Гибридные биоматериалы на основе инкапсулированных в органосиликатные материалы метилотрофных дрожжей и их применение в биосенсорном анализе

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2015. Вып. 1. С. 124-132 Химия

УДК 543.9:663:664

Гибридные биоматериалы на основе инкапсулированных в органосиликатные материалы метилотрофных дрожжей и их применение в биосенсорном анализе *

О. Н. Понаморева, В. А. Алферов, О. А. Каманина, А. В. Мачулин,

Д. Г. Федосеева

Аннотация. Метилотрофные дрожжи Р1еЫа а^^а ВКМ У-2559 иммобилизованы в органосиликатные матрицы. Впервые показано, что в условиях основного катализа формируются капсулы вокруг каждой дрожжевой клетки. Выявлено влияние количества гидрофобной добавки МТЭС на активность и стабильность иммобилизованных микроорганизмов. Инкапсулированные золь-гель методом метилотрофные дрожжи Р1еЫа а^^а ВКМ У-2559 способны эффективно функционировать в качестве биокатализаторов окисления спиртов. Гибридные биоорганосиликатные материалы на основе инкапсулированных метилотрофных дрожжей применили при разработке целоклеточного биосенсора для мониторинга этанола в процессе брожения. Чувствительность биосенсора составила 185 ± 6нА • дм3 • мин-1 • мМ-1, нижняя граница определяемых содержаний — 5 мкмоль/дм3 при наилучшем соотношении силановых прекурсоров.

Ключевые слова: золь-гель метод, инкапсулированные живые клетки, метилотрофные дрожжи, биосенсор, мониторинг брожения.

Введение

В процессе эволюции природных систем живые организмы развивают различные минерализованные структуры, которые служат для защиты организмов и генетического материала своего вида от неблагоприятных условий. [1]. Диатомовые водоросли и радиолярии — одноклеточные организмы, эволюционировали таким образом, что стали способны формировать силикатные капсулы на своей поверхности, образуя экзоскелет для обеспечения такой защиты [2]. Эти организмы вдохновили исследователей на создание

* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (госзадание № 2104/227).

гибридных биоматериалов на основе живых клеток, инкапсулированных в неорганические полимерные оболочки [3-5].

Особый интерес представляет иммобилизация клеток в органомодифици-рованные силикагели, которые имеют ряд преимуществ перед органическими и неорганическими полимерами. Для получения таких материалов применяют золь-гель метод, который не требует энергоемкого, дорогого оборудования, является экономичным, экологически чистым и позволяет формировать силикагели с различной наноструктурой [6]. Иммобилизация живых клеток золь-гель методом является относительно новым направлением исследований в прикладной биотехнологии, в том числе при разработке биосенсоров [7]. К недостаткам золь-гель метода в ходе иммобилизации живых клеток относится выделение в процессе формирования матрицы низших спиртов, которые токсичны для многих микроорганизмов. Метилотрофные дрожжи характеризуются эффективной ферментативной системой окисления спиртов, поэтому нами было высказано предположение, что их иммобилизация золь-гель методом не должна приводить к потере активности микроорганизмов под действием образующегося в процессе конденсации спирта. Следует отметить, что биосенсоры на основе метилотрофных дрожжей находят применение в биотехнологии и пищевой промышленности для мониторинга ферментационных процессов и контроля стоков производств [8-10].

В статье представлены результаты исследований по разработке гибридного биоматериала на основе метилотрофных дрожжей Pichia angusta, инкапсулированных золь-гель методом в органосиликатные материалы, и применению иммобилизованных микроорганизмов для мониторинга процесса брожения.

Экспериментальная часть

Иммобилизация микроорганизмов. В работе использовали метилотрофные дрожжи Pichia angusta BKM Y-2559 (P. angusta) (Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ РАН).

К 0.1 см3 20 % раствора полиэтиленгликоля 3000 (ПЭГ) (Ferak Berlin) в фосфатном буферном растворе прибавляли 0.25 см3 суспензии дрожжевых клеток (1.3 ± 0.1 х 109 КОЕ/см3) в фосфатном буферном растворе (20 ммоль/дм3, рН 7.6) и перемешивали в течение 3 минут (Elmi CM-70M07), добавляли 0.5 см3 смеси тетраэтоксисилана (ТЭОС) (Sigma) и метилтриэток-сисилана (МТЭС) (Sigma) и вновь перемешивали в течение 3 минут. Использовали смеси силановых прекурсоров с содержанием гидрофобной добавки МТЭС: 0, 10, 33, 50, 67, 80, 83, 85, 90 и 100 % об. по отношению к общему объему силановых прекурсоров. Затем добавляли 0.025 см3 0.2 моль/дм3 раствора катализатора NaF, перемешивали 15 минут, отбирали 0.005 см3, наносили на пористый стекловолоконный фильтр диаметром 3 мм (Whatman GF/A, Sigma) и подсушивали 15 минут. Полученный биорецепторный элемент наносили на поверхность кислородного электрода, перед использова-

нием промывали фосфатным буферным раствором в течение 5 минут. Для регистрации дыхательной активности микроорганизмов использовали электрохимическую установку, основными элементами которой являются кислородный электрод, на поверхности которого закрепляли стекловолоконный фильтр с иммобилизованными микроорганизмами, и потенциостат IPC 2000 (ООО НТФ Вольта, Россия).

Хроматографический анализ

Определение содержания этилового спирта в образцах проводили газо-хроматографическим методом, на хроматографе «Кристал-5000.2» (Хромат-эк, Россия) с использованием пламенно-ионизационного детектора и капиллярной колонки DB-FFAP (50мх0.32ммх0.50мкм) (Agilent, США). Условия анализа: температура термостата колонки — 70 ° С, температура испарителя — 200 ° С, температура детектора — 250 ° С, скорость потока газа-носителя (гелия) — 0.10 дм3/час.

Сканирующая электронная микроскопия. Образцы для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) покрывали платиново-углеродной смесью в вакуумно-напылительной установке JEE-4X («JEOL», Япония). Электронно-микроскопический анализ образцов проводили на приборе JSM-6510 LV («JEOL», Япония).

Результаты и их обсуждение

Для иммобилизации метилотрофных дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559 в золь-гель матрицы использовали основной катализ фторидом натрия силановых прекурсоров — ТЭОС и МТЭС, в присутствии ПЭГ 3000. Клетки дрожжей иммобилизовали, варьируя содержание гидрофобной добавки МТ-ЭС в реакционной смеси (от 0 до 100 % об. по отношению к общему объему силановых компонентов матрицы). Для эффективного распределения клеток в формирующейся структуре модифицированного силикагеля нами было предложено добавлять силановые прекурсоры к суспензии клеток в растворе ПЭГ. При формировании фрактальной структуры геля образуются гладкие сферические частицы золя с размерами 1-5 мкм, соединенные между собой. Важно отметить, что в конечной гибридной структуре биоматрицы помимо сферических частиц силикагеля выявляются сферы с шероховатой поверхностью, которые представляют собой отдельные дрожжевые клетки, покрытые органосиликатной капсулой (рис. 1). При определенном соотношении прекурсоров (85 % об. МТЭС и 15 % об. ТЭОС) формируется архитектура гибридного биоматериала, в которой вокруг каждой клетки образуется органосиликатная капсула, при этом инкапсулированные клетки образуют единую структуру.

Иммобилизованные в органомодифицированный силикагель клетки представляют собой объемную матрицу. Для формирования биокатализа-

Рис. 1. Изображение органосиликатной матрицы с инкапсулированными клетками метилотрофных дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559

торов в виде пластин в качестве каркаса использовали стекловолоконный фильтр. Инкапсулированные клетки обнаруживаются в матриксе самого стекловолоконного фильтра, имеющего рыхлую ячеистую структуру (рис.2).

Рис. 2. Микрофотография стекловолоконного фильтра Whatman GF/A с иммобилизованными в золь-гель матрицы метилотрофными дрожжами

Таким образом, стекловолоконная подложка участвует в формировании структуры гибридного биоматериала, но не оказывает влияния на инкасуп-лирование метилотрофных дрожжей.

Стекловолоконный фильтр с иммобилизованными микроорганизмами закрепляли на поверхности кислородного электрода, что обеспечивает сопряжение биоматериала с физико-химическим преобразователем при разработке микробного сенсора. Принцип работы такого биосенсора основан на том, что при окислении определяемого вещества иммобилизованными на поверхности электрода микроорганизмами возрастает их дыхательная активность, в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью кислородного электрода. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала потенциостата (силы тока) после добавления определяемого вещества в измерительную кювету (нА/мин).

Инкапсулированные клетки метилотрофных дрожжей способны эффективно окислять низкомолекулярные спирты, поэтому биосенсор на их основе можно использовать для селективного определения спиртов (рис. 3).

Рис. 3. Субстратная специфичность иммобилизованных дрожжей Pichia angusta БЕЖ У-2559 в золь-гель матрице

Соотношение силановых прекурсоров МТЭС и ТЭОС меняет структуру геля и, как следствие, формируются разная архитектура гибридного биоматериала [11, 12]. Для выявления влияния гидрофобной добавки МТЭС на свойства гетерогенного биокатализатора определяли метрологические и аналитические характеристики биосенсора (табл. 1).

В зависимости от соотношения силановых прекурсоров время функционирования биосенсора без замены биораспознающего элемента составляет от 8 до 26 суток, что свидетельствует о высокой жизнеспособности инкапсулированных метилотрофных дрожжей. Лучшими характеристиками обладает биосенсор на основе биораспознающего элемента с содержанием гидрофобной добавки МТЭС 85 % об. Именно при таком соотношении формируется определенная структура гибридного биоматериала, в которой все клетки инкапсулированы и связаны между собой.

Таблица 1

Характеристики биосенсора на основе метилотрофных дрожжей Pichia augusta ВКМ Y-2559, иммобилизованных в силикагели золь-гель методом при разном соотношении кремнийорганических прекурсоров (определяемое вещество -

этанол)

Содержание гидрофобной добавки (МТЭС), % Коэффициент чувствительности, нА»дм3,мин~1,ммоль~1 Нижняя граница определяемых концентраций, Сн, мкмоль/дм3 Предел обнаружения, мкмоль/дм3 Операционная стабильность*, Sr, % Долговременная стабильность**, сутки

0 67±5 13 3 1.0 9

10 67±3 8 2 1.0 8

33 66±4 9 2 1.0 8

50 61±9 6 2 0.9 23

67 99±7 5 1 1.0 26

80 171±5 5 1 2.0 14

83 182±6 5 1 1.1 14

85 185±6 5 1 1.0 17

90 87±10 5 2 3.0 10

100 86±6 8 3 1.2 8

* Операционную стабильность рассчитывали как относительное стандартное отклонение для 15 параллельных измерений при доверительной вероятности 0.95

** Долговременную стабильность определяли как время стабильной работы биосенсора, т.е. время, в течение которого ответ биосенсор составлял не менее 50% от начального ответа.

С целью апробации и коррелятивной калибровки разработанного нами биосенсора определяли содержание этанола в процессе брожения (табл. 2). В качестве референтного метода применяли газовую хроматографию (ГХ).

Статистический анализ результатов с использованием с использованием теста Фишера показал, что дисперсии концентраций этанола, определяемые с помощью разработанного биосенсора, и полученные референтным методом, незначимо различаются между собой. Результаты модифицированного теста

Стьюдента показали, что систематическая погрешность между результатами биосенсорного и хроматографического анализов отсутствует. Таким образом, биосенсор на основе в органосиликатную матрицу инкапсулированных метилотрофных дрожжей является перспективным инструментом для мониторинга спирта в биотехнологических производствах.

Таблица 2.

Содержания этанола в образцах брожения при получении этилового спирта

Время брожения, ч Способ измерения концентрации этанола, моль/дм

С помощью биосенсора ГХ

2 0.02±0.01 0.020±0.003

24 0.05±0.01 0.043±0.001

48 0.17±0.01 0.168±0.001

72 0.21=0.02 0.205±0.003

Заключение

Результаты, полученные в работе, убедительно доказывают возможность применения золь-гель технологии для инкапсулирования метилотрофных дрожжей в кремнийорганические матрицы, что расширяет диапазон методов иммобилизации микроорганизмов. Золь-гель процессы при использовании силановых прекурсоров (МТЭС и ТЭОС) и порообразователя ПЭГ в условиях основного катализа фторидом натрия обеспечивают иммобилизацию живых клеток микроорганизмов в мягких условиях с сохранением их биокаталитической активности. При определенном соотношении кремнийоргани-ческих прекурсоров (85 % об. МТЭС и 15 % об. ТЭОС) формируется структура гибридного биоматериала, в которой вокруг каждой клетки образуется органосиликатная капсула, при этом инкапсулированные клетки образуют единую структуру. Исследование вносит вклад понимание процессов формирования искусственных оболочек вокруг живых клеток и имеет практическое значение для развития гибридных биоматериалов для применения в биотехнологии, в том числе для разработки целоклеточных биосенсоров.

Список литературы

1. Wang S., Guo Z. Bio-inspired encapsulation and functionalization of living cells with artificial shells // Colloids Surf B Biointerfaces. 2014. V. 113. №1. P. 483-509.

2. Nassif N, Livage J. From diatoms to silica-based biohybrids // Chem. Soc. Rev. 2011. V. 40. №2. P. 849-859.

3. Dickson D.J., Ely R.L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: lessons for academic and applied research // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97. №5. P. 1809-1819.

4. Blondeau M, Coradin T. Living materials from sol-gel chemistry: current challenges and perspectives // Journal of Materials Chemistry. 2012. V. 22. № 42. P. 22335.

5. Meunier C.F., Dandoy P., Su B.L. Encapsulation of cells within silica matrixes: Towards a new advance in the conception of living hybrid materials //J. Colloid. Interface Sci. 2010. V. 342. №2. P. 211-224.

6. Development of sol-gel hybrid materials for whole cell immobilization / M.F. Desimone, G.S. Alvarez, M.L. Foglia, L.E. Diaz // Recent Patents on Biotechnology. 2009. V. 3. P. 55-60.

7. Depagne C, Roux C, Coradin T. How to design cell-based biosensors using the sol-gel process // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V. 400. №4. P. 965-976.

8. / Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания компонентов в многокомпонентных водных средах / В.А. Арляпов, О.Н. Понаморева, С.В. Алферов, В.А. Алферов, А.Н. Решетилов // Сенсорные системы. 2011. Т. 25. №4. C. 352-360.

9. Receptor elements for biosensors in two ways of methylotrophic yeast immobilization / M.G. Zaitsev, V.A. Arlyapov, V.A. Alferov, A.N. Reshetilov // Applied Biochemistry and Microbiology. 2012. V. 48. №. 5. P. 519-524.

10. Перспективы применения биосенсорных экспресс анализаторов при производстве спирта / Е.А. Китова, О.Н. Пономарева, В.А. Алферов, А.В. Кузмичев, А.А. Ежков, Д.В. Арсеньев, А.Н. Решетилов // Производство спирта и ликеро-водочных изделий. 2004. № 4. С. 11-13.

11. Синтез кремнийорганических золь-гель матриц и получение на их основе гетерогенных биокатализаторов / О.А. Каманина, Д.Г. Федосеева, Т.В. Рогова, О.Н. Понаморева, И.В. Блохин, А.В. Мачулин, В.А. Алферов // Журнал прикладной химии. 2014. Т. 87. № 6. С. 753-759.

12. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for biosensors design / O.N. Ponamoreva, O.A. Kamanina, V.A. Alferov, A.V. Machulin, T.V. Rogova, V.A. Arlyapov, S.V. Alferov, N.E. Suzina, E.P. Ivanova // Biosensors and Bioelectronics. In Press: http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2014.08.045/.

Понаморева Ольга Николаевна (olgaponamoreva@mail.ru), д.х.н., зав. кафедрой, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., зав. кафедрой, кафедра химии, директор, естественнонаучный институт, Тульский государственный университет.

Каманина Ольга Александровна (o.a.kamanina@gmail.com), к.х.н., младший научный сотрудник, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Мачулин Андрей Валериевич (and.machul@gmail.com), к.б.н., научный сотрудник, лаборатория цитологии микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Федосеева Дарья Геннадьевна (d.g.fedoseeva@gmail.com), магистрант, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Hybrid biomaterials based on encapsulated yeast methylotrophic organosilicate materials and application of them in biosensor assay

O.N. Ponamoreva, V. A. Alferov, O.A. Kamanina, A.V. Machulin,

D. G. Fedoseeva

Abstract. Methylotrophic yeast Pichia angusta BKM Y-2559 were immobilized in the organosilicate matrixes. First showed that in the conditions of base catalysis capsules are formed around each yeast cell. Influence of the amount of hydrophobic additive MTES on the activity and stability of immobilized microorganisms was revealed. Methylotrophic yeast Pichia angusta BKM Y-2559, encapsulated using sol-gel method, can effectively operate as biocatalyst in alcohol oxidation. Hybrid bioorganosilicate materials, based on encapsulated methylotrophic yeast, were used in the development of a microbial biosensor for monitoring of ethanol during fermentation process. The sensitivity coefficient of the developed biosensor was 185 ± 6nA • dm3 • min-1 •mM-1, lower limit of determined concentrations was 5 mol/dm3 with the best ratio of silane precursors.

Keywords: sol-gel, sol-gel encapsulation, methylotrophic yeast, biosensor.

Ponamoreva Olga (olgaponamoreva@mail.ru), doctor of chemical sciences, head of department, department of biotechnology, Tula State University.

Alferov Valeriy (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, head of department, department of chemistry, director, institute of natural sciences, Tula State University.

Kamanina Olga (o.a.kamanina@gmail.com), candidate of chemical sciences, junior researcher, department of biotechnology, Tula State University.

Machulin Andrey (and.machul@gmail.com), candidate of biological sciences, research associate, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Fedoseeva Daria (d.g.fedoseeva@gmail.com), undergraduate, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 25.12.2014