СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И КЛАССИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
METHOD FOR DETECTION AND CLASSIFICATION OF PROTEIN MOLECULES AND THEIR INTERACTIONS

Изобретение относится к аналитической химии и, в частности, к способам обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах на основе оптических сенсорных устройств без использования аналитических меток. Оптические сенсорные устройства могут быть выполнены на основе различных оптических волокон (волноводов): планарных, микроструктурных и др.
К настоящему времени в известных источниках предложено большое количество сенсоров с использованием микроструктурированных оптических волокон (МВ) в качестве чувствительного элемента для проведения анализа газов и жидкостей. Общим для всех предложенных схем является использование эффекта взаимодействия излучения с введенным в МВ анализируемым веществом, как в полых объемах волокна, так и на его поверхности, и регистрация соответствующих этому взаимодействию изменений в оптических свойствах МВ.
Обнаружение и классификация специфических взаимодействий белковых молекул играют важнейшую роль в функционировании живых систем, научных исследованиях и медицинской практике.
in situ
Известен способ обнаружения белковых молекул с помощью функционализации поверхности оптического волокна, что дает возможность создания биосенсоров для анализа специфичных взаимодействий между белками-мишенями (см. Huang Y., Yu B., Guo T., Guan B.O. Ultrasensitive and in situ DNA detection in various pH environments based on a microfiber with a graphene oxide linking layer // RSC Advances 2017. V. 7. № 22. P. 13177). В способе используется модификация поверхности МВ карбоксилированным оксидом графена, способным к π−π взаимодействию с молекулами ДНК в широком диапазоне pH (4.3−8.5), что перспективно для  определения одноцепочечных ДНК в организме человека.
Однако данному подходу свойственны недостатки, связанные с длительной и сложной процедурой формирования на поверхности МВ чувствительного слоя, обладающего стабильностью свойств на всей поверхности МВ и устойчивостью при хранении.
.
Известен способ обнаружения сердечного биомаркера тропонина cTnI без применения аналитических меток с использованием фотонно-кристаллических волокон с открытой микрополостью (см. Zhang, B., Morales, A. W., Peterson, R., Tang, L., & Ye, J. Y. (2014). Label-free detection of cardiac troponin I with a photonic crystal biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 58, 107–113). Структура сенсора содержит открытую полость, облегчающую иммобилизацию специфических к cTnI антител, которые иммобилизуются на поверхности сенсора для специфического обнаружения cTnI в широком диапазоне концентраций.
Недостатком способа в первую очередь является длительность, сложность и трудоёмкость создания на внутренней поверхности МВ однородного слоя, специфичного к сорбции целевого аналита.
Известен также способ обнаружения и классификации белковых молекул без аналитических меток с использованием пластиковых сенсорных элементов, полученных микрорепликацией (см. патент Японии № 4504686 по кл. МПКB01L3/00, опуб. 02.06.2005). Описана возможность обнаружения различных белковых молекулярных комплексов, включая олигонуклеотиды, взаимодействия антитело-антиген, взаимодействия гормона-рецептора и взаимодействия фермент-субстрат. Сенсорное устройство состоит из двух частей: элемента специфичного распознавания, систему детектирования аналитического сигнала, включающую преобразователь, который преобразует событие молекулярного распознавания в поддающийся количественной оценке сигнал. Специфичный элемент распознавания выполнен на основе оптической решетки, содержащей материал с высоким показателем преломления, слоя подложки, поддерживающего оптическую решетку, и иммобилизованных на поверхность оптической решетки веществ способных к специфическому связыванию анализируемых молекул. При взаимодействии излучения с оптической решеткой в отраженном спектре излучения возникает детектируемый резонансный эффект.
Недостатками способа являются использование отраженного сигнала, что значительно ограничивает возможности при анализе взаимодействий белковых молекул, а также сложная, длительная и трудоемкая процедура изготовления микрореплик оптических решеток с разрешением 0,1 мкм с иммобилизованными на поверхность оптической решетки веществами, способными к специфическому связыванию анализируемых молекул.
Общим недостатком описанных выше способов обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий является использование иммобилизованных на твердую подложку специфических элементов (центров) связывания, например антител, то есть проведение аналитических определений в гетерогенном формате, который предполагает длительные и сложно воспроизводимые стадии синтеза модифицированной твердой подложки и  продолжительную процедуру инкубации анализируемых растворов на подложке для осуществления специфического связывания определяемых белковых молекул и получения значимого аналитического сигнала..
Альтернативой гетерогенному формату определений является гомогенный, при котором обнаружение белковых молекул и продуктов их взаимодействия проводятся при введении специфических центров связывания непосредственно в анализируемый раствор.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения  взаимодействий антител с антигенами в микроструктурных оптических волокнах (Pavel S. Pidenko, Andrey A. Shuvalov, Anastasia A. Zanishevskaya, Natalia A. Burmistrova, "Detection of antigen-antibody interactions in microstructured optical fibers," Proc. SPIE 11457, Saratov Fall Meeting 2019:), включающий приготовление модельных образцов, представляющих собой, раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания, и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с различной концентрацией, введение растворов и смесей во внутреннюю полость микроструктурированного оптического волокна, детектирование спектров пропускания растворов и смесей, по которым судят о наличии взаимодействий. В прототипе показана принципиальная возможность обнаружения взаимодействия антигенов с антителами на примере пары антител мыши (mAb) и кроличьих антимышиных антител (rAmAb) в микроструктурных оптических волокнах в гомогенном формате. Раствор rAmAb (100 мкг/л) применяли для связывания различных концентраций mAb (1 – 100 мкг / л). Смеси mAb/ rAmAb готовили путем добавления раствора mAb к раствору rAmAb в соотношении 1:1. Смеси инкубировали 30 минут и детектировали спектр пропускания волокна. На основании изменения интенсивности характеристического максимума в спектре пропускания волокна проводили оценку степени взаимодействия антител.
К недостаткам прототипа относятся использование видимого спектрального диапазона длин волн (от 400 до 700 нм), который не охватывает ближние ультрафиолетовые (УФ) и инфракрасные (ИК) области, в которых осуществляется значительное поглощение и рассеяние излучения белковыми молекулами, а также использование одномерного подхода (оценка интенсивности сигнала при одной длине волны) при обработке спектральных данных, который вследствие сложного характера данных спектров пропускания МВ, не позволяет разделять близкие по характеру и перекрывающиеся изменения в спектрах пропускания МВ, что значительно уменьшает точность определений.
Технической проблемой заявляемого изобретения является создание способа обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах с использованием микроструктурированных оптических волокон в гомогенном формате без применения стадии иммобилизации на поверхность волокон специфических центров связывания и без использования аналитических меток.
Технический результат заключается в сокращении времени и повышении точности и достоверности обнаружения, и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах.
согласно изобретению,
Для достижения технического результата в способе обнаружения взаимодействий белковых молекул со специфическим центром связывания, включающем приготовление модельных образцов, представляющих собой, по крайней мере, один раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания, и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с различной концентрацией, введение растворов и смесей во внутреннюю полость микроструктурированного оптического волокна, детектирование спектров пропускания растворов и смесей, по которым судят о наличии взаимодействий,  детектирование спектров пропускания осуществляют в оптическом спектральном диапазоне от 250 нм до 3000 нм, данные спектров пропускания модельных образцов используют для построения математической модели взаимодействия обнаруживаемых белков, для этого данные спектров представляют в виде матрицы, строки которой соответствуют номерам образца, а столбцы - интенсивностям спектрального сигнала, проводят разложение матрицы по методу главных компонент, получают графики счетов и нагрузок, на которых выделяют группы точек, характеризующие наличие или отсутствие взаимодействия, готовят тестируемый раствор и смеси тестируемого раствора со специфическим центром связывания с различной концентрацией, вносят тестируемый раствор и смеси во внутренние полости микроструктурированного оптического волокна и детектируют спектры пропускания, которыесравнивают со спектрами модельных образцов и при попадании спектральных данных тестируемых растворов в соответствующую группу точек модельных образцов судят о наличии или отсутствии взаимодействия.
Изобретение иллюстрируется чертежами, где:
- на фиг 1 представлено распределение групп точек модельных образцов: раствора модельного белка, в частности иммуноглобулина G (область 1), раствора специфического центра связывания, в частности протеина А (область 2), смеси растворов специфических центров связывания с раствором модельного белка, в частности – комплекса протеин А/иммуноглобулин G (область 3);
- на фиг. 2 распределение групп точек тестируемых растворов относительно модельных образцов представлено символами в виде крестиков: наличие иммуноглобулина G в исследуемой жидкости – в области 2, образование комплекса протеин А/иммуноглобулин G – в области 3;
Способ осуществляется следующим образом.
Готовят модельные растворы: раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания, и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с концентрацией (плюс и минус 30% от максимально и минимально возможной).
Используют микроструктурированое оптическое волокно с полой, подвешенной, твердой сердцевиной, или волокно иной конструкции, имеющее полые микро капилляры. (см., например, Pavel S. Pidenko, Andrey A. Shuvalov, Anastasia A. Zanishevskaya, Natalia A. Burmistrova, "Detection of antigen-antibody interactions in microstructured optical fibers," Proc. SPIE 11457, Saratov Fall Meeting 2019:).
Вводят растворы и смеси в полые микрокапилляры микроструктурированного оптического волокна под действием капиллярных сил, насоса, или иным доступным способом.
Так как индивидуальные белковые молекулы и продукты их взаимодействий поглощают и рассеивают излучение в оптическом диапазоне длин волн от 250 нм до 3000 нм, то для получения спектров пропускания МВ используют источник излучения и детектор, работающие в этом спектральном диапазоне.
Данные спектров пропускания модельных образцов используют для построения математической модели взаимодействия обнаруживаемых белков. При построении модели используют многомерные методы анализа, например метод главных компонент.
Х
n
р
n
p
Для проведения обработки данные спектров пропускания МВ представляют в виде матрицы , состоящей из объектов (строк) и характеристик (столбцов). Таким образом, матрицу данных × представляют следующим образом:
(1)
На первом этапе проверяют матрицу данных на полноту и при необходимости заполняют пустоты в данных по среднему значению столбца или строки, или ближайших соседей. В случаях, когда данные сильно коррелируют друг с другом или избыточны и постоянны, их удаляют из выборки.
Х
М
Далее проводят центрирование данных. Центрирование – это вычитание из исходной матрицы матрицы . В способе используют среднее центрирование, где каждая переменная центрируется вычитанием среднего значения столбца в соответствии с уравнением (2):
(2)
Далее проводят обработку данных методом главных компонент с целью уменьшить размерность спектральных данных без значительной потери информации из-за скрытой структуры данных. Проводят разложение матрицы данных, в которой число строк соответствует количеству образцов, а число столбцов – числу независимых переменных (в частном случае – аналитических сигналов), на произведение двух матриц Т и Р с меньшими размерностями и матрицу остатков Е, которая содержит фоновую информацию (шум) (Родионова О.Е. Хемометрика в аналитической химии // 2006. 61с.).
Далее проводят отбор пробы биологической, или иной анализируемой жидкости. Проводится необходимая пробоподготовка и разбавление с целью получения визуально прозрачного исходного раствора. При приготовлении растворов, подготовке проб и выполнении измерений соблюдают следующие условия: температура окружающего воздуха (20±5) °С; атмосферное давление 84,0-106,7 кПа (630-800 мм рт.ст.); относительная влажность воздуха при 25°С ниже 85%. Проводится внесение в раствор раствора специфических центров связывания с известной концентрацией.
Проводится внесение подготовленных таким образом образцов в полые микрокапилляры микроструктурированного оптического волокна и детектирование спектров пропускания МВ, заполненных различными образцами. В качестве аналитического сигнала используется спектр пропускания МВ. При этом обнаружение и классификация белковых молекул-аналитов и продуктов их взаимодействий определяется по изменению характеристик спектра пропускания МВ. Обнаружение и классификация белковых молекул-аналитов и продуктов их взаимодействий проводится на основе описанной выше построенной математической модели методом главных компонент.
Пример.Применение белка А для специфичного распознавания иммуноглобулинов G в плазме крове человека.
n
р
На первом этапе проводится построение многомерной математической модели модельного набора данных. Для этого готовят набор не менее чем из 15 растворов белка А, иммуноглобулина G в различных концентрациях и соотношениях. Получают спектры пропускания МВ, заполненных приготовленными растворами. Данные спектров пропускания представляют в виде матрицы, состоящей из  объектов (строк) и  характеристик (столбцов).  где строки соответствуют номеру образца, а столбцы интенсивностям спектрального сигнала. Проверяют матрицу данных на полноту и при необходимости заполняют пустоты в данных по среднему значению столбца или строки, или ближайших соседей. При необходимости удаляют избыточные данные и проводят центрирование. Далее проводят разложение матрицы по методу главных компонент, получают и анализируют графики счетов и нагрузок.
При этом график счетов (см. фиг.1) содержит в своем составе три характеристические группы точек: спектральные данные образцов плазмы крови, содержащие иммуноглобулины G (область 1), протеин А (область 2) и белковые комплексы протеин А/иммуноглобулин G (область 3).
Определение наличия иммуноглобулинов G с использованием протеина A, проводится по следующей методике. Первоначально производится отбор биологического материала (цельной крови) в вакуумные пробирки с литий гепарином. В течение 24 часов после проведения отбора пробы проводятся необходимые процедуры пробоподготовки: центрифугирование образцов для выделения плазмы крови, разделение (аликвотрирование) образца плазмы крови на равные объёмы для проведения параллельных исследований (n=5) и расчета стандартного отклонения. Непосредственно перед внесением специфического центра связывания (Белок A (Sigma-Aldrich, США, кат. №P 6031), образцы плазмы крови последовательно разбавляются с использованием фосфатно-солевого буферного раствора, до достижения максимальной оптической плотности (A = 0.8 a. u) в диапазоне 200-1200 нм. Контроль оптической плотности проводят на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Shimadzu Europa GmbH, Дуйсбург, Германия). К приготовленному образцу плазмы крови, добавляют раствор Белка A в концентрации составлять 2 г/л. После внесения Белка А, смесь инкубируется при температуре 36.6 градусов Цельсия, при постоянном перемешивании (200 об/мин) в течение 15 минут. В дальнейшем смесь (100 мкл) шприцевым насосом инжектируется во внутренние полости МВ, для стабильности оптического сигнала, кювета с установленным образцом МВ, аналогично заполняется смесью (200 мкл) после заполнения смесью производят детектирование спектров пропускания МВ. После записи спектров пропускания смеси в МВ, спектральные данные, нормируются на спектральные данные источника излучения используют в качестве тестового набора данных. Тестовый набор данных соотносят с модельным набором данных. Результатом является определение, в какую из трех характеристических областей групп точек модельного набора данных (фиг. 1) попадают полученные спектральные данные тестового набора (фиг. 2). Если в образцах тестового набора данных наблюдается образование белкового комплекса протеин А/иммуноглобулин G, то они будут расположены в области 3 характеристической группы, в случае отсутствия - в области 2 группы, соответственно.
Таким образом, введение белка А в образец биологической жидкости и последующее обнаружение, и классификация его возможных взаимодействий может быть применено для количественной оценки содержания иммуноглобулинов G. Концентрационный всплеск иммуноглобулинов G в биологическом объекте, полученном от пациента, свидетельствует о наличии выраженного иммунного ответа. Поскольку для IgG1, IgG2 и IgG4 период полужизни составляет 21 день, обнаружение и классификация данного вида взаимодействий применимо при создании экспресс-тестов распознавания иммунного ответа при разработке и тестировании вакцин, а также для формирования групп риска в эпидемических условиях.
Обнаружение и классификация взаимодействий между специфичными IgG и антигенами белковой природы применимо в разработке экспрессных тест-систем и систем потокового мониторинга, взамен методов классического иммуноферментного анализа, позволяющих значительно сократить время проведения и интерпретации результатов анализа.
В качестве белковых молекул и продуктов их взаимодействий, которые могут быть обнаружены и классифицированы предлагаемым способом можно привести следующие примеры.
X
Y
1. Биотин () Биотиназа – Карбоксилазы (соединенные с биотином) – Стрептавидин/Авидин ().Биотин – витамин, дефицит которого способствует развитию ряда заболеваний. Стрептавидин и авидин – белки, селективно связывающие биотин. Введение белков стрептавидина и авидина в образец биологической жидкости (сыворотки крови) и последующее детектирование ББВ применимо для экспресс-определения уровня свободного биотина при лечении и профилактике дефицита биотина у пациента.
2. Полимераза, специфические и неспецифические продукты ее реакций при проведении процедуры полимеразной цепной реакции в различных вариантах.
X
Y
3. Белок pRb () – фактор транскрипции E2F (). Белок ретинобластомы (pRb) является ингибитором клеточного цикла и выполняет роль супрессора опухолеобразования, за счет связывания факторов транскрипции семейства E2F. pRb инактивирует транскрипцию комплекса E2F-DP (состоящего из димеров белка E2F и димеризованного партнера белка DP), активирующего прогрессирование клеточного цикла. В случае возникновения мутации в обоих аллелях гена RB1 (кодирующего pRB), pRB инактивируется, что приводит к развитию ретинобластомы. Детектирование взаимодействия между pRb пациента и введенным фактором транскрипции E2F позволяет выявить генетическую мутацию и начать терапию на раннем этапе развития ретинобластомы, что повышает шанс выживания пациента и сохранения глаза и его функции как органа зрения.
Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить точность и достоверность обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в гомогенном формате с использованием микроструктурированных оптических волокон без применения стадии иммобилизации на поверхность волокон специфических центоров связывания и без использования аналитических меток.