УСТРОЙСТВО ДЛЯ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ АКТИВАЦИИ ДИАГНОСТИКУМОВ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и биотехнологии, а точнее к вирусологии, и может быть использовано при производстве диагностикумов вирусов комплекса клещевого энцефалита (КЭ), активации их антигенных свойств, в частности гемагглютинирующей и преципитирующей активности, и устранения инфекционности получаемых препаратов.
Известен способ получения антигена вируса КЭ и использования его в качестве специфического аллергена. При котором вирусосодержащие суспензии (10 мл) помещали в стеклянные ампулы (толщина стенки 0,6 мм) и обрабатывали ультразвуком в масляной ванне непосредственно над кварцевым источником излучения при напряжении на контуре генератора 1700 V и силе тока 0,2 А. Применялась резонансная частота излучения 0,7 МГц (см. Стеткевич А.А. О влиянии ультразвука на вирус клещевого энцефалита. Вопр. Вирусол., 1961, №1, с.20-23).
Недостатком такого способа является возможный разрыв ампул с инфекционным материалом и заражение внешней среды, повышение температуры суспензии во время облучения до 60°С, что сокращало непосредственное действие ультразвука до 10-минутного интервала и требовало применения дробного озвучивания, с периодическим охлаждением суспензии до 5°С. Однако и при этом наблюдалась неполная инактивация инфекционности вируса, которая могла быть устранена только при добавлении к суспензии химических инактиваторов (спирта и формалина).
Известен так же способ использования ультразвука для повышения активности арбовирусных антигенов в серологических реакциях ин витро, заключающийся в том, что материалы обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора фирмы MSE модель 150 Watt, используя титановый зонд 34041. При этом антиген (3-5 мл) помещали в стеклянный стакан, закрывали резиновой крышкой с отверстием посредине и помещали стакан в контейнер со льдом. Затем в антиген на глубину 3-4 мм погружали зонд. Воздействие ультразвуком проводили при частоте 20000-25000 гц в течение 30-40 сек., повторяя эту процедуру трижды с интервалом 3 мин. Абсолютные титры антигенов после действия ультразвука часто не превышали таковые, которые можно получать другими методами, но в каждом конкретном случае наблюдалось увеличение исходных титров антигенов (см. Гайдамович С.Я. и др. Использование ультразвука для повышения активности арбовирусных антигенов в серологических реакциях ин витро. Вопр. вирусол., 1973, №3, с.356-360).
Недостатком такого способа является необходимость использования импортного оборудования. Кроме того у авторов отсутствуют данные о влиянии ультразвука на инфекционность антигенных препаратов; не проводились исследования с вирусами комплекса КЭ.
Известен так же "Способ получения диагностикума клещевого энцефалита" (Патент РФ №2359269, G01 №33/531, Опубл. 20.06.2009. Бюл. №17), в котором ультразвуковую обработку вирусосодержащей суспензии проводят на аппаратах УЗДН-1 или УЗДН-А с использованием универсального выносного излучателя - зонда при температуре суспензии 25-30°С.
При хороших результатах УЗ обработки по такому способу, некоторыми его недостатками являются большие габариты и масса выносного излучателя и самого аппарата, затрудняющие работу в лабораториях при сложности обработки и стерилизации излучателя после работы с инфекционным материалом.
Задачей полезной модели является разработка и применение устройства, для облегчения и ускорения ультразвуковой активации диагностикумов вирусов комплекса КЭ работающего с выпускаемыми в Российской Федерации компактными УЗ аппаратами для расширения их возможности по активации диагностикумов вирусов комплекса КЭ различных сроков изготовления и устранения их инфекционной активности, простого по изготовлению и не требующего особой специальной подготовки для работы с устройством в условиях медицинских учреждения.
Задача решается тем, что для обработки ультразвуком диагностикумов КЭ применяют ультразвуковую ванну УЗВ-1/100-ТН-44 с аппаратурой контроля и управления и с сетчатой корзиной (технологическая оснастка) работающую при частоте 22-48 кгц, мощности генератора 75 Вт, при этом в качестве емкостей (пробирок) для вирусосодержащих препаратов используют нитроцеллюлозные пробирки объемом среды облучения 3,0-5,0 мл производства US с толщиной стенок 0,2-0,3 мм, устанавливаемые в сетчатой корзине в устройстве в виде дополнительного специального УЗ проницаемого держателя и погружаемые в промежуточную среду в виде дистиллированной воды, при времени УЗ обработки от 1 до 60 минут, причем держатель выполнен с возможностью установки пробирок так, чтобы уровень промежуточной среды был выше уровня обрабатываемой суспензии в пробирках.
В медицине ультразвуковая ванна УЗВ-1/100-ТН-44 согласно инструкции используется для предстерилизационной обработки медицинских инструментов и мойки аптекарской посуды, а сетчатая корзина используется при УЗ очистки мелких деталей при загрузке их в ванну. (см. Ванна ультразвуковая типа УЗВ-1/100-ТН-44. Руководство по эксплуатации. РЭЛТЕК г.Екатеринбург, 2004 г. 20 стр.).
На фиг.1 представлено фото ванны УЗВ и сетчатой корзины с установленным в корзину держателем для пробирок со средой (общий вид).
На фиг.2 устройство в виде держателя для нитроцеллюлозных пробирок в сетчатой корзине ванны (вид сверху).
Устройство работает следующим образом.
Перед началом УЗ обработки, подготовленную вирусосодержащую суспензию заливают в нитроцеллюлозные пробирки объемом 3-5 мл. Пробирки устанавливают в держатель. Держатель с пробирками помещают в сетчатую корзину (фиг.1 на переднем плане). Сетчатую корзину с держателем и пробирками со средой помещают в ультразвуковую ванну (фиг.2) и заливают в ванну дистиллированную воду (промежуточную среду) выше уровня вирусосодержащей суспензии в пробирках. Закрывают крышку ванны. Устанавливают аппаратуру контроля и управления процессом ультразвуковой активации на заданный режим, в частности таймер ванны на заданное время и включают процесс УЗ обработки на время от 1 до 60 минут. После отключения таймера сетчатую корзину с держателем и пробирками вынимают из ванны. Пробирки с УЗ обработанной средой вынимают из держателя и направляют на дальнейшую работу - анализы и для использования по назначению.
Новизной полезной модели является то, что дополнив ультразвуковую ванну УЗВ - 1/100-ТН устройством в виде держателя нитроцеллюлозных пробирок, устанавливаемого в сетчатую корзину, возможно использование УЗ ванны по новому назначению - в медицине для ультразвуковой активации диагностикумов вирусов КЭ, расширяя спектр ее использования. При этом техническим результатом является то, что устройство обеспечивает ультразвуковую активацию диагностикумов вирусов клещевого энцефалита и устранения инфекционной активности вируса клещевого энцефалита.
Дополнительным эффектом предложенного устройства является использование отечественного медицинского УЗ оборудования практически не требующего дополнительного обучения персонала лаборатории для получения высококачественных и высокоактивных препаратов - диагностикумов клещевого энцефалита.
Основные параметры предложенного устройства как: использование ванны УЗВ-1/100-ТН, с сетчатой корзиной, применение нитроцеллюлозных пробирок объемом 3-5 мл с толщиной стенок 0,2-0,3 мм, использование в качестве промежуточной среды - дистиллированной воды, использование держателя для регулировки уровня промежуточной среды в ванне выше уровня вирусосодержащей суспензии в пробирках, время УЗ обработки от 1 до 60 минут определены авторами практическим путем в лабораториях и рекомендованы по результатам анализов качества получаемых препаратов.
Примеры использования устройства.
Пример 1. Применение устройства для обработки ультразвуком в ванне УЗВ диагностикума ОГЛ серия 3 (время изготовления 1985 г.) показало увеличение титров гемагглютининов при различны рН фосфатного буферного раствора реакции в 2 раза уже после 1-15 минут воздействия ультразвука (таблица 1).
Таблица 1
Влияние УЗ на титр ГА вируса ОГЛ серия СЗ
ОГЛСЗ
рН
Без озвучивания
1'
5'
15'
5.8
1:32
1:32
1:32
1:64
6.0
1:32
1:64
1:64
1:64
6.2
1:16
1:16
1:32
1:32
Сходные данные были получены и при обработке в предложенном устройстве антигенных препаратов других вирусов комплекса КЭ (табл.2).
Таким образом, обработка растворов диагностикумов ультразвуком в предложенном устройстве ведет к изменению титров ГА антигенов в сторону их повышения.
Пример 2. На фиг.3 представлены результаты воздействии УЗ на гемагглютинины стандартного дагностикума КЭ с исходным титром ГА 1:320.
Как видно из графиков при оптимальном значении рН фосфатно-буферного раствора 5,4 после 15 минутной обработки УЗ титр ГА резко возрастал. Следует отметить высокую стабильность гемагглютининов вируса комплекса КЭ длительного хранения (при +4-+10°С).
Таблица 2.
Влияние воздействия на титр ГА в растворе диагностикума.
№ опыта
Препарат, серия, срок годности
Дата исследования
Время экспозиции УЗ в минутах
титр
До обработки УЗ
После обработки УЗ
1
ВКЭ Томск серия 71983 г.
22.09.09
1+2
8
32
5
16
16
2
ВКЭ Томск серия 7, 1983 г.
25.09.09
25+25
32
128
3
ВКЭ Томск серия 28, 1990 г.
20.10.09
25
16
64
25+25
16
128
4
Повассан серия 1, 1986 г.
15.12.09
25
32
64
5
Повассан серия 3, 1986 г.
16.12.09
25
32
128
6
Повассан серия 1, 1986 г.
16.12.09
25+25
32
64
7
Повассан серия 3, 1986 г.
16.12.09
25+25
32
128
8
Повассан серия 3, 1986 г.
20.12.09
25
16
64
25+25
16
64
Пример 3. На фиг.4 представлены хроматограммы разделения стандартного (Том. НИИВС) диагностикума КЭ до и после обработки УЗ в ванне УЗВ с предложенным устройством.
Во всех случаях при хроматографическом анализе растворов диагностикумов обработанных УЗ в сравнении с необработанными отмечалось смещение фракции в сторону ускорения выхода из колонки, при этом всегда была задействована первая фракция, содержащая ГА антиген. Это указывает на то, что повышения титра в РГА, после обработки диагностикума УЗ, сопровождается и более ранним выходом фракции, содержащий антиген при хроматографии раствора этого диагностикума.
Таким образом в опытах было показано, что у ряда представителей вирусов комплекса КЭ (например КЭ; Софьин, ОГЛ, Повассан) ГА возрастала до уровней исходной и выше при обработке диагностических препаратов ультразвуком на предлагаемом устройстве.
Под действием УЗ белковые конгломераты, включающие в себя антиген изменяются таким образом, что труднее проходят в поры гранул сефадекса, что и приводит к более быстрому выходу фракции при гель фильтрации, при этом AT - детерминанты вирусов становятся более доступными для контакта с эритроцитами. Тем самым, была показана возможность повышения антигенности биоматериала (ГА диагностикумов вирусов комплекса КЭ) путем его физических модификаций при ультразвуковом воздействии оптимальных диапазонов частот и временных параметров. Действие УЗ вызывает по всей вероятности, развертывание глобулярных структур белков, что приводит к выходу гидрофобных участков на их наружную поверхность.
Пример 4. Дополнительно были проведены исследовании по определению влияния ультразвука на инфекционную активность вируса КЭ (штамм Софьин) и показана возможность получения неинфекционных препаратов при определенных режимах воздействия с сохранением их антигенной активности, что открывает возможности для конструирования вакцинных препаратов нового типа (таблица 3).
Проведенные исследования и испытания показали, что применение указанных элементов конструкции устройства обеспечивает повышение надежности процесса ультразвуковой активации антигенных препаратов комплекса КЭ.
Таблица 3
Влияние УЗ на ГА и инфекционную активность вирусов ВКЭ (шт.Софьин)
Время озвучивания, мин
Титр ГА
Титр инфекционности
0
1:8
10<sup>-5</sup>
10
1:16
10<sup>-2</sup>
20
1:16
0
30
1:16
0
60
1:32
0
Сравнение заявляемого решения с другими помимо прототипа и аналога техническими решениями показывает, что при простоте конструкции предложенных элементов заявляемое устройство позволяет повысить скорость и эффективность процесса ультразвуковой активации антигенных препаратов.
Заявляемое устройство может быть так же использовано для получения дезинтегратов клеток органов и тканей животных при разработке пищевых добавок, а так же с помощью этого устройства могут отрабатываться условия получения полуфабрикатов кормовых добавок из микроорганизмов и решаться другие задачи с использованием УЗ аппаратов в медицине и ветеринарии при разработке вакцин и лечебных препаратов.