Исследование активности эндогенных и экзогенных ферментов при получении препаратов из молок различных видов рыб и моллюсков

2001

Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра

Том 129

Ю.М.Позднякова, Т.Н.Пивненко, Л.М.Эпштейн, Ю.И.Касьяненко

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ПРЕПАРАТОВ ИЗ МОЛОК РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ РЫБ И МОЛЛЮСКОВ

В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные оли-гонуклеотиды (ОН) являются объектами пристального исследования в качестве лекарственных препаратов и БАД (Машковский, 1993; Касья-ненко и др., 1997; Пат. № 2049479). Для получения препаратов ДНК молоки рыб являются наиболее перспективным сырьевым источником. Сейчас биопрепараты производятся из молок лососевых и осетровых видов рыб (Пат. № 915446; Пат. № 2078581). Механизм стимулирующего действия ДНК и ОН весьма сложен и не исследован досконально, однако имеющиеся современные данные позволяют говорить о том, что он не связан с комплементарностью геному модельных тест-вирусов, а осуществляется путем связывания с рецепторами макрофагов (Карамы-шева и др., 1998; Рыкова и др., 2001). Отмечается, что введение животным ДНК млекопитающих не вызывает развития специфического гуморального ответа, тогда как при введении бактериальной ДНК Е. coli формируется иммунный ответ. Нашими исследованиями показано, что низкомолекулярная ДНК из молок лососевых в качестве БАД является мягким иммуностимулятором, а также повышает умственную и физическую работоспособность. При этом усиление работоспособности обеспечивает только ДНК из лососей, для других видов рыб такого свойства не наблюдалось (Касьяненко и др., 1997). Очень долго существовало ошибочное представление о том, что резорбция интактных макромолекул невозможна. В настоящее время доказано, что многие макромолекулы резорбируются из кишечника в кровь в комплексе с транспортными белками, не теряя фармакологической активности (Liebow and Rothman, 1975; Seifert, 1988). Как один из способов повышения биодоступности препаратов ДНК можно использовать ферментативный гидролиз исходного сырья. В состав гидролизатов входят ОН, низкая молекулярная масса которых обеспечивает образование более прочных комплексов с клеточными рецепторами.

При получении ферментативных гидролизатов из молок одной из задач является определение активности и специфичности ферментов, участвующих в гидролизе ДНК (экзогенных, входящих в состав комплексных ферментных препаратов, и эндогенных, содержащихся в молоках). В условиях получения ферментативных гидролизатов (рН 8, температура 37 оС и др.) в процессе расщепления ДНК участвуют щелочные

197

значение нуклеазной активности. Это может быть связано с деструкцией нуклеазных ферментов под действием протеаз, но наиболее вероятно зависит от источника получения ферментных препаратов.

Таблица 1

Активность нуклеаз и протеаз в ферментных препаратах различного происхождения

Table 1

Activity of nucleases and proteases in enzyme preparates of various derivation

Нуклеазная Протеолитическая Соотношение

Препарат активность, активность, активности

Е/мг Е/мг нуклеаз и протеаз

Пилорин 12,1 0,185 65,4

Гепатопанкреатин 16,3 0,300 54,3

Панкреатин 7,3 0,212 34,4

Мегатерин 4,4 1,048 4,19

Высокий показатель соотношения активностей соответствует препаратам, выделенным из панкреатических органов. Мегатерину (получен из клеточных культур B. megaterium) соответствует самый низкий показатель соотношения активностей.

В процессах выделения нуклеиновых компонентов из различных тканей и особенно молок (включая получение низкомолекулярной ДНК, ферментолизатов, нуклеотидов и др.) важную роль играют ферменты эндогенного происхождения. Они начинают действовать на первой стадии обработки молок, при гомогенизации и экстракции.

Активность и субстратная специфичность эндогенных ферментов в значительной мере определяют скорость процесса с участием экзогенных препаратов, а также влияют на молекулярный состав продуктов реакции. Поэтому прежде чем использовать новое сырье, необходимо определить содержание в нем ДНК, а также установить наличие ферментов, участвующих в гидролизе. Для исследований нами были взяты молоки различных видов рыб и беспозвоночных. По нашему мнению, при определении перспектив использования новых сырьевых источников для получения нуклеиновых кислот и их производных очень важными являются такие показатели, как протеолитическая и нуклеазная активность, а также содержание ДНК (табл. 2).

Таблица 2

Активность нуклеаз и протеаз в молоках гидробионтов

Table 2

Activity of nucleases and proteases in milts of hydrobionts

Объект Нуклеазная Протеолити- Соотношение Содержание ДНК, %

активность, ческая активность, активности

Е/г Е/г нуклеаз и протеаз

Горбуша 63,0 0,272 231,6 5,00

Сельдь 160,0 0,455 351,6 4,50

Треска 85,3 3,2 26,6 3,75

Навага 36,1 3,2 11,3 3,40

Минтай 0 0,128 0 3,00

Макрурус

малоглазый 124,8 1,8 69,3 2,40

Лемонема 6,7 0,825 8,1 3,60

Акула-катран 20,5 0 - 2,13

Гребешок 0 0 - 3,00

Осьминог 0 0 - 1,19

Отмечено отсутствие и нуклеазной, и протеолитической активности в гонадах гребешка и осьминога. Возможно, нуклеазы, содержащиеся в ткани гонад гребешка и осьминога, относятся к кислым дезоксирибонук-леазам (ДНКаза II), отличаются другим оптимумом рН (4-5) или не требуют присутствия ионов магния и кальция. Тем не менее в условиях проведения ферментативного гидролиза не происходит деградации нуклеиновых кислот. Не обнаружено нуклеазной активности и в молоках минтая. Протеолитическая активность отсутствует в молоках акулы-катрана. Близкие значения нуклеазной активности обнаружены в молоках горбуши, трески и наваги, а также сельди и макруруса.

Можно предположить наличие взаимосвязи эндогенной активности протеаз и нуклеаз, содержащихся в молоках различных видов рыб. По некоторым данным, ядерные эндонуклеазы, содержащиеся в различных органах, например в ядрах печени крыс (Лебедева и др., 1995), образуются из высокомолекулярного предшественника и активируются под действием протеаз. Этим объясняется множественность ядерных эндо-нуклеаз, выделенных из печени крыс различными исследователями.

Содержание ДНК в молоках трески, наваги, минтая, лемонемы и гребешка достаточно высоко для получения биологически активных добавок, но отсутствие активности эндогенных ферментов в молоках гребешка и минтая заметно снижает степень гидролиза нуклеиновых кислот. Нами проводилось исследование нуклеотидного состава препаратов ДНК и гидролизатов, полученных из молок горбуши и минтая (Позднякова и др., 1999), которое показало, что в условиях получения препарата низкомолекулярной ДНК на первых стадиях - гомогенизации и экстракции - из молок горбуши происходит образование небольшого количества низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот, включающих от 1 до 20 мономеров, а при получении препарата ДНК из молок минтая этого не наблюдается (табл. 3). Даже после воздействия экзогенных дезоксирибонуклеаз в молоках минтая не обнаружено низкомолекулярных компонентов, в то время как в гидролизатах молок горбуши присутствует большое содержание олигонуклеотидов. Таким образом, способность к ферментативной деструкции нуклеиновых кислот и ферментов из молок рыб определяется активностью не только экзогенных, но и эндогенных ферментов.

Таблица 3

Изменение нуклеотидного состава молок под действием эндогенных и экзогенных дезоксирибонуклеаз

Table 3

The change of nucleotide compositions of milt under action endogenic and exogenous deoxyribonucleases

Нуклеотидный состав тт

л Нуклеазная

Объект До внесения После внесения J „ ,

. . активность, h/г

экзогенных ферментов экзогенных ферментов

Мономеры + +

Молоки Ди-, тетрамеры + ++

горбуши 16-20-меры + +++ 63

>50 +++ +

Мономеры - -

Молоки Ди-, тетрамеры - -

минтая 16-20-меры - - 0

>50 +++ +++

Примечание. "-" - отсутствуют, "+++" - максимальное значение.

200

Пат. № 2049479. Способ получения вещества, обладающего противовирусной активностью / Ю.П.Вайнберг, Э.Н.Каплина, Д.Н.Носик, Н.Н.Носик. -Заявлено 10.12.93; Опубл. 10.12.95.

Пат. № 915446. Способ получения ДНК из молок рыб / М.А.Гаймула, В.Х.Кална, У.Я.Микстайс, Л.М.Эпштейн (СССР). - Заявлено 10.10.80; Опубл. 01.07.91.

Пат. № 2078581. Способ стимуляции лейкопоэза / И.Д.Трещалин, Д.А.Бодягин, Э.Р.Переверзева, А.Б.Сыркин, А.В.Асафов, В.В.Безюлев, Е.М.Тре-щалина. - Заявлено 11.10.93; Опубл. 10.05.97.

Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Влияние ферментативного гидролиза на нуклеотидный состав молок различных видов рыб // Изв. ТИНРО. - 1999. - Т. 125. - С. 147-151.

Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему // Успехи современной биологии. - 2001. - Т. 121. - № 2. - С. 160-171.

Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. - М.: МГУ, 1989. - 163 с.

Соколова И.А., Ходарев Н.Н., Александрова С.С., Вотрин И.И.

Выделение и исследование Ca/Mg - зависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека // Биохимия. - 1988. - Т. 53, № 7. - С. 1163-1173.

Hashida T., Tanaka Y., Matsunamu N. et al. Purification and properties of bull seminal plasma Ca2+, Mg2+ - dependent endonuclease // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257, № 21. - P. 13114-13119.

Junowicz E., Spenser J.H. Studies on bovine pancreatic deoxyribonu-clease A 1. General properties and activation with different bivalent metals // Biochim. et biophys. acta. - 1973. - Vol. 312, № 1. - P. 72-84.

Liebow C., Rothman S.S. Enteropancreatic circulation of digestive enzymes. - Science. - 1975. - Vol. 189. - 472 p.

Nakamura M., Sakani Y., Watanabe N., Takagy Y. Purification and characterization of the Ca2+ plus Mg2+ - dependent endodeoxyribonuclease from calf thymus chromatin // J. Biochem. - 1981. - Vol. 89, № 1. - P. 143-152.

Seifert J. Zusammenstellung der Versuchsergebnisse zur Resorption von 1251-markierten Verdauungsenzymen. Kiel: Institut fur experimentelle Chirurgie der Universitat Kiel, 1988.

Поступила в редакцию 18.05.2001 г.