Способ определения координат изменения структуры клетки по фазовым изображениям
METHOD FOR DETERMINING COORDINATES OF CHANGES IN CELL STRUCTURE BY PHASE IMAGES

Настоящее изобретение относится к области оптико-электронных измерений, а именно, к интерферометрии фазовых динамических объектов, и может быть использовано в биологии и медицине для исследования колебаний формы и показателя преломления живых клеток под воздействием химических и радиационных воздействий, которые определяют её оптическую толщину.
Как известно, для живых клеток характерны два эффекта.
Во-первых, локальные колебания мембраны, называемые также фликкер или динамические флуктуации мембраны, а также изменения внутренней структуры, которые приводят к флуктуации плотности внутри клетки. Несмотря на длительную историю исследования таких колебаний, и многочисленные работы, посвященные их спектральному анализу и моделированию, молекулярные и клеточные механизмы данного явления до сих пор обсуждаются. Важно, что не подвергается сомнению тот факт, что амплитуда фликкера определяется мембраной и зависит от состояния цитоскелета клетки: изменения упругих свойств комплекса мембраны и цитоскелета или формирования локальных изгибов (выступов) мембраны за счет перестройки спектриновой сети (например, отщепления от узлового комплекса одной из нитей спектрина и образования непланарной конфигурации сети). Также при этом возможно анализировать и характер шума, выделяя определенные частоты колебаний и оценивая с их помощью динамические процессы, протекающие в клетках. Данный процесс весьма сложен и требует значительных человеческих и машинных трудозатрат. Понимание происхождения клетки и определение характеристик колебания её мембраны могут дать информацию функционировании эритроцитов при нормальных и патологических состояниях.
Во-вторых, не менее важной задачей является определения изменение плотности внутри клетки, связанные с синтезом и распадом белка, что также приводит к квазипериодическим изменениям фазы, прошедшего через объект волнового фронта. Разделить влияние колебания мембраны и флуктуаций плотности внутри клетки из  оптических измерений практически невозможно, поэтому измеряют изменение оптической толщины клетки, характеризующей обе эти величины, а затем из априорной информации определяют влияние изменения мембраны либо плотности внутри клетки. Для исследования динамики живых клеток используются различные методы, такие как: фазово-контрастная микроскопия, отраженная интерференционная контрастная микроскопия, рассеяние света, техника, основанная на точечной темнопольной микроскопии. Однако эти методы не являются по своей сути количественными с точки зрения абсолютных измерений и не позволяют исследовать распределение мембранных колебаний и флуктуаций показателя преломления внутри клетки.
В последнее время появляются новые методы визуализации, называемые количественная фазовая микроскопия, которая продемонстрировала свою способность обеспечить точную трехмерную визуализацию прозрачных живых клеток. Использование этого метода для исследования временных колебаний мембраны и плотности внутри клетки представляет собой актуальную задачу, решением которой занимаются научные коллективы в различных странах.
Однако, задача выделения из изменения фазы влияния флуктуаций формы мембраны отдельно от изменения плотности внутри клетки остается не решенной, т.е. необходимо определять локальные координаты изменения плотности или формы клетки.
Из уровня техники известен ряд способов исследования колебаний клеточной мембраны либо плотности внутри клетки. Наиболее удобными и популярными являются оптические методы на базе интерференционной микроскопии.
Одним из аналогов заявляемого технического решения является способ, определения колебания плотности внутри клетки, что также приводит к модуляции фазы волнового фронта, реализованный в автоматизированном интерференционном микроскопе «Эйрискан» и разработанный на базе микроинтерферометра МИИ-4 по схеме Линника (Тычинский В. П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов // Успехи физических наук.- 2001.- Т.171.-№6.). В качестве источника освещения использовался He-Ne лазер. Интерференционное изображение регистрируется с помощью координатно-чувствительного фотоприемника - диссектора, который представляет собой электронно-оптический преобразователь с внешним фотоэффектом (без накопления заряда) с фотоэлектронным умножителем и магнитным переносом потока электронов в плоскость диафрагмы с малым отверстием. Для автоматизированной расшифровки интерферограмм реализован компенсационный метод. Модуляция фазы опорного пучка излучения производилась с помощью зеркала с пьезоэлементом. Область сканирования изменялась в пределах 5-50 мкм. Максимальный размер изображения 1024x1024 пикселей. Время ввода одного пикселя - 1 мс. Время захвата всего изображения изменяется от 10с (5×5мкм) - 16мин (50×50мкм). Таким образом, данный микроскоп, имеющий длительное время ввода изображения, позволяет исследовать лишь стационарные фазовые объекты, либо проводить локальные динамические измерения - в нескольких точках для динамических объектов. Основными недостатками данного метода являются: невозможность восстановления изменения внутренней структуры клетки отдельно от колебаний мембраны, для этого необходимо делать различные предположения о динамике клетки, в частности, в данной работе, предполагается изменение показателя преломления. Существенным недостатком является также невозможность компенсации собственных фазовых шумов прибора, из-за локальных измерений фазы только в области объекта.
В качестве еще одного аналога заявляемого способа определения изменения модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки, рассмотрим способ, реализуемый топографическим микроскопом, предназначенным для анализа колебаний мембраны эритроцита и описанный в работе В. Rappaz, et al., Spatial analysis of erythrocyte membrane fluctuations by digital holographic microscopy, Blood Cells Mol. Dis. (2009), doi:10.1016/j.bcmd.2009.01.018. Экспериментальная установка, реализующая данный способ, представляет собой модифицированную конфигурацию интерферометра Маха-Цендера. Свет, прошедший через объект и собираемый объективом, формирует объектную волну, которая пересекается с опорной волной R для получения голограммы, которая регистрируется цифровой камерой. Голограммы записываются в внеосевой геометрии т.е. опорная волна достигает регистратора с небольшим углом падения (угол 1°) относительно направления распространения объектной волны. Процедура реконструкции заключается в численном восстановлении голограммы по цифровому эталону опорного пучка внеосевой геометрии. Такая реконструкция процесса также позволяет исправить аберрацию волнового фронта и восстановить фазу волнового фронта, прошедшего через объект. Для уменьшения шума применяется временное суммирование четырех последовательных изображений, восстановленных с голограмм. Это позволяет частично компенсировать фазовый шум (временной сдвиг, вибрацию и т. д.). Для оценки амплитуды мембранных колебаний фазы определяется стандартное отклонение фазы сигнала в некоторой точке на изображении в течение определенного периода времени регистрации. Недостатки данного метода состоят в следующем: во-первых, по изменениям фазы во времени невозможно определить, вызваны они колебаниями мембраны или флуктуациями показателя преломления внутри клетки (в данной работе предполагается, что изменения вызваны колебаниями мембраны); во-вторых, практически отсутствует компенсация искажений, связанных с фазовыми шумами прибора, что затрудняет возможность установить само наличие изменений фазы, вызванных изменениями структуры клетки.
Наиболее близким аналогом, или прототипом заявляемого способа можно считать следующий способ, описанный в работе «Common-path diffraction optical tomography for investigation of three-dimensional structures and dynamics of biological cells», Youngchan Kim, et al., published 22 Apr 2014 (C) 2014 OSA 5 May 2014 | Vol. 22, No. 9 | DOI:10.1364/OE.22.010389 | OPTICS EXPRESS 10400
В этой работе описан метод оптической дифракционной томографии с использованием цифрового микрозеркального устройства для измерений томограмм показателя преломления внутри клетки. Экспериментальная схема основана на принципах лазерной интерферометрической микроскопии общего пути и оптической дифракционной томографии. Коллимированный лазерный луч сканировался с помощью двухосного гальванометрического зеркала, а затем проецировался на плоскость образца через систему телескопических линз 4-f, состоящую из линзы и конденсора, который представляет собой микрообъектив с большой числовой апертурой. Образец был подготовлен и помещен между двумя покровными стеклами, разделенными тонкой прокладкой из двусторонней ленты. В плоскости образца угол освещения луча можно быстро сканировать под различными углами. Таким образом, образец, который расположен между конденсорной линзой и линзой объектива, последовательно освещается с помощью лазерного луча с плоской волной под определенными углами освещения. Угол падающего луча систематически контролируется вращением двухкоординатного зеркала гальванометра. Затем, после прохождения через образец, дифрагированный луч от образца собирали объективом с высокой числовой апертурой. Направление излучения измеряется с высокой точностью с помощью интерферометрического микроскопа общего пути. Пространственно модулированная объектом голограмма, сформированная под каждым углом освещения последовательно записывается на регистратор изображения, из которого с помощью алгоритма восстановления фазы количественно извлекается изображение оптического поля с информацией как об амплитуде, так и о фазе. Изменяя углы освещения, падающего на образец, измеряют несколько 2D-оптических полей с разными углами освещения, из которых восстанавливаются ЗD-томограммы образца с использованием оптической дифракционной томографии. Синхронизированное угловое сканирование и интерферометрия общего пути точно настроены для совместной работы, что позволяет одновременно измерять 3D-томографию показателя преломления и динамические 2D- флуктуации мембран отдельных биологических клеток. Для измерения двухмерных динамических изображений клетки угол освещения фиксируется перпендикулярно образцу, из которых можно извлекать динамические колебания в мембране эритроцитов.
Недостатком прототипа является то, что при последовательном сканировании невозможно исследовать высокочастотные флуктуации показателя преломления и отличить их от колебаний мембраны.
Таким образом, среди основных недостатков известных из уровня техники аналогов заявляемого способа, применяемых для выделения из изменения фазы влияния флуктуаций формы мембраны отдельно от изменения плотности внутри клетки, можно выделить следующие два:
1. Невозможность разделения факторов воздействия на живую клетку которые приводят к изменению её фазового изображения, а именно: в аналогах при одноракурсном зондировании с одного направления решение о влиянии флуктуаций формы мембраны отдельно от изменения структуры внутри клетки принимается исходя только из априорных биофизических данных и не может быть абсолютно достоверно. В прототипе, определение влияния флуктуаций формы мембраны отдельно от изменения плотности внутри клетки по изменению фазового изображения проводится после реконструкции фазы из интерференционных картин, зарегистрированных в разные моменты времени при последовательном сканировании клетки во времени с различных направлений, что приводит к существенному увеличению времени регистрации одного состояния клетки и не позволяет анализировать высокочастотную динамику клетки.
2. Влияние внешних воздействий на интерференционную картину, таких как вибрация и периодические смещения оптических элементов, которые называют собственным фазовым шумом прибора. Они также искажают измерения изменений собственных колебаний объекта. Особенно эти вибрации существенно сказываются при настройке интерферометра на полосы конечной ширины, что необходимо для применения метода Фурье или восстановления голограмм, как в случае дифракционной томографии, при реконструкции фазы. Это не позволяет достоверно определить причину изменения фазового фронта во времени.
Техническая проблема, решаемая заявляемым изобретением, состоит в устранении указанных недостатков и одновременно в выделении из факторов изменения фазового изображения влияния флуктуаций формы мембраны, отдельно от изменения плотности внутри клетки.
Технический результат, который обеспечивается заявляемым изобретением, заключается в определении изменения положения мембраны и внутренней структуры внутри клетки за счет одновременного многоракурсного зондирования клетки и совместной обработке фазовых изображений двух последовательных кадров.
Заявляемое техническое решение характеризуется следующими существенными отличительными признаками
1. Исследуемую клетку освещают одновременно с нескольких направлений диафрагмированным излучением, что позволяет получать на одном регистраторе несколько интерферограм, которые формируют несколько фазовых изображений клетки под различными углами.
2. Путем совместной обработки отдельных фрагментов фазовых изображений, полученных под различными направлениями освещения клетки, по предложенному алгоритму, определяют координаты области изменения формы и/или изменения показателя преломления внутри неё по глубине (вдоль произвольно выбранного направления).
3. Внешние фазовые шумы прибора компенсируют за счет сравнения (вычитания) распределения функции вдоль оптической оси для двух различных по времени наборов фазовых изображений, при этом область локализации изменений внутри клетки определяют посредством расчета координаты глобального максимума разности двух измерений.
Заявляемый способ определения координат изменения структуры клетки, обусловленного флуктуацией либо формы, либо показателя преломления клетки, по модуляции фазы волнового фронта осуществляется следующим образом (см. Фиг.1). Излучение когерентного источника 1 направляется на светоделитель 2, где делится на два пучка, один из которых проходит через расширитель 3 и направляется на дифракционную решетку 5, которая делит световой пучок на несколько пучков, выходящих из неё под разными углами к оптической оси φ. Оптическая система, состоящая из двух софокусных объективов 6 и 7, формирует световые пучки, освещающие под разными углами к оптической оси φ только ту часть образца, в котором находится исследуемая клетка 9. Второй пучок проходит по опорному каналу, в котором после расширителя 4 попадает на зеркало 10 и затем через зеркало 11 и светоделитель 12 на регистратор 14.
Препарат с исследуемой клеткой 9, помещают в сигнальное плечо интерферометра, освещают лазерным излучением одновременно под разными углами к оптической оси φ таким образом, чтобы область освещения была равна размеру объекта. Для этого на видео изображении препарата выбирают исследуемую клетку и при помощи управляемой диафрагмы 8, выполненной, например, в виде пространственного модулятора света, ограничивают область освещения. Её размер и координаты определяется размером и положением исследуемой клетки. Это необходимо для того, чтобы в области регистрации излучение, прошедшее под различными углами через объект, не перекрывалось.
Оптическое излучение, прошедшее через клетку с различных направлений, проецируют при помощи оптической системы 10 на регистратор 14 таким образом, чтобы изображения, полученные с разных направлений не накладывались друг на друга. На регистратор 14 также направляют опорную волну, которая интерферирует со всеми излучениями, прошедшими через объект с различных направлений.
Получившийся набор интерферограмм формируют в плоскости регистратора 14 и преобразуют его в электрический сигнал, из которого по известному алгоритму восстанавливают набор фазовых изображений клетки, полученных под разными углами. Этот набор фазовых изображений описывается выражением:
где n(x,y,z) - распределение показателя преломления внутри клетки,
р=xcosϕi+zsinϕi,
у - координата параллельная штрихам дифракционной решетки,
z - координата совпадающая с оптической осью системы,
ϕi = углы, под которыми проходят зондирующие пучки через клетку относительно оптической оси системы; ϕ0=0; δ(…) - дельта функция,
ш
ψ - фазовый шум интерферометра.
1
1
1
1
1
ϕi
1
1
1
1
2
1
1
1
1
По фазовому изображению, полученному под углом ϕ0=0, совпадающем с оптической осью, в момент времени t выбирают точку (x, y) на фазовом изображении клетки, в которой определяют изменение структуры клетки, которое может быть обусловлено флуктуаций либо формы, либо показателя преломления, с координатами (z, x, y) и на фазовых изображениях полученными под углами ϕi≠0 выбирают значение фазы с координатами f (р, y), где р=xsinϕi+zcosϕi, и суммируют их, получая функцию f1(z), затем вычисляют сумму фаз с теми же координатами (z, x, y) в момент времени t, получая функцию f2(z), значение z, при котором достигается глобальный экстремум разности f1(z)-f2(z), определяет координату z внутри или на поверхности клетки, в которой происходит изменение. Таким образом, за искомое значение координат, в которых происходит изменения структуры клетки, принимают (x,y,z). Затем определяют изменение во времени суммы фаз, которое зависит только от изменения формы мембраны либо плотности в данной области клетки. Разность фазовых шумов прибора на двух фазовых изображениях в разные моменты времени будет постоянной, и не будет зависеть от координаты z, и таким образом, не скажется на координате глобального максимума.
Для тестирования заявляемого способа было проведено численное моделирование определения координаты неоднородности внутри клетки вдоль направления зондирования z по предложенному способу восстановления при многоракурсном зондировании объекта.
Тест-объект представляет собой двумерный круг с двумя неоднородностями в виде малых кругов внутри него. Значение функции n(x,z) внутри круга постоянно и равно 1. Значение функции n(x,z) внутри неоднородностей также постоянно. Значение функции внутри неоднородностей не замещают значение функции тела объекта, а складываются с ним (и друг с другом). Иными словами, неоднородности 0 означает отсутствие неоднородности, а не пустую дырку в теле объекта.
Параметры модели приведены в Табл. 1
Все единицы условные.
Неоднородность 1 изменяет свое значение между первым и вторым кадрами.
ш
Вычисления производились в два этапа. На первом этапе вычислялись четыре фазовых изображения тестового объекта. Изображения вычислялись под углами φ=-30°, -15°, 15°, 30° при разных фазовых шумах прибора ψ.
На втором этапе производилось восстановление плотности вдоль вертикальной оси z при X=0 по описанному выше алгоритму.
Было рассчитано две модели, отличающиеся плотностью неоднородности 1, как это указано в таблице. Восстановленная плотность для обеих моделей f1(z) и f2(z), приведена на Фиг. 2а.
На Фиг. 2б представлена разность f1(z)-f2(z), координаты экстремума совпадают с координатой z, изменяющейся неоднородности внутри объекта. Смещенная неизменяющаяся неоднородность 2, которая видна на Фиг. 2а, не проявляется на Фиг. 2б.
Хотя настоящее изобретение описано на примере конкретных вариантов его осуществления, для специалистов будут ясны возможности многочисленных модификаций данного изобретения, не выходящие за границы объема его правовой охраны, определяемого прилагаемой формулой.