УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ОБЪЕКТОВ ЛАЗЕРНЫМ ПУЧКОМ

Устройство для возбуждения люминесценции объектов лазерным пучком
Область техники
Полезная модель относится к устройствам для получения изображения люминесцирующих объектов на прозрачной или непрозрачной подложке, в частности для получения изображения биологических микрочипов в свете их люминесценции.
Предшествующий уровень техники
Для получения изображения люминесцирующих объектов в качестве источников возбуждающего света используют различные устройства: лампы накаливания, газоразрядные лампы, светодиоды, лазерные диоды. Первые два типа источников позволяют возбуждать люминесценцию объекта в разных спектральных диапазонах, от ультрафиолета до инфракрасной области. Вместе с тем, поскольку эти источники излучают энергию в широкой области спектра, эффективность возбуждения в каждой данной спектральной области оказывается очень невысокой, и в последнее время все чаще в приборах, предназначенных для исследования люминесценции разных объектов, в качестве источников возбуждающего люминесценцию излучения используются два последних типа: светодиоды и лазерные диоды. В последние годы для возбуждения люминесценции микрообъектов все чаще используют лазерные источники излучения. Достоинством этих источников является высокая яркость при малых размерах и при малом энергопотреблении, а также высокая монохроматичность излучения, что позволяет с высокой чувствительностью и низкими энергозатратами получать высококонтрастное изображение различных люминесцирующих микрообъектов, в частности, люминесцирующих микрочипов, расположенных на прозрачной или непрозрачной подложке.
В настоящее время для получения изображения микрообъектов в свете их люминесценции используют два способа лазерного освещения. В одном случае для получения изображения используют сканирование объекта узким пучком лазера (диаметр пучка от 0,2 до 2 мкм). Примером приборов, основанных на этом принципе, являются лазерные конфокальные микроскопы, описание подобных устройств дано в патентах US 4983818 А, ЕР 0833181 В1, ЕР 1064579 А1 и многих других. Этот способ использует принцип конфокальности, при котором на приемник света в каждый индивидуальный отрезок времени попадает излучение лишь малой точки, освещаемой в данный момент. Последующее воссоздание изображения производят с помощью компьютерной обработки индивидуальных сигналов. Этот способ обеспечивает более высокую чувствительность, что особенно существенно при исследовании слабо светящихся объектов; однако приборы, работающие на этом принципе, относительно дороги, они содержат прецизионные движущиеся компоненты, могут работать лишь в стационарных лабораториях.
В другом случае изображение объекта получают, возбуждая люминесценцию расфокусированным лазерным пучком, который освещает широкое поле (обычно диаметром до 10-20 мм); примером приборов, основанных на втором принципе, являются стандартные люминесцентные микроскопы (СЛМ) и анализаторы биочипов (Патенты WO 2002074055 А2, US 20120050852 А1. Приборы, работающие на этом принципе, обладают несколько меньшей чувствительностью по сравнению с конфокальными лазерными сканаторами, однако они оказываются более дешевыми и позволяют добиться высокой производительности при исследовании однотипных объектов.
Для равномерного освещения объекта с использованием расфокусированного лазерного диода используют разные методы. В некоторых случаях объект освещают одновременно несколькими источниками одной длиной волны излучения с тем, чтобы добиться максимальной освещенности объекта возбуждающим люминесценцию светом. Известно устройство для освещения объектов с помощью нескольких лазерных диодов, свет от которых подводится с помощью оптических волокон к торцам подложки (патент US 6620623 В1), на которой расположен объект, в данном случае биологический микрочип. Подложка изготовлена из стекла, и свет, попавший в толщу подложки распространяется внутри подложки, отражаясь от границы стекло-воздух в соответствии с законом полного внутреннего отражения. В местах, где на поверхности стекла имеются какие-либо объекты, имеющие показатель преломления более высокий, чем показатель преломления воздуха, свет выходит из стекла и возбуждает люминесценцию красителя, содержащегося в указанных объектах. Оптическая схема прибора собирает изображение поверхности стекла в свете люминесценции и направляет это изображение на матрицу ПЗС камеры. Данное устройство работает только с объектами, расположенными на прозрачной (стеклянной) подложке, и не может работать с объектами, расположенными на непрозрачной подложке, что ограничивает область применения прибора,
Наиболее близким к данной полезной модели является устройство, описанное в Российском патенте РФ №2510959. В данном патенте освещение люминесцирующих объектов (в данном случае, биологических микрочипов) осуществляется с помощью кольцевого волоконно-оптического осветителя, установленного на оправу объектива.
Осветитель содержит несколько индивидуальных пучков оптических волокон, таким образом, что каждому лазеру соответствует один пучок волокон. При этом каждый пучок разделен со стороны, обращенной в сторону образца, на отдельные волокна, причем концы волокон от разных лазеров расположены по окружности кольцевой опоры с чередованием и ориентированы под острым углом к оси этой кольцевой опоры в сторону анализируемого образца, когда он установлен в держатель. Данная схема освещения позволяет работать с объектами, расположенными на прозрачной и непрозрачной подложке, и позволяет увеличить равномерность освещенности исследуемого объекта за счет возможности его освещения возбуждающим светом с разных сторон при использовании индивидуальных лазеров или любой комбинации лазеров.
Недостатком данной системы освещения является то, что, хотя сами лазерные диоды являются монохроматичными источниками, тем не менее, их излучение возбуждает люминесценцию компонентов оптической системы, находящихся между ними и объектом, таких как склейки и оправы фокусирующих линз материал или оправы оптических волокон, подводящих возбуждающий свет к объекту.
В зависимости от материала компонентов, находящихся между источником света и объекта, этот вклад может быть различен при разных способах освещения объекта расфокусированным лазерным пуском и при разных длинах волн возбуждающего света. Он максимален при возбуждении в ультрафиолете или синими лучами (при исследовании красителей типа флуоресцеина или ДАПИ), меньше при возбуждении зеленым светом (исследование красителей типа Су3), еще меньше при возбуждении красным светом (исследование красителей типа Су5). В то же время, оптические волокна из полиметилметакрилата, наиболее часто применяемые в кольцевых волоконно-оптических осветителях, люминесцируют при возбуждении ближними ИК лучами. Таким образом, задачей данного изобретения являлось устранение люминесценции компонентов оптической схемы, расположенных между лазерным источником и объектом.
возб
возб
возб
Для уменьшения влияния дополнительного свечения, возникающего на компонентах приборов, использующих для возбуждения люминесценции лазерный источник, между лазерными источниками и исследуемым объектом нами были применены дополнительные узкополосные фильтр, которые пропускали длину волны излучения лазера и отсекали другие длины волн. Введение таких фильтров позволяет резко уменьшить влияние свечения оптических волокон, оправ линз и других компонентов системы, в то время, как люминесценция самого исследуемого объекта практически не будет ослаблена. Измерения показали, что при использовании таких фильтров чувствительность анализатора существенно возрастает. Этот эффект максимален для флуорохромов с максимумом возбуждения в синей области спектра (флуоресцеин: λ 488 нм), ниже для флуорохромов с максимумом возбуждения в зеленой области (аналоги Су3: λ 532 нм), еще ниже для флуорохромов со спектром возбуждения в красной области (аналоги Cy5: λ 655 нм). Наши измерения показали, что даже для флуорохромов со спектром возбуждения в красной области введение таких фильтров позволяет повысить пороговую чувствительность прибора примерно в 5-6 раз.
Для проверки эффективности влияния дополнительных фильтров на чувствительность прибора нами был сконструирован анализатор биочипов, аналогичный описанному в патенте РФ №2510959, но в котором между лазерными источниками излучения и объектом помещали один или два интерференционных фильтра, последовательно стоящих один за другим в ходе лучей. Эти фильтры пропускали основную длину излучения лазерных источников и отсекали свет флуоресценции других компонентов, в частности люминесценцию оправок и линз самих источников.
В таблице 1 показано влияние дополнительных фильтров при измерении интенсивности флуоресценции ячеек биологического микрочипа, содержащих краситель Су5 (максимум спектра возбуждения - 650 нм, максимум спектра флуоресценции - 670 нм.). Расфокусированный свет от лазерных источников с помощью кольцевого волоконно-оптического осветителя направлялся на поверхность высушенного биологического микрочипа, изображение люминесцирующего микрочипа после прохождения запирающего интерференционного фильтра собиралось оптической системой и направлялось на матрицу ПЗС камеры. В качестве источника света использовали красные лазеры с длиной волны 655 нм, в качестве запирающего фильтра использовали интерференционный фильтр фирмы Семрок (США) FF01-716/43, в качестве дополнительных возбуждающих фильтров использовали интерференционные фильтры 655AF50 фирмы Omega Opticals (США).
Таблица 1. Зависимость сигнала ПЗС камеры, полученного от флуоресцирующих ячеек микрочипа от запирающего фильтра. В качестве источников света - красный лазер 652 нм. В левом столбце столбцах - измеряемые величины, в остальных столбцах - условия измерения. Два правых столбца различаются тем, что в одном случае между источниками излучения и объектом вводили один дополнительный фильтр, в другом - два дополнительных фильтра, поставленных один за другим, для более полного отсекания флуоресценции компонентов прибора.
Два фильтра, поставленных один за другим, снижают фоновый сигнал до уровня темнового. Потери полезных сигналов при этом составляют около 10%. В случае применения лазеров с длиной волны 760 нм и пластикового осветителя разница еще более значительна. Эффект влияния дополнительного возбуждающего фильтра, помещаемого между источником лазерного излучения и объекта, зависит от длины волны и конструкции лазера и от устройства оптической схемы, однако во всех случаях он дает существенное улучшение соотношения сигнал фон.