Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции
METHOD OF PRODUCING CONJUGATE BASED ON MAGNETIC METALL-CARBON NANOPARTICLES SUITABLE FOR DIAGNOSTIC AND ANALYTICAL TARGET USING NMR-RELAXOMETRY AS A DETECTION METHOD

Изобретение относится к области молекулярной иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для количественного определения любых соединений способных к стереоспецифическим взаимодействиям (антигенов, антител, нуклеиновых кислот, биологически активных макромолекул), а также в технологии изготовления наночастиц с функционально модифицированной поверхностью, пригодных для использования в фармакологии, косметологии, медицине.
К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных аналиту соединений (анти-аналитов) оптически плотными частицами или водорастворимыми цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток - латексы, в том числе цветные (Tarcha et al., Abbot Labs., Eur. pat. appl. 89116594.6), эритроциты (Guesdon J-L., AvrameasS., Ann. Immunol., 1980, v. 131 C, p. 389-396), неметаллические коллоиды серы, селена, теллура (Yost et al., Eur. pat. appl. 88110459.0), полимеризованные красители Конго красный, Трипановый голубой, Lissamine blue (Henry Robert P., US Pat. 4.452.886), коллоидное золото (Roth J., Heitz P.U., Immunolabeling with the Protein A - Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13:467-484.). Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие аналита как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов) - например, по агглютинации довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменению спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов, так и в многочисленных гетерогенных системах -ЭритроИммуноАдсорбции и, более широко, Седиментационно-Адсорбционном (Иммуно)Анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блотинге; иммуно- и гибридофильтрации (Flow-Through анализах), иммуномиграции (иммунохроматографии) и ряде других - по окрашиванию зоны специфического связывания аналита на непористом или пористом твердофазном носителе. Учитывая, что основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение аналита, без участия регистрирующей аппаратуры, условно их можно выделить в группу так называемых безынструментальных способов анализа.
Вместе с тем, не утрачивают своего значения методы, основанные на инструментальной регистрации результатов диагностического тестирования. Их востребованность диктуется значимостью в определенных ситуациях сверх высокочувствительного определения либо следовых количеств веществ и/или низких концентраций соединений, являющихся маркерами опасных заболеваний, например, опухолевых маркеров, либо веществ, даже малые количества которых могут представлять опасность для жизни. Разработка таких систем анализа может способствовать своевременному вмешательству в онкологический процесс, значение которого трудно переоценить, контролировать и своевременно вносить коррекцию в процесс терапии, предупреждать риски событий потенциально опасных для жизнедеятельности. В любом случае безусловно важным является не только высокие чувствительность и специфичность анализа, но и воспроизводимость и надежность. Уровень последних весьма зависит от возможности максимально стандартизовать процедуру анализа, что напрямую зависит от степени простоты форматной аранжировки. Очевидно, что достичь успеха здесь можно за счет сокращения числа операционных процедур в структуре теста, а это становится возможным в результате совершенствования реагентного обеспечения теста.
Наиболее близким к заявляемому объекту по технической сущности и достигаемому результату являются способ получения конъюгатов на основе магнитных наночастиц, представляющих собой железо-углеродные композиции (М.Б. Раев, М.С. Бочкова, П.В. Храмцов, А.В. Тюленев. «Способ функционализации поверхности магнитных наночастиц». Патент РФ №2543631 от 02.002.2015).
Задача, описанная в прототипе, состояла в разработке способа получения прочных функциональных конъюгатов, основой которых являются магнитные наночастицы.
Основой для решения поставленной задачи было применение магнитных полей, создаваемых вращающимся и/или неподвижным магнитами на определенных этапах технологии.
Поставленную задачу решали путем введения магнитных наночастиц в раствор полимера, сорбируемого на их поверхности, в непосредственной близости от вращающегося магнита. При этом частицы вводимого материала приобретают вращательное движение, что способствует практически мгновенной пептизации частиц. Введение в суспензию пептизированных частиц бифункционального реагента способствует активации поверхности для дальнейшего конъюгирования частиц с молекулами аффинных соединений (анти-аналитов). Единственной промежуточной стадией является удаление избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента, которое осуществляется в ходе последовательного осаждения-ресуспендирования частиц на неподвижном магните. Последняя процедура повторяется после конъюгирования активированных частиц с молекулами анти-аналита.
Описанный способ объективно привлекателен, как с позиции экономии времени, так и в части затрат на осуществление процедур освобождения от непрореагировавших соединений.
С позиции критики следует отметить лишь два обстоятельства. Первое заключается в существенном уровне потерь материала вследствие образования агрегатов при осаждении частиц в поле действия постоянного магнита. И без того склонные к агрегации магнитные наночастицы в условиях магнитного поля многократно усиливают реализацию этой склонности, что однозначно влияет на количество удаляемого материала в виде агрегатов. Потери могут составлять в конечном итоге до 50%. Вторым существенным моментом является получение конъюгата, применение которого требует включение в форматную аранжировку конструируемой тест-системы стадию использования зонда (промежуточного участника аналитической процедуры), специфичного определяемому лиганду и одновременно биоспецифическим молекулам конъюгата. Структура аналитической процедуры при этом выглядит следующим образом: твердофазный реагент с сорбированным на его поверхности анти-аналитом - определяемое соединение (аналит) - зонд - конъюгат. При этом время аналитической процедуры без учета стадии инструментальной детекции превышает три часа. То есть, сокращение времени и упрощение технологии синтеза с учетом серьезных потерь используемых материалов, компенсируется усложнением и удлинением процедуры аналитического тестирования с использованием получаемых реагентов.
Заявляемый способ решает две принципиальные задачи, существенным образом сокращая потери материала (металл-углеродная матрица, сорбируемый полимер, аффинные соединения), а также позволяя конструировать системы анализа в аранжировке, при которой длительность процедуры сокращается не менее, чем на 30%. Это имеет существенное значение, особенно в ситуациях, когда определяемый лиганд (маркер), является индикатором быстро протекающего процесса и/или в ситуациях, когда требуется быстрое принятие решений, а также, когда количество анализируемых образцов достаточно велико.
Описание разработанного способа.
Заявляемый способ конъгирования предоставляет возможность для очень широкого выбора конкретных сорбируемых полимеров и активирующих/конъюгирующих реагентов. Данное обстоятельство вынуждает заявителя представить формулу изобретения, составленную в принципиальных терминах, попытка конкретизации которых неминуемо привела бы к сужению области действия заявляемого объекта.
В представленных ниже конкретных примерах описан способ получения детектирующих конъюгатов, осуществляемый с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего (гомо)бифункционального реагента. Использование данного вещества не является принципиальным для осуществления способа. Вместо глутаральдегида могут быть использованы другие известные гомо- и гетеробифункциональные соединения, которые в реакциях второго порядка способны реагировать предпочтительно с наиболее универсально представленными в возможных анти-аналитах и анти-анти-аналитах первичными аминогруппами (хотя, для ковалентного конъюгирования с суспензоидными метками таких анти-аналитов, как Fab'-фрагменты антител, более оптимальными могут оказаться, например, малеимидные реагенты, участвующие в реакциях тиол-дисульфидного обмена).
Использование глутаральдегида является предпочтительным, поскольку дополнительно отвечает требованию универсальности предлагаемого способа и является гомо-бифункциональным реагентом, относительно специфично реагирующим с первичными аминогруппами белков. Кроме того, немаловажным обстоятельством является доступность и практически самая низкая стоимость глутаральдегида, что также выгодно отличает его от возможных других, использование которых в рамках предлагаемого способа с экономической точки зрения, очевидно, является менее выгодной возможностью.
ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают как спектр возможных технологических приемов синтеза конкретных реагентов, так и область возможного применения изобретения в целом.
Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.
Пример 1. Получение активированных магнитных наночастиц.
К 20 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (1-50 мг/мл в 0,01-0,2М фосфатном буферном растворе (ФБР) рН 6,0-8,5 добавляют 1-2 грамма металл-углеродных магнитных частиц. Смесь перемешивают на магнитной мешалке или роторном встряхивателе типа "Vortex" в течение времени, достаточного для полной предварительной пептизации (смачивания) частиц углерода. Полученную суспензию озвучивают при помощи ультразвуков jго дезинтегратора. Условия ультразвуковой обработки суспензии (интенсивность и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирают таким образом, чтобы озвучиваемая суспензия при одновременном (возможном) охлаждении не разогревалась до температуры свыше 40°С. Полученную в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензию центрифугируют при 6000 g в течение 5-10 минут с целью удаления оставшихся относительно крупных агрегатов частиц. Покрытые БСА магнитные наночастицы с размерами 90-100 нм, содержащиеся в супернатанте, в дальнейшем активируют раствором глутаральдегида, взятым в объеме, равном объему активируемых частиц. Диапазон эффективных концентраций реагента - 1-25%, время активации - от 20 до 120 минут. Суспензию активированных частиц освобождают от избытка глутаральдегида и несвязанного БСА гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В; CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков. Полученный после хроматографии объем активированной суспензии концентрируют в диализных мешка до примерного объема суспензии, взятой на активацию.
Описанный конкретный способ получения активированных магнитных металл-углеродных наночастиц позволяет в дальнейшем синтезировать конъюгаты.
Пример 2. Получение конъюгатов магнитных металл-углеродных наночастиц с функциональными комплексами.
Активированные частицы вносят в ФБР, содержащий стрептавидин и биотинилированный аптамер в концентрации 10 мг/мл по белку. Соотношение по объему частиц и белка - 9 к 1. Соотношение стрептавидина и биотинилированного аптамера 1 к 4 по молекулярной массе. После инкубации в течение ночи при мягком перемешивании суспензию центрифугируют при 6000 g в течение 5-10 минут с целью удаления возможно образовавшихся агрегатов частиц и освобождают от молекул несвязавшихся стрептавидина и аптамера гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В; CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков. В полученный конъюгат вносят глицерин и БСА до конечных концентраций 20% и 1% соответственно.
Конъюгаты магнитных металл-углеродных частиц с комплексом, состоящим из G белка и антител в соотношении 1 к 2 по молекулярной массе, получают аналогичным способом.
По данным оптического контроля концентрации наночастиц на всех стадиях синтеза суммарные потери не превышают 10%. (Табл. 1).
Эффективность полученных с помощью предлагаемого способа реагентов оценивали в прямом сравнении с реагентами, представляющими собой конъюгаты магнитных металл-углеродных наночастиц со стрептавидином и биотинилированными зондами, а также с G белком и моноклональними антителами соответственно, использование которых предполагает введение в формат аналитической процедуры дополнительную стадию взаимодействия промежуточного аффинного соединения с иммунным комплексом на твердой фазе. Примеры сравнительных экспериментов представлены далее.
Пример 3. Двухсайтное определение стандарта простатспецифического антигена (ПСА) на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц со стрептавидином в комплексе с биотинилированным аптамером, специфичным к ПСА человека (Fe@C-Str/Bi-Apt).
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) мышиные моноклональные антитела (МКА) из клона 3А6 (производитель - Биалекса, Россия), специфичные к простатспецифическому антигену (ПСА), разведенные в 0.15М растворе NaCl, забуференном 0,015М Na-фосфатами, содержащем 0,1% азида натрия рН 7,25 (ЗФР) до концентрации 0,05 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФР + 0,1% Твина-20 (ЗФРТ), затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили по 200 мкл двукратных разведений ПСА в ЗФРТ, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. После инкубации при +37°С в течение 60 мин, тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ и вносили в лунки конъюгат, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ. Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Ecotek Corporation, Houston, USA). (Рис. 1). Общее время анализа 2 ч 15 мин.
Пример 4. Двухсайтное определение стандарта ПСА на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц со стрептавидином (Fe@C-Str), в качестве примера сравнения с аналитической процедурой предлагаемого способа.
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) мышиные моноклональные антитела (МКА) из клона 3А6 (производитель - Биалекса, Россия), специфичные к простатспецифическому антигену (ПСА), разведенные в 0.15М растворе NaCl, забуференном 0,015М Na-фосфатами, содержащем 0,1% азида натрия рН 7,25 (ЗФР) до концентрации 0,05 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФР + 0,1% Твина-20 (ЗФРТ), затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили по 200 мкл двукратных разведений ПСА в ЗФРТ, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. После инкубации при +37°С в течение 60 мин, тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ и в лунки вносили по 200 мкл раствора аптамера, специфичного ПСА в ЗФРТ концентрации 130 нМ. После 60 минутной инкубации при, 37°С и мягком перемешивании удаляли растворы из лунок, трижды промывали тест-полоски. ЗФРТ и вносили конъюгат, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ.
Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Рис. 1). Общее время анализа 3 ч 30 мин.
Визуально определяемая концентрация ПСА в обоих вариантах - 0,625 мкг/мл. Чувствительность ЯМР-релаксометрии -0,15 мкг/мл.
Пример 5. Прямое определение ПСА на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц с G белком стрептококка в комплексе с моноклональными антителами, специфичными к ПСА человека (Fe@C-G белок/МкАТ).
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) двукратные разведения ПСА в ЗФР, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФРТ, затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ.
Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Рис. 2). Общее время анализа 1 ч 30 мин.
Пример 6. Прямое определение ПСА на пористой твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц с G белком стрептококка (Fe@C-G белок).
На полоски из нитроцеллюлозной мембраны (Bio-Rad, США) с диаметром пор 0,45 мкм размером 5×10 мм сорбировали в виде точек (3 мкл на точку) двукратные разведения ПСА в ЗФР, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. Тест-полоски высушивали, помещали в пластиковые планшеты и промывали трехкратно (3×5 мин) 200 мкл ЗФРТ, затем промывочный раствор удаляли, а в лунки вносили по 200 мкл раствора моноклональных антител, специфичных к ПСА в ЗФРТ в концентрации 10 мкг/мл. После 60 минутной инкубации при 37°С и мягком перемешивании удаляли растворы из лунок, трижды промывали тест-полоски ЗФРТ и вносили конъюгат, разведенный в ЗФРТ таким образом, что конечная концентрация наночастиц составляла 0,03%. После инкубации при +37°С в течение 60 мин тест-полоски трехкратно промывали ЗФРТ.
Оценку результатов анализа производили визуально по последней различимой невооруженным глазом точке в ряду разведений и с использованием ЯМР-релаксометра (Рис. 2). Общее время анализа 2 часа 45 мин.
Визуально определяемая концентрация ПСА в обоих вариантах - 1,25 мкг/мл. Чувствительность ЯМР-релаксометрии - 0,150 мкг/мл.
Технологический результат от использования предлагаемого изобретения заключается, прежде всего, в том, что технология получения конъюгатов магнитных частиц независима от уникального или дорогостоящего оборудования и объективно дефицитных или дорогих реагентов. Предлагаемые конъюгаты могут служить основой создания эффективных систем как для упрощенного инструментально независимого диагностического тестирования с высокой чувствительностью и надежностью, так и для систем, предполагающих использование чувствительной детектирующей аппаратуры, в частности, ЯМР_релаксометра. В качестве соединений, придающих функциональные качества магнитным частицам, могут быть использованы практически любые биологически активные молекулы, несущие в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу и обладающие при этом способность связывать биологически активные соединения с аффинными свойствами по отношению к таргетным, диагностически значимым маркерам. Применение разработанного способа может найти свою реализацию не только в области высоко эффективного диагностического тестирования минимальных количеств маркеров, позволяющих прогнозировать возникновения различных заболеваний (в частности, онкологических) или оценивать эффективность принятых мер терапевтического характера, но и в решении таких актуальных проблем, как адресная доставка целого комплекса (более одного вида молекул) биологически активных соединений. Широкомасштабное применение различных магнитных носителей с целью адресной доставки биологически активных соединений в современной практике ограничивается нестабильностью конъюгатов. В основе этой нестабильности лежат прежде всего проблемы, связанные с природой связи биомолекул с частицами. В большинстве случаев - это нековалентные связи, что и является основным ограничением в применении подобных конъюгатов. Предлагаемая разработка решает проблему нестабильности, причем в отношении сразу нескольких компонентов комплекса металл-углеродных частиц и биологически активных молекул, а применение ЯМР-релаксометрии делает тест, первоначально неинструментальный с ограниченным возможностями визуальной оценки результатов порогом чувствительности, существенно более чувствительным.