СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ РЕТИНОБЛАСТОМЫ У ДЕТЕЙ
METHOD FOR ASSESSING SEVERITY OF RETINOBLASTOMA IN CHILDREN

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для оценки тяжести течения ретинобластомы у детей.
Ретинобластома (РБ) - злокачественная опухоль сетчатки у детей раннего возраста. В большинстве случаев оценку тяжести течения РБ проводят, основываясь на выявлении определенных клинических признаков и результатов различных методов обследования: биомикроскопии, офтальмоскопии, ультразвуковой эхографии, оптической когерентной томографии, флюоресцентной ангиографии, компьютерной томографии, молекулярно-генетического анализа, тонкоигольной аспирационной биопсии, иммунологических исследований [Бровкина А.Ф. Офтальмоонкология. М.: Медицина, 2002. - 421 с.; Нероев В.В., Саакян С.В., Мякошина Е.Б., Тацков Р.А., Зайцева О.В., Рябина М.В. Первый опыт применения оптической когерентной томографии в диагностике первичной и остаточной ретинобластомы // Вестник офтальмологии. - №2. - 2012. - С. 8-12]. Однако, несмотря на существующий арсенал диагностических методов, больные обращаются в высокоспециализированные учреждения с далекозашедшей стадией (D, E) РБ, осложненной кровоизлияниями, вторичной гипертензией, гипопионом. В таких случаях единственным методом лечения является энуклеация в комплексе с полихимиотерапией [Пантелеева О.Г. Ретинобластома: прогностическая значимость клинических симптомов, эффективность комбинированного лечения: Автореф. дис. канд. мед. наук. - М., 1997. - 185 с.; Саакян С.В. Ретинобластома (клиника, диагностика, лечение) / М.: Медицина, 2005. - 199 с.; Shields C.L. Retinoblastoma. Jaypee Brothers Medical Bublishers (P) Ltd., 2012. - 291 p.].
При A, B, C стадиях РБ возможно провести комбинированное органосохраняющее лечение, позволяющее сохранить не только жизнь, но и глаз ребенка как анатомический орган.
Онкогенное действие вирусов предполагалось давно, однако только в последние годы были получены прямые доказательства этиологической роли некоторых из них в генезе опухолей разной локализации. Среди возможных механизмов онкогенного действия вирусов выделяют нарушение клеточного цикла, ингибирование апоптоза [Goebel N., Mittelviefhaus А.Н., Reinhard Т., Bogdan С., Auw-Haedrich. Chlamydia psittaci, Helicobacter pylori and ocular adnexal lymphoma - is there an association? // Leukemia Research - 2007. - Vol. 31. - No 10. - P. 1450-1452].
Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) относят к порядку Herpesvirales, семейству Herpesviridae, подсемейству Gammaherpesvirinae, роду Lymphocryptovirus, виду герпесвирус человека 4 [Straus S.E. et al: Epstein-Barr virus infections: Biology, pathogenesis, and management // Ann. Intern. Med. - 1993. - Vol. 118. - P. 45; Okano M. et al: Epstein-Barr virus and human diseases: Recent advances in diagnosis // Clin. Microbiol. Rev. - 1988. - Vol. 1. - P. 300].
Развитие ВЭБ-ассоциированной карциномы желудка связывают с супрессивным влиянием вируса на белок ретинобластомы (РБ). Белок РБ играет важную регуляторную роль в клеточном росте и дифференцировке, его подавление - существенный, хотя и не единственный фактор, в развитии опухоли. Нарушение в транскрипции или экспрессии этого белка тесно коррелирует с возникновением и развитием опухоли желудка [Goebel N., Mittelviefhaus А.Н., Reinhard Т., Bogdan С., Auw-Haedrich. Chlamydia psittaci, Helicobacter pylori and ocular adnexal lymphoma-is there an association? // Leukemia Research - 2007. - Vol. 31. - No 10. - P. 1450-1452].
Риск развития РБ у детей с мутацией в гене RB1 повышается более чем на 90%. В последние годы высказана гипотеза о роли онкопротеина вируса папилломы человека Е7 в инактивации белка РБ и развитии спонтанной односторонней ретинобластомы [Orjuela М., Castaneda V.P., Ridaura С., et al Presence of human papillomavirus in tumor tissue from children with retinoblastoma: an alternative mechanism for tumor development // Clin. Cancer Res. - 2000. - Vol. 161. - Р. 4010-16]. Известна роль ВЭБ в этиопатогенезе ряда лимфом, саркомы Капоши [Cohen J.I. Epstein-Barr virus lymphoproliferative disease associated with acquired immunodeficiency // Medicine. - 1991. - Vol. 70. - P. 137; Pathmanathan R. et al. Clonal proliferations of cells infected with Epstein-Barr virus in preinvasive lesions related to nasopharyngeal carcinoma // N. Engl. J. Med. - 1995. - Vol. 333. - P. 693; Shin M.K., Sage J., Lambert P.F. Inactivating all three rb family pocket proteins is insufficient to initiate cervical cancer // Cancer Res. - 2012. - Vol. 15. - No 72. - P. 5418-27], однако связь ВЭБ-инфекции с тяжестью течения РБЛ до настоящего времени не была установлена.
Ранее проводили оценку тяжести течения РБ с помощью ультразвукового исследования. При этом выявляли локализацию, проминенцию, диаметр основания опухоли, наличие кальцинатов и при больших параметрах опухоли, юкстапапиллярной локализации и отсутствии кальцинатов оценивали течение как тяжелое [Саакян С.В. Ретинобластома (клиника, диагностика, лечение) / М.: Медицина, 2005. - 199 с.]. Этот способ принят за ближайший аналог. Однако указанный способ описывает лишь локализацию и размеры опухоли, не учитывает роль этиопатогенетических факторов в клиническом течении РБ.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа выявления тяжелого течения РБ у детей, характеризующегося переходом из стадии С в стадию D или Е, при котором отмечают появление на глазном дне новых узлов РБ, продолженного опухолевого роста, вторичной гипертензии и/или гемофтальма, несмотря на проводимое лечение.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность выбора соответствующей адекватной тактики лечения РБ у детей с учетом раннего определения индивидуальных особенностей клинического течения заболевания путем выявления серологических маркеров инфицированности онкогенным ВЭБ.
Технический результат достигается путем выявления уровня IgG-антител к раннему антигену вируса Эпштейна-Барр в сыворотке крови.
Сущность изобретения состоит в следующем.
Для оценки (выявления) тяжести течения ретинобластомы у детей в сыворотке крови определяют антитела к раннему антигену вируса Эпштейна-Барр и при их наличии оценивают течение как тяжелое.
Пациентам проведены все общеофтальмологические методы исследования, включая исследование сыворотки крови с выявлением в ней уровня IgG-антител к раннему антигену вируса Эпштейна-Барр.
В Российской Федерации вирусами группы герпеса инфицировано 82-98% популяции. Для этих микроорганизмов характерно длительное персистирование в организме инфицированного человека и склонность к реактивации под влиянием разнообразных неблагоприятных экзо- и эндогенных факторов.
В настоящее время доказано, что около 20% всех опухолей человека индуцируются вирусами или развиваются при их активном участии. Так доказано, что вирус Эпштейна-Барр, воздействуя на лимфоидную, эпителиальную и мышечную ткани человека, вызывает возникновение новообразований (лимфомы Беркитта, В-клеточных лимфобластных лимфом, Т-клеточных лимфом, болезни Ходжкина, NK-лимфомы, назофарингеальной карциномы, карциномы околоушных слюнных желез, желудка, лейомиосаркомы).
Вышесказанное послужило поводом для установления наличия или отсутствия активации ВЭБ при злокачественной опухоли - ретинобластоме.
Нами впервые была установлена связь между тяжестью течения РБ и наличием антител к раннему антигену вируса Эпштейна-Барр.
Способ осуществляется следующим образом.
Все дети обследованы под наркозом в условиях масимального медикаментозного мидриаза. В условиях медикаментозного сна с помощью анестезиологической бригады взята кровь из вены ребенка. В сухую пробирку берут 4 мл крови, дают отстояться форменным элементам крови и аккуратно (не захватывая эритроциты) отсасывают сыворотку. Сыворотку разливают по 0,3 мл, пробы хранят при -10-14°C до использования. Размораживают образцы однократно в день постановки анализа, повторное замораживание и размораживание проб не допускается.
Сыворотку исследуют в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с коммерческими наборами согласно инструкции производителя (в настоящее время несколько фирм выпускают коммерческие тест-системы для выявления IgG-, IgA- и IgM-антител к исследуемым нами возбудителям).
Постановка ИФА включает несколько этапов:
1. Внесение сыворотки пациента в лунки полистироллового планшета, на дне которого сорбирован известный антиген; контакт; отмывание. При наличии в сыворотке антител, гомологичных сорбированному антигену, образуется прочный иммунный комплекс, который не удаляется при последующем отмывании.
2. Внесение в лунки конъюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена, контакт, отмывание. Если на этапе 1 произошло образование иммунного комплекса антиген-антитело, конъюгат связывается с ним и не удаляется при отмывании.
3. Внесение хромогена, контакт. Под воздействием хромогена происходит изменение окраски лунок, в которых присутствует комплекс антиген-антитело-конъюгат. Раствор из бесцветного становится окрашенным.
4. Внесение стоп-реагента для окончания реакции.
5. Учет результатов на спектрофотометре (определение оптической плотности). Уровень антител выражают в разнице оптической плотности (ΔОП) исследуемой сыворотки по сравнению с контрольным образцом, в МЕ/мл или титре антител (в зависимости от инструкции фирмы, производящей наборы).
Производитель указывает значение cut off (отсекающей), выше которого показатели ОП оцениваются как положительные (антитела обнаружены), ниже - как отрицательные (антитела не выявлены). При выявлении в сыворотке крови серопозитивности к ВЭБ оценивают тяжелое течение РБ.
Пример 1
При диспансерном осмотре у ребенка Н., 4 мес., на глазном дне выявили серый проминирующий фокус в левом глазу.
Ребенка обследовали в условиях медикаментозного сна с максимальным медикаментозным мидриазом.
Проведенные офтальмологические исследования:
1. Визометрия: Visus OD - предметное зрение,
Visus OS - предметное зрение (эксцентрично).
2. Тонометрия: ВГД OD - 18 мм рт.ст., OS - 18 мм рт.ст.
3. Биомикроскопия: OU - спокойны, среды прозрачны.
4. Прямая офтальмоскопия и Ret Cam II:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - диск зрительного нерва бледно-розовый, границы четкие, в 2 PD от ДЗН с 5 до 6 определяется беспигментный очаг, серого цвета, овальной формы, с нечеткими и неровными границами, с гладкой поверхностью.
5. Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - «+» - ткань с проминенцией 5,2 мм, основание - 12,4 мм.
6. Результаты исследования в сыворотке крови:
Уровень IgG-антител к ранним (неструктурным) антигенам онкогенного вируса Эпштейна-Барр составил 0,9 Δ оп.
Диагноз - ретинобластома, группа С.
Проведено 3 курса системной полихимиотерапии, после чего ребенка обследовали в условиях медикаментозного сна с максимальным медикаментозным мидриазом.
Проведенные офтальмологические исследования после 3 курсов системной полихимиотерапии:
1. Визометрия: Visus OD - предметное зрение,
Visus OS - предметное зрение (эксцентрично).
2. Тонометрия: ВГД OD - 18 мм рт.ст., OS - 28 мм рт.ст.
3. Биомикроскопия: OU - спокойны, среды прозрачны.
4. Прямая офтальмоскопия и Ret Cam II:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - диск зрительного нерва бледно-розовый, границы четкие, в парамакулярной зоне, распространяясь к крайней периферии определяется рыхлая диффузная ткань серого цвета. На крайней периферии множественные мелкие узлы опухоли.
5. Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - «+» - ткань с максимальной проминенцией 4,2 мм, основание - больше 22 мм.
Отмечается неблагоприятное, тяжелое течение РБ, несмотря на проводимое лечение. Рекомендована энуклеация левого глаза с проведением 4 курсов системной полихимиотерапии с дальнейшим наблюдением обоих глаз.
Пример 2
При диспансерном осмотре у ребенка Ж., 9 мес., на глазном дне выявили серый проминирующий фокус в левом глазу.
Ребенка обследовали в условиях медикаментозного сна с максимальным медикаментозным мидриазом.
Проведенные офтальмологические исследования:
1. Визометрия: Visus OU - предметное зрение.
2. Тонометрия: ВГД OU - 18 мм рт.ст.
3. Биомикроскопия: OU - спокойны, среды прозрачны.
4. Прямая офтальмоскопия и Ret Cam II:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - диск зрительного нерва бледно-розовый, границы четкие, в 1,5 PD от ДЗН с 6 до 7 имеется беспигментный очаг, серого цвета, овальной формы, с нечеткими и неровными границами, с гладкой поверхностью.
5. Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - «+» - ткань с проминенцией 3,7 мм, основание - 14,6 мм.
6. Результаты исследования в сыворотке крови:
IgG-антител к ранним (неструктурным) антигенам онкогенного вируса Эпштейна-Барр не выявлены.
Окончательный диагноз - ретинобластома, группа С.
Рекомендовано 3 курса полихимиотерапии с дальнейшим осмотром под наркозом для определения тактики лечения.
Проведено 3 курса системной полихимиотерапии, после чего ребенка обследовали в условиях медикаментозного сна с максимальным медикаментозным мидриазом.
Проведенные офтальмологические исследования после 3 курсов системной полихимиотерапии:
1. Визометрия: Visus OU - предметное зрение,
2. Тонометрия: ВГД OD - 18 мм рт.ст., OS - 18 мм рт.ст.
3. Биомикроскопия: OU - спокойны, среды прозрачны.
4. Прямая офтальмоскопия и Ret Cam II:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - диск зрительного нерва бледно-розовый, границы четкие, в 1,5 PD от ДЗН с 6 до 7 определяется белесоватый очаг, неправильной формы, с четкими и неровными границами, с неровной поверхностью
5. Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - кальцинат с проминенцией 2,2 мм, диаметром основания - больше 10 мм.
Отмечается благоприятное, нетяжелое течение РБ. Рекомендовано продолжить 4 курса системной полихимиотерапии с дальнейшим динамическим наблюдением обоих глаз.