СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА МИКРОБНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНЫ
METHOD OF PRODUCTION OF CONCENTRATE OF MICROBIAL CELLS FOR OBTAINING LIVE TULAREMIA VACCINE

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и может быть использовано в практике производства туляремийной живой вакцины.
В настоящее время иммунизация является самым надежным способом профилактики туляремии. В 2011 году в Российской Федерации против туляремии вакцинировано 317953 человека и ревакцинировано 1294433 человека (О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2011 году: Государственный доклад. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012. - 316 с.).
Туляремийная живая сухая вакцина в 2011 году Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ (№51н от 31 января 2011 г.) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации для населения, проживающего на энзоотичных по туляремии территориях, а также прибывших на эти территории лиц, выполняющих ряд работ.
Основным компонентом вакцины туляремийной живой сухой являются клетки туляремийного микроба вакцинного штамма 15 НИИЭГ.
Известен способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии (Патент на изобретение №2221591, МПК A61K 39/40, 20.01.2004 г.), в соответствии с которым вирулентные и вакцинные штаммы Francisella tularensis выращивают в жидкой питательной среде, с последующей инактивацией биомассы фенолом в концентрации 0,5-2% и отделением низкомолекулярных примесей. Клетки отделяли путем центрифугирования при 10000 g в течение 30 минут, затем ресуспендировали в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе и подвергали обработке на ультразвуковом дезинтеграторе при 0°C. Дезинтеграт клеток центрифугировали при 12000 g в течение 30 минут, полученный супернатант - при 100000 g. После удаления супернатанта осадок препарата для активной иммунизации ресуспендировали в деионизованной воде и трижды переосаждали путем центрифугирования при 100000 g с последующим ресуспендированием в деионизованной воде. Очищенный препарат лиофилизовали. Способ предназначен для получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Препарат, полученный по данному способу, обеспечивает защиту высокочувствительных животных при заражении высоковирулентными штаммами F. tularensis как при парентеральном, так и при пероральном способе иммунизации. Однако в связи с тем, что для получения целевого продукта клетки подвергают лизису фенолом и разрушают ультразвуковым воздействием, то описанный способ не пригоден для получения живой туляремийной вакцины.
Известен способ получения биомассы туляремийного микроба (Патент на изобретение №2451743, МПК C12N 1/20, 27.05.2012 г.), согласно которому предварительно подготовленный посевной материал туляремийного микроба культивируют при pH 6,8-7,0, температуре 37°C в течение 18±2 ч на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: панкреатический гидролизат рыбокостной муки 20,5, стимулятор роста гемофильных организмов 5, экстракт пекарских дрожжей 2,3, сульфат магния 1,0, сульфит натрия 0,7, дигидрофосфат калия 1, цистеин 0,5. При культивировании туляремийного микроба в среду добавляют глюкозовитаминную добавку в количестве 2 мл на 100 мл среды (1,23 г/л). Затем культуральную жидкость освобождают от клеточной массы центрифугированием при 9000 об/мин в течение 20 мин или на сепараторе АСГ-3М при том же режиме. С полученного концентрата клеток получают антигены гидродинамическим смывом с последующим поэтапным осаждением с постепенным понижением pH (от 7,0 до 4,3) для освобождения от балластных веществ. На последнем этапе переосаждение повторяют 2-3 раза для окончательной очистки препарата. Технология позволяет получать большие объемы (для производственных целей) биомассы туляремийного микроба. Однако этапы отделения клеточной массы (получения клеточного концентрата) направлены на разрушение клеток. Концентрат, полученный по данному способу, пригоден для получения антигенных компонентов при создании диагностических препаратов против возбудителя туляремии и не может использоваться в качестве промежуточного компонента для дальнейшего приготовления живой туляремийной вакцины.
Кроме того, технология получения концентрата микробных клеток, получаемого по данному способу, не предусматривает асептического ведения процесса, что может привести к контаминации посторонней микрофлорой и, следовательно, выбраковке данного полупродукта для получения туляремийной живой вакцины, так как одним из требований является отсутствие посторонней микрофоры в культуре туляремийного микроба на всех технологических этапах приготовления живой вакцины.
Техническим результатом является получение концентрата микробных клеток туляремийного микроба, пригодного для получения живой туляремийной вакцины.
Технический результат достигается тем, что туляремийный микроб выращивают методом глубинного культивирования при температуре 37°C в течение 20±2 часов на жидкой питательной среде pH 7,2, содержащей, г/л: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости.
Для достижения технического результата разработана жидкая питательная среда, подобран режим выращивания туляремийного микроба и подобраны характеристики пористых мембран, обеспечивающих процесс концентрирования туляремийного микроба.
Возможность использования микрофильтрационного концентрирования микробных клеток туляремии установлена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информации.
Фильтрация в проточном (тангенциальном) потоке является разделительным методом, в котором поток жидкости направляется вдоль мембраны, омывая ее поверхность. Такой смывающий эффект позволяет постоянно удалять отложения, предотвращая их скапливание и образование слоя на поверхности фильтра, которое известно под названием концентрационной поляризации, уменьшающей скорость фильтрации. Материал, меньше номинального размера пор микрофильтрационной мембраны, проходит через нее в линию фильтрата. Материал, превышающей размера пор микрофильтрационной мембраны, «отбрасывается» мембранной и концентрируется в отдельную емкость. Потери продукта за счет незначительного «мертвого» объема мембраны минимальны и сводятся к нулю путем промывки мембранного модуля жидкостью в количестве, соответствующем «мертвому» объему мембраны.
Неоспоримым преимуществами тангенциальной фильтрации являются:
концентрирование и очистка происходят без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений;
перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям;
механическое и гидродинамическое воздействие на биологический материал незначительно;
легко обеспечивается герметичность и асептические условия;
аппаратурное оформление просто по конструкции, компактно, отсутствуют движущиеся детали;
процесс не обладает высокой энергоемкостью.
Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.
Пример. Получение концентрата микробных клеток.
Для выращивания туляремийного микроба подготовили питательную среду с основой из ферментативного гидролизата фибрина. Для этих целей бульон варят в реакторе: под вакуумом закачивают воду очищенную (дистиллированную воду) согласно расчета, прибавляя 10% на ее выкипание, добавляют 50-55 г/л сухого ферментативного гидролизата фибрина в количестве, обеспечивающем содержание в среде не менее 0,32% аминного азота. Затем вносят глюкозу до концентрации 1%. Все перемешивают и устанавливают в среде pH (7,2±0,2) при помощи 20% раствора натрия гидроокиси и кипятят в течение 30 мин. Бульон фильтруют через фильтр Сальникова при температуре (75±5)°C под давлением (2,5±0,5) МПа. Жидкую среду из ферментативного гидролизата фибрина стерилизуют в паровом стерилизаторе водяным насыщенным паром при (110+2)°C в течение 30 мин, давлении (0,05+0,02) МПа. Перед внесением инокулята посевной культуры в стерильную среду добавляют стерильный раствор пантотената кальция в концентрации 0,005% (0,05 г/л). Приготовление жидкого ферментативного гидролизата фибрина приведено в патенте RU 2425866. Для получения в сухой форме ферментативный гидролизат фибрина концентрировали в 6-7 раз методом выпаривания на установке вакуум-выпарной УВВ-50 и высушивали конвекционным способом на сушильной установке распылительного типа КЯУЛ 101325.002 в «псевдокипящем слое».
-1
-1
-1
Культуру F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ выращивают методом глубинного культивирования на подготовленной жидкой питательной среде при температуре 37°C в течение 20±2 ч часов. После окончания процесса культивирования нативная культура F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ имеет следующие характеристики: pH 7,0±0,1, концентрация микробных клеток 35±0,5 млрд. кл. мл (по отраслевому стандартному образцу мутности - ОСО мутности 42-28-85-П (10 ME) ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, эквивалентной концентрации 5 млрд. кл. мл), коэффициент жизнеспособности - 62±0,5%, посторонняя микрофлора отсутствует. Далее полученную микробную суспензию F. tularensis подвергают тангенциальной микрофильтрации на ультра-микрофильтрационной установке «Вива-флоу» через мембраны с размером пор 0,2 мкм до сокращения объема микробного осадка в четыре раза. При необходимости добавляют в концентрат стерильный физиологический раствор до восстановления исходного объема нативной культуры и процесс концентрирования повторяют. Полученный концентрат микробных клеток имел следующие характеристики: pH 7,2±0,1, концентрация микробных клеток 135±1,0 млрд. кл. мл (по отраслевому стандарту мутности ФГБУ НЦЭСМП), коэффициент жизнеспособности - 60±0,1%, посторонняя микрофлора отсутствует. Контроль специфической стерильности фильтрата свидетельствовал об отсутствии в нем туляремийного микроба, что говорит о правильном подборе размера пор мембран.
В полученном концентрате не происходит ухудшения характеристик (в сравнении с нативной культурой F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ после ее глубинного культивирования). В частности, pH и коэффициент жизнеспособности остаются на прежнем уровне и не происходит контаминации посторонней микрофлорой. Основываясь на этом, можно утверждать, что полученный концентрат пригоден для получения живой туляремийной вакцины.