Методы анализа метилирования ДНК

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616-006.04-092:612.6.05]-074

Ю. В. Филина, А. Г. Габдулхакова, М. И. Арлеевская МЕТОДЫ АНАЛИЗА МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК

ЦНИЛ Казанской государственной медицинской академии

Статья посвящена обзору методов анализа метилирования ДНК - одного из ключевых механизмов регуляции экспрессии генов. Сайты аберрантного метилирования являются потенциальными маркерами неопластической трансформации. В настоящее время активно ведется разработка клинических тестов на основе анализа метилирования для прогнозирования и диагностики раковых заболеваний, детекции микрометастазов и пренатальной диагностики некоторых наследственных синдромов. В обзоре проведен сравнительный анализ методов, которые используются в клинической практике и для проведения фундаментальных исследований.

Ключевые слова: метилирование, CpG, рестрикционный анализ, бисульфитная конверсия, ПЦР, иммунопре-ципитация, секвенирование

Yu.V. Filina, A.G. Gabdulkhakova, M.I. Arleyevskaya THE METHODS OF ANALYSIS OF DNA METHYLATION The article deals with the review of methods of analysis of DNA methylation as one of key mechanisms of regulation of gene expression. The sites of aberrant methylation are potential markers of neoplastic transformation. At the present time, the development of clinical tests is in the process on basis of analysis of methyla-tion to make prognosis and to diagnose oncologic diseases, micro metastases de-tection and prenatal diagnostics of certain hereditary syndromes. The comparative analysis of methods applied in clinical practice and in carrying out fundamental studies was made.

Key words: methylation, CpG, restriction enzyme digests analysis, bisulfite con-version, polymerase chain reaction, immune precipitation, sequenation

Введение. Метилирование - единственная ковалентная модификация ДНК - осуществляется путем переноса метильной группы с .^-аденозил метионина в 5-ю позицию пиримидино-вого кольца цитозина (рис. 1) [1, 11].

Метилирование ДНК является ключевым механизмом, регулирующим эмбриональное развитие, транскрипцию генов, структурную организацию хроматина, инактивацию Х-хромосомы, хромосомную стабильность и геномный им-принтинг В настоящее время появляется все больше данных о роли аберрантного метилирования ДНК в развитии различных патологий: онкологических заболеваний, импринтных расстройств, различных воспалительных процессов [3, 11, 12].

Сайты аберрантного метилирования могут использоваться как маркер неопластической трансформации даже очень малого количества клеток. В настоящее время анализ метилирования предлагают использовать для детекции микрометастазов у пациентов с гастроинтестинальным раком и раком легких, прогнозирования развития рака груди, диагностики рака простаты [14] и ранней карциномы [13], пренатальной диагностики [4, 8, 13]. Причем для анализа метилирования необязательно исследование образцов ткани, достаточно и небольшого количества опухолевой ДНК из крови, плазмы и других биологических жидкостей.

Методы анализа метилирования. Большинство методов определения метилирования ДНК основаны на одном из следующих принципов (рис. 2):

1) использование метилчувствительных рестрикционных эндонуклеаз с последующим анализом полученных фрагментов,

2) специфическая детекция 5-метилцитозина или продуктов его превращения (бисульфитная конверсия) [6, 7].

Для корреспонденции:

Филина Юлия Викторовна, мл. науч. сотр. Адрес: 420012, Казань, ул. Муштари, 11 Телефон: yulifil@rambler.ru

1. Рестрикционный анализ - классический метод анализа метилирования, основанный на неспособности некоторых рестрикционных ферментов разрезать метилированные последовательности ДНК. Пара ферментов НраП-Мзр1 распознает последовательность ССОО, но рестриктаза Нра11 не способна разрезать ДНК, в которой метилирован внутренний С, что позволяет использовать эти ферменты для быстрого определения метилированных участков. Рестрикционный метод имеет несколько недостатков. Главный - не все СО расположены в последовательностях ССОО, что может привести к появлению ложноотрицательных результатов. Для проведения рестрикции и последующего анализа необходимо не менее 0,5-1 мкг ДНК [26].

Полученные после рестрикции фрагменты можно анализировать несколькими способами: масс-спектрометрический анализ, саузерн-блотт, лигирование с мечеными нуклеотида-ми, полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и др.

1.1. Масс-спектрометрический анализ. Для анализа метилирования ДНК обычно используют специфическую ре-

5'

СН,

Н Н О

о н

3'

5'

Рис. 1. Структура цитозина (а) и 5-метилцитозина (б).

Включение меченых оснований

Масс-спектрометрия

Бисульфитная конверсия

Саузерн-блотт

Метилспецифичная рестрикция

Секвенирование

±

Иммунопреципитация

ПЦР

Микроматричный анализ

Рис. 2. Методы анализа метилирования ДНК

стрикцию совместно с МАЬВ1-ТОР-масс-спектрометрией или электроспрей-ионизацией. Основным требованием для осуществления масс-спектрометрического анализа является высокая химическая чистота исследуемого соединения. Особенности анализатора налагают ограничение на размер исследуемых молекул ДНК: средний предел измерений около 30 кДа (100 Ьр), нижняя граница не менее 600 Да [2]. Масс-спектрометрический анализ не удобен для применения в клинической практике, но в сочетании с рестрикционным анализом, гибридизацией и другими методами лег в основу высокопроизводительных систем для сканирования метилирования геномной ДНК [16].

1.2. Полимеразное лигирование с мечеными нуклеотида-ми. Меченые нуклеотиды (радиоактивные 3Н-ССТР/-сСОТР, 32Р-ССТР/-СОТР или флюоресцентно-меченые ССТР/СОТР) присоединяют по липким концам фрагментов, которые образуются после рестрикции (рис. 3). Метод позволяет определить количество 5тС в образце ДНК. Долю метилированного цитозина (в норме 80-90%) рассчитывают по формуле:

-Мдр- - [Нра-Г] %

[М--]

где [МцрГ] и [НраИ] - радиоактивность/флюоресценция образца после рестрикции соответствующей рестриктазой.

1.3. Саузерн-блотт позволяет определить общий статус метилирования СрО-островков интересующего региона, но требует довольно большого количества (не менее 5 мкг) геномной ДНК и не обладает большой чувствительностью. Количество гибридизованных фрагментов может быть довольно высоким. Для СО-богатых последовательностей, где рестрикционные фрагменты имеют длину 100-500 Ьр, для фореза применяют 1,2% агарозный гель, который довольно сложно использовать для блотта [9]. В то же время клеточные линии и особенно ткани поликлональны и содержат смешанные паттерны метилирования, поэтому анализ бандов довольно сложен. Тем не менее этот метод гораздо проще и быстрее, чем бисульфитная модификация [17].

1.4. ПЦР-анализ - более чувствительный метод, позволяющий определить статус метилирования определенного ре-

Образец ДНК

т

Метилирование

Отсутствие метилирования

Рестрикция CCGG GGCC Hpall C\CGG GGCjC

1

Полимеразное лигирование CjCGG GGCfC Mspl CjCGG GGCfC

гиона, сочетает реакцию рестрикции и ПЦР. После рестрикции проводят ПЦР с праймерами, фланкирующими рестрик-ционные сайты, амплификация происходит только в том случае, если ДНК была метилирована и не подверглась разрезанию. Так же как и Саузерн-блотт, этот метод может определить метилирование только в сайтах рестрикции ме-тилчувствительных ферментов. Более того, при полной рестрикции неметили-рованной ДНК ПЦР не происходит, что может привести к ложноположительно-му результату. Неполная рестрикция и присутствие малого количества метилированных аллелей дают сходные результаты, и этот метод нельзя использовать для определения, например, гиперметилирования онкосупрессоров, когда клетки с метилированными аллелями составляют лишь небольшую фракцию в популяции [18].

2. Бисульфитная модификация ДНК. В одноцепочечной ДНК бисульфит натрия преимущественно деаминирует ци-тозин до урацила (и очень медленно деаминирует 5-метил-цитозин в тимин) (Shapiro et al., 1973). В 1992 г. Frommer и др. предложили использовать различие в реакционности бисульфита для геномного секвенирования 5-метилцитозино-вых остатков. Проводят полную денатурацию геномной ДНК и обработку бисульфитом в условиях, при которых цитозин стехиометрически конвертируется в урацил (рис. 4), но 5-ме-тилцитозин не подвергается изменениям. Результатом би-сульфитной реакции становятся цепи ДНК, которые больше не комплементарны [18, 19].

Бисульфитная конверсия - очень мощный метод, который используют для определения метилирования ДНК не только простым секвенированием, но и в сочетании с ПЦР, SnuPE, MethyLight, олигонуклеотидными микроматрицами, HPLC, пиросеквенированием и др. [10].

2.1. Бисульфитная ПЦР. При ПЦР-амплификации региона интереса в бисульфитобработанной ДНК весь ура-цил, ранее бывший цитозином, и тимин амплифицируются и считываются так же, как тимин, а 5-метилцитозин - как цитозин. После бисульфитной ПЦР ДНК можно клонировать и секвенировать - процесс длительный и технически довольно сложный. Без клонирования ПЦР-продуктов метод даже менее чувствителен, чем Саузерн-блотт (должно быть метилировано не менее 25% аллелей) [15].

Метод бисульфитной ПЦР используют также в коммерческих наборах для определения метилирования. Quantative MethyLight (Epigenomics): детекцию метилированных и не-метилированных участков производят при помощи динуклео-тидов CG и TG, меченных разными флюорофорами (рис. 5, а) [5, 27]. В наборе HeavyMethyl (Epigenomics) специфический блокатор препятствует амплификации бисульфитмо-дифицированной ДНК, и амплификация происходит только при отсутствии метилирования. Детекция осуществляется по присоединению флюоресцентно-меченого CG рис. 5, б) [27].

2.2. Метилспецифичная ПЦР (MSP) позволяет определить статус метилирования интересующей последовательности вне зависимости от количества метилированных CpG и не требует клонирования и использования метилчувстви-тельных рестриктаз. После обработки ДНК бисульфитом проводят амплификацию с праймерами, специфичными для

Подбор праймеров для MSP

Рис. 3. Полимеразное лигирование с мечеными нуклеотидами.

Показатель Праймер смысловой цепи

Исходный праймер Метилспецифичный праймер Метилнеспецифичный праймер CAGAGGGTGGGGCGCACCGC TAGAGGGTGGGGCGCATCGT TAGAGGGTGGGGTGCACTGT

HSO^ +HN

OH"

^ S" .

H20 NH4

Рис. 4. Бисульфитная конверсия цитозина в урацил [17].

б

и

m

<3s> у1 щ ©

ш_m_т.

???

Рис. 5. Принцип работы наборов Quantative MethyLight (а) и HeavyMethyl (б).

метилированных и неметилированных участков ДНК. ПЦР-праймеры в этом случае нужно подобрать таким образом, чтобы они специфически связывались с только бисульфитмо-дифицированной цепью. Праймеры для каждой цепи будут отличаться в той позиции, где были CG оригинальной последовательности (см. таблицу).

Метод требует небольшого количества геномной ДНК. Отличается высокой чувствительностью (0,1% метилированных аллелей), поэтому представляется весьма удобным для анализа клинических образцов [20].

2.3. Single Nucleotide Primer Extension (SnuPE) - метод, который можно использовать для точного анализа метилирования в определенной позиции ДНК. После бисульфитной обработки ДНК проводят отжиг праймеров, которые заканчиваются непосредственно перед анализируемым сайтом. Затем осуществляют две реакции удлинения цепи - с радиоактивным dCTP и радиоактивным dTTP (рис. 6). В этих реакциях только один нуклеотид добавляется к праймерам. После окончания реакции продукты разгоняются в акриламидном геле, и анализируется радиоактивность меченых праймеров. Для этого метода также можно использовать флюоресцентно-меченые нуклеотиды [21].

3. Иммунопреципитация ДНК. В этом методе используют специфические антитела к белкам, способным селективно связывать метилцитозин, - таким как MeCP2 и MBD2 [6]. Метод относительно чувствительный и не требует рестрикции геномной ДНК или бисульфитной обработки. Данные, полученные методом иммунопреци-питации, проще анализировать и интерпретировать, чем, например, после бисульфитной конверсии. В то же время иммунопреципитация позволяет получить данные только об общем метилировании и не применима к изучению конкретного гена.

4. Микроматричный анализ метилирования ДНК. Конструирование микроматриц (micro-array) для анализа метилирования ДНК основывается на трех методах: рестрикции, аффинной очистке и бисульфитной конверсии. Микрома-

тричная методология позволяет проводить сканирование всей геномной ДНК.

Коммерческие микроматрицы NimbleGen ("Roche") выпускают в нескольких вариантах, что позволяет проводить анализ метилирования отдельных хромосом человека. Микроматрицы NimbleGen включают все классифицированные CpG-островки, в том числе и редко встречающиеся

[22]. Affymetrix (Santa Clara) - несколько типов платформ для анализа метилирования. Они требуют очень малого количества (не более 100 нг) ДНК, что дает возможность использовать эти платформы для анализа метилирования в эмбриогенезе и проводить анализ малых образцов

[23]. Микроматрицы Agilent (Santa Clara, CA, США) используют для полногеномного сканирования и поиска генов, метилированных при гематологических и эпите-

Метилирование

Отсутствие метилирования

Образец ДНК CG -GC- TG -АС-

X ^Отжиг праймеров -

Бисульфитная обработка -GC- - АС-

1 1 1 г

Бисульфит-специфичная — С -GC- - Т - АС-

Электрофорез, очистка ПЦР-продукта

Рис. 6. Схема метода SnuPE.

лиальных опухолях. Платформа позволяет анализировать более 25 000 CpG-островков [24]. Illumina (San Diego) BeadArrays представляют собой один из наиболее совершенных инструментов для полногеномного анализа и анализа метилирования определенных участков ДНК. Позволяет детектировать метилирование 2,5% CpG-нуклеотидов и требует около 200 нг ДНК для анализа [25].

Микроматричный анализ отличается от секвенирова-ния большей простотой и доступностью. Данные, полученные этим методом, легче интерпретировать. В то же время микроматричные анализаторы имеют и ряд недостатков: более низкое разрешение, метилирование обнаруживается только в повторяющихся последовательностях генома млекопитающих, так как метод основан на гибридизации и, таким образом, не дает полного представления о геномном метилировании. Тем не менее на сегодняшний день это наиболее удобный метод для использования в клинической практике [6].

ЛИТЕРАТУРА

1. Ванюшин Б. Ф. ,, Химия и жизнь. - 2004. - № 2. - С. 32-37.

2. Сидоров Л. Н. // Химия. - 2000. - № 4. - С. 24-30.

3. Allis C. D., Jenuwein T., Reinberg D. Epigenetic. - Cold Spring Harbor; New York, 2007. - P. 23-61.

4. Buchholz T., Jackson J., Robson L., Smith A. // Hum. Genet. - 1998. - Vol. 103, N 5. - P. 535-539.

5. Eads S., Danenberg D. K., Kawakami K. et al. // Nucl. Acids Res. -2000. - N 8. - C. 1-8.

6. Gupta R., Nagarajan A., Wajapeyee N. // Bio. Techniques. - 2010. N 4. - P. 3-11.

7. KaurH, HalliwelB. // Biochem. J. - 1996. - Vol. 318. - P. 21-23.

8. Kubota T, Aradhya S., Macha M. et al. // J. Med. Genet. - 1996. -Vol. 33. - P. 1011-1014.

9. Maniatis T., Fritsch E. E., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. - Cold Spring Harbor; New York, 1982.

10. Pappas J. J., Toulouse A., Bradley W. E. C. // Biol. Procedures Online. - 2009. - N 1. - C. 99-112.

11. Robertson K. D. // Nat. Rev. Genet. - 2005. - N 4. - P. 597-610.

12. Song F., Smith J. F., Kimura M. T. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2205. - N 9. - C. 3336-3341.

13. Tsou J. A., Hagen J. A., Carpenter C. L. et al // Oncogene. - 2002. -Vol. 21. - P. 5450-5461.

14. Vanaja D. K., Ehrich M., Van den Boom D. et al. // Cancer Invest. -2009. - Vol. 27, N 5. - P. 549-560.

15. epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php

16. http://www.sequenom.com/Home/Products—Services/Genetic-Analysis/MassARRAY-Analyzer-4

17. http://www.methods.info/Methods/DNA_methylation/Restriction_ analysis.html

18. http://www.epigeneticstation.com/sodium-bisulfite-dna-sequencind/

19. http:/www.methods.info/Methods/DNA_methylation/Bisulphite_s equencing.html

20. http://www.epigeneticstation.com/methylation-specific-pcr/

21. http://www.methods.info/Methods/DNA_methylation/SNuPE.html

22. http://www.nimblegen.com/products/lit/epigenetics_brochure_201 0_02_23.pdf

23. http://www.affymetrix.com/estore/browse/brand/affymetrixMicroa rraySolutions/brandAffymetrixMicroarraySolutions-overview.jsp

24. http://www.genomics.agilent.com/Human CpG Island Microarrays

25. http://www.illumina.com/applications.ilmntfcustom_low_to_mid_ plex_methylation_analysis

Поступила 05.04.11

© К. В. ЗОЛОТАРЕВ, 2012 УДК 616-074/-078

К. В. Золотарев

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ПОДБОР ЧАСТОТЫ ВРАЩЕНИЯ РОТОРА ЦЕНТРИФУГИ И ВРЕМЕНИ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ХИМИЧЕСКОЙ, БИОХИМИЧЕСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Учреждение РАМН Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН, Москва

В химической, биохимической и микробиологической практике часто приходится сталкиваться с суспензиями. Суспензиями называют дисперсные системы с твердой дисперсной фазой и жидкой дисперсионной средой, в которых размер частиц дисперсной фазы составляет более 100 нм (10-7м). Часто возникает необходимость отделить твердые частицы от жидкости. Если для этого использовать осаждение в гравитационном поле, то процесс осаждения может протекать слишком долго. Эффективным способом является осаждение в поле центробежных сил - центрифугирование. Частоту вращения ротора центрифуги и время центрифугирования можно подобрать аналитически, используя закономерности общей динамики и гидродинамики. Для этого необходимо написать и преобразовать объединенное уравнение первого и второго законов Ньютона для частицы суспензии, находящейся в поле центробежных сил и сил сопротивления жидкости и стенки сосуда. Сила сопротивления жидкости зависит от режима движения частицы в жидкости. Для определения режима следует использовать численные безразмерные критерии Архимеда и Рейнольдса. В настоящей статье эти преобразования проведены и получена аналитическая обратно пропорциональная зависимость времени центрифугирования от частоты вращения. Рассчитав серию данных "частота-время", можно выбрать оптимальную пару данных, исходя из возможностей центрифуги и практической целесообразности. Результаты расчетов подтверждаются реальными опытными данными, поэтому полученный физико-математический аппарат может считаться эффективным.

Поскольку ход подбора зависит от параметра (критерий Рейнольдса), а также то, что необходимо для подбора рассчитать серию данных, удобнее всего этот расчет запрограммировать. Предлагается проводить его с помощью программы Microsoft Excel и программирования на языке VBA в приложении к ней. Для удобного и быстрого решения задачи предлагается возможность скачивания готового файла из Интернета и использования его.

Ключевые слова: центрифугирование, частота вращения ротора, время центрифугирования, седиментация