БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ СПОСОБ СИНТЕЗА N-ЗАМЕЩЕННЫХ АЛИФАТИЧЕСКИХ АКРИЛАМИДОВ И ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
BIOCATALYTIC METHOD OF N-SUBSTITUTED ALIPHATIC ACRYLAMIDE SYNTHESIS AND RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS BACTERIA STRAIN FOR IMPLEMENTATION THEREOF

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается синтеза N-замещенных алифатических акриламидов, в частности N-изопропилакриламида и N-диметиламинопропилакриламида путем биокаталитического ацилирования первичных алифатических аминов акриламидом с использованием в качестве биокатализатора штамма бактерий Rhodococcus erythropolis, обладающего ацилирующей активностью.
N-замещенные алифатические акриламиды широко используют в качестве мономеров для получения водорастворимых полимеров, используемых в производстве различных флокулянтов, адсорбентов, и структурообразователей, применяемых в промышленности и сельском хозяйстве (Полиакриламид. - М., 1992.).
Традиционно N-замещенные алифатические акриламиды получают химическими способами. Наиболее универсальный из них - ацилирование алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (MacWilliams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker, 1973). Общими недостатками химических способов синтеза являются необходимость получения и использования крайне ядовитых хлорангидридов и использование токсичных органических растворителей.
Альтернативный подход к синтезу химических соединений - биокаталитический синтез. При осуществлении биокаталитических способов синтеза химических веществ в качестве катализаторов используют ферменты или клетки микроорганизмов, а проведение процесса синтеза осуществляют при невысоких температурах и давлении в водных средах (РФ 2053300).
Упомянутые отличия биокаталитических способов от химических являются во многих случаях их преимуществами. Возможность проведения синтезов в водных средах приводит к меньшей токсичности производства, возможность проведения процессов при невысоких температурах и давлениях снижает его затратность, более выраженная избирательность катализаторов на основе ферментов позволяет получать более чистые вещества. Дополнительными преимуществами биокатализаторов перед химическими катализаторами являются более простые способы получения биокатализаторов, а также возможность модификации биокатализаторов в заданном направлении для синтеза различных структурных вариантов соединений.
На сегодняшний день не известно биокаталитических способов синтеза N-замещенных алифатических акриламидов.
Задача настоящего изобретения - разработка биокаталитического способа синтеза N-замещенных алифатических акриламидов.
Задача решена путем:
- получения штамма Rhodococcus erythropolis 37, обладающего ацилирующей активностью, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ Ас-1793 и
- разработки способа синтеза N-замещенных алифатических акриламидов из акриламида и первичных алифатических аминов с использованием в качестве биокатализатора бактерий Rhodococcus erythropolis 37.
Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, основан на ацилировании первичных алифатических аминов в водной среде амидами ненасыщенных карбоновых кислот, в частности акриламидом. В качестве биокатализатора в заявляемом способе используют штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1793, обладающий ацилирующей активностью.
Заявляемый штамм обладает ацилирующей активностью с уникальной субстратной специфичностью и способен синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды, в частности N-изопропилакриламид, N-диметиламинопропилакриламид.
Штамм Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 изолирован из почвы на минимальной среде с ацетонитрилом.
Характеристика заявляемого штамма
Морфологические свойства. Клетки штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793 неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. Через 18-20 час роста при температуре 30°С на мясо-пептонном агаре - МПА (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, МГУ, 1983, стр.93) клетки образуют слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 часа распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающему типам.
На плотных питательных средах (агар Лурия Бертани, мясо-пептонный агар, агар Хотингера) через 48 часов роста при температуре 30°С заявляемый штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные в розовый цвет.
Состав питательных сред (мас.%):
агар Лурия Бертани:
Триптон
0,5
Дрожжевой экстракт
0,25
NaCl
0,5
Агар-агар
2
Вода
Остальное
Мясо-пептонный агар:
Агар-агар 2
Мясо-пептонный бульон - остальное
Агар Хотингера:
Агар-агар 2
Бульон Хоттингера (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, МГУ, 1983, стр.93) - остальное.
Физиологические свойства:
Заявляемый штамм усваивает лактозу, ацетат, сукцинат, фумарат, глицерин, фруктозу, ацетамид, акриламид, бутирамид, изобутирамид, пропионамид, валерамид. Оптимальный рН штамма находится в диапазоне 6,5-8,5.
Хранение штамма:
Хранение заявляемого штамма осуществляется в виде лиофилизированных клеток.
Нуклеотидная последовательность гена рибосомальной 16S РНК
Нуклеотидная последовательность гена рибосомальной 16S РНК заявляемого штамма соответствует роду Rhodococcus, виду erythropolis.
На основании перечисленного выше и в соответствии с руководством Берджи (Определитель бактерий Берджи, Москва, «Мир», 1997) штамм ВКПМ Ас-1793 отнесен к роду Rhodococcus и виду erythropolis.
Оптимальные условия культивирования:
Для получения клеток заявляемого штамма, обладающих ацилирующей активностью, штамм выращивают при 25-30°С в течение 24-36 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода ацетанилид в концентрациях 0,2-0,4%, или совместно фруктозу 0,2-0,4% и ацетанилид 0,4-0,6%, а в качестве источника азота аммонийные или нитратные соли в концентрациях 0,4-2%.
Состав синтетической среды М3, мас.%
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>*3H<sub>2</sub>O
0,7
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,3
MgSO<sub>4</sub>
0,05
FeSO<sub>4</sub>
0,0005
смесь витаминов
0,05
вода деионизированная
остальное
Способ в общем виде осуществляют следующим образом:
Получение водного раствора N-замещенных алифатических акриламидов, в частности N-изопропилакриламида и N-диметиламинопропилакриламида осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина, в концентрациях 1-10% с суспензией биокатализатора и инкубацией при температурах 20-40°С и значениях рН 9,5-11 в течение 1-48 часов. Концентрация биокатализатора в смеси 2-16 г сухого веса/л.
Биокатализатор хранят и используют в виде свободных клеток заявляемого штамма, полученных путем отделения от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс.об/мин и последующим суспендированием в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г сухого веса/л. Концентрацию образовавшегося N-замещенного алифатического акриламида определяют с помощью газовой хроматографии. Анализ реакционной смеси осуществляют на газовом хроматографе LXM-80 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Продукты реакции разделяют с помощью кварцевой колонки длиной 32 м, набитой сорбентом FFAP, при постоянной температуре 180°С. В качестве газа носителя используют гелий.
Образовавшийся N-замещенный алифатический акриламид выделяют из раствора экстракцией бензолом, перерастворением в диэтиловом эфире, осаждением при понижении температуры до 20°С, фильтрацией.
Сущность изобретения поясняется примерами.
Пример 1. Получение биокатализатора
4
3
9
В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 100 мл синтетической питательной среды М3, содержащей ацетанилид в концентрации 0,4% и NHNO в концентрации 0,2%, добавляют 1 мл культуры (10кл/мл) заявляемого штамма, предварительно выращенного на среде Лурия Бертани в течение 16 ч при 30°С с перемешиванием (300 об/мин). Затем колбу инкубируют с перемешиванием (200 об/мин) при 30°С в течение 36 час. Биомассу отделяют центрифугированием при 5 тыс.об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0 до концентрации 20 г/л и хранят при +4°С. Полученные таким образом клетки в количестве 20 мг сухого веса обладают ацилирующей активностью 4,4 единицы/г сухого веса клеток.
Ацилирующая активность определяется по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике:
Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (рН 10), 450 мкл суспензии клеток, содержащей 2,4 мг клеток. Инкубируют при 37°С 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин, определяют содержание N-изопропилакриламида с помощью газовой хроматографии.
За единицу активности принимают количество фермента, необходимое для синтеза 1 мМ N-изопропилакриламида за 1 час.
Пример 2. Получение биокатализатора с более высоким выходом
Биокатализатор выращивают, как в примере 1, но среда М3 дополнительно содержит 0,4% фруктозы. Биомассу ресуспендируют также, но до концентрации 32 г сухого веса/л.
В результате получают биомассу в количестве 80 мг сухого веса с ацилирующей активностью 2,2 единицы/г сухого веса клеток.
Пример 3. Синтез N-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина
Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток заявляемого штамма, полученных как в примере 1. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 3% (0,42 мМ) и 2,5% (0,42 мМ) соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 6 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество полученного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 11 г/л.
Пример 4. Синтез N-диметиламинопропилакриламида из акриламида и диметиламинопропиламина
Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток заявляемого штамма, полученных как в примере 1. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 1% (0,14 мМ) и 2,5% (0,14 мМ) соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 2,4 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс.об/мин) и количество полученного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 5 г/л.
Пример 5. Получение N-изопропилакриламида
50 мл суспензии клеток заявляемого штамма, полученных как в примере 2, вносят в сосуд объемом 200 мл. Затем туда же добавляют 25 мл 8% раствора акриламида и 25 мл 8% раствора изопропиламина с рН 10. Процесс проводят при перемешивании (200 об/мин), с контролем рН, при температуре 37°С. Через 24 часа процесс завершают, клетки отделяют центрифугированием (10 тыс.об/мин). Полученный супернатант экстрагируют 3 раза равным объемом бензола. Затем бензол выпаривают на вакуумном роторном испарителе при 38-40°С, полученную маслянистую жидкость растворяют в 15 мл диэтилового эфира. Раствор обезвоживают с помощью безводного сульфата натрия и концентрируют на вакуумном роторном испарителе. При охлаждении до 20°С выпадает белый с желтым оттенком кристаллический осадок с характерным запахом.
Полученный кристаллический осадок анализируют путем определения температуры плавления и содержания элементов с помощью элементного анализа:
- температура плавления полученных кристаллов 62-64°С соответствует известной (Journal of American Chemical Society, v.73, 1951, p.4076) для N-изопропилакриламида - 62-63°C.
-элементный анализ выявил следующие содержания элементов в полученном образце вещества (%): С - 63,77; Н - 9,68 и N - 11,52. Рассчитанные для N-изопропилакриламида содержания элементов совпадают с определенными экспериментально (%): С - 63,71; Н - 9,73 и N - 12,38.
На основании определения температуры плавления и соответствия рассчитанного и реального результатов элементного анализа сделан вывод о соответствии полученного вещества N-изопропилакриламиду.
Таким образом, получен штамм Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, обладающий ацилирующей активностью, способный синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды. На его основе впервые разработан биокаталитический способ получения N-замещенных алифатических акриламидов, в частности N-изопропилакриламида и N-диметиламинопропилакриламида с помощью клеток микроорганизма.