Способ диагностики обструкции бронхов у реципиента легочного трансплантата
METHOD FOR DIAGNOSING BRONCHIAL OBSTRUCTION IN LUNG TRANSPLANT RECIPIENT

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при мониторинге состояния реципиентов легких для диагностики обструкции бронхов трансплантированных легких.
Стабильно возрастает ежегодное количество выполняемых трансплантаций легких (ТЛ) во всем мире. Развитие программы ТЛ содействовало решению новых задач - обеспечение длительного выживания и улучшения качества жизни пациентов с трансплантированными легкими. Одним из основных патологических факторов, ограничивающих отдаленную выживаемость реципиентов после ТЛ, выступает хроническая дисфункция трансплантированных легких, гетерогенность механизмов которой привела к формированию новой классификации данной патологии.
Диагностика и лечение дисфункции трансплантата, ассоциированной с развитием обструктивных изменений дыхательных путей, представляются крайне сложной задачей ввиду отсутствия явных признаков данного патологического процесса на ранних стадиях. Таким образом, раннее выявление риска ее развития позволит эффективно корректировать стратегию лечения до наступления необратимых структурных изменений.
Для стратификации риска необходимы надежные биомаркеры характерных признаков, позволяющих диагностировать развитие патологии; к числу таковых относятся обструкция бронхов, отражающая течение обструктивных процессов в тканях трансплантата.
Разработка малоинвазивных методов выявления признаков посттрансплантационных осложнений и поиск новых биомаркеров, сигнализирующих об их развитии после трансплантации легких, направлена на повышение качества и продолжительности жизни реципиентов легких до уровня, соответствующего показателям при трансплантации других солидных органов.
В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, связанных с развитием обструктивных процессов, приводящих к хронической дисфункции легочного трансплантата.
МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушениях обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов; в том числе в развитии воспалительных процессов в легких [MicroRNAs in the lung / A. Sittka, B. Schmeck. // Adv Exp Med Biol. - 2013. - Vol.774. - P. 121-134].
Показана роль микроРНК в патогенезе хронической обструктивной болезни легких [Preliminary studies: differences in microRNA expression in asthma and chronic obstructive pulmonary disease / M. Pietrusinska, A. Pajak, P. Gorski et al. // Postepy Dermatol Alergol. - 2016. - 33(4). - P. 276-280].
В ряде работ отмечается участие микроРНК-339 при раке легких в качестве ингибитора пролиферации клеток [MicroRNA-339 inhibits human hepatocellular carcinoma proliferation and invasion via targeting ZNF689 / Hui Zeng, Jiaping Zheng, Song Wen et al. // Drug Des Devel Ther. - 2019. Vol. 13. - P. 435-445.].
На сегодняшний день объективными методами верификации степени и характера структурных изменений дыхательных путей легочного трансплантата являются трансбронхиальная биопсия и рутинные методы рентгенологической и эндоскопической визуализации [Early identification of chronic lung allograft dysfunction: the need of biomarkers / Tissot A., Danger R., Claustre J., Magnan A. and Brouard S. // Front. Immunol. - 2019. - 10:1681] - (прототип). Мультиспиральная компьютерная томография является одним из самых эффективных неинвазивных методов диагностики обструктивных процессов бронхолегочной системы, однако будучи разновидностью рентгенологических исследований, имеет ряд противопоказаний и ограничений в применении. Методика выполнения видеобронхоскопии и трансбронхиальной биопсии отличается инвазивностью, что становится существенным недостатком данных видов исследований.
Трансбронхиальная биопсия выполняется в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированных легких. Однако трансбронхиальная биопсия имеет ряд ограничений и рисков, характерных для инвазивных методов диагностики. Получение биоптата подразумевает исследование локального участка трансплантата, что не гарантирует исчерпывающей характеристики состояния всего органа [Characteristic patterns in the fibrotic lung. Comparing idiopathic pulmonary fibrosis with chronic lung allograft dysfunction / Fernandez I.E., Heinzelmann K., Verleden S., Eickelberg O. // Ann Am Thorac Soc. - 2015. - №12. - Vol. S1. - P. 34-41]. Трудоемкость реализации и высокий риск осложнений при применении данного метода подтверждаются многочисленными публикациями как отечественных, так и зарубежных исследователей.
Очевидна необходимость разработки новых неинвазивных диагностических технологий, позволяющих не только выявить наличие обструктивных изменений бронхов у реципиентов после трансплантации легких, но и осуществлять мониторинг и раннюю диагностику развития обструктивных процессов с возможностью эффективной коррекции.
Нами поставлена задача - разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики обструктивных процессов в бронхиальных путях у реципиентов после трансплантации легких.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении возможности неинвазивности, снижении трудоемкости и времени проведения, повышении доступности ранней диагностики развития обструктивных процессов бронхов у реципиентов трансплантированных легких при одновременном достижении эффективной диагностики бронхиальных осложнений у данного контингента пациентов, а также повышении ее объективности за счет возможности вынесения суждения с учетом показателя, отражающего состояние всего трансплантата.
Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированными легкими и улучшить результаты трансплантации за счет своевременного определения показаний к выполнению трансбронхиальной биопсии и коррекции терапии путем определения уровня экспрессии микроРНК-339 в плазме венозной крови.
Нами эмпирически установлен диагностически эффективный показатель развития обструктивных изменений бронхов легочного трансплантата, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-339 в плазме венозной крови реципиента трансплантированных легких.
Использование предполагаемого теста позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение инвазивных методов трансбронхиальной биопсии для уточнения диагноза обструктивных изменений трансплантированных легких.
Сущность изобретения состоит в следующем.
Для диагностики обструкции бронха у реципиента трансплантированного легкого/легких определяют в плазме его венозной крови уровень экспрессии микроРНК-339 по формуле:
-(ct1-ct2)
Э=2,
где
Э - уровень экспрессии микроРНК-339,
Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339,
Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.
При величине Э более 0,02 диагностируют наличие обструкции бронха легочного трансплантата.
Способ осуществляется следующим образом.
В качестве материала для исследования величины экспрессии микроРНК используют плазму венозной крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.
Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.
Уровень экспрессии микроРНК-339 определяют методом полимеразной цепной реакции, например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).
8
Определение проводят в соответствии с инструкцией к наборам. РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляют 1,6 × 10 копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.
Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируют путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при t°=95°С с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при t°=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.
Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы венозной крови выражают в относительных единицах (отн.ед.) и рассчитывают по формуле:
-(ct1-ct2)
Э=2,
где
Э - уровень экспрессии микроРНК-339,
Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339 (то есть значение порогового цикла микроРНК-339 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),
Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).
У реципиентов легких с величиной экспрессии микроРНК-339 Э выше 0,02 отн.ед. в плазме венозной крови определяют наличие обструкции бронха/бронхов после трансплантации.
Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Пример 1.
Пациенту Б., 44 лет, выполнена правосторонняя ортотопическая трансплантация легких. Измеренный на 610 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме венозной крови составил Э=1,23 отн.ед. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие обструкции бронха легочного трансплантата. По данным мультиспиральной компьютерной томографии зафиксированы пневмофиброзные изменения нижней доли справа, обструкция бронха, картина дисфункции легочного трансплантата. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.
Пример 2.
Пациенту Ч., 40 лет, выполнена последовательная двусторонняя трансплантация легких. Послеоперационный период протекал без осложнений. В течение периода наблюдения (с первых суток и до 1 года после трансплантации) у пациента данных за воспалительные процессы не получено. Измеренный на 162 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме венозной крови (Э) составил 0,0003 отн.ед. По результатам видеобронхоскопии признаков обструкции бронхов трансплантата не выявлено.
Предложенный способ апробирован в клинической практике на 44 реципиентах легких, специфичность предлагаемого способа - 75,9%, диагностическая эффективность - 70,4%.
Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность у реципиентов трансплантированных легких диагностировать течение обструктивных процессов в бронхах, приводящих к дисфункции легочного трансплантата.