УСТРОЙСТВО ДЛЯ МОНИТОРИНГА СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ В ЖИДКОСТЯХ

Полезная модель относится к области аналитической биотехнологии, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для мониторинга содержания глюкозы в пищевых продуктах, в ферментационных и бродильных процессах, а также в физиологических жидкостях.
2
Известна модель устройства для определения глюкозы, которая представляет собой графитовый печатный электрод с иммобилизованным ферментом глюкозооксидазой. Устройство содержит иммобилизованный фермент глюкозооксидазу на графитовом печатном электроде, модифицированном слоем берлинской лазури и оксида кремния SiO [Aller-Pellitero, М., Fremeau, J., Villa, R., Guirado, G., Lakard, В., Hihn, J.Y., & del Campo, F.J. Electrochromic biosensors based on screen-printed Prussian Blue electrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 2019. Elsevier, pp. 591-597]. Характерным признаком рассматриваемого устройства, совпадающими с существенными признаками заявляемого технического решения, является амперометрический способ измерения уровня глюкозы в крови с использованием фермента глюкозооксидазы. Существенным недостатком является способ закрепления медиатора - берлинской лазури и фермента, что в ходе эксплуатации аналитической системы приводит к вымыванию, что не обеспечивает удовлетворительную долговременную стабильность устройства, кроме того устройство не позволяет проводить мониторинг глюкозы при концентрациях ниже 0,05 мМ.
Наиболее близким, принятым за прототип, является устройство для анализа глюкозы в водных средах [Патент РФ на полезную модель №204222 от 16.11.2020. Опубликовано: 17.05.2021, Бюл. №14]. Устройство содержит графитовый печатный электрод, модифицированный гибридным материалом на основе хитозана, ковалентно связанного с ферроценом и аминированными углеродными нанотрубками, в качестве биораспознающего элемента использован фермент глюкозооксидаза. Устройство позволяет проводить мониторинг содержания глюкозы в диапазоне от 0,2 до 3,1 мМ. Недостатком данного устройства является низкая чувствительность и невозможность использования электродов в течение длительного времени.
Задачей технического решения является расширение технологических возможностей устройства, путем повышения чувствительности анализа за счет снижения значения нижней границы определяемых концентраций до 0,006 мМ глюкозы.
Поставленная задача решается тем, что устройство для мониторинга содержания глюкозы в жидкостях содержит графитовый печатный электрод, модифицированный гибридным материалом, в качестве биораспознающего элемента использован фермент глюкозооксидаза, причем в качестве гибридного композитного материала используется проводящий полимер на основе терморасширенного графита и электрополимеризованного медиатора нейтрального красного.
Электрополимеризованный медиатор нейтральный красный является эффективным переносчиком электронов благодаря наличию проводимости по всему полимерному каркасу, аналогично металлической проводимости. Помимо этого, он обладает хорошей устойчивостью и биосовместимостью, обеспечивая сохранение окислительной активности фермента продолжительное время [Idumah С.I. Novel trends in conductive polymeric nanocomposites, and bionanocomposites. Synthetic Metals. 2021. Elsevier, p. 116674.] Терморасширенный графит существенно увеличивает площадь контакта проводящего полимера с электродом и обеспечивает высокую чувствительность отклика биосенсора [Решетилов, А. Н. и др. Влияние некоторых углеродных наноматериалов на окисление этилового спирта бактериальными клетками Gluconobacter oxydans. Прикладная биохимия и микробиология. 2017. pp. 115-122]. Кроме того, поскольку технология получения терморасширенного графита включает в себя стадию обработки графита смесью концентрированных азотной и серной кислот, на его поверхности могут содержаться карбоксильные группы, которые могут образовывать водородные связи с амино-группами электрополимеризованного нейтрального красного, способствуя более плотному контакту и лучшему переносу электронов в гибридном композитном материале. [Kim Н.S., Вае H.S., Yu J., Kim S.Y. Thermal conductivity of polymer composites with the geometrical characteristics of graphene nanoplatelets. Scientific Reports. 2016. pp. 1-9]. Проводимость графитового печатного электрода является важнейшим параметром электрохимического биосенсора, т.к. от нее напрямую зависит скорость переноса заряда от активных центров фермента микроорганизмов на электрод в процессе биотрансформации субстрата и основные характеристики устройства для определения содержания глюкозы.
Устройство для мониторинга содержания глюкозы в жидкостях показано на фиг. 1. В таблице 1 представлены характеристики прототипа и заявляемого устройства для мониторинга глюкозы в жидкостях.
Устройство состоит из следующих элементов: графитового печатного электрода 1, рабочая поверхность которого модифицирована гибридным композитным материалом на основе терморасширенного графита и электрополимеризованного медиатора нейтрального красного 2, в качестве биораспознающего элемента использован фермент глюкозооксидаза 3.
3
Устройство собирают следующим образом: на рабочую поверхность графитового печатного электрода 1 наносят слой терморасширенного графита толщиной 0,1 мм прессованием при давлении 150 бар таким образом, чтобы полученный слой терморасширенного графита имел объемную плотность 16 г/л. Далее графитовый печатный электрод 1 помещают в измерительную кювету объемом 5 мл, подключают к потенциостату и проводят электрохимическую полимеризацию нейтрального красного путем циклического изменения приложенного потенциала от -1,0 до +1,0 В относительно электрода сравнения при скорости сканирования 50 мВ/с и перемешивании магнитной мешалкой в течение 20 циклов в 0,05 М натрий-калиевом фосфатном буферном растворе (рН=5,6), содержащем 1 мМ нейтрального красного и 0,1 М KNO. После синтеза проводящих полимеров электроды промывают натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=6,8) и высушивают.На высушенную поверхность графитовых печатных электродов 1 наносят 3 мкл фермента глюкозооксидазы 3 (удельная активность 15 Е/мл) и оставляют до полного высыхания. Сверху наносят 3 мкл смеси, состоящей из 0,0035 г бычьего сывороточного альбумина, 50 мкл натрий-калиевого фосфатного буферного раствора (рН=6,8) и 7,5 мкл глутарового альдегида, и оставляют до полного высыхания.
Принцип работы устройства для мониторинга содержания глюкозы в жидкостях заключается в следующем: для измерений дополнительно используют потенциостат, измерительную кювету объемом 5 мл, магнитную мешалку и портативный компьютер. Графитовый печатный электрод 1 с размещенными на нем гибридным композитным материалом 2 и глюкозооксидазой 3, помещают в измерительную кювету, добавляют 5 мл 30 мМ натрий-калий фосфатного буферного раствора (рН 6,8), включают магнитную мешалку и регистрируют фоновый ток в измерительной кювете. Для регистрации ответа биосенсора предлагается использовать потенциостат CS150 (Contest, Китай), подключаемый к графитовым печатным электродам и персональному компьютеру. Вводят анализируемую пробу. Измерения проводят при комнатной температуре, при рабочем потенциале -550 мВ, что связано с окислительно-восстановительными свойствами гибридного композитного материала. Между измерениями кювету промывают 5 мл 30 мМ натрий-калий фосфатного буферного раствора (рН 6,8). Сигналом графитового печатного электрода 1 является зависимость силы тока от времени. Рассчитывают амплитуду изменения силы тока после введения пробы в измерительную кювету (ответ биосенсора, ΔI, нА). Содержание глюкозы в пробе определяют с использованием предварительно построенной градуировочной зависимости. После каждого измерения промывают измерительную кювету 30 мМ фосфатным буферным раствором (рН 6,8) в объеме 5 мл.
Таким образом, заявляемое устройство для мониторинга содержания глюкозы в жидкостях позволяет повысить чувствительность анализа и осуществлять мониторинг глюкозы в диапазоне 0,006-0,5 мМ в течение 30 суток при длительности каждого анализа не более 2 минут.