Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидного ростка кроветворения пуповинной крови человека при экспансии in vitro

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидного ростка кроветворения пуповинной крови человека при экспансии in vitro

Н.В. Петёвка, Н.В. Гончарова, И.Н. Северин, С.М. Космачева, М.П. Потапнёв ГУ «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь, Минск, Беларусь

In vitro expansion and lineage commitment of the human umbilical cord blood myeloid progenitors

N.V. Petyovka, N.V. Goncharova, I.M. Seviaryn S.M. Kosmacheva, M.P. Potapnev Belarusian Research & Production Center for Hematology & Transfusiology

Исследованы закономерности пролиферации и диффе-ренцировки в миелоидном направлении Сй34+-популяции клеток пуповинной крови человека при экспансии in vitro над монослоем мультипотентных мезенхимных стромаль-ных клеток костного мозга (ММСК КМ) и без него в бес-сывороточной среде под воздействием рекомбинантных факторов IL-3, IL-6, SCF и Flt3/l.

Из пуповинной крови здоровых рожениц (n = 4) выделяли фракцию мононуклеарных клеток (MK), часть которой обогащали CD34+ клетками, методом положительной иммуномагнитной сепарации (CD34об). Экспансию in vitro обеих фракций проводили в течение 2 нед. По мере роста клетки рассевали на новые площади. Экспрессию CD34 и CD45 определяли методом проточной цитофлуориметрии, субпопуляции миелоидных предшественников — колониеобразующим тестом.

За две недели культивирования количество CD34+ клеток фракции МК увеличилось в 70±29 раз без подложки и в 980±414 раз на подложке. Прирост CD34+ клеток в СD34об фракции достоверно не отличался от такового в МК. В течение первой недели экспансии субпопуляцион-ный состав предшественников не менялся, на второй неделе — гранулоцитопоэз превалировал над эритропоэзом. Мониторинг экспрессии CD34 и CD45 показал существование двух популяций кроветворных клеток, одна из которых теряет CD34 на первой неделе экспансии, другая — только на второй. Подложка ММСК КМ способствует достоверно большему (р < 0,05) увеличению количества CD34+ клеток и колониеобразующих единиц в сравнении с вариантами культивирования без подложки и вызывает их перераспределение между суспензионной и адгезированной фракциями клеток. С ММСК связываются преимущественно либо эритроидные, либо мультипотентные предшественники. Для экспансии мультипотентных предшественников миелоидного ряда оптимальным является культивирование CD34об фракции клеток на подложке ММСК КМ в период до одной недели со средней кратностью увеличения ядросодержащих клеток — 56±32 раз, CD34+ клеток — 36±15 раз, мультипотентных предшественников — 45±18 раз, всех КОЕ — 60± 11 раз.

Ключевые слова: пуповинная кровь, гемопоэтические стволовые клетки, СD34+ клетки, миелоидные предшественники, экспансия in vitro.

In vitro proliferation and myeloid differentiation of human umbilical cord blood (UCB) CD34+ cells with/without bone marrow multipotential mesenchymal stromal cells (BM-MMSCs) feeding layer in serum-free medium supplemented with IL-3, IL-6, SCF and Flt3/l were investigated.

Mononuclear cells (MCs) were isolated from the healthy donor UCB specimens (n = 4), CD34-enriched MCs were obtained by positive immunomagnetic selection (CD34+-rich). Both cell fractions (MCs and CD34+-rich) were expanded for two weeks in vitro. Cells were seeded to the new vessels when necessary. The percentage of CD34/CD45-positive cells was accounted by flow cytometry, subpopulations of myeloid progenitors were assessed in colony-forming tests.

Upon two weeks of culture the number of CD34+ cells in MC fraction augmented by 70±29 and 980±414-fold with and without BM-MMSC feeding layer respectively and was not significantly differed from that in CD34+-rich fraction. Progenitor cell subpopulations were not altered during the first week of culture but granulocytopoiesis was superior over erythropoiesis during the second week. CD34 and CD45 expression patterns revealed two hematopoietic cell populations, one of them differentiating on the first week of expansion, and the other — on the second one. BM-MMSC feeder promoted significantly higher (p < 0,05) expansion rates of CD34+ cells and myeloid progenitors in comparison with non-feeding culture. BM-MMSC feeder also caused progenitor cells redistribution between suspension and adhesive fractions by predominantly binding erythroid and multipotential progenitors. Optimum expansion protocol for multipotential progenitors was culturing CD34+-rich cell population with BM-MMSC feeding layer for a week which resulted in the increase the amount of the nucleated cells, CD34+ cells, multi-potential progenitors, and colony-forming units by 56, 36, 45, and 60-fold respectively.

Key words: umbilical cord blood, hematopoietic stem cells, СD34+ cells, myeloid progenitors, expansion in vitro.

Использование пуповинной крови при лечении онкогематологических заболеваний имеет ряд преимуществ: её легче заготовить, нет риска для донора, она практически не содержит активированные Т-лимфоциты, что снижает реакцию трансплан-

e-mail: npet@bcht.by

тат против хозяина (РТПХ) и позволяет проводить успешные аллогенные трансплантации даже при несовпадении по одному-двум локусам гистосовместимости [1]. Успешное приживление гемопоэтического трансплантата зависит от количества и качества как

гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), дающих начало лимфоидному и миелоидному росткам кроветворения, так и от более дифференцированных клеток-предшественниц. Долговременные результаты репопуляции трансплантата обеспечиваются ГСК и зависят от их количества и функции, в то время как ранний период восстановления кроветворения обеспечивается клетками-предшественницами миелоидного ряда, от которых зависит быстрое восстановление уровня нейтрофилов и тромбоцитов [2, 3]. Скорость восстановления эритроидного и мегакариоцитарного ростка кроветворения также коррелирует с содержанием общих миелоидных и (или) мегакариоцитарно-эритроидных предшественников [4].

Поверхностный антиген клеток CD34 является наиболее часто используемым маркером для оценки пригодности и вероятности успешного приживления трансплантата кроветворных клеток в онкогематологии [2, 5, 6]. Как правило, этот маркер ассоциируют с активностью и функцией ГСК. Однако, большинство клеток в общей CD34+ популяции костного мозга (более 90%) и пуповинной крови человека (более 99%) являются клетками-предшественницами [7]. Примитивные ГСК могут вообще не экспрессировать CD34 [8]. Таким образом, клиническое значение CD34+ популяции клеток в гемопоэтических трансплантатах может быть связано не столько с количеством ГСК, сколько с количеством репопулирующих клеток-предшественниц.

Считают, что пуповинная кровь содержит достаточно ранних ГСК, способных обеспечить полное долговременное восстановление кроветворения взрослого пациента [1]. Проблемой таких трансплантаций скорее является малое абсолютное число предшественников, что приводит к длительному периоду цитопении после миелоаблативного кондиционирования и является одной из причин летальности пациентов в посттрансплантационном периоде [9].

Клетки-предшественницы миелоидного ряда в отличие от ГСК можно выявить по колониеобразованию в полужидкой среде. Среди них различают линейно коммитированные, которые уже необратимо определились как предшественницы клеток крови одного типа, бипотентные гранулоцитарно-моноцитарные или мегакариоцитарно-эритроидные, и общие мие-лоидные мультипотентные предшественники, выявляемые по смешанным колониям гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ). Как правило, количество КОЕ в трансплантатах костного мозга и периферической крови прямо коррелирует с количеством СD34+ клеток, однако показано, что в случае низкого (менее 2х10в/кг) содержания СD34+ клеток прогностическим критерием, наиболее точно коррелирующим со скоростью выхода из посттрансплантационной цитопении, является количество КОЕ [2, 4].

Одним из эффективных решений проблемы так называемой клеточной недостаточности трансплантата, является наращивание (экспансия) CD34+ клеток ex vivo [10]. Пролиферация, самоподдержание, дифференцировка и выживаемость кроветворных клеток зависят от микроокружения. В костном мозге таким микроокружением (так называемой «нишей» стволовых клеток) выступают негемопоэтические стромальные клетки, которые с помощью растворимых факторов и межклеточных контактов регулируют самообновление и дифференцировку пула ГСК [11,

12]. Предполагается, что интенсивно изучаемые в последнее время мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) костного мозга дают начало клеткам стромы, поддерживающим гемопоэз [13]. Для экспансии кроветворных клеток используют смеси ростовых факторов, непременными компонентами которых являются выделяемые ММСК цитокины: фактор роста стволовых клеток (stem cell factor, SCF), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-3 (IL-3), колониестимулирующие факторы гранулоцитов и макрофагов и другие. Ряд исследователей предпочитают вместе с добавляемыми цитокинами использовать и сами ММСК костного мозга в качестве подложки, моделируя, таким образом, in vitro аналог костномозговой ниши [14]. Тем не менее, очевидно, что ex vivo пока не удаётся воспроизвести условия естественного костномозгового микроокружения.

Целью настоящей работы являлось исследование закономерностей пролиферации и дифференцировки в миелоидном направлении CD34+ популяции клеток пуповинной крови человека при экспансии in vitro над монослоем ММСК костного мозга и без него для определения ключевых условий культивирования в бессывороточной среде, влияющих на наращивание субпопуляций предшественников миелоидного ряда.

Материал и методы

Выделение мононуклеарных и CD34+ клеток

пуповинной крови человека

Получение пуповинной крови производили с письменного информированного согласия рожениц в областном роддоме г. Минска. Контейнеры для сбора компонентов крови в качестве антикоагулянта содержали гепарин. Мононуклеарные клетки (МК) получали методом центрифугирования в течение 30 мин при 400g на градиенте плотности фиколла 1,077 (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare). Собранные МК дважды отмывали раствором Хэнкса (StemCell Technologies, Канада), содержавшем 2% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США). Обогащенную CD34+ клетками фракцию МК (CD34об) получали с помощью набора EasySep для положительной иммуномагнитной селекции (Stem^e!! Technologies, Канада), согласно инструкции производителя. Чистоту CD34об фракции оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии.

Получение ММСК костного мозга человека

Эксплантацию костного мозга выполняли в центре трансплантации органов и тканей на базе УЗ «9-я ГКБ» г. Минска. ММСК костного мозга получали, как описано ранее [15]. Фенотип полученных ММСК, определённый методом проточной цитофлуориме-трии, был следующий: CD34-/CD45-/CD105+/CD90+. Для получения подложки клетки второго или третьего пассажей растили до 100% конфлюэнтности, затем обрабатывали митомицином С (10 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США) в течение 2,5 ч при температуре 37°С с последующей двукратной отмывкой клеток питательной средой.

Экспансия CD34+клеток пуповинной крови in vitro

МК и CD34об фракцию каждого образца пуповинной крови высевали в количестве 5х104 и 1х104 кл/лунку соответственно в 24-луночные культураль-

ные планшеты (Sarstedt, Германия) в триплетах и культивировали в бессывороточной среде StemSpan (StemCell Technologies, Канада). В питательную среду добавляли смесь рекомбинантных ростовых факторов: интерлейкин-3 (IL-3), 20 нг/мл, интерлейкин-6 (IL-6), 20 нг/мл, фактор стволовых клеток (SCF), 50 нг/мл, лиганд тирозинкиназы-3 эмбриональной печени (Flt3-l), 100 нг/мл (все факторы производства StemCell Technologies, Канада). Для каждой фракции клеток использовали два варианта культивирования: на фидере из ММСК костного мозга и без него. Культивирование проводили в течение 2 нед. при температуре 37°С и 5% СО2. По мере увеличения концентрации клеток более чем 5х105/мл культуру рассевали на новые лунки и добавляли среду с факторами. На 1-й, 7-й и 12-й или 14-й день проводили иммунофенотипический анализ клеток, колониеобразующий тест и параллельно вели подсчет ядросодержащих клеток (ЯСК) с трипановым синим.

Иммунофенотипический анализ клеток

Оценка фенотипа ММСК костного мозга и ГСК производилась моноклональными антителами к CD90 (кат. № IM1840), CD105 (кат. № AO7414), CD34 (кат. № IM1250U), конъюгированными с фи-коэритрином (PE), и CD45, конъюгированными с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) (кат. № 0647), (все Beckman Coulter, Immunotech, Франция) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Для коррекции неспецифического окрашивания в образцы вносились блокирующие Fc-рецептор реагенты. Неспецифическое окрашивание оценивали по связыванию клетками конъюгатов IgG1-FITC (кат. № IM0639U) и IgG1-PE (кат. № IM0670U) (Beckman Coulter, Франция). Аналитическую цитометрию проводили на проточном цитофлуориметре FACS-can (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) с 15 мВт аргон-ионным лазером (длина возбуждения 488 нм), используя программу CELLQuest Software (BD). Популяции клеток оценивали после выделения логического ограничения в двумерной гистограмме по их линейному и боковому светорассеиванию (степень чистоты не менее 95%). Для расчета процентного содержания флуоресцентно меченых клеток и интенсивности флуоресценции использовали статистический пакет программы CELLQuest. Для каждого образца анализировалось не менее 50 тыс. клеток.

Колониеобразующий тест

Дифференцировочный потенциал гемопоэтиче-ских клеток-предшественниц исследовали методом колониеобразующего теста в полужидкой среде с цитокинами (MethoCult GF+ H4435, Stem Cell Technology, Канада) в соответствии с инструкцией производителя. Клетки вносили в 35-миллиметровые чашки в дуплетах в концентрациях от 5х102 до 1 х104 клеток на чашку в зависимости от варианта культивирования и времени экспансии.

Результаты

Исследование проводили в среде, не содержащей сыворотку крови животных или человека, чтобы избежать влияния неконтролируемых активных компонентов сыворотки, а также учитывая перспективу использования метода для медицинской практики. Исследовали одновременно четыре варианта культи-

вирования для каждого из образцов пуповинной крови. Фракцию МК и выделенную из части полученных МК положительной иммуномагнитной сепарацией Сй34об фракцию клеток пуповинной крови параллельно культивировали в присутствии одной и той же смеси ростовых факторов на подложке ММСК костного мозга и без него.

Вариант 1: МК (5х104 кл/лунку) в смеси ростовых факторов.

Вариант 2: МК в условиях варианта 1 на подложке из ММСК костного мозга.

Вариант 3: Сй34об фракция (1х104 кл/лунку) в смеси ростовых факторов.

Вариант 4: Сй34об фракция в условиях варианта 3 на подложке из ММСК костного мозга.

На 3—5-й день культивирования увеличение количества клеток было очевидно при наблюдении под микроскопом во всех вариантах культивирования. На фотографиях представлены 4-й (рис. 1 А—Г) и 2-й (рис. 1 Д) варианты культивирования гемопоэ-тических клеток. При экспансии на подложке ММСК большая часть (около 2/3) гемопоэтических клеток оставалась в неприкреплённом состоянии как суспензионная культура. Около трети гемопоэтических клеток можно было открепить с поверхности лунки только вместе с ММСК обработкой раствором трипсин-ЭДТА. Прикреплённые к подложке клетки располагались в двух уровнях: на подложке (круглые, выпуклые клетки) и под подложкой (плоские, так называемая «булыжная мостовая», рис. 1В, Г). При рассеве пролиферирующих клеток, находящихся над подложкой, часть клеток прикреплялась к новой подложке и продолжала пролиферировать под воздействием ростовых факторов, что указывает на экспрессию молекул адгезии клетками суспензионной фракции. В свою очередь, над отмытыми прикреплёнными к подложке гемопоэтическими клетками вскоре появлялась суспензионная фракция в тех же условиях.

По темпам прироста общего количества ядросодержащих клеток (ЯСК) Сй34об фракция значительно превосходила фракцию МК (рис. 2А). Так, при культивировании в присутствии только ростовых факторов содержание ЯСК в Сй34об. фракции через 12 дней увеличивалось в среднем для 4 образцов крови в 80 раз, тогда как в МК фракции их количество за этот период выросло только в 27 раз. При культивировании клеток на подложке ММСК кратность увеличения ЯСК была гораздо выше, но наблюдаемая закономерность сохранялась. Содержание ЯСК фракции МК в среднем увеличилось за 12 дней в 80 раз, Сй34об фракции — более чем в 1000 раз (рис. 2А). Так как значительную часть фракции МК исходно составляли зрелые клетки, а содержание Сй34+ клеток было невелико, полученные результаты закономерны.

Иная зависимость наблюдалась при анализе популяции Сй34+ клеток методом проточной цитоф-луориметрии. В течение первой недели культивирования в МК фракции их доля выросла с 1,3±0,5% до 33±6% без подложки и до 61±6% на подложке из ММСК костного мозга, а после 2 нед. культивирования значительно снизилась (рис. 2Б). Мониторинг прироста Сй34+ клеток показал, что в целом, за 2 нед. их количество в МК фракции увеличилось для различных вариантов экспансии (вариант 1 и 2) в среднем в 70±29 и 980±414 раз соответственно

(рис. 2В). В Сй34об фракции доля Сй34+ клеток снижалась в течение всего периода культивирования. Относительное содержание Сй34+ клеток коррелировало (г = 0,88) с относительным содержанием КОЕ для всех вариантов культивирования (рис. 2Б, Г). При этом общий прирост Сй34+ клеток в Сй34об фракции на подложке ММСК достоверно не отличался от такового в МК фракции, культивируемой в аналогичных условиях, и составил за 12 дней 1026±460 раз (рис. 2В). В целом, увеличение популяции Сй34+ клеток в МК фракции оказа-

лось сопоставимым с приростом в Сй34об фракции и было значительным. Известно, что зрелые клетки крови, присутствующие в мононуклеарной фракции, могут выделять ингибиторы пролиферации ГСК и клеток-предшественниц, такие как фактор некроза опухолей-а, трансформирующий фактор роста-р и др. [16]. Однако, ингибирующее воздействие в данном случае могло быть нейтрализовано избытком ростовых факторов в расчете на небольшое исходное содержание Сй34+ клеток в МК фракции.

Рис. 1.

Культуры мононуклеаров пуповинной крови, обогащенных 0034+ клетками, на фидере из аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга:

А - 1-й день экспансии, 5х103 клеток/см2;

Б - 5-й день экспансии;

В - скопление клеток под подложкой

на 4-й день экспансии;

Г - 7-й день экспансии, фазово-контрастная микроскопия: определяются тёмные круглые клетки на одном уровне с вытянутыми стромальными клетками и светлые выпуклые круглые клетки на другом уровне -над стромальными клетками;

Д - 14-й день экспансии, 4-й день после рассева суспензионной фракции на новую подложку из стромальных клеток

о

к

к

10000

1000

100

10

7-й день  12-й день

80

2456

X

80

27 I т 8,4 _

2,7 п 1

90

80

70

60

50

40

30

20

10

Г 0-й день

7-й день

12-й день

МК

МК+ММСК ОЭ34об ОЭ34об +ММСК

МК

МК+ММСК

ОЭ34об ОЭ34об +ММСК

В

а

о

10000

1000

100

350

7-й день I 12-й день

980

Т

10

1026

X

36

МК

МК+ММСК

24

II

ОР34об ОР34об +ММСК

ш

О

ш

О

о

со

Рис. 2. Численность численности клеточных популяций пуповинной крови при культивировании в течение 2 нед. в бессывороточной среде:

А - динамика увеличения количества ядросодержащих клеток (ЯСК) пуповинной крови; Б - изменение относительного содержания 0034+ клеток; В - увеличение общего количества 0034+ клеток; Г - изменение относительного содержания колоние- и бурстобразующих единиц (КОЕ+БОЕ). Обозначения клеточных популяций: МК - фракция мононуклеарных клеток (вариант 1); Мк+ММСК - фракция мононуклеарных клеток, над фидером аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (вариант 2); 0034об - обогащенная иммуномагнитной сепарацией 0034+ клетками мононуклеарная фракция пуповинной крови (вариант 3); 0034об+ММСК - обогащенная иммуномагнитной сепарацией 0034+ клетками мононуклеарная фракция пуповинной крови над подложкой ММСК КМ (вариант 4).

Приведены средние значения для 4 экспериментов, среднее квадратическое отклонение в виде интервала

0

2

1

Анализ экспрессии Сй34/Сй45 антигенов показал, что исходно Сй34+ популяция клеток пуповинной крови характеризуется очень слабой экспрессией панлейкоцитарного антигена Сй45 (рис. 3А, Б). Низкая экспрессия CD45RA связывается многими исследователями с присутствием либо ГСК, либо коммитированных предшественников эритропоэза. Клетки с высокой экспрессией CD45 обогащены гра-нуломоноцитарными предшественниками [17]. По мере экспансии уровень экспрессии CD45 на неприкреплённых гемопоэтических клетках увеличивается для всех вариантов культивирования (рис. 3 В—К, 4А). При анализе гемопоэтических клеток, откреплённых вместе с ММСК обработкой трипсин-ЭДТА, на двумерной гистограмме вновь обнаруживается небольшая фракция по уровню экспрессии CD34/CD45 антигенов аналогичная исходно выделенным клеткам пуповинной крови (рис. 3А, Б, Л, М).

Экспрессия CD34 меняется иным образом. В течение первой недели экспансии уровень экспрессии CD34 для части клеток усиливается, для другой части, наоборот, падает, что хорошо видно на приве-

денной гистограмме (рис. 4Б). Потеря CD34 антигена сопровождается появлением популяции более зрелых, скорее всего дифференцированных клеток с фенотипом CD45+/CD34- (рис. 3В—К). Подобный характер распределения CD34 маркера может указывать на существование двух популяций кроветворных клеток — ранней и более поздней, культивирование которой сопровождается дифференцировкой, в то время как более ранние предшественники начинают дифференцироваться только в течение второй недели экспансии, что подтверждается падением уровня экспрессии CD34 на большинстве клеток (рис. 3Ж—К).

Для каждого из проанализированных четырёх образцов пуповинной крови кратность увеличения ЯСК на подложке была больше чем без нее. При этом доля CD34+ клеток была выше при экспансии над подложкой в обеих культивируемых фракциях (рис. 2Б). Представленные данные одного из экспериментов (рис. 3) убедительно демонстрируют более выраженное падение экспрессии СD34 на клетках, культивируемых без подложки из ММСК костного мозга. Так, доля CD45+/CD34- клеток на 6-й день

культивирования без подложки ММСК приближалась к 50% и 47% для разных фракций клеток крови (рис. 3В, Г), тогда как при экспансии над подложкой она равнялась 35% и 20% соответственно (рис. 3Д, Е). Большая часть культивируемых с ММСК клеток была положительна по Сй34 маркеру.

МК

Ой34-обогащенная

фракция

А

Б

0-й день

и1 В £08% w 40,38% и* Г 0181% 49,95% !

50,064 * 46,44%

без ММСК

»' И* »* »*

6-й день

Д

2,19% *

Р- 19,85%

над ММСК

Ж

без ММСК

*49% 19,04%

ё 62.77%

над ММСК 12-й день

Л .

J*

М

под ММСК

CD45

Рис. 3. Результаты проточной цитофлуориметрии. Иммунофенотипический анализ экспрессии CD45 и CD34 на гемопоэтических клетках мононуклеарной (А, В, Д, Ж, И, Л) и обогащенной иммуномагнитной сепарацией CD34+ клетками (Б, Г, Е, З, К, М) фракциях клеток пуповинной крови при экспансии без фидера (В, Г, Ж, З), над (Д, Е, И, К) и под (Л, М) фидером из ММСК КМ человека.

Представлены двумерные гистограммы одного из экспериментов, полученные на 1-й (А, Б), 6-й (В-Е) и 12-й (Ж-М) дни экспансии in vitro. Прямоугольником выделен кластер СD45-(low)CD34+-клеток

Рис. 4. Результаты анализа распределения уровней экспрессии СБ45 (А) и СБ34 [Б] на популяции Сй34+ клеток пуповинной крови.

Черный пик - изотип-контроль; красный - СП34об фракция на 1-день; синий - СП34об фракция на 7-день экспансии на фидере из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга

Е

Наиболее функциональным тестом, подтверждающим экспансию клеток-предшественниц мие-лоидного ряда, является колониеобразующий тест в полужидкой среде на основе метилцеллюлозы в присутствии факторов, стимулирующих дифферен-цировку гранулоцитов, макрофагов и эритроцитов. Наблюдаемая динамика увеличения общего количества КОЕ аналогична динамике прироста Сй34+ клеток (рис. 5А). Положительное влияние подложки на экспансию предшественников также прослеживается в этих тестах. При этом не наблюдалось достоверной разницы по приросту всех КОЕ для МК и Сй34об фракций клеток в параллельных вариантах культивирования.

В то же время анализ прироста мультипотентных предшественников выявил достоверное (р < 0,05) отличие между МК и Сй34об фракциями клеток. Наилучшим вариантом экспансии КОЕ-ГЭММ оказалось культивирование Сй34об фракции клеток пуповинной крови на подложке ММСК костного мозга. Увеличение количества мультипотентных предшественников на фидере происходило в среднем почти

на порядок быстрее, чем без него: в 45 и 5 раз соответственно на первой неделе, и в 396 и 46 раз соответственно на второй (рис. 5Б). Для фракции МК общий прирост КОЕ-ГЭММ был намного ниже: в среднем 3 против 1,2 раза через одну неделю культивирования и 30 против 15 раз спустя две недели (рис. 5Б). Таким образом, ключевыми условиями экспансии мультипотентных предшественников является отсутствие в культуре зрелых мононуклеаров и присутствие стромальных клеток.

Экспансия клеток пуповинной крови в течение одной недели не привела к достоверным изменениям субпопуляционного состава КОЕ во всех вариантах культивирования (рис. 6А). На второй неделе выявлена воспроизводимая во всех случаях закономерность: вместе с абсолютным количеством увеличивается относительное процентное содержание предшественников гранулоцитов и макрофагов. Их доля достигает 80% и более от общего количества экспансированных КОЕ. Соответственно, доля предшественников эритроидного ряда в популяции снижается (рис. 6А).

МК МК+ММСК

СЭ34об СЭ34об +ММСК

10000

ш 1000

S

100

10

Г. 7-й день L 12-й день

30 46

15 I I 5 ї 1

3 І І

МК МК+ММСК

СЭ34об СЭ34об +ММСК

Рис. 5. Результаты колониеобразующего теста. Динамика увеличения колониеобразующих единиц миелоидного ряда при экспансии in vitro: А - общего количества колониеобразующих единиц; Б - мультипотентных колониеобразующих единиц гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, мегакариоцитов. Приведены усреднённые значения 4 экспериментов для четырёх параллельных вариантов культивирования, названия популяций аналогичны рис. 2

А

День культивирования

Б

40

35

30

о 25

20

* 15

10

і над ММСК а' вместе с ММСК

БОЕ-Е

КОЕ-Г

КОЕ-М КОЕ-ГМ КОЕ-ГЭММ

Рис. 6. Результаты колониеобразующего теста: А - динамика изменения субпопуляционного состава предшественников миелопоэза фракции мононуклеаров пуповинной крови, обогащённой 0034+ клетками, при культивировании в бессывороточной среде; Б - распределение субпопуляций миелоидных предшественников в суспензионной (над ММСК] и адгезированной (вместе с ММСК] фракциях гемопоэтических клеток пуповинной крови на 7-й день экспансии. Названия популяций аналогичны рис. 2

0

5

0

Данная тенденция фиксировалась для всех вариантов культивирования (данные не представлены). Интересно, что на перераспределение предшественников в динамике экспансии в сторону гранулоцитарно-макрофагального ростка влияет исходная концентрация культивируемых CD34+ клеток [18]. Показано, что низкая начальная концентрация ГСК способствует стимуляции эритропоэза, более высокая — гранулоцитопоэза, вплоть до полной дифференцировки в нейтрофилы. В таком случае, увеличение концентрации клеток в статичной культуре, несмотря на периодический рассев, по мере культивирования должно приводить к повышению доли предшественников гранулоцитов и макрофагов.

Анализ распределения коммитированных предшественников между суспензионной и адгезирован-ной с ММСК популяциями клеток пуповинной крови показал, что в прикреплённом состоянии находятся преимущественно линейно коммитированные и муль-типотентные предшественники эритроцитов, а на второй неделе и макрофагов, тогда как суспензионная фракция клеток обогащена коммитированными предшественниками гранулоцитов (рис. 6Б). Таким образом, подложка ММСК вызывает перераспределение предшественников миелодного ряда между суспензионной и адгезированной фракциями клеток. Со стромальными клетками связываются преимущественно либо эритроидные, либо ранние мульти-потентные предшественники, также обладающие эритроидным потенциалом (рис. 6Б). Кроме того, под ММСК могут находиться ГСК, колонии которых мы обнаружить не можем. Полученные результаты согласуются с данными по экспрессии панлейкоцитарного маркера CD45 суспензионной и адгезированной фракциями клеток.

Обсуждение

На пролиферацию, дифференцировку и апоптоз незрелых клеток при экспансии in vitro могут повлиять как сочетание добавляемых цитокинов и питательных веществ, так и состав и концентрация самих культивируемых клеток [19]. В статичных культурах эти параметры постоянно меняются во времени и зависят от ручных манипуляций по замене среды и добавлению ростовых факторов. Экспансия с различной эффективностью может проходить в биореакторах или газопроницаемых пакетах, в контакте со стро-мальными элементами или только с выделяемыми ими факторами. Неудивительно, что при анализе научных публикаций, посвященных экспансии стволовых клеток, мы видим большой разброс полученных результатов [20]. Исследователи отмечают увеличение количества апоптотических клеток, изменение экспрессии поверхностных маркеров, характерное для тех или иных условий культивирования, падение экспрессии маркеров незрелых клеток и маркеров адгезии [10]. Пока нет однозначных данных ни об оптимальном сочетании ростовых факторов, сокуль-тивируемых клеточных субпопуляций, среды и сыворотки, ни о временных параметрах экспансии. Большинство исследований сосредоточено на подборе компонентов ростовых смесей, тогда как в костном мозге самообновляющиеся и дифференцирующиеся клетки имеют возможность мигрировать в отдельные компартменты, получая ограниченные сигналы и необходимые контакты. Передача сигналов в условиях костномозговой ниши представляется более

упорядоченной, чем это можно соблюсти в условиях культуры ex vivo.

В наших экспериментах показано, что в присутствии SCF, IL-3, IL-6 и Flt3/l и в условиях периодического рассева культуры в период до одной недели удаётся в десятки раз (в среднем от 2 до 36 для различных вариантов) увеличить количество CD34+ клеток, сохранив субпопуляционный состав предшественников. Кроме того, в течение этого периода уровень экспрессии CD34 на значительной части размноженных клеток повышается, что указывает на присутствие самых ранних гемопоэтических предшественников с высоким пролиферативным потенциалом [21]. По этим причинам временной интервал до одной недели экспансии представляется наиболее оптимальным в этих условиях, несмотря на то, что за 2 недели экспансии очищенной CD34+ популяции клеток на подложке из ММСК костного мозга удалось в сотни раз увеличить количество миелоидных мультипотентных предшественников.

Несмотря на малое количество CD34+ клеток в трансплантате, накоплен достаточный положительный опыт трансплантаций пуповинной крови, содержащей на порядок меньшее количество ЯСК, чем костный мозг в аналогичных случаях. Неслучайно основным критерием для трансплантации пуповинной крови пока считается количество ЯСК, а не CD34+ клеток на килограмм веса реципиента. В то же время известно, что CD34+ популяция клеток пуповинной крови отличается от костного мозга меньшим содержанием ГСК, но более высоким содержанием мультипотентных предшественников [22]. Для трансплантатов костного мозга и периферической крови показано, что время восстановления эритро-идного, тромбоцитарного и гранулоцитарного ростка кроветворения прямо коррелирует с количеством соответствующих бипотентных колониеобразующих единиц и, в наибольшей степени — с КОЕ-ГЭММ [4, 23]. В связи с вышеизложенным, значение популяции мультипотентных предшественников миелоид-ного ряда, как наиболее близких к кратковременно репопулирующим незрелым клеткам крови, представляется недооцененным.

Для эффективной экспансии мультипотентных предшественников получение очищенной CD34+ популяции клеток оказалось предпочтительнее, невзирая на то, что дополнительная сепарация мононукле-арной или общей лейкоцитарной фракции сопряжена с неизбежными потерями и без того немногочисленных кроветворных клеток пуповинной крови. Потери CD34+ клеток при дополнительной сепарации могут доходить до 50%, однако они будут оправданы, если в результате экспансии удастся увеличить количество репопулирующих предшественников хотя бы в 10 раз. При семидневной экспансии над подложкой из ММСК костного мозга нам удавалось добиться для КОЕ-ГЭММ показателей в разы превышающих вышеприведенный, что может способствовать решению проблемы недостаточной клеточности. Экспансия МК фракции приводила к большей дифферен-цированности предшественников (падение уровня экспрессии CD34, меньший прирост мультипотентных КОЕ), тогда как по общему приросту CD34+ клеток и всех КОЕ достоверных отличий не выявлено.

Результаты распределения субпопуляций предшественников между суспензионной и адгезиро-ванной фракциями на подложке ММСК КМ вместе

с данными фенотипирования подтверждают возможность моделирования in vitro условий костномозговой ниши, как основы для наиболее адекватной экспансии. Значительное увеличение пула КОЕ-ГЭММ при культивировании на подложке даёт основание предполагать как дифференцировку ранних ГСК, так и самообновление популяции мультипотентных предшественников миелоидного ряда в контакте с ММСК костного мозга. Возможно, поддержание в культуре низкой концентрации предшественников и отсутствие контакта со зрелыми (созревающими) клетками, моделирует условия аналогичные заселению костного мозга после миелоабляции. Физиологическая роль отдельных пулов сокультивируемых с ММСК гемопоэтических клеток при трансплантации еще требует дальнейшего изучения, однако, не

исключено, что наилучшим вариантом для уменьшения периода цитопении окажется трансплантация всей популяции CD34+ клеток после кратковременной (до одной недели) экспансии вместе с сокульти-вируемыми ММСК костного мозга реципиента.

Проблема утери предшественниками после экспансии ex vivo потенциала к миграции в костный мозг на сегодняшний день может быть решена внутрикостной трансплантацией клеток [24]. Таким образом, стратегия преодоления недостаточной клеточности может включать внутрикостную трансплантацию экспансированных из 1/3-1/2 части единицы пуповинной крови CD34+ клеток вместе с со-культивируемыми ММСК костного мозга реципиента и внутривенную трансплантацию остального объёма пуповинной крови.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Broxmeyer H.E. Cord blood: biology, immunology, banking, and clinical transplantation. Bethesda (Maryland): AABB Press; 2004.

2. Hogge D.E., Lambie K., Sutherland H.J. et al. Quantitation of primitive and lineage-committed progenitors in mobilized peripheral blood for prediction of platelet recovery post autologous transplant. Bone Marrow Transplant 2000; 25: 589—98.

3. Zubair A., Zahrieh D., Daley H. et al. Early neutrophil engraftment following autologous BMT provides a functional predictor of long-term hematopoietic reconstitution. Transfusion 2003; 43: 614—21.

4. Arber C., Halter J., Stern M. et al. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant 2011; 46(5): 650—8.

5. Bittencourt H., Rocha V., Chevret S. et al. Association of CD34 cell dose with hematopoietic recovery, infections, and other outcomes after HLA-identical sibling bone marrow transplantation. Blood 2002; 99: 2726-33.

6. Faucher C., Le Corroller A.G., Chabannon C. et al. Autologous transplantation of blood stem cells mobilized with filgrastim alone in 93 patients with malignancies: the number of CD34+ cells reinfused is the only factor predicting both granulocyte and platelet recovery. J Hematother. 1996; 5:663-70.

7. Majeti R., Park C.Y., Weissman I.L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell 2007; 1(6): 635-45.

8. Osawa M., Hanada K., Hamada H. et al. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 1996; 273: 242-5.

9. Wagner J.E., Barker J.N., DeFor T.E. et al. Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and non malignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood 2002; 100: 1611-8.

10. Hofmeister C.C., Zhang J., Knight K.L. et al. Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche. Bone Marrow Transplantation 2007; 39: 11-23.

11. Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W. et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 2003; 425 (6960): 778-9.

12. Zhang J., Niu C., Ye L. et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 2003; 425(6960): 836-41.

13. Majumdar M.K., Thiede M.A., Haynesworth S.E. et al. Human marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) express

hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. J Hematother Stem Cell Res. 2000; 9(6): 841-8.

14. Breems D.A., Blokland E.A., Siebel K.E. et al. Stroma-contact prevents loss of hematopoietic stem cell quality during ex vivo expansion of CD34+ mobilized peripheral blood stem cells. Blood 1998; 91(1):111-7.

15. Kosmacheva S., Seviaryn I., Goncharova N. et al. Hepatogenic potential of human bone marrow and umbilical cord blood mesenchymal stem cells. Bull. Exp. Biol. Med. 2011; 151: 142-9.

16. Mayani H., Little M-T., Dragowska W. et al. Differential effects of the hematopoietic inhibitors MIP-1a, TGF-p, and TNF-a on cytocine-induced proliferation of subpopulations of CD34+ cells purified from cord blood and fetal liver. Exp. Hematol. 1995; 23: 422-7.

17. Mayani H., Dragowska W., Lansdorp P.M. Characterization of functionally distinct subpopulations of CD34+ cord blood cells in serum-free long-term cultures supplemented with hematopoietic cytokines. Blood 1993; 82: 2664-72.

18. Douay L. Culture conditions for ex vivo expansion of hematopoietic ptimitive cells. http://mmserver.cjp.com/gems/blood/ ABMT.10.Douay.pdf

19. Poloni A., Giarratana M.C., Firat H. et al. The ex vivo expansion capacity of normal human bone marrow cells is dependent on experimental conditions: role of the cell concentration, serum and CD34+ cell selection in stroma-free cultures. Hematol. Cell Ther. 1997; 39(2): 49-58.

20. Andrade-Zaldivar H., Santos L., Rodriguez A. Expansion of human hematopoietic stem cells for transplantation: trends and perspectives. Cytotechnology 2008; 56: 151-60.

21. Lu L., Xiao M., Shen R.N. et al. Enrichment, characterization and responsiveness of single primitive CD34+++ human cord blood hematopoietic progenitor cells with high proliferative and replating potential. Blood 1993; 81: 41-8.

22. Mayani H., Gutierres-Rodriguez M., Espinoza L. et al. Kinetics of hematopoiesis in Dexter-type long-term cultures established from human umbilical cord blood cells. Stem Cells 1998; 16: 127-35.

23. Ma D.D., Varga D.E., Biggs J.C. Donor marrow progenitors (CFU-Mix, BFU-E and cFU-GM) and haemopoietic engraftment following HLA matched sibling bone marrow transplantation. Leuk Res. 1987; 11(2): 141-7.

24. Frassoni F., Gualandi F., Podesta M. et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/ II study. Lancet Oncol. 2008; 9(9): 831-9.

Поступила 07.09.2011