ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СОЛИ АМИНОБИЦИКЛО[2.2.1]ГЕПТАНОВ КАК ИНГИБИТОРЫ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА NF-KB С ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (ВАРИАНТЫ) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
PHARMACEUTICAL SALTS OF AMINOBICYCLO[2,2,1]HEPTANE AS NF-KB TRANSCRIPTION FACTOR INHIBITORS WITH ANTIVIRAL ACTIVITY (VERSIONS) AND USING THEM

Изобретение относится к медицине и, в частности, к разработке средств лечения гриппа.
В настоящее время для лечения гриппа и острых респираторных вирусных инфекций используются два основных класса лекарственных средств - симптоматические средства и противовирусные этиотропные препараты.
К симптоматическим средствам относятся аспирин, парацетамол и средства, снижающие интоксикацию, сопровождающую практически все клинические формы гриппозной инфекции. На сегодняшний день вся группа этих препаратов устарела и не соответствует современным представлениям о патогенезе гриппозной инфекции [Птичий грипп: происхождение инфекционных биокатастроф. Покровский В.И., Киселев О.И., ред., Изд. «Росток», СПб., 2005, 376 стр.].
К этиотропным препаратам, использующимся для лечения гриппа, относятся амантадин, ремантадин, альгирем, реленза, тамифлю и арбидол [De Clercq E., Strategies in the design of antiviral drugs. Nature review. Drug Discivery. 2002, Vol.1, p.13-25].
Эффективность этиотропной терапии существенно зависит от одновременного применения симптоматических средств, так как купирование симптомов гриппа при этиотропной терапии происходит медленно и в значительной степени определяется только подавлением вирусной репродукции.
Особенность гриппозной инфекции состоит в том, что уже на ранней стадии инфекционного процесса происходит сильная активация провоспалительного врожденного иммунного ответа [Seo S.H., Hoffman E., Webster R.G., Lethal H5N1 influenza virus escape host anti-viral cytokine responses. Nat. Med., 2002. Vol.8, p.950-954].
Дальнейшее развитие этой реакции приводит к «цитокиновому шторму», осложняющему течение инфекции и приводящему к таким осложнениям, как отек легких и системное поражение органов [Zhou J., Law H.K.W., Cheung C.Y. et al. Differential expression of chemokines and their receptors in adult and neonatel macrophages infected with human and avian influenza viruses. J. Infect. Dis., 2006, Vol.194, p.61-70]. При этом указывается, что высокий уровень продукции фактора некроза опухолей (TNF-α) является основной причиной системного поражения органов при тяжелых формах гриппозной инфекции.
Средства патогенетического этиотропного действия для лечения гриппозной инфекции должны удовлетворять трем основным требованиям:
- действовать на репродукцию вируса;
- снижать цитопатический эффект вируса;
- снижать провоспалительную реакцию организма
[Птичий грипп: происхождение инфекционных биокатастроф. Покровский В.И., Киселев О.И., ред., Изд. «Росток», СПб., 2005, с.376].
В последние годы достигнут значительный прогресс в разработке и исследовании свойств нестероидных противовоспалительных препаратов [Davies N.M., Action and toxicity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Curr. Opin. Rheumatology, 1996, Vol.8, p.169-175]. В частности, изучены фармакологические свойства новых амино- и нитропроизводных аспирина (ацетилсалициловой кислоты).
Цель получения новых производных аспирина состояла в том, чтобы, с одной стороны, препаратам на основе ацетилсалициловой кислоты снизить или устранить побочные эффекты, а с другой стороны, придать им новые свойства [Glasgow J.F.; Middleton В.; Moore R.; Gray A.; Hill J., The mechanism of inhibition of beta-oxidation by aspirin metabolites in skin fibroblasts from Reye's syndrome patients and controls. Biochim Biophys Acta. 1999; Vol.1454(1), p.115-25]. В этом контексте следует отметить месалазин, являющийся 5-аминосалициловой (или 5-амино-2-гидроксибензойной) кислотой.
Анализ механизмов противовоспалительного действия месалазина показал, что его противовоспалительная активность связана с подавлением синтеза транскрипционного фактора NF-kB [Allgayer H., Review article: mechanism of action of mesalazine in preventing colorectal carcinoma in inflammatory bowel diseases. Aliment. Pharmacol. Ther., 2003, Vol.18, Suppl. 2, p.10-14]. Позднее получен более активный аналог Месалазина - Сульфосалазин [Wahl С., Liptay S., Adler G., Schmidt R.M. Sulfassalazine - a potent and specific inhibitor of nuclear factor Nf-k, Rappa B. J., Clin. Invest., 1998, Vol.101, p.1163-1174].
Однако использование производных салициловой кислоты противопоказано при тяжелых формах гриппа и атипичной пневмонии SARS, так как в этих случаях возрастает частота развития синдрома Рейя [Glasgow J.F., Middleton В., Moore R., Gray A., Hill J., The mechanism of inhibition of beta - oxidation by aspirin metabolites in skin fibroblast from Reye's syndrome patients and controls. Biochim Biophys. Acta, 1999, Vol.1454(1), p.115-125. Деева Э.Г. Грипп. На пороге пандемии. Руководство для врачей. М.: Изд. «Геотар». 2008. 198 стр.] Поэтому поиск наиболее эффективных нестероидных противовоспалительных препаратов осуществляется, главным образом, в направлении изыскания ингибиторов транскрипционного фактора NF-kB [Dieppe P., Dartlett С., Davey P., Doyal L., Ebrahim S., Clinical Review. Balancing benefits and harm: the example of non-steroidal anti-inflamatory drugs. BMJ, 2004, Vol.329, p.31-34].
Изменения фармакологических свойств аспирина с введением 5-аминогруппы привели к усилению одного из важнейших свойств исходного препарата, в частности способности к подавлению синтеза транскрипционного фактора NF-kB. Относительно простая модификация остается привлекательной для изменения фармакологических свойств других простейших противовоспалительных препаратов, особенно природного происхождения, в частности, таких как монотерпены.
Известно, что активация транскрипционного фактора NF-kB является ключевым моментом в индукции синтеза провоспалительных цитокинов [Tripathi P., Aggarwal A. NF-kB transcriptional factor: a key player in the generation of immune response. Current science, 2006, Vol.90, p.519-531]. Поэтому создание противовирусных препаратов со свойствами ингибиторов NF-kB представляет значительный интерес для усовершенствования терапии вирусных инфекций и, в частности, гриппа.
Гриппозная инфекция начинается с активации NF-kB и сопровождается в случае особо патогенных вирусов цитокиновым штормом, при котором наблюдается транскрипционная активация синтеза таких цитокинов, как фактор некроза опухолей (TNF)-α, интерфероны-α и -β, интерлейкины-6,8,10 и макрофагальных провоспалительных белков семейства MIP [Nimmerjahn F., Dubziak D., Dirmeier U., Hobom G., et al. Active NF-kB signaling is prerequisite for influenza virus infection. J. Gen. Virol., 2004, Vol.85, p.2347-2356]. Контроль транскрипционной активности генов, кодирующих эти цитокины, осуществляется ключевым транскрипционным фактором NF-kB [Hiscott J., Kwon H., Genin P., Hostile take over: viral appropriation of the NF-kB pathway. Clin. Invest., 2001, Vol.107(2), p.143-151, Seo S.H., Hoffman E., Webster R.G., H5N1 influenza virus escape host antti - viral cytokine responses. Nat. Med., 2002, Vol.8, p.950-954].
Таким образом, из современного состояния исследований следует, что:
1. Салицилаты противопоказаны при многих респираторных вирусных инфекциях и особенно при гриппе средней тяжести или его гипертоксических формах. Препараты на основе парацетамола высокотоксичны (применяются в крайне высокой дозировке), и до сих пор не найдено средств и методов снижения их токсичности.
2. Необходимость комбинации противовирусных средств и противовоспалительной терапии при лечении гриппа вынуждает производить комплексные препараты или проводить комплексную терапию. Комплексные препараты в большинстве случаев не оправдывают себя, так как одновременный прием индивидуальных лекарственных средств приводит к интерференции эффектов, не всегда положительных как для пациента, так и в отношении вирусной репродукции.
3. В медицинской практике фактически отсутствуют противовирусные препараты с антиоксидантной активностью или противовоспалительным эффектом.
Создание противовирусных препаратов с противовоспалительными свойствами позволит решить важнейшую задачу - осуществление лекарственного контроля за репродукцией вирусов гриппа не только через прямое противовирусное действие, но и путем снижения генерализованного воспалительного ответа, характерного для современного гриппа.
Наиболее близкими по структуре и активности к заявляемым соединениям являются монотерпены, а именно природный борнеол.
Монотерпены представляют собой обширный класс соединений. Не менее широк и спектр их действия (см. таблицу 1). Наиболее важными для данного изобретения являются противовоспалительная, антимикробная и противовирусная активность ряда представителей монотерпенов.
Таблица 1
Спектр биологических свойств монотерпенов [getinfo@haworthpressinc.com]
Название
Молекулярная Структура
Концентрация, %
Температура кипения, °С
Свойства
А-терпинол
<img file="00000001.tif" he="12" wi="30" img-content="undefined" img-format="tif" />
0.02
217-218
Антибактериальная противовоспалительная
Терпинеол-4-ол
<img file="00000002.tif" he="15" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
0.0004
209
Антибактериальная противовоспалительная
p-цимен
<img file="00000003.tif" he="12" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
0.0004
177
Антибактериальная противовоспалительная
Борнеол
<img file="00000004.tif" he="18" wi="20" img-content="undefined" img-format="tif" />
0.008
210
Антибактериальная противовоспалительная
Δ-3-Карен
<img file="00000005.tif" he="17" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
0.004
168
Антибактериальная противовоспалительная
Борнеолы и изоборнеолы являются наиболее распространенными бициклическими соединениями, относящимися к классу монотерпенов. У борнеола гидроксильная группа находится в эндо-положении, а у изоборнеола - в экзо, то есть изоборнеол является экзо-изомером борнеола http://en.wikipedia.org/wiki/Borneol
http://allrss.com/wikipedia.php?title=Borneol
В отличие от бензольных производных, таких как салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота и ибупруфен, природные борнеол и изоборнеол относятся к бицикло[2.2.1]гептанам, что и является принципиальным отличием их по химической структуре от вышеуказанных препаратов. Бициклическая структура борнеола и изоборнеола лучше адаптирована к липофильным компонентам клетки - клеточным мембранам, поэтому можно ожидать, что усиление их биодоступности может привести к появлению новых фармакологических свойств с сохранением прежних.
Борнеол и изоборнеол обладают как противовоспалительным действием, так и антиоксидантным эффектом. В медицине многих народов в Азии в качестве средства местного лечения воспалительных поражений в виде растираний и мазей используются натуральные растительные масла, содержащие борнеол и изоборнеол от 0,01 до 5%. Кроме этого применяются такие подобные им соединения, как камфора (дегидрированный борнеол), пипен (бициклический каркас которого аналогичен каркасу борнеола) и другие монотерпены [Dharmananda S. Borneol, Artemisia and moxa. http. www.itmonline.org/org/art/borneol.ytm. Household Products Database www.hhs.gov. Vail III, Banning W., Vail M.L. Method and apparatus to prevent, treat and cure infections of the respiratory system by pathogens causing sever acute respiratory syndrome (SARS). Патент США 7048953].
Однако борнеол и изоборнеол, имеющие структуру норборнанов, проявляют высокую липофильность и поэтому токсичны для клеток животных и человека [Птичий грипп: происхождение инфекционных биокатастроф. Покровский В.И., Киселев О.И., ред., Изд. «Росток», СПб., 2005, 376 стр.].
Противовоспалительное действие монотерпенов является их эссенциальным свойством. Но механизм действия этих средств неизвестен.
В связи со сходной бициклической структурой препаратов на основе природного борнеола и противовирусных каркасных синтетических производных норборнанов представляло интерес изучение аминопроизводных норборнанов (аналогов борнеола) в качестве противовоспалительных и противогриппозных средств. Более того, получение различных фармацевтических солей позволяет также придать норборнанам новые свойства, усиливающие тот или иной биологический эффект на клеточные процессы.
Противовоспалительные препараты природного происхождения, проявляющие после модификации противовирусные свойства, в литературе неизвестны.
Изобретение направлено на создание новых соединений, обладающих одновременно противовирусной и противовоспалительной активностью, нетоксичных для клеток животного и человека, а именно аминопроизводных бициклогептанов, обладающих противовоспалительным действием на уровне ингибирования транскрипционного фактора NF-kB и противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А.
Фармацевтические соли 2-(1-аминоэтил)норборнана (1a-h) и 2-аминонорборнана (2) с противовирусной и противовоспалительной активностью в литературе не описаны.
Заявляются норборнаны (структурные аналоги борнеола) - соли 2-(1-аминоэтил)[2.2.1]гептана формулы (1a-h), а также гидрохлорид 2-аминобицикло[2.2.1]гептана формулы (2)
X
(a)Cl
6
5
(b) OCOCH
2
6
4
3
(c) OCOCHOCH-2-СН
2
6
4
(d) OCOCHSCH-4-Cl
6
4
(e) ОСО-СН-2-ОН
6
4
3
(f) ОСО-СН-2-ОСОСН
2
2
(g) ООССНСНСООН
2
2
(h) (HOOC)C(OH)(CHCOOH)
проявляющие свойства противовирусной активности в отношении вирусов гриппа типа А и противовоспалительные свойства, характерные для природного аналога этих соединений - борнеола.
Аминопроизводные норборнанов как синтетические аналоги природного борнеола при снижении общей гидрофобности молекулы обладают высокой биодоступностью, низкой токсичностью и широким спектром биологической активности.
Также заявляется применение фармацевтически приемлемых солей общей формулы (1a-h) и 2 для приготовления лекарственных средств для лечения гриппа А.
Фармацевтические соли 2-(1-аминоэтил)норборнана (2a-h) обладают прямым противовирусным эффектом на репродукцию вируса гриппа типа А и одновременно проявляют способность к подавлению индукции транскрипционного фактора NF-kB - ключевого транскрипционного фактора, контролирующего синтез провоспалительных цитокинов в ответ на вирусную инфекцию.
Заявленные фармацевтические соли, обладающие как противовирусными, так и противовоспалительными свойствами, могут быть использованы для решения важнейшей задачи: осуществление лекарственного контроля за репродукцией вирусов гриппа не только через прямое противовирусное действие, но и путем снижения генерализованных воспалительных процессов.
Сущность изобретения поясняется чертежами:
ФИГ.1 - структурные формулы заявляемых соединений.
ФИГ.2 демонстрирует действие аминонорборнанов (соединения 1а и 2) на индукцию транскрипции гена NF-kB. Относительный уровень экспрессии гена NF-kB отмечен на столбиках диаграммы.
1. Фоновая транскрипция
2. Индукция 10 мкг/мл рекомбинантным TNF-α
3. Действие соединения 1а и действие соединения 2
ФИГ.3 демонстрирует действие 2(-1-аминоэтил)норборнана (соединение 1а) на индукцию транскрипции NF-kB в различных концентрациях: вверху - электрофорез ПЦР-фрагментов, внизу - график зависимости подавления экспрессии гена NF-kB от концентрации соединения. Концентрации соединений указаны по оси абсцисс. Столбики 1 и 2 (0, 0) представляют фон и индукцию TNF-α соответственно.
ФИГ.4 - электрофореграмма ПЦР-фрагментов транскриптов гена NF-kB клеток HeLa в условиях действия аминонорборнанов (соединения 1а и 2) и дигидрокверцетина:
1. Индукция TNF-α
2. Подавление индукции соединением 1а
3. Подавление индукции соединением 2
4. Подавление индукции дигидрокверцетином
5. Действие ремантадина
6. Контроль с продолжительностью стимуляции в течение 18 час
ФИГ.5 показывает подавление индукции транскрипции NF-kB изоборнеолом в различных концентрациях, где:
1. Контроль
2. Изоборнеол - 0,01%
3. Изоборнеол - 0,05%
4. Изоборнеол - 0,1%
Способ получения соединений формулы 1 осуществляется следующим образом.
Синтез гидрохлорида 2-(1-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептана 1а и других фармацевтических солей 1b-h.
При конденсации метилвинилкетона с циклопентадиеном получают бициклический кетон, а при последующей обработке гидроксиламином выделен оксим 5-ацетилбицикло[2.2.1]гепт-2-ена. Его гидрированием в среде алканола при повышенном давлении в присутствии никелевого катализатора получен исходный 2-(1-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептан или 2-(1-аминоэтил)норборнан (А).
После отделения катализатора полученный амин А выделяют из реакционной массы экстракцией органическим растворителем (эфиром) или путем вакуумной перегонки. Органические соли получают из выделенного амина А взаимодействием с соответствующими кислотами: соляной (а), бензойной (b), орто-крезоксиуксусной (с), пара-крезилтиоуксусной (d), салициловой (орто-гидроксибензойной) (е), ацетилсалициловой (аспирин) (f), янтарной (g) и лимонной (h).
Катионный фрагмент других фармацевтических солей 1a-h одинаков и представляет собой 2-(1-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептан.
Общая структурная схема полученных солей:
НХ
(a)HCl
6
5
(b) НОСОСН
2
6
4
3
(c) HOCOCHOCH-2-СН
2
6
4
(d) HOCOCHSCH-4-Cl
6
4
(e) НОСО-СН-2-ОН
6
4
3
(f) НОСО-СН-2-ОСОСН
2
2
(g) НООССНСНСООН
2
2
(h)(HOOC)C(OH)(CHCOOH)
Ниже приводятся примеры синтеза фармацевтических солей (2-(1-аминоэтил)норборнана) для последующего исследования их противовирусной и противовоспалительной активности.
1а
Пример 1. Через раствор 1,40 г (0.01 моль) 2-(1-аминоэтил)норборнана (А) в 10 мл сухого эфира при охлаждении до 5-10°C в течение 10 мин пропускают HCl (а), упаривают и получают 1,76 г (100%) гидрохлорида 1а. Чистоту продукта контролируют методом ГЖХ. Выход 78%. Содержание основного вещества - 99,0%. Т.пл. 282-283°C.
1b
6
5
Пример 2. К раствору 1,40 г (0.01 моль) 2-(1-аминоэтил)норборнана (А) в 10 мл диэтилового эфира при перемешивании прибавляют раствор 1,22 г (0.01 моль) бензойной кислоты НОСОСН кислоты (b) в 10 мл диэтилового эфира. Выпавший мелкокристаллический осадок бензоата 2-(1-аминоэтил)норборнана (1b) отфильтровывают, промывают 2 мл диэтилового эфира. Выход (1b) 2,17 г (83,1%). Т.пл. 173-174°C.
1с
2
6
4
3
Пример 3. К раствору 1,40 г (0.01 моль) (А) в 5 мл сухого хлороформа при перемешивании в течение 10 мин прибавляют по каплям раствор 1,66 г (0.01 моль) крезоксиуксусной кислоты HOCOCHOCH-2-СН (с) в 10 мл хлороформа. Реакционную смесь перемешивают 1,5 ч, упаривают наполовину и охлаждают до 0-5°С. Выпавший осадок (2б) отфильтровывают, промывают дважды 5 мл легкого петролейного эфира и высушивают в вакуум-эксикаторе при 20 мм рт.ст. в течение 5 ч. Получено 2,94 г (96,3%) о-крезоксиацетата 2-(1-аминоэтил)норборнана (1с). Т.пл. 221-223°C.
1d
2
6
4
3
Пример 4. К раствору 1,40 г (0.01 моль) 2-(1-аминоэтил)норборнана (А) в 5 мл сухого (хлороформа) при перемешивании в течение 10 мин прибавляют по каплям раствор 2,02 г (0.01 моль) HOCOCHSCH-2-СН (с). Реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч, упаривают наполовину, к охлажденному до 20°С раствору добавляют 10 мл н-пентана. Выпавший осадок отфильтровывают, дважды промывают (2×5 мл) пентаном и сушат при остаточном давлении 20 мм рт.ст. в течение 2-х часов. Выход о-крезилтиоацетата 2-(2-(1-аминоэтил)норборнана (1d) 2,83 г (83,1%). Т.пл. 191-192°C.
1е
6
4
Пример 5. Аналогично примеру 4 из 1,40 г (0.01 моль) (1) и 1,38 г (0.01 моль) о-гидроксибензойной 2-кислоты (HOCHCOOH) в 20 мл хлороформа после выдерживания раствора этих реагентов при 25°С в течение 24 ч, упаривания и осаждения пентаном получают 2,35 г (84,8%) салицилата 2-(1-аминоэтил)норборнана (1е). Т.пл. 247-249°C.
1f
6
4
Пример 6. Аналогично примеру 5 из 1,40 г (0.01 моль) (1) и 1,80 г (0.01 моль) ацетилсалициловой кислоты (НОСНСООН) в 20 мл хлороформа после выдерживания раствора этих реагентов при 25°С в течение 24 ч, упаривания и осаждения пентаном получают 2,72 г (85%) ацетилсалицилата 2-(1-аминоэтил)норборнана (1е). Т.пл. 289-290 °С.
1g
2
2
Пример 7. К раствору 1,40 г (0.01 моль) 2-(1-аминоэтил)норборнана (А) в 5 мл сухого (хлороформа) при перемешивании в течение 10 мин прибавляют по каплям раствор 1,18 г (0.01 моль) янтарной кислоты НООС(СН)СООН (g). Реакционную смесь перемешивают в течение 48 ч, упаривают наполовину, к охлажденному до 20°С раствору добавляют 10 мл н-пентана. Выпавший осадок отфильтровывают, дважды промывают (2×5 мл) пентаном и сушат при остаточном давлении 20 мм рт. ст. в течение 2-х часов. Выход сукцината 2-(2-(1-аминоэтил)норборнана (1g) 2,35 г (91,1%). Т.разл. 134-136°C.
1h
3
4
3
Пример 8. Аналогично примеру 4 из 1,40 г (0.01 моль) (1) и 1,92 г (0.01 моль) лимонной кислоты CH(ОН)(СООН) в 20 мл хлороформа после выдерживания раствора этих реагентов при 25°С в течение 48 ч, упаривания и осаждения пентаном получают 3,00 г (90,4%) цитрата 2-(1-аминоэтил)норборнана (1h). Т.разл. 142-145°C.
2
Способ получения соединения 2 осуществляется следующим образом.
2
2
3
2
4
2
2
2
Пример 9. В трехгорлой колбе емкостью 100 мл к 6,5 г фосфорного ангидрида при медленном перемешивании добавляют 13,5 мл (0,2 моль) 85%-ной ортофосфорной кислоты. Смесь охлаждают до 25°С и прибавляют 7,01 г (0,05 моль) 2-этоксинорборнана в 30 мл хлористого метилена. Реакционную смесь нагревают до кипения при перемешивании в течение 8 ч, затем добавляют 15 мл воды и 20 мл диэтилового эфира. Органический слой промывают раствором NaSO и насыщенным раствором NaCl и сушат над прокаленным NaSO. После отгонки смеси CHCl и EtO перегонкой остатка в вакууме получают 2-иоднорборнан; выход 8,82 г (79,5% от теоретического). Т.кип. 92-93°С (9 мм рт.ст.). При взаимодействии последнего с амидом натрия в жидком аммиаке получают 2-аминобицикло[2.2.1]гептан (2-аминонорборнан) 2 с выходом 97,8%.
Норборнаны, содержащие амино, аминометильные и аминоэтильные заместители, являются синтетическими аналогами природного борнеола.
Далее приводятся примеры, подтверждающие свойства полученных соединений.
Пример 10. Структура и противовирусная активность солей 2-(1-аминоэтил)норборнана.
Для изучения противовирусной активности использовали наиболее достоверный метод оценки защитного эффекта соединений на модели летальной гриппозной инфекции эталонным вирусом A/Aichi/2/68, адаптированным многократными пассажами к мышам. Инфицирование этим вирусом приводит к развитию специфической гриппозной пневмонии со смертельным исходом через 8-10 дней.
Препараты вводили животным однократно за 12 и 6 час до инфицирования в дозе 10-50 мкг/кг веса животных внутрибрюшинно. Плацебо в контрольной группе животных служил физиологический раствор или фосфатный буфер в равном объеме.
50
Вирус A/Aichi/2/68 вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 0,2 и 5 LD. В каждую группу наблюдения брали до 20 мышей. Наблюдение за животными осуществляли до 15 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается 100% смертность животных. Содержали животных в стерильных боксах, обеспечивая предупреждение инфицирования бактериальными патогенами. Стерилизовались также корма и питьевая вода.
50
На основании полученных показателей смертности рассчитывали процент смертности в каждой группе (отношение числа павших за 15 дней животных к общему числу зараженных животных в группе), что выражали в виде индекса защиты. Данные экспериментальных наблюдений представлены в таблице 4. Анализ полученных результатов показал, что действие исследованных соединений 1 и 2 в отношении вируса гриппа А, патогенного для мышей, было сравнимо с эффективностью защитного эффекта референс-препарата ремантадина (90-95% - при дозе вируса 1 LD). Высокий защитный эффект соединений 1 и 2 свидетельствует о том, что аминопроизводные бициклогептанов (1 и 3) обладают выраженным защитным эффектом в отношении летальной дозы вируса A/Aichi/2/68 на мышах.
Таким образом, модификации бициклогептана, приводящие к введению в структуру норборнанов амино или аминоэтильной групп, приводят к появлению у новых соединений выраженной противовирусной активности, соответствующей референс-препарату - ремантадину и обеспечивающей защиту животных от 5-кратно смертельной дозы вируса A/Aichi/2/68.
Известно, что такие модификации делают исследуемые производные норборнанов подобными ремантадину, что позволяет предположить их действие на ионный канал вируса гриппа, формируемый белком М2 [Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф. 2005. Ред. Покровский В.И. и Киселев О.И. СПб.: Изд. Росток, 376 стр.]. Вместе с тем, очевидны и другие эффекты полученных соединений. Так, описан антиапоптотический эффект изоборнеола на клетках нейробластомы человека. Более того, исследования показали, что в условиях стресса и повышенного содержания 6-гидроксидопамина изоборнеол способствует сохранению жизнеспособности нейробластов и других клеток [Tian L.-L., Zhou Z., Zhang Q., Sun Y.-N. et al. Protective effect of (±) isoborneol against 6-OHDA - induced apoptosis in SH-SY5Y celles. Cellular Physiology and Biochemistry, 2007, Vol. 20, p.1019-1032]. Причины повышения выживаемости клеток остаются непонятными, но данное свойство делает более привлекательными полученные соединения, так как в случае их применения можно наблюдать феномен неспецифической резистентности к различным воздействиям и, вероятно, гриппозной инфекции.
Известно, что фармакологические свойства соединений в значительной степени определяются противоионом, то есть фармацевтически адекватными солевыми компонентами. В связи с этим использовались противовирусные свойства фармацевтических солей, производных норборнана.
Пример 11. Противовирусная активность фармацевтических солей 2-(1-аминоэтил)норборнана.
Молекулярные и структурные формулы анионного фрагмента фармацевтических солей 1a-h и 2 и их противовирусная активность представлены в таблице 2.
Таблица 2
Оценка влияния солевого анионного фрагмента солей 1a-h и соединения 2 на противовирусную активность
Названия исходных кислот для получения солей 2-(1-аминоэтил)норборнана (1), 2-аминонорборнана (2)
Анионный фрагмент соли Х<sup>-</sup>
Противовирусная активность
Молекулярная формула
Структурная формула
В условных единицах*
1а
Соляная
Cl<sup>-</sup>
+++
1b
Бензойная
C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>COO<sup>-</sup>
<img file="00000009.tif" he="13" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
+++
1с
орто-Крезоксиуксусная
C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>(2-CH<sub>3</sub>)OCH<sub>2</sub>COO<sup>-</sup>
<img file="00000010.tif" he="12" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
++
1d
орто-Крезилтиоуксусная
С<sub>6</sub>Н<sub>4</sub>(2-СН<sub>3</sub>)SCH<sub>2</sub>COO<sup>-</sup>
<img file="00000011.tif" he="12" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
++
1е
Салициловая (орто-гидроксибензойная)
С<sub>6</sub>Н<sub>4</sub>(2-ОН)СОО<sup>-</sup>
<img file="00000012.tif" he="15" wi="14" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
1f
Ацетилсалициловая (аспирин)
С<sub>6</sub>Н<sub>4</sub>(2-ОСОСН<sub>3</sub>)СОО<sup>-</sup>
<img file="00000013.tif" he="21" wi="19" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
1g
Янтарная
HOOCCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>COO<sup>-</sup>
<img file="00000014.tif" he="3" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
1h
Лимонная
(СН<sub>2</sub>СООН)<sub>2</sub>С(ОН)COO<sup>-</sup>
<img file="00000015.tif" he="10" wi="30" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
2
Соляная
Cl<sup>-</sup>
Противовирусную активность in vitro определяли в культуре клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа типа A/PR8/34. Противовирусную активность определяли по снижению титра вируса на 5, 4, 2 и 1lg, что представлялось как ++++, +++, ++, + соответственно.
Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что ряд анионов повышают противовирусную активность основного фармакофора - 2-(1-аминоэтил)норборнана.
Обращает на себя внимание, что салициловая и ацетилсалициловая кислоты приводили к усилению противовирусного эффекта. Аналогичный эффект оказывали янтарная и лимонная кислоты. Сочетание известных противовоспалительных средств в солях противовирусных препаратов с отчетливым повышением их активности в отношении вирусов гриппа следует отнести с высокой вероятностью к подавлению активности провоспалительной реакции клеток и, в частности, к подавлению синтеза универсального транскрипционного фактора NF-kB [Kash J.C., Basler C.F., Garcia-Sastre A., Carter V. et al. Global host response: pathogenesis and transcriptional profiling of type A influenza virus expressing the hemagglutinin and neuraminidase genes from the 1918 pandemic virus. J. of Virology, 2004, Vol.78, p.9499-9511. Zheng B.-J., Chan K.-W., Lin Y.-P., Zhao G.-Y. et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, Vol.105, p.8091-8096.]
В отношении янтарной и лимонной кислот очевиден метаболический эффект, приводящий к снижению токсичности соединения путем повышения окислительно-восстановительного потенциала клеток как фактора повышения неспецифической резистентности.
Результаты повторных исследований противовирусной активности солей 2-(1-аминоэтил)норборнана с салициловой и ацетилсалициловой кислотой и метаболическими субстратами типа янтарной и лимонной кислот приведены в таблице 3.
Таблица 3
Анализ противовирусной активности соединений 1 и 2 в составе солей с противовоспалительными веществами и метаболическими активаторами
Противовоспалительные средства
1е
Салициловая (орто-гидроксибензойная)
С<sub>6</sub>Н<sub>4</sub>(2-ОН)COO<sup>-</sup>
<img file="00000012.tif" he="15" wi="14" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
1f
Ацетилсалициловая (аспирин)
С<sub>6</sub>Н<sub>4</sub>(2-ОСОСН<sub>3</sub>)СОО<sup>-</sup>
<img file="00000013.tif" he="21" wi="19" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
Метаболические активаторы
1g
Янтарная
HOOCCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>COO<sup>-</sup>
<img file="00000014.tif" he="3" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
1h
Лимонная
(СН<sub>2</sub>СООН)<sub>2</sub>С(ОН)СОО<sup>-</sup>
<img file="00000015.tif" he="10" wi="30" img-content="undefined" img-format="tif" />
++++
2
Соляная
Cl<sup>-</sup>
Полученные данные (табл.3) свидетельствуют о том, что метаболические компоненты в фармацевтических солях 2-(1-аминоэтил)норборнана могут играть полезную роль в проявлении фармакологических свойств этого соединения. Вместе с тем, неотчетливое аддитивное действие таких компонентов фармацевтических солей 2-(1-аминоэтил)норборнана, как салициловой и аминосалициловой кислот, требует дополнительного изучения и исключения или подтверждения противовоспалительной активности аминопроизводных норборнана. Более того, как уже указывалось, использование салициловой и ацетилсалициловой кислот ограничивается при лечении гриппа и других респираторных вирусных инфекций [WHO, 2007]. Поэтому в препаратах для лечения необходимо исключать данный компонент для снижения вероятности развития побочных эффектов.
Пример 12. Изучение противовоспалительного действия производных 2-(1-аминоэтил)норборнана по подавлению индукции транскрипционного фактора NF-kB.
Большинство противовирусных препаратов лишены противовоспалительной активности. Это относится даже к арбидолу, ближайшим аналогом которого является индометацин, который позиционируется в качестве ингибитора слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной [Anonimous: Arbidol. Drugs R D, 1999, Vol.2, p.171-172]. Вместе с тем, как уже указывалось, для производных норборнана можно предположить сохранение противовоспалительных свойств после введения аминогруппы в структуру этого соединения. Введение аминогруппы существенно снижает токсичность норборнанов и приводит к появлению у них противовирусной активности в отношении вирусов гриппа. Можно надеяться, что по аналогии с месалазином, проявляющим противовоспалительные свойства, после введения аминогруппы, норборнаны сохранят противовоспалительную активность, свойственную натуральному норборнану (борнеолу). Месалазин, его производные и многие другие противовоспалительные препараты проявляют способность к подавлению индукции ключевого транскрипционного фактора NF-kB, инициирующего транскрипцию генов, кодирующих провоспалительные цитокины [Wahl С., Liptay S., Adler G., Schmidt R.M. Sulfasalazine - a potent and specific inhibitor of nuclear factor kappa B. J. Clin. Invect., 1998, Vol.101, p.1163-1174]. В связи с этим для анализа противовоспалительных свойств производных норборнана были проведены исследования по влиянию этих соединений на экспрессию гена, кодирующего транскрипционный фактор NF-kB. Активацию экспрессии гена NF-kB исследовали на клетках HeLa, предварительно обработанных фактором некроза опухолей (TNFα). Препарат добавлялся в концентрации 10 мкг/мл, что обеспечивало достаточно высокий уровень экспрессии гена NF-kB. Тестируемые препараты добавлялись через 0,5 час после индукции TNF-α. Из клеток выделялась тотальная РНК, а анализ количества соответствующей мРНК проводился ПЦР в реальном времени с внутренними маркерами. Для детекции экспрессии гена NF-kB использовали праймеры:
прямой - GCTCAGTGAGCCCATGGAAT и
обратный - TGATGCTCTTGAAGAAACCTCATTG
(для расчета праймеров была использована последовательность гена NF-kB человека - HUMNFKB65A, кодирующего субъединицу этого транскрипционного фактора р65. № доступа в генбанке - L19067).
Для объективной оценки результатов использовалась денситометрия гелей с последующей компьютерной обработкой. На рис.1 и 2 представлены результаты индукции транскрипции гена NF-kB в клетках HeLa фактором некроза опухолей (TNF-α) и подавление индукции аминозамещенными производными норборнана (соединения 1 и 2). Стимуляция TNF-α избрана неслучайно, так как именно с гиперпродукцией фактора некроза опухолей связано развитие тяжелых форм гриппа с системным поражением органов [Kash J.C., Basler C.F., Garcia-Sastre A., Carter V. et al. Global host response: pathogenesis and transcriptional profiling of type A influenza virus expressing the hemagglutinin and neuraminidase genes from the 1918 pandemic virus. J. Virol., 2004, Vol.78, p.9499-9511].
Практически все исследованные соединения (рис.3) проявили достаточно высокий уровень ингибирующей активности по тесту подавления экспрессии гена NF-kB. При этом существенным является тот факт, что впервые установлено, что изоборнеол сам является ингибитором транскрипции гена NF-kB, что проясняет механизм его действия и делает понятным высокую активность аминопроизводных норборнана (рис.4). Таким образом аминопроизводные норборнанов проявляют противовирусную и противовоспалительную активность, что делает их перспективными средствами лечения гриппозной инфекции.
Из приведенных примеров видно, что полученные норборнаны (структурные аналоги борнеола) - производные 2-аминобицикло[2.2.1]гептана и 2-(1-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептана обладают выраженным ингибирующим действием на репродукцию вирусов гриппа как in vivo, так in vitro. Противовирусная активность некоторых солей 2-(1-аминоэтилбицикло[2.2.1]гептана превосходит референс-препарат ремантадин.
Установлено, что полученные соединения в индивидуальном виде и в составе солей проявляют способность к подавлению экспрессии гена ключевого транскрипционного фактора NF-kB, что позволяет отнести их к противовоспалительным препаратам, подавляющим провоспалительную реакцию организма в ответ на соответствующий стимул путем подавления синтеза транскрипционного активатора NF-kB, контролирующего экспрессию генов провоспалительных цитокинов.
Следовательно, аминосодержащие норборнаны, как и их природные аналоги борнеол и изоборнеол, могут быть использованы в качестве противовоспалительных и противовирусных препаратов для лечения гриппозной инфекции. Низкая токсичность препаратов и их строение, подобное природному борнеолу, позволяют рекомендовать данные средства для длительного лечения системных воспалительных заболеваний, терапия которых основана на использовании ингибиторов транскрипционного фактора NF-kB.