Способ выделения микровезикул из растений семейства амарантовых
METHOD FOR ISOLATING MICROVESICLES FROM PLANTS OF THE AMARANTH FAMILY

Изобретение относится к способам выделения биологически активных веществ из растительного сырья, в частности, к способам получения микровезикул (диаметром 50-1200 нм) из растений семейства амарантовых. Заявленный способ может быть использован в медицинской, косметической и пищевой промышленности.
Из уровня техники известен метод выделения микровезикул из культуральной среды, включающий цетрифугирование, последовательное ультрацентрифугирование, растворение полученного осадка в ФСБ и повторное центрифугирование см. стр. 25, первые два абзаца по ссылке https://www.researchgate.net/publication/323269152_Isolation_of_extracellular_micro-vesicles_from_cell_culture_medium_Comparative_evaluation_of_methods.
Основным недостатком метода, перечисленного под пунктом 1 на стр. 25, является недостаточная эффективность, т.к. известный метод не позволяет отделить по размеру микровезикулы от остальных частиц, находящихся в полученном осадке. Другим недостатком является использование в качестве материала-источника выделения экзосом культуральной клеточной среды, получение которой требует затрат определенных реагентов (питательная среда, сыворотка, L-глутамин, пируват натрия, антибиотики, растворы для отмывки типа раствора Хэнкса), заказ и получение зарегистрированных клеточных линий, ведение полученных клеточных линий или получение клеточной культуры с последующей необходимостью описания данной клеточной культуры. Перечисленные этапы требуют определенных материальных и временных затрат, что делает данный метод получения микровезикул трудоемким и затратным.
Техническим результатом предлагаемого нами способа выделения микровезикул является возможность выделения микровезикул из растений семейства амарантовых.
Вышеприведенный технический результат достигается при использовании способа выделения микровезикул, при котором осуществляют сбор растений семейства амарантовых, которые измельчают до получения гомогенизированной смеси, из которой затем отделяют жидкую фазу посредством фильтра грубой очистки, которую последовательно центрифугируют в течение 30 минут при 3000 g и в течение 60 минут при 10000 g соответственно для избавления полученной смеси от крупных частиц - клеточных конгломератов и единичных клеток, затем проводят ультрацентрифугирование отобранного супернатанта в течение 90 минут при 150000 g, затем полученный осадок суспендируют в натрий-фосфатном буфере в соотношении 1:10 и повторно ультрацентрифугируют в течение 90 минут при 150000 g. Этапы ультрацентрифугирования необходимы для избавления смеси от апоптотических телец, белковых конгломератов и белков >30 kDa. Далее полученный осадок повторно суспендируют в натрий-фосфатном буфере в соотношении 1:10, после чего проводят фильтрацию посредством фильтра с диаметром пор 1,2 μм, что позволяет отделить микровезикулы искомого спектра - до 1200 нм - от остальных частиц, находящихся в полученном осадке. Кроме того, нами экспериментально установлено, что при такой последовательности операций и режимах, заявленный способ позволяет максимально эффективно выделить микровезикулы из растений семейства амарантовых.
Пример выполнения заявленного способа:
В автоматический измельчитель помещают 10 г листьев, цветов и корней (возможно использовать любые пропорции - не влияет на получение заявленного технического результата, т.к. микровезикулы содержатся в различных частях растений примерно в равных количествах) растений Amaranthus blitoides S.Wats, измельчают, до получения гомогенной (однородной) смеси. Затем отбирают жидкую фазу посредством фильтрации через сетку с диаметром пор пор 1-2 мм. Далее проводят последовательное центрифугирование в течение 30 минут при 3000 g и в течение 60 минут при 10000 g соответственно. Затем полученный осадок суспендируют в натрий-фосфатном буфере в соотношении 1:10 и повторно ультрацентрифугируют в течение 90 минут при 150000 g, далее полученный осадок повторно суспендируют в натрий-фосфатном буфере в соотношении 1:10, после чего проводят фильтрацию посредством фильтра с диаметром пор 1,2 μм.
Затем 500 мкл полученного раствора исследовали методом фотонной корреляционной шежтроскопии (Nanophox Sympatec GmbH, Германия), где обнаружили спектры в районе 50-1200 нм, что свидетельствует о наличии в растворе микровезикул заявленного спектра.