СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ АТЕРОСКЛЕРОЗА
METHOD FOR SIMULATING ATHEROSCLEROSIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к моделированию патологических процессов.
Известен способ моделирования атеросклероза путем скармливания животным «Западной диеты» [Jawieñ J. Mouse model sof experimental atherosclerosis. / J. Jawieñ, P. nasta£ek, R. Korbut/Joumal of physiology and Pharmacology. - 2004. - V.55. - №3, - р.503-517]. Однако он имеет ряд недостатков: необоснованность выбора пола и возраста опытных животных, отсутствие комплексного воздействия факторов риска заболевания, в том числе стрессовых факторов, долгосрочность эксперимента (до 4-5 месяцев).
Известен способ моделирования атеросклероза путем скармливания экспериментальным животным атерогенной диеты с избытком витамина D2, ионов кальция на фоне угнетения функции щитовидной и паращитовидной желез мерказолилом [Крепкова Л.В. Использование модели гиперлипидемии и атеросклероза у крыс в токсикологическом эксперименте/ Л.В. Крепкова // Биомедицина.- 2011. - №3. - с.103-105]. Однако этот способ также не учитывает участие стресса в индукции атеросклероза, не обоснован выбор возраста животного, долгосрочность эксперимента (до 9 месяцев).
Известен способ моделирования атеросклероза путем скармливания экспериментальным животным натурального свиного сала, затем животных подвергают иммобилизационному стрессу в вертикальном положении 2-2,5 ч для усиления отека интимы сосудов, после чего вводят токсическую дозу обзидана (1 мг на 100 г массы), чем ослабляется транспорт жира из паравазальных липотканелл и последний накапливается во всех слоях артиериальных сосудов [Патент RU №2033646]. Известный способ имеет следующие недостатки: несбалансированность рациона по белково-углеводным, минеральным и витаминным компонентам, использование в качестве моделятора одного вида липидов (триглицеридов), искусственное ослабление работы сердца и замедление скорости кровотока, развитие атеросклеротический поражений в брюшном отделе аорты, а также необоснованность выбора возраста опытных животных, что делает данную модель довольно далекой от этиологии атеросклероза у человека.
Данное техническое решение, являющееся наиболее близким аналогом по совокупности признаков, заключающихся в замене рациона на свиное сало в комбинации с воздействием стресса на организм животного, к заявляемому способу, принято за прототип.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является создание способа моделирования экспериментального атеросклероза, позволяющего в течении 46-60 суток, благодаря воздействию на организм животного комплекса факторов риска развития атеросклероза достичь развития патологических процессов, близких по этиологии к таковым у человека.
Поставленная задача достигается тем, что в качестве опытных животных используются крысы самцы, возраст которых превышает 1 год, которым на протяжении 46-60 суток моделирования атеросклероза, с частотой 1 раз в двое суток перорально вводится витамин D2 в количестве от 35000 МЕ/кг до 60000 МЕ/кг массы тела, с частотой 1 день в семь суток сокращается длина светового дня до 3-4 часов, с частотой 1 раз в пять суток создается шум уровнем 80-90 дБ, с длительностью каждого воздействия 10-15 минут, 1 раз в десять суток воспроизводится гипоксия, за счет заключения крыс в герметичную емкость с объемом от 2,5 до 3 л на одно животное, с длительностью каждого воздействия 10 минут, также в первые 18-22 суток (1 этап) моделирования атеросклероза 2%  сбалансированного рациона заменяется на холестерин; последующие 7-10 суток (2 этап) - 15% сбалансированного рациона заменяется на свиной жир; последующие 14-18 суток (3 этап) - 11% сбалансированного рациона заменяется на свиной жир и холестерин при их соотношении 10 частей жира на 1 часть холестерина; последующие 7-10 суток (4 этап) - 25,5% сбалансированного рациона заменяется на свиной жир и холестерин при их соотношении 31 часть жира на 20 частей холестерина.
Согласно заявляемому способу, весь процесс моделирования атеросклероза следует производить, начиная с выбора крыс самцов возрастом более 1 года, замены рациона на липидные компоненты, пероральноговвода витамина D2 на фоне воздействия стрессовых факторов.
Использование крыс самцов, возраст которых превышает 1 год обусловлено половозрастными особенностями метаболизма липидов. При использовании крыс самок достижение ожидаемого результата усложняется ввиду ингибирования синтеза эндогенного холестерина в печени женскими гормонами. Катаболизм липидов и вывод их из организма замедляется с возрастом, что увеличивает концентрацию циркулирующих в крови липопротеинов, обладающих атерогенными свойствами, эластичность стенок сосудов также уменьшается с возрастом, что увеличивает их проницаемость для проникновения окисленных форм липидов. У животных моложе 1 года все обменные процессы липидов протекают в норме, введенный избыток липидов выводится из организма с калом, либо за счет ускорения обменных процессов.
Введение витамина D2 количестве от 35000 МЕ/кг до 60000 МЕ/кг массы тела с частотой введения 1 раз в двое суток приводит к увеличению усвояемости кальция и кальцификации атером. При использовании меньшей дозировки увеличивается длительность достижения желаемого уровня поражений сосудов. При использовании большей дозировки остаточное количество витамина D2 выводится из организма. При уменьшении частоты введения желаемая степень усвоения кальция не будет достигнута, при увеличении частоты введения остаточное количество витамина D2 будет выводиться из организма опытных животных.
Сокращение длины светового дня до трех-четырех часов с частотой 1 раз в 7 суток вызывает у животного активацию экспрессии стрессовых молекул. При длине светового дня более 4 часов, стрессовой реакции в организме животного может не последовать, при длине светового дня менее 3 часов, организм животного не отреагирует на наличие светового дня, животное потеряет аппетит, что ведет к уменьшению поступающих с пищей липидов и, как следствие, увеличивает сроки моделирования атеросклероза. При частоте этого воздействия реже 1 раза в 7 суток, не будет обеспечено достаточное количество стрессовых воздействий на протяжении всего процесса моделирования атеросклероза. При частоте воздействия, чаще чем 1 раз в 7 суток, вызовет привыкание к этому виду воздействия у опытных животных, что снижает экспрессию стрессовых молекул.
Воздействие шума уровнем 80-90 дБ с длительностью воздействия 10-15 минут с частотой 1 раз в 5 суток также вызывает у животного активацию экспрессии стрессовых молекул. Уменьшение уровня шума менее 80 дБ не вызовет стрессовой реакции в организме животного, увеличение же уровня шума более 90 дБ может вызвать серьезные расстройства и даже боль у животного, что запрещено правилами гуманного обращения с животными. При уменьшении частоты воздействия менее 1 раза в 5 суток не будет достигнут желаемый результат, при увеличении частоты воздействия более 1 раза в 5 суток возможно развитие привыкания у опытных животных, что снизит экспрессию стрессовых молекул. При уменьшении длительности воздействия менее 10 минут не будет достигнут желаемый результат, при увеличении частоты воздействия более 15 минут возможно развитие привыкания у опытных животных, что снизит экспрессию стрессовых молекул.
Воспроизведение гипоксии путем заключения крыс в герметичную емкость с объемом 2,5-3,0 л на одно животное, с длительностью каждого воздействия 10 минут с частотой 1 раз в 10 суток также вызывает у животного активацию экспрессии стрессовых молекул. При уменьшении длительности воздействия гипоксии менее 10 минут с учетом объема пространства 2,5-3 л на одно животное желаемый эффект не будет достигнут, увеличение же воздействия может привести к гибели животного. При уменьшении объема пространства на одно животное, может произойти его гибель, при увеличении - желаемый результат не будет достигнут. При уменьшении частоты воздействия менее 1 раза в 10 суток не будет достигнут желаемый результат, при увеличении частоты воздействия более 1 раза в 10 суток возможно развитие привыкания у опытных животных, что снизит экспрессию стрессовых молекул.
В первые 18-22 сутки моделирования атеросклероза замена двух процентов сбалансированного рациона на холестерин обусловлено накоплением в организме атерогенных классов липопротеинов, отложению холестерина в жировых депо. При длительности этапа менее 18 суток в сыворотке крови опытных животных не происходит достаточного увеличения концентрации липидов и липопротеинов. При длительности этапа более 22 суток концентрация липидов и липопротеинов не изменяется. Использование дозировки холестерина менее 2% увеличивает сроки достижения желаемого результата, использование большей концентрации холестерина на начальном этапе нецелесообразно ввиду приостановления динамики прогрессирования липидных сбоев в организме, кроме того, резкая замена рациона может привести к расстройствам желудочно-кишечного тракта, нарушений функций почек и надпочечников.
В ходе второго этапа моделирования (7-10 суток) 15% сбалансированного рациона заменяется на свиной жир, что приводит к отложению триглицеридов в печени, жировых депо, увеличению концентрации триглицеридов в сыворотке крови. Использование свиного жира обусловлено его составом: он наиболее насыщен триглицеридами, в состав которых входят насыщенные жирные кислоты, которые наиболее сложно катаболизируются в составе эфиров холестерина, переносимых атерогенными классами липопротеинов. Кроме того, введение в рацион свиного жира вызывает отложение триглицеридов в жировых депо. При длительности этапа менее 7 суток в сыворотке крови опытных животных не отмечается желаемого увеличения концентрации триглицеридов, при длительности этапа более 10 суток содержание триглицеридов в печени и крови неизменно. Использование меньшей концентрации липидов не вызовет желаемого уровня липидов в организме опытных животных, увеличение же концентрации может вызвать сопутствующие атеросклерозу осложнения, в частности, жировой инфильтрации печени, расстройств желудочно-кишечного тракта, что часто приводит к выводу из организма опытных животных липидов и кальция с каловыми массами.
В ходе третьего этапа моделирования (14-18 суток) 11% сбалансированного рациона заменяется на свиной жир и холестерин при их соотношении 10 частей жира на 1 часть холестерина, что приводит к комплексному сбою липидного метаболизма, увеличению числа окисленных форм липидов в составе циркулирующих к крови липопротеинов, а также активации воспалительных процессов в эндотелии сосудов. При длительности этапа менее 14 суток в сыворотке крови опытных животных не отмечается желаемого результата, а именно тенденции к дальнейшему резкому увеличению числа окисленных форм липидов в составе циркулирующих к крови липопротеинов, а также активации воспалительных процессов в эндотелии сосудов, при длительности этапа более 18 суток развитие целевой патологии существенно замедляется и продолжение нецелесообразно ввиду подстраивания организма опытных животных к рациону питания. Соотношение холестерина и жира обусловлено желаемым итоговым воздействием на концентрацию атерогенных классов липопротеинов и липидов в крови и печени. Использование меньшей концентрации липидов не вызовет желаемого эффекта. Увеличение же их концентрации может вызвать сопутствующие атеросклерозу осложнения, в частности, жировой инфильтрации печени, расстройств желудочно-кишечного тракта, что часто приводит к выводу из организма опытных животных липидов и кальция с каловыми массами.
В ходе третьего этапа моделирования (7-10 суток) 25,5% сбалансированного рациона заменяется на свиной жир и холестерин при их соотношении 31 часть жира на 20 частей холестерина. Увеличение дозы вносимых липидов в рацион в течение четвертого этапа моделирования проводится с целью сохранения динамики развития атеросклероза, отсутствия привыкания у животных. При длительности этапа менее 7 суток в липидном профиле сыворотке крови опытных животных не отмечается динамики, при длительности этапа более 10 суток возможна гибель животных. Использование меньшей концентрации липидов не вызовет сохранения динамики развития атеросклероза, отсутствия привыкания у животных, увеличение же концентрации может вызвать гибель животного ввиду возникновения сопутствующих атеросклерозу осложнений, в частности, жировой инфильтрации печени, расстройств желудочно-кишечного тракта, дисфункции почек и надпочечников.
Заявляемый способ моделирования атеросклероза иллюстрируется следующими примерами его осуществления.
Пример 1
Крысам самцам, возраст которых превышал 1 год, скармливали сбалансированный по белку, углеводам и зольным элементам рацион в комбинации с внутрижелудочным введением витамина D2 в количестве 35000МЕ/кг массы тела с частотой 1 раз в двое суток. Животные подвергались воздействию стрессовых факторов: с частотой 1 раз в семь суток сокращалась длина светового дня до 3 часов, с частотой 1 раз в пять суток создавался шум уровнем 80 дБ, с длительностью каждого воздействия 10 минут, 1 раз в десять суток воспроизводилась гипоксия, за счет заключения крыс в герметичную емкость с объемом 2,9 л на одно животное, с длительностью каждого воздействия 10 минут. Также в первые 18 суток (1 этап) моделирования атеросклероза 2% сбалансированного рациона заменялось на холестерин; последующие 7 суток (2 этап) - 15% сбалансированного рациона заменялось на свиной жир; последующие 14 суток (3 этап) - 11% сбалансированного рациона заменялось на свиной жир и холестерин при их соотношении 10 частей жира на 1 часть холестерина; последующие 7 суток (4 этап) - 25,5% сбалансированного рациона заменялось на свиной жир и холестерин при их соотношении 31 часть жира на 20 частей холестерина.
Примеры 2-4. Процесс моделирования атеросклероза вели также как в Примере 1, но с другими параметрами операций, составляющих данный процесс. Исходные данные всех примеров приведены в Таблице 1.
Таблица 1
Параметры
Пример
1
2
3
4
Длительность эксперимента, сут
46
50
56
60
Продолжительность замены рациона сут.:
первый этап кормления (2% рациона меняется на холестерин)
18
19
21
22
второй этап кормления (15% рациона заменяется на свиной жир)
7
8
9
10
третий этап кормления (11% рациона заменяется на свиной жир и холестерин при их соотношении 10 частей жира на 1 часть холестерина)
14
15
17
18
четвертый этап кормления (25,5% рациона заменяется на свиной жир и холестерин при их соотношении 31 часть жира на 20 частей холестерина)
7
8
9
10
Витамин D2, МЕ/кг массы тела
35000
45000
55000
60000
Длина светового дня с воздействием 1 раз в 7 суток, часы
3
3,3
3,6
4
Уровень шума с воздействием 1 раз в 5 суток, дБ
80
83
86
90
Длительность воздействия шума, мин
10
12
14
15
Длительность гипоксии с воздействием 1 раз в 10 суток, мин
10
10
10
10
Указанным методом моделирования атеросклероза был достигнут результат, заключающийся в увеличении в сыворотке крови опытных животных концентрации липидов и атерогенных классов липопротеинов, развитии лимфо- и лейкопении, снижении гемоглобина; увеличении содержания смеси моноцитов, эозинофилов, базофилов в крови у животных с моделью экспериментального атеросклероза, увеличении активности аспартат- и аланинаминотрансфераз, нарушении функций печени и сердца, развитии жировой инфильтрации печени, липоидной инфильтрации стенки венечных (коронарных) артерий сердца с последующим развитием в их стенке соединительной ткани (таблица 2).
Таблица 2
Параметры
Пример
1
2
3
4
Холестерин, ммоль/л
2,45±0,43
2,65±0,61
2,56±0,16
2,96±0,18
Триглицериды, ммоль/л
2,01±0,48
0,84±0,25
0,91±0,21
1,91±0,23
ХС ЛПВП, ммоль/л
1,33±0,16
1,30±0,09
1,19±0,07
1,49±0,07
ХС ЛПНП, ммоль/л
0,63±0,13
0,51±0,12
0,64±0,02
0,74±0,02
Остаточный ХС, ммоль/л
0,40±0,13
0,84±0,29
0,80±0,24
0,73±0,14
АЛТ, Ед/л
61,5±9,8
65,7±5,7
70,2±7.4
74,2±9,4
ACT, Ед/л
119,5±10, 9
118,4±13. 0
137,5±12. 2
158,5±17, 2
Лейкоциты, 109/л
6,61±2.8
4,82±1.3
2,76±0,6
3,26±0,6
Лимфоциты, 109/л
3,95±1,80
2,28±0,10
1,88±0,30
1,98±0,80
Содержание смеси моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток, 109/л
0,84±0,15
0,41±0,09
0,34±0,02
0,54±0,10
Гемоглобин, г/л
121,0±1,4
121,0±9,2
125,0±3,5
120,0±2,5