Биологическая активность гуминовых кислот торфов Среднего Приобья

Биологическая активность гуминовых кислот торфов Среднего Приобья

М.П. Сартаков, к.б.н., В.В. Леонов, к.т.н., Югорский ГУ

Если говорить о гуминовых кислотах как о ростовых веществах, то очень важно знать их влияние на липидные мембраны, где липидный слой постоянно подвергается воздействию различных внешних факторов, что приводит к образованию пероксидов липидов, которые очень долго живут и токсичны для растений. Поражение молекул липидов, их окисление и получение перекисных липидов происходит под влиянием различных стрессов. В природе растения многократно испытывают стрессовые состояния под действием экстремальных температур и дефицита или избытка влаги. Мембраны всё время повреждаются за счёт накопления липазы, фермента, разрушающего липидный слой [1, 2].

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования нами были использованы препараты гуминовых кислот, выделенных из поверхностных слоёв верховых, переходных и низинных торфов Среднего Приобья. Извлечение проводили по ранее описанной методике [3].

Изучали ингибирующее влияние щелочных растворов гуминовых кислот с концентрацией 0,001% на фермент липазу, которая содержится в тестовом препарате TRIGLYCERIDES GRO-PAP method/liguid, произведенном фирмой Chonolab AG (Швеция), и может расщеплять триглицериды стандартного раствора. Рабочий реагент, кроме того, имеет в своём составе для приближения к естественным стабильным природным условиям дыхательные ферменты: пероксидазу, оксидазу и каталазу, которые не участвуют в расщеплении липидов и являются переносчиками О2 и Н2 в растительной клетке.

Определение ингибирующего действия гуминовых кислот на липазу проведено спектрофотометрическим методом.

Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определённых участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами ферментов, субстратами или продуктами реакции. Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием фермента и реактивов и позволяет следить за течением реакции во времени. Для этого в 1 см (l) кювету последовательно вносят с помощью микропипетки 0,1 мл одного из приготовленных растворов триглицеридов и 2 мл рабочего реагента из набора Chronolab. Полученный раствор тщательно

перемешивают стеклянной палочкой и сразу включают секундомер. Кювету помещают в кюветное отделение КФК (к = 505 нм), выводят на ноль и измеряют оптическую плотность D исследуемого раствора против раствора сравнения, записывая результаты через каждые 30 секунд. Раствор сравнения готовят, добавляя 0,1 мл дистиллированной воды к 2 мл рабочего реагента. Измерение продолжают до тех пор, пока значения оптической плотности не перестанут изменяться. Аналогично измеряют показатели всех приготовленных растворов.

Этот процесс протекает по свободно-радикальному механизму, с накоплением чрезвычайно токсичных перекисных низкомолекулярных радикалов.

Результаты исследований. Макромолекулы гуминовых кислот можно рассматривать как стабильные свободные радикалы, способные к рекомбинации при взаимодействии с агрессивными свободными радикалами перекисей липидов, т.е. быть их «ловушками». Этот эффект проявляется в подавлении активности фермента липазы под действием гуминовых кислот.

Определяя подавление активности липазы, можно говорить о характере влияния гуминовых кислот на растения, биологической активности.

Идея мембранного эффекта обсуждается в научной литературе сейчас очень часто. Не все авторы связывают её со свободными радикалами, но учитывают, что гуминовые кислоты не проходят внутрь клетки, так как размеры их слишком велики в сравнении с параметрами пор растений и составляют 100-200Л в свёрнутом состоянии в виде глобулярной структуры.

Гуминовые кислоты производят инактивацию повреждённого липидного слоя. Своим спиновым воздействием и системой полисопряжения электроны влияют на те реакции, которые происходят на самой мембране. Наши результаты подтверждают эти положения.

Мембранные эффекты играют очень важную роль. Признаётся, что мембрана состоит из липидного и белковых слоёв, но основную роль играют липиды и изменение их структуры. Липидным мембранам клетки придаётся большое значение в метаболических процессах. Они позволяют задерживать и выбрасывать токсичные вещества, не давая им проникнуть внутрь клетки. Поэтому их поражение может носить глобальный характер.

Гуминовые кислоты являются адаптогенами, они лучше действуют в стрессовом состоянии на растения и в профилактических целях.

Для ингибирования использовали щелочные растворы гуминовых кислот с концентрацией

0,0001%, которые извлекались из торфов различного ботанического состава и степени разложения.

По мере протекания ферментативного гидролиза липидов раствор из слабо-жёлтой окраски приобретает красную окраску в результате протекания каскада ферментативных реакций, приводящих к образованию окрашенного хинонимина:

triglycérides + Н 2О | |ра^~ glycerol + fatty acid\ glycerol + ATP glycerol-3-phosphate + ADP;

glycerol-3-phosphate + О-2 (,|^) dihydroxyacelone phosphate + H202;

2H202 + 4-aminoantipyrin + 4-chlorophenol po^ guinoneimine + HC1 + 4H20.

Для выявления ингибирования липазы гу-миновой кислотой была рассчитана и изучена активность фермента в присутствии гуминовой кислоты.

Активность липазы определяли по формуле Аир —

где Alip — активность липазы;

Ингибирование активности липазы

Вид исходного торфа R, % Активность липазы, ммоль Л^МИН"1

Без гуминовых кислот - 0,53

Пушицево-с фагновый 65 0,22

Пушицевый 55 0,16

Вахтовый 60 0,25

Древесный 45 0,16

Сфагновый 15 0,26

Травяной 15 0,26

Сфагновый (100% фускум) 5 0,10

Древесный 10 0,21

Травяно-сфагновый 35 0,14

Древесный 25 0,19

Примечание: R — степень разложения

ск — концентрация контроля;

0о — оптическая плотность;

Ок — оптическая плотность контроля;

*инкуб. — время инкубации.

Активность липазы без добавления гуминовых кислот определили по отношению концентрации ко времени инкубации (табл.).

Из полученных данных видно, что активность липазы снижается в присутствии гуминовых кислот. Наибольшую ингибирующую активность на липазу оказал препарат гуминовой кислоты, извлечённый из сфагнового торфа, состоящего на 100% из сфагнума бурого со степенью разложения 5%.

Гуминовая кислота этого торфа в сравнении с другими препаратами характеризуется особой химической структурой — меньшей степенью бензоидности и конденсированности молекул, высокой долей алифатических фрагментов и концентрации парамагнитных центров.

Выводы. В ходе исследования пришли к следующим выводам.

1. Установлено ингибирующее действие гуминовых кислот торфов Среднего Приобья на активность липазы, которая может рассматриваться как мера биологической активности гуминовых. Содержание липазы при действии гуминовых кислот снижается на 50—80%.

2. Наибольший эффект антисептического действия выявлен у препарата, извлечённого из однородного по ботаническому составу сфагнового торфа с низкой степенью разложения.

Литература

1. Христева Л .А. Влияние гуминовых кислот на рост растений при различном соотношении питательных веществ в начале развития // Доклады ВАСХНИЛ. М., 1947. С. 23-29.

2. Комиссаров И.Д., Климова А. А. Влияние гуминовых кислот на биокаталитические процессы // Научные труды Тюменского СХИ, 1971. Т. 14. С. 225-242.

3. Комиссаров И.Д., Стрельцова И.Н. Влияние способа извлечения гуминовых кислот из сырья на химический состав полученных препаратов // Научные труды Тюменского СХИ, 1971. Т. 14. С. 34-48.