Фармацевтическая субстанция для лечения инфицированных ран различного генеза
PHARMACEUTICAL SUBSTANCE FOR TREATING INFECTED WOUNDS OF VARIOUS ORIGINS

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой инновационную фармацевтическую субстанцию, способную применяться как самостоятельно, так и в комплексе с антисептическими и/или анестетическими агентами для лечения инфицированных ран различного генеза.
Лечение ран, особенно осложненных, является актуальной проблемой хирургии. Гнойная инфекция считается самым серьезным осложнением, как по летальности, так и по материальным затратам. Частота летальных исходов от гнойно-септических заболеваний и осложнений у стационарных больных за последние годы не снизилась. Частоту возникновения нагноений можно объяснить различными факторами: первоначальным инфицированием раны, шовным материалом, который может вызвать асептическое воспаление в окружающих тканях.
Большое значение имеет ряд обстоятельств, характеризующих состояние входных ворот инфекции и общей реактивности организма. Перекрестные инфекции в структуре госпитальных гнойно-септических инфекций составляют 30% и увеличивают пребывание больных в стационаре в среднем на 15-18 дней.
Как известно, процесс разработки, синтез или получение фармацевтической субстанции с использованием методов биотехнологии является наиболее трудоемким и дорогостоящим этапом производства. В свете вышесказанного является актуальной и необходимой разработка такой фармацевтической субстанции, которая обладала бы комплексной терапевтической активностью, способствовала более быстрому заживлению ран, эффективнее очищала раневую поверхность от гнойно-некротических масс и в то же время была бы менее затратна в производстве.
Одно из направлений современной фармакологии - концепция разработки «многофункциональных лекарств». В рамках этой парадигмы понятию лекарственного средства с максимальной селективностью, действующего на одну строго определенную мишень, противопоставлена широта фармакологического действия и способность лекарственного вещества взаимодействовать одновременно с несколькими мишенями. Многофункциональные лекарства содержат в своей структуре несколько фармакофоров, действие которых дополняет друг друга. Такие препараты имеют более предсказуемый фармакокинетический профиль, у них существенно снижен риск несовместимости с другими препаратами.
Существует множество принципиальных способов и технологических приемов введения лекарства в матрицу, но в любом случае идея, принцип проявления лечебного действия - создание депо, в котором в качестве активного сорбента выступает твердый полимер, в который вводится лекарственное или биологически активное вещество. Из этого депо, содержащего один препарат или смесь, последние, высвобождаясь из депо, переходят в организм (в данном случае, в рану). Принципы формирования депо лекарственных веществ могут быть разными (химическая: ионная или ковалентная связи, физическая сорбция на поверхности носителя, связывание в полимерной композиции). Самой сложной из трех названных технологий является технология, связанная с ковалентной фиксацией лекарства полимером-матрицей, поскольку она требует или специального содержащего определенные функциональные группы полимера, или его химическую модификацию. Но в любом случае биологическая активность действующего начала может проявиться только если он мобилен, подвижен, способен диффундировать из депо в организм (рану, как частный случай) и проявлять лечебные свойства.
Например, имеется патент №2468814 «Ранозаживляющий гель», предназначенный для наружного применения, содержащий хитозан, салициловую кислоту, биорегулятор, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота, представляющий собой фракцию кислых белков в интервале значений pH<3,0, и воду, взятые в определенном соотношении.
Также известен патент №12140264, в котором заявлено средство для наружного применения «Полимед», содержащее фенол медицинский, резорцин, борную кислоту, дистиллированную воду, хитозан, диметилсульфоксид, йодистый калий, уксусную кислоту ледяную, глицерин и анестетик. При раневых поражениях препарат может использоваться как средство доврачебной помощи, так как на поверхности пораженной кожи образует пленку, которая служит защитным покрытием.
К недостаткам указанного средства следует отнести наличие в его составе токсических и канцерогенных веществ, таких как фенол, борная кислота, диметилсульфоксид, которые могут вызывать аллергические реакции со стороны организма при попадании на кожу и оказывать токсическое действие при попадании в кровь. Кроме того, препарат недостаточно эффективен из-за отсутствия в его составе активного ранозаживляющего вещества.
Наиболее близким по технической сущности к заявленному средству является патент №2323748 (от 21.02.2006) «Медицинская повязка, содержащая комплекс ферментов из гепатопакреаса краба, и способ ее получения», в составе которой присутствуют хитозан в качестве носителя и протеолитический комплекс.
На современном фармацевтическом рынке России существуют препараты для лечения инфицированных ран, в том числе представляющие собой комбинации. В основном, это мази на гидрофобной и гидрофильной основе. Однако все они не лишены ряда недостатков. Спектр действия на патогенную микрофлору входящих в состав препаратов активных субстанций недостаточно широк. Также возможны аллергические реакции в случаях гиперчувствительности к компонентам препарата.
Таким образом, задача по разработке новых фармацевтических субстанций, превосходящих существующий уровень техники остается актуальной, а именно разработка субстанций и средств с комплексной протеолитической, антимикробной и регенерирующей активностью для местной терапии инфицированных ран различного генеза.
Задача решалась посредством разработки технологии получения фармацевтической субстанции, которая включает активные компоненты и оказывает терапевтическое воздействие на рану. Ключевые инновационные решения сводятся к получению биологически активного соединения: протеолитического комплекса химопсина с хитозаном (КХХ).
Исходя из вышеуказанных актуальных проблем, для достижения поставленной задачи была разработана фармацевтическая субстанция, которая потенциально может состоять в комплексе с антисептическим и/или анестетическими агентами. Субстанция представляет собой инновационный комплекс хитозан - химопсин (КХХ). Комплекс является оригинальным по составу и способу получения. В доступных патентных и литературных источниках не найдены данные по получению других подобных композиций с протеолитическим ферментом химопсином на основе производных глюкозамина. Предпочтительной формой конечного лекарственного средства является гель.
Для повышения стабильности и оказания пролонгированного действия ферментного комплекса целесообразно осуществлять его иммобилизацию на носители с образованием невалентно связанных комплексов. Учитывая особенности введения (раневая поверхность), к предполагаемому комплексу предъявляются следующие требования: биосовместимость с тканями человека, отсутствие аллергических реакций, пирогенного и токсического действия на здоровые ткани.
В результате экспериментальных исследований по подбору оптимального носителя для получения комплексов с мирамистином и химопсином был выбран хитозан, представляющий собой продукт деацетилирования хитина.
При деацетилировании около 60% хитин становится растворимым в кислоте и превращается в хитозан. Это происходит путем протонирования свободных аминогрупп при pH примерно ниже 5.
3
2
3+
В хитозане присутствуют функциональные группы, такие как: -ОН, NHCOOCH, -NH. Аминогруппы придают хитозану свойства катионного полиэлектролита (pKa≈6.5) с уникальными свойствами. Материалы на основе хитозана обладают положительным зарядом NH групп, благодаря чему способны удерживаться на отрицательно-заряженных поверхностях или удерживать на себе биомолекулы с низкой изоэлектрической точкой, образуя интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК). Реакция образования таких комплексов в водных растворах полностью обратима. В комплексах отмечено два типа участков: упорядоченные участки, которые образованы противоположно заряженными звеньями обоих полиэлектролитов, связанных друг с другом (А), и участки, которые чередуются с дефектами или петлями, образованными последовательностями разобщенных звеньев полиэлектролитов (В). Благодаря наличию гидрофильных звеньев в дефектных участках (В), интерполиэлектролитные комплексы набухают в воде. Гидрофобные упорядоченные участки (А) ограничивают способность к набуханию и обуславливают их нерастворимость в воде. Благодаря своей химической природе хитозан способен к различным видам взаимодействия с образованием четырех основных типов связей: ковалентных, ионных, водородных, гидрофобных, а также связей по типу комплексообразования, в котором хитозан выступает в роли комплексообразователя.
Таким образом, основой комплекса предпочтительно является хитозан. Доказано ранозаживляющее действие хитозана, которое может быть объяснено такими механизмами, как активация иммунного ответа через стимуляцию макрофагов и использование ацетилглюкозамина в качестве предшественника мукополисахаридов, которые непосредственно участвуют в создании биоструктур, стимулируют пролиферацию фибробластов, увеличивают выделение медиаторов иммунного ответа. Механизм стимулирующего влияния хитозана на иммуногенез связывают с адъювантным действием полимеров, с их способностью оказывать влияние на процессы, происходящие на начальных этапах иммуногенеза, по-видимому, на этапе захвата антигена макрофагами и передачи антигенной информации В-лимфоцитам. Увеличение времени контакта антигена с макрофагами приводит к усилению иммунологического стимула. Кроме влияния на звено иммуногенеза, связанного с макрофагами, хитозан вызывает изменения миграции и кооперативных взаимодействий клеток, участвующих в иммунном ответе, а эффект стимуляции клеточного взаимодействия может быть опосредован через систему комплемента.
Разработка фармацевтической субстанции - комплекса хитозан - химопсин (КХХ)
При разработке субстанции КХХ была проведена серия экспериментов с целью выбора протеолитического компонента.
Изменение ферментативной активности образцов в 1/15 М калий-натрий фосфатном буфере (ФБ) изучали при различных температурах. Одновременно с определением активности снимали УФ-Вид спектры буферных растворов после выдерживания в них образцов препаратов.
Выбор активных компонентов, и в первую очередь протеолитика, базируется на теоретической и экспериментальной основе. Важно не только получить препарат с высокой специфической активностью, но и сохранить ее в соответствии со сроком годности лекарственного средства. Сохранение ферментативной активности является важным параметром, который необходим для дальнейшего его хранения и практического применения. Модификация фермента включает несколько факторов, влияющих на его структуру. Это химическое модифицирование отдельных групп белковой молекулы, приводящее к изменению заряда этих групп или их гидрофильности, а также кооперативное взаимодействие белка и матрицы, сопровождающееся образованием множественных связей (имеющих часто различную природу), приводящее как к повышению жесткости структуры, так и к нарушению ее нативности. Эти факторы могут влиять на устойчивость белка к денатурирующим воздействиям, повышая или понижая его стабильность.
Наблюдаемое изменение стабильности фермента может быть связано либо с изменением активационных параметров денатурации (кинетическая стабильность), либо с изменением равновесных параметров (термодинамическая стабильность), либо и с тем, и с другим. Кроме того важно знать, какие факторы - энтальпийные или энтропийные - вносят существенный вклад в изменение активационных и равновесных параметров денатурации. Модификация фермента и образование солевых или иных связей с матрицей приводит к повышению устойчивости белка за счет существенного понижения энтропии активации, причем наблюдающееся при этом понижение энтальпии активации перекрывается энтропийным вкладом.
Можно выделить три основных механизма взаимодействия хитозана с белками: образование полиэлектролитного комплекса (ПЭК), инкапсулирование белков в хитозановый гель и их адсорбция на агрегатах хитозана (Фиг. 1). Путь, по которому протекает взаимодействие, может определяться концентрацией находящегося в среде хитозана: при малых концентрациях хитозана происходит образование ПЭК, при ее увеличении - инкапсулирование белков в хитозановый гель, и при больших концентрациях хитозана наблюдается его агрегирование, в результате чего молекулы белков адсорбируются на поверхности сформировавшихся хитозановых агрегатов.
Для выбора протеолитического фермента в качестве активного компонента было изучено взаимодействие растворов хитозана с различными ферментными препаратами - трипсином, протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба и химопсином.
Трипсин - наиболее распространенный фермент, относящийся к сериновым протеиназам. Трипсин расщепляет только денатурированный белок, благодаря чему способен расщеплять некротизированные ткани и фибринозные образования, разжижать вязкий секрет, экссудат, сгустки крови, не затрагивая здоровые ткани.
ПК (протеолитический комплекс) - это комплекс протеолитических ферментов животного происхождения, выделяемый из гепатопанкреаса краба. Протеолитический комплекс обладает коллагенолитическим и фибринолитическим действием и состоит из множества отдельных ферментов: коллагенолитические сериновые протеиназы, эластаза панкреатическая, трипсин, химотрипсин, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза, фосфодиэстераза, фосфатаза, липаза и β-глюканаза.
Химопсин - ферментный препарат комплексного протеолитического действия. Активными действующими веществами являются химотрипсин и трипсин, обладающие протеолитической активностью. Компоненты химопсина расщепляют различные пептидные связи в белковой молекуле: трипсин гидролизует пептидные связи, содержащие остатки аргинина и лизина; химотрипсин расщепляет пептидные связи с остатками ароматических аминокислот - тирозина и триптофана.
Комплексы хитозана с протеолитическими ферментами получают при последовательной обработке хитозана раствором уксусной кислоты, введением в образовавшийся гель фермента, тщательным перемешиванием в реакторе с последующей сушкой.
Помимо выбора протеолитического компонента как основного действующего вещества в данной композиции, был осуществлен выбор концентрации хитозана. Для этого был приготовлен ряд растворов хитозана с концентрацией от 0,5 до 1,5 масс %. Растворы ферментов, отобранные для эксперимента, также готовились в различных концентрациях от 0,01 до 0,03%. Учитывалось время реакции и температура, при которой она протекала. Основная цель эксперимента - найти правильное соотношение носителя и активного вещества.
Пример 1
Приготовление 0,5%, 1%; 1,5% раствора хитозана с добавлением уксусной кислоты.
Растворы готовятся путем перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. После полного растворения хитозана раствор оставляют на сутки при комнатной температуре для дальнейшего структурирования. Далее производится иммобилизация фермента в разных концентрациях на хитозановый носитель (трипсина, ПК, химопсина).
Протеолитические ферменты - трипсин, протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба и химопсин в различных количествах: 100 мг, 200 мг и 300 мг растворялись в растворах хитозана разных концентраций, подвергались перемешиванию на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение двух часов.
Перед тем, как приступить к этапу высушивания образцов, проводилась промежуточная оценка протеолитической активности. Данные приведены в Таблице 1.
В ходе проведения эксперимента необходимо было выбрать адекватный метод сушки, наиболее щадящий по отношению к биологически активным веществам, входящим в композицию.
При высушивании на воздухе при комнатной температуре образуются тонкие хрупкие пленки. Для получения пленок Хт-фермент полученный гель (после полного растворения фермента) раскапывали (обычно 100 μl раствора) на полиэтиленовую подложку. Для определения ферментативной активности вырезали подложку с высохшим гелем и помещали в пробирки с субстратом. В специально проведенных опытах было установлено, что подложка является инертной и не оказывает влияния на ферментативную активность исследуемых препаратов.
Одним из вариантов высушивания является лиофильная сушка - способ мягкой сушки, при котором высушиваемое вещество замораживается и посредством вакуума происходит возгонка растворителя. Образцы после лиофильной сушки легко растворяются, что упрощает лабораторные исследования. Это возможно благодаря тому, что объем высушиваемой смеси меняется незначительно за счет образования мелкокристаллической структуры.
Выбор лиофильной сушки в получении экспериментальных субстанций обусловлен рядом преимуществ:
- благодаря низкой температуре отсутствует опасность микробиологического заражения, при этом ферментативное расщепление сводится к минимуму;
- благодаря высокому вакууму отсутствует опасность окисления нестабильных веществ кислородом;
- в высушиваемом продукте остается менее 1% влаги, потому его можно долго хранить.
Кроме перечисленных достоинств этого метода, в данном случае имеет место удаление избыточного количества уксусной кислоты, используемой для растворения хитозана. Высушенный материал сохраняет свою структурную целостность и биологическую активность в большей мере, чем пленки, высушенные на воздухе. При увлажнении материал восстанавливает свои первоначальные свойства.
Лиофилизация гелеобразных растворов ферментов в хитозане проводится в замороженном состоянии под вакуумом, при этом вода удаляется из замороженной субстанции путем сублимации льда, т.е. превращения его в пар, минуя жидкую фазу.
Гелеобразный раствор расфасовывают по 100 мл в контейнеры, замораживают в морозильной камере при температуре -40°C и помещают в вакуумную камеру лиофильной сушильной установки для сублимации льда. Общий объем загрузки 0,5 л (500 г). Проводят два цикла лиофильной сушки. Время сушки ~20-24 часа. Необходимо отметить, что увеличение концентрации хитозана несколько затрудняет процесс лиофилизации, увеличивая время процесса. Получают лиофилизированную массу субстанции в форме порошка в количестве 14,8 г в контейнере.
Оценка протеолитической активности проводилась в пленках и лиофилизате и зафиксирована в Таблице 2.
Как видно из приведенных в таблице данных, протеолитическая активность образцов после высушивания путем лиофилизации практически не изменилась.
Для выбора оптимальных условий получения иммобилизованных препаратов было изучено влияние способа иммобилизации и хранения на биологическую активность созданных систем.
Кинетика инактивации ферментов в процессе иммобилизации, высушивания или хранения описывается характерной для гидролаз сложной экспоненциальной зависимостью.
ин
0
Эффективную константу скорости инактивации k определяли как тангенс угла наклона прямой зависимости натурального логарифма величины остаточной активности от времени (полулогарифмические координаты ln(A/A)-τ) аналогично. В специально проведенных опытах было установлено, что на процент сохранения ферментативной активности не влияет количество ферментов в пробе (как для иммобилизованного, так и для немодифицированного ПК или X). Полученные данные приведены в Таблице 3.
В Таблице 3 в качестве примера приведены данные о потере ферментативной активности при высушивании и хранении на воздухе (на полиэтиленовой подложке) препаратов ПК, трипсина, химопсина, гелей Хт-ПК, Хт-Тр, Хт-Х при 25°C.
d
1
2
1
2
где k - эффективная константа скорости инактивации в процессе высушивания (обычно за 20 часов), k - характеризует лабильную часть фермента, а k - стабильную. При сравнении полученных систем были рассчитаны эффективные константы инактивации для полученных препаратов, где наименьшая константа соответствует минимальной потере ферментативной активности, k характеризует ферменты, связанные слабыми связями или включенные в препарат механически (лабильная часть препарата), k - связанные прочными связями (стабильная часть препарата).
t
t
2
Количественной мерой стабилизации при тепловой инактивации служит величина эффекта стабилизации (Θ) при данной температуре, которая представляет собой отношение констант скорости инактивации нативного и иммобилизованного фермента. Если Θ>1, значит, иммобилизация ферментов стабилизирует их при данной температуре. Для иммобилизованных препаратов расчет Θ необходимо проводить, используя k.
Термостабильность препаратов исследовали при различных значениях pH. Пробирки с пробами помещали в предварительно прогретый водяной термостат. В определенное время отбирали пробы и измеряли остаточную активность фермента. Полученные данные приведены в таблице 4.
* Пленки химопсина получали при высушивании на полиэтиленовой подложке раствора химопсина.
** Пленки Хт-Х(гель) получали при высушивании на полиэтиленовой подложке раствора геля Хт-Х.
*** Пленки химопсина на высушенном Хт получали при нанесении раствора химопсина на уже высушенную пленку Хт.
Одной из существенных целей, которую преследует модификация (иммобилизация) ферментов, является их стабилизация, определяемая по сохранению активности при более высокой температуре или в течение более длительного времени использования в заданных условиях по сравнению с исходным ферментом в растворе. Модификация фермента включает несколько факторов, влияющих на его структуру. Это химическое модифицирование отдельных групп белковой молекулы, приводящее к изменению заряда этих групп или их гидрофильности, а также кооперативное взаимодействие белка и матрицы, сопровождающееся образованием множественных связей (имеющих часто различную природу), приводящее как к повышению жесткости структуры, так и к нарушению ее нативности. Эти факторы могут влиять на устойчивость белка к денатурирующим воздействиям, повышая или понижая его стабильность. Наблюдаемое изменение стабильности фермента может быть связано либо с изменением активационных параметров денатурации (кинетическая стабильность), либо с изменением равновесных параметров (термодинамическая стабильность), либо и с тем, и с другим.
Было исследовано взаимодействие структурных единиц хитозана (N-ацетиглюкозамина, глюкозамина) с изучаемыми ферментными препаратами и показано, что N-ацетилглюкозамин не влияет на ферментативную активность исследованных ферментов, в то время как глюкозамин способен снижать активность при концентрациях более 5 мМоль.
Данные о взаимодействии хитозана с различными ферментами и ферментными комплексами: трипсин (Тр), ПК и химопсин отображены на Фиг. 2.
Хитозан незначительно понижает ферментативную активность исследованных ферментов (не более 30%) по отношению к высокомолекулярному субстрату (казеин или азоколл).
Взаимодействие белков с хитозаном может проходить по следующей схеме, изображенной на Фиг. 3.
Анализ дзета потенциала и геометрических параметров исследуемых систем (Таблица 5) также подтверждает предложенные варианты взаимодействия ферментов и хитозана.
Таким образом, отсутствие сильного взаимодействия (образование ионных или иных сильных связей) между Хт и исследованными белками (кроме ПК) и отсутствие инкапсулирования молекул фермента в Хт, по-видимому, и приводит к отсутствию потери ферментативной активности при растворении фермента в Хт.
На основании результатов проведенных экспериментальных работ обнаружено, что оптимальным протеолитическим компонентом комплекса является химопсин. Выбор химопсина, который является протеолитическим комплексом, объясняется тем, что сочетание двух протеолитических ферментов повышает эффективность терапии за счет усиления лечебного действия благодаря полноценному (более быстрому и полному) гидролизу пептидных связей.
Характеристика фармацевтической субстанции - комплекса хитозан - химопсин (КХХ)
Комплекс хитозан - химопсин КХХ представляет собой комбинированную фармацевтическую субстанцию ферментного препарата протеолитического действия - химопсина и высокомолекулярного полисахарида природного происхождения - хитозана кислоторастворимого.
Пример 2. Технология получения фармацевтической субстанции - комплекса хитозан - химопсин (КХХ)
1. Приготовление водного раствора хитозана. В реактор помещают 10,0 г хитозана, добавляют 5,7 мл (6,0 г) 0,5% раствора уксусной кислоты (d=1.05 кг/л), хорошо перемешивают и оставляют стоять смесь 5-10 минут до увлажнения и набухания хитозана. Затем медленно, при постоянном перемешивании приливают воды очищенной до 1,0 л. Полученную суспензию интенсивно перемешивают в течение 1,5-2,0 часов до практически полного растворения хитозана и оставляют стоять при комнатной температуре 10-12 часов до получения однородного гелеобразного раствора хитозана. pH раствора 4,5-5,5.
2. Иммобилизация ферментного комплекса химопсина на хитозан. В приготовленный раствор хитозана в реакторе добавляют 2,0 г химопсина, Смесь непрерывно перемешивают в течение 0,5-1,0 часа до полного растворения химопсина. Иммобилизацию проводят при комнатной температуре. Массовое соотношение хитозана и химопсина составляет 5:1, pH раствора 4,5-5,5.
Получают 1000 г гелеобразного раствора комплекса хитозан-химопсин КХХ.
3. Получение лиофилизированной массы комплекса хитозан-химопсин. Субстанцию КХХ получают путем лиофилизации гелеобразного раствора КХХ в замороженном состоянии под вакуумом, при этом вода удаляется из замороженной субстанции путем сублимации льда, т.е. превращения его в пар, минуя жидкую фазу. Водяной пар откачивается из рабочей камеры вакуумным насосом и конденсируется на змеевиках низкотемпературного конденсора. Во избежание потерь лиофилизированной массы при упаковке, расфасовку гелеобразного раствора КХХ осуществляют в контейнеры, предназначенные для складирования и хранения субстанции КХХ.
Гелеобразный раствор КХХ расфасовывают по 100 мл в контейнеры, замораживают в морозильной камере при температуре -40°C и помещают в вакуумную камеру лиофильной сушильной установки для сублимации льда. Общий объем загрузки 1,0 л (1000 г). Проводят два цикла лиофильной сушки. Время сушки ~20-24 часа.
Получают лиофилизированную массу субстанции КХХ в форме пластинок, порошка в количестве 14,8 г.
4. Контроль качества. В полученной субстанции определяют содержание остаточной влаги. Влажность образцов субстанции КХХ должна быть не более 10%. (ГФ X1, стр. 176). Проводят качественную реакцию на хитозан. Испытуемый препарат должен окрашивать раствор йода с добавлением йодида калия в 0,13 М азотной кислоте в фиолетовый цвет.
Проводится также качественная реакция на химопсин. Испытуемый препарат должен обладать способностью створаживать молоко. Время створаживания для субстанции КХХ должно быть не более 50 сек. Эти реакции подтверждают подлинность компонентов.
К количественному определению относится определение белка по Лоури-Гартли и определение протеолитической активности. Субстанция КХХ должна содержать - (1,95±0,5) г белка (химопсина) в 10 мг препарата.
Протеолитическая активность раствора комплекса химопсин-хитозан составляет 2,75 ПЕ/мл. Протеолитическая активность субстанции КХХ в форме лиофилизированной массы в конце срока хранения не менее 0,1 ПЕ/мг.
В результате проведения серии экспериментов с целью выбора протеолитического компонента, подбора оптимального состава композиции и технологических параметров ее получения, а также выбора концентрации хитозана и растворов ферментов, отобранных для эксперимента, было зафиксировано следующее:
- оптимальным методом получения композиции с химопсином является метод физической иммобилизации с последующей лиофильной сушкой;
- оптимальным полимером для получения композиции является хитозан;
- оптимальное массовое соотношение химопсин/хитозан равно 1:5.
Предпочтительный состав комплекса КХХ -хитозан-химопсин(количество, в % (масс)):
Химопсин - 0,2
Хитозан - 1,0
Уксусная кислота - 0,6
Вода очищенная - до 100,0
Свойства фармацевтической субстанции - комплекса хитозан-химопсин (КХХ)
Обязательным этапом является проведение качественных и количественных реакций, устанавливающих подлинность по химопсину.
Пример 3. Определение створаживающей способности химопсина. Определение УФ-спектров, определение протеолитической активности и определение количества белка по методу Лоури-Гартли
Определение створаживающей способности
Метод основан на способности химопсина створаживать молоко. Раствор молока готовят непосредственно перед проведением анализа. Приготавливают 1 М ацетатного буфера (pH 5,6).
Около 12 мг препарата растворяют в 4 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора (pH 5,6). В три пробирки вместимостью 10 мл вносят по 3 мл раствора молока и пробирки прогревают в течение 15 мин при (35,5±0,5)°C. Затем в две пробирки (последовательно) добавляют по 0,5 мл раствора испытуемой субстанции, взбалтывают и отмечают время по секундомеру. Наблюдение проводят в проходящем свете, не вынимая пробирок из термостата. Конец реакции отмечают по появлению первых признаков створаживания. В контрольную пробу (3-я пробирка) к раствору молока добавляют 0,5 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора (pH 5,6) и выдерживают в термостате 60 мин по секундомеру. Молоко не должно свертываться.
Створаживающая активность выражается временем, прошедшим с момента добавления субстанции до появления первых признаком створаживания молока. Время створаживания для субстанции КХХ должно быть не более 50 сек, что и было зафиксировано в процессе эксперимента.
Определение УФ-спектров субстанции КХХ
К качественным реакциям на химопсин, определяющим его подлинность, относится также УФ-спектр поглощения раствора препарата в области от 240 до 300 нм. Мах поглощения соответствует 279 нм.
Были определены УФ-спектры химопсина, хитозана и фармацевтической субстанции КХХ (комплекс химопсин-хитозан) с целью выяснения возможности этого метода отражать подлинность данной субстанции.
На спектрах бинарных смесей нет новых пиков или впадин, что свидетельствует об отсутствии сильных валентных образований или ковалентной или ион-ионной связи между молекулами хитозана или химопсина (Фиг. 4-6).
Определение протеолитической активности
Протеолитическая активность (ПА) характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеиназы в 1 грамме препарата. Методы определения активности протеолитических ферментов в большинстве случаев основаны на количественном учете низкомолекулярных продуктов (аминокислот и пептидов) или хромогенных веществ, образующихся при ферментативном гидролизе субстрата.
Данная методика устанавливает определение протеолитической активности белка в комбинированных медицинских препаратах с иммобилизованными ферментами и ферментными комплексами, такими как химопсин, химотрипсин, трипсин коллагеназа, эластаза, проназа и другими протеазами. Данная методика является модификацией метода KunitzM. et. al. Метод основан на гидролизе казеина по Гаммерстену исследуемым ферментным препаратом до пептидов и аминокислот с последующим их определением.
Приготовление 0,067 М фосфатного буферного раствора.
Смешиванием различных объемов растворов гидрофосфата натрия (Na2HOP4⋅12H2O) и дигидрофосфата калия (KH2PO4) получают растворы с различным значением pH.
Приготовление 2% раствора казеина по Гаммерстену. 2,0 г казеина по Гаммерстену растворяют в 100 мл фосфатного буфера с рН=8,0 при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После растворения измеряют pH раствора и при необходимости доводят его до рН=8,05 М раствором натрия гидроксида. Раствор используют свежеприготовленным.
Приготовление 10% раствора кислоты трихлоруксусной. В мерную колбу вместимостью 1000 мл наливают 200-250 мл воды и вносят 100,0 г кислоты трихлоруксусной. После растворения кислоты объем раствора доводят водой до метки и перемешивают.
Приготовление раствора А. 36,2 мг тирозина (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворяют в 100-150 мл раствора Б и доводят объем до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора содержит 0,40 мкМоль тирозина.
Приготовление раствора Б. В мерную колбу вместимостью 500 мл приливают 250 мл фосфатного буферного раствора рН=8,0 и доводят до метки 10% раствором трихлоруксусной кислоты. Раствор используют свежеприготовленным.
Построение калибровочного графика. В пробирки с притертыми пробками приливают растворы А и Б в соответствии с Таблицей 3.
Растворы перемешивают, выдерживают при комнатной температуре 10-15 мин и измеряют оптическую плотность (D) на спектрофотометре при длине волны (280±2) нм в кювете толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор Б.
Калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс концентрацию тирозина (С), а на оси ординат соответствующую оптическую плотность (D).
За единицу протеолитической активности (ПЕ) принимают количество фермента, которое за 1 мин при температуре 37°С катализирует переход в неосаждаемое состояние, 10% раствором кислоты трихлоруксусной, такого количества казеина, которое соответствует 1 мкМоль тирозина.
Испытуемый раствор. Около 0,2 г (точная навеска) субстанции КХХ помещают в мерную колбу объемом 20 мл, добавляют 10 мл воды дистиллированной, смесь перемешивают до полного растворения субстанции и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
Раствор субстрата. В качестве субстрата используют 2% раствор казеина по Гаммерстену (MP Biochemicals, 0210128901) в 0,067 М растворе фосфатного буфера, рН 8,0. Перед анализом рН раствора казеина доводят до рН 8,0 раствором 30% натрия гидроксида. Раствор субстрата хранят в темноте при температуре 5-7°C не более 10 дней.
Для определения берут три аналитические пробы испытуемого раствора объемом 0,05 мл - две опытные и одна контрольная.
В три пробирки с притертыми пробками вместимостью 10 мл приливают 2,0 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора с рН=8,0 и 2,0 мл 2% раствора казеина по Гаммерстену в каждую. Пробирки закрывают пробками и помещают в водяной термостат при температуре (37±0,5)°С. Через 10 мин в опытные пробирки быстро приливают испытуемый раствор. Реакцию останавливают через 25-30 минут (точное время отмечают по секундомеру) добавлением в опытные пробирки по 4 мл 10% раствора кислоты трихлоруксусной (ТХУ). Через 15 мин раствор фильтруют через среднефильтрующий бумажный фильтр «Синяя полоса», в фильтрате спектрофотометрически определяют оптическую плотность при длине волны (280±2) нм в кювете толщиной 10 мм.
В контрольную пробирку сначала добавляют 4 мл 10% раствора ТХУ, а затем испытуемый раствор, далее аналогично опытным.
Спектрофотометр настраивают по раствору, состоящему из равных объемов 0,067 М фосфатного буферного раствора и 10% раствора трихлоруксусной кислоты.
Протеолитическую активность X вычисляют по формуле:
1
A - оптическая плотность испытуемого раствора при 280 нм;
2
А - оптическая плотность контрольного раствора при 280 нм;
1
V - объем испытуемого раствора, мл;
V - объем реакционной смеси в пробирке, мл;
0
V - объем аналитической пробы субстанции, мл;
а - навеска субстанции, в мг;
Кт - тирозиновый коэффициент - 1,20;
t - время реакции, мин;
Норма: Протеолитическая активность субстанции КХХ должна быть не менее 0,1 ПЕ/грамм, что и было установлено в результате эксперимента.
Определение количества белка по Лоури-Гартли
Методика устанавливает определение количества иммобилизованного белка методом Лоури-Гартли, которая может быть использована для определения общего белка в комбинированных медицинских препаратах с иммобилизованными протеолитическими ферментами, такими как химопсин, химотрипсин, трипсин и другими аналогичной природы.
A. 2 г Калия-натрия виннокислого 4-водного и 100 г натрия карбоната безводного помещают в мерную колбу вместимостью 1 литр, растворяют в 500 мл 1 М раствора натрия гидроксида, перемешивают и доводят до метки водой дистиллированной.
Б. 2 г Калия-натрия виннокислого 4-водного и 1 г меди сульфата 5-водного растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 90 мл воды дистиллированной и доводят до метки 1 М раствором натрия гидроксида.
B. Разведенный реактив Фолина. 1 объем концентрированного реактива Фолина разводят 8÷15 объемами воды (в зависимости от нормальности). Раствор используют свежеприготовленным.
Берут три пробирки (одна контрольная, две опытные). К навескам образца, помещенным в опытные пробирки, приливают по 1 мл воды, тщательно перемешивают и добавляют 0,9 мл реактива А. Пробирки инкубируют в водяном термостате при 50°С в течение 10 мин. После охлаждения до комнатной температуры в пробирки добавляют по 0,1 мл реактива Б, выдерживают при комнатной температуре 10 мин, затем быстро добавляют по 3 мл разведенного реактива Фолина и вновь инкубируют в течение 10 мин при 50°С. После охлаждения до комнатной температуры в каждую пробирку добавляют 5 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и измеряют интенсивность окраски при 650 нм на спектрофотометре UV-Vis-СФ2000.
В контрольную пробирку помещают навеску образца без фермента, обрабатывают параллельно теми же растворами, что и образцы в опытных пробирках. Калибровочную кривую строят каждый раз, используя раствор химопсина с концентрацией 1,0 мг в 10 мл 0,0001 М HCl.
На графике (Фиг. 7) показана линейная зависимость оптической плотности раствора от концентрации химопсина, что иллюстрируется полученным для расчета уравнением:
Д=0.0021⋅С,
Где Д - оптическая плотность раствора, опт. ед;
С - концентрация химопсина, мкг.
Таким образом, в результате экспериментов были зафиксированы и подтверждены свойства заявленной фармацевтической субстанции, ее качественный и количественный состав и отработана технология ее получения. Разработанная инновационная субстанция способна применятся как самостоятельно, так и предпочтительно в комплексе с антисептическими препаратами, а также анестетиками, что заметно улучшает потенциал разработанной фармацевтической субстанции.
Субстанция в составе готовой лекарственной формы может представлять собой мазь, спрей, крем или гель. Гелевая форма препарата для лечения ран, особенно сложных, длительно незаживающих, является предпочтительной как в силу использования водной основы, так и других серьезных преимуществ: мягкое воздействие на рану, сохранение влажной среды, понижение температуры раны, обезболивающий эффект.
Предпочтительный состав и способ получения субстанции указывает на то, что ее получение не требует высоких затрат и подходит для промышленного производства. Данная возможность определяет доступность, пролонгированность и универсальность субстанции и способствует расширению арсенала ранозаживляющих и антимикробных средств.