КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА 2-ХЛОРО-4-МЕТОКСИ-N-[4-(8-МЕТИЛ-ИМИДАЗО[1,2-а]ПИРИДИН-2-ИЛ)-ФЕНИЛ]-БЕНЗАМИДА, АКТИВНЫЙ КОМПОНЕНТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО
CRYSTALLINE FORM OF 2-CHLORO-4-METHOXY-N-[4-(8-METHYL-IMIDAZO[1,2-a]PYRIDIN-2-YL)-PHENYL]-BENZAMIDE, ACTIVE COMPONENT, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND MEDICINAL AGENT

Изобретение относится к новому физиологически активному веществу, новому ингибитору запуска эмбрионального сигнального каскада Hedgehog (Hh)-имидазо[1,2-a]пиридин-2-ил-фенил бензамиду, его новой кристаллической форме, активному компоненту для фармацевтических композиций, к фармацевтическим композициям и лекарственным средствам, содержащим ингибитор запуска эмбрионального сигнального каскада Hedgehog (Hh), способу лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак поджелудочной железы или рак простаты.
Рак поджелудочной железы является одним из самых смертоносных злокачественных новообразований. Среднее значение продолжительности жизни после постановки диагноза составляет 2-8 месяцев, и только 1-4% всех пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы срок увеличивается до 5 лет после установления диагноза [Bardeesy N, et al. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 897-909 и Singh AP, et al. Cancer Res. 2004, 64, 622-30]. Необратимый исход от рака поджелудочной железы связано с поздней диагностикой и отсутствием эффективной терапии для лечения. В большинстве случаев болезнь диагностируют на этапе, когда он местнораспространен или уже появляются метастазы в другие органы. Современные методы терапии, которые основываются на сочетании химиотерапии или операции и излучения, по-прежнему оказываются недостаточными для многих пациентов. Расположенная в верхней части живота в забрюшинной области поджелудочная железа тесно связана со многими крупными структурами, включая воротную вену, желудок, двенадцатиперстную кишку, желчный проток и верхнюю брыжеечную артерию.
Сигнальный каскад Hedgehog (Hh) - это несколько основных сигнальных путей (например, Hedgehog, Notch, Wnt), которые встречаются в большинстве процессов, необходимых для нормального развития эмбриона. Сигнальный путь Hedgehog был найден у мухи-дрозофилы и является основным регулятором процесса дифференцирования клеток, формирования тканей и клеточного размножения. Сигнальный каскад Hedgehog (Hh) играет решающую роль в онкогенезе, когда происходит его возобновление в тканях взрослого организма посредством любых мутаций или других механизмов. Сигнальный каскад Hedgehog (Hh) является важным формирователем онкогенеза по меньшей мере в одной трети всех типов рака.
Онкогенные мутации в сигнальном каскаде Hedgehog (Hh) были обнаружены в базальных клетках карциномы и медулобластомы, а повышенная активность Hh сигнальной системы приводит к раку поджелудочной железы, толстого кишечника, желудка, печени и раку простаты. Предположительное количество заболеваний раком с лиганд-зависимой активацией Hh сигнального каскада в США превышает 200000 случаев ежегодно и приблизительно в 10 раз больше по всему миру.
Человеческий белок Sonic Hedgehog (SHh) синтезируется в виде 45 КДа белка-предшественника, который подвергается внутримолекулярному расщеплению для получения 20 КДа фрагмента, который является ответственным за нормальные сигнальные активности Hedgehog (Hh) протеинов. На поверхности клетки сигнал Hedgehog (Hh), как полагают, непосредственно связывается с 12-кратно пронизывающим мембрану протеином Patched (Ptc) и 7-кратно пронизывающим мембрану протеином Smoothened (Smo). В нормальных зрелых клетках Ptc является негативным регулятором активности белка Smo. Связывание SHh с Ptc подавляет блокирующий эффект Ptc относительно Smo, позволяя Smo преобразовать SHh сигнал через плазматическую мембрану. Сигнальный каскад, инициированный Smo, выражается в активации транскрипционных факторов Gli, которые мигрируют в клеточное ядро, где они регулируют целевой фактор транскрипции, осуществляющий рост клеток и дифференциацию в эмбриональных клетках, и в этом случае неконтролируемая активация клеток взрослого организма связана со злокачественными новообразованиями.
Эффект цитотоксической активности в отношении клеток рака поджелудочной железы человека (PANC1) или рака простаты (DU145) за счет ингибирования клеточного сигнального пути Hedgehog был продемонстрирован в значительном количестве публикаций, в частности [Y. Rifai, et al. J. Nat. Prod. 2010, 73, 995-997 или Y. Rifai, et al. Bioorg. and Med. Chem. Letters, 2011, 21, 718-722].
Вследствие указанных факторов поиск новых инновационных лекарственных средств для борьбы с раком поджелудочной железы является актуальным, а поиск эффективных ингибиторов запуска эмбрионального сигнального каскада Hedgehog (Hh), а именно имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил-фенил бензамидов, представляется исключительно важной, актуальной и многообещающей задачей.
Авторами данного изобретения были выполнены синтез и широкие исследования активности различных имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил-фенил бензамидов, среди которых наиболее предпочтительным и перспективным является 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамид формулы 1.
В публикации международной заявки [WO 2011118812, National Univ. Corp. Hokkaido University (JP)] описываются биоактивные вещества для лечения нейродегенеративных заболеваний, среди которых упоминается соединение формулы А, которые позволяют провести более фундаментальную терапию нейродегенеративных заболеваний, подавляя окислительную стресс-индуцированную гибель нервных клеток, и применяется для лечения болезни Паркинсона.
Из уровня техники известно, что наиболее релевантными источниками соединений, близких по структуре соединению формулы 1, является патент США [US 8486936, АЛЛА ХЕМ, ЛЛС (US)], который описывает соединения формулы I:
Из уровня техники также известно, что соединение формулы 1 приводится в п.19 формулы изобретения публикации [WO 2010129620, LLC INNOVATIVE PHARMA (RU0] международной заявки и в п.19 формулы изобретения евразийской заявки [EА 201101579, ООО "ИФАРМА" (RU)].
Также известно, что соединение 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамид зарегистрировано в CAS Registry под номером 1254584-50-3 и предлагается к продаже фирмой ChemDiv, Inc (US).
Однако в отношении соединения CAS 1254584-50-3 до настоящего времени имеется только сообщение о том, что это соединение получено комбинаторным способом посредством очистки из изопропанола, но его кристаллическая форма неизвестна и не охарактеризована.
Необходимо выяснить, способно ли данное соединение кристаллизоваться и иметь кристаллические формы. Затем, если кристаллические формы существуют, необходимо найти воспроизводимые способы получения химически стабильных кристаллических форм и выявить новые кристаллические формы данного соединения.
Стабильность в твердом состоянии и срок хранения активных компонентов являются очень важными факторами. Лекарственное соединение и композиции, включающие его, должны обладать способностью эффективно храниться в течение значительных периодов времени, не проявляя значительного изменения физико-химических свойств активного компонента (например, его химического состава, плотности, гигроскопичности и растворимости). Кроме того, также является важным представить лекарственный препарат в форме, которая является как можно более чистой. В этом отношении аморфные соединения могут представлять значительные проблемы. Например, с такими соединениями труднее обращаться и включать их в лекарственные формы по сравнению с кристаллическим соединением, за счет сомнительной растворимости, и часто оказывается, что они нестабильны и химически загрязнены. Специалисту в данной области будет понятно, что, если лекарственный препарат можно легко получать в стабильной кристаллической форме, то можно решить вышеуказанные проблемы. Обычно невозможно предсказать только на основе молекулярной структуры, каким будет поведение соединения при кристаллизации, и обычно это можно установить только эмпирически.
Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в нахождении новых стабильных кристаллических форм 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида.
Технический результат настоящего изобретения заключается в улучшенных свойствах данного соединения при его использовании, в частности более высокая скорость растворения и повышенная стабильность при хранении.
Поставленная задача и технический результат достигаются получением новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, или фармацевтически приемлемой соли с дифракционными пиками на порошковой рентгеновской дифрактограмме, которые характеризуют следующие показатели: углы дифракции (2θ, °), интенсивность (I, %).
Предметом настоящего изобретения является новая кристаллическая форма 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, имеющая на порошковой рентгеновской дифрактограмме характеристические пики при следующих углах дифракции 2θ (±0,10°): 8,9; 12,4; 15,0; 17,5; 19,9; 21,7
Предметом настоящего изобретения является активный компонент, обладающий свойством ингибитора запуска эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, представляющий собой новую кристаллическую форму 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1.
Предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для профилактики или лечения пролиферативных заболеваний, связанных с запуском эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, содержащая в эффективном количестве активный компонент, обладающий свойством ингибитора запуска эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, по настоящему изобретению.
Фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемые эксципиенты. Под фармацевтически приемлемыми эксципиентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители. Фармацевтическая композиция наряду с активным компонентом по настоящему изобретению может включать и другие активные ингредиенты, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов, например аллергических реакций. При необходимости использования фармацевтических композиций по настоящему изобретению в клинической практике они могут смешиваться для изготовления различных форм, при этом они могут включать в свой состав традиционные фармацевтические носители; например пероральные формы (такие как, таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, растворы или суспензии); формы для инъекций (такие как, растворы или суспензии для инъекций, или сухой порошок для инъекций, который требует лишь добавления воды для инъекций перед использованием); местные формы (такие как, мази или растворы).
Носители, используемые в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, бесцветные агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты.
Более предпочтительной фармацевтической композицией для профилактики или лечения пролиферативных заболеваний, связанных с запуском эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, является фармацевтическая композиция для профилактики или лечения пролиферативного заболевания, выбранного из рака толстой кишки, рака легкого, рака желудка, рака простаты или гепатоцеллюлярной карциномы.
Более предпочтительной фармацевтической композицией для профилактики или лечения пролиферативных заболеваний, связанных с запуском эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, является фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака поджелудочной железы.
Фармацевтическая композиции по настоящему изобретению может быть получена смешением активного компонента, представляющего собой новую кристаллическую форму 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, с инертным наполнителем, растворителем и/или другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
Предметом настоящего изобретения является лекарственное средство для профилактики или лечения пролиферативных заболеваний, связанных с запуском эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, в виде таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, содержащее в эффективном количестве активный компонент или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.
Предметом настоящего изобретения является способ профилактики или лечения пролиферативных заболеваний, связанных с запуском эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, согласно которому нуждающемуся субъекту вводят эффективное количество активного компонента, обладающего свойством ингибитора запуска эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, или фармацевтической композиции, или лекарственного средства по настоящему изобретению.
Более предпочтительным способом профилактики или лечения пролиферативных заболеваний, связанных с запуском эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, является способ профилактики или лечения пролиферативного заболевания, выбранного из рака толстой кишки, рака легкого, рака желудка, рака простаты или гепатоцеллюлярной карциномы.
Более предпочтительным способом профилактики или лечения пролиферативных заболеваний, связанных с запуском эмбрионального сигнального каскада Hedgehog, является способ профилактики или лечения рака поджелудочной железы.
Лекарственные средства могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, местно или ректально). Клиническая дозировка активного компонента (субстанции), фармацевтической композиции или лекарственного комбинированного средства, включающих фармацевтически эффективное количество активного компонента, у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10~500 мг, предпочтительно 50~300 мг. Поэтому во время приготовления фармацевтических композиций по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 10~500 мг, предпочтительно 50~300 мг. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно от одного до шести раз).
Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.
«Агонисты» означают соединения, которые, связываясь с рецепторами определенного типа, активно способствуют передаче этими рецепторами свойственного им специфического сигнала и тем самым вызывают биологический ответ клетки.
«Активный компонент» (лекарственное вещество, лекарственная субстанция, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства).
«Антагонисты» означают лиганды, которые связываются с рецепторами определенного типа и не вызывают активного клеточного ответа. Антагонисты препятствуют связыванию агонистов с рецепторами и тем самым блокируют передачу специфического рецепторного сигнала.
«Ингибиторы» (лат. inhibere - задерживать) означает вещество, замедляющее или предотвращающее течение какой-либо химической реакции; ферментативный ингибитор - вещество, замедляющее или блокирующее обратимо или необратимо протекание ферментативной реакции. Изучение ингибирования ферментов играет важную роль в создании лекарств, в изучении механизма действия и структуры ферментов.
«Лекарственное средство (препарат)» - комбинация нескольких лекарственных веществ для одновременного использования в виде таблеток, капсул, инъекций, мазей, ректальных суспензий и гелей и др. готовых форм, предназначенная для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Лекарственные вещества в одном комплекте могут быть представлены в виде различных готовых форм, предназначенных для введения в организм животного или человека различными способами, например перорально и ректально.
«Лиганды» (от латинского ligo - связывать) представляют собой химические вещества (малая молекула, неорганический ион, пептид, белок и прочее), способные взаимодействовать с рецепторами, которые трансформируют это взаимодействие в специфический сигнал.
«Рецепторы» (от латинского recipere - получать, узнавать) представляют собой биологические макромолекулы, расположенные на цитоплазматической мембране клетки или внутриклеточно, способные специфически взаимодействовать с ограниченным набором физиологически активных веществ (лигандов) и трансформировать сигнал об этом взаимодействии в определенный клеточный ответ.
«Сигнальный каскад» (сигнальная система, каскад передачи сигнала) означает совокупность взаимосвязанных последовательных и параллельных молекулярных процессов регуляции клеточного метаболизма внешними (первичными) сигналами, несущими в клетку информацию, что принципиально отличает их от других поступающих в клетку химических соединений, служащих для нее источником материи и энергии. Молекулярные механизмы передачи (трансдукции) внешних сигналов в клетку подразумевают не только передачу сигналов как таковую, но и весь комплекс событий, с ней сопряженных, в том числе усиление, ослабление и подавление (или выключение) сигналов.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение общей формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как, консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как, парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназалъные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения. Фармацевтические композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного соединения с жидким или тонко измельченным твердым носителем. Для изготовления суппозиториев помимо активных компонентов используют также масло какао, сплавы его с парафином и гидрогенизированными жирами, растительные и животные гидрогенизированные жиры, твердый жир, ланоль, сплавы гидрогенизированных жиров с воском, твердым парафином и другие основы, разрешенные для медицинского применения.
«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные. (Подробное описание свойств таких солей дано в Berge S.M., et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1-19). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезированы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как, холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин.
«Фармацевтически приемлемые эксципиенты» под фармацевтически приемлимыми эксципиентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители.
Также изобретение поясняется чертежами.
Фиг. 1. Порошковая рентгеновская дифрактограмма новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, полученной согласно настоящему изобретению. Зависимость интенсивность от угла 2θ, °.
Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.
Пример 1. Метод синтеза соединения формулы 1. Синтез осуществляют в соответствии со Схемой 1.
Смесь аминопиридина 2 (0,04 моль) и нитробромацетофенона 3 (0,04 моль) в этаноле (80 мл) кипятят в течение 3 ч, затем охлаждают до комнатной температуры. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают и сушат на открытом воздухе. Чистый желтый кристаллический продукт 4 был получен с выходом 66-75%.
2
Смесь соединения 4 (0,05 моль), SnCl (0,18 моль), воды (60 мл) и соляной кислоты (80 мл) перемешивают при 60°C в течение 1 ч, затем охлаждают до комнатной температуры и выливают в воду (500 мл). Полученную смесь подщелачивают 10%-ным раствором соды до pH 9-10. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат на открытом воздухе и перекристаллизовывают из этанола, что дает чистое соединение 5 в виде белых кристаллов с выходом 75-88%.
Карбоновую кислоту 6 (1,1 ммоль) добавляют к раствору 1, 1′-карбонилдиимидазола (1,2 мМоль) в абсолютном ДМФ (5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 80°C в течение 1 ч без доступа воздуха. Затем добавляют амин 5 (1 ммоль) и полученную реакционную смесь перемешивают при 100°C дополнительно 3-4 ч и оставляют на ночь при комнатной температуре. После этого реакционную смесь вливают в 10-кратный объем воды, осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат на открытом воздухе. Соединение формулы 1 получают с выходом 75%, LC MS m/z 392 (M+1).
Пример 2. Получение кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-n-толилацетамидо)метил)-2,3)4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1.
10 мг 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1 растворяют в 10 мл метанола, нагревая смесь до 40°C. К раствору, полученному в результате этого, по каплям добавляют 10 мл воды при той же температуре в течение 20 мин и полученную смесь охлаждают до 5°C в течение суток, после чего отфильтровывают и собирают кристаллическое вещество. Кристаллы сушат при 50°C при пониженном давлении до тех пор, пока масса кристаллов не перестает уменьшаться при дальнейшем высушивании, в результате чего было произведено 9,75 мг белого твердого вещества.
Порошковый рентгеноструктурный анализ полученной кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1 проводят при помощи дифрактометра Rigaku с детектором Saturn 944 HG и медного излучения CuKα. На спектре порошковой рентгеновской дифрактограммы кристаллического вещества (Фиг. 1) наблюдают характеристические пики при углах дифракции 2θ (±0,10°): 8,9; 12,4; 15,0; 17,5; 19,9; 21,7.
50
Пример 3. Биологические испытания и определение ингибирующей активности (IC) соединения формулы 1.
Для идентификации ингибиторов SHh-сигнального каскада белка используют клетки С3Н10Т1/2. SHh-белок активирует клетки C3Н10Т1/2, что приводит к их остеогенной дифференцировке [Kinto N., Iwamoto M., Enomoto-Iwamoto М., Noji S., Ohuchi X., Yoshioka X., Kataoka H., Wada Y., Yuhao Г., Takahashi H.E., Yoshiki C., Yamaguchi A. Fibroblasts expressing Sonic hedgehog induce osteoblast differentiation and ectopic bone formation. FEBS Lett. 1997; 404 (2-3): 319-23 и Spinella-Jaegle S., Rawadi G. Kawai S., Gallea S., Faucheu C., Mollat P., Courtois В., Bergaud В., Ramez V., Blanchet A.M., Adelmant G., Baron R., Roman-Roman S. Sonic hedgehog increases the commitment of pluripotent mesenchymal cells into the osteoblastic lineage and abolishes adipocytic differentiation. J. Cell. 2001; 114 (Pt 11): 2085-94] и, в частности, выраженному повышению фермента щелочной фосфатазы.
2
2
Клетки культивируют в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой в инкубаторе при температуре 37°C, 100% влажности и 5% содержанием CO. Клетки помещают в 384-луночные пластины и оставляют на ночь. На следующий день исследуемые соединения в концентрации 10 мкМ добавляют к клеткам, инкубируют в течение 30 мин, затем рекомбинантный (R&D, США) SHh белок в концентрации 0,3 мкг/мл добавляют и инкубируют в течении 3 дней. Клетки с ДМСО и клетки без SHh белка используют в качестве тест контроля. Для определения активности клеточной щелочной фосфатазы клетки лизируют в буфере, содержащем 0,2% Тритон-X100, лизаты инкубируют вместе с пролюминисцентной подложкой CSPD (Applied Biosystems, США) и измеряют люминесценцию с использованием анализатора VICTOR V (PerkinElmer, США).
Для устранения неспецифического ингибирования соединениями щелочной фосфатазы клетки в первую очередь инкубируют с белком SHh в течение 3 дней, лизируют и добавляют до определения активности щелочной фосфатазы исследуемых соединений. Для устранения цитотоксичных соединений клетки инкубируют вместе с исследуемыми соединениями и SHh белками в течение 3 дней и количество живых клеток в соответствующих лунках определяют с использованием реагента CellTiter-Blue (Promega, США).
50
50
Ингибирующая активность соединений определяют концентрацией соединений, вызывающей половину максимального ингибирования стимуляции клеточной щелочной фосфатазы SHh (IC). Ингибирующая концентрация IC новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1 составляет 390 нМ.
Пример 4. Определение кинетики растворения кристаллической формы.
Кинетику растворения новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, полученной в примере 2, сравнивают с кинетикой растворения аморфного соединения CAS 1254584-50-3. Прибор для определения скорости растворения представляет собой трехгорлый сосуд емкостью 1 л. В один из тубусов вводят термометр, в другой - стеклянную трубку для взятия проб и их комплексирования, а в третий - основную деталь прибора - цилиндрическую корзинку высотой 3,6 см и диаметром 2,5 см, сделанную из нержавеющей стали в виде сетки с отверстиями диаметром 40 меш (около 0,351 мм). Корзинка насажена на ось мотора.
В сосуд наливают растворяющую среду (1000 мл), в данном эксперименте ДМСО, поскольку он является важным биполярным апротонным растворителем и благодаря своей сильной растворяющей способности, ДМСО часто используется как растворитель в химических реакциях и система биологического скрининга. Исследуемый образец помещают в цилиндрическую корзинку, которую устанавливают на расстоянии 2 см от дна сосуда.
Для сравнительного образца 1 используют 200 мг новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, а для сравнительного образца - 2-200 мг аморфного соединения СAS 1254584-50-3 с получением после полного растворения раствора, содержащего 200 м.д. соединения CAS 1254584-50-3.
Температуру растворяющей среды во время опыта поддерживают постоянной (37±0,5°C). Скорость вращения корзинки в среде регулируют с точностью ±5%, она составляет 200 об/мин. Через установленные интервалы времени отбирают для анализа пробы по 1-2 мл для определения содержания лекарственного вещества. Взятый объем растворителя тотчас же восполняют новым.
Полученные результаты приведены в таблице 1 (где величины представляют собой количество (м.д.) образцов 1 или 2 в растворе:
Результаты демонстрируют, что скорость растворения новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1 в ДМСО выше, чем скорость растворения аморфного соединения CAS 1254584-50-3. В частности, время, в течение которого происходит 50% растворение новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, в несколько раза меньше, чем для сравнительного образца аморфного соединения CAS 1254584-50-3.
Пример 5. Исследование хранения кристаллической формы.
Все образцы хранились в стеклянных виалах, укупоренных резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками, в холодильной камере при температуре ~4,7°C и в морозильной камере при температура около -23°C. Количество примесей определялось методом внутренней нормализации, детектирование проводилось УФ-детектором при длине волны 220 нм.
В таблице 2 представлены результаты испытаний новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-N-[4-(8-метил-имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1, свидетельствующие об улучшении ее стабильности при пониженной температуре по сравнению с аморфным соединением CAS 1254584-50-3.
Результаты однозначно свидетельствуют о перспективности заявляемой новой кристаллической формы 2-хлоро-4-метокси-H-[4-(8-метил-имидазо[1,2-a]пиридин-2-ил)-фенил]-бензамида формулы 1.
Настоящее изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, биохимии.