ЖИДКИЙ СОСТАВ КОНЪЮГАТА ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ
LIQUID COMPOSITION OF HUMAN GROWTH HORMONE WITH PROLONGED ACTION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к жидкому составу конъюгата гормона роста человека пролонгированного действия, не содержащему альбумин, который обеспечивает стабильность конъюгата гормона роста человека пролонгированного действия при хранении в течение длительного периода времени, где конъюгат гормона роста человека пролонгированного действия содержит гормон роста человека, связанный с Fc-областью иммуноглобулина, и обладает длительной стабильностью in vivo по сравнению с нативной формой.
Предшествующий уровень техники
Гормон роста человека (далее - в настоящем описании обозначаемый как hGH) представляет собой дегликозилированный пептидный гормон, секретируемый передней долей гипофиза и взаимодействующий со специфическим рецептором на клеточной поверхности различных тканей таким образом, чтобы стимулировать секрецию других факторов роста, вызывающих увеличение размера различных частей организма. Со времени открытия того, что гормон роста из гипофиза человека является эффективным терапевтическим средством для гипофизарной карликовости, потребность в hGH мгновенно возросла. Однако общее количество hGH, которое можно экстрагировать из гипофиза человека, очень ограничено. Кроме того, после возникновения дегенеративного неврологического нарушения как болезнь Крейтцфельдта-Якоба у детей, которые получали выделенный из трупов hGH, FDA в Соединенных Штатах Америки запретило использование hGH, экстрагированного из гипофизов трупов, на основании предположения, что вызывающие заболевание инфекционные прионы переносили совместно с выделенным из трупов hGH (Roger L., Science 234: 22, 1986). В настоящее время с одобрения FDA коммерчески доступен биосинтетический гормон роста человека, получаемый посредством E. coli с применением способа генной рекомбинации.
Полипептиды, такие как hGH, быстро распадаются вследствие их низкой стабильности, легко расщепляются сывороточными протеазами и удаляются почками или печенью. Таким образом, лекарственные средства, содержащие полипептиды в качестве фармацевтически активных ингредиентов, необходимо многократно вводить пациентам для поддержания их уровней и титров в сыворотке. Однако поддержание высоких уровней активных полипептидов в сыворотке посредством многократного введения белковых лекарственных средств, которые в большинстве случаев находятся в форме инъекций, является болезненным для пациентов.
Для решения этих проблем были предприняты попытки максимально увеличить медицинские эффекты путем улучшения стабильности белковых лекарственных средств в сыворотке и поддержания высокого уровня в сыворотке белковых лекарственных средств в течение длительного периода времени. Таким образом, существует необходимость в составах белковых лекарственных средств, которые обладают повышенной стабильностью и активностью, поддерживаемых на достаточно высоких уровнях без вызывания иммунного ответа у пациентов.
Для стабилизации белков и предотвращения контактирования с протеазой и выведения почками общепринято химически добавлять высокорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG), на поверхность белковых лекарственных средств. Являясь неспецифически конъюгированным с определенными или различными участками целевых белков, PEG может увеличивать растворимость целевых белков, стабилизировать белки и предохранять их от расщепления, не вызывая существенных побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71:137-139). Конъюгирование с PEG может вносить вклад в стабильность белков, но значительно уменьшать их активность. PEG с высокой молекулярной массой обладают пониженной реакционной способностью по отношению к белкам, таким образом снижая выход.
Альтернативной стратегией увеличения стабильности in vivo физически активных белков является использование генетической рекомбинации для слияния целевых белков и белков, имеющих высокую стабильность в сыворотке, которая представляет собой способ сшивания друг с другом соответствующих генов, кодирующих белки, и культивирование клеток животных, трансформированных слитыми генами. Например, опубликовано, что слитые белки, для которых известно что альбумин или его фрагменты увеличивают стабильность белков, сливали с целевыми белками посредством генетической рекомбинации (международная публикация патента WO 93/15199 и WO 93/15200, европейская публикация патента EP 413622).
В патенте США № 5045312 описано, что hGH, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином или иммуноглобулином мыши с использованием сшивающего средства, обладает повышенной активностью по сравнению немодифицированным гормоном роста. Единственные сшивающие средства, упомянутые в патенте, представляют собой низкомолекулярные соединения, такие как карбодиимид или глутаральдегид. Однако такие низкомолекулярные сшивающие средства не обеспечивают гомогенных композиций вследствие их неспецифических связей и могут быть токсичными in vivo. Кроме того, в этом патенте раскрыто только увеличение активности гормона роста посредством химического связывания, но не показан эффект химического связывания на активность других полипептидных лекарственных средств, без интерпретации корреляции со стабильностью белков, такой как увеличение устойчивости и времени полувыведения из сыворотки.
Недавно конъюгаты, полученные между физиологически активными полипептидами с Fc-областью иммуноглобулина и непептидным полимером, были предложены в качестве составов пролонгированного действия, которые обеспечивают белковые лекарственные средства с минимальным снижением активности и увеличением стабильности, как описано в патенте Кореи № 10-0567902 (Physiologically active polypeptide conjugate having improved in vivo durability) и в патенте Кореи № 10-0725315 (Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof).
Согласно этим способам hGH можно использовать в качестве физиологически активного полипептида таким образом, что можно получать конъюгат hGH пролонгированного действия. Для таких конъюгатов hGH пролонгированного действия, которые необходимо использовать в качестве лекарственных средств, необходимо, чтобы сохранялся медицинский эффект hGH in vivo одновременно с предохранением его от происходящих физико-химических изменений, таких как денатурация, агрегация, всасывание или гидролиз, вызванные светом, нагреванием или примесями в добавках. По сравнению с hGH размер и молекулярная масса конъюгата hGH пролонгированного действия больше и, таким образом, его труднее стабилизировать.
Как правило, белки обладают очень коротким периодом полувыведения и для них показана денатурация, такая как агрегация мономеров, осаждение при агрегации и адсорбция на поверхности сосудов при воздействии неподходящих температур, на поверхности раздела вода - воздух, высокого давления, физической или механической нагрузки, органических растворителей, бактериальной контаминации и т.д. При денатурации белки теряют свои естественные физико-химические свойства и физиологическую активность. Ввиду того, что в большинстве случаев денатурация белков является необратимой, для денатурированных белков почти невозможно восстановить их естественные свойства.
Абсорбированным белкам свойственно агрегировать, т.к. они денатурируют. Агрегированные белки могут действовать как антигенные вещества при их инъекционном введении в организм и, таким образом, следует вводить белки, которые являются в достаточной степени стабильными. Исследовали различные способы предотвращения денатурации белков (John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43, No5, 220-224, 1989, David Wong, Pharm. Tech. October, 34-48, 1997, Wei Wang, Int. J. Pharm., 185, 129-188, 1999, Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25, 267-340, 1986, Michelle et al., Int. J. Pharm. 120, 179-188, 1995).
Для некоторых белковых лекарственных средств применяли способ лиофилизации для устранения проблем со стабильностью. Однако лиофилизированные продукты затруднительно растворять в растворителях для инъекции. Кроме того, для лиофилизации необходима промышленная лиофильная сушилка, увеличивающая капитальные затраты при получении белковых лекарственных средств. Для сохранения стабильности белков также предложено измельчение белков в порошок распылительной сушилкой, но это не является экономически выгодным ввиду низкого выхода продукта. Кроме того, воздействие высоких температур при сушке распылением оказывает негативное побочное действие на сами белки.
Исследовали стабилизаторы, появившиеся в качестве альтернативного подхода, преодолевающего эти ограничения, т.к. при их добавлении к растворам белковых лекарственных средств они обладают способностью подавлять физико-химические изменения белковых лекарственных средств и обеспечивать in vivo медицинскую эффективность даже после длительного хранения. В качестве стабилизатора для различных белковых лекарственных средств широко применяли сывороточный альбумин человека и его эффективность была доказана (Edward Tarelli et al., Biologicals (1998) 26, 331-346).
При введении с сывороточным альбумином человека пациенты подвергаются риску воздействия биологических загрязнителей или патогенов, таких как микоплазма, прионы, бактерии и вирусы, т.к. хотя способ, используемый для очистки альбумина, включает инактивацию, проверку или обследование на такие биологические загрязнители или патогены, эти загрязнители невозможно полностью устранить или инактивировать. Например, способ проверки включает обследование донорской сыворотки на определенные вирусы, но обследование не всегда является надежным. В частности, очень небольшое количество определенных вирусов невозможно детектировать при их наличии.
Вследствие их химических различий различные белки могут постепенно инактивироваться с различными скоростями при различных условиях во время хранения. Таким образом, увеличение срока хранения с помощью стабилизатора не является одинаковым для различных белков. По этой причине стабилизаторы, которые используют, различаются по соотношению к целевым белкам, концентрации и типу в зависимости от физико-химических свойств целевых белков. Вопреки ожиданиям стабилизаторы при использовании в комбинации могут приводить к негативным эффектам вследствие конкуренции и взаимодействия между ними. Кроме того, ввиду того, что природа или концентрация целевых белков при хранении может изменяться, используемые стабилизаторы могут обеспечивать эффекты, отличные от тех, что предполагают. Таким образом, для стабилизации белков в растворах требуется проведение большого количества работ и мер предосторожности.
В частности, для конъюгатов hGH пролонгированного действия, которые получают сшиванием физиологически активного пептида hGH с Fc-областью иммуноглобулина для улучшения устойчивости и стабильности hGH in vivo, необходимы специальные композиции для стабилизации белка, т.к. они полностью отличаются по молекулярной массе и размеру от типичного hGH.
В международной публикации патента WO 93/19776 описан стабильный жидкий состав hGH, содержащий буфер pH 6,0-7,0, аминокислоту, маннит и необязательно консервант, такой как бензиловый спирт. В международной публикации патента WO 94/03198 описан стабильный жидкий состав, содержащий hGH, буфер pH 6,0, неионное поверхностно-активное вещество, консервант и необязательно нейтральную соль или маннит. В патенте США № 6448225 описан стабильный фармацевтически приемлемый жидкий состав, содержащий hGH, буфер pH 6,0, неионное поверхностно-активное вещество и необязательно нейтральную соль или маннит, в котором не требуется глицин. В патенте Кореи № 10-0537260 описан стабильный жидкий состав hGH, содержащий PEG вместо неионного поверхностно-активного вещества и консервант, буфер и средство придания изотоничности в качестве активных ингредиентов, т.к. неионные поверхностно-активные вещества и консерванты вызывают значительное дезаминирование hGH.
Однако hGH и Fc-область иммуноглобулина, хотя и тот и другой являются пептидами или белками, обладают различными физико-химическими свойствами и требуют стабилизации в одно и то же время. Как проиллюстрировано выше, различные белки могут постепенно инактивироваться с различными скоростями при различных условиях во время хранения вследствие их химических различий. Вопреки ожиданиям применение стабилизаторов, пригодных для использования при стабилизации пептидов или белков, в комбинации могут приводить к негативным эффектам вследствие конкуренции и взаимодействия между ними. Таким образом, как и в случае конъюгатов hGH пролонгированного действия, композиции их стабильных составов отличаются от композиций составов для стабилизации одного hGH. В действительности очень трудно открыть состав для стабилизации hGH и Fc-области иммуноглобулина.
Приведшее к настоящему изобретению глубокое и тщательное исследование безопасного хранения в течение длительного периода времени конъюгатов hGH пролонгированного действия-Fc иммуноглобулина, выполненное авторами настоящего изобретения, привело к открытию того, что стабилизирующая композиция, содержащая буфер pH 5,0-6,0, неионное поверхностно-активное вещество, сахарный спирт и соль, может обеспечивать экономически целесообразный жидкий состав с конъюгатом hGH пролонгированного действия, который может вызывать значительное повышение увеличения стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия при хранении в течение длительного периода времени без опасения вирусной контаминации.
Раскрытие сущности изобретения
Техническая проблема
Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение жидкого состава конъюгата hGH пролонгированного действия, содержащего конъюгат hGH пролонгированного действия, буфер pH 5,0-6,0, сахарный спирт, соль и неионное поверхностно-активное вещество, который является улучшенным в отношении стабильности при хранении.
Решение проблемы
В соответствии с одним из его аспектов настоящее изобретение относится к жидкому составу конъюгата hGH пролонгированного действия, содержащего фармацевтически эффективное количество конъюгата hGH пролонгированного действия, буфер pH 5,0-6,0, сахарный спирт, соль и неионное поверхностно-активное вещество.
Как используют в настоящем описании, термин "конъюгат hGH пролонгированного действия" предназначен для обозначения конъюгата, в котором физиологически активный пептидный гормон роста человека связан с Fc-областью иммуноглобулина, и физиологическая активность которого характеризуется увеличенной продолжительностью по сравнению с нативным hGH.
Термин "пролонгированного действие", как используют в настоящем описании, предназначен для обозначения того, что физиологическая активность обладает более длительной продолжительностью по сравнению с нативным hGH.
Пригодный в настоящем изобретении hGH содержит аминокислотную последовательность дикого типа или близкородственный аналог, обладающий активностью, аналогичной активности дикого типа. В настоящем изобретении можно использовать любой hGH, нативный или рекомбинантный. Предпочтительным является рекомбинантный hGH, который получают с использованием E. coli в качестве хозяина. В данной области техники можно использовать любой мутант, полученный из нативного hGH посредством замещения, удаления или вставки аминокислотных остатков при условии, что его биологическая активность значительно не изменяется.
Касательно пригодного в настоящем изобретении Fc иммуноглобулина он может представлять собой Fc иммуноглобулина человека или ее близкородственный аналог, или может происходить от животных, таких как корова, козы, свиньи, мыши, кролики, хомяки, крысы, морские свинки и т.д. Fc-область иммуноглобулина можно выделять из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или их сочетаний или гибридов. Fc-область иммуноглобулина может представлять собой гибрид Fc-области различных доменов иммуноглобулинов, выбранных из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или может представлять собой димер или мультимер одноцепочечного иммуноглобулина, содержащего домены аналогичного происхождения. Предпочтительной является Fc-область, выделенная из IgG или IgM, которые являются наиболее широко распространенными в крови человека, где наиболее предпочтительна Fc-область, выделенная из IgG, который, как известно, повышает время полувыведения связывающих лиганды белков из сыворотки. Fc иммуноглобулина можно получать обработкой нативного IgG определенной протеазой или получать из трансформированных клеток с применением способа генетической рекомбинации. Предпочтительно Fc иммуноглобулина представляет собой Fc рекомбинантного иммуноглобулина человека, продуцируемого E. coli.
IgG разделяют на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и настоящее изобретение может включать их комбинации или гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительной является Fc-область IgG4, редко обладающая эффекторными функциями, такими как CDC (комплементзависимая цитотоксичность). Именно поэтому наиболее подходящая в качестве носителя лекарственных средств по настоящему изобретению Fc-область иммуноглобулина представляет собой дегликозилированную Fc-область, выделенную из IgG4 человека. Полученная от человека Fc-область является наиболее предпочтительной, чем Fc-область, полученная не от человека, которая может действовать как антиген в организме человека и вызывать нежелательный иммунный ответ, такой как образование нового антитела против антигена.
Пригодный по настоящему изобретению конъюгат hGH пролонгированного действия можно получать сшиванием hGH с Fc-областью иммуноглобулина, получаемой указанным выше способом. Способ сшивания можно выполнять поперечным сшиванием hGH с Fc-областью иммуноглобулина посредством непептидильного полимера или получением слитого белка, в которым hGH слит с Fc-областью иммуноглобулина с применением генетической рекомбинации. Предпочтительным является сшивание hGH и Fc-области иммуноглобулина посредством непептидильного полимера.
Пригодный для поперечного сшивания непептидильный полимер можно выбирать из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразрушаемых полимеров, таких как PLA (поли(молочная кислота) и PLGA (поли(молочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их сочетания. Наиболее предпочтительным является полиэтиленгликоль. В объем настоящего изобретения также входят хорошо известные в данной области их производные и производные, которые можно легко получать известным в данной области способом.
Касательно получения конъюгатов hGH пролонгированного действия можно привести ссылку на патент Кореи № 0725315, описание которого, таким образом, полностью включено в качестве ссылки. Специалисты в данной области могут получать конъюгаты hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению согласно документам.
Жидкий состав конъюгата hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению содержит конъюгат hGH пролонгированного действия в фармацевтически эффективном количестве. Как правило, фармацевтически эффективное количество hGH составляет приблизительно 1-3 мг в одноразовом флаконе. Концентрация пригодного по настоящему изобретению конъюгата hGH пролонгированного действия находится в диапазоне от 1 мг/мл до 55 мг/мл и предпочтительно от 15 мг/мл до 25 мг/мл.
Термин "стабилизатор", как используют в настоящем описании, предназначен для обозначения вещества, обеспечивающего стабильное хранение конъюгата hGH пролонгированного действия. Термин "стабилизация" означает потерю активного ингредиента менее определенного процента, как правило, менее 10% и предпочтительно менее 5%. Состав подразумевают стабильным, когда конъюгат hGH пролонгированного действия сохраняет свою активность на уровне 90% или выше, чем исходная активность, и предпочтительно на уровне приблизительно 92-95% после хранения при 10±3°C в течение двух лет, 25±2°C в течение шести месяцев или при 40±2°C в течение от одной до двух недель. Касательно белков, таких как конъюгаты hGH пролонгированного действия, их стабильность при хранении является очень важной для подавления возможного продуцирования их антигенных форм, а также обеспечения их точного дозирования.
Хотя посредством конъюгата hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению они и объединены вместе, физико-химические свойства физиологически активного пептида hGH и Fc-области иммуноглобулина являются отличными друг от друга и их необходимо стабилизировать одновременно. Физико-химические различия между ними могут вызывать постепенную инактивацию различных пептидов или белков с соответствующими скоростями при различных условиях во время хранения. Вопреки ожиданиям использование подходящих для активных пептидов или белков стабилизаторов в комбинации может приводить к негативному эффекту, т.к. они конкурируют или взаимодействуют друг с другом.
Предназначенный одновременно стабилизировать физиологически активный пептид hGH и Fc-область иммуноглобулина таким образом, что активность конъюгата hGH пролонгированного действия можно поддерживать на желаемом уровне в течение длительного периода времени, стабилизатор по настоящему изобретению содержит конкретный буфер, сахарный спирт, соль и неионное поверхностно-активное вещество.
Буфер выполняет функцию поддержания pH раствора в определенном диапазоне, предотвращения резкого изменения pH, которое может привести к инактивации hGH пролонгированного действия. В настоящем изобретении можно использовать любой буфер при условии, что он известен в данной области как фармацевтически приемлемый pH-буфер. Пригодный по настоящему изобретению буфер включает щелочную соль (фосфат натрия или калия или их водородные или двухводородные соли), цитрат натрия/лимонную кислоту, ацетат натрия/уксусную кислоту и их сочетание. Предпочтительными являются цитратный буфер и фосфатный буфер, с наибольшим предпочтением цитратный буфер. Пригодный в настоящем изобретении цитратный буфер может содержать цитрат предпочтительно в количестве от 5 мМ до 100 мМ и более предпочтительно в концентрации от 10 мМ до 50 мM.
Ввиду того, что реакция в растворе может изменяться в зависимости от pH буфера в растворе, pH стабилизатора является очень важным. pH, при котором возникают реакции, и их действие на растворимость различаются от одного белка к другому. Таким образом, трудно стабилизировать белки так, чтобы они сохраняли высокую растворимость и точную третичную структуру без образования денатурированных примесей. В общепринятых составах hGH, как правило, применяют буфер с pH 6,0-7,0 или выше для уменьшения образования примесей и увеличения растворимости белка.
Стабилизатор по настоящему изобретению содержит буфер с pH 5,0-6,0, предпочтительно с pH 5,2-6,0 и более предпочтительно с pH 5,2-5,5. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения после хранения в течение трех месяцев было определено, что содержания примесей #6 и #7, соответствующих дезаминированным примесям hGH, увеличивались, в частности, при низком pH (т.е. pH 5,2) (фиг. 1). Эти данные указывают на то, что ввиду того, конъюгат hGH пролонгированного действия, состоящий из hGH и Fc-области иммуноглобулина, отличается по свойствам от одного hGH, жидкий состав, предназначенный для стабилизации конъюгата hGH пролонгированного действия и увеличения растворимости конъюгата hGH пролонгированного действия, должен отличаться по показателю pH от общепринятых жидких составом hGH.
Кроме того, сахарный спирт действует, увеличивая стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия. В настоящем изобретении сахарный спирт предпочтительно применяют в количестве от 1 до 10% (масс./об.) и более предпочтительно в количестве 5% (масс./об.) от общих объемов состава. Примеры пригодного в настоящем изобретении сахарного спирта включают, но не ограничиваются ими, маннит, сорбит и их сочетание. Как понятно из данных таблицы 4, добавление 0,5% L-Arg-HCl к манниту не оказывало влияния на стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия.
Соль оказывает эффект дополнительной стабилизации конъюгата hGH пролонгированного действия в растворе, а также действует как средство придания изотоничности, которое поддерживает подходящее осмотическое давление при инъекции раствора конъюгата hGH в организм. Соль, как правило, представляет собой водорастворимую неорганическую соль и предпочтительно хлорид натрия.
В составе соль может содержаться предпочтительно в количестве от 5 до 200 мМ и более предпочтительно в количестве 150 мМ, и ее содержание можно доводить в зависимости от типа и количества ингредиентов таким образом, чтобы состав являлся изотоническим.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения оценивали стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия в составах, содержащих буфер с pH 5,0-6,0, сахарный спирт и неионное поверхностно-активное вещество, в присутствии или отсутствии соли. Как результат стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия поддерживалась на заметно более высоком уровне, когда он хранился при 25°C в течение четырех недель в составе, содержащем 5% маннита в присутствии NaCl, в частности 150 мМ NaCl, чем при отсутствии NaCl (таблица 2). В отличие от общепринятого hGH конъюгат hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению можно стабилизировать в составе, содержащем 1-10% (масс./об.) сахарного спирта и 5-200 мМ NaCl, и дополнительно стабилизировать в составе, содержащем буфер с pH 5,0-6,0, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и соль.
Неионное поверхностно-активное вещество уменьшает поверхностное натяжение растворов белков, предотвращая абсорбцию или агрегацию белков на гидрофобной поверхности. Примеры пригодного в настоящем изобретении неионного поверхностно-активного вещества включают полисорбаты, полоксамеры и их сочетания, предпочтительно полисорбаты. К числу неионных поверхностно-активных веществ полисорбатов относятся полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80. Предпочтительным является полисорбат 80.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения было обнаружено, что стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия увеличивалась в присутствии полисорбата 80 (таблица 8). Стабильность конъюгата пролонгированного действия была одинаковой по прошествии двух недель, когда использовали полисорбат 20 вместо полисорбата 80, но после хранения в течение четырех недель существует существенное различие в стабильности между ними, хотя поверхностно-активные вещества являются очень сходными между собой.
В жидком составе по настоящему изобретению неионное поверхностно-активное вещество содержится предпочтительно в количестве 0,1% (масс./об.) или менее, более предпочтительно в количестве от 0,001 до 0,05% (масс./об.), и еще более предпочтительно в количестве 0,005% (масс./об.). В нордитропине, жидком составе hGH, коммерчески доступном в Nordisk, в качестве поверхностно-активного вещества применяют 3 мг/мл полоксамера 188 (таблица 9). В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения наблюдали, что конъюгаты hGH пролонгированного действия в составе, содержащем 3 мг/мл полоксамера 188, агрегируют после хранения при 25°C в течение двух недель (таблица 8). Из этих данных следует, что тип и концентрация поверхностно-активного вещества, действующего в качестве стабилизатора для белковых лекарственных средств, должны быть специфическими для лекарственных средств.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения обнаружили, что состав, содержащий 1-10% (масс./об.) сахарного спирта и 5-200 мМ NaCl в дополнение к буферу с pH 5,2 и неионному поверхностно-активному веществу, существенно увеличивает стабильность при хранении конъюгата hGH пролонгированного действия, указывая на то, что комбинация буфера с pH 5,2, неионного поверхностно-активного вещества, сахарного спирта и соли проявляет синергическое действие на стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия.
Предпочтительно стабилизатор по настоящему изобретению не содержит альбумин. По причине того, что его получают из сыворотки человека, всегда существует вероятность того, что сывороточный альбумин человека, доступный как стабилизатор для белков, может быть загрязнен патогенными вирусами человеческого происхождения. Желатин или бычий сывороточный альбумин может вызывать заболевания или может вызывать аллергический ответ у некоторых пациентов. Не содержащий гетерологичные белки, такие как сывороточные альбумины человеческого или животного происхождения или очищенный желатин, стабилизатор по настоящему изобретению не может являться причиной вирусной контаминации.
В дополнении к буферу с pH 5,0-6,0, соли, сахарному спирту и неионному поверхностно-активному веществу жидкий состав по настоящему изобретению может дополнительно содержать хорошо известные в данной области ингредиенты или вещества, если они не ухудшают эффект настоящего изобретения. Например, состав по настоящему изобретению может дополнительно содержать сахара, полиспирты или нейтральные аминокислоты.
Предпочтительные примеры сахаров, которые могут дополнительно содержаться в составе для увеличения стабильности при хранении конъюгата пролонгированного действия, включают моносахариды, такие как манноза, глюкоза, фукоза и ксилоза, и полисахариды, такие как лактоза, сахароза, рафиноза и декстран. К числу полиспиртов, которые можно дополнительно использовать в настоящем изобретении, относятся пропиленгликоль, низкомолекулярный полиэтиленгликоль, глицерин, низкомолекулярный полипропиленгликоль и их сочетание. Из расчета на общий объем состава можно использовать каждый из сахара и полиспирта в количестве от 1 до 10% (масс./об.) и предпочтительно в количестве 5% (масс./об.).
В соответствии с его предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему 20 мМ Na-цитратный буфер (pH 5,2-6,0), 5-200 мМ NaCl, 1-10% (масс./об.) маннита и 0,001-0,05% полисорбата 80. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения жидкий состав конъюгата hGH пролонгированного действия, содержащий Na-цитратный буфер pH 5,2, 5% (масс./об.) маннита, 150 мМ NaCl и 0,005% (масс./об.) полисорбата 80, сравнивали с нордитропином, коммерчески доступным в Nordisk составом hGH. Жидкий состав конъюгата hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению демонстрировал стабильность при хранении такую же высокую или более высокую по сравнению с нордитропином (таблица 10). В тесте на стабильность при длительном хранении согласно другому варианту осуществления было обнаружено, что жидкий состав конъюгата hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению поддерживает активность конъюгата hGH пролонгированного действия на высоких уровнях в течение шести месяцев (таблица 11).
Не представляющий сопутствующей опасности вирусной контаминации, а также являющийся простым и обладающий превосходной стабильностью при хранении, не содержащий альбумина жидкий состав конъюгата hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению, который предназначен для обеспечения стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия, обладает экономическим преимуществом по сравнению с другими стабилизаторами или средствами для лиофилизации.
Кроме того, ввиду того, что он содержит конъюгат hGH пролонгированного действия, который обладает более высокой устойчивостью in vivo по сравнению с нативной формой, жидкий состав по настоящему изобретению обеспечивает поддержание активности белка на высоких уровнях в течение длительного периода времени по сравнению с типичным составом hGH, и, таким образом, его можно использовать в качестве эффективной лекарственной формы.
Полезные эффекты изобретения
Жидкий состав конъюгата hGH пролонгированного действия, содержащий буфер с pH 5,0-6,0, сахарный спирт, соль и неионное поверхностно-активное вещество, в соответствии с настоящим изобретением не содержит сывороточный альбумин человека и другие опасные факторы, которые потенциально загрязнены вирусами, и может обеспечивать превосходную стабильность при хранении, специально адаптированную для конъюгата hGH пролонгированного действия, состоящего из полипептида hGH и Fc-областью иммуноглобулина, который обладает более высокой молекулярной массой и устойчивостью in vivo по сравнению с нативным.
Краткое описание чертежей
Указанные выше и другие цели, признаки и другие преимущества настоящего изобретения будут более ясно поняты из следующего ниже подробного описания, приведенного в сочетании с прилагаемыми чертежами, в которых:
Фиг. 1 представляет собой характерную хроматограмму ИО-ВЭЖХ, полученную после того как проанализировали стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия посредством ИО-ВЭЖХ при его хранении при 4°C в течение трех месяцев в буфере при различных значениях pH, как описано в примере 4; и
Фиг. 2 представляет собой график, полученный после анализа стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия ИО-ВЭЖХ при его хранении при 4°C в течение шести месяцев в буфере при pH 5,2, как описано в примере 7.
Способ выполнения изобретения
Лучшее понимание настоящего изобретения можно получать посредством следующих ниже примеров, которые приведены для иллюстрирования, но их не следует истолковывать как ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1. Получение конъюгата hGH пролонгированного действия
ALD-PEG-ALD (IDB), который представляет собой 3,4 кДа полиэтиленгликоль с альдегидной группой на каждом конце, конъюгировали с hGH (Mw 22 кДа), а затем сшивали с N-концом дегликозилированной Fc-области, выделенной из IgG4 человека, (Mw 50 кДа) с последующей очисткой для получения конъюгата hGH-PEG-Fc.
Пример 2. Анализ стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия в присутствии или отсутствие соли
Для оценки стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия в составе, содержащем буфер, сахарный спирт и неионное поверхностно-активное вещество, в присутствии или отсутствие соли конъюгата hGH пролонгированного действия хранили при 25°C в течение четырех недель в составах приведенной ниже таблицы 1, а затем анализировали его стабильность с применением ионообменной хроматографии (ИОХ) и эксклюзионной хроматографии размеров (SEC). В составе использовали цитратный буфер в качестве буфера, маннит в качестве сахарного спирта и полисорбат 80 в качестве неионного поверхностно-активного вещества. В таблице 2 приведены ИО-ВЭЖХ (%) и SE-ВЭЖХ (%) в виде (площадь %/начальная площадь%), показывающие остаточную чистоту конъюгата hGH пролонгированного действия по сравнению с исходной чистотой.
Таблица 1
№
Концентрация
Буфер
Соль
Сахарный спирт
Поверхностно-активное вещество
1
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМ NaCl
5%маннит
0,005% полисорбат 80
2
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
-
5%маннит
0,005% полисорбат 80
Таблица 2
№
ИО-ВЭЖХ (%)
SE-ВЭЖХ (%)
Начало
1 неделя
2 недели
4 недели
Начало
1 неделя
2 недели
4 недели
1
100
94,5
92,5
85,0
100
98,5
98,4
93,9
2
100
94,7
90,7
80,9
100
98,9
98,1
93,6
Как видно из данных, стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия сохраняется на заметно более высоком уровне, при его хранении при 25°C в течение четырех недель в составе, содержащем 5% маннита в присутствии NaCl, в частности 150 мМ NaCl, по сравнению с хранением в отсутствие NaCl.
Пример 3. Анализ стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия в зависимости от сахарного спирта
При хранении hGH пролонгированного действия в составе, содержащем буфер в качестве стабилизатора, NaCl в качестве средства придания изотоничности, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт, исследовали эффект сахарного спирта на стабильность hGH пролонгированного действия.
В составе использовали буфер на основе лимонной кислоты (цитрат натрия, pH 5,2) в качестве буфера, маннит или сорбит в качестве сахарного спирта и полисорбат 80 в качестве неионного поверхностно-активного вещества.
Конъюгат hGH пролонгированного действия хранили при 25°C в течение четырех недель в составах из приведенной ниже таблицы 3, а затем анализировали его стабильность с применением ионообменной хроматографии (ИОХ) и эксклюзионной хроматографии размеров (SEC). В таблице 4 ИО-ВЭЖХ (%) и SE-ВЭЖХ (%) представлены в виде (площадь %/начальная площадь%), показывающие остаточную чистоту конъюгата hGH пролонгированного действия по сравнению с исходной чистотой.
Таблица 3
№
Концентрация
Буфер
Соль
Сахарный спирт
Поверхностно-активное вещество
1
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМ NaCl
5% маннит
0,005% полисорбат 80
2
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМ NaCl
5% сорбит
0,005% полисорбат 80
3
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМ NaCl
5% маннитол 5% Arg-HCl
0,005% полисорбат 80
Таблица 4
№
ИО-ВЭЖХ (%)
SE-ВЭЖХ (%)
Начало
1 неделя
2 недели
4 недели
Начало
1 неделя
2 недели
4 недели
1
100
98,8
97,6
94,7
100
96,0
100
99,9
2
100
98,6
97,4
94,6
100
100
99,9
99,9
3
100
98,8
97,8
94,6
100
99,6
99,4
99,3
Как можно видеть в приведенных выше таблицах, стабильность сахарных спиртов маннита и сорбита являлась одинаковой. Кроме того, добавление 0,5% L-Arg-HCl к манниту не оказывало влияния на стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия.
Пример 4. Анализ стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия в зависимости от pH буфера
Стабильность hGH пролонгированного действия оценивали в буфере при различных значениях pH. В связи с этим конъюгат hGH пролонгированного действия хранили при 4°C в течение трех месяцев в составах из приведенной ниже таблицы 5, а затем анализировали его стабильность с применением ионообменной хроматографии (ИОХ). В таблице 6 представлена ИО-ВЭЖХ (%) в виде (площадь %/начальная площадь %), показывающая остаточную чистоту конъюгата hGH пролонгированного действия и примеси по сравнению с исходной чистотой в виде главного пика и пиков примесей соответственно (фиг. 1).
Таблица 5
№
Концентрация
Буфер
Соль
Сахарный спирт
Поверхностно-активное вещество
1
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМ NaCl
5% маннит
0,005% полисорбат 80
2
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,5)
150 мМ NaCl
5% маннит
0,005% полисорбат 80
3
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 6,0)
150 мМ NaCl
5% маннит
0,005% полисорбат 80
Таблица 6
№
Время
ИО-ВЭЖХ (%)
#1
#2
#3
#4
#5
Главный пик
#6
#7
#8
#9
#10
1
0 мес.
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
96,6
1,4
1,5
0,3
0,1
0,1
2 мес.
0,1
0,1
0,0
0,2
0,0
93,6
2,3
3,1
0,3
0,0
0,1
3 мес.
0,1
0,2
0,1
0,4
0,0
92,7
1,9
3,8
0,4
0,0
0,2
2
0 мес.
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
96,5
1,4
1,6
0,3
0,1
0,1
2 мес.
0,1
0,4
0,1
0,0
0,0
93,9
2,1
3,0
0,3
0,1
0,2
3 мес.
0,1
0,2
0,0
0,2
0,0
92,4
2,1
4,2
0,5
0,0
0,1
3
0 мес.
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
96,2
1,4
1,8
0,3
0,1
0,2
2 мес.
0,1
0,4
0,1
0,0
0,0
93,8
2,0
3,3
0,3
0,0
0,1
3 мес.
0,1
0,2
0,0
0,0
0,0
92,3
2,1
4,7
0,4
0,0
0,1
После хранения в течение трех месяцев содержание примесей #6 и #7 было пониженным при pH 5,2 по сравнению с pH 5,5 и pH 6,0, демонстрируя, что стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия в буфере с pH 5,2 являлась улучшенной (фиг. 1). Примеси анализировали пептидным картированием с последующим определением молекулярных масс LC-MS/MS. Определено, что примеси #6 и #7 являлись дезаминированными примесями.
Пример 5. Анализ стабильности конъюгата hGH пролонгированного действия в зависимости от неионного поверхностно-активного вещества
После хранения при 25°C в течение четырех недель в составе, содержащем неионное поверхностно-активное вещество полисорбат 80 или 20, или полоксамер 188 в качестве стабилизатора, анализировали стабильность hGH пролонгированного действия с применением SEC и ИОХ. Как видно из таблицы 7, в составе использовали буфер на основе лимонной кислоты pH 5,2 и маннит в качестве буфера и сахарного спирта соответственно. В таблице 8 показана ИО-ВЭЖХ (%) и SE-ВЭЖХ (%) остаточная чистота конъюгата hGH пролонгированного действия по сравнению с исходной чистотой.
Таблица 7
№
Концентрация
Буфер
Соль
Сахарный спирт
Поверхностно-активное вещество
1
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМ NaCl
5% маннит
0,05 мг/мл полисорбат 80
2
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,5)
150 мМ NaCl
5% маннит
3 мг/мл полоксамер 188
3
19,5 мг/мл
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМ NaCl
5% маннит
2 мг/мл полисорбат 20
* 0,05 мг/мл полисорбата 80 соответствует 0,005% полисорбата 80.
Таблица 8
№
ИО-ВЭЖХ (%)
SE-ВЭЖХ (%)
Начало
1 неделя
2 недели
4 недели
Начало
1 неделя
2 недели
4 недели
1
100
98,0
96,4
93,3
100
99,6
99,5
99,3
2
100
98,3
85,8
н.д.<sup>A</sup>
100
100
95,3
н.д.<sup>A</sup>
3
100
98,3
96,4
84,8
100
99,7
99,9
96,3
<sup>A</sup>не удалось получить данные вследствие осаждения при агрегации
Как понятно из данных, наблюдали, что стабильность конъюгата hGH пролонгированного действия увеличивалась в присутствии полисорбата 80. В случае полисорбата 20 не обнаружили отличий от полисорбата 80 в стабильности конъюгата пролонгированного действия после двух недель, но после хранения в течение четырех недель наблюдали существенное различие в стабильности между ними, хотя они являлись очень сходными между собой. Кроме того, конъюгат hGH пролонгированного действия агрегировал после хранения при 25°C в течение двух недель в составе, содержащем 2 мг/мл полоксамера 188.
Пример 6. Сравнение стабильности жидкого конъюгата hGH пролонгированного действия и коммерчески доступного лекарственного средства нордитропина
Стабилизирующую способность состава, содержащего цитратный буфер pH 5,2, NaCl, маннит и полисорбат 80, в конечном итоге выбранного посредством анализа стабильности из примеров от 2 до 5, оценивали, сравнивая с коммерчески доступный жидким составом hGH нордитропина (Novo Nordisk). Концентрация нордитропина составляет 10 мг/мл и его ингредиенты приведены ниже в таблице 9. Их хранили при 25°C в течение четырех недель. Для подтверждения различий зарядов, нордитропин анализировали с применением капиллярного электрофореза (CE) и SEC, как описано в European Pharmacopoeia. С другой стороны, конъюгат hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению анализировали с применением ИОХ и SEC, которые в принципе аналогичны анализу CE. Результаты приведены ниже в таблице 10. CE (%) или ИО-ВЭЖХ (%) и SE-ВЭЖХ (%) демонстрируют остаточную чистоту конъюгата hGH пролонгированного действия по сравнению с исходной чистотой.
Таблица 9
Состав
Концентрация
Буфер
Соль и другие вещества
Сахарный спирт и другие вещества
Поверх-ностно-активное вещество
Нордитропин
10 мг/мл
-
3 мг/мл фенола
1,13 мг/мл гистидина 38,7 мг/мл маннита
3 мг/мл полоксамера 188
hGH пролонгированного действия
19,5 мг/мл(6 мг/мл hGH)
20 мМ Na-цитратный (pH 5,2)
150 мМNaCl
5% маннит
0,005% полисорбат 80
Таблица 10
№
CE (%) или ИОХ (%)
SEC (%)
Начало
1 неделя
2 недели
4недели
Начало
1неделя
2недели
4недели
Норди-тропин
100
98,2
95,9
91,5
100
100
100,1
100
hGH пролонгированного дей-ствия
100
98,0
96,4
93,3
100
99,6
99,5
99,3
Как можно видеть, состав по настоящему изобретению обеспечивал стабилизацию hGH на таком же высоком или более высоком уровне, чем обеспечивал коммерчески доступный состав hGH нордитропина. Эти результаты демонстрируют, что жидкий состав hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению может обеспечивать превосходную стабильность hGH при хранении.
Пример 7. Анализ стабильности при длительном хранении жидкого конъюгата hGH пролонгированного действия
Для оценки стабильности при длительном хранении жидкого состава, содержащего буфер на основе лимонной кислоты pH 5,2, NaCl, маннит и полисорбат 80, анализировали стабильность образцов после хранения в составе при 4°C в течение шести месяцев. Результаты приведены на фиг. 2 и в таблице 11. ИО-ВЭЖХ (%), SE-ВЭЖХ (%) и содержания белка (%) показывают остаточную чистоту конъюгата hGH пролонгированного действия по сравнению с исходной чистотой.
Таблица 11
Тест на стабильность при длительном хранении (хранение при 4°C)
Период хранения
Свойство
pH
Тест по идентификации
Тест по очистке
Содержание белка (%)
Биологическая активность
ИО-ВЭЖХ
Вестерн-блоттинг
SDS-PAGE
ИО-ВЭЖХ (%)
SE-ВЭЖХ (%)
Начало
Бесцветный
5,3
Подтверждено
Подтверждено
Подтверждено
100,0
100,0
100,0
Подтверждено
1 месяц
Бесцветный
5,3
Подтверждено
Подтверждено
Подтверждено
98,5
99,9
104,2
Подтверждено
3 месяца
Бесцветный
5,3
Подтверждено
Подтверждено
Подтверждено
98,5
100,0
104,5
Подтверждено
6 месяцев
Бесцветный
5,3
Подтверждено
Подтверждено
Подтверждено
97,2
99,3
101,9
Подтверждено
Наблюдали, что конъюгат hGH пролонгированного действия по настоящему изобретению в жидком составе являлся стабильным более 6 месяцев.
Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в иллюстративных целях, специалистам в данной области будет понятно, что возможны различные модификации, добавления и замены, не выходя за рамки объема и сущности изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения.