Использование нуклеотидных последовательностей фрагментов генома плодов и ягод для определения филогенетического родства

УДК 613.26:577

Н.А. Москвина, Л.С. Дышлюк, Ю.В. Голубцова

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ФРАГМЕНТОВ ГЕНОМА ПЛОДОВ И ЯГОД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО РОДСТВА

Показан анализ нуклеотидных последовательностей генома плодово-ягодного сырья. Использованы молекулярно-биологические методы выявления родового сродства. Объектами исследования выбраны вишня/черешня, банан и киви, проведено сравнение нуклеотидной последовательности данных образцов. Представлены качественные характеристики и химический состав исследуемых объектов. Проведен сравнительный анализ последовательностей гомологических генов растительного сырья пищевого назначения: вишни/черешни, банана, киви. Были выбраны последовательности, присутствующие во всех геномах. Выполнен анализ геномов вишни / черешни, были выбраны небольшие последовательности, присутствующие во всех геномах. Проанализировали данные геномов банана, представлено 23 последовательности. Проведен анализ геномов киви, были выбраны 10 последовательностей, имеющих наибольшее сродство. Выстроены филогенетические дендрограммы генов плодово-ягодного сырья. Произвели равнение нуклеотидных последовательностей с помощью программы Word. Определено сходство нуклеотидных последовательностей областей геномов исследуемых объектов. Полученные результаты имеют важное значение для дальнейшей разработки новой методики идентификации плодово-ягодного сырья.

Вишня/черешня, банан, киви, геном, нуклеотидная последовательность, филогенетический анализ.

Следовательно, все вышесказанное говорит о необходимости и возможности решения проблемы фальсификации и идентификации продукции на растительной основе.

Целью настоящего исследования являлось определение филогенетики плодов и ягод путем анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генома плодов и ягод.

Объект и методы исследования

В качестве исследуемого объекта были выбраны нуклеотидные последовательности вишни/черешни, банана, киви.

Вишня (лат. Prunus subg. Cerâsus) - подрод растений рода Слива (Prunus) семейства Розовые (Rosaceae). Подрод Cerasus - плод (костянка) гладкий, без налёта; листья в почкосложении вдоль сложенные; цветки расположены зонтиками, развиваются одновременно с листьями или ранее их. Подрод делят на две секции - Cerasus и Laurocerasus, которые включают более 60 видов.

Плоды вишни имеют кисло-сладкий вкус, в них содержатся органические кислоты (лимонная кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, салициловая кислота), микроэлементы (медь, железо, цинк, йод, марганец, хром, фтор, молибден, бор, ванадий, кобальт, никель, рубидий), макроэлементы (калий, кальций, фосфор, магний), а также пектиновые вещества, сахара, витамины А, С, Е, Вь В2, РР, фолиевая кислота.

Черешня, или Вишня птичья (лат. Prunus avium) - древесное растение из семейства Розовые (Rosaceae), произрастает в диком виде в лесах Украины, южной России, в Крыму, на Кавказе. Плоды черешни имеют приятный вкус и содержат органические кислоты, сахара (фруктозу, глюкозу), витамины C, A, Bi, B2, E, PP, микроэлементы (железо, йод), макроэлементы (калий, кальций, магний и дру-

Введение

Известно, что мякоть плодов и ягод содержит многочисленные витамины, микро-, макроэлементы, другие биологически активные соединения, которые оказывают благотворное воздействие на организм человека. Поэтому большое значение уделяется всеобщему изучению и последующему применению их в качестве сырья при производстве продуктов питания [1].

В настоящее время широко распространена фальсификация продукции, она существует в любой отрасли промышленности. С ростом свободной торговли и частного производства, в том числе плодово-ягодного сырья, готовых продуктов и полуфабрикатов на его основе, увеличивается возможность их фальсификации по структуре и видовой принадлежности за счет использования различных красителей и ароматизаторов. Фальсификация очень выгодна изготовителям соков и плодово-ягодной продукции, в этой связи сегодня актуальна разработка высокоэффективных методов выявления фальсификаций продукции [5, 6]. Постоянное совершенствование методов молекулярной биологии и накопление данных по составу генома плодово-ягодных растений способствовали появлению экспресс-методов идентификации сырья растительного происхождения. На молекулярно-биологических методах основаны способы исследования происхождения и выявление видового сродства, позволяющих провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов. Итак, молекулярногенетический анализ является неотъемлемой частью любого филогенетического исследования [2, 3, 4].

Основа филогенетического исследования - сравнение первичных нуклеотидных последовательностей и последующее представление результатов сравнения.

гие), пектиновые вещества. Плоды также используют для получения соков, компотов, плодового вина, приготовления варенья и джема.

Банан (лат. Músa) - род многолетних травянистых растений семейства Банановые. Съедобные сорта бананов условно делятся на две основные группы: десертные, употребляемые в основном в сыром или сушёном виде, и плантайны (или платано), которые перед употреблением требуют термической обработки. Мякоть десертных сортов очень сладкая на вкус, содержит большое количество углеводов, витамина С, фосфор, железо, калий, кальций и магний.

Киви (лат. Actinidia chinensis) - название плодов культурных сортов растений, принадлежащих к роду Актинидия, родом из Китая, поэтому киви иногда называют «китайским крыжовником». Плод киви -это ягода. Мякоть обычно зелёная или жёлтая. Плоды киви содержат высокое количество калия.

Для выявления степени филогенетического родства между разными видами организмов использовали методы, основанные на сравнение нуклеотидных последовательностей гомологических генов. Данные представлены с помощью дендрограммы -чертежа, который отражает родственные связи между макромолекулами.

Результаты и их обсуждение

Анализ геномов исследуемого плодово-ягодного сырья проводили по базам данных национального центра NCBI США, были выбраны небольшие последовательности, присутствующие во всех геномах. Все выбранные нуклеотидные последовательности представлены в табл. 1.

Таблица 1

Наименование сырья Количество нуклеотидных последователь- ностей Степень сродства по скору, %

Вишня/черешня (Prúnus subg. Cerásus) 25 95

Банан (Músa) 23 95

Киви (Actinidia chinensis) 10 95

Проведен анализ геномов вишни / черешни, были выбраны небольшие последовательности, присутствующие во всех геномах. Полученные данные говорят о том, что для вишни / черешни представлено всего 25 последовательностей, которые имеют наибольшее сродство - 95 % по скору.

Результаты анализа геномов банана свидетельствуют о том, что для банана представлено всего 23 последовательности, которые имеют наибольшее сродство - 95 % по скору.

Проведен анализ геномов киви, были выбраны небольшие последовательности, присутствующие во всех геномах. Для киви представлено всего 10 последовательностей, которые имеют наибольшее сродство - 95 % по скору.

Равнения нуклеотидных последовательностей выполнены в программе Word, результаты филогенетического анализа www.phylogeny.fr представлены на рис. 1.

gL3S43©441_gb_JQ776S33.1 _Pninus_x_.vedoensi5_vaicber_Wen_l 1796

gL120Ü2cJ33_gb_í\l'17V52CI.] J*runus_suhliirtdla_ajllivar_Aulunijli5 gi_ 1 6 22427J_g h_AF411512.1 J*nimi iJnc i üa_var_l(inlaaisi*_51 p4p 12 gLl 3430104_gb_AF3 1S71S. ] _Pnimi s ukca mcisi s_ 18 S _ri basora il_RNA . 12QÜWW gh AFl 7952b. ] J’rumis_mаїігпonicriiJulón iljiantcrib gi_l 2002913_gb_AFI 7950.1 ] J'ninu s_cyc l.i miru_i ni cmaUrans: n hnl L ] 20Q2922_gb_AFl 79512.1 _Pninus_KMgcnlii J -ec_Wm_40 14Jilon lgí_ 1 3430107_gb_All 18721 ] _]*ninus_5cnuljl i_] 8S_ribosamalJtNA_gci lgi_3&43fc5437_gbJQ77(>829.]_l:lniiius_iiipponK'a_Yar._iiippniiicj_Yoiii:li i_b223S563_gb_A YS64S31.1 _Pn.—tJm.-4fii 18S_ribraiijLRNAjcbc gi_l 3430103_gb_Al*'31 S7]7.]_l,runui_crnaiginalii_l 8S_riba»nu)_RNA_gc gi_l 3430115jb_AF318729.1 _Prunus_«rasus_ I SS_ribo«Mial_RNA_gcne

— gi_l 33752992_gb_H '111 OS 1.1 _Ршпш_аУІіші_сиІ1і varj Umg den gjnlcm gi_] 56712501 _cmb_AM5Q38 SS.2_l*nimjs_»viuin_ITS l_p¡irlul_5.8S_rRNA SÍ_31121400S_gb_HQ3321b7.l_l>ruBus_a»,iujn_cullivaiJ4co_ColDnida_l gi_l 3430117_gb_AF318731.1 _3*rumn_pscuil()ccixnis_l BS_iiboiainal_RNA

— gi_l3430123_gb_AF3 18737.1 _Pnimi s_avium_ 1 85_iihosanial_IÍNA_geiG _pj gi_Jl 1214009_gb_HQ3321b8.1_l>njBus_jvimn_cullivji_j\íiibniiies_l8S_ri

gi_í 1ЙЗЙ ftb AFl45J78.1 _l*ninui_pciidula_l._14.cndeni_inLcnaJ_tT gi_5114233_gh_AFl 43531.1 _] “типи 4_hucrgcrij n ijnlcmaljran scribed üL12002935_gb_AF179522.l J^nus.vcrccundajnlcnuljranscribcd

• gi_ 12002917_gb_AFl79506.1 J*mmis_ícvcillcanaJnUanal_spaccr_ I J>

-------------------------------g¡_21539307_gb_A Y1 CQfiH.l J’runusJusiank.M. IAS_nbo™ml_RNA_gc

-------------------------------gi_l 3430! 24_gb_AF318738.1 _Pruius_TiuI¡cosu_ 18S_ribosnnul_RNA_gcn

Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма генов вишни / черешни

Согласно рис. 1, существует один основной кластер (группа двух или больше таксонов или последовательностей ДНК, которая включает как своего общего предка, так и всех его потомков), который обозначим Cluster I, и отдельная нуклеотидная последовательность, которая является первоначальной, каждый кластер делится на меньшие кластеры. Всего Cluster I делится на 42 кластера. Кроме этого, филогенетическое дерево имеет 24 узла. Представленный анализ отражает родственные связи родов вишни/черешни.

Для построения филогенетической дендрограммы генов банана провели равнение нуклеотидных последовательностей в программе Word, результаты www.phylogeny.fr отразили на рис. 2.

Рис. 2. Начало. Филогенетическая дендрограмма генов банана

SL2lJl3WSl_gbJ:I428086.1_Musa_sianKftsis_l!iS_ribi«iimiilJiNA_sene gi_23958+246_g b _l •'] 62&J77.1 _М u 5 а_і.л mpe? lrvs_ і nle rn iljransc ribcd

gi_213 B6972_g b_l:Л 28097-1 _М їв а_ biin ks іі_ l8S_itxHomal_RNA _ртіс_р

Q.S4

I 0.86

I gi.312284030_cmbJR727939.1_Мша_ЛВВ_Спшр_Ш I _5.8S_rRNA_gc ncj OjugiJ 12284019_cmb_IH727928. LMwiUKuminaLi_AAA_Gr«ip JIS I _5.8S_r Д.!еПеі 213! 3696+_gbJ;J+2S089.1 Musa ucumiiuti subsp. zcbriiu ISS.rti IgiJ Ш84Ш7_ешЬ_ЛІ727^Мб.І_Миія_ЛАТ_Оіоіір_П'51 _5.8S jRNA^enej

fii_2! JI 36963_gb_lrI428088.1 _Muu_5chLmcarp»_ 18S_ribceorml_RN A_gc p_3! 2284056_emb_lH727965. IJVIusi_h vb rid_cullivar_I I S I _5.8S_rKNA

. £i_213I36970_gbj'1428095. LMusi_yu»nancnsis_ 18S_rihosonul_R.NA_£c

— gi_2l3 l36968_gbJ;J428M3.l_Mus!Lnibine4_18S_rihHoraaLRNA_icnc_p

— gi_213136965 _gbJ;J+28090- LMuiajura»lkci_ l8S_ribcKoiTHLRNA_gc»

£ L2395S4247_£bJ 'J626J7 8.1 .Muujaipii wj_ ini с пкіІ_ іпла гіЬс(1_ і

Si_2395S424ljb_l;J626372.l_Miisa_blciila_i»lcrnaljrjnscribcdjip gj_2! 3136966_gb_l'J428TO I. l_Musu_nuimii_ 185_ribcFonHl_KN A_jcic_pi giJI2283989.anb_Hi727898.LMusajexlifejrsl3.8S_iRNA_i«cjMi

• gi_213136967_gbJ'J42SG92.1 _Musa_vdiH ii a_ 18S_ribosamaLRNA_£ciK gi_23958+25 l_gb_l;J6263S2 І_Мівп_опиІа_іп1епиІ_Ігаіи:гіЬсЛ_іріс gi_312284008_«rb_FR7279l7J_MiBa_x_par»disiiKa_rrSI_5.8S_iRVA_gc I gi_2l313Й95б_дЬ_П428№ I .l_Musi_nibta_ 18S_iibo5omal_RN A_gcnc_par —І|І_2І313б955^Ь_П428№&.1_Мійимса_І85_пЬо50шІ_КМ,\_8спс_раг --------------------gi_2! 3136959_gbJ J428084.1 _Mwa_acumnjla_subip._siamfj_ 18S_rtw

j— fii £3—fi‘-2; I— gU

каждый кластер делится, в свою очередь, на меньшие кластеры.Всего Cluster I делится на 8 кластеров и Cluster II - также на 8 кластеров. Кроме того, филогенетическое дерево имеет 8 узлов. Представленный анализ отражает родственные связи выше приведенных родов киви.

0.62

Рис. 2. Окончание. Филогенетическая дендрограмма генов банана

Анализ полученных данных показал, что существует один основной кластер, которые обозначим Cluster I, и отдельная нуклеотидная последовательность, которая является первоначальной, каждый кластер делиться на меньшие кластеры. Всего Cluster I делится на 40 кластеров. Представленное филогенетическое дерево имеет 20 узлов. Данный анализ отражает родственные связи выше приведенных родов банана.

Для построения филогенетической дендрограммы провели равнение нуклеотидных последовательностей генов киви в программе Word, филогенетический анализ www.phylogeny.fr, результаты которого отражены на рис. 3.

Как видно из рис. 3, существуют два основных кластера, которые обозначим Cluster I и Cluster II,

¡gi_3341I846_cjnb_.'\J5.V>479.1_Aclinidia_laliJ’olia_patlial_iuilothond gi_3341i852_cmb_AI536482.1_Aclinidia_cliini;ii&is_pailiiil_milochond gi_3J4l 1850_CTnb_AJ536481. l_Acliridia_ar£uLi_t'ar._purpurca_parlia gi_334ll848_cmb_AI536480.1_Aclmidia_dclk’i(isa_varJclicis_pirt gi_334llH44_cmb_AJ53M7S.l_Aclmidia polygama partial luiiudiondr

Igi_443609874_gb_KC408111.L,'\cLinidia_crianlha_clonc_6]_NADlLdcJiy gi_443609876_gb_KC40S 112. l_Aciinidia_crianlha_clonc_62_NADILdchy gL443ifl9872_gb_KC,4QSllC.I_Aclmidia_argula_dontf_60_NADH_ddiydr gi_443609852_gb_KC40S100.l_i\clinidia_ehinensis_dotic_50_NADiLtleh gL443609850_gb_KC40S(B4.l_,\ciinidia_chinensis_donc_49_NADH_(leh

Рис. 3. Филогенетическая дендрограмма генов киви

Выводы

Для установления филогенетического родства растительного сырья пищевого назначения: вишни/черешни, банана и киви, провели сравнение нуклеотидных последовательностей их генов. По данным анализа нуклеотидного состава исследуемых генов обнаружили сходство нуклеотидных последовательностей геномов исследуемого сырья. Полученные результаты имеют весомое значение для разработки новой методики идентификации плодово-ягодного сырья и продуктов на их основе.

Список литературы

1. Левкис, З. Инновационные подходы в переработке плодов и ягод / З. Левкис, Л. Павловская // Наука и инновации. -2012. - № 6. - С. 20-21.

2. Лукашов, В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ / В.В. Лукашов. - М.: Бином, 2009. - 256 с.

3. Методы ДНК-технологии для идентификации растительного сырья в молочных продуктах / А.Ю. Просеков,

О.В. Мудрикова, А.В. Булавина, А.Н. Архипов // Молочная промышленность. - 2011. - № 12. - С. 62-63.

4. Просеков, А.Ю. Использование тест-систем в молочной промышленности / А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных // Молочная промышленность. - 2009. - № 11. - С. 70-72.

5. Тимофеева, В.А. Товароведение продовольственных товаров: учебник / В.А. Тимофеева. - изд. 6-е, перераб. и доп. - Ростов н/Д: Феникс, 2006.- 363 с.

6. Чепурна, И.П. Идентификация и фальсификация продовольственных товаров: учебник / И.П. Чепурна. - М.: Дашков и К°, 2007. - 448 с.

ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт

пищевой промышленности», 650056, Россия, г. Кемерово, б-р Строителей, 47.

Тел/факс: +7 (3842) 73-40-40, е-таП: office@kemtipp.ru

SUMMARY

N.A. Moskvina, L.S. Dyshlyuk, Yu.V. Golubtsova

USE OF NUCLEOTIDE SEQUENCES OF FRUIT AND BERRY GENOME FRAGMENTS TO DETERMINE PHYLOGENETIC RELATIONSHIP

The analysis of the nucleotide sequences of the genome of fruit and berry raw materials is given. Molecular-biological methods of identifying generic affinity are used. The objects of study were cherry/ sweet cherry, banana, kiwi. The comparison of the nucleotide sequences of samples was carried out. Qualitative characteristics and chemical composition of the studied objects are presented. A comparative analysis of homologous genes sequences of plant raw materials such as cherry/sweet cherry, banana, kiwi was carried out. The sequences present in all genomes were selected. The analysis of cherry /sweet cherry genomes was carried out, and small sequences present in all genomes were selected. The data on the banana genomes was analyzed, 23 sequences being presented. The analysis of kiwi genomes were fulfilled and 10 sequences having the greatest affinity were selected. Phylogenetic dendogram of fruit and berry raw material genes were built. The alignment of nucleotide sequences using the Word program was done. The similarity of the nucleotide sequences of the genome areas of the studied objects was determined. The results obtained are important for further development of new methodology in the identification of fruit and berry raw materials.

__________Cherry/sweet cherry, banana, kiwi, genome, nucleotide sequence, phylogenetic analysis._______________________________

REFERENCES

1. Levkis Z., Pavlovskaia L. Innovatsionnye podkhody v pererabotke plodov i iagod [Innovative approaches in the processing of fruits and berries]. Science and innovation, 2012, no. 6, pp. 20-21.

2. Lukashov V.V. Molekuliarnaia evoliutsiia i filogeneticheskii analiz [Molecular evolution and phylogenetic analysis of]. Moscow, Binom, 2009. 256 p.

3. Prosekov A.Yu., Mudrikova O.V., Bulavina A.V., Arkhipov A.N. Metody DNK- tekhnologii dlia identifikatsii rastitel'no-go syr'ia v molochnykh produktakh [The methods of the DNA technologies for the vegetable raw materials identification in milk products]. Dairy Industry, 2011, no. 12, pp. 62-63.

4. Prosekov A.Yu., Korotkaya E.V., Bespomestnykh K.V. Ispol'zovanie test - sistem v molochnoi promyshlennosti [Application of test systems in the dairy sector]. Dairy Industry, 2009, no. 11, pp. 70-72.

5. Timofeeva V.A. Tovarovedenie prodovol’stvennykh tovarov [Commodity food products]. Rostov-on-Don, Publ. Phoenix, 2006. 363 p.

6. Chepurna I.P. Identifikatsiia i fal'sifikatsiia prodovol'stvennykh tovarov [Identification and falsification of food products], Moskow, Dashkov and Ko, 2007. 448 p.

Kemerovo Institute of Food Science and Technology, 47, Boulevard Stroiteley, Kemerovo, 650056 Russia.

Phone/fax: +7 (3842) 73-40-40, e-mail: office@kemtipp.ru

ffama nocmynrnmn: 26.06.2014

_ _