Протеолитическая активность ферментных препаратов из пилорических придатков лососевых рыб

Известия ТИНРО

2005 Том 140

ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ

УДК 664.951.014:577.17

Т.П.Калиниченко, Л.П.Колмакова

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ПИЛОРИЧЕСКИХ ПРИДАТКОВ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

Исследована протеолитическая активность пилорических придатков кеты, кижуча, нерки и ферментных препаратов, полученных из этого сырья. Установлено, что препараты из пилорических придатков кеты и кижуча близки между собой по рН- (9,0) и температурному оптимуму (50 °С), тогда как препараты из пилорических придатков нерки имеют рН-оптимум 10,0, температурный оптимум — 45 оС. Технологические приемы обработки сырья обеспечивают увеличение удельной протеолитической активности готовых препаратов при всех значениях рН. Показано, что по технологии, разработанной на пилорических придатках кеты, из кижуча и нерки могут быть получены активные ферментные препараты, показатели безопасности которых позволяют применять их при обработке гидро-бионтов.

Kalinichenko T.P., Kolmakova L.P. Proteolytic activity of enzymatic preparations from pyloric caeca of salmon fishes // Izv. TINRO. — 2005. — Vol. 140. — P. 285-290.

Proteolytic activity is investigated of the pyloric caeca tissue from chum salmon, coho salmon, sockeye salmon and enzymatic preparations produced from this raw material. The preparations from pyloric caeca of chum salmon and coho salmon are similar by their рН-optimum (9.0) and temperature optimum (50 оС), whereas the preparations from pyloric caeca of sockeye salmon have рН-optimum 10.0 and temperature optimum 45 оС. Technological methods of raw material processing provide an increasing of specific proteolytic activity of ready preparations under all values of рН. The active enzymatic preparations can be produced from coho salmon and sock-eye salmon by the same technology as has been developed for pyloric caeca of chum salmon. Safety factors of enzymatic preparations allow their applying for processing of hydrobionts.

Применение протеолитических ферментов в настоящее время широко распространено в пищевых производствах (Ксенз, 2002; Pszczola, 2002). Технологические процессы, построенные на принципах биотехнологической модификации сырья с помощью ферментных препаратов, позволяют интенсифицировать традиционные производства, создавать новые безотходные технологии с полным использованием белоксодержащего сырья, улучшать качество и пищевую ценность готовых изделий (Рогов, Жаринов, 1995).

При производстве соленой рыбной продукции применение протеаз способствует не только ускорению процесса расщепления белков и обеспечению изменения структурно-механических свойств мышечной ткани (Блинова, 2001), но и появлению вкуса и аромата созревания (Слуцкая, 1997). Причем для стимулиро-

вания протеолиза рыб предпочтительно использовать препараты протеаз из тканей гидробионтов, поскольку субстратная специфичность их отличается от таковой препаратов, полученных из тканей животных или микробиальным синтезом (Пивненко, 1997). Вследствие этого ферментные препараты, выделенные из панкреатических тканей гидробионтов, не только активнее расщепляют белки рыб, но и обеспечивают формирование таких продуктов протеолиза, которые являются основными компонентами, ответственными за процесс созревания (Слуцкая, 1997). Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется изучению ферментов гидробионтов и установлению способов выделения их с целью получения ферментных препаратов для рыбной промышленности.

Целью исследований данной работы явилось изучение протеолитической активности пилорических придатков кижуча и нерки в сравнении с таковой кеты и установление возможности получения ферментных препаратов из пило-рических придатков этих видов рыб по разработанной в ТИНРО-центре технологии, предусматривающей использование в качестве сырья пилорических придатков кеты.

Объектами исследований служили мороженые пилорические придатки кеты, кижуча, нерки, заготовленные в июле 2003 г. в Беринговом море, хранившиеся при температуре минус 18 оС в течение 3 мес, а также ферментные препараты, полученные из них по ТУ 9283-143-00472012-98. Сырье заготавливали в период нагула лососевых, во время активного питания рыб, в продолжение которого интенсивность биохимических процессов в организме максимальна и панкреатические протеазы наиболее активны (Пивненко, 1987).

Протеолитическую активность определяли по методу Е .Д.Каверзневой (1971) на субстрате казеинат натрия. рН среды 6,0-9,0 создавали, используя фосфатный буфер, рН 10,0-11,0 — используя универсальный буфер. Протеолитичес-кую активность выражали в протеолитических единицах (ПЕ) на 1 г сырья или препарата. Количество общего азота в сырье и ферментных препаратах, азота небелкового определяли на автоматическом анализаторе азота Kjeltec Auto Analyser (Швеция). Подготовку проб проводили по методу Кьельдаля. Количество белкового азота рассчитывали как разницу между азотом общим и азотом небелковым; удельную протеолитическую активность — в протеолитических единицах на 1 г белка.

Расчет средних арифметических значений и среднее квадратичное отклонение, а также оценку выскакивающих вариант проводили в соответствии с рекомендациями по математической обработке результатов (Лакин, 1973).

Протеолитическая активность обнаружена у пилорических придатков лососевых в широком диапазоне рН. Установлено, что максимальную активность ферменты кеты и кижуча проявляют при рН 9,0, тогда как протеазы нерки наиболее активны при рН 10,0 (табл. 1). В пилорических придатках рыб преобладают трипсин- и химотрипсин-подобные ферменты (Пивненко, 1987), однако в сравнении с трипсином быка, проявляющим максимальную активность при рН 8,0 (Мосолов, 1971), протеолитические ферменты пилорических придатков лососевых рыб имеют сдвиг оптимума активности в более щелочную сторону рН. Полученные данные согласуются с результатами, полученными ранее для лососевых, выловленных в устьях рек Камчатки и Сахалина (Пивненко, 1987), а также в других районах промысла (Ushida et al., 1986).

Протеолитическая активность пилорических придатков нерки сравнима с таковой кеты при рН 6,0-9,0 и значительно выше в щелочной среде при рН 10,011,0. Увеличение скорости гидролиза в более высокой зоне рН считается опосредованным отражением отличий структуры молекул ферментов (Пивненко, 1998).

Протеолитическая активность, обнаруженная в пилорических придатках кижуча, как в слабокислой, нейтральной, так и в щелочной среде заметно выше, а при оптимальном значении рН — в 2 раза выше, чем у кеты.

Таблица 1 Протеолитическая активность пилорических придатков лососевых рыб, ПЕ/г

Table 1

Proteolytic activity of salmon fishes pyloric caeca, PU/g

рН

Пилорические придатки кеты кижуча нерки

6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

6,0 ± 0,6 9,1 ± 0,3 15,5 ± 0,6 15,7 ± 0,6 13,7 ± 0,3 12,0 ± 0,4

13,6 ± 0,6 11,3 ± 0,6 23,0 ± 0,4

32.3 ± 1,5

20.4 ± 1,2 17,3 ± 0,5

6,3 ± 0,1 6,1 ± 0,4 14,3 ± 3,7 16,3 ± 0,6 21,3 ± 0,6 20,3 ± 0,6

Активность расщепления белкового субстрата отражает количественное содержание ферментов в панкреатической ткани (Пивненко, 1998). Интенсивность деструкции казеината натрия ферментами пилорических придатков лососевых зависит от вида рыбы. М ак-симальная протеолитическая активность установлена для пилорических придатков кижуча, минимальная — кеты. Наименьшее количество протео-литических ферментов в панкреатической ткани кеты в ряду изученных лососевых рыб отмечали и ранее (Эп-штейн и др., 1982).

Высокая протеолитическая активность пилорических придатков кижуча и нерки позволила предположить, что они могут служить перспективным сырьем для получения ферментных препаратов.

Технология получения ферментных препаратов из пилорических придатков рыб предусматривает стадии освобождения от липидов и балластных белков, а также консервирование препаратов химическими реагентами. Технологический процесс гарантирует высокую удельную активность получаемых препаратов продолжительного срока хранения, показатели безопасности которых позволяют использовать их в пищевой промышленности.

Исследование готовых препаратов позволило установить, что протеолити-ческая активность комплексов протеаз из пилорических придатков кеты практически при всех значениях рН несколько выше, чем в сырье, тогда как активность пилорических придатков кижуча и нерки выше, чем соответствующих готовых препаратов (табл. 2). Однако при этом величина протеолитической активности ферментных препаратов из пилорических придатков кижуча и нерки превышает активность протеаз в препаратах кеты почти при всех значениях рН.

Снижение протеолитической активности в готовых препаратах по сравнению с сырьем не происходило за счет дезактивации ферментов, а являлось следствием перераспределения массовых долей фракций, входящих в препарат. Так, в готовых препаратах массовой доли белковых веществ меньше, чем в сырье, поскольку в них присутствуют консервирующие вещества, составляющие не менее 10 %. Удельная про-теолитическая активность ферментных препаратов убедительно свидетельствует, что протеазы пилорических придатков сохраняют свою активность в процессе технологической обработки при получении ферментных препаратов. Почти при всех значениях рН удельная активность готовых препаратов, полученных из всех видов сырья, приблизительно в 1,5 раза выше, чем в пилорических придатках (рис. 1).

Таким образом, технологические приемы получения ферментных препаратов позволяют частично удалить балластные белки, что и обусловливает значительное увеличение удельной протеолитической активности, а также обеспечи-

Таблица 2 Протеолитическая активность ферментных препаратов, ПЕ/г

Table 2

Proteolytic activity of enzymatic preparations, PU/ g

рН

Ферментные препараты из пилорических придатков

кеты

кижуча

нерки

6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

10,8 ± 0,4

13.1 ± 0,6

14.2 ± 0,1 17,2 ± 0,6 15,5 ± 0,7 14,8 ± 0,9

7,9 ± 0,2 17,5 ± 0,2 18,4 ± 0,4 21,1 ± 0,1

17.2 ± 0,5

17.3 ± 1,4

9,3 ± 0,4 13,6 ± 0,6 14,1 ± 0,1 14,3 ± 0,5

17.3 ± 0,2

16.4 ± 0,4

вают сохранение свойств ферментов сырья, поскольку максимальные значения удельной протеолитической активности ферментных препаратов наблюдаются при тех же значениях рН, что и в пилорических придатках.

«

а -

ъ V

-с

г

и о я s

S г

5й

<

300

250

200

, 150

100

10

11 рн

600

10

11 рн

10

11 рн

Рис. 1. Удельная протеолитическая активность пилорических придатков

Fig. 1. Specific proteolytic activity of pyloric caeca

Проведение процесса ферментирования сырья при обработке гидробионтов в зависимости от разработанной технологии может происходить при различных температурах. Поэтому провели исследование зависимости протеолитической активности полученных ферментных препаратов от температуры в среде, являющейся оптимальной для каждого из них. Установлено, что комплексы ферментов исследованных рыб различаются не только глубиной деструкции субстрата, рН-оптимумами, но и температурой, которая является оптимальной для действия протеаз каждого вида рыбы. Так, ферменты кеты и кижуча имеют температурный оптимум 50 °С, тогда как для протеаз нерки оптимальной является температура 45 оС (рис. 2). Причем активация ферментов при повышении температуры у различных видов происходит также по-разному. Увеличение активности про-теолитических ферментов кеты и кижуча происходит соответственно в 3,4 и 3,9 раза, тогда как протеазы нерки активируются лишь в 2,8 раза. Несмотря на то что изученные рыбы относятся к одному роду — ОпсоАупЛ^, — кета и кижуч более близки между собой, чем с неркой, по особенностям их протеолити-ческих ферментов (оптимум рН, температурный оптимум, увеличение активности ферментной системы при повышении температуры).

-1 2 3

30

35

40

45

50

55

60

Температура, 0С

Рис. 2. Зависимость протеолитической активности ферментных препаратов из пилорических придатков кеты (1), кижуча (2) и нерки (3) от температуры

Fig. 2. Proteolytic activity of enzymatic preparations from pyloric caeca of chum salmon (1), coho salmon (2) and sockeye salmon (3) in dependence on temperature

Исследования показателей безопасности ферментных препаратов из пилорических придатков кижуча и нерки показали, что они не содержат патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а количество колониеобразующих единиц мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов на порядок ниже установленных в нормативных документах, содержание токсичных элементов не превышает допустимых значений.

Таким образом, пилорические придатки кижуча и нерки могут служить сырьем для получения активных ферментных препаратов протеолитического действия по технологии, разработанной на пилорических придатках кеты. Оптимальное значение рН среды для действия препаратов из пилорических придатков кижуча, так же как и кеты, — 9,0, а нерки сдвинуто в более щелочную сторону — 10,0. По температурному оптимуму ферментные препараты из пилорических придатков кеты и кижуча близки между собой, он составляет 50 °С, тогда как температурный оптимум нерки ниже на 5 оС, причем увеличение активности протеаз нерки при повышении температуры до оптимума менее существенно, чем кеты и кижуча. Следовательно, препараты из пилорических при-

датков кеты и кижуча более близки между собой по химическим характеристикам — оптимуму рН и температурному оптимуму.

Высокая протеолитическая активность и показатели безопасности полученных препаратов свидетельствует о том, что они могут быть использованы для стимулирования протеолиза при производстве рыбных продуктов в широком диапазоне рН и температур.

Литература

Блинова А.Ю. Современные тенденции производства соленой продукции // Рыб. хоз-во. — 2001. — № 5. — С. 48-50.

Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназ // Прикл. биохим. и микробиол. — 1971. — Т. 7, вып. 2. — С. 225-228.

Ксенз М.В. Применение протеиназ для повышения усвояемости пищевых белков // Изв. вузов. Пищ. технология. — 2002. — № 1. — С. 52-55.

Лакин Г.Ф. Биометрия. Учебное пособие для университетов и педагогических институтов. — М.: Высш. шк., 1973. — 343 с.

Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. — М.: Наука, 1971. — 414 с.

Пивненко Т.Н. Некоторые особенности панкреатических протеаз тихоокеанских лососей. Сравнительная характеристика трипсинподобной протеазы // Технология гид-робионтов. — Владивосток: ТИНРО, 1987. — С. 54-64.

Пивненко Т.Н. Субстратная специфичность панкреатических сериновых протеи-наз различного происхождения // Изв. ТИНРО. — 1997. — Т. 120. — С. 14-22.

Пивненко Т.Н. Сравнительные исследования панкреатических сериновых проте-иназ гидробионтов Тихого океана: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Владивосток: ТИНРО-центр, 1998. — 40 с.

Рогов И.А., Жаринов А.И. Биотехнология и пищевые продукты // Вопр. питания. — 1995. — № 4. — С. 38-41.

Слуцкая Т.Н. Биохимические аспекты регулирования протеолиза. — Владивосток: ТИНРО-центр, 1997. — 148 с.

ТУ 9283-143-00472012-98 "Протин".

Эпштейн Л.М., Пивненко Т.Н., Кудинов С.А., Колодзейская М.В. Панкреатические протеазы пилорических придатков дальневосточных лососевых // Исследования по технологии рыб, беспозвоночных и водорослей дальневосточных морей. — Владивосток: ТИНРО, 1982. — С. 77-81.

Pszczola D.E. Timely ingredient via fermentatin // Food Technol. — 2002. — Vol. 56, № 2. — C. 52-62.

Ushida N., Anzai Y., Nishide E. Properties of cationic trypsin from the pyloric caeca of Chum salmon // Bull. Jap. Soc. Fish. — 1986. — Vol. 52, № 4. — P. 732-735.

Поступила в редакцию 17.08.04 г.