Способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований эмалевых призм поверхностного слоя в атомно-силовом (АСМ) и инвертированном микроскопах
METHOD FOR PREPARING DENTAL PREPARATIONS FOR MORPHOLOGICAL EXAMINATION OF SURFACE LAYER ENAMEL PRISMS IN ATOMIC-FORCE (AFM) AND INVERTED MICROSCOPES

Изобретение относится к медицине, в частности стоматологии, морфологии, гистологии, и может применяться для морфологических исследований строения эмали зуба, может быть использовано для точных морфологических исследований эмали зуба непосредственно ее поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя, где ее микроструктура имеет разное строение отличаясь стабильностью и различной зрелостью структуры органического и минерального матриксов в атомно-силовых микроскопах для эффективного зондирования поверхности в нанодиапазоне, необходимого для контролируемого исследования морфометрии эмалевых призм, позволяющее исследовать рисунок призм и межпризменных промежутков по всей полированной поверхности эмали, но в пределах одного эмалево-дентинного слоя или поверхностного слоя, также и в инвертированных микроскопах при увеличении до 1000х.
Известен способ препарирования, представляющий собой комбинацию методов фиксации тканей и заключения их в плотный компаунд эпоксидной смолы с известными техническими приемами изготовления шлифов зубов (Костиленко Ю.П., Бойко И.В. Журнал «Стоматология», №5, 2005).
Зубы после экстракции промывают в физиологическом растворе,` дегидратируют и пропитывают эпоксидной смолой, помещая в нее. После полимеризации полученный блок разрезают сепаровочным диском, и шлифуют торцевые поверхности до получения ровного шлифа. Затем частично протравливают эмаль в хелатообразуюшем агенте (трилон Б) и наносят на препарат слой электропроводящего вещества. На данном этапе препарат пригоден для изучения в сканирующем электронном микроскопе. Для исследования в трансмиссионном электронном микроскопе с препарата с помощью нитроклетчатки снимают отпечатки, с которых готовят угольные реплики путем напыления в вакууме спектрально чистого графита. Реплики наносят на предметные сетки и исследуют (Костиленко Ю.П., Бойко И.В. Метод изготовления препаратов прижизненно сохранных зубов для многоцелевых исследований. Клиническая анатомия и оперативная хирургия 2004; 3:5:63-65).
Недостатком данного способа является то, что его использование предполагает привлечение квалифицированных специалистов для изготовления препаратов. Кроме того, он не пригоден для использования в атомно-силовой микроскопии, потому что не позволяет получить исследуемую поверхность требуемой чистоты.
Известен способ приготовления препаратов зубов для исследования с применением сканирующего акустического микроскопа. Зубы распиливают при помощи алмазной пилы диаметром 50 мм, толщиной 0,5 мм при скорости 1500 об/мин. Поверхность спила обрабатывают на чугунных планшайбах с применением свободного абразива - корундового порошка со средней величиной зерна 40 мкм (М40). После предварительного выравнивания поверхности образцы дошлифовывают вручную на стеклянных пластинах с использованием абразивных порошков меньшего размера зерна - вплоть до 5 мкм (М5). (Л.А.Денисова. Акустическая гистология тканей зуба. http://www.mediasphera.ru/journals/stomo/detail/261/3954.
Недостаток данного способа в прямом предназначении изготовленного препарата для исследования лишь в сканирующем акустическом микроскопе, так как процедура ручной шлифовки в каждом препарате увеличивает вероятность появления искажений поверхности при исследовании в инвертированном микроскопе и делает невозможным исследование в атомно-силовом микроскопе.
Известна методика морфологического и морфометрического анализа поверхности эмали зуба человека с помощью атомно-силовой микроскопии. При проведении данной методики зубы распиливают при помощи алмазного сепарационного инструмента части зуба, оставляя образец толщиной 1.5-2.0 мм. С сохранением щечной (вестибулярной) поверхности После этого образец промывали дистиллированной водой и сушили при температуре 90 С в течении 5 минут, закрепляли на стеклянной пластине. (В.Д. Гончаров, И.Н. Антонова, А.В. Кипчук, А.И. Скоробогатова. Методика морфологического и морфометрического анализа поверхности эмали зуба человека с помощью атомно-силовой микроскопии, Санкт-Петербург, 2016г.)
Недостаток данного способа в прямом предназначении изготовленного препарата для исследования лишь в атомно-силовом микроскопе, так как такая методика  шлифовки в каждом препарате увеличивает вероятность появления искажений поверхности при исследовании в инвертированном микроскопе и делает невозможным высокоточное исследование в атомно-силовом микроскопе, за счет грубого распила поверхности эмали зуба, при этом необходимая исследуемая часть эмали будет с измененной ультраструктурой, не позволяющая точно интерпретировать полученные результаты. Другим существенным недостатком данного способа является высокая субъективность толщины исследуемого участка эмали зуба.
3
4
Известен способ приготовления препаратов зубов для исследования с применением атомно-силового и инвертированного микроскопов. Препарат шлифуют на шлифовально-полировальном станке шлифовальными кругами «hermes». После шлифования препарат промывают струей дистиллированной воды в течение 2 минут, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «Нейрис» с использованием полиэтиленового полировального круга с алмазной суспензией и охлаждают дистиллированной водой под струей дистиллированной воды в течение 2 минут, высушивают препарат с использованием горелки ГП при температуре 35°С в течение 3 минут. Травят поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой НРО в течение 2 секунд и промывают под струей дистиллированной воды в течение 2 секунд. Высушивают препарат с использование горелки ГП при температуре 39°С в течение 5 минут и укладывают препарат на предметный стол АСМ или предметный столик инвертированного микроскопа для исследования. (Патент RU 2458975 C1 от 04.05.2011г.)
Недостатками данного способа в том, что при изготовлении препаратов эмали зубов не учитываются анатомические особенности и толщина различных участков поверхности эмали необходимых для выборок в большом количестве, контроль за количеством сошлифованных тканей эмали носит субъективный характер, и как следствие получаемый участок шлифа поверхности эмали разнороден на всем своём протяжении. Таким образом, препарат эмали зуба приготовленный данным способом для исследования в атомно-силовом и инвертированном микроскопах имеет большой процент искажений исследуемой поверхности.
Данный метод взят нами за прототип.
Заявляемый способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований эмалевых призм поверхностного слоя и эмалево-дентинного слоя в атомно-силовом и инвертированном микроскопах прост и удобен в применении, позволяет изготавливать максимально качественные и точные препараты в пределах одного поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя эмали для морфологических исследований в атомно-силовом и инвертированном микроскопах.
Техническим результатом заявленного изобретения является усовершенствование изготовление препаратов зубов для морфологических и морфометрических исследований микроструктуры и ультраструктуры эмали в пределах поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя в атомно - силовом и инвертированном микроскопах, под точным и объективным контролем сошлифовывания необходимой толщины эмали, позволяющего исследовать рисунок призм и межпризменных промежутков по всей полированной поверхности эмали, но в пределах поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя, также и в инвертированных микроскопах при увеличении до 1000х.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе изготовления препаратов зубов для морфологических исследований эмалевых призм в атомно-силовом (АСМ) и инвертированном микроскопах, включающем дозированное шлифование и полирование эмали,` поверхность шлифа эмали полируют до 14Б класса чистоты и протравливают 37% ортофосфорной кислотой в течение 1 секунды для эмалево-дентинного слоя или 3 секунд для поверхностного слоя, в зависимости от необходимого исследования слоя эмали, в заданном временном интервале под точным и объективным контролем сошлифовывания необходимой толщины эмали.
Способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований эмалевых призм поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя осуществляют следующим образом.
Препарат (зуб) после экстракции  помещают в 40% раствор формальдегида. Готовят патрон из полипропиленовой трубки высотой 10 мм,  диаметром 80 мм. Зуб помещают в патрон вертикально, для исследования поверхностного слоя эмали на вершине бугра коренного зуба, или горизонтально, для исследования эмалево-дентинного слоя эмали в пределах пришеечной области коронковой части зуба щечной стороны, заливают эпоксидной смолой с отвердителем на 24 часа.
3
4
Препарат шлифуют на шлифовально-полировальном станке «Нейрис» шлифовальными кругами «hermes» зернистостью 100 микрон с охлаждением дистиллированной водой, при этом необходимо сошлифовать 0,5 мм поверхностного слоя эмали, для профилактики температурного воздействия на неорганическую основу поверхностного слоя эмали. Затем шлифуют шлифовальным кругом «hermes» зернистостью 65 микрон с охлаждением дистиллированной водой, при этом сошлифовывают 0,5 мм эмали. Контроль сошлифованного слоя осуществляют с помощью штангенциркуля (ГОСТ 166-89).  Все это позволяет исследовать поверхностный слой эмали. Для исследования более глубокого, эмалево-дентинного слоя, необходимо дополнительно шлифовать шлифовальным кругом «hermes» зернистостью 65 микрон с охлаждением дистиллированной водой еще 0,5 мм эмали. Контроль сошлифованного слоя осуществляют с помощью штангенциркуля (ГОСТ 166-89). После чего шлифуют шлифовальным кругом «hermes» зернистостью 25 микрон с охлаждением дистиллированной водой, при этом сошлифовывают еще 0,5 мм эмали. Контроль сошлифованного слоя осуществляют с помощью штангенциркуля (ГОСТ 166-89).  Все это позволяет максимально точно исследовать именно эмалево-дентинный слой эмали. После шлифования и контроля толщины эмали препарат промывают струей дистиллированной воды в течение 3 минут, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «Нейрис» с использованием полиэтиленового полировального круга с алмазной суспензией Akasel 15 микрон в течение 2 минут, охлаждают дистиллированной водой, затем полируют на щлифовально—полировальном станке «Нейрис» с использованием полировального крута из сукна с алмазной суспензией Akasel 3 микрон в течение 1 минут, охлаждают дистиллированной водой, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «Нейрис» с использованием полировальното круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 микрон в течение 30 секунд, охлаждают дистиллированной водой под струей дистиллированной воды в течение 2 минут, высушивают препарат с использованием горелки пропановой (ГП) при температуре 36°С в течение 3 минут. Протравливают поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой НРО в течение 1 секунды при исследовании эмалево-дентинного слоя и в течении 3 секунд при исследовании поверхностного слоя эмали. Разное время травления связано с меньшим количеством органической субстанции в межпризменных промежутках в области эмалево-дентинного слоя, в виду большей зрелости эмали в этом участке. Далее промывают под струей дистиллированной воды в течение 2 секунд.
Высушивают препарат с использование горелки ГП при температуре 36°С в течение 2,5 минут и укладывают препарат на предметный стол АСМ или предметный столик инвертированного микроскопа для исследования.
Применение описанного способа полирования эмали зуба позволяет довести поверхность эмали до 14Б класса чистоты в пределах поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя, необходимого для исследования в АСМ. Поверхностное протравливание эмали в заданном интервале в пределах различных слоев, приводит к удалению органического межпризменного вещества, при этом неорганическая основа остается без морфологических изменений. Возникающий при этом рельеф пригоден для эффективного зондирования поверхности в необходимом для морфометрии эмалевых призм нанодиапазоне. Полученные данным способом препараты позволяют исследовать рисунок призм и межпризменных промежутков по всей полированной поверхности эмали только в пределах поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя, также и в инвертированных микроскопах (Olympus GХ 41) при увеличении до 1000х без какой бы то ни было дополнительной подготовки. Данный способ позволяет изготавливать, при стандартном качестве, более 10 препаратов за один лабораторный день одним препаратором, что делает возможным контролируемое исследование ультраструктуры поверхностного слоя или эмалево-дентинного слоя эмали на значительных выборках.