Влияние вязкости реакционной среды на кинетику биферментной биолюминесцентной системы нaд(ф)h:фmн-оксидоредуктаза-люцифераза

ББК 28.071.1 УДК 577.3

О. С. Сутормин, И. Е. Суковатая, В. А. Кратасюк Влияние вязкости реакционной среды на кинетику биферментной биолюминесцентной системы НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза*

O.S. Sutormin, I.E. Sukovataya, V.A. Kratasyuk

The Effect of Viscosity on the Kinetic Parameters of Coupled

Bioluminescent Enzyme System NADH:FMN-oxidoreductase-

luciferase

Получены данные о влиянии вязкости реакционной среды на кинетические параметры ферментов биферментной системы светящихся бактерий НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза. Показано, что в экспериментальной модели биолюминесцентной биферментной системы с сахарозой в меньшей степени по сравнению с глицерином ингибируется скорость биолюминесцентной реакции; в сахарозе наблюдается стабилизация дол-гоживущего интермедиата реакции и, как следствие, увеличение квантового выхода. Величина общего выхода свечения и константа спада биферментной системы не зависят от вязкости реакционной смеси.

Ключевые слова: биферментная система светящихся бактерий НАД (Ф) Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, биолюминесценция, кинетические параметры, глицерин, сахароза.

БОТ 10.14258Лгуа8и(2013)3.2-08

The influence of the viscosity of the reaction medium on the kinetic parameters of the coupled enzyme system of bioluminescence bacteria NAD(P)H:FMN-oxidoreductase-luciferase was investigated. It was shown that in an experimental model of coupled bioluminescent enzyme system with sucrose the reaction rate inhibited to a lesser extent compared with glycerol. The value of the total yield of luminescence and a constant decay of coupled bioluminescent enzyme system do not depend on the viscosity of the reaction media.

Key words: coupled enzyme system of bioluminescence bacteria NAD(P)H:FMN-oxidoreductase-luciferase; kinetic parameters; glycerol; sucrose.

Биолюминесценция светящихся бактерий — это продукт хемилюминесцентной реакции, в которой происходит окисление субстрата — люциферина, катализируемое специфическим ферментом — люцифе-разой, в результате чего энергия химических связей трансформируется в световую. Важным преимуществом биолюминесцентных реакций является не только высокий квантовый выход, достигающий в некоторых случаях 90%, но и тот факт, что свет излучается в видимом диапазоне и делает биолюминесценцию уникальным объектом фундаментальных исследований и весьма полезным методом исследования дру-

гих объектов, инструментом для визуализации многих процессов. Известно, что светящиеся бактерии имеют специальные ферментативные системы, способствующие восстановлению флавинмононуклеотида (ФМН) и карбоновой кислоты исключительно для нужд биолюминесценции [1; 2], но связь люминесценции с общим метаболизмом клетки все еще не до конца изучена. Уникальным объектом для решения этой задачи является сопряженная биферментная система НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, реакция которой представляет собой два сопряженных процесса:

ФМНхН2 + RCHO + O2

люцифераза

ФМН + RCOOH + НО + hv

НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза

ФМН+НАДН +H+

НАД++ФМН-Н.

* Работа выполнена при поддержке мегапроекта «Биолюминесцентные биотехнологии» (договор № 11. G34.31.0058) в рамках Постановления Правительства РФ №220 от 9 апреля 2010 г «О мерах по привлечению ведущих ученых в российские образовательные учреждения высшего профессионального образования», Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 14. А18.21.1911.

В результате первой реакции, катализируемой НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой, происходит восстановление ФМН с помощью восстанавливающего реагента НАДН. Вторая реакция, катализируемая лю-циферазой, является биолюминесцентной. В этой реакции восстановленный флавин и алифатический альдегид окисляются кислородом воздуха. В результате реакции образуется окисленная форма флавина, жирная кислота, а также испускается квант света в сине-зеленой области спектра. Следует отметить, что интерес к данному биолюминесцентному процессу связан не только с изучением механизмов перехода энергии биохимической реакции в световую, но и с его все более расширяющимся применением в биохимии, медицине, биотехнологии и при мониторинге окружающей среды [3].

Для решения фундаментальной задачи понимания механизмов сопряжения и функционирования ферментативных метаболических цепей в клетке светящихся бактерий разрабатываются экспериментальные подходы для создания экспериментальной модели, которая позволит реконструировать цепь сопряжения люциферазы с другими ферментами светящихся бактерий в клетке. Имитация вязкого микроокружения ферментов, а также связь с мембранными структурами и оптимизация микроокружения могут быть достигнуты, в том числе, и за счет увеличения вязкости микроокружения ферментов по сравнению с растворами. Поэтому для понимания процессов поведения описанной выше ферментативной люминесцентной системы светящихся бактерий в условиях, близких к in vivo, целесообразно изучение влияния специально подобранной гетерогенной среды на биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, моделирование увеличенной вязкости реакционной среды, в которой можно достигать за счет подбора соответствующих реакционных сред, например, органических растворителей с высоким значением вязкости [4].

Целью данной работы было исследование влияния вязкости реакционной среды на кинетические параметры ферментов биферментной системы светящихся бактерий НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза.

Материалы и методы. Для регистрации кинетических параметров биферментной биолюминесцентной системы использовали лиофилизованные препараты высокоочищенных ферментов, произведенные в лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции Института биофизики СО РАН [5]. Один флакон лиофилизованного препарата (КРАБ) содержит 0,4 мг/мл люциферазы (L) EC 1.14.14.3 из рекомбинант-ного штамма E.coli и 0,18 ед. активности НАДН:ФМН-оксидоредуктазы (R) EC 1.5.1.29 (Ph. leiognathi). Перед измерениями лиофилизованные ферменты растворяли в 0,05 М калий фосфатном буфере (рН 6,8). В работе использовали следующие реактивы: НАДН и ФМН фирмы Serva (Германия), тетрадеканаль фирмы Merck (Германия). Для регистрации кинетических параметров

биферментной биолюминесцентной системы проводили реакцию в смеси следующего состава: 10 мкл КРАБа; 50 мкл алифатического альдегида; 200 мкл 0,05 М фосфатного буфера; 10 мкл флавинмононуклеотида (ФМН); 50 мкл 0,1М НАДН. Все вязкие растворы готовили с использованием фосфатного буфера, концентрацию вещества выражали в молях и объемных процентах. Кинетические параметры биферментной системы изучали в присутствии разных концентраций глицерина (5, 10, 25, 50 об.%), сахарозы (20, 25, 30, 40 об.%) и без них (контроль). Величину динамической вязкости биолюминесцентной системы в исследуемом диапазоне температур брали из химического справочника. Измерения проводили на люминометре GloMax-20/20 фирмы Turner BioSystems (Sunnyvale, USA). Температуру растворов поддерживали с помощью жидкостного циркуляционного ультратермостата VT-8 (Термэкс-2, Россия). Все измерения проводили при температуре 25 0С. В кювету биолюминометра вносили последовательно все компоненты реакционной смеси, быстро перемешивали, помещали кювету в биолюминометр и регистрировали величину максимальной интенсивности свечения и время спада биолюминесценции. Биолюминесцентная реакция растворимой биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза представляют собой длительное свечение с монотонным спадом биолюминесценции. Максимум интенсивности свечения (I0) характеризует начальную скорость реакции и концентрацию фермент-субстратных комплексов, образуемых в ходе реакции. Спад биолюминесценции определяет скорость распада фермент-субстратного комплекса во времени и подчиняется экспоненциальному закону. Константа спада биолюминесценции (kcat) вычисляется по спаду свечения от 80 до 20% от максимальной интенсивности: kcat= (lnI80-lnI20)/t. Общее число квантов Q=I0/kcat пропорционально общему числу молекул фермент-субстратного комплекса, распавшихся с излучением [6]. Как правило, проводили не менее 5 измерений. Статистическая обработка полученных экспериментальных результатов осуществляется методом наименьших квадратов с использованием пакета программ Microsoft Excel 1998.

Результаты и обсуждение. Экспериментальное изучение кинетических параметров функционирования ферментов биолюминесцентной биферментной системы НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при добавлении в реакционную среду увеличивающих вязкость органических растворителей сахарозы и глицерина показали, что увеличение вязкости реакционной среды для катализа изменяет кинетику биферментной биолюминесцентной реакции. На рисунке 1 представлена зависимость интенсивности свечения от времени, из которой видно, что моделирование вязкости реакционной среды для катализа разными по природе растворителями с одинаковым значением вязкости приводит к существенно разным профилям биолюминесцентной вспыш-

ки. В сахарозе данный профиль практически совпадает с контролем по форме спада биолюминесценции, отличаясь лишь временем выхода на максимум интенсивности свечения, тогда как в глицерине длительность биолюминесцентной вспышки и время выхода на максимум свечения увеличиваются на порядок, что говорит об увеличении числа оборота ферментативного процесса. Подобную зависимость наблюдали для всех исследуемых концентраций глицерина и сахарозы.

Показано, что глицерин и сахароза ингибируют интенсивность свечения биолюминесценции: при постепенном увеличении концентрации вязкого растворите-

ля в реакционной смеси наблюдается спад максимума интенсивности свечения, который зависит не только от вязкости растворителя, но от его природы (рис. 2). При этом глицерин является более сильным инакти-ватором биферментной биолюминесцентной реакции по сравнению с сахарозой при оптимуме температуры для водно-буферных смесей, который равен 25 °С, как показано в работах [6; 7]. Следовательно, увеличенная вязкость реакционной среды препятствует образованию фермент-субстратных комплексов, образуемых в ходе катализа, и зависит от природы используемого вязкого растворителя.

Рис. 1. Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции от времени в глицерине и сахарозе, моделирующих одинаковое значение вязкости

т

X В

•глицерин

сахароза

10 20 30 40 50

Концентрация растворителя, об. %

60

Рис. 2. Зависимость максимальной интенсивности свечения биолюминесцентной реакции 10

от концентрации растворителя

Экспериментальные модельные среды с различной вязкостью оказывают существенное влияние не только на интенсивность светоизлучения биферментной

биолюминесцентной системы, но и на константу спада биолюминесценции (кса) (рис. 3) и общий выход светоизлучения (рис. 4).

400

->глицерин

-и-сахароза

10 20 30 40

Концентрация растворителя, об.%

60

Рис. 3. Зависимость константы спада светоизлучения от концентрации глицерина и сахарозы

Рис. 4 Зависимость общего выхода светоизлучения от концентрации глицерина и сахарозы

Из полученных результатов видно, что величины kcat и Q не зависят от вязкости реакционной среды, а определяются только природой эффекторов, которыми варьируется вязкость. Показано, что в экспериментальной модели реакционной среды для биолюминесцентного катализа с глицерином kcat увеличивается существенно при высоких концентрациях глицерина в реакционной среде (50%), следовательно, происходит уменьшение времени светоизлу-чения биолюминесцентной реакции, что, вероятно, связано с уменьшением времени жизни долгоживу-щего интермедиата реакций. В реакционной среде, моделируемой сахарозой, происходит уменьшение величины k что может свидетельствовать о стабилизации долгоживущего интермедиата сопряженных ферментативных реакций биферментной биолюминесцентной системы.

Общий выход свечения (Q) биферментной системы изменяется в соответствии с изменениями интенсивности свечения и константы спада светоизлучения (kcat). В экспериментальной модели с сахарозой Q увеличивается, тогда как с глицерином — уменьшается.

Таким образом, показано, что экспериментальная модель реакционной среды для биолюминесцентной биферментной системы с сахарозой характеризуется рядом параметров, улучшающих характеристики данной ферментативной системы: сахароза в меньшей степени по сравнению с глицерином ингибирует скорость биолюминесцентной реакции; в сахарозе наблюдается стабилизация долгоживущего интермедиата реакции и, как следствие, увеличение квантового выхода. Величина общего выхода свечения и константа спада биферментной системы не зависят от вязкости реакционной смеси.

Библиографический список

1. Гительзон И. И., Родичева Э. К., Медведева С. Е. и др. Светящиеся бактерии. — Новосибирск, 1984.

2. Tu SC. Activity coupling and complex formation between bacterial luciferase and flavin reductases // Photochem. Photobiol. Sci. — 2007. — № 7.

3. Kratasyuk V.A., Esimbekova E. N., Gladyshev M. I., Khromichek E. B., Kuznetsov A. M., Ivanova E.A. The use of bioluminescent biotests for study of natural and laboratory aquatic ecosystems // Chemosphere. — 2001. — № 42.

4. Kratasyuk V., Esimbekova E., Nemtseva E., Sviderskaya I. Sukovataya I. Models of enzymes' functioning inside

the luminous bacrteria: new approach // Luminescence. — 2010. — T. 25, № 2.

5. Tjulkova N.A. Purification of bacterial luciferase from Photobacterium leiognathi with use FPLS-sistem // Jezowska-Trzebiatowska B., ed. Biological luminescence. — 1989.

6. Tyulkova N.A., Sandalova T. P. Comparative study of temperature effects on bacterial luciferases // Biochemistry. — 1996. — V. 2, № 61.

7. Sutormin O. S., Sukovataya I. E., Kratasyuk V. A. Thermal stability of coupled enzyme system NAD(p) H:FMN-oxidoreductase-luciferase in solvents of different viscosity // Luminescence. — 2012. — V. 27, № 2.