БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
BIOLOGICAL MATERIALS AND THEIR USE

Изобретение относится к полипептидам, образованным из шаперонина 60.1, и к их применению для лечения заболеваний и в качестве средств для смягчения боли.
Полипептиды теплового шока представляют собой семейство молекул, распространенных во всех организмах, функцией которых является поддержка биологического процессинга и стабильности биологических молекул (Zugel & Kauffman (1999) Role of heat shock polypeptides in protection from and pathogenesis of infection diseases. Clin. Microbiol. Rev. (12)1: 19-39; Ranford et al. (2000) Chaperonins are cell signalling polypeptides: - the unfolding biology of molecular chaperones. Exp. Rev. Mol. Med., 15 September, www.ermn.cbcu.cam.ac.uk/00002015h.htm).
Полипептиды теплового шока расположены в каждом клеточном компартменте и обладают способностью взаимодействовать с широким диапазоном биологических молекул. В частности, полипептиды теплового шока способствуют сворачиванию полипептида и транслокации полипептида, и влияют на них, в любой момент времени после сборки путем разборки полипептида и любых его комплексов. Помогающая природа полипептидов теплового шока привела к тому, что они также известны как молекулярные шапероны (Laskey et al. (1978) Nucleosomas are assembled by an acidic polypeptide, which binds histones and transfers them to DNA. Nature (275): 416-420).
Полипептиды теплового шока синтезируются клетками в ответ на воздействия внешней среды, которые включают, но не ограничиваются ими, изменения температуры (как повышение, так и снижение) и патофизиологические сигналы, такие как цитокины. В ответ на воздействия внешней среды полипептиды теплового шока используют их способность осуществлять процессинг других полипептидов для защиты таких полипептидов от какой-либо денатурации, которая может произойти вследствие воздействия. Этот механизм служит для защиты клеток, которые содержат этот белок.
Полипептиды шаперонинов представляют собой подгруппу полипептидов теплового шока, роль которых в сворачивании полипептидов хорошо известна. Существует два семейства полипептидов шаперонинов, семейства шаперонина 60 (приблизительно 60 кДа) и шаперонина 10 (приблизитенльно 10 кДа) (Ranford, 2000). Наиболее охарактеризованные шаперонины представляют собой шаперонины, происходящие из E. coli, из которых была установлена характерная структура шаперонина 60 и шаперонина 10. Комплексы шаперонинов большинства других организмов также по существу соответствуют этой характерной структуре.
Характерная структура шаперонинов представляет собой комплекс, образованный из двух гептамерных колец (состоящих из семи мономеров шаперонина 60), которые обращены друг к другу и накрыты гептамерным кольцом, состоящим из мономеров шаперонина 10.
Обычно шаперонины способствуют сворачиванию полипептидов, когда полипептид-мишень проникает в сердцевину кольцевых гептамеров, и при последующем высвобождении энергии из ATP полипептид-мишень высвобождается из сердцевины путем конформационных изменений структуры шаперонинов (Ranson et al. (1998) Review Article: Chaperones. Biochem. J (333): 233-242).
Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) продуцируют шаперонин 60.1 (cpn 60.1), полипептид, который так назван, исходя из идентичности его аминокислотной последовательности с другими известными шаперонинами. Другими полипептидами шаперонинов M. tuberculosis являются шаперонин 10 (cpn 10) и шаперонин 60.2 (cpn 60.2). Шаперонин 60.2 проявляет 59,6% идентичность аминокислотной последовательности и 65,6% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты с cpn 60.1.
Настоящее изобретение относится к применению фрагментов шаперонина 60.1 или функционально эквивалентных молекул из Mycobacterium tuberculosis или сходных прокариот для профилактики и/или лечения злокачественных и незлокачественных состояний. Примеры незлокачественных состояний включают аутоиммунные нарушения, остеопороз, аллергические нарушения или состояния иммуноактивации, в частности астму и/или состояния, типичным представителем которых является иммунный ответ по типу T-хелперных лимфоцитов 2 (Th2), и/или состояния, ассоциированные с эозинофилией и способами стимуляции продукции медиаторов иммунного ответа, например цитокинов, in vitro или in vivo.
Аутоиммунитет отражает утрату толерантности к "своему", что приводит к неадекватному разрушению нормальных клеток или ткани. При многих состояниях выявляются аутоантитела, однако они могут отражать эффект, а не причину заболевания. Однако при некоторых заболеваниях аутоантитела являются первым, основным или единственным поддающимся детекции нарушением. Одним из классов вовлеченных в этом отношении молекул являются шаперонины, которые являются высоко иммуногенными. Шаперонины относятся к группе белков, называемых молекулярными шаперонами, которые связывают ненативные белки и помогают им, в зависимом от ATP каталитическом процессе, сворачиваться в правильную трехмерную форму, требуемую для функционального белка.
Полагают, что шаперонины стимулируют иммунную систему на многих уровнях одновременно, включая моноциты, макрофаги, фибробластоподобные клетки, возможно, другие типы клеток, и T-клетки. Иммунная защита у млекопитающих может быть подразделена на "врожденную" и "адаптивную" защиты. Ту, которая уже находится в области действия, например, фагоциты, естественные киллерные клетки и комплемент, считают врожденными. При стимуле, адаптивный иммунитет активируется в форме B- и T-лимфоцитов. Известно, что шаперонины действуют прямо на механизмы врожденной защиты, в частности, на фагоциты. Также они стимулируют мощный адаптивный иммунный ответ, а именно продукцию антитела и стимуляцию T-лимфоцитов, которые в некоторых случаях могут быть защитными. Примечательно, что они индуцируют секрецию цитокинов, которая, как полагают, является важной для защиты хозяина. Однако в некоторых случаях полагают, что присутствие шаперонинов может быть повреждающим для хозяина.
Роль шаперонинов в аутоиммунном заболевании является противоречивой. Хотя инфекция/иммунитет в случае содержащих шаперонин организмов являются повсеместными, и здоровые люди обладают T-клеточными ответами на собственные шаперонины, включая продукцию шаперонин-специфических антител, классическое аутоиммунное заболевание является крайне редким. Так, присутствие иммунных реакций на шаперонины может быть случайным и незначительным.
Однако теория молекулярной мимикрии предполагает вовлечение шаперонинов в аутоиммунное заболевание и основана на высоких уровнях консервативности аминокислотной последовательности в шаперонинах из микроорганизмов и млекопитающих. Теория предполагает, что в процессе инфекции широким диапазоном микроорганизмов, эпитопы шаперонинов, которые являются общими между микроорганизмами и млекопитающими, стимулируют T-лимфоциты. Согласно этой теории высокий уровень представления шаперонинами эпитопов шаперонинов нарушает толерантность к собственным шаперонинам, и развивается аутоиммунное заболевание.
Было выявлено, что шаперонины, полученные из опухолей, приводят к некротическим эффектам на эти опухоли. Предполагается, что это может происходить путем усиления иммунологического распознавания опухолевых антигенов, хотя механизмы этого неизвестны. Таким образом, по-видимому, шаперонины индуцируют защитный адаптивный иммунитет против бактериальной инфекции и злокачественной опухоли.
Аллергические реакции, такие как астма, относятся соответственно к неадекватному или неправильно направленному иммунным ответам. Распространенность, например, астмы, возрастает и эффективные способы лечения всех случаев еще не найдены. В современном лечении часто используются иммунодепрессивные глюкокортикостероиды, бета-агонисты, кромгликат, модификаторы лейкотриена и т.д., которые обладают множеством побочных эффектов.
При таких аллергических реакциях выявляются высокие уровни IgE, и иммунные ответы T-хелперных лимфоцитов-2 (Th2) преобладают над ответами Th1, что приводит к воспалительному ответу. Полагают, что Th1-ответы, главным образом, являются защитными против микробной инфекции и запускаются цитокинами, в частности, интерлейкином-12 (IL-12), IL-2 и интерфероном-γ. Напротив, Th2-ответы, в соответствующем генетическом фоне, ассоциированы с вредным аллергическим повреждением тканей.
Однако было предположено, что при других состояниях, таких как аутоиммунные нарушения, например, адъювантный артрит, сверхреактивные ответы Th1 являются причиной нарушения. Таким образом, преобразование ответов Th1 в Th2 или Th2 в Th1 может быть пригодным для лечения описанных выше нарушений.
Хотя известно, что бактерии, такие как L. monocytogenes, M. bovis и M. tuberculosis, могут преобразовывать ответы Th2 в Th1, молекулы, которые отвечают за это преобразование, не были идентифицированы.
Однако существующие в данной области предположения касаются и белка теплового шока, hsp65, из M. leprae, который способен индуцировать Th1-ответы (Lowrie et al., 1999, Nature, 400, p269-271; Bonato et al., 1998, Infect. Immun., 66, p169-175). Гомолог hsp65, из M. tuberculosis, обладает способностью стимулировать в моноцитах человека синтез провоспалительных цитокинов и активировать моноциты и эндотелиальные клетки сосудов человека (Friedland et al., 1993, Clin. Exp. Immunol., 91, p5862; Peetermans et al., 1995, Infect. Immun., 63, p3454-3458; Verdegaal, et al., 1996, J. Immunol., 157, p369-376).
Также настоящее изобретение относится к применению фрагментов шаперонина 60.1 или функционально эквивалентных молекул из Mycobacterium tuberculosis или родственных прокариот для смягчения боли.
Смягчение боли обычно осуществляют пероральным или парентеральным лечением. Эффективного смягчения боли можно достигать в большинстве случаев с помощью широко известных лекарственных средств для смягчения боли, таких как парацетамол, аспирин и другие нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), такие как ибупрофен, и селективные ингибиторы циклооксигеназы-2 (CSI). Наркотические анальгетики действуют на определенные рецепторы в центральной нервной системе (CNS). Кодеин и дигидрокодеин являются наркотическими анальгетиками умеренного действия и имеют низкий потенциал к возникновению зависимости. Другие более сильные наркотические анальгетики, такие как морфин и метадон, можно использовать для борьбы с тяжелой болью.
Существует множество проблем с известными в настоящее время средствами для смягчения боли. Эти лекарственные средства имеют относительно кратковременное действие, и обезболивание продолжается в течение только нескольких часов. Обычно для борьбы с болью требуются многократные дозы лекарственного средства. Другой распространенной проблемой является субоптимальное смягчение боли, ведущее к повышению у пациента дозы или смене лекарственного средства. В случае NSAID распространены неприятные желудочно-кишечные побочные действия, такие как диспепсия и язвы, и приблизительно две трети потребителей меняют вид NSAID по меньшей мере один рез вследствие неблагоприятных побочных действий и слабой эффективности (Steinfeld S. and Bjorke P.A. Results from a patient survey to assess gastrointestinal burden of non-steroidal anti-inflammatory agent therapy contrasted with a review of data from EVA to determine satisfaction with rofecoxib. Rheumatology (Oxford) 2002, 41 (S1), 23-27.). Кроме того, NSAID и CSI могут приводить к сердечно-сосудистым осложнениям (Hillis W. S, (2000) Areas of emerging interest in analgesia: cardiovascular complications. Am. J. Then 9 (3) 259-69). Аспирин может вызывать синдром Рея у небольшой доли детей, и, таким образом, аспирин непригоден для применения у детей. Парацетамол необходимо использовать с осторожностью, поскольку передозировка им является гепатотоксической (Cranswick, N., Coghlan D. Paracetamol efficacy and safety in children: the first 40 years (2000) Am. J. Ther. 7(2) 135-41). Наркотические анальгетики имеют множество побочных действий, включая сонливость, запор, тошноту, головную боль и головокружение. Многократное введение сильнодействующих наркотических анальгетиков, таких как морфин, может вызывать зависимость.
Преимущество шаперонинов в качестве средств для смягчения боли над современными лекарственными средствами для смягчения боли состоит в том, что они могут иметь меньшие побочные действия. Согласно оценке, два миллиарда человек являются носителями M. tuberculosis без развития Tuberculosis. Носительство M. tuberculosis не ассоциировано с побочными эффектами, которые наблюдаются в случае широко известной медикаментозной терапии, такими как желудочно-кишечные побочные действия, сердечно-сосудистые осложнения, гепатотоксичность, синдром Рея или зависимость.
Следующим преимуществом над ранее известными средствами для смягчения боли является то, что болеутоляющее действие шаперонинов может длиться больше.
На этом фоне, авторы настоящего изобретения неожиданно идентифицировали пептиды и полипептидные фрагменты белка шаперонина 60.1 (также называемого Cpn60.1) Mycobacterium tuberculosis, которыми можно лечить как злокачественные, так и незлокачественные состояния, а также обеспечивать смягчение боли in vivo и in vitro.
Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к выделенной или рекомбинантной пептидной молекуле, содержащей полипептидную последовательность или состоящей из полипептидной последовательности, выбранной из группы:
(xi) полипептидной последовательности, которая обладает более чем 66%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95% идентичностью с полипептидной последовательностью, определенной в любом из (i)-(x) и имеет функцию, эквивалентную полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x); и
(xii) фрагмента полипептидной последовательность, определенной в любом из (i)-(xi), который имеет функцию, эквивалентную полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(xi).
В "полипептид" также включены пептиды, белки и соединения пептидомиметиков. Термин "пептидомиметик" относится к соединению, которое имитирует конформацию и желаемые признаки конкретного пептида как лекарственного средства, но в котором отсутствуют нежелательные признаки.
"Функция, эквивалентная полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x)," включает любой пептид, полипептид и/или их фрагмент, которые обладают функциональной активностью, идентичной или по существу сходной с любой функцией, проявляемой определенной полипептидной последовательностью или свойственной ей. Например, полипептидные последовательности, определенные в (i)-(x), могут проявлять противовоспалительные свойства (как проиллюстрировано в прилагаемых примерах), позволяя их применения для профилактики и/или лечения незлокачественного состояния, или для смягчения боли.
Функциональную эквивалентность можно измерять с использованием, например, способов, описанных в прилагаемых примерах (например, путем измерения латентного периода для подушечек лап на нагретой плите; или измерения высвобождения воспалительных цитокинов in vivo или in vitro).
Термины "полипептид" или "пептид" или "аминокислотная последовательность" относятся к олигопептиду, пептиду, полипептиду или белковой последовательности или их фрагменту и к встречающимся в природе или синтетическим молекулам. Полипептидный "фрагмент", "часть" или "сегмент" представляет собой участок аминокислотных остатков по меньшей мере приблизительно из 5 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 7 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 9 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 17 или более аминокислот. Пептид предпочтительно имеет не более чем приблизительно 200 аминокислот, более предпочтительно менее чем 150 аминокислот и наиболее предпочтительно менее чем 100 аминокислот. Предпочтительно пептид имеет от приблизительно 5 до приблизительно 200 аминокислот. Для того чтобы он был активным, любой полипептид должен обладать достаточной длиной для проявления биологической и/или иммунологической активности.
Термин "встречающийся в природе полипептид" относится к полипептидам, продуцированным клетками, которые созданы способами генетической инженерии, и конкретно охватывает различные полипептиды, появляющиеся после посттрансляционных модификаций полипептида, включающих, но не ограничивающихся ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидацию и ацилирование.
Термин "производное" относится к полипептидам, химически модифицированным такими способами, как убиквитинилирование, мечение (например, радионуклидами или различными ферментами), ковалентное присоединение полимеров, такое как пэгилирование (преобразование в производное с полиэтиленгликолем) и встраивание аминокислот или замена аминокислотами, такими как орнитин, которые не встречаются в норме в белках человека, химическим синтезом.
Термин "вариант" (или "аналог") относится к любому полипептиду, отличающемуся от встречающихся в природе полипептидов вставками, делециями и заменами аминокислот, внесенными с использованием, например, способов рекомбинантных ДНК. Те аминокислотные остатки, которые могут быть заменены, добавлены или удалены без устранения представляющей интерес активности, могут быть определены путем сравнения последовательности конкретного полипептида с последовательностями гомологичных пептидов и минимизации изменений аминокислотной последовательности, внесенных в области высокой гомологии (консервативные области) или путем замены аминокислот консенсусной последовательностью.
Альтернативно можно синтезировать или отбирать рекомбинантные варианты, кодирующие эти или сходные полипептиды, с использованием "избыточности" генетического кода. Для оптимизации клонирования в плазмиду или вирусный вектор или для экспрессии в конкретной прокариотической или эукариотической системе можно вносить различные замены кодонов, такие как молчащие изменения, которые образуют различные участки рестрикции. Мутации в полинуклеотидной последовательности могут отражаться на полипептиде или доменах других пептидов, добавленных к полипептиду для модификации свойств любой части полипептида в целях изменения характеристик, таких как аффинность связывания лиганда, межцепочечная аффинность или скорость деградации/обновления.
Предпочтительно аминокислотные "замены" являются результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные структурные и/или химические свойства, т.е. консервативных аминокислотных замен. "Консервативные" аминокислотные замены можно проводить на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы вовлеченных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Размер "инсерций" или "делеций" предпочтительно находится в диапазоне приблизительно от 1 до 20 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 10 аминокислот. Допустимое изменение может быть экспериментально определено систематическим внесением инсерций, делеций или замен аминокислот в полипептидной молекуле с использованием способов рекомбинантных ДНК и анализом активности полученных рекомбинантных вариантов.
Альтернативно, когда является желательным изменение функции, для получения измененных полипептидов можно вносить способами инженерии вставки, делеции или неконсервативные замены. Такие изменения могут, например, изменять одну или несколько биологических функций или биохимических характеристик полипептидов по изобретению. Например, такие изменения могут изменять характеристики полипептида, такие как аффинность связывания лиганда, межцепочечная аффинность или скорость деградации/обновления. Кроме того, такие изменения можно отбирать так, чтобы получить полипептиды, которые являются более пригодными для экспрессии, масштабирования и т.д. в клетках-хозяевах, выбранных для экспрессии. Например, остатки цистеина можно удалять или заменять другим аминокислотным остатком для устранения дисульфидных связей.
Фрагменты белков по настоящему изобретению, которые способны проявлять биологическую активность, также охватываются настоящим изобретением. Фрагменты белка могут иметь линейную форму или они могут быть замкнуты с использованием известных способов, например, как описано в H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) и в R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992), оба из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок. Такие фрагменты можно подвергать слиянию с молекулами носителей, такими как иммуноглобулины, для многих целей, включая повышение валентности участков связывания белка.
Кроме того, изобретение относится к выделенной или рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотидную последовательность или состоящей из полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы:
(a) полинуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(b) полинуклеотидной последовательности, которая обладает более чем 66%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95% идентичностью с полинуклеотидной последовательностью, определенной в (a); или полинуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью, определенной в (a) в условиях 2xSSC, 65°C, которая кодирует полипептидную последовательность, обладающую функцией, эквивалентной полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x); и
(c) фрагмента полинуклеотидной последовательности, определенной в (a) или (b), который кодирует полипептидную последовательность, обладающую функцией, эквивалентной полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x).
Термины "нуклеотидная последовательность" или "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" или "олигонуклеотид" используют взаимозаменяемо, и они относятся к гетерополимеру нуклеотидов или к последовательности этих нуклеотидов. Эти выражения также относятся к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь для пептидной нуклеиновой кислоты (PNA) или для любого ДНК-подобного или РНК-подобного материала. В последовательностях A представляет собой аденин, C представляет собой цитозин, T представляет собой тимин, G представляет собой гуанин, и N представляет собой A, C, G или T (U). Предусматривается, что когда полинуклеотид представляет собой РНК, T (тимин) в последовательности, представленной в настоящем документе, заменен U (урацилом). Как правило, сегменты нуклеиновых кислот по изобретению могут быть собраны из фрагментов генома и коротких олигонуклеотидных линкеров, или из серий олигонуклеотидов, или из отдельных нуклеотидов, для получения синтетической нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована в рекомбинантном транскрипционном элементе, содержащем регуляторные элементы, происходящие из микробного или вирусного оперона, или эукариотического гена.
Полинуклеотиды по изобретению включают встречающуюся в природе или полностью или частично синтетическую ДНК, например, кДНК и геномную ДНК, и РНК, например, мРНК. Полинуклеотиды могут включать всю кодирующую область кДНК или могут представлять собой часть кодирующей области кДНК.
Настоящее изобретение также относится к генам, соответствующим последовательностям кДНК, описанным в настоящем документе. Соответствующие гены можно выделять известными способами с использованием информации последовательности, описанной в настоящем документе. Такие способы включают получение зондов или праймеров на основе информации описанной последовательности для идентификации и/или амплификации генов в соответствующих геномных библиотеках и других источниках геномных материалов. Кроме того, 5'- и 3'-последовательность можно получить с использованием способов, известных в данной области. Например, полноразмерную кДНК или геномную ДНК, которая соответствует любому из полинуклеотидов по изобретению, можно получать скринингом соответствующих библиотек кДНК или геномной ДНК в пригодных условиях гибридизации с использованием любого из полинуклеотидов по изобретению или их частей в качестве зондов. Альтернативно полинуклеотиды по изобретению можно использовать в качестве основы для пригодного праймера(ов), который позволяет идентификацию и/или амплификацию генов в соответствующих библиотеках геномной ДНК или кДНК.
Последовательности нуклеиновых кислот по изобретению можно собирать из EST и последовательностей (включая последовательности кДНК и геномные последовательности), полученных из одной или нескольких общественных баз данных, таких как dbEST, gbpri и UniGene. Последовательности EST могут обеспечить идентификацию информации последовательности, информации репрезентативного фрагмента или сегмента, или информации нового сегмента для полноразмерного гена.
К полинуклеотидам по изобретению также относятся полинуклеотиды, включающие нуклеотидные последовательности, которые являются по существу эквивалентными полинуклеотидам, приведенным выше. Полинуклеотиды по изобретению могут иметь, например, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, более конкретно по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, более конкретно по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, и еще более конкретно по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность последовательности с указанным выше полинуклеотидом.
В объем последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению включены фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в строгих условиях с любой из нуклеотидных последовательностей по изобретению, или комплементарных им последовательностей, где фрагмент превышает приблизительно 5 нуклеотидов, предпочтительно 7 нуклеотидов, более предпочтительно 9 нуклеотидов и наиболее предпочтительно 17 нуклеотидов. Предусматриваются фрагменты, например 15, 17 или 20 нуклеотидов или более, которые являются селективными в отношении любого из полинуклеотидов по изобретению (т.е. специфично гибридизуются с ними). Зонды, способные специфично гибридизоваться с полинуклеотидом, могут отличать полинуклеотидные последовательности по изобретению от других полинуклеотидных последовательности в том же семействе генов, или они могут отличать гены человека от генов других видов, и предпочтительно они основаны на уникальных нуклеотидных последовательностях.
Последовательности, находящиеся в объеме настоящего изобретения, не ограничены этими конкретными последовательностями, но также они включают их аллельные и видовые варианты. Аллельные и видовые варианты можно определять общепринятыми способами путем сравнения последовательности по изобретению, ее репрезентативного фрагмента или нуклеотидной последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной, предпочтительно на 95% идентичной с последовательностью из другого изолята того же вида. Более того, для учета вариабельности кодонов изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие те же аминокислотные последовательности, что и конкретные ORF, описанные в настоящем документе. Иными словами, в кодирующей области ORF прямо предусматривается замена одного кодона другим кодоном, который кодирует ту же аминокислоту.
4
Термин "строгий" используют для обозначения условий, которые обычно понимают в данной области как строгие. Строгие условия могут включать высоко строгие условия (т.е. гибридизацию со связанной с фильтром ДНК в 0,5 M NaHPO, 7% додецилсульфате натрия (SDS), 1 мМ ЭДТА при 65°C, и промывание в 0,1x SSC/0,1% SDS при 68°C) и умеренно строгие условия (т.е. промывание в 0,2x SSC/0,1% SDS при 42°C). Другие иллюстративные условия гибридизации описаны в настоящем документе в разделе "Примеры".
В случаях гибридизации дезоксиолигонуклеотидов, дополнительные иллюстративные строгие условия гибридизации включают промывание в 6x SSC/0,05% пирофосфате натрия при 37°C (для олигонуклеотидов из 14 оснований), 48°С (для олигонуклеотидов из 17 оснований), 55°C (для олигонуклеотидов из 20 оснований) и 60°С (для олигонуклеотидов из 23 оснований).
SSC определяют как 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия, pH 7,2.
Под "идентичностью" понимают количество или процент (в зависимости от представления результатов) аминокислотных остатков или остатков нуклеиновой кислоты, в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам или остаткам нуклеиновой кислоты в представляющей интерес последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не рассматривая какие-либо консервативные замены в качестве части идентичности последовательностей.
Процентную идентичность последовательностей между двумя полинуклеотидами или полипептидами можно определять с использованием пригодных компьютерных программ, например программы GAP University of Wisconsin Genetic Computing Group, и понятно, что процентную идентичность вычисляют в отношении полипептидов, последовательность которых выровнена оптимально. Альтернативно выравнивание можно проводить с использованием программы Clustal W (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80). Используемые параметры могут быть следующими: параметры быстрого попарного выравнивания: размер K-tuple (слово); 1, размер окна; 5, штраф за делецию; 3, число верхних диагоналей; 5. способ оценки: x процент; параметры множественного выравнивания: штраф за внесение делеции; 10, штраф за продолжение делеции; 0,05, оценочная матрица: BLOSUM.
Как используют в настоящем документе, "по существу эквивалентный" или "по существу сходный" может относиться как к нуклеотидным, так и к аминокислотным последовательностям, например к мутантной последовательности, которая отличается от контрольной последовательности одной или несколькими заменами, делециями или вставками, совокупный эффект которых не приводит к неблагоприятному функциональному несходству между эталонной и рассматриваемой последовательностями. Как правило, такая по существу эквивалентная последовательность отличается от последовательностей, приведенных в настоящем документе, не более чем приблизительно на 35% (т.е. количество замен, вставок и/или делеций отдельных остатков в по существу эквивалентной последовательности, по сравнению с соответствующей эталонной последовательностью, деленное на общее количество остатков в по существу эквивалентной последовательности, составляет приблизительно 0,35 или менее). Указывают, что такая последовательность имеет 65% идентичность последовательности с приведенной последовательностью. В одном варианте осуществления по существу эквивалентная, например, мутантная, последовательность по изобретению отличается от приведенной последовательности не более чем на 30% (70% идентичность последовательности); в варианте этого варианта осуществления не более чем на 25% (75% идентичность последовательности); и в следующем варианте этого варианта осуществления не более чем на 20% (80% идентичность последовательности), и в следующем варианте этого варианта осуществления не более чем на 10% (90% идентичность последовательности), и в следующем варианте этого варианта осуществления не более чем на 5% (95% идентичность последовательности). По существу эквивалентные, например, мутантные, аминокислотные последовательности по изобретению предпочтительно имеют по меньшей мере 80% идентичность последовательности с приведенной аминокислотной последовательностью, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичность последовательности, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности. По существу эквивалентная нуклеотидная последовательность по изобретению может иметь более низкую процентную идентичность последовательности, учитывая, например, избыточность или вырожденность генетического кода. Предпочтительно нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере приблизительно 65% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичность последовательности, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности. Для целей настоящего изобретения, последовательности, имеющие по существу эквивалентную биологическую активность и по существу эквивалентные характеристики экспрессии, считают по существу эквивалентными. Для определения эквивалентности, укорочением зрелой последовательности (например, посредством мутации, которая создает случайный стоп-кодон) следует пренебрегать. Идентичность последовательности можно определить, например, с использованием способа Jotun Hein (Hein, J. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645). Идентичность между последовательностями также можно определять другими способами, известными в данной области, например, варьируя условия гибридизации.
Кроме того, изобретение относится к пептидной молекуле по изобретению для применения в медицине и/или к молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению для применения в медицине.
Предпочтительно изобретение относится к пептидной молекуле по изобретению и/или к молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении незлокачественного состояния или злокачественного состояния.
Кроме того, изобретение относится к применению пептидной молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения незлокачественного состояния или злокачественного состояния.
В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей пептидную молекулу по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент, или состоящий из них.
В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент, или состоящий из них.
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно доставлять с использованием инъецируемой системы для доставки с замедленным высвобождением. Они предназначены конкретно для снижения частоты инъекций. Примером такой системы является Nutropin Depot, которая инкапсулирует рекомбинантный гормон роста человека (rhGH) в биодеградируемые микросферы, которые после инъекции медленно высвобождают rhGH в течение длительного периода. Предпочтительно доставку проводят внутримышечно (i.m.) и/или подкожно (s.c.) и/или внутривенно (i.v.).
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить с помощью хирургически имплантируемого устройства, которое высвобождает лекарственное средство прямо в требуемую область. Например, Vitrasert высвобождает ганцикловир прямо в глаз для лечения CMV-ретинита. Прямое применение этого токсического средства в пораженной области обеспечивает эффективную терапию без существенных системных побочных действий лекарственного средства.
Также для введения веществ, лекарственных средств и фармацевтических композиций по изобретению можно использовать системы для терапии с электропорацией (EPT). Устройство, которое доставляет импульсное электрическое поле к клеткам, повышает проницаемость клеточных мембран для лекарственного средства, что приводит к значительному повышению внутриклеточной доставки лекарственного средства.
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению также можно доставлять путем электроинкорпорирования (EI). EI происходит, когда на небольшие частицы до 30 микрометров в диаметре на поверхности кожи воздействуют электрическими импульсами, идентичными или сходными с импульсами, используемыми при электропорации. При EI эти частицы направляются через роговой слой и в более глубокие слои кожи. Частицы могут быть нагружены или покрыты лекарственными средствами или генами или просто могут действовать в качестве "снарядов", которые образуют поры в коже, через которые могут проникать лекарственные средства.
Альтернативным способом доставки молекул, лекарственных средств и фармацевтических композиций по изобретению является инъецируемая система ReGel, которая является термочувствительной. При температуре ниже температуры тела ReGel представляет собой инъецируемую жидкость, а при температуре тела она сразу образует гелеобразную емкость, которая медленно разрушается и растворяется до известных, безопасных биодеградируемых полимеров. Активное вещество доставляется с течением времени по мере растворения биополимеров.
12
12
12
12
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению также можно доставлять перорально. В способе используется природный процесс перорального усвоения витамина B и/или витамина D в организме для совместной доставки белков и пептидов. Путем переноса с помощью системы усвоения витамина B и/или витамина D, нуклеиновые кислоты, молекулы и фармацевтические составы по изобретению могут продвигаться через кишечную стенку. Синтезируют комплексы аналогов витамина B и/или аналогов витамина D и лекарственного средства, которые сохраняют как выраженную аффинность к внутреннему фактору (IF) в части витамина B/части витамина D комплекса, так и выраженную биологическую активность активного вещества комплекса.
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению можно вводить в клетки с помощью "троянских пептидов". Они представляют собой класс полипептидов, называемых пенетратинами, которые обладают свойствами транслокации и способны переносить гидрофильные соединения через плазматическую мембрану. Эта система позволяет прямое нацеливание олигопептидов в цитоплазму и ядро, и может быть неспецифичной к типу клеток и высокоэффективной. См. Derossi et al. (1998), Trends Cell Biol 8, 84-87.
Предпочтительно лекарственное средство и/или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой единичную дозировку, содержащую суточную дозу или единицу, суточную субдозу или ее соответствующую часть, активного ингредиента.
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению обычно можно вводить пероральным или любым парентеральным способом, в форме фармацевтической композиции, содержащей активный ингредиент, необязательно в форме нетоксической органической или неорганической кислоты или основания или аддитивной соли, в фармацевтически приемлемой дозированной форме. В зависимости от нарушения и пациента, подвергаемых лечению, а также от способа введения, композиции можно вводить различными дозами.
При терапии человека молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению можно вводить отдельно, однако, как правило, их можно вводить в смеси с пригодным фармацевтическим эксципиентом, разбавителем или носителем, выбранным с учетом предполагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики.
Например, молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению можно вводить перорально, буккально или сублингвально в форме таблеток, капсул, суппозиториев, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать вкусовые добавки или красители, для применений с немедленным, замедленным или контролируемым высвобождением. Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению также можно вводить путем внутрикавернозной инъекции.
Такие таблетки могут содержать эксципиенты, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин, дезинтегрирующие средства, такие как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный или маниоковый крахмал), натрия крахмала гликолят, кроскармеллоза натрия и некоторые комплексные силикаты, и гранулированные связующие вещества, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), гидроксипропилцеллюлоза (HPC), сахароза, желатин и гуммиарабик. Кроме того, могут быть включены смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.
Также в качестве наполнителей в желатиновых капсулах можно использовать твердые композиции сходного типа. Предпочтительные эксципиенты в этом отношении включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Для водных суспензий и/или эликсиров средства по изобретению можно комбинировать с различными подсластителями или вкусовыми добавками, красящими веществами или пигментами, с эмульгирующими и/или суспендирующими веществам и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, и их комбинации.
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению также можно вводить парентерально, например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, интратекально, интравентрикулярно, внутригрудинно, интракраниально, внутримышечно или подкожно, или их можно вводить способами инфузии. Наилучшим образом их можно использовать в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточно солей или глюкозы для того, чтобы сделать раствор изотоничным с кровью. Водные растворы должны быть пригодным образом забуферены (предпочтительно до pH от 3 до 9), если необходимо. Пригодные парентеральные составы можно легко получать в стерильных условиях стандартными способами фармацевтики, хорошо известными специалистам в данной области.
Лекарственные средства и фармацевтические композиции, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают раствор изотоничным с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества и загустители. Лекарственные средства и композиции могут быть представлены в контейнерах для однократных или многократных доз, например, в закрытых ампулах и флаконах, и их можно хранить в сублимированном (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного выше типа можно получать инъекционные растворы и суспензии для немедленного применения.
Для перорального и парентерального введения пациентам-людям, суточный уровень дозировки молекул, лекарственных средств и фармацевтических композиций по изобретению обычно будет составлять от 0,1 до 100 мг на взрослого человека в сутки, которые вводят в однократной или разделенных дозах.
Таким образом, например, таблетки или капсулы молекул по изобретению могут содержать от 0,1 мг до 100 мг активного средства для введения одной или двух или более таблеток и капсул за один раз, в зависимости от ситуации. Врач в каждом случае может определить истинную дозировку, которая является наиболее пригодной для любого конкретного пациента, и она может варьировать в зависимости от возраста, массы и ответа конкретного пациента. Указанные выше дозировки являются иллюстративными для среднего случая. Безусловно, могут существовать отдельные случаи, когда являются подходящими более высокие или более низкие диапазоны дозировок, и они находятся в объеме этого изобретения.
Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению также можно вводить интраназально или посредством ингаляции, и их удобным образом доставляют в форме сухого ингалятора с сухим порошком или путем представления аэрозольного спрея из контейнера под давлением, насоса, спрея или устройства для распыления с использованием пригодного пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, гидрофторалкана, такого как 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA 134A или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан (HFA 227EA), диоксида углерода или другого пригодного газа. В случае аэрозоля под давлением дозированную единицу можно определять путем предоставления клапана для доставки отмеренного количества. Контейнер под давлением, насос, спрей или устройство для распыления могут содержать раствор или суспензию активного средства, например, при использовании в качестве растворителя смеси этанола и пропеллента, который, кроме того, может содержать смазывающее вещество, например сорбитана триолеат. Капсулы и кассеты (изготовленные, например, из желатина) для применения в ингаляторе или инсуффляторе можно изготавливать так, чтобы они содержали порошковую смесь средства по изобретению и пригодной порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Составы аэрозолей или сухих порошков предпочтительно являются такими, чтобы каждая отмеренная доза или "выпуск" содержали по меньшей мере 0,1 мг молекулы по изобретению для доставки пациенту. Понятно, что общая суточная доза в случае аэрозоля может варьировать от пациента к пациенту, и ее можно вводить в однократной дозе или, более часто, разделенными дозами на протяжении суток.
Альтернативно молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению можно вводить в форме суппозитория или пессария, или их можно применять местно в форме лосьона, раствора, крема, геля, мази или напыляемого порошка. Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению также можно вводить трансдермально, например, с использованием кожного пластыря. Также их можно вводить глазным путем, в частности, для лечения заболеваний глаза.
Для офтальмологического применения молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению можно изготавливать в качестве тонкодисперсных суспензий в изотоническом стерильном солевом растворе со скорректированным pH, или, предпочтительно, в качестве растворов в изотоническом стерильном солевом растворе со скорректированным pH, необязательно в сочетании с консервантом, таким как хлорид бензилалкония. Альтернативно их можно изготавливать в виде мази, такой как вазелиновая мазь.
Для местного нанесения на кожу молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению могут быть изготовлены в качестве пригодной мази, содержащей активное вещество, суспендированное или растворенное, например, в смеси с одним или несколькими из следующих компонентов: минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен-полиоксипропиленовое средство, эмульгирующий воск и воду. Альтернативно их можно изготавливать в качестве пригодного лосьона или крема, суспендированного или растворенного, например, в смеси одного или нескольких из следующих компонентов: минеральное масло, сорбитана моностеарат, полиэтиленгликоль, вазелиновое масло, полисорбат 60, воск на основе цетиловых сложных эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и вода.
Составы, пригодные для местного введения в полость рта, включают пастилки, содержащие активный ингредиент в имеющей вкус основе, обычно сахарозе и гуммиарабике или трагакантовой камеди; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик; и средства для полоскания рта, содержащие активный ингредиент в пригодном жидком носителе.
Как правило, для человека пероральное или парентеральное введение молекул, лекарственных средств и фармацевтических композиций по изобретению является предпочтительным способом, являющимся наиболее удобным.
Для ветеринарного применения молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению вводят в качестве пригодного приемлемого состава в соответствии с обычной ветеринарной практикой, и ветеринарный хирург может определить схему дозирования и способ введения, которые будут наиболее пригодными для конкретного животного.
Удобно, чтобы состав представлял собой фармацевтический состав. Преимущественно, состав представляет собой ветеринарный состав.
Предпочтительно фармацевтическая композиция предназначена для применения при профилактике или лечении незлокачественного состояния.
В следующем аспекте изобретение относится к способу профилактики и/или лечения незлокачественного или злокачественного состояния у пациента, включающему стадию введения пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества молекулы пептида по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, или фармацевтической композиции по изобретению.
Под "терапевтически эффективным количеством" или "эффективным количеством" подразумевают количество молекулы пептида по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, которые, при введении субъекту, либо отдельно, либо в сочетании с другим средством, смягчают симптом заболевания, нарушения или состояния.
"Аутоиммунное заболевание" включает случаи, когда может быть показано, что аутоиммунный процесс приводит к патогенезу заболевания. Такие заболевания, как правило, ассоциированы с иммунным ответом по типу T-хелперных лимфоцитов 1 (Th-1).
"Аллергические состояния" включают состояния, ассоциированные с иммунным ответом по типу T-хелперных лимфоцитов-2 (Th-2). При аллергической реакции наблюдаются высокие уровни IgE, и иммунные ответы Th-2 преобладают на ответами Th-1, что приводит к воспалительному ответу. Примеры аллергических состояний включают следующие состояния: астма, ринит/сенная лихорадка, экзема и анафилаксия.
Под "адъювантом" подразумевают вещество, которое, при объединении или введении одновременно с антигеном, усиливает иммунный ответ.
Как правило, незлокачественное состояние выбрано из группы, содержащей или состоящей из следующего: аутоиммунные нарушения, такие как гемолитическая анемия, тромбоцитопения, тиреоидит, пернициозная анемия, болезнь Аддисона, аутоиммунный диабет, миастения, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, атеросклероз и аутоиммунный энцефалит; аллергические состояния, такие как экзема, дерматит, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит; аллергические заболевания дыхательных путей; синдром гиперэозинофилии; контактный дерматит, пищевая аллергия; и респираторные заболевания, характеризующиеся эозинофильным воспалением дыхательных путей и повышенной реактивностью дыхательных путей, такие как аллергическая астма, наследственная астма, аллергический бронхолегочный аспергиллез, эозинофильная пневмония, аллергический бронхит, бронхоэктаз, профессиональная астма, реактивный синдром дыхательных путей, интерстициальная болезнь легких, гиперэозинофильный синдром, паразитарное заболевание легких.
Следующими примерами аутоиммунных состояний являются, например, болезнь соединительных тканей, рассеянный склероз, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, аутоиммунное воспаление легких, синдром Гийена-Барре, аутоиммунный тиреоидит, инсулинозависимый сахарный диабет, миастения, реакция "трансплантат против хозяина" и аутоиммунное воспалительное заболевание глаза. Такой белок (или его антагонисты, включая антитела) по настоящему изобретению также может быть пригоден для лечения аллергических реакций и состояний (например, анафилаксии, сывороточной болезни, реакций на лекарственные средства, пищевой аллергии, аллергии на яд насекомых, мастоцитоза, аллергического ринита, связанного с гиперчувствительностью пневмонита, крапивницы, ангионевротического отека, экземы, атопического дерматита, аллергического контактного дерматита, полиформной эритемы, синдрома Стивенса-Джонсона, аллергического конъюнктивита, атопического кератоконъюнктивита, венерического кератоконъюнктивита, гигантского папиллярного конъюнктивита и контактной аллергии), таких как астма (в частности, аллергическая астма) или другие респираторные проблемы. Также с использованием белка (или его антагонистов) по настоящем изобретению можно лечить другие состояния, при которых является желательной иммунная супрессия (включая, например, трансплантацию органов). Терапевтические эффекты полипептидов или их антагонистов на аллергические реакции можно оценивать в моделях на животных in vivo, таких как тест совокупного контактного усиления (Lastbom et al., Toxicology 125: 59-66, 1998), инъекционная кожная проба (Hoffmann et at., Allergy 54: 446-54, 1999), тест сенсибилизации кожи морской свинки (Vohr et al., Arch. Toxocol. 73: 501-9) и локальный анализ лимфатических узлов мыши (Kimber et al., J. Toxicol. Environ. Health 53: 563-79).
Пригодные анализы цитотоксичности тимоцитов и спленоцитов включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan et al., Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiiey-Interscience (Chapter 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai at al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bowman et al., J. Virology 61: 1992-1998; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079-3092, 1994.
Анализы зависимых от T-клеток ответов иммуноглобулинов и переключения изотипов (которые идентифицируют, помимо прочих, белки, которые модулируют зависимые от T-клеток антительные ответы и которые влияют на профили Th1/Th2) включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990; и анализы функции B-клеток: In vitro antibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M. Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan et al., eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.
Анализ смешанной реакции лимфоцитов (MLR) (который идентифицирует, среди прочих, белки, которые осуществляют, главным образом, Th1- и CTL-ответы) включает, но не ограничивается ими, анализы, описанные в: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan et al., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience (Chapter 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992.
Зависимые от дендритных клеток анализы (которые идентифицируют, помимо прочих, белки, экспрессируемые дендритными клетками, которые активируют наивные T-клетки) включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Guery et al., J. Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba et al., J. Experimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatonia et al., J. Immunol. 154: 5071-5079, 1995; Porgador et al., J. Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Hair et al., J. Virology 67: 4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264: 961-965, 1994; Macatonia et al., J. Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., J. Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; и Inaba et al., J. Experimental Medicine 172: 631-640, 1990.
Анализы выживания лимфоцитов/апоптоза (которые идентифицируют, помимо прочих, белки, которые препятствуют апоптозу после индукции суперантигеном, и белки, которые регулируют гомеостаз лимфоцитов) включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk, J. Immunol. 145: 4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczyca et al., Int. J. Oncol. 1: 639-648, 1992.
Анализы белков, которые влияют на ранние стадии коммитирования и развития T-клеток, включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Antica et al., Blood 84: 111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 7548-7551, 1991.
Композиции по настоящему изобретению также могут обладать противовоспалительной активностью. Противовоспалительной активности можно достигать путем предоставления стимула клеткам, вовлеченным в воспалительный ответ, путем ингибирования или запуска межклеточных взаимодействий (например, таких как адгезия клеток), путем ингибирования или запуска хемотаксиса клеток, вовлеченных в воспалительный процесс, ингибирования или запуска экстравазации клеток, или путем стимуляции или подавления продукции других факторов, которые более прямо ингибируют или стимулируют воспалительный ответ. Композиции с такими видами активности можно использовать для лечения воспалительных состояний (включающих хронические или острые состояния), включая, но не ограничиваясь этим, признаки, ассоциированные с инфекцией (такие как септический шок, сепсис или системный синдром воспалительного ответа (SIRS)), повреждение при ишемии-реперфузии, летальность от эндотоксинов, артрит, опосредуемое комплементом сверхострое отторжение, нефрит, цитокин- или хемокин-индуцированное повреждение легких, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, или являющиеся следствием продукции цитокинов, таких как TNF или IL-1. Композиции по изобретению также могут быть пригодны для лечения анафилаксии и гиперчувствительности к антигенному веществу или материалу. Композиции по этому изобретению можно использовать для профилактики или лечения состояний, таких как, но не ограничиваясь ими, сепсис, острый панкреатит, эндотоксиновый шок, индуцируемый цитокинами шок, ревматоидный артрит, хронические воспалительные артриты, повреждение клеток поджелудочной железы при сахарном диабете 1 типа, реакцию трансплантат против хозяина, воспалительное заболевание кишечника, воспаление, ассоциированное с легочным заболеванием, другим аутоиммунным заболеванием или воспалительным заболеванием, антипролиферативным средством, таким как средство от острого или хронического миелогенного лейкоза, или для профилактики преждевременных родов, вторичных относительно внутриматочных инфекций.
В предпочтительном варианте осуществления незлокачественным состоянием является астма; альтернативно незлокачественным состоянием является артрит.
Иммуносупрессивные эффекты композиций по изобретению против ревматоидного артрита определяют в экспериментальной модельной системе на животных. Экспериментальная модельная система представляет собой индуцированный адъювантом артрит у крыс, протокол для которого описан J. Holoshitz, et al., 1983, Science, 219: 56, или B. Waksman et al., 1963, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 23: 129. Индукция заболевания может быть вызвана однократной инъекцией, главным образом, внутрикожной, суспензии убитых Mycobacterium tuberculosis в полном адъюванте Фрейнда (CFA). Способ инъекции может варьировать, однако крысам можно проводить инъекцию в основание хвоста с адъювантной смесью. Полипептид вводят в фосфатно-солевом буфере (PBS) в дозе приблизительно 1-5 мг/кг. Контроль состоит из введения только PBS.
Способ тестирования эффектов тестируемого соединения может состоять из внутрикожной инъекции убитых Mycobacterium tuberculosis в CFA с последующим немедленным введением тестируемого соединения и последующем введением раз в двое суток до 24 суток. Через 14, 15, 18, 20, 22 и 24 суток после инъекции CFA Mycobacterium можно получить общий показатель для оценки артрита, как описано J. Holoskitz, выше. Анализ данных может выявить, что тестируемое соединение может иметь сильный эффект на опухание суставов при определении по снижению показателя для артрита.
Лечение злокачественной опухоли обеспечивает регрессию опухоли путем ингибирования пролиферации опухолевых клеток, ингибирования ангиогенеза (рост новых сосудов, который необходим для поддержания роста опухоли) и/или предотвращения метастазирования путем снижения подвижности опухолевых клеток или инвазивности. Терапевтические композиции по изобретению могут быть эффективными при онкологии у взрослых и детей, включая солидные опухоли/злокачественные опухоли, локально развившиеся опухоли, саркомы мягких тканей у человека, метастатическую злокачественную опухоль, включая лимфатические метастазы, злокачественные опухоли клеток крови, включая множественную миелому, острые и хронические лейкозы, и лимфомы, рак головы и шеи, включая рак полости рта, рак гортани и рак щитовидной железы, рак легкого, включая мелкоклеточную карциному и немелкоклеточный рак, рак молочной железы, включая мелкоклеточную карциному и карциному протоков, желудочно-кишечный рак, включая рак пищевода, рак желудка, рак толстого кишечника, рак ободочной и прямой кишки и полипы, ассоциированные с колоректальной неоплазией, рак поджелудочной железы, рак печени, урологический рак, включая рак мочевого пузыря и рак предстательной железы, злокачественные опухоли женских половых путей, включая карциному яичника, рак матки (включая рак эндометрия), и солидные опухоли фолликулов яичника, рак почки, включая почечноклеточный рак, злокачественные опухоли головного мозга, включая врожденные опухоли головного мозга, нейробластому, астроцитарные опухоли головного мозга, глиомы, метастатическую инвазию опухолевых клеток в центральную нервную систему, рак кости, включая остеомы, рак кожи, включая злокачественную меланому, опухолевую прогрессию кератиноцитов кожи человека, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, гемангиоперицитому и саркому Капоши.
Полипептиды, полинуклеотиды или модуляторы полипептидов по изобретению (включая ингибиторы и стимуляторы биологической активности полипептида по изобретению) можно вводить для лечения злокачественной опухоли. Терапевтические композиции можно вводить в терапевтически эффективных дозировках отдельно или в сочетании с адъювантной терапией злокачественной опухоли, такой как хирургическая операция, химиотерапия, лучевая терапия, теплолечение и лазерная терапия, и они могут обеспечить благоприятный эффект, например, снижение размера опухоли, замедление скорости роста опухоли, ингибирование метастазирования, или иное улучшение общего клинического состояния, не обязательно устраняя злокачественную опухоль.
Композицию также можно вводить в терапевтически эффективном количестве в качестве части "коктейля" против злокачественной опухоли. "Коктейль" против злокачественной опухоли представляет собой смесь полипептида или модулятора по изобретению с одним или несколькими лекарственными средствами против злокачественной опухоли в дополнение к фармацевтически приемлемому носителю для доставки. Применение "коктейлей" против злокачественной опухоли в качестве средства для лечения злокачественной опухоли является общепринятым. Лекарственные средства против злокачественной опухоли, которые хорошо известны в данной области и которые можно использовать для лечения в сочетании с полипептидом или модулятором по изобретению, включают: актиномицин D, аминоглутетимид, аспарагиназу, блеомицин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин (cis-DDP), циклофосфамид, цитарабин HCl (цитозинарабинозид), дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин HCl, доксорубицин HCl, эстрамустина натрия фосфат, этопозид (V16-213), флоксуридин, 5-фторурацил (5-Fu), флутамид, гидроксимочевину (гидроксикарбамид), ифосфамид, интерферон альфа-2a, интерферон альфа-2b, леупролида ацетат (аналог рилизинг-фактора LHRH), ломустин, мехлорэтамин HCl (азотистый иприт), мелфалан, меркаптопурин, месну, метотрексат (MTX), митомицин, митоксантрон HCl, октреотид, пликамицин, прокарбазин HCl, стрептозоцин, тамоксифена цитрат, тиогуанин, тиотепу, винбластина сульфат, винкристина сульфат, амсакрин, азацитидин, гексаметилмеламин, интерлейкин-2, митогуазон, пентостатин, семустин, тенипозид и виндезина сульфат.
Кроме того, терапевтические композиции по изобретению можно использовать для профилактического лечения злокачественной опухоли. В данной области известны наследственные состояния и/или ситуации в окружающей среде (например, воздействие канцерогенов), которые предрасполагают индивида к развитию злокачественных опухолей. В этих обстоятельствах может быть полезным лечение этих индивидов терапевтически эффективными дозами полипептида по изобретению для снижения риска развития злокачественных опухолей.
Модели in vitro можно использовать для определения эффективных доз полипептида по изобретению в качестве потенциального способа лечения злокачественной опухоли. Эти модели in vitro включают анализы пролиферации культивированных опухолевых клеток, роста культивированных опухолевых клеток в мягком агаре (см. Freshney, (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wily-Uss, New York, NY Ch 18 и Ch 21), опухолевых систем у мышей nude, как описано в Giovanella et al., J. Natl. Can. Inst, 52: 921-30 (1974), подвижности и инвазивного потенциала опухолевых клеток в анализах Boyden Chamber, как описано в Pilkington et al., Anticancer Res., 17: 4107-9 (1997), и анализах ангиогенеза, таких как индукция васкуляризации хорионаллантоисной мембраны цыпленка или индукция миграции сосудисто-эндотелиальных клеток, как описано в Ribatta et al., Intl. J. Dev. Biol., 40: 1189-97 (1999) и Li et al., Clin. Exp. Metastasis, 17: 423-9 (1999), соответственно. Пригодные опухолевые клеточные линии доступны, например, из каталогов American Type Tissue Culture Collection.
Лейкозы и родственные нарушения можно лечить или предупреждать путем введения лекарственного средства, которое стимулирует или ингибирует функцию полинуклеотидов и/или полипептидов по изобретению. Такие лейкозы и родственные нарушения включают, но не ограничиваются ими, острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкозы, эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз (для обзора таких нарушений, см. Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia).
В следующем аспекте изобретение относится к пептидной молекуле по изобретению или молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению для применения для смягчения боли.
В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая предназначена для применения для смягчения боли. Предпочтительные фармацевтические композиции по изобретению описаны выше и в прилагаемых примерах.
В следующем аспекте изобретение относится к применению пептидной молекулы по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению для изготовления лекарственного средства для смягчения боли.
"Применение для смягчения боли" включает любое введение, которое влияет на боль, которую чувствует индивид, причем такое влияние включает замедление возникновения, снижение тяжести, снижение длительности и/или устранение ощущения боли (и/или аналгезию и/или гипераналгезию) у пациента-человека или пациента-животного. "Боль" также включает аналгезию и/или гипераналгезию - "гипералгезия" включает более раннее возникновение, увеличение тяжести, повышение длительности и/или повышение чувствительности к ощущению боли.
В предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство далее включает по меньшей мере одну добавку для способствования или усиления действия молекулы пептида или молекулы нуклеиновой кислоты. Как правило, добавку выбирают из по меньшей мере одного из парацетамола, аспирина, ибупрофена, других нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID), селективных ингибиторов циклооксигеназы-2 (CSI), опиатов.
"Добавка" включает ингредиент, который предоставляют в дополнение к главному лекарственному средству и который является фармакологически активным, либо независимо, либо в сочетании с главным лекарственным средством, где его присутствие в лекарственном средстве способствует действию или усиливает действие главного лекарственного средства.
Предпочтительно лекарственное средство обеспечивает длительное или замедленное смягчение боли.
Преимущественно, при применении изобретения, суточный уровень дозирования может составлять от 0,0001 до 100000 мг, вводимые однократной или разделенными дозами; предпочтительно суточный уровень дозирования составляет от 0,0001 до 1000 мг.
Предпочтительные фармацевтические составы включают составы, в которых активный ингредиент присутствует в количестве по меньшей мере 1% (например, по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 30% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%) по массе. Таким образом, соотношение активного ингредиента и других компонентов (т.е. добавление адъюванта, разбавителя и носителя) в фармацевтической композиции составляет по меньшей мере 1:99 (например по меньшей мере 10:90, предпочтительно по меньшей мере 30:70 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50:50) по массе.
Как правило, время между введением дозы пациенту составляет между шестью и двенадцатью часами; в предпочтительном варианте осуществления время между введением доз пациенту составляет между девятью и двенадцатью часами после предыдущей дозы; более предпочтительно время между введением доз пациенту составляет между двенадцатью часами и двенадцатью сутками; еще более предпочтительно время между введением доз пациенту составляет между двенадцатью сутками и шестью месяцами.
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению, где лекарственное средство по изобретению используют для смягчения боли у пациента-человека или пациента-животного.
Предпочтительно фармацевтическую композицию или лекарственное средство по изобретению изготавливают так, чтобы обеспечить введение по меньшей мере одним способом, выбранным из группы, содержащей или состоящей из следующих: интраназальный; пероральный; парентеральный; местный; глазной способ; с помощью суппозитория; пессария или ингаляционный способ. Составы, пригодные для таких способов введения, хорошо известны специалистам в области фармацевтики и медицины, и иллюстративные составы описаны выше и в прилагаемых примерах.
Предпочтительно боль выбрана из группы, содержащей или состоящей из следующего: боль в спине; головная боль; зубная боль; боль в ухе; артрит; подагра; травма мягких тканей; травматическое повреждение связок и/или сухожилий; переломы костей; злокачественная опухоль; постоперационная боль; менструальная боль; боль при родах; боль мочеполового тракта; боль во внутренних органах; ожоги; абсцессы и другие инфекции.
В следующем аспекте изобретение относится к способу смягчения боли у пациента, включающему стадию введения пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества молекулы пептида по изобретению и/или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению и/или фармацевтической композиции по изобретению.
В следующем аспекте изобретение относится к применению молекулы пептида по изобретению и/или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в качестве адъюванта.
В следующем аспекте изобретение относится к адъювантной системе, содержащей (i) молекулу пептида по изобретению и/или молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и (ii) антиген.
Предпочтительно антиген выбран из группы, содержащей или состоящей из следующего: антиген сибирской язвы; антиген холеры; дифтерийный антиген; антиген гемофильного вируса гриппа b (Hib); антиген гепатита A; антиген гепатита B; антиген гриппа; антиген японского энцефалита; антиген кори, свинки и краснухи (MMR); менингококковый антиген; коклюшный антиген; пневмококковый антиген; антиген полиомиелита; антиген бешенства; антиген краснухи; антиген оспы и/или осповакцины; антиген столбняка; антиген клещевого энцефалита; антиген туберкулеза; тифозный антиген; антиген ветрянки/простого герпеса; антиген желтой лихорадки и антиген ветеринарной вакцины.
В следующем аспекте изобретение относится к способу стимуляции продукции цитокинов в клетке, включающему стадию введения молекулы пептида по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению.
Предпочтительно продукция цитокинов возрастает по меньшей мере в 10 раз относительно нормальных уровней. Нормальные уровни для конкретного типа клеток можно легко определить с использованием контрольного образца, который не подвергали воздействию полипептида или полинуклеотида по изобретению в любом из анализов, рассмотренных ниже, или как описано в примерах.
Полипептид по настоящему изобретению может проявлять активность, связанную с цитокином, клеточной пролиферацией (либо индукцию, либо ингибирование) или клеточной дифференцировкой (либо индукцию, либо ингибирование), или он может индуцировать продукцию других цитокинов в определенных популяциях клеток. Полинуклеотид по изобретению может кодировать полипептид, обладающий такими свойствами. Многие белковые факторы, открытые к настоящему времени, включая все известные цитокины, обладают проявляемой активностью в одном или нескольких фактор-зависимых анализах клеточной пролиферации, и, таким образом, эти анализы служат в качестве удобного подтверждения активности цитокинов. Активность терапевтических композиций по настоящему изобретению определяют одним из множества общепринятых анализов фактор-зависимой клеточной пролиферации для клеточных линий, включающих, но не ограничивающихся ими, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e, CMK, HUVEC и Caco.
Анализы пролиферации T-клеток или тимоцитов включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan et al., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience (Chapter 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994.
Анализы продукции цитокинов и/или пролиферации клеток селезенки, клеток лимфатических узлов или тимоцитов включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. and Shevach, E. M. Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; и Measurement of mouse and human interleukin-γ, Schreiber, R. D. Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan eds. Vo1 1 pp. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Анализы пролиферации и дифференцировки гемопоэтических и лимфопоэтических клеток включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L. S. and Lipsky, P. E. Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan eds. Vol. 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173: 1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336: 690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human Interleukin 6-Nordan, R. Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan eds. Vol. 1 pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11-Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C. and Turner, K. J. Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan eds. Vol. 1 pp. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9-Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C. and Turner, K. J. Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan eds. Vo1 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991.
Анализы T-клеточных ответов клонов на антигены (которые идентифицируют, среди прочих, белки, которые влияют на взаимодействия APC-T-клеток, а также прямые эффекты T-клеток путем измерения пролиферации и продукции цитокинов) включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988.
В предпочтительном варианте осуществления цитокин выбран из группы, содержащей или состоящей из: IL-1β; IL-2; IL-6; IL-8; IL-10; IL-12; TNF-α; интерферон-γ; GM-CSF.
Кроме того, изобретение относится к способу оценки наличия и/или количества в образце молекулы пептида по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, включающему стадии или состоящему из них:
i) предоставление тестируемого образца;
ii) контактирование тестируемого образца с клеткой;
iii) измерение и/или детекция уровня продукции одного или нескольких цитокинов клеткой;
iv) сравнение уровня продукции одного или нескольких цитокинов стадии (iii) с уровнем продукции одного или нескольких цитокинов в контрольном образце, где более высокий уровень продукции одного или нескольких цитокинов, индуцируемый тестируемым образцом, по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие и/или количество в тестируемом образце молекулы пептида по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению.
Термины "MT60.1", "Mtcpn60.1", "cpn60.1", "60.1" и "шаперонин 60.1" используют в описании взаимозаменяемо для обозначения аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 25.
Перечисление или обсуждение очевидно ранее опубликованного документа в этом описании не обязательно должно быть воспринято как признание того, что документ является частью утверждений данной области или является распространенным общим знанием.
Предпочтительные неограничивающие примеры, которые являются осуществлением некоторых аспектов изобретения, далее описаны с помощью представленных ниже фигур:
Фигура 1. Привлечение эозинофилов в дыхательные пути через 24 ч после многократной нагрузки овальбумином ингибировалось у мышей, которым вводили Cpn60.1, Cpn10, но не Cpn60.2. Вертикальные линии представляют собой стандартную ошибку среднего значения (SEM) для 4-12 (Cpn60.1), 3-5 (Cpn60.2), 4-10 (Cpn10) животных на группу. *Значимое снижение процента эозинофилов по сравнению с овальбумином отдельно.
Фигура 2. Повышенная бронхиальная отвечаемость на метахолин через 24 ч после многократной нагрузки овальбумином была снижена у мышей, которым вводили Cpn60.1, Cpn10, но не Cpn60.2 (n=16-17). Вертикальные линии соответствуют SEM.
Фигура 3. Уровни цитокинов в жидкости BAL через 24 ч после многократной нагрузки овальбумином ингибировались у мышей, которым вводили Cpn60.1. Вертикальные линии соответствуют SEM. *Значимое снижение уровней цитокинов по сравнению с овальбумином отдельно (n=8-10).
Фигура 4. Перенос дендритных клеток, предварительно обработанных Cpn10 (10 мкг/мл) in vitro, сенсибилизированным OVA реципиентным мышам значимо ингибировал миграцию эозинофилов в легкое. Вертикальные линии соответствуют SEM. *Значимое снижение числа эозинофилов по сравнению с сенсибилизированными мышами, которым проводили инстилляцию необработанных DC (n=9-15).
Фигура 5. Дендритные клетки (ДС), обработанные Cpn60.1 в течение 48 часов, продуцировали IL12 дозозависимым образом. Предварительная обработка дендритных клеток Cpn10 (10 мкг/мл) индуцировала низкие уровни IL12. Клетки стимулировали шаперонинами в течение 48 ч и тестировали в четырех экземплярах, и в каждом столбце представлено среднее значение для двух экспериментов. Вертикальные линии соответствуют стандартному отклонению (SD).
Фигура 6. Предварительная инкубация дендритных клеток с Cpn60.1 в течение 24 часов ингибирует продукцию IL12, индуцированную LPS. Клетки стимулировали шаперонинами в течение 248 ч и LPS в течение последующих 24 ч. Все концентрации тестировали в четырех экземплярах, и в каждом столбце представлено среднее значение для двух экспериментов. Вертикальные линии соответствуют SD.
Фигура 7. Предварительная обработка дендритных клеток Cpn60.1 или Cpn10 (10 мкг/мл) снижала уровни IL4 в кокультуре дендритных клеток и T-клеток RD11.10. IL5 и IL10 не выявлялись в этой культуре. Дендритные клетки стимулировали шаперонинами в течение 24 ч перед кокультивированием их с клетками DO.11. Кокультуру поддерживали в течение 6 суток и клетки стимулировали антителом против CD3 и антителом против CD28 в течение последующих 24 часов. Супернатанты собирали и тестировали в четырех экземплярах. Вертикальные линии соответствуют SD.
Фигура 8. Предварительная обработка клеток селезенки мышей C57B1/6 различными концентрациями Cpn60.1 и его пептидов индуцирует высвобождение IL-12 in vitro. Среда содержала 5 мкг/мл полимиксина B. Клетки стимулировали шаперонинами в течение 24 ч и супернатанты тестировали в четырех экземплярах. Каждая линия соответствует среднему значению для двух экспериментов.
Фигура 9. Клетки селезенки, собранные от мышей TLR4 KO, показали сниженный ответ на шаперонин 60.1 и его пептиды по сравнению с аналогичными мышами дикого типа C57b1/6. Также мыши TLR2 KO показали ингибирование ответа на шаперонины. Все концентрации тестировали в четырех экземплярах. Вертикальные линии соответствуют SD.
Фигура 10. Привлечение тотальных клеток в дыхательные пути через 24 ч после многократной нагрузки овальбумином ингибировалось у мышей, которым вводили Cpn60 и Cpn60.1-пептид 4. Вертикальные линии соответствуют SEM для 5-9 животных на группу. *Значимое снижение числа тотальных клеток по сравнению с имитирующей группой. **Значимое снижение числа тотальных клеток по сравнению с овальбумином отдельно.
Фигура 11. Привлечение эозинофилов в дыхательные пути через 24 ч после многократной нагрузки овальбумином ингибировалось у мышей, которым вводили Cpn60 и Cpn60.1-пептид 4. Вертикальные линии соответствуют SEM для 5-9 животных на группу. *Значимое снижение числа тотальных клеток по сравнению с имитирующей группой. **Значимое снижение числа тотальных клеток по сравнению с овальбумином отдельно.
Фигура 12. Уровни IL-5 в жидкости BAL через 24 ч после многократной нагрузки овальбумином не ингибировались на значимом уровне у мышей, которым вводили Cpn60.1 или Cpn60.1-пептид 4. Вертикальные линии соответствуют SEM.
Фигура 13. Уровни тотальных IgE, циркулирующих в сыворотке через 24 ч после многократной нагрузки овальбумином, не ингибировались на значимом уровне у мышей, которым вводили Cpn60.1-пептид 4 (0,005 мкг/мышь). Вертикальные линии соответствуют SEM. **Значимое повышение уровней тотального IgE по сравнению с овальбумином отдельно.
Фигура 14. Эффект Cpn60.1 на механическую гипералгезию у крыс, которым вводили CFA (n=6).
Фигура 15. Эффект Cpn60.1 на термическую гипералгезию у крыс, которым вводили CFA (n=6).
Фигура 16. Эффект Cpn60.1 на механическую гипералгезию у крыс, которых обрабатывали УФ-излучением (n=6).
Фигура 17. Эффект Cpn60.1 на термическую гипералгезию у крыс, которых обрабатывали УФ-излучением (n=6).
Фигура 18. Предварительная обработка моноцитов периферической крови человека Cpn60.1 подавляет индуцируемую LPS секрецию TNF-альфа. Данные демонстрируют ослабление секреции TNF-α при возрастании концентрации Cpn60.1. Максимальное ингибирование в концентрации 1 нг/мл не было значимым. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (n=5).
Фигура 19. Предварительная обработка моноцитов периферической крови человека Cpn60.1 подавляет индуцируемую LPS секрецию TNF-альфа в присутствии полимиксина-B. Данные демонстрируют ослабление секреции TNF-α при возрастании концентрации Cpn60.1. Максимальное ингибирование было в концентрации 1 нг/мл. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (n=5).
Фигура 20. Предварительная обработка моноцитов периферической крови человека Cpn10 не подавляет индуцируемую LPS секрецию TNF-альфа. Cpn10 не обладал эффектом в отношении ингибирования секреции TNF-альфа при любой концентрации по сравнению с LPS. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (n=5).
Фигура 21. Предварительная обработка моноцитов периферической крови человека Cpn60.1 или пептидами Cpn60.1 подавляет высвобождение TNF-альфа, индуцированное LPS. Данные предоставлены в качестве среднего значения двух отдельных экспериментов в трех экземплярах, выраженного в качестве процента от контрольных значений.
Фигура 22. Общее число нейтрофилов, выделенных из лаважа мышей, нагруженных возрастающей концентрацией LPS (1 мкг/мл) относительно физиологического раствора, через 24 часа (n=4).
Фигура 23. Общее число нейтрофилов, выделенных из лаважа мышей, которым вводили LPS (1 мкг/мл), и мышей, которым вводили Cpn60.1, через 24 часа (n=4).
Фигура 24. Общее число нейтрофилов, выделенных из лаважа мышей, нагруженных возрастающей концентрацией LPS (1 мкг/мл) относительно физиологического раствора, через 24 часа (n=4). У животных, которым вводили Cpn60.1, была снижена индуцированная LPS нейтрофилия. Ингибирование было значимым по сравнению с группой, в которой вводили LPS (*p<0,05).
Фигура 25. Пептиды, охватывающие экваториальный домен Cpn60.1 Mycobacterium tuberculosis. Экваториальный домен обозначен сплошными черными линиями и рамками/стрелками над последовательностью.
Пептиды 1, 2, 5, 7, 8, 9, 10 являются в высокой степени экспонированными на поверхности и/или представляют собой области высокого несходства между Cpn60.1 и Cpn60.2, и, таким образом, они должны представлять собой наиболее интересные пептиды. Пептиды 3 и 9 являются экспонированными на поверхности, но в направлении внутренней поверхности предполагаемой олигомерной структуры, и являются высоко интересными для исследования. Пептиды 4 и 6 являются частично погруженными в структуру и могут представлять собой относительно более низкий потенциальный интерес.
Примеры
Обзор примеров
Задачей экспериментов авторов настоящего изобретения было исследование противовоспалительных свойств шаперонинов в модели аллергического воспаления. Результаты расширяют предшествующие данные авторов настоящего изобретения, показывающих, что как Cpn60.1, так и Cpn10 ингибируют аллергические воспалительные ответы in vivo, и на клеточном уровне способны ингибировать функцию дендритных клеток, что может объяснить противовоспалительные свойства этих молекул in vivo.
Структурная детерминанта этого противовоспалительного свойства Cpn60.1 еще не установлена. Таким образом, различные пептидные последовательности Cpn60.1 исследовали в отношении потенциальных противовоспалительных свойств in vitro и in vivo. Оказалось, что ряд из этих пептидов обладает иммуномодулирующей активностью in vitro и противовоспалительными свойствами in vivo, указывая на то, что структурные детерминанты активности, находящиеся в шаперонинах, отвечают на этот вопрос с точки зрения открытия новых противовоспалительных средств.
Пример 1 - Эффект Cpn60.1 и 10 в модели аллергического воспаления на мышах:
Аллергические заболевания, включающие астму, считают ассоциированными с избыточной активностью Th2-лимфоцитов, и, таким образом, стратегии, предназначенные для индукции иммунного отклонения, могут быть пригодны для подавления аллогенного воспаления при астме. Было показано, что как M. tuberculosis, так и вакцина M. bovis BCG, которая антигенно является высоко сходной с M. tuberculosis (Harboe M et al. Scand J. Immunol. 1979; 9: 115-24), могут подавлять аллергическое воспаление легких. Данные для Helperby Therapeutics подтвердили, что M. tuberculosis имеет три шаперонина, а именно 60.1, 60.2 и 10. Более того, авторы настоящего изобретения ранее продемонстрировали, что Cpn10 и 60.1, но не 60.2, подавляют воспаление легких в модели астмы на мышах (Riffo-Vasquez, Y. et al., Clin. Exp. Allergy, 2004, 34: 712-19).
Аллергическое воспаление легких индуцируют 2 внутрибрюшинными инъекциями 10 мкг овальбумина (OVA) в 1 мг квасцов с интервалом между ними, составляющим 7 суток. Контрольным животным вводят только квасцы. На 14 сутки всех животных подвергают воздействию аэрозоля OVA в течение 25 минут, один раз в сутки в течение 3 последовательных суток. Все измерения проводят через 24 ч после последней нагрузки антигеном.
Авторы настоящего изобретения показали, что внутритрахеальное введение 10 мкг Cpn60.1 или Cpn10, за 24 ч до второй инъекции OVA и за один час до каждой нагрузки антигеном, может значительно ингибировать воспаление дыхательных путей (фигура 1), избыточную отвечаемость (фигура 2) и высвобождение цитокинов в легком (фигура 3). Однако механизм, посредством которого эти шаперонины оказывают этот эффект in vivo, еще не установлен.
Пример 2 - Эффект Cpn10 и Cpn60.1 на функцию дендритных клеток мыши
Было показано, что белки теплового шока (hsp) микобактерий способны усиливать процессинг антигена и представление дендритными клетками (DC) экзогенных белков T-клеткам, без необходимости в образовании комплекса между hsp и белком (Chen K., et al., J. Leuk. Biol., 2004, 75: 1-7).
Для выяснения механизма, посредством которого Cpn10 и 60.1 регулируют аллергическое воспаление легких in vivo, авторы настоящего изобретения исследовали эффект этих шаперонинов на функцию дендритных клеток костного мозга in vitro.
6
5
6
Клетки костного мозга мышей Balb/c собирали и культивировали в течение 6 суток в полной модифицированной способом Дульбекко среде Игла, содержащей 8 нг/мл GM-CSF мыши. На 6 сутки культивирования клетки собирали, повторно высевали на 1 час для удаления прикрепляющихся клеток, промывали и высевали в количестве 2x10 клеток/лунка в 6-луночные планшеты для анализа экспрессии поверхностных маркеров и экспериментов по переносу и в количестве 10 клеток/лунка в 96-луночный планшет для определения цитокинов. В других экспериментах клетки инкубировали в количестве 10 клеток/лунка в течение 24 ч с шаперонинами, а затем другие 24 ч с LPS (10 нг/мл).
DC предварительно обрабатывали in vitro в течение 24 ч посредством Cpn10 (10 мкг/мл), а затем местно вводили в легкие сенсибилизированных OVA реципиентных мышей. Эта обработка значительно ингибировала миграцию эозинофилов в легкое (фигура 4), воспроизводя эффект, наблюдаемый in vivo с самим шаперонином.
Предварительная обработка DC in vitro посредством Cpn60.1 (0,1-30 мкг/мл) индуцировала высвобождение IL-12 дозозависимым образом. Однако предварительная обработка DC посредством Cpn10 (10 мкг/мл) индуцировала более низкие уровни высвобождения IL-12 по сравнению с LPS и Cpn60.1 (фигура 5).
Предварительная инкубация DC с Cpn60.1, но не с Cpn10, в течение 24 часов ингибировала продукцию IL12, индуцированную LPS (фигура 6).
DC, предварительно обработанные посредством Cpn60.1 (10 мкг/мл) или Cpn10 (10 мкг/мл) в течение 24 ч, подавляли высвобождение IL4 из T-клеток RD11.10 в кокультуре DC/T-клеток. После культивирования в течение 6 суток клетки стимулировали антителом против CD3 и антителом против CD28 в течение последующих 24 часов и супернатанты собирали. IL5 и IL10 не выявлялись в этой культуре (фигура 7).
Пример 3 - Эффект пептидов шаперонина 60.1 in vitro
Для определения структурных детерминант шаперонина 60.1, ответственных за изучаемые биологические действия, авторы настоящего изобретения исследовали эффект 5 различных пептидных последовательностей, обозначенных как пептид 1, 2, 3, 4 и 6 в различных биологических анализах in vitro в этом исследовании.
Партия Cpn60.1, использованная в этих экспериментах: Cpn60.1 1_04-03/1.
6
Авторы настоящего изобретения исследовали эффект этих пептидов в культуре клеток селезенки. Клетки селезенки получали от мышей C57B1/6 или от мышей TLR4 и TLR2 KO. Органы вымачивали в стерильных условиях, и суспензию клеток пропускали через сито с ячейкой размером 70 мкм. Эритроциты удаляли путем осмотического шока с помощью стерильной воды. Оставшиеся клетки промывали и высевали в количестве 10/лунка для измерения IL-12. Клетки инкубировали с различными концентрациями пептидов или шаперонина 60.1 (0,001-30 мкг/мл). Супернатанты собирали через 24 ч и хранили при -20°C. IL-12 измеряли общепринятым анализом ELISA.
Экспериментальные наблюдения авторов настоящего изобретения показали, что Cpn60.1 и все пептиды индуцируют высвобождение IL-12 в культуре спленоцитов. Пептид 4 является более эффективным, чем Cpn60.1, при более низких концентрациях (0,001-0,1 мкг/мл). Однако при более высокой концентрации (0,1-30 мкг/мл) этот пептид показал сниженный эффект по сравнению с Cpn60.1. Пептид 6 обладает сходным эффектом при более высоких концентрациях по сравнению с Cpn60, однако имеет больший эффект при более низких концентрациях (фигура 8). Все культивирования проводили в присутствии полимиксина B для исключения какого-либо эффекта контаминации LPS на функциональные ответы, которые определяли.
Кроме того, авторы настоящего изобретения дополнительно исследовали роль toll-рецепторов (TLR) в ответе клеток селезенки на эти пептидные последовательности. Клетки селезенки, полученные от мышей TLR4 KO, были в значительной степени рефрактерными в отношении их способности продуцировать IL-12 в ответ на шаперонин 60.1 и его пептиды по сравнению с аналогичными им мышами дикого типа C57b1/6. Клетки селезенки от мышей TLR2 KO также были рефрактерными по их способности продуцировать IL-12 в ответ на шаперонин и его пептиды.
Это исследование in vitro демонстрирует, что биологическая активность этих пептидных фрагментов опосредуется активацией TLR2 и TLR4 (фигура 9).
Пример 4 - Эффект пептидов шаперонинов in vivo
Далее авторы настоящего изобретения исследовали эффект низких концентраций Cpn60.1 и Cpn60.1-пептида 4 на аллергическое воспаление дыхательных путей с учетом результатов, полученных из исследований in vitro, описанных ранее.
Для проведения этих экспериментов авторы настоящего изобретения немного модифицировали их протокол иммунизации. Аллергическое воспаление в легком индуцируют 2 интраназальными инстилляциями 10 мкг овальбумина (OVA) в 100 мкг квасцов с интервалом 7 суток между ними. Контрольным животным вводили только квасцы. На 14 сутки всех животных подвергали воздействию аэрозоля OVA в течение 25 минут, один раз в сутки в течение 3 последовательных суток. Все измерения проводят через 24 ч после последней нагрузки антигеном.
Авторы настоящего изобретения показали, что интраназальное введение Cpn60.1 (1 мкг) значимо ингибировало общее число клеток, привлеченных в легкие после острой нагрузки антигеном (фигура 10). Эффект Cpn60.1 и пептида 4 на привлечение эозинофилов в дыхательные пути был более выраженным (фигура 11). Как Cpn60.1 в низкой дозе (0,1 и 1 мкг), так и пептид 4 (0,005 мкг) вызывали значительное снижение привлечения эозинофилов, которое не было вызвано препятствованием продукции IL-5 из воспалительных клеток (фигура 12). Интересно, что низкая доза пептида 4 влияла на продукцию тотального IgE в этой модели аллергии (фигура 13).
Пример 5 - Cpn60.1 в моделях боли
Эффект Cpn60.1 исследовали в 2 моделях боли: индуцированной полным адъювантом Фрейнда (CFA) гипералгезии и индуцированной ожогом ультрафиолетовым излучением гипералгезии. Механическую гипералгезию измеряли с использованием нитей Von Frey, прикладываемых с возрастающей силой к задней лапе. Термическую гипералгезию измеряли с использованием времени, которое заняло отдергивание задней лапы от источника тепла. Cpn60.1 (50 и 500 мкг/кг) длительно вводили самцам крыс Wistar (200 г) подкожно в течение 7 суток. Раз в двое суток регистрировали поведенческие ответы на механическую и термическую аллодинию. После регистрации исходных уровней, в заднюю лапу инъецировали CFA для индукции гипералгезии и проводили поведенческие тесты. Ни одна доза Cpn60.1 не снижала индуцированную CFA гипералгезию по сравнению с контролем, ибупрофеном (100 мг/кг) (фигуры 14 и 15). Тестировали другую модель гипералгезии, на этот раз с использованием УФ-ожога для индукции аллодинии. Снова, Cpn60.1 оказывал небольшой эффект ингибирования гипералгезии по сравнению с группой, в которой вводили ибупрофен (фигуры 16 и 17).
Пример 6 - Исследования in vitro на воспалительных клетках человека
6
2
Авторы настоящего изобретения разработали анализ моноцитов человека для сравнения эффективности Cpn60.1 и различных пептидных последовательностей этого белка. Моноциты человека получали зависимым от плотности центрифугированием из периферической венозной крови от здоровых добровольцев. Затем моноциты выделяли и очищали с помощью клеток, доведенных до плотности 2×10 клеток/мл, которые инкубировали в течение 1 часа 30 минут. Затем планшеты промывали два раза раствором Хэнкса. Затем в каждую лунку добавляли 0,9 мл среды RPMI, а затем полимиксин-B (5 мкг/мл). Через 30 минут в лунки добавляли 0,1 мл Cpn в количестве 0,0001-1000 нг/мл или пептиды. Затем клетки инкубировали при 37°С, 5% CO в течение 1 часа. Среду удаляли и клетки промывали. В каждую лунку добавляли 0,9 мл среды, а затем 0,1 мл LPS (1 нг/мл) и оставляли инкубироваться в течение 24 часов. Супернатант отбирали из каждой лунки и замораживали для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Авторы настоящего изобретения показали, что Cpn60.1 отдельно способен стимулировать моноциты человека для индукции секреции TNF-альфа, но при добавлении к уже примененному воспалительному стимулу (т.е. в присутствии LPS), Cpn60.1 ингибировал секрецию TNF-альфа в низких дозах (1 нг/мл) (фигура 18). Напротив, Cpn10 не ингибировал секрецию TNF-альфа из моноцитов человека (фигура 20). Однако белок, по-видимому, имел некоторую степень контаминации LPS, и в присутствии полимиксина B эта контаминация снизилась (фигура 19). Этого потенциального объединения с контаминацией LPS избежали с использованием пептидных последовательностей Cpn60.1. Оказалось, что пептиды также ингибируют секрецию TNF-альфа при низких концентрациях (фигура 21).
Пример 7 - Cpn60.1 в моделях неаллергического воспаления
Вследствие ингибиторного эффекта в воспалительных клетках человека, авторы настоящего изобретения исследовали, способен ли Cpn60.1 ингибировать привлечение нейтрофилов в системе in vivo. Для дальнейшего подтверждения этого, Riffo-Vasquez et al. недавно показали, что шапероны M. tuberculosis могут подавлять привлечение эозинофилов и избыточную отвечаемость бронхов в модели аллергического воспаления на мышах (Riffo-Vasquez Y., Spina D., Page C. et al. Effect Mycobacterium tuberculosis chaperonins on bronchial eosinophilia and hyper-responsiveness in a murine model of allergic inflammation. Clin. Exp Allergy, 2004; 34(5); 712-719).
Самкам мышей Balb/c предварительно вводили интраназально Cpn60.1 (1 мкг/мл) в течение 3 суток в отсутствие предварительной обработки полимиксином B или после предварительной обработки полимиксином B (5 мкг/мл) для исключения какого-либо эффекта контаминации LPS. Через 30 минут после последней дозы Cpn60.1 мышам вводили LPS (1 мкг/мл). Приток нейтрофилов и высвобождение TNF-альфа в легких определяли с помощью бронхоальвеолярного лаважа через 24 часа. LPS индуцировал дозозависимое повышение нейтрофилии по сравнению с контролем (фигура 22). Интересно, что группа, в которой предварительно вводили Cpn60.1, показала подавление нейтрофилии, однако секреция TNF-альфа не ослаблялась значительно (фигура 24). Введение мышам полимиксина B не изменяло способности Cpn60.1 подавлять привлечение нейтрофилов, что указывает на то, что этот эффект не может быть объяснен контаминацией LPS. У мышей, которым вводили Cpn60.1 отдельно, не наблюдали привлечения нетрофилов, что далее позволяет допустить, что никакая контаминация LPS не вызывает нейтрофилию (фигура 23).
Пример 8 - Иллюстративные фармацевтические составы
Хотя можно вводить молекулу по изобретению отдельно, предпочтительно предоставлять ее в качестве фармацевтического состава, вместе с одним или несколькими приемлемыми носителями. Носитель(и) должен быть "приемлемым" с той точки зрения, что он должен быть совместимым со средством по изобретению и не вредным для его реципиентов. Как правило, носители представляют собой воду или физиологический раствор, которые являются стерильными и не содержащими пирогенов.
Представленные ниже примеры иллюстрируют лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению, в которых активный ингредиент представляет собой молекулу по изобретению.
Предпочтительно молекула по изобретению предоставлена в количестве от 10 мкг до 500 мг. Понятно, что можно получать следующие иллюстративные лекарственные средства и фармацевтические композиции, содержащие количество молекулы по изобретению, составляющее от 10 мкг до 500 мг. Например, молекула по изобретению может присутствовать в 10-ых или 100-ых или 200-ых или 500-ых долях от количества,представленного в следующих иллюстративных лекарственных средствах и фармацевтических композициях, причем количества остальных ингредиентов изменяются соответствующим образом.
Пример A: Таблетка
Активный ингредиент
1 мг
Лактоза
200 мг
Крахмал
50 мг
Поливинилпирролидон
5 мг
Стеарат магния
4 мг
Таблетки получают из указанных выше ингредиентов влажной грануляцией с последующим прессованием.
Пример B: Офтальмический раствор
Активный ингредиент
1 мг
Хлорид натрия, химически чистый
0,9 г
Тимеросал
0,001 г
Очищенная вода до
100 мл
значение pH, доведенное до
7,5
Пример C: Составы таблеток
Следующие составы A и B получают влажной грануляцией ингредиентов с раствором повидона, с последующим добавлением стеарата магния и прессованием.
Состав A
мг/таблетка
мг/таблетка
(a) Активный ингредиент
1
1
(b) Лактоза B.P.
210
26
(c) Повидон B.P.
15
9
(d) Натрия крахмала гликолят
20
12
(e) Стеарат магния
5
3
-
251
51
Состав B
мг/таблетка
мг/таблетка
(a) Активный ингредиент
1
1
(b) Лактоза
150
-
(с) Avicel PH 101 
60
26
(d) Повидон B.P.
15
9
(e) Натрия крахмала гликолят
20
12
(f) Стеарат магния
5
3
-
251
51
Состав С
мг/таблетка
Активный ингредиент
1
Лактоза
200
Крахмал
50
Повидон
5
Стеарат магния
4
-
260
Следующие составы, D и E, получают путем прямого прессования смешанных ингредиентов. Лактоза, использованная в составе E, представляет собой лактозу для прямого прессования.
Состав D
мг/капсула
Активный ингредиент
1
Прежелатинизированый крахмал NF15
150
-
151
Состав E
мг/капсула
Активный ингредиент
1
Лактоза
150
Avicel
100
-
251
Состав F (Состав с контролируемым высвобождением)
Этот состав получают влажной грануляцией ингредиентов (ниже) с раствором повидона с последующим добавлением стеарата магния и прессованием.
мг/таблетка
(a) Активный ингредиент
1
(b) Гидроксипропилметилцеллюлоза (Methocel K4M Premium)
112
(с) Лактоза B.P.
53
(d) Повидон B.P.С
28
(e) Стеарат магния
7
-
201
Высвобождение лекарственного средства происходит в течение периода приблизительно 6-8 часов, и оно завершается через 12 часов.
Пример D: Составы капсул
Состав A
Состав капсулы получают смешиванием ингредиентов состава D согласно примеру C, выше, и заполнением ими желатиновой твердой капсулы из двух частей. Состав B (ниже) получают сходным образом.
Состав B
мг/капсула
(a) Активный ингредиент
1
(b) Лактоза B.P.
143
(с) Натрия крахмала гликолят
25
(d) Стеарат магния
2
-
171
Состав C
мг/капсула
(a) Активный ингредиент
1
(b) Macrogol 4000 BP
350
-
351
Капсулы получают плавлением Macrogol 4000 BP, диспергированием активного ингредиента в расплаве и заполнением расплавом твердой желатиновой капсулы из двух частей.
Состав D
мг/капсула
Активный ингредиент
1
Лецитин
100
Арахисовое масло
100
-
201
Капсулы получают диспергированием активного ингредиента в лецитине и арахисовом масле и заполнением дисперсией мягких упругих желатиновых капсул.
Состав E (Капсула с контролируемым высвобождением)
Следующий состав капсулы с контролируемым высвобождением получают экструдированием ингредиентов a, b и c, используя экструдер, с последующим приданием экструдату сферической формы и сушкой. Затем высушенные гранулы покрывают контролирующей высвобождение мембраной (d) и заполняют ими твердую желатиновую капсулу из двух частей.
мг/капсула
(a) Активный ингредиент
1
(b) Микрокристаллическая целлюлоза
125
(с) Лактоза B.P.
125
(d) Этилцеллюлоза
13
-
264
Пример E: Инъецируемый состав
Активный ингредиент
1 мг
Стерильный, не содержащий пирогеновфосфатный буфер, (pH 7,0)
до 10 мл
Активный ингредиент растворяют в большей части фосфатного буфера (35-40°C), затем доводят до объема и фильтруют через стерильный фильтр с микропорами в стерильный флакон из желтого стекла объемом 10 мл (тип 1), и закрывают стерильной пробкой и дополнительными укупорочными средствами.
Пример F: Внутримышечная инъекция
Активный ингредиент
1 мг
Бензиловый спирт
0,10 г
Glucofurol 75
1,45 г
Вода для инъекции до
3,00 мл
Активный ингредиент растворяют в глюкофуроле. Затем добавляют бензиловый спирт и растворяют, и добавляют воду до 3 мл. Затем смесь фильтруют через стерильный фильтр с микропорами и закрывают в стерильных стеклянных флаконах объемом 3 мл (тип 1).
Пример G: Суспензия в виде сиропа
Активный ингредиент
1 мг
Раствор сорбита
1,5000 г
Глицерин
2,0000 г
Диспергируемая целлюлоза
0,0750 г
Бензоат натрия
0,0050 г
Вкусовая добавка, персик 17.42.3169
0,0125 мл
Очищенная вода до
5,0000 мл
Бензоат натрия растворяют в части очищенной воды и добавляют раствор сорбита. Добавляют активный ингредиент и диспергируют. В глицерине диспергируют загуститель (диспергируемую целлюлозу). Две дисперсии смешивают и доводят до требуемого объема очищенной водой. При необходимости дальнейшего сгущения достигают путем дополнительного сдвигающего усилия на суспензию.
Пример H: Суппозиорий
мг/суппозиторий
Активный ингредиент (63 мкм)*
1
Твердая смазка, BP (Witepsol H15-Dynamit Nobel)
1700
-
1771
*Активный ингредиент используют в качестве порошка, где по меньшей мере 90% частиц имеют диаметр 63 мкм или менее.
Одну пятидесятую часть Witepsol H15 расплавляют в емкости с паровой рубашкой максимум при 45°C. Активный ингредиент просеивают через 200-мкм сито и добавляют к расплавленной основе при перемешивании с использованием silverson, оборудованного режущей головкой, до достижения равномерной дисперсии. Поддерживая смесь при 45°C, в суспензию добавляют оставшийся Witepsol H15 и перемешивают ее для обеспечения гомогенной смеси. Всю суспензию пропускают через 250-мкм сито из нержавеющей стали и, при постоянном перемешивании, позволяют ей охладиться до 40°С. При температуре от 38°C до 40°C 2,02 г смеси заполняют в пригодные пластмассовые формы. Суппозиториям позволяют охладиться до комнатной температуры.
Пример I: Пессарии
мг/пессарий
Активный ингредиент
1
Безводная декстроза
380
Картофельный крахмал
363
Стеарат магния
7
-
751
Указанные выше ингредиенты прямо смешивают и получают пессарии путем прямого прессования полученной смеси.
Пример 9 - Лечение незлокачественного нарушения с использованием молекулы по изобретению
Пациенту с артритом вводят 1 мг средства по изобретению в сутки внутримышечно или с помощью препарата пролонгированного действия, доставляющего эту дозу согласно способам по изобретению.
Пример 10 - Способы смягчения боли
Молекулы по изобретению могут обеспечить эффективное снижение боли в следующих случаях боли: боль в спине, головная боль, зубная боль, боль в ухе, артрит, подагра, травма мягких тканей, травматическое повреждение связки/сухожилия, переломы костей, злокачественная опухоль, послеоперационная боль, менструальная боль, боль при родах, боль в мочеполовом тракте, боль во внутренних органах, ожоги, абсцессы и другие инфекции.
Предполагаемые способ введения и режим для лечения любого из этих состояний представляют собой введение от 0,1 мг до 1 грамма один раз в 12 часов путем ингаляции, доставляемой через ингалятор. Однако квалифицированному специалисту может быть известно, что наиболее пригодный режим лечения может зависеть от индивида и тяжести ощущаемой боли.