О возможности приложения метода кластерного анализа к результатам физиолого-биохимических исследований растений

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НА УКИ

УДК 51-78:57.087:581.1:577.1

О ВОЗМОЖНОСТИ ПРИЛОЖЕНИЯ МЕТОДА КЛАСТЕРНОГО АНАЛИЗА К РЕЗУЛЬТАТАМ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЙ РАСТЕНИЙ

В.В. Иванищев

Рассмотрены вопросы, касающиеся приложения метода кластерного анализа к ряду результатов, характеризующих биохимические и физиологические процессы, которые протекают в растении, на примере побегов тритикале. Полученные ранее результаты по изучению работы антиоксидантной системы, особенностей водного обмена и фотосинтетических характеристик побегов рассмотрены в новой интерпретации. Отмечено, что применение метода кластерного анализа позволяет, не только показать хорошо известные наиболее тесные взаимосвязи между отдельными параметрами, но и обнаружить новые связи, которые, безусловно, требуют объяснений с точки зрения биохимии и физиологии и, возможно, дополнительных исследований.

Ключевые слова: кластерный анализ, побеги тритикале, антиоксидантные системы, фотосинтез, водный обмен

Введение

Физиолого-биохимические исследования состояния растений в различных условиях эксперимента к настоящему времени привели к накоплению огромного количества данных об особенностях адаптивных реакций, их взаимосвязи и взаимозависимости. Наблюдения и исследования в области токсикологии в еще большей степени обогащают и расширяют данную картину фактических данных. Это позволяет выстраивать различные модели, описывающие стратегию адаптивных реакций и процессов организма, которые обеспечивают выживание биологических систем (организмов) в разных условиях среды или эксперимента. При этом обнаруживаются общие и особенные аспекты изменений физиологических и биохимических процессов, что обусловлено, в первую очередь, видовой спецификой организмов, несмотря на общую биохимическую природу всех живых существ.

Особый интерес представляют исследования динамики изменчивости признаков и свойств, что позволяет обнаруживать корреляции между ними в качественной и количественной формах. При этом статистическим закономерностям отдается предпочтение. Однако их использование в конкретных экспериментах не всегда возможно в силу недостаточного количества изученных параметров. В результате предлагаемые объяснения носят во многом субъективный характер. В связи с этим сложно обнаруживать общие и особенные черты в

проявлении адаптивных реакций разных организмов, что очень затрудняет понимание и дальнейшее моделирование изменений разных биологических систем в прогностических целях.

Среди известных методов математической статистики, которые в некоторой степени могут помочь в решении проблемы, выделяют такие специализированные пакеты как, STATISTICA, SPSS, STATGRAFICS и другие [1]. С одной стороны, они позволяют обойтись ограниченным количеством данных, в т.ч. с пропущенными по той или иной причине экспериментальными точками. С другой, позволяют обнаружить, какие из параметров являются наиболее существенными и наиболее близко взаимосвязанными, что преодолевает субъективность взгляда исследователя на интерпретацию полученных результатов. В результате может значительно повысится надежность и точность выводов, что будет способствовать развитию моделирования процессов и прогнозированию результатов при использовании моделей.

Указанные программы весьма широко применяют в экономической науке, где присутствуют огромные массивы данных. Расширяются попытки приложения метода кластерного анализа и в области биологических наук. Так, в работе [2] этот метод использован для анализа результатов исследования ответных физиолого-биохимических реакций на стресс клонов растений эвкалипта Eucalyptus globules. Изменения метаболизма злаковых культур при поражении грибными патогенами проанализированы другой группой авторов [3]. Результаты исследования устойчивости линий арахиса к засухе рассмотрены в работе [4], а данные по изучению и анализу результатов с помощью кластерного анализа по оценке солеустойчивости сортов риса проведено Chunthaburee с соавт. [5]. Значительно больше такой методический подход используется в биотехнологии [6].

Вместе с тем, можно говорить об очень ограниченном опыте приложения метода кластерного анализа к результатам конкретных физиолого-биохимических исследований, что может быть связано со сложностью интерпретации результатов в рамках такого метода. О необходимости помочь использовать компьютерные технологии в области физиологии растений говорилось и в сравнительно недавней работе [7]. По видимому, расширение использования этого метода будет продолжаться.

В новых работах [8, 9] сделана попытка обработать экспериментальный материал по развитию окислительного стресса, изменению водного обмена и показателей фотосинтеза проростков тритикале методом кластерного анализа. Поэтому цель данной работы состояла в анализе этого опыта и выявлении перспектив его дальнейшего использования.

Методические подходы

Главное назначение кластерного анализа состоит в разбиении множества исследуемых объектов и признаков на однородные группы [1]. Если исходить из этого посыла, то набор данных о динамике физиологических и/или биохимических параметров можно рассматривать как уже некую совокупность предварительно разбитых на соответствующие группы данных. В этом аспекте нет нужды проводить какие-то дополнительные манипуляции. Кроме того, кластерный анализ позволяет рассматривать множество исходных данных разной природы. Поэтому есть резон попытаться проанализировать данные об изменении самых разных характеристик и свойств за определенный промежуток времени.

Важным шагом в подготовке данных для анализа играет их унификация, поскольку величины одного признака могут меняться в пределах одного порядка, а другого - в десятки или сотни раз. Для преодоления этой проблемы рекомендуется провести предварительную стандартизацию данных. Она достигается разными путями и может включать деление каждой величины (данных одного ряда, показателя) на среднюю арифметическую, деление каждого отклонения от среднего на величину среднеквадратического отклонения и т.п. [1].

Для оценки близости объектов используют понятие расстояния между объектами, которое может не иметь привычного геометрического выражения. Поэтому в таком случае используют понятия Евклидова расстояния, расстояния Чебышева, Манхэттеновского расстояния и др. Наиболее популярной метрикой считается Евклидово расстояние, отражающее геометрическое расстояние в многомерном пространстве [1].

В оценке результатов физиологических и биохимических параметров, по-видимому, следует использовать иерархические методы кластерного анализа, которые состоят в последовательном объединении меньших кластеров в большие. В этом случае на первом шаге в единый кластер объединяются наиболее похожие (по динамике) объекты. Далее кластеры объединяются до тех пор, пока все данные не образуют единый кластер. Конечная картина представляет собой дендрограмму [1].

Расстояние между кластерами определяется с помощью разных методов. Одним из них является метод Варда (Ward), в котором используются величины внутригрупповой суммы квадратов отклонений, поэтому он направлен на объединение наиболее близко расположенных кластеров [1].

Используя описанные подходы, были проанализировали результаты физиолого-биохимических экспериментов, проведенных ранее [10-12], с применением метода кластерного анализа [8, 9], который позволяет выстроить систему отношений между отдельными данными [1].

Результаты и обсуждение

Исследование окислительного стресса. В работе [8] впервые проведен кластерный анализ данных по динамике ряда показателей окислительного стресса и работы антиоксидантной системы проростков тритикале в ответ на кратковременный стресс, создаваемый присутствием в среде хлорида натрия в концентрации 120 мМ. Построение дендрограммы, включающей показатели окислительного стресса, не противоречили известным данным о тесной взаимосвязи между биохимическими путями образования таких активных форм кислорода, как пероксид водорода и супероксидрадикал, которые вызывают повреждение биологических мембран, обозначаемое как перекисное окисление липидов [13, 14].

Построение дендрограммы, включавшей как низкомолекулярные (содержание аскорбата и глутатиона), так и высокомолекулярные (активность ферментов каталазы, аскорбат-пероксидазы, глутатион-редуктазы, гваякол-пероксидазы) показатели антиоксидантной защиты, обнаружило формирование кластера первого порядка, образованного содержанием глутатиона и активностью глутатион-редуктазы, что вполне объяснимо с биохимической точки зрения [13]. При этом ранее также была показана важная роль глутатиона в устойчивости разных видов растений к солевому стрессу [15]. Поэтому можно говорить о непротиворечивости полученных результатов анализа известным данным. Возможно, что именно глутатиону отведена ведущая роль в процессах, связанных с солеустойчивостью. Предполагаемая важная роль этого антиоксиданта в процессах передачи сигнала для запуска других защитных систем растения, показанная в обзоре [14], в рамках нашего исследования [8] обнаружить было невозможно.

Образование кластеров более высоких порядков происходило путем последовательного включения таких показателей, как активность аскорбат-пероксидазы, каталазы, гваякол-пероксидазы и содержание аскорбата. Такая очередность может говорить об относительной важности и/или последовательности включения разных компонентов антиоксидантной защиты в процессы нейтрализации избыточных количеств образуемых активных форм кислорода в побегах тритикале. Наиболее неожиданным результатом работы явилось участие аскорбиновой кислоты в формировании завершающего обобщающего кластера. Такие результаты не вполне соответствуют широко распространенным представлениям о важности, в первую очередь, аскорбиновой кислоты в антиоксидантной защите клетки [16, 17]. Среди объяснений этого феномена можно отметить многообразие физиологических и биохимических функций, приписываемых этому субстрату [16, 17], в связи с чем в условиях эксперимента в побегах тритикале аскорбат включался в систему антиоксидантной защиты в самую последнюю очередь.

Построение дендрограммы с использованием всех полученных в этой работе [8] данных показало образование первичных кластеров между такими характеристиками как ПОЛ и каталаза, пероксид водорода и глутатион-редуктаза (с подключением глутатиона на величине примерно в 0,2 единицы), аскорбатпероксидаза и гваякол-пероксидаза. Это вновь позволяет говорить о важнейшей роли обмена глутатиона в работе антиоксидантной системы тритикале в условиях засоления. В то же время отмечается теснейшая связь между показателями перекисного окисления липидов и активностью каталазы, что только подтверждает хорошо известные данные о связи этих показателей в антиоксидатной защите растений [18, 19].

Исследование показателей водного обмена и фотосинтеза. В работе [9] кластерный анализ динамики показателей водного обмена при кратковременном солевом стрессе показал образование сразу трех первичных кластеров между (1) содержанием воды и величиной осмотического потенциала, (2) величиной транспирации и содержанием пролина, (3) содержанием ионов натрия и хлора в побегах тритикале озимого. Далее второй и третий кластеры образовывали кластер второго порядка. И только на очень большой величине Евклидова расстояния все показатели объединялись в единый кластер.

Такие данные ясно показывают, что засоление отражается не только на содержании воды и осмотическом потенциале побегов тритикале, но и на транспирационных процессах. В то же время это хорошо согласуется с наблюдениями того, что задолго до появления соли в побегах происходит закрывание устьиц [20]. При этом скорость проявления этого механизма через 15-30 минут вызывает вопросы о природе сигнала и скорости его распространения, поскольку ионы соли появляются в побегах тритикале только на вторые сутки эксперимента, в то время как осмотический потенциал достоверно снижался уже к 12 часам, причем содержание воды ощутимо падало лишь к 72 часам [9].

Исследование показателей только фотосинтеза в той же работе [9] не дало никаких неожиданных результатов. При этом анализ объединенных данных, включающих показатели водного обмена и фотосинтеза, позволил обнаружить наиболее тесные взаимосвязи между показателями фотосинтетической ассимиляции СО2, содержанием воды и осмотическим потенциалом, что указывает на важность водного режима побегов тритикале для поддержания фотосинтетического процесса. Несколько неожиданным результатом оказалось формирование первичного кластера между активностью карбоангидразы и величиной транспорта электронов, что говорит о существенной роли фермента в этом процессе. Однако такая картина обычно не рассматривается в принципе.

Обобщение всех полученных результатов по изучению показателей водного обмена, фотосинтеза, проявлений окислительного стресса и работы антиоксидантной системы побегов тритикале позволило обнаружить наиболее тесные (и несколько неожиданные) взаимосвязи между (1) содержанием пероксида водорода и транспортом электронов, (2) содержанием воды и активностью глутатион-редуктазы, (3) содержанием супероксид-радикала и активностью аскорбат-пероксидазы (рисунок).

Tree Diagram for Variables Ward's method Euclidean distances

ile роке ид Трансг эпектр Сод воды Глут-редуктаза Супероксид АПО Осм. потенциал

ИФ РБФК Глутатион Хлф Каротнноиды Гваякол-ПО

ПОЛ Каталаза КА

Транспирация Продин Устьичная провод. Аскорбиновая к-та

О 1 2 3 4 S

Linkage Distance

Кластерный анализ результатов исследования показателей побегов тритикале в условиях кратковременного засоления

Среди кластеров второго порядка было неожиданным (1) объединение в единый - первых двух кластеров; (2) формирование кластера, образованного основными пигментами фотосинтеза, с активностью гваякол-пероксидазы; а также первичного кластера между величиной перекисного окисления липидов и активностью каталазы (3) с активностью карбоангидразы. Всё это требует дополнительных

Н

биохимических изысканий, которые могли бы в полной мере прояснить описанную картину.

К сожалению, в других работах с использование кластерного анализа по оценке сортов растений арахиса к действию засухи [4] и растений риса к засолению [5], соответственно, подобная взаимосвязь между физиолого-биохимическими параметрами не приводится.

Таким образом, показано, что использование кластерного анализа для оценки физиолого-биохимических параметров растения позволяет выявить не только хорошо известные взаимосвязи между отдельными показателями, но и обнаружить новые, которые вызывают необходимость поиска ответов на возникающие вопросы.

Список литературы

1. Буреева Н.Н. Многомерный статистический анализ с использованием ППП "STATISTICA". Нижний Новгород: ННГУ. 2007. 112 с.

2. Physiological and biochemical responses to severe drought of nine Eucalyptus globules clones: a multivariate approach / V. Granda, C. Delattore, C. Cuesta [et al.] // Tree physiology. 2014. V. 34. Iss. 7. P. 778-786.

3. Common motifs in the response of cereal primary metabolism to fungal pathogens are not based on similar transcriptional reprogramming / L.M. Voll, R.J. Horst, A.-M. Voitsik [et al.] // In: Computational approaches in aid of advancing understanding in plant physiology. Alisdair Fernie, ed. Frontiers in plant science. 2011. V.2. P. 46-62. - doi: 10.3389/fpls.2011.00039.

4. Cluster analysis to select peanut drought tolerance lines / J.W. de Lima Pereira, E.C. Alves da Silva, L. Nunes da Lus [et al.] // Aust. J. of Crop Sci. 2015. V. 9 (11). P. 1095-1105.

5. Physiological and biochemical parameters for evaluation and clustering of rice cultivars differing in salt stress at seedling stage / S. Chunthaburee, A. Dongsansuk, J. Sanitchon, [et al.] // Saudi J. Biol. Sci. 2016. V. 23 (4). P. 467-477.

6. Klyuchko O.M. Cluster analysis in biotechnology // Biotechnologia Acta. 2017. V.10. No 5. P. 5-18.

7. Fernie A.R. Editorial overview - computational approaches in aid of advancing understanding in plant physiology // Frontiers in plant science. 2011. V. 2. P. 5- 7.

8. Иванищев В.В., Жуков Н.Н. Проявления окислительного стресса в проростках тритикале при кратковременном действии хлорида натрия // Бутлеровские сообщения. 2017. Т. 52. № 11. С. 123-130.

9. Иванищев В.В., Жуков Н.Н. О взаимосвязи показателей водного обмена и фотосинтеза проростков тритикале при кратковременном действии хлорида натрия // Бутлеровские сообщения. 2018. Т. 53. № 3. С. 35-42.

10. Жуков Н.Н., Гарифзянов А.Р., Иванищев В.В. Динамика активности антиоксидантных ферментов в органах хTriticosecale на фоне NaCl-засоления // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2012. № 2. С.285-291.

11. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Иванищев В.В., Кособрюхов А.А. Регуляция водного обмена у тритикале озимого в условиях NaCl-засоления // Вюник Харьювского нащонального аграрного ушверситету. Серiя бюлопя. 2013. Т. 1. № 28. С. 34-43.

12. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Кособрюхов А.А., Иванищев В.В. Функциональное состояние фотосинтетического аппарата проростков тритикале при хлоридном засолении // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2014. № 1. С. 280290.

13. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Иванищев В.В. Образование и физиологические реакции активных форм кислорода в клетках растений // Современные проблемы науки и образования. 2011. Т. 2. https://elibrary.ru/download/elibrary 16903824 79256112.pdf.

14. Колупаев Ю.Е. Активные формы кислорода в растениях при действии стрессоров: образование и возможные функции // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Сер. Биология. 2007. Т. 3. № 12. С. 6-26.

15. Role of glutathione in abiotic stress tolerance / Waskiewicz A., Gladysz O., Szentner K., Golinski P. // Oxidative Damage to Plants Antioxidant Networks and Signaling (P. Ahmad. ed.). USA: Academic Press is an imprint of Elsevier. 2014. P. 149-181.

16. Short Term Effect of Salt Shock on Ethylene and Polyamines Depends on Plant Salt Sensitivity / Zapata P.J., Serrano M., Garcia-Legaz M.F. [et al.] // Front. Plant Sci. 2017. Vol. 8. P. 855- 865.

17. Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений: монография. Калининград: Калинингр. ун-т. 1997. 120 c.

18. Yang T., Poovaiah B.W. Hydrogen peroxide homeostasis: activation of plant catalase by calcium/calmodulin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 4097-4102.

19. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. M.: Дрофа. 2010. 640 c.

20. Веселов Д.С. Рост растяжением и водный обмен в условиях дефицита воды. Автореф. дис.... докт. биол. наук. Уфа. 2009. 47 c.

Иванищев Виктор Васильевич, д-р биол. наук, профессор, зав. кафедрой, avdey_VV@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого

ON THE POSSIBILITY OF AN APPLYING THE METHOD OF CLUSTER ANALYSIS TO RESULTS OF PHYSIOLOGICAL-BIOCHEMICAL INVESTIGA TIONS OF PLANTS

V. V. Ivanishchev

The paper deals with the application of the method of cluster analysis to a series of results characterizing the biochemical and physiological processes that occur in the plant, using the example of triticale shoots. The results obtained earlier on the study of the work of the antioxidant system, the features of water exchange and photosynthetic characteristics of shoots are considered in a new interpretation. It is noted that the application of the cluster analysis method allows not only to show the well-known closest interrelations between individual parameters, but also to discover new links that, of course, require explanations from the point of view of biochemistry and physiology and, possibly, additional studies

Key words: cluster analysis, triticale shoots, antioxidant systems, photosynthesis, water exchange

Ivanishchev Viktor Vasiljevich, Doctor of Biology, Professor, Head of the Department, avdey VVamaiL ru, Russia, Tula, Tula State Lev Tolstoy Pedagogical University