Использование клеток разных фракций аллогенного костного мозга для терапии сахарного диабета типа II на генетической модели

__________________

I КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

Использование клеток разных фракций аллогенного костного мозга для терапии сахарного диабета типа II на генетической модели

О.И. Степанова, Н.А. Онищенко, Н.Н. Каркищенко, О.В. Баранова, Т.В. Галахова

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва НИИ трансплантологии и искусственных органов, Москва

Целью исследования было изучение возможности коррекции гипергликемии, метаболических и иммунологических нарушений на генетической модели мышей СД II типа за счет последовательного многократного введения культивированных гемопоэтических и стро-мальных фракций аллогенных клеток костного мозга (ККМ). Донорами ККМ служили мыши линии В10^РР. По результатам нашего исследования был получен регресс клинических проявлений сахарного диабета у мышей ^/^Ь за счет нормализации регуляторных функций иммунной системы и торможения признаков системной воспалительной реакции, а так же была увеличена продолжительность и качество жизни животных.

Ключевые слова: стромальные клетки, регенерация, реципиент, трансплантация.

Несмотря на определенные достижения последних лет, современная медикаментозная терапия сахарного диабета (СД) по-прежнему не способна надежно препятствовать прогрессированию клинических проявлений СД и его осложнений. [1, 4]. Поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению СД остается актуальной проблемой диабетологии, терапии и кардиологии. С разработкой учения о стволовых клетках появилась надежда на возможность более эффективной регуляции липидного и углеводного обмена в организме с помощью стволовых клеток костного мозга [3,

5, 6].

Целью нашего исследования было изучение возможности коррекции гипергликемии, а также метаболических и иммунологических нарушений с помощью гемопо-этической и стромальной фракций аллогенных клеток костного мозга (ККМ) на генетической модели СД типа II [2].

Материал и методы

В эксперименте использовали мышей линии С57BL/KsLEPRdb/+ в возрасте 136 дней. В этот период у животных наблюдаются резкое снижение веса, выраженная полидипсия и полиурия. В крови выявляется высокий уровень содержания глюкозы и гликозилированного гемоглобина, т.е. проявляются клинические признаки СД, напоминающие сахарный диабет I типа.

Для коррекции углеводного и липидного обмена использовали клетки костного мозга от доноров мышей линии В10^РР. Сначала вводили гемопоэтические ККМ (мононуклеарную фракцию), культивированные в течение 5 суток, а затем — муль-типотентные мезенхимальные стромаль-ные (ММС КМ) (фибробластоподобные), культивированные в течение 14 суток.

Реципиентам вводили внутрибрюшинно мононуклеарную фракцию ККМ в количе-

стве 4,5—5 млн. четырехкратно с интервалом 7 дней. Стромальную фракцию клеток ММС КМ вводили по 1,5 млн. клеток трехкратно с интервалом в 14 дней после первого введения мононуклеарной фракции.

Результаты

В течение 4 месяцев у мышей-реципиентов измеряли содержание глюкозы и гли-козилированного гемоглобина в цельной крови. Взвешивали животных и их внутренние органы. На 120-е сутки исследовали криосрезы поджелудочной железы, селезенки, печени и почек на присутствие донорских ККМ с геном зеленого белка.

По результатам нашего исследования был получен регресс клинических проявлений сахарного диабета у мышей db//db. Установлено, что семикратное введение дозы культивированных гемопоэтических и стромальных ККМ способствует пролонгированному снижению содержания глюкозы и гликозилированного гемоглобина в течение всего эксперимента. Наблюдалось устранение мацерации кожных покровов, снижение и исчезновение полиурии. В контрольной группе мышей вес резко снизился, тогда как в экспериментальной группе животных вес за аналогичный период удерживался на одном уровне.

В конце исследования возраст реципиентов в экспериментальной группе составлял 256 дней (животные были забиты), тогда как в контрольной группе срок жизни составил 150-189 дней (животные погибли).

На 120-е сутки эксперимента установили, что после семикратного введения клеток при гистологическом исследовании органов мышей линии С57BL/KsLEPRdb/+ в поджелудочной железе реципиентов отмечалось увеличение количества и размеров самих островков и дегранулирован-ных в-клеток в них. Островки были среднего и крупного размера, с четкими контурами и большими центрами размножения, площадью от 64762,5 до 128347,9 усл. ед.

Площадь островка в среднем составляла 101462,7 усл. ед., что превышало размеры островков в контрольной группе в 4 раза. Среднее количество клеток в островке составило 258 клеток, что превышало количество клеток в контрольной группе в 3 раза. Преобладание в островках в-клеток подтверждалось гистохимической окраской по Гомори, при которой в-клетки окрашивались в сине-сиреневый цвет. Таким образом, анализ морфологических изменений поджелудочной железы показал, что семикратное введение клеток ККМ приводит к выраженной гиперплазии эндокринной части поджелудочной железы на фоне общей нормализации углеводного и белкового обменов.

Морфологическая картина изменений в печени свидетельствовала о полном восстановлении белково-синтетической функции в экспериментальной группе, что проявлялось внутриклеточным накоплением большого количества гликогена. Наблюдалось отсутствие признаков жировой дистрофии гепатоцитов по сравнению с контролем, что подтверждалось при окрашивании препаратов Суданом III (рис.). Следовательно, подтверждался положительный эффект от введения культур ККМ, проявляющийся в уменьшении степени выраженности жировой дистрофии гепатоцитов и улучшении белково-синтетической функции.

В почках животных экспериментальной группы отмечалось снижение дистрофических изменений эпителия дистальных и проксимальных канальцев, исчезновение эозинофильных масс в просвете канальцев, что было обусловлено нормализацией углеводного и белкового обменов. В селезенке и лимфатических узлах имелись признаки умеренной и выраженной гиперплазии с образованием лимфоидных фолликулов как среднего, так и крупного размера с большими центрами размножения. Выявлялись признаки умеренного, а в некоторых наблюдениях — выраженного, мегака-

Морфологические изменения в печени после клеточной терапии

А - Мелко-крупнокапельная жировая дистрофия печени у контрольных мышей СД II типа Б - Отсутствие жировой дистрофии после клеточной терапии, окраска, Судан III, ув. х 200

риоцитоза. Масса селезенки в этой группе колебалась от 0,053 до 1,027 г., что в среднем превышало массу селезенки в контрольной группе в 11,4 раза. Площадь лимфоидных фолликулов колебалась в пределах от 62313,5 до 249674,2 усл. ед. Средняя площадь островка составляла 140447,8 усл. ед, что превышало площадь лимфоидных фолликулов в контрольной группе в 5,38 раза и свидетельствовало о восстановлении структуры селезенки как иммунокомпетен-тного органа. Оценка введенных ККМ показала, что на 120-е сутки после внутри-брюшинного введения клеток в организм они не погибают, а сохраняют свою жизнедеятельность, мигрируя в разные органы, в том числе в поджелудочную железу и селезенку, стимулируя участие этих органов в ауторегенерации.

Выводы

Можно предположить, что последовательное многократное введение культивированных гемопоэтических и мультипотент-ных мезенхимальных стромальных фракций аллогенного ККМ позволяет достичь клинической реабилитации больных животных за счет нормализации углеводного и липидного обмена на фоне нормализации регуляторных функций иммунной системы и тор-

можения признаков системной воспалительной реакции, ведущей к снижению клинических признаков СД, а также к увеличению продолжительности и улучшению качества жизни.

Литература

1. Александровский Я.А. Сахарный диабет. Эксперименты и гипотезы. — М.: СИП РИА, 2005.

2. Бландова З.К., ДушкинВ.А., МалашенкоА.М., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. — М. : Наука 1983.

3. Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. Дифферен-цировочные потенции стволовых гемопоэ-тических клеток // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, № 1, с. 7-11, 2002.

4. ЗайчикА.Ш,. ГуриловЛ.П. Инсулинонезависимый сахарный диабет (ИНСД) // Основы патохимии. — СПб: ЭЛБИ-СПБ 2001.

5. Ende N., Chen R., ReddA.S. Transplantation of human umbilical cord blood cells improves glycemia and glomerular hypertrophy in type 2 diabetic mice // Biochem. Biophys. Res. Commun., 321,168—171, 2004.

6. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for non-hematopoietic tissues // Science, 276: 71-74,1997.

THE RELEVANCE OF VARIOUS FRACTIONS OF ALLOGENIC BONE MARROW CELLS TO THE TYPE II DIABETES CORRECTION

O.I. Stepanova, N.A. Onischenko, N.N. Karkischenko, O.V. Baranova, T.V. Galahova

The Research Centre for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow Research Institute of Transplantology and Artificial Organs, Moscow

The aim of the study was to restore the immune disturbance in mice with diabetes. The clinical and histological signs of diabetes type II were decreased by application of bone marrow cells. The mice life duration was prolonged. The expressed therapeutic effect was achieved.

Key words: stromal cells, regeneration, recipient; transplantation.

Изучение влияния агонистов и антагонистов дофаминергических рецепторов на толерантность опиатной анальгезии

Н. Пирцхелани, Е. Абзианидзе, В. Беришвили, Т. Ткемаладзе, Б. Парцхаладзе, Г. Капанадзе

Тбилисский государственный медицинский университет, Республика Грузия Институт физиологии им. И. С. Бериташвили АН Грузии, Республика Грузия Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

На крысах исследуется эффект малых доз парлодела - агониста дофамина - на вызванной морфином анальгезии, толерантности и зависимости. Парлодел в дозе 0,05 и 0,1 мг/кг не вызывает изменения латентного периода рефлекса поднятия хвоста у крыс, но дозозависимо усиливает морфиновую анальгезию. Предварительное введение 5 мг/кг алкоприда -антагониста дофаминергических рецепторов - блокирует эффект 0,1 мг/кг парлодела и уменьшает морфиновую анальгезию. Ежедневное введение 10 мг/кг морфина ускоряет толерантность к болеутоляющему эффекту у животных контрольной группы. Ежедневное совместное введение парлодела и морфина подавляет развитие толерантности к морфину. Однако ежедневное введение парлодела (0,1 мг/кг) и алкоприда (5 мг/кг) не вызывает значительных изменений развития толерантности к морфиновой анальгезии у крыс.

Ключевые слова: анальгезия, толерантность, морфин, парлодел, алкоприд.

В определенных областях мозга установлены дофаминергические и энкефали-нергические нейроны [6]. Согласно [1, 6, 12], опиаты могут влиять на синтез [14], кругооборот и высвобождение [15] дофамина. Кроме того, имеются данные, указывающие, что повышение уровня дофамина вызывает антиноцицептивное действие [3, 7]. Однако данные относительно эффекта дофаминергических агонистов на опиат-

ную анальгезию, толерантность и зависимость весьма малочисленны [5, 10]. Поэтому целью настоящей работы является определение влияния парлодела на ноцицеп-тивную чувствительность и морфиновую анальгезию. В работе также исследуется влияние низких доз парлодела на изменение степени толерантности и зависимости, вызванной морфиновой анальгезией.