Бактериальные биопленки в инфекционной патологии человека

ТЛУШАНОВА Н.А., ‘БЛИНОВ А.И., 2АЛЕКСЕЕВА Н.Б.

1 Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей, 2Городская клиническая больница № 2 Святого Великомученика Георгия Победоносца,

г. Новокузнецк

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БИОПЛЕНКИ В ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

Обоснована актуальность проблемы бактериальных биопленок в инфекционной патологии. Показано, что формирование биопленочных сообществ микроорганизмов - одна из основных стратегий выживания бактерий в организмах инфицируемых хозяев. Изложены этапы образования бактериальных биопленок. Рассмотрены биологические особенности бактерий, входящих в состав биопленок, и механизмы их повышенной антибиотикоустойчивости. Ключевые слова: бактерии; биопленки; сообщества микроорганизмов.

‘GLUSHANOVA N.A., ‘BLINOV A.I., 2ALEKSEEVA N.B.

1 Novokuznetsk State Institute of Postgraduate Medical,

2City Clinical Hospital N 2 St. George the Victorious,

Novokuznetsk

BACTERIAL BIOFILMS IN HUMAN INFECTIOUS PATHOLOGY

The urgency of the problem of bacterial biofilms in infectious pathology. It is shown that the formation of biofilm microbial communities - one of the main survival strategies of bacteria in organisms becoming infected hosts. The stages of the formation of bacterial biofilms. Reviewed the biological characteristics of bacteria belonging to the biofilm, and the mechanisms of their increased antibiotic resistance.

Key words: bacteria; biofilms; communities of microorganisms.

Ранее считалось, что единственной формой существования бактерий в природе является планктонное состояние, при котором одиночные бактериальные клетки свободно передвигаются в жидкой среде. Однако в 80-е годы XX века благодаря разработке новых методов исследования выяснилось, что в свободно плавающем состоянии находится лишь незначительная часть бактерий. Подавляющая часть (99 %) бактерий, обитающих в природных экосистемах, существуют в иммобилизованном состоянии, при котором клетки бактерий фиксированы на твердой поверхности и плотно прижаты друг к другу, образуя специфические образования, получившие название биопленок.

В последующем было установлено, что в форме биопленок существует и резидентная микрофлора слизистых оболочек полости рта, кишечника и кожи человека, а также патогенные микроорганизмы.

Выяснилось, что микроорганизмы способны образовывать биопленки на любых твердых поверхностях, что создает большие проблемы в медицинской практике и в различных областях хозяйственной деятельности. Стало ясно, что биопленки имеют экологическое, гигиеническое, эпидемиологическое и клиническое значение.

Биопленки сине-зеленых водорослей на поверхности водоемов, используемых для питьевого водоснабжения, вызывают изменение органолептических показателей качества воды. Биопленки служат причиной появления и накопления патогенных бактерий в трубопроводах холодного и горячего водоснабжения. Это приводит к крупным водным вспышкам инфекционных заболеваний. Типичным примером могут служить легионеллы и повсеместно встречающиеся вспышки легионеллеза.

Бактериальные биопленки имеют существенное значение в клинической медицине. Биоплен-

30

КЛИНИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ, ОТНОСЯЩИХСЯ К КОНТИНГЕНТУ ОСОБОГО ВНИМАНИЯ

ки являются одним из патогенетических факторов формирования хронических инфекционных процессов. В первую очередь, это касается заболеваний, связанных с парентеральным введением в организм человека различных имплантов, лечебно-диагностических устройств и инструментов (катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, контактных линз).

В последние десятилетия формируется все более полное понимание значения биопленок в экологии, медицине, промышленности. Исследованию роли биопленок в окружающей среде и в организме человека в настоящее время уделяется особое внимание, и учение о биопленках активно развивается, обещая прогресс в борьбе с инфекционными заболеваниями. В 1978 г. была сформулирована общая теория существования биопленок.

В настоящее время биопленкой называют живое, постоянно обновляющееся сообщество микроорганизмов, необратимо прикрепленных на биогенном или абиогенном субстрате и друг к другу, окруженных внеклеточным полимерным материалом (матриксом), продуцируемым этими же бактериями и предохраняющим их от агрессивных воздействий окружающей среды. Такие бактериальные сообщества могут быть образованы бактериями одного или нескольких видов, и состоять как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся, некультивируемых форм.

Биопленки, образующиеся на различных живых и неживых поверхностях, имеют важное биологическое значение. Биопленки служат естественным селективным барьером между бактериальными клетками, обитающими в них, и окружающей средой, обеспечивают защиту бактерий от других конкурирующих микроорганизмов. Находясь в составе биопленки бактерии, в отличие от планктонной формы, эффективнее используют кислород, питательные вещества и активно противостоят неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Актуальность проблемы бактериальных биопленок в медицинских учреждениях возросла в связи с обнаружением способности бактерий образовывать биопленки на многих медицинских приборах, оборудовании, аппаратуре, приспособлениях, имплантах, на стенках сосудов, покрывая холестериновые бляшки и делая их прочнее.

В настоящее время полагают, что 60-65 % инфекционных заболеваний, прежде всего инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), обусловлены способностью их возбудителей существовать в форме биопленок. Значительная их часть приходится на долю хронических инфекций, причем более 50 % — у людей с ослабленной иммунной системой.

Показано, что образовывать биопленки могут как грамположительные (Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus viridans), так и грамотрицательные (E.coli, K.pneumoniae, Proteus mirabilis, P.aeruginosa, B.cepacia, Acinetobacter, Burkholderia, Stenotrophomonas, Chryseobacterium) бактерии. Формировать биопленки способны патогенные, условно-патогенные, непатогенные микроорганизмы и их ассоциации.

В литературе широко обсуждается возможное участие пленкообразующих микроорганизмов в развитии соматической патологии: обострений язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, болезни Крона, миокардитов, атеросклероза, бронхиальной астмы, диабета 1 типа, онкологических, кардиоваскулярных заболеваний.

Биопленки, состоящие из грамотрицательных бактерий, способны продуцировать в окружающую среду эндотоксин, что может приводить к развитию инфекционно-токсического шока.

В составе биопленок клетки бактерий ограждены от воздействия стрессовых ситуаций, таких как УФ-облучение, изменения рН среды, осмотический шок, высыхание, воздействие антибактериальных препаратов. С помощью биопленки бактерии защищаются и от действия факторов естественной резистентности организма (фагоцитоз, микробиоцидное действие лизоцима, белки системы комплемента, цитокинов) и факторов специфического иммунитета.

Согласно современной модели, созданной на основании данных конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, живая полноценная биопленка представляет собой образования, сформированные микроколониями бактерий в форме башен или грибов (15-20 % объема) и экзополимерным матриксом (75-85 % объема).

Бактериальный матрикс имеет собственную систему микроциркуляции, независимую от организма хозяина. Система пор и канальцев различного диаметра обеспечивает поступление вглубь биопленки и циркуляцию питательных веществ, кислорода, углекислого газа, ферментов, сигнальных метаболитов и выведение продуктов метаболизма бактериальных клеток.

За образование и поддержание каналов в активном состоянии несут ответственность специальные механизмы, в которых важную роль играют особые поверхностные структуры - ri-рам-нолипиды. Матрикс обладает способностью к саморегуляции и может приобретать гидрофильные или гидрофобные свойства.

Снаружи матрикс биопленки покрыт поверхностной оболочкой основным элементом которой является трехслойная мембрана, ультратонкое строение которой аналогично плазматической мембране бактерий. Поверхностная оболочка выполняют барьерную функцию, и служит уни-

31

версальной защитой микробных сообществ от действия окружающей среды, а также придает биопленке прочность, необходимую для сохранения ее структурной целостности.

В составе поверхностной оболочки и матрикса биопленок обнаружены белки, полисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) и билипидный компонент, схожий по строению с элементарной мембраной, хотя и содержащий большее количество кардиолипина и меньшее — лизофосфолипидов, нежели мембраны бактериальных клеток.

Характерная особенность структуры биопленки — наличие мембранных везикул. В пузырьках содержатся периплазматические гидролитические ферменты, транспортируемые к поверхности. Предполагается, что основная функция везикул в биопленке - лизис части микробных клеток, которые используются в качестве источника необходимых ростовых факторов для остальных членов микробного сообщества. Такую примитивную «альтруистическую» «стратегию» диктует необходимость выживания бактерий в ограниченной экологической нише. Бактериальные клетки в биопленках плотно «упакованы», что обеспечивает тесный контакт клеток в микробном сообществе и передачу межклеточных сигналов, а также обмен генетическим материалом, т.е. облегчает межклеточное общение (коммуникацию) микроорганизмов.

В динамике формирования зрелой биопленки выделяют несколько стадий.

Прикрепительная стадия. Процесс формирования биопленки начинается с прикрепления планктонных бактерий в твердой биотической или абиотической поверхности. Прикрепление основано на гидрофобных и электростатических контактах с поддерживающим субстратом. При переходе к фиксированному образу жизни большую роль у подвижных бактерий играют поверхностные органеллы — жгутики, флагеллы (пили).

Неподвижные бактерии прикрепляются с помощью адгезинов фимбриальной и нефимбриаль-ной природы, способствующих преодолению сил отталкивания при взаимодействии одноименно заряженных поверхностей.

В прикреплении грамположительных бактерий участвуют тейхоевые кислоты, которые играют роль ранних адгезинов.

Первичный контакт бактерий с твердой поверхностью представляет обратимый процесс -некоторые клетки способны открепляться.

Стадия агрегации и размножения. На втором этапе происходит агрегация (объединение) клеток прикрепившихся ранее к твердой поверхности. Для агрегации необходимо наличие пилей

4 типа, синтез которых находится под контролем Quorum Sensing (QS) — «чувства кворума».

После прикрепления и агрегации клетки начинают размножаться, образуют монослой и распространяются по поверхности субстрата с помощью высокоподвижных клеток — швермеров, формируя микроколонии.

Стадия синтеза экзополисахарида. На

этом этапе происходит включение генов, определяющих синтез экзополисахарида и формирование основного компонента биопленки — экзополимерного матрикса.

Стадия созревания биопленки. В процессе созревания биопленки происходит накопление бактерий, как за счет размножения бактерий в микроколониях, так и за счет прикрепления к начальной биопленке свободно плавающих подвижных и неподвижных бактерий разных видов. Заканчивается процесс созревания биопленки формированием сообщества бактерий, иммобили-зованнного на твердой поверхности и защищенного полисахаридным матриксом.

Стадия разрушения биопленки. Последняя стадия — процесс дисперсии, или распада матрикса, во время которого бактерии активно покидают биопленку, переходя в планктонную форму. Этот процесс приводит к диссеминации инфекции или контаминации объектов окружающей среды. В разрушении биопленки участвуют альгинат-лиаза и другие полисахара-лиазы (собственные поверхностно-активные вещества бактерий).

Таким образом, цикл развития биопленки завершается, бактерии вновь возвращаются к планктонному образу жизни с тем, чтобы при необходимости вновь его повторить.

Развитие биопленок — сложный регулируемый генетически запрограммированный процесс.

К настоящему времени накоплено значительное количество информации о том, что способность микроорганизмов к образованию биопленок, как и координация и регуляция жизнедеятельности бактерий внутри биопленки, детерминирована генетически. Исследования показывают, что состав функционирующих генов у планктонных бактерий и бактерий из сообщества биопленки сильно различается.

Именно внутри биопленки происходит конью-гация и обмен хромосомным генетическим материалом между бактериями одного вида и даже разными видами. В результате появляются новые генетические клоны бактерий. Это приводит к постоянному обновлению бактериальной популяции и «ускользанию» новых клонов от факторов иммунной защиты организма. Обмен внехромосомной генетической информацией может проис-

32

КЛИНИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ, ОТНОСЯЩИХСЯ К КОНТИНГЕНТУ ОСОБОГО ВНИМАНИЯ

ходить также с помощью плазмид или транспо-зонов.

Биологические особенности бактерий, входящих в состав биопленок

Бактерии, обитающие в составе биопленок, имеют существенные биологические отличия от планктонных форм. Наибольшее внимание исследователей привлекает антибиотикоустойчивость биопленок и взаимодействие биопленок с иммунной системой.

Биопленки и иммунная система

Бактерии в составе биопленки становятся труднодоступными для атаки факторов иммунной системы макроорганизма. Даже у практически здоровых людей иммунная система не справляется с инфекциями, ассоциированными с биопленками. Биопленочная инфекция редко устраняется иммунной системой хозяина. Иммунный ответ хозяина может даже стать причиной повреждения тканей самого хозяина, окружающих пораженный участок.

В настоящее время нет прямых доказательств, что образование биопленки является определяющим моментом в развитии острого инфекционного процесса. Однако полагают, что биопленки имеют значение при хронических и персистирующих бактериальных инфекциях. Для некоторых гнойно-воспалительных заболеваний, таких как периодонтиты, эндокардиты, инфекции легких при муковисцидозе, эта связь является достаточно выраженной, для других - менее заметной. Пока мало известно об иммунобиологической характеристике «биопленочных» бактериальных клеток при развитии хронических форм гнойно-воспалительных инфекционных процессов.

Долгое время единственным объяснением устойчивости биопленок к воздействиям иммунных факторов была гипотеза о том, что клетки иммунной системы не могут проникать в биопленку. Однако in vitro было обнаружено наличие лейкоцитов человека в молодых и зрелых биопленках S.aureus. Такие лейкоциты внутри биопленок не были способны фагоцитировать бактерии. В связи с этим, авторами было выдвинуто предположение, что в биопленке имеются механизмы, способные ингибировать нормальные функции лейкоцитов.

Неясно, способны ли микроорганизмы биопленки индуцировать иммунный ответ, и может ли иммунный ответ влиять на рост биопленок и проявления возбудителем вирулентности.

Антибиотикочувствительность бактерий биопленок

Структура биопленки и особенности физиологии составляющих ее клеток обеспечивают многократно повышенную, по сравнению с планктон-

ными бактериальными клетками, устойчивость членов сообщества к антимикробным препаратам.

Показано, что бактерии и грибы, в составе биопленок, выживают в присутствии антибиотиков, в количествах в 500-1000 раз больших, чем микроорганизмы, растущие планктонно. Таким образом, чувствительность к антибиотикам микроорганизмов, ассоциированных в биопленку, не соответствует таковой, определенной в лабораторных тестах на клинических изолятах чистых культур бактерий, что создает сложности с лечением.

Механизмы повышенной антибиотикорезистентности бактерий, обитающих в биопленках, до конца не изучены.

Предполагают, что повышенная резистентность бактерий в биопленке может быть связана с:

- затруднением, замедлением или неспособностью антибиотиков проникать через поверхно-стую оболочку и компоненты полисахаридного матрикса вглубь биопленки;

- связыванием и инактивацией антибиотиков полимерами или модифицированными ферментами матрикса

- антибиотики связываются с бактериальными клетками, находящимися в биопленке значительно медленнее, по сравнению с клетками, свободно растущими в суспензии (часы и минуты соответственно); за это время клетки в биопленке успевают образовать адаптивные антибиотикоустойчивые формы;

- замедленной скоростью деления и роста бактерий в составе биопленок по сравнению с планктонными культурами. В пределах биопленки существует градиент по содержанию питательных веществ и кислорода, в результате которого на периферии биопленок находятся активно метаболизирующие, а внутри биопленок - метаболически неактивные клетки. Известно, что мишенями для действия антибиотиков являются активно растущие клетки, поэтому внутри биопленок бактерии оказываются нечувствительными к воздействию антибиотиков.

Наиболее вероятным механизмом повышенной антибиотикорезистентности бактерий, обитающих в биопленках, считается существование в составе биопленок, особенно в ее глубоких слоях, фенотипически устойчивых вариантов бактерий, названных «персистерами», а также покоящихся, неделящихся клеток со сниженным уровнем метаболизма, устойчивых к действию антибактериальных агентов. В биопленках бактерии, испытывая дефицит питательных веществ, переходят в покоящееся или некультивируемое состояние, а медленно растущие и/или не растущие клетки мало чувствительны ко многим антибактериальным агентам.

33

В целом цепь событий при антибиотикотерапии биопленок представляют следующим образом: мишенью для антибиотиков, в первую очередь становятся бактерии, покидающие биопленку для расселения.

Затем с антибиотиком контактируют микроорганизмы поверхностного слоя биопленки. Они также обречены, но прежде чем погибнуть, вырабатывают сигнальные молекулы, которые по системе микроциркуляции поступают к микроорганизмам глубоких слоев биопленки и дают им возможность среагировать на опасность. В результате развиваются адаптивные защитные реакции бактерий, снижающие эффективность антибиотиков:

- одни бактерии активируют защитные молекулы, которые препятствуют адгезии антибиотиков на внешних мембранах клеток;

- другие бактерии вырабатывают гидрофобные вещества, которые предотвращают проникновение антибиотиков через клеточную мембрану;

- третьи активируют систему перекисного окисления и ферменты, в частности р-лакта-мазу или каталазу, которые инактивируют молекулы антибиотиков.

В результате антибактериальные препараты не полностью уничтожают бактерии биопленки, а только препятствуют увеличению их числа и распространению в организме больного человека.

Последствиями низкой эффективности антимикробной терапии биопленок является длительное существование очага инфекции в организме, в результате чего бактерии оказывают постоянное влияние на состояние здоровья человека. Полагают, что именно с особенностями выживания бактерий в биопленках в значительной степени связана хронизация инфекции.

Перспективы борьбы с биопленками

Проблема подавления образования или разрушения бактериальной пленки является весьма актуальной задачей, так как классические приемы антимикробной терапии гнойно-воспалительных инфекционных процессов в ряде случаев мало-

эффективны и непредсказуемы из-за высокой лекарственной устойчивости внутрибиопленочных форм возбудителя.

Сегодня не существует средств, обеспечивающих прямое и полное уничтожение биопленки. Но есть понимание того, как их создавать и активно разрабатываются различные подходы по предотвращению образования, контролю роста и разрушению биопленок.

Ведется поиск веществ, разрушающих матрикс биопленки и облегчающих доступ антибактериальных препаратов к бактериальным клеткам.

Разрабатываются материалы и устройства с антибактериальными и антиадгезивными свойствами, препятствующими формированию биопленок на имплантируемых устройствах.

В качестве альтернативы антибиотикам активно разрабатываются средства ингибиции регуляторных систем и систем биокоммуникации бактерий Средства нарушения межклеточной кооперации бактерий без уничтожения самих бактерий перспективны в лечении заболеваний, вызванных резистентными к антибиотикам штаммами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, научные исследования последних десятилетий показали, что формирование биопленочных сообществ микроорганизмов — одна из основных стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в организмах инфицируемых хозяев.

Новые научные данные о биопленочной форме существования бактерий существенно дополняют общеизвестные представления о биологии микроорганизмов, взаимодействии паразита с организмом хозяина, механизмах развития инфекционного процесса и действия на микроорганизмы антибиотиков.

На основе этих данных для борьбы с биопленками медицинская микробиология и клиническая фармакология активно разрабатывают новые подходы и антимикробные препараты нового поколения.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Дезорганизация биопленок клинических штаммов стафилококков метаболитами лактобацилл /О.В. Рыбаль-ченко, В.М. Бондаренко, О.Г. Орлова и др. //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2010. - № 6. - С. 66-70.

2. Романова, Ю.М. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина /Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2011. - № 3. - С. 99-110.

34

КЛИНИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ, ОТНОСЯЩИХСЯ К КОНТИНГЕНТУ ОСОБОГО ВНИМАНИЯ

3. Биопленки патогенных бактерий и их роль в хрониза-ции инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками /Ю.М. Романова, Л.В. Диденко, Э.Р. То-лордава и др. //Вестник РАМН. - 2011. - № 10. - С. 31-39.

4. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лактобациллами, выделенными из полости рта здоровых людей /Ю.В. Червинец, С.Г. Ботина, А.А. Глазова и др. //Клин. лаб. диагностика. - 2011. - № 2. - С. 44-46.

5. Бухарин, О.В. Влияние активных форм кислорода на адгезивные характеристики и продукцию биопленок бактериями /О.В. Бухарин, А.В. Сгибнев //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2012. - № 3. - С. 70-73.

6. Рыбальченко, О.В. Ультраструктура микробных биопленок при межклеточных взаимоотношениях бактерий в сообществах /О.В. Рыбальченко, В.М. Бондаренко,

О.Г. Орлова //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2014. - № 4. - С. 87-92.

7. Способность к формированию биопленок у клинических штаммов S.aureus и S.epidermidis - ведущих возбудителей ортопедической имплант-ассоциированной инфекции /С.А. Божкова, М.В. Краснова, Е.М. Полякова и др. //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2014. - Т. 16, № 2. - С. 149-156.

8. Маянский, А.Н. Стратегия управления бактериальным биопленочным процессом /А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь //Журнал инфектологии. - 2012. - Т. 4, № 3. - С. 5-15.

35