Способ прогнозирования риска развития новообразований слизистой оболочки полости рта у лиц старше 40 лет
METHOD OF PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING NEW GROWTHS OF ORAL MUCOSA IN PATIENTS AGED OVER 40 YEARS

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкостоматологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития новообразований слизистой оболочки полости рта (СОПР), ассоциированных с вирусами, обладающими онкогенным потенциалом, на этапе донозологической диагностики.
Вирусная теория канцерогенеза является сегодня одной из общепризнанных и подтверждает, что ряд вирусов при определенных условиях способны влиять на генетический аппарат клеток и способствовать их злокачественной трансформации, т.е. обладают онкогенным потенциалом. До 20% всех онкологических заболеваний человека ассоциированы с инфекционными агентами, прежде всего вирусами, а также бактериями и паразитами [11, 17, 18, 19].
За последние десятилетия получено множество новых данных о значении ряда вирусов в развитии опухолей различной локализации: вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР) в развитии рака шейки матки и рака кожи гениталий; вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в этиологии африканской лимфомы Беркитта и назофарингеальной карциномы [4, 6, 7].
В настоящее время доказано, что ВПЧ ВКР являются этиологическим фактором орофарингеальных карцином, которые в 25% ассоциированы с ВПЧ ВКР. В одном из последних исследований, среди пациентов с плоскоклеточным раком языка, ДНК ВПЧ ВКР в ткани опухоли была выявлена в 26,2% [8, 9, 10].
Онкогенным потенциалом обладают и представители семейства герпесвирусов: ВЭБ, цитомегаловирус (ЦМВ), вирусы простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ 1, 2), вирус герпеса 6 типа (ГВЧ 6). При проведении молекулярно-генетического исследования при плоскоклеточной карциноме глотки и ротоглотки в 57,7% была обнаружена ДНК ВЭБ [5, 13].
Потенциальная опасность онкогенной трансформации клеток увеличивается при наличии коинфекции и выявлении ассоциаций из двух и более вирусов, обладающих онкогенным потенциалом [1]. При проведении молекулярно-генетического исследования образцов ткани плоскоклеточных карцином глотки и ротоглотки у 80 польских пациентов в 30% случаев были выявлены ассоциации различных представителей герпесвирусов и наиболее часто ВЭБ и ВПЧ ВКР [13].
В 2013-15 гг. на базе молекулярно-диагностической лаборатории КДЛ КДЦ ТГМА нами проведено молекулярно-генетическое исследование ткани доброкачественных (фибромы, папилломы) и злокачественных опухолей (плоскоклеточный рак) слизистой оболочки полости рта (СОПР). В 68,9% случаев в ткани опухолей выявлена ДНК ВЭБ, ЦМВ, ВПГ, ГВЧ 6 типа, ВПЧ ВКР и их ассоциации. В 100% случаев из ткани злокачественных новообразований СОПР выделена ДНК различных вирусов, обладающих онкогенным потенциалом, что достоверно выше (р<0,05), чем в доброкачественных, где ДНК вирусов выявлена в 62,5% случаев. Кроме того, показано достоверное расширение спектра вирусов с онкогенным потенциалом в ткани злокачественных опухолей. По результатам нашего исследования вирус обнаруживается как в опухолевой ткани, так и в слюне до 85% больных со злокачественными опухолями СОПР. При исследовании биоптатов не пораженных опухолью участков СОПР ДНК вирусов не обнаружена [2, 3, 12].
Следует также отметить, что рак СОПР - это мультифакториальное заболевание, ведущим фактором риска которого является употребление табака и табачных продуктов. Многолетние эпидемиологические исследования выявили наличие положительной корреляции между длительностью экспозиции табачного дыма и развитием многих соматических и онкологических заболеваний, в том числе рака СОПР. Сочетание хотя бы двух факторов риска имеет синергический эффект, увеличивая риск развития рака СОПР до 30 раз [2, 14, 15, 16].
Стоит отметить, что исследование на выявление ДНК ВПЧ ВКР широко применяется в гинекологической практике и вместе с вакцинацией привели к заметному снижению заболеваемости раком шейки матки. В стоматологической практике подобные исследования достаточно редки. Определение инфицированности ВПЧ ВКР проводится преимущественно в онкологических диспансерах или научно-исследовательских институтах при поступлении больных с уже диагностированной злокачественной опухолью СОПР или ротоглотки, тогда как на этапе обычного стоматологического осмотра лиц, имеющих факторы риска, наличие в ротовой жидкости ДНК вирусов с онкогенным потенциалом не оценивается. Также следует отметить, что у больных раком полости рта исследуют в основном только инфицированность ВПЧ ВКР, оставляя без внимания другие вирусы, обладающие онкогенным потенциалом, особенно ВЭБ и ГВЧ 6 типа.
Описано множество различных способов прогнозирования течения уже имеющегося у пациента злокачественного процесса различных локализаций, либо способов прогнозирования метастазирования опухоли после ее хирургического или других видов лечения.
Известен «Способ прогнозирования рака шейки матки при доброкачественных и предраковых процессах шейки матки у женщин репродуктивного возраста» (патент РФ №2466392), включающий в себя определение клинических факторов риска развития рака шейки матки, в том числе наличия ВПЧ высокого канцерогенного риска, а также метилирования генов MLH1, HIC1, RASSF1A, MGMT, N33, CDH1 в биоптате шейки матки и расчет коэффициента вероятности развития рака шейки матки р. При величине р>0,6 прогнозируют высокую вероятность риска развития рака шейки матки, при р=0,3-0,59, прогнозируют умеренную вероятность риска развития рака шейки матки, при р<0,29 прогнозируют низкую вероятность риска развития рака шейки матки. Недостатками способа являются невозможность прогнозирования риска развития первичного рака шейки матки у практически здоровых пациенток, а также низкая доступность и высокая стоимость определения метилирования генов MLH1, HIC1, RASSF1A, MGMT, N33, CDH1, необходимость выполнять для этого инвазивное вмешательство (биопсию шейки матки).
Известен способ оценки и прогнозирования факторов риска злокачественных новообразований гортани (патент РФ №2246894), включающий медико-генетическое обследование пациента и дополнительное исследование ряда факторов, включая возраст, длительность курения, стаж работы в условиях профессиональной вредности, регулярность употребления алкоголя, экологические факторы, срок проживания в загрязненном районе. Данные показатели оцениваются в баллах, затем вычисляют коэффициент прогнозирования по разработанной формуле. Недостатком представленного метода является его трудоемкость, временная и экономическая затратность при прогнозировании факторов риска только злокачественных новообразований гортани. Способ требует проведения объемных диагностических процедур, параметры полученных данных нуждаются в соответствующих измерениях и стандартизованной оценке, что ограничивает применение способа в практической медицине.
9
Известен способ прогнозирования риска развития злокачественных новообразований (патент РФ №2552305), при котором в периферической крови человека определяют абсолютное содержание естественных киллеров (CD16+ лимфоцитов) и концентрацию растворимого рецептора апоптоза (sAPO-1). При содержании CD16+ более 0,5×10 кл/л и концентрации sAPO-1 более 4000 пг/мл прогнозируют риск развития злокачественных новообразований. Для осуществления метода производят забор крови из локтевой вены в объеме 1 мл в 9-10 часов утра, натощак. Методом микроскопирования изучается содержание лимфоцитов в мазках крови, окрашенных по методу Романовского-Гимзе. Фенотип лимфоцитов (CD16+) определяется непрямой иммунопероксидазной реакцией с использованием моноклональных антител. Количественное определение растворимого рецептора Fas-sAPO-1 в сыворотке крови проводится методом «конкурентного» иммуноферментного анализа в микропланшетном формате. Метод трудоемкий, требует наличия специального оборудования, подготовленного лабораторного персонала и является инвазивным, поскольку производится забор крови.
Наиболее близким к заявленному авторами способу является «Способ прогнозирования рака молочной железы» (патент РФ №2336822). Способ позволяет прогнозировать развитие рака молочной железы на этапе лабораторного обследования и может применяться в ранней диагностике рака молочной железы. Для этого определяют прогностические коэффициенты (ПК) по 9 различным клиническим и лабораторным показателям, включая показатели клинического анализа крови. Например, для скорости оседания эритроцитов прогностический коэффициент может принимать значения от -1 до +7 единиц, а для возраста пациента от -10 до +4 единиц. Далее все прогностические коэффициенты суммируются. При сумме ПК от (-54,5) до (-21,5) прогнозируют низкую вероятность рака молочной железы, при сумме от (-21) до (+11) - среднюю вероятность, а при сумме от (+11) до (+44,5) высокую вероятность рака молочной железы. Недостатком метода является проведение инвазивного исследования - забора крови у пациента, определение риска рака другой локализации, отличной от СОПР.
При изучении научно-технической патентной информации идентичная совокупность существенных признаков, заявленная в изобретении, позволяющих прогнозировать первичное возникновение опухолей СОПР, нами не обнаружено.
Заявляемый способ решает задачу прогнозирования риска развития новообразований СОПР у пациентов в возрасте старше 40 лет на этапе донозологической диагностики, что позволит сформировать группы риска и определить врачебную тактику, включая мероприятия по элиминации вирусов.
Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является определение степени риска развития новообразований СОПР в зависимости от количества и спектра вирусов, обладающих онкогенным потенциалом, обнаруживаемых в ротовой жидкости у пациентов с длительным стажем курения.
В ходе проведенного комплексного обследования пациентов с доброкачественными и злокачественными новообразованиями СОПР установлено, что ассоциации из трех и более вирусов с онкогенным потенциалом были характерны исключительно для лиц со злокачественными опухолями СОПР. Кроме того, количество вирусов в ротовой жидкости у больных со злокачественными опухолями СОПР достоверно превышает эти показатели при доброкачественных (р<0,05), что подтверждает этиологическую роль вирусов в развитии новообразований СОПР и позволяет прогнозировать риск развития новообразований данной локализации с использованием молекулярно-генетического анализа ротовой жидкости на наличие вирусов с онкогенным потенциалом на фоне длительного стажа курения.
Осуществление. Ротовая жидкость собирается в стерильные одноразовые пластиковые пробирки с реагентом для транспортировки и хранения клинического материала «Транспортная среда с муколитиком», утвержденным ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.
Процедура взятия и хранения клинического материала проводилась в соответствии с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПНР-диагностики» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, М., 2008 г. Ротовую жидкость доставляли в молекулярно-генетическую лабораторию в течение суток. Далее в лаборатории проводили исследование ротовой жидкости методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для амплификации нуклеиновых кислот использовали комплекты реагентов "АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-скрин-FL» (набор реагентов для амплификации ДНК вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса и вируса герпеса человека 6 типа), "АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL" и «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-FL" (набор реагентов для амплификации генотипирования ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов), «АмплиСенс HSV-typing-FL» (набор реагентов для амплификации ДНК вирусов простого герпеса и генотипирования 1 и 2 типов) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и амплификатор AppliedBioSystem.
В ротовой жидкости пациентов определялись вирусы: Эпштейн-Барра, цитомегаловирус, вирус герпеса 6 типа, вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, ВПЧ высокого канцерогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов.
На основании спектра и количества выявленных вирусов и наличия или отсутствия в анамнезе длительного стажа курения (10 лет и более) нами были выделены три степени риска развития новообразований СОПР: низкая, средняя, высокая.
При выявлении одного и более ВПЧ ВКР, в связи с высоким канцерогенным потенциалом, независимо от стажа курения, пациента сразу относили к группе с высокой степенью риска.
Во всех остальных случаях определение риска осуществлялось в соответствии с Таблицей 1.
Для низкой степени риска характерно присутствие только одного из факторов риска: либо одного из вирусов с онкогенным потенциалом, либо длительного стажа курения (10 лет и более) в анамнезе.
Для средней степени риска характерно присутствие сразу двух факторов риска: одного вируса с онкогенным потенциалом и курения, либо двух вирусов с онкогенным потенциалом.
Высокая степень риска отмечается у пациентов с наличием ассоциации двух выявленных вирусов и курением, либо трех и более вирусов, независимо от стажа курения.
Новыми, ранее не известными признаками заявленного способа прогнозирования риска развития новообразований СОПР по наличию ассоциаций вирусов с онкогенным потенциалом и длительному стажу курения являются:
1) скрининговая оценка риска развития новообразований полости рта по наличию в ротовой жидкости ассоциаций вирусов, обладающих онкогенным потенциалом;
2) описаны качественные и количественные параметры для оценки значения ассоциаций вирусов и их взаимосвязь со стажем курения, что может быть использовано на этапе донозологической диагностики при проведении диспансеризации с последующим формированием групп риска и прогнозирования развития доброкачественных и злокачественных новообразований.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1. У здоровой женщины, 52 лет, некурящей, при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования ни одного из вышеперечисленных вирусов не обнаружено. В данном случае оценить вероятность развития онкопатологии невозможно.
Пример 2. У здорового мужчины, 40 лет, стаж курения 12 лет, при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования ни одного из вышеперечисленных вирусов не обнаружено. Такого пациента можно отнести к группе с низким риском развития опухолей полости рта в связи с наличием одного фактора риска (длительное курение), дать общие рекомендации по гигиене полости рта и рекомендовать отказ от курения.
Пример 3. У здоровой женщины, 58 лет, некурящей, при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования выявлена ДНК вируса Эпштейна-Барр. Такая пациентка относится к группе с низким риском развития опухолей полости рта в связи с наличием одного фактора риска (ДНК вируса, обладающего онкогенным потенциалом), дать общие рекомендации по гигиене полости рта, назначить курс местной противовирусной терапии, направленной на элиминацию вируса, повторное молекулярно-генетическое исследование ротовой жидкости через 1 год.
Пример 4. У женщины 45 лет, со стажем курения 20 лет, здоровой при профилактическом осмотре, был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования обнаружен вирус Эпштейна-Барр. Такую пациентку можно отнести к группе со средним риском развития опухолей полости рта. Рекомендовано: противовирусная терапия, отказ от курения, диспансерное наблюдение не реже 1 раза в год.
Пример 5. У женщины 68 лет, некурящей, здоровой при профилактическом осмотре, был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования обнаружены вирус Эпштейна-Барр и вирус герпеса 6 типа. Такую пациентку можно отнести к группе со средним риском развития опухолей полости рта. Рекомендовано: противовирусная терапия, диспансерное наблюдение не реже 1 раза в год.
Пример 6. У мужчины, возраст 71 год, стаж курения 25 лет, здорового при профилактическом осмотре, был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования обнаружены вирус Эпштейна-Барр и вирус герпеса 6 типа. Пациент относится к группе с высоким риском развития опухолей полости рта. Рекомендовано: противовирусная терапия, отказ от курения, диспансерное наблюдение не реже 1 раза в год.
Пример 7. У мужчины 62 лет, курящего 17 лет, здорового при профилактическом осмотре, был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования обнаружена ассоциация вируса папилломы человека 56 типа и вируса герпеса 6 типа. Данного пациента можно отнести к категории с высоким риском развития опухолей СОПР. Рекомендовано: противовирусная терапия, отказ от курения, диспансерное наблюдение 2 раз в год.
Пример 8. У мужчины 69 лет, некурящего, здорового при профилактическом осмотре, был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования обнаружена ассоциация вируса папилломы человека 16 и 18 типа. Данного пациента можно отнести к категории с высоким риском развития опухолей СОПР. Рекомендовано: противовирусная терапия, диспансерное наблюдение 2 раз в год.
Выявление низкого, среднего и высокого риска развития опухолей СОПР требует различного подхода при проведении диспансеризации с последующим назначением коррекционных профилактических мероприятий, включающих отказ от курения, местная и общая противовирусная терапия, направленная на элиминацию вирусов под контролем молекулярно-генетического исследования ротовой жидкости, мероприятия, направленные на повышение локальной и системной иммунной резистентности, укрепление организма в целом.
При сравнении высокого риска развития новообразований по отношении к среднему и низкому риску были получены следующие операционные характеристики: чувствительность 100% при 95% ДИ 88,65 до 100%, специфичность 100% при 95% ДИ 83,89 до 100% (Win PEPI. 11,61 DESCRIBE Version 3.07 J.H. Abramson, 2016).
Список литературы
1. Барышев В.В., Андреев В.Г., Попутчиев В.В. Современные аспекты изучения респираторного папилломатоза. Сибирский онкологический журнал. Томск, 2009, №5(35), С. 67-72.
2. Богатов В.В., Червинец В.М., Самоукина A.M., Лебедев С.Н., Насонова М.В. Роль вирусов с онкогенным потенциалом и их ассоциаций в генезе новообразований челюстно-лицевой области. Стоматология, 2015, Т. 94, №1, С. 23-24.
3. Насонова М.В. Новообразования полости рта и их ассоциация с вирусами, обладающими онкогенным потенциалом среди населения Тверской области. Вестник РГМУ, 2015, вып. 2, С. 772-771.
4. Ai-Di Gu, Mu-Sheng Zeng. The Criteria to Confirm the Role of Epstein-Barr Virus in Nasopharyngeal Carcinoma Initiation. Int. J. Mol. Sci., 2012, 13(10), P. 13737-13747.
5. Alibek K., Kakpenova A., Baiken Y. Role of infectious agents in the carcinogenesis of brain and head and neck cancers. Infect Agent Cancer., 2013, 8(1):7.
6. Doorbar J., Egawa N., Griffin H., Kranjec C., Murakami I. Human papillomavirus molecular biology and disease association. Rev. Med. Virol., 2015, 25(1), P. 2-23.
7. Epstein M.A., Achong B.G., Barr Y.M. Virus particles in cultured lympho-blasts from Burkitt's lymphoma. Lancet, 1964, 1, P. 702-703.
8. Fakhry C., Gillison M.L. Clinical implications of human papillomavirus in head and neck cancers. J. Clin. Oncol., 2006, 24(17), P. 2606-11.
9. Garcia-de Marcos J.A., Perez-Zafrilla В., Arriaga A., Arroyo-Rodrigez S., Poblet E. Human papillomavirus in carcinomas of the tongue: clinical and prognostic implications. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., 2014, 43(3), P. 274-80.
10. Gillison M.L., Koch W.M., Capone R.B., Spafford M., Westra W.H., Wu L, Zahurak M.L., Daniel R.W., Viglione M., Symer D.E., Shah K.V., Sidransky D. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J. Natl. Cancer. Inst., 2000, 92(9), P. 709-20.
11. Lucchese A. Viruses and oral cancer: crossreactivity as a potential Link. Anticancer Agents Med. Chem., Jul 2015.
12. Nasonova M.V., Bogatov V.V., Chervinetz V.M., Samoukina A.M., Lebedev S.N. Neoplasms of oral cavity and their association with papilloma and herpes viruses in population of Tver region, Russia. Proceedings of the 4th European Conference on Biology and Medical Sciences, Vienna, Austria, 2015., P. 97-100.
13. Polz-Gruszka D., Stec A., Dworzanski J., Polz-Dacewicz M. EBV, HSV, CMV and HPV in laryngeal and oropharyngeal carcinoma in Polish patients. Anticancer Res., 2015, 35 (3), P. 1657-61.
14. Rana M., Zapf A., Kuehle M., Gellrich N.C., Eckardt A.M. Clinical evaluation of an autofluorescence diagnostic device for oral cancer detection: a prospective randomized diagnostic study. Eur. J. Cancer Prev., 2012, 21(5), P. 460-6.
15. Van der Waal I. Are we able to reduce the mortality and morbidity of oral cancer; some considerations. Med. Oral Patol. Oral. Cir. Bucal., 2013, 18(1), P. 33-7.
16. Vladimirov B.S., Schiodt M. The effect of quitting smoking on the risk of unfavorable events after surgical treatment of oral potentially malignant lesions. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., 2009, 38(11), P. 1188-93.
17. Zamora M.R. DNA viruses (CMV, EBV, and the herpesviruses). Semin. Respir. Crit. Care Med., 2011, 32(4), P. 454-70.
18. zur Hausen H. The search for infectious causes of human cancers: where and why (Nobel lecture). Angew Chem. Int. Ed. Engl., 2009, 48(32) P. 5798-808.
19. zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers - a brief historical account. Virology, 2009, 384(2), P. 260-5.