СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КЛЮЧЕВЫХ ПОРОД МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ В РОССИИ НА ОСНОВЕ МУТАГЕННОЙ ПЦР-ПДРФ
METHOD OF DIFFERENTIATION OF KEY BREEDS OF HONEY BEES IN RUSSIA BASED ON MUTAGENIC PCR-RFLP

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа дифференциации основных пород медоносной пчелы (Apis mellifera L.) России и может быть использовано для идентификации пород медоносных пчел на пасеках и пчеловодческих предприятиях.
Карпатская (Apis mellifera carpathica), горная кавказская (Apis mellifera caucasica), краинская (Apis mellifera carnica) и среднерусская (Apis mellifera mellifera) породы медоносных пчел в настоящее время являются самыми распространенными породами в России. Важность дифференциации пород пчел обусловлена их разной способностью к сбору меда в конкретных условиях окружающий среды, плодовитостью, агрессивностью и другими поведенческими характеристиками. Дифференциация пород медоносных пчел является сложным и трудоемким процессом.
На данный момент дифференциация пород пчел Apis mellifera L. в большинстве случаев проводится по морфологическим признакам, что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный энтомолог. Зачастую необходимо быстро идентифицировать породу пчел, чтобы правильно маркировать приобретаемую продукцию, а также провести корректную породную маркировку в ульях на пасеках. Рядом авторов были исследованы молекулярно-генетические методы идентификации пород пчел. Среди них ПЦР со случайными праймерами (Чудинов, О.С. и др. Оптимизация RAPD-технологии для изучения генетического полиморфизма ДНК-генома различных пород пчел. Сельскохозяйственная биология. 1999, 6:47-56); микросателлитный анализ (Кривцов Н.И. и др. Дифференциация основных пород пчел с использованием микросателлитов. Вестник Рязанского государственного агротехнологического университета им. П.П. Костычева. 2011, 4(12):23-27), анализ межгенного участка COI-COII в митохондриальной ДНК (Конусова О.Л. и др. Характеристика морфометрической изменчивости медоносных пчел Apis mellifera L., отличающихся вариантами локуса COI-COII мтДНК. Вестник Томского государственного университета. Биология. 2016, 1 (33):62-81). Однако, перечисленные молекулярно-генетические методы имеют недостатки, такие как высокая чувствительность к контаминации чужеродной ДНК, высокая внутрипородная вариабельность анализируемого отрезка ДНК, стоимость анализа. Сложность морфологической идентификации пород помимо всего обусловлена различной выраженностью диагностических признаков у маток, самцов и рабочих особей пчел.
Известен способ определения генотипической однородности пчел (патент RU 2225108, МПК A01K 67/033, опубл. 10.03.2004), включающий проведение морфологического анализа: определения экстерьерных признаков - соответствия соразмерности длины хоботка и размеров брюшных стилетов / тергитов и стернитов.
Недостатком данного способа является сложность в стандартизации признаков для каждой породы пчел, что связано с высокой фенотипической изменчивостью морфометрических признаков пчел.
Задачей настоящего изобретения является разработка универсального способа дифференциации пород медоносных пчел России.
Технический результат заключается в возможности дифференциации пород медоносных пчел на любой стадии развития вне зависимости от пола в течение нескольких часов и без привлечения узкоспециализированного специалиста энтомолога.
Технический результат достигается тем, что в способе дифференциации ключевых пород медоносных пчел в России на основе мутагенной ПЦР-ПДРФ, включающем выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала с проведением ПЦР-ПДРФ участка цитохромоксидазы субъединицы 1 митохондриальной ДНК и рестрикционного анализа ампликона, согласно изобретению, для амплификации используются мутагенные праймеры SRg1-r, SRg2-f, K/KR-r и KA-f, которые вместе с последующей обработкой продукта ПЦР ферментами рестрикции Alu I, Hinf I, HspA I, Msp I образуют уникальные по длине фрагменты для каждой породы пчел.
Предварительно был проведен анализ нуклеотидной последовательности участка гена цитохромоксидазы субъединицы 1 митохондриальной ДНК для разных пород медоносных пчел. Установлены отличия в нуклеотидной последовательности между 4 основными породами медоносной пчелы (Apis mellifera carpathica, Apis mellifera caucasica, Apis mellifera carnica и Apis mellifera mellifera), которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации перечисленных пород пчел на основе мутагенного рестрикционного анализа (ПЦР-ПДРФ). Было выявлено, что для среднерусской породы пчел характерно 2 гаплотипа.
Дифференциация пород пчел в описываемом способе осуществляется на основе рестрикционного анализа путем проведения ПЦР-ПДРФ с мутагенными праймерами (мутагенные праймеры - праймеры, которые искусственно вносят мутацию в амплифицируемый участок ДНК таким образом, что вместе с характерным однонуклеотидным полиморфизмом конкретной породы пчелы формируется сайт рестрикции). Анализируется участок гена цитохромоксидазы субъединицы 1 митохондриальной ДНК, который предварительно амплифицируется. Существенным преимуществом представленного молекулярно-генетического метода идентификации пород пчел является возможность определения породы пчелы на стадиях яйца, личинки и куколки в независимости от пола.
На фиг. 1 приведена таблица с длинами ожидаемых фрагментов (п.н.) при расщеплении предварительно амплифицированной последовательности ДНК у разных пород.
На фиг. 2 приведена электрофореграмма: 1 и 2 - продукт ПЦР амплифицированного с праймерами K/KR-f, K/KR-r до и после обработки ферментом рестрикции HspA I; 3 и 4 - Продукт ПЦР амплифицированного с праймерами KA-f, КА-r до и после обработки ферментом рестрикции Msp I; М - маркер длин фрагментов ДНК, значения выражены в пар нуклеотидов (п.н.).
Способ дифференциация пород пчел на основе мутагенной ПЦР-ПДРФ предварительно амплифицированного участка цитохромоксидазы субъединицы 1 митохондриальной ДНК реализуется следующим образом:
1. Производится сбор биологического материала (взрослые пчелы, яйца, личинки). Если анализ производится не в тот же день, то образцы помещают в 70% спиртовой раствор.
2. Производится выделение ДНК из биологического материала. Выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов («БиоСилика», «ДНК-технологии», «Праймтех», «Zymo research)) и др.), так и методами органической экстракции.
3. Проводят ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 35 циклов 94°С 30 сек 54°С 35 сек, 72°С 30 сек. Состав используемых праймеров приведен в Перечне последовательностей:
i. Для идентификации среднерусской породы пчел (гаплотип №1):
прямой - SRg1-f; обратный - SRg1-r (мутагенный).
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР длиной 139 п.н., который вместе с однонуклеотидным полиморфизмом, характерным только для гаплотипа №1 среднерусской породы медоносных пчел, образует сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции Alu I.
ii. Для идентификации среднерусской породы пчел (гаплотип №2):
прямой SRg2-f (мутагенный); обратный SRg2-r.
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР длиной 150 п.н., который вместе с однонуклеотидным полиморфизмом, характерным только для гаплотипа №2 среднерусской породы медоносных пчел, образует сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции Hinf I.
iii. Для идентификации карпатской породы проводят две реакции:
Реакция №1:
прямой K/KR-f; обратный K/KR-r (мутагенный).
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР длиной 141 п.н., который вместе с однонуклеотидным полиморфизмом, характерным для карпатской и краинской породы медоносных пчел, образует сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции HspA I.
Реакция №2:
прямой KA-f (мутагенный); обратный КА-r.
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР длиной 148 п.н., который вместе с однонуклеотидным полиморфизмом, характерным только для краинской породы медоносных пчел, образует сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции Msp I.
iv. Для идентификации краинской породы используют те же пары праймеров и соответствующие им ферменты рестрикции, что и для идентификации карпатской породы (см. выше). Необходимо учитывать, что в 17% случаев нуклеотидная последовательность амплифицируемого гена карпатской породы пчел совпадает с нуклеотидной последовательностью краинской породы пчел.
v. Для идентификации горной кавказской породы используют все вышеперечисленные пары праймеров и соответствующие им ферменты рестрикции (см. выше).
4. Продукты ПЦР подвергают рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, индивидуального для каждой рестриктазы, и 10 ед. рестриктазы. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. Каждый из рестрикционных ферментов образует уникальные фрагменты для каждой породы пчел (фиг. 1).
Пример.
После выделения ДНК из медоносной пчелы с помощью праймеров K/KR-f, K/KR-r и KA-f, КА-r были получены продукты ПЦР длиной 141 и 148 п. н. соответственно (фиг. 2). При обработке рестриктазой HspA I продукта ПЦР, полученного с помощью пары праймеров K/KR-f и K/KR-r образовался фрагмент длиной 111 п. н. При обработке рестриктазой Msp I продукта ПЦР, полученного с помощью пары праймеров KA-f и КА-r образовался фрагмента длиной 118. Следовательно, ДНК принадлежит краинской породе медоносной пчелы.
Предлагаемый способ дифференциации пород медоносных пчел является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.