СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ TUSC2-ИММУНОТЕРАПИИ
METHODS AND COMPOSITIONS FOR TUSC2-IMMUNOTHERAPY

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США No.62/407329, поданной 12 октября 2016, которая включена в настоящее описания в качестве ссылки в полном объеме.
Предпосылки создания изобретения
1. Область изобретения
[0002] Варианты осуществления настоящего изобретения в целом относятся к области молекулярной биологии, иммунологии и терапии злокачественных новообразований.
2. Описание уровня техники
et al.,
et al.,
[0003] Поскольку молекулярные и генетические механизмы онкогенеза становятся все более понятными, то специалисты по терапии злокачественных новообразований переключили свое внимание с ткани на генетический уровень (Bishop, 1991). Мутации в генах двух основных классов, онкогенов и генов-супрессоров опухолей (TSG), играют центральную роль в онкогенезе. Очевидно, что для инактивации TSG требуется гомозиготная делеция или мутация, и восстановление экспрессии TSG может быть осуществлено в человеческих опухолях (Lowe2004; Roth, 2006). Гомозиготные делеции в области 3p21.3 в клеточных линиях рака легких и первичных опухолях легких позволили идентифицировать множество генов с опухоль-ингибирующей активностью в этой области (Lerman  2000). Эти делеции позволили разработать нацеленную противораковую терапию. Однако, остается неясным, каким образом можно повысить эффективность такой терапии.
Сущность изобретения
[0004] В первом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего злокачественным новообразованием, включающему проведение супрессивной терапии опухоли (например, TUSC2-терапии) в комбинации с введением ингибитора контрольной точки иммунитета. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего злокачественным новообразованием, где указанный индивидуум получает лечение (или ранее получал лечение) по меньшей мере одним ингибитором контрольной точки иммунитета, и где указанный способ включает проведение у индивида супрессивной терапии опухоли, например, TUSC2-терапии. Так, например, индивидуумом, который получает TUSC2-терапию, может быть индивидуум, которому вводят ингибитор контрольной точки иммунитета менее, чем за один час, 6 часов, 12 часов, 1 день, 3 дня, одну неделю или две недели до проведения TUSC2-терапии. Используемая в настоящем документе TUSC2-терапия может представлять собой терапию любого типа, которая обеспечивает или вызывает экспрессию полипептида TUSC2 в злокачественных клетках (см., например, патент США № 7902441, который включен в настоящее описание в качестве ссылки). Так, например, TUSC2-терапия может включать доставку полипептида TUSC2 или вектора экспрессии TUSC2 в злокачественную клетку. Такая терапия может быть осуществлена, например, с помощью наночастиц, или в случае векторов экспрессии на основе нуклеиновых кислот, используя вирусный вектор.
[0005] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего злокачественным новообразованием, где указанный способ включает проведение TUSC2-терапии у индивидуума в комбинации по меньшей мере с введением одного ингибитора контрольной точки иммунитета. Так, например, TUSC2-терапия может быть проведена до, после или, по существу, во время введения по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки иммунитета. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтическое средство TUSC2 и ингибитор контрольной точки иммунитета в количестве, которое является терапевтически эффективным для лечения злокачественного новообразования.
[0006] В некоторых аспектах, по меньшей мере один ингибитор контрольной точки иммунитета выбран из ингибиторов CTLA-4, PD-1, PD-Ll, PD-L2, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR или A2aR. В некоторых аспектах изобретения, по меньшей мере одним ингибитором контрольной точки иммунитета является антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути белка программируемой гибели клеток 1 человека (PD-1). В некоторых аспектах изобретения, антагонист, связывающийся с компонентом сигнального пути PD-1, выбран из группы, состоящей из антагониста, связывающегося с PD-1, антагониста, связывающегося с PDL1, и антагониста, связывающегося с PDL2. В некоторых аспектах изобретения, антагонистом, связывающимся с фактором PD-1, является антагонист, связывающий с PD-1. В некоторых аспектах настоящего изобретения, PD-L-связывающий антагонист ингибирует связывание PD-1 с PDL1 и/или PDL2. В конкретных аспектах, антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент. В конкретных аспектах изобретения, антагонистом, связывающимся с PD-L, является ниволумаб, пембролизумаб, пидиллизумаб, KEYTRUDA, АМР-514, REGN2810, СТ-011, BMS 936559, MPDL328ОA или АМР-224. В конкретных аспектах, по меньшей мере один ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой анти-CTLA-4 антитело. В конкретных аспектах, анти-CTLA-4 антителом является тремелимумаб, YERVOY или ипилимумаб. В некоторых аспектах изобретения, по меньшей мере один ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой иммуноглобулин-подобное антитело против рецептора клеток-киллеров (KIR). В некоторых аспектах настоящего изобретения, анти-KIR антителом является лирилумаб. В некоторых аспектах изобретения, индивидууму вводили или вводят более одного ингибитора контрольной точки иммунитета, такой как анти-PD1 антитело и анти-CTLA4 антитело.
[0007] В некоторых вариантах осуществления изобретения, проведение TUSC2-терапии включает введение вектора экспрессии TUSC2, такого как ДНК-плазмида, кодирующая TUSC2. Вектор экспрессии, используемый в соответствии с описанными в настоящем документе вариантами осуществления изобретения, как правило, включает элементы регуляции экспрессии TUSC2-кодирующей последовательности. Так, например, вектор может включать промоторный и энхансерный элемент, которые являются эффективными для экспрессии в представляющих интерес злокачественных клетках. В некоторых аспектах изобретения, например, экспрессия TUSC2 находится под контролем промотора CMV или его рекомбинантного варианта, таким как промоторная конструкция CMV, описанная в публикации патента США № 20070092968, приведенном в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанный вектор содержит модифицированный промотор CMV. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанный в настоящем документе вектор содержит мини-промотор CMV. Могут быть, например, включены и дополнительные элементы регуляции экспрессии, такие как, например, интрон, элемент ответа на лекарственное средство, РНК-стабилизирующая или дестабилизирующая последовательность, сигнал определения локализации в клетке, последовательность сигнала полиаденилирования и/или оптимизированный кодон инициации трансляции. Плазмидные ДНК-векторы могут также включать последовательности, которые облегчают продукцию ДНК, такие как, бактериальная точка начала репликации и/или маркер резистентности к лекарственному средству. В некоторых конкретных аспектах изобретения, вектором экспрессии TUSC2 является плазмида pLJ143/KGB2/FUSl.
in vivo
400
[0008] Способы доставки вектора экспрессии в клетки (например,  доставки) хорошо известны специалистам и включают, но не ограничиваются ими, наночастицы (например, липосомных наночастиц), липидные конъюгаты и вирусные векторы. В некоторых аспектах изобретения, вектор экспрессии TUSC2 вводят в наночастицу, такую как липосомная наночастица, содержащая хлорид N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTAP):холестерин. Специалисту в данной области будет очевидно, что различные свойства липосом можно регулировать для оптимизации доставки вектора. Так, например, липосомы могут быть модифицированы на получение липосом определенного размера и/или конкретного соотношения ДНК:липид; ДНК:холестерин; или липид:холестерин. Так, например, в случае липосомы, содержащей DOTAP:холестерин, соотношение DOTAP:холестерин может быть определено как соотношение приблизительно от 1,5:1 до 1:1,5, например, приблизительно 10:9. В других аспектах изобретения, вектор экспрессии TUSC2 присутствует в виде липосомных наночастиц, где наночастицы имеют средний размер в пределах приблизительно от 50 и приблизительно до 500 нм (например, 200-500 нм). В других аспектах изобретения, препарат в виде TUSC2-наночастиц может быть охарактеризован по их оптической плотности (OD), например, по OD приблизительно от 0,65 до 0,95.
[0009] В других вариантах осуществления изобретения, TUSC2-терапия может включать введение полипептида TUSC2. Способы введения полипептида TUSC2 описаны, например, в публикациях патентов США №№ 20060251726 и 20090023207, которые приведены в настоящем описании в качестве ссылки. Полипептид TUSC2 может быть модифицирован для повышения его активности и/или способности проникать в злокачественные клетки. Так, например, полипептид может быть модифицирован липидной молекулой (например, миристоилирован). В некоторых аспектах изобретения, TUSC2 получают в виде наночастиц (например, наночастиц на основе липидов), таких как суперпарамагнитная наночастица, нанооболочка, полупроводниковый нанокристалл, квантовая точка, наночастица на основе полимера, наночастица на основе кремния, наночастица на основе диоксида кремния, наночастица на основе металла, фуллерен или нанотрубка.
[0010] В соответствии с описанными в настоящем документе вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к TUSC2-терапии и/или введению препарата ингибитора контрольной точки иммунитета, обычно находящегося в составе с фармацевтически приемлемым носителем. В соответствии с вариантами осуществления изобретения, терапия может быть проведена, например, внутривенно, интрадермально, внутриартериально, внутрибрюшинно, путем введения в пораженный участок, интракраниально, внутрисуставно, путем введения в область предстательной железы, внутриплеврально, внутритрахеально, интраназально, путем введения в стекловидное тело, интравагинально, ректально, местно, путем введения вовнутрь опухоли, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, путем введения в подконъюнктивальное пространство, интравезикулярно, путем введения в слизистую оболочку, интраперикардиально, путем введения в область пупочного канатика, интраокулярно, перорально, местно, локально, путем ингаляции (например, аэрозольной ингаляции), путем инъекции или инфузии, и такие способы доставки могут зависеть от типа рака, подвергаемого лечению. Так, например, вектор экспрессии TUSC2 в комплексе с липосомой, содержащей DOTAP:холестерин, может быть введен путем внутривенной инфузии. В некоторых конкретных аспектах изобретения, TUSC2-терапию проводят внутривенно в дозе приблизительно от 0,01 мг/кг и до приблизительно 0,10 мг/кг, например, в дозе приблизительно 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08 0,09 или 0,10 мг/кг. В других аспектах изобретения, TUSC2-терапия может быть проведена два или более раз (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз). Время между введением доз при такой терапии может варьироваться и может включать, но не ограничивается ими, приблизительно 1, 2 или 3 дня, приблизительно 1, 2 или 3 недели или 1 месяц или более.
[0011] В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего злокачественным новообразованием, где указанный способ включает проведение у индивидуума TUSC2-терапии в комбинации с введением по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки иммунитета и/или одного или более противовоспалительных средств. Так, например, противовоспалительное средство может быть введено до, после или во время TUSC2-терапии. В другом аспекте изобретения вводят более одного противовоспалительного средства, такое как антигистамин и кортикостероид. Таким образом, в некоторых конкретных аспектах изобретения, противовоспалительное средство, для использования в комбинации с TUSC2-терапией, представляет собой дифенгидрамин и/или дексаметазон.
[0012] В других вариантах осуществления изобретения, описанный в настоящем документе способ также включает проведение дополнительной терапии злокачественных новообразований. Дополнительной терапией злокачественных новообразований могут быть, но не ограничиваются ими, хирургическая операция, химиотерапия (например, введение ингибитора протеинкиназы или терапия, нацеленная на EGFR), лучевая терапия, криотерапия, гипертермия, фототерапия, радиоабляционная терапия, гормональная терапия, иммунотерапия, терапия с использованием небольшой молекулы, терапия с использованием ингибитора киназного рецептора, антиангиогенная терапия, терапия с использованием цитокинов или биологическая терапия, такая как терапия с использованием моноклональных антител, киРНК, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, или генотерапия. Биологической терапией может быть, но не ограничивается ими, генотерапия, такая как терапия с использованием гена-супрессора опухоли, терапия с использованием гена белка клеточной гибели, терапия с использованием гена-регулятора клеточного цикла, терапия с использованием гена цитокина, терапия с использованием гена токсина, иммуногенная терапия, терапия с использованием гена суицида, терапия с использованием гена пролекарства, терапия с использованием гена, направленного против пролиферации клеток, терапия с использованием гена фермента или терапия с использованием гена, направленного против ангиогенного фактора.
[0013] Таким образом, в другом своем варианте осуществления, настоящее изобретение относится к композициям, к терапии и к способам лечения индивидуума, страдающего злокачественным новообразованием, где указанный способ включает проведение у индивидуума TUSC2-терапии (например, с полипептидом TUSC2 или вектором экспрессии TUSC2) в комбинации с введением ингибитора контрольной точки иммунитета и другого противоракового средства, такого как химиотерапевтическое средство. Так, например, химиотерапевтическим средством может быть ингибитор протеинкиназы, такой как ингибитор киназы Src или Akt. В некоторых аспектах изобретения, химиотерапевтическим средством является ингибитор рецептора эпидермального фактора роста (EGFR).
[0014] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего злокачественным новообразованием, где указанный способ включает проведение у индивидуума TUSC2-терапии в комбинации с введением по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки иммунитета и, необязательно, ингибитора протеинкиназы. Так, например, TUSC2-терапия или введение ингибитора контрольной точки иммунитета могут быть осуществлены до, после или, по существу, во время введения ингибитора протеинкиназы. Таким образом, в некоторых своих вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтический TUSC2, ингибитор контрольной точки иммунитета и ингибитор протеинкиназы в количестве, которое является терапевтически эффективным для лечения рака. Ингибиторами протеинкиназы для их применения в соответствии с вариантами осуществления изобретения, являются, но не ограничиваются ими, EGFR, VEGFR, AKT, Erb1, Erb2, ErbB, Syk, Bcr-Abl, JAK, Src, GSK-3, PI3K, Ras, Raf, MAPK, MAPKK, mTOR, c-Kit, рецептор eph или ингибиторы BRAF. Так, например, ингибиторами протеинкиназы могут быть афатиниб, акситиниб, бевацизумаб, бозутиниб, цетуксимаб, кризотиниб, дазатиниб, эрлотиниб, фостаматиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, ленватиниб, мубритиниб, нилотиниб, панитумумаб, пазораниб, пегаптаноб, ранибизумаб, руксолитиниб, саракатиниб, сорафениб, сунитиниб, трастузумаб, вандетаниб, AP23451, вемурафениб, CAL101, PX-866, LY294002, рапамицин, темсиролимус, эверолимус, ридафоролимус, альвоцидиб, генистеин, селуметиниб, AZD-6244, ваталаниб, P1446A-05, AG-024322, ZD1839, P276-00, GW572016 или их смесь. В некоторых аспектах изобретения, ингибитором протеинкиназы является ингибитор AKT (например, МК-2206, GSK690693, А-443654, VQD-002, милтефозин или перифозин).
[0015] EGFR-направленной терапией для применения в соответствии с вариантами осуществления изобретения, является, но не ограничиваются ими, введение ингибиторов EGFR/ErbB1/HER, ErbB2/Neu/HER2, ErbB3/HER3 и/или ErbB4/HER4. Такие ингибиторы широкого спектра известны специалистам и включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы тирозинкиназы, обладающие активностью против рецептора(ов) и EGFR-связывающие антитела или аптамеры. Так, например, ингибитором EGFR может быть гефитиниб, эрлотиниб, цетуксимаб, матузумаб, панитумумаб, AEE788; CI-1033, HKI-272, HKI-357 или EKB-569. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение описанных в настоящем документе композиций и проведение терапии осуществляют системно или местно. В одном из вариантов осуществления изобретения, введение описанных в настоящем документе композиций и проведение терапии осуществляют системно. В некоторых аспектах, ингибитор EGFR вводят пациенту до, после или, по существу, во время проведения TUSC2-терапии. Так, например, такая терапия может быть осуществлена совместно, например, путем совместного введения в виде внутривенной инфузии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибиторы TUSC2 и EGFR могут быть введены в любом количестве, эффективном для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения, представленные в настоящем документе композиции, терапия и способы включают использование ингибиторов TUSC2 и EGFR в более низких дозах, чем любая композиция, вводимая отдельно. В некоторых вариантах осуществления изобретения, представленные в настоящем документе композиции, терапия и способы включают применение ингибиторов TUSC2 и EGFR в более низких дозах, что позволяет снижать побочные эффекты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, применение композиций, терапии и способов включают проведение TUSC2-терапии, введение ингибитора контрольной точки иммунитета и ингибиторов EGFR в дозах, эффективных для аддитивного, комбинированного или синергического эффекта, чем это может достигаться с использованием любой отдельно вводимой композиции. В некоторых аспектах изобретения, рак, подвергаемый лечению с помощью такой терапии, может представлять собой любой описанный в настоящем документе рак, такой как рак легких (например, немелкоклеточный рак легких). В некоторых предпочтительных аспектах изобретения, рак, подвергаемый лечению с помощью такой комбинированной терапии, представляет собой EGFR-экспрессирующую раковую опухоль. В некоторых вариантах осуществления изобретения, EGFR-экспрессирующая злокачественная опухоль содержит по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% опухолевых клеток, экспрессирующих EGFR.
[0016] В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума со злокачественным новообразованием, которое, как было определено ранее, экспрессирует EGFR, где указанный способ включает проведение у индивидуума TUSC2-терапии в комбинации с введением ингибитора контроподвергаемый лечению имеет раковую опухоль, которая, как было определено ранее, экспрессирует EGFR, и в которой по меньшей мере 10% раковых клеток являются апоптотическими. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные в настоящем документе способы также включают определение того факта, являются ли по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% клеток EGFR-экспрессирующей раковой опухоли апоптотическими.
[0017] В некоторых вариантах осуществления изобретения, злокачественное новообразование, в отношении которого проводят лечение или диагностику, может представлять собой опухоль, такую как первичная или метастазирующая опухоль. Злокачественным новообразованием может быть новообразование на ранней стадии или метастазирующий рак или злокачественная опухоль на поздней стадии. В некоторых аспектах изобретения, злокачественное новообразование представляет собой рак полости рта, рак ротоглотки, рак носоглотки, рак дыхательных путей, рак мочеполовых путей, рак желудочно-кишечного тракта, рак ткани центральный или периферический нервной системы, рак эндокринной или нейроэндокринной системы, рак кроветворных органов, глиому, саркому, карциному, лимфому, меланому, фиброму, менингиому, рак головного мозга, рак ротоглотки, рак носоглотки, рак почек, рак желчных путей, рак предстательной железы, феохромоцитому, рак панкреатических островков, опухоль Ли-Фраумени, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, опухоль гипофиза, опухоль коры надпочечников, остеогенную саркому, множественные опухоли нейроэндокринной системы типа I и типа II, рак молочной железы, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ) или мелкоклеточный рак легких (МРЛ)), рак головы и шеи, рак предстательной железы, рак пищевода, рак трахеи, рак кожи, рак головного мозга, рак печени, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак яичек, рак толстой кишки, рак прямой кишки или рак кожи. В других аспектах изобретения, злокачественное новообразование может быть определено как новообразование, резистентное к одному или нескольким видам терапии злокачественных новообразований, например, рак, резистентный к химиотерапии. Так, например, злокачественным новообразованием может быть новообразование, резистентное к химиотерапевтическому средству на основе платины, такому как цисплатин.
+
+
[0018] В некоторых аспектах вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения, проведение TUSC2-терапии и введение по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки иммунитета приводит к повышению количества NK и/или CD8-T-клеток в опухоли. В конкретных аспектах изобретения, количество CD8-T-клеток повышается по меньшей мере в 3 раза, например, в 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз. В некоторых аспектах изобретения, проведение TUSC2-терапии и введение по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки иммунитета приводит к уровням CcL3, CcL4, CcL21a и/или CcL19 в сыворотке.
[0019] В других своих вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к набору, содержащему терапевтическое средство TUSC2 и по меньшей мере один ингибитор контрольной точки иммунитета. Так, например, в некоторых аспектах изобретения, описанный в настоящем документе набор содержит терапевтическое средство TUSC2, по меньшей мере один ингибитор контрольной точки иммунного ответа и реагент для определения ответа у индивидуума на терапевтическое средство TUSC2 и/или ингибитор контрольной точки иммунитета. Так, например, реагентом для определения ответа у индивидуума на терапевтическое средство TUSC2 может быть реагент для определения уровня апоптоза в злокачественных клетках индивидуума. В других аспектах изобретения, набор также содержит один или более противовоспалительных средств или ингибитор киназы. В других аспектах изобретения, набор может содержать один более дополнительных компонентов, включая, но не ограничиваясь ими, фармацевтически приемлемый агент для разведения, шприц, пакет для инфузии, оборудование для инфузии и/или ряд инструкций по применению указанного набора.
[0020] Предполагаются, что любые описанные в настоящем документе способы или композиции могут быть применены вместе с любыми другими описанными в настоящем документе способами или композициями. Аналогичным образом, аспекты вариантов настоящего изобретения, обсуждаемые при описании способа лечения индивидуума, в равной степени относятся и к способу предсказания ответа у индивидуума, и наоборот.
[0021] Употребление термина «включающий» в формуле изобретения и/или в описании изобретения, может означать включение «одного», а также «одного или нескольких», «по меньшей мере одного» и «одного или более одного» элементов.
[0022] Используемый в настоящем документе термин, «по существу, не содержащий», если он относится к конкретному компоненту, означает, что ни один из конкретных компонентов не был специально введен в композицию и/или он присутствует только как примесь или в следовых количествах. Поэтому, общее количество конкретного компонента, присутствующего в результате какого-либо случайного загрязнения композиции, должно быть ниже 0,01%. Наиболее предпочтительной является композиция, в которой не было обнаружено какого-либо количества указанного компонента с помощью стандартных аналитических методов.
[0023] Кроме того, использование признаков вместе «включающий» может означать один или более одного. Слова «другой» или «дополнительный», используемые в описании и в формуле изобретения, могут означать по меньшей мере «второй или следующий далее».
[0024] Используемый в описании и в формуле изобретения термин «приблизительно», означает, что значение данной величины включает дисперсию ошибок, присущую данному устройству, способу, применяемому для определения данной величины, или разброс, существующий между обследуемыми индивидуумами.
[0025] Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже подробного описания. Однако, следует отметить, что подробное описание и конкретные примеры с указанием некоторых вариантов осуществления изобретения, приводятся лишь в целях иллюстрации, а поэтому, в них могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки существа и объема изобретения, которые будут очевидны для специалистов в данной области из этого подробного описания.
Краткое описание чертежей
[0026] Нижеследующие чертежи являются частью настоящего описания и включены для более полной иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может быть лучше понято со ссылкой на один или более из этих чертежей в комбинации с подробным описанием представленных в настоящем документе конкретных вариантов настоящего изобретения.
Фиг. 1А-1Е:
P
Р
[0027]  Повышенная противоопухолевая активность была обнаружена при комбинированной терапии с использованием TUSC2 и анти-PD1 антитела на модели подкожного введения CMT167. (А) Последовательная стратегии лечения с указанием инокуляции опухоли, схемы лечения и доз, забора крови и селезенки для анализа иммунных клеток, и взятия опухоли для иммуногистохимического анализа, а также выделения РНК. (В) Уровень экспрессии PD-L1 на поверхности клеток CMT167-luc определяли с помощью проточной цитометрии. (С), (D) Кривые роста опухоли для четырех различных групп обработки (N=10 мышей/группу) строили исходя из данных объема опухоли и интенсивности биолюминесценции, генерируемой у небольшого животного с помощью визуализации на IVIS 200. Контрольную группу обрабатывали нановезикулами, нагруженными «пустым» вектором (без гена TUSC2). TUSC2+PD1-терапия приводила к самому высокому ингибированию роста опухоли, а за ней следовала TUSC2-терапия, PD1-терапия и контроль. (Е) Репрезентативные изображения мышей с опухолью для каждой группы обработки, полученные по биолюминесцентным сигналам на визуализирующем устройстве IVIS 200. Данные представляют собой репрезентативные данные для четырех независимых экспериментов. Программу CONTRAST в процедуре PROC MIXED в SAS использовали для сравнения интенсивности изображений между группами обработки. SAS, версия 9.4, и S-Plus, версия 8.04 были использованы для компьютерных вычислений во всех анализах. Статистические данные были представлены как уровень значимости р<0,05, если это не оговорено особо. *, <0,05, **  <0,01, *** р <0,001.
Фиг. 2A-2F:
TUSC2
In vivo
Р
Р
Р
Р
Р
Р
Р
Р
P
Р
Р
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[0028]  Введение комбинаций  и анти-PD1 антитела приводит к активации природных клеток-киллеров и цитотоксических Т-клеток и ингибирует регуляторные клетки. Обработка TUSC2+анти-PD1 антителом приводит к изменению популяции иммунных клеток в периферической крови и в селезенке. Контрольную группу обрабатывали нановезикулами, нагруженными пустым вектором (без гена TUSC2). (А) Влияние TUSC2 на NK, Т-клетки и В-клетки у мышей без опухоли. Собранные образцы n=3 мышей/группу были использованы для проточного цитометрического анализа.  поглощение нановезикул TUSC2 было определено исходя из уровня экспрессии экзогенного TUSC2. Через 24 часа после внутривенной инъекции нановезикул TUSC2, из селезенки были отсортированы четыре различных иммунных популяций (Т-клеток, В-клеток, NK-клеток и Lin-негативных клеток), а затем была проведена ОТ-ПЦР для определения уровня экспрессии TUSC2. (B) Влияние обработки TUSC2 и TUSC2+анти-PD1 антителом на природные клетки-киллеры (NK), T-клетки и B-клетки через 2 недели после имплантации опухоли. (C) TUSC2-обработка приводила к изменению статуса MDSC. Моноцитарные и гранулоцитарные MDSC определяли с использованием следующей стратегии стробирования: CD45>CD3>низкий MHCII>CD11b>Gr-1. Высокий уровень CD11bGr-1 соответствовал гранулоцитарным MDSC, а низкий уровень CD11bGr-1 соответствовал моноцитарным MDSC. Данные представлены как средний процент ± ср. кв.откл. n=5. *  <0,05; **  <0,01; ***  <0,001. (D) Влияние обработки на Treg в клетках периферической крови и селезенки. Популяция Т-лимфоцитов, позитивная по двум CD4CD25, рассматривались как Treg. Данные представлены как средний процент ± ср. кв.откл. n=5. **  <0,01; ***  <0,001. (Е) Экспрессия PD1, CTLA4 и Tim-3 на поверхности Т-лимфоцитов. Данные показаны как средний процент CD3PDL/CLTA4/Tim-3 ± ср. кв.откл. n=5; *  <0,05; **  <0,01; ***  <0,001. (F) Влияние обработки TUSC2 и анти-PD1 антителом показано как отношение клеток NK/MDSC, а также CD8-эффекторных Т-клеток/Treg среди лейкоцитов периферической крови. Данные представлены как среднее ± ср. кв.откл., n=5. Статистический анализ данных проточной цитоматрии был проведен с помощью общей модели линейной регрессии и компьютерной программы CONTRAST в процедуре PROC GENMOD в SAS. *  <0,05; **  <0,01; ***  <0,001
Фиг. 3A-3C:
Р
Р
Р
Р
[0029] Введение комбинации TUSC2 с анти-PD1 антителом приводило к повышению уровня инфильтрации NK и CD8-Т-клеток и препятствовало инфильтрации MDSC и Treg. (A) Подкожные опухоли были обработаны нановезикулами, нагруженными пустым вектором (без гена TUSC2) (контроль), нановезикулами TUSC2, анти-PD1 антителом и TUSC2+анти-PD1 антителом. Вырезанные и фиксированные в формалине опухоли подвергали иммунному окрашиванию анти-CD8 антителом, анти-NKp46 антителом на активированные NK-клетки, анти-Gr-1 антителом на MDSC и анти-Foxp3 антителом на Treg. Автоматизированная визуализирующая система Vectra была использована для получения изображений с высоким разрешением (20×) для визуализации 25% площади опухоли. Было получено изображение для N=5 срезов опухоли/группу. Приблизительно 100 изображений на группу обработки были проанализированы с помощью компьютерной программы InForm для H-баллов. Обобщенные модели линейной регрессии были использованы для статистического анализа H-баллов между группами обработки. Структура ковариационной симметрии соединения была использована для оценки изменчивости между мышами и для повторной оценки характера данных. Программа ESTIMATE в процедуре PROC MIXED в SAS была использована для сравнения H-баллов между каждой парой групп обработки. * <0,05; ** <0,01; *** <0,001. (В) РНК экстрагировали из свежевырезанных опухолей у групп обработки (n=3 опухоли/группу обработки) и определяли уровень экспрессии генов хемокинов с помощью технологии NanoString. Данные были нормализованы и был проведен анализ кратности изменений уровня экспрессии с помощью компьютерной программы для анализа nCounter. Кратность изменения сравнивали с контрольными образцами. На гистограмме показана средняя кратность изменения (n=3). (С) Показаны уровни хемокинов CCL4 и CCL5 в сыворотке крови, индуцированные путем обработки TUSC2. Мышей с подкожными опухолями обрабатывали TUSC2 в соответствии с протоколом, описанным в этом методе. Сыворотку собирали через 10 дней после обработки и проводили мультиплексный ELISA Luminex. Линейные регрессионные модели были использованы для сравнения хемокинов между группами обработки. Программа ESTIMATE в процедуре PROC MIXED в SAS была использована для сравнения хемокинов между каждой парой групп обработки. SAS, версия 9.4, и S-Plus, версия 8.04, были использованы для вычислений во всех анализах. Данные; среднее ± ср. кв. ош.; N=3; *** <0,001.
Фиг. 4A-4F:
Р
Р
Р
Р
Р
Р
P
Р
Р
Р
IL-15Ra
IL-18R1
Р
Р
IL-15Ra
IL-18R1
[0030]  Зависимость противоопухолевой активности TUSC2 на природных клетках-киллерах, которые генерируют Thl-опосредованный иммунный ответ. Цитокины IL-15 и IL-18 были ассоциированы с регуляцией природных клеток-киллеров. (А) Истощение NK-клеток приводит к элиминации эффективности лечения и противоопухолевого иммунного ответа. График интенсивности биолюминесценции опухоли иллюстрирует сигналы, поступающие от опухоли, обработанной TUSC2 и комбинацией, у мышей с истощенными и неистощенными NK. Антитело NK1.1 вводили через каждые 3 дня 5 раз для истощения NK-клеток. Контрольную группу обрабатывали нановезикулами, нагруженными пустым вектором (без гена TUSC2). *  <0,05; **  <0,01. (В) На противоопухолевую активность обработки TUSC2+анти-PD1 антителом влияло истощение CD8-Т-клеток, как показано на графике интенсивности опухоли (n=5 мышей/группу). (С) Через 10 дней после обработки, сывороточные уровни цитокинов IFN-γ и IL-4 у мышей с истощенными и неистощенными NK определяли с помощью анализа Luminex и строили гистограммы, где показано отношение IFN-γ (Thl) и IL-4 (Th2). Данные представлены как среднее ± ср. кв. ош., n=3. *  <0,05, **  <0,01, ***  <0,001, ****  <0,0001. (D) Изменение уровней цитокинов IL-18 и IL-15 после обработки мышей с истощенными и неистощенными NK. Анализ Luminex был проведен для измерения уровней цитокинов в сыворотке. Данные показаны как среднее пг/мл ± ср. кв. ош., n=3. *  <0,05, **  <0,01, ***  <0,001, ****  <0,0001. (Е) Кратность экспрессии  и  в отсортированных NK-клетках мышей, обработанных TUSC2 по сравнению с контролем. Данные представлены как среднее ± ср. кв. ош., n=3; * <0,05, **  <0,01 определяли с помощью множественного t-критерия. (F) Анализ NanoString опухоли, обработанной TUSC2 и TUSC2+PD1 для сравненеия кратности изменения уровней экспрессии мРНК и .
Фиг: 5A-5I:
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
P
Р
Р
[0031] Комбинированная обработка TUSC2 и анти-PD1 антителом приводила к значительному повышению выживаемости мышей с моделью KRAS-мутантных метастазов легких и к повышению рекрутинга природных клеток-киллеров в легкие с опухолью. (А) Клетки 344SQ-Luc использовали для этой экспериментальной модели метастазов, которая имела аллель KrasG12D и нокин аллеля Trp53R172HΔG. Уровень экспрессии PD-L1, определяли с помощью проточной цитометрии и сравнивали с уровнем для клеток CMT167-Luc. (В) Схематически показана последовательная обработка агентом, блокирующим сверочную точку (анти-PD1 антителом и анти-CTLA4 антителом) и TUSC2. (С) Выживаемость проиллюстрирована на кривых Каплана-Мейера после обработки. Клетки 344SQ вводили внутривенно, и мышей обрабатывали TUSC2 и агентом, блокирующим сверочную точку, отдельно или в комбинации (показано в группах). Контрольную группу обрабатывали нановезикулами, нагруженными пустым вектором (без гена TUSC2), и регистрировали выживаемость (n=10 мышей/группу). Одномерную модель Кокса использовали в статистическом анализе для сравнения общей выживаемости групп обработки. Самый высокий процент выживаемости наблюдался в группе TUSC2+PD1 (слева), а за ней следовали TUSC2-группа, PD1-группа и контроль. Аналогичным образом, самый высокий процент выживаемости наблюдался в TUSC2PD1CTL4-группе (справа), а за ней следовали TUSC2-группа, PD1CTL4-группа и контроль. (D) Биолюминесцентные изображения опухолей у мышей, полученные на IVIS 200, показали специфическую колонизацию опухолевых клеток в легких. Уровень интенсивности сигнала показан для групп обработки. Представлены репрезентативные данные для трех независимых экспериментов. (Е) Изображения вырезанных легких указывали на статус узелков опухоли через две недели после имплантации опухоли. (F), (G), (Н) и (I) Отдельные клетки получали из метастазов легких у различных групп в соответствии с протоколом, описанным в способах, и CD49bNK-клетки, CD4CD25Treg, Gr-1-MDSC и PD-L-1 и PD-L2(+)-лейкоциты и их инфильтрацию определяли с помощью проточной цитометрии. Данные были нормализованы на грамм ткани опухоли. NK-клетки были стробированы по CD45CD3CD19; MDSC были стробированы следующим образом: CD45CD3>низкий MHCII>CD11b>GR-1. PD+CT означают обработку анти-PD1 и анти-CTLA4 антителами. Данные показаны как клетки/грамм ткани ± ср. кв. ош., n=5. * <0,05, ** <0,01, *** <0,001. Компьютерная программа CONTRAST в процедуре PROC GENMOD в SAS была использована для сравнения данных проточной цитоматрии в статистическом анализе.
Фиг. 6A-6F:
[0032]  Комбинированная обработка TUSC2 и анти-PD1 антителом приводила к изменению иммунных профилей экспрессии генов в микроокружении опухоли. Анализ экспрессии генов для всей раковой иммунной панели 776 генов NanoString осуществляли для 12 образцов (n=3/группу обработки), взятых у четырех групп обработки (нановезикулами с пустым вектором, TUSC2, анти-PD1 антителом и комбинацией). Данные, полученные с помощью системы nCounter, нормировали, а затем использовали для количественной оценки профиля генов и статистического анализа. Позитивный контроль, гены «домашнего хозяйства» и негативный контроль использовали для коррекции на варианты препаратов образцов, фоновый шум и изменение содержания РНК. Линейную модель использовали для оценки общего эффекта обработки, а контрастную модель использовали для попарных представляющих интерес сравнений. Полученные величины р моделировали с использованием модели бета-однородной смеси (BUM) в целях определения отсечки вероятности ложного обнаружения (FDR) и идентификации значимо отличающихся экспрессированных генов. (А) На тепловой карте показаны общие значимые гены для групп обработки. 33 гена значимо отличались у групп обработки. (B) В результате попарного сравнения обработки TUSC2+анти-PD1 антителом и анти-PD1 антителом была идентифицирована другая серия из 13 генов. На графике Volcano проиллюстрировано разделение генов, которые были активированы и ингибированы после обработки. Статистически значимые гены показаны цветом. (С) Выбранные гены, которые, как известно, дают противоопухолевый иммунный ответ, имели высокую степень активации, которая в группе комбинированной обработки по меньшей мере в 2 раза превышала степень активации по сравнению с группой, обработанной только одним агентом. (D), (Е) и (F) иллюстрируют кратное изменение экспрессии CD8, INF-γ и факторов транскрипции (Tbx21, Gata3), соответственно, при обработке TUSC2, анти-PD1 антителом и их комбинациями по сравнению с контролем. Все показанные в настоящем документе данные экспрессии генов были получены с помощью технологии NanoString.
[0033] Фиг. 7: Была проиллюстрирована стратегия стробирования лейкоцитов периферической крови и спленоцитов для определения иммунных субпопуляций в целях проведения проточного цитометрического анализа на многократное окрашивание.
Фиг. 8A-8B:
[0034]  Влияние NK-истощающего антитела (NK1.1) на другие иммунные клетки. Внутрибрюшинное введение NK1.1 проводили 5 раз в соответствии с протоколом, описанным в данном способе. Эффективность истощения NK оценивали через 3 дня после последней инъекции. Спленоциты анализировали на Т-клетки, В-клетки и NK-клетки с помощью проточной цитометрии. (А) Стратегия стробирования, используемая для анализа. (B) N=3 образцов мышей объединяли вместе для окрашивания антителами против CD45, CD3, CD19, CD49b, и процент каждой популяции показан на гистограмме. На репрезентативном графике рассеяния показана эффективность истощения NK.
Фиг. 9
[0035] : Влияние истощения CD8-Т-клеток на другие иммунные клетки. Внутрибрюшинную инъекцию антитела, истощающего CD8-Т-клетки, проводили 5 раз в соответствии с протоколом, описанным в данном способе. Эффективность истощения NK оценивали через 3 дня после последней инъекции. Спленоциты анализировали на Т-клетки, В-клетки и NK-клетки с помощью проточной цитометрии. На репрезентативном графике рассеяния показана эффективность истощения CD8-Т-клеток, не влияющая на другие клетки.
Фиг. 10
[0036] : Анализ на экспрессии генов NanoString в микроокружении опухоли. Попарное сравнение между обработкой PD1 и комбинированной обработкой TUSC2+PD1 выявило 13 значимо измененных генов. Представлены P-величина и кратные изменения для всех 13 генов. Линейную модель использовали для оценки общего эффекта обработки, а контрастную модель использовали для попарных представляющих интерес сравнений. Полученные величины р моделировали с использованием модели бета-однородной смеси (BUM) в целях определения отсечки вероятности ложного обнаружения (FDR) и идентификации значимо отличающихся экспрессированных генов.
Описание иллюстративных вариантов осуществления изобретения
[0037] Развитие рака включает нарушение регуляции ряда клеточных путей, которые контролируют нормальный рост клеток. Здоровые клетки экспрессируют ряд генов-супрессоров опухолей, которые действуют как молекулярные «сторожа» и предотвращают неконтролируемое деление клеток. Таким образом, важной стадией в развитии раковых клеток является нарушение путей передпчи сигналов-супрессоров опухолей. В связи с этим, одним из перспективных направлений терапии злокачественных новообразований является экспрессия генов-супрессоров опухолей в раковых клетках для восстановления нормального контроля за ростом клеток. Однако, до настоящего времени не было известно, какие типы генов могут повышать эффективность терапии, направленной на подавление опухоли, такой как TUSC2-терапия.
[0038] Исследования, проведенные авторами настоящей патентной заявки, впервые продемонстрировали, что TUSC2-терапия является особенно эффективной, если она проводится в комбинации с введением ингибитора иммунного сверочной точки. Ингибиторы контрольной точки иммунитета, такие как терапевтические анти-PD1 антитела, действуют посредством усиления собственных иммунных клеток индивидуума для ингибирования роста опухоли. И наоборот, терапевтическое ингибирование опухолей посредством агентов-супрессоров опухоли, такое как TUSC2-терапия, предназначено для обратного развития трансформированного фенотипа раковых клеток. Поскольку более поздние терапии могли бы, так или иначе, делать опухолевые клетки «менее трансформироваными» и, возможно, менее иммуногенными, то еще раньше можно было интуитивно попытаться использовать TUSC2-терапию с ингибиторами контрольной точки иммунитета. Тем не менее, представленные в настоящем документе исследования продемонстрировали, что противоопухолевая эффективность ингибитора контрольной точки иммунитета (например, анти-PD1 антитела и/или анти-CTLA4 антитела) действительно значительно усиливается при объединении этой терапии с TUSC2-терапией (см., например, Фиг. 1).
+
+
+
+
In vivo
Kras
[0039] В частности, в настоящих исследованиях, анти-PD1 антитело обнаруживано ограниченную эффективность в регуляции роста опухоли и в повышении выживаемости двух Кras-мутантов, G12V и G12D, то есть, сингенных мышей с моделями аденокарциномы легких с различными уровнями экспрессии PDL-1. Однако, при объединении терапии с восстановлением гена TUSC2, влияние на регрессию опухоли и выживаемость были значительно выше. TUSC2 изменяет как врожденные и адаптивные популяции иммунных клеток. Об этом свидетельствует значительное увеличение числа NK- и CD8-T-клеток в кровотоке и снижение числа миелоидных клеток-супрессоров (MDCS), регуляторных Т-клеток (Tregs), В-клеток, рецепторов PD1 сверочной точки Т-клеток и белка 4, ассоциированного с Т-лимфоцитами (CTLA-4) и белка-3, содержащего муциновый домен (TIM-3). Плотность опухоль-инфильтрирующих NK и CD8-T-клеток была индуцирована путем введения комбинаци TUSC2-анти-PD1 антитела.  истощение NK- и CD8-T-клеток приводит к полному и частичному снижению эффективности комбиннированной терапии, соответственно, что позволяет предположить, что хотя CD8-T-клетки могут вносить свой вклад в повышение чувствительности к анти-PD1 антителу под действием TUSC2, однако, для достижения такой синергии необходимы NK-клетки. Уровни цитокинов, а именно, интерферона-гамма (IFN-γ), интерлейкинов 15 и 18 (IL-15 и IL-18) значительно повышались после восстановления уровня TUSC2, что также способствовало повышению выживаемости благодаря блокаде двух сверочных точек, а именно, после введения анти-PD1+анти-CTLA-4 антител. Анализ профиля экспрессии генов указывал на изменение микроокружения опухоли после комбинированной терапии TUSC2-анти-PD1 антителом. Эти данные указывают на то, что такая новая комбинированная терапия может представлять собой потенциальную стратегию для лечения -мутантной аденокарциномы легких.
[0040] Таким образом, подробно описанные в настоящем документе способы впервые оказались эффективными способами лечения рака благодаря комбинированному использованию ингибиторов контрольной точки иммунитета и агентов-супрессоров опухоли (например, TUSC2-терапия).
I. Блокада контрольной точки иммунитета
Nature Rev Cancer
et al.
Nature
[0041] Термин «иммунная сверочная точка» означает компонент иммунной системы, которая посылает своим компонентам ингибирующие сигналы для регуляции иммунных реакций. Известные белки контрольной точки иммунитета включают CTLA-4, PD-1 и его лиганды PD-Ll и PD-L2, и кроме того, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR. Специалистам известно, что пути, включающие LAG3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3 и KIR, составляют пути иммунных сверочных точек, аналогичные CTLA-4- и PD-1-зависимым путям (см., например, Pardoll, 2012,  12:252-264; Mellman , 2011,  480:480- 489).
[0042] Термин «антагонист, связывающийся с фактором PD-1» означает молекулу, которая ингибирует взаимодействие партнера по связыванию с фактором PD-1 с любым одним или более его партнеров по связыванию, что приводит к элиминации дисфункции Т-клеток в результате передачи сигнала фактору передачи сигнала PD-1, и тем самым, к восстановлению или усилению T-клеточной функции (например, пролиферации, продуцирования цитокинов, уничтожения клеток-мишеней). Термин «фактор PD-1» означает любой компонент контрольной точки иммунитета PD-1 (например, PD-1, PD-L1 и PD-L2). Используемый в настоящем документе антагонист, связывающийся с фактором PD-1, включает PD-1-связывающий антагонист, PD-L1-связывающий антагонист и PD-L2-связывающий антагонист.
[0043] Термин «PD-1-связывающий антагонист» означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, отменяет или предотвращает передачу сигнала в результате взаимодействия PD-1 с одним или более его партнеров по связыванию, таких как PD-L1 и/или PD-L2. PD-1-связывающим антагонистом может быть молекула, которая ингибирует связывание PD-1 с одним или более его партнеров по связыванию. В конкретном аспекте изобретения, PD-1-связывающий антагонист ингибирует связывание PD-1 с PD-Ll и/или PD-L2. Так, например, PD-1-связывающими антагонистами являются анти-PD-1 антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, гибридные белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, отменяют или предотвращают передачу сигнала в результате взаимодействия PD-1 c PD-L1 и/или PD-L2. Репрезентативным PD-1-связывающим антагонистом является анти-PD-1-антитело. Так, например, PD-1-связывающим антагонистом является MDX-1106 (ниволумаб), МК-3475 (пембролизумаб), СТ-011 (пидилизумаб) или АМР-224.
[0044] Термин «PD-L1-связывающий антагонист» означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, отменяет или предотвращает передачу сигнала в результате взаимодействия PD-L1 с одним или более его партнерами по связыванию, такими как PD-1 или В7-1. Так, например, PD-L1-связывающим антагонистом является молекула, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В конкретном аспекте изобретения, PD-L1-связывающий антагонист ингибирует связывание PD-Ll с PD-1 и/или В7-1. PD-L1-связывающими антагонистами могут быть анти-PD-L1 антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, гибридные белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, отменяют или предотвращают передачу сигнала в результате взаимодействия PD-L1 с одним или более его партнерами по связыванию, такими как PD-1 или В7-1. Так, например, PD-L1-связывающий антагонист снижает уровень передачи негативного костимулирующего сигнала, опосредуемого или передаваемого белками клеточной поверхности, экспрессируемыми на Т-лимфоцитах в результате передачи сигнала посредством PD-L1, что делает дисфункциональные T-клетки менее дисфункциональными (например, способствует усилению эффекторных ответов на распознавание антигена). В одном из примеров, PD-L1-связывающим антагонистом является анти-PD-L1 антитело. Анти-PD-L1 антителом могут быть YW243.55.S70, MDX-1105, MPDL3280A или MEDI4736.
[0045] Термин «PD-L2-связывающий антагонист» означает молекулу, которая снижает, блокирует, ингибирует, отменяет или предотвращает передачу сигнала в результате взаимодействия PD-L2 с одним или более его партнерами по связыванию, такими как PD-1. PD-L2-связывающим антагонистом может быть молекула, которая ингибирует связывание PD-L2 с одним или более его партнерами по связыванию. Так, например, PD-L2-связывающий антагонист ингибирует связывание PD-L2 с PD-1, то есть, антагонистами PD-L2 являются анти-PD-L1 антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, гибридные белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, отменяют или предотвращают передачу сигнала в результате взаимодействия PD-L2 с одним или более его партнерами по связыванию, такими как PD-1.
[0046] Термин «ингибитор контрольной точки иммунитета» означает любое соединение, ингибирующее функцию белка контрольной точки иммунитета. Ингибирование включает снижение функции и полную блокаду. В частности, белком контрольной точки иммунитета является человеческий белок контрольной точки иммунитета. Таким образом, ингибитором белка контрольной точки иммунитета является, в частности, ингибитор человеческого белка контрольной точки иммунитета.
[0047] Таким образом, настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности блокады контрольной точки иммунитета путем введения агента-супрессора опухоли, такого как TUSC2. Как обсуждалось выше, иммунные сверочные точки либо активируют сигнал (например, сигнал, передаваемый костимулирующими молекулами), либо ингибируют сигнал. Ингибирующими молекулами иммунных сверочных точек, которые могут быть мишенью для блокады контрольной точки иммунитета, являются аденозиновый рецептор А2А (A2AR), В7-Н3 (также известный как CD276), агент-аттенюатор В- и Т-лимфоцитов (BTLA), белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4, также известный как CD152), индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO), иммуноглобулин клеток-киллеров (KIR), ген-активатор лимфоцитов-3 (LAG-3), агент запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1), Т-клеточный домен иммуноглобулина и домен муцина 3 (TIM-3) и V-домен Ig-супрессора активации Т-клеток (VISTA). В частности, ингибиторы контрольной точки иммунитета нацелены на фактор PD-1 и/или CTLA-4.
Nat Rev Cancer,
[0048] Ингибиторами контрольной точки иммунитета могут быть лекарственные средства, такие как небольшие молекулы, рекомбинантные формы лиганда или рецепторов, или антитела, такие как человеческие антитела (см., например, Международную патентную публикацию WO2015016718; Pardoll, 12(4): 252-64, 2012; которые вводится в настоящее описание япосредством ссылки). Могут быть использованы известные ингибиторы белков иммунных сверочных точек или их аналогов, в частности, могут быть использованы химерные, гуманизованные или человеческие формы антител. Как известно специалистам, некоторые антитела, упомянутые в настоящем изобретении, могут иметь альтернативные и/или эквивалентные названия. Такие альтернативные и/или эквивалентные названия являются синонимами в контексте настоящего изобретения. Так, например, известно, что ламбролизумаб также имеет альтернативные и эквивалентные названия, МК-3475 и пембролизумаб.
et al.,
[0049] Предполагается, что могут быть использованы любые ингибиторы контрольной точки иммунитета, которые известны специалистам в данной области, и которые стимулируют иммунные ответы. Такими ингибиторами являются ингибиторы, которые прямо или опосредованно стимулируют или усиливают действие антигенспецифических Т-лимфоцитов. Такими ингибиторами иммунных сверочных точек являются, но не ограничиваются ими, агенты, нацеленные на белки иммунных сверочных точек и пути с участием PD-L2, LAG-3, BTLA, B7H4 и TIM3. Так, например, ингибиторами LAG-3, известными специалистам, являются растворимый LAG3 (IMP321 или LAG-3-Ig, описанный в заявке WO2009044273, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки), а также мышиные или гуманизированные антитела, блокирующие человеческий LAG-3 (например, IMP701, раскрытый в заявке WO2008132601, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки), или полностью человеческие антитела, блокирующие человеческий LAG-3 (например, описанный в ЕР2320940, который включена в настоящее описание в качестве ссылки). Другим примером применения блокирующих агентов, направленных против BTLA являются, но не ограничиваются ими, применение антител, блокирующих взаимодействие человеческого BTLA с его лигандом (таким как 4C7, раскрытый в заявке WO2011014438, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Другим примером применения агентов, нейтрализующих B7H4, являются, но не ограничиваются ими, антитела против человеческого B7H4 (описанные в заявках WO 2013025779 и в WO2013067492, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки) или растворимые рекомбинантные формы B7H4 (такие как формы, описанные в патенте US20120177645, который включена в настоящее описание в качестве ссылки). Еще одним примером являются агенты, нейтрализующие B7-H3, включая, но не ограничиваясь ими, антитела, нейтрализующие человеческий B7-H3 (например, MGA271, раскрытый как BRCA84D и его производные в патенте США 20120294796, который включена в настоящее описание в качестве ссылки). Другим примером являются агенты, нацеленные на TIM3, включая, но не ограничиваясь ими, антитела, нацеленные на человеческий TIM3 (например, раскрытые в заявке WO 2013006490 A2, или блокирующее антитело против человеческого TIM3, F38-2E2, описанное в публикации Jones J Exp Med. 2008; 205(12):2763-79, и каждая из них включена в настоящее описание в качестве ссылки).
A. Антагонисты фактора PD-
1
et al.
Intern. Immun
[0050] Дисфункция или анергия T-клеток происходит одновременно с индуцированием и устойчивой экспрессией рецептора, ингибирующего полипептид запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1). Таким образом, настоящее изобретение относится к терапевтическому нацеливанию на PD-1 и другие молекулы, которые передают сигнал посредством взаимодействий с PD-1, таким как лиганд запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-Ll) и лиганд запрограммированной клеточной гибели 2 (PD-L2). PD-LL свехэкспрессируется во многих раковых опухолях и часто ассоциируется с плохим прогнозом (Okazaki T , . 2007 19(7):813). Таким образом, описан улучшенные способы лечения рака путем ингибирования взаимодействия PD-Ll/PD-1 в комбинации с введением агента-супрессора опухоли, такого как терапевтический TUSC2.
[0051] Так, например, антагонистами, связывающимися с фактором PD-1, являются PD-1-связывающий антагонист, PDLl-связывающий антагонист и PDL2-связывающий антагонист. «PD-1» имеет альтернативные названия, а именно, CD279 и SLEB2. «PDLl» имеет альтернативные названия, а именно, B7-H1, B7-4, CD274 и B7-H. «PDL2» имеет альтернативные названия, а именно, В7-DC, ВМТ и CD273. В некоторых вариантах осуществления изобретения, PD-1, PDLl и PDL2 являются человеческими PD-1, PDLl и PDL2.
[0052] В некоторых вариантах осуществления изобретения, PD-1-связывающим антагонистом является молекула, которая ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по связыванию с лигандом. В конкретном аспекте изобретения, партнерами по связыванию с лигандом PD-1 являются PDLl и/или PDL2. В другом варианте осуществления изобретения, PDLl-связывающим антагонистом является молекула, которая ингибирует связывание PDLl с его партнерами по связыванию. В конкретном аспекте изобретения, партнерами по связыванию с PDLl являются PD-1 и/или B7-1. В другом варианте осуществления изобретения, PDL2-связывающим антагонистом является молекула, которая ингибирует связывание PDL2 с его партнерами по связыванию. В конкретном аспекте изобретения, партнером по связыванию с PDL2 является PD-1. Антагонистом могут быть антитело, его антиген-связывающий фрагмент, иммуноадгезин, гибридный белок или олигопептид. Репрезентативные антитела описаны в патентах США №№ US8735553, US8354509, US8008449, каждый из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки. Другие антагонисты фактора PD-1, используемые в описанных в настоящем документе способах, известны специалистам и описаны в заявках на патент США No. US20140294898, US2014022021, и US20110008369, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

[0053] В некоторых вариантах осуществления изобретения, PD-1-связывающим антагонистом является анти-PD-1 антитело (например, человеческое антитело, гуманизованное антитело или химерное антитело). В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-PD-1 антитело выбрано из группы, состоящей из ниволумаба, пембролизумаба и СТ-011. В некоторых вариантах осуществления изобретения, PD-1-связывающим антагонистом является иммуноадгезин (например, иммуноадгезин, содержащий внеклеточную или PD-1-связывающую часть PDLl или PDL2, присоединенную к константной области (например, к Fc-области последовательности иммуноглобулина). В некоторых вариантах осуществления изобретения, PD-1-связывающий антагонист представляет собой AMP-224. Ниволумаб, также известный как MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 и OPDIVO, представляет собой анти-PD-1 антитело, описанное в WO2006/121168. Пембролизумаб, также известный как MK-3475, Merck 3475, ламбролизумаб, KEYTRUDA и SCH-900475, представляет собой анти-PD-1 антитело, описанное в WO2009/114335. CT-011, также известный как hBAT или hBAT-1, представляет собой анти-PD-1 антитело, описанное в WO2009/101611. AMP-224, также известный как B7-DCIg, представляет собой растворимый рецептор гибридного белка PDL2-Fc, описанный в WO2010/027827 и WO2011/066342. Дополнительными PD-1-связывающими антагонистами являются пидилизумаб, также известный как CT-011, MEDI0680, также известный как AMP-514, и REGN2810.
[0054] В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антагонист PD-L1, такой как дурвалумаб, также известный как MEDI4736, атезолизумаб, также известный как MPDL3280A, или авелумаб, также известный как MSB00010118C. В некоторых аспектах изобретения, ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антагонист PD-L2, такой как rHIgM12B7. В некоторых аспектах изобретения, ингибитор контрольной точки иммунитета представляет собой антагонист LAG-3, такой как, но не ограничивающийся ими, IMP321 и BMS-986016. Ингибитор контрольной точки иммунитета может представлять собой антагонист аденозинового рецептора A2a (A2aR), такой как PBF-509.
[0055] В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанное в настоящем документе антитело (такое как анти-PD-1 антитело, анти-PDLl антитело или анти-PDL2 антитело) дополнительно содержит человеческую или мышиную константную область. В еще одном аспекте изобретения, человеческая константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 и IgG4. В другом конкретном аспекте изобретения, человеческой константной областью является IgG1. В еще одном аспекте изобретения, мышиная константная область выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3. В еще одном конкретном аспекте изобретения, данное антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В еще одном конкретном аспекте изобретения, минимальная эффекторная функция является результатом продуцирования антитела в прокариотических клетках. В еще одном конкретном аспекте изобретения, минимальная эффекторная функция является результатом «Fc-мутации в отсутствии эффекторной функции» или агликозилирования.
[0056] В соответствии с этим, используемое в настоящем документе антитело может быть негликозилированным. Гликозилирование антител обычно является либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное гликозилирование означает присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности «аспарагин-X-серин» и «аспарагин-Х-треонин», где Х означает любую аминокислоту, кроме пролина, представляют собой последовательности, распознающие ферментативное присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного из сахаров, а именно, N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к оксиаминокислоте, а чаще к серину или треонину, хотя могут быть также использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Удаление сайтов гликозилирования из антитела обычно осуществляют путем модификации аминокислотной последовательности, так, чтобы удалялась одна из вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Модификация может быть сделана путем замены аспарагинового, серинового или треонинового остатка в сайте гликозилирования на другой аминокислотный остаток (например, замены на глицин, аланин или консервативной замены).
[0057] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть получены описанными в настоящем документе способами, известными специалистам в данной области, например, способом, включающим культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из описанных ранее анти-PDLl антител, анти-PD-1 антител или анти-PDL2 антител или их антигенсвязывающих фрагментов в форме, подходящей для экспрессии в условиях, стимулирующих продуцирование такого антитела или его фрагмента, и выделение антитела или фрагмента.
B. CTLA-4
[0058] Другой иммунной сверочной точкой, которая может служить мишенью в описанных в настоящем документе способах, является белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4), также известный как СD152. Полная последовательность кДНК человеческого CTLA-4 имеется в Genbank под регистрационным номером L15006. CTLA4 находится на поверхности Т-клеток и действует как «выключатель» при связывании с CD80 или CD86 на поверхности антигенпрезентирующих клеток. CTLA4 является членом суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется на поверхности хелперных Т-клеток и передает этим Т-клеткам ингибирующий сигнал. CTLA4 аналогичен Т-клеточному костимулирующему белку CD28, и обе эти молекулы связываются с CD80 и CD86, также называемыми В7-1 и В7-2, соответственно, на антигенпрезентирующих клетках. CTLA4 передает Т-клеткам ингибирующий сигнал, а CD28 передает стимулирующий сигнал. Внутриклеточный CTLA4 также находится в регуляторных Т-клетках и может играть важную роль в их функционировании. Активация Т-клеток посредством T-клеточного рецептора и CD28 приводят к повышению уровня экспрессии рецептора CTLA-4, ингибирующего молекулы В7.
[0059] В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибитором контрольной точки иммунитета является анти-CTLA-4-антитело (например, человеческое антитело, гуманизованное антитело или химерное антитело), его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, гибридный белок или олигопептид.
et al.
[0060] Антитела против человеческого CTLA-4 (или VH- и/или VL-домены, происходящие от них), подходящие для их использования в способах согласно изобретению, могут быть получены методами, хорошо известными специалистам. Альтернативно, могут быть использованы анти-CTLA-4 антитела, описанные в литературе. Так, например, анти-CTLA-4 антитела, раскрытые в патенте США 8119129, в заявках WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504 (CP675206, также известный как тремелимумаб; бывшее название тицилимумаб), в патенте США No. 6207156; Hurwitz , 1998; могут быть использованы в описанных в настоящем документе способах. Содержание каждой из вышеупомянутых публикаций включена в настоящее описание в качестве ссылки. Могут быть также использованы антитела, которые конкурируют с любым из этих известных антител за связывание с CTLA-4. Так, например, гуманизированное анти-CTLA-4 антитело описано в Международной патентной заявке No. WO2001014424, WO2000037504, и в патенте США No. US8017114, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
[0061] Репрезентативным анти-CTLA-4 антителом является ипилимумаб (также известный как 10D1, MDX-010, MDX-101, и Yervoy) или его антигенсвязывающие фрагменты и варианты (см., например, WO 01/14424). В других вариантах осуществления антитело содержит CDR или VR тяжелой и легкой цепей ипилимумаба. В соответствии с этим, в одном варианте осуществления изобретения, антитело содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области ипилимумаба, и домены CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области ипилимумаба. В другом варианте осуществления изобретения, антитело конкурирует за связывание и/или связывается с тем же эпитопом на CTLA-4, с которым связываются вышеупомянутые антитела. В другом варианте осуществления изобретения, антитело имеет аминокислотную последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична аминокислотной последовательности вышеупомянутых антител (например, по меньшей мере приблизительно на 90%, 95%, или 99% идентична вариабельной области ипилимумаба).
[0062] Другими молекулами для модулирования CTLA-4 являются растворимые лиганды и рецепторы CTLA-4, описанные в патентах США №№ US5844905, US5885796 и в Международных патентных заявках NN WO1995001994 и WO1998042752; которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки, и иммуноадгезины, описанные в патенте США US8329867, который включена в настоящее описание в качестве ссылки.
С. Рецептор, подобный иммуноглобулину клеток-киллеров (KIR)
[0063] Другим ингибитором контрольной точки иммунитета для его использования в настоящем изобретении является анти-KIR антитело. Антитела против человеческого KIR (или происходящие от них VH/VL-домены), подходящие для использования в способах согласно изобретению, могут быть получены методами, хорошо известными специалистам.
[0064] Альтернативно, могут быть использованы известные анти-KIR антитела. Анти-KIR антитело может перекрестно реагировать со множеством ингибирующих рецепторов KIR и усиливать цитотоксическое действие NK-клеток, несущих один или более из этих рецепторов. Так, например, анти-KIR антитело может связываться с каждым из KIR2D2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 и усиливать активность NK-клеток за счет снижения, нейтрализации и/или устранения ингибирования цитотоксичности NK-клеток, опосредованной любыми или всеми этими KIR. В некоторых аспектах изобретения, анти-KIR антитело не связывается с KIR2DS4 и/или KIR2DS3. Так, например, могут быть использованы моноклональные антитела 1-7F9 (также известные как IPH2101), 14F1, 1-6F1 и 1-6F5, описанные в заявке WO 2006/003179, содержание которой включена в настоящее описание в качестве ссылки. Могут быть также использованы антитела, которые конкурируют с любыми из этих известных антител за связывание с KIR. Дополнительными известными анти-KIR антителами, которые могут быть использованы, являются, например, антитела, описанные в заявках WO 2005/003168, WO 2005/009465, WO 2006/072625, WO 2006/072626, WO 2007/042573, WO 2008/084106, WO 2010/065939, WO 2012/071411 и WO 2012/160448, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
[0065] Репрезентативным анти-KIR антителом является лирилумаб (также обозначаемый как BMS-986015 или IPH2102). В других вариантах изобретения, анти-KIR антитело содержит гипервариабельные области (CDR) или вариабельные области (VR) тяжелой и легкой цепей лирилумаба. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения, антитело содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области (VH) тяжелой цепи лирилумаба и домены CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области (VL) легкой цепи лирилумаба. В другом варианте осуществления изобретения, антитело имеет аминокислотную последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична аминокислотной последовательности лирилумаба.
II. Противоопухолевая терапия
[0066] В некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к композициям и способам для доставки нуклеиновой кислоты или полипептида в клетку. В частности, настоящее изобретение относится к комплексам «наночастица-нуклеиновая кислота» или «наночастица-полипептид» и к способам введения таких комплексов индивидууму. Комплексы содержат полипептид и/или нуклеиновую кислоту TUSC2 в комбинации с наночастицей. Используемый в настоящем документе термин «ассоциация» означает физическую ассоциацию, химическую ассоциацию или то и другое. Так, например, ассоциация может включать ковалентное связывание, гидрофобное взаимодействие, инкапсуляцию, адсорбцию на поверхности или т.п.
[0067] Полипептиды и нуклеиновые кислоты обычно с трудом пересекают клеточные мембраны. Молекулы обоих типов включают заряженные остатки, которые препятствуют связыванию с мембраной и мембранному транспорту в клетки. Осуществление настоящего изобретения позволяет решить эту проблему благодаря получению комплексов наночастиц, которые облегчают поглощение клетками.
[0068] В соответствии с вариантами осуществления изобретения, полипептид и/или нуклеиновая кислота могут связываться с наночастицей с образованием комплекса наночастиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицами являются липосомы или другие липидные наночастицы, такие как липидная везикула (например, везикула, содержащая DOTAP: холестерин). Липосомы, используемые в терапии злокачественных новообразований, способствуют повышенному распределению наночастиц в новой сосудистой сети раковой опухоли, что будет приводить к увеличению концентрации липосом в опухолевых участках.
et al.,
[0069] В других вариантах осуществления изобретения, наночастицами являются не-липидные наночастицы, такие как суперпарамагнитные наночастицы на основе оксида железа. Суперпарамагнитные наночастицы диаметром приблизительно от 10 до 100 нм являются довольно мелкими, что позволяет избежать их секвестрации селезенкой, но достаточно большыми, что позволяет избежать их выведения печенью. Частицы такого размера могут проникать через очень маленькие капилляры и могут эффективно распределяться в тканях организма. Комплексы суперпарамагнитных наночастиц могут быть использованы в качестве контрастных агентов для МРТ в целях идентификации и мониторинга клеток, которые поглощают терапевтические комплексы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицами являются полупроводниковые нанокристаллы или полупроводниковые квантовые точки, которые могут быть использованы для получения оптических изображений. В других вариантах осуществления изобретения, наночастицами могут быть нанооболочки, которые содержат слой золота, нанесенный на сердцевину из диоксида кремния. Одним из преимуществ нанооболочек является то, что полипептид или нуклеиновая кислота могут быть конъюгированы со слоем золота стандартными химическими методами. В других вариантах осуществления изобретения, наночастицами могут быть фуллерен или нанотрубки (Gupta 2005).
[0070] В соответствии с вариантами настоящего изобретения, комплексы наночастиц могут быть нацелены на конкретные ткани и клетки. Это может быть достигнуто путем конъюгирования молекулы, нацеленной на клетку, с наночастицей. Нацеливающими молекулами могут быть, но не ограничиваются ими, белок, пептид, липид, стероид, сахар, углевод или синтетическое соединение. Молекулы, нацеленные на клетку, такие как лиганды, распознают когнатные рецепторы на поверхности клеток и связываются с ними. Аналогичным образом, антитело может действовать как молекулы, нацеленные на клетку, посредством распознавания когнатных антигенов на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные в настоящем документе комплексы наночастиц для нацеливания могут повышать специфичность терапии заболевания и увеличивать количество терапевтического средства, доставляемого в клетку-мишень.
А. Наночастицы
in vitro
in vivo
et al.
et al.
et al.
et al.
et al.
[0071] Используемый в настоящем документе термин «наночастица» означает любой материал, имеющий размеры в пределах 1-1000 нм. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы имеют размеры в пределах 50-500 нм. Наночастицами, используемыми в вариантах осуществления настоящего изобретения, являются наноматериалы, такие как наночастица на основе липида, суперпарамагнитная наночастица, нанооболочка, полупроводниковый нанокристалл, квантовая точка, наночастица на основе полимера, наночастица на основе кремния, наночастица на основе диоксида кремния, наночастица на основе металла, фуллерен и нанотрубка (Ferrari, 2005). Конъюгирование полипептида или нуклеиновых кислот с наночастицами делает структуры более подходящими для нацеленной доставки, контролируемого высвобождения, повышения уровня поглощения клетками и внутриклеточного транспорта, а также молекулярной визуализации терапевтических пептидов  и  (West, 2004; Stayton , 2000; Ballou , 2004; Frangioni, 2003; Dubertret , 2002; Michalet , 2005; Dwarakanath , 2004.
1. Наночастицы на основе липидов
[0072] Наночастицы на основе липидов включают липосомы, липидные препараты и везикулы на основе липидов (например, везикулы, содержащие DOTAP:холестерин). Наночастицы на основе липидов могут быть положительно заряженными, отрицательно заряженными или нейтральными. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастица на основе липида является незаряженной (например, липосома DOPC).
[0073] «Липосома» является общим термином, включающим различные однослойные и многослойные липидные носители, образованные посредством генерирования замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы могут быть охарактеризованы как везикулярные структуры с бислойной мембраной, которые обычно содержат фосфолипид и внутреннюю среду, обычно содержащую водную композицию. Описанные в настоящем документе липосомы включают однослойные липосомы, многослойные липосомы и мультивезикулярные липосомы. Описанные в настоящем документе липосомы могут быть положительно заряженными, отрицательно заряженными или нейтральными. В некоторых вариантах осуществления изобретения, липосомы являются незаряженными.
[0074] Многослойная липосома имеет несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются спонтанно, в случае, когда липиды, содержащие фосфолипиды, суспендируют в избытке водного раствора. Липидные компоненты подвергаются самоперегруппировке до образования замкнутых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh and Bachhawat, 1991). Липофильные молекулы или молекулы с липофильными областями также могут растворяться в липидном бислое или ассоциироваться с ним.
[0075] В конкретных аспектах изобретения, полипептид или нуклеиновые кислоты могут, например, инкапсулироваться во внутреннем водном пространстве липосомы, распределяться в липидном бислое липосомы, прикрепляться к липосоме посредством связывающей молекулы, которая связывается как с липосомой, так и с полипептидом/нуклеиновой кислотой, захватываться в липосоме, образовывать комплекс с липосомой или т.п.
[0076] Липосома, используемая в соответствии с вариантами настоящего изобретения, может быть получена различными методами, известными специалистам в данной области. Так, например, фосфолипид (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), такой, как, например, нейтральный фосфолипид диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), растворяют в трет-бутаноле. Затем липид(ы) смешивают с полипептидом, нуклеиновой кислотой и/или с другим(и) компонентом(ами). К липидной смеси добавляют Твин 20 так, чтобы его содержание составляло приблизительно 5% по массе композиции. К этой смеси добавляют избыток трет-бутанола так, чтобы его объем составлял по меньшей мере 95%. После этого, смесь интенсивно встряхивают, замораживают на бане из смеси сухого льда/ацетона и лиофилизуют в течение ночи. Лиофилизированный препарат хранят при -20°C, и этот препарат может быть использован до трех месяцев. При необходимости, лиофилизированные липосомы разводят в 0,9% физиологическом растворе.
[0077] Альтернативно, липосома может быть получена путем смешивания липидов в растворителе в контейнере, например, в стеклянной грушевидной колбе. Контейнер должен иметь объем, в десять раз превышающий объем ожидаемой суспензии липосом. С помощью роторного испарителя, растворитель удаляют при температуре приблизительно 40°С при отрицательном давлении. Растворитель обычно удаляют в течение периода времени приблизительно от 5 минут до 2 часов, в зависимости от нужного объема липосом. Композиция может быть дополнительно осушена в эксикаторе под вакуумом. Осушенные липиды, как правило, выбрасывают приблизительно через 1 неделю, поскольку со временем, они имеют тенденцию к разложению.
[0078] Осушенные липиды могут быть гидратированы путем добавления приблизительно 25-50 мМ фосфолипида в стерильную, апирогенную воду со встряхиванием до тех пор, пока вся липидная пленка не будет ресуспендирована. Водные липосомы могут быть затем разделены на аликвоты, каждую из которых помещают в сосуд, лиофилизуют и герметично закрывают под вакуумом.
[0079] Осушенные липиды или лиофилизованные липосомы, приготовленные, как описано выше, могут быть дегидратированы и разведены в растворе белка или пептида до соответствующей концентрации с помощью подходящего растворителя, например, DPBS. Затем, смесь интенсивно встряхивают в вихревом смесителе. Неинкапсулированные дополнительные материалы, такие как агенты, включая, но не ограничиваясь ими, гормоны, лекарственные средства, конструкции нуклеиновых кислот и т.п. удаляют путем центрифугирования при 29000× g, и липосомные гранулы промывают. Промытые липосомы ресуспендируют при соответствующей общей концентрации фосфолипидов, например, приблизительно 50-200 мМ. Количество дополнительного материала или активного инкапсулированного агента может быть определено стандартными методами. После определения количества дополнительного материала или активного инкапсулированного агента в липосомном препарате, липосомы могут быть разведены до соответствующих концентраций и могут храниться при 4°C до использования. Фармацевтическая композиция, содержащая липосомы, обычно включает стерильный, фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, такой как вода или физиологический раствор.
et al.,
et al.,
[0080] В других альтернативных способах, липосомы могут быть получены в соответствии с другими известными лабораторными процедурами (см., например, публикации Bangham1965; Gregoriadis, 1979; Deamer and Uster, 1983; Szoka and Papahadjopoulos, 1978, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в соответствующую часть). Дополнительными липосомами, которые могут быть использованы в вариантах осуществления настоящего изобретения, являются катионные липосомы, например, описанные в заявке WO02/100435A1, в патенте США 5962016, в заявках на патент США 2004/0208921, WO03/015757A1, WO04029213A2, в патенте США 5030453 и в патенте США 6680068, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте без оговорки. Способ получения липосом также описан в WO04/002453A1. Нейтральные липиды могут быть включены в катионные липосомы (например, Farhood  1995). Различные нейтральные липосомы, которые могут быть использованы в некоторых вариантах осуществления изобретения, раскрыты в патенте США 5855911, который включена в настоящее описание в качестве ссылки. Эти методы имеют отличия, заключающиеся в соответствующих способностях липосом захватывать водный материал и в соответствующих отношениях «водное пространство-липид».
400
[0081] Размер липосом варьируется в зависимости от способа синтеза. Липосомы в вариантах осуществления настоящего изобретения могут иметь различные размеры. В некоторых вариантах осуществления изобретения, липосомы являются небольшими, например, их внешний диаметр составляет менее, чем приблизительно 100 нм, приблизительно 90 нм, приблизительно 80 нм, приблизительно 70 нм, приблизительно 60 нм или менее, чем приблизительно 50 нм. Так, например, в основном, до введения нуклеиновой кислоты, липосома «DOTAP:холестерин» для ее использования в соответствии с вариантами осуществления изобретения имеет размер приблизительно от 50 до 500 нм. Такие липосомные препараты могут быть также определены по заряду частиц (дзета-потенциалу) и/или по оптической плотности (OD). Так, например, липосомный препарат «DOTAP:холестерин», перед введением нуклеиновой кислоты, обычно имеет OD менее, чем 0,45. Аналогичным образом, общий заряд таких частиц в растворе может быть определен по дзета-потенциалу приблизительно 50-80 мВ.
et al.,
et al.,
et al.
et al.,
et al.,
[0082] Получение таких липосом может быть осуществлено в соответствии с любым описанным в настоящем документе протоколом, либо такое получение может быть осуществлено известным методом. Дополнительные неограничивающие примеры получения липосом описаны в патентах США 4728578, 4728575, 4737323, 4533254, 4162282, 4310505 и 4921706; в Международных заявках PCT/US85/01161 и PCT/US89/05040; в заявке на патент Великобритании 2193095 A; Mayer 1986; Hope 1985; Mayhew 1987; Mayhew 1984; Cheng 1987; и в публикации Liposome Technology, 1984, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
[0083] В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицей на основе липидов является нейтральная липосома (например, липосома DOPC). Используемые в настоящем документе «нейтральные липосомы» или «незаряженные липосомы» определяют как липосомы, имеющие один или более липидных компонентов, которые дают, по существу, нейтральный суммарный заряд (по существу, они являются незаряженными). Термин «по существу нейтральный» или «по существу незаряженный» означает, что немногие липидные компоненты, если они имеются, в пределах данной популяции (например, популяции липосом) имеют заряд, который не гасится противоположным зарядом другого компонента (то есть, менее 10% компонентов, более предпочтительно менее чем 5%, а наиболее предпочтительно менее 1% имеют непогашенный заряд). В некоторых вариантах осуществления изобретения, нейтральные липосомы могут включать, в основном, липиды и/или фосфолипиды, которые сами по себе являются нейтральными в физиологических условиях (то есть, приблизительно при рН 7).
[0084] Липосомы и/или наночастицы на основе липидов согласно вариантам осуществления изобретения могут содержать фосфолипид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, для получения липосом может быть использован фосфолипид одного вида (например, для получения нейтральных липосом может быть использован нейтральный фосфолипид, такой как DOPC). В других вариантах осуществления изобретения, для получения липосом может быть использован фосфолипид более, чем одного вида.
[0085] Фосфолипидами являются, например, фосфатидилхолины, фосфатидилглицерины и фосфатидилэтаноламины, но, поскольку фосфатидилэтаноламины и фосфатидилхолины являются незаряженными в физиологических условиях (например, приблизительно при рН 7), то эти соединения могут быть особенно подходящими для получения нейтральных липосом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фосфолипид DOPC используется для получения незаряженных липосом. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть использован липид, который не является фосфолипидом (например, холестерин).
[0086] Фосфолипидами являются глицерофосфолипиды и некоторые сфинголипиды. Фосфолипидами являются, но не ограничиваются ими, диолеоилфосфатидилхолин («DOPC»), яичный фосфатидилхолин («EPC»), дилаурилоилфосфатидилхолин («DLPC»), димиристоилфосфатидилхолин («DMPC»), дипальмитоилфосфатидилхолин («DPPC»), дистеароилфосфатидилхолинм («DSPC»), 1-миристоил-2-пальмитоилфосфатидилхолин («MPPC»), 1-пальмитоил-2-миристоилфосфатидилхолин («PMPC»), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолин («PSPC»), 1-стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолин («SPPС»), дилаурилоилфосфатидилглицерин («DLPG»), димиристоилфосфатидилглицерин («DMPG»), дипальмитоилфосфатидилглицерин («DPPG»), дистеароилфосфатидилглицерин («DSPG»), дистеароилсфингомиелин («DSSP»), дистеароилфосфатидилэтаноламин («DSPE»), диолеоилфосфатидилглицерин («DOPG»), димиристоилфосфатидиновая кислота («DMPA»), дипальмитоилфосфатидиновая кислота («DPPA»), димиристоилфосфатидилэтаноламин («DMPE»), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин («DPPE»), димиристоилфосфатидилсерин («DMPS»), дипальмитоилфосфатидилсерин («DPPS»), фосфатидилсерин головного мозга («BPS»), сфингомиелин головного мозга («BSP»), дипальмитоилсфингомиелин («DPSP»), димиристилфосфатидилхолин («DMPC»), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин («DAPC»), 1,2-диарахидоил-sn-глицеро-3-фосфохолин («DBPC»), 1,2-диэйкозеноил-sn-глицеро-3-фосфохолин («DEPC»), диолеоилфосфатидилэтаноламин («DOPE»), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин («POPC»), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин («POPE»), лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин и дилинолеоилфосфатидилхолин.
[0087] Фосфолипиды могут быть получены из природных или синтетических источников. Однако, в некоторых вариантах осуществления изобретения, фосфолипиды, происходящие от природных источников, такие как яичный или соевый фосфатидилхолин, фосфатидиновая кислота головного мозга, фосфатидилинозит головного мозга или растений, сердечный кардиолипин и растительный или бактериальный фосфатидилэтаноламин не используются в качестве первичного фосфатида (то есть, составляющего 50% или более от общего состава фосфатидов), поскольку это может приводить к нестабильности и утечке из образующихся липосом.
2. Наночастицы «DOTAP:холестерин»
[0088] В некоторых вариантах осуществления изобретения, везикулой на основе липидов является наночастица «DOTAP:холестерин». Наночастицы «DOTAP:холестерин» получают путем смешивания катионного липида DOTAP (1,2-бис(олеоилокси)-3- (триметиламмоний)пропана) с холестерином. Везикулы, полученные с использованием ДНК, могут образовывать структуру (называемую «сэндвичем»), где ДНК, как очевидно, конденсируется между двумя липидными бислоями (патенты США 6770291 и 6413544).
400
3
[0089] Комплекс «DOTAP:холестерин-нуклеиновая кислота» может быть получен как описано в следующем неограничивающем примере. Наночастицы «DOTAP:холестерин» (DC) (размером от 50 до 500 нм) синтезируют, как описано было ранее (патенты США 6770291 и 6413544; Templeton, 1997). Вкратце, берут 420 мг DOTAP и 208 мг холестерина и смешивают вместе с 30 мл хлороформа. Затем смесь сушат на роторном испарителе в течение 30 минут и лиофилизуют в течение 15 минут. Осушенную смесь разводят в 30 мл D5W путем вихревого перемешивания при 50°С в течение 45 минут и при 37°C в течение 10 минут. После этого, смесь обрабатывают ультразвуком низкой частоты в течение пяти минут с образованием липосом. Затем липосому «DOTAP:холестерин» нагревают до 50°С и последовательно фильтруют через стерильные 1,0, 0,45, 0,2 и 0,1 мкм-фильтры Whatman. Синтезированные наночастицы хранят при температуре 4°C и используют для получения комплексов наночастиц. Полученная липосома «DOTAP:холестерин» должна быть равномерно распределена и должна иметь размер частиц 50-250 нм, OD менее 0,45 и дзета-потенциал 50-80 мВ. Остаточные уровни CHCl должны составлять менее, чем 60 м.д.
400
[0090] Для получения наночастиц «DOTAP:холестерин-нуклеиновая кислота», 240 мкл липосом (см. выше) разводят в 360 мкл D5W при комнатной температуре. К смеси добавляют ДНК (~ 5 мг/мл) до общего объема 600 мкл. Смесь перемешивают с помощью пипетки путем забора и выпуска. После отстаивания, смесь должна иметь OD в пределах от 0,65 до 0,95, размер частиц 200-500 нм и подтвержденный статус грамотрицательного окрашивания. Липосомные комплексы хранят при температуре 3°С-28°С и перемешивают, по возможности, как можно реже.
В. Нацеливание наночастиц
[0091] Нацеленная доставка достигается за счет добавления лигандов так, чтобы это не оказывало негативного воздействия на способность наночастиц к доставке их полезной нагрузки. Предполагаются, что это будет обеспечивать доставку в конкретные клетки, ткани и органы. Специфичность нацеливания систем доставки на основе лигандов зависит от распределения рецепторов лигандов на клетках различных типов. Нацеливающий лиганд может быть нековалентно или ковалентно связан с наночастицей и может быть конъюгирован с наночастицами различными обсуждаемыми в настоящем документе способами.
et al.
[0092] Примерами белков или пептидов, которые могут быть использованы для доставки наночастиц, являются трансферин, лактоферин, TGF-α, фактор роста нервных клеток, альбумин, пептид Tat ВИЧ, RGD-пептид и инсулин, а также другие соединения (Gupta , 2005; Ferrari, 2005).
C. Векторы для экспрессии TUSC2
et al.
et al.,
[0093] Используемый в настоящем документе термин «вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты-носителя, в которую может быть встроена последовательность нуклеиновой кислоты для введения в клетку, где она может реплицироваться. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть «экзогенной», что означает, что она является чужеродной для клетки, в которую вводят вектор, или что эта последовательность является гомологичной последовательности в клетке, но присутствует в нуклеиновой кислоте клетки-хозяина в положении, в котором она обычно не встречается в природе. Векторами являются плазмиды, космиды, вирусы (бактериофаги, вирусы животных и вирусы растений) и искусственные хромосомы (например, YAC). Специалист в данной области может самостоятельно сконструировать вектор с применением стандартных рекомбинантных методов (см., например, руководства Maniatis, 1989 и Ausubel 1994, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
[0094] Термин «вектор экспрессии» означает генетическую конструкцию любого типа, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую РНК, способную транскрибироваться. В некоторых случаях, молекулы РНК затем транслируется в белок, полипептид или пептид. В других случаях, эти последовательности не транслируются, например, при продуцировании антисмысловых молекул или рибозимов. Экспрессионные векторы могут содержать различные «регуляторные последовательности», которые представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для транскрипции и, возможно, для трансляции функционально присоединенной кодирующей последовательности в конкретной клетке-хозяине. Помимо регуляторных последовательностей, которые регулируют транскрипцию и трансляцию, эти векторы и экспрессионные векторы могут содержать последовательности нуклеиновой кислоты, которые выполняют также и другие функции, описанные ниже.
in vivo
[0095] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты TUSC2. Так, например, такой вектор может быть использован для рекомбинантного продуцирования полипептида TUSC2 и/или для экспрессии TUSC2  у индивидуума. Последовательности могут быть модифицированы так, чтобы несколько различных кодонов могли кодировать одну аминокислоту, и при этом, тот же самый белок или полипептид. Оптимизация выбора кодонов может быть также проведена в зависимости от конкретного организма, используемого для рекомбинантной экспрессии, либо такая оптимизация может быть проведена для максимальной экспрессии в человеческой клетке (например, в раковой клетке). Вектор для его использования в соответствии с вариантами осуществления изобретения дополнительно содержит элементы, которые регулируют экспрессию генов и/или облегчают продуцирование и очистку вектора.
1. Промоторы и энхансеры
[0096] «Промотор» представляет собой регуляторную последовательность, которая является областью последовательности нуклеиновой кислоты, где происходит инициация и регуляция транскрипции. Промотор может содержать генетические элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие факторы транскрипции, для инициации специфической транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты. Термины «функционально расположенные», «функционально присоединенные», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» означают, что промотор находится в «правильном» функциональном положении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты для регуляции инициации транскрипции и/или экспрессии этой последовательности.
[0097] Промотор обычно содержит последовательность, которая функционирует в положении сайта инициации синтеза РНК. Наиболее известным примером такого промотора является ТАТА-бокс, но в некоторых промоторах, не содержащих ТАТА-бокса, таких как, например, промотор гена терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы млекопитающих и промотор поздних генов SV40, дискретный элемент, охватывающий сам сайт инициации, стимулирует фиксацию в участке инициации. Дополнительные промоторные элементы регулируют частоту инициации транскрипции. Обычно, они находятся в области 30-110 п.о., расположенной выше сайта инициации, хотя ряд промоторов, как было показано, содержат функциональные элементы, также расположенные ниже сайта инициации. Для того, чтобы кодирующая последовательность находилась «под контролем промотора», одно положение должно находиться у 5'-конца сайта инициации транскрипции транскрипционной рамки считывания, расположенной ниже (то есть, по направлению к 3'-концу) выбранного промотора. «Расположенный выше» промотор стимулирует транскрипцию ДНК и экспрессию кодируемой РНК.
[0098] Расстояние между промоторными элементами часто является гибким, что обеспечиывает сохранение функции промотора, в случае инверсии или перемещения элементов относительно друг друга. В промоторе tk, расстояние между промоторными элементами может быть увеличено до 50 пар оснований, прежде, чем активность начнет снижаться. Очевидно, что в зависимости от промотора, отдельные элементы могут функционировать либо совместно, либо независимо друг от друга для активации транскрипции. Промотор может быть, а может и не быть использован в комбинации с «энхансером», который представляет собой цис-действующую регуляторную последовательность, участвующую в активации транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты.
[0099] Промотор может представлять собой природный промотор, ассоциированый с последовательностью нуклеиновой кислоты, и этот промотор может быть получен путем выделения 5'-некодирующих последовательностей, расположенных выше кодирующего сегмента и/или экзона. Такой промотор может называться «эндогенным» или «гомологичным». Аналогичным образом, энхансер может представлять собой природный энхансер, ассоциированный с последовательностью нуклеиновой кислоты и расположенный ниже или выше этой последовательности. Альтернативно, некоторые преимущества могут быть достигнуты путем помещения кодирующего сегмента нуклеиновой кислоты под контроль рекомбинантного, экзогенного или гетерологичного промотора, представляющего собой промотор, который обычно не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в ее природном окружении. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер также означает энхансер, который обычно не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в ее природном окружении. Такими промоторами или энхансерами могут быть вирусные промоторы и энхансеры, например, промотор CMV.
[00100] Само собой разумеется, что важно использовать промотор и/или энхансер, который эффективно направляет экспрессию сегмента ДНК в органеллу, клетку, ткань, орган или организм, выбранные для экспрессии. Специалистам в области молекулярной биологии обычно известно применение промоторов, энхансеров и комбинаций клеток различных типов для экспрессии белка (см., например, руководство Sambrook et al. 1989, которое включена в настоящее описание в качестве ссылки). Используемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифическими, индуцибельными и/или подходящими для их использования в соответствующих условиях в целях достижения высокого уровня экспрессии введенного ДНК-сегмента, например, преимущественно при крупномасштабном продуцировании рекомбинантных белков и/или пептидов. Промотор может быть гетерологичным или эндогенным.
[00101] Кроме того, любая комбинация промотора/энхансера (имеющаяся, например, в базе данных эукариотических промоторов EPDB, www.epd.isb-sib.ch/) может также быть использована для инициации экспрессии. Другим возможным вариантом является использование цитоплазматической экспрессионной системы T3, T7 или SP6. Эукариотические клетки могут поддерживать цитоплазматическую транскрипцию от определенных бактериальных промоторов, если имеется соответствующая бактериальная полимераза, присутствующая либо как часть комплекса доставки, либо как дополнительная генетическая экспрессионная конструкция.
2. Сигналы инициации трансляции
[00102] Для эффективной трансляции кодирующих последовательностей может также потребоваться специфический сигнал инициации. Эти сигналы включают инициирующий кодон ATG или смежные последовательности. Могут оказаться необходимыми экзогенные сигналы регуляции трансляции, включая кодоны инициации ATG. Любой специалист в данной области может легко определить и получить такие необходимые сигналы. Хорошо известно, что инициирующий кодон должен находиться в одной рамке считывания с нужной кодирующей последовательностью для гарантии трансляции всей вставки. Экзогенные сигналы регуляции трансляции и инициирующие кодоны могут быть либо природными, либо синтетическими. Эффективность экспрессии может быть повышена путем включения соответствующих элементов-энхансеров транскрипции.
3. Сайты множественного клонирования
et al.,
et al.,
[00103] Векторы могут включать сайт множественного клонирования (MCS), который представляет собой область нуклеиновой кислоты, содержащую множество сайтов рестрикционных ферментов, любой из которых может быть использован в комбинации со стандартной рекомбинантной технологией для гидролиза вектора (см., например, публикации Carbonelli  1999, Levenson  1998, and Cocea, 1997, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Термин «расщепление рестриктирующими ферментами» означает каталитическое расщепление молекулы нуклеиновой кислоты ферментом, который функционирует только в определенных положениях в молекуле нуклеиновой кислоты. Многие из этих рестриктирующих ферментов являются коммерчески доступными. Использование таких ферментов широко известно специалистам в данной области. В большинстве случаев, вектор линеаризуют или фрагментируют с использованием рестриктирующего фермента, который осуществляет разрезание в MCS, так, чтобы это приводило к лигированию экзогенных последовательностей с вектором. «Лигирование» означает процесс образования фосфодиэфирных связей между двумя фрагментами нуклеиновой кислоты, которые могут быть, а могут и не быть смежными друг с другом. Методы, включающие реакции разрезания рестриктирующими ферментами и лигирования, хорошо известны специалистам в области рекомбинантной технологии.
4. Сайты сплайсинга
et al.
[00104] Большинство транскрибируемых эукариотических молекул РНК подвергаются РНК-сплайсингу, что приводит к удалению интронов из первичных транскриптов. Векторам, содержащим геномные эукариотические последовательности, могут потребоваться донорные и/или акцепторных сайты сплайсинга для обеспечения правильного процессинга транскрипта для экспрессии белка (см., например, публикацию Chandler , 1997, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Включение таких сайтов сплайсинга может также усиливать экспрессию путем предотвращения разрушения образовавшихся РНК-транскриптов, опосредуемого нонсенс-мутациями.
5. Сигналы терминации
in vivo
[00105] Векторы или конструкции согласно вариантам осуществления изобретения обычно содержат по меньшей мере один сигнал терминации. «Сигнал терминации» или «терминатор» состоит из последовательностей ДНК, участвующих в специфической терминации РНК-транскрипта под действием РНК-полимеразы. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения рассматривается сигнал терминации, который завершает продуцирование РНК-транскрипта. Терминатор может оказаться необходимым  для достижения желаемых уровней транскриптов.
[00106] Терминаторами, рассматриваемыми для их использования в вариантах осуществления изобретения, являются любые известные терминаторы транскрипции, описанные в настоящей заявке или известные среднему специалисту в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, например, последовательности терминации генов, такие как, например, терминатор бычьего гормона роста или вирусные последовательности терминации, такие как, например, терминатор SV40. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сигнал терминации может не содержать транскрибируемой или транслируемой последовательности, например, из-за усечения последовательности.
6. Сигналы полиаденилирования
[00107] При экспрессии, а в частности, при экспрессии в эукариотических клетках, в эти клетки обычно включают сигнал полиаденилирования для осуществления правильного полиаденилирования транскрипта. Природа сигнала полиаденилирования, очевидно, не играет решающей роли для успешного осуществления вариантов настоящего изобретения, и может быть использована любая последовательность. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают сигнал полиаденилирования SV40 или сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, которые являются подходящими и, как известно, хорошо функционируют в различных клетках-мишенях. Полиаденилирование может повышать стабильность транскрипта или облегчать цитоплазматический транспорт.
7. Ориджины репликации
[00108] Для размножения вектора в клетке-хозяине, желательно, чтобы он содержал один или более ориджинов сайтов репликации (часто обозначаемых «ori»), представляющих собой специфическую последовательность нуклеиновой кислоты, в которой инициируется репликация. Альтернативно, если клеткой-хозяином являются дрожжи, то может быть использована автономно реплицирующаяся последовательность (ARS).
8. Селективные и скринируемые маркеры
in vitro
in vivo
[00109] В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетки, содержащие описанную в настоящем документе конструкцию нуклеиновой кислоты, могут быть идентифицированы  или  путем включения маркера в вектор экспрессии. Такие маркеры будут сообщать клетке идентифицируемое изменение, что позволит облегчить идентификацию клеток, содержащих вектор экспрессии. Обычно, селективным маркером является маркер, который сообщает свойство, позволяющее проводить отбор. Позитивным селективным маркером является маркер, присутствие которого допускает позитивный отбор, тогда как негативным селективным маркером является маркер, присутствие которого запрещает такой отбор. Примером позитивного селективного маркера является маркер резистентности к лекарственному средству.
[00110] Обычно, включение маркера отбора лекарственного маркера облегчает клонирование и идентификацию трансформантов, например, подходящими селективными маркерами являются гены, сообщающие резистентность к неомицину, пуромицину, гигромицину, DHFR, GPT, зеоцину и гистидинолу. Помимо маркеров, сообщающих фенотип, позволяющий осуществлять дискриминацию трансформантов в зависимости от условий, также рассматриваются маркеры и других типов, включая скринируемые маркеры, такие как GFP, на основе которого осуществляют колориметрический анализ. Альтернативно, могут быть использованы такие скрининируемые ферменты, как тимидинкиназа вируса простого герпеса (tk) или хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT). Специалисту в данной области также известно, что, иммунологические маркеры можно использовать в комбинации с FACS-анализом. Тип используемого маркера не имеет важного значения, при условии, что он будет способен экспрессироваться одновременно с нуклеиновой кислотой, кодирующей генный продукт. Другие примеры селективных и скрининируемых маркеров хорошо известны специалисту в данной области.
9. Плазмидные векторы
E.coli
E. coli
[00111] В некоторых вариантах осуществления изобретения, плазмидный вектор рассматривается для его использования в целях трансформации клетки-хозяина. Вообще говоря, плазмидные векторы, содержащие последовательности репликона и регуляторные последовательности, которые происходят от видов, совместимых с клеткой-хозяином, используют в комбинации с этими хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечить фенотипический отбор в трансформированных клетках. В неограничивающем примере,  часто трансформируют с использованием производных плазмиды pBR322, происходящей от  различных видов. pBR322 содержит гены резистентности к ампициллину и тетрациклину и, таким образом, представляет собой простой способ идентификации трансформированных клеток. Плазмида pBR или другая микробная плазмида или фаг также должны содержать или должны быть модифицированы так, чтобы они содержали, например, промоторы, которые могут использоваться микроорганизмом для экспрессии его собственных белков.
E.coli
[00112] Кроме того, фаговые векторы, содержащие последовательности репликона и регуляторные последовательности, которые совместимы с микроорганизмом-хозяином, могут быть использованы в качестве трансформирующих векторов в комбинации с этими хозяевами. Так, например, фаг лямбда-GEM™-11 может быть использован для получения рекомбинантного фагового вектора, который может быть использован для трансформации клеток-хозяев, таких как, например,  LE392.
et al.
[00113] Другими подходящими плазмидными векторами являются векторы pIN (Inouye , 1985); и векторы pGEX, которые могут быть использованы в целях получения растворимых гибридных белков глутатион-S-трансферазы (GST) для последующей очистки и разделения или расщепления. Другими подходящими гибридными белками являются белки, связанные с β-галактозидазой, убихитином и т.п.
E. coli
[00114] Бактериальные клетки-хозяева, например, , содержащие вектор экспрессии, культивируют в любых подходящих средах, например, в LB. Экспрессия рекомбинантного белка в некоторых векторах может быть индуцирована, как известно специалистам в данной области, путем контактирования клетки-хозяина с агентом, специфичным к некоторым промоторам, например, путем добавления IPTG к среде или путем переключения инкубирования на более высокую температуру. После культивирования бактерий в течение дополнительного периода времени, обычно 2-24 часа, клетки собирают путем центрифугирования и промывают для удаления остаточной среды.
10. Вирусные векторы
[00115] Способность некоторых вирусов инфицировать клетки или проникать в клетки посредством эндоцитоза, опосредуемого рецептором, интегрироваться в геном клетки-хозяина и стабильно и эффективно экспрессировать вирусные гены, делает их привлекательными кандидатами для переноса чужеродных нуклеиновых кислот в клетки (например, в клетки млекопитающих). Таким образом, могут быть использованы вирусы, которые кодируют и экспрессируют TUSC2. Неограничивающие примеры вирусных векторов, которые могут быть использованы для доставки нуклеиновой кислоты TUSC2, описаны ниже.
[00116] Аденовирусные векторы. Конкретный способ доставки нуклеиновой кислоты включает использование аденовирусного вектора экспрессии. Хотя аденовирусные векторы, как известно, обладают низкой способностью к интеграции в геномную ДНК, однако, эта особенность компенсируется высокой эффективностью переноса генов, обеспечиваемой этими векторами. «Аденовирусный вектор экспрессии» включает конструкции, содержащие аденовирусные последовательности, достаточные для (а) сохранения упаковки конструкции и (b) конечной экспрессии тканеспецифической или клеткоспецифической конструкции, которая была клонирована в этом векторе. Информация о генетической организации аденовируса, который представляет собой линейный двухцепочечный ДНК-вирус размером 36 т.п.о., позволяет осуществлять замену больших участков аденовирусной ДНК на чужеродные последовательности до 7 т.п.о. (Grunhaus & Horwitz, 1992).
et al.,
in vivo
et al.,
et al.,
et al.,
et al.,
[00117] AAV-векторы. Нуклеиновая кислота может быть введена в клетку с помощью трансфекции посредством аденовируса. Повышение эффективности трансфекции было зарегистрировано в клеточных системах с использованием систем, связанных с аденовирусом (Kelleher and Vos, 1994; Cotten 1992; Curiel, 1994). Аденоассоциированный вирус (AAV) имеет высокую частоту интеграции и может инфицировать неделящиеся клетки, что делает его подходящим для доставки генов в клетки млекопитающих, например, в культуру ткани (Muzyczka, 1992) или . AAV имеет широкий ряд хозяев для инфицирования (Tratschin 1984; Laughlin 1986; Lebkowski 1988; McLaughlin 1988). Подробное описание получения и использования векторов rAAV приводится в патентах США 5139941 и 4797368, каждый из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки.
et al.,
et al.,
et al.,
[00118] Ретровирусные векторы. Ретровирусы обладают способностью интегрировать свои гены в геном хозяина, переносить большое количество чужеродного генетического материала, инфицировать широкий спектр видов и типов клеток, и упаковываться в специфические клеточные линии (Miller, 1992). Для конструирования ретровирусного вектора, нуклеиновую кислоту (например, кодирующую представляющий интерес белок) встраивают в вирусный геном вместо определенных вирусных последовательностей для получения вируса, дефектного по репликации. Для получения вирионов конструируют упаковывающую клеточную линию, содержащую гены gag, pol и env, но без LTR и упаковывающих компонентов (Mann1983). Если рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК вместе с ретровирусным LTR и упаковывающими последовательностями, вводят в специальную клеточную линию (например, путем осаждения фосфатом кальция), то упаковывающая последовательность позволяет РНК-транскрипту рекомбинантной плазмиды упаковываться в вирусные частицы, которые затем секретируются в культуральную среду (Nicolas and Rubinstein, 1988; Temin, 1986; Mann1983). После этого, среду, содержащую рекомбинантные ретровирусы, собирают, необязательно концентрируют и используют для переноса генов. Ретровирусные векторы способны инфицировать клетки широкого спектра. Однако, для интеграции и стабильной экспрессии требуется деление клеток-хозяев (Paskind1975).
gag, pol
env
et al.
et al.
et al.
env, vif, vpr, vpu
nef
[00119] Лентивирусы представляют собой сложные ретровирусы, которые, помимо общих ретровирусных генов и, содержат другие гены с регуляторной или структурной функцией. Лентивирусные векторы хорошо известны специалистам (см., например, Naldini , 1996; Zufferey , 1997; Blomer , 1997; патенты США 6013516 и 5994136). Некоторые примеры лентивирусов включают вирусы иммунодефицита человека: ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вирус иммунодефицита обезьян: SIV. Лентивирусные векторы были получены путем многократного аттенюирования вирулентности генов ВИЧ, например, гены  и  были делетированы для сообщения вектору биологической безопасности.
et al.,
et al.,
et al.,
[00120] Другие вирусные векторы. В вариантах осуществления изобретения, другие вирусные векторы могут быть использованы в качестве вакцинных конструкций. Могут быть использованы векторы, происходящие от вирусов, таких как вирус осповакцины (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar 1988), вирус Синдбис, цитомегаловирус и вирус простого герпеса. Эти вирусы сообщают различным клеткам млекопитающих несколько привлекательных признаков (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar 1988; Horwich 1990).
[00121] Модифицированные вирусы. Нуклеиновая кислота для доставки может быть введена в инфекционный вирус, который был сконструирован так, чтобы он экспрессировал специфический связывающий лиганд. Таким образом, вирусная частица будет специфически связываться с когнатными рецепторами клетки-мишени и доставлять содержимое в клетку. Новый способ, позволяющий осуществлять специфическую доставку ретровирусных векторов, был разработан на основе химической модификации ретровирусов посредством химического присоединения лактозных остатков к вирусной оболочке. Эта модификация может обеспечивать специфическое инфицирование гепатоцитов посредством рецепторов сиалогликопротеина.
in vitro
[00122] Был разработан еще один способ доставки рекомбинантных ретровирусов, в котором были использованы биотинилированные антитела против белка ретровирусной оболочки и против специфического клеточного рецептора. Эти антитела были присоединены посредством биотиновых компонентов с использованием стрептавидина (Roux et al., 1989). С использованием антител против антигенов главного комплекса гистосовместимости класса I и класса II было продемонстрирвоано инфицирование различных человеческих клеток, несущих эти поверхностные антигены, экотропным вирусом  (Roux et al., 1989).
III. Фармацевтические препараты
[00123] Описанные в настоящем документе фармацевтические композиции содержат эффективное количество одного или более терапевтических TUSC2 и/или ингибитора контрольной точки иммунитета, и, необязательно, дополнительного агента, растворенного или диспергированного в фармацевтически приемлемом носителе. Термины «фармацевтически или фармакологически приемлемый» относятся к молекулярным частицам и композициям, которые не вызывают негативную, аллергическую или другую неблагоприятную реакцию при их введении животному, например, человеку, если это необходимо. Приготовление фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере нуклеиновую кислоту, пептид или комплекс наночастиц TUSC2, или дополнительный активный ингредиент, будет понятно специалистам в данной области исходя из настоящего изобретения и описано в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, которое включена в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, известно, что препараты, вводимые животному (например, человеку), должны удовлетворять стандартам стерильности, апирогенности, общей безопасности и чистоты в соответствии с требованиями Управления FDA по биологическим стандартам.
[00124] Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, замедляющие абсорбцию, соли, консерванты, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, гели, связующие вещества, наполнители, дезинтегрирующие агенты, лубриканты, подсластители, ароматизаторы, красители и другие материалы и их комбинации, известные среднему специалисту в данной области (см., например, руководство Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, которое включена в настоящее описание в качестве ссылки). В терапевтических или фармацевтических композициях может быть использован любой стандартный носитель, за исключением носителя, который является несовместимым с активным ингредиентом.
[00125] В некоторых вариантах осуществления изобретения, фармацевтическая композиция может включать носители различных типов, в зависимости от того, вводятся ли они в твердой, жидкой или аэрозольной форме, и требуется ли их стерильнось для таких путей введения, как инъекция. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные в настоящем документе фармацевтические композиции могут быть введены внутривенно, интрадермально, внутриартериально, внутрибрюшинно, путем введения в пораженный участок, интракраниально, внутрисуставно, путем введения в область предстательной железы, внутриплеврально, внутритрахеально, интраназально, путем введения в стекловидное тело, интравагинально, ректально, местно, путем введения вовнутрь опухоли, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, путем введения в подконъюнктивальное пространство, интравезикулярно, путем введения через слизистую оболочку, интраперикардиально, путем введения в область пупочного канатика, интраокулярно, перорально, местно, локально, путем ингаляции (например, аэрозольной ингаляции), путем инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, локализованной перфузии для прямого вливания клеток-мишеней, введения с помощью катетера, с помощью лаважа, в виде кремов, в виде жидких композиций (например, липосом), или другими методами или любыми их комбинациями, известными специалистам в данной области (см., например, руководство Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, которое включена в настоящее описание в качестве ссылки).
[00126] В некоторых вариантах осуществления изобретения, фармацевтическую композицию вводят внутрибрюшинно. В других вариантах осуществления изобретения, фармацевтическую композицию вводят внутрибрюшинно для лечения рака (например, раковой опухоли). Так, например, фармацевтическая композиция может быть введена внутрибрюшинно для лечения рака желудочно-кишечного тракта. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться желательным введение фармацевтической композиции в опухоль или в участок вблизи опухоли.
[00127] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, фармацевтическую композицию вводят перорально для лечения рака (например, рака желудочно-кишечного тракта).
[00128] В некоторых вариантах осуществления изобретения, фактическая доза композиции, вводимая пациенту, может быть определена в зависимости от физических и физиологических факторов, таких как масса тела, тяжесть заболевания, тип заболевания, подвергаемого лечению, предшествующие или одновременные терапевтическиа вмешательства, наличие у пациента идиопатического заболевания и способа введения. В любом случае, практический врач, ответственный за введение, может определить концентрацию активного(ых) ингредиента(ов) в композиции, и соответствующую(ие) дозу(ы) для конкретного индивидуума.
[00129] В некоторых вариантах осуществления изобретения, фармацевтические композиции могут содержать, например, по меньшей мере приблизительно 0,1% активного соединения. В других вариантах осуществления изобретения, активное соединение может составлять, например, приблизительно от 2% до приблизительно 75% по массе композиции, или приблизительно от 25% до приблизительно 60%, и любую величину в этом интервале. В других неограничивающих примерах, доза может также составлять приблизительно от 1 микрограмма/кг/массы тела, приблизительно 5 микрограммов/кг/массы тела, приблизительно 10 микрограммов кг/массы тела, приблизительно 15 микрограммов/кг/массы тела, приблизительно 20 микрограммов/кг массы тела, приблизительно 25 микрограммов/кг массы тела, приблизительно 30 микрограммов/кг/массы тела, приблизительно 35 микрограммов/кг/массы тела, приблизительно 0,04 миллиграмма/кг/массы тела, приблизительно 0,05 миллиграмма/кг/массы тела, приблизительно 0,06 миллиграмма/кг/массы тела, приблизительно 0,07 миллиграмма/кг/массы тела, приблизительно 0,08 миллиграмма/кг/массы тела, приблизительно 0,09 миллиграмма/кг массы тела, приблизительно 0,1 миллиграмма/кг/массы тела, приблизительно 0,2 миллиграмма/кг/массы тела, до приблизительно 0,5 мг/кг/массы тела или более за одно введение, и любую величину в этом интервале. В неограничивающих примерах интервалов перечисленных величин может быть введена доза в интервале приблизительно от 0,01 мг/кг/массы тела до приблизительно 0,1 мг/кг массы тела, приблизительно от 0,04 микрограмма/кг/массы тела до приблизительно 0,08 миллиграмма/кг/массы тела и т.п. и эта доза может быть вычислена исходя из вышеуказанных значений.
[00130] В любом случае, композиция может содержать различные антиоксиданты для замедления окисления одного или более компонентов. Кроме того, предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с использованием консервантов, таких как различные антибактериальные и противогрибковые агенты, включая, но не ограничиваясь ими, парабены (например, метилпарабены, пропилпарабены), хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту, тимерозал или их комбинации.
[00131] Один или более пептидов, комплексов наночастиц или дополнительных агентов могут быть введены в композицию в виде свободного основания, в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемыми солями являются кислотно-аддитивные соли, например, соли, образованные свободными аминогруппами белковой композиции, или соли, образованные неорганическими кислотами, такими как, например, соляная кислота или фосфорная кислота, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или из органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин.
[00132] В тех вариантах, где композиция присутствует в жидкой форме, носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, включая, но не ограничиваясь ими, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), липиды (например, триглицериды, растительные масла, липосомы) и их комбинации. Соответствующая текучесть может поддерживаться, например, путем нанесения покрытия, такого как лецитин; путем поддержания требуемого размера частиц благодаря дисперсии в носителях, таких как, например, жидкий полиол или липиды; с использованием поверхностно-активных веществ, таких как, например, гидроксипропилцеллюлоза; или с применением комбинаций таких методов. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, такие как, например, сахар, хлорид натрия или их комбинации.
[00133] В других вариантах осуществления изобретения могут быть использованы глазные капли, интраназальные растворы или спреи, аэрозоли или ингаляторы согласно вариантам настоящего изобретения. Такие композиции обычно получают так, чтобы они были совместимы с типом ткани-мишени. В неограничивающем примере, интраназальными растворами, обычно, являются водные растворы, предназначенные для введения в носовые проходы в виде капель или спреев. Интраназальные растворы приготавливают так, чтобы они, по возможности, были похожи на интраназальные секреты для поддержания нормального функционирования ресничек носа. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения, водные интраназальные растворы обычно являются изотоничными или слегка забуференными для поддержания рН приблизительно от 5,5 до приблизительно 6,5. Кроме того, в композицию, при необходимости, могут быть включены антимикробные консерванты, аналогичные тем, которые используются в офтальмологических препаратах, лекарственных средствах или в соответствующих стабилизаторах лекарственных средств. Так, например, различные коммерчески доступные интраназальные препараты являются известными и включают лекарственные средства, такие как антибиотики или антигистамины.
[00134] В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более полипептидов, нуклеиновых кислот или комплексов наночастиц получают для введения такими способами, как пероральное введение. В этих вариантах осуществления изобретения, твердая композиция может включать, например, растворы, суспензии, эмульсии, таблетки, пилюли, капсулы (например, твердые или мягкие желатиновые капсулы с оболочкой), препараты с пролонгированным высвобождением, трансбуккальные композиции, пастилки, эликсиры, суспензии, сиропы, облатки или их комбинации. Пероральные композиции могут быть введены непосредственно с пищей. Предпочтительные носители для перорального введения включают инертные разбавители, хорошо усваиваемые пищевые носители или их комбинации. В других аспектах изобретения, пероральная композиция может быть приготовлена в виде сиропа или эликсира. Сироп или эликсир может включать, например, по меньшей мере один активный агент, подсластитель, консервант, ароматизатор, краситель или их комбинации.
[00135] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, композиция для перорального введения может включать один или более связующих веществ, наполнителей, дезинтегрирующих агентов, лубрикантов, ароматизаторов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция может включать один или более из следующих компонентов, а именно, связующих веществ, таких как, например, трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал, желатин или их комбинации; наполнителей, таких как, например, дикальцийфосфат, маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-содержащий сахарин, целлюлоза, карбонат магния или их комбинации; дезинтегрирующих агентов, таких как, например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота или их комбинации; лубрикантов, таких как, например, стеарат магния; подсластителей, таких как, например, сахароза, лактоза, сахарин, или их комбинации; ароматизаторов, таких как, например, перечная мята, масло грушанки, вишневая отдушка, апельсиновая отдушка, и т.п. или комбинации вышеуказанных компонентов. Если унифицированной лекарственной формой является капсула, то она может содержать, помимо компонентов вышеуказанного типа, носители, такие как жидкий носитель. Различные другие материалы могут присутствовать в качестве покрытий или для какой-либо другой модификации унифицированной лекарственной формы. Так, например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или тем и другим.
[00136] Дополнительные композиции, которые являются подходящими для других способов введения, включают суппозитории. Суппозитории представляют собой твердые лекарственные препараты различной массы и формы, которые, как правило, используются в медицине для введения в прямую кишку, влагалище или уретру. После введения, суппозитории размягчаются, расплавляются или растворяются в жидкостях полости. Вообще говоря, для суппозиториев, традиционными носителями могут быть, например, полиалкиленгликоли, триглицериды или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, суппозитории могут быть получены из смесей, содержащих, например, активный ингредиент в пределах приблизительно от 0,5% до приблизительно 10%, а предпочтительно приблизительно от 1% до приблизительно 2%.
[00137] Стерильные растворы для инъекций получают путем введения активных соединений в необходимом количестве в соответствующем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, если это необходимо, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Обычно, дисперсии получают путем введения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов, суспензий или эмульсий для инъекций, предпочтительными способами приготовления являются методы вакуумной сушки или лиофилизации, которые дают выход порошка активного ингредиента плюс любого дополнительного желательного ингредиента из жидкой среды, уже подвергнутой стерильной фильтрации. Жидкая среда должна быть соответствующим образом забуферена, если это необходимо, и до инъекции, жидкий разбавитель сначала делают изотоничным путем добавления достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Также рассматривается приготовление высококонцентрированных композиций для прямой инъекции, где в качестве растворителя используют ДМСО для очень быстрого проникновения активных агентов в небольшой участок и для доставки таких агенов в высоких концентрациях.
[00138] Композиция должна быть стабильной в условиях приготовления и хранения, и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. При этом, следует иметь в виду, что загрязнение эндотоксином должно быть сведено до минимума на безопасном уровне, например, до менее чем 0,5 нг/мг белка.
[00139] В конкретных вариантах осуществления изобретения, пролонгированное всасывание композиции для инъекции может быть достигнуто с использованием композиций агентов, замедляющих всасывание, таких как, например, моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.
IV. Комбинированная терапия
[00140] В целях повышения эффективности нуклеиновой кислоты, полипептида или комплекса наночастиц согласно вариантам настоящего изобретения, может оказаться желательным использовать комбининацию этих композиций с другими агентами, эффективными для лечении представляющего интерес заболевания.
[00141] В качестве неограничивающего примера, лечение рака может быть осуществлено с использованием терапевтического TUSC2 и/или ингибитора контрольной точки иммунитета согласно вариантам изобретения вместе с другими противораковыми средствами. «Противораковое» средство способно негативно влиять на раковую опухоль у индивидуума, например, посредством уничтожения раковых клеток, индуцирования апоптоза раковых клеток, снижения скорости роста раковых клеток, уменьшения частоты или числа метастазов, уменьшения размера опухоли, ингибирования роста опухоли, снижения кровоснабжения опухолевых или раковых клеток, стиуляции иммунного ответа против раковых клеток или опухоли, предотвращения или ингибирования прогрессирования рака, или увеличения продолжительности жизни индивидуума с раком. Вообще говоря, эти другие композиции могут быть получены в виде комбинации в количестве, эффективном для уничтожения клеток или ингибирования их пролиферации. Этот способ может включать контактирование клеток с противораковым пептидом или комплексом наночастиц и с агентом(ами) или со множественным факторов одновременно. Это может быть достигнуто посредством контактирования клетки с одной композицией или фармакологическим препаратом, которые включают оба агента, или контактирования клетки с двумя отдельными композициями или препаратами одновременно, где одна композиция включает противораковый пептид или комплекс наночастиц, а другая композиция включает второй(ые) агент(ы). В конкретных вариантах осуществления изобретения, одним агентом может быть противораковый пептид, а другим агентом может быть противораковый комплекс наночастиц.
[00142] Лечение с использованием противоракового пептида или комплекса наночастиц может быть проведено до или после лечения другим агентом с интервалами от нескольких минут до нескольких недель. В тех вариантах, где другой агент и противораковый пептид или комплекс наночастиц вводят в клетку по-отдельности, обычно необходимо, чтобы между этими введениями не проходило значительного количества времени, то есть, чтобы агент и противораковый пептид или комплекс наночастиц имели возможность оказывать преимущественно комбинированный эффект на клетки. В таких случаях, предполагается, что один агент может контактировать с клеткой с промежутками приблизительно 12-24 часов между двумя введениями, а более предпочтительно, приблизительно 6-12 часов между двумя введениями. В некоторых случаях может оказаться желательным существенно продлить период времени между соответствующими введениями, от нескольких дней (например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней) до нескольких недель (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель).
[00143] Аналогичным образом, в некоторых аспектах настоящего изобретения, терапевтический TUSC2 вводят в комбинации с ингибитором контрольной точки иммунитета. Могут быть использованы различные комбинации, где терапевтический TUSC2 обозначается «А», а ингибитор контрольной точки иммунитета обозначается «B»:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[00144] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение пациенту терапевтического TUSC2 и/или ингибитора иммунного сверочной точки согласно вариантам изобретения, осуществляют в соответствии с общими протоколами введения химиотерапевтических средств, принимая во внимание токсичность вектора, если он присутствует. Предполагается, что, при необходимости, циклы лечения могут быть проведены повторно. Также предполагается, что различные стандартные методы терапии, а также хирургическое вмешательство могут быть осуществлены в комбинации с описанной гиперпролиферативной клеточной терапией.
а. Химиотерапия
[00145] Противораковая терапия также включает ряд комбинированных терапий. В некоторых аспектах изобретения, терапевтический TUSC2 и/или ингибитор контрольной точки иммунитета согласно вариантам изобретения вводят (или приготавливают) в комбинации с химиотерапевтическим средством. Так, например, в некоторых аспектах изобретения, химиотерапевтическое средство представляет собой ингибитор протеинкиназы, такой как EGFR, VEGFR, AKT, Erb1, Erb2, ErbB, Syk, Bcr-Abl, JAK, Src, GSK-3, PI3K, Ras, Raf, MAPK, MAPKK, mTOR, c-Kit, рецептор eph или ингибиторы BRAF. Неограничивающими примерами ингибиторов протеинкиназы являются афатиниб, акситиниб, бевацизумаб, бозутиниб, цетуксимаб, кризотиниб, дазатиниб, эрлотиниб, фостаматиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, ленватиниб, мубритиниб, нилотиниб, панитумумаб, пазопаниб, пегаптаниб, ранибизумаб, руксолитиниб, саракатиниб, сорафениб, сунитиниб, трастузумаб, вандетаниб, AP23451, вемурафениб, МК-2206, GSK690693, А-443654, VQD-002, милтефозин, перифозин, CAL101, PX-866, LY294002, рапамицин, темсиролимус, эверолимус, ридафоролимус, альвоцидиб, генистеин, селуметиниб, AZD-6244, ваталаниб, P1446A-05, AG-024322, ZD1839, P276-00, GW572016 или их смесь.
[00146] Другие комбинированные химиотерапии включают, например, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамиды, триэтилентиофосфорамиды и триметилолмеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элейтеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловые аналоги горчичного газа; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, а в частности, калихеамицин гамма I1 и калихеамицин омега I1; динемицин, включая динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотики-хромофоры, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногалармицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, хеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергические средства, такие как митотан, трилостан; средства, восполняющие недостаток фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид алдофосфамида; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; элформитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлорoротриэтиламин; трихотецены (а в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезины; дакарбазин; манномустин; митобронитолы; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; таксоиды, например, паклитаксел и доцетаксел; гемцитабин, 6-тиогуанин; меркаптопурин; координационные комплексы платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (например, СРТ-11); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДФМО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; карбоплатин, прокарбазин, пликомицин, гемцитабин, навелбин, ингибиторы фарнезил-протеин-трансферазы, трансплатина, и любые их фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные в настоящем документе композиции могут быть использованы в комбинации с гефитинибом. В других вариантах осуществления изобретения, эти варианты могут быть осуществлены в комбинации с Gleevac (например, пациенту может быть введено приблизительно от 400 до приблизительно 800 мг/день Gleevac). В некоторых вариантах осуществления изобретения, одно или более химиотерапевтических средств могут быть использованы в комбинации с описанными в настоящем документе композициями.
b. Лучевая терапия
[00147] Были широко использованы и другие факторы, которые вызывают повреждение ДНК, включая общеизвестные факторы, такие как γ-гамма, рентгеновские лучи и/или радиоизотопы с направленной доставкой в опухолевые клетки. Рассматриваются также и другие формы ДНК-повреждающих факторов, такие как микроволны и УФ-излучение. По всей вероятности, все эти факторы вызывают повреждения ДНК широкого спектра и предшественников ДНК, и влияют на репликацию и репарацию ДНК, а также на сборку и сохранение хромосом. Интервал доз рентгеновского облучения составляет в пределах от суточных доз 50-200 рентген в течение длительного периода времени (от 3 до 4 недель) до однократных доз в пределах 2000-6000 рентген. Интервал доз радиоизотопов широко варьируется и зависит от периода полураспада изотопа, мощности и типа испускаемого излучения и его поглощения опухолевыми клетками.
[00148] Термины «приведение в контакте» и «экспонирование», если они относятся к клетке, используются в настоящем документе для описания способа введения терапевтической композиции и химиотерапевтического или радиотерапевтического средства в клетку-мишень или в область, расположенную в непосредственной близости от клетки-мишени. Для уничтожения клеток или прекращения их роста, оба этих агента доставляют в клетку в виде комбинации в количестве, эффективном для уничтожения клеток или предотвращения их деления.
с. Иммунотерапия
[00149] Иммунотерапия, как правило, основана на использовании иммунных эффекторных клеток и молекул для нацеливания на злокачественные клетки и их уничтожения. Иммунным эффектором может быть, например, антитело, специфичное к некоторым маркерам на поверхности опухолевой клетки. Антитело, взятое отдельно, может служить в качестве эффектора терапии, либо оно может осуществлять рекрутинг других клеток для более эффективного уничтожения клеток. Антитело может быть также конъюгировано с лекарственным средством или токсином (химиотерапевтическим средством, радионуклидом, А-цепью рицина, холерным токсином, коклюшным токсином и т.д.) и служит лишь в качестве нацеливающего агента. Альтернативно, эффектор может представлять собой лимфоцит, несущий поверхностную молекулу, которая взаимодействует, прямо или опосредованно, с опухолевой клеткой-мишенью. Различные эффекторные клетки включают цитотоксические Т-клетки и NK-клетки.
erb
[00150] Таким образом, иммунотерапия может быть использована как часть комбинированной терапии, в сочетании с TUSC2-терапией согласно вариантам изобретения. Общий подход к комбинированной терапии обсуждается ниже. Обычно, опухолевая клетка должна иметь определенный маркер, который ответственен за нацеливание, то есть, не присутствует на большинстве других клеток. Существует множество опухолевых маркеров, и любые из этих маркеров могут быть подходящими для нацеливания в контексте осуществления вариантов изобретения. Обычными опухолевыми маркерами являются карциноэмбриональный антиген, антиген, специфичный для предстательной железы, антиген, ассоциированный с опухолью мочевых путей, антиген плода, тирозиназа (P97), gp68, TAG-72, HMFG, сиалиловый антиген Льюиса, MucА, MucB, PLAP, рецептор эстрогена, рецептор ламинина,  B и р155.
d. Генотерапия
[00151] В еще одном варианте осуществления изобретения, дополнительной терапией является генотерапия, при которой терапевтический полинуклеотид вводят до, во время или после введения терапевтической композиции. Вирусные векторы для экспрессии генного продукта хорошо известны специалистам в данной области, и включают такие эукариотические экспрессионные системы, как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, герпесвирусы, лентивирусы, поксвирусы, включая вирусы осповакцины и вирусы папилломы, включая SV40. Альтернативно, введение экспрессионных конструкций может быть осуществлено с использованием векторов на основе липидов, таких как липосомы или везикулы «DOTAP:холестерин». Все эти методы хорошо известны специалистам (см., например, Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1998; Ausubel, 1996).
[00152] Доставка вектора, кодирующего один из нижеследующих генных продуктов, будет оказывать комбинированное анти-гиперпролиферативное воздействие на ткани-мишени. В объем вариантов настоящего изобретения входит ряд белков, некоторые из которых описаны ниже.
i. Ингибиторы пролиферации клеток
[00153] Как было отмечено выше, функция онкогенов- супрессоров опухоли заключается в ингибировании избыточной пролиферации клеток. Инактивация этих генов нарушает их ингибирующую активность, что приводит к нерегулируемой пролиферации.
ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl
[00154] Гены, которые могут быть использованы для дополнительной терапии в соответствии с вариантами осуществления изобретения, включают p53, p16, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, гибриды p27/p16, гибриды p21/p27, антитромботические гены (например, COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, , E1A, p300, гены, участвующие в ангиогенезе (например, VEGF, FGF, тромбоспондин, BAI-1, GDAIF, или их рецепторы), MCC и другие гены, перечисленные в Таблице IV.
ii. Регуляторы запрограммированной клеточной гибели
et al.,
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA,
et al.,
et al.
[00155] Апоптоз или запрограммированная клеточная гибель является важным процессом нормального эмбрионального развития, поддержания гомеостаза в тканях взрослых и подавления канцерогенеза (Kerr et al., 1972). Было продемонстрировано, что семейство белков Bcl-2 и ICE-подобные протеазы являются важными регуляторами и эффекторами апоптоза в других системах. Белок Bcl-2, обнаруженный в ассоциации с фолликулярной лимфомой, играет важную роль в регуляции апоптоза и повышении выживаемости клеток в ответ на различные апоптотические стимулы (Bakhshi  1985; Cleary and Sklar, 82(21):7439-43, 1985; Cleary 1986; Tsujimoto , 1985; Tsujimoto и Croce, 1986). Эволюционно консервативный белок Bcl-2 в настоящее время рассматривается как член семейства родственных белков, которые могут быть отнесены к категории агонистов или антагонистов гибели клеток.
XL
W
S
[00156] После открытия Bcl-2 было показано, что он подавляет гибель клеток, вызванную различными стимулами. Кроме того, теперь уже очевидно, что существует семейство белков- регуляторов Bcl-2 клеточной гибели, которые имеют общие структурные свойства и гомологичные последовательности. Было показано, что эти различные члены семейств либо обладают функциями, аналогичными функциям Bcl 2 (например, Bcl, Bcl, Bcl, Mcl-1, A1, Bfl-1), либо блокируют функцию Bcl 2 и стимулируют гибель клеток (например, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).
е. Хирургия
[00157] Приблизительно 60% индивидуумов с раком проводят хирургическую операцию определенного типа, которая включает профилактическую, диагностическую или постадийную, лечебную и паллиативную операцию. Лечебная хирургия представляет собой лечение рака, которое может быть проведено в комбинации с другими терапиями, такими как описанные в настоящем документе способы лечения, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия, генотерапия, иммунотерапия и/или альтернативная терапия.
[00158] Лечебная операция включает резекцию, при которой всю раковую ткань или ее часть физически удаляют, вырезают, и/или уничтожают. Резекция опухоли означает физическое удаление по меньшей мере части опухоли. Помимо резекции опухоли, лечебная хирургия включает лазерную хирургию, криохирургию, электрохирургию и операцию с удалением незначительных повреждений (хирургию Моса). Кроме того, предполагается, что варианты осуществления настоящего изобретения могут быть использованы в комбинации с удалением поверхностных раковых опухолей, предраковых опухолей или очень незначительных количеств нормальной ткани.
[00159] При иссечении части или всех раковых клеток, ткани или опухоли, в организме может образовываться полость. Лечение может быть осуществлено путем перфузии, прямой инъекции или местной обработки области с дополнительной терапией злокачественных новообразований. Такое лечение может повторяться, например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, или каждые 1, 2, 3, 4 и 5 недель или каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. Дозы, используемые при таком лечении, могут также варьироваться.
f. Противовоспалительные средства
[00160] В некоторых аспектах изобретения, терапевтический TUSC2 и/или ингибитор контрольной точки иммунитета вводят в комбинации с противовоспалительным средством. Противовоспалительное средство определяется в настоящем документе как средство, которое, как известно или предположительно, оказывает благоприятное действие при лечении или профилактике воспаления у индивидуума. Основным классом противовоспалительных средств являются кортикостероиды. Кортикостероиды могут обладать кратковременным, средним или длительным действием и могут быть введены различными методами. Неограничивающий список кортикостероидов, рассматриввемых в вариантах осуществления изобретения, включает пероральные кортикостероиды, такие как кортизон, гидрокортизон, преднизон и дексаметазон.
[00161] Еще один важный класс противовоспалительных средств составляют нестероидные противовоспалительные средства. Нестероидные противовоспалительные средства включают класс лекарственных средств, используемых для лечении воспаления и купирования боли. Точный механизм действия лекарственных средств этого класса неизвестен. Примерами лекарственных средств, принадлежащих к этому классу, являются, но не ограничиваются ими, ибупрофен, кетопрофен, флурбипрофен, набуметон, пироксикам, напроксен, диклофенак, индометацин, сулиндак, толметин, этодолак, флуфенаминовая кислота, дифлунизал, оксапрозин, рофекоксиб и целекоксиб. Любой специалист в данной области должен быть знаком с этими средствами. В эту категорию входят салицилаты и производные салицилатов, такие как ацетилсалициловая кислота, салицилат натрия, салицилат холина, салицилат холина-магния и дифлунизал.
[00162] Другие противовоспалительные средства включают противоревматические средства, такие как соли золота (например, тиомалат золота-натрия, ауротиоглюкоза и ауранофин), противоревматические средства (например, хлорохин, гидроксихлорохин и пеницилламин), антигистаминовые препараты (например, дифенгидрамин, хлорфенирамин, клемастин, гидроксизин, и трипролидин) и иммунодепрессанты (например, метотрексат, мехлорэтамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, циклоспорин и азатиоприн). Другими иммунодепрессантами, рассматриваемыми в вариантах осуществления изобретения, являются такролимус и эверолимус. Такролимус подавляет продуцирование интерлейкина-2, ассоциированное с активацией Т-клеток, и ингибирует дифференцировку и пролиферацию цитотоксических Т-клеток. В настоящее время, они признаны во всем мире как основополагающие терапевтические иммунодепрессанты. Любому специалисту в данной области должны быть знакомы эти средства и другие члены этого класса, а также механизмы действия этих средств и показания к их применению.
g. Другие средства
[00163] Предполагается, что для повышения терапевтической эффективности лечения, эти другие средства могут быть использованы в комбинации с описанными в настоящем документе композициями. Такими дополнительными средствами являются иммуномодулирующие средства, средства, которые влияют на активацию рецепторов клеточной поверхности и GAP-стыков, цитостатические агенты и агенты дифференцировки, ингибиторы клеточной адгезии или агенты, которые повышают чувствительность гиперпролиферирующихся клеток к индукторам апоптоза. Иммуномодулирующими средствами являются фактор некроза опухоли; интерферон-альфа, -бета и -гамма; IL-2 и другие цитокины; F42K и другие аналоги цитокинов; или MIP-1, MIP-l-бета, МСР-1, RANTES и другие хемокины. Кроме того, предполагается, что активация рецепторов клеточной поверхности или их лигандов, таких как Fas/Fas-лиганд, DR4 или DR5/TRAIL, будет повышать апоптоз-индуцирующую способность описанных в настоящем документе композиций благодаря аутокринному или паракринному влиянию на гиперпролиферирующиеся клетки. Усиление передачи межклеточного сигнала путем повышения количества GAP-стыков должно повышать антигиперпролиферативное воздействие на соседнюю популяцию гиперпролиферирующихся клеток. В других вариантах осуществления изобретения, цитостатические агенты или агенты дифференцировки могут быть использованы в комбинации с описанными в настоящем документе композициями для повышения антигиперпролиферативной эффективности лечения. Считается, что ингибиторы клеточной адгезии повышают эффективность настоящего изобретения. Примерами ингибиторов клеточной адгезии являются ингибиторы киназы, ответственной за фокальную адгезию (FAK) и ловастатин. Также считается, что другие агенты, повышающие чувствительность гиперпролиферирующихся клеток к апоптозу, такие как антитело с225, могут быть использованы в комбинации с описанными в настоящем документе композициями для повышения эффективности лечения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, гормональная терапия может быть также использована в комбинации с вариантами осуществления изобретения или в комбинации с любыми другими ранее описанными противораковыми терапиями. Гормоны могут быть применены при лечении некоторых видов рака, таких как рак молочной железы, предстательной железы, яичника или шейки матки, для снижения уровня или блокирования действия некоторых гормонов, таких как тестостерон или эстроген. Такое лечение часто применяется в комбинации по меньшей мере с одной другой терапией злокачественных новообразований как варианта лечения или снижения риска развития метастазов.
V. Примеры
[00164] Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Следует отметить, что для специалиста в данной области будет очевидно, что методы, описанные в примерах, представляют собой репрезентативные методы, раскрытые авторами изобретения для лучшего практического осуществления изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться как предпочтительные способы практической реализации изобретения. Однако, исходя из настоящего описания, специалисту в данной области должно быть очевидно, что в конкретные варианты осуществления изобретения может быть внесено множестов изменений, которые раскрываются в настоящей заявке и позволяют получить подобный или аналогичный результат, не выходящий за рамки существа и объема настоящего изобретения.
Пример 1 - TUSC2-терапия в комбинации с введением ингибитора контрольной точки иммунитета
Комбинированная обработка TUSC2 и анти-PD1 антителом эффективно ингибирует рост опухоли у модели сингенных животных, которым были подкожно введены клетки карциномы легких с мутацией Kras G12V
Kras
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
3
3
3
3
[00165] : Мышам C57BL/6 подкожно имплантировали клеточную линию мышиной карциномы легких, содержащую СМТ/167-люциферазу с мутацией  G12V и низким уровнем экспрессии . Десять мышей распределяли по группам, которым вводили: пустой вектор, содержащий «DOTAP:холестерин» (DC)/изотип; анти-PD1 антитело; наночастицы DC-; и наночастицы DC-+анти-PD1 антитело. Последовательное введение  (i.v.) и анти-PD1 антитела (i.p.), которое было рандомизировано, показано на фиг. 1А. Какой-либо токсичности, ассоциированной с комбинированной терапией, не наблюдалось. Объемы опухолей и интенсивность биолюминесценции измеряли штангенциркулем и путем визуализации на IVIS, соответственно. Экспрессия PD-L1 в клетках CMT/167 составляла 23,7% (фиг. 1В). Анти-PD1 антитело давало ограниченную эффективность в регуляции роста опухоли, тогда как  значительно ингибировал рост опухоли (фиг. 1С). Комбинированное введение также способствовало повышению уровня регрессии опухоли благодаря . Средний объем для контрольного изотипа, анти-PD1 антитела,  и +анти-PD1 антитела составлял 800 мм, 600 мм, 300 мм и 180 мм, соответственно (*р<0,05; **р<0,01 и ***р<0,001). Интенсивность биолюминесценции, измеренная путем визуализации опухоли на IVS и выраженная как общий поток клеток в секунду, также указывала на эффективность этой комбинации (фиг. 1D-E). Апостериорная вероятность комбинированного эффекта между  и анти-PD1 антителом превышала 99%. Эти результаты свидетельствуют о том, что у этой модели,  при его синергичном действии с анти-PD1 антителом, приводил к снижению роста опухоли.
Комбинированная обработка TUSC2 и анти-PD1 антителом повышает плотность NK- и CD8
-Т-клеток и подавляет регуляторные клетки
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
+
+
+
+
[00166] : Для определения иммунного воздействия комбинации  и анти-PD1 антитела, профиль основных иммунных популяций лейкоцитов периферической крови (PBL) и спленоцитов оценивали с использованием десятицветовой панели с помощью проточной цитометрии. Влияние внутривенной доставки нановезикул TUSC2 на периферические NK-, В- и Т-клетки у мышей без опухоли показано на фиг. 2А. У мышей без опухоли какого-либо различия между TUSC2 и TUSC2+анти-PD1 антитело не наблюдалось. Стратегия стробирования для проточного цитометрического анализа показана на фиг. 1, Дополнение. После инокуляции опухолевых клеток было обнаружено, что  заметно и умеренно повышал плотность NK- и CD8-Т-клеток, соответственно (р<0,001 и р<0,05) с ярко выраженным сопутствующим снижением числа В-клеток, MDSC, Treg, Т-клеток, экспрессирующих PD1, CTLA4 и Tim3 (фиг. 2B-E). Анти-PD1 антитело не оказывало какого-либо значительного влияния на NK-, В- и Т-клетки, но снижало число MDSC, Treg и T-клеток, экспрессирующих PD1, CTLA4 и Tim3. Комбинированная обработка давала такой же эффект, как и один . Наибольшее различие в комбинированной обработке заключалось в повышении соотношения количества NK-клеток по отношению к MDSC и количества CD8-T-клеток по отношению к Treg (р <0,001) (фиг. 2F). В целом, эти результаты показали, что синергия  и анти-PD1 антитела, вероятно, ассоциируется с повышением степени размножения NK- и CD8-Т-клеток.
Комбинированная обработка TUSC2 и анти-PD1 антителом повышает число опухоль-инфильтрирующих NK- и CD8
-Т-клеток
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2
+
+
+
[00167] : Для того, чтобы определить, ассоциируется ли обработка +анти-PD1 антителом с увеличением плотности инфильтрации опухолевых иммунных клеток, иммунные инфильтраты анализировали с использованием высокоэффективной системы Vectra для оценки патологии, охватывающий каждый участок опухоли (N=5 опухолей на группу обработки). Все подкожные опухоли равномерно иссекали для обработки и несколько срезов каждой опухоли анализировали чтобы исключить любое потенциальное смещение выборки с учетом различных размеров опухоли между различными группами обработки. Значения Н-баллов были использованы с учетом интенсивности окрашивания в комбинации с процентом позитивных клеток. При сравнении с контролем или анти-PD1 антителом, комбинация давала в 10 и 3 раза более высокую плотность CD8-Т-клеток в опухолях, соответственно (р<0,0001; фиг. 3A). Инфильтраты CD8-Т-клеток в TUSC2-группе были ниже, чем в случае комбинации, хотя и не существенно. Инфильтрация активированных NK-клеток была наиболее высокой в опухолях, обработанных  (р<0,0001), а затем комбинацией (р<0,0001) (фиг. 3A). Анти-PD1 антитело давало небольшое повышение числа NК-инфильтратов по сравнению с  или с комбинацией. И наоборот,  и +анти-PD1 антитело значительно подавляли опухоль-инфильтрированные Foxp3-позитивные Т-клетки (р<0,0001), маркер-экспрессируемые клетки Treg и клетки MDSC, несущие гранулоцитарный маркер 1 супрессии опухоли (Gr-1) (р<0,0001). Хотя анти-PD1 антитело незначительно снижало плотность Foxp3 (р=0,18), однако, оно не оказывало никакого влияния на GR1. Эти результаты свидетельствуют о том, что и комбинация приводили к изменению микроокружения опухолевых иммунных клеток.
Комбинированная обработка TUSC2 и анти-PD1 антителом усиливают экспрессию хемокинов, ассоциированную с NK-клетками и Т-лимфоцитами
TUSC2
et al.,
et al.,
TUSC2
TUSC2+
[00168] : Профиль экспрессии сывороточных хемокинов анализировали с использованием технологии Nanostring. Было обнаружено, что активация серии генов хемокинов связано с миграцией Т-лимфоцитов и NK-клеток после обработки и комбинацией (фиг. 3B). Экспрессия CcL3 и CcL4, которые участвуют в миграции NK-клеток посредством распознавания CCR5, усиливалась более, чем в два раза, тогда как CcL21a и CcL19, которые взаимодействовали с рецепторами CCR7 и осуществляли рекрутинг T-клеток и дендритных клеток в опухоли (Viola 2012; Griffith 2014), увеличивались более, чем в четыре раза по сравнению с необработанным контролем. Уровни хемокинов CcL4 и CcL5 в сыворотке также повышались после обработки и анти-PD1 антителом по сравнению с контрольной группой (фиг. 3C).
Истощение NK- и CD8
-Т-клеток полностью и частично отменяет противоопухолевый эффект комбинации, соответственно
TUSC2
TUSC2+
TUSC2-
+
+
+
+
+
+
+
+
[00169] : Обнаружение того, что плотность NK- и CD8-Т-клеток повышалась после комбинированной терапии, со всей очевидностью указывает на то, что CD8-Т-клетки и NK-клетки регулируют регрессию опухоли, индуцированную и анти-PD1 антителом. Для подтверждения этой гипотезы, NK- и CD8-Т-клетки истощали у мышей с опухолью CMT167 посредством внутрибрюшинной инъекции антител против NK1.1 или против CD8-T-клеток (фиг. 8, 9). Как показано на фиг. 4A, обработка анти-NK1.1 антителом полностью отменяет регрессию опухоли, вызываемую комбинацией, тогда как обработка анти-CD8Т антителом частично ухудшает этот эффект (фиг. 4B). Кроме того, истощение NК-клеток отменяет индуцированное ингибирование роста опухоли, тогда как истощение CD8Т-клеток не дает никакого эффекта. Истощение любых клеток не оказывает какого-либо влияния на анти-PD1 ответ. Эти данные свидетельствуют о том, что хотя CD8-T-клетки могут вносить свой вклад в TUSC2-усиленную чувствительность к анти-PD1 антителу, однако, NK-клетки необходимы для этой синергии.
p
p=
TUSC2
TUSC2
p
p=
TUSC2
TUSC2
p
p
TUSC2
TUSC2
TUSC2
p
TUSC2
p
TUSC2
TUSC2
p
p
[00170] Затем анализ сывороточных цитокинов, проведенный с помощью Luminex, показал, что TUSC2 и комбинация индуцировали сильный Th1-опосредуемый иммунный ответ (контроль по сравнению с TUSC2: <0,0001; контроль по сравнению с комбинацией: 0,007 (фиг. 4C), но этот эффект отменялся в случае истощения NK ( по сравнению с /NK1.1: =0,008; комбинация по сравнению с комбинацией/NK1.1: 0,0009). Это позволяет предположить, что NK-клетки играют важную роль в индуцировании Th1-опосредуемых иммунных ответов на  и комбинацию. Однако, при истощении или без истощения NK, в этих двух группах обработки, каких-либо значимых различий в отношении Th1/Th2 не наблюдалось. Терапия +анти-PD1 антителом давала более высокие уровни цитокинов IL-15 (=0,0001) и IL-18 (<0,0001) по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в отсутствии обработки или при обработке аналогами анти-PD1 антитела (фиг. 4D). IL-15 был доведен до тех же самых уровней у групп, обработанных  и комбинацией, тогда как уровни IL-18 были значительно выше при обработке , чем при обработке комбинацией. При истощении NK-клеток, уровни IL-15 (контроль по сравнению с : =0,03) и IL-18 (контроль по сравнению с : =0,0005) значительно снижались. При истощении или без истощения NK, между группами, обработанными  и комбинацией, наблюдались значимые различия в уровнях IL-18, но не IL-15. И наконец, профиль экспрессии отсортированных NK-клеток и опухолевой ткани, оцененный с помощью кол.ПЦР и технологии Nanostring, показал значительно более высокий уровень экспрессии IL-15R и IL-18R у группы, обработанной  по сравнению с группой, которую не обрабатывали и обрабатывали аналогом анти-PD1 антитела (=0,01 и =0,001, соответственно; фиг. 4E, F).
Комбинированная обработка TUSC2 и анти-PD1 антителом приводила к повышению продолжительность жизни у модели сингенных животных с мутацией Kras G12D и с метастазами в легких
et al.,
TUSC2
TUSC2
p
TUSC2
TUSC2
TUSC2
p
p
p
TUSC2
TUSC2
[00171] : Эффективность TUSC2+анти-PD1 антитела оценивали у мышей 129Sv со второй моделью Kras с метастазами, которым с внутривенно инокулировали злокачественные клетки легких с 344SQ-люциферазой, несущие мутацию K-rasG12D. Уровень экспрессии PD-L1 в клетках 344SQ составлял только 4,5% (фиг. 5А). Последовательная стратегия обработки представлена на фиг. 5В. Группы обработки были аналогичны группам предыдущей модели, но с добавлением двух групп, то есть, группы, которой вводили комбинацию анти-PD1 антитела и анти-CTLA4 антитела и комбинацию TUSC2 с анти-PD1 антителом и анти-CTLA4 антителом. В этом эксперименте была использована первая комбинация, поскольку имелись сообщения о повышении клинической эффективности по сравнению с введением только одного лекарственного средства (Larkin 2015).  приводил к значительному увеличению продолжительность жизни по сравнению с необработанной группой, группой, обработанной анти-PD1 антителом, и группой, обработанной анти-PD1 антителом+анти-CTLA4 антителом (по сравнению с контролем: <0,0001; по сравнению с анти-PD1 антителом: p<0,001;  по сравнению с анти-PD1 антителом+анти-CTLA4 антителом: p<0,001) (фиг. 5C). При объединении  с анти-PD1 антителом, продолжительность жизни значительно повышалась (комбинация по сравнению с контролем: <0,0001; комбинация по сравнению с анти-PD1 антителом: <0,001; комбинация по сравнению с TUSC2: =0,024). Объединение  с анти-PD1 антителом и анти-CTLA4 антителом приводило к увеличению продолжительности жизни на несколько дней по сравнению с обработкой TUSC2+анти-PD1 антителом. Биолюминесцентная визуализация опухолей подтвердила эти результаты (фиг. 5D). На фиг. 5E проиллюстрирован впечатляющий клиренс узелков опухоли в легких, индуцированный ri7SC2+анти-PD1 антителом на неделе 2. Эти результаты подтверждают эффективность комбинации TUSC2+анти-PD1 антитела и позволяют предположить, что комбинация  с блокадой двух сверочных точек анти-PD1 антителом и анти-CTLA4 антителом, имеет поступательное значение.
TUSC2
p
TUSC2
p
p
[00172] Анализ иммунной клеточной инфильтрации, проводимый с помощью моноклеточного анализа, указывал на более высокую инфильтрацию NK-клеток под действием  по сравнению с контрольными группами или группами, которым вводили комбинации анти-PD1 антитела и анти-CTLA4 антитела (<0,001) (фиг. 5F). Эффекты TUSC2+анти-PD1 антитела или +анти-PD1 антитела+анти-CTLA4 антитела были несколько лучше, чем в случае TUSC2. В противоположность этому, инфильтраты Treg и клеток MDSC в значительной степени подавлялись с использованием анти-PD1 антитела (=0,004; =0,0003), то есть, этот эффект еще больше улучшался при использовании TUSC2 и комбинаций (фиг. 5G и 5H). Эти результаты соответствовали результатам, которые наблюдались при оценке подкожной опухолевой модели СМТ167 (фиг. 2).
Комбинация TUSC2 с анти-PD1 антителом приводила к изменению профиля экспрессии иммунного гена в микроокружении опухоли
TUSC2+
TUSC2
TUSC2
Cd1d2, Ltf, Klra21, H60a, Tnfsf18
Bcl6.
et al.,
et al.,
+
+
[00173] : Для идентификации специфического иммунного гена, дифференциально экспрессируемого при введении комбинации анти-PD1 антитела, РНК, взятую из образцов опухоли, подвергали цифровому мультиплексному профилированию с использованием мышиной панели всех раковых опухолей, состоящей из 770 мышиных иммунных генов, дающих адаптивный и природный ответ в случае использования 40 контрольных генов «домашнего хозяйства» (NanoString Technologies Inc.). t-Критерий Уэльча с коррекцией степени ложных обнаружений (q<0,05) был применен для оценки статистически значимых различий экспрессии генов между группами обработки. Р-величина <0,05 считалась статистически значимой. Графики Volcano и тепловая карта были использованы для визуализации результатов (фиг. 6А, В). Поскольку добавление  приводило к усилению ответа на введение анти-PD1 антитела, то проводили попарное сравнение между группами, которым вводили анти-PD1 антитело и +анти-PD1 антитело. Попарные сравнения также проводили между всеми другими группами. Во-первых, было установлено, что кластер из шести генов значительно активировался в группе, которой вводили комбинацию. Этот кластер включал иБыло установлено, что значительно активировался также и другой кластер, состоящий из Egr3, Cd46, Ncr1, Klra5, Ccl1, Il12rb2 и Cd59b (фиг. 6B). Все эти гены имеют важное значение для регуляции NK- и CD8T-клеток (Deng 2013; Shevach and Stephens, 2006; Orr 2009). Комбинированная обработка также приводила к повышению экспрессии генов, ассоциированных с противоопухолевыми функциями, опосредуемыми Т-клетками, в микроокружении опухоли (фиг. 6D-F). Эти результаты подтвердили иммунологический профиль NK- и CD8-T-клеток и данные по инфильтрации опухоли (фиг. 2-3).
Пример 2 - Материалы и методы
Клеточная культура и реагенты
+
[00174] : Клетки KRasG12/CMT167-luc и К-RasG12D/344SQ-luc были любезно предоставлены Drs. Alan Fields (Mayo Clinic), Frank R. Jirik (Университет Калгари). Клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Atlanta Biological, GA) и 1% пенициллина и стрептомицина (Life Science Technologies). Изотип, анти-PD1 антитело, анти-CTLA4 антитело, антимышиные моноклональные антитела InVivoPlus против NK1.1 (клон PK136) и против CD8-T-клеток (клон 2.43) закупали у Bio X Cell (West Lebanon, NH). DOTAP и холестерин закупали у Avanti Polar Lipids (Albaster, AL). Синтез и получение DC-TUSC2 были описаны ранее (Ito et al., 2004).
Исследования на животных
TUSC2
TUSC2
TUSC2
TUSC2,
TUSC2
TUSC2
6
2
[00175] : Все процедуры на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и по использованию животных при Раковом Центре Техасского Университета MD Anderson. Для получения сингенной модели CMT167-luc, 6-8-недельным самкам мышей C57BL/6-Elite (Charles River Laboratories, Houston, TX) в правый бок подкожно инъецировали 1×10 клеток СMT167-luc, и этих мышей произвольно распределяли на группы обработки по десять мышей в каждой, следующим образом: контроль (нановезикулы с пустым вектором, изотип антитела), анти-PD1 антитело, нановезикулы  и +анти-PD1 антитело. Вкратце, 25 мкг  вводили внутривенно черех каждые 48 часов в течение 3 циклов, а 0,25 мг анти-PD1 антитела вводили внутрибрюшинно (i.p.) через каждые 4 дня в течение 3 циклов. Объемы опухолей вычисляли по формуле 1/2 (длина × ширина). Мышей умерщвляли через 3-4 недели после инъекции опухолевых клеток, и опухоли и селезенку собирали. Для получения модели с метастазами 344SQ, 6-8-недельным самкам мышей 129/Sv внутривенно инъецировали 100000 клеток 344SQ-luc. Ниже представлены группы обработки по десять мышей в каждой: контроль (нановезикулы с пустым вектором, изотип антитела), анти-PD1 антитело,  анти-CTLA4 антитело, +анти-PD1 антитело, анти-PD1 антитело+анти-CTLA4 антитело и +анти-PD1 антитело+анти-CTLA4 антитело. Для получения обеих моделей проводили рутинный мониторинг животных, и опухоли визуализировали с использованием IVIS. Все обработки и измерения проводили двойным слепым методом. Для анализа на иммунный фенотип, животных умерщвляли через 2 недели после инъекции опухолевых клеток, а затем брали легкие и проводили забор периферической крови с помощью сердечной пункции.
Истощение NK- или CD8
-T-клеток
+
+
+
+
[00176] : Для истощения NK- или CD8-T-клеток у мышей CMT167 с опухолью, этим мышам инъецировали нейтрализующие моноклональные анти-NKl.1 антитела (клон PK136) или мышиные моноклональные антитела протиа CD8-T-клеток (клон 2.43) (100 мкг, внутрибрюшинно) через каждые 3 дня в течение 4 циклов, начиная со дня 0 после подкожной инокуляции опухолевых клеток. Мониторинг статуса истощения NK- или CD8-T-клеток осуществляли с помощью проточного цитометрического анализа спленоцитов. Объемы опухолей измеряли и количественно оценивали интенсивность биолюминесценции опухоли на IVIS.
Многоцветная проточная цитометрия
[00177] : PBL выделяли и клетки окрашивали в соответствии со стандартными протоколами для проточной цитометрии. Многоцветные панели были разработаны и оптимизированы по экспериментальной системе исследований на проточном цитометре Gallios (Beckman Coulter, Brea, CA). Мышиные антитела закупали у BioLegend (San Diego, CA). Моноклеточные суспензии промывали буфером для окрашивания при проведении клеточного сортинга с активацией флуоресценции, инкубировали с ингибитором, связывающимся с мышиным Fc-рецептором в течение 10 минут, и окрашивали указанными антителами. Данные были получены и проанализированы с использованием компьютерной программы FlowJo версии 10 (FlowJo, Ashland, OR).
Иммуногистохимия
[00178] : Собранные опухоли CMT167 фиксировали в 10% параформальдегиде и 8 мкм-срезы ткани, залитой в парафин и фиксированной формалином, окрашивали мышиными антителами против CD8, FохP3, Gr-1 и NKp46. Все иммуногистохимические анализы проводили в Лаборатории Гистологического Центра MD Anderson (Smithville, TX). По меньшей мере пять образцов опухолей от каждой группы окрашивали каждым антителом, визуализировали и анализировали на автоматизированной системе визуализации для количественной оценки патологии на 200 предметных стеклах Vectra 3.0 (PerkinElmer, Waltham, MA) в Отделении Центра визуализации MD Anderson (Хьюстон, Техас). Для каждой ячейки были получены H-баллы в пределах от 0 до +3.
Количественная ПЦР
[00179] : Общую РНК экстрагировали с использованием мининабора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) и проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). Количественную ПЦР проводили с использованием ПЦР-смеси Master с визуализацией белка SYBR, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спекта (Applied Biosystems, Foster City, CA). Относительные уровни экспрессии нормализовали, и уровни экспрессии измеряли с помощью ПЦР-системы в реальном времени ABI Viia7 (Applied Biosystems). Относительную количественную оценку проводили сравнительным методом КТ, описанным производителем.
Анализ Luminex
[00180] : Для идентификации сывороточных цитокинов и хемокинов проводили 36-плексные иммуноанализы Affymetrix (eBioscience) ProcartaPlex (Affymetrix, Santa Clara, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Три образца на группу обработки анализировали в дубликатах. Вкратце, семь стандартов получали в соответствии с протоколом производителя, и 25 мкл проб сыворотки смешивали со сферами, покрытыми указанными антителами, и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 500 оборотов в минуту. Мультиплексные иммуноанализы ProcartaPlex Multiplex проводили с использованием технологии Luminex XMap (для определения профиля множества аналитов). Планшеты считывали с использованием системы Luminex 200 (Luminex, Austin, TX) и по полученным данным строили стандартную кривую. Для анализа данных использовали компьютерную программу ProcartaPlex Analyst версии 1.0.
Анализ на экспрессию генов
[00181] : Экстрагированную общую опухолевую РНК, взятую у групп обработки, по три репликата каждой, с использованием мининабора Qiagen RNeasy, отдавали в Отделение Геномного Центра Медицинского Колледжа Бейлора (Хьюстон, Tехас) для оценки контроля качества и анализа профиля экспрессии с применением технологии NanoString. В панели для определения мышиного иммунного профиля NanoString PanCancer использовали профили 776 генов, ассоциированных с конкретными типами иммунных клеток и функциями иммунных клеток. Данные были проанализированы в Отделении Биоинформационного Центра MD Anderson.
Статистические анализа
[00182] : Для получения модели CMT167 в целях проведения анализа на рост опухоли были использованы генерализованные линейные регрессионные модели. Все данные представлены как среднее ± ср. кв. ош., а статистически значимые различия между обработками тестировали с помощью двухстороннего ANOVA и одностороннего t-критерия; величина P<0,05 считается значимой. Для модели 344SQ, распределение общей продолжительности жизни (OS) оценивали методом Каплана-Мейера. Логранговый критерий оценивали для проверки различий в выживаемости между группами. Регрессионный анализ данных по выживаемости исходя из модели пропорциональных рисков Кокса был проведен на OS со времени начала обработки и до момента гибели.
[00183] Статистические анализы данных проточной цитометрии и данных Luminex были проведены с использованием общих линейных регрессионных моделей для сравнения различных групп обработки. Для получения данных иммуногистохимического анализа использовали генерализованные линейные регрессионные модели для статистического анализа H-баллов между группами обработки. Программа ESTIMATE в процедуре PROC MIXED в SAS была использована для сравнения между каждой парой. Для анализа NanoString, данные были нормализованы до их использования в целях количественной оценки профиля генов и статистического анализа. Позитивный контроль, гены «домашнего хозяйства» и негативный контроль использовали для корректировки на различные препараты образцов, фоновый шум и изменение содержания РНК. Линейную модель использовали для оценки общего эффекта обработки, а компьютерную программу CONTRAST использовали для осуществления представляющих интерес попарных сравнений. Полученные величины р моделировали с использованием модели бета-однородной смеси (BUM) в целях определения отсечки вероятности ложного обнаружения (FDR) и идентификации значимо отличающихся экспрессированных генов. Все статистические анализы проводили с использованием статистической компьютерной программы R.
* * *
[00184] Все описанные и заявленные в настоящем документе способы могут быть разработаны и осуществлены без излишнего экспериментирования исходя из описания настоящего изобретения. Хотя композиции и способы согласно изобретению описаны в виде предпочтительных вариантов его осуществления, однако, специалистам в данной области будет очевидно, что в эти способы и в стадии или последовательности осуществления стадий описанного в настоящем документе способа могут быть внесены изменения, не выходящие за рамки концепции, существа и объема изобретения. Более конкретно, очевидно, что некоторые описанные в настоящем документе агенты могут быть заменены химически и физиологически родственными агентами, дающими одинаковые или аналогичные результаты. Все такие аналогичные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области, не должны выходить за раким существа, объема и концепции изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.
Библиография
Нижеследующие документы, в той степени, в которой они описывают репрезентативные процедуры или другие детали, помимо тех, которые были указаны в настоящем описании, конкретно вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Патент США 4162282
Патент США 4310505
Патент США 4533254
Патент США 4554101
Патент США 4728575
Патент США 4728578
Патент США 4737323
Патент США 4921706
Патент США 5030453
Патент США 5397987
Патент США 5855911
Патент США 5962016
Патент США 6413544
Патент США 6610657
Патент США 6680068
Патент США 6770291
Патент США 6770291
Патент США 7902441
Публикация заявки на патент США 2004/0208921
Публикация заявки на патент США 2006/0251726
Публикация заявки на патент США 2007/0092968
Публикация заявки на патент США 2009/0023207
Публикация заявки на патент США 2011/0052570
et al., Human Gene Therapy,
Aksentijevich 7:1111-22, 1996.
et al., Cancer Res.,
Arap 55(6):1351-1354, 1995.
et al., Current Protocols in Molecular Biology
Ausubel , John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., 1996; 1998
et al., Cell,
Bakhshi 41(3):899-906, 1985.
et al., Bioconjugate Chemistry
Ballou , 15:79-86, 2004.
et al., Science
Ben-Neriah , 233:212-214, 1986.
Cell
Bishop, , 64:235-48, 1991.
Cancer Biology & Therapy,
Blankenberg, 7(10):1525-1532, 2008.
Nature
Brady and Dodson, , 368:692-693, 1994.
et al., Head and Neck
Buchhagen , 18:529-537, 1996.
et al., Leukemia Res.,
Butturini 20(6):523-529, 1996.
et al., Nat. Genet
Caldas ., 8(1):27-32, 1994.
et al., Nucleic acid Res,
Chapman 19: 3979-3986, 1991.
et al., Cancer Res
Cheng ., 54(21):5547-5551, 1994.
et al., Invest. Radiol.,
Cheng 22(1):47-55, 1987.
et al., Journal of Clinical Oncology,
Clayman 16:2221-32, 1998.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Cleary and Sklar, 82(21):7439-43, 1985.
et al., J. Exp. Med.,
Cleary 164(1):315-320, 1986.
Trends in Cell Biology,
Colledge and Scott, 9:216-221, 1999.
et al., Oncogene,
Daly 8:1721-1729, 1993.
et al., Cancer Res
Deng ., 67:709-17, 2007.
et al., Oncogene
Deng , 32:4273-83, 2013.
et al., AAPS Pharm. Sci
Drin ., 4(4):1-7, 2002.
et al., J. Pept. Res.,
Du 51:235-243, 1998.
et al., Science
Dubertret , 298:1759-1762, 2002.
et al., Biochem. Biophysical Res. Commun
Dwarakanath ., 325:739-743, 2004.
et al., EMBO J.,
Eggermont 12: 2539-2548, 1993.
et al. Nature Med.,
Ellerby 9:1032-1038, 1999.
et al., Biochim. Biophys. Act
Farhood , 289-295, 1995.
Nature Reviews
Ferrari, , 5:161-171, 2005.
Cell,
Fidler and Ellis, 79(2):185-188, 1994.
J. Biol. Chem.,
Folkman and Shing, 267(16):10931-10934, 1992.
Nature Med.,
Folkman, 1:27-31, 1995.
Current Opin. Chem. Biol.,
Frangioni, 7:626-634, 2003.
et al.
Sym. Quant. Biol.,
Gazdar In: Cold Spring Harbor, 59:565-572, 1994.
et al., Intl. J. Cancer,
Gazdar 78:766-774, 1998.
Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands,
et al.
Ghosh and Bachhawat, In: Wu (Eds.), Marcel Dekker, NY, 87-104, 1991.
et al., J. Biol Chem.,
Goodwin 267: 16330-16334, 1992.
et al., Genes Chrom. Cancer,
Gorunova 23:81-99, 1998.
Заявка на патент Великобритании 2193095 A
et al., Annual review of immunology
Griffith , 32:659-702, 2014.
et al., Biomaterials
Gupta , 26:3995-4021, 2005.
et al., Biomaterials,
Gupta 26:3995-4021, 2005.
et al., Biomaterials,
Gupta 26:3995-4021, 2005.
IEEE Trans.Nanobioscience.,
Gupta, 3:66-73, 2004.
Cell
Hanahan and Folkman, , 86(3):353-364, 1996.
et al., Cell
Hantschel , 112:845-857, 2003.
et al., Science
Hollstein , 253(5015):49-53, 1991.
et al.,
Hope 1985
MRI Physics for Radiologists: A Visual Approach
Horowitz, In: , 1995
et al., Cancer Genet. Cytogenet.,
Hughson 106:93-104, 1998.
et al., Nat. Genet
Hussussian ., 8(1):15-21, 1994.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Hvalby , 91:4761-4765, 1994.
et al., Mol Ther.,
Ito 7:409-18, 2003.
et al., Cancer Gene Ther.,
Ito 11:733-9, 2004.
et al
J Pathol,
Ivanova , 211: 591-601, 2007.
et al.,
Jameson Nature 368: 744-746, 1994
et al., Cancer Res.,
Ji 62:2715-2720, 2000.
et al., Cancer Res.,
Ji 62:2715-20, 2002.
et al., Future Oncology,
Ji 1:79-92, 2005.
et al., Journal of Thoracic Oncology.,
Ji 327-30 10.1097/JTO.0b013e31816bce65, 2008.
et al., J. Virol.,
Johnson 67:438-445, 1993.
et al., Nat. Genet.,
Kamb 8(1):23-26, 1994.
et al., Science
Kamb , 2674:436-440, 1994.
et al., Br. J. Cancer
Kerr , 26(4):239-257, 1972.
et al., Br. J. Cancer
Kerr , 26(4):239-257, 1972.
et al., Intl. J. Cancer,
Kersemaekers 79:411-417, 1998.
et al., Virology
Kloetzer , 140(2):230-238, 1985.
et al., Cancer
Kohno , 85:341-347, 1999.
et al., Oncogene,
Kondo 20:6258-6262, 2001.
et al., Oncogene
Kondo , 20:6258-6262, 2001.
J. Mol. Biol.,
Kyte and Doolittle, 157(1):105 132, 1982.
et al., Cancer Res.,
Lerman 60:6116-33, 2000.
et al., Nat. Biotechnol
Lewin ., 18:410-414, 2000.
et al., Oncogene
Lin , 20:1873-1881, 2001.
et al., Cancer Res.,
Ling 63:298-303, 2003.
Liposome Technology, Gregoriadis (Ed.), Boca Raton, FL, CRC Press, 1984.
et al., Nature,
Lowe 2004;432:307-15, 2004.
et al.,
Lung Cancer in the Genetic Basis of Human Cancer,
Mabry In: Vogelstein and Kinzler (Eds.), McGraw Hill, 671-679, 1998.
et al., Biochim. Biophys. Acta,
Mayer 858(1):161-168, 1986.
et al., Biochim. Biophys. Acta
Mayhew , 775(2):169-174, 1984.
et al., Methods Enzymol.,
Mayhew 149:64-77, 1987.
et al., Science
Michalet , 307:538-544, 2005.
et al., Cancer,
Miller 47:207-214, 1981.
et al., Oncogene
Miller , 22:6006-6013, 2003.
et al.,
Cancer: Principles and Practice of Oncology,
th
Minna In: 5 Ed., Philadelphia: Lippincott, 849-857, 1997.
et al., Current Opinion Biotech.,
Morawski 16, 89-92, 2005.
et al., Cancer Res
Mori ., 54(13):3396-3397, 1994.
et al., Cancer Letter
Nishihara , 180(1):55-61, 2002.
et al., Nature (London),
Nobri 368:753-756, 1995.
et al., Nucleic Acids Res
Obenauer ., 31(13):3635-3641, 2003.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Okamoto , 91(23):11045-11049, 1994.
et al., Cancer Res,
Orlow 54(11):2848-2851, 1994.
et al., Int. J. Oncol
Orlow ., 15(1):17-24, 1994.
et al., The Journal of experimental medicine
Orr , 206:807-17, 2009.
et al., Biometrics,
O'Quigley J 46:33-48, 1990.
Заявка PCT: PCT/US85/01161
Заявка PCT: PCT/US89/05040
Заявка PCT WO 02/100435A1
Заявка PCT WO 03/015757A1
Заявка PCT WO 04/002453A1
Заявка PCT WO 04029213A2
Pure & Appl. Chem., 63(3):427-463, 1991.
et al., Mol Ther.,
Ramesh 3:337-50, 2001.
Remington's Pharmaceutical Sciencesʺ 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580, 1990.
et al., Adv. Drug Del. Rev.,
Roberts 54(4):459-476, 2002.
et al., J. Biol. Chem.,
Rojas 271:27456-27461, 1996.
et al., Nature Biotechnol
Rojas ., 16:370-375, 1998.
et al., Nat Med.,
Roth 2:985-91, 1996.
Forum
Roth, , 8:368-376, 1998.
Expert Opinion on Biological Therapy,
Roth, 6:55-61, 2006.
et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Sambrook , 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989
et al., Science,
Schwarze 285:1569-1572, 1999.
et al., Trends Cell Biol.,
Schwarze 10:290-295, 2000.
et al., Biochimica. Biophysica. Acta,
Sekido 1378:F21-F59, 1998.
et al., Oncogene,
Sekido 16:3151-3157, 1998.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Sekido 93:4120-4125, 1996.
et al., Nature
Serrano , 366:704-707, 1993.
et al., Science
Serrano , 267(5195):249-252, 1995.
et al., Electrophoresis
Sestier , 19:1220-1226, 1998.
Nature reviews Immunology
Shevach and Stephens, , 6:613-8, 2006.
et al., Human Gene Therapy,
Simberg 16:1087-96, 2005.
et al., Proceedings of the National Academy of Sciences,
Simberg 104:932-6, 2007.
et al., Anticancer Res
Spandidos ., 9(2):383-386, 1989.
et al., J. Controlled Release
Stayton , 65:203-220, 2000.
et al., Biopolymers
Sun , 60(1):61-75, 2001.
et al., J Natl Cancer Inst.,
Swisher 91:763-71, 1999.
Nature Biotech
Templeton, ., 15:647-652, 1997.
Nature Biotechnology
Templeton, , 15:647-652, 1997.
et al., FASEB J.,
Travali 4(14):3209-3214, 1990.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Tsujimoto and Croce, 83(14):5214-5218, 1986.
et al., Science
Tsujimoto , 228(4706):1440-1443, 1985.
et al., Cancer Research
Uno , 64:2969-2976, 2004.
et al., Cancer Genet. Cytogenet.,
Uzawa 107:125-131, 1998.
et al., Trends in immunology
Viola . 33:496-504, 2012.
et al., Genes Chrom Cancer
Virmani , 21:308-319, 1998.
Oncogene
Wang, , 19(49):5643-5650, 2000.
Science
Weinberg, , 254(5035):1138-1146, 1991.
Science,
Weinberg, 254:1138-1146, 1991.
Genes and Development
Wen and Van Etten, , 11:2456-2467, 1997.
Methods in Molec. Biol.,
West, 238:113-122, 2004.
et al., Biomaterials
Wilhelm , 24:1001-1011, 2003.
et al., Cancer Res.,
Wistuba 57:3154-3158, 1997.
et al., Cancer Res
Wistuba ., 59:1973-1979, 1999.
et al., Oncogene
Wistuba , 18:643-650, 1999.
et al., J. Cellular Science,
Woodring 116(Pt.13):2613-2626, 2003.
et al., Nature
Zbar , 327:721-724, 1987.
et al., Gene Ther.,
Yang 4:950-60, 1997.
Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry,
Zhao, 9:1018-1023, 2009.