КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING INFLAMMATORY DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, относящимся к антителам, которые связывают фракталкин.
Уровень техники
Фракталкин (ФКН) представляет собой трансмембранный хемокин, который экспрессируется на поверхности активированных эндотелиальных клеток и связывается с рецептором CX3CR1. Связывание ФКН, связанного с мембраной, с CX3CR1, связанным с мембраной, опосредует сильную адгезию клетка-клетка без участия селектинов или интегринов. Секретированный ФКН, который отделяется от связанного с мембраной ФКН, также связывается с CX3CR1 и индуцирует активацию интегрина и клеточного хемотаксиса.
+
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.
Ann. NY Acad. Sci.
Экспрессия ФКН индуцируется на поверхности эндотелиальных клеток провоспалительными цитокинами. Усиленная экспрессия ФКН и накопление цитостатических эффекторных лимфоцитов CX3CR1 и макрофагов отмечались у субъектов с многочисленными нарушениями, включая воспалительные и аутоиммунные нарушения, в том числе язвенный колит (ЯК), болезнь Крона (БК), ревматоидный артрит (РА), аутоиммунный гепатит (АИГ), рассеянный склероз (РС) и сахарный диабет. Umehara et al., 24:34-40 (2004) описывает роль ФКН при атеросклерозе и поражении сосудов. Nishimura et al., 1173:350-356 (2009) рассматривает ФКН в качестве потенциальной терапевтической мишени при воспалительных заболеваниях кишечника, таких как ЯК и БК.
Антитела и ФКН-связывающие фрагменты антител являются желательными терапевтическими агентами в силу своей специфичности. Антитела и ФКН-связывающие фрагменты можно использовать для направленного воздействия на специфические клетки или ткани, минимизируя таким образом потенциальные побочные эффекты в случае неспецифического направленного воздействия. Существует потребность в идентификации и характеристике терапевтических антител, которые можно использовать для лечения воспалительных нарушений, включая описаные здесь нарушения.
Краткое описание изобретения
В первом аспекте изобретение относится к анти-ФКН антителу или его ФКН-связывающему фрагменту, где указанное антитело или его фрагмент содержит шесть CDR, выбранных из:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31;
(е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32; и
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33.
Антитело может представлять собой интактное антитело. В одном из примеров антитело представляет собой гуманизированное антитело. Вариабельный домен тяжелой цепи гуманизированного антитела может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:43, а вариабельный домен легкой цепи гуманизированного антитела может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:45.
В одном из примеров антитело представляет собой антитело против фракталкина или его ФКН-связывающего фрагмента, где указанное антитело или его фрагмент содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:37 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:44.
Антитело также может представлять собой химерное антитело. В одном из примеров вариабельный домен тяжелой цепи химерного антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, а вариабельный домен легкой цепи химерного антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27.
Также рассматриваются ФКН-связывающие фрагменты антитела. ФКН-связывающий фрагмент может представлять собой Fab, Fab', F(ab')2 или Fv фрагмент, который сохраняет специфичность связывания с ФКН.
В некоторых примерах, когда указанное антитело или его ФКН-связывающий фрагмент содержат человеческий константный участок, такой константный участок является IgG изотипом (например, IgG2 изотипом). В других примерах указанное антитело или его ФКН-связывающий фрагмент содержит мутированный Fc участок, такой, что указанное антитело обладает пониженной способностью к активации ADCC и/или комплемента по сравнению с Fc участком, у которого такая мутация отсутствует. Например, Fc участок может быть мутирован по одному или более кислотным остаткам из следующих: V234, G237, С131 или C219.
Желательно, чтобы антитело или ФКН-связывающий фрагмент существенно уменьшал или ингибировал связывание ФКН со своим рецептором, CX3CR1, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более, или существенно ингибировал нейтрализованный hФКН при оценке хемотаксиса, как раскрыто в настоящем описании.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит антитело или его ФКН-связывающий фрагмент по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит один или несколько описанных ниже дополнительных терапевтических агентов.
Также рассматривается нуклеиновая кислота, кодирующая описанное выше антитело или ФКН-связывающий фрагмент. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота кодирует всю или часть тяжелой цепи антитела или его ФКН-связывающий фрагмент. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует всю или часть легкой цепи антитела или его ФКН-связывающий фрагмент. Нуклеиновая кислота может находиться в векторе (например, векторе экспрессии).
Изобретение также относится к клетке хозяину, которая содержит один или несколько векторов по изобретению. В одном из примеров клетка хозяин содержит два вектора, из которых первый вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, а второй вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь описанного здесь антитела или его ФКН-связывающего фрагмента. Экспрессия тяжелой цепи и легкой цепи в клетке хозяине продуцирует антитело или ФКН-связывающий фрагмент. В одном из вариантов осуществления клетка хозяин является прокариотической. В другом варианте осуществления клетка хозяин является эукариотической. Иллюстративные клетки млекопитающих, которые можно использовать для продуцирования антител и ФКН-связывающих фрагментов, представляют собой клетки CHO и клетки NS0.
Изобретение также относится к способу получения анти-ФКН антитела или его ФКН-связывающего фрагмента. Способ включает: (a) экспрессию вектора по изобретению в подходящей клетке хозяине и (b) выделение антитела. Антитело или ФКН-связывающий фрагмент может секретироваться клеткой хозяином в культуральную среду. В одном из примеров антитело или его ФКН-связывающий фрагмент очищают до по меньшей мере 95% или более чистоты от веществ, не относящихся к антителу.
Также рассматриваются способы лечения воспалительных нарушений путем введения эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента по изобретению. Иллюстративные воспалительные нарушения представляют собой воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и язвенный колит. В случае этих нарушений способ также может включать введение одного или нескольких дополнительных терапевтических агентов. Иллюстративные терапевтические агенты представляют собой опиаты, 5-аминосалициловую кислоту, 6-меркаптопурин, азатиоприн, глюкокортикоиды, метотрексат, циклоспорин и метронидазол. Другие подходящие терапевтические агенты описаны ниже.
Воспалительные нарушения, которые могут быть излечены введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента по изобретению, также включают аутоиммунные болезни печени и желчных путей (например, аутоиммунный гепатит, первичный желчный цирроз печени или первичный склерозирующий холангит). В случае этих нарушений способ может также включать введение 6-меркаптопурина, урсодезоксихолевую кислоту, азатиоприн, глюкокортикоид, тиазидный диуретик, антиальдостероновый диуретик, циклоспорин, альбумин или спиронолактон.
Ревматоидный артрит (РА) также можно лечить путем введения эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента по изобретению. При лечении РА способ может также включать введение нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (НПВС), метотрексата, лефлуномида, буцилламина, 5-аминосалициловой кислоты, глюкокортикоида, гидрохлорохина, витамина D, кальция или алендроната.
Системную красную волчанку (например, волчанку с поражением центральной нервной системы или волчаночный нефрит) также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента, отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами. Иллюстративные дополнительные терапевтические агенты представляют собой глюкокортикоиды, циклофосфамид, метотрексат, циклоспорин и такролимус.
Рассеянный склероз и нейромиелит зрительного нерва также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента. Лечение также может включать введение одного или более дополнительных терапевтических агентов, таких как глюкокортикоид, интерферон-P или Копаксон.
Демиелинизирующую полирадикулопатию (например, синдром Гийена-Барре или хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулопатию) также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента. И в этом случае, также рассматривается комбинированная терапия, и лечение также может включать введение одного или более дополнительных терапевтических агентов, таких как глюкокортикоид или внутривенный иммуноглобулин.
Введение эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента, отдельно или в комбинации с дополнительным терапевтическим агентом, также может быть полезным при лечении нейропатической боли. Иллюстративные дополнительные агенты для лечения нейропатической боли представляют собой ламотригин, топирамат, окскарбазепин, леветирацетам, фентанил, трамадол, капсаицин, кларитин, НПВС, амитриптилин, прегабалин, лидокаин, дулоксетин и карбамазепин.
Болезнь Альцгеймера также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента. Способ также может включать введение одного или более дополнительных терапевтических агентов, таких как такрин гидрохлорид, донепезила гидрохлорид, ривастигмина тартрат, галантамина гидробромид, мемантина гидрохлорид, пароксетин, рисперидон, кветиапин или пероспирон.
Ассоциированную с раком висцеральную боль также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента, отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, такими как морфий, НПВС, фентанил, лидокаин, пентазоцин или клонидин.
Атеросклероз также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента. Способ также может включать введение одного или нескольких дополнительных терапевтических агентов, таких как простациклин, аспирин, клопидогрель, тиклопидин, лимапрост, простагландин Е1, ингибитор HMG CoA редуктазы, безафибрат, лидокаин, мексилетин, диуретик, дигиталис, допамин, агонист β-адренергический рецептор, изосорбида динитрат, нитроглицерин, натрийуретический пептид, варфарин, гепарин, активатор плазминогена тканевого типа, урокиназа или прокаинамид.
Васкулопатию (например, возрастную мышечную дегенерацию, болезнь Бехчета, болезнь Гарада и саркаидозный увеит) также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента по изобретению. Способ также может включать введение одного или нескольких дополнительных терапевтических агентов, выбранных из глюкокортикоидов, циклофосфамида, пегаптаниба, ранибизумаба, НПВС, колхицина, хлорамбуцила, талидомида и вертепорфина.
Нефропатии (например, волчаночный нефрит, гломерулонефрит или диабетическую нефропатию) также можно лечить введением эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента по изобретению. Способы лечения также могут включать глюкокортикоиды, сульфонилмочевину, циклофосфамид, глиниды, циклоспорин, такролимус, микофенолата мофетил, мизорибин, диуретики, инсулин, бигуанид, ингибиторы α-глюкозидазы, блокаторы рецепторов ангиотензина, тиазолидиндион, ингибиторы ангиотензин-преобразующего фермента (АПФ), блокаторы кальциевых каналов или ингибиторы β-адренергических рецепторов; способы лечения также могут включать и ингибиторы адренергических рецепторов.
Изобретение также относится к применению анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента по изобретению при лечении любого из описанных здесь воспалительных нарушений.
Изобретение также относится к использованию анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения любого из описанных здесь воспалительных нарушений.
Изобретение также раскрывает способ ингибирования рекрутинга лейкоцитов в участке воспаления у субъекта путем введения эффективного количества анти-ФКН антитела или ФКН-связывающего фрагмента нуждающемуся в таком лечении субъекту, ингибируя таким образом рекрутинг лейкоцитов на участке воспаления.
ex vivo
ex vivo
С целью терапевтических примененийтакжемогут использоватьсястратегии. Стратегии включают трансфекцию или трансдукцию полученных от субъекта клеток полинуклеотидом, кодирующим антитело или фрагмент антитела. Трансфицированные или трансдуцированные клетки затем возвращают субъекту. Клетки могут быть любыми из широкого диапазона типов клеток, включая, без ограничения, гемопоэтические клетки (например, клетки костного мозга, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, T-клетки или В-клетки), фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты или мышечные клетки.
В контексте настоящего изобретения используются сокращения и термины, определения которых приводятся ниже.
Термин “антитело” (используемый здесь взаимозаменяемо с термином “иммуноглобулин”) включает интактные моноклональные и поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антитела, которые демонстрируют необходимую биологическую активность (например, способность связать ФКН и модулировать взаимодействие между ФКН и CX3CR1). “Интактные антитела” представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, при этом количество дисульфидных связей в тяжелых цепях разных изотипов иммуноглобулинов различается. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет дисульфидные мостики, расположенные через регулярные интервалы. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен относительно первого константного домена тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен относительно вариабельного домена тяжелой цепи. Предполагается, что конкретные аминокислотные остатки формируют область контакта между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.
1
2
3
4
1
2
Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Антитело может быть частью большой слитой молекулы, образованной при помощи ковалентной или нековалентной связи антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Антитело также может быть частью иммуноконъюгата, в котором антитело конъюгировано со второй молекулой (например, токсином, радиоизотопом или меткой).
Используемый здесь термин “моноклональное антитело” относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е., отдельные антитела идентичны друг другу за исключением возможных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве.
“Гуманизированные” формы нечеловеческих антител представляют собой антитела или их фрагменты, которые содержат каркасный участок (FR), имеющий по существу аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и гипервариабельный участок (CDR), имеющий по существу аминокислотную последовательность нечеловеческого иммуноглобулина (т.е., “импортированную” последовательность). В некоторых случаях, остатки каркасного участка человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не характерными для человека. Для очистки антитела могут быть выполнены дополнительные модификации гуманизированного антитела.
“Гипервариабельный участок” или “CDR” означает одну из трех гипервариабельных последовательностей в вариабельных участках внутри каждой легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина.
“Каркасный участок” или “FR” означает последовательности аминокислот, расположенные с каждой из сторон трех CDR легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина. FR и CDR гуманизированного антитела не должны точно соответствовать родительским последовательностям, например, импортированный CDR или консенсусный FR может быть мутирован путем замены, вставки или делеции по меньшей мере одного остатка таким образом, чтобы остаток CDR или FR на этом участке не соответствовал ни консенсусной, ни импортированной последовательности. Однако такие мутации, как правило, не бывают обширными. Обычно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% остатков гуманизированного антитела соответствуют остаткам родительских последовательностей.
Используемый здесь термин “примерно”, в случае измеряемой величины, такой как количество, временная продолжительность и т.п., охватывает вариации значений указанной величины до ±20%, предпочтительно ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±2%, поскольку такие вариации являются адекватными для реализации раскрытых способов. Если не указано иное, все числа, выражающие количество компонентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия проведения реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как изменяемые во всех случаях в рамках термина “примерно”. Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, приведенные в следующем ниже описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближениями, которые могут изменяться в зависимости от требуемых свойств, подбираемых для получения настоящего изобретения. В самом крайнем случае, но не ограничивая возможности применения доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый числовой параметр следует рассматривать по меньшей мере с точки зрения числа, выраженного значащими цифрами, с применением обычных способов округления.
Под “достаточным количеством” или “эффективным количеством” подразумевается количество терапевтического антитела или его фармацевтической композиции, требуемое для лечения или облегчения нарушения, такого как воспалительное нарушение, клинически релевантным способом. Достаточное количество терапевтического анти-ФКН антитела, его ФКН-связывающего фрагмента или фармацевтической композиции, используемое при реализации настоящего изобретения на практике для терапевтического лечения, например, воспалительного нарушения, изменяется в зависимости от способа введения, возраста и общего состояния здоровья пациента.
“Сродство связывания”, как правило, относится к силе общего суммарного количества нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером связывания (например, антигеном). Сродство связывания может быть представлено константой диссоциации (Kd). Сродство может быть измерено способами, известными в данной области техники, включая радиоиммунологический анализ ФКН-связывания (РИА) или анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (например, BIACORE).
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
“Химерные” или “химеризованные” антитела (т.е., иммуноглобулины) относятся к антителам, у которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другой разновидности или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность (Morrison et al., , 81:6851-6855, 1984).
“Эпитоп” или “антигенная детерминанта” означает аминокислотную последовательность, которая либо в силу линейной структуры, либо в силу трехмерной конформации, формирует участок, связывающий антитело. Конформационный эпитоп, который может включать прерывающиеся участки аминокислотной последовательности антигена, взаимодействует с антителом благодаря третичной структуре эпитопа. Линейный эпитоп, напротив, представляет собой эпитоп, который распознается антителами по его первичной структуре. В одном из вариантов осуществления эпитоп фракталкина, который формирует минимальную область контакта с Fab, включает, например, E66-Q69, W81-Q87, H70-F73 и H88-D90.
Термины “экспрессировать” и “продуцировать” в данном описании используются синонимично и относятся к биосинтезу генного продукта. Эти термины охватывают транскрипцию гена в РНК. Эти термины также охватывают трансляцию РНК в один или более полипептидов, а также охватывают все пост-транскрипционные и пост-трансляционные модификации естественного происхождения. Экспрессия/продуцирование антитела может происходить в цитоплазме клетки и/или во внеклеточной среде, такой как среда роста для клеточной культуры.
Под термином “фракталкин”, “ФКН”, “ФК” или “нейротактин” подразумевается полипептид, который является гомологичным полипептиду, определенному последовательностью SEQ ID NO:1 (фиг.1) и который обладает биологической активностью ФКН (например, связывается с рецептором CX3CR1; вызывает хемотаксис T-клеток и моноцитов; или способствует адгезии лейкоцитов к активированным эндотелиальным клеткам). Биологическую активность полипептида ФКН можно оценивать при помощи любого стандартного способа. Согласно используемому здесь определению, ФКН также включает любой член или изоморф семейства ФКН. См., например, патент США 7390490, WO 2006/046739, и публикацию заявки на патент США 2006/0233710, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.
2
“ФКН-связывающий фрагмент” включает часть интактного антитела, содержащего его ФКН-связывающий участок и способный связывать ФКН. ФКН-связывающие фрагменты могут представлять собой Fab, Fab', F(ab') или Fv фрагменты; диатела; триатела; тетратела; мини-антитела; молекулы аффитела; минитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; или полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
“Гомологичный” означает любой ген или последовательность белка, которая по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более гомологична последовательности известного гена или белка по длине последовательности сравнения. “Гомологичный” белок также может обладать по меньшей мере одной биологической активностью белка сравнения. Для полипептидов длина последовательностей сравнения, как правило, составляет по меньшей мере 15, 20, 25, 35 или более аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина последовательностей сравнения, как правило, составляет по меньшей мере 50, 60, 75, 100, 125 или более нуклеотидов. “Гомология” также может относиться к значительному сходству между эпитопом, используемым для генерации антител, и белком или его фрагментом, на который направлены антитела. В этом случае, гомология относится к сходству, достаточному для продуцирования антител, которые могут специфически узнавать представляющий интерес белок.
“Человеческое антитело” означает, что антитело имеет либо исключительно человеческое происхождение, либо является любым антителом, в котором последовательности вариабельных и константных доменов представляют собой человеческие последовательности или последовательности человеческих антител. Этот термин охватывает антитела с последовательностями, полученными из (т.е., которые используют) человеческих генов, но которые были изменены, например, для уменьшения возможной иммуногенности, увеличения аффинности, удаления цистеинов, которые могут быть причиной нежелательной конформации, и т.д. Этот термин охватывает такие антитела, продуцированные рекомбинантно в нечеловеских клетках, которые могут вызывать гликозилирование, нетипичное для человеческих клеток.
“Гибридома” относится к продукту слияния клеток между неопластическим лимфоцитом культурального происхождения и примированным B- или T-лимфоцитом, который экспрессирует специфический иммунный потенциал родительской клетки.
Используемый здесь термин “воспалительное нарушение” относится к любому заболеванию, нарушению или состоянию, при котором иммунная система активирована аномально. Воспалительное нарушение может представлять собой, например, язвенный колит, болезнь Крона, воспалительную болезнь кишечника, ревматоидный артрит, миозит, рассеянный склероз, нейромиелит зрительного нерва, атеросклероз, псориаз, системную красную волчанку (например, волчанку с поражением центральной нервной системы или волчаночный нефрит), нефрит, гломерулонефрит, аутоиммунную болезнь печени и желчных путей (например, аутоиммунный гепатит, первичный желчный цирроз печени или первичный склерозирующий холангит), реакцию трансплантат против хозяина, атопический дерматит, астму, нейродегенеративную болезнь (например, Болезнь Альцгеймера), демиелинизирующую полирадикулонейропатию (например, синдром Гийена-Барре или хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию), нейропатическую боль, висцеральную боль при раке, атеросклероз, возрастную дегенерацию мышц, диабетическую нефропатию, саркоидозный увеит или сахарный диабет.
Альтернативно, заболевание, нарушение или состояние представляет собой заболевание верхних или нижних дыхательных путей, например, лимфоматозный трахеобронхит; аллергическую гиперчувствительность или состояние гиперсекреции, такое как хронический бронхит и кистозный фиброз; легочный фиброз различной этиологии (например, идиопатический легочный фиброз); хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ); саркоидоз; аллергический и неаллергический ринит; аллергическую или неаллергическую крапивницу; связанное с кожей заболевание, характеризующееся нерегулируемым воспалением, перестройку ткани, ангиогенез и неоплазию; заболевание желудочно-кишечного трактата, такое как болезнь Гиршспрунга, диарею, состояние малабсорбции и воспалительные состояния; нарушение центральной и периферической нервной системы, такое как депрессия, состояние тревоги, болезнь Паркинсона, мигрень и другие формы черепной боли, инсульт и рвоту; заболевание иммунной системы, такое как в тканях селезенки и лимфатических узлов, аутоиммунное заболевание или другое заболевание, связанное с иммунной системой; заболевание сердечно-сосудистой системы, такое как отек легких, гипертензию, преэклампсию, тип 2 сложного регионального синдрома боли и инсульт; хроническое воспалительное заболевание, такое как артрит; заболевание, связанное с костями; хроническую боль, такую как фибромиалгия; и другие нарушения, в патогенез, патологию, и этиологию которых вовлечено действие нейролекинов, тахикининов или других родственных веществ (например, хемокининов).
Дополнительные примеры воспалительных нарушений представляют собой обыкновенные прыщи; синдром острой дыхательной недостаточности; болезнь Аддисона; аллергические внутриглазные воспалительные заболевания; ANCA-ассоциированный гранулематозный ангиит; анкилозный спондилит; аутоиммунную гемолитическую анемию; болезнь Бехчета; паралич Белла; буллезный пемфигоид; церебральную ишемию; цирроз печени; синдром Когана; контактный дерматит; синдром Кушинга; дерматомиозит; атрофическую эритему; эозинофильный фасциит; узловатую эритему; эксфолиативный дерматит; очаговый гломерулосклероз; очаговый и сегментный гломерулосклероз; сегментный гломерулосклероз; гигантских клеток артериит; подагру; подагрический артрит; ручную экзему; пурпуру Шенлейна-Геноха; герпес беременных; гирсутизм; идиопатический цератосклерит; идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру; иммунную тромбоцитопеническую пурпуру, воспалительные нарушения кишечника или желудочно-кишечного тракта; воспалительный дерматоз; красный плоский лишай; лимфоматозный трахеобронхит; отек желтого пятна; миастению гравис; неспецифическое фиброзирующее заболевание легких; остеоартрит; панкреатит; пемфигоид беременных; обыкновенную пузырчатку; периодонтит; узелковый полиартериит; ревматическую полимиалгию; мошоночный зуд; зуд/воспаление; псориатический артрит; легочный гистоплазмоз; рецидивирующий полихондрит; розацеа; саркоидоз; склеродерму; синдром септического шока; плечевой тендинит или бурсит; синдром Шегрена; болезнь Стилла; болезнь Свита; системный склероз; синдром Такаясу; временный артериит; токсический эпидермальный некролиз; отторжение трансплантата и синдромы, связанные с отторжением трансплантата; туберкулез; диабет типа 1; васкулит; синдром Фогта-Коянаги-Харада (ФКХ); и грануломатоз Вегенера.
Термин “изолированный” или “очищенный” означают измененный “с участием человека” по отношению к естественному состоянию. Если молекула или композиция встречается в природе, ее “изолируют” или “очищают”, когда ее изменяют или выделяют из ее естественной окружающей среды, или и то и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественно присутствующий в живом растении или животном, не является “изолированным” или “очищенным”, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от материалов, существующих совместно с ним в его естественном состоянии, является “изолированым” или “очищенным”, согласно используемому в настоящем описании термину.
Термин “функционально связанный” или “функционально введенный” означает, что регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности, помещены в молекулу нуклеиновой кислоты в соответствующих положениях относительно кодирующей последовательности, обеспечивая таким образом возможность экспрессии кодирующей последовательности. В качестве примера, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор способен управлять транскрипцией или экспрессией такой кодирующей последовательности. Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с промотором или регуляторными последовательностями в смысловом или антисмысловом направлении. Термин “функционально связанный” иногда применяется к расположению других элементов контроля транскрипции (например, энхансеров) в векторе экспрессии.
“Полинуклеотид”, синонимично называемый “молекулой нуклеиновой кислоты”, означает любой полирибонуклеотид или полидезоксирибонуклеотид, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. “Полинуклеотиды” включают, без ограничения, однонитевую и двухнитевую ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь однонитевых и двухнитевых участков, однонитевую и двухнитевую РНК и РНК, которая представляет собой смесь однонитевых и двухнитевых участков, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми, или чаще двухнитевыми или смесью однонитевых и двухнитевых участков. Кроме того, “полинуклеотид” относится к трехнитевым участкам, содержащим РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Термин полинуклеотид также включает ДНК или РНК, содержащие одно или несколько модифицированных оснований, и ДНК или РНК с основной цепью, модифицированной с целью получения стабильности или с другой целью. “Модифицированные” основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. ДНК и РНК могут содержать множество различных модификаций; таким образом, термин “полинуклеотид” охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, обычно встречающиеся в природе, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток. “Полинуклеотид” также охватывает относительно короткие цепи нуклеиновых кислот, часто называемые олигонуклеотидами.
“Полипептид” относится как к коротким цепям, обычно называемым пептидами, олигопептидами или олигомерами, так и к более длинным цепям, как правило, называемым белками. Полипептиды могут содержать другие аминокислоты помимо 20 аминокислот, кодируемых геном. “Полипептиды” включают аминокислотные последовательности, модифицированные либо естественными процессами, такими как пост-трансляционный процессинг, либо методами химической модификации, которые известны в данной области техники. Такие модификации хорошо описаны в учебниках и более специализированных монографиях, а также в многочисленной научной литературе. Модификации могут возникать в любом месте полипептида, включая основную пептидную цепь, боковые цепи аминокислот и карбоксильные или аминные концы. Следует отметить, что заданный полипептид может иметь один и тот же тип модификаций, в той или иной степени, на нескольких участках. Кроме того, заданный полипептид может иметь много типов модификаций. Полипептиды могут ветвиться в результате убиквинтилирования и могут быть циклическими с боковыми цепями или без них. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут быть результатом естественных посттрансляционных процессов или могут быть получены синтетическими способами. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гем фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, поперечную сшивку, циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, формирования ковалентных поперечных связей, формирования цистина, формирование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование GPI якоря, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитическую обработку, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию, опосредуемое транспортной РНК добавление к белкам аминокислот, такое как аргинилирование, и убиквитинилирование (см., например, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, в POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., Meth Enzymol, 182, 626-646; and Rattan, et al, Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. NY Acad. Sci, (1992) 663: 48-62).
“Специфически связывает” означает, что антитело или его фрагмент узнает и связывает антиген (например, ФКН или его фрагмент) и при этом по существу не узнает и не связывает другие молекулы в образце (например, биологическом образце). “Специфически” означает отличать слабую неспецифическую агглютинирующую способность, которая иногда может происходить между случайными белками, например, с обнаженными гидрофильньными доменами. Это не подразумевает, что антитело не будет связывать ни с каким другим белком кроме антигена по изобретению. Антитела могут вступать в кросс-реакцию (и “специфически связываться”) с любым белком, который содержит соответствующий эпитоп.
“Субъектом” называется любое животное, например, млекопитающее (например, человек). Субъект, который подвержен лечению, например, воспалительного нарушения, представляет собой субъект, который был диагностирован врачом или ветеринаром в зависимости от обстоятельств, как имеющий такое состояние. Диагноз может быть выполнен любыми подходящими средствами. Для специалиста в данной области очевидно, что объект по изобретению может быть подвергнут стандартным тестам или может быть идентифицирован, без экспертизы, как субъект с высоким риском в силу наличия одного или нескольких факторов риска, таких как возраст, генетика или анамнез.
in vitro
Клетка “трансформирована” или “трансфицирована” экзогенными или гетерологичными нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК, если такая ДНК введена в клетку. Трансформирующая ДНК может или не может быть интегрирована (например, ковалентно связана) в геном клетки. В прокариотических, дрожжевых клетках и клетках млекопитающих, например, трансформирующая ДНК может находиться в эписомальном элементе, таком как плазмида. Что касается эукариотических клеток, то стабильно трансформированная клетка, или “стабильная клетка”, представляет собой клетку, в которой трансформирующая ДНК интегрирована в хромосому с тем, чтобы она передавалась по наследству дочерним клеткам через репликацию хромосом. Эта стабильность подтверждается способностью эукариотической клетки основывать клеточную линию или клоны, состоящие из популяции дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК. “Клон” представляет собой популяцию клеток, полученных из одной клетки или общего предка путем митоза. “Клеточная линия” представляет собой клон первичной клетки, которая способна к стабильному росту в течение многих генераций.
Под “лечением” подразумевается введение терапевтического антитела или его фармацевтической композиции для профилактических и/или терапевтических целей. Термины “лечить заболевание или нарушение” или применение для “терапевтического лечения” относятся к применению лечения к пациенту, уже страдающему заболеванием, для улучшения состояния субъекта. Данный субъект может быть диагностирован как имеющий воспалительное нарушение, основываясь на идентификации любого из характерных симптомов или применения диагностических методов, известных специалисту в данной области. “Предупредить заболевание или нарушение” означает профилактическое лечение субъекта, который еще не болен, но восприимчив к развитию конкретного заболевания, или каким-либо иным образом подвержен риску развития конкретного заболевания. Субъекта определяют как подверженного риску развития воспалительного нарушения, используя диагностические методы, известные в данной области.
“Вектор” представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг, космид или вирус, в который может быть функционально вставлен другой сегмент нуклеиновой кислоты с тем, чтобы вызвать репликацию или экспрессию этого сегмента.
Как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте в явном виде не указано иное. Таким образом, например, указание на “клетку” включает комбинацию двух или более клеток, и т.п.
Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 иллюстрирует аминокислотную последовательность человеческого ФКН.
Фиг.2 представляет собой таблицу, демонстрирующую характеристики связывания (т.е., нейтрализующую активность, аффинность связывания и видовую кросс-реактивность) анти-ФКН моноклональных антител.
Фиг.3 иллюстрирует выравнивание вариабельных участков тяжелых цепей гуманизированных анти-ФКН последовательностей mAb (SEQ ID NO:36-37 и 42-43, соответственно, в порядке появления), последовательности m3A5-2 (SEQ ID NO:26), последовательности Ig зародышевой линии (SEQ ID NO:40) и последовательности AAA68427.1 (SEQ ID NO:34).
Фиг.4 иллюстрирует выравнивание вариабельных участков тяжелых цепей гуманизированных анти-ФКН последовательностей mAb (SEQ ID NO:38 и 44-45, соответственно, в порядке появления), последовательность m3A5-2 (SEQ ID NO:27), последовательности Ig зародышевой линии (SEQ ID NO:41) и последовательности ABU90602.1 (SEQ ID NO:35).
Фиг.5 представляет собой таблицу, суммирующую результаты трех независимых анализов хемотаксиса. Нейтрализующую активность гуманизированных анти-hФКН mAb анализировали при помощи анализа хемотаксиса. Все комбинации H3 и H3-2 с L2 и L4 были успешно гуманизированы, поскольку эти mAb демонстрируют нейтрализующую активность, аналогичную активности химерной mAb. Однако HK2, который был получен путем использования более узкого диапазона ключевых остатков, показал пониженную нейтрализующую активность в комбинации с L2 или L4.
На фиг.6A и фиг.6B изображены серии графиков, демонстрирующих нейтрализующую активность m3A5-2 mAb и химерной mAb. Фиг.6A представляет собой график, демонстрирующий нейтрализующую активность m3A5-2 mAb, определенную анализом хемотаксиса. Фиг.6В представляет собой график, демонстрирующий нейтрализующую активность химерной mAb, определенную анализом хемотаксиса.
На фиг.7A-7D изображены серии графиков, демонстрирующие нейтрализующую активность гуманизированных анти-hФКН антител, определенную анализом хемотаксиса. На фиг.7А показана нейтрализующая активность H3L2-IgG2. На фиг.7B показана нейтрализующая активность H3-L4-IgG2. На Фиг.7C показана нейтрализующая активность HK2L2-IgG2. На фиг.7D показана нейтрализующая активность HK2L4-IgG2.
На фиг.8A-8F изображены серии графиков, демонстрирующие нейтрализующую активность гуманизированных анти-hФКН антител, определенную анализом хемотаксиса. На фиг.8A показана нейтрализующая активность H3-2L2-IgG2. На фиг.8B показана нейтрализующая активность H3-2L4-IgG2. На фиг.8C показана нейтрализующая активность H3-2L5-IgG2. На фиг.8D показана нейтрализующая активность HK3L2-IgG2. На фиг.8E показана нейтрализующая активность HK3L4-IgG2. На фиг.8F показана нейтрализующая активность HK3L5-IgG2.
Фиг.9 представляет собой таблицу, суммирующую результаты анализа BIACORE, использованного для измерения аффинности связывания mAb с hФКН и ФКН яванской макаки (cynomolgus monkey).
На фиг.10A-10C изображены серии графиков, демонстрирующие аффинность связывания химерных и гуманизированных анти-hФКН антител (H3L2, H3-2L2, H3L4, H3-2L4 и HK2L4) с hФКН-SEAP и ФКН-SEAP яванской макаки, определенную анализом BIACORE. Фиг.10A представляет собой гистограмму, демонстрирующую значения Ka (1/мс). Фиг.10B представляет собой гистограмму, демонстрирующую значения Kd (1/с). Фиг.10С представляет собой гистограмму, демонстрирующую значения KD (M).
На фиг.11 показаны результаты картирования эпитопа при помощи библиотек перекрывающихся синтетических пептидов (SEQ ID NO:115-135, соответственно, в порядке появления) из домена хемокина ФКН.
На фиг.12 показаны результаты картирования эпитопа hФКН методом ELISA.
На фиг.13 показаны результаты картирования эпитопа hФКН методом BIACORE.
На фиг.14 показаны результаты эксперимента кросс-насыщения для идентификации Fab-связывающего сайта фракталкина. График показывает, что участки ФКН E66-Q69, W81-Q87, H70-F73 и H88-D90 содержатся в минимальной области контакта с Fab.
Подробное описание изобретения
Были разработаны и выделены химерные анти-ФКН антитела, гуманизированные анти-ФКН антитела и их ФКН-связывающие фрагменты. Описанные здесь гуманизированные анти-ФКН антитела и их ФКН-связывающие фрагменты могут использоваться для лечения воспалительных нарушений. Такие антитела также могут использоваться для ингибирования рекрутинга лейкоцитов в участке воспаления. Воспалительные нарушения, которые можно лечить согласно изобретению, включают язвенный колит, болезнь Крона, воспалительную болезнь кишечника, ревматоидный артрит, миозит, рассеянный склероз, нейромиелит зрительного нерва, атеросклероз, псориаз, системную красную волчанку (например, волчанку с поражением центральной нервной системы или волчаночный нефрит), нефрит, гломерулонефрит, аутоиммунную болезнь печени и желчных путей (например, аутоиммунный гепатит, первичный желчный цирроз печени или первичный склерозирующий холангит), реакцию «трансплантат против хозяина», атопический дерматит, астму, нейродегенеративную болезнь (например, Болезнь Альцгеймера), демиелинизирующую полирадикулонейропатию (например, синдром Гийена-Барре или хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию), нейропатическую боль, висцеральную боль при раке, атеросклероз, возрастную дегенерацию мышц, диабетическую нефропатию, саркоидозный увеит, сахарный диабет, лимфоматозный трахеобронхит, аллергическую гиперчувствительность или состояние гиперсекреции, такое как хронический бронхит и кистозный фиброз, легочный фиброз различной этиологии (например, идиопатический легочный фиброз), хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), саркоидоз, аллергический и неаллергический ринит, аллергическую или неаллергическую крапивницу, связанное с кожей заболевание, характеризующееся нерегулируемым воспалением, перестройку ткани, ангиогенез и неоплазию, заболевание желудочно-кишечного трактата, такое как болезнь Гиршспрунга, диарею, состояние малабсорбции и воспалительные состояния, нарушение центральной и периферической нервной системы, такое как депрессия, состояние тревоги, болезнь Паркинсона, мигрень и другие формы черепной боли, инсульт и рвота, заболевание иммунной системы, такое как в тканях селезенки и лимфатических узлов, аутоиммунное заболевание или другое заболевание, связанное с иммунной системой, заболевание сердечно-сосудистой системы, такое как отек легких, гипертензия, преэклампсия, тип 2 сложного регионального синдрома боли и инсульт, хроническое воспалительное заболевание, такое как артрит, заболевание, связанное с костями, хроническую боль, такую как фибромиалгия, обыкновенные прыщи, синдром острой дыхательной недостаточности, болезнь Аддисона, аллергические внутриглазные воспалительные заболевания, ANCA-ассоциированный гранулематозный ангиит, анкилозный спондилит, аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь Бехчета, паралич Белла, буллезный пемфигоид, церебральную ишемию, цирроз печени, синдром Когана, контактный дерматит, синдром Кушинга, дерматомиозит, атрофическую эритему, эозинофильный фасциит, узловатую эритему, эксфолиативный дерматит, очаговый гломерулосклероз, очаговый и сегментный гломерулосклероз, сегментный гломерулосклероз, гигантских клеток артериит, подагру, подагрический артрит, ручную экзему, пурпуру Шенлейна-Геноха; герпес беременных, гирсутизм, идиопатический цератосклерит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру, воспалительные нарушения кишечника или желудочно-кишечного тракта, воспалительный дерматоз, красный плоский лишай, лимфоматозный трахеобронхит, отек желтого пятна, миастению гравис, неспецифическое фиброзирующее заболевание легких, остеоартрит, панкреатит, пемфигоид беременных, обыкновенную пузырчатку, периодонтит, узелковый полиартериит, ревматическую полимиалгию, мошоночный зуд, зуд/воспаление, псориатический артрит, легочный гистоплазмоз, рецидивирующий полихондрит, розацеа, саркоидоз, склеродерма, синдром септического шока, плечевой тендинит или бурсит, синдром Шегрена, болезнь Стилла, болезнь Свита, системный склероз, синдром Такаясу, временный артериит, токсический эпидермальный некролиз, отторжение трансплантата и синдромы, связанные с отторжением трансплантата, туберкулез, диабет типа 1, васкулит, синдром Фогта-Коянаги-Харада (ФКХ), и грануломатоз Вегенера.
Антитела
Способы получения и очистки антител или их ФКН-связывающих фрагментов известны в данной области. См., например, Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975); Hongo et al., Hybridoma 14:253-260 (1995); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2nd ed. (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier), 563-681 (1981); Ni, Xiandai Mianyixue, 26:265-268 (2006); патенты США №№ 7189826, 7078492 и 7153507; Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology 20:927-937 (2005); Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27:185-191 (2005); US 2006/258841; US 2006/183887; US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; и US 2005/026229.
Химерные антитела
Химерные антитела и способы их получения известны и используются в данной области техники. Используемый здесь термин “химерное антитело” означает антитело или его ФКН-связывающий фрагмент, имеющий по меньшей мере некоторую часть по меньшей мере одного вариабельного домена, полученного из аминокислотной последовательности антитела не относящегося к человеку млекопитающего, грызуна или рептилии, в то время как остальные части антитела или его ФКН-связывающего фрагмент получены от человека. Например, химерное антитело может включать антиген-связывающий домен мыши с человеческим Fc или другим таким структурным доменом.
Гуманизированные антитела
Изобретение охватывает гуманизированные анти-ФКН антитела и их ФКН-связывающие фрагменты, которые, например, модулируют взаимодействие между ФКН и CX3CR1. Гуманизацию можно выполнять способом прививки гипервариабельных участков (CDR) (Kontermann and Dübel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001) and Tsurushita et al., Methods 36:69-83 (2005)). Гуманизацию также можно выполнять согласно способам, известным в данной области техники (см., например, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); and Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), путем замены последовательностей гипервариабельных участков, соответствующих последовательностям человеческого антитела. Гуманизированные антитела обычно являются человеческими антителами, в которых некоторые остатки гипервариабельных участков и возможно некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных участков в нечеловеческих антителах.
Выбор человеческих вариабельных доменов, как легкой так и тяжелой цепей, для использования при создании гуманизированных антител может быть важным с точки зрения снижения антигенности. Согласно способу “наилучшего соответствия” последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу по всей библиотеке известных человеческих последовательностей вариабельных доменов. Человеческая последовательность, которая является самой близкой к последовательности грызуна, затем принимается в качестве человеческого каркасного участка для гуманизированного антитела. См., например, Sims et al., J. Immunol. 151:2296-2308 (1993) and Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). В другом методе используется конкретный каркасный участок, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркасный участок может использоваться для нескольких различных гуманизированных антител. См., например, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 89:4285-4289 (1992) and Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993).
Также желательно, чтобы антитела были гуманизированными с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели, согласно одному из методов, гуманизированные антитела получают путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов, используя трехмерные модели родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина являются общедоступными и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают на экране вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулина-кандидата. Изучение таких отображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е., анализировать остатки, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связаться со своим антигеном. Таким образом, остатки FR, полученные от реципиента, могут быть выбраны и объединены, и последовательности могут быть импортированы таким образом, чтобы получить желаемую характеристику антитела, такую как увеличенную аффинность по отношению к целевому антигену(ам) (например, ФКН или его фрагменту). Как правило, остатки CDR имеют непосредственное и наиболее существенное влияние на связывание антигена.
ФКН-связывающие фрагменты
2
В некоторых вариантах осуществления изобретения предоставляются ФКН-связывающие фрагменты, которые модулируют взаимодействие между ФКН и CX3CR1. Такие фрагменты могут представлять собой функциональные антиген-связывающие фрагменты интактных, гуманизированных и/или химерных антител, таких как фрагменты Fab, Fab', F(ab'), Fv или ScFv (см., например, Bird et al., Science 242:423-426 (1998)). Такие фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител, например, расщеплением папаином (см., например, WO 94/29348), но можно получить непосредственно из рекомбинантно трансформированной клетки хозяина. ФКН-связывающие фрагменты могут быть получены при помощи различных инженерных методик, как описано ниже.
E. coli,
2
2
2
Энергия взаимодействия между двумя цепями фрагментов Fv более низкая, чем у фрагментов Fab. Для стабилизации ассоциации VH и VL доменов фрагменты Fv связывали пептидами (см., например, Bird et al., Science 242:423-426 (1998) and Huston et al., PNAS 85:5879-5883 (1998)), дисульфидными мостиками (см., например, Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362-1367 (1990)) и мутациями “выступ-во-впадину” (“knob in hole”) (см., например, Zhu et al., Protein Sci. 6:781-788 (1997)). Фрагменты ScFv могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области (см., например, Whitlow et al., Methods Enzymol. 2:97-105 (1991) and Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10:195-217 (1993)). ScFv можно продуцировать в бактериальных клетках, таких как но также можно продуцировать в эукариотических клетках. Одним из недостатков ScFv является моновалентность продукта, которая препятствует повышенной авидности вследствие поливалентного связывания; другим недостатком является короткий период полувыведения фрагментов ScFv. Попытки решить эти проблемы включают бивалент (ScFv'), полученный из ScFV, содержащего дополнительный C-терминальный цистеин, путем химического связывания (см., например, Adams et al., Cancer Res. 53:4026-4034 (1993) and McCartney et al., Protein Eng. 8:301-314 (1995)) или путем спонтанной сайт-специфической димеризации ScFv, содержащего неспаренный остаток C-терминального цистеина (см., например, Kipriyanov et al., Cell. Biophys. 26:187-204 (1995)). Альтернативно, можно инициировать формирование мультимеров из ScFv путем укорочения пептидных линкеров до 3-12 остатков для образования “диател” (см., например, Holliger et al., PNAS 90:6444-6448 (1993)). Более того, укорочение линкера может дать тримеры ScFV, образуя “триатела” (см., например, Kortt et al., Protein Eng. 10:423-433 (1997)) и тетрамеры, образуя “тетратела” (см., например, Le Gall et al., FEBS Letters 453:164-168 (1999)). Бивалентные молекулы ScFV также можно получить путем генетического слияния с димеризующими мотивами белков для формирования “миниантитела” (см., например, Pack et al., Biochemistry 31:1579-1584 (1992)) и “минител” (см., например, Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061 (1996)). Тандемы ScFv-Sc-Fv ((ScFv)) также могут быть получены с помощью соединения двух единиц ScFv третьим пептидным линкером (см. Kurucz et al J.Immunol. 154, 4576-4582 (1995)). Биспецифические диатела могут быть получены с помощью нековалентной ассоциации продуктов слияния двух отдельных цепей, содержащих VH-домен из одного антитела, соединенного с помощью короткого линкера с VL-доменом из другого антитела (см. Kipriyanov et al, Int. J. Can. 77, 763-772 (1998)). Стабильность таких биспецифических диател можно увеличить путем введения дисульфидных мостиков или мутаций “выступ-во-впадину” (“knob in hole”), как описано выше, или путем образования одноцепочечных диател (ScDb), в которых два гибридных ScFv-фрагмента соединены при помощи пептидного линкера (см. Kontermann et al. J.Immunol. Methods 226: 179-188 (1999)). Тетравалентные биспецифические молекулы доступны, например, благодаря слиянию ScFv-фрагмента с СН3-доменом молекулы IgG или с Fab-фрагментом через шарнирную область (см. Coloma et al., Nature Biotechnol. 15: 159-163 (1997)). Альтернативно, тетравалентные биспецифические молекулы получают путем слияния биспецифических одноцепочечных диател (см. Alt et al., FEBS Lett 454: 90-94 (1999)). Меньшие тетравалентные биспецифические молекулы также могут быть образованы путем димеризации либо тандемов ScFv-ScFv с линкером, содержащим мотив спираль-петля-спираль (DiBi минидиатела, см. Muller et al., FEBS Lett 432: 45-49 (1998)), либо одноцепочечной молекулы, содержащей четыре вариабельных домена антитела (VH и VL) в ориентации, предотвращающей внутримолекулярное спаривание (тандемное диатело, см. Kipriyanov et al., J.Mol.Biol. 293: 41-56 (1999)). Биспецифические F(ab') фрагменты могут быть созданы путем химического связывания Fab' фрагментов или путем гетеродимеризации посредством лейциновых “молний” (см. Shalaby et al, J.Exp.Med. 175: 217-225 (1992), and Kostelny et al., J.lmmunol. 148: 1547-1553 (1992)). Также доступны выделенные VH и VL домены (см. патенты US 6248516; US 6291158; US 6172197).
Фармацевтические лекарственные формы
Терапевтические лекарственные формы, содержащие антитело или его ФКН-связывающий фрагмент по изобретению, могут быть объединены с физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами в виде водных или сухих лекарственных форм. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы включают, например, физраствор; буферные растворы, такие как фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды; белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты; монсахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбитол; образующие соль противоионы, такие как натрий; или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как ТВИН™, Плюроники™ или ПЭГ.
Антитела или их ФКН-связывающие фрагменты по изобретению могут быть заключены в микрокапсулы, в коллоидные системы доставки лекарственного вещества (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы или нанокапсулы) или в макроэмульсии. В случае, когда желательно введение антитела с замедленным высвобождением в лекарственной форме с характеристиками высвобождения, подходящими для лечения любого нарушения, требующего введения антитела, можно рассмотреть микроинкапсуляцию антитела. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (см., например, U.S. Patent No. 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой-кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый ацетат этиленвинила, разлагаемые сополимеры молочная кислота-гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT™ (вводимые инъекцией микросферы, состоящие из сополимера молочная кислота-гликолевая кислота и ацетата леупролида), а также поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
in vivo
Лекарственные формы, предназначенные для использования для введения , должны быть стерильными. Это легко достигается при помощи фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.
Методы комбинированной терапии
Терапевтические антитела или их ФКН-связывающие фрагменты по изобретению в процессе лечения могут использоваться либо отдельно, либо в комбинации с другими композициями. Например, антитело по изобретению можно вводить совместно с один или более другими антителами, противовоспалительными агентами, цитостатическими агентами, антиангиогенными агентами, цитокинами, ингибирующими рост агентами или совместно с анти-TNF-α терапией. Такие методы комбинированной терапии включают комбинированное введение (при котором указанные два или более агентов включены одну и ту же или отдельные лекарственные формы) и раздельное введение (например, одновременно или последовательно). При раздельном введении двух или более агентов введение антитела по изобретению можно осуществлять до или после введения вспомогательной терапии.
Эффективное количество терапевтических агентов, вводимых в комбинации с анти-ФКН антителом или его ФКН-связывающим фрагментом, назначается по усмотрению врача. Дозировка вычисляется таким образом, чтобы достичь максимального контроля состояния, которое следует вылечить. Дозировка также зависит от таких факторов как тип используемого терапевтического агента и конкретный субъект лечения. Подходящие дозировки могут быть занижены вследствие комбинированного действия (синергии) дополнительного терапевтического агента и анти-ФКН антитела или его ФКН-связывающего фрагмента.
Противовоспалительные агенты
Противовоспалительное соединение можно вводить в комбинации с антителами или их ФКН-связывающими фрагментами по изобретению. Иллюстративные противовоспалительные агенты включают стероиды, такие как глюкокортикоид, нестероидные противовоспалительные лекарственные вещества (например, ибупрофен или такролимус), специфические ингибиторы сциклооксигеназы-2, такие как рофекоксиб (Vioxx) и целекоксиб (Celebrex), кортикостероиды (например, преднизон или гидрокортизон), специфические цитокины, направленные на функцию T-лимфоцитов, флубипрофен, диклофенак и кетаролак. См., например, патенты США №№ 7112578 и 7199119, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Другие агенты
Другие терапевтические агенты, которые можно вводить, включают, например, аминосалицилаты (например, 5-аминосалициловую кислоту), сульфасалазин (например, азуфладин), мезаламин (например, Асакол или Пентаса), имуран (например, Имуран), 6-меркаптопурин (например, Пуринетол), циклоспорин, метотрексат, инфликсимаб (например, Ремикейд), интерфероны (например, интерферон-β), глатирамера ацетат (например, Копаксон), натализумаб (Тисабри), анти-интегрин-α4, урсодеоксиходевую кислоту, такрина гидрохлорид, ингибитор редуктазы HMG CoA, лидокаин, сульфонилмочевину, циклофосфамид, внутривенный иммуноглобулин, амитриптилин, опиаты (например. морфин), дифеноксилат, атропин, витамин Д, кальций, ламотригин, кветиапин, простагландин Е1, нитроглицерин, пегаптаниб, ранибизумаб, изосорбида динитрат, пероспирон, топирамат, оксарбазепин, допамин, микофенолята мофетил, мизорибин, леветирацетам, фентанил, трамадол, дигиталис, капсаицин, натрийуретический пептид, клоридин, дронаты (например, алендронат), безафибрат, мексилетин, глиниды (например, натеглинид или репаглинид), донепезила гидрохлорид, лефлуномид, прегабалин, ривастигмина тартрат, пентанил, простациклин, прокаинамид, колхицин, ингибиторы α-глюкозидазы, диуретики (например, тиазидные диуретики или антиальдостероновые диуретики), такролимус, мемантина гидрохлорид, пентазоцин, клопидогрель, тканевой активатор плазминогена, талидомид, блокатор рецептора ангиотензина, тиазолидиндион, метронидазол, спиронолактон, дулоксетин, пароксетин, клонидин, тиклопидин, гепарин, блокаторы кальциевых каналов, инсулин, альбумин, буцилламин, карбамазепин, рисперидон, лимапрост, варфарин, вертепорфин, габапентин, галантамин гидробромид, аспирин, урокиназу, хлорамбуцил, ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, бигуаниды, ингибиторы или агонисты β-адренергических рецепторов, гидрохлорохин и митоксантрон.
Лечение нарушения, раскрытого в настоящем описании (например, воспалительного нарушения), может дополнительно включать применение других методов терапии. Например, для лечения, например, синдрома Гийена-Барре, демиелинизирующей полирадикулопатии (например, хронической воспалительной демиелинизирующей полирадикулопатии), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (TTP), болезни Бехчета, или рассеянного склероза можно использовать плазмаферез (например, плазмообменную терапию).
Дозировки и введение
Облегчение или лечение воспалительного нарушения обычно включает ослабление одного или более симптомов или осложнений, связанных с нарушением. В случае воспалительных заболеваний терапевтически эффективное количество терапевтического антитела, его ФКН-связывающих фрагментов или его фармацевтической композиции может приводить к одному или комбинации следующих признаков: уменьшению воспаления; уменьшению абдоминальной боли или судорог; уменьшению вздутию живота; уменьшению или устранению диареи; уменьшению изъязвления пищеварительного трактата; уменьшению лихорадки; уменьшению или ослаблению тошноты; уменьшению усталости; минимизации потери веса; облегчению боли в суставах; уменьшению припухлости; уменьшению сыпи на коже или зуда; устранению желтухи; и/или ослаблению одного или более симптомов, связанных с воспалительным нарушением. “Терапевтически эффективное количество” антитела, предназначенное для введения, представляет собой минимальное количество, необходимое для профилактики, облегчения или лечения воспалительного нарушения.
Описанные здесь антитела, ФКН-связывающие фрагменты и фармацевтическую композицию вводят субъекту согласно известным методам, таким как внутривенное введение в виде болюса или непрерывной инфузии в течение некоторого времени, топическое, пероральное, подкожное введение, введение в виде инъекции в бронх, внутрицеребральное, интраназальное, трансдермальное, интраперитонеальное, внутримышечное, внутрилегочное, вагинальное, ректальное, внутрисуставное, внутриартериальное введение, введение непосредственно в зону очага поражения, парентеральное, интравентрикулярное введение в мозге, или внутриглазное введение. В частности, может быть желательным локальное введение, если с лечением связаны обширные побочные эффекты или токсичность.
Лекарственные составы для перорального применения также могут предоставляться в виде жевательных таблеток или в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водной или масляной средой.
ex vivo
ex vivo
Для терапевтических применений также может использоваться стратегия. Стратегиями включает трансфекцию или трансдукцию полученных от субъекта клеток полинуклеотидом, кодирующим антитело или фрагмент антитела. Затем трансфицированные или трансдуцированные клетки возвращают субъекту. Клетки могут быть любого типа в широком диапазоне, включая, без ограничения, гемопоэтические клетки (например, клетки костного мозга, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, T-клетки или В-клетки), фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты или мышечные клетки.
Дозировка и время введения композиций по настоящему изобретению зависят от различных клинических факторов, включая общее состояние здоровья субъекта и тяжесть симптомов воспалительного нарушения. Лечение может продолжаться от 1 дня до 4 лет, 1 дня до 3 лет, 1 дня до 2 лет, 1 дня до года, 1-100 дней, 1-60 дней, 1-20 дней, 1-10 дней или до излечения или облегчения воспалительного нарушения или симптомов воспалительного нарушения. Композиции по настоящему изобретению можно вводить четыре раза в сутки, три раза в сутки, два раза в сутки, ежедневно, еженедельно, два раза в месяц, ежемесячно, раз в два месяца, раз в три месяца или ежегодно. Дозировки изменяются в зависимости от тяжести состояния и подбираются для достижения устойчивой концентрации в сыворотке крови от примерно 1 нг/мл до 10 мкг/мл или от 1 до 500 нг/мл. Количество вводимого антитела обычно находится в диапазоне от примерно 0,001 до примерно 30 мг/кг массы субъекта (например, от 0,01 до примерно 10 мг/кг массы субъекта).
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, которые никоим образом не предназначены для ограничения изобретения.
Пример 1. Получение мышиных моноклональных антител против человеческого фракталкина (hФКН)
Мышиные анти-hФКН моноклональные антитела (mAbs) получали согласно описанному ранее способу (см., например, патент США 7390490, включенный в настоящее описание в виде ссылки). Получали нейтрализующие mAb клоны 1F3-1, 3A5-2, 1F3, 1G1, 2B2, 3D5, 3H7, 6D1, 7F6 и 5H7-6.
Пример 2. Выбор кандидата mAb для гуманизации
Клоны 1F3-1, 3A5-2 и 5H7-6 анализировали при помощи анализа хемотаксиса для измерения нейтрализующей активности, анализа BIACORE для измерения hФКН-связывающей аффинности и твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для измерения видовой кросс-реактивности к ФКН яванской макаки. Данные по нейтрализующей активности, аффинности связывания и видовой кросс-реактивности к ФКН яванской макаки суммированы на Фиг.2. Клон 3A5-2 показал наивысшую нейтрализующую активность и наивысшую hФКН-связывающую аффинность. Клон 3A5-2 показал одинаковую реактивность к ФКН яванской макаки и hФКН. Поэтому в качестве кандидата для гуманизации был выбран клон 3A5-2.
5
2
Анализ хемотаксиса выполняли следующим образом. Клетки помещали в верхние ячейки культуральной планшеты Трансвелл (планшета MultiScreen-MIC, 5,0 мкм, Millipore, Catalog No. MAMIC 5S10) с лигандом в нижних ячейках. Сначала рекомбинантный человеческий ФКН (R&D Systems, Catalog No. 362-CX/CF) (конечная концентрация 33 нг/мл) (Фиг.1) предварительно инкубировали с очищенными антителами при различных концентрациях (от 0 до 10 нг/мл) при комнатной температуре. Композиция содержала следующие компоненты: 15 мкл/ячейка 10х раствор хемокина; 15 мкл/ячейка 10х очищенные mAb; и 120 мкл/лунка 1x буфера для хемотаксиса (0,5% BSA, 0,5% FBS, 20 мМ HEPES (pH 7,4), 50 мкМ 2-меркаптоэтанол в RPMI1640 (Invitrogen)). Через 30 минут трансфицированные CX3CR1 клетки B300.19 (2x10 клеток/75 мкл) вносили в верхние ячейки и инкубировали в 5% CO инкубаторе при 37°C в течение 4 часов. После инкубации отбирали 150 мкл раствора из нижних ячеек фиксировали 50 мкл 4% PFA/PBS, и 30 мкл образцов использовали в клеточном анализаторе FACSCantoII для подсчета мигрированных клеток.
Анализ BIACORE выполняли следующим образом. Рекомбинантный протеин-A/G (Pierce Chemical) иммобилизовали на сенсорном чипе BIACORE (CM5), который предварительно инкубировали с амин-связывающими реагентами (GE Healthcare). Очищенные mAb добавляли в сенсорные чипы с концентрацией 0,2 мкг/мл. Растворимые антигены (растворимый ФКН, конъюгированный с секретированной щелочной фосфатазой (SEAP) или контрольными SEAP протеинами) добавляли в сенсорные чипы при различных концентрациях (от 0 до 200 нм). Непрерывно отслеживали ассоциацию добавленных антигенов с mAb, иммобилизованных на сенсорных чипах, относительный ответ связывания антигенов определяли, используя систему BIACORE A100 (GE Healthcare).
2
4
ELISA выполняли следующим образом. Поликлональное антитело к IgG кролика (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Catalog No. 711-005-152) наносили в лунки 96-луночной планшеты (Nunc, Catalog No. 442402)). После инкубации в течение ночи при 4°C лунки блокировали 1x Block-Ace (DainipponPharma) в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехразовой промывки 0,05% Твин 20/PBS в лунки добавляли 10 нМ кроличьих поликлональных анти-PLAP антител (Biomeda) (50 мкл/лунка). После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре и трех разовой промывке, как описано выше, в лунки добавляли культуральный супернатант, содержащий hФКН-SEAP или яванской макаки ФКН-SEAP (конечная концентрация 1 нМ), и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехразовой промывки очищенные анти-hФКН mAb добавляли в лунки при различных концентрациях (от 0 до 10 мкг/мл). После инкубации в течение 1 часа и трехразовой промывки конъюгированные с пероксидазой хрена антимышиные IgG антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Catalog No. 715-036-151) добавляли с концентрацией 0,16 мкг/мл (50 мкл/лунка) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехразовой промывки в лунки добавляли раствор TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) и инкубировали в течение 15-30 минут. В лунки добавляли равный объем останавливающегося раствора (2М HSO), и регистрировали оптическую плотность при 450 нм считывающим устройством для микропланшетов (Arvo, PerkinElmer).
2
Растворимый hФКН-SEAP получали следующим образом. кДНК, кодирующую внеклеточную область hФКН, амплифицировали, используя праймер 5'-SalI-hФКН (CGCGTCGACGCCACCATGGCTCCGATATCTCTGTC; SEQ ID NO:2) и праймер 3'-NotI-hФКН (GCGGGCGGCCGCCCTCCGGGTGGCAGCCTGGG; SEQ ID NO:3), и субклонировали в вектор pкДНК3.1(+)dSalI SEAP, содержащий кДНК SEAP. Вектор экспрессии hФКН-SEAP трансфицировали в клетки HEK293EBNA (HEK293E) (Invitrogen). Клетки HEK293E инкубировали с DMEM (Invitrogen), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой, за день до трансфекции. В день трансфекции среду заменяли на OPTI-MEMII, не содержащую сыворотку (Invitrogen). Вектор экспрессии трансфицировали TransIT LT1 (TAKARA) согласно инструкции изготовителя. После 3-х дневной инкубации (5% CO при 37°C) собирали культуральный супернатант. Концентрацию белка SEAP измеряли, используя набор 2.0 для хемолюминисценции Great EscAPe SEAPSEAP (Clontech).
Растворимый яванской макаки ФКН-SEAP получали следующим образом. кДНК, кодирующую внеклеточную область ФКН яванской макаки, амплифицировали, используя праймер 5'-XhoI-ФКН яванской макаки (GCGCTCGAGGCCACCATGGCTCCGATATCTCTGTCGTGG; SEQ ID NO:4) и праймер 3'-NotI-ФКН яванской макаки (CGCGGCGGCCGCGGTGGCAGCCTGGGAGTCAGGGAC; SEQ ID NO:5), и субклонировали в pENTR1A (Invitrogen), содержащий кДНК SEAP. Фрагмент, кодирующий ФКН яванской макаки и SEAP, трансфицировали в пкДНК3.1, содержащую кассету В, при помощи системы GATEWAY (Invitrogen). Культуральный супернатант, содержащий яванской макаки ФКН-SEAP, получали, как описано выше.
Пример 3. Клонирование кДНК вариабельных областей тяжелых и легких цепей клона 3A5-2 мышиных анти-hФКН mAb
кДНК тяжелых и легких цепей клона 3A5-2 амплифицировали методом ОТ-ПЦР. Полную РНК выделяли из гибридомы клона 3A5-2, используя мининабор РНКазы (QIAGEN). При помощи полной РНК синтезировали кДНК, используя набор для синтеза кДНК (TAKARA), и амплифицировали при помощи праймера 5'-Mm-HC-Leader1 (GGGATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT; SEQ ID NO:6), праймера 5'-Mm-HC-Leader2 (GGGATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT; SEQ ID NO:7) или праймера 5'-Mm-HC-Leader3 (GGGATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT; SEQ ID NO:8) и праймера 3'-Mm-IgG2a-CH3-R (TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGTC; SEQ ID NO:9) для тяжелой цепи и праймера 5'-Mm-LC-Leader1 (GGGATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT; SEQ ID NO:10), или праймера 5'-Mm-LC-Leader2 (GGGATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG; SEQ ID NO:11), или праймера 5'-Mm-LC-Leader3 (GGGATGRAGTCACAKACYCAGGTCTTYRTA; SEQ ID NO:12), или праймера 5'-Mm-LC-Leader4 (GGGATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGR; SEQ ID NO:13) или праймера 5'-Mm-LC-Leader5 (GGGATGAAGTTGGCTGTTAGGCTGTTG; SEQ ID NO:14), и праймера 3'-Mm-Ckappa-R (CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC; SEQ ID NO:15) для легкой цепи, соответственно. Амплифицированные кДНК субклонировали в вектор pCR2.1 (Invitrogen). Последовательности анализировали, используя ABI3130XL. Получали тяжелую цепь полной длины и 5'-укороченную версию L цепи. Для амплификации укороченной области L цепи и идентификации точных лидерных последовательностей выполняли 5'-быструю амплификацию концов кДНК (5'-RACE). Двухнитевую кДНК получали, используя набор для синтеза кДНК (TAKARA), и добавляли 5' адаптер (ad29S; ACATCACTCCGT (SEQ ID NO:16) и as29AS; ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT (SEQ ID NO:17), отжигали). кДНК амплифицировали, используя праймер 5'-ПЦР1 (GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG; SEQ ID NO:18) для первой ПЦР и праймер 5'-ПЦР4 (AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG; SEQ ID NO:19) для второй ПЦР и 3'HC RACE праймер_1 (GTACGGAGTACTCCAAAAATGTTG; SEQ ID NO:20) для первой ПЦР или 3'HC RACE праймер_2 (TCTTCAGGCTGCAGGCTGATGATC; SEQ ID NO:21) для второй ПЦР для H цепи, 3'LC RACE праймер_3 (AAATCTTCAGGCTGCAGGCTGTTG; SEQ ID NO:22) для первой ПЦР или 3'LC RACE праймер_4 (CTGTTGATCTTGAGAGAATATTGTG; SEQ ID NO:23) для второй ПЦР для L цепи, соответственно. Амплифицированные кДНК субклонировали и секвенировали, как описано выше. Идентифицированные последовательности вариабельных участков были следующими.
Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой (H) цепи:
Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой (L) цепи:
Аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой (H) цепи:
Аминокислотная последовательность вариабельного участка легкой (L) цепи:
Пример 4. Конструирование гуманизированных анти-ФКН mAb из клона 3A5-2
Мышиные анти-hФКН mAb, клон 3A5-2, гуманизировали методом, в котором используется привитый гипервариабельный участок (CDR) (Kontermann and Dübel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001) and Tsurushita et al., Methods 36:69-83 (2005)). Аминокислотные последовательности CDR были следующими.
CDR-H1: NYYIH (SEQ ID NO:28)
CDR-H2: WIYPGDGSPKFNERFKG (SEQ ID NO:29)
CDR-H3: GPTDGDYFDY (SEQ ID NO:30)
CDR-L1: RASGNIHNFLA (SEQ ID NO:31)
CDR-L2: NEKTLAD (SEQ ID NO:32)
CDR-L3: QQFWSTPYT (SEQ ID NO:33)
Человеческие акцепторные каркасные участки выбирали среди сегментов человеческих вариабельных доменов. Идентифицированные CDR 3A5-2 прививали в выбранные человеческие акцепторные каркасные участки. Сконструированные гуманизированные последовательности были следующими.
H цепь (обозначенная как H3: SEQ ID NO:36)
H цепь (обозначенная как H3-2: SEQ ID NO:37)
L цепь (обозначенная как L2; SEQ ID NO:38)
H цепь (обозначенная как H4; SEQ ID NO:39)
Последовательности H
цепи зародышевой линии
(SEQ ID NO:40)
Последовательности L цепи зародышевой линии
(SEQ ID NO:41)
H цепь (обозначенная как HK2; SEQ ID NO:42)
H цепь (обозначенная как HK3; SEQ ID NO:43)
L цепь (обозначенная как L4; SEQ ID NO:44)
L цепь (обозначенная как L5: SEQ ID NO:45)
Все гуманизированные последовательности выровнены (фиг.3 и 4).
Пример 5. Конструирование векторов экспрессии гуманизированного анти-hФКН mAbs
Для выбора лидерных последовательностей для экспресии гуманизированных mAb, проводили поиск сегментов зародышевой линии, основываясь на подобии AAA68427.1 и ABU90602.1. Сегменты VH1-1-18 и VKI-012 были наиболее близкими к AAA68427.1 и ABU90602.1, соответственно. Их лидерные последовательности использовали для экспрессии гуманизированных mAb. Их лидерные последовательности были следующими.
Аминокислотная последовательность H цепи (SEQ ID NO:46)
MDWTWSILFLVAAPTGAHS
Нуклеотидные последовательности H цепи
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCACCAACAGGTGCCCACTCC (для H3 и H3-2; SEQ ID NO:47)
ATGGACTGGACATGGTCCATCCTGTTCCTGGTGGCCGCTCCAACTGGCGCACACTCT (для HK2 и HK3; SEQ ID NO:48)
Аминокислотная последовательность L цепи (SEQ ID NO:49)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC
Нуклеотидные последовательности L цепи (SEQ ID NO: 50)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT
Вариабельные домены сконструированных гуманизированных анти-hФКН mAb, присоединенные к описанным выше лидерным последовательностям, получали методом ПЦР, используя следующие праймеры.
Для H3 тяжелой цепи
праймер h3A5-2_VH3-1 (SEQ ID NO:51):
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCACCAACAGGTGC
праймер h3A5-2_VH3-2R (SEQ ID NO:52):
CCAGACTGCACCAGCTGCACCTGGGAGTGGGCACCTGTTGGTGCTGCCAC
праймер h3A5-2_VH3-3 (SEQ ID NO:53):
GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGT
праймер h3A5-2_VH3-4R (SEQ ID NO:54):
GTGTATCCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTT
праймер h3A5-2_VH3-5 (SEQ ID NO:55):
TGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAACTACTATATACACTGGGTGAA
праймер h3A5-2_VH3-6R (SEQ ID NO:56):
ATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTGCTTCACCCAGTGTATATAGTA
праймер h3A5-2_VH3-7 (SEQ ID NO:57):
GGACAAGGGCTTGAGTGGATAGGATGGATTTATCCTGGAGATGGTAGTCC
праймер h3A5-2_VH3-8R (SEQ ID NO:58):
GTCCTGCCCTTGAACCTCTCATTGAACTTAGGACTACCATCTCCAGGATA
праймер h3A5-2_VH3-9 (SEQ ID NO: 59):
GAGAGGTTCAAGGGCAGGACCACCCTGACCGCAGACAAGTCCACGAACAC
праймер h3A5-2_VH3-1 OR (SEQ ID NO:60):
GATCTCAGGCTGCTCAGCAACATGTAGGCTGTGTTCGTGGACTTGTCTGC
праймер h3A5-2_VH3-11 (SEQ ID NO:61):
TTGCTGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAC
праймер h3A5-2_VH3-12R (SEQ ID NO:62):
TAGTCAAAGTAGTCGCCATCAGTGGGCCCTGTCGCACAGAAATACACGGC
праймер h3A5-2 VH3-13 (SEQ ID NO:63):
GATGGCGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
праймер h3A5-2_R (SEQ ID NO:64):
GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAAGAGACGGTGACCGTGGTCCC
Для легкой L2 цепи
праймер h3A5-2_VL2-1 (SEQ ID NO:65):
GCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGAT
праймер h3A5-2_VL2-2R (SEQ ID NO:66):
TCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATGGAGACTGGGTCATCTGGATGTCACATCTGGCACCTCGGAGCCAG
праймер h3A5-2_VL2-3 (SEQ ID NO:67):
CCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGAGCAAGCGGGAATATTCACAATTTTTT
праймер h3A5-2_VL2-4R (SEQ ID NO:68):
GAACTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCTGTTGATACCATGCTAAAAAATTGTGAATATTCCCGCTTGCTCGG
праймер h3A5-2_VL2-5 (SEQ ID NO:69):
CAGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGGTCTATAATGAAAAAACCTTAGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAG
праймер h3A5-2_VL2-6R (SEQ ID NO:70):
GTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTATATTGTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCC
праймер h3A5-2_VL2-7 (SEQ ID NO:71):
CACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCGACCTACTTCTGTCAACAGTTTTGGAGTACTCCGTAT
праймер h3A5-2_VL2-8R (SEQ ID NO:72):
TTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGCCGAACGTATACGGAGTACTCCAAAACTGTTGACAGAA
праймер h3A5-2_VL-R (SEQ ID NO:73):
GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC
Полученные H3 и L2 амплифицировали методом ПЦР, используя праймер 5'-Eco-Sal-h3A5-2_VH_F (GCGAATTCGTCGACGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTG; SEQ ID NO:74) и 3'-NheI-h3A5-2_VH_R (CGCGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCGTGGTCCC; SEQ ID NO:75) для H3 и праймер 5'-h3A5-2_VL_SalI-kozac_F (GCGGTCGACGCCACCATGGACATGAGGGTCCCC; SEQ ID NO:76) и праймер 3'-h3A5-2_VL-R (GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC; SEQ ID NO: 77) для L2, соответственно.
H4 получали согласно Genscript USA Inc. Последовательности H4 были следующими.
H4 (SEQ ID NO:78):
Вариабельные участки HK2 получали из H4 введением точечных мутаций, используя метод ПЦР со следующими праймерами.
праймер h3A5-2_HKG2_sal24F (SEQ ID NO:79):
CGCGTCGACGCCACCATGGACTGGACATGGTCCATCCTG
праймер h3A5-2_HKG2_280F (SEQ ID NO:80):
ATGACCGCCGATACCTCAACCTCCACAGCTTACATGGAA
праймер h3A5-2_HKG2_300R (SEQ ID NO:81):
GGTTGAGGTATCGGCGGTCATTGTGGTCCG
праймер h3A5-2_HKG2_340F (SEQ ID NO:82):
GAGGATACAGCAGTGTATTTCTGTGCCCGGGGGCCAACC
праймер h3A5-2_HKG2_370R (SEQ ID NO:83):
GGCACAGAAATACACTGCTGTATCCTCAGAGCGCAG
праймер h3A5-2_HKG2_Nhe24R (SEQ ID NO:84):
CGCGCTAGCACTAGACACGGTCACGGTAGTTCC
Вариабельные участки HK3 получали из HK2 введением точечных мутаций, используя метод ПЦР со следующими праймерами.
праймер h3A5-2_HKG2_sal24F (SEQ ID NO:85):
CGCGTCGACGCCACCATGGACTGGACATGGTCCATCCTG
праймер HKG3_R (SEQ ID NO:86):
TTGACTTATCGGCGGTCAGTGTGGTCCGGCCTTTAAACCTTTC
праймер HKG3_F (SEQ ID NO:87):
ACACTGACCGCCGATAAGTCAACCTCCACAGCTTACATGGAA
праймер h3A5-2_HKG2_Nhe24R (SEQ ID NO:88):
CGCGCTAGCACTAGACACGGTCACGGTAGTTCC
Вариабельные участки L4 получали из L2 введением точечных мутаций, используя метод ПЦР со следующими праймерами.
праймер h3A5-2_VL4_sal24F (SEQ ID NO:89):
CGCGTCGACGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG
праймер h3A5-2_VL4_200R (SEQ ID NO:90):
CAGCAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCTG
праймер h3A5-2_VL4_190F (SEQ ID NO:91):
GGGAAAGCCCCTAAGCTGCTGATCTATAATGAAAAA
праймер h3A5-2_VL4_260R (SEQ ID NO:92):
TGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGA
праймер h3A5-2_VL4_250F (SEQ ID NO:93):
AGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTATACTCTCACC
праймер h3A5-2_VL4_BsiW24R (SEQ ID NO:94):
20 CGCCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC
Вариабельные участки L5 получали из L4 введением точечных мутаций, используя метод ПЦР со следующими праймерами:
праймер h3A5-2_VL4_sal24F (SEQ ID NO:95):
CGCGTCGACGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG
праймер VL5_R (SEQ ID NO:96):
GGTGAGAGTATACTGTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAAC
праймер VL5_F (SEQ ID NO:97):
GGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCAGTCTG
5 h3A5-2_VL4_BsiW24R (SEQ ID NO:98):
cgcCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC
Константные участки IgG2 и IgK амплифицировали, используя праймер 5'-NheI-IgG2_F (CGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC; SEQ ID NO:99) и праймер 3'-EcoRV-IgG2_R (CGCGATATCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG; SEQ ID NO:100) для IgG2 и праймер 5'-BsiWI-Igk_F (CGCCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC; SEQ ID NO:101) и праймер 3'-EcoRV-Igk_R (CGCGATATCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT; SEQ ID NO:102) для IgK, соответственно. Амплифицированные константные участки субклонировали в pENTR1A dNotI с удаленным NotI.
Полученные вариабельные участки субклонировали в pENTR1A-IgG2 или pENTR1A-Igκ, используя сайты Sall-Nhel для тяжелых цепей или сайты Sall-BsiWI для легких цепей, соответственно. В случае L2, константный участок Igκ амплифицировали, используя праймер 5'-hIGKF (CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC; SEQ ID NO:103) и праймер 3'-hIGK_NotI-R (CGCGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT; SEQ ID NO:104). Амплифицированный константный участок Igκ и полученную L2 объединяли методом ПЦР и субклонировали в pENTR1A. Субклонированные вариабельные участки и константные участки трансфицировали в pEE6.4 или pEE12.4 (Lonza) для тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, используя систему GATEWAY (Invitrogen).
H3-2 получали введением точечной мутации, используя систему для сайт-направленного мутагенеза GeneTailor из pENTR1A-H3-IgG2 с праймером 5'-h3A5-2_H3-2_300F (TTGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCC; SEQ ID NO: 105) и праймером 3'-h3A5-2_H3-2_320R (AGATCTCAGGCTGCTCAGCAACATGTAGGC; SEQ ID NO:106). Сайт-направленный мутагенез GeneTailor выполняли согласно инструкциям производителя. Мутированный участок и константный участок трансфицировали в pEE6.4, как описано выше.
Пример 6. Получение гуманизированных анти-hФКН mAb
Векторы экспрессии тяжелой и легкой цепей гуманизированного анти-hФКН mAb трансфицировали в клетки HEK293E. В день трансфекции клетки HEK293E инокулировали в DMEM (Invitrogen), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой. После инкубирования в течение 5 часов смесь векторов экспрессии тяжелой и легкой цепей трансфицировали, используя липофектамин 2000 (Invitrogen), согласно инструкциям производителя. На 10 день после трансфекции среду заменяли не содержащей сыворотку средой 293 Serum-Free Media (SFM) II (Invitrogen). После инкубации в течение 5 дней при 37°C собирали культуральный супернатант.
Для анализа BIACORE использовали непосредственно собранный супернатант. Для анализа хемотаксиса супернатант очищали, используя колонку с сефарозой, содержащей рекомбинатный белок A (Pharmacia).
Пример 7. Получение химерных мышиных-человеческих 3A5-2 mAb
Вариабельные участки тяжелой цепи мышиного 3A5-2 амплифицровали, используя праймер 5'-EcoRI-SalI-3A5-2 VH (GCGGAATTCGTCGACGCCACCATGCGATGGAGCTGGA-TC; SEQ ID NO:107) и 3'-IgG перекрывающий 3A5-2 VH праймер (GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC; SEQ ID NO:108).
Человеческий константный участок IgG2 амплифицировали, используя праймер 5'-hIgG2 (GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTG; SEQ ID NO:109) и праймер 3'-NotI-hIgG2 (CGCGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG; SEQ ID NO:110).
Амплифицированные 3A5-2 VH и человеческий константный участок IgG2 объединяли при помощи метода ПЦР и субклонировали в pCX-IRES-bsr, которая содержала устойчивый к бластицидину ген, для отбора клеток.
Вариабельный участок легкой цепи мышиного 3A5-2 амплифицировали, используя праймер 5'-3A_VL-SalI-kozac_F (GCGGTCGACGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAG; SEQ ID NO:111) и праймер 3'-3A-IgG1,2_VH-R (GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCT; SEQ ID NO:112). Человеческий константный участок Igκ амплифицировали, используя праймер 5'-hIGK_F (CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC; SEQ ID NO:113) и праймер 3'-hIGK_NotI-R (CGCGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT; SEQ ID NO:114). Амплифицированные 3A5-2 VH и человеческий константный участок IgG2 объединяли при помощи метода ПЦР и субклонировали в pMX-IRES-puro, которая содержала ген устойчивости к пуромицину, для отбора клеток.
Вектор экспрессии химерной легкой цепи трансфицировали в клетки HEK293E, используя pE-Eco и pGp (TAKARA) для сборки ретровируса. Клетки HEK293E инокулировали в DMEM (Invitrogen), дополненную 10% FBS, за день до трансфекции. В день трансфекции векторы трансфицировали, используя TranIT LT1 (TAKARA). После инкубации в течение 3 дней собирали культуральный супернатант, содержащий ретровирус, и добавляли к клеткам B300.19. После инкубации в течение 8 дней культуральный супернатант удаляли и добавляли RPMI1640 (Invitrogen), содержащую 10% FBS. После культивирования в течение 2 дней добавляли пуромицин для отбора инфицированных клеток. Затем отобранные клетки инфицировали другим рекомбинатным ретрвирусом, несущим химерную тяжелую цепь, которую получали методом, аналогичным описанному для легкой цепи. После отбора по устойчивости к бластицидину дважды отобранные клетки культивировали с SF-O (Sanko Junyaku), содержащей 8 мМ глутамакса, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1x холестерина (Invitrogen), в Integra CELLine (Integra Bioscience).
Культуральный супернатант очищали, используя колонку с сефарозой, содержащей рекомбинатный белок А (Pharmacia) для использования в анализе хемотаксиса и анализе BIACORE.
Пример 8. Анализ гуманизированных анти-hФКН mAb
Гуманизированные анти-hФКН mAb анализировали при помощи анализа хемотаксиса для измерения нейтрализующей активности и анализа BIACORE для измерения аффинности связывания hФКН и ФКН яванской макаки. Репрезентативные данные и результаты трех независимых анализов хемотаксиса суммированы на Фиг.5 и показаны на Фиг.6A-B, 7A-D и 8A-F. Все комбинации H3 и H3-2 для тяжелой цепи с L2 и L4 для легкой цепи были успешно гуманизированы в виде этих mAb, демонстрировали аналогичную нейтрализующую активность с химерным mAb. Однако HK2, который был получен путем использования более узкого диапазона ключевых остатков, продемонстрировал пониженную нейтрализующую активность в комбинации с L2 или L4. Результаты анализа BIACORE суммированы на фиг.9 и 10A-C. Все комбинации H3 и H3-2 для тяжелой цепи с L2 и L4 для легкой цепи показали аналогичные уровни аффинности по сравнению с химерным mAb. С одной стороны, HK2L4 продемонстрировал более низкую аффинность, чем другие. Эти результаты подтверждают, что 3A5-2 не может быть успешно гуманизирован обычным способом путем использования обычной идентификации ключевых остатков, особенно в случае тяжелой цепи.
5
2
Анализ хемотаксиса выполняли следующим образом. Клетки помещали в верхние лунки культуральной планшеты Трансвелл (MultiScreen-MIC Plate, 5,0 мкм, Millipore, Catalog No. 10 MAMIC 5S10) с лигандом в нижних лунках. Сначала в нижние лунки добавляли систему с рекомбинантными человеческими ФКН (R&D Systems, Catalog No. 362-CX/CF) (конечная концентрация 10 нг/мл) очищенными антителами с разными концентрациями (от 0 до 10 нг/мл). Композиции содержали следующие компоненты: 3x раствор хемокина, 50 мкл/лунка; 1,5x очищенные mAb, 100 мкл/лунка; хемокин и очищенные антитела разбавляли 1x буфером для хемотаксиса (описан выше). В верхние лунки вносили трансфицированные CX3CR1 клетки B300.19 (2×10 клеток/75 мкл) вместе с очищенными антителами при разных концентрациях (от 0 до 10 мкг/мл). Композиции содержали следующие компоненты: 3x клеточной суспензии, 25 мкл/лунка; 1,5x раствор очищенных mAb, 50 мкл/лунка; клетки и очищенные антитела разбавляли 1x буфером для хемотаксиса. Анализ хемотаксиса выполняли в 5%-CO инкубаторе при 37°C в течение 4 часов. После инкубации собирали 150 мкл из нижних лунок, фиксировали 50 мкл 4% PFA/PBS и образцы по 30 мкл использовали в клеточном анализаторе FACSCantoII для подсчета мигрированных клеток.
Анализ BIACORE выполняли описанным выше способом. Однако для гуманизированных и химерных mAb использовали анти-человеческих IgG мышиных mAb (GE Healthcare) в качестве иммобилизованного на сенсорном чипе антитела.
Пример 9. Картирование эпитопа при помощи синтетических пептидов из домена хемокина ФКН
2
4
Картирование эпитопа выполняли, используя библиотеки перекрывающихся синтетических пептидов из домена хемокина ФКН. Двадцать один вид пептидов, состоящих из 15 остатков, синтезировали методом Sigma Genosys. Пептиды растворяли до 10 мг/мл, используя ДМСО. Эти пептиды (50 мкг/мл) наносили на планшету ELISA (Nunc) и оставляли на ночь при 4°C. Растворы пептидов удаляли, и в каждую лунку добавляли раствор PBS, содержащий 1% BlockAce (Dainippon Pharma), инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и промывали забуференным Трис физраствором (pH 7,4), содержащим 0,05% Твин 20 (раствор для промывки). В лунки добавляли раствор антител H3-10 2L4 (50 мкг/мл) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор антител удаляли и промывали раствором для промывки. В лунки добавляли раствор античеловеческих IgG антител, меченных пероксидазой (Zymed; 400 нг/мл), и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Раствор антител удаляли и промывали раствором для промывки. В каждую лунку добавляли раствор TMBZ (Sigma) и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали 1н раствором HSO и измеряли абсорбцию при 450-650 нм.
Результаты показаны на фиг.11. Антитела H3-2L4 реагировали с пептидами из N-терминального и среднего участков человеческого ФКН.
Пример 10. Получение мутантов с аланиновой или сериновой заменой
Мутантов hФКН-SEAP с аланиновой или сериновой заменой получали следующим образом.
2
кДНК, кодирующую внеклеточный участок ФКН, выделяли из вектора экспрессии hФКН-SEAP, pcDNA3.1(+)hFKN-SEAP, используя ферменты рестрикции Sall/NotI, и субклонировали в вектор pENTR1A_dSEAP-(His)10, содержащий кДНК SEAP (pENTR1A приобрели у компании Invitrogen). Мутантов с аланиновой или сериновой заменой индуцировали, используя систему сайт-направленного мутагенеза GeneTailor (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Фрагменты кДНК hFKN-SEAP с индуцированной мутацией трансфицировали в вектор pcDNA3.1(+)_cassette В (кассету В приобрели у компании Invitrogen), используя систему Gateway (Invitrogen). Векторы экспрессии мутантов hFKN-SEAP с аланиновой или сериновой заменой трансфицировали в клетки HEK293EBNA (HEK293E) (Invitrogen). Клетки HEK293E инокулировали в DMEM (Invitrogen), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, за день перед трансфекцией. Вектор экспрессии трансфицировали, используя TransIT LT1 (Takara), согласно инструкциям производителя. Через три дня инкубации (5% CO при 37°C) собирали культуральный супернатант. Концентрацию белков SEAP измеряли при помощи набора 2.0 хемилюминесценции Great EscAPe SEAP (Clontech).
Пример 11. ELISA для картирования эпитопа hФКН
Во все лунки планшеты ELISA (Nunc) наносили анти-hФКН поликлональное антитело (eBioscience) и H3-2L4 и оставляли на ночь при 4°C. Из каждой лунки удаляли раствор антитела и добавляли PBS, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин и инкубировали в течение 1 при комнатной температуре, затем промывали забуференным Трис физраствором (pH 7,4), содержащим 0,05% Твин 20 (раствор для промывки). Мутанты с аланиновой или сериновой заменой разбавляли до 0,13 нМ средой PBS, содержащей 1% BSA, и 50 мкл аликвоты добавляли в лунки планшеты ELISA и инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре. Растворы мутантов удаляли, промывали раствором для промывки. Раствор п-нитрофенилфосфата (Thermo Scientific) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали раствором 1н NaOH и измеряли абсорбцию при 405 нм. Результаты показаны на фиг.12. Мутант R68A потерял специфическую реактивность с H3-2L4. Другие мутанты, которые потеряли реактивность с H3-2L4, также потеряли реактивность с поликлональным антителом. Эти результаты демонстрируют, что R68 является критическим эпитопом H3-2L4.
Пример 12. Картирование эпитопа hФКН при помощи BIACORE
Антитело к гистидину-таг (Bethyl) иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 (GE Healthcare). Чип загружали растворами мутантов с аланиновой или сериновой заменой, разбавленными в 10 раз буфером HBS-EP (GE Healthcare), промывали HBS-EP и измеряли уровень связывания антигена. Раствор H3-2L4 и анти-ФКН поликлональных антител загружали в чип со связанными антигенами, промывали HBS-EP и измеряли уровень связывания антитела. Вычисляли [уровень связывания антитела/уровень связывания антигена] и значения, вычисленные для каждого мутанта, сравнивали со значением, полученным для дикого типа. Результаты показаны на фиг.13.
Пример 13. Реактивность других антител с мутантом R68A
Мышиные античеловеческие ФКН моноклональные антитела (1F3, 1G1, 2B2, 3D5, 6D1, 7F6) и антитело H3-2L4 наносили на планшету ELISA (Nunc) и оставляли на всю ночь при 4°C. Растворы антител удаляли. В каждую лунку добавляли раствор PBS, содержащий 1% BSA, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, лунки промывали забуференным Трис физраствором (pH 7,4), содержащим 0,05% Твин 20. Раствор антител R68A-мутированные FKN-SEAP-His и дикого типа (1, 0,5, 0,25, 0,125 нМ) добавляли в лунки и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор антигена удаляли и промывали раствором для промывки. В каждую лунку добавляли раствор п-нитрофенилфосфата (Thermo Scientific) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали 1н раствором NaOH и измеряли абсорбцию при 405 нм.
Нейтрализующую активность этих антител тестировали описанным выше анализом хемотаксиса. 10 нМ человеческие ФКН и различные концентрации этих антител добавляли в нижние лунки планшеты Трансвелл. В верхние лунки планшеты добавляли клетки, экспрессирующие CX3CR1. После инкубации в течение 4 часов при 37°C среду из нижних клеток извлекали и клетки фиксировали 4% раствором формальдегида. Количество клеток вычисляли при помощи анализатора FACS. Отношение между нейтрализующей активностью и реактивностью с мутантом R68A показано в таблице 1. Антитела, сильно нейтрализующие активность CTX, теряли реактивность с мутантом R68A. Эти результаты демонстрируют, что R68 человеческого ФКН является ключевым сайтом узнавания для антител, которые могут эффективно нейтрализовать функцию ФКН.
Таблица 1
Отношение между связыванием мутанта R68A и нейтрализующей активности
<b>Антитело</b>
<b>R68A/дикий тип (%)</b>
<b>СТХ (IC50, нМ)</b>
1F3
131
12,7
1G1
39
80<
2B2
51
80<
3D5
0
4,09
3H7
0
19,1
6D1
58
80<
7F6
56
80<
H3-2L4
0
0,2
Пример 14. Картирование эпитопа hФКН методом ЯМР
Очистка Fab от антител H3-2L4
100 мг раствора очищенных антител H3-2L4 (20 мг/мл раствор PBS) диализовали против 0,1M фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 2 мМ ЭДТА. Концентрацию антитела доводили до 15 мг/мл диализным буфером и добавляли 30 мМ цистеина. К раствору антител добавляли 0,2 мг папаина (Sigma) и инкубировали в течение 14 часов при 37°C. К этому раствору добавляли иодоацетамил для остановки ферментативной реакции. Раствор антитела, расщепленного папаином, диализовали против раствора PBS в течение ночи при 37°С. Раствор наносили на колонку ProSep vA (Millipore) и собирали проточную фракцию. Эту проточную фракцию наносили на колонку с иммобилизованным античеловеческим IgG Fc антителом (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и собирали проточную фракцию. Эту проточную фракцию концентрировали и наносили на Superose 12 10/300 GL (GE Healthcare), и собирали фракции, содержащие фрагмент Fab. Чистоту этих фракций анализировали, используя SDS PAGE, и объединяли фракции доминантных Fab.
Идентификация Fab-связывающего сайта на фракталкине
2
15
2
13
15
15
15
2
2
Для идентификации сайта связывания Fab на фракталкине получали фракталкин, меченный стабильными изотопами (H, N и H, С, N) (Mizoue, L et al., Biochemistry, 38: 1402-1414 (1999)), и выполняли ЯМР эксперимент по наблюдению Nгетероядерной одноквантовой когерентности (N-Heteronuclear Single Quantum Coherence) (HSQC). ЯМР образцы получали в 20 мМ ацетатном буфере (pH 5,0) и 80% DO (эксперимент кросс-насыщения) или 5% DO (другие эксперименты). Все ЯМР эксперименты выполняли на спектрометре 700 MHz Bruker Avance, оборудованном криогенным зондом, при температуре 45°C.
15
1
N
Добавление немеченного Fab индуцировало спектральное изменение фракталкина, указывая на взаимодействие между меченным фракталкином и Fab. Последующее выделение N and H основной цепи фракталкина в комплексе с Fab получали из 3D спектра FFNCA.
Эксперимент кросс-насыщения является одним из наиболее точных ЯМР методов для определения связывающей области контакта взаимодействия белок-белок (Takahashi, H et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 7: 220-223 (2000)). В результате этого эксперимента интенсивность сигналов нескольких остатков уменьшилась за счет селективного излучения Fab (фиг.14). Эти остатки были локализованы в двух отдельных смежных участках. Один участок состоит из E66-Q69, а другой участок состоит из W81-Q87. Более того, на химические сдвиги этих остатков сильное влияние оказывает добавление Fab, что подтверждает данные кросс-насыщения (фиг.14). На основании этих результатов было сделано заключение, что эти участки включены в область контакта с Fab.
Другие варианты осуществления
Из вышеприведенного описания очевидно, что в раскрытом здесь изобретении могут быть сделаны изменения и модификации с целью его адаптации к различным применениям и условиям. Такие варианты осуществления также входят в объем приведенной ниже формулы изобретения.
Все упомянутые в настоящем описании публикации включены здесь путем ссылки, как если бы в отношении каждой из этих публикаций или заявки на патент было специально и особо указано, что она включена в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки.