Влияние тиамазола на функциональную активность гликопротеина-Р

УДК 616.36

ВЛИЯНИЕ ТИАМАЗОЛА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р

В исследовании на кроликах изучено влияние тиамазола на функциональную активность белка-транспортера гликопротеи-на-Р (Pgp). Активность Pgp изучали по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина. Установлено, что введение тиамазола в дозах 2,5 мг/кг и 5 мг/кг массы в течение 21 дня вы-зывает дозозависимое снижение активности Pgp, сохраняющееся на 5-й день отмены препарата. Ключевые слова: гликопротеин-Р, MDR1, тиамазол, гипоти-реоз, фексофенадин.

Введение. За последние десятилетия значительно возросла частота заболеваний щитовидной железы (ЩЖ). По данным колорадского популяционного исследования, включавшего 25862 человека, распространенность гипотиреоза составляет 9,5% и варьирует от 4 до 21% у женщин и от 3 до 16% у мужчин в зависимости от возраста. В возрастной группе 45-54 года частота гипотиреоза у женщин составляет 10%, у мужчин - 5% [10]. Учитывая высокую распространенность тиреоидной патологии и преимущественно преклонный возраст данных пациентов, имеющих сопутствующие соматические заболевания, становится понятной актуальность изучения фармакокинетики лекарственных веществ при патологии щитовидной железы. Одну из важных позиций в фармакокинетике ксенобиотиков занимает глико-протеин-Р. Гликопротеин-Р (Pgp) -это белок-транспортер, функцией которого яв-ляется АТФ-зависимое выведение ксенобиотиков из клетки. Впервые Pgp был обнару-жен в опухолевых тканях, где была выявлена его связь с устойчивостью к антибла-стомным препаратам. Позднее Pgp был идентифицирован во многих органах и тканях: в тонком кишечнике, печени, почках, эндотелиальных клетках капилляров головного мозга, плаценты, семенников, в клетках периферической крови [3, 6, 7, 11]. В настоящее время установлено, что Pgp обладает широкой субстратной специ-фичностью. К числу его субстратов относятся стероидные гормоны, статины, верапа-мил, морфин, дигоксин, азитромицин, атенолол, винкристин, винбластин, нифедипин, пароксетин, празозин и другие лекарственные средства [3]. Установлено, что ряд факторов, химических и лекарственных веществ способен изменять функциональную активность белка-транспортера [7, 11]. При совместном применении с ингибиторами Pgp концентрация его субстратов повышается, что может привести к развитию нежелательных лекарственных реакций, и, наоборот, при совме-стном приеме с индукторами белка-транспортера концентрация субстратов снижается, что приводит к уменьшению эффективности фармакотерапии. Таким образом, изуче-ние функциональной активности Pgp является необходимым условием для проведения эффективной и безопасной фармакотерапии. Функциональная активность Pgp при гипотиреозе остается мало изученной, что затрудняет рациональное применение лекарственных средств при данной патологии. Цель настоящего исследования - изучить функциональную активность глико-протеина-Р при экспериментальном гипотиреозе. Материалы и методы.

Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах породы шиншилла, средней массой 3500±100 г. В исследование включались самки, которые находились в состоя-нии течки. Для моделирования экспериментального гипотиреоза животным перорально вводили тиамазол (мерказолил, «Акрихин») в течение 21 дня в дозе 2,5 (n=6) и 5 мг/кг массы (n=6). До начала эксперимента, через 14, 21 день введения препарата и на 5-й день его отмены у животных определяли функциональную активность глико-протеина-Р и сывороточный уровень ТТГ, Т3 и Т4. Активность белка-транспортера оценивали по концентрации в плазме крови его маркерного субстрата - фексофенадина. Фексофенадин (Sanofi Aventis) вводили жи-вотным перорально с помощью металлического зонда в дозе 30 мг/кг массы. Через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа от момента введения препарата из ушной вены кроликов за-бирали кровь в объеме 5 мл. Для получения плазмы пробы центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 10 минут и хранили до анализа при температуре -290С. Содер-жание фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Beckman Coulter» с ультрафиолетовым детектором и колонке

Е.Н. ЯКУШЕВА А.С. БИРЮКОВА А.В. ЩУЛЬКИН

Рязанский государственный медицинский университет e-mail: enya.rzn@yandex.ru

«Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование маркерного суб-страта осуществляли по методу Г.В. Раменской с соавт. [5] в собственной модифика-ции. Анализ выполняли при длине волны 225 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин. Использовали подвижную фазу следующего состава: 133,7 мл бидистиллиро-ванной воды, содержащей 2,33 мл ледяной уксусной кислоты (ХИММЕД) и 0,936 мл триэтиламина (Chem-Lab), доведенной ортофосфорной кислотой до рН 4,0 и 64 мл ацетонитрила (Chem-Lab). Осуществляли жидкостную экстракцию фексофенадина из плазмы крови. В качестве экстрагентов использовали дихлорметан (ACROS ORGANICS), этилацетат (ACROS ORGANICS) и диэтиловый эфир (ХИММЕД). Коэф-фициент экстракции составил 53%. Количественное определение фексофенадина выполняли по методу абсолютной калибровки, с использованием стандарта фексофенадина (Strasbourg cedex). Представ-лено уравнение калибровочной зависимости для определения фексофенадина в плаз-ме крови: y = ах + b = -0,0001+9,4089*10-6*x, где у - высота пика фексофенадина, в единицах экстинкции, х - содержание фексофенадина в стандартном растворе, нг/мл. Коэффициент регрессии r для данной калибровочной зависимости равнялся 0,9958. Примененный метод хроматографического анализа обладал следующими ха-рактеристиками: время удерживания - 13,7 мин; предел обнаружения фексофенадина в плазме крови 90 нг/мл; точность - 4,2%. Вычисление концентрации фексофенадина осуществляли с помощью програм-мы Gold. Для каждого кролика рассчитывали Cmax - максимальная концентрация при однократном введении, Tmax -время достижения максимальной концентрации, AUC0-t - площадь под кривой «концентрация-время» от нуля до последнего забора крови, AUQ>-œ - площадь под кривой «концентрация-время» от нуля до бесконечности, МRT - среднее время удержания препарата в системном кровотоке, Vd - объем рас-пределения, общий клиренс, Т1/2 -период полувыведения, Cmax / AUC0-t - коэффици-ент абсорбции. Фармакокинетические рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0. Отношение Cmax/AUQ>-œ вычисляли само-стоятельно [4]. Уровень тиреоидных гормонов определяли радиоиммунным методом с приме-нением стандартных тест-систем производства IMMUNOTECH (Чехия) и дальнейшей обработкой результатов на анализаторе «Иммунотест» (Москва) в ЦНИЛ РязГМУ. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программ Statsoft Statistica 6.1. Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Для исследования статистической значимости показателей, имеющих нормальное распределение, внутри каждой серии использовали тест ANOVA повтор-ных измерений, межгрупповые различия вычисляли по критерию Ньюмена-Кейсла. Для оценки статистической значимости различий групп при распределении признака, отличающегося от нормального, использовали критерий Фридмана, межгрупповые различия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла [1].

Полученные данные представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего результата в случае нормального распределения признака или в виде медианы, верхнего и нижнего квартиля - если распределение данных отличалось от нормального [1]. Результаты. Введение низкой дозы (2,5 мг/кг массы) тиамазола приводило к развитию экс-периментального гипотиреоза (табл. 1), что проявлялось к 14-му дню эксперимента снижением уровня Т4 на 15,0% (p<0,05) и повышением содержания ТТГ на 9,8% (p<0,05). На 21-й день эксперимента происходило снижение концентрации Т4 на 25,8% (p<0,05), Т3 - на 37,0% (p<0,05), и увеличение уровня ТТГ на 27,9% (p<0,05). На 5-й день отмены тиамазола отмечалось снижение содержания Т4 на 26,5% (p<0,05) и повышение концентрации ТТГ на 26,2% (p<0,05).

Таблица 1 Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов при введении тиамазола в дозе 2,5 мг/кг массы (М±т - при нормальном

распределении признаков; медиана, нижний и верхний квартиль - при распределении __признака, отличном от нормального) _

Изучаемые пара- Исходные зна- Тиамазол 14 дней Тиамазол 21 день 5-й день отмены

метры чения n=6 n=6 n=6 n=6

Cmax, нг/мл 314,9±27,4 367,5±25,2* 388,9±18,4* 388,6±18,7*

Tmax, ч 4

T 1/2, ч 10,9±1,9 10,5±1,7 18,1±4,1 15,0±1,7

AUG>t , нг/чхмл 2084,2 (1773,1; 2589,6 (2439,7; 3746,2 (3549,3; 4306,8 (3494,8;

2544,4) 3247,5) 4698,8) 4513,9)

AUC0-» , нг/чхмл 4645,2±972,9 4420,6±569,9 6843,5±920,8 6141,4±558,7

Общий клиренс, л 23,4±5,1 21,8±2,2 14,1±1,9 15,2±1,3

Объем распреде- 345,0±32,7 331,2±37,4 333,8±43,6 323,0±21,5

ления, л

Cmax / AUC 0,08±0,014 0,089±0,01 0,0б1±0,0082 0,0б5±0,0044

MRT, ч 16,6±2,4 16,0±2,3 25,8±5,2 21,9±2,2

MRTt, ч 5,8

ТТГ, мМЕ/л 0,6i±0,008 0,67±0,03*,**, *** 0,78±0,04* 0,77±0,04*

Т3, нмоль/л 2,0±0,17 1,9±0,18*** 1,2б±0,17* 1,67±0,17

Т4, нмоль/л 63,3±2,8 53,8±3,9* 47,0±5,3* 4б,5±5,7*

* - p<0,05 - достоверные различия с данными у интактных животных; ** - p<0,05 - достоверные различия с данными на 5-й день отмены тиамазола; *** - р<0,05 - достоверные различия с данными на 21-й день введения тиамазола.

Аналогичная динамика гормонального статуса животных наблюдалась и при введении высокой дозы (5 мг/кг массы) тиамазола (табл. 2). Так, на 14-й день гипоти-реоза уровень Т4 снизился на 16,3% (p<0,05), а концентрация ТТГ увеличилась на 12,3% (p<0,05). К 21-му дню эксперимента концентрация Т4 уменьшилась на 37,0% (p<0,05), Т3 - на 29,7% (p<0,05), а уровень ТТГ увеличился на 38,4% (p<0,05). На 5-й день отмены тиамазола содержание Т4 оставалось ниже исходного значения на 43,0% (p<0,05), Т3 - на 24,3% (p<0,05), а концентрация ТТГ превышала исходное значение на 33,8% (p<0,05). При изучении фармакокинетики фексофенадина при экспериментальном гипо-тиреозе были получены следующие результаты. При введении низкой дозы тиамазола (2,5 мг/кг массы) происходило повыше-ние Cmax фексофенадина на 14-й день эксперимента на 16,7% (p<0,05), на 21-й день - на 23,5% (p<0,05), на 5-й день отмены препарата - на 23,4% (p<0,05). Остальные фар-макокинетические параметры от исходных показателей достоверно не отличались (p>0,05) (табл. 1). При введении высокой дозы тиамазола (5 мг/кг массы) на 14-й день исследова-ния происходило повышение Cmax фексофенадина на 9,6% (p<0,05). На 21-й день ги-потиреоза наблюдалось повышение Cmax на 31,0% (p<0,05), AUC0-t - на 44,7% (p<0,05) и снижение общего клиренса на 38,4% (p<0,05). На 5-й день отмены препарата пре-вышали исходные значения С max на 35,3% (p<0,05), AUC0-t - на 60,4% (p<0,05), AUC0-M - на 72,1% (p<0,05), MRT - на 100,6% (p<0,05), а общий клиренс был снижен относи-тельно первоначального показателя на 51,3% (p<0,05) (табл. 2).

Таблица 2 Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов при введении тиамазола в дозе 5 мг/кг массы (М±т - при нормальном распределении признаков;

медиана, нижний и верхний квартиль - при распределении признака, отличном от нормального]

Изучаемые Исходные Тиамазол 14 дней Тиамазол 21 день 5-й день отмены

параметры значения n=6 n=6 n=6 n=6

Cmax, нг/мл 311,3±15,5 341,2±19,0*,**,*** 407,9±19,7* 421,1±25,9*

Tmax, ч 3

T 1/2, ч 13,5±2,7 14,7±2,5 20,1±4,8 25,6±6,0

AUG>t , нг/чхмл 2781,4±453,1 3372,9±428** 4024,1±280,0* 4462,6±265,1*

AUC0-» , нг/чхмл 4796,1±682,6 5693,7±812,4 7520,9±929 8255^838,1*

Общий клиренс, л 23,2±4,12 17,6±2,6 14,3±2,3* 11,3±1,2*

Объем 384,7±28,3 348,8±10,2 334,1±37,5 349,5±53,1

распределения, л

Cmax / AUC 0,073±0,01 0,065±0,008З 0,057±0,00б 0,052±0,0052

MRT, ч 16,6±3,7 22,2±3,4 31,0±6,3 33,3±8,2*

MRTt, ч 7,9

ТТГ, мМЕ/л 0,65±0,03 0,73±0,03*,**, *** 0,9±0,05* 0,87±0,05*

Т3, нмоль/л 1,85±0,1 1,7±0,09**,*** 1,3±0,13* 1,4±0,09*

Т4, нмоль/л 65,6±3,7 54,9±3,6*,**,*** 41,3±3,2* 37,4±2,7*

* - р<0,05 - достоверные различия с данными у интактных животных; ** - р<0,05 - достоверные различия с данными на 5-й день отмены тиамазола; *** - р<0,05 - достоверные различия с данными на 21-й день введения тиамазола.

При сравнении изучаемых фармакокинетических параметров животных двух серий (получавших низкую и высокую дозу тиамазола) между собой достоверные раз-личия были получены только на 5-й день отмены антитиреоидного препарата. При введении тиамазола в дозе 5 мг/кг АиСо-ю и общий клиренс превышали аналогичные показатели у

животных, получавших данный препарат в дозе 2,5 мг/кг на 34,4% (р<0,05) и 25,7% (p<0,05) соответственно.

Обсуждение результатов. В настоящем исследовании изучено влияние экспериментального гипотиреоза на функциональную активность Pgp на кроликах породы шиншилла. Данная тест-система является адекватной для доклинической оценки влияния различных лекарст-венных веществ на функционирование белка-транспортера [3]. В ходе эксперимента установлено, что введение низкой (2,5 мг/кг массы) и вы-сокой (5 мг/кг массы) доз тиамазола приводит к подавлению функции щитовидной железы и развитию экспериментального гипотиреоза, что проявляется снижением уровней Т4 и Т3 и повышением содержания ТТГ. Причем концентрация Т3 начинает снижаться только с 21-го дня введения тиамазола, что, скорее всего, имеет приспособи-тельное значение: в условиях нарушения синтеза тиреоидных гормонов в первую оче-редь сохраняется синтез более активного гормона [2]. Функциональные изменения со-храняются и на 5-й день отмены тиреостатика. В экспериментальном исследовании функциональную активность Pgp опреде-ляли по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина. Препарат прак-тически не подвергается биотрансформации и выводится неизмененном виде с помо-щью Pgp в печени и почках. Таким образом, фармакокинетика фексофенадина полно-стью зависит от активности данного белка-транспортера [3]. Выявлено, что при введении низкой дозы тиамазола (2,5 мг/кг массы) происхо-дит повышение Cmax фексофенадина на 14, 21-й дни введения тиреостатика и на 5-й день его отмены. Остальные фармакокинетические параметры достоверно не отлича-ются от исходных показателей (p>0,05). При введении высокой дозы тиамазола (5 мг/кг массы) на 14-й день исследова-ния обнаружено повышение Cmax фексофенадина; на 21-й день эксперимента наблю-дается повышение Cmax, AUCo-t и снижение общего клиренса; на 5-й день отмены пре-парата исходные значения превышают: С max, AUCo-t, AUC0-<», MRT, а общий клиренс становится ниже первоначального показателя. Установленные изменения фармакоки-нетических параметров свидетельствуют о повышение содержания фексофенадина в плазме крови [4] и замедлении его выведения из организма лабораторных животных, что является следствием снижения функциональной активности Pgp [3, 5]. Выявленное в настоящем исследовании снижение функциональной активности гликопротеина-Р могло происходить как за счет непосредственного влияния тиамазо-ла на активность белка-транспортера и/или на экспрессию гена MDR1 (кодирующего Pgp), так и опосредованно, за счет снижения уровня тиреоидных гормонов. Тиамазол кумулируется в щитовидной железе, период его полувыведения со-ставляет 3-6 ч, а в течение 48 ч он полностью выводится из организма [2]. В настоя-щем исследовании показано, что активность Pgp оставалась сниженной и на 5-й день отмены тиреостатика, что может свидетельствовать об уменьшении активности белка-транспортера вследствие дефицита тиреоидных гормонов. Высказанное предположение косвенно подтверждается данными других иссле-дований. Показано, что тиреоидные гормоны (Т3 и Т4) повышают экспрессию гена MDR1 в культуре клеток карциномы толстой кишки (LS180 and Caco-2) [8]. Молекулярные механизмы повышения функциональной активности Pgp ак-тивно изучаются. Согласно современным представлениям ключевую роль в регуляции активности данного белка-транспортера играет уровень экспрессии гена MDR1. Его индуцибельная экспрессия в нормальных и трансформированных клетках иницииру-ется сигналами от большого количества стимулов, которые сходятся на общей области промотора MDR1, называемого «MDR1 enhanceosome» [9]. Аналогичным образом мо-гут непосредственно связываться и активизировать промотор MDR1 рецептор SXR/PXP, стероидные рецепторы и рецепторы ксенобиотика [9]. Большинство эффектов тиреоидных гормонов реализуется в результате взаимо-действия Т3 и Т4 со специфическими ядерными рецепторами. Рецепторы тиреоидных гормонов всегда связаны с участками ДНК - «тиреоидчувствительными элементами» (thyroid response elements) [12]. В отсутствие гормонов соответствующие рецепторы ин-гибируют экспрессию генов.

Таким образом, на основе полученных данных о снижении функциональной ак-тивности Pgp на фоне экспериментального гипотиреоза можно рекомендовать сниже-ние дозировок лекарственных веществ - субстратов Pgp при назначении их пациентам с выраженным гипотиреозом для безопасной и эффективной фармакотерапии. Выводы. 1. Пероральное введение кроликам тиамазола в дозах 2,5 и 5 мг/кг массы в те-чение 21 дня

приводит к развитию гипотиреоза, который характеризуется снижением уровней Т3 и Т4 и повышением уровня ТТГ в сыворотке крови на 14, 21-е сутки приме-нения тиамазола и на 5-й день отмены препарата. 2. Введение тиамазола кроликам в течение 21 дня в дозах 2,5 и 5 мг/кг массы вызывает дозозависимое ингибирование активности гликопротеина-Р, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина, сохраняющееся на 5-й день отмены препарата.

Литература

1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц : пер. с англ. - М. : Практика, 1998. - 459 с.

2. Кубарко, А.И. Щитовидная железа. Фундаментальные аспекты / А.И. Кубарко, S. Ya-mashita. -Минск ; Нагасаки, 1997. - 368 с.

3. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализационной медици-ны: рукводство для врачей / В.Г. Кукес [и др.] - М. : ГЭОТАР-МЕДиа, 2008 - 304 с.

4. Мирошниченко, И.И. Биодоступность лекарственных средств / И.И. Мирошниченко, И.И. Тюляев, А.П. А.П. Зуев. - М. : Грамотей, 2003. - 110 с.

5. Раменская, Г.В. Разработка методики количественного определения маркера актив-ности Р-гликопротеина фексофенадина в плазме крови / Г.В. Раменская, Е.В. Скуридина, Л.М. Красных // Хим. фарм. журн. - 2006. - Т. 40, № 12. - С. 47-50.

6. Середенин, С.Б. Лекции по фармакогенетике / С.Б. Середенин. - М. : МИА, 2004. - 303 с.

7. Human Multidrug Resistance ABCB and ABCG Transporters: Participation in a Chemoim-munity Defense System / B. Sarkadi [et al.] // Physiol. Rev. - 2006. - Vol. 86. - P.1179-1236.

8. Nishio, N. Thyroid hormone regulates the expression and function of P-glycoprotein in Ca-co-2 cells / N. Nishio, T. Katsura, K. Inui // Pharm. Res. - 2008. - Vol. 25(5). - P. 1037-1042.

9. Scotto, K.W. Transcription of the multidrug resistance gene MDR1: a therapeutic target / K.W. Scotto, R.A. Johnson // Molecular Interventions. - 2001. - Vol. 1. - P. 117-125.

10. The Colorado Thyroid Disease Prevalence Study / G.J. Canaris [et al.] // Arch. Intern. Med. - 2000. -Vol. 160. - P. 526-534.

11. The multidrug resistance protein family / P. Borst / / Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 1461, №2. - P. 347-357.

12. Viguerie N. Effect of thyroid hormone on gene expression / N. Viguerie, D. Langin // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. - 2003. - Vol. 6. - P. 377-381.

INFLUENCE OF THE THIAMAZOLE ON THE P-GLYCOPROTEIN FUNCTIONAL ACTIVITY

E.N. YAKUSHEVA A.S. BYRYUKOVA A.V. SHCHULKIN

Ryazan State MedicalUniversity e-mail: enya.rzn@yandex.ru

In the research the influence of a thiamazole on the activity of the protein- transporter P-glycoprotein (Pgp) on the rabbits was studied. Activity of the Pgp was investigated by the pharma-cokinetics of its marker substrate fexofenadine. It was established that introduction of a thiamazole in a dose 2,5 mg/kg and 5 mg/kg within 21 days lead to dose-dependent decline of Pgp activity, including 5-day drug withdrawal. Key words: P-glycoprotein, MDR1, thiamazole, hypothyroid-ism, fexofenadine.