Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью
HUMIC SUBSTANCE HAVING IMMUNOMODULATORY ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, результаты которого могут быть использованы для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).
Пелоидотерапия (грязелечение природными органоминеральными коллоидальными образованиями (иловыми, торфяными, сопочными), обладающими высокой пластичностью, теплоемкостью и теплоотдачей, содержащими активные биологические вещества (соли, газы, витамины, ферменты, гормоны и др.) и живые микроорганизмы) является одним из наиболее древних методов лечения хронических заболеваний, о чем упоминается в трактатах ученых древнего Китая, Египта, Греции, Индии, датированных еще 4-5 веком до н.э. Во 2 веке в трудах Клавдия Галена содержатся рекомендации об использовании ила для лечения воспаления, отеков и болей, в 15 веке Парацельс указал на 5 главных воздействий грязей на системы организма. Пелоидотерапия и в наше время широко используется для лечения заболеваний кожи, опорно-двигательного аппарата, эндокринной и мочеполовой системы, спаечной болезни, ревматоидного артрита [1, 2, 3].
Изучение состава природных высокомолекулярных биологически активных соединений (торфа, сапропеля, мумие, угля), образовавшихся в результате распада и гумификации биологических объектов, показало, что их органическая часть состоит из гуминовых веществ, лигнина, полисахаридов, липидов, пектинов, гемицеллюлозы и целлюлозы. Гуминовые вещества - группа природных биополимеров, содержащихся главным образом в объектах растительного происхождения (каустобиолитах) - торфе, буром угле, придонных осадках (сапропелях, пелоидах), состоят на 80-90% из гуминовых и фульвовых кислот. Биологические свойства гуминовых кислот (ГК) изучены достаточно широко, показано, что гуминовые и фульвовые кислоты используются для повышения сопротивляемости организма человека действию различных неблагоприятных факторов, в том числе, в качестве вспомогательной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов [4]. Гуминовые вещества подавляют реакцию гиперчувствительности замедленного типа, реакцию трансплантат против хозяина, снижают контактную гиперчувствительность и отек лапы крыс, уровень С-реактивного белка у пациентов, страдающих остеоартрозом, сенной лихорадкой, а также обладают кардиозащитными и проангиогенными свойствами [5]. Доказано, что ГК торфа проявляют выраженную провоспалительную активность, стимулируя пролиферацию макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов (Т-киллеров) [6, 7] и секрецию ИФН-α и -γ, ФНО-α в культуре лимфоцитов человека и ИФН-β и ФНО-α перитонеальных макрофагов мышей [8, 9]. В Польше на основе ГК выпускается иммуномодулятор, обладающий интерфероногенным эффектом и являющийся индуктором фактора некроза опухолей [10]. При этом ГК не проявляют токсических эффектов в широкой линейке доз у экспериментальных животных при пероральном или накожном применении, а гумат калия безопасен для человека в суточной дозе до 1 г/кг [5, 11].
Известно, что эффективный иммунный ответ зависит от координированного функционирования различных клеток иннатного и/или адаптивного иммунитета, в котором макрофаги, как антигенпрезентирующие клетки, занимают особенное место [12]. Популяция макрофагов характеризуется значительной функциональной и фенотипической гетерогенностью и пластичностью, которая регулируются окружающей микросредой. Макрофаги, чаще всего, представлены двумя различными типами: 1) провоспалительные -классически активированные макрофаги (M1), которые поляризованы липополисахаридом (ЛПС) или в комплексе с Th1-цитокинами, такими как интерферон гамма (ИФН-γ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и продуцируют, соответственно, провоспалительные цитокины; и 2) противовоспалительные и иммунорегуляторные - альтернативно активированные макрофаги (М2), поляризованные Th2-цитокинами (ИЛ-4 и ИЛ-13), продуцируют противовоспалительные цитокины. Макрофаги M1 и М2 имеют противоположные функции и транскрипционные профили, обладают уникальными способностями, уничтожая патогенные микроорганизмы - M1 или восстанавливая травму, связанную с воспалением - М2. Поляризация баланса макрофагов М1/М2 определяет направленность иммунного ответа при воспалении или травме. При массированной инфекции или воспалении макрофаги поляризуются в фенотип M1, секретируют интерлейкин-β (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-23 и фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), активируя противомикробную защиту. Однако затягивание фазы M1, способное привести к истощению и патологическому изменению тканей и органов, вызывает усиление активности М2, секретирующих большие количества ИЛ-10 и трансформирующего фактора роста бета (ТФР-β) для подавления воспаления и способствующих восстановлению тканей, ремоделированию, васкулогенезу и сохранению гомеостаза [12]. Таким образом, вещества способные подавлять чрезмерную активацию как M1, так и М2, регулировать баланс M1 (ИЛ-12 и ФНО-α) и М2 (ИЛ-10) опосредованных цитокинов, представляют значительный интерес в качестве фармакологических регуляторов для восстановления гомеостаза организма при различных патологиях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания). [13, 14].
В предыдущих исследованиях нами показано, что ГК, выделенные раствором натрий пирофосфата из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар, усиливают продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей, не содержат примеси эндотоксина, подавляют активность аргиназы, что предполагает наличие у них потенциальной иммуномодулирующей активности [15].
Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств природного происхождения, обладающих низкой токсичностью и способностью избирательной стимуляции продукции макрофагами интерлейкина-1 бета, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и лимфоцитами интерферона-гамма.
Поставленная задача решается путем применения водорастворимых гуминовых кислот, выделенных раствором натрий пирофосфата из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар, обладающих высокой избирательной способностью стимулировать секрецию ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ, для коррекции нарушений системы иммунитета при патологических состояниях, требующих активации Th1-зависимого типа иммунного ответа, т.е. хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания.
Принципиально новое в предлагаемом авторами изобретении использование для эффективной иммуномодуляции водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар Томской области, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники, и описание этого свойства не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных фигур 1 и 2. На фиг. 1 представлен электронный спектр гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота. На фиг. 2 представлен инфракрасный (ИК) спектр гуминовых кислот из верхового магелланикум торфа.
Представительный средний образец торфа, максимально отражающий неоднородность химического состава всей партии анализируемого материала, отбирали буром ТБГ-1 в генетическом центре гряды грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар Бакчарского района Томской области, из середины однородного по ботаническому составу горизонта с глубины 100-120 см, в летний период (июнь-август) согласно ГОСТ 17644-83 «Торф. Методы отбора проб из залежи и обработки их для лабораторных испытаний». В скважине с указанной глубины каждую пробу (массой не менее 600 г, количество скважин - не менее 50) отбирали только один раз, средняя масса образца торфа составляла более 30 кг. Согласно общетехнологическим характеристикам, ботаническому и гравиметрическому анализу отобранный торф охарактеризован как верховой магелланикум торф, степень разложения растительных остатков 10-15%, содержание минеральной примеси (общей золы) - не более 2,7%, содержание биологически активных гуминовых кислот не менее 4,2 мас.%.
4
2
7
Полученный образец торфа высушивали при комнатной температуре на воздухе в хорошо проветриваемом помещении, периодически перемешивая, до воздушно-сухого состояния (влажность 15-20%), измельчали в роторно-ножевой мельнице и просеивали через сито с диаметром отверстий 1-3 мм, обрабатывали 0,1 моль/л раствором натрий пирофосфата (NaРО) в массовом соотношении 1:100 в течение 8 часов при постоянном перемешивании в реакторе Р-100 при температуре 25-27°С, отделяли жидкую фазу (экстракт гуминовых кислот) от осадка (остатка торфа) фильтрованием при помощи системы вакуумной фильтрации (нутч-фильтр), далее для осаждения гуминовых кислот из экстракта жидкую фазу обрабатывали 10% раствором водород хлорида до рН 1-2, выделившиеся гуминовые кислоты (ГК) разделяли центрифугированием, отмывали холодной водой очищенной на воронке Бюхнера до рН 7 и высушивали при комнатной температуре.
Полученные вышеописанным способом ГК из верхового магелланикум торфа были охарактеризованы по физико-химическим параметрам молекулярной структуры: элементному (С, Н, N, О) составу, электронным и молекулярным спектральным свойствам, молекулярно-массовому распределению.
1. Элементный состав ГК определяли методом сожжения на C, H, N - анализаторе «EuroEA 300» (производство Италия), содержание кислорода определяли по разности. Массовые доли элементов (% mass) рассчитывали по градуировочным зависимостям, построенным с использованием Sulphanilamide Reference standard material. Атомные доли элементов (% atom), атомные отношения и отношение ароматического и алифатического углерода (Caromatic/Caliphatic) вычисляли по общепринятым методам [16].
Элементный состав ГК верхового магелланикум торфа, представленный в таблице 1, показывает распределение основных конституционных элементов молекулярной структуры вещества и является диагностическим показателем для характеристики активной фармацевтической субстанции. Атомное отношение элементов углерода и водорода (Н/С=1,11) указывает на ароматический характер молекулы ГК, т.к. содержание водорода всего на 11% выше углерода, следовательно, алифатическая часть молекулы выражена незначительно и/или является замещенной различными кислород и азотсодержащими функциональными группами. Соотношение содержания кислорода в ГК относительно углерода порядка 44% свидетельствует о большом количестве кислородсодержащих функциональных групп их молекулярной структуры, в основном фенольных, карбонильных и карбоксильных групп. Содержание азота в структуре гуминовых кислот относительно количества углерода незначительно (около 6%).
465
650
4/6
465
650
2. Регистрацию электронных спектров поглощения 0,001% водных растворов ГК проводили на спектрофотометре Unico 2800 (производство США) в диапазоне длин волн 190-800 нм в кварцевой кювете толщиной 1 см. В полученных спектрах определяли максимумы поглощения и коэффициенты экстинкции (Е 0,001% С), которые характеризуют оптическую плотность растворов гуминовых кислот при их концентрации 0,01 мг/мл для слоя 1 см при длинах волн 465 нм (А) и 650 нм (А) и вычисляли коэффициент цветности Q по Е. Вельте [16] как отношение оптических плотностей при длинах волн 465 и 650 нм (А/А).
Согласно электронному спектру ГК верхового магелланикум торфа (фиг. 1) в видимой области (400-800 нм) спектр не имеет четко выраженных максимумов поглощения, и выглядит как пологая кривая, характеризующая сплошное поглощение с постепенным уменьшением оптической плотности по мере увеличения длины волны. В ультрафиолетовой области спектра (200-400 нм) наблюдается резко возрастающее в коротковолновую сторону поглощение света, при этом, в области 255-275 нм отмечается плечо характерное для фенольных, карбонильных, карбоксильных групп и полиеновых цепей. Более высокая интенсивность поглощения в данной области (255-275 нм) вероятнее всего соответствует π→π*- и n→π*-переходам, характерным для ароматических альдегидов, кетонов, карбоновых кислот, их функциональных и гетерофункциональньгх производных, ката-конденсированных и периконденсированных ароматических систем типа «аценов», «фенов», пиренов, периленов и др. Кроме того, поглощение света ГК в видимой и ультрафиолетовой областях имеет некоторую специфичность: помимо наклона кривой светопоглощения относительно оси абсцисс, относятся величины оптических плотностей при определенных длинах волн и рассчитанные на их основании коэффициенты экстинкции и цветности, зависящие от числа и расположения электронов в поглощающих молекулах и ионах.
465
4/6
465
650
4/6
Наиболее объективным показателем, характеризующим гуминовые кислоты как вещество в целом, является коэффициент экстинкции при А - обобщенный показатель - некий условный коэффициент поглощения, вычисленный по отношению к условной единице молекулярной массы [16]. Еще одним важным показателем, характеризующим оптические свойства гуминовых кислот, является коэффициент цветности Q по Е. Вельте (А/A). Величина Q показывает крутизну падения оптической плотности при увеличении длины волны, обусловленную особенностями химического строения ГК, и является количественной величиной ароматичности макромолекул ГК, показывающей относительное содержание ароматических фрагментов их молекулярной структуры к алифатическим заместителям.
Полученные ГК, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, характеризуются невысокими значениями коэффициентов экстинкции и цветности (табл. 2), что свидетельствует об их сложном молекулярном строении, большом содержании более объемной циклической части молекулы, где преобладают поликонденсированные ароматические структуры, а также высокой устойчивости их молекул.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
3400
1720
1225
1035
1610
2920
3. Исследование молекулярных параметров структуры ГК проводили методом инфракрасной (ИК) спектроскопии на ИК - Фурье - спектрометре ФСМ 1201 (ООО «Инфраспек») в таблетках с KBr (в соотношении 1:100 соответственно), в интервале значений частоты от 500 до 4000 см. В полученных спектрах определяли максимумы поглощения. Относительную количественную оценку параметров структуры молекул гуминовых кислот по данным ИК-спектроскопии давали на основании отношений оптических плотностей полос поглощения (ОППП) кислородсодержащих функциональных групп (υОН см, υC=O см, υC-O, С-О-С см, υС-О см) к ОППП, соответствующим ароматическим (υC=C см) и алифатическим (υAliphatic см) фрагментам.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
NH
3
2
С=О
С=С
C=O
С-С
С-О
O-C
OH
C-O
С-О
С-О
С-О-С
С-Н
Инфракрасный спектр ГК верхового магелланикум торфа (фиг. 2), выявил широкую интенсивную полосу поглощения с максимумом при 3500-3300 см, обусловленную переменными валентными колебаниями гидроксильных групп (ион) алифатического и ароматического характера, связанных преимущественно водородными связями, наличие которых проявляется максимумом поглощения в интервале 1270-1220 и 1170-1040 см. На длинноволновом крыле главной полосы при 3250-3200 см обнаружено поглощение средней интенсивности, имеющее вид уступа (перегиба) и отвечающее колебаниям N-H (υ) в структуре амида, аминов, связанных водородными связями. Полосы средней интенсивности хорошо видны при 2928-2921 см и 2855-2842 см за счет переменных валентных колебаний -СН и -СН групп боковых цепей в молекулах гуминовых кислот, в том числе связанных с ароматическими фрагментами, судя по наличию полосы поглощения в области 1385 см. Отмечается слабое поглощение при 2700-2400 см, присущее димерам карбоновых кислот. Отчетливый максимум сильной интенсивности выявлен в интервале 1725 см-1710 см, свойственном для валентных колебаний карбонильных групп (υ), которые могут быть представлены кетонами, альдегидами, карбоновыми кислотами и их функциональными производными. В ИК-спектре ГК обнаружена сильная полоса в области 1650-1600 см, обусловленная плоскостными валентными колебаниями сопряженных углерод-углеродных (ароматические, υ) и углерод-кислородных связей (карбонилы, связанные водородными связями, карбоксилат-ионы, υ) в ароматическом скелете и хинонах. Полоса поглощения около 1513 см (υ) указывает на наличие неконденсированных моноароматических структур. В данной области наблюдаются также колебания связей полипептидов в составе гуминовых кислот, связанных с атомами азота и кислорода (N-H, N-C=O): первичной (1580-1632 см) и вторичной (1512-1560 см) аминогрупп. Колебания в области 1264-1225 см определяются в основном валентными (υ) и деформационными колебаниями (δ) связей недиссоциированных карбоновых кислот и их функциональных производных (в основном сложных эфиров как арильного, так и алкильного типов). За поглощение излучения в коротковолновой части спектра в области 1175-1000 см ответственны валентные колебания гидроксильных групп (υ) спиртов и углеводов. В интервале около 1075-1013 см υ) поглощают излучение первичные спирты, при 1125-1100 см (υ) - вторичные спирты и при 1175-1150 см (υ) - третичные спирты. Поглощение в данной области (1175-1000 см) может быть также обусловлено валентными колебаниями (υ) гликозидных связей углеводов, лактонов, С-О-С-связями циклических и алифатических простых эфиров, при этом присутствие С-O связей полисахаридов также подтверждается колебаниями в области 830-1100 см. В области волновых чисел от 800 до 600 смнаблюдаются слабые полосы поглощения, возможно обусловленные внеплоскостными деформационными колебаниями (δ) в ароматических кольцах, имеющих два и более незамещенных атомов водорода, и в том числе присутствием конденсированных многоядерных аренов (755-760 см).
При исследовании ИК-спектров ГК в качестве диагностических параметров обычно используют спектральные коэффициенты, увеличение интенсивность полос поглощения которых указывает на большое содержание определенных функциональных групп или фрагментов. В описании полиморфных и высокомолекулярных соединений нестехиометрического состава для количественной оценки интенсивности полос поглощения и содержания функциональных групп, помимо метода базовых линий, также используют метод отношений оптических плотностей полос поглощения (ОППП), который позволяет получить информацию об относительных пропорциях ароматических и алифатических фрагментов молекулы, структурной организации кислородсодержащих функциональных групп, наличии белковых и углеводных компонентов.
OH
С-О
С=О
С-О
С-О-С
С=С 1610
Alif2920
-1
-1
-1
-1
-1
Относительная количественная оценка содержания функциональных групп в молекулах ГК по данным ИК-спектроскопии на основании ОППП указывает на то, что одними из основных кислородсодержащих функциональных групп в молекуле гуминовых кислот верхового магелланикум торфа являются: гидроксильные (υ 3400-3300 см, υ 1150-1000 см) группы, карбоксильные группы и их функциональные производные (υ 1725-1700 см, υ 1260-1225 см), а также простые эфирные группы (υ 1050-1035 см). Рассматривая отношения ОППП ароматических фрагментов структуры к алифатических (А/A), выявлено преобладание ароматических структур над алкильными заместителями и над кислородсодержащими функциональными группами. Также наблюдается обратная зависимость в отношениях ОППП кислородсодержащих функциональных групп к алифатическим фрагментам структуры, где в основном преобладают группы карбоновых кислот и сложных эфиров (табл. 3).
3
3
w
R
4. Молекулярную массу определяли методом эксклюзионной ВЭЖХ на приборе Ultimate 3000 (Thermo Scientific, США) с использованием колонки Ultrahydrogel 250, 300×7,8 мм, подвижная фаза - 0,1 М NaNO, 0,01% NaN в воде, скорость потока 1 мл/мин. Детектирование спектрофотометрическое при длине волны 200 нм. Расчет молекулярной массы проводили по калибровочному графику log M=f(t) построенному по стандартам PSS (polystyrene sulfonate) 891 - 976000 Da (Polymer Standarts Service Service GmbH, Германия). Среднечисленная молекулярная масса гуминовых кислот составила 4871,2 Да; среднемассовая молекулярная масса составила 18755,3; полидисперсность - 3,9; медиана - 9558,3 Да.
Иммуномодулирующие свойства гуминовых кислот изучали на линейных мышах C57BL/6 [17]. Животные (самцы/самки) в возрасте 8-10 недель были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томский НИМЦ РАН. Все процедуры (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Правила оборудования помещений и организация процедур при работе с лабораторными животными».
6
6
6
6
2
Для выделения макрофагов (МФ) и спленоцитов животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника. Спленоциты получали из дважды отмытого физиологическим раствором (ФР) клеточного гомогената селезенки мышей, МФ фракционировали, культивируя в пластиковых чашках Петри клетки перитонеального эксудата (1,5-2,0×10/мл) при 37°С (в атмосфере 5% СО и абсолютной влажности) в полной культуральной среде (RPMI 1640 («Sigma»), 10% ЭТС («Нусlcone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицин («Sigma»), 2 мМ L-глютамин («Sigma»)) и через 2 ч собирая прилипшую к пластику фракцию. Мононуклеары (Мн) выделяли из периферической крови здоровых доноров, наслаивая гепаринизированную кровь (10 ЕД/мл) на жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 мг/мл, центрифугируя 15 минут при 400 g, собирая клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности. Все виды клеток ресуспендировали в культуральной среде, оценивали жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим (использовали клеточные суспензии с жизнеспособностью не менее 95%). МФ (2,5-3,0×10 клеток/мл), спленоциты (2,5-3,0×10 клеток/мл) или Мн (2,5-3,0×10 клеток/мл) инкубировали в 96-луночных планшетах в указанных выше условиях в присутствии ГК (10 мкг/мл); 1 мкг/мл ЛПС (серотип O111:В4, «Sigma»); 4 мкг/мл конканавалина A («Sigma») или 5 мкг/мл митогена лаконоса («Sigma»). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов твердофазным иммуноферментным методом на автоматическом анализаторе ChemWellCombo при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам: цитокины мыши ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ («eBioscience», «InVitroGen»), цитокины человека ИЛ-12 и ИФН-γ («R@D Systems»), ФНО-α («Вектор-Бэст»).
7
8
Показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у мышей оценивали по окончании внутрибрюшинного введения ГК в течение 10 дней в дозе 1 мг/кг/сут, в качестве контрольного препарата использовали аналог ЛПС - пирогенал (Филиал «Медгамал» ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) - 5 мкг/кг сут в 0,1 мл ФР, животным контрольной группы вводили аналогичный объем ФР. Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа через 5 дней от начала введения ГК животных иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией эритроцитов барана (5×10) в 0,1 мл ФР. Для оценки действия ГК на клеточное звено иммунитета в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10 эритроцитов барана в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,05 мл ФР («контрольная лапа»). Через 24 часа животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава, местную воспалительную реакцию оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап. Влияние ГК на гуморальное звено иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титру антител в сыворотке крови в реакции гемагглютинации (РГА), выраженному величиной log2. Для чего животных, получавших курс ПС, забивали на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (на пике IgM-AOK и IgG-AOK), выделяли селезенку и собирали сыворотку крови [17].
Экспериментальные данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0, проверяя нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка, вычисляя для каждой выборки среднее арифметическое (X), ошибку среднего арифметического (m), среднее арифметическое отклонение (σ). Сравнение выборочных средних осуществляли по критерию Даннета для сравнения нескольких экспериментальных выборок с одной контрольной.
Пример 1.
ГК, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар Бакчарского района Томской области, значительно усиливали секрецию основных для поляризации Th1-типа иммунного ответа цитокинов: в 16,7 раза ИЛ-12 и 168 раз ФНО-α относительно спонтанного контроля (табл. 4). Инкубация клеток с ГК приводила также к увеличению продукции ИЛ-1β макрофагами и ИФН-γ лимфоцитами в 10,9 и 32,8 раза, соответственно. При этом секреция цитокинов макрофагами под влиянием ГК была достоверно выше ЛПС-стимулированного контроля в 154 (ИЛ-12), 118 (ФНО-α) и 6,5 (ИЛ-1β) раза. Стимулирующее действие митогена и ГК на продукцию ИФН-γ спленоцитами мышей было относительно равнозначным и в 26,6-32,7 раза превышало контрольные значения под воздействием, как Кон А, так и ГК.
Добавление гуминовых кислот к митоген-активированным клеткам (модель воспаления in vitro) выявило значительный взлет секреторной активности макрофагами ИЛ-1β в 2,1 раза и лимфоцитами ИФН-γ в 6,7 раз относительно соответствующего ЛПС- и КонА-стимулированного контроля (табл. 5).
На фоне выявленного повышения концентрации цитокинов Th1-типа гуминовых кислот из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива угнетали в 1,8 раза митоген-стимулированную продукцию ИЛ-10 - ключевого монокина Тh2-типа и не влияли на секрецию ИЛ-4 (табл. 6).
На другой модели - мононуклеарах периферической крови человека - показано, что исследуемые ГК также значительно усиливали секрецию основных для поляризации Th1-типа иммунного ответа цитокинов (табл. 7). Продукция ИЛ-12 возрастала в 8,3 раза, ФНО-α в 93,6 раза, ИФН-γ в 170 раз относительно интактного контроля. При этом концентрация ИЛ-12 значительно в 2,7 раза превышала значения ЛПС-активированной продукции монокина, а количество ФНО-α и ИФН-γ было достоверно в 1,4 и 167 раз ниже секреции цитокинов при инкубации с соответствующим митогеном.
Пример 2.
Курсовое введение ГК, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, мышам линии C57/BL6 на фоне развития Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, приводило к подавлению маркерной реакции клеточного Th1 иммунного ответа реакции ГЗТ (табл. 8). Величина отека при применении пирогенала и ГК снижалась в 1,6 и в 1,9 относительно контроля.
Влияние гуминовых кислот на гуморальное звено Th1-зависимого иммунного ответа оценивали по количеству АОК и РГА. Выявлено, что курсовое введение ГК, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, приводило к достоверному увеличению числа АОК в 3,8 раза и в 2,5 раза у мышей, получавших пирогенал. При этом титр гемагглютининов увеличивался в 1,6 раза только у мышей, получавших гуминовые кислоты.
Таким образом, экспериментально установлено, что гуминовые кислоты, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива с среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, среднемассовой молекулярной массой 18755,3, полидисперсностью 3,9 и медианой 9558,3 Да, при прямом воздействии снижают продукцию ИЛ-10 и не влияют на секрецию ИЛ-4 на фоне значительной стимуляции выработки антигенпрезентирующими клетками ключевых провоспалительных цитокинов ИЛ-12, ФНО-α, ИЛ-1β и ИФН-γ как у мышей, так и ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ у человека. Курсовое введение мышам гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, усиливает показатели гуморального звена иммунитета, увеличивая число антителообразующих клеток в селезенке и титр антител в сыворотке крови в реакции гемагтлютинации. Полученные данные свидетельствуют о том, что гуминовые кислоты, выделенные из верхового магелланикум торфа, отобранного с глубины 100-120 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива, обладающие способностью регулировать баланс провоспалительных (ИЛ-12 и ФНО-α) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов, представляют значительный интерес в качестве основы для создания фармакологических регуляторов для восстановления гомео стаза организма при различных патологиях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).
Список литературы
1. Биккулова, Р.В. Влияние пелоидотерапии на клинико-иммунологические параметры больных ревматоидным артритом: авторефер… дис. канд. мед. наук - Москва, 2007. - 23 с.
2. Пат. 2499613 Российская Федерация МПК А61М 35/00 А61K 35/10 А61Р 41/00 Способ консервативного лечения спаечной болезни брюшины // В.П. Быков, Е.В. Рыбакова, А.В. Сидоров / заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Северный Государственный медицинский университет». - 2012134865/14. - заявл. 14.08.2012. - опубл. Бюлл. №33. - 27.11.2013.
3. Ortega, Е. Anti-inflammatory effect as a mechanism of effectiveness underlying the clinical benefits of pelotherapy in osteoarthritis patients: regulation of the altered inflammatory and stress feedback response / E. Ortega [et al.] // Int. J. Biometeorol. 2017. - V. 61. - Is. 10. - P. 1777-1785.
4.  Investigation of the immunostimulatory properties of oxihumate / G.K.  J. Dekker, C.E. van Rensburg // Z. Naturforsch. C. - 2003. - V. 58. - Is.3-4. - P. 263-267.
5. van Rensburg C.E. The Antiinflammatory Properties of Humic Substances: A Mini Review / C.E. van Rensburg // Phytother. Res. - 2015. - V. 29. - Is.6. - P. 791-795.
6. Riede, U.N. Humate induced activation of human granulocytes / U.N. Riede [et al.] // Virchows Arch В Cell Pathol Incl Mol Pathol. - 1991. - V. 60. - Is. 1. - P. 27-34.
7. van Rensburg C.E. Potassium humate inhibits complement activation and the production of inflammatory cytokines in vitro / C.E. van Rensburg, PJ. // Naude. Inflammation. -2009. - V. 32. - Is.4. - P. 270-276.
8. Blach-Olszewska, Z. Production of cytokines by mouse peritoneal cells treated with Tolpa Peat Preparation (TPP): dependence on age and strain of the mice / Z. Blach-Olszewska [et al] // Arch. Immun Ther. Exp. - 1993. - V. 41. - P.81-85.
9. Junek, R. Bimodal effect of humic acids on the LPS-induced TNF-α release from differentiated U937 cells / R .Junek [et al.] // Phytomedicine. - 2009. - V. 16. - Is.5. - P. 470-476.
10. Inglot, A.D. A method to assess the immunomodulating effects of the Tolpa Torf Preparation (TTP) by measuring the hyporeactivity to interferon induction and tumor necrosis factor response / A.D. Inglot, J. -Jenczylik, A. Sypula // Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. - 1993. - V. 41. - Is. 1. - P. 87-93.
11. Van Rensburg, С.E. Topical application of oxifulvic acid suppresses the cutaneous immune response in mice / С.E. J. Van Rensburg, S. С.K. Malfeld, J. Dekker // Chemotherapy. - 2002.- V. 48. - P. 138-143.
12. Shapouri- Moghaddam, A. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease / A. Shapouri- Moghaddam [et al.] // J. Cell Physiol. - 2018. - V. 233. - Is.9. - P. 6425-6440.
13. Ma, X. TNF-α and IL-12: a balancing act in macrophage functioning. // Microbes and Infection. -2001. - Vol.3. - P. 121-129.
14. Iwanowycz, S. Emodin Bidirectionally Modulates Macrophage Polarization and Epigenetically Regulates Macrophage Memory / S. Iwanowycz [et al.] // The J. of Biol. Chemistry. - 2016. - 291. - P. 11491-11503.
15. Трофимова, E.C.  Влияние гуминовых кислот торфа различного генеза на продукцию оксида азота in vitro (скрининговое исследование) / Е.С. Трофимова [и др.] // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2016. - №5. - С. 626-636.
16. Орлов, Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации / Д.С. Орлов. - Москва: МГУ, 1990. - 325 с.]
17. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. 4.1. - М.: Гриф и К. 2013. - С.64-79.