Способ определения адсорбционной ёмкости гранулированного остеокондуктивного костнопластического материала
METHOD FOR DETERMINING THE ADSORPTION CAPACITY OF GRANULAR OSTEOCONDUCTIVE BONE GRAFT MATERIAL

Изобретение относится к области медицины, а именно челюстно-лицевой хирургии, и направлено на оптимизацию репаративной регенерации костной ткани методом направленной костной регенерации. Применение метода направленной костной регенерации для устранения костного дефекта подразумевает использование костнопластических материалов в качестве матрицы реконструкции с наружновнутренними поверхностями и пространствами, доступными для адсорбции факторов роста кости.
Необходимый и достаточный объем факторов роста кости (/далее ФРК), который может адсорбировать гранулированный остеокондуктивный костнопластический материал (далее ГОКМ), зависит от его адсорбционной емкости. Адсорбционная емкость гранулированного остеокондуктивного материала это показатель способности фракции костнопластического материала разместить на своих наружновнутренних поверхностях и пространствах максимально возможное количество ФРК. Адсорбционные свойства ГОКМ имеют ограничения, связанные с наличием воздуха и мелкодисперсной крошки в порах и каналах гранул фракции, приникающих в материал на этапах производственного цикла, что приводит к возникновению гидродинамических и механических препятствий для миграции ФРК и прорастания сосудов из реципиентного ложа внутрь гранул.
Известна модель прогнозирования изменений субстанции сгустка крови под действием сдвигающих сил, подобных тем, которые имели бы место in vivo в условиях пространственной неоднородности кровяного сгустка и его окружения, влияющие на процесс его сокращения и фиксации на окружающем пассивном вязкоупругом материале носителе (Valerie Tutwiler, Hailong Wang, Rustem I. Litvinov, John W. Weisel, Vivek B. Shenoy. Interplay of Platelet Contractility and Elasticity of Fibrin/Erythrocytes in Blood Clot Retraction. Biophysical Journal. Article vollume 112, issue 4, P 714-723, February 28, 2017. DOI:https://doi.org/10.1016/j.bpj.2017.01.005). Представленная модель не позволяет:
1. определить влияние пор и каналов подлежащей матрицы субстрата-носителя на способность кровяного сгустка и других компонентов крови к продвижению внутрь носителя;
2. не определяется адсорбционная емкость подлежащего субстрата и ее влияние на способность материала к адсорбции достаточного объема факторов роста кости;
3. определить объем трансформируемой в сгусток крови, который может разместить на своих доступных поверхностях субстрат носитель, включая поверхности пор и каналов;
4. не проводится удаление воздуха из пор и каналов при размещении сгустка крови на субстрате In vitro.
Известен способ оценки взаимосвязи между пористостью и размером пор биоматериалов, используемых для регенерации костей (Karageorgiou V., Kaplan D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Journal of Biomaterials.
Published online 7 April 2005 in ScienceDirect(www.sciencedirect.com). DOI: 10.1016/j.biomaterials.2005.02.002). Авторы рассмотрели влияние этих морфологических особенностей на остеогенез in vitro и in vivo. Определили, что In vitro более низкая пористость стимулирует остеогенез, подавляя пролиферацию клеток и вызывая агрегацию клеток. Напротив, in vivo было продемонстрировано, что высокая пористость и размеры пор > 300 мкм способствуют прямому остеогенезу как за счет рекрутирования остеобластических клеток, которые стимулируются к миграции в каркас, так и из-за васкуляризации, которая способствует благоприятному образованию новой кости.
Ключевыми недостатками данного метода являются:
1. не проводится удаление гидродинамической заслонки, создаваемой воздушными пузырями в порах и каналах, препятствующей их заполнению элементами крови, прорастанию сосудов и остеогенного клеточного пула внутрь трансплантата;
2. не учитывается отношение объем пор/общий объем внутренних пространств в гранулах костнопластических материалов, что не позволяет рассчитать доступную площадь для размещения факторов роста кости в трансплантате;
3. не рассчитывается адсорбционная емкость гранулированного костнопластического материала, что не позволяет определить приготовление достаточного объема факторов роста кости, для размещения на остекондуктивном носителе;
4. расчет объема массы культивируемых факторов роста без учета адсорбционной емкости остеокондуктивного носителя приводит к необоснованному повышению затрат материальных и человеческих ресурсов учреждения.
В качестве прототипа взят известный способ определения влияния геометрии гидроксиапатита как клеточного субстрата на образование кости (Q М Jin 1, Н Takita, Т Kongo, K Atsumi, Н Itoh, Y Kuboki. Effects of geometry of hydroxyapatite as a cell substratum in BMP-induced ectopic bone formation. Journal of Biomedical materials research. 2000. Dec 15; 52(4):491-9). Авторы сравнивали три различных типа пористого гидроксиапатита с размером пор 100-200 мкм в диаметре с точки зрения их способности к индукции остеогенеза при подкожной имплантации рекомбинантного человеческого ВМР-2 крысам и экстракции через 1, 2, 3 и 4 недели. Выявили, что геометрия пор влияет на регенерацию кости: длинные каналы и взаимосвязанные сфероидальные поры способствуют колонизации клеток и прорастанию кости, в то время как изогнутые поры с плохими взаимосвязями на поверхности каркаса (например, поверхностные ямки) препятствуют проникновению клеток-предшественников остеобластов и капиллярной инфильтрации, что позволяет костеобразование только на поверхности каркаса.
Недостатком известного способа является то, что не учитывается наличие гидродинамической заслонки, создаваемой воздушными пузырями в порах и каналах, препятствующей их заполнению элементами крови, прорастанию сосудов и остеогенного клеточного пула внутрь трансплантата; не учитывается отношение объем пор/общий объем внутренних пространств в гранулах костнопластических материалов, что не позволяет рассчитать доступную площадь для размещения факторов роста кости в трансплантате; невозможно рассчитать адсорбционную емкость гранулированного костнопластического материала, что не позволяет обеспечить приготовление достаточного объема факторов роста кости, для размещения на остекондуктивном носителе; расчет объема массы культивируемых факторов роста без учета адсорбционной емкости остеокондуктивного носителя приводит к необоснованному повышению затрат материальных и человеческих ресурсов учреждения.
Задачей изобретения является устранение указанных недостатков и создание способа определения адсорбционной емкости гранулированного остеокондуктивного костнопластического материала.
Суть способа заключается в выполнении последовательных действий, направленных на определение адсорбционной емкости гранулированного остеокондуктивного костнопластического материала путем определения доступной площади и объема наружновнутренних пространств трансплантата. Для этого ГОКМ подвергают пассивной и активной дегазации, определяют разницу объемов жидкости до и после каждого этапа дегазации, суммируют эти разницы и получают величину адсорбционной емкости гранулированного остеокондуктивного костнопластического материала.
Суть способа показана на примере ГОКМ CeraBone.
Для корректного определения показателя адсорбционной емкости проводили удаление из его каналов и полостей воздушных пузырей и мелкодисперсной фракционной крошки, создающих механические препятствия для миграции и адсорбции на поверхности наружновнутренних пространств факторов роста кости. Мелкодисперсная пыль и воздушные пузыри осаждаются на наружновнутренние поверхности полостей и каналов гранул на этапах производства костнопластического материала. Следовательно, перед внесением костнопластического материала в реципиентное ложе необходимо осуществлять действия, направленные на определение его адсорбционной емкости.
С этой целью предложено удалять из полостей и каналов ГОКМ CeraBone крупнодисперсную крошку, мелкодисперсную пыль и пузыри воздуха разработанным нами методом дегазации, который включает этапы пассивной и активной дегазации. Задача пассивной дегазации - освободить от крупнодисперсной крошки и воздуха наружные поверхности материала. Задача активной дегазации - освободить от мелкодисперсной пыли и остаточных газов внутренние поверхности каналов, пор и пустот материала.
3
Пассивную дегазацию осуществляют в физиологическом растворе, так как его осмотическое давление (0,9%) соответствует осмотическому давлению плазмы крови. В термостате температуру физиологического раствора доводили до +37°С, что соответствовало температуре реципиентного ложа и снижало стресс, испытываемый клеточными элементами, расположенными в окружающих трансплантат тканях. В термостате в пробирку помещали ГОКМ и заливали его физиологическим раствором в соотношении 1:2 (на 1 см ГОКМ добавляли 2 мл физиологического раствора).
Опытным путем установлено, что на стадии пассивной дегазации при погружении на 20 минут ГОКМ в физиологический раствор при +37°С из ГОМК происходит выделение пузырей газа и крупнодисперсной фракционной крошки. Через 20 минут после проведения пассивной стадии дегазации отделяли от материала физиологический раствор с помощью пипеточного дозатора и помещали его в эппендорф. Определено, что после пассивной дегазации объем извлеченной жидкости составил 1,62 мл. Разница между первоначальным объемом жидкости и после пассивной дегазации составила 0,38 мл (2 мл - 1,62 мл = 0,38 мл).
воздушных пузырей в крупные с последующим их схлопыванием и выделением из каналов материала в раствор.
По окончании стадии активной дегазации с помощью пипеточного дозатора вновь производили забор жидкости и помещали ее в эппендорф для определения ее остаточного объема, который составил 1,44 мл. Далее, приступают к стадии активной дегазации. Для этого фракцию материала заливают раствором лимонной кислоты (рН1) 1,62 мл. при +37°С на 10 минут. Затем, проводят активную дегазацию в ультразвуковой ванне УЗУ - 0,25 с частотой 18 кГц, мощностью 250 Вт и временем экспонирования 60 сек. Запуск ультразвуковых генераторов производят через 10 минут после нахождения ГОКМ в растворе лимонной кислоты. Возникал эффект кавитации, который инициировал гидроудары на наружновнутренних поверхностях гранул. Неровности этих поверхностей приводили к возникновению интерференции и дифракции волн, в результате чего происходило выделение газов и свободнолежащей мелкодисперсной пыли из гранул материала в омывающую жидкость. Происходил стабильный процесс удаления гидродинамических заслонок за счет объединения мелких остатков кислоты фракцию материала погружали в физиологический раствор при температуре +37 градусов С и озвучивали в ультразвуковой ванне УЗУ - 0,25 с частотой 18 кГц, мощностью 250 Вт и временем экспонирования 60 сек. Разница между объемами жидкости до и после активной дегазации составила 0,18 мл (1,62 мл - 1,44 мл = 0,18 мл). Суммировали результаты разницы объемов жидкости после двух стадий дегазации, сумма составила 0,56 мл (0,38 мл + 0,18 мл = 0,56 мл). Далее, приступали к расчету разницы между первоначальным объемом жидкости и окончательным после двух стадий дегазации. Таким образом, после проведения двух стадий дегазации произошло снижение объема жидкости на 0,56 мл (2,0 мл - 1,44 мл = 0,56 мл) и повышение его адсорбционной емкости на 0,56 мл. Следовательно, адсорбционная емкость гранулированного остеокондуктивного материала CeraBone составляет 0,56 мл.
Опытным путем выявлено, что по значению адсорбционной емкости можно определить адсорбируемый трансплантатом объем факторов роста кости, который материал способен разместить на своих поверхностях. Соответственно, в данном случае, для размещения на подготовленных предлагаемым способом наружновнутренних поверхностях и в свободных пространствах 1 мл гранулированного остеокондуктивного костнопластического материала CeraBone, достаточно приготовить 0,56 мл ФРК. Таким образом, определяя адсорбционную емкость ГОКМ получают значение адсорбционной емкости и увеличивают объем свободных пространств материала, доступных для адсорбции ФРК, и, в случае его использования в качестве носителя ФРК, выясняют, какой объем ФРК будет достаточно приготовить для размещения на носителе.
Аналогичным образом выяснена адсорбционная емкость для других костнопластических материалов: Maxresorb, BioOSS, Xenograft Collagen, Osteon II, данные для которых приведены в таблице №1.
Увеличенный таким образом объем наружновнутренних пространств ГОКМ, становится доступным для большей диффузии клеток, тканевой жидкости, плазмы крови и прорастания сосудов, благодаря вытеснению воздушных пузырей, крупнодисперсной крошки и мелкодисперсной пыли. Увеличенный таким образом внутренний объем трансплантата и, соответственно, очищенная площадь его поверхностей, увеличивают диффузию клеток, тканевой жидкости, плазмы крови и прорастание сосудов во внутрь гранул материала и позволяют добиться оппозиционного репаративного остеогенеза.
Способ определения адсорбционной емкости ГОКМ с помощью вышеописанной методики является новым по сравнению с описанными аналогами и прототипом, позволяет определить и повысить адсорбционную емкость ГОКМ и достигнуть нового результата: оптимизировать биотрансформацию, размещенного в реципиентном ложе костнопластического материала, в нативную кость, что позволит оптимизировать сроки лечения, избежать послеоперационных осложнений и повторных хирургических вмешательств.
КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР
Для разработки способа провели исследование ГОКМ разных производителей с однотипными характеристиками, указанными производителем в инструкции использования (BioOSS, CeraBone, Maxresorb, Osteon II, Xenograft Collagen, и зарегистрированными в России для применения (таблица 1). Суть способа изложена на примере ГОКМ CeraBone. Технический результат способа достигается следующими условиями проведения действий. С целью планирования устранения сложного дефекта кости в программе для ЭВМ по 3D рентгенологическому изображению костей черепа определяются топография, дизайн, состав сегментов и объем сложного дефекта кости в аксиальной, фронтальной и сагиттальной плоскости, проектируются границы реставрации внешних контуров рельефа поверхности дефекта кости и прорисовывается заготовка профильного шаблона наружного рельефа реставрации. Затем проводят расчет объемов сегментов дефекта в границах планируемой реставрации и промер периметра лекала шаблона для изолирующей мембраны. Вестибулярную и аксиальную части лекала объединяют по нижней границе вестибулярной части альвеолярного отростка и получают общий контур раскроя лекала шаблона изолирующей мембраны.
После расчета требуемого объема гранулированного остеокондуктивного костнопластического материала перед размещением на нем факторов роста кости осуществляли действия, направленные на определение его адсорбционной емкости, путем удаления из полостей и каналов ГОКМ CeraBone крупнодисперсной крошки, мелкодисперсной пыли и пузырей воздуха. На этапе пассивной дегазации - освобождали наружные поверхности ГОКМ от крупнодисперсной крошки и воздуха. На этапе активной дегазации - освобождали внутренние поверхности каналов, пор и пустот ГОКМ от мелкодисперсной пыли и остаточных газов.
3
Пассивную дегазацию осуществляли в физиологическом растворе, так как его осмотическое давление (0,9%) соответствует осмотическому давлению плазмы крови. В термостате температуру физиологического раствора доводили до+37°С, что соответствовало температуре реципиентного ложа и снижало стресс, испытываемый клеточными элементами, расположенными в окружающих трансплантат тканях. В термостате в пробирку помещали ГОКМ и заливали его физиологическим раствором в соотношении 1:2 (на 1 см ГОКМ добавляли 2 мл физиологического раствора).
Опытным путем установлено, что на стадии пассивной дегазации при погружении на 20 минут ГОКМ в физиологический раствор при +37°С из ГОМК происходит выделение пузырей газа и крупнодисперсной фракционной крошки. Через 20 минут после проведения пассивной стадии дегазации отделяли от материала физиологический раствор с помощью пипеточного дозатора и помещали его в эппендорф. Выявили, что после пассивной дегазации объем извлеченной жидкости составил 1,62 мл. Разница между первоначальным объемом жидкости и после пассивной дегазации составила 0,38 мл (2 мл - 1,62 мл = 0,38 мл).
Далее, приступали к стадии активной дегазации. Для этого фракцию материала заливали раствором лимонной кислоты (рН1) 1,62 мл. при +37°С на 10 минут. Затем, проводили активную дегазацию в ультразвуковой ванне УЗУ - 0,25 с частотой 18 кГц, мощностью 250 Вт и временем экспонирования 60 сек. Запуск ультразвуковых генераторов производили через 10 минут после нахождения ГОКМ в растворе лимонной кислоты. Возникал эффект кавитации, который инициировал гидроудары на наружновнутренних поверхностях гранул. Неровности этих поверхностей приводили к возникновению интерференции и дифракции волн, в результате чего происходило выделение газов и свободнолежащей мелкодисперсной пыли из гранул материала в омывающую жидкость. Происходил стабильный процесс объединения мелких воздушных пузырей в крупные с последующим их схлопыванием и выделением из каналов материала в раствор.
По окончании стадии активной дегазации с помощью пипеточного дозатора вновь производили забор жидкости и помещали ее в эппендорф для определения ее остаточного объема, который составил 1,44 мл. Для удаления остатков кислоты фракцию материала погружали в физиологический раствор при температуре +37 градусов С и озвучивали в ультразвуковой ванне УЗУ - 0,25 с частотой 18 кГц, мощностью 250 Вт и временем экспонирования 60 сек. Разница между объемами жидкости до и после активной дегазации составила 0,18 мл (1,62 мл - 1,44 мл = 0,18 мл). Суммировали результаты разницы объемов жидкости после двух стадий дегазации, сумма составила 0,56 мл (0,38 мл + 0,18 мл = 0,56 мл). Далее, приступали к расчету разницы между первоначальным объемом жидкости и окончательным после двух стадий дегазации. Таким образом, после проведения двух стадий дегазации произошло снижение объема жидкости на 0,56 мл (2,0 мл - 1,44 мл = 0,56 мл) и повышение его адсорбционной емкости на 0,56 мл. Следовательно, адсорбционная емкость гранулированного остеокондуктивного материала CeraBone составляет 0,56 мл.
Опытным путем выявлено, что по значению адсорбционной емкости можно определить адсорбируемый трансплантатом объем факторов роста кости, который материал способен разместить на своих поверхностях. Соответственно, в данном случае, для размещения на подготовленных нашим способом наружновнутренних поверхностях и в свободных пространствах 1 мл гранулированного остеокондуктивного костнопластического материала CeraBone, достаточно приготовить 0,56 мл ФРК. Таким образом, определяя адсорбционную емкость ГОКМ получают значение адсорбционной емкости, доступной для адсорбции ФРК, и, в случае его использования в качестве носителя ФРК, выясняем какой объем ФРК будет достаточно приготовить для размещения на носителе.
Изобретение позволяет точно определить адсорбционную емкость ГОКМ и требуемый объем ФРК.