Новое соединение 2,4,6-тризамещенного s-триазина, способ его получения и его применение
NOVEL 2,4,6-TRISUBSTITUTED S-TRIAZINE COMPOUND, A METHOD FOR PRODUCTION THEREOF AND USE THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к типу соединений 2,4,6-тризамещенного-1,3,5-триазина (также называемого симметричный триазин, или сим-триазин, s-триазин) или их фармацевтически приемлемых солей, пролекарств или сольватов, способам их получения и их применению.
Предшествующий уровень техники
Помимо хорошо известных форм клеточной гибели, таких как апоптоз, некроз, аутофагия и тому подобное, новая форма клеточной гибели метуоз (methuosis) была выявлена в последние годы. Характерным признаком этой формы гибели является замещение нормальной цитоплазмы крупными, заполненными жидкостью вакуолями, образуемыми макропиноцитозными везикулами или макропиносомами внутри клетки. Соответственно, клеточные потери метаболической способности и мембранной целостности без уменьшения размера клеток и фрагментации ядра, ассоциированных с апопотозом, также существенно отличаются от некроза и аутофагии (Maltese et al. Methuosis: nonapoptotic cell death associated with vacuolization of macropinosome and endosome compartments. Am J Pathol. 2014; 184 (6): 1630-42). Вследствие этого механизма метуоза, отличного от механизма клеточного апоптоза, лекарственное средство, вызывающее клеточную гибель посредством метуоза, могло бы преодолеть резистентность опухолевых клеток к антиапоптозным лекарственным средствам, а также лекарственным средствам, действующим по другим механизмам, и тем самым открыть новый объект разработки терапий против рака (Robinson et al. Synthesis and evaluation of indole-based chalcones as inducers of methuosis, a novel type of nonapoptotic cell death. J Med Chem. 2012; 55 (5): 1940-56; Kitambi et al. Vulnerability of glioblastoma cells to catastrophic vacuolization and death induced by a small molecule. Cell. 2014; 157(2): 313-28; TRabbic et al. Synthesis and biological evaluation of indolyl-pyridinyl-propenones having either methuosis or microtubule disruption activity. J Med Chem. 2015; 58 (5): 2489-512).
Виментин представляет собой главный белок промежуточных филаментов, экспрессируемый в мезенхимальных клетках, включая клетки соединительной ткани, мышц, эндотелия сосудов и крови. Высококонсервативная эволюция и динамическая экспрессия во время разных стадий развития подтверждает, что виментин является физиологически важным. Вместе с микротрубочками и актиновыми микрофиламентами промежуточные филаменты образуют цитоскелет. В дополнение к функции повышения мехнической прочности клеток для поддержания клеточной формы, целостности цитоскелета и упорядоченного в пространстве распределения субклеточной структуры, виментин также может регулировать функцию интегрина, с тем чтобы влиять на клеточную адгезию и миграцию; взаимодействовать с динеином, таким как микротрубочки, микрофиламенты и тому подобное, с тем чтобы влиять на мембранный транспорт везикул; и действовать в качестве каркаса для рецептора и протеинкиназы, с тем чтобы влиять на передачу сигналов, и т.д. (Ivaska et al. Novel functions of vimentin in cell adhesion, migration, and signaling. Exp Cell Res. 2007; 313 (10): 2050-62).
Виментин тесно связан с метаболизмом липидов, осуществляя контроль над транспортом холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL) из лизосомы к сайтам его этерификации (Sarria et al. A functional role for vimentin intermediate filaments in the metabolism of lipoprotein-derived cholesterol in human SW-13 cells. J Biol Chem. 1992 Sep 25; 267 (27): 19455-63). Принимая во внимание высокую экспрессию виментина в клетках эндотелия сосудов и гладкой мускулатуры, нацеливание на виментин может представлять собой стратегию, которая имеет большое значение для разработки новых лекарственных средств для лечения или предупреждения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз. Экспрессия виментина является маркером эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ). ЕМТ представляет собой не только существенный механизм в нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие и восстановление тканей, но также неотъемлемый путь в патологических процессах, таких как фиброз органа и образование и прогрессирование опухоли (Gonzalez et al. Signaling mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition. Sci Signal. 2014; 7 (344): re8). Таким образом, используя виментин в качестве мишени для воздействия на процесс ЕМТ, возможно разработать новое лекарственное средство для стимулирования регенерации ткани, ингибирования дегенерации органа, лечения фиброза ткани, предупреждения метастаза опухоли, и т.д. (Davis et al. Targeting ЕМТ in cancer: opportunities for pharmacological intervention. Trends Pharmacol Sci. 2014; 35(9): 479-88).
Краткое изложение сущности изобретения
В результате изучения взаимосвязи структура-активность, в настоящем изобретении предложен конкретный тип соединений, которые являются высокоэффективными в стимуляции клеточной гибели посредством метуоза. На основе этого, достоверный эффективный способ фишинга белка-мишени с помощью зонда используют для разделения и идентификации белка-мишени соединения, которое вызывает клеточную гибель посредством метуоза, где подтверждают, что белок-мишень представляет собой виментин.
Таким образом, в настоящем изобретении предложен тип соединений 2,4,6-тризамещенного s-триазина, способ их получения и применение этих соединений для регуляции протеинкиназы и виментина и стимуляции клеточного метуоза.
Согласно настоящему изобретению, соединение 2,4,6-тризамещенного s-триазина представлено формулой (I):
где:
1
1
12
1
6
1
6
1
6
R представляет собой водород, галоген, нитро, амино, гидроксил, С-Салкил, C-Салкоксил, C-Салкиламино, ди-С-Салкиламино, гидроксиметил, аминометил;
2
4
5
4
5
1
6
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
1
6
R представляет собой -NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила и C-Сгалогеналкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное или ненасыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или C-Салкилом, где R представляет собой водород, гидроксил, C-Салкил или C-Сгалогеналкил;
3
1
12
1
6
1
6
1
6
a
R представляет собой водород, галоген, нитро, амино, гидроксил, С-Салкил, С-Салкоксил, C-Салкиламино, ди-С-Салкиламино, гидроксиметил, аминометил или -COR;
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила, возможно замещенного одним или более заместителями, выбранными из галогена или NRR, и C-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S, и возможно замещенное С-Салкилом;
9
10
1
6
9
10
где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S; и
X представляет собой NH или О, присоединенный к фенильной группе по пара- или мета-положению.
Настоящее изобретение дополнительно включает фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты соединения, представленного формулой (I).
1
В одном или более воплощениях R представляет собой водород, галоген или нитро.
2
4
5
4
5
1
6
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
В одном или более воплощениях R представляет собой -NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила и C-Сгалогеналкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное или ненасыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или С-Салкилом, где R представляет собой водород, гидроксил или С-Салкил.
2
4
5
4
5
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
В одном или более воплощениях R представляет собой -NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или C-Салкилом, где R представляет собой водород или C-Салкил.
2
4
5
4
5
6
1
6
6
1
6
В одном или более воплощениях R представляет собой -NRR, где R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR и О, где указанное гетероциклическое кольцо возможно замещено заместителем, выбранным из гидроксила и C-Салкила, где R представляет собой водород или С-Салкил.
3
1
6
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
В одном или более воплощениях R представляет собой водород, галоген, нитро, амино, гидроксил, C-Салкил, гидроксиметил, аминометил или -COR, где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила, возможно замещенного одним или более заместителями, выбранными из галогена или NRR, и C-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S, и возможно замещенное С-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S.
3
1
6
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
В одном или более воплощениях R представляет собой галоген, C-Салкоксил или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из С-Салкила, возможно замещенного группой NRR, и C-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О, и возможно замещенное С-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О.
В одном или более воплощениях X представляет собой NH, присоединенный к фенильной группе по пара- или мета-положению.
В одном или более воплощениях в формуле (I):
1
R представляет собой водород, галоген или нитро;
2
4
5
4
5
1
6
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
R представляет собой -NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила, C-Сгалогеналкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное или ненасыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или C-Салкилом; где R представляет собой водород, гидроксил или C-Салкил; и
3
1
6
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
R представляет собой водород, галоген, нитро, амино, гидроксил, C-Салкил, гидроксиметил, аминометил или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила, возможно замещенного одним или более заместителями, выбранными из галогена или NRR, и C-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S, и возможно замещенное C-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S.
В одном или более воплощениях в формуле (I):
1
R представляет собой водород, галоген или нитро;
2
4
5
4
5
6
1
6
6
1
6
R представляет собой -NRR, где R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR и О, где указанное гетероциклическое кольцо возможно замещено заместителем, выбранным из гидроксила и C-Салкила; где R представляет собой водород или C-Салкил;
3
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
R представляет собой галоген или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из C-Салкила, возможно замещенного группой NRR, и C-Салкила, возможно замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О, и возможно замещенное C-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и С-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О; и
X представляет собой NH, присоединенный к фенильной группе по пара- или мета-положению.
В некоторых воплощениях, предпочтительно:
1
R представляет собой водород, галоген или нитро;
2
4
5
4
5
1
6
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
R представляет собой -NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила и C-Сгалогеналкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное или ненасыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или C-Салкилом; где R представляет собой водород, гидроксил или C-Салкил;
3
1
6
7
8
7
8
1
6
7
8
1
6
1
6
1
6
R представляет собой водород, галоген, нитро, амино, гидроксил, C-Салкил, гидроксиметил, аминометил или -CONRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и возможно замещенного C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N, О или S; где указанный C-Салкил может быть возможно замещен одним или более галогеном, C-Салкиламино, ди-С-Салкиламино;
X представляет собой пара- или мета- NH или О.
В некоторых воплощениях, более предпочтительно:
1
R представляет собой водород, галоген или нитро;
2
4
5
4
5
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
R представляет собой -NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или C-Салкилом; где R представляет собой водород или С-Салкил;
3
7
8
7
8
1
6
7
8
1
6
1
6
1
6
R представляет собой водород, галоген или -CONRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и возможно замещенного C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N, О или S; где указанный C-Салкил может быть возможно замещен одним или более C-Салкиламино, ди-С-Салкиламино;
X представляет собой пара- или мета- NH или О.
Предпочтительно, соединение вышеуказанной формулы (I) включает следующие:
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L1);
(Е)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L2);
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L3);
(E)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L4);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(3-гидроксиазетидин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L5);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(3-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L6);
(E)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(3-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L7);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(3-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L8);
(E)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(3-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L9);
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(4-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L10);
(Е)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(4-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L11);
(Е)-1-(3-фторфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(4-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L12);
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(4-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L13);
(Е)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(4-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L14);
(Е)-1-(3-фторфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(4-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L15);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L16);
(E)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L17);
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L18);
(E)-1-(4-фторфенил)-3-(4-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L19);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-диметиламино-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L20);
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(пирролидин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L21);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-(4-(3-гидроксиазетидин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L22);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(3-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L23);
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(3-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L24);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(3-(4-(морфолин-1-ил)-6-(3-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L25);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(3-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(3-хлорстиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L26);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(3-(4-(морфолин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L27);
(Е)-1-(4-хлорфенил)-3-(3-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L28);
(E)-N,N-диметил-4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина)бензамид (L29);
(E)-1-(4-((4-метилпиперидин-1-ил)формил)фенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L30);
(E)-1-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)формил)фенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L31);
(E)-N-(2-(диметиламино)этил)-4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина)бензамид (L32);
(E)-N-(2-(диэтиламино)этил)-4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина)бензамид (L33);
(E)-N-(3-(диметиламино)пропил)-4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина)бензамид (L34);
(E)-N-(2-(пирролидин-1-ил)этил)-4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина)бензамид (L35);
(E)-N-(2-(пиперидин-1-ил)этил)-4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина)бензамид (L36);
(E)-N-(2-(морфолин-1-ил)зтил)-4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина)бензамид (L37);
(E)-1-(4-метоксифенил)-3-(4-((4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазин-2-ил)оксо)фенил)мочевина (L38);
(E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-((4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазин-2-ил)оксо)фенил)мочевина (L39);
(Е)-1-(4-фторфенил)-3-(4-((4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазин-2-ил)оксо)фенил)мочевина (L40);
(E)-N-(2-(3-(1-бутин-4-ил)-3Н-диазиридин-3-ил)этил)-4-(3-(4-((4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазин-2-ил)амино)фенил)мочевина)бензамид (79); и
(E)-1-(4-карбоксифенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (14).
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. In vitro ингибирующий эффект соединений в отношении различных видов опухолевых клеток. Было выбрано 8 соединений с разными структурными признаками (#38-#45, которые представляют собой L20, L21, L16, L18, L14, L10, L13 и L11, соответственно). Для опухолевых клеток, имеющих происхождение из 11 разных видов клеточных источников, определяли активность одного и того же соединения в отношении разных опухолевых клеток и чувствительность одной и той же опухоли к действию соединений с разными структурными признаками. Для каждого соединения, столбики диаграмм относятся к Н522, НСТ15, Hela, HepG2, НТ1080, KG1, LNCap, MCF7, OVCAR3, SK-mel28 и U87, соответственно. Данные, полученные от трех независимых серий экспериментов, выражены в виде среднего значения плюс/минус стандартное отклонение.
2
Фиг. 2. Вакуолизация опухолевых клеток. 100 микролитров культуральной среды (RPMI1640, 2 ммоль глутамина, 10% фетальная бычья сыворотка), содержащей 10 клеток человеческой аденокарциномы толстой кишки (НСТ15) или клеток человеческой глиомы головного мозга (U87) и растворитель диметилсульфоксид (DMSO) в качестве контроля или 100 нМ соединения #40 (L16), помещали в 96-луночный планшет для клеточных культур и после культивирования при 5% СО и 37°С в течение 96 часов получали изображение морфологии клеток под фазово-контрастным микроскопом. И клетки НСТ5 (верхнее правое изображение), и клетки U87 (нижнее правое изображение), обработанные 100 нМ соединения #40, показали значительную вакуолизацию.
Фиг. 3. Способность тестируемых соединений ингибировать клеточный рост не коррелирует с их способностью вызывать клеточную вакуолизацию. 37 соединений (L1-L37) тестировали в отношении их способности ингибировать рост и индуцировать вакуолизацию клеток человеческой глиомы (U87). Соединение #50 (L1) проявляет наиболее сильную способность вызывать клеточную вакуолизацию.
Фиг. 4. Схематическое изображение, показывающее последовательность операций для фишинга белка-мишени с помощью зонда. Процесс фишинга с помощью зонда включает in situ специфическое связывание соединения-зонда с белком живой клетки; in situ ковалентное перекрестное сшивание между фоточувствительной группой соединения-зонда и его белком-мишенью под действием УФ-облучения; специфическое связывание алкинильной группы соединения-зонда с азидогруппой выделяемого соединения посредством клик-реакции; и выделение белка-мишени, специфически связавшегося с соединением-зондом, с помощью связывания биотин-группы выделяемого соединения с гранулой стрептавидин-агарозы.
Фиг. 5. Соединение как инструмент для фишинга белка-мишени с помощью зонда. Среди тестированных соединений соединение #50 проявляет наиболее сильную способность вызывать клеточную вакуолизацию. Основываясь на анализе взаимосвязи структура-активность, связывание фоточувствительной группы соединения #50 по положению, показанному на данной фигуре, с получением соединения-зонда #79, может не влиять на биологическую активность соединения #50. Также подтверждено экспериментально, что соединение #79 и соединение #50 могут приводить к одному и тому же клеточному фенотипу. Для облегчения твердофазного разделения и снижения неспецифичности разработанное соединение #80 имеет длинную цепь, связывающую биотин с азидогруппой, для клик-реакции.
Фиг. 6. Разделение и идентификация белка-мишени. Соединение #79, используемое в качестве зонда, связывают in situ с белком-мишенью в клетке, где образуется индуцируемое действием света ковалентное связывание, и затем подвергают взаимодействию с соединением #80 для достижения твердофазного разделения и очистки белка-мишени. А. Слева: белки, способные специфически связываться с соединением #79, как определено посредством вестерн-иммуноблоттинга (как указано стрелкой); справа: специфические белки-мишени, разделенные посредством гель-электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE), как указано посредством окрашивания кумасси синим. В. Как показано с помощью масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS/MS) с картированием пептидного сегмента и анализом последовательности, белки-мишени соответствуют последовательностям известного белка в базе даных. Подчеркнутые участки, выделенные жирным шрифтом, представляют собой соответствующие последовательности. Два выделенных белка с массой примерно 60 КДа и примерно 200 КДа соответствуют такой же последовательности известного белка. С. Информация белкового соответствия указывает на то, что белком-мишенью соединения является виментин (SEQ ID NO: 1).
Фиг. 7. Результаты докинга между соединением #50 и белком-мишенью. А: 3KLT (системный номер белка; сферическая область в центре представляет собой активную область белка) тетрамера виментина, полученного из PDB (база данных по белкам); В: соединение #50 для докинга; С: баллы для топ-10 конфигураций соединения #50, полученные в результате докинга между 3KLT и соединением #50 с использованием программного обеспечения Discovery Studio 3.0 и описанного здесь метода докинга LibDock; D: вид, показывающий взаимодействие между соединением #50 в конфигурации, имеющей наивысший балл (показано розовым цветом), и виментином; Е: аминокислоты, образующие водородные связи с соединением #50 после депротеинизации, где две аминокислоты Arg273 и Tyr276 образуют водородные связи с триазиновым кольцом в соединении #50.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что в объеме данного изобретения различные технические признаки (например, различные объемы различных групп), определенные в описанных выше воплощениях, и различные технические признаки, которые будут конкретно описаны ниже (например, в Примерах), могут быть объединены друг с другом с получением предпочтительных технических решений.
1
12
1
6
Как используют здесь, "алкил" относится к С-Салкилу, например C-Салкилу, такому как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, н-амил и т.д.
"Гетероциклическое кольцо" относится к 4-6-членному гетероциклическому кольцу, содержащему возможно гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S. Гетероциклическое кольцо может быть насыщенным или ненасыщенным гетероциклическим кольцом. Примеры гетероциклических колец включают, без ограничения, например, морфолинил, пирролидинил, пиперазинил, пиперидинил, азетидинил, пиразолил и т.д.
"Галоген" включает F, Cl, Br и I. "Карбоксил" относится к -СООН.
2
6
2
6
2
6
В "3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридиниле", указанный алкинил в С-Салкиниле обычно находится по 1-положению. В некоторых воплощениях "3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинил" представляет собой "3-(1-бутин-4-ил)-3Н-диазиридин-3-ил".
7
8
9
10
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
Как используют здесь, NRR и NRR могут представлять собой моно-С-Салкиламино или ди-С-Салкиламино, где указанный C-Салкил может быть возможно замещен, например, одним или более атомами галогена, моно-C-Салкиламино или ди-C-Салкиламино или 4-6-членным насыщенным гетероциклическим кольцом, содержащим N и возможно дополнительный N или О. Эти гетероциклические кольца включают, без ограничения, пиперидинил, пиперазинил, пирролидинил, морфолинил и т.д. Гетероциклическое кольцо также может быть возможно замещено, например, С-Салкилом.
1
6
1
6
1
6
2
6
6
14
В данном описании, когда группа является замещенной, число заместителей может составлять, например, 1, 2, 3 или 4. Как правило, если не указано иное, заместители могут быть выбраны из галогена, С-Салкила, гидроксила, карбоксила, амино, моно-С-Салкиламино, ди-С-Салкиламино, нитро, 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинила, гетероциклической группы (например морфолинила, пирролидинила, пиперазинила, пиперидинила, азетидинила, пиразолила и т.д.), С-Сарила (например фенила) и тому подобного.
В дополнение, родственные термины, такие как "изомер", "рацемат", "пролекарство", "сольват", используемые здесь, очевидно не имеют других значений, отличных от общепринятых значений указанных терминов в данной области техники. Специалистам в данной области техники должно быть известно значение этих терминов. Например, термин "изомер" относится к одному из двух или более соединений, имеющих одинаковый молекулярный состав, но разные структуры и свойства. Термин "рацемат" относится к эквимолярной смеси оптически активной хиральной молекулы и ее энантиомера. Термин "пролекарство", также называемое пролекарственное соединение, лекарство-предшественник, предшественник лекарственного соединения и тому подобное, относится к соединению, проявляющему фармакологическое действие только после превращения in vivo. Термин "сольват" относится к смеси, состоящей из растворителя и соединения.
Принимая во внимание пластичность и гетерогенность опухолей, путем нацеливания на множество путей передачи сигнала, определенно связанных с пролиферацией и гибелью опухолевых клеток, и интегрирования фармакофоров, действующих на целевые молекулы этих сигнальных путей, в данном изобретении предложен новый тип соединений, а именно соединений s-триазина, образованных путем замещения диарилмочевиной, арилвинилом и насыщенным азот-(кислород-)содержащим гетероциклическим кольцом, где указанный тип соединений имеет структуру формулы (I), как показано ниже:
1
2
3
где R, R, R и X являются такими, как описано выше.
1
В некоторых воплощениях R представляет собой водород, галоген или нитро; более предпочтительно Н, F, Cl или нитро.
1
В различных формах описанной здесь структуры, когда R представляет собой группу, отличную от водорода, она обычно находится в мета- или пара-положении фенильного кольца.
4
5
2
1
6
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
4
5
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
2
4
5
4
5
6
1
6
6
1
6
В некоторых воплощениях R и R в R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С-Салкила и C-Сгалогеналкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное или ненасыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или С-Салкилом; где R представляет собой водород, гидроксил или C-Салкил. В некоторых воплощениях R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или С-Салкилом; где R представляет собой водород или С-Салкил. В некоторых воплощениях R представляет собой -NRR, где R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR и О, где указанное гетероциклическое кольцо возможно замещено заместителем, выбранным из гидроксила и С-Салкила; где R представляет собой водород или С-Салкил. В некоторых воплощениях насыщенные 4-6-членные гетероциклические кольца включают, без ограничения, морфолинил, пирролидинил, пиперазинил, пиперидинил, азетидинил.
3
1
6
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
8
10
1
6
9
10
3
1
6
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
7
8
9
10
В некоторых воплощениях R представляет собой водород, галоген, нитро, амино, гидроксил, С-Салкил, гидроксиметил, аминометил или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С-Салкила, возможно замещенного одним или более заместителями, выбранными из галогена или NRR, и С-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S, и возможно замещенное С-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и С-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S. В некоторых воплощениях R представляет собой галоген, С-Салкоксил или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из С-Салкила, возможно замещенного группой NRR, и С-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О, и возможно замещенное С-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и С-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О. В некоторых воплощениях гетероциклическое кольцо, образуемое R, R и атомом азота, связанным с ними, и гетероциклическое кольцо, образуемое R, R и атомом азота, связанным с ними, включают, без ограничения, пиперидинил, пиперазинил, пирролидинил и морфолинил.
3
В различных формах описанной здесь структуры, когда R представляет собой группу, отличную от Н, она обычно находится в мета- или пара-положении фенильной группы.
В некоторых воплощениях X представляет собой NH, присоединенный к фенильной группе по пара- или мета-положению. В некоторых воплощениях X представляет собой О, присоединенный к фенильной группе по пара-положению.
1
2
4
5
4
5
1
6
1
6
4
5
6
1
6
6
1
6
3
1
6
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
1
2
4
5
4
5
6
1
6
6
1
6
3
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
Как описано выше, различные заместители или технические признаки в различных воплощениях данного описания могут быть объединены исключительно в пределах объема структуры формулы (I). Так, например, в некоторых воплощениях в формуле (I), R представляет собой водород, галоген или нитро; R представляет собой -NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила и С-Сгалогеналкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное или ненасыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR, О и S, где указанное гетероциклическое кольцо может быть замещено гидроксилом, галогеном, нитро, амино или C-Салкилом; где R представляет собой водород, гидроксил или С-Салкил; и R представляет собой водород, галоген, нитро, амино, гидроксил, C-Салкил, гидроксиметил, аминометил или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C-Салкила, возможно замещенного одним или более заместителями, выбранными из галогена или NRR, и С-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S, и возможно замещенное C-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и С-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, О и S. В других воплощениях в формуле (I), R представляет собой водород, галоген или нитро; R представляет собой -NRR, где R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из группы, состоящей из NR и О, где указанное гетероциклическое кольцо возможно замещено заместителем, выбранным из гидроксила и C-Салкила; где R представляет собой водород или C-Салкил; R представляет собой галоген или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из C-Салкила, возможно замещенного группой NRR, и C-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О, и возможно замещенное C-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О; и X представляет собой NH, присоединенный к фенильной группе по пара- или мета-положению.
В некоторых воплощениях описанное здесь соединение формулы (I) имеет структуру, показанную формулой (I-1) или формулой (I-2) ниже:
где:
1
R выбран из группы, состоящей из водорода, галогена или нитро;
2
1
6
R выбран из группы, состоящей из морфолинила, пирролидинила, пиперазинила и азетидинила, возможно замещенных гидроксилом или C-Салкилом; и
3
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
R представляет собой галоген или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из C-Салкила, возможно замещенного группой NRR, и C-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О, и возможно замещенное C-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О.
3
В некоторых воплощениях вышеуказанной формулы (I-2) R представляет собой галоген.
В некоторых воплощениях описанное здесь соединение формулы (I) имеет структуру, показанную формулой (I-3) ниже:
где:
1
R представляет собой Н;
2
R представляет собой морфолинил;
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из C-Салкила, возможно замещенного группой NRR, и C-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О, и возможно замещенное C-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и С-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О.
1
2
3
a
a
7
8
7
8
1
6
9
10
1
6
2
6
7
8
1
6
9
10
1
6
9
10
1
3
1
3
В некоторых воплощениях формулы (I-1) R выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и нитро; R представляет собой морфолинил; R представляет собой галоген или -COR; где R представляет собой ОН или NRR, где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из С-Салкила, возможно замещенного группой NRR, и С-Салкила, замещенного 3-(С-Салкинил)-3Н-диазиридинилом; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О, и возможно замещенное С-Салкилом; где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и С-Салкила; или R, R и атом азота, с которым они связаны, образуют насыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее возможно дополнительный гетероатом, выбранный из N или О. В некоторых воплощениях в этих соединениях R (в случае заместителя, отличного от водорода) и R независимо находятся в мета- или пара-положении фенильной группы, соответственно. В некоторых воплощениях в этих соединениях, когда R представляет собой заместитель, отличный от водорода, он находится в мета-положении фенильного кольца, и R находится в пара-положении фенильной группы. В некоторых воплощениях в этих соединениях насыщенное гетероциклическое кольцо включает, без ограничения, пиперазинил, пиперидинил, пирролидинил, морфолинил. В некоторых воплощениях эти соединения могут, в частности, быть использованы для стимуляции агрегации везикул в опухолевых клетках, тем самым приводя к клеточной гибели посредством метуоза.
Соединения 2,4,6-тризамещенного s-триазина по данному изобретению могут быть синтезированы с использованием следующих способов:
2
3
Схема синтеза 1: Метафенилендиамин или парафенилендиамин (1) используют в качестве исходного вещества, в котором одну аминогруппу защищают группой (Вос)О с получением промежуточного соединения 2, которое подвергают взаимодействию с одним из различных видов замещенных фенилизоцианатов с получением промежуточного соединения 3, из которого защитную группу Вос (трет-бутоксикарбонил) удаляют с помощью трифторуксусной кислоты с получением промежуточного соединения 4; хлорангидрид циануровой кислоты (5) подвергают взаимодействию с бромидом метилмагния (CHMgBr) с получением промежуточного соединения 6, которое подвергают взаимодействию с одним из различных видов замещенных бензальдегидов при кипячении с обратным холодильником с концентрированной соляной кислотой с получением промежуточного соединения 7, которое подвергают хлорированию оксихлоридом фосфора с получением промежуточного соединения 8; и затем промежуточное соединение 8 и промежуточное соединение 4 подвергают взаимодействию, катализируемому ди-изопропилэтиламином, с получением промежуточного соединения 9, которое подвергают взаимодействию с гетероциклическим амином, таким как морфолин или метилпиперазин, в присутствии ди-изопропилэтиламина с получением целевого соединения.
Формулы реакционного взаимодействия в схеме синтеза 1 показаны ниже:
1
2
3
где R, R, R являются такими, как описано выше.
2
Реагенты в реакционных формулах на вышеприведенной схеме: (а) основание, предпочтительно карбонат калия, (Вос)О, вода, тетрагидрофуран, диметилформамид (DMF); (b) замещенный фенилизоцианат, метилендихлорид; (с) трифторуксусная кислота, метилендихлорид; (d) раствор бромида метилмагния в тетрагидрофуране; (е) замещенный бензальдегид, концентрированная соляная кислота; (f) оксихлорид фосфора; (g) ди-изопропилэтиламин, тетрагидрофуран; (h) гетероциклический амин, ди-изопропилэтиламин, тетрагидрофуран.
Структурные формулы целевых соединений Схемы синтеза 1 могут включать:
2
Схема синтеза 2: метафенилендиамин или парафенилендиамин (1) используют в качестве исходного вещества, в котором одну аминогруппу защищают группой (Вос)О с получением промежуточного соединения 2, которое подвергают взаимодействию с метил-пара-аминобензоатом в присутствии трифосгена с получением промежуточного соединения 10, из которого защитную группу Вое удаляют с помощью трифторуксусной кислоты с получением промежуточного соединения 11; хлорангидрид циануровой кислоты (5) подвергают взаимодействию с бромидом метилмагния с получением промежуточного соединения 6, которое подвергают взаимодействию с одним из различных видов замещенных бензальдегидов при кипячении с обратным холодильником с концентрированной соляной кислотой с получением промежуточного соединения 7, которое подвергают хлорированию оксихлоридом фосфора с получением промежуточного соединения 8; и промежуточное соединение 8 и промежуточное соединение 11 подвергают взаимодействию, катализируемому ди-изопропилэтиламином, с получением промежуточного соединения 12, которое дополнительно подвергают взаимодействию с гетероциклическим амином, таким как морфолин или метилпиперазин, в присутствии ди-изопропилэтиламина с получением соединения 13; соединение 13 подвергают гидролизу в присутствии моногидрата гидроксида лития, подкисляют соляной кислотой с получением промежуточного соединения 14, которое наконец подвергают реакции конденсации с одним из различных аминов в присутствии катализаторов HOBt (1-гидроксибензотриазол), EDCl [гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида], с получением целевого соединения.
Формулы реакций на Схеме синтеза 2 являются следующими:
1
2
3
где R, R, R являются такими, как описано выше.
2
Реагенты в формулах реакций на вышеописанной схеме синтеза: (а) основание, предпочтительно карбонат калия, (Вос)O, вода, тетрагидрофуран, DMF; (b) трифосген, триэтиламин, метил-пара-аминобензоат, метилендихлорид; (с) трифторуксусная кислота, метилендихлорид; (d) раствор бромида метилмагния в тетрагидрофуране; (е) замещенный бензальдегид, концентрированная соляная кислота, кипячение с обратным холодильником в течение 12 часов; (f) оксихлорид фосфора, кипячение с обратным холодильником в течение 16 часов; (g) ди-изопропилэтиламин, тетрагидрофуран; (h) гетероциклический амин, ди-изопропилэтиламин, тетрагидрофуран; (i) моногидрат гидроксида лития, тетрагидрофуран, вода, концентрированная соляная кислота; (j) HOBt, EDCI, триэтиламин, замещенный амин, DMF.
Структурная формула целевого соединения Схемы синтеза 2 показана в виде следующего примера:
Схема синтеза 3: хлорангидрид циануровой кислоты (5) подвергают взаимодействию с бромидом метилмагния с получением промежуточного соединения 6, которое подвергают взаимодействию с одним из различных видов замещенных бензальдегидов при кипячении с обратным холодильником с концентрированной соляной кислотой с получением промежуточного соединения 7, которое подвергают хлорированию оксихлоридом фосфора с получением промежуточного соединения 8; промежуточное соединение 8 подвергают взаимодействию с пара-нитрофенолом натрия с получением промежуточного соединения 15; промежуточное соединение 15 подвергают взаимодействию с гетероциклическим амином, таким как морфолин или метилпиперазин, в присутствии катализатора ди-изопропилэтиламина с получением соединения 16. Соединение 16 подвергают восстановлению в системе порошка железа и хлорида аммония с получением промежуточного соединения 17, которое подвергают взаимодействию с одним из различных видов замещенных фенилизоцианатов с получением целевого соединения.
Формулы реакций на Схеме синтеза 3 представлены ниже:
1
2
3
1
2
3
где R, R, R являются такими, как описано выше. В некоторых воплощениях, R представляет собой водород; электроноакцепторные группы, такие как галоген, нитро, и т.д.; электронодонорные группы, такие как ал кил, амино, гидроксил, гидроксиметил, аминометил, аминоформил, и т.д.; R представляет собой амино, алкиламино, ариламино, гетероариламино; R представляет собой водород; электроноакцепторные группы, такие как галоген, нитро, и т.д.; электронодонорные группы, такие как алкил, амино, гидроксил, гидроксиметил, аминометил.
Реагенты в формулах реакций на вышеописанной схеме синтеза: (а) раствор бромида метилмагния в тетрагидрофуране; (b) замещенный бензальдегид, концентрированная соляная кислота, кипячение с обратным холодильником в течение 12 часов; (с) оксихлорид фосфора, кипячение с обратным холодильником в течение 16 часов; (d) вода, тетрагидрофуран, иара-нитрофенол натрия; (е) гетероциклический амин, ди-изопропилэтиламин, тетрагидрофуран; (f) порошок железа, хлорид аммония, этанол, вода, кипячение с обратным холодильником в течение 3 часов; (g) замещенный фенилизоцианат, метилендихлорид.
Структурная формула целевого соединения Схемы синтеза 3 показана в виде следующего примера:
Конкретные стадии способа для этих соединений более подробно описаны в Примерах.
Описанные выше стадии могут быть модифицированы специалистами в данной области техники для увеличения выхода. Они могут определить схему синтеза на основании знаний в данной области техники, например, выбор реагентов, растворителей и температур с использованием различных традиционно используемых защитных групп, чтобы избежать побочных реакций для увеличения выхода.
Настоящее изобретение дополнительно включает фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты соединения, представленного формулой (I). Примеры фармацевтически приемлемых солей включают неорганические и органические соли, такие как гидрохлоридные соли, гидробромидные соли, фосфатные соли, сульфатные соли, цитратные соли, лактатные соли, тартратные соли, малеатные соли, фумаратные соли, манделатные соли и оксалатные соли; и неорганические и органические соли, образованные основаниями, такими как гидроксид натрия, три(гидроксиметил)-аминометан (TRIS, трометамол) и N-метилглюкозамин. Примеры пролекарств включают простые эфиры карбоксил-содержащих соединений; сложные эфиры гидроксил-содержащих соединений; имины амино-содержащих соединений; уретаны амино-содержащих соединений; ацетали или кетали спиртосодержащих соединений.
Настоящее изобретение дополнительно включает фармацевтические композиции фармацевтически приемлемых солей, пролекарств или сольватов соединения, представленного формулой (I). Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать различные фармацевтически приемлемые носители, традиционно используемые для изготовления фармацевтических композиций. Как используют здесь, "фармацевтически приемлемый носитель" относится к неактивному компоненту, такому как твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, материал для покрытия, вспомогательный агент для изготовления композиции или эксципиент, используемые вместе с соединением по изобретению для образования "фармацевтической композиции", предназначенной для введения субъекту. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для субъекта в используемых вводимых дозировках и концентрациях и совместимым с другими компонентами в композиции. Фармацевтически приемлемый носитель является подходящим для соответствущей используемой композиции. Например, если терапевтический агент предназначен для введения перорально, носитель может представлять собой желатиновую капсулу. Если терапевтический агент предназначен для введения подкожно, носитель желательно не является раздражающим для кожи и не вызывает реакцию в месте введения. Фармацевтическая композиция может быть представлена в любой подходящей форме композиции, такой как таблетка, лепешка и капсула.
В общем, фармацевтическая композиция содержит терапевтически или профилактически эффективное количество фармацевтически приемлемых соли, пролекарства или сольвата соединения формулы (I) по данному изобретению. Как используют здесь, "эффективное количество" означает количество соединения или его фармацевтически приемлемых соли, пролекарства или сольвата, которое обеспечивает эффективное лечение или предупреждение в способе лечения или предупреждения заболевания. "Эффективное количество" может варьировать в зависимости от вводимого активного ингредиента, способа введения, заболевания и его тяжести, состояния здоровья, возраста, массы тела, семейного анамнеза, генетической конституции, стадии патологического развития, типа лечения, проводимого перед введением и одновременно с ним и других индивидуальных характеристик субъекта, которого лечат.
Раскрытые здесь соединения проявляют сильный ингибирующий эффект в отношении множества опухолевых клеток различных типов. Таким образом, соединения формулы (I) и соединения формул (I-1), (I-2) и (I-3) могут быть использованы для предупреждения и лечения разнообразных солидных опухолей и гематологических опухолей, включая, без ограничения, рак легкого (например немелкоклеточный рак легкого), рак толстой кишки, рак яичника, рак печени, фибросаркому, эритролейкоз, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, меланому, глиому головного мозга и тому подобное.
Некоторые соединения по изобретению могут вызывать неапоптозную гибель опухолевых клеток - метуоз. Эту форму гибели приписывают специфическому связыванию данного типа соединений с клеточным промежуточным филаментом, а именно виментином. Таким образом, изобретение также относится к применению соединений, раскрытых в данном описании, для вмешательства в патофизиологические процессы, связанные с виментином, и лечения заболеваний, ассоциированных с этим, включая, без ограничения, эпителиально-мезенхимальный переход; дифференцировку стволовых клеток; инфильтративный рост, метастазы, лекарственную устойчивость и рецидив опухолей; фиброз тканей; инфекционные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания (например атеросклероз), и т.д. В некоторых воплощениях в изобретении предложено применение соединений, раскрытых здесь, в изготовлении лекарственных средств для преупреждения или лечения заболеваний у млекопитающего, ассоциированных с дисрегуляцией виментина; образованием, транспортом и секрецией везикул; и/или клеточной вакуолизацией. Кроме того, заболевания у млекопитающего, ассоциированные с дисрегуляцией виментина; образованием, транспортом и секрецией везикул; и/или клеточной вакуолизацией, включают злокачественные новообразования, нейродегенеративные заболевания, фиброз тканей и атеросклероз. В дополнение, заболевания у млекопитающего, ассоциированные с дисрегуляцией виментина; образованием, транспортом и секрецией везикул; и/или клеточной вакуолизацией, включают различные солидные опухоли, такие как рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак желудка, рак молочной железы, рак щитовидной железы, рак печени, рак почки, рак легкого, рак предстательной железы, саркома и глиома и т.д., а также лейкоз, множественная миелома и тому подобное. В некоторых воплощениях описанные здесь инфекционные заболевания включают, без ограничения, заболевания, вызываемые вирусной инфекцией, такие как заболевания, вызываемые инфицированием вирусом гепатита С, вирусом атипичной пневмонии (SARS), вирусом иммунодефицита человека (HIV) и вирусом лихорадки Денге и т.д.
Таким образом, в некоторых воплощениях в изобретении предложено применение соединений, представленных формулой (I), их фармацевтически приемлемых солей, пролекарств или сольватов в изготовлении лекарственных средств для лечения или предупреждения опухолей. В некоторых воплощениях в изобретении предложены соединения, представленные формулой (I), их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты для лечения или предупреждения опухолей. Опухоли являются такими, как описано выше.
В некоторых воплощениях данного изобретения предложено применение соединений, представленных формулой (I), их фармацевтически приемлемых солей, пролекарств или сольватов в изготовлении лекарственных средств для вмешательства в транспорт клеточных везикул и их высвобождение из клеток наружу, или в изготовлении лекарственных средств для стимуляции клеточной гибели посредством метуоза, или в изготовлении лекарственных средств для лечения или предупреждения заболеваний, опосредованных виментином. Альтернативно, в некоторых воплощениях в изобретении предложены соединения, представленные здесь формулой (I), их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты для вмешательства в транспорт клеточных везикул и их высвобождение из клеток наружу, стимуляции клеточной гибели посредством метуоза, лечения или предупреждения заболеваний, опосредованных виментином. В частности, заболевания, опосредованные виментином, включают ассоциированные с эпителиально-мезенхимальным переходом; дифференцировкой стволовых клеток; метастазами, лекарственной устойчивостью и рецидивом опухолей; фиброзом тканей; и сердечно-сосудистые заболевания (например атеросклероз). Еще предпочтительно, опухоли включают различные солидные опухоли, такие как рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак желудка, рак молочной железы, рак щитовидной железы, рак печени, рак почки, рак легкого, рак предстательной железы, саркома, глиома; и гематологические опухоли, такие как лейкоз, множественная миелома и тому подобное.
В некоторых воплощениях в изобретении также предложен способ лечения или предупреждения опухолей, включая солидные опухоли и гематологические опухоли, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения, представленного здесь формулой (I), или его фармацевтической композиции. В изобретении также предложен способ вмешательства в транспорт клеточных везикул и их высвобождение из клеток наружу, стимуляции клеточной гибели посредством метуоза, лечения или предупреждения заболеваний, опосредованных виментином, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения, представленного здесь формулой (I), или его фармацевтической композиции. Лекарственные средства могут быть введены посредством подходящего пути для достижения предполагаемой цели. Например, лекарственные средства могут быть введены парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, трансдермально, трансбуккально, интратекально, энцефалически, назально или наружно. Дозировка лекарственного средства может быть определена с учетом возраста, состояния здоровья, массы тела, параллельного лечения, частоты лечения пациента и желаемой эффективности лечения.
Для того чтобы лучше продемонстрировать техническую сущность настоящего изобретения, оно проиллюстрировано ниже со ссылкой на следующие конкретные примеры, которыми изобретение не ограничивается. Следует понимать, что соединения формулы (I), когда они упоминаются, включают соединения, представленные здесь формулами (I-1), (I-2) и (I-3). Если не указано иное, способы и реагенты, используемые в примерах, представляют собой традиционные для данной области техники способы и реагенты.
4
В следующих примерах, где соединения были синтезированы, традиционный способ обработки представляет собой добавление подходящего количества воды к реакционной жидкости после завершения реакции с последующим разделением органической фазы и водной фазы и объединением органических фаз от нескольких операций разделения. При необходимости сушку проводят с использованием 5% раствора HCl и/или насыщенного NaSO последовательно, а затем фильтрации и вакуумной сушки с получением неочищенного продукта, который отделяют и очищают посредством колоночной хроматографии с получением конечного продукта.
Пример 1: Синтез L16
1) Получение 4-((трет-бутилоксикарбонил)амино)анилина (2)
2
пара-Фенилендиамин (3,24 г, 30,0 ммоль) и карбонат калия (1,52 г, 11,0 ммоль) растворяли в 10 мл DMF и 5 мл воды. При комнатной температуре медленно по каплям добавляли раствор (Вос)О (2,18 г, 10,0 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл). По окончании добавления по каплям этот раствор перемешивали при комнатной температуре для взаимодействия в течение 4 часов. Реакционную жидкость вливали в 100 мл ледяной воды, экстрагировали метилендихлоридом (200 мл) и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали, с последующей колоночной хроматографией на силикагеле с получением 1,79 г белого твердого вещества с выходом 86%.
2) Получение 1-(4-хлорфенил)-3-(4-((трет-бутилоксикарбонил)амино)фенил)-мочевины (3)
Раствор пара-хлорфенилизоцианата (461 мг, 3,0 ммоль) в метилендихлориде (5 мл) при комнатной температуре медленно по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения 2 (625 мг, 3,0 ммоль) в метилендихлориде (10 мл) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 часов после завершения добавления по каплям. Реакционную жидкость сразу подвергали фильтрованию с отсасыванием и осадок на фильтре сушили с получением 977 мг белого твердого вещества с выходом 90%.
3) Получение 1-(4-хлорфенил)-3-(4-аминофенил)мочевины (4)
1
2
Раствор трифторуксусной кислоты (47 мг, 4,16 ммоль) в метилендихлориде (5 мл) при комнатной температуре медленно по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения 3 (188 мг, 0,52 ммоль) в метилендихлориде (10 мл) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 часов после завершения добавления по каплям. Реакционную жидкость сушили непосредственно путем роторного выпаривания и рН доводили насыщенным карбонатом натрия до слабощелочного значения. Полученный раствор экстрагировали этилацетатом с последующей промывкой последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали с получением 129 мг белого твердого вещества с выходом 95%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 8.63 (s, 1Н, NH); 8.16 (s, 1Н, NH); 7.45 (d, 2Н, J=8,8 Гц); 7.29 (d, 2Н, J=8,8 Гц); 7.06 (d, 2Н, J=8,6 Гц); 6.50 (d, 2Н, J=8,6 Гц); 4.80 (s, 2Н, -NH).
4) 2-Метил-4,6-дихлор-1,3,5-триазин (6)
1
3
3
Под защитой газообразного азота при -20°С раствор бромида метилмагния в диэтиловом эфире (3 мл, 9 ммоль) медленно по каплям добавляли к раствору хлорангидрида циануровой кислоты (1,38 г, 7,5 ммоль) в 8 мл тетрагидрофурана; по окончании добавления по каплям эту смесь перемешивали при температуре окружающей среды для взаимодействия в течение 2 часов; и затем реакцию останавливали и гасили добавлением 20 мл насыщенного хлорида аммония. Реакционную жидкость экстрагировали дважды 20 мл этилацетата и 20 мл насыщенного хлорида натрия; и органическую фазу сушили безводным сульфатом натрия. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 615 мг белого твердого вещества с выходом 50%. Н ЯМР (CDCl) δ: 2.71 (s, 3Н, СН).
5) 2,4-Дигидрокси-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазин (7)
Промежуточное соединение 6 (1,60 г, 9,76 ммоль) и 3-нитробензальдегид (1,47 г, 9,76 ммоль) растворяли в 30 мл концентрированной соляной кислоты, нагревали до 100°С и оставляли взаимодействовать в течение 12 часов при перемешивании. Реакцию останавливали. Реакционную жидкость охлаждали до комнатной температуры, вливали в 60 мл ледяной воды, подвергали фильтрованию с отсасыванием и промывали последовательно 10 мл этилацетата и 10 мл смеси вода-петролейный эфир. Осадок на фильтре сушили с получением 2,01 г белого неочищенного продукта с выходом 79,2%.
6) 2,4-Дихлор-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазин (8)
Жидкую смесь промежуточного соединения 7 (960 мг, 3,69 ммоль) и оксихлорида фосфора (10 мл) нагревали до 140°С и оставляли взаимодействовать в течение 19 часов при перемешивании. Реакцию останавливали. Реакционную жидкость охлаждали до комнатной температуры и сушили путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 60 мл ледяной воды, экстрагировали 60 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 660 мг белого твердого вещества с выходом 60,2%.
7) 1-(4-Хлорфенил)-3-(4-хлор-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)-фенил)мочевина (9)
Под защитой газообразного азота промежуточное соединение 4 (342 мг, 1,15 ммоль), промежуточное соединение 8 (300 мг, 1,15 ммоль) и ди-изопропилэтиламин (149 мг, 1,15 ммоль) растворяли в 50 мл тетрагидрофурана и оставляли взаимодействовать в течение 5 часов при комнатной температуре при перемешивании. После завершения реакции половину растворителя удаляли путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 60 мл воды, экстрагировали 120 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия; растворитель полностью выпаривали; добавляли 2 мл безводного этанола с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 секунд и фильтрованием с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили с получением 522 мг неочищенного продукта с выходом 86,9%.
8) 1-(4-Хлорфенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L16)
1
+
28
26
8
4
Под защитой газообразного азота промежуточное соединение 9 (270 мг, 0,52 ммоль), морфолин (181 мг, 2,08 ммоль) и ди-изопропилэтиламин (202 мг, 1,56 ммоль) растворяли в 60 мл тетрагидрофурана и оставляли взаимодействовать в течение 4 часов при комнатной температуре при перемешивании. После завершения реакции половину растворителя удаляли путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 100 мл воды, экстрагировали 100 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия; растворитель полностью выпаривали; добавляли 1 мл безводного этанола с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 секунд и фильтрованием с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили с получением 206 мг бледно-желтого твердого вещества с выходом 69,0%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 9.46 (s, 1Н), 9.19 (s, 1Н), 8.96 (s, 1Н), 8.40 (s, 1Н), 8.10 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.62 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 7.53-7.58 (m, 1Н), 7.39 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 7.31 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 7.21 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 6.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.73 (m, 4Н), 3.59 (m, 4Н) м.д. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н], 573,1760, обнаружено 573,1750.
Пример 2: Синтез L31
1) Получение 4-((трет-бутилоксикарбонил)амино)анилина (2)
2
пара-Фенилендиамин (3,24 г, 30,0 ммоль) и карбонат калия (1,52 г, 11,0 ммоль) растворяли в 10 мл DMF и 5 мл воды. При комнатной температуре медленно по каплям добавляли раствор (Вос)О (2,18 г, 10,0 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл). По окончании добавления по каплям этот раствор перемешивали при комнатной температуре для взаимодействия в течение 4 часов. Реакционную жидкость вливали в 100 мл ледяной воды, экстрагировали метилендихлоридом (200 мл) и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 1,79 г белого твердого вещества с выходом 86%.
2) Получение метил-4-(3-(4-((трет-бутилоксикарбонил)амино)фенил)мочевина)-бензоата (10)
1
Раствор метил-пара-аминобензоата (500 мг, 3,3 ммоль) в метилендихлориде (5 мл) на ледяной бане медленно по каплям добавляли к раствору трифосгена (980,1 мг, 3,3 ммоль) в метилендихлориде (10 мл). По окончании этого добавления по каплям добавляли по каплям раствор триэтиламина (667 мг, 6,6 ммоль) в метилендихлориде (5 мл). По окончании добавления по каплям растворитель в реакционной жидкости удаляли путем роторного выпаривания. Снова добавляли метилендихлорид (20 мл) и промежуточное соединение 2 (618 мг, 2,97 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 часов. К реакционной жидкости добавляли насыщенный карбонат натрия для доведения рН до слабощелочного значения. Реакционную жидкость экстрагировали этилацетатом и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель полностью выпаривали. Полученный раствор промывали смесью этилацетат/петролейный эфир с соотношением объемов 1/4 и подвергали фильтрованию с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили с получением 600 мг белого твердого вещества с выходом 52,4%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 9.20 (s, 1Н), 9.01 (s, 1Н), 8.64 (s, 1Н), 7.88 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 7.58 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 7.41-7.30 (m, 4Н), 3.82 (s, 3Н), 1.47 (s, 9Н) м.д.
3) Получение метил-4-(3-(4-аминофенил)мочевина)бензоата (11)
1
Раствор трифторуксусной кислоты (474 мг, 4,16 ммоль) в метилендихлориде (5 мл) при комнатной температуре добавляли медленно по каплям к раствору промежуточного соединения 10 (200 мг, 0,52 ммоль) в метилендихлориде (10 мл) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 часов после завершения добавления по каплям. Реакционную жидкость сушили непосредственно путем роторного выпаривания и рН доводили насыщенным карбонатом натрия до слабощелочного значения. Полученный раствор экстрагировали этилацетатом с последующей промывкой последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали с получением 141 мг белого твердого вещества с выходом 95%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 8.63 (s, 1H); 8.16 (s, 1Н); 7.45 (d, J=8,8 Гц, 2H); 7.29 (d, J=8,8 Гц, 2H); 7.06 (d, 8,6 Гц, 2H); 6.50 (d, J=8,6 Гц, 2H);4.80 (s, 2Н), 3.82 (s, 3Н).
4) 2-Метил-4,6-дихлор-1,3,5-триазин (6)
1
3
3
Под защитой газообразного азота при -20°С раствор бромида метилмагния в диэтиловом эфире (3 мл, 9 ммоль) добавляли медленно по каплям к раствору хлорангидрида циануровой кислоты (1,38 г, 7,5 ммоль) в 8 мл тетрагидрофурана; по окончании добавления по каплям эту смесь помещали в условия температуры окружающей среды для взаимодействия в течение 2 часов при перемешивании; и затем реакцию останавливали и гасили добавлением 20 мл насыщенного хлорида аммония. Реакционную жидкость экстрагировали дважды 20 мл этилацетата и 20 мл насыщенного хлорида натрия и органическую фазу сушили безводным сульфатом натрия. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 615 мг белого твердого вещества с выходом 50%. Н ЯМР (CDCl) δ: 2.71 (s, 3Н, СН).
5) 2,4-Дигидрокси-6-стиролил-1,3,5-триазин (7)
Промежуточное соединение 6 (1,60 г, 9,76 ммоль) и бензальдегид (1,04 г, 9,76 ммоль) растворяли в 30 мл концентрированной соляной кислоты, нагревали до 100°С и оставляли взаимодействовать в течение 12 часов при перемешивании. Реакцию останавливали. Реакционную жидкость охлаждали до комнатной температуры, вливали в 60 мл ледяной воды, подвергали фильтрованию с отсасыванием и промывали последовательно 10 мл этилацетата и 10 мл смеси вода-петролейный эфир. Осадок на фильтре сушили с получением 1,66 г белого неочищенного продукта с выходом 79,2%.
6) 2,4-Дихлор-6-стиролил-1,3,5-триазин (8)
Жидкую смесь промежуточного соединения 7 (794 мг, 3,69 ммоль) и оксихлорида фосфора (10 мл) нагревали до 140°С и оставляли взаимодействовать в течение 19 часов при перемешивании. Реакцию останавливали. Реакционную жидкость охлаждали до комнатной температуры и сушили путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 60 мл ледяной воды, экстрагировали 60 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 560 мг белого твердого вещества с выходом 60,2%.
7) 1-(4-(Метоксикарбонил)фенил)-3-(4-хлор-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)-фенил)мочевина (12)
Под защитой газообразного азота промежуточное соединение 11 (441 мг, 1,75 ммоль), промежуточное соединение 8 (500 мг, 1,75 ммоль) и ди-изопропилэтиламин (226 мг, 1,75 ммоль) растворяли в 50 мл тетрагидрофурана и оставляли взаимодействовать в течение 5 часов при комнатной температуре при перемешивании. После завершения реакции половину растворителя удаляли путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 60 мл воды, экстрагировали 120 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия; растворитель полностью выпаривали; добавляли 2 мл безводного этанола с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 секунд и фильтрованием с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили с получением 762 мг неочищенного продукта с выходом 86,9%.
8) 1-(4-(Метоксикарбонил)фенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил))-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (13)
1
Под защитой газообразного азота промежуточное соединение 12 (840 мг, 1,68 ммоль), морфолин (584 мг, 6,72 ммоль) и ди-изопропилэтиламин (651 мг, 5,04 ммоль) растворяли в 60 мл тетрагидрофурана и оставляли взаимодействовать в течение 4 часов при комнатной температуре при перемешивании. После завершения реакции половину растворителя удаляли путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 100 мл воды, экстрагировали 100 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия; растворитель полностью выпаривали; добавляли 1 мл безводного этанола с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 секунд и фильтрованием с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили с получением 639 мг бледно-желтого твердого вещества с выходом 69,0%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 9.61 (s, 1Н), 9.37 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.89 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.75-7.64 (m, 4H), 7.60 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.42 (t, J=7,6 Гц, 5H), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.82 (s, 7H), 3.69 (s, 4H) м.д.
9) Получение 4-(3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)-фенил)мочевина)бензойной кислоты (14)
1
При комнатной температуре промежуточное соединение 13 (300 мг, 0,54 ммоль) и моногидрат гидроксида лития (68,5 мг, 1,63 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (10 мл), метаноле (5 мл) и воде (1 мл), нагревали до флегмообразования и перемешивали для взаимодействия в течение 12 часов. После завершения реакции реакционную жидкость подвергали фильтрованию с отсасыванием. значение рН осадка на фильтре доводили до 4 с использованием 2 М соляной кислоты с последующим фильтрованием с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили и добавляли 1 мл безводного этанола. После обработки ультразвуком в течение 30 секунд осадок на фильтре подвергали фильтрованию с отсасыванием и сушили с получением 171 мг бледно-желтого твердого вещества с выходом 59,0%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 12.33 (s, 1Н), 9.59 (s, 1H), 9.41 (s, 1H), 9.09 (s, 1Н), 7.94 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.88 (d, J=8,3 Гц, 2H), 7.77-7.63 (m, 4H), 7.59 (d, J=8,3 Гц, 2H), 7.51-7.36 (m, 5H), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.83 (s, 4H), 3.69 (s, 4H) м.д.
10) 1-(4-((4-Метилпиперазин-1-ил)формил)фенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина (L31)
1
13
+
34
38
9
3
Промежуточное соединение 14 (100 мг, 0,186 ммоль), HOBt (32,7 мг, 0,242 ммоль), DMF (2 мл), EDCI (53,5 мг, 0,279 ммоль), 4-метилпиперазин (24,2 мг, 0,242 ммоль) и триэтиламин (37,6 мг, 0,372 ммоль) при комнатной температуре добавляли последовательно в реакционную колбу емкостью 25 мл и перемешивали для взаимодействия в течение 8 часов. После завершения реакции реакционную жидкость вливали в 10 мл ледяной воды, экстрагировали метилендихлоридом (20 мл) и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали с последующей колоночной хроматографией на силикагеле с получением 87,6 мг бледно-желтого твердого вещества с выходом 76%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 9.60 (s, 1Н), 8.91 (s, 1Н), 8.67 (s, 1Н), 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.65-7.72 (m, 4Н), 7.52 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.41-7.43 (m, 5Н), 7.34 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1Н) 3.83 (m, 4Н), 3.69 (m, 4Н), 3.50 (m, 4Н), 2.33 (m, 4Н), 2.21 (s, 3Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.98, 168.92, 164.41, 152.41, 141.17, 138.65, 135.20, 134.18, 134.09, 129.45, 128.91, 128.55, 128.18, 127.76, 127.14, 120.57, 118.71, 117.30, 65.96, 54.78, 53.58, 47.60, 45.50, 43.38. HRMS рассчитано для CHNO [М+Н] 620,3092, обнаружено 620,3105.
Пример 3: Синтез L39
1) 2-Метил-4,6-дихлор-1,3,5-триазин (6)
1
3
3
Раствор бромида метилмагния в диэтиловом эфире (3 мл, 9 ммоль) под защитой газообразного азота при -20°С медленно по каплям добавляли к раствору хлорангидрида циануровой кислоты (1,38 г, 7,5 ммоль) в 8 мл тетрагидрофурана; по окончании добавления по каплям эту смесь помещали в условия температуры окружающей среды для взаимодействия в течение 2 часов при перемешивании; и затем реакцию останавливали и гасили добавлением 20 мл насыщенного хлорида аммония. Реакционную жидкость экстрагировали дважды 20 мл этилацетата и 20 мл насыщенного хлорида натрия и органическую фазу сушили безводным сульфатом натрия. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 615 мг белого твердого вещества с выходом 50%. Н ЯМР (CDCl) δ: 2.71 (s, 3Н, СН).
2) 2,4-Дигидрокси-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазин (7)
Промежуточное соединение 6 (1,60 г, 9,76 ммоль) и 3-нитробензальдегид (1,47 г, 9,76 ммоль) растворяли в 30 мл концентрированной соляной кислоты, нагревали до 100°С и оставляли взаимодействовать в течение 12 часов при перемешивании. Реакцию останавливали. Реакционную жидкость охлаждали до комнатной температуры, вливали в 60 мл ледяной воды, подвергали фильтрованию с отсасыванием и промывали последовательно 10 мл этилацетата и 10 мл смеси вода-петролейный эфир. Осадок на фильтре сушили с получением 2,01 г белого неочищенного продукта с выходом 79,2%.
3) 2,4-Дихлор-6-(3-нитростиролил)-1,3,5-триазин (8)
Жидкую смесь промежуточного соединения 7 (960 мг, 3,69 ммоль) и оксихлорида фосфора (10 мл) нагревали до 140°С и оставляли взаимодействовать в течение 19 часов при перемешивании. Реакцию останавливали. Реакционную жидкость охлаждали до комнатной температуры и сушили путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 60 мл ледяной воды, экстрагировали 60 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 660 мг белого твердого вещества с выходом 60,2%.
4) 2-Хлор-4-(4-нитрофенокси)-6-(стиролил)-1,3,5-триазин (15)
Промежуточное соединение 8 (78 мг, 0,31 ммоль) под защитой газообразного азота растворяли в 5 мл тетрагидрофурана; и пара-нитрофенол натрия (50 мг, 0,31 ммоль) растворяли в 5 мл воды. Водный раствор пара-нитрофенола натрия медленно по каплям добавляли к смешанной жидкости промежуточного соединения 8 и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре в течение 3 часов при перемешивании. После завершения реакции половину растворителя удаляли путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 20 мл воды, экстрагировали 50 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия; растворитель полностью выпаривали; добавляли 0,5 мл безводного этанола с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 секунд и фильтрованием с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили с получением 84 мг неочищенного продукта с выходом 76,9%.
5) 2-(Морфолин-1-ил)-4-(4-нитрофенокси)-6-(стиролил)-1,3,5-триазин (16)
Промежуточное соединение 15 (84 мг, 0,24 ммоль), морфолин (63 мг, 0,72 ммоль) и ди-изопропилэтиламин (93 мг, 0,72 ммоль) под защитой газообразного азота растворяли в 15 мл тетрагидрофурана и оставляли взаимодействовать в течение 4 часов при комнатной температуре при перемешивании. После завершения реакции половину растворителя удаляли путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 30 мл воды, экстрагировали 30 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия; растворитель полностью выпаривали; добавляли 0,5 мл безводного этанола с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 секунд и фильтрованием с отсасыванием. Осадок на фильтре сушили с получением 84 мг бледно-желтого твердого вещества с выходом 86,0%.
6) 4-(4-(Морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазин-2-оксо)анилина (17)
1
Порошок железа (100 мг, 1,79 ммоль) и хлорид аммония (40 мг, 0,74 ммоль) растворяли в 10 мл водного раствора этанола (соотношение объемов этанола к воде 8:2) и нагревали до флегмообразования. Промежуточное соединение 16 (100 мг, 0,247 ммоль) быстро добавляли к вышеописанной реакционной жидкости и взаимодействие продолжали при кипячении с обратным холодильником в течение 2 часов. После завершения реакции проводили фильтрование с отсасыванием и этанол в фильтрате удаляли путем роторного выпаривания. Оставшуюся часть вливали в 30 мл воды, экстрагировали 30 мл этилацетата и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органическую фазу собирали и сушили безводным сульфатом натрия. Осуществляли получение формовочной смеси с последующей хроматографией, где элюент представлял собой смесь петролейный эфир : этилацетат 3:1. Получили 85 мг очищенного продукта с выходом 91,5%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.73 (d, J=1,6 Гц, 2H), 7.43-7.41 (m, 3Н), 6.92 (d, J=15,9 Гц, 1H), 6.87 (d, J=8,7 Гц, 2H), 6.58 (d, J=8,7 Гц, 2H), 5.04 (s, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.66-3.60 (m, 4H) м.д.
7) (E)-1-(4-хлорфенил)-3-(4-((4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазин-2-ил)-оксо)фенил)мочевина (L39)
1
Раствор пара-хлорфенилизоцианата (37,8 мг, 0,346 ммоль) в метилендихлориде (3 мл) при комнатной температуре медленно по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения 17 (92,5 мг, 0,246 ммоль) в метилендихлориде (5 мл) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 часов после завершения добавления по каплям. Реакционную жидкость сразу подвергали фильтрованию с отсасыванием и осадок на фильтре сушили с получением 117 мг белого твердого вещества с выходом 90%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8.86 (s, 1Н), 8.80 (s, 1H), 7.96 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.73-7.11 (m, 2H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.42-7.40 (m, 3H), 7.34 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.17 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 6.93 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.89 (s, 2Н), 3.67 (s, 2Н), 3.60 (s, 4Н) м.д.
Пример 4: Получение соединений L1-L15, L17-L30, L32-L38 и L40
Соединения L1-L15 и L17-L28 получали с использованием такого же способа и соответствующих материалов, как в Примере 1; соединения L29-L30 и L32-L37 получали с использованием такого же способа и соответствующих материалов, как в Примере 2; и соединения L38 и L40 получали с использованием такого же способа и соответствующих материалов, как в Примере 3. Соответствующие данные для полученных соединений показаны ниже:
L1(#50):
1
13
+
28
27
7
2
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.57 (s, 1Н), 8.88 (s, 1Н), 8.59 (s, 1Н), 7.93 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.70 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 7.65 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 7.49 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 7.43-7.38 (m, 5Н), 7.32 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 6.88 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.82 (m, 4Н), 3.68 (m, 4Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.99, 164.43, 163.80, 152.46, 138.83, 138.63, 135.22, 134.17, 134.11, 129.44, 128.90, 128.55, 127.76, 127.16, 125.13, 120.58, 119.58, 118.75, 65.96, 43.37. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 528,1909; обнаружено 528,1918.
L2(#52):
1
+
28
27
7
2
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.65 (s, 1Н), 8.78 (s, 1Н), 8.66 (s, 1H), 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.71 (d, J=6,6 Гц, 2Н), 7.62 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.48-7.38 (m, 7Н), 7.11 (t, J=8,5 Гц, 2Н), 6.90 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.82 (m, 4Н), 3.69 (m, 4Н) м.д. HRMS рассчитано для CHFNO [М+Н] 512,2205, обнаружено 512,2215.
L3(#51)
1
13
+
29
30
8
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.53 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.93 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.71 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.66 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.50 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.44-7.39 (m, 5H), 7.32 (d, J=8,7 Гц, 2H), 6.88 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.83 (m, 4H), 2.39 (m, 4H), 2.23 (s, 3H) м.д. С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.99, 164.28, 163.80, 152.47, 138.83, 138.51, 135.24, 134.25, 134.05, 129.40, 128.89, 128.55, 127.75, 127.27, 125.12, 120.52, 119.57, 118.76, 54.34, 45.74, 42.73. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 541,2175, обнаружено 541,2190.
L4(#53):
29
30
8
+
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.55 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 7.92 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.70 (d, J=6,6 Гц, 2H), 7.64 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.48-7.38 (m, 7H), 7.12 (t, J=8,5 Гц, 2H), 6.88 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.83 (m, 4H), 2.39 (m, 4H), 2.23 (s, 3Н) м.д. HRMS рассчитано для CHFNO [M+H] 525,2521, обнаружено 525,2534.
L5(#57):
1
13
+
27
25
7
2
H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.56 (s, 1Н), 8.87 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.22 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7.98 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.74-7.69 (m, 3H), 7.49 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7.39 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.32 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.08 (d, J=15,9 Гц, 1H), 5.78 (d, J=6,6 Гц, 1H), 4.61-4.59 (m, 1H), 4.37-4.32 (m, 2H), 3.90-3.86 (m, 2H) м.д. С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.8, 165.4, 163.5, 152.5, 138.6, 135.2, 134.4, 133.9, 129.4, 128.9, 128.6, 127.8, 127.2, 125.1, 120.3, 119.5, 118.7, 60.9, 59.2. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 514,1753, обнаружено 514,1765.
L6(#54):
28
26
2
7
2
+
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.56 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.90 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.66 (d, J=9,0 Гц, 3Н), 7.50 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7.43 (dd, J=13,2, 6,6 Гц, 4H), 7.33 (d, J=8,8 Гц, 2H), 6.96 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.82 (m, 4H), 3.69 (m, 4H) м.д. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 562,1520, обнаружено 562,1505.
L7(#60):
1
13
+
28
26
7
2
H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.56 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 7.91 (d, J=15,9 Гц, 1H) 7.81 (s, 1H), 7.63-7.69 (m, 3H), 7.44-7.49 (m, 4H), 7.40 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7.12 (t, J=8,8 Гц, 2H), 6.95 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.82 (m, 4H), 3.69 (m, 4H) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.74, 164.37, 163.83, 158.75, 155.60, 152.72, 137.54, 137.07, 136.23, 134.43, 133.91, 133.72, 130.63, 129.00, 127.36, 126.32, 120.67, 119.72, 119.62, 118.55, 115.33, 115.03, 65.95, 43.35. HRMS рассчитано для CHCl FNO [M+H] 546,1815, обнаружено 546,1821.
L8(#55):
1
13
+
29
29
2
8
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.56 (s, 1Н), 8.81 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.90 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.66 (d, J=9,0 Гц, 3Н), 7.50 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7.43 (dd, J=13,2, 6,6 Гц, 4H), 7.33 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 6.96 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.84 (m, 4Н), 2.39 (m, 4Н), 2.23 (s, 3Н). С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.75, 164.23, 163.84, 152.47, 138.83, 137.57, 136.96, 134.19, 134.10, 133.71, 130.63, 128.98, 128.55, 127.37, 127.31, 125.13, 120.59, 119.59, 118.78, 54.34, 45.73, 42.74. HRMS рассчитано для СН ClNO [М+Н] 575,1836, обнаружено 575,1840.
L9(#61):
1
13
+
29
29
8
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.50 (s, 1Н), 8.67 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.89 (d, J=15,9 Гц, 1Н) 7.82 (s, 1Н), 7.63-7.69 (m, 3Н), 7.44-7.49 (m, 4Н), 7.39 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.12 (t, J=8,8 Гц, 2Н), 6.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.84 (m, 4Н), 2.39 (m, 4Н), 2.23 (s, 3Н) м.д. С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.7, 164.2, 163.8, 158.8, 155.6, 152.8, 137.5, 136.9, 134.3, 133.7, 130.6, 129.0, 127.4, 126.3, 120.6, 119.8, 119.7, 118.6, 115.4, 115.1, 54.3, 45.7, 42.7. HRMS рассчитано для CHCl FNO [М+Н] 559,2131, обнаружено 559,2144.
L10(#43):
1
+
28
26
2
7
2
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 10.46 (s, 1Н), 10.22 (s, 1H), 9.52 (s, 1Н), 7.90 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.75 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 7.53-7.61 (m, 4Н), 7.44-7.52 (m, 4Н), 7.28 (d, J=8,8 Гц, 1Н), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.83 (m, 4Н), 3.68 (m, 4Н) м.д. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 562,152, обнаружено 562,1517.
L11(#45):
1
+
28
26
7
2
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.6 (s, 1Н), 8.66 (s, 1Н), 8.54 (s, 1Н), 7.88 (d, J=15,9 Гц, 1Н),7.75 (d, J=8,4 Гц, 2Н), 7.63 (d, J=8,4 Гц, 1Н), 7.43-7.49 (m, 4Н), 7.38 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.11 (t, J=8,8 Гц, 1Н), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.82 (m, 4Н), 3.68 (m, 4Н) м.д. HRMS рассчитано для CHCl FNO [М+Н] 546,1815, обнаружено 546,1822.
L12(#49):
1
13
+
28
26
7
2
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.60 (s, 1Н), 8.86 (s, 1H), 8.62 (s, 1Н), 7.91 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.75 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 7.53-7.58 (m, 1H), 7.39 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 7.31 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 7.21 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 6.95 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.73 (m, 4Н), 3.59 (m, 4Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.8, 164.0, 152.4, 141.8, 141.6, 137.3, 134.2, 134.0, 133.9, 130.3, 130.2, 129.5, 128.9, 120.6, 118.8, 113.7, 108.0, 107.8, 104.8, 104.5, 65.9, 43.3. HRMS рассчитано для CHClFNO [М+Н] 546,1815, обнаружено 546,1823.
L13(#44):
1
13
+
29
29
2
8
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.50 (s, 1Н), 8.84 (s, 1Н), 8.64 (s, 1Н), 7.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.75 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 7.64 (d, J=8,6 Гц, 2Н), 7.46-7.50 (m, 4Н), 7.39 (d, J=8,9 Гц, 2Н), 7.32 (d, J=8,9 Гц, 1H), 6.91 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.83 (m, 4Н), 2.38 (m, 4Н), 2.23 (s, 3Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.9, 164.5, 163.8, 152.5, 138.9, 137.1, 134.2, 133.8, 129.5, 128.9, 128.6, 128.1, 125.1, 120.5, 119.5, 118.7, 54.3, 45.7, 42.7. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 575,1836, обнаружено 575,1837.
L14(#42):
1
+
29
29
8
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.51 (s, 1Н), 8.88 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.78 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7.64 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7.51-7.47 (m, 4H), 7.39 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7.32 (d, J=8,9 Гц, 1H), 6.91 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.85(m, 4H), 2.38 (m, 4H), 2.25 (s, 3H) м.д. HRMS рассчитано для CHCl FNO [M+H] 559,2131, обнаружено 559,2134.
L15(#48):
1
13
+
29
29
8
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.61 (s, 1Н), 9.37 (s, 1H), 8.98 (s, 1Н), 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н),7.89 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.66-7.72 (m, 4Н), 7.60 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.39-7.44 (m, 4Н), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.82 (m, 4Н), 3.82 (s, 3Н), 3.69 (m, 4Н) м.д. С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 164.2, 163.8, 160.8, 152.4, 141.7, 137.2, 134.2, 134.0, 133.8, 130.3, 130.2, 129.5, 118.7, 113.7, 107.7, 104.8, 104.4, 54.0, 45.3, 42.3. HRMS рассчитано для CHClFNO [М+Н] 559,2131, обнаружено 559,2136.
L17(#62):
1
13
+
28
26
8
4
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.58 (s, 1H), 8.84 (s, 1Н), 8.72 (s, 1Н), 8.52 (s, 1Н), 8.22 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 8.06 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.74 (d, J=8,0 Гц, 1Н), 7.63-7.69 (m, 2Н), 7.44-7.49 (m, 2Н), 7.40 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.13 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.07 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.84 (m, 4Н), 3.70 (m, 4Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 164.33, 163.86, 158.69, 152.79, 148.33, 137.14, 136.31, 134.58, 133.76, 133.56, 130.31, 130.13, 123.60, 122.39, 120.71, 119.57, 119.46, 118.39, 115.32, 115.03, 65.96, 43.36. HRMS рассчитано для CHFNO [М+Н] 557,2056, обнаружено 557,2060.
L18(#41):
1
13
+
29
29
9
3
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.53 (s, 1Н), 8.84 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.20 (d, J=7,6 Гц, 2H), 8.03 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.73-7.64 (m, 3H), 7.50 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.41 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.31 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.05 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.84 (m, 4H), 2.39 (m, 4H), 2.23 (s, 3Н) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.53, 164.18, 163.86, 152.48, 148.31, 138.85, 137.15, 136.20, 134.16, 133.55, 130.28, 128.53, 125.09, 123.58, 122.37, 120.60, 119.56, 118.74, 54.33, 45.72, 42.72. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 586,2076, обнаружено 586,2082.
L19(#63):
1
13
+
29
29
9
3
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.52 (s, 1Н), 8.67 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.22 (d, J=8,0 Гц, 2H), 8.04 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.73 (d, J=8,0 Гц, 1H), 7.64-7.69 (m, 2H), 7.44-7.49 (m, 2H), 7.40 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7.13 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7.06 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.85 (m, 4H), 2.40 (m, 4H), 2.24 (s, 3Н) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.6, 164.2, 158.8, 152.7, 148.3, 137.2, 136.2, 134.3, 134.0, 133.6, 130.3, 123.6, 122.4, 120.6, 119.8, 119.7, 118.7, 115.4, 115.1, 54.4, 45.7, 42.7. HRMS рассчитано для CHFNO [M+H] 570,2372, обнаружено 570,2384.
L20(#38):
1
13
+
28
24
8
3
H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.50 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.21 (dd, J=8,0 Гц, J=1,8 Гц, 2H), 8.03(d, J=15,9 Гц, 1H), 7.74-7.69 (m, 3H), 7.49 (d, J=8,9 Гц, 2Н), 7.40 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7.32 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.06 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.23-3.17 (m, 6H) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.19, 164.90, 163.64, 152.48, 148.35, 138.86, 137.19, 135.97, 134.36, 133.98, 133.59, 130.32, 128.55, 125.09, 123.56, 122.29, 120.41, 119.56, 118.74, 35.86. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 531,1654, обнаружено 531,1667.
L21(#39):
1
13
+
28
26
8
3
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.49 (s, 1Н), 8.79 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.21 (dd, J=8,0 Гц, J=1,8 Гц, 2H), 8.01 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.77-7.69 (m, 3Н), 7.49 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7.39 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7.32 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.06 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.62-3.57 (m, 4Н), 1.96-1.94 (m, 4Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6): 162.87, 152.47, 148.35, 138.85, 137.19, 134.55, 133.83, 133.61, 130.33, 128.55, 125.09, 123.55, 122.24, 120.21, 119.55, 118.75, 45.99, 24.76. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 557,1811, обнаружено 557,1816.
L22(#58):
1
13
+
27
24
8
4
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.56 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.69 (s, 1Н), 8.50 (s, 1Н), 8.22 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 7.98 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.68-7.74 (m, 3Н), 7.49 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.39 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.32 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.08 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 5.78 (d, J=6,6 Гц, 1H), 4.58-4.61 (m, 1Н), 4.32-4.37 (m, 2Н), 3.86-3.90 (m, 2Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.36, 165.26, 163.55, 152.51, 148.31, 138.88, 137.09, 136.14, 134.29, 134.05, 133.65, 130.27, 128.54, 125.06, 123.57, 122.25, 120.42, 119.49, 118.67, 60.93, 59.23. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 559,1604, обнаружено 559,1609.
L23(#64):
1
13
+
28
27
7
2
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.63 (s, 1H), 8.81 (s, 1Н), 8.70 (s, 1Н), 8.32 (s, 1H) 8.01 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.69-7.71 (m, 2Н), 7.49 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.39 (m, 3Н), 7.33 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 7.25-7.16 (m, 2Н), 6.93 (m, 1H), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.87 (m, 4Н), 3.69 (m, 4Н) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 170.09, 164.44, 163.90, 152.30, 140.28, 139.66, 138.92, 138.71, 135.25, 129.42, 128.85, 128.55, 127.77, 127.06, 125.28, 119.68, 113.68,112.19, 109.91, 66.03, 43.41. HRMS рассчитано для CHClNO [М+Н] 528,1909, обнаружено 528,1916.
L24(#65):
13
+
29
30
8
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.58 (s, 1Н), 8.90 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.34 (s, 1H) 8.00 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.69-7.71 (m, 2H) 7.50 (d, J=8,8 Гц, 2H) 7.38 (m, 3H) 7.32 (d, J=8,8 Гц, 2H) 7.18-7.21 (m, 2H), 6.94 (m, 1H), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.87 (m, 4H), 2.39 (m, 4H), 2.23 (s, 3Н) м.д. С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 170.1, 164.3, 163.9, 152.3, 140.3, 139.7, 138.8, 135.3, 129.4, 128.8, 128.6, 128.5, 127.8, 127.1, 125.2, 119.6, 113.6, 112.1, 109.9, 54.5, 45.8, 42.8. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 541,2226, обнаружено 541,2236.
L25(#59):
13
+
28
26
2
7
2
1H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.64 (s, 1Н), 8.82 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.31 (s, 1H) 7.98 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.68 (d, J=7,0 Гц, 1H), 7.43-7.50 (m, 4H), 7.32 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7.16-7.26 (m, 2H), 6.96 (d, J=15,9 Гц, 1H), 6.94 (d, J=7,0 Гц, 1H), 3.88 (m, 4H), 3.69 (m, 4H) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.84, 164.38, 163.91, 152.30, 140.20, 139.67, 138.72, 137.55, 137.36, 133.71, 130.57, 129.01, 128.76, 128.61, 128.53, 127.32, 126.37, 125.25, 119.62, 113.72, 112.23, 109.94, 66.02, 43.40. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 562,1520, обнаружено 562,1530.
L26(#56):
13
+
29
29
2
8
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.62 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.52 (s, 1H) 8.34 (s, 1H) 8.22 (d, J=8,0 Гц, 2H), 8.12 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.67 (t, J=7,0 Гц, 1H), 7.50 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7.17-7.34 (m, 4H), 7.06 (d, J=15,9 Гц, 1H), 6.94 (t, J=7,0 Гц, 1H), 3.91 (m, 4H), 2.41 (m, 4H), 2.25 (s, 3Н) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.8, 164.2, 163.9, 152.3, 140.3, 139.7, 138.7, 137.6, 137.2, 133.7, 130.6, 129.0, 128.9, 128.6, 127.3, 126.4, 125.3, 119.6, 113.7, 112.2, 109.9, 54.5, 45.8, 42.8. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 575,1836, обнаружено 575,1842.
L27(#66):
13
+
28
26
2
8
4
1H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.62 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.47 (s, 1H) 8.30 (s, 1H) 8.18 (d, J=8,0 Гц, 2H), 8.11 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.65 (t, J=7,0 Гц, 1H) 7.45 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7.14-7.32 (m, 4H), 7.05 (d, J=15,9 Гц, 1H), 6.93 (t, J=7,0 Гц, 1H), 3.87 (m, 4H), 3.67 (m, 4H) м.д. С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.63, 164.37, 163.94, 152.32, 148.28, 140.18, 139.95, 139.70, 138.72, 137.13, 136.59, 133.59, 130.21, 129.96, 128.60, 128.49, 125.24, 123.56, 122.31, 119.59, 113.72, 112.22, 109.91, 66.03, 43.42, 30.37. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 573,1687, обнаружено 573,1760.
L28(#67):
13
+
29
29
9
3
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.60 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.50 (s, 1H) 8.33 (s, 1H) 8.20 (d, J=8,0 Гц, 2H), 8.12 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.67 (t, J=7,0 Гц, 1H) 7.48 (d, J=8,0 Гц, 2H) 7.17-7.34 (m, 4H), 7.06 (d, J=15,9 Гц, 1H), 6.94 (t, J=7,0 Гц, 1H), 3.89 (m, 4H), 2.39 (m, 4H), 2.23 (s, 3Н) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.6, 164.2, 163.9, 152.3, 148.3, 140.2, 139.7, 138.7, 137.1, 133.6, 130.2, 130.0, 128.6, 128.5, 123.6, 122.4, 119.6, 113.7, 112.1, 109.9, 54.5, 45.8, 42.8. HRMS рассчитано для CHClNO [M+H] 586,2076, обнаружено 586,2085.
L29(#70):
13
+
31
33
8
3
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.60 (s, 1Н), 8.86 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 7.94 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.72-7.65 (m, 4H), 7.51 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.46-7.40 (m, 5H), 7.36 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.83 (m, 4H), 3.69 (m, 4H), 2.97 (s, 6H) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 170.0, 164.4, 163.8, 152.4, 141.0, 138.7, 135.2, 134.1, 129.5, 129.2, 128.9, 128.2, 127.8, 120.6, 118.7, 117.2, 66.0, 43.4. HRMS рассчитано для CHNO [M+H] 565,1670, обнаружено 565,2676.
L30(#76):
1
13
+
35
39
8
3
H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.56 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.94 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.71-7.64 (m, 4H), 7.50 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.44-7.39 (m, 5H), 7.30 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6.88 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.82 (m, 4H), 3.69 (m, 4H), 3.33 (m, 2H), 2.89 (m, 1H), 2.73 (m, 1H), 1.63-1.61 (m, 3H), 1.12-1.01 (m, 2H), 0.92 (d, J=6,1 Гц, 3Н) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 168.85, 164.44, 163.81, 152.42, 140.92, 135.22, 134.18, 134.11, 129.25, 128.91, 128.08, 127.87, 127.76, 120.59, 118.72, 117.34, 65.96, 43.37, 30.47, 21.57. HRMS рассчитано для CHNO [M+H] 619,3140, обнаружено 619,3151.
L32(#73):
1
13
+
33
38
9
3
H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.64 (s, 1H), 9.11 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.37 (t, J=5,4 Гц, 1H), 7.99 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.85 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.77-7.70 (m, 4H), 7.58 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.52-7.45 (m, 5H), 6.93 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.88 (m, 4H), 3.74 (m, 4H), 3.49-3.45 (m, 2H), 2.67 (t,.7=6,1 Гц, 2H), 2.41 (s, 6H) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 165.83, 164.45, 163.81, 152.38, 142.63, 138.65, 134.21, 134.08, 129.44, 128.91, 128.13, 127.75, 127.19, 120.59, 118.70, 116.90, 65.96, 57.73, 44.50, 43.37, 36.55. HRMS рассчитано для CHNO [M+H] 608,3092, обнаружено 608,3104.
L33(#74):
1
+
35
42
9
3
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.61 (s, 1Н), 9.54 (s, 1Н), 9.25 (s, 1Н), 8.50 (s, 1H), 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.82 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.72 (d, J=6,7 Гц, 2Н), 7.66 (d, J=8,3 Гц, 2Н), 7.55 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.43 (d, J=5,8 Гц, 5Н), 6.89 (d, J=15,8 Гц, 1Н), 3.82 (s, 4Н), 3.70 (s, 4Н), 3.00 (dd, J=14,2, 7,0 Гц, 4Н), 2.85 (s, 4Н), 1.17 (t, J=7,2 Гц, 6Н). HRMS рассчитано для CHNO [М+Н] 636,3405, обнаружено 636,3417.
L34(#77):
1
13
+
34
40
9
8
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.61 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.37 (t, J=5,4 Гц, 1H), 7.94 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.77 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.72-7.64 (m, 4H), 7.52 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.43-7.41 (m, 5H), 6.88 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.82 (m, 4H), 3.69 (m, 4H), 3.29-3.24 (m, 2H), 2.27 (t, J=6,9 Гц, 2H), 2.15 (s, 6H), 1.69-1.62 (m, 2H) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 165.6, 164.4, 152.4, 142.5, 135.2, 134.2, 134.1, 129.5, 128.9, 128.0, 127.8, 127.5, 120.6, 118.7, 116.9, 65.9, 56.9, 45.1, 43.3, 37.6, 27.1. HRMS рассчитано для CHNO [М+Н] 662,3249, обнаружено 662,3255.
L35(#75):
1
13
+
35
40
9
3
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.61 (s, 1Н), 9.51 (s, 1Н), 9.23 (s, 1Н), 8.43 (s, 1Н), 7.95 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.82 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.69 (dd, J=17,5, 7,5 Гц, 4Н), 7.54 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.43 (d, J=4,6 Гц, 5Н), 6.89 (d, J=15,7 Гц, 1Н), 3.83 (s, 4Н), 3.70 (s, 4Н), 3.44 (d, J=5,4 Гц, 2Н), 2.83 (d, J=45,5 Гц, 6Н), 1.76 (s, 4Н). С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.95, 165.83, 164.41, 163.77, 152.51, 142.80, 138.66, 135.21, 134.26, 134.05, 129.44, 128.91, 128.19, 127.76, 127.15, 126.95, 124.86, 120.59, 118.41, 116.69, 65.96, 54.46, 53.48, 45.44, 43.35, 37.46, 29.27, 29.00, 22.89. HRMS рассчитано для CHNO [М+Н] 634,3249, обнаружено 634,3264.
L36(#72):
1
13
+
36
42
9
3
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.66 (s, 1Н), 9.50 (s, 1H), 9.22 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.99 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.87 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.77-7.70 (m, 4H), 7.60 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.49-7.43 (m, 5H), 6.94 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.87 (m, 4H), 3.74 (m, 4H), 3.54-3.52 (m, 2H), 2.80 (m, 6H), 1.66 (m, 4H), 1.49 (m, 2H) м.д. C ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.98, 165.91, 164.40, 163.76, 152.47, 142.80, 138.62, 135.19, 134.19, 134.10, 129.43, 128.91, 128.20, 127.75, 127.12,126.92, 120.58, 118.49, 116.76, 65.96, 56.77, 53.26, 43.35, 35.56, 24.15, 22.77. HRMS рассчитано для CHNO [M+H] 648,3405, обнаружено 648,3423.
L37(#71):
1
13
+
35
40
9
4
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 9.60 (s, 1H), 8.93 (s, 1Н), 8.68 (s, 1Н), 8.27 (t, J=5,2 Гц, 1Н),7.94 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.78 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.65-7.72 (m, 4Н), 7.52 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 7.40-7.46 (m, 5Н), 7.34 (d, J=8,5 Гц, 2Н), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.83 (m, 4Н), 3.69 (m, 4Н), 3.56-3.59 (m, 4Н), 3.35 (m, 2Н), 2.43-2.50 (m, 6Н) м.д. С-ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 169.99, 165.67, 164.41, 163.78, 152.34, 142.49, 138.67, 135.19, 134.23, 134.01, 129.45, 128.91, 128.08, 127.76, 127.40, 127.12, 120.56, 118.77, 116.98, 66.15, 65.96, 57.44, 53.27, 43.35, 36.41. HRMS рассчитано для CHNO [М+Н] 650,3198, обнаружено 650,3212.
L38(#84):
1
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8.67 (s, 1Н), 8.50 (s, 1H), 7.96 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.74-7.72 (m, 2H), 7.49 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7.42-7.40 (m, 2H), 7.36 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7.14 (d, J=8,9 Гц, 2H), 6.94 (d, J=15,9 Гц, 1H), 6.88 (d, J=8,9 Гц, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 3.60 (s, 4H) м.д.
L39(#85):
1
H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8.86 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 7.96 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.73-7.11 (m, 2H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.42-7.40 (m, 3H), 7.34 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.17 (d, J=8,7 Гц, 2H), 6.93 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.89 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.60 (s, 4H) м.д.
L40(#86):
1
H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8.76 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 7.96 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.72-7.70 (m, 2H), 7.50-7.45 (m, 5H), 7.42-7.40 (m, 2H), 7.15-7.10 (m, 4H), 6.94 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.89 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.60 (s, 4H) м.д.
Пример 5: In vitro тестирование соединений на противоопухолевую активность (МТТ-эксперименты)
1) Экспериментальные материалы
2
МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия), RPM1640 культуральная среда, фетальная бычья сыворотка, 96-луночный планшет, CO термостатический инкубатор, микропланшет-ридер American BIO-RAD680, клеточные линии человеческого немелкоклеточного рака легких (Н522) и клеточные линии человеческой глиомы головного мозга (U87) все были приобретены у коммерческих поставщиков.
2) Экспериментальные стадии
(1) Инокуляция клеток: Суспензию отдельных клеток, приготовленную с культуральной средой, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, помещали в 96-луночный планшет с 5000 клеток на лунку, где объем каждой лунки составлял 100 мкл, и культивировали в течение ночи.
(2) Приготовление растворов соединений: исходный раствор соединения в DMSO разбавляли на стерильном лабораторном столе культуральной средой с получением 5 концентраций, подлежащих тестированию, где двойное разведение использовали между двумя ближайшими концентрациями.
(3) Растворы соединений различных концентраций добавляли в 96-луночные планшеты, культивированные в течение ночи, по 100 мкл на лунку в трех повторностях для каждой концентрации. Поскольку периферические лунки могут иметь пограничный эффект и чувствительны к контаминации, в них не добавляли ни клеток, ни соединений; вместо этого добавляли 100 мкл культурального раствора в качестве контрольного опыта. Дополнительно, 100% лунок устанавливали для содержания клеток и 100 мкл культуральной среды без какого-либо соединения. Планшеты инкубировали в термостатируемом инкубаторе при 37°С в течение 48 часов.
(4) Окрашивание: 10 мкл раствора МТТ (5 мг/мл, приготовленный с PBS) добавляли в 96-луночный планшет для окрашивания. После инкубирования в течение 4 часов проводили центрифугирование при 2500 об/мин в течение 10 минут. Затем использовали многоканальную пипетку для осторожного отсасывания культурального раствора без отсасывания клеток, когда кончик пипетки обращен книзу. Добавляли 150 мкл DMSO и встряхивали на шейкере в течение 5-10 минут. Кристаллы оставляли для полного растворения и измеряли значение оптической плотности (OD) для каждой лунки с использованием микропланшет-ридера при 570 нМ. Степень ингибирования рассчитывали следующим образом:
Степень ингибирования (%) равна (среднее значение OD от 100% лунок минус среднее значение OD от лунок с соединением)/(среднее значение OD от 100% лунок минус среднее значение OD от контрольных лунок) × 100%
Экспериментальные результаты соединений перечислены в следующей таблице:
"NA" означает, что соединения не проявляют ингибирующего эффекта в отношении пролиферации опухолевой клетки при тестировании в наивысшей концентрации (31,6 мкМ).
">30" означает, что соединения проявляют некоторый ингибирующий эффект в отношении опухолевых клеток, однако степень ингибирования составляет менее 50% при тестировании в наивысшей концентрации (31,6 мкМ).
Пример 6: Широкий спектр и селективность соединений в ингибировании опухолевых клеток
3
8 соединений (#38-#45, L20, L21, L16, L18, L14, L10, L13 и L11 последовательно) отобрали для тестирования в отношении их способности ингибировать рост 11 видов человеческих опухолевых клеток. Методика была такой же, как в Примере 5. Тестированные клеточные линии были следующими: клеточная линия человеческого немелкоклеточного рака легких (Н522), клеточная линия человеческой аденокарциномы толстой кишки (НСТ15), клеточная линия человеческого рака шейки матки (Hela), клеточная линия человеческого рака печени (HepG2), клеточная линия человеческой фибросаркомы (НТ1080), клеточная линия человеческого эритролейкоза (KG1), клеточная линия человеческого рака предстательной железы (LNCaP), клеточная линия человеческого рака молочной железы (MCF7), клеточная линия человеческого рака яичников (OVAR), клеточная линия человеческой меланомы (SK-mel28) и клеточная линия человеческой глиомы головного мозга (U87). Экспериментальные результаты показаны на Фиг. 1.
Пример 7: Вакуолизация опухолевых клеток и гибель посредством метуоза
После обработки определенными соединениями конкретных структур наблюдали за различными видами опухолевых клеток, для того чтобы продемонстрировать значительную степень аккумуляции везикул в цитоплазме, фенотип клеточной вакуолизации. Некоторые клетки постепенно становились округлыми и впоследствии разрывались. Эти изменения согласуются с особенностями клеточной гибели посредством метуоза (Фиг. 2).
3
2
С целью сравнения способности разных соединений вызывать клеточную вакуолизацию 100 мкл культуральной среды (RPMI1640, 2 ммоль глутамина, 10% фетальная бычья сыворотка), содержащей 10 клеток человеческой глиомы U87, и подлежащие тестированию соединения в конечных концентрациях 0,01, 0,0316, 0,1, 0,316, 1,0, 3,160 мкМ, соответственно, инокулировали в 96-луночный планшет для культур. После культивирования при 5% СО и 37°С в течение 96 часов изучали клеточную морфологию под микроскопом с большим увеличением, и способность соединений вызывать клеточную вакуолизацию оценивали в баллах: 5 баллов присваивали при явной наблюдаемой вакуолизации при 10 нМ, 4 балла при 31,6 нМ, 3 балла при 100 нМ, 2 балла при 316 нМ, 1 балл при 1000 нМ, и 0 баллов присваивали, когда никакой вакуолизации не возникало ни при какой концентрации.
На Фиг. 3 показана способность соединений с разными структурами вызывать клеточную вакуолизацию и их способность ингибировать клеточную пролиферацию. Конкретные результаты приведены ниже:
Примечание: Соединение #51 не показано на Фиг. 3; соединение #68 представляет собой соль хлорид соединения L16 (#40).
В дополнение, соединения 79 и 14, описанные в Примере 8, были тестированы согласно способу, описанному в этом Примере, и их баллы вакуолизации составили 4,5 и 1,5, соответственно.
Пример 8: Фишинг целевого белка с помощью зонда
На Фиг. 4 приведено краткое описание выделения и идентификации белка-мишени, соответствующего соединению, вызывающему клеточную вакуолизацию. Соответствующие стадии кратко описаны ниже.
Синтез зонда (Фиг. 5):
Путь синтеза и синтез соединения #79:
где боковую цепь С1 получали со ссылкой на способ, описанный в статье (Li, Z., Нао P., Li L. et al. Design and synthesis minimalist terminal alkyne-containing diazirine photo-crosslinkers and their incorporation into kinase inhibitors for cell- and tissue-based proteome profiling. Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 8551-8556).
Соединение 14 ((Е)-1-(4-карбоксифенил)-3-(4-(4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазинил-2-амино)фенил)мочевина) получали с использованием способа Примера 2 и соответствующих материалов, и данные масс-спектрального анализа даны ниже:
1
Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 12.33 (s, 1H), 9.59 (s, 1H), 9.41 (s, 1H), 9.09 (s, 1Н), 7.94 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 7.88 (d, J=8,3 Гц, 2Н), 7.77-7.63 (m, 4Н), 7.59 (d, J=8,3 Гц, 2Н), 7.51-7.36 (m, 5Н), 6.89 (d, J=15,9 Гц, 1Н), 3.83 (s, 4Н), 3.69 (s, 4Н) м.д.
(E)-N-(2-(3-(1-бутин-4-ил)-3Н-диазиридин-3-ил)этил)-4-(3-(4-((4-(морфолин-1-ил)-6-стиролил-1,3,5-триазин-2-ил)амино)фенил)мочевина)бензамид (79)
1
13
-
36
36
10
3
Промежуточное соединение 14 (100 мг, 0,186 ммоль), HOBt (32,7 мг, 0,242 ммоль), DMF (2 мл), EDCI (53,5 мг, 0,279 ммоль), С1 (33,0 мг, 0,242 ммоль) и триэтиламин (37,6 мг, 0,372 ммоль) при комнатной температуре добавляли последовательно в реакционную колбу емкостью 25 мл и перемешивали для взаимодействия в течение 8 часов. После завершения реакции реакционную жидкость вливали в 10 мл ледяной воды, экстрагировали метилендихлоридом (20 мл) и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 92,8 мг бледно-желтого твердого вещества с выходом 76%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 9.62 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.34 (t, J=5,2 Гц, 1H), 7.96 (d, J=15,9 Гц, 1H), 7.80 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7.67-7.74 (m, 4H), 7.55 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7.42-7.48 (m, 5H), 6.90 (d, J=15,9 Гц, 1H), 3.84 (m, 4H), 3.71 (m, 4H), 3.13-3.20 (m, 2H), 2.87 (d, J=2,5 Гц, 1H), 2.04 (td, J=7,4 Гц, J=2,5 Гц, 2H), 1.62-1.69 (m, 4H) м.д. С ЯМР (75 МГц, DMSO-d6) δ: 170.05, 165.66, 164.41, 163.87, 152.16, 142.45, 140.30, 139.59, 138.91, 135.22, 129.44, 128.87, 128.63, 128.07, 127.77, 127.40, 127.01, 117.02, 113.69, 112.13, 109.78, 83.13, 71.72, 66.05, 43.41, 34.27, 31.99, 31.30, 27.28, 12.67. ES-MSm/Z: 655,5 [М-Н] CHNO (MW 656,7).
Путь синтеза и синтез соединения #80:
где реагент N1 и биотин представляли собой имеющиеся в продаже продукты.
N-(2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этан-1-ил)биотинамид (80)
1
2
2
2
2
3
2
2
3
Биотин (94 мг, 0,385 ммоль, биотин), HOBt (74,5 мг, 0,551 ммоль), DMF (2 мл), EDCI (106 мг, 0,551 ммоль), N1 [80 мг, 0,367 ммоль, называемый 2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этан-1-амин] и триэтиламин (55,7 мг, 0,551 ммоль) при комнатной температуре добавляли последовательно в реакционную колбу емкостью 25 мл и перемешивали для взаимодействия в течение 8 часов. После завершения реакции реакционную жидкость вливали в 10 мл ледяной воды, экстрагировали метилендихлоридом (20 мл) и промывали последовательно водой и насыщенным рассолом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и растворитель полностью выпаривали. После колоночной хроматографии на силикагеле получили 123 мг бледно-желтого твердого вещества с выходом 72%. Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ: 4.31 (m, 1Н, CH-1-биотин), 4.14 (m, 1H, CH-4-биотин), 3.55-3.52 (m, 8H, O(CHCHO)-PEG), 3.40-3.38 (m, 4H, CHNH и CHN-PEG), 3.10 (m, 1H, CH-3-биотин), 2.83 (dd, 1H, J=4,8, 12,3 Гц, СН-2а-биотин), 2.60-2.56 (m, 1H, СН-2b-биотин), 2.07 (t, 2Н, J=7,2 Гц, СНСО-биотин), 1.50-1.30 (m, 6Н, (СН)-биотин).
2
Клеточная культура: Некоторое количество клеток человеческой глиомы U87 помещали на чашку Петри 150 см и культивировали в течение 48 часов до достижения 75-90% конфлюэнтности. Культуральную среду заменяли предварительно подогретой средой, содержащей либо 0,5 мкМ зонда (соединение #79), либо эквивалентным объемом DMSO-контроля. Клетки продолжали культивировать в течение 3 часов.
УФ-индуцированное перекрестное сшивание: Клетки дважды промывали предварительно охлажденным физиологическим раствором, забуференным фосфатом (PBS). Чашку с клеточной культурой помещали на лед и клетки облучали ультрафиолетовым светом (ультрафиолетовая лампа с мощностью 100 Вт, длина волны 350 нМ или 315-385 нМ) через поверхность чашки в течение 1 часа. Альтернативно, минимальное количество предварительно охлажденного PBS (10 мл/150 см) добавляли в чашку с культуральной средой, которую затем помещали в условия ультрафиолетового облучения. Дно чашки с клеточной культурой получало облучение в течение 30 минут (длина волны 315-385 нМ, время регулировали с учетом мощности ультрафиолетового облучения).
Получение раствора клеточного лизиса: Клетки диссоциировали с помощью трипсина, осаждали путем центрифугирования и промывали дважды PBS. Клетки ресуспендировали в буфере для лизиса HEPES (25 мМ Hepes, 150 мМ хлорида натрия, 2 мМ хлорида магния, 0,1% NP-40, ингибитор протеазы, рН 7,5), гомогенизировали кратковременной обработкой ультразвуком (необязательно), смешивали путем встряхивания при 4°С в течение 30 минут и затем центрифугировали при 4°С в течение 10 минут на высокой скорости. Концентрацию белка клеточного лизата определяли с использованием метода Брэдфорда.
Предварительная очистка: 1 мл клеточного лизата (1-2 мг/мл) добавляли к гранулам стрептавидин-агарозы, предварительно уравновешенным буфером HEPES (25 мМ Hepes, 150 мМ хлорида натрия, 2 мМ хлорида магния, рН 7,5), и смешивали путем встряхивания при 4°С в течение 2 часов или в течение ночи. Супернатант сохраняли после центрифугирования.
4
Клик-реакция: 940 мкл супернатанта, как описано выше, добавляли к свержеприготовленной реакционной смеси (20 мкл 50 мМ CuSO, 10 мкл свежеприготовленного 10 мМ ТВТА, т.е. трис[(1-бензил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина, 20 мкл 50 мМ ТСЕР, т.е. трис(2-карбоксиэтил)фосфина, и 10 мкл 1 мМ соединения #80), и осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Для остановки реакции добавляли двойной объем ацетона, предварительно охлажденного при -20°С. Полученный раствор центрифугировали при 4°С в течение 10 минут на высокой скорости (13000 об/мин) для осаждения белка. Осадок белка дважды промывали 500 мкл предварительно охлажденного метанола и растворяли в 1 мл 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) в PBS при обработке ультразвуком.
Очистка белка-мишени: Раствор перерастворенного белка, как описано выше, добавляли к гранулам стрептавидин-агарозы (объем гранул 200 мкл), уравновешенным PBS, смешивали путем встряхивания при 4°С в течение 2 часов или в течение ночи, центрифугировали для осаждения гранул агарозы. Гранулы промывали один раз 0,1% SDS PBS и четыре раза PBS, добавляли эквивалентный объему гранул 2xSDS загрузочный буфер и кипятили в течение 15 минут. После центрифугирования супернатант загружали на 10% SDS-PAGE для разделения белка. Гель затем окрашивали 20 мл раствора кумасси синего в течение 1 часа, затем обесцвечивали с использованием 2×500 мл воды двойной дистилляции в течение 2×1 часов. Полосы конкретных белков отрезали от обесцвеченного геля (Фиг. 6, А).
Идентификация белка: Для идентификации очищенного белка использовали масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS/MS) с картированием пептидного сегмента и анализом последовательности. Последовательности пептидного сегмента очищенного белка соответствовали последовательности виментина в базе данных (Фиг. 6, В, С).
Пример 9: Результаты молекулярного докинга соединения #50 с белком-мишенью.
Выбрали программное обеспечение Discovery Studio 3.0, и описанный здесь метод докинга LibDock использовали для «стыковки» 3KLT тетрамера виментина, взятого из PDB (банк данных по белкам) (см. А на Фиг. 7), и соединения #50 (В на Фиг. 7). Был построен модельный сферический активный карман с учетом лиганда, переносимого самим 3KLT, где радиус устанавливали на 10 ; количество узлов решетки составляло 1000; метод, используемый для создания конфигураций, представлял собой Best; максимальное количество генерированных низкомолекулярных конфигураций устанавливали на 255; и остальные параметры оставляли по умолчанию. Были получены баллы для топ-10 конфигураций соединения #50 (см. С на Фиг. 7). Далее предоставили схематический рисунок, показывающий взаимодействие между виментином и конфигурацией соединения #50 с наивысшим баллом (D на Фиг. 7). Также показаны аминокислоты, образующие водородные связи с соединением #50 после депротеинизации (Е на Фиг. 7). Как видно, только две аминокислоты, Arg273 и Tyr276, образовывали водородные связи с триазиновым кольцом в соединении #50.