Новые элементы технологии оздоровления и получения базовых клонов перспективных сортов и гибридов картофеля

УДК 635.21:581.86.01

НОВЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ТЕХНОЛОГИИ ОЗДОРОВЛЕНИЯ И ПОЛУЧЕНИЯ БАЗОВЫХ КЛОНОВ ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ И ГИБРИДОВ КАРТОФЕЛЯ

Е.В. ОВЭС, кандидат сельскохозяйственных наук, зам. директора

Н.А. ГАИТОВА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник

Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха, ул. Лорха, 23, пос. Красково, Московская обл., 140050, Российская Федерация

Резюме. В нашей работе представлены результаты оздоровления перспективных гибридов картофеля селекции ВНИИКХ от наиболее вредоносных вирусов. В программу исследований включены 13 образцов. Клубневой материал, предоставленный селекционерами, был протестирован на наличие вирусов методом иммуноферментного анализа (ИФА). Зараженность вирусными болезнями в латентной форме была на уровне 92%. По результатам иммунодиагностической оценки наиболее встречаемыми оказались патологии, вызванные M- и Y-вирусами картофеля. С целью оздоровления была проведена термотерапия клубней и микрорастений, полученных из этого же клубневого материала. Начавшие прорастать клубни помещали в термокамеру при 29-30 °С на две недели. Затем повышали температуру до36-37°С. Трехнедельные растения, выращенные на среде Мурасиге-Скуга, помещали в термокамеру при 28 °С и, ежедневно увеличивая температуру на 2 'С, доводили ее до 38 °С. Клубневой материал находился в термокамере 20 дней, микрорастения - не более 10 дней. Ингибирование репликации вирусов в процессе воздействия высоких температур способствовало получению регенерантов, свободных от инфекции. Доля меристем, полученных из клубней и впоследствии развившихся в полноценные растения, варьировала от 48 до 89 %; после термотерапии - от 21 до 50 %. После завершения термотерапии каждая полученная линия была протестирована на наличие вирусов и вироидов методами ИФА и ПЦР-анализа. Из 13 сортообразцов путем термотерапии клубней было освобождено от инфекции 5 линий, пробирочных растений - 12 перспективных гибридов. Результативность первого способа составила 38 %, второго была в 2,4 больше (92 %). После оздоровления меристемные линии передали оригинаторам сортов для оценки в полевых условиях, по результатам которой они были признаны типичными. Ключевые слова: картофель, оздоровление, меристемные технологии, базовые клоны, in vitro материал, микрорастения, семеноводство.

Для цитирования: Овэс Е.В., Гаитова Н.А. Новые элементы технологии оздоровления и получения базовых клонов перспективных сортов и гибридов картофеля//Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 11. С. 60-62.

Одним из критериев, влияющих на распространение нового селекционного достижения, служит его фитоса-нитарное состояние. Только здоровый посадочный материал способен реализовать биологический потенциал сорта, а из-за его отсутствия ряд генотипов уступает стандартным образцам и может быть не внесен в реестр селекционных достижений. Как правило, гибриды картофеля, передаваемые селекционерами на испытание, заражены вирусами. Именно поэтому образцы должны быть предварительно включены в процесс оздоровления.

Для оздоровления новых сортов и гибридов картофеля от вирусной инфекции используют культуру изолированных апикальных меристем. Метод основан на том, что апикальная меристема, представляющая собой конус активно делящихся клеток высотой 100 мкм (0,1 мм), свободна от вирусов. Однако этот метод требует вычленения большого количество эксплантов in vitro, для того, чтобы впоследствии выделить здоровые линии. Результатами многочисленных исследований доказано, что уменьшение

размера вычленяемой меристемы ведет к уменьшению морфогенетической способности, а при его увеличении снижается эффективность оздоровления [1, 2].

При использовании клеточных технологий исключительно важное значение имеет проблема сохранения типичности объектов in vitro. Метаморфозы могут происходить как при оздоровлении сортов, так и в результате их продолжительного депонирования. Длительное культивирование линий in vitro в процессе клонального микроразмножения не исключает появления различных модификаций, в связи с чем дискуссионным остается вопрос о его продолжительности. Условия изолированной культуры и длительное клонирование могут привести к глубокой клеточной дестабилизации, и изменения происходят, прежде всего, по показателям хозяйственно-ценных признаков [3-5]. Поддержание и хранение образцов в культуре in vitro требует регулярного контроля биоматериала на идентичность. Искусственные условия могут вызывать изменчивость, как модификационную, так и мутационную [6-8]. Накопленный опыт свидетельствует, что наиболее надежный оздоровительный эффект можно получить у лучших здоровых растений (базовых клонов), тщательно оцененных на предмет их сортовой типичности и выраженности основных сорто-отличительных признаков [9-11].

Цель проводимых исследований - оздоровление и получение базовых клонов перспективных сортов и гибридов картофеля для дальнейшего их включения в семеноводческий процесс.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили в 2013-2015 гг. в лаборатории меристемно-тканевых технологий ВНИИКХ. Однофакторный опыт был заложен в культуре in vitro с применением двух способов оздоровления: термотерапии клубней и термотерапии микрорастений.

Объектом исследований стали 13 перспективных гибридов конкурсного сортоиспытания селекции ВНИИКХ. Для этих целей в указанном питомнике отбирали наиболее здоровые по внешним признакам растения, обладающие типичностью и выраженностью основных сортоотличи-тельных признаков. Урожай каждого растения (клона) оценивали на сортовую типичность и лежкоспособность. Клоны без бактериальных и грибных болезней нумеровали и диагностировали методом ИФА на наличие вирусов с применением зимнего глазкового теста. Менее зараженные из них проращивали и получали этиолированные ростки.

Традиционно термотерапию проводят на клубнях картофеля, которые для этого помещают в термический шкаф без освещения на 2 недели при температуре 2930 °С, затем ее повышают до 37-38 °С. Длительность экспозиции при высокой температуре зависит от сортовых особенностей и составляет 3-4 недели [12, 13]. В нашем опыте продолжительность второй фазы термотерапии клубней при 37 °С составила 20 дней. В процессе эксперимента осуществляли систематический контроль и оценку состояния материала, поскольку при высоких температурах возможна гибель верхушек ростков [5].

Перед закладкой клубней на термотерапию часть этиолированных ростков, простерилизованных 0,1%-ным раствором диацида, использовали для введения в культуру

Таблица 1. Исходная зараженность клубней перспективных гибридов вирусной инфекцией

Гибрид X* S M Y

8х1 + — - —

13-2 + + + —

1504-2 — + + +

1298-5 — + + —

929-15 — - + +

Купец - + + +

1400/13 - + + —

13-24 + - - +

173 - - + +

Варяг - + - +

128-6 - - + +

Эликсир - + + +

1575-5 - + + +

*X - X-вирус картофеля, S - S-вирус картофеля, M -М-вирус картофеля, Y - Y-вирус картофеля

и получения микрорастений. Эти экспланты были взяты в качестве биоматериала для дальнейшей термотерапии микрорастений. Культивирование осуществляли на среде с минеральной основой Мурасиге-Скуга. Таким образом, для проведения исследований использовали однородный по качеству материал перспективных гибридов картофеля.

Термотерапия микрорастений - инновационный элемент технологии оздоровления картофеля от вирусов, находящийся на стадии разработки. Для этих целей растения с 4-5 междоузльями размещали в специализированной климатической камере с регулируемым фотопериодом и температурным режимом. Это позволяет растениям в культуральном сосуде расти и развиваться в температурном диапазоне 37,8-38,0 °С. Для обеспечения температурного максимума (38 °С) пробирки с растениями размещали в климатической камере при 28 °С с установленным десятичасовым фотопериодом и ежедневно повышали температуру на 1-2 °С. Продолжительность экспозиции при 38 °С зависит от сорта и составляет от 7 до 14 дней. Чем больше времени экспланты находятся при повышенной температуре, тем выше вероятность получения здоровых меристем [13, 14]. В нашем эксперименте продолжительность экспозиции была равна 10 дням, так как при высоких температурах, несмотря на определенный микроклимат в пробирках, растения теряли тургор и приобретали свет-локоричневую окраску. После прохождения термотерапии у растений брали верхний черенок и под микроскопом с 300-350-кратным увеличением вычленяли апикальную меристему. После регенерации каждая из меристем образовала новую линию in vitro. По рекомендациям ряда авторов [9, 11] по мере размножения биоматериала в культуре ткани меристемные линии диагностировали методом ИФА и ПЦР-анализа на наличие вирусной и вироидной инфекции. Здоровые по результатам диагностики линии использовали для тиражирования высококачественного оригинального семенного материала.

После оздоровления меристемные линии передавали оригинатору сорта для оценки и отбора на типичность, с последующим предоставлением клубневого материала в Банк здоровых сортов картофеля (БЗСК). Многоуровневая оценка гибридного материала в лабораторных условиях, получение здоровых базовых клонов и их поддержание в полевой коллекции в чистых фитосанитарных условиях - это одни из главных аспектов, обусловливающих успех проводимой работы по оздоровлению сортов картофеля. Их значимость заключается в возможности проведения параллельной диагностической оценки гибридного материала в полевой и in vitro коллекции.

Результаты и обсуждение. Результаты диагностической оценки клубневого материала, предназначенного

для проведения термотерапии, свидетельствуют, что латентная форма вирусной инфекции присутствовала во всех изученных образцах. При этом только в одном из тринадцати гибридов идентифицировали наличие моноинфекции (табл. 1). Чаще всего в изучаемом материале отмечали наличие М- и Y-вирусов картофеля, при этом в большинстве случаев их присутствие было комплексным.

Регенерационная способность меристемного материала, полученного после применения различных способов термотерапии, различалась более, чем в 2 раза. Эффективность регенерации из клубней варьировала от 48 до 89 %, а для микрорастений величина этого показателя составляла 21-50 % (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительная оценка эффективности получения меристемного материала при разных способах термотерапии

Меристемный материал, шт.

из микрорастений из клубней

Гибрид все- получено ре-генерантов все- получено реге-нерантов

го всего здоровых го всего здоровых

8х1 10 3 1 10 8 0

13-2 12 3 0 12 8 40

1504-2 20 5 2 20 13 1

1298-5 14 3 1 10 6 0

929-15 8 2 2 7 4 0

Купец 1400/13 10 8 3 2 1 2 7 19 5 17 0 1

13-24 10 4 1 22 19 1

173 16 8 2 18 10 0

Варяг 128-6 18 9 8 4 2 1 34 27 25 13 1 0

Эликсир 1575-5 21 30 10 13 2 3 53 33 30 17 0 1

Всего 186 68 20 272 175 5

Различная регенерационная способность меристем, полученных из разного биоматериала, объясняется технологическими особенностями проводимых культуральных работ по оздоровлению гибридов. При использовании ростков вычленяют апекс размером 100-200 мкм, что позволяет сохранить жизнеспособность эксплантов [9, 11]. Применение микрорастений дает возможность получать экспланты предельно минимального размера - 100 мкм. Более мелкие меристемы не способны к регенерации, а более крупные оказываются зараженными [5, 9].

В процессе выполнения работ по оздоровлению исследуемых перспективных гибридов на основе тер-

Таблица 3. Результаты диагностической оценки меристемных линий

Гибрид Микрорастения Клубни

здо-ро-вые зараженные* здо-ро-вые зараженные

X + S M Y X + S M Y

8х1 1 2 0 0 0 0 5 3

13-2 0 0 3 0 0 0 6 2

1504-2 2 1 2 0 1 1 9 2

1298-5 1 0 2 0 0 0 4 2

929-15 2 0 0 0 0 0 2 2

Купец 1 0 2 0 0 0 3 2

1400/13 2 0 0 0 1 0 12 4

13-24 1 1 0 2 1 3 9 6

173 2 0 4 2 0 0 8 2

Варяг 2 3 0 3 1 5 15 4

128-6 1 0 3 0 0 0 8 5

Элик- 2 2 4 2 0 6 16 8

сир

1575-5 3 3 3 4 1 3 10 3

*X - X-вирус картофеля, S - S-вирус картофеля, M -М-вирус картофеля, Y - Y-вирус картофеля

мотерапии клубней всего было изолированно 272 меристемы, с привлечением микрорастений - 186 образцов, из которых получено 175 и 68 регенерантов, соответственно.

Сравнительная оценка применяемых способов оздоровления выявила, что при использовании термотерапии клубней было освобождено от инфекции 5 из 13 исследуемых образцов. Путем термотерапии микрорастений удалось оздоровить 12 из 13 перспективных гибридов. Таким образом, результативность первого способа не превышала 40 %, а во втором случае она была больше в 2,4 раза и достигла 92 %.

Наиболее сложным для оздоровления оказался материал, в котором присутствовал М-вирус (табл. 3). При использованном температурном режиме и медленном росте биоматериала в виде ростков и микрорастений в условиях климатической камеры ему удавалось проникать в верхние слои апикальной меристемы. При этом в случае термотерапии микрорастений рост апикальной части происходит при температуре близкой к +38 °С, а при использовании клубней она на 1,0-1,5 °С ниже. Ве-

роятно, более высокая температура сильнее сдерживает передвижение вируса в растении, что способствует увеличению эффективности процесса оздоровления.

После оздоровления меристемные линии передали оригинаторам сортов для оценки в полевых условиях, по результатам которой они были признаны типичными.

Выводы. Проведенный мониторинг зараженности перспективных гибридов в селекционных питомниках ВНИИКХ выявил в изученных образцах наличие комплексной инфекции. Зараженность вирусными болезнями в латентной форме составляла около 92 %. По результатам иммунодиагностической оценки наиболее распространенными были M-и Y-вирусы.

В результате применения термотерапии микрорастений от вирусной инфекции было освобождено 12 изученных гибридов, то есть эффективность этого способа оздоровления составила 90 %. При термотерапии клубней доля здоровых меристем не превышала 40 %. Таким образом, эффективность термотерапии микрорастений выше аналогичного метода для клубней в 2,4 раза.

Литература.

1. Адамова А.И., Родькина О.И. Эффективность оценки и отбора оздоровленных линий для семеноводства новых и перспективных сортов картофеля// Картофелеводство: сб.науч. тр. Минск, 2000. Вып. 10. С. 208-213.

2. Трускинов Э.В., Фролова Д.В. Меристемный картофель: особенности и проблемы получения и использования: мат. между-нар. юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 75-летию Ин-та картофелеводства НАН Беларуси. Минск, 2003. Ч. 1. С. 322-329.

3. Трускинов Э.В. Создание коллекции картофеля in vitro: штрихи, проблемы, перспективы // К 80-летию коллекции ВИР: тр. по прикладн. ботанике, генетике и селекции. СПб, 2007. Т. 163. С. 82-90.

4. Nowbuth L., Le C.L. Teneur non conforme en AND comme indicateur беё variation samoclonale chez la pomme de terre // Revue Suisse Agric. 2005. Vol. 37 (6). Pp. 257-266.

5. Evaluation of in vitro cytotoxic activity of mono-PEGylated StAP3 (Solanum tuberosum aspartic protease 3) forms/ F. Munoz, P.C. Caraccioo, G. Daleo, G.A. Abraham, M.G.Guevara // Biotechnology Reports. 2014. Vol. 3. Pp. 1-7.

6. Анализ генетической стабильности образцов картофеля, сохраняемых в условиях in vitro / О.Ю.Антонова, Э.В. Трускинов, Д.В. Фролова, Т.А. Гавриленко//Аграрная Россия. 2004. № 6. С. 25-29.

7. Демчук И.В., Петренко Е.Н., Зарицкий Н.М. Изменение свойств оздоровленных клоновых линий сортов картофеля в зависимости от длительности культивирования in vitro // Картофелеводство: сб. науч. тр. Минск, 2008. Т. 14. С. 56-66.

8. Реуцкий В.Г., Родинов П.А., Зубей Е.С. Жизнеспособность растений картофеля in vitro. Анализ проблемы и методика оценки // Картофелеводство: сб. науч. тр. Минск, 2007. Т. 13. С. 93-104.

9. Анисимов Б.В., Овэс Е.В. Банк здоровых сортов картофеля - важнейший элемент в системе оригинального семеноводства // Картофель и овощи. 2011. № 6. С. 5-7.

10. Овэс Е.В., Жевора С.В. Современные способы сохранения сортовых ресурсов картофеля//Картофель и овощи. 2015. № 12. С. 21-23.

11. Овэс Е.В., Анисимо Б.В., Бойко В.В. Биотехнологические методы получения исходного in vitro материала для оригинального семеноводства на основе Банка здоровых сортов картофеля // Современная индустрия картофеля: состояние и перспективы развития: мат. VI науч.-практ. конф. Чебоксары: Агроинновации, 2014. С. 122-125.

12. Horackova V., Dedic P. Metodika pripravy bezvirovych materialu bramboru v novoslechteni a udrzovacim slechteni s vyuzitim biotechnologickych a virologickych postupu. Havlickiv Brod, 2009. P. 28.

13. Le C. L., Collet G.F. Assainissement de la variete de pomme de terre Sangema. Methode combinant la thermotherapie in vitro et la culture de meristemes. Premiers resultats// Revue suisse Agric. 1985. Vol. 17 (4). Pp. 221-225.

14. Оздоровление сортов картофеля с применением термотерапии микрорастений/Е.В. Овэс, В.В. Бойко, Н.А. Гаитова, Н.А. Фенина, О.С. Колесова//Картофелеводство: история развития и результаты научных исследований по культуре картофеля: сб. науч. тр. ВНИИКХ. М: ВНИИТИ, 2015. С. 143-147.

NEW ELEMENTS IN TECHNOLOGY OF IMPROVEMENT AND OBTAINING OF BASIC POTATO CLONES OF PROMISING CULTIVARS AND HYBRIDS

E.V. Oves, N.A. Gaytova

A.G. Lorkh Potato Research Institute, ul. Lorha, 23, pos. Kraskovo, Moskovskaja obl., 140050, Russian Federation Summary. Our work presents the results of improvement of the promising potato hybrids, bred in the A.G. Lorkh Potato Research Institute, from the most harmful viruses. Thirteen samples were included in the program of investigation. The tuber material, given by breeders, was tested for virus presence by ELISA. Infectiousness by virus diseases in the latent form was at the level of 92 %. According to the results of immunodiagnostic estimation the pathologies, caused by M- and Y-potato viruses, were the most common. We carried out the thermotherapy of tubers and microshoots, obtained from these tubers. The tubers, which had begun to germinate, were placed in the heat chamber at 29-30 degrees in two weeks. Then the temperature was increased up to 36-37 degrees. Three-week plants, grown on the Murashige-Skoog media, were placed in the heat chamber at 28 degrees, and by daily increase in temperature by 2 degrees drove it up to 38 degrees. However tuber material was in the heat chamber during 20 days, and microshoots - no more than 10 days. The inhibition of virus replication during the action of high temperatures contributed to the obtaining of regenerants free from virus infection. The fraction of meristems, obtained from tubers and subsequently developed into full plants, varied from 48 to 89 %; for thermotherapy of plants this value was 21-50 %. After thermotherapy each line obtained was tested for virus and viroid presence by ELISA and PCR. The thermotherapy of tubers contributed to the improvement of 5 from 13 variety samples; during plant thermotherapy 12 promising hybrids were improved. The efficiency of the first method was 38 %, the efficacy of the second method was 2.4 times higher