ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ БИОПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ СТАБИЛИЗИРОВАННОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА
ORGAN-SPECIFIC BIOPLASTIC MATERIAL BASED ON SOLUBLE FORM OF STABILIZED EXTRACELLULAR MATRIX

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, комбустиологии, трансплантологии, косметологии и может быть использовано в качестве биоматериала для стимуляции регенерации и замещения дефектов покровных тканей.
В последнее время быстрыми темпами развиваются биотехнологические методы создания тканеинженерных конструкций, которые находят применение в области регенеративной медицины для восстановления утраченных функций тканей и органов. Как правило, тканеинженерная конструкция представляет из себя биологический комплекс - матрицу - носитель с иммобилизированными на ней клетками и/или обогащенный биологическими активными компонентами. Данная конструкция определяет форму будущего трансплантата, обеспечивают необходимую механическую прочность и трехмерное ориентирование клеток.
Для создания тканеинженерных конструкций наиболее перспективными являются биодеградируемые материалы, которые после имплантации будут замещены естественной тканью, но способные в течение необходимого для этого времени выполнять биомеханические функции. Важным требованием к созданию таких биоматериалов является их адгезивность, пластичность, биосовместимость, максимальная приближенность по фиброархитектонике к тканям организма и биологическая активность, позволяющая достигать определенного фармацевтического эффекта от применения.
Известен биопластический материал Apligraf, созданный компанией Organogenesis (США), представляющий собой двухслойный биоинженерный заменитель кожи, содержащий дермальный слой фибробластов человека в решетке бычьего коллагена I типа и эпидермальный слой, образованный кератиноцитами человека (Larissa Zaulyanov, Robert S Kirsner. A review of a bilayered living cell treatment (Apligraf ) in the treatment of venous leg ulcers and diabetic foot ulcers // Clin Interv Aging. - 2007. - P. 93-98).
Известен также материал OrCel (Ortec International Inc., США) - двухслойный клеточный матрикс, в котором аллогенные клетки кожи человека располагаются в 2-х отдельных слоях, представляющих собой бычью коллагеновую губку I типа.
Однако, основными недостатками этих биоматриц является то, что данные биоматериалы труднодоступны и возможны к применению только в странах-производителях (регулирование Федеральным законом РФ №180 «О биомедицинских клеточных продуктах»), имеют ограничения по использованию в клинической практике, а также достаточно высокую стоимость. Помимо этого, использование аллогенных клеточных составляющих материала может иметь риск передачи гемотрансмисивных инфекций или вызвать аллергические реакции.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса для восстановления дефектов кожи в виде губки, геля, коллоидного раствора и пленки, где хитозановая составляющая содержит хитозан со степенью деацетилирования 0,95-0,99 и молекулярной массой 100-1000 kDa в виде аскорбата хитозана при содержании аскорбиновой кислоты 1,8 г/г сухого хитозана, а также хондроитинсерную кислоту - 5-100 мг/г сухого хитозана, гиалуроновую кислоту - 10-100 мг/г сухого хитозана, гепарин - 2,5-5 мг/г сухого хитозана и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота - 11- 220 мкг/г сухого хитозана (патент РФ №2254145). Согласно заявлению авторов патента, использование предлагаемого раневого покрытия при закрытии плоскостных раневых дефектов позволяет улучшить качественные и количественные характеристики восстанавливаемых раневых дефектов кожи рубцовой и околорубцовой зон, приводит к полноценному восстановлению эпидермально-дермального комплекса, соответствующего здоровой кожи.
Однако этот способ имеет ряд недостатков: недостаточное количество биологически активных компонентов, отвечающих за стимуляцию регенерации, отсутствие органоспецифического восстановления кожи, а также возможные аллергические реакции на наличие сывороточного фактора роста крупного рогатого скота.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является максимальное приближение к составу кожи для органоспецифического восстановления ткани, наличие большого количества стимулирующих регенерацию биологически активных компонентов, приводящих к сокращению сроков лечения.
Указанный технический результат достигается тем, получен органоспецифический биопластический материал на основе растворимой формы стабилизированного внеклеточного матрикса, высокой пористости, разной формы, толщиной от 0,1 до 3 см, отличающийся тем, что материал максимально приближен к физиологическим параметрам дермы кожи, состоит из трехмолекулярно перекрещенных нитей внеклеточного матрикса и обогащен биологически активными компонентами, причем коллаген I типа, гиалуроновая кислота, эластин и биологически активные компоненты находятся при следующем процентном соотношении компонентов в исходной смеси, %:
коллаген I типа - 70-90%
гиалуроновая кислота - 6-26%
эластин - 1-30%
концентрат биологически активных молекул - 3-5%
На фиг. 1 представлен внешний вид одного из возможных вариантов конечного биопластического материала, на фиг. 2 - микрофотография, полученная методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение ×4000.
Процесс получения биопластического материала включает в себя четыре основные стадии: приготовление исходной смеси, введение гелирующего агента, заморозка полученных образцов и заключительная стадия - вакуумная сублимационная сушка. Данный метод сушки позволяет безопасно удалять влагу из термочувствительных материалов (белки, полисахариды, пептиды и прочие). В качестве основы матрицы использовали коллаген I типа, гиалуроновую кислоту и эластин в соотношениях, равных соотношения в дерме взрослого человека. Такая технология и состав позволяют получить биопластический материал высокой пористости с заданной толщиной (от 0,1 до 3 см).
Первая стадия заключается в получении гомогенной смеси исходных компонентов. Для этого предварительно готовится водный раствор гиалуроновой кислоты. Далее осуществляется смешивание коллагена, раствора гиалуроновой кислоты и эластина. Процентное содержание исходных веществ в смеси: коллаген 70-90%, гиалуроновая кислота 6-26%, эластин 1-30%. Перемешивание смеси осуществляется с использованием лопастной мешалки, параметры перемешивания 500-900 об/мин, время перемешивания 10-20 минут.
На второй стадии в полученную гомогенную смесь вводят раствор гелирующего агента из группы альдегидов с концентрацией 2-5 масс %. Раствор гелирующего агента готовят путем разбавления исходного раствора с содержанием действующего вещества не менее 25%. Полученную смесь перешивают в течение 20 минут, после чего разливают в чашки Петри и выдерживают 20 минут при комнатной температуре.
Третья стадия заключается в заморозке образцов. Для того, чтобы защитить сформировавшуюся в ходе заморозки структуру, перед стадией замораживания возможно введение криопротекторов из группы полисахаридов. В конце стадии замораживания образцы приобретают структуру, от которой впоследствии будет зависеть качество конечного губчатого материала. Замораживание проводят в морозильном шкафу от 2 до 24 часов при температуре от -70°С до -20°С.
Заключительной стадией является процесс сублимационной сушки. Процесс проходит в вакуумно-сушильном аппарате, установка работает в автоматическом режиме. После загрузки заполненных поддонов запускается программа сушки с заданными параметрами. Температура полки в ходе процесса изменяется от 0°С до 20°С с шагом 5°С. Продолжительность каждого шага составляет от 5 до 15 часов. Давление в ходе процесса составляет 300 Па. Общее время сублимационной сушки составляет от 25 часов до 75 часов. По окончании процесса сушки вакуум гасится воздухом, поддоны вынимаются для извлечения конечного материала.
Способ получения биологически активного компонента (БАК) включает в себя культивирование охарактеризованной культуры неонатальных фибробластов человека в среде DMEM с добавлением FBS, L-глутамина, пенициллина и стрептомицина. При достижении культурой 80% монослоя проводится смена ростовой среды для получения кондиционированной среды, которая впоследствии очищается, фильтруется и концентрируется через мембраны размером 10 и 50 кДа. Таким образом, БАК представляется из себя композицию, содержащую цитокины и факторы роста, продуцируемые фибробластами, а также витамины и аминокислоты, которые содержатся в ростовой среде. Добавление концентрата БАК происходит на первой стадии получении гомогенной смеси исходных компонентов биоматрицы.
Новизной разработанного биопластического материала является то, что впервые использованы белки внеклеточного матрикса в соотношениях, равных соотношения в дерме взрослого человека с включенными в его состав БАК. Именно такая тканеинженерная конструкция позволяет создать оптимальное микроокружение для адгезии и пролиферации клеток, а включенные в состав биоматрицы БАК стимулируют регенеративные процессы в патологическом очаге поражения.
Оценку цитотоксичности и биосовместимости биопластического материала с включенными БАК проводили путем совместного культивирования клеток с материалом и путем культивирования клеток на биоматрице в течение 72 часов. Оценивали наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структуру клеток. Осуществляли подсчет клеток с оценкой жизнеспособности на автоматизированном счетчике Countess (Invitrogen, Korea) с расчетом пролиферативной активности. Для выявления клеток на биоматериале проводили окраску ядерным флуоресцентным красителем DAPI.
В ходе эксперимента мы не обнаружили токсического воздействия исследуемого материала на популяцию клеток. Вместе с тем, при культивировании фибробластов в присутствии образцов материала пролиферативная активность была выше, чем в группе контроля (без материала). Окраска с помощью DAPI показала наличие ядер клеток на материале как в центре, так и на периферии.
Полученные данные позволили сделать вывод, что полученный биоматериал, в отличии от прототипа, представляет собой максимально приближенный к структуре и составу кожи матрикс, биологически активный за счет входящих в состав биологически активных компонентов (цитокины и факторы роста, продуцируемые фибробластами, а также витамины и аминокислоты, которые содержатся в ростовой среде).
Кроме того, биоматериал обладает биологической совместимостью, повышая пролиферативный потенциал клеток, и может выступать в роли биодеградируемого скаффолда.