Совершенствование генотипирования штаммов B. pertussis

Вопросы диагностики

Совершенствование генотипирования штаммов B. pertussis

Г. А. Ивашинникова, О. Ю. Борисова, А. В. Алешкин, А. С. Пименова, В. А. Алешкин

ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора, Москва

Разработан новый ускоренный молекулярно-генетический способ типирования штаммов B. pertussis по структуре ptxP промотора коклюшного токсина. Метод основан на ПЦР-ПДРФ анализе, который позволяет получить характерный рестрикционный профиль и дает возможность дифференцировать штаммы с особенностями структуры промотора ptxP. Разработанный метод типирования штаммов B. pertussis может являться инструментом при мониторинге штаммов возбудителя коклюша в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекций, позволяющим проводить наблюдение за циркулирующей популяцией B. pertussis, выявлять высоковирулентные штаммы возбудителя коклюша и следить за их распространением. Ключевые слова: B. pertussis, рестрикционный анализ, промотор коклюшного токсина

Modernization of geneotiping of strains B. pertussis

G. A. Ivashinnikova, O. U. Borisova, A. V. Aleshkin, A. S. Pimenova, V. A. Aleshkin

Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky, Moscow

The new rapid molecular genotyping method was developed for studying the structure of ptxP promoter of pertussis toxin. Method is based on PCR-RFLP analysis, which allows studying the specific restriction profiles of the B. pertussis strains and allows differentiation of the strains with the ptxP structural particularities. The developed method for genotyping of strains of B. pertussis can be hhelpful when monitoring strains of the causative agent of whooping cough in system of an epidemiological surveillance over pertussis infections, allowing observation over circulating population of B.pertussis, revealing strains of the causative agent of whooping cough with high production of pertussis toxin and to watch their distribution. Key words: B. pertussis, restriction analysis, pertussis toxin promoter

Контактная информация: Ивашинникова Галина Антоновна — мл. научн. сотр. лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора; 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10; (495) 459-21-46; Ivashinnikova@gmail.com.

УДК 616.921.8-07

Коклюш, несмотря на 50-летную успешную практику массовой иммунизации, остается актуальной проблемой для здравоохранения в различных странах мира. С 1990-х годов прошлого века во многих странах Европы и Америки, где регистрируется высокий уровень охвата профилактическими прививками, отмечается рост заболеваемости коклюшем [1—5]. В России, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации, до настоящего времени сохраняются подъемы и спады заболеваемости, как за счет привитых, так и непривитых, регистрируются тяжелые формы болезни, высокая заболеваемость детей раннего возраста, единичные летальные исходы и увеличилась заболеваемость детей школьного возраста [6—8]. Все это привело к усилению внимания к проблеме коклюша и разработке новых методов диагностики и мониторинга возбудителя.

Молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis, проводимый во многих странах мира и в России, показал, что штаммы B. pertussis подвержены изменчивости, затрагивающей детерминанты, кодирующие не только основные факторы патогенности возбудителя, но и их регуля-торные структуры, отвечающие за уровень их продукции [1—6, 9—14]. Было установлено, что штаммы с новыми «невакцинными» аллелями этих генов постепенно вытесняют штаммы со старыми «вакцинными» аллелями, т. е. происходит селекция штаммов с измененной структурой антигенных детерминант, которые отличаются по антигенной специфичности от структуры вакцинных штаммов, используемых для производства профилактических препаратов.

Одной из регуляторных структур, изменения в которой оказывают влияние на уровень экспрессии оперона ptx и продукцию самого коклюшного токсина, является промо-

торная ptxP область коклюшного токсина [2—5, 9, 10]. В настоящее время единственным методом для определения особенностей структуры промотора ptxP является прямое секвенирование с последующим анализом нуклеотид-ной последовательности и выявлением точечных мутаций в двух положениях. Однако, данный метод является длительным, трудоемким, дорогостоящим и не может быть использован для ускоренного слежения за циркулирующими штаммами. Поэтому, большое значение на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции приобретает наблюдение за генетической структурой детерминант как основных факторов патогенности, так и за структурой регуляторных детерминант B. pertussis, и разработка новых ускоренных молекулярно-генетических методов мониторинга, позволяющих выявлять измененные клоны возбудителя, которые могут оказывать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессов.

Цель исследования — разработка ускоренного молеку-лярно-генетического метода типирования штаммов B. pertussis по структуре промотора ptxP коклюшного токсина на основании ПЦР-ПДРФ анализа.

Материалы и методы исследования

В работе изучено 258 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в Российской Федерации в 2000—2012 г г., а также 84 штамма B. pertussis, выделенные в 1948 — 1999 г г. (из коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора). Микробиологическое исследование штаммов B. pertussis проводили согласно Инструкции [15] путем изучения их морфологических, культуральных, тинкториальных и серологических свойств. Постановку ПЦР осуществляли согласно опубликованному

протоколу [4]. Секвенирование нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК штаммов B. pertussis определяли с помощью ABI PRISM Big Terminator cycling sequencing ready reaction kit на ABI DNA секвенаторе. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ BLAST и базы данных EMBL/GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov).

Результаты и их обсуждение

Для ускоренного слежения за циркулирующими штаммами B. pertussis и выявления эпидемически значимых штаммов возбудителя коклюша с повышенной продукцией коклюшного токсина нами разработан ускоренный молеку-лярно-генетический метод типирования штаммов B. pertussis по структуре промотора ptxP на основании ПЦР-ПДРФ анализа, который позволяет получить характерный рест-рикционный профиль, являющийся генетическим «маркером», тесно связанным с генотипом микроорганизма. Ускоренный метод типирования штаммов B. pertussis включает в себя выделение ДНК штаммов B. pertussis, постановку ПЦР со специфическими праймерами PF и PR, дальнейшую последовательную обработку полученных ампликонов специфическими эндонуклеазами Kpnl и MluI с последующим проведением электрофореза для разделения рестрициро-ванных фрагментов и визуализацию результатов в ультрафиолетовом спектре.

В процессе изучения генетической структуры промотора ptxP коклюшного токсина у штаммов B.pertussis методом секвенирования выявлены 3 варианта последовательности нуклеотидов, которые полностью совпадали с данными EMBL/GeneBank и соответствовали 3 аллелям промотора ptxP. Так, для ptxPl и ptxP3 аллелей в положении (-167) характерным является нуклеотид С, в то время как для ptxP2 аллеля — нуклеотид Т. Во втором положении — (-65) для аллелей ptxPl и ptxP2 характерным является нук-леотид G, а для третьего варианта — нуклеотид А. Первый аллель промотора — ptxPl, согласно базе данных, является «вакцинным», ptxP2 и ptxP3 — новыми «невакцинными» аллелями. Показано, что новый «невакцинный» ptxP3 аллель промотора имеет значимые мутационные изменения, затрагивающие функциональную область, отвечающую за связывание с BvgA димером, что приводит к усилению прочности связи, оказывающей влияние на экспрессию оперо-на ptx и, как следствие, увеличению продукции коклюшного токсина. При изучении штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время, нами было установлено, что большинство штаммов имеют значимые мутационные изменения в структуре промотора ptxP и в опытах in vivo на мышах являются высоковирулентными [9, 10].

Поэтому, учитывая выявленные особенности структуры промотора ptxP, из большого спектра существующих эндо-нуклеаз выбраны две эндонуклеазы — MluI и Kpnl, использование которых позволяет получить специфические рест-рикционные профили для штаммов с тремя аллелями промотора ptxP. Последовательность нуклеотидов в положениях 313—318 ptxPl и ptxP2 аллелей промотора коклюшного токсина создают сайт рестрикции для эндонуклеазы KpnI (5'-GGTACC-3'). Нуклеотидная последовательность ptxP2 аллеля промотора в положениях 206—211 создает сайт рестрикции для эндонуклеазы MluI (5'-ACGCGT-3'). Диф-

ференциация штаммов, несущих ptxP3 аллель промотора от штаммов несущих ptxP2 и ptxPl аллели основана на отсутствии сайтов рестрикции для эндонуклеаз MluI и Kpnl в нуклеотидной структуре ptxP3 аллеля. В свою очередь, отсутствие сайтов рестрикции для эндонуклеазы MluI в нуклеотидной структуре ptxPl аллеля — создает возможность дифференциации штаммов, несущих ptxPl аллель промотора от штаммов несущих ptxP2 аллель. Нуклеотидная структура ptxP2 аллеля промотора в положениях 313— 318 и 206—211 создает сайты рестрикции для эндонуклеаз Kpnl и MluI соответственно. Дифференциацию штаммов проводят путем сравнения размеров полученных рестрик-ционных фрагментов с контрольными образцами ДНК, имеющими ptxP1, ptxP2 и ptxP3 аллели промотора коклюшного токсина.

После обработки ампликонов промотора ptxP эндонук-леазой рестрикции Kpnl и постановки горизонтального электрофореза в агарозном геле, в ультрафиолетовом спектре выявляли 2 варианта рестрикционного профиля. Для одной группы штаммов был характерен рестрикцион-ный профиль с наличием двух специфических светящихся фрагментов размером 315 и 217 п. н. (тип KpnI-1), что соответствовало размеру специфических светящихся фрагментов ДНК контрольных штаммов B. pertussis, несущих ptxP1 и PtxP2 аллели промотора КТ, для второй группы штаммов — наличие одного специфического светящегося фрагмента размером 532 п. н. (тип KpnI-2) , что соответствовало размеру фрагмента ДНК контрольного штамма B. pertussis, несущего ptxP3 аллель. Следовательно, после рестрикции с эндонуклеазой KpnI можно дифференцировать штаммы, несущие ptxP1 и ptxP2 аллели, от штаммов, несущих ptxP3 аллель промотора КТ.

Для точной дифференциации штаммов, несущих ptxP1 и ptxP2 аллели промотора КТ, проводили обработку ампликонов эндонуклеазой рестрикции MluI. После проведения электрофореза в агарозном геле и визуализации результатов рестрикции в ультрафиолетовом спектре, выявили 2 группы штаммов, имеющие разный набор специфических светящихся фрагментов. Для первой группы характерным было наличие 2 специфических светящихся фрагментов размером 321 и 211 пар нуклеотидов (тип MluI-1), данный рестрикционный профиль совпадал с профилем контрольного образца ДНК штамма B. pertussis, несущего ptxP2 аллель промотора КТ. Для второй группы штаммов характерным было наличие одного специфического светящегося фрагмента размером 532 пар нуклеотидов (тип MluI-2), что соответствовало профилю контрольных образцов ДНК штаммов возбудителя коклюша, несущих ptxP1 и ptxP3 аллели промотора. Следовательно, после рестрикции с эндо-нуклеазой MluI можно дифференцировать между собой штаммы, несущие ptxP1 и ptxP2 аллели промотора КТ.

Таким образом, для штаммов B. pertussis, несущих ptxP1 аллель промотора КТ, характерно наличие рестрикцион-ных профилей типов KpnI-1 и MluI-2, для штаммов, несущих ptxP2 аллель, — KpnI-1 и MluI-1, для штаммов, несущих ptxP3 аллель — профилей KpnI-2 и MluI-2. Разница комбинаций рестрикционных профилей различных аллелей промотора КТ является способом быстрой дифференциации штаммов.

С использованием разработанного метода молекуляр-но-генетического типирования изучена генетическая структура промотора ptxP коклюшного токсина 342 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в 1948—2012 гг. (из них 84 штамм выделен от больных коклюшем в 1948— 1999 гг. и 258 штамм выделен от больных коклюшем в 2000—2012 гг.). Все штаммы были предварительно идентифицированы в бактериологическом методе и секвениро-ваны фрагменты их промотора ptxP. В результате проведенного исследования выявлены особенности генетической структуры ptxP промотора и показано, что для 57 (24,6%) штаммов характерным был рестрикционный профиль типов KpnI-1 и MluI-2 и данные штаммы при секвенировании несли ptxP1 аллель промотора; 24 (10,3%) штамма характеризовались рестрикционным профилем KpnI-1 и MluI-1 и имели ptxP2 аллель и 151 (65,1%) штамм характеризовался рестрикционным профилем KpnI-2 и MluI-2 и несли ptxP3 аллель промотора КТ. Следовательно, показана специфичность нового метода на основе ПЦР-ПДРФ, т. е. получено полное совпадение с результатами секвенирования промотора ptxP.

Выводы

1. Разработанный метод мониторинга штаммов B. pertussis по структуре ptxP промотора, на основе изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифици-рованных продуктов (ПЦР-ПДРФ), дает возможность дифференцировать штаммы с особенностями структуры промотора ptxP и, как следствие, с увеличенной продукцией коклюшного токсина.

2. Разработанный метод типирования штаммов B. pertussis может являться инструментом при мониторинге штаммов возбудителя коклюша в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекций, позволяющим проводить наблюдение за циркулирующей популяцией B. pertussis, выявлять высоковирулентные штаммы возбудителя коклюша и следить за их распространением. На новый молекуляр-но-генетический метод типирования штаммов B. pertussis, имеющих различную структуру промотора ptxP, подан патент на изобретение.

Литература:

1. Analysis of Swedish Bordetella pertussis isolâtes with three typing

methods: characterization of an epidemic lineage / Advani A.,

H.G.J. Van der Heide, H.O. Hallander, F.R. Mooi // J. of Microbiological Methods. — 2009. — V. 78. — P. 297 — 301.

2. Appearance of fim3 and ptxP3 -Bordetella pertussis strains in two regions of Sweden with different vaccination program / А. Advani et al // Vaccine. — 2011. — V. 29. — P. 3438 — 3442.

3. Selection and emergence of pertussis toxin promoter ptxP3 allele in the evolution of Bordetella pertussis / С. Lam et al. // Infect. Genetic Evolution. — 2012. — V. 12. — Р. 492—495.

4. Bordetella pertussis with increased pertussis toxin production associated with pertussis resurgence / F.R. Mooi F. R. et al // Emerg. Infect. Dis. — 2009. — V. 15. — P. 1206—1213.

5. Polymorphism in the pertussis toxin promoter region affecting the DNA-based diagnosis of Bordetella infection / Nygren M., Reizenstein E., Ronaghi M., Lundeberg J. // J. Clin. Microbiology — 2000. — V. 38. — P. 55 — 60.

6. Особенности коклюшной инфекции в различные периоды эпидемического процесса в г. Москве / О.Ю. Борисова и др. // Журнал эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2010. — №4. — С. 33 — 39.

7. Лыткина И.Н. Заболеваемость коклюшем в Москве и организация мероприятий по ее снижению / Лыткина И.Н., Г.Г. Чистякова, Н.Н. Филатов // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. — 2004. — № 35. — С. 8—9.

8. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве на современном этапе / Г.Г. Чистякова и др. // ЖМЭИ. — 2005. — № 5. — С. 35—40.

9. Особенности генотипической изменчивости штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России / Алешкин В.А, Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. — 2012. — № 5 (87). — Ч. 1. — С. 177 — 183.

10. Генетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в России / О.Ю. Борисова и др. // Медицинский альманах. — 2012. — № 2 (21). — С. 30 — 34.

1 1. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов В.pertussis, выделенных от больных коклюшем в Москве (1948—2005 г г.) / Мазурова И К., Борисова О.Ю., Комба-рова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. // Молекулярная медицина. — 2008. — № 1. — С. 40 — 45.

12. Семенов Б.Ф., Захарова Н.С., Мазурова И.К. Подъем заболеваемости коклюшем на фоне массовой вакцинации. Гипотезы, объясняющие этот феномен // ЖМЭИ. — 2003. — № 6. — С. 70—73.

13. Современные штаммы Bordetella pertussis: молекулярная и иммунобиологическая характеристика / А.С. Шинкарев и др. // Журн. Микробиол. — 2007. — № 4. — С. 20 — 25.

14. Antigenic divergence between B.pertussis clinical isolates from Moscow, Russia, and vaccine strains / О. Borisova et al // J. Clin. And Vaccine Immunology. — 2007. — № 28. — P. 234—238.

15. Министерство здравоохр. СССР. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и па-ракоклюше. — 1984. — 23 стр.

Шейная лимфаденопатия инфекционной этиологии у детей: вопросы дифференциальной диагностики

С. Ю. Терещенко

ГБУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН,

Красноярский филиал ФГБУ «Гематологический Научный Центр» Минздравсоцразвития РФ

Шейная лимфаденопатия является очень частой диагностической находкой в практике педиатра. Большинство случаев увеличения лимфоузлов у детей не сопряжены с серьезными, угрожающими жизни заболеваниями. Однако у некоторой части паци-