СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ СИРЕНИ IN VITRO
METHOD FOR CLONAL MICRO-PROPAGATION OF LILAC IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности цветоводству, и может быть использовано для оздоровления и микроразмножения растений сирени in vitro.
Известен способ микроразмножения сирени, включающий черенкование выращиваемых in vitro растений на одноузловые сегменты, посадку черенков на питательную среду для мультипликации, содержащую микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) [2], 1,5 концентрацию макроэлементов MS, 35 г/л сахарозы, 8 г/л Difco бакто-агара и 1 мг/л 2-изопентениладенина (2ip), получение пробирочных микрорастений, повторное их черенкование и высадку полученных регенерантов на среду укоренения с ауксинами (R.L.M.Pierik; H.H.M.Steegmans; A.A.Elias; O.T.J.Stiekema; A.J.van der Velde. Vegetative propagation of Syringa vulgaris L. in vitro. // Acta Hort., 226 (1988) 195-204.).
Недостатком данного способа размножения является то, что растения по окончанию этапа размножения получаются утолщенными и укороченными со скрученными листьями вдоль центральной жилки (витрифицированными) (Рисунок 1). Эти микропобеги плохо укореняются (Рисунок 2). Укорененные микрорастения такого качества неспособны адаптироваться к условиям ex vitro.
Технический результат изобретения заключается в повышении выхода нормально сформированных корнесобственных микрорастений, улучшении роста и развитии эксплантов при положительном влиянии оптимальных концентраций минеральных и органических компонентов питательной среды, регуляторов роста растений и антибиотиков.
Сущность изобретения заключается в том, что одноузловые сегменты выращиваемых in vitro растений помещают на среду для мультипликации, содержащую макро-, микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) или или Кворина-Лепорье (1977) (QL) (Quorin M. & Lepoivre P., Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. // Acta Hort., 78 (1977) 437-442) или Вуди Плант Медиум (WPM) (Lloyd G. & McCown В., Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by shoot tip culture. // Comb. Proc. Int. Plant Prop.Soc, 30 (1980) 421-427) или Драйвер и Куниюки (DKW) (Driver J.A., Kuniyuki A.H., In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. // Hort. Science, 19 (4), August (1984).), 30-40 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина (Z) и/или 0,5-1,5 мг/л кинетина (kin) и антибиотики (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). Культивирование проводят на светокультуральных стеллажах при освещении белыми люминесцентными лампами общей интенсивностью 2000-4000 люкс при 16-часовом фотопериоде и температуре 21-25°C. Полученные пробирочные микрорастения повторно черенкуют на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Одноузловые сегменты повторно выращиваются на среде мультипликации, а апикальные высаживают на среду укоренения. Она содержит ½ макроэлементов, полные микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи MS, 10-30 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, перечисленные выше антибиотики, 0,1 мг/л ИМК, а также 0,01 мг/л НУК или 0,1 мг/л ИУК.
Добавление сахарозы в питательные среды в концентрациях более 40 г/л снижает интенсивность роста растений и приводит к их витрификации. Добавление в питательные среды регуляторов роста и антибиотиков в предложенных концентрациях наиболее оптимально подходят для роста эксплантов и не оказывают токсического воздействия и эффекта угнетения культуры.
Предлагаемый способ клонального микроразмножения сирени реализуется следующим образом:
1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, pH 5,6-5,8. После этого растворяется навеска агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 ати (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В остывшую до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста и антибиотиков. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам.
Все манипуляции с растительным материалом производится в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в сосудах составляет 15-25 штук.
2. Размножение растительного материала проводят на средах мультипликации, приготовленных по прописи MS или QL или WPM или DKW, дополненных сахарозой (30-40 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), БАП и/или зеатином (0,2-2,0 мг/л) или кинетином (0,5-1,5 мг/л) и антибиотиками (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). При этом наиболее оптимальными минеральными композициями являются MS и QL. Для цитокининов наиболее удачны концентрации 0,2-1,0 мг/л как для БАП, так и для зеатина, для кинетина - 0,9-1,1 мг/л, а для антибиотиков - пенициллин (50-100 мг/л) и/или ампициллин (50-100 мг/л) и/или цефотаксим (50-200 мг/л) и/или тикарциллин (10-50 мг/л) и/или стрептомицин (5-50 мг/л) и/или тетрациклин (10-100 мг/л) и/или ванкомицин (1-15 мг/л).
3. Полученные микропобеги черенкуются на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Серединные сегменты повторно переносятся на среды мультипликации. Апикальные части высаживают на среду укоренения. В качестве среды для укоренения используется редуцированная до ½ по макросолям среда MS, дополненная сахарозой (10-30 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), антибиотиками (перечень и концентрации указаны в п.2).
Эффективность укоренения оценивается долей укорененных хорошо сформированных микрорастений от числа всех эксплантов, выраженной в процентах.
В таблицах 1-3 представлены результаты исследований по влиянию на укореняемость микропобегов условий предшествующего этапа культивирования, а именно: концентрация цитокининов (БАЛ, зеатин и кинетин), минеральный состав питательной среды (MS, QL, WPM и DKW), наличие антибиотиков в среде. В качестве контрольного варианта использовались среда и концентрация цитокинина (2-изопентениладенин), описанные в прототипе.
Таблица 1
Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от концентраций фитогормонов, применяемых на этапе мультипликации (при использовании среды MS)
Среда укоренения
Среда мультипликации
Прототип
Z0,5 мг/л
БАП0,2 мг/л
Z0,2 мг/л; БАП0,5 мг/л
Z0,5 мг/л;БАП 0,2 мг/л
БАП1,0 мг/л
БАП2,0 мг/л
Z 1,0 мг/л
Z 2,0 мг/л
kin 0,5 мг/л
kin 1 мг/л
kin1,5 мг/л
Примроуз
R 10*
45
60
43
63
50
60
37
95
79
53
57
39
R20*
51
43
40
72
30
63
42
95
77
50
63
43
R30*
47
45
39
57
35
60
40
90
81
46
53
30
Богдан Хмельницкий
R10
54
75
40
90
50
80
61
84
74
54
81
28
R20
51
95
35
93
95
85
57
97
79
62
92
30
R30
62
80
35
89
70
82
63
94
83
63
76
35
Надежда
R10
48
65
50
65
88
73
64
93
83
61
60
58
R20
48
70
50
62
92
76
71
87
85
67
64
61
R30
45
70
45
70
87
74
59
78
79
67
68
66
* - где R - редуцированная по макросолям до ½ среда MS, цифровой индекс после R означает концентрацию сахарозы в среде в граммах на 1 литр (Здесь и далее)
Таблица 2
Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на различных питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды
Среда укоренения
Минеральный состав среды на этапе мультипликации
MS
QL
WPM
DKW
Цитокинин (концентрация 1 мг/л)
Z
БАП
Kin
Z
БАП
Kin
Z
БАП
Kin
Z
БАП
Kin
R10
95
60
57
90
90
65
80
75
69
89
67
65
R20
95
63
63
97
93
71
79
73
70
92
72
64
R30
90
60
53
95
95
70
75
77
68
94
70
65
Результаты представлены на примере сорта Примроуз.
Таблица 3
Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды и наличия антибиотика, применяемых на этапе мультипликации
Среда укоренения
Среда мультипликации
MS; Z 1,0 мг/л
MS; Z 1,0 мг/л; CEF
QL; Z 1,0 мг/л;
QL; Z 1,0 мг/л; CEF
R10
75
80
80
85
R20
70
75
68
81
R30
80
95
84
100
Результаты представлены на примере сорта Президент Греви. Статистически достоверные различия отсутствуют в вариантах питательных сред, где цевотаксим содержится в концентрациях от 50 до 150 мг/л.
При добавлении индивидуальных антибиотиков в среду культивирования в следующих концентрациях: ванкомицин 1-15 мг/л и/или цефотаксим 50-150 мг/л и/или тикарциллин 10-50 мг/л и/или пенициллин 50-100 мг/л и/или ампициллин 50-100 мг/л и/или стрептомицин 5-50 мг/л и/или тетрациклин 10-100 мг/л - статистически достоверных различий не выявлено (данные не представлены).
Добавление НУК или ИУК в заявленных концентрациях не вызывало статистически достоверных различий процента укоренения (данные не представлены).
Использование перечисленных концентраций фитогормонов позволяют увеличить эффективность укоренения микропобегов сирени в культуре in vitro относительно прототипа до 2 раз.