СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ВНЕШНЕЙ ПОВЕРХНОСТИ ПЛАНАРНОГО ВОЛНОВОДА ДЛЯ ПРИДАНИЯ ЕЙ СПОСОБНОСТИ СВЯЗЫВАТЬ ИСПЫТУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ ВДОЛЬ МНОЖЕСТВА ЗАРАНЕЕ ЗАДАННЫХ ЛИНИЙ И ПЛАНАРНЫЙ ВОЛНОВОД
METHOD FOR PREPARING OUTER SURFACE OF PLANAR WAVEGUIDE TO BE CAPABLE OF BINDING TARGET SAMPLES ALONG PLURALITY OF PREDETERMINED LINES AND PLANAR WAVEGUIDE

Настоящее изобретение относится к способу подготовки внешней поверхности планарного волновода для придания ей способности связывать испытуемые образцы вдоль множества заранее заданных линий, равно как к планарному волноводу согласно соответствующему независимому пункту формулы изобретения.
В отдаленных технических областях, не касающихся волноводов, известно нанесение наноструктур на металлические поверхности, такие как природный титан (например, "Getachew Tizazu et al., Large area nanopatterning of alkylphosphonate self-assembled monolayers on titanium oxide surfaces by interferometric photo-lithography", Nanoscale, 2011, 3, 2511, опубликовано 23 марта 2011 в http://pubs.rsc.org, doi:10.1039/C0NR00994F). Как правило, металлы не пригодны для формирования планарного волновода. Подготовка металлических поверхностей не предоставляет рекомендаций для подготовки внешней поверхности планарного волновода. В частности, природный титан не является материалом, пригодным для применения в планарном волноводе.
Область применения настоящего изобретения относится к детектированию актов связывания. Хорошо известные устройства детектируют акты связывания испытуемого образца с молекулой захвата путем применения меток, способных испускать при их возбуждении флуоресцентный свет. Например, в качестве меток испытуемых образцов можно применять флуоресцентные метки. После возбуждения флуоресцентные метки вызывают эмиссию флуоресцентного света, обладающего характеристическим спектром эмиссии. Детектирование характеристического спектра эмиссии в конкретном пятне указывает, что отмеченная испытуемая молекула связалась с молекулой захвата определенного типа, присутствующей в соответствующем конкретном пятне на внешней поверхности планарного волновода. Сенсор для детектирования отмеченных испытуемых образцов описан в статье "Zeptosens' protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis", Proteomics 2002, 2, S. 383-393, Wiley-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, Germany.
Новое устройство для оптического детектирования актов связывания обеспечивает эффективный способ отказа от меток посредством непосредственного детектирования наличия испытуемых образцов на молекулах захвата. Устройство содержит планарный волновод, в который свет вводят посредством оптической развязки таким образом, чтобы когерентный свет распространялся через планарный волновод с полем затухающих колебаний когерентного света, распространяющегося вдоль внешней поверхности планарного волновода. Внешнюю поверхность планарного волновода подготавливают таким образом, чтобы появилась способность связывания испытуемых образцов вдоль множества заранее заданных линий, таким образом, чтобы свет поля затухающих колебаний рассеивался испытуемыми образцами, располагаемыми вдоль множества заранее заданных линий. Рассеянный свет конструктивно интерферирует в заранее определенных местоположениях детектирования, внося этим вклад в детектируемый сигнал совмещенного света, рассеянного испытуемыми образцами.
Данное новое устройство обеспечивает высокую чувствительность детектирования посредством суперпозиции когерентного света, рассеянного на испытуемых образцах, располагаемых вдоль множества заранее заданных линий, это физическое явление называют "дифракция". Рассеянный свет интерферирует конструктивно с максимумом интенсивности, например, в заранее определенных местоположениях детектирования, поскольку линии множества заранее заданных линий располагают таким образом, чтобы свет, рассеянный испытуемыми образцами на различных линиях имел в заранее заданных местоположениях детектирования разницу в длине оптического пути, являющуюся целым кратным длине волны света, распространяющегося через планарный волновод. Заранее заданное местоположение детектирования должно располагаться по отношению к множеству заранее заданных линий так, чтобы удовлетворять требованиям конструктивной интерференции. В дополнительных примерах свет дифрагирует во множестве заранее заданных линий так, чтобы он интерферировал в планарном волноводе в заранее заданных направлениях.
Поэтому задачей изобретения является предоставление способа подготовки внешней поверхности планарного волновода такой, чтобы она имела способность связывать испытуемые образцы вдоль множества заранее заданных линий. Еще одной дополнительной задачей изобретения является обеспечение планарного волновода с подготовленной внешней поверхностью, способной связывать испытуемые образцы вдоль множества заранее заданных линий.
Предпочтительные варианты выполнения способа по изобретению являются предметом соответствующих зависимых пунктов формулы изобретения.
Согласно изобретению предложен способ подготовки внешней поверхности планарного волновода для придания способности связывать испытуемые образцы вдоль множества заранее заданных линий. Способ содержит следующие этапы.
Предоставление планарного волновода, имеющего внешнюю поверхность, приспособленную для присоединения головной группы линкерной молекулы к внешней поверхности.
После этого последовательное нанесение по меньшей мере одного множества линкерных молекул на внешнюю поверхность. Каждое множество из, по меньшей мере, одного множества линкерных молекул компонуют, формируя индивидуальный слой линкерных молекул, причем индивидуальные слои формируются один над другим, начиная с внешней поверхности планарного волновода. Каждая линкерная молекула содержит, по меньшей мере, одну функциональную группу и головную группу, способную присоединяться к внешней поверхности планарного волновода или к функциональным группам предшествующего слоя линкерных молекул посредством образования ковалентной связи или посредством адсорбции путем электростатического взаимодействия. Функциональные группы множества линкерных молекул самого верхнего слоя присоединяют к фотолабильным защитным группам, таким образом, чтобы каждая функциональная группа, защищенная упомянутыми фотолабильными защитными группами, становилась неспособной присоединять
комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы.
Затем в самом верхнем слое экспонирование светом заранее заданной длины волны этих фотолабильных защитных групп, располагаемых вдоль множества заранее заданных линий, с целью удаления экспонированных фотолабильных защитных групп из функциональных групп, чтобы сделать эти функциональные группы способными присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы.
В результате удаление экспонированных фотолабильных защитных групп из функциональных групп определяет геометрические местоположения этих функциональных групп, способных присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы. Местоположения функциональных групп выбирают так, чтобы они составили множество заранее заданных линий. Как было описано во вводной части, когерентный свет, рассеянный у испытуемых образцов на этих линиях, конструктивно интерферирует в заранее определенном местоположении детектирования. С технической точки зрения предпочтительным является расположение на множестве заранее определенных кривых линий, имеющих уменьшающееся расстояние между соседними линиями. Расположение кривых линий с уменьшающимся расстоянием кривых линий позволяет сфокусировать дифрагированный свет в заранее определенном местоположении детектирования. Расположение множества заранее определенных кривых линий включает в себя повторное расположение серии множеств заранее заданных линий одна над другой таким образом, чтобы обеспечить дополнительный отдельный фокус (например, посредством легкого вращения каждого последующего множества заранее заданных линий по отношению к предыдущему множеству заранее заданных линий). Каждое из серии множеств заранее заданных линий может обладать различной химической, биологической или фармацевтической характеристикой. Альтернативным является расположение прямых линий таким образом, чтобы свет дифрагировал внутри плоскости планарного волновода, в котором дифрагированный свет интерферирует в заранее заданных направлениях внутри планарного волновода. Экспонирование этих фотолабильных защитных групп, расположенных вдоль множества заранее заданных линий, может приводить к полному (в идеале удаляются все фотолабильные защитные группы) или частичному
(удаляется заранее заданная часть фотолабильных защитных групп, например, 10%, 20%) их удалению при помощи разнообразных фотолитографических способов (например, контактным способом или фотолитографически полем в дальней зоне), но предпочтительно фотолитографически полем в ближней зоне, при выполнении этих способов фотолитографическая маска не входит в контакт с волноводом, но образует незначительный просвет между маской и внешней поверхностью волновода
(соответственно экспонированные фотолабильные защитные группы линкерных молекул, которые могут быть наполнены жидкостью в течение экспонирования фотолабильных защитных групп линкерных молекул, присоединенных к внешней поверхности волновода). Экспонирование фотолитографическими способами включает применение фотолитографических инструментов, таких как эластомерная фазовая маска для фотолитографии полем в ближней зоне, как подробно описано в John A. Rogers et al., Generating -90 nanometer features using near-field contact-mode photophoto-lithography with an elastomeric phase mask, J. Vac. Sci. Technol. В 16(1), Jan/Feb 1998, page 59 et seq.
Последовательное применение, по меньшей мере, одного множества линкерных молекул включает два предпочтительных примера, которые описаны ниже. В одном варианте, одно множество линкерных молекул, объединяемых в единичный индивидуальный слой, наносят прямо на внешнюю поверхность планарного волновода. В другом варианте, первое множество линкерных молекул наносят на внешнюю поверхность и после этого туда же наносят второе множество линкерных молекул, таким образом, что они объединяются именно в два индивидуальных слоя один над другим. В каждом примере функциональные группы линкерных молекул объединенные в самом верхнем слое линкерных молекул, связаны с фотолабильными защитными группами. Это может быть осуществлено до или после нанесения самого верхнего множества линкерных молекул. Самый верхний слой или другими словами, крайний слой, позволяет размещать фотолитографическую маску, таким образом, чтобы при фотолитографии самый верхний слой был бы посредством этого полностью освещен.
Термин «молекулы», в значении принятом в настоящей заявке, включает широкий диапазон понятий, но в принципе представляет собой объединение двух или более атомов, связанных вместе химическими связями. Тип и количество атомов не ограничивается, а термин молекулы однозначно включает в себя композицию из двух или более молекул. Термин молекула не ограничен конкретными типами меж- и внутримолекулярных связей, равно как и конкретными химическими, фармацевтическими или физическими характеристиками. В особенности, макромолекулы и молекулярные агрегаты однозначно включаются в понятие (например, полимеры, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, белки, липосомы и пептиды). Принципиально, термин молекула означает любое синтетическое или натуральное устойчивое многоатомное объединение.
Следует понимать, что в рамках объема изобретения, химические связи можно заменять любой другой устойчивой специальной совокупностью молекулярных взаимодействий, таких как ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, комплексообразование, водородная связь, адгезия перфтористыми соединениями, и тому подобное взаимодействие, известное специалистам в данной области техники.
2+
«Функциональными группами» в значении принятом в настоящей заявке являются фрагменты (участки молекул) и молекулы (включая биомолекулы), к которым возможно присоединение конкретного фрагмента или молекулы, в особенности, функциональной группы, комплементарной к добавляемой молекуле. Например, молекула линкера содержит по меньшей мере одну функциональную группу. Примерами функциональных групп являются простые функциональные группы, такие как амино-, карбоксильная-, сложноэфирная-, тиоэфирная-, гидроксильная-, меркапто-, борнокислая-, алкиновая-, азидо-, циклооктиновая-, малеинимидная-, иодацетильная-, альдегидная-, кето-, гидроксиламино-, циано-, эпокси-, сульфонокислые группы. Другие примеры представляют собой бифункциональные группы, такие как вицинальный диол, ароматический орто-диальдегид или альфа-меркаптоаминоалкан (например, N-концевой цистеин) и адсорбент органического или пептидного металлохелата, такого как нитрилотриуксусная кислота (NTA) или полигистидин, формирующий устойчивые комплексы с Ni, одноцепочечная ДНК, стрептавидин, биотин, рецептор или его лиганд. Дополнительными примерами функциональных групп являются «метки», которые как общепризнано присоединяются к ферментам с образованием ковалентной связи между меткой и комплементарной «меткой». Примерами являются метки -Snap tag, Clip tag и Sortase tag.
Также включаются многократные взаимодействия многих функциональных групп множества линкерных молекул и функциональных групп, комплементарных к добавляемой молекуле. Многократные взаимодействия могут являться ковалентными и не ковалентными и, действительно, включают в себя гидрофобное взаимодействие, которое обозначает функциональную группу, включающую гидрофобные фрагменты, способные взаимодействовать с гидрофобными участками добавляемой молекулы.
Поэтому включают любой способ взаимодействий функциональных групп и комплементарных функциональных групп, приводящий к связыванию добавляемой молекулы.
«Дополнительная молекула, имеющая комплиментарную функциональную группу» в рамках понятий, принятых в настоящей заявке является молекулой захвата, модифицированной молекулой захвата или линкерной молекулой, содержащей головную группу из наносимого добавляемого множества линкерных молекул. Комплементарная функциональная группа является способной реагировать или взаимодействовать с функциональной группой линкерных молекул.
2
2+
«Комплементарная функциональная группа» в рамках понятий, принятых в настоящей заявке представляет собой фрагмент (участок молекулы), молекулу или биомолекулу, с которой может связываться конкретный фрагмент или молекула. Например, комплементарная функциональная группа дополнительной молекулы представляет собой головную группу линкерной молекулы, равно как участок молекулы захвата способный связываться с функциональной группой линкерной молекулы из нижележащего слоя. Например, комплементарная одноцепочечная ДНК может образовать посредством водородной связи двойную спираль в рамках ортогональной химии сочетаний. Другой возможностью является образование устойчивой не ковалентной связи, применяя взаимодействия белков с лигандами. Примерами комплементарных функциональных групп являются монофункциональные группы, такие как NH-, СООН-, ОН-, SH-, сульфонокислая группа, адсорбент органического или пептидного металлохелата, такой как нитрилотриуксусная кислота (NTA) или полигистидин, образующий устойчивые комплексы с Ni, одноцепочечная ДНК, стрептавидин, биотин, рецептор или его лиганд. Как правило, комплементарная функциональная группа может быть того же типа, что и функциональная группа, поэтому примеры функциональных групп применимы к комплементарным функциональным группам.
«Молекулы захвата» представляют собой любой тип фармацевтической, биологической или химической молекулярной мишени, с которой испытуемый образец может связываться, таким образом, чтобы было возможно детектирование актов связывания. Примерами являются биологические рецепторы, белки, липосомы, нанореакторы и так далее. Как правило, «испытуемый образец» представляет собой испытуемую молекулу в образце, способную связываться с молекулой захвата, обеспечивая возможность детектирования актов связывания.
«Связывание» и «акт связывания» в рамках понятий, принятых в настоящей заявке, включают в себя любой тип распознавания молекулами друг друга и любой тип молекулярного взаимодействия между любым типом молекулы захвата или ее центром связывания и любым типом испытуемого образца. Это включает в себя фактическое связывание двух или более партнеров по связыванию, равно как накапливание партнеров по биомолекулярному взаимодействию (липосомальные мишени,имеющие канальный белок).
Термин «присоединять» применяют по аналогии с термином связывать, он относится, как правило, к любому типу химического или физического присоединения (или связывания), когда одну молекулу (например, головную группу линкерной молекулы или молекулу захвата) присоединяют к внешней поверхности планарного волновода или к функциональной группе линкерной молекулы посредством образования ковалентной связи или посредством хемосорбции или физической адсорбции путем вандерваальсовых или электростатических или ионных взаимодействий, или водородных связей, или адгезией перфтористыми соединениями. Как правило, каждый тип химического присоединения осуществляют таким образом, что один партнер связывания связывается со следующими партнерами по связыванию. Следует понимать, что оба химических партнера присоединяют друг к другу без какого бы то ни было предварительного условия по отношению к соответствующим способностям к связыванию каждой присоединяемой молекулы. Например, присоединять функциональную группу к молекуле захвата все равно, что присоединять молекулу захвата к функциональной группе, или если обе присоединять друг к другу.
2
5/
2
2
5
3
4
Предлагаемый планарный волновод изготовлен из такого материала, к которому можно присоединить головную группу линкерных молекул. Подходящими материалами волновода по настоящему изобретению являются материалы с высоким показателем преломления, такие как Та0 Ti0, Nb0 или SiN, для которых применимы технологии осаждения тонких пленок для получения гладких оптических пленок, обладающих свойствами волноводов. Эффективный процесс производства волноводов с высокими показателями преломления на стеклянных и полимерных подложках, на которых формируют оптическую решеточную развязку в деталях разъясняется в "Fattinger et al., Bidiffractive grating coupler: Universal transducer for optical interface analytics", OPTICAL ENGINEERING, Vol.34 No. 9, page 2744-2753, September 1995. Планарный волновод может содержать слои со сложной структурой, в которых по меньшей мере один слой имеет высокий показатель преломления. Предлагаемый планарный волновод имеет более высокий показатель преломления по отношению к среде на внешней поверхности, образующей верхнюю сторону планарного волновода.
Например, показатель преломления планарного волновода может быть в диапазоне от 1,7 до 2,8, в то время как показатель преломления среды у поверхности планарного волновода обычно находится в диапазоне от 1 до 1,5, в особенности, 1,33 - 1,4 для воды и исследовательских буферных растворов и 1 для воздуха. Когерентный свет входит в планарный волновод через оптическую развязку, распространяясь с полем затухающих колебаний у внешней поверхности волновода. Поле затухающих колебаний, проникающее за пределы внешней поверхности, дифрагирует у испытуемых образцов, связанных вдоль множества заранее заданных линий у внешней поверхности волновода. Толщина пленки волновода предпочтительно находится в диапазоне от 60 до 200 нм. Глубина проникновения поля затухающих колебаний в среду у внешней поверхности волновода предпочтительно составляет менее 150 нм.
В первом варианте способа, вышеописанный этап последовательного нанесения по меньшей мере одного множества линкерных молекул состоит в нанесении только двух множеств линкерных молекул. Два множества линкерных молекул компонуют, формируя два индивидуальных слоя линкерных молекул один над другим, начиная от внешней поверхности планарного волновода.
Согласно аспекту первого варианта способ дополнительно содержит следующие этапы.
Сначала присоединяют комплементарную функциональную группу молекул захвата к функциональным группам, расположенным вдоль множества заранее заданных линий. Каждая молекула захвата способна связываться с испытуемым образцом.
Затем экспонируют светом заранее заданной длины волны фотолабильные защитные группы, расположенные между множеством заранее заданных линий, с целью удаления экспонированных фотолабильных защитных групп от функциональных групп, чтобы сделать эти функциональные группы способными к присоединению комплементарной функциональной группы упомянутой дополнительной молекулы.
Впоследствии присоединяют комплементарную
функциональную группу модифицированной молекулы захвата к функциональным группам, расположенным между множеством заранее заданных линий. Каждую модифицированную молекулу захвата выбирают таким образом, чтобы она была неспособна связываться с испытуемым образцом, с которым способна связываться первая молекула захвата.
Экспонирование фотолабильных защитных групп,
расположенных между множеством заранее заданных линий (второе экспонирование) выполняют так, чтобы в слое полностью отсутствовали (без теневых зон) расположенные там фотолабильные защитные группы. Фактически фотолабильные защитные группы, расположенные между множеством заранее заданных линий, представляют собой только фотолабильные защитные группы, оставшиеся после первого фотолитографического экспонирования фотолабильных защитных групп, расположенных вдоль множества заранее заданных линий. Модифицированные молекулы захвата представляют собой молекулы, на которых когерентный свет рассеивается также как у молекул захвата. Предпочтительно, чтобы свет, рассеиваемый молекулами захвата и модифицированными молекулами захвата, был совместим по амплитудам и разнице в оптическом пути с тем, чтобы он деструктивно интерферировал в заранее определенном местоположении детектирования. Так, минимальный сигнал в заранее заданном местоположении детектирования можно отрегулировать, варьируя относительное время экспонирования, соответствующее количеству функциональных групп, от которых удаляются фотолабильные защитные группы. Минимальный сигнал предпочтителен, поскольку после нанесения испытуемых образцов, изменение сигнала в местоположении детектирования в основном является следствием связывания испытуемого образца с молекулой захвата. Поэтому вклад испытуемого образца в сигнал в местоположении детектирования возрастает по сравнению с сигналом от молекул захвата без испытуемых образцов, то есть по сравнению со светом рассеянным на молекуле захвата самой по себе. Молекулы захвата или модифицированные молекулы захвата наносят на внешнюю поверхность волновода посредством окунания, погружения, крапления, печати или применением струйного аппарата, и так далее.
Во втором варианте способа при выполнении вышеописанного этапа последовательное нанесение по меньшей мере одного множества линкерных молекул состоит в нанесении только одного множества линкерных молекул.
Согласно аспекту второго варианта, способ дополнительно содержит этап присоединения головных групп дополнительного множества линкерных молекул (которое предпочтительно ранее было частично или полностью связано с молекулами захвата через функциональные группы), коль скоро упомянутая дополнительная молекула, имеющая функциональную группу комплементарную к функциональной группе предыдущего слоя линкерных молекул (с функциональными группами со снятой защитой) расположена вдоль множества заранее заданных линий. Функциональные группы линкерных молекул из дополнительного множества линкерных молекул не являются связанными (в настоящем варианте линкерные молекулы из дополнительного множества линкерных молекул фактически никогда не были связаны с фотолабильными защитными группами) с фотолабильными защитными группами и способными присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы. Линкерные молекулы из дополнительного множества линкерных молекул отличаются от линкерных молекул предыдущего слоя с тем, чтобы обеспечить разнообразные характеристики, такие как гибкость, гидрофильность, минимальное неспецифическое связывание и оптимальная длина для иммобилизации молекулы захвата на внешней поверхности планарного волновода. После этого этапа линкерные молекулы из дополнительного множества линкерных молекул и молекулы захвата, связанные с дополнительным множеством линкерных молекул, располагают только вдоль множества заранее заданных линий.
Согласно еще одному аспекту второго варианта способ дополнительно содержит следующие этапы. Присоединение комплементарных функциональных групп молекул захвата к функциональным группам линкерных молекул дополнительного множества линкерных молекул, расположенным вдоль множества заранее заданных линий. (Это может быть достигнуто посредством нанесения линкерных молекул вместе с молекулами захвата). Затем экспонирование тех фотолабильных защитных групп, которые расположены между множеством заранее заданных линий светом заранее заданной длины волны для удаления экспонированных фотолабильных защитных групп с функциональных групп, чтобы сделать эти функциональные группы способными к присоединению комплементарной функциональной группы дополнительной молекулы. После этого осуществляют присоединение комплементарных функциональных групп (головных групп) еще одного множества линкерных молекул к функциональным группам предыдущего слоя линкерных молекул, которые располагают между множеством заранее заданных линий. Функциональные группы линкерных молекул из дополнительного множества линкерных молекул являются несвязанными -фактически никогда не были связаны - с фотолабильными защитными группами и способны присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы. После этого осуществляют присоединение комплементарной функциональной группы из еще одного дополнительного множества модифицированных молекул захвата, коль скоро дополнительная молекула, имеет функциональную группу комплементарную к функциональными группами линкерных молекул из дополнительного множества линкерных молекул, расположенных между множеством заранее заданных линий.
В этом втором варианте достигаются те же преимущества, как и в первом варианте, в особенности в отношении деструктивной интерференции света, рассеянного молекулами захвата и модифицированными молекулами захвата в заранее определенном местоположении детектирования. Преимущественно, чтобы нанесение дополнительного множества линкерных молекул проводилось совместно с нанесением молекул захвата или модифицированных молекул захвата. Это обеспечивает то преимущество, что молекулы захвата и модифицированные молекулы захвата можно наносить таким образом, чтобы они были частично окружены дополнительными молекулами линкера. В таком способе линкерные молекулы могут представлять собой неупакованную матрицу (например, полимер, такой как DEXTRAN или полиэтиленгликоль (PEG)), в которую включены молекулы захвата. Положительные эффекты этого подхода обсуждаются ниже.
Согласно одному варианту изобретения этап экспонирования тех фотолабильных защитных групп, которые расположены вдоль множества заранее заданных линий, проводят в течение первого времени экспонирования, и после этого этап экспонирования тех фотолабильных защитных групп, которые расположены между множеством заранее заданных линий, проводят в течение второго времени экспонирования. Первое время экспонирования отличается от второго времени экспонирования. Как правило, время экспонирования соотносится с количеством фотолабильных защитных групп, удаленных из функциональных групп множества линкерных молекул. Оно определяет общее количество функциональных групп, способных присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы, такой как молекулы захвата. Количество молекул захвата, связанных с функциональными группами, определяет сигнал света, рассеянного в местоположении детектирования. Таким образом, первое и второе время экспонирования определяет относительный вклад света, рассеянного на молекулах захвата, расположенных вдоль множества заранее заданных линий и тех, которые расположены между множеством заранее заданных линий. Так как вклад света в обоих случаях интерферирует деструктивно, детектируемый сигнал может быть отрегулирован до минимума, варьируя независимо оба значения времени.
2
2
Максимальное время экспонирования соответствует максимальной дозе энергии экспонирования, которую выбирают между 1 и 10 Дж/см с тем, чтобы разделить фотолабильные защитные группы вдоль линий, имеющих ширину, составляющую менее половины расстояния между заранее заданными линиями. Предпочтительно, доза первого экспонирования и доза второго экспонирования составляют менее 2 Дж/см, что обуславливает время экспонирования менее 60 секунд или более предпочтительно между 1 и 10 секундами, применяя стандартный светодиодный (LED) источник света с длиной волны около 390 нм. Как было показано, эта доза экспонирования достаточна для удаления фотолабильных защитных групп от функциональных групп, таких как фоторазрушаемые линкерные молекулы с диарилсульфидным -NPPOC каркасом, которое происходит при скоротечном синтезе биоконъюгата с высоким выходом и при минимуме побочных реакций.
В еще одном примере активирование снятия защиты светом, как в , S. Walbert, К.-P. Stengele, Т. Albert, Т. Richmond, J. Norton, М. Singer, R. Green, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, Triplet-sensitized photodeprotection of oligonucleotides in solution and on microarray chips, Helv. Chim. Acta 2004, 87(1), 28-45 может быть предпочтительно на этапе снятия защиты при облучении светом желаемой длины волны посредством триплет-триплетного энергетического перехода FRET (флуоресцентного резонансного энергетического перехода).
1
1
2
В предпочтительном варианте этап экспонирования тех фотолабильных защитных групп, которые расположены вдоль множества заранее заданных линий, содержит следующие этапы. Помещение фазовой маски вблизи внешней поверхности планарного волновода, несущего фотолабильные защитные группы. Фазовая маска имеет множество выступов, изготовленных из материала с первым показателем преломления n, причем первый показатель преломления n отличается от второго показателя преломления n среды, присутствующей между фазовой маской и внешней поверхностью планарного волновода (соответственно, крайнего слоя линкерных молекул). Свет заранее заданной длины волны проходит через фазовую маску для экспонирования к фотолабильным защитным группам, расположенным вдоль множества заранее заданных линий.
Такая фазовая маска содержит стеклянную подложку и множество выступов, предпочтительно изготовленных из
2
5
2
2
5
3
4
подходящего материала с высоким показателем преломления, такого как ТаO, TiO, NbO или SiN. Фазовая маска, например, представляет собой бинарную дифракционную фазовую маску. Каждый из таких выступов имеет заранее заданную глубину и заранее заданное расстояние от соседних выступов, с тем чтобы обеспечить сдвиг по фазе n (то есть половина длины волны) для света, распространяющегося через выступы фазовой маски по сравнению со светом, распространяющимся через жидкую среду между выступами фазовой маски. Поверхность раздела света, распространяющегося через фазовую маску, обуславливает характер интерференции с минимальной интенсивностью света вдоль краев выступов. Таким образом, характер интерференции позади фазовой маски отвечает периодичности интерферограммы сдвоенного темно-светлого типа по сравнению с локальной периодичностью выступов в фазовой маске. Ширина и форма выступов вдоль фазовой маски может варьироваться. Фотолитографическое освещение включает в себя голографические способы, как описано в Suleski, et al., "Fabrication of high-spatial -frequency gratings through computer-generated near-field holography," Optics Letters, vol. 24, No. 9, pp. 602-604, May 1, 1999. Возможность применения голографических способов, таких как голография в ближнем поле, для генерирования (или организации) множества заранее заданных линий, отражена в выдуманном термине «mologramm», который относится к центрам связывания, с которыми может связаться испытуемый образец, который располагают вдоль множества заранее заданных линий. В качестве примера множество заранее заданных линий может относиться к Mologram А и линиям, сосредоточенным между линиями множества заранее заданных линий, которые можно охарактеризовать как Mologram В. В полезных применениях, свет падает на детектор дифрагированный у Mologram А со сдвигом по фазе п (то есть половина длины волны) по сравнению со светом дифрагированным у Mologramm В. Дополнительно, фазовая маска для улучшения качества характера интерференции может иметь покрытие, как подробно описано в Pasi Laakkonen et al., Coated phase masks for proximity printing of Bragg gratings, Optics Communications 192 (2001) 153-159, ELSEVIER. Экспонированный свет, применяемый для передачи на фотолабильные защитные группы через фазовую маску, имеет, например, длину волны 390 нм. В зависимости от того какие фотолабильные защитные группы надо удалить с функциональных групп могут потребоваться другие длины волн. Следует понимать, что экспонирование данного типа может быть пригодно для любой прямой фотохимической реакции (например, применением реакций фоторадикального внедрения, опосредованных бензофенонами или арилазидами, или диазиринами или активизацией инициаторами радикалов, такими как, тиоксантоны). В принципе, размеры выступов следует выбирать, в соответствии с этими длинами волн.
Предпочтительно, чтобы множества линкерных молекул, головные группы которого присоединяются к внешней поверхности волновода, объединялись, образуя отдельный слой с толщиной от 0,5 до 10 нм, считая от внешней поверхности. Среднюю плотность линкерных молекул в первом слое выбирают таким образом, чтобы предотвратить контакт дополнительно наносимых молекул с внешней поверхностью волновода. Это важно, чтобы предотвратить, например, неспецифическое связывание молекулы захвата и дополнительных молекул нанесенных образцов с внешней поверхностью волновода.
Первый слой линкерных молекул присоединяют непосредственно к внешней поверхности планарного волновода. Предпочтительно, чтобы первый слой представлял собой слой с высокой плотностью и низкой высотой. В идеале первый слой покрывает внешнюю поверхность так, чтобы был невозможен контакт с внешней поверхностью любой из дополнительных молекул.
В предпочтительном варианте множество линкерных молекул, головные группы которого присоединяют к внешней поверхности волновода, объединяют с целью образования монослоя линкерных молекул. Качество сигнала дифрагированного света в местоположении детектирования увеличивается, если первый слой правильно расположен на внешней поверхности, что обеспечивает очень незначительный и однородный фон света, рассеянного молекулами линкера у внешней поверхности волновода. Множество линкерных молекул, образующих первый слой, предпочтительно представляет собой самоорганизованный монослой (SAM). SAM может содержать фотолабильные защитные группы с тем, чтобы было возможно осуществить фотолитографический процесс.
В одном варианте выполнения изобретения SAM может состоять из смеси алканов, из которых между 10 и 100% содержат в качестве функциональных групп аминогруппы, которые в свою очередь можно модифицировать фотозащитной группой или до образования SAM, или после образования SAM, чтобы генерировать желаемый SAM, готовый для фотомодулирования по изобретению.
В еще одном варианте выполнения изобретения SAM может состоять из смеси алканов, из которых между 10 и 100% содержат в качестве функциональных групп карбоксильные группы, которые в свою очередь можно модифицировать фотозащитной группой или до образования SAM, или после образования SAM, чтобы генерировать желаемый SAM, готовый для фотомодулирования по изобретению.
В еще одном варианте изобретения множество линкерных молекул, головные группы которых присоединены к функциональным группам предыдущего слоя линкерных молекул, объединяют, образуя самый верхний индивидуальный слой с толщиной от 10 нм до 200 нм. Локальную среднюю плотность линкерных молекул на единицу поверхности выбирают низкой с тем, чтобы молекулы захвата могли посредством этого диффундировать или чтобы молекулы захвата были частично закрыты там. Предпочтительно, что самый верхний слой содержит линкерные молекулы длины сравнимой с молекулами первого слоя. Самый верхний слой должен обладать низкой пространственной плотностью, чтобы посредством этого дать возможность диффундировать молекулам испытуемого образца латерально. Эти линкерные молекулы могут быть гибкими с тем, чтобы их форма была способной приспособиться. Предпочтительным примером этих линкерных молекул является неплотно упакованная матрица (полимер, такой как полисахарид, такой как декстран, карбоксиметилированный декстран, карбоксиметилированная гиалуроновая кислота, гиалуроновая кислота и альгиновая кислота или полимолочная кислота, полиакриловая кислота или гидрофильный ЗБ-акрилатный полимер, например, описанный D. Kyprianu et al, Talanta 103. 2013, 260-266 или полиэтиленгликоль (PEG) или одноцепочечный олигонуклетид ДНК.
Полимеры могут быть дополнительно модифицированы созданием каркаса, модифицированного полимерной сеткой, в которой модификации каркаса могут состоять из ионных групп, липидов, пептидов, олигонуклеотидов и так далее.
2
2
2
В еще одном варианте способа множество заранее заданных линий располагают в, по меньшей мере, двух раздельных дифракционных пятнах у внешней поверхности планарного волновода. Каждое дифракционное пятно имеет площадь более 25 (мкм) ((мкм)=мкм). Множество заранее заданных линий имеет расстояние между соседними линиями менее чем 1,5 мкм, в особенности менее 1 мкм. Это обеспечивает минимальный размер дифракционных пятен, достаточный для обеспечения детектирования сигнала подходящей интенсивности. Максимальное расстояние между соседними линиями в множестве заранее заданных линий определяется светом, дифрагированным в дифракционных пятнах. Предпочтительно применять свет видимого диапазона. Это расстояние включает в себя гармонику заранее заданной длины волны, для которой расстояние между соседними линиями является кратным длине волны света, распространяющегося через планарный волновод.
2
6
Изобретение дополнительно предлагает планарный волновод с внешней поверхностью, подготовленной согласно вышеописанному здесь способу. Множество заранее заданных линий располагают в по меньшей мере двух раздельных дифракционных пятнах на внешней поверхности. Каждое дифракционное пятно имеет площадь менее чем 25 мкм. Расстояние между соседними линиями множества заранее заданных линий составляет менее чем 1,5 мкм, предпочтительно менее чем 1 мкм. Предпочтительно, в планарном волноводе предусматривают множество дифракционных пятен, то есть 100, 10000, 100000,…, до 4×10 дифракционных пятен на квадратный сантиметр. Преимущества, описанные в способе, аналогично распространяются на планарный волновод.
Согласно одному варианту в каждом множестве заранее заданные линии имеют кривизну и располагаются так, что расстояние между соседними линиями уменьшается в направлении распространения света, вводимого в планарный волновод через оптическую развязку. Расположение кривых линий с уменьшающимся расстоянием между соседними линиями приводит к фокусированию (и интерферированию) света, рассеиваемого испытуемыми образцами в заранее определенном местоположении детектирования (сравнимо с линзой на основе фазовой дифракционной решетки). Согласно альтернативной организации расположения заранее заданных линий в множестве заранее заданных линий линии являются прямыми и расположены под углом относительно направления распространения света, вводимого в волновод. Альтернативное расположение заданных линий в множестве заданных линий под углом относительно направления распространения света удовлетворяет требованиям для конструктивной интерференции в заранее заданных направлениях (сравнимо с дифракцией по Брэггу). Заранее заданные прямые линии в множестве вызывают дифракцию света в плоскости планарного волновода. Свет, дифрагированный внутри планарного волновода, выводят из планарного волновода через дополнительную оптическую развязку (линза на основе фазовой дифракционной решетки) в местоположении детектирования.
Согласно дополнительному варианту изобретения комплект предоставляет ранее описанный здесь планарный волновод и фазовую маску, приготовленную на внешней поверхности планарного волновода. Фазовая маска позволяет выполнить описываемый здесь литографический способ. Такой комплект может дополнительно содержать химические, фармацевтические и/или биологические реагенты, пригодные для подготовки внешней поверхности планарного волновода, согласно ранее описанному здесь способу. Эти реагенты могут отличаться в разных комплектах.
Дополнительные предпочтительные варианты изобретения становятся очевидными из нижеследующего описания вариантов выполнения изобретения со ссылкой на сопроводительные чертежи, на которых:
Фиг. 1 показывает вариант выполнения изобретения, касающийся планарного волновода с увеличенным изображением множества заранее заданных линий и части фотолитографической маски;
Фиг. 2 показывает вид сбоку части планарного волновода, как представлено на Фиг. 1, с двумя множествами нанесенных на волновод линкерных молекул;
Фиг. 3 показывает планарный волновод согласно Фиг. 2, иллюстрирующий этап дезактивации функциональных групп, у которых отсутствует связь с молекулами линкера из дополнительного множества линкерных молекул;
Фиг. 4 показывает планарный волновод согласно Фиг. 3, иллюстрирующий этап экспонирования светом тех фотолабильных защитных групп, которые расположены вдоль множества заранее заданных линий;
Фиг. 5 показывает планарный волновод согласно Фиг. 4, иллюстрирующий этап нанесения множества молекул захвата;
Фиг. 6 показывает планарный волновод согласно Фиг. 5, иллюстрирующий этап дезактивации функциональных групп с присоединенными к ним молекулами захвата;
Фиг. 7 показывает планарный волновод согласно Фиг. 6, иллюстрирующий этап экспонирования светом фотолабильных защитных групп, расположенных между множеством заранее заданных линий;
Фиг. 8 показывает планарный волновод согласно Фиг. 7, иллюстрирующий этап нанесения множества модифицированных молекул захвата;
Фиг. 9 показывает планарный волновод согласно Фиг. 8, иллюстрирующий этап дезактивации функциональных групп, с которыми связаны модифицированные молекулы захвата;
Фиг. 10 показывает планарный волновод согласно Фиг. 9, иллюстрирующий этап нанесения множества испытуемых образцов;
Фиг. 11 показывает вид сбоку планарного волновода, как представлено на Фиг. 1, на который помещают линкерные молекулы, согласно дополнительному варианту выполнения изобретения, иллюстрирующий этап нанесения первого слоя линкерных молекул с фотолабильными защитными группами;
Фиг. 12 показывает планарный волновод согласно Фиг. 11, иллюстрирующий этап экспонирования светом тех фотолабильных защитных групп, которые расположены вдоль множества заранее заданных линий;
Фиг. 13 показывает планарный волновод согласно Фиг. 12, иллюстрирующий этап нанесения дополнительного множества линкерных молекул, частично связанных с молекулами захвата через функциональные группы, причем дополнительное множество линкерных молекул расположено вдоль множества заранее заданных линий;
Фиг. 14 показывает планарный волновод согласно Фиг. 13, иллюстрирующий этап экспонирования светом тех фотолабильных защитных групп, расположенных между множеством заранее заданных линий;
Фиг. 15 показывает планарный волновод согласно Фиг. 14, иллюстрирующий этап нанесения дополнительного множества линкерных молекул, частично связанного с модифицированными молекулами захвата через функциональные группы, причем дополнительное множество линкерных молекул располагают между множеством заранее заданных линий;
Фиг. 16 показывает планарный волновод согласно Фиг. 15, иллюстрирующий этап дезактивации оставшихся функциональных групп первого слоя линкерных молекул, с которыми не связаны дополнительные линкерные молекулы и оставшиеся функциональные группы второго слоя линкерных молекул, с которыми не связаны молекулы захвата и дезактивации оставшихся функциональных групп второго слоя линкерных молекул, с которыми связаны молекулы захвата;
Фиг. 17 показывает вид сбоку планарного волновода, на котором расположены молекулярные линкеры, согласно еще одному варианту изобретения, иллюстрирующий альтернативные молекулярные линкеры и альтернативные молекулы захвата;
Фиг. 18 показывает дополнительный вариант изобретения с тремя множествами заранее заданных линий, расположенных в одном и том же дифракционном пятне, при этом каждое множество фокусирует дифрагированный свет в различном местоположении детектирования;
Фиг. 19 показывает планарный волновод согласно Фиг. 18 с двумя множествами линкерных молекул, нанесенными полностью через дифракционное пятно на внешней поверхности планарного волновода, при этом самое верхнее множество содержит фотолабильные защитные группы;
Фиг. 20 показывает планарный волновод согласно Фиг. 19, иллюстрирующий этап частичного экспонирования светом фотолабильных защитных групп, расположенных вдоль первого множества заранее заданных линий;
Фиг. 21 показывает планарный волновод согласно Фиг. 20 с тремя типами одноцепочечной ДНК, последовательно нанесенных таким образом, чтобы они расположились на трех частично экспонированных множествах заранее заданных линий;
Фиг. 22 показывает планарный волновод согласно Фиг. 21 с тремя различными типами молекул захвата, расположенными в трех различных множествах заранее заданных линий;
Фиг. 23 показывает дополнительный вариант изобретения с двумя множествами заранее заданных линий, располагаемыми в одном и том же дифракционном пятне, при этом каждое множество фокусирует дифрагированный свет в индивидуальном местоположении детектирования и
Фиг. 24 показывает планарный волновод с двумя различными типами молекул захвата, отличающимися от вышеприведенных примеров, расположенных у двух различных множеств заранее заданных линий согласно Фиг. 23.
Фиг. 1 показывает вид в перспективе примера планарного волновода 1, имеющего внешнюю поверхность 11, на которой согласно изобретению могут располагаться линкерные молекулы. Конструктивно планарный волновод 1 расположен на верху подложки (не показана) и содержит ряд из 25 отдельных дифракционных пятен 41, расположенных на внешней поверхности 11. Множество заранее заданных линий 4 (каждая из показанных линий на чертеже отражает множественность линий) располагают в каждом из этих дифракционных пятен 41. Линии 4 в показанном примере являются кривыми, но в другом варианте могут быт прямыми. Для улучшения детектируемого сигнала расстояние между соседними линиями 4 в настоящем примере уменьшается слева направо (направление света, распространяющегося через планарный волновод). Альтернативно, линии 4 можно расположить так, чтобы они были равноудаленными или различные множества заранее заданных линий 4 можно расположить в упомянутом дифракционном пятне 41. Кроме того оптическую развязку 12 и дополнительную оптическую развязку 13 располагают у планарного волновода 1 соответственно для введения когерентного света в планарный волновод 1 и для выведения из планарного волновода 1. Обе могут быть сформированы на поверхности подложки, изготовленной из стекла или полимерного материала. Дополнительная оптическая развязка 13 может альтернативно или дополнительно представлять собой светопоглощающее средство. Согласно принципу работы устройства для детектирования актов связывания которое содержит показанный планарный волновод 1, когерентный свет вводят в планарный волновод 1 через оптическую развязку 12 с тем, чтобы он распространялся с полем затухающих колебаний у внешней поверхности 11. Поле затухающих колебаний когерентной световой волны рассеивают на молекулах (линкерных молекулах, молекулах захвата, испытуемых образцах и так далее) расположенных на внешней поверхности 11 вдоль множества заранее заданных линий 4 так, чтобы рассеянный когерентный свет конструктивно интерферировал в заранее определенных местоположениях детектирования (не показано).
Показанная окружность представляет собой увеличенное изображение нескольких множеств заранее заданных линий 4, расположенных в таком пятне 41, причем черными линиями 42 нарисованы линии, белыми линиями 43 - пространство между линиями. Вдоль черных линий 42, располагают молекулы захвата у функциональных групп линкерных молекул. Молекулы захвата способны связываться с испытуемым образцом (молекулы в настоящей иллюстрации не показаны из-за их малых размеров по сравнению с размером устройства). Белые линии 43 содержат модифицированные молекулы захвата, которые не способны связываться с испытуемым образцом, в котором молекулы захвата способны к связыванию. Поле затухающих колебаний когерентной световой волны, вводимой в планарный волновод 1, рассеивается у молекул, расположенных на показанных черных линиях 42, равно как и на показанных белых линиях 43. Свет, рассеиваемый молекулами, расположенными на черных линиях 42, имеет такую первую длину оптического пути, относительно местоположения детектирования (не показано) чтобы свет там интерферировал с максимумом интенсивности. Когерентный свет, рассеиваемый молекулами, расположенными во множестве белых линий 43 между черными линиями 42 имеет такую вторую длину оптического пути относительно местоположения детектирования, чтобы свет интерферировал с максимумом интенсивности. Оба максимума имеют, относительно друг друга, сдвиг по фазе п с тем, чтобы деструктивная интерференция осуществлялась при минимуме от суммарной интенсивности. Это позволяет минимизировать фоновый сигнал света, рассеиваемый источниками иными, чем молекулы испытуемых образцов, связанные с молекулами захвата. Минимальный сигнал может быть отрегулирован варьированием времени экспонирования для снятия защиты с конкретных функциональных групп, с которыми могут связываться молекулы захвата и модифицированные молекулы захвата. Теоретически молекулы захвата, расположенные у черных линий 42 и модифицированные молекулы захвата, расположенные у белых линий 43 до нанесения испытуемого образца не обеспечивают, рассеиваемый на них, суммарный фоновый сигнал в одиночном местоположении детектирования.
2
5
2
2
5
3
4
1
2
5
2
2
2
5
1
2
2
2
2
2
5
Та205
DMS0
Над окружностью, представляющей собой увеличенное изображение, показана часть фазовой маски 9, объясняющая фотолитографическое освещение тех фотолабильных защитных групп, которые расположены вдоль множества заранее заданных линий 4. Фазовая маска 9 содержит стеклянную подложку 92 и множество выступов 91, изготовленных из материала с высоким показателем преломления, такого как ТаO, TiO, NbO или SiN. Толщину (или глубину) выступов 91 выбирают в соответствии с первым показателем преломления n. материала выступов 91 (например, ТаO) и со вторым показателем преломления n среды, находящейся между фазовой маской 9 и внешней поверхностью 11 планарного волновода 1 с тем, чтобы обеспечить заранее заданный сдвиг по фазе. Первый показатель преломления n ТаO при длине волны 390 нм составляет n=2,246. На практике фазовую маску 9 с выступами 91 располагают поблизости от внешней поверхности 11 с тем, чтобы экспонировать к освещению в ближнем поле фотолабильных защитных групп, располагаемых вдоль множества заранее заданных линий 4. Линкерные молекулы с фотолабильными защитными группами (не показаны ввиду сравнительно малой величины) наносят на внешнюю поверхность 11 в растворе, например, ДМСО (диметилсульфоксид) с 5% воды, с тем, чтобы заполнить пространство между внешней поверхностью 11 и фазовой маской 9. Второй показатель преломления n раствора ДМСО можно оценить следующим образом. ДМСО имеет показатель преломления, составляющий при длине волны 590 нм, n=1,477. Рассчитанный показатель преломления при длине волны 390 нм составляет n=1,50, как подробно описано в Kozma, J. Opt. Soc. Am. В, 22(7), p 1479 (2005). Показатель преломления ДМСО с 5% воды при 390 нм составляет n=1,494, как подробно описано в Le Bel и Goring, J. Chem. Eng. DATA 7(1), p 100 (1962). Согласно варианту в качестве раствора для нанесения молекулярных линкеров и фотолабильных защитных групп можно применять N-метил-2-пирролидон (NMP). Фазовая маска 9 вызывает сдвиг по фазе света, распространяющегося через выступы 91, по сравнению со светом, распространяющимся через среду между фазовой маской 9 и внешней поверхностью 11. Осуществляется интерференция сдвоенного темно-светлого типа сравнительно с типом фазовой маски 9. Высоту выступов 91 для ТаO выбирают d=259 нм (d=λ/2(n-n)). Ширина выступов 91 в пятне 41 может варьироваться, например, вдоль направления распространения света через планарный волновод 1. Ширину выступов 91 предпочтительно выбирают равной или приблизительно равной расстоянию заранее заданных линий 4; 42, 43 у внешней поверхности 11 планарного волновода 1. Фотолитографическое освещение фотолабильных защитных групп выполняют помещением поблизости к ним фазовой маски 9, и освещением фотолабильных защитных групп, расположенных вдоль черных линий 42 светом, пропускаемым через фазовую маску 9. Экспонирование через фазовую маску 9 выполняют в течение первого времени экспонирования. Второе экспонирование фотолабильных защитных групп, расположенных вдоль белых линий 42 между множеством черных линий 42, выполняют без фазовой маски 9.
Показанный сплошной профиль 61 над черными линиями 42 и пунктирный профиль 62 внизу белых линий 43 представляют профиль интенсивности света (или тип интерференции) в ближнем поле света, переданного через фазовую маску 9. Оба профиля кроме того можно интерпретировать как отображение локальной средней плотности молекул захвата или функциональных групп со снятой защитой (черные линии 42) и модифицированных молекул захвата (белые линии 43), связанных с соответственно экспонированными функциональными группами линкерных молекул. В идеальном, дополнительно упомянутом выше случае, свет, рассеянный на молекулах захвата, расположенных на черных линиях 42, равно как и на модифицированных молекулах захвата, расположенных между черными линиями 42 вдоль белых линий 43 вносит минимальный (в идеале нулевой) вклад в фоновый сигнал в местоположении детектирования. Теоретически это достигается при идентичных средних плотностях молекул захвата и модифицированных молекул захвата. Острые края между черными линиями 42 и белыми линиями 43 приближенно отражают синусоидальный переход между черными и белыми линиями (ввиду формальных требований такой затененный, хотя бы и более реалистичный, рисунок не показан). В принципе локальная плотность молекул захвата подчиняется синусоидальному закону изменения интенсивности освещения полем ближней зоны через фазовую маску 9.
Ниже показаны первый и второй вариант выполнения способа по изобретению, оба из которых позволяют осуществить изобретение. В обоих вариантах выполнения изобретения применяются планарные волноводы, показанные на Фиг. 1. В этих вариантах выполнения изобретения, фотолитографический этап осуществляют одинаково, но на разных стадиях. На практике экспонирования этих фотолабильных защитных групп выполняют только один раз, применяя фотолитографическую маску. Перенастройка фотолитографической маски является трудным делом и непрактична, так что второе экспонирование представляет собой экспонирование к оставшимся фотолабильным защитным группам и проводится без применения маски.
На последующих Фиг. 2-Фиг. 10, разъясняется первый вариант выполнения способа согласно изобретению.
3
3
2
5
2
2
5
2
2
2
12
3
2
2
15
4
2
2
12
4
4
2
2-
2-
Фиг. 2 показывает нанесение множества линкерных молекул 2 и дополнительного множества линкерных молекул 5, которые последовательно наносят, начиная от внешней поверхности 11 планарного волновода 1 с тем, чтобы собрать воедино два различных индивидуальных слоя. Линкерные молекулы 2 множества линкерных молекул 2 компонуют непосредственно на внешней поверхности 11 образуя при этом самостоятельно скомпонованный монослой (SAM). Эти линкерные молекулы 2 содержат головную группу 21 (например, -(РO), -(O-РO), триалкоксисилан или поли(L-лизин) для присоединения к внешней поверхности 11 и функциональную группу 22, способную присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы. Подходящими линкерными молекулами 2, пригодными для образования самостоятельно собранного монослоя (SAM) на оксидах переходных металлов, например, ТаO, TiO, NbO являются, например, NH-концевая самособирающаяся молекула аминододецилфосфоната (NH-(СН)-(РO)Н), СООН-концевая самособирающаяся молекула карбоксипентадецилфосфата (СООН- (СН)- (Р0) Н) или ОН-концевая самособирающаяся молекула аммониевой соли гидроксидодецилфосфата (ОН-(СН)-(РO)(NH)). (подтверждено в Samuele Guido Pio Tosatti: FUNCTIONALIZED TITANIUM SURFACES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS: PHYSICO-CHEMICA CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL IN VITRO EVALUATION, DISS. ETH NO. 15095). Функциональная группа 22 может представлять собой простую функциональную группу, органический или пептидный металл хелатный адсорбент, одноцепочечную ДНК, белковый рецептор или его лиганд. Дополнительная молекула не ограничена определенными типами молекул, но как в показанном примере, неплотно упакованная матрица (например, полимер, такой как декстран или поли(этиленгликоль) (PEG)), функционализированные комплементарной функциональной группой (головной группой) 51 (например, простой функциональной группой, такой как карбокси группа линкерной молекулы 5 из впоследствии наносимого множества линкерных молекул 5. Также линкерные молекулы 5 из впоследствии наносимого множества линкерных молекул 5 содержат головные группы 51, способные присоединяться к функциональным группам 22 из предварительно нанесенного слоя. Функциональные группы 52 способны соединяться с комплементарной функциональной группой дополнительной молекулы. Функциональные группы 52 в показанном случае защищены фотолабильной защитной группой 3. Фотолабильная защитная группа 3 защищает функциональную группу 52 так, чтобы ни одна комплементарная функциональная группа дополнительной молекулы, такой как функциональная группа молекулы захвата, не могла с ней связываться. Поэтому набор функциональных групп 52 ограничен функциональными группами, способными принимать защитные фотолабильные группы, такие как амино-, меркапто-, гидроксил-, карбоксилатная группы.
На Фиг. 3, функциональные группы 22 множества линкерных молекул 2, к котором не присоединена головная группа 51 дополнительного множества линкерных молекул 5 являются дезактивированными, например, путем реакции с дополнительной молекулой, не содержащей функциональную группу, способную к реакции или взаимодействию с дополнительной молекулой, содержащей комплементарную функциональную группу.
Дезактивированные функциональные группы 221 неспособны к любому дополнительному связыванию.
На Фиг. 4, эти фотолабильные защитные группы 3, связанные с функциональными группами 52 дополнительного множества линкерных молекул 5, расположенные вдоль множества заранее заданных линий 4 подвергают воздействию света и удаляют из функциональных групп 52. Таким образом, функциональные группы 52, расположенные вдоль множества заранее заданных линий 4, способны к присоединению к комплементарной функциональной группе дополнительной молекулы, такой как молекула захвата, а функциональные группы 52, расположенные между множеством заранее заданных линий 4, содержат фотолабильные защитные группы 3. Экспонирование может быть достигнуто фотолитографически, как объясняется Фиг. 1 посредством фазовой маски. Показанная одиночная линия 4 является примером одной линии 4 из множества заранее заданных линий 4, вдоль которых фотолабильные защитные группы 3 подвергают воздействию света.
Теоретически такая структура способа обеспечивает планарный волновод, который можно применять для детектирования актов связывания. Например, если наносимый испытуемый образец связывается непосредственно с функциональными группами множества линкерных молекул, расположенных вдоль множества заранее заданных линий.
На Фиг. 5 множество молекул 6 захвата наносят на функциональные группы 52, расположенные вдоль множества заранее заданных линий 4. Как правило, такая молекула 6 захвата представляет собой любую молекулу, способную одновременно связываться с функциональной группой 52 линкерных молекул 5 и с испытуемой молекулой образца (показано на Фиг. 10), подлежащего исследованию. Иллюстрируемая молекула 6 захвата представляет собой белок с двумя центрами связывания, связывающими испытуемую молекулу в образце. Линкерные молекулы 5 могут быть неплотно упакованными и иметь расстояние между молекулами, которое может быть заполнено молекулами 6 захвата. В этом случае молекулы 6 захвата предпочтительно встраивают в неплотную упаковку множества линкерных молекул 5. Преимущественно, чтобы множество неплотно упакованных линкерных молекул 5 состояло из неплотно упакованной матрицы (например, полимерной, такой как ДЕКСТРАН или поли(этиленгликоль) (PEG)), не обладающих или обладающих минимальным неспецифическим взаимодействием с молекулами 6 захвата и молекулами нанесенного образца.
Каждая линкерная молекула 5 может содержать несколько (например, две или более) функциональные группы 52, расположенных вдоль линкерных молекул 5. В этой разновидности первого варианта выполнения способа по изобретению все функциональные группы 52, расположенные вдоль линкерных молекул 5, защищены фотолабильной защитной группой до удаления защитных групп из функциональных групп 52 посредством первого экспонирования светом.
На Фиг. 6, дезактивируются функциональные группы 52 дополнительного множества линкерных молекул 5, с которыми не связаны молекулы 6 захвата. Дезактивированные функциональные группы 521 не способны к любому дополнительному связыванию.
Это предусматривает планарный волновод, который может применяться для детектирования актов связывания. Испытуемый образец может связываться с центрами связывания, обеспечиваемыми молекулами захвата, расположенными вдоль множества заранее заданных линий, рассеивая на них когерентный свет, с тем, чтобы он максимально интерферировал в заранее определенных местоположениях детектирования. Однако, на практике в сигнал в местоположении детектирования вносит вклад сравнительно сильный фоновый сигнал от света, рассеянного только молекулами захвата, то есть молекулами захвата не связанными с испытуемым образцом. Возможность уменьшать фоновый сигнал, относительно детектируемого сигнала показана далее.
На Фиг. 7 посредством экспонирования светом фотолабильные защитные группы удаляют из функциональной группы 52 дополнительного множества линкерных молекул 5, расположенного между множеством заранее заданных линий 4. Эта повторное экспонирование (первое экспонирование проводили через фазовую маску) не нуждается в фотолитографической маске, потому что оставшиеся фотолабильные защитные группы расположены правильным образом вдоль множества заранее заданных линий сформированных между множеством заранее заданных линий 4, образованных при первом экспонировании.
На Фиг. 8 множество модифицированных молекул 7 захвата наносят на функциональные группы 52 дополнительного множества линкерных молекул 5, расположенных между множеством заранее заданных линий 4. Модифицированные молекулы 7 захвата в настоящем примере представляют собой мутировавший белок. Как правило, модифицированные молекулы 7 захвата являются структурно подобными молекулам 6 захвата и модифицированы посредством мутации или химически с тем, чтобы они стали неспособными связываться с испытуемой молекулой в образце (не показано), с которым молекулы 6 захвата способны к связыванию. Другими словами у модифицированных молекул 7 захвата отсутствуют центры связывания, способные связываться с испытуемым образцом, хотя они и рассеивают когерентный свет, аналогично молекулам 6 захвата.
На Фиг. 9 функциональные группы 52 множества линкерных молекул 5, к которым не присоединены модифицированные молекулы 7 захвата дезактивированы. Дезактивированные функциональные группы 52 не способны к любому дополнительному связыванию.
Это приводит к планарному волноводу, который можно применять для детектирования актов связывания. Преимущество такого планарного волновода, как разъяснялось выше, состоит в том, что сигнал рассеянного света от молекул захвата, равно как и от модифицированных молекул 7 захвата из-за деструктивной интерференции сведен к минимуму.
Преимущественно, что сигнал минимизируют регулировкой изменения времени экспонирования и следовательно минимизации количества молекул захвата или модифицированных молекул 7 захвата присоединенных к функциональным группам со снятой защитой с тем, чтобы минимизировать фоновый сигнал в местоположении детектирования.
Фиг. 10 показывает нанесение множества испытуемых молекул 8 образца на молекулы 6 захвата, расположенные вдоль множества заранее заданных линий 4. Как можно видеть, только испытуемые образцы 8 связываются с молекулами 6 захвата. Модифицированные молекулы 7 захвата неспособны связываться с испытуемым образцом 8. Таким образом, свет в местоположении детектирования (не показано) становится минимальным посредством регулировки вкладов света, рассеянного на молекулах 6 захвата, по отношению светом, рассеянному на модифицированных молекулах 7 захвата. Важно, чтобы после нанесения испытуемых образцов 8 изменяемый детектируемый свет в местоположении детектирования приводил к действительному связыванию испытуемых образцов 8 с молекулами 6 захвата.
Предпочтительно, чтобы при детектировании актов связывания когерентный свет рассеивался не только молекулами 6 захвата, расположенными вдоль множества заранее заданных линий 4 (соответствующими черным линиям 42 на Фиг. 1), но также дополнительно рассеивался модифицированными молекулами 7 захвата (соответствующими белым линиям 43 на Фиг. 1). Поскольку выбирают, чтобы расстояние между молекулами 6 захвата и модифицированными молекулы 7 захвата составляло половину длины волны (или кратное от длины волны плюс половина длины волны) когерентного света, рассеянный свет теоретически минимизирует интерференцию в местоположении детектирования. На практике вклад света от молекул 6 захвата и модифицированных молекул 7 захвата в местоположении детектирования не интерферирует до нуля, но напротив, имеет место некоторый фоновый свет. Связывание испытуемого образца вызовет изменение упомянутого минимального сигнала, который становится сравнительно больше по сравнению с минимальным фоновым сигналом.
В последующих Фиг. 11-Фиг. 16 показан второй вариант осуществления изобретения, поясняющий другой подход осуществления способа согласно изобретению
На Фиг. 11 множество линкерных молекул 2 наносят так чтобы, головные группы 21 присоединились к внешней поверхности 11 планарного волновода 1. Множество линкерных молекул 2 содержит функциональные группы (не показаны, потому что они закрыты), защищенные фотолабильными защитными группами 3. Второй вариант выполнения изобретения отличается от первого варианта выполнения изобретения тем, что на первом этапе единичное множество линкерных молекул 2 содержит фотолабильные защитные группы 3(только SAM).
На Фиг. 12, фотолабильные защитные группы 3, расположенные вдоль множества заранее заданных линий 4, подвергают воздействию света и удаляют. Экспонирование вдоль множества заранее заданных линий 4 выполняют фотолитографическим способом. Таким образом, функциональные группы 22 линкерных молекул 2 располагаются вдоль множества заранее заданных линий 4.
На Фиг. 13, множество молекул 6 захвата, связанных с функциональными группами 52 линкерных молекул 5, наносят совместно (присоединяют друг к другу) вдоль множества заранее заданных линий 4. Комплементарную функциональную группу молекулы 6 захвата присоединяют к функциональной группе 52 линкерной молекулы 5, и обе из них совместно присоединяют через головную группу 51 к функциональной группе 22. В предпочтительных примерах это позволяет частично поместить молекулы 6 захвата на упомянутые линкерные молекулы 5 (например, линкерные молекулы 5 образуют неплотно упакованную матрицу (например, полимер, такой как декстран или поли(этиленгликоль) (PEG)), позволяя осуществлять связывание испытуемого образца (не показано) со центрами связывания, предоставляемыми молекулами 6 захвата.
На Фиг. 14, фотолабильные защитные группы, расположенные между множеством заранее заданных линий 4, подвергают воздействию света заранее заданной длины волны (вторая экспонирование без применения фотолитографической маски). Функциональные группы 22 со снятой защитой способны присоединять комплементарную функциональную группу дополнительных молекул, таких как молекулы захвата. Минимального фонового сигнала во втором варианте выполнения изобретения добиваются так же, как разъяснялось для первого варианта выполнения изобретения (смотри Фиг. 7).
На Фиг. 15, множество модифицированных молекул 7 захвата присоединяют (связывают) с функциональными группами 52 линкерных молекул 5 и наносят на функциональные группы 22, расположенные между множеством заранее заданных линий 4 (как на Фиг. 13).
На Фиг. 16 дезактивируются функциональные группы 521, с которыми не связана модифицированная молекула, равно как функциональные группы 221 с которыми не связана головная группа линкерной молекулы. Это обеспечивает планарный волновод, подготовленный для применения как разъясняется на Фиг. 10.
Фиг. 17 показывает еще один вариант изобретения, в котором применяют альтернативные молекулярные линкеры, имеющие альтернативные головные группы 511, равно как и альтернативные функциональные группы 522. Мембраноподобные суперструктуры 61 (например, везикулы или липосомы) и модифицированные мембраноподобные суперструктуры 71 (например, модифицированные везикулы или модифицированные липосомы) располагают на альтернативных функциональных группах 522. Мембраноподобная суперструктура 61 с инкорпорированным или реконструированным мембранным транспортным белком 611 (транспортером или каналом) представляет собой связанную молекулу захвата.
Модифицированные мембраноподобные суперструктуры 71 с инкорпорированным или реконструированным мембранным транспортным белком 711 (модифицированным транспортером или модифицированным каналом) представляют собой связанную молекулу захвата. Согласно, Фиг. 10 и Фиг. 17 мембраноподобные суперструктуры 61 и модифицированные мембраноподобные суперструктуры 71 располагают вдоль множества заранее заданных линий 4 и между множеством заранее заданных линий 4, соответственно. Испытуемый образец 81 может быть захвачен связанной молекулой захвата (захваченной внутри мембраноподобных суперструктур). Таким образом, термин молекула захвата может рассматриваться не только для обеспечения множества индивидуальных центров связывания, с которой связывается, или не связывается испытуемый образец, но также она является пригодной захватывать испытуемый образец через мембранный транспортный белок. Это обеспечивает способ накопления захваченных испытуемых образцов 811 за период времени, необходимый для полного детектирования испытуемого образца 81.
Фиг. 18 показывает дополнительный вариант изобретения. Три множества заранее заданных линий 401, 402, 403 располагают в одном и том же дифракционном пятне 41 на планарном волноводе. Каждое множество располагают таким образом, чтобы свет поступающий в планарный волновод через оптическую развязку 12 дифрагировал в каждом множестве заранее заданных линий 401, 402, 403 с тем, чтобы он конструктивно интерферировал в раздельных местоположениях 421, 422, 423 детектирования. Настоящее расположение трех множеств заранее заданных линий 401, 402, 4 03 следует рассматривать как пример, но также можно располагать и другое количество множеств заранее заданных линий 401, 402, 403. То же применимо для геометрии показанных линий, которая в настоящем примере была выбрана с тем, чтобы свет, поступающий через оптическую развязку 12, конструктивно интерферировал в трех различных местоположениях 421, 422, 423 детектирования, расположенных вдоль линии. Дифракционное пятно 41 с множественными местоположениями детектирования обозначают (или представляют) как «mologramm» с множественными фокусами.
Далее описан способ нанесения (трех) различных типов молекул захвата, на различные (из трех) множества заранее заданных линий. Это расположение дает преимущество, так как становится возможным детектировать каскадные процессы. Например, испытуемый образец расщепляется на отдельные продукты на первом типе молекулы захвата с тем, чтобы обеспечить сигнал в первом местоположении детектирования. Первый продукт этой реакции затем связывается со вторым типом молекул захвата с тем, чтобы обеспечить сигнал во втором местоположении детектирования. Второй продукт реакции связывается с третьим типом молекулы захвата с тем, чтобы обеспечить сигнал в третьем местоположении детектирования. Присоединение различных типов молекул захвата к различным заранее определенным множествам заранее заданных линий можно добиться, например, применением одноцепочечных ДНК, описано ниже (ортогональная химия). Альтернативно чтобы добиться расположения заранее заданного типа молекулы захвата на заранее заданном множестве заранее заданных линий в дифракционном пятне, можно применить ортогональную фотохимию, применяя различные длины волн для экспонирования и удаления фотолабильных защитных групп.
Фиг. 19 представляет собой планарный волновод 1, имеющий внешнюю поверхность 11, на которую нанесены множества линкерных молекул 2, 5. Самое верхнее множество линкерных молекул 5, содержит фотолабильные защитные группы 3 (сопоставимо с Фиг. 3).
Фиг. 20 показывает этап частичного экспонирования светом фотолабильных защитных групп 3, расположенных вдоль первого множества заранее заданных линий 401. "Частичное экспонирование" представляет собой удаление только тех фотолабильных защитных групп 3, которые расположены вдоль линии подобной линии 401. Количество удаленных фотолабильных групп является достаточно большим для обеспечения детектируемого сигнала дифрагированного света от испытуемых образцов, связанных с множеством первой молекулы захвата. Количество должно быть до такой степени мало, чтобы стало возможным проведение дополнительных (частичных) экспонирований вдоль дополнительного множества заранее заданных линий (402, 403), что приведет к удалению дополнительного множества фотолабильных защитных групп вдоль дополнительных линий (402, 403) в одном и том же дифракционном пятне. Такие линии (401, 402, 403) могут пересекаться, или другими словами, ряд линий можно формировать одна над другой. Ссылаясь на Фиг. 18, пересечения линий (401, 402, 403) вносят вклад в сигнал в различных местоположениях (421, 422, 423) детектирования. Фиг. 20 показывает вероятную молекулярную структуру «mologramm» с множественными фокусами.
Фиг. 21 показывает три типа одноцепочечных ДНК 621 (Тип I), 622 (тип II), 623 (Тип III) последовательно наносимых путем повторения частичной экспонирования, как объясняется на Фиг. 20, подлежащих размещению вдоль трех множеств заранее заданных линий. Различные множества заранее заданных линий дифрагируют свет в различных фокусах (отдельных местоположениях детектирования).
Одноцепочечная ДНК позволяет проводить ортогональную химию, так что различные молекулы 6, 72, 73 захвата селективно связываются с различными комплементарными одноцепочечными ДНК 631, 622, 623, так что только определенный тип молекулы захвата располагается на заранее определенном множестве заранее заданных линий. Расположение, показанное на Фиг. 22, позволяет индивидуально детектировать фармацевтические, биологические или химические реакции в соответствующих местоположениях (421, 422, 423) детектирования.
Фиг. 23 показывает дополнительный вариант по изобретению. Два множества заранее заданных линий 402, 403 располагают в одном и том же дифракционном пятне 41 на планарном волноводе (аналогичном, показанному на Фиг. 18). Каждое множество располагают таким образом, чтобы свет, вводимый в планарный волновод через оптическую развязку 12, дифрагировал на каждом множестве заранее заданных линий 402, 403 с тем, чтобы свет конструктивно интерферировал в раздельных индивидуальных местоположениях 422, 423 детектирования.
Фиг. 24 представляет собой планарный волновод 1 по Фиг. 23, показывающий область на внешней поверхности 11, на которой линии двух множеств заранее заданных линий 402, 403 пересекаются. Различные молекулы 75, 76 захвата (в настоящем примере молекулы, способные связываться с одним из по меньшей мере двух центров связывания белка, нанесенного в качестве испытуемого образца) располагают на разных множествах заранее заданных линий (смотри Фиг. 23; 402, 403), что может быть достигнуто применением ортогональной химии. Как разъяснялось выше, в ортогональной химии применяют, например, различные одноцепочечные ДНК 621, 622, и соответствующие комплементарные одноцепочечные ДНК 631, 632 для иммобилизации различных типов молекул 75, 76 захвата с тем, чтобы различные множества заранее заданных линий располагались в одном и том же дифракционном пятне (смотри Фиг. 23; 41). Альтернативой является ортогональная фотохимия, в которой применяются различные длины волн для экспонирования фотолабильных защитных групп. Испытуемый образец 81, представляющий собой белок, способный связываться с обеими молекулами 75, 76 захвата, может формировать кооперативные связи посредством взаимодействий с образованием многократных связей. Такое взаимодействие с образованием многократных связей является сильным взаимодействием ввиду сложения сил связи испытуемого образца 81 с молекулами 75 захвата, так и связи испытуемого образца 81 с молекулами 76 захвата. Обе связи могут формироваться одновременно или сразу одна за другой в пределах коротких периодов времени. Взаимодействия многократных связей являются оптически детектируемыми в обоих местоположениях детектирования, обеспечивающих коррелированные сигналы в обоих местоположениях детектирования. Предпочтительно, этого достигают применением метода детектирования с временным разрешением.