ЗОНД НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ГЕНОМНЫХ ФРАГМЕНТОВ

1. Зонд нуклеиновой кислоты для связывания одноцепочечного целевого фрагмента нуклеиновой кислоты, причем зонд содержит
нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю комплементарную цели последовательность, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и
последовательности, находящиеся в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно, так, что в условиях отжига, при наличии целевого фрагмента, последовательности, находящиеся в начале и в конце, гибридизируются с фланкирующими последовательностями, задавая пробел между 5'-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, причем целевой фрагмент гибридизируется с последовательностью, комплементарной цели, в пробеле, таким образом позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5-концом последовательности, находящейся в начале и 3'-концом последовательности, находящейся в конце, и при этом
гибридизация целевого фрагмента в пробеле завершает кольцо нуклеиновой кислоты, причем кольцо содержит целевой фрагмент и последовательности, расположенные в начале и в конце.
2. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и/или в конце, являются присоединенными к заданной последовательности, причем заданная последовательность не является комплементарной другим местам зонда или целевому фрагменту.
3. Зонд по п. 1 или 2, отличающийся тем, что одна молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательности, расположенные в начале и в конце.
4. Зонд по п. 1 или 2, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце, отделены от нацеливающего олигонуклеотида и связываются in trans с фланкирующими последовательностями.
5. Зонд по п. 4, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце, находятся на 5'- и 3'-концах, соответственно, каркасного олигонуклеотида.
6. Зонд по п. 5, отличающийся тем, что каркасный олигонуклеотид содержит заданную последовательность между последовательностями, расположенными в начале и в конце, причем заданная последовательность не является комплементарной другим местам зонда или целевому фрагменту.
7. Зонд по п. 5, отличающийся тем, что последовательности, расположенные в начале и в конце каркасного олигонуклеотида являются примыкающими.
8. Зонд по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что целевой фрагмент является фрагментом генома человека.
9. Зонд по п. 8, отличающийся тем, что целевой фрагмент является фрагментом генома человека специфичным для одной хромосомы.
10. Зонд по п. 9, отличающийся тем, что целевой фрагмент является специфичным для одного локуса генома человека.
11. Набор зондов для связывания одноцепочечных целевых фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащий множество зондов по любому из пп. 1-10, при этом зонды имеют множество различных последовательностей, комплементарных цели, для связывания множества различных целевых фрагментов.
12. Набор зондов по п. 11, предназначенный для связывания нескольких фрагментов хромосомы человека, причем каждый зонд в наборе используется для связывания отдельного целевого фрагмента специфичного для этой хромосомы.
13. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что 5'-конец последовательности, расположенной в начале, и 3'-конец целевого фрагмента гибридизируется с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами, и 3'-конец последовательности, расположенной в конце, и 5'-конец целевого фрагмента гибридизируется с примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду нуклеотидами.
14. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что вышележащая фланкирующая последовательность непосредственно примыкает к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов, и нижележащая фланкирующая последовательность непосредственно примыкает к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов.
15. Применение зонда по любому из пп. 1-12, для проверки образца на наличие целевого фрагмента нуклеиновой кислоты.
16. Способ анализа образца на наличие целевого фрагмента нуклеиновой кислоты, включающий:
(i) гибридизацию зонда по любому из пп. 1-10 с образцом денатурированной нуклеиновой кислоты, содержащей целевой фрагмент;
(ii) обеспечение условий для лигирования, так что 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала и 5-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием продукта лигирования в виде кольца, и
(iii) детектирование наличия продукта лигирования в виде кольца,
где выявление продукта лигирования в виде кольца указывает на присутствие целевого фрагмента в образце.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что этап детектирования наличия продукта лигирования включает создание условий для репликации по типу катящегося кольца, и детектирование с целью определения присутствия продукта репликации по типу катящегося кольца.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что продукт репликации по типу катящегося кольца детектируют с помощью гибридизации с мечеными олигонуклеотидами.
19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является последовательностью генома человека, а образец денатурированной нуклеиновой кислоты представляет собой образец денатурированной ДНК человека.
20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является последовательностью генома человека, а образец денатурированной нуклеиновой кислоты представляет собой образец денатурированной бесклеточной ДНК, которая расщеплена эндонуклеазами рестрикции.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что бесклеточная ДНК получена из кровотока беременной женщины.
22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что последовательность, комплементарная цели, является последовательностью из хромосомы 21 человека.
23. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере один из:
5' конец последовательности, находящейся в начале и 3'-конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или
3' конец последовательности, находящейся в конце и 5' конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.
24. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере один из:
5' конец последовательности, находящейся в начале и 3'-конец последовательности целевого фрагмента гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или
3' конец последовательности, находящейся в конце и 5' конец последовательности целевого фрагмента гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.
25. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере одна из:
вышележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели; или
нижележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели.
26. Способ по п. 16, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере одна из:
вышележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели; или
нижележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели
27. Способ детектирования хромосомной аномалии, включающий:
(i) гибридизацию набора зондов по любому из пунктов 11-12 с денатурированным образцом, содержащим геномную ДНК полученную от человеческого субъекта, где зонды из набора содержат различные внутренние последовательности, комплементарные цели, которые гибридизуются с различными целевыми фрагментами одной и той же хромосомы;
(ii) обеспечение условий для лигирования, так что 3'-конец целевого фрагмента лигирует с 5'-концом последовательности начала и 5'-конец целевого фрагмента лигирует с 3'-концом последовательности конца с образованием продукта лигирования в виде кольца;
(iii) подсчет количества продуктов лигирования в виде кольца, полученных на этапе (ii);
(iv) сравнение результатов, полученных на стадии (iii) с результатами, полученными с использованием зондов, которые гибридизуются с контрольной хромосомой;
(v) определение, основанное на сравнении стадии (iv), имеется ли у человеческого субъекта хромосомная аномалия или является ли он беременным плодом, у которого имеется хромосомная аномалия.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что образец является денатурированной бесклеточной ДНК, которая расщеплена эндонуклеазой рестрикции.
29. Способ по п. 27, отличающийся тем, что бесклеточная ДНК получена из кровотока беременной женщины.
30. Способ по п. 27, отличающийся тем что стадия подсчета (iii) включает амплификацию продуктов лигирования в виде кольца с помощью амплификации по типу катящегося кольца, и подсчет количества продуктов амплификации по типу катящегося кольца.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что продукт амплификации по типу катящегося кольца детектируют с помощью гибридизации меченых олигонуклеотидов с продуктами амплификации по типу катящегося кольца и детектирования полученных комплексов.
32. Способ по п. 27, отличающийся тем, что хромосомная аномалия является анеуплоидией.
33. Способ по п. 32, где анеуплоидия является трисомией 21.
34. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере один из:
5' конец последовательности, находящейся в начале и 3'-конец последовательности целевого фрагмента гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или
3' конец последовательности, находящейся в конце и 5' конец последовательности целевого фрагмента гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.
35. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере один из:
5' конец последовательности, находящейся в начале и 3'-конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду; или
3' конец последовательности, находящейся в конце и 5' конец последовательности целевого фрагмента не гибридизуется с олигонуклеотидами, примыкающими к нацеливающему олигонуклеотиду.
36. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере одна из:
вышележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов; или
нижележащей фланкирующей последовательности является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели, без промежуточных нуклеотидов.
37. Способ по п. 27, отличающийся тем, что в продукте стадии (i), по меньшей мере одна из:
вышележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели; или
нижележащей фланкирующей последовательности не является непосредственно примыкающей к последовательности, комплементарной цели.