Оценка влияния полиморфизмов в гене PRKAG3 на качественные показатели мяса свиней

DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10417 УДК 636.018:636.4:575.162

Оценка влияния полиморфизмов в гене PRKAG3 на качественные показатели мяса свиней*

О. В. КОСТЮНИНА, доктор биологических наук, зав. лабораторией, ведущий научный сотрудник

Л. В. ГЕТМАНЦЕВА, кандидат сельскохозяйственных

наук, ведущий научный сотрудник

М. С. ФОРНАРА, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Ю. А. ПРЫТКОВ, кандидат биологических наук,

научный сотрудник

Н. А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией

Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

Резюме. В качестве гена, характеризующего качественные показатели мяса, рассматривали PRKAG3, играющий ключевую роль в регуляции углеводного и липидного обмена. Цель работы - оценка влияния мутаций T30N, S52G и I199V по PRKAG3 на качественные показатели мяса свиней. Объектом опытов служили трехпородные гибридные боровки F2 (крупная белая х ландрас х дюрок) аналоги (n=25). Свиней выращивали в условиях физиологического двора и подвергали убою в возрасте 203.208 дней. Основной рацион и условия содержания животных были идентичны и соответствовали зоогигиеническим нормам. ДНК выделяли с помощью набора «ДНК-Экстран», постановку поли-мерзаной цепной реакции и определение генотипов по PRKAG3 осуществляли согласно разработанной ранее методике. После убоя отбирали образцы мышечной ткани. Для статистического анализа результатов использовали линейную модель. Частоты аллелей T и N в позиции p.T30N составляли 0,88 и 0,12, генотипов NT и TT - 24 и 76 % соответственно. Частоты аллелей G и S в позиции p.S52Gсоставляли0,90и0,10, генотипов GGиSG-80,0и 20,0 % соответственно. Частоты аллелей I и Vв позиции p.I199V составляли0,70и0,30, генотиповII, IV и VV -44,0,48,0и8,0 %со-ответственно. Содержание жировой ткани в мясе гетерозиготных особей NT(5,34±0,47%) было достоверно больше (на 2,08 %), чем у носителей генотипа TT. По содержанию оксипролина и жировой ткани выявлено значимое превосходство гетерозиготных IV особей (51,36±1,30 мг/% и 4,91±0,58 %) над носителями генотипа II на 4,19 мг/% и 2,32 % соответственно. Генетические варианты по PRKAG3 ассоциированы с качественными признаками мяса трехпородных гибридов и могут быть использованы при усовершенствовании потребительских свойств свинины.

Ключевые слова: свиньи, ДНК-маркер, PRKAG3, гибрид, внутримышечный жир, полиморфизм.

Дляцитирования: Оценка влияния полиморфизмов в гене PRKAG3 на качественные показатели мяса свиней / О. В. Костюнина, Л. В. Гетманцева, М. С. Форнара и др.//Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 4. С. 67-69 DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10417.

Внутримышечный жир (ВМЖ) или мраморность -важная характеристика мяса, поскольку ассоциируется с сочностью и ароматом [1]. Мясо с высоким уровнем внутримышечного жира пользуется большим спросом у потребителей, а уровень ВМЖ ниже 2,5 % связан с ухудшением его качества [2].

Ген РЯКАОЗ кодирует специфическую для мышц изоформу Y-субъединицы аденозинмонофосфат-зависимой протеинкиназы (АМРК), фермента, действующего как сенсор энергии и играющего ключевую

роль в регуляции углеводного и липидного обмена в клетках скелетных мышц млекопитающих [3]. Особую значимость с точки зрения селекции свиней имеют мутации в аминокислотной последовательности в позициях p.T30N, p.S52G, p.I199V, p.R200Q [3, 4]. Достаточно широко изучен полиморфизм p.R200Q, служащий причиной образования «кислого мяса». Он приводит к снижению предельных значений рН, вследствие чего появляются дефекты цвета, снижается влагоудерживающая способность мяса и выход конечного продукта после переработки. Замена p.I199V связана с предпочтительным качеством мяса, содержанием гликогена в мышцах и конечной величиной рН [4, 5]. Предполагается, что отвечает за эти положительные характеристики аллель 199I [6, 7, 8], при этом частота его у большинства свиней современных пород и их гибридов составляет менее 10 % [4, 7, 9], за исключением породы беркшир, у которой она равна 74 % [4]. Довольно частые миссенс-мутации p.T30N (c.89C>A) и p.S52G (c.154A>G) также влияют на некоторые параметры качества мяса [10].

В связи с этим цель нашей работы - изучение качественных показателей мяса свиней с учетом полиморфных вариантов по PRKAG3 в позициях p.T30N, p.S52G и p.I199V.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2016-2018 гг. Объектом опытов служили трехпородные гибридные боровки F2 (крупная белая х ландрас х дюрок) аналоги (n=25). Свиней выращивали в условиях физиологического двора и подвергали убою в возрасте 203...208 дней. Основной рацион и условия содержания подопытных животных были идентичны и соответствовали зоогигиеническим нормам.

Выделение ДНК осуществляли из проб ткани (ушной выщип) с помощью набора «ДНК-Экстран» (НПО «Син-тол», Россия) согласно рекомендациям производителя. Полиморфизм PRKAG3 определяли посредством пиросеквенирования по методике, разработанной в отделе биотехнологии и молекулярной диагностики ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л. К. Эрнста [11].

В зависимости от установленных генотипов изучали качественные показатели мяса и гистоструктуру мышечной ткани. Для оценки качества мяса исследуемых животных определяли следующие показатели: влага (%), белок (%), жир (%), зола (%) по ГОСТ Р 51447-92 и ИСО 3100-1-94, рН - по ГОСТ Р 514789-99 и ИСО 2917-74, влагоемкость (%) - по методике Л. В. Антиповой [12], площадь «мышечного глазка» (см2) рассчитывали по формуле: S = 0,8 х h х I, где S - площадь, h - максимальная высота, I - максимальная длина мышечного глазка.

Для изучения гистоструктуры мышечной ткани отобранные при убое образцы фиксировали в 10 %-ном формалине. Гистологические препараты готовили на замораживающем микротоме. Для оценки жировых включений их окрашивали суданом [13] и анализировали с использованием микроскопа Ni-U (Nikon, Япония). Обработку и анализ изображений осуществляли с применением пакета программ NIS-Elements (Nikon, Япония).

*Работа проведена в рамках выполнения задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации ГЗ № АААА-А18-118021590138-1.

Таблица 1. Качественные показатели мяса свиней с учетом генетических вариантов по РЙКАйЗ Т30Ы и 052Б

Показатель Генотип

NT (6) TT (19) р1 GG (20) SG (5) 1 Р1

Температура плавления, °С 41,92±0,93 41,52±0,46 0,633 41,62±0,44 41,60±1,12 0,963

Влага, % 10,24±0,94 10,20±0,35 0,963 10,31±0,39 9,80±0,66 0,556

Первоначальная влага, % 74,61±0,25 74,24±0,21 0,374 74,35±0,18 74,24±0,52 0,812

Белок, % 19,69±0,36 20,22±0,23 0,251 20,21±0,23 19,62±0,21 0,226

Жир, % 4,03±0,51 3,75±0,20 0,545 3,74±0,20 4,15±0,53 0,402

Зола, % 1,78±0,14 1,79±0,07 0,921 1,73±0,07 1,99±0,06 0,0993

рН после убоя 6,05±0,04 6,10±0,02 0,312 6,07±0,02 6,15±0,06 0,0923

РН24 5,65±0,05 5,64±0,03 0,885 5,62±0,03 5,74±0,06 0,0803

Влагоемкость к влаге, % 68,12±1,19 69,25±0,79 0,478 68,39±0,72 71,31 ±1,32 0,0773

Площадь «мышечного глазка», см2 53,53±3,14 52,25±1,76 0,726 53,05±1,75 50,59±2,96 0,526

Оксипролин, мг/% 50,83±1,45 49,11±0,93 0,361 48,85±0,75 52,20±2,42 0,0903

Триптофан, мг/% 242,6±9,36 245,8±6,48 0,805 242,3±5,78 256,0±13,43 0,316

Мышечная ткань, % 94,66±0,47 96,74±0,45 0,0222 96,28±0,43 96,09±1,10 0,849

Жировая ткань, % 5,34±0,47 3,26±0,45 0,0222 3,72±0,43 3,91±1,10 0,849

Количество волокон на 1 мм2, шт. 193,21±6,06 201,35±11,14 0,699 195,27±8,86 215,89±24,82 0,342

Диаметр волокон, мкм 66,50±2,84 64,20±2,67 0,622 66,03±2,31 59,65±4,99 0,229

Площадь волокон, мкм2 2642,64±189,50 2646,83±216,98 0,992 2635,25±176,96 2688,16±513,25 0,904

'р - уровень достоверности, рассчитанный по линейной модели; 2p < 0,05; 3р < 0,10 (тенденция).

Анализ данных проводили в среде R-studio, используя линейную функцию (lm). Структура линейной модели для оценки связи генетических вариантов по гену PRKAG3 с изучаемыми признаками в R-синтаксисе:

Lm (formula = Y ~ PRKAG3_199 + PRKAG3_30 + PRKAG3_52),

^Y- изучаемый признак, PRKAG3_199 - генетические варианты в позиции I199V, PRKAG3_30 - генетические варианты в позиции N30T, PRKAG352 - генетические варианты в позиции S52G. В случае если фактор имел более двух градаций (три генотипа) дополнительно оценивали различия между генотипами по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Частоты аллелей Ти N гена PRKAG3 в позиции p.T30N составили 0,88 и 0,12 соответственно. Гомозиготный генотип NNв исследуемой выборке идентифицирован не был, а генотипы NTи ТТимели частоты 24 и 76 %, соответственно. Аллели G и S в позиции p. G52S у свиней встречались с частотой 0,90 и 0,10 соответственно. Особей с гомозиготным генотипом SS не выявлено, частоты генотипов GG и SG зафиксированы на уровне 80,0 и 20,0 % соответственно. В позиции I199V аллели I и V встречались с частотами 0,70 и 0,30, генотипы II, IV и VV - 44, 48 и 8 % соответственно). С учетом генетических вариантов сформировали группы животных для оценки качественных показателей мяса.

С лучшим качеством мяса ассоциируется аллель N30T [4]. По результатам наших исследований у гетерозиготных особей NT, в сравнении с носителями генотипа ТТ, содержание жировой ткани было значимо выше (р=0,022). По остальным признакам статистически достоверных ассоциаций выявлено не было (табл. 1).

Ранее для мутации G52S значимый эффект (р < 0,05) был обнаружен только для pH [4]. Мы наблюдали тенденцию к превосходству особей с генотипом SG по содержанию золы над особями с генотипом GG на 0,26 % (р=0,099). Влагоемкость, рН, содержание оксипролина

также были выше у гетерозигот. Для подтверждения или опровержения этих тенденций необходимо использовать в опыте большее число животных.

Dall'Olio и коллеги [14] обнаружили связь мутации 052Б с содержанием влаги (желательный 52Б) и внутримышечного жира в мясе (желательный 520). В наших исследованиях значимых зависимостей по этим признакам не выявлено.

По данным Яуап и коллег [8] мутация !199У связана с внутримышечным жиром как у крупной белой породы свиней, так и у пьетрена (!!>УУ), в наших исследованиях (табл. 2), проведенных на трехпородных гибридах, наоборот, животные с генотипом /^превосходили особей !! по доле жировой ткани при более низком содержании мышечной ткани (р < 0,01). Особи с генотипом !! в позиции 199 значимо (р < 0,01, р < 0,05) уступали носителям аллеля Упо содержанию оксипролина. Также у них выявлены достоверные различия с гетерозиготами по белку (р < 0,01) и гомозиготами УУ по жиру (р < 0,05).

Аллель ! в позиции 199 связывают с гликолитическими признаками, включая влагоудерживающую способность и рН [8]. У свиней породы дюрок была выявлена значимая аддитивная ассоциация с конечной величиной рН24 в полусухожильной мышце бедра, причем носители генотипа II имели самые высокие значения рН, а УУ- самые низкие [8].

Таблица 2. Качественные показатели мяса свиней с учетом генетических вариантов по РИКАОЗ 1199У

Показатель

Генотип

Температура плавления, °С Влага, %

Первоначальная влага, %

Белок, %

Жир, %

Зола, %

рН после убоя

РН24

Влагоемкость к влаге, % Площадь «мышечного глазка», Оксипролин, мг/% Триптофан, мг/% Мышечная ткань, % Жировая ткань, % Количество волокон на 1 мм2, Диаметр волокон, мкм Площадь волокон, мкм2

II

см'

41,50±0,57 10,31±0,48 74,23±0,27 20,53±0,31* 3,50±0,22* 1,75±0,10 6,06±0,02 5,61±0,04 67,98±0,96 53,62±2,40 47,17±0,55*,** 244,1±8,49 97,41±0,43** 2,59±0,43** 193,47±13,96 64,81±3,01 2507,87± 213,30

IV

42,03±0,67 9,71±0,46 74,42±0,27 19,76±0,22* 3,93±0,29 1,89±0,08 6,10±0,04 5,69±0,04 70,18±0,75 52,85±2,04 51,36±1,30** 244,8±8,08 95,09±0,58** 4,91±0,58** 200,98±11,83 65,23±3,59 2829,55± 304,02

VV

40,00±0,00 12,33±1,07 74,37±0,44 19,32±0,02 5,14±0,99* 1,49±0,25 6,15±0,06 5,62±0,02 68,31±5,01 44,56±1,76 53,50±2,50* 252,0±11,00 95,53±0,80 4,47±0,80 226,27±20,13 61,78±5,84 2463,12± 412,55

Р.

0,414 0,120 0,870 0,0773 0,0663 0,219 0,364 0,365 0,276 0,297 0,0072 0,933 0,0112 0,0112 0,618 0,928

0,647

(р < 0,05; 0,001) линейной модели;3 - тенденции (р < 0,10) линейной модели;

*р < 0,05, **р < 0,01 - уровень достоверности различий между генотипами!!, !У и УУ.

шт.

В наших исследованиях не было обнаружено статистически Выводы. Результаты исследований продемонстри-

достоверной связи полиморфных вариантов в позициях ровали наличие полиморфизма по мутациям T30N, G52S,

T30N, G52SиI199Vс рН мяса после убоя и pH24. Аналогичные I199V в гене PRKAG3 у изученной группы трехпородных ги-

результаты были получены Uimari и Sironen [15], которые при бридов. Наиболее выраженные отличия зафиксированы по

изучении аминокислотных замен T30N, G52S, L53P, I199Vи признакам содержания жировой и мышечной ткани. Так, по

R200Q не выявили значимых ассоциаций с рН мяса. мутации T30N разница между генотипами составила 2,08 %

Физиологические функции PRKAG3 затрагивают (при p < 0,05), по I199V- 2,32 % (при p < 0,01). широкий диапазон качественных характеристик сви- Оценка влияния PRKAG3 на качественные показатели

нины, включая цвет [16], состав туши [5] и содержание мяса трехпородных гибридов имеет важное значение для

внутримышечного жира [17]. Анализ результатов наших определения перспектив его использования в усовершен-

исследований также свидетельствует, что генетические ствовании потребительских свойств свинины. Проведение

варианты по PRKAG3 ассоциированы с показателями, ха- таких исследований на большем поголовье позволит также

растеризующими качественные признаки мяса. Наиболее изучить влияние комплексных генотипов на качественные

значимые зависимости найдены для мутации I199V. показатели мяса свиней.

Литература.

1. Prediction of intramuscular fat content using CT scanning of packaged lamb cuts and relationships with meat eating quality/N. R. Lambe, K. A. McLean, J. Gordon, etc.//MeatSci. 2017. Vol. 123. Pp. 112-119. doi: 10.1016/j.meatsci.2016.09.008.

2. Increased intramuscular fat induced by reduced dietary protein in finishing pigs: effects on the longissimus lumborum muscle proteome / V. M. Pires, M. S. Madeira, A. A. Dowle, etc. //Mol Biosyst. 2016. Vol. 19. № 12(8). Pp. 2447-2457. DOI: 10.1039/c6mb00213g.

3. A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle / D. Milan, J. T. Jeon, C. Looft, etc. //Science. 2000. Vol. 288. Pp. 1248-1251.

4. Evidence for new alleles in the protein kinase adenosine monophosphate-activated g3-subunit gene associated with low glycogen content in pig skeletal muscle and improved meat quality/D. Ciobanu, J. Bastiaansen, M. Malek, etc.// Genetics. 2001. Vol. 159. Pp. 1151-1162.

5. Development of optimal breeding pigs using dna marker information / S. W. Kim, J. G. Roh, Y. I. Cho, etc. // Genomics & Informatics. 2010. Vol. 8(2). Pp. 81-85.

6. PRKAG3 gene and meat quality of hybrid pigs / V. Bertie, Z. Bosnjak, I. Durkin, etc. // Agriculturae Conspectus Scientificus. 2013. Vol. 78. №. 3. Pp. 159-162.

7. PRKAG3 and CAST genetic polymorphisms and quality traits of dry-cured hams--III. Associations in Slovenian dry-cured ham Kraski prsut and their dependence on processing/M. Skrlep, M. Candek-Potokar, B. Zlender, etc.//Meat Sci. 2012. Vol. 92(4). Pp. 360-365. DOI: 10.1016/j. meatsci.2012.06.021.

8. SNP variation in the promoterofthe PRKAG3 gene and association with meat quality traits in pig/M. T. Ryan, R. M. Hamill, A. M. O'Halloran, etc. // BMC Genetics. 2012. Vol. 13. Pp. 66-82.

9. Effect of I199V polymorphism on PRKAG3 gene on carcass meat quality traits in Slovenian commercial pigs/M. Skrlep, T. Kavar, V. Sante-L'Houtellier, etc. // J. Muscle Foods. 2009. Vol. 20. Pp. 367-376.

10. Allelic frequencies of PRKAG3 in several pig breeds and its technological consequences on a Duroc х Landrace-Large White cross/A. Galve, C. Burgos, L.. Varona, etc. //J Anim Breed Genet. 2013. Vol. 130 (5). P.382-393. DOI: 10.1111/jbg.12042.

11. Костюнина О. В., Зиновьева Н. А. Способ диагностики аллелей T30N, S52G, I199Vи R200Q гена PRKAG3//Патент РФ A 2006120129 RU, 10.07.2008.

12. Антипова Л. В., Глотова И. В., Рогов И. А. Методы исследования мяса и мясных продуктов. М.: Колос, 2004. 576с.

13. СаркизовД. С., Перов Ю. П. Микроскопическая техника: руководство. М.: Медицина, 1996. 544 с.

14. Effects of single nucleotide polymorphisms and haplotypes of the protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 3 (PRKAG3) gene on production, meat quality and carcass traits in Italian Large White pigs/S. Dall'Olio, E. Scotti, L. N. Costa, etc. //Meat Sci. 2018. Vol. 136. Pp. 44-49. DOI: 10.1016/j.meatsci.2017.09.012.

15. Uimari P., Sironen A. A combination of two variants in PRKAG3 is needed for a positive effect on meat quality in pigs // BMC Genet. 2014. Vol. 15. Pp. 29. DOI: 10.1186/1471-2156-15-29.

16. Relationships between Single Nucleotide Polymorphism Markers and Meat Quality Traits of Duroc Breeding Stocks in Korea / J. S. Choi, S. K. Jin, Y. H. Jeong, etc. Asian-Australas J Anim Sci. 2016. Vol. 29 (9). Pp.1229-1238. DOI: 10.5713/ajas.16.0158.

17. Skrlep M., Kavar T., Candek-Potokar M. Comparison of PRKAG3 and RYR1 gene effect on carcass traits and meat quality in Slovenian commercial pigs // Czech J Anim Sci. 2010. Vol. 55 (4). Pp. 149-159.

Evaluation of the Polymorphism Effect in the PRKAG3 Gene on the Quality Indicators of Pork

O. V. Kostyunina, L. V. Getmantseva, M. S. Fornara, Y. A. Prytkov, N. A. Volkova

Federal Scientific Center of Animal Husbandry - L. K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation

Abstract. PRKAG3 gene was considered as a gene, characterized the qualitative characteristics of meat. It plays a key role in the regulation of carbohydrate and lipid metabolism. The purpose of the research was to evaluate the effect of T30N, S52G and I199V mutations on PRKAG3 gene on the quality indicators of pork. The object of the experiments was three-breed young F2 hybrid (Large White x Landrace x Duroc) hogs-analogues (n = 25). The pigs were grown under conditions of the physiological yard and were slaughtered at the age of 203-208 days. The basic diet and husbandry were identical and corresponded to zoohygienic norms. DNA was isolated using the DNA-Extran kit. The polymerase chain reaction was conducted and genotypes were determined according to PRKAG3 gene under the previously developed method. Muscle tissue was sampled after slaughter. For statistical analysis of the results a linear model was used. The frequencies of T and N alleles in p.T30N position were 0.88 and 0.12 respectively. The frequencies of NT and TT genotypes were 24 and 76%, respectively. The frequencies of G and S alleles at p.S52G position were 0.90 and 0.10, respectively. The frequencies of GG and SG genotypes were 80.0 and 20.0%, respectively. The frequencies of alleles I and Vin p.I199V position were 0.70 and 0.30, respectively. The frequencies of II, IV and VV genotype were 44.0, 48.0 and 8.0%, respectively. In the meat of heterozygous NT animals the content of adipose tissue was significantly higher (by 2.08%) (5.34 ± 0.47%), than in the meat of TT genotype carriers. The content of hydroxyproline and adipose tissue was significantly higher in the meat of heterozygous IV individuals (51.36 ± 1.30 mg/% and 4.91 ± 0.58%) than in the meat of the carriers of genotype II - by 4.19 mg/% and 2.32%, respectively. Genetic variants on PRKAG3 gene are associated with the qualitative characteristics of the meat of three-breed hybrids and can be used to improve consumer properties of pork. Keywords: pigs; DNA marker; PRKAG3; hybrid; intramuscular fat; polymorphism.

Author Details: O. V. Kostyunina, D. Sc. (Biol.), head of laboratory, leading research fellow (e-mail: kostolan@yandex.ru); L. V Getmantseva, Cand. Sc. (Agr.), leading research fellow; M. S. Fornara, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; Y A. Prytkov, Cand. Sc. (Biol.), research fellow; N. A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory, chief research fellow, professor of the RAS.

For citation: Kostyunina O. V, Getmantseva L. V, Fornara M. S., PrytkovY A., Volkova N. A. Evaluation ofthe Polymorphism Effect in the PRKAG3 Gene on the Quality Indicators of Pork. Dostizheniyanaukiitekhniki APK. 2019. Vol. 33. No. 4. Pp. 67-69 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10417.