Получение дигаплоидов ржи с использованием культуры пыльников in vitro

Получение дигаплоидов ржи с использованием культуры пыльников in vitro

I Резюме. В статье изложены основные результаты изучения возможности применения технологии культуры пыльников in vitro для получения удвоенных гаплоидов озимой ржи. Установлены наиболее приемлемые питательные среды для образования каллусов. Дигаплоидные формы выделены только при использовании пыльников тетраплоидного сорта ржи Белая Вежа. Эти формы исследованы по озерненности колоса и массе 1 тысячи зерен. Ключевые слова: биотехнология, генетика, селекция, рожь, культура пыльников.

Эрома Урбан,

заместитель генерального

Научно-практического хозяйственных наук

Станислав Гордей,

заведующий лабораторией озимой пшеницы Научно-практического центра НАН Беларуси по земледелию, кандидат биологических наук

На современном этапе развития генетики и селекции эффект гетерозиса - один из основных способов повышения урожайности сельскохозяйственных культур. К настоящему времени для большинства из них созданы гетеро-зисные гибриды Б1, которые широко используются в мировом сельхозпро-изводстве [1]. Среди зерновых культур по применению эффекта гетерозиса озимая рожь занимает лидирующее положение. Исследования

по данной проблеме ведутся с конца 60-х гг. прошлого века. Гибридные сорта ржи зарегистрированы в странах Западной и Восточной Европы, в том числе и в Беларуси.

Успех селекции гибридных сортов определяется в первую очередь наличием обширного генофонда родительских компонентов с высокой комбинационной способностью [2]. Для ржи - это создание коллекций самофертильных линий со слабым проявлением инбредной депрессии в поколениях. Получение ин-цухт-линий традиционным способом заключается во введении генов самофертильности (Sf, Z) в популяцию (сорт, образец) ржи с дальнейшими последовательными принудительными самоопылениями отдельных растений и отбором самофертильных форм [3]. Этот процесс занимает 4-6 лет, при этом достичь константности линий и 100%-ной гомозиготности невозможно.

Создание удвоенных гаплоидов растений (DH-линий, double haploid) - наиболее эффективный способ получения константных гомозиготных генотипов. В настоящее время для выделения дигапло-

идов используется культура пыльников in vitro. Данная технология позволяет существенно сократить сроки извлечения гомозиготных форм. Эта методика успешно отработана на пшенице, тритикале, ячмене, рапсе [4]. У ржи получение регенерантов из пыльников затруднено из-за биологии самой культуры, в частности по причине самонесовместимости и последующей инбредной депрессии. Рожь как никакое другое растение трудно поддается регенерации на искусственной питательной среде при использовании как эмбриокультуры, так и культуры пыльников.

Технология культуры пыльников in vitro для ржи - новое и актуальное направление научных исследований в нашей республике. Для этой культуры необходимо определение оптимальной стадии развития микроспор для посадки пыльников на искусственные среды, методов предобработки колосьев, состава питательных сред, условий искусственного климата для индукции каллусообразования, прямого эмбриогенеза и регенерации, методов удвоения числа хромосом, процесса

БИОТЕХНОЛОГИИ

Подготовка донорных растений. Предобработка в растворе Кнопа с добавлением этрела в концентрации 4 мг/л и бензимидазола в концентрации 5 мг/л. Выдерживание при t = 4 °С в течение 2-3 суток

Стерилизация посадочного материала

Инкубация посадочного материала в термостате в течение 4-5 недель до появления новообразований при t = 25-28 °С

Посадка каллусов на безгормональную питательную среду Мурасиге -Скуга для регенерации гаплоидов

Полиплоидизация гаплоидов (0,2%-ный колхицин в 4%-ном диметилсульфоксиде) с использованием вакуум-инфильтрации

I этап

II этап

III этап

IV этап

V этап

VI этап

Посадка и культивирование регенерантов в почве. Получение семенного потомства

Таблица 1. Технология получения в культуре пыльников in vitro андрогенных растений ржи

Питательная среда

Генотип ржи Мурасиге - Скуга N Potato Всего

Сахароза Мальтоза

Голубка 840 1100 1470 1290 1850 3780 1140 8060 4700 6980 9900 4590 26170

Гибрид F1 2040 1320 1080 2220 3000

Всего 5040 5330 1050 7740

Таблица2. Количество пыльников ржи, посаженных на питательные среды

Питательная среда

Генотип ржи Мурасиге - Скуга Potato Всего

Сахароза Мальтоза N6

Голубка 13 - 5 3 28 3 21 126 47 10 204

Гибрид F1 94 19 18 4 7

Всего 132 18 3 19 1 35 |

Таблица3. Выход каллусов озимой ржи на питательных средах

пересадки регенерантов в искусственную почву и грунт, а также адаптация ex vitro. В настоящее время ни один из этих этапов не отработан, подобные изыскания в Беларуси в прошедшие два десятилетия не проводились. В связи с этим освоение технологии культуры пыльников in vitro и создание удвоенных гаплоидов ржи весьма актуальны.

Исходным материалом для настоящих исследований послужили: диплоидный сорт Голубка, тетра-плоидный сорт Белая Вежа, гетеро-зисный гибрид F1 и инцухт-линия из коллекции Научно-практического центра НАН Беларуси

по земледелию. При использовании тетраплоида предполагалось исключить полиплоидизацию колхицином и, соответственно, предотвратить гибель ослабленных ре-генерантов. На основании литературных данных и опыта работы по андрогенезу in vitro с другими культурами апробация технологии получения регенерантов in vitro из пыльников ржи велась по этапам (табл. 1).

Выращивание донорных растений указанных сортов, гибрида и инцухт-линии ржи проводилось в условиях фитотронно-теплично-го комплекса при контролируемом

температурном и световом режимах, при разных сроках высадки отдельных экземпляров после яровизации для расширения периода созревания. Во избежание переопыления использовали групповые пергаментные изоляторы для каждого образца.

Для проведения исследований по всем образцам ржи с применением различных питательных сред было высажено 26 170 пыльников (табл. 2). Среди них образовалось 204 каллуса, что составляет 0,9% от общего количества пыльников (табл. 3).

Наибольшей способностью к формированию новообразований характеризуется тетраплоидный сорт ржи Белая Вежа: у его пыльников сформировано больше всего каллусов (126 шт.). Важную роль в образовании растительной ткани играет питательная среда. Наибольшее количество каллусов появилось у пыльников при использовании среды Мурасиге - Скуга с добавлением сахарозы. На этой же среде с мальтозой у популяцион-ных сортов Голубка, Белая Вежа и инцухт-линии каллусы вообще не сформировались. В наименьшей степени генотипическая специфичность по образованию каллусов проявилась при применении искусственной среды М6 (см. табл. 3). Следовательно, среди испытанных четырех типов сред наиболее приемлемой является среда Мурасиге - Скуга с добавлением сахарозы. Относительно высокая способность каллусообразования у тетраплоидного сорта ржи Белая Вежа, возможно, связана с диплоидным набором числа хромосом в генеративных тканях, что, скорее всего, повлияло на ряд физиологических процессов,воздействующих на прорастание пыльников.

78 НАУКА И ИННОВАЦИИ | №5 (183) | Май 2018 |

http://innosfera.by

Образованные каллусы были пересажены на безгормональную питательную среду Мурасиге - Скуга для регенерации гаплоидов. Из 204 каллусов новообразования регенерировались у 123, включая ризоге-нез, альбиносные и зеленые растения (табл. 4, рис. 1).

Как показывают результаты исследования, новообразования из каллусов формировались в 58,3% случаев в среднем для всех использованных форм ржи. У 73 каллусов развивались только корни (ризо-генез) разных размеров, после чего наступало их отмирание, так как не было развития верхних органов.

На 46 каллусах от тетраплоид-ного сорта ржи Белая Вежа и диплоидного гибрида Б1 шло формирование как корневой системы, так и листьев (рис. 1Б). Два растения на каллусах сорта Белая Вежа оказались альбиносами. Такой эффект часто наблюдается при использовании культуры пыльников и других культур, таких как ячмень, тритикале, а также при отдаленной гибридизации. Это связано с генетическими и физиологическими нарушениями в процессе онтогенеза, которые приводят к отсутствию в растениях хлоропластов. Во всех случаях растения погибают, поскольку не происходит фотосинтеза. В результате из 204 высаженных каллусов на искусственной питательной среде сформировалось 44 зеленых растения (21,6% от общего числа) на генетической основе сорта Белая Вежа и гибрида Б1.

Зеленые гаплоидные регенеран-ты из гибрида Б1 были подвергнуты полиплоидизации колхицином методом вакуум-инфильтрации. После колхицинирования все образцы погибли на начальных стадиях онтогенеза. Литературные данные

Рис. 1.

Формирование каллусов из пыльников

Генотип ржи Высажено каллусов, шт. Результат регенерации, шт.

Ризогенез Альбиносы Зеленые растения Нет развития

Голубка 21 9 - - 12

Белая Вежа 126 45 2 28 51

Гибрид F1 47 18 - 16 13

Инцухт-линия 10 1 - - 9

Всего 204 73 2 44 85

Таблица 4. Выход новообразований в культуре пыльников ржи in vitro

подтверждают высокий уровень гибели растений ржи при обработке этим препаратом, обладающим сильным мутагенным эффектом: он действует не только на блокирование веретена деления в мей-озе, но и на ряд других хромосомных (генных) перестроек, приводящих в большинстве случаев к летальному исходу. Как показала практика экспериментальной полиплоидии, при обработке раствором колхицина 1,5-2-дневных проростков диплоидных образцов ржи 9095% их гибнет. Поскольку в наших исследованиях регенеранты, полученные из пыльников на искусственных питательных средах, были крайне ослаблены в своем развитии,

реакция на колхицин привела к гибели в 100% случаев.

Растения-регенеранты, полученные с использованием тетраплоид-ного сорта Белая Вежа, не подвергались полиплоидизации, так как предполагалось, что тетраплоид-ный набор хромосом позволит исключить данную операцию и получить диплоидные образцы. После формирования корневой системы и первичных листьев регенеранты от пыльников этого сорта были пересажены из пробирок изначально на искусственную почву, а затем в сосуды с грунтом (рис. 2).

Из 28 зеленых растений на различных стадиях онтогенеза погибло 15 из-за различных нарушений

Рис. 2.

Выращивание растений -регенерантов ржи на искусственной почве

БИОТЕХНОЛОГИИ

№ расте- Число цветков Число зерен Озерненность, Масса

ния в колосе, шт. в колосе, шт. % 1000 зерен, г

1 58 5 8,6 11,2

2 56 12 21,4 17,5

3 58 25 43,1 19,7

4 60 19 31,7 23,0

5 54 4 7,4 14,9

6 58 16 27,6 14,4

7 52 9 17,3 12,6

Среднее 56,6 12,9 22,4 16,2

Таблица 5. Характеристика растений - регенерантов ржи по озерненности колоса и массе 1 тысячи зерен

Рис. 3. Колос дигаплоида ржи

в хромосомном составе (анеупло-идные генотипы), в основном после стадии яровизации до цветения. Из 13 оставшихся генотипов семена удалось получить на 7 растениях, остальные были полностью стерильны, что также связано в первую очередь с несбалансированностью хромосомного состава. Все 7 растений, давшие семенное потомство, характеризовались слабым уровнем озерненности колоса и низкой массой тысячи зерен (табл. 5, рис. 3).

Причина низкой озерненности колоса - нарушения в процессах микро-, макро- и гаметогенеза. По данным [5, 6], этот показатель у ржи на 44% обусловлен сбоями в макро-гаметогенезе и на 50% - изменениями в ходе эмбрио- и эндосперма-генеза. Все это приводит к образованию анеуплоидных растений с несбалансированным числом хромосом. Хотя упомянутые исследования проводились на ржи, не связанной с технологией культуры пыльников in vitro, аналогичные нарушения, несомненно, имеют место и в настоящем случае. Можно также заключить, что перевод на другой уровень плоидности вызывает дезинтеграцию системы организма, которая оказывается фактором, разрушающим сложившуюся на те-траплоидном уровне устойчивость онтогенеза в процессах регуляции

физиологических и морфологических функций клетки (цитогенети-ческий гомеостаз). Это распространяется и на перевод ржи с диплоидного уровня плоидности на тетра-плоидный [7, 8].

Есть основания полагать, что стабилизация созданных генотипов ржи произойдет в ближайшие несколько поколений. Не исключена также элиминация ряда форм вследствие указанных нами нарушений.

Результаты настоящих исследований показали возможность использования технологии андроге-неза для ржи. Тем не менее получить удвоенные гаплоиды на генетической основе диплоидных образцов не удалось. В первую очередь это обусловлено биологией данной зерновой культуры. Крайне слабая ее отзывчивость на культуру in vitro каких бы то ни было генотипов требует скрупулезной разработки каждой стадии процесса культуры пыльников. Вместе с тем, несмотря на низкий процент выхода фертильных удвоенных гаплоидов (5,6 % от числа посаженных каллусов), удалось получить растения-регенеранты (дигаплои-ды) из пыльников тетраплоидного сорта ржи Белая Вежа, а также семенное потомство. При использовании тетраплоидных популяций ржи также необходимо дальнейшее

изучение способов и методов повышения эффективности технологии культуры пыльников.

Заслуживает внимания идея предварительной по-липлоидизации диплоидных форм ржи до внедрения рассмотренной в статье технологии in vitro, поскольку, как видно из результатов наших исследований, ослабленные регенеранты полностью погибают при применении колхицина. Для создания гомозиготных инцухт-линий как родительских компонентов гибридных сортов также требуется предварительная интродукция генов самофертильности в популяции либо использование существующих ге-терозисных гибридов ржи, где уже присутствуют эти гены. Без генов самофертильности невозможно размножение инцухт-линий в поколениях, так как при принудительном самоопылении зерновки не завязываются из-за самонесовместимости. СП

ЛИТЕРАТУРА

1. Geiger H.H. Hybrid rye and Heterosis / H.H. Geiger, Т. Miedaner // Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops.- Madison, Wisconsin, USA, 1999. Р. 439-450.

2. Geiger H.H. Cytoplasmic male sterility in rye (Secale cereale L.) / H.H. Geiger, F.W. Schnell // Crop. Sci. 1970. Vol. 10. P. 56-60.

3. Гордей С.И.Селекционно-генетические аспекты использования эффекта гетерозиса у озимой ржи (Secale cereale L.) // Весц На-цыянальнай акадэми навук Беларуси Сер. бiял. навук. 2002, №1. С. 103-108.

4. Гурецкая В.С. Методические рекомендации по культуре изолированных пыльников ячменя (Hordeum vulgare L.).- Жодино, 2013.

5. Тороп А.А. Направления, методы и результаты селекции озимой ржи в условиях Центрально-Черноземной зоны РСФСР:дис. в виде науч. докл. ... д-ра с.-х. наук.- Немчиновка, 1993.

6. Тороп А.А.Наследуемость озерненности тетраплоидной ржи / А.А. Тороп, В.В. Корякин // Генетика. 1990, №5. С. 886-893.

7. Фадеева Т.С. Генетические механизмы, определяющие особенности полиплоидов и эволюционное значение полиплоидов / Т.С.Фадеева, Н.М. Иркаева// Теоретические и практические проблемы полиплоидии.- М., 1974. С. 104-114.

8. Урбан Э.П. Озимая рожь в Беларуси (селекция, семеноводство, технология возделывания): монография.- Минск, 2009.

http://innosfera.by/2018/05/in_vitro

80 НАУКА И ИННОВАЦИИ | №5 (183) | Май 2018 |

http:// in nos fera. by