КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ СУСТАВНОГО ХРЯЩА
ARTICULAR CARTILAGE IMAGING COMPOSITION

[0001] Настоящее изобретение относится к композиции для визуализации суставного хряща, которая особым образом растворяется в очаге поражения, обеспечивая визуализацию очага поражения суставного хряща.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Остеоартроз (OA) является заболеванием суставов, которое предположительно индуцируется дегенерацией суставного хряща, являющейся основной причиной и часто наблюдаемой, например, в коленном и тазобедренном суставах и головке бедренной кости. Причиной OA является не только возраст и перегрузка, но также спортивные травмы и ожирение. В частности, согласно имеющимся данным, количество пациентов с остеоартрозом коленного сустава в Японии составляет 25300000 (проект ROAD, Исследовательский медицинский центр, университет клиники в Токио, 2009), а в Соединенных Штатах количество таких пациентов выше в два или более раз. К тому же в густонаселенных областях, таких как Китай, Индия и Африка, где, например, рабочие условия и условия окружающей среды более суровые, чем в Японии, количество пациентов с OA будет только увеличиваться. Согласно последним данным (Yano Research Institute Ltd., 2011), сегодня в Японии 75 000 пациентов перенесли операцию по полной замене коленного состава искусственным в качестве окончательной терапии. Сама замена коленного сустава искусственным является в высокой степени инвазивной терапией. Кроме того, механическая эффективность искусственного сустава ограничена и зависит от обстоятельств, что приводит к необходимости неоднократной замены искусственного сустава.
[0003] Для того чтобы предупредить обострение остеоартроз коленного сустава и избежать операции по окончательной замене сустава искусственным необходимо своевременное и соответствующее лечение. Для своевременного лечения нужно выявить дегенерацию хряща на ранней стадии; однако обычным методом получения рентгеновских изображений (рентгеновских снимков) и ЯМР сканированием практически невозможно определить раннюю стадию дегенерации хряща. Наличие или отсутствие дегенерации хряща также можно установить путем обследования хряща с помощью артроскопа (разновидность эндоскопа); однако в этом способе лечащий врач касается инструментом, таким как хирургические щипцы, поверхностного слоя хряща под артроскопом и по ощущениям от касания определяет наличие или отсутствие дегенерации хряща. По этой причине своевременное выявление дегенерации все еще зависит от опыта и профессионализма врача. Кроме того, другая проблема заключается в невозможности проведения четкой грани между нормальным и дегенеративным состоянием хряща.
in vivo
in vivo
[0004] Если бы имелся неинвазивный или менее инвазивный способ исследования, который позволил бы своевременно выявить дегенерацию хряща, и который не зависел бы только от опыта и профессионализма врача, то можно было бы определить наличие или отсутствие и прогрессирование дегенеративных изменений хряща и разработать стратегию терапевтического лечения. В качестве неинвазивного и менее инвазивного способа исследования известен способ использования техник получения изображений  для визуализации живой ткани. В качестве техник получения изображений  известны различные методы, включая позитрон-эмиссионную томографию (ПЭТ), получение изображения методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР), получение изображения с помощью ультразвука (US) и фотоакустическим методом (ФАИ). Другим известным методом получения изображения является метод получения флуоресцентных изображений, такой как флуоресцентная молекулярная томография (ФМТ), при которой флуоресцирующее вещество сконцентрировано в представляющем интерес участке в живом организме, и этот участок становится высоко чувствительным. Метод получения флуоресцентного изображения привлек внимание, поскольку он позволяет осуществлять определенным образом неинвазивную визуализацию представляющего интерес участка.
in vivo
[0005] Для применения указанного выше метода получения флуоресцентного изображения суставного хряща было предложено несколько методов с применением зонда для получения изображения, который специфически связывается с тканью суставного хряща и накапливается в этом участке. В патентной литературе 1 описан маркер хряща, который специфически связывается с хрящевым матриксом, получаемый путем связывания средства генерации сигналов, такого как флуоресцирующее вещество, с полиаргинином, содержащим 6-20 остатков аргинина, или полилизином, содержащим 6-20 остатков лизина. Далее в патентной литературе 2 описан маркер хрящевой ткани, который состоит из производных олигомера лизина, получаемых путем связывания группы, способной генерировать или поглощать электромагнитные волны, с олигомером лизина, у которого ε-амино группа лизина и карбоксильная группа соединены пептидной связью.
Патентная литература
[0006] Патентная литература 1: Патент Японии 2009-023993
Патентная литература 2: Публикация международной заявки на патент WO 2013/137302
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА
[0007] В патентной литературе 1 и патентной литературе 2 говорится о том, что эти хрящевые маркеры специфически связываются с нормальным суставным хрящом; однако не описывается их действие на аномальный хрящ, т.е., дегенеративный хрящ, такой как пораженный остеоартрозом. Говоря более конкретно, в настоящее время имеется проблема, заключающаяся в отсутствии диагностической композиции для визуализации суставного хряща, которая обеспечила бы четко различимую визуализацию нормального участка и аномального участка в соединительном хряще.
[0008] Кроме того, как описано выше, необходимо разработать способ исследования, который позволил бы своевременно выявлять дегенерацию хряща независимо от опыта и профессионализма врача.
[0009] Настоящее изобретение разработано с учетом описанных выше обстоятельств. Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции для визуализации суставного хряща, которая позволяет четко различимо визуализировать нормальный и аномальный участки в соединительном хряще.
[0010] Другим объектом настоящего изобретения является предоставление композиции для визуализации суставного хряща, которая облегчает своевременное выявление дегенерации хряща и обеспечивает точную идентификацию степени дегенеративных изменений, таким образом позволяя определить стратегию лечения.
РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ
[0011] Для решения указанной выше задачи композиция для визуализации суставного хряща содержит положительно заряженные молекулы, меченные маркирующими молекулами. Нормальный хрящ имеет поверхностный слой, сформированный множеством слоев, состоящих из плоских клеток. С другой стороны, дегенеративный хрящ находится в состоянии, в котором клеточный слой удален, и хрящевой матрикс, богатый волокнами и имеющий нерегулярную структуру ткани, обнажен, или в состоянии, в котором дефектный участок занимает область, простирающуюся от поверхностного слоя вглубь суставного хряща. Композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению содержит положительно заряженные молекулы, меченные маркирующими молекулами. Положительно заряженные молекулы интенсивно проникают в обнаженный хрящевой матрикс и адсорбируются в нем. Аналогично, поскольку композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению интенсивно адсорбируется в дегенеративном участке хряща, нормальный участок и дегенеративный участок суставного хряща можно различимо визуализировать.
[0012] Положительно заряженные молекулы композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой положительно заряженные белковые или пептидные соединения. В качестве положительно заряженных молекул, служащих в качестве компонента композиции для визуализации суставного хряща, выбирают универсальное вещество, присутствующее в живом организме, совершенно безопасное, легко обрабатываемое и легко поддающееся мечению маркирующими молекулами.
[0013] Белковое или пептидное соединение композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой альбумин, продукт разложения альбумина или модифицированное соединение альбумина. Следовательно, в качестве белкового или пептидного соединения, входящего в состав положительно заряженной молекулы, выбирают предпочтительное вещество.
[0014] Положительно заряженная молекула композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению также предпочтительно представляет собой положительно заряженное соединение с сахарной цепью. В качестве положительно заряженной молекулы, являющейся компонентом композиции для визуализации суставного хряща, выбирают в высокой степени безопасное, универсальное для живого организма вещество, которое легко обрабатывается и легко метится маркирующей молекулой.
[0015] Соединение с сахарной цепью композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой декстран, циклодекстрин или их производное. Соответственно, в качестве соединения с сахарной цепью, составляющего положительно заряженную молекулу, выбирают предпочтительное вещество.
[0016] Маркирующая молекула композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из флуоресцирующего вещества, радиоактивного изотопа, поглощающего рентгеновское излучение вещества, молекулы антитела и молекулы, имеющей сайт узнавания, узнаваемый специфическим антителом. Поскольку каждую из указанных выше положительно заряженных молекул метят маркирующей молекулой, положение положительно заряженной молекулы, адсорбированной в дегенеративном участке хряща, может быть визуализировано флуоресцирующим веществом, радиоактивным изотопом, поглощающим рентгеновское излучение веществом, молекулой антитела или молекулой, имеющей сайт узнавания, узнаваемый специфическим антителом.
[0017] Из указанных выше маркирующих молекул, флуоресцирующее вещество предпочтительно представляет собой индоцианин зеленый. Соответственно, может быть выбрана в высокой степени безопасная маркирующая молекула, обеспечивающая эффективную визуализацию и позволяющая детектировать дегенеративный сайт.
[0018] Маркирующая молекула композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению представляет собой предпочтительно, по меньшей мере, одно вещество, выбранное из группы, состоящей из магнитной частицы, металлической частицы, металлической наночастицы и другого вещества, содержащего наноматериал. Соответственно, положение положительно заряженной молекулы, адсорбированной в дегенеративном участке хряща, может быть обнаружено, например, методом рентгеновской КТ, МРТ, спектроскопией комбинационного рассеяния или методом плазмонного резонанса.
ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0019] Согласно настоящему изобретению можно предоставить композицию для визуализации суставного хряща, обеспечивающую следующие положительные эффекты.
(1) возможность четкой различимой визуализации нормального участка и аномального участка (дегенеративного участка) в суставном хряще;
(2) возможность своевременного обнаружения дегенерации хряща и однозначного и точного определения степени дегенерации;
in vivo
(3) возможность проведения диагностики и лечения путем визуализации дегенеративного участка в суставном хряще  с помощью композиции для визуализации суставного хряща в случае диагностики или операции под артроскопом;
in-vivo
(4) возможность проведения неинвазивной или менее инвазивной диагностики дегенеративного состояния с помощью методов визуализации , например, путем инъекции композиции для визуализации суставного хряща в суставное пространство.
(5) легкая обработка композиции для визуализации суставного хряща, так как она состоит из веществ в высокой степени безопасных. Кроме того, продукты ее разложения также в высокой степени безопасны;
(6) эффективное удаление композиции для визуализации суставного хряща после завершения обследования и операции путем метаболизма, гидролиза или разбавления тканевой жидкостью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0020] Фиг.1 представляет собой полученную в примере 1 фотографию, показывающую результаты определения изоэлектрической точки положительно заряженного бычьего сывороточного альбумина методом электрофореза.
Фиг.2 представляет собой полученную в примере 2 фотографию, показывающую флуоресцентное излучение, возникающее в результате связывания положительно заряженного альбумина или альбумина с индоцианином зеленым.
Фиг.3 представляет собой полученную в примере 3 фотографию, показывающую результаты формирования изображения модели повреждения хряща с помощью композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению.
Фиг.4 представляет собой полученную в примере 4 фотографию, показывающую результаты получения изображения модели повреждения хряща и модели интактного хряща с помощью композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению.
Фиг.5 представляет собой полученную в примере 5 фотографию, показывающую результаты визуализации человеческого поврежденного хряща с помощью композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0021] Композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению содержит меченые положительно заряженные молекулы. В настоящем изобретении “положительно заряженная молекула” относится к молекуле, имеющей положительный заряд (катионный заряд) и способной селективно адсорбироваться в дегенеративном хряще.
[0022] Хрящ относится к соединительной ткани и состоит из хрящевого матрикса, находящегося преимущественно в виде внеклеточного матрикса, и расположенных в виде точек хрящевых клеток. Хрящ, составляющий сустав, называется гиалиновым хрящом. Основными компонентами хрящевого матрикса гиалинового хряща являются коллаген и протеогликан. Протеогликан содержит боковую цепь с отрицательным зарядом, такую как хондроитина сульфат, кератансульфат и гепарансульфат, и в целом является отрицательно заряженным. Нормальный хрящ имеет поверхностный слой, сформированный из множества слоев, состоящих из плоских клеток. С другой стороны, дегенеративный хрящ находится в состоянии, в котором клеточный слой удален, и хрящевой матрикс, богатый волокнами и имеющий нерегулярную структуру ткани, обнажен, или в состоянии, в котором дефектный участок занимает область, простирающуюся от поверхностного слоя вглубь суставного хряща. Предполагается, что положительно заряженные молекулы, содержащиеся в композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению специфически адсорбируются протеогликаном, присутствующим в хрящевом матриксе, обнаженном после удаления поверхностного слоя хрящевой ткани.
[0023] Положительно заряженные молекулы в настоящем изобретении практически не ограничены, при условии, что молекулы могут селективно адсорбироваться в дегенеративном хряще; однако с точки зрения безопасности и удобства работы предпочтительным является положительно заряженное белковое или пептидное соединение, или положительно заряженное соединение с сахарной цепью. Следует отметить, что "белок" в данном описании охватывает широкий спектр белков, таких как гликопротеин, липопротеин и нуклеотид-связывающий белок.
[0024] В качестве положительно заряженных белковых или пептидных соединений, используемых в настоящем изобретении в качестве положительно заряженной молекулы, предпочтительными являются белки плазмы и различные виды альбуминов, предпочтительным, в частности, является сывороточный альбумин. Белки плазмы и различные виды альбуминов включают продукты разложения и модифицированные соединения альбумина. Положительно заряженный альбумин (катионизированный альбумин) специфически адсорбируется в хрящевом матриксе; однако он является менее инвазивным по отношению к клеткам, находящимся внутри хрящевой ткани. Таким образом, катионизированный альбумин с трудом поглощается клетками с поверхности нормальной хрящевой ткани и практически не адсорбируется в хрящевом матриксе, присутствующим на поверхности нормальной хрящевой ткани. Вследствие этого катионизированный альбумин интенсивно адсорбируется в дегенеративном (аномальном) участке суставной хрящевой ткани. С тем, чтобы адсорбция в поврежденном участке хряща была интенсивной, альбумин или расщепленное/модифицированное соединение альбумина предпочтительно заряжают таким образом, чтобы изоэлектрическая точка (ИТ) соответствовала 8 или более и особенно предпочтительно 10 или более. Безопасность композиции для визуализации суставного хряща, предназначенной для нанесения на тело живого организма, можно дополнительно увеличить выбором альбумина, который является менее инвазивным по отношению к клеткам, расположенным внутри хрящевой ткани, как было описано выше. Кроме того, в случае выбора молекулы альбумина с более высокой молекулярной массой можно увеличить количество меток (маркирующих молекул). По той причине, в случае использования в качестве маркирующей молекулы, например, флуоресцирующего вещества яркость может быть улучшена. Поскольку такой контроль возможен, обнаружение с использованием маркирующей молекулы, другими словами визуализация, является легко осуществимой.
[0025] В качестве соединения с сахарной цепью, положительно заряженного также, как вышеуказанный альбумин и используемого в качестве положительно заряженной молекулы по настоящему изобретению, предпочтительным является линейное или циклическое соединение с сахарной цепью. В качестве линейного соединения с сахарной цепью особенно предпочтительным является декстран или производное декстрана. В качестве циклического соединения с сахарной цепью особенно предпочтительным является циклодекстрин или производное циклодекстрина. Эти положительно заряженные соединения, т.е. декстран, циклодекстрин и их производные специфически адсорбируются в хрящевом матриксе аналогично указанному выше альбумину; однако они менее инвазивны по отношению к клеткам, расположенным внутри хрящевой ткани. Таким образом, катионизированный декстран и циклодекстрин с трудом захватываются клетками с поверхности нормальной хрящевой ткани и практически не адсорбируются в хрящевом матриксе, находящемся в поверхностном слое нормальной хрящевой ткани. Вследствие этого катионизированный декстран или циклодекстрин адсорбируется в дегенеративном (аномальном) участке суставной хрящевой ткани. Для предотвращения проникновения в клетки хрящевой ткани используют декстран или циклодекстрин, имеющий молекулярную массу предпочтительно 3000 или более, и более предпочтительно 10000 или более. Безопасность композиции для визуализации суставного хряща, предназначенной для нанесения на тело живого организма, может быть дополнительно улучшена путем выбора декстрана или циклодекстрина, который является менее инвазивным по отношению к клеткам, расположенным внутри хрящевой ткани, как было описано выше. В случае выбора декстрана или циклодекстрина с высокой молекулярной массой можно увеличить количество маркирующих молекул. По этой причине в случае использования в качестве маркирующей молекулы, например, флуоресцирующего вещества яркость может быть улучшена. Поскольку такой контроль возможен, обнаружение с использованием маркирующей молекулы, другими словами визуализация, является легко осуществимой. Кроме того, в случае циклодекстрина, поскольку маркирующая молекула может легко проникать во внутреннюю полость молекулы, можно легко получить композицию для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению.
in-vivo
in situ
in-vivo
[0026] Следует отметить, что в настоящем изобретении "визуализация суставного хряща" относится к визуализации состояния суставного хряща, другими словами, к приведению его в такое состояние, в котором суставной хрящ виден невооруженным глазом или, например, с помощью устройства, благодаря использованию таких средств, как изображения, численные значения или вектора. Визуализация включает в себя как визуализацию (для обнаружения) образца, взятого из суставной хрящевой ткани, так и  () визуализацию (для обнаружения) суставной хрящевой ткани. Примеры  визуализации включают в себя визуализацию для общей хирургии, визуализацию для менее инвазивного исследования или операции с использованием артроскопа и визуализацию для менее инвазивного исследования, выполняемого посредством инъекции композиции по настоящему изобретению в суставное пространство с помощью, например, шприца.
[0027] В настоящем изобретении маркирующая молекула относится к молекуле, которая прямо или косвенно связывается с положительно заряженной молекулой или поглощается положительно заряженной молекулой, таким образом образуя положительно заряженную молекулу и обеспечивая возможность обнаружения наличия положительно заряженной молекулы невооруженным глазом или с помощью, например, устройства. В качестве маркирующей молекулы, которая не ограничена, можно соответствующим образом использовать, например, флуоресцирующее вещество, радиоактивный изотоп, люминесцентное вещество, фермент, поглощающее рентгеновское излучение вещество, молекулу антитела, молекулу (молекулу узнавания антитела), имеющую сайт узнавания, узнаваемый специфическим антителом, магнитную частицу, металлическую частицу или металлическую наночастицу, покрытую стеклом.
[0028] В качестве варианта осуществления настоящего изобретения в качестве маркирующей молекулы предпочтительно используется флуоресцирующее вещество, так как его можно легко визуализировать или обнаружить. В качестве флуоресцирующего красителя предпочтительно используется, например, индоцианин зеленый, Alexa Fluor (зарегистрированная торговая марка) 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, BODIPY (зарегистрированная торговая марка) FL, Texas Red (зарегистрированная торговая марка), Oregon Green (зарегистрированная торговая марка) 488, родамин В, родамин зеленый, тетраметил-родамин, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, фикоэритрин, фикоцианин, Су3, Cy5 и Cy7. Из них предпочтительным является, в частности, индоцианин зеленый, поскольку он является в высокой степени безопасным и может быть легко визуализирован или обнаружен. Индоцианин зеленый, который подвергается облучению в ближней инфракрасной области света в заданных условиях, испускает флуоресцентное излучение в ближней инфракрасной области с более длинными волнами по сравнению со светом ближней инфракрасной области, использованном для его облучения. Испускаемый свет практически не видим невооруженным глазом. Для наблюдения требуется устройство для обнаружения инфракрасного излучения; однако, поскольку наблюдение возможно в темном поле, контраст можно легко настроить, если наблюдение выполняется с помощью артроскопа, что облегчает процесс обнаружения. Эти флуоресцирующие молекулы используются для мечения положительно заряженных молекул авидин-биотиновым методом связывания, методом включения или другими методами, известными в данной области техники.
[0029] Если в качестве маркирующей молекулы применяется молекула распознавания антитела, флуоресценцию можно наблюдать, используя не только авидин-биотиновый метод, но также с помощью различных типов реакций флуоресцирующих антител. В случае применения в качестве маркирующей молекулы люциферина испускаемый свет можно наблюдать с помощью люциферин-люциферазной реакции. В качестве маркирующей молекулы можно использовать, например, поглощающее рентгеновское излучение вещество, магнитную наночастицу и металлическую наночастицу. В случае их использования в качестве маркирующей молекулы наблюдение можно осуществлять методом рентгеновской КТ, МРТ, спектроскопии комбинационного рассеяния света или методом плазмонного резонанса. Следует отметить, что, помимо обнаружения вышеуказанных маркирующих молекул, можно осуществлять неинвазивную оценку поглощения инфракрасного света гемоглобином, который является универсальным веществом, присутствующим в хрящевой ткани, и явления светящегося коллагенового волокна. Кроме того, можно осуществлять неинвазивную оценку вязкоупругости ткани относительно напряжения сдвига методом МР эластографии (МРЭ).
[0030] Композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению может дополнительно содержать другие, отличные от указанных выше молекул, компоненты. Примеры таких компонентов (добавок) включают изотонический агент, буфер, консервант и антиоксидант. В качестве изотонического агента предпочтительно используется, например, хлорид натрия, глицерин, D-маннит, D-сорбит или глюкоза. В качестве буфера можно отметить, например, фосфатный буфер, ацетатный буфер, карбонатный буфер и цитратный буфер.
[0031] Кроме вышеуказанных добавок композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению может содержать вещество для предотвращения дальнейшего внедрения положительно заряженной молекулы в хрящевую ткань. В качестве такого материала можно отметить, например, коллаген и альбумин, не заряженный положительно, или производное и продукт его разложения.
[0032] Следует отметить, что композицию для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению можно использовать в системе доставки лекарственного средства, селективно связывающейся с поврежденным участком хряща посредством связывания терапевтического агента, обладающего действием восстановления поврежденного хряща, или каркасной молекулы, такой как коллаген типа I, служащей в качестве каркаса для, например, пласта клеток в случае регенеративной медицины и клеточной терапии, вместо указанной выше маркирующей молекулы, а также можно использовать в послеоперационном уходе после трансплантации каркаса.
[0033] Ниже описан способ использования композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению. Композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой жидкий препарат, поскольку жидкость может легко использовать. Когда композицию по настоящему изобретению применяют в живом организме, ее можно наносить на поверхностный слой суставного хряща путем распыления, капельным способом или нанесением в виде покрытия под артроскопом или с помощью инъекции в суставное пространство. В случае применения артроскопа предпочтительно промыть поверхность хряща, например, лактатом Рингера или физиологическим раствором для удаления мукозной жидкости (синовиальной жидкости) в суставном пространстве, и после этого нанести композицию для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению, например распылением или нанесение в виде покрытия. После нанесения композиции для визуализации суставного хряща, например, распылением, композицию для визуализации суставного хряща оставляют на определенное время для проникновения. Определенное время в настоящем документе составляет, в частности, предпочтительно от примерно 3 минут до 30 минут, более предпочтительно от примерно 5 минут до 20 минут, еще более предпочтительно от примерно 10 до 15 минут, с точки зрения проницаемости в целевую ткань. После этого суставной хрящ промывают, например, лактатом Рингера для удаления неспецифической адсорбции и избытка композиции для визуализации суставного хряща. После этого регистрируют, например, флуоресцентное излучение, испускаемое маркирующей молекулой.
[0034] В качестве способа обнаружения с помощью маркирующих молекул, который в частности не ограничен, используется способ, в котором маркирующие молекулы измеряются путем введением артроскопа и оптического волокна, имеющего фильтр, который управляет возбуждающим светом, подходящим для маркирующей молекулы. Например, когда в качестве маркирующей молекулы используется флуоресцирующий индикатор, индоцианин зеленый, можно легко наблюдать зеленое флуоресцентное излучение (пиковая длина волны: от 800 до 850 нм) индоцианина зеленого с помощью изображений, получаемых ПЗС-камерой через соответствующий фильтр. При визуализации результатов обнаружения интенсивность флуоресцентного излучения может быть преобразована, например, в необходимые оператору цветовые и численные значения с помощью соответствующего программного обеспечения, и отображена на дисплее. Кроме того, на видимом изображении дегенеративного участка хряща, визуализированного с помощью композиции для визуализации суставного хряща, как было упомянуто выше, в случае, например, идентификации или регистрации контрастной плотности и изменения цвета, можно обнаружить шероховатость поверхности дегенеративной хрящевой ткани, более конкретно, степень дегенерации хряща. Поскольку время, необходимое для диагностики или хирургического вмешательства с помощью артроскопа, как правило, не превышает 1-3 часов, этого достаточно, чтобы рабочее время композиции для визуализации суставного хряща аналогично составляло примерно 1-3 часа. После завершения диагностики или операции выполняют многочисленные промывания, например, лактатом Рингера или физиологическим раствором. Таким образом, композицию почти полностью смывают (удаляют). Остаток, если остается, может быть подвергнут разложению, например, гидролизом и смыт (удален).
ой
ой
[0035] При нанесении композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению на нормальную хрящевую ткань, положительно заряженные молекулы в ней отторгаются структурой, похожей на оболочку, образованной ламеллярными клетками, и она не может проникнуть через клетки хряща. В результате, нормальная хрящевая ткань не визуализируется. В отличие от этого в случае дегенеративной хрящевой ткани, не имеющей ламеллярного клеточного слоя, композиция для визуализации суставного хряща адсорбируется непосредственно в обнаженном хрящевом матриксе. В результате чего дегенеративная хрящевая ткань выделяется. Раннюю стадию дегенерации хряща, другими словами "дегенерацию хряща 1 степени", при которой исчезает только ламеллярно-клеточный слой, трудно выявить и определить обычным способом обнаружения. Тем не менее, композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению позволяет осуществлять идентификацию и регистрировать "дегенерацию хряща 1 степени" и оказывать больным своевременное лечение.
[0036] Композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению позволяет определить состояние повреждения в ткани (хряще, крестообразной связке и мениске) внутри сустава с помощью артроскопа и обеспечить лечение повреждения, в результате чего возможна менее инвазивная диагностика и лечение. До настоящего времени, изображение суставного хряща, отображенного на мониторе с помощью артроскопа в видимой части спектра выглядело белым с высоким уровнем яркости. Это затрудняло определение дегенерации и повреждения поверхностного хрящевого слоя. Однако возможность мечения дегенерации и дефектных участков на поверхности хряща с помощью композиции по настоящему изобретению обеспечивает возможность наблюдать с помощью маркирующих молекул, испускающих инфракрасное флуоресцентное излучение в темном поле, редко наблюдаемое в видимой части спектра состояние повреждения хряща.
[0037] Ниже описаны примеры осуществления настоящего изобретения; однако настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
ПРИМЕРЫ
[0038] ПРИМЕР 1. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННОГО АЛЬБУМИНА
Бычий сывороточный альбумин (продукт производства компании Sigma-Aldrich Co. LLC.) (5 г) растворяли в чистой воде (25 мл). Отдельно в чистую воду (500 мл) добавляли безводный этилендиамин (67 мл) (продукт производства компании Sigma-Aldrich Co. LLC.). К нему постепенно добавляли 6н раствор соляной кислоты (примерно 350 мл), доводя рН до 4,75 в воде со льдом. К полученному раствору этилендиамина, добавляли гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (1,8 г) (продукт производства компании Sigma-Aldrich Co. LLC.), а также добавляли водный раствор бычьего сывороточного альбумина, полученного выше. Смесь перемешивали в течение 2 часов, охлаждая при этом контейнер с препаратом в ледяной воде для регулирования температуры и рН смеси. Реакцию останавливали добавлением 4М ацетатного буфера (5 мл). Полученный раствор подвергали диализу против чистой воды при температуре 4°С в течение 72 ч, а затем подвергали лиофилизации. Полученные лиофилизацией кристаллы были белыми и стекловидными и внешне выглядели как тонкая пленка.
[0039] Измеряли изоэлектрические точки лиофилизированного продукта, полученного как указано выше, и бычьего сывороточного альбумина, использованного в качестве исходного материала, с тем, чтобы проверить, был ли получен положительно заряженный альбумин. Каждое вещество: лиофилизированный продукт и бычий сывороточный альбумин, растворили в чистой воде и наносили на гель Novex (зарегистрированная торговая марка) IEF (продукт, производимый Life Technologies Corporation), и подвергали электрофорезу для определения изоэлектрической точки. Результаты представлены на Фиг.1. Как показано на Фиг.1, pI бычьего сывороточного альбумина в целом составляет примерно 4,9; однако pI лиофилизированного продукта достигал примерно 11. Исходя из полученных результатов, было установлено, что лиофилизованный продукт был сильно катионизирован. Это послужило подтверждением факта получения положительно заряженного альбумина.
[0040] ПРИМЕР 2. ОЦЕНКА ОПТИМАЛЬНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННОГО АЛЬБУМИНА И ИНДОЦИАНИНА ЗЕЛЕНОГО
Флуоресцентный краситель, индоцианин зеленый (ИЦЗ), не испускает флуоресцентное излучение, находясь в состоянии водного раствора (содержащего только ИЦЗ); однако ИЦЗ испускает флуоресцентное излучение в ближней инфракрасной области света, когда связывается с белком. ИЦЗ связывали с положительно заряженным альбумином, полученным в примере 1, и измеряли интенсивность флуоресцентного излучения, испускаемого ИЦЗ, следующим образом. Следует отметить, что в качестве контроля измеряли интенсивность флуоресцентного излучения, испускаемого ИЦЗ, связанным с альбумином, который не является положительно заряженным.
[0041] Положительно заряженный альбумин, полученный в примере 1, растворяли в чистой воде, получая растворы в следующих концентрациях: 1,250 мг/мл, 0,625 мг/мл, 0,313 мг/мл, 0,156 мг/мл и 0,078 мг/мл. Отдельно в чистой воде растворяли индоцианин зеленый (продукт производства компании Sigma-Aldrich Co. LLC.), получая 0,025 мг/мл раствор. Из каждого раствора положительно заряженного альбумина с разными концентрациями и раствора ИЦЗ отбирали аликвоту (50 мкл) и добавляли в отдельную лунку 96-луночного планшета ELISA и перемешивали. ИК-флуоресцентное излучение, испускаемое полученным раствором, измеряли системой камер наблюдения инфракрасного излучения (PDE-neo C10935-20, производства Hamamatsu Photonics К.К.) (возбуждающий свет: 760 нм, флуоресцентное излучение: 830 нм). Контроль получали таким же образом, как описано выше, за исключением того, что вместо положительно заряженного альбумина использовали бычий сывороточный альбумин (продукт производства фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC.), который тестировали аналогичным образом. Результаты показаны на Фиг.2.
[0042] Как показано на представленной на фиг.2 фотографии, флуоресцентное излучение альбумина, который не является положительно заряженным, идентифицировали невооруженным глазом на экспериментальных участках с концентрацией альбумина 0,313 мг/мл (концентрация альбумина: 0,156 мг/мл; концентрация ИЦЗ: 0,0125 мг/мл) или более. В противоположность этому флуоресцентное излучение положительно заряженного альбумина идентифицировали невооруженным глазом на экспериментальных участках с концентрацией альбумина 0,156 мг/мл (концентрация положительно заряженного альбумина: 0,078 мг/мл; концентрации ИЦЗ: 0,0125 мг/мл) или более. Исходя из этого, было обнаружено, что флуоресцентное излучение, испускаемое положительно заряженным альбумином может быть идентифицировано при концентрации ниже, чем у обычно используемого альбумина. Следует отметить, что при проведении теста путем добавления более высокой концентрации ИЦЗ, чем вышеупомянутая тестируемая концентрация (0,0125 мг/мл), было подтверждено увеличение яркости флуоресцентного излучения.
[0043] ПРИМЕР 3. ПОЛУЧЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ИЗОБРАЖЕНИЙ (1) МОДЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ХРЯЩА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОРМАЛЬНОГО БЫЧЬЕГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА
Суставной хрящ плеча передней конечности крупного рогатого скота (от 2 до 3 недель) вырезали и резали на куски размером примерно 1,5 см × 2 см, а субхондральную кость удаляли. Затем, как показано на иллюстрации модели повреждения хряща на фиг.3, с поверхности кусков вырезанного суставного частично срезали слой хряща с помощью бритвы глубиной примерно 0,1-0,2 мм, чтобы повредить поверхность хряща. При изучении применения в реальных клинических случаях, каждый кусок хрящевой ткани промывали путем распыления солевого раствора (около 5 мл) с помощью шприца. Затем на поверхность гидрофобной пластиковой пластины добавляли по каплям 200 мкл композиции для визуализации суставного хряща (концентрация положительно заряженного альбумина: 2,5 мг/мл, концентрация ИЦЗ: 0,125 мг/мл), полученной путем растворения положительно заряженного альбумина и ИЦЗ в чистой воде, и кусок суставного хряща клали лицевой стороной вниз на поверхность гидрофобной пластиковой пластины, погружая кусок в композицию для визуализации суставного хряща. Через 10 до 15 минут излишек композиции для визуализации суставного хряща смывали физиологическим раствором. Изображения отдельных кусков суставного хряща получали с помощью ИК-камеры (производство Hamamatsu Photonics К. К.) и регистрировали.
[0044] Изображения, наблюдаемые с помощью инфракрасной камеры, показаны на Фиг.3. В кусках суставного хряща (поверхность не срезана) из контрольного участка, не наблюдали проникновение и адсорбцию композиции для визуализации суставного хряща с поверхности хряща. Излучение наблюдали в виде белой линии; однако оно было получено в результате того, что избыток композиции для визуализации суставного хряща зафиксировался на внешней периферийной боковой поверхности куска суставного хряща под действием капиллярных сил. В противоположность этому в экспериментальном участке 1 (хрящевая поверхность срезана наполовину бритвой для создания дефекта) было подтверждено излучение света, генерируемого композицией для визуализации суставного хряща, которая проникла через дефект внутрь поверхности и адсорбировалась. Следует отметить, что излучение наблюдалось в виде белой линии; однако оно генерировалось избытком композиции для визуализации суставного хряща, адсорбированным под действием капиллярных сил во внешней периферийной боковой поверхности куска суставного хряща. В экспериментальном участке 2 (центральная часть одной из хрящевых поверхностей срезана бритвой) было подтверждено излучение света, генерируемого композицией для визуализации суставного хряща, которая проникла из дефектного участка центральной поверхности и адсорбировалась. Как было описано выше, было показано, что в срезанных поверхностях композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению проникает глубь, адсорбируется там и испускает интенсивное флуоресцентное излучение.
[0045] ПРИМЕР 4. ПОЛУЧЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ИЗОБРАЖЕНИЯ (2) МОДЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ХРЯЩА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОРМАЛЬНОГО БЫЧЬЕГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА
Суставной хрящ плеча передней конечности крупного рогатого скота (от 2 до 3 недель) асептически вырезали и разрезали на куски размером примерно 1 см × 1,5 см, а субхондральную кость удаляли до максимально возможной степени. Каждый вырезанный хрящ погружали в забуференный фосфатом физиологический раствор. Затем, почти половину (правая половина, если смотреть сверху) поверхности каждого куска суставного хряща разрезали скальпелем (No.11) до глубины примерно от 0,1 до 0,2 мм для образования дефекта на поверхности хряща. Обработку проводили таким образом, что левую половину (если смотреть сверху) куска суставного хряща оставляли интактной и использовали в качестве контрольного участка; в то время как правую половину (если смотреть сверху) использовали в качестве модели повреждения поверхности хряща. Для гарантированного определения положения при измерении и наблюдении один из углов поврежденной поверхности срезали по диагонали. Перед наблюдением флуоресцентного излучения забуференный фосфатом физиологический раствор (примерно от 2 до 3 мл) распыляли на каждый кусок суставного хряща с помощью шприца и промывали. Избыток буфера удаляли с помощью Kimwipe (зарегистрированная торговая марка). Затем, в соответствующие гидрофобные чашки Петри по каплям добавляли анализируемые растворы 1-4 (по 50 мкл каждого раствора), и куски суставного хряща клали лицевой стороной вниз в анализируемый раствор, добавляемый по каплям на поверхность гидрофобной чашки Петри, чтобы пропитать поверхность куска хрящевой ткани анализируемым раствором. Через 10 минут избыток анализируемого раствора смывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и избыток буфера удаляли Kimwipe. Каждый кусок хрящевой ткани клали на черную бумагу и фотографировали в ближней инфракрасной области и видимой части спектра.
[0046] Анализируемые растворы 1-4, использованные в этом примере, готовили, отдельно растворяя каждый из компонентов в чистой воде. Анализируемый раствор 1 содержал только чистую воду; анализируемый раствор 2 содержал ИЦЗ в концентрации 0,125 мг/мл; анализируемый раствор 3 содержал альбумин в концентрации 2,5 мг/мл и ИЦЗ в концентрации 0,125 мг/мл; и анализируемый раствор 4 содержал положительно заряженный альбумин в концентрации 2,5 мг/мл и ИЦЗ в концентрации 0,125 мг/мл. При съемке в ближней инфракрасной области света каждый из анализируемых растворов с кусками суставного хряща возбуждали воздействием источника света (возбуждающая длина волны: 770 нм, 30 мА), который получали путем размещения в виде круга 16-ти светодиодов, излучающих в ближней инфракрасной области света, а все изображения получали с помощью высокочувствительной ПЗС-камеры (ORCA-ER, производства Hamamatsu Photonics KK) через фильтр для ИЦЗ (832 нм) (BrightLine МКГ-B, производства Semrock) в одних и тех же условиях (100 мс, тусклое освещение и 8 × режим биннинга). После съемки в ближней инфракрасной области света, выполняли монохромную съемку в видимой части спектра.
[0047] Результаты показаны на Фиг.4. На каждой фотографии, сделанной в видимой части спектра и в ближней инфракрасной области света, в левой части показан интактный контроль, а в правой части показана модель повреждения. В случае анализируемого образца 1 (только чистая вода) было подтверждено, что свет не излучается обеими поверхностями. Тем не менее, в анализируемом растворе 2 (только ИЦЗ) флуоресцентное излучение испускалось интактным контролем. Флуоресцентное излучение предположительно испускается ИЦЗ, который адсорбирован белком на поверхности хряща. В модели повреждения, напротив, флуоресцентное излучение не наблюдалось. Предполагается, что при повреждении поверхности хряща сахарная цепь, например, гликозаминогликана обнажается на поверхности хряща в большем количестве, чем белки, вследствие чего ИЦЗ не адсорбируется этими сахарными цепями. В анализируемом растворе 3 (альбумин + ИЦЗ), напротив, очень слабое флуоресцентное излучение испускалось обеими поверхностями; однако по интенсивности эти излучения не отличались. Исходя из этого было установлено, что альбумин практически не адсорбируется в хрящевой ткани и клеточном слое; предполагается, что альбумин, содержащийся в анализируемом растворе, связывается с ИЦЗ, вследствие чего ИЦЗ теряет адсорбционную активность по отношению к белкам на поверхности хрящей. В случае анализируемого раствора 4 (положительно заряженные альбумин + ИЦЗ) было отмечено, что интенсивное флуоресцентное излучение испускается поверхностью с повреждением. Предполагается, что положительно заряженный альбумин проник через поврежденную поверхность внутрь и адсорбировался в промежуточном слое хряща, содержащий большое количество отрицательного заряда. В интактной контрольной поверхности клеточные слои расположены плотно и величина отрицательного заряда мала. Следовательно, количество адсорбированного положительно заряженного альбумина является низким. ИЦЗ был насыщен белком из-за присоединения положительно заряженного альбумина и, по-видимому, не адсорбировался белками на поверхности хряща. Как было описано выше, было показано, что композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению, состоящая из положительно заряженного альбумина и ИЦЗ, проникает в поврежденную часть хряща, адсорбируется и испускает флуоресцентное излучение более интенсивно, чем нормальная часть хрящевой поверхности, обеспечивая таким образом визуализацию поврежденного участка.
[0048] ПРИМЕР 5. ПОЛУЧЕНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕННОГО ХРЯЩА С ПОМОЩЬЮ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ СУСТАВНОГО ХРЯЩА
Изображение поврежденного участка человеческого суставного хряща получали с помощью композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению. В качестве исследуемого материала использовали дегенеративный хрящ человека, пораженный артритом, который был вырезан в ходе операции по установке искусственного коленного сустава. Суставной хрящ вырезали асептически и нарезали на куски размером примерно 1 см × 1,5 см. Вырезанный хрящ погружали в забуференный фосфатом физиологический раствор. Перед наблюдением флуоресцентного излучения куски суставного хряща опрыскивали забуференным фосфатом физиологическим раствором (примерно 2-3 мл) с помощью шприца и промывали, а затем получали цветные фотографии в видимой части спектра. Избыток буфера удаляли с помощью Kimwipe (зарегистрированная торговая марка). Затем 100 мкл композиции для визуализации суставного хряща (концентрация положительно заряженного альбумина: 2,5 мг/мл, концентрация ИЦЗ: 0,125 мг/мл), полученной путем растворения положительно заряженного альбумина и ИЦЗ в чистой воде, помещали на гидрофобную чашку Петри, и кусок суставного хряща клали лицевой стороной вниз на чашку Петри, чтобы пропитать поверхность куска суставного хряща композицией для визуализации суставного хряща. Через 10 минут избыток композиции для визуализации смывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (2-3 мл), и избыток буфера удаляли с помощью Kimwipe. Каждый кусок суставного хряща клали на кусок черной бумаги, и фотографировали верхнюю и боковую поверхности в ближней инфракрасной области света. При съемке в ближней инфракрасной области света анализируемый раствор в каждом куске суставного хряща возбуждали источником света (возбуждающая длина волны: 770 нм, 30 мА), который получали путем размещения в виде круга 16-ти светодиодов, излучающих в ближней инфракрасной области света, и получали изображение с помощью высокочувствительной ПЗС-камеры (ORCA-ER, производства Hamamatsu Photonics KK) через фильтр для ИЦЗ (832 нм) (BrightLine ICG-B, производства Semrock) в одних и тех же условиях (100 мс, тусклое освещение и 8 × режим бининга, режим автоконтраста).
[0049] Результаты показаны на Фиг.5. Поскольку используемый в этом примере дегенеративный человеческий хрящ был поражен тяжелой формой остеоартроза, практически все куски суставного хряща испускали интенсивное флуоресцентное излучение. Исходя из этого было установлено, что в композиции, содержащей положительно заряженный альбумин и ИЦЗ, положительно заряженный альбумин подавляет неспецифическую адсорбцию ИЦЗ биологическим белком, предпочтительно, адсорбируется за счет отрицательного заряда, присутствующего в большом количестве в промежуточном слое хряща, и испускает флуоресцентное излучение. Следует отметить, что, как показано на Фиг.5, было обнаружено, что флуоресцентное излучение, испускаемое из тонкого красного участка поверхности куска хрящевой ткани и подтвержденное наблюдением в видимой части спектра, имеет низкую интенсивность по сравнению с периферийным участком. Поскольку тонкий красный участок представляет собой ткань, расположенную близко к краю суставного хряща, предполагается, что эта часть является тканью, содержащей кровеносный сосуд, аналогичной синовиальной ткани, образуемой на поверхности хряща, и предположительно эта синовиальная ткань отсрочила проникновение композиции для визуализации по настоящему изобретению.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
in vivo
in vivo
[0050] Композиция для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению позволяет своевременно обнаружить дегенерацию хряща, который является причиной возникновения остеоартроза коленного сустава, и точно определить границу между нормальным хрящом и дегенерирующим хрящом. С помощью композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению можно не только визуализировать дегенеративный участок в суставном хряще , например, для диагностики или хирургического вмешательства под артроскопом, но также осуществлять неинвазивную или менее инвазивную визуализацию дегенеративного состояния хряща путем инъекции композиции для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению в суставное пространство, при этом, дегенеративное состояние можно наблюдать с помощью  метода формирования изображения. Кроме того, композицию для визуализации суставного хряща по настоящему изобретению можно применять для оценки степени повреждения хряща и степени улучшения и в исследованиях по поиску новых лекарств, а также при изучении патологических заболеваний суставного хряща в вырезанных или регенерированных тканях суставного хряща.