ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОЛИДНОГО СОЕДИНЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТАКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

1. Рекомбинантный микроорганизм, который представляет собой микроорганизм, обладающий способностью продуцировать макролидные соединения с гидроксильной группой в 16-положении, представленные формулой (I):
(где R представляет собой атом водорода или гидроксильную группу), и который включает:
(а) ДНК, кодирующую полноразмерный или неполный полипептид, участвующий в биосинтезе макролидных соединений, представленных формулой (II):
(где R представляет собой атом водорода или гидроксильную группу), и
(b) ДНК, кодирующую полноразмерный или неполный полипептид, обладающий ферментативной активностью, направленной на гидроксилирование макролидных соединений в 16-положении, представленных вышеуказанной формулой (II).
2. Рекомбинантный микроорганизм по п.1, где ДНК, описанная выше в п.(а), представляет собой ДНК, кодирующую полноразмерный или неполный полипептид, обладающий поликетид-синтетазной активностью; полипептид, обладающий ацетилазной активностью в 7-положении; полипептид, обладающий эпоксидазной активностью в 18, 19-положении; и полипептид, обладающий активностью фактора регуляции транскрипции.
3. Рекомбинантный микроорганизм по п.1, где ДНК, описанная выше в п.(а), представляет собой ДНК, включающую:
(а-1) непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 8340-27935 в последовательности NO:1;
(а-2) непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 28021-49098 в последовательности NO:1;
(а-3) непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 49134-60269 в последовательности NO:1;
(а-4) непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 60269-65692 в последовательности NO:1;
(а-5) непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 68160-66970 в последовательности NO:1;
(а-6) непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 69568-68270 в последовательности NO:1; и
(а-7) непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 72725-70020 в последовательности NO:1; или ее вариант.
4. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где ДНК, описанная выше в п.(а), также включает ДНК, кодирующую полноразмерный или неполный полипептид, обладающий ферментативной активностью, направленной на гидроксилирование 6-положения.
5. Рекомбинантный микроорганизм по п.4, где указанная ДНК, кодирующая полноразмерный или неполный полипептид, обладающий ферментативной активностью, направленной на гидроксилирование 6-положения, представляет собой ДНК, включающую непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 65707-66903 в последовательности NO:1, или ее вариант.
6. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-5, где ДНК, описанная выше в п.(b), представляет собой ДНК, выбранную из группы, состоящей из:
(b-1) непрерывной нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 1322-2548 в последовательности NO:2;
(b-2) непрерывной нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 420-1604 в последовательности NO:3; и
(b-3) непрерывной нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 172-1383 в последовательности NO:4; или ее вариант.
7. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-5, где ДНК, описанная выше в п.(b), представляет собой вариант ДНК, включающий непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1322-2548 в последовательности NO:2, которая имеет 1 или 2 или более модифицированных сайтов, выбранных из группы, состоящей из нижеуказанных сайтов 1)-6):
1) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1592-1594, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся аргинином;
2) модифицированного сайта, где последовательность atg, состоящая из нуклеотидов 1655-1657, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся метионином;
3) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1904-1906, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся аргинином;
4) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 2027-2029, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся аргинином;
5) модифицированного сайта, где последовательность atc, состоящая из нуклеотидов 2054-2056, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся изолейцином; и
6) модифицированного сайта, где последовательность ctg, состоящая из нуклеотидов 2528-2530, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся лейцином.
8. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-5, где ДНК, описанная выше в п.(b), представляет собой вариант ДНК, включающий непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1322-2548 в последовательности NO:2, которая имеет 1 или 2 или более модифицированных сайтов, выбранных из группы, состоящей из нижеуказанных сайтов 1)-6):
1) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1592-1594, заменена кодоном, кодирующим цистеин, метионин или пролин;
2) модифицированного сайта, где последовательность atg, состоящая из нуклеотидов 1655-1657, заменена кодоном, кодирующим треонин или серин;
3) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1904-1906, заменена кодоном, кодирующим лейцин, изолейцин, пролин, тирозин или фенилаланин;
4) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 2027-2029, заменена кодоном, кодирующим лейцин, изолейцин или пролин;
5) модифицированного сайта, где последовательность atc, состоящая из нуклеотидов 2054-2056, заменена кодоном, кодирующим фенилаланин или валин; и
6) модифицированного сайта, где последовательность ctg, состоящая из нуклеотидов 2528-2530, заменена кодоном, кодирующим метионин, цистеин или изолейцин.
9. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-5, где ДНК, описанная выше в п.(b), представляет собой вариант ДНК, включающий непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1322-2548 в последовательности NO:2, которая имеет 1 или 2 или более модифицированных сайтов, выбранных из группы, состоящей из нижеуказанных сайтов 1)-6):
1) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1592-1594, заменена кодоном, кодирующим цистеин;
2) модифицированного сайта, где последовательность atg, состоящая из нуклеотидов 1655-1657, заменена кодоном, кодирующим треонин;
3) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1904-1906, заменена кодоном, кодирующим лейцин или тирозин;
4) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 2027-2029, заменена кодоном, кодирующим лейцин;
5) модифицированного сайта, где последовательность atc, состоящая из нуклеотидов 2054-2056, заменена кодоном, кодирующим фенилаланин; и
6) модифицированного сайта, где последовательность ctg, состоящая из нуклеотидов 2528-2530, заменена кодоном, кодирующим метионин.
10. Рекомбинантный микроорганизм по п.1, представляющий собой микроорганизм-хозяин, содержащий ДНК, описанную выше в п.(а), в которую была введена ДНК, описанная выше в п.(b) и происходящая от микроорганизма другого вида.
11. Рекомбинантный микроорганизм по п.1, представляющий собой микроорганизм-хозяин, содержащий ДНК, описанную выше в п.(b), в которую была введена ДНК, описанная выше в п.(а) и происходящая от микроорганизма другого вида.
12. Рекомбинантный микроорганизм по п.1, представляющий собой микроорганизм-хозяин, не содержащий ни одну из ДНК, описанных выше в п.п.(а) и (b), в которые была введена ДНК, описанная выше в п.п.(а) и (b) и происходящая от микроорганизма другого вида.
13. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-5, где указанным рекомбинантным микроорганизом, обладающим способностью продуцировать макролидное соединение с гидроксильной группой в 16-положении, представленное формулой (I), является штамм, принадлежащий к роду Streptomyces.
14. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-5, где 50 мг или более указанного макролидного соединения с гидроксильной группой в 16-положении, представленного формулой (I), на 1 л культурального бульона, может быть продуцировано при посеве указанного рекомбинантного микроорганизма в 250 мл-колбу Эрленмейера, содержащую 30 мл описанной ниже среды, с последующим культивированием при 25°С в течение 4 дней при перемешивании на роторном шейкере (220 об/мин), экстрагированием путем добавления 270 мл ацетонитрила и анализом полученного экстракта с помощью ВЭЖХ в описанных ниже условиях анализа, проводимого для определения количества макролидного соединения с гидроксильной группой в 16-положении, представленного формулой (I):
(Среда)
3
Растворимый 5% крахмал, 1% глюкоза, 3% Pharmamedia, 0,1% СаСО, рН 7,5;
(Условия измерения с помощью ВЭЖХ)
Устройство: ВЭЖХ Shimadzu 10Avp
Колонка: Develosil ODS UG-3 (φ 4,6 мм × 50 мм × 3 мкм)
Подвижная фаза: 45-55% метанол (0-5 мин), 55% метанол (5-13 мин), 55-70% метанол (13-21 мин), 70% метанол (21-25 мин)
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Детекция: УФ на 240 нм
Объем впрыска: 5 мкл
Температура колонки: 40°С.
15. Способ получения макролидных соединений с гидроксильной группой в 16-положении, представленных формулой (I), или их фармакологически приемлемых солей или гидратов, где указанный рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-14 культивируют в питательной среде, и из этой культуральной среды выделяют макролидные соединения с гидроксильной группой в 16-положении, представленные формулой (I).
16. Способ по п.15, где в указанной культуральной среде присутствует циклодекстрин.
17. Способ по п.16, где указанным циклодекстрином является циклодекстрин, выбранный из группы, состоящей из β-циклодекстрина, γ-циклодекстрина, частично метилированного β-циклодекстрина, диметил-β-циклодекстрина, триметил-β-циклодекстрина, гликозил-β-циклодекстрина и гидроксипропил-β-циклодекстрина.
18. Вариант ДНК, включающий непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1322-2548 в последовательности NO:2, которая имеет 1 или 2 или более модифицированных сайтов, выбранных из группы, состоящей из нижеуказанных сайтов 1)-6):
1) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1592-1594, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся аргинином;
2) модифицированного сайта, где последовательность atg, состоящая из нуклеотидов 1655-1657, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся метионином;
3) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1904-1906, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся аргинином;
4) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 2027-2029, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся аргинином;
5) модифицированного сайта, где последовательность atc, состоящая из нуклеотидов 2054-2056, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся изолейцином; и
6) модифицированного сайта, где последовательность ctg, состоящая из нуклеотидов 2528-2530, заменена кодоном, кодирующим аминокислоту, не являющуюся лейцином.
19. Вариант ДНК, включающий непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1322-2548 в последовательности NO:2, которая имеет 1 или 2 или более модифицированных сайтов, выбранных из группы, состоящей из нижеуказанных сайтов 1)-6):
1) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1592-1594, заменена кодоном, кодирующим цистеин, метионин или пролин;
2) модифицированного сайта, где последовательность atg, состоящая из нуклеотидов 1655-1657, заменена кодоном, кодирующим треонин или серин;
3) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1904-1906, заменена кодоном, кодирующим лейцин, изолейцин, пролин, тирозин или фенилаланин;
4) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 2027-2029, заменена кодоном, кодирующим лейцин, изолейцин или пролин;
5) модифицированного сайта, где последовательность atc, состоящая из нуклеотидов 2054-2056, заменена кодоном, кодирующим фенилаланин или валин; и
6) модифицированного сайта, где последовательность ctg, состоящая из нуклеотидов 2528-2530, заменена кодоном, кодирующим метионин, цистеин или изолейцин.
20. Вариант ДНК, включающий непрерывную нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1322-2548 в последовательности NO:2, которая имеет 1 или 2 или более модифицированных сайтов, выбранных из группы, состоящей из нижеуказанных сайтов 1)-6):
1) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1592-1594, заменена кодоном, кодирующим цистеин;
2) модифицированного сайта, где последовательность atg, состоящая из нуклеотидов 1655-1657, заменена кодоном, кодирующим треонин;
3) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 1904-1906, заменена кодоном, кодирующим лейцин или тирозин;
4) модифицированного сайта, где последовательность cgc, состоящая из нуклеотидов 2027-2029, заменена кодоном, кодирующим лейцин;
5) модифицированного сайта, где последовательность atc, состоящая из нуклеотидов 2054-2056, заменена кодоном, кодирующим фенилаланин; и
6) модифицированного сайта, где последовательность ctg, состоящая из нуклеотидов 2528-2530, заменена кодоном, кодирующим метионин.
21. Полипептид, кодируемый вариантом ДНК по любому из пп.18-20.