СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДА ОСТРОЙ ИШЕМИИ МИОКАРДА
METHOD FOR PREDICTION OF ACUTE MYOCARDIAL ISCHEMIA OUTCOME

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования исходов острой ишемии миокарда.
Известно, что своевременная диагностика острых ишемических повреждений миокарда обуславливает эффективность их профилактики и лечения. Одним из показателей интенсивности цитолитических процессов является свободно циркулирующая митохондриальная ДНК (мтДНК) крови, уровень которой устанавливают для прогноза развития осложнений при злокачественных опухолях, септических процессах [Ellinger J., , Wernert N., von Ruecker A., Bastian P J. (2008) Mitochondrial DNA in serum of patients with prostate cancer: a predictor of biochemical recurrence after prostatectomy, BJU Int., 102, P. 628-632], а также для оценки вероятности летального исхода у пациентов отделений реанимации [Nakahira К., Kyung S.Y. et al. (2013) Circulating mitochondrial DNA in patients in the ICU as a marker of mortality: derivation and validation, PLoS Med., 10. e1001577].
Известен способ прогнозирования атеросклеротической ишемической болезни сердца путем определения количественного уровня поврежденной митохондриальной ДНК (Пат.2243558 Российская Федерация, МПК G01N 33/48, C12Q 1/68. Повреждения митохондриальной ДНК как прогностический признак атеросклеротической ишемической болезни сердца / РАНДЖ Маршалл С., БАЛЛИНДЖЕР Скотт В., ВАН ХАУТЕН Беннетт; заявитель и патентообладатель РИСЕРЧ ДИВЕЛОПМЕНТ ФАУНДЕЙШН (US). - №2001122724/15; заявл. 14.01.2000; опубл. 27.12.2004).
Известный способ осуществляют следующим образом. У пациента берут образец крови, в котором определяют количественный уровень повреждений митохондриальной ДНК методом количественной полимеразной цепной реакции (ПНР). Определение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК проводят по методу количественной ПЦР по амплификации продукта размером 16,2 т.п.н. После чего проводят сравнение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК в образце крови пациента с контрольным образцом крови субъекта, не страдающего атеросклерозом. По мнению авторов известного способа высокий количественный уровень повреждений митохондриальной ДНК у пациента, по сравнению с контрольным образцом, является прогностическим признаком атеросклеротической ишемической болезни сердца.
К основным недостаткам данного способа следует отнести то, что он не может быть использован конкретно для прогнозирования исхода острой ишемии миокарда, т.к. предназначен для прогнозирования констатации атеросклеротической ишемической болезни сердца.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ прогнозирования исхода при адреналиновом миокардите в эксперименте путем определения уровня свободно циркулирующей митохондриальной ДНК (мтДНК) крови (Судаков Н.П., Попкова Т.П. и др. Уровень свободно циркулирующей митохондриальной ДНК крови при дислипопротеидемии и адреналиновом миокардите (экспериментальное исследование) // Известия Ирк. гос. ун-та. - Серия «Биология. Экология», - 2011.- т. 4, №4, - с. 136-142).
Известный способ заключается в следующем. Экспериментальным животным - крысам линии «Вистар», моделировали адреналиновый миокардит путем подкожного введения адреналин-гидрохлорида из расчета 0,2 мг на 100 г массы животного. Забор проб крови на исследование проводили через 2, 4, 16, 24, 48 и 72 часа после инъекции адреналина. Из плазмы крови выделяли ДНК с помощью набора реагентов «ДНК-проба». Количественный анализ мтДНК осуществляли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени, при этом амплифицируют фрагмент гена 16S рРНК, используя амплификаторы iCycler IQ4 (Bio-Rad, США) и DTlite (ДНК-технология, Россия). Амплифицировали фрагмент 16S рРНК - прямой праймер: 5'-TGCAGAAGCTATTAATGGTTCG-3', обратный - 5'-TTGGCTCTGCCACCCTAATA-3' (Ellinger J., Miiller S.C., Wernert N. et al. Mitochondrial DNA in serum of patients with prostate cancer: a predictor of biochemical recurrence after prostatectomy. // BJU Int. 2008. V. 102. P. 628-632), при этом использовали реакционную смесь, содержащую краситель SYBR Green (MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix - Fermentas, Латвия).
7
6
Было установлено нарастание уровня свободно циркулирующей мито-хондриальной ДНК на 3-й сутки, который составил 1,26×10 копий/мл, что в 2.8 раза превысил уровень мтДНК контроля - 3,04×10 копий/мл (p=0,16). Полученные данные свидетельствуют, что при острой ишемии миокарда, вызванной подкожным введением адреналингидрохлорида, в миокарде возрастает активность патологических процессов, способствующих активному выходу в плазму крови митохондриальной ДНК, являющейся молекулярным показателем - биомаркером острого повреждения ткани миокарда.
К недостаткам известного способа следует отнести то, что он не может быть использован для прогнозирования исхода острой ишемии миокарда у людей, поскольку разработан для определения уровня мтДНК плазмы крови экспериментальных животных, косвенно характеризуя процесс ишемии кардиомиоцитов при повреждении миокарда.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа прогнозирования исхода острой ишемии миокарда на основе определения молекулярного биомаркера повреждения кардиомиоцитов в клинической кардиологической практике.
Техническим результатом предлагаемого способа является объективное обоснование раннего прогнозирования исхода течения острой ишемии миокарда.
Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования исхода острой ишемии миокарда включает определение в плазме крови уровня свободно циркулирующей митохондриальной ДНК (мтДНК) методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с амплифицированием фрагмента гена 16S рРНК с прямым и обратным праймерами.
Отличия предлагаемого способа заключаются в том, что уровень свободно циркулирующей мтДНК крови определяют в первые сутки заболевания, при этом амплифицируют фрагмент гена 16S рРНК прямым праймером 5'-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3' и обратным праймером 5'-GGGCTCTGCCATCTTAACAA-3. При уровне менее 900 копий/мл прогнозируют благоприятный исход, а при уровне более 1800 копий/мл прогнозируют неблагоприятный исход.
Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».
Проведенный анализ патентной и научно-медицинской литературы показал, что предлагаемый способ содержит признаки, отличающие его не только от прототипа, но и от других способов прогнозирования исхода острой ишемии миокарда.
Определение уровня свободно циркулирующей мтДНК крови в первые сутки заболевания позволяет объективно осуществить ранний прогноз исхода острой ишемии миокарда. При прогнозировании неблагоприятного исхода принять интенсивные профилактические мероприятия к выведению пациента из угрожающего здоровью состояния.
Авторами с использованием программы Vector NTI 10 подобраны прямой праймер 5'-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3' и обратный праймер 5'-GGGCTCTGCCATCTTAACAA-3, которые позволили осуществить амплифицирование фрагмента гена 16S рРНК и определить уровень мтДНК крови.
Авторами заявляемого способа установлено, что уровень мтДНК менее 900 копий/мл свидетельствует о низком риске, т.е. о благоприятном исходе заболевания, а уровень мтДНК, равный 1800 копий/мл и выше, свидетельствует о высоком риске неблагоприятного исхода острого коронарного синдрома. Уровень мтДНК от 900 до 1800 копий/мл является показателем неопределенного прогноза исхода острой ишемии миокарда.
Проведенный поиск известных в клинической и экспериментальной медицине решений показал, что полученные результаты не были обнаружены в известных решениях и ранее не применялись для прогнозирования исхода острой ишемии миокарда.
Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно объективное обоснование раннего прогнозирования исхода течения острой ишемии миокарда.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию патентоспособности «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, в частности кардиологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
Предложенный способ осуществляют следующим образом.
Пациенту с диагнозом острый коронарный синдром в первые сутки заболевания берут пробу крови, в плазме которой определяют уровень свободно циркулирующей мтДНК. Для этого после выделения суммарной ДНК крови проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени с использованием реакционной смеси, содержащей краситель SYBR Green. Амплифицируют фрагмент гена 16S рРНК с прямым праймером 5'-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3' и обратным праймером 5'-GGGCTCTGCCATCTTAACAA-3'. Определяют уровень мтДНК. При уровне мтДНК менее 900 копий/мл прогнозируют благоприятный исход, а при уровне более 1800 копий/мл прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода острой ишемии миокарда.
Сущность предлагаемого способа прогнозирования исхода острой ишемии миокарда поясняется примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Больной К. Дата рождения: 31.10.1967 г. Даты: поступления в стационар: 19.09.2014 г., выписка; 03.10.2014 г.
Основное заболевание: ИБС, инфаркт миокарда с зубцом Q передне-перегородочно-боковой и задней стенки левого желудочка от 19.09.14 г.
Данные коронарографии: Окклюзия проксимального сегмента общей нисходящей артерии (ОНА). Реканализация и стентирование правой нисходящей артерии (ПНА) с восстановлением кровотока. Стеноз среднего сегмента правой коронарной артерии (ПКА) до 50%. Осложнения основного заболевания: Хроническая сердечная недостаточность, 2 АФК, 2 Killip I.
Обследование: Общий анализ крови, биохимические показатели, коагулограмма с незначительными отклонениями. Электрокардиограмма: ритм синусовый с ЧСС 75 ударов/мин. Закономерная динамика острого трансмурального инфаркта миокарда передне-перегородочно-боковой и задней стенки левого желудочка. Холтер мониторинг ЭКГ (ХМ ЭКГ): синусовый ритм с минимальной ЧСС 60 ударов/ мин, максимальная ЧСС 111 в мин, средняя ЧСС 81 в мин, зарегистрировано 142 желудочковых экстрасистол, в том числе вставочные, 40 суправен-трикулярных экстрасистол, парные. Пауз продолжительностью больше 2000 мсек не зарегистрировано. На протяжении всей записи зарегистрирована элевация сегмента ST, обусловленная инфарктом миокарда. Эхокардиография: АО-3.4 см, ЛП - 3.3×4.4 см, ПП - 2.8×3.8 см, ПЖ - 2.3 см, КДР лж - 5.5 см, КСР лж - 3.5 см, ТМЖП - 1.0 см, ТЗСЛЖ - 1.0 см, ФВ(Т) - 64%, ФВ (5) - 42%. Акинез верхушки, среднего и верхушечного сегментов переднеперегородочной стенки, передней и боковой стенок в верхушечном сегменте. Заключение: Диастолическая дисфункция левого желудочка. Рентген грудной клетки: Легкие, сердце, аорта без особенностей. Коронарокардиография: Окклюзия проксимального сегмента правой нисходящей артерии. Реканализация и стентирование правой нисходящей артерии с восстановлением кровотока. Стеноз среднего сегмента ПКА до 50%.
19.09.2014 г., т.е. в день поступления больного К. в стационар, было проведено определение уровня мтДНК в плазме крови этого больного. Для этого была проведена полимеразная цепная реакция в реальном времени с использованием реакционной смеси, содержащей краситель SYBR Green. Амплифицируют фрагмент гена 16S рРНК с прямым праймером 5'-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3' и обратным праймером 5'-GGGCTCTGCCATCTTAACAA-3'. Уровень мтДНК в плазме крови больного К. составил 10 коп/мл. Прогноз исхода течения заболевания благоприятный.
Больному К. проведено лечение: Гепарин 1000 ЕД/ч в/в насос, Ацетилсалициловая кислота 0.5 К тх 1 раз утром, Клопидофел 75 м×1 раз, Бисопролол 5 мг 1/2 т утром, Эналаприл 2.5 мг×2 раза, Омепразол 20 мг×2 раза, Аторвастатин 20 мг вечером.
Выписан в удовлетворительном состоянии. 19.09.14=75.2 AT V2 (48±6 ч после СКС)-21.09.14=55.7
Визит отдаленной оценки 20.10.14. ПЦР анализ уровня свободно пикулирующей митохондриальной ДНК крови - 10 коп/мл. Подтвержден прогноз благоприятного исхода течения острой ишемии миокарда у пациента К.
Пример 2.
Больная М., 87 лет (22.01.1927 г.р.) поступила 13.11.2014 г.
Основное заболевание: Кардиомегалия, пневмосклероз. Атеросклероз аорты. ЭКГ: Фибрилляция предсердий, Q инфаркт передне-перегородочно-боковой области.
9
Обследование: В общем анализе крови - лейкоцитоз 15,5×10/л со сдвигом формулы влево; Тропониновый тест - 0,44 нг/мл. На чрескожном вмешательстве: окклюзивный тромбоз правой нисходящей артерии. Выполнено стентирование.
В день поступления больной М. в стационар был проведен ГЩР анализ уровня свободно цикулирующей митохондриальной ДНК крови. Уровень мтДНК в плазме крови составил 6800 коп/мл. Прогноз исхода заболевания неблагоприятный.
Рентгенография органов грудной клетки: Легкие небольшого объема, рисунок деформирован. Корни легких значительно расширены, «обрублены». Слева синусы завуалированы. Сердце расширено больше влево, «талии» нет, широкая аорта с кальцинатами.
Заключение: Порок митрального клапана с преобладанием стеноза. Дилатация левого предсердия, правых отделов. Недостаточность трикуспидального клапана. Легочная гипертензия 2 ст. Гипертрофия миокарда левого желудочка. Дегенеративные изменения артального, митрального клапанов. OAK в динамике: некоторое снижение количества лейкоцитов до 12,7. В Б/Х: ЛДГ 743 МЕ/л, креатинкиназа 526 МЕ/л, ККМВ 141,7 МЕ/л, в динамике нарастание азотемии (креатинин 0,121 ммоль/л->0,15 ммоль/л->0,233 ммоль/л), СКФ (МОВО) - 39 мл/мин/1,73 кв.см.
16.11.2014 г. Состояние пациентки нестабильное, без улучшения, с отрицательной динамикой, нарастала сердечно-сосудистая недостаточность. В 03.20 констатирована биологическая смерть.
Заключительный диагноз: Сахарный диабет 2 типа, целевой уровень гликированного гемоглобина менее 7,5%. Осложнения: Макроангиопатия коронарных артерий:. Q-инфаркт миокарда передене-перегородочно-боковой стенки левого желудочка от 13.11.2014 г. Экстренная коронарокардиография: Окклюзивный тромбоз ПНА. Прямое стентирование правой нисходящей артерии от 13.11.2014 г. Стеноз дистального сегмента ПКА до 50%. Ишемическая кардиомиопатия. Атеросклеротический митральный порок с преобладанием стеноза. Постоянная фибрилляция предсердий, тахисистолический вариант. Killip III, ХСН 2А ФК 3, ХБП Зв стадии. Полиорганная недостаточность. Сопутствующий: Гипертоническая болезнь 3 стадии, риск 4 (ИБС, возраст). Сахарный диабет 2 типа. Целевой уровень гликированного гемоглобина менее 8,0%. 19.10.14 г.
По предлагаемому способу проведено прогнозирование исхода заболевания 14 пациентам.
В исследование ретроспективно были включены результаты обследования 14-ти пациентов с диагнозом острой ишемии миокарда, подписавших информированное согласие на обработку их персональных данных.
Пациенты поступали по экстренным показаниям в Иркутскую государственную областную клиническую больницу для чрескожного вмешательства со стентированием коронарных сосудов по поводу острого коронарного синдрома.
Для анализа уровня свободно циркулирующей мтДНК было предоставлено 14 пронумерованных образцов плазмы крови, взятых в первые сутки у пациентов с острой ишемией миокарда. Количественный анализ мтДНК проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием реакционной смеси, содержащей SYBR Green (Maxima™ SYBR Green/ROXq PCR Master Mix - Thermo Fisher Scientific Inc., США). Амплифицировали фрагмент гена 16S рРНК (прямой праймер: 5'-СAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3', обратный праймер: 5'-GGGCTCTGCCATCTTAACAA-3') длиной 230 п.н. (Ellinger, 2008).
Для построения калибровочной прямой использовали серию образцов с известной концентрацией фрагмента указанного выше гена длиной 490 п.н. (прямой праймер: 5'-GGGATAACAGCGCAATCCTA-3', обратный праймер: 5'-ACGTTGGGGCCTTTGCGTAG-3'), содержащего в своем составе анализируемую последовательность длиной 230 п.н. Синтез используемых олигонуклеотидов осуществлен в ООО «Синтол» (г. Москва, Россия). Для проведения ПЦР в реальном времени использовали амплификатор «DT lite» (ДНК-технология, Россия).
Статистическую значимость различий уровня мтДНК в группах выживших и умерших пациентов определяли с помощью критерия Манна-Уитни.
Для оценки прогностических возможностей уровня свободно циркулирующей мтДНК при остром коронарном синдроме пациенты были подразделены на 2 группы: группа №1 - благоприятный исход, №2 - неблагоприятный исход.
Анализ уровня свободно циркулирующей мтДНК в крови этих пациентов показал, что у пациентов с благоприятным исходом заболевания значение данного показателя в 164 раза меньше в сравнении с неблагоприятным исходом (p=0,049). Взаимосвязь уровня мтДНК с наступлением летального исхода, характеризуемая коэффициентом корреляции Спирмена (R2), составляет 0,4 (p=0,01). При этом результаты логистического регрессионного анализа вероятности смерти у пациентов с острым коронарным синдромом в зависимости от уровня свободно циркулирующей митохондриальной ДНК плазмы крови при поступлении в стационар свидетельствовали, что вероятность гибели пациента с повышенным уровнем мтДНК (свыше 1800 копий/мл) объективно возрастает.
Диапазон значений уровня мтДНК свыше от 900 копий/мл до 1800 копий/мл не позволяет однозначно прогнозировать исход заболевания и определяет необходимость интенсивной терапии.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает объективную возможность раннего прогноза исхода течения острой ишемии миокарда для превентивного принятия интенсивных профилактических или терапевтических мероприятий. Полученные данные представляются перспективными для трансляционной медицины, направленной на внедрение в клиническую кардиологию результатов фундаментальных исследований.