АМНИОТИЧЕСКИЕ АДГЕЗИВНЫЕ КЛЕТКИ
AMNIOTIC ADHESIVE CELLS

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 61/116248, поданной 19 ноября 2009 г, содержание которой полностью включено в настоящее описание в виде ссылки.
1. Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Предоставляются новые ангиогенные клетки, выделенные из амниона, и популяции таких клеток, называемые в настоящем описании “амниотические адгезивные клетки” (AMDAC). Амниотические адгезивные клетки отличаются от ранее описанных плацентарных стволовых клеток, включая плацентарные стволовые клетки, адгезивные к пластику для тканевых культур.
2. Уровень техники
[0003] Клеточные композиции, например, композиции стволовых клеток, нашли широкое применение при лечении некоторых физиологических недостатков, например, при пересадке костного мозга. Имеется необходимость в дополнительных популяциях клеток, например, стволовых клеток или клеток-предшественников, которые обладают ангиогенным действием и/или свойствами.
3. Сущность изобретения
-
-
+
+
-
+
+
-
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
[0004] В одном из аспектов предоставляется изолированная амниотическая адгезивная клетка, также называемая в настоящем описании AMDAC, причем указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, и при этом указанная клетка представляет собой ОСТ-4 (отрицательна по ОСТ-4, также известному как POU5F1 или октамерсвязывающий белок 4) по данным полимеразной цепной реакции с использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР), например, по сравнению с соответствующей контрольной клеточной линией, такой как линия стволовых клеток эмбриональной карциномы (например, NTERA-2, например, доступная из American Type Culture Collection, ATCC номер CRL-1973), по данным ОТ-ПЦР с 30 циклами. В одном из конкретных вариантов осуществления клетки представляют собой ОСТ-4 по данным ОТ-ПЦР и VEGFR1/Flt-1 (рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста) и/или VEGFR2/KDR (рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста, также называемого рецептором вставочного киназного домена), по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления клетки представляют собой ОСТ4, по данным ОТ-ПЦР, и CD49f (интегрин-α6), по данным иммунолокализации. В конкретном варианте осуществления указанная клетка представляет собой ОСТ-4, по данным ОТ-ПЦР, и HLA-G, по данным ОТ-ПЦР. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка представляет собой ОСТ-4, по данным ОТ-ПЦР, и CD90, CD105 или CD117, по данным иммунолокализации. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка ОСТ-4 представляет собой CD90, CD105 и CD117. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка представляет собой ОСТ-4 и не экспрессирует SOX2, например, по данным ОТ-ПЦР с 30 циклами.
-
+
+
+
-
[0005] В другом варианте осуществления указанная клетка OCT-4 является одной или несколькими из: CD29, CD73, ABC-p и CD38, по данным иммунолокализации.
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
[0006] В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка OCT-4 также является одной или несколькими из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2 (рецептор ангиопротеина), TEM-7 (эндотелиальный маркер 7 опухоли), CD31, CD34, CD45, CD133, CD143 (ангиотензин-I-конвертирующий фермент, ACE), CD146 (адгезивная молекула на клетках меланомы), CXCR4 (рецептор 4 хемокина (C-X-C мотив)), по данным иммунолокализации. В другом более конкретном варианте осуществления указанная клетка представляют собой CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 и CXCR4, по данным иммунолокализации. В другом более конкретном варианте осуществления представленная амниотическая адгезивная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР; VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по данным результатам иммунолокализации; и одной или несколькими, или всеми из: CD31, CD34, CD45, CD 133 и/или Tie-2, по данным иммунолокализации. В конкретном варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка или популяция амниотических адгезивных клеток экспрессирует, по меньшей мере, на 2 log меньше ПЦР-амплифицированную мРНК для OCT-4 за, например, >20 циклов, чем NTERA-2 клетка или популяция NTERA-2 клеток с эквивалентным количеством клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка OCT-4 также представляет собой VE-кадгерин (CD 144), по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка OCT-4 к тому же является положительной по CD105 и CD200, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная OCT-4 клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF (сосудистого эндотелиального фактора роста) в течение от 4 до 21 дней.
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
[0007] В другом аспекте предоставляется изолированная амниотическая адгезивная клетка, где указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, и где указанная клетка является OCT-4 и SOX-2, по данным ОТ-ПЦР;и CD90, CD105 и CD117, по данным проточной цитометрии. В конкретных вариантах осуществления клетка OCT-4, SOX-2 также является HLA-G или CD271, по данным проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка является OCT-4, SOX-2, по результатам ОТ-ПЦР; и CD90, CD105, CD117, CD271 и HLA-G, по данным проточной цитометрии.
+
[0008] В другом аспекте предоставляется изолированная амниотическая адгезивная клетка, где указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, и где указанная клетка является положительной по CD309 (также известному как VEGFR2/KDR).
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
[0009] В другом аспекте предоставляется изолированная амниотическая адгезивная клетка, где указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, и где указанная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и одной или несколькими из: VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации. В конкретном варианте осуществления указанная клетка представляет собой OCT-4, по данным ОТ-ПЦР за, например, >20 циклов, и VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 и VE-кадгерин, по результатам иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней.
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
[0010] В другом конкретном варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка является OCT-4, CD49f, HLA-G, CD90, CD105 и CD117. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка является одной или несколькими из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 (адгезивная молекула на клетках меланомы) или CXCR4, по данным иммунолокализации или проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка является CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 и CXCR4, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка также является VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, данным иммунолокализации; и одной или несколькими из: CD31, CD34, CD45, CD133 и/или Tie-2, по результатам иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка также является VEGFR1/Flt-1, VEGFR2/KDR, CD31, CD34, CD45, CD133 и Tie-2, по данным иммунолокализации.
[0011] В другом варианте осуществления предоставляется изолированная амниотическая адгезивная клетка, где указанная клетка не экспрессирует мРНК для FGF4, IFNG, CXCL10, ANGPT4, ANGPTL3, FGA, LEP, PRL, PROK1, TNMD, FLT3, XLKD1, CDH5, LECT1, PLG, TERT, SOX2, NANOG, MMP-13, DLX5 или BGLAP, по данным ОТ-ПЦР, например, за 30 циклов. В другом варианте осуществления предоставляется изолированная амниотическая адгезивная клетка, где указанная клетка по существу не экспрессирует одно или несколько из следующего: инвариантную цепь, HLA-DR-DP-DQ, CD6, CD271, по данным проточной цитометрии.
-
+
+
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
[0012] Кроме того предоставляется изолированная популяция клеток, содержащая амниотическую адгезивную клетку. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток указанной популяции представляют собой амниотические адгезивные клетки. В одном из вариантов осуществления указанная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по результатам иммунолокализации, при этом указанная изолированная популяция клеток не является амнионом. В другом варианте осуществления предоставляется изолированная популяция клеток, содержащая амниотическую адгезивную клетку, которая представляет собой OCT-4 и HLA-G, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR1/Flt-1 или VEGFR2/KDR, по результатам иммунолокализации; и где указанная изолированная популяция клеток не является амнионом. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток указанной популяции представляют собой указанные амниотические адгезивные клетки. В другом варианте осуществления предоставляется изолированная популяция клеток, содержащая амниотическую адгезивную клетку, где указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, при этом указанная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, VEGFR1/Flt-1 и VEGFR2/KDR, по результатам иммунолокализации, причем указанная клетка также является одной или несколькими из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 или CXCR4, по данным иммунолокализации, или HLA-G, по данным ОТ-ПЦР за, например, >20 циклов, и где указанная изолированная популяция клеток не является амнионом. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции представляют собой указанные амниотические адгезивные клетки. В другом варианте осуществления предоставляется изолированная популяция клеток, содержащая амниотическую адгезивную клетку, где указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, при этом указанная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по результатам иммунолокализации, причем указанная клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней, и при этом указанная изолированная популяция клеток не является амнионом. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции являются амниотическими адгезивными клетками. В другом варианте осуществления любая из вышеуказанных популяций клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, формирует выросты (sprouts) или трубкообразные структуры при культивировании в присутствии ангиогенных факторов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), эпителиальный фактор роста (EGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF) или фактор роста фибробластов (bFGF), например, на подложке, такой как MATRIGEL™.
-
-
+
+
+
+
+
[0013] В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, где по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток указанной изолированной популяции клеток представляют собой амниотические адгезивные клетки, которые являются OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и являются положительными по VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105 или CD200. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток являются амниотическими адгезивными клетками, которые являются OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105 и CD200, согласно результатам иммунолокализации. В более конкретном варианте осуществления указанные амниотические адгезивные клетки не экспрессируют CD34, по результатам иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней. В конкретном варианте осуществления указанные амниотические адгезивные клетки являются адгезивными к пластику для тканевых культур. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток формирует выросты или трубкообразные структуры при культировании в присутствии ангиогенного фактора, такого как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), эпителиальный фактор роста (EGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF) или фактор роста фибробластов (bFGF), например, на подложке, такой как MATRIGEL™.
[0014] В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, например, человеческих клеток, где по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток представляют собой амниотические адгезивные клетки, которые экспрессируют РНК для одного или нескольких, или всех из: ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1 или VEGFR2/KDR.
[0015] В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, например, популяция амниотических адгезивных клеток или популяция клеток, где по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток представляют собой амниотические адгезивные клетки, которые экспрессируют один или несколько, или все из: CD49d, коннексин-43, HLA-ABC, бета-2-микроглобулин, CD349, CD318, PDL1, CD106, галектин-1, предшественник ADAM 17 (домен 17 дизинтегрина A и металлопротеиназы) (TNF-альфа конвертирующий фермент) (TNF-альфа конвертаза), предшественник ангиотензиногена, филамин A (альфа-филамин) (филамин 1) (эндотелиальный актин-связывающий белок) (ABP-280) (немышечный филамин), альфа-актинин 1 (цитоскелетный изоморф альфа-актинина) (немышечный альфа-актинин 1) (F-актин-связывающий белок), предшественника белка 2, родственного рецептору липопротеинов низкой плотности (мегалин) (гликопротеин 330) (gp330), скавенджер-рецептор типа I и II макрофагов (рецептор I и II ацетилированных ЛПНП в макрофагах), предшественник рецептора актинина типа IIB (ACTR-IIB), протеин Wnt-9, глиальный фибриллярный кислый белок, астроцит (GFAP), миозин-связывающий белок C сердечного типа (сердечный MyBP-C) (C-белок, сердечно-мышечный изоформ) или тяжелую цепь миозина, немышечный тип A (тяжелая цепь клеточного миозина, тип A) (тяжелая цепь-A немышечного миозина) (NMMHC-A).
[0016] В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, например, популяция амниотических адгезивных клеток или популяция клеток, где, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток представляют собой амниотические адгезивные клетки, которые секретируют один или несколько, или все из: VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, фоллистатин, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR или галектин-1, например, в культуральную среду, в которой растет клетка или клетки.
[0017] В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, например, популяция амниотических адгезивных клеток или популяция клеток, где, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток представляют собой амниотические адгезивные клетки, которые экспрессируют ангиогенные микро-РНК (миРНК) на более высоком уровне, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, где указанные миРНК содержат одну или несколько, или все из: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 и/или miR-296. В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, например, популяция амниотических адгезивных клеток или популяция клеток, где, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток представляют собой амниотические адгезивные клетки, которые экспрессируют одну или несколько, или все ангиогенные микроРНК (миРНК) на более низком уровне, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, где указанные миРНК содержат одну или несколько, или все из: miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b и/или miR-16. В некоторых вариантах осуществления AMDAC или популяции AMDAC экспрессируют одну или несколько, или все ангиогенные микроРНК: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b и/или miR-16.
2
2
[0018] В другом варианте осуществления предоставляется амниотическая ангиогенная клетка или популяция амниотических адгезивных клеток, которые экспрессируют увеличенные уровни CD202b, IL-8 и/или VEGF в условиях гипоксии (например, менее чем примерно 5% О) по сравнению с условиями с нормальным содержанием кислорода (например, примерно 20% или примерно 21% О).
+
[0019] В другом конкретном варианте осуществления изолированная популяция амниотических адгезивных клеток дополнительно содержит второй тип клетки. В конкретных вариантах осуществления AMDAC содержат по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% клеток в указанной популяции. В конкретном варианте осуществления второй тип клетки содержится или выделен из плацентарной крови, крови пуповины, необработанной ткани костного мозга или других тканей. В более конкретном варианте осуществления указанный второй тип клетки представляет собой эмбриональную стволовую клетку, клетку крови, стволовую клетку, выделенную из периферической крови, стволовую клетку, выделенную из плацентарной крови, стволовую клетку, выделенную из плацентарного перфузата, стволовую клетку, выделенную из плацентарной ткани, стволовую клетку, выделенную из крови пуповины, стволовую клетку пуповины, мезенхимальную стволовую клетку костного мозга, мезенхимальную стромальную клетку костного мозга, гематопоэтическую стволовую клетку, соматическую стволовую клетку, хондроцит, фибробласт, мышечную клетку, эндотелиальную клетку, эндотелиальную клетку-предшественник, перицит, миоцит, кардиомиоцит, миобласт, ангиобласт или кардиомиобласт. В другом конкретном варианте осуществления указанный второй тип клетки представляет собой гематопоэтическую стволовую клетку или клетку-предшественник, например, клетку CD34. В другом более конкретном варианте осуществления указанный второй тип клетки составляет по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% клеток в указанной популяции.
[0020] В другом конкретном варианте осуществления любая из вышеуказанных клеток находится в состоянии пролиферации или была размножена в культуре. В другом конкретном варианте осуществления любая из вышеуказанных клеток происходит из культуры указанных клеток, пассированной по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз, или более. В другом конкретном варианте осуществления любая из вышеуказанных клеток происходит из культуры, которая удваивалась в культуре по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или, по меньшей мере, 50 раз, или более.
[0021] В другом аспекте предоставляется композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая любую из амниотических адгезивных клеток или популяций клеток, содержащих предоставленные в данном описании амниотические адгезивные клетки. В конкретном варианте осуществления композиция представляет собой смесь или скаффолд, например, природный тканевой матрикс или скаффолд, например, постоянный или разлагаемый, бесклеточный тканевой матрикс или скаффолд; синтетический матрикс или скаффолд. В более конкретном варианте осуществления указанный матрикс или скаффолд имеет форму трубки или другую трехмерную форму или органоид. В другом более конкретном варианте осуществления указанный матрикс представляет собой бесклеточный тканевой матрикс. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит одну или несколько предоставленных изолированных амниотических адгезивных клеток или популяцию клеток, содержащую амниотические адгезивные клетки, в физиологически приемлемом растворе, например, физрастворе, культуральной среде и т.п.
[0022] В другом аспекте предоставляется способ лечения индивидуума, имеющего заболевание или нарушение сердечно-сосудистой системы, включающий введение одной или нескольких описанных в настоящем описании амниотических адгезивных клеток указанному индивидууму в количестве и в течение времени, достаточных для детектируемого улучшения одного или нескольких симптомов указанного заболевания или нарушения. В другом варианте осуществления предоставляется способ лечения индивидуума, имеющего заболевание или нарушение сердечно-сосудистой системы, включающий введение амниотических адгезивных клеток указанному индивидууму в количестве и в течение времени, достаточных для детектируемого улучшения одного или нескольких показателей сердечной функции, где указанные показатели сердечной функции представляют собой сердечный выброс (CO), сердечный индекс (CI), давление заклинивания в легочной артерии (PAWP), сердечный индекс (CI), % функции укорочения (%FS), функция выброса (EF), фракция выброса левого желудочка (LVEF); конечно-диастолический диаметр левого желудочка (LVEDD), конечно-систолический диаметр левого желудочка (LVESD), сократительная способность (dP/dt), функционирование предсердий или желудочков, увеличение эффективности накачки, уменьшение скорости падения эффективности накачки, уменьшение потери гемодинамической эффективности или уменьшение осложнений, ассоциированных с кардиомиопатией, по сравнению с показателями индивидуума до введения амниотических адгезивных клеток.
[0023] В конкретном варианте осуществления указанное заболевание или нарушение представляет собой инфаркт миокарда. В другом конкретном варианте осуществления указанное заболевание или нарушение представляет собой кардиомиопатию. В других конкретных вариантах осуществления указанное заболевание или нарушение представляет собой аневризм, ангину, стеноз аорты, аортит, аритмию, артериосклероз, артериит, ассиметричную гипертрофию перегородки (ASH), атеросклероз, фибрилляцию и мерцание предсердий, бактериальный эндокардит, синдром Барлоу (пролапс митральных клапанов), брадикардию, болезнь Брюгера (облитерирующий тромбоангиит), кардиомегалию, кардит, заболевание сонных артерий, коарктацию аорты, конгенитальные дефекты сердца, конгестивную сердечную недостаточность, болезнь коронарной артерии, синдром Эйзенменгера, эмболизм, эндокардит, эритромелалгию, фибрилляцию, фибромускулярную дисплазию, блокаду сердца, шум в сердце, гипертензию, гипотензию, идиопатический артериальный кальциноз на начальной стадии, болезнь Кавасаки (кожно-слизистый синдром лимфотического узла, кожно-слизистое заболевание лимфотического узла, начальная стадия полиартрита), метаболический синдром, микроваскулярную ангину, миокардит, пароксизмальную предсердную тахикардию (PAT), нодозный панантериит (полиартрит, узелковый полиартериит), перикардит, болезнь периферических сосудов, критическую ишемию конечностей, флебит, стеноз легочной артерии (легочный стеноз), болезнь Рейно, стеноз почечной артерии, вазоренальную гипертензию, ревматическую болезнь сердца, диабетическую васкулопатию, дефекты перегородки, безболевую ишемию, синдром X, тахикардию, артериит Такаясу, тетраду Фалло, транспозицию магистральных сосудов, атрезию трехстворчатого клапана, артериальный ствол, порок сердечного клапана, варикозные язвы, варикозное расширение вен, васкулит, дефект межжелудочковой перегородки, синдром Вольффа-Паркинсона-Уайта, открытый атриовентрикулярный канал, острую ревматическую лихорадку, острый ревматический перикардит, острый ревматический эндокардит, острый ревматический миокардит, хроническую ревматическую болезнь сердца, болезни митрального клапана, митральный стеноз, ревматическую митральную недостаточность, болезнь клапана аорты, заболевания других эндокардиальных структур, ишемическую болезнь сердца (острую и подострую), стенокардию, острую сердечно-легочную недостаточность, легочный эмболизм, хроническую сердечно-легочную недостаточность, кифосколиотическую болезнь сердца, миокардит, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, эндокардиальный фиброэластоз, атриовентрикулярную блокаду, сердечную аритмию, дегенерацию миокарда, цереброваскулярную болезнь, болезни артерий, артериол и капилляров, или болезни вен и лимфотических сосудов.
[0024] В других конкретных вариантах осуществления указанное заболевание или нарушение представляет собой окклюзию и стеноз прецеребральных артерий или окклюзию церебральных артерий. В одном из аспектов предоставляется способ лечения индивидуума с нарушением кровотока в головном мозге или в районе головного мозга, например, имеющего симптом или неврологическое расстройство, свойственное нарушению кровотока в головном мозге или в районе головного мозга или центральной нервной системы (ЦНС) индивидуума, содержащий введение указанному индивидууму терапевтически эффективное количество изолированных AMDAC. В некоторых вариантах осуществления нарушение кровотока приводит к повреждению от гипоксии или гипоксическому повреждению головного мозга или ЦНС индивидуума.
[0025] В других конкретных вариантах осуществления указанное заболевание или нарушение представляет собой окклюзию и стеноз периферических артерий. В одном из аспектов предоставляется способ лечения индивидуума с нарушением кровотока в конечности или в районе конечности, например, имеющего симптом или сосудистую недостаточность, характерную нарушению кровотока в периферической сосудистой системы индивидуума или в районе этой системы, содержащий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества изолированных AMDAC. В некоторых вариантах осуществления нарушение кровотока приводит к повреждению от гипоксии или гипоксическому повреждению конечностей или пояса конечностей индивидуума.
[0026] В некоторых аспектах предоставляется способ лечения индивидуума, страдающего от раны и травмы, включающий введение указанному индивидууму одной или нескольких описанных в данном описании амниотических адгезивных клеток в количестве и в течение времени, достаточных для детектируемого улучшения указанной раны или травмы.
[0027] В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные клетки вводят указанному индивидууму путем инъекции. В более конкретном варианте осуществления указанная инъекция представляет собой инъекцию в ишемическую область сердца индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные клетки вводят указанному индивидууму с помощью внутривенной инфузии. В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные клетки или популяцию указанных клеток, или популяцию клеток, содержащую указанные клетки, вводят указанному индивидууму путем имплантации указанному индивидууму матрикса или скаффолда, содержащего описанные выше амниотические адгезивные клетки.
[0028] Изолированные амниотические адгезивные клетки и клеточные популяции, представленные здесь, не являются изолированными плацентарными стволовыми клетками или клеточными популяциями, описанными, например, в патенте США 7255879 или публикации заявки на патент США 2007/0275362. Изолированные амниотические адгезивные клетки, представленные здесь, также не являются эндотелиальными клетками-предшественниками, амниотическими эпителиальными клетками, тромбопластами, цитотромбопластами, эмбриональными зародышевыми клетками, эмбриональными стволовыми клетками, клетками, полученными из внутренней клеточной массы эмбриона, или клетками, полученными из полового гребня эмбриона.
[0029] Используемый в настоящем описании термин “примерно” означает, например, в пределах 10% заданной цифры или значения.
[0030] Используемый в настоящем описании термин “ангиогенный”, относящийся к описанным в данном документе амниотическим адгезивным клеткам, означает, что эти клетки могут формировать сосуды или сосудоподобные выросты, или что эти клетки могут способствовать ангиогенезу (например, образованию сосудов или сосудоподобных структур) в другой популяции клеток, например, эндотелиальных клетках.
[0031] Используемый в настоящем описании термин “ангиогенез” относится к процессу образования кровеносных сосудов, который включает, без ограничений, активацию эндотелиальных клеток, миграцию, пролиферацию, ремоделирование матрикса и клеточную стабилизацию.
[0032] Используемый в настоящем описании термин “стволовая клетка” определяет функциональные свойства любой данной клеточной популяции, которая может интенсивно пролиферировать, но необязательно неограниченно, и способствовать образованию множества тканей либо во время эмбриологического развития, либо во время постнатальной замены и репарации тканей.
[0033] Используемый в настоящем описании термин “клетка-предшественник” определяет функциональные свойства любой данной клеточной популяции, которая может интенсивно пролиферировать, но необязательно неограниченно, и способствует формированию ограниченного набора множества тканей по сравнению со стволовой клеткой, либо во время эмбриологического развития, либо во время постнатальной замены и репарации тканей.
[0034] Используемый в настоящем описании термин “полученный” означает выделенный или очищенный каким-либо иным способом. Например, полученные из амниона адгезивные клетки выделяют из амниона. Термин “полученный” охватывает клетки, которые культивируют из клеток, выделенных непосредственно из ткани, например, амниона, и клетки, культивированные или размноженные из первичных изолятов.
in situ
[0035] Используемая в настоящем описании “иммунолокализация” означает детектирование соединения, например, клеточного маркера, с помощью иммунопротеина, например, антитела или его фрагмента, например, проточной цитометрией, сортировкой активированных флуоресценцией клеток, магнитной сортировкой клеток, гибридизацией , иммуногистохимией и т.п.
[0036] Используемый в настоящем описании термин “изолированная клетка” означает клетку, которую по существу отделяют от других клеток или ткани, например, амниона или плаценты, из которой получают эту клетку. Клетку “изолируют”, если, по меньшей мере, примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или, по меньшей мере, 99% клеток, с которыми стволовая клетка связана естественным образом, удаляют от других клеток, например, во время сбора и/или культивирования клетки.
[0037] Используемый в настоящем описании термин “изолированная популяция клеток” означает популяцию клеток, которую по существу отделяют от других клеток ткани, например, амниона или плаценты, из которой получают данную популяцию клеток. Клетку “изолируют”, если по меньшей мере примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или, по меньшей мере, 99% клеток, с которыми популяция клеток или клетки, из которых получают данную популяцию клеток, связана естественным образом, удаляют от данной клетки, например, во время сбора и/или культивирования амниотических адгезивных клеток.
+
-
+
[0038] Используемая в настоящем описании клетка является “положительной” по конкретному маркеру, когда такой маркер является детектируемым относительно фона, например, с помощью иммунолокализации, например, проточной цитометрии; или ОТ-ПЦР. Например, клетка описывается как положительная, например, по CD105, если CD105 является детектируемым в этой клетке в количестве, детектируемо превышающем фон (по сравнению, например, с контролем изотопа). В контексте, например, антитело-опосредованного детектирования “положительный”, как показатель конкретного маркера клеточной поверхности, означает, что маркер является детектируемым с помощью антитела, например, флуоресцентно-меченного антитела, специфического к такому маркеру; “положительный” также означает, что клетка несет такой маркер в количестве, которое генерирует сигнал, например, в цитометре, детектируемый относительно фона. Например, клетка является “CD105”, если клетка является детектируемо меченной антителом, специфическим для CD105, и сигнал от антитела детектируемо выше контроля (например, фона). Напротив, “отрицательный” в таком же контексте означает, что маркер клеточной поверхности не является детектируемым относительно фона с помощью антитела, специфического для такого маркера. Например, клетка является “CD34”, если клетка является недетектируемо меченной антителом, специфическим для CD34. Если не указано иное, маркеры кластера дифференциации (“CD”) детектируют с помощью антител. Например, OCT-4 может быть детектирован как присутствующий, и клетка является OCT-4, если мРНК для OCT-4 является детектируемой с помощью ОТ-ПЦР, например, за 30 циклов.
4. Краткое описание чертежей
[0039] На Фиг.1 показана экспрессия относящихся к стволовым клеткам генов амниотическими адгезивными клетками и клетками NTERA-2.
[0040] На Фиг.2 показана экспрессия TEM-7 на клеточной поверхности амниотических адгезивных клеток (AMDAC).
[0041] На Фиг.3 показана секреция амниотическими адгезивными клетками выбранных ангиогенных белков.
[0042] На Фиг.4 показано ангиогенное влияние среды, кондиционированной амниотическими адгезивными клетками, на формирование трубкообразных структур человеческими эндотелиальными клетками (HUVEC).
[0043] На Фиг.5 показано ангиогенное влияние среды, кондиционированной амниотическими адгезивными клетками, на миграцию человеческих эндотелиальных клеток.
[0044] На Фиг.6 показано ангиогенное влияние среды, кондиционированной амниотическими адгезивными клетками, на пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток.
[0045] На Фиг.7 показано поглощение ацетилированных ЛПНП амниотическими адгезивными клетками и HUVEC.
[0046] На Фиг.8 показано формирование трубкообразных структур амниотическими адгезивными клетками и HUVEC.
[0047] На Фиг.9 показана секреция VEGF и IL-8 амниотическими адгезивными клетками в условиях гипоксии и в условиях с нормальным содержанием кислорода.
2
2
[0048] На Фиг.10 показана экспрессия клеточного маркера Tie2 в условиях с нормальным содержанием кислорода (примерно 21% O) и в условиях гипоксии (менее примерно 5% O). Ось Y: процент клеток, положительных по Tie2, по данным проточной цитометрии.
[0049] На Фиг.11 показана эффективность дифференциации амниотических адгезивных клеток в кардиомиоцитный тип, где AM относится к амниотическим адгезивным клеткам (AMDAC), HD относится к необработанной висячей капле, HD IND относится к висячей капле в условиях индукции, и HD IND + 5-AZA относится к индукции в присутствии или отсутствии 5-азацитидина. CTRL относится к контрольной необработанной висячей капле.
[0050] На Фиг.12 показано положительное влияние AMDAC на ангиогенез на модели ангиогенеза хориоаллантоиса цыпленка. Лот 1, Лот 2, Лот 3: AMDAC из трех отдельных клеточных препаратов. bFGF: основной фактор роста фибробластов (положительный контроль). MDAMB231: линия ангиогенных клеток рака молочной железы (положительный контроль). Ось Y: степень формирования кровеносных сосудов.
[0051] На Фиг.13 показано положительное влияние AMDAC-кондиционированной среды на ангиогенез на модели ангиогенеза хориоаллантоиса цыпленка. Лот 1, Лот 2, Лот 3: AMDAC из трех отдельных клеточных препаратов. bFGF: основной фактор роста фибробластов (положительный контроль). MDAMB231: линия ангиогенных клеток рака молочной железы (положительный контроль). Ось Y: степень формирования кровеносных сосудов.
2
2
2
2
[0052] Фиг.14A, 14B: Реактивные формы кислорода, образованные пероксидом водорода, присутствующие в культурах астроцитов, сокультурах астроцитов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BM-MSC), или сокультурах астроцитов и AMDAC. 14A: AMDAC, Лот 1; 14B: AMDAC, Лот 2. Условия, в которых присутствуют только HA (человеческие астроциты), астроциты + НО, и астроциты + BM-MSC + HO, являются одинаковыми для Фиг.14A и Фиг.14B. Активность RFU ROS: единицы относительной флуоресценции для реактивных форм кислорода.
5. Подробное описание
5.1 Характеристики амниотических адгезивных клеток
[0053] Предоставляются уникальные адгезивные ангиогенные клетки и популяции таких клеток, которые могут быть выделены из амниона, называемые в настоящем описании “амниотическими адгезивными клетками” или AMDAC. На первый взгляд амниотические адгезивные клетки напоминают по внешнему виду мезенхимальные клетки, имеющие в основном фибробластоидную форму. Эти клетки прикрепляются к клеточной поверхности, например, к пластику для тканевых культур.
-
-
+
-
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
[0054] AMDAC демонстрируют клеточные маркеры, которые отличают их от других клеток, полученных из амниона или плаценты. Например, в одном из вариантов осуществления амниотическая адгезивная клетка является по данным ОТ-ПЦР OCT-4 (октамерсвязывающим белком 4). В другом конкретном варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка OCT-4 является CD49f, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная OCT-4 клетка является HLA-G, по данным ОТ-ПЦР. В другом конкретном варианте осуществления клетка OCT-4 является VEGFR1/Flt-1 (рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста) и/или VEGFR2/KDR (рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста), по результатам иммунолокализации. В конкретном варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка OCT-4 или популяция амниотических адгезивных клеток OCT-4 экспрессирует, по меньшей мере, на 2 log меньше ПЦР-амплифицированной мРНК для OCT-4 за, например, 20 циклов, чем NTERA-2 клетка или популяция NTERA-2 клеток, имеющая эквивалентное количество клеток, и за такое же количество циклов амплификации РНК. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка OCT-4 является CD90, CD105 или CD117. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка OCT-4 является CD90, CD105 и CD117. В более конкретном варианте осуществления клетка является OCT-4 или HLA-G, и к тому же является CD49f, CD90, CD105 и CD117. В более конкретном варианте осуществления клетка является OCT-4, HLA-G, CD49f, CD90, CD105 и CD117. В другом конкретном варианте осуществления клетка OCT-4 не экспрессирует SOX2, например, по данным ОТ-ПЦР за 30 циклов. Следовательно, в конкретном варианте осуществления клетка является OCT-4, CD49f, CD90, CD105 и CD117, по данным иммунолокализации или проточной цитометрии, и SOX2, по данным ОТ-ПЦР, например, за 30 циклов.
-
+
+
+
-
[0055] В другом варианте осуществления указанная клетка OCT-4 также может быть одной или несколькими из: CD29, CD73, ABC-p и CD38, по данным иммунолокализации.
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
[0056] В другом конкретном варианте осуществления, например, AMDAC OCT-4 также может быть одной или несколькими из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, TEM-7 (эндотелиальный маркер 7 опухоли), CD31, CD34, CD45, CD133, CD143 (ангиотензин-I-конвертирующий фермент, ACE), CD146 (адгезивная молекула на клетках меланомы) или CXCR4 (рецептор 4 хемокина (C-X-C мотив)), по данным иммунолокализации, или HLA-G, по результатам ОТ-ПЦР. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка является CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 и CXCR4, по данным иммунолокализации, и HLA-G, по результатам ОТ-ПЦР. В одном из вариантов осуществления амниотическая адгезивная клетка, предоставленная здесь, является одной или несколькими из: CD31, CD34, CD45 и/или CD133. В конкретном варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР; VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по данным иммунолокализации; и одной или несколькими, или всеми из: CD31, CD34, CD45 и/или CD 133.
-
+
+
[0057] В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка также является VE-кадгерин, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка также является положительной по CD105 и CD200, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 25 до 75 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней, или 50 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней. В более конкретных вариантах осуществления указанная клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75 или 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней. В других более конкретных вариантах осуществления указанная клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 7 до 14, например, 7 дней.
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
[0058] В конкретных вариантах осуществления амниотическая адгезивная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и одной или несколькими из: VE-кадгерин, VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105 и/или CD200, по данным иммунолокализации. В конкретном варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VE-кадгерин, VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105 и/или CD200, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки не экспрессируют CD34, по данным иммунолокализации, например, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней.
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
[0059] В другом варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка является OCT-4, CD49f, HLA-G, CD90, CD105 и CD117. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка является одной или несколькими из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 или CXCR4, по данным иммунолокализации. В более конкретном варианте осуществления указанная клетка является CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 или CXCR4, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка также является VEGFRl/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по данным иммунолокализации; и одной или несколькими из: CD31, CD34, CD45, CD133, и/или Tie-2, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка также является VEGFR1/Flt-1, VEGFR2/KDR, CD31, CD34, CD45, CD133, и/или Tie-2, по данным иммунолокализации.
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[0060] В другом варианте осуществления амниотическая адгезивная клетка OCT-4 также является одной или несколькими, или всеми из: CD9, CD10, CD44, CD49f, CD54, CD90, CD98, CD105, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR (CD309), по данным иммунолокализации; или также одной или несколькими, или всеми из: CD31, CD34, CD38, CD45, CD117, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G и/или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации, или SOX2, по данным ОТ-ПЦР.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[0061] В некоторых вариантах осуществления изолированные амниотические клетки, адгезивные к пластику для тканевых культур, являются CB49f. В конкретном варианте осуществления указанные CB49f клетки также являются одной или несколькими, или всеми из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD90, CD98, CD105, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFR1/Flt-1, и/или VEGFR2/KDR (CD309), по результатам иммунолокализации; или также одной или несколькими, или всеми из: CD31, CD34, CD38, CD45, CD117, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G, OCT-4 и/или VE-кадгерин, по результатам иммунолокализации, или SOX2, по данным ОТ-ПЦР.
-
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[0062] В некоторых других вариантах осуществления изолированные амниотические адгезивные клетки, адгезивные к пластику для тканевых культур, являются HLA-G, CD90 и CD117. В конкретном варианте осуществления указанные клетки HLA-G, CD90 and CD117 также являются одной или несколькими, или всеми из: CD9, CD10, CD44, CD49f, CD54, CD98, CD105, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR (CD309), по данным иммунолокализации; или также одной или несколькими, или всеми из: CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, OCT-4 и/или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации, или SOX2, по результатам ОТ-ПЦР.
[0063] В другом варианте осуществления изолированные амниотические адгезивные клетки или популяция амниотических адгезивных ангиогенных клеток по существу не экспрессирует мРНК для фактора 4 роста фибробластов (FGF4), интерферона γ (IFNG), лиганда 10 хемокина (C-X-C мотив) (CXCL10), ангиопоэтина 4 (ANGPT4), ангиопоэтин-подобного белка 3 (ANGPTL3), цепи фибриногена (FGA), лептина (LEP), пролактина (PRL), прокинетицина 1 (PROK1), теномодулина (TNMD), FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3), внеклеточного домена сцепления 1 (XLKD1), кадгерина 5, тип 2 (CDH5), хемотаксина 1 лейкоцитов (LECT1), плазминогена (PLG), теломеразной обратной транскриптазы (TERT), (области Y, определяющая пол)-блок 2 (SOX2), NANOG, матричной металлопротеиназы 13 (MMP-13), Distal-less гомеобокса 5 (DLX5) и/или костного гамма-карбоксиглутаматного (gla) белка (BGLAP), по данным ОТ-ПЦР, полученных например, за 30 циклов в стандартных условиях культивирования. В других вариантах осуществления изолированные амниотические адгезивные клетки или популяция амниотических ангиогенных клеток экспрессирует мРНК для (ARNT2), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), глиального нейротрофического фактора (GDNF), нейротрофина 3 (NT-3), NT-5, индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF1A), индуцируемого гипоксией белка 2 (HIG2), гемоксигеназы (дециклирующей) 1 (HMOX1), внеклеточной супероксиддисмутазы [Cu-Zn] (SOD3), каталазы (CAT), трансформирующего фактора роста β1 (TGFB1), рецептора трансформирующего фактора роста β1 (TGFB1R) и рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR/c-met).
[0064] В другом аспекте предоставляются изолированные популяции клеток, содержащие описанные в настоящем описании амниотические адгезивные клетки. Популяции клеток могут быть гомогенными популяциями, например, популяциями клеток, в которых, по меньшей мере, 90%, 95%, 98% или 99% клеток являются амниотическими адгезивными клетками. Популяции клеток могут быть гетерогенными популяциями, например, в которых по большей части примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% клеток в данной популяции являются амниотическими адгезивными клетками. Изолированные популяции клеток, однако, не являются тканью, например, амниотической мембраной.
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
[0065] В одном из вариантов осуществления предоставляется изолированная популяция клеток, содержащая AMDAC, например, популяция клеток по существу гомогенная по отношению к AMDAC, где указанные AMDAC являются адгезивными к пластику для тканевых культур, при этом указанные AMDAC являются OCT-4, по данным ОТ-ПЦР. В конкретном варианте осуществления AMDAC являются CD49f или HLA-G, например, по данным иммунолокализации или ОТ-ПЦР. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция AMDAC является VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по данным иммунолокализации, где указанная изолированная популяция клеток не является амнионом или амниотической мембраной. В более конкретном варианте осуществления AMDAC являются OCT-4 и/или HLA-G, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по данным иммунолокализации. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток указанной популяции представляют собой амниотические адгезивные клетки. В другом конкретном варианте осуществления указанные AMDAC являются CD90, CD105 или CD117. В более конкретном варианте осуществления указанные AMDAC являются CD90, CD105 и CD117. В более конкретном варианте осуществления AMDAC являются OCT-4, CD49f, CD90, CD105 и CD117. В другом конкретном варианте осуществления AMDAC не экспрессируют SOX2, например, по данным ОТ-ПЦР, полученным за 30 циклов. В другом более конкретном варианте осуществления популяция содержит AMDAC, где указанные AMDAC являются OCT-4, HLA-G, CD49f, CD90, CD105 и CD117, по данным иммунолокализации или проточной цитометрии, и SOX2, например, например, по данным ОТ-ПЦР за 30 циклов.
+
+
-
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
[0066] В другом конкретном варианте осуществления указанные AMDAC в указанной популяции клеток являются CD90, CD105 или CD117, по данным иммунолокализации или проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления AMDAC являются CD90, CD105 и CD117, по данным иммунолокализации или проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления AMDAC являются OCT-4 или HLA-G, например, по данным ОТ-ПЦР, а также CD49f, CD90, CD105 и CD117, по данным иммунолокализации или проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления AMDAC в указанной популяции клеток являются OCT-4, HLA-G, CD49f, CD90, CD105 и CD117. В другом конкретном варианте осуществления AMDAC не экспрессируют SOX2, например, по результатам ОТ-ПЦР, полученным за 30 циклов. Следовательно, в более конкретном варианте осуществления клетка является OCT-4, CD49f, CD90, CD105 и CD117, по данным иммунолокализации или проточной цитометрии, и SOX2, по данным ОТ-ПЦР, например, за 30 циклов. В более конкретном варианте осуществления AMDAC являются OCT-4 или HLA-G, а также CD49f, CD90, CD105 и CD117. В более конкретном варианте осуществления AMDAC являются OCT-4, HLA-G, CD49f, CD90, CD105 и CD 117.
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
[0067] В другом варианте осуществления амниотические адгезивные клетки в указанной популяции клеток являются адгезивными к пластику для тканевых культур, OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по данным иммунолокализации, а также одной или несколькими из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 или CXCR4, по данным иммунолокализации, или HLA-G, по данным ОТ-ПЦР, причем указанная изолированная популяция клеток не является амнионом. В другом варианте осуществления предоставляется изолированная популяция клеток, содержащая амниотическую адгезивную клетку, где указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, причем указанная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR1/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR, по данным иммунолокализации, при этом указанная клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней, и при этом указанная изолированная популяция клеток не является амнионом. В конкретном варианте из любого из вышеуказанных вариантов осуществления по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток указанной популяции являются указанными амниотическими адгезивными клетками.
[0068] В другом варианте осуществления, любая из вышеуказанных популяций клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, формирует выросты или трубообразные структуры при культивировании в присутствии внеклеточного матричного белка, например, подобного коллагену типа I и IV, или ангиогенного фактора, например, подобного сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF), эпителиальному фактору роста (EGF), фактору роста тромбоцитов (PDGF) или основному фактору роста фибробластов (bFGF), например, внутри подложки или на ней, такой как плацентарный коллаген или, например MATRIGEL™, в течение, по меньшей мере, от 4 дней и до 14 дней.
[0069] Амниотические адгезивные клетки и популяции амниотических адгезивных клеток демонстрируют характерную экспрессию белков, относящихся к генам, имеющих отношение к ангиогенезу или кардиомиогенезу. В некоторых вариантах осуществления предоставляется клетка, которая экспрессирует, или популяция клеток, в которой по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток являются амниотическими адгезивными клетками, которые экспрессируют РНК для одного или нескольких из: ACTA2 (актин, альфа 2, гладкая мускулатура, аорта), ADAMTS1 (ADAM мотив типа 1 металлопептидазы с тромбоспондином, 1), AMOT (ангиомотин), ANG (ангиогенин), ANGPT1 (ангиопоэтин 1), ANGPT2, ANGPTL1 (ангиопоэтиноподобный белок 1), ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1 (ингибитор ангиогенеза 1, специфичный для головного мозга), CD44, CD200, CEACAM1 (молекула клеточной адгезии, относящаяся к карциноэмбриональному антигену-1), CHGA (хромогранин A), COL15A1 (коллаген, тип XV, альфа 1), COL18A1 (коллаген, тип XVIII, альфа 1), COL4A1 (коллаген, тип IV, альфа 1), COL4A2 (коллаген, тип IV, альфа 2), COL4A3 (коллаген, тип IV, альфа 3), CSF3 (колониестимулирующий фактор 3 (гранулоцит), CTGF (фактор роста соединительной ткани), CXCL12 (лиганд 12 (стромальный клеточный фактор 1) хемокин (CXC мотив)), CXCL2, DNMT3B (DNA (цитозин-5-)-метилтрансфераза 3 бета), ECGF1 (тимидинфосфорилаза), EDG1 (ген 1 дифференциации эндотелиальных клеток), EDIL3 (EGF-подобные повторы и дискоидин I-подобные домены 3), ENPP2 (эктонуклеотид пирофосфатаза/фосфодиэстераза 2), EPHB2 (EPH рецептор B2), FBLN5 (FIBULIN 5), F2 (фактор II коагуляции (тромбин)), FGF1 (кислый фактор роста фибробластов), FGF2 (основной фактор роста фибробластов), FIGF (c-fos индуцируемый фактор роста (сосудистый эпителиальный фактор роста D)), FLT4 (fms-тирозинкиназа 4), FN1 (фибринонектин 1), FST (фоллистатин), FOXC2 (Forkhead блок C2 (MFH-1, Forkhead 1 мезенхимы)), GRN (гранулин), HGF (фактор роста гепатоцитов), HEY1 (мотив 1 YRPW с родственным hairy/enhancer-of-split), HSPG2 (гепаран сульфат протеогликан 2), IFNB1 (интерферон, бета 1, фибробласт), IL8 (интерлейкин 8), IL12A, ITGA4 (интегрин, альфа 4; CD49d), ITGAV (интегрин, альфа V), ITGB3 (интегрин, бета 3), MDK (мидкин), MMP2 (матричная металлопротеаза 2), MYOZ2 (миозенин 2), NRP1 (нейропилин 1), NRP2, PDGFB (фактор роста β тромбоцитов), PDGFRA (рецептор α фактора роста тромбоцитов), PDGFRB, PECAM1 (тромбоцитарная/эндотелиальная молекула клеточной адгезии), PF4 (фактор 4 тромбоцитов), PGK1 (фосфоглицераткиназа 1), PROX1 (гомеобокс 1 prospero), PTN (плейотропин), SEMA3F (семофорин 3F), SERPINB5 (ингибитор серпин-пептидазы, clade В (овальбумин), член 5), SERPINC1, SERPINF1, TIMP2 (тканевой ингибитор металлопротеиназы 2), TIMP3, TGFA (трансформирующий фактор роста, альфа), TGFB1, THBS1 (тромбоспондин 1), THBS2, TIE1 (с тирозинкиназной активностью иммуноглобулин-подобные и EGF-подобные домены 1), TIE2/TEK, TNF (фактор некроза опухоли), TNNI1 (тропонин I, тип 1), TNFSF15 (суперсемейство фактора некроза опухоли (лиганд), член 15), VASH1 (вазогибин 1), VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1 (рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста) и/или VEGFR2/KDR.
[0070] В случае использования человеческих клеток обозначения гена по всему тексту относятся к человеческим последовательностям, и, как хорошо известно специалисту в данной области, репрезентативные последовательности могут быть найдены в литературе или в банке данных GenBank. Зонды для этих последовательностей могут быть определены с помощью последовательностей, которые можно найти в общедоступных или коммерческих источниках, например, специфичные зонды TAQMAN или матрицы Angiogenesis TAQMAN (Applied Biosystems, part no. 4378710).
[0071] Амниотические адгезивные клетки и популяции амниотических адгезивных клеток демонстрируют характерную экспрессию белков, имеющих отношение к ангиогенезу. В некоторых вариантах осуществления предоставляется клетка, которая экспрессирует, или популяция клеток, в которой по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клее,3ток в указанной изолированной популяции клеток представляют собой амниотические адгезивные клетки, которые экспрессируют CD49d, коннексин-43, HLA-ABC, бета-2-микроглобулин, CD349, CD318, PDL1, CD106, галектин-1, предшественник 17 ADAM (домен 17 дизинтегрина А и металлопротеиназы) (TNF-альфа конвертирующий фермент) (TNF-альфа конвертаза), предшественник ангиотензиногена, филамин A (альфа-филамин) (филамин 1) (эндотелиальный актин-связывающий белок) (ABP-280) (немышечный филамин), альфа-актинин 1 (цитоскелетный изоформ альфа-актинина) (немышечный альфа-актинин 1) (F-актин связывающий белок), предшественник белка 2, родственного рецептору липопротеина низкой плотности (мегалин) (гликопротеин 330) (gp330), скавенджер-рецептор типа I и II макрофагов (рецептор I и II ацетилированных ЛПНП в макрофагах), предшественник рецептора актинина типа IIB (ACTR-IIB), белок Wnt-9, глиальный фибриллярный кислый белок, астроцит (GFAP), миозин-связывающий белок C сердечного типа (сердечный MyBP-C) (C-белок, сердечно-мышечный изоформ) и/или тяжелую цепь миозина, немышечный тип A (тяжелая цепь клеточного миозина, тип A) (тяжелая цепь-A немышечного миозина) (NMMHC-A).
[0072] Предлагаемые амниотические адгезивные клетки дополнительно секретируют белки, которые способствуют ангиогенезу, например, в эндотелиальных клетках, эндотелиальных клетках-предшественниках и т.п. В некоторых вариантах осуществления амниотические адгезивные клетки, популяция амниотических адгезивных клеток или популяция клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, например, в которой, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток являются амниотическими адгезивными клетками, секретирует одно или несколько, или все из: VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, фоллистатин, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, галектин-1, например, в культуральную среду, в которой данная клетка или клетки растут.
[0073] В других вариантах осуществления любая из вышеуказанных популяций клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, может вызывать формирование выростов (sprouts) или трубкообразных структур в популяции эндотелиальных клеток при контакте с указанными амниотическими адгезивными клетками. В одном из конкретных вариантов осуществления амниотические адгезивные клетки культивируют совместно с человеческими эндотелиальными клетками, формирующими выросты или трубкообразные структуры, или поддерживающие выросты эндотелиальных клеток, например, при культивировании в присутствии внеклеточных матричных белков, таких как коллаген типа I и IV, и/или ангиогенных факторов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), эпителиальный фактор роста (EGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF) или основной фактор роста фибробластов (bFGF), например, в подложке или на ней, такой как плацентарный коллаген или MATRIGEL™ в течение, по меньшей мере, 4 дней и/или до 14 дней.
[0074] В другом варианте осуществления любая из вышеуказанных популяций клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, секретирует ангиогенные факторы, такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), эпителиальный фактор роста (EGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) или интерлейкин-8 (IL-8), и таким образом может индуцировать формирование у человеческих эндотелиальных клеток выростов или трубкообразных структур при культивировании в присутствии внеклеточных матричных белков, таких как коллаген типа I и IV, например, в подложке или на ней, такой как плацентарный коллаген или MATRIGEL™.
[0075] В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, например, популяция амниотических адгезивных клеток или популяция клеток, в которой, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток являются амниотическими адгезивными клетками, которые экспрессируют ангиогенные микроРНК (миРНК) на более высоком уровне, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, причем указанные миРНК содержат одну или некоторые, или все из: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 и/или miR-296. В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, например, популяция амниотических адгезивных клеток или популяция клеток, в которой по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной изолированной популяции клеток являются амниотическими адгезивными клетками, которые экспрессируют одну или несколько или все из ангиогенных микро РНК (миRNA) на более низком уровне, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, причем указанные миРНК содержат одну или некоторые, или все из: miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b и/или miR-16. В некоторых вариантах осуществления AMDAC или популяция AMDAC экспрессирует одну или некоторые, или все из ангиогенных миРНК: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, (члены кластера 17-92 ангиогенных миРНК), miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b и/или miR-16.
-
+
-
+
+
-
-
+
-
+
+
-
2
2
2
2
[0076] Таким образом, в одном из вариантов осуществления предоставляется изолированная амниотическая адгезивная клетка, где указанная клетка является адгезивной к пластику для тканевых культур, при этом указанная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и CD49f, HLA-G, CD90, CD105 и CD117, по данным иммунолокализации, и при этом указанная клетка: (a) экспрессирует один или несколько из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRl/Flt-1 или VEGFR2/KDR (CD309), по данным иммунолокализации; (b) не экспрессирует CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации, или не экспрессирует SOX2, по данным ОТ-ПЦР; (c) экспрессирует мРНК для ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1 или VEGFR2/KDR; (d) экспрессирует один или несколько из следующих белков: CD49d, коннексин-43, HLA-ABC, бета-2-микроглобуллин, CD349, CD318, PDL1, CD106, галектин-1, ADAM 17, предшественник ангиотензиногена, филамин A, альфа-актинин 1, мегалин, рецептор I и II ацетилированных ЛПНП в макрофагах, предшественник рецептора активина типа IIB, белок Wnt-9, глиальный фибриллярный кислый белок, астроцит, миозин-связывающий белок C или тяжелую цепь миозина, немышечный тип A; (e) секретирует: VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, фоллистатин, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR или галектин-1 в культуральной среде, в которой растет клетка; (f) экспрессирует микроРНК: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 или miR-296 на более высоком уровне, чем эквивалентное количество мезенхимальных стволовых клеток костного мозга; (g) экспрессирует микроРНК: miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b или miR-16 на более низком уровне, чем эквивалентное количество мезенхимальных стволовых клеток костного мозга; (h) экспрессирует миРНК: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b или miR-16; и/или (i) экспрессирует повышенный уровень CD202b, IL-8 или VEGF при культивировании при менее чем примерно 5% О по сравнению с экспрессией CD202b, IL-8 или VEGF при 21% O. В одном из конкретных вариантов осуществления изолированная амниотическая адгезивная клетка является OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и CD49f, HLA-G, CD90, CD105 и CD117, по данным иммунолокализации, и (a) экспрессирует: CD9, CD10, CD44, CD54, CD90, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRl/Flt-1 и/или VEGFR2/KDR (CD309), по данным иммунолокализации; (b) не экспрессирует: CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G и/или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации, или не экспрессирует SOX2, по результатам ОТ-ПЦР; (c) экспрессирует мРНК для: ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLN5, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLT4, FN1, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1 и/или VEGFR2/KDR; (d) экспрессирует один или несколько из: CD49d, коннексин-43, HLA-ABC, бета-2-микроглобулин, CD349, CD318, PDL1, CD106, галектин-1, ADAM 17, предшественник ангиотензиногена, филамин A, альфа-актинин 1, мегалин, рецептор I и II ацетилированных ЛПНП в макрофагах, предшественник рецептора активина типа IIB, белок Wnt-9, глиальный фибриллярный кислый белок, астроцит, миозин-связывающий белок C и/или тяжелая цепь миозина, немышечный тип A; (e) секретирует: VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, фоллистин, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR и/или галектин-1, например, в культуральной среде, в которой растет клетка; (f) экспрессирует микро РНК: miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 и/или miR-296 на более высоком уровне, чем эквивалентное количество мезенхимальных стволовых клеток костного мозга; (g) экспрессирует микро РНК: miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b и/или miR-16 на более низком уровне, чем эквивалентное количество мезенхимальных стволовых клеток костного мозга; (h) экспрессирует миРНК: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b и/или miR-16; и/или (i) экспрессирует повышенный уровень CD202b, IL-8 и/или VEGF при культивировании при менее чем 5% О по сравнению с экспрессией CD202b, IL-8 и/или VEGF при 21% O. Также предоставляются популяции клеток, содержащие AMDAC, например, популяции AMDAC, имеющие одну или несколько из вышеуказанных характеристик.
in vitro
[0077] В другом варианте осуществления любая из вышеуказанных популяций клеток, содержащих амниотические адгезивные клетки, секретирует ангиогенные факторы. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток секретирует сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), эпителиальный фактор роста (EGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и/или интерлейкин-8 (IL-8). В других конкретных вариантах осуществления популяция клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, секретирует один или несколько ангиогенных факторов и таким образом индуцирует миграцию человеческих эндотелиальных клеток в испытаниях  по заживлению ран. В других конкретных вариантах осуществления популяция клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, индуцирует созревание, дифференцировку или пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток, эндотелиальных клеток-предшественников, миоцитов или миобластов.
[0078] В другом варианте осуществления любая из вышеуказанных популяций клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, поглощает ацетилированные липопротеины низкой плотности (ЛПНП) при культивировании в присутствии внеклеточных матричных белков, например, коллагена типа I или IV, и/или одного или нескольких ангиогенных факторов, например, VEGF, EGF, PDGF или bFGF, например, на подложке, такой как плацентарный коллаген или MATRIGEL™.
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
[0079] В другом варианте осуществления предоставляется популяция клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, в которой указанные клетки являются адгезивными к пластику для тканевых культур, причем указанные клетки являются OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации. В конкретных вариантах осуществления, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой амниотические клетки, которые являются OCT-4, по результатам ОТ-ПЦР, и VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции представляют собой амниотические клетки, которые являются OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 и VE-кадгерин, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки, которые являются OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации, не экспрессируют CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дней. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки также являются VE-кадгерин.
-
+
+
+
+
+
-
[0080] Предоставляемые популяции клеток, содержащие амниотические адгезивные клетки, способны к формированию выростов или трубкообразных структур, аналогичных сосудам или сосудистой сети. В другом варианте осуществления популяции клеток, содержащие амниотические адгезивные клетки, формируют выросты или трубкообразные структуры при культивировании в присутствии ангиогенного вещества, например, VEGF, EGF, PDGF или bFGF. В более конкретном варианте осуществления указанные амниотические адгезивные клетки, которые являются OCT-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 или VE-кадгерин, по данным иммунолокализации, формируют выросты или трубкообразные структуры, когда указанную популяцию клеток культивируют в присутствии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF).
-5
-15
-2
-10
-9
-4
[0081] Описанные в данном документе амниотические адгезивные клетки демонстрируют указанные выше характеристики, например, профили комбинации маркеров клеточной поверхности и/или экспрессии генов, и/или ангиогенную активность и функцию в первичной культуре или во время пролиферации в среде, подходящей для культивирования стволовых клеток. Такая среда включает, например, среду, содержащую от 1 до 100% DMEM-LG (Gibco), от 1 до 100% MCDB-201 (Sigma), от 1 до 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Hyclone Laboratories), от 0,1 до 5x смеси инсулина, трансферрина и селена (ITS, Sigma), от 0,1 до 5x смеси линоленовой кислоты, бычьей сыворотки и альбумина (LA-BSA, Sigma), от 10 до 10 M дексаметазона (Sigma), 10 до 10 M аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma), от 1 до 50 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), (R&D Systems), от 1 до 50 нг/мл фактора роста тромбоцитов (PDGF-BB) (R&D Systems) и 100 Ед. пенициллина/1000 Ед. стрептомицина. В конкретном варианте осуществления среда содержит 60% DMEM-LG (Gibco), 40% MCDB-201 (Sigma), 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Hyclone Laboratories), 1x смеси инсулина, трансферрина и селена (ITS), 1x смеси линоленовой кислоты, бычьей сыворотки и альбумина (LA-BSA), 10 M дексаметазона (Sigma), 10 M аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (R&D Systems), 10 нг/мл фактора роста тромбоцитов (PDGF-BB) (R&D Systems) и 100 Ед. пенициллина/1000 Ед. стрептомицина. Другие подходящие среды описаны ниже.
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
[0082] Предоставляемая изолированная популяция амниотических адгезивных клеток может содержать примерно, по меньшей мере или не более чем примерно, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или более амниотических адгезивных клеток, например, в контейнере. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток в представленной изолированной клеточной популяции являются амниотическими адгезивными клетками. А именно, популяция изолированных амниотических адгезивных клеток может содержать, например до 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% нестволовых клеток.
[0083] Представленные амниотические адгезивные клетки могут быть культивированы на подложке. В различных вариантах осуществления подложка может представлять собой любую поверхность, на которой можно выполнять культивирование и/или отбор амниотических адгезивных клеток. Как правило, подложка представляет собой пластик, например, чашку для тканевых культур или пластиковый многолуночный планшет. Пластик для тканевых культур может быть обработан, покрыт или мечен биомолекулой или синтетическим агентом-миметиком, например, CELLSTART™, MESENCULT™ ACF-подложка, орнитином или полилизином, или внеклеточным матричным белком, например, коллагеном, ламинином, фибронектином, витронектином и т.п.
[0084] Амниотические адгезивные клетки, например, представленные в данном описании амниотические адгезивные клетки и популяции таких клеток могут быть выделены из одной или более плацент. Например, представленная в данном описании изолированная популяция амниотических клеток может представлять собой популяцию плацентарных клеток, содержащую такие клетки, полученные, или содержащиеся в разрушенной ткани амниона, например, дигестате (т.е., наборе клеток, полученных с помощью ферментативного расщепления амниона), где указанная популяция клеток обогащена амниотическими клетками, и где ткань получена из одной плаценты или двух или более плацент. Изолированные амниотические клетки могут быть культивированы и размножены для получения популяций таких клеток. Популяции плацентарных клеток, содержащие амниотические адгезивные клетки, также могут быть культивированы и размножены для получения популяций амниотических адгезивных клеток.
[0085] В некоторых вариантах осуществления AMDAC, демонстрирующие любую из вышеуказанных характеристик маркеров и/или экспрессии гена, были пассированы, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз или более. В других некоторых вариантах осуществления AMDAC, демонстрирующие любую из вышеуказанных характеристик маркеров и/или экспрессии гена, были удвоены в культуре по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или по меньшей мере 50 раз или более.
5.2 Популяции амниотических адгезивных клеток, содержащие другие типы клеток
[0086] Изолированные клеточные популяции, содержащие описанные в данном описании амниотические адгезивные клетки, могут содержать второй тип клеток, например, плацентарные клетки, которые не являются амниотическими адгезивными клетками, или, например, клетки, которые не являются плацентарными клетками. Например, изолированная популяция амниотических адгезивных клеток может содержать, например, может быть объединена с популяцией второго типа клеток, где указанный второй тип клеток представляет собой, например, эмбриональные стволовые клетки, клетки крови (например, кровь плаценты, клетки крови плаценты, кровь пуповины, клетки крови пуповины, периферическую кровь, клетки периферической крови, ядросодержащие клетки крови плаценты, крови пуповины или периферической крови, и т.п.), стволовые клетки, выделенные из крови (например, стволовые клетки, выделенные из крови плаценты, крови пуповины или периферической крови), плацентарные стволовые клетки (например, плацентарные стволовые клетки, описанные в патенте США 7468276 и в публикации заявки на патент США 2007/0275362, раскрытие которых включено в настоящее описание во всей полноте в качестве ссылки), ядросодержащие клетки из перфузата плаценты, например, общую популяцию ядросодержащих клеток перфузата плаценты; стволовые клетки пуповины, популяции ядросодержащих клеток крови, мезенхимальные стромальные клетки костного мозга, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, гематопоэтические стволовые клетки костного мозга, общую популяцию стволовых (соматических) взрослых клеток костного мозга, популяции стволовых клеток, содержащиеся в ткани, культивированные клетки, например, культивированные стволовые клетки, популяции полностью дифференцированных клеток (например, хондроциты, фибробласты, амниотические клетки, остеобласты, мышечные клетки, клетки сердечно-сосудистой системы и т.д.), перициты и т.п. В конкретном варианте осуществления популяция клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, содержит плацентарные стволовые клетки или стволовые клетки пуповины. В некоторых вариантах осуществления, где второй тип клеток представляет собой кровь или клетки крови, из данной популяции клеток удалены эритроциты.
+
+
[0087] В конкретном варианте осуществления второй тип клетки представляет собой гематопоэтическую стволовую клетку. Такие гематопоэтические стволовые клетки могут, например, содержаться в необработанной плацентарной крови, крови пуповины или периферической крови; в общей совокупности ядросодержащих клеток плацентарной крови, крови пуповины или периферической крови; в изолированной популяции CD34 клеток плацентарной крови, крови пуповины или периферической крови; в необработанном костном мозге; в общей совокупности ядросодержащих клеткок костного мозга; в изолированной популяции CD34 клеток костного мозга и т.п.
[0088] В другом варианте осуществления изолированная популяция амниотических адгезивных клеток объединена с множеством взрослых клеток или клеток-предшественников сосудистой системы. В различных вариантах осуществления клетки представляют собой эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки-предшественники, миоциты, кардиомиоциты, перициты, ангиобласты, миобласты или кардиомиобласты.
[0089] В другом варианте осуществления второй тип клеток представляет собой клетки неэмбрионального типа, выращенные в культуре для экспрессии маркеров плюрипотентности и функций, ассоциированных с эмбриональными стволовыми клетками.
[0090] В конкретных вариантах осуществления вышеуказанные изолированные популяции амниотических адгезивных клеток, любые из двух или обе вместе, амниотические адгезивные клетки и клетки второго типа, являются аутологичными или аллогенными по отношению к реципиенту этих клеток.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
[0091] Кроме того, предоставляется композиция, содержащая амниотические адгезивные клетки и множество стволовых клеток, которые отличаются от амниотических адгезивных клеток. В конкретном варианте осуществления композиция содержит стволовую клетку, которая получена из плаценты, т.е., плацентарную стволовую клетку, например, плацентарную стволовую клетку, описанную в патентах США 7045148; 7255879; и 7311905, и в публикации заявки на патент США 2007/0275362, раскрытие которых включено в настоящее описание во всей полноте в качестве ссылки. В конкретных вариантах осуществления указанные плацентарные стволовые клетки представляют собой CD200 и HLA-G; CD73, CD105 и CD200; CD200 и OCT-4; CD73, CD105 и HLA-G; CD73 и CD105 и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанную клетку, когда указанную популяцию культивируют в условиях, которые позволяют формировать эмбриоид-подобные тельца; или OCT-4 и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей стволовую клетку, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих формировать эмбриоид-подобные тельца; или любую их комбинацию. В более конкретном варианте осуществления указанные CD200, HLA-G стволовые клетки являются CD34, CD38, CD45, CD73 и CD105. В другом более конкретном варианте осуществления указанные CD73, CD105 и CD200 стволовые клетки являются CD34, CD38, CD45 и HLA-G. В другом более конкретном варианте осуществления указанные CD200, OCT-4 стволовые клетки являются CD34, CD38, CD45, CD73, CD105 и HLA-G. В другом конкретном варианте осуществления указанные CD73, CD105 и HLA-G стволовые клетки представляют собой CD34, CD45, OCT-4 и CD200. В другом более конкретном варианте осуществления указанные CD73 и CD105 стволовые клетки являются OCT-4, CD34, CD38 и CD45. В другом более конкретном варианте осуществления указанные OCT-4 стволовые клетки являются CD73, CD105, CD200, CD34, CD38 и CD45. В другом более конкретном варианте осуществления плацентарные стволовые клетки являются по происхождению материнскими (т.е., имеют материнский генотип). В другом конкретном варианте осуществления плацентарные стволовые клетки являются клетками зародыша по происхождению (т.е., имеют генотип зародыша).
[0092] В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит амниотические адгезивные клетки и эмбриональные стволовые клетки. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит амниотические адгезивные клетки и мезенхимальные стромальные или стволовые клетки, например, мезенхимальные стромальные или стволовые клетки костного мозга. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит гематопоэтические стволовые клетки костного мозга. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит амниотические адгезивные клетки и гематопоэтические клетки-предшественники, например, гематопоэтические клетки-предшественники костного мозга, фетальной крови, крови пуповины, крови плаценты и/или периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит амниотические адгезивные клетки и соматические стволовые клетки. В другом более конкретном варианте осуществления указанная соматическая стволовая клетка представляет собой нейрональную стволовую клетку, стволовую клетку печени, стволовую клетку поджелудочной железы, эндотелиальную стволовую клетку, сердечную стволовую клетку или мышечную стволовую клетку.
[0093] В других конкретных вариантах осуществления второй тип клеток составляет примерно, по меньшей мере или более чем 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% клеток в указанной популяции. В другом конкретном варианте осуществления AMDAC в указанной композиции составляет, по меньшей мере, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% клеток указанной композиции. В других конкретных вариантах осуществления амниотические адгезивные клетки составляют примерно, по меньшей мере или более чем 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 45% клеток в указанной популяции.
[0094] Клетки в изолированной популяции амниотических адгезивных клеток могут быть объединены с множеством клеток другого типа, например, с популяцией стволовых клеток, в отношении примерно 100000000:1, 50000000:1, 20000000:1, 10000000:1, 5000000:1, 2000000:1, 1000000:1, 500000:1, 200000:1, 100000:1, 50000:1, 20000:1, 10000:1, 5000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1000; 1:2000; 1:5000; 1:10000; 1:20000; 1:50000; 1:100000; 1:500000; 1:1000000; 1:2000000; 1:5000000; 1:10000000; 1:20000000; 1:50000000; или примерно 1:100000000, содержащей количество всех ядросодержащих клеток в каждой популяции. Клетки в изолированной популяции амниотических адгезивных клеток могут быть также объединены с множеством клеток множества типа клеток.
5.3 Рост в культуре
[0095] Выращивание описанных в данном документе амниотических адгезивных клеток, как и любой клетки млекопитающего, отчасти зависит от конкретной среды, выбранной для роста. В оптимальных условиях, амниотические адгезивные клетки обычно удваиваются в количестве примерно за 24 часа. Во время культивирования описанные в данном описании амниотические адгезивные клетки прикрепляются к подложке в культуре, например, к поверхности контейнера для тканевых культур (например, пластику чашки для тканевых культур, пластику, покрытому фибронектином и т.п.) и формируют монослой. Клетки обычно образуют культуру в течение 2-7 дней после разрушения амниона. Они пролиферируют путем примерно 0,4-1,2 удвоений популяции в сутки, и могут перенести по меньшей мере 30-50 удвоений популяции. Данные клетки демонстрируют фенотип, подобный клеткам мезенхимы/фибробластов до момента смыкания монослоя и во время экспрессии, и выглядят наподобие кубовидной/крупной гальки при конфлюенсе, и в культуре происходит сильное контактное ингибирование пролиферации. Во время размножения в культуре популяции амниотических адгезивных клеток могут формировать эмбриоидные тельца.
5.4 Способы получения амниотических адгезивных клеток
[0096] Амниотические адгезивные клетки и популяции клеток, содержащие амниотические адгезивные клетки, могут быть получены, например, изолированы от других клеток или популяций клеток, например, с помощью конкретных способов расщепления ткани амниона необязательно с последующим анализом полученных клеток или популяции клеток на наличие или отсутствие маркеров или комбинации маркеров, характеристик амниотических адгезивных клеток, или путем получения амниотических клеток и отбора на основе маркеров, характерных для амниотических адгезивных клеток.
[0097] Предоставляемые амниотические адгезивные клетки и изолированные популяции клеток, содержащие амниотические адгезивные клетки, могут быть получены, например, расщеплением амниотической ткани с последующим отбором адгезивных клеток. В одном из вариантов осуществления, например, изолированные амниотические адгезивные клетки или изолированная популяция клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, может быть получена путем (1) расщепления амниотической ткани первым ферментом для отделения клеток эпителиального слоя амниона от клеток мезенхимального слоя амниона; (2) последующего расщепления мезенхимального слоя амниона вторым ферментом для формирования одноклеточной суспензии; (3) культивирования клеток в указанной одноклеточной суспензии на поверхности для тканевой культуры, например, пластике для тканевой культуры; и (4) отбора клеток, которые прикреплены к указанной поверхности после замены среды, таким образом получая изолированную популяцию клеток, содержащую амниотические адгезивные клетки. В конкретном варианте осуществления указанный первый фермент представляет собой трипсин. В более конкретном варианте осуществления указанный трипсин используется в концентрации 0,25% трипсина (мас./об.) в 5-20, например, 10 мл раствора на 1 грамм расщепляемой амниотической ткани. В другом более конкретном варианте осуществления указанное расщепление трипсином можно проводить в течение примерно 15 минут при 37°C и повторять ее до трех раз. В другом конкретном варианте осуществления указанный второй фермент представляет собой коллагеназу. В более конкретном варианте осуществления указанная коллагеназа используется в концентрации от 50 до 500 Ед./л в 5 мл на 1 грамм расщепляемой амниотической ткани. В другом более конкретном варианте осуществления указанное расщепление коллагеназой можно проводить в течение примерно 45-60 минут при 37°C. В другом конкретном варианте осуществления образованную одноклеточную суспензию после расщепления коллагеназой фильтруют через, например, 75 мкM-150 мкМ фильтр между стадией (2) и стадией (3). В другом конкретном варианте осуществления указанный первый фермент представляет собой трипсин, а указанный второй фермент представляет собой коллагеназу.
-
[0098] В другом варианте осуществления изолированная популяция клеток, содержащая амниотические адгезивные клетки, может быть получена путем выбора клеток из амниона, например, клеток, полученных расщеплением ткани амниона, как описанно в настоящем описании, которые демонстрируют одну или несколько характеристик амниотической адгезивной клетки. В одном из вариантов осуществления, например, клеточную популяцию получают способом, содержащим выбор амниотических клеток, которые являются (a) негативными по ОСТ-4, по данным ОТ-ПЦР, и (b) положительными по одному или нескольким из: VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200, по данным иммунолокализации; и изолирование указанных клеток от других клеток для формирования клеточной популяции. В конкретном варианте осуществления указанные амниотические клетки также являются VE-кадгерин. В конкретном варианте осуществления популяцию клеток получают путем выбора плацентарных клеток, которые являются (a) негативными по ОСТ-4, по данным ОТ-ПЦР, и VE-кадгерину, по данным иммунолокализации, и (b) положительными по каждому из: VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200, по данным иммунолокализации; и изолирования указанных клеток от других клеток для формирования популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления выбор с помощью иммунолокализации выполняют до выбора методом ОТ-ПЦР. В другом конкретном варианте осуществления указанный выбор содержит выбор клеток, которые не экспрессируют клеточный маркер CD34 после культивирования в течение 4-21 дня в присутствии от 1 до 100 нг/мл VEGF.
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
[0099] В другом варианте осуществления, например, клеточную популяцию получают способом, включающим выбор амниотических клеток, которые адгезивны к пластику для тканевых культур и являются ОСТ-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR1/Flt-1 и VEGFR2/KDR, по данным иммунолокализации, и изолирование указанных клеток от других клеток для формирования клеточной популяции. В конкретном варианте осуществления клеточную популяцию получают способом, включающим выбор амниотических клеток, которые являются ОСТ-4, по данным ОТ-ПЦР, и VEGFR1/Flt-1, VEGFR2/KDR и HLA-G, по данным иммунолокализации. В другом конкретном варианте осуществления указанную клеточную популяцию получают путем выбора амниотических клеток, которые также являются одной или несколькими, или всеми из:, CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 и/или CXCR4 (рецептор 4 хемокина (мотив C-X-C)), по данным иммунолокализации, и изолируют эти клетки от клеток, которые не демонстрируют одну или несколько из этих характеристик. В другом конкретном варианте осуществления указанную клеточную популяцию получают путем выбора амниотических клеток, которые также являются VE-кадгерин, по данным иммунолокализации, и изолирования этих клеток от клеток, которые являются VE-кадгерин. В другом конкретном варианте осуществления указанную клеточную популяцию получают путем выбора амниотических клеток, которые также являются CD105 и CD200, по данным иммунолокализации, и изолируют эти клети от клеток, которые являются CD105 или CD200. В другом конкретном варианте осуществления указанная клетка не экспрессирует CD34, по данным иммунолокализации, после воздействия от 1 до 100 нг/мл VEGF в течение от 4 до 21 дня.
[0100] При выборе клеток нет необходимости в тестировании всей популяции клеток на наличие характеристик, специфических для амниотических адгезивных клеток. Вместо этого на наличие таких характеристик можно протестировать одну или несколько аликвот клеток (например, примерно 0,5%-2%) популяции клеток, и результаты могут быть характерными для остальных клеток данной популяции.
4
5
[0101] Можно подтвердить, что выбранные клетки являются предлагаемыми амниотическими адгезивными клетками путем культивирования образца клеток (например, от примерно 10 до примерно 10 клеток) на подложке, например, MATRIGEL™, в течение от 4 до 14, например, 7 дней в присутствии VEGF (например, примерно 50 нг/мл), и визуального осмотра клеток на наличие выростов и/или клеточных сетей.
[0102] Амниотические адгезивные клетки могут быть выбраны с помощью вышеуказанных маркеров любым способом, известным в области выбора клеток. Например, адгезивные клетки могут быть выбраны с помощью антитела или антител к одному или нескольким маркерам клеточной поверхности, например, иммунолокализацией, например, проточной цитометрией или FACS. Выбор может быть выполнен с помощью антител вместе с магнитными сферами. Антитела, которые являются специфическими для конкретных маркеров, известны в данной области и являются коммерчески доступными, например, антитела к CD9 (Abcam); CD54 (Abcam); CD105 (Abcam; BioDesign International, Saco, ME и т.д.); CD200 (Abcam) цитокератину (SigmaAldrich). Антитела к другим маркерам также являются коммерчески доступными, например, к CD34, CD38 и CD45 выпускаются, например, StemCell Technologies или BioDesign International. Праймеры для последовательностей ОСТ-4, подходящие для ОТ-ПЦР, можно приобрести, например, у Millipore или Invitrogen, или можно легко выделить из человеческой последовательности, находящейся в GenBank под инвентарным номером DQ486513.
[0103] Подробные способы получения плацентарной и амниотической ткани и обработки такой ткани для получения амниотических адгезивных клеток предоставлены ниже.
5.4.1 Композиция для сбора клеток
[0104] Как правило, клетки можно получать из амниона плаценты млекопитающих, например, человеческой плаценты, используя физиологически приемлемый раствор, например, композицию для сбора клеток. Предпочтительно, композиция для сбора клеток предотвращает или подавляет апоптоз, предотвращает или подавляет гибель клеток, лизис, разрушение и т.п. Композиция для сбора клеток подробно описана в публикации родственной заявки на патент США 2007/0190042, озаглавленной “Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs”, раскрытие которой включено в настоящее описание во всей полноте в виде ссылки.
[0105] Композиция для сбора клеток может содержать любой физиологически приемлемый раствор, подходящий для сбора и/или культивирования амниотических адгезивных клеток, например, физраствор (например, забуференный фосфатом раствор Креба (Kreb), модифицированный раствор Креба (Kreb), раствор Игла (Eagle), 0,9% NaCl и т.д.), культуральную среду (например, DMEM, H.DMEM и т.д.) и т.п., с добавлением буферного компонента или без него, например, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES).
[0106] Композиция для сбора клеток может содержать один или несколько компонентов, позволяющих консервацию клеток, например, амниотических адгезивных клеток, т.е., с возможностью предупреждения гибели клеток или замедления гибели клеток, сокращения количества клеток в популяции клеток, которые погибли, и т.п., с момента сбора до момента культивирования. Такие компоненты могут представлять собой, например, ингибитор апоптоза (например, ингибитор каспазы или JNK ингибитор); вазодилататор (например, сульфат магния, антигипертензивное лекарственное вещество, атриальный натрийуретический пептид (ANP), аденокортикотропин, кортикотропин-высвобождающий гормон, нитропруссид натрия, гидралазин, аденозинтрифосфат, аденозин, индометацин или сульфат магния, ингибитор фосфодиэстеразы и т.д.); ингибитор некроза (например, 2-(1H-индол-3-ил)-3-пентиламино-малеимид, пирролидин дитиокарбамад или клоназепам); ингибитор TNF-α; и/или переносчик кислорода на перфторкарбоновой основе (например, перфтороктилбромид, перфтордецилбромид и т.д.).
[0107] Композиция для сбора клеток может содержать один или несколько ферментов, расщепляющих ткани, например, металлопротеазу, серинпротеазу, нейтральную протеазу, РНКазу, или ДНКазу и т.п. Такие ферменты включают, но не ограничены, коллагеназу (например, коллагеназа I, II, III или IV, коллагеназа Clostridium histolyticum, и т.д.); диспазу, термолизин, эластазу, трипсин, LIBERASE™, гиалуронидазу и т.п. Использование композиций для сбора клеток, содержащих расщепляющие ткань ферменты, обсуждаются более подробно ниже.
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus
[0108] Композиция для сбора клеток может содержать бактериоцидно или бактериостатически эффективное количество антибиотика. В определенных неограничивающих вариантах осуществления антибиотик представляет собой макролид (например, тобрамицин), цефалоспорин (например, цефалексин, сефрадин, цефуроксим, цефпрозил, цефаклор, цефиксим или цефадроксил), кларитромицин, эритромицин, пенициллин (например, пенициллин V) или хинолон (например, офлоксацин, ципрофлоксацин или норфлоксацин), тетрациклин, стрептомицин, и т.д. В конкретном варианте осуществления антибиотик является активным в отношении грамм(+) и/или грамм(-) бактерий, например,  и т.п.
[0109] Композиция для сбора клеток также может включить одно или несколько из следующих соединений: аденозин (примерно от 1 мМ до примерно 50 мМ); D-глюкозу (от примерно 20 мМ до примерно 100 мМ); ионы магния (от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ); в одном из вариантов осуществления макромолекулу с молекулярной массой более чем 20000 дальтон, присутствующую в количестве, достаточном для поддержания целостности и жизнеспособности эндотелиальных клеток (например, синтетический или естественный коллоид, полисахарид, такой как декстран или полиэтиленгликоль, присутствующий в количестве от примерно 25 г/л до примерно 100 г/л, или от примерно 40 г/л до примерно 60 г/л); антиоксидант (например, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, глутатион, витамин С или витамин Е в количестве от примерно 25 мкМ до примерно 100 мкМ); восстановитель (например, N-ацетилцистеин в количестве от примерно 0,1 мМ до примерно 5 мМ); агент, который предотвращает проникновение кальция в клетки (например, верапамил в количестве от примерно 2 мкМ до примерно 25 мкМ); нитроглицерин (например, от примерно 0,05 г/л до примерно 0,2 г/л); в одном из вариантов осуществления антикоагулянт, присутствующий в количестве, достаточном для предотвращения свертывания остаточной крови (например, гепарин или гирудин в концентрации от примерно 1000 Ед./л до примерно 100000 Ед./л); или амилорид-содержащее соединение (например, амилорид, этилизопропил-амилорид, гексаметилен-амилорид, диметил-амилорид или изобутил-амилорид в количестве от примерно 1,0 мкМ до примерно 5 мкМ).
[0110] Описанные в данном документе амниотические адгезивные клетки также могут быть собраны, например, во время и после описанного ниже расщепления в простой физиологически приемлемый буфер, например, забуференный фосфатом физраствор, 0,9% NaCl раствор, среду для клеточных культур и т.п.
5.4.2 Сбор и обработка плаценты
[0111] Как правило, человеческую плаценту получают сразу после ее выхода после рождения или после, например, Кесарева сечения. В предпочтительном варианте осуществления плаценту получают от пациента после его информированного согласия и после получения полной истории болезни пациента с определением ее связи с плацентой. Предпочтительно, историю болезни продолжают после доставки. Такую историю болезни можно использовать для согласования последующего применения плаценты или собранных из нее клеток. Например, человеческие плацентарные клетки, например, амниотические адгезивные клетки, могут использоваться, в свете истории болезни, для персонифицированной терапии младенца или близкого родственника, связанного с плацентой, или родителей, родных братьев или других родственников младенца.
[0112] До извлечения амниотических адгезивных клеток кровь пуповины и плацентарную кровь удаляют. В некоторых вариантах осуществления, после доставки из плаценты извлекают кровь пуповины. Плацента может быть подвергнута обычному процессу извлечения крови пуповины. Обычно используется игла или полая игла, плацента обескровливается благодаря силе тяжести (см., например, Anderson, патент США 5372581; Hessel et al., патент США 5415665). Иглу или полую иглу обычно вводят в пупочную вену, и плаценту можно мягко массировать, чтобы помочь крови пуповины вытечь из плаценты. Такое извлечение крови пуповины может быть выполнено коммерческими структурами, например, LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry и Cryocell. Предпочтительно, плаценту дренируют, используя силу тяжести, без дополнительных манипуляций, чтобы минимизировать разрушение ткани во время извлечения крови пуповины.
[0113] Как правило, плаценту транспортируют из комнаты доставки или родильной комнаты в другое местоположение, например, лабораторию, для извлечения крови пуповины и сбора клеток, например, путем перфузии или отделения тканей. Плаценту предпочтительно транспортируют в стерильном, теплоизоляционном устройстве для транспортировки (поддерживая температуру плаценты между 20-28°C), например, путем помещения плаценты с перевязанной проксимальной пуповиной в стерильный пластиковый пакет с замком zip-lock, которую затем помещают в изолированный контейнер. В другом варианте осуществления плаценту транспортируют в наборе для сбора крови пуповины, по существу, как описано патенте США 7147626. Предпочтительно, плаценту доставляют в лабораторию через четыре-двадцать четыре часа после доставки. В некоторых вариантах осуществления перевязанная проксимальная пуповина является перевязанной, предпочтительно, в 4-5 см (сантиметрах) от вхождения в плацентарный диск для извлечения крови пуповины. В других вариантах осуществления проксимальную пуповину зажимают после извлечения крови пуповины, но до дальнейшей обработки плаценты.
[0114] Плаценту, до сбора клеток, можно хранить в стерильных условиях при температуре, например, от 4 до 25°C (по Цельсию), например, при комнатной температуре. Плаценту можно хранить в течение, например, от нуля до двадцати четырех часов, до сорока восьми часов или дольше сорока восьми часов, до перфузии плаценты с целью удаления любой остаточной крови пуповины. В одном из вариантов осуществления плаценту собирают от нуля часов до примерно двух часов после ее выхода. Плаценту можно хранить в антикоагулирующем растворе при температуре, например, от 4 до 25°C (по Цельсию). В данной области известны подходящие антикоагулирующие растворы. Например, можно использовать раствор цитрата натрия, гепарина или варфарина натрия. В предпочтительном варианте осуществления антикоагулирующий раствор включает раствор гепарина (например, 1% мас./мас. в 1:1000 растворе). Обескровленную плаценту предпочтительно хранят в течение не более чем 36 часов до сбора клеток.
5.4.3 Физическое разрушение и ферментативное расщепление амниотической ткани
[0115] В одном из вариантов осуществления амнион отделяют от остальной части плаценты, например, отслаиванием, например, используя пальцы. Амнион может быть разрезан, например, на части или сегменты ткани до ферментативного расщепления и извлечения адгезивных клеток. Амниотические адгезивные клетки могут быть получены из целого амниона, или из небольшого сегмента амниона, например, сегмента амниона, площадь которого составляет примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или примерно 1000 кв.мл.
[0116] Как правило, амниотические адгезивные клетки можно собирать из плацентарного амниона или его части, в любое время в течение примерно первых трех дней после выхода, но предпочтительно примерно между 0 и 48 часами после выхода, или примерно между 8 и примерно 18 часами после выхода.
[0117] В одном из вариантов осуществления амниотические адгезивные клетки выделяют из ткани амниона ферментативным расщеплением, используя один или несколько расщепляющих ткань ферментов. Амнион, или его часть, может быть, например, расщеплена одним или несколькими ферментами, растворенными или смешанными в описанной выше композиции для сбора клеток.
[0118] В некоторых вариантах осуществления композиция для сбора клеток содержит один или несколько расщепляющих ткань ферментов. При ферментативном расщеплении предпочтительно используется комбинация ферментов, например, комбинация из матричной металлопротеазы и нейтральной протеазы, например, комбинация из диспазы и коллагеназы, например, используемые последовательно. В случае использования нескольких протеаз, протеазы для расщепления ткани амниона можно использовать одновременно или последовательно. В одном из вариантов осуществления, например, ткань амниона расщепляют три раза трипсином, а затем один раз коллагеназой.
[0119] В одном из вариантов осуществления ткань амниона расщепляют ферментативно одним или несколькими из: матричной металлопротеазы, нейтральной протеазы и муколитического фермента. В конкретном варианте осуществления ткань амниона расщепляют с помощью комбинации коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы. В другом конкретном варианте осуществления ткань амниона расщепляют с помощью комбинации LIBERASE™ (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) и гиалуронидазы. Другие ферменты, которые могут использоваться для расщепления ткани амниона, включают папаин, дезоксирибонуклеазы, серинпротеазы, такие как трипсин, химотрипсин или эластазы. Серинпротеазы могут быть ингибированы альфа-2-микроглобулином в сыворотке, и поэтому, в некоторых вариантах осуществления, среда, используемая для расщепления, может не содержать сыворотку. В некоторых других вариантах осуществления для расщепления ткани амниона используют ЭДТА и дезоксирибонуклеазу, например, для усиления эффективности извлечения клеток. В некоторых других вариантах осуществления растворяют дигестат с тем, чтобы избежать захвата клеток вязкими продуктами расщепления.
[0120] Обычные концентрации для расщепляющих ткани ферментов включают, например, 50-200 Ед./мл для коллагеназы I и коллагеназы IV, 1-10 Ед./мл для диспазы и 10-100 Ед./мл для эластазы. Для выделения амниотических адгезивных клеток можно использовать протеазы в комбинации, т.е., две или более протеаз в одной и той же реакции расщепления, или их можно использовать последовательно. Например, в одном из вариантов осуществления, ткань амниона или ее часть расщепляют сначала, используя соответствующее количество трипсина в концентрации примерно 0,25%, в течение, например, 15 минут при 37°C, затем коллагеназой I в количестве от примерно 1 до примерно 2 мг/мл в течение, например, 45 минут.
[0121] В одном из вариантов осуществления амниотические адгезивные клетки могут быть получены следующим образом. Амниотическую мембрану рассекают на сегменты, размером от примерно 0,1×0,1 дюймов до примерно 5×5 дюймов, например, 2×2 дюймов. Эпителиальный монослой удаляют со стороны эмбриона амниотической мембраны с помощью тройной трипсинизации следующим образом. Сегменты амниотической мембраны помещают в контейнер с теплым (например, от примерно 20°C до примерно 37°C) раствором трипсин-ЭДТА (0,25%). Объем трипсина может составлять от примерно 5 мл на 1 грамм амниона до примерно 50 мл на 1 грамм амниона. Контейнер взбалтывают в течение от примерно 5 минут до примерно 30 минут, например, 15 минут, поддерживая температуру постоянной. Затем сегменты амниотической мембраны отделяют от раствора трипсина любым соответствующим способом, таким как удаление сегментов амниона руками или с помощью фильтрации. Стадия трипсинизации может быть повторена, по меньшей мере, еще один раз.
[0122] После завершения финальной трипсинизации сегменты амниотической мембраны помещают назад в контейнер, заполненный теплым раствором для нейтрализации трипсина, таким как забуференный фосфатом физраствор (PBS)/10% FBS, PBS/5% FBS или PBS/3% FBS. Контейнер взбалтывают в течение от примерно 5 секунд до примерно 30 минут, например, 5 минут. Затем сегменты амниотической мембраны отделяют от раствора для нейтрализации трипсина, как описано выше, и сегменты амниотической мембраны помещают в контейнер, заполненный теплым PBS, pH 7,2. Контейнер взбалтывают в течение от примерно 5 секунд до примерно 30 минут, и затем амниотические мембранные сегменты отделяют от PBS, как описано выше.
g
g
g
[0123] Затем сегменты амниотической мембраны помещают в контейнер, заполненный теплым (например, от примерно 20°C до примерно 37°C) раствором для расщепления. Объем раствора для расщепления может составлять от примерно 5 мл на 1 грамм амниона до примерно 50 мл на 1 грамм амниона. Раствор для расщепления содержит ферменты для расщепления в соответствующей культуральной среде, такой как DMEM. Обычные растворы для расщепления включают коллагеназу типа I (от примерно 50 Ед./мл до примерно 500 Ед./мл); коллагеназу типа I (от примерно 50 Ед./мл до примерно 500 Ед./мл) плюс диспазу (от примерно 5 Ед./мл до примерно 100 Ед./мл); и коллагеназу типа I (от примерно 50 Ед./мл до примерно 500 Ед./мл), диспазу (от примерно 2 Ед./мл до примерно 50 Ед./мл) и гиалуронидазу (от примерно 3 Ед./мл до примерно 10 Ед./мл). Контейнер взбалтывают при 37°C, до по существу полного расщепления амниона (от примерно 10 минут до примерно 90 минут). Затем в контейнер добавляют теплый PBS/5% FBS в отношении от примерно 1 мл на 1 грамм амниотической ткани до примерно 50 мл на 1 грамм амниотической ткани. Контейнер взбалтывают в течение от примерно 2 минут до примерно 5 минут. Затем клеточную суспензию фильтруют для удаления любой нерасщепленной ткани, используя от 40 мкм до 100 мкм фильтр. Затем клетки суспендируют в теплом PBS (от примерно 1 мл до примерно 500 мл), а затем центрифугируют при от 200× до примерно 400× в течение от примерно 5 минут до примерно 30 минут, например при 300× в течение примерно 15 минут при 20°C. После центрифугирования супернатант удаляют, и клетки ресуспендируют в подходящей культуральной среде. Клеточную суспензию можно отфильтровать (от 40 мкм до 70 мкм фильтром) для удаления любой нерасщепленной ткани, получая одноклеточную суспензию.
[0124] В этом варианте осуществления клетки в суспензии собирают и культивируют, как описано в настоящем описании, для получения изолированных амниотических адгезивных клеток и популяции таких клеток. Оставшийся нерасщепленным амнион, в этом варианте осуществления, можно выбросить. Клетки, освобожденные из ткани амниона, могут быть, например, собраны, например, центрифугированием, и культивированы в стандартной среде для клеточных культур.
[0125] В любом из протоколов расщепления, представленных в данном описании, клеточная суспензия, полученная расщеплением, может быть отфильтрована, например, через фильтр, содержащий поры от примерно 50 мкм до примерно 150 мкм, например, от примерно 75 мкм до примерно 125 мкм. В другом конкретном варианте осуществления клеточную суспензию можно отфильтровать двумя или более фильтрами, например, 125 мкм фильтром и 75 мкм фильтром.
[0126] AMDAC могут быть отделены от клеток, высвобожденных во время расщепления путем выбора клеток, которые экспрессируют одну или несколько характеристик AMDAC, как описано в Разделе 5.1, выше, любым из описанных в данном документе способов.
[0127] AMDAC также можно, например, выделять, используя определенный двухстадийный способ выделения, содержащий расщепление трипсином с последующим расщеплением коллагеназой. Таким образом, в другом аспекте предоставляется способ выделения амниотических адгезивных клеток, содержащий расщепление амниотической мембраны или ее части трипсином таким образом, чтобы эпителиальные клетки высвободились из указанной амниотической мембраны; удаление амниотической мембраны или ее части от указанных эпителиальных клеток; дальнейшее расщепление амниотической мембраны или ее части коллагеназой таким образом, чтобы амниотические адгезивные клетки высвободились из указанной амниотической мембраны или ее части; и отделение указанных амниотических адгезивных клеток от указанной амниотической мембраны. В конкретном варианте осуществления расщепление амниотической мембраны или ее части повторяют, по меньшей мере, один раз. В другом конкретном варианте осуществления расщепление амниотической мембраны или ее части коллагеназой повторяют, по меньшей мере, один раз. В другом конкретном варианте осуществления трипсин составляет от примерно 0,1% до 1,0% (финальная концентрация). В другом конкретном варианте осуществления трипсин составляет примерно 0,25% (финальная концентрация). В другом конкретном варианте осуществления коллагеназа составляет от примерно 50 Ед./мл до примерно 1000 Ед./мл (финальная концентрация). В другом конкретном варианте осуществления коллагеназа составляет примерно 125 Ед./мл (финальная концентрация). В другом конкретном варианте осуществления способ выделения дополнительно содержит культивирование указанных амниотических адгезивных клеток в клеточной культуре и выделение указанных амниотических адгезивных клеток от неадгезивных клеток в указанной культуре для получения обогащенной популяции амниотических адгезивных клеток. В другом конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной обогащенной популяции амниотических адгезивный клеток представляют собой указанные амниотические адгезивные клетки.
+
+
+
-
[0128] В другом конкретном варианте осуществления вышеуказанных способов амниотические адгезивные клетки являются негативными по ОСТ-4, по данным ОТ-ПЦР, и относятся к одному или нескольким типам из: HLA-G, CD90, CD105 и CD117, по данным проточной цитометрии.
5.4.4 Выделение, отбор и характеристика амниотических адгезивных клеток
[0129] Клеточные пеллеты могут быть ресуспендированы в свежей композиции для сбора клеток, как описано выше, или среде, подходящей для поддержания клеток, например, среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM); среде Искова в модификации Дульбекко (IMDM), например, IMDM среде без сыворотки, содержащей 2 Ед./мл гепарина и 2 мМ ЭДТА (GibcoBRL, NY); смесь буфера (например, PBS, HBSS) с FBS (например, 2% об./об.); и т.п.
[0130] Амниотические адгезивные клетки, которые были культивированы, например, на поверхности, например, на пластике для тканевых культур, с дополнительным внеклеточным матричным покрытием, таким как фибронектин или без него могут быть пассированы или выделены с помощью дифференциальной адгезии. Например, клеточную суспензию, полученную из ткани амниона путем расщепления коллагеназой, выполненного как описано выше в Разделе 5.4.3, можно культивировать, например, в течение 3-7 дней в культуральной среде на пластике для тканевых культур. Во время культивирования множество клеток в суспензии прикрепляются к поверхности культуры, и, после непрерывного культивирования дают амниотические адгезивные клетки. Неадгезивные клетки, которые не приводят к образованию амниотических адгезивных клеток, удаляют во время замены среды.
+
[0131] Количество и тип клеток, собранных из амниона, можно оценить, например, путем измерения изменений в морфологии и с помощью маркеров клеточной поверхности, используя стандартные методы детектирования клеток, такие как иммунолокализация, например, проточная цитометрия, сортировка клеток, иммуноцитохимия (например, окрашивание тканеспецифическими антителами или антителами к специфическим клеточным маркерам), сортировка флюоресцентно-активированных клеток (FACS), сортировка магнитно-активированных клеток (MACS), оценка морфологии клеток с помощью световой или софокусной микроскопии, и/или путем измерения изменений экспрессии генов с помощью методов, известных в данной области, таких как ПЦР и построение профиля экспрессии генов. Эти методы также можно использовать для идентификации клеток, которые являются положительными по одному или нескольким специфическим маркерам. Например, используя одно или несколько антител к CD34, с помощью указанных выше методов можно определить, содержит ли клетка детектируемое количество CD34; если содержит, то клетка является CD34.
[0132] Амниотические клетки, например, клетки, которые были выделены с помощью разделения на Ficoll, дифференциальной адгезии или их комбинации, могут быть отсортированы с помощью сортировщика флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Сортировка флюоресцентно-активированных клеток (FACS) является хорошо известным способом для отделения частиц, включая клетки, на основе флуоресцентных свойств этих частиц (см., например, Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). Лазерное возбуждение флуоресцентных фрагментов в отдельных частицах приводит к образованию небольшого электрического заряда, позволяющего провести электромагнитное разделение положительных и отрицательных частиц смеси. В одном из вариантов осуществления антитела к специфическим маркерам клеточной поверхности или лигандам метят разными флуоресцентными метками. Клетки пропускают через сортировщик клеток, который позволяет осуществить разделение клеток на основе их способности связываться с используемыми антителами. FACS отсортированные частицы могут быть сразу помещены в отдельные лунки 96-ти луночного или 384-х луночного планшета для облегчения разделения и клонирования.
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
[0133] В одной из схем сортировки клетки из плаценты, например, амниотические адгезивные клетки могут быть отсортированы на основе экспрессии маркеров CD49f, VEGFR2/KDR, и/или Flt-1/VEGFR1. Предпочтительно, клетки идентифицируют как являющиеся ОСТ-4, например, путем определения экспрессии ОСТ-4 методом ОТ-ПЦР в образце клеток, причем клетки являются ОСТ-4, если эти клетки в образце не демонстрируют детектируемое продуцирование мРНК для ОСТ-4 после 30 циклов. Например, клетки из амниона, которые являются VEGFR2/KDR и VEGFR1/Flt-1 могут быть отсортированы от клеток, которые относятся к одной или нескольким из: VEGFR2/KDR и VEGFR1/Flt-1, CD9, CD54, CD105, CD200 и/или VE-кадгерин. В конкретном варианте осуществления амниотические клетки, адгезивные к пластику для тканевых культур, которые относятся к одной или нескольким из: CD49f, VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 и/или VE-кадгерин, или клетки, которые являются VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 и VE-кадгерин, отсортировывают от клеток, не экспрессирующих один или несколько таких маркеров, и отбирают. В другом конкретном варианте осуществления CD49f, VEGFR2/KDR, VEGFR1/Flt-1 клетки, которые также относятся к одной или нескольким или всем из: CD31, CD34, CD45, CD133 и/или Tie-2, отсортировывают от клеток, которые не демонстрируют одну или несколько, или все из этих характеристик. В другом конкретном варианте осуществления, VEGFR2/KDR, VEGFR1/Flt-1 клетки, которые также являются одной или несколькими или всеми из: CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, Tie-2, TEM-7, CD31, CD34, CD45, CD133, CD143, CD146 и/или CXCR4, отсортировывают от клеток, которые не демонстрируют одну или несколько или все из этих характеристик.
[0134] Выбор амниотических адгезивных клеток можно выполнять на клеточной суспензии, полученной после расщепления, или на изолированных клетках, собранных из дигестата, например, центрифугированием или разделением с помощью проточной цитометрии. Выбор путем экспрессии маркеров можно выполнять отдельно или, например, вместе с процедурами по выбору клеток на основе их адгезивных свойств в культуре. Например, выбор по адгезии можно выполнять до или после сортировки на основе экспрессии маркера.
125
131
35
3
[0135] Что касается антитело-опосредованного детектирования и сортировки плацентарных клеток, то можно использовать любое антитело, специфическое для конкретного маркера, в комбинации с любым флуорофором или другой меткой, подходящей для детектирования и сортировки клеток (например, сортировки флюоресцентно-активированных клеток). Комбинации антитело/флуорофор с определенными маркерами включают, но не ограничены, моноклональные антитела к CD105, конъюгированные с флуоресцеин изотиоционатом (FITC) (выпускаемые R&D Systems Inc, Minneapolis, Minnesota); моноклональные антитела к CD200, конъюгированные с фикоэритрином (PE) (BD Biosciences Pharmingen); VEGFR2/KDR-биотин (CD309, Abcam) и т.п. Антитела к любому из раскрытых в данном описании маркеров могут быть мечены любой стандартной меткой для антител, которая облегчает детектирование этих антител, включая, например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, стрептавидин/биотин ацетилхолинэстеразу, авидин/биотин, умбеллиферон, флуоресцин, флуоресцин изотиоционат (FITC), родамин, дихлортриазиниламин флуоресцин, дансил хлорид или фикоэритрин (PE), люминол, люциферазу, люциферин и экворин, а примеры подходящего радиоактивного материала включают I, I, S или H.
[0136] Амниотические адгезивные клетки могут быть мечены антителом к одному маркеру и детектированы и/отсортированы на основании этого одного маркера, или могут быть мечены одновременно множеством антител ко множеству различных маркеров и отсортированы на основании множества маркеров.
[0137] В другом варианте для отделения клеток, например, отделения описанных в данном документе амниотических адгезивных клеток от других клеток амниона можно использовать магнитные частицы. Клетки могут быть отсортированы с помощью метода сортировки магнитно-активированных клеток (MACS), способа для отделения частиц на основании их способности связать магнитные частицы (диаметром 0,5-100 мкм). На магнитных микросферах можно осуществлять множество полезных модификаций, включая ковалентное добавление антитела, которое специфически распознает конкретную молекулу клеточной поверхности или гаптен. Затем частицы смешивают с клетками, позволяя осуществить связывание. Затем клетки проходят через магнитное поле для отделения клеток, имеющих специфический маркер клеточной поверхности. В одном из вариантов осуществления эти клетки затем могут быть изолированы и повторно смешаны с магнитными частицами, связанными с антителом к дополнительным маркерам клеточной поверхности. Клетки снова пропускают через магнитное поле для отделения клеток, связанных с обоими антителами. Затем такие клетки могут быть разбавлены и помещены в отдельные чашки, такие как микротитровальные чашки для выделения клона.
[0138] Амниотические адгезивные клетки могут быть оценены на жизнеспособность, пролиферативную активность и долговечность с помощью стандартных способов, известных в данной области, таких как метод исключения с помощью трипана синего, тест поглощения флуоресцин диацетата, тест поглощения пропидиум йодида (для оценки жизнеспособности); и тест поглощения тимидина или MTT-тест пролиферативной активности клеток (для оценки пролиферации). Долговечность может быть определена способами, известными в данной области, такими как, определение максимального количества популяции, удваивающейся в размноженной культуре.
[0139] Амниотические адгезивные клетки также могут быть отделены от других плацентарных клеток с помощью других методов, известных в данной области, например, путем селективного выращивания требуемых клеток (положительный отбор), селективного разрушения нежелательных клеток (отрицательный отбор); разделения по дифференциальной способности клеток к агглютинации в смешанной популяции как, например, с агглютинином сои; методы замораживания-оттаивания; фильтрация; обычное и зональное центрифугирование; центробежная сепарация (противоточное центрифугирование); разделение под действием силы тяжести; противоточное распределение; электрофорез и т.п.
5.5 Культура амниотических адгезивных клеток
5.5.1 Культуральная среда
[0140] Изолированные амниотические адгезивные клетки или популяции таких клеток можно использовать для инициации или высева клеточных культур. Клетки, как правило, переносят в стерильные сосуды для тканевых культур, либо непокрытых, либо покрытых внеклеточным матриксом или биомолекулами, такими как ламинин, коллаген (например, естественный или денатурированный), желатин, фибронектин, орнитин, витронектин и внеклеточный мембранный белок (например, MATRIGEL™ (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).
-9
-4
[0141] AMDAC, например, могут быть помещены в среду, подходящую для культивирования стволовых клеток, среда для роста может, например, включать среду EGM-2 (Lonza), DMEM+10% FBS, или среду, содержащую 60% DMEM-LG (Gibco), 40% MCDB-201 (Sigma), 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS) (Hyclone Laboratories), IX инсулин-трансферрин-селен, IX леноленовая кислота-бычья сыворотка-альбумин (LA-BSA), 10 М дексаметазона (Sigma), 10 M аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (R&D Systems), 10 нг/мл фактора роста тромбоцитов (PDGF-BB) (R&D Systems) и 100 Ед. пенициллина/1000 Ед. стрептомицина (называемая в данном описании “стандартной средой”).
[0142] Амниотические адгезивные клетки можно культивировать в любой среде и при любых условиях, признанных в данной области как подходящие для культуры клеток, например, адгезивных плацентарных стволовых клеток. Предпочтительно, культуральная среда включает сыворотку. В различных вариантах осуществления среды для культуры или субкультуры AMDAC включают STEMPRO (Invitrogen), MSCM-cf (ScienCell, Carlsbad, CA), среду MESENCULT-ACF (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), стандартную среду, стандартную среду без EGF, стандартную среду без PDGF, DMEM+10% FBS, EGM-2 (Lonza), EGM-2MV (Lonza), 2%, 10% и 20% ES среды, среду ES-SSR или α-MEM-20%FBS. Среда, подходящая для культивирования амниотических адгезивных клеток включает, например, DMEM, IMDM, DMEM (с высоким или низким уровнем глюкозы), базальную среду Игла, среду F10 (F10) Хама (Ham), среду F-12 (F12) Хама, среду Искова с модификацией Дульбекко, среду для выращивания мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM Lonza), среду ADVANCESTEM™ (Hyclone), KNOCKOUT™ DMEM (Invitrogen), среду Лейбовитца (Leibovitz) L-15, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, усовершенствованную DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), и CELL-GRO FREE и т.п. В различных вариантах осуществления, например, DMEM-LG (основная среда с модификацией Дульбекко с низким уровнем глюкозы)/MCDB 201 (базальная среда для фибробластов цыпленка), содержащая (смесь инсулина, трансферрина и селена), LA+BSA (смесь линолевой кислоты, бычьей сыворотки и альбумина), декстрозу, L-аскорбиновую кислоту, PDGF, EGF, IGF-1, и пенициллин/стрептомицин; DMEM-HG (с высоким уровнем глюкозы), содержащая от примерно 2 до примерно 20%, например, примерно 10%, фетальной бычьей сыворотки (FBS; например определенной фетальной бычьей сыворотки, Hyclone, Logan Utah); DMEM-HG, содержащая от примерно 2 до примерно 20%, например, примерно 15%, FBS; IMDM (среда Искова с модификациями Дульбекко), содержащая от примерно 2 до примерно 20%, например, примерно 10% FBS, от примерно 2 до примерно 20%, например, примерно 10%, лошадиной сыворотки и гидрокортизон; M199, содержащая от примерно 2 до примерно 20%, например, примерно 10%, FBS, EGF и гепарин; α-МЕМ (минимальная основная среда), содержащая от примерно 2 до примерно 20%, например, примерно 10%, FBS, GLUTAMAX™ и гентамицин; DMEM, содержащая 10% FBS, GLUTAMAX™ и гентамицин; DMEM-LG, содержащая от примерно 2 до примерно 20%, например, примерно 15%, (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (например, определенной фетальной бычьей сыворотки, Hyclone, Lgan Utah), антибиотики/антимикотики (например, примерно 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и/или 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)), и 0,001% (об./об.) β-меркаптоэтанол (Sigma, St. Louis Mo.); KNOCKOUT™-DMEM базальная среда, дополненная 2%-20% FBS, заменимой аминокислотой (Invitrogen), бета-меркаптоэтанолом; базальная среда KNOCKOUT™, дополненная KNOCKOUT™ Serum Replacement (без сыворотки); альфа-МЕМ, содержащая 2%-20% FBS; базальная среда EBM2™, дополненная EGF, VEGF, bFGF, R3-IGF-1, гидрокортизоном, гепарином, аскорбиновой кислотой, FBS, гентамицином), и т.п.
[0143] Культуральная среда может быть дополнена одним или несколькими компонентами, включая, например, сыворотку (например, FCS или FBS, например, примерно 2-20% (об./об.); конскую (лошадиную) сыворотку (ES); человеческую сыворотку (HS)); бета-меркаптоэтанол (BME), предпочтительно, примерно 0,001% (об./об.); один или несколько факторов роста, например, фактор роста тромбоцитов (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), фактор ингибирования лейкемии (LIF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и эритропоэтин (EPO); аминокислоту, включая L-валин; и один или несколько антибиотиков и/или противогрибковые агенты, чтобы контролировать микробную контаминацию, такие как, например, пенициллин G, стрептомицина сульфат, амфотерицин B, гентамицин и нистатин, отдельно или в комбинации.
4
[0144] Амниотические адгезивные клетки (AMDAC) можно культивировать в стандартных условиях для тканевых культур, например, в чашках для культуры тканей или многолуночных планшетах. Клетки также можно культивировать с помощью способа висячей капли. В этом способе клетки суспендируют в количестве примерно 1×10 клеток на мл в примерно 5 мл среды, и одну или несколько капель среды помещают на внутреннюю сторону крышки контейнера для тканевых культур, например, 100 мл чашки Петри. Капли могут быть, например, единичными каплями или множеством капель из, например, многоканальной пипетки. Крышку аккуратно переворачивают и помещают сверху основания чашки, которая содержит объем жидкости, например, стерильной PBS, достаточной для поддержания влагосодержания в атмосфере чашки, и клетки культивируют. AMDAC также можно культивировать в стандартных культуральных системах или системах большого объема или высокоэффективных системах, таких как T-флаконы, Corning HYPERFLASK, Cell Factories (Nunc), 1-, 2-, 4-, 10-Tray Cell стеки и т.п.
[0145] В одном из вариантов осуществления амниотические адгезивные клетки культивируют в присутствии соединения, действие которого сохраняет недифференцированный фенотип в клетках. В конкретном варианте осуществления соединение представляет собой замещенный 3,4-дигидропиримидол[4,5-d]пиримидин. В другом конкретном варианте осуществления таким соединением является соединение, имеющее следующую химическую структуру:
Это соединение может вступать в контакт с амниотической адгезивной клеткой или популяцией таких клеток в концентрации, например, от примерно 1 мкM до примерно 10 мкM.
5.5.2 Размножение и пролиферация амниотических адгезивных клеток
in vivo
in vitro
[0146] После выделения амниотической адгезивной клетки или изолированной популяции таких клеток (например, амниотических адгезивных клеток или популяции таких клеток, отделенных от, по меньшей мере, 50% клеток амниона, с которыми клетка или популяция клеток обычно ассоциирована ), клетки могут пролифирировать и быть размножены . Например, популяция адгезивных клеток или амниотических адгезивных клеток может быть культивирована в контейнерах для тканевых культур, например, чашках, флаконах, многолуночных планшетах и т.п., в течение достаточного количества времени для того, чтобы клетки пролифирировали до 40-70% конфлюентности, т.е., пока клетки и их потомство не займут 40-70% площади культивируемой поверхности контейнера для тканевых культуры.
2
2
2
2
2
[0147] Посев амниотических адгезивных клеток может быть выполнен в культуральных сосудах с плотностью, позволяющей клеткам расти. Например, клетки можно засевать от низкой плотности (например, от примерно 400 до примерно 6000 клеток/см) до высокой плотности (например, от примерно 20000 или более клеток/см). В предпочтительном варианте осуществления клетки культивируют при от примерно 0% до примерно 5% по объему CO. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетки культивируют при от примерно 0,1% до примерно 25% O, предпочтительно от примерно 5% до примерно 20% O. Клетки предпочтительно культивируют при от примерно 25°C до примерно 40°C, предпочтительно при примерно 37°C.
[0148] Клетки предпочтительно культивируют в инкубаторе. При культивировании культуральная среда может быть статичной или может взбалтываться, например, с помощью биореактора. Амниотические адгезивные клетки предпочтительно выращивают в условиях низкого окислительного стресса (например, с добавлением глутатиона, аскорбиновой кислоты, каталазы, токоферола, N-ацетилцистеина и т.п.).
2
[0149] Хотя амниотические ангиогенные клетки могут быть выращены до конфлюентности, клетки предпочтительно не выращивают до конфлюентности. Например, после получения 40%-70% конфлюентности клетки могут быть пассированы. Например, клетки могут быть обработаны ферментами, например, трипсином, с помощью методов, известных в данной области, для отделения от поверхности для тканевых культур. После удаления клеток с помощью пипетки и их подсчета примерно 20000-100000 клеток, предпочтительно примерно 50000 клеток, или от примерно 400 до примерно 6000 клеток/см, могут быть пассированы в новый культуральный контейнер, содержащий свежую культуральную среду. Как правило, новая среда является средой того же типа, из которой были удалены клетки. Амниотические адгезивные клетки могут быть пассированы, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз, или более. AMDAC могут удваиваться в культуре, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или, по меньшей мере, 50 раз или более.
5.6 Консервация амниотических адгезивный клеток
[0150] Амниотические адгезивные клетки могут быть законсервированы, т.е., помещены в условия, которые позволяют их длительное хранение, или условия, которые задерживают гибель клеток, например, апоптоз или некроз, например, во время сбора или до получения описанных в данном документе композиций, например, с помощью описанных в данном описании способов.
[0151] Амниотические адгезивные клетки могут быть законсервированы с помощью, например, композиции, содержащей ингибитор апоптоза, ингибитор некроза и/или переносчик кислорода на перфторуглеродной основе, как описано в публикации американской заявки на патент США 2007/0190042, раскрытие которой включено в настоящее описание во всей полноте в качестве ссылки. В одном из вариантов осуществления способ консервации таких клеток или популяции таких клеток включает взаимодействие указанных клеток или популяции клеток с композицией для сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и переносчик кислорода на перфторуглеродной основе, где указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение времени, достаточном для уменьшения или предотвращения апоптоза в популяции клеток по сравнению с популяцией клеток, которые не контактировали с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза представляет собой ингибитор каспазы. В другом конкретном варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза представляет собой ингибитор JNK. В другом конкретном варианте осуществления указанный ингибитор JNK не модулирует дифференцировку или пролиферацию амниотических адгезивных клеток. В другом варианте осуществления указанная композиция для сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный переносчик кислорода на перфторуглеродной основе в раздельных фазах. В другом варианте осуществления указанная композиция для сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный переносчик кислорода на перфторуглеродной основе в эмульсии. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток дополнительно содержит эмульгатор, например, лецитин. В другом варианте осуществления во время взаимодействия с клетками указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод имеют температуру от примерно 0°C до примерно 25°C. В другом конкретном варианте осуществления во время взаимодействия с клетками указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод имеют температуру примерно от 2°C до 10°C, или примерно от 2°C до 5°C. В другом конкретном варианте осуществления указанное взаимодействие происходит во время транспортировки указанной популяции клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанное взимодействие происходит во время замораживания и оттаивания указанной популяции клеток.
[0152] Популяцию амниотических адгезивных клеток можно законсервировать, например, способом, включающим взаимодействие популяции указанных клеток с ингибитором апоптоза и соединением для консервации органов, где указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение времени, достаточном для уменьшения или предотвращения апоптоза в популяции клеток по сравнению с популяцией клеток, которая не контактировала с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления соединение для консервации органов представляет собой UW раствор (описанный в патенте США 4798824; также известный как ViaSpan; см. также Southard et al., Transplantation 49 (2):251-257 (1990)), или раствор, описанный у Stern et al. в патенте США 5552267. В другом варианте осуществления указанное соединение для консервации органов представляет собой гидроксиэтиловый крахмал, лактобионовую кислоту, раффинозу или их комбинацию. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток дополнительно содержит переносчик кислорода на перфторкарбоновой основе либо в двух фазах, либо в виде эмульсии.
[0153] В другом варианте осуществления способа амниотические адгезивные клетки взаимодействуют с композицией для сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и переносчик кислорода на перфторкарбоновой основе, соединением для консервации органов или их комбинацией во время перфузии. В другом варианте осуществления амниотические адгезивные клетки взаимодействуют с такой композицией для сбора клеток во время процесса разрушения ткани, например, ферментативного расщепления ткани амниона. В другом варианте осуществления амниотические адгезивные клетки взаимодействуют с указанным соединением для сбора клеток после сбора путем разрушения ткани, например, ферментативным расщеплением ткани амниона.
[0154] Как правило, во время сбора амниотических адгезивных клеток, обогащения и выделения предпочтительно минимизировать или устранить стресс клеток в результате гипоксии и механического стресса. Для этого в другом варианте осуществления способа амниотическую адгезивную клетку или популяцию клеток, содержащую амниотические адгезивные клетки, подвергают воздействию условий гипоксии во время сбора, обогащения или выделения в течение менее шести часов во время указанной консервации, причем условие гипоксии представляет собой концентрацию кислорода, которая, например, меньше нормальной атмосферной концентрации кислорода; меньше нормальной концентрации кислорода в крови; или т.п. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки или популяцию указанных клеток подвергают воздействию указанных условий гипоксии в течение менее двух часов во время указанной консервации. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки или популяцию указанных клеток подвергают воздействию указанных условий гипоксии в течение менее одного часа или менее тридцати минут, или не подвергают воздействию условий гипоксии во время сбора, обогащения или выделения. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток не подвергают воздействию для избежания стресса во время сбора, обогащения или выделения.
[0155] Амниотические адгезивные клетки могут быть криозаконсервированы обычным или определенными способами, раскрытыми здесь, например, в среде для криоконсервации в небольших контейнерах, например, ампулах. Подходящая среда для криоконсервации включает, но не ограничена, культуральную среду, содержащую, например, среду для роста или среду для заморозки клеток, например, коммерчески доступную среду для заморозки клеток, например, среду для заморозки клеток, обозначенную в каталоге SigmaAldrich под номерами C2695, C2639 (Cell Freezing Medium-Serum-free IX, не содержащую ДМСО) или C6039 (Cell Freezing Medium-Glycoerol 1 X, содержащую минимальную основную среду, глицерин, телячью сыворотку и бычью сыворотку), среду Lonza PROFREEZE™2x, метилцеллюлозу, декстран, человеческий сывороточный альбумин, фетальную бычью сыворотку, фетальную телячью сыворотку или Плазмалит. Среда для криоконсервации предпочтительно содержит ДМСО (диметилсульфоксид) или глицерин в концентрации, например, от примерно 1% до примерно 20%, например, примерно от 5% до 10% (об./об.), необязательно содержит фетальную бычью сыворотку или человеческую сыворотку. Среда для криоконсервации может содержать дополнительные агенты, например, метилцеллюлозу и/или глицерин. Во время криоконсервации изолированные амниотические адгезивные клетки предпочтительно охлаждают со скоростью примерно 1°C/мин. Предпочтительная температура для криоконсервации составляет от примерно -80°C до примерно -180°C, предпочтительно от примерно -125°C до примерно -140°C. Перед оттаиваннием для использования криозаконсервированные клетки могут быть перенесены в паровую фазу жидкого азота. В некоторых вариантах осуществления, например, после достижения ампулами температуры примерно -80°C, их переносят в область хранения с жидким азотом. Криоконсервация также может быть проведена с использованием морозильников с регулируемой скоростью. Криозаконсервированные клетки предпочтительно оттаивают при температуре от примерно 25°C до примерно 40°C, предпочтительно, при температуре, равной примерно 37°C.
5.7 Создание банка амниотических адгезивных клеток
[0156] Амниотические адгезивные клетки могут быть культивированы несколькими различными способами для создания набора лотов, например, набора отдельно вводимых доз таких клеток. Наборы лотов ангиогенных амниотических клеток, полученных из множества плацент, могут быть размещены в банке клеток для, например, длительного хранения. Как правило, амниотические адгезивные клетки получают из исходной культуры клеток для формирования посевной культуры, которую размножают в контролируемых условиях, формируя популяции клеток из примерно эквивалентных количеств удвоений. Лоты предпочтительно получают из ткани одной плаценты, но могут быть получены из ткани множества плацент.
[0157] В одном неограничивающем варианте осуществления лоты или дозы амниотических адгезивных клеток получают следующим образом. Ткань амниона сначала разрушают, например, расщеплением как описано выше в Разделе 5.4.3, используя последовательные расщепления трипсином и коллагеназой. Клетки из расщепленной коллагеназой ткани культивируют, например, в течение примерно 1-3 недель, предпочтительно, примерно 2 недель. После удаления неадгезивных клеток, сформированные высокоплотные колонии собирают, например, трипсинизацией. Эти клетки собирают и ресуспендируют в подходящем объеме культуральной среды и определяют как Пассаж 0 клеток.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
3
4
[0158] Затем Пассаж 0 клеток можно использовать для посева культур для размножения. Культуры для размножения могут быть размещены на любом устройстве для культивирования клеток, например, Cell Factory NUNC™. Клетки в культуре Пассажа 0 можно разделять до любой степени для засева культуры для размножения, содержащей, например, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10 или 10×10 адгезивных клеток. Предпочтительно, используются от примерно 1×10 до примерно 3×10 клеток Пассажа 0 для посева каждой культуры для размножения. Количество культур для размножения может зависеть от количества клеток в Пассаже 0 и в большей или меньшей степени от конкретной плаценты(плацент), из которой получены адгезивные клетки.
5
2
[0159] Затем культуры для размножения можно выращивать до тех пор, пока плотность клеток в культуре не достигает определенного значения, например, примерно 1×10 клеток/см. Клетки могут быть либо собраны и криозаконсервированы в этом случае, либо пассированы в новые культуры для размножения, как описано выше. Клетки могут быть пассированы, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз до их использования. Во время размножения культуры(культур) предпочтительно ведут учет суммарного количества удвоений популяции. Клетки из культуры Пассажа 0 могут размножаться в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 удвоений, или до 60 удвоений. Однако предпочтительное количество удвоений популяции до разделения популяции клеток на отдельные дозы составляет от примерно 15 до примерно 30 удвоений. Клетки можно культивировать непрерывно в течение процесса размножения, или можно замораживать на одной или нескольких стадиях во время размножения.
6
10
[0160] Клетки, которые будут использоваться для отдельных доз, могут быть заморожены, например, криозаконсервированы для более позднего использования. Отдельные дозы могут содержать, например, от примерно 1 миллиона до примерно 50 миллионов клеток на мл, и могут содержать общее количество клеток от примерно 10 до примерно 10.
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
[0161] Таким образом, в одном из вариантов осуществления банк клеток, содержащий амниотические адгезивные клетки, может быть создан способом, содержащим: размножение первичной культуры амниотических адгезивных клеток из человеческой послеродовой плаценты в течение первого множества удвоений популяции; криоконсервирование клеток для образования Главного Банка Клеток; необязательное размножение множество клеток из Главного Банка Клеток в течение второго множества удвоений популяции; криоконсервирование размноженных клеток для образования Рабочего Банка Клеток; необязательное размножение множества размноженных амниотических адгезивных клеток из Рабочего Банка Клеток в течение третьего множества удвоений популяции; и криоконсервирование полученных размноженных клеток в отдельных дозах, причем указанные отдельные дозы, все вместе, составляют Банк Клеток. Банк может включать дозы или лоты исключительно амниотических адгезивных клеток или может включать комбинацию большого количества амниотических адгезивных клеток и лоты или дозы другого вида клеток, например, другого вида клеток-предшественников или стволовых клеток. Предпочтительно, каждая отдельная доза включает только амниотические адгезивные клетки. В другом конкретном варианте осуществления все указанные клетки в указанной первичной культуре происходят из одной и той же плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанные отдельные дозы содержат от примерно 10 до примерно 10 клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные отдельные дозы содержат от примерно 10 до примерно 10 клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные отдельные дозы содержат от примерно 10 до примерно 10 клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные отдельные дозы содержат от примерно 10 до примерно 10 клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные отдельные дозы содержат от примерно 10 до примерно 10 клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные отдельные дозы содержат от примерно 10 до примерно 10 клеток.
[0162] В некоторых вариантах осуществления амниотические адгезивные клетки могут быть взяты для оттаивания из Рабочего Банка Клеток, а затем культивированы в течение множества удвоений популяции. При получении желательного количества клеток или проведения желательного количества удвоений популяции адгезивные клетки могут быть собраны, например, центрифугированием и ресуспендированы в растворе, содержащем, например, декстран, например, 5% декстран. В некоторых вариантах осуществления декстран представляет собой декстран 40. В некоторых вариантах осуществления клетки собирают второй раз и ресуспендируют в растворе, содержащем декстран и криоконсервант, например, 5% раствор декстрана (например, декстран 40), содержащий 10% HSA и 2%-20%, например, 5% ДМСО и криоконсервируют. Криозаконсервированные амниотические адгезивные клетки могут быть оттаены, например, сразу перед использованием.
[0163] В предпочтительном варианте осуществления донор, от которого получена плацента (например, мать), проходит тестирование на наличие, по меньшей мере, одного патогена. В некоторых вариантах осуществления, если у матери результат на тестируемый патоген положительный, то весь лот из этой плаценты уничтожается. Такое тестирование можно выполнять в любое время во время создания лотов амниотических адгезивных клеток, а также до или после образования Пассажа 0 клеток, или во время создания культуры для размножения. Патогены, наличие которых проверяется, могут включать, без ограничения, гепатит A, гепатит B, гепатит C, гепатит D, гепатит E, вирус иммунодефицита человека (типы I и II), цитомегаловирус, вирус герпеса и т.п.
5.8 Использование амниотических адгезивных клеток
[0164] Предоставлются композиции, содержащие амниотические адгезивные клетки. Примеры таких композиций включают фармацевтические композиции (см. Раздел 5.8.1, ниже); матриксы и скаффолды (см. Раздел 5.8.2, ниже), и среды, кондиционированные амниотическими адгезивными клетками (см. Раздел 5.8.3, ниже).
5.8.1 Композиции, содержащие амниотические адгезивные клетки
[0165] В некоторых вариантах осуществления амниотические адгезивные клетки содержатся в фармацевтической композиции или являются ее компонентами. Клетки могут быть получены в том виде, который является легко усвояемым человеком, например, амниотические адгезивные клетки, которые содержатся в контейнере, подходящем для медицинского использования. Такой контейнер может представлять собой, например, шприц, стерильный полиэтиленовый пакет, флакон, сосуд или другой контейнер, из которого можно легко извлечь популяцию амниотических ангиогенных клеток. Например, контейнер может представлять собой контейнер для крови или другой пластиковый, подходящий с медицинской точки зрения пакет для внутривенного введения жидкости реципиенту. Контейнер, в некоторых вариантах осуществления, является контейнером, который позволяет осуществлять криоконсервацию клеток. Клетки в композициях, например предоставляемых фармацевтических композициях, могут содержать амниотические адгезивные клетки, полученные от одного донора или от множества доноров. Клетки могут быть полностью HLA-совместимыми с реципиентом, или частично или полностью HLA-несовместимыми.
6
6
7
7
8
8
9
9
10
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
[0166] Таким образом, в одном из вариантов осуществления амниотические адгезивные клетки в предоставленных в данном документе композициях вводят нуждающемуся в них индивидууму в виде композиции, содержащей амниотические адгезивные клетки, в контейнере. В другом конкретном варианте осуществления контейнер представляет собой пакет, флакон или сосуд. В более конкретном варианте осуществления указанный пакет представляет собой стерильный полиэтиленовый пакет. В более конкретном варианте осуществления указанный пакет позволяет выполнить или облегчает выполнение внутривенного введения указанных адгезивных клеток, например, путем внутривенной инфузии, болюсной инъекции и т.п. Пакет может содержать множество перегородок или компартментов, которые связаны между собой, что позволяет смешивать клетки и один или несколько других растворов, например лекарственного вещества, до или во время введения. В другом конкретном варианте осуществления до криоконсервации раствор, содержащий амниотические адгезивные клетки, содержит одно или несколько соединений, которые способствуют криоконсервации клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные амниотические адгезивные клетки находятся в физиологически приемлемом водном растворе. В более конкретном варианте осуществления указанный физиологически приемлемый водный раствор представляет собой 0,9% раствор NaCl. В другом конкретном варианте осуществления указанные амниотические адгезивные клетки содержат плацентарные клетки, которые являются HLA-совместимыми с реципиентом указанных клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные амниотические адгезивные клетки содержат клетки, которые являются, по меньшей мере, частично HLA-несовместимыми с реципиентом указанных клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные амниотические адгезивные клетки получают от множества доноров. В различных конкретных вариантах осуществления указанный контейнер содержит, по меньшей мере или самое большее 1×10 указанных клеток, 5×10 указанных клеток, 1×10 указанных стволовых клеток, 5×10 указанных клеток, 1×10 указанных клеток, 5×10 указанных клеток, 1×10 указанных клеток, 5×10 указанных клеток или 1×10 указанных клеток. В других конкретных вариантах осуществления любой из предшествующих криозаконсервированных популяций указанные клетки были пассированы примерно, по меньшей мере или не более чем 5 раз, не более чем 10 раз, не более чем 15 раз или не более чем 20 раз. В другом конкретном варианте осуществления любых из предшествующих криозаконсервированных клеток, указанные клетки размножали в указанном контейнере. В конкретных вариантах осуществления единичная доза амниотических адгезивных клеток может содержать, в различных вариантах осуществления, примерно, по меньшей мере или не более чем 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или более амниотических адгезивных клеток.
[0167] В некоторых вариантах осуществления предоставляемые фармацевтические композиции содержат популяции амниотических адгезивных клеток, которые содержат 50% жизнеспособных клеток или более (т.е., по меньшей мере, 50% клеток в популяции являются функциональными или живыми). Предпочтительно, по меньшей мере, 60% клеток в популяции жизнеспособны. Более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток в популяции в фармацевтической композиции жизнеспособны.
5.8.2 Матриксы, содержащие амниотические адгезивные клетки
[0168] Кроме того, предоставляются композиции, содержащие матриксы, гидрогели, скаффолды и т.п. Такие композиции могут использоваться вместо таких клеток в жидкой суспензии или дополнительно к ним.
[0169] Матрикс может представлять собой, например, постоянную или разлагаемую бесклеточную ткань, например, амниотическую мембрану или синтетический матрикс. Матрикс может быть трехмерным скаффолдом. В более конкретном варианте осуществления указанный матрикс содержит коллаген, желатин, ламинин, фибронектин, пектин, орнитин или витронектин. В другом более конкретном варианте осуществления матрикс представляет собой амниотическую мембрану или амниотический биоматериал, полученный из мембраны. В другом более конкретном варианте осуществления указанный матрикс содержит внеклеточный мембранный белок. В другом более конкретном варианте осуществления указанный матрикс содержит синтетическое соединение. В другом более конкретном варианте осуществления указанный матрикс содержит биологически активное соединение. В другом более конкретном варианте осуществления указанное биологически активное соединение представляет собой фактор роста, цитокин, антитело или органическую молекулу менее чем 5000 дальтон.
2
[0170] Описанные в данном документе амниотические адгезивные клетки могут быть засеены на естественный матрикс, например, плацентарный биоматериал, такой как амниотический мембранный материал. Такой амниотический мембранный материал может быть, например, амниотической мембраной, вырезанной непосредственно из плаценты млекопитающего; фиксированной или термообработанной амниотической мембраной, по существу высушенной (т.е., <20% HO) амниотической мембраной, хориальной мембраной, по существу высушенной хориальной мембраной, по существу высушенной амниотической и хориальной мембраной и т.п. Предпочтительные плацентарные биоматериалы, на которых можно высевать предоставленные амниотические адгезивные клетки, описаны у Hariri, публикации американской заявки 2004/0048796, раскрытие которой включено в настоящее описание во всей полноте в виде ссылки.
[0171] В другом конкретном варианте осуществления матрикс представляет собой композицию, содержащую внеклеточный матрикс. В более конкретном варианте осуществления указанная композиция представляет собой MATRIGEL™ (BD Biosciences).
[0172] Описанные в данном описании изолированные амниотические адгезивные клетки могут быть суспендированы в растворе гидрогеля, подходящем, например, для инъекции. Гидрогель представляет собой, например, органический полимер (естественный или синтетический), который сшит ковалентными, ионными или водородными связями, создавая трехмерную открытую решетчатую структуру, которая захватывает молекулы воды, формируя гель. Подходящие гидрогели для таких композиций включают самособирающиеся пептиды, такие как RAD16. В одном из вариантов осуществления раствор гидрогеля, содержащий клетки, можно оставлять для затвердения, например в пресс-форме для формирования матрикса, имеющего диспергированные в нем клетки для имплантации. Амниотические адгезивные клетки в такой матрице также могут быть культивированы таким образом, чтобы клетки размножались митотически, например, до имплантации. Формирующие гидрогель материалы включают полисахариды, такие как альгинат и его соли, пептиды, полифосфазины и полиакрилаты, которые являются сшитыми ионными связями, или блоксополимеры, такие как полиэтиленоксид-полипропиленгликоль блоксополимеры, которые сшивают при определенной температуре или pH, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, гидрогель или матрикс является биоразрушаемым.
in situ
[0173] В некоторых вариантах осуществления предлагаемые композиции, содержащие клетки, содержат  полимеризуемый гель (см., например, публикацию заявки на патент США 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003)). В некоторых вариантах осуществления полимеры, по меньшей мере, частично растворимы в водных растворах, таких как вода, забуференных физрастворах или водных спиртовых растворах, которые имеют заряженные боковые группы или их одновалентные ионные соли. Примеры полимеров, имеющих кислые боковые группы, которые могут реагировать с катионами, представляют собой поли(фосфазены), поли(акриловые кислоты), поли(метакриловые кислоты), сополимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, поли(винилацетат) и сульфонированные полимеры, такие как сульфонированный полистирол. Также могут использоваться сополимеры, имеющие кислые боковые группы, образованные в результате реакции акриловой или метакриловой кислоты с мономерами виниловых эфиров или полимеров. Примерами кислых групп являются группы карбоновых кислот, группы сульфоновых кислот, группы галогенизированных (предпочтительно фторированных) спиртов, фенольные ОН группы и кислые ОН группы.
[0174] В конкретном варианте осуществления матрикс представляет собой войлок, который может быть составлен из мультифиламентной пряжи, изготовленной из биорассасывающегося материала, например, PGA, PLA, PCL сополимеров или смесей или гиалуроновой кислоты. Пряжу используют для изготовления войлока, с помощью стандартных методов обработки ткани, состоящих из отбортовки, раскроя, прочеса и иглопробивания. В другом предпочтительном варианте осуществления клетки по изобретению засевают на пенообразном скаффолде, который может представлять собой композитную структуру. Кроме того, трехмерный каркас может быть формован в полезную для использования форму, такую как определенная структура в теле, которая должна быть восстановлена, заменена или приращена. Другие примеры скаффолдов, которые могут использоваться, включают нетканые маты, пористые пены или самособирающиеся пептиды. Нетканые маты могут быть сформированы из волокон, состоящих из синтетического разрушающегося сополимера гликолевой и молочной кислот (например, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc, Somerville, N.J). В качестве скаффолдов также могут использоваться пены, составленные из, например, сополимера поли(ε-капролактона)/поли(гликолевой кислоты) (PCL/PGA), сформированные с помощью процессов, таких как сублимационная сушка или лиофилизация (см., например, патент США 6355699).
in vivo
[0175] Описанные в данном описании амниотические адгезивные клетки могут быть засеяны на трехмерном каркасе или скаффолде и имплантированы . Такой каркас может быть имплантирован в комбинации с любым одним или несколькими факторами роста, клетками, лекарственными веществами или другими компонентами, которые, например, стимулируют формирование ткани, например, формирование кости или формирование сосудистой сети.
[0176] В другом варианте осуществления предлагаемые плацентарные амниотические адгезивные клетки могут быть засеяны на пенообразном скаффолде, который может представлять собой композитную структуру. Такие пенообразные скаффолды могут быть формованы в полезную для использования форму, такую как часть определенной структуры в теле, которая должна быть восстановлена, заменена или приращена. В некоторых вариантах осуществления каркас обрабатывают, например, 0,1 M уксусной кислотой с последующей инкубацией в полилизине, PBS и/или коллагене до инокуляции клеток с целью усиления их прикрепления. Внешние поверхности матрикса могут быть модифицированы для улучшения прикрепления или роста клеток и дифференцировки ткани, например, путем плазменного покрытия матрикса или добавления одного или нескольких белков (например, коллагенов, эластичных волокон, ретикулярных волокон), гликопротеинов, гликозаминогликанов (например, гепарина сульфат, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматана сульфат, кератина сульфат и т.д.), клеточного матрикса и/или других материалов таких как, но без ограничения, желатин, альгинаты, агар, агароза и растительная смола и т.п.
[0177] В некоторых вариантах осуществления матрикс содержит или обработан материалами, которые делают его нетромбообразующим. Эта обработка и материалы также могут способствовать и поддерживать эндотелиальный рост, миграцию и внеклеточное отложение матрикса. Примеры таких материалов и обработки включают, но не ограничены, естественные материалы, такие как белки базальной мембраны, такие как ламинин и коллаген типа IV, синтетические материалы, такие как EPTFE, и силиконы на основе сегментированной полиуретанмочевины, такие как PURSPAN (Polymer Technology Group, Inc, Berkley, Calif.). Матрикс также может включать антитромботические агенты, такие как гепарин; скаффолды также можно обрабатывать для изменения поверхностного заряда (например, покрытием плазмой) до засева предлагаемых адгезивных клеток.
[0178] Каркас можно обрабатывать до инокуляции предлагаемых амниотических адгезивных клеток для усиления прикрепления клеток. Например, до инокуляции клеток по изобретению нейлонный матрикс может быть обработан 0,1 молярной уксусной кислотой и инкубирован в полилизине, PBS и/или коллагене для покрытия нейлона. Полистирол также может быть обработан с помощью серной кислоты.
[0179] Кроме того, внешние поверхности трехмерного каркаса могут быть модифицированы для улучшения прикрепления или роста клеток и дифференцировки ткани, например, с помощью плазменного покрытия каркаса или добавления одного или нескольких белков (например, коллагена, эластичных волокон, ретикулярных волокон), гликопротеина, гликозаминогликанов (например, сульфата гепарина, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, сульфата дерматана, сульфата кератина), клеточного матрикса и/или других материалов таких как, но без ограничения, желатин, альгинаты, агар, агароза, или растительные смолы.
[0180] В некоторых вариантах осуществления матрикс содержит или обработан материалами, которые делают матрикс нетромбообразующим, например, естественными материалами, такими как белки базальной мембраны, такие как ламинин и коллаген типа IV, и синтетическими материалами, такими как ePTFE или силиконы на основе сегментированной полиуретанмочевины, такие как PURSPAN (Polymer Technology Group, Inc, Berkley, Calif.). Такие материалы могут быть дополнительно обработаны для того, чтобы скаффолд стал нетромбообразующим, например, гепарином, и способами обработки, которые изменят поверхностный заряд материала, таким как плазменное покрытие.
in vivo
in situ
in situ
[0181] Терапевтические клеточные композиции, содержащие амниотические адгезивные клетки, также могут быть предоставлены в виде комплекса матрикс-клетки. Матриксы могут включать биосовместимые скаффолды, решетки, самособирающиеся структуры и т.п., либо биорассасывающиеся, либо нет, жидкость, гель или твердое вещество. Такие матриксы известны в областях терапевтической клеточной профилактики, хирургической реконструкции, тканевой инженерии и заживления ран. В определенных вариантах осуществления клетки прикрепляются к матриксу. В других вариантах осуществления клетки вводятся или содержатся в пространстве матрикса. Наиболее предпочтительными являются такие комплексы матрикс-клетки, в которых клетки растут в тесной ассоциации с матриксом и, при терапевтическом применении, стимулируют и поддерживают врастание внутрь клеток реципиента, или стимулируют или поддерживают ангиогенез. Композиции матрикс-клетки могут быть введены в тело человека любым известным в данной области способом, включая, но не ограничиваясь, имплантацию, инъекцию, хирургическое прикрепление, трансплантацию с другой тканью, инъекцию и т.п. В некоторых вариантах осуществления матриксы формируются  или . Например, согласно изобретению можно использовать полимеризуемые гели. Примеры таких гелей известны в данной области.
in vivo
in vivo
in vivo
[0182] В некоторых вариантах осуществления предлагаемые клетки засевают на такой трехмерный матрикс, такой как скаффолд и имплантируют , где засеянные клетки могут пролифирировать на каркасе или в каркасе или способствуют осуществлению замены ткани  с участием или без участия других клеток. Рост амниотических адгезивных клеток или их сокультуры на трехмерном каркасе предпочтительно приводят к формированию трехмерной ткани или ее основе, которая может быть использована , например для восстановления поврежденной или больной ткани. Например, трехмерные скаффолды можно использовать для формирования трубчатых структур, например, для использования при восстановлении кровеносных сосудов; или аспектов сердечно-сосудистой системы или коронарных структур. В соответствии с одним из аспектов изобретения амниотические адгезивные клетки или их сокультуры инокулируют или засевают на трехмерный каркас или матрикс, такой как скаффолд, пена или гидрогель. Каркас можно формировать в различные формы такие, как вообще плоские, вообще цилиндрические или трубчатые, или он может иметь совершенно свободную форму в зависимости от возможных потребностей или желаний относительно корректирующей структуры. В некоторых вариантах осуществления амниотические адгезивные клетки растут на трехмерной структуре, в то время как в других вариантах осуществления клетки только выживают или даже умирают, но стимулируют или способствуют врастанию новой ткани или васкуляризации у реципиента.
6
7
[0183] Клетки по изобретению можно выращивать в свободном состоянии в культуре, удалять из культуры и инокулировать в трехмерную структуру. Инокуляция в трехмерный каркас клеток с концентрацией, например, от примерно 10 до 5×10 клеток на миллилитр, предпочтительно приводит к образованию трехмерной подложки за относительно более короткие промежутки времени. Кроме того, в некоторых приложениях может быть предпочтительным использование большего или меньшего количества клеток в зависимости от требуемого результата.
[0184] В конкретном варианте осуществления матрикс может быть вырезан в виде полоски (например, прямоугольной по форме), у которой ширина примерно равна внутренней окружности трубчатого органа, в который такая полоска будет, в конечном счете, введена. Амниотические адгезивные клетки могут быть инокулированы в скаффолд и инкубированы путем флотации или суспендирования в жидких средах. На соответствующей стадии конфлюентности скаффолд может быть скатан в трубку путем соединения его длинных краев. Затем шов может быть закрыт сшиванием этих двух краев вместе с помощью волокон соответствующего диаметра из подходящего материала. Для предотвращения закупорки просвета клетками один из открытых концов трубчатой структуры может быть прикреплен к насадке. Через эту насадку можно нагнетать жидкие среды из камеры источника, связанной с инкубационной камерой, создавая поток во внутренней полости трубчатой структуры. Другой открытый конец может быть прикреплен к выходному отверстию, которое ведет в камеру для сбора, из которой среды могут быть повторно пропущены через камеру источник. Трубка может быть отделена от насадки и выходного отверстия при завершении инкубации. См., например, международную заявку WO 94/25584.
[0185] Как правило, два трехмерных каркаса могут быть объединены в трубку по изобретению с помощью любого из следующих способов. Два или несколько плоских каркаса могут быть положены друг на друга и сшиты вместе. Полученный двухслойный лист затем может быть скатан и, как описано выше, соединен и стянут. В некоторых вариантах осуществления в один из трубчатых скаффолдов, который должен служить в качестве внутреннего слоя, могут быть инокулированы амниотические адгезивные клетки и инкубированы. Второй скаффолд может быть сформирован в виде плоской полоски, ширина которой немного больше внешней окружности трубчатой структуры. После достижения соответствующего роста плоский каркас оборачивают вокруг внешней стороны трубчатого скаффолда, а затем закрывают шов двух краев плоского каркаса и прикрепляют плоскую структуру к внутренней трубке. В другом варианте осуществления две или несколько трубчатых сеток, немного отличающихся по диаметру, могут быть выращены отдельно. Каркас с меньшим диаметром может быть вставлен внутрь большего и закреплен. Для каждого из этих способов может быть добавлено больше слоев путем повторения способа с целью получения трубки с двойным слоем. Каркасы могут быть объединены на любой стадии роста амниотических адгезивных клеток, и, при необходимости, инкубация объединенных скаффолдов может быть продолжена.
in vivo
[0186] Согласно вышесказанному, предлагаемые клетки и терапевтические композиции могут использоваться вместе с имплантируемыми устройствами. Например, амниотические адгезивные клетки могут быть введены вместе, например, со стентами, искусственными клапанами, вентрикулярными вспомогательными устройствами, разделяемыми спиралями Guglielmi и т.п. Поскольку устройства могут составлять доминирующую терапию, предоставляемую индивидууму, нуждающемуся в такой терапии, клетки и т.п. могут использоваться в качестве вспомогательной или вторичной терапия для облегчения, стимуляции или содействия заживлению, должным образом, в области внедренного устройства. Клетки и терапевтические композиции по изобретению также можно использовать для предварительной обработки некоторых имплантируемых устройств с целью минимизации проблем во время их использования . Такие предварительно обработанные устройства, включая имеющие покрытие устройства, могут лучше переноситься пациентами, получившими их, с меньшим риском возникновения локальной или системной инфекции, или например, рестеноза или дальнейшей закупорки кровеносных сосудов.
5.8.3 Среды, кондиционированные амниотическими адгезивными клетками
[0187] Кроме того предоставляется среда, которая кондиционирована амниотическими адгезивными клетками, т.е., среда, содержащая одну или несколько биомолекул, секретируемых или выделяемых адгезивными клетками. В различных вариантах осуществления кондиционированная среда содержит среду, в которой клетки росли в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или более дней, или в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 удвоений популяции или более. В других вариантах осуществления кондиционированная среда содержит среду, в которой амниотические адгезивные клетки росли, по меньшей мере, до 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% конфлюентности, или 100% конфлюентности. Такая кондиционированная среда может использоваться для поддержания культуры популяции клеток, например, стволовых клеток, например, плацентарных стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, эмбриональных зародышевых клеток, взрослых стволовых клеток или т.п. В другом варианте осуществления кондиционированная среда содержит среду, в которой амниотические адгезивные клетки и клетки, которые не являются амниотическими адгезивными клетками, были культивированы вместе.
[0188] Кондиционированная среда может содержать предлагаемые адгезивные клетки. Таким образом, предоставляется клеточная культура, содержащая амниотические адгезивные клетки. В конкретном варианте осуществления кондиционированная среда включает множество, например, популяцию, амниотических адгезивных клеток.
5.9 Модифицированные амниотические адгезивные клетки
5.9.1 Генетически модифицированные амниотические адгезивные клетки
[0189] В другом аспекте описанные в данном описании амниотические адгезивные клетки могут быть генетически модифицированы, например, для продуцирования представляющей интерес нуклеиновой кислоты или полипептида, или получения дифференцированной клетки, например, остеогенной клетки, миоцитной клетки, перицитной клетки или ангиогенной клетки, которая продуцирует представляющую интерес нуклеиновую кислоту или полипептид. Например, амниотические адгезивные клетки могут быть модифицированы для продуцирования ангиогенных факторов, таких как проангиогенные молекулы, растворимые факторы и рецепторы или промиграционные молекулы, такие как хемокины, например, фактор 1 стромальной клетки (SDF-1) или рецепторы хемокина. Генетическая модификация может осуществляться, например, с помощью векторов на основе вируса, включая, но не ограничиваясь, неинтегрирующие реплицируемые векторы, например, векторы вируса папилломы, векторы SV40, аденовирусные векторы; интегрирующие вирусные векторы, например, ретровирусные векторы или адено-ассоциированные вирусные векторы; или вирусные векторы с дефектом репликации. Другие способы введения ДНК в клетки включают использование липосом, электропорации, генной пушки, прямой инъекции ДНК или т.п.
[0190] Предоставленные адгезивные клетки могут быть, например, модифицированы или трансфицированы ДНК, управляемой или находящейся в функциональной связи с одним или несколькими соответствующими элементами управления экспрессией, например, промотором или энхансером последовательностей, терминатором транскрипции, участков полиаденилирования, внутренними сайтами входа рибосом. Предпочтительно, такая ДНК включает селектируемый маркер. После введения чужой ДНК разработанные адгезивные клетки могут быть, например, выращены в обогащенных средах, а затем переведены на селективные среды. В одном из вариантов осуществления ДНК, используемая для разработки амниотической адгезивной клетки, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид, например, цитокин, фактор роста, агент дифференцировки или терапевтический полипептид.
[0191] ДНК, используемая для разработки адгезивной клетки, может содержать любой промотор, известный в данной области для стимулирования экспрессии нуклеотидной последовательности в клетках млекопитающих, например, клетках человека. Например, промоторы включают, но не ограничены, промотор/энхансер CMV, промотор SV40, промотор папилломовируса, промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор гена эластина, и т.п. В конкретном варианте осуществления промотор является регулируемым таким образом, чтобы нуклеотидная последовательность экспрессировалась только по желанию. Промоторы могут быть либо индуцибильными (например, связанными с металлотионеином и белками теплового шока), либо конститутивными.
[0192] В другом конкретном варианте осуществления промотор является специфическим для ткани или проявляет тканеспецифичность. Примеры таких промоторов включают, но не ограничены, регуляторную область легкой цепи-2 гена миозина (Shani, 1985, Nature 314:283) (скелетная мышца).
neo
[0193] Раскрытые в данном описании амниотические адгезивные клетки могут быть разработаны или отобраны другим способом для “нокаут” (подавления) или “нокдаун” (снижения) экспрессии одного или нескольких генов в таких клетках. Экспрессия гена, нативного для клетки, может быть снижена, например, путем ингибирования экспрессии полной инактивацией гена, например, путем гомологичной рекомбинаций. В одном из вариантов осуществления, например, экзон, кодирующий важный участок белка, или экзон 5' для этого участка, прерывается положительным селективным маркером, например, , предотвращая продуцирование нормальной мРНК из целевого гена и приводя к инактивации гена. Ген также может быть инактивирован путем создания делеции на участке гена или путем удаления всего гена. При использовании конструкции с двумя участками гомологии для целевого гена, которые находятся далеко друг от друга в геноме, последовательности, встраивающие эти два участка могут быть удалены (Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084). Антисмысловые участки, морфолиновые группы, ДНКазы, небольшие интерферирующие РНК, короткие шпилькообразные РНК и рибозимные молекулы, которые подавляют экспрессию целевого гена также можно использовать для снижения уровня активности целевого гена в адгезивных клетках. Например, было показано, что молекулы антисмысловой РНК, которые ингибируют экспрессию гена главного комплекса гистосовместимости (HLA) являются наиболее универсальными в отношении иммунных ответов. Молекулы в виде тройной спирали могут быть использованы для уменьшения уровня активности целевого гена. См., например, L. G. Davis et al. (eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., включенную в настоящее описание в виде ссылки.
[0194] В конкретном варианте осуществления раскрытые в данном описании амниотические адгезивные клетки могут быть генетически модифицированы с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид, где экспрессия представляющего интерес полипептида управляется экзогенным фактором, например, полипептидом, небольшой органической молекулой и т.п. Представляющий интерес полипептид может быть терапевтическим полипептидом. В конкретном варианте осуществления представляющий интерес полипептид представляет собой IL-12 или антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra). В другом конкретном варианте осуществления представляющий интерес полипептид представляет собой слитый белок антагониста рецептора интерлейкина-1 и дигидрофолат редуктазы (DHFR), а экзогенный фактор представляет собой антифолат, например, метотрексат. Такая конструкция применяется при разработке амниотических адгезивных клеток, которые экспрессируют IL-1Ra или слитый белок IL-1Ra и DHFR при взаимодействии с метотрексатом. Такая конструкция может использоваться, например, в профилактике ревматического артрита. В этом варианте осуществления слитый белок IL-1Ra и DHFR является трансляционно нерегулируемым после воздействия антифолата, такого как метотрексат. Поэтому, в другом конкретном варианте осуществления нуклеиновая кислота, используемая для генной инженерии амниотической адгезивной клетки, может содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие первый полипептид и второй полипептид, где указанные первый и второй полипептиды экспрессируются в виде слитого белка, который является трансляционно нерегулируемым в присутствии внешнего фактора. Полипептид может экспрессироваться временно или в течение длительного промежутка времени (например, в течение недель или месяцев). Такая молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который позволяет проводить положительный отбор разработанных клеток, или позволяет визуализировать разработанные клетки. В другом конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который, например, флуоресцирует при соответствующих условиях визуализации, например, люциферазу (Luc). В другом конкретном варианте осуществления такая молекула нуклеиновой кислоты может содержать IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc, где IL-1Ra представляет собой антагонист рецептора интерлейкина-1, IRES представляет собой внутренний сайт входа рибосом, и DHFR представляет собой дигидрофолатредуктазу.
5.9.2 Линии иммортализованных амниотических адгезивных клеток
cre-lox
[0195] Амниотические адгезивные клетки млекопитающих могут быть условно иммортализованы трансфекцией любым подходящим вектором, содержащим способствующий росту ген, т.е., ген, кодирующий белок, который, при соответствующих условиях, стимулирует рост трансфицированной клетки, так, что продуцирование и/или активность способствующего росту белка регулируется внешним фактором. В предпочтительном варианте осуществления способствующий росту ген представляет собой онкоген такой как, но не ограничиваясь, v-myc, N-myc, c-myc, p53, T-антиген большой SV40, T-антиген большой полиомы, аденовирус E1a или белок E7 человеческого папилломавируса. В другом варианте осуществления амниотические адгезивные клетки могут быть иммортализованы с помощью перекомбинации , как продемонстрировано для линии человеческих панкреатических β-клеток у Narushima, M., et al (Nature Biotechnology, 2005, 23(10:1274-1282).
tet
tet,
tet
tet
tet
Escherichia coli
tet
CMV*-1
[0196] Внешняя регуляция способствующего росту белка может быть получена благодаря размещению способствующего росту гена под управлением внешне-регулируемого промотора, например, промотора, активностью которого можно управлять, например, путем изменения температуры трансфицированных клеток или состава среды в контакте с клетками. В одном из вариантов осуществления может использоваться система экспрессии тетрациклином ()-управляемого гена (см. Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996). В отсутствии -управляемый трансактиватор (tTA) в этом векторе сильно активирует транскрипцию из ph, минимального промотора человеческого цитомегаловируса, слитого с операторными последовательностями. tTA представляет собой слитый белок репрессора (tetR) -резистентного оперона транспозона-10  и кислого домена VP16 вируса простого герпеса. Низкие, нетоксичные концентрации  (например, 0,01-1,0 (мкг/мл) почти полностью отменяют трансактивацию tTA.
neo
neo
R
R
[0197] В одном из вариантов осуществления вектор также содержит ген, кодирующий селективный маркер, например, белок, который обеспечивает устойчивость к лекарственному веществу. Бактериальный ген устойчивости к неомицину () является одним из таких маркеров, который можно использовать в методах по настоящему изобретению. Клетки, несущие , могут быть отобраны средствами, которые известны специалисту в данной области, такими как добавление, например, 100-200 мкг/мл G418 в среду для роста.
in vitro
[0198] Трансфекция может быть получена любым из множества различных средств, известных специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь, ретровирусную инфекцию. Как правило, клеточная культура может быть трансфицирована путем инкубации со смесью кондиционированной среды, собранной из клеточной линии продуцента для вектора и DMEM/F12, содержащей добавки N2. Например, плацентарная клеточная культура, полученная, как описано выше, может быть трансфицирована через, например, пять дней  инкубацией в течение примерно 20 часов в одном объеме кондиционированой среды и двух объемах DMEM/F12, содержащей добавки N2. Трансфицированные клетки, несущие селективный маркер, затем могут быть отобраны, как описано выше.
[0199] В нижеописанной трансфекции культуры пассируют на поверхности, которая способствует пролиферации, например, позволяет, по меньшей мере, 30% клеток удваиваться в течение 24 часов. Подложка предпочтительно представляет собой полиорнитин/ламинин подложку, состоящую из пластика для тканевых культур, покрытого полиорнитином (10 мкг/мл) и/или ламинином (10 мкг/мл), полилизин/ламинин подложку или поверхность, обработанную фибронектином. Затем каждые 3-4 дня культуры подпитывают средой для роста, которая может быть дополнена или может не дополняться одним или несколькими усиливающими пролиферацию факторами. Усиливающие пролиферацию факторы могут быть добавлены в среду для роста, когда культуры конфлюэнтностны менее чем на 50%.
[0200] Линии условно иммортализованных амниотических адгезивных клеток могут быть пассированы с помощью стандартных методов, таких как трипсинизация при 80-95% конфлюэнтности. В некоторых вариантах осуществления полезно поддерживать отбор до примерно двадцатого пассажа (путем, например, добавления G418 для клеток, содержащих ген устойчивости к неомицину). Клетки также могут быть заморожены в жидком азоте для длительного хранения.
[0201] Клональные клеточные линии могут быть выделены из линии условно иммортализованных адгезивных клеток, полученной, как описано выше. Как правило, такие клональные клеточные линии могут быть изолированы с помощью стандартных методов, таких как предельное растворение, или с помощью колец клонирования и размножения. Клональные клеточные линии обычно можно подпитывать и пассировать, как описано выше.
[0202] Линии условно иммортализованных человеческих амниотических адгезивных клеток, которые могут быть, но не обязательно, клональными, как правило, могут быть индуцированы для дифференцировки путем подавления продуцирования и/или активности способствующего росту белка в культуральных условиях, облегчающих дифференцировку. Например, если ген, кодирующий способствующий росту белок, находится под контролем внешне-регулируемого промотора, условия, например, температура или состав среды, могут быть модифицированы для подавления транскрипции способствующего росту гена. Для системы экспрессии тетрациклин-управляемого гена, описанной выше, дифференцировка может быть получена добавлением тетрациклина с целью подавления транскрипции способствующего росту гена. Как правило, 1 мкг/мл тетрациклина в течение 4-5 дней достаточно для инициации дифференцировки. Для дополнительной стимуляции дифференцировки в среду для роста могут быть введены дополнительные вещества.
5.10 Способы лечения с использованием амниотических адгезивных клеток
5.10.1 Заболевания сердечно-сосудистой системы
[0203] Предоставленные амниотические адгезивные клетки, популяции таких клеток и популяции клеток, содержащих амниотические адгезивные клетки могут использоваться для лечения индивидуумов с различными болезненными формами или состояниями, которые можно улучшить за счет ангиогенеза. Примеры таких болезненных форм или состояний включают инфаркт миокарда, инсульт, застойную сердечную недостаточность, заболевание периферических артерий, гипопластический синдром левых отделов сердца, диабетическую язву, пролежни, венозную язву, артериальную язву, ожог, несрастающийся перелом, опухоль-ассоциированную потерю костной массы, остеоартрит и регенерацию костной челюстно-лицевой ткани. Амниотические адгезивные клетки и популяции таких клеток также можно использовать для стимуляции ангиогенеза у индивидуумов с потерей тканей в результате травм или для предотвращения образования шрама, или у индивидуумов с заменой всего сустава или зубными протезами.
[0204] В другом конкретном варианте осуществления амниотические адгезивные клетки и популяции таких клеток, предоставленные здесь, можно использовать для лечения индивидуума с недостаточностью сердечно-сосудистой системы, например, индивидуума с заболеванием периферических сосудов или болезнью коронарной артерии.
[0205] В одном из аспектов предлагаются способы лечения пациента с болезнью или поражением сердца, включающие введение терапевтической клеточной композиции пациенту с болезнью или поражением сердца или сердечно-сосудистой системы, и оценку пациента на улучшение сердечной функции, где указанная клеточная композиция содержит описанные в данном описании амниотические адгезивные клетки. В одном из вариантов осуществления болезнь сердца представляет собой кардиомиопатию. В конкретных вариантах осуществления кардиомиопатия является либо идиопатической, либо кардиомиопатией с известной причиной. В других конкретных вариантах осуществления кардиомиопатия является по своей природе либо ишемической, либо неишемической. В других вариантах осуществления болезнь сердца или сердечно-сосудистой системы содержит одну или несколько из следующего: ангиопластику, аневризм, ангину (стенокардию), аортальный стеноз, аортит, аритмию, артериосклероз, артериит, асимметричную септальную гипертрофию (ASH), атеросклероз, фибрилляцию и мерцание предсердий, бактериальный эндокардит, синдром Барлоу (пролапс митрального клапана), брадикардию, болезнь Брюгера (облитерирующий тромбоангиит), кардиомегалию, кардит, заболевание сонных артерий, коарктацию аорты, конгенитальные заболевания сердца (конгенитальные дефекты сердца), конгестивную сердечную недостаточность (сердечную недостаточность), болезнь коронарной артерии, синдром Эйзенменгера, эмболизм, эндокардит, эритромелалгию, фибрилляцию, фибромускулярную дисплазию, блокаду сердца, шум в сердце, гипертензию, гипотензию, идиопатический артериальный кальциноз на начальной стадии, болезнь Кавасаки (кожно-слизистый синдром лимфотического узла, кожно-слизистое заболевание лимфотического узла, начальная стадия полиартрита), метаболический синдром, микроваскулярную ангину, миокардиальный инфаркт (сердечный приступ), миокардит, пароксизмальную предсердную тахикардию (PAT), нодозный панантериит (полиартрит, узелковый полиартериит), перикардит, болезнь периферических сосудов, критическую ишемию конечностей, диабетическую васкулопатию, флебит, стеноз клапана легочной артерии (легочный стеноз), болезнь Рейно, стеноз почечной артерии, вазоренальную гипертензию, ревматическую болезнь сердца, дефекты перегородки, безболевую ишемию, синдром X, тахикардию, артериит Такаясу, тетраду Фалло, транспозицию магистральных сосудов, атрезию трехстворчатого клапана, артериальный ствол, порок клапана сердца, варикозные язвы, варикозное расширение вен, васкулит, дефект межжелудочковой перегородки, синдром Вольффа-Паркинсона-Уайта или дефект эндокардиальных подушек.
[0206] В других вариантах осуществления болезнь сердца или сердечно-сосудистой системы содержит одно или несколько следующих заболеваний: острый ревматизм, острый ревматический перикардит, острый ревматический эндокардит, острый ревматический миокардит, хроническую ревматическую болезнь сердца, болезни митрального клапана, митральный стеноз, ревматическую митральную недостаточность, болезнь клапана аорты, заболевания других эндокардиальных структур, ишемическую болезнь сердца (острую и подострую), стенокардию, заболевания легочного кровообращения (острую сердечно-легочную недостаточность, легочный эмболизм, хроническую сердечно-легочную недостаточность), кифосколиотическую болезнь сердца, миокардит, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, эндокардиальный фиброэластоз, атриовентрикулярную блокаду, сердечную аритмию, дегенерацию миокарда, заболевания сердечно-сосудистой системы, включая цереброваскулярную болезнь, окклюзию и стеноз прецеребральных артерий, окклюзию и стеноз церебральных артерий, болезни артерий, артериолов и капилляров (артериосклероз, аневризм) или болезни вен и лимфотических сосудов.
[0207] В одном из вариантов лечение содержит лечение пациента с кардиомиопатией с помощью терапевтической клеточной композиции, содержащей амниотические адгезивные клетки либо с другим типом клеток, либо без них. В других предпочтительных вариантах осуществления пациент получает улучшения от терапии, например, способности клеток поддерживать рост других клеток, включая стволовые клетки или клетки-предшественники, имеющиеся в сердце, от прорастания внутрь ткани или васкуляризации ткани и от наличия полезных клеточных факторов, хемокинов, цитокинов и т.п., но клетки не интегрируют или не размножаются в теле пациента. В другом варианте осуществления пациент получает улучшения от терапевтической профилактики с помощью клеток, но в теле пациента не сохраняется жизнеспособность клеток в течение длительного периода времени. В одном из вариантов осуществления количество клеток, их жизнеспособность или биохимическая активность постепенно уменьшается. В других вариантах осуществления уменьшению количества клеток может предшествовать период их активности, например рост, деление или биохимическая активность. В других вариантах осуществления старые, нежизнеспособные или даже мертвые клетки могут обладать полезным терапевтическим эффектом.
[0208] Улучшение состояния индивидуума, имеющего болезнь или нарушение сердечно-сосудистой системы, где индивидууму вводят амниотические адгезивные клетки или терапевтические композиции, предлагаемые здесь, можно оценивать или продемонстрировать путем детектируемого улучшения одного или нескольких симптомов болезни или нарушения сердечно-сосудистой системы.
[0209] В другом варианте осуществления улучшение состояния индивидуума, имеющего болезнь или нарушение сердечно-сосудистой системы, где индивидууму вводят амниотические адгезивные клетки или терапевтические композиции, предлагаемые здесь, можно оценивать или продемонстрировать с помощью детектируемого улучшения одного или нескольких показателей сердечной функции, например, демонстрацией детектируемого улучшения одного или нескольких из следующих показателей: сердечный выброс (CO), сердечный индекс (CI), давление заклинивания в легочной артерии (PAWP), сердечный индекс (CI), % функции укорочения (%FS), функция выброса (EF), фракция выброса левого желудочка (LVEF); конечно-диастолический диаметр левого желудочка (LVEDD), конечно-систолический диаметр левого желудочка (LVESD), сократительная способность (например, dP/dt), петель “давление-объем”, измерения работы сердца, функционирование предсердий или желудочков, увеличение эффективности накачки, уменьшение скорости падения эффективности накачки, уменьшение потери гемодинамической эффективности; и уменьшение осложнений, ассоциированных с кардиомиопатией, по сравнению с показателями индивидуума до введения амниотических адгезивных клеток.
[0210] Улучшение состояния индивидуума, принимающего терапевтические композиции, предлагаемые здесь, также можно оценивать, используя субъективные показатели, например, оценкой самого индивидуума его или ее состояния здоровья после введения.
[0211] Успех введения клеток не основан, в некоторых вариантах осуществления, на выживании введенных амниотических адгезивных клеток в оргинизм индивидуума. Вместо этого, успех основан на одном или нескольких показателях улучшения здоровья сердца или сердечно-сосудистой системы, как отмечено выше. Таким образом, клетки не должны быть интегрированы и пульсировать в сердце пациента или кровеносных сосудах.
[0212] В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы лечения содержат стимуляцию терапевтических амниотических адгезивных клеток к дифференцировке согласно дифференцировке мезенхимных клеток, например, в кардиомиогенный, ангиогенный или васкулогенный фенотип или клетки, или в такие клетки, как миоциты, кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, миокардиальные клетки, эпикардиальные клетки, сосудистые эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры (например, клетки сосудистой гладкой мускулатуры).
[0213] Введение амниотических адгезивных клеток или терапевтических композиций, содержащих такие клетки, нуждающемуся в них индивидууму можно осуществлять, например, с помощью трансплантации, имплантанции (например, самих клеток или клеток в виде части комбинации матрикс-клетки), инъекции (например, непосредственно в участок болезни или состояния, например, непосредственно в ишемический участок в сердце индивидуума, у которого был инфаркт миокарда), инфузии, доставки через катетер или любых других средств, известных в данной области для проведения клеточной терапии.
[0214] В одном из вариантов осуществления терапевтические клеточные композиции предоставляют нуждающемуся в них индивидууму, например, путем инъекции в один или несколько участков тела индивидуума. В конкретном варианте осуществления терапевтические клеточные композиции предоставляют путем внутрисердечной инъекции, например, в ишемичскую область сердца. В других конкретных вариантах осуществления клетки инъецируют на поверхности сердца, в смежную область или даже в более удаленную область. В предпочтительных вариантах осуществления клетки могут быть введены в больную или травмированную область.
[0215] Индивидууму, имеющему болезнь или состояние коронарных или сосудистых систем, можно вводить амниотические адгезивные клетки в любое время, когда клетки могли бы быть терапевтически полезными. В некоторых вариантах осуществления, например, клетки или терапевтические композиции по изобретению вводят в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней после инфаркта миокарда. Введение, ближайшее по времени к инфаркту миокарда, например, в течение 1-3 или 1-7 дней, является предпочтительным по отношению к введению, более отдаленному по времени, например, спустя 3 или 7 дней после инфаркта миокарда. В других вариантах осуществления клетки или терапевтические композиции изобретения вводят в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней после вынесения первичного диагноза заболевания или состояния.
[0216] Также предоставляются наборы для использования при лечении инфаркта миокарда. Наборы предоставляют терапевтическую клеточную композицию, которая может быть приготовлена в фармацевтически приемлемой форме, например, путем смешивания с фармацевтически приемлемым носителем, и аппликатор наряду с инструкцией по применению. В идеале набор можно использовать в определенной области, например, в офисе врача или человеком, оказывающим неотложную помощь пациенту, которому поставлен диагноз инфаркта миокарда или аналогичный случай сердечного заболевания.
[0217] В конкретных вариантах осуществления предлагаемых в данном описании способов лечения амниотические адгезивные клетки вводят со стволовыми клетками (т.е., стволовыми клетками, которые не являются амниотическими адгезивными клетками), миобластами, миоцитами, кардиомиобластами, кардиомиоцитами или предшественниками миобластов, миоцитов, кардиомиобластов и/или кардиомиоцитов.
[0218] В конкретном варианте осуществления предоставляемые в данном описании способы лечения включают введение амниотических адгезивных клеток, например, терапевтической композиции, содержащей эти клетки, пациенту с болезнью сердца или сердечно-сосудистой системы; и оценку пациента относительно улучшения сердечной функции, где терапевтическую клеточную композициию вводят в виде комплекса матрикс-клетки. В некоторых вариантах осуществления матрикс представляет собой скаффолд, предпочтительно биорассасывающийся, содержащий по меньшей мере клетки.
[0219] Наконец, предоставляются популяции амниотических адгезивных клеток, инкубированных в присутствии одного или нескольких факторов, которые стимулируют дифференцировку стволовых клеток или клеток-предшественников по кардиогенному, ангиогенному, гемангиогенному или васкулогенному типу дифференцировки. Такие факторы известны в данной области; подходящие условия для дифференцировки можно определить с помощью обычных экспериментов. Такие факторы включают, но не ограничены, факторы, такие как факторы роста, хемокины, цитокины, клеточные продукты, агенты деметилирования и другие стимуляторы, которые известны в настоящее время или могут быть определены позже как стимуляторы дифференцировки, например, стволовых клеток по кардиогенному, ангиогенному, гемангиогенному или васкулогенному типу или пути.
[0220] Амниотические адгезивные клетки могут дифференцироваться по кардиогенному, ангиогенному, гемангиогенному или васкулогенному пути или типу культуры клеток в присутствии факторов, включающих по меньшей мере один из: агента диметилирования, BMP, FGF, белка фактора Wnt, Hedgehog и/или анти-Wnt факторов.
[0221] Включение агентов диметилирования позволяет осуществлять дифференцировку клеток согласно линии мезенхимных клеток по кардиомиогенному пути. Дифференцировка может быть определена, например, путем экспрессии, по меньшей мере, одного из следующего: кардиомиозина, скелетного миозина или GATA4; или путем получения пульсирующего ритма, индуцированного самопроизвольно или иным образом; или согласно способности к интеграции, по меньшей мере, частично в сердечную мышцу пациента, не вызывая при этом аритмии. Агенты диметилирования, которые можно использовать для стимуляции такой дифференцировки, включают, но не ограничены, 5-азацитидин, 5-аза-2'-дезоксицитидин, диметилсульфоксид, хелеритрин хлорид, ретинойную кислоту или ее соли, 2-амино-4-(этилтио)масляную кислоту, прокаинамид и прокаин.
[0222] В некоторых вариантах осуществления клетки, индуцированные одним или несколькими определенными выше факторами, становятся кардиомиогенными, ангиогенными, гемангиогенными или васкулогенными клетками или предшественниками. Предпочтительно, по меньшей мере, когда некоторые из клеток могут быть интегрированы по меньшей мере частично в сердечно-сосудистую систему реципиента, включая, но не ограничиваясь, сердечную мышцу, сосудистые и другие структуры сердца, сердечные или периферические кровеносные сосуды и т.п. В некоторых других вариантах осуществления дифференцированные амниотические адгезивные клетки дифференцируются в клетки, приобретающие два или несколько показателей кардиомиогенных клеток или их предшественников, и имеют способность к частичной или полной интеграции в сердце или сосудистую сеть реципиента. В конкретных вариантах осуществления, клетки, которые вводят индивидууму, не приводят к усилению аритмии, увеличению сердечных нарушений, нарушений кровеносных сосудов или других аномалий сердечно-сосудистой системы или здоровья индивидуума. В некоторых вариантах осуществления амниотические адгезивные клетки влияют на стимуляцию дифференцировки стволовых клеток, которые являются естественными для сердечной мускулатуры, кровеносных сосудов, крови и т.п. пациента, для их самостоятельной дифференцировки, например, в кардиомиоциты или, по меньшей мере, по кардиомиогенному, ангиогенному, гемангиогенному или васкулогенному пути.
[0223] Амниотические адгезивные клетки и популяции таких клеток могут быть предоставлены индивидууму с терапевтической или профилактической целью, например, индивидууму, имеющему болезнь, нарушение или состояние или поражение сердца или сердечно-сосудистой системы. Такие болезни, нарушения или состояния могут включать застойную сердечную недостаточность в результате атеросклероза, кардиомиопатии или поражения сердца, например, ишемического поражения, такого как от инфаркта миокарда или раны (острой или хронической).
[0224] В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят терапевтически эффективное количество амниотических адгезивных клеток, например, в популяции клеток, которая содержит амниотические адгезивные клетки. В конкретном варианте осуществления популяция содержит примерно 50% амниотических адгезивных клеток. В другом конкретном варианте осуществления популяция является по существу гомогенной популяцией амниотических адгезивных клеток. В других вариантах осуществления популяция содержит, по меньшей мере, примерно 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 33%, 40%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80% или 90% амниотических адгезивных клеток.
[0225] Амниотические адгезивные клетки можно вводить индивидууму в виде терапевтической композиции, содержащей эти клетки и другой терапевтический агент, такой как инсулин-подобный фактор роста (IGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), IL-8, антитромбогенный агент (например, гепарин, производные гепарина, урокиназу и PPack (декстрофенилаланин пролин аргинин хлорметилкетон); производные антитромбина, антагонисты рецепторов тромбоцитов, антитела к тромбину, антитела к рецепторам тромбоцитов, аспирин, дипиридамол, протамин, гирудин, ингибиторы простагландинов и/или ингибиторы тромбоцитов), антиапоптотический агент (например, EPO, производные и аналоги EPO и его соли, TPO, IGF-I, IGF-II, фактор роста гепатоцитов (HGF) или ингибиторы каспазы), противовоспалительный агент (например, ингибиторы киназы P38 MAP, статины, ингибиторы IL-6 и IL-1, пемироласт, траниласт, ремикад, сиролимус, нестероидные противовоспалительные соединения, например, ацетилсалициловую кислоту, ибупрофен, тепоксалин, толметин или супрофен), иммунодепрессивный или иммуномодуляторный агент (например, ингибиторы кальциневрина, например циклоспорин, такролимус, ингибиторы mTOR, такие как сиролимус или эверолимус; антипролиферативный агент, такой как азатиоприн и микофенолята мофетил; кортикостероиды, например, преднизолон или гидрокортизон; антитела, такие как моноклональные антитела к IL-2Ra рецепторам, базиликсимаб, даклизум, поликлональные антитела к T-клеткам, такие как глобулин антитимоцит (ATG), глобулин антилимфоцит (ALG) и моноклональное антитело к T клеткам OKT3, или адгезивные плацентарные стволовые клетки, описанные в патенте США 7468276, и публикации заявки на патент СЩА 2007/0275362, раскрытие которых включено в настоящее описание во всей полноте в качестве ссылки) и/или антиоксиданты (например, пробукол; витамины А, C, и E, кофермент Q-10, глутатион, L цистеин, N-ацетилцистеин или производные, аналоги или соли антиокислителей). В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции, содержащие амниотические адгезивные клетки, также содержат один или несколько дополнительных типов клеток, например, взрослые клетки (например, фибробласты или эндотелиальные клетки) или стволовые клетки или клетки-предшественники. Такие терапевтические агенты и/или один или несколько типов дополнительных клеток могут быть введены нуждающемуся в этом индивидууму отдельно или в комбинации или двумя или несколькими такими соединениями или агентами.
[0226] В некоторых вариантах осуществления индивидуум, проходящий лечение, является млекопитающим. В конкретном варианте осуществления индивидуум, получающий лечение, является человеком. В конкретных вариантах осуществления индивидуум представляет собой домашний скот или домашнее животное. В других конкретных вариантах осуществления индивидуум, проходящий лечение, является лошадью, овцой, коровой или бычком, свиньей, собакой или кошкой.
5.10.2 Инсульт и другие ишемические болезни
[0227] В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения индивидуума с нарушением кровотока, например, в головном мозге или в районе головного мозга, или в периферической сосудистой сети, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества AMDAC. В некоторых конкретных вариантах осуществления ишемия представляет собой периферическую артериальную болезнь (PAD), например, является критической ишемией конечностей (CLI). В некоторых других вариантах осуществления ишемия представляет собой ишемию центральной нервной системы (ЦНС). В некоторых других вариантах осуществления ишемия представляет собой периферическую артериальную болезнь, ишемическую болезнь сосудов, ишемическую болезнь сердца, ишемическую болезнь мозга или ишемическую болезнь почек.
[0228] В конкретном варианте осуществления указанное нарушение кровотока представляет собой инсульт. В более конкретном варианте осуществления указанный инсульт представляет собой ишемический инсульт. В другом более конкретном варианте осуществления указанный инсульт представляет собой геморрагический инсульт, например, внутричерепное кровоизлияние мозга или спонтанное субарахноидальное кровоизлияние. В другом конкретном варианте осуществления указанное нарушение представляет собой гематому. В более конкретном варианте осуществления гематома представляет собой дуральную гематому, субдуральную гематому или субарахноидальную гематому. В другом конкретном варианте осуществления указанная гематома вызвана приложением внешней силы к черепу, например, повреждением головы. В другом конкретном варианте осуществления указанное нарушение представляет собой транзитную ишемическую атаку (TIA), например, рецидивную TIA. В другом конкретном варианте осуществления указанное нарушение представляет собой вазоспазм, например, вазоспазм после геморрагического инсульта.
[0229] В другом конкретном варианте осуществления способа указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество AMDAC, которое приводит к устранению, детектируемому улучшению, снижению тяжести или замедлению прогрессирования одного или нескольких симптомов или неврологических расстройств, относящихся к нарушению кровотока в головном мозге или ЦНС или в районе головного мозга и ЦНС, которое проявляются у указанного индивидуума, например, аноксическое повреждение или повреждение от гипоксии. В другом конкретном варианте осуществления указанное терапевтически эффективное количество изолированных AMDAC вводят указанному индивидууму с профилактической целью, например, для уменьшения или устранения неврологического повреждения, вызванного вторым или последующим нарушением кровотока в головном мозге или ЦНС или в районе головного мозга и ЦНС после указанного нарушения кровотока.
[0230] В другом конкретном варианте осуществления указанный симптом нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга, например, инсульт, аноксическое повреждение или повреждение от гипоксии представляет собой одно или несколько из: гемиплегии (паралича одной стороны тела); гемипареза (слабости одной стороны тела); слабости мышц лица; онемения; снижения чувствительности; изменения обоняния, вкуса, слуха или зрения; потери обоняния, вкуса, слуха или зрения; обвисания века (падения); детектируемой слабости глазной мышцы; сниженного рвотного рефлекса; сниженной способности глотать; сниженной реакции зрачка на свет; пониженной чувствительности лица; сниженного баланса; нистагмы; измененной скорости дыхания; измененной частоты сердечных сокращений; слабости грудино-ключично-сосцевидной мышцы с уменьшенной способностью или неспособностью поворачивать голову в одну сторону; слабости в языке; афазии (неспособности говорить или понять язык); апраксии (измененных произвольных движений); дефекта в поле зрения; дефицита памяти; геминеглекта или игнорирования части пространства (дефицита внимании к пространству со стороны визуальной области, находящейся напротив повреждения); дезорганизованного мышления; дезориентации; развития гиперсексуальных жестов; анозогнозии (постоянного отрицания наличия дефицита); трудностей при ходьбе; измененной координации движения; головокружения; нарушения равновесия; потери сознания; головной боли; и/или рвоты.
[0231] В другом конкретном варианте осуществления описанные выше способы лечения включают введение второго терапевтического агента указанному индивидууму. В более конкретном варианте осуществления указанный второй терапевтический агент представляет собой нейропротективный агент. В более конкретном варианте осуществления указанный второй терапевтический агент представляет собой NXY-059 (дисульфонил-производное фенилбутилнитрона: динатриевый 4-((трет-бутилимино)-метил)бензол-1,3-дисульфоната N-оксид или динатриевый 4-((оксидо-трет-бутил-азаниумилиден)метил)бензол-1,3-дисульфонат; также известный как дисуфентон). В другом более конкретном варианте осуществления второй терапевтический агент представляет собой тромболитический агент. В более конкретном варианте осуществления указанный тромболитический агент представляет собой активатор плазминогена тканевого типа (tPA). В вариантах осуществления, в которых нарушение кровотока в головном мозге или в районе головного мозга представляет собой кровоизлияние, второй терапевтический агент может быть противогипертензивным лекарственным веществом, например, бета-блокатором или диуретиком, комбинацией диуретика и калийсберегающего диуретика, комбинацией бета-блокатора и диуретика, комбинацией ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента (АСЕ) и диуретика, антагониста ангиотензина II и диуретика, и/или блокатора кальциевого канала и ингибитором АСЕ. В другом боее конкретном варианте осуществления второй терапевтический агент предсталяет собой блокатор кальциевого канала, антагонист глутамата, агонист гамма-аминомасляной кислоты (GABA), антиоксидант или акцептор свободных радикалов.
[0232] В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в пределах 21-30, например, 21 дня развития одного или нескольких симптомов нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга у указанного индивидуума, например, в пределах 21-30, например, 21 дня развития симптомов инсульта, аноксического повреждения или повреждения от гипоксии. В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в течение 14 дней после развития одного или нескольких симптомов нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга у указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в течение 7 дней после развития одного или нескольких симптомов нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга у указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в течение 48 часов после развития одного или нескольких симптомов нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга у указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в течение 24 часов после развития одного или нескольких симптомов нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга у указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в течение 12 часов после развития одного или нескольких симптомов нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга у указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в течение 3 часов после развития одного или нескольких симптомов нарушения кровотока в головном мозге или в районе головного мозга у указанного индивидуума.
[0233] В конкретном варианте осуществления указанное нарушение кровотока представляет собой критическую ишемию конечностей. В другом более конкретном варианте осуществления указанная CLI представляет собой тяжелую блокаду артерий нижних оконечностей, которая заметно снижает кровоток. В другом более конкретном варианте осуществления указанная CLI характеризуется ишемической остаточной болью, сильной болью в ногах и ступнях, хотя индивидуум не двигается, незаживающими ранами на ногах или ступнях, болью или онемением в ступнях, глянцевитой, гладкой, сухой кожей на ногах или ступнях, утолщением ногтей на пальцах ноги, отсутствием или сниженным пульсом в ногах или ступнях, открытыми ранами, кожными инфекциями или язвами, которые не заживают, сухой гангреной (сухой, черной кожей) ног или ступней. В другом конкретном варианте осуществления CLI может привести к потере пальцев и или целых конечностей. В другом конкретном варианте осуществления способа указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество AMDAC, которое приводит к устранению, детектируемому улучшению, уменьшению тяжести или замедлению прогрессирования одного или нескольких симптомов из: потери функции конечности и/или недостатка кислорода (гипоксия/аноксия), характерного для нарушения кровотока в головном мозге или ЦНС или в районе головного мозга или ЦНС, которые проявляются у указанного индивидуума, например, аноксическое повреждение или повреждение от гипоксии. В другом конкретном варианте осуществления указанное терапевтически эффективное количество изолированных AMDAC вводят указанному индивидууму с профилактической целью, например, для уменьшения или устранения повреждения ткани, вызванного вторым или последующим нарушением кровотока в конечности или в районе конечности после указанного нарушения кровотока.
5.10.3 Дозировки и пути введения
[0234] Введение AMDAC нуждающемуся в этом индивидууму можно осуществлять приемлемым с медицинской точки зрения способом, релевантным для заболевания или состояния, которое следует вылечить. В другом конкретном варианте осуществления описанного выше способа лечения указанные AMDAC вводят путем болюсной инъекции. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят путем внутривенной инфузии. В конкретном варианте осуществления указанная внутривенная инфузия представляет собой внутривенную инфузию в течение от примерно 1 до примерно 8 часов. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят интракраниально. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят внутримышечно. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят интраперитонеально. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят внутриартериально. В более конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят в область ишемического очага. В другом более конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят в периферическую область ишемического очага. В другом конкретном варианте осуществления способа лечения указанные изолированные AMDAC вводят внутримышечно, внутрикожно или подкожно.
4
5
5
6
6
7
7
8
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
6
7
6
[0235] В другом конкретном варианте осуществления описанных выше способов лечения указанные AMDAC вводят указанному индивидууму один раз. В другом конкретном варианте осуществления указанные изолированные AMDAC вводят указанному индивидууму в виде двух или нескольких отдельных введений. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение примерно от 1×10 до 1×10 изолированных AMDAC, например, AMDAC на килограмм веса тела указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение примерно от 1×10 до 1×10 изолированных AMDAC на килограмм веса тела указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение примерно от 1×10 до 1×10 изолированных AMDAC на килограмм веса тела указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение примерно от 1×10 до 1×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума. В других конкретных вариантах осуществления указанное введение включает введение от примерно 1×10 до примерно 2×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 2×10 до примерно 3×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 3×10 до примерно 4×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 4×10 до примерно 5×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 5×10 до примерно 6×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 6×10 до примерно 7×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 7×10 до примерно 8×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 8×10 до примерно 9×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума; от примерно 9×10 до примерно 1×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение указанному индивидууму от примерно 1×10 до примерно 2×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение указанному индивидууму от примерно 1,3×10 до примерно 1,5×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение указанному индивидууму примерно до 3×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм веса тела указанного индивидуума. В конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение от примерно 5×10 до примерно 2×10 изолированных плацентарных клеток указанному индивидууму. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение указанному индивидууму примерно 150×10 изолированных плацентарных клеток примерно в 20 миллилитрах раствора.
6
7
7
9
8
9
7
8
7
[0236] В конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение от примерно 5×10 до примерно 2×10 изолированных плацентарных клеток указанному индивидууму, причем указанные клетки содержатся в растворе, содержащем 10% декстран, например, декстран 40, 5% сывороточный человеческий альбумин и необязательно иммунодепрессант. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение примерно от 5×10 до 3×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В более конкретных вариантах осуществления указанное введение включает введение примерно 9×10 изолированных плацентарных клеток или примерно 1,8×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В другом конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение примерно от 5×10 до 1×10 изолированных плацентарных клеток интракраниально. В более конкретном варианте осуществления указанное введение включает введение примерно 9×10 изолированных плацентарных клеток интракраниально.
5.11 Дифференциация амниотических адгезивных клеток
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
[0237] Предоставленные амниотические адгезивные клетки могут быть дифференцированы. В одном из вариантов осуществления клетка была дифференцирована в достаточной степени для указанной клетки, чтобы проявлять, по меньшей мере, одну из характеристик эндотелиальной клетки, миогенной клетки или перицитной клетки, например, путем взаимодействия клетки с сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), или как описано ниже в Разделах 5.11.2, 6.3.3 или 6.3.4. В более конкретных вариантах осуществления указанная характеристика эндотелиальной клетки, миогенной клетки или перицитной клетки представляет собой экспрессию одного или нескольких из: CD9, CD31, CD54, CD102, NG2 (нервный/глиальный антиген 2) или альфа-актина гладкой мускулатуры, которая увеличена по сравнению с амниотической клеткой, представляющей собой ОСТ-4, VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200 и VE-кадгерин. В других более конкретных вариантах осуществления указанная характеристика эндотелиальной клетки, миогенной клетки или перицитной клетки представляет собой экспрессию одного или нескольких из: CD9, CD31, CD54, CD102, NG2 (нервный/глиальный антиген 2) или альфа-актина гладкой мускулатуры, которая увеличена по сравнению с амниотической клеткой, представляющей собой ОСТ-4, VEGFR2/KDR и VEGFR1/Flt-1.
5.11.1 Индукция Ангиогенеза
-9
-4
4
[0238] Ангиогенез предлагаемых амниотических адгезивных клеток может быть осуществлен следующим образом. Амниотические адгезивные клетки культивируют, например, в среде для эндотелиальных клеток, например, EGM-2 (Lonza) или среде, содержащей 60% DMEM-LG (Gibco), 40% MCDB-201 (Sigma); 2% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone Labs.); 1x инсулин-трансферрин-селен; 1x линолевая кислота-бычий сывороточный альбумин (LA-BSA); 5×10 М дексаметазона (Sigma); 10 М аскорбиновой кислоты 2-фосфата (Sigma); 10 нг/мл эпидермального фактора роста (R&D Systems); и 10 нг/мл фактора роста фибробластов (PDGF-BB) (R&D Systems), в течение 3-х пассажей. Затем клетки помещают на MATRIGEL™ или подложку, содержащую коллаген-1, например, в 96-ти луночном планшете с плотностью, например, примерно 1,5×10 клеток на лунку в той же самой среде или DMEM с FBS (0-5% об./об.), содержащей, например, примерно 10-50 нанограммов на миллилитр сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Среду можно менять примерно два раза в неделю. Ангиогенез оценивают визуальным осмотром клеток на образование аналогичных сосудам структур и формирование трубок, видимых под микроскопом с усилением, например, от 50X до 100X.
5.11.2 Индукция дифференцировки в сердечные клетки
[0239] Миогенная (кардиогенная) дифференцировка предоставленных амниотических адгезивных клеток может быть получена, например, путем помещения клеток в условия, необходимые для клеточной культуры, которые индуцируют дифференцировку в кардиомиоциты. Предпочтительная среда для кардиомиоцитов содержит DMEM/20% CBS, дополненную ретиноидной кислотой, 1 мкM; основным фактором роста фибробластов, 10 нг/мл; трансформирующим фактором роста бета-1, 2 нг/мл; и эпидермальным фактором роста, 100 нг/мл. Вместо CBS можно использовать KnockOut Serum Replacement (Invitrogen, Carlsbad, California). В качестве альтернативы, амниотические адгезивные клетки культивируют в DMEM/20% CBS, дополненной 1-100, например, 50 нг/мл кардиотропина-1 в течение 24 часов. В другом варианте осуществления амниотические адгезивные клетки можно культивировать 10-14 дней в среде без белков, затем в течение 5-7 дней стимулировать экстрактом миокарда человека, например, полученным гомогенизацией человеческого миокарда в 1% буфере HEPES, дополненным 1% сывороткой крови пуповины.
[0240] Дифференцировку можно подтвердить демонстрацией экспрессии гена сердечного актина, например, с помощью ОТ-ПЦР, или видимым пульсированием клетки. Считается, что адгезивная клетка дифференцировалась в сердечную клетку, когда клетка демонстрирует одну или несколько таких характеристик.
6. Примеры
6.1 Пример 1: Выделение и размножение адгезивных клеток из амниотической мембраны
[0241] В этом примере продемонстрировано выделение и размножение амниотических адгезивных клеток.
6.1.1 Выделение
[0242] Амниотические адгезивные клетки были выделены из амниотической мембраны следующим образом. Амнион/хорион отсекали от плаценты, и амнион вручную отделяли от хориона. Амнион промывали стерильной PBS для удаления остаточной крови, сгустков крови и другого материала. Стерильную марлю использовали для удаления дополнительной крови, сгустков крови или другого материала, который не был удален промывкой, затем амнион снова промывали PBS. Избыток PBS удаляли с мембраны, и амнион разрезали скальпелем на сегменты размером 2 на 2 дюйма. Для высвобождения эпителиальных клеток рабочий сосуд устанавливали путем подсоединения стеклянного рабочего сосуда со стерильной рубашкой к циркулирующей при 37°C водяной бане, используя трубки и коннекторы, и устанавливали на пластине для смешивания. Трипсин (0,25%, 300 мл) нагревали до 37°C в рабочем сосуде; добавляли сегменты амниона, и суспензию амнион/трипсин взбалтывали, например, при 100-150 об./мин. при 37°С в течение 15 минут. Стерильную скрининговую систему устанавливали путем размещения стерильной емкости в стерильной области рядом с рабочим сосудом и в емкость (Millipore, Billerica, MA) вводили стерильный экран 75 мкм-125 мкм. После взбалтывания сегментов амниона в течение 15 минут содержимое рабочего сосуда переносили на экран, и сегменты амниона переносили, например, используя стерильный пинцет, назад в рабочий сосуд; раствор трипсина, содержащий эпителиальные клетки, удаляли. Сегменты амниона снова взбалтывали с 300 мл раствора трипсина (0,25%), как описано выше. Экран ополаскивали примерно 100-150 мл PBS, и раствор PBS выливали. После взбалтывания сегментов амниона в течение 15 минут содержимое рабочего сосуда переносили на экран. Сегменты амниона снова возвращали в рабочий сосуд; раствор трипсина, содержащий эпителиальные клетки, удаляли. Сегменты амниона снова взбалтывали с 300 мл раствора трипсина (0,25%), как описано выше. Экран ополаскивали примерно 100-150 мл PBS, и раствор PBS выливали. После взбалтывания сегментов амниона в течение 15 минут содержимое рабочего сосуда переносили на экран. Сегменты амниона затем возвращали в рабочий сосуд, и раствор трипсина, содержащий эпителиальные клетки, выливали. Сегменты амниона взбалтывали в PBS/5% FBS (1:1 отношение амниона к PBS/5% FBS по объему) при 37°C в течение примерно 2-5 минут для нейтрализации трипсина. Собирали свежую стерильную скрининговую систему. После нейтрализации трипсина содержимое рабочего сосуда переносили на новый экран, и сегменты амниона возвращали в рабочий сосуд. В рабочий сосуд добавляли стерильный PBS (400 мл) при комнатной температуре, и содержимое рабочего сосуда взбалтывали в течение примерно 2-5 минут. Экран ополаскивали примерно 100-150 мл PBS. После взбалтывания содержимое рабочего сосуда переносили на экран; рабочий сосуд ополаскивали PBS, и раствор PBS выливали. Затем рабочий сосуд заполняли 300 мл предварительно нагретой DMEM, и сегменты амниона переносили в раствор DMEM.
2
g
[0243] Для высвобождения амниотических адгезивных клеток обработанную амниотическую мембрану обрабатывали далее коллагеназой следующим образом. Стерильный маточный раствор коллагеназы (500 Ед./мл) готовили путем растворения соответствующего количества порошка коллагеназы (количество зависит от активности партии коллагеназы, полученной от поставщика) в DMEM. Раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр и распределяли по отдельным стерильным контейнерам. Раствор CaCl (0,5 мл, 600 мМ) добавляли к каждой 100 мл дозе, и дозы замораживали. К сегментам амниона в рабочем сосуде добавляли коллагеназу (100 мл), и рабочий сосуд взбалтывали в течение 30-50 минут или до тех пор, пока согласно визуальному осмотру не произошло полное расщепление амниона. После окончания расщепления амниона в рабочий сосуд добавляли 100 мл предварительно нагретого стерильного PBS/5% FBS, и рабочий сосуд взбалтывали в течение дополнительных 2-3 минут. После взбалтывания содержимое сосуда переносили на стерильный 60 мкм экран, и жидкость собирали вакуумной фильтрацией. Рабочий сосуд ополаскивали 400 мл PBS, и раствор PBS фильтровали. Затем отфильтрованную суспензию клеток центрифугировали при 300× в течение 15 минут при 20°C, и клеточные пеллеты ресуспендировали в предварительно нагретом PBS/2% FBS (общее количество примерно 10 мл).
6.1.2 Создание клеточной линии
2
2
g
[0244] Свежеизолированные ангиогенные амниотические клетки добавляли в среду для роста, содержащую 60% DMEM-LG (Gibco); 40% MCBD-201 (Sigma); 2% FBS (Hyclone Labs), 1x инсулин-трансферрин-селен; 10 нг/мл линолевой кислоты-бычьего сывороточного альбумина (LA-BSA); 1н дексаметазон (Sigma); 100 мкM аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma); 10 нг/мл эпидермального фактора роста (R&D Systems); и 10 нг/мл фактора роста тромбоцитов (PDGF-BB) (R&D Systems), и помещали в T-колбу с плотностью посева 10000 клеток на см. Затем устройство(устройства) для культуры инкубировали при 37°C, 5% CO с влажностью >90%. Прикрепление, рост и морфологию клеток тестировали ежедневно. Неадгезивные клетки и продукты распада клеток удаляли во время замены среды. Среду меняли два раза в неделю. Адгезивные клетки с обычной морфологией, имеющие фибробластоидную/веретеновидную форму, появились через несколько дней после начального посева. При достижении 40%-70% конфлюентности (через 4-11 дней после начального посева) клетки собирали трипсинизацией (0,25% трипсина-ЭДТА) в течение 5 минут при комнатной температуре (37°C). После нейтрализации PBS-5% FBS клетки центрифугировали при 200-400  в течение 5-15 минут при комнатной температуре, а затем ресуспендировали в среде для роста. Считалось, что на этом этапе в начальном пассаже создание AMDAC линии было успешно завершено. Начальный пассаж амниотических адгезивных клеток, в некоторых случаях, криоконсервировали или размножали.
6.1.3 Процедура культивирования
2
2
g
[0245] Амниотические адгезивные клетки культивировали в среде для роста, описанной выше, и засевали с плотностью 2000-4000 на см в соответствующем устройстве(устройствах) для культуры ткани - обработанной культуры. Затем устройство(устройства) для культуры инкубировали при 37°C, 5% CO с влажностью >90%. Во время культивирования AMDAC могут прикрепляться и пролифирировать. Рост, морфологию и конфлюентность клеток тестировали ежедневно. Среду меняли два раза в неделю для пополнения свежими питательными веществами, если культуру размножали в течение 5 дней или более. При достижении 40%-70% конфлюентности (через 3-7 дней после посева) клетки собирали трипсинизацией (0,05%-0,25% трипсин-ЭДТА) в течение 5 минут при комнатной температуре (37°C). После нейтрализации PBS-5%FBS клетки центрифугировали при 200-400  в течение 5-15 минут при комнатной температуре, затем ресуспендировали в среде для роста.
6
[0246] AMDAC изолировали и культивировали таким образом обычно до получения 33530+/-15090 колониеобразующих единиц (фибробластов) (CFU-F) из 1×10 высеянных клеток.
6.2 Пример 2: Фенотипичная характеристика амнионных адгезивных клеток
6.2.1 Профили экспрессии генов и белков
[0247] В этом примере описана фенотипичная характеристика амниотических адгезивных клеток, включая характерный маркер клеточной поверхности, мРНК, и протеомный анализ экспрессии.
Приготовление образцов
6
7
[0248] : Амниотические адгезивные клетки получали, как описано в Примере 1. Клетки в пассаже 6 выращивали примерно до 70% конфлюентности в среде для роста, как описано выше в Примере 1, трипсинизировали и промывали PBS. Клетки NTERA-2 (American Type Culture Collection, ATCC номер CRL-1973) выращивали в DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы, 2 мМ глутамина и 10% FBS. Подсчет ядросодержащих клеток выполняли до получения минимум от 2×10 до 1×10 клеток. Затем клетки лизировали, используя набор РНКаз Qiagen (Qiagen, Valencia, СА), используя QIAshredder для получения лизатов. Затем получали изолят РНК, используя набор РНКаз Qiagen. Количество и качество РНК определяли, используя спектрофотометр Nanodrop ND1000, 25 нг/мкл РНК/реакция. кДНК реакции готовили, используя архивный набор кДНК с высокой активностью Applied Biosystem (Foster City, CA). Реакции ПЦР в реальном времени выполняли, используя базовые смеси для обычной ПЦР TAQMAN от Applied Biosystem. Реакции проводили в стандартном режиме в системе ПЦР в реальном времени Applied Biosystem 7300 для 40 циклов.
Анализ и получение результатов для образцов
t
[0249] : Используя метод ПЦР в реальном времени и специфические зонды экспрессии генов TAQMAN и/или матрицу ангиогенеза человека TAQMAN (Applied Biosystem), клетки были охарактеризованы на экспрессию ангиогенных и кардиомиогенных маркеров и маркеров, относящихся к стволовым клеткам. Результаты выражали, либо в виде относительной экспрессии представляющего интерес гена по сравнению с подходящим клеточным контролем, либо относительно экспрессии (дельта C) представляющего интерес гена по сравнению с экспрессируемым во всем организме конститутивным геном (например, GAPDH, 18S или GUSB).
[0250] Амниотические адгезивные клетки экспрессировали различные гены ангиогенных и кардиомиогенных маркеров и гены, относящиеся к стволовым клеткам, и показали относительное отсутствие экспрессии ОСТ-4 по сравнению с клетками NTERA-2. В таблице 1 суммирована экспрессия выбранных генов ангиогенных, кардиомиогенных маркеров и генов стволовых клеток.
<b>Таблица 1</b><b>Профиль экспрессии генов амниотических адгезивных клеток по данным ОТ-ПЦР</b><img file="00000002.tif" he="27" wi="85" img-content="undefined" img-format="tif" /><img file="00000003.tif" he="186" wi="84" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000004.tif" he="45" wi="77" img-content="undefined" img-format="tif" /><img file="00000005.tif" he="186" wi="81" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000006.tif" he="44" wi="82" img-content="undefined" img-format="tif" /><img file="00000007.tif" he="75" wi="83" img-content="undefined" img-format="tif" />
Колонка “мРНК” указывает, что наличие или отсутствие мРНК было определено для конкретного маркера в каждом случае.
[0251] В отдельном эксперименте AMDAC, в котором дополнительно определяли экспрессию генов для ядерного транслокатора 2 арильного углеводородного рецептора (ARNT2), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), глиального нейротрофического фактора (GDNF), нейротрофина 3 (NT-3), NT-5, индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF1A), индуцируемого гипоксией белка 2 (HIG2), гемоксигеназы (дециклирования) 1 (HMOX1), внеклеточной супероксиддисмутазы [Cu-Zn] (SOD3), каталазы (САТ), трансформирующего фактора роста β1 (TGFB1), рецептора трансформирующего фактора роста β1 (TGFB1R) и рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR/c-met).
6.2.2 Проточная цитометрия для оценки ангиогенной активности амниотических адгезивных клеток
g
g
3
6
5
[0252] Проточную цитометрию использовали в качестве способа количественного определения фенотипических маркеров амниотических адгезивный клеток для определения идентичности клеток. Образцы клеток получали из замороженных запасов. Перед оттаиванием и во время приготовления реактивов пробирки с клетками держали на сухом льду. Затем образцы быстро оттаивали, используя водную баню с температурой 37°C. Подсчет клеток до заморозки использовали для вычислений начальных разбавлений, которые зависели от количества клеток после оттаивания. Вкратце, криопробирки оттаивали на водяной бане при 37°C в течение примерно 30 секунд, слегка потряхивая. Сразу после оттаивания примерно 100-200 мкл холодного (2-8°C) оттаявшего раствора (PBS с 2,5% альбумином и 5% Гентран 40) добавляли в криопробирки и смешивали. После аккуратного перемешивания весь объем в криопробирках переносили в 15 мл коническую пробирку, содержащую равный объем холодного (2-8°C) оттаявшего раствора. Клетки центрифугировали в конической пробирке при 400  в течение 5 минут при комнатной температуре для удаления супернатанта. Оставшийся объем измеряли пипеткой (оценка); оставшийся объем и клеточный пеллет ресуспендировали при комнатной температуре в 1%-ом FBS в PBS, получая концентрацию клеток 250×10 клеток/100 мкл буфера. Например, можно было бы ресуспендировать 1×10 клеток в 400 мкл 1% FBS. Клеточную суспензию помещали в заранее маркированные 5 мл пробирки FACS (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ). Для каждого первичного изотипа антитела помещали 100 мкл аликвоты клеточной суспензии в одну контрольную пробирку для изотипа. До проведения анализа фенотипа концентрации всех антител оптимизировали для получения хорошего сигнала по отношению к шуму и адекватного обнаружения CD антигенов в потенциальном динамическом диапазоне 4-log. Определяли объем каждого изотипа и тестируемого антитела, которое использовалось для окрашивания каждого образца. Чтобы стандартизировать количество антитела (в мкг) в изотипе и тестовых поробирках, вычисляли концентрацию каждого антитела следующим образом: (1/фактическая концентрация антитела (мкг/мкл))×(требуемое конечное количество антитела в мкг для 2,5×10 клеток)=# мкл добавленного антитела. Основной раствор антител как для изотипа, так и для образца, готовили путем добавления соответствующего количества антитела в каждую пробирку. Клетки окрашивали в течение 15-20 минут при комнатной температуре в темноте. После окрашивания несвязанное антитело в каждом образце удаляли центрифугированием (400 × 5 минут) с последующим промыванием 2 мл 1% FBS PBS (комнатная температура) перед ресуспендированием в 150 мкл 1% FBS PBS при комнатной температуре. Затем образцы анализировали, используя проточный цитометр Becton Dickinson FACSCalibur, FACSCantoI или BD FACSCantoII согласно инструкции изготовителя. Многопараметрические наборы данных проточной цитометрии (боковое светорассеяние (SSC), малоугловое рассеяние (FSC) и профили интегрированной флуоресценции (FL)) получали без настройки параметров компенсации инструмента в реальном времени. Параметры компенсации определяли после измерения, используя программное обеспечение FACSDiva согласно инструкции изготовителя. Эти параметры настройки инструмента применяли к каждому образцу. Конъюгаты флуорофора, использованные в этих исследованиях, представляли собой аллофикоцианин (APC), AlexaFluor 647 (AF647), флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE) и перидинин-хлорофилл-белок (PerCP), все от BD Biosciences. В таблице 2 суммированы результаты экспрессии выбранных маркеров клеточной поверхности, включая ангиогенные маркеры.
<b>Таблица 2</b><b>Экспрессия маркеров клеточной поверхности в амниотических адгезивный клетках по данным проточной цитометрии</b><img file="00000008.tif" he="120" wi="105" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000009.tif" he="97" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
Колонка “иммунолокализация, проточная цитометрия” указывает, что наличие или отсутствие конкретных маркеров было определено иммуноолокализацией, более конкретно, проточной цитометрией.
+
[0253] В другом эксперименте AMDAC клетки метили античеловеческим CD49f (Клон GoH3, фикоэритрин-конъюгированный; BD Pharmingen часть № 555736) и анализировали проточной цитометрией. Примерно 96% AMDAC были меченны анти-CD49f (т.е., был CD49f).
[0254] В других экспериментах AMDAC также исследовали с помощью иммунолокализации на экспрессию CD49a, CD106, CD119, CD130, c-met (рецептор фактора роста гепатоцитов; HGFR), рецептор 1 хемокина CXC (CXCR1), PDGFRA и PDGFRB. Также с помощью иммунолокализации AMDAC исследовали на отсутствие экспрессии CD49e, CD62E, рецептора 3 фактора роста фибробластов (FGFR3), члена 12A суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF12A), рецептора инсулин-подобного фактора 1 роста (IGF-1R), CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, рецептора 1 хемокина (CCR1), CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), рецептора инсулина (CD220), рецептора интерлейкина 4 (IL4-R; CD124), IL6-R (CD126), TNF-R1a и 1b (CD120a, b) и erbB2/Her2.
6.2.3 Иммуногистохимия (IHC)/иммунофлуорохимия (IFC) для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
[0255] Амниотические адгезивные клетки из пассажа 6 выращивали до примерно 70% конфлюентности в 4-х луночных камерах слайд-планшетов и каждую фиксировали 4% раствором формалина в течение 30 минут. После фиксации слайд-планшеты ополаскивали PBS два раза в течение 5 минут. Затем слайд-планшеты инкубировали с 10% нормальной сывороткой того же хозяина, что и для вторичного антитела, 2x казеином и 0,3% Тритон X100 в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре во влажной камере. Избыток сыворотки удаляли, и слайд-планшеты инкубировали с первичным антителом (козлиным поликлональным IgG (Santa Cruz; Santa Cruz, CA) во влажной камере. Время и температуру инкубации определеляли, выбирая оптимальные условия для используемого антитела. Как правило, время инкубации составляло 1-2 часа при 37°C или всю ночь при 4°C. Затем слайд-планшеты ополаскивали PBS три раза в течение 5 минут каждый и инкубировали в течение 20-30 минут при комнатной температуре во влажной камере с конъюгированным с флуоресцентной меткой вторичным антителом-антииммуноглобулином к хозяину первичного антитела (кроличье анти-козлиное антитело (Santa Cruz)). После этого слайд-планшеты ополаскивали PBS три раза в течение 5 минут каждый, устанавливали на монтажном столике, используя заливочный раствор DAPI VECTASHIELD (Vector Labs) с тем, чтобы избежать контрастной окраски ядер. Окрашенные клетки визуализировали, используя флуоресцентный микроскоп Nikon. Все снимки получали при одном и том же времени экспозиции, нормализованном относительно фона соответствующего изотипа (козлиные IgG (Santa-Cruz)). В таблице 3 суммированы результаты экспрессии ангиогенных белков амниотическими адгезивными клетками.
<b>Таблица 3</b><b>Ангиогенные маркеры, присутствующие или отсутствующие в амниотических адгезивных клетках</b><img file="00000010.tif" he="56" wi="110" img-content="undefined" img-format="tif" />
[0256] Амниотические адгезивный клетки экспрессировали ангиогенный эндотелиальный маркер 7 опухоли (TEM-7), один из белков, показанных в таблице 3. См. Фиг.2.
6.2.4 Мембранные протеомиксы для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
Очистка мембранных белков
g
g
[0257] : Клетки в пассаже 6 выращивали примерно до 70% конфлюентности в среде для роста, трипсинировали и промывали в PBS. Затем, до проведения лизиса клеток, их инкубировали в течение 15 минут с раствором, содержащим коктейль протеазных ингибиторов (P8340, Sigma Aldrich, С-Louis, MO). После чего клетки лизировали путем добавления 10 мМ раствора HC1 (таким образом избегая использования детергентов) и центрифугировали в течение 10 мин при 400  для образования пеллетов, и удаляли ядра. Пост-ядерный супернатант переносили в пробирки для ультрацентрифугирования и центрифугировали, используя ультрацентрифугу WX80 с ротором T-1270 (Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC) при 100000  в течение 150 минут, получая пеллет мембранных белков.
Создание, иммобилизация и расщепление протеолипосом
[0258] : пеллет мембранных белков промывали несколько раз, используя буфер Nanoxis (10 мм Трис, 300 мМ NaCl, pH 8). Пеллет мембранных белков суспендировали в 1,5 мл буфера Nanoxis, а затем обрабатывали ультразвуком погружением в среду ультразвукового наконечника, используя ультразвуковой процессор VIBRA-CELL™ VC505 (Sonics & Materials, Inc, Newtown, СТ), в течение 20 минут на льду. Размер протеолипосом определяли путем окрашивания красителем FM1-43 (Invitrogen, Carlsbad, CA) и визуализацией с помощью флуоресцентного микроскопа. Концентрацию белков в протеолипосомной суспензии определеляли с помощью анализа BCA (Thermo Scientific). Затем протеолипосомы вводили в проточную ячейку (Flow Cell) LPI™ (Nanoxis AB, Gothenburg, Sweden), используя пипетку со стандартным наконечником, и оставляли для иммобилизации на 1 час. После иммобилизации выполняли несколько стадий промывки, и вводили 5 мкг/мл трипсина (Princeton Separations, Adelphi, NJ) непосредственно в проточную ячейку LPI™. Чип инкубировали всю ночь при 37°C, и обработанные трипсином пептиды элюировали из LPI™ ячейки, а затем опресняли, используя картридж Sep-Pak (Waters Corporation, Milford, MA).
[0259] Анализ с помощью LTQ линейной ионной ловушки ЖХ/МС/МС: Каждый образец, расщепленный трипсином, разделяли на 0,2 мм × 150 мм 3 мкм 200 Е MAGIC C18 колонке (Michrom Bioresources, Inc., Auburn, CA), которую присоединяли с лицевой стороны непосредственно к источнику с ионизацией распылением в электрическом поле (электроспрей-ионизация) с аксиальной десольвацией в вакууме с помощью нанокапилляра (ADVANCE) (Michrom Bioresources, Inc), используя 180 минутный градиент (буфер A: вода, 0,1% муравьиная кислота; Буфер B: ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота). Источник ADVANCE достигал чувствительности, которая сравнима с традиционным nanoESI, работая со значительно более высокой скоростью потока 3 мкл/мин. Элюированные пептиды анализировали на масс-спектрометре с линейной ионной ловушкой LTQ (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA), в которой использовали десять МС/МС сканирований в зависимости от данных, исходя из каждого сканирования по всему масс-спектру. Для каждого биологического образца было собрано семь аналитических дублированных массивов данных.
Биоинформация
[0260] : Семь RAW файлов, соответствующих семи аналитическим дублированным массивам данных, которые были собраны для каждой линии клеток, исследовали в виде одномерного поиска относительно Человеческой Базы данных IPI, используя алгоритм SEQUEST на рабочей станции Sorcerer Solo™ (Sage-N Research, San Jose, CA). Был задан допуск по массе белка 1,2 amu, окисление метионина задавали как дифференциальную модификацию, а карбамидометелирование задавали как статическую модификацию. Для сортировки и анализа протеомных данных для мембран использовали программное обеспечение Scaffold, Trans-Proteomic Pipeline (TPP). Белки учитывали в анализе, если они были идентифицированы с 95% вероятностью подтверждения белка, 95% вероятностью подтверждения белка и 1 уникальным пептидом. Сравнение протеомных наборов данных для мембран проводили, используя скрипты Perl, разработанные по заказу для внутреннего использования.
Результаты
[0261] : Как показано в таблице 4, амниотические адгезивные клетки экспрессировали различные ангиогенные и кардиомиогенные маркеры.
<b>Таблица 4</b>
<b>Кардиомиогенные или ангиогенные маркеры, экспрессированные амниотическими адгезивными клетками</b>
Маркер AMDAC
Положительный
Отрицательный
Иммунолокализация, протеомы мембран
Рецептор IIB актина
х
х
ADAM 17
х
х
Альфа-актинин 1
х
х
Ангиотензиноген
х
х
Филамин А
х
х
Рецептор I и II ацетилированных ЛПНП в макрофагах
х
х
Мегалин
х
х
Тип А тяжелой цепи немышечного миозина
х
х
Миозин-связывающий белок C сердечного типа
х
х
Wnt-9
х
х
6.2.5 Получение профиля секретом для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
Анализ белков:
[0262]  Амниотические адгезивный клетки в пассаже 6 высевали в равных количествах в среде для роста, и кодиционированную среду собирали через 4 дня. Одновременно проводили качественный анализ множества ангиогенных цитокинов/факторов в кондиционированной клетками среде, используя биочип для белков ангиогенеза RayBiotech (Norcross, GA). Вкратце, биочип для белков инкубировали с 2 мл IX блокирующего буфера (Ray Biotech) при комнатной температуре в течение 30 минут (мин) для блокирования мембран. Затем блокирующий буфер фильтровали, и мембраны инкубировали с 1 мл образца (среда для роста, кондиционированная соответствующими клетками в течение 4 дней) при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Затем образцы фильтровали, и мембраны промывали 3 раза по 5 минут, используя 2 мл 1X буфера для промывки I (Ray Biotech) при комнатной температуре, потряхивая. Затем мембраны промывали 2 раза по 5 минут, используя 2 мл 1X буфера для промывки II (Ray Biotech) при комнатной температуре, потряхивая. После этого 1 мл разбавленных биотин-конъюгированных антител (Ray Biotech) добавляли к каждой мембране и инкубировали при комнатной температуре в течение 1-2 часов и промывали буфером для промывки, как описано выше. Затем к каждой мембране добавляли разбавленный HRP-конъюгированный стрептавидин (2 мл), и мембраны инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Наконец, мембраны снова промывали, инкубировали с набором для детектирования ECL™ (Amersham) согласно спецификации, и результаты визуализировали и анализировали, используя систему формирования изображений Kodak Gel Logic 2200. Секреция различных ангиогенных белков AMDA клетками показана на Фиг.3.
ELISA
6
[0263] : Количественный анализ ангиогенных цитокинов/факторов роста в кондиционированной клетками среде, отдельно для каждого вида, выполняли, используя наборы выпускаемые R&D Systems (Minneapolis, MN). Вкратце, анализ ELISA выполняли согласно инструкциям изготовителя, и количество соответствующих ангиогенных факторов роста в кондиционированной среде нормализовали на 1×10 клеток. Амниотические адгезивные клетки (n=6) показали примерно 4500 пг VEGF на миллион клеток и примерно 17200 пг IL-8 на миллион клеток.
<b>Таблица 5</b><b>Результаты ELISA для ангиогенных маркеров</b><img file="00000011.tif" he="123" wi="93" img-content="undefined" img-format="tif" />
[0264] В отдельном эксперименте также подтверждали секрецию ангиопоэтина-1, ангиопоэтина-2, PECAM-1 (CD31; молекула тромбоцитарно-эндотелиальной адгезии), ламинина и фибронектина клетками AMDA.
6.2.6 Экспрессия микроРНК AMDA клетками подтверждает ангиогенную активность
[0265] В этом примере показано, что AMDAC экспрессируют более высокие уровни некоторых микроРНК (миРНК) и более низкие уровни некоторых других миРНК, каждая из которых коррелирует с ангиогенной функцией, по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга.
[0266] Известно, что проангиогенная miR-296 регулирует ангиогенную функцию через регуляцию уровней рецепторов факторов роста. Например, miR-296 в эндотелиальных клетках вносит значительный вклад в ангиогенез путем прямого нацеливания на мРНК субстрата тирозинакиназы, регулируемую фактором роста гепатоцитов (HGS), приводя к уменьшенным уровня HGS и, таким образом, снижая HGS-опосредованную деградацию рецепторов фактора роста VEGFR2 и PDGFRb. См. Wixrdinger et al, Cancer Cell 14:382-393 (2008). Кроме того, показано, что miR-15b и miR-16 управляют экспрессией VEGF, ключевого проангиогенного фактора, вовлеченного в ангиогенез, и что уменьшение miR-15b и miR-16, индуцированное гипоксией, способствует увеличению VEGF, проангиогенного цитокина. См. Kuelbacher et al., Trends in Pharmacological Sciences, 29(1): 12-15 (2007).
6
6
[0267] AMDAC получали, как описано выше в Примере 1. AMDAC и клетки BM-MSC (использованные в качестве компаратора) использовали для получения препаратов микроРНК (миРНК), используя набор для выделения миРНК MIRVANA™ (Ambion, Cat# 1560). В буфере для лизиса разрушали от 0,5×10 до 1,5×10 клеток. Затем образцы экстрагировали, используя смесь кислота-фенол+хлороформ для выделения РНК, высоко обогащенной малыми видами РНК. Добавляли 100% этанол для получения образцов в 25% этаноле. Когда эту смесь лизат/этанол пропускали через стекловолоконный фильтр, большие РНК были иммобилизованы, а малые виды РНК собирались в фильтрате. Затем концентрацию этанола в фильтрате увеличивали до 55%, и смесь пропускали через второй стекловолоконный фильтр, где были иммобилизованы малые РНК. Эту РНК промывали и элюировали в растворе с низкой ионной силой. Концентрацию и чистоту восстановленной малой РНК определяли путем измерения ее спектральной поглощательной способности при 260 и 280 нм.
[0268] Было обнаружено, что AMDAC экспрессируют следующие ангиогенные миРНК: miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, (члены ангиогенной группы миРНКа 17-92), miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, miR-16. Также было найдено, что AMDAC экспрессируют более высокие уровни следующих ангиогенных миРНК по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга (BM-MSC): miR-17-3р, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 (члены ангиогенной группы миРНК 17-92), miR-296. Эти результаты хорошо коррелируют с наблюдением высоких уровней VEGFR2/KDR экспрессии AMDA клетками (см. выше). Наоборот, было найдено, что AMDAC экспрессируют более низкие уровни следующих ангиогенных миРНК по сравнению с BM-MSC: miR-20a, miR-20b, (члены ангиогенной группы миРНК 17-92), miR-221, miR-222, miR-15b, miR-16. Сниженная экспрессия miR-15b и miR-16 коррелировала с более высокими уровнями экспрессии VEGF, наблюдаемыми у AMDAC.
6.3 Пример 3: Функциональная характеристика амниотических адгезивных клеток
[0269] В этом примере показаны различные характеристики AMDAC, связанные с их способностью к дифференцировке и ангиогенезу.
6.3.1 HUVEC формирование трубкообразных структур для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
2
2
[0270] Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) пересевали в трех пассажах 3 или менее в среде EGM-2 (Cambrex, East Rutherford, NJ) в течение 3 дней, и собирали при примерно 70%-80% конфлюентности. HUVEC промывали один раз базальной средой/антибиотики (DMEM/F12 (Gibco)) и ресуспендировали в той же среде при требуемой концентрации. HUVEC использовали в течение 1 часа после получения. Человеческий плацентарный коллаген (HPC) доводили до концентрации 1,5 мг/мл в 10 мМ HC1 (pH 2,25), “нейтрализовали” буфером с pH 7,2 и держали на льду до момента использования. HPC объединяли с суспензией HUVEC при конечной концентрации клеток 4000 клеток/мкл. Полученную суспензию HUVEC/HPC сразу переносили с помощью пипетки в 96-ти луночные планшеты по 3 мкл на лунку (периметр планшета должен быть предварительно наполнен стерильным PBS, чтобы избежать испарения, n=5 на режим). Капли HUVEC инкубировали при 37°C и 5% CO в течение 75-90 минут без добавления среды, чтобы позволить коллагену полимеризоваться. После завершения “сухой” инкубации каждую лунку аккуратно заполняли 200 мкл кондиционированной AMDAC среды (n=5 клеточных линий) или контрольной среды (например, DMEM/F12 в качестве отрицательного контроля, и EGM-2 в качестве положительного контроля) и инкубировали при 37°C и 5% CO в течение 20 часов. Кондиционированную среду получали инкубацией амниотических адгезивных клеток из пассажа 6 в среде для роста в течение 4-6 часов; после прикрепления и размножения среду заменяли на DMEM/F12 на 24 часа. После инкубации среду удаляли из лунок, не нарушая капли HUVEC, лунки промывали один раз PBS, затем капли HUVEC фиксировали в течение 10 секунд и окрашивали в течение 1 минуты, используя набор для окрашивания клеток Diff-Quik, после чего ополаскивали 3 раза стерильной водой. Окрашенные капли оставляли на воздухе сохнуть, и изображения каждой лунки получали, используя микроскоп Zeiss SteReo Discovery V8. Затем изображения анализировали, используя пакет программного обеспечения, “ImageJ” и/или MatLab. Изображения были преобразованы из цветных в 8-битовые изображений в оттенках серого, и были заданы пределы для преобразования в черно-белое изображение. Затем изображение анализировали, используя особенности анализа частиц, которые обеспечивали данные пиксельной плотности, включая подсчет (количество отдельных частиц), общую площадь, средний размер (отдельных частиц) и площадь фракции, которая равна количеству образованных эндотелиальных трубкообразных структур в испытании.
[0271] Кондиционированная среда оказывала ангиогенное воздействие на эндотелиальные клетки, как было продемонстрировано путем стимулирования пролиферативного формирования трубкообразных структур (см. Фиг.4).
6.3.2 Анализ миграции HUVEC
6
[0272] В этом эксперименте показана ангиогенная активность амниотических адгезивных клеток. HUVEC выращивали до образования монослоя в 12-ти луночном планшете, покрытом фибронектином (FN), и монослой “ранили” 1 мл пластмассовым наконечником пипетки, образуя бесклеточную линию вдоль лунки. Миграцию HUVEC тестировали путем инкубирования “раненных” клеток в кондиционированной среде без сыворотки (EBM2; Cambrex), полученной из 5-ти линий амниотических адгезивных клеток после 3 дней роста. Среду EBM2 без клеток использовали в качестве контроля. Через 15 часов регистрировали миграцию клеток в бесклеточную область (n=3) с помощью инвертированного микроскопа. Затем картинки анализировали, используя пакет программного обеспечения “ImageJ” и/или MatLab. Изображения были преобразованы из цветных в 8-битовые изображений в оттенках серого, и были заданы пределы для преобразования в черно-белое изображение. Затем изображение анализировали, используя особенности анализа частиц, которые обеспечивали данные пиксельной плотности, включая подсчет (количество отдельных частиц), общую площадь, средний размер (отдельных частиц) и площадь фракции, которая равна количеству образованных эндотелиальных трубкообразных структур в испытании. Степень клеточной миграции оценивали относительно размера первоначально зарегистрированной линии раны, и результаты были нормализованы на 1×10 клеток.
[0273] Трофические факторы, секретируемые амниотическими адгезивными клетками, оказывали ангиогенное воздействие на эндотелиальные клетки, как продемонстрировано путем стимулирования клеток к миграции (Фиг.5).
6
[0274] В отдельном эксперименте HUVEC выращивали до субмонослоя в 96-ти луночном планшете, покрытом FN, и индукцию пролиферации оценивали инкубацией клеток в кондиционированной среде без сыворотки из каждой из 5 линий амниотических адгезивных клеток (среда EBM-2, 3 дня). Среду EBM-2 использовали в качестве отрицательного контроля, а EGM-2 использовали в качестве положительного контроля. Через 48 часов пролиферацию клеток оценивали путем измерения содержания ДНК, используя биочип для пролиферации клеток с одним раствором Promega Cell Titer 96 AZ (Promega, Madison, WI). “Величина” ошибки обозначает стандартные отклонения аналитических репликатов (n=3), а результаты нормализованы на 1×10 клеток.
[0275] Трофические факторы, секретируемые амниотическими адгезивными клетками, привели к увеличению концентрации ДНК, которая характерна для пролиферации HUVEC. См. Фиг.6, где “СМ” обозначает кондиционированную среду.
6.3.3 Поглощение ацетилированных липопротеинов низкой плотности (АцЛПНП) для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
[0276] Эндотелиальные клетки и микроглиальные клетки в культуре могут быть идентифицированы по способности поглощать флуоресцентные АцЛПНП. Если остатки лизина апопротеина ЛПНП ацетилированы, комплекс ЛПНП больше не связывается с рецептором ЛПНП, и вместо этого может поглощаться эндотелиальными клетками и макрофагами высоко спцифическим способом для данной клетки.
[0277] Амниотические адгезивные клетки выращивали либо в среде для роста без VEGF, либо в EGM2-MV (Cambrex) с VEGF для оценки ангиогенной актиивности амниотических адгезивных клеток вообще, а также для оценки влияния VEGF на эффективность дифференцировки амниотических адгезивных клеток. Клетки культивировали в соответствующих им средах в 12-ти луночных планшетах в течение 4-7 дней до достижения 70-80% конфлюентности, а затем инкубировали с 10 мкг/мл ацетилированных ЛПНП (Invitrogen) всю ночь. Затем выполняли контрасное окрашивание клеток Кальцеином AM (Invitrogen) и оценивали поглощение ацетилированных ЛПНП, используя флуоресцентную микроскопию. HUVEC, в качестве контрольных клеток для поглощения ацетилированных ЛПНП, выращивали в EGM2-MV и анализировали, как описано выше. Амниотические адгезивные клетки показали минимальное поглощение ацетилированных ЛПНП при нормальных условиях роста, но были индуцированы/дифференцированы с целью увеличения их поглощения с помощью VEGF-стимуляции. См. Фиг.7.
6.3.4 Образование трубкообразных структур для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
4
2
[0278] Амниотические адгезивные клетки выращивали либо в среде для роста без VEGF, либо в EGM2-MV с VEGF для оценки ангиогенной активности клеток вообще, а также для оценки влияния VEGF на способность клеток к дифференцировке. HUVEC, в качесте контрольных клеток для образования трубкообразных структур, выращивали в EGM2-MV. Клетки культивировали в соответствующих средах в течение 4-7 дней до достижения 70-80% конфлюентности. Холодный (4°C) раствор MATRIGEL™ (50 мкл; BD Biosciences) распределяли по лункам 12-ти луночного планшета, и планшет инкубировали в течение 60 минут при 37°C, позволяя раствору желировать. AMDAC и клетки HUVEC трипсинизировали, ресуспендировали в соответствующих средах (с и без VEGF), и 100 мкл разбавленных клеток (1-3×10 клеток) добавляли в каждую из MATRIGEL™-содержащих лунок. Клетки на полимеризированном MATRIGEL™, в присутствии или отсутствии от 0,5 до 100 нг VEGF, помещали на 4-24 часов в 5% CO инкубатор при 37°C. После инкубации клетки оцененивали на наличие признаков образования трубкообразных структур, используя стандартную световую микроскопию.
[0279] Амниотические адгезивные клетки показали минимальное образование трубкообразных структур в отсутствии VEGF, но были индуцированы/дифференцированы на формирование трубкообразных структур с помощью VEGF-стимуляции. См. Фиг.8.
6.3.5 Чувствительность к гипоксии для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
2
2
6
[0280] Для оценки ангиогенных функциональных возможностей эндотелиальных клеток и/или предшественников эндотелиальных клеток клетки можно оценить в отношении их способности секретировать ангиогенные факторы роста в условиях гипоксии и нормального содержания кислорода. Культура в условиях гипоксии обычно индуцирует увеличенную секрецию ангиогенных факторов роста или эндотелиальных клеток или клеток-предшественников, которые могут быть измерены в кондиционированной среде. Амниотические адгезивные клетки высевали в равных количествах в стандартной для них среде для роста и выращивали до примерно 70-80% конфлюентности. Затем клетки переводили на среду без сыворотки (EBM-2) и инкубировали в условиях с нормальным содержанием кислорода (21% O) или в условиях гипоксии (1% O) в течение 48 часов. Кондиционированные среды собирали, и секрецию ангиогенных факторов роста анализировали, используя коммерчески доступные наборы ELISA от R&D Systems. Анализ ELISA выполняли согласно инструкциям изготовителя, и количество соответствующих ангиогенных факторов роста (VEGF и IL-8) в кондиционированных средах нормализовали на 1×10 клеток.
[0281] Амниотические адгезивные клетки показали увеличенную секрецию различных ангиогенных факторов роста в условиях гипоксии. См. Фиг.9.
2
2
6
[0282] В отдельном эксперименте AMDAC высевали, используя одинаковое количество клеток, в стандартную среду для роста и выращивали примерно до 70-80% конфлюентности. Затем клетки переводили на среду без сыворотки (EBM-2) и инкубировали в условиях с нормальным содержанием кислорода (21% O) или в условиях гипоксии (1% O) в течение 48 часов. Клетки исследовали с помощью проточной цитометрии на наличие клеточного маркера CD202b (также известного как Tie2, Tek, или рецептор ангиопоэтина-1), рецептор, вовлеченный в развитие сосудистой сети и ангиогенез. Кондиционированные среды собирали, и секрецию ангиогенных факторов роста анализировали, используя коммерчески доступные наборы ELISA (R&D Systems). Анализ с помощью проточной цитометрии выполняли, как описанно выше, а анализ ELISA выполняли согласно инструкциям изготовителя. Количество соответствующих ангиогенных факторов роста в кондиционированных средах нормализовали на 1×10 клеток. AMDAC показали повышенную экспрессию CD202b в условиях гипоксии по сравнению с условиями с нормальным содержанием кислорода. См. Фиг.10.
6.3.6 Кардиомиогенная дифференцировка для оценки активности ангиогенных амниотических адгезивных клеток
dickkopf
2
[0283] Для индуцирования дифференцировки клеток-предшественников по кардиомиогенному пути в несколько стадий выполняли комбинацию культуры висячей капли (HD, чтобы остановить пролиферацию клеток и начать процесс дифференцировки) с последующей обработкой клеток с остановленным ростом, используя определенные факторы. Согласно культуре висячей капли, клетки индуцировали в комбинации с активином A, костным морфогенетическим белком 4 (BMP4), основным фактором роста фибробластов (bFGF, также известным как FGF2), сосудистым эпителиальным фактором роста (VEGF, также известным как VEGFA) и гомологом 1  (DKK1) в течение 16 дней. Вкратце, амниотические адгезивные клетки выращивали примерно до 70% конфлюентности в стандартной среде для роста. Затем клетки трипсинизировали и промывали буфером, как описано выше. Капли по 20 мкл, содержащие 700 клеток, суспендировали в соответствующей среде и помещали на внутреннюю сторону крышки 100 мм чашки Петри, используя многоканальную пипетку. Крышку аккуратно переворачивали и помещали сверху чашки, которая содержала 25 мл стерильной PBS с тем, чтобы капли не высохли. Культуры висячих капель инкубировали в течение 48 часов при 37°C в 5% CO инкубаторе. Затем агрегированные тела клеток повторно засевали на культуральные планшеты, покрытые 0,1% желатином, содержащим специфическую среду для дифференцировки для дополнительной индукции.
[0284] Стадии стимуляции выполняли следующим образом: стадия 1, 4 дня BMP4 (0,5 нг/мл); Стадия 2, 5 дней BMP4 (10 нг/мл), bFGF (5 нг/мл), активин (3 нг/мл); Стадия 3, 3 дня VEGF (10 нг/мл), DKK1 (150 нг/мл); Стадия 4, 4 дня VEGF (10 нг/мл), DKK1 (150 нг/мл), bFGF (5 г/мл) (+/-5-10 нМ 5-аза-цитидин). Затем получали общую РНК обработанных клеток, и выполняли анализ количественной ОТ-ПЦР для кардиомиогенных маркеров, как описано выше.
[0285] Результаты показали, что амниотические адгезивные клетки могут быть индуцированы/дифференцированы для экспрессии различных кардиомиогенных маркеров. См. Фиг.11.
6.3.7 HUVEC ответ на AMDAC-кондиционированную среду
[0286] AMDAC культивировали в течение 48 часов в среде для роста, содержащей 60% DMEM-LG (Gibco); 40% MCBD-201 (Sigma); 2% FBS (Hyclone Labs), 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS); 10 нг/мл линолевая кислота-бычий сывороточный альбумин (LA-BSA); 1 н дексаметазон (Sigma); 100 мкМ аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma); 10 нг/мл эпидермального фактора роста (Системы R&D); и 10 нг/мл фактора роста тромбоцитов (PDGF-BB) (R&D Systems), и затем культивировали в течение дополнительных 48 часов в среде без сыворотки. Кондиционированную среду из AMDAC культуры собирали и использовали для стимуляции бессывороточных HUVEC в течение 5, 15 и 30 минут. HUVEC затем лизировали и окрашивали, используя набор BD™ CBA (Cytometric Bead Assay) Cell Signaling Flex Kit (BD Biosciences) для фосфопротеинов, о которых известно, что они играют роль в ангиогенной передаче сигналов. Было обнаружено, что AMDAC являются сильными активаторами АКТ-1 (который ингибирует процессы апоптоза), AKT-2 (который является важным сигнальным белком в пути передачи инсулинового сигнала), и ERK 1/2 пути пролиферации клеток в HUVEC. Эти результаты также демонстрируют ангиогенную способность AMDAC.
6.4 Пример 4: Индукция ангиогенеза AMDAC
in vivo
[0287] В этом примере продемонстрировано, что AMDAC способствуют ангиогенезу в  исследованиях, где использовалась хориоаллантоисная мембрана цыпленка (САМ).
[0288] Проводили два отдельных испытания САМ. В первом испытании САМ оценивали пеллеты неповрежденных клеток из различных препаратов AMDAC. Во втором испытании САМ оценивали супернатанты различных препаратов AMDAC. Фактор роста фибробластов (bFGF) использовали в качестве положительного контроля, а человеческие клетки рака молочной железы MDA-MB-231 в качестве контроля (отрицательного контроля). Конечная точка исследования должна была дать плотность кровеносной сети всех обработанных и контрольных групп.
6.4.1 Анализ САМ с использованием клеток
[0289] Использовали три препарата клеток AMDAC, названные в данном описании как Лот 1, Лот 2 и Лот 3, приготовленные, как описано выше и подвергнутые криоконсервации. AMDAC оттаивали для дозирования, и определяли количество клеток, дозированных на САМ.
План исследования
[0290] : исследование включало 7 групп по 10 эмбрионов в каждой группе. Проект исследования описан в таблице 6.
<b>Таблица 6</b>
<b>Исследование групп, анализ ангиогенеза хориоаллантоисной мембраны цыпленка</b>
№ группы
# эмбрионов
обработка
Конечная точка
1
10
Контроль, носитель (40 мкл смесь PBS/MATRIGEL<sup>TM</sup>, 1:1 по объему)
Оценка плотности кровеносной сети
2
10
Положительный контроль, обработанный bFGF (100 нг/САМ в 40 мкл смеси DMEM/MATRIGEL<sup>TM</sup>, 1:1)
То же самое как в группе 1
3
10
Контроль среды (40 мкл DMEM)
То же самое как в группе 1
4
10
AMDAC, Лот 1
То же самое как в группе 1
5
10
AMDAC, Лот 2
То же самое как в группе 1
6
10
AMDAC, Лот 3
То же самое как в группе 1
7
10
Клетки MDA-MB-231 P34, Лот 092608
То же самое как в группе 1
5
[0291] Процедура анализа САМ: Свежие оплодотворенные яйца выводили в течение 3 дней в стандартном инкубаторе для яиц при 37°C. На третий день яйца раскалывали в стерильных условиях, и эмбрионы помещали в двадцать 100 мм пластиковых планшетов и выращивали в инкубаторе для эмбрионов с резервуаром с водой на нижней полке при 37°C. Через резервуар с водой непрерывно прокачивали воздух, используя небольшой насос, с тем, чтобы влажность в инкубаторе сохранялась постоянной. На шестой день в каждый САМ помещали стерильное силиконовое “O” кольцо, а затем в каждое кольцо “O” в стерильном колпаке помещали AMDAC с плотностью 7,69×10 клеток/40 мкл смеси среда/MATRIGEL™ (1:1). В таблицах 2A и 2B представлено количество использованных клеток и количество среды, добавленной к каждому клеточному препарату для дозирования. Контрольные эмбрионы в носителе получали 40 мкл носителя (PBS/MATRIGEL™, 1:1), положительные контроли получали 100 нг/мл bFGF в 40 мкл смеси среды DMEM/MATRIGEL™ (1:1), а контроли среды получали только 40 мкл среды DMEM. Эмбрионы возвращали в инкубатор после того, как каждое дозирование было закончено. На восьмой день эмбрионы вынимали из инкубатора и держали при комнатной температуре, при этом определяли плотность кровеносной сети под каждым кольцом “O”, используя систему получения изображений с усилением 100X.
[0292] Плотность кровеносной сети измеряли с помощью системы для оценки ангиогенеза, в которой использовались арифметические числа от 0 до 5, или числа геометрической прогрессии от 1 до 32 для указания количества кровеносных сосудов, присутствующих на участках обработки на САМ. Более высокое число показателя представляло более высокую плотность сосудов, при этом 0 свидетельствовал об отсутствии ангиогенеза. На каждом участке дозирования вычисляли процент ингибирования, используя показатель, зарегистрированный для такого участка, деленный на средний показатель, полученный из контрольных образцов для каждого отдельного эксперимента. Процент ингибирования для каждой дозы данного соединения вычисляли путем объединения всех результатов, полученных для этой дозы из 8-10 эмбрионов.
[0293] <b>Таблица 7</b>
<b>Количество среды, добавленной к каждому клеточному препарату для нормализации конечной клеточной суспензии для дозирования</b>
Линия клеток
Размер пеллета
Нормализация с использованием DMEM и MATRIGEL<sup>TM</sup>
Конечный объем клеточной суспензии
AMDAC, Лот 1
260 мкл
0 мкл + 260 мкл MATRIGEL<sup>TM</sup>
520 мкл
AMDAC, Лот 2
170 мкл
90 мкл + 260 мкл MATRIGEL<sup>TM</sup>
520 мкл
AMDAC, Лот 3
170 мкл
90 мкл + 260 мкл MATRIGEL<sup>TM</sup>
520 мкл
MDA-MB-231
40 мкл
220 мкл + 260 мкл MATRIGEL<sup>TM</sup>
520 мкл
Все клетки использовали в пассаже 6.
Результаты
[0294] Результаты показателей плотности кровеносной сети представлены на Фиг.12. Результаты ясно указывают на то, что показатели плотности кровеносной сети хориоаллантоисных мембран цыпленка, обработанные каждой из суспензий стволовой клетки или 100 нг/мл bFGF, или суспензиями клеток рака молочной железы MDAMB231, были статистически значимо выше по сравнению с таковыми из контроля CAM с носителем (P<0,001, критерий “t” Стьюдента). Среда, использованная для культивирования стволовых клеток, не имела никакого влияния на плотность кровеносной сети. Кроме того, в индукции кровеносной сети препаратов AMDAC были замечены некоторые вариации плотности, но эти вариации не были статистически значимыми. Из этого можно заключить, что эффективность индукции каждого из 5 препаратов стволовых клеток была приблизительно одинаковой.
6.4.2 Анализ САМ с использованием супернатантов клеток AMDAC
[0295] Образцы супернатантов из клеток MDA-MB-231 и из каждого из различных препаратов стволовых клеток, описанных выше в анализе САМ AMDAC, использовали во втором испытании САМ. Как и в испытании САМ AMDAC, клетки bFGF и MDA-MB-231 использовали в качестве положительного контроля.
[0296] Проект испытания: испытание включало 7 групп по 10 эмбрионов в каждой группе. Проект испытания описан в таблице 8.
[0297] <b>Таблица 8</b>
<b>Проект испытания - САМ анализ с использованием клеточных супернатантов</b>
№ группы
# эмбрионов
обработка
Конечная точка
1
10
Контроль, носитель (40 мкл смесь PBS/MATRIGEL<sup>TM</sup>, 1:1 по объему)
Оценка плотности кровеносной сети
2
10
Положительный контроль, обработанный bFGF (100 нг/САМ в 40 мкл смеси DMEM/MATRIGEL<sup>TM</sup>, 1:1)
То же самое как в группе 1
3
10
Контроль среды (40 мкл DMEM)
То же самое как в группе 1
4
10
Супернатант AMDAC, Лот 1
То же самое как в группе 1
5
10
Супернатант AMDAC, Лот 2
То же самое как в группе 1
6
10
Супернатант AMDAC, Лот 3
То же самое как в группе 1
7
10
Супернатант клеток MDA-MB-231 (P34)
То же самое как в группе 1
AMDAC клетки использовали в пассаже 6
[0298] Процедура САМ анализа: процедура испытания была такой же, как описано выше в испытании САМ AMDAC. Единственное различие заключалось в том, что супернатант из каждого препарата стволовых клеток или клеток MDA-MB-231 использовали в качестве тестируемого материала. Для дозирования каждый супернатант смешивали с MATRIGEL™ (1:1 по объему), и по 40 мкл смеси добавляли к каждому эмбриону.
Результаты
[0299] Показатели плотности кровеносной сети (см. Фиг.13) указывают на то, что индукция формирования кровеносной сети супернатантами из каждого препарата стволовых клеток отличается. Образцы супернатантов из трех лотов AMDAC показали существенное влияние на индукцию кровеносной сети, P<0,01, P<0,001 и P<0,02 (критерий “t” Стьюдента), соответственно. Как ожидалось, положительный контроль bFGF также показал мощную индукцию формирования кровеносной сети, как отмечено выше в испытании САМ номер 1 (P<0,001, критерий “t” Стьюдента). Однако супернатант человеческих клеток рака молочной железы MDA-MB-231 не показал значимой индукции на формирование кровеносной сети по сравнению с контролями, содержащими только носитель. Как было показано выше, одна только культуральная среда не имеет никакого эффекта.
6.5 Пример 5: AMDAC проявляют нейропротективный эффект
[0300] В этом примере показано, что AMDAC обладают нейропротективным эффектом в условиях низкого содержания кислорода и низкого уровня глюкозы, во время изучения инсульта в условиях кислород-глюкозной недостаточности (OGD), и уменьшают реактивные формы кислорода. Сами по себе, эти результаты указывают на то, что AMDAC полезны при лечении ишемических состояний, таких как инсульт или болезни периферических сосудов, и могут служить в качестве защитного средства от реперфузных повреждений, являющихся следствием ишемических состояний.
2
[0301] Человеческие нейроны (ScienCell, каталог # 1520) культивировали согласно рекомендациям изготовителя. Вкратце, культуральные сосуды покрывали поли-L-лизином (2 мкг/мл) в стерильной дистиллированной воде в течение 1 часа при 37°C. Сосуд промывали дважды дистиллированной HO три раза. Среду для нейронов (ScienCell) добавляли в сосуд и уравновешивали при 37°C в инкубаторе. Нейроны оттаивали и добавляли непосредственно в сосуд без центрифугирования. Во время последующего культивирования среду меняли в день инициирования культуры, после инициирования, а также через день после инициирования. Нейроны обычно были готовы для инсульта на 4 день.
[0302] Среду OGD (среда Игла с модификацией Дульбекко без глюкозы) готовили сначала путем нагревания среды на водной бане, частично для уменьшения растворимости кислорода в жидкой среде. Через среду пропускали пузыри 100% азота в течение 30 минут, используя 0,5 мкм диффузионный камень для удаления растворенного кислорода. Добавляли буфер HEPES до конечной концентрации 1 мМ. Среду добавляли непосредственно к нейронам в конце орошения. Брали аликвоту небольшого образца среды для подтверждения уровней кислорода, используя кислородный датчик погружного типа. Уровни кислорода обычно уменьшали до содержания кислорода от 0,9% до примерно 5,0%.
2
2
[0303] Гипоксическую камеру готовили, помещая камеру в инкубатор при 37°C на, по меньшей мере, 4 часа (предпочтительно, на всю ночь) для выделения газов. Среду в культуральных сосудах удаляли и заменяли дегазированной средой, и культуральные сосуды помещали в гипоксическую камеру. Затем гипоксическую камеру заполняли газом 95% N/5% CO, прогоняя через систему со скоростью 20-25 л/мин в течение, по меньшей мере, 5 минут. Систему инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 4 часов, с дегазацией камеры еще раз через 1 час.
[0304] В конце процедуры инсульта среду OGD отсасывали и к нейронам добавляли теплую среду. Через 24-28 часов AMDAC и нейроны высевали равными количествами по 100000 клеток на каждую лунку 6-ти луночной планшеты, суспендировали в среде для нейронов, добавляли к нейронам и культивировали совместно в течение 6 дней.
[0305] Микрофотоснимки делали для случайных областей в 6-ти луночной планшете для каждого состояния. Клетки с обычной нейроной морфологией идентифицировали, и регистрировали длину нейрита. Средняя длина нейритов положительно коррелировала со здоровьем нейронов, при этом нейриты были длиннее в сокультурах нейронов и AMDAC, указывая на то, что AMDAC защищали клетки от инсульта.
Анализ реактивных форм кислорода
[0306] AMDAC оценивали на экспрессию генов супероксиддисмутазы, каталазы и гемоксигеназы во время гипоксии. Способность AMDAC акцептировать реактивные формы кислорода и защищать клетки от таких форм определяли в данном испытании, используя перекись водорода в качестве генератора реактивных форм кислорода.
2
2
[0307] Описание анализа: Целевые клетки (астроциты, ScienCell Research Laboratories) высевали в 96-ти луночные с черными лунками планшеты, предварительно покрытые поли-L-лизином, по 6000/см. Астроцитам давали возможность прикрепляться в течение ночи в среде для роста при 37°C с 5% углекислого газа. На следующий день культуральную среду удаляли, и клетки инкубировали с проникающим в клетку красителем DCFH-DA (дихлорфлуоресцин диацетат), который является флуорогенным зондом. Лишнюю краску удаляли, промывая забуференным фосфатом солевым раствором Дульбекко или забуференным солью раствором Ханка. Затем клетки повреждали, используя реактивные формы кислорода путем добавления 1000 мкM перекиси водорода в течение 30-60 минут. Затем среду, содержащую перекись водорода, удаляли и заменяли средой для роста без глюкозы, без сыворотки. AMDAC (или клетки, обозначенные Лот 1 или Лот 2), или BM-MSC добавляли в количестве 6000/см, и клетки культивировали в течение еще 24 часов. Затем клетки считывали на стандартном флуоресцентном планшетном устройстве считывания при 480Ex и 530Em. Содержание реактивных форм кислорода было прямо пропорционально уровням DCFH-DA в клеточной цитозоли. Содержание реактивных форм кислорода измеряли относительно предварительно определенной стандартной кривой DCF. Все эксперименты проводили с N=24.
2
2
[0308] Для испытания среду 1X DCFH-DA готовили сразу перед использованием путем разбавления 20X DCFH-DA маточного раствора до 1X в клеточной культуральной среде без фетальной бычьей сыворотки и перемешивали до однородности. Разбавления перекиси водорода (HO) готовили в DMEM или DPBS по мере необходимости. Стандартную кривую получали в виде серии разбавлений 1:10 в диапазоне концентраций от 0 мкM до 10 мкM путем разбавления 1 мM стандарта DCF в клеточной культуральной среде, перенося 100 мкл стандарта DCF в 96-ти луночный планшет, подходящий для флуоресцентного измерения, и добавляя 100 мкл буфера для лизиса клеток. Флуоресценцию подсчитывали при 480Ex и 530Em.
Результаты
[0309] : Оба использованных лота AMDAC значимо уменьшали концентрацию реактивных форм кислорода в сокультурах астроцитов. См. Фиг.14A и 14B. Напротив, BM-MSC были не в состоянии значимо уменьшить реактивные формы кислорода в сокультурах астроцитов.
6.6 Способы лечения, используя амниотические адгезивные клетки
6.6.1 Лечение инфаркта миокарда
8
8
[0310] Мужчина 50-ти лет жаловался на боль в груди, отдаваемую в левой руке, дольше 20 минут, одышку, тошноту, учащенное сердцебиение, потоотделение. По результатам электрокардиограммы и на основе повышения и падения уровней креатинкиназы в крови был поставлен дифференциальный диагноз инфаркта миокарда (трансмурального) передней стенки сердца. После стабилизации индивидуума нитроглицерином и стрептокиназой ему вводили от 1×10 до 5×10 AMDAC в 0,9% физрастворе непосредственно в пораженную область, используя сердечный шприц с локальной анестезией. Затем индивидуума наблюдали на случай неотложной помощи в течение следующих 72 часов. Далее индивидуума наблюдали в течение следующих трех месяцев после лечения с помощью электрокардиограммы и/или методов визуализации с использованием красителей для оценки степени реваскуляризации области, пораженной инфарктом. Терапевтическую эффективность устанавливали, когда результаты электрокардиограммы имели ярко выраженное сходство с нормальной, по сравнению с той, что была до введения AMDAC, или когда визуализированная пораженная инфарктом область была заметно реваскуляризована.
6.6.2 Лечение кардиомиопатии
8
8
[0311] Индивидуум имел одышку, отек ног и лодыжек и нерегулярное сердцебиение. После исключения других причин и по результатам электрокардиограммы был поставлен диагноз кардиомиопатии. Сонограммой было подтверждено наличие у индивидуума застойной кардиомиопатии. Индивидууму вводили от 1×10 до 5×10 AMDAC в 0,9% физрастворе непосредственно в сердечную артерию, используя сердечный шприц с местной анестезией. Индивидуума наблюдали в течение трех месяцев на изменения в результатах сонограммы, указывающие на нормализацию кровотока, и на снижение ощущения одышки и уменьшение отека ног и лодыжек. Наличие терапевтической эффективности устанавливали, когда любой из этих признаков показывал улучшение во время периода наблюдения индивидуума.
6.6.3 Лечение болезни периферических сосудов
9
9
[0312] Индивидуум испытывал ощущение холода, покалывание в ступнях, которые краснели при свободном покачивании, а также боль, слабость и усталость в ногах. После исключения диабета был поставлен диагноз болезни периферических артерий. Индивидууму вводили от 1×10 до 5×10 AMDAC внутривенно в 450 мл 0,9% физраствора и наблюдали каждые две недели в течение следующих трех месяцев. Терапевтическую эффективность устанавливали при улучшении любого из описанных выше признаков во время периода наблюдения.
6.6.4 Лечение болезни периферических сосудов
8
8
[0313] Индивидуум испытывал ощущение холода, покалывание в ступнях, которые краснели при свободном покачивании, а также боль, слабость и усталость в ногах. После исключения диабета был поставлен диагноз болезни периферических артерий. Индивидууму вводили от 1×10 до 5×10 AMDAC внутримышечно в 5 мл 0,9% физраствора и/или эквивалентное количество внутривенно или внутриартериально, локально между пальцами ноги, и наблюдали каждые две недели в течение следующих трех месяцев. Терапевтическую эффективность устанавливали при улучшении любого из описанных выше признаков во время периода наблюдения.
6.6.5 Комбинированное лечение болезни периферических сосудов
9
9
[0314] Индивидуум испытывал ощущение холода, покалывание в ступнях, которые краснели при свободном покачивании, а также боль, слабость и усталость в ногах. После исключения диабета был поставлен диагноз болезни периферических артерий. Индивидууму вводили от 1×10 до 5×10 AMDAC внутривенно в 450 мл 0,9% физраствора и наблюдали каждые две недели в течение следующих трех месяцев. Индивидууму также прописали Цилостазол, 100 мг, два раза в сутки. Терапевтическую эффективность устанавливали при улучшении любого из описанных выше признаков во время периода наблюдения.
6.6.6 Комбинированное лечение болезни периферических сосудов
9
9
[0315] Индивидуум испытывал ощущение холода, покалывание в правой ступне, которая краснела при свободном покачивании, а также боль, слабость и усталость в ногах. После исключения диабета был поставлен диагноз болезни периферических артерий. Индивидууму была сделана ангиопластика и операция по имплантированию стента в бедренную артерию. Затем индивидууму вводили от 1×10 до 5×10 AMDAC внутривенно в 450 мл 0,9% физраствора и наблюдали каждые две недели в течение следующих трех месяцев. Терапевтическую эффективность устанавливали при улучшении любого из описанных выше признаков во время периода наблюдения.
6.6.7 Лечение инсульта с помощью AMDAC
7
8
[0316] 52-летний мужчина страдал от гемиплегии левой стороны тела и частичной афазии. Был поставлен диагноз ишемического инсульта. После локализации области ишемии с помощью магнитно-резонансной томографии, индивидуума препарировали, формируя отверстие в черепе на пораженной стороне. После формирования отверстия в ишемическую область вводили от 5×10 до 1×10 AMDAC в 1-2 мл 0,9% физраствора. Индивидуума наблюдали следующие 7-14 дней на признаки улучшения по любому симптому инсульта, в частности, гемиплегии или афазии. Терапевтическую эффективность устанавливали при улучшении любого из описанных выше признаков во время периода наблюдения.
6.6.8 Лечение инсульта с помощью AMDAC
9
9
[0317] 52-летний мужчина страдал от гемиплегии левой стороны тела и частичной афазии. Был поставлен диагноз ишемического инсульта. После локализации области ишемии с помощью магнитно-резонансной томографии, индивидуума препарировали, формируя отверстие в черепе на пораженной стороне. После формирования отверстия ему вводили от 1×10 до 5×10 AMDAC в 450 мл 0,9% физраствора внутривенно. Индивидуума наблюдали следующие 7-14 дней на признаки улучшения по любому симптому инсульта, в частности, гемиплегии или афазии. Терапевтическую эффективность устанавливали при улучшении любого из описанных выше признаков во время периода наблюдения.
Эквиваленты:
[0318] Настоящее изобретение не следует ограничивать объемом описанных в данном описании конкретных вариантов осуществления. На самом деле, различные модификации изобретения, дополнительно к описанным, станут очевидными для специалиста в данной области из предшествующего описания и прилагаемых чертежей. Такие модификации находятся в объеме прилагаемой формулы изобретения.
[0319] В настоящем описании процитированы различные публикации, патенты и заявки на патент, раскрытие которых включено во всей полноте в виде ссылки.