Электронная структура комплексов гема гемоглобина с лигандами и динамика их атомного остова при физиологической температуре

ЭЛЕКТРОННАЯ СТРУКТУРА КОМПЛЕКСОВ ГЕМА ГЕМОГЛОБИНА С ЛИГАНДАМИ И ДИНАМИКА ИХ АТОМНОГО ОСТОВА ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Романова Т. А.

(1) Институт вычислительного моделирования СО РАН, г. Красноярск (2)Институт физики им. Л. В Киренского СО РАН, г. Красноярск

РЕЗЮМЕ

Полуэмпирическим квантово-химическим методом РМ3 проведено сравнительное исследование атомной и электронной структур комплексов гема гемоглобина с кислородом и оксидом азота. Установлено, что в результате оптимизации геометрии межъядерное расстояние в молекулах лиганда значимо меняется: в молекуле кислорода при связывании с гемом -возрастает на 0,046 А, в то время как, в молекуле NO - на 0,064 А, что указывает на более прочную химическую связь между NO и Fe гема. Исходя из значений суммарного заряда молекулы, NО связан с железом гема ковалентно, а между кислородом и Fe формируются лишь слабые ион-дипольные взаимодействия. В комплексах гема с O2, орбитали атомов лиганда дают небольшой вклад в верхнюю заполненную и нижнюю вакантную орбитали, в то время как, в комплексах с NO орбитали атомов лиганда существенно замешиваются в молекулярные орбитали комплекса, при этом неспаренный электрон молекулы NO переходит на ё-орбиталь железа, формируя конфигурацию ё , а сама молекула оксида азота приобретает положительный заряд. Проведение молекулярно-динамических расчетов для всех комплексов при физиологической температуре (310К) показало, что существенно меняется не только эффективная геометрия комплексов, но и заселенность ^-орбиталей атомов углерода и азота порфиринового кольца в результате тепловых молекулярных колебаний. В комплексах гема с NO (но не с O2 ) под действием температуры меняются относительные вклады ^-орбиталей атомов азота и кислорода лиганда, ё-орбиталей железа, что должно влияет на реакционную способность комплекса.

Центральное место в литературе последних лет отводится оксиду азота (N0) как универсальному регулятору ключевых биохимических процессов [1,2,3]. Исследователи столкнулись с неожиданным фактом: оказалось, что в качестве эндогенного регулятора могут выступать не только сложные по химическому строению и высокомолекулярные соединения, но и такое простое как двухатомная молекула оксид азота. В отличие от других сигнальных молекул, оксид азота оказывает влияние на клеточный метаболизм без участия каких-либо мессенджеров [4]. В качестве регулятора N0 функционирует практических во всех тканях организма, непосредственно в которых и образуется при участии N0-синтаз в т.н. цикле оксида азота, где в качестве субстрата используется Ь-аргинин.

Одно из важных свойств данного соединения - способность с высоким сродством взаимодействовать с железом клеточных металлопротеинов, в большинстве случаев необратимо ингибируя их активность. В то время как цианиды и СО способны конкурентно ингибировать лишь гем гемоглобина, миоглобина и цитохрома а дыхательной цепи, то N0 связывается со всеми железопротеидами организма и константа связывания при этом значительно выше чем у перечисленных ранее лигандов. Так, взаимодействуя с активным центром гуанилатциклазы, оксид азота выступает в качестве вазоделататора, при этом экзогенным продуцентом N0, обеспечивающим такой эффект, является нитроглицерин. В тоже время сами эндотелиальные клетки в определенных условиях вырабатывают фактор релаксации сосудов, где оксид азота - активный компонент [4].

В последние годы активно введутся экспериментальные исследования энергетики, атомной и электронной структуры комплексов гема с различными лигандами, в числе которых и оксид азота [2,5,6]. Описаны не только особенности электронной структуры подобного класса соединений, но определены энергии диссоциации и ряд других термодинамических характеристик. Тем не менее, эти исследования так и не дают объяснений столь высокому сродству оксида азота с железопротеинами, хотя ответ на этот вопрос можетет объяснить механизмы регуляции ряда биохимических процессов, протекающих при участии данного соединения. Остается невыясненной природа химической связи и характер изменений электронной структуры гема при образовании комплекса с оксидом азота.

В последнее время в теоретической молекулярной биологии для решения подобных задач все большее распространение получают квантово-химические методы, поскольку именно электронные аспекты процессов, протекающих в биологических системах, привлекают внимание исследователей. Но, к сожалению, расчеты электронной структуры комплексов гема с лигандами встречаются в литературе достаточно редко и авторы, в большинстве случаев, не делают попыток связать полученные результаты с биологическими свойствами изучаемых объектов.

Целью настоящей работы явилось сравнительное теоретическое квантово-

химическое и молекулярно-динамическое исследование электронной и атомной

структур комплексов гема с молекулярным кислородом и оксидом азота и динамики

их атомного остова при физиологической температуре.

МЕТОДИКА РАСЧЕТА

Атомную и электронную структуры комплексов гема с лигандами исследовали полуэмпирическим квантово-химическим методом РМ3. Влияние физиологической температуры (310К) на атомные и электронные структуры комплексов исследовали методом неэмпирической молекулярной динамики в полуэмпирическом квантово-химическом потенциале РМ3.

Квантово-химические методы расчета электронной и атомной структур

Наиболее подходящими с теоретической точки зрения для изучения особенностей электронной структуры активных биологических центров являются квантово-химические методы. Они основаны на приближенном решении уравнения Шредингера Н¥ = ЕЕ¥ (здесь ¥ - это полноэлектронная волновая функция системы, построенная из атомных орбиталей, Е -полная энергия системы, а Н = Т + V - гамильтониан системы, состоящий из суммы операторов кинетической Т и потенциальной V энергий) для молекул и их фрагментов.

В методе Хартри-Фока-Руттана волновая функция системы электронов и ядер, полностью описывающая их состояние, представлена в виде детерминанта (у)|| который

составлен из отдельных молекулярных орбиталей системы (7) = ^ сшфк (7) представляются

к

в виде линейной комбинации атомных орбиталей фк. В ряде случаев квантово-химические методы позволяют с хорошей точностью (порядка одной 0,01 - 0,001 ккал/моль) вычислять теплоты образования исследуемых объектов, которые равны разности между теплотой образования отдельных атомов, входящих в систему и энергией атомизации, последняя вычисляется как разность полной энергии системы и энергии всех атомов.

Метод молекулярной динамики

Подавляющее большинство современных физических методов исследования вещества, которыми пользуются при определении структуры и свойств биологических объектов, требуют для себя низких температур (порядка 77К). Но для подобного рода объектов, такой подход неадекватен, так как при этом происходит достаточно серьезные изменения в атомном строении вещества за счет подавления внутримолекулярных тепловых колебаний и фазовых переходов под действие температуры (к примеру - кристаллизации гидратной оболочки белковой молекулы и пр.). Более того, большинство биологических свойств как раз и определяются слабыми типами химических связей (такими как водородные, различного типа донорно-акцепторные взаимодействия и пр.), на которые кардинальным образом может влиять

изменение температуры и, следовательно, изменение атомной структуры биологических объектов.

В настоящее время для теоретического исследования влияния температуры в частности и динамики атомного остова вообще широкое применение нашел метод неэмпирической молекулярной динамики [7,8], который не требует введения эмпирических межмолекулярных и межатомных потенциалов для расчетов.

В подходе неэмпирической молекулярной динамики электронная система описывается

набором волновых функций {¥ | (Г)}, которые принадлежат основному состоянию

потенциальной поверхности Борна-Оппенгеймера в любой момент времени, что позволяет описать совместное движение электронов и ядер, которые описываются набором координат

{КI} . При этом фиктивная кинетическая энергия электронов остается малой по сравнению с

кинетической энергией ионов, что позволяет рассчитывать силы, действующие на ядра в

любой момент времени по теореме Гельмана-Феймана для электронных систем,

соответствующих мгновенным ядерным конфигурациям.

Фиктивную электронную динамику, ионную динамику и влияние внешних условий, например - температуры, описывают уравнения движения Эйлера-Лагранжа:

««

1Уг (г,О = -5Е5¥*( А + ЕлЛ(г,О,

г /5¥ г(г, г) к

М1В1 = -V КЕ,

где }, }, |ау}] - функционал полной энергии, получаемый в любом квантово-

химическом методе, набор {ау} - любые возможные внешние условия - температура,

давление, объем и пр., 1- фиктивная масса для электронной динамики, 1 - произвольный параметр соответствующей размерности. Матрица Лг- ^ является набором множителей

Лагранжа, которые обеспечивают ортонормированность {¥ | ( Г)}.

Неэмпирическая молекулярная динамика удовлетворяет приближению Борна-Оппенгеймера только при определенных условиях. Для систем, в которых щель мала, ионы и электроны сильно взаимодействуют. Это приводит к тепловому равновесию между ионами и электронами и к отходу от условий применимости Борна-Оппенгеймера. Для того чтобы преодолеть эти трудности, в неэмпирической молекулярной динамики используется алгоритм термостатов, один для ионов, другой - для электронов:

1 ¥ г (г) = - Н Ъ | ¥ г (г)) + £ Л гк ¥ к (г) -1П

к

где/¡- число заполнения.

¥ г (г) ,

М1Я1 = -V КЕ - М1 % %

I'

Переменные термостата п и 5 определяются уравнениями:

Qeп= цХ[Уi V-Ee , • • •

Qr 5 = цХ Mi R^ - gkT ,

где и ^^ - массы термостатов для электронной и ионных частей соответственно, Ее и Т

- необходимые из условий задачи кинетическая энергия электронов и ионная температура, g -число степеней свободы ионов. Температурные флюктуации, зависящие от времени, включены в уравнения электронного и ионного термостатов, а динамика всей системы подчиняется принципу минимума термодинамического потенциала.

В методе неэмпирической молекулярной динамики выполняется закон сохранения энергии во всей системе (термодинамический потенциал), включающей в себя электронный и ионный термостаты, который записывается в следующем виде:

тогда как энергия электронно-ядерной системы без термостатов из-за температурных флюктуаций не сохраняется. Следовательно, для систем с нежестким атомным остовом возможны ситуации, когда из-за невыполнения закона сохранения энергии температурные условия будут влиять на электронную структуру.

В работе использовалась демонстрационная версия программы ИурегСИеш 5.1, позволяющая проводить расчеты соединений переходных элементов с использованием как неэмпирических, так и полуэмпирического потенциала метода РМ3. Плотности состояний строились с полушириной на полувысоте 0,4eV.

Геометрия комплексов

Согласно экспериментальным данным, комплекс молекулярного кислорода с железом гема может иметь два изомера (рис. 1). В первом изомере молекула кислорода координирована к железу гема горизонтально, во втором - одним атомом и находится под углом к плоскости порфиринового кольца, при этом последний изомер более стабилен [9,10].

С обеих сторон плоскости гема гемоглобина, «над» и «под» атомом железа, располагаются имимдазольные кольца двух остатков гистидина (His). Один занимает восьмое положение в а-спирали глобина и наиболее приближенный к атому железа (проксимальный). Атом азота имимдазольного кольца His находится в контакте с атомом железа, так что можно думать об образовании между ними ковалентной связи (рис. 1 ).

+ 1~Qe п2 +1 Qr 52 + 2Eeп+gkT5,

I ~2

РЕЗУЛЬТАТЫ РАСЧЕТОВ

Рис. 1. Проксимально и дистально относительно плоскости порфиринового кольца расположены остатки гистидина цепи глобина

Нами были рассчитаны комплексы гема с His в 5-ом координационном положении (проксимально относительно плоскости) и молекулами О2 и NO в шестом (дистально относительно плоскости). Ограничения по симметрии объектов не использовались, при этом порфириновое кольцо в процессе оптимизации геометрии приобретало форму «седла» (рис. 2), а отсутствие лиганда в 6-ом положении усиливало такой эффект.

Молекула NO, как и молекула О2, координирована под углом к плоскости гема через атом азота (рис.2). Изменение межатомного расстояния при исследовании геометрии комплексов позволяет судить об изменении силы химической связи. Согласно нашим расчетам, расстояние между Fe и азотом имидазольного кольца His практически не отличалось как при связывании гемом кислорода, так и оксида азота. Но межатомное расстояние в самой молекуле лиганда значимо менялось (таб. 1).

о

Рис. 2. Способ координации молекулы оксида азота с железом гема

Так, расстояние между атомами в молекуле кислорода при связывании с гемом возрастало на 0,046 А, в то время как, межатомное расстояние в молекуле N0 на 0,064 А, что указывает на более прочную химическую связь между N0 и Fe гема.

Таблица 1

Геометрическая структура комплексов гема с His и лигандами в шестом

координационном положении

Комплекс Ее-01 Ее-02 Ее-^к О1 - О2

О2 - - - 1,169

Гем+Ш+О2 (О 1 ,8 1 4 2,265 1,881 1,215

Ш Ее^ Ее-О Ее-^к N - О 1 . 1 29

Гем+Ш 1.848 1.971 1.882 1,193

Здесь и далее: О1 и О2 - атомы молекулы кислорода, - атом азота имидазольного кольца Н^, ...+ О2 (X) - молекула кислорода координирована под углом к плоскости порфиринового кольца

Эффективные атомные заряды комплексов гема с лигандами

Заряд железа в комплексе гема с О2 существенно выше, чем в комплексе с N0 (рис.3). Атом кислорода, координированный с железом гема, имеет положительный заряд, и соизмерим с зарядом атома азота в комплексе с N0.

Исходя из значений суммарного заряда молекулы лиганда можно сделать вывод, что молекула кислорода поляризуется, т.к. ее суммарный заряд близок к нулю, в то же время в молкуле N0 он приблизительно равен +0,3, что указывает на значительное перераспределении заряда с N0 на порфириновую плоскость. Следовательно, молекула NО связана с железом гема ковалентно, а между кислородом и Fe формируются лишь слабые ион-дипольные взаимодействия.

Рис.3. Заряды атомов кислорода ( а ) и оксида азота ( б ) в комплексе с железом гема

Электронное строение

Структуры верхних заполненных и нижних вакантных орбиталей комплексов гема с молекулой 02 и N0 в основном сформированы ^-орбиталями атомов углерода и азота порфиринового кольца. Доли остальных атомных орбиталей, участвующих в формировании данных молекулярных орбиталей относительно малы. Замена кислорода на оксид азота приводит к увеличению парциального вклада ^-орбиталей в верхнюю заполненную и нижнюю вакантную орбиталь Бе, что в свою очередь также указывает на более прочное взаимодействие Бе с N0, чем с О2. (Рис. 4, таб. 2).

Реакционная способность комплексов зависит, в частности, от величины энергетической щели (АЕ) или энергетического расщепления между верхней заполненной и нижней вакантной орбиталями. Чем меньше величина этой щели, тем выше реакционная способность комплекса, что связано с уменьшением энергии возбуждения системы при переходе электрона с верхней заполненной на нижнюю вакантную орбиту. Большей реакционной способностью, согласно нашим расчетам, обладают комплексы гема с N0 (таб.2).

Рис.4. Плотности состояний J-орбиталей железа в комплексе гема с His и оксидом азота

Таблица 2

Электронная структура верхней заполненной и нижней вакантной молекулярных

орбиталей в комплексах гема с лигандами

Атомные орбитали Комплексы

Гем + His

Верхняя заполненная орбиталь комплекса гема с О2

^-орбитали O1 0

^-орбитали O2 0.9%

J-орбитали Fe 0.7%

Нижняя вакантная орбиталь комплекса гема с О2

^-орбитали O1 0

^-орбитали O2 0.88%

J-орбитали Fe 0.34%

^-орбитали NaK 0

AE (эВ) 5.838

Верхняя заполненная орбиталь комплекса гема с NO

^-орбитали N 0.31%

^-орбитали O 0.27%

J-орбитали Fe 1.15%

^-орбитали N^ 0

Нижняя вакантная орбиталь комплекса гема с NO

^-орбитали N 0

^-орбитали O 0

J-орбитали Fe 1.5%

^-орбитали NaK 6.2%

AE (эВ) 2.527

Примечание: % -парциальные вклады ^-орбиталей Fe в молекулярные орбитали комплексов.

Результаты молекулярно-динамическихрасчетов

Проведение молекулярно-динамических расчетов с учетом температуры (310К) показало, что существенно меняется не только эффективная геометрия комплексов (в среднем на 0,03А,) (таб. 3), но и заселенность ^-орбиталей атомов углерода и азота порфиринового кольца.

Таблица 3

Атомная геометрия комплексов с учетом температуры

Комплекс Fe-O(N) ZFe-O(N) O (N)-O Fe-^к

Гем+Ш+ О2 1.818 1.760-1.917

Гем+Ш+ Ш 1.855 1.815-1.877

Примечание: приведены максимальные и минимальные значения по каждому массиву данных, полученных в ходе молекулярно-динамических расчетов (310К). В скобках указаны углы и расстояния оптимизированных структур, полученных в ходе квантово-химических расчетов (при 0 К).

Рис. 5 Плотности состояний dz2 -орбиталей железа в комплексе гема с His и оксидом азота под влиянием температуры

В комплексах гема с NO под действием температуры меняются относительные вклады р-орбиталей атомов азота и кислорода лиганда (NO), d-орбиталей железа (рис.5). На данном рисунке предствалена электронная структура стоп-кадров динамического кино смоделированного при температуре 310К. Пик соответсвует верхней заполненной орбитали. Видно, что при температуре 310К меняются парциальные вклады dz2 - орбиталей в ее плотность. А в комплексе гема с О2 таких изменений во вкладах и положении d-орбиталей не наблюдалось.

На основании проведенных расчетов мы можем сделать следующие выводы:

1. Энергетическая щель в комплексах гема с NO в 1.5 раза меньше, чем в комплексах с O2, что говорит о большей реакционной способности первых.

2. В комплексах гема с O2, орбитали атомов лиганда дают небольшой вклад в верхнюю заполненную и нижнюю вакантную орбитали, в то время как, в комплексах с NO орбитали атомов лиганда существенно замешиваются в молекулярные орбитали комплекса, при этом неспаренный электрон молекулы NO переходит на J-орбиталь железа, формируя конфигурацию d7, а сама молекула оксида азота приобретает положительный заряд. Следовательно, молекула NO испытывает более сильное химическое связывание с гемом, нежели молекула O2 и константа диссоциации также должна быть значительно выше.

3. Физиологическая температура (310К) оказывает существенное влияние на эффективную геометрию комплексов и вызывает перераспределение электронной плотности d-орбиталей железа и р-орбиталей лиганда NO, что должно влияет на реакционную способность комплекса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Abu-SoudH. M., Wu Ch., Ghosh D. K, et al. // Biochemistry. - 199S.- V. 3V. - Р. 3777 - 37S6.

2. Boffi A., Chiancone El., Takahashi S., Rousseau D. L. //Biochemistry. - 1997. - V. Зб. Р. 45054509.

3. Ghosh A, Gonzales E, Vangberg T. J. // Phys. Chem. B. - 1999. - Т. 10З. - Р. 1363-1367.

4. Ванин А. Ф. //Успехи физических наук.-2000. - Т. 1V0. - № 4. - С 455-45S

5. Miller L.M, Pedraza A.I.ChanceM.R // Biochemistry. - 1997. V. Зб.-P. 12199-12207.

6. Watanabe Y. // 11th Int. Symp. Microsomes and Drug. Oxid., Los Angeles, Calif. - 1996.- P. S4.

7.Car R, ParinelloM. //Phys. Rev. Lett.- 19S5. - V. 55. - P. 2471-24S3.

8. Bloechl P.E., Parinello M. //Phys. Rev. B. - 1992. - V. 45. - P. 9413-9419.

9. Proniewicz. L. M., PaengI. R., Nakamoto K. // J. Am. Chem. Soc.- 1991. - V. 11З. - P. 3294-3306

10. Rovira C, Kunc K. Hutter J. Ballone P. Parinello M// J. Phys.Chem. A. - 1997.- V. 101. - P. S91-S9S.