СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОЙ КОАГУЛОПАТИИ У КРЫС
METHOD FOR PREVENTION OF TOXIC COAGULOPATHY IN RATS

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии и может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики и патогенетической коррекции проявлений токсической коагулопатии у крыс при длительном воздействии бихромата калия.
Хром относится к тяжелым металлам высокого класса токсичности. При избыточном поступлении его соединений в организм могут развиваться полиорганные структурно-функциональные нарушения. Доказаны их аллергенные, мутагенные, канцерогенные, гонадотропные и др. эффекты(Sun Н, Brocato J, Costa М. 2015,Chen Q.Y., Murphy A., Sun H. et al. 2019, DesMarais T.L., Costa M. 2019). Вместе с тем до настоящего времени обсуждается вопрос об эссенциальности микроэлемента хрома (Cr3+) и его влиянии на углеводный, жировой и белковый обмен. Описываются состояния недостатка хрома в организме, но при этом научное обоснование выявляемых положительных эффектов хрома недостаточное(Vincent J.B. New Evidence against Chromium as an Essential Trace Element. The Journal of Nutrition. 2017 Dec; 147(12):2212-2219. https://doi.org/10.3945/jn.117.255901). Реактив «Самохоцкого», «Калиумбихромикум», пиколинатхрома и другие хромсодержащие препараты доступны в аптечных сетях в виде БАДов (San Mauro-Martin I.,  A.M.,  M.A. et al. 2016.).Однако по поводу их эффективности или вреда ведутся многочисленные дискуссии (Vincent JB, Lukaski НС. Chromium. AdvNutr. 2018; 9(4):505-506.https://doi.org/10.1093/advances/nmx021).
Механизмы патогенного действия ионов хрома связывают с генерацией активных форм кислорода и высокой мембрантоксичностью (Zeng М, Xiao F, Zhong X, et al. Reactive oxygen species play a central role in hexavalent chromium-induced apoptosis in Нер 3В cells without the functional roles of p53 and caspase-3. Cell PhysiolBiochem. 2013;32(2):279-290. https://doi.org/10.1159/000354436). Показано, что мемранотропное влияние сопровождается поступлением в кровоток большого количества тромбогенных субстанций, источниками которых могут выступать компоненты мембран эндотелия, форменных элементов крови, а так же клеточных структур различных органов (Pretorius, L., Taute, Н., Van Rooy, М., & Oberholzer, Н. М. Investigating the ultrastructural and viscoelastic characteristics of whole blood after exposure to the heavy metals cadmium, lead and chromium, alone and in combination. Ultrastructuralpathology, 2022, 1-11. Advanceonlinepublication. https://doi.org/10.1080/01913123.2022.2075999). Актуальным является поиск средств патогенетической профилактики токсического действия хрома на организм в ряду антиоксидантов (Гаглоева Э.М., Брин В.Б., Ахполова В.О. Процессы гемокоагуляции и липопероксидации и механизмы нарушения осморегулирующей функции почек при хронической интоксикации соединениями хрома // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2020;15(3):320-324).
В качестве средства профилактики токсической коагулопатии под влиянием хрома у крыс мы использовали аналог гормона эпифиза мелатонина - Мелаксен. В современной литературе широко изучается роль мелатонина практически во всех процессах жизнедеятельности, влияние на сон, деятельность сердечно-сосудистой, эндокринной, иммунной системы, а также системы гемостаза (Арушанян Э.Б. Влияние мелатонина на тромбоцитарный гемостаз и его циркадную организацию 2013,76(5);Kumari S, Dash D. Melatonin elevates intracellular free calcium in human platelets by inositol 1,4,5-trisphosphate independent mechanism. FEBS Lett. 2011;585(14):2345-2351. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2011.05.067).Активно изучаются возможности его применения как лекарственного средства. Сочетание традиционных схем терапии с мелатонином оказалось более эффективным, чем без него. Описывается выраженное адаптогенное действие, десенсибилизирующее, противовоспалительное, гепатопротекторное действие, антистрессорные эффекты и др. Выраженные мембранопротекторные свойства мелаксена обусловлены его выраженным антиоксидантным действием (Арушанян Э.Б. 2006-2019). Учитывая многообразие описываемых свойств мелатонина можно ожидать высокую эффективность мелатонина при хронической интоксикации, однако данных о возможности его применения с целью профилактики нарушений в системе гемостаза при длительном введении хрома в организм мы в доступной литературе не обнаружили.
Существует способ профилактики нарушений гемостаза при токсическом воздействии свинца с помощью витаминов-антиоксидантов (Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Ральченко И.В. и др. Влияние комбинации витаминов-антиоксидантов на гемостаз при экспериментальной гипероксидации // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2005,68(3), 34-36.). Животным вводили с рационом препарат компливит в дозе 1,8 мг/кг в сутки из расчета по витамину А, дно временно с ежедневным введением ацетата свинца в дозе 0,5 мг/кг в течение 15 дней с пищей. Избыток витамина А на фоне токсического влияния свинца вызывает ослабление сдвигов показателей системы гемостаза вызванных металлом, сдерживает активацию тромбоцитов и вызывает снижение уровня маркеров внутрисосудистого свертывания крови (продуктов деградации фибрина, растворимые комплексы фибринмономеров, D-димеры, факторы Р3 и Р4). Недостатком способа является то, что с его помощью, невозможно изучение профилактики коагулопатии вызванной введением бихромата калия, так как в данной работе не рассматривалось влияние хрома на свертывающую систему крови.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ профилактики токсической коагулопатии у крыс с применением одного из компонентов прополиса обладающего антиоксидантными и противовоспалительными свойствами (фениловый эфир кофейной кислоты в дозе 10 мг/кг) (Ashour, TariqHelal. Preventative effects of caffeic Acid phenyl ester on cadmium intoxication induced hematological and blood coagulation disturbances and hepatorenal damage in rats //ISRN Hematol. 2014 Mar30;2014:764754. http://dx.doi.Org/10.1155/2014/764754) одновременно с внутрибрюшинным введением хлорида кадмия в дозе 0,05 мг/кг в течение 21 дня.
Недостатками прототипа являются:
• Невозможность разработки профилактики хромовой коагулопатии, так как в прототипе не рассматривалось профилактическое влияние фенилового эфира кофейной кислоты на свертывающую систему крови при токсическом воздействии хрома на организм экспериментальных животных. Известно, что разные металлы имеют преимущественные органы и «мишени» токсического действия. Соответственно эффективность данного способа при кадмиевой интоксикации не доказывает возможность и эффективность профилактического использования антиоксиданта при длительном воздействии хрома.
• В условиях техногенного загрязнения окружающей среды попадание в организм хрома происходит в основном с пищей и водой перорально, соответственно внутрижелудочное введение более соответствует естественным условиям интоксикации. Моделирование интоксикации при внутрибрюшинном введении тяжелого металла также более сложно в техническом исполнении чем внутрижелудочное введение через атравматичный зонд.
• профилактическое введение антиоксиданта в течение короткого времени не позволяет получить способ профилактики хронической коагулопатии. Хронический эксперимент проводимый в течение двух месяцев является более информативным, и позволяет более подробно в разные сроки в динамике изучить механизмы профилактического действия антиоксиданта на формирование нарушений звеньев системы гемостаза в условиях токсического воздействия, что особенно важно при изучении системы гемостаза.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики хронической токсической коагулопатии у крыс под влиянием хрома.
Решение этой задачи обеспечивает значительное уменьшение патологических сдвигов показателей в системе гемостаза при хроническом отравлении бихроматом калия у крыс, что сопровождалось уменьшением интенсивности процессов перекисного окисления липидов и восстановлением активности ферментов антиоксидантной защиты.
Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики хронической токсической коагулопатии у крыс, включающий ежедневное введение антиоксиданта и тяжелого металла, отличается тем, что в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг и раствор бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл.
Ежедневное введение мелатонина через зонд в желудок в дозе 5 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением водного раствора бихромата калия способствует уменьшению степени патологических сдвигов показателей плазменного и клеточного гемостаза, препятствовало уменьшению активности антикоагулянтного и фибринолитического звеньев системы гемостаза, уменьшая степень тромбинемии. Положительные эффекты связаны с выраженным антиоксидантным и мембранопротекторным действием мелатонина, уменьшением цитотоксичности хрома. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики хронической токсической коагулопатии, отличающегося тем, что крысам водят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение двух месяцев одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением водного раствора бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг, в пересчете на металл, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики хром-индуцированной токсической коагулопатии, препятствуя патологической активации системы гемостаза и восстановлению противосвертывающего и фибринолитического потенциала крови, уменьшению уровня маркеров тромбинемии при длительном воздействии хрома, путем уменьшения интенсивности процессов липопероксидации, восстановления активности антиоксидантной системы, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществляется следующим образом: для приготовления раствора хрома в дистиллированной воде растворяют бихромат калия таким образом, что на единицу раствора, равную 0,5 мл, приходится 0,05 мг хрома, в пересчете на металл. На каждые 100 г массы крысы вводят 0,5 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм крыс. Раствор мелатонина готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением, для чего в дистиллированной воде растворяют таблетки Мелаксена таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,5 мг мелатонина.
Двум группам крыс вводят раствор бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг через атравматичный зонд в желудок ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней. Одновременно с первого дня введения соли хрома одной из групп каждый день вводят раствор мелаксена в дозе 5 мг/кг через внутрижелудочный зонд.
Для исследования состояния системы гемостаза определяется количество тромбоцитов и их агрегационная активность; содержание фибриногена; АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время; ПВ - протромбиновое время; ВПФМ - относительное время полимеризации фибрин-мономера для оценки состояния конечного этапа свертывания крови; АТ(III)активность антитромбина (III) и активность протеина С - для оценки состоянии противосвертывающей системы; по времени спонтанного эуглобулинового лизиса исследуется состояние фибринолитического звена; РФМК концентрацию растворимых фибрин-мономерных комплексов определяли количественным вариантом фенантролинового теста - для оценки уровня тромбинемии (Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. 1999; Момот А.П., 2009).Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по концентрации малоновогодиальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. С целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ) определяют активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах.
Результаты исследования с введением Мелаксена и бихромата калия у крыс демонстрируют эффективность применения антиоксиданта с целью профилактики хронической хром-индуцированной токсической коагулопатии. Мелатонин способствует уменьшению выраженности изменений клеточного и плазменного гемостаза, снижает уровень тромбинемии, восстанавливая активность процессов противосвертывающей системы и фибринолиза, благодаря выраженной антиоксидантной активности в условиях хронической интоксикации бихроматом калия.
Пример конкретного выполнения.
Крысам самцам линии Вистармассой 300-350 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг каждый день в течение двух месяцев. Одновременно, с первого дня введения бихромата калия половине крыс каждый день интрагастрально вводили мелаксен в дозе 5 мг/кг. Контролем служили интактные животные (10 крыс) содержащиеся в стандартных условиях вивария. Стабилизацию и получение образцов плазмы крови осуществляли с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в области гемостаза (Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. 1999; Момот А.П. Цывкина Л.П., Тараненко И.А. 2011).Материалом для исследования являлась цельная кровь, а также плазма крови, богатая и бедная тромбоцитами. Исследовали показатели свертывающей системы, состояние противосвертывающего и фибринолитического звеньев системы гемостаза, активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты по стандартным методикам.
Для исследования состояния системы гемостаза определяется количество тромбоцитов и их агрегационную активность (индуктор АДФ в конечной концентрации 10,0 мкг/мл), фибриноген, АЧТВ, ПВ, ВПФМ, активность протеина С и АТ(III), СЭЛ, РФМК, с применением диагностических наборов фирмы «Технология стандарт», Барнаул, Россия. Тесты выполнялись на турбидиметрическом коагулометре «CGL-2110» Solar, агрегометре АР 2110 Solar (Беларусь). Состояние ПОЛ оценивали по содержанию гидроперекисей в плазме крови (диеновые конъюгаты и диеновые кетоны) и МДА в эритроцитах. Антиоксидантный статус оценивали по активности каталазы и СОД в эритроциах. Измерения выполнялись на спектрофотометре «PV1251A», Solar, Беларусь.
Статистический анализ данных проводили с помощью программ Microsoft Excel 2016 и STATISTICA 10.0., StatSoft с учетом распределения признаков в группах по критерию Шапиро-Уилка. Переменные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25÷Q75). Различия между группами животных оценивали с использованием U-критерий Манна-Уитни. Для оценки статистической зависимости рядов наблюдений использовали коэффициент ранговой корреляции (rs) Спирмена. Критическим уровнем значимости считали р≤0,05.
Проеденные эксперименты показали, что внутрижелудочное введение раствора бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг массы тела в течении двух месяцев вызывает нарушения в системе гемостаза у крыс, способствует развитию токсической коагулопатии (Таблица 1.). Через две недели у крыс достоверно возрастала концентрация фибриногена в плазме крови, увеличивалась степень АДФ-агрегации тромбоцитов. Гиперкоагуляционная направленность процессов свертывания крови через месяц подтверждалось укорочением хронометрических показателей АЧТВ, ПВ, высоким уровнем фибриногена, укорочением ВПФМ. Регистрировалось уменьшение количества тромбоцитов, при увеличении их функциональной активности. Смещение гемостатического потенциала в сторону гиперкоагуляции компенсировалось активацией антикоагулянтной и фибринолитической систем. Выявлялось достоверное увеличение активности протеина С, АТ(III) и укорочение времени спонтанного эуглобулинового лизиса.
Гиперкоагуляционные изменения через два месяца эксперимента прогрессировали, АЧТВ и ПВ укорачивались, концентрация фибриногена была выше контроля. Сохранялась высокая агрегационная активность тромбоцитов и выявлялось резкое увеличение концентрации маркеров тромбинемии - РФМК, что может свидетельствовать о развитии состояния тромботической готовности. Вместе с тем выявлялось снижение активности антитромбина на фоне подавления фибринолитической активности (Таблица 1.) (Момот А.П., Цывкина Л.П., Тараненко И.А. Современные методы распознавания тромботической готовности. Барнаул, 2011).
Введение антиоксиданта мелатонина в течение двух месяцев способствовало уменьшению напряжения в системе гемостаза, снижению вероятности развития состояния тромботической готовности, по сравнению с данными у крыс с изолированным введением хрома. Об этом свидетельствует уменьшение выраженности изменений РФМК, восстановление активности физиологических антикоагулянтов и фибринолиза (Таблица 1).
В современной литературе широко представлена информация о взаимосвязи процессов ПОЛ в плазме крови, эритроцитах, лейкоцитах и тромбоцитах с изменением активности процессов свертывания крови, тромбинемии при различных состояниях в норме и патологии (Бышевский А.Ш. 2006).
Внутрижелудочное введение хрома вызывало увеличением концентрации МДА в эритроцитах и повышение уровня гидроперекисей в плазме крови. Вместе с тем выявлялось снижением активности супероксиддисмутазы и каталазы, что вероятно связано с истощением ферментативной активности антиоксидантов (Таблица 2.).
Профилактическое применение естественного антиоксиданта мелаксена препятствовало снижению уровня активности каталазы и СОД в эритроцитах, с одновременным снижением концентрации МДА и восстановлением уровня гидроперекисей в плазме крови, что свидетельствует о выраженном антиоксидантном действии мелаксена в условиях длительного введения хрома в организм крыс.
Статистический анализ полученных экспериментальных данных выявил корреляционные связи положительной динамики показателей системы гемостаза при введении мелатонина с уменьшением уровня продуктов перекисного окисления липидов и восстановлением активности антиоксидантных ферментов крови при хронической интоксикации бихроматом калия.
Через два месяца эксперимента увеличение активности АТ(Ш) и восстановление времени спонтанного эуглобулинового лизиса ассоциировалось с уменьшением концентрации МДА (rs=-0,65; р<0,05; rs=0,71; р<0,001) и ростом активности СОД (rs=0,68; p<0,05;rs=-0,72; р<0,05) и каталазы (rs=0,65; p<0,01;rs=-0,63; р<0,05). Установлена корреляционная связь уменьшения степени тромбинемиис уменьшением концентрации МДА (rs=0,62; р<0,05) и увеличением активности каталазы (rs=- 0,74; р<0,05).
Проведенные опыты показали, что профилактическое введение мелатонина при хронической хромовой интоксикации вызывает уменьшение выраженности сдвига показателей сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, антикоагулянтной и фибринолитической систем, а также способствует уменьшению тромбинемии. Изменения показателей системы гемостаза коррелируют с восстановлением уровня процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных ферментов -каталазы и супероксиддисмутазы при профилактическом введении мелаксена одновременно с тяжелым металлом.
Результаты экспериментов позволяют считать целесообразным изучение возможности применения антикоагулянтов и антиоксидантов при разработке принципов профилактики и коррекции нарушения в системе гемостаза и мочеобразовательной функций почек при при воздействии на организм соединений тяжелых металлов.