ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ DEINOCOCCUS RADIODURANS
NUTRIENT MEDIUM FOR DEINOCOCCUS RADIODURANS CULTIVATION

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии, а, именно к получению питательных сред для выращивания Deinococcus radiodurans.
Непатогенная бактерия Deinococcus radiodurans известна устойчивостью к дозам радиации, в десятки раз превышающим летальные для изученных к настоящему времени микроорганизмов.
Одной из характерных особенностей этой бактерии является выработка деиноксантина - каротиноида, придающего колониям характерную розово-оранжевую окраску. Это вещество обладает уникально высокой антиоксидантной активностью. Деиноксантин способен значительно эффективнее, чем β-каротин и α-токоферол, перехватывать синглетный кислород и гидроксильный радикал (наиболее опасные виды активных форм кислорода).
Это вещество безвредно и, следовательно, может иметь целый ряд применений:
- в пищевой технологии как недорогой натуральный краситель для разнообразных продуктов или как натуральный антиоксидант, препятствующий прогорканию жирных продуктов (майонеза, шоколадной пасты и др.);
- в фармакологии как эффективный антиоксидант; в том числе как основа адаптогенов, геропротекторов, анестетиков нового поколения, протекторов ближнего ультрафиолета.
В связи с вышеизложенным разработка дешевых питательных сред для выращивания бактерии Deinococcus radiodurans в настоящее время является актуальной задачей.
Используемая культуральная среда должна соответствовать требованиям конкретного организма, в данном случае бактерии Deinococcus radiodurans.
Пригодные для инкубации микроорганизмов питательные среды содержат источник углерода, например углеводы; источник азота в виде различных азотсодержащих соединений; а также различные комплексные добавки, к примеру соли металлов, которые необходимы для роста.
Известна питательная среда (1), используемая для выращивания штамма микроорганизмов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, содержащая питательную основу, где в качестве источника азота используются органические азотсодержащие соединения - пептон, дрожжевой экстракт, в качестве соли - хлористый натрий, а также агар, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:
дрожжевой экстракт
5,0
пептон
15,0
NaCl
5,0
агар
15,0
дистиллированная вода
до 1 л
Недостатком известной питательной среды является дороговизна составляющих компонентов, т.к. в ее состав входят продукты животного происхождения - пептон, дрожжевой экстракт, агар. При этом производительность культивирования бактерий Deinococcus radiodurans с использованием данной среды невысока.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда (2) для выращивания штамма микроорганизма Deinococcus radiodurans, содержащая питательную основу, где в качестве источника углеводов использована глюкоза, в качестве органических азотсодержащих соединений - дрожжевой экстракт, и важный для роста источник аминокислот - триптон, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:
триптон
5,0
глюкоза
1,0
дрожжевой экстракт
3,0
дистиллированная вода
до 1 л
Недостатком данной среды является использование дорогостоящих ингредиентов (триптон - трипсиновый гидролизат белкового субстрата животного происхождения, дрожжевой экстракт - автолизат пекарских дрожжей) при невысоком выходе биомассы выращиваемых бактерий.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка новой пригодной для выращивания бактерий Deinococcus radiodurans питательной среды, которая была бы более экономичной и обеспечивала более высокий выход биомассы бактерий Deinococcus radiodurans по сравнению с известными в настоящее время питательными средами.
4
2
2
Указанная задача достигается тем, что питательная среда для выращивания Deinococcus radiodurans, содержащая питательную основу, источник углерода, ростовый компонент и дистиллированную воду, согласно изобретению в качестве питательной основы содержит соевую муку, в качестве источника углерода - глюкозу или сахарозу, а в качестве ростовых компонентов - MgSO×7HO и MnCl, при следующем соотношении компонентов, г/л:
соевая мука
40,0-60,0
глюкоза или сахароза
8,0-20,0
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,02-0,07
MnCl<sub>2</sub>
0,0004-0,001
дистиллированная вода
до 1 л
В предлагаемой среде в качестве питательной основы использована соевая мука, которая обеспечивает оптимальные условия для развития микроорганизмов Deinococcus radiodurans, а также значительно удешевляет стоимость данной питательной среды. В качестве источника углерода использованы глюкоза или сахароза, которые, кроме того, способствуют лучшему пигментообразованию.
4
2
2
Кроме того, в качестве ростовых компонентов, а также для наибольшей степени образования пигмента в питательную среду добавлены MgSO×7НО и MnCl.
Сочетание предложенных компонентов для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans обеспечило увеличение роста их биомассы по сравнению с прототипом в 5,8 раз.
Неизвестно сочетание предложенных компонентов для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans, что является отличительным признаком предлагаемой питательной среды.
В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, а определение прототипа из выявленных аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".
При дополнительном поиске других решений, относящихся к питательным средам, указанных отличительных признаков не обнаружено. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".
Разработка питательной среды поясняется следующими примерами.
Питательную среду готовят следующим образом.
4
2
2
Берут 50 г соевой муки, 10 г глюкозы или сахарозы, 0,05 г MgSO×7НО, 0,0006 г MnCl, добавляют до 1 л дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
Согласно методическим рекомендациям (3) были проведены качественный и количественный контроли биологических свойств предложенной среды с использованием Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 в качестве тестового штамма.
Качественный контроль выполняли путем посева односуточного тестового штамма в предлагаемую питательную среду с помощью общепринятой методики.
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов.
По истечении срока инкубации тестовый штамм дал хорошо различимый рост с типичными отличительными признаками: помутнение жидкой среды с равномерным окрашиванием в розово-оранжевый цвет (штамм образует пигмент розово-оранжевого цвета) и образованием осадка розово-оранжевого цвета. Проведение качественного контроля показало способность тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 расти на предложенной среде с получением при этом характерных дифференцирующих признаков.
Также проводили количественный контроль предложенной среды по биологическим показателям. Для этого готовили суспензию тестового штамма с использованием стандарта мутности в 10 единиц (концентрация микробных клеток в 1 млрд) и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно).
Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевали по 0,1 мл суспензии прямым посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делали по три таких посева. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 30°С в течение 24-48 часов. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний, выросших на трех чашках.
Среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 из шестого разведения, составило 91, а из седьмого - 9. Согласно методическим рекомендациям (3) среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма из шестого разведения, должно составлять около 100 КОЕ (колониеобразующих единиц), а соотношение средних значений при посеве из шестого в седьмое разведение должно быть близко 10: 1. Таким образом, полученные значения свидетельствуют о пригодности и эффективности предложенной среды для выращивания Deinococcus radiodurans.
Экспериментально был проведен подбор оптимального количества компонентов (ингредиентов) в питательной среде.
Пример 1. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:
соевая мука
40,0
глюкоза
20,0
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,07
MnCl<sub>2</sub>
0,0004
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.
Пример 2. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:
соевая мука
40,0
сахароза
20,0
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,07
MnCl<sub>2</sub>
0,0004
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.
Пример 3. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:
соевая мука
50,0
глюкоза
10,0
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,05
MnCl<sub>2</sub>
0,0005
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.
Пример 4. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:
соевая мука
50,0
сахароза
10,0
MgSO<sub>4</sub>×7Н<sub>2</sub>О
0,05
MnCl<sub>2</sub>
0,0006
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.
Пример 5. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:
соевая мука
60,0
сахароза
8,0
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,02
MnCl<sub>2</sub>
0,001
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.
Таблица 1
Примеры
Содержание компонентов, г/л
Количество колоний, единиц/мл (КОЕ/мл)
соевая мука
глюкоза
сахароза
MgSO<sub>4</sub>×7Н<sub>2</sub>О
MnCl<sub>2</sub>
1
40,0
20,0
0,07
0,0004
1,9×10<sup>9</sup>
2
40,0
20,0
0,07
0,0004
2,0×10<sup>9</sup>
3
50,0
10,0
0,05
0,0005
3,7×10<sup>9</sup>
4
50,0
10
0,05
0,0006
3,9×10<sup>9</sup>
5
60,0
8,0
0,02
0,001
2,1×10<sup>9</sup>
Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что количество КОЕ/мл на средах из примеров 1, 2 и 5 примерно одинаково. Максимальный рост культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 наблюдался на средах из примеров 3 и 4. Количество КОЕ/мл на этих средах было больше в 1,95 и 2,05 раз соответственно, чем таковое на среде в примере 1.
Кроме того, была проведена сравнительная характеристика роста Deinococcus radiodurans при выращивании на разных питательных средах.
Интенсивность роста Deinococcus radiodurans на разных средах оценивали путем выращивания штамма и приготовления ряда разведений суспензии штамма из каждой питательной среды, посева на агаризованные среды и учета количества КОЕ/мл.
Пример 6. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда L, описанная в аналоге (1) и имеющая следующий состав, г/л:
дрожжевой экстракт
5,0
пептон
15,0
NaCl
5,0
агар
15,0
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 2.
Пример 7. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда TGY, описанная в прототипе (2) и имеющая следующий состав, г/л:
триптон
5,0
глюкоза
1,0
дрожжевой экстракт
3,0
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 2.
Пример 8. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена предлагаемая питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:
соевая мука
50,0
сахароза
10,0
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,05
MnCl<sub>2</sub>
0,0006
дистиллированная вода
до 1 л
Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл предложенной соевой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.
Подсчитанное количество КОЕ/мл приведено в таблице 2.
Таблица 2
Примеры
Количество колониеобразующих единиц / мл (КОЕ/мл)
6
2,3×10<sup>8</sup>
7
6,7×10<sup>8</sup>
8
3,9×10<sup>9</sup>
Как видно из таблицы 2, максимальный рост культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 наблюдался при выращивании в предлагаемой среде - количество КОЕ/мл было в 16,9 и 5,8 раза больше, чем КОЕ/мл на среде 6 и 7 соответственно.
Это позволяет сделать вывод о явных преимуществах предлагаемой питательной среды в сравнении с известными средами для выращивания бактерий Deinococcus radiodurans, в том числе и со средой-прототипом.
Таким образом, более дешевая питательная среда позволяет получать более высокие выходы колоний бактерий Deinococcus radiodurans. При этом предлагаемая питательная среда технически проста в приготовлении (без предварительного этапа подготовки основы), в нее не входят дорогие компоненты.
Питательная среда может быть приготовлена в сухом виде. Для этого все компоненты среды смешиваются и могут храниться в банках из стекла. При практическом использовании сухой среды навеску 60-70 г среды тщательно размешивают в колбе с 1000 мл дистиллированной воды и автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 мин. Готовая к применению среда имеет цвет топленого молока.
Источники информации
1. Паспорт на штамм микроорганизма Deinococcus radiodurans ВКПМ 8209. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов. ФГУП ГосНИИГенетика.
2. Zhang Y.M., Wong T.Y., Chen L.Y., Lin C.S., Liu J.K. Induction of a futile Embden-Meyerhof-Parnas pathway in Deinococcus radiodurans by Mn: possible role of the pentose phosphate pathway in cell survival. Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol.66. №.1, p.105-112 (прототип).
3. МР «Контроль качества питательных сред» №04-3-16/1615 от 27.06.2003.