Способ грануляции пироугля с иммобилизованными микроорганизмами и гранулы, полученные указанным способом
METHOD FOR GRANULATION OF BIOCHAR WITH IMMOBILIZED MICROORGANISMS AND GRANULES OBTAINED BY SAID METHOD

Заявленное техническое решение относится в целом к сельскому хозяйству, более точно - к биотехнологии, в частности, к способу получению гранулированного удобрения, предназначенного для упрощения внесения сельскохозяйственных удобрений посредством применения стандартной техники. Более детально заявленное техническое решение относится к способу изготовления гранул из удобрений с иммобилизованным на нем консорциуме почвенных микроорганизмов прямым гранулированием.
Далее заявителем представлены термины, используемые в заявленном материале:
Пироуголь - продукт, богатый углеродом, полученный из биомассы (древесина, помет, растительные остатки и т.д.) путем пиролиза (термическое разложение органических материалов в отсутствии кислорода); классифицируется в зависимости от исходной биомассы и параметров пиролиза (температуры, длительности, режима пиролиза); применяется в качестве удобрения, источника углерода, сорбента для тяжелых металлов и т.п. [Biochar for Environmental Management: Science and Technology / J. Lehmann and S. Joseph - Earthscan - 2009.] [1].
Пресс-гранулятор - устройство для изготовления гранул из материалов различного происхождения, используется в химической, строительной, сельскохозяйственной, пищевой и других областях промышленности. Пресс-гранулятор содержит корпус, перфорированную цилиндрическую матрицу, два прессующих ролика и, по меньшей мере, один привод. Прессующие ролики имеют механизм регулирования зазора между матрицей и роликами [Патент RU 375188]. Подготовленная сырьевая масса направляется в узлы прессования, в которых происходит продавливание ее сквозь матрицу, диаметр отверстий которой придает диаметр гранулам. Готовые гранулы обрезаются специальными ножами и направляются для сушки, фасовки и хранения.
Консорциум микроорганизмов - это совокупность или ассоциация двух или более микроорганизмов, в это понятие входят и такие формы сообществ микроорганизмов, как ассоциация и смешанная культура [Международный кодекс номенклатуры бактерий/ Москва: Наука - 1978.] [2].
Плотность - величина, определяемая для однородного вещества его массой в единице объема. Средняя плотность неоднородного тела также есть отношение массы тела к занимаемому этим телом к объему [Физическая энциклопедия. В 5-ти томах./ Главный редактор А. М. Прохоров. - Москва: Советская энциклопедия. - 1988.][3]. В контексте данной заявки далее по тексту под плотностью подразумевается средняя плотность.
Влажность - это содержание влаги в твердом теле (пористом или набухающем), порошке. Абсолютная влажность - отношение массы жидкости к массе сухой части материала. Относительная влажность - отношение массы жидкости к массе влажного материала [Большой энциклопедический политехнический словарь/ Ред. А.Ю Ишлинский. - Москва: Наука. - 2004.] [4]. В контексте данной заявки далее по тексту под влажностью подразумевается абсолютная влажность материала.
50
50
Токсичность - свойство вещества или организма оказывать вредное воздействие на другие организмы или токсикометрический показатель, вычисляемый как величина, обратная абсолютному значению среднесмертельной дозы (l/DL) или концентрации (l/CL) [Экологический энциклопедический словарь. / И.И. Дедю - Кишинев: Главная редакция Молдавской советской энциклопедии. - 1989.] [5]. В контексте данной заявки далее по тексту под токсичностью подразумевается токсикометрический показатель с указанием типа организмов, в отношении которых данный показатель был определен.
Биогенные элементы - 1) химические элементы, постоянно входящие в состав организмов и выполняющие жизненно необходимые биологические функции (углерод, фосфор, азот, калий, кислород и др.); 2) вещества, возникающие в результате распада мертвых организмов; 3) растворенные в воде соли, необходимые растениям и автотрофным бактериям для поддержания жизнедеятельности [Экологический энциклопедический словарь. / И.И. Дедю - Кишинев: Главная редакция Молдавской советской энциклопедии. - 1989.] [5].
Содержание основных биогенных элементов - в контексте данной заявки далее по тексту под основными биогенными элементами подразумевается углерод, азот, калий и фосфор, соответственно, содержание каждого элемента определяется как отношение массы этого элемента к массе всего материала.
Иммобилизация (инокуляция) - связывание клеток микроорганизмов с поверхностью твердого нерастворимого носителя за счет физико-химических процессов (адсорбция, ковалентное связывание) [Биотехнология. / Под ред. А.А. Баева. - М. - 1984.] [6].
Далее заявителем приведено описание проблемы, на решение которой направлено заявленное техническое решение.
В связи с активным применением пироугля с иммобилизованными микроорганизмами или консорциумом микроорганизмов в качестве удобрения для сельскохозяйственных культур [Lehmann J. et al. Biochar effects on soil biota-a review // Soil biology and biochemistry. - 2011. - Т. 43. - №.9. - С. 1812-1836.] [7] существует проблема разработки способа гранулирования данного типа удобрений, т.к. хранение, транспортировка до места внесения и, собственно, внесения в почву порошкооборазного пироугля, связано с большими потерями удобрения, например, унос ветром, неравномерность внесения и т.д., что приводит его низкой технологичностью при использовании по назначению.
Технические решения, выявленные заявителем на дату подачи заявочных материалов, не обеспечивают выживаемость иммобилизованных микроорганизмов или консорциума микроорганизмов, нанесенных на гранулированный пироуголь, сохранение содержания основных биогенных элементов в составе гранулированного пироугля, пор и их распределения гранулированного пироугля на надлежащем уровне.
Выявленные технические решения не удовлетворяют указанным требованиям из-за особенностей технологического процесса получения гранул (высокие температуры получения гранул, агрессивные по отношению к иммобилизованным микроорганизмам пластификаторы и т.п.) и технологических свойств пироугля (низкая плотность, высокая слеживаемость и т.п.), используемого в качестве матрицы для иммобилизации микроорганизмов и их консорциумов.
Пироугль, изготовленный на основе биомассы различного происхождения, включая пометы домашней птицы и скота, зарекомендовал себя в качестве удобрения пролонгированного действия, агента, обеспечивающего секвестирование углерода, сорбента для тяжелых  металлов и т.п. [Biochar for Environmental Management: Science and Technology / J. Lehmann and S. Joseph - Earthscan - 2009.][1]. Внесение пироугля как удобрения приводит к существенному увеличению урожайности целого ряда сельскохозяйственных культур, благодаря высокому содержанию углерода и азота, что обеспечивает питание растений, и высокой гигроскопичности и пористой структуре пироугля, что улучшает газообмен и водный обмен почв [Biochar for Environmental Management: Science and Technology / J. Lehmann and S. Joseph - Earthscan - 2009.][1]. Также производство удобрений из пироугля способствует решению проблемы хранения и переработки отходов сельского хозяйства, животноводства, деревообрабатывающей, пищевой промышленности и пр.
Для улучшения качества получаемых удобрений на основе пироугля в последнее время применяется стратегия нанесения на пироуголь микроорганизмов, способствующих разложению биогенных элементов, суппрессивных бактерий в отношении фитопатогенных бактерий и грибов [Chen B., Yuan M., Qian L. Enhanced bioremediation of PAH-contaminated soil by immobilized bacteria with plant residue and biochar as carriers/ Journal of Soils and Sediments. - 2012. - V. 12(9). - P. 1350-1359.] [8]. При этом актуальной задачей является обеспечение выживаемости полезных микроорганизмов на пироугле, и затем в почве. Основным фактором, способствующим выживанию микроорганизмов на пироугле, является доступность биогенных элементов, предпочтительно углерода, азота, калия и фосфора в водорастворимой форме. При этом наличие макропор на поверхности пироугля обеспечивает необходимую влажность, газообмен, например, снабжение кислородом, что важно для аэробных микроорганизмов. Кроме этого, адсорбция микроорганизмов в порах повышает конкурентную способность вносимых организмов по сравнению с «аборигенными» почвенными микроорганизмами из-за обеспечения локальных благоприятных условий и разделения сферы потребления при внесении удобрений в почву [Sun D., Hale L., Crowley D. Nutrient supplementation of pinewood biochar for use as a bacterial inoculum carrier / Biology and Fertility of Soils.. - 2016. - V. 52., Issue 4. - P. 515-522.][9].
На дату подачи заявленных материалов существует различные эффективные способы нанесения микроорганизмов на твердую матрицу, в том числе пироуголь [Патент US 2017/0174578 A1]. Большинство таких методик предполагают нанесение отдельных микроорганизмов либо их консорциумов на порошкообразную твердую матрицу, либо на уже готовые пеллеты или гранулы. При этом оба способа либо в полной мере не решают проблемы с обеспечением выживаемости микроорганизмов и их консорциумов, либо не обеспечивают технологичность конечного продукта - удобрения с микроорганизмами.
Стратегия производства гранул или пеллет из матрицы, с последующим нанесением культуры микроорганизмов имеет следующие ограничения - нанесение микроорганизмов в жидком виде, например, при помощи распыления, не позволяет обеспечить однородность распределения микроорганизмов по грануле и создать условия для проникновения их в поровое пространство матрицы, что понижает эффективность выживаемость микроорганизмов, особенно при хранении и внесении в почву.
Также стандартные методы гранулирования предполагают использование пластификаторов на основе ПВА, поливинилового клея, щелочи, ПАВов и т.п. Наличие в матрице подобных пластификаторов либо их следов пагубно сказывается на выживаемости микроорганизмов. К тому же после нанесения на гранулы культуры из микроорганизмов требуется сушка для обеспечения необходимого для хранения уровня гигроскопичности материала. Зачастую сушка осуществляется при температурах более 60-80°С, что может привести к гибели вносимых микроорганизмов [Патент US 2017/0174578 A1].
Аналогичные трудности имеются и при гранулировании твердой порошкообразной матрицы с нанесенными микроорганизмами или их консорциумом - это высокие температуры, применяемые при гранулировании, и «агрессивные» по отношению к микроорганизмам пластификаторы.
На дату предоставления заявочных материалов выполнены исследования уровня техники и выявлено, что известные технические решения не позволяют получать гранулированный пироуголь с иммобилизированным консорциумом микрорганизмов, обладающий следующими базовыми техническими и технологическими характеристиками: наличие макропор и их распределение, содержание основных биогенных элементов, низкая токсичность, свойственное исходному пироуглю, заданная численность микроорганизмов в составе консорциума.
Заявителю также не удалось выявить технические решения, содержащие описание прямого гранулирования с помощью стандартного пресс-гранулятора, позволяющего обеспечить выживание консорциума микроорганизмов на пироугле, изготовленного преимущественно из помета домашней птицы, в частности, куриного помета.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту CN 102050644 A «Способ получения гранулированного биоорганического удобрения». Сущностью является способ получения гранулированного биоорганического удобрения, включающий приготовление микробного агента, отличающийся тем, что способ включает следующие стадии: (1) получение жидкого микробного агента, то есть ферментационной жидкости: ферментацию микробных бактерий, используемых в поле для удобрения с использованием ферментационного устройства. Производство, получение ферментационного бульона, где общие эффективные жизнеспособные бактерии в ферментационном бульоне достигают 2-6 миллиардов/грамм; (2) гранулирование: жидкая жидкость аминокислот плюс органическое сырье распыляются и гранулируются с образованием органических гранул, так что массовое соотношение органического вещества в органических гранулах составляет более 25%; (3) инокуляция аминокислотной органической гранулы: добавление органических гранул в непрерывный и однородный поток материала, добавление ферментационной жидкости, полученной на стадии (1), к распылению, а затем сушку на воздухе до получения готового биоорганического удобрения; ферментационная жидкость добавляется в количестве от 0,5% до 1,5% от общей массы готового биоорганического удобрения. 2. Способ получения биоорганического удобрения в виде частиц по п. 1, в котором микробный штамм для использования в поле для удобрения выбирают из группы, состоящей из Bacillus subtilis, Bacillus megaterium и капсулоподобных спор, один или несколько Bacillus mucilagimosus krassilm. 3. Способ получения биоорганического удобрения в виде частиц по п. 1, в котором органическое вещество выбрано из одного или двух из торфа и/или гуминовой кислоты. 4. Способ получения биоорганического удобрения в виде частиц по п. 1, в котором жидкая аминокислота является побочным продуктом процесса получения глутаминовой кислоты и глутамата натрия. 5. Способ получения биоорганического удобрения в виде частиц по п. 1, в котором мешалка на стадии (3) представляет собой диск или барабан. 6. Способ получения биоорганического удобрения в виде частиц по п. 1, в котором имеется компонент стадии (3), в который спрей добавляется в ферментационную жидкость, представляет собой плунжерный насос. Способ получения гранулированного биоорганического удобрения по п. 1, в котором к стадии (2) добавляется один или несколько из следующих материалов на стадии грануляции распылением: азотное удобрение, фосфатное удобрение, калийное удобрение и микроэлементы.
2
Недостатком известного технического решения является низкая пористость органической матрицы, т.к. в качестве матрицы использована смесь органических кислот, которая не обладает пористой структурой, характерной для пироугля из куриного помета (пироуголь из куриного помета содержит макропоры 5-10 μм, при этом удельная площадь поверхности макропор составляет от 1-12 м/г), что сказывается на выживаемости иммобилизованных микроорганизмов, поскольку при прочих равных условиях наличие пор в матрице локально - на поверхности матрицы - приводит к увеличению влажности, улучшению газообмена, а также нивелированию внешних негативных факторов (высыхания, температуры, облучения и т.д.), что создает благоприятные условия для выживания микроорганизмов. Более высокая сложность технологического процесса гранулирования методом распыления по сравнению с прямым гранулированием на стандартном пресс-грануляторе, ведет к повышению себестоимости удобрения, и, как следствие, ограничивает его широкое применения. Гранулы, получаемые известным способом, обладают неустановленной токсичностью, также не определено наличие макропор в матрице гранул.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту RU 2130005 «Способ получения биоудобрения». Сущностью является способ получения биоудобрения, включающий приготовление микробной биомассы и иммобилизацию биомассы на органическом носителе, отличающийся тем, что в качестве органического носителя используется сухой гранулированный куриный помет.
Более детально - сущность способа заключается в том, что штамм или сообщество микроорганизмов стерильно культивируют на питательной среде до достижения титра бактериальной массы 108-109 кл/мл. Полученную биомассу отделяют от среды, концентрируют. Концентрированную биомассу наносят на высушенный гранулированный куриный помет. Иммобилизованную таким образом биомассу высушивают. Данный способ обеспечивает повышение выживаемости микроорганизмов и повышение биологической активности почвы.
Недостатком является использование в качестве матрицы для консорциума микроорганизмов сухого куриного помета, не обладающего высокой пористостью, низкой токсичностью и содержанием основных биогенных элементов, характерных для пироугля из куриного помета. В качестве биомассы применяется один штамм Azotobacter crhoococcum, соответственно, предлагаемое решение не позволяет решить проблему выживаемость консорциума микроорганизмов. Способ нанесения микроорганизмов на гранулы носителя не позволяет контролировать количество наносимой биомассы и однородность ее распределения на носителе. Гранулы, получаемые известным способом, обладают неустановленной токсичностью, не определена численность микроорганизмов в составе консорциума, так как в известном способе наносится один тип микроорганизмов, а также не указано наличие макропор в матрице гранул.
Известно изобретение по патенту RU 2099315 «Способ получения комплексного удобрения с биоактивной массой», выбранное заявителем в качестве прототипа, совпадающее с заявленным техническим решением совокупностью совпадающих признаков и назначением. Сущностью является способ, предусматривающий тонкое измельчение бурого угля и смешивание его с биоактивной добавкой, предлагается после измельчения бурый уголь обрабатывать водным раствором щелочи, затем последовательно смешать его с минеральным удобрением и биоактивной добавкой, в качестве последней использовать водную суспензию отходов дрожжевой, молочной и/или сахарной промышленности, а полученную смесь формовать в гранулы и сушить. При этом рекомендуется использовать водный раствор KOH, на стадии формования добавлять пластификатор, обработку щелочью и смешивание компонентов вести при 20-25°C, а сушку гранул - при 60-80°C. В качестве пластификатора возможно использование раствора аммиачной селитры и мочевины в количестве до 2 масс. % от общей массы удобрения.
Недостатком является отсутствие возможности выживания всех видов иммобилизованных бактерий в силу того, что перед нанесением биоактивных добавок (массы) остатки щелочи их дезактивируют. Кроме того, последующее повышение температуры при сушке приводит к неконтролируемой выживаемости микроорганизмов не идентифицированного состава. В гранулах, получаемых известным способом, не определена численность микроорганизмов в составе консорциума, не определено наличие макропор в матрице гранул, а также не приведены данные по токсичности гранул.
Основной задачей заявленного технического решения является разработка способа гранулирования удобрений из пироугля с предварительно нанесенным на него консорциумом микроорганизмов и получения гранул с заявленными характеристиками. Указанная задача решена заявителем благодаря выбору оптимального пластификатора, оптимальной влажности обрабатываемого материала и приемлемого метода гранулирования посредством применения стандартного пресс-гранулятора.
В качестве пластификатора в заявленном техническом решении выбран кремнезоль, который характеризуется низким токсическим действием в отношении микроорганизмов, растений и т.д., при этом позволяет получать гранулы, препятствующие слеживанию удобрения, обеспечивает технологичность хранения и возможность внесения удобрения при помощи стандартной сельскохозяйственной техники.
В свою очередь, влажность гранулируемого удобрения в заявленном способе составляет около 50%, в сочетании с методом прямого пресс-гранулирования такая влажность позволяет обеспечить температуру гранулирования в пределах 40±10°С.
Таким образом, низкая температура гранулирования, высокая влажность материала и нетоксичность пластификатора в выбранной заявителем совокупности позволяет обеспечить выживаемость консорциума микроорганизмов. Заявленный способ не предполагает существенного изменения исходных свойств пироугля, а именно размера и распределения пор материала, содержания биогенных элементов, сохранения низкой токсичности и обеспечивает получение гранул с заявленными характеристиками.
Заявленное техническое решение по сравнению с аналогами, позиционируемыми на рынке, должно иметь следующие преимущества:
- гранулировать пироуголь из отходов сельского хозяйства с использованием стандартного пресс-гранулятора;
- сохранять длительное время содержание основных биогенных элементов, низкую токсичность, гигроскопичность, размер и распределение пор, свойственное исходному пироуглю во время хранения, перевозки, а также исключает слеживание гранулированного удобрения;
- обеспечить выживаемость консорциума микроорганизмов на гранулированном пироугле;
- получить гранулы с заявленной токсичностью, содержанием основных биогенных элементов, численностью микроорганизмов в составе консорциума, наличием макропор и требуемой удельной площадью поверхности макропор.
Техническим результатом заявленного технического решения является способ получения гранулированного пироугля преимущественно из куриного помета с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов. Заявленное техническое решение по сравнению с прототипом, реализуется путем прямого гранулирования с помощью стандартного пресс-гранулятора с учетом условий, необходимых для выживания консорциума микроорганизмов на пироугле преимущественно из куриного помета.
Условия выживания выбранного консорциума микроорганизмов в рамках заявленного технического решения реализованы благодаря совокупности низкотемпературного режима гранулирования (40±10°С) и применения в качестве пластификатора Кремнезоля (гидрозоль диоксида кремния) «ЛЭЙКСИЛ» 40-AL, выпускаемый по ТУ 2145-012-61801487-2014 ООО «Научно-технический центр «КОМПАС» (ООО «НТЦ «КОМПАС»), не обладающего бактерицидным или токсичным действием по отношению к микроорганизмам или растениям.
Заявленный способ гранулирования, в отличие от выявленных из исследованного заявителем уровня техники аналогов, обеспечивает возможность:
- гранулировать пироуголь с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов с использованием стандартного пресс-гранулятора;
- сохранить пористую структуру материала и содержание основных биогенных элементов, свойственное исходному пироуглю;
- обеспечить выживаемость консорциума микроорганизмов на пироугле, в процессе хранения после изготовления, в процессе транспортировки до места складирования, до внесения и после внесения его в почву;
- обеспечить низкую токсичность гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов;
- исключить слеживаемость удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов;
- повысить технологичность внесения гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов посредствам стандартной сельскохозяйственной техники;
- увеличить всхожесть, морфометрические характеристики сельскохозяйственных культур в результате внесения гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов;
- увеличить урожайность сельскохозяйственных культур в результате внесения гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов с возможностью пролонгированного действия не менее 2-х лет;
- получить гранулы с заявленной токсичностью, содержанием основных биогенных элементов, численностью микроорганизмов в составе консорциума, наличием макропор и требуемой удельной площадью поверхности макропор.
Принимая во внимание плотность, сыпучесть и другие технологические свойства пироугля, полученного методом низкотемпературного, медленного (slow) - пиролиза [Biochar for Environmental Management: Science and Technology / J. Lehmann and S. Joseph - Earthscan - 2009.][1], заявленный способ грануляции может найти применение и для материалов с близкими технологическими свойствами, разработанного заявителем предпочтительно для пироугля, полученного на основе преимущественно помета домашней птицы.
При этом следует акцентировать внимание на том, что заявленное техническое решение является заключительным этапом единой технологии, представляющей собой технологическую цепочку от процесса получения пироугля, нанесения на него консорциума микроорганизмов и последующую его (пироугля) грануляцию.
2
10
Сущностью заявленного технического решения является способ грануляции пироугля из помета домашней птицы с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов, характеризующийся тем, что в гранулятор подают пироуголь в количестве 1 кг с влажностью до 5%, со средним линейным размером частиц пироугля не более 2 мм ± 0,5 мм, добавляют на 1 кг пироугля с иммобилизованными микроорганизмами 500 мл пластификатора, представляющего собой водный раствор Кремнезоля «ЛЭЙКСИЛ» 40-AL в соотношении кремнезоль : вода = 4:1, затем выполняют процесс гранулирования при температуре 40°С ± 10°С и атмосферном давлении с получением целевого продукта в виде гранул с размером 4 мм, далее выполняют сушку гранул при комнатной температуре в течение 2 часов. Гранулы пироугля, полученные способом по п. 1, имеющие размер макропор не менее 5 μм, удельную площадь поверхности не менее 10 м/кг, токсичность (Кр) в отношении P. caudatum не более 5 и D. magna не более 20, содержание по сухому веществу углерода не менее 40% вес., азота не менее 3,5% вес., фосфора не менее 1,5% вес., калия не менее 4% вес.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг. 8.
На Фиг. 1. приведена диаграмма, на которой проиллюстрирована выживаемость микроорганизмов A. zeae, B. megaterium, P. putida и P. Fluorescens в составе консорциума, иммобилизированного на исходном и гранулированном пироугле.
На Фиг. 2 приведены микрофотографии микроорганизмов на поверхности исходного и гранулированного пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов, полученные методом сканирующей электронной микроскопии:
2А - микрофотографии исходного пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов,
2Б - микрофотографии гранулированного пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов;
На Фиг. 3 приведены микрофотографии пористой структуры исходного и гранулированного пироугля, полученные методом сканирующей электронной микроскопии:
3А - микрофотографии исходного пироугля,
3Б - микрофотографии гранулированного пироугля;
На Фиг. 4 приведено содержание основных биогенных элементов исходного пироугля и гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов.
На Фиг. 5 приведены данные по токсичности исходного пироугля, гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов и куриного помета. В качестве тест-объектов были использованы P. caudatum и D. magna.
На Фиг. 6 приведены данные о биомассе растений (пшеница) и содержание в листьях хлорофила при внесении гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов в рамках мелкоделяночного эксперимента.
На Фиг. 7 представлены диаграммы, на которых приведены длина стебля и урожайность растений (пшеница) при внесении гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов в рамках мелкоделяночного эксперимента, где:
7А - длина стебля пшеницы,
7Б - урожайность пшеницы;
На Фиг. 8 приведены фотографии исходного и гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов непосредственно после изготовления и через месяц хранения при комнатной температуре и относительной влажности 50%.
8А - фотографии гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов непосредственно после изготовления,
8Б - фотографии гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов через месяц хранения;
8В - фотографии исходного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов непосредственно после изготовления,
8Г - фотографии исходного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов через месяц хранения.
Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом:
- Берут пироуголь в количестве 1 кг с влажностью до 5%, предпочтительно из помета домашней птицы, в основном куриного помета, с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов со средним линейным размером частиц пироугля не более 2 мм ± 0,5 мм.
- Берут пластификатор (водный раствор Кремнезоля «ЛЭЙКСИЛ» 40-AL в соотношении Кремнезоль : вода = 4:1) в количестве 500 мл.
- Добавляют на 1 кг пироугля с иммобилизованными микроорганизмами 500 мл пластификатора.
- Выполняют процесс гранулирования (например, c помощью бытового гранулятора ZLPS 120B) при температуре 40°С ± 10°С и атмосферном давлении в соответствии с инструкцией гранулятора, для чего исходные материалы подают в гранулятор с получением целевого продукта - гранул с размером 4 мм со следующими характеристиками:
5
- численность каждого типа микроорганизмов в составе консорциума не менее 10 копий генов/г,
- размер макропор не менее 5 μм,
2
- удельная площадь поверхности не менее 10 м/кг,
10
- токсичность (Кр) в отношении P. caudatum не более 5 и D. magna не более 20,
- содержание по сухому веществу углерода не менее 40% вес., азота не менее 3,5% вес., фосфора не менее 1,5% вес., калия не менее 4% вес.
- Просушивают гранулы при комнатной температуре в течении 2 часов.
В результате осуществления заявленного технического решения заявителем получен гранулированный пироуголь с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов с заявленными характеристиками.
Далее заявителем приведены примеры конкретного выполнения заявленного технического решения.
Пример 1. Оценка выживаемости микроорганизмов на гранулированном пироугле с иммобилизованными консорциумом микроорганизмов
Для проверки эффективности иммобилизации из гранулированного пироугля с иммобилизованными на нем клетками микроорганизмов экстрагируют тотальную ДНК с использованием соответствующего набора реактивов. В полученном образце ДНК определяют количество микроорганизмов с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Для определения количества копий генов индивидуальных бактерий выделяют тотальную ДНК соответствующими китами согласно инструкции производителя. Для определения числа копий генов для каждой культуры используют соответствующие праймеры: Azospirillum zeae (5'-GACGATCCGTAGCTGGTCTG-3' и 5'-TCACGCTACCGTCATCATCG-3'), Bacillus megaterium (5'-CTGCGGGAGGATCAGCTAAG-3' и 5'-TCGTCACCAATACCCGTTCC-3'), Pseudomonas fluorescens (5'-TGATYGTGTCCAACCTGCTGCTGGC 3' и 5'-GAAVAGGCTGTCGAGCAA-3'’) и Pseudomonas putida (5'-CTGCTGCCCGACAACCAC-3' и 5'-TCACGAACTCCAGCAGGAC-3’). Амплификацию в реальном времени проводят на DNA Engine OPTICON 2 (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA) в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1-20 нг ДНК.
6
6
5
5
Как можно видеть из диаграммы на Фиг. 1, при выбранном методе иммобилизации (Патент US 20170174578 A1) в исходном (порошкообразном) пироугле численность микроорганизмов в составе консорциума составила 1,06⋅10 копий генов/г для A. zeae, 1,26⋅10 копий генов/г для B. megaterium,, 1,15⋅10 копий генов/г для P. putida, 3,51⋅10 копий генов/г для P. fluorescens.
6
6
5
5
После проведения гранулирования заявленным способом численность микроорганизмов в составе консорциума составила 0,92⋅10 копий генов/г для A. zeae, 1,12⋅10 копий генов/г для B. megaterium, 1,03⋅10 копий генов/г для P. putida, 3,12⋅10 копий генов/г для P. fluorescens.
Полученные значения численности микроорганизмов в составе консорциума на гранулированном пироугле отличаются от аналогичных значений для исходного пироугля в пределах 11-15%, что позволяет утверждать, что заявленный метод грануляции не снижает выживаемость микроорганизмов в составе консорциума в пределах ошибки измерений.
Данные о выживаемости микроорганизмов на гранулированном пироугле, полученные методами молекулярной биологии, были подтверждены с помощью электронной сканирующей микроскопии образцов исходного (Фиг. 2А.) и гранулированного пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов (Фиг. 2Б). Видно (Фиг. 2), что на поверхности обоих образцов обнаружены скопления бактериальных клеток, предпочтительно в углублениях и порах.
Полученные данные позволяют утверждать, что заявленный метод грануляции пироугля с иммобилизованными микроорганизмами позволяет обеспечить выживаемость консорциума, при этом численность микроорганизмов на гранулированном пироугле сравнима с аналогичным параметром для исходного пироугля.
Пример 2. Оценка пористой структуры исходного и гранулированного пироугля.
При заявленном методе гранулирования удобрений из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов сохраняется пористая структура матрицы. Как можно видеть из Фиг. 3., размер и характер распределения пор в исходном пироугле (Фиг. 3А.) и в составе гранулированного удобрения существенно не отличается (Фиг. 3Б.) - средний размер макропор составляет 5-10 μм, сохраняется форма и распределение пор по поверхности материала.
Пример 3. Исследование содержания основных биогенных элементов исходного и гранулированного пироугля с иммобилизованными микроорганизмами
Для определения влияния способа грануляции пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов было измерено содержание основных биогенных элементов в исходном пироугле и в гранулированном пироугле, полученном заявленным способом.
Как можно видеть из Фиг. 4., в результате гранулирования содержание углерода, азота, калия и фосфора в составе удобрения снижается не более чем на 5-10%, что подтверждает сохранение содержания основных биогенных элементов в гранулированном пироугле по сравнению с исходным.
Пример 4. Исследование токсичности гранулированного пироугля с иммобилизованными микроорганизмами.
Были проведены исследования влияния заявленного способа грануляции на токсонометрический параметр на дафниях и парамециях (P. caudatum и D. magna).
Из Фиг. 5. можно видеть, что значения токсичности для гранулированного и исходного пироугля существенно не отличаются. Отметим, что значение токсичности и для гранулированного и исходного пироугля значительно ниже, чем токсичность куриного помета, используемого в качестве контроля в данном исследовании.
Пример 5. Исследования биомассы, содержания хлорофила и урожайности сельскохозяйственных растений при внесении в качестве удобрения гранулированного пироугля с иммобилизованными микроорганизмами.
В рамках мелкоделяночного эксперимента исследовалось влияние гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов на рост и урожайность сельскохозяйственных культур. В качестве параметров роста сельскохозяйственных культур, в данном случае на примере злаковой культуры - пшеницы, были выбраны биомасса растений, длина стебля и содержание хлорофила.
Как можно видеть из Фиг. 6 и Фиг. 7, внесение гранулированного удобрения с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов увеличивает все параметры роста растений (Фиг. 6., Фиг. 7А) по сравнению с контролем.
Также внесение гранулированного удобрения с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов приводит к повышению урожайности пшеницы не менее, чем на 20% (Фиг. 7Б). При этом эффект от внесения гранулированного удобрения с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов оказывается не хуже, чем эффект от внесения исходного пироугля в той же дозе (30 т/га) (см. Фиг. 7Б).
Пример 6. Оценка слеживаемости гранулированного и исходного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов.
Для определения степени слеживаемости исходного и гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов была исследована доля слежавшегося удобрения, расфасованного в стандартные полипропиленовые мешки (25 л), обоих типов при хранении его при комнатной температуре (около 20°С) и относительной влажности около 50% в течение месяца.
Как можно видеть (Фиг. 8), доля слежавшегося удобрения в случае исходного пироугля достигает 25-30% вес., для грануллированного удобрения - 2-5%. Очевидно, что слеживаемость гранулированного удобрения оказывается существенно ниже, что повышает технологичность хранения гранулированного удобрения по сравнению с исходным пироуглем.
7. Технологичность внесения гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов.
Для определения технологичности внесения гранулированного пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов был проанализирован парк сельскохозяйственной техники в Лаишевском районе Республики Татарстан. На момент подачи заявки выявлено, что большинство разбрасывателей удобрений минеральных (РУМ), например, Амазон, РИТ и т.п., предназначены для внесения гранулированных и пеллетируемых удобрений. Таким образом, для широкого практического применения необходимо, чтобы производимое удобрение было гранулированным, что говорит о том, что заявленное техническое решение позволяет повысить технологичность внесения пироугля с иммобилизированным консорциумом микроорганизмов с учетом существующего уровня техники.
Из изложенного выше можно сделать вывод, что заявителем решены поставленные задачи и достигнут заявленный технический результат, а именно - разработан способ получения гранулированного пироугля из куриного помета с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов. Заявленное техническое решение, по сравнению с прототипом, реализовано путем прямого гранулирования с помощью стандартного пресс-гранулятора с учетом условий, необходимых для выживания консорциума микроорганизмов на пироугле. Условия выживания консорциума - низкотемпературный режим (40±10°С) и применение в качестве пластификатора Кремнезоля (гидрозоль диоксида кремния) «ЛЭЙКСИЛ» 40-AL, не обладающего бактерицидным или токсичным действием по отношению к микроорганизмам или растениям.
Заявленный способ гранулирования позволил, в отличие от приведенных выше аналогов, обеспечить возможность:
- гранулировать пироуголь с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов с использованием стандартного пресс-гранулятора;
- сохранить пористую структуру материала и содержание основных биогенных элементов, свойственное исходному пироуглю;
- обеспечить выживаемость консорциума микроорганизмов на пироугле, в процессе хранения после изготовления, в процессе транспортировки до места складирования, до внесения и после внесения его в почву;
- обеспечить низкую токсичность гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов;
- исключить слеживаемость удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов;
- повысить технологичность внесения гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов посредствам стандартной сельскохозяйственной техники;
- увеличить всхожесть, морфометрические характеристики сельскохозяйственных культур в результате внесения гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов;
- увеличить урожайность сельскохозяйственных культур в результате внесения гранулированного удобрения из пироугля с иммобилизованным консорциумом микроорганизмов с возможностью пролонгированного действия не менее 2-х лет;
- получить гранулы с заявленной токсичностью, содержанием основных биогенных элементов, численностью микроорганизмов в составе консорциума, наличием макропор и требуемой удельной площадью поверхности макропор.
Заявленный способ грануляции применим для материалов с близкими технологическими свойства, предпочтительно для пироугля, полученного на основе помета домашней птицы, в первую очередь куриного подстилочного помета.
Заявленное техническое решение является элементом единой технологии от получения пироугля, до нанесения на него консорциума микроорганизмов и его грануляцию.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, представленным в независимом пункте формулы изобретения, включая характеристику назначения, при достижении более высоких, по сравнению с прототипом, технических результатов.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. может быть реализовано в промышленных масштабах для гранулирования пироугля из помета домашней птицы с иммобилизованном на нем консорциумом микроорганизмов, причем - посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.
Перечень использованных источников
1. Biochar for Environmental Management: Science and Technology / J. Lehmann and S. Joseph - Earthscan - 2009.
2. Международный кодекс номенклатуры бактерий/ Москва: Наука - 1978.
3. Физическая энциклопедия. В 5-ти томах. / Главный редактор А.М. Прохоров. - Москва: Советская энциклопедия. - 1988.
4. Большой энциклопедический политехнический словарь/ Ред. А.Ю Ишлинский. - Москва: Наука. - 2004.
5. Экологический энциклопедический словарь. / И.И. Дедю - Кишинев: Главная редакция Молдавской советской энциклопедии. - 1989.
6. Биотехнология. / Под ред. А.А. Баева. - М. - 1984.
7. Lehmann J. et al. Biochar effects on soil biota-a review // Soil biology and biochemistry. - 2011. - Т. 43. - №. 9. - С. 1812-1836.
8. Chen B., Yuan M., Qian L. Enhanced bioremediation of PAH-contaminated soil by immobilized bacteria with plant residue and biochar as carriers/ Journal of Soils and Sediments. - 2012. - V. 12(9). - P. 1350-1359.
9. Sun D., Hale L., Crowley D. Nutrient supplementation of pinewood biochar for use as a bacterial inoculum carrier / Biology and Fertility of Soils. - 2016. - V. 52., Issue 4. - P. 515-522.