КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ С УЧАСТИЕМ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, НАЦЕЛЕННЫХ НА НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

1. Композиция, содержащая
модифицированный белок Cas9, причем указанный модифицированный белок Cas9 содержит модификацию области белка Cas9 дикого типа, выбранной из группы, состоящей из области спирального мостика Cas9; высокоосновного участка Cas9 в N-концевой области Cas9; области NHN-домена Cas9; области RuvC-домена Cas9; области распознавания Р-домена Cas9; дополнительную ферментную активность, вставку, делецию или замену домена; вставку, делецию или замену структурного мотива, слияние или любую их комбинацию.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что белок Cas9 дикого типа представляет собой белок Cas9 Streptococcus pyogene.
3. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области белка Cas9 дикого типа, соответствующей аминокислотам 1-270 Cas9 Streptococcus pyogene.
4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 50-100 Cas9 Streptococcus pyogenes.
5. Композиция по п. 4, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 65-95 Cas9 Streptococcus pyogenes.
6. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 22-49 Cas9 Streptococcus pyogenes.
7. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 551-556 Cas9 Streptococcus pyogenes.
8. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 445-507 Cas9 Streptococcus pyogenes.
9. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 860-1100 Cas9 Streptococcus pyogenes.
10. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 1096-1225 Cas9 Streptococcus pyogenes.
11. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 1105-1138 Cas9 Streptococcus pyogenes.
12. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная модификация содержится в области, соответствующей аминокислотам 718-757 Cas9 Streptococcus pyogenes.
13. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная модификация представляет собой вставку нуклеазного домена или вставку РНК-связывающего домена.
14. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что вставленный РНК-связывающий домен представляет собой Csy4.
15. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный белок Cas9 по любому из пп. 1-14.
16. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, содержащая
сконструированную CRISPR РНК (crPHK), сконструированную транс-активирующую CRISPR РНК (tracrPHK), или их комбинацию, причем (i) сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, может связываться с белком Cas9 с образованием комплекса нуклеиновая кислота, нацеленная на нуклеиновую кислоту-Cas9, способного связывать целевую ДНК, и (ii) сконструированная crPHK , сконструированная tracrPHK, или их комбинация отлична от соответствующей crPHK, tracrPHK, или обеих дикого типа; и
сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, содержит по меньшей мере одно из следующих: последовательность tracr с 3'-гибридизующимся удлинением, последовательность спейсера с удлинением, последовательность tracr с удлинением, модифицированную область петли, модифицированный Р-домен, Csy4 связывающая последовательность, с которой связывается белок Csy4 с Kd ~50 рМ, Cas5 связывающая последовательность, с которой связывается белок Cas5, Cas6 связывающая последовательность, с которой связывается белок Cas6, соединение/вариант шпильки, модифицированная структура «петля-на-стебле», содержащая функциональную группу, или их комбинации.
17. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту по п. 16, отличающаяся тем, что указанная сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, представляет собой структуру двойной направляющей нуклеиновой кислоты.
18. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту по п. 16, отличающаяся тем, что указанная сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, представляет собой структуру одинарной направляющей нуклеиновой кислоты.
19. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту по п. 16, отличающаяся тем, что указанное соединение/вариант шпильки содержит соединение «петля-на-стебле» модифицированной длины или соединение «петля» модифицированного размера по сравнению с соответствующей tracrPHK дикого типа.
20. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту по п. 16, отличающаяся тем, что указанный Р-домен начинается с 2, 3, 4, или 5 нуклеотидов в прямом направлении от последнего парного нуклеотида дуплекса, образованного crPHK и tracrPHK, и указанный Р-домен содержит 2, 3, 4, или 5 следующих друг за другом нуклеотидов.
21. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту по п. 20, отличающаяся тем, что указанный модифицированный Р-домен содержит одну или более мутаций для обеспечения гибридизации сконструированной нуклеиновой кислоты, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, с различным примыкающим к протоспейсеру мотивом по сравнению с соответствующим tracrPHK.
22. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту по п. 16, отличающаяся тем, что указанная Csy4 связывающая последовательность представляет собой Csy4-метки, представленные на фигурах фиг. 27А или фиг. 27В.
23. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, по п. 16, отличающаяся тем, что указанная последовательность tracr с удлинением дополнительно содержит функциональный фрагмент.
24. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, по п. 16, отличающаяся тем, что указанная последовательность спейсера с удлинением дополнительно содержит функциональный фрагмент.
25. Сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, по п. 16, отличающаяся тем, что сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, содержит ДНК.
26. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сконструированную нуклеиновую кислоту, нацеленную на нуклеиновую кислоту, по любому из пп. 16-24.
27. Композиция, содержащая композицию модифицированного белка Cas9 по любому из пп. 1-14, и сконструированную нуклеиновую кислоту, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, по любому из пп. 16-25.
28. Способ детекции того, находятся ли два комплекса поблизости друг от друга, включающий
(а) приведение первой целевой нуклеиновой кислоты в контакт с первым комплексом, при этом указанный первый комплекс содержит первый сайт-специфический полипептид, первую модифицированную нуклеиновую кислоту, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, комплементарную первой целевой нуклеиновой кислоте, и первый эффекторный белок, причем указанный первый эффекторный белок выполнен с возможностью связывания с указанной модифицированной нуклеиновой кислотой, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, и при этом указанный первый эффекторный белок содержит негативную последовательность, которая содержит первый фрагмент комбинированной системы; и
приведение второй целевой нуклеиновой кислоты в контакт со вторым комплексом, при этом указанный второй комплекс содержит второй сайт-специфический полипептид, вторую модифицированную нуклеиновую кислоту, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, содержащую вторую последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную второй целевой нуклеиновой кислоте, и второй эффекторный белок, причем указанный эффекторный белок выполнен с возможностью связывания с указанной второй модифицированной нуклеиновой кислотой, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, и при этом указанный второй эффекторный белок содержит вторую ненативную последовательность, которая содержит второй фрагмент комбинированной системы; и
детекция взаимодействия между указанным первым фрагментом и указанным вторым фрагментом, причем указанная детекция показывает, что указанные первый и второй комплексы находятся поблизости друг от друга.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что указанная комбинированная система содержит два или более фрагментов белка, причем указанные фрагменты белка по отдельности не являются активными, но образуемый из указанных белковых фрагментов комплекс является активным.
30. Способ по п. 28, отличающийся тем, что указанное детектирование включает обнаружение явления генетической мобильности.
31. Способ идентификации нецелевых сайтов связывания по отношению к целевой последовательности ДНК, включающий
приведение смеси фрагментов ДНК, содержащей целевую последовательность ДНК, в контакт с ферментно неактивным белком Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, причем (i) указанный белок Cas9 содержит афинную метку, нуклеиновая кислота, нацеленная на нуклеиновую кислоту, содержит афинную метку, или их комбинация, и (ii) Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, связывается с целевой последовательностью ДНК;
выделение белка Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, и связывание фрагментов ДНК с применением агента захвата, связывающегося с афинной меткой;
очистка фрагментов ДНК, которые были связаны Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту;
секвенирование фрагментов ДНК, которые были связаны Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту; и
идентификация нецелевых сайтов связывания из последовательностей фрагментов ДНК, которые были связаны Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, и не содержали последовательности связывания целевой ДНК.
32. Способ получения липких концов или разрезов с тупыми концами в двуцепочечной ДНК, содержащей целевой сайт, содержащий первую цепь и вторую цепь, включающий
приведение двуцепочечной ДНК в контакт с Cas9-никазой в комплексе с первой нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, причем Cas9-никаза в комплексе с первой нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, разрезает первую цепь целевого сайта и образует сайт разрезания первой цепи; и
приведение двуцепочечной ДНК в контакт с Cas9-никазой в комплексе со второй нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, причем Cas9-никаза в комплексе со второй нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, разрезает вторую цепь целевого сайта и образует сайт разрезания второй цепи;
причем либо (i) сайт разрезания первой цепи и сайт разрезания второй цепи находятся в одном положении целевого сайта с образованием разреза с тупым концом; либо (ii) сайт разрезания первой цепи и сайт разрезания второй цепи находятся в разных положениях целевого сайта с образованием липких концов.
33. Способ обогащения целевой нуклеиновой кислоты, включающий
приведение смеси нуклеиновых кислот, содержащих целевую нуклеиновую кислоту, в контакт с ферментативно неактивным белком Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, причем (i) белок Cas9, нуклеиновая кислота, нацеленная на нуклеиновую кислоту, или их комбинация дополнительно содержит афинную метку, и (ii) Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, связывается с целевой нуклеиновой кислотой; и
выделение целевой нуклеиновой кислоты, связанной с белком Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, с применением агента захвата, связывающегося с афинной меткой с обеспечением обогащения целевой нуклеиновой кислоты.
34. Мультиплексный направляющий генетический агент, содержащий
множество нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты, причем каждая нуклеиновая кислота, нацеленная на нуклеиновую кислоту, содержит одиночную направляющую РНК (sgPHK), причем указанная sgPHK содержит crPHK и tracrPHK, при этом указанная sgPHK может ассоциироваться с белком Cas9 с образованием sgPHK-Cas9 комплекса; и
множество ненативных последовательностей, причем каждая ненативная последовательность содержит фрагмент, последовательность, связывающую эндорибонуклеазу, или рибозим;
при этом модуль нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту, нацеленную на нуклеиновую кислоту, расположенную рядом с ненативной последовательностью, и множество модулей нуклеиновых кислот объединены в тандем.
35. Мультиплексный направляющий генетический агент по п. 34, отличающийся тем, что каждая ненативная последовательность содержит последовательность, связывающую эндонуклеазу, и указанная последовательность, связывающая эндонуклеазу, выбрана из группы, состоящей из сайта связывания белка Csy4, сайта связывания белка Cas5, и сайта связывания белка Cas6.
36. Комплекс для стехиометрической доставки, содержащей
сконструированный тандемный гибридный полипептид, содержащий множество белков, связывающих нуклеиновые кислоты, причем каждый белок, связывающий нуклеиновые кислоты, может связывать нуклеиновую кислоту, содержащую когнатный сайт для связывания белков, связывающих нуклеиновую кислоту, который может связываться белком, связывающим нуклеиновую кислоту.
37. Комплекс для стехиометрической доставки по п. 36, отличающийся тем, что каждый белок, связывающий нуклеиновую кислоту, представляет собой РНК-связывающий белок или ДНК-связывающий белок.
38. Комплекс для стехиометрической доставки по п. 36, отличающийся тем, что белок, связывающий нуклеиновую кислоту, связан с нуклеиновой кислотой, содержащей когнатный сайт для связывания белков, связывающих нуклеиновую кислоту.
39. Способ модификации геномной ДНК клетки, причем указанная геномная ДНК содержит целевую нуклеиновую кислоту, включающий
вставку донорного полинуклеотда в целевую нуклеиновую кислоту геномной ДНК, причем (i) белок Cas9 в комплексе с первой нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, расщепляет целевую нуклеиновую кислоту, (ii) донорный полинуклеотид интегрирован в расщепленную целевую нуклеиновую кислоту, и (iii) донорный поинуклеотид содержит интересующий генетический элемент и репортерный элемент, причем указанный репортерный элемент фланкирован 5' целевым сайтом и 3' целевым сайтом;
отбор клеток, экспрессирующих репортерный элемент; и
выделение репортерного элемента, причем (i) белок Cas9 в комплексе со второй нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, расщепляет 5' целевой сайт с образованием первого конца, и белок Cas9 в комплексе с третьей нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, расщепляет 3' целевой сайт с образованием второго конца, и (ii) первый конец и второй конец объединены.
40. Способ отслеживания развития клеточной линии в популяции клеток, включающий
мечение геномной ДНК, содержащей целевой сайт, в клетках популяции клеток посредством приведения геномной ДНК клеток в контакт с белком Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, который разрезает целевой сайт с образованием первого конца и второго конца, причем механизм клеточной репарации соединяет первый конец и второй конец и образует большое количество характерных последовательностей в большом количестве клеток;
размножение популяции клеток, содержащих характерные последовательности;
анализ клеток популяции для определения клеток, ассоциированных с каждой характерной последовательностью; и
применение характерных последовательностей для определения клеточной линии клеток в клетках популяции клеток.
41. Способ по п. 40 отслеживания развития клеточной линии в популяции клеток, дополнительно включающий приведение геномной ДНК в контакт с (i) белком Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, и (ii) донорный полинуклеотид.
42. Способ количественной оценки событий редактирования геномной ДНК в популяции клеток, причем геномная ДНК содержит целевую нуклеиновую кислоту, включающий
приведение геномной ДНК клеток в популяции в контакт с белком Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, причем (i) белок Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, может разрезать целевой сайт с образованием первого конца и второго конца, (ii) когда белок Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, разрезает целевой сайт, причем механизм клеточной репарации соединяет первый конец и второй конец с устранением целевого сайта, и (iii) указанное приведение в контакт образует множество клеток, содержащих геномную ДНК, содержащую целевой сайт, и множество клеток, содержащих геномную ДНК, где целевой сайт устранен;
выделение геномной ДНК из популяции клеток;
выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с выделенной геномной ДНК с применением праймеров, фланкирующих целевой сайт с образованием амплифицированного ПЦР-продукта;
приведение амплифицированного ПЦР-продукта в контакт с белком Cas9 в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту; и
количественную оценку событий редактирования генома путем сравнения количества амплифицированного ПЦР-продукта, полученного из геномной ДНК, содержащей целевой сайт в амплифицированном ПЦР-продукте с количеством амплифицированного ПЦР-продукта, полученного из геномной ДНК, целевой сайт которой устранен.
43. Способ по п. 42 для количественной оценки событий редактирования геномной ДНК, отличающийся тем, что количественная оценка выполняется с применением гель-электрофореза.
44. Композиция, содержащая
Сконструированную нуклеиновую кислоту, нацеленную на нуклеиновую кислоту, содержащую crPHK и tracrPHK, причем (i) сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, может связываться с белком Cas9 с образованием комплекса crPHK-tracrPHK-Cas9 (ii) указанная tracrPHK содержит 3' конец, (iii) указанный tracrPHK дополнительно содержит гибридизующую последовательность на 3' конце, и (iv) указанная гибридизующая последовательность содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая может гибридизоваться с донорным полинуклеотидом.
45. Композиция по п. 44, дополнительно содержащая белок Cas9.
46. Способ доставки донорного полинуклеотида к двуцепочечному разрыву в целевом сайте, включающий
приведение последовательности ДНК, содержащей целевой сайт, в контакт со сконструированной нуклеиновой кислотой, нацеленной на нуклеиновую кислоту, содержащей crPHK и tracrPHK, причем (i) сконструированная нуклеиновая кислота, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, ассоциирована в комплексе с белком Cas9 с образованием комплекса crPHK-tracrPHK-Cas9, (ii) указанная tracrPHK содержит 3' конец, (iii) указанная tracrPHK дополнительно содержит гибридизующую последовательность на 3' конце, (iv) указанная гибридизующая последовательность содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с донорным полинуклеотидом, и (v) указанный комплекс crPHK-tracrPHK-Cas9 связывается с последовательностью ДНК, содержащей целевой сайт, и разрезает указанный целевой сайт с получением двуцепочечного разрыва, и связывание указанного crPHK-tracrPHK-Cas9 комплекса доставляет указанный донорный полинуклеотид к двуцепочечному разрыву в целевом сайте.