Способ полной корреляционной спектроскопии ЯМР со смешиванием спинов ядер в ультраслабом магнитном поле
METHOD FOR COMPLETE NMR CORRELATION SPECTROSCOPY WITH MIXING OF NUCLEAR SPINS IN ULTRAWEAK MAGNETIC FIELD

Изобретение относится к области исследования структуры и свойств диамагнитных веществ методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса и может быть использовано для отнесения сигналов ЯМР в сложных спектрах, идентификации малых молекул в многокомпонентных смесях различных веществ, в частности, биомолекул и метаболитов.
Двумерная (2D) спектроскопия ЯМР (Ядерный Магнитный Резонанс) [1] представляет собой набор мощных методов увеличения спектрального разрешения, используемых для отнесения сигналов в сложных спектрах ЯМР и получения информации о структуре, динамике и взаимодействии различных молекул. В частности, методы многомерной ЯМР спектроскопии широко используются для получения информации о структуре, динамике и взаимодействии различных биомолекул - метаболитов, белков, нуклеиновых кислот и т.п.
Двумерные методы спектроскопии ЯМР могут быть использованы также для решения других задач, например, задачи установления корреляции между химическими сдвигами двух спинов, причем спины могут принадлежать магнитным ядрам одного изотопа (гомоядра) или магнитным ядрам различных изотопов (гетероядера). Основным преимуществом 2D-экспериментов по сравнению с обычными спектрами ЯМР является создание второго спектрального измерения (косвенного измерения), которое позволяет решать задачи, решение которых посредством одномерных методов спектроскопии ЯМР является трудными или невозможными.
Известен патент CN 101479619 «Измерение гомоядерных J-связей в сверхнизких магнитных полях методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения».
Изобретение относится к способу и устройству для обнаружения веществ с помощью спектрального метода ЯМР. Задачей изобретения является характеризация образца с высоким разрешением и полнотой с помощью способа и устройства для обнаружения образца. Способ и связанное с ним устройство для изучения образца обнаруживают вещество с использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса путем измерения констант гетероядерной J-связи и гомоядерной J-связи в небольшом магнитном поле, вещество обнаруживается по измеренным значениям гетероядерной и гомоядерной констант скалярного взаимодействия J.
Недостатки способа: 1) измерение спектра непосредственно в слабом поле приводит к ухудшению чувствительности примерно в 10000 раз по сравнению со стандартным подходом к измерению спектров ЯМР 2) отсутствие информации о химических сдвигах сигналов ЯМР, поскольку химический сдвиг резонансной частоты пропорционален напряженности приложенного магнитного поля 3) отсутствие корреляции химических сдвигов гетероядер. Указанные недостатки сводят область применимости данного способа только к чистым веществам низкой сложности, с число магнитно-неэквивалентных ядер не более 5. Сложность элементов биологически важных веществ - аминокислот, нуклеиновых кислот, простейших углеводов - превышает возможности данного метода.
Известен «Метод измерения ядерного магнитного резонанса с использованием двух полей» - US 2016299204 А1.
Способ проведения измерений с помощью двухполевого ядерного магнитного резонанса (=2F NMR) включает подготовку образца в первом рабочем объеме однородного (лучше 0.01 ppm) магнитного поля с первой напряженностью поля; перенос образца во второй рабочий объем с магнитным полем, имеющим более низкую однородность (лучше 100 ppm) и вторую напряженность поля, причем первая напряженность поля по меньшей мере на 2 Тесла больше, чем вторая напряженность поля; манипулирование образцом во втором рабочем объеме путем применения последовательности радиочастотных импульсов и/или градиента поля; перенос образца обратно в первый рабочий объем; и регистрация спектра ЯМР образца в первом рабочем объеме.
Недостатки метода: Метод требует наличия специфического оборудования: ЯМР магнита с двумя областями однородного магнитного поля, а также двух датчиков ЯМР. Эти датчики должны быть размещены в двух областях с заданным магнитным полем и настроены на соответствующие резонансные частоты исследуемых ядер в выбранных магнитных полях. Напряженность магнитного поля во втором рабочем объеме - фиксированная. Метод позволяет добиться выполнения условия сильной связи для ядерных спинов одного магнитного изотопа (гомоядер) во втором рабочем объеме, однако, осуществление метода при выполнении условия сильной связи между гетероядрами во втором рабочем объеме - невозможно, поскольку в этом случае принципиально нет возможности проводить независимые манипуляции над спинами ядер различных магнитных изотопов. Любые радиочастотные импульсы будут одновременно менять состояние всех сильно связанных спинов, что делает невозможным проведение экспериментов, аналогичных экспериментам 2F NMR в условиях слабой связи.
Все двумерные эксперименты ЯМР (например, COSY [2], HSQC [3] и НМВС [4]) состоят из циклически повторяющейся последовательности манипуляций с состоянием ядерных спинов. В общем случае, один цикл манипуляций (импульсная последовательность) состоит из следующих этапов (рис. 1а):
- релаксации спинов к состоянию термодинамического равновесия в магнитном поле и приготовления когерентного состояния спинов (Preparation, этап 1);
1
- эволюции интересующего нас когерентного состояния в течение интервала времени t (Evolution, этап 2);
- смешивания, необходимого для перевода этого когерентного состояния в наблюдаемый сигнал ЯМР (Mixing, этап 3);
2
- наблюдения сигнала спада свободной индукции (ССИ) как функции времени t (Detection, этап 4).
1
2
1
2
1
1
2
1
2
1
2
1
2
2
1
В ходе эксперимента цикл многократно повторяют, при этом для получения интенсивности сигнала S(t,t) как функции обоих временных переменных t и t варьируется длительность интервала t. Полученный сигнал S(t,t) подвергают преобразованию Фурье по параметрам t и t, в результате чего получают требуемый двумерный (2D) спектр ЯМР S(ω,ω). При этом, о 2D ЯМР спектре S(ω,ω) говорят, что частота ω определяет прямое измерение (на спектрах обычно представлено горизонтальной осью), а частота ω - непрямое измерение (на спектрах обычно представлено вертикальной осью).
Конкретная реализация блоков приготовления (этап 1) и смешивания (этап 3) определяет результат действия импульсной последовательности и зависит от целей эксперимента. Например, в спектрах, полученных методами COSY [2], HSQC [3] и НМВС [4]) кросс-пики возникают при наличии прямого скалярного взаимодействия (J-взаимодействия) между ядрами одного магнитного изотопа (т.н. гомоядер, соответствует методу COSY) или ядрами различных магнитных изотопов (т.н. гетероядер, соответствует методам HSQC и НМВС), и поэтому являются индикатором наличия между ними одной или нескольких ковалентных химических связей.
В то же время, в эксперименте NOESY наличие кросс-пика является индикатором кросс-релаксации межу соответствующими спинами, на основании относительной скорости которой можно рассчитать расстояние между соответствующими атомами [5].
Наиболее близким к предлагаемому способу является широко используемый в области 2D ЯМР метод TOCSY (TOtal Correlation Spectroscopy - полная корреляционная спектроскопия) [6], созданный для выявления цепочек скалярно взаимодействующих спинов гомоядер. В случае эксперимента TOCSY, блок смешивания реализован при помощи мощных радиочастотных импульсов, которые приводят к так называемому изотропному смешиванию между гомоядрами. В результате изотропного смешивания, все спины, объединенные общей цепью J-взаимодействий, обмениваются поляризацией, что приводит к формированию кросс-пиков между всеми сигналами спинов, относящихся к цепи, в том числе между сигналами спинов, не связанных напрямую скалярным взаимодействием. Эксперимент TOCSY очень полезен для разделения сигналов на группы, внутри которых прослеживаются цепочки скалярных взаимодействий; поэтому, он нашел широкое применение для решения задачи отнесения сигналов в спектре, в особенности для ЯМР.
Недостаток Традиционный метод TOCSY применим только к цепям скалярно связанных ядер одного магнитного изотопа (гомоядрам).
Задача, решаемая изобретением: создание способа, который делал бы возможным изотропное смешивание между гетероядрами, и при этом сохранял высокую чувствительность и спектральное разрешение современных методов ЯМР в сильном поле.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения является получение корреляции химических сдвигов ядер различных магнитных изотопов (гетероядер) в условиях, когда эти ядра не связаны прямым скалярным взаимодействием, без приложения РЧ импульсов во время смешивания спинов.
Способ позволяет в одном эксперименте выявить весь набор корреляций между химическими сдвигами гетероядер в составе индивидуальных веществ, что упрощает идентификацию малых молекул в многокомпонентных смесях различных веществ.
Задача решается предлагаемым нами методом ZULF-TOCSY.
ZULF
Для удовлетворения условий изотропного смешивания, мы переносим образец в нулевое или ультраслабое поле (Zero or UltraLow Field - ZULF, напряженность нулевого или ультраслабого магнитного поля B < 1 мкТл), в то время как этапы приготовления, эволюции в непрямом измерении и детектирования происходят в поле спектрометра ЯМР высокого разрешения (см. рис. 1б).
Осуществление способа
Осуществление способа в случае гетероядерной системы спинов (спины I и S - магнитные ядра различных изотопов) состоит в следующем (рис. 1b):
0
0
IS
I
S
IS
I
S
rel
Этап 1 - Исследуемый образец помещают в сильное магнитное поле В, удовлетворяющее условию слабой связи между спинами I и S: B>2πJ/|γ-γ|, где J - константа скалярного взаимодействия между спинами I и S, а γ и γ - гиромагнитные отношения спинов I и S, в котором происходит релаксация спинов к состоянию термодинамического равновесия в магнитном поле (начальный спиновый порядок) в течение времени t. Приготовление когерентного состояния спинов осуществляют подачей 90-градусного радиочастотного (РЧ) импульса на резонансной частоте спинов I, создающего поперечную намагниченность спинов I.
1
1
1
13
15
Этап 2 - Когерентное состояние спинов эволюционирует в течение времени t. Скалярное взаимодействие с гетероядром S рефокусируется приложением 180-градусного РЧ импульса на резонансной частоте спинов S (в данной работе S-спинами были изотопы С и N) в момент времени t=t/2. При t=t поперечная поляризация спинов I переводится в продольную путем приложения 90-градусного РЧ импульса на резонансной частоте спинов I.
Этап 3 - Этап смешивания для перевода состояния спинов в наблюдаемый сигнал ЯМР.
0
0
UL
UL
IS
I
S
UL
UL
mix
0
Для реализации этапа смешивания, производится быстрое (неадиабатическое) переключение напряженности магнитного поля, действующего на спиновую систему, с напряженности В (В > 4 Тл) сильного однородного поля ЯМР спектрометра до напряженности ультраслабого поля B, удовлетворяющего условию сильной связи между спинами I и S: B<<2πJ/|γ-γ|, (B порядка 100 нТл). Система находится в поле B в течение времени t, за это время спины I и S обмениваются поляризацией, после чего напряженность магнитного поля быстро (неадиабатически) переключается обратно, до значения В.
0
L
L
IS
I
S
L
UL
IS
I
S
Для осуществления этапа смешивания за время, не превышающее характерного времени релаксации спинов, производят перенос образца в остаточном поле ЯМР спектрометра из сильного магнитного поля В в промежуточное поле B, в котором выполняется условие слабой связи B>2πJ/|γ-γ|, и производят быстрое (неадиабатическое) переключение магнитного поля от промежуточного B до ультраслабого B<<2πJ/|γ-γ|.
jump
L
UL
jump
IS
UL
0
Время переключения напряженности поля t от промежуточного B до ультраслабого B должно быть много меньше характерного времени переноса поляризации: t << 1/2J. Неадиабатическое переключение напряженности магнитного поля из ультраслабого поля B в сильное магнитное поле В производится путем повторения в обратном порядке действий, указанных выше.
jump
L
UL
jump
IS
Время переключения напряженности поля t от промежуточного B до ультраслабого B должно быть много меньше (на один или более порядок) характерного времени переноса поляризации: t << 1/2J.
UL
0
Неадиабатическое переключение напряженности магнитного поля из ультраслабого поля B в сильное магнитное поле В производится путем повторения в обратном порядке действий, указанных выше.
UL
0
Этап 4 - После переключения напряженности магнитного поля B→В, прикладывается 90-градусный импульс на резонансной частоте спинов S и записывается сигнал спада свободной индукции (ССИ) этих спинов. При этом, во время записи ССИ спинов S на резонансной частоте спинов I может прикладываться композитный РЧ импульс, обеспечивающий развязку скалярного взаимодействия между спинами I и S.
Неадиабатичность переключений поля во время этапа 3 для спинов I и S является необходимым условием работоспособности метода ZULF-TOCSY. Ранее нами было показано, что имеющийся в нашем распоряжении 400 МГц ЯМР спектрометр, оборудованный приставкой для быстрого переключения поля, включающей систему механического перемещения ампулы с образцом и магнитный экран с системой шиммирующих и подстоечных катушек, действительно позволяет неадиабатически переключать напряженность магнитного поля [7].
Схема приставки для быстрого переключения поля представлена на рис. 2. Стандартная 5 мм ЯМР ампула (Sample) с жидким образцом внутри вставляется в каретку (Carriage), которая механически перемещается в остаточном поле магнита ЯМР спектрометра при помощи реечной передачи. Для достижения напряженности поля, меньшей 2 мТл, установлен магнитный экран (magnetic shield). Величина напряженности поля внутри магнитного экрана контролируется током в электромагнитных катушках (adjusting coils), однородность поля внутри магнитного экрана контролируется подстроечными катушками (shim coils).
Приставка перемещает образец в стандартной ЯМР ампуле, зафиксированной в каретке, в свою очередь закрепленной на паре зубчатых реек; перемещение реек контролируется шаговым двигателем посредством зубчатого колеса. Вращение шагового двигателя контролируется компьютером, управляющим спектрометром, и синхронизировано с приложением РЧ импульсов.
0
L
UL
L
IS
I
S
UL
IS
I
S
IS
I
S
L
IS
I
S
UL
IS
I
S
jump
jump
IS
Реализация неадиабатического переключения поля заключается в механическом перемещении образца в ЯМР ампуле при помощи механической приставки (шаттла) установленной на магните ЯМР спектрометра (Bruker AVANCE III HD, сильное поле спектрометра В=9.4 Тл) внутрь магнитного экрана, подачей соответствующего тока в катушки внутри экрана и порядком их включения/выключения. Внутри магнитного экрана могут быть созданы сильное поле B и ультраслабое поле B, удовлетворяющие условиям: B>2πJ/|γ-γ| - условию слабой связи; B<<2πJ/|γ-γ| - условию сильной связи, где J - константа скалярного взаимодействия между спинами I и S, γ и γ - гиромагнитные отношения спинов I и S, а время переключения напряженности поля от B>2πJ/|γ-γ| до B<<2πJ/|γ-γ| (t) много меньше характерного времени переноса поляризации: t<<1/2J.
0
UL
0
IS
I
S
L
L
IS
I
S
L
IS
I
S
UL
IS
I
S
UL
0
Неадиабатическое переключение напряженности магнитного поля из сильного магнитного поля В в ультраслабое поле B производят в два этапа: на первом этапе за время, не превышающее характерного времени релаксации спинов, производят механический перенос образца в остаточном поле ЯМР спектрометра из сильного магнитного поля B>2πJ/|γ-γ| в промежуточное сильное магнитное поле B, в котором еще выполняется условие слабой связи B>2πJ/|γ-γ|; на втором этапе производят быстрое (неадиабатическое) переключение магнитного поля от промежуточного B>2πJ/|γ-γ| до ультраслабого B<<2πJ/|γ-γ| выключением тока в электромагнитных катушках, управляемым сигналом компьютера. Неадиабатическое переключение напряженности магнитного поля из ультраслабого поля B в сильное магнитное поле В производится путем повторения в обратном порядке действий, указанных выше.
L
0
L
В условиях приведенных ниже примеров напряженность промежуточного поля B составляла 25 мкТл, а время переключения напряженности поля образца из сильного магнитного поля В в промежуточное магнитное поле B составляет 0,4 секунды.
13
1
13
15
Использование приставки позволяет производить неадиабатическое переключение напряженности магнитного поля, что открывает новые возможности изучения структуры вещества. Неадаиабатическое переключение поля переводит разность поляризаций спинов I и спинов S в гетероядерную нуль-квантовую когерентность (ZQC), ответственную за перенос поляризации между спинами I и S; эволюция ZQC задается скалярными взаимодействиями [7, 8]. Пример зависимости поляризации спинов С (спины S) от времени смешивания W со спинами H (спинами I) C,N изотопно-обогащенной аминокислоты L-лизин в результате эволюции ZQC представлен на Рис. 3b.
Мы продемонстрируем, как метод работает для простых модельных систем, таких как изотопно-обогащенные аминокислоты, а также применим его для отнесения сигналов в сложной смеси веществ.
1
13
1
15
Метод ZULF-TOCSY позволяет определять скалярно-связанные гетероядерные спиновые системы, например, H-C и Η-Ν, по появлению кросс-пиков в 2D спектре ЯМР. Метод был протестирован на изотопно-обогащенных аминокислотах L-лизин (Рис. 4) и L-лейцин (Рис. 5). Кроме того, мы применили метод ZULF-TOCSY к раствору изотопно-обогащенной питательной среды ISOGRO [9] - сложной смеси различных биомолекул.
15
1
α
β
γ
δ
ε
α
β
γ
δ
ε
UL
mix
rel
Пример 1. В аминокислоте L-лизин присутствует 6 атомов углерода, 2 атома азота и 5 групп магнитно-неэквивалентных протонов. В спектре С-Н ZULF-TOCSY (Рис. 4а) наблюдаются корреляции между всеми шестью углеродами (обозначенными С'; С; С; С; С; С) и всеми пятью группами магнитно-неэквивалентных протонов (обозначенными Н; Η; Η; Η; Η). Эксперимент проводился при следующих значениях параметров: B=100 нТл, t=2 мс, 128 повторений цикла импульсной последовательности (этапы 1-4), 4 накопления на цикл, релаксационная задержка t=6 секунд.
15
1
α
ε
α
β
γ
δ
ε
α
ε
UL
mix
rel
В спектре Ν-H ZULF-TOCSY (Рис. 4b) наблюдаются корреляции между всеми азотами (обозначенными Ν; Ν) и всеми пятью группами магнитно-неэквивалентных протонов (обозначенными Η; Η; Η; Η; Η), за исключением корреляции Η-Ν. Эксперимент проводился при следующих значениях параметров: B=100 нТл, t=50 мс, 64 повторения цикла импульсной последовательности (этапы 1-4), 128 накоплений на цикл, релаксационная задержка t=23 секунды.
13
1
α
β
γ
δ1
δ1
α
β
γ
δ1
δ2
mix
rel
Пример 2. В аминокислоте L-лейцин присутствует 6 атомов углерода, 1 атом азота и 3 группы магнитно-неэквивалентных протонов. В спектре С-Н ZULF-TOCSY (Рис. 5а) наблюдаются корреляции между всеми шестью углеродами (обозначенными С'; С; С; С; С; С) и всеми тремя группами магнитно-неэквивалентных протонов (обозначенными Н; Η, Η; Η, Η). Эксперимент проводился при следующих значениях параметров: BUL=100 нТл, t=3 мс, 128 повторений цикла импульсной последовательности (этапы 1-4), 4 накопления на цикл, релаксационная задержка t=5 секунд.
15
1
α
β
γ
δ1
δ2
UL
mix
rel
В спектре N-H ZULF-TOCSY (Рис. 5b) наблюдаются корреляции между азотом и всеми группами магнитно-неэквивалентных протонов (обозначенными Η; Η, Η; Η, Η). Эксперимент проводился при следующих значениях параметров: B=100 нТл, t=50 мс, 64 повторения цикла импульсной последовательности (этапы 1-4), 128 накоплений на цикл, релаксационная задержка t=25 секунды.
13
1
13
15
β
α
13
15
UL
mix
rel
Пример 3. В спектре C-H ZULF-TOCSY С, N изотопно-обогащенной питательной среды ISOGRO (Рис. 6) квадратами из разных линий выделены сигналы корреляции углеродов и протонов, относящихся к различным веществам, а именно аминокислотам: аланину (квадраты из сплошной линий, 3 углерода, 2 группы магнитно-неэквивалентных протонов), глицину (квадраты из штрих-пунктирных линий, 2 углерода, 1 группа магнитно-неэквивалентных протонов), и аспаргиновой кислоте (квадраты из штриховой линии, 4 углерода, 2 группы магнитно-неэквивалентных протонов). Эксперимент проводился при следующих значениях параметров: B=50 нТл, t=40 мс, 64 повторения цикла импульсной последовательности (этапы 1-4), 960 накопления на цикл, релаксационная задержка t=3 секунд. В данном спектре не наблюдается только корреляция С-Н аспаргиновой кислоты. Наблюдение в прямом измерении ССИ спинов гетероядра S позволяет получить преимущество в интерпретации спектра, связанное с более широким диапазоном возможных значений химического сдвига гетероядра S (С, N и т.д.).
Последний пример показывает, что метод ZULF-TOCSY позволяет быстро выделять сигналы, относящиеся к свободным аминокислотам. Мы ожидаем, что предложенный метод может быть использован для отнесения сигналов ЯМР и идентификации малых молекул в сложных, многокомпонентных смесях различных веществ, в частности, биомолекул и метаболитов.
Использованные источники информации
1. Principles of nuclear magnetic resonance in one and two dimensions. The International series of monographs on chemistry. / Ernst R.R., Bodenhausen G, Wokaun A. - Oxford Oxfordshire, New York: Clarendon Press; Oxford University Press, 1987. - T. 14: The International series of monographs on chemistry.
2. Bax Α., Freeman R. Investigation of Complex Networks of Spin-Spin Coupling by Two-Dimensional NMR // Journal of Magnetic Resonance. - 1981. - T. 44, №3. - C. 542-561.
3. Bodenhausen G, Ruben D.J. Natural Abundance N-15 NMR by Enhanced Heteronuclear Spectroscopy // Chemical Physics Letters. - 1980. - T. 69, №1. - C. 185-189.
4. Bax Α., Summers M.F. H-1 and C-13 Assignments from Sensitivity-Enhanced Detection of Heteronuclear Multiple-Bond Connectivity by 2D Multiple Quantum NMR // Journal of the American Chemical Society. - 1986. - T. 108, №8. - C. 2093-2094.
5. Kumar Α., Ernst R.R., Wuthrich K.A Two-Dimensional Nuclear Overhauser Enhancement (2D NOE) Experiment for the Elucidation of Complete Proton-Proton Cross-Relaxation Networks in Biological Macromolecules // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1980. - T. 95, №1. - C. 1-6.
6. Braunschweiler L., Ernst R.R. Coherence Transfer by Isotropic Mixing - Application to Proton Correlation Spectroscopy // Journal of Magnetic Resonance. - 1983. - T. 53, №3. - C. 521-528.
7. Zhukov I.V., Kiryutin A.S., Yurkovskaya Α.V., Grishin Υ.Α., Vieth H.-M., Ivanov K.L. Field-cycling NMR experiments in ultra-wide magnetic field range: relaxation and coherent polarization transfer // Physical Chemistry Chemical Physics. - 2018. - T. 20, №18. - C. 12396-12405.
8. Ivanov K.L., Yurkovskaya Α.V., Vieth H.-M. Coherent transfer of hyperpolarization in coupled spin systems at variable magnetic field // Journal of Chemical Physics. - 2008. - T. 128, №15. - C. 154701.
9. Merck. Description of ISOGRO sample. // URL: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/stable-isotopes/isogro-complex-growth-media.html (дата обращения: 03.06.2020).