Оптимизация условий проведения ПЦР-амплификации локуса BoLA-DRB3-rEHA

6. Папуниди, К.Х. Сукцинаты d-элементов - перспективные биологически активные препараты / К.Х. Папуниди, Б.М. Гильметдинов, А.С. Гасанов и др. // Материалы II Международ. научно-практической конф. «Научно--технич. Прогресс в животноводстве России - ресурсосберегаемые технологии производства экологически безопасных продуктов

животноводства». - Дубровицы. ВНИИ животноводства. - 2003. - Ч.2. - С. 251-254.

7. Шустов, В.Н. Роль экологических факторов в развитии анемии. / В.Н. Шустов, Т.Е. Евзерова, Л.Я. Фетисова // Материалы 3 Всероссийск. Съезда гематол.-Сиб.. - 1996. -С.46-47.

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «ФЕРСЕЛ» НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОЛИКОВ ПРИ ОСТРОЙ ПОСТГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ АНЕМИИ

Гатаулина Л.Р., Гасанов А.С., Сергеев М.А., Тамимдаров Б.Ф., Акимбаева Д.И.

Резюме

Введение в организм кроликов препарата «Ферсел» в дозе 3 мг/кг массы тела при анемии оказывает восстанавливающий эффект на гематологический состав крови. Уровень содержания эритроцитов и гемоглобина не только нормализовались, но и были выше фоновых данных здоровых кроликов.

INFLUENCE OF "FERSEL" PREPARATION ON THE HEMATOLOGICAL INDICATORS OF RABBITS IN ACUTE POSTHEMORRAGIC ANEMIA

Gataulina L.R., Hasanov A.S., Sergeev M.A., Tamimdarov B.F., Akimbaeva D.I. Summary

The introduction into the organism of rabbits of the drug "Fersel" in a dose of 3 mg/kg of body weight with anemia has a restorative effect on the hematological composition of the blood. The levels of erythrocytes and hemoglobin is not only normal, but was above background data healthy rabbits.

УДК 636.2.082

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ ЛОКУСА

BoLA-DRB3-rEHA

Гильманов Х.Х. - аспирант ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: ПЦР, ДНК, ген, праймер, крупный рогатый скот, BoLA-DRB3, SBT Key words: PCR, DNA, gene, primer, cattle, BoLA-DRB3, SBT

Область II класса бычьего лейкоцитарного антигена (BoLA) состоит из одного локу-са ВЯЛ, трех локусов ОЯБ и множественных генов БОЛ и ВОБ [5, 8]. Ген БоЬЛ-ОЯБЗ является наиболее полиморфным локусом II класса у крупного рогатого скота и влияет как на величину, так и на эпитопную специфичность ответов антигенспецифических Т-клеток на инфекционные заболевания [5, 8].

БоЬЛ ОЯБЗ - ключевой ген, связанный с формированием первичного иммунного ответа организма на вирусную инфекцию. При этом, разные аллели данного гена играют роль,

ассоциированую с устойчивостью или чувствительностью к лейкозу крупного рогатого скота [2, 1].

Способ типизации групп аллелей BoLA-DRB3 на основе PCR-SSP метода (Sequence-Specific Primers - метод специфических праймеров), ранее разработанный S.N. Takeshima et al. (2001) [6], реализован в ПЦР с восемью специфическими праймерами к первой гипервариабельной области полиморфного экзона 2.

Однако для этого способа проведения PCR-SSP требуется проведение восьми реак-

ций ПЦР каждого образца и дополнительных процедур секвенирования, данные которых не включают первые 30 оснований экзона 2 вышеупомянутой гипервариабельной области, что является существенным недостатком [8].

Для решения этих проблем D. Miltiadou et al. (2003) [4] разработали способ BoLA-типирования методом секвенирования (SBT, Sequence Based Typing) с расшифровкой всего экзона 2 DRB3, предварительно амплифициро-ванного в двухраундной ПЦР (nested PCR).

В последующем, R. Baxter et al. (2008) [3] оптимизировали протокол проведения PCR-SBT до уровня проведения однораундной ПЦР с применением набора праймеров DRB3FRW и DRB3REV, фланкирующих анализируемый экзон 2 DRB3.

Позже, S.N. Takeshima et al. (2011) [8], комбинацией двух общеизвестных способов [3, 7], предложил усовершенствованную технику PCR-SBT для BoLA -типирования, где

праймеры DRB3FRW и DRB3REV, инициирующую амплификацию локуса ВоЬА-ВЯВЗ-тена длиной 319 Ьр, также используются в качестве сиквенсных при расшифровке анализируемой нуклеотидной последовательности каппиляр-ным секвенатором.

Цель настоящей работы - оптимизация условий проведения ПЦР-амплификации локуса ВоЬА-ВКВ3-гена, до уровня, пригодного для дальнейших процедур типирования методом секвенирования ^ВТ).

Материалы и методы исследований. Для выделения нуклеиновых кислот из крови крупного рогатого скота применяли комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК Сорб В» (ЦНИИ Эпидемиологии).

Информация о синтезированных нук-леотидных последовательностях праймеров (ООО "ДНК-синтез"), использованных в работе, представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Нуклеотидные последовательности праймеров

Наименование праймеров Последовательность праймеров Длина праймеров

Прямой праймер DRB3FRW 5/-CGCTCCTGTGAYCAGATCTATCC-3/ 23 н.

Обратный праймер DRB3REV 5/-CACCCCCGCGCTCACC-3/ 16 н.

При постановке ПЦР использовали набор реактивов "Encyclo Plus PCR kit" (ЗАО "Евроген") рассчитанный на 200 проб. В комплект набора входит: 50* смесь полимераз Encyclo (100 мкл); 10* Encyclo буфер (600 мкл); 5* Encyclo Red буфер (1.2 мл); 2*

Епсус1о GC буфер (2 * 1.5 мл); 50* смесь dNTP (120 мкл); стерильная вода для ПЦР (3 * 1.5 мл).

Для проведения ПЦР, использовали следующий состав реакционной смеси, представленный в таблице 2.

Таблица 2 - Приготовление реакционной смеси для ПЦР

Реакция с Реакция с Реакция с Конечная

Компонент Encyclo Red Encyclo Encyclo GC концентрация

Буфером, (мкл) Буфером , (мкл) Буфером, (мкл) компонента

Стерильная вода 16,5 19 7 -

5* Encyclo Red буфер 5 - - 1*

10х Encyclo буфер - 2,5 - 1*

2* Encyclo GC буфер - 12,5 1*

DRB3FRW 0,25 0,25 0,25 0,5 мкМ

DRB3REV 0,25 0,25 0,25 0,5 мкМ

50* Encyclo полимераза 0,5 0,5 0,5 1*

Проба ДНК 2 2 4 -

Конечный объем 25 мкл 25 мкл 25 мкл -

Для проведения амплификации был использован амплификатор «Терцик» (ООО

"ДНК-Технология"). Режимы термоциклиро-вания представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Режимы термоциклирования

Стадия Цикл Режим №1 Режим №2 Режим №3 Режим №4 Режим №5

Пред. денатурация > 1 94 0С - 4 мин.

Денатурация 94 0С - 30 с. 94 0С - 10 секунд

Отжиг 40 57 0С - 30 с. 58 0С - 10 с. 59 0С - 10 с. 61 0С - 10 с. 62 0С - 10 с.

Синтез 72 0С - 30 с. 72 0С - 10 с.

Досинтез > 1 72 0С - 7 м. 72 0С - 5 мин.

Хранение 10 0С

Электрофоретическую детекцию продуктов амплификации проводили с помощью комплекта реагентов "ЭФ-генотип 200" (ЦНИИ Эпидемиологии) в 2% агарозном геле в буфере ТБЕ, содержащим бромид этидия, с последующей визуализацией ДНК в УФ-трансиллюминаторе (Vilber Lourmat) и фиксацией результата ПЦР на цифровую фотокамеру (Canon).

Результаты исследований. Для определения оптимальных условий проведения ПЦР-амплификации локуса БоЬА-ОЯБ3-гена

использовали реакционные смеси и режимы термоциклирования, представленные в таблице 2 и 3, соответственно.

На первом этапе апробировали ПЦР с Encyclo Red буфером (табл. 2) и первый режим термоциклирования (табл. 3). В качестве пробы ДНК использовали нуклеиновые кислоты, экстрагированные сорбентным и комбинированным щелочным методом. Соответствующая электрофореграмма ПЦР-амплификации локу-са локуса BoLA-DRB3-гена представлена на рис. 1.

Рисунок 1 - Электрофореграмма результата ПЦР-амплификации

Обозначения: 1) ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp; 2-3) свежевыделенная ДНК, экстрагированная «ДНК Сорб В»; 4) ДНК с истекшим сроком хранения, экстрагированная «ДНК Сорб В»; 5) ДНК, экстрагированная комбинированным щелочным способом; 6) ОКО (отрицательный контрольный образец).

Как видно из электрофореграммы рисунка 1, при использовании в реакции Encyclo Red буфера происходит низкий выход специфичного ПЦР-продукта длиной 319 bp на фоне шмера ярковыраженной интенсивности. На следующем этапе апробировали ПЦР со стандартным Encyclo буфером (табл. 2) в поста-

новке второго и третьего режима термоцикли-рования (табл. 3), используя в качестве пробы ДНК нуклеиновые кислоты, экстрагированные сорбентным методом. Соответствующая элек-трофореграмма ПЦР-амплификации локуса ВоЬА-ОКВ3-гена представлена на рис. 2.

Рисунок 2 - Электрофореграмма результата ПЦР-амплификации (стандартный Епсус1о буфер) Обозначения: 1-5) ПЦР-пробы, амплифицированные в режиме термоциклирования №2; 6) ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp; 7-9) ПЦР-пробы, амплифицированные в режиме термоциклирования №3.

Как видно из электрофореграммы рисунка 2, использование в реакции стандартного Епсус1о буфера также приводит к низкому выходу специфичного ПЦР-продукта, но уже на фоне шмера слабовыраженной интенсивности. На заключительном этапе апробировали ПЦР с Епсус1о GC буфером (табл. 2), рекомен-

дуемым для работы со сложными для амплификации фрагментами, например, с фрагментами, богатыми GC участками, в постановке четвертого и пятого режима термоциклирова-ния (табл. 3). Полученная в результате реакции электрофореграмма ПЦР-амплификации локу-са БоЬЛ-ОКБЗ-гена представлена на рис. 3.

Рисунок 3 - Электрофореграмма результата ПЦР-амплификации

Обозначения: 1-4) ПЦР-пробы, амплифицированные в режиме термоциклирования №4; 5) ДНК-маркеры 100 Ьр + 50 Ьр; 6-9) ПЦР-пробы, амплифицированные в режиме термоциклирования №5.

Как видно из электрофореграммы рисунка 3, применение в реакции Encyclo GC буфера обеспечивает сравнительно высокий выход специфичного ПЦР-продукта локуса ВоЬА-0КВ3-гена длиной 319 bp без образования шмеров и неспецифики.

Таким образом, установлено, что ПЦР с Encyclo GC буфером является наиболее оптимальным вариантом для накопления специфического продукта амплификации изучаемой мишени в сравнении с двумя другими буферами из набора реактивов "Encyclo Plus PCR kit.

Заключение. В результате проведенной работы оптимизированы условия проведения ПЦР-амплификации локуса BoLA-DRB3-гена с праймерами DRB3FRW и DRB3REV и набором реактивов "Encyclo Plus PCR kit", обеспечивающие эффективную наработку специфического продукта реакции до уровня, пригодного для дальнейших процедур типиро-вания методом секвенирования (SBT).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ковалюк, Н.В. Молекулярно-генетические аспекты в селекции и ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота // дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.23 / Ковалюк Наталья Викторовна. - Краснодар. - 2008. -174с.

2. Эрнст, Л.К. Особенности распространения антигенов BoLA-DRB3 у черно-пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом / Л.К. Эрнст, Г.Е. Сулимова, А.Р. Орлова, И.Г. Удина, С.П. Павленко // Генетика. - 1997. - №1. - С. 84-95.

3. Baxter, R. A rapid and robust sequence-based genotyping method for BoLA-DRB3 alleles in large numbers of heterozygous cattle / R. Baxter, N. Hastings, A. Law // Anim enet. - 2008. - V. 39. - P. 561-563.

4. Miltiadou, D. Establishment of a sequence-based typing system for BoLA-DRB3 exon 2 / D. Miltiadou, A.S. Law, G.C. Russell // Tissue Antigens. - 2003. - V. 62(1). - P. 55-65.

5. Takeshima, S. Structure, function and disease susceptibility of the bovine major histocompatibility complex / S. Takeshima, Y. Aida // Anim Sci J. - 2006. - V. 77. - P. 138-150.

6. Takeshima, S. Identification of new cattle BoLA-DRB3 alleles by sequence-based typing / S. Takeshima, M. Ikegami, M. Morita, Y. Nakai, Y. Aida // Immunogenet. -2001. - №53. - P. 74-81.

7. Takeshima, S. Short communication: establishment of a new polymerase chain reaction sequence-based typing method for geno-typing cattle major histocompatibility complex class II DRB3 / S. Takeshima, Y. Matsumoto, Y. Aida // J Dairy Sci. - 2009. - V. 92. - P. 29652970.

8. Takeshima, S. A new method for typing bovine major histocompatibility complex class II DRB3 alleles by combining two established PCR sequence-based techniques / S. Takeshima, Y. Matsumoto, T. Miyasaka, M. Arainga-Ramirez, H. Saito,M. Onuma & Y. Aida // John Wiley & Sons A/S Tissue Antigens. -2011. - V. 78. - P. 208-213.

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ ЛОКУСА BoLA-

DRB3-rEHA

Гильманов Х.Х.

Резюме

BoLA DRB3 - ген иммунного ответа организма, чьи аллели ассоциированы с устойчивостью или чувствительностью к лейкозу крупного рогатого скота. Из уровня техники известны способы BoLA-типирования методом секвенирования (SBT) с расшифровкой всего экзона 2 DRB3. Цель работы состояла в оптимизации условий проведения ПЦР-амплификации локуса BoLA-DRB3-rern, до уровня, пригодного для дальнейших процедур типирования методом секвенирования. В результате проведенных исследований были оптимизированы условия проведения ПЦР для амплификации локуса BoLA-DRB3-гена с праймерами DRB3FRW и DRB3REV и набором реактивов "Encyclo Plus PCR kit", обеспечившие эффективную наработку специфического продукта реакции.

OPTIMIZATION OF CONDITION FOR PCR AMPLIFICATION OF THE BOLA-DRB3-GENE LOCUS

Gilmanov Kh.Kh.

Summary

BoLA DRB3 is the immune response gene of an organism whose alleles are associated with resistance or sensitivity to bovine leukemia. Methods for BoLA typing by sequencing (SBT) with decipher-

ment of the entire exon 2 DRB3 are known in the art. The aim of the work was to optimize the conditions for PCR amplification of the BoLA-DRB3 gene locus, to a level suitable for further procedure of typing by sequencing. As a result of the studies, the PCR conditions for amplification of the BoLA-DRB3 gene locus with the DRB3FRW & DRB3REV primers and the "Encyclo Plus PCR kit" reagents were optimized to ensure the effective production of a specific reaction product.

УДК 619: 577.122.

ТЕРМИНОЛОГИЧЕСКИЕ ТРУДНОСТИ ОСВОЕНИЯ СТУДЕНТАМИ КУРСА НОРМАЛЬНОЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИОЛОГИИ

Гильмутдинов Р.Я. - д.б.н., профессор ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: терминология, белок, протеин, протеид; белковая дистрофия, диспротеино-зы, амилоидоз; белково-энергетическая недостаточность, гипотрофия, гипостатура, мальнутриция; гиперпротеинемия, гипопротеинемия.

Key words: terminology, albumin, protein, proteid; protein-energy malnutrition, malnutrition, un-dernutrition; giperproteinemiya, gipoproteinemiya.

Совокупность терминов в медицине, достигающая на сегодня нескольких сотен тысяч, отражает имеющийся на данный исторический момент уровень знаний о том или ином физиологическом или патологическом явлении. Некоторые термины вследствие универсальности и «практичности» стали «долгожителями», что зачастую только осложняет понимание проблемы. Последние десятилетия характеризуются унификацией международной медицинской терминологии. Тем более, наличие множества терминов-синонимов встречающихся в вузовских учебниках затрудняет понимание соответствующих тем студентами, которые не в состоянии дифференцировать эти достаточно близкие понятия. Ниже приводятся соответствующие примеры и их анализ.

Белок - протеин - протеид. Представление о белках как классе соединений формировалось в XVШ-XIX веках. В этот период из разнообразных объектов живого мира были выделены вещества, обладающие сходными свойствами: они образовывали вязкие, клейкие растворы, свертывались при нагревании, при их высушивании получалась роговидная масса, при «анализе огнем» ощущался запах паленой шерсти или рога и выделялся аммиак. Поскольку все перечисленное характерно для яичного белка, новый класс веществ получил название «белки».

Впервые данный термин был употреблен применительно к веществу птичьих яиц, свертывающемуся при нагревании в белую нерастворимую массу. Позднее его распространили на другие соединения с подобными свойствами, выделенные из животных и расте-

ний. C XVIII века термин «белок» стал ходовым. Открытие белков связывают (приписывают) с итальянцем Якобом-Якопом Бекари (Beccari G.), в 1728 году заметившим в тесте наличие клейкого вещества, придающего ему тягучесть (сейчас его называют клейковиной). Значительно позже Жерард Мульдер (Mulder G.) предположил, что сумел выделить общую для всех белков структурную электроположительную единицу-радикал с формулой C43H62N10O16, которую, по совету шведского химика Якоба Берцелиуса (Berzelius J.), назвал «протеином» (греч. «лрютеюд, protos» - первый, важнейший). Некоторые исследователи считают, что термин предложил в 1838 году сам Я. Берцелиус, справедливо рассматривавший «протеины» как некие первичные строительные блоки живых организмов. Обычно оба термина рассматриваются как синонимы, хотя по смыслу термин «протеин» безусловно точнее. Исторически же сложилось, что в русском научном языке гораздо чаще употребляется «белок», а в западной - «протеин».

Между тем, представление о существовании такой группы в скором времени было опровергнуто и значение термина «протеины» изменилось. Протеины - белки, состоящие только из остатков аминокислот, и к ним относятся многие ферменты. Для обозначения сложных белков, содержащих дополнительно к полипептидной части небелковый компонент (простетическую группу) в виде какого-либо остатка иной химической природы, ранее использовали термин «протеиды - proteid» (греч. «protos» - первый, важнейший и ««idos» - вид) (липопротеиды, нуклеопротеиды, хромопроте-иды, фосфопротеиды и т. д.). Первым его ввел