ЛИОФИЛИЗАЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ЛИПОСОМАЛЬНОГО ЛЕГОЧНОГО СУРФАКТАНТА
LYOPHILISATION OF SYNTHETIC LIPOSOMAL PULMONARY SURFACTANT

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к синтетическому легочному сурфактанту и способу его получения.
2. ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Легочный сурфактант (также называемый как "сурфактант легких") представляет собой комплексную смесь липидов и белков, которая обеспечивает образование монослоя на границе раздела альвеолярного воздуха-воды и, путем снижения поверхностного натяжения, предотвращает слипание альвеол во время выдоха. Легочный сурфактант выстилает эпителий альвеол зрелых легких млекопитающих. Натуральный легочный сурфактант описан как "липопротеиновый комплекс", так как он содержит и фосфолипиды, и апопротеины, которые взаимодействуют, снижая поверхностное натяжение на границе фаз воздуха-жидкости в легких. Было обнаружено, что четыре белка ассоциированы с легочным сурфактантом, а именно SP-A, SP-B, SP-C и SP-D. Специфически, SP-B, вероятно, необходим для биофизического действия легочного сурфактанта. Он является общепринятой терапией для лечения множества дыхательных расстройств путем введения легочного сурфактанта в легкие пациента.
С фармакологической точки зрения оптимальный экзогенный легочный сурфактант для использования в лечении должен полностью синтезироваться в лаборатории. В этом отношении применимым является один миметик SP-B, представляющий собой KL4, который является катионным полипептидом из 21 аминокислоты.
2
2
Одним методом получения легочного сурфактанта в коммерческих масштабах для медицинского применения является способ, при котором используют типовой процесс тонкопленочного испарителя (TFE). Способ при применении в получении легочного сурфактанта KL4 состоит из следующих стадий: 1) растворение четырех основных компонентов композиции, дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерина (POPG) и пальмитиновой кислоты (PA) и KL4 в этаноле; 2) удаление этанола с использованием TFE; и 3) распределение конечной дисперсии во флаконы. Типовой процесс TFE как таковой является комплексным и имеет ограничения по масштабу. Специфически, 1 фт TFE дает 40-литровую партию и наибольший сравнимый доступный блок имеет 10 фт TFE. Это ограничивает объем партии, что нежелательно, так как для сурфактанта KL4 одобрены дополнительные показания, требующие еще больших количеств сурфактанта. Более того, процесс осуществляют в асептических условиях, что существенно влияет на стоимость, гибкость производств и комплектность продукта.
В добавление к стоимости и комплексности использования TFE, существуют дополнительные проблемы из-за хранения композиции в жидком состоянии. Так как полипептидные и липидные компоненты композиции подвергаются разрушению, раствор необходимо хранить в холодильнике для замедления разложения и достижения длительной стабильности.
Лиофилизация или сублимационная сушка представляет собой важный процесс получения твердых фармацевтических композиций. Твердые композиции обладают более длительной стабильностью, чем жидкие композиции, и их легко транспортировать и хранить. Во время процесса лиофилизации фармацевтическую композицию можно сушить до 2% или менее остаточной влаги без повышения температуры выше 30°C. Следовательно, указанный процесс с меньшей вероятностью вызывает термическое разложение композиций, чем высокотемпературный процесс, такой как, например, распылительная сушка.
Процесс лиофилизации включает замораживание жидкой композиции и удаление растворителя, ассоциированного с ней, путем прямой возгонки из твердой фазы в парообразную фазу без прохождения через промежуточную жидкую фазу. Обычно процесс лиофилизации состоит из трех стадий: стадии замораживания, первичной сушки и вторичной сушки.
Замораживание представляет собой процесс отвердевания исходной жидкости посредством охлаждения материала ниже заданной температуры, менее чем или равной 0°C. Первичная сушка представляет собой часть цикла лиофилизации, в которой удаляют возгонку основной массы замороженных растворителей, тогда как материал выдерживают ниже пороговой температуры с целью сохранения структуры, полученной во время замораживания. Вторичная сушка представляет собой процесс десорбции части остаточной влаги, и ее обычно проводят при температуре 25°C и выше. Критические параметры процесса, связанные с каждой из трех указанных стадий, представляют собой температуру хранения, давление в камере и время.
Процесс лиофилизации продолжают использовать в течение десятилетий. Несмотря на достаточное количество знаний, полученных в указанной области, остаются проблемы получения однородно распределенной лепешки, имеющей механически стабильную структуру, в коммерческих масштабах при разумной стоимости и времени.
В патенте США №5952303, выданном Bornstein, описан лиофилизированный синтетический легочный сурфактант, полученный путем лиофилизации водной суспензии комбинации фосфолипидов, пальмитиновой кислоты и пептида.
В патенте США №7582312, выданном Johnson, описан способ получения лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта путем лиофилизации жидкой композиции фосфолипидов, пальмитиновой кислоты и пептида в системе растворителей, содержащей 20% или более органического растворителя.
Применение процессов лиофилизации, описанных в патентах выше для лиофилизации жидкого синтетического легочного сурфактанта, содержащего органический растворитель в диапазоне от 5% и выше до менее чем 20%, давало хрупкий и прессованный материал, неприемлемый для коммерческого распределения. Получение синтетического легочного сурфактанта с использованием ранее описанных циклов лиофилизации давало материал, поднимающийся со дна флакона ("левитация" ("перемещение")), что приводило к сниженному теплообмену, неоднородному распределению тепла и выходу продукта с различными показателями качества, такими как физическая структура и остаточное содержание жидкости.
Следовательно, существует необходимость в улучшенных методах получения композиций легочного сурфактанта и улучшенных композициях легочного сурфактанта. Настоящее изобретение представляет решение проблемы получения сухого синтетического легочного сурфактанта, который является химически и механически стабильным, не влияя на его биологическую активность в процессе лиофилизации.
Все ссылки, цитированные в настоящем описании, включены в виде ссылок полностью.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один аспект изобретения обеспечивает способ получения лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта с менее выраженным перемещением или отсутствием перемещения лепешки в течение процесса. Процесс включает заполнение в лиофилизирующую камеру прелиофилизированной смеси, включающей по меньшей мере один фосфолипид и синтетический пептид, диспергированные в растворителе, содержащем органический растворитель в диапазоне между 3% (об/об) и 20% (об/об) общего объема прелиофилизированной смеси с остальной водой и/или буфером, где прелиофилизированную смесь заполняют в контейнер и где синтетический пептид имеет по меньшей мере 10 остатков аминокислот и представлен формулой:
a
b
c
d
(ZU)Z
где Z представляет собой остаток гидрофильной аминокислоты, и U представляет собой остаток гидрофобной аминокислоты; где каждый Z представляет собой независимо R, D, E или K; и каждый U представляет собой независимо V, I, L, C, Y или F; и где a представляет собой целое число со средним значением от около 1 до около 5; b представляет собой целое число со средним значением от около 3 до около 20; c представляет собой целое число от около 1 до около 10; и d представляет собой целое число от около 1 до около 3; понижение температуры внутри лиофилизационной камеры для начала охлаждения и отвердевания прелиофилизированной смеси в фазе замораживания; и проведение фазы отжига перед фазой первичной сушки, посредством этого снижая или устраняя перемещение лепешки лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта.
В одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает проведение фазы замораживания в процессе снижения температуры внутри лиофилизационной камеры, где прелиофилизированную смесь охлаждают до первой температуры ниже -45°C со скоростью между 0,1 и 1,0°C/мин и выдерживают прелиофилизированную смесь при первой температуре в течение первого периода времени, достаточного для отвердевания по меньшей мере 76% растворителя для получения первой отвержденной смеси; проводят фазу отжига и, таким образом, снижают или устраняют перемещение лепешки первой отвержденной смеси, где первую отвержденную смесь (i) нагревают до второй температуры, выбираемой для снижения или устранения перемещения первой отвержденной смеси, (ii) выдерживают при второй температуре в течение второго периода времени, достаточного для снижения или устранения перемещения первой отвержденной смеси, и (iii) охлаждают до третьей температуры ниже -45°C со скоростью между 0,1 до 1,0°C/мин для получения второй отвержденной смеси, где вторую отвержденную смесь выдерживают при третьей температуре в течение третьего периода времени, достаточного для обеспечения отделения незамороженного органического растворителя от второй отвержденной смеси и таким образом достижения миграции незамороженного органического растворителя на границу фаз между контейнером и второй отвержденной смесью; проведение фазы первичной сушки при пониженном давлении 30 мТ или выше, где вторую отвержденную смесь выдерживают при четвертой температуре в течение четвертого периода времени, достаточного для удаления по меньшей мере 5% органического растворителя, с последующим нагреванием до четвертой температуры, достаточной для предохранения второй отвержденной смеси от перемещения в контейнере и сохранения структуры, установившейся во время фазы отжига, и дополнительно выдерживают при четвертой температуре в течение пятого периода времени, достаточного для удаления по меньшей мере 70% растворителя и, таким образом, получают третью отвержденную смесь; и проводят фазу вторичной сушки при пониженном давлении в течение шестого периода времени, достаточного для получения лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта, имеющего остаточное содержание растворителя максимально 2%.
В определенных вариантах осуществления способа соотношение объема прелиофилизированной смеси в контейнере к объему контейнера составляет от около 28% до около 68%.
В определенных вариантах осуществления способа соотношение высоты прелиофилизированной смеси в контейнере к диаметру контейнера находится в диапазоне от около 0,3 до около 0,8.
В определенных вариантах осуществления изобретения способ включает обеспечение прелиофилизированной смеси, где органический растворитель содержится в диапазоне от около 3% до около 15%. Более конкретно, органический растворитель содержится в диапазоне от около 5% до около 10%. Еще более конкретно, органический растворитель содержится в диапазоне от около 7% до около 10%.
Любой из вышеописанных вариантов способа может быть осуществлен путем (1) проведения фазы замораживания таким образом, что прелиофилизированную смесь охлаждают до первой температуры -50°C±5°C со скоростью между 0,1 и 1,0°C/мин; (2) проведения фазы отжига таким образом, что первую отвержденную смесь (i) нагревают до второй температуры -22°C±5°C со скоростью 0,1-1,0°C/мин, (ii) выдерживают при второй температуре в течение второго периода времени между 4 и 8 часами, (iii) охлаждают до третьей температуры -50°C±5°C со скоростью между 0,1 и 1,0°C/мин; и (iv) выдерживают при третьей температуре в течение третьего периода времени в течение от около 3 до 8 часов; и (3) проводят фазу первичной сушки при давлении, выбираемом из диапазона от около 30 мТ до около 200 мТ и температуре первичной сушки, выбираемой из диапазона от около -25°C до 0°C с изменением от -50°C±5°C, и дополнительно выдерживают при первичной сушке в течение по меньшей мере 10 часов.
В определенных вариантах осуществления изобретения вышеописанного способа фазу вторичной сушки проводят при давлении, выбираемом из диапазона от около 30 мТ до около 200 мТ и температуре максимально 46°C±5°C.
2
2
2
В различных вариантах осуществления вышеуказанных способов по изобретению прелиофилизированная смесь включает пептид, имеющий SEQ ID NO: 1 (KL4 полипептид), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG) и пальмитиновую кислоту, и способ дает лиофилизированный синтетический легочный сурфактант с удельной площадью поверхности по меньшей мере 2,2 м/г. В определенных вариантах осуществления изобретения удельная площадь поверхности находится в диапазоне от около 3,7 м/г до около 2,2 м/г. В определенных вариантах осуществления изобретения лиофилизированный синтетический легочный сурфактант имеет пористость выше 40% по объему общей площади лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта.
Другой аспект изобретения охватывает композицию лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта, которая включает один или более фосфолипидов и синтетический полипептид, имеющий по меньшей мере 10 остатков аминокислот, представленный формулой:
a
b
c
d
(ZU)Z
2
где Z представляет собой остаток гидрофильной аминокислоты, и U представляет собой остаток гидрофобной аминокислоты; где каждый Z представляет собой независимо R, D, E или K; и каждый U представляет собой независимо V, I, L, C, Y или F; и где a представляет собой целое число со средним значением от около 1 до около 5; b представляет собой целое число со средним значением от около 3 до около 20; c представляет собой целое число от около 1 до около 10; и d представляет собой целое число от около 1 до около 3, где композиция лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта имеет удельную площадь поверхности по меньшей мере 2,7 м/г.
2
2
В определенных вариантах осуществления изобретения лиофилизированный синтетический легочный сурфактант имеет удельную площадь поверхности, находящуюся в диапазоне от около 3,7 м/г до около 2,7 м/г.
В определенных вариантах осуществления лиофилизированный синтетический легочный сурфактант имеет пористость выше 40% по объему общей площади лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта.
В определенных вариантах осуществления изобретения лиофилизированный синтетический легочный сурфактант включает пептид, имеющий SEQ ID NO: 1 (KL4 полипептид), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG) и пальмитиновую кислоту.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 представляет гистограмму, демонстрирующую перемещение лиофилизированного материала во флаконе при переворачивании или отсутствии движения ряда флаконов, содержащих лиофилизированный материал, который перемещается при переворачивании (показано как черные столбики), и ряда флаконов, содержащих лиофилизированный материал, который не перемещается при переворачивании (показаны как заштрихованные столбики) (см. пример 5).
Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий перемещение материала в течение процесса лиофилизации (см. пример 5).
Фиг. 3A и 3B представляют собой изображения сканирующего электронного микроскопа (SEM) лиофилизированного легочного сурфактанта по изобретению, полученного в 30 мл флаконах, с увеличением ×20, поверхность A и поверхность B, соответственно.
Фиг. 4A и 4B представляют собой изображения SEM лиофилизированного легочного сурфактанта композиции II, полученной при помощи Bornstein Lyo Cycle в 30 мл флаконах, как описано в примере 3, с увеличением ×20, поверхность A и поверхность B, соответственно.
Фиг. 5A и 5B представляют собой SEM изображения лиофилизированного легочного сурфактанта по изобретению, полученного в 30 мл флаконах, с увеличением ×100, поверхность A и поверхность B, соответственно.
Фиг. 6A и 6B представляют собой SEM изображения композиции II лиофилизированного легочного сурфактанта, полученной посредством Bornstein Lyo Cycle в 30 мл флаконах, как описано в примере 3, с увеличением ×100, поверхность A и поверхность B, соответственно.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было обнаружено, что сухой синтетический легочный сурфактант, имеющий однородно распределенное твердое вещество, расположенное в механически стабильной, ригидной композиции, способной к устойчивому хранению на воздухе и обработке, может быть получен посредством улучшенного цикла лиофилизации.
Предпочтительно, чтобы лиофилизированная фармацевтическая композиция имела однородный по структуре и текстуре внешний вид и хорошую физическую силу (например, способна выдерживать транспортировку и обработку), чтобы соответствовать требованиям для коммерческого распределения. Однородный внешний вид связан с улучшенной стабильностью и меньшей вариабельностью активности лекарственного средства, фармацевтической элегантностью внешнего вида, остаточной влагой и временем восстановления.
Лиофилизированные фармацевтические композиции, содержащие суспензию липосомальной композиции и органического растворителя, представляют собой сложную задачу из-за того, что органический растворитель захватывается как незамороженная жидкость и испаряется с различной скоростью по сравнению с другими замороженными жидкостями, такими как лед, следовательно, создавая варианты состава растворителя, приводящие к потере контроля за процессом, трудностям поддержания критических параметров обработки камеры под давлением, а также трудностям регуляции присутствия остаточных растворителей в сухом продукте.
Попытки получить сухой синтетический легочный сурфактант из прелиофилизированной смеси, содержащей органический растворитель в диапазоне от 3% до 20%, с использованием циклов лиофилизации, описанных в патентах США №№5952303 и 7582312, не смогли обеспечить коммерчески приемлемые продукты. Полученные продукты содержали твердые вещества, неоднородно распределенные по поверхности лиофилизационных флаконов; вероятно, твердое вещество передвигалось во флаконах во время процесса и имело сдавленную порошкообразную поверхность.
Рутинные модификации температур хранения, давления и времени не давали требуемого продукта, имеющего однородный по структуре и текстуре внешний вид и хорошую физическую силу (например, лиофилизированный продукт, способный сохранять форму и остающийся на месте при переворачивании флакона, в котором его лиофилизировали). Начальная стадия в разработке способа лиофилизации по изобретению заключалась в идентифицикации термоаналитических данных, относящихся к материалу, присущих специфическим составляющим, и соотношений указанных составляющих, содержащихся в композиции (главным образом аморфных вспомогательных веществ, также содержащих соли в буфере и органическом растворителе). Такой термоанализ проводили путем проведения исследований лиофилизирующей микроскопии (FDM), электрического сопротивления (ER) и низкотемпературной дифференциальной сканирующей калориметрии (LT-DSC). Термоанализ обеспечивал критическую информацию, такую как данные об адекватной температуре кристаллизации и пороговой температуре, при которой безопасно сушить материал в присутствии льда во время первичной сушки для обеспечения сохранения структуры, установившейся во время стадии замораживания. На основании знаний характера и поведения органических составляющих во время обработки ожидали, что полное отвердевание не может быть достигнуто в условиях, используемых для обычного процесса лиофилизации. Указанный факт представляет собой дополнительную существенную проблему при обработке, так как нерасфасованный раствор (т.е. прелиофилизированная смесь) состоит из системы растворителей, содержащей летучие составляющие, такие как органический растворитель, в диапазоне от 3% до ниже 20%, предпочтительно от 3% до 1%, более предпочтительно от 5% до 10% и более предпочтительно от 7% до 10% (об/об) общего объема прелиофилизированной смеси, с остальной водой и/или буфером. Летучие составляющие имеют температуру плавления ниже температуры, достигаемой конденсатором. Следовательно, органический растворитель не может быть отвержден конденсатором и часто недостаточно собирается конденсатором на протяжении процесса сушки, как при обычном подходе. В указанном процессе лиофилизации во время фазы сушки органические пары, удаляемые из материала при пониженном давлении в камере, немедленно собирают на поверхности конденсатора в результате разницы температур между растворителями в продукте и конденсаторе. Указанные пары на поверхности конденсатора присутствуют в жидком состоянии. Давление пара, ассоциированное с каждым органическим растворителем, собираемым как жидкость, при снижении до температуры конденсатора, существенно выше давления в камере, что вызывает последующее преобразование органических жидкостей обратно в парообразное состояние. Такой ряд событий называют обратным током (пар>жидкость>пар) и непрерывно повторяют на всем протяжении процесса до тех пор, пока с течением времени органические пары не выйдут из тяги конденсатора и не удалятся из камеры посредством вакуумного насоса. Между тем материал в состоянии обратного тока постоянно высвобождает тепловую энергию (пар в жидкость) и потребляет тепловую энергию (жидкость в пар) с целью перехода из одной фазы в другую. Материал, собранный на конденсаторе, в результате подвергают поглощению и высвобождению тепла, ассоциированному с обратным током, и он больше не способен поддерживать стационарный режим. Если во время обратного тока органических растворителей осуществляют возгонку льда на высоком уровне, и постоянные колебания температуры и количество свободной площади поверхности конденсатора, лишенные органического растворителя, участвуют в конденсации паров воды на льду, контролируемом давлении камеры и наконец, возгонке льда из продукта. Обычным подходом лиофилизации является возгонка льда для получения паров воды и конверсия таких паров воды обратно в лед при сборе на конденсаторе, что является обычным состоянием области техники. На основании проблем, вызванных присутствием органических растворителей, в комбинации с наблюдаемым перемещением лепешки во время обработки для успешного преодоления таких эффектов использовали специфическую попытку двухстадийной первичной сушки. Целью двух сегментов первичной сушки было отделить испарение любого периферического органического растворителя с границы фаз матрицы/флакона от возгонки замороженной воды. Масс-спектрометр использовали для измерения уровня остаточного газа в лиофилизационной камере. Полученные данные показывают, что органический растворитель удаляют во время указанного начального сегмента первичной сушки и что целевые параметры цикла для определенного указанного сегмента приводили к снижению уровня органического растворителя, предполагая, что процесс может продвигаться к второй части первичной сушки. Применение указанной методики с использованием сегмента, предназначенного для удаления свободных растворителей посредством выпаривания, первоначально приводило к устранению перемещения лепешки в целевом варианте. Затем было доказано, что удаление незамороженных органических растворителей в этом начальном сегменте может уменьшить феномен перемещения лепешки, если параметры связанного сегмента, такие как скорость замораживания, отжига и нагревания для первичной сушки, дополнительно контролируют для преодоления подвижности продукта, ассоциированной с перемещением во флаконе.
Авторы изобретения определили что одной из причин перемещения было неадекватное отвердевание, достигаемое ранее используемыми температурами замораживания -30°C и -40°C. Различные попытки для уменьшения перемещения посредством снижения температуры хранения до -45°C и повышения давления в камере во время стадии первичной сушки не давали существенного улучшения. Присутствие спирта в лиофилизационной смеси создавало "смазывающий" эффект; когда лепешку приводили к более теплым температурам, присутствие спирта на стенках флакона позволяло лепешке всплывать. Путем снижения окончательной температуры замораживания до -45°C или ниже на фазе замораживания, включая, перед фазой первичной сушки, термическую обработку отжигом, чтобы вызвать большее отделение органического растворителя от смеси, перемещение устраняли. Предпочтительными параметрами фазы замораживания были следующие: постепенное охлаждение до температуры хранения -45°C или ниже, предпочтительно от -50°C до -40°C ("окончательная температура замораживания"), с последующим выдерживанием температуры хранения в течение 1-10 часов, предпочтительно 2-8 часов, более предпочтительно 3-5 часов после уравновешивания прелиофизированной смеси при 2-8°C в течение нескольких часов на полке, и затем снижением температуры с приблизительной скоростью 0,1-1°C/мин.
3
3
Кроме того, в попытке улучшить время обработки и все еще сохранить требуемую однородность и внешний вид, авторы проанализировали соотношение между объемом образца и размером флакона. Так как перемещение лепешки представляет собой редкий феномен, новым является оценка технологического режима при различных размерах флаконов, основанная исключительно на создании большей площади поверхности для прилипания замороженной лепешки, скорее чем обычный подход оценки различных размеров флаконов на основании получения минимального соотношения высоты заполнения к флакону. Неожиданно было обнаружено, что варьирование размера флаконов от емкости 20 мл до емкости 50 мл при одном и том же исходном количестве заполнения (13,7 мл) не обеспечивало коррелирующего улучшения внешнего вида лиофилизированной лепешки от меньшего размера флакона до наибольшего размера флакона. Тогда как образцы флаконов 30 мл имели более однородно распределенную фильтрпрессную лепешку, чем образцы флаконов 20 мл, образцы флаконов 50 мл были менее однородны, чем образцы флаконов 20 мл. Отсутствие улучшения материала, обработанного во флаконе с емкостью 50 мл, вероятно, коррелировало с повышенной частотой перемещения лепешки, наблюдаемой в таком контейнере, что было ассоциировано с высотой полученной лепешки по сравнению с высотой лепешки флаконов 20 см и 30 см. При увеличении заполнения необходимо оценивать соотношение между заполняемым объемом (объем прелиофилизированной смеси) и объемом флакона (или другим типом контейнера, используемым для заполнения) и/или соотношение высоты заполнения прелиофизированной смеси во флаконе к диаметру флакона для устранения перемещения заполненного материала во флаконе. Соотношение высоты заполнения во флаконе к диаметру флакона должно находиться в диапазоне от около 0,3 до около 0,8, предпочтительно от около 0,4 до около 0,7 и более предпочтительно от около 0,5 до около 0,6. Соотношение заполненного объема к объему флакона должно составлять от около 28% до около 68%, и предпочтительный диапазон составляет от около 35% до около 55%. Необходимо понимать, что объемы флаконов, используемые в этом расчете, представляют собой "каталогизированные" объемы (т.е. объемы, перечисленные в каталогах и торговых брошюрах), а не точные внутренние объемы, где каталогизированные объемы могут отличаться от реальных объемов до около 10%.
Авторы изобретения определили, что добавление фазы отжига после фазы замораживания или в качестве промежуточной стадии перед достижением конечной температуры замораживания помогает создавать более плотную лепешку с усиленным остовом, которая лучше прилипает к стенкам и дну флакона, и что, следовательно, устраняет перемещение твердого вещества. Другая задача, достигаемая путем добавления фазы отжига, заключалась в получении увеличения скорости возгонки и, посредством этого, уменьшения общего времени процесса, без нарушения внешнего вида лепешки.
Далее будет подробно описана фаза отжига. Термин "фаза отжига" обозначает условия термической обработки, которая запускает отделение компонента и/или кристаллизацию компонента смеси. Такая термическая обработка может предусматривать (A) охлаждение до промежуточной температуры с последующим дополнительным охлаждением до конечной низкой температуры ("конечной температуры замораживания"), или (B) охлаждение до низкой температуры, затем нагрев до промежуточной температуры с последующим охлаждением до конечной низкой температуры, или (C) охлаждение до низкой температуры, затем нагревание до промежуточной температуры. "Фазу отжига" проводят во время фазы замораживания процесса лиофилизации. Проведение отжига увеличивает вероятность предотвращения перемещения лепешки от дна флакона во время обработки путем создания более ригидной замороженной матрицы. Кроме того, отжиг обеспечивает миграцию незамороженного растворителя к границе раздела флакона/матрицы и дополнительно запускает последующее отделение растворителя от продукта во время исходных условий, используемых для первичной сушки, эффективно снижая количество растворителя и делая растворенные вещества, т.е. API и буферные соли, более ригидными, тогда как вся вода преобразуется в лед. Промежуточную температуру выбирают на основании низкотемпературных термоаналитических и визуальных характеристик материала, когда определяют или температуру стеклообразования (Tg'), или соответствующую температуру наблюдаемого физического изменения. Низкую температуру выбирают на основании термоаналитических и визуальных характеристик материала, при измерении температуры полного отвердевания. Tg' или другие наблюдаемые физические изменения, такие как изменение прозрачности или жидкость-подобные движения, определяют, при какой промежуточной температуре продукт должен быть прокален, и по температуре полного отвердевания определяют, что заданные значения низкой температуры должны использоваться для обеспечения идеальных свойств замороженного материала, для которого запускают первичную сушку. Специфически, материал должен быть прокален при температуре на несколько градусов выше Tg' или наблюдаемого физического изменения, и как минимум, материал должен быть охлажден до температуры или ниже температуры полного отвердевания. Для материала, описанного как композиция I в настоящем документе, во время термоанализа наблюдаемые физические изменения жидкость-подобного движения наблюдали при температуре -28°C (температура, при которой наблюдали жидкость-подобное движение под сублимационным микроскопом). В определенных вариантах осуществления изобретения температуру полного отвердевания наблюдали при -45°C. Перед получением промежуточного продукта или низком выдерживании должно быть подтверждено ядрообразование. Температуры должны быть одинаковыми или сходными для каждого из вариантов A, B и C, однако, порядок, в котором они используются, меняется. Выбор температуры может быть основан на составляющих композиции или пороговой температуре. Пороговую температуру определяют как температуру, ниже которой необходимо поддерживать температуру продукта во время первичной сушки, или в присутствии льда, во избежание деформации, плавления или, в некоторых случаях, перемещения лепешки.
В определенных вариантах осуществления изобретения стадию отжига проводят, как описано в варианте (B) выше. В таких вариантах осуществления изобретения фаза отжига включает нагревание замороженной лепешки от -45°C±5°C (конечная температура замораживания) до -22°C±5°C (промежуточная температура) со скоростью, выбираемой из диапазона от около 0,1°C/мин до около 1°C/мин (стадия нагревания), и поддержание в течение периода времени, достаточного для обеспечения отделения органического растворителя из смеси растворенных веществ и образования более ригидного твердого вещества для уменьшения или устранения левитации, предпочтительно 3-8 часов при -22°C±5°C (стадия выдерживания), затем дополнительного охлаждения до -45°C±5°C со скоростью от около 0,1°C/мин до около 1°C/мин (стадия охлаждения) и выдерживания в течение периода времени, достаточного для обеспечения адекватного отвердевания, например, в течение 3-8 часов, предпочтительно в течение 4 часов, при -45°C±5°C, где все четыре стадии проводят при атмосферном давлении. В определенных вариантах осуществления изобретения стадию отжига проводят, как описано в примерах 2 и 9-13.
Альтернативно, адекватное отвердевание может быть достигнуто с помощью непосредственного охлаждения до крайне низкой температуры без конечной стадии выдерживания посредством охлаждения флаконов с постоянной скоростью, выбираемой из диапазона от около 0,1°C/минуту до около 1°C/минуту до окончательной низкой температуры до достижения желаемой температуры. В другом варианте осуществления изобретения (вариант (A) выше), фазу отжига проводят как промежуточную стадию перед достижением конечной низкой температуры в фазе замораживания. В указанном варианте осуществления изобретения фаза отжига начинается, когда температура хранения достигает температуры ядрообразования жидкого продукта (около -15°C±5°C) ("температура ядрообразования"), и включает выдерживание температуры ядрообразования в течение периода времени, достаточного для преобразования воды в лед и разделения растворенных веществ смеси, между 45 мин и 4 часами (промежуточная стадия выдерживания), затем продолжение охлаждения смеси со скоростью от 0,1°C/мин до 1,0°C/мин до достижения требуемой конечной температуры замораживания (-50°C±5°C), и стадию выдерживания при такой температуре проводят до завершения фазы замораживания.
В одном варианте осуществления изобретения фаза отжига включает нагревание замороженной фильтрпрессной лепешки от -50°C±5°C до -22°C±5°C со скоростью от 0,1 до 1°C/мин и выдерживание в течение 3-8 часов при -22°C±5°C, затем охлаждение снова до -50°C±5°C со скоростью от 0,1 до 1°C/мин и выдерживания в течение 3-8 часов, предпочтительно 4 часов, при -50°C±5°C, где все четыре стадии проводят при атмосферном давлении.
В определенных вариантах осуществления изобретения стадию отжига проводят, как описано в варианте (A) выше. Промежуточная температура может быть выбрана между -10°C и -35°C. Выдерживание при промежуточной температуре проводят в течение времени, достаточного для преобразования воды в лед и разделения растворенных веществ смеси, между 45 мин и 4 часами. Изменение до конечной замораживающей температуры проводят с приблизительной скоростью от 0,1 до 1°C/мин с последующим выдерживанием при такой температуре до завершения фазы замораживания, от около 0,5 до 5 ч. Затем проводят стадию первичной сушки, как описано. Один пример такого процесса описан в примере 14, см. таблицу 16.
Фазу первичной сушки проводят при пониженном давлении (вакуум), и она включает необязательное выдерживание при температуре предшествующей стадии в течение периода времени, достаточного для испарения по меньшей мере 5%, предпочтительно от 5 до 10% органического растворителя, постепенное повышение от температуры предшествующей стадии -50°C±5°C до температуры в диапазоне от около -25°C до около 0°C (температура первичной сушки) со скоростью от 0,1°С/мин до 2°C/мин, и давлении от 30 мТ до 200 мТ, предпочтительно 40 мТ±10 мТ (стадия нагревания), с последующей стадией выдерживания при температуре первичной сушки в течение периода времени, достаточного для возгонки по меньшей мере 70% растворителя, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно от 5 до 10% органического растворителя, или если не проводят необязательную стадию выдерживания, тогда в течение периода времени, достаточного для возгонки по меньшей мере 80% растворителя. Стадия выдерживания может продолжаться 10 часов или более. В определенных вариантах осуществления изобретения стадия выдерживания составляет 18-140 часов, предпочтительно 18-100 часов. Выбор температуры для первичной сушки между 0°C и -25°C основан на желании предотвратить перемещение образца во флаконе и осуществить сушку с сохранением структуры, установившейся во время замораживания. Возможную оптимизацию длительности фазы первичной сушки проводят посредством регуляции фазы отжига.
Далее будет описана фаза вторичной сушки. Целью фазы вторичной сушки является снижение содержания остаточной влаги в продукте, полученном на фазе первичной сушки путем повышения его температуры, обычно до температуры выше температуры окружающей среды, для удаления какой-либо остаточной воды и поддержания при выбранной температуре в течение периода времени, достаточного для получения лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта, имеющего остаточное содержание растворителя максимум 2%. Типичный диапазон температур вторичной сушки составляет от 20°C до 30°C. Однако температура вторичной сушки может находиться в диапазоне, настолько низком как -7°C до настолько высокого как +60°C. Заданную температуру вторичной сушки необходимо выбирать на основании 1) сохранения продукта стабильным в течение фазы вторичной сушки путем обеспечения температуры хранения, которая поддерживает температуру продукта ниже наблюдаемой Tg на по меньшей мере 5°C, и 2) обеспечения десорбции путем обеспечения температуры, которая является достаточно теплой для эффективного уменьшения остаточной влаги до таковой в рамках спецификации с объективной ценой. Наблюдаемая Tg композиции I находилась между 45°C и 51°C, так температура во время вторичной сушки может быть настолько высокой как 46°C. Результаты остаточного содержания влаги показывают, что заданная температура вторичной сушки 25°C была эффективной для достижения результатов остаточного содержания влаги. Затем выдерживали продукт при выбранной температуре вторичной сушки в течение периода времени, достаточного для получения конечного продукта с остаточным содержанием растворителя максимум 2%. Одним из путей оценки, завершена ли сушка, является проведение проверки герметичности при возрастании давления (тест prize), где давление 10 микрон показывает, что остаточное содержание влаги находится в рамках спецификации. В определенных вариантах осуществления изобретения фазу вторичной сушки проводят путем нагревания от температуры хранения на предыдущей стадии до 25°C±3°C со скоростью 0,1-1°C/мин, предпочтительно со скоростью от 0,2 до 0,5°C/мин. Указанную фазу также проводят в вакууме, как предшествующую фазу. Предпочтительный диапазон давления составляет от 30 мТ до 500 мТ, более предпочтительно от 40 мТ до 150 мТ. После того, как продукт достигнет выбранной температуры хранения, проводят стадию выдерживания при 25°C±3°C в течение 4-10 часов, предпочтительно в течение 6 часов.
Затем лиофилизированный материал прокачивают инертным газом, например, азотом, при 0,5 бар, перед окончательным полным закупориванием и герметизацией для хранения.
Для определения воспроизводимости целевых параметров цикла, сравнивали ключевые характеристики продукта, такие как профили температуры, температуры перерыва возгонки и окончательные характеристики продукта после обработки посредством обычных одинаковых циклов лиофилизации. Температура "отключения" возгонки представляет собой температуру непосредственно перед точкой, когда температура продукта резко достигает температуры хранения во время первичной сушки. "Отключение" температуры продукта показывает завершение возгонки в заданном контейнере, принимая во внимание размещение измеряющей термопары в рабочем положении (центр дна), где обнаружение льда вероятно в последнюю очередь. Для каждой значимой стадии в процессе (например, отжига, замораживания, первичной сушки, отключения возгонки и вторичной сушки) диапазоны температур продукта обоих исследований находились в рамках 0,5°C для отжига и замораживания, в рамках 1°C для первичной сушки и отключения возгонки и в рамках 1,5°C для вторичной сушки. На основании таких малых вариаций температурный режим во время обработки расценивали воспроизводимым. Оценка диапазонов времени окончания возгонки показала, что возгонка завершалась в рамках 6 часов от исследования к исследованию, также предполагая адекватную воспроизводимость. Наконец, все параметры конечного продукта, такие как внешний вид, остаточная влага, время восстановления, прозрачность раствора, восстановленный pH, потеря термогравиметрической массы (TGA) и высокотемпературная дифференциальная сканирующая калориметрия (HT-DSC), давали сравнимые результаты, дополнительно подтверждая эффективность воспроизведения продукта соответствующего качества от исследования к исследованию в больших масштабах. Заключение, сделанное из оценки проведенных исследований, было таким, что параметры цикла лиофилизации, используемые для лиофилизации синтетического легочного сурфактанта, содержащего от 3 до 20% органического растворителя, предпочтительно от 3% до 15%, более предпочтительно от 5% до 10% и еще более предпочтительно от 7% до 10% (об/об) общего объема прелиофилизированной смеси, являются надежными и адекватными для получения соответствующего материала с приемлемыми характеристиками качества продукта, без феномена перемещения лепешки.
Лиофилизацию проводили в лиофилизационном блоке с четырьмя полками с восемью квадратными футами полочного пространства, с внутренней емкостью конденсатора 15 килограммов льда. Блок состоял из нержавеющей стали типа 304L, сертифицированной как камера высокого давления для работы вплоть до 20 фунт/кв дюйм изб. для стерилизации паром. Типичное лиофилизационное оборудование состоит из камеры высокого давления, конденсатора, вакуумной системы с устройством регулирования давления и петлей с циркулирующим теплоносителем, с регулируемым температурным диапазоном приблизительно -55°C-50°C.
Лиофилизированный материал кажется белым, однородно распределенным во флаконах, цилиндрическим по форме (т.е., имитирующим форму флаконов), плотным по виду, имеющим минимальную усадку по сравнению с исходным заполнением, имеющим ригидную структуру, так что он не перемещается при переворачивании флакона, и без следов материала или ободка выше верхней поверхности материала. Материал имеет матовые верхнюю, боковые и нижнюю поверхности лепешки. Лиофилизированный материал соответствует спецификации в отношении остаточной влаги, DSC, восстановления pH и вязкости.
Далее будут подробно описаны прелиофилизированная смесь и ее получение. Исходные компоненты - активные фармацевтические ингредиенты (API) представляют собой фосфолипиды (например, дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) и пальмитоилолеоилглицерин (POPG)), пальмитиновую кислоту (PA) и синтетический легочный пептид (предпочтительно, KL4).
В определенных вариантах осуществления изобретения имитатор полипептида легочного сурфактанта относится к полипептидам с последовательностью аминокислотных остатков, которая имеет составную гидрофобность меньше нуля, предпочтительно менее чем или равную -1, более предпочтительно менее чем или равную -2. Значение общей гидрофобности для пептида определяют путем присвоения каждому остатку аминокислоты в пептиде его соответствующего значения гидрофильности, как описано в Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3829, 1981, чье содержание включено в виде ссылки. Для заданного пептида значения гидрофобности суммируют, сумма представляет собой составное значение гидрофобности.
В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность аминокислот полипептида легочного сурфактанта имитирует последовательность гидрофобных и гидрофильных остатков SP18 и осуществляет функцию гидрофобного участка SP18, как описано в патенте США №3789381, полностью включенного в настоящее описание. В определенных вариантах осуществления изобретения имитатор SP-B для применения в настоящем описании включает полипептид, содержащий чередующиеся участки гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков, и характеризуется как имеющий по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, представленный формулой:
a
b
c
d
(ZU)Z
Z и U представляют собой остатки аминокислот, которые независимо выбирают в каждом положении Z и U. Z представляет собой остаток гидрофильной аминокислоты, предпочтительно выбираемый из группы, состоящей из R, D, E и K. U представляет собой остаток гидрофобной аминокислоты, предпочтительно выбираемый из группы, состоящей из V, I, L, C, Y и F, Буквы, "a", "b", "c" и "d" представляют собой числа, которые показывают количество гидрофильных или гидрофобных остатков. Буква "a" имеет среднее значение от около 1 до около 5, предпочтительно от около 1 до около 3. Буква "b" имеет среднее значение от около 3 до около 20, предпочтительно от около 3 до около 12, наиболее предпочтительно от около 3 до около 10. Буква "c" составляет 1-10, предпочтительно 2-10, наиболее предпочтительно 3-6. Буква "d" составляет 1-3, предпочтительно 1-2.
Под утверждением, что остаток аминокислоты, представленный Z и U, выбирают независимо, понимают, что в каждом случае выбирают остаток из установленной группы. То есть, когда "a" равно 2, например, каждый из гидрофильных остатков, представленных Z, будет выбираться независимо и, следовательно, может включать RR, RD, RE, RK, DR, DD, DE, DK и др. Утверждая, что "a" и "b" имеют средние значения, обозначают, что хотя количество остатков в повторяющейся последовательности (ZaUb) может некоторым образом варьироваться в рамках последовательности пептида, средние значения "a" и "b" будут составлять от около 1 до около 5 и от около 3 до около 20, соответственно.
В определенных вариантах осуществления изобретения примерный имитатор полипептида SP-B, который может быть использован в настоящем изобретении, включает, без ограничения, таковые, представленные в таблице пептидов имитаторов легочного сурфактанта.
Таблица пептидов имитаторов легочного сурфактанта
Обозначение<sup>1</sup>
SEQ ID NO
Последовательность остатков аминокислот
KL4
1
KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK
DL4
2
DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD
RL4
3
RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR
RL8
4
RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL
R2L7
5
RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL
6
RLLLLCLLLRLLLLLCLLLR
7
LLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL
8
RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLRDLLLDLLLDLLLDLLLDLLLD
RCL1
9
RLLLLCLLLRLLLLCLLLR
RCL2
10
RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL
RCL3
11
RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR
KL8
12
KLLLLLLLLKLLLLLLLLKLL
KL7
13
KLLLLLLLKKLLLLLLLKKL
<sup>1</sup>Обозначение представляет собой сокращение для указанной последовательности остатков аминокислот.
Примеры фосфолипидов, применимых в композициях, полученных по изобретению, включают нативные и/или синтетические фосфолипиды. Фосфолипиды, которые могут быть использованы, включают, без ограничения, фосфатидилхолины, фосфатидилглицерины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины, фосфатидовые кислоты, фосфатидилинозитолы, сфинголипиды, диацилглицериды, кардиолипин, церамиды, цереброзиды и подобные. Примерные фосфолипиды включают, без ограничения, дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дилаурилфосфатидилхолин (DLPC) (C12:0), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) (C14:0), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), дифитаноилфосфатидилхолин, нонадеканоилфосфатидилхолин, арахидоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) (C18:1), дипальмитолеоилфосфатидилхолин (C16:1), линолеоилфосфатидилхолин (C18:2), миристоилпальмитоилфосфатидилхолин (MPPC), стероилмиристоилфосфатидилхолин (SMPC), стероилпальмитоилфосфатидилхолин (SPPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), пальмитоилпальмитоолеоилфосфатидилхолин (PPoPC), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), пальмитоилолеоилфосфатидилсерин (POPS), соевый лецитин, лецитин яичного желтка, сфингомиелин, фосфатидилинозитолы, дифосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидовые кислоты и яичный фосфатидилхолин (EPC).
Примеры жирных кислоты и жирных спиртов, применимых в указанных смесях, включают, без ограничения, стерины, пальмитиновую кислоту, цетиловый спирт, лауриловую кислоту, миристиловую кислоту, стеариновую кислоту, фитановую кислоту, дипальмитиновую кислоту и подобные. Предпочтительно, жирной кислотой является пальмитиновая кислота, и предпочтительно жирным спиртом является цетиловый спирт.
Примеры сложных эфиров жирных кислот, применимых в указанных смесях, включают, без ограничения, метилпальмитат, этилпальмитат, изопропилпальмитат, холестерилпальмитат, пальмитилпальмитат, пальмитат натрия, пальмитат калия, трипальмитин и подобные.
Примером полусинтетического или модифицированного натурального липида является любой из липидов, описанных выше, который был химически модифицирован. Химическая модификация может включать ряд модификаций; однако, предпочтительной модификацией является конъюгация одной или более полиэтиленгликолевых групп (PEG) с желаемой частью липида. Полиэтиленгликоль (PEG) широко используется в биоматериалах, биотехнологии и медицине преимущественно из-за того, что PEG является биосовместимым, нетоксичным, неиммуногенным и водорастворимым полимером. В области доставки лекарственных средств производные PEG широко используют в ковалентных связях, (например, "PEG-илирование") с белками для снижения иммуногенности, протеолиза и почечного клиренса и для увеличения растворимости.
Липиды, которые конъюгированы с PEG, обозначают в настоящем описании как "PEG-липиды." Предпочтительно, когда PEG-липиды используют в методах и композициях по настоящему изобретению, они присутствуют в спиртах и/или альдегидах.
2
Другие вспомогательные вещества могут быть скомбинированы с полипептидом легочного сурфактанта, одним или более липидами и системой органических растворителей перед лиофилизацией, включая, без ограничения, различные сахара, такие как декстроза, фруктоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, сорбит, трегалоза и подобные, поверхностно-активными веществами, такими как, например, полисорбат-80, полисорбат-20, триолеат сорбита, тилоксапол и подобные, полимерами, такими как PEG, декстран и подобные, солями, такими как NaCl, CaCl и подобные, спиртами, такими как цетиловый спирт, и буферами.
Предпочтительно, пептид легочного сурфактанта смешивают с фосфолипидами и свободными жирными кислотами или жирными спиртами, например, DPPC (дипальмитоилфосфатидилхолин), POPG (пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин) и пальмитиновой кислотой (PA), См., например, патент США №5789381, описание которого включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме и для любых целей.
Первой стадией в получении прелиофилизированной смеси является получение по существу однородной жидкой смеси пептида легочного сурфактанта, одного или более липидов в системе органических растворителей, содержащей 93-100% органического растворителя, предпочтительно 95% этанола. Термином "по существу однородный" обозначают, что компоненты однородно распределены друг в друге, например, как в растворе. API смешивают в системе органических растворителей, нагретой до 45°C±5°C, до получения раствора. Полученный раствор затем фильтруют через стерильный фильтр (0,22 микрон) в буфер, предпочтительно раствор буфера трис(гидроксиметил)аминометана (TPJS), нагретый до 45°C±5°C, и перемешивают для получения прелиофилизированной смеси в форме суспензии липосом, имеющей концентрацию органического растворителя в диапазоне от 3% до 20% (об/об) общего объема прелиофилизированной смеси, предпочтительно от 3% до 15%, более предпочтительно от 5% до 10% и еще более предпочтительно от 7% до 10% с остальной водой и/или буфером.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения смесь пептида легочного сурфактанта, фосфолипидов и свободных жирных кислот или жирных спиртов, например, DPPC (дипальмитоилфосфатидилхолин) и POPG (пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин) и пальмитиновой кислоты (PA) смешивают с системой органических растворителей для получения по существу однородной жидкой смеси. Отдельные компоненты могут присутствовать в смеси в любой концентрации. Общая концентрация фосфолипида в дисперсии может варьироваться, например, от около 1 до более чем около 80 мг общего содержания фосфолипида/мл. Подходящие буферы включают, без ограничения, трис ацетат, трис гидрохлорид, фосфат натрия, фосфат калия и подобные. Буферы обычно коммерчески доступны.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения суспензия липосом для применения в методах по настоящему изобретению включает DPPC, POPG, PA и KL4 (массовое соотношение приблизительно 7,5:2,5:1,35:0,267) в физиологически приемлемом растворителе, имеющем концентрацию органического растворителя в диапазоне от 3% до 20% (об/об) общего объема прелиофилизированной смеси, предпочтительно от 3% до 15%, более предпочтительно от 5% до 10% и еще более предпочтительно от 7% до 10% с остальной водой и/или буфером.
2
В определенных вариантах осуществления изобретения система органических растворителей дополнительно включает дополнительные вспомогательные вещества, включающие, без ограничения, различные сахара, такие как декстроза, фруктоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, трегалоза и подобные, поверхностно-активные вещества, такие как, например, полисорбат-80, полисорбат-20, триолеат сорбита, тилоксапол и подобные, полимеры, такие как PEG, декстран и подобные, соли, такие как NaCl, CaCl, и буферы. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения система органических растворителей по существу не содержит соли. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения система органических растворителей по существу не содержит NaCl.
В определенных вариантах осуществления изобретения система органических растворителей может быть получена посредством смешивания всех компонентов системы. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения, где органический растворитель состоит из органического растворителя и водной среды при комнатной температуре, водная среда и органический растворитель могут быть смешаны для получения системы органических растворителей. Предпочтительно, системой органических растворителей является эмульсия или смешиваемый раствор.
Выбираемый органический растворитель предпочтительно является совместимым со стерильной фильтрацией и лиофилизацией. Предпочтительно, органические растворители по настоящему изобретению выбирают из группы, состоящей из низших оксигидроуглеводородов, низших галогенуглеводородов, низших галогеноксиуглеводородов, низших сульфоксиуглеводородов, низших циклоуглеводородов и их комбинаций.
Подходящие органические растворители для применения в настоящем изобретении включают, без ограничения, изопропиловый спирт, метанол, этанол, ацетон, ацетонитрил, циклогексан, хлорбутанол, диметилсульфоксид, трет-бутанол, гексанол, бензиловый спирт, уксусную кислоту, пентанол (1-пентанол), н-бутанол, н-пропанол, метилацетат, диметилкарбонат, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, тетрахлорид углерода, гексафторацетон, хлорбутанол, диметилсульфон, циклогексан и их комбинации. Предпочтительные растворители включают низшие алканолы, такие как трет-бутанол, этанол, изопропиловый спирт и подобные. Особенно предпочтительным растворителем по изобретению является этанол.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения композицией легочного сурфактанта является люцинактант или другая композиция легочного сурфактанта, включающая синтетический пептид сурфактанта KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK (KL4; SEQ ID NO: 1). В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения лиофилизированный легочный сурфактант по изобретению при восстановлении дает комбинацию API: DPPC, POPG, PA и KL4 пептида в массовом соотношении приблизительно 7,5:2,5:1,35:0,267) или в том же массовом соотношении как в SURFAXIN (люцинактант) жидкий синтетический легочный сурфактант от Discovery Laboratories, Inc. (Warrington, PA, USA). В определенных вариантах осуществления изобретения композицию легочного сурфактанта составляют в концентрациях, например, 10, 20 и 30 мг/мл содержания фосфолипида. В других определенных вариантах осуществления изобретения композицию легочного сурфактанта составляют в больших концентрациях, например, 60, 90, 120 или более мг/мл содержания фосфолипидов, с сопутствующим повышением концентрации KL4.
В определенных примерных вариантах осуществления настоящего изобретения относительные количества пептида легочного сурфактанта, фосфолипидов и свободных жирных кислот или жирных спиртов составляют около 1 части по массе синтетического пептида сурфактанта; от около 20 до около 150 частей по массе фосфолипида на массовую часть синтетического пептида сурфактанта; от около 0 до около 25 частей по массе свободной жирной кислоты или жирного спирта на массовую часть синтетического пептида сурфактанта. В определенных вариантах осуществления изобретения относительное количество системы органических растворителей находится в диапазоне от 62,5 и до 250 частей по массе на массовую часть пептида легочного сурфактанта. В определенных вариантах осуществления изобретения система органических растворителей присутствует в диапазоне от 80 до 125 частей по массе на массовую часть пептида легочного сурфактанта. В определенных примерных вариантах осуществления изобретения относительные количества пептида легочного сурфактанта, фосфолипидов и свободных жирных кислот или жирных спиртов составляют около 1 части по массе пептида легочного сурфактанта, такого как, например, KL4; от около 20 до около 100 частей по массе DPPC; от 0 до около 50 частей по массе POPG; и от около 0 до около 25 частей по массе пальмитиновой кислоты.
2
2
2
Лиофилизированный материал по изобретению кажется белым, однородно распределенным во флаконах, цилиндрическим по форме (т.е. имитирующим форму флаконов), плотным, имеющим минимальное сжатие по сравнению с исходным наполнением, имеющим ригидную структуру, так что он не перемещается при переворачивании флакона, и без следов материала или ободка на верхней поверхности материала. Лиофилизированный синтетический легочный сурфактант по изобретению, полученный посредством вышеописанного метода, имеет большую удельную площадь поверхности (по меньшей мере 2,2 м/г) и большую общую площадь отверстий (по меньшей мере 40%), чем таковая легочных сурфактантов, полученных другими методами лиофилизации. Предпочтительно, удельная площадь поверхности лиофилизированного легочного сурфактанта по изобретению находится в диапазоне от около 3,7 м/г до около 2,2 м/г. Также было обнаружено, что в добавление к применению отжига для создания более ригидной структуры лепешки, варианты в вакууме во время первичной сушки влияли на удельную площадь поверхности. BET данные, представленные в примере 5, показывают что при 40 микрон, удельная площадь поверхности была максимальной по сравнению с удельной площадью поверхности образцов, полученных при 150 микрон. Данное открытие дополнительно помогает усовершенствовать дизайн структуры лепешки лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта.
-3
-3
Лиофилизированный материал прошел исследование остаточной влаги, времени восстановления, pH, вязкости и биологической активности. Лиофилизированный материал восстанавливали с помощью 10 мл стерильной воды для инъекций (WFI), и твердое вещество диспергировали в течение 20-30 секунд. pH находился в диапазоне 7,6-7,9. Вязкость, измеренная с использованием вискозиметра Brookfield, модель LVDV-II при 37°C (Brookfield Engineering Laboratories, Inc., Middleboro, MA), находилась в диапазоне 77-105 сП (0,077-0,105 Па·с). Образцы анализировали при помощи Pulsating Bubble Surfactormeter (PBS), модель EC-PBS-B (Electronetics Corporation, USA, в настоящее время General Transco Inc., Largo, FL) при 37°C в отношении способности снижать поверхностное натяжение (например, биологической активности); средние измерения поверхностного натяжения составляли между 2 и 7 дин/см (2×10 до 7×10 Н/м). Приемлемое значение для эффективного легочного сурфактанта было ниже 10 дин/см (0,01 Н/м).
3
3
3
5
Одним путем характеристики лиофилизированного материала является измерение его удельной площади поверхности. Удельная площадь поверхности представляет собой меру повергаемой воздействию поверхности твердого образца на молекулярной основе. Метод анализа площади поверхности BET (Brunauer Emmet and Teller) является утвержденной моделью, используемой для определения удельной площади поверхности твердого вещества посредством физической адсорбции молекул газа (см. Фармакопею США Заголовок: <846> Specific Surface Area (http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c846.html)). Образцы обычно получают путем нагревания при одновременном отведении или токе газа через образец для удаления высвобождающихся примесей. Полученные образцы затем охлаждают жидким азотом или криптоном и анализируют путем измерения объема газа, адсорбированного при установленном давлении. 11-точечные тесты BET проводили на выбранных образцах Micromeritics Pharmaceutical Services (Norcross, GA) с использованием ASAP 2420 Accelerated Surface Area and Porosimetry System (Micromeritics Instruments Co., Norcross, GA). Образцы дегазировали при 25°C в течение 16 часов в вакууме. 100% криптон использовали как адсорбент. Температура аналитической ванны составила около 77K. Измеряли следующие параметры: Масса образца (г), свободное холодное пространство (см), свободное теплое пространство (см), давление насыщения (Po) (мм рт. ст.), абсолютное давление (P) (мм рт. ст.) и время работы. Линейные диаграммы изотермы рассчитывали для каждого образца, где ось Y была абсорбируемым количеством (см/г STP), и ось X была относительным давлением (P/Po). STP известны как стандартная температура и давление, т.е. температура 273,15 K и атмосферное давление (1,013×10 Па). Данные представлены в примерах ниже.
Другим параметром, применимым в характеристике морфологии лиофилизированного материала, является его пористость, определяемая как соотношение объема всех пор в материале к объему в целом. Пористость лиофилизированного материала определяют с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM) JEOL 6480 Scanning Electron Microscope (JEOL, Japan). Образцы забирали из флаконов посредством отрезания крышки флакона алмазным ножом-пилой и разрезали пополам по ширине. Перекрестные сечения разрезанных образцов помещали в блок SEM и визуализировали с увеличением (×) 20 и 100. Анализ запускали в вакууме при комнатной температуре. Площадь поверхности при увеличении ×20 составила приблизительно 6,4 мм × 5,1 мм. Площадь поверхности при увеличении ×100 составила приблизительно 1200 микрон × 965 микрон.
Микрофотографии SEM перекрестно разрезанного каркаса выявили микроканалы или пористые структуры на всем перекрестном сечении каждого образца. Для визуализации выбирали две классические точки: верх лепешки (неразрезанная площадь) как "поверхность A", и внутренняя часть лепешки как "поверхность B". На Фиг. 3A и 3B показано увеличенное изображение лиофилизированного легочного сурфактанта по изобретению, сделанное в 30 мл флаконах, с увеличением ×20, поверхность A и поверхность B, соответственно. На Фиг. 4A и 4B показано увеличенное изображение композиции II лиофилизированного легочного сурфактанта, полученной при помощи Bornstein Lyo Cycle в 30 мл флаконах, как описано в примере 3, с увеличением ×20, поверхность A и поверхность B, соответственно. На Фиг. 5A и 5B показаны увеличенные изображения лиофилизированного легочного сурфактанта по изобретению, полученного в 30 мл флаконах, с увеличением ×100, поверхность A и поверхность B, соответственно. На Фиг. 6A и 6B показано увеличенное изображение композиции II лиофилизированного легочного сурфактанта, полученной посредством Bornstein Lyo Cycle в 30 мл флаконах, как описано в примере 3, с увеличением ×100, поверхность A и поверхность B, соответственно.
В частности, композиция III (A0490-62), полученная как описано в примере 4 с использованием "Johnson Lyo Cycle", не могла быть проанализирована SEM из-за ее хрупкости. Лепешка не переносила даже небольшого давления ножа и распадалась. При сравнении общей площади отверстий композиции I (A0490-55), полученной, как описано в примере 2, с использованием Novel Lyo Cycle с общей площадью отверстий композиции II (A0490-58), полученной, как описано в примере 3, с использованием "Bornstein Lyo Cycle", наблюдали, что композиция I была более пористой с абсолютным различием по меньшей мере 11%.
Программное обеспечение MOTIC Images Plus 2.0 (Motic Group Co., Ltd, Xiamen, China) для микроскопа использовали для расчета открытой области выбранного изображения. Фильтр рельефа применяли для высвечивания открытых областей и затем, используя характеристики автосегмента и авторасчета, рассчитывали открытую площадь поверхности. Указанный подход минимизировал ручную обработку данных и устранял ошибки при сравнении изображений. Для композиции I площадь отверстий составляла 49,1% измеренной области для верхней части образца (поверхность A) и 50,5% измеряемой области для внутренней части лепешки (поверхность B). Для композиции II, площадь отверстий составляла 37,3% измеренной области для верхней части образца (поверхность A) и 36,7% измеренной области для внутренней части образца (поверхность B). Соответствующие различия составили 11,8% и 13,8%.
Ручной подсчет отверстий проводили для исследования точности вышеуказанного подхода для образцов, показанных на Фиг. 5A (композиция I, поверхность A, ×100) и Фиг. 6A (композиция II, поверхность A, ×100). Каждую микрофотографию обрезали до размера 6,4 мм (ширина) и 3,9 мм (высота), и 20 "отверстий" измеряли в отношении длины и ширины на каждом изображении и сравнивали.
2
Композиция лиофилизированного синтетического легочного сурфактанта имела уникальную комбинацию большей площади поверхности (по меньшей мере, 2,7 м/г), большей пористости (более 40% по объему) и демонстрировала ригидность, например, наблюдаемую устойчивость к движению при переворачивании и также устойчивость к перемещению при вскрытии флакона, содержащего материал. Более ригидная масса коррелировала со сниженной молекулярной подвижностью, предшественником химических реакций, и следовательно, более стабильным продуктом.
Ранее наблюдали, что из четырех API, синапультид или пептид KL4 быстрее разрушаются в жидком окружении, чем в твердом состоянии в виде лиофилизированного материала (см. патент США №5952303, выданный Bornstein). На основании убеждения, что однородный внешний вид лиофилизированной композиции также является характеристикой более стабильного продукта, авторы изобретения предположили, что лиофилизированная композиция, полученная методом по изобретению, описанным в настоящем описании, будет демонстрировать улучшенную стабильность по меньшей мере KL4 пептида в течение по меньшей мере 3 месяцев хранения при 25°C. Ожидают, что в рамках более длительного срока хранения, например, 6 месяцев и 9 месяцев при 25°C и также при хранении при более высокой температуре, например 30°C и 40°C, стабильность KL4 и других API будет статистически лучше для лиофилизированной композиции, полученной методом по изобретению по сравнению с лиофилизированной композицией, полученной другими способами лиофилизации. Улучшение стабильности ожидают на по меньшей мере более чем 2%, по меньшей мере более чем 5% или по меньшей мере более чем 10%.
Лиофилизированные легочные сурфактанты по изобретению могут быть восстановлены водой или другими фармацевтически приемлемыми разбавителями. Применение легочных сурфактантов, жидких или лиофилизированных, описано ранее. Новые лиофилизированные легочные сурфактанты дают превосходную лепешку и способность противостоять движению и транспортировке, что является обязательными характеристиками фармацевтического продукта.
Изобретение будет проиллюстрировано более подробно со ссылками на следующие примеры, но необходимо понимать, что настоящее изобретение ими не ограничивается.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Лиофилизацию проводили с использованием нового способа и ранее опубликованных способов, описанных в патентах США №№5952303 и 7582312, для демонстрации различий, присущих каждому способу для каждого полученного лиофилизированного продукта.
Материалы: ингредиенты в композициях, лиофилизированных посредством каждого из трех способов, суммированы ниже в таблице 1. Точные количества отрегулированы в отношении чистоты исходных материалов.
Таблица 1Исходные материалы для композиций I, II и III (объем партии 3000 г)
Материалы
Количество (мг) на грамм композиции
Количество (г) на партию
KL4 (API)
0,74 мг
DPPC (API)
18,00 мг
POPG, Na (API)
5,82 мг
PA (API)
3,113 мг
95% этанол
0,105 мг
Буфер TRIS:
NaCl
5,83 мг
Трометамин
1,86 мг
Вода
Методика: две партии по 3000 грамм получали для каждого из трех способов. Шприц использовали для введения стандартной массы заполнения 13,7 грамм на флакон. Получение прелиофилизированной смеси: API растворяли в 95% этаноле при 46°C±1°C для получения раствора. Полученный раствор стерильно фильтровали с использованием давления через фильтр 0,22 микрон 33 мм в перемешиваемый буферный раствор трис(гидроксиметил)аминометана (TRIS) при 45°C±2°C с получением композиции липосом с конечной концентрацией этанола 10% (масс/масс). После охлаждения до температуры ниже 30°C, полученную композицию липосом, т.е. прелиофилизированную смесь, переносили в 20, 30 и 50 мл лиофилизационные флаконы из боросиликатного стекла с объемом заполнения 13,7 г/флакон. Полученный лиофилизированный материал хранили при 5°C.
ПРИМЕР 2
Композиция I. Прелиофилизированную смесь из таблицы 1 использовали как наполнитель для 20, 30 и 50 мл стеклянных флаконов и лиофилизировали с использованием нового метода лиофилизации, описанного выше. В таблице 2 суммированы параметры процесса лиофилизации.
Таблица 2Параметры нового процесса лиофилизации
Фазы цикла лиофилизации
Стадии
Параметры
Начальная фаза*
Исходная температура хранения:
5°С, держат в течение 2 часов
Фаза замораживания*
Стадия охлаждения
-20°С при 1,0°С/мин
Стадия охлаждения
-30°С при 0,5°С/мин
Стадия охлаждения
-40°С при 0,25°С/мин
Стадия охлаждения
-50°С при 0,10°С/мин
Стадия выдерживания
-50°С в течение 4 часов
Фаза отжига*
Стадия нагревания
-22°С при 0,5°С/мин
Стадия отжига
-22°С в течение 4 часов
Стадия охлаждения
-30°С при 0,5°С/мин
Стадия охлаждения
-40°С при 0,25°С/мин
Стадия охлаждения
-50°С при 0,10°С/мин
Стадия выдерживания
-50°С в течение 4 часов
Фаза первичной сушки**
Вакуум:
40 мТ
Стадия выдерживания
-50°С в течение 1 часа
Стадия нагревания
-25°С при 0,10°С/мин
Стадия выдерживания
-25°С в течение 100 часов
Фаза вторичной сушки**
Стадия нагревания
25°С при 0,5°С/мин
Стадия выдерживания
25°С в течение 6 часов
Завершающая фаза**
Полуобратная продувка:
N<sub>2</sub> до ½ бар перед герметизацией флаконов
* Фазу проводят при атмосферном давлении.** Фазу проводят в вакууме
ПРИМЕР 3
Композиция II. Прелиофизилированную смесь из таблицы 1 использовали в качестве наполнения стеклянных флаконов 20, 30 и 50 мл и лиофилизировали с использованием процесса, описанного в патенте США №5952303, выданном Bornstein ("Bornstein Lyo Cycle"). В таблице 3 суммированы параметры процесса.
Таблица 3Параметры лиофилизации для Bornstein Lyo Cycle
Исходная температура хранения*:
25°С
Стадия охлаждения*
-40°С при 1,0°С/мин
Стадия выдерживания*
-40°С в течение 2 часов
Вакуум:
100 мТ
Стадия нагревания**
0°С при 0,5°С/мин
Стадия выдерживания**
0°С в течение 48 часов
Стадия нагревания**
26°С при 0,5°С/мин
Стадия выдерживания**
26°С в течение 12 часов
Полуобратная продувка**:
N<sub>2</sub> до ½ бар перед герметизацией флаконов
* Фазу проводят при атмосферном давлении.** Фазу проводят в вакууме.
ПРИМЕР 4
Композиция III. Прелиофилизированную смесь из таблицы 1 использовали в качестве наполнения для стеклянных флаконов 20, 30 и 50 мл и лиофилизировали с использованием способа, описанного в патенте США №7582312, выданном Johnson ("Johnson Lyo Cycle"). В таблице 4 суммированы параметры процесса.
Таблица 4Параметры лиофилизации для Johnson Lyo Cycle
Исходная температура хранения*:
25°С
Стадия охлаждения*
-30°С при 1,0°С/мин
Стадия выдерживания*
-30°С до тех пор, пока флаконы не достигнут температуры
Вакуум**:
500 мТ
Стадия нагревания**
0°С при 1°С/мин
Стадия выдерживания**
Выдерживают до достижения флаконами температуры
Полуобратная продувка**:
N<sub>2</sub> до ½ бар перед герметизацией флаконов
* Фазу проводят при атмосферном давлении.** Фазу проводят в вакууме.
ПРИМЕР 5
Оценка внешнего вида лиофилизированного материала. Случайно выбирали 20 флаконов. Партии 55-20, 55-30 и 55-50 соответствовали композиции I в 20, 30 и 50 мл флаконах, соответственно. Партии 58-20, 58-30 и 58-50 соответствовали композиции II в 20, 30 и 50 мл флаконах, соответственно. Партии 62-20, 62-30 и 62-50 соответствовали композиции III в 20, 30 и 50 мл флаконах, соответственно. Все качественные переменные суммировали с использованием частоты и, когда применимо, процентов. Все непрерывные переменные суммировали с использованием среднего и стандартного отклонения (SD), с медианой и диапазоном (минимум, максимум), используемыми для избранных оценок. Композиции I, II и III, лиофилизированные в 20, 30 и 50 мл флаконах, визуально оценивали в отношении признаков передвижения, таких как белое кольцо выше исходной высоты наполнения. Для флакона 20 мл высота наполнения жидкостью составила 25 мм, для 30 мл флакона высота наполнения жидкостью составила 20 мм, и для 50 мл флакона высота наполнения жидкостью составила 15 мм.
Осуществляли измерение точного расстояния передвижения и измерение расстояния от дна флакона до белого кольца выше исходной высоты наполнения за вычетом исходной высоты наполнения, что представлено в таблице 5 и Фиг. 2.
Таблица 5
Высота передвижения (мм)
Номер флакона
Партия №62-20
Партия №62-30
Партия №62-50
Партия №58-20
Партия №58-30
Партия №58-50
Партия №55-20
Партия №55-30
Партия №55-50
1
11
4
0
3
4
4
1
0
0
2
6
4
0
2
5
0
1
0
0
3
15
4
0
3
3
5
0
0
0
4
7
5
0
2
3
3
0
0
0
5
20
4
4
2
3
3
0
0
0
6
10
6
5
2
3
4
0
0
0
7
7
3
4
3
4
3
0
0
0
8
12
5
7
3
4
4
2
0
0
9
14
5
4
4
4
4
1
0
0
10
8
4
3
3
3
3
2
0
0
11
10
5
5
4
2
3
0
0
0
12
10
5
6
5
3
0
0
0
0
13
9
4
5
4
3
2
0
0
0
14
12
4
5
3
4
1
0
0
0
15
8
6
10
3
2
3
1
0
0
16
4
5
5
3
3
0
1
0
0
17
11
3
2
4
2
3
0
0
0
18
9
5
3
4
3
2
0
0
0
19
10
5
2
4
2
2
0
0
0
20
8
5
4
3
3
2
0
0
0
Образцы композиции I (партии 55-30 и 55-50) (лиофилизированный легочный сурфактант по изобретению) в 30 и 50 мл флаконах не проявляли каких-либо признаков перемещения, тогда как образцы в 20 мл флаконах (партия 55-20), проявляли некоторое небольшое перемещение до 2 мм в 7 из 20 образцов. Образцы композиции II (58-20, 58-30 и 58-50) во всех трех размерах, а также образцы композиции III (62-20, 62-30 и 62-50), с образцами композиции III в 20 мл флаконах оказались наихудшими, все проявляли признаки перемещения во время процесса лиофилизации. Очевидно, с использованием нового способа лиофилизации проблема перемещения достоверно снижалась или устранялась.
20 случайно выбранных флаконов композиций I, II и III, лиофилизированных в 20, 30 и 50 мл флаконах, оценивали в отношении признаков движения при переворачивании посредством однократного опрокидывания флакона. Фиг. 1 представляет собой столбчатую диаграмму, которая показывает количество флаконов, содержащих лиофилизированный материал, который перемещается при переворачивании (показано как черные столбики), и количество флаконов, содержащих лиофилизированный материал, который не перемещается при переворачивании (показано как заштрихованные столбики). Ни один из образцов композиции I (лиофилизированный легочный сурфактант по изобретению) не перемещался при переворачивании, тогда как все образцы композиции III и большая часть образцов композиции II перемещались. Проведенный тест продемонстрировал, что лиофилизированный легочный сурфактант по изобретению расположен во флаконах выше по сравнению с другими образцами.
ПРИМЕР 6
Предложенные исследования стабильности и эффективности API. Четыре API, KL4 (синапультид), DPPC, POPG и пальмитиновую кислоту (PA) исследовали в отношении целостности в течение выбранных временных интервалов в рамках 3-12 месяцев хранения при 25°C, 30°C или 40°C с использованием ВЭЖХ. Параметры ВЭЖХ представлены в таблице 6.
Таблица 6Условия хроматографии
Прибор:
ВЭЖХ (Waters ALLIANCE<sup></sup>, Waters Corp., Milford, MA)
Колонка:
Zorbax SB-C189 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 150×4,6 мм, размер частиц 3,5 микрон или эквивалентная колонка того же размера и фазы
Температура колонки:
50°С
Скорость тока:
0,8 мл/минуту
Определение:
Нагруженный аэрозольный детектор Corona Plus (CAD); ESA Corona Plus CAD
Ввод. объем:
По меньшей мере 33 мкл
Азот (N<sub>2</sub>):
Генератор тока азота N<sub>2</sub>; установленный на 35 футов на кв дюйм
Подвижная фаза А:
Метанол:вода:трифторуксусная кислота (50,0:50,0:0,8, об/об/об)
Подвижная фаза В:
изопропанол:метанол: тетрагидрофуран:трифторуксусная кислота (70:15:15:0,8, об/об/об/об)
Стандарты, включающие каждый из 4 API, запускали для оценки вида элюции. Образцы загружали на колонку и рассчитывали количества API.
ПРИМЕР 7
Композиции I, II и III в 20, 30 и 50 мл флаконах одновременно подвергали тестированию BET. Более конкретно, когда композиции I, II и III помещали в Micromeritics посредством FEDEX в течение ночи для тестирования BET, композиция III становилась неинтактной, так что лепешка оказалась разрушена и, следовательно, была неприменима для исследования. Материал снова транспортировали с использованием более безопасной упаковки, и образцы в 50 мл флаконах (62-50) все еще оказались разрушенными. Результаты теста для образца 62-50 не показали истинного значения.
BET тест проводили как указано далее: Адсорбирующий анализ: Kr; термическая коррекция: да; Интервал уравновешивания: 10 сек; Окружающая температура: 22,00°C; Автоматическая дегазация: да. Результаты для лиофилизированного материала по изобретению (композиция I) в 20 мл, 30 мл и 50 мл флаконах представлены в таблице 7. Результаты для композиции II и III представлены в таблице 8.
Таблица 7
Параметры
Образец: 55-20 Композиция I в 20 мл флаконах
Образец: 55-30 Композиция I в 30 мл флаконах
Образец: 55-50 Композиция I в 50 мл флаконах
Темп. аналитической ванны
77,155 К
77,139 К
77,110 К
Масса образца
Измеренное теплое свободное пространство
27,7288 см<sup>3</sup>
27,4722 см<sup>3</sup>
28,0054 см<sup>3</sup>
Холодное свободное пространство
84,7298 см<sup>3</sup>
83,1997 см<sup>3</sup>
85,6894 см<sup>3</sup>
Площадь поверхности в одной точке
Измеренная при Р/Ро = 0,241772386: 2,4402 м<sup>2</sup>/г
Измеренная при Р/Ро = 0,229917356: 2,5954 м<sup>2</sup>/г
Измеренная при Р/Ро = 0,243909821: 1,9668 м<sup>2</sup>/г
Площадь поверхности ВЕТ
3,4203 м<sup>2</sup>/г ± 0,0239 м<sup>2</sup>/г
3,6868 ± 0,0194 м<sup>2</sup>/г
2,7108 ± 0,0243 м<sup>2</sup>/г
Уклон
1,438722 ± 0,011382 г/см<sup>3</sup> STP
1,328621 ± 0,007963 г/см<sup>3</sup> STP
1,825983 ± 0,018413 г/см<sup>3</sup> STP
Y-отрезок
0,211127 ± 0,001832 г/см<sup>3</sup> STP
0,201998 ± 0,001275 г/см<sup>3</sup> STP
0,255709 ± 0,003006 г/см<sup>3</sup> STP
С
7,814496
7,577384
8,140860
Qm
0,6061 см<sup>3</sup>/г STP
0,6533 см<sup>3</sup>/г STP
0,4804 см<sup>3</sup>/г STP
Коэффициент корреляции
0,9997498
0,9998563
0,9995935
Площадь молекулярного поперечного сечения
0,2100 нм<sup>2</sup>
0,2100 нм<sup>2</sup>
0,2100 нм<sup>2</sup>
Таблица 8
Композиция II, 20 мл
Композиция II, 30 мл
Композиция II, 50 мл
Композиция III, 20 мл
Композиция III, 30 мл
Площадь поверхности ВЕТ, м<sup>2</sup>/г
1,7613 ± 0,0167 м<sup>2</sup>/г
1,7663 ± 0,0193 м<sup>2</sup>/г
0,6462 ± 0,0069 м<sup>2</sup>/г
0,9445 ± 0,0061 м<sup>2</sup>/г
0,7282 ± 0,0032 м<sup>2</sup>/г
Qm, см<sup>3</sup>/г STP
0,3121 см<sup>3</sup>/г STP
0,3130 см<sup>3</sup>/г STP
0,1145 см<sup>3</sup>/г STP
0,1674 см<sup>3</sup>/г STP
0,1291 см<sup>3</sup>/г STP
2
2
2
2
2
Удельная площадь поверхности для образцов композиции I варьировалась от около 3,7 м/г до около 2,7 м/г. Удельная площадь поверхности для образцов композиции II составила около 1,7 м/г. Удельная площадь поверхности для образцов композиции III находилась в диапазоне от около 0,6 м/г до около 0,9 м/г. Очевидно, удельная площадь поверхности для образцов композиции I была достоверно больше, чем для других образцов.
ПРИМЕР 8
Композиция IV
При восстановлении 10 мл стерильной воды для инъекций, лиофилизированная композиция IV обеспечивала следующие концентрации API, как показано в таблице 9:
Таблица 9
API
(мг/мл)
Синапультид (KL<sub>4</sub>)
0,862
Пальмитиновая кислота
4,05
DPPC
22,50
POPG
7,50
Таблица 10Исходные материалы для композиции IV (объем партии 8000 г)
Материалы
Количество (мг) на грамм композиции
Количество (г) на партию
KL<sub>4</sub> (API)
0,797 мг
DPPC (API)
17,99 мг
POPG, Na (API)
5,82 мг
PA (API)
3,11 мг
95% этанол
TRIS буфер:
NaCl
5,83 мг
Трометамин
1,86 мг
Вода
Несколько партий получали в соответствии с таблицей 10. Получение прелиофилизированной смеси: API растворяли в 95% этаноле при 46°C±1°C с получением раствора. Полученный раствор фильтровали под давлением через фильтр 0,22 микрон 33 мм (PVDF) Millipore Millex GY кат. № SLGV033NS в перемешиваемый буферный раствор TRIS при 45°C±2°C с получением композиции липосом с конечной концентрацией этанола 7% (масс/масс). После охлаждения до температуры ниже 30°C полученную композицию липосом, т.е. прелиофилизированную смесь, переносили в 30 мл флаконы для лиофилизации из боросиликатного стекла до объема наполнения 13,7 г/флакон с использованием перистальтического насоса, и лиофилизировали, как описано в примерах 9-14, циклы 1-6.
ПРИМЕР 9
Цикл 2
Таблица 11
Стадия
Температура
Давление
Продолжительность
Описание
°С
микрон
часы
минуты
Нагрузка
1
5
Температура нагрузки при хранении
Замораживание
2
5
1
00
Выдерживают при 5,0°С
3
-45
4
10
Изменение при 0,2°С/мин
4
-45
4
00
Выдерживают при -45°С
5
-22
1
55
Изменение при 0,2°С/мин
6
-22
4
00
Выдерживают при -22°С
7
-45
4
40
Изменение при 0,1°С/мин
Эвакуация
1
-45
100
0
30
Убирают вакуум
Первичная сушка
1
-5
100
3
20
Изменение при 0,2°С/мин
2
-5
100
18
00
Выдерживают при -5°С
Вторичная сушка
3
+25
100
2
30
Изменение при 0,2°С/мин
4
+25
100
13
00
Выдерживают при +25°С Тест Prise 100 мк
5
+25
100
10
00
Выдерживают при +25°С
Закрывают 10,0 фунт/кв дюйм абс.
Конец цикла
ПРИМЕР 10
Цикл 3
Таблица 12
Стадия
Температура
Давление
Продолжительность
Описание
°С
микрон
часы
минуты
Нагрузка
1
5
Температура нагрузки при хранении
Замораживание
1
5
Температура нагрузки при хранении
2
5
1
00
Выдерживают при 5,0°С
3
-45
4
10
Изменение при 0,2°С/мин
4
-45
4
00
Выдерживают при -45°С
5
-22
1
55
Изменение при 0,2°С/мин
6
-22
4
00
Выдерживают при -22°С
7
-45
4
40
Изменение при 0,1°С/мин
Эвакуация
1
-45
150
0
30
Убирают вакуум
Первичная сушка
1
0
150
3
45
Изменение при 0,2°С/мин
2
0
150
18
00
Выдерживают при 0°С
Вторичная сушка
3
+25
150
2
05
Изменение при 0,2°С/мин
4
+25
150
13
00
Выдерживают при +25°С Тест Prise 100 мк
5
+25
150
10
00
Выдерживают при +25°С
Закрывают 10,0 фунт/кв дюйм абс.
Конец цикла
ПРИМЕР 11
Цикл 4
Таблица 13
Стадия
Температура
Давление
Продолжительность
Описание
°С
микрон
часы
минуты
Нагрузка
1
5
Температура нагрузки при хранении
Замораживание
2
5
1
00
Выдерживают при 5,0°С
3
-45
4
10
Изменение при 0,2°С/мин
4
-45
4
00
Выдерживают при -45°С
5
-22
1
55
Изменение при 0,2°С/мин
6
-22
4
00
Выдерживают при -22°С
7
-45
4
40
Изменение при 0,1°С/мин
Эвакуация
1
-45
50
0
30
Убирают вакуум
Первичная сушка
1
0
50
3
45
Изменение при 0,2°С/мин
2
0
50
18
00
Выдерживают при -0°С
Вторичная сушка
3
+25
50
2
05
Изменение при 0,2°С/мин
4
+25
50
13
00
Выдерживают при +25°С Тест Prise 100 мк
5
+25
50
10
00
Выдерживают при +25°С
Закрывают 10,0 фунт/кв дюйм абс.
Конец цикла
ПРИМЕР 12
Цикл 5
Таблица 14
Стадия
Температура
Давление
Продолжительность
Описание
°С
микрон
часы
минуты
Нагрузка
1
5
Температура нагрузки при хранении
Замораживание
2
5
1
00
Выдерживают при 5,0°С
3
-45
4
10
Изменение при 0,2°С/мин
4
-45
4
00
Выдерживают при -45°С
5
-22
1
55
Изменение при 0,2°С/мин
6
-22
4
00
Выдерживают при -22°С
7
-45
4
40
Изменение при 0,1°С/мин
Эвакуация
1
-45
50
0
30
Убирают вакуум
Первичная сушка
1
-10
50
2
55
Изменение при 0,2°С/мин
2
-10
50
18
00
Выдерживают при -10°С
Вторичная сушка
3
+25
50
2
55
Изменение при 0,2°С/мин
4
+25
50
13
00
Выдерживают при +25°С Тест Prise 100 мк
5
+25
50
10
00
Выдерживают при +25°С
Закрывают 10,0 фунт/кв дюйм абс.
Конец цикла
ПРИМЕР 13
Цикл 6
Таблица 15
Стадия
Температура
Давление
Продолжительность
Описание
°С
микрон
часы
минуты
Нагрузка
1
5
Температура нагрузки при хранении
Замораживание
2
5
1
00
Выдерживают при 5,0°С
3
-45
4
10
Изменение при 0,2°С/мин
4
-45
4
00
Выдерживают при -45°С
5
-22
1
55
Изменение при 0,2°С/мин
6
-22
4
00
Выдерживают при -22°С
7
-45
4
40
Изменение при 0,1°С/мин
Эвакуация
1
-45
150
0
30
Убирают вакуум
Первичная сушка
1
-10
150
2
55
Изменение при 0,2°С/мин
2
-10
150
18
00
Выдерживают при -10°С
Вторичная сушка
3
+25
150
2
55
Изменение при 0,2°С/мин
4
+25
150
13
00
Выдерживают при +25°С Тест Prise 100 мк
5
+25
150
10
00
Выдерживают при +25°С
Закрывают 10,0 фунт/кв дюйм абс.
Конец цикла
ПРИМЕР 14
Цикл 1
Таблица 16
Стадия
Температура
Давление
Продолжительность
Описание
°С
микрон
часы
минуты
Нагрузка
1
5
Температура нагрузки при хранении
Замораживание
2
5
1
00
Выдерживают при 5,0°С
3
-15
1
40
Изменение при 0,1°С/мин
-15
1
00
Выдерживают при -15°С
4
-45
5
00
Изменение при 0,1°С/мин
5
-45
3
00
Выдерживают при -45°С
Эвакуация
1
-45
100
0
30
Убирают вакуум
Первичная сушка
1
-5
100
3
20
Изменение при 0,2°С/мин
2
-5
100
18
00
Выдерживают при -5°С
Вторичная сушка
3
+25
100
2
30
Изменение при 0,2°С/мин
4
+25
100
13
00
Выдерживают при +25°С Тест Prise 100 мк
5
+25
100
10
00
Выдерживают при +25°С
Закрывают 10,0 фунт/кв дюйм абс.
Конец цикла
ПРИМЕР 15
Лиофилизированный продукт, полученный в результате циклов 1-6, одновременно подвергали тесту BET.
Тест BET проводили с теми же параметрами, как описано в примере 7 выше. Тестировали три флакона для каждого цикла. Результаты представлены в таблице 17.
Таблица 17
Флакон 1 Площадь поверхности ВЕТ, м<sup>2</sup>/г
Флакон 2 Площадь поверхности ВЕТ, м<sup>2</sup>/г
Флакон 3 Площадь поверхности ВЕТ, м<sup>2</sup>/г
Стадия 1
2,8346
2,3442
2,81
Стадия 2
2,811
2,2773
2,9054
Стадия 3
2,3712
2,4207
2,2615
Стадия 4
2,8611
3,0281
2,9269
Стадия 5
2,7151
3,4333
3,2092
Стадия 6
2,3428
2,4349
2,2654
МЕТОДЫ: Восстановление. Требованиями к восстановленному раствору было отсутствие видимого нерастворенного материала и раствор не менее прозрачный, чем растворитель по истечение заранее определенного количества времени. Объем восстановления должен возвращать продукту тот же объем и концентрацию, как у исходного продукта для заполнения исходного раствора, и может иметь тот же объем, предназначенный для введения пациенту в клинических условиях. Очищенную воду, USP, в качестве растворителя, в объеме 10 мл набирали в шприц. Разбавитель затем вносили в центр высушенной лепешки и включали таймер. Затем продукт исследовали с приблизительно 5 секундными интервалами в светлой коробке для подтверждения отсутствия какого-либо нерастворенного материала и прозрачности раствора. Раствор при полном восстановлении характеризовали как прозрачный, бесцветный, мутный, непрозрачный и/или замутненный. Частицы, если есть, классифицировали как мелкие нерастворенные вещества - грубые волокна. Нерастворенные вспомогательные вещества или API отмечены как есть.
Измерение рН - В восстановленных растворах (см. выше) измеряли рН посредством UPS <791>, pH. Перед применением проводили стандартизацию двумя или тремя буферами рН, которые охватывали ожидаемый диапазон образца. Выбранные буферы рН должны были отличаться на не более чем три единицы рН, но на не менее чем две единицы рН (например, 4,01, 7,00 и 10,01). Зонд АТС использовали для автоматической компенсации температуры. Количество образца раствора, достаточное для покрытия сенсора зонда рН и любых свободных спаев на поверхностях зонда, помещали в подходящий контейнер. Раствор аккуратно взбалтывали и затем позволяли стоять и стабилизироваться до постоянного значения в течение периода по меньшей мере 15 секунд, в каждой точке, записывали полученное значение рН.
Кулонометрическое титрование Karl Fischer - Исследование влаги проводили общепринятыми обычными методами, перечисленными под USP <921>, Water Determination. Исходный высушенный образец и контейнер взвешивали. В методе экстракции растворителя безводным метанолом, специальным реагентом, A.C.S. вводили в контейнер, используемый для суспендирования и растворения сухого вещества. Объем экстракции метанола, используемый для покрытия сухого материала, составил 13,0 мл - 13,7 мл для каждого исследования. Затем образцам позволяли набухнуть в течение заранее определенного периода времени для экстракции влаги из продукта. Затем удаляли аликвоту, измеряли объем, затем вводили в реакционный сосуд прибора KF. При достижении конечной точки титрования сообщали результаты. Прибор KF различает содержание воды до микрограмм. Пустой контейнер затем взвешивали и рассчитывали процент влаги для исходного содержимого контейнера.

Высокотемпературная дифференциальная сканирующая калориметрия (HT DSC) - Использовали в качестве средства определения температуры стеклообразования твердых материалов, что обеспечивает полезную информацию для оценки композиции и исследования поведения в высушенном состоянии. HTDSC следует существующему USP <891>, Thermal Analysis, и ее проводят с использованием Perkin Elmer DSC7, присоединенного к инструментальному контроллеру TAC 7/7. Параметры теста и анализ данных проводили с использованием программного обеспечения PYRIS версии 4.0 в интерфейсе РС. Приблизительно 10-15 мг твердого материала помещали в алюминиевую канистру для образцов с гофрированной вентилируемой крышкой. Азот, NF, использовали для непрерывной продувки образца со скоростью тока 20 мл/минуту. Лиофилизированный материал нагревали для оценки термического поведения при более высоких температурах. При нагревании, процесс изменения или потребления тепла из образца отражал различия в энергии при термическом воздействии на образец. Данные сканирования записывали и одновременно изображали графически с использованием программного обеспечения Pyris 4.0. Расчеты показывали температуру в начале и на пике термического события при завершении сканирования. На основании результатов сканирования определяли температуры для таких термических событий, как стеклообразование (Tg), кристаллизация, температура плавления (Tm) и ассоциированная теплота плавления и/или удельная теплоемкость высушенного конечного продукта с использованием указанного метода.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Средние значения остаточной влаги лиофилизированных образцов композиции I были близки к 0%. Среднее время восстановления составило 8 и 10 секунд. Высокотемпературные DSC сканирования, проводимые на материале по 2°С в минуту, показали, что соответствующий значительный эндотермический пик наблюдали при температуре между 49,0° и 51,0°.
Тогда как изобретение было описано подробно и со ссылками на его конкретные примеры, специалисту в области техники очевидно, что могут быть сделаны различные изменения и модификации без отклонения от его сущности и объема.