ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНАЯ БИОДЕГРАДИРУЕМАЯ СОСУДИСТАЯ ЗАПЛАТА ДЛЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ РЕКОНСТРУКЦИИ
FUNCTIONALLY ACTIVE BIODEGRADABLE VASCULAR PATCH FOR ARTERIAL RECONSTRUCTION

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано для восстановления стенки сонных артерий при проведении каротидной эндартерэктомии, а также для закрытия дефекта стенки других кровеносных сосудов при осуществлении хирургических вмешательств.
На сегодняшний день существуют два основных подхода к закрытию артериотомии при хирургических операциях на кровеносных сосудах, к ним относятся первичное ушивание и ангиопластика заплатой. При первичном ушивании края разреза артерии соединяют наложением шва, в том время как заплату имплантируют в область артериотомии, способствуя расширению просвета кровеносного сосуда. Так, в клинической практике для закрытия разреза при каротидной эндартерэктомии предпочтение отдается ангиопластике заплатой, что связано с рекомендациями руководств, основанных на результатах метаанализов, в которых отмечается значимое снижение частоты осложнений после использования заплат по сравнению с первичным ушиванием артериотомии в раннем и позднем послеоперационных периодах (Naylor AR, R icco JB, de Borst GJ, Debus S, de Haro J, Halliday A, Hamilton G, Kakisis J, Kakkos S, Lepidi S, Markus HS, McCabe DJ, Roy J, Sillesen H, van den Berg JC, Vermassen F, Esvs Guidelines Committee, Kolh P, Chakfe N, Hinchliffe RJ, Koncar I, Lindholt JS, Vega de Ceniga M, Verzini F, Esvs Guideline Reviewers, Archie J, Bellmunt S, Chaudhuri A, Koelemay M, Lindahl AK, Padberg F, Venermo M Editor's choice e management of atherosclerotic carotid and vertebral artery disease: 2017 clinical practice guidelines of the european society for vascular surgery (ESVS). Eur J Vasc Endovasc Surg 2018; 55: 3-81).
Наиболее часто в качестве заплат используют аутологичные ткани, а именно собственную большую подкожную вену голени пациента, так как они обладают полной биосовметимостью, не вызывают иммунной реакции организма, удобны в имплантации, устойчивы к тромбозу и рестенозу, благодаря наличию эндотелиальной выстилки. К недостаткам венозных заплат относятся формирование аневризм и возможные разрывы ткани в области шва. Кроме того, для получения данного материала необходимо проведение дополнительного хирургического вмешательства у пациента. В свою очередь, использование аутовен может быть ограничено в результате их более раннего применения при аорто-коронарном шунтировании, а также из-за варикозной болезни, тромбофлебита и других перенесенных заболеваний. В связи с этим, в клинической практике на сегодняшний день широкое применение имеют заплаты из ксеногенных (из тканей животного происхождения) и синтетических материалов.
Так, заплаты из бычьего перикарда для закрытия артериотомии обладают преимуществами, связанными с доступностью, износостойкостью, минимальным кровотечением из проколов по сравнению с аутовеной. Однако использование сшивающих агентов на основе глутарового альдегида для стабилизации биоматериала приводит к его кальцификации и может провоцировать цитотоксичность. Заплаты из синтетических матриалов таких, как политетрафторэтилен (polytetrafluoroethylene, PTFE) и полиэтилентерефталат (Dacron) характеризуются гемосовместимыми свойствами и способностью поддерживать эндотелизацию. Однако недостатком данных синтетических материалов является формирование псевдоаневризм в отдаленном периоде. Кроме того, закрытие артериотомии заплатами Dacron ассоциировано с высоким риском инфекционных осложнений и тромбообразования, тогда как при использовании заплат из PTFE необходимо больше времени для гемостаза.
Одним из главных осложнений при использовании заплат является гиперплазия неоинтимы, которая обусловлена клеточной реакцией на инородное тело, миграцией гладкомышечных клеток из прилежащих тканей артерии на внутреннюю поверхность заплаты, их активной пролиферацией и синтезом внеклеточного матрикса. Разрастание неоинтимы приводит к уменьшению эффективного просвета артерии и ее рестенозу в отдаленный послеоперационный период.
Таким образом, использование существующих, в том числе, коммерческих сосудистых заплат хоть и в меньшей степени, но сопряжено с рядом осложнений, таких, как тромбоз, формирование аневризматического выпячивания, рестеноз и других, в результате свойств имплантируемых материалов, изменения геометрии анастамоза и локальной гидродинамики.
Решением данной проблемы может стать создание сосудистой биосовместимой заплаты, содержащей биологически активные молекулы для снижения тромбообразования и гиперплазии неоинтимы, а также регуляции процесса регенерации тканей стенки кровеносного сосуда на основе данного имплантата.
Известны сосудистые заплаты из PTFE и Dacron, содержащие биологически активные вещества, которые препятствуют воспалителительной реакции, тромбообразованию и гиперплазии неоинтимы (US 2003/0216758 A1: Int. Cl. А61В 17/08. Coated surgical patches / Pierre E. Signore (CA); appl. no. 10/331137, filed 27.12.2002; pub. date 20.11.2003). В качестве биологически активных веществ могут быть использованы антипролиферативные препараты (например, паклитаксел и другие), противовоспалительные препараты (например, ибупрофен, дексаметазон, преднизолон, кортизон, серолимус, рапамицин, интерлейкин-10 и другие), антиагреганты (например, аспирин, клопидогрел, симвастатин, цилозол и другие), антикоагулянты (например, гепарин, низкомолекулярный гепарин, гирудин и другие) и фибринолитики (например, активатор тканевого плазминогена, урокиназа, стрептокиназа и другие) как по отдельности, так и в комбинациях. Заплаты покрывают биологически активными веществами напрямую, либо с использованием полимерных (например, полиэтиленвинилацетата, полилактида, желатина и других) или неполимерных (например, этанола, этиленгликоля, фосфатидилглицерола и других) носителей. Покрытие на заплату наносится распылением, в виде гидрогеля, в виде полимерных волокон, либо входит в состав заплаты.
Недостаток предложенных изделий заключается в использовании заплат из небиодеградируемых полимеров, комплаентность которых значительно отличается от комплаентности нативных кровеносных сосудов, что в свою очередь приводит к изменению кровотока в зоне анастомоза, которое обуславливает увеличение гиперплазии неоинтимы. Кроме того, применение антивоспалительных и антипролиферативных препаратов способствует снижению воспалительной реакции, что может привести к нарушению процесса ремоделирования сосудистой заплаты, в том числе, эндотелизации внутренней поверхности и ее интеграции с нативными тканями, так как воспаление является одним из основных этапов ремоделирования.
Известны заплаты для реконструкции стенки артерий и вен, состоящие из небиодеградируемого внутреннего слоя и бидеградируемого внешнего слоя (US 2004/0171978 A1: Int. Cl. A61F 2/06; A61M 5/00. Composite vascular constructs with selectively controlled properties. Shalaby W. Shalaby (US); appl. no. 10/735063; filed 12.12.2003; pub. date 02.09.2004). Внутренний слой представляет собой тканный или вязаный материал из полипропиленовых, полиэстеровых или полиамидных волокон, содержащий иммобилизированные биоактивные молекулы, альбумин и фибриноген, на контактирующей с кровью поверхности. Внешний слой сформирован из биодеградируемой пленки, нетканого или вспененного материала из полиэстеров и их сополимеров (например, полилактида, полигликолида, поликапролактона и других) и содержит ростовые факторы для стимуляции роста сосудистой ткани.
Недостатком таких сосудистых заплат является использование нетканого или вязаного материала для изготовления внутреннего слоя. Структура такого материала будет препятствовать интерстициальной миграции эндотелиальных клеток на внутреннюю поверхность имплантата, что, в свою очередь, является одним из путей эндотелизации. Кроме того, внутренняя поверхность не содержит биологически активных веществ, способных стимулировать привлечение эндотелиальных клеток. Все это может привести к снижению скорости эндотелизации заплаты и увеличит риск тромбообразования. Также, недеградируемая внутренняя поверхность из полипропилена имеет комплаентность, отличную от комплаентности нативного сосуда, что в отдаленный период может привести к гиперплазии неоинтимы и рестенозу.
Известна биосовместимая биодеградируемая сосудистая заплата на основе фибриногена и тромбина (US 2011/0071499 A1: Int. Cl. A6M 25/10; A61K 38/48; A61K 35/00; A61K 9/70; A61P 7/02; A61P 9/12; A61P 7/02; A61P 31/00; A61P 37/08. Free-standing biodegradable patch. Dorna Hakimimehr (US), Raoul Bonan (CA); appl. no. 12/885322; filed 17.09.2010; pub. date 24.03.2011). Заплата изготовлена из смеси или расположенных слоями твердого фибрина и твердого фибриногена. При взаимодействии с водной средой, а также с кровью, происходит полимеризация компонентов с формированием фибриновой пленки. Эластичность материала может регулироваться добавлением различных пластифицирующих веществ (например, эфиров фталата, эфиров себаката, сурфактанта и других). Для формирования прочной непрерывной пленки также могут быть добавлены биодеградируемые полимеры (например, полиангидриды, полилактид, полигликолид, полиэтиленоксид и другие). Кроме того, в заплаты может быть введен широкий спектр биологически активных веществ для их локальной и системной доставки. К таким веществам относятся противовоспалительные, противоаллергические, антибактериальные, противовирусные, антипролиферативные средства, гормоны, антикоагулянты, а также ростовые факторы, белки, гены и клетки для стимуляции роста сосудистой ткани. Высвобождение биологически активных веществ из заплаты осуществляется диффузией или в результате биодеградации изделия.
Недостатком данного технического решения является полимеризация материала с образованием фибринового матрикса только после имплантации и взаимодействии с кровью, что в свою очередь не позволяет контролировать структуру заплаты и ее пригодность для заселения клетками и формирования новой сосудистой ткани до имплантации. В связи с этим данные заплаты пригодны для малоинвазивных операций и не могут быть использованы при реконструкции значительных дефектов сосудистой стенки. Кроме того, достаточно сложно подобрать необходимую дозу биологически активных веществ для введения в заплату, поскольку их высвобождение диффузией и при деградации материала является слабо контролируемым процессом. При этом, слишком высокие дозы препаратов могут привести как локальным, так и к системным осложнениям.
Известна сосудистая заплата на основе шелка тутового шелкопряда, содержащего фиброин шелка, обработанная 4-гексилрезорцином, природным феноловым соединением, обладающим антисептическим, антивоспалительным и антитромботическим действием (Kim C-W, Kim M-K, Kim S-G, Park Y-W, Park Y-T, Kim D-W, Seok H. Angioplasty using 4-hexylresorcinol-incorporated silk vascular patch in rat carotid defect model. Appl Sci 2018; 8: 2388). Заплату изготавливают путем отслаивания шелковой пленки нужной толщины от шелкового кокона. Биологически активное вещество наносится на полученное изделие путем вымачивания шелкового лоскута в 3% спиртовом растворе 4-гексилрезорцинома.
К основным недостаткам данного подхода относится модификация заплаты 4-гексилрезорцином с помощью вымачивания, что не позволяет надежно связать биоактивные молекулы с поверхностью материала и увеличивает вероятность его быстрого вымывание током крови. Кроме того, заплата не содержит биомолекул, способных стимулировать заселение клетками имплантированного материала и его ремоделирование, что может привести к деградации заплаты до момента формирования новой функциональной ткани и разрыву имплантата.
Известна биодеградируемая заплата для сосудистых реконструкций, способная к быстрой эндотелизации (Thitiwuthikiat Р, Ii М, Saito Т, Asahi М, Kanokpanont S, Tabata Y.A vascular patch prepared from Thai silk fibroin and gelatin hydrogel incorporating simvastatin-micelles to recruit endothelial progenitor cells. Tissue Eng Part A. 2015; 21(7-8): 1309-19). Внешний слой заплаты изготовлен из композиции фиброина шелка с желатином для придания механической прочности конструкции, внутренний слой представлен желатиновым гидрогелем с мицеллами, содержащими симвастатин. В свою очередь, симвастатин представляет собой гиполиподемический препарат, для которого также показано участие в процессе активации эндотелиальных прогениторных клеток костного мозга и их миграции в область повреждения стенки кровеносного сосуда. Контролируемый выход симвастатина в зону регенерации тканей осуществляется с помощью полимерных мицелл из олигомера L-лактида, помещенных в гидрогель из желатина.
Существенный недостаток данных заплат заключается в наличии желатинового гидрогеля в составе, который обладает низкой тромборезистентностью и может быть причиной тромбоза сосуда. Кроме того, желатин является белком животного происхождения, что увеличивает риск аллергических реакций.
Наиболее близким к заявленному техническому решению является состав биодеградируемого сосудистого графта с модифицированной поверхностью для регенерации тканей кровеносного сосуда в месте имплантации (RU 2675269 С1; МПК A61L 27/00. Способ изготовления биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра с модифицированной поверхностью. Антонова Л.В., Сильников В.Н., Кудрявцева Ю.А., Королева Л.С., Миронов А.В., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С.; №2018105259 заявл. 12.02.2018; опубл. 18.12.2018). Сосудистый графт малого диаметра (<5 мм) изготовлен из смеси биодеградируемых полимеров, поликапролактона и полигидроксибутирата/валерата, метом электроспининга, после чего на внутреннюю поверхность иммобилизованы молекулы циклического c[RGDFK] пептида.
Недостаток данного подхода заключаются в использовании циклического c[RGDFK] пептида, который хоть и обеспечивает улучшение адгезии клеток к материалу после его имплантации в кровеносное русло, но в то же время ассоциирован с высоким уровнем кальцификации имплантата. В свою очередь, кальцификация имплантатов является одной из главных проблем сердечно-сосудистой хирургии, поскольку приводит к неэффективному функционированию протезов и их дисфункциям (Глушкова Т.В., Овчаренко Е.А., Севостьянова В.В., Клышников К.Ю. Особенности кальцификации элементов сердечно-сосудистой системы и их заменителей: состав, структура и локализация кальцификатов. Кардиология. 2018; 58(5): 72-81). Кальцификация сосудистых заплат может стать причиной расслоения имплантата, увеличения его жесткости, и, как следствие, нарушения гемодинамики в месте имплантации с дальнейшим разрастанием соединительной ткани на внутренней поверхности и рестенозом сосуда.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание биосовместимой биодеградируемой заплаты, имеющей высокопористую структуру, с иммобилизованными на поверхности линейными пептидами, содержащими последовательность аминокислот аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) для усиления адгезии клеток на поверхности имплантата, быстрой эндотелизации его внутренней поверхности, заселения пористой структуры, формирования новой сосудистой ткани с замещением материала заплаты.
Технический результат достигается тем, что:
- для изготовления сосудистых заплат используется композиция синтетического биодеградируемого полиэстера, ε-поликапролактона (ε-polycaprolactone, PCL), и природного биодеградируемого полиэстера, полигидроксибутирата/валерата (poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV). PCL обладает высокой прочностью и эластичностью, в то время как PHBV является высоко биосовместимым материалом. Использование смеси двух полимеров позволяет регулировать механические свойства, скорость деградации и биосовместимость изделия.
- заплаты изготавливают из раствора смеси PHBV/PCL методом электроспинига. В результате этого они имеют высокопористую структуру, которая обеспечивает большую площадь поверхности материала к его объему и имитирует архитектонику нативного внеклеточного матрикса. В свою очередь, поверхность данного материала благоприятна для миграции, адгезии, пролиферации и дифференцировке клеток, что делает возможным его заселение клетками после имплантации в организм.
- на поверхность пористого полимерного материала иммобилизируют линейные RGD-пептиды, содержащие алифатическую аминогруппу, а именно ε-аминогруппу лизина (RGDK-пептиды). RGD-содержащие пептиды имеют широкое применение в качестве адгезивных молекул. Последовательность RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота) является доменом белков внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, витронектин, остеопонтин, фибриноген и других, и способен связывать интегрины различных клеток. Кроме того, RGD-пептиды могут действовать как мощный антагонист тромбоцитарного интегрина α2β3 и ингибировать образование тромба (Cheng S., Craig W.S., Mullen D., Tschopp J.F., Dixon D., Pierschbacher M.D.. Design and synthesis of novel cyclic RGD-containing peptides as highly potent and selective integrin alpha IIb beta 3 antagonists. Journal of Medicinal Chemistry. 37(1): 1-8). Благодаря этому, данные пептиды имеют высокий потенциал применения для увеличения функциональности имплантатов, имеющих контакт с кровью, с целью регуляции процесса формирования новых тканей на границе нативных тканей и имплантированного материала (Bellis S.L. Advantages of RGD peptides for directing cell association with biomaterials. Biomaterials. 2011. 32(18): 4205-10). Иммобилизация RGDK-пептидов на всей поверхности высокопористой заплаты из PHBV/PCL, в том числе и в толще изделия, способствует лучшей адгезии клеток после имплантации заплаты in situ. В результате того, что RGDK-пептиды способны связывать интегрины различных клеток, на внутренней поверхности сосудистой заплаты быстро адгезируются преимущественно эндотелиальные клетки, которые формируют эндотелий, а во внутренней части материала и на внешней поверхности - гладкомышечные клетки и фибробласты. В свою очередь клетки синтезируют внеклеточный матрикс и формируют новую ткань, постепенно замещая деградируемый полимерный материал заплаты.
Получение функционально активной сосудистой заплаты осуществляется следующим образом. Высокопористую полимерную заплату изготавливают из раствора смеси PHBV и PCL в трихлорметане с конечной концентрацией смеси полимеров 15%-20% методом электроспининга. При изготовлении изделия используют следующие параметры: подаваемое напряжение - 10-25 кВ, скорость подачи раствора 0,1-5 мл/ч, расстояние между иглой и коллектором - 5-30 см, коллектор - плоская металлическая пластина или металлический вращающийся барабан диаметром 8 мм и более. Процесс электроспининга продолжают до получения изделия толщиной 100-1000 мкм. При использовании в качестве коллектора плоской металлической пластины изделие аккуратно снимают с подложки, при использовании в качестве коллектора вращающегося барабана полученное изделие разрезают вдоль и аккуратно распрямляют с получением полимерного лоскута.
Иммобилизацию RGDK-пептида на поверхности полимерной заплаты осуществляют с использованием линкерной группы, в качестве которой используют амин 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine. Для этого пористую заплату помещают в 10% раствор 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine в смеси изопропанола и воды в соотношении 1:1 при 37°С на 10-60 минут. Далее образец последовательно промывают смесью изопропанола и воды в соотношении 1:1, бидистиллированной водой, 0,1% раствором тритон Х-100 и бидистиллированной водой. При иммобилизации пептида заплату обрабатывают 2% водным растворов глутарового альдегида при 24°С в течение 3 ч, тщательно промывают бидистиллированной водой и помещают в раствор 0,2 мг/мл RGDK-пептида в 50 мМ карбонатном буфере (рН=8,5), содержащем 2,5 мМ цианоборгидрид натрия на 4 ч при 24°С. После присоединения пептида полученное изделие отмывают 0,1% раствором тритон Х-100 и затем бидистиллированной водой.
Сущность изобретения поясняется иллюстрациями.
Фиг. 1. Сосудистые заплаты из PHBV/PCL с линейным пептидом RGDK (А) через 12 месяцев после имплантации в стенку брюшной аорты крыс в сравнении с ксеноперикардом (Б) и в сравнении с заплатами из PHBV/PCL с циклическим пептидом c[RGDFK] (В), окраска гематоксилин и эозин.
Фиг. 2. Сосудистые заплаты из PHBV/PCL с линейным пептидом RGDK (А) через 12 месяцев после имплантации в стенку брюшной аорты крыс в сравнении с ксеноперикардом (Б) и в сравнении с заплатами из PHBV/PCL с циклическим пептидом c[RGDFK] (В), окраска ализариновый красный С.
Фиг. 3. Сосудистые заплаты из PHBV/PCL с линейным пептидом RGDK (А) через 12 месяцев после имплантации в стенку брюшной аорты крыс в сравнении с ксеноперикардом (Б) и в сравнении с заплатами из PHBV/PCL с циклическим пептидом c[RGDFK] (В), окраска ализариновый красный С, флуоресцентная микроскопия.
Пример 1. Функционирование, биосовместимость сосудистых заплат и регенерация сосудистой стенки на основе имплантированной заплаты in situ.
Сосудистые заплаты изготавливали методом электроспининга из 15% раствора смеси PHBV (Sigma-Aldrich) и PCL (Sigma-Aldrich) в трихлорметане при использовании напряжения - 18 кВ, расстояния до коллектора - 15 см, скорости подачи раствора - 0,5 мл/ч, коллектора - вращающегося барабана диаметром 8 мм до формирования изделия толщиной 400 мкм с последующим выкраиванием лоскута. На заплаты иммобилизировали RGDK-пептиды как описано выше. Возможность использования PHBV/PCL заплат с иммобилизированными RGDK-пептидами для реконструкции сосудистой стенки оценивали с помощью их имплантации в стенку аорты крыс. Для определения эффективности ангиопластики с помощью данных заплат проводили их сравнение с заплатами из ксеноперикарда, которые имеют широкое применение в сосудистой хирургии, а также с заплатами PHBV/PCL с иммобилизированными c[RGDFK] пептидами. В свою очередь, c[RGDFK] представляет собой циклический RGD-пептид, с одной стороны которого находится лизин, а с другой - фенилаланин, которые соединяясь, образуют кольцо. Известно, что c[RGDFK] устойчив к протеазам, обладает высокой стабильностью и высоким сродством к эндотелиальным клеткам (Xiao Y., Truskey G.A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophysical Journal. 1996. 71: 2869-2884). При этом заплаты с c[RGDFK] изготавливали аналогичным образом, что и заплаты с линейным RGDK-пептидом, чтобы исключить влияние полимерного материала и процесса его модификации на свойства изделия.
Заплаты имплантировали в стенку брюшной аорты шестимесячных самцов крыс популяции Wistar весом 400-450 г (n=15). Всех животных вводили в наркоз ингаляцией 3% изофлурана. В течение операции анастезию поддерживали 1,5% изофлураном. Все хирургические процедуры выполняли в стерильных условиях. Проводили срединную лапаротомию, открывали забрюшинное пространство, выделяли аорту и пережимали ее ниже почечной артерии и выше бифуркации. Далее осуществляли разрез аорты вдоль ее брюшного отдела протяженностью 1 см. Для вшивания выкраивали заплату длиной 1 см шириной 0,4 см и подшивали ее к рассеченным краям аорты в продольном положении узловыми швами с использованием шовного материала Prolene 8.0. Разрез закрывали послойным ушиванием. После операции всех животных содержали при свободном доступе к пище и воде. Крыс с имплантированными заплатами из PGBV/PCL/RGDK (n=5), ксеноперикарда (n=5) и PGBV/PCL/c[RGDFK] (n=5) выводили из эксперимента через 12 месяцев после имплантации. Заплаты эксплантировали вместе с прилежащими участками нативной артерии и фиксировали в 10% забуференном формалине (Electron Microscopy Sciences) в течение 24 часов при 4°С для гистологической оценки.
Для проведения гистологической оценки эксплантированные фиксированные образцы промывали в проточной водопроводной воде, после чего обезвоживали в серии спиртов с последовательным увеличением концентрации в течение 5 часов. Далее заплаты дважды помещали в ксилол на 1 час. Затем образцы оставляли в смеси ксилол-парафин в термостате на ночь (на 16-18 часов) при 37°С. Заключение образцов осуществляли троекратным погружением в парафин при 56°С на 30-40 мин. Срезы толщиной 8 мкм изготавливали из образцов, заключенных в парафин HISTOMIX (БиоВитрум), с использованием микротома (НМ 325, Thermo Scientific). Полученные срезы помещали в термостат и сушили в течение ночи при 37°С. После полного высыхания образцов их троекратно депарафинировали в ксилоле в течение 1-2 мин и повторно троекратно гидратировали в 96% спирте в течение 1-2 мин.
Для окрашивания депарафинированных срезов гематоксином-эозином их отмывали дистиллированной водой и помещения в раствор гематоксилина Hariss (БиоВитрум) на 15 мин с последующим промыванием водой в течение 3-10 минут. Затем срезы погружали в раствор эозина (БиоВитрум) на 0,5 мин, промывали в воде в течение 1 мин, обезвоживали в градуированной серии спиртов 1 мин и очищали в ксилоле в течение 3 мин.
Для окрашивания по Ван-Гизон депарафинизированные срезы промывали водой и помещали в гематоксилин Вейгерта (БиоВитрум) на 2 минуты, затем отмывали в воде до исчезновения окраски. Далее срезы окрашивали пикрофуксином (БиоВитрум) в течение 2-3 минут, затем промывали проточной водопроводной водой, обезвоживали в градуированной серии спиртов 5 минут, очищали в ксилоле в течение нескольких минут до исчезновения окраски.
После этого полученные препараты исследовали с помощью световой микроскопии с использованием микроскопа AXIO Imager A1 (Carl Zeiss).
Для оценки степени кальцификации заплат определяли присутствие аморфного и кристаллического кальция в эксплантированных образцах с помощью окрашивания срезов ализариновым красным С (Химсервис) и DAPI (Sigma-Aldrich). Гистологические срезы заплат погружали в 2% водный раствор ализаринового красного С на 70 секунд, затем ядра клеток окрашивали раствором DAPI 10 мкг/мл в течение 3 минут. После этого образцы промывали дистиллированной водой и высушивали. Полученные препараты исследовали с помощью световой и флуоресцентной микроскопии с использованием микроскопа AXIO Imager A1.
Результаты исследования заплат из PGBV/PCL/RGDK, ксеноперикарда и PGBV/PCL/c[RGDFK] in vivo в течение 12 показали их удовлетворительное функционирование без разрывов имплантатов и кровотечения в месте имплантации. Оценка биосовместимости и ремоделирования заплат с помощью окраски гематоксилином и эозином, а также по Ван-Гизон, позволила установить, что ксеноперикард подвергался разволокнению и набуханию (фиг. 1Б). При этом в полимерных заплатах PGBV/PCL/RGDK и PGBV/PCL/c[RGDFK] отмечали формирование зрелого эндотелиального слоя на внутренней поверхности (фиг. 1А, 1В). В то же время оба вида полимерных заплат были полностью заселены клетками, синтезирующими внеклеточный матрикс, по всей стенке с небольшим количеством гигантских многоядерных клеток инородных тел во внешней 1/3 образцов (фиг. 1А и 1В). Оценка уровня кальцификации всех образцов показала массивное отложение кальцификатов в ксеноперикарде (фиг. 2Б, 3Б). Также, значительные очаги кальцификации по всей длине имплантата обнаружены в полимерных заплатах с циклическим пептидом c[RGDFK] (фиг. 2В, 3В). В свою очередь, в заплатах с линейным RGDK пептидом наблюдали только отдельные небольшие очаги отложения кальция, располагавшиеся под неоинтимой (фиг. 2Б, 3Б).
Полученные результаты свидетельствуют, что линейный RGDK-пептид не уступает циклическому пептиду c[RGDFK] по способности улучшать адгезию клеток сосудистой стенки при иммобилизации данных пептидов на поверхность полимерных сосудистых имплантатов с целью улучшения их биосовместимости и ускорению ремоделирования тканей. Кроме того, использование иммобилизации линейного RGDK-пептида на высокопористых заплатах из PGBV/PCL ассоциировано с меньшем уровнем кальцификации имплантата по сравнению с пептидом c[RGDFK], что является неоспоримым преимуществом для применения в сердечнососудистой хирургии. Эффективность сосудистых заплат PHBV/PCL/RGDK для реконструкции сосудистой стенки также подтверждается их лучшим ремоделированием по сравнению с коммерческими заплатами из ксеноперикарда, применяемыми в клинической практике.