PlA полиморфизм гена gp3A - новый прогностический фактор рака почки

PLA полиморфизм гена GP3A — новый прогностический фактор рака почки

О.Б. Лоран1, А.В. Серегин1, Г.И. Мяндина2,

К.Ю. Кашинцев1, Н.А. Шустицкий1, А.А. Серегин1

Кафедра урологии и хирургической андрологии РМАПО, Москва;

2кафедра биологии и общей генетики РУДН, Москва

PLА POLYMORPHISM OF GP3A GENE IS A NEW PROGNOSTIC FACTOR OF RENAL CANCER

O.B. Loran, A.V. Seregin, G.I. Myandina, K.Yu. Kashintsev, N.A. Shustitsky, A.A. Seregin

Urology Department, Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow, Russia

Introduction & Objectives. Cell adhesion molecules play an important role in the pathogenesis of renal cell carcinoma (RCC). Glycoprotein Ilia gene (gp3A) encodes the beta chain of integrin receptor and contains PllllA (Leu33Pro) polymorphism. The authors have earlier investigated a role of GP3A polymorphism in prostate cancer and determined that the PlA2 polymorphism of gp3A gene increased the risk of prostate cancer development and invasion. The aim of the study was to examine an association of PlA polymorphism with sporadic RCC patients in the Moscow region.

Material and methods. We determined the genotype of gp3A of 100 patients with RCC and 30 age-matched controls, by using polymerase chain reaction was used.

Results. The distribution of PlA polymorphism in the Moscow population was 76% of PlA1/A1 allele, 22% of PlA1/A2 allele and 2% of PlA2/A2 allele.

Sixty (60%) patients with RCC had PlA1/A1 allele, 33 (33%) had PlA1/ A2 allele and 4 (4%) had PlA2/A2 allele. The frequency of PlA1/A2 allele was significantly higher in RCC patients (33%) than in the population (22%) (p < 0,02). Analyzing the genotype subject to TNM stage in patients with localized cancer (T1—2N0M), allele PlA1/A1 was determined in 27 (60%), PlA1/A2 in 15 (35,6%), and PLA1/A2 in 2 (4,4%). Among the patients with invasive cancer (T3—4N0—2M0), 23 (82,1%) and 5 (17,9%) had PLA1/A1 allele and PLA1/A2, respectively. Also, 13 (48%) patients of those with metastatic cancer had PLA1/A1; 12 (44,5%) and 2 (7,5%) had PLA1/A2 and PLA2/A2 alleles, respectively. As for the metastatic group, the frequency of PlA1/A2 genotype was significantly higher (44,5%) than that in the population (22%) (p = 0,02).

The OR RCC development for PLA1/A2 genotype as compared to PlA1/A1 was 2,1 for localized cancer and 3,17 for the metastatic group. Conclusions. PlA2 polymorphism of gp3A gene increases the risk of RCC and metastasis. The course of RCC in patients carrying PlA2 polymorphism is characterized by a more rapid metastatic progression. Comparison of the results of the invasive and metastatic groups can lead to some conclusions. PlA2 polymorphism may be of more considerable importance in metastatic processes than in the development of RCC. The determination of PlA polymorphism seems to be a new predictor of RCC and it is useful and suitable for screening of high-risk patients.

На долю рака почки (РП) приходится 3% от всех онкологических новообразований; он занимает одно из ведущих мест по темпам прироста среди онкоурологических заболеваний. Приблизительно у половины пациентов болезнь приобретет системный характер в разные сроки после оперативного лечения [1—3]. РП практически нечувствителен к традиционной химио- и лучевой терапии; иммунотерапия же, единственный практически значимый до недавнего времени вид системного лечения, эффективна лишь в небольшом проценте случаев [4]. Таким образом, интерес к исследованиям в сфере молекулярно-генетических изменений при РП вызван как необходимостью разработки новых этиопатогенетиче-ски обоснованных методов терапии почечноклеточного рака, так и возможностью выработки более эффективных подходов к диагностике и прогнозированию клинического течения РП.

В настоящее время на разных стадиях испытаний клинической эффективности находятся такие потенциальные молекулярно-генетические маркеры, как ферритин, индекс апоптоза, p53, Ю-67, гелсолин, CA IX, СА XII, PTEN, EpCAM, гамма-энолаза, CD44, CD95, MN/CA9, кадхерин-6, ви-ментин, муцин-1 и парвалбумин [5—7].

Одним из направлений исследований является изучение влияния клеточно-клеточного и клеточно-матриксного взаимодействия, определяемого свойствами молекул клеточной адгезии (МКА) на процессы канцерогенеза. Основные функции МКА — осуществление пространственных связей «клетка — клетка» и «клетка — внеклеточный матрикс», а также участие в процессах «сигналинга» (передача сигналов между клетками и внеклеточным матриксом), что влияет на движение, пролиферацию, дифференцировку, апоп-тоз и другие функции клетки [8, 9] (рис. 1).

МКА представлены четырьмя суперсемействами: кадхерины, селектины, иммуноглобулины и интегрины. Ген гликопротеина 3A (GP3A) кодирует бета-3 субъединицу интегринового рецептора и может быть рассмотрен как объект изучения влияния МКА на онкогенез РП. GP3A содержит PLA (Leu33Pro) полиморфизм и представлен двумя аллельными формами — PLA1 и PLA2 [10]. Ранее нами было продемонстрировано повышение относительного риска заболеваемости раком предстательной железы у носителей гетерозиготного генотипа PLA1A2 в 2,3 раза при сравнении с носителями генотипа PLA1A1 [11]. Целью данной работы явилось определение клинического значения PLA полиморфизма гена GP3A при РП.

Материалы и методы

В наше исследование были включены 100 больных почечно-клеточным раком (средний возраст 61,3 года; соотношение мужчины/женщины 1,13/1,0), которые получали лечение в урологической клинике РМАПО на базе ГКБ им. Боткина в период с ноября 2005 г. по ноябрь 2006 г., и 30 пациентов с мочекаменной болезнью, доброкачественной гиперплазией предстательной железы или воспалительными заболеваниями мочевых путей, составивших группу контроля. Диагноз РП был установлен на основе комплексного обследования (УЗИ в режимах цветного и энергетического допплеровского картирования, компьютерная томография — КТ — почек, по показаниям — экскреторная урография, магнитно-резонансная томография — МРТ — почек и костей скелета, рентгенография костей скелета, КТ легких) и последующего гистологического

исследования опухоли с определением степени дифференцировки опухоли.

Произведен анализ аллельного распределения GP3A по группам сравнения, составленным исходя из стадии TNM и степени клеточной ана-плазии (G). При сравнении по стадии TNM в 1-ю группу (n=47) вошли пациенты с локализованным РП (T1—2N0M0), во 2-ю (n=28) — пациенты с местно-распространенным процессом (Т3а—4^—2М0), 3-ю (n=25) — больные с метастатическим РП (TxNxM+). Степень клеточной анаплазии была определена только у 96 пациентов, оперированных в нашей клинике, так как 4 пациента были оперированы в более ранние сроки в других клиниках и информации о степени злокачественности их опухолей мы не имели. Пациентов с высокодифференцированными опухолями (G1) было 23, умеренно дифференцированными (G2) — 47, низкодифференцированными (G3—4) — 26.

Для определения генотипа пациентов по GP3A использовалась методика полимеразной цепной реакции (ПЦР). Фрагмент GP3A, содержащий области анализируемого полиморфизма, получали в ходе ПЦР-амплификации при помощи олигонуклеотидных пар праймеров с последовательностями 5-ttctgattgctggacttctctt-3 и 5-tctctccc-catggcaaagagt-3; для идентификации точечной замены в гене использовали олигонуклеотидный зонд cttacaggccctgcctc.

Достоверность различия распределения относительных частот гена GP3A в исследуемых группах от популяционных значений проводили по методике сравнения наблюдаемых и ожидаемых значений (х2) и г-критерия достоверности Стьюдента, значение ^<0,05 считалось статистически достоверным.

Результаты

Первоначально мы установили, что аллельное распределение GP3A в контрольной группе не отличалось от популяционного. Популяционные значения распределения PLA полиморфизма составляют 76% для носителей генотипа PLA1A1, 22% — PLA1A2 и 2% — PLA2A2 [10]. У пациентов, страдающих раком почки, аллельное распределение PLA полиморфизма статистически значимо отличалось от популяционного: генотип PLA1A1 выявлен у 63 (63%; 95% ДИ 53,4—72,6) больных РП, генотип

Рис. 1. Структура и функции МКА

Аллельное распределение (в %) ОР3А при РП в группе контроля и в популяции

Группа A1A1 A1A2 Л2Л2 p

РП (100) 63 (63) 33 (33) 4 (4) < 0,05

Контроль (30) 73,4 (22) 23,3 (7) 3,3 (1) 0,85

Популяция 76 22 2

Примечание. В скобках — число больных.

Р1Л1Л2 — у 33 (33%; 95% ДИ 23,6—42,4), генотип РІА2А2 — у 4 (4%; 95% ДИ 0,08—7,92).

При анализе наблюдаемых и ожидаемых частот аллельное распределение гена ОР3Л у больных почечно-клеточным раком статистически значимо отличалось от такового в популяции (р<0,05; см. таблицу).

При анализе распределения аллелей ОР3Л в зависимости от стадии заболевания были получены следующие результаты (рис. 2): в группе больных локализованным РП выявлено 28 (59,5%; 95% ДИ 45,3—73,7) носителей генотипа Р1Л1Л1, 17 (36,2%; 95% ДИ 22,6—49,8) носителей генотипа РІЛ1Л2 и 2 (4,3%; 95% ДИ 0—10,28) носителя генотипа РІЛ2Л2. В группе местно-распространенного РП генотип РІЛ1Л1 выявлен у 23 (82,1%; 95% ДИ 67,3—96,9) пациентов, РІЛ1Л2 — у 5 (17,9%; 95% ДИ 3,1—32,7), а в группе пациентов с метастатическим РП у 12 (48%; 95% ДИ 27,8—68,7) пациентов выявлен генотип РІЛ1Л1, у 11 — РІЛ1Л2 (44%; 95% ДИ 24,4—65,1), у 2 — РІЛ2Л2 (8%; 95% ДИ 1—26).

При оценке относительного риска установлено, что у пациентов с генотипом РІЛ1Л2 относительный риск развития РП в 1,8 раза (95% ДИ 1,44—2,23) выше, чем у носителей генотипа РІЛ1Л1. Кроме того, относительный риск развития метастатической формы почечно-клеточного рака у носителей генотипа РІЛ1Л2 возрастает в 3,17 раза (95% ДИ 2,02—4,9) по сравнению с носителями генотипа РІЛ1Л1.

При анализе аллельного распределения ОР3А в зависимости от степени дифференциров-ки получены следующие данные (рис. 3): в группе пациентов с высокой степенью клеточной ана-плазии ^1) генотип РЬА1А1 обнаружен у 16 человек (69,6%; 95% ДИ 47,1—86,8), РЬА1А2 — у 5 (21,7%; 95% ДИ 7,5—43,7), РЬА2А2 — у 2 (8,7%; 95% ДИ 0,1—21,9). При умеренно дифференцированном РП ^2) генотип РЬА1А1 выявлен у 27 (57,4%; 95% ДИ 50,2—64,6) больных, РЬА1А2 — у 18 (38,3%; 95% ДИ 31,2—45,4), РЬА2А2 — у 2 (4,3%; 95% ДИ 1,35—7,3), а при выраженной степени клеточной анаплазии ^3 —4) генотип РЬА1А1 был выявлен у 16 (61,5%; 95 % ДИ 40,6— 79,8) больных, РЬА1А2 — у 10 (38,5%; 95% ДИ 20,2—59,4).

Аллельное распределение ОР3А при высокодифференцированном почечно-клеточном раке ^1) статистически не отличается от популяционного (^=0,94). При РП умеренной ^2) степени дифференцировки статистически достоверно повышается частота носительства генотипа РЬА1А2, а РЬА1А1 соответственно снижается (^<0,05), в группе же низкодифференцированных

% больных 100 -і

80 -

60 -

40 -

20 -

р<0,05

р=0,34

р<0,05

82,1

76

59,5

22

36,2

4,3

1

48

17,9

44

Популяция I | РІЛ1Л1

Т1—2ШМ0 Т3—4Ш—2М0

Т1—4Ш—2М+ | | РІЛ2Л2

8

2

0

0

Рис. 2. Зависимость аллельного распределения ОР3Л от стадии ТШИу больных РП

(G3—4) опухолей достоверных различий не выявлено (р=0,07), что могло быть связано с небольшим размером выборки. При объединении для анализа пациентов 2-й и 3-й групп оказалось, что при опухолях со степенью дифференцировки ниже G1 имеется статистически достоверное различие аллельного распределения PLA полиморфизмов GP3A в сравнении с популяционными величинами (р< 0,05).

Обсуждение

Изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих при РП, преследует две основные цели. Первая — разработать новые подходы к системному лечению РП; так, например, уже начальное понимание некоторых аспектов онкогенеза позволило создать принципиально новую группу препаратов, уже используемую для терапии РП — ингибиторы неоангиогенеза (сора-фениб, сунитиниб, бевацизумаб, эрлотиниб) [12]. Второй целью является разработка на основе знания молекулярной биологии РП новых ге-нетико-протеомических номограмм, способных заменить имеющиеся в настоящий момент так называемые классические факторы прогноза.

Появление и рост раковой опухоли — процесс комплексный и многоэтапный, в котором участвует множество генов, ответственных за определенные процессы, происходящие в клетке. Даже при наличии такого хорошо изученного гена-супрессора, каким является VHL, имеются многочисленные указания на наличие иного VHL-независимого пути канцерогенеза почечноклеточного рака. Так, W. Huber и соавт. [13] описывают 389 генов и порядка 1700 белковых фрак-

ций, показатели которых изменяются в клетках почечно-клеточного рака в сравнении с нормальными тканями почки.

В связи с этим изучение генов МКА, ответственных за передачу сигналов на уровне «клетка — клетка» и «клетка — межклеточный матрикс», является одним из возможных перспективных направлений использования уже имеющихся сведений о молекулярной биологии раковой опухоли. Опухоль в своем развитии вынуждена использовать нормальные регуляторные и метаболические механизмы клеточных взаимоотношений, следовательно, нормальные генетические варианты (аллельные полиморфизмы) становятся одним из факторов, способных определять возникновение, развитие и исход ракового заболевания. Этиологию РП нельзя объяснить аллельными полиморфизмами в отдельных локусах. В настоящее время наиболее активно изучается значение аллельных полиморфизмов таких суперсемейств МКА, как кадхерины и иммуноглобулины, роль интегринов изучена в меньшей степени. По имеющимся сведениям, наиболее часто клетки почечно-клеточного рака используют комплексы альфа-3 — бета-1 и альфа-6 — бета-1, прослеживается корреляция со степенью диффе-ренцировки опухоли: так, при высокой диффе-ренцировке наиболее часто встречается альфа-6 — бета-1, а при G3 (низкодифференцированные опухоли) — альфа-3 — бета-1 [14].

Проведенное нами исследование показало, что носительство генотипа РЬА1А2 является неблагоприятным фактором как возникновения, так и дальнейшего течения РП. В настоящий мо-

% больных 100 п

80 -

60 -

40 -

20 -

p=0,94

p<0,05 p=0,07 p<0,05

76

69,6

22

57,4

61,5

21,7

8,7

38,3

4,3

58,9

38,5

38,4

2,7

Популяция G1

PLA1A1  PLA1A2  PLA2A2

2

0

Рис. 3. Распределение генотипа PLA в зависимости от степени клеточной анаплазии

мент результаты многих исследований, посвященных проблемам генетики РП, носят противоречивый характер. Это обусловлено как методологическими недоработками, так и несоблюдением размеров исследуемой выборки. Также иногда для анализа используются группы, подобранные по принципу максимального удобства их набора (пациенты одной клиники, члены их семей, доноры и т.д.), что не может быть популяционно значимым. Будущее генетических исследований при РП — за многоцентровыми исследованиями ассоциаций аллельных полиморфизмов, способных объяснить весь многоступенчатый характер патогенеза неопластического процесса в почке. Без сомнения, появление и прогрессия почечноклеточного рака являются результатом целой серии генетических изменений, и дальнейшие исследования должны выявить все эти ключевые события для объяснения особенностей клинического течения РП.

Наши результаты еще раз подтверждают целесообразность изучения аллельных полиморфизмов генов МКА в возникновении и прогрес-

сии злокачественных новообразований. Накопление сведений о генетических изменениях при РП и осмысление их участия в многоступенчатых процессах канцерогенеза, происходящих в почке, может быть использовано в создании новых препаратов этио- и патогенетически направленного действия, а также компьютерных алгоритмов прогнозирования течения злокачественного процесса в почке, определении на их основе оптимального вида лечения и тактики послеоперационного ведения пациентов.

Заключение

Проведенное нами исследование показало, что у носителей гетерозиготного генотипа РЬА1А2 гена ОР3А относительный риск развития РП выше, чем у носителей генотипа РЬА1А1. Кроме того, установлено, что носительство аллели РЬА2 способствует как развитию более низкодифференцированной раковой опухоли почки, так и приобретению ею метастатического фенотипа. В связи с этим целесообразным представляется дальнейшее изучение особенностей влияния генотипа ОР3А на клиническое течение РП.

1. Аксель Е.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями мочевых и мужских половых органов

в России в 2003 г. Онкоурология 2005;(1):6—9.

2. Atkins M.B., Avigan D.E.,

Bukowski R.M. et al. Innovations and challenges in renal cancer: consensus statement from the first international conference. Clin Cancer Res 2004;10(18 Pt 2):6277S—81S.

3. Linehan W.M., Zbar. B. Focus on kidney cancer. Cancer Cell 2004;6(3):223—8.

4. Atkins M.B., Regan M., McDermott D. Update on the role of interleukin 2 and other cytokines in the treatment of patients with stage IV renal carcinoma. Clin Cancer Res 2004;10(18 Pt 2):6342S—6S.

5. Potter C., Harris A.L. Hypoxia inducible carbonic anhydrase IX, marker

of tumor hypoxia, survial pathway and therapy target. Cell Cycle 2004;3:164—7.

6. Bamias A., Chorti M., Deliveliotis C. et al. Prognostic significance of CA 125, CD 44 and epithelial membrane antigen in renal cell carcinoma. Urology 2003;62(2):368—73.

7. Kim H.L., Stligson D., Liu X. et al. Using tumor markers to predict the survival of patients with metastatic renal cell carcinoma. J Urol 2005;173(5):1496—501.

8. Syrigos K.N., Harrington K.J.,

Pignatelli M. et al. Role of adhesion molecules in bladder cancer: an important part of the jigsaw. Urology 1999;53(2):428—34.

9. Takeichi M. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Science 1991;22(251):1451—5.

10. Bojesen S.E., Tybjaerg-Hansen A., Nordestgaard B.G. Integrin Leu33Pro

-------------------- Литература

homozygosity and risk of cancer. J Natl Cancer Inst 2003;95:1150 —7.

11. Серегин А.А. Клиническое значение аллельного распределения гена GP3A при раке предстательной железы. Автореф. дис. ... канд. мед наук. М.; 2005.

12. Staehler M., Rohrman K., Haseke N., Stief C.G. Targeted agents for the treatment of advanced renal cell carcinoma. Curr Drug Targets 2005;6(7):835—46.

13. Huber W., Boer J.M., von Heydeberck A. et al. Transcription profiling of renal cell carcinoma. Verh Dtsch Ges Pathol 2002;86:153—64.

14. Wechsel H.W., Petri E., Feil G. et al. Renal cell carcinoma: immunohistological investigation of expression of the integrin alpha v beta 3. Anticancer Res 1999;19(2C):1529—32.

ВНИМАНИЕ!

УВАЖАЕМЫЕ ЧИТАТЕЛИ!

В Издательском доме «АБВ-пресс» готовится к печати книга проф. А.С. Переверзева и проф. М.И. Когана «ИНФЕКЦИИ И ВОСПАЛЕНИЕ В УРОЛОГИИ».

В книге рассматриваются проблемы инфекций в урологии. Охарактеризованы особенности развития и размножения микрофлоры, в том числе процессы тропизма и адгезии. Обсуждаются антибактериальное и комплементарные виды лечения. Особое внимание уделено высокой вариабельности восприимчивости микроорганизмов к антибиотикам. Пропагандируется новый подход к антибактериальному лечению — от эмпирического выбора к доказательным принципам.

Заказать книгу можно по тел.: (495) 252 96 19, а также на сайте: www.netoncology.ru;www.abvgrp.ru