Клинико-иммунологические и цитогенетические аспекты патогенеза спастических форм детского церебрального паралича

Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 6, стр. 507-512 © 2012, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА СПАСТИЧЕСКИХ ФОРМ ДЕТСКОГО ЦЕРЕБРАЛЬНОГО ПАрАЛИЧА

Гайнетдинова Д.Д., Гайсина Л.З., Хакимова Р.Ф.

Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Казань

Резюме. В последние годы в генезе детского церебрального паралича большое значение придается изменениям в перивентрикулярной области (в частности, перивентрикулярной лейкомаляции). Важным патогенетическим механизмом, определяющим внутриутробное повреждение мозга, вероятно, является иммунопатологический процесс. Проведенный анализ клинико-цитогенетических и иммунологических (содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов, функциональная активность фагоцитов, количественное содержание фактора некроза опухоли-а в сыворотке крови и слюнной жидкости) параметров у детей с перивентрикулярной лейкомаляцией с исходом в спастические формы ДЦП в возрасте от 1 до 4-х лет показал угнетение клеточного иммунитета, увеличение окислительно-восстановительной активности нейтрофилов и повышение содержания фактора некроза опухоли-а в сыворотке периферической крови и слюнной жидкости. Установлена взаимосвязь уровня нестабильности генома с содержанием цитокина фактора некроза опухоли-а, что свидетельствует о существовании активных иммунопатолгических процессов в организме больных ДЦП в исходе перивентрикулярной лейкомаляции.

Ключевые слова: детский церебральный паралич, перивентрикулярная лейкомаляция, нестабильность генома, фактор некроза опухоли-а, иммунный статус.

Gaynetdinova D.D., Gaysina L.Z., Khakimova R.F.

CLINICO-IMMUNOLOGIC AND CYTOGENETIC ASPECTS OF PATHOGENESIS IN SPASTIC INFANTILE Cerebral pARALYSIS

abstract. Over recent years of studies in infantile cerebral paralysis

Keywords: infantile cerebral paralysis, periventricular leukomalacia, gemone instability, TNF, immune state.

Адрес для переписки:

Гайсина Лейсан Закиевна, аспирантка кафедры неврологии, нейрохирургии, медицинской генетики, КГМУФА по здравоохранению и социальному развитию, г. Казань

425570, Республика Марий Эл, Параньга, ул. Хасанова, д. 6а E-mail: lisenok_af@list.ru

Введение

Проблема изучения перинатальной патологии нервной системы у детей раннего возраста остается в настоящее время наиболее актуальной. Среди детей, впервые признанных инвалидами, 57% составляют больные детским церебральным

507

Гайнетдинова Д.Д., Гайсина Л.З., Хакимова Р.Ф.

Медицинская Иммунология

параличом (ДЦП) [1, 9]. Данные литературы свидетельствуют о том, что в патогенезе ДЦП основную роль играют гипоксические и ишемические изменения головного мозга, в особенности пе-ривентрикулярной области (ПВО), приводящие к деструктивным процессам мозгового вещества и лейкомаляции с необратимыми последствиями [13, 15, 17]. В литературе имеется предположение о том, что среди множества патогенетических аспектов стойкости двигательного дефицита при ДЦП нестабильность клеточного генома играет немаловажное значение [4, 5, 14, 19]. Предполагается, что в основе этого явления лежит интенсификация в организме больных ДЦП процессов мутагенеза, за счёт усиленной генерации эндомутагенов (например, активных форм кислорода, цитокинов). В то же время, как сами механизмы дестабилизации генома, так и процессы их поддерживающие, остаются малоизученными [2, 7, 11, 12]. Среди маркеров нейродеструктивных и репаративных механизмов, исследуемых в последнее время у больных с гипоксически-ишеми-ческими поражениями ЦНС, особое внимание уделяется цитокинам, основную роль из которых многие исследователи отводят фактору некроза опухоли-а (TNFa), повреждающее действие которого проявляется в индукции программированной гибели клеток с включением процессов дестабилизации клеточного генома [5, 6, 9]. Важным патогенетическим механизмом, определяющим внутриутробное повреждение мозга является, вероятно, и иммунопатологический процесс.

Цель исследования: изучить особенности

иммунного статуса и уровня TNFa при нестабильности клеточного генома у детей с ПВЛ в неонатальном возрасте, в исходе которой сформировались спастические формы ДЦП.

Материалы и методы

Объектом исследования явились 55 детей от 1 до 4-х лет: 35 детей с ранней резидуальной стадией ДЦП (основная группа) и 20 практически здоровых детей аналогичного возраста (контрольная группа). В исследование включались дети, у которых отсутствовали клинические и лабораторные данные о перенесенной в неонатальном периоде ВУИ и инфекционного процесса за 30 дней до и в момент исследования. Патология ПВО устанавливалась на основании нейросонографии в возрасте до одного года (по имеющимся протоколам в амбулаторной карте) и после установления диагноза ДЦП (в возрасте старше 1 года) по результатам компьютерной или магнитно-резонансной томографии. Основная группа включала 25 детей со спастической диплегией и 10 — с гемипарети-ческой формой ДЦП. При нейровизуализации у 20 детей (36%) основной группы выявлены при-

знаки перенесенной ПВЛ. У 15 детей (27%) нейровизуализация не выявила каких-либо находок в головном мозге, в том числе и в ПВО.

Степень неврологического дефицита у больных ДЦП оценивалась по шкалам: спастичности Ashworth (1964); Клуба Моторики (по A. Ashburn, 1982; D. Wade, 2000); моторики Ривермид (по F. Collen и соавт., 1990), адаптированным к детскому возрасту. Степень тяжести ДЦП оценивалась по сумме баллов каждой шкалы.

Для выявления цитогенетических аномалий в соматических клетках использовался метод учета микроядер в эритроцитах периферической крови. Забор крови для исследования производился в первый день поступления больного в стационар до начала лечения. Регистрация эритроцитов с микроядрами (ЭМ) в периферической крови осуществлялось согласно методике микроядерного теста (Shmid W, 1975).

Исследование иммунного статуса проводилось с использованием иммунологических методов. Фенотипирование лимфоцитов проводилось методом проточной цитофлюориме-трии; содержание иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови изучалось методом радиальной иммунодиффузии в геле по Manchini D. (1965) с использованием тест-систем в соответствии с прилагаемыми инструкциями; фагоцитарная и окислительно-восстановительная активность нейтрофилов определялась в тесте фагоцитоза и НСТ-тесте; количественное определение TNFa в сыворотке крови и слюне изучалось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов «а-ФНО-ИФА-Бест» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc, США): производился подсчет среднего арифметического значения, стандартного отклонения, параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни и коэффициента корреляции (R) по Пирсону. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Цитогенетическое исследование выявило достоверное повышение среднего числа ЭМ в группе детей с ДЦП по сравнению с показателями спонтанного мутагенеза (0,79±0,21% и 0,29±0,18% соответственно; p < 0,05). Показатель цитогенетических нарушений в эритроцитах колеблется от минимальных (0,56±0,19%) при гемипарети-ческой форме до максимальных (0,98±0,25%) при спастической диплегии (p < 0,05). Изучение уровня нестабильности генома в зависимости от нейровизуализационных находок в ПВО обна-

508

2012, Т. 14, № 6

Клинико-иммунологические аспекты ДЦП

ружило достоверное преобладание активности эндомутагенеза у детей, перенесших ПВЛ в неонатальном возрасте, по сравнению с детьми без каких-либо изменений в головном мозге, в т.ч. и в ПВО (0,94±0,15% и 0,59±0,06% соответственно; р < 0,05). При этом у больных со спастической диплегией число ЭМ достоверно выше в группе детей, перенесших ПВЛ (0,89±0,17%) по сравнению с детьми, не имевшими изменения в ПВО (0,76±0,12%) (р < 0,05). Более выраженный феномен нестабильности клеточного генома у детей со спастической диплегией, сформировавшейся в исходе ПВЛ, позволяет предположить существование активных процессов эндомутагенеза у этих больных.

Между степенью тяжести двигательных нарушений, установленной различными, адаптированными к детскому возрасту, шкалами и уровнем нестабильности клеточного генома, оцененного микроядерным тестом, выявлена корреляционная зависимость (рис. 1).

Анализ показал, что наиболее чувствительной оказалась шкала Ривермид (R = -0,41), продемонстрировавшая изучаемую взаимосвязь: чем тяжелее неврологический дефицит, тем более выраженные процессы эндомутагенеза протекают у больных ДЦП.

В связи с этим проведено изучение показателей иммунного статуса и содержание цитокина TNFa в сыворотке крови и слюне у обследованных детей. Результаты проведенного фенотипирования лимфоцитов свидетельствуют о выраженном дефиците основных популяций лимфоцитов в целом, и субпопуляций Т-лимфоцитов. Так, абсолютное содержание CD3+ лимфоцитов у детей, больных ДЦП, составило 1,67 х 109 /л, тогда как у здоровых — 2,74 х 109 /л (р < 0,05). При этом отмечался достоверно более низкий уровень CD3+CD4+ и CD3+CD8+ лимфоцитов у детей основной группы по сравнению с контрольной (соответственно, 0,77 х 109 /л и 1,77 х 109 /л, р < 0,01; 0,74 х 109 /л и 0,97 х 109 /л, р < 0,05). Наряду с этим выявлено снижение количества циркулирующих CD19+ лимфоцитов в группе детей с ДЦП в отличие от контрольной (0,67 х 109 /л и 1,18 х 109 /л,

р < 0,01).

Сравнительный анализ показателей клеточного звена иммунитета у детей с ДЦП в зависимости от нейровизуализационных находок в ПВО выявил наиболее низкие показатели CD19+ лимфоцитов и CD3+CD4+ лимфоцитов (0,87 х 109 /л и 0,66 х 109 /л соответственно; р < 0,05) у детей, перенесших ПВЛ, по сравнению с контрольной группой (1,18 х 109 /л и 1,77 х 109 /л соответственно; р < 0,05).

Результаты исследования иммунного статуса анализированы в зависимости от клинической

А

R=0,10

со

. У = 0,092х + 0,578 ♦ ♦ ~R2 = 0,013

баллы

Примечание. Степень тяжести по шкале Ashworth: 0-1 балл -легкая; 2 балла - средняя; 3-4 балла - тяжелая.

Б

R= - 0,31

со

у = -0,015х + 1,287

R2 = 0,107

баллы

Примечание. Степень тяжести по шкале Клуба Моторики: 41-50 баллов - легкая; 16-40 баллов - средняя; 0-15 баллов - тяжелая.

В

R = -0,41

Примечание. Степень тяжести по шкале Ривермид: 27-35 баллов - легкая; 13-26 баллов - средняя; 0-12 баллов - тяжелая.

Рисунок 1. Корреляционные кривые зависимости уровня нестабильности клеточного генома

формы ДЦП. Выявлены достоверные различия между содержанием лимфоцитов (CD3+; CD19+; CD3+CD8+) у детей со спастической диплегией и таковыми у детей с гемипаретической формой: в первой группе показатели значительно ниже, чем во второй (1,43 х 109 /л, 0,63 х 109 /л, 0,56 х 109 /л и 2,08 х 109 /л, 0,69 х 109 /л, 1,06 х 109 /л соответственно; р < 0,01; р < 0,05), при этом все показатели оказались достоверно ниже по сравнению с показателями контрольной группы (р < 0,01; р < 0,05).

Кроме того, установлено, что при среднетяжелой и тяжелой степени ДЦП (по шкалам

509

Гайнетдинова Д.Д., Гайсина Л.З., Хакимова Р.Ф.

Медицинская Иммунология

го по шкале Ashworth

**

£ Q легкая Q средняя** Q тяжелая Щ контрольная группа**

го

по шкале Клуба Моторики

*

го

по шкале Ривермид

Рисунок 2. Уровни абсолютного числа лимфоцитов

Ashworth, Клуба Моторики, Ривермид) также отмечались достоверно более низкие уровни содержания лимфоцитов (рис. 2) по сравнению с контрольной группой.

Изучение уровня сывороточных Ig A, М, G у детей с ДЦП не выявило достоверных отличий между показателями здоровых детей.

Изучение окислительно-восстановительной активности нейтрофилов обнаружило превышение показателей НСТ-спонт. и ИАН-спонт. более, чем в 2 раза, у детей с ДЦП (27,7±19,9%

и 0,34±0,28 усл. ед.) по сравнению со здоровыми (11,0±12,5% и 0,12±0,08 усл. ед. соответственно; р < 0,05). В то же время установлено, что у больных ДЦП с верифицированной ПВЛ показатели достоверно превышали уровень здоровых (р < 0,01).

Изучаемые показатели достоверно выше у детей со спастической диплегией по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

Установлено, что наиболее выраженные достоверные отличия (р < 0,05) окислительно-вос-

510

2012, Т. 14, № 6

Клинико-иммунологические аспекты ДЦП

ТАБЛИЦА 1. ПОКАЗАТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОИ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ В ЗАВИСИМОСТИ

от форм дцп

Формы ДЦП Показатели окислительно-восстановительной активности нейтрофилов

НСТ спон.

Спастическая диплегия (n = 25) 36,8±16,4** 0,42±0,2* 0,75±0,1

Гемипаретическая (n = 10) 25,6±26,2 0,31±0,3 0,78±0,2

Контроль (n = 20) 11,0±12,5** 0,12±0,08* 0,70±0,2

Примечание. * - р < 0,05; ** - р < 0,01.

становительной активности нейтрофилов отмечались у детей со средне-тяжелой и тяжелой степенью заболевания.

Анализ результатов, полученных при изучении содержания TNFa, выявил некоторые различия: у детей с ДЦП уровень TNFa в сыворотке крови составил 8,17±6,99 пг/мл, в слюнной жидкости — 27,54±17,44 пг/мл, что достоверно выше, чем у здоровых (соответственно, 0,74±0,87 пг/мл и 1,99±1,11 пг/мл; р < 0,05).

У детей со спастической диплегией и гемипа-ретической формой содержание TNFa в сыворотке крови и в слюнной жидкости достоверно преобладало над контролем (р < 0,01) (табл. 2).

Анализ содержания TNFa в сыворотке крови у детей с ДЦП в зависимости от наличия ПВЛ выявил достоверное повышение показателя у детей с ПВЛ по сравнению с группой детей без признаков перенесенной ПВЛ (13,2±4,85 пг/мл и 7,04±6,08 пг/мл соответственно; р < 0,05).

Установлена сильная положительная корреляционная зависимость между уровнем TNFa в сыворотке крови и слюнной жидкости и абсолютным содержанием лимфоцитов в периферической крови (соответственно, R = 0,71 и R = 0,67) у детей, перенесших ПВЛ. У больных ДЦП без изменений в ПВО имела место отрицательная корреляционная связь между аналогичными показателями (R = -0,83 и R = -0,38 соответственно), как и у детей контрольной группы (R = -0,45).

Анализ взаимосвязи содержания TNFa в сыворотке крови и слюнной жидкости у детей с ДЦП в исходе ПВЛ показал сильную положительную корреляционную связь (R = 0,82 и R = 0,64 соответственно) с показателем цитоге-

нетических нарушений в эритроцитах, в то время, как в контрольной группе выявлена сильная отрицательная корреляционная связь (R = -0,99) между этими показателями.

Обсуждение

Анализ результатов проведенного исследования показал, что у больных ДЦП, сформированного в исходе ПВЛ, существуют неизвестные механизмы, усиливающие спонтанный эндомутагенез и провоцирующие цитогенетические нарушения в клетках периферической крови. Выявленная положительная корреляционная зависисимость цитогенетических нарушений и уровня TNFa позволяет предположить высокую вероятность иммунопатологического процесса, как генератора эндомутагенеза у этих детей. У детей с перенесенной ПВЛ и тяжелым течением ДЦП снижение содержания популяций и субпопуляций лимфоцитов сопровождается достоверным повышением функциональной активности фагоцитарного звена иммунной системы. Принимая во внимание то, что показатели НСТ-теста являются отражением окислительно-восстановительной активности нейтрофилов, полученные высокие показатели НСТ-спон. могут свидетельствовать о наличии у детей с ДЦП факторов, способствующих активации нейтрофилов, например, наличие поврежденных астроцитов в ПВО. Установленная взаимосвязь между уровнем лимфоцитов и выработкой TNFa у детей с патологическими изменениями в ПВО не исключает, что процессы в ПВО стимулируют активацию кле-ток-продуцентов к синтезу TNFa.

таблица 2. показатели TNFa сыворотки крови и слюнной жидкости у Больных дцп

Форма ДЦП TNFa сыворотки

Спастическая диплегия (n = 25) 11,7±7,79* 27,4±19,64*

Гемипаретическая (n = 10) 2,57±4,28* 23,9±10,05*

Контроль (n = 20) 0,74±0,87* 1,99±1,11*

Примечание. * - р < 0,01.

511

Гайнетдинова Д.Д., Гайсина Л.З., Хакимова Р.Ф.

Медицинская Иммунология

Таким образом, у детей с ДЦП в исходе ПВЛ выявлены два значимых звена патогенеза: с одной стороны нестабильность клеточного генома, выражающаяся в увеличении числа клеток с цитогенетическими нарушениями, с другой стороны — иммунные нарушения, характеризующиеся снижением абсолютного количества лимфоцитов, высокой окислительно-восстановительной активностью нейтрофилов и увеличением содержания цитокина TNFa в сыворотке крови и слюнной жидкости. Возможно, эти звенья взаимосвязаны и свидетельствуют об активных процессах, протекающих в организме детей с ДЦП. Не исключено, что у детей со спастической ди-плегией, сформированной в исходе ПВЛ, иммунопатологический процесс, инициированный внутриутробной гипоксией, возможно, имеет место и в начальной резидуальной стадии ДЦП. Безусловно, эти предположения диктуют необходимость дальнейших исследований в этом направлении.

Выводы

1. Выявлена взаимосвязь тяжести клинических проявлений ДЦП в исходе ПВЛ с уровнем цитогенетических нарушений в эритроцитах периферической крови.

2. У детей с ДЦП обнаружены иммунные нарушения, характеризующиеся снижением абсолютного содержания лимфоцитов, высокой окислительной активностью нейтрофилов и увеличением содержания цитокина TNFa в сыворотке периферической крови и слюнной жидкости.

3. Установлена взаимосвязь уровня нестабильности генома с содержанием цитокина TNFa.

Список литературы

1. Барашнёв Ю. И. Клинико-морфологическая характеристика и исходы церебральных расстройств при гипоксически-ишемических энцефалопатиях // Акуш. и гинек. — 2009. — № 5. — С. 39-42.

2. Болдырев А.А. Роль АФК в жизнидеятель-ности нейрона // Успехи физиологии — 2009. — Т 34, № 3. - С. 21-23.

3. Власюк В.В. Перивентрикулярная лейко-маляция у детей. — СПб.: Геликон Плюс, 2009. — 172 с.

4. Гайнетдинова Д.Д. Состояние генетического аппарата у больных детским церебральным параличом // Казанский медицинский журнал. — 2005. — Т 86, приложение. — С. 47-48.

5. Громада Н.Е. Иммунологические и структурно-метаболические нарушения у доношенных детей с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы, про-

гнозирование исходов и оптимизация лечения: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. — 2009. — 56 с.

6. Клюшник Т.П., Лидеман Р.Р. Аутоиммунные механизмы в генезе нарушений развития нервной системы // Вестн. Рос. АМН. — 2010. — № 7. — C. 32-34.

7. Коган А.Х. Фагоцитозависимые кислородные свободнорадикальные механизмы аутоагрессии в патогенезе внутренних болезней // Вестник Росс. мед. наук. — 2009. — № 2. — C. 3-10.

8. Семенов А.С., Скальный А.В. Иммунопатологические и патобиохимические аспекты патогенеза перинатального поражения мозга. — СПб.: Наука. — 2009. — 368 с.

9. Amato M., Donati F. Update on perinatal

hypoxic insult: mechanism, diagnosis and

interventions // Paediatr. Neurol. — 2010. — Vol. 4, N 5. — P. 203-209.

10. Blumenthal I. Periventricular leucomalacia: a review // Pediatr. — 2009. — Vol. 163, N 8. — P. 435-442.

11. Christos P. Cerebral palsy. — New York,

2009. — P. 267.

12. Crawford C. L. Can periventricular leucomalacia cause spastic diplegia in premature infants // J. Pediatr. —

2010. — Vol. 164, N 2. — P. 121-122.

13. Day R. E. Genetic aspects of cerebral palsy // Dev. Med. Child Neurol. — 2010. — Vol. 34. — P. 834.

14. Folkerth R.D. Periventricular leukomalacia: overview and recent findings // Pediatr. Dev. Pathol. —

2009. — N 1. — P. 3-13.

15. Hashimoto K. Correlation between neuroimaging and neurological outcome in periventricular leukomalacia: diagnostic criteria // Pediatr. Int. — 2011. — Vol. 43, N 3. — P. 240-245.

16. Haynes R.L., Folkerth R.D., Keete R.J. Nitrosative and oxidantive injury to premyelinating oligodendrocytes in periventricular leukomalacia // Neuropathol. Exp. Neurol. — 2010. — Vol. 62, N 5. — P. 441-450.

17. Jacobsson B., Hagberg G. Antenatal risk factors for cerebral palsy // Obstet. Gynaecol. —

2010. — N 3. — P. 25-36.

18. Nelson K.B., Dambrosia J.M. Genetic polymorphisms and cerebral palsy in very preterm infants // Pediatr. Res. — 2008. — N 4. — P. 494-499.

19. Schmid W. The micronucleus test // Mutat. Res. — 1975. — Vol. 31, N 1. — Р. 9-15.

20. Schmitz T., Chew L.J. Cytokines and myelination in the central nervous system // Scientific World J. — 2008. — N 8. — P. 39-47.

поступила в редакцию 25.04.2012 отправлена на доработку 10.05.2012 принята к печати 21.05.2012

512