СПОСОБ БЫСТРОЙ ОЧИСТКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КАПСУЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

1. Способ получения, по существу, очищенных капсульных полисахаридов лизата клеток Streptococcus pneumoniae, указанный способ включает следующие стадии:
(a) обеспечение ферментативного бульона, содержащего бактериальные клетки, которые продуцируют выбранный серотип Streptococcus pneumoniae;
(b) лизирование бактериальных клеток стадии (а) литическим агентом, с получением лизата клеток, который содержит остатки клеток, растворимые белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды;
(c) осветление лизата клеток, полученного на стадии (b), с применением центрифугирования или фильтрования для удаления остатков клеток, с получением осветленного лизата клеток;
(d) ультрафильтрование и диафильтрование осветленного лизата клеток, полученного на стадии (с) для удаления низкомолекулярных примесей и повышения концентрации полисахарида с получением ретентата;
(e) понижение рН ретентата, полученного на стадии (d) до значения менее чем 4,5, для преципитации белка и нуклеиновых кислот с получением подкисленного раствора ретентата;
(f) выдерживание подкисленного раствора ретентата, полученного на стадии (е), в течение времени, достаточного для осаждения преципитата, а затем фильтрование или центрифугирование подкисленного раствора ретентата с получением осветленного раствора полисахарида;
(g) фильтрование осветленного раствора полисахарида, полученного на стадии (f) через фильтр с активированным углем;
(h) ультрафильтрование и диафильтрование указанного фильтрованного раствора, полученного на стадии (g) с получением концентрированного очищенного раствора полисахарида; и
(i) фильтрование концентрированного очищенного раствора полисахарида, полученного на стадии (h), с применением стерильного фильтра;
в результате чего получают, по существу, очищенные капсульные полисахариды в виде раствора.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выбранный серотип Streptococcus pneumoniae выбран из группы, состоящей из 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рН на стадии (е) понижают до значения, равного приблизительно 3,5.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (h) включает подведение рН до значения между приблизительно 5,5 и приблизительно 7,5.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (h) включает подведение рН до значения между приблизительно 7,0 и приблизительно 7,5.
6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (h) включает подведение рН до значения приблизительно 7,4.
7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на стадии (е) удаляют по меньшей мере 98% белка из ретентата, полученного на стадии (d).
8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на стадии (g) удаляют по меньшей мере 90% белка из осветленного раствора полисахарида, полученного на стадии (f).
9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный фильтр с активированным углем, который применяют на стадии (g), включает древесный уголь, активированный фосфорной кислотой.
10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадия (f) включает выдерживание подкисленного раствора ретентата, полученного на стадии (е), в течение по меньшей мере 2 ч.
11. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный литический агент, который применяют на стадии (b), представляет собой дезоксихолат натрия.
12. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный литический агент, который применяют на стадии (b), представляет собой литический агент неживотного происхождения.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный литический агент неживотного происхождения выбран из группы, состоящей из: декансульфоновой кислоты, трет-октилфеноксиполи(оксиэтилен)этанолов, конденсатов оксида октилфенол-этилена, н-лаурилсаркозината натрия (NLS), лаурилиминодипропионата, додецилсульфата натрия, хенодезоксихолата, гиодезоксихолата, гликодезоксихолата, тауродезоксихолата, таурохенодезоксихолата и холата.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный литический агент неживотного происхождения представляет собой н-лаурилсаркозинат натрия.
15. Способ получения, по существу, очищенных капсульных полисахаридов из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, включая серотип 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19F или 23F, указанный способ включает следующие стадии:
(a) обеспечение ферментативного бульона, который содержит бактериальные клетки, которые продуцируют серотип Streptococcus pneumoniae 1, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F или 23F;
(b) лизирование бактериальных клеток, полученных на стадии (а), литическим агентом с получением лизата клеток, который содержит остатки клеток, растворимые белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды;
(c) осветление лизата клеток, полученного на стадии (b), посредством центрифугирования или фильтрования для удаления остатков клеток с получением осветленного лизата клеток;
(d) ультрафильтрование и диафильтрование осветленного лизата клеток, полученного на стадии (с), при комнатной температуре при нейтральном рН в бессолевых средах для удаления низкомолекулярных примесей и повышения концентрации полисахарида с получением бессолевого ретентата;
(e) понижение рН бессолевого ретентата, полученного на стадии (d), до значения менее чем 4,5, для преципитации белка и нуклеиновых кислот с получением подкисленного раствора ретентата;
(f) выдерживание подкисленного раствора ретентата, полученного на стадии (е), в течение по меньшей мере 2 ч при комнатной температуре для осаждения преципитата, а затем фильтрование или центрифугирование подкисленного раствора ретентата с получением осветленного раствора полисахарида;
(g) фильтрование осветленного раствора полисахарида, полученного на стадии (f), через фильтр с активированным углем;
(h) ультрафильтрование и диафильтрование указанного фильтрованного раствора, полученного на стадии (g), с получением концентрированного очищенного раствора полисахарида; и
(i) фильтрование концентрированного очищенного раствора полисахарида, полученного на стадии (h), с применением стерильного фильтра;
в результате чего получают, по существу, очищенные капсульные полисахариды, включая серотип 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14,18C, 19F или 23F в виде раствора.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что рН на стадии (е) понижают до значения приблизительно 3,5.
17. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (h) включает подведение рН до значения между приблизительно 5,5 и приблизительно 7,5.
18. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (h) включает подведение рН до значения между приблизительно 7,0 и приблизительно 7,5.
19. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (h) включает подведение рН до значения приблизительно 7,4.
20. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что на стадии (е) удаляют по меньшей мере 98% белка из бессолевого ретентата, полученного на стадии (d).
21. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что на стадии (g) удаляют по меньшей мере 90% белка из осветленного раствора полисахарида, полученного на стадии (f).
22. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что указанный фильтр с активированным углем на стадии (g) включает древесный уголь, активированный фосфорной кислотой.
23. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что указанный литический агент, который применяют на стадии (b), представляет собой дезоксихолат натрия.
24. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что указанный литический агент, который применяют на стадии (b), представляет собой литический агент неживотного происхождения.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный литический агент неживотного происхождения выбран из группы, состоящей из: декансульфоновой кислоты, трет-октилфеноксиполи(оксиэтилен)этанолов, конденсатов оксида октилфенол-этилена, н-лаурилсаркозината натрия (NLS), лаурилиминодипропионата, додецилсульфата натрия, хенодезоксихолата, гиодезоксихолата, гликодезоксихолата, тауродезоксихолата, таурохенодезоксихолата и холата.
26. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный литический агент неживотного происхождения представляет собой н-лаурилсаркозинат натрия.
27. Способ получения, по существу, очищенных капсульных полисахаридов из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, включая серотип 19А, указанный способ включает следующие стадии:
(a) обеспечение ферментативного бульона, который содержит бактериальные клетки, которые продуцируют серотип 19А Streptococcus pneumoniae;
(b) лизирование бактериальных клеток, полученных на стадии (а), литическим агентом с получением лизата клеток, который содержит остатки клеток, растворимые белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды;
(c) осветление лизата клеток, полученного на стадии (b), посредством центрифугирования или фильтрования для удаления остатков клеток с получением осветленного лизата клеток;
(d) ультрафильтрование и диафильтрование осветленного лизата клеток, полученного на стадии (с), при приблизительно 4°С при рН, равном приблизительно 6, в натриево-фосфатном буфере для удаления низкомолекулярных примесей и повышения концентрации полисахарида, с получением ретентата;
(e) понижение рН ретентата, полученного на стадии (d), до значения менее чем 4,5 для преципитации белка и нуклеиновых кислот с получением подкисленного раствора ретентата;
(f) выдерживание подкисленного раствора ретентата, полученного на стадии (е), в течение по меньшей мере 2 ч при приблизительно 4°С для осаждения преципитата с последующим фильтрованием или центрифугированием подкисленного раствора ретентата, с получением осветленного раствора полисахарида;
(g) подведение рН осветленного раствора полисахарида, полученного на стадии (f), до значения приблизительно 6 с получением осветленного раствора полисахарида с подведенным рН;
(h) фильтрование осветленного раствора полисахарида с подведенным рН на стадии (g) через фильтр с активированным углем;
(i) ультрафильтрование и диафильтрование указанного фильтрованного раствора, полученного на стадии (h), с получением концентрированного очищенного раствора полисахарида; и
(j) фильтрование концентрированного очищенного раствора полисахарида, полученного на стадии (i), с применением стерильного фильтра;
в результате чего получают, по существу, очищенные капсульные полисахариды, включая серотип 19А в виде раствора.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что рН на стадии (е) понижают до значения приблизительно 3,5.
29. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (i) включает подведение рН до значения между приблизительно 5,5 и приблизительно 7,5.
30. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (i) включает подведение рН до значения между приблизительно 7,0 и приблизительно 7,5.
31. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что диафильтрация на стадии (i) включает подведение рН до значения приблизительно 7,4.
32. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что на стадии (е) удаляют по меньшей мере 98% белка из ретентата, полученного на стадии (d).
33. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что на стадии (h) удаляют по меньшей мере 90% белка из осветленного раствора полисахарида с подведенным рН, полученного на стадии (g).
34. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что указанный фильтр с активированным углем, который применяют на стадии (h), включает древесный уголь, активированный фосфорной кислотой.
35. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что указанный натриево-фосфатный буфер, который применяют на стадии (d), представляет собой 25 мМ фосфат натрия.
36. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что указанный литический агент на стадии (b) представляет собой дезоксихолат натрия.
37. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что указанный литический агент, который применяют на стадии (b), представляет собой литический агент неживотного происхождения.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что указанный литический агент неживотного происхождения выбран из группы, состоящей из: декансульфоновой кислоты, трет-октилфеноксиполи(оксиэтилен)этанолов, конденсатов оксида октилфенол-этилена, н-лаурилсаркозината натрия (NLS), лаурилиминодипропионата, додецилсульфата натрия, хенодезоксихолата, гиодезоксихолата, гликодезоксихолата, тауродезоксихолата, таурохенодезоксихолата и холата.
39. Способ по п.37, отличающийся тем, что указанный литический агент неживотного происхождения представляет собой н-лаурилсаркозинат натрия.
40. Способ производства пневмококковой вакцины, который включает получение, по существу, очищенных капсульных полисахаридов из лизата клеток Streptococcus pneumoniae с помощью способа по любому из пп.1, 2, 13-16, 25-28, 38, 39 и применение указанных, по существу, очищенных капсульных полисахаридов для производства пневмококковой вакцины.
41. Способ по п.40, отличающийся тем, что указанная пневмококковая вакцина содержит полисахарид, конъюгированный с белковым носителем.
42. Состав, содержащий, по существу, очищенные капсульные полисахариды из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, отличающийся тем, что серотип Streptococcus pneumoniae выбран из группы, состоящей из 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, а указанный состав получен согласно способу по п.1.
43. Состав, содержащий, по существу, очищенные капсульные полисахариды из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, отличающийся тем, что серотип Streptococcus pneumoniae выбран из группы, состоящей из 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, а указанный состав получен согласно способу по п.15.
44. Состав, содержащий, по существу, очищенные капсульные полисахариды из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, отличающийся тем, что серотип Streptococcus pneumoniae представляет собой 19А, а указанный состав получен согласно способу по п.27.
45. Капсульный полисахарид серотипа 6А Streptococcus pneumoniae, отличающийся тем, что указанный капсульный полисахарид имеет молекулярный вес от 488,000 до 525,000 Да.
46. Состав, содержащий, по существу, очищенные капсульные полисахариды серотипа 6А Streptococcus pneumoniae по п.45.
47. Капсульный полисахарид серотипа 19А Streptococcus pneumoniae serotype, отличающийся тем, что указанный капсульный полисахарид имеет молекулярный вес от 488,000 до 525,000 Да.
48. Состав, содержащий, по существу, очищенные капсульные полисахариды серотипа 19А Streptococcus pneumoniae по п.47.