Генотоксичность донных отложений реки дон и Азовского моря

делов «Отходы» и «Лимиты на размещение отходов» в раздел «Платежи».

Формирование документов отчетности на различные уровни определяется требованиями соответствующих органов, контролирующих положение с отходами. Состав хранимых данных, степень подробности их контроля позволяют создавать документы отчетности в самых разнообразных разрезах.

НИИ механики и прикладной математики РГУ__________

Литература

1. Остроухова В.М. и др. Компьютерная система «Отходы». Экология. Экономика. Информатика. Ростов н/Д, 1999. С. 130-133.

2. Шустова В.Л. и др. Подготовка внедрения компьютерной информационной системы управления данными об отходах на региональном уровне в Ростовской области. Экология. Экономика. Информатика Ростов н/Д, 2001. С. 52-54.

____________________________________14 Февраля 2003 г.

УДК 573.224.045

ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ РЕКИ ДОН И АЗОВСКОГО МОРЯ

© 2003 г. М.А. Сазыкина

SOS-induction in E.Coli was used for genotoxisity of bottom sediments testing. There were detected two areas contaminated by genotoxins -delta of r. Don and mouthe of river Manych. Genotoxisity was registered for all samples from Sea of Azov too.

Дон - крупнейшая река юга России. Район его нижнего течения - один из самых густонаселенных в европейской части России. Экосистема Нижнего Дона подвержена интенсивному антропогенному прессингу, проявляющемуся, в частности, в загрязнении промышленными, бытовыми и сельскохозяйственными стоками [1].

Одним из наиболее опасных следствий загрязнения водной среды является накопление в компонентах экосистем веществ, способных повреждать генетический аппарат клетки - генотоксинов. Поэтому проблема мониторинга генотоксичности различных природных сред является актуальной.

Донные отложения - важный компонент водных экосистем, в них проходят основные процессы биодеструкции, обитают моллюски- биофильтраторы и другие беспозвоночные, составляющие основу кормовой базы промысловых рыб. Одновременно донные отложения являются признанным депо генотоксинов. Поэтому корректные генетико-токсикологические исследования водных экосистем возможны только при условии изучения донных отложений.

Материалы и методы

Материалом проведенных исследований служили донные отложения, отобранные в 2001 - 2002 гг. в нижнем течении реки Дон и в Азовском море, при помощи дночерпателя. По 100 г каждой пробы упаковывали в химически чистую посуду и доставляли в лабораторию.

Главной методической проблемой при исследовании донных отложений является экстракция генотоксинов. Традиционно для этой цели применяются процедуры экстракции органическими растворителями, взятые из аналитической химии. В 1992 г. было показано, что более эффективной экстракции мутагенов, при использовании теста Эймса для их детекции,

можно достичь, применяя раствор неполярного детергента твин-80 в 96 % этаноле [2].

Для экстракции 20 г донных отложений помещали в коническую колбу Эрленмейера с притертой крышкой, добавляли 20 мл 1 % раствора твина-80 в этаноле и экстрагировали в течение 60 мин на круговой качалке УВМТ-12-250 при 69 об/мин при комнатной температуре. Затем экстракты фильтровали через обсззоленный бумажный фильтр «синяя лента», 50 мкл экстракта брали для тестирования генотоксичности.

Для тестирования генотоксичности применяли БОЗ-1их тест, основанный на использовании штамма Е. СоН РТ-1 (С600(рРЬ51)), несущего плазмиду, содержащую 1их-оперон под контролем БОБ-промотора. Повреждение ДНК тестерного штамма ведет к индукции свечения [3]. .

БОБ-Ьх тест был разработан для чистых веществ с выраженным мутагенным эффектом. Его применение для сложных смесей, которыми являются природные пробы, осложнено тем, что многие вещества способны усиливать и подавлять свечение,бактерий, действуя на ферментбактериальную люциферазу. Это может вызывать серьезные артефакты. Для решения данной проблемы мы предложили использовать дополнительный штамм РТ-5 (С600(рРЬ85)), генотип которого аналогичен 808-1их штамму, но 1их-оперон находится под контролем конститутивного промотора [4].

Операции с обоими штаммами проводили параллельно. Штаммы выращивали на среде ЬВР (пептон -10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлористый натрий -10 г на 1 л раствора; pH 7,0) в присутствии 50 мкг/мл ампициллина. В 50 мл среды вносили 1 мл ночной культуры Е.соН и инкубировали в термостате в течение часа при 1=37 °С. Затем добавляли среду ЬВР до достижения оптической плотности культуры 0,1 (550 нм). Аликвоты этой культуры по 1 мл переносили в стерильные пробирки типа «эппендорф» и добав-78

ляли в них необходимый объем тестируемой пробы. Тестирование и контроль проводили в двух повторностях. Содержимое пробирок тщательно перемешивали. Пробирки. помещали в термостат на 1 час при 37 °С. В процессе инкубации пробирки несколько раз встряхивали.

По окончании инкубации культуры охлаждали до комнатной температуры (10 мин). Измерение интенсивности биолюминесценции культур, содержащих анализируемые соединения, и контрольных культур проводили на люминометре ЛТ-01(Россия). Метаболическую активацию проводили по методу [5].

Степень индукции I (фактор индукции) определяли как отношение интенсивности свечения культуры штамма РТ-1, содержащей тестируемое соединение (среднее трех параллельных измерений), к интенсивности свечения контрольной культуры того же штамма (среднее трех параллельных измерений):

1=ЬсЯ±.

Коэффициент подавления свечения рассчитывали по формуле:

К = 1А,

где 1с - интенсивность свечения культуры штамма РТ-5 в присутствии тестируемого соединения; 1к - интенсивность свечения контрольной культуры того же штамма.

Истинное значение фактора индукции I рассчитывали по формуле:

Г = 1/К,

где К - коэффициент подавления.

Достоверность отличий по интенсивности свечения между опытными и контрольными пробами оценивали по критерию Стыодента. Вывод о генотоксич-ности пробы делали при р<0,05. Если при достоверном отличии опыта от контроля Г<2, обнаруженный генотоксический эффект оценивали как «слабый», то при 2<Г< 10 - как «средний», при 10<Г - как «сильный» эффект.

Величина Г после действия К-метил-1Ч-питро-М-нитрозогуанидина (5х10'6М), перекиси водорода (1,5х10'5М) и бенз(а)пирена (7,9х10'8 М), использованных в качестве позитивных контролей, составила 4,6; 21,1 и 2,6 соответственнно.. >

Результаты и их обсуждение

Результаты тестирования генотоксичности экстрактов представлены в табл. 1 и 2.

По данным табл. 1, из проб, отобранных в апреле 2001 г., генотоксичность проявляют только 2 (№ I, 8), отобранные в устьях Дона и Маныча.

В октябре 2001 г. генотоксичность выявлена в 5 пробах (№ 1, 2, 3, 8, 9), отобранных в тех же районах. Генотоксичные пробы 1,2,3 отобраны в дельте Дона, пробы 8,9 - в устье и ниже по течению Маныча. Весной 2002 г. генотоксичность регистрируется также в 5 пробах, отобранных в тех же районах. Повышенную генотоксичность образцов из авандельты Дона мы отмечали и ранее в наших исследованиях конца

Таблица I

Генотоксичность экстрактов донных отложений, отобранных в 2001-2002 гг.

№ пп Место отбора Г енотоксичность

Апрель 2001 Октябрь 2001 Апрель 2002

+Б9 -Б9 +Б9 -Б9 +Б9 -Б9

1 0 км, створ 1,7* 1,9* 0,9 2,3* 0,6 1,6*

2. 500 м ниже Азова 1,3 0,8 1,1 1,7* 0,8 1,5*

3 500 м ниже канализации г. Ростова -на-Дону 1,0 0,6 0,9 2,1* 1,2 1,1

4. 500 м ниже устья р. Темерник 0,6 0,4 0,6 1.4 1,1 0,8

5. 500 м ниже устья р Аксай 1.5 0,4 0,7 0,9 1,4 1,0

6. Устье р. Аксай 1,2 0,4 0,4 0,8 1,5 1,0

7. 500 м выше устья р. Аксай - - 0,4 1,2 1,4 1,1

8. 500 м ниже устья р. Маныч 1.0 0,4 0,7 2,6* 1,6* 1,1

9. Устье р. Маныч 1,6* 0,3 0,8 1,6* 1,6* 0,7

10. 500 м выше устья р. Маныч — - 0,7 1,3 2,5* 0,8

11. 500 м ниже устья р. Сал - - 0,5 0,9 1,5 0,7

12. Устье р. Сал 0,4 0,3 0,4 0,8 1,4 1,3

13. 500 м выше устья р. Сал - - 0,6 0,8 1,0 1,5

14. 500 м ниже устья р. Северский Донец 0,6 0,3 0,9 1,2 - -

15. Устье р. Северский Донец 1,0 0,3 0,7 1.3 1.0 0,7

16. 500 м выше устья р. Северский Донец - - 0,8 1,3 1,0 0,5

*- Отличия от контроля статистически достоверны (р<0.05).

80-х - начала 90-х гг., в период до промышленного спада [б]. Вероятно, эффекты, регистрируемые в дельте Дона, вызваны сбросами промышленных предприятий Ростова-на-Дону. Пониженная активность образцов, отобранных весной, по сравнению с осенью подтверждает это предположение. Видимо, токсичные компоненты промстоков смываются паводковыми водами и накапливаются летом.

Генотоксичность воды Маныча может быть связана с пестицидным загрязнением, интенсивным источником которого является выращивание риса, осуществляемое в бассейне этой реки.

В свете полученных данных Азовское море представляется резервуаром генотоксинов, приносимых током, особенно паводковым, впадающих в него рек. Это подтверждается данными, представленными в табл. 2: все пробы, отобранные из различных точек акватории, проявляют генотоксичность, при этом величина регистрируемых эффектов превышает таковую для Дона.

Таблица 2

Генотоксичность донных отложений Азовского моря

Регистрируемые уровни загрязнения генотоксина-ми следует признать высокими, они эквивалентны эффектам бенз(а)пирена в концентрациях 10-30 мкг/кг сырой массы донных отложений при условии 100 % экстракции, что на порядок превышает глобальный фон этого соединения. Такие концентрации встречаются в донных отложениях Нижнего Дона [1].

Однако существующие данные химанализа не дают возможности проидентифицировать действующее вещество. Такое положение характерно для исследований, проводимых на самых разных водоемах. В частности в [7] показано, что конверсия всего объема полиароматических углеводородов (ПАУ), содержащихся в образцах воды из реки Св. Лаврентия (Канада), в бенз(а)пирен способна объяснить только небольшую часть - около 10 % наблюдаемой геноток-сичности. При этом необходимо иметь в виду, что далеко не все ПАУ генотоксичны. Как показали наши исследования, генотоксичность Донской воды, выявляемая в экспресс-тестах, хорошо коррелирует с ее способностью вызывать кластогенные, тератогенные

и летальные эффекты у ценных промысловых рыб [8, 9]. С большой долей уверенности можно предположить и индукцию негативных эффектов у человека. Так, согласно статистическим материалам Комитета по охране природы Ростовской области в Азове, расположенном в дельте Дона, отмечена повышенная по сравнению со средней по области частота онкологических заболеваний [1].

Проблема неполноты данных химического анализа, проводимого в ходе «экологических» исследований водоемов Азово-Донского бассейна, неоднократно обсуждалась нами ранее [8]. Полученные данные указывают на то, что пауза в токсикологическом прессинге, вызванная спадом промышленности, кончилась, а проведение специальных исследований по идентификации и выявлению источников генотокси-нов, в том числе и канцерогенных, присутствующих в воде Дона, стало насущной необходимостью.

Литература

1. Государственный доклад «О состоянии окружающей среды Ростовской области в 1999 году». Ростов н/Д, 2000.

2. Чистяков В.А., Корнилов В.Н. Способ определения мутагенной активности донных отложений: А.с. № 1835924. РФ. 13.10. 1992

3. ПтицынЛ.Р. //Генетика. 1996. Т.32.№ 3. С.354—358.

4. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Войнова Н.В. Способ определения генотоксичности химических веществ. Патент№ 2179581. РФ. 2001.

5. Сазыкина М.А. II Вопросы рыболовства. 2000. Т.1. № 2-3. С. 105-106

6. Чистяков В.А., Корнилов В.Н. II Генетика. 1991. Т. 27. № 4. С. 749-752.

7. P. White, J. Rasmussen., С. Blaise II Environmental Toxicology and Chemistry. 1998. Vol.17. N.2. P. 286-303.

8. Тихонова JI.C. и dp 11 Основные проблемы рыбного хозяйства и охраны рыбохозяйственных водоемов Азовского бассейна. Ростов н/Д, 1996. С.75-81

9. Чистяков В.А. и др. II Среда, биота и моделирование экологических процессов в Азовском море / Ред. Г.Г. Матишов. Аппатиты, 2001. С. 218-226.

5 августа 2002 г.

Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства

Районы моря, координаты Г енотоксичность

+S9 -S9

Темрюкский район 45°32’Ы/37°14’Е 1,3 3,6*

Центральная часть 45°36’Ы/37°02’Е 1,4 5,4*

Центральная часть 45°52’М/37°12'Е 1,6* 4,5*

Ахтарский район 40°23’Ы/37“39’Е 1,1 1,8*

Ахтарский район 46°28’М/37°27’Е 0,8 2,3*

Камышеватско-Должанский район 46°28’М/37°27’Е 1,0 2,3*

Камышеватско-Должанский район 40°23’Ы/37°37’Е 3.1* 2,1*

Белосарайский район 46°32’Ы/37°37’Е 0,6 2,5*

*- Отличия от контроля статистически достоверны (р<0.05).