Диагностика инфекционных заболеваний крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа в сухих пятнах крови с использованием нового формата пробоподготовки

УДК 619:578.828.11

ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО ФОРМАТА ПРОБОПОДГОТОВКИ

Н.Ю. Саушкин1*, Ж.В. Самсонова12, А.П. Осипов1'2, С.Э. Кондаков1'2, М.А. Ефимова3, А.Н. Чернов3

Проведено выявление антител к инфекционным заболеваниям крупного рогатого скота (энзоотический лейкоз, вирусная диарея, инфекционный ринотрахеит) методом иммуноферментного анализа в сухих образцах цельной крови, полученных с использованием нового формата пробоподготовки на пористых мембранных носителях. Диагностирование инфекций проводили с использованием нескольких коммерческих тест-систем и сравнивали полученные данные с результатами анализа жидких образцов сыворотки крови. Результаты анализа сухих и жидких образцов полностью совпадали. Новый формат пробоподготовки позволяет исключить холо-довую цепь при транспортировке образцов в диагностические лаборатории и упростить их хранение.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, энзоотический лейкоз, вирусная диарея, инфекционный ринотрахеит, иммуноферментный анализ, пористые мембранные носители, сухие пятна крови.

Инфекционные заболевания крупного рогатого скота (КРС), такие как энзоотический лейкоз (ЭЛ), вирусная диарея (ВД), инфекционный ринотрахеит (ИРТ), широко распространены в животноводческих хозяйствах и наносят серьезный экономический ущерб [1-3]. Эти заболевания характеризуются длительным латентным периодом и множеством различных форм течения болезни. В условиях промышленного животноводства вирусы легко передаются от одной особи к другой, что приводит к быстрому распространению инфекции в стадах и высокой доле инфицированных животных.

Для своевременного выявления зараженных особей и последующего оздоровления стад проводят ряд диагностических мероприятий. Диагностика в большинстве случаев основывана на применении серологических методов исследования, таких как реакция иммунодиффузии в агарозном геле и иммуноферментный анализ (ИФА). Эти методы направлены на выявление специфических антител, которые вырабатываются в организме животного в качестве иммунного ответа на чужеродные белки вирусов. Используют также методы, например полиме-разную цепную реакцию (ПЦР), направленные

на непосредственное выявление возбудителей инфекционных заболеваний.

В целях планового мониторинга стад на наличие инфекционных заболеваний, а также проверки напряженности иммунитета после вакцинации отобранные образцы крови пересылают для анализа в диагностическую лабораторию. В большинстве случаев после отбора проб появляется острая необходимость в заморозке биоматериала и последующем соблюдении требований холодовой цепи при его транспортировке. Проблему хранения и доставки биообразцов может решить применение новой технологии пробоподготовки, основанной на высушивании биологических жидкостей (кровь, молоко и др.), нанесенных на мембранный пористый носитель. Подобная технология (DBS - Dried Blood Spot) отбора, хранения и транспортировки биологических жидкостей в виде сухих пятен, обычно крови, относительно широко распространена в медицине [4, 5].

При данном подходе несколько капель крови наносят на специальную целлюлозную мембрану, высушивают на воздухе и отправляют в лабораторию. Для получения сухого образца требуется

всего несколько капель жидкости, что снижает ин-вазивность процесса и позволяет меньше травмировать животное при отборе крови.

В последние годы технологию, основанную на получении сухих образцов, стали все чаще применять для ветеринарной диагностики, так как получение сухих образцов имеет ряд преимуществ перед традиционным методом отбора крови и других биологических жидкостей [6, 7]. К преимуществам технологии сухих пятен следует отнести существенное упрощение отбора и хранения образцов, сокращение расходов на транспортировку образцов за счет отсутствия холодовой цепи, возможность проведения пробоподготовки в полевых условиях.

Ранее нами предложен новый формат пробо-подготовки на пористых мембранных носителях, изготовленных в виде узких маркированных полосок. Этот формат был успешно использован для количественного определения прогестерона методом ИФА в целях раннего выявления нестельных особей [8], а также выявления прови-русной ДНК вируса лейкоза КРС в сухих образцах крови методом ПЦР [9].

Цель данной работы - изучение возможности использования нового формата пробоподготовки для выявления специфических антител методом ИФА в сухих образцах крови при диагностике инфекционных заболеваний КРС.

Материалы и методы

Отбор и подготовка образцов. Для анализа использовали образцы крови 62 голов КРС, отобранные в полевых условиях в животноводческих хозяйствах республики Татарстан. Сухие образцы получали нанесением цельной крови на мембранные носители с последующим высушиванием. Носитель представлял собой тонкую маркированную мембранную полоску шириной 0,5 см, закрепленную в специальной карточке для хранения и транспортировки биологических жидкостей в виде сухих пятен (ООО «Им-муновед», Москва) [10]. Для нанесения биоматериала начальный участок мембраны помещали в образец жидкой крови, выдерживали до полного смачивания полоски, затем вынимали и высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч. Высушенные образцы хранили при 4°С в плотно закрытых пластиковых пакетах с осушителем. Для получения жидкой сыворотки пробирки с образцами цельной крови центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин. Аликвоты полученных сывороток хранили при -18°С.

Определение антител к возбудителям инфекционных заболеваний КРС в сухих пятнах крови методом ИФА. Для проведения качественного иммуноферментного анализа в целях выявления антител к белку gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота (ЭЛ КРС) использовали диагностический набор реагентов BLV Antibody Test Kit («IDEXX», Франция). От мембраны с сухим образцом крови, согласно маркировке, отрезали ножницами участок мембраны размером 0,5^0,5 см и помещали его в лунку 96-луночного планшета. Образцы исследовали в двух повторах. Перед отрезанием нового образца ножницы протирали бумажной салфеткой для удаления оставшихся частиц сухой крови. В лунки с образцами добавляли 200 мкл буфера для разведения образцов. Образцы перемешивали на шейкере при 120 об/мин в течение 10 мин, а затем накрывали крышкой и выдерживали при температуре 37°C в течение 1 ч. После инкубации раствор декантировали, оставшиеся в лунках участки мембран удаляли пинцетом. Дальнейшие действия и интерпретацию результатов проводили согласно инструкции к набору. Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре «Anthos 2010» («Biochrom Ltd», Великобритания) при длине волны 450 нм.

Для выявления антител к белкам вируса ИРТ КРС использовали диагностический набор «ИРТ-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим», Москва). От мембраны с сухим образцом крови, согласно маркировке, отрезали ножницами участок мембраны размером 0,5*0,5см и помещали в пробирку. Перед отрезанием нового образца ножницы протирали бумажной салфеткой для удаления оставшихся частиц сухой крови. Необходимое разведение образца получали путем добавления к одному маркированному участку мембраны 700 мкл буфера для разведения. Далее анализ проводили согласно инструкции к набору.

Для выявления антител к белкам вируса ВД КРС использовали диагностический набор «ВДКРС-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим», Москва). От мембраны с сухим образцом крови, согласно маркировке, отрезали ножницами 2 участка мембраны размером 0,5*0,5см и помещали в лунку планшета. Перед отрезанием нового образца ножницы протирали бумажной салфеткой для удаления оставшихся частиц сухой крови. Образцы перемешивали на шейкере при 120 об/мин в течение 10 мин, а затем накрывали крышкой и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. После инкубации раствор декантировали из лунки резким движением, а оставшиеся в лунках участ-

ки мембран удаляли пинцетом. Следующие этапы анализа и интерпретацию результатов проводили согласно инструкции к набору.

Результаты и обсуждение

Для отбора, хранения, транспортировки и проведения анализа сухих образцов крови применяли новый формат пробоподготовки и в качестве носителя биологического материала использовали тонкую маркированную мембрану, выполненную в виде полоски из пористого гидрофильного стекловолоконного материала. По сравнению с традиционно используемым целлюлозным носителем стекловолоконная мембрана обладает рядом как механических (повышенная прочность и устойчивость к деформациям при нагрузках), так и структурных (цельная структура волокон) преимуществ. Электронные микрофотографии двух мембранных носителей, полученные на сканирующем электронном микроскопе «Tescan, Vega 3SB» («Jeol Ltd.», Япония), наглядно демонстрируют структурные различия целлюлозной и стекловолоконной мембран (рисунок). Электронные фотографии получали как для чистых мембран, так и для мембран с высушенным образцом крови. В отличие от полых целлюлозных волокон (рисунок В, Г), цельность

В

структуры стекловолоконных тяжей исключает проникновение биологической жидкости внутрь волокон (рисунок А, Б) и увеличивает эффективность элюирования анализируемых компонентов с мембраны. Кроме того, структура стекло-волоконных мембран позволяет исключить хро-матографический эффект распределения компонентов в процессе впитывания биологической жидкости, а также преодолеть трудности в количественном анализе цельной крови, связанные с проявлением эффекта гематокрита, характерные для целлюлозных мембран [5]. Объемное содержание клеточных элементов в крови (гемато-крит) может сильно варьировать в зависимости от возраста, физического состояния и жизненного цикла животного, что приводит к ошибкам при измерениях с использованием целлюлозных мембран. Равномерное распределение биологической жидкости в стекловолоконной мембране независимо от содержания форменных элементов позволяет исключить неточности при анализе сложных биологических жидкостей, таких как кровь и молоко.

Адаптация коммерческих диагностических наборов для выявления антител в сухих образцах биологических жидкостей зависит от требуемого конечного разведения исследуемого

Г

Изображения мембран, полученные методом сканирующей электронной микроскопии: А -стекловолоконная мембрана без образца, Б - с образцом сухой крови, В - целлюлозная мембрана без образца, Г - с образцом сухой крови

образца для конкретной диагностической системы, а также от типа биологической жидкости, нанесенной на мембрану. В работе использовали образцы сухой цельной крови КРС, адсорбированной на стекловолоконной мембране емкостью около 15 мкл жидкости на один маркированный квадратный участок (0,5^0,5 см). Исходя из того, что среднее значение гематокрита КРС равно 3050%, можно считать, что на одном участке мембраны содержится 7-9 мкл плазмы в высушенном виде. Для получения требуемого разведения (в 100 раз) при анализе сухих образцов крови диагностическим набором «ИРТ-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим», Москва) к одному маркированному участку добавляли 700 мкл буфера для разведения. Для анализа образцов жидкой сыворотки крови набором реагентов BLV Antibody Test Kit («IDEXX», Франция) требовалось разведение пробы в 20 раз, т.е. добавление к одному квадрату, содержащему 15 мкл высушенной крови, 160 мкл буфера для разведения, что меньше необходимого для анализа объема жидкости, помещаемого в лунку (суммарный объем должен быть равен 200 мкл). В целях исключения стадии дополнительного разведения образцов участок мембраны помещали непосредственно в лунку планшета, а затем добавляли 200 мкл буфера для разведения образца. При таком подходе конечное разведение было близко к расчетному, а методика не усложнялась дополнительными стадиями. Для правильной интерпретации результатов варьировали объем добавляемых положительного и отрицательного контролей от 5 до 15 мкл. Варьирование отрицательного контроля практически не влияло на интерпретацию результатов. Объем добавленного положительного контроля в пределах 7-10 мкл пропорционально влияет на измеряемую оптическую плотность контрольной лунки. Наиболее точную интерпретацию результатов анализа сухих образцов крови (по сравнению с жидкими образцами сыворотки) получали при использовании аликвоты положительного контроля в объеме 7 мкл.

В таблице представлены итоговые результаты исследования сухих образцов на наличие антител к антигенам вирусных инфекций. Результаты ИФА, полученные с использованием сухих образцов крови, нанесенных на мембранные носители, полностью совпали с результатами, полученными при исследовании жидких образцов сыворотки. 22 из 62 (35%) образцов оказались ИФА-поло-жительными к белкам вируса лейкоза. Очевидно, что при столь высокой степени инфицирования стада необходима изоляция зараженных живот-

ных. Молоко больных лейкозом коров запрещено к реализации, что приводит к серьезным экономическим потерям животноводческих хозяйств.

Как известно, ЭЛ КРС неизлечим и зараженные животные выбраковываются во избежание распространения инфекции. Для борьбы с ВД и ИРТ КРС проводят плановую вакцинацию, а для проверки ее эффективности оценивают напряженность иммунитета, измеряя уровень поствакцинального титра антител. Анализ испытуемых проб, взятых от вакцинированных животных, на наличие антител к белкам вируса ИРТ показал, что 98% голов имеют высокий уровень напряженности иммунитета ИРТ. Для ВД КРС количество положительных проб составило 90%. Полученные данные свидетельствуют об успешно проведенных мерах по вакцинации против указанных инфекций, однако серонегативные животные должны быть ревакци-нированы и повторно протестированы.

Использование сухих образцов крови КРС показало высокую аналитическую надежность полученных данных качественного и полуколичественного ИФА. Титры антител (предельное разведение образца, при котором детектируется наличие антител) к вирусу ИРТ при анализе сухих образцов попали в те же диапазоны, что и при анализе жидких. Расхождение в значениях титра антител с двукратным шагом разведения допускается на границах диапазонов двукратных разведений. Процесс десорбции анализируемых веществ с мембраны в буфер для разведения происходит достаточно эффективно как во время предварительного разведения в пробирке, так и непосредственно в лунках планшета. Для проведения анализа жидкие образцы крови следует предварительно центрифугировать для получения сыворотки или плазмы. При использовании сухих образцов крови в ИФА необходимость в предварительном выделении жидкой фракции крови отпадает. Чтобы получить пробу, равномерно содержащую в своем объеме анализируемые компоненты (в нашем случае антитела), достаточно поместить участок мембраны с образцом в элюирую-щий буфер и перемешать в шейкере.

Таким образом, можно сделать вывод, что использованный в работе формат пробоподготовки и анализа образцов, высушенных на стекловолокон-ных мембранных носителях, пригоден для получения, хранения и транспортировки биоматериала в целях дальнейшего проведения анализа методом ИФА для диагностирования таких инфекционных болезней, как ИРТ, ВД и ЭЛ КРС.

Новый подход имеет ряд преимуществ перед традиционным отбором жидкой крови: цельную кровь КРС можно наносить непосредственно на

Результаты анализа сухих образцов крови на инфекционные заболевания КРС методом ИФА

Номер образца ЭЛ ВД ИРТ Титр антител к вирусу ИРТ Номер образца ЭЛ ВД ИРТ Титр антител к вирусу ИРТ

1 отр отр пол >1/3200 32 отр отр пол >1/3200

2 отр пол сомн 1/100 33 отр пол пол >1/3200

3 отр пол пол >1/3200 34 отр пол пол >1/3200

4 отр пол пол >1/3200 35 отр пол пол >1/3200

5 отр пол пол >1/3200 36 пол пол пол >1/3200

6 отр пол пол >1/3200 37 пол пол пол >1/3200

7 отр пол пол >1/3200 38 отр пол пол >1/3200

8 пол пол пол >1/3200 39 отр отр пол >1/3200

9 отр пол пол >1/3200 40 пол отр пол >1/3200

10 пол пол пол >1/3200 41 отр пол пол >1/3200

11 отр пол пол >1/3200 42 отр пол пол >1/3200

12 отр пол пол >1/3200 43 пол пол пол >1/3200

13 отр пол пол >1/3200 44 отр пол пол >1/3200

14 пол пол пол >1/3200 45 отр пол пол >1/3200

15 отр пол пол >1/3200 46 пол пол пол >1/3200

16 отр пол пол >1/3200 47 отр пол пол >1/3200

17 отр пол пол >1/3200 48 отр пол пол >1/3200

18 пол пол пол >1/3200 49 пол пол пол >1/3200

19 пол пол пол >1/3200 50 отр пол пол >1/3200

20 пол пол пол >1/3200 51 пол отр пол >1/3200

21 пол пол пол >1/3200 52 пол пол пол >1/3200

22 пол отр пол >1/3200 53 отр пол пол 1/1600

23 пол пол пол >1/3200 54 отр пол пол >1/3200

24 пол пол пол >1/3200 55 отр пол пол >1/3200

25 отр пол пол >1/3200 56 пол пол пол >1/3200

26 пол пол пол >1/3200 57 отр пол пол >1/3200

27 отр пол пол >1/3200 58 отр пол пол >1/3200

28 пол пол пол >1/3200 59 отр пол пол >1/3200

29 пол пол пол >1/3200 60 отр пол пол >1/3200

30 отр пол пол >1/3200 61 отр пол пол 1/800

31 отр пол пол >1/3200 62 отр пол пол >1/3200

О б о з н а ч е н и я. отр -отрицательные образцы, пол - положительные образцы, сомн - сомнительные образцы.

мембранный носитель и использовать в анализе без проведения стадии отделения сыворотки, а транспортировка высушенных образцов возможна без соблюдения специальных температурных условий. Стекловолоконные мембраны обладают лучшими структурными и физико-химическими свойствами по сравнению с существующими целлюлозными аналогами за счет цельной структуры волокон, высокой капиллярной впитываемости, емкости и устойчивости к

деформации. Применение стекловолоконных носителей в ветеринарии для отбора биоматериала позволит более эффективно проводить мониторинг стад на наличие инфекционных заболеваний и своевременно осуществлять комплекс мероприятий по его оздоровлению.

Авторы выражают благодарность инженеру НИТУ МИСиС Е.А. Колесникову за проведение исследования структуры мембранных материалов с использованием электронной микроскопии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы»; проект № КРМБР157814Х0010 (соглашение № 14.578.21.0010).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Минсельхоз России, Департамент ветеринарии. 23.08.2000 №13-7-2/2130.

2. Ridpath J.F. // Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2010. Vol. 26. № 1. P. 105.

3. Nandi S., Kumar M., Manohar M., Chauhan R.S. // Anim Health Res Rev. 2009. Vol. 10.

№ 1. P. 85.

4. Demirev P.A. // Anal. Chem. 2013. Vol. 85. № 2. Р. 779.

5. Meesters R.J.W., Hooff G.P. // Bioanalysis. 2013. Vol. 5. № 17. P. 2187.

6. Sun D., Cho Y.I., Comyn P., Yoon K.J. // Vet J. 2013. Vol. 198. № 2. P. 494.

7. Lehner A.F., Rumbeiha W., ShlosbergA., Stuart K., Johnson M., Domenech R., Langner H. // J Anal Toxicol. 2013. Vol. 37. № 7. P. 406.

8. Samsonova J.V., Osipov A.P., Kondakov S.E. // Vet. J. 2014. Vol. 199. № 3. P. 471.

9. Samsonova J.V Chadina A.S, Osipov A.P, Kondakov S.E, Makarova T.E, KomarovA.B. // Moscow Univ Chem Bull. 2014. Vol. 69. № 6. P. 282.

10. Осипов А .П., Кондаков С.Э., Григоренко В. Г., Смоленский В.И., Прокопцева О.С., Самсонова Ж.В. Устройство для получения, хранения и транспортировки сухих образцов жидкостных объектов, предназначенных для последующего проведения лабораторного анализа. Пат. РФ № 2519030.

Поступила в редакцию 01.03.16

A NEW SAMPLING FORMAT FOR BOVINE INFECTIOUS DISEASES ELISA DIAGNOSTIC IN DRIED BLOOD SPOTS

N.Yu. Saushkin1*, J.V. Samsonova1,2, A.P. Osipov1,2, C.E. Kondakov1,2, M.A. Efimo-va3, A.N. Chernov3

Bovine infectious diseases antibody detection (enzootic bovine leucosis, viral diarrhea, infectious rhinotracheitis) by ELISA in dried blood samples obtained with a new sampling format on porous membranes was carried out. Several commercial test systems were used for infection diagnostic. The obtained data were compared with the results of the analysis of liquid blood serum. ELISA results of dried and liquid samples were in full concordance. A new sampling format can simplify the storage and transportation of samples from farms to diagnostic laboratories.

Key words: cattle, enzootic bovine leucosis, viral diarrhea, infectious rhinotracheitis, ELISA, porous membranes, dried blood spots.

Сведения об авторах: Саушкин Николай Юрьевич - аспирант кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (sushk_90@mail.ru); Самсонова Жанна Васильевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, кан. хим. наук (jvs@enz.chem.msu.ru); Осипов Александр Павлович - ст. науч. сотр. кафедры функциональных наносистем и высокотемпературных материалов НИТУ МИСиС, кан. хим. наук (APOsipov@mail.ru); Кондаков Сергей Эмильевич - вед. науч. сотр. кафедры функциональных наносистем и высокотемпературных материалов НИТУ МИСиС, докт. фарм. наук (ksekse@mail.ru); Ефимова Марина Анатольевна - зав. лабораторией иммунологии и биохимии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», докт. биол. наук (marina-2004r@mail.ru); Чернов Альберт Николаевич - зам. директора по инновациям ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», докт. биол. наук (rt-kazan@mail.ru).