Тестирование микроделеций на Y-хромосоме у пациентов с различными нарушениями сперматогенеза

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Тестирование микроделеций на У-хромосоме у пациентов с различными нарушениями сперматогенеза

Д.Г.Джавадова

Республиканская клиническая больница им. акад. Мир-Касимова, г.Баку

В последние годы при лечении бесплодия используются новые вспомогательные репродуктивные технологии, такие как ИКСИ, ПЕЗА, ТЕЗА, которые позволяют иметь детей супружеским парам, где мужья страдают тяжелыми формами бесплодия. Большой процент в этиологии такого рода заболеваний занимает генетический фактор. Более двух десятилетий назад L.Tiepolo и O. Zuffardi [9] обнаружили микроде-леции (потери участка гена) на длинном плече Y-хромосомы у пациентов с азооспермией. Они предположили наличие группы генов, ответственных за инициацию и поддержание нормального сперматогенеза у мужчин. Позже этот участок Y-хромосомы был обозначен как "фактор азооспермии" (AZF), в нем было выделено три неперекрывающихся функциональных участка - ATPase 6, ND1 и Oytb. [2, 4, 8].

Целью настоящей работы явилось изучение мутаций в митохондриях ДНК в спермальных клетках у бесплодных мужчин.

В соответствии с поставленной целью изучен анамнез и спермаграммы у мужчин с целью установления диагноза бесплодия, проведен хромосомный анализ (цитогенетика) в периферической крови у бесплодных мужчин, изучены и выделены ДНК у мужчин репродуктивного возраста, а также возможные аномалии, изменения и мутации в Y хромосоме.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. С целью уточнения частоты встречаемости микроделеций (потери участка гена) в Y-хромосоме у пациентов с выраженными нарушениями сперматогенеза, определения их особенностей (характера локализации, размеров), а также практической значимости такого скрининга, нами проведено генетическое

тестирование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, выделенной из крови, полученной от 60 мужчин турецкой популяции репродуктивного возраста (из которых 30 - пациентов с выявленными диагнозом первичное бесплодие и 30 мужчин, которые уже являлись отцами -контрольная группа). Продолжительность бесплодия в семьях пациентов составила от 2 до 18 лет (в среднем 7,1±3,8 года).

Обследование пациентов, помимо сбора анамнеза, включало общее и специальное андрологическое исследование, двукратное стандартное исследование спермы. Мужчины были обследованы на предмет количества спермы и подвижности на ATPase 6, ND1 и Cytb в области митохонд-риального полиморфизма. Медико-генетическое иследова-ние включало: цитогенетический (кариотипирование лимфоцитов периферической крови); молекулярно-генетичес-кий метод (полимеразная цепная реакция - ПЦР).

В исследованиях были использованы наборы: Spin Tissue Mini Kit, Invisorb (Германия), High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche), Y chromosome Deletion Detection Kit (Promega) (США). ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, 0,3 мкмоль каждого праймера, 200 мкмоль dNTPs, 1 ед. Taq-полимеразы и буфер (67 мM трис-HCl, pH 8,6; 2,5 MgCl, 16,6 мМ (NH)SO; 0,001% Тритон X-100), в режиме: 94°C - 2.20 мин, 94°C - 1 мин, 57°C - 30 сек, 72°С - 1 мин, 72°С - 5 мин, число циклов - 34.

В качестве примеров использовали последовательности и порядок расположения STSs, предложенные P.Reynier и соавт.: для АТПаср6 - DBY1, DBY2, sY 84 и KAL-Y, интервал 5С - 5D; для ND1 - sY124; sY130; sY143, интервал 5P - 6D; для Cytb. - sY242; sY254; sY157; интервал 6E - 6F.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В таблице представлена характеристика пациентов, имеющих микроделеции Y-хромо-сомы (Таблица 1).

Таблица 1. Характеристика пациентов, имеющих микроделеции Y-хромосомы

Код пациента Сперматозоиды в эякуляте ФСГ Тестостерон Status genitalis Делеция

1-10 Единичные нет данных нет данных Норма ATPazô

1-18 Отсутствуют норма норма Гипогонадизм AZFc

2-12 Норма А2Бс+Ь 2-30 Гипогонадизм AZFc+b

2-37 нет данных

2-40 Гипогонадизм + монархизм левого яичка АТРагб AZFc+b

рртН2

14 12 10

6 4 2 О

натощак

Из таблицы видно, что, например, у пациента 1-10 с тяжелой формой олигозоос-пермии делеция охватывала участок хромосомы, расположенный между 242 и 254 STSs; у него были делетиро-ваны DAZ гены в AТРaz6 участке. У пациентов 1-18 и 2-37 делеции также располагались в AZFс участке, но имели больший размер (захватывали участок между 242, 254 и 157 STSs). В двух других случаях (2-12, 2-30) микроделеции, затрагивающие AZFc и AZFb участки, были одинаковыми и включали 124, 130, 242, 254 и 157 STSs. Причем у одного из этих пациентов (2-37) при ка-риотипировании была выявлена терминальная делеция участка Yq хромосомы, 46,XYq. У пациента 2-37 делеция частично затрагивала как AZFb, так и AZF. Все эти пациенты кроме первого, страдали азооспермией. Ни у одного из пациентов не было выявлено делеций в AZFa-участке.

Изучения микровыпадений и половых анаплоид-ных хромосом (47,XXY) показали, что показатели в соматических клетках были приблизительно 3.2% и 4.7%, соответственно. Спермальные показатели бесплодия были определены как 9%, 22%, и 47% на трех пациентах из шести. Двое из троих пациентов также имели высокие показатели аномалий в головной части сперматозоида в образцах спермы.

Пока что трудно установить строгую корреляцию между типом делеции и патологии репродуктивной системы мужчины. Однако основываясь на данных литературы и результатах наших исследований, мы уже можем говорить о прогностическом значении той или иной микроделеции. На основании этого можно прийти к следующим предположениям:

1. У пациентов, несущих изолированную AТРaz6 делецию (Рис.1), может наблюдаться гипос-перматогенез или синдром клеток Сертоли II типа (СКС-П). В то же время известно, что при СКС-П могут быть обнаружены островки "нормального" сперматогенеза при выполнении мультифокальной множественной биопсии.

2. У половины пациентов, несущих такую деле-цию, при ТЕЗА могут быть получены и успешно использованы в ИКСИ или КРИО-ИКСИ циклах тести-кулярные сперматозоиды [2, 3, 7].

3. Делеции, включающие и выходящие за границы AZFc региона (AZFb+c и АZFa+b+c), по-видимому связаны с полным отсутствием тестикулярных сперматозоидов.

* * *

**

30 мин.

60 мин.

здоровые дети

дети с ротавирусной инфекцией

дети с ротавирусной и бактериальной инфекцией

Рис. 1. Результаты анализа ПЦР в агарозном геле микроделеций в Y-хромосоме в области ATPaz6

1 "столбец" - (М - маркер) 50у.е. в группе контроля, 2-12 "столбцы" - от больных

4. Микроделеции, охватывающие только часть AТРaz6-региона, приводят к более гетерогенному фенотипу, включая и олигозооспермию, а затрагивающие весь AZFb регион ведут к блоку сперматогенеза на стадии сперматоцитов или сперматид.

Делеции AZFa-региона (делеционный интервал 500) наблюдаются реже и предположительно связаны с почти полным отсутствием зародышевых клеток - с СКС-1 [1, 9].

По количеству спермы и ее подвижности в АТРа7б-локусе был обнаружен полиморфизм в позициях 8584, 8697, 8701, 8730, 8860, 8927, 9041, 9105, 9196. В позиции 8584 G-A полиморфизм был обнаружен у одного больного и наравне с этим встречался и у здоровых пациентов. В 8860 позиции А^ полиморфизм обнаружен у 20 больных и 14 здоровых. В 8927 позиции С^ - по одному больному в контрольной и тестовой группе.

Таким образом, микроделеций, затрагичающих DAZ-гены или даже целый AZFc-участок, по-видимому, недостаточно для полного прекращения сперматогенеза. В нашем исследовании пациент 1-10 с DAZ-делецией имел незначительное число сперматозоидов в эякуляте, которых было достаточно для проведения ИКСИ и достижения беременности. В то же время в эякулятах пациентов 1-18 и 2-37 полностью отсутствовали сперматозоиды.

По данным литературы, частота оплодотворения при использовании сперматозоидов, полученных от пациентов, несущих AZF-микроделеции, и развитие эмбрионов были сравнимы с соответствующими показателями при использовании сперматозоидов без де-леций [4, 5, 7].

ВЫВОДЫ:

1. Установлена корреляционная связь между на-

личием микроделеций и сперматогенезом. В то же время можно предположить, что микроделеций, затрагивающих лишь DAZ-гены или даже целый участок, по-видимому, недостаточно для полного прекращения сперматогенеза.

2. Результаты тестирования микроделеций в AZF-регионе Y-хромосомы у пациентов с различными нарушениями сперматогенеза свидетельствуют о возможности выявления еще одной малоизвестной причины бесплодия в браке, позволяют оценивать ее частоту, степень тяжести и значение для конкретной супружеской пары и ее потомства, воздержаться от попыток бесперспективного лечения нарушений репродуктивной системы мужчины и прогнозировать вероятность получения сперматозоидов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Джавадова Д.Г. Связь между мутациями в митохондрииальных ДНК спермальных клеток и параметрами спермы при мужском бесплодии. "Azsrbaycan tsbabstinin mflasir nailiyystbri", Бакы 2009, № 6, с.46-48; 2. Cigdem Cinar, Cenk Yazici et al. Genetic Diagnosis in Infertile Men with Numerical and Constitutional Sperm Abnormalities. Genetic Testin Journal., 2008, v. 12, N12, pp.195-202; 3. Brandell R.A. et al. AZFb deletions predict the absence of spermatozoa with testicular sperm extraction: preliminary report of a prognostic genetic test. Hum Reprod 1998; 13: p. 2812-2815; 4. Chandley A.C. and Cooke H.J. Human male fertilitY-Y linked genes and spermatogenesis. Hum Mol Genet 1994; 3: p. 1449-1452; 5. Foresta C. et al. Deletion and expression analysis of AZFa genes on the human Y chromosome revealed a major role for DBY in male infertility.

Генерализованные формы иерсиниозов протекают с вовлеченнем в патологический процесс всех органов и систем, в том числе печеночной паренхимы, проявляющейся явлениями паренхиматозной желтухи со схожими при вирусных гепатитах симптомами в виде желтушности кожных покровов и склер, увеличением печени, темной мочи, повышения уровня билирубина в крови и активности трансаминаз и др. Эти признаки заболевания вызывают затруднения в дифференциации вирусных гепатитов и гепатитов иерси-ниозной этиологии.

В связи с этим, ошибки в постановке поликлинических и клинических диагнозов составляет более 60%.

Целью настоящей работы является попытка определения клинических и лабораторных дифференци-

Hum Mol Genet 2000; 9: p.1161-1169; 6. Girardi S.K. et al. Submicroscopic deletions in the Y-chromosome of infertile men. Hum Reprod 1997; 12: p. 1635-1641; 7. Oates R.D. et al. The spectrum of sper-matogenic deficiency in 20 men with Y interstitial microdeletions confined to the AZFc (DAZ) region. Poster, 16th World Congress on Fert. and Steril. (IFFS'98 - San Francisco, USA) 1998; 8. Palka G. and Dallapiccola B. Widening of a Y-chromosome interval-6 deletion transmitted from a father to his infertile son accounts for an oligozoospermia critical region distal to the RBM1 and DAZ genes. Am J Hum Genet 1996; 59: 1393-1395; 9. Tiepolo L. and Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet 1976; 34: 119-124.

SUMMARY

The testing of microdeletings on Y-chromosome beside patients with different breaches of spermatogenesis D.Javadova

In this article have shown results of testing included 30 patients and 30 persons of control group. Investigations have been taken in Marmara University Medicine Faculty Urology Department and IVF Department in 2006 and 2007. In this study, the sperm analyses of 19 normospermia and 11 oligospermia patients are reported. As a result of this study, mutation in mtDNA ATPase 6, ND1 and Cytb regions were not detected in patient and control groups.

Поступила 05.11.2009

ально-диагностиченских критериев иерсиниозной инфекции и вирусных гепатитов.

В течении нескольких лет [1] проводилось обследование больных вирусными гепатитами А и В на иер-синиозы (кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез). Диагноз подтверждался традиционными функциональными исследованиями печени с выявлением поверхностного антигена вируса гепатита В, данными эпидемиологического анализа, развитием заболевания, объективной симптоматикой. Диагноз иерсиниоз устанавливали путем изучения анамнестичекских данных и клинических признаков заболевания, а также бактериологическими исследованиями крови, кала, мочи, слюны и серологического исследования крови больных в РПГА. Детальный анализ клинических проявлений болезни и результатов лабораторных ис-

Эпидемиологическая значимость дифференциальной диагностики гепатитов вирусной и иерсиниозной этиологии

Р.А.Ахмедов, К.Т.Насибов, А.Н.Талыбзаде, Н.Устун

Азербайджанская противочумная станция, Городская клиническая больница №1, г.Баку