СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА САХАРОВ ИЗ БИОМАССЫ, ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ РАСТЕНИЙ ГВАЮЛА
METHOD FOR PRODUCTION OF SUGARS OF BIOMASS OBTAINED FROM GUAYULE PLANTS

Настоящее изобретение относится к способу производства сахаров из биомассы, получаемой из растений гваюла.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения сахаров из биомассы, получаемой из растений гваюла, включающему: подвергание указанной биомассы предварительной биологической обработке в присутствии по меньшей мере одного лигнинолитического гриба с получением жидкой фазы, содержащей сахара, и первого твердого остатка; подвергание указанного первого твердого остатка гидролизу в присутствии по меньшей мере одной разбавленной неорганической кислоты с получением первого гидролизата, содержащего сахара, и второго твердого остатка; подвергание указанного второго твердого остатка ферментативному гидролизу с получением второго гидролизата, содержащего сахара и третьего твердого остатка.
Полученные таким образом сахара могу быть преимущественно использованы в качестве источников углерода в процессах ферментации для получения спиртов (например, этанола, бутанола), липидов, диолов (например, 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола, 1,4-бутандиола, 2,3-бутандиол) или в процессах химического синтеза для получения других промежуточных продуктов или химических продуктов (например, фурфурола). Указанные спирты и липиды могут быть преимущественно использованы в свою очередь при производстве биотоплива (например, биодизеля или «зеленого дизеля»), которое может быть использовано как таковое или смешано с другими видами топлива для транспортировки, тогда как указанные диолы можно использовать при производстве таких продуктов, как биобутадиен, которые, в свою очередь, могут быть использованы для производства каучуков (например, полибутадиен или его сополимеры). Указанные виды применения особенно важны в случае биопереработки.
Натуральный каучук представляет собой углеводородный полимер (цис-1,4-полиизопрен), содержащийся в сотнях видов растений в форме водной эмульсии, обычно обозначаемой термином латекс. Основным источником натурального каучука является Hevea brasiliensis, дерево, произрастающее в Амазонии, и Южная Америка оставалась основным источником ограниченного количества латекса, необходимого на протяжении всего XIX века. В настоящее время из-за паразитов и болезней американские плантации были почти полностью заброшены, а производство натурального каучука почти полностью сосредоточено в Юго-Восточной Азии.
Чтобы преодолеть недостатки производства, которое все чаще подвергается болезням и нападению паразитов, в течение двадцатого века были разработаны различные методы для производства синтетических каучуков, кульминацией которых стало открытие катализаторов Циглера-Натта, которые позволяют полимеризовать изопропен с очень высокой регио- и стереоселективностью, получая синтетический цис-1,4-полиизопрена, который практически неотличим от цис-1,4-полиизопрена растительного происхождения. Однако натуральный каучук никогда не был полностью заменен, потому что некоторые его свойства, в основном механические, на самом деле являются результатом содержания в нем небольших количеств липидов и белков, связанных с ним. Таким образом, в общем объеме производства каучука в 2013 году (27,5 млн.т) по-прежнему учитывается 12 млн.т (43%) натурального каучука.
Но, производство каучука из Hevea brasiliensis подразумевает некоторые проблемы технического и этического характера. Фактически, все еще возможно, что те же самые болезни и паразиты, которые уничтожили американские плантации, также влияют на плантации Юго-Восточной Азии. Кроме того, сбор латекса требует значительного труда и приносит прибыль только потому, что этот труд оплачивается чрезвычайно низкими зарплатами. По этим причинам исследуются альтернативные источники натурального каучука. Среди них гваюла (Parthenium argentatum), безусловно, является одним из наиболее перспективных.
Гваюла (Parthenium argentatum) это многолетний кустарник, произрастающий в полупустынных районах юго-западной части США (особенно в Техасе) и северной Мексики. Это растение накапливает натуральный каучук, в основном содержащий эластомерный цис-1,4-полиизопрен, в форме латекса (молочная дисперсия или суспензия в воде), особенно в коре ветвей и стебля. Содержание натурального каучука может зависеть от различных факторов окружающей среды, сельского хозяйства и хранения и поэтому колеблется от 5% до 20% от общего веса сухого растения.
Экстракция натурального каучука из растений гваюла, как и из других растений, принадлежащих к роду Asteraceae, Euphorbiaceae, Campanulaceae, Labiatae и Moraceae, таких как, например, Euphorbia lathyris, Parthenium incanum, Chrysothamnus nauseosus, Pedilanthus macrocarpus, Cryptostegia grandiflora, Asclepias syriaca, Asclepias speciosa, Asclepias subulata, Solidago altissima, Solidago gramnifolia, Solidago rigida, Sonchus arvensis, Silphium spp., Cacalia atriplicifolia, Taraxacum kok-saghyz, Pycnanthemum incanum, Teucreum canadense, Campanula americana (обозначаемые коротко термином «типа гваюла»), представляет собой важную альтернативу экстракции натурального каучука из Hevea brasiliensis, особенно учитывая большую устойчивость этих видов к патогенным агентам, которые поражают Hevea, более низкие затраты на импорт растительного сырья и в силу более низкого содержания, в каучуках, извлеченных из этих растений, по сравнению с каучуками, полученными из Hevea, многочисленных белковых загрязняющих агентов, ответственных за аллергию на латекс типа I (или опосредованных-IgE).
Однако производство натурального каучука из гваюлы выгодно только в том случае, если эксплуатируются также все другие фракции, составляющие растение: в основном смола (присутствует в количествах, сопоставимых с содержанием каучука) и лигноцеллюлозная фракция, а также небольшие количества эфирных масел и воски. В частности, после экстракции каучука и смолы, широко описанный в научной и патентной литературе, лигноцеллюлозный остаток (багасса), включающий лигнин и полисахариды, должен быть подвергнут процессу осахаривания, который состоит из гидролиза полисахаридов [которые таким образом превращают в сахара с 5 атомами углерода (С5) и сахара с 6 атомами углерода (С6)], растворенные в полученном гидролизате, что оставляет твердый остаток, содержащий лигнин. Полученные таким образом сахара могут затем использоваться для подачи в процессы производства органических промежуточных продуктов путем ферментации, тогда как лигнин может использоваться в качестве топлива или другими способами.
Среди процессов осахаривания, описанных в предшествующем уровне техники, предпочтительными процессами являются те, которые позволяют получить как можно более полный гидролиз гемицеллюлозы и максимально возможной концентрации мономерных сахаров с 5 атомами углерода (С5) и мономерных сахаров с 6 атомами углерода атомы (C6), в то же время сводя к минимуму образование олигомеров и образование субпродуктов реакции, полученных в результате дегидратации сахаров и частичной деполимеризации лигнина, таких как, например, фурфурол (F), гидроксиметилфурфурол (HMF), фенольные соединения, которые действуют как ингибиторы роста микроорганизмов, обычно используемые в последующих процессах ферментации сахара, определяя существенное снижение эффективности и продуктивности указанных процессов.
Среди процессов, способных достичь этих результатов, те, которые предусматривают предварительную обработку лигноцеллюлозного остатка (багассы) при высокой температуре или с агрессивными химическими веществами (например, с кислотами или основаниями), хотя и являются эффективными, могут вызывать проблемы из-за коррозии растений, до чрезмерной деградации сахара, удалению токсичных или остаточных веществ (например, солей) и т.д. В качестве альтернативы упомянутых обработок или с целью снижения их агрессивности, предварительная обработка лигноцеллюлозного остатка (багассы) с помощью биологических методов, таких как, например, обработка, предусматривающая использование грибов, способных избирательно разлагать лигнин, может рассматриваться как приемлемая альтернатива из-за мягких условий реакции, простоты технологических решений и отсутствия производства токсичных вещества, подлежащие утилизации.
Например, заявка на патент США 2016/0304830 относится к способу увеличения выхода натурального каучука из растительного материала (например, растительного материала, полученного из растения гваюла) путем обработки водного раствора или взвеси (суспензии), содержащей растительный материал, причем указанный растительный материал содержит натуральный каучук с термофильным грибом, а именно Thermomyces lanuginosus. Указанная заявка на патент также относится к способу осахаривания лигноцеллюлозной биомассы, включающему следующие стадии: а) получение водного раствора или взвеси (суспензии), содержащей лигноцеллюлозный растительный материал; b) инокулирование указанного водного раствора или взвеси (суспензии) эффективным количеством Thermomyces lanuginosus или одного или нескольких его производных; c) инкубирование указанного водного раствора или взвеси (суспензии) с эффективным количеством Thermomyces lanuginosus или одного или нескольких производных; d) извлечение ферментируемых сахаров, полученных из указанного водного раствора или взвеси (суспензии) после стадии инкубации. Сахара, полученные после инкубации, представляют собой в основном мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5), такие как ксилоза (42,62%) и арабиноза (5%), тогда как мономерные сахара с 6 атомами (С6) получают в небольших количествах (5,91% глюкозы).
Также известны предварительные обработки лигноцеллюлозной биомассы лигнинолитическими грибами, которые вызывают так называемую белую гниль, известную как «грибы белой гнили» (WRF). Фактически, указанные грибы, в отличие от менее селективных «грибков коричневой гнили», способны селективно гидролизовать лигнин и, следовательно, делать полисахариды, содержащиеся в биомассе, более доступными и более пригодными для последующего гидролиза, либо химического/термического типа или ферментативного типа, и, следовательно, для улучшения конечного производства мономерных сахаров с 5 атомами углерода (C5) и мономерных сахаров с 6 атомами углерода (C6).
Например, Taniguchi M. et al., в следующей статье: “Evaluation of pretreatment with Pleurotus Ostreatus for enzymatic hydrolysis of rice straw”, опубликованной в “Journal of Bioscience and Bioengineering” (2005), Vol.100, Issue 6, pg.637-643, описывает предварительную обработку рисовой соломы грибами белой гнили (WRF) Pleurotus Ostreatus перед тем, как подвергнуть ее ферментативному гидролизу. Указанная предварительная обработка привела к деградации лигнина после 60 дней инкубации, равной 41%. Однако в конце указанной предварительной обработки получение мономерных сахаров с 5 атомами углерода (С5) или мономерных сахаров с 6 атомами углерода (С6) не было продемонстрировано.
Ma F. et al., в следующей статье: “Combination of biological pretreatment with mild acid pretreatment for enzymatic hydrolysis and ethanol, production from water hyacinth”, опубликованной в “Bioresource Technology” (2010), Vol. 101, pg. 9600-9604, описывают процесс улучшения ферментативного гидролиза и производства этанола из биомассы, полученной из водяного гиацинта (с особенно низким содержанием лигнина, равным приблизительно 2,8%). С этой целью указанную биомассу предварительно обрабатывали грибами белой гнили (WRF) Echinodontium taxodii и через 10 дней обрабатывали разбавленной серной кислотой (0,25% об/об раствором): полученный остаток подвергали ферментативному гидролизу с получением сахаров, которые впоследствии используются при сбраживании дрожжей Saccharomyces cerevisiae для получения этанола. Комбинация предварительной обработки с грибами белой гнили (WRF) Echinodontium taxodii и разбавленной серной кислотой обладает синергетическим эффектом и позволяет увеличить выход сахаров в 1,13-2,11 раза по отношению к выходу сахаров, полученных при предварительной обработке только разбавленной серной кислотой. То же самое справедливо для последующего производства этанола, которое показывает увеличенный выход в 1,34 раза выше, чем выход этанола, полученного при предварительной обработке только разбавленной серной кислотой.
Isikhuemhen O. S. et al., в следующей статье: “Biodegradation and Sugar Release from Canola Plant Biomass by Selected White Rot Fungi”, published in “Advances in Biological Chemistry” (2014), Vol. 4, pg. 395-406, описывают использование шести различных белых грибков гнили (WRF) для предварительной обработки растения канолы. Наблюдалось, что мономерные сахара, включая глюкозу, высвобождаются в культуральные среды вместе с экзополисахаридами: количество полученных мономерных сахаров в среднем составляло 2 г - 3 г на 100 г биомассы.
Международная патентная заявка WO 2016/062753 на имя заявителя относится к интегрированному способу переработки и использования каждой части растения гваюла, включающему следующие стадии в последовательности:
- отделение стебля от листьев указанного растения путем механической обработки;
- обработка листьев для получения восков и эфирных масел и фракции, включающей целлюлозу, гемицеллюлозу и в меньшей степени соли, органические соединения и лигнин;
- извлечение из стебля и ветвей жидкой фазы, образуя таким образом первый твердый древесный остаток, обозначенный как багасса;
- обработка указанного первого твердого древесного остатка с образованием сахаров, целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина.
Считается, что вышеупомянутый интегрированный способ может дополнительно использовать растение гваюла, добавляя к производству латекса, каучука, смолы и багассы, а также для производства сбраживаемых сахаров: указанная эксплуатация особенно важна в случае биопереработки органических веществ, предназначенных для производства органических промежуточных соединений, отличных от этанола, например, для получения 1,3-бутандиола, который может быть превращен после его двойной каталитической дегидратации в биобутадиен. Производство сбраживаемых сахаров осуществляется посредством процесса осахаривания в два этапа: на первом этапе проводится кислотный гидролиз для превращения лигнина в мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5), а на втором этапе - ферментативный, химический или термохимический гидролиз проводится с целью получения мономерных сахаров с 6 атомами углерода (С6). Не делается никаких ссылок на какие-либо биологические предварительные обработки биомассы, полученной из растений гваюлы.
Биопереработка органических веществ, основанная на использовании всех компонентов, получаемых из растения гваюлы, будет тем более обоснованной, чем больше будет возможности переработать остаточную лигноцеллюлозную биомассу, полученную после экстракции основных компонентов, то есть латекса, смолы и каучука (т.е. багассы) в мономерные сахара с пятью атомами углерода (C5) или в мономерные сахара с шестью атомами углерода (C6) (т.е. сахара вторичной переработки).
Известно, что, хотя применение мономерных сахаров с 6 атомами углерода (С6) для получения органических соединений (например, этанола) не представляет проблемы, этого нельзя сказать в случае мономерных сахаров с 5 атомами углерода (C5). Причину можно найти в том факте, что мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5) метаболически менее эффективны, чем мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), поскольку они следуют катаболическими путям, которые частично различаются. Мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6), такие как глюкоза, катаболизируются в соответствии с гликолитическим путем, тогда как мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5), такие как ксилоза, вступают в метаболизм клеток в соответствии с путем фосфатпентозы и только впоследствии присоединяются к заключительной части гликолитического пути: указанное различие в катаболическом пути приводит к потреблению мономерных сахаров с 5 атомами углерода (С5) многими микроорганизмами с явно более медленной кинетикой, чем наблюдаемые при потреблении мономерных сахаров с 6 атомы углерода (С6). Микроорганизмы даже существуют и используются в микробиологической промышленности, которые не могут использовать мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5).
Поэтому, как правило, смеси сахаров, полученные во многих процессах гидролиза биомассы, включающие как мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6), так и мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5), не являются подходящей подачей для многих ферментаций, за исключением для традиционной спиртовой ферментации, проводимой в присутствии штаммов Saccharomyces cerevisiae, соответствующим образом генетически модифицированных, с целью получения этанола и, как известно, довольно толерантных по отношению к качеству питания.
Следовательно, получение гидролизатов с преобладающим содержанием мономерных сахаров с 5 атомами углерода (С5) представляет собой проблему, в частности, в случае биопереработки органических веществ, предназначенных для получения органических промежуточных соединений, отличных от этанола, например, для получения 1,3-бутандиола, который может быть переработан, после двойной каталитической дегидратации в биобутадиен.
Поэтому заявитель решил решить проблему увеличения количества сахаров, полученных при обработке биомассы, получаемой из растений гваюла, в частности количества мономерных сахаров с 6 атомами углерода (С6), с целью получения органических промежуточных соединений, отличных от этилового спирта.
В настоящее время заявитель обнаружил, что количество сахаров, полученных при обработке биомассы, полученной из растений гваюла, в частности количество мономерных сахаров с 6 атомами углерода (С6), может быть увеличено путем предварительной обработки биомассы, полученной из растений гваюлы, в присутствии по меньшей мере одного лигнинолитического гриба с получением жидкой фазы, содержащей сахара и первый твердый остаток; подвергания указанного первого твердого остатка гидролизу в присутствии по меньшей мере одной разбавленной неорганической кислоты с получением первого гидролизата, содержащего сахара и второй твердый остаток; подвергания указанного второго твердого остатка ферментативному гидролизу с получением второго гидролизата, содержащего сахара и третий твердый остаток. Полученные таким образом сахара могут быть преимущественно использованы в качестве источников углерода в процессах ферментации для получения спиртов (например, этанола, бутанола), липидов, диолов (например, 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола, 1,4-бутандиола, 2,3-бутандиол) или в процессах химического синтеза для получения других промежуточных продуктов или химических продуктов (например, фурфурола). Указанные спирты и липиды могут быть преимущественно использованы в свою очередь при производстве биотоплива (например, биодизеля или «зеленого дизеля»), которое может быть использовано как таковое или смешано с другими видами топлива для транспортировки, тогда как указанные диолы можно использовать при производстве таких продуктов, как биобутадиен, которые, в свою очередь, могут быть использованы для производства каучуков (например, полибутадиен или его сополимеры). Указанные виды применения особенно важны в случае биопереработки.
Благодаря способу в соответствии с настоящим изобретением получены многочисленные преимущества, такие как, например:
- биологическая предварительная обработка по меньшей мере одним лигнинолитическим грибом, в частности грибом, выбранным из грибов белой гнили (WRF), позволяет высвобождать мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6) в культуральную среду, главным образом глюкозу, полученную в результате метаболической трансформации осуществляемой указанным лигнинолитическим грибом из некоторых компонентов биомассы непосредственно в растворимые мономерные сахара, в частности, глюкоза может быть получена в количестве, равном 28 г/100 г багассы (как указано в следующих примерах);
- гидролизная обработка первого твердого остатка, по меньшей мере, одной разбавленной неорганической кислотой, в частности разбавленной серной кислотой, позволяет получить почти количественный гидролиз гемицеллюлозы, содержащейся в биомассе, в основном с получением мономерных сахаров с 5 атомами углерода (С5) более конкретно, указанный количественный выход получают с использованием половины количества разбавленной неорганической кислоты в отношении случая, когда биологическая предварительная обработка биомассы не проводится;
- ферментативный гидролиз второго твердого остатка позволяет гидролизовать целлюлозу, все еще содержащуюся, преимущественно получая мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), в частности глюкозу, причем указанный выход выше, чем в случае, когда биологическая предварительная обработка биомассы не проводится;
- указанный способ позволяет получить мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5) и мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6) примерно 50 г/100 г багассы (сухой вес), причем указанный выход явно выше, чем полученный без предварительной биологической обработки багассы, равной 22 г/100 г багассы (сухой вес) (как указано в следующих примерах).
Следовательно, настоящее изобретение относится к способу производства сахаров из биомассы, получаемой из растений гваюла, включающему:
- подвергание указанной биомассы биологической предварительной обработке в присутствии по меньшей мере одного лигнинолитического гриба с получением жидкой фазы, содержащей сахара и первый твердый остаток;
- подвергание указанного первого твердого остатка гидролизу в присутствии по меньшей мере одной разбавленной неорганической кислоты с получением первого гидролизата, содержащего сахара и второй твердый остаток;
- подвергание указанного второго твердого остатка ферментативному гидролизу с получением второго гидролизата, содержащего сахара и третий твердый остаток.
Для целей настоящего описания и последующей формулы изобретения определения числовых диапазонов всегда включают крайние значения, если не указано иное.
Для целей настоящего описания и последующей формулы изобретения термин «содержащий» также включает термины «который по существу состоит из» или «который состоит из».
Для целей настоящего описания и следующей формулы изобретения «растение гуайюла» обычно означает как виды Parthenium argentatum, так и растения типа гваюла перечисленных выше видов.
5
10
5
6
12
6
Для целей настоящего описания и следующей формулы изобретения «мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5)» означают пентозные сахара или, проще говоря, пентозы, которые представляют собой моносахариды, содержащие пять атомов углерода, имеющие химическую формулу CHO. Аналогично, для целей настоящего описания и последующей формулы изобретения «мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6)» означают гексозные сахара или, более просто, гексозы, которые представляют собой моносахариды, содержащие шесть атомов углерода, имеющие химическую формулу CHO.
Для целей настоящего описания и последующей формулы изобретения термин «биомасса, полученная из растений гваюла» означает любую форму (например, целое растение, части растения, включая корни, ветви и/или стебли, листья, любую кору, фрагменты растений, полученные путем рубки, размалывания и т.д., брикеты и пеллеты, полученные путем прессования фрагментов растений), где растение гваюла используют с целью получения, с помощью химических и/или физических методов, латекса, каучука, смолы, багассы, сахара и других компонентов, присутствующих в самом растении.
Для целей настоящего описания и последующей формулы изобретения термин «багасса» означает остаточную часть растительного материала, полученную в результате процессов экстракции, которым могут подвергаться растения гваюла. Багасса может также включать в себя некоторые количества не растительного материала, например почвы, песка и т.д.), обычно связанного с корнями растений и полученного из обрабатываемой земли.
Для целей настоящего описания и последующей формулы изобретения термин «мисцелла» означает раствор, суспензию или эмульсию, состоящую из латекса, каучука и/или смолы, воды и/или органических растворителей, в которых осуществляется процесс экстракции, полученный после отделения багассы.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанная биомасса, полученная из растений гваюлы, представляет собой багассу, полученную в результате процессов экстракции, которым подвергаются указанные растения гваюла.
Процессы экстракции, которым растения гваюла могут быть подвергнуты с целью получения багассы, известны в данной области техники. Для целей настоящего изобретения, предпочтительно, указанная багасса может быть получена посредством процесса, описанного в международной заявке на патент WO 2016/062753 на имя заявителя, о которой сообщалось выше, включенной в настоящий документ для справочных целей.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный по меньшей мере один лигнолитический гриб может быть выбран, например, из грибов белой гнили (WRF), принадлежащих к штамму Pleurotus ostreatus, Formitiporia mediterranea.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения указанный лигнинолитический гриб может быть выбран, например, из: Pleurotus ostreatus MUCL 29420, Formitiporia mediterranea MUCL 45670, полученного от BCCM (BE) Belgian Coordinated Collection of Microorganism, Agro-food & Environmental fungal collection MUCL (Бельгийской координированной коллекции микроорганизмов, Agro-food & Экологическая грибковая коллекция MUCL).
Для цели настоящего изобретения инокулят готовят с указанным лигнинолитическим грибом в соответствии со способами, известными в данной области техники, в присутствии питательных сред, содержащих глюкозу и различные питательные вещества, такие как, например, азот, фосфат калия, магний, соли, витамины, постепенно переходя к все более и более минимальным культуральным средам (т.е. содержащим все более низкую концентрацию макронутриентов, которые могут быть легко ассимилированы лигнолитическим грибом, таким как, например, углерод, азот, фосфор), при переходе от одной субкультуры к следующей. Затем аликвоту (5 мл) полученной таким образом культуры переносят, работая в стерильных условиях, в колбу на 500 мл, содержащую 100 г зерен мягкой пшеницы, которую выдерживают при перемешивании до тех пор, пока грибной мицелий не покроет всю массу зерен пшеницы. Затем колбу помещают в условия шкафа с ламинарным потоком с целью высушивания полученной массы, которую затем тонко измельчают, получая пшеничную муку, загрязненную грибами, и используют для предварительной обработки биомассы (как указано в следующих примерах).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанную биологическую предварительную обработку можно проводить при температуре в диапазоне от 20 до 40°С, предпочтительно в диапазоне от 23 до 35°С.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанная биологическая предварительная обработка может проводиться в течение периода времени от 5 дней до 25 дней, предпочтительно от 10 дней до 20 дней.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанную биологическую предварительную обработку можно проводить при рН в диапазоне от 4,5 до 7, предпочтительно в диапазоне от 5 до 6,7.
В результате биологической предварительной обработки указанной биомассы получают суспензию, содержащую твердую фазу (то есть первый твердый остаток) и водную фазу (то есть жидкую фазу, содержащую сахара). Указанную суспензию подвергают фильтрации или центрифугированию с целью получения твердой фазы, то есть первого твердого остатка, содержащего лигнин, целлюлозу и клетки лигнинолитического гриба (мицелий), и водной фазы, то есть жидкой фазы, содержащей сахара.
Следует отметить, что сахара, содержащиеся в указанной жидкой фазе, в частности мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), в частности глюкоза, происходят от метаболической активности лигнинолитического гриба.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанная разбавленная неорганическая кислота может быть выбрана, например, из серной кислоты, фосфорной кислоты или их смесей. Предпочтительно указанная разбавленная неорганическая кислота представляет собой разбавленную серную кислоту, еще более предпочтительно она представляет собой 2,5 мас.% водный раствор серной кислоты.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанный гидролиз в присутствии по меньшей мере одной разбавленной неорганической кислоты можно проводить в течение времени в диапазоне от 30 минут до 120 минут, предпочтительно в диапазоне от 45 минут до 90 минут.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанный гидролиз в присутствии по меньшей мере одной разбавленной неорганической кислоты может проводиться при температуре в диапазоне от 110 до 160°С, предпочтительно в диапазоне от 110 до 130°С.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанный гидролиз в присутствии по меньшей мере одной разбавленной неорганической кислоты можно проводить при рН в диапазоне от 0,05 до 2, предпочтительно в диапазоне от 0,08 до 1,0.
В результате гидролиза указанного первого твердого остатка получают смесь, содержащую твердую фазу (то есть второй твердый остаток) и водную фазу (то есть первый гидролизат). Указанную смесь подвергают фильтрации или центрифугированию с целью получения твердой фазы, то есть второго твердого остатка, содержащего лигнин и целлюлозу, и водной фазы, то есть первого гидролизата, преимущественно содержащего мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5).
Следует отметить, что сахара, содержащиеся в указанном первом гидролизате, в частности мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5), в частности ксилоза, образуются в результате гидролиза гемицеллюлозы, содержащейся в указанном первом твердом остатке.
Ферментативный гидролиз указанного второго твердого остатка, содержащего лигнин и целлюлозу, может быть осуществлен в соответствии с методиками, известными в данной области техники, как описано, например, в патентах US 5628830, US 5916780 и US 6,090,595, с использованием коммерческих ферментов, таких как: например, Cellic CTec2 от Novozymes Bioenergy, Celluclast 1,5 л (Novozymes), Econase CE (Rohm Enzymes), Spezyme (Genecor), Novozym 188 (Novozymes), используемые индивидуально или смешанные вместе. В результате ферментативного гидролиза указанного второго твердого остатка получают смесь, содержащую твердую фазу (то есть третий твердый остаток) и водную фазу (то есть второй гидролизат). Указанную смесь подвергают фильтрации или центрифугированию с целью получения твердой фазы, то есть третьего твердого остатка, содержащего лигнин и целлюлозу, и водной фазы, то есть второго гидролизата, преимущественно содержащего мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), в частности глюкозу, полученный в результате гидролиза целлюлозы.
Полученные таким образом сахара могут быть преимущественно использованы в качестве источников углерода в процессах ферментации для получения спиртов (например, этанола, бутанола), липидов, диолов (например, 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола, 1,4-бутандиола, 2,3-бутандиол) или в процессах химического синтеза для получения других промежуточных продуктов или химических продуктов (например, фурфурола). Указанные спирты и липиды могут быть преимущественно использованы в свою очередь при производстве биотоплива (например, биодизеля или «зеленого дизельного топлива»), которое можно использовать как таковое или смешивать с другими видами топлива для транспортировки, тогда как указанные диолы можно использовать при производстве таких продуктов, как биобутадиен, которые, в свою очередь, могут быть использованы для производства каучуков (например, полибутадиен или его сополимеры). Указанные виды применения особенно важны в случае биопереработки.
Лигнин может использоваться в качестве топлива или для приготовления композиционных материалов (например, после тонкого помола лигнин может быть диспергирован в соответствующих синтетических полимерах, таких как, например, полиэтилен, полистирол) или в виде бионаполнителей (например, после тонкого измельчения, лигнин может быть диспергирован в резиновых смесях).
Количества сахаров, полученных после гидролиза, могут быть определены с помощью методов, известных в данной области техники, таких как, например, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или ионообменная хроматография.
Настоящее изобретение теперь будет проиллюстрировано более подробно посредством варианта осуществления со ссылкой на фиг. 1, описанную ниже.
Фиг. 1 изображает вариант осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением. Для этой цели от растения гваюла (1) ветви, стебли и листья (100) отделяют, например, путем механической обработки. Ветви, стебли и листья (100) подвергают экстракции, например, в присутствии основного водного раствора (не показан на фиг. 1) с получением первой мисцеллы, из которой экстрагируется латекс (101), и первая багасса без латекса (не показано на фиг. 1). Указанная первая багасса без латекса подвергается экстракции, например, в присутствии системы полярных растворителей (не показано на фиг. 1), получая вторую мисцеллу, из которой извлекается смола (103), и вторая багасса без латекса и без смолы (не показано на фиг. 1). Указанная вторая багасса без латекса и без смолы подвергается экстракции, например, в присутствии системы неполярных растворителей (не показано на фиг. 1) с получением третьей мисцеллы, из которой извлекается каучук (102), и третья багасса без латекса, без смолы и без каучука (110). Багассу (110) подвергают биологической предварительной обработке в присутствии по меньшей мере одного лигнолитического гриба, выбранного из грибов белой гнили (WRF), принадлежащих к штамму Pleurotus ostreatus или Formitiporia mediterranea, с получением жидкой фазы (111), содержащей мономерные сахара с 6 атомов углерода (С6), в частности глюкозу, и первый твердый остаток (120). Указанный первый твердый остаток (120) подвергают гидролизу в присутствии по меньшей мере одной разбавленной неорганической кислоты (например, в присутствии разбавленной серной кислоты) с получением первого гидролизата (121), преимущественно содержащего мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5) и второй твердый остаток (130). Указанный второй твердый остаток (130) подвергают ферментативному гидролизу с получением второго гидролизата (131), преимущественно содержащего мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), в частности глюкозу, и третий твердый остаток (140) (обозначенный как лигнин на фиг. 1). Лигнин (140) может быть удобно использован для приготовления композиционных материалов или бионаполнителей (400). Гидролизаты, содержащие мономерные сахара (111), (121) и (131), могут быть использованы при получении путем ферментации биопродуктов (300) (таких как, например, биобутандиолы) или биотоплива (таких как, например, микробные масла или этанол) (300) или при получении посредством химического синтеза химических продуктов (200) (таких как, например, фурфурол).
Более подробную информацию о получении указанных различных типов багассы, как, например, о получении латекса, смолы, каучука, эфирных масел из растений гваюла, можно найти, например, в международной заявке на патент WO 2016/062753 на имя упомянутого выше заявителя, или в итальянской патентной заявке IT2015000082659 на имя заявителя, включенной в настоящий документ для справочных целей.
Багасса, полученная из растений гваюла, использованная в следующих примерах, содержала: 18 мас.% целлюлозы (глюкан), 11,6 мас.% ксилана, 5,5 мас.% арабинана, 1,5 мас.% галактана и 31 мас.% лигнина по отношению к общему весу (сухому весу) багассы. Состав багассы, полученной из растений гваюла, определяли в соответствии с международным стандартным методом, определенным NREL, США (A. Sluiter et al., NREL/TP-510-42618, пересмотренный в июле 2011 г. «Определение структурных углеводов и лигнина в Биомасса»).
Для лучшего понимания настоящего изобретения и его практического применения, ниже приведены некоторые иллюстративные и не ограничивающие его примеры.
Пример 1 (сравнительный)
Ферментативный гидролиз багассы, полученной из растений гваюла
200 г багассы, полученной из растений гваюла (Parthenium argentatum), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и измельчали (диаметр частиц <2 мм).
Затем в колбе на 500 мл была приготовлена 10% -ная по весу суспензия в воде вышеуказанной багассы по отношению к общей массе суспензии, к которой была добавлена ферментная смесь Cellic CTec2 (Novozymes Bioenergy) в количестве 10% по весу по отношению к загруженной багассе (сухой вес) и 100 мл 50 мМ исходного раствора цитратного буфера при pH 5: все оставляли при перемешивании (150 об/мин) при 50°C в течение 72 часов, получая смесь, содержащую твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и гидролизат, содержащий сахара с 6 атомами углерода (C6). После того как все остыло до комнатной температуры (25°C), указанный твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и указанный гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6), отделяли фильтрованием.
Указанный гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), после выпаривания под вакуумом (40 мбар, 40°С) содержал 2,05 г глюкозы/100 г багассы (сухой вес).
Содержание сахара определяли с помощью ионообменной хроматографии (HPAE-PAD), используя хроматографическую систему Dionex, снабженную колонкой Carbopac PA 100, с градиентом гидроксида натрия и ацетатом натрия в качестве противоиона.
Пример 2 (изобретение)
Предварительная биологическая обработка Pleurotus ostreatus багассы, полученной из растений гваюла
200 г багассы, полученной из растений гваюла (Parthenium argentatum), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и измельчали (диаметр частиц <2 мм).
4
3
6
20 г (сухой вес) вышеуказанной багассы, 1 г/л нитрата аммония (NHNO), 1 г/л дрожжевого экстракта и 400 мл 0,1 М исходного раствора фосфатного буфера при рН 5,5 загружали в стеклянный биореактор емкостью 500 мл, герметично закрытый, с двумя входами для отбора проб и подачи газов. Полученную смесь стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 10 минут. После стерилизации добавляли 1 г инокулята Pleurotus ostreatus (пшеничная мука, загрязненная грибами, содержащая около 10 КОЕ/г): полученную суспензию выдерживали при перемешивании (250 об/мин) при комнатной температуре (25°С) в течение 18 дней. В течение этого периода чистым кислородом продували биореактор (1 мл/мин) в течение примерно 60-90 минут каждые 2-3 дня, и образцы брали в разные дни после инокуляции: 0, 4, 9, 14 и 18 соответственно. Каждый тест был проведен три раза.
Наблюдалось, что мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), включая в основном глюкозу, постепенно накапливались в культуральной среде (жидкая фаза) в соответствии с колоколообразной кинетикой. Максимальная величина накопления глюкозы, соответствующая 14 дням культивирования, составляла 28 г глюкозы/100 г загруженной багассы (сухой вес). Содержание сахара определяли, как описано в примере 1.
Первый твердый остаток, содержащий лигнин, целлюлозу и клетки лигнинолитического гриба (мицелия) Pleurotus ostreatus, был отделен от суспензии путем фильтрации и подвергнут анализу с использованием метода международного стандарта, определенного с помощью NREL, указанного выше. Указанные анализы подтвердили, что количество целлюлозы, содержащейся в полученном твердом остатке, было лишь немного ниже, чем количество, содержащееся в багассе (снижение на 2%), загруженное во время биологической предварительной обработки: учитывая, что количество получаемой глюкозы выше, чем теоретически полученное из целлюлозы, содержащейся в исходной биомассе (см. Пример 1), можно сделать вывод, что глюкоза, содержащаяся в культуральной среде, произошла из-за метаболической активности лигнинолитического гриба Pleurotus ostreatus.
Пример 3 (изобретение)
Биологическая предварительная обработка Fomitiporia mediterranea багассы, полученной из растений гваюла
200 г багассы, полученной из растений гваюла (Parthenium argentatum), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и измельчали (диаметр частиц <2 мм).
4
3
6
Загружали 20 г (сухой вес) вышеуказанной багассы, полученной из растений гваюла, 1 г/л (NHNO), 1 г/л дрожжевого экстракта и 400 мл 0,1 М исходного раствора фосфатного буфера при рН 5,5, в стеклянный биореактор емкостью 500 мл, герметично закрытый, снабженный двумя входами для отбора проб и подачи газов. Полученную смесь стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 10 минут. После стерилизации добавляли 1 г инокулята Fomitiporia mediterranea (пшеничная мука, загрязненная грибами, содержащая около 10 КОЕ/г): полученную суспензию хранили при перемешивании (250 об/мин) при комнатной температуре (25°С) в течение 18 дней. В течение этого периода чистым кислородом продували биореактор (1 мл/мин) в течение примерно 60-90 минут каждые 2-3 дня, и образцы брали в разные дни после инокуляции: 0, 4, 9, 14 и 18 соответственно. Каждый тест был проведен три раза.
Наблюдалось, что мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6), включая глюкозу, постепенно накапливались в культуральной среде (жидкая фаза) в соответствии с колоколообразной кинетикой. Максимальная величина накопления глюкозы, соответствующая 14 дням культивирования, составляла 14 г глюкозы/100 г загруженной багассы (сухой вес). Содержание сахара определяли, как описано в Примере 1.
Первый твердый остаток, содержащий лигнин, целлюлозу и клетки лигнинолитического гриба (мицелий) Fomitiporia mediterranea, отделяли от суспензии фильтрованием и подвергали анализу по методу международного стандарта, определенного NREL, указанному выше. Указанные анализы подтвердили, что количество целлюлозы, содержащейся в полученном твердом остатке, было лишь немного ниже, чем количество, содержащееся в багассе (снижение на 1,5%), загруженное во время биологической предварительной обработки. Можно сделать вывод, что глюкоза, содержащаяся в культуральной среде, происходит от метаболической активности лигнинолитического гриба Fomitiporia mediterranea.
Пример 4 (сравнительный)
Ферментативный гидролиз первого твердого остатка, полученного после биологической предварительной обработки Pleurotus ostreatus багассы, полученной из растений гваюла
Первый твердый остаток, полученный после биологической предварительной обработки Pleurotus ostreatus (пример 2), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и, наконец, подвергали ферментативному гидролизу.
Затем в колбе на 500 мл была приготовлена 5%-ная по массе суспензия в воде указанного первого твердого остатка по отношению к общей массе суспензии, в которую была добавлена смесь ферментов Cellic CTec2 (Novozymes Bioenergy), в количестве 10 мас.% по отношению к первому загруженному твердому остатку (сухой вес) и 100 мл 50 мМ маточного раствора цитратного буфера при рН 5: все оставляли при перемешивании (150 об/мин) при 50°С, в течение 72 часов, с получением смеси, содержащей твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6). После того как все остыло до комнатной температуры (25°C), указанный твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и указанный гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6), отделяли фильтрованием.
Указанный гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), после концентрирования в вакууме (40 мбар, 40°С) содержал 2,8 г глюкозы/100 г багассы (сухой вес). Таким образом, полученный результат свидетельствует о том, что лигнинолитическая активность гриба Pleurotus ostreatus (пример 2) приводила только к частичному разрушению загруженной багассы, доступ к которой увеличился по отношению к багассе как таковой (пример 1), но она все еще остается неполной.
Пример 5 (сравнительный)
Ферментативный гидролиз первого твердого остатка, полученного после биологической предварительной обработки Fomitiporia mediterranea багассы, полученной из растений гваюла
Первый твердый остаток, полученный после биологической предварительной обработки с помощью Fomitiporia mediterranea (пример 3), промывали водой, сушили в печи при 60°C в течение одной ночи и, наконец, подвергали ферментативному гидролизу.
Затем в колбе на 500 мл была приготовлена 5% -ная по массе суспензия в воде указанного первого твердого остатка по отношению к общей массе суспензии, в которую была добавлена смесь ферментов Cellic CTec2 (Novozymes Bioenergy), в количестве 10 мас.% по отношению к первому загруженному твердому остатку (сухой вес) и 100 мл 50 мМ маточного раствора цитратного буфера при рН 5: все оставляли при перемешивании (150 об/мин) при 50°С, в течение 72 часов, с получением смеси, содержащей твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6). После того как все остыло до комнатной температуры (25°C), указанный твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и указанный гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6), отделяли фильтрованием.
Указанный гидролизат, содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), после концентрирования через выпаривание под вакуумом (40 мбар, 40°С) содержал 3,0 г глюкозы/100 г багассы (сухой вес). Таким образом, полученный результат свидетельствует о том, что лигнинолитическая активность гриба Fomitiporia mediterranea (пример 3) приводила только к частичному разрушению загруженной багассы, доступность которой повышена по отношению к багассе как таковой (пример 1), но она все еще остается неполной.
Пример 6 (сравнительный)
Гидролиз разбавленной серной кислотой (5 мас.% водный раствор) багассы, полученной из растений гваюла
200 г багассы, полученной из растений гваюла (Parthenium argentatum), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и измельчали (диаметр частиц <2 мм).
Затем 2 г вышеуказанной багассы и 20 мл 5%-ного по массе водного раствора серной кислоты загружали в стеклянную бутылку объемом 100 мл с герметичным уплотнением, получая суспензию с pH, равным 0,1: бутылку помещали в автоклав, при 121°C, в течение 1 часа, с получением смеси, содержащей твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5) и меньшие количества мономерных сахаров с 6 атомами углерода (C6). После того как все остыло до комнатной температуры (25°C), указанный твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и указанный гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5) и меньшие количества мономерных сахаров с 6 атомами углерода (C6), разделяли с помощью фильтрация.
Указанный гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5) и меньшие количества мономерных сахаров с 6 атомами углерода (C6), после концентрирования в вакууме (40 мбар, 40°C) содержал 3,5 г глюкозы/100 г загруженного багассы (сухой вес) и 8,2 г ксилозы/100 г багассы (сухой вес).
Пример 7 (изобретение)
Гидролиз разбавленной серной кислотой (2,5 мас.% водным раствором) первого твердого остатка, полученного после биологической предварительной обработки багассы Pleurotus ostreatus, полученной из растений гваюла
Первый твердый остаток, полученный после биологической предварительной обработки Pleurotus ostreatus (пример 2), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и, наконец, подвергали ферментативному гидролизу.
Затем 2 г вышеуказанного багассы и 20 мл 2,5%-ного по весу водного раствора серной кислоты загружали в стеклянную бутылку объемом 100 мл с герметичным уплотнением, получая суспензию с pH, равным 0,3: бутылку помещали в автоклав, при 121°С, в течение 1 часа, с получением смеси, содержащей второй твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и первый гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5) и меньшие количества мономерных сахаров с 6 атомами углерода (С6). После того как все остыло до комнатной температуры (25°C), указанный второй твердый остаток, включающий лигнин и целлюлозу, и указанный первый гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5) и меньшие количества мономерных сахаров с 6 атомами углерода (C6), были отделены фильтрацией.
Указанный первый гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5) и меньшие количества мономерных сахаров с 6 атомами углерода (C6), после концентрирования вакуумным испарением (40 мбар, 40°C) содержал 3,8 г глюкозы/100 г загруженной багассы (сухой вес) и 6,4 г ксилозы/100 г загруженной багассы (сухой вес). Следовательно, были получены результаты, аналогичные полученным в Примере 6 (сравнительном), но с использованием более разбавленной серной кислоты (2,5 мас.% водного раствора вместо 5 мас.%).
Пример 8 (сравнительный)
Ферментативный гидролиз твердого остатка, полученного из багассы, полученной из растений гваюла, после гидролиза разбавленной серной кислотой (5% по массе водный раствор)
Твердый остаток, полученный после гидролиза водным раствором 5%-ной по массе серной кислоты (пример 6), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и, наконец, подвергали ферментативному гидролизу.
Затем в колбе на 500 мл готовили 5 мас.% суспензию в воде указанного твердого остатка по отношению к общей массе суспензии, к которой добавляли ферментную смесь Cellic CTec2 (Novozymes Bioenergy) в количестве 10 мас.% по отношению к загруженному твердому остатку (сухой вес) и 100 мл 50 мМ исходного раствора цитратного буфера при рН 5: все оставляли при перемешивании (150 об/мин) при 50°С, в течение 72 часов получают смесь, содержащую твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6) и меньшие количества мономерных сахаров с 5 атомами углерода (C5). После того как все остыло до комнатной температуры (25°C), указанный твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и указанный гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6) и меньшие количества мономерных сахаров с 5 атомами углерода (C5), разделяли с помощью фильтрации.
Указанный второй гидролизат, содержащий мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5) и преимущественно мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), после концентрирования выпариванием в вакууме (40 мбар, 40°С) содержал 6,0 г глюкозы/100 г загруженной багассы (сухой вес) и 0,7 г ксилозы/100 г загруженной багассы (сухой вес).
Пример 9 (изобретение)
Ферментативный гидролиз второго твердого остатка, полученного из багассы, полученной из растений гваюла, после биологической предварительной обработки Pleurotus ostreatus и гидролиза разбавленной серной кислотой (2,5% по массе водный раствор)
Второй твердый остаток, полученный после обработки водным раствором 2,5 мас.% серной кислоты (пример 7), промывали водой, сушили в печи при 60°С в течение одной ночи и, наконец, подвергали ферментативному гидролизу.
Затем в колбе на 500 мл готовили 5 мас.% суспензию в воде указанного твердого остатка по отношению к общей массе суспензии, к которой добавляли ферментную смесь Cellic CTec2 (Novozymes Bioenergy) в количестве 10 мас.% по отношению к загруженному твердому остатку (сухой вес) и 100 мл 50 мМ исходного раствора цитратного буфера при рН 5: все оставляли при перемешивании (150 об/мин) при 50°С, в течение 72 часов получают смесь, содержащую твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и второй гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6) и меньшие количества мономерных сахаров с 5 атомами углерода (C5). После того как все остыло до комнатной температуры (25°C), указанный третий твердый остаток, содержащий лигнин и целлюлозу, и указанный второй гидролизат, преимущественно содержащий мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6) и меньшие количества мономерных сахаров с 5 атомами углерода (C5), были отделены фильтрацией.
Указанный второй гидролизат преимущественно содержит мономерные сахара с 6 атомами углерода (C6) и меньшие количества мономерных сахаров с 5 атомами углерода (C5), после концентрирования вакуумным испарением (40 мбар, 40°C) содержится 6,4 г глюкозы/100 г загруженной багассы (сухой вес) и 0,7 г ксилозы/100 г загруженной багассы (сухой вес). Следовательно, были получены выходы, аналогичные полученным в примере 7 (сравнительном), но с использованием разбавленной серной кислоты (2,5 мас.% водного раствора вместо 5 мас.%).
Из приведенных выше примеров можно вывести количества мономерных сахаров с 5 атомами углерода (С5) и мономерных сахаров с 6 атомами углерода (С6), полученных при работе в соответствии с процессом осахаривания в соответствии с объектом способа настоящего изобретения (пример 2, пример 7 и пример 9) с биологической предварительной обработкой и в соответствии с обработкой осахаривания в соответствии с предшествующим уровнем техники (пример 6 и пример 8) без биологической предварительной обработки. Как можно увидеть, если проводится биологическая предварительная обработка в присутствии по меньшей мере одного лигнинолитического гриба, набор мономерных сахаров, включающий как мономерные сахара с 5 атомами углерода (С5) (например, ксилозу, арабинозу, галактозу), происходящие из-за деградации гемицеллюлозы, так и мономерные сахара с 6 атомами углерода (С6), в частности глюкозу, образующиеся в результате разложения целлюлозы или непосредственно произведенной лигнинолитическим грибом, соответствует 49,6 г/100 г загруженной багассы (сухой вес), из которых 38,2 г/100 г загруженной багассы (сухой вес) содержат глюкозу. В случае, если биологическая предварительная обработка не проводится, набор мономерных сахаров, включающий в себя как мономерные сахара с 5 атомами углерода (C5) (например, ксилозу, арабинозу, галактозу), происходящие из разложения гемицеллюлозы, так и мономерные сахара с 6 атомами углерода атомы (С6), в частности глюкоза, соответствует 22,6 г/100 г загруженной багассы (сухой вес), из которых 9,5 г/100 г загруженной багассы (сухой вес) содержат глюкозу.