КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНОПАТИЙ

1. Молекула gРНК, содержащая tracr и crРНК, где crРНК содержит целевой домен, комплементарный целевой последовательности гена BCL11a человека, энхансера BCL11a человека или области HPFH человека.
2. Молекула gРНК по п.1, в которой:
a) целевая последовательность относится к гену BCL11A человека, а целевой домен содержит любую из последовательностей от SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 85 или от SEQ ID NO: 400 до SEQ ID NO: 1231, или их фрагменты;
b) целевая последовательность относится к энхансеру гена BCL11a человека, а целевой домен содержит любую из последовательностей от SEQ ID NO: 182 до SEQ ID NO: 277, или от SEQ ID NO: 278 до SEQ ID NO: 333, или от SEQ ID NO: 334 до SEQ ID NO: 341, или от SEQ ID NO: 1232 до SEQ ID NO: 1499, или от SEQ ID NO: 1596 до SEQ ID NO: 1691, или их фрагменты; или
(c) целевая последовательность относится к области HFPH человека, а целевой домен содержит любую из последовательностей от SEQ ID NO: 86 до SEQ ID NO: 181, от SEQ ID NO: 1500 до SEQ ID NO: 1595, или от SEQ ID NO: 1692 до SEQ ID NO: 1761, или их фрагменты.
3. Молекула gРНК по п.2, в которой:
(a) целевой домен содержит любую из SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, или SEQ ID NO: 337, или их фрагменты; или
(b) целевой домен содержит любую из SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 289, или SEQ ID NO: 281, или их фрагменты; или
(c) целевой домен содержит любую из SEQ ID NO: 1683, SEQ ID NO: 1638, SEQ ID NO: 1647, SEQ ID NO: 1609, SEQ ID NO: 1621, SEQ ID NO: 1617, SEQ ID NO: 1654, SEQ ID NO: 1631, SEQ ID NO: 1620, SEQ ID NO: 1637, SEQ ID NO: 1612, SEQ ID NO: 1656, SEQ ID NO: 1619, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1645, SEQ ID NO: 1598, SEQ ID NO: 1599, SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1677, или SEQ ID NO: 1626, или их фрагменты; или
(d) целевой домен содержит любую из SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 1505, SEQ ID NO: 1580, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 1503, SEQ ID NO: 1589, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 1537, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 1536, SEQ ID NO: 1539, SEQ ID NO: 1585, SEQ ID NO: 1700, или SEQ ID NO: 1750, или их фрагменты.
4. Молекула gРНК по любому из пп.1-3, содержащая от 5'до 3', [целевой домен]-:
(a) SEQ ID NO: 6601;
(b) SEQ ID NO: 6602;
(c) SEQ ID NO: 6603;
(d) SEQ ID NO: 6604;
(e) SEQ ID NO: 7811; или
(f) любую из вышеперечисленных (а)-(е), дополнительно содержащую на 3'-конце 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов урацила (U).
5. Молекула gРНК по любому из пп.1-4, где одна или более одной молекул нуклеиновой кислоты, составляющих молекулу gРНК, содержат:
(a) одну или несколько модификаций фосфоротиоата на 3'-конце указанной молекулы (или молекул) нуклеиновой кислоты;
(b) одну или несколько модификаций фосфоротиоата на 5'-конце указанной молекулы (или молекул) нуклеиновой кислоты;
(c) одну или несколько 2'-О-метил-модификаций на 3'- конце указанной молекулы (или молекул) нуклеиновой кислоты;
(d) одну или несколько 2'-O-метил-модификаций на 5'-конце указанной молекулы (или молекул) нуклеиновой кислоты;
(e) 2'-O-метильную модификацию на каждом из 4-ого от конца, 3-ого от конца и 2-ого от конца 3'-(нуклеотидных) остатков указанной молекулы (или молекул) нуклеиновой кислоты;
(f) 2'-метильную модификацию на каждом из: 4-ого от конца, 3-ого от конца и 2-ого от конца 5'-(нуклеотидных)остатков указанной молекулы (или молекул) нуклеиновой кислоты; или
(g) любую их комбинацию.
6. Молекула gРНК по п.1, содержащая:
(a) SEQ ID NO: 342;
(b) SEQ ID NO: 343;
(c) SEQ ID NO: 1762;
(d) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 344, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 6660;
(e) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 344, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 346;
(f) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 345, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 6660;
(g) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 345, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 346;
(h) SEQ ID NO: 347;
(i) SEQ ID NO: 348;
(j) SEQ ID NO: 1763;
(k) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 349, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 6660;
(l) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 349, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 346;
(m) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 350, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 6660; or
(n) crРНК, содержащую SEQ ID NO: 350, и tracr, содержащий SEQ ID NO: 346.
7. Композиция, включающая:
a) одну или несколько молекул gРНК по любому из пп.1-6 и молекулу Cas9;
b) одну или несколько молекул gРНК по любому из пп.1-6 и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу Cas9;
c) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько молекул gРНК по любому из пп.1-6 и молекулу Cas9;
d) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько молекул gРНК по любому из пп.1-6 и нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу Cas9;
e) любой из вышеперечисленных a)-d), и матричную нуклеиновую кислоту; или
f) любой из вышеперечисленных a)-d), и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую матричную нуклеиновую кислоту.
S.pyogenes
8. Композиция по п.7 или 8, где молекула Cas9 является активной или неактивной  Cas9.
9. Композиция по п.7 или 8, где молекула Cas9 содержит SEQ ID NO: 6611, или последовательность, гомологичную ей по меньшей мере на 95%.
10. Композиция по п.7, в которой молекула Cas9 содержит:
(a) SEQ ID NO: 7821;
(b) SEQ ID NO: 7822;
(c) SEQ ID NO: 7823;
(d) SEQ ID NO: 7824;
(e) SEQ ID NO: 7825;
(f) SEQ ID NO: 7825, далее содержащую лейцин в позиции 88 (C88L) в последовательности SEQ ID NO: 7825, и содержащую глутаминовую кислоту в позиции 582 (C582E) в последовательности SEQ ID NO: 7825;
(g) SEQ ID NO: 7826;
(h) SEQ ID NO: 7827;
(i) SEQ ID NO: 7828;
(j) SEQ ID NO: 7829;
(k) SEQ ID NO: 7830; или
(l) SEQ ID NO: 7831.
11. Композиция по любому из пп.7-10, в которой молекула gРНК и молекула Cas9 присутствуют в рибонуклеопротеиновом комплексе (RNP).
12. Композиция по любому из пп.7-11, дополнительно содержащая вторую молекулу gРНК, или вторую молекулу gРНК и третью молекулу gРНК, или вторую молекулу gРНК и третью молекулу gРНК и четвертую gРНК, где каждая молекула gРНК композиции комплементарна различной целевой последовательности-мишени.
13. Композиция по п.12, где каждая из указанных молекул gРНК находится в рибонуклеопротеиновом комплексе (RNP) с молекулой Cas9.
14. Композиция по любому из пп.7-13, содержащая матричную нуклеиновую кислоту, в которой матричная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей:
(а) бета-глобин человека или его фрагменты; или
(b) гамма-глобин человека или его фрагмент.
15. Композиция по любому из пп.7-14, составленная в среде, пригодной для электропорации.
16. Композиция по любому из пп.7-15, где каждая из указанных молекул gРНК находится в RNP с молекулой Cas9, описанной здесь, и где каждый из указанных RNP находится в концентрации менее чем примерно 10 мкМ.
17. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует одну или несколько молекул gРНК по любому из пп.1-6.
18. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.17.
19. Способ изменения клетки внутри или вблизи целевой последовательности, на которую нацелена одна или несколько gРНК молекул в указанной клетке, включающий контактирование указанной клетки с:
(a) одной или несколькими молекулами gРНК по любому из пп.1-6 и молекулой Cas9;
(b) одной или несколькими молекулами gРНК по любому из пп.1-6 и нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу Cas9;
(c) нуклеиновой кислотой, кодирующей одну или несколько молекул gРНК по любому из пп.1-6 и молекулой Cas9;
(d) нуклеиновой кислотой, кодирующей одну или несколько молекул gРНК по любому из пп.1-6 и нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу Cas9;
(e) любым из вышеперечисленных (a)-(d) и матричной нуклеиновой кислотой;
(f) любым из вышеперечисленных (a)-(d) и нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую матричную нуклеиновую кислоту;
(g) композицией по любому из пп.7-16; или
(h) вектором по п.18.
20. Способ по п.19, где клетка представляет собой клетку млекопитающего, примата или человека.
21. Способ по п.20, в котором клетка является гематопоэтической стволовой клеткой или клеткой-предшественником (HSPC).
22. Способ по любому из пп.19-21, в котором клетка представляет собой CD34+ клетку.
23. Способ по любому из пп.19-21, в котором клетка представляет собой CD34+CD90+ клетку.
24. Способ по любому из пп.19-23, в котором клетка находится в композиции, содержащей популяцию клеток, которая была обогащена клетками CD34+.
25. Способ по любому из пп.19-24, в котором клетка была выделена из костного мозга, мобилизованной периферической крови или пуповинной крови.
26. Способ по любому из пп.19-25, где изменение приводит к инделу внутри или вблизи целевой последовательности-мишени одной или нескольких молекул gРНК.
27. Способ по п.26, в котором индел представляет собой индел, представленный на Фиг. 25, Таблице 15, Таблице 26, Таблице 27 или в Таблице 37.
28. Способ по любому из пп.19-27, в котором способ приводит к популяции клеток, где по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99%) клеток популяции изменены, содержат индел.
29. Способ по любому из пп.19-28, в котором изменение приводит к популяции клеток, которая способна дифференцироваться в дифференцированную популяцию эритроидной линии, и где указанная популяция дифференцированных клеток проявляет повышенный уровень фетального гемоглобина по сравнению с популяцией неизмененных клеток.
30. Способ по любому из пп.19-29, где указанная популяция дифференцированных клеток имеет увеличенную фракцию F клеток по сравнению с популяцией неизмененных клеток.
31. Способ по любому из пп.19-30, в котором дифференцированные клетки продуцирует по меньшей мере примерно 6 пикограмм (например, по меньшей мере примерно 7 пикограмм, по меньшей мере примерно 8 пикограмм, по меньшей мере примерно 9 пикограмм, по меньшей мере примерно 10 пикограмм, от примерно 8 до примерно 9 пикограмм, или от примерно 9 до примерно 10 пикограмм фетального гемоглобина на клетку.
32. Клетка, измененная способом по любому из пп.19-31.
33. Клетка, содержащая первую молекулу gРНК по любому из пп.1-6 или композицию по любому из пп.7-16, нуклеиновую кислоту по любому из п.17 или вектор по п.18.
34. Клетка по п.33, где экспрессия фетального гемоглобина увеличивается в указанной клетке или ее потомстве еепо сравнению с клеткой того же типа клеток или потомством такой клетки, которая не содержит молекулу gРНК или композицию, или нуклеиновую кислоту, или вектор.
35. Клетка по п.34, где клетка или ее потомство продуцирует, по меньшей мере, примерно 6 пикограмм (например, по меньшей мере примерно 7 пикограмм, по меньшей мере примерно 8 пикограмм, по меньшей мере примерно 9 пикограмм, по меньшей мере примерно 10 пикограмм, от примерно 8 до примерно 9 пикограмм или от примерно 9 до примерно 10 пикограмм) фетального гемоглобина.
36. Клетка по любому из пп.32-35, находившаяся в контакте с соединением, способствующим экспансии стволовых клеток.
37. Клетка по п.36, где соединение, способствующее экспансии стволовых клеток, представляет собой Соединение 1, Соединение 2, Соединение 3, Соединение 4 или их комбинацию.
38. Клетка, содержащая индел, представленный на Фиг. 25, в Таблице 15, Таблице 26, Таблице 27 или Таблице 37.
39. Клетка по любому из пп.33-38, где клетка представляет собой клетку млекопитающего, примата или человека.
40. Клетка по любому из пп.33-39, в котором клетка является гематопоэтической стволовой клеткой или клеткой-предшественником (HSPC).
41. Клетка по любому из пп.33-40, в котором клетка представляет собой CD34+ клетку.
42. Клетка по п.41, в котором клетка представляет собой CD34+CD90+ клетку.
43. Клетка по любому из пп.33-42, в котором клетка была выделена из костного мозга, мобилизованной периферической крови или пуповинной крови.
44. Популяция клеток, содержащая клетки по любому из пп.33-43.
45. Популяция клеток по п.44, где по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере, примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере, примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или, по меньшей мере примерно 99% клеток популяции являются клетками по любому из пп.33-43.
46. Популяция клеток по любому из пп.44-45, где популяция клеток способна дифференцироваться в популяцию дифференцированных клеток и где указанная популяция дифференцированных клеток имеет увеличенную фракцию F клеток по сравнению с популяцией немодифицированных клеток того же типа.
47. Популяция клеток по п.46, где F клетки популяции дифференцированных клеток продуцируют в среднем по меньшей мере примерно 6 пикограмм, по меньшей мере примерно 7 пикограмм, по меньшей мере примерно 8 пикограмм, по меньшей мере примерно 9 пикограмм, по меньшей мере примерно 10 пикограмм, или от примерно 8 до примерно 9 пикограмм, от примерно 9 до примерно 10 пикограмм фетального гемоглобина на клетку.
48. Популяция клеток по любому из пп.44-47, включающая:
6
(a) по меньшей мере 1e CD34+ клеток/кг массы тела пациента, которому необходимо ввести клетки;
6
(b) по меньшей мере 2e CD34+ клеток/кг массы тела пациенту, которому необходимо ввести клетки;
6
(c) по крайней мере 3e CD34+ клеток/кг массы тела пациента, которому необходимо ввести клетки;
6
(d) по меньшей мере 4e CD34+ клеток/кг массы тела пациента, которому необходимо ввести клетки; или
6
6
(e) от 2e до 10e CD34+ клеток/кг массы тела пациента, которому необходимо ввести клетки.
49. Популяция клеток по любому из пп.44-48, где по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50% по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80% или по меньшей мере 90%) клеток популяции являются клетками CD34+.
50. Популяция клеток по п.49, где по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30% клеток популяции являются клетками CD34+CD90+.
51. Популяция клеток по любому из пп.44-50, где популяция клеток выделена из костного мозга, мобилизованной периферической крови или пуповинной крови.
52. Популяция клеток по любому из пп.44-51, где популяция клеток выделена из пациента, страдающего гемоглобинопатией.
53. Композиция, содержащая популяцию клеток по любому из пп.44-52.
54. Композиция по п.53, содержащая фармацевтически приемлемую среду, пригодную для криоконсервации.
55. Способ лечения гемоглобинопатии, включающий введение пациенту, в этом нуждающемуся, терапевтически эффективного количества клеток по любому из пп.32-43, популяции клеток по любому из пп.44-52 или композиции по любому из пп.53-54.
56. Способ по п.55, где гемоглобинопатия представляет собой бета-талассемию или серповидно-клеточную болезнь.
57. Способ получения популяции клеток, включающий:
(a) предоставление популяции клеток;
(b) культивирование указанной популяции ex vivo в среде для культивирования клеток, содержащей соединение, способствующее экспансии стволовых клеток; и
(c) введение в клетки указанной популяции клеток первой молекулы gРНК по любому из пп.1-6, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей первую молекулу gРНК по любому из пп.1-6, композиции по любому из пп.7-16, нуклеиновой кислоты по п.17 или вектора по п.18.
58. Способ по п.57, где соединение, способствующее экспансии стволовых клеток представляет собой Соединение 1, Соединение 2, Соединение 3, Соединение 4 или их комбинацию.
59. Способ по любому из пп.57-58, в котором среда для культивирования клеток содержит соединение, способствующее экспансии стволовых клеток, в концентрации от примерно 1 нМ до примерно 1 мМ.
60. Способ по любому из пп.57-59, в котором культивирование на стадии (b) включает период культивирования перед осуществлением стадии (с).
61. Способ по п.60, в котором период культивирования перед осуществлением стадии (с) составляет, по меньшей мере, 12 часов, является периодом примерно от 1 дня до примерно 3 дней, является периодом примерно от 1 дня до 2 дней, является периодом примерно 2 дней.
62. Способ по любому из пп.57-61, в котором культивирование на стадии (b) включает период культивирования после осуществления стадии (с).
63. Способ по п.62, в котором период культивирования после осуществления стадии (с) составляет по меньшей мере 12 часов, является периодом от примерно 1 дня до примерно 10 дней, является периодом от примерно 1 дня до примерно 5 дней, является периодом от примерно 2 дней до примерно 4 дней, является периодом примерно 2 дней, является периодом примерно 3 дней, или является периодом примерно 4 дней.
64. Способ по любому из пп.57-63, в котором популяция клеток увеличивает численность по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по сравнению с популяцией клеток, которая не была культивирована в соответствии со стадией (b).
65. Способ по любому из пп.57-64, в котором осуществление стадии (с) содержит электропорацию.
66. Способ по любому из пп.57-65, в котором популяция клеток, предоставленная на стадии (а), представляет собой популяцию клеток человека.
67. Способ по п.66, в котором популяция клеток, предоставленная на стадии (а), выделена из костного мозга, мобилизованной периферической крови или пуповинной крови.
68. Способ по п.67, в котором популяция клеток, предоставленная на стадии (а), выделена из пациента, страдающего гемоглобинопатией.
69. Способ по любому из пп.57-68, в котором популяция клеток, предоставленная на стадии (а), обогащена по клеткам CD34+.
70. Способ по любому из пп.57-69, в котором, после осуществления стадии (с), популяция клеток подвергается криоконсервации.
71. Способ по любому из пп.57-70, в котором, после осуществления стадии (с), по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере, примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90% по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% клеток популяции содержат индел внутри или вблизи последовательности геномной ДНК, комплементарной целевому домену первой молекулы gРНК композиции, причем необязательно индел представляет собой индел, представленный на Фиг. 25, в Таблице 15, Таблице 26, Таблице 27 или Таблице 37.
72. Популяция клеток, которую можно получить способом по любому из пп.57-71.
73. Способ лечения гемоглобинопатии, включающий введение пациенту-человеку, в этом нуждающемуся, композиции, содержащей популяцию клеток) по п.72.
74. Способ по п.73, в котором гемоглобинопатия представляет собой бета-талассемию или серповидно-клеточную болезнь.
6
75. Способ по любому из пп.73-74, в котором композиция содержит по меньшей мере приблизительно 1е CD34+ клеток по п.219 на кг массы тела пациента-человека.
76. Молекула gРНК по любому из пп.1-6, композиция по любому из пп.7-16 или 53-54, нуклеиновая кислота поп.17, вектор по п.18, клетка по любому из пп.32-43, или популяция клеток по любому из пп.44-52 или 72, для применения в качестве лекарственного средства.
77. Молекула gРНК по любому из пп.1-6, композиция по любому из пп.7-16 или 53-54, нуклеиновая кислота по п.17, вектор по п.18, клетка по любому из пп.32-43, или популяция клеток по любому из пп.44-52 или 72, для применения при изготовлении лекарственного средства.