ПРИМЕНЕНИЕ ПИНОЛЕНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ КОНТРОЛИРОВАНИЯ ВЕСА
APPLICATION OF PINOLINIC ACID FOR WEIGHT CONTROL

Область техники
Настоящее изобретение относится к фармацевтической или пищевой промышленности и, в частности, к композициям, которые могут использоваться для контролирования веса, для контроля потребления пищи и аппетита и для контроля и/или снижения массы тела. Композиции содержат пиноленовую кислоту или ее производные.
Предшествующий уровень техники
Ожирение становится все более широко распространенным в развитых странах. В большинстве случаев избыточный вес и ожирение являются результатом дисбаланса между потреблением и расходом энергии в организме. Энергетический дисбаланс у разных индивидуумов может быть обусловлен комбинацией нескольких факторов из существующего множества факторов, вызванных как окружающей средой, так и генетически детерминированных. Ожирение может быть решающим фактором увеличения числа случаев различных заболеваний, включая ишемическую болезнь сердца, гипертонию, инсульт, диабет и некоторые виды рака.
Снижение веса часто рекомендуется в качестве первого этапа лечения больных, страдающих указанными связанными с ожирением заболеваниями. В своей попытке контролировать общую массу тела индивидуум может пытаться контролировать вес, причем цели таких действий могут быть различными в зависимости от задач, стоящих перед индивидуумом. Например, в то время как одни индивидуумы, страдающие ожирением или избыточным весом, могут стремиться уменьшить массу тела, другие индивидуумы могут стремиться к поддержанию массы тела на примерно постоянном уровне. Даже если индивидуум сбросил массу тела, ему зачастую требуется контролировать свою массу с тем, чтобы предупредить ее прирост на ранее сброшенные килограммы. Наиболее эффективные программы снижения веса обычно включают низкокалорийную диету и/или повышенный расход энергии. Со временем многие люди, перенимая опыт контролирования веса, могут испытывать усиленное чувство голода и/или тягу к пищевым продуктам с высоким содержанием сахара. Это может приводить к отказу индивидуумов от режима контролирования веса. Таким образом, существует необходимость разработки новых и эффективных подходов для контролирования веса, помогающих индивидуумам не отказываться от соблюдения режима контролирования веса. Целью настоящего изобретения является создание новых средств обеспечения такой поддержки.
Пиноленовая кислота (5,9,12-С18:3 жирная кислота, т.е. жирная кислота с 18 атомами С, имеющая три двойные связи в положениях 5, 9 и 12) содержится, например, в масле из семян сосны и его фракциях (J. Am. Oil Chem. Soc. 1998, 75, р.45-50). Известно, что масло из семян сосны и, следовательно, пиноленовая кислота могут использоваться в пищевых продуктах, см., например, FR-A-2756465, где раскрывается использование концентрата с 15% пиноленовой кислоты в пищевых добавках. Присутствие пиноленовой кислоты придает композиции, как указывается, гиполипемическое действие.
В WO 98/43513 указывается, что пилки для ногтей могут покрываться пиноленовой кислотой и что это предупреждает случаи инфекций при пользовании пилками.
Согласно JP-A-61238729 масло из семян сосны может использоваться в качестве агента, снижающего уровень холестерина. Другие документы, в которых раскрывается оздоровляющее действие пиноленовой кислоты, включают JP-A-61058536, где указывается на ее очень высокую целебную активность, полезную для здоровья человека. Однако эта целебная активность раскрывается недостаточно подробно. Sugano в Brit. J. of Nutr. 72 (1994), 775-783 раскрывает целый ряд полезных для здоровья диет, содержащих пиноленовую кислоту. Упомянутое оздоровляющее действие включает гипохолестеринемический эффект, действие на ADP-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, продуцирование аортального простациклина и кровяное давление. ЕР-А-1088552 описывает применение пиноленовой кислоты в качестве противовоспалительного агента.
Matsuo et al. в Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids (1996), 55 (4), 223-229 описывает действие γ-линоленовой и пиноленовой кислот на иммунные параметры у крыс Brown-Norway.
Однако ни в одном из документов предшествующего уровня техники не указывается, что пиноленовая кислота или ее производные могут использоваться для лечения или предупреждения ожирения и/или для контролирования веса.
US 6429190, US 2002/0119948 и US 2002/0119915 описывают композиции, вызывающие длительное чувство насыщения и содержащие источник кальция, белок и С12-С18 жирную кислоту. Олеиновая кислота является жирной кислотой, описанной в документах.
WO 02/088159 раскрывает фармацевтически активные уридиновые эфиры и комбинации, содержащие их компоненты - кислоту и уридиновое соединение, а также их широкое применение в медицинских целях. Но в этом документе не раскрывается применение одних свободных жирных кислот и не дается примера лечения ожирения.
ЕР-А-1504778, опубликованный 9 февраля 2005 г., описывает имплантируемый насос для лечения ожирения. Насос может содержать жирную кислоту, пиноленовая кислота не называется.
CN-F-1377673 относится к применению масла из семян сосны для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, заболеваний сосудов головного мозга и тучности, вызванной гиперлипемией, а также диабета, вызванного гипергликемией.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает применение пиноленовой кислоты или ее производных для производства композиции для контролирования веса путем уменьшения чувства голода и/или усиления чувства сытости. Изобретение обеспечивает также применение пиноленовой кислоты или ее производных для уменьшения чувства голода и/или усиления чувства сытости. Таким образом, композиции изобретения пригодны для лечения или предупреждения ожирения и/или для контролирования веса и содержат пиноленовую кислоту или ее производные. Производные пиноленовой кислоты, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают соли пиноленовой кислоты и алкиловые эфиры. Другими производными пиноленовой кислоты, которые могут использоваться в изобретении, являются изомеры пиноленовой кислоты, такие как, например, геометрические изомеры (имеющие одну или более транс двойных связей; все двойные связи в пиноленовой кислоте являются цис-) и/или соединения, имеющие 18 углеродных атомов и три двойные связи с одной или более из трех двойных связей в другом положении в алкиловой цепи по сравнению с пиноленовой кислотой, включая, например, гамма-линоленовую кислоту, альфа-линоленовую кислоту, пунициновую кислоту, элеостеариновую кислоту и их соли и алкиловые эфиры.
Таким образом, изобретение охватывает применение альфа-линоленовой кислоты или ее производных для контролирования веса путем уменьшения чувства голода и/или усиления чувства сытости; применение гамма-линоленовой кислоты или ее производных для контролирования веса путем уменьшения чувства голода и/или усиления чувства сытости; применение пунициновой кислоты или ее производных для контролирования веса путем уменьшения чувства голода и/или усиления чувства сытости и применение элеостеариновой кислоты (называемой также альфа-элеостеариновой кислотой) или ее производных для контролирования веса путем уменьшения чувства голода и/или усиления чувства сытости.
Изобретение рассматривает также применение пиноленовой кислоты или ее производных для лечения или предупреждения ожирения и/или для контролирования веса. Пиноленовая кислота или ее производные могут применяться как отдельный компонент или может быть компонентом композиции, которая содержит и другие пищевые и/или фармацевтически приемлемые компоненты. Предпочтительно композиция содержит также от 10 до 60% масс. линолевой кислоты и/или от 5 до 52% масс. олеиновой кислоты либо в виде свободных кислот либо в виде глицеридов (например, моно-, ди- или триглицеридов). Дополнительно или альтернативно композиция может содержать от 0,5 до 5% масс. таксолеиновой кислоты.
Совершенно неожиданно было установлено, что жирные кислоты масла из семян сосны и, следовательно, пиноленовая кислота могут использоваться для стимуляции высвобождения холецистокинина (ССК). ССК - это пептид, высвобождаемый после потребления пищи. В процессе потребления пищи высвобождающий ССК белок (CCKRP) высвобождается в тонком кишечнике. CCKRP стимулирует высвобождение ССК из клеток кишечника. Высвобождение ССК вызывает поведенческие симптомы, связанные с насыщением. В дополнение к этому повышенный уровень ССК может увеличивать уровень IgA в кишечнике, который может повышать иммунитет слизистой. Повышенный уровень IgA в кишечном тракте может обеспечить усиленную защиту от заражения микроорганизмами. Таким образом, изобретение обеспечивает также способ повышения иммунитета (например, иммунитета слизистой), предусматривающий прием пиноленовой кислоты или ее производных для повышения иммунитета (например, иммунитета слизистой) и применение пиноленовой кислоты или ее производных для производства композиции для повышения иммунитета (например, иммунитета слизистой). Способ повышения иммунитета может использоваться для лечения и/или предупреждения инфекций, таких как бактериальные или вирусные инфекции.
В широком смысле изобретение относится к применению карбоновых кислот с неразветвленной (прямой) цепью (и их производных, таких как соли и сложные эфиры), имеющих 18 углеродных атомов и три двойные связи, для контролирования веса и/или для лечения или предупреждения ожирения. Контролирование веса может включать уменьшение чувства голода и/или усиления чувства сытости.
Композиции изобретения могут быть в любом, пригодном для употребления виде, например в виде пищевой добавки, фармацевтической композиции или пищевой композиции. Термин "композиция" означает, что пиноленовая кислота или ее производные могут присутствовать вместе с одним или более другим компонентом (например, которые присутствуют в масле из семян сосны). Один или более других компонентов могут присутствовать в смеси с пиноленовой кислотой или ее производными, либо они могут составлять часть упаковки с продуктом (например, капсулы, в которую инкапсулируется пиноленовая кислота или ее производные).
Композиции изобретения обычно содержат от 0,3 до 100% масс., предпочтительно от 5 до 80% масс., более предпочтительно от 10 до 50% масс.(например, от 10 до 30% масс. или от 20 до 30% масс.) пиноленовой кислоты или ее производных. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что процентное содержание пиноленовой кислоты или ее производных в композиции изобретения будет зависеть от природы композиции. Например, в фармацевтической композиции или пищевой добавке процентное содержание пиноленовой кислоты или ее производных будет, вероятно, выше, чем в пищевой композиции.
Если композиция изобретения используется в виде пищевой добавки или фармацевтического продукта, то пиноленовая кислота или ее производные либо смесь, содержащая одно из этих соединений, может быть в инкапсулированной форме в капсуле из материала пищевого качества. Пригодные для изготовления капсул материалы хорошо известны из уровня техники и включают, например, желатин и глицерин.
Пиноленовая кислота, используемая в настоящем изобретении, может быть в форме свободной жирной кислоты, производных пиноленовой кислоты или их смесей, включая смеси различных производных. Производные нетоксичны и пригодны для пищевых целей и предпочтительно включают, например, соли и сложные эфиры. Другими производными пиноленовой кислоты, которые могут использоваться в изобретении, являются изомеры пиноленовой кислоты, такие как, например, геометрические изомеры (имеющие одну или более транс двойных связей; все двойные связи в пиноленовой кислоте являются цис-) и/или соединения, имеющие 18 углеродных атомов и три двойных связи с одной или более из трех двойных связей в другом положении в алкиловой цепи по сравнению с пиноленовой кислотой, включая, например, гамма-линоленовую кислоту, альфа-линоленовую кислоту, пунициновую кислоту, элеостеариновую кислоту и их соли и алкиловые эфиры. Пригодные для данной цели соли включают соли с катионами пищевого качества, такие как соли натрия. Пригодные для данной цели сложные эфиры включают алкиловые эфиры, имеющие от одного до шести атомов углерода. Предпочтительными сложными эфирами являются моно-, ди- и триглицериды.
Предпочтительно композиции изобретения не содержат (или в основном не содержат, т.е. содержат менее 0,1 мг) уридиновых эфиров и/или нуклеозидов, и/или нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из уридина, дезоксиуридина, уридинмонофосфата, дезоксиуридинмонофосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей.
Пригодным источником пиноленовой кислоты, используемой в настоящем изобретении, является масло из семян сосны или его концентраты. Например, глицериды пиноленовой кислоты могут быть получены из масла из семян сосны или его концентратов. Предпочтительно используется масло или концентрат с содержанием пиноленовой кислоты или ее производных более 15% масс. или более 28% масс. соответственно.
Композиции изобретения могут содержать одну или более других жирных кислот (т.е. карбоновых кислот с прямой цепью, имеющих от 12 до 24 атомов углерода). Примеры других жирных кислот, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают линолевую кислоту, олеиновую кислоту, таксолеиновую, юниперовую, скиадоновую, насыщенные жирные кислоты, конъюгированную линолевую кислоту (не обязательно в виде смеси, обогащенной изомерами), ЕРА (эйкозапентаеновая кислота) и DHA (докозагексаеновая кислота) (не обязательно в виде смеси, обогащенной изомерами ЕРА или DHA). Обогащение включает изменение смеси из обычно присутствующих изомеров (например, в натуральном продукте), такое как изменение относительных количеств различных геометрических изомеров. В этих композициях другая жирная кислота или каждая из других жирных кислот может присутствовать самостоятельно в форме свободной жирной кислоты или ее производных (включая моно-, ди- или триглицериды и соли) либо в виде их смеси.
Пиноленовая кислота или ее производные не обязательно смешиваются с этими дополнительными жирными кислотами или глицеридами перед использованием для приготовления композиции согласно настоящему изобретению. Если композиции изобретения содержат одну или более жирных кислот и/или глицеридов в дополнение к пиноленовой кислоте или ее производным, то дополнительные жирная кислота(ы) и/или глицериды предпочтительно выбираются из жидких масел, таких как соевое масло, подсолнечное масло, масло из семян рапса и масло из семян хлопчатника; какао-масло и эквиваленты какао-масла; пальмовое масло и его фракции; жиры, полученные ферментативным путем; рыбий жир и его фракции; конъюгированная линолевая кислота (CLA) и смеси, обогащенные ее изомерами; гамма-линоленовая кислота и смеси, обогащенные ее изомерами; отвержденные жидкие масла, а также смеси вышеперечисленных масел.
Смеси, содержащие одну или более дополнительные жирную кислоту или глицериды, предпочтительно имеют содержание твердого жира, измеряемое с помощью ЯМР-импульса в нестабилизированных жирах:
N20=1-80, предпочтительно 5-45; N35 - менее 20, предпочтительно менее 10, наиболее предпочтительно менее 5.
Эти значения были получены путем плавления жира при 80°С, охлаждения до 0°С и выдержки жира при 0°С в течение 30 минут, после чего жир нагревался до температуры измерения N и выдерживался при этой температуре в течение 30 минут перед измерением значения N.
Смеси жирных кислот, которые используются в производстве композиций изобретения, предпочтительно содержат от 1,5 до 60% масс., более предпочтительно от 28 до 60% масс. пиноленовой кислоты, от 10 до 60% масс.линолевой кислоты и от 5 до 52% масс. олеиновой кислоты, например, от 25 до 85% масс. (линолевая плюс олеиновая кислоты), от 0 до 70% масс., например, от 25 до 65% масс. (транс- плюс насыщенная жирные кислоты). Содержание транс-жирных кислот предпочтительно составляет менее 10% масс. Примером пригодной смеси является смесь, в которой содержание транс- плюс насыщенной жирных кислот составляет менее 10% масс.
Альтернативно композиции изобретения могут не содержать или в основном не содержать свободные жирные кислоты, другие, чем пиноленовая кислота (т.е. могут содержать менее 1% масс., более предпочтительно менее 0,1% масс., например, менее 0,01% масс. других С12 - С24 жирных кислот).
Композиции изобретения могут содержать источники кальция и/или магния. Дополнительно или альтернативно композиции могут содержать белок (включая белковые гидролизаты). Комбинация пиноленовой кислоты с кальцием и/или магнием и/или белком в композициях настоящего изобретения может увеличивать высвобождение ССК из клеток кишечника.
В другом варианте композиции изобретения могут не содержать или в основном не содержать ионы кальция и/или белок (т.е. каждый из этих компонентов присутствует в композициях в количестве менее 1% масс., более предпочтительно менее 0,1% масс., например, менее 0,01% масс.).
Обычно композиции изобретения содержат пиноленовую кислоту и/или ее производные в качестве единственного активного компонента.
Композиции настоящего изобретения могут использоваться как вспомогательное средство для контролирования массы тела, например для поддержания массы тела в основном на постоянном уровне или для снижения массы тела. Другими словами, применение композиций может способствовать похудению, например, за счет индуцирования потерь жира.
Применение композиций изобретения может помочь снизить потребление калорий. Это может помочь поддерживать массу тела на постоянном в основном уровне и/или может помочь снизить массу тела и/или помочь похудению. Снижение массы тела может увеличить уровень энергии.
Применение композиций изобретения может уменьшить чувство голода и/или усилить чувство сытости и/или снизить тягу к высококалорийным пищевым продуктам, например, за счет того, что в желудке останется меньше места для высококалорийной пищи. В частности, применение композиций изобретения может усилить и/или продлить во времени чувство сытости или наполненности желудка до, во время и/или после приема пищи.
Применение композиций изобретения может уменьшать чувство голода при соблюдении диеты и ускорять тем самым успешный результат соблюдения диеты.
Употребление композиции изобретения может стимулировать высвобождение СКК и/или IgA.
Применение композиций изобретения может помочь уменьшить аппетит, например, за счет усиления насыщения и чувства сытости и/или наполненности желудка.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ лечения или предупреждения ожирения. В этом способе эффективное количество композиции, описанной выше, потребляется млекопитающим, например человеком. Настоящее изобретение обеспечивает также способ контролирования веса. В данном способе эффективное количество композиции, описанной выше, потребляется млекопитающим, например человеком. Указанный прием композиции не обязательно должен проводиться под наблюдением лечащего врача или под медицинским контролем и может просто включать потребление млекопитающим композиции, например, в виде пищевого продукта или пищевой добавки. Предпочтительно композиции изобретения принимаются (или потребляются) за время от 2 часов до 3 минут, более предпочтительно - от 1 часа до 15 минут, наиболее предпочтительно - от 35 до 25 минут до приема пищи.
Изобретение применимо к млекопитающим, предпочтительно к человеку. Другие млекопитающие, которым композиции изобретения могут быть полезны, включают домашних животных (например, собаки, кошки, лошади, кролики, хомяки и морские свинки) и сельскохозяйственных животных (например, крупный рогатый скот, овцы и свиньи). Особенно предпочтительными являются собаки и кошки.
Для производства пищевого продукта пиноленовая кислота или ее производные сначала смешивается со структурирующими компонентами, разрешенными к использованию в пищевых продуктах. Однако это не так уж важно. Эти смеси могут, например, с успехом использоваться в пищевых продуктах как оздоровляющие жировые композиции.
Масло из семян сосны может использоваться в композициях изобретения. Однако поскольку масло из семян сосны может содержать примерно до 26% масс. пиноленовой кислоты, более предпочтительным (в частности, при использовании в пищевых добавках и для обеспечения дозировочных форм более мелкого размера) является получение концентратов с повышенным уровнем пиноленовой кислоты. Концентраты пиноленовой кислоты или ее производных, которые могут использоваться в настоящем изобретении, могут приготовляться любым, пригодным для данной цели способом. Такой способ описан в ЕР-А-1088552.
В одном из пригодных для этой цели способов проводится ферментативный гидролиз или глицеролиз с использованием фермента, который способен различать между жирными кислотами с дельта 5 двойной связью и другими жирными кислотами. Данный способ предусматривает:
5
i) реакцию глицеридного материала, содержащего, по меньшей мере, 2% масс. жирной кислоты с цис двойной связью, с водой или глицерином в присутствии фермента, способного различать между жирными кислотами, содержащими дельта 5 двойную связь, и другими жирными кислотами;
ii) разложение реакционной смеси на компонент, обогащенный частично замещенными глицеридами, и компонент, обогащенный жирными кислотами;
iii) (необязательное) превращение частично замещенных глицеридов со стадии (ii) в свободные жирные кислоты в присутствии пригодного для данной цели фермента;
iv) (необязательное) превращение обогащенного жирными кислотами компонента со стадии (ii) в триглицериды путем реакции с глицерином в присутствии подходящего катализатора, например подходящего фермента;
v) (необязательное) разложение материала, обогащенного частично замещенными глицеридами, со стадии (ii) на компоненты, которые (а) обогащены моноглицеридами, (b) обогащены диглицеридами и (с) обогащены триглицеридами, а затем (необязательное) превращение частично замещенных глицеридов (а) и (b) в триглицериды путем реакции с жирными кислотами в присутствии подходящего фермента.
На стадии (i) предпочтительно используется глицеридный материал с содержанием пиноленовой кислоты от 5 до 50% масс., более предпочтительно - от 10 до 35% масс. Примерами таких материалов являются пиноленовые масла и их концентраты. Указанный способ позволяет получить концентрат, который содержит, по меньшей мере, 28% масс. пиноленовой кислоты.
Ферментами, пригодными для использования на стадиях (i), (iii), (iv) и (v), являются липазы. Пригодные для данной цели липазы включают липазу от Candida rugosa; липазы Lipase QL, Lipase SL, Lipase OF; липазу от Rhizopus delemar, липазу от Rhizopus oryzae; липазу от Geotrichum candidum В и липазу от Rhizomucor miehei. Предпочтительными ферментами для стадии (i) являются липаза от Candida rugosa и липаза от Geotrichum candidum В.
Пригодные для данной цели липазы включают также Lipozyme IM (промышленный фермент). Предпочтительным ферментом для использования на стадии (iv) является Lipozyme M (от Rhizomucor miehei).
Композиции изобретения могут представлять собой пищевые продукты. Пищевые продукты, в которых могут использоваться пинолевая кислота или ее производные либо смеси, содержащие эти соединения, включают, но их перечень не ограничивается только названными здесь продуктами, маргарины; низкожирные спреды; очень низкожирные спреды; спреды с двойной непрерывной фазой; спреды с непрерывной водной фазой; кондитерские изделия, такие как шоколад, покрытия или начинки; мороженое; покрытия из мороженого; включения из мороженого; подливы; майонезы; соусы; хлебопекарные жиры; шортенинги; сыр; продукты-заменители еды; оздоровляющие батончики; батончики с мюсли; напитки; молочные продукты; продукты с низким содержанием углеводов; низкокалорийные продукты; супы; крупяные продукты и молочные коктейли.
Добавление пиноленовой кислоты или ее производных либо смесей, содержащих, по меньшей мере, одно из этих соединений, в пищевые продукты может оказывать положительное влияние на текстуру, твердость, внешний вид, реологию, таяние во рту, аромат, способность к намазыванию, микроструктуру (размер кристаллов, размер капель), аэрационную способность или облегчать обработку этих пищевых продуктов. Особенно предпочтительным в этом отношении является применение глицерида пиноленовой кислоты.
Другими примерами композиций являются фармацевтические композиции, например, в виде таблеток, пилюль, капсул, капель, множества частиц, включая гранулы, шарики, пеллеты и микроинкапсулированные частицы; порошков, эликсиров, сиропов, суспензий и растворов. Фармацевтические композиции включают фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Фармацевтические композиции предпочтительно предназначаются для парентерального приема (например, через рот). Композиции для приема через рот могут быть в твердой или жидкой форме и могут иметь форму таблеток, порошков, суспензий и сиропов. Композиции могут содержать, но не обязательно, один или более ароматизаторов и/или красителей. Фармацевтически приемлемые носители, пригодные для использования в таких композициях, хорошо известны из уровня техники в фармации. Композиции изобретения могут содержать от 0,1 до 99% масс. пиноленовой кислоты. Композиции изобретения в большинстве случаев приготовляются в единичной дозированной форме. Предпочтительно единичная дозировка пиноленовой кислоты составляет от 1 мг до 1000 мг (более предпочтительно - от 100 мг до 750 мг). Лекарственные среды, используемые для приготовления этих композиций, известны из уровня техники.
Другим примером формы композиции являются пищевые добавки (этот термин включает питательные продукты), например, в виде мягкого геля или твердой капсулы, содержащей инкапсулирующий материал, выбираемый из группы, состоящей из желатина, глицерина, крахмала, модифицированного крахмала, производных крахмала, таких как глюкоза, сахароза, лактоза и фруктоза. Инкапсулирующий материал может не обязательно содержать агенты сшивки или полимеризующиеся агенты, стабилизаторы, антиоксиданты, светопоглощающие агенты для защиты чувствительного к свету содержимого капсул, консерванты и т.п. Предпочтительно единичная дозировка пиноленовой кислоты в пищевых добавках составляет от 1 мг до 1000 мг (более предпочтительно - от 100 мг до 750 мг). Количество масла из семян сосны, которое используется в единичной дозировке, предпочтительно составляет от 100 мг до 2000 мг, например от 250 мг до 1500 мг (например, 750 мг), например, при кратности приема 4 раза в день.
Композиции изобретения могут содержать другие добавки, которые хорошо известны из уровня техники производства пищевых и фармацевтических продуктов, включая, но их перечень не ограничивается только перечисленным здесь, ароматизаторы, красители, подсластители и эмульгаторы.
Приведенные ниже примеры, не лимитирующие сущности изобретения, служат его иллюстрацией и ни в коей мере не ограничивают его масштаб. В примерах, равно как и в описании, количество в процентах, частях и соотношения даются по массе, если нет ссылки на другую размерность.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Проводили исследование in vitro для измерения влияния различных свободных жирных кислот на высвобождение ССК из клеток кишечника. Исследование показало влияние свободных жирных кислот масла из семян сосны и, следовательно, пиноленовой кислоты как ингредиента сытости (см. данные ниже).
Клеточная культура
2
6
2
Линию клеток STC1-1 культивировали при 37°С в среде RPMI 1640 с добавлением 5% FSC, 2 мМ глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 50 мкМ стрептомицина в атмосфере 5% CO и 95% воздуха. По достижении 70-80% конфлюентности клетки пассировали обычным способом путем промывки клеточного слоя PBS и инкубации в растворе трипсина-EDTA. Для обычного пересева использовали плотность посева 2×10 клеток/75 см.
Методика эксперимента
За 24 часа до начала эксперимента клетки STC1 выращивали в 6-луночных культуральных планшетах до 40-50% конфлюентности. В день эксперимента клетки промывали 1 мл бикарбонатного буфера Кребса-Рингера (рН 7,4), содержащего 0,2% (масс./об) BSA (KRBB). Предварительно клетки STC1 преинкубировали в течение 15 минут с 2 мл KRBB, а затем инкубировали с 2 мл KRBB с или без добавления исследуемых агентов в течение 1 часа. По окончании инкубации супернатант собирали, центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин и сразу же замораживали при - 20°С для RIA-анализа. Содержание ДНК измеряли флюорометрией после экстракции клеточной культуры.
RIA анализ
Иммунореактивность ССК измеряли с использованием антисыворотки 39А (1/300000), которая в ходе перекрестной реакции на 100% реагировала с ССК-33 и ССК-8, на 12% с сульфатированным гастритом-17, на 5% с несульфатированным гастрином-17 и менее чем на 0,1% с несульфатированными ССК-8 и гастрином-34. ССК-8 использовался как стандарт. Bolton-Hunter (Thr, Nle)-CCK-9 метили радиоактивным йодом 125 методом с хлорамином-Т и очищали HPLC с обращенной фазой. В качестве реакционного буфера использовали 0,05 М фосфат натрия с рН 7,5. Аликвотные супернатанты объемом от 1 мкл до 200 мкл тестировали дважды (день 0). Метку вводили в день 1, а осаждение древесным углем проводили спустя 48 часов.
На фиг.1 представлена гистограмма, показывающая уровень ССК, обеспечиваемый свободными жирными кислотами (FFA) из семян сосны и другими FFA.
Фиг.1 показывает, что масло из семян сосны приводило к продукции значительно более высокого уровня ССК, чем другие исследуемые материалы. Уровень ССК для каждого образца определяли при трех различных концентрациях, а именно: 100 мкМ, 500 мкМ и 1 мМ из расчета на молекулярную массу свободной жирной кислоты (FFA) 300 г/моль. Marinol - это концентрат рыбьего жира от фирмы Loders Croklaan BV (Wormerveer, Нидерланды), содержащий ЕРА (эйкозапентаеновую кислоту) и DHA (докозагексаеновую кислоту). Clarinol - это продукт от фирмы Loders Croklaan BV (Wormerveer, Нидерланды), содержащий 80% конъюгированной линолевой кислоты (CLA). Образцы других FFA отбирались из ряда натуральных продуктов.
Пример 2
В настоящем примере использовали наполненную желатиновую капсулу согласно изобретению. Композиция, содержащая пиноленовую кислоту, инкапсулировалась в желатиновую капсулу методами, известными из уровня техники. Готовый инкапсулированный продукт содержал 500 мг пиноленовой кислоты; одна капсула рассчитана на четыре приема в день взрослым человеком.
Пример 3
К примеру 3 относятся описанные ниже фигуры:
Фиг.2 показывает уровень ССК в крови (пмолей/л) после приема 3 г пиноленовой кислоты в виде свободной жирной кислоты (FFA) (верхний график, пунктирная линия) или плацебо (нижний график, сплошная линия).
Фиг.3 показывает уровень GLP1 в крови (пмолей/л) после приема 3 г пиноленовой кислоты в виде FFA (верхний график, пунктирная линия) или плацебо (нижний график, сплошная линия).
Фиг.4 показывает желание принять пищу в течение 4 часов после приема 3 г пиноленовой кислоты в виде FFA (нижний график, пунктирная линия) или плацебо (верхний график, сплошная линия).
Фиг.5 показывает ожидаемый прием пищи в течение 4 часов после приема 3 г пиноленовой кислоты в виде FFA (нижний график, пунктирная линия) или плацебо (верхний график, сплошная линия).
Фиг.6 показывает уровень ССК в крови (пмолей/л) после приема 3 г пиноленовой кислоты примера 3 (ii) в виде триглицеридов (TG) (верхний график, пунктирная линия) или плацебо (нижний график, сплошная линия).
Фиг.7 показывает желание принять пищу в течение 4 часов после приема 3 г пиноленовой кислоты в виде TG (нижний график, пунктирная линия) или плацебо (верхний график, сплошная линия).
Фиг.8 показывает ожидаемый прием пищи в течение 4 часов после приема 3 г пиноленовой кислоты в виде TG (нижний график, пунктирная линия) или плацебо (верхний график, сплошная линия).
Звездочка на фигурах указывает на существенную разницу.
Исследовали две композиции, содержащие пиноленовую кислоту: композицию примера 3 (i), содержащую пиноленовую кислоту в форме свободной жирной кислоты (FFA) и композицию примера 3 (ii), содержащую пиноленовую кислоту в триглицеридной форме (TG). Данные анализа метиловых эфиров жирных кислот (FAME) в двух композициях, см. таблицу 1.
Таблица 1
Тривиальное название
Химическое название
Сокращенное обозначение
Масло-сырец из семян сосны
Пример 3 (ii) TG
Пример 3(i) FFA
Пальмитиновая кислота
Гексадекановая кислота
С16:0
4,3
4,1
4,4
Пальмито-леиновая кислота
Cis-9-гексадеценовая кислота
С16:1
0,2
0,2
0,2
Маргариновая кислота
Гептадекановая кислота
С17:0
0,1
0,1
0,1
Стеариновая кислота
Октадекановая кислота
С18:0
2,1
2,1
2,1
Олеиновая кислота
Cis-9-октадеценовая кислота
С18:1
24,4
24,5
24,9
Линолевая кислота
Cis-9,12-октадекадиеновая кислота
С18:2
44,3
45,5
45,9
Таксолеиновая кислота
Cis-5,9-октадекадиеновая кислота
5,9-С18:2
2,1
2,2
2,1
Линоленовая кислота
Cis-9,12,15-октадекатриеновая кислота
9,12,15-С18:3
0,3
0,2
0,2
Пиноленовая кислота
Cis-5,9,12-октадекатриеновая кислота
5,9,12-С18:3
15,6
15,9
15,8
Перекрестное, дважды слепое испытание с элементами случайной выборки и с плацебо в качестве контроля проводили на 18 женщинах с избыточным весом (BMI=25-30), получавших 3 г композиции примера 3 (i) FFA, 3 г композиции примера 3 (ii) TG или 3 г капсул с плацебо (оливковое масло) в комбинации с легким низкожирным завтраком, состоящим из двух ломтиков белого хлеба и мармелада. Через 0, 30, 60, 90, 120, 180 и 240 минут брали образцы крови для анализов на содержание ССК, GLP-1, глюкозы, инсулина, свободных жирных кислот и триглицеридов. Субъективное чувство сытости оценивали с помощью визуально-аналоговой шкалы (VAS) для определения желания поесть и ожидаемого потребления пищи. Каждый субъект получал в произвольном порядке три средства за период две недели с недельным перерывом по принципу латинского квадрата.
VAS-шкала состояла из 150-мм горизонтальных линий с фразами на каждом конце, которые выражали наиболее положительное или наиболее отрицательное ощущение. Субъекты проводили вертикальную линию до точки на горизонтальной линии, которая соответствовала их ощущению голода. Расстояния по VAS-шкале пересчитывали в баллы от 0 до 100.
Концентрации ССК и GLP-1 в образцах крови измеряли с использованием оптимизированных и надежных промышленных готовых наборов реактивов для RIA анализа крови человека. Результаты оценивали статистически методом ANOVA при коэффициенте значимости Р<0,05.
Случаи вредного влияния (АЕ) контролировали.
Прием 3 г композиции примера 3 (i) FFA индуцировал спустя 30 минут пик высвобождения ССК, который был значительно выше, чем высвобождение ССК в случае плацебо (фиг.2). Пик высвобождения GLP-1 наблюдался спустя 60 минут после приема композиции примера 3 (i) FFA, и он также был значительно выше, чем уровень GLP-1 в ответ на прием плацебо (фиг.3). За период 4 часа общее количество высвободившегося в кровоток ССК в ответ на прием композиции примера 3 (i) FFA было на 60% выше, а уровень GLP-1 был на 25% выше, чем в случае плацебо, что определили путем измерения площадей под кривой. Композиция примера 3 (i) FFA также снижала балльные оценки за "желание поесть" и "ожидаемый прием пищи" в течение 4 часов после приема (фиг.4 и 5). Эти балльные оценки были самыми низкими спустя 30 минут после приема композиции примера 3 (i) FFA, и разница по сравнению с плацебо были существенной. Композиция примера 3 (ii) TG оказывала влияние на ощущение аппетита и высвобождение ССК, которое было аналогичным его высвобождению после приема композиции примера 3 (i) FFA (фиг.6-8).
В целом данные по ССК и GLP-1 показали четко выраженное и существенное влияние приема средств. Композиции с пиноленовой кислотой в форме FFA и TG повышали уровни вызывающих насыщение гормонов - ССК и GLP-1 - в крови за период 30-60 минут, и эти уровни оставались повышенными в течение до четырех часов после приема. Кроме того, желание поесть и ожидаемое потребление пищи спустя 30 минут были менее выраженными после приема композиций примера 3 (i) FFA и примера 3 (ii) TG, чем после приема плацебо.
Случаев вредного или серьезного вредного действия не было отмечено. Кроме того, измеряли уровни глюкозы, инсулина, свободных жирных кислот и уровни триглицеридов в крови спустя от 0 до 4 часов после приема капсул, и измеренные данные показали, что уровни триглицеридов и свободных жирных кислот в любой момент времени существенно не различались между группами. Уровни глюкозы и инсулина повышались в обеих группах как следствие приема всеми участницами легкого сахарсодержащего завтрака. Во всех группах уровни глюкозы и инсулина в течение 4 часов были одинаковыми, что указывает на хорошую переносимость композиций примера 3 (i) FFA и примера 3 (ii) TG.
Однако уровень глюкозы после приема композиции примера 3 (i) FFA повышался не столь значительно, как после приема композиции примера 3 (ii) TG и плацебо, и более постепенно снижался после приема композиции примера 3 (i) FFA и композиции примера 3 (ii) TG, чем после приема плацебо (оливковое масло). В результате этого уровень инсулина после приема композиции примера 3 (i) FFA и композиции примера 3 (ii) TG повышался более медленно, а впоследствии быстро снижался, чем после приема плацебо. Таким образом, композиция примера 3 (i) FFA вызывала более умеренные изменения уровня глюкозы и инсулина в крови, чем плацебо с композицией примера 3 (ii) TG, которая заняла среднее положение между ними.
Пример 4
В эксперименте in vitro определяли относительное высвобождение ССК рядом различных соединений с целью измерения влияния разных жирных кислот на высвобождение ССК из клеток кишечника. Исследование показало влияние свободных жирных кислот масла из семян сосны и, следовательно, пиноленовой кислоты как агента сытости (см. данные ниже). Другие жирные кислоты, присутствующие в высоких и низких количествах в масле из семян сосны (например, олеиновая кислота, линолевая кислота, таксолеиновая кислота, скиадоновая кислота и юниперовая кислота), были не способны индуцировать высокие количества ССК. Композиция с 27% пиноленовой кислоты индуцировала несколько более высокие количества ССК, чем композиция с 16% пиноленовой кислоты.
Клеточная культура
2
6
2
Линию энтероэндокринных STC1-1 клеток культивировали в стандартной питательной среде (DMEM) при 37°С в атмосфере из 5% CO и 95% воздуха. По достижении 70-80% конфлюентности клетки пассировали путем промывки слоя клеток PBS и инкубации в растворе трипсина-EDTA. При субкультивировании плотность клетки вносили в количестве 2×10 клеток/75 см.
Методика эксперимента
STC1 клетки выращивали в 6-луночных культуральных планшетах в контрольной питательной среде с или без добавления исследуемых агентов в течение 1 часа. Все агенты тестировали при концентрации 100 мкМ в форме свободных жирных кислот. Поскольку жирные кислоты разводили этанолом, то также учитывали влияние этанола и определяли базовый уровень ССК. Каприновую кислоту использовали в качестве отрицательной контрольной жирной кислоты, поскольку известно, что каприновая кислота не индуцирует ССК. Бомбезин использовали в качестве положительного контроля. По окончании инкубации супернатант собирали, центрифугировали и сразу же замораживали при -20°С для RIA-анализа.
Жизнеспособность клеток контролировали микроскопическим анализом, содержание ДНК измеряли флюорометрией после экстракции содержимого клеточной культуры и в дополнение к этому измеряли высвобождение LDH.
RIA-анализ
Высвобождение ССК измеряли с применением стандартного RIA-анализа ССК, влияние жирных кислот измеряли 6-кратно.
Приведенная ниже таблица 2 показывает, что образцы с 16% и 27% пиноленовой кислоты соответственно продуцировали более высокий (примерно в 4 и 5 раз выше) уровень ССК, чем использовавшаяся в качестве отрицательного контроля жирная кислота - каприновая кислота. Масло из семян Pinus pinea (сосна итальянская, пиния), содержащее менее 1% пиноленовой кислоты, было менее способно индуцировать высвобождение ССК (только примерно в 2 раза по отношению к каприновой кислоте). Другие жирные кислоты, присутствующие в масле из семян сосны, такие как олеиновая кислота, линолевая кислота, таксолеиновая кислота, юниперовая и скиадоновая кислоты, также не были способны индуцировать высокие количества ССК (примерно в 2 раза больше по отношению к каприновой кислоте). В отличие от других 18:3 жирных кислот такие жирные кислоты, как пунициновая кислота, гамма-линоленовая, альфа-линолевая и альфа-элеостеариновая кислоты, показали хорошую способность к индуцированию ССК, аналогичную пиноленовой кислоте, однако следует заметить, что эти жирные кислоты измерялись в чистом виде, тогда как исследуемая пиноленовая кислота тестировалась при чистоте только 16% и 27%. Чистая на 95% CLA (смесь 50:50 изомеров с9, t11 и t10, c12) была не способна индуцировать такие же высокие количества ССК, какие индуцировала CLA с пиноленовой кислотой. Промышленный продукт, состоящий из смеси фракционированного пальмового масла и овсяного масла, также был недостаточно активным в индуцировании ССК (лишь в 2 раза больше по сравнению с каприновой кислотой).
Таблица 2
Соединение
Относительное количество высвобожденного ССК
16% пиноленовая кислота
188
27% пиноленовая кислота
210
Масло из Pinus pinea (0,35% пиноленовой кислоты)
101
Олеиновая кислота 18:1
90
Линолевая кислота 18:2
68
Гамма-линолевая кислота 18:3
140
Альфа-линолевая кислота 18:3
177
Альфа-элеостеариновая кислота 18:3
212
Пунициновая кислота 18:3
320
Пальмовое масло/овсяное масло (промышленный продукт)
91
Смесь CLA + 16% пиноленовой кислоты
112
Каприновая кислота
43
Этанол
53
Пример 5
Композиции примеров 3 (i) и 3 (ii), содержащие пиноленовую кислоту в форме TG и FFA соответственно, получали из масла-сырца из семян сосны в качестве сырья.
Семена сосны измельчались поставщиками в экспеллере (шнековый пресс) с применением высокого давления при комнатной температуре. В экспеллере использовалась только теплота, генерируемая в процессе измельчения семян, и она никогда не превышала 50°С. Затем экстрагированное масло фильтровали через марлю. Полученный продукт и является масло-сырцом из семян сосны.
Масло-сырец подвергали обработке для получения композиций TG и FFA. Обработка состояла из следующих основных стадий: рафинирование, гидролиз и дистилляция.
Стадия рафинирования представляет собой физическое рафинирование, состоящее из стадии отбеливания с использованием отбеливающей земли с целью удаления остатков загрязняющих веществ с последующей стадией дезодорации (отгонка паром легких фракций). Рафинированное масло из семян сосны и есть композиция TG.
Рафинированное масло из семян сосны можно подвергнуть далее гидролизу с применением липазы пищевого качества для получения свободных жирных кислот, глицерина и остатков не полностью гидролизованного масла (ди- и триглицериды). В заключение гидролизованная смесь дистиллируется для получения композиции FFA.
Пример 6
Капсулы из мягкого геля получают обработкой в ротационных матрицах. Материал для внешней оболочки капсул, т.е. гель, и начинку капсул готовят отдельно. Как только масса геля и масса начинки готовы, гель распыляется в виде тонкой пленки с образованием двух желатиновых лент, которые затем пропускаются через две отдельные матрицы, определяющие размер и форму капсул. Как только желатиновые пленки будут подогнаны под матрицы, начинается осторожное дозирование начинки капсул на уровне 500 мг, 750 мг или 1000 мг масла из расчета на одну капсулу и впрыскивание ее между двумя желатиновыми лентами, которые сразу после этого герметично запечатываются с применением теплоты и давления. Готовые капсулы выпадают из машины, а затем подсушиваются в потоке нагретого воздуха.