Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения убихинона в гидробионтах

2003

Известия ТИНРО

Том 135

УДК 577.115:574.5

В.Г.Рыбин

ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УБИХИНОНА

В ГИДРОБИОНТАХ

Разработан метод определения убихинона Q-10 в тканях гидробионтов высокоэффективной жидкостной хроматографией. Метод включает экстракцию общих липидов из тканей гидробионтов, получение убихинонсодержащей фракции посредством отделения балластных липидов от суммарной липидной фракции и последующий ее анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией. Идентификация убихинона осуществляется по времени удерживания и спектру поглощения в УФ-диапазоне электромагнитных колебаний. Метод был применен к анализу содержания убихинона Q-10 в морских ежах Strongylocentrotus nudus (гонады), в корбикуле Corbicula japonica и в кукумарии Cucumaria japonica (гонады). Применение данного метода позволило определить убихинон Q-9 в сердце горбуши Oncorhynchus gorbuscha.

Rybin V.G. Application of high performance liquid chromatography to determination of ubiquinone in hydrobionts // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 135. — P. 302-318.

Method of determination of ubiquinone Q-10 in hydrobionts tissues by means of high performance liquid chromatography has been developed. The method includes the extraction of common lipids from hydrobionts tissues , isolating the fraction containing ubiquinone by its separation from ballast lipids by solid phase extraction , and then analysis of the ubiquinone-containing fraction by means of high performance liquid chromatography. Identification of ubiquinone was carried out by retention time and UV spectrum of absorbance using ubiquinone Q-10 standard spectral characteristics. Qualitative calibration of standard chromatogram has been carried out by HPLC-MS analysis. Pure ubiquinone Q-10 has been isolated from standard solution by column chromatography on silica gel and used for quantitative calibration of all following analytical procedures by weight method. The method has been applied to analysis of ubiquinone Q-10 content in some invertebrates species such as Strongylocentrotus nudus (gonads), Corbicula japonica and Cucumaria japonica (gonads), and in salmon Oncorhynchus gorbuscha (heart). The obtained results have good correspondence with early reported ones.

Распространенные в мировой практике методы определения соединений группы биогенных хинонов основываются на характеристическом поглощении этих соединений в ультрафиолетовом диапазоне электромагнитных колебаний. Известно, например, что все гомологи убихинона имеют специфический качественно идентичный УФ-спектр (рис. 1) с несколько различающимися коэффициентами экстинкции (табл. 1). Характеристические максимумы поглощения всех гомологов убихинона наблюдаются при 275 нм и 405 нм в этаноле.

Рис. 1. Электронный спектр поглощения гомологов убихинона в этаноле

Fig. 1. UV-VIS spectrum of ubiquinones homologs in ethanol

X, HM

Таблица 1

УФ-спектральные показатели убихинонов

Table 1

UV spectral data of ubiquinones

Показатель Q-6 Q-7 Гомологи Q-8 Q-9 Q-10

УФ-спектр в этаноле, Е1%1 см:

при Xmax 275 нм 252 221 206 185 165

при X . 236 нм r min - 39,5 38,0 33,1 28,4

Отмеченное обстоятельство объясняется наличием в структурах всех гомологов убихинона одного и того же хромофора — хинонового ядра. Боковые же цепи не поглощают УФ-лучи в этой части спектра, однако общее количество двойных связей влияет на величину коэффициента экстинкции. В гексане максимумы смещаются на 2-3 нм в коротковолновую область (Донченко, 1988).

Для разделения и идентификации убихинонов до сравнительно недавнего времени широко применялись такие хроматографические методы, как бумажная, тонкослойная, колоночная и газовая хроматография (Katsш, Ohmae, 1967). Применение описанных методов характерно для обнаружения широкого ряда пренил-хинонов и родственных соединений, однако на последнем этапе — идентификации — во всех случаях использовалась УФ-спектрофотометрия как метод обнаружения характеристического хромофора.

Применение вышеописанных методов подразумевает необходимость проведения предварительного сложного процесса пробоподготовки. Это связано с тем, что УФ-спектральные либо хроматографические (ТСХ) характеристики для ряда прениллипидов являются близкими, а количественное отделение их от основного балластного компонента любого липидного экстракта — триглице-ридов — практически невозможно. При использовании в качестве метода для такого разделения колоночной хроматографии на силикагеле значительно снижается воспроизводимость общей процедуры. Для преодоления этого затруднения исследователи предпринимали ряд усовершенствований, связанных, например, с заменой силикагеля на частично дезактивированную добавлением воды окись алюминия (Донченко, 1988). Тем не менее максимальный выход убихинона согласно этой процедуре составлял менее 90 %. При отделении хинонов от балластных триглицеридов посредством проведения предварительного омыления также возникает ряд осложнений, связанных, например, с тем, что при использовании водно-спиртовой (этанол) щелочи происходит частичное замещение метоксильных групп в хиноновом кольце на этоксильные (Shunk et а1., 1960) и, как результат, — изменение спектральных и хроматографических характеристик анализируемых хинонов. В случае применения водно-метанольной щелочи существенно снижается общая степень извлечения целевых пренилхинонов (Shunk

215 235 255 275 295 315 335 355 375 395 415 435 455

е! а1., 1960). Тем не менее на сегодняшний день предложен ряд методов количественного извлечения ряда прениллипидов из биологических объектов для их последующего анализа (Донченко, 1988). Выход некоторых представителей данной группы соединений составлял около 95 % для холестерина и токоферолов, однако убихиноны в результате проведения таких процедур выделялись в частично восстановленном виде, что, несомненно, можно отнести к недостаткам предлагаемых методик, которые в дальнейшем модифицировались, однако к существенному изменению показателя выхода хинонов это не приводило (Донченко и др., 1979).

Применение метода ТСХ для проведения качественного анализа пренилхи-нонов после проведения предварительного омыления в некоторой степени себя оправдывало. Были подобраны условия для осуществления хорошего разделения ряда прениллипидов на пластинках с различными неподвижными фазами. Тем не менее при наличии в экстракте широкого списка представителей данной группы липидов часто наблюдалась смазанная картина, обусловленная высокой степенью диффузности большинства наблюдаемых пятен, что в свою очередь требовало проведения этапа предварительного гидролиза липидов, благодаря тому, что основной компонент экстрактов — триглицериды — полностью собой перекрывали на пластинке ряд искомых прениллипидов (рис. 2). Кроме того, предложенные оптимальные условия для проведения колоночной хроматографии прениллипидов (элюирование градиентом петролейного эфира и диэтилового эфира, табл. 2) отличались от условий элюирования целевых компонентов экстрактов в бензольных системах.

Рис. 2. Зарисовка хроматографической пластинки после проведения ТСХ-анализа неомыляемых компонентов липид-ного экстракта из тканей крыс (справа) и общего липидного экстракта до проведения омыления. H еподвижная фаза — окись алюминия (рН 7), элюент — бензол-диэтиловый эфир (95: 5). 1 — холестерин, 2 — ретинол, 3 — неидентифицированный компонент, 4 — убихроменолы, 5 — а-токоферол, 6 — убихиноны, 7 — филлохинон, 8 — в-каротин

Fig. 2. TLC analysis of unsaponified components of lipid extract from rat tissues (right) and common lipid extract before saponification. Sorbent — aluminium oxide, solvent system — benzene-diethylic ether (95: 5). 1 — cholesterol, 2 — retinol, 3 — unknown component, 4 — ubichromenols, 5 — а-toco-pherol, 6 — ubiquinones, 7 — phylloquinone, 8 — (3-carotene

Таблица 2

Порядок и условия элюирования неомыляемых компонентов липидных экстрактов

Table 2

Elution conditions of unsaponified components of lipid extracts

Условия элюирования

Элюируемые компоненты экстрактов

30 мл петролейного эфира (ПЭ), ^ 20 мл диэтилового эфира: ПЭ, % 5 8 12 14 16 20 50

30 мл диэтилового эфира

40-60 оС Каротины и другие углеводороды

Филлохинон

Убихиноны

Токоферолы

Убихроменолы

Ретинол

Холестерин,стеролы Неидентифицированные _Минорные компоненты_

Таким образом, проведение по современным меркам достаточно громоздких процедур, необходимых для спектрофотометрического определения пренил-липидов, весьма снижает точность анализа. Этому способствует и высокая лабильность определяемых соединений (убихиноны, например, высокочувствительны к свету, поэтому все процедуры, связанные с их выделением, необходимо проводить в темноте или в защищенной от света лабораторной посуде, что само по себе представляет определенные неудобства). С активным внедрением в последнее время в практику биохимических исследований высокоэффективной жидкостной хроматографии на химически инертных неподвижных фазах возрастает степень воспроизводимости анализа высоколабильных соединений. Кроме того, возможность использования ряда детекторов, регистрирующих сигналы анализируемых веществ по их УФ-спектральным, флюоресцентным и другими характеристикам, позволяет провести количественное определение искомого компонента смеси с высокой степенью точности. Применение масс-селективного детектора, а в особенности комбинированного, например, с УФ-детектором, существенно облегчает идентификацию анализируемых веществ (Энгельгардт, 1980; Высоцкий и др., 2001). Проведение процесса пробоподго-товки исследуемых экстрактов в ряде случаев, и в том числе в случае липид-ных экстрактов, минимизировано за счет применения широко распространенного в последнее время метода твердофазной экстракции на химически инертных сорбентах, например обращенных фазах. К примеру, было показано, что одновременное определение ретинола, а-токоферола и эргокальциферола в жирах и липидных экстрактах из тканей биологических объектов значительно облегчается при проведении предварительной твердофазной экстракции этих витаминов на обращенной С12 фазе, причем выходы этих прениллипидов приближались к 99 % (Рыбин, Саяпина, 1999).

Высокоэффективная жидкостная хроматография применялась и для анализа липидных экстрактов из тканей разных биологических объектов на предмет обнаружения прениллипидов. Более того, разработаны условия для полного разделения широкого списка представителей класса прениллипидов с целью их одновременного определения практически в любых биологических объектах (ЫЛ-1епШа1ег, 1984). Однако проведение ВЭЖХ-анализа подразумевает адаптацию известных условий хроматографического разделения к конкретному оборудованию, а также качественную и количественную перекалибровку хроматограммы стандартных смесей, получаемых в новых условиях.

С другой стороны, состав прениллипидов организмов животных зависит от способа питания последних. Например, липиды растительноядных животных содержат повышенное количество неметаболизируемых их организмами растительных прениллипидов. Это обстоятельство наблюдается и для ряда представителей гидробионтов, использующих фильтрующий способ питания, при котором прениллипиды микроводорослей аккумулируются в органах пищеварительного тракта. Поэтому анализ полного состава прениллипидов в тканях таких организмов весьма затруднен и иногда требует проведения специальной пробоподготовки с целью последующей точной идентификации искомых компонентов липидной фракции, а также определения их содержания в анализируемых тканях.

Целью настоящей работы была разработка метода определения убихинона Q-10 в тканях различных гидробионтов высокоэффективной жидкостной хроматографией. Подход к реализации поставленной задачи заключал в себе оптимизацию условий количественного извлечения убихинона Q-10 из тканей морских гидробионтов и определение условий проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии, при которых достигается максимально возможное разрешение пика убихинона Q-10, позволяющее определить содержание этого вещества в тканях исследуемых гидробионтов с высокой степенью точности.

Объекты исследования

Двустворчатый моллюск Corbicula japónica был предоставлен лабораторией биотехнологии пищевых и технических продуктов ФГУП "ТИНРО-центр", образцы сердец горбуши Oncorhynchus gorbucsha, образцы мужских и женских гонад кукумарии Cucumaria japónica были предоставлены лабораторией прикладной биохимии ФГУП "ТИНРО-центр", морские ежи Strongylocentrotus nu-dus были собраны в период активного промысла в июне—июле, в бухте Прогулочной зал. Петра Великого.

В работе использованы следующие органические растворители: н-гексан, петролейный эфир (40-70 oC), хлороформ, бензол, этилацетат, метанол, этанол, изопропиловый спирт, ацетонитрил, ацетон, диэтиловый эфир. Все растворители очищали по стандартным методикам (Гордон, Форд, 1976). Серная, соляная, уксусная кислоты были квалификации "хч"; гидрооксид натрия, гидрооксид калия, сульфат натрия, фосфорномолибденовая кислота, оксид фосфора (V) — квалификации "чда". Препарат "CO-Q10" производства фирмы "Enrich" (США) приобретен в розничной аптечной сети.

Экстракцию липидов проводили по методу Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959).

Твердофазную экстракцию осуществляли на колонках Supelclean C18 (Supelco, США) c использованием водно-метанольных систем в качестве элюен-та. Контроль содержания фракций проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляли на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-6A (Япония) c использованием колонок Z orbax ODS (4,6 х 250 мм, 5 мкм, "D uPont", США), Z orbax SIL (4,6 х 250 мм, 5 мкм, "D uPont", США) и детектора с диодной матрицей SPD-M6A ("Shimadzu", Япония). Скорость элюирования составляла 3,0-3,5 мл/мин. Для препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии использовали колонку "Z orbax ODS" (9,4 x 250 мм, 5 мкм, "D uPont", США), скорость элюирования составляла 6 мл/мин. В качестве элюента применяли ацетонитрил. Высокоэффективную жидкостную хроматографию—масс-спектрометрию проводили на хромато-масс-спектрометре Agilent 1100 Series LC/MSD ("Hewlett Packard", США) с использованием колонки HyperSil ODS (4 x 125 мм, 5 мкм) при температуре термостата 55 оС. В качестве элюента использовали ацетонитрил. Скорость элюирования 0,5 мл/мин, детекция (УФ) — полный диапазон 200-600 нм, ионизация — химическая ионизация при атмосферном давлении, режим регистрации положительных ионов, напряжение на фрагменторе 70 В, напряжение в ионизационной камере 4 кВ, поток газа-осушителя (азот) 6 л/мин и давление газа-распылителя (азот) 50 кгс/ см2. Диапазон регистрируемых масс составил 150-1000 Да.

Разработка и оптимизация условий определения убихинона Q-10 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Для проведения любого хроматографического анализа компонентов биологических объектов необходимо осуществить как качественную, так и количественную калибровку получаемых в ходе анализа хроматограмм. Указанная калибровка проводилась с использованием коммерческого препарата "C0-Q10" (Enrich, США), представляющего собой капсулированный раствор убихинона Q-10 в рисовом масле с содержанием целевого компонента 20-30 мг на капсулу.

На первом этапе осуществлялось исследование препарата Q-10 с целью получения хроматографических характеристик убихинона Q-10. ТСХ-анализ (рис. 3) показал наличие в препарате четырех основных групп липидов, различающихся по полярности, и двух минорных липидных компонентов. В препарате

отсутствовали свободные жирные кислоты и, кроме того, обнаружено, что один из основных классов липидов представлен витамином Е (группа токоферолов). Верхнее пятно на пластинке имело оранжевую окраску, а его хрома-тографическая подвижность соответствовала таковой для р-каротина.

• I

Рис. 3. ТСХ-анализ препарата "CO-QIO": 1 — триглице-риды, 2 — а-токоферол, 3 — жирные кислоты, 4 — препарат "CO-QIO". Элюент — н-гексан—диэтиловый эфир

Fig. 3. TLC analysis of "CO-QIO" preparation: 1 — triglycerides, 2 — а-tocopherol, 3 — fatty acids, 4 — "CO-QIO" preparation. Eluent — n-hexane—diethylic ether

•.......»....... «-

2 3 4

С целью определения местоположения на хроматограмме пятна, соответствующего убихинону Q-10, смесь всех компонентов препарата "С0^10" была разделена на фракции, обогащенные отдельными компонентами методом колоночной хроматографии на силикагеле. В результате анализа полученных фракций обнаружено, что при элюировании бензольными системами происходит разделение веществ, проявляющихся на ТСХ-пластинке одним пятном со значением Rf 0,54 при элюировании системой растворителей н-гексан—диэтиловый эфир (3: 2) (рис. 4).

•••• •

Рис. 4. ТСХ-анализ фракций, полученных после колоночной хроматографии на силикагеле препарата "CO-QIO"

Fig. 4. TLC analysis of fractions after "CO-QIO" preparation column chromatography on Silica gel

#

*———*-".....-„

5 6 исх

Для определения нахождения убихинона Q-10 в полученных фракциях был проведен анализ препарата "С0^10" методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора для определения природы хромофоров компонентов смеси и масс-селективного детектора для определения их

Ф

• •

1

" W %

12 3 4

молекулярных масс. Результаты ВЭЖХ-анализа "С0^10" с использованием детектора на диодной матрице (рис. 5) позволили провести предварительное соотнесение хроматографических сигналов компонентов анализируемой смеси с типами их хромофоров. Отмеченные на хроматограмме пики соответствовали группе токоферолов (пики 1-3), в-каротину (пик 4), пренилхинону (возможно убихинон Q-10, пик 5) и группе триглицеридов (пики 6-9).

Рис. 5. ВЭЖХ-анализ препарата "CO-QIO". Условия анализа: колонка Zorbax ODS (4,6 x 250 мм, 5 мкм), предколонка Shim-Pack FLC-ODS (4,6 х 50 мм, 3 мкм), температура термостата 55 °С, элюент — ацетонитрил, скорость элюирования 3 мл/ мин, детекция — полный диапазон 200-600 нм; 1 — 5-токоферол, 2 — P+y-токоферол, 3 — а-токоферол, 4 — P-каротин, 5 — убихинон Q-10, 6-9 — триглицериды

Fig. 5. HPLC analysis of "C0-Q10" preparation. Conditions: Zorbax ODS (4,6 x х 250 mm, 5 ¡jm) column, Shim-Pack FLC-ODS (4,6 х 50 mm, 3 ¡jm) precolumn, temperature 55 oC, eluent — acetonitrile, elution rate 3 ml/min, detection — full range 200600 nm: 1 — 5-tocopherol, 2 — P+y-tocopherol, 3 — а-tocopherol, 4 — P-carotene, 5 — ubiquinone Q-10, 6-9 — triglycerides

Результаты ВЭЖХ-анализа того же препарата с использованием масс-се-лективного детектора в сходных условиях хроматографирования (рис. 6) позволили соотнести хроматографические сигналы компонентов смеси с их молекулярными массами. Так, на основании результатов проведенных анализов установлено, что пик 1 соответствует 8-токоферолу (^тах 298 нм, Мг = 402,7 Да), пик 2 — в- или у-токоферолу (изомеры, обычно их сумма, ^тах 298 нм, Мг = 416,7 Да), пик 3 — а-токоферолу (^тах 294 нм, Мг = 430,7 Да), пик 4 — в-каротину (^ х 455 нм, Мг = 536,9 Да), пик 5 — убихинону Q-10 йтах 275 нм, Мг = 863,4 Да), а пики 6-9 — триглицеридам (^тах 210-215 нм, Мг 878-924 Да).

Принадлежность сигнала, соответствующего пику 4, в-каротину была косвенно подтверждена результатами ВЭЖХ-анализа н-гексанового экстракта из моркови, содержащего смесь а- и в-каротина (рис. 7), причем известно, что в подобных условиях проведения ВЭЖХ анализа а-каротин элюируется раньше в-каротина (Высокоэффективная жидкостная хроматография ..., 1988). Время удерживания компонента, соответствующего пику 4 (см. рис. 5), полностью соответствовало времени удерживания в-каротина из экстракта из моркови, все полученные спектральные характеристики также совпадали для отмеченных компонентов обеих смесей.

Принадлежность сигналов, соответствующих пикам 1-3, группе токоферолов была косвенно подтверждена результатами ВЭЖХ-анализа подсолнечного масла, фрагмент которого показан на рис. 8. Время удерживания отмеченных

Рис. 6. ВЭЖХ-МС-анализ препарата " CO-Q1O". Условия анализа: колонка HyperSil ODS (4 x 125 мм, 5 мкм), температура термостата 55 оС, элюент — ацетонитрил, скорость элюирования O,5 мл/мин, детекция (УФ) — полный диапазон 2OO-6OO нм, ионизация — химическая ионизация при атмосферном давлении, режим регистрации положительных ионов, напряжение на фрагменторе 7O В; а — хроматографический сигнал, записанный по полному ионному току, б — масс-спектр, записанный с вершины пика 5, в — УФ-спектр, записанный с вершины пика 5. Нумерация пиков соответствует показанной на рис. 5

Fig. 6. HPLC-mass-spectrometry analysis of "CO-Q1O" preparation. Conditions: HyperSil ODS (4 x 125 mm, 5 |m) column, temperature 55 oC, eluent — acetonitrile, elution rate O,5 ml/min, detection (UV-VIS) — full range 2OO-6OO nm, ionization — APCI, positive ions registration, fragmentor voltage 7O V; a — chromatogram of full ion current, б — mass-spectrum on peak 5 top, в — UV spectra on peak 5 top. Peak names were shown on Fig. 5

компонентов подсолнечного масла, их спектральные характеристики и молекулярные массы полностью соответствуют подобным величинам для а-, в-, у- и 8-токоферолов. Также известно, что последовательность элюирования токоферолов соответствует показанной на рис. 5 и 8 (Высокоэффективная жидкостная хроматография ..., 1988).

Далее фракции, полученные после разделения смеси компонентов препарата "CO-Q1O" методом колоночной хроматографии на силикагеле, были проанализированы методом ВЭЖХ при указанных выше условиях. Результаты анализа показали, что фракция 1 (см. рис. 4) содержит только в-каротин, фракция 2 обогащена группой токоферолов, фракция 3 содержит помимо группы триглицеридов минорные неидентифицированные компоненты смеси, фракция 4 обогащена убихино-ном Q-1O. После чего проведена дополнительная очистка убихинона Q-1O от примесей триглицеридов на патроне с силикагелем до получения хроматографически однородного продукта, контроль чистоты осуществляли методами ТСХ и ВЭЖХ. Полученный убихинон Q-1O использовали в дальнейшем для приготовления стандартных растворов с известным содержанием этого вещества.

Рис. 7. ВЭЖХ-анализ н-гексанового экстракта из моркови. Условия анализа приведены на рис. 5

Fig. 7. HPLC analysis of n-hexane extract from carrot. Conditions were shown on Fig. 5

Рис. 8. ВЭЖХ-анализ экстракта из подсолнечного масла. Условия анализа приведены на рис. 5. Показаны УФ-спектры, записанные с вершин пиков, соответствующих последовательно 5-, (р+у)- и а-токоферолам

Fig. 8. HPLC analysis of extract from sunflower oil. Conditions were shown on Fig. 5. UV spectra were registered on peak tops corresponding to 5-, (р+у)- and а-tocopherols

Обобщая вышеописанное, нетрудно отметить, что в условиях изократного элюирования (наиболее приемлемого для осуществления серийных анализов) время удерживания убихинона является довольно большой величиной, чтобы обеспечить низкую погрешность измерения. Например, предположительно низкое содержание этого вещества в липидных экстрактах будет способствовать низкой точности его определения из-за слишком большой ширины пика (около 5 мин), соответствующего убихинону. Учитывая достаточно хорошую хромато-графическую подвижность убихинона в условиях хроматографирования на полярных сорбентах (см. рис. 3), исследовали хроматографическое поведение данного соединения в условиях проведения ВЭЖХ на полярной фазе (силикагель). Были определены условия, при которых пик, соответствующий искомому веществу, удовлетворял требованиям уменьшения погрешности анализа, а именно:

характеризовался низким значением ширины, которая составила 0,75 мин (рис. 9), т.е. значительно меньшим значением, по сравнению с подобной величиной для убихинона Q-10, полученной в условиях хроматографического анализа на обращенной фазе.

Рис. 9. ВЭЖХ-анализ препарата "CO-QIO". Условия анализа: колонка Zorbax-SIL (4,6 x 250 мм, 5 мкм), предколонка Shim-Pack FLC-SIL (4,6 х 50 мм, 3 мкм), температура термостата 55 оС, элюент — н-гексан—изопропиловый спирт (1000: 5), скорость элюиро-вания 3 мл/мин, детекция — полный диапазон 200-600 нм. Отмеченный пик соответствует сигналу убихинона Q-10

Fig. 9. HPLC analysis of "CO-Q10"preparation. Conditions: Zorbax-SIL (4,6 x 250 mm, 5 цт) column, Shim-Pack FLC-SIL (4,6 х 50 mm, 3 цm) precolumn, temperature 55 oC, eluent — n-hexane-isopropyl alcohol (1000: 5), elution rate 3 ml/min, detection — full range 200-600 nm. Marked peak corresponds to ubiquinone Q-10 signal

В описанных выше условиях, применив высокоэффективную жидкостную хроматографию на силикагеле, проанализировали липидный экстракт из внутренностей морского ежа Strongylocentrotus nudus. На хроматограмме, показанной на рис. 10, отчетливо виден пик, имеющий хроматографические показатели (время удерживания) идентичные показателям убихинона. Несмотря на это обстоятельство, УФ-спектральные характеристики, записанные с вершины пика, соответствующего убихинону Q-10, существенно отличались от спектральных характеристик искомого соединения. Так, максимумы поглощения исследуемого компонента экстракта из S. nudus составили 225 (интенсивный), 245, 273 и 455 нм. Такие полосы поглощения являются характерными для каротиноидов.

Исходя из этого было предположено, что если в липидном экстракте из S. nudus убихинон Q-10 присутствует, на что указывают время удерживания и максимум поглощения при 273 нм, то в условиях хроматографического разделения на силикагеле он не отделяется от мешающего каротиноида, составляя с ним критическую пару. На это обстоятельство указывают результаты анализа того же экстракта, но с предварительным добавлением в него стандартного раствора убихинона Q-10, полученного, как описано выше (рис. 11). На указанной хрома-тограмме отчетливо видно не только изменение интенсивности сигнала, соответствующего убихинону, но и значительное изменение спектральных характеристик соответствующего компонента анализируемой смеси. Суммарный УФ-спектр, записанный с отмеченного пика, в этом случае полностью соответствовал спектру убихинона Q-10.

Вообще, критические пары — явление не столь редкое, и для выяснения их состава проводят хроматографирование, изменяя в первую очередь неподвиж-

О.245/0.264/0.121СAU/FS) UP DOWN

DT- О О О DIIDTTU- QQOyl  QQOO

_i_i_i_i_i_i_i_i_L!1j_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_L_

0 12 34 56 78 9 10

ABS./FS: .5 Время, мин

Рис. 10. Фрагмент хроматограммы, записанной при проведении ВЭЖХ-анализа липидного экстракта из внутренностей морского ежа Strongylocentrotus nudus. Условия анализа приведены в описании к рис. 9. Время удерживания отмеченного пика соответствует сигналу убихинона Q-10

Fig. 10. Part of chromatogram written at HPLC analysis of lipid extract from internal organs of sea urchin Strongylocentrotus nudus. Conditions were shown on Fig. 9. Retention time of marked peak corresponds to ubiquinone Q-10 signal

0 12 34 56 78 9 10

ABS./FS: .5 Время, мин

Рис. 11. Фрагмент хроматограммы, записанной при проведении ВЭЖХ-анализа липидного экстракта из внутренностей морского ежа Strongylocentrotus nudus с добавлением стандартного раствора убихинона Q-10. Условия анализа приведены в описании к рис. 9. Время удерживания отмеченного пика соответствует сигналу убихинона Q-10

Fig. 11. Part of chromatogram written at HPLC analysis of lipid extract from internal organs of sea urchin Strongylocentrotus nudus with injected internal ubiquinone Q-10 standard. Conditions were shown on Fig. 9. Retention time of marked peak corresponds to ubiquinone Q-10 signal

ную и подвижную фазы. Согласно этому препарат Q-10, а также липидный экстракт из S. nudus, как нативный, т.е. без добавления стандартного раствора убихинона, так и с добавлением последнего, был проанализирован в условиях хрома-тографирования на обращенной фазе (рис. 12, 13, 14). Однако с учетом недостатков результатов анализа стандартного раствора убихинона при вышеописанных условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ (см. рис. 5), а также достаточно высокой

устойчивости убихинонов при температуре до 60-70 °С (Донченко, 1988) уменьшение параметра ширины пика было достигнуто увеличением температуры колонки и расхода элюента (см. рис. 12). При этом время удерживания убихинона Р-10 сократилось с 40 мин (см. рис. 5) до 15,12 мин (рис. 12), а ширина пика у основания составила 1,1 мин, т.е. немногим больше, чем подобная величина, полученная при проведении хроматографирования на силикагеле.

Рис. 12. ВЭЖХ-анализ липидного экстракта из внутренностей морского ежа Stron-gylocentrotus nudus. Условия анализа: колонка Zorbax ODS (4,6 x 250 мм, 5 мкм), предколонка Shim-Pack FLC-ODS (4,6 х 50 мм, 3 мкм), температура термостата 65 °С, элюент — ацетонитрил, скорость элюирования 3,5 мл/ мин, детекция — полный диапазон 200-600 нм. Отмеченный пик соответствует сигналу убихинона Q-10

Fig. 12. HPLC analysis of lipid extract from internal organs of sea urchin Strongylo-centrotus nudus. Conditions: Zorbax ODS (4,6 x 250 mm, 5 jam) column, Shim-Pack FLC-ODS (4,6 х 50 mm, 3 jm) precolumn, temperature 65 oC, eluent — acetonitrile, elution rate 3,5 ml/min , detection — full range 200-600 nm. Marked peak corresponds to ubiquinone Q-10 signal

16.2 IB Время, мин

Рис. 13. ВЭЖХ-анализ липидного экстракта из внутренностей морского ежа Strongy-locentrotus nudus с добавлением стандартного раствора убихинона Q-10. Условия анализа приведены на рис. 12. Время удерживания отмеченного пика соответствует сигналу убихинона Q-10

Fig. 13. HPLC analysis of lipid extract from internal organs of sea urchin Strongylo-centrotus nudus with injected internal ubiquinone Q-10 standard. Conditions were shown on Fig. 12. Retention time of marked peak corresponds to ubiquinone Q-10 signal

16.2 18 Время, мин

Рис. 14. ВЭЖХ анализ препарата "CO-Q10". Условия анализа приведены на рис. 12

Fig. 14. HPLC analysis of "CO-QIO" preparation. Conditions were shown on Fig. 12

Кроме того, была проведена калибровка для количественного определения убихинона Q-10, для осуществления которой из очищенного согласно процедуре колоночной хроматографии на силикагеле убихинона Q-10 приготовлены растворы с разными известными концентрациями, установленными весовым методом. Такие растворы были проанализированы методом обращенно-фазо-вой ВЭЖХ при оптимизированных условиях, и рассчитано экспериментальное значение коэффициента молярной экстинкции, которое составило при максимуме поглощения 275 нм 1430O, т.е. 0,98етабл (етабл 275 нм = 14600 (Досон и др., 1991)). Это значение было использовано для всех последующих расчетов концентрации убихинона Q-10 в анализируемых образцах. Определено истинное содержание убихинона в препарате "C0-Q10", которое составило 81 ± 3 мг на 1 г масла, или 27 ± 1 мг на капсулу, что полностью согласуется с паспортными данными на препарат.

На рис. 13, где показана хроматограмма, записанная в процессе анализа липидного экстракта из внутренностей S. nudus, видно, что пик, который должен соответствовать сигналу убихинона Q-10 (см. рис. 12), отсутствует и появляется только после добавления в экстракт стандартного раствора убихинона Q-10 (см. рис. 14).

Таким образом, использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в оптимизированных условиях (см. рис. 12) позволило разрешить проблему критической пары и показать, что убихинон Q-10 во внутренностях морского ежа S. nudus либо отсутствует, либо присутствует в количестве ниже предела обнаружения на используемом оборудовании (0,006 мкг на 1 г ткани).

Следующим объектом исследования был двустворчатый моллюск Corbicula japónica, разрабатываемый в ТИНРО-центре препарат "Корбикулин" из мягких тканей которого обладает выраженными антирадикальным и антиоксидан-тным свойствами. В целях исследования происхождения такой активности было проведено определение убихинона Q-10 в мягких тканях этого моллюска. Применив метод обращенно-фазовой ВЭЖХ при условиях, описанных к рис. 12, проанализировали липидный экстракт из C. japónica (рис. 15). Результаты анализа показали, что в исследуемом экстракте наблюдается присутствие искомого соединения (отмеченный на рисунке пик имеет хроматографические и УФ-спектральные характеристики, идентичные таковым для убихинона Q-10). Используя метод количественного расчета содержания компонента хроматог-рафируемой смеси в режиме УФ-детекции (Рыбин, Саяпина, 1999), определили

содержание убихинона Q-10 в мягких тканях C. japonica, которое составило 0,65 ± 0,02 мкг/г сырого веса ткани.

Рис. 15. ВЭЖХ-анализ липидного экстракта из двустворчатого моллюска Corbicula japonica. Условия анализа приведены на рис. 12. Отмеченный пик соответствует сигналу убихинона Q-10

Fig. 15. HPLC analysis of lipid extract from Corbicula japonica. Conditions were shown on Fig. 12. Marked peak corresponds to ubiquinone Q-10 signal

Разработанный метод был также применен к анализу содержания убихинона в сердцах горбуши Oncorhynchus gorbuscha. На хроматограмме (рис. 16) наблюдался пик с временем удерживания (13,12 мин) меньшим, чем у пика убихинона Q-10 (15,23 мин), и с УФ-спектральными характеристиками такими же как, и характеристики убихинона Q-10 (X = 275 нм).

Рис. 16. ВЭЖХ-анализ липидного экстракта из сердец Oncorhynchus gorbuscha. Условия анализа приведены на рис. 12. Отмеченный пик соответствует сигналу убихинона Q-9

Fig. 16. HPLC analysis of lipid extract from hearts of Oncorhynchus gorbuscha. Conditions were shown on Fig. 12. Marked peak corresponds to ubiquinone Q-9 signal

ВЭЖХ-МС-анализ липидного экстракта из сердец O. gorbuscha показал, что пик, соответствующий соединению с максимумом поглощения 275 нм, образован

током ионов с m/z 796,3, отвечающим [M+H]+ убихинона Q-9. Известно, что в условиях проведения обращенно-фазовой хроматографии данное соединение элю-ируется несколько раньше, чем убихинон Q-10 (Высокоэффективная жидкостная хроматография 1988), благодаря более короткой изопренильной цепи (на один изопренильный фрагмент меньше). Кроме того, наличие убихинона Q-9 в сердцах рыб установлено ранее (Higashi et al., 1972), причем содержание его, например, в сердцах трески было определено как 46 мкг на 1 г ткани. Учитывая, что eQ9 275 = 0,986eQ10 275 (Досон и др., 1991), рассчитали содержание убихинона Q-9 в тканях сердец O. gorbucsha, которое составило 36 ± 1 мкг на 1 г сырого веса ткани, что согласуется с литературными данными (Higashi et al., 1972).

С применением разработанного метода были проанализированы липидные экстракты из женских и мужских гонад кукумарии Cucumaria japónica. На хроматограммах (рис. 17, 18) сигналы, отвечающие поглощению при 275 нм, с временем удерживания убихинонов Q-10 и Q-9 отсутствовали. Следовательно, учитывая предел обнаружения прибора, который из расчета на убихиноны Q-9 и Q-10 составляет 160-180 пг, содержание этих соединений в образцах исследуемых тканей составляет менее 0,006 мкг на 1 г ткани.

16.2 18 Время, мин

Рис. 17. ВЭЖХ-анализ липидного экстракта из гонад самцов кукумарии Cucumaria japonica. Условия анализа приведены на рис. 12

Fig. 17. HPLC analysis of lipid extract from male gonads of Cucumaria japonica. Conditions were shown on Fig. 12

16.2 18 Время, мин

Рис. 18. ВЭЖХ-анализ липидного экстракта из женских гонад кукумарии Cucumaria japonica. Условия анализа приведены на рис. 12

Fig. 18. HPLC analysis of lipid extract from female gonads of Cucumaria japonica. Conditions were shown on Fig. 12

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что качественное и количественное определение убихинона в тканях морских гидроби-онтов, а именно: моллюсков и иглокожих, — с высокой степенью точности возможно при проведении анализа липидных экстрактов из этих тканей методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Кроме того, установленный факт полного отделения убихинона от других компонентов липидных экстрактов при проведении обращенно-фазовой ВЭЖХ свидетельствует в пользу отсутствия необходимости проводить предварительное омыление компонентов экстракта, а это, в свою очередь, увеличивает точность анализа, благодаря полному сохранению нативной формы убихинона, и существенно снижает время полного цикла анализа.

Оптимизация условий экстракции убихинона Q-10 из тканей морских гидробионтов

Одним из решающих факторов, определяющих степень точности количественного анализа компонентов биологических объектов, является глубина проведенной экстракции, т.е. минимизация ошибки на первом этапе обработки объекта. Описанные в литературе методы извлечения биогенных хинонов из тканей биологических объектов приводили более чем к 10 %-ным потерям целевых веществ. С целью минимизации потерь при экстракции убихинона Q-10 был опробован ряд процедур экстракции, включая жидко- и твердофазную экстракции, а также их комбинирование. Известно, что среди органических растворителей, используемых для экстракции неполярных липидов из биологических тканей, наилучшей экстрагирующей способностью обладают хлороформ и ацетон. Последний имеет недостаток, связанный со свойством неограниченной смешиваемости с водой, благодаря которому липидные экстракты, получаемые при экстракции данным растворителем, содержат значительное количество балластных нелипидных примесей. Кроме того, определенная часть убихинона, содержащегося в клеточных субстанциях, представлена водорастворимыми липопротеидными комплексами, которые в процессе экстракции ацетоном без разрушения переходят в указанный растворитель. Использование хлороформа как экстрагирующего растворителя практически сводит на нет отмеченные недостатки.

Для сравнения степени извлечения убихинона из тканей разных биологических объектов были взяты образцы гонад кукумарии Cucumaria japonica и внутренностей морского ежа 5. nudus с заведомым отсутствием регистрируемых количеств убихинонов Q-9 и Q-10 (см. рис. 13, 17, 18). Во всех случаях ткани были гомогенизированы с добавлением известного количества очищенного, как описано выше, убихинона Q-10. Гомогенаты выдерживались в течение 1 сут при температуре около 0 оС с целью полного смешения убихинона с клеточными субстанциями. Далее проводилась экстракция липидов хлороформом, и после высушивания и концентрирования в мягких условиях (в отсутствии попадания в образец прямых солнечных лучей — обязательное условие!) осуществлялось отделение компонентов полученной смеси от неполярных балластных соединений методом твердофазной экстракции на обращенной фазе при элюировании ацетонитрилом. После этого осуществлялся анализ компонентов результирующих экстрактов. Результаты исследования показали, что независимо от количества добавленного убихинона (добавляли до 20 мкг на 1 г ткани) выход по целевому веществу составлял 98-99 %, что значительно больше, чем при экстракции н-гексаном и последующем омылении липидов, как описано ранее (Донченко, 1988). Возможно, это связано с тем, что описанные в данном источнике методики предполагают проведение большего числа процедур, приводящих к неизбежной потере убихинона Q-10 на каждом из этапов.

Описанный способ экстракции, а именно: последовательное проведение жид-кофазной и твердофазной экстракции, — был применен при анализе содержания

убихинона Q-10 в тканях четырех видов гидробионтов. Учитывая тот факт, что извлечение убихинона при проведении контрольных исследований было достаточно полным, можно полагать, что экстракция этого вещества из тканей исследуемых видов животных также прошла с высоким (98-99 %-ным) выходом.

Таким образом, разработаны условия проведения подготовки образцов из биологических объектов для определения в их тканях содержания убихинона Q-10. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии установлено наличие и определено содержание убихинона Q-10 в двустворчатом моллюске Corbicula japónica. Установлено отсутствие (либо присутствие в нерегистриру-емых на используемом оборудовании количествах — менее 0,006 мкг на 1 г ткани) его во внутренностях морского ежа Strongylocentrotus nudus, а также в мужских и женских гонадах кукумарии Cucumaria japonica. Определено содержание убихинона Q-9 в сердцах горбуши Oncorhynchus gorbucsha. Применение данного метода позволит точно устанавливать перспективу использования гид-робионтов как источников препаратов, содержащих такие ценные биологически активные вещества, как убихиноны.

Автор выражает благодарность заведующей лабораторией биотехнологии пищевых и технических продуктов, к.т.н. Н.М.Купиной и научному сотруднику лаборатории прикладной биохимии к.х.н. Н.Б.Аюшину за предоставленные образцы биологического материала и стандарт убихинона Q-10.

Литература

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / Ред. А .Хен-шен, К.-П.Хупе, Ф.Лотшпайх, В.Вельтер. — М.: Мир, 1988. — 687 с.

Высоцкий В.И., Рыбин В.Г., Слабко О.Ю. и др. Использование ВЭЖХ-масс-спектрометрии в анализе биологически активных веществ из морских источников // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 40-51.

Гордон Ф., Форд Р. Спутник химика. — М.: Мир, 1976.

Донченко Г.В. Биохимия убихинона (Q). — Киев: Наук. думка, 1988. — 240 с.

Донченко Г.В., Коваленко В.Н., Забарная Е.Н. Действие производных а-токоферола на содержание природных хинонов в тканях витамин Е-недостаточных крыс // Биохимия. — 1979. — Т. 44, № 5. — С. 923-930.

Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. — М.: Мир, 1991. — 543 с.

Рыбин В.Г., Саяпина Т.А. Применение твердофазной экстракции в одновременном определении витаминов А, D2 и Е в рыбных жирах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — C. 122-126.

Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. — М.: Наука, 1980. — 245 с.

Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — Vol. 37. — P. 911-917.

Higashi H., Tareda K., Nakahira T. Studies on roles of tocopherols in fish (III). Ubiquinone and tocopherol content in fish. Pt 1 // Vitamins. — 1972. — Vol. 45 , № 3. — P. 113-120.

Katsui G., Ohmae M. Properties of coenzyme Q homologues and their determination // Vitamins. — 1967. — Vol. 36, № 1. — P. 69-80.

Lichtenthaler H.K. Prenyllipids including chlorophylls , carotenoids , prenylquinones, and fat-soluble vitamins // Handbook of Chromatography. Lipids. — CRC Press. Boca Raton. Florida, 1984. — Vol. 2. — P. 115-169.

Morton R.A. Ubiquinones (Coenzyme Q) , ubichromenols and related substances // Vitamins and Hormons. — 1961. — Vol. 19. — P. 1-37.

Shunk C.H., Wolf D.E., Pherson I.F. et al. Coenzyme Q. Alkoxy homologs of coenzyme Q-10 from methoxy group exchange // J. Amer. Chem. Soc. — 1960. — Vol. 82, № 22. — P. 5914-5918.

Поступила в редакцию 22.06.03 г.