СРЕДСТВО ПРОФИЛАКТИКИ ПТИЧЬЕГО ГРИППА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
MEDICATION FOR PREVENTION OF BIRD FLU IN MAMMALS

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и может быть использовано при создании профилактических препаратов против птичьего гриппа.
Традиционными способами профилактики различных вирусных заболеваний, в частности птичьего гриппа, являются вакцины на основе живых или инактивированных вирусов. В последние годы для создания таких вакцин стали использовать ДНК вирусов и фрагменты вирусной ДНК. Дополнительно к вакцинации или в виде самостоятельных лечебно-профилактических средств используют специфичные для каждого вируса иммуноглобулины. Все известные средства профилактики птичьего гриппа, основанные на использовании вакцин, а также специфичных иммуноглобулинов, имеют ряд общих недостатков:
1. Технология получения вакцин из сыворотки крови людей, переболевших птичьим гриппом, с учетом мутаций вируса и региональных разновидностей штаммов птичьего гриппа, достаточно сложный и дорогостоящий процесс.
2. Вакцинация практически всегда сопровождается определенным процентом осложнений иммунологического характера.
3. Эффективность вакцинации не всегда достаточно высока, кроме того, для профилактики большинства вирусных заболеваний нужна периодическая ревакцинация.
Известен способ лечения и профилактики птичьего гриппа, включающий введение в организм человека композиции, состоящей из IgG-, IgM-антител или их фрагментов (F(ab').sub.2) или их комбинации, полученных из плазмы здоровых людей, переболевших птичьим гриппом или подвергнутых ранее вакцинации против этого заболевания, устойчивых к нему. Композиция может содержать дополнительные терапевтические агенты, вакцину в виде ослабленного вируса, адъюванты или их комбинацию. Адъюванты включают в себя минеральные соли, поверхностно-активные агенты, микрочастицы, виросомы, сапонины, протеосомы, иммуностимулирующие комплексы, витамины Е, А, бактериальные продукты, олигодеоксинуклеотиды, цитокины, гормоны, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, дегидроэпиандростерон, 1,25-дигидрокси-витамин D3; полианионы, носители, белки теплового шока, водно-масляные эмульсии и их комбинации (1). Недостатком известного способа является крайне ограниченный контингент людей, переболевших или вакцинированных против птичьего гриппа, разнообразие мутантных вариантов вируса на различных территориях, что делает невозможным применение данного способа при эпидемиях или пандемиях.
Известна вакцина против вируса птичьего гриппа H5N1, включающая реплицирующиеся (с дефицитом в Е1 или Е3) аденовирусные векторы, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид вируса гриппа А, а именно гемагглютинин НА или его субъединицу НА1, являющиеся производными соответствующего полипептида вируса ATVietnam/l 203/2004 (H5N1), и фармацевтически приемлемый носитель. При экспрессии вектора в организме животного или человека полипептид индуцирует наработку антител против вируса птичьего гриппа (2). Недостатком известного средства является то, что оно узкоспецифично и создано на основе вьетнамского штамма вируса птичьего гриппа, т.е. не ориентировано на штаммы вируса H5N1, распространенные в других регионах, например Сибири.
Известно использование интерферона типа I субтипа альфа, в заданном сочетании и пропорциях интерферонов альфа 1, 2, 8, 10, 14 и 21, интерферона-бета и гликозилированного и нативного интерферона для лечения и профилактики птичьего гриппа типа А, имеющего гемагглютинин субтипов Н5, Н7 или Н9, соответствующий штаммам вируса H5N1, H9N2, H7N2, H7N3 или H7N7. Дополнительно предлагается использование антивирусных препаратов из группы: рибавирин, амантандин, римантандин, оселтамивир или занамивир. Предполагается, что предложенное средство будет эффективно и по отношению к вновь появляющимся мутантным вирусам (3). Недостатками предложенного средства является весьма высокая иммуногеннность и аллергогенность препаратов интерферона, которая связана с его полипептидным строением. Это ограничивает возможность широкого его использования в качестве профилактического средства.
В последние годы снижение иммунобиологической резистентности рассматривается как ключевое патогенетическое звено в развитии многих заболеваний бактериальной, вирусной и сочетанной этиологии. В настоящее время известны различные фармацевтические субстанции для стимуляции иммунного ответа как природного происхождения, так и полученные синтетическим путем. Из природных стимуляторов иммунитета наибольшую популярность приобрели полисахариды, выделяемые из растительного и микробиологического сырья.
Известно, что стандартизованный экстракт корней эхинацеи {Echinacea purpurea) обладает противовирусными свойствами против птичьего гриппа (Pleschka et al. 2009), однако профилактический эффект данного средства показан только на культуре клеток (4).
5
Известна фармацевтическая композиция, обладающая иммуностимулирующими, противовирусными свойствами, включающая полисахарид из корней Echinacea angustifolia, имеющий молекулярную массу 1,3×10 Да, состоящий из рамнозы, арабинозы, галактозы и галактуроновой кислоты в соотношении 0,5:2,5:1,75:10,25, причем он имеет остов с чередующимися прямыми и разветвленными участками (5). Иммуностимулирующий эффект известной композиции основан на ее способности стимулировать продукцию гамма-интерферона Т-лимфоцитами мышей. Известная композиция понижает в эксперименте смертность мышей, например, при вирусной инфекции. Недостатком известной композиции является наличие побочных аллергических реакций, свойственных для полисахаридов растительного происхождения. Кроме того, профилактическая эффективность известного средства при птичьем гриппе не установлена.
Известна фармацевтическая композиция, включающая водорастворимый полисахарид, выделенный из Aloe vera, с молекулярным весом более 2 млн. Да, содержащая гликозилированные компоненты - глюкозу, галактозу, маннозу и арабинозу и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель (6). Известная композиция может быть применена в форме инъекций, липосом, таблеток, в составе диетических добавок (внутримышечно, per os). Известная композиция обладает иммуностимулирующим, опосредованным противовирусным и антибактериальным действием и применяется при иммунодефиците, раке, бактериальных, вирусных и грибковых инфекциях, лечении травм у человека и животных. Известная композиция обладает теми же недостатками, что и описанная выше.
В последние годы в качестве средств лечения вирусных заболеваний, в том числе птичьего гриппа, стали использовать антиметаболиты на основе модифицированных нуклеозидов, производные адамантана и синтетические ингибиторы вирусной нейраминидазы.
Так, на культуре клеток и модели грызунов в России показана эффективность применения рибавирина, амантадина, ремантадина, оселтамивира, занамивира, арбидола по отношению к инфекции вируса птичьего гриппа H5N1 (7).
Согласно рекомендациям Американского комитета педиатров по инфекционным заболеваниям, римантадин и амантадин являются менее предпочтительными в сравнении с занамивиром и оселтамивиром, т.к. к первым достаточно быстро развивается резистентность вируса птичьего гриппа (8).
Оселтамивир рекомендован Всемирной организацией здравоохранения для лечения птичьего гриппа H5N1 у человека (9). Несмотря на это оселтамивир, как и другие ингибиторы нейраминидазы, эффективны только при приеме в первые 48 часов после инфицирования и не могут быть использованы как сезонное профилактическое средство, а лишь в период вспышки заболевания (Jefferson Т., 2006).
Наиболее близким к заявляемому средству является фармацевтическая композиция с синтетическим индуктором интерфероногенеза, содержащая N-амфоглюкаминовую соль акридонуксусной кислоты (циклоферон) и воду для инъекций в качестве фармацевтического наполнителя (10). Известная композиция обладает иммуностимулирующей, противовирусной активностью и применяется в качестве лечебно-профилактического средства при вирусных заболеваниях, включая птичий грипп.
Препарат циклоферон является синтетическим индуктором эндогенного интерферона с широким спектром противовирусной, иммуномодулирующей, противовоспалительной, антипролиферативной, противоопухолевой активности, нормализующий различные звенья иммунитета в зависимости от исходного уровня. При введении в организм больных циклоферон одновременно действует на возбудителя заболевания (этиотропный эффект) и стимулирует специфическую (иммунитет) и неспецифическую (интерферон) резистентность. Полифункциональность действия во многом объясняет широкий спектр клинической лечебной и профилактической противовирусной эффективности циклоферона, в том числе для вируса птичьего гриппа (11).
Однако циклоферон, как низкомолекулярный индуктор интерферона, в отличие от полисахаридов, слабо активирует систему мононуклеарных фагоцитов, в частности фагоцитоз, что, возможно, объясняет его недостаточную эффективность для профилактики тяжелых вирусных заболеваний, например таких, как птичий грипп.
Технической задачей настоящего изобретения является повышение эффективности средства профилактики птичьего гриппа у млекопитающих.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве такого средства используют окисленный декстран с молекулярной массой 35-60 кДа, в концентрации 0,4-4,0 мас.% в фармацевтически приемлемом растворителе.
Описание изобретения
Заявленное средство профилактики птичьего гриппа включает в качестве активного компонента окисленный декстран с молекулярной массой 35-60 кДа в концентрации 0,4-4,0 мас.% в фармацевтически приемлемом растворителе.
Окисленный декстран представляет собой декстран, содержащий карбонильные группы. Он может быть получен известными способами на основе химического или радиационного окисления декстрана В частности, окисленный декстран может быть получен химическим путем, например путем выделения фракций декстрана из коммерческого препарата «Реополиглюкин», последующего окисления декстрана периодатом натрия и осаждения окисленного декстрана этанолом (12). Известны модификации данного метода, отличающиеся использованием дополнительных способов очистки окисленного декстрана от примесей (13-16). В качестве окислителя декстрана используют также перманганат калия (17).
Окисленный декстран может быть также получен в соответствии со способом, описанным в евразийском патенте на изобретение №011718 (17), путем окисления декстрана перманганатом калия в кислой среде при нагревании (80-100°С), после чего примеси удаляют путем отделения жидкости от осадка, выпавшего на стадии окисления декстрана и содержащего двуокись марганца. Окисленный декстран осаждают из надосадочной жидкости этанолом. В качестве исходного продукта для получения заявленного средства используют декстран с молекулярной массой 35-60 кДа в виде водного или водно-солевого раствора концентрации 1-10%.
В качестве фармацевтически приемлемого растворителя могут быть использованы вода для инъекций или физиологический раствор или фармацевтически приемлемый буферный раствор, например фосфатный буфер рН 7.3-7.5 и др.
Механизм действия заявленного средства при птичьем гриппе пока не установлен.
Примеры конкретного выполнения.
Для проверки применимости заявленного средства для профилактики птичьего гриппа получили три варианта средства следующими способами:
Пример 1. Окисленный декстран получали согласно евразийскому патенту №011718 (17). Для этого 10% водный раствор декстрана с молекулярной массой 35 кДа нагревали на кипящей водяной бане до температуры 100°С, прибавляли к нему 35%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 2% от объема раствора декстрана. Смесь перемешивали и прибавляли к ней 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 1% от исходного объема декстрана. Реакционную смесь нагревали до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца. Надосадочную жидкость сливали, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали с помощью фильтровальной бумаги. К полученному фильтрату прибавляли два объема 96° этанола, смесь нагревали до температуры 60°С и перемешивали. Надосадочную жидкость (после выпадения осадка окисленного декстрана) сливали, выпавший в осадок окисленный декстран промывали 1/4 объема 96° этанола, высушивали при температуре 50°С в термостате. Выход целевого продукта составлял 95% от расчетного. Использование перманганата калия позволило снизить содержание в окисленном декстране цитотоксичных примесей.
Для получения раствора заявляемого средства 0,4 г сухого очищенного окисленного декстрана растворяли в 99,6 мл воды для инъекций и полученный раствор пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. В результате получали заявляемое средство следующего состава:
1. Окисленный декстран с мол. массой 35 кДа - 0,4 мас.%.
2. Вода для инъекций - до 100 мас.%.
Пример 2. Окисленный декстран, очищенный от цитотоксических примесей получали согласно евразийскому патенту №011718 (17). Для этого 10% водный раствор декстрана (коммерческое название «Реополиглюкин») с молекулярной массой 60 кДа нагревали на кипящей водяной бане до температуры 100°С, прибавляли к нему 15%-ный раствор фосфорной кислоты в количестве 2% от объема раствора декстрана, смесь перемешивали и прибавляли 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 6% от исходного объема «Реополиглюкина». Реакционную смесь нагревали до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца, надосадочную жидкость сливали, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали с помощью фильтровальной бумаги. К полученному фильтрату прибавляли два объема 96° этанола, смесь нагревали до температуры 70°С и перемешивали, после выпадения осадка окисленного декстрана надосадочную жидкость сливали, выпавший в осадок окисленный декстран промывали 1/4 объема 96° этанола, высушивали при температуре 45°С в термостате. Выход целевого продукта составлял 92% от расчетного.
Для получения раствора заявляемого средства 2,0 г сухого очищенного окисленного декстрана растворяли в 98 мл 0,01 М Трис-HCl буфера с рН 7,4 и полученный раствор пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. В результате получали заявляемое средство следующего состава:
1. Окисленный декстран с молекулярной массой 60 кДа - 2,0 мас.%.
2. 0,01 М Трис-HCl буфер с рН 7,4 - до 100 мас.%.
Пример 3. Окисленный декстран, очищенный от цитотоксических примесей получают следующим образом. 10% водный раствор декстрана с молекулярной массой 35 кДа облучали на ускорителе электронов потоком ускоренных электронов (поглощенная доза 3,5-5,0 Мрад). К облученному раствору прибавляли два объема 96° этанола, смесь нагревали до температуры 80°С и перемешивали. После выпадения осадка окисленного декстрана надосадочную жидкость сливали, выпавший в осадок окисленный декстран очищали от цитотоксичных примесей путем промывания 1/4 объема 96° этанола, затем высушивали при температуре 60°С в термостате. Выход целевого продукта составлял 97% от расчетного.
Для получения заявленного средства 4,0 г сухого очищенного окисленного декстрана растворяли в 96 мл физиологического раствора, и полученный раствор пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. В результате получали заявляемое средство следующего состава:
1. Очищенный от цитотоксических примесей окисленный декстран молекулярной массы 35 кДа - 4,0 мас.%.
2. Физиологический раствор - до 100 мас.%.
Профилактические противовирусные свойства заявляемого средства исследовали на беспородных мышах следующим образом.
Мышей разделяли на три экспериментальные и две контрольные группы.
Мышам экспериментальной группы №1 за 2 суток до заражения вирусом внутривенно вводили заявляемое средство, приготовленное, как описано в примере №1, в количестве 0,2 мл.
Мышам экспериментальной группы №2 за 2 суток до заражения вирусом внутривенно вводили заявляемое средство, приготовленное как описано в примере №2 в количестве 0,2 мл.
Мышам экспериментальной группы №3 за 2 суток до заражения вирусом внутривенно вводили заявляемое средство приготовленное как описано в примере №3 в количестве 0,2 мл.
Мышам контрольной группы №1 внутривенно вводили циклоферон в суточной дозе 20 мг/мышь за 2 суток до заражения вирусом.
Мышам контрольной группы №2 вводили 50 мкл (по 25 мкл в каждую ноздрю) фосфатного буфера (рН 7.2) за 2 дня до заражения вирусом.
50/50 мкл
Мышей экспериментальных групп 1-3 через 2 дня после приема заявленного профилактического средства, а также мышей контрольных групп 1-2 через 2 дня после введения циклоферона или фосфатного буфера соответственно заражали вирусом птичьего гриппа. Непосредственно перед заражением размораживали аликвоту аллантоисной жидкости с известным титром вируса H5N1 (предварительно оттитрованной на куриных эмбрионах, мышах). Подготавливали разведения аллантоисной жидкости в фосфатном буфере (рН 7.2) до титра 10 МЛД. Вводили препарат вируса в объеме 50 мкл (по 25 мкл в каждую ноздрю). Для введения использовали автоматические пипетки с переменным объемом 20-200 мкл с наконечником 20-100 мкл.
Учитывали количество погибших животных до 14 дня после заражения в каждой группе, и по их доле от исходного количества судили о выживаемости мышей в экспериментальных и контрольных группах. Результаты исследования представлены в таблице.
Из таблицы видно, что летальность в экспериментальных группах животных, которым перед заражением вирусом птичьего гриппа вводили внутривенно заявляемое средство, значительно ниже, чем в контрольных группах, что свидетельствует о высокой профилактической активности заявляемого средства против птичьего гриппа у млекопитающих.
Источники информации
1. Заявка на патент США №20070092524. Способ лечения и профилактики инфекции птичьего гриппа. Дата публ. 2007.04.26. МПК A61K 39/42.
2. Заявка на патент США №20070003576. Вакцины для быстрого ответа на пандемию птичьего гриппа. Дата публ. 2007.01.04. МПК A61K 39/145, C12N 15/861.
3. Международная заявка на патент WO 2006082435. Способ и применение композиций интерферона для лечения птичьего гриппа. Дата публ. 2006.08.10. МПК A61K 38/21, А61Р 31/16, А61Р 31/00.
4. Pleschka S., Stein М., Schoop R., Hudson J.B. Anti-viral properties and mode of action of standardized Echinacea purpurea extract against highly pathogenic avian Influenza virus (H5N1, H7N7) and swine-origin H1N1 (S-OIV) // Virol J. 2009, No. 6. P.197.
5. Патент РФ №2308460 Полисахарид из корней Echinacea angustifolia, способ его получения, фармацевтическая композиция. Дата публ. 2007.10.20. МПК С08В 37/00, С08В 37/18, A61K 31/715, А61Р 37/00.
6. Патент США №№7196072. Фракция высокомолекулярного полисахарида из Aloe vera с иммуностимулирующими свойствами. Дата публ. 2007.03.27. МПК A61K 31/715, С08 В 37/00.
7. Ленева И.А., Шустер A.M. Противовирусные этиотропные химиопрепараты: эффективность против вирусов гриппа А подтипа H5N1 // Вопросы вирусологии. 2006. Т.51. №5. С.1-8.
8. American Academy of Pediatrics Committee on Infection Diseases. Antiviral therapy and prophylaxis for influenza in children // Pediatrics. 2007. V.119. N.4. P.852-860.
9. Schunemann H.J., Hill S.R., Kakad M., Bellamy R., Uyeki T.M., Hayden F.G. et al. WHO Rapid Advice Guidelines for pharmacological management of sporadic human infection with avian influenza A (H5N1) virus // Lancet Infect. Dis. 2007. V.7. N.1. P.21-31.
10. Ершов Ф.И., Коваленко А.Л., Романцов М.Г., Голубев С.Ю. Циклоферон. Клиническая фармакология и терапия: Руководство для врачей. М.: СПб., 1998. 109 с.
11. Циклоферон в клинической пульмонологии: Пособие для врачей / Под ред. М.Г.Романцова. СПб., 2005. 88 с.
12. Патент на изобретение РФ №2087146. Способ лечения генерализованного туберкулезного процесса в эксперименте. Дата публикации 20.08.1997. МПК А61К 31/455, А61К 31/70.
13. Патент на изобретение РФ №2163120 Конъюгат изониазид-декстран и его применение в качестве противотуберкулезного препарата. Дата публикации 20.02.2001. МПК А61К 31/455, А61К 31/721.
14. Патент на изобретение РФ №2168994. Средство для лечения туберкулеза с низкой гепатотоксичностью. Дата публикации 20.06.2001. МПК А61К 31/455, А61К 31/70.
15. Патент на изобретение РФ №2185166. Средство для лечения туберкулеза с низким уровнем фибротических осложнений. Дата публикации 20.07.2002. МПК А61К 31/455, А61К 31/721, А61Р 31/06.
16. Патент на изобретение РФ №2125451. Способ получения конъюгата изониазид-декстран. Дата публикации 27.01.1999. МПК А61К 31/715, А61К 31/455.
17. Евразийский патент на изобретение №011718. Способ получения диальдегиддекстрана. Дата публикации 28.04.2009. МПК С08В 37/02.
Таблица
Сравнительная эффективность заявленного средства, полученного разными способами, и средства по прототипу (циклоферон)
Группы мышей
Выживаемость мышей после заражения вирусом птичьего гриппа штамма H5N1 (%)
Экспериментальная группа №1
80±6,0
Экспериментальная группа №2
85±10,0
Экспериментальная группа №3
78±9,0
Контрольная группа 1
40±6,0
Контрольная группа 2
30±9,0
Примечание.
Экспериментальные группы №1-3 - введение заявленного средства, полученного разными способами (см. описание) за 2 суток до заражения вирусом.
Контрольная группа №1 - введение циклоферона за 2 суток до заражения вирусом.
Контрольная группа №2 - введение фосфатного буфера за 2 суток до заражения вирусом.