РАСТЕНИЯ-ТРАНСФОРМАНТЫ КУКУРУЗЫ PV-ZMIR13 (MON863) И КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ОБНАРУЖЕНИЯ
PLANT TRANSFORMANTS OF PV-ZMIR13 (MON863) MAIZE AND COMPOSITIONS AND METHODS OF IDENTIFYING THEM

Область, к которой относится изобретение
Zea mays
Diabrotica vergifera, Diabrotica undecimpunctata
Leptinotarsa decemlineata
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии растений. Более конкретно настоящее изобретение относится к растению кукурузы (), резистентному к жесткокрылым, PV-ZMIR13 и обозначенному MON863; а также к семенам и к потомству указанного растения кукурузы MON863. Растение кукурузы MON863 и его потомство являются, в частности, резистентными к  и .
Более конкретно настоящее изобретение также относится к ДНК-конструкции, встроенной в геном растения-трансформанта (event) кукурузы MON863 для сообщения ему резистентности к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых (Coleopteran). Настоящее изобретение также относится к анализам на детекцию присутствия ДНК растения кукурузы MON863 в образце и ее композиций.
Предпосылки создания изобретения
Кукуруза является ценной сельскохозяйственной культурой и главным источником питания во многих регионах мира. Для улучшения агрономических показателей и качества продуктов, производимых из растений кукурузы, применяются методы биотехнологии. Известно, что экспрессия чужеродных генов в растениях зависит от их положения на хромосоме, определяемого структурами хроматина (например, гетерохроматина) или непосредственной близостью элементов регуляции транскрипции (например, энхансеров) к сайту интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). По этой причине часто оказывается необходимым скринировать большое число трансформантов для идентификации трансформанта, характеризующегося оптимальной экспрессией нужного встроенного гена. Как известно, например, из наблюдений растений и других организмов, у различных трансформантов уровни экспрессии встроенного гена могут широко варьироваться. Могут также наблюдаться различия в типах пространственной или временной экспрессии, например различия в относительной экспрессии трансгена в различных тканях растений, которые могут не соответствовать ожидаемому характеру экспрессии, оцениваемому исходя из элементов регуляции транскрипции, присутствующих во встроенной генной конструкции. По этой причине обычно продуцируются сотни или тысячи различных трансформантов, и эти трансформанты скринируют в целях поиска одного трансформанта, который имеет желаемые уровни и типы экспрессии трансгена, необходимые для промышленного применения. Трансформант, который имеет нужные уровни или типы экспрессии трансгена, может быть использован для интрогрессии трансгена в другой генетический фон путем полового ауткроссинга с использованием стандартных методов селекции. Потомство таких кроссов сохраняет экспрессионные свойства трансгена, характерные для исходного трансформанта. Эта стратегия используется для гарантии надежной экспрессии гена у растений различных сортов, хорошо адаптированных к условиям роста в определенной местности.
Для того чтобы определить, содержит ли потомство кросса, полученного половым скрещиванием, нужный трансген, предпочтительно детектировать конкретный продукт трансформации. Кроме того, способ детекции конкретного трансформанта может оказаться полезным с точки зрения соблюдения правил, предписываемых регуляторными органами, дающими разрешение на поступление данного продукта на рынок и требующими, например, наличия на упаковке пищевого продукта информации о том, что он произведен из рекомбинантных сельскохозяйственных растений. Присутствие трансгена может быть установлено любым хорошо известным методом детекции нуклеиновых кислот, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или ДНК-гибридизация с использованием нуклеиновокислотных зондов. Эти методы детекции обычно направлены на часто используемые генетические элементы, такие как промоторы, терминаторы, маркерные гены и т.п. А поэтому такие методы не могут быть использованы для идентификации различных трансформантов, а в частности, тех трансформантов, которые продуцируются с использованием тех же самых ДНК-конструкций, за исключением тех случаев, когда последовательность хромосомной ДНК, смежная со встроенной ДНК (“фланкирующая ДНК”), является известной. Трансформант-специфический ПЦР-анализ обсуждается, например, в работе Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent. 64/5b:459-462, 1999), где был идентифицирован резистентный к глифосату трансформант сои 40-3-2 ПЦР-методом с использованием серии праймеров, охватывающих стык между вставкой и фланкирующей ДНК, а в частности, одного праймера, который включает последовательность, начинающуюся от вставки, и второго праймера, который включает последовательность, начинающуюся от фланкирующей ДНК.
Краткое описание изобретения
В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к композициям и к способам детекции присутствия области-вставки “трансген/геном” в новом растении кукурузы PV-ZMIR13, обозначенном MON863. Настоящее изобретение относится к ДНК-последовательностям, которые содержат, по меньшей мере, одну последовательность стыка в MON863, выбранную из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO:1 (стыка “произвольно установленная 5'-концевая вставка - геном”) и последовательности SEQ ID NO:2 (стыка “произвольно установленная 3'-концевая вставка - геном”) и их комплементов, где указанная последовательность стыка охватывает область стыка между гетерологичной ДНК, встроенной в геном кукурузы, и ДНК клетки кукурузы, фланкирующей сайт инсерции, и является диагностическим признаком для данного трансформанта.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения описаны, например, ДНК-последовательности, которые содержат новую область-вставку “трансген/геном”, SEQ ID NO:3 (последовательность, содержащая произвольно установленный 5'-конец встроенной ДНК) и SEQ ID NO:4 (последовательность, содержащая произвольно установленный 3'-конец встроенной ДНК).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения также описаны ДНК-последовательности, которые содержат, по меньшей мере, примерно от 11 до 50 или более нуклеотидов 5'-трансгенной части ДНК-последовательности SEQ ID NO:7 и 5'-фланкирующую ДНК-последовательность кукурузы SEQ ID NO:5 аналогичной длины, или 3'-трансгенную часть ДНК-последовательности кукурузы SEQ ID NO:8 аналогичной длины и 3'-фланкирующую ДНК кукурузы SEQ ID NO:6 аналогичной длины, и которые используются в качестве ДНК-праймеров в методах амплификации ДНК. Ампликоны, продуцированные с использованием этих праймеров, являются диагностическими показателями присутствия трансформанта кукурузы MON863. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к ампликону, продуцированному первым ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:7 и связанным со вторым ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:5, где оба этих праймера присутствуют в реакционной смеси вместе с ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к ампликону, продуцированному третьим ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:8, и связанным с четвертым ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:6, где оба эти праймера присутствуют в реакционной смеси вместе с ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к растению кукурузы MON863 и к его потомству, происходящему от растений, которые содержат указанные ДНК-последовательности, используемые в реакции амплификации ДНК для получения одного или нескольких диагностических ампликонов.
В еще одном предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способам детекции присутствия ДНК, соответствующей ДНК трансформанта кукурузы MON863, в образце. Указанные способы включают стадии: (а) контактирования биологического образца, предположительно содержащего ДНК трансформанта MON863, с парой праймеров, которые, при использования в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с указанной ДНК, продуцируют ампликон, который является диагностическим показателем присутствия трансформанта кукурузы MON863; (b) проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты с продуцированием ампликона; и (с) детекции указанного ампликона. Конкретно проиллюстрированные здесь ампликоны соответствуют первому ампликону, имеющему примерно 508 пар нуклеотидов и представленному в SEQ ID NO:3, и второму ампликону, имеющему примерно 584 пар нуклеотидов и представленному в SEQ ID NO:4, либо более длинным или более коротким ампликонам, где указанный первый ампликон содержит, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1 и простирающуюся примерно от нуклеотида 1 до нуклеотида 11, или примерно от нуклеотида 10 до нуклеотида 20, а указанный второй ампликон содержит, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:2 и простирающуюся примерно от нуклеотида 1 до нуклеотида 11, или примерно от нуклеотида 10 до нуклеотида 20.
В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способам детекции присутствия ДНК, соответствующей трансформанту MON863, в образце. Указанные способы включают стадии: (а) контактирования биологического образца, предположительно содержащего ДНК трансформанта MON863, с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с указанной ДНК и не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК контрольного растения кукурузы, не содержащего встроенную ДНК, происходящую от pMON25097; (b) создания жестких условий гибридизации для указанного образца и зонда; и (с) детекции гибридизации указанного зонда с геномной ДНК, где детекция связывания зонда с указанной ДНК является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта MON863 в указанном образце.
В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к новому растению кукурузы MON863, которое включает ДНК-последовательности, содержащие новые области вставки трансген/геном и представленные в SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4. В других своих вариантах настоящее изобретение относится к семенам растений MON863, к потомству растений MON863 и к способам продуцирования растения кукурузы путем скрещивания растения кукурузы MON863 с этим же растением или с другим растением кукурузы.
Вышеуказанные и другие предпочтительные варианты настоящего изобретения будут более понятными из нижеследующего подробного описания.
Краткое описание чертежей и последовательностей
Описание чертежей
На фиг.1 проиллюстрирован экспрессирующий вектор PV-ZMIR13, также обозначенный pMON25097, с помощью которого был генерирован трансформант растения кукурузы MON863, резистентный к кукурузному листоеду, методом бомбардировки ускоренными частицами с использованием рестрикционного M1ul-фрагмента, расположенного примерно от положения нуклеотида 149 до положения нуклеотида 4840.
На фиг.2 представлена графическая схема, иллюстрирующая общую организацию элементов, содержащих гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, встроенные в геном трансформанта кукурузы MON863, и указаны основные положения, в которых встроенные последовательности нуклеиновой кислоты присоединены к геномным ДНК-последовательностям кукурузы, именуемым здесь как геномные последовательности нуклеиновой кислоты кукурузы, фланкирующие концы встроенных гетерологичных ДНК-последовательностей; ниже охарактеризован трансформант кукурузы MON863, который содержит следующие последовательности: геномную ДНК кукурузы [1] (SEQ ID NO:5), фланкирующую произвольно установленный 5'-конец полноразмерной первичной функциональной встроенной ДНК-последовательности и являющуюся смежной с неприродной промоторной последовательностью CaMV35S AS4, [2], (P-CaMV.AS4 SEQ ID NO:17), функционально присоединенной к нетранслируемой лидерной последовательности связывающего белка А/В хлорофилла пшеницы, [3], (L-Ta.hcbl, SEQ ID NO:18), которая функционально присоединена к интронной последовательности актина риса, [4], (I-Os.Actl, SEQ ID NO:19), которая в свою очередь функционально присоединена к неприродной последовательности, кодирующей вариант белка Cry3Bb, [5], (SEQ ID NO:20) и функционально присоединенной к последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования белка теплового шока Hspl7 пшеницы, [6], (Т-Ta.Hspl7, SEQ ID NO:21), и полноразмерную первичную функциональную встроенную ДНК-последовательность, фланкированную геномной ДНК кукурузы у произвольно установленного 3'-конца, [7] (SEQ ID NO:6), где стык между [1] и [2] ([8]) соответствует SEQ ID NO:1, а стык между [6] и [7] ([9]) соответствует SEQ ID NO:2.
Описание последовательностей
SEQ ID NO:1 соответствует последовательности стыка между геномной и встроенной ДНК кукурузы, которая является диагностическим признаком для произвольно установленного 5'-конца полноразмерной первичной функциональной встроенной ДНК-последовательности в трансформанте кукурузы MON863.
SEQ ID NO:2 соответствует последовательности стыка между геномной и встроенной ДНК кукурузы, которая является диагностическим признаком для произвольно установленного 3'-конца полноразмерной первичной функциональной встроенной ДНК-последовательности в трансформанте кукурузы MON863.
SEQ ID NO:3 соответствует последовательности, представленной, в основном, последовательностями [1] и [2] на фиг.2.
SEQ ID NO:4 соответствует последовательности, представленной, в основном, последовательностями [6] и [7] на фиг.2.
SEQ ID NO:5 соответствует неполной геномной ДНК-последовательности кукурузы, которая является смежной с произвольно установленным 5'-концом неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863, и фланкирует указанный 5'-конец.
SEQ ID NO:6 соответствует неполной геномной ДНК-последовательности кукурузы, которая является смежной с произвольно установленным 3'-концом неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863, и фланкирует указанный 3'-конец.
SEQ ID NO:7 соответствует последовательности произвольно установленного 5'-конца неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863.
SEQ ID NO:8 соответствует последовательности произвольно установленного 3'-конца неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863.
SEQ ID NO:9 соответствует 5'-праймерной последовательности (праймер А), комплементарной части геномной ДНК-последовательности кукурузы, идентифицированной как последовательность, фланкирующая произвольно установленный 5'-конец полноразмерной первичной функциональной ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим обратному комплементу последовательности, представленной в SEQ ID NO:10 и с матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:3, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.
SEQ ID NO:10 соответствует обратному комплементу 3'-праймерной последовательности (праймер В), комплементарной части произвольно установленной 5'-концевой полноразмерной первичной функциональной ДНК, встроенной в геном кукурузы в трансформанте кукурузы MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим последовательности, представленной в SEQ ID NO:9 и матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:3, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.
SEQ ID NO:11 соответствует 5'-праймерной последовательности (праймер С), комплементарной части произвольно установленной 3'-концевой последовательности полноразмерной первичной функциональной ДНК, встроенной в геном кукурузы в трансформанте MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим обратному комплементу последовательности, представленной в SEQ ID NO:12 и с матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:4, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.
SEQ ID NO:12 соответствует обратному комплементу 3'-праймерной последовательности (праймер D), комплементарной части геномной ДНК-последовательности кукурузы, идентифицированной как последовательность, фланкирующая произвольно установленный 3'-конец полноразмерной первичной функциональной ДНК, встроенной в трансформант кукурузы MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и с матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:4, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.
SEQ ID NO:13 соответствует 5'-праймеру 1 для “прогулки по геному”.
SEQ ID NO:14 соответствует 5'-праймеру 2 для “прогулки по геному”.
SEQ ID NO:15 соответствует 3'-праймеру 1 для “прогулки по геному”.
SEQ ID NO:16 соответствует 3'-праймеру 2 для “прогулки по геному”.
SEQ ID NO:17 соответствует промоторной последовательности CaMV35S AS4.
SEQ ID NO:18 соответствует нетранслируемой лидерной последовательности связывающего белка А/В хлорофилла пшеницы (L-Ta.hcb1).
SEQ ID NO:19 соответствует интронной последовательности актина риса (I-Os.Act1).
SEQ ID NO:20 соответствует неприродной последовательности, кодирующей вариант белка Cry3Bb.
SEQ ID NO:21 соответствует последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования белка теплового шока Hsp17 пшеницы (Т-Ta.Hsp17).
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Ниже приводятся определения терминов и описание методов для лучшей характеризации настоящего изобретения и для облегчения его практического осуществления. Термины, которые не определены конкретно в нижеследующем описании, следует понимать в их обычно принятом значении. Определения общих терминов в молекулярной биологии можно также найти в работах Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991, и у Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Номенклатура для оснований ДНК используется в соответствии со ст. 37 Свода федеральных правил (CFR) § 1.822.
При использовании в настоящем описании термина “биологический образец” или “образец” предусматривается, что он включает нуклеиновые кислоты, полинуклеотиды, ДНК, РНК, тРНК, кДНК и т.п. в композиции с субстратом или фиксированные на субстрате, который позволяет проводить анализ образца с использованием молекулярного зонда или термоамплификацию с использованием олигонуклеотидных зондов и/или праймеров.
Zea mays
Используемый здесь термин “кукуруза” означает  или маис и охватывает все сорта растений, которые могут быть скрещены с кукурузой, включая дикие виды маиса.
Используемый здесь термин “содержащий” означает “включающий, но не ограничивающийся”.
Используемый здесь термин “диагностический” относится к показателю, используемому в целях идентификации последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащихся в трансформанте кукурузы MON863 или происходящих от этого трансформанта; причем любая одна или несколько новых описанных здесь ДНК-последовательностей должны содержать геномные фланкирующие последовательности кукурузы, смежные и связанные с произвольно установленными концами встроенных гетерологичных ДНК-последовательностей, что является необходимым и достаточным для описания отличительных признаков генома трансформанта кукурузы MON863 при условии, что данная последовательность содержит, по меньшей мере, часть одного из концов встроенной гетерологичной ДНК-последовательности или кукурузной геномной последовательности, фланкирующей один из этих концов или смежной с этим концом, и включает, по меньшей мере, два нуклеотида, то есть динуклеотид, содержащий сайт, в котором кукурузная геномная последовательность и встроенная гетерологичная ДНК-последовательность присоединены друг к другу фосфодиэфирной связью. Специалистам хорошо известно, что если последовательность, которая является диагностическим признаком для конкретного трансформанта, такого как описываемый здесь трансформант кукурузы MON863, не присутствует в конкретном образце, содержащем геномные нуклеиновые кислоты кукурузы, то это является показателем того, что данный образец не содержит диагностической последовательности, а значит в указанном образце данные нуклеиновые кислоты отсутствуют либо эти нуклеиновые кислоты не происходят от генома трансформанта кукурузы MON863 и не содержатся в геноме этого трансформанта. Кроме того, в трансформанте кукурузы MON863 присутствуют описанные здесь дополнительные новые и диагностические последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 и их комплементов.
Трансгенный “трансформант” (“event”) продуцируется путем трансформации клеток растения гетерологичной ДНК, то есть нуклеиновокислотной конструкцией, которая включает нужный трансген, с последующей регенерацией популяции растений в результате встраивания трансгена в геном растения и отбора конкретного растения, характеризующегося наличием вставки в конкретном положении генома. Термин “трансформант” (“event”) означает исходный трансформант и потомство этого трансформанта, которое включает гетерологичную ДНК. Термин “трансформант” (“event”) также означает потомство, продуцированное путем полового ауткроссинга между данным трансформантом и другим сортом, который включает гетерологичную ДНК. Даже после повторного возвратного скрещивания (беккроссинга) с рекуррентным родителем встроенная ДНК и фланкирующая ДНК от трансформированного родителя присутствует в потомстве этого кросса в том же самом положении хромосомы. Термин “трансформант” (“event”) также означает ДНК от исходного трансформанта, содержащего встроенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно смежную со встроенной ДНК, которая, как ожидается, должна передаваться потомству, которое наследует встроенную ДНК, включающую нужный трансген, переданный в результате полового скрещивания родительской линии, содержащей встроенную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), с родительской линией, которая не содержит встроенной ДНК.
Следует также отметить, что могут быть также скрещены два различных трансгенных растения с продуцированием потомства, которое содержит два или более независимо сегрегирующихся экзогенных гена (термин “экзогенные гены” означает нуклеотидные последовательности, которые не встречаются в природном геноме данного растения, то есть являются гетерогенными для данного растения кукурузы). В результате самоопыления соответствующего потомства могут продуцироваться растения, которые являются гомозиготными по любой комбинации этих экзогенных генов. В настоящем изобретении также рассматривается беккроссинг с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Описание других методов скрещивания, которые обычно используются для получения различных фенотипов и культур, можно найти в одной из нескольких работ, например, Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox, J. ed. American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
“Зонд” представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, к которой может быть присоединена или с которой может быть связана стандартная детектируемая метка или репортерная молекула, например радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент. Такой зонд является комплементарным последовательности, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, а в случае настоящего изобретения последовательности геномной ДНК, происходящей от трансформанта кукурузы MON863, либо от растения кукурузы, либо из образца, который включает ДНК данного трансформанта. Зонды настоящего изобретения включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также и полиамиды и другие материалы-зонды, которые специфически связываются с ДНК-последовательностью-мишенью и могут быть использованы для детекции на присутствие такой ДНК-последовательности-мишени.
“Праймеры” представляют собой выделенные нуклеиновокислотные зонды, которые, в случае любого одного из данных праймеров, отжигаются с комплементарной ДНК-последовательностью-мишенью посредством гибридизации нуклеиновых кислот с образованием гибрида между праймером и ДНК-последовательностью-мишенью с последующим удлинением вдоль цепи ДНК-мишени под действием полимеразы, например ДНК-полимеразы. Термин “пары праймеров” настоящего изобретения означает две или более различных праймерных последовательности, используемых для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, которая присутствует между последовательностями-мишенями и связана с этими последовательностями-мишенями, называемыми обратным комплементом или, по существу, обратным комплементом праймеров, и где указанная амплификация осуществляется, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или другими стандартными методами амплификации нуклеиновых кислот.
Зонды и праймеры обычно имеют длину примерно от 11 нуклеотидов или более, предпочтительно, примерно от 18 нуклеотидов или более, более предпочтительно, примерно от 24 нуклеотидов или более, а наиболее предпочтительно, примерно от 30 нуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры специфически гибридизуются с последовательностью-мишенью в условиях гибридизации высокой жесткости. Зонды и праймеры настоящего изобретения, предпочтительно, имеют полную последовательность, аналогичную последовательности-мишени, хотя в соответствии со стандартными методами могут быть сконструированы зонды, отличающиеся от последовательности-мишени и сохраняющие способность гибридизоваться с последовательностями-мишенями.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Current Protocols in Molecular Biology
Методы получения и использования зондов и праймеров описаны, например, в руководстве , 2nd ed., vol.1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (далее называемом “Sambrook et al., 1989”);  ed. Ausubel et al., Greene Publisching Associates and Wiley Interscience, New York, 1992 (с периодическими исправлениями) (далее называемом “Ausubel et al., 1992”); и Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Пары ПЦР-праймеров могут быть получены из известной последовательности, например, с использованием компьютерных программ, таких как программа “Primer”, предназначенная для этих целей (Version 0,5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Праймеры и зонды, сконструированные на основе фланкирующей ДНК, последовательностей-вставок и последовательностей стыков, описанных в настоящей заявке, могут быть использованы для подтверждения присутствия рассматриваемых последовательностей в образце стандартными методами, например путем повторного клонирования и секвенирования таких последовательностей.
Любой отдельно взятый нуклеиновокислотный зонд или праймер настоящего изобретения гибридизуется со специфической ДНК-последовательностью-мишенью в жестких условиях. Для идентификации присутствия ДНК, происходящей от трансгенсодержащего трансформанта в образце, могут быть использованы любые методы гибридизации или амплификации. Молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагменты специфически гибридизуются с другими молекулами нуклеиновой кислоты в определенных условиях. В соответствии с настоящим изобретением считается, что используемые здесь две различные молекулы нуклеиновой кислоты, каждая из которых содержит различные последовательности, специфически гибридизуются друг с другом, если указанные две молекулы образуют антипараллельную двухцепочечную структуру нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты считается “комплементарной” другой молекуле нуклеиновой кислоты, если эти молекулы имеют полную комплементарность. Считается, что используемые здесь молекулы имеют “полную комплементарность”, если каждый нуклеотид одной молекулы комплементарен нуклеотиду другой молекулы. В соответствии с настоящим изобретением считается, что две молекулы имеют “минимальную комплементарность”, если они могут гибридизоваться друг с другом со стабильностью, достаточной для их гибридизации друг с другом, по меньшей мере, в стандартных условиях “низкой жесткости”. Аналогичным образом считается, что данные молекулы являются комплементарными, если они могут гибридизоваться друг с другом со стабильностью, достаточной для их гибридизации друг с другом, по меньшей мере, в стандартных условиях “высокой жесткости”. Стандартные условия жесткости описаны у Sambrook et al., 1989, и у Haymes et al. (Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985). Поэтому отклонение от полной комплементарности допускается при условии, что такие отклонения абсолютно не препятствуют способности данных молекул образовывать двухцепочечные структуры. Для того чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, необходимо лишь, чтобы она была достаточно комплементарной последовательности, способной образовывать стабильную двухцепочечную структуру в конкретном растворителе и в конкретных концентрациях соли.
Термин “специфический для (последовательности-мишени)” указывает на то, что зонд или праймер гибридизуется в жестких условиях гибридизации только с последовательностью-мишенью в образце, содержащем такую последовательность-мишень, и что такая гибридизация является детектируемой.
Используемый здесь термин “выделенная нуклеиновая кислота” означает нуклеиновую кислоту, которая является, в основном, отделенной или очищенной от других последовательностей нуклеиновой кислоты в клетке данного организма, в которой обычно присутствует данная нуклеиновая кислота, то есть от других хромосомных и внехромосомных ДНК и РНК, стандартными методами очистки нуклеиновых кислот. Этот термин также включает рекомбинантные нуклеиновые кислоты и химически синтезированные нуклеиновые кислоты.
Current Protocols in Molecular Biology
Используемый здесь термин “по существу гомологичная последовательность” означает последовательность нуклеиновой кислоты, специфически гибридизующуюся с комплементом последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она сравнивается, то есть с последовательностью-мишенью, в условиях высокой жесткости. Соответствующие условия жесткости, которые обеспечивают гибридизацию ДНК, такие как, например, использование 6,0 × хлорида натрия/цитрат натрия (SSC) примерно при 45°С, и промывки 2,0 × SSC при 50°С, являются известными либо их описание можно найти в руководстве , John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6., 1989. Так, например, концентрация соли в стадии промывки может быть выбрана из концентрации, используемой в условиях низкой жесткости и составляющей примерно 2,0 × SSC при 50°С, и концентрации, используемой в условиях высокой жесткости и составляющей примерно 0,2 × SSC при 50°С. Кроме того, температура в стадии промывки может быть увеличена от комнатной температуры, используемой в условиях низкой жесткости и составляющей примерно 22°С, до температуры, используемой в условиях высокой жесткости и составляющей примерно 65°С. Температура реакции и концентрация соли могут одновременно варьироваться, либо температура может оставаться постоянной, а концентрация соли варьироваться, или наоборот. В предпочтительном варианте нуклеиновая кислота настоящего изобретения может специфически гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, представленными либо в SEQ ID NO:1, либо в SEQ ID NO:2, или с их комплементами или фрагментами в условиях умеренной жесткости, например, примерно в присутствии 2,0 × SSC и при температуре примерно 65°С. В особенно предпочтительном варианте нуклеиновая кислота настоящего изобретения может специфически гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, представленными либо в SEQ ID NO:1, либо в SEQ ID NO:2, или с их комплементами или фрагментами в условиях высокой жесткости. Нуклеиновая кислота настоящего изобретения, которая гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:1, или с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:3, необязательно должна гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:2, или последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:4, и наоборот.
В одном из аспектов настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или ее комплементы или фрагменты. В другом аспекте настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения на 80 - 100% или на 90 - 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, ее комплементу или фрагментам. В другом аспекте настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения на 95 - 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, ее комплементу или фрагментам. SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 могут быть использованы в качестве маркеров для идентификации потомства генетических кроссов в методах скрещивания растений, аналогичных методам, описанным для простого анализа на наличие ДНК-маркеров повторяющихся последовательностей, как описано в “DNA markers: Protocols, Applications, and Overviews, 173-185, Cregan et al., eds., Wiley-Liss NY, 1997. Гибридизация зонда с молекулой ДНК-мишени может быть детектирована различными методами, известными специалистам, и такими методами являются, но не ограничиваются ими, методы с использованием флуоресцентных меток, радиоактивных меток, меток на основе антител и хемилюминесцентных меток.
Что касается амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени (например, с помощью ПЦР), проводимой с использованием конкретной пары праймеров для амплификации, то “жесткими условиями” являются такие условия, которые позволяют отдельным праймерам в данной паре праймеров гибридизоваться только с отдельной и уникальной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, с которой должен связываться каждый праймер, содержащий соответствующую последовательность дикого типа (или ее комплемент), а предпочтительно продуцировать уникальный продукт амплификации, ампликон, в реакции термоамплификации ДНК.
Используемый здесь термин “трансформация” означает перенос фрагмента нуклеиновой кислоты в геном организма-хозяина, такого как растение-хозяин, в результате генетически стабильного наследования. Растения-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновой кислоты, называются “трансгенными растениями”.
Используемый здесь термин “амплифицированная ДНК” или “ампликон” означает продукт амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которая является частью матричной нуклеиновой кислоты. Так, например, для того чтобы определить, содержит или не содержит данное растение кукурузы, полученное в результате полового скрещивания, геномную ДНК трансгенного растения, происходящую от растения кукурузы MON863 настоящего изобретения, ДНК, экстрагированная из образца ткани растения кукурузы, может быть подвергнута нуклеиновокислотной амплификации с использованием пары праймеров, которая включает один праймер, происходящий от фланкирующей последовательности в геноме растения, смежной с сайтом инсерции встроенной гетерологичной ДНК, и второй праймер, происходящий от встроенной гетерологичной ДНК, в результате чего будет продуцироваться ампликон, который является диагностическим признаком присутствия трансгенной ДНК. Ампликон имеет длину и последовательность, которые также являются диагностическими показателями присутствия трансгенной ДНК. Длина этого ампликона может составлять в пределах от общей длины пар праймеров плюс одна пара нуклеотидов, предпочтительно плюс примерно пятьдесят пар нуклеотидов, более предпочтительно плюс примерно двести пятьдесят пар нуклеотидов, и даже более предпочтительно плюс примерно четыреста пятьдесят пар нуклеотидов. Альтернативно пара праймеров может происходить от фланкирующей последовательности с обеих сторон от встроенной ДНК так, чтобы мог продуцироваться ампликон, который включает всю вставку нуклеотидной последовательности. Член пары праймеров, происходящий от геномной последовательности растения, может быть локализован на определенном расстоянии от встроенной ДНК-последовательности, причем это расстояние может варьироваться в пределах, примерно, от одной пары нуклеотидов до двадцати тысяч пар нуклеотидов. В частности, используемый здесь термин “ампликон” исключает димеры праймеров, которые могут образовываться в реакции термоамплификации ДНК.
inter alia
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications
Амплификация нуклеиновых кислот может быть осуществлена различными известными методами амплификации нуклеиновых кислот, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Такие методы амплификации известны специалистам и описаны, , в патентах США №№ 4683195 и 4683202 и в руководстве , Innis et al., Academic Press: San Diego, 1990. Методы ПЦР-амплификации были разработаны для амплификации до 22 т.п.н. геномной ДНК и до 42 т.п.н. ДНК бактериофага (Cheng et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 91:5695-5699, 1994). Эти методы, а также другие методы, известные специалистам в области амплификации ДНК, могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. Последовательность гетерологичной ДНК-вставки или фланкирующей последовательности, происходящей от трансформанта кукурузы MON863, может быть подтверждена (и при необходимости скорректирована) путем амплификации таких последовательностей указанного трансформанта, с использованием праймеров, происходящих от описанных здесь последовательностей, и последующего проведения стандартного ДНК-секвенирования ПЦР-ампликона или клонированной ДНК.
Ампликон, продуцированный этими методами, может быть детектирован многими способами. Одним из таких способов является анализ генетического кода (Nikiforov et al., Nucleic Acid Res., 22:4167-4175, 1994), где конструируют ДНК-олигонуклеотид, перекрывающийся как со смежной фланкирующей геномной ДНК-последовательностью, так и со встроенной ДНК-последовательностью. Указанный олигонуклеотид иммобилизуют на лунках микролуночного планшета. После проведения ПЦР нужной области (с использованием одного праймера во встроенной последовательности и одного праймера в смежной фланкирующей геномной последовательности) одноцепочечный ПЦР-продукт может быть гибридизован с иммобилизованным олигонуклеотидом и может служить в качестве матрицы для реакции удлинения на одно основание с использованием ДНК-полимеразы и меченных ddNTP, специфических к следующему предполагаемому основанию. Считывание данных может быть осуществлено с помощью флуоресцентного анализа или ELISA-анализа. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно основание сигнал указывает на присутствие вставки/фланкирующей последовательности.
Другим методом является метод пиросеквенирования, описанный Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). В этом методе конструируют олигонуклеотид, перекрывающийся со стыком смежной геномной ДНК и ДНК-вставки. Этот олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечным ПЦР-продуктом, происходящим от нужной области (с одним праймером во встроенной последовательности и одним праймером во фланкирующей геномной последовательности), и инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ, сульфурилазы, люциферазы, апиразы, аденозин-5'-фосфосульфата и люциферина. Затем отдельно добавляют DNTP, и его включение продуцирует световой сигнал, который измеряют. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно или множество оснований этот световой сигнал указывает на присутствие трансгенной вставки/фланкирующей последовательности.
Флуоресцентная поляризация, описанная Chen et al. (Genome Res. 9:492-498, 1999), представляет собой метод, который может быть использован для детекции ампликона настоящего изобретения. С использованием этого метода был сконструирован олигонуклеотид, который перекрывается со стыком геномной фланкирующей последовательности и встроенной ДНК. Этот олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечным ПЦР-продуктом, происходящим от нужной области (с одним праймером во встроенной ДНК и одним праймером во фланкирующей геномной ДНК-последовательности), и инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы и флуоресцентно меченного ddNTP. Удлинение на одно основание приводит к включению ddNTP. Такое включение может быть измерено по изменению поляризации с использованием флуориметра. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно основание изменение поляризации указывает на присутствие трансгенной вставки/фланкирующей последовательности.
Метод Такмана (Taqman) (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) описан как метод детекции и количественного определения присутствия ДНК-последовательности и его полное объяснение приводится в инструкциях производителя. Вкратце, был сконструирован олигонуклеотидный зонд FRET, который перекрывается со стыком геномной фланкирующей последовательности и ДНК-вставки. Зонд FRET и ПЦР-праймеры (один праймер во встроенной ДНК и один праймер во фланкирующей геномной ДНК-последовательности) подвергают циклам гибридизации в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. Гибридизация зонда FRET приводит к отщеплению и высвобождению флуоресцентной части от нефлуоресцирующей части на зонде FRET. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно основание флуоресцентный сигнал указывает на присутствие фланкирующей последовательности/трансгенной вставки.
Молекулярные сигнальные индикаторы, используемые для детекции последовательностей, описаны в работе Tyangi et al. (Nature Biotech. 14:303-308, 1996). Вкратце, был сконструирован олигонуклеотидный зонд FRET, который перекрывается со стыком геномной фланкирующей последовательности и ДНК-вставки. Зонд FRET и ПЦР-праймеры (один праймер во встроенной ДНК и один праймер во фланкирующей геномной ДНК-последовательности) подвергают циклам гибридизации в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. После успешной ПЦР-амплификации гибридизация зонда FRET с последовательностью-мишенью приводит к удалению вторичной структуры зонда и пространственному отделению флуоресцентной части от нефлуоресцирующей части. В результате этого продуцируется флуоресцентный сигнал. При успешной амплификации и гибридизации этот флуоресцентный сигнал указывает на наличие фланкирующей последовательности/трансгенной вставки.
Все вышеуказанные способы могут быть модифицированы в целях определения типа зиготности конкретного образца нуклеиновых кислот, происходящих от одного источника. Так, например, трансформант растения кукурузы MON863, который является гомозиготным по трансгенному аллелю 863, содержит в своем геноме две копии данного трансгенного аллеля 863, являющегося характерным и диагностическим признаком генома этого трансформанта кукурузы MON863, а поэтому при самоопылении должно продуцироваться чистосортное растение. Альтернативно гомозиготное растение трансгенной кукурузы MON863 может быть скрещено с другим сортом кукурузы, и в результате такого скрещивания должны продуцироваться растения, которые являются гетерозиготными по трансгенному аллелю MON863. Рассматриваются методы, с помощью которых каждый специалист может определить тип зиготности конкретного растения по трансгенному аллелю MON863.
Так, например, использование трех различных праймеров в реакции амплификации ДНК трансформанта кукурузы MON863 в качестве матрицы и в отдельной и параллельной реакции амплификации ДНК кукурузы негативного контроля, которая не является MON863, то есть не содержит встроенную ДНК, присутствующую в ДНК MON863, должно приводить к двум различным результатам в зависимости от типа зиготности ДНК кукурузы, содержащей ДНК трансгенной кукурузы. Подходящие праймеры могут быть выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:12. Амплификация ДНК не-MON863 с использованием этой группы праймеров будет, в случае пары праймеров SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:12, приводить к продуцированию первого ампликона, соответствующего непрерывной геномной последовательности кукурузы, в которую была встроена последовательность PV-ZMIR13, то есть амплифицированной последовательности, в основном, соответствующей комбинации связанных SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6. При этом предполагается, что указанный первый ампликон должен находиться в растении, которое является гетерозиготным по трансгенному аллелю кукурузы MON863, однако гетерозигота также должна продуцировать второй ампликон, соответствующий последовательности SEQ ID NO:3 и образованный в результате удлинения пары праймеров, соответствующих SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Растение кукурузы, содержащее ДНК, которое является гомозиготным по аллелю MON863, должно продуцировать лишь второй ампликон.
Аналогичным образом третий ампликон должен продуцироваться в результате реакции термоамплификации, в которой используются праймеры SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 с матричной ДНК, происходящей от растения кукурузы MON863, где указанный третий ампликон соответствует SEQ ID NO:4. Этот третий ампликон должен представлять собой ампликон, продуцируемый лишь с использованием данной конкретной комбинации праймеров и матричной ДНК, если указанное растение является гомозиготным по аллелю MON863, однако использование гетерозиготной матричной ДНК должно приводить к амплификации первого и третьего ампликонов, а использование матричной ДНК не-MON863 должна приводить к амплификации только первого ампликона.
Посредством молекулярной характеризации авторами настоящего изобретения было определено, что трансформант кукурузы MON863 содержит первичную функциональную вставку, включающую значительную часть трансформирующей плазмиды, PV-ZMIR13. Этот сегмент является детектируемым и диагностическим показателем присутствия последовательностей нуклеиновой кислоты трансформанта MON863 в образце, а в частности, в растениях, которые были подвергнуты самоопылению после продуцирования трансформанта MON863.
Agrobacterium
Zea mays
Существует много методов трансформации молекул нуклеиновой кислоты Cry3Bb в клетки растения, такого как клетки растения кукурузы, для продуцирования нужного трансформанта, такого как MON863. Очевидно, что подходящими методами являются, фактически, любые методы, с помощью которых молекулы нуклеиновой кислоты могут быть введены в данные клетки, например посредством инфицирования  или посредством прямой доставки молекул нуклеиновой кислоты, которая может быть осуществлена путем ПЕГ-опосредованной трансформации, электропорации и бомбардировки ускоренными частицами, покрытыми ДНК, и т.п. (Pottykus, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 42:205-225, 1991; Vasil, Plant Mol. Biol. 25:925-937, 1994). Так, например, электропорация была использована для трансформации протопластов  (Fromm et al., Nature 312:791-793, 1986). В основном наиболее часто используемыми общими методами доставки гена в клетки являются следующие четыре типа методов: (1) химические методы (Graham and van der Eb, Virology, 54:536-539, 1973), (2) физические методы, такие как микроинжекция (Capecchi, Cell 22:479-488, 1980), электропорация (Wong and Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-587, 1982; Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:5824-5828, 1985, патент США № 5384253) и “выстреливание” гена (Jonhston & Tang, Methods Cell Biol. 43:353-365, 1994); (3) метод с использованием вирусных векторов (Clapp, Clin. Perinatol. 20:155-168, 1993; Lu et al., J. Exp. Med. 178:2089-2096, 1993; Eglitis & Anderson, Biotechniques 6:608-614, 1988) и (4) метод на основе опосредуемых рецепторами механизмов (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3:147-154, 1992; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:6099-6103, 1992).
Трансформация протопластов растения может быть достигнута методами на основе преципитации фосфатом кальция, обработки полиэтиленгликолем, электропорации и их комбинации. См., например, Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 205:193-200, 1986; Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199:178, 1985; Fromm et al., Nature, 319:791, 1986; Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet. 204:204, 1986, Callis et al., Genes and Development, 1183, 1987; Marcotte et al., Nature, 335:454, 1988. Применение этих систем к различным видам растений зависит от способности растения данного вида регенерироваться из протопластов. Из этих методов подходящими методами для кукурузы являются методы, описанные в патенте США № 5569834 и в патенте США № 5416011; McCabe et al., Biotechnology 6:923, 1988; Christou et al., Plant Physiol., 87:671-674, 1988. Примерами методов регенерации зерновых культур из протопластов являются также методы, описанные Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2:74, 1985; Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205:34, 1986; Yamada et al., Plant Cell Rep.4:85, 1986; Abdullah et al., Biotechnology, 4:1087, 1986.
Трансгенное растение, такое как трансгенное растение кукурузы MON863, продуцированное методами трансформации, обычно содержит один добавочный ген Cry3Bb на одной хромосоме. Такое трансгенное растение может называться гетерозиготным по добавочному гену Cry3Bb. Более предпочтительным является трансгенное растение, гомозиготное по добавочному гену Cry3Bb, то есть трансгенное растение, содержащее два добавочных гена Cry3Bb, один ген в одном и том же локусе на каждой из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено путем полового скрещивания (самоопыления) независимо сегрегированного трансгенного растения, которое содержит один добавочный ген Cry3Bb, проращивания некоторых продуцированных семян и анализа полученных растений на присутствие гена Cry3Bb.
Следует отметить, что два различных трансгенных растения могут быть также скрещены с получением потомства, которое содержит два независимо сегрегирующихся добавочных гена Cry3Bb. Самоопыление соответствующего потомства может продуцировать растения, которые являются гомозиготными по обоим добавочным генам Cry3Bb, кодирующим полипептиды Cry3Bb. В настоящем изобретении также рассматривается возвратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение.
В частности, способ продуцирования растения кукурузы, резистентного к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых, может быть осуществлен путем проведения следующих стадий: 1) полового скрещивания первого растения кукурузы, выращенного из семян трансгенной кукурузы MON863, содержащих молекулу ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:20, и сообщающую резистентность к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых, и второго растения кукурузы, не обладающего резистентностью к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых, и продуцирования в результате этого скрещивания множества растений первого потомства; 2) отбора растений первого потомства, которые являются резистентными к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых; 3) самоопыления растения указанного первого потомства с продуцированием множества растений второго потомства; и 4) отбора из указанных растений второго потомства растения, резистентного к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых. Растение первого потомства, которое является резистентным к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых, или растение второго потомства, которое является резистентным к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых, может быть подвергнуто возвратному скрещиванию со вторым растением кукурузы или с третьим растением кукурузы с получением растения кукурузы, резистентного к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых.
Methods for Plant Molecular Biology
Методы регенерации, выведения и культивирования растений, таких как растения MON863, из трансформантов или различных трансформированных эксплантатов хорошо известны специалистам (Weissbach & Weissbach, , Eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1988). Такой способ регенерации и культивирования обычно включает стадии отбора трансформированных клеток, содержащих экзогенные гены Cry3Bb, культивирования этих специализированных клеток путем проведения обычных стадий эмбрионального развития с последующим проведением стадии укоренения проростков. Трансгенные эмбрионы и семена регенерируются аналогичным образом. Полученные трансгенные корневые отпрыски затем высаживают в соответствующую среду для выращивания растений, такую как почва.
Методы регенерации растений, содержащих чужеродный экзогенный ген, кодирующий нужный белок, хорошо известны специалистам. Как описано в настоящем изобретении, регенерированные растения, такие как регенерированные растения MON863, содержащие нуклеиновые кислоты Cry3Bb, либо дикого типа, либо химически синтезированные, и кодирующие белки Cry3Bb, могут быть, предпочтительно, подвергнуты самоопылению с получением гомозиготных трансгенных растений кукурузы, обсуждаемых ниже. В другом случае пыльца, полученная от указанных регенерированных растений кукурузы, может быть подвергнута скрещиванию с пыльцой выращенных из семян растений агрономически ценных линий. И наоборот, пыльца от этих ценных линий может быть использована для опыления регенерированных растений. Трансгенное растение MON863 настоящего изобретения может быть культивировано методами, хорошо известными специалистам.
Agrobacterium
Существуют различные методы регенерации растений из растительных тканей. Выбор конкретного метода регенерации зависит от ткани исходного растения и от конкретного вида регенерируемого растения. Трансформация однодольных растений методами электропорации, бомбардировки частицами и инфицирования  также описана в литературе. Трансформация и регенерация растения может быть осуществлена для многих однодольных растений, включая кукурузу, спаржу, ячмень и пшеницу и т.п. (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:5345, 1987; Wan & Lemaux, Plant Physiol 104:37, 1994; Rhodes et al., Science 240:204, 1988; Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2:603, 1990; Fromm et al., Bio/Technology 8:833, 1990; Armstrong et al., Crop Science 35:550-557, 1995; Vasil et al., Bio/Technology 10:667, 1992; патент США № 5631152).
Помимо процедур, обсуждаемых выше, специалисты-практики знакомы с известными источниками, в которых описаны конкретные условия, процедуры конструирования, модификации и выделения макромолекул (например, молекул ДНК, плазмид и т.п.), генерирование рекомбинантных организмов, а также скрининг и выделение клонов (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Maliga et al., Methods in Pland Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, New York, 1997).
Наборы для детекции ДНК могут быть разработаны с использованием описанных здесь композиций и методов, хорошо известных специалистам в области детекции ДНК. Такие наборы могут быть использованы для идентификации ДНК трансгенной кукурузы MON863 в образце и для выведения растений кукурузы, содержащих ДНК MON863. Эти наборы содержат одну или несколько ДНК-последовательностей, содержащих, по меньшей мере, 11 смежных нуклеотидов, гомологичных или комплементарных последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 и их комплементов. Эти ДНК-последовательности могут быть использованы в реакциях амплификации ДНК или в качестве зондов в методе гибридизации ДНК.
Нижеследующие примеры приводятся в целях иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Для каждого специалиста очевидно, что в способах, описанных в этих примерах, в которых авторы подробно излагают принципы осуществления настоящего изобретения, заложены основные идеи, необходимые для осуществления настоящего изобретения, а поэтому эти способы могут рассматриваться как примеры осуществления предпочтительных вариантов настоящего изобретения. Однако для каждого специалиста очевидно, что, исходя из представленного описания изобретения, в конкретные варианты изобретения может быть внесено множество изменений, в результате которых могут быть получены такие же или аналогичные результаты, не выходящие за рамки существа и объема настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Выделение и характеристика ДНК-последовательностей, фланкирующих трансгенную вставку MON863
Mlu
Трансформированную кукурузу MON863 генерировали методом бомбардировки ускоренными частицами с использованием выделенного из агарозного геля рестрикционного 4,7 т.п.н.-I-фрагмента, происходящего от плазмидного вектора PV-ZMIR13 (pMON25097, фиг.1). Экспрессирующий растительный вектор pMON25097 содержит первую экспрессионную кассету, включающую неприродную промоторную последовательность CaMV35S AS4 (Р-CaMV.AS4 SEQ ID NO:17), функционально присоединенную к нетранслируемой лидерной последовательности связывающего белка А/В хлорофилла пшеницы (L-Ta.hcb1, SEQ ID NO:18), которая функционально присоединена к интронной последовательности актина риса (I-Os.Act1, SEQ ID NO:19), функционально присоединенной к неприродной последовательности, кодирующей вариант белка Cry3Bb (SEQ ID NO:20) и функционально присоединенной к последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования белка теплового шока Hsp17 пшеницы (Т-Ta.Hsp17, SEQ ID NO:21). Экспрессирующий растительный вектор pMON25097 содержит вторую экспрессионную кассету, присоединенную к Cry3Bb-экспрессионному кластеру, который сообщает трансформированной ткани растения резистентность к паромомицину (то есть 3'-конец Cry3Bb-экспрессионной кассеты присоединен к 5'-концу второй экспрессионной кассеты, сообщающей резистентность к паромомицину). Эта сообщающая резистентность кассета состоит из энхансерной промоторной последовательности CaMV35S (патент США № 5164316), которая функционально присоединена к последовательности, кодирующей неомицин-фосфотрансферазу (патент США № 5569834) и функционально присоединенной к последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования нопалин-синтазы (Fraley et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 80:4803-4807, 1983). Трансгенные растения кукурузы, резистентные к паромомицину, получали, в основном, как описано в патенте США № 5424412.
ТМ
ТМ
ТМ
ТМ
ТМ
ТМ
Молекулярная характеризация вставки в трансгенную кукурузу MON863 продемонстрировала, что в указанной трансгенной кукурузе MON863 присутствует одна копия ДНК-фрагмента, используемого для трансформации. Для разработки трансформант-специфических методов ПЦР-идентификации последовательности ДНК кукурузы, фланкирующие 5'- и 3'-концы вставки в трансформанте кукурузы MON863, были определены с использованием технологии “прогулки по геному” (GenomeWalker, Clontech Laboratories, Inc.) в соответствии с инструкциями производителей. Указанный метод “прогулки по геному”, GenomeWalker, предусматривает сначала полный гидролиз очищенной ДНК кукурузы MON863 различными рестриктирующими и затупляющими концы ферментами, имеющимися в наборе GenomeWalker. Затем очищенные геномные ДНК-фрагменты с тупыми концами лигировали с адапторами GenomeWalker, содержащими известные фрагменты нуклеиновой кислоты. После этого каждый продукт лигирования амплифицировали в первой ПЦР-реакции с использованием внешнего праймера-адаптора, SEQ ID NO:22 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'), поставляемого GenomeWalker, и внешнего генспецифического праймера (SEQ ID NO:13, 5'-GAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCC-3' и SEQ ID NO:15, 5'-GCGAGTCTGATGAGACATCTCTGTAT-3' для 5'- и 3'-концов трансгенной вставки соответственно). Затем первую смесь ПЦР-продукта разводили и использовали в качестве матрицы для второй или “гнездовой” ПЦР с “гнездовым” праймером-адаптором, SEQ ID NO:23 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'), поставляемым GenomeWalker, и с “гнездовым” генспецифическим праймером (SEQ ID NO:14, 5'-TCGGCAGAGGCATCTTGAATGATAGC-3' и SEQ ID NO:16, 5'-AATTTGGTTGATGTGTGTGCGAGTTCT-3' для 5'- и 3'-концов трансгенной вставки соответственно). Вторичный ПЦР-продукт, который начинается с известных генспецифических последовательностей и простирается до неизвестной смежной геномной ДНК, может быть затем секвенирован методами, хорошо известными специалистам. После определения фланкирующих геномных последовательностей кукурузы были разработаны ПЦР-анализы, с помощью которых может быть детектировано присутствие ДНК растения кукурузы PV-ZMIR13 (MON863) в образце.
После проведения этой процедуры нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO:5, была охарактеризована как геномная последовательность кукурузы, которая является непосредственно смежной с произвольно установленным 5'-концом ДНК-фрагмента pMON25097 и расположенной выше от этого фрагмента, который был встроен в геном кукурузы, в результате чего был сконструирован и выделен трансгенный трансформант кукурузы MON863. Специалисту в данной области или даже любому среднему специалисту должно быть известно, что дополнительная информация о нуклеотидной последовательности может быть легко получена даже в том случае, если эта последовательность расположена на более дальнем расстоянии от последовательности стыка, представленной в SEQ ID NO:1, но, при этом, находится в геноме кукурузы, чем последовательность длиной в 242 нуклеотида, представленная в SEQ ID NO:5, и последовательность, простирающаяся от нуклеотида в положении 267 до нуклеотида в положении 508 и представленная в SEQ ID NO:3. Аналогичным образом нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO:6, была охарактеризована как геномная последовательность кукурузы, которая является непосредственно смежной с произвольно установленным 3'-концом ДНК-фрагмента pMON25097 и расположенной ниже от этого фрагмента, который был встроен в геном кукурузы, в результате чего был сконструирован и выделен трансгенный трансформант кукурузы MON863. Специалисту в данной области также известно, что дополнительная информация о нуклеотидной последовательности может быть легко получена даже в том случае, если эта последовательность расположена на более дальнем расстоянии от последовательности стыка, представленной в SEQ ID NO:2, но, при этом, находится в геноме кукурузы, чем последовательность длиной в 224 нуклеотида, представленная в SEQ ID NO:6, и последовательность, простирающаяся от нуклеотида в положении 361 до нуклеотида в положении 584 и представленная в SEQ ID NO:4.
Пример 2. Детекция присутствия ДНК MON863 в образце
Ниже приводится неограничивающий пример ПЦР-анализов, разработанных для детекции наличия ДНК MON863 в образце.
ДНК экстрагировали приблизительно из 100 мг ткани дробленого зерна с использованием мини-набора (Qiagen Dneasy Plant Mini Kit (catalog # 68163, Valencia CA) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями, с одним лишь исключением. А именно перед экстракцией используемое зерно выдерживали в холодильнике при -80°С и не измельчали в присутствии жидкого азота с использованием ступки и пестика непосредственно перед экстракций. Количественную оценку ДНК проводили методами, хорошо известными специалистам, с использованием флуориметра Hoeffer DNA Quant 2000 Fluorometer и молекулярного маркера IX Boehringer Mannhiem (Indianapolis, IN) в качестве ДНК-стандарта для калибровки.
2+
ПЦР-анализ геномных ДНК-последовательностей, фланкирующих 5'-конец вставки в MON863, осуществляли с использованием одного праймера (праймера А), происходящего от 5'-геномной фланкирующей последовательности (SEQ ID NO:9, 5'-GTCTTGCGAAGGATAGTGGGAT-3'), и спаренного со вторым праймером (праймером В), локализованным возле 5'-конца встроенной ДНК в промоторе 35S (SEQ ID NO:10, 5'-CATATGACATAAGCGCTCTTGG-3'), охватывая область в 508 п.н. ПЦР-анализ геномных ДНК-последовательностей, фланкирующих 3'-конец вставки в MON863, осуществляли с использованием одного праймера (праймера D), происходящего от 3'-геномной фланкирующей последовательности (SEQ ID NO:12, 5'-AGACTCTATGCTCTGCTCATAT-3'), и спаренного со вторым праймером (праймером C), локализованным в последовательности полиаденилирования tahsp17 возле 3'-конца вставки, охватывая область в 584 п.н. (SEQ ID NO:11, 5'-CTGATCATTGGTGCTGAGTCCTT-3') (фиг.2). ПЦР-анализы проводили с использованием 50 нг геномной ДНК трансгенной кукурузы MON863 или матрицы геномной ДНК нетрансгенной MON863 в реакционном объеме 50 мкл, содержащем Mg в конечной концентрации 1,5 мМ, 0,4 мкМ каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP и 2,5 единиц ДНК-полимеразы Taq. Реакцию осуществляли при следующих условиях: 1 цикл при 94°С в течение 3 минут; 38 циклов при 94°С в течение 30 секунд, при 60°С в течение 30 секунд, и при 72°С в течение 1,5 минуты, и 1 цикл при 72°С в течение 10 минут.
~
ПЦР-продукты (20 мкл) ожидаемого размера, представляющие собой геномную последовательность, фланкирующую 5'- и 3'-концы вставки, выделяли с помощью гель-электрофореза в 2,0% агарозном геле при 60 В в течение  1 часа и визуализировали путем окрашивания этидийбромидом. ПЦР-фрагменты, представляющие собой 5'- и 3'-фланкирующие последовательности, вырезали из геля и очищали с использованием набора для гель-фильтрации QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, catalog #28704) в соответствии с процедурой, рекомендованной производителем. Затем очищенные ПЦР-продукты секвенировали с использованием исходных ПЦР-праймеров химическим методом обрыва цепи красителем.
Как и ожидалось, контрольные реакции, не содержащие матрицу, а также реакции, содержащие нетрансгенную ДНК кукурузы, не генерировали ПЦР-продукт с любым набором праймеров. В ПЦР-анализах ДНК резистентного к листоеду трансформанта MON863, проводимых с использованием праймеров А и В, имеющих последовательности SEQ ID NO:9 и 10, генерировались продукты ожидаемого размера в 508 п.н., представляющие собой 5'-фланкирующую последовательность (SEQ ID NO:3), а в ПЦР-анализах, проводимых с использованием праймеров D и C, имеющих последовательности SEQ ID NO:11 и 12, генерировались продукты размером в 584 п.н., представляющие собой 3'-фланкирующую последовательность (SEQ ID NO:4).
Данные, полученные для этих последовательностей, показали, что 5'-ампликон, то есть SEQ ID NO:3, состоит из 266 п.н. 5'-конца промотора 35S у 5'-конца вставки, за которой следуют 242 п.н. геномной фланкирующей ДНК кукурузы. Данные для этих последовательностей показали, что 3'-ампликон, то есть SEQ ID NO:4, состоит из 360 п.н. 3'-последовательности полиаденилирования tahsp17, которая определяет 3'-конец вставки, за которой непосредственно следуют 224 п.н. геномной фланкирующей ДНК кукурузы.
Агрономически и экономически ценные продукты и/или их композиции, которыми являются, но не ограничиваются ими, корм для животных, основные продукты питания, а также продукты и субпродукты из кукурузы, и которые могут быть использованы в качестве пищевых продуктов или в качестве композиций, предназначенных для употребления в пищу, включая, но не ограничиваясь ими, кукурузная мука, кормовая кукурузная мука, кукурузная патока, кукурузное масло, кукурузный крахмал, попкорн, кукурузные лепешки, кукурузные хлопья и субпродукты из кукурузы и т.п., также входят в объем настоящего изобретения, если эти продукты и их композиции содержат детектируемые количества нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей заявке и являющихся диагностическими показателями для идентификации трансгенной кукурузы MON863.
Zea mays
Семена, содержащие трансген кукурузы MON863, были депонированы заявителем 17 октября 2000 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA ZIP 20110-2209. Заявителю была выдана расписка АТСС о приеме депозита трансформанта кукурузы  MON863 PV-ZMIR13, которому был присвоен регистрационный номер АТСС № РТА-2605.
Однако для каждого специалиста очевидно, что, исходя из представленных примеров, в вышеуказанные анализы, используемые для детекции ДНК, происходящей от трансформанта кукурузы MON863, в образце, может быть внесено множество изменений. Так, например, может быть рассмотрена серия праймеров, содержащая один праймер, комплементарный геномной ДНК кукурузы, и другой праймер, комплементарный последовательностям, находящимся внутри вставки. Кроме того, могут быть также рассмотрены любые другие ранее описанные анализы гибридизации с использованием ДНК-зондов, комплементарных новым последовательностям нуклеиновой кислоты, локализованным в месте стыка “трансген/геном”.
При этом очевидно, что в соответствии с проиллюстрированными и описанными выше принципами настоящего изобретения, каждый специалист может внести изменения в общую структуру и конкретные детали описания изобретения, не выходящие за рамки указанных принципов. Авторами настоящего изобретения заявлены все изменения, не выходящие за рамки существа и объема изобретения, сформулированного в прилагаемой ниже формуле изобретения.
Все публикации и опубликованные патенты, цитированные в настоящей заявке, вводятся в настоящее изобретение посредством ссылки, так как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно введена в настоящее изобретения посредством ссылки.