ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ
ALLERGIC SENSITISATION PREVENTION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к снижению риска аллергической сенсибилизации, в особенности сенсибилизации, опосредованной иммуноглобулинами класса E (IgE), и ее прогрессирования до клинически выраженного заболевания, посредством чего можно предотвращать или лечить такие аллергические болезни, как астма, экзема, аллергические ринит и конъюнктивит. Более конкретно, настоящее изобретение относится к использованию определенного вируса в изготовлении фармацевтической композиции для предотвращения или лечения заболеваний, связанных с аллергической сенсибилизацией.
Уровень техники
На протяжении последних нескольких десятков лет уровень распространения аллергических заболеваний постоянно повышается. Иммунная система у новорожденных незрелая, ее развитие продолжается в течение первых месяцев и лет жизни. В организме здорового ребенка формируется иммунный ответ на патогенные агенты окружающей среды, но у все большего числа детей появляется аллергическая реакция на безвредные внешние факторы, ведущая к аллергическим заболеваниям.
Предпринимались неоднократные попытки предотвратить развитие аллергических заболеваний. Многие годы считалось, что полностью грудное вскармливание и исключение контакта с возможными источниками аллергенов (например, с собаками и кошками) в раннем детстве могут снизить риск аллергических заболевания. Однако результаты такой стратегии неубедительны.
Одно из недавних предположений относительно причины аллергических заболевания - гипотеза о влиянии гигиены («гигиеническая» гипотеза), базирующаяся на том факте, что в благополучных странах с высокими нормами уровня жизни и гигиены распространенность аллергических заболеваний значительно выше, чем в тех странах, где общеприняты менее строгие санитарно-гигиенические требования. Кроме того, в эпидемиологических исследованиях отмечалась обратная связь между числом детей в семье и аллергическими заболеваниями [1, 2]. У детей, растущих в деревенских условиях, аллергический ринит, по-видимому, встречается реже [3, 4, 5]. Среди городских детей, регулярно контактирующих с домашними животными, также менее распространена аллергическая сенсибилизация [4]. Причины этих связей по большей части неизвестны, но «гигиеническая» гипотеза дает возможное объяснение, полагающее, что экспозиция организма разнообразным микробам в детский период жизни обеспечивает защиту от аллергических заболеваний, способствуя созреванию иммунной системы [2, 6]. Один из возможных подходов в борьбе с аллергией состоит во введении в организм пробиотиков, в особенности молочнокислых бактерий, которые, как показано, способствуют толерогенному иммунному ответу.
+
В ряде работ предполагалась роль Th2-поляризованных CD4Т-клеток в патогенезе астмы и аллергии [7-9], но точные механизмы, управляющие аллергической сенсибилизацией, неизвестны. Иммунный ответ, поляризованный по типу Th1, может подавлять эффекты Th2-клеток [7] или же регуляторные T-клетки могут влиять на функцию как Th1, так и Th2-клеток, равно как и на баланс Th1/Th2 [8, 9]. Хотя некоторые сообщения противоречивы, имеются эпидемиологические данные в пользу того, что некоторые инфекции, как, например, вызываемые вирусом гепатита A (HAV) [10-13], простейшим Toxoplasma gondii [12, 13], бактерией Helicobacter pylori [12-14] и некоторыми бактериальными факторами [15-17], ассоциированы с пониженным риском аллергических заболеваний, что поддерживает гипотезу, полагающую микробную нагрузку важным фактором окружающей среды, нужным для создания защиты от развития аллергии в детский период жизни [18]. Более того, в Великобритании была обнаружена независимая обратная связь между числом желудочно-кишечных инфекций в возрасте до 5 лет и риском атопических заболеваний [19]. Сообщалось также, что инфекция вирусом герпеса человека типа 6 (HHV-6) в раннем детском возрасте может защищать от развития IgE-сенсибилизации, атопических заболеваний и аллергии у маленьких детей (WO 2006/031195).
Однако не все микробные инфекции имеют защитный эффект в отношении предотвращения атопических заболеваний. Например, было обнаружено, что серопозитивная реакция на такие кишечно-патогенные бактерии, как Clostridium difficile, Campylobacter jejuni и Yersinia enterocolitica, ассоциирована с повышенной частотой распространения атопии среди взрослого населения Дании [13]. Недавно Бенн с коллегами сообщили о том, что инфекционные заболевания в первые 6 месяцев жизни (главным образом инфекционные заболевания верхних дыхательных путей) повышают риск атопических заболеваний [20], а по наблюдениям Бейджера с сотрудниками риск атопических заболеваний растет с увеличением числа воздушных вирусных инфекций (корь, краснуха, эпидемический паротит, ветряная оспа) в возрасте до 1 года [21].
Несомненно, есть нужда в эффективных средствах снижения риска аллергической сенсибилизации и тем самым предотвращения и лечения связанных с ней заболеваний. В частности, нужно предотвращать развитие таких аллергических заболеваний, как астма, экзема, аллергические ринит и конъюнктивит, пищевые аллергические реакции. Этим потребностям отвечает настоящее изобретение.
Раскрытие изобретения
В основе настоящего изобретения лежит использование энтеровирусов для предотвращения или лечения заболеваний, связанных с аллергической сенсибилизацией. В частности, данное изобретение касается использования энтеровируса в изготовлении фармацевтической композиции для предотвращения или лечения заболеваний, связанных с аллергической сенсибилизацией, причем указанный энтеровирус не содержит экзогенных нуклеотидных последовательностей, интегрированных в вирусный геном и кодирующих аллерген, вызывающий указанную аллергическую сенсибилизацию. Также предлагается способ предотвращения или лечения заболеваний, связанных с аллергической сенсибилизацией, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, в состав которой входит энтеровирус, не содержащий экзогенных нуклеотидных последовательностей, интегрированных в вирусный геном и кодирующих аллерген, вызывающий указанную аллергическую сенсибилизацию.
Конкретные воплощения перечислены в зависимых пунктах формулы изобретения. Другие задачи, подробности и преимущества данного изобретения явствуют из нижеследующего описания осуществления изобретения.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 иллюстрирует уровень распространения аллерген-специфичных IgE у детей, проживающих в Карельской республике Российской федерации, по данным о серопозитивной реакции на различные серотипы энтеровирусов.
Фигура 2 иллюстрирует индукцию мРНК FoxP3 в культурах мононуклеаров периферической крови, стимулированных инфекционным вирусом (CBV4); очищенным энтеровирусом (CBV4), подвергнутым термообработке; различными агонистами TLR (поли(I:C), LPS, резиквимод); поликлональным стимулятором Т-клеток (анти-CD3 + анти-CD28). Клетки собирали после 24-часовой инкубации. Результаты выражены как относительная экспрессия мРНК FoxP3 в сравнении с клетками, обработанными средой.
Фигура 3 иллюстрирует индукцию мРНК IL-10 в культурах мононуклеаров периферической крови, стимулированных инфекционным энтеровирусом (CBV4); очищенным энтеровирусом (CBV4), подвергнутым термообработке; различными агонистами TLR (поли(I:С), LPS, резиквимод); поликлональным стимулятором Т-клеток (анти-CD3 + анти-CD28). Клетки собирали после 24-часовой инкубации. Результаты выражены как относительная экспрессия мРНК IL-10 в сравнении с клетками, обработанными средой.
Осуществление изобретения
В основе настоящего изобретения лежит открытие того, что аллергическую сенсибилизацию и связанные с ней заболевания можно предотвратить путем вакцинации композицией, содержащей в качестве иммунореактивного ингредиента энтеровируса. Ранее на роль противоаллергических вакцин предлагали (WO 93/11251) рекомбинантные вирусы, содержащие экзогенные нуклеотидные последовательности, интегрированные в вирусный геном и кодирующие эпитоп аллергена и искусственный сайт протеолитического расщепления; однако примеров, доказывающих противоаллергический эффект, не приводилось. Этот подход радикально отличается от предлагаемого по настоящему изобретению: в упомянутой публикации вирус функционирует как пассивный носитель или средство доставки (вектор) для экзогенной нуклеотидной последовательности, интегрированной в вирусный геном и кодирующей антиген, который предполагается вызывающим желаемый иммунный ответ против указанного антигена; настоящее же изобретение базируется на иммунорегуляторном действии, вызываемом самим энтеровирусом. Таким образом, энтеровирус, используемый по данному изобретению, является активным компонентом и не содержит интегрированной в его геном экзогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей аллерген, вызывающий аллергическую сенсибилизацию, которую нужно предотвратить или купировать. Однако энтеровирус, используемый по данному изобретению, может включать некодирующие экзогенные нуклеотидные последовательности, интегрированные в его геном, а также кодирующие или некодирующие экзогенные нуклеотидные последовательности, не интегрированные в вирусный геном. Энтеровирус, используемый по данному изобретению, может также включать экзогенные белки. В одном воплощении данного изобретения энтеровирус не содержит экзогенные нуклеотидные последовательности, кодирующие экзогенные белки, в частности не содержит интегрированные экзогенные нуклеотидные последовательности, кодирующие экзогенные белки.
Термином «аллерген» здесь называется соединение, которое может вызывать аллергический иммунный ответ; это может быть цельный белок или же только его иммуноактивный фрагмент, т.е. эпитоп. В этой связи нуклеиновые кислоты не считаются аллергенами.
Группа энтеровирусов включает более 100 различных серотипов. Энтеровирусные инфекции обычно протекают субклинически, но могут и приводить к разнообразным заболеваниям. О таких энтеровирусах, как полиовирусы, экховирусы, вирусы Коксаки B и A, а также энтеровирусы, обозначаемые цифрами, известно, что они участвуют в развитии различных болезней. Энтеровирусные инфекции распространяются фекально-оральным путем, проникая в организм-хозяин через иммунный заслон слизистых оболочек и кишечника. Они являются мощными активаторами иммунной системы и вызывают в ней существенные изменения.
Термин «энтеровирусы» здесь включает и цельные вирусные частицы, и их фрагменты или их комбинации. Энтеровирус может быть представлен ослабленным или неослабленным живым вирусным штаммом, генетически модифицированным штаммом или компонентом, происходящим из энтеровирусного штамма, как, например, субъединицей или пептидом, структурным белковым компонентом или их комбинацией, вирусоподобной частицей, геномом или фрагментом генома (например, РНК или кДНК), кодирующим иммунологически активный вирусный белок. Энтеровирус также может быть представлен убитым, т.е. инактивированным штаммом.
Энтеровирусы, особенно ценные для предотвращения и купирования аллергической сенсибилизации, можно выявить по их способности индуцировать иммунорегуляторные механизмы или подавлять иммунные ответы типа Th2. Такие энтеровирусы можно выявить, определяя их действие на регуляторные T-клетки и/или баланс Th1/Th2 и/или образование иммунорегуляторных цитокинов, как, например, IL-10, в ходе стимуляции лейкоцитов периферической крови различными энтеровирусами in vitro либо in vivo у детей с энтеровирусными инфекциями. Как правило, такие энтеровирусы должны активировать FoxP3-позитивные регуляторные Т-клетки или регуляторные клетки, продуцирующие IL-10 или другие иммунорегуляторные цитокины. Такие энтеровирусы могут также снижать активность клеток типа Th2, что выражается в снижении продукции IL-4 или других цитокинов типа Th2 и/или в параллельном усилении активности клеток типа Th1 и увеличении продукции гамма-интерферона или других цитокинов типа Th1. Энтеровирусы, особенно ценные для использования по данному изобретению, могут быть также выявлены в эпидемиологических исследованиях по их защитному эффекту. Как правило, такие энтеровирусы должны чаще встречаться у тех индивидов, у которых не развивается аллергическая сенсибилизация или аллергические симптомы, чем у тех, у кого развивается аллергическая сенсибилизация или аллергические симптомы. Эти вирусы могут быть выявлены путем определения количества серотип-специфичных антител в крови или путем анализа антигенных или генетических свойств вирусов, обнаруженных в такого рода эпидемиологических исследованиях.
Ослабленные (аттенюированные) вирусы - это вирусы со сниженной вирулентностью. Ослабление вируса достигается различными методами, включая серийное пассирование вируса в культурах клеток; химическую модификацию антигенных детерминант; конструирование рекомбинантных или химерных вирусных частиц; индукцию мутаций в вирусном геноме, делеций или инсерций определенных участков генома; отбор температурочувствительных мутантов; облучение. Или же энтеровирусы могут быть представлены ослабленными природными изолятами вируса либо кДНК или РНК инфекционных вирусов с пониженной способностью вызывать клинически выраженное заболевание.
5,5
6
5
5,5
5,8
50
50
50
50
Живые ослабленные или неослабленные энтеровирусы обычно вводят в организм человека через рот. Каждая иммунизирующая доза включает инфекционный вирус или инфекционную РНК либо кДНК в концентрации (титре), способной вызвать инфекцию или активацию врожденного или приобретенного иммунитета либо индуцировать регуляторные Т-клетки или регуляторные цитокины. Такая доза соответствует обычно используемой дозе в традиционной пероральной живой полиовакцине Сэбина, включающей минимум 10-10 TCID полиовируса типа 1, 10 TCID полиовируса типа 2, 10-10 TCID полиовируса типа 3 живых аттенюированных штаммов Сэбина. Доза может быть и другой, если показана ее безопасность и инфекционность или способность активировать врожденный или приобретенный иммунитет. (TCID - доза, инфицирующая культуру ткани; TCID - средняя цитопатогенная доза, инфицирующая 50% клеток в культуре).
В альтернативном варианте энтеровирус по данному изобретению может включать цельные вирусные частицы со сниженной инфекционностью или субъединичные вакцины, содержащие определенные антигенные структуры, вирусные белки или пептиды или их комбинации (например, вирусоподобные частицы); или фрагменты вирусной РНК или кДНК, кодирующие цельный вирус либо индивидуальные вирусные белки; или инактивированные формы вируса. Инактивированные вакцины могут быть получены путем размножения вируса в культурах клеток, его выделения из зараженных клеток и культуральной среды и очистки с помощью высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или других плотных средах. Или же очистка вируса может осуществляться хроматографически. Инфекционность очищенных вирионов снижают, инактивируя их путем химической обработки (например, инактивация формалином наподобие применяемой при производстве IPV), облучения или тепловой обработки. Субъединичные вакцины могут состоять из очищенных вирусных белков или рекомбинантных вирусных белков; синтетических пептидов, соответствующих вирусным антигенным эпитопам; вирусоподобных частиц или пустых вирусных оболочек, которые образуются в ходе инфекции, но не содержат вирусный геном. Субъединичные вакцины вводят в организм сами по себе либо конъюгированными с гаптенами или носителями (например, частицами ISCOM - молекулярными комплексами с иммуностимулирующими свойствами, хитозаном, агонистами TLR, биодеградируемыми микрочастицами).
Вышеупомянутые энтеровирусы вводят в организм человека парентерально путем инъекции, через рот, внутрикожно, чрезкожно, сублингвально, интраназально, путем вдыхания или через прямую кишку. Каждая иммунизирующая доза включает вирусные структуры в концентрации (титре), способной вызывать должный иммунный ответ. Эта доза соответствует дозе, используемой в случае инактивированной противополиомиелитной вакцины Солка, включая 1,8-2 мкг вирусного белка на дозу и 20-40 D-антигенных единиц полиовируса типа 1,4-8 D-антигенных единиц полиовируса типа 2 и 16-32 D-антигенных единиц полиовируса типа 3. Доза также может быть иной, если доказана ее безопасность и иммуногенность или способность стимулировать врожденный либо приобретенный иммунитет, или индуцировать регуляторные Т-клетки или регуляторные цитокины. Энтеровирусы можно вводить в различных сочетаниях, включая один или более энтеровирусных серотипов, вводимых одновременно или последовательно. В случае одновременного введения фармацевтическая композиция может быть в форме смеси различных энтеровирусов. Энтеровирус можно вводить в организм также в сочетании с по меньшей мере одним аллергеном, например цельным аллергеном или его иммунологически активной частью, чтобы стимулировать толерогенную реакцию на указанный аллерген. В одном из воплощений вакцина по данному изобретению содержит энтеровирусы в качестве единственного иммуноактивного ингредиента, а в другом воплощении она содержит смесь энтеровирусов и одного или более экзогенных аллергенов.
Энтеровирус по данному изобретению включен в состав фармацевтической композиции, которая помимо активных ингредиентов, обусловливающих иммуностимуляцию, может содержать фармацевтически приемлемые эксипиенты, носители, гаптены и адъюванты. Эксипиенты, носители, гаптены и адъюванты могут включать, например, феноксиэтиловый спирт, хлорид магния, сахарозу, тиомерсал, формальдегид, фенол, антибиотики (консерванты) или соли алюминия, полимерные микрочастицы, частицы ISCOM, белки-носители (например, холерный токсин), липосомы, белковые мицеллы (гаптены/адъюванты) или агонисты TLR.
Фармацевтическую композицию по данному изобретению вводят предпочтительно детям в возрасте до 5 лет, более предпочтительно до 3 лет, особенно предпочтительно до 2 лет, наиболее предпочтительно до 1 года с последующим введением бустер-доз на протяжении дальнейшей жизни для предотвращения аллергической сенсибилизации. Лица, у которых сенсибилизация уже произошла, могут получать фармацевтическую композицию по данному изобретению в любом возрасте независимо от наличия симптомов заболевания.
reg
«Эффективное количество» фармацевтической композиции по настоящему изобретению - это такое ее количество, которое способно вызывать врожденный или приобретенный иммунный ответ, ведущий к развитию иммунитета и защиты организма реципиента от данного вируса путем стимуляции образования нейтрализующих антител или клеточного иммунного ответа, или того и другого. Эффективным количеством также может быть такое количество композиции, которое способно вызывать образование регуляторных цитокинов (как, например, IL-10), или активировать регуляторные Т-клетки (T), или вызывать благоприятный сдвиг равновесия клеток Th1/Th2, даже если противовирусный защитный иммунитет не возник. Индукция регуляторных цитокинов или регуляторных клеток или сдвиг равновесия Th1/Th2 могут иметь место при вирус-специфичном или при аллерген-специфичном иммунном ответе, или при том и другом. Возможно также более генерализованное влияние на иммунную систему, затрагивающее широкий спектр иммунных ответов с различной антигенной или аллергенной специфичностью. Такой генерализованный эффект, как правило, опосредуется растворимыми иммунорегуляторными цитокинами, как, например, IL-10.
Когда иммунная система сталкивается с чужеродными компонентами окружающей среды, включая патогенные агенты, возникает иммунный ответ, в котором может преобладать реакция типа Th1 либо Th2. При обоих вариантах иммунного ответа идет борьба с инфекцией, но клетки Th2 также способствуют аллергии. Для адекватного иммунного ответа существенно важно должное равновесие клеток Th1/Th2. Но у людей, подверженных аллергическим заболеваниям, доминирует ответ по типу Th2. Кроме того, у этих людей могут аномально функционировать регуляторные Т-клетки и другие компоненты иммунной регуляции.
Термин «аллергическая сенсибилизация» относится к формированию иммунного ответа с доминированием клеток Th2, ведущего к образованию аллерген-специфичных IgE против различных антигенов окружающей среды, преимущественно безвредных. Аллерген-специфичные IgE, в свою очередь, опосредуют реакции гиперчувствительности, которые обусловливают симптомы аллергического заболевания. Такой иммунный ответ можно оценить, измеряя количество аллерген-специфичных IgE, например, в образце крови. Повышенные уровни аллерген-специфичных IgE отражают аллергическую сенсибилизацию на данный аллерген. Кроме того, об аллергической сенсибилизации может свидетельствовать высокий общий уровень IgE. Для диагностики аллергических заболеваний применяются также инъекционные кожные пробы. Фармацевтическая композиция по данному изобретению, содержащая энтеровирус, является вакциной, способной предотвратить или купировать любое заболевание, связанное с аллергической сенсибилизацией.
Опосредованная IgE аллергическая сенсибилизация может вести к разнообразным аллергическим заболеваниям, включая аллергическую экзему, астму, IgE-опосредованную пищевую или лекарственную аллергию, аллергический ринит и аллергический конъюнктивит. Энтеровирусная вакцина по данному изобретению способна снижать риск IgE-опосредованной сенсибилизации и тем самым предотвращать заболевания, обусловленные IgE-сенсибилизацией, как, например, аллергический ринит и астма.
Энтеровирусную вакцину по данному изобретению для предотвращения аллергической сенсибилизации могут получать как тотально все новорожденные, так и избранные группы населения, например дети из семей, в которых по меньшей мере у одного члена семьи были диагностированы аллергическая реакция или аллергическое заболевание. Кроме того, энтеровирусную вакцину по данному изобретению можно вводить индивидам с бессимптомной аллергической сенсибилизацией (повышенные уровни аллерген-специфичных IgE в отсутствие симптоматики) для предотвращения развития клинически выраженных симптомов. Также энтеровирусную вакцину по данному изобретению можно использовать для облегчения симптомов аллергической реакции или аллергического заболевания.
Были изучены вариации и ассоциации в уровнях распространения микробных инфекций и аллергической сенсибилизации среди детей в Финляндии и в Карельской республике Российской федерации в ходе уникального эпидемиологического исследования, проведенного на двух географически соседних территориях, значительно различавшихся в социально-экономическом и культурном отношениях.
Методы
Объект исследования
В исследовании участвовали две когорты: 266 школьников, проживающих в Карельской республике Российской федерации, и 266 школьников, проживающих в Финляндии. Эти дети представляли основные популяции и были выбраны вне зависимости от возможных аллергических или иных заболеваний. У всех детей из Карельской республики и отец, и мать были финской или карельской этнической принадлежности, что создавало этнический фон, близкий к таковому детей из Финляндии. В каждую из когорт - российскую и финскую - входило по 114 мальчиков и 152 девочки из соответствующей страны. Средний возраст выборки на момент исследования в обеих когортах составлял 11,4 года (диапазон 7-15 лет).
Образцы крови были взяты в совокупности у 1988 случайным образом выбранных школьников, проживающих в Карельской республике. Отслеживалось этническое происхождение обоих родителей каждого ребенка, и все дети, у которых и отец, и мать были финской либо карельской этнической принадлежности, включались в данное исследование (N=266). Каждому из этих 266 детей, проживающих в Карельской республике, в Финляндии была найдена пара - ребенок такого же возраста и пола, у которого брали образец крови в такое же время года (не более 1 месяца разницы), чтобы свести к минимуму сезонный эффект в воздействии микробов и аллергенов на организм. В финскую когорту вошли дети, выбранные по тем же принципам, что и в Карельской республике; исходно было охвачено 3654 школьника, проживающих в губернии Оулу (Финляндия) [23]. У каждого ребенка были взяты образцы крови.
Иммуноглобулины Е и противовирусные антитела
Уровни аллерген-специфичных IgE измеряли, используя систему флуоресцентного иммуноферментного анализа UniCAP (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden). Определяли IgE, специфичные к двум обычным аэроаллергенам (береза и кошка) и к яичному альбумину, согласно инструкциям производителя. Эти аллергены были выбраны потому, что контакт с ними, как можно ожидать, вполне обычен в обеих фигурирующих в данном исследовании популяциях. В случае аллереген-специфичных IgE положительными считались значения 0,35 МЕ/л или более. В ранее проводившихся исследованиях свидетельством предрасположенности к атопии считались значения общего уровня IgE свыше 100 МЕ/л [24].
Группореактивные антитела против энтеровирусов определяли с помощью иммуноферментного анализа (EIA) и подвергнутых термообработке вирусов Коксаки В4 (CBV4) в качестве антигена, как описано ранее [25]. Этот метод выявляет антитела, не специфичные в отношении серотипа, но способные к перекрестной реакции между несколькими серотипами энтеровируов. Способность этого метода выявлять кросс-реактивные антитела против нескольких серотипов усиливали путем термообработки вирусного антигена, в результате которой экспонируются скрытые кросс-реактивные структуры вируса.
Антитела, специфичные в отношении данного серотипа, определяли с помощью реакции нейтрализации бляшкообразования, как описано ранее [26]. Этот метод позволяет количественно определить нейтрализующие антитела, специфичные для того серотипа, который используется в анализе. Мы определяли антитела против двух серотипов вируса Коксаки В (CBV4 и CBV5) и двух серотипов экховирусов (ECHO9 и ECHO11), используя эталонные вирусные штаммы АТСС.
Антитела класса G (IgG) против вируса гепатита A (HAV) определяли, используя имеющийся в продаже набор для иммуноферментного анализа Enzygnost Anti HAV согласно инструкциям производителя (Dade Behring, Marburg, Germany). Для дальнейшего анализа, обработки данных и расчета уровней антител использовали Behring Elisa Processor III.
Индукция иммунорегуляторных механизмов
2
Влияние энтеровирусов на иммунорегуляторные механизмы исследовали путем стимуляции энтеровирусами культур мононуклеаров. Мононуклеары периферической крови, взятой у здоровых сотрудников лаборатории, очищали при помощи системы BD Vacutainer СРТ™ Tube (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) согласно инструкциям производителя. Мононуклеары дважды промывали RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, СА, USA) и культивировали в течение 48 часов при +37°C (5% CO) в лунках культурального круглодонного 96-луночного планшета (Costar 96, Corning Inc., Corning, NY, USA), содержавшего 200000 клеток в 100 мкл на лунку. Культуральная среда содержала человеческую сыворотку крови (10%), пенициллин (1%), стрептомицин (1%) и L-глутамин (1%) в RPMI 1640 и один из следующих стимулирующих агентов: среда (контроль); инфекционный энтеровирус (вирус Коксаки В4, 3 бляшкообразующих единицы на клетку); высокоочищенный и подвергнутый термообработке CBV4 в концентрации 1,0 мкг/мл; аналог двухцепочечной РНК поли(I:C) (агонист TLR-3) в концентрации 5 мкг/мл (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA); резиквимод (агонист TLR7/8) в концентрации 5 мкг/мл (Alexis Biochemicals); липополисахарид (LPS) Е. coli серотипа J5 (Rc) в качестве агониста TLR4 в концентрации 100 мкг/мл (Alexis Biochemicals); комбинацию растворимых антител анти-CD3 и анти-CD28 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) в качестве поликлонального активатора Т-клеток.
t
t
Влияние вируса на регуляторные Т-клетки оценивали, определяя экспрессию мРНК FoxP3 и IL-10 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени в системе 7900 HT Fast real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). РНК выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно инструкциям производителя. В ходе выделения РНК осуществляли обработку ДНКазой непосредственно на колонках при помощи набора ферментов RNase-Free DNase Set (Qiagen, Hilden, Germany). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием ревертазы M-MLV и буферного раствора производства Promega (Madison, WI, USA) и случайных гексамерных праймеров. Для полимеразной цепной реакции в реальном времени конструировали специальные праймеры для FoxP3 и IL-10, а для белка, связывающего ТАТА-бокс (ТВР), праймеры были по публикации [27] с некоторой модификацией прямого праймера. В каждом наборе праймеров был один праймер, перекрывающий границу между экзонами. Последовательности праймеров были следующие: FoxP3 прямой 5'-АСА GCA CAT ТСС CAG AGT ТСС-3', обратный 5'-GAA СТС CAG СТС АТС САС G-3'; IL-10 прямой 5'-CAG ТТТ ТАС CTG GAG GAG GTG-3', обратный 5'-AGA TGC CTT TCT СТТ GGA GCT ТАТ-3'; ТВР прямой 5'-CGA ATA ТАА ТСС САА GCG GTT-3' и обратный 5'-АСТ ТСА CAT САС AGC ТСС СС-3'. Синтезированную кДНК амплифицировали, используя набор DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes, Espoo, Finland). Условия температурного цикла были следующие: 7 мин при 95°C, 40 циклов по 10 с при 95°C, 30 с при 60°C и 30 с при 78°C (для устранения димеров праймеров), после чего конечная элонгация в течение 1 мин при 60°C. В конце каждой ПЦР добавлялась стадия для получения кривой плавления в интервале температур 60°C - 95°C. Для анализа данных значения порогового цикла (C) для FoxP3 и IL-10 нормализовали по значениям C для эндогенного контрольного гена ТВР. Величины относительной экспрессии рассчитывали, используя метод с применением систем Пфаффа, как описано ранее [28].
Статистические методы
Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS версия 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) и CIA (Confidence Interval analyses) [29]. Уровни распространения специфичных IgE, высоких значений (>100МЕ/л) общего уровня IgE и противомикробных антител в двух вышеуказанных парных когортах сравнивали с помощью критерия Мак-Немара. Сравнение общих уровней IgE (непрерывная переменная с асимметричным распределением) в парных когортах проводили, используя знаково-ранговый критерий Уилкоксона. Для анализа ассоциаций между антителами к вирусу, высокими значениями общего уровня IgE и уровнями специфичных IgE в российской (Карельская республика) и финской (губерния Оулу) когортах применяли построение таблиц сопряженности и критерий хи-квадрат или точный критерий Фишера. При анализе ассоциаций между общими уровнями IgE и уровнями специфичных IgE (классифицировавшихся как положительные или отрицательные) и при анализе ассоциаций между уровнями IgG против CBV4 и специфичных IgE применяли U-критерий Манна-Уитни. Для определения независимого эффекта каждого параметра, когда это требовалось, применяли в качестве мультивариантного метода логистический регрессионный анализ. Выбор модели основывался на прямом пошаговом отборе при пороге включения и исключения 0,10. Результаты подтверждали оценкой отношения шансов (OR) и 95%-ных доверительных интервалов (CI). Если имелись пропущенные или безразличные значения, случай не включали в анализ с участием этих конкретных параметров. Таких случаев было мало: например, в серологических данных о микроорганизмах у детей из Карельской республики на каждый исследованный микроорганизм получилось 0-2 пропущенных случая. Все анализы были двухсторонними. Приводятся статистически значимые величины P (<0,05).
Результаты
Уровни распространения аллерген-специфичных IgE были значительно ниже у российских детей, чем у финских (таблица 1).
Уровни распространения антител к энтеровирусам и вирусу гепатита A были значительно выше у российских детей, чем у финских (таблица 2). Кроме того, в Карельской республике Российской федерации аллергическая сенсибилизация встречалась реже у тех детей, у которых имелись антитела к энтеровирусам, тогда как в отношении антител к вирусу гепатита A такого эффекта не наблюдалось (таблица 3). Из числа детей с серонегативной реакцией на энтеровирусы в совокупности у 22% имелся по меньшей мере один положительный результат по специфичным IgE, а среди детей с серопозитивной реакцией - у 5%. У детей, не имевших специфичных IgE, средний уровень антител к энтеровирусам составлял 74 иммуноферментных единицы (ИФЕ) (диапазон 0-224), а у тех, у кого имелся по меньшей мере один аллерген-специфичный IgE, эта величина составляла 49 ИФЕ (диапазон 0-154) (Р=0,048).
В финской когорте число детей с серопозитивной реакцией на вирус гепатита B (HAV) было очень невелико (таблица 2), что затрудняло анализ их ассоциации с аллерген-специфичными IgE. Однако антитела к энтеровирусам встречались у финских детей часто, но, в противоположность российским детям, у них не наблюдалось ассоциации с аллерген-специфичным IgE-ответом. (У 18% детей с серонегативной реакцией на энтеровирусы отмечался по меньшей мере один положительный результат в отношении специфичных IgE, а среди детей с серопозитивной реакцией таких было 23%.)
Тот факт, что ассоциация между инфекциями и уровнем распространения атопии наблюдалась лишь у российских детей, но не у финских, можно объяснить, предположив, что финские дети инфицируются в более старшем возрасте, поскольку циркуляция энтеровирусов и других микроорганизмов в Финляндии значительно меньше. Согласно «гигиенической» гипотезе наиболее важны инфекции в первые месяцы жизни, так как в этом возрасте они существенно влияют на созревание связанных с кишечником механизмов иммунной системы, развитие регуляторных путей и баланс Th1/Th2.
Чтобы проверить, есть ли разница в защитном эффекте энтеровирусов различных серотипов, мы обследовали в совокупности 244 детей, проживающих в Карельской республике Российской федерации, на наличие аллерген-специфичных IgE и нейтрализующих антител против четырех различных серотипов энтеровирусов (CBV4, CBV5, ЕСНО9, ECHO11). Поскольку уровень нейтрализующих антител остается повышенным многие годы, присутствие этих антител свидетельствует об инфекции данным серотипом в прошлом, что и использовалось в данном исследовании. Экховирус 11 (ECHO11) ассоциировался с сильной защитой от аллергической сенсибилизации (фигура 1). Из числа детей с серонегативной реакцией на ECHO11 в совокупности у 31,8% имелись аллерген-специфичные IgE по меньшей мере против одного из трех аллергенов, перечисленных в таблице 1; среди детей с серопозитивной реакцией на ECHO11 таких было только 13,2% (P<0,001). По результатам множественного логистического регрессионного анализа, серопозитивная реакция на ECHO11 имела явный независимый эффект в отношении аллерген-специфичных IgE (P<0,001; OR 3,2 [95% CI 1,7-6,2]). Эти результаты свидетельствуют, что защитный эффект энтеровируса в отношении аллергической сенсибилизации может зависеть от серотипа вируса.
Защитный эффект энтеровирусов в отношении аллергической сенсибилизации может быть опосредован их воздействием на иммунную систему. Обычно считается, что развитие аллергической сенсибилизации связано с аномальной иммунной регуляцией. В иммунной регуляции важную роль играют регуляторные T-клетки, и одним из возможных механизмов, опосредующих противоаллергическое действие вирусов, является индуцированная вирусом активация этих клеток. Для регуляторных T-клеток характерна экспрессия фактора транскрипции FoxP3 (натуральные регуляторные T-клетки) и секреция иммунорегуляторных цитокинов, как, например, IL-10 (регуляторные клетки Tr1). В частности, секреция IL-10 клетками Tr1 может быть важна в подавлении аллергической реакции [30]. Мы исследовали, могут ли энтеровирусы стимулировать регуляторные клетки, путем экспозиции мононуклеаров периферической крови с инфекционным энтеровирусом или очищенным энтеровирусом, подвергнутым термообработке, in vitro. Индуцированный вирусом ответ сравнивали с ответом, получаемым в случае агонистов TLR (поли(I:C), резиквимод, липополисахарид (LPS) E.coli) и поликлонального активатора Т-клеток (смесь моноклональных антител анти-CD3 и анти-CD8).
Экспозиция мононуклеаров с инфекционным CBV4 приводила к явному усилению экспрессии мРНК FoxP3 (фигура 2) и IL-10 (фигура 3): соответственно в 3,3 и 3,6 раза по сравнению с контролем. Аналогично, подвергнутый теромообработке CBV4 вызывал усиление экспрессии мРНК FoxP3 в 1,9 раза, мРНК IL-10 - в 3-4 раза. Поли(I:C) не индуцировал мРНК ни FoxP3, ни IL-10, тогда как комбинация антител анти-CD3/анти-CD28 усиливала экспрессию мРНК и FoxP3, и IL-10 (в 8,1 и 2.6 раза соответственно). Резиквимод и LPS не вызывали экспрессии мРНК FoxP3 (фигура 2), но явно усиливали экспрессию мРНК IL-10. Эти результаты показывают, что энтеровирусы способны активировать регуляторные Т-клетки. Вызванная энтеровирусами активация сравнима с активацией мощным поликлональным активатором Т-клеток - смесью антител анти-CD3/анти-CD28, что подтверждает биологическое значение этого явления. Кроме того, энтеровирусы способны индуцировать экспрессию FoxP3 сильнее, чем три классических агониста TLR, а экспрессию IL-10 не слабее, чем агонисты TLR4 и TLR7/8 (LPS и резиквимод, соответственно).
Итак, эти результаты позволяют полагать, что энтеровирусные инфекции ассоциированы с пониженным риском аллергической сенсибилизации и могут оказывать модулирующее действие на иммунную систему таким образом, что стимулируются иммунорегуляторные механизмы, тем самым защищая от аллергических заболеваний.
Таблица 1
Уровни распространения (% и 95%-ный CI) аллерген-специфичных IgE у детей школьного возраста в Финляндии и Карельской республике Российской федерации
Финляндия (n=266)
Карельская республика (n=266)
P
Антиген
Кошка
11% (8-16%)
2% (1-5%)
<0,001
Береза
11% (8-16%)
2% (1-5%)
<0,001
Яичный
6% (4-10%)
3% (2-6%)
0,093
альбумин
По меньшей мере
22% (17-27%)
6% (4-10%)
<0,001
один положительный результат
Таблица 2
Уровни распространения (% и 95%-ный CI) антител против энтеровируса и вируса гепатита А у детей школьного возраста в Финляндии и Карельской республике Российской федерации
Финляндия (n=266)
Карельская республика (n=266)
P
Энтеровирус
77% (72-82%)
93% (90-96%)
<0,001
Вирус гепатита A
2%* (1-5%)
24% (19-29%)
<0,001
- На наличие антител против вируса гепатита А обследовали 166 финских детей.
- В этом исследовании в качестве энетеровирусного антигена использовали высокоочищенный вирус Коксаки B4, подвергнутый термообработке для достижения широкой реактивности с антителами против различных энтеровирусных серотипов.
Таблица 3
Доля индивидов (% и 95%-ный CI) с позитивной реакцией на по меньшей мере один аллерген-специфичный IgE среди имеющих серопозитивную реакцию на антитела против энтеровируса и вируса гепатита A у детей школьного возраста, проживающих в Карельской республике Российской федерации
Серопозитивная реакция на вирус
Серонегативная
Логистическая
реакция
P
модель*
на вирус
Энтеровирус
13/247
4/18
OR (95% CI)
P
(5%; 3-9%)
(22%; 9-45%)
0,02
0,16 (0,04-0,6)
0,006
Вирус гепатита A
5/63 (8%; 3-17%)
12/201
0,579
НЗ
(6%; 3-10%)
Н3 - незначимо
* Прямая пошаговая модель (порог включения/исключения 0,10)