Способ диагностики туберкулеза
METHOD FOR DIAGNOSING TUBERCULOSIS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для серодиагностики туберкулеза с использованием оценки диагностической специфичности бактериального антигена, против которого направлены моноклональные антитела, например, противотуберкулезные моноклональные антитела и распознаваемые ими микобактериальные антигены.
Знания о специфичности антигенов микобактерий важны, прежде всего, для диагностических целей.
Во-первых, это микроскопические исследования мокроты и другого клинического материала больных с предварительным окрашиванием по Циль-Нильсену на наличие кислотоустойчивых микобактерий и с последующим культуральным исследованием материала.
Эффективность бактериоскопической идентификации можно повысить, применяя противотуберкулезные моноклональные антитела (МАТ), так при использовании обширной панели МАТ и поликлональных антител против МРТ64 (стандартным окрашиванием в микробиологических лабораториях выявляется только 20-40% больных туберкулезом) удается выявить до 83% случаев туберкулеза [Hoel I.M., Mohammed Ali I.A., Ishtiaq S., Sviland L., Wiker H.G., Mustafa T. 2021. Immunochemistry-Based Diagnosis of Extrapulmonary Tuberculosis: A Strategy for Large-Scale Production of MPT64-Antibodies for Use in the MPT64 Antigen Detection Test. Antibodies (Basel), 2021;10(3):34. DOI: 10.3390/antib10030034].
Во-вторых, информация о специфичности микобактериальных антигенов востребована при диагностике, основанной на использовании иммунохроматографических тестов для выявления М. tuberculosis в микробиологических культурах, полученных на жидкой питательной среде Миддлбрук 7Н9 в автоматизированной системе учета роста микобактерий ВАСТЕС MGIT320-960. Например, микобактериальный белок МРТ64 присутствует только в микобактериях М. tuberculosis complex, которые вызывают туберкулез у людей. Поэтому тесты на МРТ64 позволяют быстро идентифицировать рост микобактерий М. tuberculosis complex в жидкой среде при посеве материала от больных туберкулезом [Chikamatsu et al., 2014].
Поиск специфичных антигенов и их эпитопов для создания подобных тестов важен для создания новых иммунохроматографических тестов, обладающих большей специфичностью/чувствительностью, что подтверждает полезность нового подхода для их поиска.
В-третьих, этот метод полезен при оценке диагностической эффективности микобактериальных антигенов в серологических исследованиях. Это актуально, как для поиска серодиагностических маркеров [Ma G., Wang P., Yang Y., Wang W., Ma J., Zhou L., Ouyang J., Li R., Zhang Sh. emPAI-assisted strategy enhances screening and assessment of Mycobacterium tuberculosis infection serological markers. 2021. Microb.Biotechnol.; 14(4): 1827-1838. DOI: 10.1111/1751-7915.13829], так и для создания мультипротеинных диагностикумов [Chen Y., Ge P., Zhang K., Xiang J., Zhang Li, Robertson I.D., Guo A. 2021. Use of Rv0222-Rv2657c-Rv1509 Fusion Protein to Improve the Accuracy of an Antibody ELISA for Extra-Pulmonary Tuberculosis in Humans. Pathogens, Jun 30;10(7):828. doi: 10.3390/pathogens10070828] [Lyashchenko KP, Sikar-Gang A, Sridhara AA, Johnathan-Lee A, Elahi R, Lambotte P, Esfandiari J, Duthie M, Reed SG, Jones G, Vordermeier HM, Thacker TC, Palmer MV, Waters WR. 2021. Novel polyprotein antigens designed for improved serodiagnosis of bovine tuberculosis. Vet Immunol Immunopathol.;240:110320. doi: 10.1016/j.vetimm.2021.110320].
Серодиагностические тесты удобны и быстры для выявления ряда инфекций.
Однако, все они имеют серьезное ограничение, связанное с наличием в организме «естественных» (natural) перекрестных антител [Dermicik F., Kostka S.L., Tenzer S., Waisman A., E. Von Stebut Cross-reactive, natural IgG recognizing L. major promote parasite internalization by dendritic cells and promote protective immunity J Mol Med (Berl)2021 Oct 4. doi: 10.1007/s00109-021-02137-4.].
Эти антитела присутствуют в сыворотке человека и животных и направлены, как против собственных антигенов организма, так и против вирусов, бактерий и паразитов [Beutgen V.M., Schmelter C., Pfeiffer N., Grus F.H. Contribution of the Commensal Microflora to the Immunological Homeostasis and the Importance of Immune-Related Drug Development for Clinical ApplicationsInt J Mol Sci. 2021 Aug 18;22(16):8896. doi: 10.3390/ijms22168896.]. Естественные антитела являются нормальными компонентами физиологического состояния и присутствуют в организме без предварительной иммунизации. Эти антитела бывают IgG, IgM и IgA классов были выявлены как части естественного иммунитета [Fereidan-Esfahani, M.; Nayfeh, Т.; Warrington, A.; Howe, C.L.; Rodriguez, M. IgM Natural Autoantibodies in Physiology and the Treatment of Disease. Methods Mol. Biol. 2019, 1904, 53-81.] [Nagele, E.P.; Han, M.; Acharya, N.K.; DeMarshall, C.; Kosciuk, M.C.; Nagele, R.G. Natural IgG Autoantibodies Are Abundant and Ubiquitous in Human Sera, and Their Number Is Influenced By Age, Gender, and Disease. PLoS ONE 2013, 8.] [Reyneveld, G.I.; Savelkoul, H.F.J.; Parmentier, H.K. Current Understanding of Natural Antibodies and Exploring the Possibilities of Modulation Using Veterinary Models. A Review. Front. Immunol. 2020, 11, 2139.]]. Они обладают низкой аффинностью к потенциально патогенным организмам, и способны связываться с собственными антигенами (естественные аутоантитела). Происхождение, репертуар и функция естественных антител все еще активно изучается, хотя и разработано несколько гипотез [Palma, J.; Tokarz-Deptula, В.; Deptula, J.; Deptula, W. Natural antibodies-facts known and unknown. Cent. Eur. J. Immunol. 2018, 43, 466-475.]. Естественные антитела могут сильно искажать диагностические показатели. Предложенный способ позволяет учесть эти искажения и позволяет повысить диагностическую эффективность.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ серологической диагностики туберкулеза у больных [RU 2133965, C1, G01N 33/569, 27.07.1999], включающий в себя иммуноферментный анализ для определения уровня антител в контрольной и опытной сыворотках к микобактериальному антигену по уровню относительной экстинкции, на основании которой судят о положительности реакции, при этом, после определения экстинкции контрольной сыворотки с микобактериальным антигеном дополнительно ставят реакцию этой же сыворотки с общим перекрестнореагирующим бактериальным антигеном и уровень экстинкции ее доводят до уровня реакции с микобактериальным антигеном, затем опытную сыворотку ставят в этом же разведении с общим бактериальным антигеном, измеряют величину относительной экстинкции опытной сыворотки, после чего определяют коэффициент, соответствующий разнице в относительной экстинкции между контрольной и опытной сыворотками при постановке реакции с общим бактериальным антигеном, и при постановке реакции опытной сыворотки с микобактериальным антигеном повышают уровень положительности реакции с учетом этого коэффициента.
Недостатком наиболее близкого технического решения является относительно низкая точность диагностики.
Задача, которая решается в изобретении, заключается в разработке способа серодиагностики туберкулеза обладающем высокой чувствительностью и точностью.
Требуемый технический результат заключается в повышении чувствительности и точности.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе диагностики микобактерий туберкулеза, основанном на идентификации микобактериального антигена, согласно изобретению, идентификацию микобактериального антигена осуществляют в гетерологичном двусайтовом иммуноферментном анализе, основными компонентами теста в котором являются моноклональные антитела против антигенов М. tuberculosis и антитела сыворотки больного туберкулезом человека, что позволяет реализовать двусайтовую структуру типа «гетеросэндвич» и детектировать специфические противотуберкулезные антитела в исследуемых образцах сыворотки человека, индивидуально исключая неспецифическое «фоновое» связывание естественных антител сыворотки.
На графических материалах представлены:
в таблице 1 - противотуберкулезные МАТ, их изотип и специфичность по отношению к микобактериальным и бактериальным ультразвуковым дезинтегратам (УЗД) и исходному иммуногену;
на фиг. 1 - иммуноблоттинг МАТ с культуральным фильтратом M. tuberculosis H37Rv;
на фиг. 2 - ИФА МАТ с культуральным фильтратом М. tuberculosis H37Rv, с указанием К связывания;
на фиг. 3 - стандартные кривые для определения противотуберкулезных IgG, IgA и IgM-антител;
в таблицах 2, 4, 6 - определение анти-CFP10 IgG, IgA и IgM антител сыворотки людей на MAT 2F9 в 136 образцах от больных туберкулезом и другими нетуберкулезными заболеваниями и здоровых доноров;
в таблицах 3, 5, 7 - статистические данные обработки результатов противотуберкулезных антител анти-CFP10 (анти-2F9 MAT) IgG, IgA и IgM в исследуемых группах;
в таблицах 8, 9, 10 - статистические данные обработки результатов противотуберкулезных антител анти-МРТ63 (анти-2Н2 MAT) IgG, IgA и IgM в исследуемых группах;
в таблицах 11, 12, 13 - статистические данные обработки результатов противотуберкулезных антител анти-МРТ63 (анти-1А5 MAT) IgG, IgA и IgM в исследуемых группах.
Реализуется предложенный способ диагностики микобактерий туберкулеза следующим образом.
Предлагаемый способ дает обоснование для скрининга серологических маркеров (микобактериальных антигенов, выявляемых моноклональными антителами) в качестве перспективных для клинического теста на туберкулез. Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает новую техническую поддержку для скрининга потенциальных серологических маркеров любых инфекционных заболеваний.
Способ основан на стандартном двусайтовом методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), который позволяет регистрировать комплекс антитело-антиген-антитело, зафиксированный на твердой фазе, с помощью видоспецифических «вторых» антител с ковалентно-связанной ферментной меткой. Реакция фермента с субстратом позволяет количественно в зависимости от величины регистрируемого комплекса получить большую или меньшую засветку реакции, которая считывается спектрофотометрически. Основным компонентом теста являются противотуберкулезные моноклональные антитела, направленные против разных антигенов М. tuberculosis complex, т.е. обладающие специфичностью и высокой аффинностью по отношению к исследуемому антигену. Моноклональные антитела фиксируются на твердой фазе (лунка планшета для ИФА). После отмывки не адсорбировавшихся антител и блокировки свободных сайтов планшета бычьим сывороточным альбумином в избытке добавляется комплексный растворимый микобактериальный антиген культурального фильтрата М. tuberculosis H37Rv и инкубируется. Образуется комплекс антиген-моноклональные антитела, и после очередной отмывки добавляются «вторые» антитела в виде разведенной исследуемой сыворотки человека, которые связываются с антигеном в комплексе антиген-моноклональные антитела, образуя 3-х этажную структуру типа «сэндвич». Эти вторые антитела сыворотки распознаются меченными пероксидазой видоспецифическими антителами против иммуноглобулинов человека, что позволяет детектировать комплекс в количественной манере, по калибровочной кривой стандартов иммуноглобулинов человека с известной концентрацией противотуберкулезных иммуноглобулинов.
Пример реализации способа.
При проведении двусайтового ИФА для определения антител сыворотки человека против антигена, распознаваемого МАТ, использовали моноклональные антитела 2F9, 2Н2 и 1А5. Специфичность реакции этих МАТ в ИФА и распознаваемый ими антиген приведены в таблице 1 и на фиг. 1. МАТ реагируют только с антигенами микобактерий М. tuberculosis complex и распознают эпитоп на микобактериальном антигене CFP10 (массой 10 кДа (2F9)), МРТ63 (16 кДа (2Н2)) и 24 кДа (1А5).
Прежде всего, для проведения ИФА, иммуноглобулины МАТ были максимально очищены из супернатанта культуральной среды методом иммуноаффинной хроматографии на сорбенте, содержащем белок А или белок G или L. Отдиализованы против забуренного фосфатами физраствора (PBS) и спектрофотометрически определена концентрация иммуноглобулинов.
Далее иммуноглобулины адсорбировали на дно лунок 96-ти луночных планшетов для ИФА в PBS в концентрации 5 мкг/мл. После инкубации в течение 18 часов при 4°С планшеты трехкратно отмывали PBS с 0,1% Tween 20 (PBS-Tw) и «блокировали» 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS-Tw. После получасовой инкубации планшеты отмывали PBS-Tw и в половину лунок вносили 100 мкг/мл культурального фильтрата М. tuberculosis H37Rv. После 60-минутной инкубации при 37°С планшеты трижды отмывали PBS-Tw и добавляли «вторые» антитела - разведенные 1:10 образцы исследуемых сывороток в PBS-Tw, сыворотки вносили как в лунки, содержащие комплекс антиген-МАТ, так и в лунки, где не был добавлен микобактериальный антиген - контроль неспецифического связывания антител сыворотки. Кроме того, в лунки с комплексом антиген-МАТ добавляли стандарты противотуберкулезных антител в концентрации от 0 мкг/мл до 100 мкг/мл. После получасовой инкубации и отмывки не связавшегося материала во все лунки планшета вносили иммунопероксидазный конъюгат против IgG человека (в качестве конъюгата использовали MAT F5 против IgG человека меченные пероксидазой хрена), или конъюгаты против IgA или IgM (MAT 4Е7 или 2G12) [В.Г. Авдиенко и др. Количественные, спектральные и серодиагностические характеристики антимикобактериальных IgG, IgM и IgA антител у больных туберкулезом легких. Probl Tuberk Bolezn Legk. 2006;(10):47-55]. После 30-мин инкубации и пятикратной отмывки PBS-Tw цветную реакцию в течение 15 минут проявляли с помощью 0,05 мМ ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) в качестве хромогена в 0,1М цитратном буфере рН5,3 в присутствии пербората натрия. Реакцию останавливали 10% серной кислотой и считывали на автоматическом спектрофотометре с вертикальным лучом для определения оптической плотности реакции в ИФА-планшетах ELx800 (Biolline, США). Концентрацию специфических и фоновых антител исследуемых сывороток, связавшихся с комплексом антиген-МАТ, рассчитывали по стандартам противотуберкулезных антител. А, данные представляли в концентрации мкг/мл с учетом неспецифического связывания или без его учета, т.е. вычитая или нет концентрацию фонового связывания.
На фиг. 2 представлена калибровочные кривые для определения противотуберкулезных антител IgG, IgA и IgM классов. Расчет значений иммуноглобулинов проводится для каждого образца по калибровочной кривой, полученной индивидуально для каждой постановки (каждого планшета), где значению оптической плотности пробы соответствует определенное значение концентрации противотуберкулезных антител.
Высокая физическая чувствительность метода достигается путем использования моноклональных антител и антител сыворотки, реагирующих с различными антигенными детерминантами на поверхности одного и того же антигена, что позволяет выявлять комплекс антиген-МАТ с аффинностью, превышающей аффинность моноклональных антител, тем самым многократно повышая физическую чувствительность метода.
-7
-1
MAT 2F9, 2Н2 и 1А5 обладали достаточной аффинностью, константы диссоциации для этих МАТ были не ниже 10М (титрационные кривые на фиг. 3), что позволило использовать их для создания хороших аффинных подложек с микобактериальными антигенами в описываемом ИФА.
Для изучения диагностической специфичности и чувствительности в тесте были исследованы образцы сыворотки больных туберкулезом (активный туберкулез легких различных форм и локализации), неспецифическими заболеваниями легких (от больных, не имеющих в анамнезе заболевание туберкулезом) и здоровых доноров со станции переливания крови.
В таблицах 2, 4, 6 приведены данные по исследованию анти-CFP10 антител IgG, IgA и IgM классов сыворотки людей на MAT 2F9 в 136 образцах 3-х исследуемых групп.
Результаты статистической обработки данных для 3-х разных классов противотуберкулезных антител приведены в таблице 3, 5, 7.
Как видно из приведенных статистических выкладок, тест позволяет специфично определять противотуберкулезные антитела против CFP10 сыворотки больных и здоровых людей. Кроме этого, показатели диагностической специфичности, чувствительности и эффективности диагностики описываемого метода возрастают при учете неспецифического (фонового) связывания антител сыворотки, подтверждая специфичность моноклональных антител, используемых в тесте. А также подтверждает достижение требуемого технического результата - повышение чувствительности и точности диагностики. Аналогичные результаты можно увидеть при исследовании антител сыворотки на антигенах, находящихся в комплексе с другими MAT 2Н2 (анти-МРТ63) и 1А5 (анти -24 кДа) (Таблицы 8-13).
Таким образом, в предложенном способе достигается требуемый технический результат, который заключается в повышении чувствительности и точности. Одновременно это расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для диагностики микобактерий туберкулеза.