ЛЕКАРСТВЕННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА
MEDICINAL COMPOUND FOR INHIBITION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS REPRODUCTION

Изобретение относится к лекарственным составам на основе производных глицирризиновой кислоты, позволяющим значительно увеличить биодоступость соединений, и может использоваться в медицине, вирусологии, фармакологии, например, в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека.
Известно, что глицирризиновая кислота - основной ингредиент экстракта корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и солодки уральской (Gl.Uralensis) обладает высокой биологической активностью и является высокоэффективным средством в лечении различных заболеваний. Так, она применяется при лечении вирусных гепатитов, входит в перечень препаратов (который насчитывает около 50 наименований), подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека in vitro. Названная кислота оказывает противовирусное, противовоспалительное, противозудное и иммуномодулирующее действие, действует на разные типы ДНК и РНК-вирусов in vitro и in vivo (Varicella zoster; Herpes simplex 1 и 2 типа; различные типы вируса папилломы человека, в т.ч. онкогенные), прерывает репликацию вирусов на ранних стадиях, вызывает выход вириона из капсида, тем самым не допуская его проникновение в клетки, что связано с селективным дозозависимым ингибированием фосфорилирующей киназы Р. Глицирризиновая кислота взаимодействует со структурами вируса (возможно, с белками), изменяя различные фазы вирусного цикла, что сопровождается необратимой инактивацией вирусных частиц, находящихся в свободном состоянии вне клеток, блокирует внедрение активных вирусных частиц внутрь клетки, нарушает способность вируса к индукции синтеза новых вирусных частиц, индуцирует образование интерферона, что является одним из компонентов противовирусного действия, инактивирует указанные вирусы в нетоксичных для нормально функционирующих клеток концентрациях. Мутантные штаммы вирусов, резистентные к ацикловиру и йодоуридину, так же высокочувствительны к глицирризиновой кислоте, как и немутантные штаммы. Противовоспалительная активность глицирризиновой кислоты сочетается со стимулирующим влиянием на гуморальные и клеточные факторы иммунитета.
Производные глицирризиновой кислоты так же, как и сама кислота, обладают высокой биологической активностью. В частности, моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам Г) или пента-O-никотинат глицирризиновой кислоты, 3-(b-D-2,3,4-три-о-никотинилглюкуронпиранозил)12(a-D-3,4-ди-О-никотинилглюкуронпиранозил) глицирретовой кислоты (ниглизин, НГ) используются для ингибирования репродукции вируса Марбург (Патент РФ №2088232, МПК А61К 31/70, опубл. 27.08.97).
Известны и другие производные глицирризиновой кислоты, проявляющие полезные для лечения различных заболеваний свойства, что указывает на высокую перспективность этих веществ для использования в медицине, фармакологии и биологии.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является производное глицирризиновой кислоты - гликопептид глицирризиновой кислоты, обладающий анти-СПИД-активностью (Патент РФ №2024546, МПК C07J 53/00, А61К 31/705, опубл. 15.12.1994).
Одной из важнейших характеристик для кандидатов в лекарственные противовирусные препараты является не только противовирусная активность соединения, но его биодоступность, т.е. способность усваиваться организмом. Многие производные глицирризиновой кислоты, в том числе и соединение-прототип, обладают слабой растворимостью в воде, а значит, и недостаточной биодоступностью при введении в организм.
По этой причине подбор дополнительных компонентов для улучшения биодоступности производных глицирризиновой кислоты при пероральном применении является актуальной задачей.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка такого лекарственного состава, который обеспечивает повышение биодоступности биологически активного компонента - производного глицирризиновой кислоты, например ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты.
Указанный технический результат достигается тем, что в лекарственном составе для ингибирования репродукции вируса иммунодефицита человека, включающем производные глицирризиновой кислоты, согласно изобретению, он дополнительно содержит карбонат натрия, а в качестве производных глицирризиновой кислоты он содержит ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты, имеющие общую формулу:
где R - это  или Н, причем два и/или три из названных R - это
.
причем массовое соотношение в составе ди - и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты и карбоната натрия находится в интервале от 1:1 до 1:3.
При увеличении указанного соотношения компонентов более 1:1 значительно уменьшается растворимость ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты, а при уменьшении соотношения компонентов менее 1:3 снижается стабильность и биологическая активность лекарственного состава.
Соединения ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты являются ингибитором репродукции вируса иммунодефицита человека, на которые подана заявка на изобретение №2006108329/04 (009055), дата подачи заявки 17.03.2006 г.
Синтез ди - и триникатинатов глицирризиновой кислоты осуществляют в соответствии со следующий схемой:
Для реализации этой схемы никотиновую кислоту растворяют в органическом апротонном растворителе при нагревании реакционной смеси с образованием суспензии, в которую добавляют также при нагревании пятихлористый фосфор, затем суспензию охлаждают. В охлажденную суспензию добавляют глицирризиновую кислоту и затем ее снова нагревают. После окончания протекания реакции и охлаждения полученной реакционной смеси в нее добавляют лед и концентрированную соляную кислоту до слабокислой реакции. Ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты выпадают в виде осадка, представляющего собой их смесь. При необходимости диникотинаты могут быть отделены от триникотинатов и таким образом выделены раздельно.
Исследования токсичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты показали, что они не токсичны и могут применяться в медицине, фармакологии и биологии. Однако ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты относятся к водонерастворимым и вследствие этого их биодоступность при введении per os невелика.
Как указывалось выше, для повышения биодоступности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты был разработан оптимальный лекарственный состав, обеспечивающий повышение биодоступности соединения более чем в 6 раз. При этом данный состав не ухудшает анти-ВИЧ активности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты (таблица 3).
В результате исследований выявлено, что при использовании состава, содержащего смесь ди - и триникотинаты глицирризиновой кислоты с карбонатом натрия, биодоступность целевого препарата ди - и триникотинаты глицирризиновой кислоты существенно увеличивается по сравнению с исходным препаратом без добавок соли (таблица 1).
Добавление карбоната натрия в указанных соотношениях не влияет на стабильность препарата и его биологическую активность.
Исследование биодоступности заявляемого лекарственного состава представлено двумя лекарственными формами, одна из которых в виде суспензии для введения per os, другая - водорастворимая для внутривенного введения.
В исследовании использованы белые крысы-самцы Вистар. Пробы крови у крыс отбирали из хвостовой вены через 0, 1, 3, 5, 10 и 24, 48 и 72 часа после однократного введения препарата.
Для оценок фармакокинетических показателей опытные животные получали лекарственное вещество в дозе 7,8 мг/кг однократно внутрижелудочно или внутривенно. В качестве биологического материала для оценки фармакокинетических параметров использовали цельную кровь. Пробы до проведения количественного определения хранили при -20°С.
4
В работе использованы хлороформ, метанол, гексан и LiClO квалификации ХЧ и ацетонитрил квалификации «для высокоэффективной жидкостной хроматографии», сорбент Nucleosil 100-5-C185 мкм, производимый фирмой MACHEREY-NAGEL (Германия), хроматограф «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», Новосибирск), бета-счетчик 1211 Rackbeta (LKB).
Пример 1. Исследование стабильности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты при добавлении различных количеств карбоната натрия.
2
3
-7
В стеклянной колбе в 10 мл воды растворяют необходимое количество NaCO, после чего добавляют 1 мг (7×10 моль) ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты, смесь тщательно перемешивалась до растворения. Увеличение
2
3
2
3
содержания NаСО выше чем массовое соотношение 1:3 приводит к деградации препарата. Уменьшение содержания NaCO приводит к увеличению времени растворения (таблица 1).
Контроль стабильности продукта осуществлялся методом ВЭЖХ: фаза LiChrospher 100-5-RP-18; подвижная фаза - 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле.
Пример 2. Исследование биодоступности различных соотношений карбонат натрия и ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты.
При внутрижелудочном введении крысам дозы 7,8 мг/кг (соответствующей предполагаемой для клинических испытаний дозе 100 мг) максимальная концентрация в крови крыс достигается через 8, 9 час после однократного введения per os, период полувсасывания составляет 5, 3 часа. Фракция биодоступной дозы варьирует в зависимости от соотношения карбоната натрия и ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты и составляет от 12% (в отсутствии карбоната натрия) до 68% (при массовом соотношении 1:3) (таблица 2). Определение биодоступности проводили с использованием программы ASKID, двукамерная модель.
Таблица 1.Влияние соотношения ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты и карбоната натрия на стабильность соединения.
Кол-во Na<sub>2</sub>CО<sub>3</sub>, мг
Молярное соотношение Кислотный центр/Nа<sub>2</sub>СО<sub>3</sub>
Массовое соотношение ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты и карбоната натрия
Стабильность
рН
0
Отсутствие гидролиза
6,5
1
4
1:1
Отсутствие гидролиза
8,4
3
14
1:3
Незначительный гидролиз
9
5
22
1:5
Почти полный гидролиз
9
10
44
1:10
Полный гидролиз
10
Таблица 2.Влияние соотношения ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты и карбоната натрия на биодоступность при внутрижелудочном введении крысам.
Кол-во Na<sub>2</sub>СО<sub>3</sub>, мг
Массовое соотношение ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты и карбоната натрия
Биодоступность при внутрижелудочном введении (%)
0
12
1
1:1
35
3
1:3
68
5
1:5
<5
10
1:10
<5
Таблица 3.Влияние карбоната натрия на анти-ВИЧ активность ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на культуре клеток МТ-4.
Соединение
CD<sub>50</sub>, мкМ
ID<sub>50</sub>, мкМ
IS
Ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты
2600
1,2
2166,7
Смесь ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты и карбоната натрия в соотношении 1:3
2600
1,1
2363,6
Глицирризиновая кислота
2040
212,5
9,6
Моноаммонийная соль глицирризиновой кислоты
2065
46,3
44,6
Пента-никотинат глицирризиновой кислоты
863
15,1
57,0