REP белок в качестве белкового антигена для диагностических анализов
REP PROTEIN AS PROTEIN ANTIGEN FOR DIAGNOSTIC ANALYZES

Изобретение относится к обнаружению и количественному определению содержания белка, связанного с репликацией ДНК (Rep-белка), или анти-Rep антител в диагностировании нейродегенеративных заболеваний, таких как, например, рассеянный склероз (РС). Изобретение предполагает использование MSBI1 геном-кодированного Rep-белка.
Этиология рассеянного склероза (РС) неизвестна. Поэтому существует потребность в биомаркере РС, который можно использовать для диагностики и/или контроля течения или эффективности лечения РС, а также для оценки предрасположенности к развитию РС.
Рассеянный склероз (РС) характеризуется появлением очагов демиелинизации с повреждением нейронов в головном и спинном мозге. Симптомы РС проявляются в виде эпизодов внезапного ухудшения состояния (рецидивы, обострения, припадки, приступы) или в виде постепенного ухудшения состояния с течением времени (прогрессирующие формы). Демиелинизация вызывает развитие воспалительных процессов, активирующих Т-лимфоциты и выработку цитокинов и антител. Для диагностики РС, помимо прочего, используются методы нейровизуализации, анализ спинномозговой жидкости и определение вызванных потенциалов в мозге.
Из разных исследуемых материалов (ткань головного мозга пациента с рассеянным склерозом (РС), сыворотка, молоко КРС) были выделены 17 различных, но частично родственных молекул ДНК (Funk, Gunst et al. 2014, Gunst, Zur Hausen et al. 2014, Lamberto, Gunst et al. 2014, Whitley, Gunst et al. 2014).
2 молекулы ДНК, выделенные из мозговой ткани пациентов с РС, были тесно связаны с последовательностью генов в материале, выделенного из организма животного, больного инфекционной губчатой энцефалопатией (TSE) - Sphinx 1.76 (1758 пар оснований; учетный номер: HQ444404, (Manuelidis L. 2011)). Эти молекулы - MSBI1.176 (MSBI, изолят головного мозга при рассеянном склерозе) (1766 пар оснований) и MSBI2.176 (1766 пар оснований), названные “геном MSBI1” и “геном MSBI2”, соответственно. Нуклеотидная последовательность в геноме MSBI1176 на 98% совпадает с последовательностью Sphinx 1.76. Крупные открытые рамки считывания (ORF) изолятов кодируют предполагаемый белок, участвующий в репликации ДНК, который характеризуется большим сходством между ними. Еще одной общей чертой является наличие итероноподобных тандемных повторов. Расположение этого повторного участка указывает на изменение в ядре отдельных нуклеотидов. Такие итероноподобные повторы могут представлять собой места связывания для Rep-белков. Последовательности изолятов хранятся в хранилище данных европейской лаборатории по молекулярной биологии под учетными номерами LK931491 (MSBI1.176) и LK931492 (MSBI2.176) (Whitley C. et al. 2014). Они были изучены и описаны в WO 2016/005064.
Также материалы для изучения были выделены из коровьего молока. К таким изолятам коровьего молока (CMI) относятся CMI1.252, CMI2.214 и CMI3.168, называемые “геном CMI1”, “геном CMI2” и “геном CMI3”, соответственно. Последовательности геномов хранятся в хранилище данных европейской лаборатории по молекулярной биологии под учетными номерами LK931487 (CMI1.252), LK931488 (CMI2.214) и LK931489 (CMI3.168). Они были изучены и описаны в WO 2016/005064.
Авторы данного изобретения выявили, что геном MSBI1 обусловливает существенную выработку транскрибированной РНК, а кодируемый геномом MSBI1 Rep-белок экспрессируется в клетках человека. Авторы изобретения выявили, что Rep-белок, кодируемый геномами MSBI1 и MSBI2 (MSBI1 Rep и MSBI2 Rep) представляет собой биомаркер для патогенетических скрининговых анализов. Как белок, связанный с репликацией ДНК (RepB), Rep-белок способен связывать ДНК и имеет важное значение в запуске репликации эписомальных или вирусных молекул ДНК. Rep-белки, структурно не отличающиеся от Rep-белка, кодируемого геномом MSBI1, согласно настоящему изобретению, характеризуются значительным потенциалом к само-олигомеризации и агрегации, что было описано с применением прокариотических систем in vivo и in vitro (Giraldo, Moreno-Diaz de la Espina et al. 2011, Torreira, Moreno-Del Alamo et al. 2015).
Изобретение предлагает использование платформы для патоген-специфических диагностических скрининговых анализов с использованием Rep-белка в качестве антигена.
В определенных вариантах осуществления анти-Rep антитела используются в качестве патогенетических маркеров благодаря связи между патогенной активностью выделенных ДНК (например, MSBI1) и экспрессией Rep-белка. Содержание повышенного количества анти-Rep антитела в сыворотке пациента указывает на то, что в его организме присутствуют Rep-белки, или что он экспрессировал их в течение длительного времени для развития Rep-специфичного иммунного ответа. Как мишень для человеческих антител, Rep-белок используется в качестве антигена. На основании результатов количественного анализа содержания анти-Rep антител можно диагностировать острый РС, а также определить предрасположенность к РС. Так как было признано, что повышенное количество анти-Rep антител или экспрессируемого Rep-белка в образце указывает на развитие и/или наличие РС, эти показатели можно использовать в качестве патогенетических биомаркеров для диагностики РС.
Преимущественно, патогенетический биомаркер РС можно определять в образцах крови, сыворотки или плазмы без необходимости забора образцов спинномозговой жидкости.
Таким образом, изобретение предлагает использовать белок, связанный с репликацией ДНК (Rep-белок), для диагностики нейродегенеративных заболеваний, например, рассеянного склероза (РС). В определенных вариантах осуществления Rep-белок кодируется геномом MSBI1 и состоит из (i) аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO:1;
(ii) фрагмента SEQ ID NO:1, способного связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:1; или
(iii) аминокислотной последовательности, на 90% или более гомологичной аминокислотной последовательности (i) или (ii) и способной связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:1.
Как показано в других вариантах осуществления Rep-белок кодируется геномом MSBI2 и состоит из (i) аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO:8;
(ii) фрагмента SEQ ID NO:8, способного связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 8; или
(iii) аминокислотной последовательности, на 90% или более гомологичной аминокислотной последовательности (i) или (ii) и способной связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:8.
В других вариантах осуществления Rep-белок кодируется геномом CMI1 и состоит из (i) аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO:10;
(ii) фрагмента последовательности SEQ ID NO:10, способного связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:10; или
(iii) аминокислотной последовательности, на 90% или более гомологичной аминокислотной последовательности (i) или (ii) и способной связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:10.
В других вариантах осуществления Rep-белок кодируется геномом CMI2 и состоит из (i) аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO:11;
(ii) фрагмента последовательности SEQ ID NO:11, способного связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:11; или
(iii) аминокислотной последовательности, на 90% или более гомологичной аминокислотной последовательности (i) или (ii) и способной связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:11.
В других вариантах осуществления Rep-белок кодируется геномом CMI3 и состоит из (i) аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO:12;
(ii) фрагмента последовательности SEQ ID NO:12, способного связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:12; или
(iii) аминокислотной последовательности, на 90% или более гомологичной аминокислотной последовательности (i) или (ii) и способной связывать анти-Rep антитело, специфичное к белку, содержащему аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:12.
В определенных вариантах осуществления повышенное содержание Rep-белка в образце пациента в сравнении с содержанием Rep-белка в контрольном образце соотносится с диагностированием нейродегенеративного заболевания, например, РС, т.е. указывает на РС. Согласно настоящему изобретению, на диагностирование нейродегенеративного заболевания, например, РС, или выявление предрасположенности к таковым, например, РС, указывает на повышенное содержание Rep-белка по меньшей мере в 2 раза в сравнении с контрольным образцом.
В других вариантах осуществления повышенное содержание анти-Rep антител в образце пациента в сравнении с содержанием их в контрольном образце соотносится с диагностированием нейродегенеративного заболевания, например, РС, т.е. указывает на РС. Согласно настоящему изобретению, на диагностирование нейродегенеративного заболевания, например, РС, или выявление предрасположенности к таковым, например, РС, указывает повышенное содержание анти-Rep антител по меньшей мере в 2 раза в сравнении с контрольным образцом.
Согласно настоящему изобретению, Rep-белок можно применять практически для любых анализов с известными антигенами для определения содержания антител или клеточного иммунного ответа. Таким образом, изобретение также охватывает определение клеточного иммунного ответа (Т-клеточного ответа) к Rep-белку.
В определенных вариантах осуществления изобретение предлагает способ диагностики нейродегенеративных заболеваний у пациента, включающий следующие этапы:
(a) инкубация образца, полученного от пациента, с Rep-белком;
(b) определение количества антител в образце пациента, образующих иммунологический комплекс с Rep-белком; и
(c) соотнесение количества антител, связанных с Rep-белком, в сравнении с количеством в контрольном образце с диагностированием нейродегенеративного заболевания.
В определенных вариантах осуществления изобретение предлагает способ диагностики РС у пациента, включающий следующие этапы:
(a) инкубация образца, полученного от пациента, с Rep-белком;
(b) определение количества антител в образце пациента, образующих иммунологический комплекс с Rep-белком; и
(c) соотнесение количества антитела, связанного с Rep-белком, по сравнению с количеством в контрольном образце с диагностированием РС.
В определенных вариантах осуществления Rep-белок иммобилизируют, то есть фиксируют на носителе, с последующей инкубацией иммобилизированного Rep-белка с образцом пациента.
В других вариантах осуществления Rep-белок экспрессируется в клетках с последующей инкубацией клеток с образцом пациента.
В определенных вариантах осуществления количество антител, образующих иммунологический комплекс с Rep-белком, определяется с использованием дополнительного связывающего агента, связанного с сигналообразующим соединением, способным связываться с анти-Rep антителами иммунологического комплекса, например, детектируемо мечеными вторичными антителами, предпочтительно античеловеческими антителами.
В других вариантах осуществления антитела в образце пациента иммобилизируют с последующей инкубацией с определенным количеством Rep-белка.
Предпочтительно, образец пациента и контрольный образец представляет собой образец крови, такой как образец сыворотки или плазмы.
В других вариантах осуществления изобретение предлагает способ диагностики нейродегенеративных заболеваний у пациента, содержащий следующие этапы:
(a) определение количества Rep-белка в образце пациента при помощи анти-Rep антител, и
(b) соотнесение количества rep-белка в образце пациента на этапе (а) по сравнению с количеством в контрольном образце с диагностированием нейродегенеративного заболевания.
В определенных вариантах осуществления изобретение предлагает способ диагностики РС у пациента, содержащий следующие этапы:
(a) определение количества Rep-белка в образце пациента при помощи анти-Rep антител, и
(b) соотнесение количества rep-белка в образце пациента на этапе (а) по сравнению с количеством в контрольном образце с диагностированием РС.
В таких вариантах осуществления образец пациента и контрольный образец могут представлять собой образцы сыворотки, плазмы или ткани.
В определенных вариантах осуществления Rep-антитела связываются с эпитопом, который находится в пределах аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот от 1 до 136, от 137 до 229 и от 230 до 234 в SEQ ID NO:1. Например, антитело связывается с эпитопом, состоящим из SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3.
В других вариантах осуществления изобретение предлагает набор для использования в диагностировании РС, состоящий из (a) Rep-белка, в частности кодируемого MSBI1, MSBI2, CMI1, CMI2 или CMI3, (b) дополнительного связывающего агента, связанного с сигналообразующим соединением, например, античеловеческим антителом, связанным с детектируемой меткой и способной связываться с Rep-антителом согласно изобретению, и (c) твердой матрицей, подходящей для иммобилизации Rep-белка согласно (a) или анти-Rep антител, если наличие антител подозревается в образце, в частности, в образце сыворотки или плазмы.
В определенных вариантах осуществления набор используется для иммунологических анализов, например, иммуносорбентного анализа (ИСА), радиоиммунологического анализа (РИА), иммуноферментного анализа (ИФА), иммунофлуоресцентного анализа, иммунолюминесцентного анализа и анализа с применением тест-полосок.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - пример скринингового анализа сыворотки (2×8 образцов) с инкубацией с 1D-размерными полосками с Rep-беком. Полоски из нитроцеллюлозы, содержащие Rep-белок, инкубировали с двумя разными разведениями сыворотки/плазмы (1:500 и 1:2000) пациента с РС или здорового донора. Человеческие IgG, связанные с Rep, детектировали с применением HRP-совмещенных вторичных антител к человеческим IgG. Сигналы антител с размером полноразмерной мишени Rep-белка (см. окрашивание белка Кумасси и контрольные образцы с анти-Rep антителами справа (WB)) определяли методом денситометрии.
На Фиг. 2 представлен количественный анализ Rep-специфичных антител в сыворотке с использованием ИФА. 50, 100, 200, 400 или 800 нг Rep-белка (целевой антиген) помещали в 96-луночный планшет. После фиксации и промывки Rep-белковый антиген инкубировали с общим образцом сыворотки с РС или с контрольным образцом плазмы в разведении 1:500 в течение 6 часов при комнатной температуре (RT). После промывки и инкубации с HRP-конъюгированными античеловечными вторичными антителами к IgG человека и последнего этапа промывки выполняли количественный анализ содержания Rep-связанных человеческих IgG с применением реакции с субстратом TMB и определением оптической плотности при 450 нм. Количественный анализ показал положительную взаимосвязь между интенсивностью сигнала и количеством Rep-белка (антиген). В среднем степень интенсивности сигнала пула РС превышает интенсивность сигнала с контрольным пулом по меньшей мере в 1,9 раза. В целом, анализ сыворотки методом ИФА выявил детектируемый уровень сывороточных антител в разведении по меньшей мере 1:1000 (данные не показаны), то есть титр для данного анализа, вероятно, должен быть выше 1:1000 в диапазоне от 1:2000 до 1:4000 или даже выше после оптимизации платформы.
На Фиг. 3 представлен количественный анализ Rep-специфичных антител в сыворотке по результатам скринингового анализа по методу ИСА. Было определено 200 нг Rep-белка (целевой антиген) в 96-луночном планшете. После фиксации и промывки Rep-белковый антиген инкубировали с 7 отдельными сыворотками пациентов с РС или 7 контрольными сыворотками в двух повторностях в разведении 1:500 в течение 6 часов при комнатной температуре (RТ). После промывки и инкубации с HRP-связанными вторичными антителами к человеческим IgG HRP на последнем этапе промывки наличие Rep-связанных человеческих IgG определяли путем реакции с субстратом TMB и определением оптической плотности при длине волны 450 нм. Средний результат анализа образцов пациентов с РС превышает средний результат анализов контрольных образцов по меньшей мере в 8 раз, при этом в некоторых случаях наблюдается разница в 10-16 раз.
На фиг. 4-6 представлены результаты иммунофлуоресцентного анализа с применением анти-Rep-антител A, B, C, D1 и D2 (по оси y).
Фиг. 7 - Анализ Вестерн-Блот, где A, B, C и D1 обозначают группы используемых анти-Rep антител.
Фиг. 8 - Взаимное расположение "оптимизированной" (=SEQ ID NO:13) и “оригинальной” (=дикий тип; SEQ ID NO:15) последовательности MSBI1. Помечены оптимизированные кодоны.
Изобретение предлагает диагностические скрининговые анализы для определения наличия анти-Rep антител в качестве патогенетических маркеров. Содержание повышенного количества анти-Rep антитела в образцах указывает на то, что в соответствующем организме присутствуют Rep-белки или что он экспрессировал их в течение длительного времени для развития Rep-специфичного иммунного ответа. Благодаря таким скрининговым анализам можно проводить диагностику, прогнозирование и мониторинг течения РС на основании количественного определения анти-Rep антител. В альтернативных вариантах осуществления возможно непосредственное обнаружение и количественное определение содержания Rep-белка в образцах с использованием анти-Rep антител.
"Rep-белок", как используется в настоящем документе, означает белок, связанный с репликацией ДНК (RepВ). Rep-белок способен связывать ДНК и имеет важное значение в инициировании репликации эписомальных или вирусных молекул ДНК. В целом, Rep-белок представляет собой белок из группы генома Small Sphinx (Whitley et al. 2014). В частности, Rep-белок - это Rep-белок, кодируемый геномом MSBI1 (MSBI1 Rep), геномом MSBI2 (MSBI2 Rep), геномом CMI1 (CMI1 Rep), CMI2 (CMI2 Rep) или геномом CMI3 (CMI3 Rep). Предпочтительно, Rep-белок MSBI1 кодируется геномом MSBI1.176, зарегистрированном в банке данных EMBL под номером: LK931491. Он имеет аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:1, или Rep-белок представляет собой MSBI2, кодируемый геномом MSBI2.176, зарегистрированным в банке данных EMBL под номером: LK931492. Он имеет аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:8 (Whitley, Gunst et al. 2014). Другой вариант предполагает, что Rep-белок CMI1 кодируется геномом CMI1.252, зарегистрированном в банке данных EMBL под номером: LK931487. Этот геном характеризуется аминокислотной последовательностью, соответствующей описанию последовательности SEQ ID NO:10. Другой вариант предполагает, что Rep-белок CMI2 кодируется геномом CMI2.214, зарегистрированном в банке данных EMBL под номером: LK931488. Этот геном характеризуется аминокислотной последовательностью, соответствующей описанию последовательности SEQ ID NO:11. Другой вариант предполагает, что Rep-белок CMI2 кодируется геномом CMI3.168, зарегистрированном в банке данных EMBL под номером: LK931489. Этот геном характеризуется аминокислотной последовательностью, соответствующей описанию последовательности SEQ ID NO:12. В определенных условиях Rep-белок содержит N-конечный участок, расположенный среди малых Sphinx-геномов, состоящий в основном из аминокислот с 1 по 229 согласно описанию последовательности SEQ ID NO:1, и C-конечный участок, специфический для MSBI1.176, состоящий в основном из аминокислот с 230 по 324 из последовательности SEQ ID NO:1. N-конечный участок включает, предположительно, первый ДНК-связывающий домен, который состоит из аминокислот с 1 по 136 из последовательности SEQ ID NO:1, и второй предположительный ДНК-домен, состоящий из аминокислот с 137 по 229 з последовательности SEQ ID NO:1.
6
“Rep-белок” также содержит фрагменты и варианты белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8, что обусловливает способность связывать анти-Rep антитела, специфических для Rep-белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8. Предпочтительно, такой фрагмент является иммуногенным фрагментом белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8, который охватывает по меньшей мере один эпитоп для анти-Rep антитела против Rep-белка SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8 и, предпочтительно, содержит по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или 50 заменимых аминокислот. В определенных вариантах осуществления фрагмент содержит или состоит из домена Rep-белка, например, N-терминального участка, C-терминального участка, первого или второго ДНК-связывающего домена. Вариант белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8 содержит одну или более делецию, замену или добавление аминокислот в сравнении с последовательностью SEQ ID NO:1 и обладает гомологичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8, при этом вариант способен связывать анти-Rep антитела, специфичные по отношению к Rep-белку, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8. В понятие варианта включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (например, содержащие искусственные аминокислоты, пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК) и т.д.), полипептиды с замещенными связями, а также другие известные специалистам в данной области техники модификации природного или искусственного происхождения. Термин "Rep-белок" охватывает белок слияния с гетерологичной аминокислотной последовательностью, с лидерной последовательностью или Tag-последовательностью и т.п. В определенных вариантах осуществления белковые метки генетически встраиваются в описанный выше Rep-белок, например, Rep-белок, выбранный из группы, включающей геномы MSBI1, MSBI2, CMI1, CMI2 или CMI3. В частности, по меньшей мере одна белковая метка прикрепляется к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1-3, 8-12, 14. Такие белковые метки могут отщепляться под действием химических агентов или ферментов. Примером таких меток может быть аффинные или хроматографические метки для очистки. Например, Rep-белок может быть совмещен с Tag-последовательностью, например, выбранной из группы, включающей метки His-Tag (SEQ ID NO:4), T7-Tag (SEQ ID NO:5), FLAG-Tag (SEQ ID NO:6) и StRep-II-Tag (SEQ ID NO:7). Метки His-Tag (SEQ ID No:4), T7-Tag (SEQ ID NO:5), FLAG-Tag (SEQ ID NO:6) или StRepII-Tag (SEQ ID NO:7). Кроме того, согласно изобретению, флуоресцентные метки, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его разновидности, могут также связываться с Rep-белком.
В предпочтительном варианте Rep-белок, кодируемый геномом MSBI1 (MSBI1 Rep) является кодон-оптимизированным для образования в человеческих клеточных линиях (HEK-293, HEK293TT, HEK293T, HEK293FT, HaCaT, HeLa, SiHa, CaSki, HDMEC, L1236, L428, BJAB, MCF7, Colo678, любые первичные клеточные линии), а также в клеточных линиях КРС (например, MAC-T) или мышей (например, GT1-7). Касательно оптимизации кодона, нуклеотидные последовательности, кодирующие антигены, могут программироваться для использования кодонов, задействованных в генах субъекта, в организме которого предполагается продуцирование антигена. В предпочтительном варианте используются "гуманизированные" кодоны. Такое использование кодона обеспечивает эффективную экспрессию антигенов в клетках человека. Можно использовать любой подходящий метод оптимизации кодонов. Такие методы и алгоритм их выбора хорошо известны специалистам в данной области. Согласно настоящему изобретению, такой кодон-оптимизированный вариант Rep-белка, кодируемого геномом MSBI1 (MSBI1 Rep) содержит или состоит из последовательности, описанной в SEQ ID. №: 13 и содержит аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID №: 14. Всего было заменено 686 из 927 нуклеотидов в гене Rep MSBI1, кодирующем Rep-белок (с пускового до стопорного кодона) для усовершенствования использования кодона. Максимально эффективное использование кодона с оптимальной адаптацией описывается индексом адаптации кодона (CAI), равным 1, то есть указывающим на оптимизацию всех кодонов для экспрессии у человека. Для исходного MSBI1-кодируемого Rep-гена CAI составил 0,67 для человека, что значительно ниже CAI 0,8, который считается минимальным пороговым значением положительной адаптации кодона. После оптимизации кодона MSBI1 Rep гена был определен CAI, равный 0,94, относительно оптимизированной ДНК, что указывает на почти оптимальную адаптацию кодона для человека. В частности, были изменены 18 очень редко используемых кодонов, большинство из которых являются кодонами лейцина с очень низкой частотой использования (<10%) у человека. Расположение последовательности кодон-оптимизированного генома MSBI1 SEQ ID NO:13 в сравнении с последовательностью MSBI1 дикого типа SEQ ID NO:15 представлено на Фиг. 8.
Согласно изобретению, Rep-белок, включая Rep-фрагменты и Rep-варианты, описанные выше, можно получить посредством классического химического синтеза. Синтез можно выполнить в однородном растворе или в неподвижной фазе. Полипептиды также можно получить с применением техник с использованием рекомбинантной ДНК. Синтез и очистка Rep-белка согласно представленному изобретению представлены на примере 1.
Здесь "субъект" означает млекопитающее существо или человека (в том числе мыши, крупный рогатый скот (быки), обезьяны и человек). Предпочтительно, субъект представляет собой человека.
Как используется в настоящем документе, "образец" означает жидкий или твердый биологический материал. Жидкие образцы охватывают жидкие компоненты крови (такие как, например, сыворотка, плазма) и спинномозговую жидкость (СМЖ). Твердые образцы охватывают образцы ткани, такие как тканевые культуры или биоптаты.
Как используется в настоящем документе, термин "соотносится" обозначает количество, то есть содержание или титр анти-Rep антител и Rep-белка, соответственно, со значительной взаимосвязью с течением заболевания, например, РС. Соотнесение определяется посредством определения степени различия количества материала в образце исследуемого субъекта и в контрольном образце. "Контрольный образец" обозначает отдельный образец или среднее от любого количества (два и более) образцов. Забор контрольного образца производят от здорового человека без РС. Альтернативно, соотнесение теоретическим может определяться посредством определения степени различия в количестве материала в образце исследуемого субъекта с заранее установленным пороговым значением. Пороговое значение принято для справки в качестве уровня статистически значимых различий между статусами заболевания, например, здоровый/больной. Пороговое значение можно определить методом статистического анализа результатов достаточно большого количества анализов у больных субъектов и образцов из группы здоровых субъектов с применением статистических методов, известных специалистам в данной области.
В определенных вариантах осуществления диагноз РС (к примеру) подтверждается по меньшей мере 2-кратным (3, 4, 5, 10, 50, 100, 500 или 1000-кратным) повышением количества белка, т.е. Rep-белка и анти-Rep антител в образце, взятом у испытуемого, в сравнении с контрольным образцом.
Как используется в настоящем документе, “анти-Rep антитело” означает антитело, связывающееся в значительной степени с Rep-белком в способах согласно настоящему изобретению, аффинность которого к Rep-белку более выражена, чем к другим белкам. Предпочтительно, аффинность антигенов к Rep-белку по меньшей мере в 2 раза выше, чем основная связывающая способность. В частности, анти-Rep антитело обладает специфичностью к MSBI1 Rep, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или MSBI2 Rep. В определенных вариантах осуществления антитела обладают перекрестной специфичностью к MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep и/или CMI3 Rep. В определенных вариантах осуществления анти-Rep антитела обладают перекрестной специфичностью к двум или более (предпочтительно - всем) белкам MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep и/или CMI3 Rep, и связываются с эпитопом в пределах аминокислот с 1 по 136 последовательности SEQ ID NO: 1.
Общей характеристикой всех анализов является то, что Rep-белок контактирует с образцом, в котором предполагается наличие анти-Rep антител, в условиях, допускающих связывание Rep-белка с любыми такими антителами в образце. К таким условиям относятся физиологичная температура, pH и ионная сила при избыточном количестве Rep-белка. После инкубации Rep-белка с образцом производится определение содержания иммунных комплексов с антигеном. В определенных вариантах осуществления Rep-белок связывается с сигналообразующим соединением, например, детектируемой меткой, или дополнительный связывающий агент, например, вторичное античеловеческое антитело, связывается с сигналообразующим соединением для определения иммунных комплексов.
Анти-Rep антитела можно обнаружить и определить количественно в анализах с применением Rep-белка в качестве белкового антигена, который является мишенью для антител млекопитающих (например, человека), предположительно содержащихся в образце. Предпочтительно, Rep-белок очищается (см. пример 1) из образцов сыворотки или плазмы. Способы включают фиксацию Rep-белка на матрице с последующей инкубацией его с образцами. Наконец, Rep-связанные антитела сформированного иммуннологического комплекса Rep-белка и антител в образцах определяются количественно посредством определения содержания связывающего агента с сигналообразующим соединением, например, вторичными HRP-(пероксидаза хрена)-связанными детектирующими антителами, что позволяет проводить количественный анализ на основании субстрата HRP. Такое сигналообразующее соединение или метка сами по себе являются детектируемыми или могут реагировать с дополнительными соединениями с образованием детектируемого продукта.
В других вариантах осуществления анти-Rep антитела определяются непрямым методом, при котором сначала антитела в образце фиксируют на матрице, после чего выполняют инкубацию с определенным количеством Rep-белка, который может быть помечен или содержать Tag-белок. Затем фиксированные Rep-антитела на матрице связывают Rep-белок из белкового раствора образца, после чего выполняют количественный анализ связанного Rep-белка.
В других вариантах осуществления Rep-белок может экспрессироваться клетками, при этом производится инкубация таких клеток с образцом. Затем производят обнаружение и количественное определение содержания анти-Rep антител в образце, связанных с Rep-белком, экспрессируемым клетками.
Дизайн иммунологического анализа в значительной степени изменчив, и большое количество его разновидностей известны специалистам в данной области. Например, возможно использование твердых носителей или метода иммуноосаждения. Большинство анализов включают использование связывающих агентов, соединенных с сигнальными соединениями, например, мечеными антителами или меченым Rep-белком; возможны ферментные, флуоресцентные, хемилюминесцентные, радиоактивные метки или молекулы красителя. Также существуют количественные анализы с усилением сигнала от иммунных комплексов, например, анализы с применением биотина и авидина или стрептавидина, а также иммунологические анализы с метками и катализаторами в виде ферментов, например, иммуносорбентные анализы.
Иммунологические анализы могут проводиться в гетеро- и гомогенном варианте и в стандартном или сравнительном режиме. В гетерогенном варианте полипептид (Rep-белок или анти-Rep антитело) связывается с твердой матрицей или основой, или носителем для способствования отделению образца от полипептида после инкубации. В качестве примеров твердых основ можно привести нитроцеллюлозу (например, на мембране или форме с микролунками для титрования), поливинилхлорид (листы или микролунки для титрования), полистирольный латекс (гранулы или микропланшеты для титрования), поливидинилид-фторид (иммунолон), диазотированную бумагу, нейлоновые мембраны, активированные гранулы и гранулы с белком А. Плотная основа, содержащая антигенные полипептиды, промывается стандартным способом после отделения испытуемого образца, после чего производят количественный анализ связанных анти-Rep антител. Специалистам в данной области техники известны как стандартный, так и сравнительный варианты.
В гомогенном формате испытуемый образец инкубируют с Rep-белком в растворе. Например, в условиях, при которых происходит осаждение образующихся комплексов Rep-белок-антитело. Специалистам в данной области техники известны как стандартный, так и сравнительный варианты этих анализов.
В стандартном формате производится прямое определение количества анти-Rep антител в комплексах антитело-Rep-белок. При этом возможно определение связывания (меченных) анти-ксеногенных (антител к человеческим антигенам), распознающих эпитоп на антителах к Rep-белку из-за образования комплекса. В конкурентном варианте количество анти-Rep антител в образце определяется путем контроля конкурентного эффекта на связывание известного количества меченых антител (или других конкурентных лиганд) в комплексе.
Образующиеся комплексы, содержащие анти-Rep антитела (или при конкурентных анализах - количество конкурентных антител), определяются любым из методов, в зависимости от типа анализа. Например, немеченые анти-Rep антитела в комплексе могут определяться с применением конъюгата антиксеногенных Ig с меткой (например, ферментной (HRP)).
В анализах методом иммунопреципитации или агглютинации реакция между Rep-белком и антителом к Rep-белку приводит к образованию комплекса, который осаждается в растворе или суспензии с появлением видимого слоя или пленки. Если в образце отсутствуют антитела, видимый осадок не образуется.
Выбранная твердая фаза может представлять собой полимерные или стеклянные гранулы, нитроцеллюлозу, микрочастицы, реакционные микролунки, пробирки для анализа и магнитные гранулы. Сигнальные вещества могут включать ферменты, люминесцентные вещества, хромоген, радиоактивный элемент и хемилюминесцентное вещество. Примеры ферментов: щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена (HRP), бета-галактозидаза. Примеры усилителей: биотин, антибиотин, авидин. Примеры связывающих элементов усилителей: биотин, антибиотин, авидин.
В других вариантах осуществления изобретение предлагает методы, согласно которым повышенное количество Rep-белка в образце указывает на наличие или предрасположенность к нейродегенеративным заболеваниям, например РС, или используется для мониторинга течения заболевания или лечения заболевания. В таких вариантах осуществления содержание Rep-белка в образце определяется с помощью анти-Rep антител.
Такие методы включают этапы:
(a) определение количества Rep-белка в образце пациента при помощи анти-Rep антител; и
(b) соотнесение количества rep-белка в образце пациента на этапе (а) по сравнению с количеством в контрольном образце с диагностированием нейродегенеративного заболевания, например, РС.
Примеры анализов для определения Rep-белка в образцах сыворотки или плазмы включают, помимо прочих, реакции иммунопреципитации, иммунофлуоресценции, дот-блоттинг и вестерн-блот.
Например, образец сыворотки можно инкубировать с анти-Rep антителами для связывания Rep-белка в образце с последующей иммунопреципитацией Rep-белка и определением его содержания методом SDS-PAGE или Вестерн-Блот.
В другом примере возможна инкубация мембраны для дот-блот анализа с сывороткой с последующим анализом методом SDS-PAGE и Вестерн-Блот.
Кроме того, допускается использование метода с загрузкой разведений сыворотки образца в аппарат для анализа SDS-Page с последующим анализом методом Вестерн-Блот.
В других вариантах осуществления Rep-белок определяют в образцах тканей иммуногистохимическими методами или иммунофлуоресцентной микроскопией.
В определенных вариантах осуществления анти-Rep антитела используются для определения содержания или связывания Rep-белка в образце.
Термин "антитело", предпочтительно,  относится к антителам, состоящим в основном из поликлональных антител с разными особенностями эпитопов, а также отдельным препаратам на основе антител. В данном документе "антитело (АТ)" или "моноклональное антитело (МАТ)" означает антитела, содержащие интактные молекулы иммуноглобулина, а также фрагменты антител (например, Fab и F(ab')2 фрагменты), способные специфически связываться с Rep-белком. Fab и F(ab’)2 фрагменты не содержат Fc фрагмент интактного антитела, более быстро выводятся из кровотока и обладают меньший потенциал к неспецифическому связыванию с тканями в сравнении с интактным антителом. Таким образом, такие фрагменты предпочтительнее, как и продукты FAB или из другой библиотеки иммуноглобулин-экспрессирующих соединений. Кроме того, антитела, подходящие для целей данного изобретения, включают химерные, одноцепочечные, многофункциональные (например, бисферические) и гуманизированные антитела или человеческие антитела.
В определенных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент соединяется с сигнальным веществом, например, содержащим детектируемую метку. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут быть меченными прямым или косвенным методом, например, с помощью радиоизотопа, флуоресцентного, биолюминесцентного, хемилюминесцентного вещества, металлохелатора или фермента. Средним специалистам в данной области техники известны и другие подходящие метки для связывания с антителами, или их можно определить в процессе стандартных экспериментов.
Анти-Rep антитела предпочтительно вырабатываются к Rep-белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:8 или его фрагменту с применением способов, известных специалистам в данном области.
В определенных вариантах осуществления анти-Rep антитела используются в способах согласно изобретению, которые позволяют связывать несколько или все виды Rep-белка из группы генома Small Sphinx (антитела к Small Sphinx-подобным Rep-белкам или антитела к SSL-Rep-белку). Такие антитела к SSLRep связываются с эпитопом с N-концевым участком Rep-белка с аминокислотами с 1 по 229 в SEQ ID NO:1. В определенных вариантах осуществления используются анти-Rep антитела типа SSLRep, которые связываются с эпитопом с последовательностью SEQ ID NO:2 (аминокислоты 32 - 49 последовательности SEQ ID NO:1) или SEQ ID NO:3 (аминокислоты 197 - 216 последовательности SEQ ID NO:1). Пептидные фрагмент последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 значительно скомплектованы в Rep-белках из группы генома Small Sphinx и подвергаются действию с учетом их гидрофильных свойств. Анти-Rep антитела типа SSLRep могут вырабатываться в результате иммунизации, например, у мышей или морских свинок, с применением пептидов, состоящих в основном из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2 или 3; или других иммуногенных фрагментов, предпочтительно состоящих из 8-15 аминокислот, полученных из N-терминального участка Rep-белка, аминокислот 1 - 299 в SEQ ID NO:1.
В других вариантах осуществления используются антитела, специфичные к MSBI1 Rep-белку. Такие антитела могут вырабатываться, например, в результате иммунизации млекопитающих (мыши, морские свинки) полноразмерным Rep-белком с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.
Предпочтительно, способы согласно изобретению используют анти-Rep антитела, позволяющие определять Rep-белок на уровне от пикограмма до фемтограмма в различных биологических жидкостях, например, в крови, сыворотке, спинномозговой жидкости.
Могут использоваться либо анти-Rep антитела определенного вида, либо совокупность двух и более типов анти-Rep антител. Если используется совокупность различных анти-Rep антител, она может содержать разные антитела, связывающиеся с разными эпитопами на разных доменах Rep-белка, например, первый ДНК-связывающий домен (аминокислоты 1 - 136 последовательности SEQ ID NO:1), второй ДНК-связывающий домен (аминокислоты 137 - 229 последовательности SEQ ID NO:2) и/или вариабельный домен (например, аминокислоты 230 - 324 последовательности SEQ ID NO:1), в частности, MSBI1 Rep-белка (SEQ ID NO:1).
Анти-Rep антитела используются для скринингового анализа образцов материалов пациентов /или здоровых субъектов на содержание Rep-белка. Избирательное обнаружение Rep-белка в тканях пациентов, например, больных нейродегенеративными заболеваниями, указывает на причинно-следственную связь между ДНК-геномом Rep-белка, определенном в образце, и заболеванием у пациента.
Для обнаружения Rep-белка с использованием анти-Rep антител могут использоваться такие методы, как вестерн-блот, микроскопия с иммунофлуоресценцией или иммуногистохимический метод.
В определенных вариантах осуществления используются анти-Rep антитела, которые позволяют определить содержание Rep-белка в определенных клетках. Например, анти-Rep антитело может помочь определить наличие Rep-белка в цитоплазме, ядерной мембране и ядре или обнаружить включения в цитоплазме. Примеры таких групп анти-Rep антител представлены в таблице 1:
Группа антител
Расположение Rep-белка
Специфичность
Антитело
Банк данных DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур)
Группа А
цитоплазма + ядерная мембрана (+ ядро)
MSBI1 + малые sphinx-подобные
AB01 523-1-1
DSM ACC3327
Группа B
Цитоплазматические включения
MSBI1 + малые sphinx-подобные
AB02 304-4-1
DSM ACC3328
Группа C
цитоплазма + ядерная мембрана (+ ядро)
MSBI1 специфичные
MSBI1 381-6-2
DSM ACC3329
Группа D
Цитоплазматические включения
MSBI1 специфичные
D1: MSBI1 961-2-2D2: MSBI1 761-5-1
DSM ACC3330
Анти-Rep антитела группы A имеют эпитоп в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 (аминокислоты 198-217 последовательности SEQ ID NO:1) и способны определять наличие MSBI1 Rep-белка и Rep-белков, содержащих этот консервативный эпитоп из группы генома Small Sphinx (MSBI2, CMI1, CMI4). В иммунофлуоресцентных анализах такие анти-Rep антитела определяют специфический шаблон расположения Rep, при этом основное расположение однородно распределено по цитоплазме и ядерной мембране; дополнительной неустойчивой и однородной локализацией является ядро. Пример таких антител группы А - антитело AB01 523-1-1 (DSM ACC3327), представленное в примерах, как антитело группы А.
Анти-Rep антитела группы B имеют эпитоп в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 (аминокислоты 33-50 последовательности SEQ ID NO:1) и способны определять наличие MSBI1 Rep-белка и Rep-белков, содержащих этот консервативный эпитоп из группы генома Small Sphinx (MSBI2, CMI1, CMI4). В иммунофлуоресцентных анализах такие анти-Rep антитела определяют специфические включения (цитоплазматические) Rep-белка (часто по периферии ядерной мембраны). Пример таких антител группы B - антитело AB02 304-4-1 (DSM ACC3328), представленное в примерах, как антитело группы B.
Анти-Rep антитела группы С специфически выявляют структурный эпитоп MSBI1 (SEQ ID NO:1). В иммунофлуоресцентных анализах такие анти-Rep антитела определяют специфический шаблон расположения Rep, при этом основное расположение однородно распределено по цитоплазме и ядерной мембране; дополнительной неустойчивой и однородной локализацией является ядро. Пример таких антител группы С - антитело MSBI1 381-6-2 (DSM ACC3329), представленное в примерах, как антитело группы С.
Анти-Rep антитела группы D специфически определяют структурный эпитоп MSBI1 (SEQ ID NO:1), где антитело MSBI1 961-2-2, обозначенное как "D1", определяет эпитоп, как показано в SEQ ID NO:9 (аминокислоты 281-287) в C-концевом домене MSBI1. Антитело MSBI1 761-5-1 (DSM ACC3328), обозначенное “D2”, определяет 3D структурный эпитоп MSBI1, который связывается только в анализах in vivo, но не в анализе методом вестерн блот. В иммунофлуоресцентных анализах такие анти-Rep антитела определяют специфические включения (цитоплазматические) Rep-белка (часто по периферии ядерной мембраны).
В определенных вариантах осуществления анти-Rep антитела групп A, B, C или D; или комбинация анти-Rep антител по меньшей мере в двух разных группах A, B, C или D используются для определения локализации Rep-белка в образце и соответствия локализации такого Rep-белка с функцией патогена. Например, для определения наличия включений. В определенных вариантах осуществления в предлагаемых методах использования набора по меньшей мере одно анти-Rep антитело из групп A и B соединяется с по меньшей мере одним анти-Rep антителом, выбранным из групп C и D. В определенных вариантах осуществления, т.е. способах или наборах, анти-Rep антитело из группы A соединяется с по меньшей мере одним анти-Rep антителом, выбранным из групп B, C и D. Например, анти-Rep антитело из группы A может соединяться с анти-Rep антителами из групп C и D. Такие комбинации анти-Rep антител из разных групп повышают характерность диагностики, например, при диагностике РС. Такие антитела из групп A, B, C или D предпочтительны для использования в диагностике РС.
Описанные ниже антитела были внесены в банк данных Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) [Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур] на 28 сентября 2017:
антитело AB01 523-1-1, DSM ACC3327;
антитело AB02 304-4-1, DSM ACC3328;
антитело MSBI1 381-6-2, DSM ACC3329 и
антитело MSBI1 761-5-1, DSM ACC3330.
Антитело MSBI1 961-2-2 было включено в банк данных DSMZ 6 октября 2017 г.
В других вариантах осуществления предлагается набор для диагностики РС. Набор может включать материал для обнаружения анти-Rep антител и/или Rep-белок с инструкциями по использованию материалов для количественных анализов для диагностики РС. Набор может содержать один или несколько из следующих компонентов: биомаркер в соответствии с изобретением, т.е. Rep-белок и анти-Rep антитела, например, антитела из таблицы 1; сигналообразующее соединение, твердая матрица для фиксации связывающего агента, разбавитель для образцов, буфер для промывки. Сигналообразующее соединение представляет собой детектируемую метку, которая связывается с дополнительным связывающим агентом, способным соединяться с биомаркером, или непосредственно связывается с биомаркером.
Изобретение дополнительно описывается, без ограничения, на примерах ниже:
Пример 1:
Очистка Rep-белка MSBI1
Открытая рамка считывания аминокислот, кодирующих полноразмерный Rep-белок (ORF) в геноме MSBI1 клонируется в экспрессирующие плазмиды (pEXP5-CT, Invitrogen), обусловливающие экспрессию белка на основании трансляционной системы in vitro без существенного количества клеток E. coli (ExpresswayTM, бесклеточная система экспрессии E. coli, Invitrogen). Синтезируемый Rep-белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 в трансляционной реакции in vitro денатурируется путем добавления 20 реакционных объемов 8 M буферного раствора мочевины с pH 8,0, содержащего 100 ммоль NaH2PO4, 10 ммоль трис-HCl, pH 8,0, 5 ммоль имидазола. Затем Rep-белок очищают в денатурирующих условиях (20 ммоль имидазола для промывания и 300 ммоль имидазола для элюирования белка) на основании C-терминальной His-метки, связанной с Rep-белком. Качество очистки определяется методом окрашивания белка Кумасси и вестерн-блот-анализа с анти-Rep антителами-белку. Чистота Rep-белка рассчитывается денситометрически и составляет более 95%. Очищенный белок используется непосредственно для иммуносорбентного анализа сыворотки или для анализа SDS-Page с последующим блоттингом на мембраны из нитроцеллюлозы для инкубации сыворотки с 1D-размерными мембранными полосками с Rep-белком.
Пример 2:
Образование сывороточных мастер-пластин
Сначала производится отбор равных объемов образцов сыворотки для снижения числа циклов заморозки/разморозки. Затем формируется основной планшет путем разведения сыворотки в PBS с pH 7,2 в соотношении 1:1 со стабилизацией 0,02% раствором азида с заключительным концентрированием на U-образном планшете с 96 лунками. Планшет сохраняет стабильность в течение по меньшей мере 2 месяцев при температуре 4°C в стерильных условиях и используется в качестве шаблона для дальнейшего разведения сыворотки (конечное разведение 1:20) перед отдельными скрининговыми анализами.
Пример 3:
Скрининговый анализ сыворотки путем инкубации 1D-размерных мембранных полосок с Rep-белком.
Для скрининговых анализов с использованием 1D-размерных Rep-белковых мембранных полос с сывороткой 20 мкг очищенного Rep-белка загружают на заранее залитый гель Sigma Tru-PAGE 4-20%. Стенки, разделяющие гелевые блоки, удаляют перед его загрузкой с образованием одного крупного блока и отдельного размерного блока. После анализа методом SDS-PAGE 1D-размерные образцы помещаются на мембраны из нитроцеллюлозы с применением стандартного протокола blot-переноса сырого материала/материала в контейнерах. Затем белок на блот-мембране (по существу одна полоса полноразмерного Rep-белка с рабочей высотой около 40 кДа) обрабатывается PonceauS для оценки качества переноса и приготовления путем нарезкой мембранных полос шириной по 2 мм и высотой 1D-размерной мембраны. Затем полоски фиксируют на 1 ч фиксирующим реагентом для сывороток в объеме 500 мкл (универсальный фиксирующий реагент Genetex Trident). Затем проводился анализ сыворотки в двух разных разведениях. Инкубация сыворотки проводится в течение 14 ч (в течение ночи) при температуре 4°C на линейном встряхивателе. Затем мембранные полоски промывают PBS-T с pH 7,2, 0,1% раствором Твин-20 в течение 3×5 минут при комнатной температуре. Обнаружение Rep-специфичных связанных человеческих IgG в сыворотке выполняют методом инкубации с HRP-связанными козьими античеловеческими вторичными IgG (H+L) антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. После трех промываний PBS-T pH7,2 0,1% Твин-20 в течение 3×5 минут при комнатной температуре каждая полоска фиксируется на ленте на полимерной пленке. Затем пленку инкубировали с субстратом ECL (Biorad Clarity) для визуализации связанных человеческих IgG в системе BioRad WesternBlot. Количественный анализ сигналов, соответствующих количеству IgG, специфически связываемых с Rep-полосами на белковой мембране проводится методом денситометрии.
Пример результата анализа 1D-размерных полосок с Rep-белковыми мембранами представлен на Фиг. 1, а количественное определение серопозитивных образцов сыворотки/плазмы представлено в таблице 2: Почти 50% образцов сыворотки обусловливали появление очень сильных сигналов в обоих разведениях (1:500 и 1:2000), и только 3 из 21 анализа были полностью отрицательными. Из контрольных образцов плазмы: в анализе 7 образцов были получены средние сигналы в разведении 1:500 (один с очень низким уровнем сигнала), а в разведении 1:20000 только 3 анализа образцов демонстрировали очень слабый сигнал, а остальные были серонегативными. Все количественные анализы указывают на то, что у пациентов с РС наблюдается повышение сигнала по меньшей мере в 30 раз в сравнении с анализами контрольных образцов плазмы.
разведение сыворотки
количество серопозитивных образцов
1:2000
17
3
1:500
21
8
Сыворотка пациента с РС
контрольный образец плазмы
Таблица 2: Количественный анализ серопозитивных образцов сыворотки/плазмы.
Анализ сыворотки/плазмы с определением Rep-специфичных человеческих IgG проводился с оценкой интенсивности сигналов в разведении 1:500 и 1:2000 при анализе совокупности сывороток пациентов с РС и здоровых контрольных субъектов (всего по 21). Почти 50% образцов сыворотки обусловливали появление очень сильных сигналов в обоих разведениях (1:500 и 1:2000), и только 3 из 21 анализа были полностью отрицательными. При анализе контрольных образцов плазмы в анализе 7 образцов были получены средние сигналы в разведении 1:500 (один с очень низким уровнем сигнала), а в разведении 1:20000 только 3 анализа образцов демонстрировали очень слабый сигнал, а остальные были серонегативными. Все количественные анализы указывают на то, что у пациентов с РС наблюдается повышение сигнала по меньшей мере в 30 раз в сравнении с анализами контрольных образцов плазмы.
Пример 4:
Скриннговые анализы образцов сыворотки по методу иммуносорбентного анализа
Необходимое количество очищенного Rep-белка (обычно от 50 до 200 нг/лунка) добавляют к смеси 8М мочевины с pH 8,0 и PBS с pH 7,2 (в соотношении 1:1), нанесенной на планшет с 96 лунками для иммуносорбентного анализа (Fisher Scientific). Процесс связывания белка с матрицей происходит в течение 14 часов при температуре 4°C на линейном встряхивателе. Затем планшет промывают PBS-T с pH 7,2 0,1% Твин-20 в течение 3×5 мин при комнатной температуре с последующей фиксацией по меньшей мере на 14 ч при температуре 4°C с PBS с pH 7,2 1% BSA, содержащего 0,02% азида натрия. Затем добавляют сыворотку в разведении 1:500 и инкубируют в течение 6 часов при комнатной температуре. Затем планшет промывают PBS-T с pH 7,2, 0,1% раствором Твин-20 в течение 3×5 минут при комнатной температуре. Обнаружение Rep-специфичных связанных человеческих IgG в сыворотке выполняют методом инкубации с HRP-связанными козьими античеловеческими вторичными IgG (H+L) антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. После трех промывок PBS-T с pH 7,2 0,1% Твин-20 в течение 3×5 минут при комнатной температуре добавляют 100 мкл раствора TMB (3,3´,5,5´-тетраметилбензидин, HRP-чувствительный) в каждую лунку, после чего инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают путем добавления 199 мкл 8M уксусной кислоты/1М серной кислоты. Анализ интенсивности сигнала выполняют на устройстве, совместимом с ИСА анализатором Perkin Elmer с определением оптической плотности при длине волны 450 нм.
Результаты примера количественного определения Rep-специфичных антител в сыворотке с использованием иммуносорбентного анализа представлен на Фиг. 2. Количественный анализ продемонстрировал положительную взаимосвязь между интенсивностью сигнала и количеством Rep-бека (антиген). В среднем результат анализа совокупных образцов от пациентов с РС превышает результат анализа контрольных образцов по меньшей мере в 1,9 раза. В целом, скрининговый иммуносорбентный анализ сыворотки продемонстрировал детектируемое количество сывороточных антител в разведении 1:1000 (данные не представлены), то есть после оптимизации платформы титр в таком анализе, вероятно, будет выше 1:1000 (1:2000 - 1:4000 или более).
Пример 5:
Иммунофлуоресцентный анализ
Клетки HEK293TT (125,000/лунка) культивировали в течение 24 часов в 8-луночных камерах для иммунофлуоресцентного анализа в DMEM 10% FCS (с добавлением 1x глутамакса (Gibco) и 1x заменимыми аминокислотами (Gibco)) с последующей трансфекцией ДНК с полиэтиленимином (PEI) с любой из контрольных плазмид ZsGreen1CI (Clontech), экспрессирующих белок-маркер аутофлуоресценции ZsGreen или той же плазмиды, несущей полноразмерную MSBI1 Rep ORF на 3-прайм-конце с кодировкой ZsGreen-Rep-белка. Через 48 часов после трансфекции ДНК клетки промывали PBS, фиксировали на 20 минут при КТ с использованием PBS 4% PFA при КТ и пермеабилизировали с помощью PBS 0,5% Triton X-100 на 10 минут при КТ на встряхивателе. Клетки промывали PBS с фиксацией с помощью PBS 1% BSA в течение 45 минут при КТ. Инкубация с мышиными моноклональными анти-Rep антителами (таблица 1) проводилась в течение 1 часа при температуре 37°C в PBS 1% BSA с антителами в разведении 1:500 (были включены контрольные субъекты с отсутствием первичных антител). Клетки промывали трижды с применением PBS с инкубацией с PBS 1% BSA в течение 15 минут при КТ. Затем выполняли инкубацию с вторичными антителами (AlexaFluor488 антитела козы к мышиным антигенам, 1:500; ДНК-маркер Hoechst 33342, 1:5.000) в течение 45 минут при КТ в PBS 1% BSA. Клетки трижды промывали PBS 1% BSA и трижды - PBS с последующей фиксацией покрывными стеклами (фиксирующая среда Dako). Иммунофлуоресцентные снимки получали с помощью инструмента Zeiss Cell Observer (объектив 20x, фиксированная экспозиция пар образец/контроль).
На иммунофлуоресцентных снимках (рис. 4) показано, что обработка антителами групп A и B обусловливает специфическое обнаружение искомого белка в цитоплазме и ядерной мембране (+ ядре) при отсутствии скоплений. И наоборот, антитела из групп B и D демонстрируют специфическую окраску с точечным белком и отсутствие низких сигналов от цитоплазмы. Контрольная инкубация антител на связывающем белке ZsGreen не обусловливала обнаружение значительных сигналов (одинаковое время экспозиции для визуализации сигналов от антител).
Пример 6:
Иммунофлуоресцентный анализ
Клетки HEK293TT (125,000/лунка) культивировали в течение 24 часов в 8-луночных камерах для иммунофлуоресцентного анализа в DMEM 10% FCS (с добавлением 1x глутамакса (Gibco) и 1x заменимыми аминокислотами (Gibco)) с последующей трансфекцией ДНК с полиэтиленимином (PEI) с любой из контрольных плазмид ZsGreen1CI (Clontech), экспрессирующих белок-маркер аутофлуоресценции ZsGreen или той же плазмиды, несущей полноразмерную CMI1 Rep ORF на 3-прайм-конце с кодировкой ZsGreen-Rep-белка. Через 48 часов после трансфекции ДНК клетки промывали PBS, фиксировали на 20 минут при КТ с использованием PBS 4% PFA при КТ и пермеабилизировали с помощью PBS 0,5% Triton X-100 на 10 минут при КТ на встряхивателе. Клетки промывали PBS с фиксацией с помощью PBS 1% BSA в течение 45 минут при КТ. Инкубация с мышиными моноклональными анти-Rep антителами (таблица 1) проводилась в течение 1 часа при температуре 37°C в PBS 1% BSA с антителами в разведении 1:500 (были включены контрольные субъекты с отсутствием первичных антител). Клетки промывали трижды с применением PBS с инкубацией с PBS 1% BSA в течение 15 минут при КТ. Затем выполняли инкубацию с вторичными антителами (AlexaFluor488 антитела козы к мышиным антигенам, 1:500; ДНК-маркер Hoechst 33342, 1:5.000) в течение 45 минут при КТ в PBS 1% BSA. Клетки трижды промывали PBS 1% BSA и трижды - PBS с последующей фиксацией покрывными стеклами (фиксирующая среда Dako). Иммунофлуоресцентные снимки получали с помощью инструмента Zeiss Cell Observer (объектив 20x, фиксированная экспозиция пар образец/контроль).
На иммунофлуоресцентных снимках (рис. 5) показано, что антитело группы A специфически определяет целевой белок в цитоплазме + ядерной мембране (+ ядре) без обнаружения комплексов, антитело группы B определяет разрушенный целевой белок с минимальным фоновым наличием цитоплазматических включений. MSBI1-специфические антитела группы C и D не обусловливают специфическое определение сигналов. Антитела D1 и D2 относятся к группе “D”, но обладают несколько разными свойствами распознавания эпитопов.
Пример 7:
Иммунофлуоресцентный анализ
Клетки HEK293TT (125,000/лунка) культивировали в течение 24 часов в 8-луночных камерах для иммунофлуоресцентного анализа в DMEM 10% FCS (с добавлением 1x глутамакса (Gibco) и 1x заменимыми аминокислотами (Gibco)) с последующей трансфекцией ДНК с полиэтиленимином (PEI) с любой из контрольных плазмид pcDNA3.1(-) (Invitrogen) или тех же плазмид, экспрессирующих кодон-оптимизированный вариант полноразмерной последовательности MSBI1 Rep ORF (SEQ ID. №: 13). Через 48 часов после трансфекции ДНК клетки промывали PBS, фиксировали на 20 минут при КТ с использованием PBS 4% PFA при КТ и пермеабилизировали с помощью PBS 0,5% Triton X-100 на 10 минут при КТ на встряхивателе. Клетки промывали PBS с фиксацией с помощью PBS 1% BSA в течение 45 минут при КТ. Инкубация с мышиными моноклональными анти-Rep антителами (таблица 1) проводилась в течение 1 часа при температуре 37°C в PBS 1% BSA с антителами в разведении 1:500 (были включены контрольные субъекты с отсутствием первичных антител). Клетки промывали трижды с применением PBS с инкубацией с PBS 1% BSA в течение 15 минут при КТ. Затем выполняли инкубацию с вторичными антителами (AlexaFluor488 антитела козы к мышиным антигенам, 1:500; ДНК-маркер Hoechst 33342, 1:5.000) в течение 45 минут при КТ в PBS 1% BSA. Клетки трижды промывали PBS 1% BSA и трижды - PBS с последующей фиксацией покрывными стеклами (фиксирующая среда Dako). Иммунофлуоресцентные снимки получали с помощью инструмента Zeiss Cell Observer (объектив 20x, фиксированная экспозиция пар образец/контроль).
На иммунофлуоресцентных снимках (рис. 6) показано, что обработка антителами групп A и B обусловливает специфическое обнаружение искомого белка в цитоплазме и ядерной мембране (+ ядре) при отсутствии скоплений. И наоборот, антитела из групп B и D демонстрируют специфическую окраску с точечным белком и отсутствие низких сигналов от цитоплазмы. Контрольная инкубация антител на связывающем белке ZsGreen не обусловливала обнаружение значительных сигналов (одинаковое время экспозиции для визуализации сигналов от антител).
Пример 8:
Анализ Вестерн-блот
HEK293TT (1,5 Mio/6 лунок) культивировали в течение 24 ч в 6-луночных культуральных планшетах в DMEM 10% FCS (с добавлением 1x глутамакса (Gibco) и 1x заменимых аминокислот (Gibco)) с последующей трансфекцией ДНК с полиэтилемином (PEI) с ZsGreen1CI плазмидами с чрезмерным количеством MSBI1, CMI1 или MSBI2 Rep-белка в качестве бека связывания с N-терминальной меткой ZsGreen. Через 48 часов после трансфекции ДНК клетки промывали PBS, отсоединяли путем трипинирования, снова промывали PBS и лизировали в буфере SDS-PAGE Lämmli (кипячение в течение 5 минут при температуре 98°C). Образцы загружали на заранее сформированные гели (12,5% SDS-PAGE) в виде одного крупного блока. После блот-переноса 2 полоски мембран разрезали на полоски для инкубации по отдельности с разными моноклональными антителами мыши в таблице 1 (разведение 1:1000 в PBS 5% снятого латекса). Полоски трижды промывали PBS 0,1% Твин-20 и инкубировали с вторичными антителами к мышиным антигенам, связанными с HRP для проведения анализа Westernblot с антителами с обнаружением разных ZsGreen-Rep связывающих белков на устройстве Biorad ChemiDoc. Положительный контрольный анализ проводился с инкубацией с антителами ZsGreen (OriGene, 1:2000).
На Фиг. 7 представлено, то в то время как антитела групп A и B специфически определяют все три связывающих Rep-белка, включая CMI1 и MSBI2 Rep-белки, помимо MSBI1 Rep-белка, MSBI1 специфичные антитела из групп C и D определяют исключительно MSBI1 Rep-белок Антитела D2 WB-отрицательны, вероятно, вследствие определения 3D-структурного эпитопа, отсутствующего в условиях денатурирования в анализе SDS-PAGE, следовательно, он не подвергался анализу в данном исследовании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Идентификационный номер последовательности
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
1
Аминокислотная последовательность в Rep-белке, кодируемом геномом MSBI1.176MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAIIEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRMYELLICWRSTGKTPIIELDEFRKRIGVLDTEYTRTDNLKMRVIELALKQINEHTDITASYEQHKKGRVITGFSFKFKHKKQNSDKTPKNSDSSPRIVKHSQIPTNIVKQPENAKMSDLEHRASRVTGEIMRNRLSDRFKQGDESAIDMMKRIQSEIITDAIADQWESKLEEFGVVF
2
Аминокислотная последовательность в Rep-пептидном фрагментеEARETGKGINANDPLTVH
3
Аминокислотная последовательность в Rep-пептидном фрагментеKQINEHTDITASYEOHKKGRT
4
His-Tag (с двумя нейтральными вставочными аминокислотами)GAHHHHHH
5
T7-TagMASMTGGQQMG
6
FLAG-TagDYKDDDDK
7
StRep-II-TagWSHPQFEK
8
Аминокислотная последовательность в Rep-белке, кодируемом геномом MSBI2.176MSKLVVKDNALMNASYNLDLVEQRLILLAIIEARESGKGINANDPLTVHAESYINQFGVHRVTAYQALKDACDNLFARQFSYQSKSEKGNIQNHRSRWVSEIIYIDTEATVKIIFAPAIVPLITRLEEQFTKYDIEQISDLSSAYAIRLYELLICWRSTGKTPIIGLGEFRNRVGVLDSEYHRIAHLKERVIEHSIKQINEHTDITATYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKPKQAEIATETPKTATNDPDTTKPLTEPQIAKYSMILCKLGSISDLSNFPDYPAFANWIGNILRNPEKADEQIAKRIFTALKTETDYSKKN
9
MSBI.1 специфический эпитопNRLSDRF
10
Аминокислотная последовательность в Rep-белке, кодируемом геномом CMI1.252MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAILEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISELSSAYAVRLYELLICWRSTGKTPIIDLTEFRKRLGVLDTEYTRTDNLKMRVIELGLKQINEHTDITASYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKKTGAEMPKNSDSSPHIEKPSQIPANIAKQPENAKKDDLGHRASKITGLIMSNGLADRFKRGDESVIDMMKRIKEEITTDTTADQWENKLEEFGVIFQS
11
Аминокислотная последовательность в Rep-белке, кодируемом геномом CMI2.214MSDLIVKDNALMNASYNLDLVEQRLILLAILEARETGKGINANDPLTVHAESYINQFGVARQTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRANITSRWVSQIAYIDETATVEVIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRLYELLICWRSTGKTPVIELAEFRKRLGVLNDEYTRSDNFKKWIIENPIKQINEHTDITASYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKKTEPETPKNSDSSQRIEKPSQIPANIVKQPENANLSDLQHRASKITGLIMSNRLSDRFKQGDESIMQMMARIQSEITTDSIADQWQSKLEEFGVVF
12
Аминокислотная последовательность в Rep-белке, кодируемом геномом CMI3.168MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAILEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRANITSRWVSQIAYIDETATVEVIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRLYELLICWRTTGKTPVLDLTEFRKRLGVLDTEYTRTDNLKMRVIEQSLKQINKHTDITASYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKKTEPETPKNNDSGVSKPKTVEIPAEVVKQPKNTNLSDLEKRVRMITGAIAKNNLASRFQHGNESPLDMMKRIQSEITSDETADLWQNKLESMGVVF
13
ДНК-последовательность кодон-оптимизированного MSBI1 RepATGAGCGACCTGATCGTGAAAGACAATGCCCTGATGAACGCCTCCTACAACCTGGCACTGGTCGAACAGAGACTGATTCTGCTGGCTATCATCGAGGCAAGGGAGACCGGCAAGGGCATCAACGCCAATGACCCCCTGACAGTGCACGCCAGCTCCTACATCAACCAGTTTAATGTGGAGCGCCACACCGCCTATCAGGCCCTGAAGGACGCCTGCAAGGATCTGTTTGCCCGGCAGTTCAGCTACCAGGAGAAGCGGGAGAGAGGCAGGATCAACATCACAAGCAGATGGGTGTCCCAGATCGGCTATATGGACGATACCGCCACAGTGGAGATCATCTTTGCACCAGCAGTGGTGCCTCTGATCACCAGGCTGGAGGAGCAGTTCACACAGTACGACATCGAGCAGATCTCCGGACTGTCTAGCGCCTACGCCGTGCGCATGTATGAGCTGCTGATCTGTTGGCGGTCTACCGGCAAGACACCTATCATCGAGCTGGATGAGTTCCGCAAGCGGATCGGCGTGCTGGACACCGAGTACACCAGAACAGATAACCTGAAGATGAGAGTGATCGAGCTGGCCCTGAAGCAGATCAATGAGCACACCGATATCACAGCCTCTTATGAGCAGCACAAGAAGGGCCGCGTGATCACCGGCTTCAGCTTTAAGTTCAAGCACAAGAAGCAGAACTCTGACAAGACACCAAAGAATAGCGATTCCTCTCCCCGGATCGTGAAGCACAGCCAGATCCCTACCAACATCGTGAAGCAGCCAGAGAATGCCAAGATGTCCGACCTGGAGCACAGGGCATCTAGGGTGACAGGCGAGATCATGAGAAATAGGCTGAGCGATCGGTTCAAGCAGGGCGACGAGTCCGCCATCGATATGATGAAGAGAATCCAGTCCGAGATCATCACCGACGCCATCGCCGATCAGTGGGAATCTAAACTGGAAGAGTTTGGAGTCGTGTTTGGAGCACATCACCATCATCATCACTGA
14
Белковая последовательность кодон-оптимизированного MSBI1 RepMSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAIIEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRMYELLICWRSTGKTPIIELDEFRKRIGVLDTEYTRTDNLKMRVIELALKQINEHTDITASYEQHKKGRVITGFSFKFKHKKQNSDKTPKNSDSSPRIVKHSQIPTNIVKQPENAKMSDLEHRASRVTGEIMRNRLSDRFKQGDESAIDMMKRIQSEIITDAIADQWESKLEEFGVVFGA
15
ДНК-последовательность MSBI1 Rep дикого типаATGAGCGATTTAATAGTAAAAGATAACGCCCTAATGAATGCTAGTTATAACTTAGCTTTGGTTGAACAGAGGTTAATTCTATTAGCAATCATAGAAGCGAGAGAAACAGGCAAAGGGATTAATGCCAATGATCCTTTAACAGTTCATGCAAGTAGCTATATCAATCAATTTAACGTAGAAAGGCATACGGCATATCAAGCCCTCAAAGATGCTTGTAAAGACTTGTTTGCCCGTCAATTCAGTTACCAAGAAAAGCGAGAACGAGGACGAATTAATATTACAAGTCGATGGGTTTCGCAAATTGGCTATATGGACGATACAGCAACCGTTGAGATTATTTTTGCCCCTGCGGTTGTTCCTCTGATTACACGGCTAGAGGAACAGTTCACCCAGTACGATATTGAGCAAATTAGCGGTTTATCGAGTGCATATGCTGTTCGTATGTACGAACTGCTGATTTGTTGGCGTAGCACAGGCAAAACACCAATTATTGAGCTAGACGAGTTTAGAAAGCGAATAGGTGTTTTAGATACTGAATACACTAGAACAGATAATTTAAAGATGCGAGTTATTGAATTAGCCCTAAAACAAATCAACGAACATACAGACATCACAGCAAGCTATGAACAACACAAAAAAGGGCGAGTGATTACAGGATTCTCATTCAAGTTTAAGCACAAGAAACAAAACAGCGATAAAACGCCAAAAAATAGCGATTCTAGCCCACGTATCGTAAAACATAGTCAAATCCCTCCAACATTGTAAAACAGCCTGAAAACGCCAAAATGAGCGATTTAGAACATAGAGCGAGCCGTGTTACAGGGGAAATAATGCGAAATCGTCTGTCAGATCGGTTTAAACAAGGCGATGAATCAGCAATCGACATGATGAAACGTATTCAAAGTGAAATAATAACCGATGCAATAGCAGACCAGTGGGAAAGCAAACTGGAGGAGTTTGGCGTGGTTTTTTAG
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Funk, M., et al. (2014). “Выделение белок-ассоциированной циркулярной ДНК из сыворотки здоровых особей КРС”. Genome Announc 2(4).
Giraldo, R., et al. (2011). “RepA-WH1 прионоид: протеинопатия синтетического амлоида у минимальных хозяев”. Prion 5(2):60-64.
Gunst, K., et al. (2014). “Выделение репликационных циркулярных ДНК, связанных с бактериальными плазмидами, из образца сыворотки пациента с рассеянным склерозом”. Genome Announc 2(4).
Lamberto, I., et al. (2014). “Миковирусоподобные ДНК последовательности в образцах сыворотки КРС и мозга и сыворотки человека с рассеянным склерозом”. Genome Announc 2(4).
Manuelidis L., 2011. “Совместная очистка нуклеазорезистентных циркулярных ДНК при почесухе и  болезни Кройцфельдта Якоба”. J. Neurovirol. 17:131-145.
Torreira, E., et al. (2015). “Амилоидогенез бактериального прионоида RepA-WH1 повторяет переход димера в мономер RepA при запуске репликации ДНК”. Structure 23(1):183-189.
Whitley, C., et al. (2014). “Новые реплицируемые молекулы ДНК в сыворотке и молоке здоровых коров и ткани мозга пациента с рассеянным склерозом”. Genome Announc 2(4).
--->
Перечень последовательностей
<110>  Deutsches Krebsforschungszentrum
<120> REP БЕЛОК В КАЧЕСТВЕ БЕЛКОВОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ
АНАЛИЗОВ
<130>  K 3610PCT
<150>  EP16193119.1
<151>  2016-10-10
<160>  15
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  324
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  MSBI1 Rep protein
<400>  1
Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr
1               5                   10                  15
Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Ile Glu
20                  25                  30
Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val
35                  40                  45
His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala
50                  55                  60
Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ile Asn Ile Thr Ser Arg
85                  90                  95
Trp Val Ser Gln Ile Gly Tyr Met Asp Asp Thr Ala Thr Val Glu Ile
100                 105                 110
Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln
115                 120                 125
Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr
130                 135                 140
Ala Val Arg Met Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Pro Ile Ile Glu Leu Asp Glu Phe Arg Lys Arg Ile Gly Val Leu
165                 170                 175
Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu
180                 185                 190
Leu Ala Leu Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr
195                 200                 205
Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Val Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe
210                 215                 220
Lys His Lys Lys Gln Asn Ser Asp Lys Thr Pro Lys Asn Ser Asp Ser
225                 230                 235                 240
Ser Pro Arg Ile Val Lys His Ser Gln Ile Pro Thr Asn Ile Val Lys
245                 250                 255
Gln Pro Glu Asn Ala Lys Met Ser Asp Leu Glu His Arg Ala Ser Arg
260                 265                 270
Val Thr Gly Glu Ile Met Arg Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe Lys Gln
275                 280                 285
Gly Asp Glu Ser Ala Ile Asp Met Met Lys Arg Ile Gln Ser Glu Ile
290                 295                 300
Ile Thr Asp Ala Ile Ala Asp Gln Trp Glu Ser Lys Leu Glu Glu Phe
305                 310                 315                 320
Gly Val Val Phe
<210>  2
<211>  18
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Rep peptide
<400>  2
Glu Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr
1               5                   10                  15
Val His
<210>  3
<211>  20
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Rep peptide
<400>  3
Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr Glu His Lys
1               5                   10                  15
Lys Gly Arg Thr
20
<210>  4
<211>  8
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  His tag
<400>  4
Gly Ala His His His His His His
1               5
<210>  5
<211>  11
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  T7 tag
<400>  5
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1               5                   10
<210>  6
<211>  8
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  FLAG tag
<400>  6
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210>  7
<211>  8
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Trep II tag
<400>  7
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1               5
<210>  8
<211>  319
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  MSBI2.176
<400>  8
Met Ser Lys Leu Val Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr
1               5                   10                  15
Asn Leu Asp Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Ile Glu
20                  25                  30
Ala Arg Glu Ser Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val
35                  40                  45
His Ala Glu Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Gly Val His Arg Val Thr Ala
50                  55                  60
Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Asp Asn Leu Phe Ala Arg Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Gln Ser Lys Ser Glu Lys Gly Asn Ile Gln Asn His Arg Ser
85                  90                  95
Arg Trp Val Ser Glu Ile Ile Tyr Ile Asp Thr Glu Ala Thr Val Lys
100                 105                 110
Ile Ile Phe Ala Pro Ala Ile Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu
115                 120                 125
Gln Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Asp Leu Ser Ser Ala
130                 135                 140
Tyr Ala Ile Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Thr Pro Ile Ile Gly Leu Gly Glu Phe Arg Asn Arg Val Gly Val
165                 170                 175
Leu Asp Ser Glu Tyr His Arg Ile Ala His Leu Lys Glu Arg Val Ile
180                 185                 190
Glu His Ser Ile Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Thr
195                 200                 205
Tyr Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Thr Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys
210                 215                 220
Phe Lys Gln Lys Lys Pro Lys Gln Ala Glu Ile Ala Thr Glu Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Thr Ala Thr Asn Asp Pro Asp Thr Thr Lys Pro Leu Thr Glu Pro
245                 250                 255
Gln Ile Ala Lys Tyr Ser Met Ile Leu Cys Lys Leu Gly Ser Ile Ser
260                 265                 270
Asp Leu Ser Asn Phe Pro Asp Tyr Pro Ala Phe Ala Asn Trp Ile Gly
275                 280                 285
Asn Ile Leu Arg Asn Pro Glu Lys Ala Asp Glu Gln Ile Ala Lys Arg
290                 295                 300
Ile Phe Thr Ala Leu Lys Thr Glu Thr Asp Tyr Ser Lys Lys Asn
305                 310                 315
<210>  9
<211>  7
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  MSBI1 epitope
<400>  9
Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe
1               5
<210>  10
<211>  326
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  CMI1.252
<400>  10
Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr
1               5                   10                  15
Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Leu Glu
20                  25                  30
Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val
35                  40                  45
His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala
50                  55                  60
Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ile Asn Ile Thr Ser Arg
85                  90                  95
Trp Val Ser Gln Ile Gly Tyr Met Asp Asp Thr Ala Thr Val Glu Ile
100                 105                 110
Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln
115                 120                 125
Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Glu Leu Ser Ser Ala Tyr
130                 135                 140
Ala Val Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Pro Ile Ile Asp Leu Thr Glu Phe Arg Lys Arg Leu Gly Val Leu
165                 170                 175
Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu
180                 185                 190
Leu Gly Leu Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr
195                 200                 205
Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Thr Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe
210                 215                 220
Lys Gln Lys Lys Lys Thr Gly Ala Glu Met Pro Lys Asn Ser Asp Ser
225                 230                 235                 240
Ser Pro His Ile Glu Lys Pro Ser Gln Ile Pro Ala Asn Ile Ala Lys
245                 250                 255
Gln Pro Glu Asn Ala Lys Lys Asp Asp Leu Gly His Arg Ala Ser Lys
260                 265                 270
Ile Thr Gly Leu Ile Met Ser Asn Gly Leu Ala Asp Arg Phe Lys Arg
275                 280                 285
Gly Asp Glu Ser Val Ile Asp Met Met Lys Arg Ile Lys Glu Glu Ile
290                 295                 300
Thr Thr Asp Thr Thr Ala Asp Gln Trp Glu Asn Lys Leu Glu Glu Phe
305                 310                 315                 320
Gly Val Ile Phe Gln Ser
325
<210>  11
<211>  324
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  CMI2.214
<400>  11
Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr
1               5                   10                  15
Asn Leu Asp Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Leu Glu
20                  25                  30
Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val
35                  40                  45
His Ala Glu Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Gly Val Ala Arg Gln Thr Ala
50                  55                  60
Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ala Asn Ile Thr Ser Arg
85                  90                  95
Trp Val Ser Gln Ile Ala Tyr Ile Asp Glu Thr Ala Thr Val Glu Val
100                 105                 110
Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln
115                 120                 125
Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr
130                 135                 140
Ala Val Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Pro Val Ile Glu Leu Ala Glu Phe Arg Lys Arg Leu Gly Val Leu
165                 170                 175
Asn Asp Glu Tyr Thr Arg Ser Asp Asn Phe Lys Lys Trp Ile Ile Glu
180                 185                 190
Asn Pro Ile Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr
195                 200                 205
Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Thr Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe
210                 215                 220
Lys Gln Lys Lys Lys Thr Glu Pro Glu Thr Pro Lys Asn Ser Asp Ser
225                 230                 235                 240
Ser Gln Arg Ile Glu Lys Pro Ser Gln Ile Pro Ala Asn Ile Val Lys
245                 250                 255
Gln Pro Glu Asn Ala Asn Leu Ser Asp Leu Gln His Arg Ala Ser Lys
260                 265                 270
Ile Thr Gly Leu Ile Met Ser Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe Lys Gln
275                 280                 285
Gly Asp Glu Ser Ile Met Gln Met Met Ala Arg Ile Gln Ser Glu Ile
290                 295                 300
Thr Thr Asp Ser Ile Ala Asp Gln Trp Gln Ser Lys Leu Glu Glu Phe
305                 310                 315                 320
Gly Val Val Phe
<210>  12
<211>  324
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  CMI3.168
<400>  12
Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr
1               5                   10                  15
Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Leu Glu
20                  25                  30
Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val
35                  40                  45
His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala
50                  55                  60
Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ala Asn Ile Thr Ser Arg
85                  90                  95
Trp Val Ser Gln Ile Ala Tyr Ile Asp Glu Thr Ala Thr Val Glu Val
100                 105                 110
Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln
115                 120                 125
Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr
130                 135                 140
Ala Val Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Thr Thr Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Pro Val Leu Asp Leu Thr Glu Phe Arg Lys Arg Leu Gly Val Leu
165                 170                 175
Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu
180                 185                 190
Gln Ser Leu Lys Gln Ile Asn Lys His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr
195                 200                 205
Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Thr Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe
210                 215                 220
Lys Gln Lys Lys Lys Thr Glu Pro Glu Thr Pro Lys Asn Asn Asp Ser
225                 230                 235                 240
Gly Val Ser Lys Pro Lys Thr Val Glu Ile Pro Ala Glu Val Val Lys
245                 250                 255
Gln Pro Lys Asn Thr Asn Leu Ser Asp Leu Glu Lys Arg Val Arg Met
260                 265                 270
Ile Thr Gly Ala Ile Ala Lys Asn Asn Leu Ala Ser Arg Phe Gln His
275                 280                 285
Gly Asn Glu Ser Pro Leu Asp Met Met Lys Arg Ile Gln Ser Glu Ile
290                 295                 300
Thr Ser Asp Glu Thr Ala Asp Leu Trp Gln Asn Lys Leu Glu Ser Met
305                 310                 315                 320
Gly Val Val Phe
<210>  13
<211>  999
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  codon-optimized MSBI1
<400>  13
atgagcgacc tgatcgtgaa agacaatgcc ctgatgaacg cctcctacaa cctggcactg       60
gtcgaacaga gactgattct gctggctatc atcgaggcaa gggagaccgg caagggcatc      120
aacgccaatg accccctgac agtgcacgcc agctcctaca tcaaccagtt taatgtggag      180
cgccacaccg cctatcaggc cctgaaggac gcctgcaagg atctgtttgc ccggcagttc      240
agctaccagg agaagcggga gagaggcagg atcaacatca caagcagatg ggtgtcccag      300
atcggctata tggacgatac cgccacagtg gagatcatct ttgcaccagc agtggtgcct      360
ctgatcacca ggctggagga gcagttcaca cagtacgaca tcgagcagat ctccggactg      420
tctagcgcct acgccgtgcg catgtatgag ctgctgatct gttggcggtc taccggcaag      480
acacctatca tcgagctgga tgagttccgc aagcggatcg gcgtgctgga caccgagtac      540
accagaacag ataacctgaa gatgagagtg atcgagctgg ccctgaagca gatcaatgag      600
cacaccgata tcacagcctc ttatgagcag cacaagaagg gccgcgtgat caccggcttc      660
agctttaagt tcaagcacaa gaagcagaac tctgacaaga caccaaagaa tagcgattcc      720
tctccccgga tcgtgaagca cagccagatc cctaccaaca tcgtgaagca gccagagaat      780
gccaagatgt ccgacctgga gcacagggca tctagggtga caggcgagat catgagaaat      840
aggctgagcg atcggttcaa gcagggcgac gagtccgcca tcgatatgat gaagagaatc      900
cagtccgaga tcatcaccga cgccatcgcc gatcagtggg aatctaaact ggaagagttt      960
ggagtcgtgt ttggagcaca tcaccatcat catcactga                             999
<210>  14
<211>  326
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  MSBI1 protein
<400>  14
Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr
1               5                   10                  15
Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Ile Glu
20                  25                  30
Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val
35                  40                  45
His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala
50                  55                  60
Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ile Asn Ile Thr Ser Arg
85                  90                  95
Trp Val Ser Gln Ile Gly Tyr Met Asp Asp Thr Ala Thr Val Glu Ile
100                 105                 110
Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln
115                 120                 125
Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr
130                 135                 140
Ala Val Arg Met Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Pro Ile Ile Glu Leu Asp Glu Phe Arg Lys Arg Ile Gly Val Leu
165                 170                 175
Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu
180                 185                 190
Leu Ala Leu Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr
195                 200                 205
Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Val Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe
210                 215                 220
Lys His Lys Lys Gln Asn Ser Asp Lys Thr Pro Lys Asn Ser Asp Ser
225                 230                 235                 240
Ser Pro Arg Ile Val Lys His Ser Gln Ile Pro Thr Asn Ile Val Lys
245                 250                 255
Gln Pro Glu Asn Ala Lys Met Ser Asp Leu Glu His Arg Ala Ser Arg
260                 265                 270
Val Thr Gly Glu Ile Met Arg Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe Lys Gln
275                 280                 285
Gly Asp Glu Ser Ala Ile Asp Met Met Lys Arg Ile Gln Ser Glu Ile
290                 295                 300
Ile Thr Asp Ala Ile Ala Asp Gln Trp Glu Ser Lys Leu Glu Glu Phe
305                 310                 315                 320
Gly Val Val Phe Gly Ala
325
<210>  15
<211>  974
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  MSBI1 wild type
<400>  15
atgagcgatt taatagtaaa agataacgcc ctaatgaatg ctagttataa cttagctttg       60
gttgaacaga ggttaattct attagcaatc atagaagcga gagaaacagg caaagggatt      120
aatgccaatg atcctttaac agttcatgca agtagctata tcaatcaatt taacgtagaa      180
aggcatacgg catatcaagc cctcaaagat gcttgtaaag acttgtttgc ccgtcaattc      240
agttaccaag aaaagcgaga acgaggacga attaatatta caagtcgatg ggtttcgcaa      300
attggctata tggacgatac agcaaccgtt gagattattt ttgcccctgc ggttgttcct      360
ctgattacac ggctagagga acagttcacc cagtacgata ttgagcaaat tagcggttta      420
tcgagtgcat atgctgttcg tatgtacgaa ctgctgattt gttggcgtag cacaggcaaa      480
acaccaatta ttgagctaga cgagtttaga aagcgaatag gtgttttaga tactgaatac      540
actagaacag ataatttaaa gatgcgagtt attgaattag ccctaaaaca aatcaacgaa      600
catacagaca tcacagcaag ctatgaacaa cacaaaaaag ggcgagtgat tacaggattc      660
tcattcaagt ttaagcacaa gaaacaaaac agcgataaaa cgccaaaaaa tagcgattct      720
agcccacgta tcgtaaaaca tagtcaaatc cctccaacat tgtaaaacag cctgaaaacg      780
ccaaaatgag cgatttagaa catagagcga gccgtgttac aggggaaata atgcgaaatc      840
gtctgtcaga tcggtttaaa caaggcgatg aatcagcaat cgacatgatg aaacgtattc      900
aaagtgaaat aataaccgat gcaatagcag accagtggga aagcaaactg gaggagtttg      960
gcgtggtttt ttag                                                        974
<---