Функциональная ангиоархитектоника мозга при действии низких температур в условиях экспериментальной модели хронического алкоголизма

УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НАДЗРИТЕЛЬНОГО ЯДРА ГИПОТАЛАМУСА В НОРМЕ И ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ Левицкий В.А., Жураковская О.Я.

Работа посвящена изучению ультраструк-турной организации надзрительного ядра переднего гипоталамуса в норме и при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете. Установлено, что в норме это ядро состоит из светлых и темных нейросекреторных клеток, которые окружены глиальными клетками и капиллярами. Через 2 недели после моделирования стрептозотоцинового диабета отмечаются значительные ультраструк-турные изменения нейро-глио-капиллярных комплексов ядра, признаки синтетической и транспортной активации нейросекреторных клеток.

Ключевые слова: гипоталамус, надзритель-ное ядро, сахарный диабет, кровеносные сосуды.

ULTRA-STRUCTURAL ORGANIZATION OF SUPRAOPTIC NUCLEUS OF HYPOTHALAMUS IN NORM AND AT DIABETES MELLITUS Levytskiy V.A., Zhurakivska O. Ya.

The advanced study is devoted to studies of ultra-structural organization of supraoptic nucleus of anterior hypothalamus in norm and at the experimental streptozotocin-induced diabetes mellitus. It is set that in norm this nucleus consists of light and dark neurosecretorial cells which are surrounded by glial cells and capillaries. In 2 weeks after designing the stretpozotocin-induced diabetes ultrastructural changes of neuro-glial-ca-pillary complexes of nucleus have come noticeable, signs of the synthetic and transporting activation of neurosecretorial cells have appeared.

Key words: hypothalamus, supraoptic nucleus, diabetes mellitus, blood vessels.

УДК 612.592:612.135.085

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АНГИОАРХИТЕКТОНИКА МОЗГА ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОГО

АЛКОГОЛИЗМА

Несмотря на успехи современной медицины, алкоголизм остается актуальной научной и социальной проблемой. Многочисленные исследования показали, что длительная алкоголизация, оказывая воздействие на нейрохимические процессы в головном мозге, вызывает функциональную деградацию нейромедиаторных систем, зависимую от поступающих доз психически активного вещества. Развивающиеся межсистемные и межорганные взаимозависимые патологические реакции на фоне продолжающейся алкоголизации способствуют перерастанию функциональных изменений в органах в стойкие морфофункциональные поражения органов и систем. Так как в патологический процесс включены не только органы и системы, а практически все регуляторные и межсистемные цепи, реализующие взаимосвязь регуляторных и исполнительных механизмов, то и терапевтические воздействия должны быть направлены одновременно на все патологические проявления хронической этиловой интоксикации. Поэтому в комплекс лечебных мероприятий должны входить методы, обладающие возможностью одновременного воздействия на психоэмоциональную, центральную регуляторную и соматическую сферы. Одним из таких методов, как показано экспериментальными исследованиями, может быть экстремальная криотерапия -кратковременное нахождение живого организма в криокамере при -1200С. Экстремальное криовоздействие (ЭК) приводит к развитию компенсаторно-адаптационных реакций, направленных на повышение интенсивности метаболических внутриклеточных процессов, возрастанию активности репаративных внутриклеточных процессов. Метод ЭК направлен прежде всего на активацию собственных гомеостатических регуляторных систем. Лечебные эффекты, которые наблюдаются при ЭК, могут быть связаны с тем, что организм реагирует на влияние холода не только системой терморегуляции, но и всеми возможными адаптационными механизмами, включая гипоталамо-гипофизарно-адреналовую, иммунную, эндокринную системы. К числу наиболее важных аспектов физиологического действия экстремального холода при ЭК относятся изменения деятельности высших вегетативных

центров и систем нейроэндокринной регуляции, непосредственно отвечающих за температурный гомеостаз организма. Начавшиеся клинические исследования действия ЭК и оценка объективных данных функциональных исследований дают основания утверждать, что используемые при ЭК физические параметры воздействия на организм не вызывают перенапряжения центральных механизмов терморегуляции. Напротив, общая ЭК оказывает на них несомненное тренирующее действие. В то же время, подверженные прямым регуляторным влияниям высших (нервных) центров регуляции сосудистые реакции в различных функциональных системах организма в условиях воздействия направленного экзогенного стрессового фактора ЭК изучены недостаточно. Поэтому, говоря об общей направленности микроциркуляторных реакций в организме при ЭК, целесообразно провести анализ изменений микроциркуляции в центрах регуляции функциональных систем - головном мозге. Остается много неисследованных вопросов в данном направлении, которые определяются специфичностью патологического процесса (хронической этиловой интоксикацией) и применением в терапевтических целях экстремального общего низкотемпературного воздействия -1200С .

Целью работы был анализ изменений микроциркуляции в головном мозге экспериментальных животных (крыс) при экстремальном общем охлаждении -1200С в условиях длительной хронической алкогольной интоксикации (ХрА).

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на 40 белых беспородных крысах-самках 12 мес. массой 400-450 г в соответствии с “Общими принципами экспериментов на животных”, одобренными 11 Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2004 г.) и согласованными с положениями ’’Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей” (Страсбург, 1985 г.). После предварительного отбора животных, склонных к алкоголизации, в рацион крыс вместо воды включали в первые две недели 5%-й, а затем 15%-й раствор этанола, а также добавляли в рацион 96%-й этанол на стандартных кусочках белого хлеба. Алкоголизация проводилась не менее 120 суток. Экстремальное общее криовоздействие проводилось на установке для экстремальной криотерапии с температурой -120°С (четыре сеанса по 1,5 минуты) [4]. Температуру кожных покровов измеряли цифровым инфракрасным термометром Mikrolife IR 1DE1.

Животные были разделены на четыре группы (по 10 крыс): 1 группа - интактные животные (контроль); 2 группа - животные в состоянии хронической алкогольной интоксикации; 3 группа - интактные животные, подверженные воздействию экстремальной криотерапии; 4 группа - животные в состоянии хронической алкогольной интоксикации, подверженные воздействию экстремальной криотерапии.

Исследования проведены in vivo в условиях медикаментозной анестезии, достигавшейся внутрибрюшинным введением смеси 5%-го раствора тиопентала натрия и 20%-го раствора оксибутирата натрия в соотношении 1:3 в дозе 0,4 мл на 100 г массы тела.

Микрогемоциркуляцию в головном мозге, печени и подкожной клетчатке исследовали методом контактной биомикроскопии с помощью микроскопа Люмам К-1, снабженного средствами фото- и вццеорепистрации [3]. Прижизненная микроскопия позволила оценить скорость кровотока, определить диаметр и контуры стенок микрососудов, количество функционирующих микрососудов, а также взаимодействие форменных элементов крови. Для исследования микрогемоциркуляции конвекситальной поверхности головного мозга в лобнотеменной области черепа высверливалось отверстие площадью 1см2, твердую мозговую оболочку удаляли, пиальную сосудистую сеть наблюдали в поляризованном свете. Биомикроскопию проводили в режимах поляризации и люминесценции. В качестве флюорохрома использовали 2%-й раствор флюоресцеина натрия (уранина), 1 мл которого вводили внутривенно. Все полученные фото- и видеоизображения анализировали с помощью компьютерной программы “Fram”, предназначенной для расчетов морфометрических характеристик объекта. При интерпретации данных основывались на положениях теории обобщенного броуновского движения, в котором фигурирует величина Н (показатель Херста) [2,6]. Фрактальная размерность Н даёт возможность количественной оценки промежуточных состояний между в целом детерминированном и абсолютно случайным структурно-функциональным состоянием системы. Размерность Н, которая лежит в интервале между 0,5-1,0,

соответствует состоянию саморегулирующегося органа, т.е. персистентного. Антиперсис-тентное состояние системы нестабильно, имеет тенденцию к разрушению или перестройки, соответствует значениям Н в интервале 0-0,5. В настоящее время показатели Н используются в клинической практике для оценки характера происходящих в органах изменений при патологических процессах [9].

Препарирование образцов гипоталамуса для микроскопии полутонких срезов и трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов проводилось в соответствии с общепринятыми методами и рекомендациями. Полутонкие (0,5 мкм) срезы изготавливали на ультрамикротоме УМТП-4, закрепляли на предметном стекле, окрашивали толуидиновым синим и метиленовым синим. Срезы анализировались в оптическом микроскопе МБИ-15У с целью оценки морфологического состояния ткани гипоталамуса, а также выбора интересующего участка для дальнейшего изготовления ультратонких срезов. Ультратонкие срезы изготавливали в автоматическом режиме работы ультрамикротома УМТП-4, монтировали на опорные сетки, контрастировали 2% уранилацетатом на 70% этиловом спирте, а также цитратом свинца по методу Рейнольдса. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов осуществляли в электронных микроскопах просвечивающего типа ПЭМ-100К и ЭМВ-100БР.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами [1].

Результаты исследования и их обсуждение. Система кровоснабжения каждого органа представляет собой подсистему, которая полностью приспособлена к его структуре и функции. Метод прижизненной микроскопии позволил исследовать микрососуды только на поверхности органа. Видимые при биомикроскопии сосуды конвекситальной поверхности головного мозга интактных животных (1 группа) представляли собой сеть артериальных, венулярных и капиллярных сосудов. При этом диаметр венул в 2-3 раза больше, чем диаметр артериол. Анастомозов между сосудами мы не наблюдали. В контрольной группе животных сосудистая сеть pia mater сформирована и содержит сосуды всех звеньев микроциркуляторного русла. Тип ветвления кровеносных сосудов магистральный и смешанный. Отмечаются различные варианты хода сосудов, но чаще одна артериола сопровождается несколькими венулами, и диаметр венозного русла превышает диаметр артериального в 1,5 раза. Магистральные сосуды и сосуды малого диаметра делятся чаще дихотомически под различным углом отхождения ветвей (рис. 1а). Данная архитектоника гемоциркуляторного русла обеспечивает скорость кровотока и степень интенсивности обменных процессов в тканях мозга. Обилие кровеносных сосудов отмечается в поверхностном и последующем слоях гемоциркуляторного русла.

Хроническая алкогольная интоксикация у животных 2 группы вызвала изменения в системе кровообращения, которые ярко проявились на микрогемоциркуляторном уровне (рис. 1б). Визуальная оценка показывает увеличение плотности сосудистой сети, ее расширение и геморрагическое пропитывание, обусловленное значительными изменениями микрососудов. Характерной особенностью сосудов в алкоголизированной группе является уменьшение по сравнению с контрольной группой случаев дихотомического деления магистральных сосудов. Морфометрия выявила увеличение диаметра венул и посткапилляров в алкоголизированной группе крыс по сравнению со значениями в контрольной группе на 10-15 %. Отмеченная дилятация сосудов посткапиллярно-венулярного звена в диаметре больше на 20 % по сравнению с контрольной группой. В то же время, отмечаются изменения в структуре цитоархитектоники гемомикроциркуляторного русла за счет соотношений количества плазматических капилляров. Определяются сосуды с облитерированными ветвями и обедненной капиллярной сетью, вытянутые в единичные цепочки. Капилляры приобретают извитой ход, определяются участки выбухания стенок. Для артериол и прекапилляров характерной является спастико-атоническая реакция, которая представлена чередованием участков спастического сокращения сосудов и их паретической дилатацией. Отводящее звено микрососудистого русла паравезикулярно расширено с проявлением геморрагического пропитывания. Отмечается увеличение неравномерности диаметров посткапилляров и венул по их ходу. В некоторых капиллярах определяются локальные участки агрегации эритроцитов, признаки экстравазации форменных элементов крови в перикапиллярную зону.

РисІ.Микроциркуляторное русло мозга крыс: а) - интактные животные (контроль); б) - животные в состоянии хронической алкогольной интоксикации; в) - интактные животные, подверженные воздействию экстремальной криотерапии; г) животные в состоянии хронической алкогольной интоксикации, подверженные воздействию экстремальной криотерапии (объектив х10, окуляр х7).

По сравнению с контрольной группой, расширенные капилляры резко извиты и деформированы, в ряде случаев они приобретают микроварикозную структуру . Параметры микрогемоциркуляторного русла мозга, расчитанные с помощью программы “Fram”, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Морфометрические параметры микроциркуляторного русла мозга крыс в норме, при ХрА, у интактных животных после ЭК, при ХрА и последующей ЭК

Ткань Площадь сосудистого русла S,% от поля зрения

1группа 2 группа 3 группа 4 группа

Мозг 30,2±2,6 36,6±1,6 38,1 ±1,4 38,8±2,4

Н (показатель Херста) 0,91±0,08 0,98±0,02 0,62±0,01 0,62±0,09

Примечание: для каждой группы п=1 0

Животным 3 и 4 группы проводилось многократное (4 сеанса) ЭК. Температура непосредственно после ЭК на поверхности бедра составляла 22,1 ±0,2 °С, передней брюшной стенки - 24,1±0,6°С, головы - 22,1±0,2°С, ректальная - 36,7±0,1°С. Исследования микрогемоциркуляции проводились через сутки после последнего ЭК, т.е. после восстановления температуры до исходного уровня и сглаживания вегетативных реакций на охлаждение [3].

Исследование конвекситальной поверхности головного мозга у животных 3 группы после ЭК показало существенное увеличение диаметров микрососудов и площади сосудистого русла в поле зрения (табл.1) и практически были идентичны по числовым значениям показателям животных 4 группы. Кровоток у 3 группы животных струйный, агрегации форменных элементов не наблюдалось (рис. 1в).

После ЭК у алкоголизированных животных (рис. 1г) на макропрепаратах наблюдалось расширение сосудов конвекситальной поверхности головного мозга, в контрольных группах на макропрепаратах сосуды конвекситальной поверхности головного мозга не расширены. При микроскопическом исследовании отмечалось наличие участков локальных спастических сокращений прекапиллярного звена микроциркуляторного русла, обнаруживаются бессосудистые зоны. Организация кровеносного русла в большинстве случаев сохраняла основные закономерности конструкции, за исключением сохраняющегося объема запустевания и облитерации сосудов варьирующих калибров. Выбухание стенок сосудов микроциркуляторного русла характерно для сосудов среднего калибра. Отмечается дилятация сосудов посткапиллярно-венулярного звена. Увеличивается извитость отводящих микрососудов, в посткапилляpax и венулах также определяются различные по форме выбухания стенок микрососудов. Встречаются эритроцитарные агрегаты, которые заполняют просветы как отводящих, так и приносящих микрососудов. Вокруг отдельных капилляров, посткапилляров и венул определяются локальные геморрагии.

Представляет интерес сравнительный размах показателей у животных 1 и 3 групп и также у животных 2 и 4 групп. Возможно, это отражает пластичность регуляторных процессов у интактных животных и парадоксальность у животных в состоянии ХрА.

Данные площади сосудистого русла мозга соответствуют данным, представленным в предыдущих исследованиях [3,4,7]. Объем сосудистого русла отражает функциональную активность ткани мозга и характерен анатомической структуре. В условиях ХрА показатели S существенно различаются и указывают, с одной стороны, на перераспределение объемов циркулирующей крови, а с другой, зависят от функционального участия органа в процессах метаболизма алкоголя. Анализ изменений показателя Херста (Н) согласуется с вышеизложенными предположениями. Показатель Н также отражает динамические изменения состояния микроциркуляторного русла в соответствии с функциональным состоянием органа и указывает на снижение процессов саморегуляции микроциркуляторной системы при ХрА.

Изучение особенностей формирования привыкания к алкоголю и развития хронической алкогольной интоксикации позволило выявить некоторые изменения состояния клеток гипоталамуса. Структура переднего гипоталамуса представлена нервными и глиальными клетками с многочисленными отростками и сетью терминальных кровеносных сосудов. Среди нейронов преобладают клетки средней величины (10-20 мкм), крупные (22-30 мкм) и мелкие (5-9 мкм) встречаются редко (~ 1%). Наиболее многочисленные нейроны характеризуются сравнительной простотой ультратонкой организации. Однако среди клеток одинакового размера обнаруживается некоторая морфологическая гетерогенность. Так, часть нейронов имеет типично округлое ядро и отдельные скопления гранулярного эндоплазматического ретикулума, а другие — выраженные цитоплазматические инвагинации в ядро, хорошо развитый аппарат Гольджи. Отростки нервных клеток образуют разнообразные синапсы с характерным для всех отделов ЦНС общим планом структурной организации. Клетки микроглии, имеющие небольшие размеры (4-5 мкм), сосредоточены вокруг сосудов и нейронов и контактируют с ними. Электронноплотное ядро занимает почти весь объем этих клеток. Цитоплазма образует узкий слой вокруг ядра и содержит цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, рибосомы. Нейропиль исследуемой области головного мозга пронизан сетью капилляров и артериол (рис.2).

В результате ХрА отмечается слабо выраженный периваскулярный отек, разрыхление базальных мембран капилляров и мелких артериол. Отмечается округление перинуклеарной части клеток эндотелия сосудов и выбуханием их в просвет сосудов. В просветах некоторых артериол выявляется сладж эритроцитов. Межнейрональные контакты приобретают различные реактивные изменения в виде набухания аксональной части синапсов, численности, формы, осмиофильности и расположения везикул. Отмечаются контакты аксонных терминалей с шипиками дендритов, имеющих изменения деструктивного характера (рис.3). В основном - дегенерация по светлому типу. Важное значение имеют изменения шипикового аппарата, потому что наряду с синаптическими мембранами, им уделяется важное значение в процессе определения и формирования

временных связей. Типичным для алкогольной интоксикации является снижение информативности межнейронных контактов, что морфологически выявляется уменьшением площади контакта активных зон синаптических мембран и расширением синаптической щели. Во всех случаях вокруг измененных межнейрональных контактов наблюдается отек астроцитарной глии.

Таким образом, при алкогольной интоксикации через изменения в синапсах отмечается частичный разрыв межнейрональных ансамблей и, как следствие, появляется морфофункциональная основа развития алкогольной патологии.

Рис. 2. Участок нейропиля с фрагментом кровеносного капилляра интактной крысы. Ув. 10000.

Рис. 3. Синаптические бутоны в нейропиле крысы при хронической алкогольной интоксикации. Ув. 25000.

Рис. 4. Нейропиль крысы при хронической алкогольной интоксикации после ЭК. Ув. 25000.

После ЭК у животных с ХрА в ткани гипоталамуса эндотелий сосудов формирует тонкие периферические участки эндотелиоцитов, клетки микрососудов содержат гиперхромные ядра. Тела и отростки перицитов с гиперхромными ядрами в структуре базальной мембраны. Первый этап исследований выявил, что после применения Эк микроскопическая картина ткани переднего отдела гипоталамуса приближается к норме (рис.4). Состояние микрососудистого русла приходит в норму, кроме реактивности эндотелия в некоторых мелких артериолах.

/////^¿/.//^/^//////////////////////////////////////////////^

Изменения микрогемоциркуляторного русла - процесс динамичный, зависимый от морфофункциональных особенности органа и характера производимых воздействий. При длительной алкоголизации возникают специфические изменения гемомикроциркулятор-ного русла головного мозга. Отмечены более выраженные повреждения артериальных сосудов. Изменения венозного русла наиболее проявляются после ЭК воздействия, причём характер повреждений затрагивает сосуды всех калибров. Показатели фрактальной размерности, подтвержденные данными морфометрических исследований, могут служить аналитической характеристикой патофизиологических изменений, происходящих в системе микрогемоциркуляции.

1. Атраментова Л. О.Статистические методы в биологии: учебник [для студ. высш. уч. зав.] / Атраментова Л. О. Утевская О. М. - Горловка: ЧП «Видавництво Ліхтар>>, 2008. - 248с.

2. Божокин С. В. Фракталы и мультифракталы / С. В. Божокин, Д. А. Пашин. - Ижевск:НИЦ <<РХД>>, 2001.-128 с.

3. Комплекс для фрактальной морфометрии микроциркуляторного русла in vivo/ Луценко Д. Г.,

Марченко Н. В., Марченко В. С. [ и др.] //Проблемы криобиологии. -2005.-Т.15, № 3.-С. 516-518.

4. Ломакин И. И. Экспериментальная модель алкоголизма в условиях воздействия низких температур / И. И. Ломакин, Г. А. Бабийчук, В. В. Мамонтов //Проблемы криобиологии. -2005.-№ 3. -С. 499-503.

5. Судаков К. В. Основы физиологии функциональных систем / Судаков К. В. - М.: Медицина ,1983.-272с.

6. Фрактальный анализ процессов, структур и сигналов / Под редакцией Р. Э. Пащенко.-Х. : ЭкоПерспектива, 2006.-348 с.

7. Фрактальна організація мікроциркуляторного русла при штучній гіпотермії/ Луценко Д. Г., Слета І. В., Марченко В. С. [ и др.] // Науковий вісник національного аграрного університету.-Київ,2008.-С. 75-80.

8. Шабанов П. Д.Основы наркологии/ Шабанов П. Д. - Санкт-Петербург, 2002.- 560с.

9. Sampling variability of computer-aided fractal-corrected measures of liver fibrosis in needle biopsy

specimens. /Grizzi F, Russo C, Franceschini B [at al] //World J. Gastroenterol.-2006,Dec 21 .-12(47).-Р.7660-7665.

ФУНКЦІОНАЛЬНА АНГІОАРХІТЕКТОНІКА МОЗКУ ПРИ ДІЇ НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР В УМОВАХ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ МОДЕЛІ ХРОНІЧНОГО АЛКОГОЛІЗМУ Ломакін І.І., Луценко Д.Г., Марченко В.С., Марченко Л.М.

Відображено особливості організації' функціональної ангіоархітектоніки мозку при загальному екстремальному охолодженні (-120оС). Подається порівняльний аналіз змін фрактальної розмірності мікроциркуляторного руслу мозку щурів в нормі та за умов хронічної алкоголізації. Також наводяться результати морфологічного аналізу гіпоталамусу піддослідних тварин при хронічній алкогольній інтоксикації з наступним загальним екстремальним охолодженням.

Ключові слова: мозок, низькі температури, хронічний алкоголізм.

FUNCTIONAL BRAIN ANGIOARCHITECTONICS AFTER EXTREME COOLING IN EXPERIMENTAL MODEL OF A CHRONIC ALCOHOLISM Lomakin I.I., Lutsenko D.G., Marchenko V.S., Marchenko L.N.

In the article we show the characteristics of the functional brain architectonics after extreme cooling (about -120oC). We give a comparative analysis of changes in the fractal dimension of brain microcirculatory bed in rats in control and after chronic alcoholization. Also we give a morphological analysis of rat hypothalamus after chronic alcoholization and following extreme cooling.

Key words: brain, extreme cooling, chronic alcoholization.

УДК 615.361.018.46.014.41

ПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КЛЕТОК ПЛАЦЕНТЫ, КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ В РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ

Работа выполнена в рамках темы 2.2.6.38 № Госрегистрации 0107U006893.

Использование клеток плаценты рассматривается в настоящее время как одно из перспективных направлений терапии аутоиммунных заболеваний. Обоснованием такого подхода является способность этих клеток продуцировать широкий спектр иммуномодулирующих активностей. Так, показано изменение клетками трофобласта баланса регуляторных Т-хелперов в сторону противовоспалительного компартмента [11, 20], установлена продукция клетками цитотрофобласта супрессорных активностей в виде ТФРбета и ИЛ-10 [17], гигантскими трофобластическими клетками - фермента IDO [18]. Обсуждается участие макрофагов плаценты в поглощении иммунных комплексов [22],