СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНЫХ РАН МЕТОДОМ АНТИМИКРОБНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ
AGENT FOR THE TREATMENT OF PURULENT WOUNDS BY THE METHOD OF ANTIMICROBIAL PHOTODYNAMIC THERAPY

Изобретение относится к фармацевтической химии, а именно к лекарственной форме (ЛФ) фотосенсибилизатора для антимикробной фотодинамической терапии (АФДТ).
Разработанная нами ЛФ предназначена для АФДТ, при которой фотосенсибилизатор под действием света образует цитотоксический синглетный кислород, инициирующий окислительную деструкцию патогенных микроорганизмов и гибель вирусов, грибов и бактерий, включая их антибиотикорезистентные штаммы. В отличие от антибиотиков, противомикробное действие ФДТ не приводит к развитию резистентности микроорганизмов к лечению.
Действующим веществом в исследуемом препарате является Холосенс, представляющий собой С-холинилзамещенный фталоцианин цинка со средним содержанием холинильных заместителей около 7.5, структурная формула которого приведена ниже.
Ранее это соединение было выбрано нами как наиболее эффективный фотосенсибилизатор для АФДТ из ряда синтезированных соединений этого класса (Патент РФ №2282647 (2006), опубл. 27.08.2006; Kuznetsova N.A., Makarov D.A., Yuzhakova О.А. et al. Photosensitizing properties of polycationic Al and Zn Phthalocyanines. J. Porphyrins Phthalocyanines. 2006. Vol. 10. №4-6. P. 627).
2
2
Холосенс обладает высокой тропностью к бактериальным клеткам, имеет высокий (0,65) квантовый выход бактерицидного агента - синглетного кислорода и эффективное поглощение видимого света в области 680-683 нм - в так называемом «терапевтическом окне», области спектрального пропускания тканей. При этом для достижения фотоинактивации бактерий требуются дозы облучения, безопасные для окружающих тканей {in vitro не более 15 Дж/см, in vivo не более 30 Дж/см).
Известно применение Холосенса в виде геля или пленки (Патент РФ №2465899; опубл. 10.11.2012), содержащих в качестве вспомогательных компонентов гидроксиэтилцеллюлозу, блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида, пропиленгликоль и бензалконий хлорид.
Однако, учитывая разнообразие возможных ран, не всегда удобно применять для лечения гели и пленки. Гели могут частично оставаться на ранах, а пленки неплотно прилегать к поверхности раны. Во многих случаях эффективнее рану обработать раствором фотосенсибилизатора, приготовленным непосредственно перед применением.
Описано применение растворов Холосенса, наносимых на поврежденные участки, в том числе и на гнойные раны, с помощью пропитанных раствором марлевых салфеток (Патент РФ №2282647 (2006), опубл. 27.08.2006). При этом растворы получают из навесок препарата, взятых с использованием расфасовок субстанций. Поскольку Холосенс является очень эффективным фотосенсибилизатором, для лечения методом АФДТ его используют в очень малых количествах. Готовая ЛФ в каждом флаконе должна содержать около 10 мг Холосенса для получения 500-1000 мл раствора, что достаточно для многократной обработки любой раны. Выпускать готовый препарат с такой маленькой навеской не технологично, и по описанным в литературе нормам масса вещества во флаконе должна быть не менее 50 мг.
Задача данного изобретения состоит в разработке готовой ЛФ препарата Холосенс, удобной в применении и обладающей высокой эффективностью при лечении гнойных ран. Поставленная задача решается включением в препарат наполнителя путем лиофильной сушки его водного раствора с Холосенсом.
Исследована возможность использования двух наполнителей: лактозы и D-маннита. Оба эти вещества хорошо растворяются в воде, нетоксичны и образуют прозрачный раствор с Холосенсом. Оптимальное соотношение Холосенса и наполнителя составляет от 10 мг:40 мг до 10 мг:60 мг. Преимущество готовой ЛФ с D-маннитом по сравнению с лактозой состоит в более равномерной окраске получаемого порошка и в более быстром высушивании раствора. Поэтому лекарственный препарат предлагается получать с использованием D-маннита.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами.
Пример 1
Технологический процесс производства ЛФ препарата Холосенс состоит из следующих стадий:
- приготовление исходного раствора Холосенса и D-маннита;
- стерилизующая фильтрация и разлив раствора во флаконы;
- лиофильная сушка раствора.
Для приготовления раствора используют субстанцию Холосенс, D-маннит и воду для инъекции. Концентрацию раствора рассчитывают таким образом, чтобы 10 мг Холосенса находилось в 2-х мл раствора.
а) Для получения ГЛФ с соотношением Холосенса и наполнителя 10 мг: 60 мг применяют раствор, содержащий 6,4 г Холосенса, 38,4 г D-маннита и 1280 мл воды. Для фильтрации использовали фильтры капсульного типа с размерами пор 0,45 мкм (предфильтр) и 0,2 мкм (стерилизующий фильтр). Раствор разливали во флаконы нейтрального стекла по 2 мл в каждый флакон.
Для сушки раствора флаконы с раствором, прикрытые пробками, располагали на полках лиофильной сушилки. Время лиофильной сушки составляло 23-25 часов при температуре от минус 50°С до плюс 25°С. По окончании лиофильной сушки флаконы в автоматическом режиме укупоривали в атмосфере азота, вдавливая пробки в горлышко флаконов при подъеме полок в установке. Укупоренные флаконы обкатывали алюминиевыми колпачками. Полученная ЛФ представляет собой сине-зеленый равномерно окрашенный порошок без запаха, легко растворимый в воде, умеренно гигроскопичный.
б) Для получения ГЛФ с соотношением Холосенса и наполнителя 10 мг: 40 мг применяют раствор, содержащий 6,4 г Холосенса, 25,6 г D-маннита и 1280 мл воды.
Количественное определение содержания Холосенса в растворе с D-маннитом проводят так же, как и в растворе без наполнителя - методом спектроскопии, так как D-маннит не поглощает свет в области максимума поглощения Холосенса и не влияет на его интенсивность.
Пример 2
Проверка антимикробной активности ЛФ препарата Холосенс
Проверку активности ЛФ проводили на культурах типовых штаммов бактерий Staphylococcus aureus и Escherichia coli как представителей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Для культивирования бактерий использовали Columbia Agar. Культивирование проводили в стандартных условиях в течение суток в термостате при 37°С. Материал агаровых культур суспендировали в растворе для инфузий, содержащем 0,9% хлорида натрия, до показателя мутности 1,0 McF с использованием денситометра "Densimat" ("bioMerieux", Франция).
2
Препарат вносили в суспензии бактерий в концентрации в пересчете на действующее вещество 0,5-2 мкг/мл, а затем через 15 мин инкубации в отсутствие освещения 2 мл суспензии клеток облучали с использованием галогеновой лампы источника ЭКОМП с широкополосным фильтром КС-15 с пропусканием света с длиной волны более 640 нм в дозе 5 Дж/см. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли после высева 0,1 мл суспензии бактерий на агаровую среду стандартным способом множественных разведений и культивирования в течение 1 суток при 37° в режиме термостатирования в затемненных условиях. Все измерения проводили в трехкратной повторности.
По результатам первичных данных подсчета КОЕ строили дозовые зависимости фотодинамической инактивации КОЕ, по которым графически определяли концентрации Холосенса, вызывающие гибель 99,9% КОЕ в суспензиях бактерий. Результаты измерений приведены в таблице 1.
Таким образом, присутствие в готовой ЛФ D-маннита не уменьшает активность Холосенса в опытах АФДТ in vitro.
Пример 3
Исследования in vivo
Исследования in vivo проводили на моделях гнойных ран собак, у которых моделировались кожно-мышечные гнойные раны, инфицированные микробными ассоциациями госпитальных грам(+)- и грам (-) штаммов Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.

2
2
Холосенс наносили аппликационно. На рану накладывали марлевую салфетку, пропитанную раствором ГЛФ Холосенс с концентрацией действующего вещества, 8 мкг/мл (с расчетом 0,6 мкг/см) Через 10 минут салфетки удаляли и раны и облучали в течение 10 мин полным светом источника ЭКОМП с интенсивностью 50 мВт/см на расстоянии 5 см от конца световода.
Через 3 суток после фотодинамической обработки наблюдался процесс затягивания раны. Через 6 суток после фото динамической обработки наблюдалось практически полное заживление ран животных.
В отсутствие лечения заживление ран наблюдалось через 9±1 суток.
Таким образом, фотодинамическая обработка с использованием ГЛФ Холосенс является эффективной и уменьшает срок заживления инфицированных ран в среднем с 9±1 до 6 суток.