СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ С У ВЗРОСЛЫХ И ДЕТЕЙ
METHOD FOR PREDICTION OF ANTIVIRAL THERAPY IN CHRONIC HEPATITIS C IN ADULTS AND CHILDREN

Предлагаемое изобретение относится к гепатологии и предназначено для прогнозирования ответа на противовирусную терапию (ПВТ) при хроническом гепатите С (ХГС) у взрослых и детей.
Уровень техники.
Прогнозирование эффективности лечения больных ХГС представляет собой важную практическую задачу в связи с высокой стоимостью противовирусных препаратов, наличием многочисленных побочных действий при их применении и связанной с этим необходимостью тщательного выбора методов лечения, оптимальных для конкретного пациента (персонализированная медицина).
Проведение ПВТ при ХГС - процесс длительный (24-48 недель и более), многокомпонентный, отягощенный большим количеством побочных явлений и высокой стоимостью препаратов.
Дозы, схемы и длительность ПВТ должны быть индивидуализированы и определяются целым рядом параметров, относящихся как к особенностям вируса (например, его генотипу), так и характеристике пациента. Совокупность этих факторов серьезно влияет на эффективность проводимого лечения.
Перед началом терапии принято учитывать так называемые «предикторы эффективности» (Протокол диагностики и лечения больных вирусными гепатитами В и С, РЖГГК, 2010. т. ХХ, №6). К ним относят:
- генотип вируса не - 1;
- вирусная нагрузка менее 600000 МЕ/мл;
- женский пол;
- возраст моложе 40 лет;
- раса европейская;
- масса тела менее 75 кг;
- отсутствие резистентности к инсулину;
- повышенная активность трансаминаз;
- отсутствие выраженного фиброза или цирроза печени.
Каждый из этих признаков в отдельности и их сочетания в определенной степени предопределяют вероятность благоприятного ответа на терапию.
В самое последнее время предложено также учитывать генетический статус пациента в виде определения полиморфизма гена IL - 28В, кодирующего синтез интерферона лямбда 3 (Клин. Гепатология, 2010, №1, стр. 42). Однако все эти данные ориентировочны и позволяют лишь наметить общий план лечения.
В последние годы принято ориентироваться на характер индивидуального ответа конкретного пациента в ходе уже начатой терапии. При этом основными (реперными) точками, к которым «привязаны» критерии оценки эффективности ПВТ и ее коррекции, являются 4 и 12 недель от начала лечения. Снижение на 2 log или исчезновение РНК ВГС из крови пациента в эти сроки считается предиктором устойчивого вирологического ответа (РГГКЖ, 2010, т. XX, №6, стр. 31). Однако, как показывает практика, и этот критерий не является абсолютным, и поиск дополнительных тестов представляет собой в настоящее время одно из важнейших направлений совершенствования ПВТ ХГС.
Известен способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии вирусных гепатитов у детей с помощью оценки показателей лейкоцитмодулирующей активности сыворотки крови до начала лечения (RU 2739689, 20.10.2001). Способ этот имеет ряд недостатков, ограничивающих его применение, к ним относятся:
- способ предназначен только для детей;
- определение показателя до начала лечения имеет характер группового, а не индивидуального прогнозирования;
- методы интерферонотерапии, которыми пользовались авторы (оральные препараты интерферона, интерферон в сочетании с циклофероном), не относятся к методам лечения ХГС, общепризнанным мировым гепатологическим сообществом, и поэтому не могут использоваться для прогнозирования официально рекомендуемой в настоящее время ПВТ при ХГС.
Известен также способ прогнозирования результатов лечения больных ХГС препаратами интерферона-альфа (ИФН-а), который предусматривает оценку уровня синтеза ИФН-гамма и ИЛ-4 непосредственно перед началом ПВТ и повторно через 4,5 часа после 1-й инъекции (RU 2287825, 20.11.2006). Способ обладает рядом недостатков и ограничений:
- разработан и может быть использован только у взрослых пациентов;
- характеризует избранные показатели только перед началом терапии и ответ на 1-ю инъекцию, которые могут не совпадать с таковыми в ходе многомесячной ПВТ;
- повторное взятие крови через 4,5 часа после первого ее забора на практике затруднено у амбулаторных пациентов, каковыми являются больные ХГС;
- 4,5 часа, избранные авторами как пик терапевтической активности ИФН, не могут относиться в равной мере и к стандартным ИФН-ам, и к его пегилированным формам, в то время как пациенты, у которых проводилось исследование, получали и те, и другие и не разделены по этому признаку.
Известен способ прогнозирования ответа на ПВТ с помощью определения фактора некроза опухоли (ФНО-а), исследуемого перед началом лечения и соотносящего его с показателями, определяемыми в ходе лечения (патент RU №2454666, публ. 02.02.2011). Однако этот способ относится к лечению другого гепатита - ХГВ, протекающего на фоне ХГС.
Наиболее близким способом прогнозирования эффективности ответа на ПВТ при ХГС, принятым за ближайший аналог, является способ, предложенный В.В. Макашовой с соавт.(патент RU №2461834, публ. 14.02.2011), предусматривающий определение соотношения интерлейкина - 18 и ФНО-перед началом терапии в сравнении с величиной этого соотношения в конце лечения. Недостатками этого способа являются:
- прогноз, который делается лишь по окончании терапии, является запоздалым, так как может относиться только к прогнозированию рецидивов заболевания;
- может быть использован только у взрослых пациентов.
Раскрытие изобретения.
Задачей изобретения является разработка нового подхода к индивидуализации проведения ПВТ при ХГС как у взрослых, так и у детей.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности прогнозирования для выбора оптимальной тактики лечения у каждого пациента.
Технический результат достигается за счет определения перед началом противовирусного лечения уровня интерферона в плазмоцитоидных дендритных клетках крови (ПДК).
С описанием в 1999 году ПДК открыта новая страница в учении об иммунитете. Эти уникальные клетки играют ключевую роль в иммунном ответе, обеспечивая взаимодействие врожденного (мощная выработка интерферона) и приобретенного (представление антигена) иммунитета (Liu YJ. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu Rev Immunol 2005;23:275-306; Kadowaki N., YJ Liu. Natural type I interferon-producing cells as a link between innate and adaptive immunity. Hum. Immunol. 2002 Dec 12; 63: 1126-1132).
В зрелом виде ПДК циркулируют в периферической крови, а также в очень малых количествах присутствуют в костном мозге (до 1%), селезенке, тимусе, лимфоузлах (0,05-0,5%); практически отсутствуют в периферических тканях. Исключение составляют ткани печени (Cella М, Jarrossay D. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat Med 1999; 5(8):919-23), где их количество достигает 10%.
Отличительными особенностями ПДК являются немедленная (через 2-4 часа) выработка полного спектра ИФН I и III типа (λ) и наличие специфических TLR-рецепторов (TLR7 и TLR9). С помощью регулятора экспрессии ИФН I типа (IRF7) стремительно активируется распознавание TLR рецепторами вирусных нуклеиновых кислот (Cisse В, Caton ML, Lehner М, Maeda Т, Scheu S, Reizis В. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.Cell. 2008; 135(1):37-48), после чего начинается немедленная и мощная (в 1000 раз превышающая возможности других клеток) продукция ИФН I типа. Транскрипционные уровни IRF7 в ПДК выше, чем в обычных клетках (Crozat К, Guiton R, Guilliams М, Henri S, Baranek T, Schwartz-Cornil I et al. Comparative genomics as a tool to reveal functional equivalences between human and mouse dendritic cell subsets. Immunol Rev 2010; 234(1): 177-98).
При ХГС в 2010 году в этих клетках был открыт новый биологический механизм ИФН-образования. Особенности образования ИФН при HCV-инфекции с участием ПДК продемонстрировали в своем исследовании Takahashi et al. (Takahashi К, Shinichi A. Plasmacytoid dendritic cells sense hepatitis С virus-infected cells,produce interferon, and inhibit infection. Proc Natl Acad Sci U S A, Pablished on line 2010-03-15). По мнению авторов, при ХГС инфицированный гепатоцит, в котором активно реплицируется вирус, взаимодействует с ПДК, вызывая массивную выработку ИФН без заражения самой ПДК.
В наших исследованиях при изучении ПДК, их роли в патогенезе и ИФН-образовании при ХГС у взрослых и детей получен ряд доказательств того, что состояние этих клеток может лежать в основе хронического течения инфекции, а уровень ИФН-генеза в ПДК в ответ на ПВТ - определять ее эффективность.
В ходе предварительно проведенного нами исследования было показано, что у здоровых детей и взрослых ИФН в ПДК не определяется, поэтому за уровень выработки ИФН в ПДК у здоровых лиц принято 3 пг/мл - верхний уровень детекции используемого метода. При определении уровня интерфероногенеза в ПДК у больных ХГС получены следующие результаты:
-выработка ИФН в ПДК у больных ХГС, как у детей - 113,3±21,7 пг/мл, так и у взрослых - 321±141,2 достоверно выше нормальных значений (р=0,0002 и р=0,0034, соответственно);
- у взрослых интерфероногенез в ПДК интенсивнее, чем у детей (р<0,0001).
Проведено специальное изучение показателей ИФН-генеза в ПДК перед началом противовирусного лечения в сопоставлении с его результатами. У больных, ответивших на ПВТ, выработка ИФН в ПДК перед лечением была в 6,5 раз выше (391,5±126,9 пг/мл; N=6), чем у пациентов, не ответивших на лечение (59,9±38,4 пг/мл; N=6) устойчивым прекращением репликации вируса (УВО) (р=0,0278).
В ходе проведенного исследования отобраны 2 группы пациентов:
1 группа - пациенты, страдающие ХГС (взрослые и дети), которые были обследованы перед началом противовирусной терапии и имели ранний вирологический ответ (РВО) на 12 неделе проведения и УВО после ее окончания (N=6, выработка интерферона составила 391,5±126,9 пг/мл);
2 группа - пациенты, страдающие ХГС (взрослые и дети), которые были обследованы перед началом противовирусной терапии и не имели как РВО на 12 неделе проведения ПВТ, так и УВО после ее окончания (N=6, выработка интерферона составила 59,9±38,4 пг/мл).
Различия, полученные в группах сравнения, достоверны (р=0,0278). Статистическая достоверность получена при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни.
Показано, что исходный (определяемый перед началом лечения) уровень выработки ИФН в ПДК тесно связан с ответом на ПВТ и может служить прогностическим тестом эффективности проводимой терапии.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациента, страдающего ХГС, проводят забор венозной крови до назначения противовирусной терапии. Забор венозной крови осуществляют стандартным способом в пробирку 10 мл (или 5 мл) с консервантом ЭДТА (пробирка должна быть наполнена полностью, для соблюдения правильного соотношения кровь/антикоагулянт). Сразу после заполнения пробирки кровью и извлечения из держателя, необходимо тщательное перемешивание ее содержимого.
Исследование функциональной активности плазмоцитоидных дендритных клеток осуществляют не ранее, чем через 40 мин после забора крови (время, необходимое для клеточной стабилизации). При необходимости проведения отсроченного исследования венозную кровь транспортируют и хранят не более 6 часов (температурный режим 21-23°С).
2
Далее в ламинаре, в стерильных условиях отбирают 100 мкл крови, к которым добавляют 200 мкл раствора А (для приготовления раствора А необходим стимулятор клеточного роста ODN2216 - синтетический олигонуклеотид, иммуностимулирующий сугубо TLR9 рецепторы) и 200 мкл раствора В (для приготовления раствора В необходим IL3, который стимулирует дифференцировку мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток). Затем пробу помещают в СО инкубатор на 24 часа, после чего кровь центрифугируют и отбирают супернатант культуры клеток, который при необходимости длительного хранения замораживают при -80°С. После этого пробы проходят стандартную постановку методом ИФА «ELISA», который предназначен для определения уровня выработки ИФН.
Если уровень интерферона в выделяемых из крови плазмоцитоидных дендритных клетках составляет 136,7 пг/мл и более, прогнозируют благоприятный исход проводимой терапии.
Имеющий прогностическое значение уровень выработки ИФН в 136,7 пг/мл установлен нами как сумма средней в группе без УВО и удвоенного стандартного отклонения (59,9+(38,4×2)=136,7 пг/мл).
Клинические примеры.
Пример 1.
Больной Дмитрий С., 6 лет, № карты амбулаторного больного - 74. Обратился на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на снижение аппетита, повышенную утомляемость, боли в правом подреберье при физической нагрузке.
Из анамнеза заболевания было установлено, что у мальчика с рождения определяются маркеры ВГС. Эпид. анамнез: вертикальный путь передачи, мать страдает ХГС.
Противовирусная терапия не проводилась, в процессе лечения периодически получал курсы гепатопротекторов.
Объективно: состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые. Печень пальпируется у края реберной дуги, слегка уплотнена.
4
По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ -46,1 Ед/л и ACT - 65,8 Ед/л. Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич.- 1,78×10 коп./мл, генотип 1в.
Фиброэластография печени - F1 балла по шкале METAVIR.
Диагноз: Хронический гепатит С, минимальной активности, репликативный, низкая вирусная нагрузка, генотип 1в, F1 балл по шкале METAVIR.
Исходный уровень выработки ИФН в ПДК, определяемый перед началом терапии - 298,7 пг/мл.
Больному проведена стандартная комплексная ПВТ (РоферонА+рибавирин) в возрастной дозировке.
На 12-ой неделе терапии отмечается нормализация уровня трансаминаз - АЛТ -35 Ед/л и ACT - 30,5 Ед/л. Маркеры ГС: HCV РНК - не определяется.
При лабораторном обследовании через 6 мес после окончания ПВТ: показатели уровня трансаминаз остались в пределах нормы, HCV РНК - не определяется, что соответствует устойчивому вирологическому ответу, под которым понимается отсутствие репликации вируса через 6 мес после окончания терапии и более. Дальнейшее наблюдение подтвердило отсутствие рецидива виремии.
Таким образом, по окончании терапии у мальчика был достигнут УВО, возможность прогнозирования которого была доступна до начала противовирусной терапии и базировалась на определении исходного уровня выработки ИФН в ПДК. У ребенка до начала проведения ПВТ зафиксирован высокий уровень интерферонообразования в ПДК - 298,7 пг/мл по сравнению с показателем у здоровых детей. Случай демонстрирует надежность позитивного прогноза перед началом проведения ПВТ и возможность на его основе строить терапию.
Пример 2.
Больной Равшан Г., 34 года, № карты амбулаторного больного - 147.
Обратился на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на недомогание, снижение аппетита, ощущение тяжести в правом подреберье.
Из анамнеза заболевания было установлено наличие маркеров ВГС с 2001 года. Эпид. анамнез: парентеральные вмешательства отрицает, оперативные вмешательства не проводились, вредных привычек нет, источник инфицирования не установлен.
Противовирусная терапия не проводилась, в лечении периодически получал курсы гепатопротекторов.
Объективно: состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые. Умеренная иктеричность склер. Печень+1 см - ср/3, слегка уплотнена.
3
По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ -72,8 Ед/л и ACT - 31,7 Ед/л. Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич.-3,49×10 коп./мл, генотип 1в.
Фиброэластография печени - F1 по шкале METAVIR.
Диагноз: Хронический гепатит С, активный, репликативный, низкая вирусная нагрузка, генотип 1в, F1 балл по шкале METAVIR.
Исходный уровень выработки ИФН в ПДК, определяемый перед началом терапии - 851,1 пг/мл.
Больному проведена стандартная комплексная ПВТ (пегинтерферон альфа 2а+рибавирин).
На 12-ой неделе терапии отмечена нормализация уровня трансаминаз - АЛТ -30,3 Ед/л и ACT - 27,7 Ед/л. Маркеры ГС: HCV РНК колич. - не определяется.
При лабораторном обследовании через 6 мес после окончания ПВТ: показатели уровня трансаминаз остались в пределах нормы, HCV РНК - не определяется, что соответствует УВО, под которым понимается отсутствие репликации вируса через 6 мес после окончания терапии и более. Дальнейшее наблюдение подтвердило отсутствие рецидива виремии.
Таким образом, по окончании терапии у больного был достигнут УВО, возможность прогнозирования которого была доступна до начала противовирусной терапии и базировалась на определении исходного уровня выработки ИФН в ПДК.
Случай демонстрирует надежность позитивного прогноза перед началом проведения ПВТ и возможность на его основе решить вопрос о целесообразности ее проведения.
Пример 3.
Больной Фирдавс X., 12 лет, № карты амбулаторного больного - 109.
Обратился на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на снижение аппетита, повышенную утомляемость, боли в правом подреберье при физической нагрузке.
Из анамнеза заболевания было установлено, что у мальчика с рождения определяются маркеры ВГС. Эпид. анамнез: вертикальный путь передачи, мать страдает ХГС.
Этиотропная противовирусная терапия не проводилась, периодически получал курсы гепатопротекторов.
Объективно: состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые. Печень у края реберной дуги слегка уплотнена, «пузырные» симптомы ±. По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ -65,5 Ед/л и ACT - 54,2 Ед/л.
4
Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич.- 7,51×10МЕ/мл, генотип 3а.
Фиброэластография печени - F1 баллов по шкале METAVIR.
Диагноз: Хронический гепатит С, минимальной активности, репликативный, низкая вирусная нагрузка, генотип 3а, F1 балл по шкале METAVIR.
Исходный уровень выработки ИФН в ПДК, определяемый перед началом терапии - 3 пг/мл.
Ребенку проведена стандартная комплексная ПВТ (РоферонА+рибавирин) в возрастной дозировке.
3
На 12-ой неделе терапии уровень трансаминаз - АЛТ -41,2 Ед/л и ACT - 24,9 Ед/л. Маркеры ГС: HCV РНК колич. -1,86×10МЕ/мл.
4
При лабораторном обследовании через 6 мес после окончания ПВТ: показатели уровня трансаминаз остались в пределах нормы, однако HCV РНК колич 2,8×10 МЕ/мл - определяется, что соответствует отсутствию эффективности проводимой ПВТ.
Таким образом, у ребенка, после проведения курса ПВТ не был достигнут вирологический ответ. Случай демонстрирует, что низкий показатель интерфероногенеза в ПДК, определяемый перед началом лечения, соответствует неудаче ПВТ, которую можно было с высокой вероятностью прогнозировать до ее проведения. Пример 4.
Больной Андрей В., 32 года, № карты амбулаторного больного - 160.
Обратился на амбулаторный прием к гепатологу с жалобами на ощущение тяжести в правом подреберье.
Из анамнеза заболевания было установлено наличие маркеров ВГС с 2003 года. Эпид. анамнез: парентеральные вмешательства отрицает, оперативные вмешательства не проводились, вредных привычек нет, источник инфицирования не установлен.
Этиотропная противовирусная терапия не проводилась.
Объективно: состояние средней степени тяжести по основному заболеванию. Кожа и видимые слизистые чистые. Печень пальпируется на +1,0, +1,0+ср/3 см из-под края ребер, уплотнена, «пузырные» симптомы ±.
По результатам биохимического анализа крови активность трансаминаз - АЛТ -45,3 Ед/л и ACT - 29,6 Ед/л.
6
Маркеры ГС: HCV РНК+, HCV РНК колич.- 2,67×10 МЕ/мл, генотип 1в. Фиброэластография печени - F0 баллов по шкале METAVIR. Уровень выработки ИФН в ПДК - 3 пг/мл
Диагноз: Хронический гепатит С, минимальной активности, репликативный, высокая вирусная нагрузка, генотип 1в, F0 баллов по шкале METAVIR.
Больному проведена стандартная комплексная ПВТ (пегинтерферон альфа 2а+рибавирин).
5
На 12-ой неделе терапии уровень трансаминаз - АЛТ -10,7 Ед/л и ACT - 19,4 Ед/л. Маркеры ГС: HCV РНК колич. -1,73×10 МЕ/ мл.
5
При лабораторном обследовании через 6 мес после окончания ПВТ: показатели уровня трансаминаз нормализовались, HCV РНК колич. - 2,3×10 МЕ/мл, что говорит о продолжающейся репликации вируса и соответствует отсутствию ответа на проведенную терапию.
В данном примере отсутствие достаточного уровня выработки интерферона в ПДК перед началом лечения соответствует отсутствию желаемого эффекта терапии. Подобная ситуация, так же, как у детей, может служить основой для решения вопроса о проведении ПВТ.
Таким образом, предложенный способ определения уровня ИФН в ПДК перед началом ПВТ позволяет предсказать ее конечный результат с прогностической точностью (эффективность) 75% при высокой чувствительности (83%) и специфичности (67%), что принципиально важно для решения вопроса о назначении, характере и длительности ПВТ.
Учитывая предложенный нами предиктор эффективности проводимой ПВТ, практикующий врач может иметь объективную информацию, необходимую для решения вопроса о начале терапии и выборе соответствующей схемы ее проведения.
При наличии отрицательного предиктора (выработка ИФН в pDC ниже 136,7 пг/мл) дорогостоящая и обладающая большим количеством негативных побочных эффектов ПВТ может быть мотивированно отложена до момента появления более эффективных противовирусных препаратов.