Технология изготовления живой вакцины против реовирусного теносиновита птиц с использованием культуры клеток Vero и изучение ее эффективности

способности животных были в опытных группах коров, при использовании принудительного активного моциона и их пастбищного содержания в течение как одного, так и двух месяцев перед отёлом. В сравнительном аспекте доказано преимущество двухмесячного принудительного активного моциона по сравнению с одномесячным, способствующего дополнительному усвоению из корма каротина, что выразилось дополнительным проявлением охоты у 9 % животных (соответственно 79 против 70), а также повышением их оплодотворяющей способностью на 6,8 % (61,2 против 54,4 %).

ЛИТЕРАТУРА

1. Герговска, Ж. Родилни усложнения и пуерперални ендометрити при крави от кафявата порода с различна степен на двигателна активност през сухостойния период / Ж. Герговска, Б. Николаев, Р. Христов // Животни науки. - 1995. - С. 39-42.

2. Горбунов, Ю.А. Практические советы по организации работы групп и звеньев по воспроизводству, повышению оплодотворяемости коров и телок, увеличению выхода телят в хозяйствах Минской области / Ю.А. Горбунов // Бел НИИЖ. - Минск, 1997. -92 с.

3. Влияние принудительного моциона на воспроизводительные функции и продуктивность коров при беспривязном их содержании / Е.З. Петруша, Н.М. Рыбалка, Н.А. Васенкова [и др.] // Молочное и мясное скотоводство. - 1987. - Т. 71. - С. 17-21.

4. Республиканская программа по племенному делу в животноводстве на 2012015 гг. (Постановление Совета Министров РБ № 1917 от 31.12.2010 г). - Минск, 2011. -С. 5-14.

5. Galindo, F. The relationships between social behaviour of dairy cows and the occurrence of lameness in three herds / F. Galindo F; D.M. Broom // Res. in veter. Sciences. - 2000. -Vol. 69. - № 1. - P. 75-79.

6. Pasierbski, Z. Wlyw aktiwnego i pasiwnego spaceruna winiti produkcyjne krow mlecznych / Z. Pasierbski // Preglad hodowlani. - 1978. - Vol. 45. - № 9. - Р. 14-15.

7. Steinberger, S. Vollweide mit Winterkalbung aus Bayern. Osterreichische Fachtagung fur Biologische Landwirtschaft gemass Fortbildungsplan des Bundes «Low-Input» Vollweidehaltung von Milchkuhen in Osterreich / S. Steinberger, P. Rauch, H. Spiekers // Arch. Andrology. - 2008. - Vol. 6. - P. 105-107.

8. Uhrincat, M. Vplyv ustajnenia krav v obdobi statia na sucho a porodu na rast teliat a reprodukciu matiek / M. Uhrincat, J. Broucek, A. Hanus // Pol'nohospodarstvo. - 2000. -Vol. 46. - Р. 374-386.

УДК 619:616.98:578.823.2:636.5

ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕОВИРУСНОГО ТЕНОСИНОВИТА ПТИЦ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК VERO И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ

И.С. РАДЮШ, А.А. ГУЛЯКО, И.В. НАСОНОВ РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» г. Минск, Республика Беларусь, 220003

Введение. Эпизоотическое и финансовое благополучие птицеводческих предприятий во многом обусловлено своевременной профилактикой заболеваний птицы вирусной этиологии, к числу которых отно-

276

сится вирусный теносиновит птиц [15], характеризующийся хромотой, связанной с воспалением сухожилий и суставов конечностей, высокой ранней смертностью, замедленным ростом, снижением яйценоскости и выводимости цыплят [3, 4, 11].

Вирус широко распространен при интенсивных методах содержания птицы. Реовирусы обычно выделяют в первые две недели после заражения птицы [2].

Реовирусы были обнаружены у уток, гусей, американских вальдшнепов и попугаев. Однако в настоящее время только куры и индейки признаны естественными и экспериментальными носителями теноси-новита, вызываемого реовирусом [1].

Экономические потери в промышленном птицеводстве значительны и связаны с гибелью птицы (до 6 %), повышенной выбраковкой (до 50 %), низким приростом живой массы, снижением категорийности мяса, уменьшением яйценоскости 15-20 % [6]. Кроме того, реовирус обладает иммунодепрессивным действием, что приводит к увеличению восприимчивости к инфекционным заболеваниям [10, 14].

Вируснейтрализующие антитела выявляют на 7-10-е сутки после контакта организма с возбудителем, а вируспреципитирующие - на 720-е сутки [7].

В связи с широким распространением реовирусов в природе и присутствием их даже у клинически здоровых птиц случаи заболевания, вызванные данным возбудителем, регистрируют по всему миру [3, 4].

Причиной возникновения заболевания и быстрого распространения возбудителя инфекции является его высокая контагиозность, а также устойчивость к физико-химическим факторам и условиям внешней среды. Инфекционная активность вируссодержащего материала не снижается при плюс 22 °С в течение 51 недели, при минус 20 °С -4 года, реовирус устойчив к воздействию УФ-облучения, эфира, переносит широкий спектр рН [8].

Источником инфекции является больная и переболевшая птица [3]. Факторами передачи возбудителя служат инфицированный помет, вода, корма, инвентарь, предметы ухода и скорлупа, оставшаяся после инкубации. Заболевание передается контактно при совместном содержании больных цыплят со здоровыми, алиментарно - через зараженные вирусом корм и воду, трансовариально - через инкубационное яйцо в течение 19 суток после инфицирования кур-несушек [4, 16]. Наиболее чувствительными являются суточные цыплята, с возрастом их восприимчивость снижается [3, 11].

Общие ветеринарно-санитарные мероприятия не обеспечивают в полной мере оздоровления птицеводческих хозяйств от реовирусного теносиновита. Во многих странах основным способом борьбы с данной инфекцией является выбраковка и убой пораженной птицы, что в условиях промышленного птицеводства является экономически нецелесообразным.

На протяжении многих десятилетий основным средством профилактики инфекционных заболеваний остаются вакцины [12, 13]. Создание эффективных вакцинных препаратов, обладающих высокой защитной активностью и в то же время не имеющих побочных свойств, является одним из наиболее приоритетных направлений в биотехнологии и вирусологии.

В странах с развитым птицеводством широко применяют как живые, так и инактивированные вакцины [5, 17].

В настоящее время меры борьбы с реовирусным теносиновитом птиц в основном направлены на предотвращение реовирусной инфекции у суточных цыплят, это осуществляется путем иммунизации племенного стада с передачей пассивного иммунитета [15]. Однако наиболее эффективным способом является вакцинация самих цыплят живыми вакцинами [5].

Для специфической профилактики теносиновита кур в нашей стране используют живые и инактивированные вакцины [5, 17]. Вакцину готовят из вируссодержащей жидкости, которую получают путем культивирования вируса в куриных эмбрионах или различных культурах клеток (культурах фибробластов, легких, почек и печени эмбрионов кур, культуре перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки (Vero), BHK-21) [1, 5, 17, 18].

Потребность птицефабрик Беларуси в вакцине - 3 млн. доз в год. В Республике Беларусь нет производства вакцин против теносиновита птиц. Поэтому возникла острая необходимость в создании отечественной вакцины для специфической профилактики реовирусного теноси-новита птиц, разработке методов и схем применения вакцины.

Цель работы - изготовить живую вакцину против реовирусного теносиновита птиц с использованием культуры клеток Vero и изучить ее эффективность на цыплятах.

Материал и методика исследований. В опытах использовался штамм реовируса теносиновита птиц «КМИЭВ^118». Вирус культивировали на перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки Vero.

Культуру клеток Vero 48 часов культивирования со 100%-ным монослоем инфицировали вирусом с множественностью заражения 0,10,5 ТЦД/кл, выдерживали при температуре плюс 37,5±0,5 °С в течение часа для контакта вируса с клеткой. В качестве поддерживающей использовали среды DMEM и DMEM-HEPES в соотношении 1:1 с добавлением 2%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. Зараженную культуру культивировали при температуре плюс 37,5±0,5 °С.

Сбор материала проводили спустя 48-72 часа при поражении не менее 80 % клеток. Сосуды с вирусом замораживали при температуре минус 20 °С. Затем механическим путем удаляли монослой со стекла и размораживали при температуре плюс 20-25 °С. Вируссодержащий материал стерильно собирали в 5-10-литровые бутыли. Отбирали пробу (1-2 см3) для определения титра вируса.

278

Для титрации реовируса использовали монослойную культуру клеток Vero, выращенную в 96-луночных культуральных планшетах с плоским дном в СО2-инкубаторе при температуре плюс 37±0,5 °С.

Десятикратные разведения вируса от 10-1 до 10-7 делали в отдельной стерильной посуде на питательной среде, используемой для культивирования клеток с содержанием 2%-ной сыворотки.

После исследования под микроскопом культуры клеток, подготовленные разведения реовируса переносили в культуральные планшеты по 100 мкл на лунку с культурой клеток. На каждое разведение использовали не менее четырех лунок. Планшеты слегка встряхивали и оставляли при температуре плюс 37±0,5 °С на 1 ч для сорбции вируса клетками. Затем добавляли по 100 мкл поддерживающей питательной среды. Реакцию сопровождали контроли: контроль культуры клеток -лунки с культурой клеток этой же партии, в которую вносили поддерживающую среду без вируса; контроль вируса - лунки с культурой клеток этой же партии, в которую вносили поддерживающую среду и нативный вирус. После этого планшеты помещали в СО2-инкубатор (СО2 5 %).

После 3-7-дневной инкубации при температуре плюс 37±0,5 °С оценку наличия вируса проводили по характерным вирус-индуцированным изменениям клеточной морфологии. Результаты учитывали через 67 суток по появлению характерных цитопатических изменений в зараженной культуре клеток при отсутствии таковых в контроле.

Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Аш-марина и выражали в lg ТЦД50/см3 [9].

Иммунологическую активность экспериментального образца вакцины живой против реовирусного теносиновита, полученной на культуре клеток Vero производства РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им С.Н. Вышелесского», проверяли на СПФ-цыплятах.

Для этого было сформировано две группы цыплят-СПФ по 5 голов. 1-я группа была провакцинирована двукратно в 7- и 35-суточном возрасте внутримышечно живой вакциной против реовирусного теноси-новита птиц с активностью 6,25 lg ТЦД50/см3 в объеме 0,2 см3, полученной на культуре клеток Vero. 2-я группа - контрольная, не подвергалась вакцинации.

До начала опыта (фон), на 14-й, 21-й день после первой вакцинации, а также на 7, 14, 21, 30-й день после второй вакцинации проводилось взятие крови из подкрыльцовой вены. Для выявления в сыворотке крови цыплят специфических антител против реовирусного теносино-вита птиц использовался метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Результаты исследований и их обсуждение. После инфицирования культуры клеток Vero реовирусом через 24-48 ч наблюдалось характерное для реовируса ЦПД: появление в цитоплазме пораженных клеток оксифильной зернистости, образование гигантских многоядерных клеток - синцитиев, появление в монослое «стерильных пятен» (участки без клеток); а затем полное «сползание» клеток со стекла и появление в среде гигантских клеток.

Экспериментальный образец вакцины получали из вируссодержа-щей жидкости путем последовательного замораживания и оттаивания культуры клеток. Биологическая активность данного экспериментального образца вакцины составляла 6,25 ^ ТЦД 50/см3.

Результаты изучения титра антител после вакцинации цыплят вакциной живой сухой против реовирусного теносиновита птиц представлены в таблице.

Титры антител у СПФ-цыплят, иммунизированных вакциной живой сухой против реовирусного теносиновита, полученной на Vero

1-я вакцинация 2-я вакцинация

№ проб Дней после вакцинации

14 21 7 14 21 30

1 776 1047 2754 2344 2399 4169

2 891 1230 2344 2042 2399 3090

3 851 1622 2239 1820 1778 1995

4 794 1445 2344 1905 1862 2138

5 977 759 2455 2291 3548 4074

Среднее знач. (при Р<0,05) 857,8± ±36,1 1220,6± ±150,8 2427,2± ±88,6 2080,4± ±103,4 2397,2± ±315,8 3093,2± ±460,3

Из данных, приведенных в таблице, видно, что через 14 дней после вакцинации в сыворотке крови цыплят выявляются антитела со средним титром 1:857,8±36,1. Уже через 21 день после 1-й вакцинации титр антител в сыворотке крови цыплят достоверно возрастает (при Р<0,05) и составляет в среднем 1:l220,6±150,8. Через 7 дней после 2-й вакцинации титр антител в сыворотке крови цыплят достоверно возрастает по отношению к титру антител после первой вакцинации (при Р<0,05) и составляет в среднем 1:2427,2±88,6. На 14-й день после 2-й вакцинации титр антител в сыворотке крови цыплят незначительно снизился по отношению к титру антител на 7-й день после 2-й вакцинации (достоверных различий нет) и в среднем составил 1:2080,4± ±103,4. В дальнейшем на 21-й и 30-й день после 2-й вакцинации титр антител в сыворотке крови цыплят незначительно возрос по сравнению к титру антител на 7-й и 14-й день после 2-й вакцинации (достоверных различий нет) и в среднем составил 1:2397,2±315,8 и 3093,2± ±460,3 соответственно.

Таким образом, в результате иммунизации живой вакциной против реовирусного теносиновита птиц, полученной с использованием культуры клеток Vero у СПФ-цыплят, уже на 14-й день после 1-й вакцинации выявляются антитела. На 21-й день титр антител в 1,4 раза достоверно (при Р<0,05) выше по сравнению с титром антител на 14-й день после 1-й вакцинации. На 7-й день после 2-й вакцинации титр антител в 1,99 раза достоверно (при Р<0,05) выше по сравнению с титром антител на 21-й день после 1-й вакцинации. До конца опыта (на 30-й день после 2-й вакцинации) титр антител в сыворотке крови цыплят достоверно (при Р<0,05) не изменялся.

Многочисленные литературные данные [5, 17] указывают на то, что титры антител в ИФА не ниже 1:800 свидетельствуют о формировании напряженного иммунитета у птиц и о высокой иммуногенной активности штамма вируса. В нашей работе титр антител в сыворотке крови цыплят уже через 14 дней после первой вакцинации составил в сред-

нем 857,8±36,1, что позволяет предположить о высокой иммуногенной активности вакцины живой сухой против реовирусного теносиновита, полученной с использованием Vero.

Заключение. Результаты исследований позволяют утверждать, что вакцина против теносиновита птиц может быть изготовлена с использованием культуры клеток Vero. При этом у цыплят, вакцинированных данной вакциной, уже на 14-й день в сыворотке крови выявляются антитела в титре 857,8±36,1, что свидетельствует о формировании у цыплят напряженного иммунитета и высокой иммуногенной активности штамма реовируса теносиновита птиц «KMИЭВ-V118», полученного путем культивирования на культуре клеток Vero .

ЛИТЕРAТУРA

1. Болезни домашних и сельскохозяйственных нтиц / ^лнек [и др.]; нод общ. ред. ^лнека. - М.: Дквариум Бук, 2003. - 1232 с.

2. Болезни птицы: монография / пер. О.В. Мищихи, ОА. Покорной; ред. В.П. Kарпов. - М.: Aгронромиздат, 1985. - 349 с.

3. Болезни нтиц: учеб. пособие / Б.Ф. Бессарабов [и др.]; нод ред. Б.Ф. Бессарабова. -СПб., М., ^аснодар: Лань, 2007. - 448 с.

4. Болезни сельскохозяйственных нтиц: справочник: учеб. для вузов / A.A. Лимарен-ко [и др.]; нод ^ред. A. A. Лимаренко. - СПб.: Лань, 2005. - С. 221-225.

5. Бурдейная, Л.В. Разработка технологии изготовления живой вакцины против реовирусного теносиновита кур: дис. ... канд. вет. наук: 03.00.06 / Л.В. Бурдейная. -Владимир, 2001. - 113 с.

6. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин [и др.] ; нод общ. ред. В.Н. Сюрина. -М.: ВНТИБП, 1998. - 928 с.

7. Диагностика вирусных болезней животных / В.Н. Сюрин [и др.] ; нод общ. ред. В. Н. Сюрина. - М.: Лгронромиздат, 1991. - 281 с.

8. Жбанова, С.Ю. Эпизоотология инфекционной бурсальной болезни и реови-русного теносиновита кур на птицефабрике яичного направления: дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / С. Ю. Жбанова. - СПб., 2003. - 189 с.

9. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: гаравочник / В.Н. Сюрин [и др.] ; нод общ. ред. В. Н. Сюрина. - М.: Aгропромиздат, 1986. - 351 с.

10. Мытарова, Н.В. Экспериментальный реовирусный теносиновит у цыплят / Н.В. Мытарова, Б.Б. Трефилов, AM. ^ролев // Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве: межрегиональное научно-производственное координационное совещание. - Петрозаводск, 1994. - С. 7-8.

11. Пругло, В. В. Течение реовирусного теносиновита кур в ассоциации с кокковыми инфекциями: дис. ... канд. вет. наук: 16.00.03 / В.В. Пругло. - СПб., 2005. - 139 с.

12. Скутарь, И.Г. Профилактика инфекционных болезней нтиц в условиях Республики Молдовы / И. Г. Скутарь, И. С. ^ецу // Ветеринария. - 1977. - № 2. - С. 12-13.

13. Смоленский, В.И. i Средства и методы специфической профилактики болезней нтиц вирусной этиологии: дис. ... д-ра биол. наук: 16.00.03 / В.И. Смоленский. - М., 1999. - 270 с.

14. Трефилов, Б.Б. Разработка и внедрение средств диагностики и специфической профилактики наиболее опасных вирусных болезней птиц: инфекционный ларинготрахеит, вирусный энтерит гусей, реовирусный теносиновит: автореф. дис. . д-ра вет. наук: 16.00.03 / Б. Б. Трефилов; Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный ин-т птицеводства. - СПб., 2000. - 42 с.

15. Трефилов, Б. Б. Реовирусная инфекция нтиц / Б.Б. Трефилов, Н.В. Никитина // Информационный листок / Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства. - СПб., 1996. - Вып. 2. - С. 20-31.

16. Реовирусная инфекция у нтиц и меры борьбы с ней / Б.Б. Трефилов [и др.] // Новое в диагностике и профилактике болезней нтиц: матер. науч.-практ. конф., Санкт-Петербург, Ломоносов, 3-4 июня 2008 г. / Российская академия сельскохозяйственных наук, Межрегиональный научно-технический центр «Племптица», Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства; редкол.: Э.Д. Джавадов [и др.]. - СПб.: Ломоносов, 2008. - С. 98-111.

17. Шкиря, В.И. Технология изготовления инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита нтиц: дис. .канд. вет. наук: 16.00.03 / В.И. Шкиря. - Владимир, 2000. - 125 с.

18. A comparison of avian and mammalian cell cultures for the propagation of avian reovi-rus WVU 2937 / V. Barta [et al.] // Avian Dis. - 1984. - Vol. 28. - P. 216-223.