СРЕДСТВО ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ АЦЕТОНА
ACETONE DECOMPOSITION AGENT

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки многокомпонентных парогазовых смесей от вредных примесей, в частности для очистки от ацетона.
Известен (RU, патент № 2155804) штамм бактерий Alcaligenes latus ВКПМ В 75-05, разлагающий полихлорированные бифенилы.
Известен (RU, патент № 2105061) консорциум штаммов бактерий Alcaligenes species ВКПМ В-7003 и Pseudomonas species ВКПМ В-7004, разлагающий продукты фенолформальдегидного ряда.
Известен (RU, патент № 2109051) штамм бактерий Pseudomonas fluorescens KM 93=101/2, разлагающий ацетон, уайт-спирит, стирол и ксилол.
T
Наиболее близким аналогом разработанного штамма можно признать штамм Alcaligenes monasteriensis штамм DPN7, описанный Вëбблером с соавторами (Wübbeler, J.H., Lütke-Eversloh, Т., Van Trappen, S., Vandamme, P., Steinbüchel, A. “Alcaligenes monasteriensis, sp.nov., a new betaproteobacterium isolated from compost utilizing the organic disulfide 3,3-dithiodipropionic acid.” J.Gen. Appl. Microbiol., 46(1), pp.133-146, (2005).
Техническая задача, решаемая посредством использования разработанного штамма, состоит в обеспечении эффективной возможности удаления паров ацетона из газо-воздушных смесей, в частности вентиляционных выбросов промышленных предприятий.
Технический результат, получаемый при промышленном использовании разработанного штамма, состоит в улучшении экологической обстановки в зоне промышленных предприятий.
Указанный технический результат осуществим при использовании разработанного штамма Alcaligenes monasteriensis Ac2-VH (коллекция производственных штаммов микроорганизмов лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН) - деструктора ацетона.
(Специфическая нуклеотидная последовательность из 16S-рибосомной РНК зарегистрирована 21.04.2006 в Международном Генетическом банке (GenBank) под номером DQ469586).
Штамм выделен путем направленной селекции из естественного источника без применения искусственных мутагенов и методов генной инженерии.
Заявленный штамм выделен из активной биопленки биореактора, работающего на заводе РТИ “Каучук”.
4
2
4
2
4
2
4
4
2
2
4
3
3
4
4
В качестве среды для выделения и культивирования использовали минимальную минеральную среду следующего состава (в граммах на 1 л дистиллированной воды): (NH)SO - 2,0; KHPO (б/в) - 4,3; NaHPO (б/в) - 3,2; MgSO - 0,12; CaCl - 0,04; MnCl - 0,02; CuSO - 0,005; HBO - 0,004; ZnSO - 0,01; FeSO - 0,03. Значение рН среды устанавливали на уровне от 6,8 до 7,0 путем добавления 10%-го раствора HCl или КОН, соответственно. Для получения твердых сред применяли агар-агар в конечной концентрации 1,5-2%. Стерилизацию готовой среды проводили нагреванием при избыточном давлении 0,5 атм в течение 40 минут. Источником органического углерода служили пары ацетона или этилацетата.
Первоначальные накопительные культуры получали путем помещения исходного материала (слизь, снятая с полиамидных нитей, образующих полки биореактора, работающего на заводе РТИ “Каучук”) в стеклянные мини-реакторы с полимерным наполнителем, орошаемым циркулярно-капельным методом минимальной минеральной средой. Поток воздуха с парами ацетона пропускали непосредственно через слой увлажняемого полимерного наполнителя. При наличии заметного роста бактерий, среду несколько раз (не менее 5) частично заменяли на свежую. Культивирование проводили до появления четко регистрируемого методом газовой хроматографии снижения концентрации паров ацетона в потоке воздуха на выходе из аппарата, применяемого для накопительного культивирования. Температура накопительного культивирования - комнатная (18-20°С).
Выделение чистых культур и штаммов проводили традиционными микробиологическими методами, используя культивирование в чашках Петри на поверхности агаризованной минеральной среды минимального состава в парах ацетона. Выделенные штаммы сохраняли в пробирках со скошенными столбиками агаризованной минимальной минеральной среды, используя посев уколом в основание столбика с последующим распределением посевного материала по его скошенной поверхности. Выращивание культур при этом проводили также в парах ацетона. Во всех случаях использовали либо термостаты с температурой 28°С, либо термостатированную комнату (27-28°С).
X
X
Проверку чистоты выделенных штаммов проводили микроскопированием живых препаратов (с применением фазового контраста, объектив 40) и фиксированных и окрашенных карболовым фуксином или генцианвиолетом препаратов (с иммерсией, объектив 100), а также высевом на богатые агаризованные среды.
Таксономическое определение проводили на основании данных морфологических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических исследований.
Предварительное таксономическое определение было проведено по результатам изучения основных морфологических и биохимических характеристик. По этим признакам штамм был первоначально отнесен к виду Pseudomonas fluorescence, приведенному в определителе бактерий Берджи.
T
Окончательное определение до вида было проведено с учетом данных молекулярно-генетического анализа характерных нуклеотидных последовательностей консервативных участков 16S-PHK (код по IEGB: DQ469586.1 GI:93484002). Наиболее близким по этому показателю описанным видом оказался Alcaligenes monasteriensis штамм DPN7, описанный Вëбблером с соавторами (Wübbeler, J.H., Lütke-Eversloh, Т., Van Trappen, S., Vandamme, P., Steinbüchel, A. “Alcaligenes monasteriensis, sp.nov., a new betaproteobacterium isolated from compost utilizing the organic disulfide 3,3-dithiodipropionic acid.” J. Gen. Appl. Microbiol., 46(1), pp.133-146, (2005).
В итоге, на основании вышеизложенных аргументов, было принято решение определить выделенный штамм по совокупности признаков как Alcaligenes monasteriensis штамм Ac2-VH.
T
В приведенном авторами описании штамма Alcaligenes monasteriensis DPN7 он позиционирован как микроорганизм, выделенный из компоста по признаку способности к утилизации 3,3-дитиодипропионата. Окисление кетонов, и в частности ацетона, не упоминается авторами в качестве отличительной характеристики указанного микроорганизма.
Описание штамма Alcaligenes monasteriensis Ac2-VH.
Мелкие прямые палочки 0,7-1,0×1,2-1,8 мкм. Цепочек, как правило, не образуют. При росте на жидких и твердых минеральных средах в присутствии паров ацетона чаще всего представлены подвижными одиночными клетками, значительно реже, главным образом в молодых активно растущих культурах, встречаются короткие, быстро распадающиеся цепочки из двух-трех клеток. Капсул и чехлов не образуют.
Грамотрицательные.
Подвижные за счет нескольких перитрихиальных жгутиков. В старых культурах подвижность теряется.
При росте на агаризованной минеральной среде в парах ацетона образуют мелкие, округлые, диаметром 1-2 мм, гладкие, выпуклые, с ровными краями, бесцветные прозрачные колонии слизистой консистенции, имеющие голубоватое свечение при боковом освещении. При росте на агаризованной минеральной среде с глюкозой (1%) и пептоном (0,25%) образует средние, округлые, диаметром 3-5 мм, гладкие, выпуклые, с ровными краями, светлые бледно-желтые полупрозрачные колонии слизистой консистенции, которые со временем накапливают бледно-желтый слегка флюоресцирующий пигмент.
Облигатный аэроб, имеет метаболизм чисто дыхательного типа с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов. В органических факторах роста не нуждается. Имеет хемоорганотрофный тип метаболизма. Каталаза присутствует.
Диапазон пригодных для роста значений рН - от 5,5 до 9,5.
Наиболее оптимальный для роста диапазон значений рН - 6,6-6,9.
Диапазон пригодных для проявления специфической субстратной активности температур - от 9°С до 32°С.
Оптимальный для роста диапазон температур - 28-30°С.
Полностью разлагает ацетон, этилацетат, метилизобутилкетон. Ферментирует глюкозу, ксилозу, ацетат, D-глюконат, мезо-тартрат, итаконат. В качестве источника азота может использовать нитрат. Способен накапливать поли-β-гидроксибутират.
3
Способен полностью утилизировать ацетон в концентрациях до 1000-1200 мг/м; восстановление конверсии ацетона после выделения и лабораторного культивирования чистого штамма - полное. Указанный штамм был выделен в чистую культуру и охарактеризован с целью его применения в устройствах микробиологической очистки воздуха и промышленных вентиляционных выбросов от паров ацетона, этилацетата, метилизобутилкетона и сходных с ними органических субстратов в качестве живого компонента соответствующих биокатализаторов.
Активную культуру сохраняют на пластинках (чашки Петри) и косяках (микробиологические пробирки) агаризованной базовой минеральной среды после предварительного выращивания в парах целевого субстрата.
2
3
Для длительного хранения используют замораживание и хранение суспензий клеток в базовой минеральной среде с 5% (объем/объем) сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) при температуре -70°С или лиофилизацию суспензий клеток стандартными методами в забуференном фосфатами физрастворе (0,75% NaCl в 0,1N K-Na-фосфатном буфере с рН=7,2), содержащем 10% (объем/объем) СКРС и 0,05% (вес/объем) NaSO. Лиофилизованные препараты хранят расфасованными в герметичные упаковки при температуре -18°С.
Штамм непатогенный, безопасен для здоровья человека и животных, обеспечивает быструю и полную деструкцию паров ацетона, этилацетата, метилизобутилкетона, ацетата, причем без заметного закисления питательной среды, обладает высокой генетической стабильностью, хорошей адаптивностью и стойкостью к условиям работы в микробиологических воздушных фильтрах, высокой устойчивостью к посторонней микрофлоре, а также практически полным отсутствием образования вредных и пахучих вторичных метаболитов; имеет минимальные потребности к составу питательной среды, хорошо переносит высушивание и другие виды консервации, быстро и полно восстанавливает после этого свои рабочие свойства.
Примеры специфической субстратной активности
Пример 1.
Проверяли способность выделяемого штамма обеспечивать удаление из воздуха паров ацетона на стадии первичной накопительной культуры.
4
2
4
2
4
2
4
4
2
2
4
3
3
4
4
В эксперименте использовали стеклянный лабораторный мини-реактор, заполненный полимерной насадкой, покрытой слоем растущих микроорганизмов (биопленкой) и орошаемой циркулярно-капельным методом минимальной минеральной средой, описанного выше состава (в граммах на 1 л дистиллированной воды): (NH)SO - 2,0; KHPO (б/в) - 4,3; NaHPO (б/в) - 3,2; MgSO - 0,12; CaCl - 0,04; MnCl - 0,02; CuSO - 0,005; НВО - 0,004; ZnSO - 0,01; FeSO - 0,03; значение рН среды от 6,8 до 7,0.
В качестве очищаемой газо-воздушной смеси использовали нагнетаемый компрессором комнатный воздух, к которому с использованием дозирующего устройства подмешивали пары ацетона в нужной концентрации. Смесь подавали в мини-реактор со скоростью порядка 600-660 мл/час на 1 мл объема насадки (от 200 до 220 мл/мин), контролируя ее лабораторным ротаметром.
Контроль концентрации паров ацетона в исследуемой газо-воздушной смеси осуществляли с использованием стандартного газохроматографического анализа проб объемом от 100 до 500 мкл в газовом хроматографе ЛХМ-2000 (завод “Хроматограф”, г.Москва) с пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Условия анализа: стеклянная колонка длиной 200 см, диаметром 3 мм, заполненная нейтральным носителем (Chromaton N-AW-DWCS, пропитанный 5% силикона SE-30, фирмы Chemapol, Чехия) с диаметром частиц 120-150 мкм; температура термостата 70°С, температура испарителя 150°С; температура детектора (ПИД) 220°С; газ-носитель азот или аргон хроматографической чистоты со скоростью протока 15 мл/мин; скорость протока водорода и сжатого воздуха для ПИД - 20 мл/мин и 150 мл/мин, соответственно. Пробы на входе и на выходе мини-реактора отбирали через силиконовые клапаны с использованием шприцев для отбора проб. Концентрацию ацетона рассчитывали интегрированием нормализованной площади под кривыми его выходных пиков по калибровочной кривой, заранее построенной с использованием стандартных разведений смеси воздуха с парами ацетона в точно известной концентрации. Построение диаграмм и расчет интегрированной площади под кривыми пиков выхода ацетона проводили с использованием компьютерной программы “Z-lab, v.2.6.40”, поставляемой службой технической поддержки завода “Хроматограф” совместно с фирмой ЗАО НТФ “Бинар”.
По данным хроматографии пары ацетона утилизированы полностью.
Пример 2.
Проверяли способность выделенного штамма Alcaligenes monasteriensis штамм Ac2-VH обеспечивать удаление из воздуха паров ацетона на стадии чистой, поддерживаемой в лабораторных условиях культуры.
4
2
4
2
4
2
4
4
2
2
4
3
3
4
4
В эксперименте использовали стеклянный лабораторный мини-реактор, заполненный полимерной насадкой, покрытой слоем культуры Alcaligenes monasteriensis штамм Ac2-VH (биопленкой) и орошаемой циркулярно-капельным методом минимальной минеральной средой состава (в граммах на 1 л дистиллированной воды): (NH)SO - 0,1; KHPO (б/в) - 0,8; NaHPO (б/в) - 0,5; MgSO - 0,04; CaCl - 0,04; MnCl - 0,02; CuSO - 0,005; НВО - 0,004; ZnSO - 0,01; FeSO - 0,03; значение рН среды от 6,6 до 6,9.
В качестве очищаемой газо-воздушной смеси использовали нагнетаемый компрессором комнатный воздух, к которому с использованием дозирующего устройства подмешивали пары ацетона в нужной концентрации. Смесь подавали в мини-реактор со скоростью порядка 960-1020 мл/час на 1 мл объема насадки (от 320 до 340 мл/мин), контролируя ее лабораторным ротаметром.
Контроль концентрации паров ацетона в исследуемой газо-воздушной смеси осуществляли с использованием стандартного газохроматографического анализа согласно описанию, приведенному в Примере 1.
По данным хроматографии пары ацетона утилизированы полностью.