ФЕРМЕНТНЫЕ КОМПОЗИЦИИ
ENZYME COMPOSITIONS

Настоящее изобретение относится к ферментным композициям в сухой форме и к использованию таких ферментных композиций для приготовления ферментных композиций в жидкой форме.
Уровень техники
Применение ферментов для лечения животных хорошо известно. Ферменты часто добавляют в корма для животных, чтобы улучшить усвояемость и повысить питательную ценность комбикорма, например, за счет увеличения энергии и/или питательных веществ, доступных животному.
Однако, несмотря на многочисленные преимущества ферментов в качестве кормовых добавок, их применение ограничено и имеет ряд недостатков. Ферменты являются белками и поэтому чувствительны к ряду параметров окружающей среды, таких как температура и рН.
При приготовлении кормовых продуктов часто желательно иметь возможность хранить ферментные растворы в течение некоторых периодов времени перед применением. Условия окружающей среды, необходимые при хранении ферментов для поддержания их эффективности, часто являются оптимальными условиями для роста микробных организмов, что может привести к загрязнению.
Экстрагированные ферменты часто могут быть нестабильными, если находятся не в их родных средах, например, в клеточном компартменте, внеклеточной жидкости, и могут не функционировать должным образом или оставаться растворимыми, если оптимальные условия не поддерживаются. Например, активность может быть утрачена в результате протеолиза или агрегации. Срок годности может варьироваться от нескольких дней до более чем одного года и зависит от природы фермента и используемых условий хранения.
В общем случае жидкие ферменты по своей природе менее стабильны, чем ферменты в гранулированной или сухой форме. Водная среда также привносит значительные риски размножения микроорганизмов. Стабильность и риски также возрастают, когда при хранении смешивают разные ферменты.
Хранение при комнатной температуре обычно приводит к разрушению белка и/или неактивности фермента всего лишь через несколько часов, например, из-за роста микроорганизмов, гидролиза или протеолитической деградации.
Хранение при пониженной температуре, например, около 4°C, известно в данной области техники для повышения срока годности, однако микробная и протеолитическая деградация все еще распространена и часто неизбежна. Более того, хранение больших количеств жидких ферментов при низкой температуре связано с относительно высокими затратами как на инфраструктуру, так и на энергию для охлаждения.
Лиофилизация ферментов (обычно путем вымораживания) также используется в некоторых случаях и обеспечивает гораздо более длительный срок хранения при минимальной деградации.
3
3
Стабилизирующие белок растворы и добавки также известны для повышения стабильности при хранении и продления срока годности растворов ферментов. Противомикробные агенты, такие как азид натрия (NaN), также известны, однако, они часто вызывают повреждение структуры фермента и, следовательно, ингибируют активность. Более того, NaN очень токсичен и не приемлем для последующего применения в пищу.
Документ CN 101617740 раскрывает жидкую рецептуру фитазы, которая предназначения для разбрызгивания на гранулированный комбикорм. Жидкая рецептура предпочтительна, так как твердые рецептуры в форме порошков, гранул или таблеток необходимо добавлять к корму перед процессом гранулирования. Однако при проведении процесса гранулирования корм подвергается воздействию высоких температур, в частности температур выше чем 70°C, так что фитазный фермент теряет свою активность. На самом деле фермент фитазы, который обычно используют в корме для животных, начинает терять свою активность уже от температуры 60°C.
Недостатком жидких фитазных рецептур является их пониженная стабильность при хранении по сравнению с сухими фитазными рецептурами. Для повышения стабильности при хранении жидких рецептур в документе CN 101617740 раскрыто добавление полиэтиленгликоля для защиты молекулы фермента и стабилизатора, в частности трегалозы, чтобы повысить осмотическое давление раствора для стабилизации фермента. Более того, добавляют бензоат натрия в качестве консерванта и pH раствора буферизуют при между 4,5 и 5. За счет таких добавок потерю ферментной активности уменьшают от -40% до -10% при хранении в течение 6 месяцев при комнатной температуре и от -40% до -17% при хранении в течение 6 недель при температуре 40°C.
Недостатком жидких рецептур, раскрытых в документе CN 101617740, является то, что необходимо использовать довольно много добавок, то есть, например, на 1000 кг раствора приблизительно 30 кг полиэтиленгликоля, 50 кг трегалозы, 0,5 кг бензоата натрия и 20 кг 0,5 M HCl. В целом, недостаток жидких ферментных рецептур состоит в том, что они должны храниться в прохладных условиях (и даже при хранении в прохладных условиях их стабильность при хранении ниже, чем сухих рецептур) и необходимо хранить намного более высокие объемы. Несмотря на эти недостатки, в документе CN 101617740 предпочтение было отдано жидким рецептурам ввиду потери ферментной активности при смешении сухих ферментных рецептур с кормовым составом перед процессом гранулирования.
В документе WO 2014/159185 также раскрыта жидкая ферментная рецептура, которая может быть разбрызгана на гранулы корма, и гранулированная ферментная рецептура, которая может быть смешана с кормом перед его гранулированием. Жидкая ферментная рецептура содержит фитазу, буфер, стабилизатор, в частности трегалозу, и противомикробный агент, например, бензоат натрия. Гранулированная ферментная рецептура содержит, наряду с прочим, носитель и фитазу. Носитель включает, например, муку или крахмал и, следовательно, нерастворим в воде, особенно при низкой температуре, например, при 20°C, то есть, при температуре, которая не деактивирует фермент.
Таким образом, существует потребность в новой и улучшенной ферментной композиции, которая может быть разбрызгана на корм, но которая не обнаруживает недостатков известных жидких ферментных рецептур с точки зрения стабильности при хранении, условий хранения и больших количеств воды, которые необходимо хранить, транспортировать и обрабатывать.
Сущность изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, как видно из первого аспекта, предложена ферментная композиция, содержащая один или несколько водорастворимых кормовых фермента, соль бензойной кислоты и слабую кислоту, и эта ферментная композиция находится в сухой форме, которая растворима в воде с образованием ферментной композиции в жидкой форме, причем жидкая ферментная композиция буферизована с помощью слабой кислоты, присутствующей в водорастворимом порошке, до pH 5 или меньше.
Вследствие того, что ферментная композиция находится в сухой форме, она имеет хорошую стабильность при хранении, которая даже лучше, чем у известных стабилизированных растворов. Более того, ее можно хранить в более компактном пространстве, при менее контролируемых условиях, и благодаря ее более низким массе и объему ее легче транспортировать и с ней легче работать. Ферментная композиция легко растворима в воде, так что она может быть растворена в воде непосредственно перед разбрызгиванием на корм. Так как она должна храниться в жидкой форме в течение короткого периода времени, например, в течение меньше чем одна неделя или даже меньше чем один день (24 час), активность фермента не теряется или почти не теряется в течение этого периода хранения, даже когда жидкость хранят при более высоких температурах, например, при температурах выше чем 20°C. Следовательно, в ферментной рецептуре не должно быть никаких стабилизаторов, особенно в водорастворимой сухой композиции, что затрудняет получение полностью водорастворимой сухой рецептуры, в которой фермент остается стабильным.
Благодаря относительно низкому значению pH жидкой рецептуры, полученной растворением сухой рецептуры в воде, бензоат (соль) частично превращается в противомикробную активную кислотную форму. Жидкая рецептура буферизована до желаемых значений pH из-за присутствия слабой кислоты и сопряженной соли такой слабой кислоты, которая образована по реакции слабой кислоты с солью бензойной кислоты.
В некоторых вариантах осуществления соль бензойной кислоты может включать бензоат натрия.
В некоторых вариантах осуществления ферментная композиция может содержать указанную соль бензойной кислоты в количестве, по меньшей мере, 3,0% масс., предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 4,0% масс. и более предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 5,0% масс., но предпочтительно в количестве меньше чем 15% масс., более предпочтительно в количестве меньше чем 10% масс.
В некоторых вариантах осуществления жидкая ферментная композиция может быть буферизована слабой кислотой, присутствующей в водорастворимой ферментной композиции, до pH 4,5 или меньше. Значение pH жидкой композиции может находиться в интервале от pH 4,3 до pH 4,5.
В некоторых вариантах осуществления кормовой фермент может присутствовать в сухой кормовой композиции в количестве, по меньшей мере, 75% масс., предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 80% масс. и более предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 85% масс.
Кормовой фермент может содержать один или несколько ферментов, выбираемых из группы, включающей фитазу, ксиланазу, глюканазу, амилазу, протеазу, галактозидазу, целлюлазу, карбогидразу, гемицеллюлазу, липазу и ксилоглюканазу. В варианте осуществления фермент содержит фитазу, в частности фитазу, которая оптимально функционирует при pH ниже 4. В другом варианте осуществления фермент содержит ксиланазу и предпочтительно целлюлазу и/или гемицеллюлазу.
В некоторых вариантах осуществления ферментная композиция может находиться в форме водорастворимого порошка. В других вариантах осуществления ферментная композиция может находиться в форме водорастворимых гранул.
В некоторых вариантах осуществления сухая ферментная композиция полностью растворима в дистиллированной воде при температуре 20°C в количестве 10 г/л.
Водорастворимый порошок предпочтительно является свободно текучим. Он может содержать антислеживатель, в частности диоксид кремния. Диоксид кремния может присутствовать в сухой рецептуре в количестве между 1 и 3% масс., предпочтительно в количестве приблизительно 2% масс.
В некоторых вариантах осуществления слабая кислота может включать лимонную кислоту, в частности моногидрат лимонной кислоты.
В соответствии с настоящим изобретением, как можно увидеть из второго аспекта, предложен способ получения ферментной композиции в жидкой форме, где растворимую в воде ферментную композицию в соответствии с первым аспектом изобретения растворяют в воде.
В некоторых вариантах осуществления жидкую ферментную композицию смешивают с кормом для животных в течение периода меньше чем одна неделя, предпочтительно в течение периода меньше чем один день после ее приготовления.
В некоторых вариантах осуществления бензоат и бензойная кислота могут присутствовать в жидкой ферментной композиции в количестве приблизительно между 0,01 и 1,5% масс. В некоторых вариантах осуществления бензоат и бензойная кислота могут присутствовать в количестве приблизительно от 0,05 до 0,15% масс.
В соответствии с настоящим изобретением, как можно увидеть из третьего аспекта, предложен способ получения кормовой рецептуры, включающий стадии:
- приготовления ферментной композиции в соответствии с настоящим изобретением в сухой форме;
- необязательно хранения композиции в течение некоторого периода времени;
- растворения сухой ферментной композиции в воде;
- разбрызгивание растворенной ферментной композиции на кормовую смесь, в частности на кормовые гранулы.
Чертежи
Изобретение дополнительно описано со ссылкой на сопроводительные чертежи.
ФИГ. 1 представляет собой диаграмму, показывающую активность фермента ферментной композиции в соответствии с настоящим изобретением, содержащей фитазный фермент, через 0 (ноль), 3 и 15 дней после растворения в воде.
ФИГ. 2 представляет собой диаграмму, показывающую количество микробов в ферментной композицииФИГ. 1, через 0 (ноль), 3 и 15 дней после растворения в воде.
ФИГ. 3 представляет собой диаграмму, показывающую активность фермента ферментной композиции в соответствии с настоящим изобретением, содержащей ксиланазный фермент, через 0 (ноль), 3 и 15 дней после растворения в воде.
ФИГ. 4 представляет собой диаграмму, показывающую количество микробов в ферментной композиции ФИГ. 3, через 0 (ноль), 3 и 15 дней после растворения в воде.
Подробное описание
Определения
фермент
Термин «» относится к веществу, например, к белку, который действует как катализатор для достижения определенного химического изменения, такому как фитаза, ксиланаза, глюканаза, амилаза, протеаза, галактозидаза, целлюлаза, карбогидраза, гемицеллюлаза, липаза.
пищевые ферменты
in vivo
in vitro
Термин «кормовые ферменты» или «» относится к ферментам, обычно обнаруживаемым в пищеварительных трактах животных, которые могут быть специфически приспособлены для расщепления или переваривания корма или пищи. Например, фермент фитаза катализирует гидролиз фитиновой кислоты, которая обычно находится в семенах и орехах. Такие ферменты могут быть получены из природных или синтетических источников и могут быть выращены  или .
активность
Термин «» по отношению к ферментам будет понятен специалисту в данной области техники. Например, активность фермента может относится к количеству, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в минуту. Активность фермента может быть измерена с использованием соответствующего стандарта, например, ISO 30024:2009 в случае фитазной активности. Методы с соответствующими стандартами для измерения активности других ферментов известны в данной области техники.
Изменение в активности фермента, например, пониженная ферментная активность, может быть вызвана такими факторам, как pH, температура, конкурентные или неконкурентные ингибиторы, и иммобилизаторы. Сильное изменение активности фермента в некоторых случаях может относится к падению ферментной активности ниже 50% от начальной активности. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления активность фермента ниже 50% от начальной активности будет определять значительное изменение, например, падение или уменьшение, в активности фермента. Понятно, что существенное изменение в активности фермента будет сильно зависеть, например, от фермента, условий хранения и предполагаемого использования ферментной композиции. Также понятно, что существенное изменение в активности фермента, то есть, ниже 50%, все еще будет соответствовать требованиям активности фермента композиций настоящего изобретения при конкретном варианте применения.
бензоат
7
5
2
6
5
-
Термин «» известен специалисту в данной области техники и относится к аниону химической формулы CHO. Анион обычно находится в солях и сложных эфирах бензойной кислоты (CHCOOH), например, в бензоате натрия.
буфер
Термин «» относится к одному или нескольким соединениям, которые могут ограничивать изменения в значении pH, будь то кислое или основное. Буферы обычно находятся в форме водного раствора, содержащего одну или несколько слабых кислот и их соответствующих сопряженных оснований. Однако буфер может быть получен в жидкой (водной) форме или в сухой форме, которые могут быть добавлены к раствору, чтобы буферизировать pH. Подходящие буферы содержат, например, цитрат, аконитат, ацетат, сукцинат, малеат, фосфат, борную кислоту, карбонат и т.д. В варианте осуществления настоящего изобретения буфером является цитрат. Преимущественно цитрат является безопасным, экономичным и может обеспечить стабильную буферизацию для многих разных типов кормовых и пищевых добавок.
Термин «кормовая рецептура» относится к композиции корма или пищи. Количество каждого ингредиента в пищевых рецептурах часто определяют количественно и выбирают в количествах, подходящих для конкретных потребностей в питании. Ингредиенты могут быть объединены с получением кормовой смеси.
функциональность
Термин «» будет понятен в отношении фермента. Например, функциональность может быть выражена в виде процента функциональности, сохраненной ферментом, например, после хранения.
хранение
срок годности
влажность
Термины «», «», «» по отношению к ферменту будет понятен для специалиста в данной области техники. Однако они могут варьироваться в зависимости от географического положения композиции по настоящему изобретению.
температура
Термин «» по отношению к ферментным композициям по изобретению может относится, например, к температуре инкубации, температуре испытания, температуре хранения. В некоторых вариантах осуществления температура инкубации может быть равна около 30°C, и температура испытания, например, для тестирования активности фермента может составлять около 50°C.
рост микроорганизмов
Термин «» относится к увеличению объема, размножению, быстрому разрастанию или распространению популяции микроскопических организмов, например, бактерий, грибов, вирусов или водорослей.
контролирование
Термин «» относительно контроля роста микроорганизмов относится к изменению, например, к уменьшению или ослаблению роста, или распространения популяции, или скорости роста указанных микробов, например, определяемого с помощью стандарта ISO 4833-2:2013. Контроль роста может также означать полное ингибирование роста или гибель микроскопических организмов.
период времени
Термин «», как следует понимать, означает любой отрезок времени. Например, в отношении хранения ферментных композиций в некоторых вариантах осуществления ферментные композиции можно хранить в течение периода времени один или несколько часов, один или несколько дней, или одна или несколько недель. В некоторых вариантах осуществления ферментные композиции хранят в течение 1 дня, 3 дней или 15 дней.
В соответствии с настоящим изобретением, как видно из первого аспекта, предложена ферментная композиция, содержащая один или несколько водорастворимых пищевых фермента, соль бензойной кислоты и слабую кислоту, и эта ферментная композиция находится в сухой форме, которая растворима в воде с получением ферментной композиции в жидкой форме, причем жидкая ферментная композиция буферизована слабой кислотой, присутствующей в водорастворимом порошке, до pH 5 или меньше. Значение pH, полученное при растворении сухой ферментной композиции в воде, определяют, в частности, путем растворения 10 г сухой композиции в 1 л дистиллированной воды при температуре 20°C. Ферментная композиция предпочтительно полностью растворима в дистиллированной воде при температуре 20°C в количестве 10 г/л.
В зависимости от требуемой концентрации фермента в жидкой рецептуре сухая ферментная композиция может быть растворена в воде в разных количествах. В некоторых вариантах осуществления сухую ферментную композицию растворяют в количестве, по меньшей мере, 1 г, предпочтительно, по меньшей мере, 3 г, более предпочтительно, по меньшей мере, 5 г и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 7 г на литр воды. В некоторых вариантах осуществления сухую ферментную композицию растворяют в количестве самое большее 100 г, предпочтительно самое большее 75 г, более предпочтительно самое большее 50 г и наиболее предпочтительно самое большее 25 г на литр воды.
Сухие ферментные композиции по настоящему изобретению практически не показывают рост микроорганизмов и значительное изменение в активности фермента при хранении при комнатной температуре в течение одного года.
Кроме того, ферментные композиции по настоящему изобретению оптимизированы и достигнут баланс между стабильностью фермента и функциональностью фермента.
За счет соблюдения принципов настоящего изобретения активность фермента может быть сохранена при хранении в жидкой форме, то есть, после растворения в воде при 20°C, в течение 3 или более дней, в течение 5 или более дней, в течение 10 или более дней, в течение 15 или более дней, в течение 20 или более дней при существенно уменьшенном или при отсутствии микробного заражения ферментных композиций.
Активность фермента 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше или 99% или больше может быть сохранена, когда ферментные композиции по настоящему изобретению хранят в жидкой форме при 20°C в течение 3 или более дней, в течение 5 или более дней, в течение 10 или более дней, в течение 15 или более дней, в течение 20 или более дней при существенно уменьшенном или при отсутствии микробного заражения ферментных композиций.
В некоторых вариантах осуществления соль бензойной кислоты включает бензоат натрия или кальция.
В варианте осуществления соль бензойной кислоты содержит бензоат натрия. Неожиданно установлено, что добавление бензоата натрия предупреждает или существенно уменьшает рост микроорганизмов в растворенном ферментном продукте без значительного снижения активности фермента.
В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль присутствует в растворенной рецептуре в количестве приблизительно между 0,01 и 1,5% масс. Бензоатная соль может присутствовать в количестве приблизительно от 0,05 до 1,1% масс. В варианте осуществления композиция растворенного фермента содержит приблизительно 0,1% масс. бензоатной соли. Бензоатная соль может присутствовать в количестве приблизительно между 0,9 и 1,1% масс. В варианте осуществления ферментная композиция содержит приблизительно 1% масс. бензоатной соли.
Известная функция бензоатов в качестве противомикробных агентов введена в изобретение. Кроме того, функциональность бензоатов может варьироваться, например, может быть уменьшена или увеличена в зависимости от условий, например, от pH.
Бензойная кислота в ее недиссоциированной форме представляет собой активный противомикробный агент. Бензойная кислота только незначительно растворима в воде и, следовательно, не приемлема для включения в сухую рецептуру. Бензоаты, такие как бензоат натрия, являются высоко растворимыми и при кислых условиях, например, при pH <5, превращаются в недиссоциированную бензойную кислоту. Следовательно, в настоящем изобретении ферментные композиции буферизованы до рН≤5.
В некоторых вариантах осуществления значение pH растворенной композиции соответствует приблизительно рН 5 или меньше. Значение pH растворенной композиции находится в интервале приблизительно от pH 4 до pH 4,8. В варианте осуществления pH растворенной композиции находится в интервале приблизительно от pH 4,0 до 4,5, предпочтительно приблизительно между pH 4,3 и 4,5. При оценке эффективности разных концентраций 0,1% масс. и 1% масс. бензоата натрия в растворах растворенного фермента установлено, что целевое значение pH, находящееся в интервале от 4,3 до 4,5, гарантирует оптимальное функционирование фермента и также бензоата.
7
5
2
При кислых условиях, в частности при pH 4,5 или меньше, бензоат натрия является бактериостатическим, фунгистатическим и консервантом. Его часто используют в качестве кормовой добавки с E номер E211. Бензоат натрия имеет химическую формулу NaCHO, которая приемлема в качестве кормовой добавки или корма для животных.
В некоторых вариантах осуществления водорастворимая сухая ферментная композиция содержит указанные водорастворимые кормовые ферменты в количестве, по меньшей мере, 75% масс., предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 80% масс. и более предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 85% масс.
В некоторых вариантах осуществления кормовой фермент может присутствовать в количестве, по меньшей мере, 0,05% масс. из расчета на массу конечного объема растворенной композиции. В некоторых вариантах осуществления кормовой фермент может присутствовать в количестве, по меньшей мере, 0,5% масс. в растворенной ферментной композиции.
В некоторых вариантах осуществления фермент может присутствовать в жидкой композиции в количестве приблизительно между 0,2 и 10% масс. В некоторых других вариантах осуществления фермент может присутствовать в количестве приблизительно между 0,2 и 5% масс. В других вариантах осуществления фермент может присутствовать в количестве приблизительно от 0,2 до 2% масс. Фермент может присутствовать в количестве приблизительно между 0,2 и 1% масс. В варианте осуществления композиция содержит приблизительно 0,7% масс. кормового фермента. Фермент может присутствовать в количестве приблизительно от 1 до 2% масс. В варианте осуществления композиция может содержать приблизительно 1,5% масс. фермента.
В альтернативных вариантах осуществления кормовой фермент может присутствовать в жидкой композиции в количестве приблизительно от 0,05 до 1% масс., в количестве приблизительно от 0,5 до 1% масс., в количестве от 0,6 до 0,8% масс.
В альтернативных вариантах осуществления кормовой фермент может присутствовать в жидкой композиции в количестве приблизительно от 1 до 2,5% масс., в количестве приблизительно от 1 до 2% масс. или в количестве приблизительно от 1,4 до 1,6% масс.
Понятно, что количество фермента, присутствующего в жидкой композиции, будет зависеть от его активности и желаемой дозировки.
Фермент может представлять собой любой подходящий кормовой фермент известный в данной области техники. Фермент может содержать один или несколько ферментов, выбираемых из группы, включающей фитазу, ксиланазу, глюканазу, амилазу, протеазу, галактозидазу, целлюлазу, карбогидразу, гемицеллюлазу, липазу и ксилоглюканазу. В варианте осуществления ферментом является фитаза и/или ксиланаза. В одном варианте осуществления ферментом является фитаза, ксиланаза или альфа-галактозидаза, или их комбинация. В одном варианте осуществления фермент представляет собой фитазу, которая функционирует оптимально при pH ниже 4,0. Неограничивающими примерами фитаз, функционирующих оптимально при рН ниже 4, являются в частности коммерчески доступные 3- и 6-фитазы.
Например, ферментная композиция по настоящему изобретению может находиться в форме водорастворимых порошка, гранул, таблеток, высушенных вымораживаем, лиофилизированных, или в другой подходящей сухой форме.
В некоторых вариантах осуществления ферментная композиция может быть предложена в жидкой форме, например, фермент может быть представлен в растворенном состоянии за счет растворения сухой ферментной композиции в воде.
В соответствии с настоящим изобретением, как можно увидеть из второго аспекта, предложен способ получения ферментной композиции в жидкой форме, где растворимую в воде ферментную композицию в соответствии с первым аспектом растворяют в воде. В некоторых вариантах осуществления сухую ферментную композицию растворяют в количестве, по меньшей мере, 1 г, предпочтительно, по меньшей мере, 3 г, более предпочтительно, по меньшей мере, 5 г и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 7 г на литр воды. В некоторых вариантах осуществления сухую ферментную композицию растворяют в количестве самое большее 100 г, предпочтительно самое большее 75 г, более предпочтительно самое большее 50 г и наиболее предпочтительно самое большее 25 г на литр воды.
В некоторых вариантах осуществления жидкую ферментную композицию смешивают с кормом для животных в течение периода меньше чем одна неделя, предпочтительно в течение периода меньше чем один день после ее приготовления. Активность фермента, таким образом, сохраняется полностью или почти полностью, даже когда на участке разбрызгивания фермента температура будет выше комнатной температуры.
Ферментные композиции по настоящему изобретению могут представлять собой компонент или ингредиент кормовой рецептуры.
Жидкую композицию, полученную путем растворения сухой композиции в воде, можно хранить в течение некоторого периода времени перед ее нанесением на корм. Понятно, что период времени может составлять любой подходящий период времени, который может быть необходим ферментной композиции для хранения перед использованием, например, от нескольких минут до одного или нескольких дней или недель. Предпочтительно активность фермента 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше или 99% или больше может быть сохранена, когда ферментные композиции по настоящему изобретению хранят при 20°C в течение 3 или более дней, в течение 5 или более дней, в течение 10 или более дней, в течение 15 или более дней, в течение 20 или более дней, при существенно пониженном микробном загрязнении или при отсутствии микробного загрязнения ферментных композиций.
Кормовая рецептура может быть использована для приготовления корма для животных. Кормовая рецептура может быть приготовлена сразу же перед применением или может храниться в течение некоторого периода времени, например, меньше чем неделя, или меньше чем один день, или меньше чем несколько часов, без потери существенной ферментной активности и перед смешением с кормом для животных, в частности перед разбрызгиванием жидкой композиции на корм для животных.
Ферментная композиция в соответствии с настоящим изобретением после ее растворения в воде может сохранять функциональность 50% или больше, 60% или больше, 70% или больше, 80% или больше при ее хранении в течение трех дней или больше, одной недели или больше, пятнадцати дней или больше, трех недель или больше (см. ФИГ. 1 и 3).
Композиция растворенного фермента может сохранять функциональность 85% или больше, функциональность 90% или больше, функциональность 95% или больше, функциональность 99% или больше при ее хранении в течение трех дней или больше, одной недели или больше, пятнадцати дней или больше, трех недель или больше (см. ФИГ. 1 и 3).
Функциональность фермента представляет собой способность осуществлять свои обычные функции, например, функция фитазы состоит в катализе гидролиза фитиновой кислоты. Понятно, что функциональность фермента связана главным образом с активностью фермента, следовательно, пониженная функциональность фермента часто будет сопутствовать пониженной активности фермента. Понятно, что могут быть и другие факторы, которые могут вызывать снижение функциональности фермента, например, температура, освещение, влажность.
Особенно при растворении в воде ферментные композиции по настоящей модели показывают существенно пониженный микробный рост или по существу никакого микробного роста в отсутствие значительного воздействия на активность фермента.
Следует понимать, что микробный рост относится к росту любых микроскопических организмов, например, вирусов, грибов, бактерий или водорослей. Контроль роста можно отнести к уменьшению развития или распространения популяции микроскопических организмов, полному ингибированию роста или к гибели микроскопических организмов, или к уровню контроля их спектра.
Экспериментальная часть
Далее будет описан способ получения ферментной композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Способ
Запатентованные ферменты, содержащие фитазу и ксиланазу, готовят в виде водорастворимого порошка или гранул (ВРП (WSP) или ВДГ (WSG), соответственно). Эти ферменты растворяют в емкости для воды установки для приготовления кормовых рецептур в концентрациях 7 г/л (фитаза) и 15 г/л (ксиланаза), соответственно.
Оценивают эффективность разных концентраций 0,1% масс. и 1% масс. бензоата натрия в растворах фермента.
Водорастворимые таблетки (ВРТ (WSP)) запатентованной фитазы растворяют в воде в концентрации 7 г/л и буферизуют до pH 4,3-4,5. Готовят два раствора для испытания, содержащие 0,1% масс. и 1% масс. бензоата натрия, соответственно.
Водорастворимые таблетки (ВРТ (WSP)) запатентованной ксиланазы растворяют в воде в концентрации 15 г/л и буферизуют до pH 4,3-4,5. Готовят два раствора для испытания, содержащие 0,1% масс. и 1% масс. бензоата натрия, соответственно.
Каждый ферментный раствор буферизуют между pH 4,3 и 4 с использованием подходящего количества лимонной кислоты. Установлено, что целевое значение pH, находящееся в интервале от 4,3 до 4,5, гарантирует оптимальное функционирование фермента и также бензоата натрия.
Чтобы воспроизвести стандартные уровни микробного загрязнения, обнаруживаемые на комбикормовых заводах и кормовых фабриках, например, из-за образования пыли, 0,1 г тонкоизмельченного корма добавляют на литр раствора в каждом эксперименте. Общее число анаэробных микробов и активность фермента оценивают через 0 (ноль), 3 и 15 дней после растворения и инкубации ферментных композиций при 30°C.
В случае фитазы активность фермента измеряют с использованием стандартного метода ISO 30024:2009: (http://www.iso.org/iso/iso_catalogue/catalogue_tc/catalogue_detail.htm?csnumber=45787). Метод ISO 30024:2009 описывает технические требования к определению фитазной активности в образцах корма и одобрен исключительно для определения фитазной активности и исключительно в полных кормах.
Аэробный микробный рост измеряют с использованием стандартного метода ISO 4833-2:2013: (http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=59509). Метод ISO 4833-2:2013 дает точное описание горизонтального метода подсчета микроорганизмов, способных расти и формировать колонии, на поверхности твердой среды после аэробной инкубации при 30°C. Этот метод применим к продуктам, предназначенным для потребления человеком, или для корма для животных, и образцов окружающей среды в области производства продуктов питания и кормов и переработки пищевых продуктов.
В случае ксиланазы (эндо-1,4-β-D-ксиланаза) активность фермента измеряют при pH 4,7 и при 50°C с использованием таблеток Xylazyme от компании Magazyme. Активность ксиланазы выражают в единицах активности эндо-пентозаназы (EPU). Единицы EPU рассчитывают с использованием фермента эндо-1,4-β-ксиланазы с известной активностью и метода стандартных дополнений. Одна EPU представляет собой количество фермента, которое высвобождает 0,0083 мкмоль редуцирующих сахаров (эквивалент ксилозы) в минуту из ксилана овсяной полбы при pH 4,7 и при 50°C.
Результаты
ФИГ. 1 показывает фитазную активность в ФЕ/г (фитазные единицы на грамм) после растворения и инкубации при 30°C в течение периода времени 0 дней, 3 дня и 15 дней. Ферментная композиция, содержащая 0,1% бензоата натрия, удерживает самую хорошую активность через 15 дней.
ФИГ. 2 показывает аэробный рост микроорганизмов ферментной композиции ФИГ. 1 через те же периоды времени. Никакого микробного роста на отмечено в растворах, содержащих 0,1% или 1% бензоата натрия.
ФИГ. 3 показывает ксиланазную активность в EPU/г (ксиланазные единицы на грамм) после растворения и инкубации при 30°C в течение периодов времени 0 дней, 3 дня и 15 дней. Активность фермента не подвержена воздействию через 3 дня или через 15 дней за счет присутствия бензоата.
ФИГ. 4 показывает аэробный рост микроорганизмов ферментной композиции ФИГ. 3 через те же периоды времени. Никакого микробного роста на наблюдается в растворах, содержащих 0,1% масс. или 1% масс. бензоата натрия. Через 15 дней аэробный бактериальный рост в контроле также подавлен. Вероятно, это вызвано конкурентным ингибированием из-за разрастания грибков, которое заметно наверху культуры через 15 дней.
Таким образом, установлено, что ферментные композиции можно хранить, по меньшей мере, 15 дней в емкостях для воды перед нанесением и применением при приготовлении кормовых рецептур.