Способ получения и композиция для повышения эффективности пробиотических микроорганизмов
METHOD OF PRODUCING AND A COMPOSITION FOR INCREASING THE EFFECTIVENESS OF PROBIOTIC MICROORGANISMS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к лекарственным препаратам - пробиотикам для медицинского и ветеринарного применения и способам их получения, и может быть использовано в медицине и сельском хозяйстве.
Уровень техники
Пробиотики - живые микроорганизмы, которые при введении в адекватном количестве оказывают благотворное воздействие на здоровье хозяина (Report of a Joint FAO/WHO, 2001). Известно, что пробиотики эффективны для профилактики и лечении диарей различной природы, энтероколитов, воспалительных заболеваний кишечника, а также способствуют нормализации углеводного и липидного обмена, здоровью костей; могут применяться при неалкогольной жировой болезни печени, для лечения депрессии и тревожности ( 2019; Amin N. et al., 2020; Liu R.T. et al., 2019; Liu L. et al., 2019).
В исследовании (Macfarlane S. et al., 2004) было установлено, что у здорового человека в биопленке кишечника преобладают микроорганизмы двух групп Bacteroides и Bifidobacterium. Показано, что бифидобактерии находятся в биопленке в виде микроколоний. Исследование колонизации частиц пищи в кишечнике человека (Macfarlane S., Macfarlane G.T., 2006) показало, что на них также формируются биопленки близкие по микробному составу к пристеночному биотопу. Толщина таких пленок составляет около 20 мкм, причем в наружнем слое локализованы в основном энтеробактериии и бактероиды, в то время как саму частицу покрывают преимущественно микроколонии бифидобактерий. Таким образом, преобладающей формой функционально активного существования пробиотиков, в частности, бифидобактерий, в кишечнике являются микроколонии. Под микроколонией понимают стабильную структуру, которая представляет собой сформировавшийся естественным путем агрегат микроорганизмов, и является, в сущности, элементарной единицей биопленки. Известно, что формирование биопленок начинается с образования микроколоний (Николаев Ю.А., Плакунов В.К., 2007).
Известна композиция, включающая пробиотики в виде микрокапсул, и способ ее получения (US 20100189767 A1). Способы включают микроинкапсулирование живых микроорганизмов для получения сухого препарата с возможным нанесением покрытия на микрокапсулы, что позволяет сохранить жизнеспособность микроорганизмов в значительной степени. Указанный способ предполагает напыление суспензии пробиотических микрорганизмов на частицу носителя в установке кипящего слоя, после чего на частицу наносят защитное гидрофобное покрытие, например, воска, что обеспечивает защиту от влаги. Данная композиция обеспечивает стабильность пробиотиков при хранении. Однако не предоставлена информация о действии композиции в кишечнике. Также известна композиция в виде кишечных микрокапсул (Yus С. et al., 2019). Данная композиция обеспечивает защиту клеток пробиотиков при прохождении через экстремальные условия верхних отделов желудочно-кишечного тракта и таргетное высвобождение пробиотиков в кишечнике, что подтверждено в исследованиях in vitro. Однако разрушение произойдет в просвете кишечника, при этом образуются одиночные клетки. Вероятность внедрения таких клеток в биопленку кишечника невелика и пробиотики будут эффективны только во время транзита через кишечник вместе с химусом, т.е. непродолжительное время.
8
10
8
10
Известен препарат (RU 2118535 С1), который включает носитель, представляющий собой сорбент и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе. Клетки эубиотиков используют совместно с компонентами питательной среды с биотитром 10-10 КОЕ/мл. В качестве сорбента используют энтеросорбент на основе оксида алюминия типа СУМС, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ при следующем количественном соотношении компонентов препарата, мас.%: клетки эубиотиков (бифидо- или лактобактерии) с титром 10-10 КОЕ/мл 1,0-50,0, сорбент остальное до 100%. Комплексный бактериальный препарат обеспечивает более эффективное пролонгированное лечебно-профилактическое действие на организм человека или животного за счет сохранения активности препарата при введении в организм на всех участках желудочно-кишечного тракта. Однако указанное утверждение подтверждено только тестами in vitro. Также не показано, как повышение стабильности в неблагоприятных условиях связана с колонизацией биопленки кишечника.
8
10
Известен препарат для медицинского и ветеринарного применения (RU 2164801 С1), который включает носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованные на указанном носителе. Препарат содержит клетки пробиотиков с питательной средой, в частности концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10-10 КОЕ/г и защитную среду. В качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой в различных формах, в частности оксид алюминия, поверхность которого модифицирована углеродом при получении сорбента типа СУМС. Указанный препарат в иммобилизованной форме имеет более длительный срок хранения. Авторы утверждают, что указанный препарат обладает более эффективным пролонгированным лечебно-профилактическим действием на всех участках желудочно-кишечного тракта за счет более высокой его колонизационной активности. Тем не менее колонизационная активность определена косвенно, по увеличению численности бактерий в фекалиях подопытных животных, а не в биопленке кишечника. Также в представленных данных обращает на себя внимание, что увеличение численности бифидобактерий произошло не после длительного (15 дней) приема препарата, а после 12 дней с момента его отмены, что не объяснено авторами и может быть связано как с неисследованными особенностями препарата, так и с техникой постановки эксперимента.
Известен (RU 2317089 С2) схожий по составу препарата-пробиотик медицинского и ветеринарного назначения, который обеспечивает более высокую эффективность сорбции и десорбции клеток бактерий энтеросорбентом СУМС-1, определяющей его клиническую эффективность, и более высокую колонизационную активность бактерий-эубиотиков. Однако для указанного препарата также не подтверждена в исследованиях in vivo эффективная колонизация биопленки кишечника вводимыми пробиотическими микроорганизмами.
Таким образом, описанные изобретения направлены, преимуществено, на защиту пробиотических микроорганизмов от стрессового воздействия и гибели в экстремальных условиях желудка и верхних отделов кишечника, либо при длительном хранении. Недостатком всех описанных изобретений является то, что способ их получения не предполагает иммобилизацию микроколоний пробиотических бактерий, которые образовались в ходе предшествующего этапа культивирования. Таким образом, при попадании в нижние отделы кишечника, в которых пробиотики проявляют наибольшую активность и оказывают положительные эффекты на здоровье человека, каждая из иммобилизованных клеток должна сначала сформировать микроколонию, что требует нескольких последовательных актов бинарного деления и, как следствие, является длительным процессом, в течение которого с высокой долей вероятности частица носителя вместе с содержимым кишечника будет выведена из организма. Внедрение же одиночных клеток пробиотических микроорганизмов в густонаселенную биопленку кишечника является маловероятным, поскольку, как указывалось выше, автохтонные микроорганизмы в ней уже находятся в виде микроколоний.
Наиболее близким является средство для коррекции микробиоценоза (RU 2159624 С1), которое представляет собой выполненные из фармацевтически приемлемого полисахарида микрокапсулы диаметром, не превышающим 100 мкм, в каждой из которых размещен приемлемый сорбент с размером частиц 10-100 мкм с нанесенными на них не менее 12 клетками аутохтонных штаммов микроорганизмов. Средство обеспечивает защиту от воздействия среды кишечника и желудка. При этом авторы утверждают, что одна частица сорбента с нанесенными на нее не менее 12 клетками, является одной микроколонией. Также в изобретении показано, что частицы угля, полученного из растительных материалов, эффективно внедряются в муциновый слой. Однако в соответствии с данным изобретением на поверхности закреплены единичные клетки. Из сказанного выше очевидно, что закрепление на частицы нескольких микроколоний должно повысить эффективность композиции.
Раскрытие сущности изобретения.
Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности пробиотических микроорганизмов путем получения их микроколоний в ходе ферментации с последующей иммобилизацией на подходящем носителе. Изобретение обеспечивает восстановление и поддержание микроэкологического равновесия в микробном биоценозе кишечника, благодаря чему усиливается полезное действие на организм человека или животного.
Одним из оптимальных путей достижения поставленной задачи является создание композиции, обеспечивающей увеличение количества микроколоний в биопленке кишечника, поскольку данная форма организации микробной популяции является наиболее характерной для существования пробиотических бактерий в данном микробиоценозе. Особенностью предлагаемой композиции является то, что клетки пробиотических бактерий находятся в ней преимущественно в форме микроколоний. Таким образом, снижается вероятность элеминации из биопленки одиночных клеток до того, как они сформируют микроколонии. Микроколонии сорбированы на частицах носителя, обеспечивающего их внедрение в биопленку. Компоненты среды высушивания повышают устойчивость бактерий к стрессовым факторам. В основе получения композиции лежит способ, заключающийся в культивировании пробиотических бактерий в условиях, обеспечивающих их агломерацию с образованием микроколоний, очистке от среды культивирования, смешении и экспозиции с сорбентом-носителем, добавлении защитной среды и лиофильном высушивании.
Осуществление изобретения
Ключевым этапом осуществления изобретения является процесс культивирования бактерий. Его необходимо проводить таким образом, чтобы в результате в суспензии находились в достаточном количестве не свободные клетки, а микроколонии и агломераты. Для этого используют среду культивирования, полностью обеспечивающую потребности пробиотических бактерий в питательных веществах, однако с пониженной концентрацией лимитирующего энергетического субстрата. В качестве лимитирующего энергетического субстрата выступает углеводный субстрат, например, глюкоза, или лактоза, или олигофруктоза, или лактулоза. Поддерживают оптимальные для роста условия: температуру и рН культивирования, концентрированный раствор энергетического субстрата подают дробно в течение всего времени роста. В результате жизнедеятельности пробиотических бактерий изменяется химический состав среды, происходит истощение по отдельным аминокислотам и накопление продуктов жизнедеятельности (лактат- и ацетат-ионов). В результате этого клетки бактерий, не переходя в стационарную фазу роста, не разъединяются после бинарного деления, а также активно агломерируют. Культивирование прекращают, когда не менее 70% культуры по результатам микроскопических исследований агломерируют в микроколонии из 5 и более клеток, что при используемой среде соответствует продолжительности более 8 часов. Данный подход отличает предлагаемый способ от предложенных ранее, в которых используют культуру на стадии роста, когда агломераты еще не образуются.
Удаление продуктов жизнедеятельности и не потреблённых культурой компонентов питательной среды также важно для создания композиции, поскольку входящие в состав среды культивирования пептиды и углеводы, а также образованные органические кислоты будут конкурировать за сайты адгезии на частицах носителя (активированного угля) с пептидогликанами поверхностных структур (пили) пробиотических бактерий, что будет снижать эффективность сорбции последних. Лактат и ацетат являются известными природными консервантами, с повышением концентрации которых стабильность пробиотических бактерий при хранении и будет снижаться. Удаление продуктов проводят одним из доступных способов: ультрафильтрацией, микрофильтрацией, центрифугированием или сепарацией. Удаленный объем восстанавливают забуференным физиологическим раствором, однако могут быть использованы и другие растворы, например, раствор пептона 1%.
К подготовленной таким образом суспензии клеток добавляют сорбент. В качестве сорбента используют активированный уголь, полученный из растительных материалов, таких как древесина лиственных пород, скорлупа кокоса, косточки фруктовых плодов. Активированный уголь должен по безопасности соответствовать требованиям, предъявляемым к углям, которые применяют в фармацевтической или пищевой промышленности. Перед использованием активированный уголь подвергают стерилизации сухим жаром при 160°C в течение 2 часов, либо в водной суспензии паром при 127°C в течение 1 часа.
Уголь вносят из расчета от 10 до 40% от массы готовой сухой композиции. Проводят сорбцию с перемешиванием суспензии в течение 5-60 минут. После завершения сорбции вводят защитную среду для лиофильного высушивания. Может быть применена защитная среда на основании желатина (5-15%) и сахарозы (до 100%), на основе 10% суспензии обезжиренного молока или другие известные среды. Полученную суспензию замораживают до температуры не выше минус 38°C и подвергают лиофильному высушиванию.
Пример 1
Для получения биосуспензии бифидобактерий проводят культивирование в ферментере. Используют питательную среду, содержащую: панкреатический гидролизат казеина (жидкий) - от 20 до 30% об. (стандартизуют по содержанию аминного азота), дрожжевой аутолизат - от 7 до 10% об., солевую основу. В качестве солевой основы используют цитрат натрия, хлорид натия, сульфат магния, фосфаты. Глюкозу вводят из расчета концентрации в среде не более 10 г/л, предпочтительно от 2 до 7 г/л. Жидкий гидролизат казеина может быть заменен на триптон казеиновый (концентрация в среде 15 г/л), а дрожжевой аутолизат, на сухой дрожжевой экстракт (концентрация в среде 15 г/л). Среду стерилизуют паром в ферментере.
Инокулят готовят в 2 пассажа на среде Блаурокка. При необходимости проводят дополнительный пассаж в среде близкой по составу к среде культивирования. Инкубирование всех пассажей проводят при температуре от 36 до 38°C. Мутность инокулята должна составлять не менее 1,0 единицы.
9
Культивирование проводят в ферментере при температуре от 36 до 38°C и перемешивании. Ферментер заполняют инертным газом (азотом или аргоном). Все операции по внесению инокулята и добавок проводят в асептичеких условиях. В ходе культивирования поддерживают рН культуральной жидкости в интервале от 5,0 до 7,0 в зависимости от предпочтений используемого штамма. Например, для штаммов вида Bifidobacterium bifidum поддерживают рН в интервале от 5,7 до 6,5, для штаммов вида Bifidobacterium adolescentis - от 5,5 до 6,5, для штаммов Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium longum - от 6,0 до 6,8. Для поддержания рН используют водный раствор аммиака (25% об.) или гидроокиси натрия (от 20 до 40% об.) или их смесь. Когда концентрация глюкозы в среде опускается ниже 1 г/л, добавляют ее раствор из расчета восстановления исходной концентрации в среде. Примерно после 8 часов культивирования, обычно после 10 часов культивирования для Bifidobacterium bifidum, после 6 часов культивирования, обычно после 7 часов для Bifidobacterium adolescentis, после 10 часов культивирования, обычно после 12 часов для Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium longum при микроскопии начинает наблюдаться образование агломератов бактериальных клеток. К этому моменту культура накапливает не менее 2⋅10 КОЕ/мл. Культивирование продолжают, выполняя микроскопирование примерно 1 раз за час и определяя соотношение агломератов и свободных клеток в культуральной жидкости, а также число клеток в агломерате. Агломерат, содержащий более 12 клеток можно считать микроколонией. Культивирование прекращают, когда более 70% клеток находится в агломератах.
Проводят удаление продуктов жизнедеятельности и не потребленных культурой компонентов питательной среды. Для этого в асептических условиях подсоединяют ферментер к предварительно подвергнутой химической стерилизации ультрафильтрационной установке. Удаляют от 20 до 40% пермеата, при этом клетки остаются в системе и циркулируют между ферментером и ультрафильтрационной установкой. Восстанавливают суспензию до исходного объема, добавляя стерильный раствор, содержащий 8 г/л натрия хлористого, по 0,5 г/л гидрофосфат натрия и дигидрофосфат калия. Диафильтрацию по указанной схеме проводят от 2 до 4 раз. После последнего цикла в ферментер вносят подготовленный стерильный активированный уголь. Количество угля определяют в зависимости от его сорбционной активности, определенной при входном контроле. Данная величина составляет от 10 до 40% от массы готовой сухой композиции, оптимально, около 30%. Сорбцию проводят при температуре не ниже 20°C при постоянном перемешивании. Продолжительность составляет от 10 до 50 минут. После этого в ферментер вводят защитную среду.
На стерильные кассеты для лиофильного высушивания разливают полученную суспензию из расчета, чтобы высота слоя составляла от 10 до 15 мм. Замораживают суспензию на плитах установки лиофильного высушивания до температуры не выше минус 38°C или в морозильном ларе, работающем при минус 40°C. Установку вакуумируют и производят постепенный нагрев до температуры 25°C в течение 30-40 часов.
2
В результате получены частицы угля с сорбированными на них микроколониями бифидобактерий. Для контроля проводили сканирующую электронную микроскопию. Как видно из полученной микрофотографии (фиг. 1) на поверхности примерно 0,0036 мм иммобилизовано не менее 7 микроколоний, каждая из которых включает более 20 клеток бифидобактерий. Остальные клетки иммобилизованы в несколько слоев и образуют агломераты меньшего размера. При этом макропоры, как видно из фиг. 1 практически не участвуют в иммобилизации бактерий. Следовательно, иммобилизация осуществляется преимущественно за счет связывания молекул поверхностных структур пробиотических бактерий с активными центрами связывания сорбента-носителя. Таким образом, удаление из среды конкурирующих за химическое связывание углеводов и аминокислот является необходимым, т.к. позволяет управлять процессом сорбции. На фиг. 2 и 3 показана тонкая структура микроколоний и видно, что в их окружении свободные клетки отсутствуют.
Пример 2
Проводили исследование стабильности композиции и лекарственного препарата на ее основе. Три серии композиции, полученной по примеру 1, хранили в течение 1 года при температуре от 2 до 10°C. Определяли долю мертвых клеток путем прямого подсчета с применением флюоресцентной микроскопии и набора LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (табл. 1). После года хранения измельчали композицию на мельнице ударно-ножевой конструкции, смешивали с подходящим наполнителем. Подходящим наполнителем является лактоза. Полученный продукт фасовали в пакеты из комбинированного материала на основе фольги и хранили в течение 2 лет при температуре от 2 до 10°C. Результаты см. в табл. 1. Суммарное снижение численности живых бифидобактерий составило не более 35% за суммарные 3 года хранения.
Пример 3
8
Крысам самцам массой 180-200 г давали со стандартным рационом композицию, полученную в соответствии с примером 1, в разовой дозе, соответствующей численности бифидобактерий 10 КОЕ. В группе сравнения животным давали не сорбированные бифидобактерий того же вида и в той же дозе, а в контрольной группе - только стандартный рацион. Крыс вскрывали через 24 часа после дачи препарата. Исследовали состав пристеночного биотопа толстой кишки. Для этого препарат фиксировали по стандартной методике и микроскопировали с применением метода флюоресцентной in situ гибридизации с зондом Bif164-FAM, позволяющего визуализировать отдельные клетки и микроколонии выбранной группы микроорганизмов в многовидовых микробных сообществах, в частности в биопленке кишечника. Оценка количества микроколоний бифидобактерий в различных вариантах показала, что после 24 часов в контрольной группе и группе сравнения количество микроколоний на участке слизистой протяженностью примерно 100 мкм составляло не более 1-2 (7 полей зрения), в то время как после введения предлагаемой композиции количество микроколоний составило на участке той же протяженности 5-8. Отсутствие разницы между контрольной группой и группой сравнения говорит о низком уровне приживаемости несорбированных пробиотиков. Увеличение численности микроколоний в биопленке кишечника крысы, по сравнению с контролем напротив говорит о более высоком уровне заселения бифидобактериями. Наличие большего числа внедрившихся в биопленку и не элиминировавших микроколоний бифидобактерий также можно связать с усилением полезных эффектов пробиотических бактерий.
Пример 4
9
Пациентам обоего пола возрастом от 21 до 58 лет с диагнозом острая кишечная инфекция проводили в контрольной группе (21 человек) лечение в соответствии с утвержденными протоколами лечения с применением антимикробных агентов, а в основной группе (24 человека) с применением композиции, полученной в соответствии с примером 1, в разовой дозе, соответствующей численности бифидобактерий 3×10 КОЕ в форме препарата. У пациентов в основной группе по сравнению с контрольной достоверно сокращалась частота стула, купировались диарея и боли в животе. К тому же у больных контрольной группы на фоне применения антимикробной терапии возникали осложнения, которых не было в опытной группе.
Библиография:
1. Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food. - Cordoba, 2001. - 34 p.
2.  Probiotics and prebiotics in clinical tests: an update. F1000Research, 2019, Vol. 8, F1000 Faculty Rev-1157.
3. Amin N., Boccardi V., Taghizadeh M., Jafarnejad S. Probiotics and bone disorders: the role of RANKL/RANK/OPG pathway. // Aging Clin Exp Res. 2020, Vol. 32(3), p. 363-371.
4. Liu R.T., Walsh R.F.L., Sheehan A.E. Prebiotics and probiotics for depression and anxiety: A systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. // Neurosci Biobehav Rev. 2019, Vol. 102, p 13-23.
5. Liu L., Li P., Liu Y., Zhang Y. Efficacy of Probiotics and Synbiotics in Patients with Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Meta-Analysis. // Dig Dis Sci. 2019, Vol. 64(12), p. 3402-3412.
6. Macfarlane S., Furrie E., Cummings J.H., Macfarlane G.T. Chemotaxonomic analysis of bacterial populations colonizing the rectal mucosa in patients with ulcerative colitis. // Clin Infect Dis. 2004. Vol. 38(12), pp. 1690-1699.
7. Macfarlane S., Macfarlane G.T. Composition and Metabolic Activities of Bacterial Biofilms Colonizing Food Residues in the Human Gut. Applied and Environmental Microbiology. 2006. Vol. 72 (9), pp. 6204-6211.
8. Николаев Ю.А., Плакунов B.K. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? Микробиология. 2007. Т. 76. №2. С. 149-163.
9. Yus С, Gracia R., Larrea A., Andreu V., Irusta S., Sebastian V., Mendoza G., Arruebo M. Targeted Release of Probiotics from Enteric Microparticulated Formulations. // Polymers, 2019. Vol. 11(10), p. 1668.