Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR CATTLE LEUKEMIA

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способам диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание, распространенное по всему миру. Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и/или образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.
Среди болезней животных лейкоз крупного рогатого скота прочно занимает первое место среди инфекционных болезней, поэтому проблема своевременной эффективной диагностики лейкоза крупного рогатого скота стоит остро. В связи с этим совершенствование способов прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота актуально.
Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота путем проведения поэтапной иммобилизации на твердом носителе антигена вируса лейкоза. В результате его специфического иммунологического связывания с адсорбированными моноклональными антителами мыши против гликопротеидного антигена вируса лейкоза, внесение и инкубацию контрольных и анализируемых образцов сыворотки крови или молока крупного рогатого скота, внесение и инкубацию антител к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, меченных пероксидазой, внесение субстрата ферментативной реакции и учет результатов реакции по величине оптической плотности анализируемых образцов. [RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010 г.]. Данный метод непрямого иммуноферментного анализа обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако его методика выполнения в три этапа требует специализированного оборудования и высококвалифицированного персонала.
Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, который включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих. При этом ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME. [RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), 26.05.2017 г.]. Данный способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота представляет значимость при проведении диагностических аллергических исследований на туберкулез, тем не менее, он не может применяться регулярно в течение года.
Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота провокацией иммунного ответа, включающий серологическое исследование сыворотки крови в РИД с повторным серологическим исследованием крови серо-негативных животных после трехкратного введения инактивированной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота с интервалом в 14 дней [RU 2264628 С2, G01N 33/53 (2000.01), 20.11.2005]. Но при сложности осуществления известный способ недостаточно эффективен, что обусловлено строго индивидуальным действием вакцины на фоне вторичных иммунодефицитов.
Диагностику лейкоза осуществляют с использованием серологических, молекулярно-генетических (полимеразной цепной реакции - ПЦР), гематологических, клинических, патоморфологических методов и метода биопробы. В настоящее время в государственных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота основу диагностики составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА) (Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные Руководителем Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В. Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130).
Метод реакции иммунодиффузии основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота, которые появляются в крови через 14-60 дней после заражения животных и сохраняются пожизненно. Это связано с тем, что онкогенный процесс у разных животных имеет различный временной характер. Поскольку лейкоз крупного рогатого скота является медленной инфекцией, то существует необходимость в выявлении противовирусных антител в ранней период онкогенеза. Данная реакция позволяет выявлять эти антитела в период от 14 до 60 дней в период инокуляции возбудителя. Но, при незначительных концентрациях антител в исследуемых сыворотках и не соответствующих температурных режимах, при которых наступает связывание (in vivo) антигена с антителом, происходит в незначительных концентрациях (in vitro) при проведении реакции иммунодиффузии, которые не позволяют их выявить и видеть их в виде линий преципитаций.
Задачей изобретения является раннее выявление инфицированных лейкозом животных, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, сокращая при этом время их нахождения в стаде и способствуя ускорению проведения оздоровительных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.
Это достигается тем, что при предлагаемом способе диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении пробоподготовки постановки реакции иммунодиффузии для выявления лейкозных животных на первом этапе исследования, проводят концентрирование иммунноглобулинов, в которых содержатся специфические антитела. Данное концентрирование специфических антител заключается в том, что дополнительно проводят центрифугирование сыворотки крови в пробирках Эппендорфа при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. А саму реакцию проводят при 37°C в термостате, выдерживая агар с исследуемым материалом 48 часов. При этом увеличивается концентрация специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота и повышается температура проведения реакции до 37°C.
Данные выводы были сделаны на основе проведенного опыта. В опыте участвовало 330 голов крупного рогатого скота из неблагополучного хозяйства по лейкозу, ранее не имеющих положительной реакции в реакции иммунодиффузии. Испытуемые сыворотки от этих животных готовили по образцам №№1-7 и проводили в условиях, указанных в соответствующих образцах.
1. Образец №1. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37°C, затем читали реакцию.
2. Образец №2. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 40°C, затем читали реакцию.
3. Образец №3. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 1 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37°C, затем читали реакцию.
4. Образец №4. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 1 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 24°C, затем читали реакцию.
5. Образец №5. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 3 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 32°C, затем читали реакцию.
6. Образец №6. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 2 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 40°C, затем читали реакцию.
7. Образец №7. Стандартное проведение реакции иммунодиффузии. После получения сыворотки крови, центрифугирование не проводили. Исследуемый материал сразу помещали в лунки с агаром. После проводили учет реакции (проведено согласно Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота от 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130).
Результаты проведения реакции иммунодиффузии с испытуемыми сыворотками животных, ранее нереагирующих серологически, приведены в таблице.
В результате опыта сделали вывод, что предлагаемый способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота основан на установленной прямой связи концентрации антител в испытуемой сыворотке и абсолютного связывания антител с антигенами при более физиологически приближенного к in vivo (37°C) реакции антигена с антителом, что приводит к повышению чувствительности реакции иммуннодиффузии (образец №1) и позволяет выявлять на 35% больше инфицированных вирусом лейкоза животных по сравнению с постановкой стандартной реакции иммунодиффузии.
Применение предлагаемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет выявлять инфицированных лейкозом животных на более ранних стадиях, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, что позволяет сократить время их нахождения в стаде и способствует ускорению проведения оздоровительных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.
Источники информации
1. RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010 г.
2. RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), 26.05.2017 г.
3. RU 2264628 C2, G01N 33/53 (2000.01), 20.11.2005 г.
4. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные Руководителем Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В. Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130.