СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ ИЗ НЕПИЩЕВОГО ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
METHOD OF OBTAINING ORGANIC SOLVENTS FROM NONFOOD RENEWABLE NATURAL RAW MATERIAL

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к микробиологическим способам получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол.
В современном мире актуально использование непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья (ЦСС) вместо крахмалосодержащего сырья, имеющего пищевую ценность, для гидролиза и производства из получаемых гидролизатов полисахаридов различных коммерчески значимых продуктов. Интерес к ЦСС в виде сельскохозяйственных и лесотехнических отходов продиктован возможностью получения из них ценных продуктов одновременно с решением ряда экологических проблем. В частности, глюкоза, получаемая путем гидролиза ЦСС, может быть конвертирована под действием бактерий рода Clostridium в такие полупродукты, полезные для химического синтеза, как ацетон, бутанол, этанол [Qureshi N., Saha B.C., Dien В., Hector R.E.,. Cotta M.A. (2010) Production of butanol (a biofuel) from agricultural residues: part I - use of barley straw hydrolysate // Biomass Bioenergy, V.34, P.559-565; Qureshi N., Saha B.C., Hector R.E., Dien В., Hughes S., Liu S., Iten L., Bowman M.J., Cotta M.A. (2010) Production of butanol (a biofuel) from agricultural residues: part II - use of corn stover and switchgrass hydrolysates // Biomass Bioenergy, V.34, P.566-571].
Бутанол является важным органическим сырьем, используемым при производстве пластиков или их растворителей, красок, лаков, пластификаторов, фармацевтических препаратов, а также он все чаще используется как перспективный энергоноситель, который может быть использован в качестве компонента моторного топлива.
Этанол также является одним из перспективных энергоносителей и применяется как добавка к топливу, в том числе для ракетных двигателей. Вместе с этим этанол традиционно широко применяется в химической промышленности, медицине, парфюмерной и пищевой промышленностях.
Ацетон используется как растворитель в химической промышленности (в производстве лаков, взрывчатых веществ, лекарственных препаратов и др.). Наряду с этим широко применяется при синтезе поликарбонатов, полиуретанов и эпоксидных смол.
Интерес к биологическим способам получения этих растворителей обусловлен мягкими условиями их реализации (низкими температурами, отсутствием необходимости использования высоких давлений и металлических катализаторов, получение которых требует отдельных затрат), возможностью переработки ЦСС-содержащих отходов и решением экологических задач, а также возможностью одновременного получения всех трех органических растворителей в комплексе в одном процессе, катализируемом клетками рода Clostridium. Бактериальные клетки рода Clostridium являются единственными катализаторами «ацетон-бутанол-этанольной» (АБЭ) ферментации, сопровождающейся конверсией в ацетон, этиловый и бутиловый спирты потребляемых клетками моносахаридов, содержащихся в гидролизатах ЦСС [Shapovalov O.I., Ashkinazi L.A (2008) Biobutanol: biofuel of second generation. / Rus J Appl Chem., V.81 (12), P.2232-2236; Zverlov V.V., Schwarz W.H. (2007) Biofuels from microbes // Appl.Microbiol.Biotechnol, V.77, P.23-35].
Одними из наиболее эффективных способов получения органических растворителей с использованием клеток рода Clostridium являются способы, объединяющие технологическую стадию гидролитической предобработки сырья с помощью ферментов и получение моносахаридов со стадией их конверсии в целевые продукты [Shan M.M., Lee Y.Y. (1992) Simultaneous saccharification and extractive fermentation for acetone/butanol production from pretreated hardwood // Appl. Biochem. Biotech., V.34-35, P.557-567; Shan M.M., Song S.K., Lee Y.Y., Torget M. (1991) Effect of pretreatment on simultaneous saccharification and fermentation of hardwood into acetone/butanol // Appl. Biochem. Biotechnol., V.28-29, P.99-109].
2
2
Такие способы получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации сырья позволяют соединить ферментативный гидролиз ЦСС с конверсией образующихся сахаров в органические растворители в одном и том же реакторе в одно и то же время, сократив общую длительность всего процесса и экономические расходы, связанные с установкой и обслуживанием одного реактора вместо двух. В таких способах достигается общий сдвиг химического равновесия в сторону образования конечных продуктов (растворителей), поскольку ферменты гидролиза целлюлозы ингибируются накапливающимися сахарами, а при объединении стадии ферментативного гидролиза с ферментацией клетки конвертируют образующиеся простые сахара в органические растворители, не давая накопиться сахарам в концентрациях, ингибирующих ферментативный гидролиз. В целом такой подход позволяет увеличить степень гидролиза и потребления субстрата, а также повысить продуктивность процесса в целом по накапливающимся органическим растворителям. Следует заметить, что совместить стадию осахаривания и ферментации ЦСС можно только в том случае, если гидролиз ЦСС осуществляется с использованием ферментов, а не кислот, поскольку кислотный гидролиз негативно действуют на клетки, продуцирующие органические растворители, из-за низких значений рН и высоких температур (выше 100°С), которые используются в случае кислотного гидролиза. Вместе с этим целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию, так как целлюлоза в них имеет высокоупорядоченную (кристаллическую) структуру, и во многих случаях ЦСС содержит в своем составе сопутствующие вещества (в первую очередь лигнин), которые служат естественной защитой растений, затрудняющей доступ ферментов к гликозидным связям полисахаридного субстрата. В этой связи необходимо увеличение реакционной способности ЦСС, которое может быть достигнуто за счет специальной обработки сырья перед контактом с ферментами. Известна предобработка целлюлозы химическим путем, основанным на кислотном гидролизе полисахаридов, проведении делигнификации разбавленными щелочами, обычно NaOH или аммиаком. Однако такая предобработка имеет ряд недостатков, главными из которых является отсутствие полного разрушения целлюлозы и наличие отходов производства, утилизация которых представляет довольно серьезную проблему. Большое развитие получили методы предобработки, основанные на взрывной дефибрации ЦСС по декомпрессионному принципу (парового взрыва) [De Bari I., Nanna F., Braccio G. (2007) SO2 - catalyzed steam fractionation of aspen chips for bioethahnol production: Optimization of the catalyst impregnation // Ind Eng Chem Res., V.46, P.7711-7720]. ЦСС подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением в присутствии или в отсутствие SO или CO и далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв материала. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, под действием парового взрыва происходит частичная дезинтеграция целлюлозы, а также гидролиз гемицеллюлоз. Однако недостатком такого метода является, с одной стороны, большой расход энергии и пара, а, с другой - образование трудно утилизируемых отходов (модифицированного лигнина). Поэтому большее предпочтение отдается физико-механическим методам, основанным на измельчении ЦСС на различных видах мельниц.
6
Так известен способ получения органических растворителей [Патент РФ №2405827, МПК: С12Р 7/00], который включает одновременное осахаривание предварительно измельченного растительного сырья и ферментацию полученных сахаров в питательной среде с помощью бактерий Clostridium acetobutylicum ВКМ В-2531 D, а также выделение органических растворителей из ферментационной среды, чтобы снизить уровень ингибирования клеток растворителями. Процесс осуществляют в одну стадию, причем выделение органических растворителей осуществляется путем диффузионного испарения через мембрану, представляющую собой синтетическое (силиконовое) или растительное масло, с использованием вакуума. Процесс осуществляют при рН среды 4,2 и температуре 35°С в течение 48 ч. В качестве растительного сырья используют древесные опилки, в том числе опилки хвойных пород, в которых предварительно осуществляют экстракцию смолы, солому пшеницы и др. Предобработка ЦСС заключается в помоле на мельницах до размера частиц 1-5 мкм с одновременной сушкой сырья. В качестве ферментов для гидролиза используют лиофильно высушенную культуральную жидкость, полученную культивированием мицелиального гриба Penicillium funiculosum ВКМ F-3887 D, в концентрации 2,5 г/кг сырья. Во время процесса в реакторе постоянно поддерживается концентрация сахаров в пределах 20 г/л. Продуктивность процесса по растворителям составляет 8-8,3 г/л/сут (то есть 0,333-0,346 г/л/ч).
Главным недостатком получения комплекса органических растворителей с использованием суспензионных клеток бактерий рода Clostridium являются сами растворители, накапливающиеся в культуральной жидкости, так как они являются токсичными для бактериальных клеток [Воробьева Л.И. Промышленная микробиология: учеб. пособие / М.: изд-во МГУ, 1989. - 294 с.]. В этой связи в процесс необходимо использование технических устройств, позволяющих отделять растворители от культуральной жидкости. Применение селективных мембран для этих целей, которые способны отделить бутанол или этанол от воды, приводит к их быстрому засорению измельченным сырьем и суспензионными клетками, необходимости замены этих дорогостоящих мембран, а в целом к существенному удорожанию процесса.
Для преодоления ингибирующего воздействия растворителей на клетки используются генно-модифицированные штаммы бактерий рода Clostridium [Thirmal С., Dahman Y. (2011) Different physical and chemical pretreatments of wheat straw for enhanced biobutanol production in simultaneous saccharification and fermentation // Int J Energ Environ., V.2 (4), P.615-626}. Так известен способ получения органических растворителей путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС под действием клеток С. beijerinckii P260 [Qureshi N., Saha B.C., Hector R.E., Hughes S., Cotta M.A. (2008) Butanol production from wheat straw by simultaneous saccharification and fermentation using Clostridium beijerinckii: part I-batch fermentation // Biomass Bioenergy, V.32, P.168-175]. В качестве ЦСС данный способ использует измельченную пшеничную солому, предобработанную 1% раствором серной кислоты при 121°С в течение 1 ч. В качестве инокулята используются клетки бактерий Clostridium beijerinckii P260. Процесс ведут при температуре 35°С в течение 72 ч. В полученную смесь добавляют раствор целлюлаз (0,21 мл/г субстрата), состоящий из коммерческих препаратов целлюлаз Celluclast 1.5L, β-глюкозидазы Novozyme 188 и ксиланазы Viscostar 150L. Помимо пшеничной соломы (86 г/л) в реакционную среду дополнительно добавляют дрожжевой экстракт (1 г/л) и глюкозу (0,3 г/л), раствор витаминов и минеральных солей. В ходе процесса из среды периодически выделяют органические растворители, чтобы снять их ингибирующее влияние на клетки. В результате процесса концентрация растворителей, накапливающаяся в реакционной среде, составляет 21,4 г/л, что соответствует продуктивности процесса по растворителям 0,297 г/л/ч.
К недостаткам данного способа относится необходимость введения в реакционную среду помимо основного субстрата добавок в виде раствора глюкозы, дрожжевого экстракта, минеральных солей и витаминов, что приводит к дополнительным экономическим затратам. Кроме того, после предобработки пшеничной соломы разбавленной серной кислотой, в реакционной среде содержатся вещества, ингибирующие каталитическую активность целлюлаз и клеток бактерий, такие как фурфурол и уксусная кислота. Кроме того, все способы получения органических растворителей на основе генно-модифицированных штаммов обладают рядом значительных недостатков, среди которых необходимость введения индукторов в среды для биосинтеза в клетках необходимых ферментов, антибиотиков для подавления развития посторонних микроорганизмов, необходимость решения вопросов по утилизации биомассы генно-модифицированных клеток и т.п. Поэтому огромен интерес к природным штаммам-продуцентам, чье применение в этой области биотехнологии более актуально.
6
Эффективным подходом к увеличению устойчивости клеток природных штаммов рода Clostridium к воздействию растворителей является их иммобилизация, позволяющая значительно увеличить устойчивость клеток к воздействию растворителей и делающая возможным их неоднократное использование для получения органических растворителей [Shapovalov О.I., Ashkinazi L.A. (2008) Biobutanol: biofuel of second generation // Rus J Appl Chem., V.81 (12), P.2232-2236; Патент Международный WO/2010/151706, Integrated system and process for bioproduct production. МПК С12Р 7/16, C12M 1/10, C12N 1/22]. Использование иммобилизованных бактериальных клеток также позволяет технически упростить стадию отделения иммобилизованных клеток от культуральной жидкости, содержащей органические растворители, создать высокие концентрации бактериальных клеток в реакторе с равномерным распределением их по всему объему и использовать одни и те же иммобилизованные клетки многократно, увеличив продуктивность процесса по бутанолу в сравнении со свободными клетками.
Однако несмотря на привлекательность использования иммобилизованных клеток на сегодняшний день известен только один способ получения органических растворителей путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС, в котором применяются иммобилизованные клетки рода Clostridium [Efremenko E., Stepanov N., Senko O., Nikolskaya A., Maslova O., Zorov I., Sinitsyn A. (2011) Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 6-9 June, P.1735-1738]. Это связано с тем, что предлагаемые к использованию только на стадии АБЭ-ферментации носители для клеток не обладают необходимой химической и физической стабильностью или проявляют подверженность биодеградации, что практически исключает возможность их применения при одновременном осахаривании и ферментации ЦСС, где используются сложные по составу среды, содержащие измельченные образцы ЦСС, ферменты и бактериальные клетки, различные сахара и накапливающиеся органические растворители.
Целесообразным является использование в качестве носителя для клеток, продуцирующих органические растворители, криогеля поливинилового спирта (ПВС) [Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Никольская А.Н., Сенько О.В., Спричева О.В., Варфоломеев С.Д. (2010) Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола // Катализ в пром-ти, т.5, с.70-76] - синтетического полимера, формирующего криогель при замораживании и последующем оттаивании его водного раствора [В.И. Лозинский (2002) Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, т.71, с.559-585]. Порообразователем при этом в матрице такого криогеля служат кристаллы замораживаемой воды. Высокая пористость образующейся матрицы криогеля ПВС обеспечивает незатрудненную диффузию субстратов и продуктов к и от клеток, находящихся в полимерной матрице [Лозинский В.И., Дамшкалн Л.Г., Шаскольский Б.Л., Бабушкина Т.А., Курочкин И.Н., Курочкин И.И.
Изучение криоструктурирования полимерных систем. 27. Физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта и особенности их макропористой морфологии. // Колоидн. журн. 69 (6) 798-816 (2007)]. Кроме того, этот носитель обладает высокой износостойкостью, химической стабильностью и не подвержен биодеструкции.
В этой связи известен способ получения органических растворителей [Efremenko E., Stepanov N., Senko О., Nikolskaya A., Maslova О., Zorov I., Sinitsyn A. (2011) Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 6-9 June, P.1735-1738] путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС под действием клеток бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованных в криогель ПВС. В качестве субстрата способ предполагает использование образцов рисовой и пшеничной соломы, кукурузных стеблей, осиновых и сосновых опилок, измельченных до размера частиц 300-800 мкм. Предварительно ЦСС осахаривают при 50-55°С в течение 8 ч, для чего в среду с ЦСС вводят ферментные препараты, содержащие целлюлазы, ксиланазы и β-глюкозидазу, в общей концентрации по белку 6 г/л. Далее в эту среду, содержащую частично предобработанное (осахаренное) ЦСС и гидролитические ферменты, вводят гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками, которые предварительно формируют методом замораживания - оттаивания суспензии биомассы клеток (7% масс.) в 10% (масс.) растворе ПВС. Гранулы имеют цилиндрическую форму с диаметром и высотой 4 и 8 мм соответственно. Также в эту же среду вносят глюкозу (30 г/л) и дрожжевой экстракт (1 г/л). Далее процесс одновременного осахаривания и ферментации ведут при 37°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса в зависимости от различных типов ЦСС составляет соответственно: для пшеничной соломы - 18,2 г/л и 0,364 г/л/ч, для рисовой соломы - 20,2 г/л и 0,404 г/л/ч, для кукурузных стеблей - 18,5 г/л и 0,370 г/л/ч, для осиновых опилок - 12,0 г/л и 0,240 г/л/ч, для сосновых опилок - - 11,5 г/л и 0,230 г/л/ч. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса составляет 500 ч.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол, путем одновременного ферментативного осахаривания (гидролиза) углеводов, входящих в состав непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья, и ферментации получаемых гидролизатов в целевые продукты под действием клеток бактерий Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, принято за прототип.
К существенным недостаткам прототипа относится обязательное внесение в реакционную среду помимо основного субстрата (ЦСС) добавок глюкозы и дрожжевого экстракта (дополнительные источники углерода и азота). В этой связи накопление органических растворителей в среде происходит не только за счет сахаров, образующихся при гидролизе ЦСС, но и за счет того количества глюкозы, которое дополнительно вносится в среду. Это не только экономически затратно, но и делает невозможным проведение оценки эффективности конверсии основного сырья, то есть искажает адекватность получаемых параметров процесса, а также создает опасность контаминации процесса посторонними микроорганизмами, так как глюкоза и дрожжевой экстракт являются прекрасными субстратами для роста многих микроорганизмов. В этой связи требуется строгое соблюдение условий стерильности при проведении процесса, а это ухудшает его экономическую сторону, так как требует применения специального оборудования и затрат времени и энергии на стерилизацию не только оборудования и сред, но и всех коммуникаций. Кроме того, длительность последовательного использования иммобилизованных клеток в таком процессе (500 ч) не является удовлетворительной и требует увеличения. Увеличение длительности эффективного использования одних и тех же адаптированных к условиям процесса иммобилизованных клеток существенно улучшает экономику процесса, так как позволяет избежать необходимости накопления биомассы медленно растущих анаэробных клеток бактерий перед каждым рабочим циклом с последующим решением вопросов по утилизации отработанной биомассы свободных клеток.
Задачей заявляемого технического решения является создание усовершенствованного способа получения органических растворителей, характеризующегося устранением перечисленных выше недостатков, присущих прототипу.
Технический результат заключается в улучшении показателей процесса (продуктивности и суммарно накапливающейся концентрации растворителей) при снижении энергетических и экономических затрат, необходимых на реализацию самого процесса, за счет снижения температуры процесса и устранения необходимости введения в реакционные среды дополнительных питательных компонентов сред в виде глюкозы и дрожжевого экстракта, а также за счет сокращения времени ферментативного предгидролиза сырья наряду с увеличением срока эффективного использования одних и тех же иммобилизованных клеток-продуцентов целевых продуктов.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол из возобновляемого растительного целлюлозосодержащего сырья путем одновременного ферментативного осахаривания углеводов, входящих в состав сырья, и ферментации получаемых гидролизатов в целевые продукты под действием биокатализатора на основе клеток бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, согласно изобретению, перед ферментативным осахариванием углеводов и ферментацией получаемых гидролизатов осуществляют измельчение сырья до размера частиц 20-80 мкм и проводят предварительное ферментативное осахаривание измельченного сырья в течение 1-5 ч при температуре 45-55°С, при этом последующий процесс одновременного ферментативного осахаривания углеводов и ферментации получаемых гидролизатов ведут при температуре 31±3°С в течение времени, обеспечивающем получение органических растворителей. Измельчение может быть проведено на шаровой мельнице. Предварительное ферментативное осахаривание измельченного сырья проводят в присутствии смеси гидролитических ферментов из целлюлазы, ксиланазы и β-глюкозидазы. Наилучший результат достигается при использовании биокатализатора в виде цилиндрических гранул, имеющих диаметр и высоту 3-5 мм. Процесс одновременного ферментативного осахаривания углеводов и ферментации получаемых гидролизатов ведут в течение 45-50 часов, при этом биокатализатор после окончания технологического цикла может быть отделен от реакционной среды для повторного использования в технологическом цикле, при этом период эффективного действия биокатализатора составляет от 1000-1200 ч.
2
Для эффективного контакта гидролитических ферментов и субстрата в заявляемом техническом решении проводят измельчение образцов ЦСС, например, на шаровой мельнице активаторного типа так, чтобы размер частиц составлял 20-80 мкм. Для этого образец ЦСС помещают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и при центробежном ускорении 300 м/с и скорости вращения барабанов 1290 об/мин в течение 5 мин осуществляют измельчение сырья. Шаровая мельница активаторного типа, используемая для измельчения ЦСС, обеспечивает в заданном режиме не только значительное измельчение, но и способствует механоактивации сырья, в результате чего происходит разрыв множественных химических, а именно водородных связей между линейными молекулами целлюлозы, что сопровождается заменой кристаллической структуры полимера на аморфную, а также частичной деполимеризацией молекул целлюлозы. В ходе процесса измельчения локально повышается температура частиц сырья, при этом остаточная вода в волокнах растительной биомассы выполняет функцию катализатора кислотного гидролиза. Таким образом, при механической дезинтеграции (физической обработке) ЦСС на шаровой мельнице активаторного типа происходят его физико-химические изменения, то есть достигается частичная физико-химическая трансформация исходного сырья без дополнительного применения химических реагентов. При относительной технологической простоте реализации (без применения химреагентов, высоких температур и повышенного давления), экологичности и благоприятности для основного процесса, физико-химическая предобработка биосырья, осуществляемая в момент механического измельчения ЦСС на шаровой мельнице в установленных условиях, обеспечивает эффективную подготовку целлюлозосодержащего сырья к его ферментативной обработке (осахариванию).
Получаемый диапазон размера частиц разных типов ЦСС, измельчаемых в указанном режиме работы шаровой мельницы в предлагаемом техническом решении, составляет 20-80 мкм. Именно такой диапазон частиц получается при задаваемом режиме работы шаровой мельницы. Изменение режима работы мельницы приводит либо к увеличению размера частиц более 80 мкм и изменению показателей процесса в сторону прототипа, а уменьшение размера частиц (менее 20 мкм) приводит к появлению сложностей при работе с такими частицами (при их смачивании, взвешивании, пересыпании, и др.) ввиду их большой «летучести» (легкости).
В заявляемом техническом решении перед началом основного процесса получения органических растворителей путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС под действием ферментов, как и в прототипе, проводят предварительное осахаривание сырья в присутствии той же смеси гидролитических ферментов, взятых в такой же концентрации (6 г общего белка/л), что и в прототипе. Это необходимо для накопления в среде начальной концентрации сахаров, способных обеспечить условия, необходимые для начала функционирования клеток бактерий рода Clostridium, конвертирующих сахара, в частности
глюкозу, в органические растворители. В случае отсутствия в среде глюкозы и введения в нее клеток бактерий последние оказываются лимитированы по наличию в среде биодоступного субстрата и, будучи склонными к спорообразованию в неблагоприятных условиях культивирования, коим и является отсутствие субстрата, клетки переходят из активного метаболического состояния в состояние покоя, что приводит к остановке процесса получения органических растворителей. Таким образом, перед внесением клеток в среду с ЦСС и ферментами, необходимо обеспечить наличие в среде субстрата для клеток. С этой целью проводят предварительное осахаривание ЦСС в присутствии смеси гидролитических ферментов при температуре 45-55°С, являющейся оптимальной для действия целлюлолитических ферментов.
В отличие от прототипа предварительное осахаривание ЦСС проводят не 8 ч, а 1-5 ч в тех же условиях, что и в прототипе. Снижение длительности этой стадии оказывается возможным за счет предлагаемого в заявляемом техническом решении использования частиц ЦСС меньшего размера, позволяющим за существенно более короткий промежуток времени провести предварительное осахаривание ЦСС с накоплением необходимого количества сахаров, являющихся субстратом для клеток бактерий. Длительность предварительного осахаривания ЦСС в заявляемом способе (1-5 ч) определяется только типом ЦСС, используемым для получения органических растворителей.
В составе смеси ферментов, осуществляющих гидролиз ЦСС, в заявляемом техническом решении используют те же ферменты, что и в прототипе, а именно целлюлазы, ксиланазы и β-глюкозидазу. Использование различных ферментных препаратов позволяет осуществлять более глубокий гидролиз целлюлозы.
В заявляемом техническом решении, как и в прототипе, в среду, содержащую частично предобработанное (осахаренное) ЦСС и гидролитические ферменты, вводят гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые предварительно формируют методом замораживания-оттаивания суспензии биомассы клеток (7% масс.) в 10% (масс.) растворе ПВС. В техническом решении, как и в прототипе, используются для иммобилизации в криогель ПВС клетки Clostridium acetobutylicum B-4786. Гранулы, как и в прототипе, имеют цилиндрическую форму, но уменьшенный размер - диаметр и высота гранул в заявляемом техническом решении составляют соответственно не 4 и 8 мм, как в прототипе, а имеют диаметр и высоту гранул по 3-5 мм. Уменьшение размера гранул происходит за счет того, что объем аликвоты, используемой для формирования гранул, уменьшают в 2 раза по сравнению с прототипом. Так в заявляемом, техническом решении для формирования гранул нужной величины готовят суспензию клеток бактерий в растворе полимера, распределяют полученную суспензию в виде аликвот объемом 0,5 мл по лункам 96-луночной плашки, которую помещают в морозильную камеру при -20°С, замораживают содержимое плашки, выдерживают при этой температуре в течение 24 ч и размораживают при +8°С. Полученные в результате такой операции гранулы с иммобилизованными в криогель ПВС клетками используют для получения органических растворителей. Снижение размера гранул направлено на улучшение массообменных процессов для клеток, находящихся внутри гранул. Снижение размера гранул более чем в 2 раза по сравнению с прототипом, приводит к необходимости уменьшения объема суспензии клеток в растворе полимера, используемого для формирования гранул, что приводит к определенным техническим сложностям ввиду высокой вязкости суспензии, распределяемой по лункам плашки. Меньшее снижение размера гранул не позволяет существенно улучшить метаболическую активность клеток, незначительно изменив массообменные процессы в их микроокружении.
Сформированные гранулы с иммобилизованными клетками помещают как и в прототипе, в той же концентрации в среду с предварительно осахаренным ЦСС и смесью гидролитических ферментов, которую, в отличие от прототипа, предварительно охлаждают не до 37°С, а до 31±3°С для одновременного осахаривания и ферментации ЦСС с целью получения органических растворителей. При этом в среду, в отличие от прототипа, не вносят никаких дополнительных питательных компонентов (глюкозы и дрожжевого экстракта) для клеток.
Снижение температуры процесса одновременного осахаривания и ферментации ЦСС, предлагаемое в заявляемом техническом решении, позволяет замедлить метаболическую активность клеток и снизить скорость потребления иммобилизованными клетками сахаров, накапливающихся в среде под действием ферментов. В этих условиях устраняется необходимость введения в среду дополнительного количества глюкозы, которая есть в прототипе, поскольку скорости накопления сахаров под действием ферментов и потребления их клетками становятся соизмеримыми, а процесс более сбалансированным. Кроме того, снижение температуры позволяет существенно снизить расходы на поддержание необходимой температуры процесса в течение 50 ч. Снижение температуры процесса ниже 31±3°С приводит к существенному замедлению процесса в целом и, в частности, ферментативного гидролиза ЦСС, а использование температуры выше 31±3°С для проведения процесса не приводит к уравниванию скоростей ферментативного гидролиза ЦСС и ферментации сахаров под действием клеток, и, как следствие, остается необходимость внесения в среду дополнительного количества глюкозы в качестве субстрата для клеток.
При той же длительности процесса, что и в прототипе (50 ч), заявляемое техническое решение позволяет улучшить технологические показатели процесса, в частности поднять суммарную концентрацию органических растворителей, накапливающихся в среде, и продуктивность процесса на 15-30% в зависимости от типа ЦСС (см. Примеры).
Заявляемое техническое решение, обеспечивающее создание для иммобилизованных клеток более эффективных условий их использования при получении органических растворителей, обеспечивает возможность их более длительного использования для проведения процесса одновременного осахаривания и ферментации ЦСС (1000-1200 ч), чем в прототипе (500 ч). К условиям, позволяющим получить такой результат, относится снижение температуры процесса, которое приводит к существенному замедлению термоинактивации собственных ферментов клеток при их длительном экспонировании в средах для накопления органических растворителей. Кроме того, уменьшение размера гранул приводит к более эффективному массообмену и своевременному доступу субстрата к клеткам, включенным в криогель ПВС, а также к более эффективному удалению из микроокружения клеток продуктов метаболизма. Сбалансированность скоростей накопления сахаров и их потребления клетками при заявляемых условиях приводит к тому, что в среде не накапливается высоких концентраций сахаров, способных привести к субстратному ингибированию клеток, с одной стороны, а с другой клетки оказываются обеспеченными необходимой концентрацией сахаров.
Таким образом, в результате выполнения предлагаемой последовательности действий при заявляемых условиях реализуется способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания (гидролиза) углеводов, входящих в состав целлюлозосодержащего сырья, и ферментации получаемых гидролизатов в целевые продукты под действием клеток бактерий Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель ПВС, в котором, в сравнении с прототипом:
- проводится измельчение ЦСС на шаровой мельнице активаторного типа до получения частиц с меньшим в 10-15 раз размером (вместо частиц размером 300-800 мкм получают частицы размером 20-80 мкм), что обеспечивает лучший контакт ферментов с субстратом, делая его более биодоступным для гидролиза и увеличивая, таким образом, скорость и эффективность гидролиза,
- сокращена длительность предварительного осахаривания ЦСС в присутствии смеси гидролитических ферментов с 8 ч до 1-5 ч при 45-55°С за счет улучшения контакта фермента с субстратом,
- упразднено введение в среду дополнительных питательных компонентов среды (30 г/л глюкозы и 1% дрожжевого экстракта), поскольку более эффективен гидролиз основного субстрата (ЦСС),
- снижена температура проведения процесса одновременного осахаривания и ферментации ЦСС с 37°С до 31±3°С, который реализуется на протяжении 50 ч, что делает процесс более экономически выгодным, так как снижены, таким образом, энергетические затраты,
- улучшены показатели процесса (продуктивности и суммарно накапливающейся концентрации растворителей) при использовании разных типов ЦСС,
- уменьшен размер гранул с иммобилизованными клетками при их формировании в 2 раза, что способствует улучшению массообменных процессов внутри гранул и обеспечивает увеличение эффективности их использования, приводящее к повышению срока эффективного использования иммобилизованных клеток-продуцентов органических растворителей от 500 до 1000-1200 суток для разных источников ЦСС, представленных в более широком спектре, чем в прототипе. Последнее достижение в виде увеличенного срока эффективного использования иммобилизованных клеток, отличающее заявляемое техническое решение от прототипа, позволяет решить важную экологическую и экономическую проблему, связанную с необходимостью утилизации отработанных иммобилизованных клеток за счет их в 2 раза более длительного использования.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемое техническое решение.
Пример 1. Способ получения органических, растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде пшеничной соломы, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогелъ ПВС.
2
Образец пшеничной соломы (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают в течение 5 мин при центробежном ускорении 300 м/с и скорости вращения барабанов 1290 об/мин. Получаемый размер частиц измельченной пшеничной соломы составляет 20 мкм. Измельченный образец пшеничной соломы суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, содержащем в общей концентрации по белку 6 г/л целлюлаз, ксиланаз и β-глюкозидазу, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание пшеничной соломы проводят при 50°С в течение 2 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 30°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые предварительно формируют методом замораживания оттаивания суспензии биомассы клеток (7% масс.) в 10% (масс.) растворе ПВС. Гранулы имеют цилиндрическую форму с диаметром и высотой по 4±1 мм. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 30°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для пшеничной соломы - 22 г/л и 0,44 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 21%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием пшеничной соломы составляет 1200 ч.
Пример 2. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде рисовой соломы, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогель ПВС
Образец рисовой соломы (112 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченной рисовой соломы составляет 30 мкм. Измельченный образец рисовой соломы суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе ацетатного буфера (рН 5,5) и помещают в термостатируемый при 55°С реактор. Предварительное осахаривание рисовой соломы проводят при 55°С в течение 1 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 28°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 28°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для рисовой соломы - 23,3 г/л и 0,464 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 15%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием рисовой соломы составляет 1160 ч.
Пример 3. Способ получена органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде кукурузных стеблей, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогель ПВС
Образец кукурузных стеблей (115 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных кукурузных стеблей составляет 50 мкм. Измельченный образец кукурузных стеблей суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,3) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание кукурузных стеблей проводят при 50°С в течение 3 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для кукурузных стеблей - 20,5 г/л и 0,41 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 19,5%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием кукурузных стеблей составляет 1150 ч.
Пример 4. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде осиновых опилок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогель ПВС
Образец осиновых опилок (125 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных осиновых опилок составляет 70 мкм. Измельченный образец осиновых опилок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 45°С реактор. Предварительное осахаривание осиновых опилок проводят при 45°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 31°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично Примеру 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 31°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для осиновых опилок - 14,5 г/л и 0,29 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 20,8%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием осиновых опилок составляет 1050 ч.
Пример 5. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде сосновых опилок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогель ПВС
Образец сосновых опилок (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных сосновых опилок составляет 80 мкм. Измельченный образец сосновых опилок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе ацетатного буфера (рН 5,5) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание сосновых опилок проводят при 50°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ведут ЦСС при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для сосновых опилок - 15,0 г/л и 0,30 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 30,4%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием сосновых опилок составляет 1000 ч.
Пример 6. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде свекловичного жома, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогель ПВС
Образец свекловичного жома (115 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченного свекловичного жома составляет 60 мкм. Измельченный образец свекловичного жома суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе ацетатного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 45°С реактор. Предварительное осахаривание свекловичного жома проводят при 45°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 34°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации свекловичного жома ведут при 34°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для свекловичного жома - 21,5 г/л и 0,43 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием свекловичного жома составляет 1100 ч.
Пример 7. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде яблочных выжимок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогель ПВС
Образец яблочных выжимок (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных яблочных выжимок составляет 80 мкм. Измельченный образец яблочных выжимок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание яблочных выжимок проводят при 50°С в течение 3 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации яблочных выжимок ведут при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для яблочных выжимок - 17,0 г/л и 0,34 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием яблочных выжимок составляет 1100 ч.
Пример 8. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде топинамбура, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогелъ ПВС
Образец топинамбура (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченного топинамбура составляет 80 мкм. Измельченный образец топинамбура суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание топинамбура проводят при 50°С в течение 1 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 30°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации топинамбура ведут при 30°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для топинамбура - 20,8 г/л и 0,416 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием топинамбура составляет 1420 ч.
Пример 9. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде березовых опилок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогелъ ПВС
Образец березовых опилок (110 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных березовых опилок составляет 30 мкм. Измельченный образец березовых опилок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание березовых опилок проводят при 50°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично Примеру 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации березовых опилок ведут при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для березовых опилок - 14,0 г/л и 0,28 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием березовых опилок составляет 1020 ч.