Средство на основе липосомной формы фотосенсибилизатора и способ его получения для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей
AGENT BASED ON A LIPOSOMAL FORM OF A PHOTOSENSITIZER AND A METHOD FOR ITS PREPARATION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF INFECTIOUS AND INFLAMMATORY DISEASES OF THE ORAL CAVITY, NASOPHARYNX AND UPPER RESPIRATORY TRACT

Область изобретения
а
Изобретение относится к химии биологически активных соединений, конкретно, к средству, содержащему природный порфирин, например, феофитин  формулы (1)
(1)
и природные или модифицированные липиды, в смеси или в виде индивидуальных веществ, так что указанные соединения образуют липосомную форму или эмульсию.
а
b,
Изобретение также относится к области фармацевтики, в частности, получению композиций, лосьонов-спреев, аэрозолей или жидкостей для ингаляций, содержащих природные порфирины (феофитин , либо  либо их производные), а в качестве липидов – фосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и другие), холестерин и прочие полярные липиды, образующие мультиламеллярные липосомы (МЛЛ), как средства эффективной доставки активного компонента в пораженную ткань или клетку.
Изобретение относится также к области медицины, в частности, фотодинамической терапии (ФДТ), с применением фотосенсибилизаторов (ФС) и источников света для генерации активных кислородных частиц в обработанных участках тканей. Указанные соединения, образующие МЛЛ, могут найти применение в качестве ФС для ФДТ коронавирусной инфекции нового типа – SARS CoV-2, поскольку при облучении светом приводят к образованию стабильных в течение нескольких часов в биологических средах активных кислородных частиц. Эти частицы, при определенных условиях, способны взаимодействовать с микроокружением, вызывая его фотохемомодификацию [Способ фотоиммунотерапии фотосенсибилизатором, активируемым волновой энергией вне организма человека. 30.11.2006. Патент РФ № 2006142366. Васильев Н.Е., Решетников А.В., с соавт.], приводящую к эффектам иммуностимуляции и иммуномодуляции. Данные эффекты впоследствии приводят к улучшению работы иммунной системы человека, выражающемуся в усилении ее общего и специфического действия на патогенные факторы, такие как атипичные клетки [Novel TLR2-binding adjuvant induces enhanced T cell responses and tumor eradication. 2018. J. Immunother. Cancer 6: 146. G.G. Zom, M.M.J.H.P. Willems, S. Khan, T.C. van der Sluis, J.W. Kleinovink, M.G.M. Camps, G.A. van der Marel, D.V. Filippov, C.J.M. Melief, and F. Ossendorp], на бактерии, грибки и вирусы, по отношению к циркулирующим иммунным комплексам при аутоиммунных заболеваниях, и также влияющему на медиаторы процесса воспаления в тканях (гистамин и простагландины типа II).
Описание предшествующего уровня техники
Существуют такие вирусные заболевания, при которых возбудитель проникает через слизистую оболочку, например, носоглотки в клетки, реплицируется в них, выходит в межклеточную среду и разносится с кровью, может впоследствии приводить к поражению кровеносных сосудов и легких, дальнейшим серьезным аутоиммунным патологиям органов и систем человека, - это коронавирусная инфекция нового типа, SARS CoV-2.
Известны средства барьерного типа, например, маски [Aerosol Science and Technology. 2021. Vol. 55, Iss. 4, P. 449-457. Efficacy of face masks, neck gaiters and face shields for reducing the expulsion of simulated cough-generated aerosols. W.G. Lindsley, F.M. Blachere, B.F. Law, D.H. Beezhold & J.D. Noti], используемые для защиты от подобной инфекции. Преимуществами таких средств является простота их применения, доступность, а недостатками – их низкая экологичность, необходимость замены каждые два часа, вред для сердечно-легочной системы людей, ввиду повышенного респираторного сопротивления, их низкая эффективность в связи с тем фактом, что диаметр пор подавляющего большинства подобных барьерных средств превышает размер вирусных частиц.

Известен продукт «Taffix»в виде порошка, предложенный с целью преодоления недостатков указанных выше средств, распыляемый в носоглотке для формирования пленки кислого геля, который, подобно маске, защищает слизистую оболочку от проникновения частиц вируса [Taffix Nasal Powder forms an Effective Barrier against SARS-CoV-2. 2021. Biomed J. Sci. & Tech. Res. 33(3). B.J. Mann, G.B. Moreau, T. Lapidot, D. Megiddo]. Это решение является аналогом настоящего изобретения. Его недостатком является необходимость применения каждые несколько часов, поскольку пленка геля легко разрушается, а также то, что она снижает сенсорные возможности человека и недостаточно активно воздействует на возбудителя, подавляя его лишь за счет своей повышенной кислотности и не влияя на активность фагоцитов, не формируя против вирусных частиц долгосрочной системной устойчивости. Так, недостатком барьерных средств в целом является обеспечение ими лишь пассивной защиты без формирования активного специфического иммунитета.
Известно также использование вакцин для формирования специфического Т-В-клеточного иммунитета в отношении коронавируса нового типа – SARS CoV-2 [Neutralizing Antibody Response of Vaccinees to SARS-CoV-2 Variants. 2021. Vaccines (Basel). 9(5). G. Anichini, C. Terrosi, G.S. Gori, C. Gandolfo, F.Franchi, M.G.Cusi]. Широкая вакцинация населения была призвана выработать «коллективный иммунитет» в отношении возбудителя. Но, во-первых, мутации нового коронавируса опережали разработчиков таких вакцин [NIH National Library of Medicine National Center for Biotechnology Information. 2021, Jun 1. doi: 10.1101/2021.05.26.21257441. Preprint. Emerging SARS-CoV-2 variants of concern evade humoral immune responses from infection and vaccination. T.G. Caniels, et. al.], во-вторых, эффект АЗУИ (антитело-зависимого усиления инфекции), ранее описанный для предполагаемого технического предшественника вируса SARS CoV-1 [Investigation of antibody-dependent enhancement (ADE) of SARS coronavirus infection and its role in pathogenesis of SARS. 2011. BMC Proc. V. 5 (Suppl. 1). P. 80. Yip M.S., Cheung C.Y., Li P.H. et al.], детально не был клинически изучен для большинства вакцин от SARS CoV-2, и, в-третьих, привитыми оказались и те, кто не должен был бы быть привит во время эпидемии по медицинским противопоказаниям. Например, в случае вакцин, основанных на мРНК, тканевые дендритные клетки захватывают ее, синтезируют на ее матрице белки и экспонируют их на поверхности своей мембраны в комплексе MHC II для презентации Т-киллерам. Другие клетки также могут презентовать эти белки, но в комплексе с MHC I. В обоих случаях они могут быть распознаны, как «чужие», и вакцина сориентирует Т-киллеры на нормальные клетки организма, в первую очередь, клетки, отвечающие за функции местного иммунитета. При этом, если в организме имеется воспалительный процесс или произошла чрезмерная активация иммунитета, то у привитых начинают развиваться аутоиммунные заболевания. Это может вызывать осложнения, вплоть до смертельного исхода. По данным «Системы сообщений о неблагоприятных эффектах прививок США (VAERS) на 09.07.21 2939 чел. скончались после прививки вакциной MODERNA и 7366 чел. – вакциной PFIZER.
То, что вакцинация – не лучшее средство, подтверждалось актуальной на время подачи данного патента информацией из общедоступных авторитетных источников (отчеты Министерств здравоохранения стран и ВОЗ на заданную дату) (Табл.1).
В Израиле, где первой дозой было вакцинировано 62% населения страны (85% взрослых), а второй - 58% (79% взрослых), где 4% населения страны, 5% взрослого населения и 29% граждан старше 60 лет были привиты третьей дозой, был в 8 раз больше процент больных, чем в соседнем Египте, где 1,3% населения получили две дозы вакцины, 3,6% - одну. Аналогичная ситуация складывалась в почти полностью привитых (70-80%) Великобритании, Исландии и Швеции с тяжело заболевшими и умершими во время «третьей волны».  Там, по сравнению с близкими, в региональном Европейском смысле, Украиной, Словенией и Черногорией, где было лишь 10-45% привитых, процент заболеваемости был в 8-50 раз выше, и только между Исландией и Черногорией – сопоставим, но не в пользу Исландии (Табл.1). При этом, надо отметить закрытость Исландии от туристов и более высокий уровень медицины. Аналогичная корреляция по числу вакцинированных и заболевших в «третью волну» прослеживалась и по российским регионам. Лидирующие по вакцинации лидировали и по заболеваемости, и наоборот.
В этой связи, была впоследствии высказана такая точка зрения, что вакцинация уменьшает не заболеваемость, а число госпитализаций (средних и тяжелых случаев) и, наконец, летальность.  Однако, и она в дальнейшем не нашла своего подтверждения. «Напротив, те остаточные количества антител к эпитопам белка S, которые будут присутствовать в сыворотке крови вакцинированных на протяжении десятилетий, станут своего рода триггером, запускающим тяжелый инфекционный процесс при повторной встрече иммунной системы человека с CoV» [Вестник войск РХБ защиты. 2020. Т. 4. № 1. С. 32-65. Новый коронавирус SARSCoV-2 в аспекте глобальной эпидемиологии коронавирусных инфекций. Супотницкий М.В.]. Таким образом, прирост числа тяжело больных в наиболее вакцинированных Европейских странах шел в 1,5-18,5 раз быстрее, чем в наименее привитых. В Ближневосточных странах разница в нормированном на 10 млн населения числе тяжело больных тоже была в 30 раз не в пользу Израиля (Табл.1), при закрытой границе и всевозможных ограничениях (в то время, как Египет был открыт для туристов и вводил минимальные рестрикции для населения). Двое умерших в день на пике «третьей волны» на небольшую по населению Черногорию (при нулевой смертности в Исландии, но и нулевой же и в 2 раза менее вакцинированной Словении) выбивались из общей картины, в которой Великобритания в 3,5 раза опережала по летальности от коронавируса Украину, а Израиль – в 10 раз – Египет. Отношение числа случаев среднетяжелого течения заболевания и смертности к количеству привитых для Великобритании было в два раза лучше, чем для Украины, и в 1,5 и 5,5 раз, соответственно, лучше, чем для Черногории, но Исландия по показателю тяжелой заболеваемости среди привитых в 2 раза опередила Украину, в 3 – Черногорию, и в 10 – Словению, а Израиль по этому показателю в два раза проиграл Египту, и только по параметру «число умерших к числу вакцинированных» - в два раза опередил его. Но при этом Египет по тому же показателю оказался сопоставим с Великобританией (Табл.1). Так что и с заявлениями по поводу уменьшения смертности у вакцинированных не все было так однозначно. Так, по данным Британского Минздрава на 25.06.21, непривитых заболело 53822 чел., из которых умерло 44 чел. или 0,08%. Вакцинированных заболело 27192 чел., из них умерло 70 чел. или 0,26%, что в три раза больше, чем в группе невакцинированных.
При этом, наблюдалось множество осложнений и даже смертей от вакцин (например, при ИБС и аллергиях). Это вносило не учитываемый в официальной статистике вклад в косвенную заболеваемость и смертность от осложнений, от неоказания своевременной помощи плановым и экстренным больным, а не собственно от COVID-19.  Кроме того, по причине АЗУИ, недоисследованности противопоказаний и ограничений к применению вакцин при сплошной вакцинации (например, у лиц, страдающих заболеваниями аллергической природы, нарушениями функций слизистых оболочек, заболеваниями хронического и  воспалительного характера, такими как тонзиллиты, риниты, фарингиты, лейкоцитопенией различного генеза и прочими проблемами не только местного, но и системного иммунитета), у привитой части населения могло развиваться  значительное количество разнообразных осложнений.
В эпидемиологическом популяционном исследовании, основанном на открытых данных, ежедневно публикуемых Министерством здравоохранения Израиля, процент полностью вакцинированных среди новых заболевших в большинстве возрастных групп старше 20 лет в «третью волну» пандемии превысил процент таковых среди взрослого населения страны в целом (Табл.2) [07.08.2021. Rafael Zioni. Личная коммуникация] и составил в среднем 86% при 85% вакцинированных двумя дозами совершеннолетних граждан.
in vitro,

Известно применение ФДТ для ирадикации коронавируса нового типа – SARS CoV 2 -  с ФС «Радахлорин» [Патент РФ №2183956. Фотосенсибилизатор и  способ его получения. Решетников А.В., c соавт.] и источником лазерного излучения с длиной волны 662±3 нм (красный свет) [Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2021 Mar; 33: 102112. Antiviral photodynamic therapy: Inactivation and inhibition of SARS-CoV-2 in vitro using methylene blue and Radachlorin. V.A. Svyatchenko, S.D. Nikonov, A.P. Mayorov, M.L. Gelfond and V.B. Loktev]. Данный препарат включает комбинацию натриевых солей хлорина e6, хлорина p6, пурпурина 5 в количестве 3.5 мг, с меглюмином 0,2 г в воде объемом 1 мл.
in vitro

6
Описанный способ также является аналогом и принят за прототип настоящего изобретения. Преимуществом его использования является селективность, высокая специфичность, низкая цитотоксичность, безвредность для окружающей среды и способность положительно влиять на иммунитет. Среди недостатков - эффект –доказан только , активный компонент является водорастворимым - легко смывается со здоровых слизистых оболочек и, таким образом, не может быть эффективно применен для профилактики коронавирусной инфекции у здоровых людей, так как является селективным, по сути, только для тканей, в которых уже развился воспалительный процесс, а специфичность противовирусного действия доказана только в лабораторных экспериментах в культуре зараженных вирусом клеток. Еще одним недостатком препарата «Радахлорин», а также аналогичных ему по основному водорастворимому действующему компоненту, хлорину е (70-90%), препаратов «Фотолон», «Фоторан» и «Фотодитазин», является необходимость активировать их лазерным излучением, что ограничивает их использование клиникой, в то время, как профилактическое использование метода ФДТ подразумевает широкую распространенность и доступность источника их фотоактивации у населения. Активация нелазерными источниками (светодиодными, широкополосными, люминесцентными, а также дневным светом) не упоминается в инструкциях по медицинскому применению данных лекарственных средств, в то время как именно они имеются в распоряжении почти у каждого человека.
Описание фигур
а
На Фиг. 1 представлен спектр поглощения феофитина в составе композиции согласно изробретению.
На Фиг. 2 представлены спектры излучения источников света: на Фиг. 2а представлен спектр излучения ртутной лампы с фильтром отсечки УФ менее 370 нм.; на Фиг. 2б представлен спектр при люминесцентном источнике излучения; на Фиг. 2в представлен спектр при светодиодных источниках излучения, используемых в смартфонах.
а
На Фиг. 3 представлен спектр ПМР феофитина  из крапивы.
Описание изобретения
а
транс
Предложено средство для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей методом фотодинамической терапии, содержащее фотосенсибилизатор порфириновой природы, отличающееся тем, что в качестве порфирина используется феофитин  (13,15-[15’-метоксициклопентан-13’-он]ил-17-[2-карбоксифитилэтил]-15-карбоксиметил-17,18--дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин) формулы
b
или феофитин  или их производное в количестве 0,001-1%, в форме препарата с природными или модифицированными липидами в количестве 0,01-10%, в смеси или в виде индивидуальных веществ, при этом указанные соединения образуют липосомы или эмульсию в композиции с приемлемыми вспомогательными компонентами, вкусоароматическими добавками и водой в количестве – остальное.
Spirulina
Urtica
В одном из вариантов реализации средство согласно изобретению включает липиды для солюбилизации активного компонента из группы фосфатидилхолинов и других липидов, полученных из цианобактерий рода . В другом варианте реализации средство включает липиды для солюбилизации активного компонента из группы фосфатидилхолинов и других липидов, полученных из растений рода .
В еще одном варианте реализации средство включает липиды для солюбилизации активно компонента в виде индивидуального лецитина и холестерина в мольном соотношении 7:3. В еще одном варианте реализации средство включает феофитины с фосфатидилхолином в виде мультиламеллярных липосом.
При этом, эти липосомы могут быть получены с применением других липидов, например, фосфатидилинозитола или фосфатидилэтаноламина.
Средство согласно изобретению может быть изготовлено и применено в форме лосьона-спрея, аэрозоля с возможностью дозирования, ополаскивателя для полости рта, жидкости для ингаляций.
При применении средство может быть активировано светом с длиной волн УФ-А и видимого диапазона для оказания фотодинамического воздействия на патогенную микрофлору полости рта и носоглотки и профилактики их заболеваний.
in vivo
Задачей настоящего изобретения является разработка средства, эффективного , с возможностью обеспечения пассивной защиты от инфицирования в виде липидной пленки в носоглотке, активный компонент которого является липофильным, для хорошего проникновения в здоровые слизистые оболочки, активации некогерентными источниками излучения (светодиодными, щирокополосными, люминесцентными, а также дневным светом), превентивного действия по отношению к возбудителю, к прививкам, приводящим к феномену АЗУИ, и других видам гетерологичных  иммунных ответов, связанных с перекрестными реакциями T-киллеров [Eur J Immunol. 1980. May; 10(5):396-401. Cross-protection and cross-reactive cytotoxic T cells induced by influenza virus vaccines in mice. R.G. Webster, B.A.Askonas], то есть создать защиту как барьерного, так и прямого противовирусного и активирующего естественный фагоцитарный иммунитет действия.
ФДТ-воздействие предлагаемого средства является наиболее щадящим по отношению к иммунной системе человека, исходит из принципа «не навреди», способствует модулированию иммунного ответа по отношению к актуальным, а не устаревшим штаммам вируса и опирается на идею, что проще не заболеть, чем потом вылечить. Во-первых, предлагаемое средство механически препятствует проникновению вируса в слизистую оболочку. Во-вторых, при облучении светом, оно инактивирует скопившиеся в липидной пленке частицы вируса. В-третьих, этими фрагментами вирусных частиц может достигаться эффект иммуномодуляции вплоть до появления специфических «нейтрализующих» антител без применения вакцин. Формирование антител без применения экзовакцины было описано для случаев ФДТ рака с аналогичными производными порфиринового ряда  [Specific anti-tumor immune response with photodynamic therapy mediated by benzoporphyrin derivative and chlorin (e6). 2003. Proc. SPIE 4961, 1-9. A.P. Castano, F. Gad, T. Zahra, M.R. Hamblin]. В экспериментах по ФДТ рака для данного метода воздействия на ткань был также описан его высокий потенциал активировать макрофаги, переключать их тип с толерантных к раку обратно в направлении их нормальной функции и, таким образом, компенсировать ущерб, наносимый клеткам местного иммунитета действием повышенного титра антител в крови людей, переболевших и снова заразившихся или многократно повторно вакцинируемых от коронавируса (эффект АЗУИ) [Clin. Cancer Res. 2016 Mar 15. 22(6):1459-68. Combination of Photodynamic Therapy and Specific Immunotherapy Efficiently Eradicates Established Tumors. J.W. Kleinovink, P.B. van Driel, T.J. Snoeks, N. Prokopi, M.F. Fransen, L.J. Cruz, L. Mezzanotte, A. Chan, C.W. Löwik, F. Ossendorp]. Именно местный иммунитет слизистых оболочек является естественной преградой на пути любой инфекции. Подрыв этой функции у вакцинированных, как было показано выше, делает их более уязвимыми не только к новым, более заразным и тяжелым формам самой коронавирусной инфекции, но и к прочим патогенам, раковым клеткам и токсичным продуктам жизнедеятельности организма.
Таким образом, стоит задача поддержания нормальной функции местного фагоцитарного звена иммунитета у здоровых людей и ее восстановления у переболевших и вакцинированных, особенно, перед угрозой новых «волн» пандемии.
Поставленная задача была решена предлагаемым средством – препаратом, содержащим ФС - производное порфиринового ряда (хлорин природного происхождения) и липиды, отличающимся тем, что, производные порфиринового ряда представлены гидрофобными ФС, а препарат изготовлен в форме эмульсии, лосьона – спрея, аэрозоля, раствора для ингаляций, МЛЛ. В предлагаемое решение также входит способ получения активного вещества и готовой формы и способ применения, при котором облучение препарата в носоглотке светом от любого источника индуцирует инактивацию вирусных частиц, а липидная пленка механически препятствует их проникновению в слизистые оболочки. ФДТ активирует макрофаги и может модулировать иммунный ответ возникающими в результате фотохимической реакции фрагментами вирусных частиц, вплоть до появления специфических «нейтрализующих» антител, может преодолевать эффект АЗУИ за счет активации макрофагов и переключения их типа обратно в направлении их нормальной функции и, таким образом, компенсировать ущерб, наносимый им действием повышенного титра антител в крови людей, переболевших и повторно заразившихся в течение 7 месяцев или/и неоднократно вакцинированных/заболевших в течение 6 мес после прививки от коронавируса.
а
транс
При решении поставленной задачи, в данном изобретении предложен лосьон, содержащий ФС порфириновой природы, отличающийся тем, что в качестве порфирина взят гидрофобный феофитин  (13,15-[15’-метоксициклопентан-13’-он]ил-17-[2-карбоксифитилэтил]-15-карбоксиметил-17,18--дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин (IUPAC), 1,3,5,8-тетраметил-4-этил-2-винил-9-оксо-10-карбметокси-форбин-7-фитиловый эфир пропионовой кислоты (систематическая)) (Пример 1)
в количестве 0,001-1%, а в качестве эмульгатора – липиды в количестве 0,01-10%, и приемлемые вспомогательные компоненты, вкусоароматические добавки и вода в количестве – остальное так, что указанные компоненты образуют МЛЛ и/или эмульсии.
Spirulina
Urtica
При этом липиды для активного компонента могут быть представлены природными смесями фосфолипидов, полученных из цианобактерий рода  или из растений рода  (Пример 2), либо коммерческим лецитином в композициях с холестерином для получения МЛЛ, порфирин с липидами образуют МЛЛ или эмульсии, а лосьон может быть изготовлен и применен в форме эмульсии, спрея для полости рта, аэрозоля или раствора для ингаляций и активирован светом с длиной волны видимого диапазона, например, УФА-люминесцентной или ртутной лампой, светодиодом лампы-вспышки (фонарика) смартфона, дневным светом до или после нанесения для оказания фотодинамического (ФД-) воздействия на патогенную микрофлору полости рта и носоглотки и профилактики их заболеваний.
При концентрации феофитина менее 0,001% выраженного противовирусного и антимикробного эффекта не наблюдается (Табл.4). При концентрации феофитина более 1% наблюдается повреждение здоровых тканей при облучении, экранирование излучения, и его плохое проникновение в ткани. При содержании липидов менее 0,01% образуемые липосомы не стабильны и не обеспечивают транспорта феофитина в глубь слизистой оболочки, также не формируют достаточной толщины и протяженности пленку для обеспечения пассивной защиты от вируса. При содержании липидов более 10% указанная композиция превращается в плотную эмульсию, мало пригодную для нанесения способом распыления, забиваются дозаторы, ухудшаются коллоидные свойства системы (Пример 2).
Степень включения феофтина в липосомы (отношение активное вещество/липиды) и эффективность включения (отношение количества вещества, включившегося в липосомы, к его общему количеству) определяли в 2-х параллельных экспериментах: гель-хроматографией и равновесным диализом лосьона (Пример 3). Состав лосьона можно представить следующим образом:
несвязанный ФС/мембраносвязанный ФС/внутрилипосомный ФС = 280/≥460/≤120 ±35 мкг = 31/≥54/≤14 ±4% в 1 мл.
Скорость выхода феофитина из липосом оценивали, определяя через фиксированные промежутки времени количество феофитина во внешнем растворе и относя его к общему количеству феофитина, включившемуся в липосомы. Фотостабильность заключенного в липосомы феофитина оценивали в "холостом" опыте.
Диализ лосьона показал (Пример 3), что равновесная концентрация составляет 26,8 ± 2,5 мкг/мл. За 10 суток через внешнюю бислойную мембрану терялось 10% феофитина, а в присутствии феофитина во внешнем растворе этот процесс еще более замедлялся, поэтому его диффузией из липидной мембраны в раствор пренебрегли. Расчет дает эффективность включения 69±3%, что хорошо согласовывалось с данными гель-фильтрации (Пример 3).
Настоящее изобретение содержит описание способа получения активной субстанции порфиринов природного происхождения, лекарственных форм на основе данной субстанции, их физико-химических, биологических свойств, экспериментов, подтверждающих эффективность данных фармацевтических готовых форм прямыми тестами на клетках, животных и в клинике, а также описание световых источников, используемых при практической реализации метода ФДТ с применением этих лекарственных форм.
а
Spirulina platensis
а
b
Способ получения ФС включает экстракцию, обработку кислотой для удаления иона магния, промывку органическими растворителями (гексаном, ацетоном), соляной кислотой и цитратным буферным раствором и сушку над пятиокисью фосфора в вакууме, отличаясь применением флэш-хроматографии в сочетании с традиционной колоночной для повышения эффективности. Согласно предложенному способу, элюируют сначала гексаном (для удаления неполярных примесей), затем системой гексан-хлороформ-ацетон 35:25:4 на окиси алюминия, и получают обогащенные фракции, которые подвергают 3-х кратной рехроматографии на колонке 25х200 мм, для чего в настоящем изобретении предложена система гексан-хлороформ-ацетон 35:25:4. Это позволяет на промышленном этапе не только очистить до необходимой фармацевтической степени чистоты 95% сырой феофитин  из цианобактерии , разделив его на фракции липидов, каротины и ксантофилы, но и разделить феофитины  и  в случае применения сырья из высших растений, например, крапивы двудомной (Urtica). (Пример 1.1).
По типу липосомы бывают мультиламеллярные (МЛЛ), большие однослойные (БОЛ), маленькие однослойные (МОЛ). Выбор типа используемых липосом (МЛЛ, БОЛ или МОЛ) обычно осуществляется в зависимости от ожидаемого биологического эффекта. Тип липосом определяет степень включения вещества. Размер липосом влияет на их проникновение из кровотока в ткани (в т.ч. на скорость выведения из организма), на биораспределение и фармакологическое действие включенного в них вещества. Поскольку выход растворенного вещества из внутреннего объема липосом ограничен проницаемостью липидного бислоя, МЛЛ, благодаря своей структуре, обладают наибольшей удерживающей способностью. Для крупных липофильных молекул также лучше подходят МЛЛ, ввиду относительно большего содержания в них липидной фазы. Внутренний объем МЛЛ достигает 30 мкл/(мкмоль липидов). Препараты МЛЛ могут быть приготовлены с более высокой концентрацией липидов, чем МОЛ, что также способствует увеличению эффективности загрузки.
Итак, в данном изобретении был остановлен выбор на МЛЛ, полагая, что предложенный ФС, как крупная и липофильная молекула, должен, по сравнению с другими типами липосом, включаться в них лучше и удерживаться дольше. Кроме того, МЛЛ получать просто, что немаловажно для промышленной реализации изобретения и экономического эффекта. Таким образом, данное решение подразумевает перемешивание спиртового раствора ФС (1) с водно-липидно-спиртовой смесью (2) при обязательном применении глицерина или тизоля, при добавлении первого ко второму в турбулентном режиме смешивания.  Это новое технологическое решение, предлагаемое настоящим изобретением, проще и удобнее для промышленности, чем традиционная методика экструзии липидов через водную фазу лекарственной субстанции или встряхивания ее с липидной пленкой [Biotechnology. №11. 1984. P. 979 — 984. G. Gregoriadis, C. Kirby], способы ультразвукового диспергирования. Оно технологично, что имеет принципиальное значение для промышленности.
Полученный лосьон (липосомный препарат) прост в применении (Пример 4) и эффективен в достижении поставленной терапевтической задачи (Примеры 5-7). Он может быть применен в форме аэрозоля (спрея) для профилактики и лечения широкого круга воспалительных и инфекционных заболеваний носоглотки [Патент РФ №2228775 от 01.10.2002 г. Способ фотодинамического лечения острого и хронического гнойного гайморита. Наседкин А.Н., Решетников А.В., с соавт.], бронхо-легочных инфекций в виде ингаляционной формы (ультразвуковые ингаляторы) [Патент РФ №2359711 от 25.04.2007. Устройство для создания и фотоактивации аэрозоля. Армичев А.В., Решетников А.В., с соавт.], а также дезинфекции и защиты кожных покровов тела и дезинфекции поверхностей за счет взаимодействия одного из его активных компонентов (ФС) со светом (эффект фотодинамической терапии) (Пример 9) [Патент РФ №2379073 от 11.09.2007. Способ лазерного лечения хронического тонзиллита с применением фотосенсибилизатора. Пыхтеева Е.Н., Решетников А.В., с соавт.].
2
Положительный результат достигается за счет использования источников оптического излучения со спектром в диапазоне 350 - 750 нм с нижней границей в спектральной области свыше 380 нм (УФ-А), и ФС на основе веществ растительного происхождения, с наиболее интенсивным поглощением именно в этом диапазоне, а также средств введения последнего в организм.  При этом, источники оптического излучения могут работать при плотности мощности свыше 0,1 мВт/см,а средства введения ФС выполнены в форме устройства для дозированного перорального и интраназального введения с возможностью дополнительного эффективного транспорта препарата в глубь слизистых оболочек. Средства введения содержат дополнительный элемент для активного транспорта на основе этанола, глицерина или тизоля.
Практическим результатом применения изобретения является обеспечение профилактического, терапевтического и репарационного в отношении клеток местного иммунитета (макрофагов, моноцитов) эффекта при контролируемой процедуре при пониженных  световых нагрузках, обеспечивающих ее быстроту, доступность, комфортность, хорошую укрывистость за счет применения выбранной формы – спрея - формирование липидного монослоя на слизистых оболочках, увеличенное  проникновение ФС в ткань за счет его гидрофобности.
Структура предлагаемого решения иллюстрирована рисунками: фиг.1 - спектр поглощения ФС, фиг. 2 - спектры излучения примененных источников света, фиг.3 и пример 1 – характеристики активного вещества ФС и лосьона, а также таблицами: табл.1 - относительное число вакцинированных, больных, суточный прирост заболеваемости и смертности на 05.08.21 в регионально близких государствах с различной политикой по отношению к вакцинации, табл.2 - заболеваемость коронавирусом привитых и непривитых в Израиле за неделю с 25 по 31.07.21 по возрастным группам, табл.3 - данные по хранению лосьона, табл.4 – антимикробный эффект лосьона до и после его применения у людей по мазкам из зева.
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Получение порфирина.
0
а
b.
Пример 1.1. Феофитин а из фитомассы крапивы. Сухую крапиву размельчали до состояния порошка в блендере и просеивали через сито. В 1,25 кг измельченной крапивы добавляли 6,25 литров 0,0003 н водного раствора дигидрофосфата натрия, полученную смесь перемешивали и оставляли для набухания на 2 часа при комнатной температуре. Полученную смесь после набухания ставили в морозильник для вымораживания на 12 ч. Затем смесь дозировали в центрифужные стаканы и центрифугировали 10 мин при 0С. Надосадочную водно-белковую фракцию сливали. Осадок вынимали и обрабатывали ацетоном (3х2,5л) до полного извлечения смеси хлорофилла и  Фитомассу центрифугировали, надосадочную жидкость (экстракт) сливали в плоскодонную колбу. Весь полученный экстракт объединяли и фильтровали от механических примесей. Определяли объем полученного экстракта.
а
b
а
b
а
b
Смесь феофитинов  и  из смеси хлорофиллов  и . В полученный экстракт хлорофиллов  и при интенсивном перемешивании приливали 20 мл концентрированной соляной кислоты для удаления из молекулы хлорофилла иона магния. Выдерживали 20 мин при комнатной температуре. Избыток кислоты нейтрализовали 20%-ным раствором натрия едкого до значения рН 6-8. Определяли рН суспензии с помощью универсальной индикаторной бумаги. Выпавшую смесь феофитинов отделяли адсорбцией на слое хлопковой ваты. Вату с феофитином переносили в стакан при помощи пинцета, и экстрагировали смесь феофитинов ацетоном порциями по 50 мл (общий объем ацетона около 300 мл). Объединенный экстракт профильтровывали через стеклянную воронку со слоем ваты, переливали в мерный цилиндр и затем во взвешенную круглодонную колбу. Растворитель упаривали на роторном испарителе при температуре бани (60±2)ºС. После упаривания колбу помещали в вакуум-эксикатор с пятиокисью фосфора, откачивали воздух с помощью вакуумного водоструйного насоса в течение 10 мин. Остаток высушивали в колбе в течение 12 часов. Колбу взвешивали на весах, массу определяли по разности.
а
а
b
Феофитин  из смеси феофитинов  и . Смесь феофитинов хроматографировали на колонке 27х100 мм с окисью алюминия (II ст. акт. по Брокманну), элюируя сначала гексаном (для удаления неполярных примесей), затем системой гексан-хлороформ-ацетон 35:25:4, и получали обогащенные фракции, которые подвергали 3-х кратной рехроматографии на колонке 25х200 мм. Объединенные по фракциям элюаты (контроль по ТСХ) профильтровывали через стеклянную воронку со слоем ваты, переливали в мерный цилиндр и измеряли объем, затем переливали во взвешенную круглодонную колбу. Растворитель упаривали на роторном испарителе при температуре бани (40±2)ºС. После упаривания колбу помещали в вакуум-эксикатор с пятиокисью фосфора, откачивали воздух с помощью вакуумного водоструйного насоса в течение 10 мин. Остаток высушивали в колбе в течение 12 часов. Колбу взвешивали на весах, массу определяли по разности.
а
3
2
2
2
2
3
3
2
3
3
3
2
3
2
3
3
2
3
Спектр ПМР феофитина (1,5 мг/мл, CDCl): 9,55, 9,41, 8,58 (3Н, все с, мезо-Н); 8,02 (т,   СН=СН); 6,29 (с, 10-Н); 6,26 (д, -СН=СН); 5,15 (Р2, т, =CH-), 4,49 (Р1, м, -СН-); 4,47 (м, 8-Н); 4,23 (уд, 7-Н), 3,90 (с, 10-СОСН); 3,74 (с, 5-СН); 3,70 (к, 4-СНСН); 3,43 (с, 1-СН); 3,26 (с, 3-СН); 2,64 (м, 7-СH-CH-); 2,49 (м, 7-СH-CH-), 2,36 (м, 7-СH-CH-); 2,21 (м, 7-СH-CH-); 1,91 (ук, Р4, =ССН-); 1,82 (д, 8-СН); 1,72 (т, 4-СНСН); 1,60 (с, Р3 =ССН-); 1,03-1,54 (16Н, м, Р5-Р14 -СН- и 3Н, м, P7, P11, P15 -СН-); 0,87, 0,82, 0,78 (12Н, д, Р7, Р11, Р15, Р16- СН); -1,42, -1,60, (2Н, ус, неравн. инт., 2× -NH-).
max
*
-3
Спектр поглощения в видимой области, этанол 95%, λ  (ɛ10),  нм: 416 (115,8), 509 (12,7), 538 (11,0), 668 (55,5).
а
а
Наработка крупных партий феофитинаиз фитомассы крапивы.Разработанная полупромышленная технология получения феофитина  из фитомассы крапивы отличается от описанной (см. выше) применением флэш-хроматографии на стадии очистки. Смесь феофитинов хроматографировали на фильтре 100х100 мм со стеклянной пористой пластинкой под давлением 2 атм с окисью алюминия (II ст. акт. по Брокманну), элюируя системой гексан-хлороформ-ацетон 35:25:4, и получали обогащенные фракции, которые подвергали 3-х кратной повторной флэш-хроматографии. Объединенные по фракциям элюаты (контроль по ТСХ) профильтровывали через стеклянную воронку со слоем ваты, переливали в мерный цилиндр и затем во взвешенную круглодонную колбу. Растворитель упаривают на роторном испарителе при температуре бани (40±2)ºС. После упаривания колбу помещали в вакуум-эксикатор с пятиокисью фосфора, откачивали воздух с помощью вакуумного водоструйного насоса в течение 10 мин. Остаток высушивали в колбе в течение 12 часов. Колбу взвешивали на весах, массу определяли по разности.
а
Spirulina Platensis.
Пример 1.2. Феофитин  из биомассы
а
Spirulina Platensis
b
а
а
b
Аналогично получали чистый феофитин  из биомассы цианобактерии , без хроматографического разделения смеси феофитинов, так как в ней не содержится производных -ряда. При обработке спирулины выход феофитина , при загрузке в 1,25 кг, составил 7,55 ± 0,24 г, что составило 0,60 ± 0,02 % от массы загруженного сырья. При обработке крапивы получали два продукта: феофитин , при загрузке в 1,25 кг, его выход составил 2,25 ± 0,15 г, что составило 0,18 ± 0,01 % от общей загрузки; феофитин  (пример другого порфирина).
Пример 2.
Липосомная лекарственная форма.
Пример 2.1. Спиртовой раствор лецитина (фосфатидилхолина) при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и глицерином (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 0,001% порфирина и 0,01% лецитина. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Пример 2.2. Спиртовой раствор лецитина и холестерина в мольном соотношении 7:3 при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и тизолем (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 0,01% порфирина и 0,1% липидов. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Spirulina Platensis
Пример 2.3. Спиртовой раствор липидов цианобактерии  при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и глицерином (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 0,1% порфирина и 1% липидов. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Пример 2.4. Спиртовой раствор липидов из крапивы двудомной при интенсивном перемешивании в турбулентном режиме прикапывали к раствору порфирина в спирте этиловом, смешанному с водой очищенной и глицерином (20%), так, чтобы получить эмульсию, содержащую 1% порфирина и 10% липидов. В конце добавляли вкусоароматическую добавку.
Описание: устойчивая, не расслаивающаяся при хранении в течение 1 года эмульсия от желтоватого до желто-зеленого цвета, без запаха или с запахом водорослей или крапивы (без отдушки). Эмульсия не должна расслаиваться при центрифугировании 5 минут и 8000 об/мин.
-1
-1
Подлинность: эмульсию встряхивали, аликвоту (0,2÷2 мл) добавляли к 8,0÷9,8 мл спирта этилового ректификационного, 95%, медицинского или высшей очистки и измеряют оптическую плотность на длине волны 668 нм (D). Рассчитывали молекулярную экстинкцию ɛ (Мсм) по формуле ɛ=D*888/(0,0016÷0,016). Полученное значение должно находиться в диапазоне 50000-55000.
Раствор в этиловом спирте имел желто-зеленый цвет.
а
Количественное определение (пример порфирина – феофитин ): эмульсию встряхивали, навеску (1 г) растворяли в 9 г (11,5 мл) спирта этилового ректификационного, 95%, медицинского или высшей очистки и измеряли оптическую плотность на длине волны 668 нм (D). Рассчитывали содержание феофитинапо формуле:   с,%=(D*888*9*11,2)/(55500*1). Полученное значение соответствовало заданному (0,08%).
о
о
Устойчивость изучали путем хранения в темноте в герметически укупоренных склянках при двух температурных режимах: холодильника (0+5С) и комнаты (+20+25С). Каждые 2 месяца отбирали аликвоты 1 мл в 9 мл этанола и измеряли оптическую плотность на длинах волн 509, 538 и 668 нм. Измерения проводились на пишущем спектрофотометре Hitachi 557. Соотношение 509/538 для чистого феофитина составляло 1,15. При распаде хлоринового макроцикла до линейных тетрапирролов уменьшалась величина поглощения на длине волны 668 нм (и, соответственно, уменьшалась удельная экстинкция) и одновременно уменьшалось соотношение 509/538 за счет одновременного роста поглощения на обеих длинах волн (росло фоновое поглощение в этом диапазоне длин волн). Изменение данных контрольных величин за 2 мес. и за год представлено в Табл.3.
Известно, что уменьшение экстинкции при хранении примерно на 5-10% в год для фармацевтических форм допустимо. В данном примере хранение в условиях холодильника ведет к уменьшению обоих показателей на 4-13% за год, а в условиях комнаты - на 15-16% за год. При этом сохраняется однородность эмульсии (не образуется осадка), что важно для фармацевтики. Наряду с измерением оптических свойств лосьона в процессе хранения проводили анализ образцов методом тонкослойной хроматографии. Для этого брали аликвоты 0.1 мл, и проводили ТСХ на пластинках Kieselgel 60 F254 “Merck” в системе гексан/ацетон 7:3. Согласно этому анализу, во всех образцах заметное образование неполярных продуктов желтого цвета началось с 4-го месяца хранения и в наибольшей степени отмечалось в образцах, хранение которых осуществлялось при комнатной температуре. Этот процесс коррелирует с падением экстинкции. В результате исследования, предлагаемый срок хранения составил 1 год в условиях холодильника или 4 мес при комнатной температуре.
Табл.3.<i></i>Данные по хранению лосьона
Условия хр.
Время хр.,мес.
D<sup>668</sup>
E<sup>1%</sup><sub>1cm</sub><sup>654</sup>
D<sup>509</sup>
D<sup>538</sup>
D<sup>509</sup>/D<sup>538</sup>
"0+5°С"
0
1,11
275
0,375
0,326
1,15
2
1,04
258
0,351
0,325
1,08
4
1,01
252
0,336
0,323
1,04
6
0,97
247
0,335
0,325
1,03
8
0,96
244
0,335
0,325
1,03
12
0,95
241
0,36
0,327
1,10
"+20+25°С"
0
1,11
275
0,375
0,326
1,15
2
1,02
256
0,357
0,328
1,09
4
0,95
241
0,342
0,326
1,05
6
0,94
238
0,344
0,328
1,05
8
0,93
236
0,348
0,331
1,05
12
0,92
234
0,32
0,327
0,98
Пример 3.
Определение параметров липосом
[Биоорганическая химия. 1999.  №10. c.782-790. Получение и некоторые свойства липосомного препарата 2,4-ди(1-метил-3-гидроксибутил)дейтеропорфирина-IX. Решетников А.В., и др.].
Лосьон (0.1 мл) наносили на колонку с 15 мл сефадекса G-50 в физиологическом растворе и элюировали физиологическим раствором со скоростью 2 мл/мин. Собирали две фракции, поглощающие при 405 и 414 нм,  первая из которых содержала нагруженные липосомы, а вторая - свободный феофитин.
Концентрацию ФС в липосомах и степень включения в них вещества рассчитывали по данным измерения оптической плотности при 414 нм после добавления к 2 мл фракции, содержащей липосомы, и к фракции, содержащей не включившийся ФС, по 0.1 мл 5.4% раствора SDС для разрушения липосом и сдвига поглощения с 405 к 414 нм.
= D
*V
*100/(D
*V
+D
*V
);
1
1
1
1
2
2
Расчетная формула: Включение ФС в липосомы (%)
D
D
V
V
1
2
1
2
где  – оптическое поглощение фракции липосом после добавления SDС,  – оптическое поглощение фракции не включившегося ФС после добавления SDС,  – суммарный объем фракции липосом, мл,  – суммарный объем фракции не включившегося ФС, мл.
о
Равновесный диализ. В пробирки со шлифами и пробками емкостью 25 мл помещали 5 мл фосфатного буфера,  еще 4.5-5 мл вносили внутрь каждого диализного мешочка. Эксперименты проводили на качалке при 20С, в 3-х повторах каждый.
С =11.2 х D
11.2
D
С
k
ср
ср
Диализовали свободный феофитин, 0,6 мл спиртового раствора феофитина с концентрацией 0,8 мг/мл (500 мкг), - против фосфатного буфера; лосьон, 0,6 мл лосьона с концентрацией феофитина 0,8 мг/мл (600 мкг),  - против фосфатного буфера; феофитин совместно с лосьоном, 0,32 мл препарата незагруженных липосом и  0,28 мл спиртового раствора феофитина с концентрацией 1,7 мг/мл (600 мкг), - против фосфатного буфера. Для определения "захвата" феофитина из внешнего раствора незагруженными липосомами диализовали 0,32 мл препарата незагруженных липосом в буфере против раствора 0,6 мл (500 мкг) феофитина в этаноле с начальной концентрацией феофитина 0,8 мг/мл. При определении зависимости поправочного коэффициента k на нестабильность феофитина от времени к 9,4 мл буферного раствора прибавляли 0,6 мл спиртового раствора феофитина с концентрацией 0,8 мг/мл (500 мкг). Концентрацию феофитина (в мкг/мл) вычисляли по формуле , где  - коэффициент пересчета, связывающий концентрацию и оптическую плотность (при 414 нм) эталона феофитина,  - усредненное значение оптической плотности в эксперименте. Исправленные концентрации получали, умножая  на поправочный коэффициент . Для определения концентраций на короткое время извлекали диализный мешочек, измеряли оптическую плотность раствора и возвращали мешочек на место. Диализ считали завершенным, когда изменение концентрации феофитина во внешнем растворе переставало детектироваться.
Пример 4.
Применение.
Лосьон применяли следующим образом: ФС с помощью дозирующих средств наносят на слизистые оболочки рта (три нажатия на дозатор – 0,12 мл) и носа (по одной дозе в каждую ноздрю – 0,04 мл), при необходимости проводили предварительную флуоресцентную диагностику (наблюдение флуоресценции) с помощью отдельных, не являющихся предметом настоящего изобретения, технических средств, и далее в течение 20 с в каждую ноздрю и 40 с в рот - обработку излучением источников света, при вышеприведенных спектро-энергетических параметрах. Обработка могла сопровождаться контролем (мониторингом) флуоресценции с помощью средств регистрации флуоресценции и оценки эффективности (фотообесцвечивание, оценка генерации активных кислородных частиц, что в принципе реализуемо, как отдельное техническое решение).
В качестве источников оптического облучения использованы:
-  ртутные лампы (аппарат ОРК-2 на базе ртутной лампы ДРТ 400 с фильтром отсечки УФ менее 370 нм, лампа ртутная ДРВ Philips ML 160W, ОУФК-01 New «Солнышко» 380-450 нм);
- УФА-люминесцентные лампы Philips;
ibid.
- светодиодные источники (сверхъяркие светодиоды LUMILEDS HPWN MB00-00000 430-470 устройства для создания и фотоактивации аэрозоля [] или аналогичные, применяемые в качестве фонариков и вспышек для смартфонов), а в качестве препарата использован лосьон - спрей на основе порфирина с фосфатидилхолином, образующих МЛЛ, средством нанесения служил дозатор типа механического поршневого насоса с распылителем, средством регистрации флуоресценции служили или очки с интерференционным покрытием 650-670 нм, или видеокамера с фильтром выделения диапазона 650-670 нм, подсоединенная либо к видеоустройству, либо к РС со специализированной программой обработки изображения и блоком, формирующим сигнал при спаде интенсивности флуоресценции в 10 раз.
Пример 5.
Оценка эффективности.

Противовирусную эффективность по отношению к коронавирусной инфекции оценивали с помощью стандартного экспресс-ПЦР-теста до и через 30 мин после применения лосьона. Повторный тест был отрицательным. У испытуемых брали мазок из горла согласно Инструкции к тесту NADAL COVID 19 Ag. Чувствительность: 97,56 % (диапазон Кт 20-30)/ Специфичность : > 99,9 %.
Пример 6.
Оценка коэффициента активации макрофагов.
in vitro
Проводили по стандартной методике , взяв 5 мл венозной крови испытуемого, прибавив 0,04 мл лосьона (1 нажатие на дозатор) и облучив образец, как указано выше, в течение 20 с в тонком слое (в лунке).
Пример 7.
Оценка иммунизирующего действия.
Проводили на трех добровольцах по способу и из групп, описанных в Примере 4, по случайной выборке, с дополнительным анализом на IgM и IgG до исследования, в середине и в конце месяца (три анализа). У одного испытуемого были обнаружены IgM + IgG в середине месяца, у одного - IgG в конце месяца и еще у одного – не обнаружено антител. При этом симптомов заболевания не наблюдалось, ПЦР-тест давал у всех отрицательный результат.
Пример 8.Оценка пассивного защитного действия.
Проводили на трех группах из 30 здоровых добровольцев каждая, возрастом от 12 до 65 лет. Лосьон применяли в период пиков трех волн пандемии коронавируса нового типа в 2020-2021 гг при посещении мест скопления людей, появлении симптомов ОРВИ, по желанию несколько раз в день, а также обязательно ежедневно на ночь в течение 1 мес, при условии отказа от ношения маски и от прочих защитных и профилактических средств. В группах испытуемых не наблюдалось заболевших с подтвержденным медицинским диагнозом, в то время как таковые имелись в их непосредственном окружении.
Табл.4. Антимикробный эффект лосьона до и после его применения у людей по мазкам из зева.
Наиболее часто высеваемыемикроорганизмы
ДО ПРИМЕНЕНИЯ
ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ
<i>Количество больных</i>
<i>Титр</i>
<i>Количество больных</i>
<i>Титр</i>
<i>Enterococcus faecalis</i>
20
4×0<sup>6</sup>
12
4×10<sup>3</sup>
<i>Streptococcus. гр. D</i>
22
2,4×10<sup>9</sup>
11
2,4×10<sup>4</sup>
<i>Streptococcus viridans</i>
24
4×10<sup>6</sup>
12
4×10<sup>3</sup>
<i>Staphilococcus aureus</i>
12
6×10<sup>4</sup>
3
6×10<sup>4</sup>
<i>Micrococcus</i>
9
4,6×10<sup>9</sup>
3
4,6×10<sup>2</sup>
<i>Candida albicans</i>
11
1,2×10<sup>4</sup>
3
1,2×10<sup>2</sup>
<i>Neisseria </i>
5
3×10<sup>4</sup>
3
1,2×10<sup>2</sup>