Способ моделирования эссенциальной гиперхолестеринемии
METHOD OF ESSENTIAL HYPERCHOLESTEROLAEMIA MODELLING

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и касается моделирования эссенциальной гиперхолестеринемии в эксперименте.
Известно, что высокий уровень холестерина в крови приводит к развитию атеросклероза и ряда сердечно-сосудистых заболеваний, таких как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, острые нарушения мозгового кровообращения и т.д. (см. Н.М. Ахмеджанов, Д.В. Небиеридзе и др. соавторы. Анализ распространенности гиперхолестеринемии в условиях амбулаторной практики (по данным исследования арго): часть I // Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии. -2015; 11(3)).
Экспериментальное моделирование развития болезней у человека в настоящее время используется для подробного изучения механизмов формирования и развития патологических процессов на тканевом и клеточном уровне, что позволяет разработать новые лекарственные средства или их комбинации для профилактики и лечения заболеваний. В связи с этим актуальным является разработка экспериментальных моделей наиболее адекватных для понимания механизмов последствий гиперхолестеринемии.
Из литературных источников известны исследования гиперхолестеринемии у крыс путем моделирования.
При исследовании гиполипидемических препаратов Н.Н. Клюева и соавторы использовали экспериментальные модели дислипопротеинемии у крыс (см. Клюева Н.Н., Окуневич И.В., Белова Е.В. Использование модели гиперхолестеринемии у крыс с низкой способностью к выработке условного рефлекса при скрининге гиполипидемических препаратов. Матер. III съезда фармакологов России. Психофармакол. биол. наркол. 2007, Спец Вып; 7 (Ч 1, А-Л): 1-1727-1-1728 (Тез 295)). Спектр липидов и липопротеинов крови этих животных характеризуется значительным содержанием холестерина в антиатерогенной фракции липопротеинов высокой плотности. Для развития дислипопротеинемии, кроме обогащенной пищевым холестерином диеты, необходимы дополнительные повреждающие агенты - метилтиоурацил, холевая кислота, эргокальциферол и другие, которые затрагивают различные обменные процессы, в частности, угнетающие функцию щитовидной железы. Авторами была разработана модель, основанная на предварительном отборе крыс, плохо поддающихся условному питьевому рефлексу. При кормлении таких крыс гиперхолестеринемиевой диетой, без каких-либо дополнительных ингредиентов, через 10 дней развивается умеренная дислипопротеинемия, при которой увеличено содержание общего холестерина и триглицеридов сыворотки крови. Эта модель дислипопротеинемии позволяет в более короткие сроки изучить изменения спектра крови липопротеинов и оценить потенциальное гиполипидемическое действие перспективных соединений.
Другая группа авторов (см. Л.М. Непомнящих, Е.Л. Поляков, О.П. Молодых и др. соавторы. Структурные реакции миокарда и липидный спектр сыворотки крови при моделировании гиперхолестеринемии и гипотериоза. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013; Том 155, №5) рассматривала на крысах-самцах особенности изменения липидного спектра крови и структурной реорганизации миокарда при моделировании гиперхолестеринемии на фоне и без гипотиреоза. Сочетанная алиментарная гиперхолестеринемия и гипотиреоидный статус вызывают более значительные изменения липидного спектра крови и индекса атерогенности, а также более значительные литические и некробиотические изменения кардиомиоцитов. Исследование проводилось в течение 68 суток на крысах-самцах Вистар массой 390-560 г. Крысы 1-й группы получали атерогенную диету (модель алиментарной гиперхолестеринемии): холестерин в дозе 25 мг/100 г массы тела («Panreac Quimica SA»), добавленный в стандартный лабораторный рацион. Крысы 2-й группы - ту же атерогенную диету и антитиреоидный препарат «Мерказолил» в дозе 1 мг/100 г массы тела («Акрихин»), добавленные в стандартный лабораторный корм. Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышенный уровень холестерина в крови, особенно на фоне угнетения функции щитовидной железы, может непосредственно обусловливать значительные повреждения кардиомиоцитов, интрамуральных сосудов и эритроцитов без развития ишемии миокарда в отсутствии формирования атеросклеротических бляшек.
Недостатками предоставленных авторами исследований являются искусственные повышения уровня холестерина в крови, невозможности дифференцировать роль гиперхолестеринемии и нарушений функций щитовидной железы, высокие денежные затраты на лекарственные препараты, применяемые для развития гиперхолестеринемии.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка простого, не инвазивного способа, с участием алиментарного фактора, позволяющего создать наиболее адекватную модель эссенциальной гиперхолестеринемии.
Технический результат достигается тем, что беспородных крыс-самцов возрастом 12-14 месяцев, весом 300-350 г. в течение трех месяцев кормят манной кашей, сваренной на воде таким образом, что на 1 кг крупы, добавляют 2 кг тростникового сахара и 2 кг топленного сливочного масла, при этом индивидуально каждому животному дают 50 г белого несоленого свиного сала в сутки.
Сущность способа поясняется рисунками.
Рисунок 1. Результаты липидограммы мышечной ткани животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.
Рисунок 2. Динамика биохимических показателей мышечной ткани животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.
Рисунок. Ткань сердечной мышцы (х 200). На снимке изображена ткань сердечной мышцы у испытуемого животного №5 из группы с экспериментальной гиперхолестеринемией.
В эксперименте принимали участие беспородные крысы-самцы 12-14 месяцев (300-350 г). В процессе эксперимента животные были разделены на 2 группы: в первую группу входили интактные животные (контрольная) - 30 животных, которых кормили натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом №755 от 12.08.77 (см. Приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»); у крыс второй группы - 30 животных (экспериментальная группа) индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию путем содержания в течение 3-х месяцев на рационе, обогащенном животными жирами и легко усваиваемыми углеводами: в течение трех месяцев кормили манной кашей, сваренной на воде таким образом, что на 1 кг крупы, добавлял 2 кг тростникового сахара и 2 кг топленного сливочного масла, при этом индивидуально каждому животному давали 50 г белого несоленого свиного сала в сутки.
По окончанию эксперимента животных декапитировали под эфирным наркозом. Все манипуляции выполнялись в соответствии с «Общими этическими принципами экспериментов над животными», утвержденным I Национальным конгрессом по биоэтике. Забор биоматериала для биохимического и морфологического исследования проводили в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (см. Приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003).
Для оценки липидного статуса кровь брали после 12 ч голодания из хвостовой вены крыс (0,3-0,7 мл). В сыворотке крови определяли уровни триглицеридов (ТГ), общего холестерина (ХС), липопротеины высокой плотности (ЛПВП) и липопротеины низкой плотность (ЛПНП).
При рассмотрении результатов липидограммы (см. табл. 1, см. рис. 1) в крови животных с экспериментальной гиперхолестеринемией было выявлено увеличение количества общего ХС на 74,09% (р<0,001) и количество ТГ увеличилось на 32,22% (р<0,05) относительно группы контроля.
При этом у экспериментальной группы коэффициент индекса атерогенности значительно увеличился на 70,71% (р<0,001) по отношению к контрольной группе, что подтверждается фракциями липопротеидов: ЛПВП снизился на 23,13% (р<0,05), а уровень ЛПНП стремительно увеличился на 195,89%(р<0,001).
Такие изменения говорят о нарушениях липидного обмена, сопровождающегося отложением холестерола и липопротеидов низкой плотности в стенках сосудов, а именно наличии гиперхолестеринемии у животных экспериментальной группы.
Для оценки выраженности окислительного стресса и уровня тканевой гипоксии гомогенат мышечной ткани сердца готовили в соотношении 1 г ткани: 9 мл охлажденного физиологического раствора, центрифугировали при 3000 об/мин.
В гомогенатах определяли концентрацию лактата, пировиноградной кислоты (ПВК) и восстановленного глутатиона (GSH) (см. Справочник по лабораторным методам исследований. Под ред. Л.А. Даниловой. Издательский Дом ПИТЕР; 2003), а также активность ферментов: глутатионпероксидазы (ГПО) и глутатионредуктазы (ГР) (см. Микашинович З.И., Летуновский А.В., Волжин О.О., Белоусова Е.С.Биохимические исследования слюны в клинической практике. М.: Издательство РостГМУ (Ростов-на-Дону); 2004). Митохондрии выделяли дифференциальным центрифугированием после гомогенизации в солевом растворе (0,15 М KCl и 10 мМ трис-HCl).
Для удаления ядерной фракции гомогенаты центрифугировали 15 мин при 640 g. Фракцию митохондрий выделяли в течение 25 мин при 20000 g с двукратным промыванием средой выделения. Суспензию митохондрий использовали для определения активности цитохромоксидазы (ЦХО) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (см. Микашинович З.И., Летуновский А.В., Волжин О.О., Белоусова Е.С.Биохимические исследования слюны в клинической практике. М.: Издательство РостГМУ (Ростов-на-Дону); 2004).
Учитывая, что эксперимент проводился на лабораторных животных (крысах-самцах), статистическая обработка проводилась с использованием пакета прикладной программы STATISTICA версия 10.0 и Microsoft Office Excel Worksheet.
После проверки распределения на нормальность о достоверности отличий учитываемых показателей сравниваемых групп судили по величине t-критерия Стьюдент, при ненормальности распределения - U критерия Манна-Уитни. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р<0,05.
Результаты биохимических изменений, полученные при сравнении группы с экспериментальной гиперхолестеринемией по отношению к контрольной отражены в таблице 2.
На диаграмме (см. рис. 2) отчетливо наблюдается, что в группе животных с экспериментальной гиперхолестеринемией произошло статистически значимое увеличение концентрации лактата на 173,23% (р<0,001) и ПВК на 317,78% (р<0,001) по отношению к группе контроля. Такое значительное повышение уровня лактата и ПВК можно рассматривать как результат накопления недоокисленных продуктов, что способствует формированию метаболического ацидоза.
При анализе активности ферментов глутатионового звена антиоксидантной защиты были выявлены разнонаправленные изменения в мышцах испытуемых животных с экспериментальной гиперхолестеринемией. Активность ГПО снизилась на 50,08% (р<0,001) на фоне существенного увеличения активности показателей ГР - на 104,35% (р<0,001) и концентрации GSH - на 244,20% (р<0,001) относительно контрольной группы. Изменения, произошедшие в активности ферментов глутатионового звена антиоксидантной защиты свидетельствуют о нарушению антиоксидантной защиты, что обусловлено усилением продукции активных форм кислорода в процессе митохондриального и пероксисомального окисления жирных кислот, активацией НАДФ-оксидазы и накоплением свободных радикалов различного генеза.
Изменения в ткани сердечной мышцы, были подтверждены гистологическим исследованием, проведенном на базе морфологического центра ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России. Для гистологического исследования кусочки ткани сердечной мышцы экспериментальных крыс фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы окрашивались гематоксилином-эозином.
Морфологически в мышечной ткани сердца был выявлено: набухание кардиомиоцитов с утратой поперечной исчерчености, концевая дистрофия миоцитов, венозное полнокровие, периваскулярная гистиоцитарно-фибробластическая реакция, набухание стенок артериол, жировая инфильтрация, гиалиноз стенок отдельный сосудов (см. рис. 3).
Динамика биохимических изменений при моделировании эссенциальной гиперхолестеринемии свидетельствует о нарушении регуляции глутатионового баланса, что может способствовать формированию окислительного стресса и накоплением недоокисленных продуктов, нарушениями липидного статуса и формированием тканевой гипоксии.
Таким образом, предлагаемый способ моделирования эссенциальной гиперхолестеринемии является адекватным, простым, не инвазивным способом моделирования с применением недорогостоящего алиментарного фактора.