GLP-1/GLP-2 ДВОЙНЫЕ АГОНИСТЫ
GLP-1/GLP-2 DUAL AGONISTS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к соединениям, обладающим агонистической активностью в отношении рецепторов GLP-1 (глюкагоноподобного пептида 1) и GLP-2 (глюкагоноподобнго пептида 2). Соединения находят применение, среди прочего, в профилактике или лечении повреждения и дисфункции кишечника, регуляции массы тела и профилактике или лечении нарушения метаболизма.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ткань кишечника отвечает за выработку как человеческого глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1 (7-36)), так и человеческого глюкагоноподобного пептида 2 (GLP-2 (1-33)), поскольку они продуцируются одними и теми же клетками. Человеческий GLP-2 представляет собой пептид, состоящий из 33 аминокислот следующей последовательности: Hy-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH (SEQ ID NO: 1). Он получается в результате специфической посттрансляционной обработки проглюкагона в энтероэндокринных L клетках кишечника и в определенных областях ствола мозга. GLP-2 связывается с одним рецептором, связанным с G-белком, относящимся к семейству секретина-глюкагона класса II. GLP-2 секретируется совместно с GLP-1, оксинтомодулином и глицинтином в ответ на прием пищи. Человеческий GLP-1 продуцируется в виде 30-аминокислотного пептида следующей последовательности: Hy-His-Ala-Glu-Gly-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-NH2 (SEQ ID NO 2).
Имеются сообщения о том, что GLP-2 индуцирует усиленный рост эпителия слизистой оболочки тонкой кишки через стимуляцию пролиферации стволовых клеток в криптах и за счет ингибирования апоптоза в ворсинках (Drucker et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. США 93:7911-7916). GLP-2 также оказывает влияние на рост толстой кишки. Кроме того, GLP-2 ингибирует опорожнение желудка и секрецию желудочной кислоты (Wojdemann et al., 1999, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84: 2513-2517), усиливает барьерную функцию кишечника (Benjamin et al., 2000, Gut 47:112-119), стимулирует транспорт гексозы в кишечнике через усиление экспрессии транспортеров глюкозы (Cheeseman, 1997, Am. J. Physiol. R1965-71) и увеличивает кровоток в кишечнике (Guan et al., 2003, Gastroenterology, 125:136-147).
GLP-1 был описан как физиологический гормон семейства инкретинов и, следовательно, в основном известен как увеличивающий инсулиновый ответ после перорального приема глюкозы или жира. Однако считается общепринятым, что GLP-1 снижает концентрацию глюкагона и оказывает благоприятное влияние на ингибирование быстрых движений кишечника (Tolessa et al., 1998, Dig. Dis. Sci. 43 (10):2284-90) и замедляет опорожнение желудка.
В WO2013/164484 описаны аналоги GLP-2, которые содержат одну или более замен относительно h[Gly2]GLP-2 и которые могут иметь свойства измененной активности GLP-1, и их медицинское применение.
В WO2016/066818 описаны пептиды, обладающие двойной агонистической активностью в отношении рецепторов GLP-1 и GLP-2, и предлагается их применения в медицине. Однако остается потребность в дополнительных соединениях, которые бы эффективно демонстрировали агонистические активности обоих рецепторов с приемлемыми уровнями стабильности.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
in vitro
В широком смысле, настоящее изобретение относится к соединениям, которые обладают агонистической активностью в отношении рецепторов GLP-1 (глюкагоноподобного пептида 1) и GLP-2 (глюкагоноподобного пептида 2), например, согласно оценке по результатам анализа активности . Такие соединения упоминаются в настоящем описании как «GLP-1/GLP-2 двойные агонисты» или просто «двойные агонисты». Таким образом, соединения по настоящему изобретению обладают активностями как GLP-1 (7-36), так и GLP-2 (1-33).
Изобретение относится к GLP-1/GLP-2 двойному агонисту, представленному формулой:
1
*
2
R-X-U-R,
где:
1
1-4
R представляет собой водород (Hy), C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
2
2
R представляет собой NH или OH;
*
Х представляет собой пептид формулы I:
H-X2-EG-X5-F-X7-X8-E-X10-X11-TIL-X15-X16-X17-A-X19-X20-X21-FI-X24-WL-X27-X28-X29-KIT-X33 (I),
где
Х2 представляет собой Aib или G;
Х5 представляет собой S или Т;
Х7 представляет собой S или Т;
Х8 представляет собой S, E или D;
Х10 представляет собой L, М или V;
X11 представляет собой A, N или S;
X15 представляет собой D или E
Х16 представляет собой Е, А или G;
X17 представляет собой Q, E, L или K;
X19 представляет собой A, V или S;
X20 представляет собой R или K;
Х21 представляет собой D, L или E;
Х24 представляет собой А, N или S;
X27 представляет собой I, Y, Q, H или K;
Х28 представляет собой А, Е, Н, Y, L, К, Q, R или S;
X29 представляет собой H, Y, K или Q;
Х33 представляет собой D или E;
U отсутствует или представляет собой последовательность из 1-15 остатков, каждый из которых независимо выбирают из K и k;
и где по меньшей мере один из Х5 и Х7 представляет собой Т;
или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата.
*
Различные положения аминокислот в пептиде X в представленных в настоящей заявке формулах, пронумерованы в соответствии с их линейным положением в направлении от N- к C-концу в аминокислотной цепи.
Двойные агонисты, имеющие аспарагиновую кислоту (Asp, D) в положении 3 и глицин (Gly) в положении 4, могут быть очень сильными агонистами рецепторов GLP-1 и GLP-2. Однако эта комбинация замен приводит к получению соединений, которые являются нестабильными и не могут храниться в водном растворе в течение длительного времени. Не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагаете, что Asp в положении 3 может подвергаться изомеризации в изо-Asp через циклическое промежуточное соединение, образуемое между функциональной группой карбоновой кислоты его боковой цепи и атомом азота остатка в положении 4 основной цепи.
В настоящее время обнаружено, что молекулы, имеющие глутаминовую кислоту (Glu, E) в положении 3 вместо Asp, гораздо менее восприимчивы к таким реакциям и, следовательно, могут быть значительно более стабильными при хранении в водном растворе. Однако замена Asp на Glu в положении 3 может снизить активность одного или обоих рецепторов GLP-2 и GLP-1, даже несмотря на присутствие Glu в положении 3 нативной молекулы GLP-1. Одновременное включение остатка Thr в одно или оба положения 5 и 7, по-видимому, компенсирует часть или всю потерянную активность, особенно в комбинации с включением His (H), Tyr (Y) или Gln (Q) в положение 29 вместо остатков Gly (G) и Thr (T), присутствующих в человеческом GLP-1 и 2 дикого типа, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления формулы I:
Х2 представляет собой Aib;
Х5 представляет собой S или Т;
Х7 представляет собой S или Т;
Х8 представляет собой S или D;
Х10 представляет собой L;
Х11 представляет собой А или S;
X15 представляет собой D или E
Х16 представляет собой Е или G;
X17 представляет собой Q или K;
Х19 представляет собой А или S;
Х20 представляет собой R;
Х21 представляет собой D или E;
Х24 представляет собой А, N или S;
X27 представляет собой I, Y, Q или K;
Х28 представляет собой А, Е, Н, Y или L;
Х29 представляет собой Н, Y или Q; и
Х33 представляет собой D.
В некоторых вариантах осуществления X2 представляет собой Aib.
В некоторых вариантах осуществления X8 представляет собой S.
В некоторых вариантах осуществления X7 представляет собой Т.
В некоторых вариантах осуществления X5 представляет собой Т.
В некоторых вариантах осуществления X29 представляет собой H.
В некоторых вариантах осуществления X27 представляет собой I.
В некоторых вариантах осуществления X27 представляет собой Q и X29 представляет собой Q.
В некоторых вариантах осуществления X28 представляет собой A и X29 представляет собой H.
В некоторых вариантах осуществления X28 представляет собой E и X29 представляет собой H.
В некоторых вариантах осуществления X11 представляет собой A.
В некоторых вариантах осуществления X16 представляет собой E и X17 представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления X16 представляет собой G и X17 представляет собой K.
*
Если X содержит любой из: X11, представляющий собой S, X15 представляющий собой E, X19 представляющий собой S или X21 представляющий собой E, он может содержать два, три или все четыре из этих остатков. Например:
Х11 представляет собой S и Х15 представляет собой Е;
Х11 представляет собой S и Х19 представляет собой S;
Х11 представляет собой S и Х21 представляет собой Е;
Х15 представляет собой Е и Х19 представляет собой S;
Х15 представляет собой Е и Х21 представляет собой Е;
X11 представляет собой S, X15 представляет собой E и X19 представляет собой S;
X11 представляет собой S, X15 представляет собой E и X21 представляет собой E;
X11 представляет собой S, X19 представляет собой S и X21 представляет собой E;
Х15 представляет собой Е, Х19 представляет собой S и Х21 представляет собой Е; или
X11 представляет собой S, X15 представляет собой E, X19 представляет собой S и X21 представляет собой E.
В некоторых вариантах осуществления остатки X8-X24 содержат максимум четыре замены по отношению к последовательности SELATILDEQAARDFIA, например, максимум три, максимум две или максимум одну замену по отношению к этой последовательности.
В некоторых вариантах осуществления X27 может представлять собой I. Например, X27 представляет собой I и X28 представляет собой A.
В некоторых вариантах осуществления остатки X27-X29 имеют последовательность, выбранную из:
IAH;
HAH;
QAH;
YAH;
IAQ;
IAY;
YEH;
IQH;
IKH;
IRH;
ISH;
HQH;
QAQ;
HAQ;
YAH;
YRH;
KAH;
KSY;
KEQ;
IEH; и
ILH.
*
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой пептид формулы II:
H[Aib]EG-X5-F-X7-SELATILDEQAARDFIAWLI-X28-X29-KITD (II),
где
Х5 представляет собой S или Т;
Х7 представляет собой S или Т;
Х28 представляет собой А, Е, Н, Y или L;
Х29 представляет собой Н, Y или Q;
и где по меньшей мере один из Х5 и Х7 представляет собой Т.
В любой из формул или вариантов осуществления, описанных выше, двойной агонист содержит одну из следующих комбинаций остатков:
Х5 представляет собой S и Х7 представляет собой Т;
Х5 представляет собой Т и Х7 представляет собой S;
Х5 представляет собой Т и Х7 представляет собой Т.
Может быть предпочтительным, когда Х5 представляет собой S и Х7 представляет собой Т, или Х5 представляет собой Т и Х7 представляет собой Т.
X29 может представлять собой H, Y или Q, и в некоторых вариантах осуществления представляет собой H.
1-15
1-10
1-7
3
4
5
6
7
5
6
1-15
1-10
1-7
3
4
5
6
7
5
6
U, если присутствует, представляет собой пептидную последовательность из 1-15 остатков лизина, например, 1-10 остатков лизина. Каждый из аминокислотных остатков в пептидной последовательности U может иметь либо D-конфигурацию (обозначенную «k»), либо L-конфигурацию (обозначенную «K»). В некоторых вариантах осуществления все они имеют L-конфигурацию или D-конфигурацию. Примеры включают K, K и K, например, K, K, K, K и K, особенно K и K. Дополнительные примеры включают k, k и k, например, k, k, k, k и k, особенно k и k.
В некоторых вариантах осуществления U отсутствует.
1
2
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой Hy, и/или R представляет собой OH.
*
Пептид X может иметь последовательность:
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFSSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIEHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIEHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIHHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIYHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLILHKITD;
H[Aib]EGTFTDELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELSTILDEQAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLHAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLQAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLYAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIKHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIRHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLISHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAQKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAYKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLHQHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLHAHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYEHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLQAHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIAQKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLQAQKITD;
H[Aib]EGTFTSELSTILDEQAARDFIAWLHAQKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYAHKITD;
H[Aib]EGTFTDELATILDEQAARDFIAWLQAQKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYRHKITD;
H[Aib]EGSFTSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFSSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFISWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKAHKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKSYKITD;
H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKEQKITD;
HGEGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD;
H[Aib]EGTFSSELSTILEEQASREFIAWLIAHKITE;
HGEGSFSSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD; или
H[Aib]EGSFSSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD.
Двойной агонист может представлять собой:
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 1);
Hy-H[Aib]EGTFSSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 2);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 3);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIEHKITD-OH (Compound 4);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIEHKITD-OH (Compound 5);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIHHKITD-OH (Compound 6);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIYHKITD-OH (Compound 7);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLILHKITD-OH (Compound 8);
Hy-H[Aib]EGTFTDELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 9);
Hy-H[Aib]EGTFTSELSTILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 10);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 11);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLHAHKITD-OH (Compound 12);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLQAHKITD-OH (Compound 13);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLYAHKITD-OH (Compound 14);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD-OH (Compound 15);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIKHKITD-OH (Compound 16);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIRHKITD-OH (Compound 17);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLISHKITD-OH (Compound 18);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAQKITD-OH (Compound 19);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAYKITD-OH (Compound 20);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLHQHKITD-OH (Compound 21);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLHAHKITD-OH (Compound 22);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYEHKITD-OH (Compound 23);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLQAHKITD-OH (Compound 24);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIAQKITD-OH (Compound 25);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLQAQKITD-OH (Compound 26);
Hy-H[Aib]EGTFTSELSTILDEQAARDFIAWLHAQKITD-OH (Compound 27);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYAHKITD-OH (Compound 28);
Hy-H[Aib]EGTFTDELATILDEQAARDFIAWLQAQKITD-OH (Compound 29);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYRHKITD-OH (Compound 30);
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 31);
Hy-H[Aib]EGTFSSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 32);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLIAHKITD-OH (Compound 33);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFISWLIAHKITD-OH (Compound 34);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKAHKITD-OH (Compound 35);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKSYKITD-OH (Compound 36);
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKEQKITD-OH (Compound 37);
Hy-HGEGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH (Compound 38);
Hy-H[Aib]EGTFSSELSTILEEQASREFIAWLIAHKITE-OH (Compound 39);
Hy-HGEGSFSSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD-[NH2] (Compound 40); или
Hy-H[Aib]EGSFSSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD-OH (Compound 41).
Двойной агонист может быть в форме фармацевтически приемлемой соли или сольвата, например, фармацевтически приемлемого аддукта кислоты.
Изобретение также относится к композиции, содержащей двойной агонист по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль или сольват вместе с носителем, вспомогательным веществом или напонителем. Носитель может представлять собой фармацевтически приемлемый носитель.
Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде жидкости, подходящей для введения путем инъекции или инфузии. Она может быть составлена таким образом, чтобы обеспечивалось медленное высвобождение двойного агониста.
Настоящее изобретение также относится к двойному агонисту по изобретению для применения в терапии. В другом аспекте предлагается двойной агонист по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Также предлагается двойной агонист по изобретению для применения в способе терапевтического лечения.
Изобретение также относится к двойному агонисту для применения в способе увеличения массы кишечника, улучшения функции кишечника (особенно барьерной функции кишечника), увеличения кровотока в кишечнике или восстановления повреждения или дисфункции кишечника, например, повреждения кишечного эпителия.
Изобретение также относится к двойному агонисту по изобретению для применения в способе профилактики или лечения мальабсорбции, язв (например, пептической язвы, синдрома Золлингера-Эллисона, язв, вызванных медикаментозными средствами, и язв, связанных с инфекциями или другими патогенами), синдрома короткой кишки, синдрома слепого кармана (cul-de-sac), воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и язвенного колита), синдрома раздраженного кишечника (СРК), поушита, целиакии-спру (например, вызванной глютен-индуцированной энтеропатией или глютеиновой болезни), тропического спру, гипогаммаглобулинемического спру, мукозита, вызванного химиотерапией или лучевой терапией, диареи, вызванной химиотерапией или лучевой терапией, воспаления слабой степени, метаболической эндотоксемии, некротизирующего энтероколита, первичного билиарного цирроза печени, гепатита, ожирения печени (включая атрофию кишки, ассоциированную с парентеральным питанием, PNALD (заболевания печени, ассоциированного с парентеральным питанием), NAFLD (неалкогольной жировой болезни печени) и NASH (неалкогольного стеатогепатита) или гастроинтестинальных побочных эффектов воспалительных состояний, таких как панкреатит или болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD).
Изобретение также относится к двойному агонисту по изобретению для применения в способе уменьшения или ингибирования увеличения веса, уменьшения скорости опорожнения желудка или кишечного транзита, уменьшения потребления пищи, снижения аппетита или содействия снижению веса.
Изобретение также относится к двойному агонисту для применения в способе профилактики или лечения ожирения, морбидного ожирения, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, синдрома апноэ во сне, вызванного ожирением, неадекватного контроля уровня глюкозы, толерантности к глюкозе, дислипидемии (например, повышенных уровней ЛПНП) или пониженного соотношения ЛПВП/ЛПНП), диабета (например, диабета 2 типа, гестационного диабета), предиабета, метаболического синдрома или гипертонии.
Изобретение также относится к способу увеличения массы кишечника, улучшения функции кишечника (особенно барьерной функции кишечника), увеличения кровотока в кишечнике или восстановления повреждения или дисфункции кишечника у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение субъекту двойного агониста по изобретению.
Изобретение также относится к способу профилактики или лечения мальабсорбции, язв (например, пептических язв, синдрома Золлингера-Эллисона, язв, вызванных медикаментозными средствами, и язв, связанных с инфекциями или другими патогенами), синдрома короткой кишки, синдрома слепого кармана, воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и язвенного колита), синдрома раздраженного кишечника (СРК), поушита, целиакии-спру (например, вызванной глютен-индуцированной энтеропатией или глютеиновой болезни), тропического спру, гипогаммаглобулинемического спру, мукозита, вызванного химиотерапией или лучевой терапией, диареи, вызванной химиотерапией или лучевой терапией, воспаления слабой степени, метаболической эндотоксемии, некротизирующего энтероколита, первичного билиарного цирроза печени, гепатита, ожирения печени (включая атрофию кишки, ассоциированную с парентеральным питанием, PNALD (заболевания печени, ассоциированного с парентеральным питанием), NAFLD (неалкогольной жировой болезни печени) и NASH (неалкогольного стеатогепатита) или гастроинтестинальных побочных эффектов воспалительных состояний, таких как панкреатит или болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD) у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение субъекту двойного агониста по изобретению.
Изобретение также относится к способу уменьшения или ингибирования увеличения веса, уменьшения скорости опорожнения желудка или кишечного транзита, уменьшения потребления пищи, снижения аппетита или содействия снижению веса у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение субъекту двойного агониста по изобретению.
Изобретение также относится к способу профилактики или лечения ожирения, морбидного ожирения, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, синдрома апноэ во сне, вызванного ожирением, неадекватного контроля уровня глюкозы, толерантности к глюкозе, дислипидемии (например, повышенных уровней ЛПНП) или пониженного соотношения ЛПВП/ЛПНП), диабета (например, диабета 2 типа, гестационного диабета), предиабета, метаболического синдрома или гипертонии у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение субъекту двойного агониста по изобретению.
Изобретение также относится к применению двойного агониста по изобретению при изготовлении лекарственного средства для увеличения массы кишечника, улучшения функции кишечника (особенно барьерной функции кишечника), увеличения кровотока в кишечнике или восстановления повреждения или дисфункции кишечника, например, повреждения кишечного эпителия.
Изобретение также относится к применению двойного агониста по изобретению при изготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения мальабсорбции, язв (например, пептических язв, синдрома Золлингера-Эллисона, язв, вызванных медикаментозными средствами, и язв, связанных с инфекциями или другими патогенами), синдрома короткой кишки, синдрома слепого кармана, воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и язвенного колита), синдрома раздраженного кишечника (СРК), поушита, целиакии-спру (например, вызванной глютен-индуцированной энтеропатией или глютеиновой болезни), тропического спру, гипогаммаглобулинемического спру, мукозита, вызванного химиотерапией или лучевой терапией, диареи, вызванной химиотерапией или лучевой терапией, воспаления слабой степени, метаболической эндотоксемии, некротизирующего энтероколита, первичного билиарного цирроза печени, гепатита, ожирения печени (включая атрофию кишки, ассоциированную с парентеральным питанием, PNALD (заболевания печени, ассоциированного с парентеральным питанием), NAFLD (неалкогольной жировой болезни печени) и NASH (неалкогольного стеатогепатита) или гастроинтестинальных побочных эффектов воспалительных состояний, таких как панкреатит или болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD).
Изобретение также относится к применению двойного агониста по изобретению при изготовлении лекарственного средства для снижения или ингибирования увеличения веса, уменьшения скорости опорожнения желудка или кишечного транзита, уменьшения потребления пищи, снижения аппетита или содействия снижению веса.
Изобретение также относится к применению двойного агониста по изобретению при изготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения ожирения, патологического ожирения, морбидного ожирения, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, синдрома апноэ во сне, вызванного ожирением, неадекватного контроля уровня глюкозы, толерантности к глюкозе, дислипидемии (например, повышенных уровней ЛПНП) или пониженного соотношения ЛПВП/ЛПНП), диабета (например, диабета 2 типа, гестационного диабета), предиабета, метаболического синдрома или гипертонии.
В дополнительном аспекте предлагается терапевтический набор, содержащий двойной агонист или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, в соответствии с изобретением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если иное не определено в настоящем описании, научные и технические термины, используемые в настоящей заявке, имеют значения, в которых их обычно понимают специалисты в данной области техники. Как правило, используемые в настоящей заявке номенклатура и методы, имеющие отношение к химическим соединениям, молекулярной биологии, клеточной и онкологической биологии, иммунологии, микробиологии, фармакологии и химии белков и нуклеиновых кислот, описанные в настоящей заявке, являются хорошо известными и широко используемыми в данной области техники.
Все патенты, опубликованные патентные заявки и непатентные публикации, упомянутые в этой заявке, специально включены в настоящее описание посредством ссылки. В случае конфликта настоящее описание, включая приведенные в нем конкретные определения, имеют преимущественную силу.
Каждый вариант осуществления изобретения, описанный в настоящей заявке, можно рассматривать отдельно или в комбинации с одним или более другими вариантами осуществления изобретения.
Определения
Если не указано иное, представленные ниже определения относятся к конкретным терминам, которые используются в настоящем письменном описании.
В настоящем описании слово «содержать» и его грамматические варианты, такие как «содержит» или «содержащий», следует понимать как подразумевающие включение указанного целого числа или компонента или группы целых чисел или компонентов, без исключения любого другого целого числа или компонента или группы целых чисел или компонентов.
Формы единственного числа включают множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное.
Термин «включающий» используется для обозначения «включающий, без ограничения». «Включающий» и «включающий, без ограничения» могут использоваться взаимозаменяемо.
Термины «пациент», «субъект» и «индивидуум» могут использоваться взаимозаменяемо и относятся либо к человеку, либо к животному, не являющемуся человеком. Эти термины включают млекопитающих, таких как люди, приматы, домашние животные (например, коровы и свиньи), домашних животных (например, собак и кошек) и грызунов (например, мышей и крыс).
Термин «сольват» в контексте настоящего изобретения относится к комплексу определенной стехиометрии, образованному между растворенным веществом (в частности, пептидом или его фармацевтически приемлемой солью по изобретению) и растворителем. Растворителем в этой связи может быть, например, вода, этанол или другие фармацевтически приемлемые, обычно мелкомолекулярные органические вещества, такие как, без ограничения, уксусная кислота или молочная кислота. Когда рассматриваемым растворителем является вода, такой сольват обычно называют гидратом.
Термин «агонист», используемый в контексте изобретения, относится к веществу (лиганду), которое активирует определенный тип рецептора.
В настоящем описании и формуле изобретения для обозначения встречающихся в природе аминокислот используются обычные трехбуквенные и однобуквенные коды, т.е.
A (Ala), G (Gly), L (Leu), I (Ile), V (Val), F (Phe), W (Trp), S (Ser), T (Thr), Y (Tyr), N (Asn), Q (Gln), D (Asp), E (Glu), K (Lys), R (Arg), H (His), M (Met), C (Cys) и P (Pro);
а также общепринятые трехбуквенные коды для других α-аминокислот, таких как саркозин (Sar), норлейцин (Nle), α-аминоизомасляная кислота (Aib), 2,3-диаминопропановая кислота (Dap), 2,4-диаминобутановая кислота (Dab) и 2,5-диаминопентановая кислота (орнитин; Orn). Такие другие α-аминокислоты могут быть указаны в квадратных скобках «[]» (например, «[Aib]») в случае их использования в настоящем описании в общей формуле или последовательности, особенно когда остальная часть формулы или последовательности представлена в виде однобуквенного кода. Если не указано иное, аминокислотные остатки в пептидах по изобретению имеют L-конфигурацию. Однако могут включать аминокислоты D-конфигурации. В настоящем контексте аминокислотный код, написанный маленькой буквой, представляет D-конфигурацию указанной аминокислоты, например, «k» представляет собой D-конфигурацию лизина (K).
2
2
2
2
2
1
2
2
Среди последовательностей, раскрытых в настоящей заявке, имеются последовательности, включающие фрагмент «Hy-» на аминоконце (N-конце) последовательности и либо фрагмент «-OH», либо фрагмент «-NH» на карбокси-конце (C-конце) последовательности. В таких случаях, и если не указано иное, фрагмент "Hy-" на N-конце рассматриваемой последовательности указывает на атом водорода [т.е. R=водород=Hy в общих формулах; что соответствует наличию свободной первичной или вторичной аминогруппы на N-конце], тогда как «-ОН» или «-NH» фрагмент на С-конце последовательности указывает на гидроксильную группу [например, R=OH в общих формулах; что соответствует наличию карбокси (COOH) группы на С-конце] или аминогруппу [например, R=[NH] в общих формулах; что соответствует наличию амидной (CONH) группы на С-конце], соответственно. В каждой последовательности по изобретению С-концевой фрагмент -ОН может быть заменен на С-концевой фрагмент -NH, и наоборот.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к полипептидным последовательностям GLP-2 определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности GLP-2 дикого типа (человека) после выравнивания последовательностей и введения зазоров (гэпов), при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности и без учета любой консервативной замены в контексте идентичности последовательности. Выравнивание последовательностей может быть выполнено специалистом методами, хорошо известными в данной области техники, например с помощью общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST2 или программного обеспечения Align. Например, см. Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996) или Pearson et al., Genomics 46:24-36, 1997.
Процент идентичности последовательности, используемый в настоящей заявке в контексте настоящего изобретения, может быть определен с помощью этих программ с использованием настроек по умолчанию. В более общем смысле, специалист в данной технике может легко определить соответствующие параметры для выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
Соединения двойных агонистов
in vivo
В соответствии с настоящим изобретением двойной агонист обладает по меньшей мере одной биологической активностью GLP-1 и по меньшей мере одной биологической активностью GLP-2. Типичные физиологические активности GLP-1 включают снижение скорости кишечного транзита, снижение скорости опорожнения желудка, снижение аппетита, потребления пищи или массы тела, а также улучшение контроля уровня глюкозы и толерантности к глюкозе. Типичные физиологические активности GLP-2 включают увеличение массы кишечника (например, тонкой кишки или толстой кишки), восстановление кишечника и улучшение барьерной функции кишечника (т.е., снижение проницаемости кишечника). Эти параметры могут быть оценены в анализах , в которых массу и проницаемость кишечника или его части определяют после лечения тестируемого животного двойным агонистом.
50
50
50
50
in vitro
Двойные агонисты обладают агонистической активностью в отношении рецепторов GLP-1 и GLP-2, например человеческих рецепторов GLP-1 и GLP-2. Значения EC для активности агониста рецептора  можно использовать в качестве числовой меры активности агониста для данного рецептора. Значение ЕС представляет собой меру концентрации (например, моль/л) соединения, необходимой для достижения половины максимальной активности этого соединения в конкретном анализе. Соединение со значением ЕС для конкретного рецептора, которое ниже, чем ЕС эталонного соединения в том же анализе, следует рассматривать как соединение, обладающее более высокой активностью по отношению к этому рецептору, чем эталонное соединение.
Активность GLP-1
50
В некоторых вариантах осуществления EC двойного агониста по отношению к рецептору GLP-1 (например, рецептору человеческого GLP-1) составляет менее 2,0 нМ, менее 1,5 нМ, менее 1,0 нМ, менее 0,9 нМ, менее 0,8 нМ, менее 0,7 нМ, менее 0,6 нМ, менее 0,5 нМ, менее 0,4 нМ, менее 0,3 нМ, менее 0,2 нМ, менее 0,1 нМ, менее 0,09 нМ, менее 0,08 нМ, менее 0,07 нМ, менее 0,06 нМ, менее 0,05 нМ, менее 0,04 нМ, например по результатам оценки с использованием анализа активности рецептора GLP-1, описанного в приведенных ниже примерах.
50
В некоторых вариантах осуществления EC двойного агониста по отношению к рецептору GLP-1 находится в пределах от 0,001 нМ до 1,0 нМ, от 0,001 нМ до 0,5 нМ или от 0,001 нМ до 0,1 нМ, например по результатам оценки с использованием анализа активности рецептора GLP-1, описанного в приведенных ниже примерах.
Альтернативная мера активности агониста GLP-1 может быть получена путем сравнения активности двойного агониста с активностью известного (или эталонного) агониста GLP-1, которые измерены в одном и том же анализе. Таким образом, относительная активность по отношению к рецептору GLP-1 может быть определена как:
50
50
[EC(эталонный агонист)]/[EC(двойной агонист)].
50
50
Таким образом, значение 1 указывает на то, что двойной агонист и эталонный агонист имеют одинаковые активности, значение >1 указывает на то, что двойной агонист имеет более высокую активность (т.е., более низкую величину EC) по сравнению с эталонным агонистом, а значение <1 указывает на то, что двойной агонист имеет более низкую активность (т.е. более высокую величину EC) по сравнению с эталонным агонистом.
Эталонный агонист GLP-1 может представлять собой, например, человеческий GLP-1 (7-37), лираглутид (NN2211; Victoza) или эксендин-4, но предпочтительно лираглутид.
Как правило, относительная активность находится в пределах от 0,001 до 100, например,
от 0,001 до 10, от 0,001 до 5, от 0,001 до 1, от 0,001 до 0,5, от 0,001 до 0,1, от 0,001 до 0,05 или от 0,001 до 0,01;
от 0,01 до 10, от 0,01 до 5, от 0,01 до 1, от 0,01 до 0,5, от 0,01 до 0,1 или от 0,01 до 0,05;
от 0,05 до 10, от 0,05 до 5, от 0,05 до 1, от 0,05 до 0,5 или от 0,05 до 0,1;
от 0,1 до 10, от 0,1 до 5, от 0,1 до 1 или от 0,1 до 0,5;
от 0,5 до 10, от 0,5 до 5 или от 0,5 до 1;
от 1 до 10 или от 1 до 5; или
от 5 до 10.
Двойные агонисты по изобретению обладают сопоставимой с лираглутидом активностью GLP-1. Таким образом, относительная активность может, в частности, находиться в пределах от 0,5 до 10, от 0,5 до 5, от 0,5 до 1, от 1 до 10 или от 1 до 5.
Напротив, двойные агонисты по изобретению обладают более высокой активностью к рецептору GLP-1 (например, рецептору человеческого GLP-1), чем человеческий GLP-2 дикого типа (hGLP-2 (1-33)) или [Gly2]-hGLP-2 (1-33) (т.е. человеческий GLP-2, имеющий глицин в положении 2, также известный как тедуглутид). Таким образом, относительная активность двойных агонистов по отношению к рецептору GLP-1 по сравнению с активностью по отношению к hGLP-2 (1-33) или тедуглутиду больше 1, обычно больше 5 или больше 10, и может быть больше 100, вплоть до 500 или даже выше.
Активность GLP-2
50
В некоторых вариантах осуществления EC двойного агониста по отношению к рецептору GLP-2 (например, рецептору человеческого GLP-2) составляет менее 2,0 нМ, менее 1,5 нМ, менее 1,0 нМ, менее 0,9 нМ, менее 0,8 нМ, менее 0,7 нМ, менее 0,6 нМ, менее 0,5 нМ, менее 0,4 нМ, менее 0,3 нМ, менее 0,2 нМ, менее 0,1 нМ, менее 0,09 нМ, менее 0,08 нМ, менее 0,07 нМ, менее 0,06 нМ, менее 0,05 нМ, менее 0,04 нМ, менее 0,03 нМ, менее 0,02 нМ или менее 0,01 нМ, например по результатам оценки с использованием анализа активности рецептора GLP-1, описанного в приведенных ниже примерах.
50
В некоторых вариантах осуществления EC двойного агониста по отношению к рецептору GLP-2 находится в пределах от 0,001 нМ до 1,0 нМ, от 0,001 нМ до 0,5 нМ или от 0,001 нМ до 0,25 нМ,
например от 0,01 до 1,0 нМ, от 0,01 до 0,5 нМ или от 0,01 до 0,25 нМ, например по результатам оценки с использованием анализа активности рецептора GLP-2, описанного в примерах ниже.
Альтернативная мера активности агониста GLP-2 может быть получена путем сравнения активности двойного агониста с активностью известного (или эталонного) агониста GLP-2, которые измерены в одном и том же анализе. Таким образом, относительная активность в отношении рецептора GLP-2 может быть определена как:
50
50
[EC(эталонный агонист)]/[EC(двойной агонист)].
50
50
Таким образом, значение 1 указывает на то, что двойной агонист и эталонный агонист имеют одинаковые активности, значение >1 указывает на то, что двойной агонист имеет более высокую активность (т.е., более низкую величину EC) по сравнению с эталонным агонистом, а значение <1 указывает на то, что двойной агонист имеет более низкую активность (т.е. более высокую величину EC) по сравнению с эталонным агонистом.
Эталонный агонист GLP-2 может представлять собой, например, человеческий GLP-2 (1-33) или тедуглутид ([Gly2]-hGLP-2 (1-33)), но предпочтительно тедуглутид. Как правило, относительная активность находится в пределах от 0,001 до 100, например.
от 0,001 до 10, от 0,001 до 5, от 0,001 до 1, от 0,001 до 0,5, от 0,001 до 0,25, от 0,001 до 0,1, от 0,001 до 0,05 или от 0,001 до 0,01;
от 0,01 до 10, от 0,01 до 5, от 0,01 до 1, от 0,01 до 0,5, от 0,01 до 0,25, от 0,01 до 0,1 или от 0,01 до 0,05;
от 0,05 до 10, от 0,05 до 5, от 0,05 до 1, от 0,05 до 0,5, от 0,05 до 0,25 или от 0,05 до 0,1;
от 0,1 до 10, от 0,1 до 5, от 0,1 до 1, от 0,1 до 0,5 или от 0,1 до 0,25;
от 0,25 до 10, от 0,25 до 5, от 0,25 до 1 или от 0,25 до 0,5;
от 0,5 до 10, от 0,5 до 5 или от 0,5 до 1;
от 1 до 10 или от 1 до 5; или
от 5 до 10.
GLP-2 активность двойных агонистов по изобретению сопоставима или немного ниже активности тедуглутида. Таким образом, относительная активность, в частности, может находится в пределах от 0,1 до 1, от 0,1 до 0,5 или от 0,1 до 0,25, от 0,25 до 1 или от 0,25 до 0,5.
Напротив, двойные агонисты по настоящему изобретению имеют более высокую активность по отношению к рецептору GLP-2 (например, человеческому рецептору GLP-2), чем человеческому GLP-1 (7-37), лираглутиду (NN2211; Victoza) или эксендину-4. Таким образом, относительная активность двойных агонистов по отношению к рецептору GLP-2 по сравнению с человеческим GLP-1 (7-37), лираглутидом (NN2211; Victoza) или эксендином-4, больше чем 1, обычно больше чем 5 или больше чем 10, и может быть больше 100, вплоть до 500 или даже больше (если эталонный агонист GLP-1 проявляет детектируемую активность по отношению к рецептора GLP-2).
Понятно, что абсолютные активности двойных агонистов по отношению к каждому рецептору гораздо менее важны, чем баланс между GLP-1 и GLP-2 агонистческими активностями. Таким образом, вполне приемлемо, чтобы абсолютная GLP-1 или GLP-2 активность была ниже, чем у известных агонистов этих рецепторов, при условии, что соединение, двойной агонист, проявляет приемлемые относительные уровни активности по отношению к обоим рецепторам. Любой очевидный дефицит абсолютной активности при необходимости может быть компенсирован повышенной дозой.
Синтез двойных агонистов
Предпочтительным является синтез двойных агонистов по изобретению методом твердофазного или жидкофазного синтеза пептидов. В связи с этим можно сослаться на WO 98/11125 и, среди прочего, на Fields, G.B. et al., 2002, «Principles and practice of solid-phase peptide synthesis». In: Synthetic Peptides (2nd Edition), а также на приведенные в настоящем описании примеры.
Согласно настоящему изобретению двойной агонист по изобретению может быть синтезирован или получен различными способами, включая, например, способ, включающий:
(а) синтез двойного агониста методом твердофазного или жидкофазного синтеза пептидов и извлечение полученного таким образом синтезированного двойного агониста; или же
(b) экспрессию последовательности пептида-предшественника из конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид-предшественник, выделение продукта экспрессии и модификацию пептида-предшественника с получением соединения по изобретению.
1
2
Пептид-предшественник может быть модифицирован путем введения одной или более непротеиногенных аминокислот (например, Aib), введения соответствующих концевых групп R и R и т.д.
Экспрессию обычно выполняют из нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид-предшественник, которая может быть выполнена в клетке или в бесклеточной экспрессионной системе, содержащей такую нуклеиновую кислоту.
Предпочтительным является синтез аналогов по изобретению методом твердофазного или жидкофазного синтеза пептидов. В связи с этим можно сослаться на WO 98/11125 и, среди прочего, на Fields, GB et al., 2002, «Principles and practice of solid-phase peptide synthesis». In: Synthetic Peptides (2nd Edition), а также на приведенные в настоящем описании примеры.
Для рекомбинантной экспрессии фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие пептид-предшественник, обычно вводят в подходящие векторы с образованием клонирующих или экспрессирующих векторов. Векторы, в зависимости от цели и типа применения, могут быть в форме плазмид, фагов, космид, мини-хромосом или вируса, при этом важным вектором является голая ДНК, которая экспрессируется только временно в клетках определенного типа. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы (плазмидные векторы) способны к автономной репликации, тем самым обеспечивая высокое количество копий для интенсивной экспрессии или усиленной репликации для последующего клонирования.
В общих чертах, вектор экспрессии содержит следующие признаки в направлении 5'→ 3' и функциональные связи: промотор для управления экспрессией фрагмента нуклеиновой кислоты, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующий лидерный пептид, который обеспечивает секрецию (во внеклеточную среду или, где это применимо, в периплазму), фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид-предшественник, и, необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. Вектор может содержать дополнительные функции, такие как селективные маркеры и точку начала репликации. При работе с векторами экспрессии в штаммах-продуцентах или клеточных линиях предпочтительной может быть способность вектора интегрироваться в геном клетки-хозяина. Специалист в данной области хорошо знаком с подходящими векторами и способен разработать их в соответствии с конкретными требованиями.
Векторы по изобретению используются для трансформации клеток-хозяев для продуцирования пептида-предшественника. Такими трансформированными клетками могут быть культивируемые клетки или клеточные линии, используемые для размножения фрагментов и векторов нуклеиновой кислоты и/или используемые для рекомбинантного продуцирования пептидов-предшественников.
Escherichia
E.coli
Bacillus
Bacillus subtilis
Salmonella
Mycobacterium
M.bovis
Saccharomyces cerevisiae
Pichia pastoris
Предпочтительными трансформированными клетками являются микроорганизмы, такие как бактерии [такие как виды  (например, ),  (например, ),  или  (предпочтительно непатогенные, например,  BCG), дрожжи (например,  и ) и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки могут быть получены из многоклеточного организма, т.е., это могут быть клетки грибов, насекомых, водорослей, растений или клетки животных, такие как клетки млекопитающих. Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты по изобретению. Клетки, экспрессирующие нуклеиновый фрагмент, можно использовать для мелкомасштабного или крупномасштабного получения пептидов по изобретению.
При получении пептида-предшественника с помощью трансформированных клеток удобно, хотя и далеко не обязательно, секретировать продукт экспрессии в культуральную среду.
Фармацевтические композиции и введение
Один из аспектов настоящего изобретения относится к композиции, содержащей двойной агонист по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль или сольват вместе с носителем. В одном из вариантов осуществления изобретения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, а носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей двойной агонист по изобретению или его соль или сольват вместе с носителем, вспомогательным веществом или наполнителем. Соответственно, двойной агонист по настоящему изобретению или его соли или сольваты, особенно их фармацевтически приемлемые соли или сольваты, могут быть составлены в виде композиций или фармацевтических композиций, приготовленных для хранения или введения, которые содержат терапевтически эффективное количество двойного агониста по настоящему изобретению или его соли или сольвата.
Подходящие соли, образованные с основаниями, включают соли металлов, такие как соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, например соли натрия, калия или магния; соли аммиака и соли органических аминов, такие как соли морфолина, тиоморфолина, пиперидина, пирролидина, низшего моно-, ди- или триалкиламина (например, этил-трет-бутил-, диэтил-, диизопропил-, триэтил-, трибутил- или диметилпропил-амина) или низший моно-, ди- или три-(гидроксиалкил)амина (например, моно-, ди- или три-этаноламина). Также могут быть образованы внутренние соли. Аналогично, когда соединение по настоящему изобретению содержит фрагмент основания, соли могут быть образованы с использованием органических или неорганических кислот. Например, соли могут быть образованы из следующих кислот: муравьиная, уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая, щавелевая, молочная, лимонная, винная, янтарная, фумаровая, малеиновая, малоновая, миндальная, яблочная, фталевая, соляная, бромистоводородная, фосфорная, азотная, серная, бензойная, углекислая, мочевая, метансульфоновая, нафталинсульфоновая, бензолсульфоновая, толуолсульфоновая, п-толуолсульфоновая (т.е., 4-метилбензолсульфоновая), камфорсульфоновая, 2-аминоэтансульфоновая, аминометилфосфоновая, трифторметансульфоновая кислота, а также другие известные фармацевтически приемлемые кислоты. Также могут быть образованы аддукты с аминокислотами, такими как лизин, глицин или фенилаланин.
В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по изобретению представляет собой композицию, в которой двойной агонист находится в форме фармацевтически приемлемого аддукта кислоты.
Как будет очевидно специалисту в области медицины, «терапевтически эффективное количество» соединения, двойного агониста, или его фармацевтической композиции по настоящему изобретению, будет варьировать в зависимости, среди прочего, от возраста, веса и/или пола субъекта (пациента), в отношении которого проводится лечение. Другие факторы, которые могут иметь значение, включают физические характеристики конкретного рассматриваемого пациента, диету пациента, природу любого одновременно принимаемого лекарства, конкретное используемое(ые) соединение(я), конкретный способ введения, требуемый фармакологический эффект(ы) и особые терапевтические показания. Поскольку эти факторы и их взаимосвязь при определении указанного количества хорошо известны в медицине, определение терапевтически эффективных уровней доз, количества, необходимого для достижения желаемого результата лечения и/или профилактики и/или для устранения мальабсорбции и/или низкой степень воспаления, описанные в настоящей заявке, а также других медицинских показаний, раскрытых в настоящей заявке, находятся в пределах компетенции специалиста.
Используемый в настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое уменьшает проявление симптомов заданного состояния или патологии и, предпочтительно, которое нормализует физиологические реакции у индивидуума, имеющего такое состояние или патологию. Уменьшение проявления симптомов или нормализация физиологических реакций может быть определена методами, которые являются рутинными в данной области техники и которые могут меняться в зависимости от конкретного состояния или патологии. В одном из аспектов терапевтически эффективное количество одного или более двойных агонистов или их фармацевтических композиций представляет собой количество, которое восстанавливает измеряемый физиологический параметр по существу до такого же значения (предпочтительно в пределах 30%, более предпочтительно в пределах 20% и еще более предпочтительно в пределах 10% от значения) параметра у индивидуума, не страдающего рассматриваемым состоянием или патологией.
В одном из вариантов осуществления изобретения введение соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению начинают с более низких уровней доз, причем уровни доз увеличивают до тех пор, пока не будет достигнут требуемый эффект профилактики/лечения соответствующих медицинских показаний. Это позволяет определить терапевтически эффективное количество. Для двойных агонистов по настоящему изобретению, используемых отдельно или как часть фармацевтической композиции, такие дозы двойного агониста для человека могут находиться в пределах от примерно 0,01 пмоль/кг до 500 мкмоль/кг массы тела, от примерно 0,01 пмоль/кг до 300 мкмоль/кг массы тела, от 0,01 пмоль/кг до 100 мкмоль/кг массы тела, от 0,1 пмоль/кг до 50 мкмоль/кг массы тела, от 1 пмоль/кг до 10 мкмоль/кг массы тела, от 5 пмоль/кг до 5 мкмоль/кг массы тела, от 10 пмоль/кг до 1 мкмоль/кг массы тела, от 50 пмоль/кг до 0,1 мкмоль/кг массы тела, от 100 пмоль/кг до 0,01 мкмоль/кг массы тела, от 0,001 мкмоль/кг до 0,5 мкмоль/кг массы тела, от 0,05 мкмоль/кг до 0,1 мкмоль/кг массы тела.
Терапевтическая доза и режим, наиболее подходящие для лечения пациента, конечно, будут меняться в зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и в зависимости от веса пациента и других параметров. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, предполагается, что дозы в определенном диапазоне, выраженные в единицах мкг/кг, и вводимые в течение более короткого или более длительного промежутка времени или с некоторой частотой в процессе лечения могут обеспечивать терапевтически полезные результаты, такие как статистически значимое увеличение, в частности, массы тонкой кишки. В некоторых случаях терапевтический режим может включать введение поддерживающих доз, подходящих для профилактики регрессии ткани, которая происходит после прекращения первоначального лечения. Размеры доз и режим дозирования, наиболее подходящие для введения человеку, могут быть основаны на результатах, полученных в настоящем изобретении и могут быть подтверждены в правильно спланированных клинических испытаниях.
Эффективные дозы и протокол лечения можно определить обычными способами, начиная с низкой дозы, вводимой лабораторным животным, с последующим увеличением доз с одновременным отслеживанием эффектов, а также систематически изменяя режим дозирования. Клиницист может принять во внимание множество факторов при определении оптимальной дозы для заданного субъекта. Такие факторы известны специалисту в данной области.
Медицинские состояния
В широком аспекте настоящее изобретение относится к двойному агонисту для применения в качестве лекарственного средства.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к двойному агонисту для применения в терапии.
Двойные агонисты, раскрытые в настоящем описании, обладают биологической активностью как GLP-1, так и GLP-2.
GLP-2 индуцирует существенный рост эпителия слизистой оболочки тонкой кишки через стимуляцию пролиферации стволовых клеток в криптах и ингибирование апоптоза на ворсинках (Drucker et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1996, 93:7911-6). GLP-2 также оказывает влияние на рост толстой кишки. GLP-2 также ингибирует опорожнение желудка и секрецию желудочной кислоты (Wojdemann et al., 1999, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84: 2513-2517), усиливает барьерную функцию кишечника (Benjamin et al., 2000, Gut 47:112-119), стимулирует транспорт гексозы в кишечнике через усиление экспрессии транспортеров глюкозы (Cheeseman, 1997, Am. J. Physiol. R1965-71) и увеличивает кровоток в кишечнике (Guan et al., 2003, Gastroenterology, 125:136-147).
Благоприятные эффекты GLP-2 в тонкой кишке вызвали значительный интерес к применению GLP-2 для лечения заболеваний или поражений кишечника (Sinclair and Drucker, Physiology 2005:357-65). Кроме того, на многих моделях повреждения кишечника, используемых в доклинических исследованиях, включая энтерит, вызванный химиотерапией, ишемически-реперфузионное повреждение, колит, индуцированный декстрансульфатом, и на генетических моделях воспалительного заболевания кишечника было показано, что GLP-2 предотвращает или уменьшает повреждение эпителия слизистой оболочки (Sinclair and Drucker Physiology 2005:357-65). Аналог GLP-2, тедуглутид (Gly2-hGLP-2), одобрен для лечения синдрома короткой кишки под торговыми названиями Гаттекс и Ревестив.
GLP-1 представляет собой пептидный гормон, известный своей важной ролью в гомеостазе глюкозы. При секреции из желудочно-кишечного тракта в ответ на прием питательных веществ GLP-1 усиливает стимулированную глюкозой секрецию инсулина из β-клеток (Kim and Egan, 2008, Pharmacol.Rev. 470-512). Кроме того, было показано, что GLP-1 или его аналоги усиливают секрецию соматостатина и подавляют секрецию глюкагона (Holst JJ, 2007, Physiol Rev. 1409-1439).
Помимо основного действия GLP-1 на стимулированную глюкозой секрецию инсулина, GLP-1 также известен в качестве ключевого регулятора аппетита, потребления пищи и массы тела. Кроме того, GLP-1 может ингибировать опорожнение желудка и моторику желудочно-кишечного тракта как у грызунов, так и у людей, скорее всего, через рецепторы GLP-1, присутствующие в желудочно-кишечном тракте (Holst JJ, 2007, Physiol Rev. 1409-1439; Hellström et al., 2008, Neurogastroenterol Motil. Jun; 20 (6):649-659). Помимо этого, GLP-1, по-видимому, обладает инсулиноподобными эффектами в основных экстрапанкреатических тканях, участвуя в гомеостазе глюкозы и липидном обмене в тканях, таких как мышцы, печень и жировые ткани (Kim and Egan, 2008, Pharmacol.Rev. 470-512).
Таким образом, соединения, двойные агонисты по настоящему изобретению, могут быть использованы для увеличения массы кишечника, улучшения функции кишечника (особенно барьерной функции кишечника), увеличения кровотока в кишечнике или восстановления повреждения или дисфункции (структурной или функциональной) кишечника, например повреждение кишечного эпителия. Они также могут быть использованы для профилактики или лечения состояний, которые могут быть улучшены этими эффектами, и для снижения частоты заболеваемости, связанной с повреждением желудочно-кишечного тракта.
Поэтому двойные агонисты находят применение при многих желудочно-кишечных расстройствах. Термин «желудочно-кишечный», используемый в настоящем описании, включает весь желудочно-кишечный тракт, включая пищевод, желудок, тонкую кишку (двенадцатиперстную кишку, тонкую кишку, подвздошную кишку) и толстую кишку (слепую кишку, толстую кишку, прямую кишку), особенно тонкую кишку и толстую кишку.
Таким образом, состояния, при которых двойные агонисты могут быть полезными, включают мальабсорбцию, язвы (например, пептические язвы, синдром Золлингера-Эллисона, язвы, вызванные медикаментозными средствами, и язв, связанных с инфекциями или другими патогенами), синдром короткой кишки, синдром слепого кармана, воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), синдром раздраженного кишечника (СРК), поушита, целиакии-спру (например, вызванную глютен-индуцированной энтеропатией или глютеиновой болезни), тропический спру, гипогаммаглобулинемический спру, мукозит или диарею, вызванную химиотерапией или лучевой терапией.
Двойные агонисты также могут найти применение в случае определенных состояний, которые не затрагивают главным образом желудочно-кишечную ткань, но могут быть вызваны или усугублены факторами, возникающими в результате дисфункции кишечника. Например, нарушение барьерной функции кишечника (которую можно назвать «утечкой» кишечника или кишки) может привести к переносу материалов из просвета кишечника непосредственно в кровоток и, таким образом, в почку, легкое и/или печень. Эти материалы могут включать пищевые молекулы, такие как жиры, которые способствуют развитию гепатита и/или жировой болезни печени, включая атрофию кишки, ассоциированную с парентеральным питанием, PNALD (заболевание печени, ассоциированное с парентеральным питанием), NAFLD (неалкогольной жировой болезни печени) и NASH (неалкогольного стеатогепатита). Материалы, попадающие в кровоток, также могут включать патогены, такие как бактерии, и токсины, например бактериальный липополисахарид (ЛПС), которые могут способствовать системному воспалению (например, сосудистому воспалению). Такое воспаление часто называют «воспалением слабой степени», которое является фактором, вовлеченным в патогенез метаболической эндотоксемии (состоянии, наблюдаемом как при диабете, так и при ожирении, которое обсуждается ниже), первичного билиарного цирроза и гепатита. Попадание патогенных микроорганизмов в кровоток также может привести к таким состояниям, как некротический энтероколит.
Воспаление слабой степени не характеризуется нормальными симптомами острого воспаления, такими как боль, лихорадка и покраснение, но может быть выявлено по наличию маркеров воспаления в крови, таких как С-реактивный белок и провоспалительные цитокины, включая TNF-альфа (фактор некроза опухоли альфа).
Двойные агонисты также могут найти применение в случае состояний, которые преимущественно влияют на другие ткани, но имеют гастроинтестинальные побочные эффекты. Например, воспалительные состояния, такие как панкреатит, приводят к повышенным уровням циркулирующих медиаторов воспаления, которые могут, в свою очередь, вызывать повреждение кишечника или дисфункцию кишечника, такую как нарушение барьерной функции. В некоторых случаях это может привести к более серьезным системным воспалительным состояниям, таким как сепсис, или к повреждениям при хирургических процедурах или механическим повреждениям (заворот кишок), когда кровоснабжение кишечника прерывается, что в конечном итоге приводит к травмам ишемии-реперфузии.
Аналогичным образом, заболевание «трансплантат против хозяина» (GVHD) может привести к значительному повреждению тканей желудочно-кишечного тракта, что ведет к нарушению барьерной функции и другим побочным эффектам, таким как диарея. Таким образом, описанные двойные агонисты могут быть полезны для профилактики или лечения дисфункции или повреждения кишечника, вызванного или связанного с GVHD, а также для профилактики или лечения побочных эффектов, таких как диарея, вызванных или связанных с GVHD.
Соединения, двойные агонисты, описанные в настоящей заявке, также находят применение, среди прочего, для уменьшения или ингибирования увеличения веса, уменьшения скорости опорожнения желудка или кишечного транзита, уменьшения потребления пищи, снижения аппетита или содействия потере веса. Влияние на массу тела может быть опосредовано частично или полностью через уменьшение потребления пищи, снижение аппетита или кишечного транзита.
Таким образом, двойные агонисты по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики или лечения ожирения, морбидного ожирения, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, синдрома апноэ во сне, вызванного ожирением.
Независимо от их влияния на массу тела, двойные агонисты по изобретению могут оказывать благоприятное влияние на толерантность к глюкозе и/или контроль уровня глюкозы. Их также можно использовать для модуляции (например, улучшения) уровней циркулирующего холестерина, будучи способными снижать уровни циркулирующего триглицерида или ЛПНП и увеличивать соотношение ЛПВП/ЛПНП.
Таким образом, их можно использовать для профилактики или лечения недостаточного контроля уровня глюкозы, толерантности к глюкозе или дислипидемии (например, повышенных уровней ЛПНП или снижения соотношения ЛПВП/ЛПНП) и связанных с ними состояний, включая диабет (например, диабет 2 типа, гестационный диабет), предиабет, метаболический синдром и гипертонию.
Многие из этих состояний также связаны с ожирением или избыточным весом. Поэтому воздействие двойных агонистов на эти состояния может следовать из их влияния на массу тела, полностью или частично, или может быть независимым от них.
Воздействие на массу тела может быть терапевтическим или косметическим.
Двойная агонистическая активность соединений, описанных в настоящей заявке, может быть особенно полезной при многих описанных состояниях, поскольку эти две активности могут дополнять друг друга.
Например, мальабсорбция представляет собой состояние, возникающее в результате нарушения поглощения воды и/или пищевых питательных веществ, таких как аминокислоты, сахара, жиры, витамины или минералы, через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), что приводит к недоеданию и/или обезвоживанию. Нарушение всасывания может быть результатом физического (например, травматического) или химического повреждения кишечного тракта. Двойные агонисты, раскрытые в настоящем описании, могут быть способны улучшить барьерную функцию кишечника, уменьшить скорость опорожнения желудка и увеличивать всасывание в кишечнике, нормализуя при этом время кишечного транзита. Это не только поможет повысить усвоение питательных веществ и жидкости у пациентов, но и облегчит социальные проблемы пациентов, связанные с движением кишечника, стимулированным приемом пищи.
Кроме того, функция и метаболические нарушения кишечника могут быть тесно взаимосвязаны, при этом каждое из них способствует развитию или проявлению симптомам другого.
Как упоминалось выше, ожирение связано с воспалением слабой степени (иногда обозначаемым как «воспаление, связанное с ожирением»). Также общепризнанно, что ожирение (наряду с другими синдромами) вызывает повышенную проницаемость сосудов, которая позволяет патогенам и токсинам, таким как ЛПС, проникать в клеточную стенку кишечного тракта и тем самым инициировать воспаление. Изменения, возникающие в результате воспалительного ответа, по существу являются одинаковыми, независимо от причины и независимо от того, где возникает повреждение. Воспалительный ответ может быть острым (кратковременным) или хроническим (продолжительным).
Было продемонстрировано, что, например, мыши с ожирением (мыши ob/ob и db/db) имеют нарушенную барьерную функцию слизистой оболочки и демонстрируют усиление воспаления слабой степени (Brun et al., 2007, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292: G518-G525, Epub 5 Oct 2006). Позже это также наблюдали у мышей C57BL6/J, которых держали на диете с высоким содержанием жира (Cani et al., 2008, Diabetes, vol. 57, 1470-1481), и у диабетических мышей без ожирения (Hadjiyanni et al., 2009, Endocrinology, 150 (2):592-599).
Cani и коллеги (Gut; 2009, 58:1091-1103,) отметили, что у мышей ob/ob модуляция кишечной микробиоты приводила к уменьшению дисфункции барьера кишечника и уменьшению системного воспаления через GLP-2-зависимый путь. Кроме того, повышенная проницаемость кишечника, наблюдаемая у пациентов с диабетом и ожирением, вероятно, играет более важную роль в прогрессировании заболевания, чем предполагалось ранее. Повышенная проницаемость кишечника приводит к увеличению транспорта бактериальных липополисахаридов (ЛПС) через барьер кишечника. Это увеличение ЛПС активирует иммунные клетки, такие как циркулирующие макрофаги и макрофаги, находящиеся в органах тела, вызывая хроническое воспаление слабой степени, которое может быть вовлечено в патогенез многих заболеваний. Это явление называется метаболической эндотоксемией (МЭ).
Воспалительный процесс также может играть роль в возникновении метаболической дисфункции у людей с ожирением, например, резистентность к инсулину и другие метаболические нарушения.
Таким образом, соединения, двойные агонисты по изобретению, могут быть особенно полезными для профилактики или лечения слабой степени воспаления, особенно у людей с ожирением или с избыточным весом, оказывая полезные эффекты через GLP-1 агонистический компонент и/или GLP-2 компонент в свой активности.
Терапевтическую эффективность лечения с использованием двойных агонистов по настоящему изобретению можно контролировать с помощью биопсии кишечника для оценки морфологии ворсинок, биохимической оценки всасывания питательных веществ, неинвазивного определения кишечной проницаемости, увеличения массы тела пациента или облегчения симптомов, связанных с этими состояниями.
В дополнительном аспекте предлагается терапевтический набор, содержащий двойной агонист по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль или сольват.
Примеры ниже приведены для иллюстрации предпочтительных аспектов изобретения и никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения.
Примеры
Примеры ниже приведены для иллюстрации предпочтительных аспектов изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Общий синтез пептидов
Список сокращений и поставщиков приведен в таблице ниже.
<b>Список сокращений и поставщиков</b>
<b>Сокращение</b>
<b>Название</b>
<b>Торговая марка/Поставщик</b>
<b>Смолы</b>
TentaGel<sup>TM</sup> PHB AA(Proct)-Fmoc
Rapp Polymere
TentaGel<sup>TM</sup> SRAM
Rapp Polymere
<b>Амино-</b><b>кислоты</b>
Псевдопролины (например, QT, AT, FS)
Jupiter Bioscience Ltd.
Fmoc-L-AA-OH
Senn Chemicals AG
<b>Связывающие агенты</b>
COMU
(1-Циано-2-этоки-2-оксоэтлиденамноокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат
Watson International Ltd.
DIC
Диизопропилкарбодиимид
Fluka/Sigma Aldrich Co.
HATU
N-оксид N-[(диметиламино)-1H-1,2,3-триазол[4,5-b]пиридин-1-илметилен]-N-метилметанаминия гексафторфосфоната
ChemPep Inc.
HOBt
Hydroxybenzotriazole
Sigma-Aldrich Co.
<b>Растворители</b>
Boc<sub>2</sub>O
Ди-трет-бутил пирокарбонат
Advanced ChemTech
DCM
Дихлорметан
Prolabo (VWR)
DIPEA
Диизопропилэтиламин
Fluka/Sigma Aldrich Co.
DMF
N,N-диметилформамид
Taminco
DODT
3,6-диокса-1,8-октандитиол
Sigma-Aldrich Co.
Et<sub>2</sub>O
Диэтиловый эфир
Prolabo (VWR)
EtOH
Этанол
CCS Healthcare AB
Муравьиная кислота (HPLC)
Sigma-Aldrich Co.
H<sub>2</sub>O
Вода, вода Milli-Q
Millipore
MeCN
Ацетонитрил (HPLC)
Sigma-Aldrich Co.
NMP
N-метилпирролидон
Sigma-Aldrich Co.
Пиперидин
Jubliant Life Sciences Ltd.
TFA
Трифторуксусная кислота (HPLC)
Chemicals Raw Materials Ltd.
TIS
Триизопропилсилан
Sigma-Aldrich Co.
MeOH
Метанол
Sigma-Aldrich Co.
Устройство и стратегия синтеза
Пептиды синтезировали партиями на пептидном синтезаторе, таком как пептидный синтезатор CEM Liberty или синтезатор Symphony X, в соответствии с процедурами твердофазного синтеза пептидов, используя 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) в качестве N-α-аминозащитной группы и подходящие общие защитные группы для функциональных групп боковых цепей.
TM
В качестве смол на основе полимерного носителя, использовали смолы, такие как, например, TentaGel. Синтезатор загружали смолой, которую перед использованием оставляли набухать в DMF.
Связывание
Синтезатор пептидов CEM Liberty
Раствор Fmoc-защищенной аминокислоты (4 экв.) добавляли к смоле вместе с раствором связывающего агента (4 экв.) и раствором основания (8 экв.). Смесь либо нагревали в микроволновом блоке до 70-75°С, и реакцию связывания выполняли в течение 5 минут, либо реакцию связывания выполняли без нагревания в течение 60 минут. Во время реакции связывания через смесь барботировали азот.
Синтезатор Symphony X
Растворы для связывания переносили в реакционные сосуды в следующем порядке: аминокислота (4 экв.), HATU (4 экв.) И DIPEA (8 экв.). Время связывания составляло 10 минут при комнатной температуре (RT), если не указано иное. Смолу промывали DMF (5×0,5 мин). В случае повторных реакций связывания время связывания во всех случаях составляло 45 мин при комнатной температуре.
Снятие защиты
Синтезатор пептидов CEM Liberty
С группы Fmoc снимали защиту, используя пиперидин в DMF или другие подходящие растворители. Раствор для снятия защиты добавляли в реакционный сосуд, и смесь нагревали в течение 30 секунд до достижения примерно 40°С. Содержимое реакционного сосуда сливали, добавляли свежий раствор для снятия защиты и затем нагревали до 70-75°С в течение 3 минут. После слива содержимого реакционного сосуда смолу промывали DMF или другими подходящими растворителями.
Синтезатор Symphony X
Удаление защиты Fmoc проводили в течение 2,5 минут, используя 40% пиперидин в DMF, и процедуру повторяли в тех же условиях. Смолу промывали DMF (5×0,5 мин).
Расщепление
Высушенную смолу с пептидом обрабатывали TFA и подходящими поглотителями в течение примерно 2 часа. Объем фильтрата уменьшали, и неочищенный пептид осаждали добавлением диэтилового эфира. Осадок неочищенного пептида несколько раз промывали диэтиловым эфиром и, наконец, сушили.
Очистка неочищенного пептида методом ВЭЖХ
Неочищенный пептид очищали препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ на обычном устройстве для ВЭЖХ, таком как Gilson GX-281 с комбинацией насосов 331/332 для создания бинарного градиента, оборудованном колонкой, такой как 5×25 см колонка 110A Gemini NX 5u C18, и коллектором фракций, используя поток 20-40 мл/мин с подходящим градиентом буфера A (0,1% муравьиной кислоты, водн.) или A (0,1% TFA, водн.) и буфера B (0,1% муравьиной кислоты, 90% MeCN, водн.) или B (0,1% TFA, 90% MeCN, водн.). Фракции анализировали методом аналитической ВЭЖХ и МС, и отобранные фракции объединяли и лиофилизировали. Конечный продукт характеризовали ВЭЖХ и МС.
Аналитическая ВЭЖХ
Конечную чистоту определяли аналитической ВЭЖХ на хроматографе серии Agilent 1100/1200, снабженном автоматическим пробоотборником, дегазатором, 20 мкл проточной ячейкой, используя программное обеспечение Chromeleon. ВЭЖХ выполняли, используя поток 1,2 мл/мин, при 40°С, на аналитической колонке, такой как 100×4,6 мм колонка Kinetex 2,6 мкм XB-C18 100A. Соединение детектировали и выполняли количественное определение при 215 нм. Буферы A (0,1% TFA, водн.) и B (0,1% TFA, 90% MeCN, водн.).
Масс-спектроскопия
Окончательный анализ МС выполняли методом обычной масс-спектроскопии, например, на масс-спектрометре Waters Xevo G2 Tof, оборудованном детектором с электрораспылительной ионизацией с калибровкой фиксированной массы, используя программное обеспечение MassLynx. Анализ выполняли в положительном режиме с прямым впрыском и напряжением на конусе 15 В (1 TOF), 30 В (2 TOF) или 45 В (3 TOF), как указано на хроматограмме. Точность составляла 5 частей на миллион с типичным разрешением 15000-20000.
Анализы эффективности рецепторов GLP-1 и GLP-2
in vitro
50
Пептиды по настоящему изобретению функционируют как агонисты GLP-1 и GLP-2 и, таким образом, активируют рецептор GLP-1 и рецептор GLP-2, соответственно. Одним из используемых анализов  для измерения активности рецепторов GLP-1 и GLP-2 является количественное определение цАМФ, т.е. 3'-5'-циклического аденозинмонофосфата, который является вторым мессенджером, необходимым для осуществления многих биологических процессов, и представляет собой один из наиболее распространенных механизмов для регулирования клеточных функций. Примером является анализ цАМФ AlphaScreen от Perkin Elmer, который использовали для количественной оценки ответа цАМФ на активацию рецепторов GLP-1 и GLP-2 в клетках HEK293, стабильно экспрессирующих GLP-1 R или GLP-2 R. С помощью этих анализов можно оценить тестируемые соединения, вызывающие увеличение цАМФ на внутриклеточном уровне, и нормализовать ответ по отношению к положительному и отрицательному контролю (наполнителю) для определения ЕС и максимального ответа по кривой реакции концентрации с использованием нелинейной 4-параметрической логистической модели (4PL) для подгонки кривой.
Пример 1: Синтез соединений
Синтезированные соединения
Следующие соединения таблицы 1 были синтезированы вышеописанными методами.
Таблица 1.1: Синтезированные соединения
1
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH
2
Hy-H[Aib]EGTFSSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH
3
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH
4
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIEHKITD-OH
5
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIEHKITD-OH
6
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIHHKITD-OH
7
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIYHKITD-OH
8
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLILHKITD-OH
9
Hy-H[Aib]EGTFTDELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH
10
Hy-H[Aib]EGTFTSELSTILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH
11
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD-OH
12
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLHAHKITD-OH
13
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLQAHKITD-OH
14
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLYAHKITD-OH
15
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD-OH
16
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIKHKITD-OH
17
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIRHKITD-OH
18
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLISHKITD-OH
19
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAQKITD-OH
20
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAYKITD-OH
21
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLHQHKITD-OH
22
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLHAHKITD-OH
23
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYEHKITD-OH
24
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLQAHKITD-OH
25
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIAQKITD-OH
26
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFIAWLQAQKITD-OH
27
Hy-H[Aib]EGTFTSELSTILDEQAARDFIAWLHAQKITD-OH
28
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYAHKITD-OH
29
Hy-H[Aib]EGTFTDELATILDEQAARDFIAWLQAQKITD-OH
30
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLYRHKITD-OH
31
Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD-OH
32
Hy-H[Aib]EGTFSSELATILDGKAARDFIAWLIAHKITD-OH
33
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLIAHKITD-OH
34
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFISWLIAHKITD-OH
35
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKAHKITD-OH
36
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKSYKITD-OH
37
Hy-H[Aib]EGTFTSELATILDEQAARDFINWLKEQKITD-OH
38
Hy-HGEGTFTSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH
39
Hy-H[Aib]EGTFSSELSTILEEQASREFIAWLIAHKITE-OH
40
Hy-HGEGSFSSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD-[NH2]
41
Hy-H[Aib]EGSFSSELATILDEQAARDFIAWLIQHKITD-OH
Исключительно с целью иллюстрации ниже подробно описан синтез двух выбранных соединений.
Синтез соединения 2
Hy-Н[Aib]EGTFSSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-ОН
Твердофазный синтез пептида выполняли на синтезаторе Symphony X с использованием стандартной химии Fmoc. Перед использованием оставляли TentaGel S PHB Asp (tBu) Fmoc (1,22 г; 0,23 ммоль/г) набухать в DMF (10 мл), и с Fmoc-группы снимали защиту в соответствии с описанной выше процедурой.
Связывание
Подходящие защищенные Fmoc-аминокислоты в соответствии с последовательностью связывали, как описано выше, используя HATU в качестве связывающего агента. Все реакции связывания выполняли при комнатной температуре. Чтобы облегчить синтез, использовали псевдопролин: в положениях 6 и 7 Fmoc-Phe-Ser(psi Me, Mepro)-OH. Псевдопролин связывали в соответствии со стандартной процедурой, описанной выше для Fmoc-аминокислот.
Снятие защиты
Снятие защиты с Fmoc выполняли в соответствии с процедурой, описанной выше.
Отщепление пептида от твердой подложки
2
Пептид-смолу промывали EtOH (3 × 10 мл) и Et2O (3 × 10 мл) и сушили при комнатной температуре (r.t.) до достижения постоянного веса. Пептид отщепляли от смолы обработкой смесью TFA/TIS/HO (95/2,5/2,5; 40 мл, 2 часа; r.t.). Объем фильтрата уменьшали, и неочищенный пептид осаждали добавлением диэтилового эфира. Осадок неочищенного пептида промывали несколько раз диэтиловым эфиром и, наконец, сушили при комнатной температуре до достижения постоянного веса, получая 950 мг продукта в виде неочищенного пептида (чистота ~48%).
Очистка неочищенного пептида методом ВЭЖХ
Неочищенный пептид очищали препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием системы Gilson GX-281 с комбинацией насосов 331/332 для формирования бинарного градиента, снабженной 5×25 см колонкой Gemini NX 5u C18 110A и коллектором фракций, используя поток 30 мл/мин с градиентом буфера A (0,1% TFA, водн.) и градиентом буфера B (0,1% TFA, 90% MeCN, водн.) от 30%B до 60%B за 47 мин. Фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, и соответствующие фракции объединяли и лиофилизировали с получением 224 мг с чистотой 93%, согласно результатам ВЭЖХ и МС, как описано выше. Расчетная моноизотопная молекулярная масса=3682,86, найденная=3682,87.
Синтез соединения 7
Hy-Н[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIYHKITD-ОН
Твердофазный синтез пептида выполняли на синтезаторе Symphony X с использованием стандартной химии Fmoc. Перед использованием TentaGel S PHB Asp (tBu) Fmoc (1,19 г; 0,23 ммоль/г) оставляли набухать в DMF (10 мл), и с Fmoc-группы снимали защиту в соответствии с описанной выше процедурой.
Связывание
Подходящие защищенные Fmoc-аминокислоты в соответствии с последовательностью связывали, как описано выше, используя HATU в качестве связывающего агента. Все реакции связывания выполняли при комнатной температуре. Чтобы облегчить синтез, использовали псевдопролин: в положениях 6 и 7 Fmoc-Phe-Thr(psi Me, Mepro)-OH. Псевдопролин связывали в соответствии со стандартной процедурой, описанной выше для Fmoc-аминокислот.
Снятие защиты
Снятие защиты с Fmoc выполняли в соответствии с процедурой, описанной выше.
Отщепление пептида от твердой подложки
2
Пептид-смолу промывали EtOH (3 × 10 мл) и Et2O (3 × 10 мл) и сушили при комнатной температуре (r.t.) до достижения постоянного веса. Пептид отщепляли от смолы обработкой смесью TFA/TIS/HO (95/2,5/2,5; 40 мл, 2 часа; r.t.). Объем фильтрата уменьшали, и неочищенный пептид осаждали добавлением диэтилового эфира. Осадок неочищенного пептида несколько раз промывали диэтиловым эфиром и, наконец, сушили при комнатной температуре до достижения постоянного веса, получая 750 мг продукта в виде неочищенного пептидного (чистота ~30%).
Очистка неочищенного пептида методом ВЭЖХ
Неочищенный пептид очищали препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием системы Gilson GX-281 с комбинацией насосов 331/332 для формирования бинарного градиента, снабженной 5×25 см колонкой Gemini NX 5u C18 110A и коллектором фракций, используя поток 30 мл/мин с градиентом буфера A (0,1% TFA, водн.) и градиентом буфера B (0,1% TFA, 90% MeCN, водн.) от 30%B до 60%B за 47 мин. Фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, и соответствующие фракции объединяли и лиофилизировали с получением 53 мг с чистотой 84% согласно результатам ВЭЖХ и МС, как описано выше. Расчетная моноизотопная молекулярная масса=3774,89, найденная=3774,87
Пример 2: Измерения EC
для GLP-1R и GLP-2R
50
Генерация клеточной линии, экспрессирующей человеческие рецепторы GLP-1
кДНК, кодирующую рецептор человеческого глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1R) (первичный регистрационный номер P43220), клонировали из кДНК BC112126 (MGC: 138331/IMAGE:8327594). ДНК, кодирующую GLP-1-R, амплифицировали с помощью ПЦР с помощью праймеров, кодирующих терминальные сайты рестрикции для субклонирования. 5'-концевые праймеры дополнительно кодировали так, чтобы имелась консенсусная последовательность, близкая к Козак, для обеспечения эффективной трансляции. Точность воспроизведения ДНК, кодирующей GLP-1-R, подтверждали секвенированием ДНК. Продукты ПЦР, кодирующие GLP-1-R, субклонировали в вектор экспрессии млекопитающего, содержащий маркер резистентности к неомицину (G418). Векторы экспрессии млекопитающих, кодирующие GLP-1-R, трансфицировали в клетки HEK293 стандартным методом трансфекции с фосфатом кальция. Через 48 часов после трансфекции клетки высевали для клонирования методом серийных разведений и выполняли селекцию с помощью 1 мг/мл G418 в культуральной среде. Через 3 недели селекции с использованием G418 клоны отбирали и тестировали в функциональном анализе активности рецептора GLP-1, как описано ниже. Один клон выбирали для использования в анализе активности соединения.
Получение линии клеток, экспрессирующих рецепторы человеческого GLP-2
hGLP2-R приобретали в компании MRC-geneservice, Babraham, Cambridge в форме клона Image:5363415 (11924-I17). Для субклонирования в вектор экспрессии млекопитающих праймеры для субклонирования получали от компании DNA-Technology, Risskov, Denmark. 5'- и 3'-праймеры, используемые в реакции ПЦР, включали концевые сайты рестрикции для клонирования, и содержимое 5'-праймера модифицировали для достижения консенсуса с последовательностью Козак без изменения последовательности продукта, кодируемой ОРС (ORF). Стандартную реакцию ПЦР проводили с использованием Image clone 5363415 (11924-I17) в качестве матрицы с помощью указанных выше праймеров и полимеразы Polymerase Herculase II Fusion в общем объеме 50 мкл. Полученный продукт ПЦР очищали с помощью набора GFX PCR и набора для очистки полос геля, расщепляли рестрикционными ферментами и клонировали в вектор экспрессии млекопитающих с использованием набора для быстрого лигирования ДНК (Rapid DNA Ligation). Продуктами реакции лигирования трансформировали ультракомпетентные клетки XL10 Gold и отбирали колонии для получения ДНК с использованием набора Endofree Plasmid maxi. Последующий анализ последовательности проводили в MWG Eurofins, Германия. Было подтверждено, что клон является рецептором hGLP-2 (1-33), вариант сплайсинга rs17681684.
6
Клетки HEK293 трансфицировали методом трансфекции Lipofectamine PLUS. За день до трансфекции клетки НЕК293 высевали в две колбы Т75 с плотностью 2×10 клеток/флакон Т75 в среду для культивирования клеток без антибиотиков. В день трансфекции клетки промывали 1x DPBS, и среду заменяли на Optimem до объема 5 мл/флакон T75 перед добавлением комплексов липофектамин-плазмида, которые осторожно и по каплям добавляли к клеткам в колбах T75, и заменяли средой для роста через 3 часа и затем снова через 24 часа средой для роста, дополненной 500 мкг/мл G418. Через 4 недели селекции с использованием G418 клоны отбирали и тестировали с помощью функционального анализа активности рецептора GLP-2, как описано ниже. Один из клонов отбирали для использования в анализе активности соединения.
Анализы активности рецепторов GLP-1R и GLP-2
50
Анализ цАМФ AlphaScreen от Perkin Elmer использовали для количественной оценки ответа цАМФ на активацию рецепторов GLP1 и GLP2, соответственно. Эксендин-4 использовали в качестве контрольного соединения для активации рецептора GLP1, а тедуглутид использовали в качестве контрольного соединения для активации рецептора GLP2. Выполняли нормализацию данных по тестируемым соединениям, вызывающим повышение внутриклеточного уровня цАМФ, относительно положительного и отрицательного контроля (наполнитель) для определения ЕС и максимального ответа по кривой концентрация-эффект. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2: Определение EC
50
<b>Соединение</b>
<b>EC</b><sub><b>50</b></sub><b> для GLP-1 (нМ)</b>
<b>EC</b><sub><b>50</b></sub><b> для GLP-2 (нм)</b>
Тедуглутид
39,0
0,027
Лираглутид
0,029
N/A
1
0,014
0,036
2
0,046
0,034
3
0,0074
0,036
4
0,015
0,044
5
0,0098
0,067
6
0,014
0,047
7
0,017
0,110
8
0,021
0,084
9
0,007
0,041
10
0,005
0,050
11
0,011
0,085
12
0,055
0,076
13
0,016
0,083
14
0,021
0,049
15
0,005
0,038
16
0,006
0,026
17
0,006
0,066
18
0,006
0,054
19
0,005
0,150
20
0,012
0,260
21
0,049
0,110
22
0,280
0,042
23
0,120
0,034
24
0,042
0,049
25
0,008
0,062
26
0,013
0,190
27
0,120
0,370
28
0,110
0,024
29
0,044
0,110
30
0,100
0,034
31
0,020
0,078
32
0,038
0,150
33
0,004
0,041
34
0,005
0,049
35
0,006
0,048
36
0,007
0,110
37
0,007
0,160
38
0,008
0,043
39
0,030
0,960
40
1,400
0,050
41
0,078
0,026
N/A=недетектируемая активность
Пример 3: Оценка растворимости
Готовили маточный раствор тестируемого пептида (2 мг/мл; по количеству взвешенного пептида) в деминерализованной воде, доведенной до рН 2,5 с помощью HCl, и аликвоты разбавляли в соотношении 1:1 в 100 мМ ацетатном буфере (рН 4,0 и рН 5,0), 100 мМ гистидинового буфера (рН 6,0 и рН 7,0) и 100 мМ фосфатного буфера (рН 6,0, рН 7,0 и рН 7,5), соответственно, и загружали в стандартный нестерильный 96-луночный УФ-микропланшет с плоским дном. Поглощение образцов (единичные образцы, n=1) при 280 и 325 нм измеряли на планшетном ридере по оптической плотности, который предварительно нагревали до температуры окружающей среды (обычно 25°C). Показатель мутности по результатам поглощения для растворимости пептида ≥1 мг/мл составил ≤0,025 единиц поглощения при 325 нм (что в 5-6 раз превысило стандартное отклонение для 8 буферных образцов в планшете). Данные по растворимости для пептидов по изобретению приведены в таблице 3 ниже.
Таблица 3: Данные по растворимости
Cpd
Ацетатный буферpH 4
Ацетатный буферpH 5
Гистидиновый буферpH 6
Гистидиновый буферpH 7
Фосфатный буферpH 6
Фосфатный буферpH 7
Фосфатный буферpH 7.5
1
SS
II
SS
SS
SS
SS
SS
3
SS
II
SS
SS
SS
SS
SS
4
SS
II
SS
SS
SS
SS
SS
5
SS
II
SS
SS
SS
SS
SS
6
SS
II
II
SS
II
SS
II
7
SS
II
II
SS
II
SS
SS
8
SS
II
II
SS
II
SS
SS
* SS указывает на растворимость ≥1 мг/мл
** II указывает на растворимость <1 мг/мл
Пример 4: Химическая стабильность
ТМ
Образцы каждого тестируемого пептида растворяли в воде MilliQ, и рН раствора доводили до рН 6, 7, 7,5 или 9, используя либо HCl, либо NaOH. Конечная концентрация пептида составляла 0,2 мг/мл. Образцы помещали в стеклянные флаконы и инкубировали при 40°С. Образцы анализировали методом ОТ-ВЭЖХ на колонке С18 с градиентным элюированием с использованием элюентной системы ацетонитрил/TFA/вода. Процент площади (площадь%) основного пика после времени инкубации T=t (относительно времени T=0) определяли с помощью УФ-спектроскопии при 220 нм.
Чистоту сначала определяли следующим образом:
Чистота (площадь%)=(площадь основного пика/общая площадь всех пиков) х 100.
Затем чистоту нормализовали между временными точками, устанавливая чистоту в момент времени 0 (Т=0), равную 100, для каждого значения рН для данного пептида, следующим образом:
Нормализованная площадь (%) в момент времени t (T=t)=[площадь (%) (T=t)/площадь (%) (T=0)] x 100.
Результаты оценки химической стабильности после 14-дневной инкубации (в виде нормированных значений чистоты) суммированы в таблице 4.
Таблица 4: Данные по химической стабильности
Соединение
pH 6 нормализованная стабильность
pH 7 нормализованная стабильность
1
A
B
3
A
B
5
A
B
4
C
A
6
C
C
7
C
C
8
C
C
26
C
B
29
C
B
34
C
C
35
C
C
10
NA
C
31
NA
C
38
NA
C
41
C
A
2
C
A
22
NA
C
Ключ: A ->90% нормализованной стабильности; B ->80% стабильности; С - <80% нормализованной стабильности.
Пример 5: Влияние на уровень глюкозы натощак и вес кишки у нормальных мышей
Использовали самцов мышей C57BL/6J, получавших стандартную пищу. Мышей содержали в стандартных условиях, в помещении с контролируемой освещенностью, температурой и влажностью (12:12 часовой цикл свет-темнота, с включенным освещением в период с 06.00 до 18.00 ч; 20-22°C; относительная влажность 50-80%). Каждая группа дозирования состояла из 6 животных. Мышам подкожно вводили один раз в сутки 250 нмоль/кг тестируемых соединений или носителя в течение 4 дней.
В день 0 мыши голодали, и после однократной инъекции пептидов у них измеряли уровень глюкозы в крови. Животных умерщвляли через 24 часа после введения конечной дозы на 3-й день, и измеряли сырую массу тонкой кишки.
Результаты
Все тестируемые соединения (250 нмоль/кг) снижали уровни глюкозы в крови натощак по сравнению с группой носителя (таблица 5).
Тестируемые соединения увеличивали сырую массу тонкой кишки по сравнению с мышами, получавшими носитель (таблица 5).
Таблица 5. Влияние на уровень глюкозы в крови натощак и массу тонкой кишки
<b>Лечение</b>
<b>Уровень глюкозы в крови натощак (мМ)</b>
<b>Сырая масса тонкой кишки (г)</b>
Носитель
8,24
0,76
Cpd. 1
5,76
0,90
Cpd. 5
5,43
0,90
Cpd. 22
6,18
0,82
Cpd. 26
5,70
0,78
Cpd. 34
5,62
0,93
Cpd. 35
5,95
0,81