Способ иммуноферментного определения уровня антигенраспознающих рецепторов В-лимфоцитов, представленных мембранными, специфическими к RBD PROTEIN SARS-CoV-2, IgG антителами
METHOD FOR ENZYME IMMUNOASSAY DETERMINATION OF THE LEVEL OF ANTIGEN-RECOGNIZING B-LYMPHOCYTE RECEPTORS REPRESENTED BY MEMBRANE-SPECIFIC RBD PROTEIN SARS-COV-2, IgG ANTIBODIES

Изобретение относится к иммунологии и, в частности, к лабораторной диагностике с использованием генно-инженерных биотехнологий в конструировании тест-системы для оценки активности В-клеточного иммунного ответа у инфицированных SARS-CoV-2 и привитых лиц, c целью характеристики инфекционного процесса у населения, а также для определения эффективности вакцинации и иммунотерапии при получении соответствующих лечебно-профилактических препаратов против SARS-CoV-2.
Распространение среди людей вируса SARS-CoV-2, послужившего причиной инфекционного заболевания под названием СOVID-19, привело к вспышке, носящей характер пандемии, и, в настоящее время, является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Клинические проявления COVID-19 широко варьируют от бессимптомной инфекции до острой дыхательной недостаточности (9, 16). Летальность составляет около 2,6 - 4%, в связи с чем SARS-CoV-2 включен в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих (14, 25).
Понятно, что вероятность встречи с SARS-CoV-2 возрастает для каждого человека. Тем не менее, многие люди, неоднократно и длительно контактировавшие с заболевшими COVID-19, не заболевают или у них, зачастую, отсутствуют характерные клинические симптомы. Почему так происходит – один из самых насущных вопросов понимания иммунного ответа на SARS-CoV-2. В имеющихся публикациях о механизмах специфического иммунного ответа на SARS-CoV-2 наиболее подробно описаны варианты протекания инфекционного процесса при COVID-19, механизмы, сроки и вариабельность антителообразования (гуморальный иммунный ответ).
Одним из типичных проявлений заболевания у пациентов с COVID-19, помимо ряда специфических клинических синдромов, была лимфопения, которая сохранялась в течение 4-11 недель и более после выздоровления. Это, по мнению авторов, говорит о том, что инфекция SARS-CoV-2 глубоко влияет на лимфоциты и приводит к их длительным дисфункциям (8, 27). Между тем, лимфоцитам определена решающая роль для устранения инфекции и создания длительного иммунитета (22, 23). Исследования иммунной реакции человека против SARS-COV-2, характеризующие ТОРС-COV-2 антиген-специфические Т - клеточные ответы, неожиданно, показали, что от 20 до 50% людей, которые не подвергались воздействию SARS-CoV-2, имели значительную реактивность Т-клеток, направленную против пептидов, соответствующих последовательностям SARS-CoV-2 (10). Отмечена активация субпопуляций Т - клеток у пациентов при острых COVID-19 (12, 13).
Нет сомнений, что клеточные реакции имеют прямой защитный эффект против тяжелой коронавирусной инфекции, а также поддерживают производство антител (2). Вместе с тем, понимание защитных не только Т-, но и В-клеточных иммунных реакций против SARS-CoV-2, важны для борьбы с  вирусом и контроля развития болезни, и их следует учитывать в стратегиях вакцинации. В одной из исследовательских работ было обнаружено, что у погибших пациентов с COVID-19 развивался более быстрый рост анти-S антител по сравнению с пациентами, которые выздоравливали, с последующим ранним снижением В-клеточного иммунитета и нарушением нейтрализующей способности антител (11). Как известно, антигенраспознающие рецепторы В-лимфоцитов (BCR) представляют собой молекулы иммуноглобулинов, имеющих трансмембранные и цитоплазматические сегменты. В процессе иммунного ответа В-лимфоцит получает одновременно два сигнала активации: от антигенраспознающего рецептора при его соединении с антигеном  и от связывания его поверхностных костимулирующих молекул с соответствующими лигандами на Т-лимфоцитах (28, 31) При иммунном ответе одновременно с эффекторными клетками образуются В-клетки памяти, не вовлекаемые в текущий иммунный ответ, но формирующие пул защитных клеток при повторной встрече с тем же антигеном и которые уже прошли этап переключения изотипа секретируемых антител и должны обеспечивать более быстрый и эффективный иммунный ответ при повторном контакте с антигеном. Особенностями долгоживущих В-клеток памяти являются: способность быстро отвечать пролиферацией и дифференцировкой в плазматические клетки на повторную встречу с антигеном; способность быстро переключаться с синтеза IgM на синтез IgG и IgA; способность быстро продуцировать и секретировать большое количество специфических антител с выраженными защитными свойствами (28, 31).
SARS-CoV-2, также, как и SARS-CoV и MERS-CoV, представляет собой вирус, относящийся к семейству Coronaviridae и роду бетакороновирусов (16). Изучение коронавируса  SARS-CoV, который вызвал всемирную эпидемию в 2002 и 2003 годах, и in vitro исследования связывания вируса SARS-CoV-2 с клеткой показали, что связь с рецептором ангиотензин-превращающего фермента 2 (ACE2), осуществляется через рецептор- связывающий домен (RBD). То есть, RBD является ключевым функциональным компонентом в субъединице S1, который отвечает за связывание SARS-CoV-2 с ACE2 (4, 5, 24, 30). Этот факт предопределяет необходимость разработки вакцин на основе RBD SARS-CoV-2 для профилактики инфекции.
Немногочисленная патентная база, посвященная диагностике  COVID-19, касается серодиагностики в иммуноферментном анализе. Современные тест-системы с использованием S-антигенов для серологического обнаружения антител к SARS-CoV-2 характеризуются, как правило, довольно высокой специфичностью. Описаны результаты сравнительных исследований по созданию двух различных версий рекомбинантного спайк-белка SARS-CoV-2, используемых в исследованиях (1). Между тем, вариант коронавируса SARS-CoV-2 с мутацией, затрагивающей рецептор-связывающий (RBM) S-белка и изменяющей его структуру, может уклоняться от иммунного ответа в организме человека, ранее переболевшего COVID-19, и хуже нейтрализуется некоторыми моноклональными антителами. Если согласиться с мнением о том, что RBD более консервативен в мутациях, чем спайковый RBM (6), то определение уровня нейтрализующих антител к RBD-эпитопу вируса SARS-CoV-2 как в сыворотке крови, так и в связи с рецепторами В-клеток будет важным показателем в оценке иммунного статуса и в случаях заражения мутирующим вирусом SARS-CoV-2.
На сегодняшний день абсолютно не исследована роль этого домена в реакции активации специфических поверхностных рецепторов В- лимфоцитов. Отсутствует патентная база, посвященная иммунному ответу к вирусу SARS-CoV-2 популяцией В-клеток.
Аналогов и прототипов предлагаемого изобретения, характеризующего специфичность активации популяции В-лимфоцитов и В-клеток памяти к RBD-эпитопу SARS-CoV-2, обнаружено не было.
Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является создание метода, который позволяет в иммуноферментном анализе выявлять у инфицированного человека, перенесшего COVID-19 или вакцинированного уровень специфических нейтрализующих IgG-антител к RBD - эпитопу короновируса, потенциально характеризующих активность рецепторов В-лимфоцитов и, в частности, В-клеток памяти. Для решения поставленной технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагаются следующие технические решения.
1. В качестве иммуногена использовали рекомбинантный белок S Protein RBD (ATAGENIX LABORATORIES, кат.№ATMP02479COV), полностью соответствующий RBD-белку вируса SARS-CoV-2, сорбированный в лунки 96-луночного разборного планшета, выполненного из полистирола.
2. Для осуществления метода иммуноферментного выявления IgG-антител, представленных поверхностными рецепторами В-лимфоцитов крови человека, была сформирована тест-система с набором реагентов.  Сокращенное наименование тест-системы: «IgG-л-SARS-CoV-2 - RBD-ИФА».
Тест-система и набор реагентов включают сорбент, концентрат конъюгата IgG-антител, референс-систему с калибраторами, градиент фиколл-пак для выделения лимфоцитов из периферической крови, концентрат раствора для разведения образцов взвеси лимфоцитов, раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.
Предлагаемый метод определения уровня специфических IgG к RBD-эпитопу вируса SARS-CoV-2, представленных поверхностными рецепторами В-лимфоцитов, включает следующие этапы: внесение в лунки референс-системы калибровочных образцов и в лунки с иммуногеном - анализируемые образцы; перемешивание, инкубирование иммуносорбента с последующей промывкой, добавлением хромогена, остановкой реакции и оценкой оптической плотности.
6
В качестве анализируемого образца используют взвесь лимфоцитов периферической крови в концентрации 2-3х10/мл.
Для решения заявленной технической проблемы, а именно, осуществления тестирования пациентов, мониторинга лечения больных COVID-19 и поствакцинального периода у привитых и получения максимально адекватного технического результата:
- в состав разработанной тест-системы для осуществления метода иммуноферментного анализа введен рекомбинантный белок RBD Protein, соответствующий по структуре эпитопу RBD-белка вируса SARS-CoV-2, сорбированный в лунках разборного полистиролового планшета, как основы тест-системы;
- использование взвеси лимфоцитов крови в качестве анализируемого образца;
- формирование тест-системы с набором реагентов для осуществления метода иммуноферментного определения уровня антигенраспознающих рецепторов В-лимфоцитов, представленных мембранными, специфическими к RBD Protein SARS-CoV-2, IgG антителами в исследованиях взвеси лимфоцитов крови человека: «IgG-л- SARS-CoV-2 - RBD-ИФА».
- апробация метода в клинических условиях.
Предлагаемый метод и реализующую его тест-систему рекомендуется использовать в клинической лабораторной практике при мониторинге терапии больных COVID-19, динамическом наблюдении за пациентами, прогнозировании тяжести течения заболевания, при мониторинге в поствакцинального периода у привитых.
В состав тест-системы для осуществления предлагаемого метода входят:
- планшет полистироловый 96-луночный, стрипованный, наборный, из прозрачного полимерного материала (фирма GreinerBio-OneGmbH, Германия)  готовый к применению. Планшет состоит из:
- двух 8-луночных референс-стрипов, иммобилизованных моноклональными анти-IgG-антителами (МКАТ анти-IgG) (МКАТ-анти-IgG, фирма Полигност, Россия, ТУ 9398-001-11122195-08, РУ № ФСР 2009/05707 от 15.09.2009).
- десяти 8-луночных стрипов, сорбированных рекомбинантным RBD Protein (производства  Cloud-CloneCorporation (США).
А
В
С
D
Е
- калибровочные пробы (КП) (фирма Полигност, Россия), содержащие известные количества IgG в мкг/мл в виде 10-кратных концентратов: 50 (КП), 20 (КП), 10 (КП), 2 (КП), 0 (КП), готовые к применению. Концентрация аналита (IgG) в КП определялась производителями (фирма Полигност, Россия) методом двуцентрового ИФА, в котором образцом сравнения служил внутрилабораторный эталон St№2, представляющий собой пул 300 сывороток донорской крови. Содержание аналита в St№2 определялось методом двуцентрового ИФА с применением международного референс образца WHO 67/97 Liquichek ImmunologyControl (Bio-Rad) Level 2, lot 5215.
- конъюгат моноклональных антител против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов G человека, меченных пероксидазой хрена (МКАТ- анти-IgG -ПХ), 100-кратный концентрат;
- раствор фиколл-пак (градиент для выделения лимфоцитов, d=1,077);
- промывающий буфер,10-кратный концентрат;
- буфер для промывки и разведения анализируемых образцов, 10-кратный концентрат;
- тетраметилбензидин (ТМБ);
- стоп-реагент;
- липкая пленка в виде отдельных листов для заклейки планшетов;
- трафарет для анализа;
- инструкция по применению.
Тест-система для осуществления метода рассчитана на 90 определений, включая 5 калибровочных проб в дублях. Предназначена для ручной постановки с возможностью как дробного использования планшета (набора), так и использования целого планшета (набора); предназначена для исследований invitro; должна храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре от +2 до +8°С в течение всего срока годности (6 месяцев).
Воспроизведение метода включает следующие этапы:
1. Предварительная подготовка промывающего буфера и буфера для разведения образцов клеток из соответствующих  концентратов.
6
2. Получение образцов  взвеси лимфоцитов периферической крови из пробирок с гепарином или ЭДТА, используя градиент плотности фиколл-пак, отмывку выделенных мононуклеаров и доведение взвеси клеток до рабочей концентрации 2-3х10 (12-18 клеток в 1 большом квадрате камеры Горяева).
3. Внесение образцов согласно предлагаемой схеме:
Схема постановки анализа
<b>1</b>
<b>2</b>
<b>3</b>
<b>4</b>
<b>5</b>
<b>6</b>
<b>7</b>
<b>8</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>11</b>
<b>12</b>
<b>A</b>
КП<sub>А</sub>
КП<sub>А</sub>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>B</b>
КП<sub>B</sub>
КП<sub>B</sub>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>C</b>
КП<sub>C</sub>
КП<sub>C</sub>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>D</b>
КП<sub>D</sub>
КП<sub>D</sub>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>E</b>
КП<sub>E</sub>
КП<sub>E</sub>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>F</b>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>G</b>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>H</b>
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000001.jpg" he="5" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<b>РЕФЕРЕНС-</b><b>СИСТЕМА</b>
<b>СТРИПЫ, СОРБИРОВАННЫЕ АНТИГЕНОМ:</b><b>SProteinRBD</b>;
В лунки референс-стрипов внести по 90 мкл промывающего раствора и по 10 мкл калибровочных проб. В остальные лунки внести по 100 мкл взвеси лимфоцитов периферической крови обследуемых. Планшет заклеивается клейкой пленкой, в течение 10-15 сек. встряхивается легкими постукиваниями по рамке планшета и инкубируется в термостате при температуре (37±2)°С в течение 60 минут. По окончании инкубации лунки планшета промываются 3 раза промывающим буфером. Во все лунки вносится по 100 мкл рабочего разведения конъюгата с последующим инкубированием при тех же условиях; повторное 3-кратное промывание буферным раствором и двукратное промывание дистиллированной водой. В лунки добавляется по 100 мкл раствора хромогена (ТМБ). Иммуносорбент инкубируется в защищенном от света месте при температуре (20±5) °С в течение 7-10 минут. Для остановки цветной реакции в лунки вносится по 50 мкл стоп-реагента. Не позже чем через 15 минут после остановки цветной реакции на фотометре измеряется оптическая плотность при 450 нм.
Для расчета результатов при использовании компьютерного, или встроенного в фотометр, программного обеспечения, в настройках выбрать метод, соответствующий кусочно-линейной аппроксимации. При ручных расчетах для получения стандартной кривой построить калибровочный график, откладывая по оси абсцисс концентрацию IgG в мкг/мл, по оси ординат - оптическую плотность при длине волны 450 нм.
Результаты проведенных нами исследований позволяют предложить следующую интерпретацию получаемых данных:
<b>количество IgG в мкг/мл</b>
<b>интерпретация результатов</b>
0-10
Отрицательный результат
10-20
Сомнительный результатсвидетельствует о низком уровне антител IgG к вирусу.Рекомендуется повторное исследование через 1-2 недели.
20-50 и выше
Положительный результатвыявление положительного результата диктует необходимость динамического наблюдения  при оценке степени распространения инфекции, в мониторинге терапии, проводимой у пациентов с COVID-19 и мониторинге эффективности вакцинации вакцинами, содержащими RBD-эпитоп вируса.
Определение диагностических критериев, диагностического значения и рекомендаций для выполнения определения уровня нейтрализующих IgG к RBD эпитопу вируса SARS-CoV-2, представленных антигенраспознающими рецепторами B-лимфоцитов, проводилось на спектрофотометре "Лазурит" (Dynex, США) с использованием метода и тест-системы для иммуноферментного анализа, входящих в предмет данного изобретения. Сопоставления с другими методами не проводилось в следствии их отсутствия. Аналитические и функциональные характеристики тест-системы для иммуноферментного анализа, входящие в предмет данного изобретения, оценивались согласно перечню руководящих документов (19, 20, 21, 25, 26).
Аналитическая специфичность составила 100% и обусловлена использованием моноклональных антител (МКАТ) в референс-системе, обладающих высокой специфичностью к IgG и не распознающих антитела других классов или альбумина в физиологических концентрациях при таком же разведении, что доказано производителем.
Диапазон определяемых концентраций специфических IgG набора «IgG-л-SARS-CoV-2-RBD-ИФА»  составил 2-50 мкг/мл.
Аналитическая чувствительность составила не более2 мкг/мл.
Коэффициент вариации (КВ) внутри- и межсерийной  воспроизводи-мости не превышает 8%.
Биологический референтный интервал для значений концентрации IgG-антител к RBD-белку SARS-CoV-2, связанных со специфическими поверхностными  рецепторами В-лимфоцитов, составил от 0 до10 мкг/мл.
Mycoplasma pneumoniae
Диагностическая эффективность теста, по результатам сравнительных иследований с образцами взвеси лимфоцитов периферической крови от  пациентов с острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ), цитомегаловирусом, бактериальной пневмонией и бронхитом, вызванными составила 100%.  Перекрестных реакций не обнаружено.
Клиническая апробация метода осуществлялась согласно этическим стандартам в соответствии с Хельсинской декларацией 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г. От всех участников исследований получено информированное письменное согласие. В исследовании приняли участие 78 человек, сотрудников медицинских организаций и членов их семей. Из них 24 человека (30,7%)  перенесли COVID-19, что было ранее подтверждено ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) и наличием клинических симптомов. Клинический диагноз был им поставлен согласно критериям Всемирной организации здравоохранения (17).
6 человек (7,7%) отмечали близкий контакт с людьми с инфекцией SARS-CoV-2 и отсутствие признаков заболевания; 4 человека (5,1%) были в динамическом наблюдении после вакцинации. Группа из 15 (19,2%) обследуемых отмечала наличие признаков ОРВИ, при этом результаты ПЦР на SARS-CoV-2 были отрицательными. Контрольную группу составили 29 человек (37,2%), отрицающих заболевание и контакты с заболевшими COVID-19. На момент сбора образцов все переболевшие и контактировавшие с ними не имели симптомов, указывающих на COVID-19, и положительных результатов ОТ ПЦР в течение как минимум 15дней.
В группе переболевших наиболее частыми симптомами (84,6%) были существенное повышение температуры, одышка, утомляемость (79,9%), кашель (72,4%) и миалгия (71,5%). Практически все отмечали кратковремен-ную (до 5 суток) или более длительную (до трех недель) аносмию и дисгевзию.
Был проведен сравнительный анализ уровней нейтрализующих IgG-антител, связанных с поверхностными рецепторами В-клеток между рекомбинантными Strimer и RBD-белками и между вируснейтрализующими IgG к этим эпитопам в сыворотке крови. С этой целью мы подготовили аналогичную тест-систему, где иммуносорбентом был рекомбинантный Strimer Рrotein этой же фирмы. Содержание этих показателей оценивали в мкг/мл.
У 7 из 15 обследованных лиц (46,7%), которые перенесли респираторную инфекцию в эпидемический период, но при обследовании методом ОТ ПЦР Covid-19 не был подтвержден, обнаруживались высокие значения IgG к RBD-белкам как в сыворотке, так и в связи с рецепторами мембран В-лимфо-цитов (таблица 1). Оценка содержания IgG-антител к RBD Protein, ассоциированных с рецепторами В-клеток, показала, что в группе не болевших, тем не менее, определяются эти показатели. Однако их количество было низким (Ме=7 мкг/мл), даже у лиц,  имевших высокое содержание сывороточных IgG к RBD Protein. Интересно, что наиболее высокое их значение обнаружено у лиц перенесших респираторную инфекцию при неподтвержденном Covid-19.
У лиц, перенесших Covid-19, выявлялись две категории результатов. У 6 человек из 15 (40%) было низкое содержание IgG-антител, ассоциированных с рецепторами В-лимфоцитов. У остальных их количество было достаточно высоким.  Мы предположили, что эти различия могут быть объяснены применением глюкокортикостероидов (как в виде инъекций, так и в виде ингаляций) в лечении этих 6 обследуемых, что могло обусловить умеренную иммуносупрессию иммунного ответа. Полученные данные согласуются с наблюдениями исследователей, обследовавших работников медицинской организации и выявивших наличие положительного иммунного ответа при отсутствии симптомов Covid-19. У некоторых, серонегативных по IgG к RBD-белку, медработников был положительный ПЦР-тест на SARS-CoV-2. При этом уровни IgG к нуклеокапсиду и  IgG к спайк-белку изменялись взаимосвязанно [15]. Дальнейшими исследованиями обнаружено (табл.2), что у переболевших Cоvid-19 через 2 месяца после болезни уровень нейтрализующих IgG к RBD-белку составлял 82,7% от величины антител к S trimer Рrotein, а через 6 месяцев - 67,8%.  Кроме того, величина IgG-антител к этим эпитопам вируса через 6 месяцев от начала заболевания выросла в 1,9 и 1,8 раз соответственно.
Интересен тот факт, что у 4 переболевших величина антител к RBD-белку была на 8,7% выше, чем к белку S trimer и это превышение сохранилось и через 6 месяцев, хотя, из-за малой численности группы, показатели были не достоверны. В других группах достоверность была отмечена (р˂0,05).Таким же значимым было увеличение уровня IgG-антител и к Strimer, и к RBD-белкам через 6 месяцев от начала заболевания. Не менее интересны показатели величины IgG-антител в контрольной группе. У 16 из 29 человек (55,2%), отрицающих контакты и какие-либо клинические признаки вирусных заболеваний за весь период пандемии, обнаружены IgG антитела, ассоциированные с рецепторами В-лимфоцитов, и к Strimer, и к RBD-белкам вируса Sars-Cov-2. Этот факт позволил нам предположить наличие естественной ответной иммунной реакции на небольшие дозы вирусной нагрузки.
).
В таблице 3 указаны значения нейтрализующих IgG у 4 испытуемых перед прививкой вакциной Спутник V. Для более полной картины провели дополнительные исследования с величиной коэффициента позитивности (КП) с использованием наборов реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к SARS-COV-2 "SARS-COV-2-IgG-ИФА-БЕСТ", где иммуносорбентом служил рекомбинантный Strimer Protein.У одного из обследуемых значения IgG-антител, ассоциированных с рецепторами В-лимфоцитов  достоверно отличались от показателей других обследуемых (р˂0,05). Вероятно, определенный иммунный ответ на вирус Sars-Cov-2 был сформирован в отсутствии клинических проявлений. Это согласуется с данными  рядоа авторов, предполагающих возможность бессимптомно перенесённого заболевания, что диктует необходимость определять долю бессимптомных инфекций путем скрингингового обследования населения (7, 29Однако, по нашему мнению, скрининговых обследований с использованием только ОТ ПЦР и серологических тестов явно не достаточно. Необходимо в комплекс тестов вводить анализ оценки клеточного ответа и, в частности, В-клеточного, на антигены вируса.
При индивидуальном анализе изменений показателей уровня вируснейтрализующих IgG через 21 день после прививки (таблица 4) прослеживается четкий иммунный ответ в виде увеличения уровня сывороточных IgG, зафиксированных и предлагаемой тест-системой и регистрируемый коэффициентом позитивности (КП) тест-системой Вектор-Бест. Наиболее значимы изменения в показателях вируснейтрализующих антител у "бессимптомного" испытуемого, где величина IgG к RBD Рrotein несколько выше, чем к Strimer Рrotein.Это согласуется с мнением авторов, пришедших к выводу, что ответ В-клеток памяти на SARS-CoV-2 развивается между 1,3 и 6,2 месяцами после заражения и согласуется с персистенцией антигена, зафиксированного в кишечнике у 50% "бессимптомных" пациентов (3). В нашем наблюдении катализатором значительного роста антител послужила, видимо, вакцина.
По нашим данным ответ В-клеток памяти против RBD белка вируса SARS-CoV-2 развивается в течение первых 6 месяцев после заражения или вакцинации, и это подтверждается авторами, изучающими активацию иммунного ответа В-клетками памяти  с накоплением соматических мутаций Ig и выработкой антител с повышенной нейтрализующей широтой и эффективностью, изучающих этот феномен у пациентов, у которых SARS-CoV-2 обнаруживался в эпителии тонкой кишки (3).
Таким образом, у лиц, перенесших Covid-19, и у вакцинированных, выраженность иммунного ответа может сильно варьировать, что подтверждает необходимость динамических тестирований. Несомненно, определение уровня IgG-антител, обладающих вируснейтрализующей активностью, препятствующей связыванию гликопротеина RBD вируса SARS-CoV-2 с рецептором клеток человека АСЕ2 и ассоциированных с поверхностными рецепторами В-лимфоцитов может пролить свет на готовность активированных В- клеток к быстрому и эффективному ответу на повторную  встречу с вирусом и, конкретно, к его наиболее иммуногенныму эпитопу.
Апробация заявляемого метода и реализующей его тест-системы в клинических условия показала, что она способна выявлять вируснейтрализующие IgG к RBD-эпитопу SARS-CoV-2, представленные антигенраспознающими рецепторами В-клеток как у больных COVID-19, так и у вакцинированных в сроки, соответствующие данным, представленным в современной литературе. Метод проявил высокую чувствительность и может использоваться для  оценки активации В-клеточного иммунного ответа, как в процессе заражения, так и в процессе вакцинации. Чувствительная и специфичная идентификация IgG-антител к RBD-эпитопу коронавируса SARS-Cov-2 может быть включена в перечень методов для скрининга широких групп населения, поскольку достаточно дешева, экономична по времени и не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Метод позволяет детально характеризовать вируснейтрализующий иммунный ответ В-клеток на SARS-CoV-2 как качественным, так и количественным образом, быть одним из критериев выздоровления и оценки воздействия вакцинации. Предлагаемый метод и тест-система «IgG-л-SARS-CoV-2 - RBD-ИФА» согласуются с временными методическими рекомендациям МЗ РФ по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (COVID-19) (18), где при оценке напряженности поствакцинального иммунитета методом ИФА рекомендуется определение антител к RBD -домену вируса.
В наборе реагентов «IgG-л-SARS-CoV-2 - RBD-ИФА», предлагаемого для осуществления заявляемого метода, используется рекомбинантный  RBD-protein, полностью соответствующий RBD-эритопу вируса SARS-COVE-2  и позволяет выявлять иммуноглобулины класса G, представленные поверхностными рецепторами В-клеток,  к  RBD-эпитопу вируса, поэтому данный набор подходит и для включения в оценку поствакцинального иммунного ответа, полученного иммунизацией вакцинным препаратом на основе RBD-домена Spike.
Метод иллюстрируется следующими таблицами:
Таблица 1.
Уровень специфического IgG к RBD-Protein SARS-CoV-2  в сыворотке крови и ассоциированных с рецепторами В-лимфоцитов [Mе(Q 25-75%)]
Группа не болевшихn=13
Группа перенесших респираторное заболеваниеn=7
Группа перенесших Covid-19n=15
Уровень IgGкRBD-Protein (мкг/мл) в сыворотке крови
21,1 (2,9 – 35,5)
63,7 (53,4 – 77,5)
29,5 (19,2 – 67,9)
Уровень IgGкRBD-Protein (мкг/мл) связанных с рецепторами В- лимфоцитов
3,42  (1,96 – 13,3)
40,0 (27,1 – 112,3)
13,9 (3,0 – 30,8)
Таблица 2
Показатели уровня нейтрализующих IgG к RBD-и  Strimer-протеинам SARS-CoV-2 ассоциированных с рецепторами В-лимфоцитов (в мкг/мл)
контрольn = 13
контрольn = 16
переболевшиечерез 2 месn = 20
переболевшиечерез 6 месn = 20
переболевшиечерез 2 месn = 4
переболевшиечерез 6 месn = 4
S trimer
3,48±1,08Ме=2,1 (1,6 – 3,4)
19,55±1,24Ме=19,3 (15,9 – 23,8)
31,6±2,3 *Ме=31,6 (24,9 – 37,2)
61,02±3,9 *Ме=58,4(52,7 – 71,2)
27,54±1,36 *Ме=28,2(25,8 – 29,3)
63,47±7,4 *Ме=65,0(53,0 – 73,9)
RBD
3,42±0,73Ме=2,2 (1,5 – 4,1)
15,91±8,09 *Ме=17,1 (11,6 – 20,1)
27,42±1,31 *Ме=26,4(22,5 – 33,9)
50,42±3,5 *Ме=49,7 (36,9 – 60,0)
38,33±5,8 *Ме=40,0(28,6 – 48,0)
74,91±9,6Ме= 75,0 (57,3 – 92,5)
Таблица 3
Показатели уровня нейтрализующих антител у 4 человек перед прививкой вакциной Спутник V.
IgG в сыворотке Тест-система Вектор-БестКП (коэфф. позитивности)
IgG в сыворотке кровипредлагаемая тест-система (мкг/мл)
IgG, ассоциированные с рецепторами В-клетокпредлагаемая тест-система (мкг/мл)
Strimer
RBD
Strimer
RBD
Е.В., 65 л
не обнаруж
1,35
1,08
1,5
1,94
А.Р., 52 г.
не обнаруж
1,07
5,66
9,8
6,4
В.А., 68 л.
не обнаруж
1,8
2,1
3,2
2,4
В.Г., 69 л.
не обнаруж
13,4 *
8,7 *
28,75 *
31,32 *
* - достоверность отличий от аналогичных показателей других обследуемых (р<0,05)
Таблица 4.
Показатели уровня нейтрализующих антител у 4 человек через 21 день после прививки вакциной Спутник V.
IgG в сыворотке Тест-система Вектор-БестКП (коэфф. позитивности)
IgG в сыворотке кровипредлагаемая тест-система (мкг/мл)
IgG, ассоциированные с рецепторами В-клетокпредлагаемая тест-система (мкг/мл)
Strimer
RBD
Strimer
RBD
Е.В., 65 л
12,4
21,59
17,97
28,99
22,78
А.Р., 52 г.
12,4
38,0
20,42
38,32
23,19
В.А., 68 л.
12,5
41,52
24,12
38,4
24,7
В.Г., 69 л.
12,7
85,43 *
64,47 *
90,3 *
95,7 *
* - достоверность отличий от аналогичных показателей других обследуемых (р<0,05)
Литература
1. Amanat F., Stadlbauer D., Strohmeier S.,  et all // Aserological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans // https: //doi.org/ 10.1101/ 2020.03.17. 20037713.med Rxiv preprint 2. - 2020.
2. Channappanavar R, Fett C, Zhao J, Meyerholz DK, Perlman S. // Virus-specific memory CD8 T cells provide substantial protection from lethal severe acute respiratory syndrome coronavirus infection. JVirol.2014;88(19):11034-44.
3.ChristianGaebler, ZijunWang, Julio C. C.Lorenzi, FraukeMuecksch.//Evolution of Antibody Immunityto SARS-CoV-2 //Naturedoi: 10.1038/s41586-021-03207-w .
4. Du L. // The spike protein of SARS-CoV - a target for vaccine and therapeuticdevelopment //Nat Rev Microbiol,2009. Vol. 7, N 3. - P. 226-236.
5. Du L. MERS-CoV spike protein: a key target for antivirals // Expert Opin TherTargets,2017. - Vol. 21, N 2. - P. 131-143.
6. Emma C. Thomson, et al. // Thecirculating SARS-CoV-2 spike variant N439K maintains fitness while evading antibody-mediated immunity. // BioRxiv, 2020,  DOI:  10. 1101/ 2020. 11.04.355842.
N. Engl. J. Med.
7. https://www.nature.com/articles/s41591-020-0965-6 - ref-CR12Gudbjartsson, DF, etal. Распространение SARS-CoV-2 среди населения Исландии. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2006100(2020).
8. Grifoni , Вайскопф D , Рамирес С.И. , и др. Мишени Т-клеточного ответа на коронавирус SARS-CoV-2 у людей с заболеванием COVID-19 и у людей, не подвергшихся воздействию. Ячейка 2020.
9. JiangS.//AnemergingcoronaviruscausingpneumoniaoutbreakinWuhan, China: callingfordevelopingtherapeuticandprophylacticstrategies //EmergMicrobesInfect, 2020. - Vol. 9, N 1. - P. 275-277.
10. J. Braun et al.// Presence of SARS-CoV-2 reactive T cells in COVID-19 patients and healthy donors. medRxiv2020.2004.2017.20061440 [Preprint]. 22 April 2020; Y. Pengetal., bioRxiv 2020.06.05.134551 (2020).
11. LiuL., WeiQ., LinQ.Anti-spike IgG causes severe a cutelung in jurybyskewing macrophage responses duringacute SARS-CoV infection // JCIInsight, 2019. - Vol. 4, N 4. - e123158.
12. L. Rodriguez et al.// Systems-level immunomonitoring from acute to recovery phase of severe COVID-19. medRxiv 2020.2006.2003.20121582 [Preprint]. 7 June 2020.
13. Liu J.et al.// EBioMedicine 55, 102763 (2020). D. Mathew et al., Science eabc8511 (2020).
14. Ramzy A., McNeil D.G. // W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Availableathttps://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020.
December 23, 2020
15. Sheila F. Lumley, B.M., B.Ch.,  et al. for the Oxford University Hospitals Staff Testing Group.//Antibody Status and Incidence of SARS-CoV-2 Infection in Health Care Workers.NEnglJMed . doi:10.1056/NEJMoa2034545.
16. ZhouP. // Apneumoniaoutbreakassociatedwithanewcoronavirusofprobablebatorigin // Nature, 2020. - Vol. 579, N 7798. - P. 270-273.
17. Всемирная организация здравоохранения. Определения случаев для эпиднадзора за тяжелым острым респираторным синдромом  (SARS). Доступно по адресу: http://www.who.int/csr/sars/casedefinition/en. Accessed: 6 июня 2003.
18. Временные методические рекомендации МЗ РФ- " Профилактика, диагностика и лечение новой короновирусной инфекции (COVID-19)", Версия 9 (26.10.2020).
19. ГОСТ Р 51088-2013, "Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест-системы, контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и поддерживающей документации".
20. ГОСТ Р 51352-2013, "Медицинские изделия для диагностики ин витро. Методы испытаний".
21. ГОСТ Р ИСО 23640-2015, " Изделия медицинские для диагностики invitro. Оценка стабильности реагентов для диагностики invitro".
22. Кори Л., Фауси А.С., etal. //Стратегический подход к исследованиям  и разработкам вакцины против COVID-19. Наука 2020; 368 ( 6494 ): 948 - 50 ).
23. Лесли М.// Т-клетки, обнаруженные у пациентов с коронавирусом, служат хорошим предзнаменованием для длительного иммунитета. Наука 2020; 368 (6493) 809 – 10.
24.  П.  Прабакаран,  Дж. Ган, Ю. Фэн, З. Чжу, В. Чоудри, X. Сяо, X. Джи,Д.С. Димитров. // Структура рецептор-связывающего домена коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома в комплексе с нейтрализующим антителом . J. Biol. Chem. 281 , 15829 -15836 ( 2006 ). DOI : 10.1074 / jbc.M600697200 pmid: 16597622.
25. Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 №715.
26. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 10.11.2017 N 106  "О Требованиях к внедрению, поддержанию и оценке системы менеджмента качества медицинских изделий в зависимости от потенциального риска их применения. Требования к внедрению, поддержанию и оценке системы менеджмента качества медицинских изделий в зависимости от потенциального риска их применения, Приложение N 5. Требования к содержанию технического файла на медицинское изделие для диагностики invitro, раздел VIII. Деятельность по верификации и валидации".
395
27. Хуанг С , Ван У , Ли Х , и др. Клинические особенности пациентов, инфицированных новым коронавирусом 2019 г., в Ухане, Китай . Ланцет 2020 ;  ( 10223 ): 497 - 506 .
28. Хаитов P.M., Ярилин А.А., Пинегин Б.В., Иммунология : атлас. — М .: ГЭОТАР-Медиа, 2011, с 187-191.
,
29. Цюань-Синь Лун ,Сяо-ЦзюньТан ,Цю-Линь Ши ,Цинь Ли ,Хай-Цзюнь Дэнеtall // Клинико-иммунологическая оценка бессимптомных инфекций SARS-CoV-2, Природа Медицина, объем 26, страницы 1200–1204 ( 2020 ).
30. Ю. Юань , Д. Цао , Ю. Чжан etall. // Крио-ЭМ структуры МЭРС-CoV и SARS-CoV Spike гликопротеинов раскрывают динамические рецепторы связывающих доменов . Nat. Commun. 8, 15092 ( 2017 ). DOI : 10.1038.
31. Ярилин А.А., Иммунология, 2010, стр.36-44; стр. 242; разд. 3.1.3, 3.6.2.2).