Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей
DRUG APPLICATION FOR INDUCTION OF SPECIFIC IMMUNITY AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS SARS-COV-2 IN CHILDREN

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники
В декабре 2019 года в провинции Хубэй Китайской Народной Республики распространился новый коронавирус зоонозного происхождения, который получил название SARS-CoV-2. Эпидемическое заболевание, вызванное SARS-CoV-2, называется коронавирусная болезнь-19 (coronavirus disease-19), сокращенно COVID-19. Данное заболевание может протекать как в бессимптомной или легкой форме, так и в тяжелой форме, которая может сопровождаться сепсисом и полиорганной недостаточностью. В течение нескольких месяцев заболевание распространилось по всему миру, затронув более 200 стран. В январе 2020 года Всемирная организация здравоохранения объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию. К 28 июля 2021 года количество заболевших превысило 195 млн человек, а количество погибших - 4 млн человек.
Продолжающаяся вспышка COVID-19 представляет исключительную угрозу для общественного здравоохранения. Разработка безопасной и эффективной вакцины против SARS-CoV-2 в настоящее время является важнейшим глобальным приоритетом.
В течение года после начала пандемии различные фармацевтические компании предложили свои варианты кандидатной вакцины против COVID-19.
Фармацевтическая компания Pfizer при сотрудничестве с биотехнологической компанией BioNTech разработала вакцину BNT162b2 (tozinameran). Данная вакцина представляет собой липидные наночастицы, внутрь которых инкапсулирована модифицированная мРНК, кодирующая мутантную форму S белка SARS-CoV-2. В данный момент разрешено использование данной вакцины у взрослых и детей с 12 лет (F.P. Polacketal. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med 2020; 383: 2603-2615; www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/recommendations/adolescents.html).
Фармацевтическая компания Moderna в сотрудничестве с Национальным Институтом здоровья (США) разработала вакцину mRNA-1273. Активным компонентом данной вакцины является мРНК, кодирующая S белок SARS-CoV-2, которая окружена липидной оболочкой. Сейчас вакцина разрешена для экстренного применения у взрослых от 18 лет. Также Moderna провела исследование для детей от 12 до 17 лет, которое сейчас находится на рассмотрении. В настоящий момент проходит клиническое исследование KidCOVE, в ходе которого проводится иммунизация детей от 6 месяцев до 12 лет (L. A. Jackson etal. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. N Engl J Med 2020; 383:1920-1931;https://penntoday.upenn.edu/news/covid-vaccine-kids; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04796896).
Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOx1, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. TheLancet. Vol. 397, Issue 10269, P99-111, 2021).
Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2. В настоящее время вакцина разрешена для экстренного использования у взрослых людей старше 18 лет. (GenBankYP_009724390) (Feng-Cai Zhu et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. The Lancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020).
Исследовательские группы JohnsonandJohnson и JanssenPharmaceutical в сотрудничестве с Медицинским центром BethIsraelDeaconess, с помощью технологии JanssenAdVac создали несколько кандидатных вакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVS1). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и Е3 области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумя пролин-стабилизирующими мутациями. Вакцина разрешена для экстренного применения у взрослых старше 18 лет. В настоящий момент проводятся исследования для использования вакцины у подростков и детей с рождения. (J. Sadoff et al. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 2021 Jan 13.DOI: 10.1056/ NEJMoa2034201; https://www.janssenmd.com/janssen-covid19-vaccine/special-populations/pediatrics/use-of-janssen-covid19-vaccine-in-pediatric-participants).
В Beijing Institute of Biological Products Co. была разработана инактивированная вакцина против COVID-19. Вакцина одобрена для экстренного применения у взрослых с 18 лет. Также опубликована информация о клиническом исследовании данной вакцины на детях в возрастных группах 3-6 лет, 7-12 лет, 13-17 лет. В настоящий момент исследование продолжается (https://www.who.int/news/item/07-05-2021-who-lists-additional-covid-19-vaccine-for-emergency-use-and-issues-interim-policy-recommendations; https://clinicaltrials.gov /ct2/show/NCT04917523?cond=covid-19+vaccine&age_v=5&draw=2&rank=10).
Таким образом, в настоящее время, для применения у детей одобрена всего одна вакцина против COVID-19 на базе мРНК (Pfizer). Между тем, наблюдения врачей показывают, что количество молодых пациентов, госпитализированных в стационары с диагнозом COVID-19, возрастает. Также увеличивается смертность среди молодого населения (https://www.paho.org/en/news/5-5-2021-hospitalizations-and-deaths-younger-people-soar-due-covid-19-paho-director-reports), а вместе с этим увеличивается потребность в вакцинах для профилактики COVID-19 у детей.
Защитный иммунитет против коронавируса SARS-CoV-2 задействует несколько звеньев иммунной системы. Эффективная вакцина против COVID-19, по-видимому, должна индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Кроме того, важным элементом защитного иммунитета может служить активация мукозального иммунитета (например, реализуемого через экспрессию IgA антител) в носоглотке, которая является воротами проникновения вируса.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых средств, которые способны индуцировать у детей иммунный ответ против SARS-CoV-2, в том числе на слизистых оболочках дыхательных путей, которые являются основными воротами инфекции.
Осуществление изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа (в том числе мукозального иммунного ответа) против вируса SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Технический результат заключается в создании безопасного и эффективного средства, которое обеспечивает развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Ребенок рождается с незрелой врожденной и адаптивной иммунной системой, которая развивается и приобретает память по мере его роста. От рождения до периода полового созревания человека, его иммунная система проходит в своем развитии ряд этапов.
Иммунная система новорожденного находится в супрессии. Система фагоцитоза не развита. Неонатальные Т-клетки значительно отличаются от взрослых клеток, что является следствием внутриутробной жизни плода, где воздействие чужеродных антигенов в значительной степени ограничивается материнскими аллоантигенами. Поэтому очень ранний адаптивный Т-клеточный иммунитет характеризуется толерогенной реактивностью, сниженным распознаванием аллоантигена и слабыми ответами на чужеродные антигены. В-клетки новорожденных также сильно отличаются от В-клеток взрослого человека. Известно, что неонатальные В-клетки имеют пониженную экспрессию TACI, BCMA и BAFF-R, а также сниженную продукцию IgG и IgA вответна CD40L и IL-10 (Kaur K, Chowdhury S, Greenspan NS, Schreiber JR. Decreased expression of tumor necrosis factor family receptors involved in humoral immune responses in preterm neonates. Blood. 2007 Oct 15; 110(8):2948-54. doi: 10.1182/blood-2007-01-069245. Epub 2007 Jul 18. PMID: 17634409). Вместе эти особенности способствуют притуплению гуморальных иммунных ответов с неполным переключением класса иммуноглобулинов. В-клетки новорожденных и младенцев в возрасте до 2 месяцев демонстрируют снижение соматической гипермутации по сравнению со взрослыми, что ограничивает созревание аффинности антител. Также, стромальные клетки костного мозга на ранних этапах жизни неспособны поддерживать долгосрочную выживаемость плазмобластов и дифференцировку в плазматические клетки, так что любые антитела IgG, вырабатываемые после иммунизации, быстро снижаются, в отличие от детей старшего возраста и взрослых (Pihlgren M, Friedli M, Tougne C, Rochat AF, Lambert PH, Siegrist CA. Reduced ability of neonatal and early-life bone marrow stromal cells to support plasmablast survival. J Immunol. 2006 Jan 1; 176(1):165-72. doi: 10.4049/jimmunol.176.1.165. PMID: 16365407). Следовательно, эффективность адаптивной иммунной системы по раннему ответу на Т-клеточно-зависимые антигены заметно снижена у новорожденных по сравнению с детьми старшего возраста и взрослыми (A.K. Simon, G.A. Hollander, A. McMichael. Evolution of the immune system in humans from infancy to old age. Proc Biol Sci. 2015 Dec 22; 282(1821): 20143085. doi: 10.1098/rspb.2014.3085, PMCID: PMC4707740, PMID: 26702035).
В младенчестве иммунная система постепенно созревает. Критически важная ранняя защита от многих инфекционных заболеваний, ранее перенесенных матерью, обеспечивается пассивными антителами IgG, передаваемыми от матери трансплацентарно и с молоком.
Следующий этап развития обусловлен разрушением материнских антител. Первичный иммунный ответ на проникновение инфекции развивается за счет синтеза иммуноглобулинов класса М и не оставляет иммунологической памяти. Такой тип иммунного ответа наступает также при вакцинации против инфекционных заболеваний, и только ревакцинация формирует вторичный иммунный ответ с продукцией антител класса IgG.
С ростом ребенка расширяются его контакты с внешним миром. Постепенно начинается переключение иммунных реакций на образование антител класса IgG. Однако на многие антигены сохраняется первичный иммунный ответ (синтез IgM). Система местного иммунитета все еще остается незрелой. Постепенно средняя концентрация IgG и IgM в крови увеличивается и достигает уровня, соответствующего взрослым, однако уровень IgA в крови еще не достигает окончательных значений.
Последний этап развития иммунной системы наступает в период полового созревания. На фоне повышения секреции половых стероидов уменьшается объем лимфоидных органов. Секреция половых гормонов ведет к подавлению клеточного звена иммунитета (Щеплягина Л.А., Круглова И.В. Возрастные особенности иммунитета у детей, Русский медицинский журнал №23 от 11.11.2009 стр. 1564).
Таким образом, разработка средства для применения у детей, обеспечивающего эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, включающую развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, является сложной научной задачей.
Когда ребенок сталкивается с SARS-CoV-2, вирус в первую очередь поражает слизистые оболочки дыхательных путей. Это означает, что взаимодействия вируса с иммунной системой сначала происходят преимущественно на слизистых оболочках дыхательных путей и полости рта. Поэтому индукция мукозального иммунитета является важным фактором, влияющим на протективные свойства фармацевтического средства.
Исходя из уровня техники можно предположить, что введение детям вакцины, которая используется у взрослых, приведет к уменьшению ее эффективности вследствие незрелости детской иммунной системы. Однако проведенные исследования показали, что введение детям 1/10 взрослой дозы разработанного средства индуцирует гуморальный иммунный ответ сравнимый с иммунным ответом взрослого человека. В данном случае это является неожиданным результатом.
Также, на молодых животных было показано, что введение разработанного средства индуцирует повышение уровня IgG антител на слизистой оболочке респираторного тракта. При этом, если в схему иммунизации включается интраназальный способ введения средства, это приводит к секреции на слизистой оболочке IgA антител. Таким образом, в результате проведенной работы были разработаны схемы введения средства, обеспечивающие усиленный мукозальный ответ в респираторном тракте.
Указанный технический результат достигается тем, что предложено:
Применение средства, содержащего компонент в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего компонент в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего комбинацию, представляющую собой компонент 1 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, и компонент 2 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего компонент в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего комбинацию, представляющую собой компонент 1 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, и компонент 2 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего комбинацию, представляющую компонент 1 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащего компонент 2 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
В частных случаях осуществления:
Средство обеспечивает индукцию мукозального иммунного ответа на слизистых оболочках дыхательных путей;
Средство выполнено в жидкой или лиофилизированной форме.
При этом жидкая форма средства содержит буферный раствор, масс %:
трис
от 0,1831 до 0,3432
хлорид натрия
от 0,3313 до 0,6212
сахароза
от 3,7821 до 7,0915
магния хлорида гексагидрат
от 0,0154 до 0,0289
ЭДТА
от 0,0029 до 0,0054
полисорбат-80
от 0,0378 до 0,0709
этанол 95%
от 0,0004 до 0,0007
вода
остальное
При этом восстановленная лиофилизированная форма средства содержит буферный раствор, масс %:
трисхлорид натриясахарозамагния хлорида гексагидратЭДТАполисорбат-80вода
от 0,0180 до 0,0338от 0,1044 до 0,1957от 5,4688 до 10,2539от 0,0015 до 0,0028от 0,0003 до 0,0005от 0,0037 до 0,0070остальное
В частном случае, компонент и/или компоненты средства предназначены для интраназального и/или внутримышечного введения.
9
10
В частном случае, средство предназначено для введения в дозе 5*10- 5*10 вирусных частиц.
В частном случае, компоненты средства предназначены для последовательного введения с интервалом более 1 недели или предназначены для одновременного введения.
При этом компоненты средства могут находиться в индивидуальных упаковках.
Краткое описание фигур
На фиг. 1
представлен процент пролиферирующих CD4+ (А) и CD8+ (Б) Т лимфоцитов до иммунизации (1 день) и на 14 день исследования, после иммунизации мышей разработанным фармацевтическим средством Ad26-CMV-S-CoV2. Точками обозначены значения по каждому животному, участвующему в исследовании. Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Отклонения обозначают 95% доверительный интервал. Символ **, обозначает статистически достоверную разницу между значениями 1 и 14 дня (p<0.01, по критерию Манн-Уитни).
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс - время, дни
На фиг. 2
представлен процент пролиферирующих CD4+ (А) и CD8+ (Б) Т лимфоцитов до иммунизации (1 день) и на 14 день исследования, после иммунизации мышей разработанным фармацевтическим средством Ad5-CMV-S-CoV2. Точками обозначены значения по каждому животному, участвующему в исследовании. Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Отклонения обозначают 95% доверительный интервал. Символы * (p<0.05) и ** (p<0.01), обозначают статистически достоверную разницу между значениями 1 и 14 дня по критерию Манн-Уитни.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс - время, дни
На фиг. 3
10
представлены титры IgG антител, специфичных к RBD-домену S белка вируса SARS-Cov2, до вакцинации (1 день) и на 21, 28 и 42 дни исследования, после иммунизации добровольцев разработанным фармацевтическим средством в дозе 1×10 вирусных частиц. Точками обозначены значения по каждому добровольцу, участвующему в исследовании. Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Отклонения обозначают 95% доверительный интервал. Статистически достоверная разница между значениями на 21, 28 и 42 день обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т-критерию Вилкоксона (#### - p<0.0001). НД обозначает недостоверные различия между указанным выборками данных. Статистически достоверная разница между значениями 21, 28 и 42 день в сравнении со значениями до вакцинации (1 день) определено по Т-критерию Вилкоксона (**** - p<0.0001).
Ось ординат - титр антигенспецифических IgG антител;
Ось абсцисс - время, дни.
На фиг. 4
10
представлены титры IgG антител, специфичных к RBD-домену S белка вируса SARS-Cov2, до вакцинации (1 день) и на 21, 28 и 42 дни исследования, после иммунизации добровольцев разработанным фармацевтическим средством в дозе 2×10 вирусных частиц. Точками обозначены значения по каждому добровольцу, участвующему в исследовании. Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Отклонения обозначают 95% доверительный интервал. Статистически достоверная разница между значениями на 21, 28 и 42 день обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т-критерию Вилкоксона (#### - p<0.0001). НД обозначает недостоверные различия между указанным выборками данных. Статистически достоверная разница между значениями 21, 28 и 42 день в сравнении со значениями до вакцинации (1 день) определено по Т-критерию Вилкоксона (**** - p<0.0001).
Ось ординат - титр антигенспецифических IgG антител;
Ось абсцисс - время, дни.
На фиг. 5
10
представлен процент пролиферирующих CD4+ (А) и CD8+ (Б) Т лимфоцитов до иммунизации (1 день) и на 28 день исследования, после иммунизации добровольцев разработанным фармацевтическим средством в дозе 1×10 вирусных частиц. Точками обозначены значения по каждому добровольцу, участвующему в исследовании. Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Отклонения обозначают 95% доверительный интервал. Символ ****, обозначает статистически достоверную разницу между значениями 1 и 28 дня (p<0.0001, по критерию Вилкоксона).
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс - время, дни
На фиг. 6
10
представлен процент пролиферирующих CD4+ (А) и CD8+ (Б) Т лимфоцитов до иммунизации (1 день) и на 28 день исследования, после иммунизации добровольцев разработанным фармацевтическим средством в дозе 2×10 вирусных частиц. Точками обозначены значения по каждому добровольцу, участвующему в исследовании. Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Отклонения обозначают 95% доверительный интервал. Символ ****, обозначает статистически достоверную разницу между значениями 1 и 28 дня (p<0.0001, по критерию Вилкоксона).
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - время, дни.
Реализация изобретения
Первым этапом в разработке средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 являлся выбор вакцинного антигена. В ходе работы был проведен литературный поиск, который показал, что наиболее перспективным антигеном для создания кандидатной вакцины является S белок коронавируса. Это трансмембранный гликопротеин I типа, который отвечает за связывание, слияние и проникновение вирусных частиц в клетку. Было показано, что он является индуктором нейтрализующих антител (Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. BiomedEnvironSci. 2005 Dec; 18(6):363-74).
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций против S белка SARS-CoV-2 авторы разработали различные варианты экспрессионных кассет.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CMV промотор - это промотор ранних генов цитомегаловируса, который обеспечивает конститутивную экспрессию во множестве типов клеток. Однако сила экспрессии гена-мишени, управляемая промотором CMV, варьируется в зависимости от типов клеток. Кроме того, было показано, что уровень экспрессии трансгена под контролем CMV-промотора уменьшается с увеличением времени культивирования клеток из-за подавления экспрессии генов, которое связано с метилированием ДНК [Wang W., Jia YL., Li YC., Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao CP., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. // Scientific Reports - 2017. - Vol. 8. - P. 10416].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CAG-промотор - синтетический промотор, который включает ранний энхансер промотора CMV, промотор β-актина курицы и химерный интрон (β-актина курицы и β-глобин кролика). Экспериментально показано, что транскрипционная активность промотора CAG выше, чем у промотора CMV.[Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. // Genet. Mol. Res. - 2014. - Vol. 13. - P. 1270-1277].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. Промотор EF1 - промотор человеческого эукариотического фактора элонгации трансляции 1β (EF-1α). Промотор является конститутивно активным в широком диапазоне типов клеток [PMID: 28557288. The EF-1α promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells]. Ген EF-1α кодирует фактор элонгации-1α, который является одним из наиболее распространенных белков в эукариотических клетках и экспрессируется почти во всех типах клеток млекопитающих. Данный промотор EF-1α часто активен в клетках, в которых вирусные промоторы не способны экспрессировать контролируемые гены, и в клетках, в которых вирусные промоторы постепенно заглушаются.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Для эффективной доставки гена S белка коронавируса SARS-CoV-2 в организм человека была выбрана векторная система на основе аденовирусов. Аденовирусные векторы обладают целым рядом преимуществ: они не способны размножаться в клетках человека, проникают как в делящиеся, так и неделящиеся клетки, способны индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ, обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого антигена.
Авторы разработали варианты средства, содержащие два компонента, а также варианты средств, содержащие один компонент на основе аденовирусов различных серотипов. Таким образом, иммунный ответ на векторную часть аденовируса, который может возникать после введения первого компонента средства или однокомпонентного средства, в дальнейшем не бустируется и не влияет на генерацию антиген-специфических иммунных ответов против вакцинного антигена в случае использования двухкомпонентного средства или при необходимости повторного введения однокомпонентного средства, так как в последнем случае может быть введено средство на основе иного аденовируса.
Кроме того, разработанные средства расширяют арсенал средств для индукции иммунного ответа против коронавируса SARS-CoV-2, что обеспечит преодоление трудностей, связанных проблемой наличия у части населения предсуществующего иммунного ответа к некоторым серотипам аденовирусов.
Таким образом, в результате проведенной работы были разработаны следующие технические решения.
Применение средства, содержащего компонент в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего компонент в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего комбинацию, представляющую собой компонент 1 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, и компонент 2 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего компонент в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего комбинацию, представляющую собой компонент 1 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, и компонент 2 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Применение средства, содержащего комбинацию, представляющую компонент 1 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащего компонент 2 в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
В частных случая осуществления:
Средство обеспечивает индукцию мукозального иммунного ответа на слизистых оболочках дыхательных путей;
Средство выполнено в жидкой или лиофилизированной форме.
При этом жидкая форма средства содержит буферный раствор, масс %:
трис
от 0,1831 до 0,3432
хлорид натрия
от 0,3313 до 0,6212
сахароза
от 3,7821 до 7,0915
магния хлорида гексагидрат
от 0,0154 до 0,0289
ЭДТА
от 0,0029 до 0,0054
полисорбат-80
от 0,0378 до 0,0709
этанол 95%
от 0,0004 до 0,0007
вода
остальное
При этом восстановленная лиофилизированная форма средства содержит буферный раствор, масс %:
трисхлорид натриясахарозамагния хлорида гексагидратЭДТАполисорбат-80вода
от 0,0180 до 0,0338от 0,1044 до 0,1957от 5,4688 до 10,2539от 0,0015 до 0,0028от 0,0003 до 0,0005от 0,0037 до 0,0070остальное
В частном случае, компонент и/или компоненты средства предназначены для интраназального и/или внутримышечного введения.
9
10
В частном случае, средство предназначено для введения в дозе 5*10- 5*10 вирусных частиц.
В частном случае, компоненты средства предназначены для последовательного введения с интервалом более 1 недели или предназначены для одновременного введения.
При этом компоненты средства могут находиться в индивидуальных упаковках.
Кроме того, авторами изобретения были подобраны варианты буферного раствора, которые позволяют хранить разработанное средство как в замороженном виде при температуре ниже -18°С, так и в виде лиофилизата при температуре от +2°С до +8°С.
Также был разработано применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца, путем его введения в организм в эффективном количестве.
Было показано, что разработанное средство обеспечивает индукцию мукозального иммунного ответа на слизистых оболочках дыхательных путей.
Кроме того, средство, в том числе состоящее из одного компонента, может применяться однократно.
Для ревакцинации может быть использовано любое из предложенных средств, независимо от того, каким средством проводили вакцинацию.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1
Получение экспрессионного вектора, содержащего геном рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн плазмидной конструкции pAd26-Ends, несущей два участка, гомологичных геному аденовируса человека 26 серотипа (два плеча гомологии), и ген устойчивости к ампициллину. Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 26-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок. Второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4 области до конца генома. Синтез конструкции pAd26-Ends осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Выделенную из вирионов ДНК аденовируса человека 26-го серотипа смешивали с pAd26-Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pAd26-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pAd26-dlE1, несущая геном аденовируса человека 26-го серотипа с делетированной E1-областью.
Затем, в полученной плазмиде pAd26-dlE1 с использованием стандартных методов клонирования была заменена последовательность, содержащая открытую рамку считывания 6 (ORF6-Ad26), на аналогичную последовательность из генома аденовируса человека 5-го серотипа для того, чтобы аденовирус человека 26-го серотипа был способен эффективно размножаться в культуре клеток HEK293. В результате была получена плазмида pAd26-dlE1-ORF6-Ad5.
Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов в сконструированной плазмиде pAd26-dlE1-ORF6-Ad5 была удалена E3-область генома аденовируса (примерно 3321 п.о. между генами pVIII и U-exon) для увеличения пакующей емкости вектора. В результате этого был получен рекомбинантный вектор pAd26-only-null на основе генома аденовируса человека 26-го серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей.
Кроме того, авторами было разработано несколько дизайнов экспрессионной кассеты:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
На основе плазмидной конструкции pAd26-Ends генно-инженерным методом были получены конструкции pArms-26-CMV-S-CoV2, pArms-26-CAG-S-CoV2, pArms-26-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. После этого, конструкции pArms-26-CMV-S-CoV2, pArms-26-CAG-S-CoV2, pArms-26-EF1-S-CoV2 линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-only-null. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-only-CMV-S-CoV2, pAd26-only-CAG-S-CoV2, pAd26-only-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно.
На четвертом этапе, плазмиды pAd26-only-CMV-S-CoV2, pAd26-only-CAG-S-CoV2, pAd26-only-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
Пример 2
Получение средства в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
На данном этапе работы экспрессионные векторы, полученные в примере 1, очищали методом анионообменной и эксклюзионной хроматографии. Готовая суспензия содержала аденовирусные частицы в буферном растворе для жидкой формы средства или в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
Таким образом, были получены следующие иммунобиологические средства на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5:
1. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad26-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
2. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad26-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
3. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad26-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
4. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad26-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
5. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad26-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
6. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad26-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
Каждое из представленных иммунобиологических средств является компонентом 1 в варианте 1 и в варианте 2 разработанного средства.
Пример 3
Получение экспрессионного вектора, содержащего геном рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн плазмидной конструкции pSim25-Ends, несущей два участка, гомологичных геному аденовируса обезьян 25-го серотипа (два плеча гомологии). Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса обезьян 25-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность от конца Е1-области до pIVa2 белка. Второе плечо гомологии содержит последовательность конца генома аденовируса, включая правый инвертированный концевой повтор. Синтез конструкции pSim25-Ends осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Выделенную из вирионов ДНК аденовируса обезьян 25-го серотипа смешивали с pSim25-Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pSim25-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pSim25-dlE1, несущая геном аденовируса обезьян 25-го серотипа с делетированной E1-областью.
Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов в сконструированной плазмиде pSim25-dlE1 была удалена E3 область генома аденовируса (3921 п.о. от начала гена 12,5К до гена 14,7К) для увеличения пакующей емкости вектора. В результате была получена плазмидная конструкция pSim25-null, кодирующая полный геном аденовируса обезьян 25-го серотипа с делецией Е1 и Е3-областей.
Кроме того, авторы разработали несколько дизайнов экспрессионной кассеты:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Далее генно-инженерным методом на основе плазмидной конструкции pSim25-Ends были получены конструкции pArms-Sim25-CMV-S-CoV2, pArms-Sim25-CAG-S-CoV2, pArms-Sim25-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно, а также несущие плечи гомологии из генома аденовируса обезьян 25-го серотипа. После этого конструкции pArms-Sim25-CMV-S-CoV2, pArms-Sim25-CAG-S-CoV2, pArms-Sim25-EF1-S-CoV2 линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pSim25-null. В результате гомологичной рекомбинации были получены рекомбинантные плазмидные векторы pSim25-CMV-S-CoV2, pSim25-CAG-S-CoV2, pSim25-EF1-S-CoV2, содержащие полный геном аденовируса обезьян 25-го серотипа с делецией Е1 и Е3-областей и экспрессионную кассету SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно.
На третьем этапе плазмиды pSim25-CMV-S-CoV2, pSim25-CAG-S-CoV2, pSim25-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. Полученный материал был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
В результате были получены рекомбинантные аденовирусы человека 25 серотипа, содержащие ген S белка вируса SARS-CoV-2: simAd25-CMV-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 4), simAd25-CAG-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 2), simAd25-EF1-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 3).
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
Пример 4
Получение средства в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
На данном этапе работы экспрессионные векторы, полученные в примере 3, очищали методом анионообменной и эксклюзионной хроматографии. Готовая суспензия содержала аденовирусные частицы в буферном растворе для жидкой формы средства или в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
Таким образом, были получены следующие иммунобиологические средства на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области:
1. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 4 (simAd25-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
2. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 4 (simAd25-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
3. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (simAd25-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
4. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (simAd25-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
5. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (simAd25-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
6. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (simAd25-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
Каждое из представленных иммунобиологических средств является компонентом 2 в варианте 1 разработанного средства и компонентом 1 в варианте 3 разработанного средства.
Пример 5
Получение экспрессионного вектора, содержащего геном рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн плазмидной конструкции pAd5-Ends, несущей два участка, гомологичных геному аденовируса человека 5-го серотипа (два плеча гомологии). Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок. Второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома. Синтез конструкции pAd5-Ends осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Выделенную из вирионов ДНК аденовируса человека 5-го серотипа смешивали с pAd5-Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pAd5-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pAd5-dlE1, несущая геном аденовируса человека 5-го серотипа с делетированной E1-областью.
Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов в сконструированной плазмиде pAd5-dlE1 была удалена E3 область генома аденовируса (2685 п.о. от конца гена 12,5К до начала последовательности U-exon) для увеличения пакующей емкости вектора. В результате этого был получен рекомбинантный плазмидный вектор pAd5-too-null на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа с делецией E1 и Е3 областей генома. Кроме того, авторы разработали несколько дизайнов экспрессионной кассеты:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Далее генно-инженерным методом на основе плазмидной конструкции pAd5-Ends были получены конструкции pArms-Ad5-CMV-S-CoV2, pArms-Ad5-CAG-S-CoV2, pArms-Ad5-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно, а также несущие плечи гомологии из генома аденовируса 5-го серотипа.
После этого, конструкции pArms-Ad5-CMV-S-CoV2, pArms-Ad5-CAG-S-CoV2, pArms-Ad5-EF1-S-CoV2 лианеризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологи, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too-null. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-GAC-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с делецей Е1 и Е3 областей и экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно.
На четвертом этапе плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-GAC-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. Полученный материал был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантного аденовируса.
В результате были получены рекомбинантные аденовирусы человека 5-го серотипа, содержащие ген S белка вируса SARS-CoV-2: Ad5-CMV-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 1), Ad5-CAG-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 2), Ad5-EF1-S-CoV2 (содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO: 3).
Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма human adenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
Пример 6
Получение средства в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
На данном этапе работы экспрессионные векторы, полученные в примере 5, очищали методом анионообменной и эксклюзионной хроматографии. Готовая суспензия содержала аденовирусные частицы в буферном растворе для жидкой формы средства или в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
Таким образом, были получены следующие иммунобиологические средства на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области:
1. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad5-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
2. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 1 (Ad5-CMV-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
3. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad5-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
4. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей CAG промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 2 (Ad5-CAG-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
5. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad5-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для жидкой формы средства.
6. Иммунобиологическое средство на основе генома рекомбинантного human adenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области с экспрессионной кассетой, содержащей EF1 промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, SEQ ID NO: 3 (Ad5-EF1-S-CoV2) в буферном растворе для лиофилизированной формы средства.
Каждое из представленных иммунобиологических средств является компонентом 2 в варианте 1 и в варианте 3 разработанного средства.
Пример 7
Получение буферного раствора.
Каждый компонент разработанного средства представляет собой средство на основе рекомбинантного аденовируса с экспрессионной кассетой в буферном растворе.
Авторами изобретения был подобран состав буферного раствора, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Данный раствор включает:
1. Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис), который необходим для поддержания рН раствора.
2. Хлорид натрия, который добавляют для достижения необходимой ионной силы и осмолярности.
3. Сахарозу, которая используется в качестве криопротектора.
4. Магния хлорида гексагидрат, который необходим в качестве источника двухвалентных катионов.
5. ЭДТА, который используется в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
6. Полисорбат-80, который используется в качестве поверхностно-активного вещества.
7. Этанол 95%, который применяют в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
8. Воду, которая используется в качестве растворителя.
Авторами изобретения было разработано 2 варианта буферного раствора: для жидкой формы средства и для лиофилизированной формы фармацевтического средства.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из компонентов средства:
10
1. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1*10 вирусных частиц.
10
2. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1*10 вирусных частиц.
10
3. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса обезьяны 25-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1*10 вирусных частиц.
Таким образом, была проверена стабильность каждого из серотипов аденовирусов, входящих в состав средства. Полученные средства хранили при температуре -18°С и -70°С в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титрарекомбинантных аденовирусов.
Таблица 1. Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы средства.
№ группы
Состав буферного раствора
Трис (мг)
Хлорид натрия (мг)
Сахароза (мг)
Магния хлорида гексагидрат (мг)
ЭДТА (мг)
Полисорбат-80 (мг)
Этанол 95% (мг)
Вода
1
0,968
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
2
1,815
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
3
1,21
1,752
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
4
1,21
3,285
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
5
1,21
2,19
20
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
6
1,21
2,19
37,5
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
7
1,21
2,19
25
0,0816
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
8
1,21
2,19
25
0,153
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
9
1,21
2,19
25
0,102
0,0152
0,25
0,0025
до 0,5 мл
10
1,21
2,19
25
0,102
0,0285
0,25
0,0025
до 0,5 мл
11
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,2
0,0025
до 0,5 мл
12
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,375
0,0025
до 0,5 мл
13
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,002
до 0,5 мл
14
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,00375
до 0,5 мл
15
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы средства при температурах -18°С и -70°С в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ (масс %):
Трис: от 0,1831 масс. % до 0,3432 масс. %;
Хлорид натрия: от 0,3313 масс. % до 0,6212 масс. %;
Сахароза: от 3,7821 масс. % до 7,0915 масс. %;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0154 масс. % до 0,0289 масс. %;
ЭДТА: от 0,0029 масс. % до 0,0054 масс. %;
Полисорбат-80: от 0,0378 масс. % до 0,0709 масс. %;
Этанол 95%: от 0,0004 масс. % до 0,0007 масс. %;
Растворитель: остальное.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для лиофилизированной формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 2). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из компонентов средства:
10
1. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1*10вирусных частиц.
10
2. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1*10вирусных частиц.
10
3. Иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса обезьяны 25-го серотипа с экспрессионной кассетой, содержащей CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнал полиаденилирования, 1*10вирусных частиц.
Таким образом, была проверена стабильность каждого из серотипов аденовирусов, входящих в состав средства. Полученные средства хранили при температуре +2 и +8°С в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Таблица 2. Состав экспериментальных буферных растворов.
№ группы
Состав буферного раствора
Трис (мг)
Хлорид натрия (мг)
Сахароза (мг)
Магния хлорида гексагидрат (мг)
ЭДТА (мг)
Полисорбат-80 (мг)
Вода
1
0,1936
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
2
0,363
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
3
0,242
1,1224
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
4
0,242
2,1045
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
5
0,242
1,403
58,8
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
6
0,242
1,403
110,25
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
7
0,242
1,403
73,5
0,01632
0,0038
0,05
до 1 мл
8
0,242
1,403
73,5
0,0306
0,0038
0,05
до 1 мл
9
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,00304
0,05
до 1 мл
10
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0057
0,05
до 1 мл
11
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,04
до 1 мл
12
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,075
до 1 мл
13
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для лиофилизированной формы средства при температуре +2°С и +8°С в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для лиофилизированной формы вакцины обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ:
Трис: от 0,0180 масс. % до 0,0338 масс. %;
Хлорид натрия: от 0,1044 масс. % до 0,1957 масс. %;
Сахароза: от 5,4688 масс. % до 10,2539 масс. %;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0015 масс. % до 0,0028 масс. %;
ЭДТА: от 0,0003 масс. % до 0,0005 масс. %;
Полисорбат-80: от 0,0037 масс. % до 0,0070 масс. %;
Растворитель: остальное.
Пример 8 Оценка способности разработанного средства индуцировать мукозальный иммунный ответ при внутримышечном введении.
Для данного исследования использовали молодых мышей линии BALB/c (возраст 21-28 дней). Животные были распределены на группы по 10 шт, которым вводили следующие средства:
9
9
Ad26-CMV-S-CoV2, внутримышечно (в/м), в дозе 5×10 в.ч./100 мкл; через 21 день Ad26-CMV-S-CoV2, внутримышечно (в/м), в дозе 5×10 в.ч./100 мкл.
9
9
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, в дозе 5×10в.ч./100 мкл; через 21 день Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл.
9
9
simAd25-CMV-S-CoV2, в/м, в дозе 5×10в.ч./100 мкл; через 21 день simAd25-CMV-S-CoV2, в/м, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл
9
9
Ad26-null, в/м, в дозе 5×10в.ч./100 мкл; через 21 день Ad26-null, в/м, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл
9
9
Ad5-null, в/м, в дозе 5×10в.ч./100 мкл; через 21 день Ad5-null, в/м, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл
9
9
simAd25-null, в/м, в дозе 5×10в.ч./100 мкл; через 21 день simAd25-null, в/м, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл
9
9
Ad26-CMV-S-CoV2, интраназально (ин), в дозе 5x10 в.ч./100 мкл; через 21 день Ad26-CMV-S-CoV2 ин, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл.
9
9
Ad5-CMV-S-CoV2, ин, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл; через 21 день Ad5-CMV-S-CoV2, ин, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл.
9
9
Ad26-CMV-S-CoV2, в/м, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл; через 21 день Ad26-CMV-S-CoV2 ин, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл.
9
9
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл; через 21 день Ad5-CMV-S-CoV2, ин, в дозе 5×10 в.ч./100 мкл.
Буферный раствор
Через 14 дней после последней иммунизации определяли титр IgG и IgA антител методом ИФА в смывах бронхоавеолярного лаважа (БАЛ) экспериментальных животных.
Для этого:
Антиген (рекомбинантный RBD) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
Образцы БАЛ разводили в 25 раз и далее методом 2-х кратных разведений.
Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 3.
Таблица 3. Среднее геометрическое титра IgG и IgA антител к S белку вируса SARS-CoV-2 в смывах БАЛ экспериментальных животных.
Название группы
Титр IgG антител
Титр IgA антител
1
Ad26-CMV-S-CoV2 в/м; Ad26-CMV-S-CoV2 в/м
162
3
2
Ad5-CMV-S-CoV2 в/м, Ad5-CMV-S-CoV2 в/м
325
4
3
simAd25-CMV-S-CoV2 в/м, simAd25-CMV-S-CoV2 в/м
214
3
4
Ad26-CMV-S-CoV2 ин; Ad26-CMV-S-CoV2 ин
123
76
5
Ad5-CMV-S-CoV2 ин, Ad5-CMV-S-CoV2 ин
264
81
6
Ad26-CMV-S-CoV2 в/м; Ad26-CMV-S-CoV2 ин
373
283
7
Ad5-CMV-S-CoV2 в/м, Ad5-CMV-S-CoV2 ин
348
303
8
Ad26-null в/м; Ad26-null в/м
0
0
9
Ad5-null в/м; Ad5-null в/м
0
0
10
simAd25-null в/м; simAd25-null в/м
0
0
11
Ad26-null ин; Ad26-null ин
0
0
12
Ad5-null ин; Ad5-null ин
0
0
13
Буферный раствор
0
0
Как видно из представленных результатов, все варианты разработанного средства приводят к повышению титра IgG антител на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей. Экспрессия IgA антител зависит от способа введения средства. Максимальные титры IgA антител индуцируются, когда иммунизация животных проводится последовательно: внутримышечно, а затем интраназально.
Таким образом, в результате проведенной работы было разработано иммунобиологическое средство, способное индуцировать мукозальный иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2 на слизистой оболочке дыхательных путей у детей, а также схема введения данного средства, приводящая к потенцированию мукозального иммунного ответа.
Пример 9. Оценка способности разработанного средства индуцировать иммунный ответ у млекопитающих разного возраста.
Для данного исследования использовали молодых мышей линии BALB/c различного возраста. Животные были распределены на группы по 5 шт:
Мыши возраста 15-18 дней
Мыши возраста 28 -35 дней
Мыши возраста 50-60 дней
8
Всех животных однократно иммунизировали разработанным иммунобиологическим средством на основе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-CMV-S-CoV2) в дозе 10 вч/50 мкл. Через 21 день после иммунизации измеряли титр IgG антител в сыворотке крови животных. Для этого:
Антиген (рекомбинантный RBD) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
Образцы сыворотки разводили в 50 раз и далее методом 2-х кратных разведений.
Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 4.
Таблица 4. Среднее геометрическое титра IgG антител к S белку вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови экспериментальных животных в зависимости от их возраста.
№
Возраст животных
Титр IgG антител
1
15-18 дней
6400
2
28-35 дней
5572
3
50-60 дней
4222
Таким образом, как видно из представленных данных разработанное иммунобиологическое средство индуцирует развитие гуморального иммунного ответа как у взрослых, так и у молодых мышей различного возраста. Это позволяет предположить, что средство будет эффективно для использования у людей различных возрастных категорий.
Пример 10. Исследование иммуногенности разработанного средства на молодых мышах по оценке клеточного иммунного ответа после однократной вакцинации.
Для исследования иммуногенности разработанного средства были использованы молодые мыши BALB/c (21-28 дней.). Животные были распределены на группы по 5 шт, которым вводили однократно следующие средства:
10
Ad26-CMV-S-CoV2, внутримышечно (в/м), в дозе 10вч/100 мкл;
10
Ad5-CMV-S-CoV2, внутримышечно (в/м), в дозе 10 вч/100 мкл.
5
Напряженность клеточного иммунитета определяли путем оценки количества пролиферирующих CD4+ и CD8+ лимфоцитов выделенных из селезенки мыгей в культуре in vitro после повторной рестимуляции клеток рекомбинантным S белком SARS-CoV-2. Перед иммунизацией, а также через 14 дней, у животных отбирали селезенки, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (1,09 g/mL; ПанЭко). Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки 96л планшета (2*10 кл/лунку). Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген.
Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (BDBioscienses, США). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BD Biosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток из результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса.
Результаты (с проведенной статистической обработкой) определения процента пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т лимфоцитов на 1 день (до иммунизации) и на 14 день исследования представлены на фиг. 1 (Ad26-CMV-S-CoV2) и фиг. 2 (Ad5-CMV-S-CoV2).
Полученные данные показали, что однократная иммунизация мышей разработанным средством позволяет достоверно повысить процент пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т лимфоцитов после антигенной рестимуляции на 14 день после иммунизации.
Таким образом, можно заключить, что однократная иммунизация мышей разработанным иммунобиологическим средством способна приводить к формированию напряженного поствакцинального клеточного иммунитета.
Пример 11. Исследование иммуногенности разработанного средства на молодых мышах при различных способах введения.
Для исследования иммуногенности разработанного средства были использованы молодые мыши BALB/c(21-28 дней.). Животные были распределены на группы по 5 шт, которым вводили следующие средства:
9
Ad26-CMV-S-CoV2,внутримышечно (в/м), в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad26-CAG-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad26-EF1-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad5-CMV-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad5-CAG-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad5-EF1-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
simAd25-CMV-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
simAd25-CAG-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
simAd25-EF1-S-CoV2,внутримышечно, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad26-CMV-S-CoV2,интраназально (ин), в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad26-CAG-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad26-EF1-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad5-CMV-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad5-CAG-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл
9
Ad5-EF1-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл
9
simAd25-CMV-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл
9
simAd25-CAG-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл
9
simAd25-EF1-S-CoV2,интраназально, в дозе 10 вч/100 мкл.
Через 21 день у животных отбирали кровь, выделяли сыворотку крови и определяли титр IgG антител к Sбелку вируса SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа. Для этого:
Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
Методом 2-кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр IgG антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 5. Титр IgG антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Группа животных
Титр IgG антител
1
Ad26-CMV-S-CoV2, в/м
696
2
Ad26-CAG-S-CoV2, в/м
528
3
Ad26-EF1-S-CoV2 в/м
459
4
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м
9701
5
Ad5-CAG-S-CoV2, в/м
11143
6
Ad5-EF1-S-CoV2, в/м
14703
7
simAd25-CMV-S-CoV2, в/м
3676
8
simAd25-CAG-S-CoV2, в/м
5572
9
simAd25-EF1-S-CoV2, в/м
3676
10
Ad26-CMV-S-CoV2, ин
230
11
Ad26-CAG-S-CoV2, ин
200
12
Ad26-EF1-S-CoV2, ин
174
13
Ad5-CMV-S-CoV2, ин
606
14
Ad5-CAG-S-CoV2, ин
459
15
Ad5-EF1-S-CoV2, ин
459
16
simAd25-CMV-S-CoV2, ин
459
17
simAd25-CAG-S-CoV2, ин
400
18
simAd25-EF1-S-CoV2, ин
303
Как видно из представленных данных, однократная иммунизация разработанным средством индуцирует гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2.
Пример 12. Исследование иммуногенности разработанного средства при введении молодым животным в различных дозах.
Целью данного исследования являлось оценка гуморального иммунного ответа к Sбелку SARS-CoV-2 при введении разработанного средства в различных дозах молодым животным.
Для исследования иммуногенности разработанного средства были использованы молодые мыши линии С57/Bl6 (3-4 нед). Животные были распределены на группы по 5 шт, которым вводили следующие средства внутримышечно, двукратно с интервалом 28 дней:
9
Ad5-CMV-S-CoV2, 5*10 вч/100 мкл,
10
Ad5-CMV-S-CoV2, 10 вч/100 мкл,
10
Ad5-CMV-S-CoV2, 5*10 вч/100 мкл.
Через 21 день у животных отбирали кровь, выделяли сыворотку крови и определяли титр IgG антител к Sбелку вируса SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа. Для этого:
Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5% молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
Образцы сыворотки иммунизированных мышей разводили в 100 раз и далее методом 2-кратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 6.
Таблица 6. ТитрIgG антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Группа животных
Титр IgG антител
1
Ad5-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>9</sup> вч/100 мкл
22286
2
Ad5-CMV-S-CoV2, 10<sup>10</sup> вч/100 мкл
44572
3
Ad5-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup> вч/100 мкл
117627
Как видно из представленных данных, разработанное средство проявляет иммуногенность во всем диапазоне выбранных доз.
Пример 13. Исследование иммуногенности разработанного средства на молодых мышах при различных схемах введения.
Для исследования иммуногенности разработанного средства были использованы молодые мыши (3-4 нед.). Животные были распределены на группы по 5 шт, которым вводили следующие средства:
9
9
Ad26-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 неделиAd26-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
Ad26-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 неделиAd5-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
Ad26-CMV-S-CoV2, ин, 10вч/100 мкл; через 3 неделиAd5-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
Ad26-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 недели simAd5-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
8
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 неделиAd5-CMV-S-CoV2 в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 неделиAd26-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
Ad5-CMV-S-CoV2, ин, 10вч/100 мкл; через 3 неделиAd26-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл;через 3 неделиsimAd5-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
simAd25-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 неделиsimAd5-CMV-S-CoV2в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
simAd25-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 недели Ad5-CMV-S-CoV2 в/м, 10вч/100 мкл;
9
9
simAd25-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл; через 3 недели Ad26-CMV-S-CoV2, в/м, 10вч/100 мкл.
Через 21 день у животных отбирали кровь, выделяли сыворотку крови и определяли титр IgG антител к S белку вируса SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа. Для этого:
Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.
Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5% молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
Методом 2-х кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение.
Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 7.
Таблица 7. Титр IgGантител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Группа животных
Титр IgG антител
1
Ad26-CMV-S-CoV2 в/м, Ad26-CMV-S-CoV2 в/м
11143
2
Ad26-CMV-S-CoV2, в/м, Ad5-CMV-S-CoV2 в/м
29407
3
Ad26-CMV-S-CoV2, ин, Ad5-CMV-S-CoV2 в/м
22286
4
Ad26-CMV-S-CoV2, в/м, simAd5-CMV-S-CoV2 в/м
14703
5
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, Ad5-CMV-S-CoV2 в/м
16890
6
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, Ad26-CMV-S-CoV2 в/м
33779
7
Ad5-CMV-S-CoV2, ин, Ad26-CMV-S-CoV2 в/м
25600
8
Ad5-CMV-S-CoV2, в/м, simAd5-CMV-S-CoV2 в/м
14703
9
simAd5-CMV-S-CoV2, в/м, simAd5-CMV-S-CoV2 в/м
12800
10
simAd5-CMV-S-CoV2, в/м, Ad5-CMV-S-CoV2 в/м
16890
11
simAd5-CMV-S-CoV2, в/м, Ad26-CMV-S-CoV2, в/м
14703
Полученные результаты показывают, что разработанное средство обеспечивает развитие гуморального иммунного ответа против SARS-CoV-2 у молодых животных при различных схемах введения.
Пример 14. Исследование безопасности использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 для детей.
В данном исследовании приняли участие 100 добровольцев в возрасте от 12 до 17 лет. Предполагаемая схема иммунизации включала последовательное внутримышечное введение компонента 1 и компонента 2 фармацевтического средства по варианту 1 (Ad26-CMV-S-CoV2, Ad5-CMV-S-CoV2).Один доброволец выбыл до введения компонента 1 по причине впервые диагностированной артериальной гипертензии, соответственно 99 добровольцев начали исследуемую терапию. Так же компонент 2 не получили: 1 человек - по причине неявки, 1 человек - по причине нежелательного явления (лейкопения), 1 человек - по причине кишечной инфекции неустановленной этиологии (по типу энтеровирусной), 1 человек - по причине госпитализации с гнойным фурункулом через 5 дней после введения компонента, 1 человек - по причине госпитализации (кишечная инфекция) и 1 человек - по причине заболевание ковидом, 2 человека - отказались от участия. Соответственно, оба компонента вакцины получил 91 доброволец.
Было зарегистрировано 205 НЯ, развившихся у 73 добровольцев (73,0%) после введения вакцины. В таблице 8 приведено число (доля) добровольцев с наличием НЯ в каждой группе по классу системы органов (SOC) и предпочтительному термину (PT) в соответствии со словарем MedDRA, а также по связи с исследуемым препаратом и степени тяжести. Межгрупповое сравнение частоты развития НЯ было проведено с помощью χ2-критерия и при необходимости точного тест Фишера, если ожидаемая частота в какой-либо из ячеек была менее 5. Анализ не выявил статистически значимых отличий по частоте возникновения отдельных НЯ между группами.
Таблица 8. Нежелательные явления, зарегистрированные в анализируемый период, по классам систем органов, предпочтительным терминам и группам (FAS-популяция)
Описание
Группа 1 (дозировка 1/10)N=50
Группа 2 (дозировка 1/5)N=50
ВсегоN = 100
p-value
N
%
N
%
N
%
Любой PT
37
74,0
36
72,0
73
73,0
0,822
Общие нарушения и реакции в месте введения (78 эпизодов НЯ)
Боль в месте инъекции
15
30,0
11
22,0
26
26,0
0,362
Болезненные ощущения (1)
7
14,0
7
14,0
14
14,0
1,000
Гипертермия
5
10,0
3
6,0
8
8,0
0,715
Гриппоподобное заболевание
3
6,0
5
10,0
8
8,0
0,715
Эритема в месте инъекции
4
8,0
0
0,0
4
4,0
0,117
Зуд в месте инъекции
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Местное повышение температуры в месте введения
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Озноб
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Отек в месте инъекции
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Пирексия
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Всего в системе органов
29
58,0
23
46,0
52
52,0
0,230
Лабораторные и инструментальные данные (76 эпизодов НЯ)
Снижение числа нейтрофилов
17
34,0
18
36,0
35
35,0
0,834
Положительный результат анализа мочи на эритроциты
8
16,0
5
10,0
13
13,0
0,372
Повышение уровня билирубина в крови
3
6,0
2
4,0
5
5,0
1,000
Наличие белка в моче
1
2,0
2
4,0
3
3,0
1,000
Снижение уровня гемоглобина
1
2,0
2
4,0
3
3,0
1,000
Наличие лейкоцитов в моче
1
2,0
1
2,0
2
2,0
1,000
Повышение уровня щелочной фосфатазы в крови
1
2,0
1
2,0
2
2,0
1,000
Снижение числа лимфоцитов
1
2,0
1
2,0
2
2,0
1,000
Снижение числа тромбоцитов
1
2,0
1
2,0
2
2,0
1,000
Исследование на бактерии (2)
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Наличие глюкозы в моче
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Наличие цилиндров в моче
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Повышение скорости оседания эритроцитов
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Повышение уровня лактатдегидрогеназы в крови
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Повышение уровня холестерина в крови
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Повышение числа лейкоцитов
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Повышение числа эритроцитов
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Всего в системе органов
25
50,0
23
46,0
48
48,0
0,689
Нарушения со стороны нервной системы (18 эпизодов НЯ)
Головная боль
5
10,0
4
8,0
9
9,0
1,000
Сомнолентность
4
8,0
1
2,0
5
5,0
0,362
Головокружение
1
2,0
1
2,0
2
2,0
1,000
Всего в системе органов
9
18,0
5
10,0
14
14,0
0,249
Нарушения со стороны мышечной, скелетной и соединительной ткани (9 эпизодов НЯ)
Боль в конечности
0
0,0
3
6,0
3
3,0
0,242
Миалгия
2
4,0
1
2,0
3
3,0
1,000
Артралгия
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Всего в системе органов
2
4,0
5
10,0
7
7,0
0,436
Желудочно-кишечные нарушения (6 эпизодов НЯ)
Боль в животе
0
0,0
3
6,0
3
3,0
0,242
Рвота
1
2,0
1
2,0
2
2,0
1,000
Сухость во рту
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Всего в системе органов
2
4,0
3
6,0
5
5,0
1,000
Нарушения со стороны дыхательной системы, органов грудной клетки и средостения (5 эпизодов НЯ)
Заложенность носа
3
6,0
0
0,0
3
3,0
0,242
Боль в ротоглотке (орофарингеальная)
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Ринорея
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Всего в системе органов
3
6,0
1
2,0
4
4,0
0,617
Инфекции и инвазии (3 эпизода НЯ)
Ротавирусная инфекция
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Фурункул (3)
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Энтеровирусная инфекция
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Всего в системе органов
2
4,0
1
2,0
3
3,0
1,000
Нарушения со стороны сосудов (3 эпизода НЯ)
Влагалищное кровоизлияние (4)
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Геморрой
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Гиперемия
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Всего в системе органов
3
6,0
0
0,0
3
3,0
0,242
Нарушения метаболизма и питания (1 эпизод НЯ)
Снижение аппетита
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Нарушения со стороны кожи и подкожной клетчатки (1 эпизод НЯ)
Сыпь
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Нарушения со стороны крови и лимфатической системы (1 эпизод НЯ)
Лейкопения
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Нарушения со стороны органа слуха и лабиринта (1 эпизод НЯ)
Ушная боль
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Нарушения со стороны почек и мочевыводящих путей (1 эпизод НЯ)
Поллакиурия
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Психические расстройства (1 эпизод НЯ)
Паническая атака
0
0,0
1
2,0
1
1,0
1,000
Травмы, интоксикации и осложнения процедур (1 эпизод НЯ)
Пищевое отравление
1
2,0
0
0,0
1
1,0
1,000
Примечания:Результаты представлены в форме: число субъектов, у которых зарегистрировано нежелательные явления (НЯ), процент от популяции безопасности в данной группе.1 Повышенная чувствительность в месте инъекции. PT «Болезненные ощущения» соответствует PT «Tenderness [10043224]».2 PT «Исследование на бактерии» соответствует LLT «Наличие бактерий в моче [10060857]».3 PT «Фурункул» соответствует LLT «Фурункул уха [10017556]», НЯ - «Фурункул ушной раковины слева».4 PT «Влагалищное кровоизлияние» соответствует LLT «Кровянистые выделения из влагалища [10049851]».
В ходе исследования отмечались нежелательные явления (НЯ) в следующих категориях:
1) Общие нарушения и реакции в месте введения - 76 НЯ:
1/10 дозы: 35 случаев
1/5 дозы: 22 случая
2) Системные реакции - 54 НЯ
1/10 дозы: 29 случаев
1/5 дозы: 25 случаев
3) Лабораторные отклонения - 76 НЯ
1/10 дозы: 44 случая
1/5 дозы: 32 случая.
При этом связанными с исследуемым препаратом (т.к. оценка связи «возможная», «вероятная» или «определенная») были следующие НЯ: болезненность в месте инъекции, гриппоподобный синдром, утомляемость, субфебрильная температура, чувство жара, заложенность носа возникла сразу после инъекции вакцины, головная боль, боль в горле, кашель, ломота в суставах, общая слабость, боль в животе, паническая атака, снижение нейтрофилов, повышение уровня билирубин.
Для остальных НЯ связь была указана как «сомнительная» или «нет связи». Аллергические реакции на исследуемый препарат не отмечались.
В целом можно сказать, что выявленные в ходе исследования нежелательные явления характерны для большинства вакцинных лекарственных препаратов. Случаев развития нежелательных явлений, угрожающих жизни не было зарегистрировано.
Пример 16. Определение эффективности иммунизации детей разработанным фармацевтическим средством, по оценке напряженности гуморального иммунитета.
В данном исследовании приняло участие 95 детей в возрасте от 12 до 18 лет. Напряженность гуморального иммунитета определяли путем оценки титра IgG антител, специфичных к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2. Участники исследования были разделены на две группы:
10
последовательное внутримышечное введение компонента 1 и компонента 2 фармацевтического средства по варианту 1 (Ad26-CMV-S-CoV2, Ad5-CMV-S-CoV2) в дозе 1×10вирусных частиц/1 мл, 47 человек.
10
последовательное внутримышечное введение компонента 1 и компонента 2 фармацевтического средства по варианту 1 (Ad26-CMV-S-CoV2, Ad5-CMV-S-CoV2) в дозе 2×10 вирусных частиц/1 мл, 48 человек.
В качестве референса использовались образцы тех же добровольцев, взятые на 1 день исследования до вакцинации.
Оценка титра антиген-специфичного IgG в первой группе проводили на 21, 28 и 42 дни исследования, а во второй группе на 21 и 28 дни исследования.
Титр антител определяли с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа, которая позволяет определять титр IgG к RBD домену S антигена вируса SARS-CoV-2.
Планшеты с предварительно адсорбированным RBD (100 нг/лунку) промывали 5 раз промывочным буфером. Далее в лунки планшета вносили в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля. В остальные лунки планшета добавляли серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец). Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрывали липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от +20°С. После этого останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты). Результат учитывали в течение 10 мин после остановки реакции путем измерения на спектрофотометре оптической плотности при длине волны 450 нм.
Титр IgG определяли как максимальное разведение сыворотки, при котором значение OD450 сыворотки иммунизированного участника превышает значение контрольной сыворотки (сыворотка участника до иммунизации) более чем в 2 раза.
10
Результаты определения титра RBD-специфичных IgG антител в первой группе (1×10вирусных частиц/дозу) представлено на Фиг. 3. Как видно из представленных данных, титр антител, специфичных к RBD-домену S белка вируса SARS-Cov2, постепенно нарастает после проведения вакцинации, достигая максимального значения на 42 день. Реципроктное среднее геометрическое в данной точке 13192.К 42 дню исследования сероконверсия наблюдалась у всех 47 добровольцев, составляющих данную группу.
10
Результаты определения титра RBD-специфичных IgG антител во второй группе (2×10вирусных частиц/дозу) представлено на Фиг. 4. Как видно из представленных данных, титр антител, специфичных к RBD-домену S белка вируса SARS-Cov2, постепенно нарастает после проведения вакцинации 1/5 полной терапевтической дозой вакцины для взрослых, достигая максимального значения на 42 день. Реципроктное среднее геометрическое в данной точке 19292. К 42 дню исследования сероконверсия наблюдалась у всех 49 добровольцев, составляющих данную группу.
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что вакцинация детей разработанным иммунобиологическим средством способна приводить к формированию напряженного поствакцинального гуморального иммунитета.
Пример 15. Определение эффективности иммунизации детей разработанным фармацевтическим средством, по оценке напряженности клеточного иммунитета.
В данном исследовании приняло участие 95 детей в возрасте от 12 до 18 лет. Участники исследования были разделены на две группы:
10
последовательное внутримышечное введение компонента 1 и компонента 2 фармацевтического средства по варианту 1 (Ad26-CMV-S-CoV2, Ad5-CMV-S-CoV2) в дозе 1×10вирусных частиц/1 мл, 47 человек.
10
последовательное внутримышечное введение компонента 1 и компонента 2 фармацевтического средства по варианту 1 (Ad26-CMV-S-CoV2, Ad5-CMV-S-CoV2) в дозе 2×10вирусных частиц/1 мл, 48 человек.
5
Напряженность клеточного иммунитета определяли путем оценки количества пролиферирующих CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови добровольцев в культуре in vitro после повторной рестимуляции клеток рекомбинантным S белком SARS-CoV-2. Перед иммунизацией, а также через 28 дней, у пациентов отбирали образцы крови, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (1,077 g/mL; ПанЭко). Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки 96л планшета (2*10 кл/лунку). Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 часа после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток, а культуральную среду отбирали для измерения количества гамма-интерферона.
Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, клон SK7), anti-CD4 APC (BDBiosciences, клон SK3), anti-CD8 PerCP-Cy5.5 (BDBiosciences, клон SK1)). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BDBiosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток из результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса.
Результаты (с проведенной статистической обработкой) определения процента пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т лимфоцитов на 1 день (до иммунизации) и на 28 день исследования представлены на фиг. 5 и фиг. 6.
Полученные данные показали, что иммунизация детей разработанным средством в обеих выбранных дозах позволяет достоверно повысить процент пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т лимфоцитов после антигенной рестимуляции на 28 день после вакцинации.
Исходя из полученных данных, можно заключить, что двукратная вакцинация детей разработанным иммунобиологическим средством способна приводить к формированию напряженного поствакцинального клеточного иммунитета.
Таким образом, представленные примеры подтверждают, что в результате проведенной работы было создано безопасное и эффективное средство, которое обеспечивает развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность разработанных средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у детей старше 1 месяца и промышленную применимость.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России
<120> Применение средства для индукции специфического иммунитета против
вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей.
<160> 4
<170> BISSAP1.3.6
<210> 1
<211> 4711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 1
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata    60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat   120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga   180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc   240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt   300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat   360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag   420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc   480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga   540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt   600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttggta ccatgtttgt gttccttgtg ttattgccac   660
tagtctctag tcagtgtgtg aacctgacca caagaaccca gctgcctcca gcctacacca   720
acagctttac cagaggcgtg tactaccccg acaaggtgtt cagatccagc gtgctgcact   780
ctacccagga cctgttcctg cctttcttca gcaacgtgac ctggttccac gccatccacg   840
tgtccggcac caatggcacc aagagattcg acaaccccgt gctgcccttc aacgacgggg   900
tgtactttgc cagcaccgag aagtccaaca tcatcagagg ctggatcttc ggcaccacac   960
tggacagcaa gacccagagc ctgctgatcg tgaacaacgc caccaacgtg gtcatcaaag   1020
tgtgcgagtt ccagttctgc aacgacccct tcctgggcgt ctactatcac aagaacaaca   1080
agagctggat ggaaagcgag ttccgggtgt acagcagcgc caacaactgc accttcgagt   1140
acgtgtccca gcctttcctg atggacctgg aaggcaagca gggcaacttc aagaacctgc   1200
gcgagttcgt gttcaagaac atcgacggct acttcaagat ctacagcaag cacaccccta   1260
tcaacctcgt gcgggatctg cctcagggct tctctgctct ggaacccctg gtggatctgc   1320
ccatcggcat caacatcacc cggtttcaga cactgctggc cctgcacaga agctacctga   1380
cacctggcga tagcagcagc ggatggacag ctggtgccgc cgcttactat gtgggctacc   1440
tgcagcctag aaccttcctg ctgaagtaca acgagaacgg caccatcacc gacgccgtgg   1500
attgtgctct ggatcctctg agcgagacaa agtgcaccct gaagtccttc accgtggaaa   1560
agggcatcta ccagaccagc aacttccggg tgcagcccac cgaatccatc gtgcggttcc   1620
ccaatatcac caatctgtgc cccttcggcg aggtgttcaa tgccaccaga ttcgcctctg   1680
tgtacgcctg gaaccggaag cggatcagca attgcgtggc cgactactcc gtgctgtaca   1740
actccgccag cttcagcacc ttcaagtgct acggcgtgtc ccctaccaag ctgaacgacc   1800
tgtgcttcac aaacgtgtac gccgacagct tcgtgatccg gggagatgaa gtgcggcaga   1860
ttgcccctgg acagacaggc aagatcgccg actacaacta caagctgccc gacgacttca   1920
ccggctgtgt gattgcctgg aacagcaaca acctggactc caaagtcggc ggcaactaca   1980
attacctgta ccggctgttc cggaagtcca atctgaagcc cttcgagcgg gacatctcca   2040
ccgagatcta tcaggccggc agcacccctt gtaacggcgt ggaaggcttc aactgctact   2100
tcccactgca gtcctacggc tttcagccca caaatggcgt gggctatcag ccctacagag   2160
tggtggtgct gagcttcgaa ctgctgcatg cccctgccac agtgtgcggc cctaagaaaa   2220
gcaccaatct cgtgaagaac aaatgcgtga acttcaactt caacggcctg accggcaccg   2280
gcgtgctgac agagagcaac aagaagttcc tgccattcca gcagtttggc cgggatattg   2340
ccgataccac agacgccgta cgagatcccc agacactgga aatcctggac atcacccctt   2400
gcagcttcgg cggagtgtct gtgatcaccc ctggcaccaa caccagcaat caggtggcag   2460
tgctgtacca ggacgtgaac tgtaccgaag tgcccgtggc cattcacgcc gatcagctga   2520
cacctacatg gcgggtgtac tccaccggca gcaatgtgtt tcagaccaga gccggctgtc   2580
tgatcggagc cgagcacgtg aacaatagct acgagtgcga catccccatc ggcgctggca   2640
tctgtgccag ctaccagaca cagacaaaca gccccagacg ggccagatct gtggccagcc   2700
agagcatcat tgcctacaca atgtctctgg gcgccgagaa cagcgtggcc tactccaaca   2760
actctatcgc tatccccacc aacttcacca tcagcgtgac cacagagatc ctgcctgtgt   2820
ccatgaccaa gaccagcgtg gactgcacca tgtacatctg cggcgattcc accgagtgct   2880
ccaacctgct gctgcagtac ggcagcttct gcacccagct gaatagagcc ctgacaggga   2940
tcgccgtgga acaggacaag aacacccaag aggtgttcgc ccaagtgaag cagatctaca   3000
agacccctcc tatcaaggac ttcggcggct tcaatttcag ccagattctg cccgatccta   3060
gcaagcccag caagcggagc ttcatcgagg acctgctgtt caacaaagtg acactggccg   3120
acgccggctt catcaagcag tatggcgatt gtctgggcga cattgccgcc agggatctga   3180
tttgcgccca gaagtttaac ggactgacag tgctgccacc actgctgacc gatgagatga   3240
tcgcccagta cacatctgcc ctgctggccg gcacaatcac aagcggctgg acatttggag   3300
ctggcgccgc tctgcagatc ccctttgcta tgcagatggc ctaccggttc aacggcatcg   3360
gagtgaccca gaatgtgctg tacgagaacc agaagctgat cgccaaccag ttcaacagcg   3420
ccatcggcaa gatccaggac agcctgagca gcacagcaag cgccctggga aagctgcagg   3480
acgtggtcaa ccagaatgcc caggcactga acaccctggt caagcagctg tcctccaact   3540
tcggcgccat cagctctgtg ctgaacgaca tcctgagcag actggacaag gtggaagccg   3600
aggtgcagat cgacagactg atcaccggaa ggctgcagtc cctgcagacc tacgttaccc   3660
agcagctgat cagagccgcc gagattagag cctctgccaa tctggccgcc accaagatgt   3720
ctgagtgtgt gctgggccag agcaagagag tggacttttg cggcaagggc taccacctga   3780
tgagcttccc tcagtctgcc cctcacggcg tggtgtttct gcacgtgaca tacgtgcccg   3840
ctcaagagaa gaatttcacc accgctccag ccatctgcca cgacggcaaa gcccactttc   3900
ctagagaagg cgtgttcgtg tccaacggca cccattggtt cgtgacccag cggaacttct   3960
acgagcccca gatcatcacc accgacaaca ccttcgtgtc tggcaactgc gacgtcgtga   4020
tcggcattgt gaacaatacc gtgtacgacc ctctgcagcc cgagctggac agcttcaaag   4080
aggaactgga taagtacttt aagaaccaca caagccccga cgtggacctg ggcgacatca   4140
gcggaatcaa tgccagcgtc gtgaacatcc agaaagagat cgaccggctg aacgaggtgg   4200
ccaagaatct gaacgagagc ctgatcgacc tgcaagaact ggggaagtac gagcagtaca   4260
tcaagtggcc ctggtacatc tggctgggct ttatcgccgg actgattgcc atcgtgatgg   4320
tcacaatcat gctgtgttgc atgaccagct gctgtagctg cctgaagggc tgttgtagct   4380
gtggcagctg ctgcaagttc gacgaggacg attctgagcc cgtgctcaaa ggagtcaaat   4440
tacattacac ataagatatc cgatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata   4500
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga   4560
aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca   4620
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt   4680
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt a                  4711
<210> 2
<211> 5984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 2
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc    60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca   120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga   180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc   240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct   300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat   360
tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct   420
ccccccctcc cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg   480
ggggcggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg   540
cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta   600
tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg   660
ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc   720
tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct   780
gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg   840
aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg   900
tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc   960
gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg   1020
ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg   1080
gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca cccccctccc   1140
cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg tggcgcgggg   1200
ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct   1260
cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg cggctgtcga   1320
ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt   1380
cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc   1440
gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt   1500
gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc gcggggggac   1560
ggctgccttc ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct   1620
ctagaaagct tggtaccatg tttgtgttcc ttgtgttatt gccactagtc tctagtcagt   1680
gtgtgaacct gaccacaaga acccagctgc ctccagccta caccaacagc tttaccagag   1740
gcgtgtacta ccccgacaag gtgttcagat ccagcgtgct gcactctacc caggacctgt   1800
tcctgccttt cttcagcaac gtgacctggt tccacgccat ccacgtgtcc ggcaccaatg   1860
gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ccttcaacga cggggtgtac tttgccagca   1920
ccgagaagtc caacatcatc agaggctgga tcttcggcac cacactggac agcaagaccc   1980
agagcctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtggtcat caaagtgtgc gagttccagt   2040
tctgcaacga ccccttcctg ggcgtctact atcacaagaa caacaagagc tggatggaaa   2100
gcgagttccg ggtgtacagc agcgccaaca actgcacctt cgagtacgtg tcccagcctt   2160
tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca acttcaagaa cctgcgcgag ttcgtgttca   2220
agaacatcga cggctacttc aagatctaca gcaagcacac ccctatcaac ctcgtgcggg   2280
atctgcctca gggcttctct gctctggaac ccctggtgga tctgcccatc ggcatcaaca   2340
tcacccggtt tcagacactg ctggccctgc acagaagcta cctgacacct ggcgatagca   2400
gcagcggatg gacagctggt gccgccgctt actatgtggg ctacctgcag cctagaacct   2460
tcctgctgaa gtacaacgag aacggcacca tcaccgacgc cgtggattgt gctctggatc   2520
ctctgagcga gacaaagtgc accctgaagt ccttcaccgt ggaaaagggc atctaccaga   2580
ccagcaactt ccgggtgcag cccaccgaat ccatcgtgcg gttccccaat atcaccaatc   2640
tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaatgcca ccagattcgc ctctgtgtac gcctggaacc   2700
ggaagcggat cagcaattgc gtggccgact actccgtgct gtacaactcc gccagcttca   2760
gcaccttcaa gtgctacggc gtgtccccta ccaagctgaa cgacctgtgc ttcacaaacg   2820
tgtacgccga cagcttcgtg atccggggag atgaagtgcg gcagattgcc cctggacaga   2880
caggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc tgtgtgattg   2940
cctggaacag caacaacctg gactccaaag tcggcggcaa ctacaattac ctgtaccggc   3000
tgttccggaa gtccaatctg aagcccttcg agcgggacat ctccaccgag atctatcagg   3060
ccggcagcac cccttgtaac ggcgtggaag gcttcaactg ctacttccca ctgcagtcct   3120
acggctttca gcccacaaat ggcgtgggct atcagcccta cagagtggtg gtgctgagct   3180
tcgaactgct gcatgcccct gccacagtgt gcggccctaa gaaaagcacc aatctcgtga   3240
agaacaaatg cgtgaacttc aacttcaacg gcctgaccgg caccggcgtg ctgacagaga   3300
gcaacaagaa gttcctgcca ttccagcagt ttggccggga tattgccgat accacagacg   3360
ccgtacgaga tccccagaca ctggaaatcc tggacatcac cccttgcagc ttcggcggag   3420
tgtctgtgat cacccctggc accaacacca gcaatcaggt ggcagtgctg taccaggacg   3480
tgaactgtac cgaagtgccc gtggccattc acgccgatca gctgacacct acatggcggg   3540
tgtactccac cggcagcaat gtgtttcaga ccagagccgg ctgtctgatc ggagccgagc   3600
acgtgaacaa tagctacgag tgcgacatcc ccatcggcgc tggcatctgt gccagctacc   3660
agacacagac aaacagcccc agacgggcca gatctgtggc cagccagagc atcattgcct   3720
acacaatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctactc caacaactct atcgctatcc   3780
ccaccaactt caccatcagc gtgaccacag agatcctgcc tgtgtccatg accaagacca   3840
gcgtggactg caccatgtac atctgcggcg attccaccga gtgctccaac ctgctgctgc   3900
agtacggcag cttctgcacc cagctgaata gagccctgac agggatcgcc gtggaacagg   3960
acaagaacac ccaagaggtg ttcgcccaag tgaagcagat ctacaagacc cctcctatca   4020
aggacttcgg cggcttcaat ttcagccaga ttctgcccga tcctagcaag cccagcaagc   4080
ggagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aagtgacact ggccgacgcc ggcttcatca   4140
agcagtatgg cgattgtctg ggcgacattg ccgccaggga tctgatttgc gcccagaagt   4200
ttaacggact gacagtgctg ccaccactgc tgaccgatga gatgatcgcc cagtacacat   4260
ctgccctgct ggccggcaca atcacaagcg gctggacatt tggagctggc gccgctctgc   4320
agatcccctt tgctatgcag atggcctacc ggttcaacgg catcggagtg acccagaatg   4380
tgctgtacga gaaccagaag ctgatcgcca accagttcaa cagcgccatc ggcaagatcc   4440
aggacagcct gagcagcaca gcaagcgccc tgggaaagct gcaggacgtg gtcaaccaga   4500
atgcccaggc actgaacacc ctggtcaagc agctgtcctc caacttcggc gccatcagct   4560
ctgtgctgaa cgacatcctg agcagactgg acaaggtgga agccgaggtg cagatcgaca   4620
gactgatcac cggaaggctg cagtccctgc agacctacgt tacccagcag ctgatcagag   4680
ccgccgagat tagagcctct gccaatctgg ccgccaccaa gatgtctgag tgtgtgctgg   4740
gccagagcaa gagagtggac ttttgcggca agggctacca cctgatgagc ttccctcagt   4800
ctgcccctca cggcgtggtg tttctgcacg tgacatacgt gcccgctcaa gagaagaatt   4860
tcaccaccgc tccagccatc tgccacgacg gcaaagccca ctttcctaga gaaggcgtgt   4920
tcgtgtccaa cggcacccat tggttcgtga cccagcggaa cttctacgag ccccagatca   4980
tcaccaccga caacaccttc gtgtctggca actgcgacgt cgtgatcggc attgtgaaca   5040
ataccgtgta cgaccctctg cagcccgagc tggacagctt caaagaggaa ctggataagt   5100
actttaagaa ccacacaagc cccgacgtgg acctgggcga catcagcgga atcaatgcca   5160
gcgtcgtgaa catccagaaa gagatcgacc ggctgaacga ggtggccaag aatctgaacg   5220
agagcctgat cgacctgcaa gaactgggga agtacgagca gtacatcaag tggccctggt   5280
acatctggct gggctttatc gccggactga ttgccatcgt gatggtcaca atcatgctgt   5340
gttgcatgac cagctgctgt agctgcctga agggctgttg tagctgtggc agctgctgca   5400
agttcgacga ggacgattct gagcccgtgc tcaaaggagt caaattacat tacacataat   5460
tcactcctca ggtgcaggct gcctatcaga aggtggtggc tggtgtggcc aatgccctgg   5520
ctcacaaata ccactgagat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc   5580
cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt   5640
ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc   5700
agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca tatgctggct gccatgaaca   5760
aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat   5820
tccatagaaa agccttgact tgaggttaga tttttttata ttttgttttg tgttattttt   5880
tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc   5940
tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatc           5984
<210> 3
<211> 5314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 3
ggtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt    60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg   120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa   180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa   240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt   300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg   360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg   420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg   480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt   540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg   600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc   660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg   720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg   780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat   840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct   900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc   960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg   1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga   1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc   1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaggaatt agcttggtac   1200
taatacgact cacaagcttg gtaccatgtt tgtgttcctt gtgttattgc cactagtctc   1260
tagtcagtgt gtgaacctga ccacaagaac ccagctgcct ccagcctaca ccaacagctt   1320
taccagaggc gtgtactacc ccgacaaggt gttcagatcc agcgtgctgc actctaccca   1380
ggacctgttc ctgcctttct tcagcaacgt gacctggttc cacgccatcc acgtgtccgg   1440
caccaatggc accaagagat tcgacaaccc cgtgctgccc ttcaacgacg gggtgtactt   1500
tgccagcacc gagaagtcca acatcatcag aggctggatc ttcggcacca cactggacag   1560
caagacccag agcctgctga tcgtgaacaa cgccaccaac gtggtcatca aagtgtgcga   1620
gttccagttc tgcaacgacc ccttcctggg cgtctactat cacaagaaca acaagagctg   1680
gatggaaagc gagttccggg tgtacagcag cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc   1740
ccagcctttc ctgatggacc tggaaggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgcgagtt   1800
cgtgttcaag aacatcgacg gctacttcaa gatctacagc aagcacaccc ctatcaacct   1860
cgtgcgggat ctgcctcagg gcttctctgc tctggaaccc ctggtggatc tgcccatcgg   1920
catcaacatc acccggtttc agacactgct ggccctgcac agaagctacc tgacacctgg   1980
cgatagcagc agcggatgga cagctggtgc cgccgcttac tatgtgggct acctgcagcc   2040
tagaaccttc ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgacgccg tggattgtgc   2100
tctggatcct ctgagcgaga caaagtgcac cctgaagtcc ttcaccgtgg aaaagggcat   2160
ctaccagacc agcaacttcc gggtgcagcc caccgaatcc atcgtgcggt tccccaatat   2220
caccaatctg tgccccttcg gcgaggtgtt caatgccacc agattcgcct ctgtgtacgc   2280
ctggaaccgg aagcggatca gcaattgcgt ggccgactac tccgtgctgt acaactccgc   2340
cagcttcagc accttcaagt gctacggcgt gtcccctacc aagctgaacg acctgtgctt   2400
cacaaacgtg tacgccgaca gcttcgtgat ccggggagat gaagtgcggc agattgcccc   2460
tggacagaca ggcaagatcg ccgactacaa ctacaagctg cccgacgact tcaccggctg   2520
tgtgattgcc tggaacagca acaacctgga ctccaaagtc ggcggcaact acaattacct   2580
gtaccggctg ttccggaagt ccaatctgaa gcccttcgag cgggacatct ccaccgagat   2640
ctatcaggcc ggcagcaccc cttgtaacgg cgtggaaggc ttcaactgct acttcccact   2700
gcagtcctac ggctttcagc ccacaaatgg cgtgggctat cagccctaca gagtggtggt   2760
gctgagcttc gaactgctgc atgcccctgc cacagtgtgc ggccctaaga aaagcaccaa   2820
tctcgtgaag aacaaatgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctgaccggca ccggcgtgct   2880
gacagagagc aacaagaagt tcctgccatt ccagcagttt ggccgggata ttgccgatac   2940
cacagacgcc gtacgagatc cccagacact ggaaatcctg gacatcaccc cttgcagctt   3000
cggcggagtg tctgtgatca cccctggcac caacaccagc aatcaggtgg cagtgctgta   3060
ccaggacgtg aactgtaccg aagtgcccgt ggccattcac gccgatcagc tgacacctac   3120
atggcgggtg tactccaccg gcagcaatgt gtttcagacc agagccggct gtctgatcgg   3180
agccgagcac gtgaacaata gctacgagtg cgacatcccc atcggcgctg gcatctgtgc   3240
cagctaccag acacagacaa acagccccag acgggccaga tctgtggcca gccagagcat   3300
cattgcctac acaatgtctc tgggcgccga gaacagcgtg gcctactcca acaactctat   3360
cgctatcccc accaacttca ccatcagcgt gaccacagag atcctgcctg tgtccatgac   3420
caagaccagc gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgat tccaccgagt gctccaacct   3480
gctgctgcag tacggcagct tctgcaccca gctgaataga gccctgacag ggatcgccgt   3540
ggaacaggac aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc   3600
tcctatcaag gacttcggcg gcttcaattt cagccagatt ctgcccgatc ctagcaagcc   3660
cagcaagcgg agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgacactgg ccgacgccgg   3720
cttcatcaag cagtatggcg attgtctggg cgacattgcc gccagggatc tgatttgcgc   3780
ccagaagttt aacggactga cagtgctgcc accactgctg accgatgaga tgatcgccca   3840
gtacacatct gccctgctgg ccggcacaat cacaagcggc tggacatttg gagctggcgc   3900
cgctctgcag atcccctttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggagtgac   3960
ccagaatgtg ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg   4020
caagatccag gacagcctga gcagcacagc aagcgccctg ggaaagctgc aggacgtggt   4080
caaccagaat gcccaggcac tgaacaccct ggtcaagcag ctgtcctcca acttcggcgc   4140
catcagctct gtgctgaacg acatcctgag cagactggac aaggtggaag ccgaggtgca   4200
gatcgacaga ctgatcaccg gaaggctgca gtccctgcag acctacgtta cccagcagct   4260
gatcagagcc gccgagatta gagcctctgc caatctggcc gccaccaaga tgtctgagtg   4320
tgtgctgggc cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt   4380
ccctcagtct gcccctcacg gcgtggtgtt tctgcacgtg acatacgtgc ccgctcaaga   4440
gaagaatttc accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga   4500
aggcgtgttc gtgtccaacg gcacccattg gttcgtgacc cagcggaact tctacgagcc   4560
ccagatcatc accaccgaca acaccttcgt gtctggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat   4620
tgtgaacaat accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gacagcttca aagaggaact   4680
ggataagtac tttaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgaca tcagcggaat   4740
caatgccagc gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgaccgg ctgaacgagg tggccaagaa   4800
tctgaacgag agcctgatcg acctgcaaga actggggaag tacgagcagt acatcaagtg   4860
gccctggtac atctggctgg gctttatcgc cggactgatt gccatcgtga tggtcacaat   4920
catgctgtgt tgcatgacca gctgctgtag ctgcctgaag ggctgttgta gctgtggcag   4980
ctgctgcaag ttcgacgagg acgattctga gcccgtgctc aaaggagtca aattacatta   5040
cacataagat ctagagtcgg ggcggccggc cgctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc   5100
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc   5160
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg   5220
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa   5280
tagcaggcat gctggggatc cgagtgtcga taag                 5314
<210> 4
<211> 4678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 4
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata    60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat   120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga   180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc   240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt   300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat   360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag   420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc   480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga   540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccat   600
gtttgtgttc cttgtgttat tgccactagt ctctagtcag tgtgtgaacc tgaccacaag   660
aacccagctg cctccagcct acaccaacag ctttaccaga ggcgtgtact accccgacaa   720
ggtgttcaga tccagcgtgc tgcactctac ccaggacctg ttcctgcctt tcttcagcaa   780
cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgtc cggcaccaat ggcaccaaga gattcgacaa   840
ccccgtgctg cccttcaacg acggggtgta ctttgccagc accgagaagt ccaacatcat   900
cagaggctgg atcttcggca ccacactgga cagcaagacc cagagcctgc tgatcgtgaa   960
caacgccacc aacgtggtca tcaaagtgtg cgagttccag ttctgcaacg accccttcct   1020
gggcgtctac tatcacaaga acaacaagag ctggatggaa agcgagttcc gggtgtacag   1080
cagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcct ttcctgatgg acctggaagg   1140
caagcagggc aacttcaaga acctgcgcga gttcgtgttc aagaacatcg acggctactt   1200
caagatctac agcaagcaca cccctatcaa cctcgtgcgg gatctgcctc agggcttctc   1260
tgctctggaa cccctggtgg atctgcccat cggcatcaac atcacccggt ttcagacact   1320
gctggccctg cacagaagct acctgacacc tggcgatagc agcagcggat ggacagctgg   1380
tgccgccgct tactatgtgg gctacctgca gcctagaacc ttcctgctga agtacaacga   1440
gaacggcacc atcaccgacg ccgtggattg tgctctggat cctctgagcg agacaaagtg   1500
caccctgaag tccttcaccg tggaaaaggg catctaccag accagcaact tccgggtgca   1560
gcccaccgaa tccatcgtgc ggttccccaa tatcaccaat ctgtgcccct tcggcgaggt   1620
gttcaatgcc accagattcg cctctgtgta cgcctggaac cggaagcgga tcagcaattg   1680
cgtggccgac tactccgtgc tgtacaactc cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg   1740
cgtgtcccct accaagctga acgacctgtg cttcacaaac gtgtacgccg acagcttcgt   1800
gatccgggga gatgaagtgc ggcagattgc ccctggacag acaggcaaga tcgccgacta   1860
caactacaag ctgcccgacg acttcaccgg ctgtgtgatt gcctggaaca gcaacaacct   1920
ggactccaaa gtcggcggca actacaatta cctgtaccgg ctgttccgga agtccaatct   1980
gaagcccttc gagcgggaca tctccaccga gatctatcag gccggcagca ccccttgtaa   2040
cggcgtggaa ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggctttc agcccacaaa   2100
tggcgtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc tgcatgcccc   2160
tgccacagtg tgcggcccta agaaaagcac caatctcgtg aagaacaaat gcgtgaactt   2220
caacttcaac ggcctgaccg gcaccggcgt gctgacagag agcaacaaga agttcctgcc   2280
attccagcag tttggccggg atattgccga taccacagac gccgtacgag atccccagac   2340
actggaaatc ctggacatca ccccttgcag cttcggcgga gtgtctgtga tcacccctgg   2400
caccaacacc agcaatcagg tggcagtgct gtaccaggac gtgaactgta ccgaagtgcc   2460
cgtggccatt cacgccgatc agctgacacc tacatggcgg gtgtactcca ccggcagcaa   2520
tgtgtttcag accagagccg gctgtctgat cggagccgag cacgtgaaca atagctacga   2580
gtgcgacatc cccatcggcg ctggcatctg tgccagctac cagacacaga caaacagccc   2640
cagacgggcc agatctgtgg ccagccagag catcattgcc tacacaatgt ctctgggcgc   2700
cgagaacagc gtggcctact ccaacaactc tatcgctatc cccaccaact tcaccatcag   2760
cgtgaccaca gagatcctgc ctgtgtccat gaccaagacc agcgtggact gcaccatgta   2820
catctgcggc gattccaccg agtgctccaa cctgctgctg cagtacggca gcttctgcac   2880
ccagctgaat agagccctga cagggatcgc cgtggaacag gacaagaaca cccaagaggt   2940
gttcgcccaa gtgaagcaga tctacaagac ccctcctatc aaggacttcg gcggcttcaa   3000
tttcagccag attctgcccg atcctagcaa gcccagcaag cggagcttca tcgaggacct   3060
gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggcttcatc aagcagtatg gcgattgtct   3120
gggcgacatt gccgccaggg atctgatttg cgcccagaag tttaacggac tgacagtgct   3180
gccaccactg ctgaccgatg agatgatcgc ccagtacaca tctgccctgc tggccggcac   3240
aatcacaagc ggctggacat ttggagctgg cgccgctctg cagatcccct ttgctatgca   3300
gatggcctac cggttcaacg gcatcggagt gacccagaat gtgctgtacg agaaccagaa   3360
gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat cggcaagatc caggacagcc tgagcagcac   3420
agcaagcgcc ctgggaaagc tgcaggacgt ggtcaaccag aatgcccagg cactgaacac   3480
cctggtcaag cagctgtcct ccaacttcgg cgccatcagc tctgtgctga acgacatcct   3540
gagcagactg gacaaggtgg aagccgaggt gcagatcgac agactgatca ccggaaggct   3600
gcagtccctg cagacctacg ttacccagca gctgatcaga gccgccgaga ttagagcctc   3660
tgccaatctg gccgccacca agatgtctga gtgtgtgctg ggccagagca agagagtgga   3720
cttttgcggc aagggctacc acctgatgag cttccctcag tctgcccctc acggcgtggt   3780
gtttctgcac gtgacatacg tgcccgctca agagaagaat ttcaccaccg ctccagccat   3840
ctgccacgac ggcaaagccc actttcctag agaaggcgtg ttcgtgtcca acggcaccca   3900
ttggttcgtg acccagcgga acttctacga gccccagatc atcaccaccg acaacacctt   3960
cgtgtctggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac aataccgtgt acgaccctct   4020
gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggataag tactttaaga accacacaag   4080
ccccgacgtg gacctgggcg acatcagcgg aatcaatgcc agcgtcgtga acatccagaa   4140
agagatcgac cggctgaacg aggtggccaa gaatctgaac gagagcctga tcgacctgca   4200
agaactgggg aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg tacatctggc tgggctttat   4260
cgccggactg attgccatcg tgatggtcac aatcatgctg tgttgcatga ccagctgctg   4320
tagctgcctg aagggctgtt gtagctgtgg cagctgctgc aagttcgacg aggacgattc   4380
tgagcccgtg ctcaaaggag tcaaattaca ttacacataa gatatcgcgg ccgctcgagt   4440
ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa   4500
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact   4560
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata   4620
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatctta    4678
<---