Композиция на основе лития цитрата и мелатонина с антиглиобластомным действием
COMPOSITION BASED ON LITHIUM CITRATE AND MELATONIN WITH ANTI-GLIOBLASTOMA EFFECT

Изобретение относится к области водорастворимых композиций, в частности для медицинского применения в качестве нейротропного средства при опухолевых процессах головного мозга.
Известно, что мультиформная глиобластома (МГБ) - одна из самых распространенных злокачественных опухолей головного мозга [1,2]. Стандартное лечение включает хирургическую операцию, облучение и химиотерапию. Прогноз болезни неблагоприятный, медиана выживаемости больных 6-12 месяцев [3]. Считается, что причина терапевтической резистентности МГБ связанна с наличием в составе клеточной популяции МГБ опухолевых стволовых клеток (ОСК), обладающих уникальными сигнальными и морфогенными свойствами. Клетки этого типа почти независимы от внешних сигналов, обладают мультипотентностью, самой высокой пролиферативной активностью среди всех клеток МГБ, способностью к самообновлению и восстановлению поврежденной ДНК. ОСК взаимодействуют как с общим пулом клеток МГБ, так и с клетками других типов, поглощаемых опухолью - микроглиоцитами, клетками эндотелия фибробластами, моноцитами и иммунными клетками, что делает эту цель практически не доступной для поражения с применением существующих методов и технологий.
Для воздействия на глиому наиболее близким к заявляемой композиции является препарат лития хлорид (LiCl), нацеленный на клетки глиомы, который диффузно проникает в нормальный мозг [4, 5]. Литий эффективно блокировал миграцию клеток глиомы. Наблюдаемые эффекты были дозозависимыми и обратимыми и работали с использованием каждой из протестированной клеточной линии глиомы. Лечение литием было связано с заметным изменением морфологии клеток, когда клетки втягивали длинные отростки на своем переднем крае. Изучение известных мишеней лития показало, что ингибирование инозитол-монофосфатазы не оказывало влияния на миграцию глиомы, в то время как ингибирование киназы гликогенсинтазы-3 (GSK-3) оказывало. Отмечается и эффективность лития хлорида в сочетании с темозо ломи дом: комбинация с 1,2 мМ Li потенцировала индуцированную ТМЗ гибель клеток в клетках глиомы TP53wt, что определяли анализы образования нейросфер и апоптоза. Темозоломид в сочетании с обработкой литием ингибировал активацию GSK-3, способствовал ядерной транслокации NFAT1 и повышал экспрессию Fas/FasL. Направленный нокдаун экспрессии NFAT1 блокировал индукцию гибели клеток TMZ и Li посредством ингибирования FasL.
Однако, недостатком использования лития хлорида является его достаточно высокая токсичность по отношению к здоровым клеткам. Так, полулетальная доза (ЛД50) лития хлорида составляет 255 мкг/кг [6]. Известно, что среднесмертельная доза лития цитрата (ЛД50) при внутрижелудочном введении крысам составляет 1517 мг/кг массы тела, а при внутрибрюшинном введении - 1025 мг. Для цыплят LD50 составила 2013 мг/кг [7].
Настоящим изобретением для воздействия на глиому предлагается водная композиция, содержащая четырехводный лимоннокислый литий (лития цитрат), который значительно превышает по безопасности лития хлорид, в сочетании с гормоном эпифиза - мелатонином. Совместное их действие оказывает в целом синергический эффект, заключающийся в понижении жизнестойкости клеток глиомы за счет лития и сохранении жизнеспособности клеток фибробластов при воздействии на них лития за счет мелатонина.
Оценка жизнестойкости опухолевых клеток проводилась по следующей методике. Клетки глиобластомы человека (U-87MG) и нормальных фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) размораживали и культивировали в течение 5-7 пассажей. Далее клетки были помещены в лунки 96-луночного планшета в количестве 7 тыс. клеток на лунку с добавлением 100 мкл среды DMEM/F12 с 10% сыворотки. В каждую лунку был добавлен либо чистый цитрат лития (5 mM), либо в сочетании с мелатонином (0,12 mM). Итоговые концентрации вещества на 100 мкл питательной среды составили: 3.91, 7.81, 15.62, 31.25, 62.5, 125, 250 мкг/мл. Контрольные клетки инкубировались в чистой питательной среде. Через 4 суток инкубации клеток с тестируемыми соединениями проводили МТТ тест для оценки числа живых клеток в каждой лунке. Для этого среду с препаратом заменяли на чистую питательную среду и добавляли 10 мкл раствора МТТ (в концентрации 5 мг/мл) в каждую лунку. Клетки инкубировали еще 4 часа, затем среду удаляли и вносили ДМСО по 100 мкл/лунку с последующим ресуспендированием раствора и его инкубацией в течение 5 мин при температуре 37°С в термостате. После инкубации измеряли оптическую плотность полученного раствора на BioRadiMarkMicroplatereader при длине волны 490 нм. В качестве нулевого контроля использовали лунки без клеток с раствором ДМСО без добавления МТТ-реагента. По полученным результатам рассчитывали долю живых клеток. Жизнеспособность клеток в каждой лунке считалась как процент от контрольных клеток. Лунки с контрольными клетками принимались за 100% [8].
Полученные результаты приведены в примерах и таблице.
Пример 1. Водный раствор композиции, содержащий мелатонин в концентрации 0.003 мг/мл и лития цитрат 0.031 мг/мл, приводит по вышеуказанной методике к понижению жизнестойкости опухолевых клеток U-87MG до 35% от исходной 100%-ной величины. При данных концентрациях мелатонина и лития уровень жизнестойкости ФБЧ составляет 100%.
Пример 2. Водный раствор композиции, содержащий-добавлен мелатонин в концентрации 0.01 мг/мл и лития цитрат 0.062 мг/мл, приводит по вышеописанной методике к понижению жизнестойкости U-87MG до 20% от исходной 100%-ной величины. Уровень жизнестойкости ФБЧ при этом составляет 80%.
Пример 3. Водный раствор композиции, содержащий мелатонин (МТ) в концентрации 0,015 мг/мл и лития цитрат 0,126 мг/мл, приводит по методике к понижению жизнестойкости U-87MG до 20% от исходной 100%-ной величины. Уровень жизнестойкости ФБЧ составляет 60%.
Из приведенных примеров в таблице видно, что найдено оптимальное соотношение концентраций в композиции из лития цитрата и мелатонина, способствующего эффективной гибели раковых клеток на 65-80% в эксперименте invitro при сохранении жизнеспособности фибробластов (60-100%).
1. Louis D.N. The next step in brain tumor classification: "Let us now praise famous men"or molecules? // ActaNeuropathol. - 2012. - Vol.124, No 6. - P. 761- 762.
2. A. Brodbelt, D. Greenberg, T. Winters, M.Williams, S. Vernon, V.P. Collins // Eur J Cancer. -2015. - Vol.51, No 4. - P. 533 - 542.
3. Брюховецкий И.С. Взаимодействие стволовых и опухолевых клеток на модели глиобластомы. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Владивосток, 2017. Министерство образования и науки РФ. Дальневосточный федеральный университет.
4. NowickiMO, DmitrievaN, SteinAM, CutterJL, GodlewskiJ, SaekiY, NitaM, BerensME, SanderLM, NewtonHB, ChioccaEA, LawlerS. Lithiuminhibitsinvasionofgliomacells; possibleinvolvementofglycogensynthasekinase-3. Neuro Oncol. 2008 Oct;10(5):690-9. doi: 10.1215/15228517-2008-041
5. Han, S., Meng, L., Jiang, Y. et al. Lithium enhances the antitumour effect of temozolomide against TP53 wild-type glioblastoma cells via NFATl/FasLsignalling. Br J Cancer 116, 1302-1311 (2017). https://doi.org/l 0.1038/bic.2017.89
6. Менынанов, П.Н. Токсические эффекты хлорида лития в раннем неонатальном периоде развития крыс / П.Н. Меныпанов, А.В. Баннова, Н.Н. Дыгало // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. -Том 160, №10. - С.460- 464.
7. Бурсуков, А.В. Изучение токсических свойств соли лития цитрата / А.В. Бурсуков // Успехи естествознания. - 2004. - №1. - С.90-91.
8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / А. Н. Миронов [и др.]; под ред.: А. Г. Муляра, О. Н. Чиченкова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.