Вольтамперометрический контроль объектов медицинской диагностики на содержание антибиотиков

Е.С. Моисеева1, Г.Б. Слепченко2, В.А. Федорчук2

Вольтамперометрический контроль объектов медицинской диагностики на содержание антибиотиков

1 ФГБУЗ «Головной центр гигиены и эпидемиологии» ФМБА России, г. Москва 2 Национальный исследовательский Томский политехнический университет», г. Томск

E.S. Moiseeva1, G.B. Slepchenko2, V.A. Fedorchuk2

Voltammetric detection of antibiotics in substances that are subjects to medical control

1 Federal State Budgetary Healthcare Institution, Leading Hygiene and Epidemiology Center of the Federal Medical and Biological Agency, Moscow 2 Tomsk National Research Polytechnic University, Tomsk Polytechnic University, Tomsk

Ключевые слова: вольтамперометрия, лекарственные препараты, антибиотики, биологические среды, электрохимические методы анализа, квантово-химические расчеты.

С помощью квантово-химическихрасчетов и математического моделирования изучены механизмы электрохимического превращения антибиотиков и кинетические параметры, протекающие на электродах в электрохимической ячейке. На основании полученных данных выбраны рабочие условия вольтамперометрического определения некоторых антибиотиков (левомицетина, стрептомицина, тетракциклина, азитромици-на). Разработаны методики количествтенного химического анализа проб биообъектов и фармпрепаратов для определения антибиотиков.

Keywords: voltammetry, drugs, antibiotics, biological environments, electrochemical analysis, quantum and chemical calculations.

Quantum and chemical calculations and mathematical modeling were used to study mechanisms of electrochemical processes on electrodes in an electrochemical cell. Conditions for volammetric determination of some antibiotics were researched and developed.

Медицинская диагностика и контроль качества лекарственных препаратов основаны на проведении анализов различными методами. Стандартными методами определения органических веществ в биообъектах и лекарственных препаратах являются спек-трофотометрические и хроматографические. Несмотря на бесспорное лидерство этих инструментальных методов, для определения органических веществ в объектах медицинской диагностики в последние годы все чаще используют электрохимические методы. Известно применение электрохимических методов анализа в контроле различных биологических проб (крови и ее фракций, мочи, мышечной ткани, волос и др.), лекарствен-

ных средств ( таблеток, капсул, инъекций и др.), используемых для медицинской диагностики, мониторинга и контроля за состоянием здоровья людей и животных, а также пищевых продуктов. Широкий спектр лекарственных препаратов, определяемых электрохимическими методами, составляют про-тивомикробные, противовирусные, противо-паразитарные средства; препараты, приме -няемые для лечения онкологических заболеваний; средства, регулирующие метаболические процессы, действующие на нервную и сердечно-сосудистую системы, на периферические нейромедиаторные процессы и др. Большое внимание уделяется определению антибиотиков левомицетинового, пеницилли-

нового, тетракциклинового, аминогликозид-ного рядов, антибиотиков группы карбопене-мов, цефалоспоринов и др. [2—4; 6—8].

Пределы обнаружения указанных веществ составляют от 1*10-6 до 1*10-10 моль/л.

Круг веществ (особенно различных лекарственных препаратов), определяемых электрохимическими методами, достаточно широк, но во многих случаях речь идет о выборе условий определения тех или иных веществ, а не о разработке конкретных методик анализа реальных объектов.

Цель настоящей работы — выбор условий определения ряда широко используемых антибиотиков (левомицетина, стрептомицина, тетрациклина и азитромицина дигидра-та), изучение электрохимического поведения на примере азитромицина дигидрата и разработка вольтамперометрических методик анализа лекарственных препаратов и биообъектов на содержание указанных антибиотиков.

Эксперимент и обсуждение результатов

В работе использовали вольтампероме-трический комплекс для аналитических измерений СТА (Россия, г. Томск, ООО «ИТМ»).

Использовали двух- и трехэлектрод-ные системы с индикаторными стеклоугле-родными электродами (СУЭ) или ртутно-

пленочными электродами (РПЭ), насыщенными хлоридсеребряными электродами сравнения и вспомогательными платиновыми электродами. Перемешивание раствора и удаление кислорода осуществляли потоком азота.

Получены вольтамперные кривые восстановления левомицетина и стрептомицина, окисления и восстановления азитроми-цина, окисления тетрациклина, которые регистрировались на электродах различных типов (РПЭ и СУЭ), в различных режимах регистрации вольтамперограмм (линейном и дифференциально-импульсном) , при различной скорости изменения потенциала (рис. 1-4).

При регистрации вольтамперограмм всех антибиотиков скорость изменения потенциала варьировали в диапазоне от 15 до 50 мВ/с. При более высоких скоростях изменения потенциала чувствительность аналитического сигнала повышается, но при этом увеличивается остаточный ток, а при меньших скоростях существенно снижается величина аналитического сигнала антибиотиков.

При дифференциально-импульсном режиме полярографирования величина остаточного тока на вольтамперограмме антибиотиков минимальна ( см. рис. 1б) и наклон

Рис. 1. Вольтамперограммы восстановления стрептомицина ) на РПЭ при линейном (а) и дифференциально-импульсном (б) режимах регистрации вольтамперограмм:

фон 0,01 моль/дм3 NaOH

Рис. 2. Вольтамперограммы восстановления левомицетина (Lv) на СУЭ (а) и РПЭ (б):

фон 0,1 моль/дм3

градуировочных графиков максимален, а при линейном режиме регистрации вольтамперограмм — наоборот, поэтому для количественного определения указанных антибиотиков рекомендован вариант дифференциально-импульсной вольтамперометрии.

В целях выбора фонового электролита для стрептомицина и азитромицина использовали различные растворы: NaOH, KOH, Na2HPO4, Na3PO4, NaClO4 (концентрации от 0,01 до 0,1 моль/л), Na3Citr, буферные растворы: Бриттона—Робинсона (рН 8,00— 11,00), борно-щелочной Na2B4O7 — NaOH (рН 9,23—11,02). Все перечисленные электролиты можно использовать для количественного определения стрептомицина и азитромицина. Однако лучшим фоновым электролитом для стрептомицина является 0,01 моль/дм3 NaOH, для азитромицина — 0,1 M Na3Citr.

Для количественного определения ле-вомицетина оптимальными электролитами являются: 0,1 M аммоний лимоннокислый двузамещенный C6H14O7N2 (рН 4,7— 5,1), 0,1 M KCl, 0,1 M сульфат аммония

(NH4 ) 2SO4.

В качестве фоновых электролитов для определения тетракциклина использовали цитратно-фосфатные буферные смеси (0,2 моль/дм3 Na2HPO4 и 0,1 моль/дм3

H3C6H5O7).

В дальнейшем для выполнения измерений при определении антибиотиков выбраны рабочие фоновые электролиты, где регистрировались четко выраженные аналитические сигналы. В табл. 1 приведены рабочие условия вольтамперометрического определения антибиотиков: электроды, фоновые электролиты и режимы полярографирования.

Линейность градуировочных графиков на указанных фонах сохраняется в диапа-

dl/dE, fiA/mV

Е, V

02 0.4 0.6 08

Рис. 3. Вольтамперограмма окисления тетрациклина (Шг) в дифференциальном режиме полярографирования на СУЭ на фоне 0,2 моль/дм3 Ма2ИР04

и 0,1 моль/дм3 ИСНОг 1) Стет = 0,0 мг/дм3; 2) Стет = 0,02 мг/дм3; 3) Стет = 0,04 мг/дм3

Рис. 4. Вольтамперограмма окисления азитромицина дигидрата на СУЭ (а) и восстановления на РПЭ (б) в дифференциальном режиме полярографирования.

1) фон 0,2 ММа2ЫР04

зоне концентраций левомицетина, стрептомицина, тетрациклина и азитромицина (8,0-10-9 - 1,0-10-7) моль/л, (3,4 • 10-8 - 1,0-10-6) моль/л, (1,0-10-8-1,0-10-5) моль/л и (3,4 -10-1° - 1,0-10-5) моль/л соответственно. При концентрации антибиотиков, превышающей указанные выше, наблюдали отклонение от линейности градуировочных графиков, что, по-видимому, связано с насыщением поверхности индикаторного электрода.

Важным фактором при определении органических веществ является значение рН раствора, которое оказывает влияние не только на скорость электродного процесса, но и на его механизм. Установлено, что изменение рН раствора оказывает влияние на значение потенциала максимума пиков антибиотиков, причем эти зависимости носят сложный характер. Более подробно этот во-

прос изучен на примере окисления азитро-мицина и восстановления стрептомицина.

Исследования показали, что с увеличением рН буферного раствора Бриттона-Робинсона выше 8,0 потенциал пика окисления азитромицина смещается в более положительную область потенциалов от 0,774 до 0,850 В. При рН больше 9,0 может регистрироваться дополнительный пик с Еп « 0,90 В, который затрудняет его аналитическое определение. При рН меньше 8,0 молекула азитромицина находится в ионизированном состоянии и поэтому окисляется при менее положительном потенциале. В кислой среде при рН меньше 6,0 пик окисления не регистрируется, по-видимому, происходит распад молекулы азитромицина. Значения рН от 8,0 до 9,0 являются оптимальными для количественного определения азитромицина.

Таблица 1 Рабочие условия вольтамиерометрического определения антибиотиков

Определяемый компонент Электрод Фоновый электролит Потенциал электролиза Е , В Время электролиза Т , с Скорость изменения потенциала ш, мВ/с Потенциал пика определяемого компонента Е , В п

Левомицетин РПЭ 0,1М -0,45 30 25

Тетрациклин СУЭ 0,2М Ка2НР04 0,1М Н,С6Н507 7 3 6 5 7 -0,4 20 20 0,65-0,75

Стрептомицин РПЭ 0,01М КаОН -1,2 30 50

Азитромицин СУЭ РПЭ 0,2М Ка2НР04 1М ^СНг 0,2 -1,2 30 30 30 50 0,65-0,75 -

При регистрации катодного пика стрептомицина увеличение рН раствора приводило к смещению потенциала в сторону более отрицательных значений, т.е. к затруднению процесса его восстановления, что, по-видимому, связано с предшествующей протолитической реакцией депротонизации протонированных форм стрептомицина. Депротонизация может предшествовать стадии передачи электрона от электрода к молекуле деполяризатора или протекать одновременно с ней. Очень щелочные растворы, рН которых более 9,8, затрудняют регистрацию вольтамперограмм, поэтому в качестве оптимального значения рН для количественного определения стрептомицина в водных растворах рекомендовано использовать рН от 9,0 до 9,5.

Для улучшения метрологических характеристик регистрации аналитических сигналов были проведены исследования по изучению зависимостей величины предельного тока антибиотиков от потенциала электролиза и времени электролиза. Использование оптимальных значений т и Е

э э ^ '

позволяет регистрировать вольтамперограм-мы антибиотиков с четко выраженными максимумами. Это приводит к повышению точности и разрешающей способности метода и позволяет экспрессно определять антибиотики до 7,5*10-11 моль/л, что на 2-3 порядка ниже по сравнению с известными микробиологическими методами, применяемыми в настоящее время при анализе антибиотиков в сложных по составу смесях.

В работе были также рассмотрены вопросы теории процессов разряда ионизации антибиотиков на примере азитроми-цина дигидрата, а также сделана их опытная проверка. Изучение обратимости процессов электроокисления азитромицина ди-гидрата проводили по экспериментальным данным, для получения которых использовали известные в литературе критерии [1]. Установлено, что процесс электроокисле -

ния антибиотика протекает необратимо, это подтверждает вид кривой, представленной на рис. 4а.

Эффективные коэффициенты переноса вп были рассчитаны как из полулогариф-

мических зависимостей ( Е f1п

V ^ -1J

)

так и по зависимости потенциала максимума тока окисления азитромицина от логарифма скорости изменения потенциала (Е—ДпШ) [2-4; 6-8].

Расчет по представленным зависимостям дает вполне согласующиеся друг с другом результаты (табл. 2).

С использованием полуэмпирического метода РМ3 (программа ИурегСИеш 6.0) были выполнены квантово-химические расчеты структуры молекулы ( субстрата) ази-тромицина, его катион- и анион-радикалов для определения наиболее вероятного механизма окисления антибиотика. Нами получены значения теплот образования субстрата (-2298,9 кДж/моль), его катион- (-1522,2 кДж/моль) и анион-радикалов (-2358,9 кДж/моль), а также значения энергии ионизации (ЕВЗМО = -8,87 эВ) и энергии сродства к электрону (ЕНВМО = 1,20 эВ). Расчеты показывают, что у азитромицина небольшие значения ЕНВМО, т.е. азитроми-цин относительно легко должен принимать на эти орбитали электроны, образуя анион-радикалы. Об этом же свидетельствуют и данные по изменению теплоты образования анион-радикала по сравнению с катион-радикалом, а также сравнительные результаты значений энергий ЕНВМО и ЕВЗМО. Энергия ВЗМО, отображая потенциал ионизации, соответствует достаточно высокой энергетической области (-8,86 эВ).

Проанализированы данные по распределению зарядов на соответствующих атомах для молекулярной формы азитромицина и его анион-радикала. Можно отметить, что

Таблица 2 Кинетические параметры процесса окисления азитромицина на СУЭ

Кинетические параметры Способы расчета кинетических параметров

По данным полулогарифмических зависимостей По данным потенциала пика от логарифма скорости потенциала

Эффективный коэффициент переноса (вп) 0,19 0,17

в результате реакции электроокисления сначала, по-видимому, образуется моноанион за счет кислорода (О-2) 15-членного лактонно-го кольца, так как на данном атоме наблюдается наиболее высокая электронная плотность для анион-радикала по сравнению с исходной формой. Далее в результате реакции электроокисления моноанион переходит снова в исходное состояние. Изложенное позволяет судить в целом о большой устойчивости анион-радикала по сравнению с катион-радикалом азитромицина.

Как показали проведенные нами исследования, процессы окисления азитромицина на СУЭ и восстановления на РПЭ - это сложные диффузионно-контролируемые электродные процессы с участием более одного электрона, осложненные не только дополнительными промежуточными стадиями, но и, вероятно, процессами адсорбции [5].

В результате исследования нами выбраны условия проведения измерения ряда широко используемых антибиотиков, установлены физико-химические закономерности, что позволило разработать методики количественно химического анализа лекарственных препаратов и биообъектов на их содержание.

При определении содержания антибиотиков как основного компонента в лекарственных препаратах ( таблетках, капсулах, вакцинах и др.) нужна высокая точность измерения при значительных концентрациях антибиотиков в подготовленных растворах. Как правило, в этом случае не требуется предварительного выделения антибиотиков и отделения сопутствующих веществ.

Сущность метода состоит в разведении проб лекарственного препарата с последующим вольтамперометрическим определением антибиотика.

Подготовку проб таблеток и капсул, содержащих антибиотик, осуществляли следующим образом. Таблетки, освобожденные от оболочки, растирали до порошкообразного состояния. Капсулы, содержащие порошкообразное вещество, вскрывали. К навеске порошка, взятой на аналитических весах, добавляли 96% этанол, осуществляли интенсивное перемешивание в течение 20-30 минут, после чего фильтровали через бумажный фильтр. Для анализа брали аликвоту полученного фильтрата.

При определении содержания антибиотиков как примесного компонента в биологических объектах (моче, крови, тканях и др.) требуется определение микроконцентраций антибиотиков устранение мешающих компонентов матрицы пробы.

При определении антибиотиков в биологических объектах применяли методы «мягкой» обработки проб. Матрицу отделяли путем гидролиза и высаливания белков с последующим их отделением центрифугированием или фильтрованием. Пробоподготовка биологических объектов для определения антибиотиков левомицетина, стрептомицина и тетрациклина вольтамперометрическим методом приведена на рис. 5.

Некоторые сложности при определении содержания азитромицина в крови возникают из-за связывания его с белками плазмы, степень которого зависит от концентрации антибиотика в крови и может варьировать от 37 до 50%. Для устранения этого влияния перед вольтамперометрическим измерением проводили пробоподготовку, которая заключалась в удалении белковой части

Навеска пробы биообъектов

г

Гидролиз 0,1 М НС1

Высаливание белков щавелевой кислотой

--Твердофазная Вольтампером

Вольтампером экстракция на етрическое

етрическое^- полимерном сорбенте измерение

измерение (тетрациклин) (левомицетин,

Рис. 5. Пробоподготовка биологических объектов для определения антибиотиков левомицетина, стрептомицина и тетрациклина вольтамперометрическим методом

Высаливание белков сульфатом аммония

Твердофазная экстракция на полимерном сорбенте

матрицы (путем денатурации) и дальнейшей экстракции антибиотика этанолом.

На этапе проведения вольтамперомети-ческих измерений были оценены следующие валидационные характеристики методов: диапазон измерений, линейность, предел определения, чувствительность, избирательность, неопределенность результатов, правильность, прецизионность (повторяемость и воспроизводимость) результатов измерений.

Основные метрологические характеристики разработанных вольтамперометриче-ских методик анализа приведены в табл. 3.

Показатели правильности предложенных методик оценивали с использованием стандартных образцов, высокочистых веществ, по методу «введено - найдено» и путем сравнения с результатами, полученными по стандартной методике. Значения характеристик погрешности результатов анализа определены расчетным способом по установленным значениям характеристик случайных и систематических составляющих погрешности результатов анализа.

Выполненные исследования расширяют возможности использования вольтампероме-трического метода для количественного определения антибиотиков в сложных природных и биологических объектах. Разработанные методики позволяют проводить оперативный экспрессный контроль качества анализируемых объектов с высокой чувствительностью. При этом значительно удешевляется анализ за счет сокращения числа используемых реактивов (5-6 вместо 30 по известным ранее методикам) , не требуется применения дефицитных и дорогостоящих веществ. Разработанные ме-

тодики количественного химического анализа антибиотиков экспрессны и позволяют проводить анализ в мутных и окрашенных средах без отделения пигментов. Время анализа проб с учетом пробоподготовки не превышает 2 часов против 2-3 суток по рекомендуемым ранее методикам.

Выводы

1. Получены вольтамперные кривые восстановления и окисления некоторых антибиотиков (левомицетина, стрептомицина, тетракциклина. азитромицина). Выбраны рабочие условия их вольтамперометриче-ского определения.

2. Выполнены квантово-химические расчеты, которые позволили предложить наиболее вероятный механизм электрохимического превращения азитромицина диги-драта на стеклоуглеродном электроде.

3. На основании полулогарифмических зависимостей, а также с использованием математической модели, предложен -ной по результатам квантово-химических расчетов, были получены основные кинетические параметры процесса окисления азитромицина.

4. Впервые разработаны методики вольтам -перометрического определения антибиотиков на уровне макро- и микроконцентраций и проведена валидация методик количественного химического анализа проб биообъектов и фармпрепаратов (таблеток, капсул, растворов, инъекционных препаратов) вольтамперометрическим методом.

Таблица 3

Метрологические характеристики разработанных вольтамперометрических методик определения антибиотиков в

лекарственных препаратах и биологических объектах

Объект анализа Определяемый Диапазон определяемых а , % относ. Ас, % относ.

компонент концентраций

Лекарственные препараты

Таблетки, капсулы левомицетин, 230-550 мг/табл 4 2

тетрациклин, 40-300 мг/табл 6 3

азитромицин 8-800 мг/табл 3 1

Глазные капли, левомицетин, 0,24-0,55% 4 2

инъекционные растворы тетрациклин 0,40-3,0% 3 1

Биологические объекты

Моча, кровь, ткани левомицетин, 3-100 мг/дм3 (мг/кг) 12 5

азитромицин 3-150 мг/дм3 (мг/кг) 14 4

Примечания: а — среднеквадратическое отклонение воспроизводимости, % относительные; Ас — характеристика

систематической погрешности, % относительные.

Литература

1. Electroanalytical methods. Guide to experiments and applications / Ed. by F. Scholz. Berlin, 2002.

2. Hilali A., Jimftnez J.C., Callejyn M. et al. Electrochemical study of imipenem's primary metabolite at the mercury electrode: Voltammetric determination in urine // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005. Vol. 38. No. 4. P. 768-775.

3. Ibrahim M.S. Voltammetric behaviour and determination of the anthracycline antitumor drug nogalamycin // Analytica Chimica Acta. 2000. Vol. 409. No. 1-2. P. 105-112.

4. Mara A., Milo^ I., Kapetanovic V. Adsorptive properties of cefpodoxime proxetil as a tool for a new method of its determination in urine // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2004. Vol. 36. No. 4. P. 899-903.

5. Nigovic B. Adsorptive stripping voltammetric determination of azithromycin at a glassy carbon electrode modified by electrochemical oxidation // Analytical Sciences. 2004. Vol. 20. No. 4. P. 639-643.

6. Sun Nan, Mo Wei-Min, Shen Zhen-Lu, Hu Bao-Xiang. Adsorptive stripping voltammetric technique for the rapid determination of tobramycin on the hanging mercury electrode // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005. Vol. 38. No. 2. P. 256-262.

7. Trindade Magno Aparecido G., da Silva Glaucia M., Ferreira Valdir S. Determination of moxifloxacin in tablets and human urine by square-wave adsorptive voltammetry // Microchemical Journal. 2005. Vol. 81. No. 2. P. 209-216.

8. Wang Xue Liang, Yu Zhang Yu, Jiao Kui. Voltammetric studies on the interaction of amikacin with methyl blue and its analytical application // Chinese Chemical Letters. 2007. Vol. 18. No. 1. P. 94-96.

Контакты:

Моисеева Евгения Сергеевна,

химик-эксперт, ФГБУЗ «Головной центр гигиены

и эпидемиологии» ФМБА России,

кандидат химических наук.

Тел. раб.: (499) 190-49-59.

E-mail: fox-80@yandex.ru

_информация

Федеральное медико-биологическое агентство и Сбербанк России подписали соглашение о стратегическом сотрудничестве

18 июня 2015 г. в рамках Петербургского международного экономического форума Сбербанк России и Федеральное медико-биологическое агентство заключили соглашение о стратегическом сотрудничестве. Со стороны Сбербанка документ подписал первый заместитель председателя правления Максим Полетаев, со стороны Агентства -руководитель ФМБА России Владимир Уйба.

ФМБА России рассматривает Сбербанк как стратегического партнера в рамках развития международных проектов, в частности проекта по строительству Латиноамериканского биотехнологического предприятия им. И.И. Мечникова в Никарагуа. Проектная мощность завода предусматривает выпуск 30 млн доз вакцины от гриппа в 2017 г. В настоящее время управляющий проектом - Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток ФМБА России - проходит аккредитацию как поставщик Панамериканской организации здравоохранения (ПАОЗ), делегация специалистов института в мае посетила предприятие и провела оценку производственных процессов.

Подписание соглашения о строительстве предприятия в Никарагуа позволит множеству российских компаний и разработок выйти на рынки стран Центральноамериканской интеграционной системы (ЦАИС) и Боливарианского альянса для народов Америки (АЛБА), а также других стран Латинской Америки с общей численностью населения более 600 млн человек.

В рамках церемонии подписания прошла презентация макета завода с утвержденной технологической цепочкой производства вакцин от гриппа.