СРЕДСТВО ДЛЯ ИММУНОКОРРЕКЦИИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНЫХ
PREPARATION FOR IMMUNE CORRECTION OF ANIMAL ORGANISMS

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к препаратам, воздействующим на иммунную систему организма животных.
Необходимость применения существующих и разработка новых иммуномодулирующих препаратов в ветеринарной медицине диктуется большим распространением среди животных, особенно молодых, вторичных иммунодефицитов. Это обусловлено как нарастающим неблагоприятным влиянием на организм загрязнений окружающей среды в результате антропогенного воздействия, так и снижением адаптационных возможностей организма животных к условиям, в которых они находятся, в том числе к воздействию не только патогенных, но и условно патогенных микроорганизмов. Введение иммуномодуляторов в организм при условии объективных показателей в нарушении конкретного звена иммунной системы позволяет изменить иммунный статус животного, устранить или снизить дисбаланс иммунологических показателей. При этом иммунокорригирующие препараты в оптимальных дозах дополняют этиотропное и симптоматическое лечение.
Известны различные иммуноактивные препараты, доводящие до нормы иммунные реакции, подавленные в результате воздействия на организм различных факторов внешней среды.
Известно иммуномодулирующее средство "натрия нукленат" (Natrii nucleinas) - натриевая соль нуклеиновой кислоты, представляющая собой белый или слегка желтоватый порошок, легко растворимый в воде с образованием опалесцирующих растворов, обладающая способностью повышать кроветворную функцию красного костного мозга, стимулировать миграцию и кооперацию Т- и В-лимфоцитов, повышать фагоцитарную активность макрофагов и активность факторов неспецифической гуморальной защиты организма (см., например, В.М.Субботин с соавт. Современные лекарственные средства в ветеринарии. «Феникс», Ростов-на-Дону, 2000, с.343).
Однако инъекцирование этого средства достаточно болезненно, вызывая беспокойство и агрессию животных, что может быть небезопасно для врача.
Известен (-)2,3,5,6-тетрагидро-6-фенилимидазо-2,1-b)-тиазола гидрохлорид, представляющий собой белый аморфный или кристаллический, легко растворимый в воде порошок, названный "Левамизол".
Этот препарат способствует восстановлению измененных функций Т-лимфоцитов и фагоцитов и может регулировать клеточные механизмы иммунологической системы. При этом вследствие избирательной стимуляции регуляторной функции Т-лимфоцитов, левамизол может выполнять функции иммуномодулятора, способного усилить слабую реакцию клеточного иммунитета, ослаблять сильную и не действовать при нормальной реакции (см., например, М.Д.Машковский. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1985, т.2, с.169-171).
Тем не менее при применении этого препарата из-за передозировки возможно не иммуностимулирующее, а иммунодепрессивное, т.е. подавляющее иммунный ответ, действие.
8
6
3
2
2
8
6
3
2
В качестве иммуномодулятора известно применение 2-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4 дион натриевой соли дигидрата, химическая формула которого может быть записана в виде CHNNaО·2НО или CHNNaО - безводный. Препарат представляет собой светло-желтый, легко растворимый в воде кристаллический порошок, названный "Галавит" (Galavitum), получаемый путем нагрева на водяной бане смеси 2-нитрофталгидазида и раствора NaOH в дистиллированной воде в присутствии катализатора, например никель-алюминиевого сплава. Введение этого препарата при слабой реакции клеточного иммунитета, например, при наличии злокачественных новообразований вызывает активизацию макрофагов, интерлейкинов и других острофазных белков. При воспалительных процессах препарат на несколько часов подавляет активность макрофагов, но одновременно усиливает микробицидную систему клеток. (Патент РФ №2113222, кл. А61К 31/04, А61К 31/13).
Недостатком данного лекарственного средства является длительность применения (от 1 до 6 месяцев с перерывами), что в условиях животноводческих ферм и комплексов невозможно. Кроме того, препарат известен только в медицине и для лечения животных не применяется из-за отсутствия схем лечения, кратности и дозировок применения.
Задачей является увеличение спектра воздействия на различные звенья иммунной системы животного, сокращение сроков лечения, доз и кратности применения, доступности и безопасности использования, а также расширение области применения иммунокорригирующих средств и повышения их терапевтического эффекта.
Техническим результатом является коррекция иммунодефицитных состояний животных и птицы за счет средства, обладающего низким уровнем токсичности на живой организм, отсутствием побочных эффектов (аллергизирующего, эмбриотоксического и тератогенного действия) и кумуляции (накопления), невысокой терапевтической дозой, доступностью сырья и простотой получения. Использование данного средства позволяет стимулировать количество циркулирующих нейтрофилов в периферической крови, активизировать миграцию, фагоцитарную и функциональную активность фагоцитов, пролиферацию В- и Т-лимфоцитов за счет увеличения количества Т-хелперов и Т-эффекторов, не влияя на количество Т-супрессоров, что влечет за собой улучшение функциональной активности органов иммунитета и повышение терапевтического эффекта.
Сущность изобретения состоит в применении полимеракриловой кислоты (поликарбоксиэтилена) в качестве иммунокорректора.
Химическая формула этого препарата может быть записана в виде:
Поставленная задача достигается тем, что для коррекции дефектного функционирования иммунной системы животных, согласно изобретению, предложен полимерактивный препарат - полиакриловая кислота, введение которого в организм не сопровождается побочными последствиями, а вызывает системный лечебно-профилактический эффект, основанный на нормализации процессов в самой иммунной системе.
Механизм действия полимерактивного препарата основан на стимуляции лимфокинов, в том числе интерферонов, и нормализации количественных и качественных функциональных показателей Т-системы иммунитета. Усиливается функциональная дифференциация Т-клеток за счет появления маркеров дифференцировки, контролируется рост и развитие лимфоидных клеток за счет их прямого действия на продукцию медиаторов иммунитета.
Получают препарат радикальной полимеризацией акриловой кислоты в водном растворе или среде органических растворителей; процесс экзотермичен. Полиакриловая кислота и ее соли - стеклообразные хрупкие бесцветные полимеры. При нагревании кислоты происходит ангидридизация с образованием преимущественно цикличных ангидридных звеньев, выше 250°С - декарбоксилирование и сшивание. Хорошо растворима в воде, диоксане, метаноле, этаноле, формамиде, не растворяется в своем мономере, ацетоне, диэтиловом спирте, углеводородах.
Производственным названием средства для коррекции иммунитета животных является слово «Имактин», образованное от сокращения слов «иммунитет» и «активация».
Оценка иммуногенных и аллергенных свойств предлагаемого соединения проводилась в соответствии с "Методическими указаниями по тестированию естественной резистентности телят" М., 1980; "Тестирование состояния микобицидной системы нейтрофильных гранулоцитов в диагностике иммунного дефицита" и "Методах оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов", И.В.Нестерова с соавт., 1992. Титры антиэритроцитарных антител определяли в РМГА согласно "Иммунологическим методам" под редакцией Г.Фримеля, 1987.
3
3
50
Острую токсичность препарата исследовали при внутримышечном введении белым крысам с массой тела 195-205 г, в диапазоне доз от 4 до 646 мг/кг массы тела (объемы от 0,02 см до 5,0 см). Значение ЛД составило 359,0 мг/кг массы тела.
При исследовании хронической токсичности белым крысам в течение 3-х месяцев с интервалом в 10 дней полимерактивный препарат (поликарбоксиэтилен) вводили парентерально в терапевтической дозе (0,1 мг/кг массы тела), а также дозах, превышающих терапевтическую в три и пять раз. В результате проведенных исследований установлено, что длительное применение изучаемого препарата в терапевтических дозах, а также дозах, превышающих терапевтические в 3 и 5 раз, не оказывает отрицательного влияния на физиологическое и клиническое состояние лабораторных животных.
50
Полученные данные по оценке токсикологических свойств полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) позволяют сделать выводы о его слабой токсичности, не вызывающей выраженного токсикоза. Установленные дозы LD, составляющие 359,0 мг/кг массы тела, и коэффициент кумуляции, равный 12,7, позволяют по ГОСТ «Вредные вещества», отнести данный препарат к 4-му классу опасности (неопасные вещества).
В доказательство решаемых задач проведена опробация предлагаемого средства.
Местное и аллергизирующее действие полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на организм животных.
3
3
3
Местнораздражающее действие препарата изучали путем эпикулярных провокационных накожных аппликаций на морских свинках. Перед началом опыта проводили сенсибилизацию животных путем многократных нанесений на кожу полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена). На выстриженный участок кожи с левой задней трети спины трем морским свинкам ежедневно наносили 18 раз 0,1 см препарата. Затем с правой стороны выстригали такой же участок и наносили по 0,1 см полиакриловую кислоту в первый, третий, пятый, седьмой дни. После выдержки инкубационного периода, продолжавшегося 14 дней, на свежевыстриженный участок кожи наносили разрешающую дозу препарата - 0,3 см. В течение всего эксперимента за морскими свинками вели наблюдения, проводили измерения температуры тела, толщины кожной складки на месте аппликации, определяли местную кожную температуру. Изменений в клиническом статусе животных и на месте аппликации за время проведения опыта и после его прекращения выявлено не было. Эластичность, подвижность и упругость кожи оставалась неизменной. При пальпации места аппликации болевая реакция не отмечалась. Отека кожи и геморрагий не установлено.
На основании перечисленного выше реакцию оценили как отрицательную.
Поскольку конъюнктивальная проба является очень чувствительным тестом и в ряде случаев позволяет выявить реакцию животного на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных пробах, нами двум кроликам под верхнее веко правого глаза вносили по 1 капле 0,7%, 1,5% и 3% раствора препарата. Одновременно для контроля в левый глаз этим же животным вносили по 1 капле физиологического раствора. Учет реакции проводили через 5 минут, 24 и 48 часов с момента введения и учитывали состояние слизистой оболочки глаза и век, наличие инъекции сосудов и секрецию слезы.
Установлено, что у кролика, которому вводили 3% раствор полимерактивного препарата, наблюдалась слабая положительная реакция на введение, проявившаяся слезотечением и слабым покраснением конъюнктивы глаза. Сужение зрачка не наблюдалось. Однако все признаки действия препарата исчезали в течение 1 часа.
Таким образом, применение препарата не оказывает патологически значимых изменений местного аллергического характера на организм животных.
Исследование влияния полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на иммуногенез по иммунному ответу на внутривенное введение эритроцитарного антигена проводили с трехкратной повторностью на 40 беспородных белых мышах с массой тела 18-20 г, разделенных на четыре группы по 10 животных в каждой.
3
Всем мышам, взятым в опыт дважды, с интервалом 7 дней внутривенно ввели по 0,2 см 10% взвеси отмытых PBS (рН-7,2) эритроцитов барана на физиологическом растворе.
Животным первой опытной группы дважды, вместе с введением эритроцитов, инъецировали внутримышечно препарат из расчета 0,5 мг/кг массы тела; мышам 2-й и 3-й опытных групп изучаемый препарат вводили аналогично в дозе 0,25 мг/кг и 0,1 мг/кг массы тела. Десяти мышам контрольной группы вместо препарата вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.
Через 7 дней после второго введения эритроцитов у мышей всех групп взяли кровь и определили уровень антиэритроцитарных антител в РМГА. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние различных доз полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на титры антиэритроцитарных антител
№ п/п
Группа
Доза препарата, мг/кг массы тела
Средние титры антител в РМГА
1
1-я опытная
0,5
1: 51
2
2-я опытная
0,25
1:80
3
3-я опытная
0,1
1:256
4
Контрольная
нет
1:26,7
Как видно из данных таблицы 1, наиболее высокие титры антиэритроцитарных антител были у животных 3-ей опытной группы, которым в качестве стимулятора иммуногенеза ввели препарат в дозе 0,1 мг/кг массы тела - 1:256. При введении этого препарата в более высоких дозах - 0,25 мг/кг массы тела и 0,5 мг/кг массы тела титры антител были значительно ниже и соответственно достигали значений 1:80 и 1:51.
Основываясь на полученных результатах, в дальнейшем, проводили изучение полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) в дозе 0,1 мг/кг массы тела животного при внутримышечным введении.
Исследование влияния полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на фагоцитоз in vivo проводили на белых беспородных крысах, которым внутримышечно вводили препарат в различных дозах от 0,1 до 1,0 мг/кг массы тела. Через 48 часов животных умерщвляли хлороформом, вскрывали, а затем с помощью шприца из сердца отсасывали кровь, в которую добавляли антикоагулянт.
Реакцию проводили на специальных плато для серологических исследований, в лунки которых вносили по 0,2 мл исследуемых проб стабилизированной крови и добавляли равный объем суспензии суточной тест-культуры St.aureus 209р, содержащий 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Перемешивали легким встряхиванием и инкубировали при t 37°С в течение 30 и 120 минут. После инкубации делали из лейкоцитарного слоя мазки на предметных стеклах, фиксировали в этаноле 20 минут и окрашивали по Романовского-Гимза в течение 30 минут.
Учет результатов осуществляли под микроскопом при увеличении 90 раз. Подсчитывали фагоцитарную активность, фагоцитарный индекс, фагоцитарную емкость и фагоцитарное число, определяли завершенность фагоцитоза.
Результаты эксперимента свидетельствуют (таблица 2), что препарат в дозах от 0,1 до 1,0 мг/кг массы тела оказывает стимулирующее действие на фагоцитоз, усиливая поглотительную и переваривающую активность нейтрофилов.
Таблица 2
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на фагоцитоз
Группа
Доза препарата
ФА
ФИ
ФЕ
ФЧ
ЗФ
1 опыт
0,1 мг/кг
40,6±3,3
0,7±0,04
787,9±16
1,73±0,05
1,17±0,06
2 опыт
0,6 мг/кг
34,7±3,5
0,69±0,09
961,1±13
1,7±0,01
1,19±0,03
3 опыт
1,0 мг/кг
36,7±3,4
0,65±0,1
714,7±10,8
1,74±0,01
1,2±0,03
контроль
-
31,3±0,6
0,58±0,06
641,3±9
1,52±0,1
1,03±0,05
Обоснование влияния полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на функциональный потенциал нейтрофильных гранулоцитов.
Исследование проводили на 40 белых беспородных крысах, разделенных на 4 группы по 10 животных в группе. Препарат крысам вводили внутримышечно в дозировках 0,1-1,0 мг/кг массы тела. Через 48 часов после введения у животных отбирали кровь из боковой вены хвоста. Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на функциональный потенциал нейтрофильных гранулоцитов определяли в спонтанном и стимулированном НБТ-тесте, согласно методическим рекомендациям «Тестирование состояния микробицидной системы гранулоцитов в диагностике синдрома иммунного дефицита», Краснодар, 1992.
Полученные образцы крови белых крыс стабилизировали 25% раствором ЭДТА в соотношении 10:1 и наносили каплю крови на середину хорошо обезжиренного предметного стекла, добавляли 10 мкл гепарина в разведении 20 ед/мл физиологического раствора, 10 мкл 0,1% водного раствора тетранитросинего тетразолия и 10 мкл нейтрального физиологического раствора. Перемешивание осуществляли осторожным покачиванием стекла. Инкубировали при температуре 37°С в течение 15 минут и охлаждали 15 минут при комнатной температуре. Излишек крови осторожно удаляли наклоном стекла на 45°. В результате чего на предметном стекле остается микролейкоконцентрат, ограниченный хорошо видимыми контурами капли. Полученный препарат фиксировали этанолом в течение 3 минут, промывали дистиллированной водой и окрашивали ядра 0,5% раствором нейтрального красного на ЗФР, рН-7,0 в течение 1 минуты. При проведении НБТ-теста со стимуляцией лабораторным штаммом St.aureus 209р в разведении 1 млрд. микробных тел в мл физиологического раствора вместо физиологического раствора добавляли 10 мкл микробной взвеси и через 2 минуты вносили раствор тетранитросинего теразолия. Подсчет результатов осуществляли под микроскопом при увеличении 90. Подсчитывали количество фармазин-позитивных нейтрофилов. Коэффициент мобилизации (КМ) и средний цитохимический индекс (СЦИ) подсчитывали по формулам.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на функциональный потенциал нейтрофильных гранулоцитов.
Группа
Доза препарата
Спонтанный НБТ-тест
КМ
% фармазин-позитивных
СЦИ
1 опыт
0,1 мг/кг
18,0±1,5
0,22±0,03
1,34±0,11
2 опыт
0,6 мг/кг
18,0±2,0
0,21±0,03
1,69±0,15
3 опыт
1,0 мг/кг
16,7±2,6
0,19±0,02
1,19±0,2
контроль
-
15,33±0,9
0,16±0,02
0,91±0,12
Полученные данные свидетельствуют, что полимерактивный препарат (поликарбоксиэтилен), введенный крысам в дозах 0,1 и 0,6 мг/кг массы тела, существенно повышают функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, о чем свидетельствуют показатели спонтанного НБТ-теста. В дозе 1,0 мг/кг массы тела активизация функциональной активности нейтрофилов выражена слабее. Аналогичная ситуация наблюдается и при оценке функционального потенциала нейтрофильных гранулоцитов, о чем свидетельствует показатель КМ.
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на клеточное звено иммунитета и пролиферативные процессы путем определения количества Т- и В-лимфоцитов.
Исследование проводили на 40 белых беспородных крысах, разделенных на 4 группы по 10 крыс. Препарат животным вводили внутримышечно в дозировках 0,1-1,0 мг/кг массы тела. Через 48 часов после введения препарата животных умерщвляли хлороформом, вскрывали и из сердца с помощью шприца отсасывали кровь, в которую добавляли антикоагулянт. Процентное количество Т- и В-лимфоцитов определяли в реакциях спонтанного и комплементарного розеткообразования.
Выделения чистой лейкоцитарной взвеси проводили с помощью фиколл-верограцинового градиента плотностью 1,093. ЕАС-комплекс для проведения комплементарного розеткообразования готовили с применением 2,5% взвеси фиксированных глютаральдегидом эритроцитов быка. В качестве комплемента использовали пуловую сыворотку крови беспородных белых мышей, в разведении
1:10. Антисыворотку против эритроцитов быка получали путем гипериммунизации кроликов. Результаты исследований приведены в таблице 4.
Представленные в таблице данные свидетельствуют о то, что препарат не только стимулирует пролиферацию лимфоцитов, но и нормализует соотношение Т- и В- клеток.
Таблица 4
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на клеточное звено иммунитета
Группа
Доза препарата
Т-лимф., %
Т-лимф., 10×9
В-лимф., %
В-лимф., 10×9
Т-лимф.%/ В-лимф.%
1 опыт
0,1 мг/кг
40,6±6,3
1,29±0,3
30,6±4,2
1,44±0,4
1,33
2 опыт
0,6 мг/кг
39,0±4,0
2,17±1,06
26,33±1,2
1,39±0,6
1,48
3 опыт
1,0 мг/кг
34,3±4,0
1,02±0,03
24,7±5,5
1,03±0,6
1,39
контроль
-
31,3±8,2
1,24±0,12
28,7±4,9
0,83±0,13
1,09
Кроме рассмотренных выше исследований, проводимых на лабораторных животных, были проведены клинические исследования иммунокорригирующей активности полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) для активации и коррекции иммунной системы.
Результаты клинических исследований проиллюстрированы примерами.
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на иммунобиологические показатели и сохранность коров после отела.
Исследования проводили на базе ОАО племзавода «им. В.И.Чапаева» Динского района Краснодарского края.
В первой серии для проведения опыта на МТФ №6 п/з «им. В.И.Чапаева» было отобрано 20 коров в возрасте 2-4 отела, срок стельности - 7-7,5 месяцев. Всех животных по принципу пар-аналогов разделили на две группы по десять коров в каждой группе: опытную и контрольную, и до начала эксперимента отобрали кровь для проведения гематологических, иммунологических, биохимических и серологических исследований.
Всем коровам, участвующим в эксперименте, за 1,5 месяца до отела ввели дважды с интервалом 14 дней вакцину против ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота, сорбированную, инактивированную, выпускаемую ВНИИЗЖ г.Владимир в дозе
3
5,0 см.
Коровам опытной группы внутримышечно ввели препарат полиакриловой кислоты, в дозе 0,1 мг/кг массы телам трижды, с интервалом 7 дней. Животным контрольной группы по аналогичной схеме вводили физиологический раствор в объеме 5,0 см.
Повторно кровь для исследования у коров брали через 14-20 дней после отела, у телят - через 14 дней после второй иммунизации.
Проанализировав состояние коров после отела, установили, что заболеваемость животных в опытной группе была ниже, чем в контрольной. Так, сохранность коров опытной группы после отела составила 100%, а количество дней до первого осеменения - 88,5, тогда как в контрольной группе эти показатели были соответственно 71,4% (выбыло 2 коровы) и 107 дней, или на 2 дня больше, чем в первой, и на 18,5 - чем во второй (таблица 5).
Таблица 5
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на сохранность и оплодотворяемость коров после отела (n=7)
№ группы
Препарат
Сохранность коров после отела
Количество дней до 1-го осеменения
Стельных коров
коров
%
коров
%
1
Поликарбоксиэтилен
7
100
88,5
6
85,7
2
Физ. раствор
5
71,4
107
4
57,1
При изучении гематологических и иммунологических показателей у животных опытной и контрольной групп установили, что исследуемый препарат оказал выраженное влияние на показатели естественной резистентности, а также уровень клеточного и гуморального иммунитета (таблица 6).
Таблица 6
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на показатели крови коров (М±m; n=7)
Показатели
До отела
После отела
контроль
полиакриловая кислота
контроль
полиакриловая кислота
Лейкоциты, 10<sup>9</sup>/л
13,8±2,88
11,81±2,59
6,47±1,5
9,27±2,98
Эритроциты, 10<sup>12</sup>/л
4,17±0,21
4,39±0,16
4,55±0,21
4,45±0,28
Гемоглобин, г/л
11,03±0,32
11,17±0,5
9,2±0,42
9,33±0,29
ЦП, ед.
0,81±0,03
0,79±0,03
0,62±0,04
0,66±0,09
Лейкоформула, % Эозинофилы
3,29±0,92
3,14±0,8
2,0±0,58
1,67±0,33
Нейтрофилы
17,43±3,4
18,86±2,57
27,67±4,06
53,0±8,72
Лимфоциты
79,0±4,12
77,14±3,32
70,0±4,76
44,67±8,45*
Моноциты
0,29±0,18
0,86±0,34
0,33±0,33
0,67±0,33
БАСК,%
83,0±4,03
61,79±9,52
85,7±4,83
89,43±5,27
ЛАСК, ед./л
18,61±5,03
8,57±2,36
18,37±3,79
32,2±4,18*
Ig G г/л
20,63±2,42
20,4±3,85
22,03±1,88
24,79±3,47
Ig А г/л
1,4±0,29
1,33±0,26
0,96±0
1,2±0,12
ФА, %
33,6±2,0
34,86±1,87
18,0±4,36
22,0±2,52
ФЧ, ед.
1,7±0,06
1,7±1,04
2,57±0,41
2,8±0,23
*Р>0,05
Применение препарата позволило снизить уровень лейкоцитов в крови опытных животных с одновременным увеличением количества нейтрофильных гранулоцитов (в 1,9 раза) и моноцитов (в 2 раза).
Результаты наших исследований свидетельствуют, что его использование повышает показатели клеточного иммунитета коров. Так, у животных опытной группы к концу эксперимента произошло увеличение фагоцитарной активности на 22,2%.
Дополнительным показателем клеточного иммунитета, характеризующим агрессивность лейкоцитов (интенсивность фагоцитоза), является фагоцитарное число. В крови опытных коров фагоцитарное число к концу эксперимента имело тенденцию к повышению, составив 2,8±0,054 против 2,57±0,07 показателей контроля (108,9%).
Оценивая гуморальное звено иммунной системы по возрастной динамике изменения лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови коров, было установлено, что применение полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) повышает лизоцимную активность 1,75 раза. Поскольку лизоцим стимулирует фагоцитоз нейтрофилов и макрофагов, синтез антител способен разрушать липополисахаридные поверхностные слои клеточных стенок большинства микроорганизмов, снижение титра лизоцима или исчезновение его в крови приводит к возникновению инфекционных болезней. Поэтому лизоцимная активность сыворотки крови может служить индикатором макрофагальной функции организма и отражать уровень неспецифической защиты.
Помимо этого состояние естественной резистентности организма характеризуется уровнем бактерицидной активности сыворотки крови, которая заключается в способности подавлять рост микроорганизмов и зависит от активности всех гуморальных факторов неспецифической резистентности, являясь ее интегральным выражением. В ходе экспериментов установлено, что уровень бактерицидной активности сыворотки крови опытных животных увеличился на 4,3% по сравнению с коровами контрольной группы.
Исследованиями гуморальных звеньев иммунитета установлено, что применение препарата способствует возрастанию содержания Ig G на 12,7% и Ig А на 25,0%. Титры специфических антител против парагриппа-3 свидетельствуют о более высокой степени латентного переболевания коров контрольных групп (Ig 11, 7 и Ig 13) против Ig 10,6-Ig 11,9 у коров опытных групп (таблица 7).
Таблица 7
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на титры специфических антител к ПГ-3 у коров в РТГА. (n=7)
Препарат
Титры специфических антител до отела
Титры специфических антител после отела
титр
Ig
титр
Ig
полимерактивный препарат
1952,0±768,1
10,29±1,13
2742,9±672,0
11,86±0,63
физ. раствор
1673,14±677
10,43±0,92
4096±0
13±0
Влияние полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) на иммунобиологические показатели и сохранность телят.
При профилактике болезней молодняка для повышения резистентности на фоне нормализации обменных процессов целесообразно применение иммуномодуляторов.
Влияние препарата изучали на телятах айширской породы двухнедельного возраста, которым дважды с интервалом в 14 дней парентерально вводили препарат из расчета 0,1 мг/кг массы тела. Животным контрольной группы вместо иммуностимулятора в тех же объемах вводили стерильный физиологический раствор.
Кроме того, телят в 14-20-дневном возрасте дважды с интервалом 14 дней вакцинировали против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, инактивированной сорбированной вакциной, выпускаемой ВНИИЗЖ, согласно наставлению по применению.
Всех взятых в опыт телят обрабатывали по схеме, применяемой в хозяйстве - гипериммунная сыворотка против колибактериоза телят, по схеме, принятой в хозяйстве, согласно инструкции по применению.
Критериями оценки эффективности применения полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) были показатели массы тела телят при рождении, заболеваемости, сохранности, прироста массы тела, титры специфических антител к ПГ-3.
Анализируя полученные данные, установили, что через 14 дней после введения препарата у телят опытной группы установлено достоверное повышение количества эритроцитов (на 12%-12,7%), гемоглобина (на 9,8%-12,3%), бактерицидной и фагоцитарной активности сыворотки крови, коэффициента мобилизации по НБТ-тесту.
Количество лейкоцитов, напротив, снизилось на 33,6%-40,4%, что может свидетельствовать об отсутствии воспалительных процессов, тогда как у телят контрольной группы данный показатель превышал значения физиологической нормы на 12,4% с одновременным увеличением относительного количества нейтрофильных гранулоцитов и абсолютного количества лимфоцитов.
Бактерицидная активность сыворотки крови у телят опытной группы возросла в среднем на 44,5% по отношению к фоновым показателям и была выше на 40,1%-97%, чем у телят контрольной группы в тот же период.
2
2
Титры поствакцинальных антител к парагриппу-3 крупного рогатого скота составили у опытных телят - Ig 8,8 с колебаниями в пределах 1:64-1:1024. В то время как у телят контрольной группы показатель составлял соответственно Ig 7,8, с колебанием титров специфических антител от 1:32 до 1:256. Заболевания парагриппом-3 в опытной группе телят не отмечали, тогда как в контроле заболело 57% животных.
Сохранность телят опытной группы была выше показателей контроля на 6,7%. Среднесуточные приросты массы тела телят опытной группы превышали показатели контрольных аналогов на 26,6% и составляли 0,654 кг против 0,480 кг.
Таким образом, введение в систему комплексной этиопатогенетической фармакопрофилактики иммуностимулирующего полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) способствует снижению заболеваемости, повышению сохранности молодняка крупного рогатого скота, увеличению прироста массы тела телят.
Примеры получения препарата.
Пример 1.
Для получения 1% раствора полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) в трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником и барботером, поместили 2,5 г (0,035 моль) акриловой кислоты, растворенной в 250 мл дистиллированной воды. Реакцию вели при пропускании аргона и нагревании до 80-85°С в течение 30-32 часов. В качестве инициатора реакции в смесь добавляли 30%-ную перекись водорода в количестве 1 мл.
Процесс вели до достижения характеристической вязкости раствора 0,125-0,135.
Пример 2.
Для синтеза 5% раствора полимерактивного препарата (поликарбоксиэтилена) поступали следующим образом: в трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником и барботером, помещали 12,5 г (0,167 моль) акриловой кислоты, растворенной в 250 мл дистиллированной воды. Реакцию вели при пропускании аргона и нагревании до 80-85°С в течение 30-32 часов. В качестве инициатора реакции использовали 30%-ную перекись водорода в количестве 1 мл. Процесс вели до достижения характеристической вязкости раствора 0,125-0,135.
Пример 3.
Получение 10% раствора проводили по вышеописанной схеме, поместив в колбу 25 мл (0,35 моль) свежеперегнанной акриловой кислоты, растворенной в 250 мл дистиллированной воды.
Разработанный полимер акриловой кислоты с молекулярной массой 9000 обладает более выраженной иммунотропной активностью в сравнении с используемыми ранее полиакрилатами с другой молекулярной массой, получаемых в процессе катализации полимеризации ультрафиолетовым облучением.
В отличие от химических иммуностимулирующих препаратов полимерактивный препарат поликарбоксиэтилен отличается низкой терапевтической дозой, что приближает его к тимическим стимуляторам (аналогам препаратов тимуса).