УСТРОЙСТВО ДЛЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Полезная модель относится к молекулярной биологии и биотехнологии, и конкретно к устройствам для синтеза полипептидов и белков в бесклеточных системах.
Уровень техники
Рассматриваемая полезная модель относится к устройствам для синтеза полипептидов и белков в бесклеточных системах. Конструкции устройств для бесклеточного синтеза проектируются с возможностью повышения эффективности синтеза.
Один из способов увеличения эффективности синтеза основан на использовании принципа непрерывного обмена (CECF режим) компонентов питающей смеси с компонентами реакционной смеси бесклеточной системы через полупроницаемый барьер, выполненный из диализной мембраны, за счет диффузионного процесса (Choi et al. 1997; Yamane et al., 1998, Endo et al., 2005). Устройства, реализующие принцип непрерывного обмена компонентов питающей смеси с компонентами реакционной смеси, просты в изготовлении однако не обеспечивают возможности синтеза достаточного количества белка.
Для повышения эффективности синтеза были разработаны устройства, которые реализовали принцип (CFCF), который состоит в формировании непрерывного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного восстановления исходной концентрации низкомолекулярных веществ, расходуемых в процессе синтеза (Алахов Ю.Б. и др. 1991, Spirin A.S. 1992, Alakhov et al., 1995, Бирюков и др., 2000, Бирюков и др. 2001).
Наиболее близким к заявляемому устройству являются варианты устройства для синтеза белков и полипептидов в бесклеточной системе, принятый за прототип описаный в патенте РФ №2148649. В данном патенте приведены варианты синтеза одного типа полипептида или белка в одном или нескольких параллельно соединенных реакционных объемах. При этом условия проведения синтеза в одном реакционном объеме или при параллельном соединении нескольких реакторов строго одинаковы, имеют один и тот же тип питающей смеси и аналогичный состав активных элементов осуществляющих трансляцию или транскрипцию/трансляцию в процессе биосинтеза. Увеличение эффективности синтеза происходит за счет суммирования синтезированных продуктов синтезированных в нескольких реакционных объемах.
В известных устройствах затруднена возможность увеличения времени биосинтеза белков за счет того, что со временем биосинтеза из реакционного объема вымываются компоненты бесклеточной системы, которые не входят в питающую смесь.
Существует потребность в разработке новых устройств, которые позволяют увеличивать выход целевого продукта не за счет параллельного соединения нескольких реакторов, а за счет увеличения времени синтеза в одном объеме реакционной ячейки. Задача разработки полезной модели состоит в том, чтобы предоставить исследователю возможность наработки препаративного количества белка в процессе бесклеточного синтеза.
Целью разработки полезной модели является усовершенствование устройства для синтеза целевых полипептидов в эукариотических и прокариотических бесклеточных системах. Технические решения, приведенные в полезной модели, связаны с модификацией способа синтеза в режиме непрерывного потока (CFCF), в котором наряду с поддержанием процесса синтеза за счет ввода в реакционную смесь компонентов, поддерживающих синтез и вывода из реакционной смеси низкомолекулярных компонентов, ингибирующих синтез, осуществляют периодическую частичную или полную смену реакционной смеси.
Технический результат, на достижение которого направлена заявляемая полезная модель, состоит в повышении эффективности работы реактора и в обеспечении длительности процесса синтеза.
Сущность технического решения полезной модели.
Для достижения вышеуказанных целей объектом полезной модели является устройство для синтеза белков в бесклеточной системе, содержащее реакционную ячейку с первым и вторым пористыми барьерами, образующими объем с реакционной смесью, насосы обеспечивающие подачу раствора питающей смеси в реакционный объем и отвод раствора продуктов синтеза, емкости хранения растворов питающей смеси, высокомолекулярных продуктов синтеза, низкомолекулярных продуктов синтеза. Устройство дополнительно содержит внешнюю, по отношению к реакционной ячейке, жидкостную коммуникацию, которая соединяет вход и выход реакционного объема с помощью последовательно соединенных первого и второго крана и насоса. При этом выход реакционного объема подключен к выходу первого крана, первый вход которого подключен к первому входу второго крана, второй вход первого крана подключен к емкости для сбора отработанной реакционной смеси, второй вход второго крана подключен к емкости содержащей новую реакционную смесь. Выход второго крана соединен с входом насоса, который обеспечивает возможность перекачки новой реакционной смеси на вход реакционного объема ячейки.
Другой аспект полезной модели связан с выбором параметров реакционной ячейки, где реакционный объем ячейки выбирают в пределах от 100 мкл до 10 мл, параметры первого пористого барьера выбирают в пределах 50-300 кД, предпочтительно, пределах 50-100 кД, размер пор второго пористого барьера выбирают в пределах 10-30 кД.
Следующий аспект полезной модели связан с выбором условий проведения синтеза, где синтез проводят в диапазоне температур от +25 до +37°С, реакционную и питающую смеси сохраняют в диапазоне от +2 до +7°С.
Краткое описание чертежей.
На фиг. 1 приведена структурная схема устройства для синтеза белка, в котором осуществлена возможность частичной или полной смены реакционной смеси.
Описание полезной модели
В процессе исследования и оптимизации устройств, позволяющих длительно синтезировать полипептиды и белки в бесклеточных системах, выяснилось, что за счет вымывания некоторых компонентов, входящих в состав реакционной смеси, в которой происходит бесклеточный синтез полипептидов и белков, через некоторый период времени эффективность синтеза снижается, несмотря на дополнительную подпитку реакционной смеси низкомолекулярными компонентами, которые вымываются из реакционной смеси в больших количествах.
Было обнаружено, что замена в реакционном объеме части или всей выработавшей свой ресурс реакционной смеси на свежий раствор реакционной смеси позволяет продолжить эффективный синтез белка. Смену реакционной смеси в рабочем объеме ячейки возможно осуществить за счет формирования внешней жидкостной коммуникации, которая позволяет переместить новую порцию реакционной смеси в рабочий объем ячейки.
Устройство полезной модели поясняется примером выполнения со ссылками на прилагаемый чертеж.
Для реализации данного технического решения устройство, для синтеза белков в бесклеточной системе, структурная схема которого приведена на фиг. 1 состоит из реакционной ячейки (1), в которой установлены первый (3) и второй (4) пористые барьеры, расстояние между внутренними поверхностями которых формирует рабочий объем (2), в котором осуществляется синтез полипептидов и белков. Ко входу (6) реакционной ячейки (1) подключены выходы насоса (10) и насоса (14). Насос (10) подает питающую смесь, размещенную в емкости (11). Насос (14) вместе с кранами (15) и краном (16) входит в состав внешней жидкостной коммуникации соединяющей вход (6) и выход (8) рабочего объема реакционной ячейки (1). Это позволяет подавать на вход (6) реакционной ячейки (1) через жидкостной кран (16) и насос (14) частичный или полный объем реакционной смеси, хранящейся в емкости (18) для смены отработавшей реакционной смеси в реакционном объеме (2) ячейки (1).
Кроме этого, замкнутая внешняя жидкостная коммуникация подключенная ко входу (6) и выходу (8) реакционного объема (2) через краны (15) и (16) позволяет осуществить продольное (вдоль внутренней поверхности) пористых барьеров (3) и (4) перемещение реакционной смеси (вперед/назад) при смене реверса работы насоса (14). Это позволяет осуществить перемешивание реакционной смеси и частичное открытие пор пористых барьеров (3) и (4) в случаях, когда объем реакционной смеси мал и не позволяет вводить мешалки в объем (2) реакционной ячейки.
Выход (5) реакционной ячейки (1) подключен к емкости (9) для слива низкомолекулярных фракций реакционной смеси, содержащих продукты распада образовавшихся в процессе синтеза. Выход (7) реакционной ячейки (1) подключен к входу насоса (12), выход которого соединен с емкостью (13), в которой собирается синтезируемый высокомолекулярный продукт в виде полипептидов и белков для последующей очистки и хранения. Выход (8) реакционной ячейки (1) подключен к жидкостному крану (15) через который отработанная реакционная смесь перемещается из рабочего объема (2) реакционной ячейки (1) в резервуар емкости (17) при заполнении объема (2) питающей смесью поступающей из емкости (11) с помощью насоса (10).
Устройство работает следующим образом. На первом этапе осуществляют подготовку реакционной смеси и питающей смеси. В качестве примера, который включает, но не ограничивает вариантов подготовки и состава реакционной смеси и питающей смеси, возможно, использовать концентрации компонентов и состав смесей, как это описано в патенте РФ №2148649.
Синтез полипептидов и белков в реакционной ячейке проводят при температуре от +25 до +37°С. Питающую смесь подают в реакционную ячейку со скоростью, составляющей 1,5-2,0 внутреннего объема ячейки за 1 час. Проводят подпитку реакционной смеси питающей смесью. Проводят отбор продукта. В процессе синтеза анализируют уровень выхода синтезируемого продукта, например за счет измерения флуоресценции раствора (Бирюков С.В. и др. 2000).
Определяют время, после которого эффективность синтеза падает, несмотря на подпитку реакционной смеси питающей смесью. Переводят работу устройства в режим частичной или полной смены реакционной смеси в реакционном объеме. Для этого приостанавливают подачу питающей смеси, включают насос (14) и переключают кран (16) в положение, которое способствует подаче реакционной смеси из емкости (18) через включенный насос (14) на вход реакционного объема (2) реакционной ячейки (1). Для слива реакционной смеси из реакционного объема (2) переключают кран (15) в положение, когда с выхода реакционного объема (2) смесь поступает в емкость (17).
Параметры первого пористого барьера выбирают в пределах 50-300 кД, предпочтительно, пределах 50-100 кД, размер пор второго пористого барьера выбирают в пределах 10-30 кД.
Реакционный объем ячейки выбирают в пределах от 100 мкл до 10 мл. Предпочтительной является конструкция модуля реактора, в которой осуществляют формирование тонких слоев реакционной смеси любой формы. Толщину слоя реакционной смеси выбирают в пределах от 0,1 до 10 мм из условия того, что при заданных площадях первого и второго пористых барьеров и выбранных размеров пор барьеров средняя скорость ввода питающей среды в реакционный объем обеспечивает ввод компонентов питающей смеси в максимально удаленные точки реакционной смеси за время, в течение которого концентрация питающей среды в удаленных точках снижается до допустимого уровня, а концентрация низкомолекулярных компонентов, ингибирующих процесс синтеза, не превышает допустимый уровень.
При этом реакционная смесь, хранящаяся в емкости (18) и питающая смесь, находящаяся в емкости (11), находятся в дополнительном термостате с температурой от +2 до +7°С.
Предпочтительно, использовать дополнительное перемешивание в зоне реакционного объема. Такое перемешивание может быть обеспечено с помощью вращения магнитной мешалки. Дополнительно, за счет кратковременного включения насоса (12) в реверсивном режиме в процессе синтеза, возможно обеспечить очистку пор первого пористого барьера (3) которые забиваются в процессе синтеза.
Преимущество полезной модели состоит в том, что в период работы устройства его структура позволяет осуществлять:
а) свободный ввод питающей среды в реакционные объемы, б) отвод низкомолекулярных продуктов, ингибирующих процесс синтеза, в) частичное или полное замещение реакционной смеси для поддержания синтеза, г) эффективную очистку пор пористых барьеров, д) снижение мертвых объемов в жидкостных коммуникациях для ввода/вывода высокомолекулярных и низкомолекулярных компонентов и продуктов синтеза, е) перемешивание реакционной смеси.
Предлагаемая полезная модель позволяет повысить эффективность работы устройства, обеспечить более длительный процесс синтеза и удобство в эксплуатации.
Источники информации
Choi С. et al. Method producing protein in a cell-free system: US Patent 5593856, U.S. Cl. - 435/68.1, Jan. 14 (1997).
Yamane T. et al. Synthesis of protein by cell-free protein synthetic system and apparatus therefor. JP Patent 10080295, IPC Cl. C12P 21/00 (31.03.1998).
Endo Y. et al. Preparation containing cell extracts for synthesizing cell-free protein and means for synthesizing cell-free protein US Patent 6905843 IPC Cl. C12M 1/12 (2005-06-14)
Алахов Ю.Б. и др. Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции, Авт. свид. SU 1618761 Al, Int. Cl. С12Р 21/02, 07.01.91, Бюл. N1 (1991).
Spirin A.S. Cell-Free Protein Synthesis Bioreactor, from Frontiers in Bioprocessing II, 31-43, Editors: Todd P. et al., Amer. Chem. Soc. (1992).
Alakhov Yu. B. et al. Method of preparing polypeptides in a cell-free translation system: US Patent 5478730, U.S. Cl. - 435/68.1, Dec. 26 (1995).
Бирюков С.В. и др. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ (ВАРИАНТЫ) И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Патент РФ №2148649, С12Р 21/00 (10.05.2000).
Бирюков С.В. и др. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ Патент РФ 2169154, C07K 1/04 (20.06.2001).