Способ отбора коров-доноров ооцитов
METHOD FOR SELECTING OOCYTE DONOR COWS

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности репродуктивной биотехнологии для разведения крупного рогатого скота методом трансплантации эмбрионов in vitro.
Основу технологии трансплантации эмбрионов in vitro составляет ряд последовательных технологических операций, к которым относится отбор доноров, и реципиентов; получение, оценка и культивирование ооцитов; подбор спермы от быков производителей, оценка качества спермы, капацитация сперматозоидов; оплодотворение ооцитов; замораживание эмбрионов или пересадка их реципиентам.
Первым этапом в реализации технологии трансплантации эмбрионов in vitro является отбор коров-доноров ооцитов, где используют ограниченное количество особей, которые могут стать улучшателями породы по одному или нескольким значимым признакам. На роль доноров выбирают породистых телок или коров, обладающих высокоценными качествами.
При работе с донорами одним из важнейших этапов в технологии трансплантации эмбрионов является суперовуляция, под которой понимается выделение множества яйцеклеток из яичников коровы в течение одного полового цикла. Для этих целей существуют определенные методы, которые позволяют максимально полно использовать биологический репродуктивный потенциал яичников коров. В основе этого метода лежит синхронный рост множества фолликулов, их созревание с последующей овуляцией. Для этого используют специальные программы гормональной обработки коров доноров.
Зачастую введение гормональных препаратов не оправдывает себя, и планируемое количество ооцитов не всегда получается. В результате происходит существенная трата времени специалистов при работе с донорами, расход дорогостоящих гормональных препаратов. Применение гормональных препаратов зачастую негативно отражается на физиологическом здоровье коров доноров, животное страдает и выпадает из технологической цепи производства.
В технологии трансплантации эмбрионов in vitro большинство специалистов при получении ооцитов от коров доноров не используют схемы гормональных обработок. При вымывании ооцитов не всегда гарантировано стабильное получение ооцитов, и их количество при вымывании колеблется от 0-10 ооцитов. Нестабильное количество при получении ооцитов обуславливает увеличение трудоемкости процесса и увеличение экономических затрат.
В этом отношении становится актуальным вопросом разработка предварительной оценки коров доноров для стабильного гарантированного получения ооцитов.
Поскольку биохимические показатели крови животных, характеризующие интенсивность и качество обменных процессов, протекающих в организме животного, отражают физиологические показатели здоровья, в том числе и воспроизводительные способности, то ряд показателей может служить индикатором для отбора коров доноров с целью получения большего количества ооцитов.
В литературных источниках в большей степени представлен материал по отбору и работе с коровами донорами эмбрионов в технологии in vivo, в то время как по подбору коров доноров ооцитов в технологии in vitro информация практически отсутствует.
Согласно общеизвестному способу, по ГОСТ 28424-2014 «Средства воспроизводства. Эмбрионы крупного рогатого скота. Технические условия» коров доноров эмбрионов отбирают по ряду показателей, в числе которых проводится отбор в состав коров - доноров эмбрионов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Доноров яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) отбирают из поголовья, на которое не наложены ветеринарные ограничения по причине наличия болезни или возбудителя болезни. Доноры яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) должны подбираться с учетом комплекса селекционно-генетических признаков, иметь продуктивность (молочную, мясную, мясомолочную), превышающую стандарт породы. Однако использование данного метода не гарантирует получения ооцитов при проведении процедуры аспирации от коров доноров.
Одним из способов, наиболее часто применяемых в производственной практике на технологическом этапе отбора коров - доноров, является способ прогнозирования ответа на введенные гонадотропины, согласно которому учитывают индивидуальные особенности суперовуляции за счет проведения разовой гормональной обработки животного, отобранного в качестве донора эмбрионов по селекционным признакам и клиническому состоянию здоровья (Попов Д.В., Бригида А.В., Косовский Г.Ю. Руководство по получению и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. - М.: КлабПринт, 2017 г., страницы 7-9. Сайт Интернет: http://ceerb.ru/Rukovodstvo.pdf, 2018 г.). Недостатком вышеизложенного метода является то, что отбирают коров - доноров на основе прогнозируемого показателя - количества желтых тел на яичниках (число овуляций), определяемого после факта проведения разовой гормональной обработки.
Известен патент RU 2032338, опубл. 10.04.1995 «Способ определения потенциальных доноров эмбрионов и ранней половозрелости у овец», который предусматривает яркам в возрасте 11-12 месяцев и овцематкам в период сезонного анэструса инъекцию тестостерона пропионата, преимущественно в дозе 0,225-0,230 мг/кг живой массы, а затем выявление в течение 5 суток животных в половой охоте. Однако заявленный способ предусматривает определение потенциальных доноров эмбрионов только в овцеводстве.
Существует способ отбора коров-доноров эмбрионов в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов (патент RU 2699519, опубл. 05.09.2019) включающий проведение прогнозирования ответной реакции яичников коровы-донора эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами, причем прогнозируют ответную реакцию яичников путем проведения у коровы-донора эндоректального исследования яичника и желтого тела с использованием метода ультразвуковой эхографии и проведения морфометрических измерений параметров яичника и желтого тела.
В качестве ближайшего аналога выбран способ получения эмбрионов от телок- доноров голштинской породы (патент RU 2750208, опубл. 24.06.2021), включающий отбор телок- доноров голштинской породы в возрасте 13-15 месяцев клинически здоровых, имеющих хороший экстерьер, отличную родословную, продуктивность матери за наивысшую лактацию не менее 9000 кг с содержанием жира в молоке не менее 3,9%, белка - 3,3%, индукцию суперовуляции по схеме путем многократного введения в виде инъекций гормональных препаратов, содержащих фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны, и гормональных препаратов для синхронизации половой охоты и регулирования воспроизводительной функции.
Недостатками предлагаемых способов является достаточно трудоемкий процесс, сложность проведения измерения и расчетов. Также все представленные способы описывают способы получения эмбрионов с использованием гормональных препаратов.
Техническим результатом изобретения является повышение количества ооцитов на одну аспирацию, полученных от коров-доноров в результате проведения процедуры вымывания ооцитов в технологии трансплантации эмбрионов in vitro.
Благодаря разработанному способу отбора коров-доноров при вымывании ооцитов увеличивается количество ооцитов на одну процедуру вымывания, что дает возможность максимально использовать биологический репродуктивный потенциал яичников коров, обуславливает снижение трудоемкости процесса при получении ооцитов на одно вымывание и что обуславливает снижение экономических затрат.
Технический результат достигается тем, что в технологию отбора коров-донора дополнительно вводится этап оценки с использованием оценки биохимических параметров крови по прогестерону, холестерину и каротину, что позволяет исключить животных, из которых вымывается малое количество ооцитов.
Пример выполнения
Научно-хозяйственный опыт проводили на коровах черно-пестрой породы. Оценку эффективности предлагаемого способа отбора коров доноров проводили по количеству полученных ооцитов.
Предложенный способ отбора ооцитов у коров-доноров состоит из двух этапов:
1 этап.
Отбор коров доноров ооцитов по ветеринарным и зоотехническим параметрам согласно ГОСТ 28424-2014 «Средства воспроизводства. Эмбрионы крупного рогатого скота».
Для разработки способа было отобрано 67 аналогичные коровы-донора с однотипным кормлением и условиями содержания. Характеристика отобранных коров доноров представлена в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристика коров доноров
Количество коров доноров
Порода
Масса, кг
Количество лактаций
Физиологический статус
67
Черно-пестрая
500-550
2-4
Здоровые животные.2-3 месяц после отела.
2 этап.
Способ оценки с использованием оценки биохимических параметров крови.
Оценку биохимических показателей крови коров доноров проводили по схеме, представленной в таблице 2.
На 10 день полового цикла за 10 дней до планируемой процедуры аспирации ооцитов проводили забор крови из яремной вены по общепринятой методике у коров доноров.
Всего было проведено 67 аспираций из 134 яичников коров доноров.
Аспирацию ооцитов проводили с помощью OPU технологии.
Полученные ооциты доставляли в лабораторию в течении 2 часов, где проводили их подсчет. В среднем за все время исследования было получено 3,18±0,22 ооцитов.
Таблица 2 - Влияние биохимических показателей крови на количество полученных ооцитов
Исследуемый показатель
Значение показателя
Вымыто ооцитов
Проведено аспираций
Количество ооцитов на 1 аспирацию
Прогестерон, нг/мл
1,85±0,10
0-2
21
1,05±0,17
Холестерин, ммоль
1,74±0,11
Каротин, мг%
0,51±0,07
Прогестерон, нг/мл
2,43±0,11<sup>0-2***</sup>
3-4
32
3,41±0,09<sup>0-2***</sup>
Холестерин, ммоль
1,98±0,12
Каротин, мг%
0,87±0,09<sup>0-2**</sup>
Прогестерон, нг/мл
3,39±0,24<sup>0-2***3-4***</sup>
5 и более
14
5,86±0,24<sup>0-2***3-4***</sup>
Холестерин, ммоль
2,23±0,22
Каротин, мг%
1,28±0,21<sup>0-2**</sup>
Примечание: разница достоверна при **p<0,01; ***p<0,001
Оценка полученных результатов позволила установить достоверную взаимосвязь по изучаемым показателям. Установлено достоверно большее значение по количеству полученных ооцитов при более высоком содержании в крови коров доноров прогестерона, холестерина и каротина.
В таблице 3 приведена корреляционная связь между биохимическими показателями крови коров-доноров и количества вымытых ооцитов.
Таблица 3 - Корреляционная связь между изучаемыми показателями
Показатели
Описание
Прогестерон - количество вымытых ооцитов
Коэффициент корреляции Спирмена (ρ) равен 0.801.Связь между исследуемыми признаками - прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока - высокая.Число степеней свободы (f) составляет 65.t-критерий Стьюдента равен 10.788.Критическое значение t-критерия Стьюдента при данном числе степеней свободы составляет 1.998.tнaбл > tкрит, зависимость признаков статистически значима.
Холестерин - количество вымытых ооцитов
Коэффициент корреляции Спирмена (ρ) равен 0.492.Связь между исследуемыми признаками - прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока - умеренная.Число степеней свободы (f) составляет 65.t-критерий Стьюдента равен 4.552.Критическое значение t-критерия Стьюдента при данном числе степеней свободы составляет 1.998.tнaбл > tкрит, зависимость признаков статистически значима.
Каротин - количество вымытых ооцитов
Коэффициент корреляции Спирмена (ρ) равен 0.643.Связь между исследуемыми признаками - прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока - заметная.Число степеней свободы (f) составляет 65.t-критерий Стьюдента равен 6.772.Критическое значение t-критерия Стьюдента при данном числе степеней свободы составляет 1.998.tнaбл > tкрит, зависимость признаков статистически значима.
Таким образом, применение предложенного способа позволяет гарантировано получать более 3 ооцитов за одну процедуру вымывания.
Возможностью осуществления данного изобретения является применение способа оценки биохимических показателей крови (прогестерона, холестерина и каротина) коров-доноров за 10 дней до процедуры вымывания ооцит кумулюсных комплексов на 10 день полового цикла.