ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА ЖИВОТНЫЕ, КОТОРЫЕ ВЫРАБАТЫВАЮТ ОДНОДОМЕННЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ

1. Генетически модифицированное отличное от человека животное, содержащее в своей зародышевой линии
Н
(а) делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен С1 по меньшей мере одного эндогенного гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом по меньшей мере один эндогенный ген константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой IgG, IgA, IgE, IgD или их комбинацию, и
(b) любой или оба компонента из
L
L
L
L
L
L
Н
(i) нуклеотидной последовательности, содержащей по меньшей мере один переаранжированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V) и по меньшей мере один нереаранжированный соединительный генный сегмент легкой цепи иммуноглобулина (J), при этом переаранжированные генные сегменты V и J способны рекомбинировать с образованием реаранжированной нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен С1, и/или
L
L
L
L
(ii) локуса легкой цепи иммуноглобулина, который содержит единственную реаранжированную генную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина V/J, содержащую последовательности генных сегментов V и J, при этом единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина функционально связана с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
L
L
L
L
2. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент V, по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент J и/или единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина V/J являются человеческими.
3. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 2, отличающееся тем, что константная область легкой цепи иммуноглобулина и/или константная область тяжелой цепи иммуноглобулина являются отличными от человеческих.
L
L
4. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 2, отличающееся тем, что по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент V и по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент J представляет собой сегмент человеческой каппа-цепи.
L
L
H
H
H
5. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент V и по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент J замещает один или более эндогенных генных сегментов V, D, J в эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина.
L
L
6. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 5, отличающееся тем, что по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент V и по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент J замещает все или практически все эндогенные отличные от человеческих генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина в эндогенном отличном от человеческого локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.
7. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что все или практически все эндогенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи и/или все или практически все эндогенные генные сегменты вариабельной области легкой цепи удалены или функционально инактивированы.
L
L
8. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 2, отличающееся тем, что единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина V/J представляет собой человеческую генную последовательность Vκ1-39/J или человеческую генную последовательность Vκ3-20/J.
9. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 8, отличающееся тем, что человеческая генная последовательность Vκ1-39/J содержит человеческий генный сегмент Vκ1-39, перестроенный с человеческим генным сегментом Jκ5.
10. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 8, отличающееся тем, что человеческая генная последовательность Vκ3-20/J содержит человеческий генный сегмент Vκ3-20, перестроенный с человеческим генным сегментом Jκ1.
L
L
L
L
L
L
H
11. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что животное не содержит (i) нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V) и по меньшей мере один нереаранжированный соединительный генный сегмент легкой цепи иммуноглобулина (J), при этом нереаранжированные генные сегменты V и J способны рекомбинировать с образованием реаранжированной нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, и
при этом локус тяжелой цепи содержит отличные от человеческих генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи.
L
L
L
L
L
L
H
12. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что животное не содержит (i) нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V) и по меньшей мере один нереаранжированный соединительный генный сегмент легкой цепи иммуноглобулина (J), при этом нереаранжированные генные сегменты V и J способны рекомбинировать с образованием реаранжированной нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, и
при этом локус тяжелой цепи содержит человеческие генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи.
13. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 12, отличающееся тем, что человеческие генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи замещают все или практически все эндогенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина.
14. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что генная последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина является отличной от человеческой генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
15. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что генная последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина является человеческой генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
L
L
16. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что единственная реаранжированная генная последовательность легкой цепи V/J замещает все или практически все эндогенные генные сегменты вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного.
L
L
L
L
17. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 2, отличающееся тем, что единственная реаранжированная человеческая генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина V/J содержит последовательности генных сегментов V человеческой зародышевой линии и последовательности генных сегментов J человеческой зародышевой линии.
18. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит инактивированную шарнирную область.
H
19. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что делеция или инактивирующая мутация в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, находится в последовательности IgG1, и при этом эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит делецию или инактивирующую мутацию гена иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA и их комбинации.
20. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 19, отличающееся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит делецию или инактивирующую мутацию в генах иммуноглобулинов IgG2a и IgG2b.
21. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 19, отличающееся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит делецию или инактивирующую мутацию в генах иммуноглобулинов IgG2b и IgG2c.
22. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 19, отличающееся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит делецию или инактивирующую мутацию в генах иммуноглобулинов IgG3, IgD, IgA и IgE.
23. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что отличное от человека животное дополнительно содержит ген Adam6 или его часть, функциональный в организме самца отличного от человека животного, при этом ген Adam6 представляет собой ген Adam6a, ген Adam6b или их оба.
H
24. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что в сыворотке крови животного дополнительно содержится антигенспецифический однодоменный антигенсвязывающий белок, в котором отсутствует функциональный домен C1.
H
25. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 24, отличающееся тем, что животное дополнительно содержит тяжелую цепь IgM, содержащую функциональный домен C1.
L
L
L
H
26. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 24, отличающееся тем, что однодоменный антигенсвязывающий белок представляет собой V-однодоменный связывающий белок, кодируемый реаранжированной нуклеотидной последовательностью вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1.
L
L
27. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 25, дополнительно содержащее генетически сконструированную универсальную легкую цепь, кодируемую единственной реаранжированной генной последовательностью вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, содержащей последовательности генных сегментов V и J, функционально связанной с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
L
L
L
H
L
L
28. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 25, отличающееся тем, что однодоменный антигенсвязывающий белок представляет собой V-однодоменный антигенсвязывающий белок, кодируемый реаранжированной нуклеотидной последовательностью вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, и при этом отличное от человека животное дополнительно содержит генетически сконструированную универсальную легкую цепь, кодируемую единственной реаранжированной генной последовательностью вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, содержащей последовательности генных сегментов V и J, функционально связанной с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
29. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 24, отличающееся тем, что по меньшей мере в одной тяжелой цепи однодоменного антигенсвязывающего белка дополнительно отсутствует функциональная шарнирная область.
30. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 24, отличающееся тем, что однодоменный антигенсвязывающий белок имеет изотип IgG, выбранный из группы, состоящей из IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c и IgG3.
31. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 24, отличающееся тем, что однодоменный антигенсвязывающий белок содержит человеческий вариабельный домен и отличный от человеческого константный домен.
32. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 24, отличающееся тем, что однодоменный антигенсвязывающий белок является мономерным.
33. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 25, отличающееся тем, что тяжелая цепь IgM связана с когнатной легкой цепью.
L
L
34. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 33, отличающееся тем, что когнатная цепь представляет собой универсальную легкую цепь, кодируемую единственной реаранжированной генной последовательностью вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, содержащей последовательности генных сегментов V и J, функционально связанной с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
35. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 24, дополнительно содержащее высокий титр однодоменного антигенсвязывающего белка.
2
3
4
5
36. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 35, отличающееся тем, что титр антигенспецифического однодоменного связывающего белка составляет по меньшей мере 1×10 мкг/мл, по меньшей мере 1×10 мкг/мл, по меньшей мере 1×10 мкг/мл или по меньшей мере 1×10 мкг/мл.
L
L
37. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 35, отличающееся тем, что титр однодоменного антигенсвязывающего белка по меньшей мере в 5 раз больше, по меньшей мере в 10 раз больше, по меньшей мере в 100 раз больше, чем у соответствующего контрольного животного, которое не экспрессирует генетически сконструированную универсальную легкую цепь, кодируемую единственной реаранжированной генной последовательностью вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, содержащей последовательности генных сегментов V и J, функционально связанной с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
38. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 35, отличающееся тем, что титр определяют методом ферментного иммуносорбентного анализа.
39. Генетически модифицированное животное по п. 1, отличающееся тем, что животное является грызуном.
40. Генетически модифицированное животное по п. 39, отличающееся тем, что грызун представляет собой крысу или мышь.
41. Генетически модифицированное отличное от человека животное по п. 40, отличающееся тем, что животное является мышью.
42. Генетически модифицированная мышь, содержащая
(а) замещение в мышином локусе тяжелой цепи всех или практически всех эндогенных генных сегментов V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина любым из
H
H
H
H
H
H
(i) одного или более нереаранжированных человеческих генных сегментов V тяжелой цепи иммуноглобулина, одного или более нереаранжированных человеческих генных сегментов D тяжелой цепи иммуноглобулина и одного или более нереаранжированных человеческих генных сегментов J тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом один или более нереаранжированных человеческих генных сегментов V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связаны с мышиной генной последовательностью константной области тяжелой цепи, или
L
L
L
L
(ii) одного или более нереаранжированных человеческих генных сегментов V легкой цепи и одного или более нереаранжированных человеческих генных сегментов J легкой цепи, при этом один или более нереаранжированных человеческих генных сегментов V и J легкой цепи функционально связаны с мышиной генной последовательностью константной области тяжелой цепи,
H
при этом мышиная генная последовательность константной области тяжелой цепи содержит полноразмерный ген IgM и делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1 в гене IgG, выбранном из группы, состоящей из IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 и их комбинации,
(b) замещение всех или практически всех эндогенных генных сегментов V и J легкой цепи иммуноглобулина одиночной реаранжированной человеческой вариабельной генной последовательностью Vκ/Jκ, и при этом мышь экспрессирует рецептор В-клеток, который содержит тяжелую цепь IgM, связанную с когнатной легкой цепью.
43. Способ получения генетически модифицированного отличного от человека животного по п. 1, включающий
H
(а) модификацию по меньшей мере одной отличной от человеческой константной области тяжелой цепи в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного так, чтобы константная область тяжелой цепи содержала делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1 IgG, IgA, IgE, IgD или их комбинации, и
(b) любое или оба действия из
L
L
L
L
L
L
H
(i) вставки нуклеотидной последовательности в эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом последовательность содержит по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V) и по меньшей мере один нереаранжированный соединительный генный сегмент легкой цепи иммуноглобулина (J), при этом нереаранжированные генные сегменты V и J способны рекомбинировать с образованием реаранжированной нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, и/или
L
L
L
L
(ii) внесения локуса легкой цепи иммуноглобулина, который содержит единственную реаранжированную генную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина V/J, содержащую последовательности генных сегментов V и J, при этом единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина функционально связана с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
H
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что этап (а) дополнительно включает удаление или инактивацию шарнирной области IgG, IgA, IgE, IgD или их комбинации, содержащего модифицированный домен C1.
L
L
L
L
L
L
H
45. Способ по п. 43, отличающийся тем, что этап (а) дополнительно включает замещение одного или более эндогенных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина локуса тяжелой цепи иммуноглобулина человеческими генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи так, чтобы экспрессия локуса тяжелой цепи иммуноглобулина приводила к получению вариабельного домена тяжелой цепи, который включает человеческие идиотипы, и при этом способ не включает (b) (i) вставку нуклеотидной последовательности в эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V) и по меньшей мере один нереаранжированный соединительный генный сегмент легкой цепи иммуноглобулина (J), при этом нереаранжированные генные сегменты V и J способны рекомбинировать с образованием реаранжированной нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1.
L
L
L
H
46. Способ по п. 43, отличающийся тем, что этап вставки включает замещение одного или более эндогенных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина локуса тяжелой цепи иммуноглобулина переаранжированными генными сегментами V и J легкой цепи так, чтобы экспрессия локуса тяжелой цепи иммуноглобулина приводила к получению V-однодоменного связывающего белка, содержащего вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина и константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором отсутствует домен C1.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что ген константной области иммуноглобулина является отличным от человеческого.
L
L
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что переаранжированные генные сегменты V и J легкой цепи являются человеческими сегментами.
L
L
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что нереаранжированные генные сегменты V и J легкой цепи являются человеческими сегментами каппа-цепи.
L
L
50. Способ по п. 48, отличающийся тем, что нереаранжированные генные сегменты V и J легкой цепи являются человеческими сегментами лямбда-цепи.
L
L
51. Способ по п. 46, отличающийся тем, что нереаранжированные генные сегменты V и J легкой цепи замещают все или практически все эндогенные отличные от человеческих генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина в эндогенном отличном от человеческого локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.
H
52. Способ по п. 43, отличающийся тем, что делеция или инактивирующая мутация нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, находится в гене IgG.
H
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что делеция или инактивирующая мутация нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, находится в гене IgG1.
54. Способ по п. 43, отличающийся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генные сегменты вариабельной области, кодирующие человеческий вариабельный домен, и ген константной области, кодирующий отличный от человеческого константный домен.
55. Способ по п. 43, отличающийся тем, что единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, функционально связанная с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина, кодирует универсальную легкую цепь.
L
L
L
L
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина V/J представляет собой человеческую генную последовательность V/J.
L
L
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что человеческая генная последовательность V/J представляет собой человеческую генную последовательность Vκ1-39/J или человеческую генную последовательность Vκ3-20/J.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что человеческая генная последовательность Vκ1-39/J содержит человеческий генный сегмент Vκ1-39, перестроенный с человеческим генным сегментом Jκ5.
59. Способ по п. 57, отличающийся тем, что человеческая генная последовательность Vκ3-20/J содержит человеческий генный сегмент Vκ3-20, перестроенный с человеческим генным сегментом Jκ1.
60. Способ по п. 43, отличающийся тем, что единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина функционально связана с отличной от человеческой генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
61. Способ по п. 43, отличающийся тем, что единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина функционально связана с человеческой генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
L
L
62. Способ по п. 43, отличающийся тем, что одиночная реаранжированная вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина замещает все или практически все эндогенные генные сегменты V и J легкой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного.
63. Способ по п. 43, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность и/или одиночная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина находится в зародышевой линии отличного от человека животного.
H
64. Способ по п. 43, отличающийся тем, что делеция или инактивирующая мутация C1 находится в IgG1, а способ дополнительно включает (с) удаление или инактивацию гена иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA и их комбинации.
65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что гены иммуноглобулинов IgG2a и IgG2b удалены или инактивированы.
66. Способ по п. 64, отличающийся тем, что гены иммуноглобулинов IgG2b и IgG2c удалены или инактивированы.
67. Способ по п. 64, отличающийся тем, что гены иммуноглобулинов IgG3, IgD, IgA и IgE удалены или инактивированы.
68. Способ по п. 43, отличающийся тем, что отличное от человека животное является грызуном.
69. Способ по п. 68, отличающийся тем, что грызун представляет собой крысу или мышь.
70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.
H
71. Способ получения антигенспецифических одно доменных связывающих белков IgG, в которых отсутствует, полностью или частично, домен C1, включающий этап(ы):
(а) иммунизации генетически модифицированного отличного от человека животного антигеном, при этом генетически модифицированное отличное от человека животное содержит
H
(i) делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, по меньшей мере одного эндогенного гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом по меньшей мере один эндогенный ген константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой IgG, IgA, IgE, IgD или их комбинацию, и
(ii) любой или оба компонента из:
L
L
L
L
L
L
H
1) нуклеотидной последовательности, содержащей по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V) и по меньшей мере один нереаранжированный соединительный генный сегмент легкой цепи иммуноглобулина (J), при этом нереаранжированные генные сегменты V и J способны рекомбинировать с образованием реаранжированной нуклеотидной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (V/J), функционально связанной с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим делецию или инактивирующую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей домен C1, и/или
L
L
L
L
2) локуса легкой цепи иммуноглобулина, который содержит единственную реаранжированную генную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина V/J, содержащую последовательности генных сегментов V и J, при этом единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина функционально связана с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина, и
(b) содержания мыши так, чтобы мышь экспрессировала:
(i) антитело IgM, содержащее две тяжелых цепи IgM, связанные с двумя когнатными легкими цепями; и
H
(ii) однодоменный антигенсвязывающий белок, содержащий по меньшей мере одну тяжелую цепь, в которой отсутствует функциональный домен C1.
72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что по меньшей мере один ген константной области тяжелой цепи выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2b, IgG2a и их комбинации.
73. Способ по п. 72, отличающийся тем, что ген константной области тяжелой цепи представляет собой ген константной области IgG1.
H
74. Способ по п. 71, отличающийся тем, что в однодоменном антигенсвязывающем белке полностью отсутствует домен C1.
75. Способ по п. 71, отличающийся тем, что однодоменный антигенсвязывающий белок содержит человеческую вариабельную область тяжелой цепи.
76. Способ по п. 71, отличающийся тем, что однодоменный антигенсвязывающий белок содержит человеческую вариабельную область легкой цепи.
77. Способ по п. 71, отличающийся тем, что когнатная легкая цепь представляет собой универсальную легкую цепь, кодируемую единственной реаранжированной последовательностью вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, функционально связанной с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.
78. Способ по п. 77, отличающийся тем, что отличное от человека животное не экспрессирует эндогенные легкие цепи.
79. Способ по п. 77, отличающийся тем, что одиночная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой человеческую генную последовательность Vκ1-39/J или человеческую генную последовательность Vκ3-20/J.
80. Способ по п. 79, отличающийся тем, что человеческая генная последовательность Vκ1-39/J содержит человеческий генный сегмент Vκ1-39, перестроенный с человеческим генным сегментом Jκ5.
81. Способ по п. 79, отличающийся тем, что человеческая генная последовательность Vκ3-20/J содержит человеческий генный сегмент Vκ3-20, перестроенный с человеческим генным сегментом Jκ1.
82. Способ по п. 71, дополнительно включающий
(с) выделение из отличного от человека животного клетки или белка, который специфически связывает антиген, при этом клетка или белок содержит соматически мутированный однодоменный антигенсвязывающий белок.
83. Способ по п. 82, дополнительно включающий
(d) выделение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен однодоменного антигенсвязывающего белка, из клетки, выделенной на этапе (с).
84. Способ по п. 83, дополнительно включающий в качестве последних этапов
(е) культивирование клетки, трансфицированной вектором, в условиях, достаточных для экспрессии вектора, при этом вектор содержит вторую нуклеиновую кислоту, функционально связанную с человеческим геном константной области тяжелой цепи, при этом вторая нуклеиновая кислота идентична или в значительной степени идентична первой нуклеиновой кислоте, выделенной на этапе (d).
85. Способ по п. 84, отличающийся тем, что ген константной области тяжелой цепи представляет собой ген константной области человеческого IgG, выбранного из группы, состоящей из IgG1, IgG2a, lgG2b и IgG3.
86. Способ по п. 82, дополнительно включающий этапы
(d) сбора супернатанта из гибридомной культуры, при этом гибридома получена из клетки, выделенной в (с).
87. Способ по п. 86, дополнительно включающий
(е) выделение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен однодоменного антигенсвязывающего белка, из гибридомы, полученной в (d).
88. Способ по п. 87, дополнительно включающий
(f) культивирование клетки, трансфицированной вектором, в условиях, достаточных для экспрессии вектора; при этом вектор содержит вторую нуклеиновую кислоту, функционально связанную с человеческим геном константной области тяжелой цепи, при этом вторая нуклеиновая кислота идентична или в значительной степени идентична первой нуклеиновой кислоте, выделенной на этапе (е).
89. Способ по п. 88, отличающийся тем, что ген константной области тяжелой цепи представляет собой ген константной области человеческого IgG, выбранного из группы, состоящей из IgG1, IgG2a, lgG2b и IgG3.
90. Гибридома, полученная из клетки, выделенной в соответствии со способом по п. 82.
91. Нуклеиновая кислота, выделенная способом по п. 83.
92. Нуклеиновая кислота, выделенная способом по п. 87.
93. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, идентичную или в значительной степени сходную с нуклеиновой кислотой по п. 83.
94. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, идентичную или в значительной степени сходную с нуклеиновой кислотой по п. 87.
95. Выделенная клетка отличного от человека животного по п. 1.
96. Выделенная клетка по п. 95, отличающаяся тем, что клетка является эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой или В-клеткой.
H
97. Однодоменный антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен легкой цепи, функционально связанный с константной областью тяжелой цепи, в которой отсутствует функциональный домен C1.
98. Однодоменный антигенсвязывающий белок, выделенный из отличного от человека животного по п. 1.
99. Однодоменный антигенсвязывающий белок, выделенный из мыши по п. 42.
100. Однодоменный антигенсвязывающий белок, полученный способом по п. 71.