать в основе патогенеза когнитивных нарушений при умеренных когнитивных расстройствах и болезни Альцгеймера (Bruno et al., 2009, J Neuropathol. Exp. Neurol., 68(12): 1309-1318).
Роль MMP9 связывали с фиброзными заболеваниями, к примеру, системным склерозом, многоочаговым фибросклерозом, склеродермальной реакцией "трансплантант против хозяина" у реципиентов при пересадке костного мозга, нефрогенным системным фиброзом, а также такими орган-специфичными заболеваниями, как фиброз легких, печени и почек (Piera-Velazquez et al., 2011, Am J Pathol, 179(3): 1074-80; Peng et al, 2012, J. Clin. Immunol, 32(6): 1409-14). Например, недавние исследования показали, что MMPs, в частности ММР-9, участвуют в возникновении и развитии фиброза почек посредством перехода канальцевых эпителиальных клеток в мезенхимальные и активации резидентных фибробластов, перехода эндотелиальных клеток в мезенхимальные и трансдифференцировки перицитов в миофибробласты (Zhao et al, 2013, World J Nephrol, 2(3): 84-9).
С активностью MMP9 связывали патофизиологию различных глазных заболеваний. Некоторые примеры включают: фиброзные патологии хрусталика (Nathu et al, 2009, Ex. Eye Res., 88(2): 323-330), заболевания роговицы, связанные с повышающей регуляцией ММР9 (Sakimoto et al., 2012, Cornea 31, Suppl 1: S50-6), диабетическую ретинопатию, при которой повышается уровень ММР9 в сетчатке и стекловидном теле пациентов (Kowluru et al, 2012, Expert Opin Investig Drugs, 21(6): 797-805), и возрастную дегенерацию желтого пятна, в патогенезе которой, как оказалось, какую-то роль играет ММР9 (Nita et al, 2014, Med Sci Monit, 20: 1003-16).
Сердечнососудистые заболевания включают воспаление и ремоделирование измененных тканей, связанное с реорганизацией внеклеточного матрикса и активацией ММР9. Поэтому полагают, что ММР9 связан с патофизиологией таких сердечных заболеваний, как гипертензия, атеросклероз, инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и ишемическая болезнь сердца (Yabluchanskiy et al, 2013, Physiology, 28(6): 391-403).
Кроме того, роль ММР9 связывали с различными группами заболеваний, таких как кожные заболевания (Mezentsev et al, 2014, Gene, 540(1): 1-10), сепсис и синдром острого воспалительного шока (Lorento et al, 2014, PLoS One 9(4): e94318; Qui et al, 2012, Comb Chem High Throughput Screen., 15(7): 555-70), остеоартрит (Bian et al., 2012, Front Biosci (Elite Ed). 4: 74-100), вызванный химиотерапией мукозит (Al-Dasooqi et al., 2009, Cancer Chemother Pharmacol, 64: 1-9), заболевания полости рта (Al-Azri et al., 2013, Oral Diseases, 19: 347-359), остеосклероз (Teti et al., 1999, J Bone Miner Res. 14(12): 2107-17), эндометриоз (Pitsos et al., 2009, Reprod Sci., 16(8): 717-26) или болезнь Чагаса (Geurts et al, 2012, Pharmacol Ther., 133(3): 257-79).
В различных нормальных и раковых клетках (Goldberg et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 4583-4591), а также в биологических жидкостях и тканях были идентифицированы и мономерные, и димерные формы ММР9, указывая на то, что обе формы являются физиологически важными. Наряду с протеолизом, димеризация ММР9 через гемопексиновый домен представляется необходимой для усиления ММР9 миграции клеток (Dufour et al., 2010, J. Biol. Chem., 285, 35944-35956), а изучение паттернов секреции мономера и димера ММР9 в различных линиях клеток карциномы, саркомы, аденокарциномы и лейкемии показало, что высокий уровень секреции ММР9 и особенно димера коррелирует с наиболее агрессивными линиями раковых клеток (Roomi et al., 2014, Int. J. Oncol. 44, 986-992). В целом все эти наблюдения подчеркивают важность эффективного средства для нейтрализации ММР9 для эффективного ингибирования всех природных форм ММР9, а более конкретно димера ММР9 и комплекса NGAL/MMP9 для лечения очень агрессивных метастазирующих раковых заболеваний.
Исторически стратегии блокирования ММР были сосредоточены на конструировании низкомолекулярных ингибиторов, тесно взаимодействующих с каталитическим сайтом активированного фермента. Пока что этот подход не дал ожидаемых клинических преимуществ частично из-за дозозависимой токсичности и тяжелых побочных эффектов типа костно-мышечного синдрома. Поскольку архитектура каталитического сайта ММР9 сильно консервативна по всему семейству ММР, то это противопоказание может быть связано с отсутствием избирательности к мишени ММР при терапевтических дозах.
Антитела или фрагменты антител могут взаимодействовать с и перекрывать гораздо большую часть структуры ММР9, чем направленные на активный сайт небольшие молекулы, обеспечивая большую избирательность при ингибировании мишени.
Некоторые антитела, специфичные к ММР9, были описаны на предшествующем уровне техники, как-то мышиное АВ0041 и гуманизованное АВ0045 (WO 2013/130078), а также человеческие 539А-М0240-В03 (US 2009/0311245), M0166-F10 (US 2009/0311245 US 2011/0135573), 539A-M0237-D02 (US 2009/0297449 и US 2011/0135573), мышиное REGA-3G12 (Martens et al., 2007, Biochim. Biophys. Acta 1770, 178-186). Некоторые из антител предшествующего уровня техники были описаны как связывающиеся и с ММР9, и с ММР2.
Таким образом, существует потребность в разработке новых терапевтических средств, проявляющих высокое сродство и специфичность к ММР9 и проявляющих слабое или ограниченное сродство и/или специфичность к другим MMPs типа ММР2, проявляющих лучшую перекрестную реактивность к ортологам ММР9 не от человека, а также обладающих и другими свойствами типа пониженной иммуногенности у людей и/или большей стабильности, что делает их особенно подходящими для терапевтического применения на людях.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение направлено на белки, которые связываются с ММР9, в частности, с ММР9 человека, и содержат по меньшей мере один фрагмент вариабельной области тяжелой цепи и/или по меньшей мере один фрагмент вариабельной области легкой цепи антител, как описано здесь.
Первый аспект изобретения касается выделенных антител, специфичных к ММР9, либо их антигенсвязывающих фрагментов, причем данные антитела или фрагменты связываются с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом, включающим по меньшей мере одну аминокислоту в пределах участка, состоящего из SEQ ID NO: 41, по меньшей мере одну аминокислоту в пределах участка, состоящего из SEQ ID NO: 42, и по меньшей мере одну аминокислоту в пределах участка, состоящего из SEQ ID NO: 43, при этом данные участки находятся в пределах каталитического домена ММР9 человека.
Во втором аспекте изобретения предусмотрены выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
(i) CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами.
В более предпочтительном аспекте изобретения предусмотрены выделенные антитела, как описано выше, дополнительно содержащие вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
a) вариабельной области легкой цепи, включающей:
(i) CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 21 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 22 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 23 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 легкой цепи заменены другими аминокислотами, или
b) вариабельной области легкой цепи, включающей:
(i) CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 26 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 27 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 28 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 легкой цепи заменены другими аминокислотами.
Третий аспект изобретения касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты, как описано здесь.
Четвертый и пятый аспекты изобретения касаются рекомбинантных экспрессирующих векторов, включающих данные молекулы нуклеиновых кислот, а также клеток хозяина, содержащих данные рекомбинантные векторы, соответственно.
Шестой аспект изобретения касается способа получения антител или их фрагментов, как описано здесь, включающего культивирование клеток хозяина, трансформированных экспрессирующим вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей данные антитела или их фрагменты, в условиях, достаточных для экспрессирования данных антител или их фрагментов.
В седьмом аспекте изобретения предусмотрены фармацевтические композиции, включающие одно или несколько из следующего: (i) антитело, специфичное для ММР9, или его антигенсвязывающий фрагмент, (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, (iii) вектор и/или (iv) клетки хозяина, как описано здесь, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Восьмой аспект изобретения касается композиций для визуализации или диагностики, включающих одно или несколько антител против ММР9 или их антиген-связывающих фрагментов, как описано здесь.
Девятый аспект изобретения составляет набор, включающий одно или несколько антител против ММР9 или их антиген-связывающих фрагментов, как описано здесь.
Десятый аспект изобретения касается антител или их лекарственных форм по изобретению для применения при профилактике и/или лечении связанных с ММР9 заболеваний, как-то воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний либо раковых заболеваний или фиброзных заболеваний.
Одиннадцатый аспект касается способа профилактики и/или лечения связанных с ММР9 заболеваний типа воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний либо раковых заболеваний или фиброзных заболеваний, включающего введение нуждающимся в этом лицам терапевтически эффективного количества данных антител или их фрагментов либо данной фармацевтической композиции.
Следующий аспект изобретения касается антител против ММР9 по изобретению или их лекарственных форм для применения в качестве лекарственных средств.
Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 схематически представлена доменная структура молекул белка ММР9 человека. Цифрами указаны положения аминокислот в аминокислотной последовательности незрелого белка ММР9.
На фиг. 2 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей ММР9 человека, макаки-крабоеда (cyno), крысы и мыши. Значком (*) указаны положения, в которых находится один полностью консервативный остаток, (:) означает консервативность между группами с очень близкими свойствами - дающими > 0,5 по матрице Gonnet РАМ 250, (.) означает консервативность между группами с не очень близкими свойствами - дающими ≤ 0,5 по матрице Gonnet РАМ 250.
На фиг. 3 представлено совмещение последовательностей типичных фрагментов тяжелой цепи антител человека, содержащих константную область тяжелой цепи и вариабельную область тяжелой цепи антител человека против ММР9 по изобретению. Последовательности фрагментов тяжелой цепи антител помечены по названиям последовательностей вариабельной области тяжелой цепи значком * перед названием: * F20-VH, * F20-VH-GL1, * F20-VH-GL1-V1-V9, * F20-VH-GL1-V1-V9-V14, * F20-VH-GL1-V4-V9, * F20-VH-GL1-V4-V9-V14. Участки CDR подчеркнуты. Аннотации идентичны приведенным на фиг. 2.
На фиг. 4 представлено совмещение последовательностей типичных фрагментов легкой цепи антител человека, содержащих константную область легкой цепи и вариабельную область легкой цепи антител человека против ММР9 по изобретению. Последовательности фрагментов легкой цепи антител помечены по названиям последовательностей вариабельной области легкой цепи значком * перед названием: * B03-VL, * B03-VL-GL1. Участки CDR подчеркнуты. Аннотации идентичны приведенным на фиг. 2.
На фиг. 5 представлено совмещение последовательностей типичных фрагментов легкой цепи антител человека, содержащих константную область легкой цепи и вариабельную область легкой цепи антител человека против ММР9 по изобретению. Последовательности фрагментов легкой цепи антител помечены по названиям последовательностей вариабельной области легкой цепи значком * перед названием: * B08-VL, *B08-VL-GL6. Участки CDR подчеркнуты. Аннотации идентичны приведенным на фиг. 2.
На фиг. 6 представлено титрование нейтрализующей активности типичных антител против ММР9 по изобретению (вариантов F20-VH/B03-VLc и F20-VH/B08-VLc) в отношении proMMP9 человека (А, В) и зрелого ММР9 человека (С, D). Варианты F20-VH/B03-VLc (А, С), варианты F20-VH/B08-VLc (В, D).
На фиг. 7 представлена нейтрализующая активность типичных антител против ММР9 по изобретению в отношении каталитических доменов различных рекомбинантных матриксных металлопротеиназ человека.
На фиг. 8 представлено титрование нейтрализующей активности типичного антитела против ММР9 по изобретению (варианта F20-VH/B08-VLc, сплошные линии и темные символы) или изотипного контроля (пунктирные линии и светлые символы) в отношении димерного ММР9 из нейтрофилов человека (кружочки), мономерного ММР9 человека (треугольнички) и комплекса NGAL-MMP9 человека (квадратики).
На фиг. 9 представлено титрование нейтрализующей активности типичного антитела против ММР9 по изобретению (варианта F20-VH/B08-VLc, сплошные линии и закрытые символы) или сравнительного антитела 1 против ММР9 (пунктирные линии и светлые символы) в отношении активированного мономерного ММР9 человека (треугольнички), димерного ММР9 (кружочки) и комплекса NGAL-MMP9 (квадратики) из нейтрофилов человека.
На фиг. 10 представлена кинетика связывания антител против ММР9 с антигеном - рекомбинантным ММР9 человека. ММР3-активированный ММР9 (панели А и В) и про-ММР9 (панели С и D) титровали на сенсорном чипе BIAcore, на котором сначала были фиксированы антитела против ММР9: вариант F20-VH/B08-VLc (панели А и С) и сравнительное антитело 1 (панели В и D). Представлены сенсограммы кинетики связывания. Единицы резонанса (ЕО). По оси у - ответ (ЕО); по оси х - время (сек).
На фиг. 11 представлено прямое и конкурентное связывание антител против ММР9 с ММР9 человека. Способность к прямому связыванию при различных концентрациях биотинилированных антител против ММР9 - варианта F20-VH/B08-VLc (темные кружочки) и сравнительного антитела 1 (светлые кружочки) в отношении про-ММР9 (панель А) или ММР3-активированного ММР9 (панель В) определяли по стандартной методике ELISA. Антигены ММР9 наносили при 2,5 мкг/мл. Контролями служили стрептавидин-HRP сам по себе (темные треугольники) или IgG4 контрольного изотипа человека плюс биотинилированное вторичное Fab-антитело против IgG человека (темные квадратики).
450
620
В экспериментах по конкурентному связыванию (панель С) после предварительной инкубации с буфером (без ничего) или очищенным вариантом F20-VH/B08-VLc или сравнительным антителом 1 (оба при 50 мкг/мл) проявляли фиксированный ММР3-активированный ММР9 при оптимальной дозе биотинилированного сравнительного антитела 1 (2,5 мкг/мл) или варианта F20-VH/B08-VLc (50 мкг/мл). Для панелей А, В, С результаты выражали в виде среднего значения ± SD скорректированного поглощения (А-А) для каждого условия в двух повторах.
На фиг. 12 представлено действие антител против ММР9 (вариант F20-VH/B08-VLc) на инвазию клеток раковой линии через покрытые матригелем лунки Transwell. Раковые клетки MGC803 желудка человека инкубировали с форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) и с химическим ингибитором ММР широкого спектра (GM-6001), антителом против ММР9 (F20-VH/B08-VLc), изотипным контролем или только со средой. Инвазивные клетки количественно определяли через 16 часов с помощью кальцеина-АМ. Каждое условие выполняли в двух повторах и выражали в виде среднего и SD в единицах флуоресценции.
На фиг. 13 представлены эндоскопические показатели на модели индуцированного DSS колита у мышей. На 6-й день после DSS-индукции мышей обрабатывали антителом против ММР9 (вариант F20-VH/B08-VLc) или контрольным изотипным антителом. Эффекты варианта F20-VH/B08-VLc представлены в виде черных столбиков, изотипного контроля - заштрихованных столбиков. Представлены среднее и SD эндоскопических показателей для обеих групп получавших обработку мышей (n=5 для F20-VH/B08-VLc; n=6 для изотипного контроля). Статистическое сравнение групповых данных (F20-VH/B08-VLc против изотипного контроля через 14 дней после DSS-индукции) проводили по двустороннему непарному t-критерию с помощью GraphPad Prism. * р=0,005.
На фиг. 14 представлены показатели общей гистологии, показатели инфильтрата и эпителиального повреждения на срезах толстой кишки у мышей с индуцированным DSS колитом, получавших обработку антителом против ММР9 (вариант F20-VH/B08-VLc) или контрольным изотипным антителом. Показатели (А) общей гистологии, (В) инфильтрата и (С) эпителиального повреждения. Представлены индивидуальные значения, среднее и SD для каждого критерия по обеим группам получавших обработку мышей (n=5 для F20-VH/B08-VLc, n=5 для изотипного контроля).
На фиг. 15 представлены репрезентативные поперечные срезы привитых трансплантатов в кишечнике мыши при окрашивании гематоксилином-эозином. (А) День 0: свежевыделенный при резекции участок тонкой кишки с открытым просветом и типичными структурами крипт.(В) Изотипный контроль, день 14: полная закупорка просвета кишечника через 14 дней после трансплантации у получавших изотипный контроль мышей (n=5). (С) Вариант F20-VH/B08-VLc, день 14: частичная закупорка просвета кишечника через 14 дней после трансплантации у мышей, получавших антитело против ММР9 (n=5).
На фиг. 16 представлены репрезентативные поперечные срезы привитых трансплантатов в кишечнике мыши при окрашивании с помощью Sinus red и количественная оценка толщины коллагенового слоя. Свежевыделенные при резекции участки тонкой кишки (А и В). День 14 после трансплантации у получавших изотипный контроль мышей (С и D). День 14 после трансплантации у мышей, получавших антитело против ММР9 (вариант F20-VH/B08-VLc) (Е и F). Проходящий свет (А, С и Е), поляризованный свет (В, D и F). (G) Количественная оценка толщины коллагенового слоя в гетеротопических кишечных трансплантатах у мышей, получавших антитело против ММР9 или изотипный контроль. Представлены среднее значение и SD толщины коллагенового слоя из срезов трансплантатов для обеих групп получавших обработку мышей (72 среза для F20-VH/B08-VLc; 64 среза для изотипного контроля). Статистическое сравнение групповых данных (F20-VH/B08-VLc против изотипного контроля) проводили по двустороннему непарному t-критерию с помощью GraphPad Prism. *** p<0,0001.
Раскрытие сущности изобретения
Определения
Термин "матриксная металлопротеиназа 9", сокращенно "ММР9", также известная как коллагеназа типа IV в 92 кДа, желатиназа в 92 кДа или желатиназа В (GELB), означает фермент, который у человека кодируется геном ММР9, последовательность которого приведена в NCBI под номером доступа ENSG00000100985. Форма человеческого ММР9 человека имеет последовательность из 707 аминокислот, которая доступна в NCBI под номером доступа NP_004985.2 (SEQ ID NO: 1). Общая структура доменов ММР9 включает последовательность лидера секреции (остатки 1-19 в SEQ ID NO: 1), ингибиторный пропептидный домен (pro-domain), необходимый для сдерживания каталитической активности (остатки 20-106 в SEQ ID NO: 1), "расщепленный" каталитический домен (остатки 107-441 в SEQ ID NO: 1), содержащий три подобные фибронектину II типа повторяющиеся петли, которые вместе образуют коллаген-связывающий домен (CBD), гипергликозилированный богатый пролином линкер (который также называют доменом OG) (остатки 442-520 в SEQ ID NO: 1) и С-концевой домен с повторами типа гемопексина (РЕХ) (остатки 521-707 в SEQ ID NO: 1) (Rowsell et al., 2002, J Mol Biol 319: 173-81) (фиг. 1). MMP9 секретируется и поддерживается в неактивной, латентной форме под действием про-домена. Протеолитическое удаление про-домена активизирует ферментативную активность ММР9, после чего ММР9 может называться "активной" ММР9. Его каталитический домен содержит желатин-связывающий участок, который обеспечивает специфическое сродство к желатину. Наряду с желатином, ММР9 имеет различные субстраты, включая коллагены (например, коллаген IV и коллаген V), эластин, галектин-3, энтактин и ICAM-1 (Ram et al, 2006, J. Clin. Immunol. 26, 299-307), а также цитокины и хемокины (Opdenakker et al, Trends Immunol. 2001: 22:527-81).
h
l
h
l
H
l
2
3
2
h
h
h
н
l
l
н
н
н
н
н
н
н
l
Термин "антитело" в настоящем изобретении обозначает полипептиды, которые связываются с антигеном. Сюда относятся целые антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты. Термин "антитело" применяется в самом широком смысле и охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, человеческие антитела, гуманизованные антитела, химерные антитела и другие генно-инженерные антитела, если только они сохраняют характерные свойства по изобретению, в частности, способность к связыванию с целевым антигеном, более предпочтительно с тем же самым эпитопом ММР9, который распознается антителами по изобретению. Примеры антител и их фрагментов включают фрагмент вариабельного домена ("Fv", состоящий из доменов V и V одного плеча антитела), Fab-фрагмент (моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V, V, C1 и C), Fab-фрагмент (бивалентный), Fab-фрагмент (тривалентный), Fab'-фрагмент (Fab с шарнирным участком), F(ab')-фрагмент (бивалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирном участке), Fd-фрагмент (состоящий из доменов V и C1), rIgG (редуцированный IgG или полу-IgG), диатела, триатела, тетратела, минитела, моновалентные антитела, бивалентные или поливалентные антитела, содержащие фрагменты более чем одного антитела, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), бис-scFv (биспецифичные) и такие производные антител, как стабилизированные дисульфидной связью Fv-фрагменты, CDR-содержащие пептиды, а также эпитопосвязывающие фрагменты любых из вышеприведенных (Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23(9): 1126-1136). Антитело означает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, либо их антигенсвязывающие фрагменты. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (V) и константную область тяжелой цепи (С). Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (V) и константную область легкой цепи (C). У млекопитающих тяжелая цепь может быть альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ), что определяет классы антител IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно. У млекопитающих легкая цепь может быть лямбда (λ) или каппа (κ). У млекопитающих, в зависимости от класса антител, константная область тяжелой цепи содержит три иммуноглобулиновых домена, С1, С2 и С3 (для IgA, IgD, IgG) или четыре иммуноглобулиновых домена, С1, С2, С3, С4 (для IgE и IgM). Константная область легкой цепи содержит один иммуноглобулиновый домен, C. Антитело может иметь структуру IgA, IgG, IgE, IgD и IgM, а также любого их подтипа. Антитела могут происходить из любых источников, включая, в частности, приматов (человекообразных и других приматов) и приматизированных источников.
l
h
Термин "вариабельный домен" или "вариабельная область" (вариабельный домен легкой цепи (V), вариабельный домен тяжелой цепи (V)) в настоящем изобретении относится к каждому из пары доменов легких и тяжелых цепей, непосредственно участвующих в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных ("FR") участка, последовательности которых очень консервативны, соединенные тремя "гипервариабельными участками", которые называются "определяющими комплементарность участками" или "CDRs". Каркасные участки принимают конформацию β-слоя, a CDRs могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDRs в каждой цепи удерживаются в своей трехмерной структуре каркасными участками и вместе с CDRs из другой цепи образуют антигенсвязывающий сайт.Термин "антигенсвязывающий участок антитела" в настоящем изобретении относится к тем аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Антигенсвязывающий участок антитела включает аминокислотные остатки из "гипервариабельных участков" или "CDRs". "Каркасные" или "FR-участки" это такие участки вариабельного домена, которые отличны от гипервариабельных участков, как определено здесь. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антител содержат, от N- к С-концу: участки FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Остатки в участках CDR и FR обычно нумеруются в соответствии со стандартным определением Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Publication No. 91-3242). Эта система нумерации применяется и в настоящем описании, если не указано иначе. Обозначения остатков по Kabat не всегда прямо соответствуют линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или больше аминокислот, чем при строгой нумерации по Kabat, что соответствует укорочению или вставке структурного компонента в основную структуру вариабельного домена, будь то в каркасный или определяющий комплементарность участок (CDR). Правильная нумерация остатков по Кабат может быть установлена для данного антитела путем совмещения гомологичных остатков в последовательности антитела со "стандартной" пронумерованной по Кабат последовательностью. Участки CDR вариабельного домена тяжелой цепи располагаются по остаткам 31-35 (CDR-H1), остаткам 50-65 (CDR-H2) и остаткам 95-102 (CDR-H3) по системе нумерации Кабат. Участки CDR вариабельного домена легкой цепи располагаются по остаткам 24-34 (CDR-L1), остаткам 50-56 (CDR-L2) и остаткам 89-97 (CDR-L3) по системе нумерации Кабат.
В настоящей заявке, если не указано иначе, нумерация для всех вариабельных доменов тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека соответствует "системе нумерации Кабат" (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Publication No. 91-3242).
В настоящей заявке, если не указано иначе, нумерация для всех константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина человека соответствует "системе нумерации EU" (Edelman et al, 1969, Proc Natl Acad Sci., 63(1): 78-85).
Термин "моноклональное антитело" в настоящем изобретении означает антитело, полученное из популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела очень специфичны, они направлены против единственного антигенного сайта. Определение "моноклональное" указывает на то, что антитело получено из практически однородной популяции антител и не должно восприниматься как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом.
Термин "химерное антитело" в общем означает антитело, содержащее вариабельную область из одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области, происходящую из другого источника или вида, которое обычно получают методами рекомбинантной ДНК. Типичные примеры химерных антител включает такие, которые содержат вариабельную область мыши и константную область человека. В настоящем изобретении этот термин также охватывает антитела, содержащие по меньшей мере один участок CDR из первого антитела человека и по меньшей мере часть константной области из второго антитела человека. Он также охватывает антитела, содержащие CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из первого антитела человека и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из второго антитела человека.
Термин "гуманизованное антитело" обозначает антитела из других видов, чем человек, которые содержат один или несколько определяющих комплементарность участков (CDR) из другого вида, чем человек, и каркасную область из молекулы иммуноглобулина человека. Гуманизованные антитела необязательно могут дополнительно содержать один или несколько каркасных остатков, происходящих из того другого вида, из которого происходят CDRs.
Термин "человеческое антитело" или "полностью человеческое антитело" относится к таким антителам, у которых вариабельные области и константные области как тяжелых, так и легких цепей имеют человеческое происхождение или практически идентичны последовательностям человеческого происхождения, но не обязательно из одного и того же антитела.
Термин "выделенное антитело" означает такое антитело, которое было отделено от компонентов своего естественного окружения. Например, выделенное антитело было очищено до чистоты более чем 95% или 99% при определении принятыми в данной области методами (например, см. Flatman et al, 2007, J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci., 848: 79-87), включая электрофоретические (например, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирование, капиллярный электрофорез) или хроматографические (например, ионнообменной или обратнофазовой HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) методы.
Термины "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" относятся к полимерам, содержащим нуклеотиды. Примеры молекул нуклеиновой кислоты включают ДНК, РНК, закрытую нуклеиновую кислоту (LNA), комплементарную ДНК (кДНК).
"Полипептид" понимается как пептид, олигопептид, олигомер или белок, содержащий по меньшей мере две аминокислоты, соединенные друг с другом нормальной или модифицированной пептидной связью, как-то в случае изостерических пептидов, к примеру. Полипептид может состоять и из других аминокислот, чем те 20 аминокислот, которые определяются генетическим кодом. Полипептид в равной степени может состоять из аминокислот, модифицированных под действием естественных процессов, таких как процессы посттрансляционного созревания, или под действием химических процессов, хорошо известных специалистам. Такие модификации полностью описаны в литературе. Эти модификации могут находиться в любом месте полипептида: в пептидном остове, в боковой цепи или даже на С- или N-терминальных концах. Например, полипептидные модификации охватывают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, ковалентное или нековалентное перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, в том числе ПЭГилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитические процессы, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, добавление аминокислот типа аргинилирования или убиквитинизации. Такие модификации полностью описаны в литературе (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., Т.Е. Creighton, New York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and non-protein cofactors. Meth. Enzymol. 182: 626-646; и Rattan et al. (1992) Protein Synthesis: Post-translational modifications and aging. Ann NY Acad Sci. 663: 48-62).
"Выделенный полинуклеотид" или "выделенный полипептид" понимается как полинуклеотид или полипептид, как определено выше, который выделен из организма человека или иным образом получен при помощи технического процесса.
Термин "вариант" может применяться к полинуклеотидам и/или полипептидам. Например, вариант пептида или полипептида в настоящем изобретении означает такой пептид или полипептид, который существенно гомологичен указанной пептидной последовательности, но отличается от нее по аминокислотной последовательности из-за одной или нескольких делеций, вставок и/или замен аминокислот. Существенно гомологичный означает, что аминокислотная последовательность данного варианта идентична указанной пептидной последовательности за исключением делеций, вставки и/или замены нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот. Существенно гомологичный означает, что аминокислотная последовательность данного варианта по меньшей мере на 85%, на 90%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентична указанной аминокислотной последовательности. Последовательность варианта нуклеиновой кислоты может быть по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей может быть установлена путем визуального осмотра и/или математических вычислений или же более просто путем сравнения информации о последовательности с помощью известной компьютерной программы, используемой для сравнения последовательностей, типа пакета Clustal версии 1.83. Вариант может иметь последовательность, содержащую по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты, то есть данный аминокислотный остаток заменен остатком, имеющим сходные физико-химические характеристики. Как правило, замены по одной или нескольким аминокислотам в исходном полипептиде должны производиться консервативно. Примеры консервативных замен включают замены одного алифатического остатка на другой типа Ile, Val, Leu или Ala друг на друга или замены одного полярного остатка на другой типа между Lys и Arg; Glu и Asp; или Gln и Asn. Хорошо известны и другие такие консервативные замены, к примеру, замены целых участков, имеющих аналогичные характеристики гидрофобности (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol., 157: 105-131). Например, "консервативная аминокислотная замена" может означать замену остатка исходной аминокислоты на такой другой остаток, который почти или совсем не влияет на полярность или заряд аминокислотного остатка в этом положении. Желательные замены аминокислот (консервативные или неконсервативные) могут быть установлены специалистами на тот момент, когда такие замены желательны. Типичные замены аминокислот представлены ниже в таблице 1. Термин "вариант" также охватывает такие пептиды или полипептиды, которые существенно гомологичны указанной пептидной последовательности, но отличаются нее по аминокислотной последовательности тем, что одна или несколько аминокислот подвергались химической модификации или были заменены аналогами аминокислот. Этот термин также охватывает гликозилированные полипептиды.
Термин "эпитоп" охватывает любые антигенные детерминанты, способные специфически связываться с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых воплощениях детерминанта эпитопа охватывает химически активные поверхностные группировки таких молекул, как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорила или сульфонила, а в некоторых воплощениях может иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп является тем участком антигена, который связывается с антителом. Некоторые эпитопы содержат прерывистые отрезки аминокислотной последовательности антигена, в которых несмежные аминокислоты располагаются близко друг к другу по пространственной конфигурации антигена ("конформационные эпитопы"), или содержат отрезки смежных аминокислот в аминокислотной последовательности антигена ("линейные эпитопы").
В настоящем изобретении термин "связывается" или "связывание" антитела с целевым антигеном означает по крайней мере временное взаимодействие или ассоциацию данного антитела с данным целевым антигеном (типа ММР9) или же с фрагментами данного целевого антигена, содержащего эпитоп, распознаваемый данным антителом.
Термины "избирательно связывается", "специфически связывается", "специфичное к" в применении к антителу означают, что антитело предпочтительно распознает и/или связывается с целевым полипептидом или эпитопом, то есть с более высоким сродством, чем с каким-либо другим антигеном или эпитопом, то есть связывание с целевым полипептидом можно отличить от неспецифического связывания с другими антигенами. Сродство связывания антитела может быть легко определено рядовым специалистом в данной области, например, по методу Скэтчарда (Scatchard et al., 1949, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51, 660-672).
a
a
d
2
a
a
В настоящем изобретении термин "сродство связывания" обычно относится к кажущейся константе ассоциации или "K". Значение K - обратная величина константы диссоциации "K". Сродство связывания можно определить различными методами, включая равновесный диализ, равновесное связывание, гель-фильтрацию, ELISA, поверхностный плазмонный резонанс или спектроскопию (например, флуоресцентным методом). Типичные условия для оценки сродства связывания: трис-буфер (50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl при рН 7,5). Эти методы можно использовать для измерения концентрации связанного и свободного связывающего белка в зависимости от концентрации связывающего белка (или мишени). Концентрация связанного связывающего белка ([Bound]) связана с концентрацией свободного связывающего белка ([Free]) и с концентрацией сайтов связывания для связывающего белка на мишени, где (N) означает количество сайтов связывания на молекуле мишени, по следующему уравнению: [Bound] = N × ([Free])/((1/Ka) + [Free]). Сравнение сродства между двумя антителами можно установить и без фактического определения значения K для каждого антитела, а на основе количественного измерения сродства (например, методом ELISA или FACS), которое пропорционально K, или качественного измерения сродства или выведения сродства (например, при функциональном определении или анализе in vitro или in vivo).

Термин "блокирующая" или "нейтрализующая" активность антитела относится к его способности ингибировать активность своей мишени. Применительно к антителам, связывающимся с ММР9, этот термин обозначает способность антитела вообще нейтрализировать активность ММР9 путем ингибирования активации proMMP9 и/или путем ингибирования каталитической активности активированного ММР9 на одном из его субстратов типа желатина, например, как описано в разделе «Примеры». Нейтрализующая активность антитела против ММР9 может быть определена бесклеточными методами in vitro или методами in vivo или функциональными методами in vitro типа анализа инвазии клеток раковой линии человека. При анализе инвазии клеток раковой линии человека методом Transwell раковые клетки спускаются и мигрируют через матрикс типа базальной мембраны (Matrigel), тем самым имитируя процесс интравазации опухолевых клеток in vivo в близлежащие кровеносные сосуды и экстравазации и инвазии в отдаленные ткани.
50
50
"Действенность (potency)" антитела может выражаться в виде концентрации антитела или антигенсвязывающего фрагмента, дающей полумаксимальный эффект при данной концентрации антигена. Например, "эффектом" антитела может быть ингибирование или нейтрализация активности своей мишени. В этом случае концентрация антитела, дающая полумаксимальное ингибирование, обозначается как IC и приводится в моль/л или М. На действенность обычно влияет аффинность до тех пор, пока при данной концентрации антигена не достигается такая аффинность, при дальнейшем повышении которой связывание антигена больше не будет улучшаться (так называемый потолок действенности). Применительно к антителам против ММР9 силу действия можно определить, к примеру, путем измерения значений IC зависимого от ММР9 расщепления желатинового субстрата в присутствии антитела.
Термин "эффективность ингибирования" или "эффективность нейтрализации" в применении к нейтрализующим антителам означает степень эффективности данного антитела при ингибировании определенной биологической или биохимической функции, выраженной в процентах от возможного общего ингибирования биологической или биохимической активности, которое принимается за 100%. Применительно к антителам, связывающимся с ММР9, 100%-ная эффективность может означать, к примеру, опосредованное антителом полное ингибирование ММР9-зависимого расщепления желатинового субстрата.
В настоящем изобретении термин "эффекторная функция антитела" означает такое биохимическое событие, которое возникает при взаимодействии Fc-области антитела с Fc-рецептором или лигандом. Эффекторные функции включают такие опосредованные FcγR эффекторные функции, как ADCC (опосредованная антителами клеточная цитотоксичность) и ADCP (опосредованный антителами клеточный фагоцитоз), и такие опосредованные комплементом эффекторные функции, как CDC (опосредованная комплементом цитотоксичность). Эффекторная функция антитела может быть изменена путем изменения, т.е. усиления или уменьшения, предпочтительно усиления, сродства антитела к эффекторной молекуле типа Fc-рецептора или компонента комплемента. Сродство связывания Fc-области антитела с Fc-рецептором или лигандом можно изменить путем модификации сайта связывания эффекторной молекулы. К тому же изменение сайта связывания эффекторной молекулы на антителе может изменить геометрию взаимодействия без существенного изменения общего сродства связывания, делая эффекторный механизм неэффективным, как при непродуктивном связывании. Эффекторную функцию также можно изменить путем модификации сайта, не участвующего непосредственно в связывании эффекторной молекулы, но участвующего в выполнении эффекторной функции иным образом. Изменение эффекторной функции антитела дает возможность контролировать различные аспекты иммунного ответа, например, усиливать или подавлять различные реакции иммунной системы, с возможными положительными эффектами при диагностике и терапии.
Термин "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель состоит из такого материала, который не является нежелательным в биологическом или ином смысле.
Термин "носитель" относится к любым компонентам, присутствующим в фармацевтической композиции и отличным от активного средства, куда входят разбавители, связующие, смазывающие вещества, разрыхлители, наполнители, красители, смачивающие или эмульгирующие средства, рН-буферные вещества, консерванты и т.п.
В настоящем изобретении "лечение", "лечить" и т.п. обычно означает получение требуемого фармакологического и физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в смысле предотвращения или частичного предотвращения заболевания, симптома или состояния и/или он может быть терапевтическим в смысле частичного или полного излечения заболевания, состояния, симптома или неблагоприятного эффекта, обусловленного заболеванием. Термин "лечение" в настоящем изобретении охватывает любое лечение заболеваний у млекопитающих, в частности, у человека, и включает: (а) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположенным к нему, но еще не диагностирован как страдающий им, к примеру, на основании семейной истории; (b) торможение заболевания, то есть прекращение его развития; или (с) облегчение заболевания, то есть вызывая регрессию заболевания и/или его симптомов или состояния типа исправления или излечения повреждений. Например, лечение воспалительной болезни кишечника включает предотвращение, уменьшение или даже устранение симптомов заболевания, к примеру, частичное или полное купирование диареи, болей в животе и колик, крови в стуле, абсцесса, язвы и свищей.
"Заболевания, связанные с ММР9", как они определяются здесь, обозначают заболевания, опосредованные или вызванные, по крайней мере частично, экспрессией и/или активностью ММР9. Примеры связанных с ММР9 заболеваний включают воспалительные и аутоиммунные заболевания, раковые заболевания, легочные заболевания, фиброзные заболевания типа фиброзных заболеваний легких, септицемию, мышечную дистрофию, аллергию, фиброз почек, склеродермию, дилатационную кардиомиопатию, болезнь Чагаса, сердечнососудистые заболевания, нервно-психиатрические заболевания, диабет и глазные заболевания.
Термины "воспалительные и аутоиммунные заболевания" в общем определяются здесь как воспалительные аномалии, которые могут и не затрагивать иммунную систему, а также заболевания, возникающие при аномальной иммунной реакции организма субъекта на вещества и ткани, которые в норме присутствуют в организме, соответственно. Неограничительные примеры воспалительных и аутоиммунных заболеваний включают прежде всего воспалительные заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона (CD) (в частности, проникающую и стриктурирующую болезнь Крона), язвенный колит (UC), неопределенный колит, коллагеновый колит, ревматоидный артрит (RA), рассеянный склероз (MS), системную красную волчанку (SLE), синдром , системный склероз, полимиозит, атеросклероз.
Термин "воспалительное заболевание кишечника" (IBD) определяется здесь как заболевание, связанное с хроническим воспалением всего пищеварительного тракта или его части. Неограничительные примеры IBD включают болезнь Крона, в частности, непроникающую и стриктурирующую болезнь Крона, проникающую и стриктурирующую болезнь Крона и фистулирующую болезнь Крона, язвенный колит (UC), неопределенный колит, коллагеновый колит, лимфоцитарный колит и фиброз кишечника. Болезнь Крона (CD) определяется как болезнь типа трансмурального воспаления с язвочками, которые могут поражать любую часть GI-тракта от полости рта до анального отверстия. Язвенный колит - заболевание типа воспаления слизистой, ограниченного толстой кишкой.
Термин "раковые заболевания" определяется здесь как заболевания, связанные с аномальным ростом клеток с возможностью инвазии или распространения в другие части организма. Термин "раковые заболевания" обозначает такие заболевания, к примеру, но без ограничения, как гематопоэтический рак, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак легких, рак печени, меланома, рак простаты, мышечный рак, мезенхимальный рак, пищеводно-желудочная аденокарцинома, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточный рак легких, аденокарцинома легких, аденокарцинома желудка, аденокарцинома поджелудочной железы, гепатоцеллюлярный рак и колоректальный рак.
Термин "легочные заболевания" обозначает такие заболевания, к примеру, но без ограничения, как астма, фиброзные заболевания легких типа идиопатического фиброза легких, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD) и ринит.
Термин "фиброзные заболевания" определяется здесь как заболевания, при которых пораженные ткани проявляют чрезмерное скопление волокнистой соединительной ткани (компонентов внеклеточного матрикса типа коллагена и фибронектина) внутри и вокруг воспаленной или поврежденной ткани, что может привести к образованию постоянных рубцов, нарушению функционирования органов и в конечном счете к смерти, что наблюдается на конечной стадии заболеваний печени, почечных заболеваний, идиопатического фиброза легких (IPF) и сердечной недостаточности. Неограничительные примеры фиброзных заболеваний включают системный склероз, многоочаговый фибросклероз, склеродермические реакции типа трансплантат против хозяина у реципиентов при пересадке костного мозга, нефрогенный системный фиброз, фиброз легких, фиброз печени, фиброз почек, ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, миелофиброз и системную красную волчанку.
Термины "глазные заболевания" или "заболевания глаз" определяются здесь как заболевания глаз, связанные с прогрессирующей дегенерацией пигментного эпителия сетчатки и фоторецепторов, ведущей к потере зрения и/или заболеваниям глаз, связанным с повреждением кровеносных сосудов сетчатки. Неограничительные примеры глазных заболеваний включают фиброзные патологии хрусталика, заболевания роговицы, диабетическую ретинопатию, "сухую" или "влажную" возрастную дегенерацию желтого пятна, пролиферативную витреоретинопатию, образование катаракты, птеригию, кератоконус, возрастную дегенерацию желтого пятна и диабетическую ретинопатию.
Термин "сердечнососудистые заболевания" определяется здесь как заболевания сердечнососудистой системы, которые включают воспаление, перемоделирование измененных тканей с возрастанием коллагена и нарастание фиброзного рубца при инфаркте миокарда. Неограничительные примеры сердечнососудистых заболеваний включают гипертензию, легочную гипертензию, порок легочного или трехстворчатого клапана, порок клапанов аорты и митрального клапана, коарктацию аорты, атеросклероз, инфаркт миокарда, сердечную недостаточность, ишемическую кардиомиопатию, дилатационную кардиомиопатию, хроническую аритмию, фиброз сердца и коронарную недостаточность.
Термины "неврологические заболевания" или "нервно-психиатрические заболевания" определяются здесь как заболевания, характеризующиеся дисфункцией нейронов и гибелью нервных клеток, что приводит к неизлечимым и зачастую фатальным функциональным дефектам. Неограничительные примеры неврологических заболеваний включают боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, нейровоспаление, церебральную ишемию и невропатические боли.
В настоящем изобретении термин "субъект" относится к млекопитающим. Например, млекопитающие, предусмотренные настоящим изобретением, включают человека, приматов, таких домашних животных, как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади, лабораторных грызунов и пр.
"Эффективность" лечения или способа по изобретению может быть измерена на основании изменений течения заболевания в ответ на применение способа по изобретению. Например, эффективность лечения или способа по изобретению может быть измерена по его воздействию на признаки или симптомы заболевания. Ответ достигается, если пациент испытывает частичное или полное облегчение или уменьшение нежелательных симптомов заболевания.
В настоящем изобретении термин "эффективное количество" означает такое количество по меньшей мере одного антитела по изобретению или его фармацевтической композиции, которое вызывает заметное ослабление симптомов заболевания у субъекта, которому вводится данное антитело, причем эти симптомы могут включать, к примеру: а) понос, боли в животе и колики, кровь в кале, абсцессы, язвы и свищи при воспалительной болезни кишечника либо b) запор или понос, ярко-красную или темно-красную кровь в кале, потерю веса, усталость, тошноту и анемию при колоректальном раке.
ММР9-связывающие белки
Общая характеристика ММР9-связывающих белков
В первом аспекте настоящего изобретения предусмотрены белки, которые связываются с ММР9, в частности, с ММР9 человека или его фрагментами, и содержат по меньшей мере один фрагмент вариабельной области тяжелой цепи и/или по меньшей мере один фрагмент вариабельной области легкой цепи антител, как описано здесь.
В одном воплощении изобретения предусмотрены выделенные антитела, специфичные к ММР9, в частности ММР9 человека, либо их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие по меньшей мере один фрагмент вариабельной области тяжелой цепи и по меньшей мере один фрагмент вариабельной области легкой цепи, а также необязательно хотя бы один фрагмент константной области, как описано здесь.
В альтернативном воплощении изобретения предусмотрены выделенные антитела, специфичные к ММР9, в частности ММР9 человека, либо их антигенсвязывающие фрагменты, характеризующиеся их связыванием с эпитопом на ММР9, как описано здесь.
Белок, с которым связываются антитела по изобретению или их фрагменты, может представлять собой белок ММР9 из любого вида.
Антитела по настоящему изобретению обычно проявляют высокую специфичность к ММР9 человека. Однако, в зависимости от степени идентичности последовательностей между гомологами ММР9 из разных видов (см. фиг. 2), данное антитело или антигенсвязывающий фрагмент может проявлять перекрестную реактивность с ММР9 из по меньшей мере еще одного другого вида, например, мыши, крысы, мартышки, макаки (например, макаки-крабоеда), собаки и/или кролика. Для антител, направленных на ММР9 человека, может быть желательным некоторый уровень перекрестной реактивности с другими формами ММР9 млекопитающих при определенных обстоятельствах, например, при тестировании антител на животных моделях определенных заболеваний или при проведении исследований по токсикологии, безопасности и дозировке.
В одном конкретном воплощении антитела по изобретению либо их фрагменты преимущественно связываются с ММР9 человека.
В другом воплощении антитела по изобретению либо их фрагменты проявляют перекрестную реактивность с ММР9 человека, ММР9 макаки-крабоеда, ММР9 крысы и необязательно ММР9 мыши.
d
В некоторых воплощениях сродство связывания (которое обратно пропорционально значению K) антител и их фрагментов по изобретению для ММР9 человека по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 500 раз или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем сродство связывания для других ММР9, а не человека.
В одном воплощении антитела по изобретению либо их фрагменты преимущественно связываются с ММР9 и необязательно также проявляют слабое связывание или практически не связываются (т.е. незначительное связывание или оно не обнаруживается) с другими матриксными металлопротеиназами (MMPs), такими как ММР1, ММР2, ММР3, ММР7, ММР8, ММР9, ММР10, ММР12, ММР13, ММР14, ММР16, ММР17, ММР19.
В предпочтительном воплощении антитела по изобретению либо их фрагменты преимущественно связываются с ММР9 и проявляют слабое связывание или практически не связываются (т.е. незначительное связывание или оно не обнаруживается) с ММР2.
Для терапевтического применения может быть выгодным, чтобы антитела по изобретению либо их фрагменты не связывались и тем самым не нейтрализировали ММР2 с тем, чтобы они существенно не влияли на активность ММР2. Действительно, ММР2 необходима для нормального гомеостаза тканей и также может иметь защитную роль против заболеваний, о чем свидетельствуют наблюдения, согласно которым мыши с нокаутом ММР2 проявляют худший фенотип, чем мыши дикого типа, на нескольких моделях заболеваний (Grag et al., 2006, J. Immunol., 177(6): 4103-12).
d
В некоторых воплощениях сродство связывания антител (которое обратно пропорционально значению равновесной константы диссоциации K) и их фрагментов по изобретению для ММР9 человека по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 500 раз или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем сродство связывания для ММР2.
d
eq
Сродство связывания может быть измерено любым методом, известным в данной области, включая равновесный диализ, равновесное связывание, гель-фильтрацию, ELISA, поверхностный плазмонный резонанс или спектроскопию (например, флуоресцентным методом) (Jiang et al., ВМС Pharmacology 2010, 10: 10) и может быть выражено, к примеру, в виде константы диссоциации (K), константы равновесия (K) или любого другого термина, используемого в данной области.
d
В некоторых воплощениях антитела и их фрагменты по изобретению специфически связываются с ММР9 человека с константой диссоциации (K), равной или меньше 100 нМ, в частности, менее 10 нМ, более предпочтительно менее 1 нМ или менее 0,5 нМ или менее 0,1 нМ или менее 0,01 нМ или менее 0,005 нМ.
Белок, с которым связываются антитела по изобретению либо их фрагменты, представляет собой любую форму ММР9: незрелый белок, содержащий последовательность лидера секреции ("препрофермент") (соответствующий остаткам 1-707 в SEQ ID NO: 1 в случае ММР9 человека), зрелый латентный ММР9, лишенный последовательности лидера секреции ("профермент") (соответствующий остаткам 20-707 в SEQ ID NO: 1 в случае ММР9 человека), "активированный фермент" (соответствующий остаткам 107-707 в SEQ ID NO: 1 в случае ММР9 человека) или любой фрагмент ММР9.
Антитела по изобретению либо их фрагменты могут связываться с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом, включающим аминокислоты, расположенные в любом месте белка, например, в про-домене, каталитическом домене, в частности, в Fn-повторах или домене OG линкера, причем распознаваемые аминокислоты располагаются в одном или нескольких местах внутри белка.
В предпочтительном воплощении антитела по изобретению либо их антигенсвязывающие фрагменты связываются с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом, включающим аминокислоты, расположенные в каталитическом домене ММР9, в частности, ММР9 человека.
В более предпочтительном воплощении антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом, включающим по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 41, по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 42, и по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 43, который располагается в каталитическом домене ММР9 человека.
В еще более предпочтительном воплощении антитела по изобретению либо их антигенсвязывающие фрагменты связываются с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом, включающим аминокислоты из участка, состоящего из SEQ ID NO: 41, аминокислоты из участка, состоящего из SEQ ID NO: 42, и аминокислоты из участка, состоящего из SEQ ID NO: 43, который располагается в каталитическом домене ММР9 человека.
В следующем предпочтительном воплощении антитела по изобретению либо их антигенсвязывающие фрагменты связываются с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом, включающим по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять аминокислот из участка, состоящего из SEQ ID NO: 41, по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять аминокислот из участка, состоящего из SEQ ID NO: 42, и по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять аминокислот из участка, состоящего из SEQ ID NO: 43, который располагается в каталитическом домене ММР9 человека.
Так, в одном воплощении антитела по изобретению или их фрагменты не только связываются с ММР9, но также нейтрализируют или ингибируют активность ММР9 (например, каталитическую активность ММР9) путем ингибирования процессинга препрофермента и/или профермента в каталитически активный фермент и/или путем ингибирования протеолитической активности активированного фермента.
В одном предпочтительном воплощении антитела по изобретению либо их фрагменты не только связываются с ММР9, но также нейтрализируют или ингибируют активность ММР9 (например, каталитическую активность ММР9) путем ингибирования протеолитической активности активированного фермента ММР9.
В одном предпочтительном воплощении антитела по настоящему изобретению проявляют высокую специфичность и ингибирующую активность в отношении ММР9 человека и могут проявлять перекрестную реактивность с ММР9 макаки-крабоеда (Macaca fascicularis), ММР9 крысы и/или ММР9 мыши.
В одном предпочтительном воплощении антитела по изобретению либо их фрагменты ингибируют активность ММР9 и необязательно также проявляют слабую ингибирующую активность или практически не проявляют ингибирующей активности (т.е. активность незначительна или не обнаруживается) в отношении других матриксных металлопротеиназ (ММР), таких как ММР1, ММР2, ММР3, ММР7, ММР8, ММР9, ММР10, ММР12, ММР13, ММР14, ММР16, ММР17, ММР19.
В одном предпочтительном воплощении антитела по изобретению либо их фрагменты проявляют нейтрализующую активность в отношении ММР9 и слабую или практически не проявляют нейтрализующей активности в отношению ММР2 (т.е. активность незначительна или не обнаруживается).
50

Способность антитела блокировать или нейтрализировать активность целевого белка можно оценить по его действенности, как определено здесь, которая сама выражается, к примеру, величиной IC. Как правило, нейтрализующая активность антитела против ММР9 определяется бесклеточными методами in vitro или методами in vivo или функциональными методами in vitro типа анализа инвазии клеток раковой линии человека. При анализе инвазии клеток раковой линии человека методом Transwell раковые клетки спускаются и мигрируют через матрикс типа базальной мембраны (Matrigel), тем самым имитируя процесс интравазации опухолевых клеток in vivo в близлежащие кровеносные сосуды и экстравазации и инвазии в отдаленные ткани.
50
В некоторых воплощениях ингибирующая или нейтрализующая способность (которая обратно пропорциональна значению IC) антител и их фрагментов по изобретению для ММР9 человека по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 500 раз или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем нейтрализующая способность для других ММР9, а не человека.
50
В некоторых воплощениях ингибирующая или нейтрализующая способность, которая обратно пропорциональна значению IC, антител и их фрагментов по изобретению для ММР9 человека по меньшей мере в 10 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 500 раз или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем ингибирующая или нейтрализующая способность для ММР2.
50
В некоторых воплощениях антитела и их фрагменты по изобретению проявляют значение IC, равное или меньше 100 нМ, в частности, менее 50 нМ, более предпочтительно менее 20 нМ, менее 10 нМ, менее 8 нМ, менее 7 нМ, менее 6 нМ, менее 5 нМ, менее 4 нМ, менее 3 нМ, менее 2 нМ, менее 1 нМ, менее 0,5 нМ, менее 0,3 нМ, менее 0,2 нМ или менее 0,1 нМ; при ингибировании каталитической активности ММР9 на желатине.
Способность антитела блокировать или нейтрализировать активность целевого белка также можно оценить по его эффективности ингибирования, как определено здесь, которая сама выражается, к примеру, величиной процента (%) ингибирования.
В некоторых воплощениях антитела и их фрагменты по изобретению проявляют эффективность, равную или больше 50%, в частности, равную или больше 60%, в частности, равную или больше 70%, в частности, равную или больше 80%, в частности, равную или больше 90%, в частности, равную или больше 95%, в частности, равную 100%, при ингибировании процессинга препрофермента и/или профермента и/или при ингибировании протеолитической активности активированного ММР9, которая определяется, к примеру, методом измерения каталитической активности ММР9 в отношении желатина, как описано в разделе «Примеры».
В предпочтительном воплощении антитела и их фрагменты по изобретению проявляют эффективность, равную или больше 50%, в частности, равную или больше 60%, в частности, равную или больше 70%, в частности, равную или больше 80%, в частности, равную или больше 90%, в частности, равную или больше 95%, в частности, равную 100%, при ингибировании протеолитической активности активированного ММР9, которая определяется, к примеру, методом измерения каталитической активности ММР9 в отношении желатина, как описано в разделе «Примеры».
Предполагается, что любой вариант антитела по изобретению или его фрагмента, который описан здесь, способен связываться с ММР9 и необязательно нейтрализовать активность ММР9. В предпочтительном воплощении такой вариант может проявлять такое же или еще более высокое сродство связывания для ММР9 и/или такую же или еще большую действенность и/или такую же или большую видоспецифичность и/или такую же или большую избирательность для ММР9 и/или такую же или большую нейтрализующую эффективность по сравнению с тем исходным антителом или фрагментом, из которого происходит данный вариант.
Антитела по изобретению могут представлять собой моноклональные антитела, поликлональные антитела, человеческие антитела, гуманизованные антитела, химерные антитела и другие генно-инженерные антитела, если только они сохраняют характерные свойства по изобретению, в частности, способность к связыванию с целевым антигеном, более предпочтительно с тем же самым эпитопом ММР9, который распознается антителами по изобретению, а также необязательно способность к нейтрализации активности ММР9.
В одном предпочтительном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9 по изобретению, либо их фрагменты, которые специфически связываются с ММР9, являются моноклональными антителами.
В другом предпочтительном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9 по изобретению, либо их фрагменты, которые специфически связываются с ММР9, являются человеческими антителами.
Антитела, специфичные к ММР9 по изобретению, либо их фрагменты, которые специфически связываются с ММР9, могут характеризоваться той частью, которая взаимодействует с целевым белком, в частности, их вариабельной областью, которая обычно включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи.
Характеристики ММР9-связывающих белков в отношении вариабельной области тяжелой цепи
В одном воплощении изобретение касается выделенных антител, специфичных к ММР9, либо их антиген-связывающих фрагментов, содержащих вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
(i) CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами.
В одном конкретном воплощении изобретения по меньшей мере одна аминокислота в положениях 53 и 61 данного CDR2 тяжелой цепи и/или одна аминокислота в положении 100J данного CDR3 тяжелой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по одной из следующих замен: N53Q или N53R, D61E, M100JI.
В одном конкретном воплощении изобретения по меньшей мере одна аминокислота в положениях 53, 61 и 62 данного CDR2 тяжелой цепи и/или одна аминокислота в положении 100L данного CDR3 тяжелой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по одной из следующих замен: N53Q, N53R, N53K, N53H, D61E, S62T, M100LI или M100LL.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 и вплоть до 25 аминокислот в SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 заменены другими аминокислотами, либо ее вариант, который по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12, соответственно.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 и вплоть до 25 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области тяжелой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области тяжелой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11 либо ее вариант, у которого 2 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области тяжелой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11 либо ее вариант, у которого 2 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область тяжелой цепи представлена SEQ ID NO: 12.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11 либо ее вариант, у которого 3 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области тяжелой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11 либо ее вариант, у которого 3 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область тяжелой цепи представлена SEQ ID NO: 48.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают вариант SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты по меньшей мере одного из CDR1, CDR2 и/или CDR3 тяжелой цепи и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи заменены другими аминокислотами.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают вариант SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты по меньшей мере одного из CDR1, CDR2 и/или CDR3 тяжелой цепи и/или 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи заменены другими аминокислотами.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 11, у которого по меньшей мере одна аминокислота в положениях 53 и 61 CDR2 тяжелой цепи, по меньшей мере одна аминокислота в положении 100J CDR3 тяжелой цепи и в положениях 84 и 89 каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по одной из следующих замен: N53Q, N53R, D61E, M100JI, D84A и V89L.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 11, у которого по меньшей мере одна аминокислота в положениях 53, 61 и 62 CDR2 тяжелой цепи, по меньшей мере одна аминокислота в положении 100L CDR3 тяжелой цепи и в положениях 84 и 89 каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по одной из следующих замен: N53Q, N53R, N53K, N53H, D61E, S62T, D84A, V89L, M100LL и M100LI.
Более предпочтительно специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 11, у которого аминокислоты в положениях 84 и 89 каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи и по меньшей мере одна аминокислота в положениях 53 и 61 CDR2 тяжелой цепи и в положении 100J CDR3 тяжелой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, при заменах D84A и V89L и по меньшей мере одной из следующих замен: N53Q, N53R, D61E и M100JI.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 11, у которого по меньшей мере одна аминокислота в положениях 53, 61 и 62 CDR2 тяжелой цепи, по меньшей мере одна аминокислота в положении 100L CDR3 тяжелой цепи и в положениях 30, 84 и 89 каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по одной из следующих замен: N53Q, N53R, N53K, N53H, D61E, S62T, M100LL, M100LI, N30D, D84A и V89L.
Конкретные примеры вариабельной области тяжелой цепи, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включают:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
Альтернативные конкретные примеры вариабельной области тяжелой цепи, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включают:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18,
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19,
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
Альтернативные конкретные примеры вариабельной области тяжелой цепи, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включают:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48,
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53,
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54,
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55,
(v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56.
Характеристики ММР9-связывающих белков в отношении вариабельной области легкой цепи
В одном воплощении изобретение касается выделенных антител, специфичных к ММР9, либо их антиген-связывающих фрагментов, содержащих вариабельную область тяжелой цепи, как описано выше, а также содержащих вариабельную область легкой цепи, включающую:
(i) CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 21 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 22 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 23 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В одном конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, до 22 или вплоть до 25 аминокислот в SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25 заменены другими аминокислотами, либо ее вариант, который по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25, соответственно.
В одном конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 67 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, до 22 или вплоть до 25 аминокислот в SEQ ID NO: 67 заменены другими аминокислотами, либо ее вариант, который по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен SEQ ID NO: 67.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают вариант SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты по меньшей мере одного из CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот каркасных участков вариабельной области легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают вариант SEQ ID NO: 67, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты по меньшей мере одного из CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот каркасных участков вариабельной области легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 67 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 и вплоть до 25 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 67 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 67 либо ее вариант, у которого 1 аминокислота заменена другой аминокислотой, причем данная аминокислота содержится в каркасном участке данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 67 либо ее вариант, у которого 1 аминокислота заменена другой аминокислотой, причем данная вариабельная область легкой цепи представлена SEQ ID NO: 68.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 67 либо ее вариант, у которого 3 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 67 либо ее вариант, у которого 3 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область легкой цепи представлена SEQ ID NO: 57.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают вариант SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты по меньшей мере одного из CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи и/или 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот каркасных участков вариабельной области легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 24, у которого по меньшей мере одна аминокислота в положении 104 каркасного участка вариабельной области легкой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по следующей замене: V104L.
Один конкретный пример вариабельной области, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 67, у которого аминокислота в положении 104 каркасного участка легкой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по следующей замене: V104L.
Один конкретный пример вариабельной области, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 67, у которого по меньшей мере три аминокислоты в положениях 46, 71 и 104 каркасных участков легкой цепи заменены другими аминокислотами, в частности, по меньшей мере по следующей замене: V46L, V71A и V104L.
Один конкретный пример вариабельной области, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57.
В альтернативном воплощении изобретение касается выделенных антител, специфичных к ММР9, либо их антиген-связывающих фрагментов, содержащих вариабельную область тяжелой цепи, как описано выше, а также содержащих вариабельную область легкой цепи, включающую:
(i) CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 26 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 27 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 28 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В одном конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, до 22 или вплоть до 25 аминокислот в SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30 заменены другими аминокислотами, либо ее вариант, который по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, соответственно.
В одном конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, до 22 или вплоть до 25 аминокислот в SEQ ID NO: 69 заменены другими аминокислотами, либо ее вариант, который по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен SEQ ID NO: 69.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают вариант SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты по меньшей мере одного из CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот каркасных участков вариабельной области легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают вариант SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты по меньшей мере одного из CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи и/или 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот каркасных участков вариабельной области легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69 либо ее вариант, у которого 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 и вплоть до 25 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69 либо ее вариант, у которого 3, 4, 5, 6, 7, 8 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69 либо ее вариант, у которого 4 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69, у которой 4 аминокислоты заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область легкой цепи представлена SEQ ID NO: 58.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69 либо ее вариант, у которого 5 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69, у которой 5 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область легкой цепи выбрана из SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 29 либо ее вариант, у которого 6 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 29, у которой 6 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область легкой цепи представлена SEQ ID NO: 30.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69 либо ее вариант, у которого 6 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69, у которой 6 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область легкой цепи выбрана из SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 70.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69 либо ее вариант, у которого 7 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данные аминокислоты содержатся в каркасных участках данной вариабельной области легкой цепи.
В другом конкретном воплощении изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 69, у которой 7 аминокислот заменены другими аминокислотами, причем данная вариабельная область легкой цепи представлена SEQ ID NO: 63.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 29, у которого по меньшей мере одна аминокислота в положениях 8, 19, 47, 60, 79 и 81 каркасных участков легкой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по одной из следующих замен: R8A, V19I, L47M, T60N, L79Q и А81Е.
Один конкретный пример вариабельной области, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
В частности, специфичные к ММР9 антитела либо их фрагменты по изобретению включают вариант SEQ ID NO: 69, у которого по меньшей мере одна аминокислота в положениях 8, 19, 47, 60, 79, 81, 86 каркасных участков легкой цепи заменена другой аминокислотой, в частности, по меньшей мере по одной из следующих замен: R8A, V19I, L47M, T60N, L79Q, А81Е и F86Y.
Один конкретный пример вариабельной области, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70.
Конкретные примеры вариабельной области легкой цепи, содержащейся в антителах либо их фрагментах по изобретению, включают:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,
(v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57,
(vi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58,
(vii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59,
(viii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60,
(ix) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61,
(x) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62,
(xi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63,
(xii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67,
(xiii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68,
(xiv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69,
(xv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70.
Характеристики ММР9-связывающих белков в отношении константной области
В выделенных антителах, специфичных к ММР9, либо их антиген-связывающих фрагментах по изобретению необязательно содержится часть, соответствующая константной области антител.
В зависимости от предполагаемой функции антител, в частности, эффекторных функций, которые могут потребоваться, константная область антител может и не присутствовать в антителах по изобретению.
Как правило, если она присутствует в антителах либо их антиген-связывающих фрагментах по изобретению, то константная область тяжелой цепи или ее часть может происходить из антител любого изотипа. Например, константная область тяжелой цепи или ее часть может происходить из антитела, выбранного из IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA (например, IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgM (например, IgM1, IgM2). В частности, это может быть константная область или ее часть из IgG, более предпочтительно IgG4.
В частности, когда молекула антитела предназначается для терапевтического применения и требуются эффекторные функции антитела, можно использовать домены константной области IgG человека, особенно изотипов IgG1 и IgG3. С другой стороны, когда молекула антитела предназначается для терапевтического применения, но его эффекторные функции не нужны, например, для простого блокирования активности ММР9, то можно использовать изотипы IgG2 и IgG4.
Понятно, что также можно использовать и варианты последовательностей этих доменов константной области. Например, константная область тяжелой цепи или ее часть может представлять собой искусственный вариант IgG4 типа варианта IgG4, содержащего S228P, R409K и делению концевого лизина, что соответствует аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40.
Когда она присутствует в антителах или антиген-связывающих фрагментах по изобретению, константная область легкой цепи или ее часть может происходить из константной области любой легкой цепи. Например, константная область легкой цепи или ее часть может происходить из легкой цепи каппа или лямбда.
В предпочтительном аспекте изобретения антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты включают: (i) по меньшей мере одну тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, как описано здесь, и константную область или ее часть из антитела типа IgG, и (ii) по меньшей мере одну легкую цепь, содержащую вариабельную область, как описано здесь, и константную область или ее часть из легкой цепи лямбда (в частности, лямбда-2).
В предпочтительном воплощении константная область или ее часть из тяжелой цепи и/или легкой цепи, которая содержится в антителах по изобретению, имеет аминокислотную последовательность, которая подвергалась модификации по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью известными в данной области способами с тем, чтобы увеличить химическую стабильность антител, уменьшить их агрегацию, повысить их выработку, в частности, в вырабатывающих антитела клетках (например, в клетках HEK293, клетках СНО), и/или устранить способность к обмену полумолекул, что эффективно приводит к моновалентным антителам.
3
3
Примеры аминокислот в аминокислотной последовательности константной области антител, которые влияют на стабильность антител, включают аминокислотную мутацию S228P (нумерация по EU) в тяжелой цепи IgG4 человека, которая стабилизирует шарнирный домен антител (Angal et al, 1993, Molec. Immunol. 30: 105-108) и устраняет взаимодействия Fc-Fc (Rispens et al., 2013, Mol. Immunol. 53: 35-42), замену Lys (K) на Arg (R) в аллотипическом положении 409 (нумерация по EU), которая усиливает взаимодействия СН-СНв IgG4 (Allberse et al, 2002, Immunology 105: 9-19), причем эти примеры включены сюда путем ссылки. Кроме того, для упрощения мониторинга гетерогенности заряда моноклональных антител можно удалить С-концевой лизин тяжелой цепи IgG4 человека.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают по меньшей мере одну тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, как описано здесь, и константную область или ее часть из антитела типа IgG4, причем аминокислотная последовательность константной области IgG4 включает следующие модификации аминокислот: S228P (нумерация по EU), R409K (нумерация по EU), делецию концевого Lys (K), при этом данная модифицированная константная область представлена SEQ ID NO: 40.
В следующем воплощении антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают по меньшей мере одну легкую цепь, содержащую вариабельную область, как описано здесь, и константную область или ее часть из антитела типа IgG4, причем данная константная область представлена SEQ ID NO: 66.
Из вышеизложенного следует, что настоящим изобретением предусмотрены, в частности, выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
(i) CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами; и
(2) вариабельную область легкой цепи, включающую:
(i) CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 21 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 22 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 23 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В другом воплощении настоящим изобретением предусмотрены выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие: (1) вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
(1) CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 тяжелой цепи заменены другими аминокислотами; и
(2) вариабельную область легкой цепи, включающую:
(i) CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 26 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR1 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(ii) CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 27 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR2 легкой цепи заменены другими аминокислотами;
(iii) CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 28 или его вариант, у которого 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR3 легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В другом конкретном воплощении изобретения данный вариант CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.
Антитела по изобретению содержат по меньшей мере один антиген-связывающий сайт, например, один или два антиген-связывающих сайта. В некоторых воплощениях, к примеру, для содержащих CDR пептидов, вариабельный домен может содержать только участки CDR, соединенные короткими пептидными линкерами, вместо полных каркасных участков.
В некоторых воплощениях выделенные антитела и их антиген-связывающие фрагменты по изобретению являются гликозилированными. Как правило, такие моносахариды, как N-ацетилглюкозамин, манноза, глюкоза, галактоза, фукоза, сиаловая кислота и др., составляют олигосахариды в отдельных сайтах гликозилирования на антителах.
Специалисты должны понимать, что один из аспектов настоящего изобретения относится к таким выделенным антителам, специфичным к ММР9, либо их антигенсвязывающим фрагментам, которые характеризуются некоторыми из описанных здесь признаков, но не обязательно включают все указанные признаки.
Например, в одном аспекте предусмотрены выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, которые характеризуются любыми из описанных здесь признаков в отношении последовательностей их вариабельных областей и/или константных областей.
В предпочтительном воплощении данного аспекта указанные антитела либо их фрагменты дополнительно характеризуются связыванием с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом на ММР9, как описано здесь, в частности, эпитопом, включающим по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 41, по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 42, и по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 43, который располагается в каталитическом домене ММР9 человека.
В альтернативном аспекте предусмотрены выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, которые характеризуются связыванием с ММР9 путем взаимодействия с эпитопом на ММР9, как описано здесь, в частности, эпитопом, включающим по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 41, по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 42, и по меньшей мере одну аминокислоту из участка, состоящего из SEQ ID NO: 43, который располагается в каталитическом домене ММР9 человека.
В предпочтительном воплощении данного альтернативного аспекта указанные антитела либо их фрагменты дополнительно характеризуются любыми из описанных здесь признаков в отношении последовательностей их вариабельных областей и/или константных областей.
Примеры антител, специфичных к ММР9, либо их антиген-связывающих фрагментов
Примеры антител и их фрагментов по изобретению включают те, которые содержат вариабельные домены, указанные в таблице 2 (также см. фиг. 3, 4, 5).
Так, в одном конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16,
(vii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(viii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(ix) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(x) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20,
(xi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48,
(xii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53,
(xiii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54,
(xiv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 55,
(xv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, и
(2) вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58,
(vii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59,
(viii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60,
(ix) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61,
(x) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62,
(xi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63,
(xii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67,
(xiii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68,
(xiv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69,
(xv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70.
Так, в одном конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16,
(vii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(viii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(ix) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(x) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20,
(xi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48,
(xii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53,
(xiii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54,
(xiv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 55,
(xv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, и
(2) вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62,
(vii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63,
(viii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67,
(ix) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68,
(x) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69,
(xi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70.
Так, в одном конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70.
Так, в одном конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68.
Так, в одном конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 70.
Так, в одном конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и
(2) вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25.
В другом конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25.
Более предпочтительно выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению могут содержать:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25.
В другом конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и
(2) вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30.
В другом конкретном воплощении ММР9-связывающие белки по изобретению включают выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30.
Более предпочтительно выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению могут содержать:
(1) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 30.
Более предпочтительно выделенные антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению могут содержать вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 70.
Конъюгаты, содержащие вспомогательные молекулы
В другом аспекте изобретения выделенные антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению необязательно конъюгированы со вспомогательными молекулами, при этом они также именуются здесь как "конъюгированные антитела" или "конъюгированные фрагменты антител".
Вспомогательная молекула может быть конъюгирована с антителом или фрагментом антитела непосредственно или через спейсер подходящей длины, например, как описано в Kellogg et al., 2011, Bioconjug Chem., 22: 717-27).
В одном воплощении, особенно подходящем для терапевтических целей, вспомогательная молекула может представлять собой лечебную эффекторную группировку типа цитотоксического (например, энзиматически активного токсина бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения либо его фрагмента), цитостатического или иммуномодулирующего средства, включая радиоактивные группы (т.е. группы, содержащие радионуклиды или радиоизотопы) или небольшие молекулы.
В другом воплощении вспомогательная молекула включает антиген-связывающий фрагмент антител, который при конъюгировании с антителом или фрагментом антитела по изобретению образует биспецифичное антитело. В частности, такое биспецифичное антитело может быть направлено на два разных MMPs или на два разных эпитопа одного ММР типа двух разных эпитопов ММР9.
В одном конкретном воплощении вспомогательная молекула может представлять собой, к примеру, активное средство для лечения заболевания, как-то для лечения болезни Крона: вариабельная область антитела против TNFα, которая при конъюгировании с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по изобретению может образовывать биспецифичное антитело против TNFα/MMP9 для лечения лиц, страдающих умеренной или тяжелой формой болезни Крона.
Конъюгированные антитела и конъюгированные фрагменты антител по изобретению могут направлять препарат in vivo к участку заболевания (например, участку воспаления или опухоли) с тем, чтобы конъюгированная вспомогательная молекула могла оказывать терапевтическое действие на пораженном заболеванием участке.
3
14
32
35
125
В альтернативном воплощении, особенно подходящем для целей диагностики, вспомогательная молекула может представлять собой, к примеру, маркирующую группировку, включая радиоизотопы (например, Н, С, Р, S, I), хромогенные метки, например, ферменты, которые можно использовать для превращения субстрата в детектируемое окрашенное (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза) или флуоресцентное соединение (например, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок), спектроскопические метки (например, такие флуоресцентные метки, как флуоресцеин и его производные типа FITC, Texas red, цианиновые красители, фотоциан, родамин, или же метки, дающие видимую окраску), люминесцентные метки, включая люциферины, аффинные метки, которые могут проявляться под действием другого соединения, специфичного для этой метки и позволяющего легкое детектирование и количественное определение, или любые другие метки, используемые в стандартном методе ELISA.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению
В соответствии с другим воплощением предусмотрены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению.
Выделенная нуклеиновая кислота по изобретению может представлять собой, к примеру, природную ДНК или РНК либо рекомбинантную или синтетическую ДНК, РНК или ЗНК (LNA) или же рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую любые молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению сами по себе или в сочетании. В предпочтительном воплощении молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой кДНК.
В одном конкретном воплощении предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие одно или несколько из следующего:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3, CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4 или их варианты, у которых 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR тяжелой цепи заменены другими аминокислотами; и
(2) (i) нуклеиновую кислоту, кодирующую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 22, CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 23 или их варианты, у которых 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR легкой цепи заменены другими аминокислотами; или
(2) (ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 26, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 27, CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 28 или их варианты, у которых 1, 2 или 3 аминокислоты данного CDR легкой цепи заменены другими аминокислотами.
В одном конкретном воплощении предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие одно или несколько из следующего:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16,
(vii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(viii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(ix) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(x) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20,
(xi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48,
(xii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53,
(xiii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54,
(xiv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 55,
(xv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56,
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58,
(vii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59,
(viii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60,
(ix) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61,
(x) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62,
(xi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63,
(xii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67,
(xiii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68,
(xiv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69,
(xv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70.
В одном конкретном воплощении предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие одно или несколько из следующего:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25.
В альтернативном воплощении изобретения предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие одно или несколько из следующего:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25.
В другом конкретном воплощении предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие одно или несколько из следующего:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,
(vi) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30.
В альтернативном воплощении изобретения предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие одно или несколько из следующего:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,
(ii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,
(iii) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,
(iv) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19,
(v) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 30.
В другом конкретном воплощении предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие одно или несколько из следующего:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, включающую SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33 или их варианты, идентичные по меньшей мере на 80%, на 90%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98% или по меньшей мере на 99% одной из данных последовательностей, и/или
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из:
a) последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36 или их варианты, идентичные по меньшей мере на 80%, на 90%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98% или по меньшей мере на 99% одной из данных последовательностей,
b) последовательности нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39 или их варианты, идентичные по меньшей мере на 80%, на 90%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98% или по меньшей мере на 99% одной из данных последовательностей.
Векторы и клетки хозяина для получения и очистки полипептидов по изобретению
В одном воплощении изобретения предусмотрены рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, причем вектор необязательно содержит контролирующую экспрессию последовательность, которая способствует экспрессии кодируемого полипептида в прокариотических или эукариотических клетках хозяина и функционально связана с данной молекулой нуклеиновой кислоты.
Можно использовать различные системы экспрессии, включая, без ограничения, хромосомы, эписомы и производные вирусов. В частности, можно использовать рекомбинантные векторы, происходящие из бактериальных плазмид, транспозонов, дрожжевых эписом, вставочных элементов, элементов дрожжевых хромосом, таких вирусов, как бакуловирусы, вирусы папилломы типа SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, лисьи поксвирусы, вирусы псевдобешенства, ретровирусы. Эти рекомбинантные векторы могут в равной степени быть производными космид или фагемид.
Последовательности нуклеиновой кислоты можно вставить в рекомбинантный экспрессирующий вектор способами, хорошо известными специалистам в данной области, такими, к примеру, как описанные в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.
Рекомбинантный вектор может включать последовательности нуклеотидов, которые способствуют, контролируют или регулируют экспрессию и транскрипцию полинуклеотида по изобретению, а также трансляцию полипептида по изобретению, причем эти последовательности выбирают в соответствии с используемыми клетками хозяина.
Так, например, в рекомбинантный вектор можно встроить подходящий сигнал секреции с тем, чтобы полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению, направлялся в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство, на мембрану или во внеклеточную среду. Выбор надлежащего сигнала секреции может способствовать последующей очистке белка.
В другом воплощении предусмотрены клетки хозяина, содержащие рекомбинантный вектор по изобретению.
Введение рекомбинантного вектора в клетки хозяина может проводиться методами, хорошо известными специалистам в данной области, типа описанных в Basic Methods in Molecular Biology, Davis et al., 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995; и Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, как-то трансфекции с помощью фосфата кальция, трансфекции с помощью DEAE-декстрана, трансфекции, микроинъекции, трансфекции с помощью катионных липидов, электропорации, трансдукции или инфекции.
Клетками хозяина могут быть, к примеру, такие бактериальные клетки, как Е. coli или Streptomyces, клетки грибков типа Aspergillus и дрожжей типа Saccharomyces, клетки насекомых, клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки линии С127 мыши, клетки линии ВНК сирийского хомячка, клетки 293 эмбриональных почек человека (HEK 293). В предпочтительном воплощении клетками хозяина служат клетки СНО или клетки HEK 293.
Клетки хозяина могут применяться, к примеру, для экспрессии полипептида по изобретению. После очистки стандартными методами полипептид по изобретению можно использовать в способе, описанном ниже.
Например, при использовании систем экспрессии, секретирующих рекомбинантный белок, можно сначала сконцентрировать культуральную среду с помощью коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, например, установки для ультрафильтрации типа Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования можно нанести концентрат на матрикс для очистки типа матрикса для гель-фильтрации. С другой стороны, можно использовать анионообменную и/или аффинную смолу. Матриксом может служить акриламид, агароза, декстран, целлюлоза или матриксы других типов, которые обычно применяются для очистки белков. С другой стороны, можно использовать стадию катионного обмена. Наконец, для дополнительной очистки антител либо их фрагментов можно использовать одну или несколько стадий обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с использованием гидрофобной среды для RP-HPLC. Некоторые или все вышеописанные стадии очистки хорошо известны в различных комбинациях и могут применяться для получения практически однородного рекомбинантного белка.
Рекомбинантный белок, получаемый в бактериальной культуре, можно выделить путем первоначального разрушения клеток хозяина, центрифугирования, экстракции из клеточных осадков, если это нерастворимый полипептид, или из надосадочной жидкости, если это растворимый полипептид, с последующей одной или несколькими стадиями концентрирования, высаливания, ионного обмена, аффинной очистки или эксклюзионной хроматографии. Микробные клетки могут быть разрушены любым удобным методом, включая циклическое замораживание-оттаивание, обработку ультразвуком, механическое разрушение или использование реагентов, вызывающих лизис клеток.
В другом воплощении изобретения предусмотрен способ получения клеток, способных экспрессировать полипептид по изобретению, который включает генетическую инженерию клеток с помощью вектора или нуклеиновой кислоты по изобретению.
В другом воплощении изобретения предусмотрен способ получения антител либо их фрагментов по изобретению, который включает культивирование клеток хозяина, трансформированных экспрессирующим вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует данные антитела либо их фрагменты в условиях, достаточных для экспрессирования данных полипептидов. Затем антитело или его фрагмент по изобретению извлекают из культуральной среды или клеточных экстрактов, в зависимости от используемой системы экспрессии. Как это известно специалистам, процедуры для очистки рекомбинантных белков будут варьироваться в зависимости от таких факторов, как тип используемых клеток хозяина и то, будет ли секретироваться рекомбинантный белок в культуральную среду, как описано выше.
Композиции
Изобретением предусмотрены фармацевтические или терапевтические средства в виде композиций и способы лечения пациента, предпочтительно млекопитающего и наиболее предпочтительно человека, страдающего медицинскими заболеваниями, в частности, воспалительными и/или аутоиммунными заболеваниями или раком. С другой стороны, изобретением предусмотрены способы профилактики медицинских заболеваний, в частности, воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний или рака.
В одном воплощении предусмотрены фармацевтические композиции, включающие одно или несколько из следующего: (i) антитело, специфичное к ММР9, либо его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, (ii) нуклеиновую кислоту по изобретению, (iii) вектор по изобретению и/или (iv) клетку хозяина по изобретению, а также по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать одно или несколько антител, специфичных к ММР9, либо их антиген-связывающих фрагментов в любой из описанных здесь форм.
Композиции настоящего изобретения также могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых дополнительных ингредиентов, как-то квасцы, стабилизаторы, противомикробные средства, буферы, красители, ароматизаторы, адъюванты и т.п.
Соединения по изобретению вместе со стандартными адъювантами, носителями, разбавителями или эксципиентами, могут входить в состав фармацевтических композиций и их дозовых форм и в таком виде могут применяться в твердом виде типа таблеток или наполненных капсул, в лиофилизованном виде или в жидком виде типа растворов, суспензий, эмульсий, эликсиров или наполненных ими капсул, все для перорального применения, или же в виде стерильных растворов для инъекций для парентерального (в том числе подкожного) применения. Такие фармацевтические композиции и их дозовые формы могут содержать ингредиенты в обычных пропорциях, с добавлением других активных соединений или составляющих или без них, причем такие стандартные дозовые формы могут содержать любое подходящее эффективное количество активного ингредиента, соизмеримое с предполагаемым диапазоном суточной дозировки.
Композиции настоящего изобретения могут представлять собой жидкие формы, включая, без ограничения, водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры. Жидкие формы, подходящие для перорального введения, могут включать подходящий водный или неводный носитель с буферами, суспендирующими и диспергирующими средствами, красителями, ароматизаторами и т.п. Композиции также могут быть составлены в виде сухих препаратов для восстановления с водой или другим подходящим носителем перед применением. Такие жидкие препараты могут содержать и добавки, включая, без ограничения, суспендирующие вещества, эмульгаторы, неводные носители и консерванты. Суспендирующие вещества включают, без ограничения, сироп из сорбитола, метилцеллюлозу, глюкозный/сахарный сироп, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия и гидрогенизированные пищевые жиры. Эмульгирующие вещества включают, без ограничения, лецитин, моноолеат сорбитана и гуммиарабик. Неводные носители включают, без ограничения, пищевые масла, миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, масляные сложные эфиры, пропиленгликоль и этиловый спирт. Консерванты включают, без ограничения, метил- или пропил-n-гидроксибензоат и сорбиновую кислоту. Другие материалы, а также методы обработки и пр. изложены в 5-й части Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press and the University of the Sciences, Philadelphia College of Pharmacy, которая включена сюда в качестве ссылки.
Твердые композиции по изобретению могут иметь вид таблеток или пастилок, составленных обычным способом. Например, таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать стандартные эксципиенты, включая, без ограничения, связующие вещества, наполнители, смазывающие вещества, разрыхляющие и смачивающие вещества. Связующие вещества включают, без ограничения, сироп, гуммиарабик, желатин, сорбит, трагакант, разжиженный крахмал и поливинилпирролидон. Наполнители включают, без ограничения, лактозу, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, фосфат кальция и сорбит. Смазывающие вещества включают, без ограничения, стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и диоксид кремния. Разрыхлители включают, без ограничения, картофельный крахмал и натриевый гликолят крахмала. Смачивающие вещества включают, без ограничения, лаурилсульфат натрия. Таблетки могут иметь покрытие в соответствии с хорошо известными способами.
Композиции для инъекций обычно готовят на основе стерильных инъекционных солевых растворов или солевых растворов с фосфатным буфером или других носителей для инъекций, известных в данной области.
Композиции настоящего изобретения также могут быть составлены в виде трансдермальных форм, содержащих водные или неводные носители, включая, без ограничения, кремы, мази, лосьоны, пасты, лекарственные пластыри, пластыри или мембраны.
Композиции настоящего изобретения также могут быть составлены для парентерального введения, включая, без ограничения, посредством инъекций или непрерывного вливания. Формы для инъекций могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях и могут содержать рецептурные средства, включая, без ограничения, суспендирующие, стабилизирующие и диспергирующие вещества. Композиции также могут быть представлены в виде порошка для восстановления с подходящим носителем, включая, без ограничения, стерильную апирогенную воду.
Композиции настоящего изобретения также могут быть составлены в виде депо-препаратов, которые можно вводить путем имплантации или внутримышечной инъекции. Композиции могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (к примеру, в виде эмульсии в приемлемом масле), ионообменными смолами или в виде слабо растворимых производных (к примеру, в виде слабо растворимой соли).
Композиции настоящего изобретения также можно вводить в виде форм с замедленным высвобождением или из систем доставки лекарств с замедленным высвобождением. Описание типичных материалов для замедленного высвобождения также можно найти во включенных материалах, в Remington's Pharmaceutical Sciences.
Для введения композиций по изобретению особенно подходят формы для инъекций.
В другом воплощении изобретения предусмотрены композиции для визуализации или диагностические композиции, содержащие специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты, как описано здесь.
В другом воплощении изобретения предусмотрены диагностические композиции, содержащие специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты, как описано здесь, для выявления активной ММР9 у субъектов.
В другом воплощении изобретения предусмотрены диагностические композиции, содержащие специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты, как описано здесь, для выявления активной ММР9 у субъектов, причем данные антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 70.
В одном воплощении диагностические композиции по изобретению содержат специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты, как описано здесь, конъюгированные с группировкой, выбранной из группы, состоящей из радиоизотопов, биотина, авидина, стрептавидина, хромофоров, флуорофоров, хемилюминесцентных группировок, гаптенов и ферментов.
Композиции для визуализации или диагностические композиции по изобретению применимы для выявления повышенного уровня ММР9 в связи с воспалительными и/или аутоиммунными заболеваниями или раковыми заболеваниями.
Комбинации
В соответствии с изобретением, специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению можно вводить по отдельности или в сочетании с другим средством, применимым при профилактике и/или лечении воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний, например, с иммуномодулирующими препаратами, включая биопрепараты, небольшие молекулы и вакцины.
С другой стороны, специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению можно вводить в сочетании с другим средством, применимым при лечении рака, например, с такими противораковыми препаратами, как цитотоксические средства (Folfox, Xelox, Folfirinox, Folfox6, капецитабин, доцетаксель (Taxotere), паклитаксель (Taxol), Nab/паклитаксель, 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-МР), капецитабин (Xeloda), цитарабин (Ara-С), флоксуридин, флударабин, гемцитабин (Gemzar), гемцитабин-цисплатин, гидроксимочевина, метотрексат, пеметрексед (Alimta), иксабепилон (Ixempra), винбластин (Velban), винкристин (Oncovin), винорелбин (Navelbine) и эстрамустин (Emcyt)), ингибиторы тирозинкиназ (иматиниб (Gleevec/Glivec), гефитиниб (Iressa), эрлотиниб (Tarceva), афатиниб (Giotrif), акситиниб (Inlyta), босутиниб (Bosulif), кризотиниб (Xalkori), дасатиниб (Sprycel), лапатиниб (Tyverb), нилотиниб (Tasigna), пазопаниб (Votrient), сорафениб (Nexavar), сунитиниб (Sutent)) и такие терапевтические антитела, как трастузумаб (Herceptin), бевацизумаб (Avastin), цетуксимаб (Erbitux), панитумумаб (Vectibix), пертузумаб (Perjeta), ипилимумаб (Yervoy), ниволумаб (Opdivo) и пембролизумаб (Keytruda) или антитело ритуксимаб против CD20 (Rituxan).
Изобретение охватьшает введение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов, причем антитело или его фрагмент вводится индивидууму до, одновременно или последовательно с другими, схемами лечения или с другими средствами, применимыми при профилактике и/или лечении связанных с ММР9 заболеваний, входящих в группу, состоящую из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника, раковых заболеваний, фиброзных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, неврологических заболеваний, глазных заболеваний или любых других связанных с ММР9 заболеваний, в терапевтически эффективном количестве. Специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению, которые вводятся одновременно с такими другими средствами, можно вводить в одних и тех же или разных композициях и такими же или разными способами введения.
В предпочтительном воплощении специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению вводятся в комбинации с антителом против TNF для лечения лиц, страдающих умеренной или тяжелой формой болезни Крона.
Способы введения
Композиции настоящего изобретения можно вводить любым способом, включая, без ограничения, перорально, парентерально, под язык, трансдермально, ректально, через слизистую, наружно, посредством ингаляции, путем буккального или интраназального введения или в мочевой пузырь либо их комбинации.
Парентеральное введение включает, без ограничения, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, интратекальное и внутрисуставное введение. Композиции настоящего изобретения также можно вводить в виде имплантатов, обеспечивающих медленное высвобождение композиций, а также в виде медленного контролируемого внутривенного вливания.
В одном предпочтительном воплощении специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению вводятся системно или локально.
В другом предпочтительном воплощении специфичные к ММР9 антитела либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению вводятся подкожно или внутривенно.
Дозировка при введении индивиду в виде однократной или многократной дозы будет варьироваться в зависимости от целого ряда факторов, включая фармакокинетические свойства, состояние и характеристики пациента (пол, возраст, вес тела, состояние здоровья, размер), выраженность симптомов, сопутствующее лечение, частота лечения и требуемый эффект.
Как правило, терапевтически эффективное количество фармацевтически активного антитела составляет дозу от 1 мг до 150 мг/кг массы тела. Если схема лечения заключается в непрерывном вливании, то оно может составлять от 0,250 мг до 20 мг на кг массы тела.
В частности, терапевтически эффективное количество фармацевтически активного антитела составляет дозу от 1 мг до 150 мг/кг массы тела. Если схема лечения заключается в непрерывном вливании, то оно может составлять от 0,250 мг до 13 мг на кг массы тела.
Пациенты
Как правило, пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие заболеваниями, связанными с ММР9, в частности, заболеваниями, связанными с ММР9, входящими в группу, состоящую из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, раковых заболеваний, легочных заболеваний, фиброзных легочных заболеваний, септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных болезней или любых других заболеваний или расстройств, связанных с ММР9.
В одном воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие воспалительными и/или аутоиммунными заболеваниями, включая, к примеру, воспалительные заболевания кишечника (IBD), в том числе болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC), неопределенный колит, коллагенозный колит, ревматоидный артрит (RA), рассеянный склероз (MS), системную красную волчанку (SLE), синдром Шегрена, системный склероз, полимиозит, атеросклероз.
В предпочтительном воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие воспалительными заболеваниями кишечника, более предпочтительно проникающей и стриктурирующей болезнью Крона и язвенным колитом.
В другом воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие легочными заболеваниями, включая астму, фиброзные заболевания легких типа идиопатического фиброза легких, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), или же заболеваниями из числа септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных заболеваний.
В другом воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие раковыми заболеваниями, включая, к примеру, гематопоэтический рак, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легких, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак печени, меланому, рак простаты, мышечный рак, мезенхимальный рак, пищеводно-желудочную аденокарциному, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточную карциному легких, аденокарциному легких, аденокарциному желудка, аденокарциному поджелудочной железы и гепатоцеллюлярную карциному.
В предпочтительном воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие колоректальным раком или аденокарциномой.
В другом воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие заболеваниями, входящими в группу, состоящую из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника, раковых заболеваний, фиброзных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний или глазных заболеваний.
В другом воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие фиброзными заболеваниями, к примеру, системным склерозом, многоочаговым фибросклерозом, склеродермальной реакцией "трансплантант против хозяина" у реципиентов при пересадке костного мозга, нефрогенным системным фиброзом, фиброзом легких, фиброзом печени, фиброзом почек, ревматоидным артритом, болезнью Крона, язвенным колитом, миелофиброзом и системной красной волчанкой.
В другом воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие глазными заболеваниями, к примеру, фиброзной патологией хрусталика, заболеваниями роговицы, диабетической ретинопатией, "сухой" или "влажной" возрастной дегенерацией желтого пятна, пролиферативной витреоретинопатией, образованием катаракты, птеригией, кератоконусом, возрастной макулодистрофией и диабетической ретинопатией.
В другом воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие сердечнососудистыми заболеваниями, к примеру, гипертонией, атеросклерозом, инфарктом миокарда, сердечной недостаточностью или гипертонической болезнью коронарных артерий, легочной гипертензией, пороком легочного или трехстворчатого клапана, пороком клапанов аорты и митрального клапана, коаркцией аорты, атеросклерозом, инфарктом миокарда, сердечной недостаточностью, ишемической кардиомиопатией, дилатационной кардиомиопатией, хронической аритмией, фиброзом сердца и коронарной недостаточностью.
В другом воплощении пациентами согласно изобретению являются больные, страдающие неврологическими заболеваниями, к примеру, боковым амиотрофическим склерозом, болезнью Альцгеймера, рассеянным склерозом, нейровоспалением, церебральной ишемией и невропатическими болями.
Применение и способы по изобретению
Антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты, нуклеиновые кислоты, векторы, клетки хозяина, композиции по изобретению предназначаются для применения при диагностике, профилактике или лечении заболеваний, связанных с, вызванных или сопровождающихся повышением уровня ММР9 и/или повышением активности ММР9.
В одном воплощении предусмотрены антитела, специфичные к ММР9, либо их антиген-связывающие фрагменты по изобретению для применения в качестве лекарственных средств.
В другом воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении связанных с ММР9 заболеваний, входящих в группу, состоящую из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, раковых заболеваний, легочных заболеваний, фиброзных заболеваний легких, септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных заболеваний или любых других связанных с ММР9 заболеваний или расстройств.
В другом воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении связанных с ММР9 заболеваний, входящих в группу, состоящую из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника, раковых заболеваний, фиброзных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний или глазных заболеваний.
В другом конкретном воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний, в частности воспалительных заболеваний кишечника, включая болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC), неопределенный колит, коллагенозный колит, ревматоидного артрита (RA), рассеянного склероза (MS), системной красной волчанки (SLE), синдрома , системного склероза, полимиозита, атеросклероза.
В другом конкретном воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении легочных заболеваний, включая астму, фиброзные заболевания легких типа идиопатического фиброза легких, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), или же заболеваний из числа септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных заболеваний.
В следующем конкретном воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении раковых заболеваний, в частности, входящих в группу, состоящую из гематопоэтического рака, рака головного мозга, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака легких, рака печени, меланомы, рака простаты, мышечного рака, мезенхимального рака, пищеводно-желудочной аденокарциномы, немелкоклеточного рака легких, плоскоклеточной карциномы легких, аденокарциномы легких, аденокарциномы желудка, аденокарциномы поджелудочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, более предпочтительно колоректального рака или аденокарциномы.
В следующем конкретном воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении фиброзных заболеваний, в частности, системного склероза, многоочагового фибросклероза, склеродермальной реакции "трансплантант против хозяина" у реципиентов при пересадке костного мозга, нефрогенного системного фиброза, фиброза легких, фиброза печени, фиброза почек, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, миелофиброза и системной красной волчанки.
В следующем конкретном воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении глазных заболеваний, в частности, фиброзной патологии хрусталика, заболеваний роговицы, диабетической ретинопатии, "сухой" или "влажной" возрастной дегенерации желтого пятна, пролиферативной витреоретинопатии, образования катаракты, птеригии, кератоконуса, возрастной макулодистрофии и диабетической ретинопатии.
В следующем конкретном воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении сердечнососудистых заболеваний, в частности, гипертонии, легочной гипертензии, порока легочного или трехстворчатого клапана, порока клапанов аорты и митрального клапана, коаркции аорты, атеросклероза, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности, ишемической кардиомиопатии, дилатационной кардиомиопатии, хронической аритмии, фиброза сердца и коронарной недостаточности.
В следующем конкретном воплощении предусмотрены антитела либо их фрагменты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении неврологических заболеваний, в частности, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, нейровоспаления, церебральной ишемии и невропатических болей.
В другом воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения связанных с ММР9 заболеваний, входящих в группу, состоящую из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, раковых заболеваний, легочных заболеваний, фиброзных заболеваний легких, септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных заболеваний или любых других связанных с ММР9 заболеваний или расстройств.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника, раковых заболеваний, фиброзных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний или глазных заболеваний.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний у больных, в частности, для профилактики или лечения воспалительных заболеваний кишечника, включая болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC), неопределенный колит, коллагенозный колит, ревматоидного артрита (RA), рассеянного склероза (MS), системной красной волчанки (SLE), синдрома , системного склероза, полимиозита, атеросклероза.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения воспалительных заболеваний кишечника, в частности, проникающей и стриктурирующей болезни Крона и язвенного колита.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения легочных заболеваний, включая астму, фиброзные заболевания легких типа идиопатического фиброза легких, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), или же заболеваний из числа септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных заболеваний.
В альтернативном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения раковых заболеваний, в частности, для профилактики и/или лечения рака, входящего в группу, состоящую из гематопоэтического рака, рака головного мозга, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака легких, рака печени, меланомы, рака простаты, мышечного рака, мезенхимального рака, пищеводно-желудочной аденокарциномы, немелкоклеточного рака легких, плоскоклеточной карциномы легких, аденокарциномы легких, аденокарциномы желудка, аденокарциномы поджелудочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, более предпочтительно колоректального рака или аденокарциномы.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения колоректального рака или аденокарциномы.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения фиброзных заболеваний, в частности, системного склероза, многоочагового фибросклероза, склеродермальной реакции "трансплантант против хозяина" у реципиентов при пересадке костного мозга, нефрогенного системного фиброза, фиброза легких, фиброза печени, фиброза почек, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, миелофиброза и системной красной волчанки.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения глазных заболеваний, в частности, фиброзной патологии хрусталика, заболеваний роговицы, диабетической ретинопатии, "сухой" или "влажной" возрастной дегенерации желтого пятна, пролиферативной витреоретинопатии, образования катаракты, птеригии, кератоконуса, возрастной макулодистрофии и диабетической ретинопатии.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения сердечнососудистых заболеваний, в частности, гипертонии, легочной гипертензии, порока легочного или трехстворчатого клапана, порока клапанов аорты и митрального клапана, коаркции аорты, атеросклероза, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности, ишемической кардиомиопатии, дилатационной кардиомиопатии, хронической аритмии, фиброза сердца и коронарной недостаточности.
В одном конкретном воплощении предусмотрено применение специфичных к ММР9 антител либо их антиген-связывающих фрагментов по изобретению для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения неврологических заболеваний, в частности, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, нейровоспаления, церебральной ишемии и невропатических болей.
В другом воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения связанных с ММР9 заболеваний, входящих в группу, состоящую из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, раковых заболеваний, легочных заболеваний, фиброзных заболеваний легких, септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных заболеваний или любых других связанных с ММР9 заболеваний или расстройств, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника, раковых заболеваний, фиброзных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний или глазных заболеваний, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, в частности, профилактики или лечения воспалительных заболеваний кишечника (IBD), включая болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC), неопределенный колит, коллагенозный колит, ревматоидного артрита (RA), рассеянного склероза (MS), системной красной волчанки (SLE), синдрома , системного склероза, полимиозита, атеросклероза, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения воспалительных заболеваний кишечника, в частности, профилактики или лечения проникающей и стриктурирующей болезни Крона и язвенного колита, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В другом конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения легочных заболеваний, включая астму, фиброзные заболевания легких типа идиопатического фиброза легких, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), или же заболеваний из числа септицемии, мышечной дистрофии, аллергии, фиброза почек, склеродермии, дилатационной кардиомиопатии, болезни Чагаса, сердечнососудистых заболеваний, нервно-психиатрических заболеваний, диабета и глазных заболеваний, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антиген-связывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В альтернативном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения раковых заболеваний, в частности, профилактики и/или лечения рака, входящего в группу, состоящую из гематопоэтического рака, рака головного мозга, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака легких, рака печени, меланомы, рака простаты, мышечного рака, мезенхимального рака, пищеводно-желудочной аденокарциномы, немелкоклеточного рака легких, плоскоклеточной карциомы легких, аденокарциномы легких, аденокарциномы желудка, аденокарциномы поджелудочной железы, колоректального рака и гепатоцеллюлярной карциномы, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антиген-связывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения колоректального рака или аденокарциномы, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антиген-связывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения фиброзных заболеваний, в частности, системного склероза, многоочагового фибросклероза, склеродермальной реакции "трансплантант против хозяина" у реципиентов при пересадке костного мозга, нефрогенного системного фиброза, фиброза легких, фиброза печени, фиброза почек, ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, миелофиброза и системной красной волчанки, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антиген-связывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения глазных заболеваний, в частности, фиброзной патологии хрусталика, заболеваний роговицы, диабетической ретинопатии, "сухой" или "влажной" возрастной дегенерации желтого пятна, пролиферативной витреоретинопатии, образования катаракты, птеригии, кератоконуса, возрастной макулодистрофии и диабетической ретинопатии, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антиген-связывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения сердечнососудистых заболеваний, в частности, гипертонии, легочной гипертензии, порока легочного или трехстворчатого клапана, порока клапанов аорты и митрального клапана, коаркции аорты, атеросклероза, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности, ишемической кардиомиопатии, дилатационной кардиомиопатии, хронической аритмии, фиброза сердца и коронарной недостаточности, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антиген-связывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В одном конкретном воплощении предусмотрен способ профилактики и/или лечения неврологических заболеваний, в частности, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, нейровоспаления, церебральной ишемии и невропатических болей, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к ММР9 антитела либо его антиген-связывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом лицу.
В альтернативном воплощении предусмотрен способ обнаружения ММР9 в биологических образцах, включающий контактирование биологического образца от субъекта со специфичным к ММР9 антителом либо его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению.
В настоящем изобретении "биологический образец" означает клетки, образцы тканей или клеточные компоненты (как-то клеточные мембраны или другие клеточные компоненты), полученные от субъекта, в частности, от субъекта с подозрением на или страдающего воспалительным или аутоиммунным заболеванием и/или раковым заболеванием или же с высоким риском возникновения такого заболевания.
Примеры биологических образцов включают кровь, сыворотку, плазму, цереброспинальную жидкость, синовиальную жидкость, мочу, кал и образцы тканей, включая клетки, выделенные из данной ткани. Образцы тканей включают фиксированные формалином или замороженные срезы тканей.
Для выявления и анализа ММР9 может применяться любой подходящий метод, включая методы диагностического анализа, известные в данной области, как-то методы конкурентного связывания, методы прямого или непрямого "сэндвич"-анализа и методы иммунопреципитации, которые проводятся в неоднородной либо однородной фазе.
В одном конкретном воплощении изобретения предусмотрен способ выявления присутствия и/или концентрации белка ММР9 ex vivo в биологическом образце, включающий стадии:
(i) получение биологического образца от субъекта;
(ii) проведение реакции данного биологического образца по меньшей мере с одним антителом либо его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению в условиях, достаточных для связывания белка ММР9, присутствующего в данном биологическом образце, с данным по меньшей мере одним антителом или его фрагментом посредством взаимодействия антиген-антитело; и
(iii) детектирование сигнала, пропорционального уровню комплекса антиген-антитело, образовавшегося на стадии (ii),
причем интенсивность сигнала коррелирует с концентрацией белка ММР9 в биологическом образце.
В одном конкретном воплощении изобретения предусмотрен способ выявления присутствия и/или концентрации активного белка ММР9 ex vivo в биологическом образце, включающий стадии:
(i) получение биологического образца от субъекта;
(ii) проведение реакции данного биологического образца по меньшей мере с одним антителом либо его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению в условиях, достаточных для связывания активного белка ММР9, присутствующего в данном биологическом образце, с данным по меньшей мере одним антителом или его фрагментом посредством взаимодействия антиген-антитело; и
(iii) детектирование сигнала, пропорционального уровню комплекса антиген-антитело, образовавшегося на стадии (ii),
причем интенсивность сигнала коррелирует с концентрацией активного белка ММР9 в биологическом образце.
В одном конкретном воплощении изобретения предусмотрен способ выявления присутствия и/или концентрации активного белка ММР9 ex vivo в биологическом образце, при этом по меньшей мере одно антитело либо его антиген-связывающий фрагмент по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 70.
Более предпочтительно предусмотрен способ прогнозирования или диагностики ех vivo воспалительного и/или аутоиммунного или ракового заболевания, связанного с повышенным уровнем ММР9, по биологическому образцу от субъекта, включающий стадии:
(a) получение биологического образца от субъекта;
(b) приведение данного биологического образца в контакт с твердым матриксом, с которым связано по меньшей мере одно антитело либо его фрагмент по изобретению, причем контактирование проводится в условиях, достаточных для связывания белка ММР9, присутствующего в данном образце биологической жидкости, с данным по меньшей мере одним антителом или его фрагментом посредством взаимодействия антиген-антитело;
(c) удаление любого несвязавшегося белка ММР9 с поверхности данного твердого матрикса;
(d) детектирование сигнала, пропорционального уровню комплекса антиген-антитело, связанного с данным твердым матриксом;
(e) сравнение уровня сигнала, обнаруженного на стадии (d), с уровнем сигнала, обнаруженного при таких же условиях с отрицательным контролем,
при этом более высокий уровень сигнала, обнаруженного в образце субъекта, чем уровень сигнала, обнаруженного в отрицательном контроле, указывает на повышенный уровень ММР9, связанный с воспалительным и/или аутоиммунным или раковым заболеванием.
Наборы
Один аспект изобретения касается набора, содержащего по меньшей мере одно антитело либо его антиген-связывающий фрагмент по изобретению и/или по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую данное антитело или его фрагмент, и/или по меньшей мере один вектор, содержащий данную нуклеиновую кислоту, и/или по меньшей мере одну клетку хозяина по изобретению, а также необязательно инструкцию.
В предпочтительном воплощении набор по изобретению содержит по меньшей мере одно антитело либо его антиген-связывающий фрагмент по изобретению, которые подлежат связыванию или уже связаны с твердым матриксом.
Примеры твердого матрикса, подходящего для изобретения, включают любые твердофазные подложки, подходящие для проведения иммунологического анализа или способа по изобретению, как-то шарики, микрочастицы, наночастицы, трубочки, ткани или пластины, пленки, предметные стекла, лунки, сформированные из стекла или покрытые им, полистиролом, полипропиленом, нитроцеллюлозой, кварцем, керамикой, декстраном или другими материалами. Например, твердый матрикс имеет вид микролунок типа 96-луночного микропланшета.
Фиксация антител либо их фрагментов по изобретению к твердому матриксу в наборе по изобретению может осуществляться посредством адсорбции или химического присоединения к твердофазной подложке. Для иммобилизации белка или пептида на твердом носителе можно использовать любые известные средства. Антитела либо их фрагменты по изобретению можно ковалентно или нековалентно связывать с твердым матриксом такими методами, как образование ковалентной связи через амидную или сложноэфирную связь или посредством адсорбции. Пептиды можно связывать с помощью таких связывающих пар, как биотин и авидин либо антитело и антиген. После прикрепления пептидов к твердому матриксу этот твердый матрикс можно инкубировать с блокирующим раствором (содержащим блокирующий белок типа бычьего сывороточного альбумина), чтобы уменьшить неспецифическую адсорбцию антител в исследуемом образце на поверхности подложки. В соответствии с одним аспектом, антитела либо их фрагменты по изобретению можно синтезировать непосредственно на твердом матриксе из набора по изобретению.
В соответствии с одним воплощением, когда набор содержит по меньшей мере одно антитело или его фрагмент по изобретению либо их комбинацию для связывания с твердым матриксом в виде твердофазной подложки, набор необязательно дополнительно содержит сшивающие реагенты и/или твердый матрикс для проведения иммуноанализа.
В соответствии с другим воплощением набор по изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один промывочный реагент для отмывки несвязавшегося материала перед детектированием, чтобы избежать попадания фонового шума. Обычно промывочные реагенты включают стандартные буферы, известные в данной области.
Приведенные здесь ссылки включены сюда в качестве ссылки во всей полноте. Настоящее изобретение не ограничивается в объеме конкретными описанными здесь воплощениями, которые служат как отдельные иллюстрации индивидуальных аспектов изобретения, а функционально эквивалентные способы и компоненты входят в рамки изобретения. Так, специалистам в данной области должны стать очевидными различные модификации изобретения, в дополнение к представленным и описанным здесь, из вышеприведенного описания и сопровождающих рисунков. Такие модификации должны входить в рамки прилагаемой формулы изобретения.
После описания изобретения приводятся нижеследующие примеры в качестве иллюстрации, а не для ограничения.
Примеры
Пример 1. Создание и выделение антител против ММР9 по изобретению
Антитела против ММР9 по изобретению получали путем выполнения следующих стадий.
1) Выявление "попаданий" (HD) при фаговом дисплее
9
h
l
h
50
В качестве источника фрагментов scFv использовали библиотеку scFv. Эта библиотека является наивной по происхождению (т.е. она построена с использованием PBMCs неиммунизированных здоровых доноров), имеет небольшой размер (около 2,5×10 комбинаций V/V) и содержит домены V, полученные из репертуара IgM, не проходившего клональную селекцию и переключение изотипа. Используя эту библиотеку, сначала проводили отбор кандидатов scFv на основании их связывания с ММР9 человека или мыши (полноразмерные, про- и активированные формы) методом фагового дисплея, затем эти scFvs переводили в формат IgG1 и проверяли на функциональную нейтрализацию активности ММР9 (в частности, путем определения IC, видоспецифичности, типа нейтрализации (proMMP9 или ММР9).
Эта стадия позволила идентифицировать 10 антител-кандидатов, которые подразделялись на два класса по механизму: те, которые блокируют активность ММР9 путем препятствия активации латентной proMMP9 (свидетельствуя, что про-домен является частью эпитопа, распознаваемого этими антителами), и те, которые непосредственно препятствуют каталитической активности активированной ММР9 (свидетельствуя, что домен CAT_fn является частью эпитопа, распознаваемого этими антителами).
L
2) Оптимизация "попаданий" (НО) путем перетасовки цепи V для созревания сродства
h
l
Четыре из HD-кандидатов, полученных на предыдущем этапе, подвергали оптимизации "попаданий" посредством перетасовки легкой цепи лямбда, чтобы улучшить их действенность. В принципе, цепи V исходного HD-клона подвергали пермутации по всему содержимому исходной библиотеки V лямбда, получая несколько новых клоноспецифичных библиотек.
3) Оптимизация "лидеров"
h
l
Были отобраны два НО-кандидата (F20-VH/B03-VLc и F20-VH/B08-VLc) на основе их механизма действия, т.е. ингибирования ферментативной активности ММР9, для оптимизации и характеристики в качестве "лидеров", в частности, путем (i) оптимизации по гаметным каркасным остаткам (согласно определению Кабат), чтобы минимизировать отклонение последовательности от ближайшей гаметной последовательности человека и потенциально улучшить биофизические свойства и уменьшить риск иммуногенности, и (ii) путем изменения некоторых аминокислот или аминокислотных мотивов в CDRs, которые могли бы привести к химической нестабильности или агрегации антител. Эта стратегия позволила генерировать антитела, содержащие области V/V, приведенные выше в таблице 2.
h
l
h
l
В дальнейшем определенные области V/V, приведенные ниже в таблице 3, были переведены в формат IgG4 человека для дальнейшего изучения. Для этого нуклеиновые кислоты, кодирующие представлявшие интерес цепи V и V, клонировали в векторы рТТ (созданные для совместимости с исходными цепями при клонировании) для краткосрочной совместной экспрессии IgG4 в клетках HEK293.
Пример 2. Действенность и эффективность некоторых антител против ММР9 по изобретению при анализе активности ММР3/ММР9 человека и ММР9 человека
Оценивали функциональную нейтрализацию каталитической активности ММР9 в отношении флуорогенного полимерного субстрата DQ-желатина некоторыми антителами по изобретению.
Характерная активность ММР9 (и ММР2) - разложение желатина. Желатин представляет собой практически необратимо денатурированную форму, происходящую из различных коллагенов, из которых некоторые считаются ключевыми физиологическими субстратами для ММР9. В отличие от мелких пептидных субстратов, связывание и распознавание желатина (подобно коллагену) у ММР9 является сложным и известно, что оно опосредовано другими участками молекулы, чем активный сайт, включая домены фибронектина и РЕХ. Для того, чтобы сохранить эти физиологически важные взаимодействия "экзосайтов" и облегчить выделение потенциальных "неклассических" классов аллостерических нейтрализаторов, в качестве главного субстрата для скрининга на пластинах и в целях ранжирования был выбран флуорогенно заглушенный растворимый желатиновый полимер (DQ-желатин). Гидролиз субстрата опосредовался укороченным фрагментом ММР9 (с отщепленным про-доменом). Анализ проводили в двух режимах.
В первом режиме, названном "анализ ММР9", использовалась предварительно активированная ММР9 (из переделанной ММР9, содержащей мотив распознавания каспазы 8 LETD в природном участке расщепления), в которой сначала удаляли про-домен путем направленного расщепления каспазой 8. Второй режим, названный "анализом ММР3/ММР9", был разработан так, чтобы он включал удаление про-домена (то есть стадию активации) в качестве дополнительного связанного процесса при анализе. Это достигалось путем объединения каталитического домена ММР3 человека (Calbiochem, 444217-5) и полноразмерной (латентной формы) proMMP9 в среде определения вместе с субстратом DQ-желатином (Lubio Science, D12054) и исследуемыми антителами. Показано, что ММР3, которая считается физиологически значимым активатором ММР9, удаляет про-домен по двухстадийному последовательному механизму (Ogata et al., 1992, J. Biol, Chem., 267 (6): 3581-4) и часто экспрессируется совместно с ММР9 в пораженных тканях. Важно то, что активированная ММР3 сама по себе не проявляет существенного расщепления субстрата - DQ-желатина. Поэтому гидролиз DQ-желатина (испускание флуоресценции) в этом методе зависит от опосредованной ММР3 активации ММР9 и собственной каталитической активности ММР9, что дает возможность характеризовать нейтрализаторы, которые препятствуют любому из этих процессов.
50
Итак, "метод ММР3/ММР9" использовали для определения способности антител против ММР9 нейтрализовать активацию proMMP9 и ее последующую каталитическую активность. Вкратце, аликвоты рекомбинантной proMMP9 человека преинкубировали с различными разведениями тест-антител в течение одного часа. Расщепление запускали добавлением рекомбинантного каталитического домена ММР3 человека вместе со специфичным к ММР9 флуоресцентным субстратом DQ-желатином. Испускаемый сигнал флуоресценции (возбуждение при 485 нм, излучение при 520 нм) пропорционален расщеплению желатинового субстрата, а тем самым и каталитической активности зрелого фермента ММР9. Сигналы флуоресценции наносили на график относительно концентрации антител и выводили значения полумаксимального ингибирования (значения IC) из кривых нелинейной регрессии.
Метод "ММР9" использовали для определения способности антител против ММР9 напрямую нейтрализировать каталитическую активность зрелой ММР9. Вкратце, анализ подобен анализу "ММР3/ММР9", но используется каталитически активная расщепляемая каспазой рекомбинантная ММР9 вместо proMMP9, поэтому добавление рекомбинантного каталитического домена ММР3 человека не требуется.
Все антитела по изобретению, которые исследовали, были способны эффективно уменьшать расщепление DQ-желатина в обоих методах ферментативного анализа. Этот результат означает, что все антитела по изобретению блокируют активацию proMMP9 в каталитически активный фермент и/или блокируют каталитическую активность ММР9 (таблица 4, фиг. 6).
50
Антитело F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c по изобретению сравнивали со сравнительным антителом 1 (которое известно как АВ0041 и имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи по SEQ ID NO: 44 и легкой цепи по SEQ ID NO: 45), используя "метод ММР9" с высокоочищенной активированной ММР9. Только антитело F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c по изобретению эффективно снижало расщепление DQ-желатина с IC 2,6 нМ, тогда как сравнительное антитело 1 было неактивным. Этот результат означает, что антитело F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c по изобретению является ингибитором ферментативной активности ММР9, тогда как сравнительное антитело 1 - нет.
50
При анализе "методом ММР3/ММР9" антитело F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c по изобретению и сравнительное антитело 1 эффективно снижали расщепление DQ-желатина с IC 9,52 нМ и 0,20 нМ, соответственно. В целом результаты этих двух ферментативных анализов показывают, что сравнительное антитело 1 является ингибитором активации ММР9, тогда как антитело F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c является ингибитором каталитической активности ММР9, а возможно и ингибитором активации ММР9.
Пример 3. Видоспецифичность некоторых антител против ММР9 по изобретению при анализе ММР3/ММР9
Видоспецифичность ингибирования ферментативной активности у антител против ММР9 оценивали "методом ММР3/ММР9", описанным в примере 2. В качестве фермента использовали про-ММР9 макаки-крабоеда (cyno), крысы или мыши.
Некоторые антитела по изобретению, которые тестировали, оказались способными эффективно блокировать активацию и/или последующую каталитическую активность про-ММР9 макаки-крабоеда (cyno), крысы и мыши (таблицы 5, 6 и 7, соответственно).
Н/о: не определяли
Пример 4. Избирательность по ММР у некоторых антител против ММР9 по изобретению при анализе каталитической активности ММР человека
Избирательность антител против ММР9 оценивали методом оценки опосредованного MMPs расщепления флуорогенного пептидного субстрата OmniMMP™ Red (Enzo, BML-P277-9090), используя набор ММР Inhibitor Profiling Kit (Enzo, BML-AK308). Вкратце, аликвоты рекомбинантного каталитического домена различных ММР человека (ММР1, ММР2, ММР3, ММР8, ММР9, ММР12, ММР13, ММР14 и ММР19) преинкубировали при фиксированной концентрации (100 нМ) исследуемых антител в течение 1 часа. При тестировании в качестве положительного и отрицательного контроля включали ингибитор ММР NNGH (Enzo, BML-PI115-9090) и антитело против ММР2/9 (539A-M0237-D02, сравнительное антитело 3, которое имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи по SEQ ID NO: 64 и легкой цепи по SEQ ID NO: 65), антитело против ММР9 (539А-М0240-В03, сравнительное антитело 2, которое имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи по SEQ ID NO: 46 и легкой цепи по SEQ ID NO: 47) и контрольное изотипное антитело (IgG1 против HEL). Затем добавляли флуорогенный пептидный субстрат и измеряли флуоресценцию. Испускаемый сигнал флуоресценции пропорционален расщеплению пептидного субстрата, а тем самым и активности каталитических доменов ММР. Сигнал флуоресценции в отсутствие ингибитора принимали за 100% активности. Сигнал, полученный в присутствии каждого ингибитора, приводили к этой величине и выражали в процентах остающейся активности.
Все антитела по изобретению, которые тестировали, оказались способными эффективно блокировать каталитическую активность ММР9 человека и в то же время не оказывали существенного влияния на каталитическую активность восьми других ММР человека (фиг. 7). Все антитела по изобретению также не оказывали существенного влияния на каталитическую активность ММР7, ММР10, ММР16 и ММР17 человека (данные не приводятся).
Пример 5. Действенность антител против ММР9 по изобретению при анализе активности с использованием секретируемых нейтрофилами природных форм ММР9 человека
Было описано несколько природных форм ММР9 человека (мономерная ММР9, димерная ММР9 и форма ММР9, связанная с липокалином NGAL (его также называют липокалин-2), который связывается с желатиназой В нейтрофилов, причем эта последняя форма также именуется NGAL/MMP9 (Rudd et al, 1999, Biochemistry, 38, 13937-13950)) и показано, что они связаны с заболеваниями.
Дальнейшая характеристика антител против ММР9 по изобретению включала нейтрализацию природных форм ММР9, происходящих из нейтрофилов. Для этого оценивали функциональную нейтрализацию каталитической активности ММР9 из нейтрофилов в отношении флуорогенного субстрата OmniMMP™ Red (фирмы Enzo) антителами по изобретению.
Активацию фракции proMMP9 в препаратах ММР9 из нейтрофилов проводили путем предобработки АРМА (ацетатом n-аминофенилртути), которая делает доступным каталитический сайт ММР9, перед функциональным анализом нейтрализации с вариантом антитела F20-VH/B08-VLc против ММР9 по изобретению (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c). Вкратце, аликвоты различных активированных АРМА форм про-ММР9 человека из нейтрофилов (мономерной, димерной и NGAL/MMP9) инкубировали с исследуемым антителом в течение 1 часа. В качестве отрицательного контроля при тестировании включали контрольное изотипное антитело (IgG4 против HEL). Затем добавляли флуорогенный пептидный субстрат и измеряли флуоресценцию. Испускаемый сигнал флуоресценции (возбуждение при 540 нм, излучение при 590 нм) пропорционален расщеплению пептидного субстрата, а тем самым и активности каталитических доменов ММР.
Как видно из фиг. 8, вариант антитела F20-VH/B08-VLc по изобретению (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) нейтрализует активность нескольких физиологических форм ММР9 человека: мономерной ММР9, димерной ММР9 и NGAL/MMP9 со 100%-й эффективностью.
Антитело по изобретению сравнивали со сравнительным антителом 1, используя "метод ММР3/ММР9", описанный в примере 2. Вариант антитела F20-VH/B08-VLc по изобретению (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) ингибирует ферментативную активность ММР9 из нейтрофилов человека со 100%-й эффективностью, будь это мономерная или димерная форма или связанная с NGAL (фиг. 9), тогда как сравнительное антитело 1 проявляет лишь частичное ингибирование (25% эффективность) при всех формах ММР9 из нейтрофилов (фиг. 9). Полная нейтрализация всех природных активных форм ММР9 вариантом антитела F20-VH/B08-VLc по изобретению (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) должна трансформироваться в превосходную эффективность у пациентов с высокими уровнями мономерной, димерной ММР9 и/или комплекса NGAL/MMP9 в сыворотке.
Пример 6. Кинетика связывания и сродство к про- и активированной формам ММР9 человека у антител против ММР9 по изобретению
d
D
Связывание антител против ММР9 с рекомбинантным антигеном ММР9 человека характеризовали стандартным методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). На первой стадии антитела против ММР9 захватывались антителом против Fc человека, иммобилизованным на сенсорном чипе BIAcore. На второй стадии титровали про-ММР9 или ММР3-активированную ММР9 от 4,7 до 150 нМ в 2-кратных разведениях. Сенсограммы показывают, что и вариант F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c), и сравнительное антитело 1 хорошо связываются с ММР3-активированной ММР9 (фиг. 10). Сравнительное антитело 1 хорошо связывается и с про-ММР9, но у варианта F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) (фиг. 10) наблюдался лишь минимальный сигнал. В таблице 8 представлено сродство связывания (K) варианта антитела F20-VH/B08-VLc по изобретению (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) и сравнительного антитела 1 в отношении рекомбинантной про-ММР9 человека и ММР3-активированной ММР9. Поскольку при концентрации антитела в 150 нМ связывание составляло менее 1%, то оценка K у варианта антитела F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) для про-ММР9 составила более 15 мкМ.
D
K - равновесная константа диссоциации, рассчитанная из графика
Пример 7. Картирование эпитопов у антител против ММР9 по изобретению
Дальнейшая характеристика антител против ММР9 по изобретению включала идентификацию тех участков ММР9 человека, которые важны для связывания антител и которые в этой связи определяют эпитопы. Эта характеристика проводилась на одном из представителей каждого из антител F20/B08 и F20/B03, а именно F20-VH-GL1-V1-V9-V14/B03-VL-GL1C и F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c.
Для определения эпитопов ММР9, способных специфически связываться с антителами против ММР9 по изобретению, применяли методы химического сшивания и масс-спектрометрии (Peter and Tomer, 2001, Anal. Chem., 73, 4012-4019; Pimenova et al, 2008, J. Mass Spectrom. JMS, 43, 185-195; Herzog et al., 2012, Science 337, 1348-1352). Сначала смешивали антитела по изобретению и про-ММР9 в растворе и подвергали химической сшивке, используя специально разработанные дейтерированные сшивающие реагенты. Затем ММР9 и ковалентно связанный комплекс ММР9-антитело подвергали протеолизу с помощью 3 различных протеолитических ферментов с тем, чтобы генерировать большое количество перекрывающихся пептидов, покрывающих всю последовательность ММР9. Пептиды из самой ММР9 и из сшитого комплекса ММР9-антитело подвергали анализу методом масс-спектрометрии с высоким разрешением (nLC-Orbitrap MS) и сравнивали с тем, чтобы определить взаимодействующие пептиды иммунокомплекса.
Этот анализ показал, что интерфейс взаимодействия между ММР9 человека (SEQ ID NO 1) и антителами по изобретению располагается в пределах 3 прерывистых эпитопов ММР9, которые включают следующие аминокислотные последовательности ММР9:
SEQ ID NO: 41:  (соответствует положениям аминокислот 150-170 в ММР9 человека) (далее именуется участком 1),
SEQ ID NO: 42:  (соответствует положениям аминокислот 198-223 в ММР9 человека) (далее именуется участком 2) и
SEQ ID NO: 43:  (соответствует положениям аминокислот 419-440 в ММР9 человека) (далее именуется участком 3).
Для определения аминокислот, важных для связывания сравнительного антитела 1 с ММР9 (моноклональное АВ0041 мыши, WO 2013/130078), использовали различные рекомбинантные мутанты ММР9 человека. При анализе были идентифицированы остатки E111, D113, R162 и I198 как важные для связывания сравнительного антитела 1 с ММР9 человека. Две из этих аминокислот, R162 и I198, присутствуют в участках эпитопов, распознаваемых антителами против ММР9 по изобретению (участок 1 и участок 2). Однако участок 3 определяет новый эпитопный участок, особенно важный для антител против ММР9 по изобретению. Участок 3 находится в пределах каталитического домена ММР9. Поскольку антитела против ММР9 по изобретению, в отличие от сравнительного антитела 1, способны ингибировать ферментативную активность полностью зрелой ММР9, тогда как сравнительное антитело 1 только связывается с полностью зрелой ММР9, возможно, что связывание с участком 3 придает антителам против ММР9 по изобретению способность к нейтрализации ферментативной активности полностью зрелой ММР9.
Кроме того, при анализе связывания и конкуренции было показано, что моноклональное антитело REGA-3G12 мыши (Martens et al., supra) связывается с пептидом G171-L187 из ММР9 человека. Участок ММР9 (G171-L187), с которым связывается антитело REGA-3G12, находится за пределами 3 участков ММР9, распознаваемых антителами против ММР9 по изобретению.
Пример 8. Прямое связывание и конкурентное связывание антител против ММР9 с про- и активированной формами ММР9 человека
450
620
Способность антител против ММР9 к прямому связыванию с про-ММР9 человека и ММР3-активированной ММР9 человека, соответственно, оценивали по стандартной методике ELISA. Вкратце, 96-луночные планшеты покрывали (2,5 мкг/мл) одной из форм ММР9 в течение 16 ч при комнатной температуре. После 2-часовой инкубации с блокирующим буфером (2% козьей сыворотки в PBS/Tween) и 4 отмывок промывочным буфером (PBS/Tween 0,05% об./об.) добавляли различные концентрации биотинилированных антител против ММР9 (сравнительное антитело 1 или вариант F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) в двух повторах и инкубировали в течение 1 ч. Затем лунки отмывали четыре раза и проявляли связавшиеся биотинилированные антитела с помощью конъюгированного с HRP стрептавидина и субстрата ТМВ. Считывали поглощение при 450 нм и 620 нм по каждой из двойных проб и выражали данные в виде скорректированного поглощения (А-А). Представленные на фиг. 11 результаты показывают, что и сравнительное антитело 1, и вариант антитела F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) против ММР9 сильно связываются с ММР3-активированной ММР9 (фиг. 11В) дозозависимым образом. Напротив, хотя сравнительное антитело 1 хорошо связывается с про-ММР9 дозозависимым образом (фиг. 11А), вариант антитела F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) против ММР9 проявляет заметное связывание с про-ММР9 только при самой высокой концентрации (5 мкг/мл) (фиг. 11А).
Чтобы проверить, будет ли вариант антитела F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) конкурировать со сравнительным антителом 1 за связывание с ММР9, использовали тот же метод ELISA с фиксацией ММР3-активированной ММР9, только очищенный вариант антитела F20-VH/B08-VLc или сравнительное антитело 1 добавляли за 2 часа до добавления биотинилированных антител против ММР9. После 4 отмывок промывочным буфером добавляли заранее определенную оптимальную дозу биотинилированного сравнительного антитела 1 или F20-VH/B08-VLc и инкубировали в течение 1 часа. Представленные на фиг. 11 результаты на панели С показывают, что добавление варианта антитела F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) против ММР9 не препятствует связыванию сравнительного антитела 1 с ММР9, тогда как такая же концентрация очищенного сравнительного антитела 1 полностью предотвращает дальнейшее связывание биотинилированного сравнительного антитела 1 с ММР9.
В совокупности эти эксперименты по связыванию показывают, что, в отличие от сравнительного антитела 1, вариант антитела F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) против ММР9 предпочтительно связывается с активной формой ММР9, чем с про-ММР9, и что он не конкурирует со сравнительным антителом 1 за связывание с ММР9.
Пример 9. Эффект антитела против ММР9 по изобретению при анализе инвазии раковых клеток
6
Инвазию клеток раковой линии оценивали на покрытых матригелем планшетах типа Transwell. Вставные мембраны транслунок (входящие в набор фирмы Cultrex - 3455-024) покрывали экстрактом базальных мембран (ВМЕ×0,5, входит в набор фирмы Cultrex) и инкубировали 24 часа при 37°С. В то же время клетки MGC803 (раковой линии клеток желудка человека - Easy-Bio, Китай) подвергали голоданию в культуральной среде RPMI (Gibco - 52400025), лишенной сыворотки (среда голодания). Затем клетки извлекали и ресуспендировали при 0,5×10 клеток/мл в среде голодания, содержащей 100 нг/мл РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат фирмы Sigma - Р8139) и либо 25 мкМ ингибитора ММР (GM-6001 фирмы Millipore - СС1000), 10 мкг/мл антитела против ММР9 (варианта F20-VH/B08-VLc - F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c), 10 мкг/мл антитела против IgG4 (изотипный контроль) или ничего (среда). В покрытые матригелем транслунки вносили 100 мкл обработанных клеток и добавляли 500 мкл среды RPMI, содержащей 10% FCS, в нижнюю часть транслунки. Планшеты инкубировали 16 часов при 37°С. Инвазию клеток определяли путем инкубации нижней части мембраны транслунок с кальцеин-АМ, расщепление которого на флуоресцентный кальцеин пропорционально количеству клеток. Испускаемый сигнал флуоресценции (возбуждение при 485 нм, излучение при 520 нм) отражает эффективность инвазии клеток через матригель.
Результаты показывают, что вариант антитела F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) против ММР-9 эффективно ингибирует миграцию раковых клеток MGC803 через матригель с такой же эффективностью, как и ингибитор ММР GM-6001 (фиг. 12). Поскольку метастатические клетки выходят из своего места происхождения путем инвазии окружающих тканей, включая базальные мембраны, то этот результат означает, что антитела против ММР9 по изобретению могли бы стать эффективным антимиграционным и антиинвазивным средством при метастазирующем раке.
Пример 10. Действие антитела против ММР9 по изобретению на модели колита у мышей
Модель вызванного декстран-сульфатом натрия (DSS) колита широко применяется в доклинических исследованиях в качестве модели воспалительной болезни кишечника (IBD). Препараты, которые одобрены для лечения язвенного колита, как-то стероиды, метронидазол, 5'-аминосалицилаты, циклоспорин и иммунотерапия антителами против TNFα, оказались эффективными в уменьшении тяжести заболевания на модели DSS, свидетельствуя, что эта модель является релевантной моделью для переноса данных по мышам на заболевание человека (Perse et al., 2012, J. Biomed. Biotechnol., 2012: 718-617). Колит у мышей вызывают добавлением DSS в питьевую воду, что приводит к повреждению слизистой оболочки толстой кишки. Клинические проявления DSS-колита в острой фазе могут включать потерю веса и диарею. Типичные гистологические изменения при остром DSS-колите аналогичны тем, что наблюдаются при IBD человека, и включают истощение муцина, дегенерацию и некроз эпителия, что ведет к исчезновению эпителиальных клеток. Последнее сопровождается инфильтрацией нейтрофилов в базальную мембрану и подслизистую оболочку, криптитом, абсцессом кишечных крипт и воспалением слизистой и подслизистой оболочки толстой кишки.
Терапевтическую эффективность антитела против ММР9 по изобретению оценивали на модели индуцированного DSS колита у мышей BALB/c. Колит индуцировали добавлением 4% (мас./об.) DSS в питьевую воду на протяжении 5 дней. Группам из 10 мышей вводили внутрибрюшинно антитело F20-VH/B08-VLc (вариант F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) или контрольные изотипные антитела (IgG4) в дозе 30 мг/кг на 6, 9 и 12-й день и забивали животных на 14-й день.
Течение болезни оценивали слепым методом по видеоэндоскопии нижней части толстой кишки на 6, 10 и 14-й день. Колит оценивали визуально по шкале от 0 до 14 на основании степени изъязвления, васкуляризации и гранулярности, отмеченной в ткани, и длины пораженных участков толстой кишки следующим образом: изъязвление (0, 1, 2 или 3), гранулярность (0, 1, 2 или 3), эритема (0, 1, 2 или 3), длина пораженного участка (0, 1: локализованный, 2: диффузный). Каждой мыши присваивали баллы эндоскопического показателя, соответствующие повреждению, наблюдавшемуся по всей длине толстой кишки. Животных, у которых эндоскопический показатель составлял <5 баллов на 6-й день, до начала лечения антителом, считали недостаточно серьезно заболевшими и исключали из дальнейшего анализа. Как видно из фиг. 13, на 6-й день обе группы имели близкие средние эндоскопические показатели, тогда как под конец исследования на 14-й день у животных, получавших F20-VH/B08-VLc, наблюдалось значительное улучшение (р=0,005) по среднему эндоскопическому показателю в сравнении с группой, получавшей контрольное изотипное антитело.
Под конец исследования (на 14-й день) у каждой мыши отсекали дистальную часть толстой кишки, фиксировали формалином, заключали в парафин и делали срезы для гистологии. Все срезы окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали слепым методом в отношении опытных групп. Ткани оценивали на повреждение эпителия и инфильтрацию воспалительных клеток по шкале от 1 до 4 баллов по каждому параметру. Гистологический показатель представляет собой сумму баллов по повреждению эпителия и инфильтрации воспалительных клеток и поэтому составляет от 0 до 8. Результаты представлены на фиг. 14.
У обработанных DSS мышей развивался колит, характеризующийся гиперплазией эпителия и истощением бокаловидных клеток, инфильтрацией воспалительных клеток в слизистую и подслизистую оболочку. На некоторых поперечных срезах толстой кишки также наблюдались абсцессы кишечных крипт, эрозия и изъязвление слизистых оболочек. Как видно из фиг. 13, анализ гистологических показателей показал, что обработка антителом против ММР9 была связана со снижением среднего показателя тяжести колита у получавшей F20-VH/B08-VLc группы по сравнению с контрольной группой, получавшей изотипное антитело. Аналогичным образом средние баллы по инфильтрации воспалительных клеток и повреждении эпителия также снижались при обработке антителом против ММР9 по сравнению с контрольной группой, получавшей изотипное антитело.
Пример 11. Действие антитела против ММР9 по изобретению на модели кишечного фиброза у мышей с гетеротопическими трансплантатами
Главным признаком воспалительной болезни кишечника (IBD) является тяжелое повреждение ткани слизистой оболочки. Повреждение ткани запускает репарационные действия окружающих клеток. Быстрое закрытие раны важно для сокращения времени, в течение которого нарушается барьерная функция стенки кишечника, но чрезмерная репарация ткани способствует фиброзу, обычному явлению при болезни Крона (CD). Фиброз приводит к образованию стриктур у 10-40% пациентов (Cosnes et al., 2002, Inflamm. Bowel Dis., 8(4): 244-50; Freeman, 2003, J. Clin. Gastroenerol., 37(3): 216-9), показанию к операции примерно у 80% пораженных стриктурами пациентов (Cosnes et al., 2002, supra).
Гетеротопическая трансплантация взятых при резекции участков кишечника у мышей ведет к исчезновению кишечного эпителия и завершается фиброзной окклюзией просвета кишечника, воспроизводя гистологические и молекулярные признаки фиброза кишечника у человека, как-то утолщение люминальной стенки, чрезмерное отложение коллагена и экспрессия профибротических медиаторов.
Донорские (помеченные зеленым флуоресцентным белком мыши C57BL/6-Tg UBC-GFP) участки резекции тонкой кишки трансплантировали подкожно в затылки мышей-реципиентов C57BL/6. Через 5, 8 и 10 дней мышам вводили внутрибрюшинно 30 мг/кг антитела против ММР9 по изобретению (F20-VH/B08-VLc, вариант F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) или контрольного изотипного антитела (IgG4), по 5 мышей на группу. Через 14 дней после трансплантации небольшие привитые участки кишечника подвергали эксплантации. После этого каждый эксплантат делили на три равных сегмента. Центральный сегмент фиксировали в 4%-ном формалине и готовили для гистопатологической оценки. Два внешних сегмента быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С до выделения РНК или белка.
Гистологические поперечные срезы окрашивали с помощью Sirius red, чтобы подкрасить коллаген (красным цветом). Толщину коллагенового слоя определяли независимые исследователи, не знавшие о типе эксперимента. Микроскопическую оценку проводили с помощью AxioCam MRc5 на микроскопе Zeiss Axiophot. Толщину коллагенового слоя измеряли с помощью программы AxioVision версии 4.7.2 (Zeiss). Толщину рассчитывали из восьми мест в репрезентативных зонах (по 8 образцов для каждой временной точки) при 100-кратном увеличении. Статистический анализ проводили с помощью программы Prism 6. Для сравнения между группами использовали непарный t-критерий.
По сравнению с изотипным контролем, обработка антителом F20-VH/B08-VLc против ММР9 дает существенную защиту от потери эпителиальной структуры у гетеротопических трансплантатов кишечника, как видно из фиг. 15, и значительно (р<0,0001) уменьшает толщину коллагенового слоя в гетеротопических трансплантатах кишечника, как видно из фиг. 16. Этот результат означает, что антитела против ММР9 по изобретению могли бы быть эффективными при фиброзных заболеваниях и фистулизирующей болезни Крона.
Пример 12. Влияние антител против ММР9 на мышей Swiss nude, несущих подкожно раковые клетки НСТ-116 толстой кишки человека
7
3
Клетки раковой линии НСТ-116 толстой кишки человека (1×10 клеток) вводили подкожно в правый бок мышей nude и давали им вырасти до ≈100 мм перед началом обработки. Внутрибрюшинно вводили антитело против ММР9 по изобретению F20-VH/B08-VLC, вариант F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c, или контрольное изотипное антитело типа IgG4 в течение 3 недель. Мышам давали ударную дозу антител по 50 мг/кг в первый день обработки, а после этого вводили два раза в неделю по 30 мг/кг. Через 21 день после начала обработки мышей забивали и извлекали первичные опухоли и органы с метастазами для анализа. Измеряли вес и размеры первичных опухолей и подсчитывали количество видимых метастатических очагов в лимфатических узлах, печени, легких и брюшине.
Список последовательностей
Аминокислотная последовательность ММР9 человека (номер последовательности в NCBI: NP_004985.2)
SEQ ID NO: 1
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR1 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 2:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 3:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR3 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 4:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V1 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 5:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V4 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 6:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V9 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 7:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V1-V9 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 8:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V4-V9 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 9:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR3-V14 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 10:
Аминокислотная последовательность F20-VH тяжелой цепи
SEQ ID NO: 11:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 12:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V1 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 13:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V4 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 14:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V9 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 15:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V14 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 16:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V1-V9 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 17:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V1-V9-V14 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 18:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V4-V9 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 19:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V4-V9-V14 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 20:
Аминокислотная последовательность B03-VL-CDR1 легкой цепи
SEQ ID NO: 21:
Аминокислотная последовательность B03-VL-CDR2 легкой цепи
SEQ ID NO: 22:
Аминокислотная последовательность B03-VL-CDR3 легкой цепи
SEQ ID NO: 23:
Аминокислотная последовательность B03-VL легкой цепи
SEQ ID NO: 24:
Аминокислотная последовательность B03-VL-GL1 легкой цепи
SEQ ID NO: 25:
Аминокислотная последовательность B08-VL-CDR1 легкой цепи
SEQ ID NO: 26:
Аминокислотная последовательность B08-VL-CDR2 легкой цепи
SEQ ID NO: 27:
Аминокислотная последовательность B08-VL-CDR3 легкой цепи
SEQ ID NO: 28:
Аминокислотная последовательность B08-VL легкой цепи
SEQ ID NO: 29:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL6 легкой цепи
SEQ ID NO: 30:
Нуклеотидная последовательность F20-VH-CDR1 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 31:
Нуклеотидная последовательность F20-VH-CDR2 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 32:
Нуклеотидная последовательность F20-VH-CDR3 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 33:
Нуклеотидная последовательность B03-VL-CDR1 легкой цепи
SEQ ID NO: 34:
Нуклеотидная последовательность B03-VL-CDR2 легкой цепи
SEQ ID NO: 35:
Нуклеотидная последовательность B03-VL-CDR3 легкой цепи
SEQ ID NO: 36:
Нуклеотидная последовательность B08-VL-CDR1 легкой цепи
SEQ ID NO: 37:
Нуклеотидная последовательность B08-VL-CDR2 легкой цепи
SEQ ID NO: 38:
Нуклеотидная последовательность B08-VL-CDR3 легкой цепи
SEQ ID NO: 39:
Аминокислотная последовательность генноинженерной константной области тяжелой цепи IgG4 человека
SEQ ID NO: 40:
Аминокислотная последовательность 1-го участка, входящего в состав эпитопа ММР9
SEQ ID NO: 41:
Аминокислотная последовательность 2-го участка, входящего в состав эпитопа ММР9
SEQ ID NO: 42:
Аминокислотная последовательность 3-го участка, входящего в состав эпитопа ММР9
SEQ ID NO: 43:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи сравнительного антитела 1 (известного как АВ0041)
SEQ ID NO: 44:
Аминокислотная последовательность легкой цепи сравнительного антитела 1 (известного как АВ0041)
SEQ ID NO: 45:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи сравнительного антитела 2 (известного как 539А-М0240-В03)
SEQ ID NO: 46:
Аминокислотная последовательность легкой цепи сравнительного антитела 2 (известного как 539А-М0240-В03)
SEQ ID NO: 47:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL2 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 48:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V2 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 49:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V3 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 50:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR2-V11 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 51:
Аминокислотная последовательность F20-VH-CDR3-V13 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 52:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V2 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 53:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V3 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 54:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V11 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 55:
Аминокислотная последовательность F20-VH-GL1-V13 тяжелой цепи
SEQ ID NO: 56:
Аминокислотная последовательность B03-VL-GL2 легкой цепи
SEQ ID NO: 57:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL1 легкой цепи
SEQ ID NO: 58:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL2 легкой цепи
SEQ ID NO: 59:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL3 легкой цепи
SEQ ID NO: 60:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL4 легкой цепи
SEQ ID NO: 61:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL5 легкой цепи
SEQ ID NO: 62:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL7 легкой цепи
SEQ ID NO: 63:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи сравнительного антитела 3 (известного как 539A-M0237-D02)
SEQ ID NO: 64:
Аминокислотная последовательность легкой цепи сравнительного антитела 3 (известного как 539A-M0237-D02)
SEQ ID NO: 65:
Аминокислотная последовательность генноинженерной константной области легкой цепи IgG4 человека
SEQ ID NO: 66:
Аминокислотная последовательность В03-VLc легкой цепи
SEQ ID NO: 67:
Аминокислотная последовательность В03-VL-GL1c легкой цепи
SEQ ID NO: 68:
Аминокислотная последовательность B08-VLc легкой цепи
SEQ ID NO: 69:
Аминокислотная последовательность B08-VL-GL6c легкой цепи
SEQ ID NO: 70:
Аминокислотная последовательность, объединяющая вариабельную область тяжелой цепи F20-VH-GL1-V1-V9 (SEQ ID NO: 17) и константную область тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 40)
SEQ ID NO: 71:
Аминокислотная последовательность, объединяющая вариабельную область тяжелой цепи F20-VH-GL1-V1-V9-V14(SEQ ID NO: 18) и константную область тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 40)
SEQ ID NO: 72:
Аминокислотная последовательность, объединяющая вариабельную область тяжелой цепи F20-VH-GL1-V4-V9 (SEQ ID NO: 19) и константную область тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 40)
SEQ ID NO: 73:
Аминокислотная последовательность, объединяющая вариабельную область тяжелой цепи F20-VH-GL1-V4-V9-V14 (SEQ ID NO: 20) и константную область тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 40)
SEQ ID NO: 74:
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  CALYPSO BIOTECH SA
MERCK PATENT GMBH
<120>  ANTIBODIES SPECIFIC FOR MMP9
<130>  P1750PC00
<150>  EP14180765
<151>  2014-08-13
<160>  70
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  707
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys
1               5                   10                  15
Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro
20                  25                  30
Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr
35                  40                  45
Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser
50                  55                  60
Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr
85                  90                  95
Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly
100                 105                 110
Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr
115                 120                 125
Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala
130                 135                 140
Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly
165                 170                 175
Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe
180                 185                 190
Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu
195                 200                 205
Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn
210                 215                 220
Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser
225                 230                 235                 240
Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys
245                 250                 255
Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro
260                 265                 270
Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys
275                 280                 285
Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr
290                 295                 300
Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr
305                 310                 315                 320
Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr
325                 330                 335
Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr
340                 345                 350
Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp
355                 360                 365
Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys
370                 375                 380
Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala
385                 390                 395                 400
His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu
405                 410                 415
Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His
420                 425                 430
Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu
435                 440                 445
Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro
450                 455                 460
Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg
465                 470                 475                 480
Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro
485                 490                 495
Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val
500                 505                 510
Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly
515                 520                 525
Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu
530                 535                 540
Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp
545                 550                 555                 560
Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser
565                 570                 575
Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly
580                 585                 590
Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala
595                 600                 605
Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met
610                 615                 620
Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln
625                 630                 635                 640
Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly
645                 650                 655
Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr
660                 665                 670
Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu
675                 680                 685
Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys
690                 695                 700
Pro Glu Asp
705
<210>  2
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR1
<400>  2
Asp Tyr Pro Met His
1               5
<210>  3
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2
<400>  3
Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  4
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR3
<400>  4
Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  5
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V1
<400>  5
Gly Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  6
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V4
<400>  6
Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  7
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V9
<400>  7
Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  8
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V1-V9
<400>  8
Gly Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  9
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V4-V9
<400>  9
Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  10
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR3-V14
<400>  10
Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Gly Ile Asp Val
20
<210>  11
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH
<400>  11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  12
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  F20-VH-GL1
<400>  12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  13
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V1
<400>  13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  14
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V4
<400>  14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  15
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V9
<400>  15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  16
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V14
<400>  16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  17
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V1-V9
<400>  17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  18
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V1-V9-V14
<400>  18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  19
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V4-V9
<400>  19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  20
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V4-V9-V14
<400>  20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  21
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-CDR1
<400>  21
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1               5                   10
<210>  22
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-CDR2
<400>  22
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1               5
<210>  23
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-CDR3
<400>  23
Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His Arg Val Val Leu
1               5                   10
<210>  24
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL
<400>  24
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr
35                  40                  45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Ser Ser Gly Asn Thr Val Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His
85                  90                  95
Arg Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210>  25
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-GL1
<400>  25
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr
35                  40                  45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Ser Ser Gly Asn Thr Val Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His
85                  90                  95
Arg Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210>  26
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-CDR1
<400>  26
Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr Asn Arg Val Ser
1               5                   10
<210>  27
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-CDR2
<400>  27
Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser
1               5
<210>  28
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-CDR3
<400>  28
Thr Ser Tyr Ser Ser Ser Thr Thr Ser Tyr Val Val
1               5                   10
<210>  29
<211>  113
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL
<400>  29
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Leu Ala Ala Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
Gly
<210>  30
<211>  113
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL6
<400>  30
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
Gly
<210>  31
<211>  15
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR1
<400>  31
gactacccca tgcac                                                        15
<210>  32
<211>  51
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2
<400>  32
ggcatctcct ccaactccgg ctccgtgggc tacgccgact ccgtgaaggg c                51
<210>  33
<211>  60
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR3
<400>  33
gacaagatct actacggctc cggctcctac gacttctact actactacgg catggacgtg       60
<210>  34
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-CDR1
<400>  34
caaggcgatt ctctgcgctc atattatgct tct                                    33
<210>  35
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-CDR2
<400>  35
ggaaaaaaca accgaccatc t                                                 21
<210>  36
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-CDR3
<400>  36
caatctcgag acaatatagg gaaccataga gttgttctg                              39
<210>  37
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-CDR1
<400>  37
acaggaacgt ctaatgatgt gggggcttac aatcgcgtca gt                          42
<210>  38
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-CDR2
<400>  38
ggcgtgtcta acaggcctag c                                                 21
<210>  39
<211>  36
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-CDR3
<400>  39
acaagctaca gtagcagtac cacatcatat gtcgtc                                 36
<210>  40
<211>  326
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Engineered human IgG4 heavy chain constant region
<400>  40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210>  41
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  region 1 comprised in MMP9 epitope
<400>  41
Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr Ser Arg Asp Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Val Ile Gln Phe
20
<210>  42
<211>  26
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  region 2 comprised in MMP9 epitope
<400>  42
Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Leu Trp Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly
20                  25
<210>  43
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  region 3 comprised in MMP9 epitope
<400>  43
Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His Lys Asp
1               5                   10                  15
Asp Val Asn Gly Ile Arg
20
<210>  44
<211>  441
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain of comparative antibody 1
<400>  44
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115                 120                 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130                 135                 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165                 170                 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180                 185                 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195                 200                 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210                 215                 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245                 250                 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260                 265                 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275                 280                 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290                 295                 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305                 310                 315                 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325                 330                 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340                 345                 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355                 360                 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370                 375                 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405                 410                 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420                 425                 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435                 440
<210>  45
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain of comparative antibody 1
<400>  45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Thr
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  46
<211>  454
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain of comparative antibody 2
<400>  46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Gln Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Pro Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Glu Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Pro Gly Ala Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115                 120                 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130                 135                 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145                 150                 155                 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165                 170                 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180                 185                 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195                 200                 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210                 215                 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245                 250                 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290                 295                 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305                 310                 315                 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325                 330                 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340                 345                 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355                 360                 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370                 375                 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385                 390                 395                 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405                 410                 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420                 425                 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>  47
<211>  216
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain of comparative antibody 2
<400>  47
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85                  90                  95
Tyr Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  48
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL2
<400>  48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  49
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V2
<400>  49
Gly Ile Ser Ser His Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  50
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V3
<400>  50
Gly Ile Ser Ser Lys Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  51
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR2-V11
<400>  51
Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  52
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-CDR3-V13
<400>  52
Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Gly Leu Asp Val
20
<210>  53
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V2
<400>  53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser His Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  54
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V3
<400>  54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Lys Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  55
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V11
<400>  55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  56
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain F20-VH-GL1-V13
<400>  56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  57
<211>  110
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-GL2
<400>  57
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35                  40                  45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His
85                  90                  95
Arg Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  58
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL1
<400>  58
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  59
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL2
<400>  59
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  60
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL3
<400>  60
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  61
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL4
<400>  61
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  62
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL5
<400>  62
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  63
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL7
<400>  63
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  64
<211>  454
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  heavy chain of comparative antibody 3
<400>  64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
20                  25                  30
Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Val Pro Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Asp Arg Ala Tyr Gly Asp Tyr Val Gly Trp Asn Gly Phe Asp
100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115                 120                 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130                 135                 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145                 150                 155                 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165                 170                 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180                 185                 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195                 200                 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210                 215                 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245                 250                 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290                 295                 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305                 310                 315                 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325                 330                 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340                 345                 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355                 360                 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370                 375                 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385                 390                 395                 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405                 410                 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420                 425                 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>  65
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain of comparative antibody 3
<400>  65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Phe
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  66
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  engineered human IgG4 light chain constant region
<400>  66
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20                  25                  30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35                  40                  45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50                  55                  60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65                  70                  75                  80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85                  90                  95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100                 105
<210>  67
<211>  110
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VLc
<400>  67
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr
35                  40                  45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Ser Ser Gly Asn Thr Val Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His
85                  90                  95
Arg Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  68
<211>  110
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B03-VL-GL1c
<400>  68
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr
35                  40                  45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Ser Ser Gly Asn Thr Val Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His
85                  90                  95
Arg Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  69
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VLc
<400>  69
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Leu Ala Ala Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  70
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  light chain B08-VL-GL6c
<400>  70
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  71
<211>  455
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Amino acid sequence combining heavy chain variable region
F20-VH-GL1-V1-V9 (SEQ ID NO: 17) and an IgG4 heavy chain constant
region (SEQ ID NO: 40)
<400>  71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
130                 135                 140
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
195                 200                 205
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
325                 330                 335
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450                 455
<210>  72
<211>  455
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Amino acid sequence combining heavy chain variable region
F20-VH-GL1-V1-V9-V14(SEQ ID NO: 18) and an IgG4 heavy chain
constant region (SEQ ID NO: 40)
<400>  72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
130                 135                 140
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
195                 200                 205
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
325                 330                 335
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450                 455
<210>  73
<211>  455
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Amino acid sequence combining heavy chain variable region
F20-VH-GL1-V4-V9 (SEQ ID NO: 19) and an IgG4 heavy chain constant
region (SEQ ID NO: 40)
<400>  73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
130                 135                 140
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
195                 200                 205
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
325                 330                 335
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450                 455
<210>  74
<211>  455
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Amino acid sequence combining heavy chain variable region
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 (SEQ ID NO: 20) and an IgG4 heavy chain
constant region (SEQ ID NO: 40)
<400>  74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Glu Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
130                 135                 140
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
195                 200                 205
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
325                 330                 335
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450                 455
<---