ОПРЕДЕЛЕНИЕ СНИЖЕНИЯ УРОВНЯ мРНК ГЕНОВ ITGA9, HYAL1 И HYAL2 КАК СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Маркеры для диагностики немелкоклеточного рака легкого, представляющие собой изменение уровней мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, где сниженный уровень мРНК в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с уровнем мРНК в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легкого.
2. Маркер по п.1, где рак легкого является плоскоклеточным раком легкого.
3. Применение уровней мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в качестве маркеров для диагностики немелкоклеточного рака легкого человека.
4. Применение по п.3, где рак легкого является плоскоклеточным раком легкого.
5. Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого, включающий следующие стадии:
а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани;
б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;
в) синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;
г) проведение количественной реакции амплификации фрагментов генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы, и геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов;
д) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК каждого из генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, причем уменьшение уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 служит диагностическим признаком ПКРЛ.
6. Способ по п.5, в котором рак легкого представляет собой плоскоклеточный рак легкого.
7. Способ по п.5, в котором на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dТ)-содержащих праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.
8. Способ по п.5, в котором для амплификации кДНК на стадии г) используют олигонуклеотидные праймеры, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.
9. Способ по п.8, в котором последовательности праймеров для каждого гена представлены SEQ ID NO: 1, 2; 4, 5; 7, 8.
10. Способ по п.9, в котором последовательности зондов для каждого гена представлены SEQ ID NO: 3, 6, 9.
11. Способ по п.5, в котором на стадии г) количественная реакция амплификации фрагментов генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2 представляет собой ПЦР в реальном времени.
12. Способ по п.5, в котором на стадии д) в качестве контрольных генов используют ген GAPDH, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу и ген RPN1, кодирующий белок рибофорин 1.
13. Набор праймеров и зонда для осуществления полимеразной цепной реакции для определения изменения уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2, имеющих последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3; 4, 5, 6; 7, 8, 9.
14. Способ по п.5, отличающийся тем, что РНК выделяли с использованием отечественного набора реагентов Trizol RNA Prep («Лаборатория Изоген»).
15. Способ по п.5, отличающийся тем, что РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия).
16. Способ по п.5, отличающийся тем, что для ПЦР-РВ использовали первые цепи кДНК.
17. Способ по п.5, отличающийся тем, что в случае отсутствия образцов прилежащих к опухоли морфологически нормальных тканей или непригодности условной нормы для сравнения использовали несколько условных норм, усредняли для них полученные данные (ΔCt), которые далее использовали для расчетов относительного уровня мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2.
18. Способ по п.5, отличающийся тем, что для проведения ПЦР-РВ использовали набор реактивов фирмы Applied Biosystems (США).
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что использовали вместо набора реактивов для ПЦР-РВ фирмы Applied Biosystems (США) наборы отечественных реактивов.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что для проведения ПЦР-РВ использовали набор из отечественных реактивов Реалити (ИМБ РАН).