СПОСОБ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДНОГО ФРАГМЕНТА, ПОДХОДЯЩЕГО ДЛЯ NCL

1. Способ эффективного получения первого полипептидного фрагмента N-концевым цистеиновым остатком и второго полипептидного фрагмента, имеющего модифицированный C-конец, которые подходят для связывания способом NCL, включающим в себя:
(1) стадию взаимодействия полипептида, имеющего следующую структуру:
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-Cys-W-(His)n-Z-Met-первый
полипептидный фрагмент (C-концевой),
где n представляет собой целое число от 0 до 10, Cys означает цистеин, W означает любые 1, 2 или 3 аминокислоты, Z означает любые 0, 1 или 2 аминокислоты, His означает гистидин, Met означает метионин, и N-концевым аминокислотным остатком первого полипептидного фрагмента является цистеин
с CNBr для получения следующих полипептидных фрагментов:
(A) первого полипептидного фрагмента с N-концевым цистеиновым остатком и
(B) третьего полипептидного фрагмента, имеющего следующую структуру:
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-Cys-W-(His)n-Z-Met′ (C-концевой), где Met′ означает производное Met;
(2) стадию взаимодействия упомянутого третьего полипептидного фрагмента с соединением, представленным следующей формулой (I):
Химическая формула 1
где является атомом серы или кислорода, и
1
2
R и R являются удаляемыми группами
а в дальнейшем взаимодействия в органическом растворителе с соединением, представленным формулой (II):
Химическая формула 2
в которой
Y является атомом кислорода, атомом серы или =NH, а
3
R является атомом водорода, ацильной группой или алкоксикарбонильной группой
для получения второго полипептидного фрагмента с модифицированным С-концом, имеющего следующую структуру:
3
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-C(=O)-NH-C(=Y)NHR (C-концевой).
2. Способ получения по п. 1, включающий в себя:
стадию взаимодействия второго полипептидного фрагмента, имеющего модифицированный С-конец и полученного на упомянутой стадии (2), с тиолом, представленным формулой
4
R-SH,
4
где R является любой из групп, выбираемых из группы, состоящей из замещенной или незамещенной бензильной группы, замещенной или незамещенной арильной группы и замещенной или незамещенной алкильной группы
3
и обмена группы -NH-C(=Y)NHR на С-конце с тиоловой группой с образованием второго полипептидного фрагмента с модифицированным С-концом, имеющего следующую структуру:
4
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-C(=O)-SR (C-концевой).
3. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что X в соединении, представленном формулой (I), является атомом серы.
1
6
4. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что R в соединении, представленном формулой (I), является -O-C арильной группой.
2
6-10
5. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что R в соединении, представленном формулой (I), является атомом галогена, или замещенной, или незамещенной -S-C арильной группой.
6. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что Y в соединении, представленном указанной формулой (II), является =NH.
3
7. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что R в соединении, представленном указанной формулой (II), является ацетильной группой.
8. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый полипептид, имеющий следующую структуру:
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-Cys-W-(His)n-Z-Met-первый полипептидный фрагмент (C-концевой),
является рекомбинантным полипептидным фрагментом, экспрессируемым клеткой.
9. Способ получения по п. 8, отличающийся тем, что клеткой является Е. coli.
10. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что W является одной аминокислотой, причем аминокислотой, выбираемой из группы, состоящей из Val, Ile, Leu и Trp.
11. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что n является целым числом от 6 до 10.
12. Способ получения первого полипептидного фрагмента с цистеиновым аминокислотным остатком на N-конце, подходящего для связывания способом NCL, отличающийся тем, что полипептид, имеющий следующую структуру:
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-P-Met-первый полипептидный фрагмент (C-концевой),
где P любое количество аминокислот от 0 до 10, Met означает Met, и N-концевым аминокислотным остатком первого полипептидного фрагмента является цистеин,
взаимодействует с CNBr.
13. Способ получения гликозилированного полипептида, включающий:
(1) стадию классификации и конструирования пептидной последовательности целевого гликозилированного полипептида, получаемого в виде по меньшей мере:
полипептидного фрагмента, содержащего сахарную цепочку, который состоит из полипептида, содержащего гликозилированную аминокислоту,
второго полипептидного фрагмента на N-концевой части полипептидного фрагмента, содержащего сахарную цепочку и состоящего из полипептида, содержащего N-концевую часть целевого гликозилированного пептида,
первого полипептидного фрагмента на C-концевой части полипептидного фрагмента, содержащего сахарную цепочку и состоящего из полипептида, содержащего C-концевую часть целевого гликозилированного пептида,
полипептидного фрагмента между полипептидным фрагментом, содержащим сахарную цепочку, и вторым полипептидным фрагментом, если присутствие такого фрагмента возможно, и
полипептидного фрагмента между полипептидным фрагментом, содержащим сахарную цепочку, и первым полипептидным фрагментом, если присутствие такого фрагмента возможно, в которых первый полипептидный фрагмент сконструирован так, чтобы на N-конце его был аминокислотный остаток цистеина;
(2) стадию получения полипептидного фрагмента упомянутой выше структуры с помощью вектора экспрессии, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид следующей структуры:
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-Cys-W-(His)n-Z-Met-первый полипептидный фрагмент (C-концевой),
где n равно целому числу от 0 до 10, Cys означает цистеин, W означает 1, 2 или 3 аминокислоты, Z означает 0,1 или 2 аминокислоты, His означает гистидин, а Met означает метионин, и N-концевым аминокислотным остатком первого полипептидного фрагмента является цистеин,
и обеспечивающего возможность экспрессии клетками Е. coli;
(3) стадию взаимодействия полипептида со стадии (2) с CNBr для получения следующих полипептидных фрагментов:
(A) первого полипептидного фрагмента с цистеиновым аминокислотным остатком на N-конце и
(B) третьего полипептидного фрагмента следующей структуры:
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-Cys-W-(His)n-Z-Met′ (C-концевой),
где Met′ означает производное Met);
(4) стадию взаимодействия упомянутого третьего полипептидного фрагмента с соединением, представленным следующей формулой (I):
Химическая формула 1
1
2
в которой X является атомом серы или атомом кислорода, R и R являются удаляемыми группами и затем взаимодействия в органическом растворителе с соединением, представленным следующей формулой (II):
Химическая формула 2
в которой
V является атомом кислорода, атомом серы или NH группой, и
3
R является атомом водорода, ацильной группой или алкоксикарбонильной группой,
для получения второго полипептидного фрагмента с модифицированным C-концом, имеющего следующую структуру:
3
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-C(=O)-NH-C(=Y)NHR (C-концевой);
(5) условно стадию взаимодействия второго полипептидного фрагмента, имеющего модифицированный С-конец и полученного на стадии (4), с тиолом, представленным следующей формулой
4
R-SH,
4
в которой R является одной какой-либо группой, выбираемой из группы, состоящей из замещенной или незамещенной бензильной группы, замещенной или незамещенной арильной группы и замещенной или незамещенной алкильной группы,
3
и обмена -NH-C(=Y)NHR группы на C-конце с тиоловой группой для получения второго полипептидного фрагмента с модифицированным C-концом, имеющего следующую структуру:
(N-концевой) второй полипептидный фрагмент-С(=O)-SR4 (C-концевой); и
(6) стадию связывания:
упомянутого полипептидного фрагмента, содержащего сахарную цепочку,
упомянутого полипептидного фрагмента, если присутствие его возможно, между полипептидным фрагментом, содержащим сахарную цепочку, и вторым полипептидным фрагментом и
упомянутого полипептидного фрагмента, если присутствие его возможно, между полипептидным фрагментом, содержащим сахарную цепочку, и первым полипептидным фрагментом, полученным отдельно химическим синтезом с:
первым полипептидным фрагментом, имеющим на N-конце цистеиновый аминокислотный остаток и полученным на стадии (3) и
вторым полипептидным фрагментом, имеющим модифицированный С-конец и полученным на стадиях (4) и (5)
в порядке, который позволит получить целевой гликозилированный полипептид с помощью лигирования.
14. Способ получения по п. 13, отличающийся тем, что X в соединении, представленном упомянутой формулой (I), является атомом серы.
1
6
15. Способ получения по п. 13, отличающийся тем, что R в соединении, представленном упомянутой формулой (I), является -O-C арильной группой.
2
6-10
16. Способ получения по п. 13, отличающийся тем, R в соединении, представленном формулой (I), является атомом галогена, или замещенной, или незамещенной -S-C арильной группой.
17. Способ получения по п. 13, отличающийся тем, что У в соединении,
представленном упомянутой формулой (II), является NH группой.
3
18. Способ получения по п. 13, отличающийся тем, что R в соединении, представленном упомянутой формулой (II), является ацетильной группой.
19. Способ получения по п. 13, отличающийся тем, что W является аминокислотой, причем эту аминокислоту выбирают из группы, состоящей из Val, Ile, Leu и Trp.
20. Способ получения по п. 13, отличающийся тем, что n является целым числом от 6 до 10.