СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ИССЛЕДУЕМОГО ВЕЩЕСТВА
METHOD FOR ELECTROCHEMICAL ANALYSIS OF INVESTIGATED SUBSTANCE

Область техники, к которой относится изобретение
Это изобретение имеет отношение к улучшенному способу для электрохимического обнаружения исследуемого вещества.
Предшествующий уровень техники
WO 00/011473 описывает способы электрохимического анализа исследуемого вещества (например, антигена) в сложных образцах, проводимого с использованием потенциометрических электродов-датчиков для электрохимического обнаружения исследуемого вещества. Электроды-датчики, которые используются при применении этих способов, как правило, состоят из проводящих электродов, покрытых электропроводящим полимером (например, полипирролом). Молекулы-рецепторы, способные к выборочному взаимодействию с исследуемым веществом, иммобизизуются (адсорбируются) на электропроводящем полимерном покрытии, что и позволяет в конечном итоге обнаружить искомое исследуемое вещество. Обнаружение происходит с помощью формируемого специального комплекса, содержащего исследуемое вещество и компонент-метку, которая облегчает электрохимическое обнаружение. Этот специальный комплекс на поверхности электрода-датчика взаимодействует с молекулой-рецептором.
Способы обнаружения в соответствии с WO 00/011473, как правило, используются в несколько этапов, резюме чего дается ниже:
(a) подготовка электрода-датчика с электропроводящим полимером, который покрыт иммобилизованными или адсорбированными рецепторами, специфицируемыми под исследуемое вещество, являющееся объектом интереса;
(b) обработка электрода-датчика путем погружения его в образец так, чтобы вышеупомянутое искомое исследуемое вещество стало взаимодействовать на поверхности датчика с иммобилизованными или адсорбированными рецепторами, с целью формирования комплекса, в состав которого включен и компонент-метка;
(c) удаление электрода-датчика из образца и последующий мониторинг разности электрических потенциалов электрода-датчика, подвергшегося обработке, и эталонного электрода в условиях, когда оба электрода погружаются в соответствующий неактивный измерительный буфер, а также последующий;
(d) мониторинг разности электрических потенциалов электрода-датчика, подвергшегося обработке, и эталонного электрода после того, как оба электрода будут погружены в другой буфер, который в отличие от первого является электрохимически активным, что позволяет стимулировать электрохимическую активность компонента-метки.
WO 03/019171 описывает улучшенные способы производства потенциометрических электродов-датчиков, а также улучшенные способы электрохимического обнаружения, при применении которых используются вышеуказанные электроды-датчики. Однако улучшенные способы электрохимического обнаружения, описанные в WO 03/019171, все еще основываются на первых измерениях разности электрических потенциалов электрода-датчика, подвергшегося обработке, и эталонного электрода в условиях, когда оба электрода погружаются в соответствующий неактивный измерительный буфер, а также последующем мониторинге разности электрических потенциалов электрода-датчика, подвергшегося обработке, и эталонного электрода, выполняемом после того, как оба электрода будут погружены в другой буфер, который в отличие от первого является электрохимически активным, что позволяет стимулировать электрохимическую активность компонента-метки.
Раннее изобретатели разработали упрощенный способ электрохимического обнаружения, который не требует отдельного этапа (который бы выполнялся каждый раз для обнаружения заданного исследуемого вещества), применяется измерение разности электрических потенциалов электрода-датчика, подвергшегося обработке, и эталонного электрода в условиях, когда оба электрода погружаются в соответствующий неактивный измерительный буфер, то есть этапа, который предваряет этап погружения в буфер, во время которого происходит стимулирование электрохимической активности компонента-метки.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно данному изобретению предлагается способ электрохимического исследуемого вещества обнаружения в образце, который включает в себя следующие составные части:
(a) подготовка электрода-датчика, который представляет собой проводящий электрод, покрытый слоем электропроводящего полимера;
(b) взаимодействие электрода-датчика с раствором, который представляет собой образец, подлежащий тестированию, на предмет присутствия в нем исследуемого вещества, в условиях, которые обеспечивают формирование электрохимически активного исследуемого комплекса, который состоит из исследуемого вещества и электрохимически активного компонента-метки и находится на поверхности слоя электропроводящего полимера;
(c) взаимодействие электрода-датчика плюс электрохимически активного исследуемого комплекса с раствором, с электрохимически активным мерным раствором, который стимулирует электрохимическую активность электрохимически активного исследуемого комплекса;
(d) подключение электрического тока с целью получения на электроде-датчике предопределенного исходного потенциала;
(e) отключение электрического тока и возвращение электрода-датчика в состояние остаточного потенциала разомкнутого контура;
(f) измерение одного или большего количества следующих параметров как индикаторов количества исследуемого вещества, присутствующего в образце:
(i) разность двух потенциалов - исходного потенциала и остаточного потенциала разомкнутого контура,
(ii) скорость нарастания приращения испытательного напряжения, с которой исходный потенциал электрода-датчика возвращается к остаточному потенциалу разомкнутого контура,
(iii) величина электрического тока, необходимого для поддержания электрода-датчика в состоянии предопределенного исходного потенциала.
Способ, являющийся темой изобретения, - упрощение способов, описанных, например, в WO 00/11473 и WO 03/019171. С тех пор не возникало никаких требований в отношении отдельных этапов измерения разности электрических потенциалов электрода-датчика и эталонного электрода в неактивном измерительном буфере и во втором буфере, который обеспечивает электрохимическую активность компонента-метки. Таким образом, нет никакой нужды готовить отдельный неактивный мерный раствор и нет никакой нужды в дополнительной жидкости и/или в этапах манипулирования электродом, во время которых электрод-датчик перемещается из неактивного мерного раствора в активный мерный раствор.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 - схематическая иллюстрация способа измерения согласно изобретению, когда потенциал приводится к предопределенному потенциалу «y», затем происходит отключение электрического тока и замеряется потенциал разомкнутого контура в течение периода времени (t), то есть до тех пор, когда будет получен остаточный потенциал «z». Δzy - измеряется величина электрического тока и скорость нарастания приращения испытательного напряжения.
Фиг.2 - схематическая иллюстрация способа измерения, как и на фиг.1, но с этапом измерения колебаний потенциала до достижения предопределенного потенциала «у» и остаточного потенциала.
Фиг.3 - схематическая иллюстрация способа измерения согласно изобретению, который включает в себя до этапа финальных измерений циклы из четырех приведенных потенциалов и открытого потенциала.
Фиг.4 демонстрирует результаты испытания, во время которого применялся способ изобретения, основанный на использовании пероксидазы хрена. Ответная реакция электрода-датчика (потенциал в милливольтах) на воздействие различных концентрацией HRP был измерен после установки значения к исходному потенциалу - 130 милливольт. Потенциал разомкнутого контура измерялся в течение 60 сек.
Подробное описание изобретения
В способе, являющемся темой изобретения, используются электроды-датчики, покрытые слоем электропроводящего полимера. Основные характеристики этих электродов-датчиков, а также рекомендуемые способы производства электродов, покрытых слоем электропроводящего полимера, описаны более полно ниже, а также в изданных Международных патентных заявках заявителей WO 00/11473 и WO 03/019171, содержание которых включено здесь в виде ссылки.
Электроды-датчики могут быть по существу любыми подходящими электродами, в которых имеется проводящий или полупроводящий слой. Среди подходящих электродов нужно отметить стандартные потенциометрические электроды, обладающие металлической или квазиметаллической проводимостью и которые проявляют стойкость характеристик в водной среде, то есть, например, золотые электроды или электроды из других благородных металлов. Поверхность электродов-датчиков, по крайней мере, главная ее часть, должна быть электрохимически покрыта слоем электропроводящего полимера, например полипиррола, политиофена, полифурана, полианилина и т.д. Тонкий слой полимера должен быть положен на проводящий электрод способом электрохимического синтеза из раствора, в котором содержатся мономеры, полярный растворитель и фоновый электролит, согласно процедурам, которые хорошо известны в технологи (см. WO 00/11473 и WO 98/37409). Из мономеров предпочтение отдается пирролу, но также могут использоваться и другие мономеры, такие как тиофен, фуран или анилин. Могут также использоваться комбинации из двух (или более) этих мономеров, относящиеся к области производства проводящих сополимеров.
Предпочтительно использовать в качестве вспомогательного электролита додецилсульфат натрия, но и другие электролиты также могут использоваться. Электролит кроме всего прочего служит в качестве диффузанта. Предпочтительно использовать в качестве полярного растворителя деионизированную воду.
Раствор для электрохимической полимеризации вообще состоит из водного раствора вспомогательного электролита и мономеров. Однако к полимеризационному раствору могут быть добавлены и другие компоненты, например, компоненты, которые представляют собой определенные функциональные группы, которые могут использоваться как компоновщики для биологических рецепторов или для химической модификации поверхности датчика (см. WO 00/11473 и WO 98/37409).
Электрохимическая полимеризация обычно выполняется в трехэлектродной ячейке, включающей в себя электрод-датчик(и), на который будет наноситься покрытие, вспомогательного электрода и электрода сравнения. Соответствующие комплекты были описаны в предшествующих технологиях (см. WO 00/11473 и справочную информацию, которая там содержится). Мультиплицированные электроды-датчики могут быть объединены в блоке с одним электрическим контактом. Весь массив электродов-зондов может быть покрыт соответствующим слоем в один единственный прием реакции полимеризации. Так что можно потратить или только один сменный вспомогательный электрод или только один вспомогательный электрод на пару, состоящую из электрода-зонда и электрода сравнения. Например, массивы, которые включают в себя третий вспомогательный электрод, связанный с парой, состоящей из электрода-зонда и электрода сравнения (например, для амперометрического анализа) могут быть подвергнуты гальванической обработке, при которой третий электрод будет использоваться как вспомогательный электрод. В дальнейшем будет считаться, что электроды сравнения могут использоваться как вспомогательные электроды на этапе полимеризации. Электродом сравнения можно манипулировать таким образом, что он может функционировать как вспомогательный электрод при полимеризации, например, в случае с электродами Ag/AgCl, при этом отношение Ag/AgCl может быть временно изменено так, что электрод при полимеризации будет функционировать как вспомогательный электрод, а затем его функции могут быть восстановлены для того, чтобы после полимеризации он мог функционировать как электрод сравнения.
Как хорошо известно специалистам-технологам, электропроводящие полимеры на стадии электрохимического синтеза часто подвергаются допированию для того, чтобы изменить структуру и/или свойства проводимости полимера. Легкость, с которой происходит ионный обмен, и скорость, с которой в электропроводящих полимерах, погруженных в раствор, достигается ионное равновесие, по существу зависят от размера аниона допанта, введенного на стадии гальваностегии: чем больше ионный радиус аниона допанта, тем быстрее происходит реакция ионного обмена и тем быстрее достигается состояние равновесия. Эти процессы зависят непосредственно от величины электрического тока и порогового значения изменения потенциала системы "Электропроводящего полимера металлического электрода" в ответ на изменение ионного состава раствора. Тип ответа (анионный, катионоактивный, окислительно-восстановительный) и скорость нарастания приращения испытательного напряжения могут быть определены в течение процесса полимеризации.
4
2-
Типичный анион допанта - сульфат (SO ), который включается в состав раствора во время процесса полимеризации, нейтрализуя положительный заряд остова полимера. Сульфат с готовностью не выпущен ионным обменом и таким образом помогает поддерживать{обслуживать} структуру полимера.
Для pH- и редокс-датчиков при подготовке электрохимического полимеризационного раствора в качестве фонового электролита предпочтительно использовать соль, анионы которой имеют большой ионный радиус.В этом случае ионный отклик будет минимизирован и будет преобладать редокс- или pH-отклик. При этом потенциометрический отклик вызывается электронным обменом между полимерной пленкой и раствором, выступающим к качестве окружающей среды.
В качестве подходящих солей, анионы которых имеют большой ионный радиус, выступают такие соли, как додецилсульфат натрия и сульфат декстрана. Концентрация этих солей в электрохимическом полимеризационном растворе различна в зависимости от типа теста и находится в пределах диапазона от 0,0001 до 0,05 м.
3
6
4
6
Редокс-отклик может быть усилен, если в раствор добавить ионы допанта-полимера, которые могут изменить редокс-состояние из-за изменения раствора, выступающего в качестве окружающей среды и который позволяет датчику зафиксировать дополнительные изменения редокс-состоянии. Допант должен быть в редуцированной форме, если один из компонентов раствора окислен, и наоборот. K[Fe(CN)]/K[Fe(CN)] может выступать как пример для обоих случаев. Концентрация этих электролитов в электрохимическом полимеризационном растворе может быть различна в пределах диапазона от 0,001 до 0,1 мв зависимости от требований теста.
Структура поверхности электродов, покрытых слоем электропроводящего полимера, может быть в дальнейшем изменена, путем гальванизации биологическими молекулами (также упомянутыми здесь как "рецепторы"), которые взаимодействуют с исследуемым веществом особым способом, или другими функциональными группами или молекулами, которые могут использоваться как линкеры или адаптеры биологических молекул или для химической модификации поверхности датчика (см. WO 00/11473, WO 98/37409 и WO 96/02001).
Биологические молекулы, например, молекулы-рецепторы, способные к определенному взаимодействию с исследуемым веществом, могут быть иммобилизованы на датчике с помощью известных технологий твердофазового нанесения покрытий. Биологические молекулы могут быть включены в электропроводящий полимер в ходе реакции полимеризации, или они могут адсорбироваться на поверхности покрытого электрода-зонда в ходе реализации отдельного этапа модификации, который запускается после этапа полимеризации, или они могут быть ковалентно связаны с полимерным покрытием (см. WO 00/11473, WO 98/37409 и WO 96/02001).
В своем специфическом воплощении биологические молекулы могут быть «молекулами-адаптерами», которые допускают в дальнейшем присоединение других молекул или даже целых клеток к поверхности датчика с помощью специальных формул взаимодействия. Путем соответствующего подпора молекул-адаптеров возможно также изготовить "универсальные" электроды-зонды, содержащие такие молекулы-адаптеры, которые могут взаимодействовать с большим диапазоном различных молекул-рецепторов. Вся специфичность для исследуемого вещества заключена в "универсальном" электроде-зонде, поскольку картина взаимодействия с молекулами - адаптерами, являющимися рецепторами, определяется их соответствующей специфичностью.
Белки авидин и стрептавидин предпочтительны при использовании их в качестве молекул-адаптеров. Исследования, выполненные авторами настоящего изобретения, показали, что авидин и стрептавидин, иммобилизованые в слой электропроводящего полимера, сохраняют свои природные характеристики в течение длительного периода времени (по крайней мере один год, а возможно и дольше) и могут использоваться в течение всего этого периода для взаимодействия с биотинилированными рецепторами. Методики, которые позволяют осуществлять конъюгацию биотина с широким диапазоном различных молекул, хорошо известны в технологии. Таким образом, для каждого заданного исследуемого вещества можно легко изготовить подходящие для него электроды-зонды с иммобилизованым авидином или стрептавидином, соответствующие биотинилированные рецепторы которых будут легко взаимодействовать с помощью связки биотин/авидин или биотин/стрептавидин.
Хотя авидин и стрептавидин являются предпочтительными молекулами-адаптерами, в рамках данного изобретения можно использовать альтернативные молекулы-адаптеры, например, белок А, белок G, лектины и FITC. Объединение молекул-адаптеров дает возможность другим биологическим молекулам или даже целым клеткам присоединиться к поверхности электрода-зонда, например, через интерактивное взаимодействие белок А/антитело, белок G/антитело, ПТС/анти-ПТС или лектин/сахар. Биологические молекулы могут быть поглощены альтернативно, будучи непосредственно или ковалентно связанными с поверхностью покрытого полимером датчика.
Чтобы продемонстрировать способ, являющийся темой данного изобретения, электрод датчика сначала погружается раствор, содержащий образец, который будет подвергнут тестированию на присутствие исследуемого вещества. Поскольку используемый здесь термин "образец" подразумевает в пределах возможностей его использования любой желаемый материал, который нужно протестировать на предмет присутствия в нем исследуемого вещества, включая в этот термин (но не ограничиваясь этим) биологические жидкости, типа крови, сыворотки, плазмы, мочи, лимфы, спинномозговой жидкости, асцита, плеврального излияния или спермы; экологические жидкости, типа стоков или отходов химической промышленности; материалы, используемые или произведенные в пищевой промышленности и промышленности спиртных и безалкогольных напитков, например, молоко; или растворы или экстракты любого из вышеупомянутых продуктов. Образец может также выступать в виде раствора или экстракта твердого материала. Должно быть учтено, что определенные типы образцов могут быть протестированы непосредственно без потребности в какой-либо обработки типа растворения. Такие образцы также нужно рассматривать в качестве "раствора, включающего образец, подлежащий тестированию на предмет присутствия исследуемого вещества". Раствор, включающего образец, подлежащий тестированию на предмет присутствия исследуемого вещества, может быть также упоминаться здесь как "тестируемый раствор".
Взаимодействие между электродом-датчиком и раствором, включающим образец, подлежащий тестированию на предмет присутствия исследуемого вещества, может быть обеспечено полностью или частично путем погружения электрода-датчика в раствор. В этом виде раствор может быть удобно помещен в подходящий контейнер, типа, например, титрационного микропланшета, микроцентрифужной пробирки или любого другого судна подходящего размера, достаточного для размещения электрода-датчика или электродного комплекта, включающего электрод-датчик. В качестве альтернативы, взаимодействие может быть обеспечено путем помещения капли раствора на поверхность электрода-датчика. Объем тестируемого раствора вообще может составлять от 5 до 200 µI в зависимости от геометрических размеров электрода-зонда.
Электрод-датчик взаимодействует с раствором, включающим образец, в течение достаточного промежутка времени и в условиях, которые позволяют сформировать специфический электрохимически активный комплекс с исследуемым веществом на поверхности электрода-датчика, и еще более специфический - на слое электропроводящего полимера, нанесенного на электрод-датчик. Продолжительность взаимодействия между электродом - датчиком и тестируемым раствором (примером данного изобретения продолжительность не ограничивается) обычно с 3 до 30 минут при 15-40°С при непрерывном или без какого-либо помешивания. Электрохимически активный комплекс с исследуемым веществом должен включать в себя, по крайней мере, само исследуемое вещество, а также электрохимически активный компонент-метку. Формирование этого комплекса на поверхности электрода-датчика, таким образом, прямо или косвенно пропорционально концентрации исследуемого вещества в образце.
Комплекс с исследуемым веществом формируется в или на электропроводящем полимерном покрытии, нанесенном на поверхность электрода-датчика, так, что электрохимически активный компонент-метка непосредственно физически соприкасается с электропроводящим полимером. Компонент-метка может, таким образом, оказывать прямое или косвенное воздействие на окислительно-восстановительные свойства электропроводящего полимера, и этот эффект обеспечивает выявление объема исследуемого вещества, находящегося в образце, что возможно благодаря тому, что формирование комплекса, включающего в себя стехиометрические показатели исследуемого вещества и компонента-метки, прямо- или непрямопропорционально зависит от концентрации исследуемого вещества в образце. Таким образом, электропроводящее полимерное покрытие в действительности является трансдукционным элементом датчика, то есть окислительно-восстановительное состояние проводящего полимера работает как преобразователь, преобразовывая химический сигнал, связанный с концентрацией исследуемого вещества, в измеримый электрический сигнал.
Электрохимически активный компонент-метка может быть любой меткой, которая прямо или косвенно воздействует на окислительно-восстановительные свойства электропроводящего слоя электрода-датчика.
В наиболее предпочтительном варианте электрохимически активный компонент-метка может быть любой меткой, если она является заряженной меткой, имеющей следующие свойства:
a) она несет в себе результирующий заряд в pH-факторе электрохимически активного мерного раствора; и
b) величина этого заряда изменяется тогда, когда в электроде-датчике вызывается предопределенный исходный потенциал, заряжая таким образом частицу положительно или отрицательно в зависимости от состояния ее предпочтительного заряда.
Соответствующие заряженные метки также характеризуются тем, что величина их заряда изменяется в ответ на изменение ионной силы мерного раствора при постоянном pH-факторе или в ответ на изменение pH-фактора при постоянной ионной силе. Этот эффект можно редуплицировать путем обеспечения в электроде-датчике предопределенного неподвижного потенциала, заряжая таким образом частицу положительно или отрицательно в зависимости от состояния ее предпочтительного заряда. Таким образом, согласно способу, который является темой данного изобретения, нет никакой необходимости выполнять замеры потенциала электрода-датчика относительно потенциала эталонного электрода в двух разных мерных растворах, то есть в неактивном измерительном буфере и во втором буфере, который отличается от измерительного буфера изменяемым pH-фактором при постоянной ионной силе или изменяемой ионной силой при постоянном pH-факторе. Вместе с тем, эффект перехода компонента-метки из "неактивного" в "активный" буфер редуплицируется путем индукции предопределенного потенциала. Когда применяется предопределенный потенциал, величина заряда на заряженных метках изменяется настолько, что проявляется видимый эффект воздействия на окислительно-восстановительные свойства электропроводящего полимерного слоя.
Предпочтительные заряженные метки состоят (но этим не ограничены) из таких элементов, как золото, ферроцен или латексные микросферы.
В последующем, в одном из предпочтительных вариантов реализации изобретения электрохимически активный компонент-метка может быть ферментной меткой. Соответствующие ферментные метки включают в себя любой фермент, способный к преобразованию субстрата в продукт, благодаря чему фермент прямо или косвенно начинает оказывать воздействие на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия электрода-датчика.
В одном из вариантов реализации изобретения фермент может обладать способностью к преобразованию такого субстрата, который до этого не оказывал какого-либо видимого воздействия на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия электрода-датчика, в продукт с новыми свойствами, обладающий способностью оказывать непосредственное воздействие на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия.
В последующем, в одном из вариантов реализации изобретения фермент может обладать способностью к преобразованию такого субстрата, который обладает способностью непосредственно воздействовать на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия электрода-датчика, в продукт с новыми свойствами, который уже не будет обладать способностью оказывать какое-либо видимое воздействие на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия электрода-датчика.
Продукт - фермент или субстрат, может прямо или косвенно воздействовать на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия электрода-датчика в тех случаях, когда происходят изменения в химическом составе электропроводящего полимера, и/или изменения pH-фактора, и/или изменения в ионной силе мерного раствора в области его соприкосновения с поверхностью электропроводящего полимерного покрытия.
Предпочтительные ферметные метки состоят (но этим не ограничены) из таких элементов, как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, уреаза, каталаза и оксидаза глюкозы.
В последующем, в одном из вариантов реализации изобретения компонент-метка может состоять из или являться частью ферментного комплекса, состоящего из множества составных модулей, или мультиферментным каскадом. Например, метка-фермента может обладать способностью к преобразованию такого субстрата, который до этого не оказывал какого-либо видимого воздействия на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия электрода-датчика, в такой продукт, который является субстратом для второго фермента, то есть возбудить действие второго фермента, генерирующего второй продукт, который прямо или косвенно оказывает воздействие на окислительно-восстановительную картину электропроводящего полимерного покрытия электрода-датчика. Второй фермент может также являться частью электрохимически активного комплекса с исследуемым веществом, или же может быть отдельно связан с электропроводящим полимерным покрытием электрода-датчика. В качестве альтернативы первый фермент может быть отдельно связан с электропроводящим полимерным покрытием электрода-датчика, или же может даже присутствовать в основном растворе вместе со вторым ферментом, являющимся частью электрохимически активного комплекса с исследуемым веществом.
Формирование электрохимически активного комплекса с исследуемым веществом может быть осуществлено разными способами, в зависимости от того, насколько будет схвачена ситуация специалистом, специализирующимся в области технологии диагностического тестирования. Эти способы включают в себя, среди прочего, все формы гетерогенного и гомогенного, конкурсного и многоуровнего анализа состава, как описано в деталях ниже.
Способ, который является темой данного изобретения, может быть адаптирован для того, чтобы выполнять количественный анализ для широкого круга веществ, подлежащих исследованию. В частности, этот способ может использоваться для выполнения электрохимического анализа в многоуровневом формате или в конкурсном формате.
2
Для проведения типичного многоуровневого анализа требуется рецептор "захвата", спецификация которого сопряжена с особенностями исследуемого вещества. Рецептор может быть по существу связующим веществом любого типа, обладающим способностью к сопряженному взаимодействию с исследуемым веществом. Соответствующими рецепторами могут являться (но этими компонентами список не ограничен) связующие вещества как естественного происхождения, так и рекомбинантно-биологические связующие вещества, например, антитела или их фрагменты, например фрагменты F(ab'), фрагменты scAbs, Fv и scFv и т.д., нуклеиновые кислоты, лектины, все типы лиганд-связующих рецепторов, например, гормональные рецепторы, рецепторы цитокина и т.д., нуклеиновая кислота, связующая белки и аптамеры.
Рецептор захвата обычно иммобилизуется на поверхности электрода(ов)-датчика(ов), например, он может адсорбироваться на поверхности электрода, покрытого слоем полимера, или быть захваченным полимером покровного слоя электрода-датчика. Когда электрод-датчик находится в состоянии функционирования, любое исследуемое вещество, если оно содержится в образце, свяжется с иммобилизованным рецептором захвата. Для электрохимического обнаружения связанного исследуемого вещества требуется вторичный рецептор, обладающий способностью связываться с исследуемым веществом в месте, пространственно отличном от места связывания со связующим веществом. Вторичный рецептор обычно конъюгирует с компонентом-меткой так, как это происходит с заряженной или ферментной меткой, что и позволяет обеспечить электрохимическое обнаружение таким образом, как здесь и описано. В этом варианте реализации "электрохимически активный комплекс с исследуемым веществом", сформированный на электропроводящем полимерном покрытии электрода-датчика, является комплексом, состоящим из рецептора захвата, исследуемого вещества, вторичного рецептора и компонента-метки.
Этапы реакции сродства, относящиеся к вышеописанному анализу, эквивалентны хорошо известному специалистам многоуровневому анализу связывания. Многоуровневый формат анализа особенно подходит для работы по обнаружению многопараметрических антигенов, когда агент захвата и маркированный вторичный рецептор, используемый в тесте, предпочтительно являются антителами, которые связываются с различными, пространственно разграниченными антигенными детерминантами на антигене. Многоуровневый формат может также применяться тогда, когда антиген несет две или более идентичные антигенные детерминанты, которые пространственно разграничены. В этом последнем варианте реализации агент захвата и маркированный вторичный рецептор, используемый в тесте, могут являться антителами идентичной спецификации.
Для проведения типичного конкурсного анализа требуется рецептор "захвата", спецификация которого сопряжена с особенностями исследуемого вещества, который обычно иммобилизовывается на поверхности электрода(ов)-датчика(ов) так, как это описано в отношении проведения многоуровневого анализа. Когда электрод-датчик приведен в соприкосновение с образцом, какое бы исследуемое веществ не присутствовало в образце, оно будет связано с иммобилизованным рецептором захвата. Конкурирующие молекулы, также обладающие способностью к связыванию с агентом захвата, конкурируют с исследуемым веществом за то, чтобы связаться с доступным агентом захвата. Конкурирующие молекулы маркированы компонентом-меткой, которая позволяет осуществить электрохимическое обнаружение, например, такой как заряженная метка или ферментная метка. В этом варианте реализации "электрохимически активный комплекс с исследуемым веществом", сформированный на электропроводящем полимерном покрытии электрода-датчика, является комплексом, состоящим из рецептора захвата, конкурирующей молекулы и компонента-метки.
В условиях конкурсного электрохимического анализа конкурирующие молекулы могут быть маркированным исследуемым веществом или маркированными структурными аналогами исследуемого вещества, которые обладают способностью к связыванию в том же самом месте, в котором происходит связывание исследуемого вещества, на иммобилизованном/адсорбируемом агенте захвата. Использование маркированного исследуемого вещества как конкурирующей молекулы особенно предпочтительно при обнаружении исследуемого вещества с маленькими молекулами. В качестве альтернативы конкурирующая молекула может связаться с другим местом на иммобилизованном/адсорбируемом агенте захвата. Например, если иммобилизованный агент захвата является антителом, конкурирующая молекула могла бы быть антителом антииммуноглобулина (предпочтительно - Fab-специфичным) или даже антителом с набором антиидиотипических детерминант соответствующей спецификации. Эффективность конкурсных способов обнаружения обычно зависит от того, насколько много мест захвата находится на поверхности электрода-датчика. Те агенты захвата, которые не связались с исследуемым веществом, становятся доступными для того, чтобы связаться с конкурирующей молекулой. Если предположить, что общее количество мест захвата остается постоянным, количество связанных конкурирующих молекул будет обратно пропорционально количеству содержащегося исследуемого вещества.
Этапы реакции сродства, относящиеся к вышеописанному анализу, действительно эквивалентны хорошо известному специалистам многоуровневому или конкурсному иммуноферментному анализу (ELISA). Хотя способ, являющийся темой данного изобретения, специально предназначен для выполнения электрохимического анализа ELISA, в будущем будет доказано, что базовый анализ, являющийся темой данного изобретения, может быть использован для выполнения других типов анализа, касающихся изменения в pH-факторе, ионной силе или окислительно-восстановительном потенциале, например, для выполнения анализов, касающихся альтернативных рецепторов (например, односпиральных нуклеиновых кислот, ферментов, клеточных систем и т.д). Способ, являющийся темой данного изобретения, может также использоваться для выполнения прямых ферментативных анализов тех исследуемых веществ, которые являются также и субстратами для соответствующего фермента. В таких вариантах реализации фермент, который также формирует компонент-метку, может быть иммобилизован или адсорбирован непосредственно на электропроводящем полимере вместо того, чтобы быть конъюгированным на дополнительный компонент-рецептор.
После формирования электрохимически активного комплекса с исследуемым веществом электрод-датчика приводится в контакт с электрохимически активным мерным раствором или помещается в буфер, в котором происходит стимуляция электрохимической активности электрохимически активного комплекса с исследуемым веществом. «Стимуляция электрохимической активности» сводится к тому, что активный мерный раствор обеспечивает такие условия, которые вызывают изменения в свойствах или активности компонента-метки комплекса с исследуемым веществом, например, в ответ на подключение и последующее отключение ток во внешней цепи. Эти изменения в свойствах или активности комплекса с меткой, в свою очередь, прямо или косвенно оказывает воздействие на окислительно-восстановительные свойства электропроводящего покрытия электрода-датчика.
Например, в вариантах реализации, когда комплекс с исследуемым веществом включает в себя заряженный компонент-метку, pH-фактор и/или ионная сила активного мерного раствора будут такими, что величина заряда на заряженном компоненте-метке может изменяться в ответ на подачу тока от внешней цепи. Молярность, ионная сила и pH-фактор активного мерного раствора, используемого с заряженными метками, могут изменяться в зависимости от величины/силы и полярности заряда. В вариантах реализации, когда комплекс с исследуемым веществом включает в себя ферментный компонент-метку, активный мерный раствор может включать в себя субстрат для фермента. Соответствующие активные мерные растворы, используемые с ферментными метками, являются буферами с маленькой ионной силой, содержащими в себе все реактивы, которые необходимы для активации фермента в условиях оптимального pH-фактора для специфических ферментов, например, для пероксидазы хрена буфер может состоять из 50 тМ цитратного буфера (pH-фактор 5,0) содержащий OPD на 0,1 мг/мл и 0,03% w/v водородного пербората.
Этап (с), когда электрод-датчик входит в соприкосновение с электрохимически активным мерным раствором, может быть достигнут несколькими различными способами. В одном варианте реализации электрод-датчик может быть перемещен из раствора, содержащего образец, находящийся в состоянии этапа (b), в активный мерный раствор этапа (с). Электрод-датчик может быть физически перемещен из первого контейнера или судна, в котором содержится раствор с образцом, во второй отдельный контейнер или судно, в котором содержится активный мерный раствор. Электрод-датчик, после удаления из раствора с образцом и перед перемещением в активный мерный раствор, можно промыть, чтобы были удалены какие бы то ни были следы раствора с образцом, включая следы какого бы то ни было несвязанного исследуемого вещества.
В последующих вариантах реализации данного изобретения этапы (b) и (с) могут быть выполнены в одном контейнере или судне: просто после того как электрохимически активный комплекс с исследуемым веществом сформируется на поверхности датчика, нужно добавить в раствор с образцом этапа (b) дополнительное количество активного мерного раствора этапа (с). Добавление активного мерного раствора уменьшает какой бы то ни был эффект воздействия образца и в то же самое время удаляет легкосвязанные комплексы. Этот вариант реализации данного изобретения работает таким же образом, как и вариант реализации, когда электрод-датчик "перемещается" в мерный раствор, поскольку замеряемый эффект происходит на поверхности датчика, и любые реакции, происходящие в основном растворе, не имеют какого бы то ни было существенного эффекта на измеряемые параметры комплекса, связанного на поверхности проводящего полимерного покрытия.
В вариантах реализации способа, являющегося темой данного изобретения, когда не рассчитывают на использование контейнеров для каких бы то ни было растворов, каплю раствора, в котором содержится образец, сразу же помещают на датчик. При возникновении необходимости переместить образец с активным мерным раствором, датчик может быть просто промыт, чтобы удалить раствор с образцом, а затем капля активного мерного раствора опять помещается на датчик.
Перед тем как к датчику подать ток для его активации, нужно в течение короткого промежутка времени (обычно от 10 секунд до 60 секунд) подержать датчик в активном мерном растворе, не подвергая его каким-либо действиям. Подав ток, нужно сдвинуть потенциал электрода-датчика в состояние предопределенного потенциала. Предопределенный потенциал имеет отношение к тому, из-за чего в контрольно-мерном растворе, состав которого должен быть максимально идентичен составу активного мерного раствора, но без электрохимически активного компонента, должен быть остаточный потенциал электрода-датчика относительно эталонного электрода. В случае с ферментной меткой контрольно-мерный раствор должен быть раствором, состав, pH-фактор и ионная сила которого идентичны соответствующим параметрам активного мерного раствора, но без присутствия субстрата фермента. В случае с заряженной меткой контрольно-мерный раствор должен быть раствором, в котором ионная сила слабее или pH-фактор отличается от активного измерительного буфера. Для любой заданной системы соответствующее значение или узкий диапазон значений предопределенного потенциала может быть определен на этапе калибровки с помощью простых измерений остаточного потенциала системы в контрольно-мерном растворе. Должно быть принято во внимание, что выбранный предопределенный потенциал может изменяться только немного от точно измеренного значения остаточного потенциала, если в существенной степени не затрагивать функцию способа анализа. Как только будут определены или предоставлены соответствующие значения предопределенного потенциала для специфической системы датчиков, после этого не будет необходимо повторять такие измерения каждый раз при использовании датчика.
Электрический ток, управляющий предопределенным исходным потенциалом, может быть отрегулирован так, чтобы поддерживать электрод-датчик на данном уровне предопределенного потенциала в течение требуемого промежутка времени (обычно от 1 секунды до 10 секунд). Затем электрический ток отключается, и в течение определенного времени (обычно от 1 секунды до 180 секунд) замеряется потенциал разомкнутого контура. В течение этого периода потенциал датчика возвращается к своему нейтральному состоянию, обусловленному исключительно электрохимической деятельностью комплекса с исследуемым веществом (см. фиг.1(а)). Время, требуемое для возврата датчика в его нейтральное состояние, зависит от реакции, которая должна подвергнуться измерениям, и от концентрации этой реакции, происходящей на поверхности, а это в свою очередь зависит от количества в образце исследуемого вещества.
В случае с комплексами, содержащими исследуемое вещество и включающими в себя ферментные метки, электрохимически активная реакция (ферментативное преобразование субстрата в продукт) происходит непрерывно на поверхности электрода-датчика так, что электрод быстро возвращается к электрохимически индуцированному остаточному потенциалу, как только удаляется удерживающий ток (электрически индуцированный потенциал). Различие между электрически индуцированным исходным потенциалом и электрохимически индуцированным остаточным потенциалом (также был упомянут здесь как остаточный потенциал разомкнутой цепи) является индикатором концентрации в образце исследуемого вещества (примите к сведению: значение этого электрохимически индуцированного остаточного потенциала в активном мерном растворе будет отличаться от остаточного потенциала в контрольном буфере, в котором отсутствует электрохимически активный компонент).
При использовании этого способа могли бы быть произведены замеры других параметров, которые также являлись бы индикаторами концентрации исследуемого вещества.
Вот эти параметры:
величина электрического тока, необходимая для поддержания заданного предопределенного потенциала, и;
начальная скорость нарастания приращения испытательного напряжения, с которой достигнутый потенциал возвращается к электрохимически индуцированному остаточному потенциалу.
Таким образом, способ, являющийся темой данного изобретения, может основываться на измерении любого из или любой комбинации из двух или более нижеследующих параметров:
(i) разность двух потенциалов - исходного потенциала и остаточного потенциала разомкнутого контура,
(ii) скорость нарастания приращения испытательного напряжения, с которой исходный потенциал электрода-датчика возвращается к остаточному потенциалу разомкнутого контура,
(iii) величина электрического тока, необходимого для поддержания электрода-датчика в состоянии предопределенного исходного потенциала.
Это больше всего подходит для способа, основанного на измерении параметра (i), но и включение одного из или обоих параметров (ii) и (iii) в качестве "вторичных замеряемых параметров" значительно повысило бы уверенность относительно результатов анализа, потому что вместо того, чтобы иметь только одно измерение, можно воспользоваться тремя синергетически связанными измерениями. Кроме того, любой из этих параметров может также использоваться, чтобы контролировать состояние электрода-датчика и сигнала на предмет возникновения неисправностей и быстро устранять возможные неполадки.
Хотя данный способ только того и требует, чтобы подводимый электрический ток поддерживал датчик в пределах одного единственного предопределенного потенциала, могут также использоваться и альтернативные профили активации, позволяющие расширить диапазон отклика датчика и гарантировать оптимальную сбалансированность электрода сравнения. Например, перед установкой потенциала, производимой еще до измерения потенциала разомкнутого контура, датчик может приводиться более чем к одному потенциалу, на уровень выше или ниже предопределенного потенциала. Или, например, может быть выполнено несколько этапов разрядки и/или несколько потенциалов активации, как это проиллюстрировано, например, на фиг.2 и 3.
При выполнении этапов измерений (d) и (f), являющихся составными частями способа анализа, являющегося предметом данного изобретения, необходимо наличие комплекта электродов, состоящего из электрода-датчика, электрода сравнения и вспомогательного электрода. Выполнение функций электрода сравнения и функций вспомогательного электрода можно обеспечить за счет использования одного единственного электрода в двухэлектродной системе. В качестве альтернативы раздельные электрод сравнения и вспомогательный электрод могут использоваться и в трехэлектродной системе. Среди соответствующих электродов сравнения можно отметить, например, стандартные электроды Ag/AgCl или каломельные электроды. Среди соответствующих вспомогательных электродов можно отметить, например, электроды, изготовленные из платины, других благородных металлов или из других проводящих материалов типа графита или углерода.
Электрод сравнения и вспомогательный электрод могут быть внешними по отношению к электроду-датчику или могут быть интегрированы с электродом-датчиком для формирования комплекта электродов.
При выполнении этапов измерения параметров обязательно подается электрический ток между вспомогательным электродом и электродом-датчиком для того, чтобы поддерживать электрод-датчик в предопределенном потенциале. При этом потенциал электрода-датчика измеряется относительно потенциала электрода сравнения только тогда, когда все электроды находятся в соприкосновении с активным мерным раствором. Таким образом, комплект электродов может быть скомпанован только после формирования электрохимически активного комплекса с исследуемым веществом на электропроводящей полимерной поверхности электрода-датчика, но до или в ходе соприкосновения с активным мерным раствором. Например, датчик, вспомогательный электрод и электрод сравнения для формирования электрохимической клетки должны быть полностью или частично погружены в активный мерный раствор и должны взаимодействовать друг с другом с помощью соответствующих приспособлений. С другой стороны, в этом нет необходимости, если планируется приведение электрода сравнения и вспомогательного электрода в соприкосновение с раствором, в котором содержится образец, на этапе (b).
В последующих вариантах реализации один или более электродов-датчиков вспомогательные электроды и электроды сравнения могут быть заранее сформированы в виде интегрированного комплекта датчиков. Комплект датчиков может быть сформирован до покрытия электрода-датчика электропроводящим полимерным покрытием. В этом случае электрод сравнения и вспомогательный электрод могут также использоваться в целях электрохимической полимеризации, в соответствии с описаниями в WO 00/11473 и WO 03/019171. Соответствующие комплекты датчиков также описаны в WO 00/11473 и WO 03/019171. На финальной стадии возможно много вариантов различных компоновок комплекта датчиков, например, можно включать в комплект датчики типа "измерительного стержня", многолуночные (агглютинационные) планшеты, содержащие интегрированные электрохимические датчики (в соответствии с описанием, содержащимся в WO, 03/081253) и боковые устройства потока, состоящие из электрохимических датчиков (в соответствии с описанием, содержащимся в WO 2004/010143).
Изобретение станет далее более понятным при обращении к нижеследующим неограничивающим экспериментальным примерам:
Пример 1
Если иначе не заявлено, все материалы, реактивы, а также способы их подготовки соответствуют описанию, данному в WO 00/11473 и WO 03/019171.
Подготовьте электроды-датчики, покрытые полипиррольной оболочкой с иммобилизованным/адсорбируемым стрептавидином, при этом использовались методики электрохимического покрытия, описанные в WO 00/11473 или WO 03/019171.
Промойте стрептавидин-покрытые датчики в буфере 0,1М фосфата калия, pH-фактор 7,8, помещая каждый датчик последовательно в каждую из трех ячеек микротитрационного планшета, заполненного буфером объемом 250 µI (датчики могут быть находится в этом буфере в течение следующего этапа).
Подготовьте концентрат биотинилированной пероксидазы хрена (HRP) в буфере 0.1М фосфата калия, pH-фактор 7.8. Регулярные концентраты, используемые для QC: 0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 и 1.0 нанограмма/мл (для других экспериментов могут потребоваться другие концентраты).
Поместите по 200 µI каждого из концентрата HRP-биотина в ячейку микротитрационного планшета.
Разместите все датчики по отдельным ячейкам. Рабочая часть каждого датчика должна быть полностью погружена раствор.
Датчики должны находится в биотинилированном HRP-концентрате при комнатной температуре в течение 15 мин.
Промойте датчики в буфере 0,1М фосфата калия. Вымойте датчики с 0.1М, pH-фактор 7,8.
Примите к сведению: после этого этапа датчики можно держать в промывочном буфере в течение 1-2 часов.
При измерениях пользуйтесь регулятором напряжения (например, автолабом), которым можно зарядить датчик с неподвижным потенциалом и затем измерить потенциал разомкнутого контура.
Поместите датчики в 50 mM цитратного буфера (pH-фактор 5,0), содержащего о-фенилендиамин (OPD) на 0,1 мг/мл и 0,03% w/v водородного пербората.
В течение 10 секунд зарядите датчик до уровня -130mV и в течение 60 секунд проводите замеры потенциала разомкнутого контура. Результаты проиллюстрированы на фиг.4.