Разработка метода эффективной трансформации ячменя (Hordeum vulgare L. ) c помощью Agrobacterium tumefaciens

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭФФЕКТИВНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЯЧМЕНЯ (HORDEUM VULGARE L.) C ПОМОЩЬЮ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

И В. ТАНАСИЕНКО; А.И. ЕМЕЦ кандидат биологических наук;

Я.Б. БЛЮМ, доктор биологических наук Иинститут пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев

Введение

К наиболее широко используемым методам генетической трансформации растений относятся методы прямого переноса ДНК и Agrobacterium-опосредованная трансформация, хотя каждый из них имеет как свои недостатки, так и преимущества. Методы прямого переноса ДНК, в частности биолистическая трансформация, не явлются видоспецифичными, в то время как агробактериальная трансформация используется в основном для усовершенствования конкретных генотипов двудольных растений. Однако с момента успешной трансформации риса в 1994 г. [6] метод агробактериальной трансформации начали все шире использовать для трансформации злаковых, которые не являются такими же восприимчивыми к A. tumefaciens, как двудольные [15]. Преимущество агробактериального метода трансформации также состоит в переносе ограниченного количества вставок ДНК в геном реципиента [17] по сравнению с биолистической трансформацией, для которой характерно встраивание большого количества копий гена-«интереса» [10], что может приводить к так называемому «молчанию генов».

После получения в 1997 г. первых трансформированных фертильных растений ячменя (Hordeum vulgare L.) с помощью метода агробактериальной трансформации [15] данный метод стал успешно применяться для улучшения хозяйственных характеристик данной культуры [13]. Однако до сих пор не разработан универсальный протокол генетической трансформации ячменя, который был бы применим не только для трансформациии модельных, но и коммерческих сортов. Одна из причин, усложняющих процесс разработки подобного протокола, состоит, прежде всего, в генотипической зависимости регенерационного потенциала ячменя [9]. В связи с этим для разработки эффективной методики агробактериальной трансформации нами ранее было протестировано восемь элитных сортов ячменя, районированных на территории Украины [2].

Целью данной работы была разработка эффективного протокола агробактериальной трансформации ячменя с дополнительным использованием ультразвука и вакуум-инфильтрации.

Объекты и методы исследования

Растительный материал. В качестве эксплантов использовали зрелые зародыши семян ячменя сорта Гетьман, любезно предоставленного Институтом земледелия УААН Украины. Стерилизацию растительного материала проводили в соответствии с ранее описанной методикой [2]. Изолированные щитки ячменя высаживали на среду для индукции каллусообразования [2]. Экспланты культивировали в условиях рассеянного освещения при температуре 24-26°С и 16-часовом фотопериоде. Экспланты, достигшие размеров 0,5-0,8 см, использовали для дальнейшей трансформации.

Agrobacterium-опосредованная трансформация. Для агробактериальной трансформации использовали супервирулентный штамм A. tumefaciens EHA 105, который содержал плазмиду pBECKS.GUSint, несущую репортерный gus-ген под контролем 35S промотора. Бактерию выращивали в течение двух суток на среде LB [11] с добавлением 50 мг/л рифампицина, 100 мг/л карбенициллина и 100 мг/л

спектиномицина при температуре 28°С и постоянном качании на орбитальном шейкере. Перед началом трансформации в бактериальную суспензию добавляли 200 мкМ ацетосерингона.

Для достижения оптимальных условий трансформации тестировали влияние таких дополнительных физических параметров, как: ультразвук (1-3 с), вакуум-инфильтрация (20 мин), последовательное воздействие ультразвука (1-3 с) и вакуум-инфильтрации (20 мин). В качестве контроля использовали инокуляцию эксплантов бактериальной суспензией без дополнительных обработок.

Гистохимический анализ. Для подтверждения переноса плазмидной ДНК в клетки-мишени на вторые сутки после трансформации проводили GUS-тест на наличие транзиентной экспрессии гена ß-глюкуронидазы в клетках эксплантов. Для этого осуществляли гистохимический анализ с использованием раствора X-Gluc [7]. Эффективность трансформации определяли по количеству образовавшихся синих точек на эксплант, подсчет которых проводили под бинокуляром.

Статистическую обработку данных проводили согласно методу Лакина [1].

Результаты и обсуждение

Известно, что важной предпосылкой для создания успешной системы трансформации какого-либо определенного вида растений является наличие высокоэффективной системы регенерации побегов в культуре in vitro. Ранее для определения регенерационного потенциала районированных в Украине сортов ячменя отечественной и зарубежной селекции нами была проведена оценка их способности к каллусогенезу и регенерации растений в условиях in vitro [2] (рис. 1). Был отобран ряд генотипов, обладающих высоким регенерационным потенциалом. Поскольку одним из таких сортов оказался сорт Гетьман, характеризующийся высоким эмбриогенным и регенерационным потенциалом, он был избран в качестве основного объекта для последующей разработки эффективного метода агробактериальной трансформации ячменя.

Для улучшения эффективности трансформации ячменя с помощью A. tumefaciens в нашей работе было исследовано влияние ультразвука и вакуум-инфильтрации на этот процесс. Ранее уже проводились эксперименты по изучению этих факторов на эффективность трансформации [3, 5, 13, 16]. Обработка нами каллусных тканей ячменя ультразвуком приводила к увеличению эффективности транзиентной экспрессии GUS-гена, что проявлялось в образовании значительно большего количества синих точек на поверхности каллусной ткани (19,3 точек на эксплант) по сравнению с контролем (14,2 точек на эксплант) (рис. 2), что совпадает с ранее полученными результатами для различных видов растений [16].

Исследования, проведенные в ряде лабораторий по изучению причин повышения эффективности трансформации с помощью ультразвука, показали возникновение микроповреждений на поверхности обработанных растительных тканей [12, 14]. В результате появления таких микроповреждений образовывался индуктор vir-генов, что приводило к активации переноса Т-ДНК в клетки-мишени [16]. На эффективность ответа обработанных тканей влияло и время обработки ультразвуком, так как длительная обработка приводила к необратимым нарушениям клеточной стенки и к гибели клеток [16]. Согласно полученным данным, наиболее эффективная продолжительность обработки ультразвуком составляет 0,5-2 секунды [12]. Однако в некоторых случаях обработка тканей ячменя ультразвуком приводила к снижению эффективности его генетической трансформации, что может объясняться особенностью структуры клеточной стенки различных сортов [5].

А

В

Д

т

Рис. 1. Введение в культуру in vitro ячменя (H. vulgare): A - изолированный щиток;

Б - прорастание зрелого зародыша; В - образование первичного каллуса; Г -образование эмбриогенного каллуса; Д, Е - регенерация побегов, Ж - GUS-экспрессия после Agrobacterium-опосредованной трансформации. Масштаб (A-Д) -

5 мм, (Е) - 1 см, (Ж) - 1,6 мм, (З) - 1 см

Нам удалось достичь увеличения эффективности GUS-экспрессии почти в два раза (27,6 точек на эксплант) при трансформации ячменя с помощью вакуум-инфильтрации (рис. 2). Вакуум-инфильтрацию также ранее использовали для агробактериальной трансформации тканей некоторых видов растений [3, 4] и, в частности, ячменя [13]. Например, в исследованиях по трансформации незрелых зародышей ячменя было показано повышение уровня GUS-экспрессии с 17,6 до 47,3% при увеличении длительности обработки вакуумом от 1 до 15 минут [13]. Увеличение же времени действия вакуума до 30 мин и выше приводило к сильному бактериальному заражению эксплантов и, как следствие, к снижению жизнеспособности трансформированных тканей [13]. Повышение эффективности трансформации при использовании вакуум-инфильтрации может быть объяснено тем фактом, что сильное разрежение воздуха сначала сопровождается его выходом из межклеточного пространства, а затем под давлением вновь впущенного воздуха бактериальные клетки эффективнее туда проникают. Таким образом, значительно повышается площадь обработки тканей бактериальной культурой, что может приводить к повышению уровня трансформации.

О и-

о

I-

о m

I-

о о и-s t; о

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

_

1—1

—±—

вакуум-инфильтрация

ультразвук ультразвук и вакуум-инфильтрация

Методы воздействия

контроль

Рис. 2. Среднее количество GUS-точек на эксплант на поверхности каллусной ткани ячменя после трансформации GUS-геном

Последовательное же использование нами обоих факторов - ультразвука (1-3 с) и вакуум-инфильтрации (20 мин) еще значительнее повышало эффективность трансформации, что проявлялось в увеличении транзиентной СШ-экспрессии в 2,6 раза (36,8 точек на эксплант) (см. рис. 2). Полученные данные свидетельствует о высокой эффективности совместного использования ультразвука и вакуум-инфильтрации для агробактериальной трансформации, что ранее никем не изучалось.

Выводы

В результате проведенных исследований было изучено влияние таких физических факторов, как ультразвук и вакуум-инфильтрация, при их раздельном и совместном использовании на эффективность агробактериальной трансформации ячменя. Установлено значительное повышение уровня транзиентной экспрессии GUS-гена после соответствующей обработки этими факторами. Значительнее всего на эффективность агробактериальной трансформации оказывала влияние последовательная обработка ультразвуком и вакуумом, что отражают данные транзиентной экспрессии GUS-гена.

Список литературы

1. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

2. Танасиенко И.В., Емец А.И., Блюм Я.Б. Оценка эффективности каллусообразования и регенерации ярых сортов ячменя, районированных на территории Украины // Цитол. и генетика. - 2009. - Том 43, № 4. - С. 12-19.

3. Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants // C.R. Acad. Sci. Paris. - 1993. - V. 316. - P. 1194-1199.

4. Haq I. Agrobacterium-mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) via vacuum infiltration // Plant Mol. Biol. Rep. - 2004. - V. 22. - P. 879-288.

5. Efficient generation of transgenic barley: The way forward to modulate plant-microbe interactions / Hensel G., Valkov V., Middlefell-William J., Kumlehn J. // J. Plant Physiol. -2008. - V. 165. - P. 71-82.

6. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA / Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. // Plant J. - 1994. - V. 6. - P. 271-282.

7. Jefferson R.A., Bevan M.W., Kavanagh T.A. The use of the Escherichia coli beta-glucuronidase as a gene fusion marker for studies of gene expression in higher plants // Biochem. Soc. Trans. - 1987. - V. 15. - P. 17-18.

8. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15. - P. 473-479.

9. Comparison of GFP and GUS reporter genes / Murray F., Brettell R., Matthews P., Bishop D., Jacobsen J. // Plant Cell Rep. - 2004. - V. 22. - P. 397-402.

10. Inheritance of gusA and neo genes in transgenic rice / Peng J.Y., Wen F.J., Lister R.K., Hodges T.K. // Plant Mol. Biol. - 1995. - V. 27. - P. 91 - 104.

11. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, second ed. - Cold Spring Harbor Laboratory Press. - Cold Spring Harbor: NY, 1989. - 1659 p.

12. Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression / Santarem E.R., Trick H.N., Essig J.S., Finer J.J. // Plant Cell Rep. - 1998. - V. 17. - P. 752-759.

13. Shrawat A.K., Becker D., Lorz H. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Sci. - 2007. - V. 172. - P. 281-290.

14. Tang W. Additional virulence genes and sonication enhance Agrobacterium tumefaciens mediated loblolly pine transformation // Plant Cell Rep. - 2003. - V. 21. - P. 555562.

15. Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation / Tingay S., McElroy D., Kalla R., Fieg S., Wang M., Thornton S., Brettell R. // Plant J. - 1997. - V. 11. - P. 1369-1376.

16. Trick H.N., Finer J.J. SAAT: sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation // Transgenic Res. - 1997. - V. 6. - P. 29-36.

17. Agrobacterium-mediated stable transformation of cell suspension cultures of barley (Hordeum vulgare) / Wu H., McCormac A.C., Elliott M.C. Chen D.-F. // Plant Cell Tis. Org. Cult. - 1998. - V. 54. - P. 161-171.

ЭКСПРЕССИВНОСТЬ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ ПЕРОКСИДАЗЫ В

ОНТОГЕНЕЗЕ СОИ

Л.Ф. ДЬЯЧЕНКО, кандидат биологических наук; В.Н. ТОЦКИИ, доктор биологических наук;

В.А. ТОПТИКОВ, кандидат биологических наук Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова В.И. СИЧКАРЬ, доктор биологических наук Селекционно-генетический институт УААН, Одесса

Введение

Наряду с каталазой и супероксиддисмутазой пероксидаза (ПО) входит в ферментативную антиоксидантную систему растений и обладает способностью реагировать на любые воздействия внешней среды изменениями наборов изозимов и/или экспрессивности отдельных изоформ этого фермента [1, 2, 7]. Не исключено, что на разных стадиях развития растений адаптивная роль отдельных изоформ ПО не одинакова, однако убедительных доказательств дифференцированной экспрессии генов пероксидазы в онтогенезе многих растений, в частности сои, мы не нашли. В связи с этим цель настоящей работы состояла в изучении экспрессивности отдельных изоформ пероксидазы на разных стадиях развития растений сои, отличающихся