Изменения активности хитотриозидазы и концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови пациентов с ишемической болезнью сердца и после коронарного шунтирования

УДК 616.12-02:616.13

М. С. Черканова, Т. Г. Филатова, Т. A. Короленко, И. Ю. Бравве

ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХИТОТРИОЗИДАЗЫ И КОНЦЕНТРАЦИИ С-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА И ПОСЛЕ КОРОНАРНОГО ШУНТИРОВАНИЯ

ГУ НИИ физиологии СО РАМН, Новосибирск

ОГУЗ «Новосибирский областной клинический кардиологический диспансер», Новосибирск

Среди маркеров атеросклероза и предикторов кардиоваскулярных катастроф значительное место занимают белки острой фазы и новые ферменты, секретируемые стимулируемыми макрофагами (хитотриозидаза). Исследованы «базовая» концентрация С-реактивного белка (острофазный белок) и активность хитотриозидазы в сыворотке крови пациентов в возрасте 50-65 лет без клинических проявлений ишемической болезни сердца и их изменения в раннем послеоперационном периоде после коронарного шунтирования. «Базовые» концентрации сравнивались с аналогичным показателем в группе практически здоровых лиц в возрасте 2045 лет. По сравнению с молодыми людьми (20-45 лет) у практически здоровых лиц 50-65 лет обнаружено повышение концентрации С-реактивного белка и активности хитотриозидазы. В раннем периоде после операции коронарного шунтирования обнаружено резкое увеличение концентрации С-реактивного белка - реактанта острой фазы (более чем в 70 раз). Существенное (почти в 10 раз) увеличение активности хитотриозидазы происходит позднее, чем увеличение активности С-реактивного белка, и свидетельствует об активации макрофагов, развивающейся при атеросклерозе. Обсуждается влияние изменений указанных показателей как возможных предикторов кардиоваскулярных осложнений при атеросклерозе.

Ключевые слова: хитотриозидаза, С-реактивный белок, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца

Наряду с хитиназами и хитин-связывающими лектинами растений, грибов, вирусов и простейших хитотриозидаза человека (ХТ) является одним из представителей семейства 18 гликозидгидролаз (хи-тиназ), объединенных особенностями молекулярной структуры (значительная гомология аминокислотных последовательностей и сходство кристаллической структуры) [1, 2]. Как известно, ген ХТ локализован в хромосоме 1 q31 - q32. В настоящее время изучена структура молекулы фермента; показано, что в тканях человека ХТ гетерогенна по молекулярной массе и изоэлектрической точке [3]. Установлено, что ХТ является истиной хитиназой, т. е. фермент способен расщеплять хитин, а также синтетические субстраты, созданные на основе Р-^-хитоолигосахаридов (4-MUF-NAGn). В то же время биологический субстрат, на который ХТ воздействует в организме, неизвестен и роль фермента т изучена недостаточно. По-видимому, наряду с экзогенным хитином грибов и простейших в организме человека точкой приложения фермента является гиалуроновая кислота - гликозаминогликан внеклеточного матрикса рыхлой неоформленной соединительной ткани, синовии,

хряща, кожи, костей и стекловидного тела [4].

Скорость синтеза и секреции ХТ макрофагами является одним из важнейших показателей при оценке их активности [3, 5]. Экспериментально показано. что у крыс в ответ на стимуляцию зимозаном или карбоксиметилированным (1-3) Р-^-глюканом и при депрессии, вызванной хлористым гадолинием, происходят значительные разнонаправленные изменения активности этого фермента, хотя клеточная локализация ХТ у крыс и человека различна. У человека отмечена зависимость повышения активности ХТ от степени активации макрофагов [3]. Показана активация и повышение экспрессии ХТ при болезни Гоше и некоторых других лизосомных болезнях накопления у человека [3, 6], бронхиальной астме [2], болезни Альцгеймера, талассемии [7], неалкогольном жировом гепатите [8], различных артритах [4], нарушениях иммунного статуса, воспалении [9]. Обнаружено повышение активности ХТ в сыворотке крови при атеросклерозе [8, 10], в частности у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), и при ишемическом инсульте [3]. Эти изменения свидетельствуют о возможности использования ХТ в качестве одного

из маркеров, отражающих степень активации макрофагов при этих заболеваниях. Если рассматривать атеросклероз в качестве воспалительного процесса, сопровождающегося активацией макрофагов, представляется важной оценка изменений активности ХТ у пациентов с данной патологией, а также сопоставление этих изменений с изменением острофазных показателей, например С-реактивного белка (СРБ).

Одним из высокочувствительных неспецифических маркеров воспаления у человека является СРБ, синтез которого увеличивается под действием интерлейкинов-1, -6 и ФНО-а [11]. До недавнего времени концентрацию СРБ в биологических жидкостях оценивали с помощью радиальной иммунодиффузии, им-мунотурбидиметрии и нефелометрии. Концентрации этого белка в сыворотке крови в диапазоне 8-1000 мг/мл рассматривались как «патологические», свидетельствующие о наличии острого воспаления; при концентрации же СРБ менее 8-10 мг/мл отмечалось только отсутствие системного воспалительного процесса. В настоящее время разработаны и внедрены новые высокочувствительные современные наборы (иммунотурбидиметрия с латексным усилением) для оценки концентрации этого белка в биологических жидкостях в диапазоне 0,05-10 мг/мл, ранее считавшейся «нормальной» [12]. В настоящее время такие концентрации СРБ принято называть «базовыми», т. е. стабильно выявляемыми у практически здоровых лиц или у пациентов при отсутствии острого воспалительного процесса и обострения заболевания. В настоящее время изучению «базовых» и уточнению «нормальных» концентраций этого белка уделяется большое внимание. Уточняется значение СРБ при прогрессировании атеросклероза. СРБ обнаруживается в бляшках и зоне повреждения при остром инфаркте миокарда, кроме того, в бляшках сонной артерии происходит локальный синтез СРБ [11]. Установлено, что связывание СРБ с холестерином модифицированных липидов низкой плотности сопровождается активацией системы комплемента и инициированием воспалительного процесса [11]. Показано, что при концентрациях более 5 мг/мл СРБ обладает выраженным провоспалительным действием на эндотелиальные клетки коронарных артерий человека, стимулируя экспрессию молекул адгезии 1САМ-1, УСАМ-1, Е-селектина [11]. Выявлена связь умеренно повышенной концентрации СРБ в сыворотке крови пациентов с ИБС с высокой вероятностью развития у них инфаркта миокарда [13]. Однако диапазон нормальных значений концентрации в сыворотке крови и их изменение при атеросклерозе нуждаются в уточнении [14].

Целью данного исследования является оценка активности хитотриозидазы, «базовых» концентраций и изменения уровня СРБ в группах пациентов молодого и зрелого возраста с различной выраженностью атеросклеротического процесса, а также после операции коронарного шунтирования.

Материалы и методы

Использовали сыворотку крови практически здоровых доноров в возрасте 20-45 лет, пациентов в возрасте 50-65 лет без клинических проявлений ИБС и у поступивших в клинику ОГУЗ «Новосибирский областной клинический кардиологический диспансер» для проведения операции коронарного шунтирования (КШ). Всего исследовано 108 проб сыворотки крови 58 мужчин. Пробы крови забирали натощак с 8 до 9 ч утра одновременно с забором крови для проведения рутинных биохимических тестов после получения информированного согласия пациентов. Работа проведена согласно рекомендациям Комитета по биомедицинской этике ГУ НИИ физиологии СО РАМН. Сыворотку получали путем центрифугирования образцов крови (1500 об/мин, 10 - 15 мин) и хранили при температуре -20 С не более одного мес.

Активность ХТ определяли, используя флуоресцентный субстрат 4-МУФ-Р-.0-К-№-№,-триацетилхи-тотриозид («Sigma», USA) по методу [5, 6]. Экстинкция оцениваемая с помощью флуоресцентного спектрофотометра ShimadzuRF-530101 (РС^(Япония)составила 360 нм, эмиссия - 445 нм. Результаты выражали в нмоль освобожденного метилумбеллиферона (МУФ) /(мл ч).

Для определения СРБ в сыворотке крови пациентов использовали два вида наборов. Оценку «базовой» концентрации СРБ (0,05-10 мг/л) в сыворотке всех групп обследованных производили с помощью коммерческих наборов для определения СРБ-hs человека (высокочувствительный СРБ, иммунотурбиди-метрия, высокочувствительный латекс, «BioSystems», Испания). После коронарного шунтирования в раннем послеоперационном периоде концентрацию СРБ в сыворотке крови пациентов в возрасте 50-65 лет оценивали, используя коммерческие наборы («BioSystems», Испания) для определения концентрации СРБ в биологических жидкостях человека (им-мунотурбидиметрия для оценки концентраций СРБ свыше 10 мг/л). Измерения проводили с помощью полуавтоматического биохимического фотометра с проточной термостатируемой кюветой Screen Master («Hospitex Diagnostics», Швейцария). Концентрацию СРБ выражали в мг/л биологического образца.

Результаты обрабатывали статистически методом параллельных рядов вариационной статистики с использованием /-критерия Стьюдента. Различия счита-

Концентрация

СРБ

226,50

Ш Практически здоровые, 20 -45 лет, п=26

Пациенты 50-65 лет, п=15

Г Пациенты 50-65 лет, до КШ, п=17

[ Пациенты 50-65 лет, после КШ, п=16

П Пациенты 50-65 лет, вторые сутки после КШ, п=17

Пациенты 50-65 лет, третьи сутки после КШ, п=17

Рис. Концентрация СРБ в сыворотке крови (мг/л) обследуемых в сравнении с группой практически здоровых лиц среднего возраста

ли достоверными при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Обнаружено, что «базовая» концентрация СРБ в сыворотке крови пациентов в возрасте 50-65 лет без клинических проявлений ИБС и пациентов, поступивших в клинику для выполнения коронарного шунтирования, достоверно выше показателей лиц в возрасте 20-45, причем наибольшие значения отмечены в группе поступивших для выполнения шунтирования (рис.). Возможно, это обусловлено более выраженными атеросклеротическими изменениями сосудов у пациентов в возрасте 50-65 лет. Различия между группами пациентов в возрасте 50-65 лет с клиническими проявлениями ИБС и без клинических проявлений ИБС незначительны (рис.).

В раннем послеоперационном периоде концентрация СРБ возрастала по сравнению с «базовой» более чем в 30 раз (в первые сутки). На вторые сутки после оперативного вмешательства показатель достоверно снижался (превышение «базовой» концентрации более чем в 12 раз). На третьи сутки после КШ концентрация СРБ была выше исходных «базовых» значений более чем в 4 раза (рис.).

Активность ХТ в сыворотке крови лиц в возрасте 50-65 лет достоверно выше, чем у обследованных в возрасте 20-45 лет (табл.). Достоверные различия выявлены между группами практически здоровых лиц молодого возраста (20-45 лет) и пациентами (50-65 лет), поступившими в клинику для выполнения КШ

(табл.). Полученные при обследовании практически здоровых лиц данные в целом соответствуют описанным в литературе: колебания активности фермента в сыворотке крови практически здоровых лиц в интервале 9-195 нмоль/(мл ч), тенденция к повышению сывороточной активности фермента с возрастом [3]. Предполагается, что важным источником ХТ в сыворотке крови являются макрофаги, перегруженные липидным материалом [3]. Этот вопрос пока до конца не изучен. Представляет интерес оценка корреляции активности ХТ с изменениями липидного спектра в исследуемых группах при продолжении исследования.

После КШ активность ХТ возрастала, превышая на третьи сутки дооперационные показатели в группе более чем в 4 раза, а показатели в контрольной группе (50-65 лет) и в группе практически здоровых лиц (20-45 лет) - более чем в 7 и 10 раз соответственно (табл.). Возможно, это обусловлено как активацией макрофагов, так и увеличением секреции фермента молодыми формами гранулоцитов (в качестве фактора неспецифической защиты организма в ответ на возможное внедрение патогенов, содержащих хитин и аналогичные субстраты) [3].

Таким образом, у лиц в возрасте 50-65 лет обнаружено увеличение как концентрации СРБ, так и активности хитотриозидазы в сыворотке крови, причем наибольшие изменения обоих показателей наблюдались в группе пациентов, поступивших в клинику для выполнения КШ (при ишемической болезни сер-

дца). При сравнении в обеих группах обследованных в возрасте 50-65 лет достоверные различия выявлены только в отношении активности хитотриозидазы (табл.), но не СРБ (рис.).

В раннем послеоперационном периоде максимальные значения концентрации СРБ наблюдали в первые сутки после операции (рис.). Далее происходило ее снижение, не достигавшее исходных цифр на третьи сутки. Активность хитотриозидазы в этот период возрастала значительно: на 3 сут после шунтирования уровень показателя был более чем в 4 раза выше по сравнению с уровнем до операции, а по сравнению с группой практически здоровых лиц в возрасте 20-45 лет более чем в 10 раз.

Таким образом, можно сделать вывод, что увеличение активности ХТ в сыворотке крови обследованных отражает степень активации макрофагов при атеросклерозе и хирургическом лечении ИБС. В течение первых трех суток после КШ активность ХТ значительно увеличивается. При сравнении динамики активности ХТ с изменениями концентрации СРБ, входящего в группу острофазных белков, обнаруживается некоторое сходство (относительно быстрый и значительный прирост показателей в обоих случаях). Однако в отличие от СРБ максимальных значений ХТ достигает позднее. Возможно, рост активности фермента в раннем послеоперационном периоде обусловлен не только стимулирующим моноциты/макрофаги влиянием липополисахаридов, интерферона-у. ТНФ -а [9, 15], но и воздействием на клетки коллоидных плазмозаменителей вводимых во время и после операции [16].

THE CHANGES OF CHITOTRIOSIDASE ACTIVITY AND CRP CONCENTRATION IN PATIENTS WIRH ISCHEMIC CORONARY DISEASE AND OPERATION OF CORONARY SHUNTING

M.S. Cherkanova, T.G. Filatova, T.A. Korolenko,

I.Yu. Bravve

Chitotriosidase activity and C-reactive protein concentration were assayed in serum of healthy persons and patients with atherosclerosis. Chitotriosidase activity was determined by fluorometric method against 4-methylumbelliferil-P-D-N, N’,N”-triacetylchitotriosidе as a substrate, C-reactive protein concentration was measured with help of BioSistems kits (Spain) for CRP and hs-CRP. It was shown that elevation of chitotriosidase activity and C-reactive protein concentration was noted in aged persons. After operation of aortic shunting there was rapid increase of CRP concentration and chitotriosidase activity. The role of chitotriosidase and C-reactive protein as possible predictors of cardio-vascular events is discussed.

Таблица

Активность хитотриозидазы в сыворотке крови обследованных лиц

Группа Число обследо- ванных Активность хитотриозидазы, нмоль МУФ/

1. Практически здоровые, 20 -45 лет 26 156,89 і 33,45

2. Пациенты 50-65 лет без клинических проявлений ИБС ІЗ 249,85 і 44,25 P ^ < 0,05

3. Пациенты 50-65 лет, ИБС, до КШ I7 374 і 5I,20 PI3 < 0,05 P< 0,05

4. Пациенты 50-65 лет непосредственно после КШ I6 504,20 і 73,92 P 2.4 < 0,05 P ,4 < 0,05

5. Пациенты 50-65 лет на 2 сут после КШ I7 I333,50 і I42,90 P 25 < 0,00I

6. Пациенты 50-65 лет на 3 сут после КШ I7 I785,97 і 203,5 P < 0,00I 2-6

Литература

1. Renkema G.N., Boot R.G., Muijsers A.O. et al. Purification and characterization of human chitotriosidase, a novel member of family of the chitotriosidase family of proteins // J. Biol. Chem. 1995. 270. 5. 2198-2202.

2. BootR.G., Renkema G.H., Strijland A. et al. Cloninng of a cDNA encoding chitotriosidase, a human chitinase produced by macrophages // J. Biol. Chem. 1995. 270. 2625226256.

3. Malaguarnera L. Chitotriosidase: the yin and yang // Cell. Mol. Life Sci. 2006. 63. 3018-3029.

4. Ярыгина E.C., Соболева М.К., Богатырева А.В. и др. Активность хитотриозидазы - фермента активированных макрофагов при ювенильном ревматоидном артрите // Мать и Дитя в Кузбассе. 2004. 3. 8-13.

Yarygina E.S., Soboleva M.K., Bogatyreva A.V etc. Chito-triosidase activity - ferment of activated macrophages under juvenile rheumatoid arthritis // Mother and child in Kuzbass. 2004. 3. 8-13.

5. Короленко Т.А., Жанаева С.Я., Фаламе-ева О.В. и др. Хитотриозидаза как маркер стимуляции макрофагов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. 130. 10. 948-950.

Korolenko T.A., Zhanaeva S.Ya., Falameeva O.V Chitotriosidase as a marker of macrophages stimulation // Bulletin of experimental biology and medicine. 2000. 130. 10. 948-950.

6. Короленко Т.А., Фаламеева О.В., Жанаева С.Я. и др. Хитотриозидаза - новый фермент макрофагов: биологическая роль и значение в диагностике ли-зосомных болезней накопления // Бюллетень СО РАМН. 2001. 1. 28-34.

Korolenko T.A., Falameeva O.V., Zhanaeva S.A. etc. Chi-

totriosidase - a new ferment of macrophages // Bulletin of SB RAMS. 2001. і. 28-34.

7. Altarescu G., Rudensky B., Abrahamov A. et al. Plasma chitotriosidase activity in patients with beta-thalassemia // Am. J. Hematol. 2GG2. 71. 7-10.

8. Malaguarnera L., Di Rosa M., Zambito A.M. et al. Chitotriosidase gene expression in Kupffer cells of nonalcoholic fatty liver disease patients // Gut. 2GG6. 55. 13131320.

9. Di Rosa M. , Musumeci M., Scuto A. et al. Effect of interferon-gamma, interleukin 1G, lipopolysaccharide and tumor necrosis factor-alpha on chitotriosidase synthesis in human macrophages // Сііп. Chem. Lab. Med. 2GG5. 43. 499-5G2.

1G. Artieda M., Cenarro A., Ganan A. et al. Serum chitotriosidase activity is increased in subjects with atherosclerosis disease // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2GG3. 23. 1645-1652.

11. Dallegri F., Ottonello L. Pharmacological implications in the switch from acute to chronic inflammation // Inflammopharmacology. 2GG2. 1G. 3.

і59-і7і.

12. Benzaqen L.R., Yu H., Rifai N. High sensitivity C-reactive protein: an emerging role in cardiovascular risk assessment // Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 2GG2. 39. 4-5. 459 - 497.

13. Evrin P.E., Nilsson S.E., Oberg T. et al. Serum C-reactive protein in elderly men and women: association with mortality, morbidity and various biochemical values // Scan. J. Lab. Invest. 2GG5. 65. 25 - 31.

14. Chenilliot O., Henny J., Steinmets J. et al. High-sensitive C-reactive protein: biological variations and reference limits // Clin. Chem. Lab. Med. 2GGG. 38. 1GG3-1G11.

15. Malaguarnera L., Musumeci M., Di Rosa M. et al Interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha and lipopolysaccharide promote chitotriosidase gene expression in human macrophages // J. Clin. Lab. Anal. 2GG5. 19. 3. 128 - 132.

16. Auwerda J.J., Leebeek F.W., Wilson J.H. et al Acquired lysosomal storage caused byfrequent plasmaphaeresis procedures with hydroxyethyl starch // Transfusion. 2GG6. 46. 1G. 17G5-1711.