Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови
METHOD FOR DETECTION OF NEUTROPHIL EXTRACELLULAR TRAPS IN SUPRAVITAL STAINED BLOOD PREPARATION

Brinkmann, V. Neutrophil extracellulartraps kill bacteria / V.Brinkmann, U.Rechard, C.Goosmann et al. // Sciense. - 2004. - Vol.303. - P.1532-1535
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, патофизиологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для визуализации нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) [], формируемых изолированными нейтрофилами после стимуляции специфическими стимуляторами (культура бактерий или специфический антиген).
Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка метода, позволяющего одномоментно определить нейтрофилы путем их иммунофенотипирования с  визуализацией экспрессированных на поверхности дифференцировочных антигенов  лейкоцитов (CD15), оценить их жизнеспособность, идентифицировать морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции и визуализировать нейтрофильные ловушки разного типа (нитевидные и облаковидные) с возможным подсчетом бактерий, захваченных сформировавшимися НВЛ.
Задача, на решение которой направлено изобретение, решается тем, что после стимуляции изолированных нейтрофилов бактериальным антигеном производят суправитальную окраску взвеси клеток с интеркалирующим ДНК-красителем не проникающим через неповрежденную клеточную мембрану (йодид пропидия, синонимы - propidium iodide, PI) с одновременной инкубацией с антителами к антигену CD15, меченными флуоресцентным красителем  под покровным стеклом в темноте в строго контролируемых условиях (37°С) в течение 5 минут. В процессе активации нейтрофила йодид пропидия начинает проникать в клетку за счет повышения проницаемости мембраны нейтрофила, причем чем сильнее активация нейтрофила, тем больше йодида пропидия связывается с ДНК ядра гранулоцита.
Способ осуществляется следующим образом.
Нейтрофилы выделяют из 5 мл гепаринизированной периферической венозной крови. После центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-верографина с плотностью верхнего градиента 1,077 и нижнего градиента 1,105 на границе между градиентами гранулоциты формируют кольцо. Собранные нейтрофилы дважды отмывают физиологическим раствором натрия хлорида. Затем после подсчета в камере Горяева концентрацию нейтрофилов доводят до 5000 клеток на 1 мкл. Следующий этап метода предусматривает стимуляцию нейтрофилов пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. Гранулоциты инкубируют с пробиотиком 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют нейтрофилы, инкубируемые в тех же условиях, но без пробиотика. Для окрашивания препарата к 10 мкл взвеси клеток добавляют 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченые FITC в разведении 1:10. После чего одну каплю взвеси клеток переносят на обезжиренное предметное стекло, накрывают покровным стеклом. Предметное стекло во влажной камере помещают в суховоздушный термостат при 37°С на 5 минут.
Затем с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны 450-480 нм и эмиссию с длиной волны от 515 нм, обнаруживают: жизнеспособные интактные клетки ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) без прокрашенного ядра (Фиг. 1. Жизнеспособные нейтрофилы); морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции: слабоактивированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) и слабопрокрашенным красным ядром (окрашено йодидом пропидия) (Фиг. 2. Слабоактивированные клетки), активированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и красно-оранжевым ядром, не достигающим границы цитолеммы (Фиг. 3. Активированные клетки), гиперактивированные клетки - поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром, достигающим границы цитолеммы (Фиг. 4. Гиперактивированные клетки), гиперактивированные клетки с начальными признаками нетоза (ранний нетоз) с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром с визуализируемым выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации, но не окружающее клетку со всех сторон (Фиг. 5. Ранний нетоз), одномоментно с клеточными эквивалентами подсчитываются два варианта нетоза: нитевидный нетоз - красно-оранжевые структурированные нитевидные нейтрофильные внеклеточные ловушки, превышающие размер клетки более чем в 2 раза (Фиг. 6. Нитевидные нейтрофильные ловушки с захваченными бактериями. Фиг. 7. Нитевидные нейтрофильные ловушки с остатками мембраны нейтрофила - клетки-источника нетоза), облаковидный нетоз - неструктурированные гомогенные нейтрофильные внеклеточные ловушки красно-оранжевого цвета, расположенные вокруг клетки-источника нетоза, превышающие размер клетки в 1,5-2 раза (Фиг. 8. Облаковидная нейтрофильная ловушка с остатками мембраны нейтрофила - клетки-источника нетоза).
После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывают процентное содержание каждого элемента: интактных клеток, слабоактивированных клеток, активированных клеток, гиперактивированных клеток, раннего нетоза, НВЛ в виде нитей, и облаковидных НВЛ в препарате - морфологический профиль нетоза.
Морфологический профиль нетоза
1. Интактные клетки - (процентное содержание)
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - (процентное содержание)
2.2 Активированные - (процентное содержание)
2.3. Гиперактивированные - (процентное содержание)
3. Ранний нетоз - (процентное содержание)
4. Нетоз:
4.1. Нитевидный нетоз - (процентное содержание)
4.2. Облаковидный нетоз - (процентное содержание)
В препарате после стимуляции культурой бактерий, подсчитывают количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Из существующих способов визуализации НВЛ известны и запатентованы следующие:
После активации взвеси нейтрофилов in vitro различными активаторами (форболмиристатацетат, интерлейкин-8, культура бактерий) формируемые нейтрофилами НВЛ наблюдают с использованием методов световой и люминесцентной микроскопии.
Возможности люминесцентной и световой микроскопии при определении внеклеточных нейтрофильных ловушек / Дядичкина О.В., Коротина О.Л., Радецкая Л.Е., Генералов И.И. // Вестник Витебского государственного медицинского университета. - 2014. - Т. 13, № 5. - С. 81-86
Ряд авторов используют световую микроскопию с цитологическим окрашиванием мазка крови по Романовскому – Гимзе, с последующим подсчетом процента нейтрофилов, сформировавших НВЛ. При использовании данного метода НВЛ будет визуализироваться в виде нитевидных структур, окрашенных в красный цвет, по размеру превышающих нейтрофильный гранулоцит в 10-15 раз []. Недостатком указанного метода является тот факт, что окрашивание по Романовскому - Гимзе не является специфическим для структур ДНК и выявляет все продукты распада клеток крови независимо от их происхождения.
Возможности люминесцентной и световой микроскопии при определении внеклеточных нейтрофильных ловушек /Дядичкина О.В., Коротина О.Л., Радецкая Л.Е., Генералов И.И. // Вестник Витебского государственного медицинского университета. - 2014. - Т. 13, № 5. - С. 81-86
Cпособ обнаружения нейтрофильных ловушек; пат. 2384844 Рос. Федерация; МПК G01N 33/48 (2006.01); No 2008112636/15; заявл. 01.04.2008; опубл. 10.10.2009 / Долгушин И.И., Андреева Ю.С.; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию". - 5 с.
Другая группа методов заключается в использовании интеркалирующих ДНК-красителей, обладающих способностью к флуоресценции (акридиновый оранжевый, SYTOX, PicoGreen, Hoechst 33342, DAPI) с визуализацией продуктов их окрашивания при помощи люминесцентной микроскопии. В данном случае НВЛ будут представлены тонкими нитями, занимающими пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила и окрашенные в цвет, соответствующий спектру испускания флуоресцентного красителя. []. В частности, описан способ обнаружения нейтрофильных ловушек в клеточной взвеси, отличающийся тем, что фиксированный препарат окрашивают 200 мкл акридинового оранжевого в концентрации 0,2 мг/мл в течение 2 минут, результат учитывают с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Обнаруживают ядра нейтрофилов, которые окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки, представленные тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, и бактерии-активаторы ярко-оранжевого цвета [].
De Buhr, N. How Neutrophil Extracellular Traps Become Visible. / N. De Buhr, M. von Köckritz-Blickwede // Journal of Immunology Research. - 2016. - P. 1–13. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4884809/ (access date: 25.05.2021)
Козлов, В.А. Свободная внеклеточная ДНК в норме и при патологии. / В.А. Козлов // Медицинская иммунология. - 2013. - Т. 15, №5 - С. 399-412
Недостаток данного метода - окрашивание ДНК с помощью ДНК-специфичных красителей может быть заблокировано катионными пептидами []. Кроме того, во всех биологических жидкостях присутствует свободная внеклеточная ДНК [], которая в свою очередь также может окрашиваться интеркалирующими красителями, вызывая аналитическую интерференцию. В подобной ситуации результат оценки наличия ВЛН может быть ложноположительным.
NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers / S. Masudaa, D. Nakazawab, H. Shidab, A. Miyoshib, Y. Kusunokib, U. Tomaruc, A. Ishizu // Clinica Chimica Acta. - 2016. - Vol. 459. - P. 89-93
NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers / S. Masudaa, D. Nakazawab, H. Shidab, A. Miyoshib, Y. Kusunokib, U. Tomaruc, A. Ishizu // Clinica Chimica Acta. - 2016. - Vol. 459. - P. 89-93
Gavillet, M. Flow cytometric assay for direct quantification of neutrophil extracellular traps inblood samples / K. Martinod, R. Renella, C. Harris, N.I. Shapiro, D.D. Wagner, D.A. Williams // Am. J. Hematol. - 2015. - Vol. 90(12). - P. 1155–1158
Следующая группа методов обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек предусматривает совместную регистрацию результатов окраски интеркалирующими красителями и  иммунофлюоресценции. Визуализация результатов также проводится при помощи люминесцентной микроскопии []. Для иммунофлуоресценции используются антитела к белкам гранул нейтрофилов, таким как миелопероксидаза, нейтрофильная эластаза, протеиназа-3. По данным некоторых авторов, при одновременном окрашивании и совместной локализации белков нейтрофилов и внеклеточной ДНК предполагается, что наблюдаемая структура является НВЛ, поскольку данные белки оказываются во внеклеточном пространстве в процессе нетоза и остаются связанными с НВЛ []. Однако, гранулы нейтрофильных ферментов по размеру существенно меньше ДНК-компонента ВЛН, что обеспечивает относительно слабую флуоресценцию этих структур на фоне интеркалирующего красителя и делает подобную комбинацию методов более применимой для проточной цитофлуориметрии, чем для микроскопии [].
Основным недостатком указанных способов визуализации является потеря клетками жизнеспособности в процессе фиксации препарата и невозможность определить какие из клеток оставались жизнеспособными, а какие клетки подверглись некрозу или апоптозу, поскольку после фиксации препарата все клетки оказываются проницаемыми для интеркалирующего красителя. Другим недостатком данных методов является невозможность идентифицировать клетку-источник внеклеточной ДНК.
Технический результат, обеспечиваемый предложенной нами  совокупностью действий, заключается не только в идентификации жизнеспособных (интактных) нейтрофилов, но и определении морфологических эквивалентов клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции, раннего нетоза и возможном выявлении экспрессированных на их поверхности специфических антигенов дифференцировки лейкоцитов с одновременной визуализацией НВЛ. Окраска препарата двухцветная - структуры ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) и прокрашенные йодидом пропидия нити ДНК красно-оранжевого цвета.
Клинические примеры
Пример 1
о
о
Окрашивали гранулоциты здорового мужчины К. 29 лет, выделенные на двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Взвесь нейтрофилов стимулировали пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. в течение 30 мин при 37С. Контролем являлись клетки, к которым до инкубации вместо пробиотика добавляли физиологический раствор натрия хлорида. После нанесения 10 мкл взвеси инкубированных клеток на предметное стекло в каплю добавляли 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченых FITC в разведении 1:10. Помещали каплю под покровное стекло с последующей инкубацией полученного препарата в термостате при 37С в течение 5 мин.
При люминесцентной микроскопии подсчитывали содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате. После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывали процентное содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате - морфологический профиль нетоза.
Подсчитывали количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Морфологический профиль нетоза
(препарат без стимуляции пробиотиком - контроль с 0,9% NaCl)
1. Интактные клетки - 79%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 5%
2.2 Активированные - 3%
2.3. Гиперактивированные - 3%
3. Ранний нетоз - 4%
4. Нетоз:
4.1. Облаковидный нетоз - 3%
4.2. Нитевидный нетоз - 3%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0
Морфологический профиль нетоза
(препарат после стимуляции пробиотиком - стимуляция)
1. Интактные клетки - 55%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 7%
2.2 Активированные - 7%
2.3. Гиперактивированные - 9%
3. Ранний нетоз - 9%
4. Нетоз:
4.1. Облаковидный нетоз - 4%
4.2. Нитевидный нетоз - 9%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0,52
Пример 2
Окрашивали гранулоциты здорового мужчины Д. 35 лет, выделенные на двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Взвесь нейтрофилов стимулировали пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. в течение 30 мин при 37°С. Контролем являлись клетки, к которым до инкубации вместо пробиотика добавляли физиологический раствор натрия хлорида. После нанесения 10 мкл взвеси инкубированных клеток на предметное стекло в каплю добавляли 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченых FITC в разведении 1:10. Помещали каплю под покровное стекло с последующей инкубацией полученного препарата в термостате при 37°С в течение 5 мин.
При люминесцентной микроскопии подсчитывали содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате. После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывали процентное содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате - морфологический профиль нетоза.
Подсчитывали количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Морфологический профиль нетоза
(препарат без стимуляции пробиотиком - контроль с 0,9% NaCl)
1. Интактные клетки - 75%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 8%
2.2 Активированные - 4%
2.3. Гиперактивированные - 3%
3. Ранний нетоз - 4%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 3%
4.1. Нитевидный нетоз - 3%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0
Морфологический профиль нетоза
(препарат после стимуляции пробиотиком - стимуляция)
1. Интактные клетки - 50%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 5%
2.2 Активированные - 6%
2.3. Гиперактивированные - 10%
3. Ранний нетоз - 12%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 7%
4.1. Нитевидный нетоз - 10%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0,45
Пример 3
Окрашивали гранулоциты здорового мужчины Р. 39 лет, выделенные на двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Взвесь нейтрофилов стимулировали пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. в течение 30 мин при 37°С. Контролем являлись клетки, к которым до инкубации вместо пробиотика добавляли физиологический раствор натрия хлорида. После нанесения 10 мкл взвеси инкубированных клеток на предметное стекло в каплю добавляли 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченых FITC в разведении 1:10. Помещали каплю под покровное стекло с последующей инкубацией полученного препарата в термостате при 37°С в течение 5 мин.
При люминесцентной микроскопии подсчитывали содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате. После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывали процентное содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате - морфологический профиль нетоза.
Подсчитывали количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Морфологический профиль нетоза
(препарат без стимуляции пробиотиком - контроль с 0,9% NaCl)
1. Интактные клетки - 79%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 5%
2.2. Активированные - 3%
2.3. Гиперактивированные - 3%
3. Ранний нетоз - 4%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 3%
4.1. Нитевидный нетоз - 3%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0
Морфологический профиль нетоза
(препарат после стимуляции пробиотиком - стимуляция)
1. Интактные клетки - 62%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 4%
2.2 Активированные - 5%
2.3. Гиперактивированные - 7%
3. Ранний нетоз - 10%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 5%
4.1. Нитевидный нетоз - 7%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0,65
Таким образом
, применение предлагаемого способа позволяет идентифицировать интактные нейтрофилы и морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции, а также визуализировать нейтрофильные ловушки разного типа (нитевидные и облаковидные) с возможным составлением формулы нетоза и одномоментным подсчетом бактерий, захваченных сформировавшимися НВЛ.