Общие принципы постановки реакции иммунофлюоресценции для определения видовой принадлежности изолированных клеток животного происхождения

2. Жаров В. В., Куздыбаев А. С. Биофизические методы как новое направление исследований для судебно-медицинского определе-ния давности наступления смерти // Тезисы докладов 1-го Всесоюзного съезда судебных медиков. - Киев, 1976. - С. 256-257.

3. Кан В. Б., Беликов И. Е. Судебная медицина. Курс лекций. - Екатеринбург, 2002. - 115 с.

4. Кишеневский А. Н., Кузнецов Л. Е., Каукаль В. Г. Оптические методы сравнительного исследования влажных минерализатов волос человека// Судебно-медицинская экспертиза. —М., 1972. —№3. — С. 32-36.

5. Найденова Т.В., Вавилов А.Ю. Определение давности пятен крови,расположенных на предметах-носителях тканой природы // Проблемы экспертизы вмедицине. -Ижевск, 2012. —№ 3-4. - С. 19-22.

6. Найденова Т.В., Вавилов А.Ю. О возможности дифференциальной диагностики происхождения крови в пятне от трупа или живоголица// Медицинская экспертиза и право. -Москва, 2013. —№1. — С. 37-39.

7. Шалаев Н. Г. Метод фотоколориметрического исследования в определении давности кровяных пятен: автореф. дисс... канд. мед. наук. - Горький, 1954. - 20 с.

© Ю.Д. Алексеев, Е.Н. Савенкова, 2013 УДК 340.6

Ю.Д. Алексеев, Е.Н. Савенкова ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Кафедра судебной медицины им. М.И.Райского (зав. кафедрой - доц. А.А.Ефимов) ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» В работе установлены общие принципы постановки реакции иммунофлюоресценции на примере клеток буккального эпителия и печени человека, которые включают: систему контроля качества, специфичности, активности, красящего титра и рабочего разведения люминесцирующих сывороток, выявление свободного флюорохрома, выбор фиксации препаратов, буферной смеси, температурных режимов. Указанные этапы постановки РИФ гарантируют стандартизацию исследования и сводят к минимуму неспецифическое связывание флюоресцирующих антител.

Ключевые слова: реакция иммунофлюоресценции, люминесцирующие сыворотки, клетка.

GENERAL PRINCIPLES FOR SETTING IMMUNOFLUORESCENCE REACTION FOR THE DETERMINATION OF A SPECIFIC ACCESSORY OF ISOLATED CELLS OF ANIMAL ORIGIN

Y.D. Alekseev, E.N. Savenkova In setting established general principles for immunofluorescence reaction on the example of buccal epithelium cells and human liver, which include: a quality control system, specificity, activity, coloring and working of breeding titer of luminescing serums of free fluorochrome detection, selection of fixation preparations buffer mixture, temperature regimes. Specified stages guarantee standardization setting RIF research and minimize any non-specific binding fluorescing antibodies. Key words: reaction of immunofluorescence, luminescent sera, cell.

С целью выделения общих принципов постановки реакции иммунофлюоресценции были проведены исследования с клетками буккального эпителия и печени человека.

При разработке методики определения видовой специфичности изолированных клеток требовалось провести эксперименты по оценке качества люминесцирующих сывороток (наличие свободного флюорохрома, красящего титра и рабочего разведения, контроля специфичности и активности), выбора способа фиксации, температурного режима, контрастирования фона препаратов и др.

Известно, что проведение реакции иммунофлюоресценции (РИФ) возможно в трех основных вариантах: прямое окрашивание, непрямое окрашивание, непрямой метод с использованием комплемента. Для окрашивания препаратов использовали отечественные стандартные антивидовые люминесцирующие сыворотки (ЛС) против глобулинов человека, кролика и барана, выпускаемых НИИ эпидемиологии и микробиологии АМН РФ им. Н.Ф. Гамалеи. Они представляют собой лиофилизированную глобулиновую фракцию иммунной сыворотки, связанную (конъюгированную) с флюорохромом флюоресцеинизо-тиоцианатом (ФИТЦ).

Прямая РИФ (или прямое окрашивание) заключается в инкубации объектов с соответствующей ЛС, последующим удалением не прореагировавших антител и учете результатов реакции под люминесцентным микроскопом. Отличается простотой выполнения, но требует для каждого выявленного антигена определенной антивидовой люминесцирующей сыворотки (ЛС).

Непрямая РИФ проводится в два этапа. На первом этапе объекты инкубируют с соответствующей обычной иммунной сывороткой с последующим удалением не прореагировавших антител. На втором этапе реакции препараты окрашивают ЛС, гомологичной белкам сыворотки, примененной на первом этапе. Такой вариант РИФ позволяет с помощью одной сыворотки определить многие антигены.

Непрямой метод с использованием комплемента основан на выявлении с помощью антикомплементарной люминесцирующей сыворотки комплекса антиген - антитело - комплемент. Этот вариант РИФ хотя и обладает наибольшей чувствительностью, однако из-за сложности постановки не нашел широкого применения в биологии и медицине.

Прямой и непрямой способы окрашивания равноценны по чувствительности. Однако, использование прямого метода предпочтительнее в связи с тем, что при этом исключается введение в реакцию дополнительных белков - реагентов, которые могут стать причиной неспецифического свечения объектов.

Диагностическая ценность РИФ, по мнению многих исследователей, зависит от качества приготовленных цитологических препаратов, так как даже незначительные повреждения клеток могут вызвать изменения в параметрах их флюоресценции. Перечисленные в специальной литературе многочисленные методические приемы позволяют получить качественные цитологические препараты, которые, являются малопригодными для изучения видовой дифференцировки изолированных клеток. Это

связано с тем, что в препаратах, приготовленных любым из способов, на поверхности клеток содержалась примесь крови, или слюна, специфические белки которых выявлялись при помощи РИФ даже в очень больших разведениях, и, несомненно, их люминесценция искажала или маскировала картину свечения клеток.

В своей модификации мы избрали наиболее щадящий метод приготовления цитологических препаратов (при наибольшем сохранении в клетках видоспецифического антигена) для дальнейшего их люминесцентного анализа, а также флюориметрии и денситометрии. Данный метод был подробно и неоднократно освящен нами в предыдущих публикациях.

Применительно к исследованию клеток в следах-наложениях на вещественных доказательствах, требовалось также разработать щадящую методику извлечения их из следов с получением качественных цитологических препаратов. В большинстве опубликованных методик рекомендуется выделять изолированные клетки из следов-наложений на орудиях травмы путем смывов или смывов-соскобов (сочетание смыва с механическим отделением клеток от поверхности предмета - носителя), с последующим центрифугированием и приготовлением препаратов. Все эти методики имеют общую сущность и различаются лишь в деталях.

Так, для приготовления смывов-соскобов авторами использовалась подкисленная соляной или уксусной кислотами дистиллированная вода, что позволяло осуществить наиболее полное извлечение и реставрацию клеток. В наших исследованиях эти реактивы не применялись, так как в специальной серии экспериментов был отмечен их разрушающий эффект на видоспецифические белки клеток. Поэтому для выделения клеток из следов-наложений на предметах с невпитывающей поверхностью, мы применяли методику смывов-соскобов физиологическим раствором.

В большинстве методик с использованием РИФ предусмотрена предварительная фиксация изучаемых объектов. Выбор рационального фиксирующего агента и условий проведения фиксации имеет исключительно важное значение, так как фиксатор не должен вызывать деструктивных изменений в клетках, обеспечивая вместе с тем свободное проникновение белка через мембраны, увеличивая их пористость и предотвращая потерю антигенов. Клетки, не подвергнутые фиксации и сохранившие целостность наружной мембраны, не проницаемы для флюоресцирующих антител и приобретают только неспецифическую окраску вследствие диффузии таких низкомолекулярных веществ, как флюорохромы.

В литературе нет единого мнения относительно выбора фиксирующей жидкости при выявлении ви-доспецифического антигена в объектах с помощью РИФ. В зависимости от задач исследований для фиксации клеток применялись этанол, метанол, ацетон, растворы мочевины и формалина и др. Согласно результатам наших опытов, наиболее универсальным фиксатором для поли-сахаридных и белковых комплексов является абсолютный охлажденный ацетон.

Контроль качества ЛС начинали с выявления в них свободного, то есть несвязавшегося с белками ФИТЦ флюо-рохрома методом восходящей хроматографии на бумаге, так как независимо от активности и специфичности ЛС, присутствие в ней свободного флюорохрома приводит к резкому усилению свечения фона препарата и неспецифическому окрашиванию объектов - ложноположительному результату РИФ. Поэтому такие сыворотки подлежали выбраковке.

Специфичность ЛС проверяли двумя способами: путем постановки РИФ с гетерологичными антигенами и

с помощью реакции преципитации (РП) в агаровом геле между сыворотками и гетерологичными антигенами.

Для пр ов ерки специфично сти сыв ороток первым способом, постановка РИФ в прямом варианте осуществлялась с клетками печени трупа человека, кролика, барана, свиньи. Испытуемыми ЛС (античеловеческой, антикроличьей и антибараньей) окрашивали препараты с гомо -, и гетерологичными сыворотками. Оказалось, что античеловеческие ЛС некоторых серий при прямом окрашивании РИФ, реагировали не только с антигенами человека, но и с антигенами клеток барана и кролика, то есть эти сыворотки оказались не специфичными. При постановке РИФ с сыворотками других серий, в препаратах ярко-зеленое свечение наблюдалось лишь при взаимодействии антител только с гомологичными антигенами, что подтверждало специфичность этих сывороток. Реакцию преципитации между ЛС и гомо - и гетерологичными антигенами проводили в агаровом геле (агар фирмы <^1&о»).

В связи с наличием во многих из имеющихся в нашем распоряжении ЛС гетерологичных антител, применяли метод специфической абсорбции их на соответствующих антигенах, в результате получали высокоспецифичные ЛС, которые как в прямом, так и в непрямом вариантах РИФ, взаимодействовали только с гомологичными антигенами. Использование реакции преципитации для контроля специфичности ЛС является, по нашему мнению, более объективным способом, чем постановка РИФ с гетеро-логичными антигенами, так как результаты реакции не зависят от активности и красящего титра ЛС, а также возможного неспецифического связывания перегруженных флюорохромами сывороток с белками клеток.

Определение активности (титра антител) ЛС осуществляли с помощью реакции преципитации в агаровом геле (техника постановки реакции такая же, как и при установлении специфичности сывороток). Были отобраны наиболее активные в иммунологическом отношении ЛС. Остальные серии сывороток из дальнейшей работы были исключены из-за риска получения ложноположительных результатов вследствие низкого титра специфических антител.

Завершающим этапом подготовки ЛС к постановке РИФ, являлось определение их красящего титра - наибольшего разведения, при котором отмечается яркая люминесценция комплекса антиген-антитело, и рабочего разведения, в два раза меньшего, чем красящий титр, которое используют при введении сывороток в РИФ.

Красящий титр ЛС обычно не соответствует титру антител, а зависит, от количества связанного с глобулинами флюорохрома (ФИТЦ), которое может быть различным. Часто ЛС могут иметь высокую серологическую активность и вместе с тем отличаться низкой окрашивающей способностью. Для уменьшения вероятности неспецифического окрашивания необходимо использовать в РИФ люминесцирующие сыворотки в рабочем разведении. Красящий титр ЛС определяли путем постановки РИФ в прямом варианте с печеночными клетками человека, кролика и барана. При люминесцентной микроскопии препаратов отмечали наибольшие разведения сывороток, с которыми регистрировалось отчетливое специфическое свечение клеток, то есть фиксировали красящий титр ЛС.

При постанове РИФ, как и других иммунологических реакций, широко используются буферные растворы (БР), значение рН и солевой состав которых обеспечивает хорошую растворимость и подвижность молекул иммуноглобулинов, их быструю диффузию через поры фиксированных клеток. Кроме того, рН БР является важным фактором, влияющим на интенсивность специфической люминесценции изолированных клеток. Учитывая это,

были проведены специальные исследования с целью изучения влияния состава и рН некоторых буферных растворов на результаты РИФ.

Объектами исследования в постановке реакции РИФ в прямом и непрямом вариантах являлись изолированные клетки буккального эпителия. В изучаемых под люминесцентным микроскопом препаратах учитывалась степень интенсивности свечения клеток и фона, как при положительных, так и при отрицательных результатах реакции.

Установлено, что при инкубации клеток с гомологичной иммунной сывороткой наибольшая яркость свечения наблюдалась при разведении ЛС фосфатным буфером при рН 7,0 - 8,0. Невысокая яркость свечения объектов при разведении ЛС ацетатным буфером обусловлена с одной стороны, низкими значениями рН, а с другой - гасящим люминесценцию влиянием ацетат - иона. Была отмечена низкая интенсивность свечения при разбавлении ЛС водопроводной и дистиллированной водой. Небольшая яркость свечения клеток при использовании трисбуфера обусловлена способностью его основного компонента тригидроксиметиламинометана гасить люминесценцию.

Механизм связывания антител с антигенами представляет собой сложный абсорбционно-химический процесс, скорость которого во многом зависит от воздействия различных факторов, в том числе и от температуры инкубации с сыворотками. Выбор температурных режимов и времени продолжительности взаимодействия антител с антигенами являются одними из условий, сказывающихся на результатах иммунологических реакций.

При всех изученных температурных режимах с увеличением времени инкубации наблюдался рост люминесценции клеток до определенного предела, достигнув которого, яркость свечения становилась постоянной (практически равной при всех испытанных температурах) и не зависела от последующего времени контакта сывороток с объектами. При этом, чем выше была температура, тем через меньший промежуток времени наступал момент стабилизации интенсивности свечения. Скорость реакции взаимодействия видоспецифического антигена с соответствующими сыворотками пропорциональна температуре (то есть насыщению их флюорохромами) через определенное время инкубации, является следствием соединения ЛС практически со всеми видовыми антигенами.

Т. о., момент установления наиболее высокой яркости свечения клеток, по существу, служит показателем завер-

шения реакции антиген-антитело и соответствует оптимальному времени инкубации объектов с сыворотками.

Помехами при оценке результатов РИФ могут оказаться остатки не прореагировавших антител, которые нередко сорбируются в складках, царапинах и толстых участках мазков, а также на поверхности клеток и могут внешне напоминать скопления специфически реагирующего антигена. Для устранения данных артефактов и получения видоспецифического окрашивания антигена в клетках необходимо тщательное отмывание препаратов.

При визуальной оценке яркости свечения клеточных элементов в РИФ исследователь может встретиться с разнообразной по характеру интенсивности аутолю-минесценцией, то есть способностью клеток светиться при освещении их УФЛ без предварительной окраски. Так, изменения рН среды, температуры, механические повреждения клеток, влияющих на структуру их белков, приводят к изменениям параметров аутолюминесценции.

При правильном приготовлении и фиксации препаратов, соблюдении режимов окраски клетки имеют слабо выраженную аутолюминесценцию зеленовато-серого цвета, которая не влияет на оценку результатов РИФ. Однако, собственная люминесценция зеленого или близкого к нему цвета, может препятствовать или затруднять диагностику видового происхождения объектов. Для преодоления этого явления возможно применение ЛС, меченых не ФИТЦ, а производными родамина (оранжево-красное свечение). Большое распространение для гашения аутолюминесценции получил способ контрастирования препаратов растворами бычьего альбумина, меченого родамином (БАМР), реагента способного неспецифически окрашивать изучаемые объекты в оранжево-красный цвет. При постановке РИФ с окрашенными БАМР препаратами, на оранжево-красном фоне отчетливо выделяются участки зеленой специфической люминесценции. Контрастирование препаратов БАМР полностью устраняет аутолюминесценцию и не оказывает влияния на результаты РИФ при определении видовой принадлежности изолированных клеток.

Разработанная система контроля качества ЛС, включающая выявление свободного флюорохрома, проверку специфичности, активности, красящего титра и рабочего разведения, выбор фиксации препаратов, буферной смеси и температурных режимов гарантирует стандартизацию исследования и сводит к минимуму неспецифическое связывание флюоресцирующих антител.

© Н.С. Стрелков, 2013 УДК 618.6-053.3-08-06:612.56

Н.С. Стрелков1, Ф.К. Тетелютина2, Н.А. Уракова1,2,3 ТЕМПЕРАТУРА ТЕЛА МАТЕРИ И НОВОРОЖДЕННОГО КАК ИНДИКАТОР БЕЗОПАСНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ

1Кафедра хирургических болезней детского возраста (зав.кафедрой - проф. В.В. Поздеев) ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия»;

2Кафедра акушерства и гинекологии ФПП и ПК (зав. кафедрой - проф. Ф.К. Тетелютина) ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия»;

3Отдел деформированного твердого тела (зав. - проф. В.Б.Дементьев) ФГБУН «Институт механики Уральского отделения РАН»

Изменение теплоизлучения тканей при взаимодействии их с лекарственными средствами предложено рассматривать в роли универсального критерия локальной безопасности лекарства при его введении в организм матери, плода и новорожденного. Показано, что температура тканей в месте введения безопасного лекарственного средства может снижаться на короткий промежуток времени, но затем нормализуется. Лекарства, обладающие раздражающим или прижигающим действием, вызывают длительную локальную гипертермию.

Ключевые слова: температура, лекарство, локальная гипертермия, лекарственная ятрогения, постинъекционный абсцесс.