Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS
METHOD FOR OBTAINING MAGNETIC IMMUNOSORBENTS FOR SELECTIVE CONCENTRATION OF F. TULARENSIS FROM ENVIRONMENTAL OBJECTS WITH SUBSEQUENT DETECTION BY THE MALDI-TOF MS METHOD

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и в частности, к способу получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования патогенов с последующей детекцией методом масс-спектрометрии (МС).
В связи с тем, что концентрация патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды может быть очень низкой, а исследуемые образцы контаминированы посторонней микрофлорой, процедура выявления возбудителя в пробах из объектов окружающей среды должна включать стадию селективного концентрирования. Это довольно длительный процесс, требующий материальных и трудовых затрат.
Наиболее простой и быстрый способ пробоподготовки биологического объекта - осаждение белков. Однако в этом случае полностью освободиться от матричного эффекта не удается при использовании метода MALDI-TOF MS. При анализе биологических образцов после процедуры осаждения белков может наблюдаться ионная супрессия, поскольку этот путь не позволяет эффективно удалять эндогенные компоненты биологической матрицы (липиды, фосфолипиды, жирные кислоты и др.). Коэлюирование таких соединений с определяемым компонентом влияет на процесс десольватации капель электроспрея [1, 2].
Известна работа Цимбалистова М.В. с соавт. [3], в которой описано сравнительное изучение белковых профилей типичных вирулентных и изогенных авирулентных ЛПС-дефектных штаммов туляремийного микроба с помощью масс-спектрометрического анализа. Пробоподготовку образцов вирулентных штаммов проводили методом экстракции этиловым спиртом и муравьиной кислотой в соответствии с рекомендациями MP 4.2.0089-14 [4].
Недостатком данной работы является то, что описанный метод не является селективным и применяется только для исследований чистых культур. Известно, что при анализе методом MALDI основной проблемой является получение воспроизводимых и информативных масс-спектров. Это особенно важно при исследовании высокоразвитых поверхностей, которые могут, как увеличивать, так и уменьшать эффективность ионизации, а, следовательно, может снижаться предел чувствительности метода. Также возникает проблема при исследовании объектов окружающей среды, когда необходимо выявить патоген из большого объема и сильно загрязненной пробы. Решить эти проблемы можно путем селективного концентрирования целевых аналитов на стадии пробоподготовки образца с использованием сорбентов. При этом сокращается число стадий выделения аналитов из сложных матриц.
Элюаты, получаемые с использованием сорбционного концентрирования - твердофазной экстракции, значительно чище. Это продемонстрировано в работе Yadav М., 2012 [5].
Сорбенты занимают важное место среди разнообразия пористых и высокодисперсных материалов при решении задач химии, медицины, фармацевтики и т.д. В качестве сорбентов известно использование различных типов саж: графитированная термическая сажа Carbopack, графитированная печная сажа ПМ-16Э, печная сажа ПМ-75 и Vulcan ХС 72R. Показано, что добавление к исследуемым сажам хлорида серебра позволяет повысить информативность и чувствительность определения исследуемых соединений. Метод MALDI с применением предложенных сорбентов позволяет проводить анализ с минимальной пробоподготовкой [6]. Недостатком является то, что данный сорбент нельзя использовать для селективного концентрирования, что снижает выявляемость аналита.
Известен способ получения магноиммуносорбента для обнаружения антигенов микроорганизмов путем получения биомагноиммуносорбента на основе полиакролеиновых латексных микросфер с лигированием специфических антител [7]. Способ включает получение иммуносорбента на основе магнитных полиакролеиновых латексных частиц, содержащих оксид железа. Ферромагнитный материал - оксид железа - вводят в микросферы полиакролеиновых магноиммуносорбентов не в момент их синтеза, а после его завершения. Недостатком данного способа является многостадийность получения магноиммуносорбентов. Использование глутарового альдегида для сшивки сорбентов с антителами может приводить к неспецифической реакции. Данный метод применим только для иммуноферментного анализа (ИФА).
Известен способ получения биомагноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов на основе биоматериала (биологических клеток: эритроцитов барана, микробных клеток - грамположительных и грамотрицательных) с лигированием на нем специфических антител для обнаружения антигенов особо опасных инфекций (ООИ). Предлагаемый способ включает получение магнитного биоматериала (магнитных клеток), содержащих оксид железа (магнетит), лигирование на их поверхности компетентных видоспецифических иммуноглобулинов из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл и постановку серологической иммуноферментной реакции с биомагноиммуносорбентом на основе магнитных эритроцитов, клеток вакцинных штаммов чумного, сибиреязвенного микробов, кишечной палочки и Вас. cereus, содержащих магнетит [8]. Недостатком способа является то, что в качестве сорбентов применяется нестабильный и не стандартизованный биоматериал. Так, например, поверхностные свойства наружной мембраны эритроцитов широко варьируются в зависимости от многих условий, таких как пол, возраст, гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови, источника выделения и методов предварительной обработки.
Наиболее близким к заявляемому методу является применение магнитного сорбента при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы [9]. Но данный сорбент, применяемый для ИФА и ПЦР, показал отрицательные результаты при постановке масс-спектрометрического анализа.
Цель изобретения - получение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования и детекции F. tularensis в полевом материале и объектах окружающей среды методом MALDI-TOF MS.
Технический результат изобретения заключается в разработке магнитной матрицы, иммобилизованной антителами туляремийного микроба для пробоподготовки возбудителя туляремии с последующей постановкой масс-спектрометрического анализа.
4
Первоначальной стадией является получение магносорбента по схеме описанной нами ранее [10]: окисление сульфата железа (II) - FeSO нагретой гидроокисью калия (KOH), прокаливание, измельчение. При этом формируется гидроксид железа, обладающий сорбционными, магнитными свойствами.
Отмечается преимущество магнитных сорбентов при пробоподготовке для извлечения и концентрирования аналитов из сложных матриц, т.к. разделение можно осуществить в одну стадию с помощью магнита, без центрифугирования или фильтрации.
4
Магносорбенты затем используются для химического модифицирования активными группами, применяемыми для ковалентной иммобилизации лигандов. Для данной цели нами разработан метод модифицирования твердофазного носителя окислением с помощью перхлората натрия (NaClO). Синтез проводили следующим образом: к 1 г полученного магносорбента приливали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 г перхлората натрия. Инкубировали при температуре (22±4)°С в течение 1 ч в темноте. Затем сорбент отмывали дистиллированной водой (5 кратно, по 60-80 мл). Качественной реакцией на наличие перхлорат-иона является появление фиолетового цвета при действии метиленового голубого.
Определена концентрация альдегидных групп активированных сорбентов в соответствии с методом, описанным в работе В.А. Климовой (1971), которая составила 0,64 мг-экв/г. Содержание альдегидных групп на единицу поверхности носителя обеспечивает высокую концентрацию иммобилизованного лиганда.
Для получения магнитных иммуносорбентов использовали IgG туляремийные, выделенные из сыворотки крови гипериммунных животных, с помощью ПЭГ-6000. Иммобилизацию иммуноглобулинов туляремийных на поверхности магносорбента проводили следующим образом: к 0,4 мл 10% взвеси магносорбента приливали 1 мл иммуноглобулинов с концентрацией белка 2,5 мг/мл, что явилось оптимальным для полного насыщения сорбента антителами. Иммобилизированный сорбент отмывали на спектрофотометре при длине волны 280 нм 0,1 М фосфатно-солевым раствором до отсутствия показаний белка в надосадке. Далее использовали для концентрирования возбудителя туляремии с последующей постановкой масс-спектрометрии.
Сорбенты на основе оксидов металлов могут быть использованы в различном аппаратурном исполнении. Нами использован batch-вариант, в котором сорбент помещен в микропробирку, что позволяет патогенам дольше взаимодействовать с ним. В результате взаимодействия патогенов в течение 20-30 мин происходит максимальная адсорбция на сорбенте.
Для процесса пробоподготовки использовали магнитный концентратор. Процесс заключался в следующем: в микропробирку с 50 мкл разработанных активированных магнитных иммуносорбентов вносили по 100 мкл микробной взвеси туляремийного микроба, инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и вносили элюирующий раствор - 0,03 М KOH на 10 мин, переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген) в чистую микропробирку.
Параллельно проводили постановку контрольных проб: контроль магноиммуносорбентов (без инкубации с микробной взвесью) и контроль микробной взвеси (отсутствие магнитных сорбентов).
Согласно методическим рекомендациям (MP 4.2.0089-14) экстракцию белков проводят с использованием 80% раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ). В связи с этим, нами апробирован данный вариант использования ТФУ. Далее постановку метода MALDI-TOF проводили по традиционной схеме, согласно MP 4.2.0089-14 с автоматической идентификацией на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных. В работе использовали мишени MSP 96 Anchor Chip.
Эксперименты проводились как с чистыми культурами, так и контаминированными пробами. В результате, получены идентичные положительные данные.
Частицы сорбента имеют высокую магнитную восприимчивость. Их преимущество на стадии пробоподготовки для извлечения и концентрирования патогенов из сложных объектов заключается в том, что разделение можно осуществить в одну стадию с помощью магнита, без центрифугирования или фильтрации. А использование аффинных свойств сорбента позволяет проводить селективное концентрирование возбудителя туляремии для пробоподготовки патогена с последующей постановкой масс-спектрометрического анализа без осуществления предварительного посева исследуемого материала.
Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.
Пример 1. Разработка туляремийных магноиммунносорбентов для селективного концентрирования возбудителя туляремии (при использовании чистых культур музейных штаммов) с последующей постановкой масс-спектрометрии.
Способ получения аффинного магноиммуносорбента включал следующие основные стадии:
получение активированного магносорбента: к 1 г магносорбента приливали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 г перхлората натрия. Инкубировали при температуре (22±4)°С в течение 1 часа в темноте. Затем сорбент отмывали дистиллированной водой (5 кратно, по 60-80 мл);
получение магнитного иммусорбента: к 0,4 мл 10% взвеси активированного магносорбента приливали 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией белка 2,5 мг/мл;
отмывали от несвязавшихся антител дистиллированной водой и использовали для концентрирования возбудителя туляремии, с последующей постановкой масс-спектрометрии.
6
Для процесса пробоподготовки применяли магнитный концентратор. В микропробирку с 50 мкл разработанных активированных туляремийных магнитных иммуносорбентов вносили 100 мкл взвеси туляремийного микроба (1×10 м.к./мл), инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и вносили элюирующий раствор - 0,03 М KOH на 10 мин, переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген) в чистую микропробирку. Проводили постановку контрольных проб: контроль магноиммуносорбентов (без инкубации с микробной взвесью) и контроль микробной взвеси (отсутствие магнитных сорбентов). Для контроля специфичности использовали гетерологичные штаммы: Br.abortus 544, Br.melitensis 16-M, Br.suis 133O, Y.enterocolitica 64, 178, 383.
Экстракцию белков проводили с использованием 80% раствора ТФУ. Далее постановку метода MALDI-TOF осуществляли по схеме, согласно MP 4.2.0089-14, используя мишени MSP 96 AnchorChip.Автоматическую идентификацию проводили на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных F. tularensis. В результате установлено присутствие возбудителя в исследуемых образцах, подтверждаемое совпадением спектров экспериментальных образцов с базой данных, при отсутствии совпадения спектров с референтными спектрами гетерологичных штаммов.
Для процесса идентификации образцов, подозрительных на наличие возбудителя туляремии, в Ставропольском противочумном институте разработаны и депонированы в ФИПС следующие базы:
1. Электронная база данных «Белковые профили масс-спектры микроорганизмов I-II групп патогенности» ГР №2-16620345;
2. «ЭБД Протеомных профилей штаммов Francisella tularensis sp.holarctica, выделенных на территории природного очага туляремии в Ставропольском крае и референтных штаммов сравнения в среде программы Biotyper v. 3.0.» ГР №2019620236.
При исследовании чистых культур и небольших объемов проб получены аналогичные результаты, как с применением магнитных иммуносорбентов, так и без них.
Пример 2. Сорбент получали по методике, описанной в примере №1 с целью применения его для селективного концентрирования возбудителя туляремии на разработанном магнитном иммуносорбенте. Отличием являлось исследование проб из объектов окружающей среды.
В процессе эксперимента получены положительные результаты только при применении магнитных иммуносорбентов. Установлено, что происходило совпадение спектров экспериментальных образцов с референтными спектрами базы данных.
Выявить возбудитель туляремии из загрязненных проб объектов окружающей среды при использовании традиционного метода подготовки образцов (без использования магнитных иммуносорбентов) для масс-спектрометрических исследований не удалось.
Пример 3. Сорбент получали по методике описанной в примере 2 с целью применения его для селективного концентрирования возбудителя туляремии на разработанном магноиммуносорбенте. Отличием являлось время инкубации (30 мин) разработанных активированных туляремийных магноммуносорбентов с пробами, подозрительными на наличие возбудителя туляремии, из объектов окружающей среды. Получены результаты аналогичные примеру 2. Увеличение времени инкубации не повлияло на результат реакции.
Используемая литература
1. Bakhtiar R., Majumdar Т. Tracking problems and possible solutions in the quantitative determination of small molecule drugs and metabolites in biological fluids using liquid chromatography-mass spectrometry // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2007. V. 55. P. 262.
2. Chambers E., Wagrowski-Diehl D., Lu Z., Mazzeo J. Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses // J. Chromatogr. B. 2007. V. 852. P. 22.
3. Цимбалистова M.B., Павлович H.B., Аронова H.B., Чайка И.А., Чайка C.O., Водопьянов А.С. Масс-спектрометрический анализ природных и антиген-измененных штаммов туляремийного микроба. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (4): С. 92-96.
4. MP 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ ионизацией (MALDI-TOF MS) для индикации и идентификации возбудителей I-II групп патогенности».
5. Yadav М., Trivedi V., Upadhyay V., Shah G., S. Goswami G.A Baxi, Shrivastav S. Comparison of extraction procedures for assessment of matrix effect for selective and reliable determination of atazanavir in human plasma by LC-ESI-MS/MS // J. Chromatogr. B. 2012. V. 885. P. 138-149.
6. Кузнецова E.C., Буряк A.K. // Физикохимия поверхности и защита материалов. 2011. Т. 47. №6. С.586-593.
7. Кальной С.М., Жарникова И.В., Зайцев А.А. Способ получения магноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов // Патент РФ №2246968 A61K 39/02 G01N 33/543. Заявка №2003109118. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 27.02. 2005. Бюл. №6.
8. Кальной С.М., Жарникова И.В. Способ получения биомагноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов (варианты) // Патент РФ №2271540 С2, G01N 33/543. Заявка №2003123051. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 10.03.2006.
9. Тюменцева И.С., Курчева С.А., Афанасьев Е.Н., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Старцева О.Е., Гаркуша Ю.Ю., Семирчева А.А. Особенности пробоподготовки с использованием иммуномагнитного сорбента при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы Военно-медицинский журнал. 2018. Т. 339, №5. С. 42-46.
10. Геогджаян А.С., Жарникова И.В., Курчева С.А., Кошкидько А.Г., Гнусарева О.А., Котенева Е.А., Жарникова Т.В., Калинин А.В. Разработка эффективного способа пробоподготовки с применением магнитных сорбентов при исследовании образцов в масс-спетрометрии // Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания: матер. VI Всеросс.междисциплинарной науч.-практ.конф. с международным участием, г. Сочи, 30 окт. - 2 ноября 2019 г. Краснодар: Новация, 2019. С. 58-59.