Использование валидации при выборе методики количественного определения суммы флавоноидов в геле с экстрактом цветков лабазника вязолистного

при пониженном давлении на ротационном испарителе ИР-1М2. Полученное густое извлечение использовали для хроматографического определения сесквитерпеновых лакто-нов, в частности партенолида. Были опробованы системы растворителей различной полярности: хлороформ - этилацетат, этанол -этилацетат - петролейный эфир, хлороформ -ацетон, толуол - ацетон в различных соотношениях [2]. Лучшие результаты были получены при использовании системы хлороформ - ацетон (6:1). При идентификации использовали следующие проявители: "анисовый альдегид - кислота серная"; "ванилин - кислота серная разведенная"; "ванилин - серный реактив". Наиболее яркие и контрастные зоны адсорбции были получены при обработке хроматографических пластин ванилин - серным реактивом (0,5 г ванилина, 9,5 мл спирта этилового, 0,5 мл кислоты серной и 3 капли кислоты уксусной ледяной) с последующим нагреванием при 60°С в течение 5 минут. Хроматографирование осуществляли на пластинках "БогЬШ" (ПТСХ-П-А-УФ, 10x20 см) производства ЗАО "Сорбполимер", г. Краснодар.

Для изучения фенольных соединений надземную часть пиретрума девичьего, собранную в окрестностях горы Бештау (г. Пятигорск) в фазу цветения, экстрагировали 70% спиртом этиловым. Полученное извлечение концентрировали, центрифугировали в течение 2 мин. при 5800 об./мин., отделяли от осадка фильтрованием через беззольный фильтр, удаляли растворитель. Полученный сухой остаток растворяли в спирте и использовали для бумажной хроматографии в системах: 15% кислота уксусная; н-бутанол -кислота уксусная - вода (БУВ) в соотношении 4:1:5, 4:1:1 и 5:1:4; этанол - кислота ук-

сусная - вода (40:13:30); этанол - вода (25:75) [1]. Однако лучшие результаты (интенсивность окраски и более четкие контуры зон абсорбции) были получены при использовании БУВ (4:1:5). Свидетелями являлись спиртовые растворы рабочих стандартных образцов (РСО) следующих флавоноидов: апиге-нина, гиперозида, кверцетина, лютеолина и рутина.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нами проведено хроматографическое изучение извлечений из травы пиретрума девичьего. Результаты тонкослойной хроматографии хлороформного извлечения пиретрума девичьего представлены в табл. 1.

Данные таблицы свидетельствуют, что в хлороформном извлечении травы пиретрума девичьего обнаружено 6 зон абсорбции, значение Rf и окраска одной из них совпадает с литературными данными (Rf партенолида 0,85, сине-голубое пятно) [3].

Результаты бумажной хроматографии спиртоводного извлечения пиретрума девичьего представлены в табл. 2.

Как видно из таблицы в спиртоводном извлечении пиретрума девичьего обнаружено 6 зон абсорбции, значение Rf и окраска трех из них совпадает со свидетелями гиперозида, лютеолина и рутина.

В результате хроматографического исследования подобраны оптимальные условия проведения бумажной и тонкослойной хроматографии сесквитерпеновых лактонов и флавоноидов пиретрума девичьего. По литературным данным значений показателя распределений (Rf), а также в сравнении с достоверными образцами веществ-свидетелей

Таблица 1

Результаты определения сесквитерпеновых лактонов с помощью тонкослойной хроматографии

Видимый свет УФ-свет Ванилин - серный реактив Ванилин - серный реактив, УФ-свет

1. желтая, Rf 0,97 красная желтая, Rf 0,97 красная

2. - - сине-голубая, Rf 0,85 -

3. - светло-желтая, Rf 0,71 - светло-желтая, Rf 0,71

4. - - зелено-желтая, Rf 0,46 -

5. желтая, Rf 0,33 - желтая, Rf 0,33 -

6. сиреневая, Rf 0,23 красная сиреневая, Rf 0,23 красная

Таблица 2

Результаты определения фенольных соединений с помощью бумажной хроматографии

Свидетели и образец Пары аммиака УФ-свет 10% раствор алюминия хлорида спиртовой в УФ-свете

Окраска Значение Rf Окраска Значение Rf Окраска Значение Rf

1. Апигенин желтая 0,94 желто- зеленая 0,94 желто- зеленая 0,94

2. Гиперозид желтая 0,71 зеленовато- бурая 0,71 желто- зеленая 0,71

3. Кверцетин желтая 0,80 желтая 0,80 ярко- зеленая 0,80

4. Лютеолин желтая 0,90 желто- зеленая 0,90 желто- зеленая 0,90

5. Рутин желтая 0,60 желто- зеленая 0,60 желтая 0,60

- - зеленая 0,32 - -

- - - - желто- зеленая 0,34

6. Спиртоводное извлечение пиретрума девичьего желтая 0,60 желто- зеленая 0,60 желтая 0,60

желтая 0,71 буро- зеленая 0,71 зелено- желтая 0,71

желтая 0,90 желто- зеленая 0,90 желто- зеленая 0,90

- - желто- зеленая 0,95

идентифицированы сесквитерпеновый лактон - партенолид и флавоноиды: гиперозид, лю-теолин, рутин, из них гиперозид и рутин в траве пиретрума девичьего обнаружены впервые. Разработанная нами методика тонкослойной хроматографии включена в проект фармакопейной статьи на сырье данного вида.

ЛИТЕРАТУРА

1. Клышев Л.К., Бандюкова В.А. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования). -Алма-Ата: Наука, 1978. - 220 с.

2. Рыбалко К.С. Природные сесквитерпеновые лактоны. - М.: Медицина, 1978. - 319 с.

3. Brown A.M.G. Sexual hybrids of Tanacetum: biochemical, cytological and pharmacological characterization // J Exp Bot. - 1999. - Vol. 50, N 333. - P. 435-444.

4. Fraga B.M. Natural sesquiterpenoids // Nat Prod Rep. - 2005. - Vol. 22. - P. 465-486.

5. Kaplan M., Simmonds M.R., Davidson G. Com-parsion of Supercritical Fluid and Solvent Extraction of Feverfew (Tanacetum parthenium) // Turk J Chem. - 2002. - Vol. 26. - P. 473-480.

6. Knight D.W. Feverfew: chemistry and biological activity // Nat Prod Rep. - 1995. - N 12. -P.271-276.

УДК 615.322:547.972.062:543

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВАЛИДАЦИИ ПРИ ВЫБОРЕ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ГЕЛЕ С ЭКСТРАКТОМ ЦВЕТКОВ

ЛАБАЗНИКА ВЯЗОЛИСТНОГО

© Степанова Э.Ф., Губанова Л.Б., Голова Г.А.

Кафедра технологии лекарств, кафедра фармацевтической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, Пятигорск

Методами валидационной оценки методики количественного определения содержания суммы флаво-ноидов в геле с экстрактом цветков лабазника вязолистного установлена линейность методики, ее воспроизводимость и точность. Рассчитаны величины открываемости и относительного стандартного отклонения. Методика аттестована для количественного определения флавоноидов в геле лабазника вязолистного. Ключевые слова: экстракт лабазника, гель, валидация, линейность, прецизионность, точность.

APPLICATION OF VALIDATION IN CHOOSING TO TECHNIQUE TOTAL FLAVONOID QUANTITATIVE DETERMINATION IN A GEL WITH FILIPENDULAE ULMARIAE

FLOWER EXTRACT Stepanova E.F., Gubanova L.B., Golova G.A.

Drugs Technology Department, Pharmaceutical Chemistry Department of the Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy, Pyatigorsk The technique of linearity, reproducibility and accuracy has been determined by the methods of the validative evaluation of the quantitative determination technique of the total flavonoid content in a gel with Filipendulae ul-mariae flower extract.The values of dehiscence and relative standard deviation have been calculated. The technique is recommended for flavonoid quantitative determination in the Filipendulae ulmariae gel.

Key words: Filipendulae extract, gel, validation, linearity, reproducibility, accuracy.

В системе обеспечения качества фармацевтической продукции важную роль играет аналитический контроль как сырья, так и готового продукта.

Для того, чтобы аналитические методики гарантировали достоверные и точные результаты анализа, предусмотрена процедура их валидации (аттестации). В данной работе нами проведена валидационная оценка методики количественного определения суммы флавоноидов в геле с экстрактом цветков лабазника вязолистного.

Лабазник вязолистный - широко применяемое лекарственное растение. В качестве лекарственного растительного сырья в настоящее время используются цветки лабазника вязолистного. Лабазник и его экстракты обладают широким спектром фармакологического действия: противовоспалительным,

ранозаживляющим, антисептическим.

При приеме внутрь экстрактов и настоек лабазника отмечается противоязвенное, иммуностимулирующее, сосудоукрепляющее, противоревматическое действие [1].

Экстракт цветков лабазника вязолистного применяют при лечении трофических язв и как средство, стимулирующее эритроидный и гранулоцитарный ростки кроветворения при цитостатических миелодепрессиях. Настой и отвар применяют для лечения дизентерии. Стандартизацию этого сырья проводят по сумме флавоноидов в пересчете на гликозиды кверцетина (спиреозид) [2].

При получении парафармацевтического продукта - геля с экстрактом из цветков лабазника вязолистного, обладающего выраженным противовоспалительным и антиок-сидантным действием на кожу и слизистую, мы использовали экстракт из цветков лабазника вязолистного [1].

Экстракт из цветков лабазника вязолист-ного (1:8) получали общеизвестным способом - дробной мацерацией. Полученный экстракт сгущали, стандартизировали и определяли числовые показатели. Сумма флавонои-дов в пересчете на гликозиды кверцетина (спиреозид) составила 1,27±0,03%.

Целью настоящего исследования является валидационная оценка методики спектрофотометрического определения количественного содержания суммы флавоноидов в геле с экстрактом цветков лабазника, которая позволила бы достоверно оценить качество геля. Эта методика включена в нормативную документацию на цветки лабазника вязолистно-го [2].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Валидацию методики проводили методом математической статистики по следующим показателям: линейность, прецизионность и точность [2].

Линейную зависимость устанавливали на основании результатов количественного определения, которые пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образцах геля. Это зависимость оптической плотности продукта взаимодействия флаво-ноидов с алюминия (III) хлоридом от рассчитанной концентрации суммы флавоноидов в геле (в пересчете на гликозиды кверцетина -спиреозид). Для обоснованности линейной зависимости рассчитывали уравнение регрессии и коэффициент корреляции [3].

Для определения прецизионности (воспроизводимости) методики устанавливали повторяемость, которой достаточно для целей фармацевтического анализа. Этот показатель характеризует степень совпадения результатов индивидуальных испытаний при многократном его использовании. Она выражается величиной стандартного отклонения методики (SD) и доверительным интервалом. Воспроизводимость характеризует надежность анализа в выбранных параметрах метода.

Точность методики свидетельствует о близости результатов единичных определений к истинному значению. Оценку правильности (точности) методики проводили по относительному стандартному отклонению (RSD) и открываемости (К).

Достоверность полученных результатов определяли по критерию Стьюдента с вероятностью 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения геля мы использовали сгущенный экстракт цветков лабазника вязо-листного, содержание которого в парафарма-цевтическом продукте составило 7%. Гель готовили с использованием в качестве основы карбопола 940 с добавлением натрия гидроксида и воды очищенной до 100 мл. Полученный гель представляет собой темнокоричневую массу.

Для стандартизации геля по содержанию суммы флавоноидов мы провели валидацию аналитической методики, количественного определения суммы флавоноидов в геле с экстрактом цветков лабазника вязолистного по следующим показателям: линейность,

прецизионность и точность[2].

Линейность методики устанавливали по результатам определения количественного содержания суммы флавоноидов в 9 образцах геля, приготовленных с различным содержанием в них сгущенного экстракта (от 2,0 до 10,0 г).

Для этого точные навески каждого из 9 образцов геля (около 2,0 г) нагревали на водяной бане с 30 мл спирта этилового 96% для осаждения карбопола. Полученный раствор фильтровали в мерную колбу на 50 мл, фильтр дважды (по 10 мл) промывали спиртом этиловым 96%, фильтрат охлаждали и доводили до метки тем же растворителем (раствор А).

Аликвоты (3 мл) раствора А переносили в мерный цилиндр на 25 мл и доводили до 16 мл 0,05М раствором алюминия (III) хлорида в спирте этиловом 96% (раствор Б). Оптическую плотность полученных растворов регистрировали на спетрофотометре СФ-2000 при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 0,05М раствор алюминия (III) хлорида в спирте этиловом 96%. В табл. 1 представлены найденные экспериментально данные для установления линейности методики определения суммы флавоноидов в геле с экстрактом из цветков лабазника вязолист-ного.

Таблица 1