Тестирование in vitro остеопластического материала в гелевой форме

Одним из распространенных моногенных заболеваний такого типа является миодистрофия Дюшенна, при которой нарушен синтез белка дистрофина. На экспериментальных моделях мышей и собаках показано, что некоторые типы клеточных линий с выраженными стволовыми свойствами при местной трансплантации в аллогенных условиях оказывают на мышечные ткани значительный терапевтический эффект, оцениваемый по усилению синтеза дистрофина,снижению уровня клеточной гибели и другим признакам дифференци-ровки. Однако продолжительность терапевтического эффекта ограничена во времени. В наших экспериментах однократная трансплантация в сингенных условиях стволовых клеток костного мозга дикого типа усиливала синтез дистрофина через 4—6 мес. только у 2% мышечных волокон. По литературным данным синтез дистрофина также не усиливается при трансплантации мутантным мышам mdx костного мозга дикого типа после смертельного рентгеновского облучения в дозах 7 и 11 Гр. В наших экспериментах на радиационных химерах мышей mdx замена мутантного костного мозга после рентгеновского облучения в дозе 5 Гр на костный мозг дикого типа через 2 мес. вызывала синтез дистрофина только у 1,2% мышечных волокон. Факт транскрипционной инертности трансплантированных стволовых клеток костного мозга, ядра которых входят в состав мышечных волокон, общепризнан. Нам удалось преодолеть транскрипционную инертность ядер трансплантированных стволовых клеток после воздействия на радиационных химер мышей mdx Са-специфи-ческого параметрического (циклотронного) магнитного резонанса, в результате которого синтез дистрофина через 2 мес. после трансплантации был обнаружен у 16% мышечных волокон. Также было показано, что у радиационных химер мышей mdx после облучения в дозе 3 Гр трансплантация стволовых клеток костного мозга дикого типа приводит через 2 и 6 мес. к усилению синтеза дистрофина у 4 и 27% мышечных волокон соответственно. Полученные данные указывают на возможность сравнительно быстрого преодоления транскрипционной инертности трансплантированных стволовых клеток в мышцах и на перспективность дальнейшего изучения замены мутантного костного мозга на костный мозг дикого типа для лечения моногенных заболеваний тканевых систем, которые имеют предшественники — стволовые клетки — в костном мозге.

Г.В. Мкртчян \ К.С. Десятниченко а, А. А. Докторов 3,

С.Г. Курдюмов а, Г.А. Воложин 1

Тестирование in vitro остеопластического

материала в гелевой форме

1МГМСУ, Москва, Россия

2 НПО «ПОЛИСТОМ», Москва, Россия

3 НИЦ БМТ ГНУ ВИЛ АР, Москва, Россия

G.V. Mkrtchyan, K.S. Desyatnichenko, А.А. Doctorov,

S.G. Kurdyumov, G.A. Volozhin

In vitro testing of a gel-formed osteoplastic material

Альтернативой имплантации остеопластического материала в виде керамики, гранул, губок, пластин в костные дефекты с целью их возмещения новообразованной костью, требующей открытого хирургического доступа, может быть использование остеопластического материала в виде геля, мягкой пасты, эмульсии, которые можно вводить в костный дефект с минимальной травматизацией здоровых тканей из шприца или

аналогичного устройства. Материалом такого назначения является «ИНДОСТ-гель-н», разработаный в НПО «ПОЛИСТОМ» (патент РФ № 2360663), выпускаемый там же по ТУ 9391-008-77330104-2006, разрешенный для клинического использования, который получил положительную оценку и пользуется спросом у стоматологов различных специальностей и челюстнолицевых хирургов.

«ИНДОСТ-гель-н» представляет собой композицию из ортофосфатов кальция — гидроксиапатит и трикаль-ций фосфат — в виде гранул и нанодисперсного порошка, комплекса полипептидов, обладающих свойствами факторов роста, из ксенокости, антиоксиданта и гелеобразующей основы — линейного полимера биологического или синтетического происхождения с тиксотропными свойствами. В настоящем сообщении приводятся данные о взаимоотношениях in vitro данного материала с мультипотентными мезенхимальными стро-мальными клетками (ММСК) из тканей пародонта.

Работу проводили с ММСК из губчатого вещества альвеолярного отростка челюсти и надкостницы челюсти, показавшими наилучшие показатели костеобразовательной активности и активности ЩФ. Клетки культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) («ПанЗко», РФ), 10% эмбриональной сыворотки коров («HyClon», Новая Зеландия) и 40 ед./мл гентамицина. Использовали культуральные флаконы площадью 25 см2 («Corning», США), которые инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% углекислого газа в термостате (Sanyo МСО-15АС, Япония). По достижении клетками монослоя их пересевали, используя трипсин («ПанЗко», РФ) или смесь трипсин/Версен («ПанЗко», РФ) по обычной схеме. В работе использовали клетки 8—15 пассажа.

Клетки высаживали в культуральной среде в 24-или 96-луночные планшеты для культивирования клеток («Corning», США) с плотностью 1000 клеток на

1 см2. На следующий день вносили в лунки «Индост-гель+». Клетки с гелевым материалом культивировали

2 и 7 сут. Производили фотографические наблюдения и на определенном сроке для определения количества клеток в лунках производили МТТ-тест, основанный на способности дегидрогеназ в живых клетках восстанавливать водорастворимый желтый 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в темно синий водонерастворимый формазан, который накапливается внутри клетки. Количество образовавшегося формазана, пропорциональное числу жизнеспособных клеток, измеряли спектрофотометрически на плашечном денситометре Chameleon V (Hidex, Финляндия).

Для индукции остеогенной дифференцировки клетки высаживали в культуральной среде в 24- или 96-луночные планшеты для культивирования клеток («Corning», США) в плотности 20 ООО клеток на 1 см2. На следующий день уже после внесения гелевого материала клетки переводили в среду следующего состава: среда DMEM, 10% эмбриональной сыворотки коров, 50 мкМ аскорбат-2-фосфата, 10 мМ р-глицеро-фосфата и 0,1 мкМ дексаметазона (все реактивы Sigma, США). Среду меняли каждые 3^4 сут. В качестве маркера остеогенной дифференцировки определяли активность щелочной фосфатазы (ЩФ). Активность щелочной фосфатазы определяли на сроках от 4-го до 21-го дня с использованием реактивов набора «Щелочная фосфатаза-Ново» (В-8327, Вектор-Вест, Россия) согласно инструкции производителя.

Контролем служили клетки, культивировавшиеся без гелевого препарата. Культуру клеток наблюдали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diavert (Nikon, Япония). Фотографии делали цифровой камерой Nikon D5000. Цифровое усиление контраста проводили с помощью программы Image J. Люминесцентную микроскопию проводили с помощью микроскопа Olympus ВХ61 (Япония). Использовали цифровую камеру CoolSNAP (США).

В результате проведенных исследований было выяснено, что оба вида ММСК для сохранения жизнеспособности требуют доступа к культуральному пластику. При микроскопическом наблюдении в течение нескольких дней стало ясно, что оба типа клеток прикрепляются к пластику в свободных от геля местах и сохраняют нормальную структуру и жизнеспособность по МТТ-тесту. Таким образом, можно полагать, что изучаемый материал не обладает выраженной цитотоксичностью, однако клетки не в состоянии использовать его как непосредственный субстрат для роста. Со временем такие неприкрепившиеся клетки погибают от анойкиса (апоптоз от невозможности прикрепиться).

Для определения влияния гелевого материала на пролиферацию клеток сначала высаживали клетки в лунки, а затем добавляли «Индост-гель + ». В этих условиях клетки достаточно хорошо росли под гелем. Их количество после недели культивирования было сходным с контролем, что позволяет утверждать об отсутствии отрицательного влияния материала на пролиферацию.

При исследовании индукции дифференцировки в культуре положительный результат был получен после исключения аскорбата из состава индуцирующей среды и снижении количества добавляемого гелевого материала. В этом случае на 21-е сут. культивирования активность ЩФ в опыте была существенно выше (р<0,05), чем в контроле. Показателем стимулирования остеогенной дифференцировки было также более высокое отложение минерализованного матрикса. В тот же срок культивирования гелевый материал подвергается контракции в результате объединения клетками мелких частиц в более крупные образования с тем, чтобы компактизовать и изолировать гель. Похожее действие производят фибробласты при добавлении к ним гранул коллагена. По биологическому смыслу это действие in vivo направлено на очистку раны.

В.Н. Никандров, О.Н. Жук

Компоненты перицеллюлярного протеолиза

в биотехнологии клеток нервной ткани

Институт физиологии НАН Беларуси,

Минск, Республика Беларусь

V.N. Nikandrov, O.N. Juk

The components of pericellular proteolysis

biotechnology in cells of nervous tissue

Обобщены результаты собственных исследований роли плазминогена и стрептокиназы в жизнедеятельности клеток нервной ткани в органотипических, диссоциированных культурах чувствительных и симпатических ганглиев, неокортекса, а также перевиваемых линий глиомы С6, нейробластомы IMR-32 и феохро-моцитомы РС12.

В дефицитной по белкам сыворотки крови питательной среде плазминоген и стрептокиназа стимулировали жизнеспособность клеток, и в концентрации

10-7—10~10 М защищали клетки чувствительных, симпатических ганглиев, неокортекса и перевиваемых линий от повреждающего действия Н202 (0,0001 М), NH4CI (0,01 М), глутамата, АТР (0,001 М) в анионной форме и охлаждения. Даже кратковременная экспозиция (20 мин) клеток глиомы С6 или феохромоцито-мы РС12 с этими белками в концентрации 10~9 М вела к резким изменениям перицеллюлярного или внутриклеточного АТР- или Са2+-активируемого протеолиза. В присутствии изучаемых белков активировались биосинтетические процессы в клетках нервной ткани, изменялась их энзиматическая активность.

Исследуемые белки в ряде случаев ускоряли созревание культур ткани, улучшали адгезивность, обеспечивали высокую жизнеспособность, увеличивали количество отростков и их арборизацию. Электронная микроскопия выявила характер структурных перестроек клеток нервной ткани, отражающих нейротрофические свойства плазминогена или стрептокиназы. Стрептокиназа способна регулировать водно-элетролитный баланс клетки.

Обсуждается значение полученной совокупности результатов в фундаментальном и прикладном аспектах, включая проблемы биотехнологии нервной ткани.

А.В. Новицкая, А.А. Смикодуб, М.П. Демчук,

И.В. Архипенко

Фетальные стволовые клетки в лечении метаболического синдрома

Центр эмбриональных тканей «ЭмСелл»

Киев, Украина infocenter@emcell.com

A.V. Novytska, А.А. Smikodub, М.P. Demchuk, I.V. Arkhipenko Fetal Stem Cells in Metabolic Syndrome

Под наблюдением находились 12 пациентов

2 типа легкой степени (утренняя гипергликемия, аг-люкозурия) с гиперинсулинемией и повышением уровня +

циентов имели место нарушения липидного обмена: повышение уровня холестерина, триглицеридов, повышенная концентрация липопротеидов низкой плотности (ЛНП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), снижение концентрации липопротеидов высокой плотности (ЛВП) и абдоминальное ожирение ++

+

Всем пациентам проведена трансплантация фетальных гемопоэтических и негемопоэтических стволовых клеток (СК) мезенхимального и эндодермального происхождения, полученных из ростковых зон внутренних органов трупов фетусов человека 4—8 нед. гестации.

После введения пациенты наблюдались на протяжении 1—5 лет. Через 1—2 мес. после трансплантации отмечали постепенное снижение артериального давления с дальнейшей его стабилизацией в течение последующих 2—3 месяцев — 135—140/80—90 мм рт. ст. на фоне снижения дозы гипотензивных препаратов у 83% пациентов. Тест на толерантность к глюкозе, проведенный через 7—9 мес. после лечения, показал улучшение углеводного обмена у пациентов с нару-