СПОСОБ СКРИНИНГОВОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСОКОЙ ВЕРОЯТНОСТИ НАЛИЧИЯ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА ВОСПАЛЕНИЯ, АССОЦИИРОВАННОГО С ПОВЫШЕННЫМ УРОВНЕМ В КРОВИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8, ПРИ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ У ДЕТЕЙ
METHOD FOR SCREENING DETERMINATION OF HIGH PROBABILITY AN ALLERGIC NATURE ASSOCIATED WITH HIGH LEVEL OF INTERLEUKIN-8 IN BLOOD IN CHILDREN WITH BRONCHOPULMONARY DISEASES

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии, клинической лабораторной диагностике. Изобретение может использоваться для оценки характера воспалительного процесса, скрининга аллергического характера воспаления у детей с бронхолегочными заболеваниями.
Известно, что аномалии воспалительного процесса могут приводить к нарушению регенерации и репарации тканей, развитию широкого спектра заболеваний, их тяжелым осложнениям (хронизации болезни, развитию аллергических реакций, фиброзу органов и тканей, ателектазам легких и пр.). При клиническом и инструментальном обследовании больного не всегда можно объективно оценить характер воспаления, хотя это необходимо для определения тактики лечения, разработки и применения новых лекарственных средств.
Исследования последних лет внесли вклад в понимание патогенеза тяжелых бронхолегочных заболеваний, их хронизации и серьезных осложнений (ателектазы или фиброз легких) [Tzouvelekis A., Bonella F., Spagnolo P. Update on therapeutic management of idiopathic pulmonary fibrosis. // Ther. Clin. Risk Manag. - 2015. - Vol. 11. - Р. 359-370].
Хронизация болезней легких, их осложнения, развитие тяжелых аллергических заболеваний являются результатом нарушений механизмов воспаления, опосредованного широким спектром регулирующих факторов [Atamas S., Chapoval S.P., Keegan A.D. Cytokines in chronic respiratory diseases. // Biol. Rep. - 2013. - Vol. 5. - N3. - Р. 1-12].
Однако до настоящего времени не предложено достаточно информативного и объективного способа оценки динамики и характера воспалительного процесса при бронхолегочных заболеваниях - биопсия тканей с последующим морфологическим исследованием является опасным и травмирующим методом, его осуществление часто невозможно ввиду состояния больного. Поэтому использование альтернативного, безопасного и малоинвазивного метода диагностики фаз воспаления, каким является метод оценки асептического воспаления in vivo, по-прежнему актуально.
Известен метод оценки асептической воспалительной реакции in vivo, разработанный Rebuch G., Crowley J. (1955) [Rebuck J.W., Crowley J.H. A method of studying leukocytic functions in vivo. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1955. - Vol. 59. - N 5. - Р. 757-805]. Он предполагает получение монослоя лейкоцитов, вышедших в зону асептического воспаления на участке кожи со скарифицированным эпидермисом. При смене предметных стекол, плотно прижатых к участку скарификации, указанный метод позволял оценить таксис лейкоцитов в зону альтерации кожного покрова в динамике локального асептического воспаления.
Модификация данного способа адаптирована к использованию в клинической лабораторной практике для характеристики активности нейтрофилов и моноцитов в процессе воспаления in vivo [Цветкова Е.И., Капелько М.А., Рябинская Т.Ф. и др. Цитологические методы в оценке реактивности детей при острой и хронической пневмонии. / Методические рекомендации. - М., 1982. - С. 16-19]. Данный метод позволял оценить состав клеточных элементов в двух фазах воспаления: I (нейтрофильной) и II (моноцитарной/макрофагальной). К достоинствам методов-прототипов относятся а) возможность оценки клеточных реакций in vivo; б) низкая травматичность; в) полная безопасность при соблюдении асептики.
Известен также способ оценки активности воспаления при бронхиальной астме [RU 2277710, C1]. В указанном способе использован тот же метод постановки реакции асептического воспаления и те же методы его оценки, что и в вышеуказанных известных способах. Дополнительным преимуществом этого метода является включение в оценку динамики реакции дополнительной точки исследования результатов (12 часов от начала реакции).
Известен способ оценки функциональных и цитоморфологических дефектов фагоцитов в экссудате асептического воспаления с элементами статистической обработки данных [RU 2013129534, А]. Было проведено исследование функциональных и цитоморфологических дефектов фагоцитов в экссудате асептического воспаления. К дополнительным достоинствам данного метода можно отнести возможность частичного использования статистических методов оценки результатов.
Однако известные, указанные выше способы предполагают лишь фрагментарную количественную оценку воспаления, не обеспечивают полной объективности при интерпретации данных.
Они позволяют получить только описательный характер заключения, интерпретация результатов проведенного исследования сложна и субъективна.
Кроме того, известные лабораторные методы исследования по уровню техники не позволяют количественно охарактеризовать аллергический характер воспаления при бронхолегочных заболеваниях у детей старше 2 лет, что ограничивает их внедрение в клиническую, особенно в педиатрическую практику.
Нами поставлена задача разработать простой, объективный способ скрининга аллергического характера воспаления у детей с бронхолегочными заболеваниями, позволяющий отобрать пациентов для последующего углубленного исследования и выбора оптимальной лечебной тактики.
Технический результат заключается в обеспечении доступности и объективности выявления аллергического характера воспаления у детей с бронхолегочными заболеваниями путем анализа количественных показателей кожной асептической воспалительной реакции трех фаз воспаления.
Нами установлен комплекс объективных показателей - скрининговых критериев, указывающих на аллергический характер воспаления при бронхолегочных заболеваниях у детей с повышенным уровнем интерлейкина-8 в крови (по сравнению с нормальным уровнем), основанных на количественной (морфометрической) оценке определенных клеточных элементов, характеризующих кожную асептическую воспалительную реакцию с учетом трех фаз воспаления.
Предлагаемые скрининговые критерии объективны и понятны специалистам. Внедрение в клиническую практику предложенного нами способа позволит повысить уровень диагностики аллергического воспаления при бронхолегочных заболеваниях у детей. Сущность изобретения заключается в следующем.
Для скринингового определения высокой вероятности наличия аллергического характера воспаления при бронхолегочных заболеваниях у детей старше 2 лет с повышенным содержанием интерлейкина-8 в крови (в сыворотке крови) скарифицируют участок эпидермиса на ладонной стороне предплечья. Получают отпечаток клеток и экссудата кожной асептической воспалительной реакции на предметных стеклах через 6, 24 и 32 часа с момента скарификации. Препараты фиксируют этанолом, окрашивают по Гимзе-Романовскому и микроскопируют при увеличении ×1000. Определяют во всех препаратах максимальное число лейкоцитов в поле зрения. В препарате, полученном через 6 часов с момента скарификации, дополнительно определяют количество лейкоцитов с признаками аутолиза в процентах от общего числа лейкоцитов (показатель аутолиза). В препарате, полученном через 24 часа с момента скарификации дополнительно определяют количество эозинофилов в процентах от общего числа лейкоцитов и максимальное количество ядер фибробластов в поле зрения. При наличии более 26 лейкоцитов в поле зрения через 6 часов с момента скарификации, менее 94 лейкоцитов через 24 часа с момента скарификации и менее 85 лейкоцитов через 32 часа с момента скарификации, при наличии через 6 часов с момента скарификации показателя аутолиза менее 67%, через 24 часа менее 0,3% эозинофилов и менее 5 ядер фибробластов в поле зрения определяют высокую вероятность наличия аллергического характера воспаления.
Способ осуществляется следующим образом.
-6
2
-8
2
На участке кожи внутренней поверхности предплечья у ребенка старше 2 лет с бронхолегочным заболеванием и повышенным содержанием интерлейкина-8 в крови по намеченному трафарету снимают слой эпидермиса. Размеры участка скарифицированного эпидермиса должны составлять 0,003×0,003 м (9×10 м=900×10 м). Нормальные показатели интерлейкина-8 в крови у детей -1 l,5-15,5 pg/ml.
На образовавшуюся поверхностную ранку накладывают стерильное предметное стекло размерами 0,025×0,025 м с зашлифованными краями. Плотно прижимают стекло к поверхности кожи и тщательно фиксируют. Через 6 часов (I, нейтрофильная фаза), 24 часа (II, моноцитарная/макрофагальная) и 32 часа (III, фибробластическая фаза) от начала постановки реакции стекла снимают, маркируют и немедленно заменяют на новые, за исключением III фазы.
Препараты в течение 15 мин фиксируют 96% этанолом и окрашивают по Гимзе-Романовскому. Под световым микроскопом при увеличениях ×100, ×1000 посредством компьютерной морфометрии оценивают результаты реакции асептического воспаления. Может быть использован микроскоп Axioscop 40 (Zeiss, Германия) с программным обеспечением морфометрического исследования «ВидеоТест Мастер», СПб, Россия.
Во всех препаратах определяют максимальное число лейкоцитов в поле зрения, которое регистрируют в результате просмотра всего препарата. Поиск зон с высокой плотностью лейкоцитов, как и ядер фибробластов, осуществляют при увеличении ×100. Подсчет числа лейкоцитов и ядер фибробластов осуществляют при увеличении ×1000.
2
-8
-6
2
-8
В каждой из трех фаз нами оценивались следующие количественные параметры воспалительного процесса: площадь зоны выхода элементов воспаления (в м ×10 при увеличении ×100); максимальная плотность (число) лейкоцитов в п/зр. (при увеличении ×1000); показатель аутолиза (% лейкоцитов с признаками аутолиза при увеличении ×1000), коэффициент спрединга (соотношение максимального и минимального диаметра, в ед), средний диаметр клеток в м ×10), площадь, занимаемая экссудатом (в м ×10 при увеличении ×100), максимальное количество волокон в п/зр. (при увеличении ×1000), количество нейтрофилов (% от всех лейкоцитов), моноцитов (% от всех лейкоцитов), лимфоцитов (% от всех лейкоцитов), эозинофилов (% от всех лейкоцитов, при увеличении ×1000), ядер фибробластов (максимальное количество в п/зр. при увеличении ×1000). Максимальные плотность лейкоцитов, число волокон и ядер фибробластов устанавливали по результатам анализа всего препарата. Относительное количество нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, эозинофилов в процентах определяли на 100 лейкоцитов.
Полное количественное параметрирование процесса воспаления позволило значительно увеличить объективность и точность оценки результатов, поднять на более высокий уровень методическую и диагностическую ценность метода.
Определяли высокую вероятность наличия аллергического характера воспаления, при бронхолегочных заболеваниях у детей старше 2 лет с повышенным уровнем интерлейкина-8 в крови, при наличии следующего комплекса показателей: максимальное число лейкоцитов более 26 в поле зрения через 6 часов с момента скарификации, менее 94 через 24 часа с момента скарификации и менее 85 через 32 часа с момента скарификации, при наличии через 6 часов с момента скарификации показателя аутолиза менее 67%, через 24 часа менее 0,3% эозинофилов и менее 5 ядер фибробластов.
С помощью предлагаемого способа высокая вероятность аллергического характера воспаления у детей в возрасте от 2 до 18 лет с болезнями органов дыхания с повышенным уровнем интерлейкина-8 со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания была выявлена у 48 больных. Во всех случаях аллергический характер воспаления был верифицирован данными клинического, лабораторного и инструментального обследования.
Результаты исследования подтверждают объективность динамической характеристики воспаления, полученной посредством разработанного нами количественного морфометрического способа.