ОДНОФОТОННЫЙ СПЕКТРОМЕТР
SINGLE-PHOTON SPECTROMETER

Притязание на приоритет
Данная заявка притязает на приоритет предварительной патентной заявки США №61/000,320, поданной 25 октября 2007 г.
Раскрытое здесь изобретение выполнено при государственной поддержке с источником финансирования Award Number R21HG00371702 от Национального института исследования генома человека. Соответственно, правительство США имеет определенные права на это изобретение.
Область техники
Настоящее изобретение относится к системам датчиков и, в частности, к системам однофотонных датчиков и способам регистрации и анализа многоцветного флуоресцентного излучения от биологических образцов, помеченных множественными флуоресцентными маркерами. Системы датчиков и способы регистрации включают в себя блок разделения оптических спектров, блок регистрации и алгоритмы обработки сигнала для собранных данных.
Уровень техники
Существует ряд методов регистрации флуоресценции на основе регистрации отдельных фотонов. Такие методы обычно называются методами однофотонной регистрации (SPD). Ввиду их сложности и дороговизны в биомедицинских применениях методов однофотонной регистрации в основном используются для флуоресцентной спектроскопии или регистрации с разрешением по времени отдельных флуоресцентных молекул.
RESPONSE
RESPONSE
RESPONSE
6
7
Согласно блок-схеме, показанной на фиг.1, традиционный однофотонный детектор состоит из нескольких модулей, включая однофотонный датчик или детектор на основе фотоэлектронного умножителя (ФЭУ), импульсный усилитель, формирователь импульсов, счетчик и компьютер. В настоящее время фактором, ограничивающим производительность однофотонных детекторов, является относительно узкий динамический диапазон линейности имеющихся устройств отсчета фотонов. Динамический диапазон детектора определяется временем реакции, τ, необходимым детектору для реагирования на отдельный фотон. Величина τ зависит от времени реакции всех модулей устройства и обычно рассматривается как сумма времен реакции отдельных модулей. Согласно графику, показанному на фиг.2, на практике кратчайшее время реакции в современных однофотонных датчиках составляет около 1 нс. Однако традиционные однофотонные детекторы ФЭУ с данным τ имеют динамический диапазон в пределах 10-10 фотоотсчетов в секунду.
В биологических применениях и, в частности, в регистрации ДНК современные системы секвенирования ДНК не способны обрабатывать и регистрировать сверхвысокоскоростное секвенирование ДНК. В действительности традиционные секвенсоры ДНК ограничены процессом записи секвенирования с частотой 10-30 кадров в секунду. Кроме того, динамический диапазон традиционных ДНК-машин ограничен 16 битами. Традиционное оборудование для последовательного разведения стандарта секвенирования ДНК BigDye имеет чувствительность, по меньшей мере, в 10 раз меньше желаемой.
7
8
Соответственно, требуются датчики, включающие в себя однофотонные детекторы, в которых счетчики фотонов имеют диапазон линейности свыше 10 фотоотсчетов в секунду, например до 10 фотоотсчетов в секунду, возможность обработки секвенирования ДНК свыше 10-30 кадров в секунду и значительно более чувствительный стандарт секвенирования ДНК BigDye. Спектрометры на основе многоканальных однофотонных детекторов, например на основе 32-канального датчика ФЭУ, обеспечивают очень точную, высокоскоростную регистрацию многоцветного излучения. В частности, такие детекторы демонстрируют высокоточное и быстрое распознавание комбинаций флуоресцентных компонентов и высококачественную регистрацию секвенирования ДНК.
Сущность изобретения
7
Волоконный спектрометр, чувствительный к отдельным фотонам, на основе 32-канального датчика ФЭУ имеет высокую чувствительность и широкий динамический диапазон регистрации. Спектрометр обеспечивает точные и высокоскоростные регистрацию, идентификацию и анализ биологических образцов, помеченных множественными флуоресцентными маркерами, например составами многоцветных сигналов флуоресценции или излучения, излучаемых множественными флуоресцентными красителями. Волоконный оптический вход спектрометра позволяет легко и эффективно подключаться к любой измерительной системе на основе волоконного сбора анализируемой флуоресценции. Спектрометр обеспечивает высокоточное секвенирование ДНК. 32-канальный однофотонный детектор ФЭУ имеет динамический диапазон регистрации более 20 битов и имеет частоту кадров около 3300 кадров в секунду. Динамический диапазон пикселей детектора может достигать 10 фотоотсчетов в секунду и допускает увеличение в 10 раз.
RESPONSE
Методы обработки сигнала применяются с эффективным увеличением динамического диапазона многоканальных детекторов для обеспечения регистрации и распознавания комбинаций множественных флуоресцентных компонентов. В одном варианте осуществления описан датчик флуоресценции, который способен измерять излучение отдельного фотона, излучаемого смесями небольших количеств множественных флуоресцентных красителей, и очень точно определять состав отдельных красителей в смеси красителей. Такой датчик, или однофотонный детектор, включающий в себя 32-канальный ФЭУ, импульсный усилитель, компаратор и счетчик, может иметь времена τ, меньшие или равные 1 нс, например 0,1 нс или 0,01 нс. Применяются алгоритмы обработки сигнала, обеспечивающие точное разделение сигналов флуоресценции, излучаемых отдельными флуоресцентными красителями.
В частности, приведенные здесь варианты осуществления предусматривают:
оптические волокна, передающие полихроматический свет на разделитель спектров света;
по меньшей мере, один многоканальный фотодатчик, причем каждый канал фотодатчика имеет фоточувствительные пиксели, предназначенные для приема разных спектров света от разделителя спектров света и для создания импульсов тока в ответ на отдельные фотоны принятых спектров света;
многоканальный усилитель, причем каждый канал усилителя предназначен для приема импульсов тока, соответствующих спектрам света от соответствующего одного из каналов датчика многоканального фотодатчика и для усиления импульсов тока;
многоканальный счетчик фотонов, причем каждый канал счетчика предназначен для приема усиленных импульсов тока от соответствующего одного из каналов усилителя многоканального усилителя, причем многоканальный счетчик фотонов имеет интегратор, предназначенный для суммирования усиленных импульсов тока на каждом канале счетчика в течение заранее определенного интервала времени.
Также предусмотрен способ идентификации последовательностей ДНК, содержащий этапы, на которых:
маркируют выбранные фрагменты ДНК флуоресцентными красителями;
вводят фрагменты ДНК в оптоволоконный разделительный капилляр;
освещают маркированные фрагменты ДНК в оптоволоконном разделительном капилляре лазерным светом заранее определенной длины волны для создания спектров флуоресценции из фрагментов ДНК;
освещают оптическое волокно спектрами флуоресценции из фрагментов ДНК, причем оптическое волокно переносит спектры флуоресценции на разделитель спектров света, выход разделителя спектров света падает на, по меньшей мере, один многоканальный фотодатчик, причем каждый канал фотодатчика имеет фоточувствительные пиксели, предназначенные для приема разных спектров света от разделителя спектров света и для создания импульсов тока в ответ на отдельные фотоны каждой отдельной длины волны разных спектров света.
Также предусмотрен способ регистрации микрочастиц с цветовой кодировкой, содержащий этапы, на которых:
маркируют микрочастицы флуоресцентными красителями;
взвешивают меченые микрочастицы в буферной жидкости;
пропускают буферную жидкость с мечеными микрочастицами через оптоволоконный капилляр с заранее определенной скоростью;
освещают меченые микрочастицы в оптоволоконном капилляре лазерным светом для создания спектров флуоресценции от них;
освещают оптическое волокно спектрами флуоресценции от меченых микрочастиц, причем оптическое волокно переносит спектры флуоресценции на разделитель спектров света, выход разделителя спектров света падает на, по меньшей мере, один многоканальный фотодатчик, причем каждый канал фотодатчика имеет фоточувствительные пиксели, предназначенные для приема разных спектров света от разделителя спектров света и для создания импульсов тока в ответ на отдельные фотоны каждой отдельной длины волны разных спектров света.
Краткое описание чертежей
Для лучшего понимания настоящего изобретения обратимся к нижеследующим чертежам, в которых:
фиг.1 - блок-схема традиционного однофотонного датчика;
фиг.2 - график, демонстрирующий импульсы, измеренные непосредственно из одного канала коммерческого 32-канального ФЭУ;
фиг.3 - блок-схема датчика, чувствительного к отдельным фотонам;
фиг.4 - схема модуля спектрального разделения;
фиг.4A - чертеж в перспективе модуля спектрального разделения, показанного на фиг.4;
фиг.5 - чертеж в перспективе двойного модуля спектрального разделения, имеющего два 32-канальных детектора ФЭУ;
фиг.6 - импульсы, измеренные из диода SiPM после усиления с помощью усилителя 400 МГц, 26 дБ;
фиг.6A - электрическая схема 3-каскадного импульсного усилителя, 2 ГГц, 60 дБ;
фиг.7 - типичный импульс напряжения от ФЭУ длительностью 1 нс;
фиг.8 - схематическая блок-схема для 32-канального однофотонного детектора;
фиг.9 - форма импульса для усиленных импульсов из одного канала 32-канального ФЭУ и форма импульса после компаратора ПЭСЛ;
фиг.10 - принципиальная схема 2-каскадного импульсного усилителя;
фиг.11 - график, демонстрирующий перекрестную канальную помеху однофотонного детектора;
фиг.12 - блок-схема высокоскоростного счетчика фотонов;
фиг.13 - график, демонстрирующий характеристики света в зависимости от фотоотсчетов одного канала однофотонного детектора;
фиг.14 - канальное разрешение в верхней панели и разрешение по длине волны в нижней панели спектрометра с 32-канальным датчиком ФЭУ;
фиг.15 - блок-схема оптической системы для однофотонного детектора;
фиг.16 - график, демонстрирующий характеристики света в зависимости от фотоотсчетов одного канала однофотонного детектора, показанного на фиг.15, измеренные для трех длин волны;
фиг.17 - гистограммы распределения фотоотсчетов на выходе модуля регистрации фотонов;
фиг.18 - фотография и схема однополосного секвенсора ДНК;
фиг.19 - график, демонстрирующий системную матрицу C в верхней панели и матрицы цветовой деконволюции в нижней панели, используемые для обработки данных секвенирования ДНК;
фиг.20 - графики кривых секвенирования ДНК и показателей качества назначения названия нуклеотидного основания;
фиг.21 - графики, демонстрирующие распознавание цветовых кодов и точность компьютерно-моделированного цветового декодирования;
фиг.22 - схематический чертеж системы регистрации шариков;
фиг.23 - график, демонстрирующий распознавание случайно окрашенных шариков;
фиг.24 - блок-схема 32-канального скоростного однофотонного спектрометра с большим динамическим диапазоном;
фиг.25 - принципиальная схема 32-канального импульсного усилителя.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
На фиг.3 показана блок-схема датчика 10, чувствительного к отдельным фотонам, для измерения излучения, излучаемого смесями небольших количеств множественных флуоресцентных красителей. Входное оптическое волокно 11 собирает полихроматическую флуоресценцию, которая затем проходит через модуль 12 спектрального разделения, схематически изображенный на фиг.4. Пройдя через модуль 12, разложенный флуоресцентный сигнал освещает фоточувствительные пиксели 32-канального фотодатчика 13, который может представлять собой, исключительно в порядке примера, 32-канальную матрицу ФЭУ H7260-20 производства Hamamatsu Corporation, Япония. Каждая из разделенных длин волны регистрируются одним каналом ФЭУ, и каждый канал ФЭУ способен регистрировать длины волны в диапазоне около 10 нм. Принятые фотоны создают очень короткие импульсы тока, которые подвергаются усилению и отсчету фотонов.
Например, согласно фиг.7, когда ФЭУ работает в режиме отсчета отдельных фотонов, каждый канал создает поток коротких, около 1 нс, импульсов тока в ответ на падающий поток фотонов. Амплитуды импульсов составляют 0,4-0,6 мА с соответствующим пиком напряжения от 8 до 12 мВ. Импульсы отсчитываются компаратором, который настроен на пороговое напряжение, меньшее, чем амплитуда импульса. Полученный фотоотсчет поступает на компьютер 14 для записи и обработки данных. В одном варианте осуществления модуль 12 спектрального разделения осуществляет разделение и измерение полихроматической флуоресценции в диапазоне длин волны от 480 нм до 630 нм. Согласно фиг.4 и 4A, полихроматическая флуоресценция поступает на модуль спектрального разделения через оптоволоконный вход 16, подключенный к коллиматору 17, примером которого может быть коллиматор F810SMA-543 производства Thorlabs Inc, Нью-Джерси. Коллиматор 17 создает параллельный полихроматический пучок около 10 мм в диаметре. Коллимированный или параллельный пучок проходит через лазерный режекторный фильтр 18 и подвергается разделению на компоненты разных длин волны с помощью дифракционной решетки 19, которая может представлять собой, например, дифракционную решетку GR13-1850 производства Thorlabs Inc, Нью-Джерси. В одном варианте осуществления дифракционную решетку 19 можно настроить на осуществление спектрального разделения и измерения флуоресценции в диапазоне длин волны от 490 нм до 630 нм.
Разделенные монохроматические компоненты пучка фокусируются на пиксели 32-канального ФЭУ 13. Такую фокусировку можно осуществлять с помощью сферического собирающего зеркала 21, которое может представлять собой сферическое зеркало CM254-075-G01 производства Thorlabs Inc, Нью-Джерси, и цилиндрической линзы 22, которая может представлять собой цилиндрическую линзу LJ1095L2 также производства Thorlabs Inc.
В одном варианте осуществления модуль спектрального разделения способен регистрировать длины волны, которые отличаются на 10 нм. Каждая отдельная длина волны в основном регистрируется одним каналом ФЭУ. Каждый ФЭУ канал регистрирует длины волны в диапазоне около 10 нм.
Модуль спектрального разделения спектрометра может обеспечивать спектральное разрешение вплоть до 1 нм. Спектральное разрешение около 10 нм можно получить с помощью 32-канального ФЭУ, имеющего зоны регистрации 0,8 мм ×7 мм, разделенные расстоянием 0,2 мм. Было обнаружено, что полное спектральное разрешение датчика можно повысить с использованием матрицы фотоприемных волокон, причем каждая матрица подключена для освещения однофотонного датчика. Выяснилось, что спектральное разрешение спектрометра с пучком волокон для каждого датчика фотонов составляет около 5 нм. Фактически приемные волокна можно использовать в качестве полосовых фильтров в некоторых приложениях, где требуется высокое спектральное разрешение. Когда флуоресцентные красители имеют широкий оптический спектр, несколько матриц пучков волокон можно использовать для сбора спектра красителя и для направления его для покрытия нескольких каналов спектрометра, что более подробно описано ниже.
Согласно фиг.5, один вариант осуществления спектрометра можно приспособить для более широкого диапазона длин волны. Для увеличения диапазона длин волны можно использовать светоделитель 23 на основе дихроичной пластины, который, исключительно в порядке примера, может представлять собой светоделитель NT47-424 производства Edmund Optics, Inc, Нью-Джерси. Светоделитель также может представлять собой светоделитель FF650-Di01 производства Semrock Inc., Нью-Йорк. После коллимации падающего излучения, или света, светоделитель 23 делит коллимированный свет на две части. Более короткие волны, например 530-585 нм для светоделителя Edmund или 500-640 нм для светоделителя Semrock, отводятся по одному пути 24. В то же время более длинные волны, например 601-800 нм для светоделителя Edmund и 660-825 нм для светоделителя Semrock, направляются по второму пути 26. Таким образом, более длинные и более короткие волны пространственно разделяются примерно на 90 градусов в спектрометре. Использование светоделителя на основе дихроичной пластины обеспечивает более широкий диапазон спектрального разделения и более высокое спектральное разрешение на спектрометре в диапазонах длины волны 500-800 нм и 300-500 нм в зависимости от типа детекторного оборудования. Коммерчески доступные модели детектора H7620-20 и H7620-04 были признаны полезными соответственно для таких диапазонов длины волны.
5
7
Специалисту в данной области техники очевидно, что датчик или спектрометр может включать в себя два разных типа многоканальных однофотонных детекторов. Например, не выходя за рамки объема изобретения, ФЭУ можно использовать для более длинных волн, и детектор на основе кремниевого фотоумножительного диода SiPM можно использовать для более коротких волн. Диод SiPM построен по технологии КМОП, относительно недорог и состоит из матрицы отдельных пикселей, параллельно соединенных друг с другом на общей кремниевой подложке. В ответ на отдельные фотоны SiPM вырабатывает отдельные импульсы напряжения. Технология такова, что матрицы SiPM можно использовать c электронной схемой возбуждения и считывания, интегрированной на том же чипе. SiPM имеют высокий коэффициент усиления, порядка 10-10, и работают при сравнительно низком напряжении, например порядка 20-70 В. Их время реакции изменяется в пределах 1-20 нс. Из фиг.6 можно видеть, что единичные фотонные импульсы длительностью около 2 нс можно получить из диода SiPM после усиления с помощью импульсного усилителя 400 МГц, 26 дБ. Было обнаружено, что 1-каскадные, 2-каскадные или 3-каскадные импульсные усилители SiPM 2 ГГц, 60 дБ совместно с диодом SiPM можно использовать в качестве детектора для отдельных фотонов в режиме отсчета отдельных фотонов. На фиг.6A показана электрическая схема для 3-каскадного импульсного усилителя, 2 ГГц, 60 дБ. Матрицы SiPM также можно использовать в качестве однофотонного датчика для однофотонного спектрометра. Также выяснилось, что SiPM можно приспособить к регистрации секвенирования ДНК.
Специалистам в данной области техники очевидно, что вместо дихроичного светоделителя можно использовать полупрозрачное зеркало. Использование полупрозрачного зеркала может увеличить динамический диапазон регистрации, поскольку полный поток фотонов, принятый спектрометром, будет регистрироваться двумя однофотонными детекторами. Аналогично, поток фотонов можно разделить на несколько потоков, каждый из которых регистрируется отдельным однофотонным детектором. Такой подход также можно использовать для увеличения динамического диапазона системы регистрации фотонов.
Согласно фиг.8 в одном варианте осуществления детектор состоит из 32-канального импульсного усилителя 27, который может быть построен на основе технологии устройства, смонтированного на поверхности, и 32-канального счетчика фотонов 31, который может быть построен на основе вентильной матрицы, программируемой пользователем. Усилительная часть детектора содержит 32 идентичных канала импульсного усиления 28, каждый из которых в одном варианте осуществления имеет коэффициенты усиления 35-40 дБ и полосу 1 ГГц. Детектор также может быть снабжен 32 быстрыми компараторами 29, каждый из которых имеет время нарастания и спада около 2 нс. Эта конфигурация ограничивает минимальную ширину импульса величиной примерно 4,5 нс и увеличивает отрицательные импульсы ФЭУ от 10-50 мВ до уровней, которые могут надежно запускать компараторы. На фиг.9 показана на верхней кривой форма импульса для усиленных импульсов от одного канала 32-канального ФЭУ и на нижней кривой форма импульса после компаратора ПЭСЛ.
RESPONSE
Согласно фиг.10, где представлен вариант осуществления электронной схемы для импульсного усилителя, 2-каскадный усилитель состоит из 2 усилителей 32 и 33 BGA 427, а именно U57 и U58 соответственно. Каждый каскад усилителя обеспечивает усиление 20 дБ в диапазоне 2 ГГц. Усиленный сигнал поступает на компаратор ADCCMP553 LVPECL 34, имеющий τ 1 нс. Отрицательный усиленный сигнал генерирует выходной импульс уровня ПЭСЛ из компаратора, который поступает на счетчик 31 (фиг.8).
Опорное напряжение можно регулировать с использованием потенциометра 36, а именно потенциометра R9, от 0 до 3,3 вольт. В одном варианте осуществления опорное напряжение можно устанавливать от 1,2 В (средней точки усилителя) до высоты усиленного импульса. Пороговое напряжение можно выбирать так, чтобы оно было как можно ближе к нижнему уровню импульса, но в то же время оставалося выше уровня шума. Следует понимать, что 1-каскадный усилитель также может обеспечивать достаточный коэффициент усиления для запуска компаратора 34. В таком варианте осуществления конденсатор 37, а именно конденсатор C35, можно не использовать. В итоге, схема обеспечивает усиление 20 дБ и меняет полярность импульса только один раз. Как указано, на фиг.9 показана на верхней кривой форма импульса для усиленных импульсов до поступления на компаратор 34 и на нижней кривой форма импульса для выходных импульсов компаратора 34.
В однофотонном детекторе может возникать перекрестная помеха двух основных типов. Один тип представляет собой электронную перекрестную помеху внутри 32-канального ФЭУ. На фиг.11 графически представлена типичная перекрестная помеха между соседними каналами ФЭУ. Такая перекрестная помеха обусловлена некоторыми признаками электронной оптики внутри ФЭУ. Перекрестная канальная помеха в 32-канальном ФЭУ содержит оптическую и электронную составляющую. Оптическая перекрестная помеха обусловлена освещением соседних каналов вследствие несовершенной фокусировки света, и электронная перекрестная помеха обусловлена внутренними электронными потоками между каналами ФЭУ. Небольшую перекрестную канальную помеху порядка 3 процентов можно наблюдать в известных 32-канальных ФЭУ, когда отдельные каналы освещаются оптическим волокном.
Другим типом перекрестной помехи является электронная перекрестная помеха между каналами усиления в усилителе и каналами в счетчике. Вообще электронная перекрестная помеха между каналами усилителя и каналами 32-канального счетчика фотонов не наблюдалась. Однако даже очень малая перекрестная канальная помеха в датчике может приводить к неопределенности, например, в анализе смесей красителей, в частности, когда состав разных компонентов красителя различается на порядки величины. Для минимизации оптической перекрестной помехи отдельные каналы ФЭУ можно освещать, фокусируя на них пучок от коммерческого лазера АИГ-Nd с длиной волны 532 нм. Можно видеть, что полная перекрестная канальная помеха ограничивается несколькими процентами и является линейной относительно сигнала, измеренного на основном канале.
Согласно фиг.8 после усиления выходной сигнал каждого из каналов усилителя 27 поступает на 32-канальный высокоскоростной счетчик фотонов 31. Счетчик 31 суммирует импульсы, поступающие на канальные входы. Интервалы времени интегрирования задаются генератором синхросигнала в счетчике 31 (не показан). В одном варианте осуществления минимальное время интегрирования равно около 0,3 мс.
,
,
,
.
На фиг.12 показана подробная блок-схема высокоскоростного счетчика 31 (фиг.8) согласно варианту осуществления. В этом варианте осуществления высокоскоростной счетчик содержитпару идентичных счетных схем 38 и 38A. Каждая счетная схема состоит из трехбайтового счетчика ПЭСЛ 39 и 39Aтрех буферов ПЭСЛ/ТТЛ с тремя состояниями 41A-C и 41D-F соответственнои трех логических элементов И 42A-C и 42D-F соответственно. Каждая счетная схема подключена к схеме синхронизации, состоящей из модуля 44 байтов синхронизации с фиксированным значениемсчетчика 46 двухбайтовых блоков синхронизации трех буферов с тремя состояниями 47A-C и 3 логических элементов И 48A-C
,
,
Высокоскоростной счетчик также содержит схему управления 49, которая состоит из кварцевого генератора 5114-каскадного двоичного счетчика пульсаций 52 и совокупности переключателей 53, каждый из которых соответствует каскаду счетчика 52. Схема управления 49 также включает в себя счетчик байтов 54, выходной сигнал которого поступает на счетчик блоков 56. Счетчик байтов 54 и счетчик блоков 56 подключены к логическим элементам И 42A-F и 48A-C. Выходной сигнал счетчика байтов 54 также поступает на пару дополнительных логических элементов И 57A и 57B, каждый из которых подключен к одному из четырех преобразователей ТТЛ/ПЭСЛ 58A-D. Логический элемент НЕ 59 подключен к счетчику блоков 56 и логическим элементам И 42A-F и 48A-C. Схема управления содержит триггер, подключенный к каждому из четырех преобразователей ТТЛ/ПЭСЛ 58A-D.Выход LPT схемы управления 62 состоит из модуля 63 задержки по временилогических элементов ИЛИ64итриггера.
Импульсы от высокоскоростного усилителя 27 одновременно поступают на входы 3-байтовых счетчиков ПЭСЛ 39 и 39A. Один из этих счетчиков всегда находится в режиме отсчета, а другой - в режиме ожидания. Накопленные данные побайтово переносятся на порт LPT 67 через буфер ПЭСЛ/ТТЛ с тремя состояниями,который соответствует номеру байта.
Состояния трехбайтовых счетчиков ПЭСЛ39 и 39A определяются сигналами схемы управления, преобразованными соответствующими преобразователями ТТЛ/ПЭСЛ 58A-D. В порядке примера, выходной сигнал преобразователя ТТЛ/ПЭСЛ 58B устанавливает и поддерживает трехбайтовый счетчик ПЭСЛ 39 в ждущем режиме и в то же время устанавливает трехбайтовый счетчик ПЭСЛ 39A на режим отсчета. Выходной сигнал преобразователя ТТЛ/ПЭСЛ 58C устанавливает и поддерживает трехбайтовый счетчик ПЭСЛ 39A в ждущем режиме и устанавливает трехбайтовый счетчик ПЭСЛ 39 на режим отсчета. Выходные сигналы преобразователей 58A и 58C сбрасывают соответствующий трехбайтовый счетчик ПЭСЛ после переноса его данных на порт LPT 67.
.
После передачи каждых 102 байтов инициируется три байта синхронизации из схемы синхронизации 43. Первый байт имеет фиксированное значение 00010001, как указано на фиг.11, и второй и третий байты представляют текущее состояние счетчика 46 двухбайтовых блоков синхронизации. Байты синхронизации, выдаваемые счетчиком 46, поступают на выход 67 системы через соответствующие буферы с тремя состояниями 47A-C
Кварцевый генератор51 схемы управления 49генерирует тактовые импульсы с частотой 2 МГц, которые поступают на 14-каскадный двоичный счетчик пульсаций 52. Счетчик 52 имеет 14 выходных контактов, совместно обозначенных позицией 68. Каждый контакт выводит тактовые импульсы, начальная частота которых получена делением на величину от 2 до 16386. Переключатели 53 используются для выбора надлежащего контакта из 1-14 и, таким образом, задания тактовой частоты для всей схемы. В этом варианте осуществления переключателимогут задавать скорость передачи данных на порт LPT 67 от 122 до 1,000,000 байтов в секунду.
Тактовые импульсы поступают на счетчик байтов 54. После приема каждого тактового импульса счетчик байтов 54 последовательно генерирует сигнал на каждом из трех выходов, указанных как номера 1, 2 и 3 “Байт” на фиг.11. Каждый такой сигнал передает соответствующий байт данных, и каждый байт данных поступает на обе счетные схемы 38 и 38A. Каждый сигнал данных также поступает на схему синхронизации 43 через соответствующий логический элемент И 48A-C.
Сигнал высокого уровня на четвертом выходе счетчика байтов 54 сбрасывает счетчик и поступает на счетчик блоков 56,который отсчитывает количество переданных 3-байтовых слов. Отсчитав 34-ое 3-байтовое слово, что составляет 102 байта данных, счетчик блоков56генерирует сигнал для 35-ого 3-байтового слова. Этот сигнал поступает на логические элементы И48A-C,которые передают данные схемы синхронизации на выход LPT 67. В то же время сигнал для 35-ого 3-байтового слова блокирует выход счетных схем 38 и 38A. Выходной сигнал счетчика блоков 56, который соответствует 36-му 3-байтовому слову, сбрасывает счетчик, как указано на фиг.11, и тактирует двухбайтовый счетчик 46 блоков синхронизации для отсчета количества последовательностей из 105 байтов. Двухбайтовый счетчик 46 блоков синхронизации сбрасывается по достижении значения 65536.
Триггер 61 активируется каждым импульсом первого байта от счетчика байтов 54. Сигналы, вырабатываемые триггером 61, попеременно переводят трехбайтовые счетчики ПЭСЛ 39 и 39A в режим отсчета или ожидания. Такие сигналы также разблокируют или блокируют выход счетчиков и разрешают или запрещают передачу импульса сброса на счетчики через логические элементы И 57A и 57B. На фиг.13 показан график, демонстрирующий типичную характеристику света в зависимости от фотоотсчетов для одного канала счетчика, аналогичного описанному со ссылкой на фиг.12.
На фиг.7 показаны типичные импульсы напряжения на входе и выходе импульсного усилителя согласно варианту осуществления. Ширина усиленного импульса равна примерно 5 нс, т.е. примерно в 5 раз больше ширины входного импульса. Динамический диапазон детектора (отношение максимального фотоотсчета к темновому шуму) составляет -20 бит. Благодаря использованию программного обеспечения записи данных, счетчик может регистрировать импульс, имеющий длительность менее 2 нс и амплитуду -1,5 В.
7
7
8
Благодаря чувствительности и линейности 32-канального однофотонного детектора согласно настоящему варианту осуществления можно регистрировать частоту фотоотсчетов вплоть до 5×10 отсчетов в секунду. В действительности линейность детектора обеспечивает чрезвычайно широкий диапазон линейного отсчета фотонов, например, вплоть до и свыше 2×10 фотоотсчетов в секунду. Наблюдались также отсчеты фотонов вплоть до 2×10. Эти диапазоны отсчетов превышают динамический диапазон регистрации любого известного коммерческого однофотонного детектора. Сравнение эффективности регистрации фотонов для детектора согласно настоящему варианту осуществления и для доступного коммерческого однофотонного детектора, например модели SPCM-AQR-12-FC, указывает, что на длине волны 490 нм эффективность регистрации фотонов для 32-канального детектора ФЭУ согласно настоящему варианту осуществления составляет около 20% от эффективности регистрации фотонов для вышеупомянутого коммерческого SPCM и снижается на 5% на длине волны 610 нм.
Согласно фиг.8 и 12 данные, собранные счетчиком 31, переносятся на ПК с использованием интерфейса параллельного порта 67 по стандарту IEEE 1284. Данные переносятся в виде 105-байтовых кадров с использованием двоичного формата. Кадры данных состоят из значений отсчета, полученных для каждого из 32 каналов регистрации (по 3 байта на канал). Каждый кадр начинается с 6-байтового заголовка, который включает в себя следующие поля: 1-байтовый тип счетчика, 2-байтовый номер кадра и 2-байтовый период отсчета, измеренный в миллисекундах. Номер кадра содержит номер текущего кадра. Номер увеличивается на 1 для каждого следующего кадра, образуя, таким образом, возрастающую последовательность с переполнением. Номера кадров служат метками синхронизации и используются программным обеспечением обработки данных для отыскания кадров данных в непрерывном потоке данных. Номера кадров также используются для проверки целостности данных и для отыскания ошибок, обусловленных помехами на линии передачи. Особый программный пакет осуществляет запись и оперативную визуализацию данных, переносимых счетчиком.
При обработке спектров флуоресценции, основной задачей обработки сигнала является определение вкладов отдельных флуоресцентных красителей во флуоресцентный сигнал, генерируемый смесями красителей, состоящими из n красителей, имеющих различные известные флуоресцентные спектры. Вклады отдельных красителей смеси можно найти путем разложения флуоресценции, измеренной на N независимых каналах спектрометра, при условии, что спектрометр вырабатывает линейный отклик на регистрируемую флуоресценцию.
(N×n)
1
2
n
i
1i
Ni
i
1
N
1
2
n
1
N
=
T
T
T
T
В порядке примера, если количество анализируемых флуоресцентных красителей n<N (например «=4 для секвенирования ДНК), то с использованием известного метода системной матрицы H=(h, h, …, h),где h(h…h),(1≤i≤n) - N-компонентные векторы, представляющие спектры флуоресцентных красителей в анализируемой смеси красителей, можно получить системную матрицу Hпутем предварительной калибровкисистемы для спектральных откликов отдельных флуоресцентных красителей h. Если r=(r…r) - измеренный флуоресцентный спектр смеси красителей и s=(s, s, …, s) - вектор компонентных весовых коэффициентов, выражающих концентрации отдельных флуоресцентных красителей, то при наличии шума ω=(ω…ω), измеренный спектр r равен:
i
i
Оптимальное решение s Уравнения (1) зависит от свойств распределения для шумовых компонентов ω. Можно сделать упрощающее допущение, что ω являются независимыми, и, предполагая идентично распределенные нормальные случайные значения, общеизвестное и вычислительно эффективное решение без смещения с минимальной дисперсией было получено Кэем (Kay) в 1993 г. (Fundamentals of Statistical Signal Processing. Estimation Theory на стр. 97), для оценивания в следующем виде:
i
i
При отсчете фотонов, наблюдения на отдельной частоте r имеют распределение Пуссона с одинаковыми математическим ожиданием и дисперсией. Для более высоких частот фотоотсчетов (свыше 50 отсчетов за период наблюдения) наблюдаемые частоты хорошо аппроксимируются суперпозицией 'истинной' средней частоты  и гауссова шума ω с дисперсией, зависящей от средней частоты следующим образом:
i
Более точные решения можно получить посредством g, что компоненты ω независимые неодинаково распределенные нормальные случайные переменные. Общее решение Уравнения (1) было получено Кэем в 1993 г., Id, в виде:
i
i
где C- ковариационная матрица компонентов ω. Благодаря независимости ω матрица Cявляется диагональной:
i
i
где  - дисперсия ω. На практике средняя частота  неизвестна и для вычисления дисперсии используется наблюдаемая частота r:
.
i
i
i
i
i
Дисперсии  оцениваются для каждого измерения. Функция, связывающая  и r, характерна для каждого способа предобработки, используемого для получения r. Например, если r получаются непосредственно путем отсчета фотонов в течение периода выборки, то . Если фон b вычитается из результата наблюдения отсчета, то . Если r получается путем усреднения наблюдения отсчета по k периодам выборки, то . Оператор оценки Уравнения (3) является более точным, но требует больше вычислительных ресурсов, чем оператор оценки Уравнения (2).
Вышеописанный метод обработки сигнала допускает вычитание фона на стадии удаления перекрестных помех. Это достигается путем создания дополнительного спектра (столбец в матрице H), выражающего фон. Операторы оценки Уравнений (2) и (3) с новой матрицей H отделяют фон от других спектральных компонентов.
На фиг.15 показана блок-схема измерительного прибора, используемого для тестирования однофотонного детектора. В приборе свет от источника света 69, который может представлять собой монохроматор или лазер 532 нм, проходит через комплект нейтральных оптических фильтров 71 и поступает в волокно, оканчивающееся градиентной линзой 72. Свет от градиентной линзы фокусируется на один из 32 фотокатодов 32-канального ФЭУ. Характеристики фотоотсчета и света, измеренные для однофотонного детектора с использованием прибора, показанного на фиг.15 с монохроматором в качестве источника света 69, представлены на фиг.16. Можно видеть, что для всех трех измеренных длин волны выход детектора остается линейным вплоть до 108 фотоотсчетов в секунду и динамический диапазон детектора превышает 2×108 фотоотсчетов в секунду. Существенное различие в абсолютной частоте отсчетов показано для длин волны 488 нм и 530 нм по сравнению с 630 нм. На длинах волны свыше 600 нм наблюдается снижение квантовой эффективности ФЭУ.
Шум в системе отсчета фотонов согласно настоящему варианту осуществления определяется временным распределением фотоотсчетов. Правильно работающий счетчик фотонов использует распределение Пуссона, для которого дисперсия оценки частоты фотоотсчетов, например количества фотонов, отсчитанное в течение периода интегрирования, равна ее среднему значению. Это задает нижнюю границу отношения сигнал-шум фотонного детектора. На фиг.17 показаны гистограммы распределения фотоотсчетов на выходе модуля регистрации фотонов для четырех разных уровней освещения. Фотоотсчет собирали в течение интервалов 25 мс и записывали с использованием программного обеспечения записи данных в течение около 30 мин для каждого уровня освещения. На фиг.17 показано хорошее совпадение между средними значениями и дисперсиями для всех четырех уровней освещения. Это указывает, что измеренный шум обусловлен только стохастической природой потоков фотонов, регистрируемых детектором, и что сам детектор не производит никакого дополнительного шума.
В одном варианте осуществления однофотонный спектрометр можно использовать для приложений, требующих чувствительной регистрации и распознавания смесей, состоящих из нескольких известных флуоресцентных красителей. В частности, описанный здесь спектрометр можно использовать в качестве фотодатчика для регистрации секвенирования ДНК, которая осуществляется методом электрофореза в единичном капилляре из кварцевого стекла с использованием возбуждения флуоресценции коммерчески доступными Ar-ионным и АИГ-Nd лазерами. Для подавления длин волны лазера можно использовать лазерные щелевые фильтры ОП 5522 нм и 538 нм (522AELP, 538AELP, Omega Optical Inc, Вермонт, США) для Ar-ионного и АИГ-Nd лазеров соответственно.
На фиг.18 показаны фотография и схема варианта осуществления однополосного секвенсора ДНК. Образцы ДНК подвергаются электрофоретическому разделению в однокапиллярном разделительном модуле, показанном на фотографии. Модуль состоит из миниатюрного источника высокого напряжения 73 (до 15 кВ) со встроенными вольтметром и амперметром, системы 74 замещения полимера, системы 76 регулировки температуры (25-70°C+0,01°C), карусели 77 для смены пробирок для образцов ДНК и подвижного буфера и прецизионной оптической системы 78. Согласно схеме на фиг.18, когда флуоресцентно маркированные фрагменты ДНК проходят через оптическую систему 78, они освещаются волоконным лазером, например, но без ограничения, Ar-ионным лазером (488 и 514 нм, 20 мВт) производства Uniphase, Калифорния или АИГ-Nd лазером (532 нм, 25 мВт, GCL-025-S) производства CrystaLaser, Невада. Лазерно-индуцированная флуоресценция собирается волокном 81, которое может иметь диаметр сердцевины 200 мкм, и доставляется на модуль спектрального разделения 12 (фиг.3). В одном варианте осуществления для подавления длин волны лазера Ar-ионного и АИГ-Nd лазеров соответственно можно использовать лазерные щелевые фильтры ОП 5522 нм и 538 нм (522AELP и 538AELP) производства Omega Optical Inc, Вермонт.
Образцы ДНК, помеченные BigDye Terminator v1.1 стандарт секвенирования, полученные от Applied Biosystems (Фостер сити, Калифорния) денатурировали в 25 мкл формамида и развели в отношении 1 к 5 в воде уровня очистки ЖХВР непосредственно до впрыска. Разделение ДНК проводили при 150 В/см в 40 см (длина разделения 35 см) капиллярах без покрытия, имеющих внутренний диаметр 50 мкм и внешний диаметр 365 мкм, заполненных разделительной средой POP-7 при 50°C. В этом примере использовался подвижный буфер.
i
Существует, по меньшей мере, два эффективных подхода для оценивания интенсивности флуоресценции, вырабатываемой четырьмя красителями, используемыми для маркировки терминаторов A, C, G и T. Один такой подход состоит в разложении измеренного спектра согласно вышеприведенному Уравнению (3). В отношении разложения всего измеренного спектра спектральные компоненты c, описывающие отдельные красители, получаются экспериментально путем измерения флуоресценции, излучаемой каждым красителем в отдельности, и нормирования измеренного вектора частот фотоотсчетов. Определение концентраций отдельных красителей s[n] в смеси осуществляется для каждого временного кадра. Полученная последовательность концентраций красителя образует четыре кривые секвенирования, которые затем используются для назначения названия нуклеотидного основания.
Другой подход предусматривает применение виртуальных фильтров. Метод виртуальных фильтров можно использовать, если спектры компонентов хорошо разделены. Падающий свет, содержащий спектры с хорошим пространственным разделением длин волны, облучает входные концы пучков волокон, имеющие выбранный угол приема. Благодаря конечному углу приема, конкретные волокна собирают сигнал только определенной длины волны и доставляют сигнал на определенный канал фотодетектора. В порядке примера, виртуальные фильтры можно формировать, выбирая три канала ФЭУ таким образом, что каждая из трех разных длин волны флуоресценции каждого красителя захватывается одним из трех каналов ФЭУ и поэтому дает наибольший вклад в измерения на назначенном канале и обеспечивает минимальный отклик на других каналах. Такая система делает ненужными полосовые фильтры для регистрации многоцветной флуоресценции. В другом примере пространственно широкие спектры конкретного красителя, имеющие определенную длину волны, одновременно захватываются группой из нескольких, например трех, волокон или пучков волокон. Такая конфигурация позволяет значительно увеличить динамический диапазон без снижения отношения сигнал-шум системы.
В одном варианте осуществления можно добиться высокого динамического диапазона линейности для спектров с узкими эмиссионными спектрами. В этом случае каждая из нескольких длин волны флуоресценции каждого красителя захватывается одним из каналов ФЭУ и поэтому дает наибольший вклад в измерения на назначенном канале и обеспечивает минимальный отклик на других каналах. Волокна пропускают конкретные длины волны на соответствующие детекторы в фотодетекторе 1×N. Оттуда сигналы поступают на фотодетектор M×N для сбора пространственно разделенных спектров. Для проецирования N-ой длины волны на N-ый столбец фотодетектора M×N можно использовать проекционную оптику. Таким образом, сигналы определенных длин волны одновременно собираются M однофотонными фотодетекторами. Эта конфигурация также обеспечивает высокий динамический диапазон линейности и высокое отношение сигнал-шум для системы.
В подходах обработки данных для описанных вариантов осуществления, четыре кривые секвенирования подвергаются стандартной обработке, которая включает в себя фильтрацию и сглаживание шума, вычитание фона, удаление перекрестной помехи, коррекцию электрофоретической подвижности, выравнивание высоты и разнесения импульсов. После повторной выборки до 7-15 точек на пик кривые сохраняются в формате SCF и обрабатываются стандартной программой назначения названия нуклеотидного основания PHRED. Результат обработки возвращается в виде последовательностей назначений названия нуклеотидного основания с их позициями и показателями качества.
i
Как указано выше, существует, по меньшей мере, два подхода к обработке данных секвенирования ДНК. Согласно фиг. 19, где показаны график 82 системной матрицы и матрицы цветовой деконволюции 83 и 84 для Ar-ионного и АИГ-Nd лазеров соответственно, упрощенный подход к обработке данных использует сигналы, полученные из канала 18 (546 нм), канала 15 (568 нм), канала 11 (589 нм) и канала 5 (610 нм) ФЭУ. Каналы 18, 15, 11 и 5 соответствуют соответственно G, A, T и C. Полученные матрицы цветовой деконволюции 83 и 84 для Ar-ионного и АИГ-Nd лазеров представлены в формате электронной таблицы в нижней панели фиг. 19. Напротив, спектральные компоненты h для определения матрицы H системы можно получить экспериментально путем измерения флуоресценции, излучаемой каждым красителем в отдельности, и нормирования измеренного вектора частот фотоотсчетов, показанного на графике 82 в верхней панели фиг.19.
7
Вышеописанные подходы к обработке данных секвенирования дают сходные кривые секвенирования и качество назначения названия нуклеотидного основания. Однако для измерений, характеризуемых малыми отношениями сигнал-шум, разложение всего спектра измерения дает лучшие результаты, поскольку при этом используется полная информация о флуоресценции, излучаемой каждым красителем, а не только флуоресценции, полученной лишь на четырех выбранных каналах спектрометра. Другое преимущество использования полного спектра флуоресценции, полученной от красителя, состоит в значительном увеличении динамического диапазона регистрации. Действительно, в описанном здесь 32-канальном фотодатчике каналы имеют линейный отклик до 2×10фотоотсчетов в секунду, и если измеренный флуоресцентный краситель имеет широкий спектр, линейный диапазон регистрации для этого красителя будет пропорционален количеству одновременно освещаемых каналов датчика.
На фиг.20 показаны две кривые секвенирования ДНК и показатели качества назначения названия нуклеотидного основания, полученные согласно описанному здесь варианту осуществления спектрометра с использованием Ar-ионного и АИГ-Nd лазеров. Кривые секвенирования, записанные с помощью двух лазеров, выглядят очень похоже, и показатели качества почти идентичны. Полученная длина чтения последовательности Q20 составляет около 650 пар оснований, что очень хорошо согласуется с длинами чтения, полученными для той же длины капилляра в коммерческих секвенсорах ДНК, например, модели ABI-3730 от Applied Biosystems Inc.
В одном варианте осуществления однофотонный спектрометр может распознавать и точно декодировать цветовые коды. На фиг.21 верхняя панель иллюстрирует измерения и декодирование смесей, содержащих три типа QD с сильно перекрывающимися спектрами. Средняя панель фиг.21 показывает, что, когда содержание QD2 в смеси изменяется от 0% до 15%, можно добиться почти полного совпадения заранее смешанных и декодированных концентраций. Кривые на нижней панели фиг.21 демонстрируют статистику декодирования, полученную при осуществлении нескольких тысяч измерений для каждой смеси QD (около 10,000 фотонов на измерение), а также результаты декодирования, полученные для компьютерного моделирования измерений, произведенных с помощью однофотонного спектрометра.
В одном варианте осуществления однофотонный спектрометр может регистрировать микрочастицы с цветовой кодировкой. На фиг.22 показана система считывателя шариков, в которой отдельные шарики взвешены в буферной жидкости, удерживаемой в системе нагнетания 86 шариков. Шарики измеряются путем проталкивания их через капилляр 87 на высокой скорости. Пучок возбуждения 88 возбуждает флуоресценцию в шариках. Флуоресценция регистрируется оптоволоконным детектором 89 и передается через подходящий спектрометр или оптическую отражательную систему 91 на однофотонный детектор 92. Зарегистрированные сигналы записываются компьютером (не показан), и записанные данные надлежащим образом обрабатываются. В одном варианте осуществления система нагнетания 86 представляет собой программируемый микронасос, и капилляр 87 представляет собой капилляр с внутренним диаметром 25 мкм. Капилляр вставлен в оптическую головку (не показана) для обеспечения равномерного освещения капилляра пучком возбуждения 88. Пучок 88 вырабатывается подходящим источником на основе волоконного лазера (не показан). Когда шарики проходят через лазерный пучок, они излучают флуоресценцию, которая собирается волоконным микрообъективом 89. Собранная флуоресценция поступает на спектрометр 91, где регистрируется однофотонным детектором 92, который в этом варианте осуществления является высокоскоростным многоканальным детектором.
Согласно фиг.23 считыватель шариков, показанный на фиг.22, можно использовать для производства измерений случайно окрашенных шариков. В одном варианте осуществления измерения производили над полистироловыми шариками, окрашенными квантовыми точками. Результаты декодирования, полученные для 100 таких шариков, представлены на фиг.23, где по оси x отложен номер шарика в порядке регистрации считывателем шариков и по оси y отложены коды шариков, нормированные к 1.
4
4
8
Основной характеристикой вышеописанной системы регистрации шариков является количество шариков, которое можно регистрировать в единицу времени и декодировать с нужной точностью. В общем случае точность декодирования определяется количеством фотонов, собранных за время регистрации шарика. Очевидно, что для коммерчески доступных комплектов квантовых точек, можно получить точность декодирования вплоть до 99 процентов, если суммарное количество фотонов, собранных от шарика, будет больше 10. Частота, с которой происходит регистрация шариков, зависит от динамического диапазона фотонного детектора. Согласно блок-схеме на фиг.24 в одном варианте осуществления частота регистрации шариков вплоть до 10 единиц в секунду достигается с помощью фотонного детектора, состоящего из модуля спектрального разделения 93, 32-канального ФЭУ 94, 32-канальной FPGA 96, высокоскоростного USB микроконтроллера 97 и компьютера 98. Такая система имеет диапазон линейности 10 фотоотсчетов в секунду на канал и скорость переноса данных 32 МБ в секунду. Принципиальная схема одного канала 32-канального импульсного усилителя системы, показанного в блок-схеме на фиг.24, представлена на фиг.25.
Хотя различные варианты осуществления были описаны выше с определенной степенью детализации или точности или со ссылкой на один или несколько отдельных вариантов осуществления, специалисты в данной области техники могут внести многочисленные изменения в раскрытые варианты осуществления, не выходя за рамки сущности и объема заявленного изобретения. Предполагается, что весь материал, изложенный в вышеприведенном описании и представленный в прилагаемых чертежах, следует интерпретировать лишь как иллюстрацию конкретных вариантов осуществления, но не как ограничение. Изменения, касающиеся деталей или конструкции, можно вносить, не отклоняясь от элементов изобретения, установленных в нижеследующей формуле изобретения.