Влияние ЭГТА на клетки Streptomyces rubiginosus Ас 836

УДК 577.15:576.8

С. В. Борисова

ВЛИЯНИЕ ЭГТА НА КЛЕТКИ Streptomyces rubiginosus Ас 836

Ключевые слова: микроорганизмы, рост, ГлИ активность, хелатирующий агент.

Исследовано влияние хелатирующего агента ЭГТА на рост и ГлИ активность штамма Streptomyces rubiginosus Ас 836. Показано воздействие ЭГТА на рост и ГлИ активность штамма Streptomyces rubiginosus Ас 836 посредством изменения транспорта Na+, K+, Са2+.

Keywords: microorganisms, growth, Gly activity, chelating agent.

The effect of the chelating agent EGTA on the growth and Gly activity strain Streptomyces rubiginosus Ac 836 have been researched. EGTA effect on the growth and Gly activity strain Streptomyces rubiginosus Ac 836 by changing the transport Na+ K+ Са2+has been shown.

Введение

В биологических процессах важная роль отводится неорганическим ионам. Накопленные в литературе данные позволяют рассматривать неорганические ионы как систему, посредством которой можно управлять клеточным метаболизмом. Потребность микроорганизмов в ионах металлов в процессе выращивания меняется. Фактором, с помощью которого можно управлять минеральным составом питательных сред являются хелатирующие агенты.

Биохимические исследования, посвященные изучению механизмов клеточной регуляции, позволили получить обширный материал о способах и путях сопряжения внешних стимулов с внутриклеточными структурами, обеспечивающими ее конечный физиологический ответ. Основой механизмов сопряжения во многих случаях являются низкомолекулярные вторичные посредники (мессенджеры), образование которых индуцируется в клетке при воздействии внешних стимулов. Повышение их внутриклеточного уровня, влияние на биохимические процессы и последующая инактивация осуществляются специальными системами. В настоящее время в качестве мессенджеров можно рассматривать цАМФ, Са2+, цГМФ, ДАГ, ИФ3 [1].

Важная роль отводится свободным Са2+ в регуляции биохимических процессов в качестве вторичного мессенджера. Известно, по меньшей мере, наличие семи систем, функционирование которых основано на механизмах, регулирующих концентрацию Са2+ в клетке [2].

Регуляция клеточного ионного гомеостаза играет первостепенную роль в метаболизме, т.к. в процессе жизнедеятельности потребность в ионах металлов в зависимости от фазы роста меняется.

В клетке присутствует множество транспортных систем, связанных с изменением внутриклеточного содержания Са2+, что приводит к изменению не только внутриклеточного содержания Са2+, но и других ионов, и, конечно же, в целом отражается на уровне ионного гомеостаза [3].

Однако следует обратить внимание на то, что известен достаточно широкий спектр хелатирующих агентов, отличающихся специфичностью по отношению к ионам металлов. С

практической точки зрения несомненный интерес может представлять этиленгликольбисдинитрил-тетрауксусная кислота (ЭГТА) - хелатирующий агент, специфичный в отношении Са2+.

Экспериментальная часть

Следует отметить, что ранее были опубликованы данные, связанные с использованием универсального хелатирующего агента ЭДТА на клетки стрептомицетов [4]. Цель же настоящей работы состояла в изучении влияния хелатирующего агента ЭГТА, способного влиять на доступность катионного состава среды, особенно Са2+, на рост биомассы и ГлИ (глюкозоизомераз-ную) активность штамма Streptomyces rubiginosus Ас 836. Исследования проводились с использованием питательных сред, приготовленных на дистиллированной воде, а добавление ЭГТА производили в период экспоненциальной фазы роста.

Результаты исследований, связанные с влиянием ЭГТА на рост и ГлИ активность штамма X rubiginosus Ас 836, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние ЭГТА на клетки штамма S. rubiginosus Ас 836

Концентрация Биомасса ГлИ активность

ЭГТА (с), г/л (х), г/л (Е), % к конт.

0,01 93±2,79 110±3,30

0,1 93±2,77 116±3,48

0,3 95±2,85 146±3,65

0,6 92±2,76 167±4,17

1,2 85±2,55 186±4,65

2,0 84±2,52 210±5,25

При добавлении в среду культивирования ЭГТА - высокоспецифичного хелатирующего агента на Са2+ - уровень биомассы стрептомицетов снижался незначительно. Так как Са2+ [5], являясь вторичным мессенджером, участвуют в регуляции множества биохимических процессов, включая и биосинтез биомассы, то пониженный по отношению к контрольным величинам и мало изменяющийся уровень биомассы в присутствии ЭГТА, очевидно, связан с тем, что извлечение даже малых концентраций Са2+ из среды существенным образом сказывается на биосинтезе белка.

ГлИ активность в присутствии ЭГТА изменялась следующим образом. С увеличением концентрации ЭГТА наблюдался монотонный рост ГлИ активности. В области малых концентраций ЭГТА (0,01-0,6 г/л) просматривалось снижение поступления Са2+ в клетки и рост ГлИ активности, то есть снижение поступления Са2+ в клетки сопровождалось увеличением ГлИ активности. Дальнейшее увеличение концентрации ЭГТА до 2,0 г/л индуцировало одновременное поглощение Са2+ клетками стрептомицетов и рост ГлИ активности, что может быть связано с усилением биосинтеза фермента ГлИ. Очевидно, что в присутствии ЭГТА регулирование поступления Са2+ в клетки и ГлИ активность связано с Са2+-зависимым фосфорилиро-ванием белков и, возможно функционированием Са2+ -зависимой полифосфоинозитольной системы.

В таблице 2 представлены данные по поступлению Са2+, №+ и К+ в клетки штамма X rubiginosus Ас 836 в присутствии различных концентраций ЭГТА.

Таблица 2 - Влияние ЭГТА на поступление Са2+, Ка+ и К+ в клетки штамма S. rubiginosus Ас 836

Концентрация ЭГТА (с), г/л Са2+, % к конт. Na+, % к конт. K+, % к конт.

0,01 105±2,62 102±2,55 130±3,25

0,1 100±2,50 105±2,62 115±2,87

0,3 85±2,12 107±2,67 92±2,30

0,6 80±2,00 109±2,73 92±2,30

1,2 120±3,12 115±2,87 120±3,00

2,0 160±4,00 138±3,45 150±3,75

Известно [1], что транспорт Са + тесно связан с транспортом других ионов. Транспорт №+, К+, Са2+ может регулироваться рядом механизмов, например посредством функционирования антипортерных систем К+/Ыа+, Н+/К+, Са2+/К+, Са2+/№+. При работе К+/№+-АТФазы количество №+ заменяется на эквивалентое количество К+ (№+ - выходит, а К+ - входит). При работе Са2+/К+, Са2+/Н+-антипортеров происходит замена одного Са2+ на два К+ или Н+, Са2+/Ма+-антипортера - на три-четыре №+.

Увеличение поглощения Са2+ в присутствии ЭГТА (0,6-2,0 г/л) сопровождалось увеличением выхода №+. Можно было бы говорить об активации

№+/Са2+-антипортера, если бы не соотношение Ca2+:Na+, равное практически 1:1, а у обменника оно составляет 1:(2-3). Это отношение может быть снижено вследствие одновременного выхода K+ из клеток, который связан с транспортом Са2+ и Na+ через Са2+/Н+, Са2+/К+, К+/Н+-антипортеры и K+/Na+-АТФазу. Увеличение входа Са2+ в клетки может быть связано с изменением потенциала на клеточной мембране [6].

В целом на регуляцию ГлИ активности оказывает влияние концентрация Са2+ во внешней среде. Кроме того, транспорт Са2+ связан с транспортом К+ и Na+. С учетом полученных результатов, активность исследуемого фермента ГлИ способна регулироваться посредством Са2+-зависимого фосфорилирования. Эта система хорошо изучена на клетках эукариот, данные же о работе транспорта Са2+ в клетках стрептомицетов достаточно скудны. В клетках эукариот все транспортные системы локализованы в мембранах (ЦПМ и внутриклеточных). Их функция тесно связана с прилегающей зоной цитозоля. Однако в клетках стрептомицетов качестве мембранной системы можно рассматривать лишь ЦПМ, и, вероятно, все процессы клеточной регуляции связаны с ней. Кроме того, содержание цитоплазмы в клеточной структуре незначительно и составляет от 5 до 40 % клеточной массы. Это позволяет говорить о том, что регуляция физиологической активности клетки за счет использования Са2+ в качестве вторичного мессенджера должна проявляться в клетках стрептомицетов достаточно ярко.

Литература

1. В.П. Кухарь, А.И. Луйек, С.Е. Могилевич и др., Химия биорегуляторных процессов. - Киев: Наук. Думка, 1991. - 368 с.

2. P. Coroni, E. Carafoli, J. Biol. Chem., 256, 9371-9373 (1981).

3. A.M. Веренников, И.И. Морахов, Транспорт ионов у клеток в культуре. - M.: Наука, 1986. - 291 с.

4. О.В. Старовойтова, С.В. Борисова, Вестн. Казан. технол. ун-та, 14, 16, 167-172 (2011).

5. Н. Rasmussen, P.Q. Barret, Physiol. Rev., 64, 3, 938-984 (1984).

6. С.Н. Орлов, Итоги науки и техники. Общие проблемы физико-химической биологии, 8, 212 (1987).

© С. В. Борисова - канд. техн. наук. доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, borsv@rambler.ru.

© S. Borisova - Candidate of Siences (Ph.D.) in Ingineering, Docent (Associated Professor) in Department of Technology of Food Productions from Faculty of Food Technology in KNRTU, borsv@rambler.ru.