АНАЛИЗ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИКИРОВАННЫХ ГЕМОГЛОБИНОВ ПОСРЕДСТВОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА, БУФЕРНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И НАБОРЫ ДЛЯ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ANALYSIS AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF GLYCATED HEMOGLOBINS BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS, BUFFER COMPOSITIONS AND KITS FOR CAPILLARY ELECTROPHORESIS

1c
Настоящее изобретение относится к области анализа и количественного определения гликированных гемоглобинов, в частности A гемоглобина, методом капиллярного электрофореза.
Изобретение относится к способу анализа посредством капиллярного электрофореза биологического образца, содержащего один или несколько гемоглобинов и, в частности, один или несколько гликированных гемоглобинов, а также к буферным композициям, которые можно применять для осуществления указанного анализа, и наборам для анализа и количественного определения гликированных гемоглобинов посредством капиллярного электрофореза.
Гемоглобин (Нb) представляет собой глобулярную молекулу, обычно состоящую из четырех субъединиц, каждая из которых представлена полипептидной цепью, конъюгированной с гемом. Полипептидные цепи в совокупности называют «глобиновой частью» молекулы гемоглобина.
Все гемоглобины человека состоят из четырех полипептидных цепей: две группы по две идентичных цепи. В организме взрослого человека обычно присутствуют три типа гемоглобина: гемоглобин А (НbА), составляющий подавляющее большинство (обычно примерно 97% всего гемоглобина взрослого человека) и состоящий из двух альфа-цепей и двух бета-цепей (гемоглобин α2β2); гемоглобин А2 (НbА2) обычно составляет примерно 1-3% гемоглобина взрослого человека), состоящий из двух альфа-цепей и двух дельта-цепей (гемоглобин α2δ2); и фетальный гемоглобин (HbF), состоящий из двух альфа-цепей и двух гамма-цепей (гемоглобин α2γ2), который обнаруживается лишь в следовых количествах (обычно менее 1% гемоглобина взрослого человека) и ограничен определенной популяцией клеток ("F-клетки").
Гемоглобин включает разновидности, известные как минорные; это гликированные гемоглобины.
2
2
Термин «гликированный гемоглобин» (также известный как гликозилированный гемоглобин или гликогемоглобин) соответствует совокупности молекул гемоглобина, модифицированных путем связывания с сахарами, в основном с глюкозой, аминогруппы (NH) глобина; NH-группа гемоглобина конденсируется с альдегидной группой восстанавливающего сахара. Эта реакция, которая является неферментативной, затем стабилизируется в результате перегруппировки Амадори. Потенциальными сайтами гликирования являются N-концевые аминокислоты четырех глобиновых цепей гемоглобина (α-цепи или β-, δ-, γ-цепей - в зависимости от типа гемоглобина) и свободные амино-эпсилон-группы (в частности, из остатков лизина) глобиновых цепей гемоглобина.
Существует множество форм гликированного гемоглобина; форма зависит от количества присоединенных сахаров, природы глобиновых цепей и сахаров, связанных с указанными цепями, и расположения указанных сахаров на глобиновых цепях.
2
Под термином «общий гликированный гемоглобин» подразумевают молекулы гемоглобина, гликированные по любым остаткам NH.
1a
1b
1c
1a
1а
1a1
1a1
1a2
1a2
1b
1b
1c
1с
1c
2
1c
1c
Термин «гемоглобин А1 (НВА1)» используется для обозначения таких молекул гемоглобина, в которых с N-концевой аминокислотой одной или двух бета-цепей белка связана одна молекула сахара. А1 - неоднородная фракция, содержит, в частности, незначительные включения A, A и, особенно, A. Гемоглобин A (НbА) включает в себя гемоглобин A (HbA), в котором сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой, является фруктозо-1,6-дифосфат, и гемоглобин A (HbA), в котором сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой, является глюкозо-6-фосфат. В случае гемоглобина А (НbА) сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой, является пируват. И, наконец, сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой бета-цепи гемоглобина A (НbА), является глюкоза; HbA образуется путем конденсации одной молекулы глюкозы с NH-гpyппoй N-концевого валина бета-цепи с формированием стабильного аминокетона в результате перегруппировки (перегруппировки Амадори) из образованного ранее неустойчивого альдимина (обозначаемого как «лабильный HbA», или npe-A).
Наконец, термин «гемоглобин А0 (НВА0)» обычно включает не-гликированные гемоглобины и гликированные гемоглобины, не имеющие в составе сахаров, связанных с N-концевыми аминокислотами β-цепей.
1c
Гликирование белков (включая гликированные гемоглобины и, в частности, гемоглобин A, наряду с многими другими) вызывается слишком высокой концентрацией сахаров в крови (как, например, в случае диабета). Гликирование белков изменяет их функционирование, вызывает повреждение клеток и тканей, старение сосудов, а также вносит вклад в прогрессирование некоторых заболеваний, таких как атеросклероз, почечная недостаточность, диабетическая ретинопатия и катаракта. После гликирования способность гемоглобина к переносу кислорода снижается.
1с
1c
1c
1с
1c
1с
Среди гемоглобинов всех групп и подгрупп гемоглобин НbА представляет особый интерес, поскольку служит долгосрочным маркером диабетического состояния пациентов. Образование HbA зависит от гликемии (концентрации глюкозы в крови). Тем не менее, оно происходит в течение всего срока жизни эритроцитов, составляющего, как правило, 120 дней. Концентрация HbA в крови, таким образом, является показателем средних уровней гликемии за 2-3 предшествующих количественному определению месяца. Повышение концентрации НbА в крови свидетельствует о длительной гипергликемии в этот период. Концентрация HbA в крови не зависит от краткосрочных колебаний уровней глюкозы в крови. Таким образом, измерение уровней НbА в начале и конце определенного периода времени позволяет отслеживать развитие диабета.
1c
1c
В случае пациентов, страдающих диабетом, целью является достижение концентраций HbA, как можно более близких к характерным для хорошего гликемического баланса. Эталонные значения концентраций НbА в крови не страдающего диабетом человека с нормальной гликемией составляют от 4% до 6% от общей концентрации гемоглобинов А (гликированных и не гликированных гемоглобинов) (т.е. от 20 до 42 ммоль/моль; Panteghini et al, 2007).
1c
Таким образом, распознавание гликированных гемоглобинов, в частности выявление увеличения уровня НbА, представляет интерес для диагностики диабета (типа 1 или типа 2) или мониторинга пациентов с диабетом, в частности для оценки эффективности лечения диабета (типа 1 или типа 2).
Однако интерпретация результатов может в некоторых случаях представлять собой трудную задачу, поскольку множество факторов - в частности, присутствие абнормальных гемоглобинов - может приводить к искажению результатов.
Действительно, у некоторых пациентов встречаются гемоглобины, объединяемые термином «абнормальные» или абберантные, в частности обозначаемые буквами S, С, D, Е, Н и J. Одна или несколько форм абнормальных гемоглобинов частично или полностью замещают гемоглобин А. Абнормальные гемоглобины образуются, в частности, в результате снижения уровней синтеза определенных глобиновых цепей и/или изменения структуры α, β, γ или δ цепей в результате замены одной аминокислоты на другую. Таким образом, модификация бета-цепи может, например, приводить к формированию S- или С-гемоглобинов (α2β2-гемоглобинов, в которых глутаминовая кислота в положении 6 в β-цепи замещена, соответственно, валином или лизином).
1c
1c
1c
1c
1c
Эти абнормальные гемоглобины также восприимчивы к гликированию. Таким образом, существуют гемоглобины S (HbS) и C (HbC), в которых, как и в HbA, одна молекула глюкозы связана с N-концевым валином β-цепи (Abraham et al., 1984).
1c
Методы анализа и количественного определения гликированного гемоглобина и, в частности, гемоглобина HbA могут быть разделены на две большие категории.
Первая и основная категория включает такие методы, как иммунологический анализ и аффинная хроматография. Они основаны на структурных характеристиках молекул сахара, связанных с гемоглобином. Например, в публикации (Wilson et al, 1993) и в патенте США 6162645 описан метод количественного определения гликированного гемоглобина в образце крови человека при помощи аффинной хроматографии. Указанный метод основан на использовании твердой положительно заряженной фазы, связанной через полианионное соединение (например, полиакриловую кислоту) с бороновой кислотой, фенилбороновой кислотой, борной кислотой или аналогичными боронатными соединениями. При инкубации исследуемого образца крови с твердой фазой присутствующие в образце остатки глюкозы в молекулах гликированного гемоглобина образуют комплексы с боронатными соединениями. Молекулы гликированного гемоглобина, таким образом, оказываются прикреплены к твердой фазе. После этого может быть подсчитано отношение количества иммобилизованного на твердой фазе гликированного гемоглобина к количеству не иммобилизованного гемоглобина. Это осуществляется либо путем измерения уменьшения интенсивности флуоресценции (Wilson et al., 1993), либо с помощью меченых антител к гемоглобину человека (US 6,162,645).
Вторая категория методов анализа и количественного определения гликированного гемоглобина включает ионообменную хроматографию или электрофорез. Эти методы основаны на физико-химических характеристиках молекул; используется разница зарядов, существующая между гликированными и не гликированными белками.
1c
В числе разнообразных описанных в литературе аналитических методов, позволяющих осуществить количественное определение гликированного гемоглобина, электрофоретические методы подразделяют на несколько категорий: гельэлектрофорез, включающий изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле (Beccaria, 1978; Simon, 1982; Stickland, 1982; Bosisio, 1994) и электрофорез в агарозном геле (US 5,246,558; US 4,222,836; Menard, 1980). Методы капиллярного электрофореза включают изоэлектрофокусирование (Molteni, 1994; Hempe, 1994), анализ в свободном растворе с использованием анти-A антител (патент США 5431793), анализ в свободном растворе с использованием капилляра без покрытия (US 5,599,433) и анализ в свободном растворе с динамическим нанесением фазы (ЕР 0 733 900 А2; US 5,611,903).
1
0
1
0
1
0
С помощью электрофоретического анализа биологического образца можно разделить различные белки, присутствующие в образце, в частности различные гемоглобины, а также определить количество и/или относительное содержание одного или нескольких представляющих интерес белков в биологическом образце. В процессе капиллярного электрофореза в заполненной электролитом капиллярной колонке характер движения белков биологического образца от анода к катоду под действием электрического поля зависит от их массы и заряда. Таким образом, формируется профиль электрофоретической миграции, включающий ряд пиков (также называемых фракциями), каждый из которых соответствует одному или нескольким белкам. Абнормальные гемоглобины, такие как HbS, НbС и НbЕ, имеют отличную от характерной для НbА электрофоретическую подвижность. Кроме того, из-за остатка сахара, связанного с N-концевой аминокислотой в бета-цепи, HBA свойственно меньшее значение изоэлектрической точки и, как результат, электрический заряд, немного отличающийся от характерного для других гемоглобинов НВА-типа. Таким образом, в электрофоретическом поле или в ионообменной смоле скорость миграции HBA отличается от скорости НВА, что позволяет отделить HBA от НВА, имеющего другой заряд.
Преимущество капиллярного электрофореза также заключается в том, что для анализа требуются очень небольшие количества биологического образца. Кроме того, разделение с помощью этой методики может быть очень быстрым, поскольку может быть использовано высокое напряжение без опасности перегрева образца во время разделения.
3
4
1c
1c
0
Анализ методом изоэлектрической фокусировки (Molteni, 1994; Hempe, 1994) осуществляют в закрытых капиллярах. Для изоляции используют метилцеллюлозу. В качестве католита используют гидроксид натрия (NaOH), в качестве анолита - фосфорную кислоту (НРО). Использование амфолитов при этом методе анализа дает возможность выделения различных вариантов гемоглобина, в том числе HbA, пик которого очень близок к пику НbА (Δрl<0,10). Несмотря на то что данный метод хорошо работает, он не является простым для рутинного проведения и требует большой точности, в частности в отношении диапазонов рН амфолитов (изоэлектрическая точка (pl) НbА очень близка к таковой НВА).
1c
1c
1c
1c
1c
1c
1c
1c
1c
1c
Анализ в свободном растворе с использованием анти-HbA антител (US 5,431,793) проводят в боратном буфере при основных значениях рН (рН от 8 до 10), с использованием образцов, обработанных моноклональными антителами анти-НbА. Точнее говоря, первую электрофореграмму получают с использованием рабочего образца без предварительной реакции с антителами анти-HbA. Получают единственный пик площадью х, содержащий все гемоглобины (включая НbА). Вторую электрофореграмму получают путем анализа рабочего образца, обработанного антителами к HbA. Определяют таким образом несвязанные анти-НbА антитела, комплексы анти-HbA/HbA, что обеспечивает разделение не связанных с антителами гемоглобинов. Количество HbA в этом случае определяют по разности площади под пиком первой электрофореграммы и площади под пиком второй электрофореграммы, соответствующим гемоглобинам, не связанным с анти-НbА антителами (площадь у), т.е. подсчитывают разность площадей х-у. Этот метод, таким образом, является времязатратным и сложным для реализации.
1
1c
0
1а,b
1c
0
1
1
При анализе в свободном растворе с использованием капилляров без покрытия (US 5,599,433) используют образующий комплекс с сахаром агент, связанный с гемоглобином (борат) и цвиттерионный буфер (CAPS) при основных значениях рН (рН от 9 до 12). На полученном в описанных условиях профиле (показанном на рисунке 1 настоящей заявки) видно довольно незначительное разделение пиков HbA (описанного как пик HbA в патенте US 5,599,433) и НbА (см. пример 1). Кроме того, анализ очищенных минорных фракций показывает, что фракции НbА мигрируют совместно с HbA, влияя на конечный результат количественного определения (см. пример 2 и рисунок 2 настоящей заявки). Фактически, данная методика позволяет отделить фракции НbА и HbA, но не сами фракции HbA.
1с
Методика капиллярного анализа с двойным динамическим покрытием (ЕР 0 733 900 А2; US 5,611,903) используется в единственном тесте на основе капиллярного электрофореза, который является коммерчески доступным (Analis CEofix ™ НbА). Он состоит из первой промывки капилляра «инициатором», содержащим поликатион (в растворе, рН 4,6), что обеспечивает покрытие стенок капилляра указанным поликатионом. Затем осуществляют вторую промывку аналитическим буфером, содержащим полианион (рН 4,6), обеспечивающий образование второго слоя покрытия за счет взаимодействия с поликатионом. Отрицательный электрический заряд, формирующийся таким образом на внутренних стенках капилляра, даже выше, чем в капилляре без покрытия, что обеспечивает значительно более интенсивный электроосмотический ток. Разрешение метода при анализе различных форм гемоглобина (в том числе гликированных гемоглобинов А1) является удовлетворительным, анализ занимает короткое время. На пректике описанное двойное покрытие нужно обновлять перед каждым новым анализом, используя точный протокол, предусмотренный производителем набора, однако он описан только для монокапиллярных аппаратов (Р/АСЕ, Beckman), не приспособленных для рутинного анализа.
1с
1а
1b
1с
Таким образом, существует потребность в реагентах и простом способе, позволяющих эффективно отделять гликированные гемоглобины, в частности НbА, от других гемоглобинов, абнормальных форм, смешанных форм (лабильных, ацетилированных, карбамилированных форм) и других минорных фракций (в особенности от НbА и НbА), присутствующих в биологических образцах, содержащих другие гемоглобины. В идеале такой способ будет обеспечивать проведение полуколичественного или количественного определения гликированного гемоглобина, в частности НbА, непосредственно на основании получаемого электрофоретического профиля.
В настоящем изобретении предложен альтернативный способ капиллярного электрофореза, позволяющий осуществить полуколичественный или количественный анализ одного или нескольких гликированных гемоглобинов, включающих по меньшей мере одну цепь глобина, включающую остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении, содержащихся в биологическом образце, в частности включающем другие гемоглобины (гликированные и/или не гликированные). В указанном методе, предложенном в настоящем изобретении, использованы как структурные характеристики молекул глюкозы, связанных с указанными гликированными гемоглобинами, так различия в зарядах, существующие между различными гемоглобинами из образца.
1с
Авторы изобретения показали, что использование определенной буферной композиции обеспечивает значительно лучшее разделение гликированных гемоглобинов, содержащих остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении, хотя бы на одной цепи глобина, в частности, на бета-цепях, и, в частности значительно улучшить отделение HbА.
1с
1
1с
1b
1c
Одним из преимуществ способа согласно настоящему изобретению является то, что использование указанной буферной композиции обеспечивает смещение электрофоретического пика, соответствующего одному или нескольким видам представляющих интерес гликированных гемоглобинов (одного или нескольких типов гемоглобинов, содержащих остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении, хотя бы на одной цепи глобина, например НbА), если таковой присутствует в биологическом образце, по отношению к положению пика, который может быть получен без использования буферной композиции. Это смещение не влияет на разделение других белков, в частности других гемоглобинов (гликированных и/или не гликированных) из образца. Это, в частности, позволяет отделить HbAic от других минорных НbА (в частности, НbА и НbА). Соответственно, предложенный способ позволяет получить достоверные результаты и провести точное количественное определение одного или нескольких представляющих интерес гликированных гемоглобинов, имеющих в составе один или несколько остатков глюкозы, где один остаток глюкозы связан с аминокислотой в N-концевом положении по меньшей мере в одной цепи глобина (например, гемоглобина A).
Таким образом, способ согласно настоящему изобретению представляет собой способ выбора для постановки диагноза или для мониторинга состояния пациентов с диабетом, в частности, для оценки эффективности антидиабетического лечения.
Таким образом, в данной заявке предложен способ анализа посредством капиллярного электрофореза гликированных гемоглобинов (одного или нескольких гликированных гемоглобинов), включающих один или несколько остатков глюкозы, содержащихся в биологическом образце, содержащем один или несколько гемоглобинов; причем указанный способ включает использование буферной композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение, способное специфично связываться с остатками глюкозы (одним или несколькими остатками) в составе гликированных гемоглобинов (одного или нескольких гликированных гемоглобинов) биологического образца, а также обеспечивающего формирование отрицательного электрического заряда(ов) на указанных гликированных гемоглобинов в щелочной среде (например, при значениях рН более 7).
Термин «несколько» в настоящей заявке означает «по меньшей мере два», т.е. два или более двух, например два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и более десяти.
Термин «по меньшей мере один» в настоящей заявке означает «один или несколько».
Термин «гемоглобин» в настоящей заявке означает любую форму или фракцию гемоглобина (в том числе второстепенные фракции), включая нормальные или абнормальные гемоглобины, а также разнообразные варианты указанных гемоглобинов (было описано по меньшей мере 1000 вариантов гемоглобина).
Термин «гликированный гемоглобин» в настоящей заявке означает любой гемоглобин, модифицированный путем связывания одной или нескольких молекул сахара (сахаров), в частности одной или нескольких молекул глюкозы, глюкозо-6-фосфата, фруктозо-1-6-дифосфата или пирувата, с одной или несколькими глобиновыми цепями (любой (любыми) из глобиновых цепей). Сахар или сахара могут быть связаны с аминокислотой в N-концевом положении цепи глобина и/или аминокислотой со свободной аминокислотной группой (например, лизином).
1
1c
Термин «глобиновая цепь» в настоящей заявке означает любую цепь глобина из известных специалистам, в частности цепь, выбранную из цепей альфа (α), бета (β), дельта (δ) и гамма (γ) как нормальных, так и абнормальных, или вариант одной из указанных цепей. В одном варианте осуществления указанная «глобиновая цепь» является бета-цепью, например бета-цепью гемоглобина A, в частности A, S или С.
В случае, когда в описании вариантов осуществления изобретения упоминается «гликированный гемоглобин», следует понимать, что указанные варианты осуществления применяют в отношении каждого конкретного типа гликированного гемоглобина, упомянутого в настоящей заявке.
Если не указано иное, каждый вариант осуществления из перечисленных в этой заявке применяют самостоятельно и/или в комбинации с любым одним или несколькими другими описанными вариантами.
Способ анализа посредством капиллярного электрофореза согласно настоящему изобретению можно применять для биологических образцов, содержащих по меньшей мере один гликированный гемоглобин, содержащий один или несколько остатков глюкозы и обязательно содержащий в составе одной или нескольких глобиновых цепей, в частности бета-цепи, остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении. Такие гемоглобины в настоящей заявке обозначаются как «гемоглобины, гликированные по N-концевому участку».
Указанный способ обеспечивает отделение одного или более гемоглобинов, гликированных по N-концевому участку, от других гликированных гемоглобинов (например, гликированных гемоглобинов, глобиновые цепи которых не содержат остатков глюкозы, связанных с аминокислотой в N-концевом положении) или от не-гликированных гемоглобинов, которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце.
В определенном варианте осуществления аминокислота в N-концевом положении на бета-цепи (цепях) является валином.
1с
1с
1a
1b
В предпочтительном варианте осуществления способ анализа согласно настоящему изобретению предназначен для анализа биологических образцов, содержащих гемоглобин А. В частности, он подходит для отделения гемоглобина А от других гемоглобинов, или от определенных гемоглобинов (гликированных иным образом или не гликированных), которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце, и, в частности, от гемоглобинов других минорных фракций, например от НbА и от НbА.
1c
1с
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, метод анализа согласно настоящему изобретению позволяет отделить гемоглобин S и/или гемоглобин С от других гемоглобинов (гликированных иным образом или не гликированных), которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце.
Термин "буферная композиция" означает состав, в частности раствор, который сохраняет приблизительно одинаковый уровень рН при добавлении небольших количеств кислоты или щелочи или при разбавлении.
Термином «связываться с образованием комплекса» или «образовывать комплекс» в настоящей заявке обозначается связывание (химическое или просто физическое) между двумя объектами, в частности между двумя молекулами (например, небольшой молекулой и макромолекулой), посредством функциональных групп.
В предпочтительном варианте осуществления одна из этих двух молекул (соединение, способное к образованию комплексов с остатками глюкозы) связывается (например, вступает в реакцию) с цис-диольной группой, в частности с двумя соседними гидроксильными группами остатков глюкозы, другой молекулы (гликированного гемоглобина).
Как можно увидеть из раздела «Примеры», «специфичное связывание с остатком (остатками) глюкозы одного или нескольких гликированных гемоглобинов с образованием комплексов и формирование отрицательного заряда на указанных гликированных гемоглобинах при основных значениях рН» в рамках настоящей заявки означает, что соединение, используемое в контексте настоящего изобретения, позволяет сместить пик электрофоретической миграции, соответствующий гемоглобинам, гликированным глюкозой по N-концевому участку, за пределы зоны электрофоретической миграции, соответствующей гемоглобинам, гликированным по N-концевому положению другими сахарами (например, глюкозо-6-фосфатом, фруктозо-1-6-дифосфатом или пируватом), и, желательно, за пределы зон пиков электрофоретической миграции, соответствующих другим гемоглобинам в образце.
1a
1b
1с
Таким образом, минорные фракции, которые не содержат остатков глюкозы, связанных с N-концевой аминокислотой в бета-цепи, в частности фракции A и A, не мешают анализу НbА, выполняемому способом согласно настоящему изобретению.
1a
1b
1c
0
0
1c
0
1b
1a
1с
0
1с
0
1b
1а
1с
1b
1
0
1b
1а
Например, способность соединения специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы одного или нескольких гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование отрицательных зарядов при основных значениях рН в контексте настоящего изобретения может быть продемонстрирована при помощи следующего теста: эталонный образец (например, "смесь HbA и HbA, "A" и "А" от Exocell, США), содержащий различные очищенные фракции гликированного гемоглобина и, в частности, фракции А и A или фракции А, A и A, вводят в капилляр для капиллярного электрофореза, содержащий следующую буферную композицию: 200 мМ CHES, 20 мМ путресцина, от 10 до 120 мМ (например, 30 мМ или 50 мМ) тестируемого соединения, при необходимости - 2,5 г/л хлорида натрия, воду, и, при необходимости, основание для доведения рН до значений более 9, например до 9,4. Проводят капиллярный электрофорез в свободном растворе в капиллярах без покрытия, например, с использованием аппарата Capillaries (Sebia) на длине волны 415 нм. Затем исследуют полученный электрофоретический профиль; если наблюдается разделение пика, относящегося к НbА, и пика, относящегося к НbА (или, в зависимости от типа используемого образца, пика, относящегося к НbА, и пиков, относящихся к HbA, НbА и НbА), следовательно, тестируемое соединение признается способным к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы и к обеспечению формирования отрицательных зарядов при основных значениях рН в контексте настоящего изобретения. Напротив, если пик, соответствующий НbА, и пик, соответствующий HbA (или, в зависимости от типа используемого образца, пик, соответствующий НbАс, и пики, соответствующие HbA, НbА или НbА), накладываются или перекрываются, то тестируемое соединение не считается подходящим для осуществления способа согласно настоящему изобретению.
1c
1с
Концентрация тестируемого соединения в тесте, описанном выше, дается исключительно в справочных целях; если концентрация тестируемого соединения 10-120 мМ не может обеспечить достаточного расстояния между пиком, соответствующим НbА, и пиком, соответствующим другим гемоглобинам в образце, в условиях описанного выше теста, допустимо превышение границ этого диапазона концентраций для получения оптимального разделения пиков, соответствующих НbА.
Любое химическое соединение (т.е. обычно органическая молекула), любое антитело, полипептид, пептид или любое другое соединение, способное специфично связываться с образованием комплекса с остатками глюкозы и обеспечивать формирование отрицательных зарядов при щелочных значениях рН в условиях согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в настоящем изобретении. Соответствующие антитела могут быть созданы любым известным специалистам способом, и могут, например, быть поликлональными или моноклональными антителами, химерными антителами или фрагментами антител, например Fab-фрагментами.
1с
Как можно увидеть из раздела «Примеры», борная кислота не является химическим соединением, способным к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы и формированию отрицательных зарядов при щелочных значениях рН согласно настоящему изобретению, и не позволяет выполнить надежный анализ и, в частности, надежное измерение гликированных гемоглобинов и, в частности, НbА. Примеры подходящих химических соединений более подробно описаны ниже.
Каждый остаток глюкозы в комплексе с соединением, способным к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы, взаимодействует с отдельной молекулой соединения.
1с
1c
1с
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, согласно которому соединение присутствует в достаточном количестве в буферной композиции согласно настоящему изобретению, указанное соединение, в частности, способно к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы в N-концевых положениях гликированного гемоглобина, т.е. к специфичному связыванию указанных остатков глюкозы в каждой цепи глобина (в частности, бета-цепях), содержащей остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении. Указанное соединение, таким образом, способно специфично образовывать комплекс с каждым остатком глюкозы, связанным с N-концевым положением бета-цепей гемоглобинов А, S или С.
В соответствии с конкретнвм вариантом осуществления, когда соединение присутствует в буферной композиции согласно настоящему изобретению в достаточном количестве, указанное соединение способно специфично образовывать комплекс со всеми остатками глюкозы гликированных глюкозой по N-концевому положению гемоглобинов.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, в случае когда соединение присутствует в буферной композиции согласно настоящему изобретению в достаточном количестве, указанное соединение способно специфично образовывать комплексы со всеми остатками глюкозы в составе гемоглобина, независимо от их положения на глобиновой цепи (гемоглобиновых цепях). Таким образом, когда указанное соединение присутствует в достаточном количестве в буферной композиции согласно настоящему изобретению, молекула гемоглобина, содержащая х остатков глюкозы, может связать х молекул указанного соединения.
Посредством специфичного комплексообразования с одним или несколькими остатками глюкозы гликированных гемоглобинов из биологического образца, указанное соединение обеспечивает формирование на указанном гликированном гемоглобине или гемоглобинах нескольких отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН, то есть позволяет дозарядку этих гликированных гемоглобинов отрицательными электрическими зарядами при щелочных значениях рН.
Таким образом, указанные соединения обеспечивают образование нескольких электрических зарядов на каждом остатке глюкозы в составе комплекса на одном и том же гемоглобине при щелочных значениях рН. Благодаря такому формированию отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН электрофоретическая подвижность гемоглобинов, содержащих по меньшей мере один остаток глюкозы, изменяется в результате образования комплекса с указанным соединением. Это проявляется на электрофоретическом профиле в виде смещения электрофоретического пика или пиков, соответствующих гликированным гемоглобинам, содержащим один или несколько остатков глюкозы, которые присутствуют в анализируемом биологическом образце.
Все гемоглобины, содержащие по меньшей мере один остаток глюкозы, которые присутствуют в биологическом образце, образуют комплекс с соединением, образующим комплексы с глюкозой и формирующим отрицательные электрические заряды при щелочных значениях рН (конечно, при условии, что указанное соединение присутствует в достаточном количестве, чтобы образовать комплекс с каждым из этих гемоглобинов). Тем не менее, различные гемоглобины и, в частности, различные гемоглобины, содержащие по меньшей мере один остаток глюкозы, имеют различные изоэлектрические точки (в зависимости от природы глобиновых цепей, количества и расположения остатков глюкозы на этих глобиновых цепях; количества, природы и расположения других сахаров, которые могут быть связаны с указанными гемоглобинами). Благодаря формированию отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН в результате образования комплекса с участием указанного соединения и каждого остатка глюкозы, разница в зарядах между этими различными гемоглобинами даже более выражена, когда они существуют в форме комплекса с указанным соединением.
1с
1
Таким образом, гликированные гемоглобины, включающие остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении в составе по меньшей мере одной из глобиновых цепей (в частности, в составе бета-цепей), содержат по меньшей мере на одну молекулу глюкозы больше, чем другие гемоглобины (гликированные иным образом или негликированные). В частности, гемоглобин А имеет в составе бета-цепи по меньшей мере на одну молекулу глюкозы больше, чем другие минорные фракции гемоглобина A. Как следствие, в процессе комплексообразования, описанного в настоящем изобретении, эти гемоглобины, гликированные по N-концевым участкам, приобретают больший отрицательный электрический заряд при щелочных значениях рН за счет указанного соединения, по сравнению с другими гемоглобинами (гликированными гемоглобинами, не содержащими остатков глюкозы, связанных с N-концевыми аминокислотами глобиновых цепей, или не гликированными гемоглобинами).
1с
1
Таким образом, за счет увеличения разницы в электрофоретической подвижности, существующей между различными гемоглобинами, содержащими глюкозу, и/или между одним или несколькими гемоглобинами, содержащими глюкозу, и другими гемоглобинами, присутствующими в анализируемом биологическом образце, достигается лучшее отделение одного или более гемоглобинов, гликированных по N-концевому положению и других гемоглобинов, которые могут присутствовать в указанном образце, в частности гемоглобина А, от других минорных фракций гемоглобина A, которые могут присутствовать в указанном образце.
1с
1с
1с
1
1a
1b
Таким образом, способ согласно настоящему изобретению позволяет эффективно отделить гемоглобины, гликированные по N-концевому положению, в частности НbА, от других гемоглобинов, некоторых вариантных гемоглобинов и других минорных фракций, присутствующих в биологическом образце, содержащем другие гемоглобины. Кроме того, молекулы, обычно мешающие проведению анализа, такие как лабильные, ацетилированные или карбамилированные формы, не мешают количественному определению НbА при использовании способа согласно настоящему изобретению. В частности, способ согласно настоящему изобретению позволяет избежать помех, которые могут возникать в отсутствие отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН, формирующихся при образовании комплекса, в результате совместной миграции гемоглобина А и других минорных фракций гемоглобина A (в том числе НbА и НbА), присутствующих в биологическом образце, в ходе электрофоретического разделения.
1с
1
1a
1b
Отделенные гемоглобины, гликированные по N-концевым положениям, могут быть затем количественно проанализированы в присутствии других неизвестных или определенных гемоглобинов, которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце. Таким образом, например, может быть проведено количественное определение НbА в присутствии других минорных фракций гемоглобина A и, в частности, в присутствии НbА и/или НbА, без помех со стороны данных минорных фракций, присутствующих в анализируемом биологическом образце.
Под термином "количественно анализировать" или "количественное определять" в настоящей заявке понимается определение количества представляющего интерес гемоглобина(ов), возможно, в присутствии одного или нескольких других гемоглобинов в анализируемом биологическом образце и/или доли количества указанного гемоглобина(ов) по отношению к общему количеству гемоглобина или к количеству некоторых гемоглобинов, присутствующих в указанном образце.
1с
1с
1с
0
1с
0
1с
0
2
Анализ, проводимый согласно настоящему изобретению, может быть полуколичественным; в этом случае измеряют процентное содержание данного гемоглобина относительно количества другого гемоглобина или других гемоглобинов, присутствующих в указанном образце. Таким образом, в случае НbА, как правило, измеряют процентное содержание НbАотносительно количества одного или нескольких других гемоглобинов; как правило, площадь электрофоретического пика, соответствующего НbА, делят на площадь пика, соответствующего НbА, или на сумму площадей пика, соответствующего НbА, пика, соответствующего НbА, или на сумму площадей всех пиков НbА, или на сумму площадей пика, соответствующего НbА, и пика, соответствующего НbА, и пика, соответствующего НbА, или даже на общую площадь всего электрофоретического профиля.
1с
Анализ может также быть количественным; результаты затем выражают в миллимолях (ммоль) данного гемоглобина на моль другого гемоглобина или других гемоглобинов, присутствующих в указанном образце, например количество ммоль НbА на моль НbА.
В определенном варианте осуществления настоящего изобретения соединение, специфично связывающееся с образованием комплекса с остатком(ами) глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивающее формирование на указанных гликированных гемоглобинах отрицательных зарядов при щелочных значениях рН, содержит несколько функциональных групп, в частности две или более двух функциональных групп.
По меньшей мере одна из указанных функциональных групп специфично связывает с образованием комплекса остаток глюкозы (в частности, остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении цепи глобина), взаимодействуя, например, с цис-диольной группой, в частности с двумя соседними гидроксильными группами остатка глюкозы. Например, эта группа или эти группы могут быть бороновыми группами, в частности бороновыми группами, определенными в настоящей заявке.
Указанная группа, образующая комплекс с глюкозой (или группы), может обеспечить формирование при щелочных значениях рН на гликированном гемоглобине одного отрицательного электрического заряда на каждый входящий в состав комплекса остаток глюкозы, то есть формирование одного или нескольких отрицательных зарядов при щелочных значениях рН на каждую комплексообразующую молекулу гемоглобина (формируется один отрицательный заряд, если молекула гемоглобина включает в себя только один остаток глюкозы, и n отрицательных зарядов, если молекула гемоглобина включает n остатков глюкозы).
Другая, одна из других или другие функциональные группы указанного соединения (то есть функциональная группа или группы, не образующие комплекс с глюкозой) обеспечивают формирование на гликированном гемоглобине одного или нескольких отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН на каждый входящий в состав комплекса остаток глюкозы молекулы указанного гемоглобина.
Таким образом, в этом конкретном варианте осуществления изобретения каждая молекула соединения, специфично связывающего остатки глюкозы с образованием комплекса, согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну функциональную группу, способную специфично образовывать комплекс с остатком глюкозы в составе гликированного гемоглобина (и, в частности, N-концевой остаток глюкозы гемоглобина, гликированного по N-концевому положению), и по меньшей мере одну функциональную группу, которая не образует комплекса с глюкозой, но увеличивает заряд указанного гликированного гемоглобина отрицательными зарядами при щелочных значениях рН, поскольку придает указанному гликированному гемоглобину один или несколько дополнительных отрицательных зарядов при щелочных значениях рН. Функциональная группа, способная специфично образовывать комплекс с глюкозой, может также обеспечивать формирование отрицательного электрического заряда при щелочных значениях рН.
В конкретном варианте осуществления изобретения соединение, специфично образующее комплексы с остатками глюкозы и обеспечивающее формирование отрицательного электрического заряда при щелочных значениях рН (точнее, каждая молекула указанного соединения), придает молекуле гликированного гемоглобина, в частности гемоглобина, гликированного по N-концевому участку, несколько отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН на каждый участвующий в образовании комплекса остаток глюкозы указанной молекулы гликированного гемоглобина. В предпочтительном варианте она придает молекуле гликированного гемоглобина по меньшей мере два (в частности, два, три, четыре, пять или шесть) отрицательных электрических заряда при щелочных значениях рН на каждый участвующий в образовании комплекса остаток глюкозы.
В конкретном варианте осуществления изобретения, функциональная группа или по меньшей мере одна из функциональных групп, специфично образующих комплексы с остатками глюкозы, имеет отрицательный заряд при щелочных значениях рН.
В конкретном варианте осуществления изобретения, соединение, способное специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование отрицательных зарядов на указанных гликированных гемоглобинах при щелочных значениях рН, содержит одну или несколько групп, ионизируемых (в частности, анионируемых) при щелочных значениях рН. Указанное соединение может быть различных типов. Например, данное соединение может включать один или несколько карбоксилатов, карбоксилов, сульфонатов и/или сульфонилов. Указанное соединение может быть, в частности, поликарбоновой кислотой; в частности дикарбоновой или трикарбоновой кислотой. Указанное соединение также может быть полисульфоновой кислотой, в частности дисульфоновой или трисульфоновой кислотой.
В конкретном варианте осуществления изобретения, группа, одна из групп или группы, обеспечивающие формирование одного или нескольких отрицательных зарядов на молекуле гликированного гемоглобина при щелочных значениях рН на каждый участвующий в образовании комплекса остаток глюкозы указанного гликированного гемоглобина, содержат или представляют собой одну или несколько групп, ионизируемых при щелочных значениях рН, в значении, определенном в настоящей заявке, и, в частности, одну или несколько (в частности, два или три) карбоксилатных, карбоксильных, сульфонатных и/или сульфонильных групп.
В конкретном варианте осуществления изобретения группа, одна из групп или группы, способные специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы, содержат или представляют собой одну или несколько боронатных групп.
В настоящей заявке термин "боронатная группа" означает группу, имеющую формулу:
1
где D и D2 выдраны независимо друг от друга из гидроксильной группы и группы, способной гидролизоваться с образованием гидроксильной группы в водном растворе, в частности, при щелочных значениях рН.
2
В конкретном варианте осуществления изобретения, указанная боронатная группа представляет собой группу -В(ОН) (известную также как боронильная группа) или ионизированную форму, в частности .
В конкретном варианте осуществления изобретения, соединение, способное специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование отрицательных зарядов на указанных гликированных гемоглобинах при щелочных значениях рН, представляет собой:
2
(i) боронатное соединение общей формулы RB(OH) (соединение, известное также как бороновая кислота) или общей формулы , где группа R содержит по меньшей мере один арил и/или алкил (линейный, разветвленный или циклический) и/или аралкил и/или комбинацию таковых; указанная группа R придает гликированным гемоглобинам один или несколько отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН на каждый остаток глюкозы, образующий комплекс с боронатной группой; или
(ii) соль указанного боронатного соединения.
Таким образом, при щелочных значениях рН, в дополнение к отрицательному электрическому заряду при щелочных значениях рН, обеспечиваемому боронилом или боронатом из боронатного соединения или его соли, группа R придает гликированным гемоглобинам один или несколько дополнительных отрицательных электрических зарядов на каждый остаток глюкозы, образующий комплекс с боронильной или боронатной группой.
2
В контексте настоящего изобретения термин «соединение общей формулы RB(OH)» также означает ионную форму, находящуюся в равновесии с указанным соединением, в частности , или любую форму, которая способна находиться в равновесии с указанным соединением в определенных условиях среды.
В контексте настоящей заявки, термин «соль» означает любую соль и, в частности, натриевую, литиевую или калиевую соль.
Группа R боронатного соединения согласно настоящему изобретению может также включать другие функциональные группы и/или гетероатомы, в дополнение к арильной, алкильной, аралкильной функциям или одной из их комбинаций.
В конкретном варианте осуществления на каждый остаток глюкозы, образующий комплекс с боронильной или боронатной группой боронатного соединения согласно настоящему изобретению или его соли, группа R придает два или более (предпочтительнее два) отрицательных электрических заряда при щелочных значениях рН.
В конкретном варианте осуществления группа R состоит из одного или нескольких арилов, алкилов (линейных, разветвленных или циклических) и/или аралкила(ов) и/или комбинации указанных групп.
В конкретном варианте осуществления арил(ы), алкил(ы), аралкил(ы) или другие функциональные группы и/или гетероатомы или их комбинации, присутствующие в группе R боронатного соединения согласно настоящему изобретению, могут быть замещенными.
Термин "замещенный» в настоящей заявке может обозначать моно-замещенный или, напротив, полизамещенный, в частности дву-, три-, тетра-, пента- или гекса- замещенный.
Заместители могут представлять собой, в частности, группы, ионизируемые (в частности, анионируемые) при щелочных значениях рН в значении, определенном в настоящей заявке. Группа R может включать один или несколько гетероатомов или других функциональных групп.
В конкретном варианте осуществления изобретения группа R боронатного соединения обеспечивает формирование на молекуле гликированного гемоглобина одного или нескольких отрицательных зарядов при щелочных значениях рН на каждый участвующий в образовании комплекса остаток глюкозы. Предпочтительно, чтобы при щелочных значениях рН она обеспечивала формирование на молекуле гликированного гемоглобина одного, двух, трех или четырех отрицательных электрических зарядов на каждый участвующий в образовании комплекса остаток глюкозы.
Боронатное соединение, определенное выше, включает, в частности, бороновые кислоты и, в частности, фенилбороновые кислоты.
В конкретном варианте осуществления изобретения соединение, способное специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование отрицательных зарядов на указанных гликированных гемоглобинах при щелочных значениях рН, представляет собой полизамещенный фенилборат, в частности двузамещенный фенилборат, например двузамещенный карбоксильной и/или сульфонильной группами.
В конкретном варианте осуществления изобретения группа R боронатного соединения или его соли представлет собой двухосновную кислоту, в частности двуосновную карбоновую кислоту. В конкретном варианте осуществления изобретения, боронатное соединение представляет собой дикарбоксифенилбороновую кислоту, предпочтительно 3,5-дикарбоксифенилбороновую или 3,4- дикарбоксифенилбороновую кислоту.
Таким образом, используемое боронатное соединение может представлять собой, например, 3,5- дикарбоксифенилбороновую кислоту (3,5-dCPBA). Это соединение является коммерчески доступным, в частности, от компании-поставщика Combi-blocks Inc. (San Diego, США) под торговым наименованием «3,5-дикарбоксифенилбороновая кислота» и компании Apollo Scientific Ltd (Cheshire, Великобритания) под торговым наименованием «3,5-дикарбоксибензенбороновая кислота».
В буферной композиции согласно настоящему изобретению концентрация соединения, способного специфично образовывать комплексы с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование на указанных гликированных гемоглобинах отрицательных зарядов при щелочных значениях рН, обычно стехиометрически избыточна относительно общего количества белков, в частности относительно общего количества всех гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце, или относительно общего количества всех содержащих глюкозу гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце. Таким образом, количество этого компонента в буферной композиции больше количества, необходимого для того, чтобы все остатки глюкозы гемоглобинов, присутствующих в образце, были связаны с указанным соединением при разведении образца или аликвоты образца в буферной композиции. Таким образом, на каждую молекулу гликированного гемоглобина, присутствующую в анализируемом биологическом образце, приходится по меньшей мере столько же молекул данного соединения в буферной композиции, сколько остатков глюкозы содержится в данной молекуле гликированного гемоглобина. Это позволяет достичь полного разделения представляющего интерес гликированного гемоглобина или гликированных гемоглобинов и других гемоглобинов, также присутствующих в анализируемом биологическом образце.
В конкретном варианте осуществления изобретения в буферной композиции согласно настоящему изобретению концентрация соединения, способного специфично связываться с образованием комплекса с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование на указанных гликированных гемоглобинах отрицательных зарядов при щелочных значениях рН, находится в диапазоне от 0,10 до 100 мМ, предпочтительно в диапазоне от 10 до 60 мМ и еще более предпочтительно в диапазоне от 20 до 50 мМ, например 30 мМ или 50 мМ.
Выражение "в диапазоне от х до у" в настоящей заявке означает, что предельные значения х и у включены в обозначенный диапазон х-у.
В конкретном варианте осуществления буферная композиция согласно настоящему изобретению содержит:
- буферное соединение с рКа в диапазоне от 8,0 до 11,0; и/или
- замедлитель потока; и/или
- основание; и/или
- соль; и/или
- подходящий разбавляющий раствор, например вода.
Таким образом, буферная композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, включает или представляет собой (i) соединение, способное специфично связываться с образованием комплекса с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование на указанных гликированных гемоглобинах отрицательных зарядов при щелочных значениях рН, и (ii) один или несколько, и, в частности, все компоненты из следующих: буферное соединение, имеющее рКа в диапазоне от 8,0 до 11,0, замедлитель потока, основание, соль, подходящий разбавляющий раствор, (например, воду) и смеси указанных компонентов.
Буферное соединение предпочтительно представляет собой цвиттерионное соединение. Оно может, в частности, быть выбрано из: AMP, AMPD, AMPSO, бицина, CABS, CAPS, CAPSO, CHES, HEPBS, метиламина, TABS, TAPS, таурина, трицина и Tris; в частности могут быть выбраны CAPS, CAPSO или CHES, предпочтительно CHES. Эти соединения обладают высокой буферной емкостью при целевых рН (рН 8-11) и в том числе подходят для получения хорошей фокусировки гемоглобинов.
Концентрация буферного соединения согласно настоящему изобретению, как правило, находится в диапазоне от 20 до 500 мМ, предпочтительно в диапазоне от 50 до 400 мМ и более предпочтительно в диапазоне от 100 до 350 мМ или в диапазоне от 150 до 300 мМ, например приблизительно 200 мМ или приблизительно 300 мМ.
Замедлитель потока предназначен для усиления эффекта различий в электрических зарядах с целью получения хорошего разрешения при разделении различных гемоглобинов. Такие соединения действуют за счет снижения величины электроосмотического потока, что задерживает миграцию различных фракций и может усиливать их разделение. Используемый замедлитель потока может представлять собой алифатический диамин, в частности алифатический диамин из следующих: 1,3-диаминопропан, 1,4-диаминобутан (путресцин), 1,5-диаминопентан (кадаверин), 1-6-диаминогексан, спермин и DETA, или производное указанных алифатических диаминов, или смесь таковых.
Термин "производное" в данном документе означает алифатический полиамин, циклический полиамин, соль (например, натриевую соль) или их смесь.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замедлитель потока выбирают из путресцина, его производных или их смесей.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замедлитель потока представляет собой путресцин, в частности чистый путресцин, в некоторых случаях смешанный с солью.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения замедлитель потока представляет собой гидрохлорид путресцина (или путресцин-2HCl).
В буферной композиции согласно настоящему изобретению концентрация замедлителя потока находится преимущественно в диапазоне от 0,10 до 40 мМ, предпочтительно в диапазоне от 10 до 30 мМ, еще более предпочтительно в диапазоне от 15 до 25 мМ, например 20 мМ.
Основание, в некоторых случаях добавляемое в буферная композиция, позволяет корректировать рН указанного состава. В частности, могут быть использованы основания из группы гидроксидов, в частности могут быть использованы следующие основания: гидроксид лития, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид рубидия, цезия, гидроксид франция; моно-, ди-, три- или тетра-алкил аммония гидроксид и их смеси.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, основание, в некоторых случаях добавляемое в буферная композиция, представляет собой гидроксид натрия.
В предпочтительном варианте соответствующее основание добавляют к буферной композиции с таким расчетом, чтобы ее рН составлял 9,0 или более предпочтительно в диапазоне от 9,0 до 11,0 и более предпочтительно в диапазоне от 9,0 до 10,0; например в диапазоне от 9,3 до 9,5; и еще более предпочтительно получение значений рН=9,4 или 9,5. Основные значения рН более 9 могут способствовать образованию отрицательно заряженных фракций гемоглобина (изоэлектрическая точка гемоглобинов находится в диапазоне от 6,05 до 7,63).
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, соль, в некоторых случаях присутствующая в буферной композиции согласно настоящему изобретению, представляет собой натриевую соль, предпочтительно хлорид натрия. Буферная композиция может содержать, например, 2.5 г/л хлорида натрия.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, когда буферная композиция содержит путресцин, в частности чистый путресцин, она содержит дополнительно соль (в частности, натриевую соль), предпочтительно хлорид натрия, например 2.5 г/л хлорида натрия.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, буферная композиция содержит гидрохлорид путресцина, не содержит хлорид натрия и, предпочтительно, не содержит никакой соли.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, буферная композиция содержит или представляет собой комбинацию следующих компонентов:
- 200 мМ CAPSO;
- 10 мМ путресцина (например, путресцина-2НС1 или чистого путресцина и хлорида натрия);
- 50 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты;
- вода; и
- при необходимости, основание, например гидроксид натрия, обеспечивающее коррекцию уровня рН, например, доведения до значений выше 9 или 10, и, предпочтительно, до значения 10.2;
или, более предпочтительно, из:
- 200 мМ CAPSO;
- 15 мМ путресцина (например, путресцина-2НСl или чистого путресцина и хлорида натрия);
- 100 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты;
- воды; и
- при необходимости, основания, например гидроксида натрия, обеспечивающего коррекцию уровня рН, например, доведения до значений выше 9 или 10, и, предпочтительно, до значения 10.2;
или, еще более предпочтительно, из:
- 200 мМ CHES;
- 20 мМ путресцина (например, путресцина-2НС1 или чистого путресцина и хлорида натрия);
- 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты;
- воды; и
- при необходимости, основания, например гидроксида натрия, обеспечивающего коррекцию уровня рН, например, доведения до значений выше 9, и, предпочтительно, до значения 9.4.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, буферная композиция содержит или представляет собой комбинацию компонентов, указанных выше, в концентрациях, указанных выше, и одной или нескольких солей, в частности натриевой соли, чаще всего хлорида натрия, например 2,5 г/л хлорида натрия.
1c
1a
1b
1с
Как показано в разделе «Примеры», такие буферные композиции позволяют достичь оптимального отделения гемоглобина HbA от других гемоглобинов, присутствующих в анализируемых биологических образцах, а также разделения различных второстепенных фракций друг от друга (в том числе HbA, HbA и НbА), не обеспечиваемого другими модификациями метода капиллярного электрофореза.
Термин «биологический образец» в настоящей заявке означает любую биологическую жидкость, содержащую эритроциты. Указанная биологическая жидкость может быть получена от здорового или больного человека (например, от больного диабетом пациента) или иметь животное происхождение, в частности быть получена от млекопитающего, не являющегося человеком (здорового или больного). Указанная биологическая жидкость (взятая от человека или другого млекопитающего) может, например, представлять собой кровь, в частности нормальную или абнормальную кровь, промытую, декантированную, центрифугованную, гемолизированную или цельную кровь. Биологические образцы могут быть также синтетического или происхождения или очищенными.
Данное изобретение особенно полезно для анализа образцов крови, в частности для анализа крови, полученной от пациентов, больных диабетом или от других млекопитающих, больных диабетом.
1с
В конкретном варианте осуществления, указанный биологический образец содержит или представляет собой комбинацию нескольких гемоглобинов, в частности нескольких гликированных гемоглобинов, содержащих остаток глюкозы, связанный с аминокислотой на N-концевом участке по меньшей мере одной цепи глобина (например, бета-цепей), и, более конкретно, гемоглобина А.
Используемые биологические образцы могут быть разбавлены до проведения анализа методом капиллярного электрофореза подходящим разбавляющим раствором, например гемолизирующим раствором и/или анализирующим буферным раствором, в частности буферной композицией согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, анализ осуществляют с использованием образца гемолизированной крови.
В другом конкретном варианте осуществления биологический образец сначала разводят в гемолизирующем растворе, а затем в буферной композиции согласно настоящему изобретению.
В зависимости от состава раствора он может обеспечивать полный лизис эритроцитов, в некоторых случаях при этом используют незначительное дополнительное механическое воздействие (встряхивание, перемешивание и т.д.). Гемолизирующий раствор может включать обычные добавки для лизиса клеток, такие как Triton×100, который обычно используют в концентрации 1 г/л. Гемолизирующий раствор также может в некоторых случаях включать соединение, способное специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование на указанных гемоглобинах отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН, как это определено в настоящей заявке.
1c
Например, гемолизирующий раствор может быть выбран из следующей группы: гемолизирующий раствор Capillaries Hemoglobin(e) от Sebia, гемолизирующий раствор MINICAP Hemoglobin(e) от Sebia, гемолизирующий раствор Hydragel HbA от Sebia, чистая вода, вода с добавлением поверхностно-активного вещества, в частности вода с добавлением Triton×100 (например, 1 г/л Triton×100), и смеси вышеуказанных компонентов.
В конкретном варианте осуществления способ анализа посредством капиллярного электрофореза согласно настоящему изобретению включает следующие этапы:
- введение буферной композиции согласно настоящему изобретению и биологического образца в капилляр для электрофореза; и
- разделение компонентов указанного биологического образца посредством капиллярного электрофореза.
Этим двум этапам, как правило, предшествует этап разбавления биологических образцов, например, в гемолизирующем растворе. Этап разбавления может, в частности, осуществляться на носителях для проб, например в сегментах для разведения Capillaries (Sebia) или в пробирках для образцов MINICAP  (Sebia).
На этапе а) буферная композиция согласно настоящему изобретению и биологический образец могут быть введены по отдельности (одновременно или не одновременно) в один и тот же капилляр для электрофореза, в результате чего в капилляре получают смесь. Например, возможно введение в капилляр для электрофореза сначала буферной композиции согласно настоящему изобретению, а затем образца.
Или же, в качестве альтернативы, биологический образец может быть введен в капилляр для электрофореза на этапе а) в виде смеси с буферной композицией, предложенной в настоящем изобретении.
В зависимости от типа используемого аппарата для капиллярного электрофореза и в зависимости от необходимого числа тестов используют один или несколько капилляров параллельно. При использовании одного капилляра этот капилляр, как правило, используется последовательно несколько раз для проведения нескольких тестов. Разумеется, при использовании нескольких капилляров, в случае необходимости может быть последовательно проведено несколько электрофоретических миграций, в ходе которых несколько капилляров используются параллельно.
Этап разделения компонентов биологического образца методом капиллярного электрофореза, в частности, состоит в приложении к капилляру(ам) электрического поля с напряжением, достаточным для разделения одного или нескольких представляющих интерес гликированных гемоглобинов и других белков, в частности других гемоглобинов, которые могут присутствовать в биологической пробе.
Условия для проведения жидкостного капиллярного электрофореза являются стандартными условиями, используемыми специалистами на этапах введения образца и буферной композиции в капилляр(ы) и разделения составляющих образца посредством электрофоретической миграции. Приложенное электрическое поле может составлять, например, около 400 В/см. Как правило, условия включают промывание капилляров моющим раствором, промывание буферной композицией, используемой для анализа, в некоторых случаях - однократное или неоднократное разбавление пробы, введение образца в капилляр(ы), миграцию и регистрацию. Эти шаги могут осуществляться при помощи автоматизированных установок.
Условия проведения капиллярного электрофореза могут, например, представлять собой условия, подходящие для использования автоматизированной установки Capillaries от Sebia или MINICAP от Sebia.
За этапом разделения компонентов биологического образца, как правило, следует этап детектирования одного или нескольких белков, в частности одного или более гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце, и, в частности, одного или нескольких представляющих интерес гликированных гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце, например гемоглобина Aic.
Этот этап детектирования может, в частности, быть осуществлен путем измерения оптической плотности, например, на длине волны около 415 нм, которая является характерной для гемоглобина; гемоглобины можно исследовать и на длинах волн около 200 нм, но для того, чтобы избежать влияния на результаты, в частности, белков плазмы, анализ проводят предпочтительно на длине волны 415 нм.
В контексте настоящего изобретения результаты электрофоретического разделения могут быть представлены, как показано на примерах, в форме электрофоретических профилей, сгенерированных на основе детектируемого сигнала, пропорционального количеству обнаруживаемого гемоглобина. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению обычно дополнительно включает этап для генерирования электрофореграммы на основе детектируемого сигнала.
Как отмечено выше, если представляющий интерес гемоглобин присутствует в анализируемом биологическом образце, может быть определено его количество. Для этого определяют площадь пика, соответствующего указанному гемоглобину.
0
1с
1c
1с
Таким образом, указанный способ, обычно включает дополнительно этап детекции, в частности, по электрофореграмме, количества одного или более гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце и/или пропорциональное содержание одного или более гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце, относительно общего количества белков, общего количества гемоглобина и/или количества определенных гемоглобинов (например, относительно количества НbА или НbА), присутствующих в биологическом образце. В частности, может быть определена доля гемоглобинов А, S и/или С, присутствующих в биологическом образце, относительно общего количества всех гемоглобинов или относительно количества определенных гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце, например относительно общего количества гемоглобинов A, S и/или С, соответственно.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количественное определение может быть осуществлено непосредственно по электрофоретическому профилю.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, способ анализа включает дополнительно этап детектирования содержания одного или более гемоглобинов, присутствующих в анализируемом биологическом образце, относительно одного или нескольких стандартных калибраторов (например, одного или нескольких контрольных биологических образцов); это обеспечивает стандартизацию результатов.
1c
1c
1c
1c
1c
Таким образом, для того, чтобы получить высокий уровень точности в ходе количественного определения, каждый капилляр, как правило, калибруют при каждом запуске аппарата для электрофореза с использованием эталонных биологических образцов (например, стандартных образцов, содержащих известные концентрации различных природных и/или синтетических фракций гликированного гемоглобина, при необходимости очищенные). Например, для количественного определения HbA обычно используют по меньшей мере два калибратора; например, первый калибратор с известной высокой концентрацией HbA и второй калибратор с известной низкой концентрацией HbA. Затем в каждом капилляре аппарата для электрофореза измеряют количество HbA в каждом калибраторе. Это позволяет создать кривую регрессии (по меньшей мере по двум точкам) для каждого капилляра, и, таким образом, измерения, проведенные с использованием различных капилляров, могут быть нормированы. Это также обеспечивает стандартизацию полученных результатов относительно метода сравнения, с использованием значения HbA, определенных данным способом для калибраторов.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, капиллярный электрофорез представляет собой капиллярный электрофорез в свободном растворе, в частности капиллярный электрофорез в свободном растворе с капиллярами без покрытия.
Что касается используемых для капилляров материалов, применяют материалы, являющиеся стандартными для капиллярного электрофореза. У специалиста есть возможность выбрать тип капилляра и его размеры, соответствующие требованиям анализа.
Например, в конкретном варианте осуществления капилляр(ы) для электрофореза изготовлен(ы) из плавленого кварца.
Настоящее изобретение также относится к применению способа анализа посредством капиллярного электрофореза согласно настоящему изобретению для отделения одного или нескольких гликированных гемоглобинов, содержащих глюкозу, а точнее, одного или нескольких гликированных гемоглобинов, каждый из которых содержит в составе одной или нескольких глобиновых цепей (например, бета-цепей) один или несколько остатков глюкозы, связанных с аминокислотой в N-концевом положении, от других белков, в частности от еще по меньшей мере одного гемоглобина, и, предпочтительно, других гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце; и, при необходимости, для количественного определения указанного(ых) гликированного(ых) гемоглобина(ов).
Настоящее изобретение также относится к буферной композиции, подходящей для анализа посредством капиллярного электрофореза биологического образца, содержащего гемоглобины и, в, частности, один или несколько гликированных гемоглобинов, более конкретно один или несколько гликированных гемоглобинов, содержащих одну или несколько молекул глюкозы в составе одной или нескольких глобиновых цепей (например, бета-цепей). Указанная буферная композиция содержит по меньшей мере одно соединение, способное специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов, а также обеспечивать формирование на указанных гемоглобинах нескольких отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН.
Под указанной буферной композицией, в частности, понимают композицию, обычно применяемую для анализа биологического образца способом капиллярного электрофореза согласно настоящему изобретению.
В частности, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения буферная композиция содержит поликарбоновую бороновую кислоту, в частности дикарбоновую кислоту или трикарбоновую кислоту, например 3,5-дикарбоксифенилбороновую кислоту, в качестве компонента, способного специфично связывать с образованием комплекса остатки глюкозы и обеспечивать формирование отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, буферная композиция содержит, в дополнение к компоненту, способному специфично связывать с образованием комплекса остатки глюкозы и обеспечивать формирование отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН,
- замедлитель потока; и/или
- буферное вещество с рКа в диапазоне от 8,0 до 11,0; и/или
- основание; и/или
- соль (в частности, натриевую соль, например хлорид натрия); и/или
- подходящий разбавляющий раствор, например воду.
Указанные различные компоненты могут быть такими, как определено в настоящей заявке
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, буферная композиция имеет рН, равный 9,0 или более, предпочтительно попадающий в диапазон от 9,0 от 11,0 и, более предпочтительно в диапазон от 9,0 до 10,0, например значение рН в диапазоне от 9.3 до 9.5, и еще более предпочтительно рН, равный 9.4. Такое значение рН может быть достигнуто, в частности, путем обеспечения достаточного количества основания, как определено выше.
Буферные композиции согласно настоящему изобретению готовят стандартным для приготовления аналитических буферных композиций способом, а именно разбавлением компонентов в твердой или жидкой форме в подходящей основе. Как правило, основа представляет собой воду, дистиллированную или деминерализованную.
Настоящее изобретение относится к набору, включающему буферную композицию согласно настоящему изобретению и, при необходимости, инструкцию по осуществлению анализа методом электрофореза. Иными словами, набор согласно настоящему изобретению может включать или представлять собой: буферную композицию согласно настоящему изобретению и упаковочный материал, и дополнительно, при необходимости, инструкцию по применению.
Таким образом, набор согласно настоящему изобретению в частности содержит соединение, способное специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированного гемоглобина и обеспечивать формирование отрицательных зарядов при щелочных значениях рН, как определено в настоящей заявке. В том случае, если, кроме указанного соединения, указанный набор содержит другие соединения, в частности одно или несколько соединений из следующих: буферное соединение с рКа в диапазоне от 8,0 до 11,0, замедлитель потока, основание, соль (в частности, натриевую соль, например хлорид натрия), подходящий разбавляющий раствор (например, вода) и смеси вышеуказанных компонентов, различные компоненты указанного набора могут быть упакованы для экстемпорального смешивания или, напротив, могут быть упакованы совместно, в частности в составе одной композиции, в форме смеси. Как вариант, определенные соединения из указанного набора могут быть упакованы по отдельности, в то время как другие могут быть упакованы совместно, в частности в виде смеси.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, буферная композиция согласно настоящему изобретению представлена в виде одной или нескольких составляющих, с тем, чтобы потребитель мог приготовить ее перед анализом. Это позволяет избежать проблем со стабильностью, которые могут возникать, например, если все или некоторые компоненты указанной композиции упакованы в виде смеси.
Набор согласно настоящему изобретению может также включать один или несколько растворов для промывки капилляров, и/или один или несколько разбавляющих компонентов, и/или один или несколько растворов, подходящих для разбавления анализируемого биологического образца (например, гемолизирующий раствор, в частности гемолизирующий раствор, соответствующий определению, данному в настоящей заявке), и/или один или несколько контрольных биологических образцов (например, натуральные и/или синтетические гликированные фракции, при необходимости, очищенные), которые позволяют откалибровать каждый капилляр.
1с
1c
1c
Настоящее изобретение также относится к использованию буферной композиции, соответствующей данному в настоящей заявке определению и/или к предложенному в настоящем изобретении набору для анализа методом капиллярного электрофореза одного или нескольких гликированных гемоглобинов, содержащих один или несколько остатков глюкозы, в частности, для анализа гемоглобинов А, S и C, содержащихся в биологическом образце, в состав которого входит один или несколько гемоглобинов.
1с
1с
1c
Настоящее изобретение также относится к применению буферной композиции, соответствующей данному в настоящей заявке определению, и/или набору, предложенному в настоящем изобретении и/или соединению, способному специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы (одним или несколькими) гликированных гемоглобинов (одного или нескольких гликированных гемоглобинов) и обеспечивать формирование на этом или на этих гликированных гемоглобинах нескольких отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН, для разделения посредством капиллярного электрофореза одного или нескольких гликированных гемоглобинов, содержащих остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении по меньшей мере на одной цепи глобина (например, на бета-цепях), и, более конкретно, для отделения посредством капиллярного электрофореза гемоглобина А от других белков, в частности гемоглобина А и по меньшей мере одного гемоглобина и, предпочтительно, гемоглобина А и других гемоглобинов, присутствующих в биологическом образце, и, при необходимости, количественного измерения указанного гемоглобина (гемоглобинов), разделенных описанным образом.
В частности, буферная композиция согласно настоящему изобретению, набор согласно настоящему изобретению и/или соединение, способное специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН, согласно настоящему изобретению пригодны для применения, например, в способе согласно настоящему изобретению для диагностики диабета у человека или других млекопитающих и/или для контроля баланса гликемии у людей или других млекопитающих (в частности, страдающих диабетом), в частности для оценки эффективности лечения диабета и/или для коррекции программы лечения диабета у страдающих диабетом пациентов. Биологические образцы для анализа при этом берут у указанного человека или другого млекопитающего.
Термин «диабет» в настоящей заявке обозначает диабет 1-го и/или диабет 2-го типа.
Настоящее изобретение также относится к применению буферной композиции согласно настоящему изобретению, набора согласно настоящему изобретению и/или соединения, которое способно специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование отрицательных зарядов при щелочных значениях рН, соответствующего данному в настоящей заявке определению, для изготовления диагностического набора. Указанный диагностический набор можно, в частности, применять для диагностики диабета у человека или другого млекопитающего и/или для контроля баланса гликемии у человека или другого млекопитающего, в частности, страдающих диабетом. С помощью указанного набора, таким образом, возможно оценивать эффективность лечения диабета у человека или другого млекопитающего, страдающих диабетом, и/или корректировать программу лечения от диабета страдающих диабетом пациентов.
1с
1с
Уровни НbА, как правило, составляют от 4% до 6% (т.е. от 20 до 42 ммоль НbА на моль гемоглобина в крови) у людей, не страдающих диабетом, и более 7% у пациентов, страдающих диабетом (в отсутствие лечения).
1с
1с
В случае, если концентрации НbА находятся в диапазоне от 6% до 7% (т.е., от 42 до 53 ммоль НbА на моль гемоглобина в крови), рекомендуется начать антидиабетическую терапию.
1с
За порогом в 8%, что эквивалентно концентрации 64 ммоль НbА на моль гемоглобина в крови (Panteghini, John, 2007), пациент подвергается повышенному риску развития одного из осложнений сахарного диабета (микроангиопатии, макроангиопатии и т.д.). В этом случае рекомендуется изменение антидиабетического лечения пациента.
Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из нижеследующих примеров и рисунков, иллюстрирующих изобретение.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Рисунок 1: электрофореграмма, полученная на аппарате СЕ Agilent с использованием образцов нормальной крови человека с использованием аналитического буфера, описанного в патенте США 5,599,433, который содержит 100 мм CAPS и 300 мм борной кислоты (рН: 11,00, температура: 24°С; напряжение: 6,1 кВ, т.е. 190 В/см; давление: 50 мбар в течение в течение 20 с).
1a,b
1c
Рисунок 2: стандартные электрофоретические профили A и A, полученные на аппарате СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов, с использованием аналитического буфера, описанного в патенте США 5,599,433, который содержит 100 мМ CAPS и 300 мМ борной кислоты (рН: 11; температура: 24°С; напряжение: 6.1 кВ, т.е. 190 В/см; давление: 50 мбар в течение 20 с).
1a,b
1c
Рисунок 3: стандартные электрофоретические профили A и A, полученные на аппарате СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO и 10 мМ путресцина, но не содержащей ни боратных, ни боронатных соединений (рН: 10.20; температура: 24°С; напряжение: 6.1 кВ, т.е. 190 В/см; давление: 50 мбар в течение 20 с).
1a,b
1c
Рисунок 4: стандартные электрофоретические профили A и A, полученные на аппарате СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 10 мМ путресцина и 50 мМ бората (рН: 10.20; температура: 24°С; напряжение: 6.1 кВ, т.е. 190 В/см; давление: 50 мбар в течение 20 с).
1a,b
1c
Рисунок 5: стандартные электрофоретические профили для A и A, полученные на аппарате СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 10 мМ путресцина и 50 мМ 3-карбоксифенилбороновой кислоты (рН: 10.20; температура: 24°С; напряжение: 6.1 кВ, т.е. 190 В/см; давление: 50 мбар в течение 20 с).
1a,b
1с
Рисунок 6: стандартные электрофоретические профили A и А, полученные на аппарате СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 10 мМ путресцина и 50 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты (рН: 10.20; температура: 24°С; напряжение: 6.1 кВ, т.е. 190 В/см; давление: 50 мбар в течение 20 с).
1a,b
1с
Рисунок 7: стандартные электрофоретические профили A и А, полученные на аппарате СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 15 мМ путресцина и 100 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты (рН: 10.20; температура: 30°С; напряжение: 10 кВ, т.е. 310 В/см; давление: 50 мбар в течение 20 с).
0
1a,b
1с
0
Рисунок 8: стандартные электрофоретические профили А, A и А, полученные на аппарате СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих НbА и/или различные очищенные фракции гликированного гемоглобина, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты при рН, равном 9.40. Капилляры из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 17.3 кВ т.е. 520 В/см; давление 50 мбар в течение 20 с).
0
1a,b
1с
0
Рисунок 9: стандартные электрофоретические профили А, A и А, полученные на СЕ Agilent с использованием эталонных образцов, содержащих НbА и/или различные очищенные фракции гликированного гемоглобина, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,4-дикарбоксифенилбороновой кислоты при рН, равном 9.40. Капилляры из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 17.3 кВ т.е. 520 В/см; давление 50 мбар в течение 20 с).
1a,b
1с
Рисунок 10: стандартные электрофоретические профили A и А, полученные на аппарате Capillaries (Sebia) с использованием эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов, с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40. Капилляры из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 9.4 кВ, т.е. 520 В/см; давление 20 мбар в течение 6 с).
Рисунок 11: электрофореграмма, полученная на аппарате Capillaries (Sebia) с использованием образца нормальной крови человека, разбавленной до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100), с использованием буферной композиции, содержащей (А) 200 мМ буфера CAPSO, 10 мМ путресцина и 50 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты при рН, равном 10.2, или (В) 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40. Капилляры из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 9.4 кВ, т.е. 520 В/см; давление 8 мбар в течение 6 с).
1с
0
Рисунок 12: исследование влияния концентрации 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты в буферной композиции на разделение гемоглобинов А и А (температура: 30°С; напряжение: 10 кВ, т.е. 310 В/см).
Рисунок 13: электрофореграмма, полученная на аппарате Capillaries (Sebia) с использованием образца нормальной крови человека, содержащего вариантный гемоглобин НbЕ и разведенного до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40, и капилляра из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 9.4 кВ, т.е. 520 В/см; давление 8 мбар в течение 6 с).
Рисунок 14: электрофореграмма, полученная на аппарате Capillaries (Sebia) на основе контрольной сыворотки AFSC, разбавленной до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40, и капилляра из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 9.4 кВ, т.е. 520 В/см; давление 8 мбар в течение 6 с).
Рисунок 15: электрофореграмма, полученная на аппарате Capillaries (Sebia) из смешанного образца нормальной крови человека, содержащего формы гемоглобина - гемоглобин F и гемоглобин Барта, и разведенного до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40, и капилляра из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 9.4 кВ, т.е. 520 В/см; давление 8 мбар в течение 6 с).
Рисунок 16: электрофореграмма, полученная на аппарате Capillaries (Sebia), из образца нормальной крови человека, содержащего форму гемоглобина HbD и разведенного до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л de Triton×100), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40, и капилляра из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 9.4 кВ, т.е. 520 В/см; давление 8 мбар в течение 6 с).
Рисунок 17: сравнение результатов, полученных с использованием капиллярного электрофореза на анализаторе Capillaries (Sebia), с результатами, полученными с использованием ВЭЖХ на анализаторе Variant II Turbo (Bio-Rad).
1c
1c
1c
Рисунок 18А: анализ агарозного геля с HbA на автоматической установке Hydrasys (Sebia). Дорожки 1 и 2: слабый (5.0%) A калибратор и сильный (10.8%) A калибратор. Дорожки 3-9: нормальная цельная кровь, инкубированная в течение 3 ч при 37°С с глюкозой в концентрации 0 г/л (контроль; дорожка 3), 1 г/л (дорожка 4), 5 г/л (дорожка 5), 10 г/л (дорожка 6), 20 г/л (дорожка 7), 30 г/л (дорожка 8) и 50 г/л (дорожка 9).
Рисунок 18В: профили капиллярного электрофореза, полученные на анализаторе Capillaries (Sebia) с использованием образцов, представленных на рисунке 18А. Анализ образца, содержащего 1 г/л глюкозы, не проводился, так как анализ в геле не давал никаких видимых отличий (см. рисунок 18А). Образцы разводили до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100), использовали буферную композицию, содержащую 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40, и капилляр из плавленого кварца, без покрытия (температура: 34°С; напряжение: 9.4 кВ, т.е. 520 В/см; давление 8 мбар в течение 6 с).
Рисунок 18С: таблица, в которой приведены значения для HbAic, полученные на агарозном геле и на анализаторе Capillaries (Sebia) при анализе крови способами, представленными на рисунках 18А и 18В.
ПРИМЕРЫ
А. АППАРАТУРА И МЕТОДЫ
КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Принцип разделения представляет собой капиллярный электрофорез в свободном растворе при щелочных значениях рН (рН>9), позволяющий получить отрицательно заряженные фракции гемоглобина (изоэлектрическая точка гемоглобинов находится в диапазоне от 6,05 до 7,63).
3D
Капиллярный электрофорез биологических образцов проводили в аппарате для капиллярного электрофореза с 8 капиллярами из плавленого кварца внутренним диаметром 25 микрон, полезной длиной 16 см и общей длиной 18 см (система для капиллярного электрофореза Capillaries (Sebia)) или на аппарате для капиллярного электрофореза с одним капилляром из плавленого кварца внутренним диаметром 25 микрон, полезной длиной 24 см и общей длиной 32 см (система для капиллярного электрофореза CE от Agilent Technologies).
Регистрацию осуществляли на длине волны 425 нм. Образцы крови разводили в гемолизирующем растворе (Triton×100 1 г/л в воде) и вводили путем гидродинамической инжекции. Капилляр промывали перед каждым анализом 0,25 М гидроксидом натрия, затем буферной композицией.
БУФЕРНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
Буферные композиции, в которых осуществляли капиллярный электрофорез, содержали воду, буферное соединение с рКа в диапазоне от 8 до 11 (CAPS, CAPSO или CHES в зависимости от ситуации), основание, позволяющее довести рН до желаемых значений, в некоторых случаях - замедлитель потока (путресцин), и иногда - борат (борную кислоту) или боронат.
3,5-дикарбоксифенилбороновая кислота (3,5-dCPBA) была приобретена у компаний Combi-blocks Inc. (San Diego, USA) и Apollo Scientific Ltd (Cheshire, United Kingdom).
3,4-дикарбоксифенилбороновая кислота (3,4-dCPBA) была синтезирована компанией BoroChem SAS (Caen, France).
В. РЕЗУЛЬТАТЫ
Пример 1
0
0
2
Проводили капиллярный электрофорез нормальной крови человека (содержащей гемоглобины HbA, HbA и НbА), разбавленной до 1/6 гемолизирующим раствором (1 г/л Triton×100, растворенный в деминерализованной воде), с использованием аналитического буфера, описанного в патенте США 5,599,433, который содержит 100 мМ CAPS и 300 мМ борной кислоты, рН 11. Полученная электрофореграмма представлена на рисунке 1. Плохое разделение пиков гемоглобинов.
Пример 2
0
1с
0
1b
1а
1a,b
1с
1c
1a,b
1c
1а
1b
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов (Exocell, США), содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов (фракции А и А или фракции А, A и А), с использованием аналитического буфера, описанного в патенте США 5,599,433, который содержит 100 мМ CAPS и 300 мМ борной кислоты, рН 10.20. Полученные стандартные электрофоретические профили для A и А представлены на рисунке 2. Разделение гемоглобинов HbA и HbA определенно является недостаточным; электрофоретический пик HbA перекрывается с пиками НbА/НbА.
Пример 3
0
1c
0
1b
1а
1a,b
1c
1c
o
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов (Exocell, США), содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов (фракции А и А или фракции А, A и А), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO и 10 мМ путресцина (рН 10.20), но не содержащей боратов либо боронатов. Полученные стандартные электрофоретические профили для A и A представлены на рисунке 3. Пик, соответствующий HbA, мигрирует совместно с пиком, соответствующим HbA.
Пример 4
0
1c
0
1b
1a
1a,b
1c
1c
0
1a
1b
1
1c
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов (Exocell, США), содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов (фракции А и A или фракции А, A и A), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 10 мМ путресцина и 50 мМ бората (рН 10.20). Полученные стандартные электрофоретические профили для A и A представлены на рисунке 4. Пик, соответствующий HbA, расположен между пиками, соответствующими НbА и HbA/HbA, и слишком близко к пику, соответствующему другим НbАs, для проведения достоверного количественного определения HbA.
Пример 5
0
1c
0
1b
1a
1a,b
1c
1c
1b
1а
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов (Exocell, США), содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов (фракции А и A или фракции А, A и A), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 10 мМ путресцина и 50 мМ 3-карбоксифенилбороновой кислоты (рН 10.20). Полученные стандартные электрофоретические профили для A и A представлены на рисунке 5. Пик, соответствующий HbA, расположен между пиками, соответствующими HbA и НbА.
Пример 6
0
1с
0
1b
1a
1а,b
1с
1c
1b
1a
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов (Exocell, США), содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов (фракции А и А или фракции А, A и A), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 10 мМ DAB и 50 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты (рН 10.20). Полученные стандартные электрофоретические профили для А и А представлены на рисунке 6. Пик, соответствующий HbA расположен за пиками, соответствующими HbA и HbA.
Пример 7
0
1с
0
1b
1a
1a,b
1с
1c
1b
1a
1a
1b
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов (Exocell, США), содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов (фракции А и А или фракции А, A и A), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CAPSO, 15 мМ замедлителя потока (путресцина) и 100 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты (рН 10.20). Полученные стандартные электрофоретические профили для A и А представлены на рисунке 7. Пик, соответствующий НbА, расположен за пиками, соотвествующими HbA и HbA, и отделен от этих пиков; разделение гемоглобина НЬА1 с и гемоглобинов HbA и НbА превосходное.
Пример 8
0
0
1с
0
1b
1a
0
1a,b
1c
1c
0
1b
1a
1c
1a
1b
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов, содержащих НbА и/или различные очищенные фракции гликированного гемоглобина (фракции А и А или фракции А, A и A), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CHES, 20 мМ замедлителя потока (путресцинА) и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты (при рН, равном 9.40). Полученные стандартные электрофоретические профили для А, A и A представлены на рисунке 8. Пик, соответствующий НbА расположен за пиками, соответствующими HbA, HbA и HbA, и четко отделен от этих пиков; разделение гемоглобина НbА и гемоглобинов HbA и НbА превосходное.
Пример 9
0
0
1с
0
1b
1a
0
1a,b
1c
1с
0
1b
1a
1c
1а
1b
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов, содержащих НbА и/или различные очищенные фракции гликированного гемоглобина (фракции А и А или фракции А, A и A), с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ CHES, 20 мМ замедлителя потока (путресцина) и 30 мМ 3,4-дикарбоксифенилбороновой кислоты (при рН, равном 9.40). Полученные стандартные электрофоретические профили для А, A и A представлены на рисунке 9. Можно видеть, что пик, соответствующий НbА, расположен за пиками, соответствующими HbA, HbA и HbA, и четко отделен от этих пиков; разделение гемоглобина HbA и гемоглобинов НbА и НbА превосходное.
1c
При сравнении электрофоретических профилей из примеров 8 и 9 можно видеть, что 3,5-дикарбоксифенилбороновая кислота может обеспечивать небольшое улучшение отделения HbA по сравнению с другими фракциями, в то время как 3,4-дикарбоксифенилбороновая кислота обеспечивает небольшое улучшение фокусировки.
Пример 10
0
1с
0
1b
1a
1а,b
1c
1с
1b
1a
1c
1a
1b
Проводили капиллярный электрофорез эталонных образцов, содержащих различные очищенные фракции гликированных гемоглобинов (фракции А и А или фракции А, A и A) на аппарате Capillaries (Sebia) (Exocell, США) с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40. Полученные стандартные электрофоретические профили для А и A представлены на рисунке 10. Можно видеть, что пик, соответствующий НbА, расположен за пиками, соответствующими HbA и HbA, и четко отделен от этих пиков; разделение гемоглобина HbA и гемоглобинов HbA и НbА превосходное.
Пример 11
1c
Методом капиллярного электрофореза анализировали нормальную кровь человека, разведенную до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100), с использованием буферной композиции, содержащей либо 200 мМ буфера CAPSO, 10 мМ путресцина и 50 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты при рН, равном 10.20, либо 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40. Электрофореграммы, полученные на аппарате Capillaries (Sebia) с использованием капилляров из плавленого кварца, без покрытия, представлены на рисунках 11А и 11 В, соответственно. В обоих случаях наблюдается полное отделение гемоглобина НbА от других форм гемоглобинов.
Пример 12
1c
0
1c
0
Исследовали влияние концентрации 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты в буферной композиции на разделение гемоглобинов А и А друг от друга. Использовали буферную композицию, содержащую 200 мМ CAPSO, 15 мМ путресцина и 0-120 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты. Результаты представлены на рисунке 12. Разделение A/A улучшается при увеличении концентрации 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты.
Пример 13
Проводили капиллярный электрофорез на аппарате Capillaries (Sebia) четырех различных образцов, разбавленных до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100): нормальной крови человека, содержащей форму гемоглобина НbЕ (Рисунок 13), контроль AFSC (рисунок 14), смешанного образца нормальной крови, содержащего гемоглобин формы F и гемоглобин Барта (Рисунок 15) и нормальной крови человека, содержащей форму гемоглобина HbD (Рисунок 16). Капиллярный электрофорез проводили в буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40, с использованием капилляра из плавленого кварца, без покрытия.
1c
1c
1c
На рисунках 13-16 продемонстрировано отсутствие смешивания основных форм гемоглобина (Е, F, S, С, D и гемоглобина Барта) и фракции НbА. Отметим, тем не менее, что в случае гемоглобина Барта разделение фракций гемоглобинов Барта и НbА не является полным. Следовательно, для количественного определения НbА в присутствии гемоглобина Барта эти две фракции следует количественно анализировать с применением подходящего комплексного метода. Если это невозможно, необходимо предупредить об этом потребителя на случай, если будет наблюдаться данный тип профиля с плечом в области предполагаемого пика.
Пример 14
Результаты, полученные при анализе способом капиллярного электрофореза согласно настоящему изобретению на анализаторе Capillaries (Sebia), сравнивали с результатами, полученными с использованием одной из эталонных методик: ВЭЖХ на анализаторе Variant II Turbo (Bio-Rad)
Капиллярный электрофорез цельной крови, разбавленной до 1/6 гемолизирующим раствором (вода + 1 г/л Triton×100), проводили в буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40.
1c
с
с
Рисунок 17 демонстрирует очень хорошую корреляцию между новой методикой анализа посредством капиллярного электрофореза и анализом HbA при помощи ВЭЖХ на аппарате Variant II Turbo от Bio-Rad. После калибровки данных капиллярного электрофореза (КЭ) с использованием двух калибраторов (слабый А1 и сильный А1), полученные способом согласно настоящему изобретению значения были очень близки к значениям, полученным при помощи эталонного метода.
1c
1с
Пример 15: Исследование, демонстрирующее отсутствие интерференции от лабильной фракции HbA для количественного определения НbА при использовании способа согласно настоящему изобретению.
1c
1с
Предположив, что соединение, образующее комплексы с глюкозой и приводящее к формированию отрицательных зарядов при щелочных значениях рН, используемое в условиях способа анализа согласно настоящему изобретению, будет способно взаимодействовать с глюкозой крови (это взаимодействие является гипотетическим и не было ранее продемонстрировано), провели исследование возможного влияния свободной глюкозы в крови на результаты анализа НbА1с. Исследование осуществили следующим образом: нормальную кровь инкубировали в течение 3 часов при 37°С с различными концентрациями глюкозы (от 0 до 50 г /л), чтобы создать лабильную форму HbA (форма, возникающая перед перегруппировкой молекулы (перегруппировкой Амадори)). После инкубации образцы крови центрифугировали, полученный осадок разбавляли физиологическим раствором и гемолизирующим раствором (15 мкл осадка + 25 мкл физиологического раствора + 160 мкл гемолизирующего раствора (вода+1 г/ л Triton×100)), а затем исследовали параллельно на автоматической установке Hydrasys  от Sebia (НbА-гель) и на аппарате Capillaries (Sebia) с использованием буферной композиции, содержащей 200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9,40.
1c
1c
1с
Анализ НbА в геле, проведенный на автоматизированной установке Hydrasys (см. рисунок 18А), подтвердил формирование лабильной фракции НbА, мигрирующей на тот же уровень, что и НbА, и увеличение концентраций этой формы соответственно увеличению концентрации глюкозы при инкубации с кровью. Следует отметить, что в геле, в стандартных условиях, рекомендованных Sebia, лабильная фракция не формируется, в частности, благодаря кислотным значениям рН гемолизирующего раствора.
1с
В отличие от этого, анализ тех же образцов крови, проведенный на аппарате Capillaries (Sebia) с использованием буферной композиции согласно настоящему изобретению (200 мМ буфера CHES, 20 мМ путресцина и 30 мМ 3,5-дикарбоксифенилбороновой кислоты, при рН, равном 9.40), показал, что присутствие свободной глюкозы не мешает количественному определению, независимо от концентрации глюкозы в исследованном диапазоне (от 0 до 50 г/л) при инкубации: профили и значения для НbА не менялись (см. рисунки 18В и 18С).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Abraham, E.C.; Cameron, B.F.; Abraham, A.; Stallings, M., "Glycosylated hemoglobins in heterozygotes and homozygotes for hemoglobin C with or without diabetes", Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 104, 602-609, 1984. Beccaria, L; Chiumello, G.; Gianazza, E.; Luppis, B.; Righetti, PG., "Hemoglobin Aic separation by isoelectric focusing'", American Journal of Hematology, 4, 367-374, 1978.
1c
Bosisio, A.; Righetti, P., "Determination of glycated haemoglobin by isoelectric focusing in non-linear pH gradients", Journal of Chromatography, 307, 103-110, 1984. Doelman, C; Siebelder, C; Nijhof, W.; Weykamp, W.; Janssens, J.; Penders, T., "Capillary electrophoresis system for hemoglobin A determinations evaluated", Clinical Chemistry, 43, 4, 644-648,1997.
Hempe, JM.; Craver, RD., "Quantification of hemoglobin variants by capillary isoelectric focusing",Clinical Chemistry, 40,12, 2288-2295, 1994. Hempe, JM.; Granger, JN.; Craver, RD., "Capillary isoelectric focusing of hemoglobin variants in the pediatric clinical laboratory", Electrophoresis, 18, 1785-1795, 1997. Janssens, J., "Capillary electrophoresis detection and/or analysis method and unit", EP 0 733 900 A2, 1996.
Janssens, J.; Chevigne, P.; Louis, P., "Capillary electrophoresis method using initialized capillary and polyanion-containing buffer and chemical kit therefore", US Patent 5,611,903, 1997.
Menard, L; Dempsey, M.; Blankstein, L; Aleyassine, H.; Wacks, M,; Soeldner, J., "Quantitative determination of glycosylated hemoglobin A1 by agar gel electrophoresis", Clinical Chemistry, 26, 11, 1598-1602,1980.
Molteni, S.; Frischknecht, H.; Thormann, W., "Application of dynamic capillary isoelectric focusing to the analysis of human hemoglobin variants", Electrophoresis, 15, 22-30, 1994.
1c
Panteghini, M. John, W.G., on behalf of the IFCC Scientific Division, "Implementation of haemoglobin A results traceable to the IFCC reference system: the way forward.", Clin Chem Lab Med., 45(8), 942-4, 2007.
le
Simon, M.; Cuan J., "Hemoglobin A by isoelectric focusing", Clinical Chemistry, 28,1, 9-12, 1982.
1c
Siren, H.; Laitinen, P.; Turpeinen, U.; Karppinen, P., "Direct monitoring of glycohemoglobin A in the blood samples of diabetic patients by capillary electrophoresis. Comparison with an immunoassay method", Journal of Chromatography A, 979, 201-207, 2002.
Stickland, M.; Perkins, C; Wales, J,, "The measurement of haemoglobin А1c by isolectric focusing in diabetic patients", Diabetologia, 22, 315-317,1982.
Wilson, D.H., Bogacz, J.P., Forsythe, СМ., Turk, P.J., Lane, T.L., Gates, R.C., Brandt, D.R. "Fully automated assay of glycohemoglobin with the Abbott IMx analyzer: novel approaches for separation and detection", Clin Chem., 39(10), 2090-7, 1993.