ФАКТОРЫ ТРАНСКРИПЦИИ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ МАРКЕРЫ КАНЦЕРОГЕННЫХ ЭФФЕКТОВ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ. ОБЗОР

DOI: 10.21870/0131-3878-2022-31-4-132-147 УДК 616-006.04-02:614.876

Факторы транскрипции как потенциальные маркеры канцерогенных эффектов хронического облучения. Обзор

Кодинцева Е.А.

ФГБУН Уральский научно-практический центр радиационной медицины ФМБА России, Челябинск

При хроническом воздействии ионизирующего излучения на человека с преимущественным поражением красного костного мозга длительно регистрируются изменения, затрагивающие преимущественно Т-клеточное звено иммунитета, у пострадавших людей в отдалённые сроки регистрируется повышенная частота онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний. Механизмы возникающих в отдалённые сроки после облучения изменений иммунитета изучены недостаточно, а патофизиологические механизмы реализации этих эффектов хронического облучения человека неизвестны. В статье представлен обзор актуальной информации о некоторых факторах транскрипции, участвующих в реализации клеточных реакций на ионизирующие излучения (в частности, NF-kB, JNK, Р38 и других), и об основных факторах, обеспечивающих процессы дифференцировки Т-лимфоцитов (STAT3, GATA3, T-BOx, FOXP3, RORC и иных). Представлена локализация отдельных факторов транскрипции и кратко описаны их основные функции. Обобщена информация о современных методах исследования транскрипционных факторов, проанализированы их основные преимущества и недостатки. Сделано заключение о том, что на клеточном уровне значительная часть радиационно-индуцированных эффектов реализуется по общебиологическому «стресс-адаптационному» алгоритму, что существенно затрудняет изучение реакций клеток на воздействие ионизирующих излучений и механизмов реализации эффектов, особенно, отсроченных во времени. Комплексное исследование внутриклеточных сигнальных путей в их взаимосвязи с генетическим и рецепторным аппаратом клеток (Т-лимфоцитов, выполняющих регуляторные функции, и клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета) позволит в будущем прояснить механизмы реализации отдалённых, в первую очередь, канцерогенных, эффектов хронического облучения человека.

Ключевые слова: река Теча, хроническое радиационное воздействие, отдалённые сроки, иммунная система, Т-лимфоциты, факторы транскрипции, митоген-активируемые про-теинкиназы, сигнальные пути, дифференцировка Т-лимфоцитов, апоптоз, методы исследования факторов транскрипции.

Введение

Лимфоциты (основные эффекторные клетки иммунной системы) с одной стороны и часть гемопоэтического компартмента с другой - обладают высокой радиочувствительностью. При этом различные субпопуляции лимфоцитов различаются по своей радиочувствительности: B-клетки, наивные T-клетки и НК-клетки обладают высокой радиочувствительностью, тогда как T-клетки памяти, НКТ-клетки и Treg-клетки более устойчивы к воздействию ионизирующего излучения. Сообщается о более высокой радиочувствительности ИЛ-4-продуцирующих клеток tk2 по сравнению с клетками tk1 [1, 2].

Повреждения клеток при непосредственном воздействии ионизирующих излучений обусловлены в первую очередь индукцией двунитевых (наиболее опасных) и однонитевых разрывов ДНК, а также структурно-функциональными нарушениями макромолекул и мембран за счёт свободных радикалов [3]. В облучённых лимфоцитах активируется транскрипция ряда генов, большинство из которых являются мишенями Р53 и участвуют в восстановлении ДНК и регуляции апоптоза [4, 5].

Кодинцева Е.А. - науч. сотр., руководитель центра коллективного пользования, к.б.н. ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России. Контакты: 454141, Челябинск, ул. Воровского, 68А. Тел.: +7(351) 232-79-22; e-mail: ovcharova.cat@mail.ru.

Косвенный ответ организма на радиационное повреждение опосредован «сигналами опасности», выделяемыми повреждёнными или отмирающими клетками в облучённых тканях, которые приводят к активации лимфоцитов, инфильтрации ими повреждённой ткани и высвобождению медиаторов воспаления [3]. Основными путями, участвующими в реализации немишенных эффектов радиации (эффект «свидетеля», нестабильность генома, адаптивные реакции), являются пути передачи сигналов апоптоза, TLR-подобного и NOD-подобного рецепторов [6].

После облучения в течение длительного периода времени в иммунной системе сохраняются разнонаправленные пострадиационные изменения [7]. При хроническом воздействии ионизирующего излучения на человека с преимущественным поражением красного костного мозга длительно регистрируются изменения, затрагивающие преимущественно Т-клеточное звено иммунитета [8]. Механизмы возникающих в отдалённые сроки после облучения изменений иммунитета в настоящее время изучены недостаточно [9], а патофизиологические механизмы реализации отдалённых эффектов хронического облучения человека (таких, как канцерогенез, заболевания сердечно-сосудистой системы) неизвестны [7].

Учитывая вышеизложенное, молекулярно-клеточные исследования структурно-функциональных особенностей и процессов дифференцировки иммуноцитов (включая эффекторные клетки иммунной системы и структурно-функциональные элементы системы гемопоэза) у хронически облучённых людей в отдалённые сроки приобретает особую актуальность. Значительный интерес представляет изучение факторов транскрипции, опосредующих реакции клеток на ионизирующее излучение, особенно в малых дозах, и процессы дифференцировки Т-лимфоцитов у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию с низкой мощностью дозы, в отдалённые сроки после начала облучения.

Целью данной работы является обзор актуальной научной информации о некоторых факторах транскрипции, участвующих в реализации клеточных реакций на ионизирующие излучения (в частности, NF-kB, JNK, Р38 и других), и об основных факторах, обеспечивающих процессы дифференцировки Т-лимфоцитов (STAT3, GATA3, T-BOX, FOXP3, RORC и иных).

Факторы транскрипции, обеспечивающие реакции клеток на ионизирующее излучение

Процессы, активируемые в клетках при воздействии ионизирующего излучения, включают различные сигнальные пути, которые часто пересекаются между собой. Одними из наиболее значимых с точки зрения реализации радиационно-индуцированных эффектов в настоящее время являются пути МАРК, NF-kB, АКТ, MTOR, PI3K [10]. Не менее важны редокс-чувствительные внутриклеточные системы, включая АТМ, фосфатазы, которые фосфорилируют EGFR и PDGFR после облучения и стимулируют образование активных форм кислорода (АФК), PTEN (АФК-активируемый мощный медиатор выживания и пролиферации клеток), белки семейства AKT и другие киназы [11].

Активность антиоксидантных ферментов варьируется в зависимости от дозы, мощности дозы и линейной передачи энергии (ЛПЭ). Излучение с низкой ЛПЭ (у-лучи 137Cs) при малых дозах с низкой мощностью дозы усиливает антиоксидантную защиту: повышается уровень глутати-она и активируется регуляция экспрессии у-глутамил-цистеин-синтетазы. Высокодозовое воздействие вызывает окислительный стресс в облучённых клетках и в соседних необлучённых клетках-свидетелях» [12].

Такие факторы, как АТМ, COX-2, ERK, JNK, АФК, P53, участвуют в реализации феномена радиорезистентности клеток при облучении в дозах, ниже порогового значения. Сигнальный каскад COX-2 (простагландин эндопероксидсинтеза-2), ERK, MAPK, митохондриально-зависимая NF-кВ-индуцируемая синтаза оксида азота (iNOS)/NO и NF-KB/COX-2/простагландин E2 сигнальные пути, путь PI3K-AKT, путь IGF-R^AKT-ИЛ-ЗЗ, путь NADPH-оксидаза/NF-кВ, ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа, АФК могут быть вовлечены в радиационно-индуцированный, в том числе малыми дозами, эффект «свидетеля». Внутриклеточные пути передачи сигнала, опосредованные ATM, ERK, MAPK, JNK и P53, могут быть вовлечены в индуцированный малыми дозами радиации гор-мезис. Пути передачи сигнала, в которых задействованы ATM, ERK, MAPK, P53, активные формы кислорода, ФНОа, участвуют в реализации феномена нестабильности генома, индуцированного малыми дозами ионизирующего излучения [13].

Ядерный фактор NF-kB

Сигнальный путь NF-kB описан в литературе достаточно подробно. В норме NF-kB является одним из ключевых звеньев в реализации иммунных реакций на субклеточном уровне. Функции NF-kB опосредуются через активацию генов, кодирующих регуляторы апоптоза и клеточной пролиферации. NF-kB регулирует многие гены цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНОа, ГМ-КСФ), хемокинов (ИЛ-8, MIP1, RANTES и эотоксина), белков острой фазы, молекул адгезии, индуцибельных эффекторов ферментов (например, iNOS, COX-2). Активация NF-kB обеспечивает радиорезистентность клетки за счёт активации большого количества генов, кодирующих ме-таллопротеины и другие белки, вовлечённые в стресс-ответ, воспаление и апоптоз [14].

Ядерный фактор NF-kB участвует в реализации радиоадаптивных реакций клетки, способствующих её выживанию, в частности, активация NF-kB угнетает JNK-опосредованный апоптоз. Повышенная экспрессия NF-kB в некоторых опухолях связана с устойчивостью опухоли к радиации и химиотерапии, блокирование фактора повышает апоптоз, уменьшает выживаемость отдельных клеточных линий рака человека. При этом ионизирующее излучение может цитокин-опосредованно активировать не только NF-kB, но и JNK [14].

Митоген-активируемые протеинкиназы

JNK и P38 - белки из семейства сериновых/треониновых киназ (митоген-активируемые протеинкиназы) являются одними из наиболее значимых с точки зрения ответа клетки на радиацию и стресс. Они обеспечивают трансдукцию внеклеточных сигналов внутрь клетки, отвечают на воспалительные цитокины и повышают активацию провоспалительных цитокинов. Р38 играет главную роль в воспалительном ответе [15]. Фактор транскрипции P38 может активироваться в цитоплазме или ядре, он регулирует протеинкиназы PRAK, MSK1, MSK 2 и транскрипционные факторы P53, ATF-2 и AP-1, контролируя пролиферацию, апоптоз и метастазирование клеток [16]. JNK2 необходим для эффективной активации периферических Т-клеток, участвует в регуляции апоптоза тимоцитов в процессе созревания [17].

Митоген-активируемые протеинкиназы, включая c-Jun N-концевые киназы (JNK1, JNK2, JNK3), регулируемые внеклеточными сигналами (ERK1, ERK2), ERK5 и P38-митоген-активируе-мые протеинкиназы (p38MAPK), реагируют через транскрипционную активацию Р53 в ответ на повреждение мембран, окислительный стресс, в том числе, обусловленные воздействием ионизирующего излучения, осмотический или тепловой шок [18].

Установлено, что АФК путём окисления сигнальных молекул приводят к устойчивой активации JNK, p38MAPK и апоптозу [11]. В то же время регуляция белков апоптоза по пути ERK1/ERK2-MAPK является основным механизмом, обеспечивающим устойчивость клеток к апоптозу [16]. Сигнальный путь РКС-р38МАРК-Р53 задействован в реализации адаптивного ответа клеток при облучении в малых дозах [13] и участвует в его обратной регуляции при облучении в высоких дозах [14]. Нарушение равновесия между регуляцией JNK/RAC, выраженное избыточной активностью ERK, способствует радиорезистентности [13]. Радиационная активация ERK ответственна за ранний эффект «свидетеля», в то время как активация MAPK1, MAPK8, MAPK14 отвечает за поздний эффект «свидетеля». Активация JNK может привести к деактивации BCL2, а увеличенное соотношение BAX/BCL2 в «клетках-свидетелях» указывает на повышенное сродство к апоптозу генов BCL2, MAPK8 [6].

Множество фактов подтверждает роль P53 в реализации радиоадаптивных реакций. В человеческих фибробластах радиоадаптивный ответ полностью зависел от функции P53. Облучение клеток человека космическим излучением также вызывает P53-зависимые адаптивные реакции. При воздействии у-излучения на цельную кровь человека было показано, что CDK2, циклин E и P53 участвуют в радиоадаптивном ответе. Радиоадаптивный ответ в селезёнке мыши связан с подавлением P53-опосредованного апоптоза [13].

Один из путей активации апоптоза опосредован через подсемейство рецепторов ФНО (TNFR), имеющих цитоплазматические «домены смерти» (DD). Они рекрутируют адаптерные белки (например, FADD) и запускают каскад каспазы 8, реализуя клеточную гибель. Этот процесс ингибируется FLICE-ингибирующим белком, который связывается с FADD и каспазой 8. Подсемейство TNFR, не имеющих цитоплазматические DD, функционирует в качестве регуляторов путей DD. Эти рецепторы могут связывать комплексы регуляторных белков с TNFR-ассоциирован-ным фактором (TRAF) и передавать сигналы MAPKp38, ERK и PI3K, а также NF-кВ и JNK [11].

Факторы транскрипции, участвующие в дифференцировке Т-лимфоцитов

Ниже представлены данные литературы о факторах транскрипции, которые играют важную роль в процессах дифференцировки основных регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов, а также сведения о внутриклеточных сигнальных путях, реализуемых на основе этих факторов в ответ на воздействие ионизирующих излучений.

Транскрипционный фактор STAT3. STAT - семейство из шести ядерных транскрипционных факторов, которые в результате цитокиновой стимуляции фосфорилируются одной из четырёх рецептор-связанных янус-киназ (тирозинкиназы JAK) [19]. JAK и STAT являются внутриклеточными сигнальными медиаторами, участвующими в передаче сигналов от цитокиновых рецепторов первого и второго типа внутрь клетки [11].

STAT-сигнальная система играет центральную роль в процессе канцерогенеза [20]. Конститутивная активация передачи сигналов STAT3, опосредованная аберрациями в JAK, подтверждена при различных гемопоэтических злокачественных новообразованиях [21]. STAT3 косвенно способствует экспрессии проонкогенов, она за счёт индукции экспрессии ДНК-метилтрансфера-зы 1 эпигенетически подавляет гены опухолевых супрессоров [19].

JAK-STAT путь передачи сигнала запускается многими цитокин-рецепторными взаимодействиями. Негативными регуляторами этого сигнального пути являются факторы транскрипции семейства SOCS, с экспрессией которых связана поляризация Тх1/Тх2 [22].

Установлено, что экспрессия pSTAT3 в CD4+ Т-клетках селезёнки мыши увеличивалась через 3 ч после облучения в дозе 10 Гр in vitro и оставалась повышенной по сравнению с необ-лучёнными CD4+ Т-клетками через 24 ч (в 1,7 и 1,8 раза соответственно). Это было связано со статистически значимым увеличением Treg (в 1,7 раза) и TGFp1 (в 2,5 раза) [23]. Рентгеновское облучение активировало сигнальный путь STAT3, вызывая активацию астроцитов крыс в культуре и секрецию цитокинов [24].

Факторы транскрипции GATA3, T-BOX, T-BET. Дисбаланс Тх1/Тх2 является причиной радиационной иммуносупрессии [25]. При этом воздействие ионизирующего излучения в малых (0,075-0,2 Гр) и высоких (2,0-6,0 Гр) дозах вызывает различные биологические эффекты, которые могут стимулировать адаптационные функции организма или тканей, активировать функции иммунной системы, преимущественно Т-лимфоцитов, или, наоборот, угнетать их [26].

Ионизирующее излучение в малых дозах способствует дифференцировке Тх1 (за счёт ИЛ-12 через STAT4-сигнальный путь) [25, 27], подавляют экспрессию ключевого фактора транскрипции GATA3 в Тх2, сильно угнетают экспрессию TGFp в Тх3 [26].

При высоких дозах излучение индуцирует длительный Тх2 иммунный ответ (ИЛ-4 и сигнальный путь STAT6), подавляя Тх1 иммунные ответы у экспериментальных животных и людей, выживших после атомных бомбардировок [25, 27]. Сообщается, что при дозах ионизирующего излучения 2,0 Гр дифференцировка Тх2 может быть обусловлена активацией SOCS1 и SOCS3 [26].

Транскрипционные факторы T-BOX, T-BET и GATA3 стимулируют дифференцировку Тх1 и Тх2, соответственно, ИФНу/ИЛ-4 и T-BET/GATA3 играют ключевую роль в регуляции функций Тх1/Тх2 [28]. Фактор транскрипции TBX21 экспрессируется при облучении в дозе 0,1 Гр, активирует продукцию ИФНу клетками Тх1, поддерживает их дифференцировку и ингибирует Тх2 [29].

Исследование Тх1, Тх2 и Тх3 лимфоцитов в тимусе мышей показало, что высокие дозы облучения активируют экспрессию цитокинов ИЛ-12Ь, ИЛ-15, ИЛ-18, ГМ-КСФ и других, ингиби-руют продукцию цитокинов ИЛ-5, TGFp, ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-23 и некоторых других, подавляют ранние эффекты генов GFI-1 и CD124 (ИЛ-4RA) в Тх2. При облучении в малых дозах увеличивается продукция ИФНу- и ИЛ-2, снижается секреция ИЛ-1р, ИЛ-4, TGFp и экспрессия ИЛ-21. Эти результаты подтверждают, что малые дозы ионизирующего излучения вызывают иммунный ответ по Тх1 типу, тогда как облучение в высоких дозах стимулирует иммунный ответ по Тх2 типу [26].

Транскрипционный фактор FOXP3. Treg - это гетерогенная субпопуляция CD4+ T-лим-фоцитов, куда входят естественные (nTreg), TGFp-индуцированные (iTreg). Среди iTreg выделяют Тг1 и Тх3. Treg характеризуются экспрессией высокоаффинного рецептора ИЛ-2, CD25 и гена FOXP3 и ингибируют цитотоксичность и аутоиммунитет. Для iTreg клеток характерна менее стабильная экспрессия FOXP3 из-за частичного деметилирования мотивов CpG в пределах ло-куса foxp3. Деметилирование локуса foxp3 делает ген, доступным для связывания многочисленных транскрипционных факторов [30]. Установлено, что TET-зависимые сайты деметилирования в вышестоящем энхансере FOXP3 могут способствовать стабильной экспрессии FOXP3 [31].

В норме иммунный ответ по Тх3 типу опосредован TGFp, угнетает пролиферацию и дифференцировку Тх1 и Тх2, ингибирует выработку провоспалительных цитокинов. Путь COX2/PGE2 вносит вклад в регуляторные функции инфильтрирующих опухоль клеток Treg [32].

В экспериментах на мышах установлена более высокая радиорезистентность Treg относительно других лимфоцитов [1], однако данные о влиянии облучения на функциональную активность этих клеток противоречивы [33]. Сообщается об увеличении пропорции опухолевых и

селезёночных Treg после локального облучения мышей в дозах 10 Гр и 20 Гр [2] и уменьшении частоты и общего количества CD4+FOXP3+ Treg в лимфоузлах после общего облучения мышей в дозе 1,25 Гр. При этом отмечено дозозависимое снижение экспрессии FOXP3 в Treg человека и повышенная радиочувствительность (гибель) Treg человека при дозах облучения 0,94 Гр и 1,875 Гр относительно CD4+ лимфоцитов [34].

Предполагается, что FOXР3-регулируемые гены могут быть наиболее чувствительными к подавлению радиацией. Через 48 ч после воздействия в дозе 10 Гр выявлено значительное снижение экспрессии FOXP3 в nTreg и iTreg, более выраженное в iTreg клетках, которые, возможно, более радиочувствительны. Снижение экспрессии FOXP3 в облучённых iTreg in vitro не связано с их дифференцировкой в Тх1 или Тх2. При этом через 48 ч после аналогичного облучения CD4+CD25+ iTreg клеток не выявлено увеличения экспрессии T-BET, связанного с их дифференцировкой в Тх1, или GATA3, обусловливающего дифференцировку клеток в Тх2. Экспрессия T-BET была низкой до и после воздействия, экспрессия GATA3 уменьшилась после облучения [33]. С другой стороны, сообщается, что фракционированное локальное (колоректально) гамма-облучение индуцирует экспрессию Тх2-специфичного фактора транскрипции GATA3 до 6 мес. после облучения [35].

Облучение iTreg клеток приводило к повышению экспрессии LAG-3 и снижению экспрессии CD25 и CTLA-4, также снижалась способность этих клеток к подавлению пролиферации CD8+ Т-клеток [33].

Фактор транскрипции RORC. Тх17, наряду с ^eg, влияют на гомеостаз и ремоделиро-вание тканей, участвуют в регуляции воспаления в тканях и слизистых, включая радиационно-индуцированные воспалительные реакции и фиброз [3].

Тх17 экспрессируют фактор транскрипции RORC [11] и высвобождают цитокины ИЛ-17 [36], ИЛ-22, ГМ-КСФ, а также лимфотоксины [3]. Доказана чёткая связь между RORC и экспрессией ИЛ-17 [37, 38]. Сообщается, что TGFp и ИЛ-6 вместе могут индуцировать экспрессию RORC, что стимулирует развитие Тх17 и подавляет дифференцировку Тх1 и Тх2. Целевые гены RORC и механизм продукции ИЛ-17 изучаются [39]. Процесс перехода Treg в Тх17 под влиянием ИЛ-6, предположительно, контролируется HIF-1 [11].

В экспериментах на крысах с комбинированной травмой (механическое повреждение и общее облучение у-квантами в дозе 5 Гр) выявлен сдвиг Treg/Тх^ в сторону Тх17 с максимумом на третьи сутки после воздействия [40]. В экспериментах на крысах с радиационно-индуцированным заболеванием кишечника выявлена инфильтрация слизистой кишечника Т-клетками, среди которых Тх17 преобладали над Тх1 и Тх2, с последующим фиброзом [41].

Факторы транскрипции MTOR и AMPK. Метаболическим регулятором баланса Т^/Тх^ является сигнальный путь PI3K/AKT/МTOR [30]. Ключевыми для дифференцировки многих субпопуляций лимфоцитов являются факторы-антагонисты MTOR и AMPK, которые участвуют в контроле процессов аутофагии и метаболической регуляции [42].

Сигнальный путь MTOR через каскад реакций участвует в биогенезе рибосом и трансляции белка, опосредовано инициирует экспрессию генов, контролирующих гликолиз, воспаление и синтез липидов de novo. Продукты метаболического пути MTOR отрицательно регулируют ауто-фагию: фосфорилируют сигнальные белки и моделируют фактор аутофагосомального и лизосо-мального биогенеза TFEB на поверхности лизосом, предотвращая его транслокацию в ядро и активацию генетической программы аутофагии. Сигнальный путь MTOR обусловливает дифференцировку Тх0 в Тх1, Тх17 в условиях гипоксии клеток, реализует анаболизм, гликолиз, провос-палительный профиль цитокинов [42].

Фактор AMPK - это положительный регулятор аутофагии, активность которого супрессиру-ется прямым фосфорилированием отдельных сигнальных белков каскада MTOR. AMPK переключает дифференцировку Тх0 на Treg и T-клетки памяти, при нормоксии - переключает метаболизм на катаболизм, окислительное фосфорилирование, противовоспалительные цитокины [42]. АТМ является позитивным регулятором АМРК в энергетическом метаболизме [43].

MTOR и AMPK-пути (определяют клеточные питательные и энергетические уровни, угнетение процессов биосинтеза, включая функции протеасом, продукцию АФК, аутофагию до гибели клетки) и HIF-1 (вносит основной вклад в ангиогенную продукцию цитокинов, также активируется провоспали-тельными цитокинами) являются редокс-чувствительными факторами транскрипции [11]. AMPK влияет на окислительно-восстановительное состояние клеток, активируя антиоксидантные ферменты. Механизмы, с помощью которых AMPK регулирует антиоксидантные реакции, остаются в значительной степени неизвестны [44].

Методы исследования факторов транскрипции

К современным методам исследования факторов транскрипции относятся нано-потоковая высокоэффективная жидкостная хроматография - тандемная масс-спектрометрия (нВЭЖХ-МС/МС) [45, 46], классический иммуноферментный анализ (ИФА) и его модификации, в частности, мультиплексный ИФА [47], гель-электрофорез белков в денатурирующих условиях с предварительной изоэлектрофокусировкой в совокупности с вестерн-блоттингом [48, 49], проточная ци-тометрия с предварительной внутриклеточной окраской целевых белков [50].

Для более глубокого изучения белок-белковых взаимодействий и особенностей функционирования факторов транскрипции на уровне генов применяются методы на основе биосенсеров [51], методы на основе плазмонного резонанса [52], биочипов (ChIP-sequencing [53], ChIP-chip [54], SELEX [55-57]) в совокупности с биоинформационными методами.

Основными преимуществами метода нВЭЖХ-МС/МС являются минимальный объём пробы, высокая точность и чувствительность, широкий охват аналитов (сотни белков) с возможностью проведения целевого количественного определения конкретных аналитов. Обзорная нВЭЖХ-МС/МС позволяет оценивать спектр белковых компонентов сложных проб и относительное количество отдельных компонентов, целевая - определять абсолютные количества конкретных аналитов в минимальных концентрациях. К ограничениям метода следует отнести высокую стоимость оборудования, программного обеспечения, технического обслуживания, реагентов и расходных материалов, что неизбежно повышает себестоимость спектрального анализа; много-этапность подготовки проб; относительно невысокую информативность обзорных методов и дороговизну целевых анализов [45, 46].

Метод гель-электрофореза белков в денатурирующих условиях с предварительной изоэлектрофокусировкой в совокупности с вестерн-блоттингом обладает при адекватном подборе красителей относительно высокой чувствительностью. Этот метод позволяет визуализировать тысячи белков, определять молекулярную массу и относительное количество целевых белков. При этом использование метода в молекулярно-клеточных исследованиях предполагает выделение чистых субпопуляций клеток (не менее 0,5х106 клеток). Следует учитывать, что при анализе неизбежно происходит утрата части информации о белках за счёт протеолиза исходных молекул и посттрансляционных модификаций, часть биоматериала теряется при переносе с геля на мембрану. Метод полуколичественный, при значительных трудозатратах (десятки стадий,

разные типы лабораторного оборудования для двухмерного электрофореза и вестерн-блот-тинга) позволяет идентифицировать только единичные пятна-мишени (все белковые пятна идентифицировать невозможно) [48, 49].

Достоинствами метода иммуноферментного анализа (ИФА) являются высокая специфичность и чувствительность при удовлетворительной точности. Производители предлагают широкий ассортимент наборов реагентов с установленными характеристиками, что обеспечивает относительную простоту постановки. Метод ИФА позволяет оценивать абсолютное количество ана-лита в пробе. К недостаткам метода можно отнести зависимость результата от опыта оператора, при классическом варианте постановки возможна идентификация одного аналита единовременно [58]. Последнее ограничение отсутствует в мультиплексном иммуноферментном анализе, который обладает всеми достоинствами классического ИФА, но позволяет количественно анализировать до 100 аналитов в одной пробе малого объёма. Ограниченный спектр аналитов, стоимость оборудования, программного обеспечения, реагентов и расходных материалов являются ограничениями данного метода [47].

Метод проточной цитометрии с предварительной внутриклеточной окраской целевых белков позволяет выполнять точный подсчёт малых субпопуляций клеток, экспрессирующих целевые белки клеток без сортинга и разделение клеток по степени экспрессии целевого белка (по интенсивности свечения) - полуколичественная градация клеток по степени окраски флуорохро-мами. Для сортировки клеток требуется дополнительное оборудование [50].

Методы на основе биосенсеров (интерферометрия слоя биомолекул - при взаимодействии анализируемых молекул с биосенсором происходит изменение преломления светового пучка внутри биосенсора, которое регистрируется в виде кривых ассоциации/диссоциации) могут использоваться для определения количества целевых макромолекул в растворе и анализа взаимодействий лигандных молекул с молекулами-рецепторами в динамике. Эти методы позволяют измерять константы диссоциации в режиме реального времени и не требуют специфического мечения анализируемых молекул, образец остаётся интактным. К недостаткам методов относятся стоимость и сложность оборудования и реагентов, ограниченный рабочий диапазон (концентрации аналита от 25 до 2 мг/мл) [51].

Методы на основе плазмонного резонанса позволяют получать надёжные данные о кинетике, сродстве, концентрации, специфичности, селективности и термодинамических свойствах исследуемых взаимодействий в режиме реального времени без какой-либо предварительной модификации. Ограничения в их широком использовании обусловлены сложностью и высокой стоимостью оборудования и реагентов [52].

В последнее время внедряются в практику методы на основе чипов и биоинформационные методы, позволяющие выполнять целевой анализ взаимодействий белков и нуклеиновых кислот:

- метод ChIP-sequencing (иммунопреципитация хроматина c секвенированием) - секвениро-вание нуклеотидной последовательности ДНК, специфически связывающейся с белком-аналитом;

- метод ChIP-chip (иммунопреципитация хроматина на чипе) - биоинформационный анализ последовательности нуклеотидов ДНК по иммунофлуоресцентным сигналам от участков ДНК, специфически связывающих белок-аналит;

- метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), то есть систематическая эволюция путём экспоненциального обогащения) или селекция in vitro - отбор нуклеиновых молекул (аптамеров), связывающих белки-аналиты;

- чипы на основе сомамеров (аптамеры из нуклеиновой кислоты с химически модифицированными азотистыми основаниями).

Основными ограничениями для широкого внедрения в практику таких методов являются высокая стоимость оборудования и реагентов, сложность оборудования, необходимость биоинформационного анализа данных. Методы последней группы активно совершенствуются, решаются проблемы недостаточно высокой избирательности и прочности связывания аналитов [53-57].

Наиболее широко используемыми методами количественного анализа белков являются нВЭЖХ-МС/МС и иммуноферментный анализ, включая его мультиплексный вариант. Метод нВЭЖХ-МС/МС рассматривается, преимущественно, в качестве референтного метода в силу высоких точностных характеристик. Этот метод ограниченно применяется в рутинной лабораторной практике главным образом из-за высокой себестоимости анализа. Экономически более выгодный метод обзорной масс-спектрометрии при всех его достоинствах позволяет оценивать лишь относительные количества аналитов.

Заключение

Разные проявления клеточных ответов на облучение, в том числе и в малых дозах, могут иметь разные пути передачи сигнала, но в то же время разные ответы могут идти на основе одинаковых сигнальных путей [11].

Факты говорят о том, что на клеточном уровне значительная часть радиационно-индуциро-ванных эффектов (независимо от вида ионизирующего излучения, дозы, интенсивности воздействия) реализуется на основе сигнальных путей по общебиологическому «стресс-адаптационному» алгоритму. Общность эффекторных молекул стресс-опосредованных сигнальных путей, присущих организмам разных уровней биологической организации, свидетельствует о раннем эволюционном происхождении таких систем. Это существенно затрудняет изучение механизмов реакций клеток и организмов на воздействие ионизирующих излучений, особенно отсроченных во времени эффектов.

Представленные научные публикации подчеркивают важность исследования основных сигнальных путей, участвующих в реализации клеточных ответов на ионизирующее излучение. Необходимость изучения роли влияющих на процессы дифференцировки и функционирования регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов факторов транскрипции (NF-kB, JNK1, JNK2, STAT3, FOXP3, GATA3, RORC и других), у людей, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию в диапазоне малых и средних доз с преимущественным поражением красного костного мозга, в отдалённые сроки после начала облучения не вызывает сомнения. Комплексное исследование внутриклеточных сигнальных путей во взаимосвязи с генетическим и рецепторным аппаратом Т-лимфоцитов, выполняющих регуляторные функции, и клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета позволит в будущем прояснить механизмы реализации отдалённых канцерогенных эффектов хронического облучения человека.

Литература

1. Baba J., Watanabe S., Saida Y., Tanaka T., Miyabayashi T., Koshio J., Ichikawa K., Nozaki K., Koya T., Deguchi K., Tan C., Miura S., Tanaka H., Tanaka J., Kagamu H., Yoshizawa H., Nakata K., Narita I.

Depletion of radio-resistant regulatory T cells enhances antitumor immunity during recovery from lymphopenia //Blood. 2012. V. 120, N 12. P. 2417-2427.

2. Muroyama Y., Nirschl T.R., Kochel C.M., Lopez-Bujanda Z., Theodros D., Mao W., Carrera-Haro M.A., Ghasemzadeh A., Marciscano A.E., Velarde E., Tam A.J., Thoburn C.J., Uddin M., Meeker A.K., Anders R.A., Pardoll D.M., Drake C.G. Stereotactic radiotherapy increases functionally suppressive regulatory T cells in the tumor microenvironment //Cancer Immunol. Res. 2017. V. 5, N 11. P. 992-1004.

3. Wirsdorfer F., Jendrossek V. The role of lymphocytes in radiotherapy-induced adverse late effects in the lung //Front. Immunol. 2016. V. 7. P. 591. DOI: 10.3389/fimmu.2016.00591.

4. Macaeva E., Saeys Y., Tabury K., Janssen A., Michaux A., Benotmane M.A., De Vos W.H., Baatout S., Quintens R. Radiation-induced alternative transcription and splicing events and their applicability to practical biodosimetry //Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 19251. DOI: 10.1038/srep19251.

5. Li J.F., Xie L.J., Qin L.P., Liu Y.F., Zhang T.J., Huang Y., Cheng M.H. Apoptosis gene reprograming of human peripheral blood mononuclear cells induced by radioiodine-131 (131I) irradiation //Indian J. Med. Res. 2019. V. 149, N 5. P. 627-632.

6. Nikitakia Z., Mavragania I.V., Laskaratoua D.A., Gika V., Moskvin V.P., Theofilatos K., Vougas K., Stewart R.D., Georgakilas A.G. Systemic mechanisms and effects of ionizing radiation: a new 'old' paradigm of how the bystanders and distant can become the players //Semin. Cancer Biol. 2016. V. 37-38. P. 77-95.

7. ICRP, 2012. ICRP statement on tissue reactions and early and late effects of radiation in normal tissues and organs - threshold doses for tissue reactions in a radiation protection context. ICRP Publication 118 //Ann. ICRP. 2012. V. 41, N 1/2. P. 1-322 p.

8. Последствия радиоактивного загрязнения реки Течи /под ред. А.В. Аклеева. Челябинск: Книга, 2016. 400 c.

9. Ahmed R., Roger L., Costa del Amo P., Miners K.L., Jones R.E., Boelen L., Fali T., Elemans M., Zhang Y., Appay V., Baird D.M., Asquith B., Price D.A., Macallan D.C., Ladell K. Human stem cell-like memory T cells are maintained in a state of dynamic flux //Cell Rep. 2016. V. 17, N 11. P. 2811-2818.

10. Hei T.K., Zhao Y., Zhou H., Ivanov V.N. Mechanism of radiation carcinogenesis: role of the TGFBI gene and the inflammatory signaling cascade //Adv. Exp. Med. Biol. 2011. V. 720. P. 163-170.

11. Schaue D., Kachikwu E.L., McBride W.H. Cytokines in radiobiological responses: a review //Radiat. Res. 2012. V. 178, N 6. P. 505-523.

12. Azzam E.I., Jay-Gerin J.-P., Pain D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury //Cancer Lett. 2012. V. 327, N 1-2. P. 48-60.

13. Tang F.R., Loke W.K. Molecular mechanisms of low dose ionizing radiation induced hormesis, adaptive responses, radioresistance, bystander effects, and genomic instability //Int. J. Radiat. Biol. 2014. V. 91, N 1. P. 1-68.

14. Хаитов Р.М., Аклеев А.В., Кофиади И.А. Индивидуальная радиочувствительность и иммунитет: национальное руководство. Челябинск: Книга, 2018. 216 с.

15. Human radiosensitivity: Report of the independent Advisory Group on Ionising Radiation. London: Health Protection Agency Radiation, Chemical and Environmental Hazards, 2013. 164 p.

16. Zhang Y., Xu M., Zhang X., Chu F., Zhou T. MAPK/c-Jun signaling pathway contributes to the upregulation of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL induced by Epstein-Barr virus-encoded BARF1 in gastric carcinoma cells //Oncol. Lett. 2018. V. 15. P. 7537-7544.

17. Sabapathy K., Hu Y., Kallunki T., Schreiber M., David J.P., Jochum W., Wagner E.F., Karin M. JNK2 is required for efficient T-cell activation and apoptosis but not for normal lymphocyte development //Curr. Biol. 1999. V. 9, N 3. P. 116-125.

18. Yu H. Typical cell signaling response to ionizing radiation: DNA damage and extranuclear damage //Chin. J. Cancer Res. 2012. V. 24, N 2. P. 83-89.

19. Жуков А.С., Белоусова И.Э., Самцов А.В. Иммунологические и молекулярно-генетические механизмы развития грибовидного микоза //Вестник дерматологии и венерологии. 2015. № 4. С. 42-50.

20. Netchiporouk E., Litvinov I.V., Moreau L., Gilbert M., Sasseville D., Duvic M. Deregulation in STAT signaling is important for cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) pathogenesis and cancer progression //Cell Cycle. 2014. V. 13, N 21. P. 3331-3335.

21. Vainchenker W., Dusa A., Constantinescu S.N. AKs in pathology: role of Janus kinases in hematopoietic malignancies and immunodeficiencies //Semin. Cell Dev. Biol. 2008. V. 19. P. 385-393.

22. Murray P.J. The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration //J. Immunol. 2007. V. 178. P. 2623-2629.

23. Oweida A.J., Darragh L., Phan A., Binder D., Bhatia S., Mueller A., Van Court B., Milner D., Raben D., Woessner R., Heasley L., Nemenoff R., Clambey E., Karam S.D. STAT3 modulation of regulatory T cells in response to radiation therapy in head and neck cancer //J. Natl. Cancer Inst. 2019. V. 111, N 12. P. 1339-1349.

24. Zhou G., Xu Y., He B., Ma R., Wang Y., Chang Y., Xie Y., Wu L., Huang J., Xiao Z. Ionizing radiation modulates vascular endothelial growth factor expression through STAT3 signaling pathway in rat neonatal primary astrocyte cultures //Brain Behav. 2020. V. 10. P. e01529. DOI: 10.1002/brb3.1529.

25. Ryan J.L. Ionizing radiation: the good, the bad, and the ugly //J. Invest. Dermatol. 2012. V. 132. P. 985-993.

26. Gao H., Dong Z., Gong X., Dong J., Zhang Y., Wei W., Wang R., Jin S. Effects of various radiation doses on induced T-helper cell differentiation and related cytokine Secretion //J. Radiat. Res. 2018. V. 59, N 4. P. 395-403.

27. Tang Y., Chen X., Zhang Y., Tang Z., Zhuo M., Li D., Wang P., Zang G., Yu Y. Fusion protein of tapasin and hepatitis B core antigen 1827 enhances T helper cell type 1/2 cytokine ratio and antiviral immunity by inhibiting suppressors of cytokine signaling family members 1/3 in hepatitis B virus transgenic mice //Mol. Med. Rep. 2014. V. 9. P. 1171-1178.

28. Xiang L., Rehm K.E., Marshall G.J. Effects of strenuous exercise on Th1/Th2 gene expression from human peripheral blood mononuclear cells of marathon participants //Mol. Immunol. 2014. V. 60. P. 129-134.

29. Singh R., Miao T., Symonds A., Omodho B., Li S., Wang P. Egr2 and 3 inhibit T-betmediated IFN-у production in T cells //J. Immunol. 2017. V. 198, N 11. P. 4394-4402.

30. Lee W., Lee G.R. Transcriptional regulation and development of regulatory T-cells //Exp. Mol. Med. 2018. V. 50, N 3. P. e456. DOI: 10.1038/emm.2017.313.

31. Nakatsukasa H., Oda M., Yin J., Chikuma S., Ito M., Koga-Iizuka M., Someya K., Kitagawa Y., Ohkura N., Sakaguchi S., Koya I., Sanosaka T., Kohyama J., Tsukada Y.-I., Yamanaka S., Takamura-Enya T., Lu Q., Yoshimura A. Loss of TET proteins in regulatory T cells promotes abnormal proliferation, Foxp3 destabilization and IL-17 expression //Int. Immunol. 2019. V. 31, N 5. P. 335-347.

32. Emel S., Mehmet S. Epigenetical targeting of the FOXP3 gene by S-adenosylmethionine diminishes the suppressive capacity of regulatory T cells ex vivo and alters the expression profiles //J. Immunother. 2019. V. 42, N 1. P. 11-22.

33. Beauford S.S., Kumari A., Garnett-Benson C. Ionizing radiation modulates the phenotype and function of human CD4+ induced regulatory T cells //BMC Immunol. 2020. V. 21. P. 18. DOI: 10.1186/s12865-020-00349-w.

34. Cao M., Cabrera R., Xu Y., Liu C., Nelson D. Different radiosensitivity of CD4+ CD25+ regulatory T cells and effector T cells to low dose gamma irradiation in vitro //Int. J. Radiat. Biol. 2011. V. 87, N 1. P. 71-80.

35. Gremy O., Benderitter M., Linard C. Acute and persisting Th2-like immune response after fractionated colorectal gamma-irradiation //World J. Gastroenterol. 2008. V. 14, N 46. P. 7075-7085.

36. Jasiulionis M.G. Abnormal epigenetic regulation of immune system during aging //Front. Immunol. 2018. V. 9. P. 197. DOI: 10.3389/fimmu.2018.00197.

37. Korn T., Bettelli E., Oukka M., Kuchroo V.K. IL-17 and Th17 cells //Annu. Rev. Immunol. 2009. V. 27. P. 485-517.

38. Ivanov I.I., McKenzie B.S., Zhou L., Tadokoro C.E., Lepelley A., Lafaille J.J., Cua D.J., Littman D.R. The

orphan nuclear receptor ROR-gammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells //Cell. 2006. V. 126, N 6. P. 1121-1133.

39. Chen Z., Lin F., Gao Y., Li Z., Zhang J., Xing Y., Deng Z., Yao Z., Tsun A., Li B. FOXP3 and RORyt: transcriptional regulation of Treg and Th17 //Int. Immunopharmacol. 2011. V. 11, N 5. P. 536-542.

40. Cai J.-L., Du L., Ma Q., Pan X., Yang X., Xiao F., Cui Y. Characteristics and significance of change in Treg/Th17 balance in rats with combined trauma and y-radiation //Med. J. Chin. People's Lib. Army. 2013. V. 38, N 1. P. 19-22.

41. Bessout R., Demarquay C., Moussa L., René A., Doix B., Benderitter M., Sémont A., Mathieu N. TH17 predominant T-cell responses in radiation-induced bowel disease are modulated by treatment with adipose-derived mesenchymal stromal cells //J. Pathol. 2015, V, 237, N 4. P. 435-446.

42. Riffelmacher T., Richter F.C., Simon A.K. Autophagy dictates metabolism and differentiation of inflammatory immune cells //Autophagy. 2018. V. 14, N 2. P. 199-206.

43. Sanli T., Rashid A., Liu C., Harding S., Bristow R.G., Cutz J.-C., Singh G., Wright J., Tsakiridis T. Ionizing radiation activates AMP-activated kinase (AMPK): a target for radiosensitization of human cancer cells //Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2010. V. 78, N 1. P. 221-229.

44. Wang Z., Chen Z., Jiang Z., Luo P., Liu L., Huang Y., Wang H., Wang Y., Long L., Tan X., Liu D., Jin T., Wang Y.I., Wang Y., Liao F., Zhang C., Chen L., Gan Y., Liu Y., Yang F., Huang C., Miao H., Chen J., Cheng T., Fu X., Shi C. Cordycepin prevents radiation ulcer by inhibiting cell senescence via NRF2 and AMPK in rodents //Nat. Commun. 2019. V. 10. P. 2538. DOI: 10.1038/s41467-019-10386-8.

45. Stone K.L., Elliott J.I., Peterson G., McMurray W., Williams K.R. Reversed-phase high-performance liquid chromatography for fractionation of enzymatic digests and chemical cleavage products of proteins //Methods Enzymol. 1990. V. 193. P. 389-412.

46. Marcotte E.M. How do shotgun proteomics algorithms identify proteins? //Nat. Biotechnol. 2007. V. 25. P. 755-757.

47. Codorean E., Nichita C., Albulescu L., Râducan E., Popescu I.D., Lonitâ A.C., Albulescu R. Correlation of XMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro //Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 2010. V. 69, N 1. P. 13-19.

48. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins //J. Biol. Chem. 1975. V. 250, N 10. P. 4007-4021.

49. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76, N 9. P. 4350-4354.

50. Schuerwegh A.J., Stevens W.J., Bridts C.H., De Clerck L.S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes //Cytometry. 2001. V. 46, N 3. P. 172-176.

51. Baksh M.M., Kussrow A.K., Mileni M., Finn M.G., Bornhop D.J. Label-free quantification of membrane-ligand interactions using backscattering interferometry //Nat. Biotechnol. 2011. V. 29, N 4. P. 357-360.

52. Ivanov A.S., Medvedev A., Ershov P., Molnar A., Mezentsev Y., Yablokov E., Kaluzhsky L., Gnedenko O., Buneeva O., Haidukevich I., Sergeev G., Lushchyk A., Yantsevich A., Medvedeva M., Kozin S., Popov I., Novikova S., Zgoda V., Gilep A., Usanov S., Lisitsa A., Archakov A. Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: practical realization and further SPR validation //Proteomics. 2014. V. 14. P. 2261-2274.

53. Yevshin I., Sharipov R., Valeev T., Kel A., Kolpakov F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments //Nucleic Acids Res. 2017. V. 45, N D1. P. D61-D67.

54. Rubina A.Y., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E., Ivanov S.M., Konovalova E.V., Mirzabekov A.D. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications //Biotechniques. 2003. V. 34, N 5. P. 1008-1014.

55. Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase //Science. 1990. V. 249, N 4968. P. 505-510.

56. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands //Nature. 1990. V. 346. P. 818-822.

57. Hathout Y., Brody E., Clemens P.R., Cripe L., DeLisle R.K., Furlong P., Gordish-Dressman H., Hache L., Henricson E., Hoffman E.P., Kobayashi Y.M., Lorts A., Mah J.K., McDonald C., Mehler B., Nelson S., Nikrad M., Singer B., Steele F., Sterling D., Sweeney H.L., Williams S., Gold L. Large-scale serum protein biomarker discovery in Duchenne muscular dystrophy //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112, N 23. P. 7153-7158.

58. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E. A microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay and its application to malaria //Bull. World Health Organ. 1974. V. 51, N 2. P. 209-211.

Transcription factors as potential markers of carcinogenic effects of chronic exposure. Review

Kodintseva E.A.

Urals Research Center for Radiation Medicine, FMBA of Russia, Chelyabinsk

Chronic human exposure to ionizing radiation causes mainly damage to red bone marrow cells, that primarily affects T-cell part of the immunity. Increased incidence of cancer and cardio-vascular diseases in the affected people has been registered during long time. Mechanisms of the late radiation-induced immunity changes have not been sufficiently studied. Pathophysiological mechanisms of late effects of chronic exposure are unknown. The paper reviews the latest information on some transcription factors, among them NF-kB, JNK, P38 and other, involved in cellular response to ionizing radiation. The main transcription factors, such as STAT3, GATA3, T-BOX, FOXP3, RORC and other, control T-lymphocytes differentiation. Location of some transcription factors and short description of their functions are given in the paper. The latest methods of the transcription factors research have been summarized, their advantages and disadvantages have been analyzed. Radiation effects on cells are mainly realized through stress-adaptive mechanism, this makes difficult to study cells response to ionizing radiation and mechanisms of the effects realization, especially delayed effects. Complex research of intracellular signal pathway in relation to genetic and receptor cells apparatus (T-lymphocytes, performing regulatory functions, and cells effectors of antitumor immunity) will allow the future researches to find out mechanisms of late effects of ionizing radiation chronic exposure to a human, primarily carcinogenic effects.

Key words: the Techa River, chronic radiation exposure, long-term period, immune system, T-lymphocytes, transcription factors, mitogen-activated protein kinases, signaling pathways, T-lymphocyte differentiation, apoptosis, methods for studying transcription factors.

References

1. Baba J., Watanabe S., Saida Y., Tanaka T., Miyabayashi T., Koshio J., Ichikawa K., Nozaki K., Koya T., Deguchi K., Tan C., Miura S., Tanaka H., Tanaka J., Kagamu H., Yoshizawa H., Nakata K., Narita I.

Depletion of radio-resistant regulatory T cells enhances antitumor immunity during recovery from lymphopenia. Blood, 2012, vol. 120, no. 12, pp. 2417-2427.

2. Muroyama Y., Nirschl T.R., Kochel C.M., Lopez-Bujanda Z., Theodros D., Mao W., Carrera-Haro M.A., Ghasemzadeh A., Marciscano A.E., Velarde E., Tam A.J., Thoburn C.J., Uddin M., Meeker A.K., Anders R.A., Pardoll D.M., Drake C.G. Stereotactic radiotherapy increases functionally suppressive regulatory T cells in the tumor microenvironment. Cancer Immunol. Res., 2017, vol. 5, no. 11, pp. 992-1004.

3. Wirsdorfer F., Jendrossek V. The role of lymphocytes in radiotherapy-induced adverse late effects in the lung. Front. Immunol., 2016, vol. 7, pp. 591. DOI: 10.3389/fimmu.2016.00591.

Kodintseva E.A. - Researcher, Manager, C. Sc., Biol. URCRM.

Contacts: 68A Vorovsky Str., Chelyabinsk, 454141, Russia. Tel.: +7(351) 232-79-22; e-mail: ovcharova.cat@mail.ru.

4. Macaeva E., Saeys Y., Tabury K., Janssen A., Michaux A., Benotmane M.A., De Vos W.H., Baatout S., Quintens R. Radiation-induced alternative transcription and splicing events and their applicability to practical biodosimetry. Sci. Rep., 2016, vol. 6, pp. 19251. DOI: 10.1038/srep19251.

5. Li J.F., Xie L.J., Qin L.P., Liu Y.F., Zhang T.J., Huang Y., Cheng M.H. Apoptosis gene reprograming of human peripheral blood mononuclear cells induced by radioiodine-131 (131I) irradiation. Indian J. Med. Res., 2019, vol. 149, no. 5, pp. 627-632.

6. Nikitakia Z., Mavragania I.V., Laskaratoua D.A., Gika V., Moskvin V.P., Theofilatos K., Vougas K., Stewart R.D., Georgakilas A.G. Systemic mechanisms and effects of ionizing radiation: a new 'old' paradigm of how the bystanders and distant can become the players. Semin. Cancer Biol., 2016, vol. 37-38, pp. 77-95.

7. ICRP, 2012. ICRP statement on tissue reactions and early and late effects of radiation in normal tissues and organs - threshold doses for tissue reactions in a radiation protection context. ICRP Publication 118. Ann. ICRP, 2012, vol. 41, no. 1/2, pp. 1-322.

8. Consequences of radioactive contamination of the Techa river. Ed.: Prof. A.V. Akleev. Chelyabinsk, Kniga, 2016. 400 p. (In Russian).

9. Ahmed R., Roger L., Costa del Amo P., Miners K.L., Jones R.E., Boelen L., Fali T., Elemans M., Zhang Y., Appay V., Baird D.M., Asquith B., Price D.A., Macallan D.C., Ladell K. Human stem cell-like memory T cells are maintained in a state of dynamic flux. Cell Rep., 2016, vol. 17, no. 11, pp. 2811-2818.

10. Hei T.K., Zhao Y., Zhou H., Ivanov V.N. Mechanism of radiation carcinogenesis: role of the TGFBI gene and the inflammatory signaling cascade. Adv. Exp. Med. Biol., 2011, vol. 720, pp. 163-170.

11. Schaue D., Kachikwu E.L., McBride W.H. Cytokines in radiobiological responses: a review. Radiat. Res., 2012, vol. 178, no. 6, pp. 505-523.

12. Azzam E.I., Jay-Gerin J.-P., Pain D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Lett., 2012, vol. 327, no. 1-2, pp. 48-60.

13. Tang F.R., Loke W.K. Molecular mechanisms of low dose ionizing radiation induced hormesis, adaptive responses, radioresistance, bystander effects, and genomic instability. Int. J. Radiat. Biol., 2014, vol. 91, no. 1, pp. 1-68.

14. Khaitov R.M., Akleyev A.V., Kofiadi I.A. Individual radiosensitivity and immunity: national guidelines. Chelyabinsk, Kniga, 2018. 216 p. (In Russian).

15. Human radiosensitivity: Report of the independent Advisory Group on Ionising Radiation. London, Health Protection Agency Radiation, Chemical and Environmental Hazards, 2013. 164 p.

16. Zhang Y., Xu M., Zhang X., Chu F., Zhou T. MAPK/c-Jun signaling pathway contributes to the upregulation of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL induced by Epstein-Barr virus-encoded BARF1 in gastric carcinoma cells. Oncol. Lett., 2018, vol. 15, pp. 7537-7544.

17. Sabapathy K., Hu Y., Kallunki T., Schreiber M., David J.P., Jochum W., Wagner E.F., Karin M. JNK2 is required for efficient T-cell activation and apoptosis but not for normal lymphocyte development. Curr. Biol., 1999, vol. 9, no. 3, pp. 116-125.

18. Yu H. Typical cell signaling response to ionizing radiation: DNA damage and extranuclear damage. Chin. J. Cancer Res., 2012, vol. 24, no. 2, pp. 83-89.

19. Zhukov A.S., Belousova I.E., Samtsov A.V. Immunological and molecular genetic mechanisms of the development of mycosis fungoides. Vestnik dermatologii i venerologii - Bulletin of Dermatology and Venerology, 2015, no. 4, pp. 42-50. (In Russian).

20. Netchiporouk E., Litvinov I.V., Moreau L., Gilbert M., Sasseville D., Duvic M. Deregulation in STAT signaling is important for cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) pathogenesis and cancer progression. Cell Cycle, 2014, vol. 13, no. 21, pp. 3331-3335.

21. Vainchenker W., Dusa A., Constantinescu S.N. AKs in pathology: role of Janus kinases in hematopoietic malignancies and immunodeficiencies. Sem. Cell Dev. Biol., 2008, vol. 19, pp. 385-393.

22. Murray P.J. The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration. J. Immunol., 2007, vol. 178, pp. 2623-2629.

23. Oweida A.J., Darragh L., Phan A., Binder D., Bhatia S., Mueller A., Van Court B., Milner D., Raben D., Woessner R., Heasley L., Nemenoff R., Clambey E., Karam S.D. STAT3 modulation of regulatory T cells in response to radiation therapy in head and neck cancer. J. Natl. Cancer Ins., 2019, vol. 111, no. 12, pp. 1339-1349.

24. Zhou G., Xu Y., He B., Ma R., Wang Y., Chang Y., Xie Y., Wu L., Huang J., Xiao Z. Ionizing radiation modulates vascular endothelial growth factor expression through STAT3 signaling pathway in rat neonatal primary astrocyte cultures. Brain and Behav., 2020, vol. 10, pp. e01529. DOI: 10.1002/brb3.1529.

25. Ryan J.L. Ionizing radiation: the good, the bad, and the ugly. J. Invest. Dermatol., 2012, vol. 132, pp. 985-993.

26. Gao H., Dong Z., Gong X., Dong J., Zhang Y., Wei W., Wang R., Jin S. Effects of various radiation doses on induced T-helper cell differentiation and related cytokine Secretion. J. Radiat. Res., 2018, vol. 59, no. 4, pp. 395-403.

27. Tang Y., Chen X., Zhang Y., Tang Z., Zhuo M., Li D., Wang P., Zang G., Yu Y. Fusion protein of tapasin and hepatitis B core antigen 1827 enhances T helper cell type 1/2 cytokine ratio and antiviral immunity by inhibiting suppressors of cytokine signaling family members 1/3 in hepatitis B virus transgenic mice. Mol. Med. Rep., 2014, vol. 9, pp. 1171-1178.

28. Xiang L., Rehm K.E., Marshall G.J. Effects of strenuous exercise on Th1/Th2 gene expression from human peripheral blood mononuclear cells of marathon participants. Mol. Immunol., 2014, vol. 60, pp. 129-134.

29. Singh R., Miao T., Symonds A., Omodho B., Li S., Wang P. Egr2 and 3 inhibit T-betmediated IFN-y production in T cells. J. Immunol., 2017, vol. 198, no. 11, pp. 4394-4402.

30. Lee W., Lee G.R. Transcriptional regulation and development of regulatory T-cells. Exp. Mol. Med., 2018, vol. 50, no. 3, pp. e456. DOI: 10.1038/emm.2017.313.

31. Nakatsukasa H., Oda M., Yin J., Chikuma S., Ito M., Koga-Iizuka M., Someya K., Kitagawa Y., Ohkura N., Sakaguchi S., Koya I., Sanosaka T., Kohyama J., Tsukada Y.-I., Yamanaka S., Takamura-Enya T., Lu Q., Yoshimura A. Loss of TET proteins in regulatory T cells promotes abnormal proliferation, Foxp3 destabilization and IL-17 expression. Int. Immunol., 2019, vol. 31, no. 5, pp. 335-347.

32. Emel S., Mehmet S. Epigenetical targeting of the FOXP3 gene by S-adenosylmethionine diminishes the suppressive capacity of regulatory T cells ex vivo and alters the expression profiles. J. Immunother., 2019, vol. 42, no. 1, pp. 11-22.

33. Beauford S.S., Kumari A., Garnett-Benson C. Ionizing radiation modulates the phenotype and function of human CD4+ induced regulatory T cells. BMC Immunol., 2020, vol. 21, pp. 18. DOI: 10.1186/s12865-020-00349-w.

34. Cao M., Cabrera R., Xu Y., Liu C., Nelson D. Different radiosensitivity of CD4+ CD25+ regulatory T cells and effector T cells to low dose gamma irradiation in vitro. Int. J. Radiat. Biol., 2011, vol. 87, no. 1, pp. 71-80.

35. Gremy O., Benderitter M., Linard C. Acute and persisting Th2-like immune response after fractionated colorectal gamma-irradiation. World J. Gastroenterol., 2008, vol. 14, no. 46, pp. 7075-7085.

36. Jasiulionis M.G. Abnormal epigenetic regulation of immune system during aging. Front. Immunol., 2018, vol. 9, pp. 197. DOI: 10.3389/fimmu.2018.00197.

37. Korn T., Bettelli E., Oukka M, Kuchroo V.K. IL-17 and Th17 cells. Annu. Rev. Immunol., 2009, vol. 27, pp. 485-517.

38. Ivanov I.I., McKenzie B.S., Zhou L., Tadokoro C.E., Lepelley A., Lafaille J.J., Cua D.J., Littman D.R. The

orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell, 2006, vol. 126, no. 6, pp. 1121-1133.

39. Chen Z., Lin F., Gao Y., Li Z., Zhang J., Xing Y., Deng Z., Yao Z., Tsun A., Li B. FOXP3 and RORyt: transcriptional regulation of Treg and Th17. Int. Immunopharmacol., 2011, vol. 11, no. 5, pp. 536-542.

40. Cai J.-L., Du L., Ma Q., Pan X., Yang X., Xiao F., Cui Y. Characteristics and significance of change in Treg/Th17 balance in rats with combined trauma and y-radiation. Med. J. Chin. People's Lib. Army, 2013, vol. 38, no. 1, pp. 19-22.

41. Bessout R., Demarquay C., Moussa L., René A., Doix B., Benderitter M., Sémont A., Mathieu N. TH17 predominant T-cell responses in radiation-induced bowel disease are modulated by treatment with adipose-derived mesenchymal stromal cells. J. Pathol., 2015, vol. 237, no. 4, pp. 435-446.

42. Riffelmacher T., Richter F.C., Simon A.K. Autophagy dictates metabolism and differentiation of inflammatory immune cells. Autophagy, 2018, vol. 14, no. 2, pp. 199-206.

43. Sanli T., Rashid A., Liu C., Harding S., Bristow R.G., Cutz J.-C., Singh G., Wright J., Tsakiridis T. Ionizing radiation activates AMP-activated kinase (AMPK): a target for radiosensitization of human cancer cells. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 2010, vol. 78, no. 1, pp. 221-229.

44. Wang Z., Chen Z., Jiang Z., Luo P., Liu L., Huang Y., Wang H., Wang Y., Long L., Tan X., Liu D., Jin T., Wang Y.I., Wang Y., Liao F., Zhang C., Chen L., Gan Y., Liu Y., Yang F., Huang C., Miao H., Chen J., Cheng T., Fu X., Shi C. Cordycepin prevents radiation ulcer by inhibiting cell senescence via NRF2 and AMPK in rodents. Nat. Commun., 2019, vol. 10, pp. 2538. DOI: 10.1038/s41467-019-10386-8.

45. Stone K.L., Elliott J.I., Peterson G., McMurray W., Williams K.R. Reversed-phase high-performance liquid chromatography for fractionation of enzymatic digests and chemical cleavage products of proteins. Methods Enzymol., 1990, vol. 193, pp. 389-412.

46. Marcotte E.M. How do shotgun proteomics algorithms identify proteins? Nat. Biotechnol., 2007, vol. 25, pp. 755-757.

47. Codorean E., Nichita C., Albulescu L., Räducan E., Popescu I.D., Lonitä A.C., Albulescu R. Correlation of XMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol., 2010, vol. 69, no. 1, pp. 13-19.

48. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 1975, vol. 250, no. 10, pp. 4007-4021.

49. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, no. 9, pp. 4350-4354.

50. Schuerwegh A.J., Stevens W.J., Bridts C.H., De Clerck L.S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factoralpha in monocytes. Cytometry, 2001, vol. 46, no. 3, pp. 172-176.

51. Baksh M.M., Kussrow A.K., Mileni M., Finn M.G., Bornhop D.J. Label-free quantification of membrane-ligand interactions using backscattering interferometry. Nat. Biotechnol., 2011, vol. 29, no. 4, pp. 357-360.

52. Ivanov A.S., Medvedev A., Ershov P., Molnar A., Mezentsev Y., Yablokov E., Kaluzhsky L., Gnedenko O., Buneeva O., Haidukevich I., Sergeev G., Lushchyk A., Yantsevich A., Medvedeva M., Kozin S., Popov I., Novikova S., Zgoda V., Gilep A., Usanov S., Lisitsa A., Archakov A. Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: practical realization and further SPR validation. Proteomics, 2014, vol. 14, pp. 2261-2274.

53. Yevshin I., Sharipov R., Valeev T., Kel A., Kolpakov F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res., 2017, vol. 45, no. D1, pp. D61-D67.

54. Rubina A.Y., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E., Ivanov S.M., Konovalova E.V., Mirzabekov A.D. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques, 2003, vol. 34, no. 5, pp. 1008-1014.

55. Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 1990, vol. 249, no. 4968, pp. 505-510.

56. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature, 1990, vol. 346, pp. 818-822.

57. Hathout Y., Brody E., Clemens P.R., Cripe L., DeLisle R.K., Furlong P., Gordish-Dressman H., Hache L., Henricson E., Hoffman E.P., Kobayashi Y.M., Lorts A., Mah J.K., McDonald C., Mehler B., Nelson S., Nikrad M., Singer B., Steele F., Sterling D., Sweeney H.L., Williams S., Gold L. Large-scale serum protein biomarker discovery in Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2015, vol. 112, no. 23, pp. 7153-7158.

58. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E. A microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay and its application to malaria. Bull. World Health Organ., 1974, vol. 51, no. 2, pp. 209-211.