Влияние полимерных субстратов на биосинтез ферментов лигнолитического комплекса гриба p. tigrinus

Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Атыкян H.A.

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ СУБСТРАТОВ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ ЛИГНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ГРИБОМ P.TIGRINUS

Исследовано влияние полимерных субстратов на процесс биосинтеза ферментов лигнолитического комплекса грибом P.tigrinus BKM F-3616D при глубинном культивировании. Показано, что внесение целлолигнина в среду снижает активность ферментов лигнолитического комплекса. Березовые опилки в концентрации 2% повышают Mn-пероксидазную и глюкозооксидазную, а в концентрации 5% лакказ-ную и пероксидазную активности.

Введение

В настоящее время базидиальные грибы привлекают внимание многих исследователей. Особое место среди них занимают грибы «белой гнили» из-за способности разрушать лигнин и его производные. В литературе имеются данные о том, что эти грибы можно использовать для отбеливания бумаги, получения ферментов и других биологически активных веществ, биоконверсии лигнинсодержащих отходов (7, 12). Еще одним перспективным направлением является использования грибов белой гнили в производстве экологически безопасных композиционных материалов. В результате предыдущих исследований нами было показано, что гриб Р. tigrinus ВКМ Б-3616Б обладает высокой лигнолитической активностью и продуцирует комплекс ферментов - перокси-дазу растительного типа, несколько изоформ лакка-зы, Мп-пероксидазу и глюкозооксидазу (1). Целенаправленная модификация отходов древесины этим грибом позволяет получить пластики без применения токсичных связующих (2, 4). Длительность обработки отходов грибом занимает несколько суток и зависит от многих факторов и прежде всего от лиг-нолитической активности. Повышение активности гриба позволило бы сократить продолжительность биомодификации и снизить себестоимость плит. Одним из наиболее простых путей решения этой проблемы является применение индукторов, в качестве которых могут выступать полимерные субстраты.

Целью работы было подбор индукторов для повышения лигнолитической активности гриба Р^ппш.

Методы исследования

Гриб пилолистник тигровый - Р. (Ь.) tigrinus был выделен на кафедре биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева из сухих плодовых тел, растущих на березовом валежнике в окрестностях Саранска, и депонирован в ВКМ РАН как штамм ВКМ Б-3616 Б (5).

Инокулят Р. tigrinus выращивали на среде Чапе-ка-Докса, содержащей 20 г/л кукурузного экстракта (по сухим веществам). Гриб со скошенного сусло-агара высевали в жидкую питательную среду. Кусочек заросшего агара вносили в конические колбы Эр-

ленмейера объемом 500 мл с 100 мл питательной среды и выращивали 4 сут. при 260 на круговых качалках (235 об/мин). Инокулят объемом 5 мл вносили в экспериментальные питательные среды.

При изучении влияния соотношения азота и углерода на лигнолитическую активность гриб культивировали на жидкой питательной среде следующего состава (на 1 л): глюкоза - 3 г; КН2Р04 - 1 г; ШН2Р04 - 0,26 г; Мв804-7Н20 - 0,5 г; (2ЧН4)2804 -0,317 г; СиБ04  5Н20 - 0,5 мг; СаС12 -2Н20 - 74 мг;

ZnSO4 -7H2O

мг; FeSO4 -7H2O - 5 мг; MnSO4 -5

H2O - 5 мг; CoCl2 -6 H2O - 1 мг; (9). В средах варьировали концентрацию полимерных субстратов целлолигнина и березовых опилок от 0,5 до 5%. Культуру гриба выращивали глубинным способом при температуре 260C в конических колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл питательной среды в течение 12 сут. на круговых качалках со скоростью 235 об/мин. В процессе культивирования каждые два дня отбирали пробы. Пробы центрифугировали при 6000 об/мин 10 мин. В супернатанте определяли активность пероксидазы, лакказы и Mn-пероксидазы - по окислению ABTS (»ICN», USA) (9). Начальную скорость реакции измеряли на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее окисление 1 мкм субстрата в течение 1 мин. при оптимальных условиях. Также определяли концентрацию белка спектрофотометрически по методу Бредфорд, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин («BDH biochemicals», England) (8).

Реактивы. В работе использованы реактивы 2,2' -азино-бис(3-этил-бензтиазолин-6-сульфонат) аммония (АБТС) - «ICN» (USA), бычий сывороточный альбумин - «BDH biochemicals» (England). Остальные реактивы - отечественного производства марки х. ч., ч. д. а. и ч.

Результаты и их обсуждение

Введение целлолигнина в культуральные среды оказало неблагоприятное действие на синтез лигно-литических ферментов грибом Panus tigrinus. Синтез Mn-пероксидазы на средах с варьированием концентрации целлолигнина был в 2,5 раза ниже, чем в контрольной среде (рис. 1). При этом на среде с мак-

Кадималиев ДА. и др.

Влияние полимерных субстатов на биосинтез ферментов..

симальным содержанием целлолигнина - 5% активность не детектировалась. Аналогичная картина наблюдалась и при изучении влияния целлолигнина на синтез пероксидазы и лакказы грибом. Как общая, так и удельная активность (рис. 2) была выше на среде без целлолигнина, а при максимальном содержании его пероксидаза детектировалась на низком уровне, а лакказа не определялась. Неблагоприятное воздействие введения целлолигнина в питательные среды на биосинтез пероксидаз и лакказы грибом, вероятно, обусловлено наличием ингибирующих веществ, например остатков фурфурола, переходящих в куль-туральную среду из целлолигнина. Однако введение целлолигнина в среды для культивирования стимулировало биосинтез глюкозооксидазы грибом. Максимальный уровень биосинтеза глюкозооксидазы наблюдался на среде, содержащей 1% целлолигнина, что связано с наличием дополнительного источника углерода - целлюлозы, при гидролизе которой образуются большие количества глюкозы - субстрата глю-козооксидазы.

Иное влияние на биосинтез ферментов оказало добавление в питательные среды различных концентраций березовых опилок. При низких концентрациях растительного субстрата (0,5 и 1%) увеличения пе-роксидазной и лакказной активности в надосадочной жидкости не наблюдалось (рис. 3). Более высокие концентрации березовых опилок вызывали увеличение как пероксидазной, так и лакказной активности, что, вероятно, связано с индукцией низкомолекулярными продуктами деградации лигнина, например, ве-ратровым спиртом, олиго- и дилигнолами и др., образующимися при биодеградации лигнинового компонента опилок грибом.

Вопрос о роли индукторов в проявление лигно-литической активности грибами до конца не выяснен. Несмотря на то, что лигнолитическая активность грибов белой гнили носит конститутивный характер и ее проявление не зависит от наличия лигнина или

его производных, уровень активности, включая титр отдельных ферментов, может быть повышен внесением лигнина или его аналогов. В литературе имеются достаточно сведений о том, что введение в среды вератрового спирта (он является одним из метаболитов гриба и продуцируется им в фазу вторичного роста) увеличивает лигниназную активность (9, 13, 15). При этом он не столько индуцирует синтез, сколько, вероятно, защищает фермент от инактивации (10). Добавление вератровой кислоты или нефе-нольного р -О-4 димера в среды культивирования гриба РЫеЫа гай1а1а также оказывало стимулирующий эффект на синтез внеклеточных ферментов (14), а анисовый спирт в 2,5 раза увеличивал синтез Мп-пероксидазы грибом Р. tigrinus 8/18 (3). Возможно также, что присутствие достаточного количества целлюлозы, кометаболизируемого субстрата, энергетически обеспечивает дополнительный синтез лигно-литических ферментов, образование возможных эффекторов лигнолитической системы, медиаторов электронного транспорта и перкиси водорода, необходимой для функционирования большинства лиг-нолитических ферментов.

Наиболее высокие пероксидазная и лакказная активности наблюдались на восьмые сутки культивирования на среде, содержащей 5% березовых опилок. Синтез Мп-пероксидазы увеличился почти в 5 раз при росте гриба в присутствии 2% березовых опилок. На этой среде была отмечена и максимальная удельная Мп-пероксидазная активность (рис. 4), т. е. введение лигноцеллюлозного субстрата оказало стимулирующее действие именно на синтез фермента, а не только увеличило общую активность культуры. Биосинтез глюкозооксидазы также повысился при введении в среду березовых опилок. Оптимальным вариантом, стимулирующим синтез данного фермента, была среда, содержащая 2% березовых опилок.

Различия в величинах оптимальных концентраций березовых опилок, вероятно, могут быть связа-

2,5

1,5

0,5

ь

й

тл - п

контроль 0,5 1 2 5

Концентрация, %

пероксидаза  Мп-пероксидаза  лакказа  глюкозооксидаза Рисунок 1.

45

40

л 35

.5

ч 30

е

ь, ст 25

ос ЕВ 20

Я

кт 15

<

10

5

0

т 111-п

п.

л

контроль 0,5 1 2 5

Концентрация, %

пероксидаза  Мп-пероксидаза  лакказа  глюкозооксидаза

Рисунок 2.

2

1

0

Естественные науки

и <

l"L Н

r^T^l rt

ГП-п Г

Я 4

й

М

ш.

ГП-п Г

ii

контроль 0,5 1 2 5

Концентрация, %

пероксидаза  Ыи-пероксидаза Шлакказа  глюкозооксидаза Рисунок 3.

ны с тем, что чувствительность отдельных ферментов к образующимся продуктам деградации полимера зависит как от количества этих продуктов, так и от химической структуры. Например, исследование субстратной специфичности лакказы по отношению к метоксифенольным соединениям, в том числе к ванилиновому спирту, о-ванилину - продуктам биодеградации березы, показало существенные различия в значениях кинетических констант (15).

контроль 0,5 1 2 5

Концентрация, %

пероксидаза  Ыи-пероксидаза  лакказа  глюкозооксидаза Рисунок 4.

Таким образом, добавление березовых опилок в среду повышает лигнолитическую активность гриба Р. tigrinus и дает возможность регулировать синтез ферментов. Уровень биосинтеза отдельных ферментов лигнолитического комплекса гриба зависит от количества внесенного полимерного субстрата. Максимальная Мп-пероксидазная и глюкозооксидазная активность наблюдается при концентрации опилок 2%, а лакказная и пероксидазная - 5%.

8

8

4

0

0

Список использованной литературы:

1. Атыкян Н.А., Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Лафуткина Т.Т. Изучение роли ферментов лигнолитического комплекса гриба P.tigrinus BKM F-3616 D в биомодификации древесный отходов./Интеграция фундаментальной науки и высшего лесотехнического образования по проблемам ускоренного воспроизводства, использования и модификации древесины: Мат-лы Междун. Научно-практ. Конф (13-16 июня 2000 г.)-Воронеж, Воронеж.гос.лесотехн.акад., 2000 г.-С.109-113.

2. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Шутова В.В. Влияние прессования на свойства лигнина древесины сосны, обработанной грибом P. tigrinus//Химия раст.сырья., 2001.-№3.-С.111-118.

3. Мясоедова Н.М. Влияние условий культивирования на лигнолитическую активность гриба Phanerochoate chrysosporium и Panus tigrinus.//Дис.на соиск.уч.степени канд.биол.наук, Пущино, 1997.-132с.

4. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Шутова В.В., Самуилов В.Д. Модификация лигнина древесины грибом Panus tigrinus .//Прикл.био-хим. и микроб.,2002.-№38.-В.5.-С.450-453.

5. Ревин В.В., Прыткова Т.Н., Лияськина Е.В., Черкасов В.Д., Соломатов В.И. Свидетельство о депонировании микроорганизма Panus (Lentinus) tigrinus (Bulliard:Fries) Fries,317. Регистрационный номер BKM F-3616D присвоен 5 марта 1998г.

6. Смирнов С.А., Королева О.В., Гаврилова В.П., Белова А.Б., Клячко Н.Л. Лакказы базидиальнык грибов: физико-химические характеристики и субстратная специфичность по отношению к метоксифильным соединениям.//Биохимия., 2001.-Т.66.-В.7.-С.952-958.

7. Элисашвили В.И. Биоконверсия растительного сырья высшими базидиомицетами.//Микол. и фитопатол., 1993.-Т.27.-В.6.-С.83-92.

8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantites of protein utilizing the principle of protein-drye binding.//Anal.Biochem.,1976.-V72.-P.248-254.

9. Cancel A.M., Orth A.B., Tien M. Lignin and veratryl alcohol are not inducers of the lignolytic system of Phanerochoate chrysosporium.// Appl.Environ.Microbiol.,1993.-V.59.-№9.-P2909-2913.

10. Eggert C., Temp U., Eriksson K.E. The lignolytic system of the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and characterization of laccase.//Appl.Environ.Microbiol.,1996.-V.62.-№4.-P 1151-1158.

11. Faison B.D., Kirk T.k., Farrell R.L. Role of veratryl alcohol in regulating ligninase activity in Phanerochaete chrysosporium.// Appl.Environ. Microbiol., 1986.-V.52.-P.251-254.

12. Jie I., Guanying W. Antitumor polysaccharides from a chinese mushroom, «Juhuagmo», the fruiting body of Pleurotus citrinopillatus.// Biosci.Biotechnol and Biochem.,1994.-V.58.-№7.-P.1195-1201.

13. Kirk T.K., Croan S., Tien M., Murtagh K.-E., Farrell R.L. Production of multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporiun: effect of selected growth conditions and use of mutant strain.//Enzyme Microb.Technol.,1986.-V8.-P.27-32.

14. Niku-Paavola M.-L., Karhunen E., Kantelinen A., Viikari L., Lundel T., Hatakke A. The effect of culture conditions on the production of lignin modifyling enzymes by the white-rot fungus Phlebia radiate.//J.Biotech.,1990.-V.13.-P.211-221.

15. Tonon F., Odier E. Influence of veratryl alcohol and hydrogen peroxide on ligninase activity and ligninase production by Phanerochaete chrysosporium.//Appl.Environ.Microbiol.,1988.-V.54.-P.466-472.