СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАЧАЛЬНЫХ ФОРМ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА
METHOD FOR DIAGNOSTICS OF INITIAL FORMS OF EXTERNAL GENITAL ENDOMETRIOSIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и позволяет повысить точность и эффективность неинвазивной диагностики начальных форм наружного генитального эндометриоза.
Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) является одним из самых распространенных заболеваний репродуктивной сферы женщин и занимает 3 место в структуре гинекологических заболеваний. (Ярмолинская, М.И. Генитальный эндометриоз. Различные грани проблемы / М.И. Ярмолинская, Э.К. Айламазян. - Санкт-Петербург: Эко-Вектор, 2017. - 615 с.) Согласно данным статистики, каждая 10-я женщина репродуктивного возраста страдает эндометриозом, что означает, что данное заболеванием диагностируется во всем мире как минимум у 190 млн женщин. (Becker СМ, Bokor A, Heikinheimo О, et al. ESHRE guideline: endometriosis. Hum Reprod Open. 2022;2022(2):hoac009. doi:10.1093/hropen/hoac009) Длительность постановки диагноза в первую очередь связана с неспецифичностью симптомов, которые также характерны для других заболеваний, в том числе и не связанных с репродуктивной системой. (Agarwal SK, Chapron С, Giudice LC, et al. Clinical diagnosis of endometriosis: a call to action. Am J Obstet Gynecol. 2019;220(4):354.el-354.el2. doi:10.1016/j.ajog.2018.12.039)
В настоящее время отсутствует «золотой» стандарт диагностики НГЭ. (Becker CM, Bokor A, Heikinheimo О, et al. ESHRE guideline: endometriosis. Hum Reprod Open. 2022;2022(2):hoac009. doi:10.1093/hropen/hoac009) Существующие способы диагностики в виде использования бимануального осмотра, УЗИ, МРТ исследований, лапароскопической хирургии, и даже гистологического верифицирования не позволяют с уверенностью исключить наличие заболевания.
Несмотря на постоянный процесс разработки новых неинвазивных способов диагностики данного заболевания, отсутствуют достоверные лабораторные биомаркеры начальных форм НГЭ, определяющих чувствительность к медикаментозной терапии и которые могли быть рассмотрены в качестве критерия отбора пациенток для хирургического вмешательства. (Rogers PA, Adamson GD, Al-Jefout Μ, et al. Research Priorities for Endometriosis. Reprod Sci. 2017;24(2):202-226. doi:10.1177/1933719116654991) Биомаркер - это биологическая молекула, которая может быть объективно измерена и оценена как показатель биологических, так и патологических процессов, а также изменений в ответ на терапевтическое вмешательство.
Обзор 2016 г. в рамках методологии Cohrane подтвердил ранее известные выводы о том, что в настоящее время не существует надежных биомаркеров диагностики НГЭ для клинического использования. (Gupta D, Hull ML, Fraser I, et al. Endometrial biomarkers for the non-invasive diagnosis of endometriosis. Cochrane Database Syst Rev. 2016;4(4):CD012165. Published 2016 Apr 20. doi:10.1002/14651858.CD012165) Все включенные в данный обзор исследования были признаны низкого методологического качества.
Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент RU 2726971 МПК G01N 33/49, дата публикации: 17.07.2020 г.) по исследованию методом газовой хромато-масс-спектрометрии в сыворотке крови уровня метаболитов триптофана, аланина, глицина, пролина, серина, когда регистрируется снижение концентрации глицина, аланина, пролина и серина не менее чем в 1,4 раза и повышение триптофана не менее чем в 1,4 раза по сравнению с референтными значениями, и на данном основании диагностируют НГЭ.
Недостатком способа является большая вариабельность уровня метаболитов аминокислот у каждой пациентки, зависящая от образа жизни и питания, а также низкая доступность способа диагностики исследования в связи с ее дороговизной.
Известен способ диагностики генитального эндометриоза (патент RU 2756027 С1 МПК G01N 33/74, дата публикации: 24.02.2021 г.) по исследованию в плазме крови концентрации окситоцина 36,1 пг/мл и выше диагностируют НГЭ.
Недостатком способа является невозможность определения стадии заболевания, недостаточная специфичность способа, поскольку содержание окситоцина может значительно варьировать в зависимости от наличия не только неврологических заболеваний, но также от психического состояния пациентки, которое может быть нарушено и у пациентки без эндометриоза.
Известен способ диагностики НГЭ (патент RU 2164687, дата публикации: 27.03.2001 г.) по определению в крови спонтанной НСТ-активности нейтрофилов после их инкубации с ПАМГ-2 и при показателях ее 24% и выше диагностируют НГЭ.
Для данного способа характерна субъективная оценка в связи с использованием светового микроскопирования, которое также является довольно неспецифичным методом иммунологического исследования.
Известен способ диагностики НГЭ (патент RU 2363001 МПК G01N 33/68, дата публикации 27.07.2009) по определению содержания сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) в перитонеальной жидкости и сыворотке крови, где при повышении отношения СЭФР в сыворотке крови к СЭФР в перитонеальной жидкости больше 4,35 диагностируют наличие НГЭ.
К недостаткам способа относятся инвазивность, а именно необходимость забора перитонеальной жидкости, неспецифичность, учитывая роль СЭФР в ангиогенезе не только эндометриоидных гетеротопий, но и организма в целом.
Известен диагностический тест, при котором учитывается уровень коэнзима Q10 и α-токоферола в сыворотке крови (патент RU 2599019 МПК G01N 33/53, дата публикации 10.10.2016). В случае регистрации уровня коэнзима Q10 выше 1,352 мкг/мл и α-токоферола более 21,03 мкг/мл НГЭ исключают, при концентрации коэнзима Q10 менее 1,057 мкг/мл и α-токоферола менее 18,00 мкг/мл диагностируют тяжелые или умеренные формы НГЭ; при концентрациях коэнзима Q от 1,057 мкг/мл до 1,352 мкг/мл и α-токоферола от 18,00 мкг/мл и до 21,03 мкг/мл - малые формы НГЭ.
Однако недостатками данного метода является как низкая специфичность исследуемых биомаркеров именно к эндометриозу, так и недостаточная точность способа.
Вышеперечисленные способы диагностики НГЭ взяты за прототип настоящего изобретения.
Известно, что степень распространенности НГЭ не коррелирует с наличием или выраженностью симптомов, что и является одной из главных причин задержки постановки диагноза в среднем от 8 до 12 лет, кроме того, невозможно точно установить время возникновения заболевания. (Kiesel L, Sourouni Μ. Diagnosis of endometriosis in the 21st century. Climacteric. 2019;22(3):296-302. doi:10.1080/13697137.2019.1578743) Однако, сложность планируемого хирургического вмешательства и его возможных рисков ассоциировано со степенью распространенности процесса) начальной или распространенной формы НГЭ). (Menakaya U, Reid S, Lu С, Gerges В, Infante F, Condous G. Performance of ultrasound-based endometriosis staging system (UBESS) for predicting level of complexity of laparoscopic surgery for endometriosis Ultrasound Obstet Gynecol. 2017 May;49(5):667. doi: 10.1002/uog. 15858) В связи с этим поиск биомаркеров диагностики начальных форм заболевания является крайне актуальным.
Существует два подхода к поиску потенциальных биомаркеров: в первом случае гипотеза о патогенезе эндометриоза приводит к исследованию определенных маркеров, при втором подходе большое количество биомаркеров исследуется на основе системной биологии (например, метод омиксных технологий, миРНК). В нашем исследовании мы обратились к первому подходу.
Известно о значимой роли нарушения процессов апоптоза в развитии эндометриоза. Эутопический эндометрий женщин с НГЭ характеризуется повышенной экспрессией антиапоптотических факторов и сниженной экспрессией проапоптотических факторов по сравнению с эндометрием здоровых женщин. Эти различия могут способствовать выживанию клеток эндометрия в перитонеальной полости и возникновению заболевания. (Taniguchi F, Kaponis A, Izawa Μ, et al. Apoptosis and endometriosis. Front Biosci (Elite Ed). 2011;3(2):648-662. Published 2011 Jan 1. doi:l0.2741/e277)
Сурвивин относится к семейству белков ингибиторов апоптоза, задача которых защищать клетку от запрограммированной гибели. При сравнении с другими антиапоптотическими факторам, известно участие сурвивина в процессах ангиогенеза и миграции клеток, которые также вносят свой вклад в развитие эндометриоза. (Kapoor R, Stratopoulou СА, Dolmans ММ. Pathogenesis of Endometriosis: New Insights into Prospective Therapies. Int J Mol Sci. 2021;22(21):11700. Published 2021 Oct 28. doi:10.3390/ijms222111700)
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для неинвазивной диагностики НГЭ, специфичность, высокая точность, возможность диагностики НГЭ на ранних стадиях, использование в клинической практике.
Указанный технический результат достигается в способе диагностики начальных  форм НГЭ, включающем исследование сыворотки крови, в котором определяют содержание сурвивина в сыворотке крови, взятой из локтевой вены натощак на 5-7 день менструального цикла и при содержании сурвивина в сыворотке крови 56,9 пг/мл и выше диагностируют НГЭ I-II степени.
Способ иллюстрируется фиг. 1, где представлена ROC-кривая диагностической эффективности способа для диагностики начальных форм НГЭ.
Высокая скорость инвазии, автономия и разрастание по мере прогрессирования заболевания с последующим повреждением подлежащих органов, активация неоангиогенеза с формированием эндометриоидных инфильтратов в органах и тканях, зачастую с нарушением их функции - все это предполагает сходство патогенеза НГЭ и рака, где сурвивин используется в качестве маркера рецидива и прогрессирования неопластических процессов (2019) Так значение уровня сурвивина в сыворотке крови выше порогового значения 110 пг/мл рекомендовано к использованию с целью раннего выявления серозного рака яичников при чувствительности и специфичности 82% и 43% соответственно. (Dobrzycka В, Mackowiak-Matejczyk В, Terlikowska KM, Kulesza-Bronczyk В, Kinalski Μ, Terlikowski SJ. Prognostic significance of pretreatment VEGF, survivin, and Smac/DIABLO serum levels in patients with serous ovarian carcinoma. Tumour Biol. 2015;36(6):4157-4165. doi: 10.1007/s 13277-015-3050-x)
Для верификации заявленного способа определяли содержание сурвивина в группе (60 женщин) больных с НГЭ I-IV степени распространенности, из которых 33 женщины с НГЭ I-II степени распространенности, и в контрольной группе (17 человек) здоровых женщин.
Степень распространенности процесса в группе с НГЭ определяли в баллах по пересмотренной классификации Американского Общества Фертильности (R-AFS) в соответствии с результатами лапароскопического исследования. Диагноз у всех больных был установлен на основании лапароскопии и подтвержден результатами гистологического исследования.
Контрольную группу составили здоровые женщины, у которых на основании проведения лапароскопии перед протоколом ЭКО не было выявлено гинекологической патологии.
Средний уровень сурвивина в сыворотке крови в группе больных с НГЭ был достоверно выше по сравнению с показателями в контрольной группе (58,0±5,3 пг/мл и 42,7±3,1 пг/мл, р<0,05). При проведении дисперсионного анализа среднее значение сурвивина в сыворотке крови среди больных с начальными формами распространенности НГЭ (70,6±3,9 пг/мл) статистически значимо был выше среднего уровня группы контроля (42,7±3,1 пг/мл) (р 0,001).
Для проведения оценки качества (диагностической эффективности) прогностической модели использовался метод построения кривой взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и истинно положительных результатов (ROC-кривой). При оценке уровня сурвивина в группах НГЭ I-IV и контроля площадь ROC-кривой (фиг.2) составила 0,650 с 95% ДИ: 0,433-0,884, что свидетельствует об отсутствии возможности построения прогностической модели. В свою очередь площадь под ROC-кривой (фиг.1), соответствующей взаимосвязи прогноза НГЭ I-II степени и уровня сурвивина в сыворотке крови, составила 0,853 с 95% ДИ: 0,710-0,995. Пороговое значение уровня сурвивина в точке порога классификации составляло 56,9 пг/мл. При уровне сурвивина в сыворотке крови равного 56,9 пг/мл или превышающего данное значение соответствовало прогнозу наличия НГЭ I-II степени. Чувствительность и специфичность метода составили 71,3% и 88,2% соответственно.
Таким образом, у больных с подозрением на НГЭ определение уровня сурвивина в периферической крови на 5-7 день менструального цикла может рассматриваться в качестве биомаркера для неинвазивной диагностики заболевания.
Вышеизложенное подтверждает диагностическую ценность заявляемого способа: высокие чувствительность и специфичность, возможность ранней диагностики НГЭ, назначение соответствующей терапии либо необходимости применения хирургического вмешательства.
Способ осуществляют следующим образом.
Для определения уровня сурвивина образцы крови собирают из локтевой вены натощак на 5-7 день менструального цикла в полипропиленовую пробирку, содержащую диоксид кремния в качестве активатора свертывания. Спустя 2 часа после забора крови пробирки центрифугируют при скорости 2000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Для количественного измерения уровня сурвивина в сыворотке крови используют метод твердофазного иммуноферментного анализа, основанный на принципе конкурентного связывания (набор «Survivin ELISA» компании Cloud-Clone Corp.). Динамический диапазон метода: 8,2-252,33 пг/мл. Функциональная чувствительность теста составила <8,2 пг/мл. При необходимости хранения образцы сыворотки крови должны храниться при температуре -70°С до момента использования.
Сущность способа подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка Α., 27 лет, обратилась с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение последних 2 лет регулярной половой жизни без контрацепции, болезненные менструации с периода менархе, периодические боли внизу живота, не связанные с менструальным циклом, которые усилились в последний год.
УЗИ малого таза (20-й день цикла): матка 46x29x58 мм. Миометрий однородный. Эндометрий 10 мм, однородной структуры, секреторный. Правый яичник 30x19x16 мм, объем 4,7 см3, содержит 6-7 фолликулов диаметром 5-6 мм, левый яичник 36x21x19 мм, объем 7,5 см3, содержит 7-8 фолликулов диаметром до 5-8 мм и желтое тело диаметром 21 мм.
Предварительный диагноз: НГЭ? Первичное бесплодие 2 года.
Спермограмма мужа- нормозооспермия.
Содержание сурвивина в сыворотке крови натощак на 5-й день цикла составило 78,9 пг/мл.
Выполнено: операционная лапароскопия. Электрокоагуляция и иссечение очагов эндометриоза, хромогидротубация, гистероскопия, биопсия эндометрия. Послеоперационный диагноз: НГЭ II степени, что подтверждает диагноз, установленный по заявленному способу. Верификация диагноза проведена на основании результатов гистологического исследования.
Пример 2. Пациентка К., 22 лет, обратилась с жалобами на боли внизу живота, значительно усиливающиеся во время менструации, с межменструальными кровянистыми выделениями за 7-9 дней до начала менструального цикла. В последний год боли стали более интенсивными, самостоятельно принимает нестероидные противовоспалительные средства до 3 раз в день, дважды вызывала «Скорую помощь». Половой жизнью не живет.
Предварительный диагноз: НГЭ?
Содержание сурвивина в сыворотке крови натощак на 5-й день цикла составило 60,9 пг/мл.
УЗИ малого таза (5-й день менструального цикла): матка 46x29x52 мм. Миометрий однородный. Эндометрий 5 мм, однородной структуры. Правый яичник 30x19 x16 мм, объем 4,7 см3, содержит 6-7 фолликулов диаметром 5-6 мм, левый яичник 34x19x16 мм, объем 5,4 см3, содержит 7-8 фолликулов диаметром до 5-8 мм, расположены хаотично, строма в обычном объеме.
Выполнено: операционная лапароскопия. Электрокоагуляция и иссечение очагов эндометриоза.
Послеоперационный диагноз: НГЭ II степени, что подтверждает диагноз, установленный по заявленному способу. Верификация диагноза проведена на основании результатов гистологического исследования.
Пример 3. Пациентка В., 30 лет, обратилась с жалобами на болезненные менструации, отсутствие наступления беременности на протяжении 3-х лет регулярной половой жизни без контрацепции.
Результаты УЗИ (5-й день цикла): матка 4,6x3,5x4,7 см, эндометрий 0,3 см, правый яичник 3,5x1,9x2,7 см, объем 9,3 см3, левый яичник 3,2x2,1x2,8 см, объем 9,8 см3. Оба содержат 7-8 фолликулов диаметром 5-8 мм, расположены хаотично.
Спермограмма мужа - нормозооспермия.
Предварительный диагноз: НГЭ?
Содержание сурвивина в сыворотке крови натощак на 7-й день цикла составило 42,4 пг/мл.
Выполнено: операционная лапароскопия, двусторонний сальпингоовариолизис, гистероскопия, биопсия эндометрия.
Установлен диагноз: хронический сальпингоофорит.
Пример 4. Пациентка Г.В., 29 лет, поступила на гинекологическое отделение с жалобами на тянущие боли внизу живота во время менструации, диспареунию, отсутствие наступления беременности в течение 1 года на фоне регулярной половой жизни без применения средств контрацепции.
Предварительный предоперационный диагноз: генитальный эндометриоз?
Уровень сурвивина в сыворотке крови натощак на 5-й день менструального цикла составил 56,9 пг/мл.
Выполнено: лапароскопия, хромогидротубация, иссечение эндометриоидного инфильтрата брюшины малого таза, аблация эндометриоидных гетеротопий, гистероскопия, биопсия эндометрия.
Послеоперационный диагноз: НГЭ II степени, что подтверждает правильность диагноза, установленного по заявленному способу. Верификация диагноза проведена на основании результатов гистологического исследования.
Заявляемый способ расширяет арсенал средств неинвазивной диагностики НГЭ, является специфичным, обладает высокой точностью, позволяет диагностировать НГЭ на ранних стадиях, может широко использоваться в клинической практике.