ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ МАКРОЛИДНОГО АНТИБИОТИКА ОЛИГОМИЦИНА А И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
CYTOTOXIC SEMI-SYNTHETIC MACROLIDE ANTIBIOTIC OLIGOMYCIN A DERIVATIVES AND SYNTHESIS METHOD THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
0
1
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается новых производных ингибитора FF АТФ-синтаз - макролидного антибиотика олигомицина А - и способа их получения.
Уровень техники
0
1
0
1
0
1
Макролидные антибиотики семейства олигомицинов, механизм действия которых связан с подавлением активности FF АТФ-синтаз, являются природными веществами, проявляющими цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, грибов и бактерий (Salomon A.R., Voehringer D.W., Herzenberg L.A., Khosla C. Understanding and exploiting the mechanistic basis for selectivity of polyketide inhibitors of FF-ATPase. Proc Natl Acad Sci USA. 2000, 97(26):14766-14771; Senior AE, Nadanaciva S, Weber J. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-synthase. Biochim Biophys Acta. 2002 Feb 15; 1553(3): 188-211; Devenish R.J., Prescott M., Boyle G. M., Nagley P. The Oligomycin Axis of Mitochondrial ATP Synthase: OSCP and the Proton Channel. J Bioenerg Biomembr. 2000, 32(5):507-515; Salomon A.R., Voehringer D.W., Herzenberg L.A., Khosla C. Apoptolidin, a selective cytotoxic agent, is an inhibitor of FF-ATPase. Chemistry & Biology, 2001, 8, 71-80; Comelli M., Di P.F., Mavelli I. Apoptosis is induced by decline of mitochondrial ATP synthesis in erythroleukemia cells. Free Radicals Biol. Med. 2003; 34(9):1190-1199; Li Y.C., Fung K.P., Kwok T.T., Lee C.Y., Suen Y.K., Kong S.K. Mitochondria-targeting drug oligomycin blocked P-glycoprotein activity and triggered apoptosis in doxorubicin-resistant HepG2 cells. Chemotherapy. 2004, 50(2):55-62; M.G.Alekseeva, S.M.Elizarov, О.В.Bekker, I.K.Lubimova and V.N.Danilenko. F0F1ATP Synthase of Streptomycetes: Modulation of Activity and Oligomycin Resistance by Protein Ser/Thr Kinases. Biologicheskie Membrany, 2009, Vol.26, No.1, pp.41-49). Олигомицины влияют на важные клеточные процессы, такие как транслокацию протонов, связанную с АТФ-азой.
1
2
2
3
3
4
1
2
3
3
4
1
2
2
3
3
4
Важнейшими представителями этого химического класса являются олигомицин А (формула 1, R=CH, R=СН, R=H, R=OH), олигомицин В (формула 1 R=C=O, R=H, R=CH, R=OH), олигомицин C (формула 1, R=CH, R=H, R=CH, R=H), рутамицин А (формула 2, R=OH), рутамицин В (формула 2, R=H), цитоварицин (формула 3) и ряд других.
0
0
1
0
1
0
1
0
0
Олигомицин А - цитотоксичный макролидный антибиотик. По строению он представляет собой 26-членный α,β-ненасышенный лактон, сочлененный с бициклической спирокетальной структурой. Структура и абсолютная конфигурация олигомицина А были установлены при их сравнении с продуктами деградации рутамицина (G.Т.Carter. Structure Determination of Oligomycins A and С.J. Org. Chem. 1986, 51, 4264-4271). Хорошо изученный механизм действия макролидных антибиотиков группы олигомицинов основан на взаимодействии с F комплексом FFАТФ-синтазы митохондрий эукариотов и цитоплазматического комплекса FFАТФ-синтазы некоторых актинобактерий (http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/part2/f1fo.htm). Вместе с тем предполагают, что у семейства данной группы антибиотиков могут быть другие биомишени [Wender PA, Jankowski OD, Longcore, K, Tabet EA, Seto H, Tomikawa T. Correlation of FF-ATPase inhibition and antiproliferative activity of apoptolidin analogues. Org Lett. 2006, 8(4):589-592]. Олигомицин специфичен в отношении С-субъединицы F комплекса АТФ-синтазы и в микромолярных концентрациях эффективно блокирует транспорт протонов через субъединицу F и синтез АТФ. Ферментный комплекс F0F1 АТФ-синтазы в настоящее время рассматривается как перспективная молекулярная мишень в противораковой и инфекционной терапии. [L.A Shchepina, О.Y Pletjushkina, А.V Avetisyan, L.E Bakeeva, Е.K Fetisova, D.S Izyumov, V.В Saprunova, M.Yu Vyssokikh, В.V Chernyak, and V.P Skulachev, Oligomycin, inhibitor of the F0 part of H+-ATP-synthase, suppresses the TNF-induced apoptosis, Oncogene (2002), 21, 8149-8157; Cole S.T., Alzari P.M. Microbiology. ТВ - a new target, a new drug. Science. 2005 Jan 14; 307(5707): 214-215].
1
13
Химическая модификация природных антибиотиков - важнейший способ получения новых препаратов, обладающих преимуществами перед исходными антибиотиками. Химическая модификация антибиотиков группы олигомицинов практически не проводилась. Описано частичное ацетилирование олигомицина А, которое привело к образованию 5,9,33-три-О-ацетил и 5,9,13,33-тетра-О-ацетил производных, чьи полные структуры установили на основе Н и С ЯМР спектров. Эти производные не проявили ингибирующей активности при тестировании на спорах Aspergillus niger [László Szilágyi; János Samu; Ilona Harsányi, Structure Elucidation of Two Acetylated Derivatives of Oligomycin A, Spectroscopy Letters, 28, Issue 5 July 1995, 699-707]. Олигомицин А содержит несколько кето-групп, и была исследована их реакционная способность [Fausto Rfmires, James F. Marecek, Shu-I Tu, Thomas V. Kantor, and Hiroshi Okazaki, Effects of Borohydride-Treated Oligomycins on Processes of Energy Transduction in Mitochondria, Eur. J. Biochem. (1982), 121, 275-2279]. Авторами показано, что постепенное прибавление боргидрида натрия в этанольный раствор рутамицина и олигомицинов восстанавливает кето-группы по С-7 и С-11 положениям макролидного агликона до соответствующих гидроксильных групп без дальнейшего изменения лактонного цикла. Восстановленные соединения так же, как и исходные антибиотики, ингибируют АДФ-зависимое дыхание и выбрасывание протона, связанное с гидролизом АТФ, но не влияют на другие связанные с дыханием активности в интактных митохондриях печени крыс.
Ранее описаны способы химической модификации олигомицина А, селективно изменяющие 7-кето-группу и С-2, С-3-двойную связь. Взаимодействие олигомицина А с гидроксиламином привело к образованию 6-членного нитрона, аннелированного с исходным антибиотиком по положениям 3-7. Реакции с 1-аминопиридиниум йодидом дала пиразоло[1,5-а]пиридины, конъюгированные с олигомицином А по положениям С-2 и С-3, за которым последовало спонтанное окисление продукта присоединения по двойной связи С2-С3. Полученные производные менее токсичны, чем исходный. [L.N Lysenkova, K.F Turchin, V.N Danilenko, A.M Korolev and M.N Preobrazhenskaya, The first examples of chemical modification of oligomycin A, The Journal of Antibiotics (2010), 63, 17-22].
Раскрытие изобретения
По сравнению с полусинтетическими производными, описанными выше, в настоящем изобретении заменена 33-гидроксильная группа. Изобретение включает способ получения новых полусинтетических аналогов антибиотика олигомицина А, заключающийся в селективной этерификация гидроксильной группы в боковой цепи олигомицина А в положении С-33 хлорангидридом метансульфоной кислоты с образованием 33-O-метансульфонил-олигомицина А (формула 4), с последующим нуклеофильным замещением аниона метансульфоновой кислоты на азидогруппу (Схема 1). Реакцию азидирования 33-O-мезил-олигомицина А (формула 5) азидом натрия с получением 33-дезокси-33-азидо-олигомицина А проводили в апротонных растворителях - N,N-диметилформамиде и диметилсульфоксиде.
Схема 1
Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного соединения, соответствующего формуле 4 или 5 в смеси по меньшей мере с одним приемлемым носителем.
Термин «Фармацевтически приемлемый» означает материал, используемый при получении фармацевтической композиции, обычно безопасный, нетоксичный и приемлемый для использования в фармацевтике и ветеринарии.
Примеры получения производных олигомицина А по настоящему изобретению
Пример 1
33-O-Мезил-олигомицин А (Формула 4).
f
t
46
76
13
46
76
13
33
33
2
3
33
1
13
1
1
1
13
1
1
1
13
1
Олигомицин в количестве 1,0 г помещали в круглодонную колбу с магнитной мешалкой и растворяли в 30 мл сухого пиридина. При сильном перемешивании в колбу добавляли 0,5 г диметиламинопиридина в виде порошка и метансульфохлорид 0,3 мл. Реакционную смесь перемешивали 1,5 часа при комнатной температуре и добавляли метансульфохлорид 0,2 мл, через час добавляли еще 0,1 мл метансульфохлорида. Контролировали реакцию методом тонкослойной хроматографии в системе гексан-ацетон (1:1), по окончании реакции реакционную смесь выливали на лед, подкисляли 1 N раствором соляной кислоты до pH 3 и экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Экстракт промывали водой до нейтрального значения pH, сушили и концентрировали в вакууме. Вещество очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле в системе гексан-ацетон (4:1). Получали 0,6 мг (58%) производного олигомицина в виде бесцветного аморфного порошка, R 0,47 в системе гексан-ацетон, R 12,4 мин (подвижная фаза - вода - ацетонитрил. Элюция в градиентном режиме, при котором процентное содержание ацетонитрила изменялось от 80 до 95% за 10 минут и сохранялось 20 минут при 95% при скорости потока - 1 мл/мин). Найдено: m/z 891.4939 [М+Na]+. CHNaOS. Вычислено: М=891.4904. Найдено: m/z 907.4638 [М+К]+. СНKOS. Вычислено: М=907.4643. Методами спектроскопии ЯМР Н и С в вариантах 1D и 2D (кореляционные спектры H-Н COSY и Н-С HETCOR)] изучено строение мезилата олигомицина А. Обнаружено значительное слабопольное смещение сигнала СН (на ~0.9 м.д., отнесение на основании Н-H COSY) и сигнала С (на ~14 м.д., отнесение на основании Н-С HETCOR) относительно соответствующих сигналов в исходном олигомицине А. Указанный эффект, а также наличие в спектре ЯМР Н мезилата синглета при δ 3.00 интенсивностью 3 п.е. согласуется с электронно-акцепторными свойствами заместителя O-S(O)СН и подтверждает его присутствие при С в мезилате олигомицина А.
Пример 2
33-Дезокси-33-азидо-олигомицин А (Формула 5)
f
t
45
73
3
10
-1
33-O-Мезилолигомицин А в количестве 0,5 г помещали в круглодонную колбу, снабженную термометром и магнитной мешалкой, и растворяли в 10 мл сухого диметилформамида. Азид натрия 0,25 г присыпали в сухом виде, реакционную смесь нагревали до 60-65°C при перемешивании 2 часа. Контролировали реакцию методом тонкослойной хроматографии в системе гексан-ацетон, 1:1, и хлороформ-метанол, 10:0,5. Затем добавляли 0.125 г азида натрия. По окончании реакции реакционную смесь экстрагировали смесью толуола и этилацетата в соотношении 1:1, промывали водой, сушили сульфатом натрия. Азид олигомицина выделяли на силикагеле, используя хроматографическую систему хлороформ-метанол (30:0,5). Получали азид олигомицина в виде аморфного белого порошка с R 0,68 в системе хлороформ-метанол (10-0,5) с выходом 60%. R 23,0 мин (подвижная фаза - вода - ацетонитрил. Элюция в градиентном режиме, при котором процентное содержание ацетонитрила изменялось от 80 до 95% за 10 минут и сохранялось 20 минут при 95% при скорости потока - 1 мл/мин). ИК-спектр (порошок), v/см: 2103 (азидо-группа). Найдено: m/z 838.5178 [М+Na]+. CHNONa. Вычислено: М=838.5194.
Пример 3
Биологическая активность 33-O-мезилата и 33-дезокси-33-азидо олигомицина А
50
В таблице 1 представлены результаты сравнительного измерения активности олигомицина А и его производных 4 и 5 на линиях опухолевых клеток НСТ116 и K562, в клеточной тест-системе Streptomyces sp.(сверхчувствительной к олигомицинам) и протеолипосомах этого штамма. 33-Дезокси-33-азидо-олигомицин показал IC, сопоставимую с олигомицином А, проявив при этом в 1000 раз меньшую активность в бактериальной тест-системе Streptomyces sp., и почти пропорционально сниженную активность на протеолипосомах, содержащих F0F1АТФ синтазу. 33-о-мезилолигомицин менее активен по сравнению с олигомицином А в отношении линий раковых клеток НСТ116 и К562 в 6 и 45 раз соответственно, а также в 100 раз в клеточной тест-системе Streptomyces sp., как и предыдущее производное он проявлял активность в отношении F0F1АТФ синтазы в протеолипосомах.
Таблица 1
Токсичность олигомицина А и его новых производных.
Соединение
Streptomyces sp*.
Линии опухолевых клеток**, IC<sub>50</sub>, µМ
АТФазная активность в протеолипосомах***
Концентрация, нмоль/диск
Зона, мм
НСТ116
К562
Концентрация, нМ
Активность, пмоль <sup>32P</sup> <sub>i</sub>/мин
Олигомицин А
0.001
10
1.0+0.2
0.2+0.01
5.0
412±50
50.0
249±25
250,0
124±12
1000,0
69±7
33-O-
0.1
9.5
6.4±0.9
5.8±2.1
5,0
467±68
Мезилолигомицин
50,0
454±59
А4
250,0
463±45
1000,0
408±23
33-Дезокси-33-
1
7.5
1.0+0.3
0.1+0.03
5,0
451±46
азидо-
50,0
452±43
олигомицин А5
250,0
483±72
1000,0
450±65
* Уровень чувствительности определяли методом наложения дисков с различными концентрациями антибиотика на чашках Петри с агаризованной средой, как описано ранее [М.G.Alekseeva, S.M.Elizarov, О.В.Bekker, I.K.Lubimova, and V.N.Danilenko. F0F1-ATP Synthase of Streptomycetes: Modulation of Activity and Oligomycin Resistance by Protein Ser/Thr Kinases. Biochemistry (Moscow) SUPPLEMENT SERIES A: MEMBRANE AND CELL BIOLOGY. Vol.3, No.1, P.16-22, 2009].** Клетки линий НСТ116 (аденокарцинома толстой кишки) и К562 (промиелоцитарный лейкоз) инкубировали в течение 72 часов с добавлением различных концентраций исследуемых веществ (для анализа выживаемости клеток использовался МТТ-тест).
*** АТФазная активность в препарате протеолипосом, пмоль <sup>32P</sup> <sub>i</sub>, освобожденного за 1 мин в присутствии 1 мкг белка. В контроле (только ДМСО) АТФазная активность в препарате протеолипосом равна 462±34 пмоль <sup>32P</sup> <sub>i</sub>/мин.
0
1
Таким образом, получены новые производные антибиотика олигомицина А, обладающие высокой цитотоксической активностью в отношении линий опухолевых клеток. Поскольку новые производные не ингибируют АТФазу в протеолипосомах, следует считать, что биомишень для воздействия 4 и 5 не АТФаза. Такое утверждение правомерно, т.к. независимая от АТФазы мишень ранее показана для производных апоптолидина - соединения, близкого по структуре к олигомицину [Wender PA, Jankowski OD, Longcore K, Tabet EA, Seto H, Tomikawa T. Correlation of FF-ATPase inhibition and antiproliferative activity of apoptolidin analogues. Org Lett. 2006, 8(4):589-592]. Отсутствие воздействия синтезированных веществ 4 и 5 на F0F1 АТФсинтазу при сохранении высокой цитотоксичности и способности индуцировать апоптоз позволяет предполагать их меньшую токсичность для человека. Полученные нами соединения 4 и 5 можно использовать в качестве хит-соединений для создания на их основе новых противоопухолевых препаратов.