Наш способ предоперационной подготовки к пластике деминерализованного костного трансплантата в эксперименте

Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи

УДК 616.211-089.844-092.4

А.Г. Волков, И.И. Ромашевская

НАШ СПОСОБ ПРЕДОПЕРАЦИОННОЙ ПОДГОТОВКИ К ПЛАСТИКЕ ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО ТРАНСПЛАНТАТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Ростовский государственный медицинский университет, кафедра оториноларингологии

Цель: ускорение индукции остеогенеза в костной ране.

Материалы и методы. 15 белым крысам была проведена трансплантация деминерализованных костных трансплантатов (ДКТ) в плоские кости черепа. После искусственного формирования трепанационных отверстий всем животным, 5 из них (1 группа) в них были введены, заранее подготовленные адекватные по размеру отверстий, фрагменты консервированного ДКТ без какого-либо воздействий на них, а 10 (2 группа) - ДКТ, озвученные с помощью генератора низкочастотного ультразвука.

Результаты. Через 30 дней обе группы животных выведены из опыта, а участки лобной кости подвергнуты гистологическому исследованию. Оказалось, что у животных 2 группы процессы остеогенеза шли значительно быстрее, даже с формированием в новообразованной пластинчатой костной ткани гаверсовых каналов с полноценным костным мозгом, что указывает на большую степень зрелости ткани, чем у животных 1 группы.

Выводы. Предоперационное озвучивание трансплантируемого ДКТ у экспериментальных животных ускоряет процессы репаративного остеогенеза.

Ключевые слова: белая крыса, деминерализованные костные трансплантаты, ультразвук, индукция, остеогенез.

A.G. Volkov, I.I. Romashevskaya

OUR WAY OF PREOPERATIVE PREPARATION FOR PLASTIC REPAIR OF A DEMINERALIZED OSTEAL GRAFT

IN EXPERIMENT

Rostov State Medical University Otorhinolaryngology Department

Purpose: to accelerate osteogenesis induction in the osteal wound.

Materials and methods: we transplanted demineralized osteal grafts (DOGs) to the skull flat bone in 15 white rats. After an artificial creation of trephine openings in all the animals, 5 out of the above number (group 1) received prearranged, fitting to the size of the openings, preserved DOG fragments without any manipulation with them, while 10 animals (group 2) were introduced DOGs insonated with a low-frequency ultrasound generator.

Results: 30 days later both groups of animals were excluded from the experiment, and the frontal bone areas histologically studied. Osteogenesis proved to progress much faster in the group 2 animals and was even followed by formation, in the neoformed lamellar ostein bone tissue, of Haversian spaces with adequate marrow, which indicates a greater degree of tissue maturity than in the animals of group 1.

Summary: preoperative insonation of transplantable DOG in test animals accelerates reparative osteogenesis.

Keywords: white rat, demineralized osteal grafts, ultrasound, induction, osteogenesis.

оригинальные статьи

Журнал фундаментальной медицины и биологии

Введение

Важным элементом восстановления поврежденных костных структур является трансплантация гомо - или гетеротрансплантатов. В последние три десятилетия все чаще стали использовать для этой цели гомогенные материалы - деминерализованные костные трансплантаты (ДКТ), другое их название - костный матрикс. ДКТ, установленные в костные раны, в послеоперационном периоде стимулируют эндохондральный остеогенез, производя замещение костного дефекта аутотканью [1]. Кроме того, ДКТ являются го-мотрансплантатами, изготавливаются из костных структур человека, после специальной обработки теряют свои антигенные свойства, обладают одновременно пластичностью, возможностью моделировать их, при достаточной толщине имеют значительную жесткость [2].

Анализ остеогенеза после ранений, переломов и других повреждений костных структур, поиск и обоснованное применение средств, управляющих регенерацией костной ткани, возможны только на основании углубленных знаний общих закономерностей гистогенеза, а также реактивных изменений костной ткани в процессе регенерации. Все эти данные можно получить, преимущественно, в эксперименте. Лабораторные животные, экспериментальные или подопытные - это животные, используемые в лабораториях для научных и практических целей. Они должны быть здоровы, обладать некоторыми специфическими особенностями (например, восприимчивостью к вносимым инфекциям, чувствительностью к исследуемым веществам и др.), отличаться дешевизной, скоростью размножения и дешевизной содержания [3].

Цель исследования: предоперационным воздействием на трансплантат во время пластики улучшить индукцию остеогенеза в костной ране.

Материал и методы

В качестве экспериментальных животных были взяты 15 беспородных белых крыс весом 260320 г, без выделения пола.

В качестве трансплантата - ДКТ для проводимого эксперимента использовали материал из бедренной кости здоровой белой крысы, изготовленный по специальному заказу в ФГБУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росмедтехнологий» (Санкт-Петербург) по методике, разработанной в учреждении. Заготовки трансплантата обладали паспортом, ксерокопией лицензии учреждения, государственным сертификатом качества на его приготовление и инструкцией по хранению и использованию.

Животные содержались в виварии ФБУН «Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии» (директор — д.м.н. Твердохлебова Т.И.), в комфортных температурных условиях (около 21°С). Световой день составлял 12 часов. Для питания животных

использовались полноценные корма для грызунов с дополнительным прикормом в виде фруктов и овощей. Вода употреблялась животными самостоятельно из поилок. Текущая уборка клеток осуществлялась ежедневно. Генеральная уборка с дезинфекцией клеток выполнялась еженедельно. Все процедуры содержания животных, проведения манипуляций и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2003 и ГОСТ РИСО 10993.2-2006.

Для вводного наркоза использовали стеклянную емкость с плотно-притертой крышкой для исключения испарения эфира в окружающую среду. В емкости имелось ванночка с ватой и нанесенным на нее диэтиловым медицинским эфиром. Животное помещали в указанную емкость. В условиях общего обезболивания ингаляцией паров эфира достигалась достаточная глубина наркоза. Затем животное извлекали из емкости и фиксировали на препараторском столике за 4 конечности. После этого проводили предоперационную подготовку с выбриванием волосяного покрова в лобной области, частичную санитарную обработку операционной области мыльным раствором с окончательным промыванием ее дистиллированной водой. При соблюдении правил асептики и антисептики выполняли обработку операционного поля раствором антисептика, производили линейный разрез кожи, апоневроза и надкостницы с последующим скелетированием лобной кости распатором на площади, необходимой для размещения трансплантата.

Послеоперационный шов обрабатывали 1% спиртовой настойкой йода без наложения защитной повязки. Затем животное снимали с препараторского столика и помещали в отдельную клетку на 2 часа для восстановления после перенесенного вмешательства. На протяжении последующих 3-х суток послеоперационный шов обрабатывали 1 раз в сутки 1% спиртовой настойкой йода. Швы снимали с соблюдением асептики и антисептики на 5-6 дни после вмешательства.

Гистологические исследования микропрепаратов осуществлены в лаборатории филиала патоло-гоанатомического бюро в г.Ростове-на-Дону (заведующий — к.м.н. Кириченко Ю.Г.).

Подготовка к исследованиям осуществлялась следующим образом: пластинки костной ткани фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали в 10% растворе азотной кислоты. После фиксации и деминерализации исследуемые образцы заливали в парафин, а изготовленные парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу ван Гизон, в некоторых случаях дополнительно использовали окраску коллагеновых волокон трихромом. Для изучения ретикулярной стромы применяли импрегнацию солями серебра. Гистологические срезы исследовались методом световой микроскопии.

Журнал фундаментальной медицины и биологии

Результаты

По данным наших более ранних исследований [4, 5] через 90 дней после имплантации ДКТ в стерильную искусственно сформированную рану в области лобных костей белых крыс происходила перестройка структуры трансплантата с замещением его новообразованной костной тканью реципиента, была сформирована полноценная система кровоснабжения, налицо - зрелая пластинчатая ткань с костно-мозговыми каналами, заполненными миелоидными элементами.

Нами были изучены научно-практические и патентные материалы по возможности ускорения репаративного остеогенеза.

Так, в стоматологической практике, для предоперационной подготовки ДКТ к пластике, некоторые авторы [6] обрабатывают полость зуба и вносимую в нее в качестве остеопластического материала лиофилизированную губчатую аллокость раствором антибиотика широкого спектра действия с помощью ультразвуковых волн с частотой 24000-29000 Гц в течение 1-3 мин.

В.И. Савельев, В.Ю. Зотов [7] предлагают на поверхность заготавливаемой для пластики кости наносить углубления, которые заполняют во время операции размельченной деминерализованной костной тканью, обработанной в 0,9% растворе метилурацила.

Ю.В. Этитейн и соавт. [8] проводят имплантацию деминерализованного костного трансплантата, а начиная с 7-х суток после вмешательства на ДКТ воздействуют пульсирующим низкоинтенсивным электромагнитным полем индукцией 30+7,5 мТл, частотой 50 Гц, ежедневно, по 10 мин., в течение 5 суток.

Наиболее близким по приемам и получения искомого эффекта, который был целью нашей разработки, явился способ, предложенный Л.Т. Воловой [9], которая проводила механическое измельчение ДКТ и обработку его ультразвуком, получая порошок, состоящий на 60-70% из частиц размером 10-100 нм. Однако к недостаткам данного способа относятся: а) отсутствие полноценного костного фрагмента, выполняющего просвет костного дефекта и соприкасающегося с его краями; б) невозможность задать порошку определенную форму и фиксировать в костной ране; в) отсутствие конкретных указаний на срок формирования полноценной кости.

Мы попытались вызвать ускорение репаратив-ных процессов при трансплантации фрагментов ДКТ заданной формы у экспериментальных животных путем воздействия физического фактора на трансплантат при определенных условиях.

При имплантации ДКТ в искусственно сформированную рану лобных костей в эксперименте, мы руководствовались тем, что у белых крыс от-

оригинальные статьи

сутствуют лобные пазухи, а передние стенки верхнечелюстных пазух имеют не типичное для других плоских костей черепа строение.

Подготовку в вмешательству осуществляли следующим образом. Из консервированной заготовки ДКТ с помощью специальных пуансонов вырезали фрагменты для трансплантатов. За 1 час до вмешательства их помещали в физиологический раствор при комнатной температуре. После этого фрезой накладывали отверстие в лобных костях животных и удаляли наружную пластику и диплоэ.

1 группе крыс укладывали фрагменты ДКТ в костную рану «заподлицо», так что края трансплантата соприкасались с краями собственной кости животного. Затем рану мягких тканей ушивали.

Перед тем как провести трансплантацию материала 2 группе животных, фрагменты ДКТ, подлежащие трансплантации, 2 часа до вмешательства выдерживали в 0,9% растворе хлористого натрия при комнатной температуре, затем их подвергали воздействию низкочастотного ультразвука генератором с частотой 44 кГц с амплитудой до 880 кГц при нахождении их в 0,9% растворе хлористого натрия при температуре 36оС. После этого мы стали означать их как ОДКТ (озвученный ДКТ).

После выведения из опыта животных 1 группы без озвучивания костных фрагментов ДКТ через 30 суток после его трансплантации в гистологических препаратах мы наблюдали появление фокусов остеогенеза за счет активации функции остебластов с формированием примитивных осте-оидных структур и молодых костных балочек. Остеоидные незрелые костные структуры слабо воспринимали окраску, более зрелые костные балки окрашивались более интенсивно, приобретая умеренную базофилию (рис. 1).

Изучая гистологические препараты 2 группы животных после выведения их из опыта через 30 дней после трансплантации ОДКТ, отметили: имелась сформировавшаяся пластинчатая костная ткань с наличием костномозгового канала, заполненного костным мозгом. При этом структура костного вещества была достаточно зрелой, характеризовалась выраженной минерализацией основного матрикса, содержала значительное количество зрелых остеоцитов (рис. 2, 4). Новообразованное костное вещество имело пластинчатое строение, костные пластинки были прочно фиксированы между собой, питание новой кости обеспечивалось новообразованными сосудами. Костные пластинки содержали большое количество остеоцитов и остеобластов, наряду с которыми встречались одиночные многоядерные гигантские клетки типа остеокластов.

Рис. 1. Фрагмент собственной и новообразованной костной ткани через 30 дней после имплантации ДКТ

без озвучивания. Г.-э. Ув. 80х.

Рис. 2. Пластинчатая костная ткань с формированием костно-мозгового канала, заполненного пролиферирующим костным мозгом через 30 дней после трансплантации ОДКТ. Г.э. х80.

Рис. 3. Структура фрагмента сформировавшейся пластинчатой костной ткани у животного через 30 дней после трансплантации ОДКТ. Г.э. х200.

Сформировавшийся костный мозг был богат клетками миелоидного ряда, среди которых визуализировались в большом количестве плюрипо-тентные гигантские многоядерные клетки, морфологически сходные как с мегалобластами, так и остеокластами. Подобную реакцию можно объ-

яснить реакцией активацией костномозговых клеток ответ на травматическое повреждение. Среди клеток костного мозга новообразованной кости регистрировались множественные гигантские многоядерные клетки типа мегалобластов, морфологически сходные с остеокластами

Рис. 4. Клетки костного мозга фрагмента новообразованной кости животного через 30 дней

после трансплантации ОДКТ. Г.э. х 200.

оригинальные статьи

Журнал фундаментальной медицины и биологии

Обсуждение

Заключения, основанные на данных наших гистологических исследованиях, базировались на следующих критериях зрелости новообразованной костной ткани (по сравнению с препаратами животных контрольной группы):

1. развитие большинства элементов пластинчатой костной ткани в месте трансплантации;

2. формирование костномозгового канала, заполненного костным мозгом;

3. появление пула плюрипотентных гигантских многоядерных клеток, наличие которых можно связать как с процессом созревания костных пластинок с остеолизом неполноценных костных структур, остатков ДКТ, так и с функционированием новообразованной кости, ее костно-мозго-вых структур. Приведенные данные указывают на

значительно большую степень зрелости участков трансплантации ОДКТ в искусственно сформированный дефект лобных костей экспериментального животного по сравнению с трансплантацией не озвученного материала.

Выводы

Рекомендуемый нами способ обладает следующим преимуществами (обнаруженными у экспериментальных животных) по сравнению с данными изученной научной литературы и патентного поиска: 1) ускоряет репаративный остеогенез после трансплантации ДКТ; 2) не требует дополнительного введения медикаментов; 3) является полноценным смоделированным фрагментом ДКТ, выполняющим просвет операционного костного дефекта, соприкасаясь с его краями.

ЛИТЕРАТУРА

1. Neigel, J.M. Use of demineralized bone implants in orbital and craniofacial reconstruction and a review of the literature. [Review] [63 refs] / J.M. Neigel, P.O. Ruzicka // Ophthalmic Plastic & Reconstructive Surgery. - 1996. 12(2). - P.108-120.

2. Савельев, В.И. Опыт заготовки и применения деминерализованных костных трансплантатов / В.И. Савельев // Транс-плант. деминерал. костн. ткани при патологии опорно-двиг. сист.-Л.,1990.-С.4-22.

3. Каркищенко, Н.Н. Основы биомоделирования / Н.Н. Карки-щенко. М.:Межакадемическое издательство ВПК,2004.- 607 с.

4. Исследование остеогенеза лобной кости при трансплантации деминерализованной кости в условиях стерильной раны у экспериментальных животных (Сообщение 1) / И.И. Рома-шевская, А.Г. Волков, А.Р. Боджоков.-Оториноларингология -Бас, Мойын Хирургиясы.- 2011.- №1-2.-С. 21-23.

5. Волков А.Г. Ринология - ведущее направление разрабо-

ток Ростовской ЛОР кафедры за последние годы / Матер. V межрегиональной научно-практ. конф.оторинол. Южного и Северо-Кавказ.федер. округов с межд.участием (Ростов н/Д, 15-16 июня 2012).- Ростов н/Д, 2012.-С. 3-11.

6. Волова Л.Т. Способ лечения зубосодержащих кист челюстей у детей // Л.Т. Волова, Е.Ю. Гавеля, Л.Ю. Гниломедова / Патент РФ Ш № 2393794 С 1, опубл. 10.07.2010.- Бюл. № 19.

7. Савельев В.И. Способ подготовки кости к пересадке // В.И. Савельев, В.Ю. Зотов / Патент РФ № Ш 02023433 С1, опубл. 30.11.1994.

8. Этитейн Ю.В. Способ стимуляции остеоиндукции в эксперименте // Ю.В. Этитейн, В.Т. Подорожная, И.А. Кирилова / Патент РФ № Ш 02210997 С2, опубл. 27.08.2003.

9. Волова Л.Т. Аллогенные деминерализованные костные ма-триксы и регуляция остеогенеза: Автореф. дис. д-ра мед. наук. - М., 1997. - С. 33.