Способ дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных узловых образований щитовидной железы
METHOD FOR PREOPERATIVE DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF BENIGN AND MALIGNANT NODULAR FORMATIONS OF THE THYROID GLAND

Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургической эндокринологии, и может быть использовано для дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественной или злокачественной природы узловых образований щитовидной железы, определяющей выбор тактики ведения пациентов.
Высокая заболеваемость и динамика патоморфоза рака щитовидной железы требует совершенствования диагностических подходов (Vargas-Pinto S., Minerva A., Arenas R. Lobectomy Compared to Total Thyroidectomy for Low-Risk Papillary Thyroid Cancer: A Systematic Review. Journal of Surgical Research. 2019).
На сегодняшний день среди хирургов сложились две противоположные точки зрения по поводу хирургического вмешательства на ранних стадиях рака щитовидной железы (ЩЖ) - радикальное и менее радикальное. Использование тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАПБ) с цитологическим исследованием биоптата позволило чаще выявлять больных с ранними стадиями папиллярного рака, у которых вопрос объема операций высоко актуален (Осипенко С.К. Диагностическая и лечебная тактика при "фолликулярной опухоли" щитовидной железы. Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2015; 2: 77-80). Стандартный метод дооперационной диагностики, основанный на цитологическом исследовании препаратов, полученных ТАПБ, предполагает разделение узловых образований ЩЖ на 6 диагностических категорий, используя классификацию поражений ЩЖ по системе Bethesda (Е. Cibas, Syed Z. Ali, The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Thyroid: official journal of the American Thyroid Association, 2009).
Однако, остается группа пациентов, у которых результаты цитологического исследования ТАПБ не позволяют дифференцировать доброкачественные и злокачественные новообразования на основании клеточных характеристик, в том числе из-за субъективности оценки, что определяет различную хирургическую и терапевтическую тактику их ведения. Такое исследование требует большого опыта от исполнителя и относительно часто приводит к ошибкам, и в 30% случаев заключение оказывается неопределенным, поскольку цитологических признаков недостаточно для разделения доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей. В соответствии с клиническими рекомендациями, большинство пациентов с неопределенным цитологическим заключением, в том числе все, относящиеся к категории Bethesda III и IV, направляются на диагностическую операцию или молекулярное тестирование. При этом от 70% до 80% узловых образований ЩЖ, по результатам послеоперационного гистологического исследования, оказываются доброкачественными, а сама операция -ненужной (Haugen B.R., Alexander Е.K., Bible K.С. et al. American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016 Jan; 26 (1): 1-133). Риск послеоперационных осложнений и послеоперационный гипотиреоз, требующий пожизненной заместительной гормональной терапии, существенно снижают качество жизни.
В настоящее время все большее распространение в исследовании щитовидной железы приобретает иммуногистохимическое исследование, что позволяет оценить степень пролиферативной активности клеток ЩЖ (Стяжкина С.Н. Возможности иммуногистохимического исследования для оценки пролиферативной активности ткани щитовидной железы. Современные проблемы науки и образования. 2017; 2: 21). Возможность диагностировать образцы с неопределенной цитологией на доброкачественные и злокачественные, позволит снизить количество хирургических вмешательств и, соответственно, последующий риск осложнений. В связи с необходимостью совершенствования подходов к дооперационному типированию патологий ЩЖ, актуальной задачей является разработка способов диагностики узловых образований ЩЖ с использованием биомаркеров.
Известен способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы человека (Патент RU 2569154, опубл. 20.11.2015), включающий взятие образца ткани опухоли ЩЖ и прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля, выделение суммарного пула РНК из образцов, измерение уровня экспрессии диагностируемых микроРНК с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии 13 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b, в опухолевых образцах в сравнении с нормальными тканями методом ОТ-ПЦР в реальном времени, составление заключения о наличии и типе новообразования ЩЖ на основании комплексного критерия, рассчитанного на основе средних значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах новообразований ЩЖ, характеризующихся специфическим профилем микроРНК.
К недостаткам данного способа относятся такие, как недостаточная информативность и эффективность для дооперационной диагностики узловых образований ЩЖ, так как способ ориентирован на анализ операционного материала.
Известен способ дифференциальной диагностики опухолей щитовидной железы (Патент РФ №2332172; Опубл. 2008), включающий определение экспрессии белков Ki-67, Bc1-2, р53 в клетках опухоли с помощью специфических моноклональных антител в комплексе с хромогеном, при этом определяют для каждого белка индекс мечения ядер клеток, дополнительно определяют индексы мечения цитоплазмы клеток для белков Вс1-2 и р53, оценивают коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности по формуле, в которой используют индексы мечения ядер клеток опухоли для каждого из белков соответственно, причем оценивают коэффициент возможной атипии цитоплазмы (КВА) как отношение индекса мечения цитоплазмы клеток для белка Вс1-2 к индексу мечения цитоплазмы клеток для белка р53, и определяют коэффициент активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности (КАОРЗ) как произведение КВА и коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности и при величине 0≤КАОРЗ≤4,35 диагностируют атипическую фолликулярную аденому, а при величине КАОРЗ>4,36 - фолликулярный рак.
Недостатками известного способа является то, что он недостаточно информативен и не обладает необходимой точностью при дифференциальной диагностике, что наиболее важно для врача и пациента.
Известен способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы (Патент РФ 2705110. Опубл. 20219), заключающийся в том, что выявляют узловые образования щитовидной железы, проводят пункционную биопсию, последующее цитологическое исследование пунктата и при неопределенных цитологических заключениях выполняют молекулярно-генетическое исследование, производя методом ОТ-ПЦР количественную оценку матричной РНК и микроРНК, и при условии показателей HMGA2 более 0.09, микроРНК-221 более 0,0105 и микроРНК-375 более - 12,1213, определяют фолликулярную опухоль с признаками злокачественности, при условии показателей микроРНК-146b более 0.1721, определяют папиллярный рак, при показателях миРНК-375 более 5.2514, определяют медуллярный рак, а показатель соотношения митохондриальной ДНК/ядерной ДНК более 5716,3013 - В-клеточный рак, наличие мутации V600 в гене BRAF - папиллярный рак и является риском наличия высокой биологической агрессивности данного папиллярного рака.
Основными недостатками данного способа являются недостаточная точность, ограниченные функциональные возможности, так как он не позволяет дифференцировать узлы паращитовидной железы, узловые образования с присутствием клеток Гюртля.
В качестве прототипа выбран способ дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы (Патент РФ №2614700; Опубл. 2017), включающий тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования, промывку и консервацию аспирата, центрифугирование, отбор супернатантов, проведение иммуноцитохимического (ИЦХ) анализа экспрессии Ki-67 и расчет диагностического показателя р по формуле, в которой HS=∑P(i)×i, где i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3, P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью, и при величине р>0,5 - образование признают злокачественным, при величине р<0,5 - доброкачественным.
К недостаткам прототипа относятся следующие: не высокая точность и недостаточная информативность, так как измерение уровня экспрессии Ki-67 - маркера пролиферации при опухолевых процессах, который в некоторых случаях позволяет определить злокачественность процесса и склонность опухоли к метастазированию, в клинике эндокринной хирургии динамика экспрессии Ki-67 не является патогномоничным достоверным признаком опухолевого роста в тироцитах, а ИЦХ метод без изготовления клеточного блока (cell-block) в мазке малоинформативен, и по релевантности в клинике уступает методу клеточных блоков (Воробьев С.Л. Морфологическая диагностика заболеваний щитовидной железы. СПб.: Издательско-полиграфическая компания «КОСТА»; 2014), а неоднозначность трактовки не всегда удовлетворяет потребность врача в принятии решения на предоперационном этапе.
Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов дооперационной дифференциальной диагностики типов узловых образований щитовидной железы с существенными признаками заявляемого способа.
Исходя из вышеприведенного уровня техники, при дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы проблемой является сложность оценки образцов с неопределенной цитологией на доброкачественные и злокачественные, что влияет на количество хирургических вмешательств и возможный последующий риск специфических послеоперационных осложнений.
Разработка более эффективного способа дооперационной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы путем использования дополнительных прогностических значимых критериев оценки опухоли ЩЖ за счет применения технологии пробоподготовки, позволит решить вышеуказанную проблему, а именно повысить достоверность верификации опухолевых поражений и, соответственно, достигнуть сокращения количества необоснованных хирургических вмешательств.
Технический результат заключается в повышении точности и информативности предоперационной дифференциальной диагностики природы узловых образований щитовидной железы, и, как следствие, оптимизации тактики ведения пациентов с улучшением их качества жизни.
Предлагается, как и в прототипе, выполнение тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБП) под контролем ультразвукового исследования (УЗИ) для забора образцов узловых образований ЩЖ, приготовление цитологического препарата, проведение иммуноцитохимического (ИЦХ) анализа экспрессии маркера пролиферации Ki-67.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных узловых образований щитовидной железы, включающем выполнение тонкоигольной аспирационной биопсии узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования, приготовление цитологического препарата, проведение иммуноцитохимического анализа экспрессии маркера пролиферации Ki-67, согласно изобретению, дополнительно проводят изготовление цитологического препарата методом клеточного блока и иммуноцитохимическую реакцию с маркером апоптоза Fas-R, измеряют уровни экспрессии Ki-67 и Fas-R, вычисляют индекс злокачественности Z по формуле Z=Fas-R/(Ki-67+1), где Fas-R - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером апоптоза, Ki-67 - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером пролиферации, по 10 полям зрения в препарате, и при величине индекса Z менее 1,1 судят о низком риске злокачественного роста узлового образования щитовидной железы, при величине индекса Z более 2,8 делают заключение о высоком риске злокачественности узлового образования щитовидной железы.
Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в том, что проводят иммуноцитохимическое исследование гистологического препарата из цитологического материала, сформированного методом клеточных блоков, причем ИЦХ реакцию ставят на клеточном блоке с двумя маркерами - маркером пролиферации Ki-67 и с дополнительным маркером апоптоза Fas-R, по соотношению уровней экспрессии которых вычисляют индекс злокачественного потенциала опухоли ЩЖ, что позволяет повысить точность и качество дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы, так как ИЦХ анализ динамики экспрессии Ki-67 и Fas-R с изготовлением клеточного блока cell-block является более информативным, и по релевантности в клинике значительно лучше по сравнению со способом-прототипом.
Рецепторы CD-95, называемые также FAS-R, важны для иммунного устранения трансформированных клеток. FAS-R - это белки, индукторы апоптоза, которые при взаимодействии с соответствующим лигандом, активируют цепочку внутриклеточных процессов для гибели клетки. У раковых клеток этот сигнальный механизм трансформирован, большинство раковых клеток устойчивы к апоптозу через активацию FAS-R или имеют рецепторные и ферментативные нарушения в этой цепи. (Peter ME, Hadji А, Murmann АЕ, et al. The role of CD95 and CD95 ligand in cancer [published correction appears in Cell Death Differ. 2015 May; 22 (5): 885-6]. Cell Death Differ. 2015; 22 (4): 549-559).
Использование метода клеточных блоков cell-block имеет преимущества, в отличие от мазков, он позволяет проводить обзорные и селективные окраски, получать серийные срезы, сохраняет структуру материала, молекулярные реакции при этом методе дают стабильный хорошо воспроизводимый результат, что позволяет проводить последовательно разные молекулярно-генетические исследования, сводя к минимуму повторные инвазивные манипуляции для пациента.
Выбор диагностических значимых маркеров Fas-R и Ki-67 для использования в комплексе с цитологическими характеристиками мазка для прогностической оценки злокачественного потенциала новообразования является более информативным и способствует повышению эффективности лечения больных с узловыми образованиями ЩЖ.
Так, например, низкие значения маркера Fas-R и повышенные значения маркера Ki-67 на фоне отсутствия признаков аутоиммунного тиреоидита свидетельствует об активации неопластических процессов, а при наличии цитологических характеристик фолликулярной опухоли, низкие показатели маркера Fas-R и повышенные Ki-67 сигнализируют о большей вероятности наличия фолликулярной карциномы.
Заявляемый способ дооперационной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы разработан впервые.
Способ заключается в следующем.
При подозрении на опухоль щитовидной железы под контролем УЗИ выполняют тонкоигольную аспирационную биопсиию, материал направляют для цитологии и изготовления клеточного блока cell-block. Для этого пунктат фиксируют, промывают, взвесь клеток помещают в стеклянную пробирку, добавляют 500 мкл цитратной плазмы и 5 мкл хлорида кальция, инкубируют в термостате 15-20 минут при 37°С, формируя тромбиновый сверток как связующую основу, далее обезвоживают и пропитывают парафином, изготавливают срезы по стандартной методике, и инструкциям гистологических реагентов и приборов.
Для верификации сомнительных цитологических изменений, например, таких как, папиллярные структуры, плазмоцитоидность цитоплазмы, наличие внутриядерных борозд, нагромождение ядер и их укрупнение, проводят иммуноцитохимическую реакцию с двумя маркерами на клеточном блоке cell-block. Ставят реакцию с маркером пролиферации Ki-67 и с апоптотическим маркером Fas-R. Данный этап выполняют по стандартной методике, включающей депарафинизацию, промывку, обработку первичным антителом, обработку системой детекции, демаскировку, окрашивание ядер, промывку и заключение под стекло.
По полученным значениям уровней экспрессии маркера Ki-67 и маркера Fas-R в абсолютных числах определяют злокачественный потенциал опухоли путем вычисления индекса злокачественности Z по формуле:
Z=Fas-R/(Ki-67+1),
где Fas-R - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером апоптоза, Ki-67 - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером пролиферации, по 10 полям зрения в препарате.
При величине индекса Z менее 1,1 судят о низком риске злокачественного роста. При этом рекомендуют динамическое наблюдение пациента с повторной ТАПБ в случаях увеличения размеров узла или изменении его эхогенности.
При величине индекса Z более 2,8 делают заключение о высоком риске злокачественного роста.
При гипоэхогенности узла, а также нормальных показателях антител к тиреоидной пироскидазе (АТ-ТПО), антител к тиреоидной пироскидазе (АТ-ТТГ) и величине индекса Z более 2,8 рекомендуют гемитиреоидэктомию с ревизией региональных лимфоузлов.
При подозрении на метастатическое поражение по данным КТ, МРТ - рекомендуют регионарную лимфодиссекцию с тиреоидэктомией.
В случаях изоэхогенных ультразвуковых характеристик узла, наличии биохимических показателей аутоимунного тиреоидита АТ-ТПО, АТ-ТТГ и величине индекса Z более 2,8 рекомендуют проведение жидкостной цитологии для исключения папиллярной карциномы.
Если величина индекса Z составляет 1,1-2,8, то судят о среднем риске злокачественного роста опухоли. Рекомендуют при этом повторную ТАПБ, и в случае подтверждения опухолевой трансформации клеток - оперативное вмешательство, гемитиреоидэктомию.
Использование заявляемого способа дает возможность исключить риск врачебной ошибки в диагностике природы узловых образований щитовидной железы и выборе тактики ведения пациентов в сомнительных случаях.
Заявляемый способ дифференциальной диагностики был применен у 61 пациента (как мужчины, так и женщины) возрастом от 30 до 75 лет, которые обратились в клинику эндокринной хирургии для тиреоидэктомии. Все пациенты, участвовавшие в исследовании, дали на это письменное добровольное информированное согласие. Во время предоперационного УЗИ-исследования отбиралась ТАПБ по стандартной методике, при заполнении направления на цитологическое исследование указывали описание локализации и ультразвуковых характеристик узла. Материал биопсии доставлялся в лабораторию в шприце в течение 30 минут после взятия, и сразу же после поступления содержимое шприца выдавливали в пробирку-эппендорф, содержащую 0,5 мл сыворотки, и добавляли 50 мкл хлорида кальция, после чего помещали в термостат на 30 минут. Полученный сгусток, содержащий биопсийный материал, фиксировали в 10% забуференном формалине в течение двух часов и подвергали гистологической проводке по стандартной методике из инструкции и руководств пользователя приборов для гистолаборатории фирмы Leica (Австрия) и Millestone (Италия) - вырезная станция Leec LTD, гистологический процессор Logos, заливочная станция, автоматический микротом и микроскоп Leica. Из парафинового блока изготавливали тонкие срезы, окрашивали их гематоксилином и эозином в ручном стандартном протоколе согласно инструкции к реагентам (Биовитрум, Россия). Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования использовали срезы с тех же блоков, уложенные на высокоадгезивные стекла. Протокол ИГХ соответствовал рекомендациям, указанным производителями антител и иммуностейнеру Bond Max (Leica, Австрия). Использовали антитела Ki-67 (клон ММ1, RTU; Novocastra, Великобритания) и Fas-R (ab82419, концентрат, разведение 1:200; Abeam, США). Окрашенные препараты просматривали под микроскопом DM 2000 (Leica, Германия) с объективами Plan10x, Plan40x. Расчет индекса соотношения уровней экспрессии маркеров проводили по формуле Z=Fas-R/(Ki-67+1), где Z - индекс злокачественности, Fas-R и Ki-67 - среднее количество позитивных клеток, окрашенных соответствующим маркером, по 10 полям зрения в препарате. Операционный материал, поступивший от этих же больных, фиксировали в формалине и подвергали тем же процедурам, что и материал ТАПБ. Исследование было выполнено в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ред. 2013 г).
В 97% случаев результаты реакции по заявляемому способу на предоперационном этапе показали соответствие с послеоперационным диагнозом. Наиболее высокие значения маркера Ki-67 (15-20 клеток в поле зрения) наблюдали у пациентов с токсическим зобом или аутоиммунным тиреоидитом. То есть, данный маркер в изолированном применении не специфичен для онкологической патологии щитовидной железы, а в сочетании с маркером апоптоза FAS-R и вычислении их соотношения он чувствителен и специфичен.
В таблице 1 приведены значения экспрессии маркеров Ki-67 и FAS-R, а также Z-индекса в тироцитах в нозологических группах (m; Me[Min; Max])
На основании анализа количества достоверно положительных, ложно- и достоверно отрицательных диагнозов по четырем нозологическим группам чувствительность заявляемого способа показала 96,80%, и специфичность - 96,17%. Применение предложенного способа дополнительно к стандартным методам исследования, таким как УЗИ и цитологическое исследование позволяет улучшить дооперационную диагностику и осуществить дальнейший выбор адекватного метода лечения.
Использование способа позволяет исследовать на до госпитальном этапе узловые образования ЩЖ с большей точностью и информативностью по сравнению со способом-прототипом, а следовательно, дает возможность не только верифицировать диагноз, но и выбрать оптимальный способ терапии, определить адекватный объем оперативного вмешательства, особенно при многоузловом поражении щитовидной железы.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1.
Пациентка И., 34 года во время планового УЗИ исследования щитовидной железы обнаружен узел 24×13 мм, с нечеткими контурами, гипоэхогенный. Т3 - 2,7 нмоль/л, Т4 - 13,6 пмоль/л, ТТГ - 4,0 МЕ/мл, АТ-ТТГ - 0,5 МЕ/мл, АТ-ТПО - 31 мкМЕ/мл.
Проведена ТАПБ. В цитологических препаратах: на фоне форменных элементов крови с умеренно плотным коллоидом определяются микро-нормофолликулярные и папиллярные скопления из тироцитов со слабо полиморфными, укрупненными и очагово нагромождающимися ядрами округлой и округло-овальной формы и наличием внутриядерных борозд. В фоновом материале - примесь умеренного количества малых лимфоцитов. Заключение: Атипия неясного значения. Категория по системе Bethesda 2017 - III.
Проведена дифференциальная диагностика по заявляемому способу.
При проведении ИЦХ реакции величина индекса Z составила 2,7. Заключение: Подозрение на папиллярную карциному. Средний риск злокачественности - ближе к высокому.
Была проведена повторная ТАПБ: Подозрение на папиллярную карциному. Категория по системе Bethesda 2017 - VI. Проведена гемитиреоидэктомия. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: Папиллярная карцинома правой доли щитовидной железы, диаметр 2,3 см, без признаков прорастания капсулы щитовидной железы. рТ2 L0 V0 PnO.
При использовании данного способа удалось определить характер патологического процесса, выполнить органосохраняющий объем операции. Пациентка после операции чувствует себя хорошо, получает минимальную дозу заместительной терапии.
Пример 2.
Пациентка И., 58 лет во время УЗИ исследования щитовидной железы обнаружен узел 32×10 мм, с нечеткими контурами, изоэхогенный. Т3 - 1,8 нмоль/л, Т4 - 10,5 пмоль/л, ТТГ - 6,8 мкМЕ/мл, АТ-ТТГ - 1,5 мкМЕ/мл, АТ-ТПО - 56 мкМЕ/мл.
Проведена ТАПБ. В цитологических препаратах: на фоне форменных элементов крови со скудным комковатым коллоидом определяются кластеры, солидно-шаровидные скопления из тироцитов с признаками В-клеточной трансформации и дистрофическим ядерным полиморфизмом. Определяется наличие единичных трабекулярных и папиллярных структур с нагромождающимися овальными ядрами с неровными ядерными контурами и наличием внутриядерных борозд. Очаговая плоскоклеточная метаплазия. В фоновом материале - примесь макрофагов и единичных эпителиоидных многоядерных клеток, обилие лимфоидных клеток: малых лимфоцитов, клеток герминативных центров, единичных плазмоцитов. Заключение: Атипия неясного значения на фоне аутоимунного тиреоидита. Категория по системе Bethesda 2017 - III.
Пациентке проведена дифференциальная диагностика по заявляемому способу.
При проведении ИЦХ реакции индекс Z составил 3,3 - Заключение: Вероятно, папиллярная карцинома. Высокий риск злокачественности.
Была проведена повторная ТАПБ: Папиллярная карцинома на фоне аутоимунного тиреоидита. Категория по системе Bethesda 2017 - VI. Проведена тиреоидэктомия. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: Папиллярная карцинома левой доли щитовидной железы, диаметр 3,1 см, без признаков прорастания капсулы щитовидной железы. рТ2 L0 V0 PnO.
Применение заявляемого способа диагностики позволило определить характер патологического процесса, была выполнена радикальная операция. Пациентка после операции чувствует себя хорошо, получает заместительную терапию.
Заявляемый способ обеспечивает повышение достоверности верификации опухолевых поражений щитовидной железы и может быть эффективно использован для диагностики опухолей в дооперационном периоде у больных с узловыми заболеваниями ЩЖ для выбора адекватного метода лечения.