СНИЖЕНИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ НИКОТИНА В НОРНИКОТИН В РАСТЕНИЯХ

1. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака, содержащая:
(i) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую функциональную никотин-N-деметилазу, состоящий из нее или, по сути, состоящий из нее, и характеризующийся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2;
(ii) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, изложенным в (i);
(iii) полипептид, содержащий последовательность, кодирующую никотин-N-деметилазу, состоящий из нее или, по сути, состоящий из нее, и характеризующийся по меньшей мере 96% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3; или
(iv) конструкцию, вектор или вектор экспрессии, содержащие выделенный полинуклеотид, изложенный в (i),
и где экспрессия или активность указанной никотин-деметилазы снижена по сравнению с контрольной клеткой растения табака, в которой экспрессия или активность указанной никотин-деметилазы не была снижена.
2. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1, где указанная клетка растения табака характеризуется одной или более мутациями, которые снижают экспрессию или активность указанной никотин-деметилазы.
3. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1 или 2, которая характеризуется одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E4, где указанная мутация приводит в результате к сниженной экспрессии или функции указанной никотин-деметилазы CYP82E4, где предпочтительно указанная никотин-деметилаза CYP82E4 выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 12-16 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация приводит в результате к модификации указанной никотин-деметилазы CYP82E4 и происходит в положении, выбранном из группы, включающей аминокислотные остатки 329, 364, 376, 382 и 458 в SEQ ID NO: 5 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация выбрана из группы, включающей: а) замену на стоп-кодон остатка триптофана в положении 329 SEQ ID NO: 5; b) замену на аспарагин остатка лизина в положении 364 SEQ ID NO: 5; с) замену на метионин остатка валина в положении 376 SEQ ID NO: 5; d) замену на серии остатка пролина в положении 382 SEQ ID NO: 5; d) замену на серии остатка пролина в положении 458 SEQ ID NO: 5 и е) любую комбинацию двух или более из них.
4. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1 или 2, которая характеризуется одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E5, где указанная мутация приводит в результате к сниженной экспрессии или функции указанной никотин-деметилазы CYP82E5, где предпочтительно указанная никотин-деметилаза CYP82E5 выбрана из SEQ ID NO: 24 или 25 или их комбинации, где предпочтительно указанная мутация приводит в результате к модификации указанной никотин-деметилазы CYP82E5 и происходит по аминокислотным остаткам 422 или 449 в SEQ ID NO: 17 или их комбинации, где предпочтительно указанная мутация выбрана из группы, включающей: а) замену на стоп-кодон остатка триптофана в положении 422 SEQ ID NO: 17; b) замену на лейцин остатка пролина в положении 449 SEQ ID NO: 17 и с) их комбинацию.
5. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1 или 2, которая характеризуется одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E10, где указанная мутация приводит в результате к сниженной экспрессии или функции указанной никотин-деметилазы CYP82E10, где предпочтительно указанная никотин-деметилаза CYP82E10 выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 32-35 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация приводит в результате к модификации указанной никотин-деметилазы CYP82E10 и происходит в положении, выбранном из группы, включающей аминокислотные остатки 79, 107, 382, 419 в SEQ ID NO: 26 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация выбрана из группы, включающей: а) замену на серии остатка глицина в положении 79 SEQ ID NO: 26; b) замену на серии остатка пролина в положении 107 SEQ ID NO: 26; с) замену на серии остатка пролина в положении 382 SEQ ID NO: 26; d) замену на серии остатка пролина в положении 419 SEQ ID NO: 26 и е) любую их комбинацию.
6. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1 или 2, которая дополнительно характеризуется
(i) одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E4, где указанная мутация приводит в результате к сниженной экспрессии или функции указанной никотин-деметилазы CYP82E4, где предпочтительно указанная никотин-деметилаза CYP82E4 выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 12-16 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация приводит в результате к модификации указанной никотин-деметилазы CYP82E4 и происходит в положении, выбранном из группы, включающей аминокислотные остатки 329, 364, 376, 382 и 458 в SEQ ID NO: 5 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация выбрана из группы, включающей: а) замену на стоп-кодон остатка триптофана в положении 329 SEQ ID NO: 5; b) замену на аспарагин остатка лизина в положении 364 SEQ ID NO: 5; с) замену на метионин остатка валина в положении 376 SEQ ID NO: 5; d) замену на серии остатка пролина в положении 382 SEQ ID NO: 5; d) замену на серии остатка пролина в положении 458 SEQ ID NO: 5 и е) любую комбинацию двух или более из них; и
(ii) одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E5, где указанная мутация приводит в результате к сниженной экспрессии или функции указанной никотин-деметилазы CYP82E5, где предпочтительно указанная никотин-деметилаза CYP82E5 выбрана из SEQ ID NO: 24 или 25 или их комбинации, где предпочтительно указанная мутация приводит в результате к модификации указанной никотин-деметилазы CYP82E5 и происходит по аминокислотным остаткам 422 или 449 в SEQ ID NO: 17 или их комбинации, где предпочтительно указанная мутация выбрана из группы, включающей: а) замену на стоп-кодон остатка триптофана в положении 422 SEQ ID NO: 17; b) замену на лейцин остатка пролина в положении 449 SEQ ID NO: 17 и с) их комбинацию; и
(iii) одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E10, где указанная мутация приводит в результате к сниженной экспрессии или функции указанной никотин-деметилазы CYP82E10, где предпочтительно указанная никотин-деметилаза CYP82E10 выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 32-35 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация приводит в результате к модификации указанной никотин-деметилазы CYP82E10 и происходит в положении, выбранном из группы, включающей аминокислотные остатки 79, 107, 382, 419 в SEQ ID NO: 26 или комбинацию двух или более из них, где предпочтительно указанная мутация выбрана из группы, включающей: а) замену на серии остатка глицина в положении 79 SEQ ID NO: 26; b) замену на серии остатка пролина в положении 107 SEQ ID NO: 26; с) замену на серии остатка пролина в положении 382 SEQ ID NO: 26; d) замену на серии остатка пролина в положении 419 SEQ ID NO: 26 и е) любую их комбинацию.
7. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1 или 2, которая дополнительно характеризуется:
(i) одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E4, одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E5, и одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E10, где указанная никотин-деметилаза CYP82E4 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 13 (W329Stop), указанная никотин-деметилаза CYP82E5 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 24 (W422Stop), и указанная никотин-деметилаза CYP82E10 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33 (G79S); или
(ii) одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E4, одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E5, и одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E10, где указанная никотин-деметилаза CYP82E4 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 13 (W329Stop), указанная никотин-деметилаза CYP82E5 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 24 (W422Stop), и указанная никотин-деметилаза CYP82E10 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34 (P107S); или
(iii) одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E4, одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E5, и одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E10, где указанная никотин-деметилаза CYP82E4 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 13 (W329Stop), указанная никотин-деметилаза CYP82E5 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 24 (W422Stop), и указанные никотин-деметилазы CYP82E10 содержат последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35 (P382S).
(iv) одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E4, одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E5, и одной или более мутациями в гене, кодирующем никотин-деметилазу CYP82E10, где указанная никотин-деметилаза CYP82E4 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 13 (W329Stop), указанная никотин-деметилаза CYP82E5 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 24 (W422Stop), и указанная никотин-деметилаза CYP82E10 содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 32 (P419S).
8. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1 или 2, где указанная(указанные) мутация(мутации) представляет(представляют) собой мутацию в гетерозиготной или гомозиготной форме.
9. Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная клетка растения табака по п. 1 или 2, где указанная клетка растения характеризуется показателем превращения никотина в норникотин, составляющим менее 1%.
10. Мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение или его компонент или часть, содержащие клетку растения по любому из пп. 1-9.
11. Растительный материал, включающий биомассу, семя, стебель, цветки или листья растения по п. 10.
12. Табачный продукт, содержащий клетку растения по любому из пп. 1-9, по меньшей мере часть растения по п. 10 или растительный материал по п. 11.
13. Способ получения растения табака со сниженными уровнями норникотина и/или NNN, причем указанный способ предусматривает стадии:
(a) обеспечения растения, содержащего (i) полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую функциональную никотин-N-деметилазу, состоящий из нее или, по сути, состоящий из нее, и характеризующийся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2;
(b) введения одной или более мутаций в указанный полинуклеотид указанного растения табака для создания мутантного растения табака;
(c) необязательно сушки растительного материала табака и
(d) измерения уровня норникотина и/или NNN в мутантном растении табака, где уменьшение уровня норникотина и/или NNN в мутантном растении табака по сравнению с контрольным растением табака свидетельствует о том, что уровни норникотина и/или NNN в указанном мутантном растении табака были снижены.
14. Способ по п. 13, где растение табака из стадии (b) представляет собой мутантное растение табака, где предпочтительно указанное мутантное растение табака характеризуется одной или более мутациями в одном или более дополнительных генах никотин-N-деметилазы.
15. Способ по п. 14, где указанное мутантное растение табака характеризуется одной или более дополнительными мутациями в генах, включающих группу CYP82E4, CYP82E5 или CYP82E10 или комбинацию двух или более из них.
16. Способ идентификации одной или более мутаций у растения табака, которые коррелируют с низкими уровнями норникотина и/или NNN в растении табака, растительном материале табака или в табачном дыме, полученном из указанного растения или растительного материала, причем указанный способ предусматривает стадии:
(a) идентификации растения табака с низкими уровнями норникотина и/или NNN по сравнению с контрольным растением табака;
(b) получения образца нуклеиновой кислоты из растения табака, идентифицированного на стадии (а);
(c) осуществления скрининга образца нуклеиновой кислоты из стадии (b) на присутствие одной или более мутаций в последовательности под SEQ ID NO: 1, которые не присутствуют у контрольного растения;
(d) необязательного сравнения одной или более мутаций, идентифицированных на стадии (с), с известными мутациями, которые снижают уровни норникотина и/или NNN в растении табака; и
(e) идентификации тех одной или более мутаций, которые коррелируют с низкими уровнями норникотина и/или NNN.
17. Способ получения сушеного растительного материала, предпочтительно сушеных листьев или цветков со сниженными в них уровнями норникотина по сравнению с контрольным растительным материалом, или сниженными в них уровнями по меньшей мере NNN по сравнению с контрольным растительным материалом, или их комбинацией, предусматривающий стадии:
(a) обеспечения растения по п. 10 или растительного материала по п. 11;
(b) необязательно сбора с него растительного материала и
(c) сушки растительного материала в течение некоторого периода времени с тем, чтобы уровни по меньшей мере норникотина или NNN были ниже, чем в контрольном сушеном растительном материале.