Модифицированный антисмысловой олигонуклеотид против вируса SARS-CoV-2
MODIFIED ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST SARS-CoV-2

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для блокирования экспрессии РНК вблизи 5' конца генома вируса SARS-CoV-2, вызывающего заболевание новой коронавирусной инфекцией COVID-19.  Данное изобретение обеспечивает высокоспецифичное связывание заявляемого антисмыслового олигонуклеотида с РНК с известной последовательностью нуклеотидов вблизи 5' конца генома вируса SARS-CoV-2.
На сегодняшний день специфических противовирусных средств для огромного массива вирусов не существует. Однако разрабатываются методы специфического селективного «выключения» РНК, в том числе и вирусной, с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Принцип действия антисмысловых олигонуклеотидов заключается в ведении в организм больного препарата, содержащего однонитиевые цепочки ДНК, комплементарные какому-либо участку однонитиевой ДНК или РНК, например РНК вируса. Комплементарное связывание ДНК препарата и РНК вируса приводит к невозможности транскрипции и трансляции вирусной РНК и вырезанию блокированного участка РНК вируса РНКазой Н. Это останавливает синтез новых вирусных частиц и предотвращает внутриклеточное размножение вируса [Pharmacology of Antisense Drugs C. Frank Bennett, Brenda F. Baker, Nguyen Pham, Eric Swayze, and Richard S. Geary Annual Review of Pharmacology and Toxicology 2017 57:1, 81-105].
Некоторые противовирусные антисмысловые препараты были выпущены на рынок, например фомивирсен (Vitraven); - препарат против цитомегаловируса (Novartis), Миравирсен - препарат для лечения гепатита С (Santaris Pharma).
Некоторые противовирусные антисмысловые препараты были выпущены на рынок, например фомивирсен (Vitraven); - препарат против цитомегаловируса (Novartis), Миравирсен  - препарат для лечения гепатита С (Santaris Pharma). В настоящее время клинические испытания в различных фазах проходят более 100 препаратов от различных заболеваний, основанных на применении антисмысловых олигонуклеотидов.
Антисмысловая РНК-терапия представляет собой развивающуюся стратегию специфического лечения новых и социально значимых заболеваний. Принцип угнетения РНК ранее изучался in vitro для сдерживания репликации высокопатогенных РНК- вирусов [. Spurgers K.B., C. Sharkey M., Warfield K.L., Bavari S. Oligonucleotide antiviral therapeutics: Antisense and RNA interference for highly pathogenic RNA viruses. Antiviral Res. 2008; 78(1): 26-36. doi: 10.1016/j-antiviral.2007.12.008]. Таким образом, учитывая предыдущий опыт терапии антисмысловыми олигонуклеотидами, можно предположить, что эта стратегия может быть применена в качестве антивирусного препарата путем связывания и расщепления РНК SARS-CoV-2. Учитывая, что SARS-CoV-2 является РНК-вирусом, который не интегрируется в геном хозяина, стратегия использования антисмысловых олигонуклеотидов, по мнению ряда авторов, может дать эффективные результаты [Lulla V. et al. (2020) Antisense oligonucleotides target a nearly invariant structural element from the SARS-CoV-2 genome and drive RNA degradation. bioRvix. https://doi.org/10.1101/2020.09.18.304139].
Предпосылки использования антисмысловой терапии при лечении Covid 19 существуют. Коронавирусные инфекции ранее уже вызывали вспышки эпидемий. В частности, вспышка атипичной пневмонии (тяжёлого острого респираторного синдрома) в Китае в 2002 – 2003 гг была вызвана коронавирусом SARS-CoV, вспышка ближневосточного респираторного синдрома (MERS) также была вызвана коронавирусом [Стовба Л.Ф., Лебедев В.Н., Петров А.А., Ручко В.М., Кулиш В.С., Борисевич С.В. Новый коронавирус, вызывающий заболевания человека// Проблемы особо опасных инфекций, 2015. - вып. 2.  – С. 68 – 74].
После эпидемии атипичной пневмонии ряд авторов проводил исследования по влиянию антисмысловой терапии на подавление роста коронавирусов в исследуемых тканях [Neuman, B.W., Stein D.A., Kroeker A.D., Churchill M. J., Kim A.M., Kuhn P., Dawson P., Moulton H.M., Bestwick R.K., Iversen P.L., and Buchmeier M.J. Inhibition, escape, and attenuated growth of severe acute respiratory syndrome coronavirus treated with antisense morpholino oligomers. J. Virol. 2005. 79. P. 9665–9676.; Neuman, B.W., Stein D.A., Kroeker A.D., et al., Antisense Morpholino-Oligomers Directed against the 5` End of the Genome Inhibit Coronavirus Proliferation and Growth// Journal of virology, June 2004, Vol. 78, No. 11., p. 5891–5899; Renaud Burrer, Benjamin W. Neuman, Joey P. C. Ting, David A. Stein, Hong M. Moulton, Patrick L. Iversen, Peter Kuhn, and Michael J. Buchmeier. Antiviral Effects of Antisense Morpholino Oligomers in Murine Coronavirus Infection Models// Journal of virology, June 2007, Vol. 81, No. 11. p. 5637–5648]. В данных работах авторы среди нескольких последовательностей нашли наиболее эффективные ингибиторы вирусной транскрипции, подавляющие размножение коронавируса в клетках и предотвращающие заражение других клеток. Это антисмысловые блокаторы, комплементарные начальным нуклеотидам вирусной РНК - т.н. регуляторным последовательностям транскрипции TRS (по терминологии авторов) штамма коронавируса SARS-CoV-Tor2 (GenBank AY274119). Нуклеотидная последовательность исследованных антисмысловых препаратов представлена в табл. 1:
Таблица 1
Исследованные антисмысловые препараты (1)
<b>Наименование</b>
<b>Нуклеотидная последовательность (5`–3`)</b>
<b>№№ блокируемых участков РНК вируса</b>
<b>TRS1  </b>
<b>GTTCG TTTAG AGAAC AGATC</b>
<b>56–76</b>
<b>TRS2</b>
<b>TAAAG TTCGT TTAGA GAACAG</b>
<b>53–72</b>
Указанные последовательности комплементарны следующим последовательностям нуклеиновой кислоты вируса (табл. 2):
Таблица 2
Генетические таргетные последовательности генома коронавирусов для препаратов TRS1 и TRS2
<b>Наименование</b>
<b>Нуклеотидная последовательность вирусной РНК (5`–3`)</b>
<b>gen trs1   </b>
<b>GATCTGTTCTCTAAACGAAC</b>
<b>gen trs2   </b>
<b>CTGTTCTCTAAACGAACTTTA</b>
* - стандартным является использование обозначения «Т» для урацила в РНК
Авторы использовали морфолиновую модификацию боковой цепи для предотвращения разрушения антисмыслового олигонуклеотида и конъюгацию с аргининовым полипептидом для улучшения проникновения в инфицированные клетки.
При сопоставлении данных нуклеотидных последовательностей (табл.2) с последовательностью генома вируса SARS-CoV-2 (CoVid-19) было обнаружено наличие данных последовательностей почти во всех штаммах вируса, выделенных у пациентов во время пандемии 2019-2020 гг.
BLAST-анализ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показал 100% совпадение последовательности РНК у всех подтипов коронавирусов, что предполагает высокую консервативность данного участка генома коронавирусов. Это позволяет использовать для лечения коронавирусной инфекции те антисмысловые олигонуклеотидные последовательности TRS1 и TRS2, которые были исследованы в 2005 году.
trs1
trs2.
Однако, начиная с середины марта 2020 года, в штаммах вируса наблюдается изменения, связанные с потерей участков с 5` конца. В частности, образец вируса  MT263462 USA: WA 2020-03-23 не имел участков, обозначенных как  и
В связи с этим актуальным был проведен поиск антисмыслового олигонуклеотида, комплементарного участку консервативной олигонуклеотидной последовательности генома вируса SARS-CoV-2, присутствующего во всех штаммах.
Нуклеотидная последовательность, которую предполагалось блокировать у вируса SARS-CoV-2, была выбрана рядом с генами trs1 и trs2 на расстоянии четырех нуклеотидов от конечного участка (3`-конца) гена trs2.Такой выбор был обусловлен тем, что данная последовательность входит в участок сайта, регулирующего транскрипцию (transcription regulatory site, trs)  и выключение данной последовательности также приведет к невозможности транскрипции. BLAST-анализ на ресурсе GenBank (NCBI) показал присутствие данной последовательности в геномах всех секвенированных образцов SARS-CoV-2. Данная последовательность имеет вид:
5`–CTG TGT GGC TGT CAC TCG GCT
Комплементарная ей последовательность антисмыслового олигонуклеотидного препарата для лечения имеет вид:
5`–AGC CGA GTG ACA GCC ACA CAG
Выбор нуклеотидной последовательности вируса для блокирования  антисмысловым препаратом также был продиктован минимальной способностью формировать нуклеотидные шпильки, препятствующие гибридизации участка РНК вируса и антисмыслового препарата. При расчете данной последовательности на олигокалькуляторе (Kibbe WA. 'OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator'. (2007) / Nucleic Acids Res. 35(webserver issue): May 25. http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html) было обнаружено, что на протяжении 210 нуклеотидов от 5`-конца последовательности вирусной РНК, нуклеотиды могут теоретически формировать 38 – 39 шпилек, из которых исследуемая нами последовательность может быть задействована в 6 шпильках, в то время, как последовательности trs1 и trs2 могут быть фрагментами 16 и 11 нуклеотидных шпилек, соответственно. Таким образом, по теоретическим расчетам нами предполагался более специфичный характер выбранной нуклеотидной последовательности для блокирования транскрипции и трансляции вирусного генома.
Пример.
Синтез антисмыслового олигонуклеотида с фосфоротиоатной защитой боковой сахарофосфатной цепи 5`–AGCCGAGTGACAGCCACACAG  был осуществлен по заказу компанией «Genterra», Москва (https://www.genterra.ru/synth.html). Синтез (medium-scale DNA) осуществлен с фосфоротиоатной защитой фосфатной группы между всеми нуклеотидами c очисткой обращено-фазовой ВЭЖХ (Паспорт на синтетические олигонуклеотиды №1312 от 14.04.2020). Общее количество синтезированного 21-членного олигонуклеотида составило 15,371 мг (2,38 мкмоль).
Исследование токсичности и противовирусной активности было осуществлено по заказу в Испытательном центре контроля качества иммунобиологических лекарственных средств ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Исследование №0044/20 от 11.09.2020).
Исследование включало в себя исследование цитотоксического действия антисмыслового препарата, исследования противовирусной активности препарата при лечебной схеме введения препарата по  выявлению РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР в реальном режиме.
В экспериментальной работе использовалась перевиваемая линию клеток почки африканской зеленой мартышки (Chlorocebus aethiops) Vero-E6- которая была предоставлена Всероссийской Коллекцией клеточных культур при ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Культивирование клеток осуществлялось на среде для выращивания клеток с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) (конечная концентрация - 10%).
6
50
В исследованиях использовался пандемический штамм коронавируса человека SARS-CoV-2 «ГК2020/1» пассаж 4, с инфекционной активностью 10 ТЦИД/мл (тканевых цитопатогенных доз) для клеток Vero Е6 из Государственной Коллекции вирусов РФ при ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
2
Вирус культивировался в культуре клеток Vero Е6 в течение 96 ч при 37°С в 5% атмосфере СО. Инфекционная активность определялась согласно методам, рекомендованным ВОЗ.
2
2
50
Определение цитотоксического действия препарата в культуре клеток Vero Е6 проводилось с использованием 96-луночных культуральных плоскодонных планшетов, в которые помещали клетки Vero Е6 по 12000 кл./лунку в объеме 100 мкл свежеприготовленной полной среды. Культивирование проводилось 24 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СО. После инкубации клеток с препаратами в течение 96 часов при температуре 37°С в атмосфере 5% СОвизуально оценивалось состояние клеточного монослоя. Далее культуральная среда из планшетов удалялась и в каждую лунку к монослою культуры клеток добавлялось по 100 мкл среды для постановки реакции и 20 мкл раствора MTS. После инкубации в течение 3 часов при 37°С результаты учитывались на автоматическом ридере BIORAD при длине волны 490 нм. Референс-фильтр - 630 нм. Концентрация препаратов, уменьшающую значение оптической плотности при длине волны 490 нм на 50% по сравнению с контролем клеток, принималась за 50% цитотоксической дозы (СС).
Оценка противовирусной активности препарата учитывалась по снижению инфекционного титра вируса в культуре клеток Vero E6 по данным ПЦР РНК SARS-CoV-2, определяемых по порогу числа циклов реакции (cycle treshold, Ct) в различных разведениях исследуемого препарата.
Исследование РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР проводилось путем забора 200 мкл надосадочной жидкости лунок с разведениями препарата, выделения РНК параллельно с положительным и отрицательным контролем. Результатом исследования являлось заключение о наличии/отсутствии РНК SARS-CoV-2 в культуральной жидкости при воздействии препарата: наличие РНК SARS-CoV-2 (значение Ct более 0), отсутствие РНК SARS-CoV-2 (значение Ct отсутствует).
50
Оценка цитотоксичности препарата в различных концентрациях определялось при инкубации препарата с клетками Vero Е6 в течение 96 ч с использованием красителя MTS и визуальной оценки клеточного монослоя. На основании данных, полученных при изучении цитотоксического действия тестируемой субстанции с использованием MTS в культуре клеток Vero Е6, была построена аналитическая кривая, из которой была определена СС.
Определение цитотоксичности субстанции антисмыслового олигонуклеотида при визуальной оценке состояния монослоя культуры клеток Vero Е6 под инвертированным микроскопом не выявило значительных изменений в морфологии клеток при концентрации вещества 2 мг/мл и ниже через 96 часов инкубирования препарата с клетками (табл. 3).
Таблица 3
Цитотоксичность антисмыслового препарата в культуре клеток Vero E6
<b>Препарат</b>
<b>CC50 (мг\мл), 96 часов инкубации</b>
<b>Метод визуального определения</b>
<b>Метод с использованием MTS</b>
<b>Антисмысловой олигонуклеотид</b>
<b>>2</b>
<b>>2</b>
Результаты исследования противовирусной активности препарата методом ПЦР представлены в табл. 4.
Таблица 4
Противовирусная активности препарата методом ПЦР в реальном времени РНК SARS-CoV-2 по пороговому числу циклов (Ct) при разведении вируса 10
-4
<b>Препарат</b>
<b>Концентрация препарата, мг\мл</b>
<b>Пороговое число циклов ПЦР (Ct)</b>
<b>Антисмысловой олигонуклеотид</b>
<b>1,0</b>
<b>13,8</b>
<b>0,1</b>
<b>11,2</b>
<b>0,01</b>
<b>11,2</b>
<b>0,001</b>
<b>10,3</b>
<b>Контроль вируса</b>
<b>-</b>
<b>11,4/10,1</b>
<b>Контроль клеток</b>
<b>-</b>
<b>отсутствует</b>
Из представленных данных видно, что показатель Ct группы с добавлением препарата в дозировке 1,0 мг/мл составляет 13,8 по сравнению с группой контроля вируса (11,4 – 10,1).
В ходе исследований был установлено, что антисмысловой олигонуклеотид малотоксичен для культуры клеток Vero E6. Величина 50% цитотоксической дозы CC50 была выше 2,0 мг/мл. При этом результаты визуального определения цитотоксичности препаратов (CC50) были сопоставимы с результатами определения СС50 с использованием витального красителя MTS. Таким образом, данный препарат является малотоксичным и безопасным для использования.
В результате исследования содержания РНК вируса при различных дозировках было обнаружено, что при дозировке препарата 0,001 – 0,1 мг/мл параметр Ct - количество циклов реакции амплификации (удвоения вирусной РНК), которое необходимо для достижения флуоресцентного сигнала составляет 10,3 – 11,2 циклов удвоения. Контрольные значения Ct в опыте с инфицированными клетками без добавления антисмыслового олигонуклеотида  составили значения 11,4 - 10,1. При дозировке 1 мг/мл величина Ct составила 13,8. Это означает, что при дозировке препарата в 1 мг/мл для достижения флуоресцентного сигнала, эквивалентного контрольной группе потребовалось увеличить количество циклов амплификации в среднем на 2,4 -  3,7 цикла. Это свидетельствует о том, что дозировка препарата в 1 мг/мл не ингибировала полностью размножение вируса, но существенно снижала репликацию вирусной РНК. Снижение репликации вируса по расчету дополнительных циклов амплификации [9] составило диапазон в 5,3 – 13,0 раз (22,4 – 23,7). То есть при дозировке 1 мг/мл препарата вирусная нагрузка клеток может быть снижена в 5,3 – 13 раз.