МУТАНТНЫЕ ШТАММЫ MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE
MUTANT MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE STRAINS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области разработки способов и инструментов для генетических манипуляций с Mycoplasma hyopneumoniae с целью получения трансформированных мутантных штаммов указанного вида бактерий, которые могут применяться в качестве вакцин против заболеваний свиней.
Уровень техники
В области ветеринарии заболевания, вызываемые микроорганизмами, такими как бактерии, вирусы или паразиты, приводят к серьезным экономическим потерям, вследствие гибели животных или из-за низкой эффективности процессов роста и откорма.
Один из путей защиты животных от инфекций в будущем заключается во введении вакцин с целью получения иммунного ответа.
Вакцины, основанные на инактивированных микроорганизмах или живых аттенуированных микроорганизмах, до сих пор являются главной иммунологической основой для контроля и искоренения большинства инфекционных заболеваний.
Однако, несмотря на хорошие результаты, полученные с этими типами вакцин, с ними связаны такие проблемы, как возможное возвращение вирулентности аттенуированных вакцин, невозможность отличить вакцинированных животных от инфицированных животных или трудность получения вакцины, являющейся эффективной при всех заболеваниях.
Создание инструментов для генетической манипуляции с микроорганизмами, как правило, позволяет получать вакцины, которые являются более эффективными по сравнению с вышеупомянутыми вакцинами, такие как, например, субъединичные вакцины, генетически модифицированные инактивированные или живые вакцины, маркерные вакцины (DIVA) или ДНК вакцины.
Тем не менее, не все вызывающие заболевания микроорганизмы в области ветеринарии могут легко поддаваться генетическим манипуляциям.
Микоплазмы относятся к тем микроорганизмам, с которыми трудно манипулировать на генетическом уровне.
Микоплазмы принадлежат к классу Mollicutes, обширной группе микроорганизмов, являющихся близкими родственниками грамположительных бактерий.
Микоплазмы имеют небольшие кольцевые геномы с размерами, как правило, меньше 1000 т.п.н. с числом генов, находящимся в диапазоне от 500 до 1000.
У этой группы бактерий также отсутствуют многие из метаболических путей, которые, как правило, имеются у всех живых организмов, возможно, это является результатом адаптации к паразитическому образу жизни. Вследствие этого, микоплазмы являются микроорганизмами со сложными питательными потребностями, которые очень трудно культивировать как на жидких, так и на твердых средах.
Микоплазмы включают в себя вид Mycoplasma hyopneumoniae (далее «Mhyo»), который представляет собой бактерию, являющуюся причиной огромных экономических потерь в свиноводческой отрасли сельского хозяйства. Хотя большинство инфекций Mhyo являются нетяжелыми, животные, инфицированные Mhyo, предрасположены к вторичным инфекциям дыхательной системы, которые могут замедлить динамику суточных привесов или даже вызвать гибель животных.
Mhyo является возбудителем энзоотической пневмонии свиней (далее ЭПС) - очень широко распространенного во всем мире хронического респираторного заболевания. Это заболевание характеризуется высокой заболеваемостью и низкой смертностью. Распространенность ЭПС особенно высока у свиней на откорме, и тяжесть клинических признаков зависит от штамма Mhyo, вызвавшего инфекцию, условий окружающей среды, состояния здоровья животных и от развития вторичных инфекций, вызванных другими патогенами. В некоторых случаях ЭПС находится в субклинической форме без видимых клинических признаков. В тех случаях, когда отсутствуют осложнения, у животных наблюдается хронический сухой кашель, связанный с замедленной динамикой суточных привесов с последующим снижением эффективности использования кормов. Когда имеют место вторичные инфекции, клинические признаки становятся более выраженными, представляя собой острые респираторные симптомы и гипертермию, которые могут даже привести к гибели животного. Тем не менее, даже при отсутствии осложнений, вызванных вторичными инфекциями, ЭПС приводит к серьезным экономическим потерям, обусловленным низким коэффициентом конверсии корма и затратами на лечение. После того как заболевание появилось на ферме, оно передается другим животным горизонтально воздушно-капельным путем и вертикально от репродуктивных самок к поросятам.
Кроме проблематичного культивирования генетические манипуляции с микоплазмами затруднены из-за малого количества доступных инструментов.
Трудности при генетических манипуляциях с микоплазмами, в частности с Mhyo, описаны в уровне техники.
Последовательность генома штамма 232 Mhyo описана в статье Minion et al., The Genome Sequence of Mycoplasma hyopneumoniae Strain 232, the Agent of Swine Mycoplasmosis, J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133. Автор этой статьи утверждает, что Mhyo является микроорганизмом со сложными питательными потребностями, и что отсутствуют инструменты и протоколы для его трансформации.
В контексте изучения модификаций, возникающих у Mhyo под воздействием изменения температуры, в статье Madsen et al., Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during Heat Shock Using Microarrays, Infect. Immun., 2006, 74(1), 160-166 авторы утверждают, что, несмотря на огромное значение Mhyo в свиноводстве, существует мало исследований, посвященных потенциальным молекулярным механизмам его патогенеза при изменении условий окружающей среды, и что это вероятно обусловлено трудностями его культивирования, а также тем, что этот микроорганизм с трудом поддается генетическим манипуляциям.
В статье Pich et al., Comparative analysis of antibiotic resistance marker genes in Mycoplasma genitalium: application to studies of the minimal gene complement, Microbiology, 2006, 152, 519-527 описана генетическая модификация Mycoplasma genitalium различными плазмидами при помощи электропорации, но отсутствуют какие-либо упоминания о Mhyo.
В диссертации B. Machado, Construçao de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae - uma ferramenta para estudos genéticos do agente da Pneumonia Enzoótica Suína, Porto Alegre, 2007 описана трансформация штамма 7448 Mhyo репликативной плазмидой pOSTM при помощи электропорации. Для конструирования этой плазмиды область oriC из Mhyo и экспрессионную кассету, содержащую ген устойчивости к тетрациклину (tetM) под контролем промотора гена из Spiroplasma citri, встраивали в вектор. Хотя экспериментальная часть показала при помощи ПЦР включение плазмиды и устойчивость к антибиотику, придаваемую указанным вектором, никаких убедительных результатов, показывающих, что плазмида pOSTM была фактически стабильно включена в Mhyo, в этой работе не приводится, так как не описано выделение этой плазмиды из устойчивых к тетрациклину трансформированных штаммов. Кроме того, также указано, что трансформированные штаммы имели трудности с культивированием после двух пересевов на селективной среде. Следовательно, эти результаты показывают, что с применением трансформации, раскрытой в этом документе, скорее всего, невозможно осуществить стабильное введение экзогенной последовательности ДНК в штамм Mhyo, так как эта вставка не может быть сохранена в ряду многих поколений трансформированных бактерий.
Несмотря на это раскрытие в 2007 году, было показано, что проблема генетической модификации Mhyo была решена в последующих исследованиях.
В сообщении M. Calcutt по проекту, озаглавленному Development of genetic manipulation protocols for Mycoplasma hyopneumoniae clade of animal pathogens, University of Missouri, соответствующему периоду с 01.10.209 по 30.09.2010 (загруженному с веб-страницы http://www.reeis.usda.gov/web/crisprojectpages/220630.html 16.02.2013) указано, что целью этого проекта является разработка методологии для генетической манипуляции с Mhyo. Также указано, что для этого предполагалось осуществлять электротрансформацию Mhyo плазмидами, содержащими ген устойчивости к тетрациклину. Однако результаты ДНК-анализа, проведенного в отношении трансформированных бактерий, не оказались положительными и привели авторов к заключению, что трансформация не имела место. Данные об экспрессии этого гена устойчивости также не были описаны.
В статье Browning et al., Developing attenuated vaccines to control mycoplasmoses, Microbiology Australia, 2011, 121-122 описана разработка вакцин, содержащих температурно-чувствительные штаммы Mycoplasma, которые не растут при температуре тела хозяина. Указанные штаммы были получены из штаммов дикого типа путем химической мутации. Авторы этой статьи утверждают направленные генетические манипуляции с Mhyo и M. synoviae продолжают оставаться проблемой, и что они не были проведены с указанными видами. Международная патентная заявка WO-A-2010/132932, поданная этой рабочей группой, также относится к температурно-чувствительным штаммам Mhyo.
В статье Maboni et al., Mycoplasma hyopneumoniae Transcription Unit Organization: Genome Survey and Prediction, DNA Research, 2011, 18, 413-422 проведен сравнительный обзор геномов трех штаммов Mhyo (7448, J и 232) с целью выявления открытых рамок считывания. Авторы данной статьи утверждают, что, несмотря на разработку метода искусственной трансформации и других генетических инструментов для некоторых видов Mycoplasma, такие методики еще не разработаны для Mhyo.
Таким образом, способы трансформации Mhyo еще не описаны в уровне техники, хотя было предпринято несколько безуспешных попыток осуществить такую трансформацию.
Таким образом, все еще существует необходимость в создании способа получения мутантных штаммов Mhyo при помощи инструментов генной инженерии и получении с его помощью мутантных штаммов, пригодных для приготовления вакцинных композиций против энзоотической пневмонии свиней, иногда в комбинации с другими антигенными компонентами, для предотвращения и/или лечения других заболеваний свиней.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является способ получения мутантных штаммов Mhyo.
Другим аспектом настоящего изобретения является репликативный плазмидный вектор, используемый в указанном способе.
Другим аспектом настоящего изобретения является транспозонный вектор, используемый в указанном способе.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение указанного вектора для получения мутантных штаммов Mhyo.
Другим аспектом настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, получаемый указанным способом.
Другим аспектом настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, содержащий экзогенную последовательность ДНК.
Другим аспектом настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, содержащий вектор настоящего изобретения.
Другим аспектом настоящего изобретения является штамм Mhyo, трансформированный вектором настоящего изобретения.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение указанного мутантного штамма в качестве экспрессионного хозяина.
Другим аспектом настоящего изобретения является вакцина, содержащая указанный мутантный штамм.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение мутантного штамма Mhyo настоящего изобретения для приготовления вакцины.
Другим аспектом настоящего изобретения является набор для вакцинации, содержащий указанный мутантный штамм.
Авторами настоящего изобретения был разработан способ получения мутантных штаммов Mhyo, в котором экзогенные последовательности ДНК неожиданно могут быть стабильно введены в цитоплазму или в геном штамма Mhyo, и содержимое этих последовательностей экспрессируется.
Под термином «экзогенная последовательность ДНК, стабильно введенная в цитоплазму или в геном штамма Mhyo» следует понимать, что такая последовательность не теряется в ряду последовательных поколений бактерий, трансформированных указанной экзогенной последовательностью. Эта стабильность означает, что эта экзогенная последовательность ДНК может реплицироваться внутри трансформированной бактерии и в ее потомках, и что она может быть сохранена в ряду многих поколений трансформированных бактерий.
Благодаря разработанному способу впервые открывается возможность модифицировать штаммы Mhyo при помощи инструментов генной инженерии.
Мутантные штаммы Mhyo, содержащие экзогенные последовательности ДНК, могут быть получены указанным способом. Указанные мутантные штаммы могут иметь различные характеристики, такие как, например, экспрессия конкретного белка, или пониженная степень вирулентности по сравнению с исходным штаммом дикого типа.
Указанные мутантные штаммы могут применяться в качестве вакцин, например, живых аттенуированных вакцин, инактивированных вакцин, маркерных вакцин, которые позволяют отличать вакцинированных животных от инфицированных животных, или поливалентных вакцин против энзоотической пневмонии свиней и других дополнительных заболеваний, которые могут поражать свиней, таких как, например, инфекции, вызванные цирковирусом свиней типа 2 (ЦВС-2).
Способ настоящего изобретения впервые позволил генетически модифицировать Mhyo в стабильной форме, и кроме того также стало возможно использование этих трансформированных штаммов в качестве экспрессионного вектора экзогенных последовательностей ДНК, таких как, например, нуклеотидные последовательности, кодирующие белки для терапевтических или профилактических целей, такие как, среди прочего, последовательность капсида ЦВС-2. При помощи технологии, раскрытой в настоящем изобретении, были разработаны и получены новые вакцинные кандидаты, которые также являются поливалентными, так как они могут применяться для предотвращения различных заболеваний путем введения одного штамма, модифицированного при помощи способа настоящего изобретения.
В настоящем описании и формуле изобретения формы единственного числа существительных включают в себя соответствующие формы множественного числа, если иное явно не указано в контексте.
Также в контексте настоящего изобретения термин «последовательность» относится к последовательности ДНК, за исключением тех случаев, когда явно указано, что он относится к аминокислотной последовательности.
Описание чертежей
Фигура 1
На Фигуре 1 показана схема репликативных плазмид, использованных для генетической модификации Mhyo и обеспечения синтеза рекомбинантных белков или антисмысловых транскриптов. Промоторы, гены и сайты ферментов рестрикции, используемые для операций клонирования, указаны стрелками.
Плазмида pOG содержит элементы, необходимые для того, чтобы этот вектор мог реплицироваться в Mhyo, и в то же время обеспечивающие возможность отбора клеток, несущих указанную плазмиду. Эта плазмида имеет область oriC из Mhyo (основания с 2096 по 4043) и маркерный ген устойчивости к гентамицину (aac, основания с 1 по 1816) под контролем промотора гена белка P97 из Mhyo (pp97, основания с 1823 по 2087).
Плазмида pOGCRE получена непосредственно из плазмиды pOG и дополнительно содержит ген cre фага P1 (основания с 1 по 1032) под контролем промотора pp97 (основания 1039-1303).
В отличие от предыдущих плазмид, плазмида pOGA159 содержит ген устойчивости к тетрациклину (tetM, основания с 945 по 2883) под контролем промотора pp97 (основания 674-938). Область oriC из Mhyo расположена между основаниями 2901-4848. И, наконец, она содержит сегмент генома Mhyo, соответствующий 5’-концу гена tlyA (a159, основания с 4855 по 4980) в обратной ориентации и под контролем промотора pp97 (основания 4996-5260).
Фигура 2
На Фигуре 2 показана схема репликативных плазмид, использованных для генетической модификации Mhyo и обеспечения синтеза различных рекомбинантных вариантов белка капсида вируса ЦВС-2. Промоторы, гены и сайты ферментов рестрикции, используемые для операций клонирования, указаны стрелками.
Плазмида pOGC содержит те же элементы, что и плазмида pOG (Фигура 1) и, кроме того, включает в себя дополнительную копию промотора pp97 (основания 7654-7918), контролирующую экспрессию синтетического гена, кодирующего капсид цирковируса, включенный в ORF2V2 (основания 6946-7647) вирусного капсида ЦВС-2. Эта плазмида обеспечивает экспрессию белка капсида ЦВС-2 в цитоплазме клетки-носителя.
Плазмида pOGL содержит те же элементы, что и плазмида pOG (Фигура 1) и, кроме того, включает в себя промоторную последовательность белка P46 из Mhyo (pp46, основания 8918-9181), контролирующую экспрессию слитой последовательности гена белка вирусного капсида ЦВС-2 (ORF2) внутри гена, кодирующего мембранный белок P46 из Mhyo (основания 8642-8917 и 6946-7930). Эта плазмида продуцирует гибридный белок, который характеризуется тем, что в нем аминокислоты с 1 по 92 являются аминокислотами N-концевой части белка P46, аминокислоты с 95 по 327 соответствуют белку вирусного капсида ЦВС-2, и аминокислоты 330-656 являются аминокислотами C-концевой части белка P46 из Mhyo.
Плазмида pOGT содержит те же элементы, что и плазмида pOG (Фигура 1) и, кроме того, включает в себя промоторную последовательность pp46 (основания 8905-9169), контролирующую экспрессию слитой последовательности гена белка вирусного капсида ЦВС-2 (ORF2) на 3’-конце гена, кодирующего мембранный белок P46 из Mhyo (основания 7648-8904). Эта плазмида продуцирует гибридный белок, который характеризуется тем, что в нем аминокислоты с 1 по 419 являются аминокислотами белка P46, и аминокислоты с 420 по 652 соответствуют белку вирусного капсида ЦВС-2, вариант ORF2 (основания 6946-7647).
Фигура 3
На Фигуре 3 показана схема плазмид, несущих минитранспозоны, используемые для получения вставок в хромосому Mhyo. Промоторы, гены и мишени ферментов рестрикции, используемые для конструирования этих плазмид, и другие важные последовательности ДНК указаны стрелками.
Плазмида pTC3 содержит элементы, необходимые для получения штаммов Mhyo, несущих транспозонные вставки. Эта плазмида была сконструирована на основе плазмиды pMTn4001. Первым элементом этой плазмиды является промотор pp97 (основания 7-271), контролирующий экспрессию транспозазы плазмиды pMTn4001 (основания 284-1261). Основания 1461-1486 и 3774-3799 соответствуют инвертированным повторам и указаны на схеме как IRI и IRO, соответственно. Последний элемент этой плазмиды соответствует маркерному гену устойчивости к тетрациклину (основания 1761-3692), который также находится под контролем промотора белка P97 из Mhyo (1502-1766).
Плазмида pTC366 получена непосредственно из плазмиды pTC3 и содержит последовательности lox66 (субстрат Cre-рекомбиназы, основания 1485-1518 и 3762-3795), фланкирующие маркерный ген устойчивости к тетрациклину TetM (снования 1791-3722).
Плазмида pTC3C получена непосредственно из плазмиды pTC366 и содержит ген, кодирующий белок вирусного капсида ЦВС-2 ORF2V2 (основания 4078-4779) вируса ЦВС-2, под контролем промотора pp97 (основания 3808-4071). Эта плазмида осуществляет синтез рекомбинантного белка, соответствующего белку капсида ЦВС-2, в цитоплазме штамма Mhyo, трансформированного указанной плазмидой.
Плазмида pTC3L получена непосредственно из плазмиды pTC366 и содержит слитую последовательность гена белка вирусного капсида ЦВС-2 (ORF2) внутри гена, кодирующего мембранный белок P46 из Mhyo (основания 4347-5045 и 4066-4340 и 5052-6036, соответственно), под контролем промотора pp46 (основания 3801-4065). Эта плазмида осуществляет синтез гибридного белка, который характеризуется тем, что в нем аминокислоты с 1 по 92 являются аминокислотами N-концевой части белка P46, аминокислоты с 95 по 327 соответствуют белку вирусного капсида ЦВС-2, и аминокислоты 330-656 являются аминокислотами C-концевой части белка P46 из Mhyo.
Плазмида pTC3T получена непосредственно из плазмиды pTC366 и содержит слитую последовательность гена белка вирусного капсида ЦВС-2 (ORF2) и гена, кодирующего мембранный белок P46 из Mhyo (основания 5322-6031 и 4065-5321, соответственно), под контролем промотора гена, кодирующего мембранный белок P46 из Mhyo (основания 3801-4065). Эта плазмида осуществляет синтез гибридного белка, который характеризуется тем, что в нем аминокислоты с 1 по 419 являются аминокислотами белка P46, и аминокислоты с 420 по 652 соответствуют белку вирусного капсида ЦВС-2.
Фигура 4
На Фигуре 4 показана стабильность репликативных плазмид и их использование для получения рекомбинантных белков.
Эта фигура разделена на три фотографии. На Фотографии A показы результаты электрофореза в 0,7% агарозном геле при напряжении 6 В/см в течение 2 часов. Маркер молекулярной массы Ladder 1kb Plus (Invitrogen) соответствует дорожке M. Плазмида pOG, выделенная из E. coli XI1-blue и обработанная ферментом рестрикции ScaI, соответствует дорожке 1. Тотальная ДНК, выделенная из штамма 232POGc9 Mhyo и обработанная ферментом рестрикции ScaI, соответствует дорожке 2. Ожидаемые фрагменты плазмиды pOG, обработанной ферментом рестрикции ScaI, имеют размеры 3564 п. н., 2225 п. н. и 1143 п. н. (Фигура 4, Фотография A). Путем сравнения с маркером молекулярной массы и фрагментами плазмиды, выделенной из E. coli XI1-blue, было подтверждено, что плазмида pOG стабильно размножается в штамме 232POGc9. Размеры различных соответствующих фрагментов ДНК маркера указаны с левой стороны фигуры.
На Фотографии B показан Вестерн-блоттинг образцов белков различных штаммов Mhyo после их электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле с детекцией при помощи специфичных поликлональных антител к Cre-рекомбиназе бактериофага P1. На дорожке 1 показан белковый экстракт штамма 232POGCREc1, в котором наблюдался ожидаемый фрагмент размером 39 кДа. На дорожке 2 показан экстракт штамма 232, в котором не наблюдалось никаких фрагментов, и маркер молекулярной массы Precision Plus Protein Dual Xtra (Biorad) соответствует дорожке M. Соответствующие молекулярные массы указаны в кДа с правой стороны фигуры. Эти результаты свидетельствуют о том, что плазмида pOGCRE способна продуцировать белок Cre, после того, как ею был трансформирован штамм 232 Mhyo.
На Фотографии C показы результаты электрофореза в агарозном геле образцов ДНК исходного штамма Mhyo 6314 (дорожка 1) и штамма 6314pOGAc4, который является продуктом трансформации штамма 6314 плазмидой pOGA159 (дорожка 2). Стрелками показаны положения двух конформаций, принимаемых плазмидой pOGA159 в трансформированном мутантном штамме Mhyo.
Фигура 5
На Фигуре 5 показано выделение штаммов Mhyo, несущих транспозонные вставки, и их пригодность для получения рекомбинантных белков.
Эта фигура разделена на 3 изображения. На Изображении A (дорожки M и 1-4) показы результаты электрофореза в 0,7% агарозном геле при напряжении 6 В/см в течение 2 часов, а на правой стороне Изображения A (дорожки 5-8) показаны результаты Саузерн-блоттинга этого геля на нейлоновой мембране. Фрагменты, наблюдаемые при Саузерн-блоттинге, соответствуют фрагментам, распознаваемым зондом, специфичным в отношении последовательности TetM под контролем промотора белка P97 из Mhyo. Маркер молекулярной массы Ladder 1kb Plus (Invitrogen) соответствует дорожке M. Дорожки 1 и 5 соответствуют тотальной ДНК, выделенной из штамма 232TC3hlyC, обработанной ферментом рестрикции EcoRI. Дорожки 2 и 6 соответствуют тотальной ДНК, выделенной из штамма 232, обработанной ферментом рестрикции EcoRI. Дорожки 3 и 7 соответствуют тотальной ДНК, выделенной из штамма 232TC3hlyC, обработанной ферментом рестрикции EcoRV. Дорожки 4 и 8 соответствуют тотальной ДНК, выделенной из штамма 232, обработанной EcoRV. Фрагмент размером 6,3 т.п.н. в дорожке 5 и фрагмент размером 2 т.п.н. в дорожке 7 демонстрируют присутствие транспозона, содержащего ген устойчивости TetM под контролем промотора белка P97 в геноме Mhyo, в то время как отсутствие этих фрагментов в дорожках 6 и 8 подтверждает эти результаты.
На Изображении B показы результаты ELISA анализа, проведенного с использованием набора реагентов INGEZIM PCV DAS (Ingenasa, Испания) с различными образцами белков из Mhyo. Разведение, использованное в каждом из анализов, указано в левом столбце таблицы, а анализируемый штамм указан в верхней строке. Численные результаты представляют собой значения показаний оптической плотности при длине волны 450 нм, нормированные по количеству белка, внесенного в каждую лунку. Все штаммы Mhyo, трансформированные векторами pTC3C, pTC3L и pTC3T, имели оптическую плотность, которая была явно выше, чем оптическая плотность отрицательного контроля, что указывает на то, что экспрессия рекомбинантного белка капсида ЦВС-2 имеет место в каждом из этих штаммов.
На Изображении C показан Вестерн-блоттинг образцов белков различных штаммов Mhyo после их электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле с детекцией при помощи специфичных моноклональных антител к белку капсида ЦВС-2. Дорожка 1 содержит белковый экстракт штамма 232Cc6, в котором наблюдался ожидаемый фрагмент размером 28 кДа. Дорожка 2 содержит белковый экстракт штамма 232, в котором не наблюдалось никаких фрагментов. Дорожка 3 содержит образец белка капсида ЦВС-2, используемый в качестве положительного контроля в наборе реагентов INGEZIM PCV DAS (Ingenasa, Испания), в котором наблюдался ожидаемый фрагмент размером 28 кДа. Дорожка 4 содержит белковый экстракт штамма 6314, в котором не наблюдалось никаких фрагментов, при этом в белковом экстракте штамма 6314 Cc1, находящемся на дорожке 5, наблюдался ожидаемый фрагмент размером 28 кДа, хотя этот фрагмент имел более слабую интенсивность, по сравнению с фрагментами в дорожках 1 и 3. Эти результаты указывают на то, что в обоих штаммах 6314 и 232 вставка в геном Mhyo транспозона, присутствующего в плазмиде pTC3C, индуцирует экспрессию белка капсида ЦВС-2, кодируемого ORF2v2.
Фигура 6
На Фигуре 6 показана серологическая реакция на Mhyo, полученная с экспериментальными вакцинами, в группах 1-4 из Примера 7.1. Группы 5 и 6 являются невакцинированной, но инфицированной контрольной группой, и невакцинированной и неинфицированной контрольной группой, соответственно.
День исследования, когда проводился анализ, указан по оси X, и отношение О/ПК (образец/положительный контроль), выраженное в %, измеренное с помощью ELISA анализа, указано по оси Y, как показатель ответа IgG антител против Mhyo.
Звездочкой показано, что различие с невакцинированной, но инфицированной контрольной группой является статистически значимым (p<0,05, по U-критерию Манна-Уитни).
Фигура 7
На Фигуре 7 показана серологическая реакция на цирковирус свиней (ЦВС-2), полученная с экспериментальными вакцинами, в группах 1-4 из Примера 7.1. Группы 5 и 6 являются невакцинированной, но инфицированной контрольной группой, и невакцинированной и неинфицированной контрольной группой, соответственно.
День исследования, когда проводился анализ, указан по оси X, и отношение О/ПК (образец/положительный контроль), выраженное в %, измеренное с помощью ELISA анализа, указано по оси Y, как показатель ответа IgG антител против ЦВС-2.
Звездочкой показано, что различие с невакцинированной, но инфицированной контрольной группой является статистически значимым (p<0,05, по однофакторному дисперсионному анализу).
Фигура 8
На Фигуре 8 показана вирусная нагрузка сыворотки крови в экспериментальных группа 1-4 и контрольных группах 5 и 6 Примера 7.1.
10
День исследования, когда проводился анализ, указан по оси X, и log вирусной нагрузки сыворотки крови цирковирусом свиней типа 2 (ЦВС-2), выраженной в количестве копий на мл, указан по оси Y.
Звездочкой показано, что различие с контрольной группой (невакцинированной и инфицированной) является статистически значимым (p<0,05, по U-критерию Манна-Уитни).
Фигура 9
На Фигуре 9 показана серологическая реакция на инфекцию Mhyo из Примера 8.2. В группе 1 были животные, инфицированные мутантным штаммом Примера 4.8, в группе 2 были животные, инфицированные исходным штаммом дикого типа, и группа 3 представляла собой неинфицированную контрольную группу.
День исследования, когда проводился анализ, указан по оси X, и отношение О/ПК (образец/положительный контроль), выраженное в %, измеренное с помощью анализа ELISA, указано по оси Y, как показатель ответа IgG антител против Mhyo.
Звездочкой показано, что различие с группой, инфицированной исходным штаммом дикого типа, является статистически значимым (p<0,05, по однофакторному дисперсионному анализу).
Фигура 10
На Фигуре 10 показан процент Mhyo-положительных по данным ПЦР животных Примера 8.2. В группе 1 были животные, инфицированные мутантным штаммом Примера 4.8, в группе 2 были животные, инфицированные исходным штаммом дикого типа, и группа 3 представляла собой неинфицированную контрольную группу.
День исследования, когда проводился анализ, указан по оси X, вместе с типом анализируемого образца (назальный или бронхиальный), и процент положительных по данным ПЦР животных, указан по оси Y.
Звездочкой показано, что различие с группой, инфицированной исходным штаммом дикого типа, является статистически значимым (p<0,05, по точному критерию Фишера).
Фигура 11
На Фигуре 11 показана средняя поверхность легких, пораженная патологическими изменениями, приписываемыми инфекции Mhyo, в соответствии с анализом Примера 8.2. В группе 1 были животные, инфицированные мутантным штаммом Примера 4.8, в группе 2 были животные, инфицированные исходным штаммом дикого типа, и группа 3 представляла собой неинфицированную контрольную группу.
Среднее значение пораженной легочной поверхности показано на оси Y.
Звездочкой показано, что различие с группой, инфицированной исходным штаммом дикого типа, является статистически значимым (p<0,05, по U-критерию Манна-Уитни).
Фигура 12
На Фигуре 12 показана вирусная нагрузка сыворотки крови, определенная в экспериментальной группе 1 и контрольных группах 2 и 3 Примера 7.2.
10
День после инфицирования, в который проводился анализ, указан по оси X, и log вирусной нагрузки сыворотки крови цирковирусом свиней типа 2 (ЦВС-2), выраженной в количестве копий на мл, определенный при помощи количественной ПЦР, указан по оси Y.
Фигура 13
На Фигуре 13 показан процент животных, имеющих виремию ЦВС-2, в экспериментальной группе 1 и контрольных группах 2 и 3 Примера 7.2.
День после инфицирования, в который проводился анализ, указан по оси X, и процент положительных животных указан по оси Y.
Фигура 14
На Фигуре 14 показана медианная поверхность легких, пораженная Mhyo-подобными патологическими изменениями, выраженная в процентах, для экспериментальной группы 1 и для контрольных групп 2 и 3 Примера 7.2 на 28-й день после инфицирования.
Группа указана на оси X, и медианная поверхность легких, пораженная Mhyo-подобными патологическими изменениями, указана на оси Y.
Подробное описание изобретения
Целью настоящего изобретения является способ получения мутантного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, включающий в себя этап трансформации штамма M. hyopneumoniae посредством применения вектора-носителя, содержащего, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность ДНК, которая является последовательностью, находящейся под контролем последовательности ДНК, имеющий степень идентичности с промоторной областью M. hyopneumoniae, по меньшей мере, 80%.
Мутантный штамм Mhyo, стабильно включающий экзогенную последовательность ДНК в свой цитозоль или геном и экспрессирующий содержимое указанной последовательности, может быть получен способом настоящего изобретения.
Способ настоящего изобретения дополнительно включает в себя этапы, которые являются обычными в способах получения мутантных штаммов бактерий, которые хорошо известны специалисту в данной области техники, и которые не являются существенными для указанного способа.
Таким образом, способ настоящего изобретения дополнительно включает в себя этапы:
a) конструирования вектора перед переносом этого вектора в бактерию на этапе трансформации, и
b) отбора мутантных бактерий, которые оказались трансформированными экзогенной последовательностью ДНК после этапа трансформации.
Эффективность способа настоящего изобретения определяют путем выделения и характеризации последовательностей ДНК, присутствующих в трансформированных штаммах, а также, например, путем проверки генотипических или фенотипических характеристик мутантного штамма, или путем проверки синтеза их рекомбинантных белков, как это будет описано ниже в разделе Примеры.
Мутантный штамм Mhyo, стабильно включающий экзогенную последовательность ДНК в свой цитозоль или геном и экспрессирующий содержимое указанной последовательности, может быть получен при помощи вектора-носителя, используемого в способе настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор-носитель выбран из группы, образованной репликативным плазмидным вектором и транспозонным вектором.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор-носитель представляет собой репликативный плазмидный вектор.
В контексте настоящего изобретения термин «репликативный плазмидный вектор» или «репликативная плазмида» означает вектор, несущий последовательности ДНК, который реплицируется как эписомный элемент в бактерии-хозяине, где эписомный элемент представляет собой самореплицирующуюся внехромосомную единицу.
В контексте настоящего изобретения репликативный плазмидный вектор представляет собой вектор, который обеспечивает стабильное включение экзогенной последовательности ДНК в цитозоль бактерии Mhyo и, при необходимости, экспрессию РНК или белка, кодируемых указанной последовательностью, в цитозоле этой бактерии.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор-носитель представляет собой вектор, предпочтительно плазмиду, где, по меньшей мере, одна содержащаяся в нем экзогенная последовательность ДНК включена в геном штамма Mhyo путем транспозиции. Это означает, что данный штамм трансформирован вектором-носителем путем транспозиции с получением мутантного штамма Mhyo, включающего в геном путем транспозиции существенную часть данного вектора, где эта часть является частью, заключенной между последовательностями инвертированных повторов IRI и IRO и содержащей, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность ДНК. Указанные инвертированные повторы являются последовательностями-мишенями для транспозазы.
В контексте настоящего изобретения термин «транспозонный вектор» означает вектор, несущий последовательности ДНК, где, по меньшей мере, одна из них встраивается в геном хозяина путем транспозиции.
В способе настоящего изобретения транспозонный вектор представляет собой вектор, который обеспечивает стабильное включение экзогенной последовательности ДНК в геном бактерии Mhyo.
Указанное включение в геном бактерии происходит случайным образом. Таким образом, в зависимости от конкретного сайта, в который осуществляется указанная вставка, любой из генов бактерии может быть инактивирован, так как его последовательность разрывается вставкой транспозона. Если инактивированный ген вовлечен в формирование факторов вирулентности Mhyo, то полученный в результате штамм может быть использован для приготовления аттенуированной вакцины против ЭПС, и это также позволяет получить маркерные вакцины против ЭПС. Кроме того, как и в случае репликативных векторов, транспозон может содержать другие гены под контролем промоторной области Mhyo для экспрессии рекомбинантных белков с различными функциями.
Так как генетическая модификация, выполненная при помощи способа настоящего изобретения, интегрирована в геном, то трансформированный штамм является стабильным в ряду следующих поколений.
Экзогенная последовательность ДНК
В контексте настоящего изобретения термин «экзогенная последовательность ДНК» означает фрагмент ДНК, который стабильно введен в цитозоль или в геном штамма Mhyo.
Было обнаружено, что при помощи способа настоящего изобретения экзогенная последовательность ДНК может быть стабильно введена в штамм Mhyo, так как указанная последовательность не теряется в последующих поколениях бактерии, которая была трансформирована указанной экзогенной последовательностью. Эта стабильность означает, что экзогенная последовательность ДНК может реплицироваться внутри трансформированной бактерии и в ее потомках, и что она может быть сохранена в ряду многих поколений трансформированной бактерии.
Экзогенная последовательность ДНК может быть весьма разнообразной, и имеет широкое определение, как объясняется ниже.
В контексте настоящего изобретения указанная последовательность может представлять собой, например, маркерный ген. Вектор, содержащий экзогенную последовательность ДНК, как правило, содержит указанный маркер для того чтобы обеспечить более легкий отбор мутантных штаммов, которые были трансформированы. Указанный генетический маркер может представлять собой, например, ген устойчивости к антибиотику. Эти гены могут включать в себя, например, ген TetM, который придает устойчивость к тетрациклину, из плазмиды pIVT-1, описанный в Dybvig et al., J. Bacteriol, 2000, 182, 4343-4347, или ген aac(6’)-aph(2’’), который придает устойчивость к аминогликозидным антибиотикам, таким как, например, гентамицин, и который описан в Chow et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2001, 45/10, 2691-2694. Ген для фенотипического отбора предпочтительно представляет собой TetM.
Экзогенная последовательность ДНК также может представлять собой ген, кодирующий рекомбинантные белки, такие как, например, Cre-рекомбиназа бактериофага P1 или транспозаза транспозона Tn4001, или последовательности-мишени для транспозазы, такие как, например, IRI или IRO.
Экзогенная последовательность ДНК также может представлять собой ген, кодирующий рекомбинантный белок для терапевтических или профилактических целей. Указанный белок может иметь отношение к факторам вирулентности или антигенным детерминантам микроорганизмов, вызывающих заболевания у свиней, и он способен индуцировать или способствовать индуцированию защитного ответа против заболеваний или патологических состояний, которые могут поражать свиней. Экзогенная последовательность ДНК предпочтительно кодирует рекомбинантный белок, который индуцирует защитный ответ против заболеваний или патологических состояний, поражающих свиней, вызываемых микроорганизмами группы, состоящей из Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вируса свиного гриппа, вируса контагиозного гастроэнтерита, свиного парвовируса, вируса энцефаломиокардита, коронавируса, ротавируса, агента синдрома послеотъемного снижения веса у поросят, вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы свиней, калицивируса, вируса гепатита TTV и цирковируса свиней. Среди них, например, ген, кодирующий гликопротеин 5 (gp5) вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС), ген, кодирующий белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), ген, кодирующий гликопротеин E (gpE) вируса классической чумы свиней, ген, кодирующий белок sp1 свиного парвовируса (PPV), ген, кодирующий токсин Pasteurella multocida, ген, кодирующий дермонекротоксин Bordetella bronchiseptica, гены, кодирующие токсины Clostridium spp, Escherichia coli или Actinobacillus pleuropneumoniae. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный белок индуцирует защитный ответ против указанных заболеваний.
Фрагмент ДНК Mhyo, при необходимости перегруппированный или рекомбинированный с другими фрагментами ДНК, также рассматривается как экзогенная последовательность ДНК. Примерами этой экзогенной последовательности ДНК являются, например, ориджин репликации из Mhyo, антисмысловая последовательность РНК или ген, кодирующий белок P97 или P46 из Mhyo, для повышения скорости транскрипции и трансляции указанного гена.
Экзогенная последовательность ДНК предпочтительно выбирается из группы, включающей в себя ген устойчивости к антибиотику, ген, кодирующий рекомбиназу, ген, кодирующий транспозазу, последовательность-мишень для транспозазы, фрагмент ДНК Mhyo, фрагмент, который предпочтительно перегруппирован или рекомбинирован с одним или несколькими фрагментами ДНК, ген, кодирующий антигенный компонент микроорганизма, вызывающего заболевания свиней, и их комбинации; более предпочтительно, она представляет собой маркерный ген, придающий устойчивость к антибиотику, ген, кодирующий антигенный компонент микроорганизма, вызывающего заболевания свиней, и их комбинации; и еще более предпочтительно, она представляет собой ген устойчивости к антибиотику, комбинированный с геном, кодирующим антигенный компонент микроорганизма, вызывающего заболевания свиней, предпочтительно с геном, кодирующим белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), и при необходимости комбинированный с геном, кодирующим мембранный белок Mhyo, предпочтительно белок P46 из Mhyo.
Промоторная область Mhyo
В контексте настоящего изобретения термин «промоторная область Mhyo» означает последовательность ДНК, характерную для Mhyo, которая инициирует или способствует транскрипции последовательности ДНК Mhyo.
Последовательность ДНК, которая инициирует или способствует транскрипции экзогенной последовательности ДНК, имеет степень идентичности, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% и еще более предпочтительно 100% с промотороной областью Mhyo.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность ДНК, которая инициирует или способствует транскрипции экзогенной последовательности ДНК, имеет степень идентичности 100% с промотороной областью Mhyo.
Последовательность, которая индуцирует синтез матричной РНК (транскрипта) в направлении к ее 3’-концу, после того как она определена холоферментом РНК-полимеразой, называется промоторной областью. Этот транскрипт нормально транслируется и продуцирует белок с определенной функцией, или это приводит к образованию РНК, которая нарушает синтез белка или регуляцию указанной транскрипционной активности.
Специалисту в данной области техники известно значение термина «промоторная область», и она может быть идентифицирована при помощи стандартных методов.
Промотороная область Mhyo соответствует сегменту ДНК, предпочтительно включающему в себя, по меньшей мере, 50 пар оснований, предпочтительно, по меньшей мере, 100 пар оснований, более предпочтительно, по меньшей мере, 200 пар оснований и еще более предпочтительно от 200 до 300 пар оснований, расположенному на 5’-конце общепризнанных кодирующих последовательностей Mhyo.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность ДНК, используемая в качестве промотора в способе и векторе-носителе настоящего изобретения, имеет степень идентичности 100% с промоторной областью Mhyo, содержащей, по меньшей мере, 50 пар оснований.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность ДНК, используемая в качестве промотора в способе и векторе-носителе настоящего изобретения, имеет степень идентичности 100% с промоторной областью Mhyo, содержащей от 200 до 300 пар оснований.
В контексте настоящего изобретения термин «общепризнанные кодирующие последовательности» означает последовательности ДНК, кодирующие белки Mhyo, или транскрипционно активные области генома Mhyo, которые приводят, например, к образованию молекул РНК, нарушающих синтез белков или регуляцию транскрипционной активности. Эти последовательности включают в себя, например, поверхностные белки P46, P65, P97 и P102, описанные в Minion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133; адгезины P76, P146, P216 или мембранный белок P95, описанные в Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577, или цитозольный белок P36, описанный в Caron et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38(4), 1390-1396, или рибосомальную РНК.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения промоторная область Mhyo содержит промоторную область гена белка Mhyo, выбранного из группы, состоящей из белков P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 и P216, более предпочтительно, белками P46 и P97, еще более предпочтительно, она выбрана из группы, содержащей промоторную область гена mhj_0194 штамма J Mhyo, кодирующего белок P97, и соответствующую последовательности ДНК, находящейся между основаниями 214293 и 214557 штамма J Mhyo, (SEQ ID NO: 1), и промоторную область гена mhj_0511 штамма J Mhyo (SEQ ID NO: 2), кодирующего белок P46, и соответствующую последовательности ДНК, находящейся между основаниями 656451 и 656713 штамма J Mhyo, депонированного в базе данных GenBank под номером AE017243 и описанного в вышеупомянутой работе Vasconcelos et al.
Промоторная область Mhyo, которая контролирует экзогенные последовательности, может быть одной и той же для всех последовательностей, или она может быть различной. Предпочтительно она является одной и той же.
Промоторная последовательность ДНК может быть легко идентифицирована специалистом в данной области техники путем выбора последовательности ДНК, имеющей степень идентичности, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 99% и еще более предпочтительно 100% с промоторной областью Mhyo, предпочтительно содержащей, по меньшей мере, 50 пар оснований, предпочтительно, по меньшей мере, 100 пар оснований, более предпочтительно, по меньшей мере, 200 пар оснований и еще более предпочтительно от 200 до 300 пар оснований, расположенных на 5’-конце общепризнанных кодирующих последовательностей Mhyo, и полученной способом настоящего изобретения. Способы идентификации промоторной последовательности ДНК описаны, например, в руководстве Sambrook and Russell, Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001).
Репликативный плазмидный вектор
Целью настоящего изобретения является репликативный плазмидный вектор, содержащий:
1) последовательность ДНК, содержащую область oriC штамма Mycoplasma sp., и
2) экзогенную последовательность ДНК, содержащую маркерный ген, и при необходимости дополнительную экзогенную последовательность ДНК, которые находятся под контролем последовательности ДНК, имеющей степень идентичности, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% с промоторной областью Mhyo.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность ДНК, которая инициирует или способствует транскрипции экзогенной последовательности ДНК, содержит от 200 до 300 пар оснований и имеет степень идентичности 100% с промоторной областью Mhyo.
В репликативной плазмиде настоящего изобретения промоторная область Mhyo, выбранная из группы, содержащей промоторную область гена белка P97 Mhyo и промоторную область гена белка P46 Mhyo, является предпочтительной для использования, промоторная область Mhyo, предпочтительно содержит промоторную область гена белка P97 Mhyo, или в альтернативном варианте промоторную область гена белка P46 Mhyo, упомянутых выше.
Промоторная область Mhyo, которая контролирует последовательности, содержащиеся в репликативной плазмиде, может быть одной и той же для всех последовательностей, или она может быть различной. Предпочтительно она является одной и той же последовательностью.
Область oriC позволяет реплицировать введенный фрагмент ДНК как эписомный элемент, а также стабильно поддерживать этот фрагмент ДНК в потомстве трансформированной клетки, предпочтительно поддерживая условия для фенотипического отбора.
В репликативном плазмидном векторе настоящего изобретения область oriC представляет собой область oriC штамма Mycoplasma sp.
В контексте настоящего изобретения термин «Mycoplasma sp.» означает любую бактерию рода Mycoplasma, такую как, например, среди прочих M. pneumoniae, M. hyopneumoniae, M. hominis, M. genitalium, M. pulmonis, M. capricolum, M. mycoides, M. ovipneumoniae, M. haemofelis, M. gallisepticum, M. laboratorium или M. bovis.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения область oriC принадлежит штамму Mhyo, более предпочтительно, она принадлежит штамму J, и более предпочтительно, она содержит последовательность ДНК, находящуюся между основаниями 897262 и 1802 штамма J Mhyo.
Маркерный ген, также именуемый как ген для фенотипического отбора, позволяет проводить отбор клонов, которые включили в себя плазмиду с экзогенной последовательностью ДНК, как описано выше.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК. Мутантные штаммы Mhyo, которые могут быть использованы для приготовления моновалентных или поливалентных вакцин, при необходимости маркерных вакцин, и которые также могут экспрессировать генетические инструменты, необходимые для последующей модификации указанных мутантов, такие как, например, Cre-рекомбиназа фага P1, FLP-рекомбиназа Saccharomyces cerevisiae, тетрациклин репрессорный белок (TetR), или способные полностью или частично блокировать трансляцию конкретного гена Mhyo, могут быть получены при помощи указанной дополнительной экзогенной последовательности ДНК.
Дополнительная экзогенная последовательность ДНК, которая может быть встроена в репликативную плазмиду, включает в себя, например, ОРС гена cre, кодирующего Cre-рекомбиназу фага P1.
Cre-рекомбиназа способна расщеплять области ДНК, фланкированные последовательностями типа loxP. Таким образом, например, если репликативная плазмида включает в себя ОРС гена cre и ген устойчивости к антибиотику, фланкированный последовательностями типа loxP, например lox66, то когда Cre-рекомбиназа экспрессируется, устойчивость к антибиотику элиминируется трансформированной бактерией. Другими словами, на последующих этапах маркерный ген может быть удален. Это является важным в случае получения трансформированных мутантных штаммов Mhyo, обладающих ослабленной вирулентностью и используемых для приготовления живых вакцин, в которых присутствие гена устойчивости к антибиотику является нежелательным свойством.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения репликативная плазмида также содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок для терапевтических или профилактических целей. Указанный белок может иметь отношение к факторам вирулентности или антигенным детерминантам микроорганизмов, вызывающих заболевания у свиней, и он способен индуцировать или способствовать индуцированию защитного ответа против заболеваний или патологических состояний, которые могут поражать свиней, вызываемых микроорганизмами, описанными выше.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения репликативная плазмида содержит, по меньшей мере, две копии дополнительной экзогенной последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный белок для терапевтических или профилактических целей, предпочтительно две, и более предпочтительно две или три копии. Таким образом, вводится несколько копий дополнительной экзогенной последовательности ДНК, и повышается уровень экспрессии этого белка. Промоторная область Mhyo, которая контролирует последовательности, находящиеся в репликативной плазмиде, может быть одной и той же для всех последовательностей, или она может быть различной.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из последовательности, кодирующей белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), и экзогенной последовательности ДНК, кодирующей белок, содержащий белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), дополнительно несущий аминокислоты MetSerGlySer на N-конце указанного белка, где указанный белок капсида описан в базе данных GenBank под регистрационным номером AAC61864 (SEQ ID NO: 6).
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК кодирует белок капсида ЦВС-2, используя наиболее распространенный в геноме Mhyo кодон для каждой из аминокислот, соответствующих указанному белку, и выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 3 имеет 699 пар оснований, SEQ ID NO: 4 имеет 702 пары оснований, и SEQ ID NO: 5 имеет 992 пары оснований, одна последовательность ДНК имеет существенно большую длину, чем две другие, так как она также включает в себя промоторную область гена белка P97, соответствующую последовательности ДНК, расположенной между основаниями 214293 и 214557 штамма J Mhyo, для упрощения этапа клонирования. В этом описании SEQ ID NO: 5 также именуется ORF2v2.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК содержит ген белка вирусного капсида ЦВС-2 (ORF2), слитый с последним основанием гена, кодирующего мембранный белок Mhyo, предпочтительно мембранный белок Mhyo выбран из группы, состоящей из белка P46 и белка P97, более предпочтительно, он представляет собой белок P46, более предпочтительно, под контролем промотора генов белка P46 или P97 Mhyo, и еще более предпочтительно, под контролем промотора гена белка P46 Mhyo.
В случае белка P46, слияние осуществляется на 3’-конце гена, кодирующего указанный мембранный белок (основания 7648-8904). Эта плазмида осуществляет синтез гибридного белка, который характеризуется тем, что в нем аминокислоты с 1 по 419 являются аминокислотами белка P46, и аминокислоты с 420 по 652 соответствуют белку вирусного капсида ЦВС-2, вариант ORF2 (основания 6946-7647).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК содержит ген, кодирующий белок капсида ЦВС-2, вставленный в последовательность ДНК, кодирующую петлю мембранного белка Mhyo, предпочтительно мембранный белок Mhyo выбран из группы, состоящей из белка P46 и белка P97, более предпочтительно, он представляет собой белок P46, более предпочтительно, под контролем промотора генов белка P46 или P97 Mhyo, и еще более предпочтительно, под контролем промотора гена белка P46 Mhyo.
В случае предпочтительного варианта осуществления изобретения с белком P46, плазмида осуществляет синтез гибридного белка, который характеризуется тем, что в нем аминокислоты с 1 по 92 являются аминокислотами N-концевой части белка P46, аминокислоты с 95 по 327 соответствуют белку вирусного капсида ЦВС-2, и аминокислоты 330-656 являются аминокислотами C-концевой части белка P46 из Mhyo.
Петли в аминокислотных последовательностях идентифицируют при помощи способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, в результате чего возможно предсказать их расположение с приемлемой эффективностью.
Указанные петли, как правило, обладают высокой пластичностью и имеют хорошую переносимость вставки аминокислотных последовательностей из других белков. Кроме того, так как они находятся на поверхности бактерий, они дают возможность получать хороший иммуногенный ответ.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения репликативная плазмида содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК, которая представляет собой ген Mhyo, находящийся в обратной ориентации по отношению к промоторной области Mhyo, предпочтительно этот ген Mhyo кодирует фактор вирулентности Mhyo, предпочтительно под контролем промотора белка P46 или P97 Mhyo, и еще более предпочтительно под контролем промотора белка P46 Mhyo.
Указанная последовательность ДНК способна продуцировать антисмысловую РНК, которая может блокировать трансляцию указанного гена Mhyo. Если эта последовательность представляет собой ген, кодирующий фактор вирулентности Mhyo, то трансформация может уменьшить степень вирулентности микроорганизма.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения репликативная плазмида содержит последовательность, расположенную между основаниями 194535 и 194654 генома штамма J Mhyo, находящуюся в обратной ориентации по отношению к промоторной области Mhyo.
Указанная последовательность продуцирует антисмысловую РНК, которая может блокировать трансляцию гена tlyA указанного штамма, который соответствует гемолизину Mhyo.
В разделе Примеры описано получение плазмид pOG, pOGCRE, pOGA159, pOGC, pOGL и pOGT. Первая плазмида включает в себя ген aac(6’)-aph(2’’), который придает устойчивость к гентамицину. Кроме того, плазмида pOGCRE включает в себя ОРС гена cre, кодирующего Cre-рекомбиназу фага P1; плазмида pOGA159 включает в себя последовательность, ингибирующую трансляцию гена гемолизина a159 Mhyo; а плазмиды pOGC, pOGL и pOGT включают в себя, кроме того, гены, кодирующие различные варианты белка капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2).
Транспозонные векторы
Другой целью настоящего изобретения является транспозонный вектор, предпочтительно плазмида, содержащий:
1) последовательность ДНК, кодирующую транспозазу,
2) экзогенную последовательность ДНК, содержащую маркерный ген, и
3) при необходимости дополнительную экзогенную последовательность ДНК,
где последовательность ДНК, кодирующая транспозазу, и, по меньшей мере, одна экзогенная последовательность ДНК находится под контролем последовательности ДНК, имеющей степень идентичности, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% с промоторной областью Mhyo.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность ДНК, которая инициирует или способствует транскрипции последовательностей ДНК, содержит от 200 до 300 пар оснований и имеет степень идентичности 100% с промотороной областью Mhyo.
Ген, кодирующий транспозазу, содержит последовательность ДНК, кодирующую фермент, который связывается с конкретной последовательностью в транспозоне и катализирует перемещение указанного транспозона в другую часть генома. Выбор гена, кодирующего транспозазу, не является критическим. Гены, кодирующие транспозазу, включают в себя транспозон TN4001T, встроенный в плазмиду pIVT-1, упомянутую выше, или транспозон Tn916, встроенный в плазмиду pAM120, описанную, например, в Cao et al., J. Bacteriol., 1994, 176(14), 4459-4462.
Маркерный ген или ген для фенотипического отбора может представлять собой ген устойчивости к антибиотику, такой как, например, ген TetM или ген aac(6’)-aph(2’’), упомянутые выше. Ген для фенотипического отбора предпочтительно представляет собой ген TetM.
Маркерный ген фланкирован двумя инвертированным повторам, например, такими как транспозон, присутствующий в вышеупомянутой плазмиде pIVT-1. Указанные последовательности распознаются транспозазой, и без них ген фенотипического отбора не сможет перемещаться по бактериальной хромосоме, и генетическая модификация не будет осуществляться. После того как генетическая модификация встроена в геном, она будет стабильно поддерживаться в ряду следующих поколений трансформированной клетки.
Инвертированные повторы предпочтительно присутствуют в последовательностях SEQ ID NO: 7 для IRO и SEQ ID NO: 8 для IRI.
Промоторную область Mhyo, выбранную из группы, включающей в себя промоторную область гена белка P97 Mhyo и промоторную область гена белка P46 Mhyo, как описано выше, предпочтительно использовать в транспозонном векторе настоящего изобретения. Промоторная область Mhyo предпочтительно включает в себя промоторную область гена белка P97 Mhyo, или в альтернативном варианте промоторную область гена белка P46 Mhyo.
Промоторная область Mhyo, которая контролирует последовательности, содержащиеся в транспозонном векторе, может быть одной и той же для всех последовательностей, или она может быть различной. Предпочтительно она является одной и той же.
Как и в случае репликативной плазмиды, в предпочтительном варианте осуществления изобретения транспозонный вектор также содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК, кодирующую целевой рекомбинантный белок. Указанный белок способен индуцировать или способствовать индуцированию защитного ответа против заболеваний или патологических состояний, которые могут поражать свиней.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения транспозонный вектор содержит, по меньшей мере, две копии дополнительной экзогенной последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный белок для терапевтических или профилактических целей, предпочтительно две, и более предпочтительно две или три копии. Таким образом, вводится несколько копий дополнительной экзогенной последовательности ДНК, и повышается уровень экспрессии этого белка. Промоторная область Mhyo, которая контролирует последовательности, находящиеся в транспозонном векторе, может быть одной и той же для всех последовательностей, или она может быть различной.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК выбрана из последовательности, кодирующей белок капсида цирковируса свиней (ЦВС-2), и экзогенной последовательности ДНК, кодирующей белок, содержащий белок капсида цирковируса свиней (ЦВС-2), дополнительно несущий аминокислоты MetSerGlySer на N-конце указанного белка, где белок капсида цирковируса свиней (ЦВС-2) описан в базе данных GenBank под регистрационным номером AAC61864 (SEQ ID NO: 6).
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК кодирует белок капсида ЦВС-2, используя наиболее распространенный в геноме Mhyo кодон для каждой из аминокислот, соответствующих указанному белку, и выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, где каждая из этих последовательностей ДНК находится под контролем промоторной области Mhyo. Наиболее предпочтительным является использование SEQ ID NO: 5, которая уже включает в себя промоторную область гена, кодирующего белок P97 Mhyo.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК содержит последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, слитую с последним основанием гена, кодирующего мембранный белок Mhyo, предпочтительно мембранный белок Mhyo выбран из группы, состоящей из белка P46 и белка P97, более предпочтительно, он представляет собой белок P46. Штамм, трансформированный этой плазмидой, экспрессирует белок Mhyo, в котором аминокислоты, соответствующие белку капсида ЦВС-2, расположены непосредственно после его последней аминокислоты, т.е. он экспрессирует гибридный белок, образованный белком P46 или P97 Mhyo и белком капсида ЦВС-2. Принимая во внимание, что это мембранный белок, штамм Mhyo, трансформированный указанной плазмидой, экспрессирует продукт слияния обоих белков в бактериальной мембране. Белок капсида ЦВС-2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, более предпочтительно он представляет собой SEQ ID NO: 4. Промоторная область Mhyo предпочтительно представляет собой промоторную область гена, кодирующего белок P97 или P46 Mhyo, и еще более предпочтительно промотор белка P46 Mhyo.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительная экзогенная последовательность ДНК содержит ген, кодирующий белок капсида ЦВС-2, вставленный в последовательность ДНК, кодирующую петлю мембранного белка Mhyo, предпочтительно мембранный белок Mhyo выбран из группы, состоящей из белка P46 и белка P97, более предпочтительно, он представляет собой белок P46. Штамм, трансформированный этой плазмидой, экспрессирует белок капсида ЦВС-2, вставленный между белком P46 или P97 Mhyo, т.е. он экспрессирует гибридный белок, образованный белком P46 или P97 Mhyo и белком капсида ЦВС-2. Белок капсида ЦВС-2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, более предпочтительно он представляет собой SEQ ID NO: 3.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок капсида ЦВС-2 вставлен между аминокислотами 92 и 93 белка P46.
Следующие транспозонные векторы, предпочтительно плазмиды, являются особенно предпочтительными:
1) Вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую транспозазу, предпочтительно транспозон TN4001T, последовательность ДНК, кодирующую маркерный ген, предпочтительно ген tetM, при необходимости фланкированный последовательностями типа loxP, и последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, предпочтительно определенную SEQ ID NO: 5, где каждая из этих последовательностей ДНК находится под контролем промоторной области Mhyo, выбранной из промоторной области белка P97 или белка P46 Mhyo, предпочтительно промоторной области белка P97. Примером плазмиды этого типа является плазмида, обозначенная pTC3C и описанная в разделе Примеры.
2) Вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую транспозазу, предпочтительно транспозон TN4001T, последовательность ДНК, кодирующую маркерный ген, предпочтительно ген tetM, при необходимости фланкированный последовательностями типа loxP, и последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, предпочтительно определенную SEQ ID NO: 4, которая слита с последним основанием гена, кодирующего мембранный белок Mhyo, предпочтительно этот мембранный белок Mhyo выбран из группы, состоящей из белка P46 и белка P97, более предпочтительно, он представляет собой белок P46, где каждая из этих последовательностей ДНК находится под контролем промоторной области Mhyo, выбранной из промоторной области белка P97 или P46 Mhyo, предпочтительно промоторной области белка P46. Примером плазмиды этого типа является плазмида, обозначенная pTC3T и описанная в разделе Примеры.
3) Вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую транспозазу, предпочтительно транспозон TN4001T, последовательность ДНК, кодирующую маркерный ген, предпочтительно ген tetM, при необходимости фланкированный последовательностями типа loxP, и последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, предпочтительно определенную SEQ ID NO: 3, которая слита с петлей мембранного белка Mhyo, предпочтительно этот мембранный белок выбран из группы, состоящей из белка P46 и белка P97, более предпочтительно, он представляет собой белок P46, предпочтительно эта последовательность ДНК вставлена между аминокислотами 92 и 93 белка P46, где каждая из этих последовательностей ДНК находится под контролем промоторной области Mhyo, выбранной из промоторной области белка P97 или белка P46 Mhyo, предпочтительно промоторной области белка P46. Примером плазмиды этого типа является плазмида, обозначенная pTC3L и описанная в разделе Примеры.
В этих трех предпочтительных векторах группа экзогенных последовательностей ДНК, за исключением последовательностей, кодирующих транспозазу, фланкирована двумя инвертированными повторами, обеспечивающими включение указанной в геном трансформируемой бактерии Mhyo. Инвертированные повторы предпочтительно представлены последовательностями SEQ ID NO: 7 для IRO и SEQ ID NO: 8 для IRI.
Еще одной целью настоящего изобретения является применение репликативного плазмидного вектора и транспозонного вектора для получения мутантного штамма Mhyo.
Штамм Mhyo
Любой штамм Mhyo может быть использован в способе настоящего изобретения, т.е. этот штамм может быть выбран, в том числе, из полевых штаммов, коллекционных штаммов (например, штамм J или штамм 232) или генетически модифицированных штаммов.
Штамм Mhyo, пригодный для использования в способе настоящего изобретения, может быть получен от животных с клиническими или субклиническими формами заболевания при помощи стандартных способов, известных специалисту в данной области техники, или он может быть выбран из штаммов, которые депонированы в коллекциях типовых культур. В клинических случаях штамм является характерным для патологии ЭПС, в то время как в субклинических случаях штамм колонизирует слизистые оболочки, но не является характерным для какой-либо патологии. Штамм Mhyo, который может быть использован для применения в способе настоящего изобретения, может обладать различной степенью вирулентности. Вирулентный штамм, или штамм, экспрессирующий основные иммуногенные детерминанты Mhyo, является предпочтительным для использования в способе настоящего изобретения. Штаммы, которые могут быть использованы в способе настоящего изобретения, включают в себя штамм 232, геном которого был описан в статье Minion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133 и помещен в базу данных GenBank под номером AE017332; штамм J, геном которого был описан в статье Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577 и помещен в базу данных GenBank под номером AE017243; или штамм дикого типа, такой как 6314, который соответствует вирулентному изоляту Mhyo, принадлежащему Laboratorios Hipra (Amer, Girona, Spain).
Трансформация штамма
В контексте настоящего изобретения термин «трансформация штамма Mhyo» имеет обычное значение, понимаемое специалистом в области молекулярной биологии, и он относится к способу, при помощи которого бактерия, в данном случае бактерия Mhyo, включает в себя экзогенную последовательность ДНК, и указанная последовательность выполняет определенную функцию.
Функции, которые экзогенная последовательность ДНК, включенная в бактерию Mhyo, может выполнять, включают в себя, например, транскрипцию РНК, экспрессию белка, рекомбинацию с другими последовательностями ДНК или разрыв последовательности, кодирующей ген в геноме организма-хозяина.
Способ трансформации является одним из трех способов, при помощи которых экзогенная последовательность ДНК может быть введена в бактерию. Другие два представляют собой конъюгацию, которая состоит из переноса генетического материала между двумя бактериями при непосредственном контакте, и трансдукцию, которая состоит из введения экзогенной последовательности ДНК в бактерию при помощи вируса-бактериофага.
Трансформация бактерии может быть осуществлена в способе настоящего изобретения при помощи биохимических процедур, известных специалисту в данной области техники, таких как, например, инкубация бактерий в присутствии соли, содержащей двухвалентные ионы, такой как, например, хлорид кальция или фосфат кальция, воздействие смеси полиэтиленгликоля, инкубация в присутствии поливинилового спирта, применение липосом, в которых экзогенная последовательность ДНК покрыта липидом, диэтиламиноэтилдекстран-опосредованная трансфекция, или при помощи физических процедур, таких как электропорация, также именуемая электротрансформация, или биолистический метод.
В способе настоящего изобретения бактерию предпочтительно трансформируют путем инкубации этой бактерии в присутствии соли, содержащей двухвалентные ионы, воздействия на нее смеси полиэтиленгликоля, или, подвергая ее электропорации; и более предпочтительным является осуществление трансформации путем электропорации.
Электропорация представляет собой метод, хорошо известный специалисту в данной области техники, экспериментальный протокол которого описан, например, в вышеупомянутом руководстве Sambrook and Russell.
В процессе электропорации суспензия бактерий в буфере для электропорации, содержащем вектор-носитель, несущий экзогенную последовательность ДНК, подвергается воздействию электрического импульса, вызывающего изменения в структуре бактериальной мембраны, с целью облегчения проникновения указанной последовательности в бактерию.
Буфер для электропорации может представлять собой, например, буфер с pH 7,2, образованный сахарозой и 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновой кислотой (HEPES), хотя может быть использован любой буфер, подходящий для электропорации, который хорошо известен специалисту в данной области техники, такой как те буферы, которые описаны в вышеупомянутом руководстве Sambrook and Russell.
Вектор-носитель, несущий экзогенную последовательность ДНК, как правило, используется в концентрации от 0,1 до 5 мкг/мл, предпочтительно от 0,5 до 2 мкг/мл. Буфер для электропорации, как правило, используется в качестве среды для указанного вектора.
5
12
Суспензия бактерий, как правило, имеет концентрацию от 10 до 10 КОЕ/мл.
Как правило, электропорация может проводиться при напряжении в диапазоне от 1 до 3 кВ, сопротивлении в диапазоне от 75 до 300 Ω и электрической емкости в диапазоне от 10 до 40 мкФ. В способе настоящего изобретения электропорация предпочтительно проводится при напряжении в диапазоне от 2 до 3 кВ, сопротивлении в диапазоне от 100 до 175 Ω и электрической емкости в диапазоне от 20 до 30 мкФ.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения перед проведением электропорации суспензию бактерий Mhyo подвергают инкубации в буфере для электропорации с хелатирующим агентом, имеющим двухвалентный ион. Хотя указанный этап не является принципиальным в способе настоящего изобретения, было обнаружено, что он значительно повышает эффективность трансформации.
Хелатирующие агенты, которые могут быть использованы для указанной инкубации, включают в себя, например, аминокарбоновые кислоты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), нитрилотриуксусная кислота (НТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) или их щелочные соли; гидроксикарбоновые кислоты, такие как лимонная кислота, глюконовая кислота или их щелочные соли; фосфоновые кислоты, такие как 2-аминоэтилфосфоновая кислота, 1-гидроксиэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота (ОЭДФ), амино-трис(метиленфосфоновая кислота) (ATMP), этилендиаминтетра- (метиленфосфоновая кислота) (ЭДТМФ) или их щелочные соли. Хелатирующий агент предпочтительно представляет собой ЭДТА.
После проведения электропорации, т.е. после испускания электрического импульса, суспензию бактерий предпочтительно инкубируют с дополнительным количеством вектора-носителя, содержащего экзогенную последовательность ДНК.
Как правило, используется такое же количество вектора-носителя, какое добавлялось перед испусканием электрического импульса.
Указанную инкубацию осуществляют путем инкубации суспензии бактерий и вектора-носителя на льду в течение периода времени меньшего, чем приблизительно 1 час, с последующим выдерживанием ее в течение периода времени от 2 до 5 часов при температуре 37°C в атмосфере 5% диоксида углерода.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения перед проведением электропорации суспензию бактерий Mhyo подвергают инкубации в буфере для электропорации с хелатирующим агентом, имеющим двухвалентный ион, и после электропорации суспензию бактерий инкубируют с дополнительным количеством вектора-носителя, содержащего экзогенную последовательность ДНК.
В способе настоящего изобретения трансформация может быть проведена с использованием репликативного плазмидного вектора или с использованием вектора, предпочтительно плазмиды, в котором, по меньшей мере, одна его часть встраивается путем транспозиции.
Таким образом, трансформация штамма Mhyo в соответствии со способом настоящего изобретения позволяет получить штамм Mhyo, содержащий, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность ДНК, встроенную в его геном, если трансформация была осуществлена путем транспозиции, или содержащий указанный фрагмент ДНК во внехромосомном векторе (или эписомном элементе), который стабильно автономно реплицируется в Mhyo, если трансформация была осуществлена с использованием репликативных плазмидных векторов.
Получение мутантных штаммов
Целью настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, получаемый способом настоящего изобретения.
Другой целью настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, содержащий, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность ДНК, стабильно включенную в его геном или в цитозоль. Предпочтительно, экзогенная последовательность ДНК находится под контролем последовательности ДНК, которая имеет степень идентичности, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% и еще более предпочтительно 100% с промоторной областью Mhyo. В предпочтительном варианте осуществления изобретения экзогенная последовательность ДНК находится в репликативном плазмидном векторе настоящего изобретения.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения экзогенная последовательность ДНК находится между последовательностями инвертированных повторов IRI и IRO транспозонного вектора настоящего изобретения.
Мутантный штамм Mhyo настоящего изобретения содержит репликативный плазмидный вектор настоящего изобретения или значительную часть транспозонного вектора настоящего изобретения. При использовании репликативного плазмидного вектора мутантный штамм Mhyo содержит указанный вектор в своем цитозоле. В случае использования транспозонного вектора мутантный штамм Mhyo включает в себя значительную часть этого вектора, которая представляет собой часть, находящуюся между последовательностями инвертированных повторов IRI и IRO и содержащую, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность ДНК.
Еще одной целью настоящего изобретения является штамм Mhyo, трансформированный вектором-носителем настоящего изобретения.
В контексте настоящего изобретения термин «мутантный штамм Mycoplasma hyopneumoniae» означает штамм Mhyo, который был генетически модифицирован путем использования инструментов генной инженерии.
Мутантный штамм Mhyo, стабильно включающий в себя экзогенную последовательность ДНК, которая является функциональной в указанном мутантном штамме, может быть получен способом настоящего изобретения.
В контексте настоящего изобретения следует понимать, что экзогенная последовательность ДНК является функциональной в мутантном штамме Mhyo, когда, например, она экспрессирует белок, кодируемый указанной последовательностью, транскрибирует РНК или генетически модифицирует указанный штамм.
В способе настоящего изобретения исходным материалом для получения трансформированных штаммов Mhyo предпочтительно является культура Mhyo, находящаяся в экспоненциальной фазе роста.
Указанную культуру предпочтительно получают путем использования культуральной среды, содержащей среду ФризаЛС (лошадиная сыворотка, дрожжевой экстракт, бульон с сердечной вытяжкой, сбалансированный солевой раствор Хенкса и бульон для культивирования плевро-пневмониеподобных микроорганизмов (PPLO)).
Культуру предпочтительно выращивают в течение 48-144 часов при температуре приблизительно 37°C и встряхивании с частотой от 100 до 200 об./мин до достижения экспоненциальной фазы роста.
Затем бактерии выделяют, предпочтительно путем центрифугирования, и подвергают трансформации.
После трансформации суспензию бактерий предпочтительно рассевают на чашки со средой ФризаЛС с добавлением агара и соответствующего селективного антибиотика.
Трансформированные колонии, обладающие устойчивостью к антибиотику среды, могут быть выделены после 2 или 3 недель инкубации при температуре 37°C в атмосфере 5% диоксида углерода. Затем указанные трансформированные колонии предпочтительно инокулировали в среду ФризаЛС с добавлением селективного антибиотика, и через примерно 10 или 20 суток генотип и/или фенотип полученных мутантов изучали путем выделения их геномной ДНК или белковых экстрактов способами, хорошо известными специалисту в данной области техники.
Трансформированные мутантные штаммы Mhyo, экспрессирующие рекомбинантный белок, могут быть получены способом настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутантный штамм Mhyo настоящего изобретения экспрессирует содержимое, кодируемое экзогенной последовательностью ДНК, например, белок. Экзогенная последовательность ДНК может представлять собой, например, белок капсида цирковируса (ЦВС-2) или белок Mhyo, например, белок P46, чтобы обеспечить их сверхэкспрессию. Примерами мутантных штаммов являются штаммы 232Cc6, 6314Cc1, 232Lc2 и 232Tc2, включающие экзогенную последовательность ДНК в геном бактерии.
Целью настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, который был депонирован Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain) в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) Лейбниц-института (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) под регистрационным номером DSM 26027 29 мая 2012. Указанный штамм, именуемый 232Cc6, включает в себя транспозон, присутствующий в плазмиде pTC3C в штамме 232 Mhyo. Этот штамм экспрессирует белок капсида ЦВС-2 в цитоплазме в количестве, которое может быть обнаружено при помощи Вестерн-блоттинга и ELISA анализа.
Целью настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, который был депонирован Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain) в DSMZ Лейбниц-института (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) под регистрационным номером DSM 26020 29 мая 2012. Указанный штамм, именуемый 6314Cc1, включает в себя транспозон, присутствующий в плазмиде pTC3C в штамме дикого типа 6314 Mhyo. Этот штамм экспрессирует белок капсида ЦВС-2 в цитоплазме в количестве, которое может быть обнаружено при помощи Вестерн-блоттинга и ELISA анализа.
Целью настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, который был депонирован Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain) в DSMZ Лейбниц-института (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) под регистрационным номером DSM 26033 29 мая 2012. Указанный штамм, именуемый 232Lc2, включает в себя транспозон, присутствующий в плазмиде pTC3L в штамме дикого типа 232 Mhyo. Этот штамм экспрессирует белок капсида ЦВС-2 в цитоплазме в количестве, которое может быть обнаружено при помощи ELISA анализа.
Целью настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, который был депонирован Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain) в DSMZ Лейбниц-института (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) под регистрационным номером DSM 26034 29 мая 2012. Указанный штамм, именуемый 232Tc2, включает в себя транспозон, присутствующий в плазмиде pTC3T в штамме дикого типа 232 Mhyo. Этот штамм экспрессирует белок капсида ЦВС-2 в цитоплазме в количестве, которое может быть обнаружено при помощи ELISA анализа.
Следующие штаммы также экспрессируют белок, кодируемый экзогенной последовательностью ДНК, в этом случае включенной в цитозоль бактерии в виде эписомного элемента:
- трансформированный штамм 232POGc9 Mhyo, включающий в себя репликативную плазмиду pOG в штамме дикого типа 232 Mhyo. Указанное включение было обнаружено путем расщепления тотальной ДНК этого штамма Mhyo ферментами рестрикции и анализа полученных фрагментов при помощи электрофореза в агарозном геле.
- трансформированный штамм 232POGCREc1 Mhyo, включающий в себя репликативную плазмиду pOGCRE в штамме дикого типа 232 Mhyo. Экспрессию Cre-рекомбиназы выявляли при помощи Вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа.
Мутантные штаммы Mhyo, в которых экзогенная последовательность ДНК, включенная путем транспозиции, продуцирует антисмысловую РНК, способную блокировать трансляцию гена, ответственного за вирулентность указанного штамма, например, гена, соответствующего гемолизину Mhyo, могут быть получены способом настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутантный штамм Mhyo включает экзогенную последовательность ДНК в геном или в цитозоль так, что указанный штамм продуцирует антисмысовую РНК, специфичную в отношении гена, ответственного за вирулентность указанного штамма.
Мутантные штаммы Mhyo, в которых экзогенная последовательность ДНК, включенная путем транспозиции в геном этого штамма, разрывает ген, кодирующий фактор вирулентности Mhyo, могут быть получены способом настоящего изобретения, и они обладают ослабленной вирулентностью.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутантный штамм Mhyo включает в себя экзогенную последовательность ДНК, которая разрывает ген, кодирующий фактор вирулентности Mhyo, например, гемолизин. Одним примером является штамм, именуемый 232TC3hlyC.
Мутантные штаммы, несущие разорванный ген, кодирующий фактор вирулентности Mhyo, могут быть отобраны при помощи способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, таких как секвенирование генома указанных мутантов.
Целью настоящего изобретения является мутантный штамм Mhyo, который был депонирован Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain) в DSMZ Лейбниц-института (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) под регистрационным номером DSM 26049 29 мая 2012. Указанный штамм, именуемый 232TC3hlyC, включает в себя транспозон, присутствующий в плазмиде TC3 в штамме дикого типа 232 Mhyo. Этот штамм имеет разрыв ОРС, кодирующей фактор вирулентности hlyC Mhyo, и таким образом он является хорошим кандидатом для использования в качестве аттенуированного вакцинного штамма. Вставку в геном определяют при помощи Саузерн-блоттинга и прямого секвенирования.
Исходя из информации, содержащейся в настоящем описании, специалист в данной области техники сможет получить другие трансформированные штаммы Mhyo посредством применения способа настоящего изобретения и путем выбора экзогенных последовательностей ДНК, отличных от тех, которые конкретно описаны.
Целью настоящего изобретения является применение мутантного штамма Mhyo, содержащего экзогенную последовательность ДНК в своем цитозоле или геноме, в качестве хозяина для ее экспрессии. Эта экзогенная последовательность ДНК может кодировать рекомбинантные белки или другие представляющие интерес последовательности, как описано в данном описании.
Следует отметить, что с помощью способа настоящего изобретения могут быть получены мутантные штаммы Mhyo с очень разными характеристиками, так чтобы специалист в данной области техники имел свое предпочтение в выборе способа генетической модификации штаммов Mhyo и получения штаммов, обладающих различными функциональными возможностями.
В Примерах 5 и 6 показано, что мутантные штаммы Mhyo, полученные способом настоящего изобретения, неожиданно стабильно включают в себя экзогенную последовательность ДНК, встроенную в вектор-носитель, и экспрессируют ее содержимое, например, путем продуцирования рекомбинантных белков.
Штамм, полученный способом настоящего изобретения, может быть аттенуирован или инактивирован при помощи стандартных процедур, хорошо известных специалисту в данной области техники. Таким образом, он может быть использован для приготовления вакцин. Предпочтительно он используется в инактивированной форме.
Новые штаммы Mhyo, полученные способом настоящего изобретения, ранее не были известны. Их отличительные признаки позволяют получать новые вакцины против Mhyo и одновременно против других патогенов свиней. То есть, мутантные штаммы настоящего изобретения позволяют получать поливалентные вакцины, используя один штамм, трансформированный способом настоящего изобретения.
Вакцины
Целью настоящего изобретения является вакцина для защиты свиней от энзоотической пневмонии свиней, вызываемой Mhyo, и при необходимости от другого заболевания или патологических состояний, вызываемых микроорганизмами, поражающими свиней, содержащая иммунологически эффективное количество мутантного штамма Mhyo настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина содержит фармацевтически приемлемый носитель и при необходимости адъювантный агент.
Штамм в вакцине настоящего изобретения является инактивированным или аттенуированным, предпочтительно инактивированным.
Инактивированная вакцина может быть получена путем инактивации патогенного агента, в данном случае бактерии, как правило, с использованием термической обработки; химических соединений, таких как формальдегид, БЭИ (бинарный этиленимин) или поверхностно-активные вещества; механической силы с применением гомогенизатора и т.д. Инактивация патогенного агента может приводить к сохранению его структуры, но без сохранения способности к репликации, или она может приводить к разрушению или дезинтеграции этой структуры. В контексте настоящего изобретения термин «инактивированная вакцина» включает в себя композицию, содержащую инактивированные бактерии, которые сохраняют свою структуру, а также композицию, в которой структура бактерий была разрушена или дезинтегрована.
Другой целью настоящего изобретения является применение мутантного штамма Mhyo настоящего изобретения для приготовления вакцины против энзоотической пневмонии свиней, вызываемой Mhyo, и при необходимости против других заболеваний или дополнительных патологических состояний, поражающих свиней.
Термин «иммунологически эффективное» означает, что количество бактерий, введенное в процессе вакцинации, является достаточным для того, чтобы вызвать у хозяина эффективный иммунный ответ против инфекции вирулентными формами Mhyo, в случае, если трансформированный штамм Mhyo экспрессирует рекомбинантный белок, который способен индуцировать или способствовать индуцированию защитного ответа против заболеваний или патологических состояний, которые могут поражать свиней. Оно также является достаточным для того, чтобы вызвать у хозяина эффективный иммунный ответ против инфекции, вызванной указанным микроорганизмом.
Вакцина предпочтительно направлена на обеспечение защиты свиней от заболеваний или патологических состояний, таких как, например, те, которые вызываются микроорганизмами Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вирусом свиного гриппа, вирусом контагиозного гастроэнтерита, свиным парвовирусом, вирусом энцефаломиокардита, коронавирусом, ротавирусом, цирковирусом свиней, агентом синдрома послеотъемного снижения веса у поросят, вирусом классической чумы свиней, вирусом африканской чумы свиней, калицивирусом и вирусом гепатита (TTV).
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительным заболеванием является заболевание, известное как ЦАЗС (цирковирус-ассоциированные заболевания свиней), вызываемое цирковирусом свиней типа 2 (ЦВС-2), независимо от того, является ли он единственным агентом или находится в присутствии других сопутствующих патогенов или микроорганизмов.
Вакцина настоящего изобретения также может быть объединена в одном или разных резервуарах с дополнительной вакцинной или антигенной композицией. Дополнительная вакцинная или антигенная композиция предпочтительно направлена на обеспечение защиты свиней от заболеваний или патологических состояний, таких как, например, те, которые вызываются микроорганизмами Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вирусом свиного гриппа, вирусом контагиозного гастроэнтерита, свиным парвовирусом, вирусом энцефаломиокардита, коронавирусом, ротавирусом, цирковирусом свиней, агентом синдрома послеотъемного снижения веса у поросят, вирусом классической чумы свиней, вирусом африканской чумы свиней, калицивирусом и вирусом гепатита (TTV).
Вакцина настоящего изобретения содержит иммунологически эффективное количество бактерий инактивированного или живого штамма Mhyo, который может быть получен способом, описанным в настоящем изобретении.
Как известно, применяемая доза зависит от возраста и массы тела вакцинируемого животного, а также от способа введения.
3
10
6
10
8
9
Подходящие дозы, как правило, находятся в диапазоне от 10 до 10 цветоизменяющих единиц (ЦИЕ), предпочтительно, от 10 до 10 ЦИЕ, и более предпочтительно, от 10 до 10 ЦИЕ.
Животные могут быть вакцинированы в любое удобное время. Дозу вакцины настоящего изобретения предпочтительно вводят в возрасте от 1 до 12 недель, и более предпочтительно, вакцину вводят, начиная с возраста 3 недели. В отдельных случаях для обеспечения удовлетворительной защиты может потребоваться введение дополнительных доз. В таких случаях вторую дозу предпочтительно вводят через 1-5 недель после первой дозы, более предпочтительно, через 3 недели после первой дозы. Предпочтительно вакцина представляет собой однократно вводимую вакцину.
Вакцина настоящего изобретения предназначена для разных групп свиней, в том числе, для откормочного молодняка, хряков, свиноматок и поросят любого возраста или в любой фазе их репродуктивного цикла; предпочтительно она предназначена для свиней, находящихся на стадии откорма, и более предпочтительно для свиней в возрасте от 1 до 12 недель жизни.
Вакцина может быть введена интраназально, внутрикожно, мукозально или субмукозально, подкожно, в виде аэрозоля, внутримышечно или перорально. Предпочтительно вакцину вводят внутрикожно или внутримышечно.
Указанная вакцина может быть получена при помощи стандартных методик, применяемых специалистом в данной области техники для приготовления фармацевтических препаратов, пригодных для различных лекарственных форм, таких как те, которые описаны, например, в руководстве Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].
Как правило, вакцины готовят в форме инъекционных вакцин в виде растворов, эмульсий или жидких суспензий. Также они могут быть приготовлены в твердой форме, пригодной для растворения или суспендирования в жидком носителе перед инъекцией.
Как правило, объем дозы инъекционной вакцины составляет от 0,1 мл до 5 мл, предпочтительно от 0,15 мл до 3 мл и более предпочтительно от 0,2 мл до 2 мл. Как правило, при внутрикожном введении этот объем составляет от 0,1 мл до 0,5 мл, предпочтительно от 0,15 мл до 0,4 мл и более предпочтительно 0,2 мл. При внутримышечном введении этот объем, как правило, составляет от 0,5 мл до 5 мл, предпочтительно от 1 мл до 3 мл и более предпочтительно от 1 мл до 2 мл.
Для иммунизации животного вакциной настоящего изобретения мутантный штамм Mhyo обычно смешивают с фармацевтически приемлемым носителем.
Жидкие носители, которые могут быть использованы для приготовления вакцины, включают в себя, например, воду, солевой раствор с физиологической концентрацией соли или культуральную жидкость, в которой культивируются бактерии.
Кроме того, при необходимости носитель может содержать фармацевтически приемлемые наполнители или вспомогательные вещества, такие как, например, смачивающие агенты, диспергирующие агенты, эмульгирующие агенты, буферные агенты (например, фосфатный буфер), стабилизирующие агенты, такие как углеводы (например, глюкоза, сахароза, маннит, сорбит, крахмал или декстраны) или белки (например, альбумин, казеин, бычья сыворотка или обезжиренное молоко).
Физико-химические свойства наполнителей, а также наименования коммерческих продуктов, под которыми они поступают на рынок, могут быть найдены в книге R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9].
Адъюванты при необходимости также могут быть включены в состав вакцины для повышения ее эффективности. Предпочтительно вакцина настоящего изобретения дополнительно содержит адъювант.
Адъюванты представляют собой неспецифические стимуляторы иммунной системы, которые усиливают иммунологический ответ хозяина против инвазивного патогена. Примерами адъювантов являются: гидроксид алюминия, фосфат алюминия, оксид алюминия, витамин E, сквален, растительное масло, сапонины, женьшень, зимозан, глюканы, диметиламиноэтилдекстран, декстраны, неионные блок-полимеры, полиакрилат (карбомер), полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, мурамил-дипептиды, эмульсии типа В/М, М/В, В/М/В, а также их смеси.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина представляет собой инъекционную вакцину и содержит мутантный штамм настоящего изобретения, инактивированный неионным поверхностно-активным веществом. Предпочтительно для этого используется неионное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, состоящей из алкилфенолэтоксилатов, этоксилированных сложных эфиров сорбитана, этоксилированных жирных спиртов, этоксилированных жирных кислот, алканоламидов жирных кислот, этоксилированных алканоламидов жирных кислот, этоксилированных жирных аминов, оксидов жирных аминов, оксидов жирных амидоаминов, глицеридов жирных кислот, сложных эфиров сахарозы, алкилполигликозидов, сополимеров этиленоксида и пропиленоксида, и этоксилированных и пропоксилированных жирных спиртов; более предпочтительно, оно выбрано из алкилфенолэтоксилатов и этоксилированных сложных эфиров сорбитана, и еще более предпочтительно оно представляет собой алкилфенолэтоксилат, такой как, например, Triton X-100 от компании Dow.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина представляет собой инъекционную вакцину и содержит мутантный штамм настоящего изобретения, инактивированный неионным поверхностно-активным веществом, и в качестве адъюванта эмульсию типа В/М/В, такую как, например, продукт Montanide ISA 201, поставляемый на рынок компанией SEPPIC (Франция).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина может содержать штамм настоящего изобретения в лиофилизированной форме. Процесс лиофилизации выполняется при помощи методов, хорошо известных специалисту в данной области техники.
Набор для вакцинации
Целью настоящего изобретения также является набор для вакцинации, предназначенный для вакцинации свиней против инфекции или заболевания, вызываемого Mhyo, и при необходимости против другого заболевания или патологического состояния, вызываемого микроорганизмами, поражающими свиней.
Указанный набор для вакцинации включает в себя контейнер, содержащий иммунологически эффективное количество мутантного штамма настоящего изобретения или вакцину настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления изобретения набор для вакцинации включает в себя комбинацию вакцины настоящего изобретения и дополнительной антигенной композиции, которые находятся в одном или разных резервуарах. Такая дополнительная антигенная композиция направлена на обеспечение защиты свиней от таких заболеваний или патологических состояний, как те которые упомянуты в разделе Вакцины.
Промышленная применимость настоящего изобретения явно следует из описания. Следует отметить, что ЭПС является широко распространенным в мире хроническим респираторным заболеванием, с которым связаны большие экономические потери в свиноводстве, и что возможность направленной и стабильной генетической модификации штаммов Mhyo позволяет получать вакцины со свойствами, улучшенными по сравнению со свойствами традиционных бактериальных вакцин. Например, аттенуированные мутантные штаммы Mhyo, мутантные штаммы, сверхэкспрессирующие конкретный фактор вирулентности, штаммы, ингибирующие конкретный фактор вирулентности, или штаммы, дополнительно экспрессирующие антигенные компоненты микроорганизмов, ответственных за заболевания, поражающие свиней, которые являются пригодными для приготовления эффективных вакцин против ЭПС и против других патологий свиней, могут быть получены при помощи способа настоящего изобретения.
Впервые осуществленная направленная стабильная генетическая модификация Mhyo позволила авторам настоящего изобретения, в том числе, использовать эти трансформированные штаммы в качестве экспрессионного вектора экзогенных последовательностей ДНК, таких как, например, нуклеотидные последовательности, кодирующие белки для терапевтических или профилактических целей, такие как, среди прочего, белок капсида ЦВС-2. При помощи технологии, раскрытой в настоящем изобретении, были разработаны и получены новые поливалентные вакцинные кандидаты, которые могут применяться для одновременного предотвращения различных заболеваний путем введения одного штамма.
Анализ продуцирования рекомбинантных белков штаммами Mhyo, трансформированными способом настоящего изобретения
Для выявления присутствия белка, экспрессированного экзогенной последовательностью ДНК, в мутантных штаммах Mhyo настоящего изобретения может быть использован метод ELISA.
В частности, для обнаружения присутствия белка капсида ЦВС-2 и его количественного определения в полученных штаммах Mhyo был использован коммерческий набор реагентов, который позволяет проводить обнаружение и приблизительную оценку количества указанного антигена при помощи твердофазного иммунологического (ELISA) анализа.
Белковые экстракты получали после концентрации культуры каждого штамма в экспоненциальной фазе роста и лизиса полученных клеток.
Результаты были положительными, указывая на то, что белки, кодируемые ORF2 или ORF2V2, в большем или меньшем количестве экспрессируются во всех проанализированных штаммах и плазмидах (Фигура 5B).
Штаммы с вариантом, являющимся производным плазмиды pTC3C, также анализировали при помощи электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинга (Фигура 5C). Были обнаружены фрагменты, имеющие молекулярную массу такую же, как белок капсида ЦВС-2.
Можно наблюдать, что фрагменты протеолитической деградации, которые являются распространенной проблемой при экспрессии рекомбинантных белков, отсутствуют в случае данного электрофореза в полиакриламидном геле.
В связи с этим, белок капсида ЦВС-2, рекомбинантным образом экспрессированный в Mhyo, может служить хорошим антигеном при разработке рецептуры поливалентной вакцины. В свою очередь, Mhyo является хорошим хозяином для рекомбинантного синтеза белков.
Анализ вакцинации
Проводили оценку эффективности вакцин, содержащих мутантные штаммы Mhyo, полученные способом настоящего изобретения, где указанные штаммы содержали экзогенную последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, в геноме бактерий, и они экспрессировали указанный белок в цитозоль бактерий.
Таким образом, проводили оценку вакцин, содержащих штаммы 6314Cc1 или 232Cc6, и животных вакцинировали однократной дозой или повторно вакцинировали второй дозой, как описано в разделе Примеры.
Кроме того, в исследование были включены две группы животных: невакцинированная, но инфицированная группа (группа 5), и невакцинированная и неинфицированная группа (группа 6).
Оценивали следующие реакции: иммунологический ответ против Mhyo, иммунологический ответ против ЦВС-2 и нагрузка вирусной ДНК ЦВС-2 в сыворотке крови животных.
На основании результатов анализов вакцинации вакцинами, содержащими мутантные штаммы Mhyo, полученные способом настоящего изобретения, приведенных на Фигурах 6, 7 и 8, было сделано заключение, что трансформированные штаммы Mhyo, экспрессирующие белок капсида ЦВС-2, вызывают значительный иммунологический ответ против Mhyo, и неожиданно против ЦВС-2 и значительное снижение вирусной нагрузки ЦВС-2, вследствие чего они могут использоваться в вакцинах, направленных одновременно против инфекций, вызываемых Mhyo и ЦВС-2.
Также проводили оценку вакцины, содержащей мутантный штамм Mhyo, полученный способом настоящего изобретения, против инфекции ЦВС-2 и Mhyo, где указанный штамм содержал в геноме бактерии экзогенную последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2 и экспрессирующую указанный белок в цитозоль бактерии.
Оценивали вакцину, содержащую штамм 6314Cc1, и животных вакцинировали однократной дозой и инфицировали изолятом ЦВС-2 и патогенным штаммом Mhyo, как описано в разделе Примеры.
Кроме того, в анализ были включены две группы животных: невакцинированная, но инфицированная (группа 2), и невакцинированная и неинфицированная (группа 3).
Оценивали следующие реакции: иммунологический ответ против Mhyo, иммунологический ответ против ЦВС-2, нагрузка вирусной ДНК ЦВС-2 в сыворотке крови животных и Mhyo-подобные патологические изменения в легких животных.
Было обнаружено, что штамм Mhyo, генетически модифицированный способом настоящего изобретения, который экспрессирует белок капсида ЦВС-2, вызывает значительное снижение нагрузки вирусной ДНК ЦВС-2 и уменьшение Mhyo-подобные патологические изменения в легких животных, по сравнению с невакцинированными животными.
Также проводили оценку вакцины, содержащей мутантный штамм Mhyo, полученный способом настоящего изобретения, где указанный штамм содержал репликативный плазмидный вектор, содержащий экзогенную последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2 и экспрессирующую указанный белок в цитозоль бактерии. Как и в предыдущих экспериментах, было обнаружено, что штамм Mhyo, генетически модифицированный способом настоящего изобретения при помощи репликативных плазмид, который экспрессирует белок капсида ЦВС-2, вызывает значительное снижение вирусной нагрузки ЦВС-2.
Изучение степени ослабления мутантных штаммов
Мутанты, полученные после введения в практику способа настоящего изобретения по трансформации штаммов Mhyo, включают в себя штамм 232TC3hlyC, содержащий плазмиду pTC3, встроенную путем транспозиции в область генома, кодирующую фактор вирулентности Mhyo: гемолизин C, кодируемый геном hlyC.
Для оценки степени ослабления указанного штамма, отбирали 8-неделных свиней и разделяли их на две группы по 8 животных в каждой группе. Животных первой группы внутритрахеально инфицировали дозой штамма 232TC3hlyC, а животных второй группы - дозой штамма Mhyo дикого типа (немодифицированный штамм 232 Mhyo).
Животных умерщвляли через 28 дней после заражения и наблюдали, что колонизация носовой области имела место в каждой из двух групп животных, в то время как у 25% животных из группы, инфицированной штаммом дикого типа, имела место бронхиальная колонизация.
Ни у одного животного, инфицированного трансформированным штаммом Mhyo, не наблюдалась бронхиальная колонизация.
Таким образом, трансформированный штамм 232TC3hlyC Mhyo является ослабленным по сравнению с исходным штаммом дикого типа, и в силу этого он может быть использован в качестве вакцинного кандидата в аттенуированной живой вакцине.
Мутантный штамм 6314POGAc4 Mhyo был получен способом настоящего изобретения. Указанный мутантный штамм подавляет экспрессию гена гемолизина 159, так как экзогенная последовательность ДНК, встроенная при помощи репликативной плазмиды (pOGA159), продуцирует антисмысловую РНК, соответствующую гену, кодирующему гемолизин Mhyo. Когда животных инфицировали этим штаммом, было обнаружено, что этот штамм является ослабленным по сравнению с исходным штаммом дикого типа. Указанный мутантный штамм характеризовался пониженной способностью колонизировать верхние и нижние дыхательные пути, а также пониженной способностью вызывать патологические изменения, типичные для ЭПС.
Следующие примеры приведены, с целью дать специалисту в данной области техники достаточно ясное и полное объяснение настоящего изобретения, но они не должны рассматриваться как ограничивающие существенные аспекты его цели, изложенные в предыдущих разделах этого описания.
ПРИМЕРЫ
Технологии рекомбинантных ДНК и методы, применяемые ниже, подробно описаны в руководствах Sambrook and Russell, Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York 5 (2001) и Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998).
Штамм XL1-blue E. coli (Stratagene) использовали в качестве хозяина для векторов на основе плазмид pMTn4001 или pBluescript II SK.
Если не указано иное, то все последовательности ДНК, указанные в плазмидных конструкциях, описанных в этом разделе, происходят из последовательности, депонированной в базе данных GeneBank под регистрационным номером AE017243. Эта геномная последовательность соответствует последовательности штамма J Mhyo, описанного в Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577.
Все олигонуклеотидные последовательности, описанные ниже, записаны в направлении от 5’-конца к 3’-концу, если не указано иное. Во всех ПЦР реакциях использовали термостабильную полимеразу Phusion (Finnzymes), обладающую корректирующей активностью.
Подчеркнутые олигонуклеотидные последовательности указывают на наличие сайта узнавания того фермента рестрикции, который указан в названии каждой из последовательностей.
Пример 1 - Выбор штамма Mhyo
Используемыми штаммами Mhyo дикого типа были штамм 6314, соответствующий вирулентному изоляту Mhyo из Laboratorios Hipra (Amer, Girona, Spain), и штамм 232 из Университета штата Айова (Ames-Iowa-USA).
Пример 2 - Конструирование репликативных плазмид
Пример 2.1 - Конструирование репликативной плазмиды pOG
Для получения репликативной плазмиды в Mhyo, область oriC из Mhyo, амплифицированную при помощи ПЦР, вводили в плазмиду pBluescript II SK. Для этой амплификации использовали олигонуклеотиды 5OriCNotI (ATG CGC GGC CGC TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG) (SEQ ID NO: 9) и 3OriCXbaI (AGT CGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG ATG ATG GAT TC) (SEQ ID NO: 10), и геномную ДНК штамма J Mhyo использовали в качестве матрицы. Полученный фрагмент размером 1,96 т.п.н. затем расщепляли ферментами рестрикции NotI и XbaI. Одновременно с этим, ген устойчивости к гентамицину aac(6’)-aph(2’’) амплифицировали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами 5GmORF (ACT GGG ATC CAT GAA TAT AGT TGA AA ATG) (SEQ ID NO: 11) и 3GmApa (GGA TGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG) (SEQ ID NO: 12), используя плазмиду pIV-T в качестве матрицы. ПЦР-продукт размером 1,8 т.п.н. затем расщепляли соответствующими ферментами рестрикции. Промоторную область гена белка P97 амплифицировали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами 5’p97XbaI (G ATC TCT AGA TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 13) и 3’p97BamHI (GAT CGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT CAA TTA T) (SEQ ID NO: 14), используя ДНК штамма J Mhyo в качестве матрицы. ПЦР-продукт (266 п. н.) затем расщепляли соответствующими ферментами рестрикции. В заключение, эти три полученных фрагмента лигировали в плазмиду pBluescript II SK, предварительно расщепленную ферментами рестрикции XbaI и BamHI, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Колонии, имеющие необходимую конструкцию, выделяли из колоний, полученных в результате трансформации, при помощи анализа набора рестрикционных фрагментов и секвенирования. Одному из положительных клонов присвоили название pOG и отобрали его для следующих этапов (Фигура 1).
Пример 2.2 - Конструирование репликативной плазмиды pOGCRE
Репликативную плазмиду pOGCRE получали путем расщепления плазмиды pOG ферментами рестрикции BamHI и ApaI и выделения фрагмента размером 5,1 т.п.н. Одновременно с этим, ген устойчивости к гентамицину aac(6’)-aph(2’’) амплифицировали при помощи ПЦР из плазмиды pIV-T, используя олигонуклеотиды 5GmORF и 3GmORFSpeI (ACT GAC TAG TAG CTT GCG CAT CAT TGG) (SEQ ID NO: 15), и получали фрагмент размером 1,8 т.п.н., который затем расщепляли ферментами рестрикции BamHI и SpeI. Ген, соответствующий Cre-рекомбиназе, амплифицировали при помощи ПЦР, используя плазмиду pSH62 (Euroscarf) в качестве матрицы и олигонуклеотиды 5CreBglII (ATG CAG ATC TAT GTC CAA TTT ACT GAC CGT ACA CCA AAA TTT G) (SEQ ID NO: 16) и 3CreApaI (ATG CGG GCC CTTA ATC GCC ATC TTC CAG CAG GCG CAC) (SEQ ID NO: 17). ПЦР-продукт (1,0 т.п.н.) расщепляли ферментами BglII и ApaI. В заключение, плазмиду pOG снова расщепляли, на этот раз ферментами рестрикции BamHI и XbaI, и выделяли фрагмент размером 266 п. н., соответствующий промотору гена белка P97. Четыре полученных фрагмента лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Из полученных в результате трансформации колоний путем анализа набора рестрикционных фрагментов выделяли колонии, имеющие необходимую конструкцию. Одному из положительных клонов присвоили название pOGCRE и отобрали для следующих этапов (Фигура 1).
Пример 2.3 - Конструирование репликативной плазмиды pOGC
Для получения плазмиды pOGC плазмиду pBluescript II SK расщепляли ферментом NotI, и после очистки дефосфорилировали ее ферментом щелочная фосфатаза. Одновременно с этим, фрагмент размером 992 п. н. получали путем расщепления синтетического гена ORF2v2 (SEQ ID NO: 5) ферментами рестрикции SpeI и NotI. Используя плазмиду pOGCRE в качестве матрицы, сегмент ДНК амплифицировали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами 3gmORFSpeI и 5OriCNotI, и после очистки этот ПЦР-продукт расщепляли ферментами SpeI и NotI. Три полученных фрагмента лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Положительные клоны выявляли при помощи рестрикционного картирования и секвенирования (Фигура 2).
Пример 2.4 - Конструирование репликативной плазмиды pOGL
Для получения плазмиды pOGL плазмиду pOGC расщепляли ферментами NotI и SpeI, и выделяли фрагменты размером 2,8 т.п.н. и 4 т.п.н. Фрагмент ДНК, соответствующий фрагменту размером 2,8 т.п.н. дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Одновременно с этим, фрагмент размером 2,25 т.п.н. получали путем расщепления плазмиды pTC3L (см. Пример 3.4) ферментами рестрикции SpeI и NotI. Три полученных фрагмента лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Положительные клоны выявляли при помощи рестрикционного картирования и секвенирования (Фигура 2).
Пример 2.5 - Конструирование репликативной плазмиды pOGT
Для получения плазмиды pOGT плазмиду pOGC расщепляли ферментами NotI и SpeI, и выделяли фрагменты размером 2,8 т.п.н. и 4 т.п.н. Фрагмент ДНК, соответствующий фрагменту размером 2,8 т.п.н. дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Одновременно с этим, фрагмент размером 2,23 т.п.н. получали путем расщепления плазмиды pTC3T (см. Пример 3.5) ферментами рестрикции SpeI и NotI. Три полученных фрагмента лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Положительные клоны выявляли при помощи рестрикционного картирования и секвенирования (Фигура 2).
Пример 2.6 - Конструирование репликативной плазмиды pOGA159
Репликативную плазмиду pOGA159 конструировали в два последовательных этапа клонирования. При помощи ПЦР реакции с олигонуклеотидами 5’p97ApaI и 3TetMClaI (TGT TAT CGA TACC GTC GAT GCA CCT CGA GCT AAG TTA TTT TAT TG) (SEQ ID NO: 18), используя плазмиду pMTn4001 в качестве матрицы, амплифицировали фрагмент размером 2,2 т.п.н., соответствующий промотору гена белка P97. Этот ПЦР-продукт расщепляли ферментами рестрикции ClaI и ApaI. Одновременно с этим, используя плазмиду pOG в качестве матрицы, с олигонуклеотидами 5OriCClaI (AGA CAT CGA AAG CTT GAT TAT GCT GAT TGC ATT CTT TCA ATT TG) (SEQ ID NO: 19) и 5OriCEcoRI (AGA GGA AT CC GAT TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG TCT TTT CC) (SEQ ID NO: 20) амплифицировали фрагмент размером 1,9 т.п.н., соответствующий oriC Mhyo. Этот ПЦР-продукт расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и ClaI. Затем фрагмент размером 316 п. н., соответствующий промотору гена белка P97, амплифицировали с олигонуклеотидами 5XbaIpp97 (AGA CTC TAG AAC TAG TGG ATC CCC CGG GCC CCT CGA GGA AGA CTG ATT AGA AAT TTA G) (SEQ ID NO: 21) и 3EcoRIpp97 (AGA CGA ATT CGA ATT CCT GCA GGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT C) (SEQ ID NO: 22). После очистки этот фрагмент расщепляли ферментами EcoRI и BamHI. Последним этапом этого первого процесса клонирования было расщепление плазмиды pBluescript II SK ферментами рестрикции XbaI и ApaI. Эти четыре фрагмента ДНК лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Колонии, имеющие необходимую конструкцию, выделяли из колоний, полученных в результате трансформации, при помощи анализа набора рестрикционных фрагментов. Полученную таким образом новую плазмиду расщепляли ферментом рестрикции EcoRI. На последнем этапе предназначенную для сайленсинга ДНК амплифицировали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами 5ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAC GAA TTA GTG ATT CTG CCT TTT C) (SEQ ID NO: 23) и 3ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAT TAA AGT TGA TTC GGT GTT TAA TC) (SEQ ID NO: 24). Полученные фрагменты ДНК, расщепленные ферментом рестрикции EcoRI и дефосфорилированные при помощи щелочной фосфатазы, лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Колонии, имеющие необходимую конструкцию, выделяли из колоний, полученных в результате трансформации, при помощи секвенирования (Фигура 1).
Пример 3 - Конструирование плазмид для трансформации путем транспозиции
Пример 3.1 - Конструирование плазмиды pTC3 для трансформации путем транспозиции
Плазмиду pMTn4001 (Pich et al., Microbiology 152: 519-527 (2006)) амплифицировали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами 5pMTn4001PstI (CAT GCT GCA GCC CGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AG) (SEQ ID NO: 25) и 3pMTn4001 (GTA CCC AAT TCG CCC TAT AGT GAG TCG) (SEQ ID NO: 26). 5’-конец олигонуклеотида 3pMTn4001 был фосфорилирован. Продукт этой ПЦР реакции (2,98 т.п.н.) расщепляли ферментом рестрикции PstI. Одновременно с этим, промотор гена белка P97 амплифицировали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами 5’p97 (TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 27) и 3’p97BamHI, используя ДНК штамма J Mhyo в качестве матрицы. Этот ПЦР-продукт (280 п. н.) расщепляли ферментом рестрикции BamHI и дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Тот же промотор также амплифицировали при помощи второй пары олигонуклеотидов 5’p97ApaI (GAT CGG GCC CTC GAG GAA GAC TGA TTA GAA ATT TAG AAC T) (SEQ ID NO: 28) и 3’p97BamHI и расщепляли ферментами рестрикции ApaI и BamHI. Ген транспозазы амплифицировали при помощи ПЦР, используя плазмиду pMTn4001 в качестве матрицы и олигонуклеотиды 5’TnpBamHI (GAT CGG ATC CAT GAC CCA AGT ACA TTT TAC ACT GAA AAG) (SEQ ID NO: 29) и 3’TnpApaI (GAT CCT CGA GGG GGG GCC CTT TTA CAC AAT TAT ACG GAC) (SEQ ID NO: 30). Полученный фрагмент размером 978 п. н. затем расщепляли ферментами рестрикции BamHI и ApaI. На последнем этапе фрагмент, соответствующий гену устойчивости к тетрациклину tetM амплифицировали из плазмиды pMTnTetM438 (Pich et al., Microbiology 152:519-527 (2006)), используя олигонуклеотиды 5’TetMBamHI (GAT CGG ATC CAT GAA AAT TAT TAA TAT TGG AGT T) (SEQ ID NO: 31) и 3’TetMPstI (GAT CGC TGC AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTA TCG ATA CCG TCG ATG CAC CT) (SEQ ID NO: 32). Полученный фрагмент размером 1,9 т.п.н. расщепляли ферментами рестрикции SalI и BamHI и дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Пять полученных фрагментов лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Из полученных в результате трансформации колоний колонии, имеющие необходимую конструкцию, выделяли при помощи анализа набора рестрикционных фрагментов и секвенирования. Одному из положительных клонов присвоили название pTC3 и отобрали его для следующих этапов (Фигура 3).
Пример 3.2 - Конструирование плазмиды pTC366 для трансформации путем транспозиции
Эту плазмиду получали непосредственно из pTC3 путем включения двух последовательностей lox66 размером 34 п. н. (ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAC GGT A) (SEQ ID NO: 33), фланкирующих ген устойчивости к тетрациклину. Одновременно с этим, последовательность гена устойчивости к тетрациклину TetMp97 плазмиды TC3 амплифицировали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами 5loxp66Tetp97 (GAT TAA GGG CCC ATA ACT TCG TAT AGG ATA CTT TAT ACG AAG TTA TGT CGA CCC CCT CGA GGA AGA CTG) (SEQ ID NO: 34) и 3loxp66Tetp97 (GGG ACT AGT TAC GGT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TCT GCA GGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CGT CG) (SEQ ID NO: 35), получая ПЦР-фрагмент размером 2,2 т.п.н., который расщепляли ферментами рестрикции ApaI и SpeI. Одновременно с этим, плазмиду TC3 расщепляли теми же ферментами рестрикции и выделяли фрагмент размером 4,4 т.п.н. Эти два фрагмента лигировали при помощи ДНК-лигазы T4, и этой лигазной смесью трансформировали клетки штамма XL1-blue E. coli. Положительный клон, имеющий правильно встроенные последовательности lox66, получивший название pTC366 (Фигура 3), выделяли из колоний, полученных в результате трансформации, путем секвенирования.
Пример 3.3 - Конструирование плазмиды pTC3C для трансформации путем транспозиции
Для получения плазмиды pTC3C плазмиду pTC366 расщепляли ферментами SpeI и NotI. В эту плазмиду клонировали фрагмент размером 992 п. н., полученный путем расщепления синтетического гена ORF2v2 (SEQ ID NO: 5) теми же ферментами рестрикции. Положительные клоны выявляли при помощи рестрикционного картирования (Фигура 3).
Пример 3.4 - Конструирование плазмиды pTC3L для трансформации путем транспозиции
При помощи ПЦР реакции с олигонуклеотидами P46CtFdHindIII (GTG TAA GCT TAA AAA CCA GGA TGC ACA AAA TAA C) (SEQ ID NO: 36) и P46CtRv-NotI (TGT TGC GGC CGC TTT AGG CAT CAG GAT TAT CAA C) (SEQ ID NO: 37), используя геномную ДНК штамма 232 в качестве матрицы, амплифицировали фрагмент размером 1,0 т.п.н., соответствующий 3’-концу гена белка P46. Этот ПЦР-продукт расщепляли ферментами рестрикции HindIII и NotI. Одновременно с этим, используя ту же геномную ДНК в качестве матрицы, фрагмент размером 276 п. н. амплифицировали с олигонуклеотидами P46NtFdSpeI (AGA CAC TAG TTT GAA TTT GTA TTT TCC ATA ATC) (SEQ ID NO: 38) и P46NtRvBamHI (AGA GGG ATC CTG TAA TTG TTG AAG TTG CTG CCT) (SEQ ID NO: 39). Этот фрагмент, соответствующий промотору и 5’-концу гена белка P46, затем расщепляли ферментами рестрикции SpeI и BamHI. На последнем этапе, используя плазмиду pTC3C в качестве матрицы, с олигонуклеотидами CircRv-NotI (TGT TGC GGC CGC TTA TGG TTC TAA 55 TGG TGG ATC) (SEQ ID NO: 40) и Circ2Fd-BamHI (GTG TGG ATC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 41) амплифицировали ген, соответствующий белку капсида ЦВС-2. Этот фрагмент ДНК размером 712 п. н. затем расщепляли ферментами рестрикции NotI и BamHI. Все полученные фрагменты клонировали в плазмиду pTC366, предварительно обработанную ферментами SpeI и NotI. Положительные клоны выявляли при помощи рестрикционного картирования (Фигура 3).
Пример 3.5 - Конструирование плазмиды pTC3T для трансформации путем транспозиции
В этом примере олигонуклеотиды P46NtFdSpeI и P46CIRCRv (ATC TTC TTC TTG GAT ATG TCA TGG CAT CAG GAT TAT CAA CAT TA) (SEQ ID NO: 42) использовали для ПЦР амплификации промоторной области и 5’-конца гена белка P46 из геномной ДНК штамма 232. Полученный фрагмент размером 1,25 т.п.н. расщепляли ферментом рестрикции SpeI. Одновременно с этим, проводили вторую ПЦР реакцию с олигонуклеотидами P46CIRCFd (TAA TGT TGA TAA TCC TGA TGC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 43) и CircRv-NotI, используя pTC3C в качестве матрицы, с получением фрагмента ДНК размеромм 732 п. н. При помощи рекомбинантной ПЦР реакции, в которой вышеуказанные фрагменты использовались в качестве матрицы, с олигонуклеотидами P46NtFdSpeI и CircRv-NotI получали фрагмент размером 2,2 т.п.н. Этот фрагмент расщепляли ферментами рестрикции SpeI и NotI и лигировали в плазмиду pTC366, предварительно расщепленную ферментами SpeI и NotI. Положительные клоны выявляли при помощи рестрикционного картирования и секвенирования (Фигура 3).
Пример 4 - Получение трансформированных бактерий
2
Все продукты и реагенты, используемые в этой методике, стерилизовали путем автоклавирования, фильтрации или облучения. Исходным материалом служила культура Mhyo, находящаяся в экспоненциальной фазе роста. Эту фазу роста предпочтительно получают путем разбавления инокулята в соотношении 1/100 и выращивания культуры в течение примерно 48-144 часов в среде ФризаЛС (20% (об./об.) облученная лошадиная сыворотка, 2,4% (об./об.) дрожжевой экстракт, 0,1% (об./об.) феноловый красный, 0,4% (об./об.) сбалансированный солевой раствор Хенкса, 0,058% (масс./об.) бульон с сердечной вытяжкой, 0,054% (масс./об.) PPLO и ампицилин в конечной концентрации 100 мкг/мл). После получения примерно 40 мл культуры Mhyo в стационарной фазе, содержимое колб с культурой пипетировали 10 раз для отделения клеток и затем культуру фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм для окончательного отделения клеток. Затем клетки центрифугировали в течение 20 минут при 20000×g, ресуспендировали в буфере для электропорации (272 мМ Сахарозы, 200 мМ HEPES, pH 7,2) с добавлением 1 мМ ЭДТА и инкубировали на льду в течение 10 минут. После 10 минут инкубации с ЭДТА повторяли центрифугирование при 20000×g в течение 20 минут и ресуспендировали клетки в объеме от 100 до 300 мкл буфера для электропорации. 20 мкг плазмиды, предварительно растворенной в буфере для электропорации с концентрацией от 0,5 до 2 мкг/мл, и суспензию клеток до конечного объема 100 мкл вносили в 0,2 см кювету для электропорации. При проведении электропорации были установлены следующие значения параметров прибора для электропорации: напряжение 2,5 кВ, сопротивление от 100 до 175 Ω и электрическая емкость 25 мкФ. Как правило, полученное значение «постоянной времени» составляло от 2,3 до 3 мс. После испускания электрического импульса добавляли 900 мкл среды ФризаФБС (с точно такой же рецептурой, как среда ФризаЛС, но с заменой лошадиной сыворотки фетальной бычьей сывороткой) и дополнительных 20 мкг плазмиды. Полученную суспензию инкубировали в течение 20 минут на льду и затем 3 часа при температуре 37°C в атмосфере 5% CO. Спустя 3 часа, полученную суспензию распределяли (примерно 200 мкл на чашку) по чашкам со средой ФризаЛС с добавлением 0,7% (масс./об.) легкоплавкого агара и соответствующего селективного антибиотика (0,5 мкг/мл тетрациклина и/или 10 мкг/мл гентамицина).
2
После 2 или 3 недель инкубации при температуре 37°C в атмосфере 5% CO, трансформированные колонии, полученные на чашках со средой ФризаЛС, выделяли и инокулировали в 50 мл колбы, содержащие 10 мл среды ФризаЛС с добавлением селективного антибиотика в ранее указанных концентрациях. После того как среда изменяла свой цвет (через 10-20 суток после инкубации при температуре 37°C и встряхивании с частотой 150 об./мин), проводили изучение генотипа и/или фенотипа полученных мутантов путем выделения их геномной ДНК или белковых экстрактов, как это хорошо известно любому специалисту в данной области техники.
Примеры 4.1-4.8. - Получение трансформированных мутантных штамов Mhyo
В основном следуя методике, описанной в Примере 4, трансформированные мутантные штаммы Mhyo, представленные в Таблице 1, получали с использованием плазмид, которые также перечислены в этой таблице.
Таблица 1
Пример
Плазмида
Исходный штамм
Трансформированный мутантный штамм
4.1
pTC3C
232
232Cc6
4.2
pTC3C
6314
6314Cc1
4.3
pTC3L
232
232Lc2
4.4
pTC3T
232
232Tc2
4.5
pTC3
232
232TC3hlyC
4.6
pOG
232
232POGc9
4.7
pOGCRE
232
232POGCREc1
4.8
pOGA159
6314
6314POGAc4
Мутантные штаммы, представленные в таблице, были выбраны из различных мутантов, полученных в результате трансформации, проведенной способом настоящего изобретения. Эти штаммы использовали в различных анализах вакцинации и степени ослабления.
Пример 5 - Анализ мутантных штаммов, полученных путем трансформации репликативными плазмидами
Пример 5.1 - Анализ мутантных штаммов, полученных путем трансформации репликативной плазмидой pOG
Трансформированный штамм Примера 4.6 232POGc9 использовали для того, чтобы подтвердить наличие плазмиды в клетках, полученных в результате трансформации на чашках с агаризованной средой Фриза и выращенных на среде ФризаЛС с 10 мкг/мл гентамицина.
Для этого из клеток выделяли тотальную ДНК. Полученную ДНК расщепляли ферментом рестрикции ScaI, что в этом случае приводило к образованию фрагментов, которые могли быть легко идентифицированы в агарозном геле (Фигура 4A).
Наличие фрагментов, соответствующих плазмиде, которые отчетливо выделяются на фоне геномной ДНК, указывает на то, что анализируемый клон содержит плазмиду, и что эта плазмида стабильно реплицируется, образуя 25-30 копий плазмиды на клетку.
Анализ полученных результатов показал, что репликативные плазмиды настоящего изобретения стабильно размножаются в потомстве трансформированных бактерий.
Пример 5.2 - Анализ мутантных штаммов, полученных путем трансформации репликативной плазмидой pOGCRE
Трансформированный штамм Примера 4.7 232POGCREc1 включает в себя ген, кодирующий белок Cre.
Для того чтобы проверить приводит ли введение гетерологичных генов при помощи репликативных плазмид к экспрессии соответствующих белков в обнаруживаемых количествах в Mhyo, тотальный белковый экстракт из колоний, выделенных в экспериментах по трансформации плазмидой pOGCRE, анализировали при помощи электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле с последующим Вестерн-блоттингом для обнаружения наличия Cre-рекомбиназы иммунологическими методами (Фигура 4B).
В этом случае белок Cre был обнаружен только в штамме, который был трансформирован плазмидой pOGCRE, что свидетельствует о применимости репликативных плазмид для гетерологичной экспрессии белков в Mhyo.
Пример 5.3 - Анализ мутантных штаммов, полученных путем трансформации репликативной плазмидой pOGA159
Трансформированный штамм Примера 4.8 6314POGAc4 использовали для того, чтобы подтвердить наличие плазмиды в клетках, полученных в результате трансформации на чашках с агаризованной средой Фриза и выращенных на среде ФризаЛС с 0,5 мкг/мл тетрациклина.
Для этого из клеток выделяли тотальную ДНК. Полученную ДНК анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле, что в этом случае приводило к образованию фрагментов, которые могли быть легко идентифицированы при сравнении с препаратом ДНК, полученным из исходного штамма 6314 (Фигура 4C).
Пример 6 - Анализ мутантных штаммов, полученных при помощи трансформации путем транспозиции
Пример 6.1 - Анализ мутантных штаммов, полученных при помощи трансформации путем транспозиции плазмиды pTC3
Различные трансформированные клоны, полученные путем электропорации плазмидой TC3, анализировали как путем Саузерн-блоттинга, так и прямого секвенирования геномной ДНК, чтобы показать, что устойчивые к тетрациклину мутанты являются результатом наличия транспозонной вставки в бактериальной хромосоме.
Для подтверждения того, что все полученные клоны имеют одну транспозонную вставку, и эта вставка повторно не перемещается после нескольких поколений, проводили Саузерн-блоттинг геномной ДНК клона, полученного с плазмидой pTC3 и получившего название 232TC3hlyC. Этот клон получил такое название, потому что результаты секвенирования показали, что транспозон встроился в кодирующую последовательность гена hlyC (основание 843448 генома штамма 232, регистрационный номер в GenBank AE017332.1). Для этого геномную ДНК штамма 232 и геномную ДНК штамма 232TC3hlyC расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и EcoRV. Полученные фрагменты разделяли в 0,7% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану. Зонд получали с олигонуклеотидами SondaTet-5 (ATG AGT GGA TCC ATG AAA ATT ATT AAT ATT G) (SEQ ID NO: 44) и SondaTet-3 (CTA AGT TAT TTT ATT GAA CAT ATA TCG TAC TTT ATC) (SEQ ID NO: 45) при помощи ПЦР реакции с дигоксигенин-меченным дУТФ, используя плазмиду pTC3 в качестве матрицы. Этот зонд распознает последовательность гена устойчивости к тетрациклину TetM, благодаря чему области генома, в которые произошла вставка транспозона (Фигура 5A), могут быть обнаружены при помощи Саузерн-блоттинга. Количество и размер фрагментов, совпадающие с теоретически ожидаемыми, указывают на то, что мутанты, полученные этим способом, и такие векторы имеют одну копию транспозонной вставки, и что указанная вставка стабильно сохраняется после нескольких поколений.
Пример 6.2 - Анализ мутантных штаммов, полученных при помощи трансформации путем транспозиции плазмиды pTC3C, pTC3L и pTC3T
Было отобрано несколько мутантов, полученных с каждым транспозоном, которые получили названия 6314Cc1, 232Cc6, 232Lc2, 232Tc2. Как упоминалось ранее, было отобрано два мутанта с плазмидой, предназначенной для экспрессии в цитозоле, (один 6314Cc1 для штамма 6314 и другой 232Cc6 для штамма 232), в то время как варианты, предназаначенные для локализации в мембране, были представлены только штаммом 232, такие как мутант 232Lc2 с плазмидой pTC3L и мутант 232Tc2 с pTC3T.
Места вставки цитозольных вариантов транспозонов (pTC3C) в бактериальную хромосому определяли путем прямого секвенирования геномной ДНК. В соответствии с нумерацией оснований в геноме штамма 232 (GenBank AE017332.1), в клоне 6314Cc1 транспозон встроился в основание 224547, а в клоне 232Cc6 транспозон встроился в основание 569253.
Для выявления наличия белка капсида ЦВС-2 и определения его количества в полученных штаммах Mhyo (232Lc2, 232Cc6, 232Tc2 и 6314Cc1), использовали коммерческий набор реагентов (Ingenasa), который позволяет проводить обнаружение и количественное определение указанного антигена при помощи твердофазного иммунологического анализа (ELISA). Белковые экстракты получали после 100-кратной концентрации культуры каждого штамма в экспоненциальной фазе роста и лизиса полученных клеток в ФСБ и Triton X-100 при конечной концентрации 0,1% (об./об.) Результаты были положительными, указывая на то, что все проанализированные штаммы и плазмиды экспрессируют белки, кодируемые кодируемые ORF2 или ORF2V2, в большем или меньшем количестве (Фигура 5B).
Штаммы с вариантом плазмиды pTC3C также анализировали при помощи электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинга (Фигура 5C). Были обнаружены фрагменты с молекулярной массой такой же, как у белка капсида ЦВС-2. Интересным является то, что отсутствуют фрагменты протеолитической деградации, которые являются распространенной проблемой при экспрессии рекомбинантных белков. Все это говорит о том, что белок капсида ЦВС-2, рекомбинантным образом экспрессированный в Mhyo, может служить хорошим антигеном при разработке рецептуры поливалентной вакцины. Также подтверждено, что, Mhyo является хорошим хозяином для экспрессии рекомбинантных белков.
Пример 7 - Анализ вакцинации
Пример 7.1 - Вакцинация и заражение ЦВС-2
Проводили оценку эффективности вакцин, содержащих трансформированные штаммы Mhyo, полученные способом настоящего изобретения, где указанные штаммы экспрессировали в своем цитозоле белок капсида цирковируса ЦВС-2, а животных заражали патогенным штаммом ЦВС-2.
Реакции оценивали по иммунологическому ответу против Mhyo и против ЦВС-2, определяемому при помощи ELISA анализа, и нагрузке вирусной ДНК ЦВС-2 в сыворотке крови животных.
Для эксперимента было отобрано 72 свиньи в возрасте 28 дней, которых случайным образом разделили на 6 групп по 12 животных в каждой.
2
Указанную эффективность оценивали по 2 факторной схеме для четырех групп животных, в которой оцениваемыми факторами были трансформированные штаммы Mhyo и режим вакцинации. В этом эксперименте оценивали вакцины, содержащие штаммы 6314Cc1 и 232Cc6, и животных вакцинировали по схеме с однократной дозой или по схеме с повторной вакцинацией дополнительной дозой.
Экспериментальные группы приведены в Таблице 2:
Таблица 2
Группа
Повторная вакцинация
Штамм
1
Нет
6314Cc1
2
Да
6314Cc1
3
Нет
232Cc6
4
Да
232Cc6
Кроме того, в исследование были включены две группы животных: невакцинированная, но инфицированная группа (группа 5), и невакцинированная и неинфицированная группа (группа 6).
Вакцины содержали мутантные штаммы Mhyo, инактивированные неионным поверхностно-активным веществом, и эмульсию типа В/М/В в качестве адъюванта. Эти вакцины вводили внутримышечно в шею животного.
Схема вакцинации состояла из введения 2 мл дозы вакцины в день исследования 0 всем животным, которые не входили в контрольные группы, и повторной вакцинации половины животных через 14 дней после первой дозы.
Животные в группах 5 и 6 получали 2 мл ФСБ в качестве плацебо в первый день и в 14-й день.
Для получения антигенов для вакцин трансформированные штаммы Mhyo выращивали на среде Фриза с 0,5 мкг/мл тетрациклина при температуре 37°C и встряхивании с частотой от 100 до 200 об./мин, до тех пор, пока не наблюдалось изменение цвета, вызванное изменением значения pH культуральной среды.
10
10
Культуры центрифугировали и дважды промывали ФСБ для получения 30-кратной концентрированной культуры. Антиген, соответствующий трансформированному штамму 6314Cc1 Mhyo, имел титр 9,2 цветоизменяющих единиц/мл (ЦИЕ/мл log), и антиген, соответствующий трансформированному штамму 2324Cc6 Mhyo, имел титр 9,45 ЦИЕ/мл log. Продуцирование белка капсида ЦВС-2 подтверждали при помощи ELISA анализа (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, Spain). Суммарный белок каждого антигена составлял 373 мг/л и 350,2 мг/л, соответственно, и был определен методом окрашивания Кумасси синим.
Антигены инактивировали неионным поверхностно-активным веществом, и эмульсию типа В/М/В, такую как, например, продукт Montanide ISA 201 (SEPPIC, France) в массовом соотношении 50:50, использовали в качестве адъюванта.
Образцы крови отбирали у животных за день до вакцинации (день -1), в день 13 (день перед повторной вакцинацией), день 27 (перед инфицированием) и в дни 7, 14 и 21 после инфицирования, что соответствует дням исследования 35, 42 и 49, соответственно.
Сыворотку крови получали для определения иммунологического ответа против ЦВС-2 при помощи анализа ELISA тест-системы PCV2 Antibody (Biocheck, The Netherlands) и против Mhyo при помощи набора реагентов CIVTEST SUIS Myo (Hipra, Girona-Amer, Spain), а также для анализа виремии ЦВС-2.
Образцы сыворотки крови получали в дни -1, 13 и 27, и так как ожидалось, что они будут отрицательными, их анализировали при помощи стандартной ПЦР, так как описано, например, в Quintana et al., Veterinary Record, 2001, 149, 357-361, в то время как образцы, полученные в дни 7 и 14 после инфицирования анализировали при помощи количественной ПЦР, как описано, например, в Olvera et al., J. Virol. Meth., 2004, 10 117, 75-80.
50
10
Животных из групп 1-5 инфицировали интраназально 2 мл (5,66 ИД/мл log) вирулентного штамма дикого типа ЦВС-2 (Sp-107-54-13 PCV2, Fort et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234) через 28 дней после введения первой дозы вакцины. Животные из группы 6 интраназально получали 2 мл ФСБ в качестве плацебо. Животных умерщвляли на 49-й день исследования, т.е. через 21 день после инфицирования.
Во время полностью слепого рандомизированного исследования инфицирования-вакцинации животные содержались в помещениях 3-го уровня биологической безопасности. Группа 6 содержалась в отдельном помещении для предотвращения перекрестного инфицирования, и поэтому являлась единственной группой, которая была выведена из слепого метода для персонала, отвечающего за уход за животными.
Принимая во внимание, что животные имели материнские анти-ЦВС-2 антитела, группы подвергали экспериментальному воздействию в блоках с учетом этого параметра, чтобы предотвратить начальные различия между группами.
Первичным параметром для оценки эффективности в отношении инфекции ЦВС-2 являлось уменьшение виремии ЦВС-2, определяемое при помощи количественной ПЦР.
Первичным параметром для оценки эффективности в отношении Mhyo являлась сероконверсия, анализируемая при помощи ELISA анализа.
Серологическая реакция на Mhyo показана на Фигуре 6. Четыре тестируемые вакцины вызывали значительную сероконверсию по сравнению с невакцинированными группами (группы 5 и 6), начиная с 13 дня исследования и далее.
После инфицирования ЦВС-2 в вакцинированных группах наблюдался более сильный иммунологический ответ по сравнению с невакцинированной, но инфицированной группой на 14-й день после инфицирования, а также на 21-й день после инфицирования, за исключением группы 4.
В невакцинированной и неинфицированной группе наблюдалось нормальное снижение количества материнских антител к ЦВС-2 с достоверным различием с невакцинированной и инфицированной группой на 21-й день после инфицирования.
Никаких клинических признаков, связанных с инфекцией ЦВС-2, не было отмечено. Экспериментальные модели ЦВС-2 являлись нормальными субклиническими моделями, и ключевым параметром для определения эффективности вакцины являлось уменьшение виремии.
Все животные были ЦВС-2-отрицательными в соответствии с результатами анализа, проведенного перед инфицированием при помощи стандартной ПЦР. На Фигуре 8 показано количество геномных копий ЦВС-2, которое было определено при помощи ПЦР в реальном времени в 7-й и 14-й дни после инфицирования. Ни одной геномной копии ЦВС-2 не было обнаружено в образцах сыворотки крови животных из невакцинированной и неинфицированной группы.
Виремия ЦВС-2 была значительно ниже в вакцинированных группах по сравнению с невакцинированной, но инфицированной группой на 14-й день после инфицирования.
Результаты этого исследования показывают, что штаммы Mhyo, трансформированные способом настоящего изобретения и экспрессирующие белок капсида ЦВС-2, одновременно вызывают значительный иммунологический ответ против Mhyo и против цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2).
Характерный иммунологический ответ против ЦВС-2 у вакцинированных животных был явно выражен на 14-й день после инфицирования, когда развивалась ЦВС-2 инфекция, что следует из виремии ЦВС-2, которая наблюдалась в невакцинированной и инфицированной группе (группа 5).
В отличие от ситуации с Mhyo, присутствие материнских антител к ЦВС-2 препятствует проведению оценки иммуногенности вакцины без экспериментального инфицирования.
Так как клинические признаки, соответствующие макроскопическим патологическим изменениям, вызванным ЦВС-2 инфекцией, не могут быть воспроизведены в экспериментальной модели, результат инфицирования ЦВС-2 оценивали по виремии при помощи количественной ПЦР, и эффективность вакцины рассматривали как уменьшение виремии. Это уменьшение наблюдалось для четырех тестируемых вакцин через 14 дней после инфицирования, когда виремия достигала своего самого высокого уровня.
Таким образом, трансформированные штаммы Mhyo, экспрессирующие белок капсида ЦВС-2, могут использоваться в вакцинах, направленных одновременно против инфекций, вызываемых Mhyo и цирковирусом свиней типа 2 (ЦВС-2).
Пример 7.2 - Вакцинация и заражение ЦВС-2 и Mhyo
Проводили оценку эффективности вакцины, содержащей трансформированный штамм Mhyo, полученный способом настоящего изобретения, где указанный штамм экспрессировал в своем цитозоле белок капсида цирковируса ЦВС-2. Животных заражали патогенными штаммами ЦВС-2 и Mhyo.
Оцениваемыми реакциями были нагрузка вирусной ДНК ЦВС-2 в сыворотке крови животных, количество животных с виремией ЦВС-2 и Mhyo-подобные патологические изменения в легких животных.
Для эксперимента было отобрано 36 свиней в возрасте 28 дней, которых случайным образом разделили на 3 группы по 12 животных в каждой.
Указанную эффективность оценивали для вакцины, содержащей штамм 6314Cc1. Животных группы 1 вакцинировали по схеме с однократной дозой. Кроме того, в исследование были включены две группы животных: невакцинированная, но инфицированная группа (группа 2), и невакцинированная и неинфицированная группа (группа 3).
Вакцина содержала мутантный штамм Mhyo, инактивированный неионным поверхностно-активным веществом, и эмульсию типа В/М/В в качестве адъюванта, и вводили внутримышечно в шею животного.
Схема вакцинации состояла из введения 2 мл вакцины в день исследования 0 всем животным, которые не входили в контрольные группы.
Животные в группах 2 и 3 получали 2 мл ФСБ в качестве плацебо.
Для получения антигенов для вакцины трансформированный штамм Mhyo выращивали на среде Фриза с 0,5 мкг/мл тетрациклина при температуре 37°C и встряхивании с частотой от 100 до 200 об./мин, до тех пор пока не наблюдалось изменение цвета, вызванное изменением значения pH культуральной среды.
10
Культуры центрифугировали и ресуспендировали в ФСБ для получения 25-кратной концентрированной культуры. Антиген, соответствующий трансформированному штамму 6314Cc1 Mhyo, имел титр 9,325 цветоизменяющих единиц/мл (ЦИЕ/мл log). Продуцирование белка капсида ЦВС-2 подтверждали при помощи ELISA анализа (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, Spain).
Антигены инактивировали неионным поверхностно-активным веществом, и в качестве адъюванта использовали эмульсию типа В/М/В, например, продукт Montanide ISA 201 (SEPPIC, France) в массовом соотношении 50:50.
Образцы крови отбирали у животных за день до вакцинации (день -1), в день 13, 21 и 27 после вакцинации и в дни 7, 14, 21 и 28 после инфицирования, что соответствует дням исследования 35, 42, 49 и 56, соответственно.
Сыворотку крови получали для определения виремии ЦВС-2 при помощи количественной ПЦР, так как описано, например, в ранее упомяноутой работе Quintana et al.
50
10
50
10
Каждое из животных из групп 1 и 2 инфицировали интраназально 2 мл (5,33 ИД/мл log) вирулентного штамма дикого типа ЦВС-2 (Sp-107-54-13 PCV2, Fort et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234) и внутритрахеально 10 мл патогенного штамма 3371 Mhyo (7,325 ИД/мл log) через 28 дней после введения вакцины. Животные из группы 3 получали по 2 мл ФСБ интраназально и по 10 мл ФСБ/животное внутритрахеально в качестве плацебо. Животных умерщвляли на 56-й день исследования, т.е. через 28 день после инфицирования, в этот момент оценивали наличие Mhyo-подобных патологических изменений в легких животных.
Во время полностью слепого рандомизированного исследования инфицирования-вакцинации животные содержались в помещениях 3-го уровня биологической безопасности. Группа 3 содержалась в отдельном помещении для предотвращения перекрестного инфицирования, и поэтому являлась единственной группой, которая была выведена из слепого метода для персонала, отвечающего за уход за животными.
Принимая во внимание, что животные имели материнские антитела к ЦВС-2, группы подвергали экспериментальному воздействию в блоках с учетом этого параметра, чтобы предотвратить начальные различия между группами.
Первичным параметром для оценки эффективности в отношении инфекции ЦВС-2 являлось уменьшение виремии ЦВС-2, определяемое при помощи количественной ПЦР. Первичным параметром для оценки эффективности в отношении Mhyo являлась поверхность легких, пораженная Mhyo-подобными патологическими изменениями.
Все животные были ЦВС-2-отрицательными в соответствии с результатами анализа, проведенного перед экспериментальным инфицированием при помощи стандартной ПЦР. На Фигуре 12 показано количество геномных копий ЦВС-2, которое было определено при помощи ПЦР в реальном времени в 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни после инфицирования. Ни одной геномной копии ЦВС-2 не было обнаружено в образцах сыворотки крови животных из невакцинированной и неинфицированной группы. Виремия ЦВС-2 была значительно ниже в вакцинированной группой по сравнению с невакцинированной, но инфицированной группой на 14-й и 21-й день после инфицирования.
На Фигуре 13 показаны те же результаты, выраженные в процентах животных с виремией (положительных по данным количественной ПЦР).
На Фигуре 14 показана медианная поверхность легких, пораженная Mhyo-подобными патологическими изменениями, выраженная в процентах. Было установлено, что пораженная поверхность легких у вакцинированных животных была значительно меньше, чем у невакцинированных, но инфицированных животных (группа 2).
Результаты этого исследования позволяют сделать заключение, что штамм Mhyo, генетически трнасформированный способом настоящего изобретения и экспрессирующий белок капсида ЦВС-2, одновременно вызывает значительное уменьшение виремии ЦВС-2 и Mhyo-подобных патологических изменений, по сравнению с невакцинированными животными.
Таким образом, трансформированные штаммы Mhyo, экспрессирующие белок капсида ЦВС-2, могут использоваться в вакцинах, направленых одновременно против инфекций, вызываемых Mhyo и цирковирусом свиней типа 2 (ЦВС-2).
Пример 8 - Изучение степени ослабления трансформированных мутантных штаммов
Пример 8.1 - Изучение степени ослабления трансформированного мутантного штамма, имеющего транспозонную вставку в ген гемолизина C Mhyo
В этом исследовании степень ослабления мутантного штамма Mhyo, полученного путем транспозиции, определяли путем оценки способности указанного штамма колонизировать верхние и нижние дыхательные пути свиней.
Изучаемый мутантный штамм 232TC3hlyC, полученный в Примере 4.5, имел транспозонную вставку в ген гемолизина C Mhyo (hlyC).
Отбирали свиней в возрасте 8 недель, их случайным образом разделили на 2 группы по 8 животных в каждой, и каждую группу содержали в отдельных помещениях для предотвращения перекрестного инфицирования.
10
Перед инфицированием животных успокаивали. Одну группу животных внутритрахеально инфицировали в день 0 10 мл мутантного штамма 232TC3hlyC, а другую группу 10 мл исходного штамма 232 Mhyo. Инокуляты имели титр 7 ЦИЕ/мл log. Животных умерщвляли на 28-й день исследования.
Назальные образцы отбирали в дни -1 (день перед инфицированием), 8, 15, 21 и 28 для проведения анализа на Mhyo при помощи ПЦР с вложенными праймерами.
Бронхиальные образцы отбирали в день 28 у умерщвленных животных для проведения анализа на Mhyo также при помощи ПЦР с вложенными праймерами.
Не было выявлено ни одного животного, имеющего геномную ДНК Mhyo в назальных образцах, отобранных на протяжении всего исследования. Однако штамм дикого типа 232 Mhyo был обнаружен в 25% бронхиальных образцов животных, в то время как уровень обнаружения для трансформированного мутантного штамма составил 0%.
Этот результат свидетельствует о том, что мутантный штамм 232TC3hlyC обладает ослабленными свойствами по сравнению с исходным штаммом, из которого он был получен, в отношении колонизации нижних дыхательных путей, и поэтому, он может использоваться в качестве аттенуированного кандидата в вакцине против Mhyo.
Пример 8.2 - Изучение степени ослабления трансформированного мутантного штамма, в котором осуществляется подавление экспрессии гена гемолизина 159 Mhyo
Степень ослабления мутантного штамма 6314POGAc4, полученного в Примере 4.8, в котором осуществляется подавление экспрессии гена гемолизина 159 Mhyo, определяли в еще одном исследовании.
Отбирали свиней в возрасте 8 недель, их случайным образом разделили на 3 группы по 8 животных в каждой, и каждую группу содержали в отдельных помещениях для предотвращения перекрестного инфицирования.
10
В день исследования 0 животным из группы 1 внутритрахеально вводили 10 мл штамма 6314POGAc4 с концентрацией 8 ЦИЕ/мл log, и такое же количество исходного штамма дикого типа 6314 вводили животным из группы 2. Перед инфицированием животных успокаивали. Группа 3 являлась неинфицированной контрольной группой. Животных умерщвляли на 28-й день исследования.
Образцы крови отбирали у животных за день до инфицирования (день -1) и в дни 15 и 28. Серологический анализ Mhyo проводили при помощи набора реагентов CIVTEST SUIS Myo (Hipra, Girona-Amer, Spain). Назальные образцы отбирали в дни -1, 8, 15, 21 и 28 для проведения анализа на Mhyo при помощи ПЦР с вложенными праймерами.
Бронхиальные образцы отбирали в день 28 у умерщвленных животных для проведения анализа на Mhyo также при помощи ПЦР с вложенными праймерами.
Оценивали макроскопические катаральные бронхопневмонические изменения легких, соответствующие инфекции Mhyo. Каждую долю легкого оценивали по шкале от 0 до 5 баллов, в зависимости от доли ткани, пораженной патологическими изменениями, вызванными Mhyo.
Вклад каждой доли легкого в общую пораженную поверхность легких вычисляли с применением метода, описанного в Diseases of Swine. 8th Edition. Straw B.E., D'Allaire S., Mengeling W.L. and Taylor D.J. Iowa State University Press, Ames (IA) 1999, page 914.
На Фигуре 9 показана серологическая реакция на инфекцию Mhyo. Можно наблюдать, что только исходный штамм дикого типа (группа 2) вызывает сероконверсию на 28-й день после инфицирования с достоверным различием с группой 1, инфицированной трансформированным мутантным штаммом 6314POGAc4, и контрольной группой.
На Фигуре 10 показано, что Mhyo была обнаружена только в назальных образцах группы 2 на 21-й и 28-й дни после инфицирования. У 8 животных группы 2 Mhyo была обнаружена в бронхиальных образцах, отобранных на 28-й день, в то время как это количество было значительно меньше в группе, которой вводили трансформированный мутантный штамм настоящего изобретения.
На Фигуре 11 можно наблюдать, что макроскопические патологические изменения в легких, вызываемые Mhyo, были значительно большими в группе 2, инфицированной исходным штаммом дикого типа, в то время как животные, инфицированные мутантным штаммом настоящего изобретения, имели меньше патологических изменений, по сравнению с патологическими изменениями, наблюдаемыми в неинфицированной группе.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что трансформированный мутантный штамм настоящего изобретения, исследованный в этом примере, обладает пониженной способностью колонизировать верхние и нижние дыхательные пути, а также пониженной способностью вызывать патологические изменения легких, связанные с ЭПС.
Все это свидетельствует о том, что указанный трансформированный мутантный штамм может использоваться для приготовления аттенуированных вакцин против ЭПС и патологий, связанных с Mhyo.