Выявление в Западной Сибири высокопатогенных вирусов гриппа птиц типа а субтипа H5N1

\

ВЫЯВЛЕНИЕ В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ ВЫСОКОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ ГРИППА ПТИЦ ТИПА А СУБТИПА Н5Ш

А. С.ДОНЧЕНКО, академик РАСХН Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

А.М.ШЕСТОПАЛОВ, кандидат биологических наук

А.Г.ДУРЫМАНОВ

С.И.ЗОЛОТЫХ

С.В.НЕТЕСОВ, член-корреспондент РАН ФГУЛГНЦ ВБ «Вектор»

Ю.Г. ЮШКОВ, кандидат ветеринарных наук Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

Грипп птиц — высоко контагиозная вирусная инфекция, которая может поражать все виды пернатых. Наиболее чувствительны из домашних видов — индюки и куры. Дикие птицы могут служить переносчиками инфекции. В силу естественной резистентности они сами, как правило, при этом не заболевают и преодолевают в процессе миграции значительные расстояния.

Сейчас продолжаются вспышки вируса гриппа типа А, Н5И1 серогруппы среди птиц и людей во Вьетнаме, Индонезии, Камбодже, а также у птиц — в Японии и в Республике Казахстан. В Японии в начале августа зафиксирована циркуляция вируса гриппа типа А (Н5Ы2), вызвавшая заболевания и гибель птиц на 7 фермах, где было забито все поголовье, случаев заболеваний людей не выявлено.

В 2005 г. в 25 км от границы с Восточным Казахстаном ветеринарные врачи Китая установили более тысячи случаев заболевания гриппом гусей, почти половина из них погибла. Всего в зоне заражения китайские специалисты уничтожили порядка 13 тыс. птиц.

До недавнего времени считалось, что вирусы гриппа птиц не патогенны для людей, а в случае заражения наблюдаются быстро проходящие симптомы конъюнктивита, легкое недомогание и иногда — слабо выраженный респираторный синдром. Это положение оказалось опровергнутым в 1997 г., когда вирусы гриппа А (Н5М1) вызвали чрезвычайно тяжелые формы заболевания людей в Гонконге, в трети случаев закончившиеся летально. В результате быстрого и полного уничтожения кур в этом

регионе дальнейшее инфицирование людей удалось предотвратить.

В конце 2003 г. и в 1 квартале 2004 г. вирус гриппа А (Н5Ш) широко распространился в странах Юго-Восточной Азии. Во время вспышки тяжело заболели 34 человека, более чем 60 % случаев оказались смертельными.

По данным Всемирной организации здравоохранения, с декабря 2003 г. по 5 августа 2005 г. в мире зарегистрировано 112 случаев инфицирования людей вирусом гриппа птиц А (Н5Ш), из них 57 — с летальным исходом.

Вирус, выделенный от людей и птиц в 2004 г., существенно отличалися от штаммов из Гонконга (1997 и 2003 гг.), что свидетельствует о его мутациях. Сегодня вирус гриппа птиц А (Н5Ш) резко изменил свои биологические свойства и приобрел способность не только преодолевать видовой барьер с непосредственным инфицированием людей, но и вызывать чрезвычайно тяжелые клинические формы заболевания, значительная часть которых заканчивается летальными исходами.

В России в период с 20 июля 2005 г. до сегодняшнего дня на территории Сибирского (в 3 субъектах Федерации) и Уральского (в 2 субъектах) федеральных округов зарегистрирована эпизоотия гриппа. Установлены заболевания дикой и домашней птицы

ь

0.02

ч

A/Bar-headed Goose/Qinghai/67/2005 A/Black-headed gull/Qinghai/1 /2005 A/Great black-headed gull/Qinghai/1/200 A/Chiken/Shantou/4231 /2003 A/Grow/Osaka/102/2004 A/Chiken/lndonesia/BL/2003 A/Chiken/Suzdalka/Nov-12/2005 A/Turkev/Su?dalka/Nov-1 /2005 A/Chiken/Suzdalka/Nov-11 /2005 A/Goose/Thailand/79/2004 A/Viet Nam/1194/2004 A/Hong Kong/156/97 A/Chiken/Hong Kong/220/97 A/Duck/An yang/AVL-1 /2001 A/Goose/Guangdong/1/96 A/Enviroment/Hong Kong/437-6/99 A/Goose/Hong Kong/385.3/2000 A/Duck/Potsdam/1402-6/86 A/Chiken/ltaly/312/97 A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/S/2003 A/Mallard/64650/2003 A/Mallard/Netherlands/3/99 A/Tern/South Africa/61 A/Duck/New York/44018-2/2000 A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84 A/Tu rkey/On tat io/7732/66

Рис 1. Филогенетическое дерево H5 НА генов вирусов гриппа А. Штаммы, выделенные в ходе нашей работы, подчеркнуты. Для филогенетического анализа был использован фрагмент гена гемагглютинина длиной 660 н. о. Филогенетическое дерево построено алгоритмом «neighbor joining» с использованием MEGA2 программы.

в личных подворьях, люди, контактировавшие с пораженными особями, остались здоровы.

На конец августа, в Новосибирской области падеж домашней птицы отмечался в 20 населенных пунктах 5 районов, в Алтайском крае — 12 населенных пунктах 8 районов, в Омской области — 9 населенных пунктах 8 районов, в Тюменской области — 6 населенных пунктах 2 районов, в Курганской области — в 4 селах 2 районов.

Мы изолировали и депонировали 3 штамма вирусов гриппа Н5Ш из органов погибших птиц по-

ступивших из села Суздалка Новосибирской области: A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/05 — из селезенки индюшки, A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/05, A/Chicken/ Suzdalka/Nov-12/05 — из почек кур. Изоляцию вирусов на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) и их серологическую идентификацию проводили стандартными методами [7].

После этого были частично секвенированы гены, кодирующие гемагглютинин выделенных штаммов и проведен филогенетический анализ, который показал что они образуют кластер (индекс поддержки = 99) с H5N1 вирусами, изолированными от птиц во время вспышки птичьего гриппа на озере Цинхай (Qinghai) в Китае в 2005 г. [6], в Японии в 2004 г. [5], а также от человека и птиц в странах Юго-Восточной Азии в 2003-04 гг. [3] (рис. 1).

Ранее установлено, что один из важнейших маркеров патогенности вирусов гриппа A (H5N1) - последовательность аминокислот гемагглютинина, по которой происходит протеолитическое расщепление (сайт расщепления) [9], благодаря чему они приобретают инфекционность для клеток. Сравнительный анализ сайта расщепления показал, что у выделенных нами изолятов эта последовательность — ERRRKKR/GL — соответствует обнаруженной у высокопатогенных штаммов, циркулирующих в странах Юго-Восточной Азии (см. табл.).

Для определения нуклеотидной последовательности фрагмента NA-гена и уточнения подтипа нейраминидазы мы выделили вирусную РНК из аллантоисных жидкостей, содержащих изолированные штаммы. Выделение РНК и синтез кДНК осуществляли, как описано ранее для НА-гена. ПЦР и секвенирование проводили с использованием рассчитанных нами праймеров, специфичных к NA-гену N1 -подтипа. Сравнение полученного фрагмента с опубликованными в Genbank показало, что он имеет 100 %-ную гомологию с аналогичными последовательностями NA-генов H5N 1-штаммов, изолированных в Китае на озере Цинхай (Qinghai) в 2005 г. (A/great black-headed gull/Qinghai/1/2005, и др.) [4] и лишь несколько единичных замен в сравнении со структурой гена NA штамма от вороны в Японии в 2004 г. (рис. 2).

Важнейшая характеристика вирусов гриппа Н5 серогруппы — устойчивость к ремантадину. Известно, что это свойство генетически контролируется их М2 геном [11]. Мы провели частичный сиквенс М2 гена штаммов из села Суздалка и сравнительный анализ выявленной последовательности с данными из Genbank. В результате было установлено, что изоляты вируса гриппа H5N1, циркулирующие на территории Юга Западной Сибири, ремантадин-чувствительны. То есть этот препарат можно будет использовать для профилактики и лечения людей в случае возникновения необходимости.

Для характеристики патогенного потенциала выделенных вирусов мы поставили эксперимент на цыплятах. Тест проводился на десяти 6-ти недельных особях, инфициорнованных внутривенно 0,1 мл вируссодержащей аллантоисной жидкостью, разведенной 1:10 согласно стандартной методике [7,10]. Все птицы погибли в течение 36 часов после заражения, что характеризует исследуемые штаммы как высокопатогенные для птиц (HPAI) — индекс патогенности равен 3.

Таким образом, проведенные исследования показали, что летом 2005 г. среди птиц на территории Западной Сибири циркулировали высокопатогенные H5N1 вирусы гриппа, генетически родственные (2003-05 гг.) азиатским вариантам. До недавнего вре-

Таблица. Выравнивание аминокислотных последовательностей сайта расщепления гемагглютинина вирусов гриппа А, Н5 субтипа

Название штамма

Сайт расщепления

Низкопатогенные

A/Anas Platyrhynchos/Chany 09 04 (H5N3) PQRE—TRGLFG

A/duck/Ho Chi Minh 014 78 (H5N3) PQR—ETRGLFG

A/duck/Potsdam/1402-6-86 (H5N2) PQRE—-TRGLFG

A/mallard duck/PA/10218 84 (H5N2) PQRE—TRGLFG

A/duck/MN/1525-81 (H5N2) PQRE-—TRGLFG

A/mallard/Ohio/556 1987 (H5N9) PQRE—TRGLFG

A/chukkar/NY/51375 00 (H5N2) PQRE—-TRGLFG

A/duck/Malaysia/F119-3 97_________(H5N3) PQR—-ETRGLFG

A/turkey/England/50_92-91 A/tern/South Africa/61 A/duck/lreland/113/86___

Патогенные

PQRKR-KTRGLFG

PQRETRRQKRGLFG

PQRKR-KKRGLFG

Высокопатогенные

A/Environment/Hong Kong/437-4 99

A/Hong Kong/482/97

A/Hong Kong/156/97

A/swine/Shandong/2-03

A/goose/Guangdong/1-96

A/chicken/Hubei/489 2004

A/chicken/Thailand/CH-2 2004

A/quail/Vietnam/36-04

A/Viet Nam/1203-04

A/Hong Kong/213/2003

A/Chicken/HongKong/YU822.2/01

А/Duck/Anyang/AVL-1 2001

A/Chicken/Suzdalka/Nov-ll/2005 (H5N1)*

A/Chicken/Suzdalka/Nov-12/2005 (H5N1 )*

АЛигкеу/5игаа1ка/Ыоу-1/2005 (H5N1)*

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQRERRRKKRGLFG

PQGERRRKKRGLFG

PQGERRRKKRGLFG

PQGERRRKKRGLFG

*) Вирусы, выделенные во время летней эпизоотии на территории Новосибирской области.

\

0.1

A/great black-headed gull/Qinghai/1/2005

A/duck/Fujian/19/2000

A/Dk/Viet Nam/11 /2004

A/chiken/Viet Nam/HauGiang-617/2004

A/Dk/YN/6445/2003

A/Ph/ST/44/2004

A/duck/NJ/117228-7/01

A/duck/ME/151895-7A/02

Рис. 2. Филогенетическое дерево H5 NA генов вирусов гриппа А. Штамм, выделенный в ходе нашей работы, подчеркнут. Для филогенетического анализа был использован фрагмент гена нейраминидазы длиной 547 н. о. Филогенетическое дерево построено алгоритмом «neighbor joining» с использованием MEGA2 программы.

мени считалось, что основная опасность их широкого географического распространения связана с деятельностью человека - транспортировкой инфицированных птиц, зараженного мяса и предметов, кон-таминированных вирусом. Однако Н5Ы1 вирусы, вызвавшие вспышку гриппа на озере Цинхай, по всей видимости, были занесены перелетными птицами [4]. С ними же скорее всего связана вспышка гриппа среди домашних птиц в Новосибирской области, поскольку этот регион находится на путях весеннего пролета птиц, мигрирующих из стран Юго-Вос-точной Азии [1, 2], а экспорта птичьего мяса и птицы из Китая в Россию не зарегистрировано.

Известно, что основная роль в поддержании циркуляции вируса гриппа типа А (птичьего гриппа) в природе принадлежит диким водным и околоводным видам (гуси, утки, вороны, чайки и др.). Их сезонные миграции способствуют эффективной трансмиссии новых вариантов вируса в различные географические

регионы. Юг Западной Сибири (долины рек Оби и Иртыша, Обь-Иртышское междуречье) находится на путях перелета многих ввдов птиц и служит их гнездовым ареалом.

Анализ миграции птиц показал, что в осенний период 2005 е не исключена вероятность заноса патогенного вируса Н5№ из Западной Сибири в районы Каспийского и Черного морей (Астраханская, Ростовская, Волгоградская области, Краснодарский, Ставропольский края и др). Такое предположение связано с тем, что часть птицы, обитающей в Барабо-Ку-лундинской степи (Новосибирская область, Алтайский край), улетает в указанные районы на зимовку или останавливается на этой территории во время миграции в Африку или Европу.

Кроме юга России, возможно попадание вируса в сопредельные страны (Азербайджан, Иран, Ирак, Грузия, Украина, страны Средиземноморья), поскольку пути перелета птиц из Сибири осенью проходят и через них.

Этот прогноз уже частично подтвердился. Так, на сегодняшний день высокопатогенный вирус гриппа выявлен в Европейской части России, в Греции, Хорватии и Румынии.

Весенняя миграция 2006 г. может привести к разносу патогенных вирусов гриппа типа А, Н5К1 се-рогруппы по всей территории Европейской части Российской Федерации, поскольку птицы, обитающие там и мигрирующие из Сибири, имеют общие районы зимнего гнездования.

Таким образом, сейчас мы наблюдаем продолжающуюся экспансию высокопатогенных азиатских вариантов Н5Ш вирусов, которая может привести к появлению новых пораженных территорий.

Литература

1. Юрлов К. Т. Перелеты и зимовки птиц Западной Сибири/Трансконтинентальные связи перелетных птиц и их роль в распространении арбовирусов. Новосибирск, 1972, 365 с.

2. Юрлов А.К., Чернышов В.М., Яновский АП. Новые сведения о путях пролета и районах зимовки некоторых видов птиц из южной части Западной Сибири. / Материалы к распространению птиц на Урале, в Приуралье и Западной Сибири. Екатеринбург, 1998. 405 с.

3. Li KS, Guan Y, Wang J, Smith GJ, Xu KM, Duan L, Rahardjo AP, Puthavathana P, Buranathai C, Nguyen TD, Estoepangestie AT, Chaisingh A, Auewarakul P, LongHT, HanhNT, Webby RJ, Poon LL, Chen H, Shortridge KF, YuenKY, Webster RG, PeirisJS.//Nature. 2004Jul 8;430(6996):209-13.

4. Dennis Normil. //SCINCE., July 2005 VOL 39, P.215-16

5. Mase M, Tsukamoto K, Imada T, Imai K, Tanimura N, Nakamura K, Yamamoto Y, Hitomi T, Kira T, Nakai T, Kiso M, Horimoto T, Kawaoka Y, Yamaguchi S. //Virology. 2005 Feb 5;332(1):167-76.

6. H. Chen, G. J. D. Smith, S. Y. Zhang, K. Qin,J. Wang, K. S. Li, R. G. Webster, J. M. Peiris and Guan. //Nature. 14 July 2005, 436, p. 191-192.

7. The National Training Course on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. — Harbin, 2001. — 79p.

8. McClure H.E., Migration and survival of the birds of Asia. Bangkok, Thailand, 1974. 476 P.

9. Guan Y, Poon LL, Cheung CY, et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 May 25;101(21):8156-61. Epub 2004 May 17.

10. Hulse D.J., R. G. Webster, R.J. Russell at all. Molecular Determinants within the Surface Proteins Involved in the pathogenicity ofH5Nl influenza virus in chickens. J. of Virology,Sept.2004, p. 9954 — 9964.

11. Ilyushina NA, Govorkova EA, Webster RG. Detection of amantadine-resistant variants among avian influenza viruses isolated in North America and Asia. Virology. 2005 Oct 10;341(l):102-6.