СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОДУЛЯТОРОВ GPR92
METHODS FOR IDENTIFYING MODULATORS OF GPR92

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 62/322601, зарегистрированной 14 апреля 2016 года, включенной в настоящее описание в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способам идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию GPR92.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящее описание также в качестве ссылки включает список последовательностей, поданный посредством EFS 14 апреля 2017 года. В соответствии с 37 C.F.R. 1,52(e)(5), текстовый файл списка последовательностей, определяемый как seqlistingGPR92.txt, имеет размер 14567 байтов и создан 14 апреля 2017 года. Список последовательностей, поданный в электронном виде, не выходит за рамки описания и, таким образом, не содержит какой-либо новый объект изобретения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вкусовые профили съедобных композиций включают основные вкусы, такие как сладкий, соленый, горький, кислый, умами и кокуми. Вкусовые профили также описывают как включающие вкусы свободных жирных кислот. Химические соединения, проявляющие эти вкусы, часто обозначают как тастанты. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что тастанты ощущаются вкусовыми рецепторами во рту и глотке, передающими сигналы в головной мозг, где регистрируются тастанты и получающиеся вкусовые профили. Вкусовые рецепторы включают GPR92 (также известный как GPR93 и LPAR5), являющийся членом класса A сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR) (также известных как родопсин-подобные GPCR). Показано, что GPR92 экспрессируется во вкусовых чувствительных клетках (см.Haid et al., Histochem. Cell Biol., 140(2): 137-145 (2013)), и его могут активировать белковые гидролизаты, т.е. продукты гидролиза белков (пептон) (см.Choi et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292: G98-G112 (2007); Choi et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292(5): G1366-75 (2007)).
У производителей кормов для домашних животных уже долгое время сохраняется потребность в получении кормов для животных с высокой пищевой ценностью. Кроме того, особенно в отношении кормов для кошек и собак, производителям кормов для домашних животных необходима высокая степень вкусовой привлекательности таким образом, чтобы домашние животные могли получать полную питательную пользу от кормов. Домашние животные, особенно кошки, как известно, очень переменчивы в своих пищевых предпочтениях и часто отказываются есть корм, который был приемлемым для них в течение какого-то времени, или отказываются есть больше минимального количества корма. Это явление, частично, может быть результатом небольших различий сенсорных профилей исходного сырья, которые могут воспринимать домашние животные благодаря своей вкусовой и обонятельной системам. В результате, владельцы домашних животных часто меняют типы и марки кормов для поддержания здоровья и удовлетворительного состояния своих домашних животных.
Хотя последнее время наблюдают прогресс в технологиях вкусов и ароматов, сохраняется потребность в соединениях, которые могут усиливать или модифицировать вкусовую привлекательность кормов для домашних животных посредством усиления или модификации профилей вкуса, текстуры и/или аромата корма для домашних животных. Усиление или модификация могут служить для повышения интенсивности желаемого признака, для замены желаемого признака, отсутствующего или каким-либо образом утраченного в корме для домашних животных, или для снижения интенсивности нежелательного признака. В частности, желательно повышать интенсивность желаемого тастанта в корме для домашних животных.
Таким образом, в этой области сохраняется потребность в способах идентификации соединений, повышающих вкусовую привлекательность и/или модулирующих вкус кормов для домашних животных, и ароматизации композиций, содержащих эти соединения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам идентификации соединений, повышающих и/или модулирующих активность рецептора GPR92. После идентификации такие соединения можно включать во вкусоароматическую композицию, которую можно добавлять в различные корма для домашних животных для повышения вкусовой привлекательности продуктов. Например, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такую вкусоароматическую композицию комбинируют с кормом для домашних животных в количестве, эффективном для усиления вкуса и/или вкусовой привлекательности корма для домашних животных.
В определенных вариантах осуществления способ идентификации соединений, повышающих и/или модулирующих активность и/или экспрессию рецептора GPR92, включает экспрессию рецептора GPR92, имеющего нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, 2 или 3 или ее фрагменте или варианте, в клетке. Способ дополнительно может включать приведение клетки, экспрессирующей рецептор GPR92, в контакт с тестируемым соединением и определение активности и/или экспрессии рецептора GPR92 в присутствие соединения по сравнению с активностью и/или экспрессией рецептора в отсутствие соединения.
В определенных вариантах осуществления способ идентификации соединений, повышающих и/или модулирующих активность рецептора GPR92, включает экспрессию рецептора GPR92, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, 5 или 6 или ее фрагменте или варианте, в клетке. Способ дополнительно может включать приведение клетки, экспрессирующей рецептор GPR92, в контакт с тестируемым соединением и определение активности и/или экспрессии рецептора GPR92 в присутствие соединения по сравнению с активностью и/или экспрессией рецептора в отсутствие соединения.
В определенных вариантах осуществления клетка, экспрессирующая GPR92, также экспрессирует кальций-связывающий фотобелок. В определенных вариантах осуществления кальций-связывающий фотобелок выбран из группы, состоящей из клитина, экворина, обелина и их комбинаций.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу идентификации композиции, модулирующей активность рецептора GPR92, включающему (a) приведение тестируемого средства в контакт с рецептором GPR92, (b) определение активности рецептора GPR92 и (c) выбор тестируемого средства, повышающего активность рецептора GPR92, в качестве композиции.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу идентификации композиции, модулирующей активность рецептора GPR92, включающему (a) приведение тестируемого средства в контакт с рецептором GPR92, (b) определение взаимодействия между тестируемым средством и одной или нескольких аминокислот в трансмембранном домене 7 (7TM) рецептора GPR92, и (c) выбора тестируемого средства, взаимодействующего с одной или несколькими аминокислотами, в качестве композиции.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействует модулирующее соединение, включают одну или несколько из Arg83 на спирали 2; Gly103, Phe106, Gln107, Met110 и/или Cys114 на спирали 3; Thr161 и/или His165 на спирали 4; Ala200, Gly204 и/или Pro208 на спирали 5; Phe248, Phe252, Tyr255, Asn256 и/или Leu259 на спирали 6; Arg281, Met285 и/или Val288 на спирали 7; и/или Glu182 на второй внеклеточной (EC2) петле и их комбинации в рецепторе GPR92, например, рецепторе GPR92 кошки, например, как представлено в SEQ ID NO: 4.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействует модулирующее соединение, включают одну или несколько из Arg83, Arg281, Tyr255 и их комбинаций в рецепторе GPR92, например, рецепторе GPR92 кошки, например, как представлено в SEQ ID NO: 4.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействует модулирующее соединение, включают одну или несколько из Arg76 на спирали 2; Gly96, Phe99, Gln100, Met103 и/или Cys107 на спирали 3; Thr154 и/или His158 на спирали 4; Ala193, Gly197 и/или Pro201 на спирали 5; Phe241, Phe245, Tyr248, Asn249 и/или Leu252 на спирали 6; Arg274, Met278 и/или Val281 на спирали 7 и/или Glu175 на петле EC2 и их комбинации в рецепторе GPR92, например, GPR92 собаки, например, как представлено в SEQ ID NO: 5.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействует модулирующее соединение, включают одну или несколько из Arg76, Arg274, Tyr248 и их комбинаций в рецепторе GPR92, например, рецепторе GPR92 собаки, например, как представлено в SEQ ID NO: 5.
В определенных вариантах осуществления взаимодействие определяют посредством сайт-специфического мутагенеза, рентгеновской кристаллографии, рентгеновской спектроскопии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), оценки перекрестного сшивания, масс-спектроскопии, электрофореза, анализа смещения и их комбинаций.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу идентификации композиции, модулирующей активность рецептора GPR92, включающему (a) приведение агониста GPR92 в контакт с рецептором GPR92, (b) определение активности рецептора GPR92, (c) приведение тестируемого средства в контакт с рецептором GPR92, (d) определение активности рецептора GPR92 и (e) выбор тестируемого средства в качестве композиции, если активность (d) выше активности (b).
В определенных вариантах осуществления агонист рецептора GPR92 выбран из группы, состоящей из NAG (N-арахидонилглицина), FPP (3,7,11-триметил-2,6,10-додекатриен-1-ил пирофосфата), LPA (18:0) (1-стеароил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата), CPA (18:1) (1-олеоил-sn-глицеро-2,3-циклофосфата), LPA (14:0) (1-миристоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата), LPA (16:0) (1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата), LPA (18:1) (1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата), фарнезил монофосфата (FMP), алкил-глицерофосфата (AGP, также известного как алкил-LPA), циклической фосфатидной кислоты (CPA); карбо-CPA (CCPA), 2-карбо-CPA (2CCPA) или 3-карбо-CPA (3CCPA) и их комбинаций.
В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 экспрессируется клеткой, и тестируемое средство приводят в контакт с клеткой. В определенных вариантах осуществления клетка экспрессирует кальций-связывающий фотобелок. В определенных вариантах осуществления кальций-связывающий фотобелок выбран из группы, состоящей из клитина, экворина, обелина, любых их рекомбинантных или выделенных версий и любых их комбинаций. В определенных вариантах осуществления внутриклеточные уровни кальция подвергают мониторингу посредством детекции люминесценции или детекции флуоресценции. В определенных вариантах осуществления кальций-чувствительный флуоресцентный краситель выбран из группы, состоящей из Fura-2 AM, Fura-2 пентакалия, Fura Red AM, Indo-1 AM, Indo-1 пентакалия, Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8, Calcium Green-1, Calcium 3, Calcium 4, Calcium 5, Rhod-2, их производных и их комбинаций.
Выше в общих чертах представлены признаки и технические преимущества настоящего изобретения для лучшего понимания подробного описания, представленного ниже. Дополнительные признаки и преимущества изобретения будут представлены далее, образуя объект формулы настоящего изобретения. Специалистам в этой области будет понятно, что описываемую концепцию и конкретный вариант осуществления легко можно использовать в качестве основы для модификации или создания других структур для тех же целей, что и настоящее изобретение. Специалистам в этой области также будет понятно, что такие эквивалентные конструкции не отклоняются от сущности и объема настоящего изобретения, приведенного в формуле изобретения. Новые признаки, которые, как считают, характерны для настоящего изобретения, как для организации, так и для способа действия, вместе с дополнительными объектами и преимуществами будут более понятны из следующего описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность GPR92 кошки (SEQ ID NO: 1).
На фигуре 2 представлена нуклеотидная последовательность GPR92 собаки (SEQ ID NO: 2).
На фигуре 3 представлена нуклеотидная последовательность GPR92 человека (SEQ ID NO: 3).
На фигуре 4 представлена аминокислотная последовательность GPR92 кошки (SEQ ID NO: 4).
на фигуре 5 представлена аминокислотная последовательность GPR92 собаки (SEQ ID NO: 5).
На фигуре 6 представлена аминокислотная последовательность GPR92 человека (SEQ ID NO: 6).
На фигуре 7 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей GPR92 кошки, собаки и человека.
На фигуре 8 представлена схема спиралей домена 7TM GPR92 кошки.
На фигуре 9 представлена схема спиралей домена 7TM GPR92 собаки.
На фигуре 10 представлена схема спиралей домена 7TM GPR92 человека.
in silico
На фигуре 11A-C представлено моделирование  связывания соединения FPP (3,7,11-триметил-2,6,10-додекатриен-1-ил пирофосфата) с доменом 7TM GPR92 кошки. На (A) представлена структура связывающего соединения, на (B) представлена модель связывания соединения с GPR92, и на (C) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
in silico
На фигуре 12A-B представлено моделирование  связывания FPP (3,7,11-триметил-2,6,10-додекатриен-1-ил пирофосфата) с доменом 7TM GPR92 собаки. На (A) представлена модель связывания соединения с GPR92, и на (B) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
in silico
На фигуре 13A-C представлено моделирование  связывания LPA (18:0) (1-стеароил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата) с доменом 7TM GPR92 кошки. На (A) представлена структура связывающего соединения, на (B) представлена модель связывания соединения с GPR92, и на (C) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
in silico
На фигуре 14A-B представлено моделирование  связывания LPA (18:0) (1-стеароил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата) с доменом 7TM GPR92 собаки. На (A) представлена модель связывания соединения с GPR92 и на (B) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
in silico
На фигуре 15A-C представлено моделирование  связывания NAG (N-арахидонилглицина) с доменом 7TM GPR92 кошки. На (A) представлена структура связывающего соединения, на (B) представлена модель связывания соединения с GPR92, и на (C) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
in silico
На фигуре 16A-B представлено моделирование  связывания NAG (N-арахидонилглицина) с доменом 7TM GPR92 собаки. На (A) представлена модель связывания соединения с GPR92, и на (B) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
in silico
На фигуре 17A-C представлено моделирование  связывания CPA (18:1) (1-олеоил-sn-глицеро-2,3-циклофосфата) с доменом 7TM GPR92 кошки. На (A) представлена структура связывающего соединения, на (B) представлена модель связывания соединения с GPR92, и на (C) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
in silico
На фигуре 18A-B представлено моделирование  связывания CPA (18:1) (1-олеоил-sn-глицеро-2,3-циклофосфата) с доменом 7TM GPR92 собаки. На (A) представлена модель связывания соединения с GPR92, и на (B) представлены предполагаемые аминокислотные остатки GPR92, взаимодействующие со связывающим соединением.
На фигуре 19A-C представлены ответы выбранного клона K1.4 при тестировании с использованием LPA 14:0 (1-миристоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата) (A), LPA 16:0 (1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата) (B), LPA 18:1 (1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата) (C). Также представлены ответы ложнотрансфицированной линии клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к способам идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию GPR92, где указанные соединения можно включать во вкусоароматическую композицию, которую можно использовать для повышения вкусовой привлекательности и/или усиления или модификации вкуса различных кормов для домашних животных, таких как питательно полный корм для домашних животных или лакомства для домашних животных.
1. Определения
Термины, используемые в настоящем описании, как правило, обладают своими значениями, общепринятыми в этой области, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, в котором используют каждый термин. Конкретные термины описаны ниже или где-либо в описании для обеспечения дополнительного руководства для практикующего специалиста в описании способов и композиций по изобретению и их получения и применения.
В рамках изобретения использование единственного числа в комбинации с термином "содержащий" в формуле изобретения и/или описании может означать "один", но оно также соответствует значению "один или несколько" и "по меньшей мере один". Кроме того, термины "имеющий", "включающий" и "содержащий" являются взаимозаменяемыми, и специалисту в этой области известно, что эти термины являются неограничивающими терминами.
Термин "приблизительно" означает "в пределах приемлемого диапазона ошибок для конкретного значения", как определено специалистом в этой области, что будет частично зависеть от того, как измеряют или определяют значение, т.е. ограничений системы измерения. Например, термин "приблизительно" может означать в пределах 3 или более 3 стандартных отклонений в соответствии с практикой в этой области. Альтернативно, термин "приблизительно" может означать диапазон до 20%, предпочтительно - до 10%, более предпочтительно - до 5%, и более предпочтительно - до 1% указанного значения. Альтернативно, особенно в отношении биологических систем или процессов, термин может означать "в пределах порядка величины", предпочтительно - в пределах 5-кратного, и более предпочтительно - в пределах 2-кратного значения величины.
В рамках изобретения термин "вкус" относится к ощущению, вызываемому активацией рецепторов клетки во вкусовых луковицах индивидуума. В определенных вариантах осуществления вкус можно выбирать из группы, состоящей из сладкого, кислого, соленого, горького, кокуми и умами. В определенных вариантах осуществления "вкус" может включать вкус свободных жирных кислот. См., например, Cartoni et al., J. of Neuroscience, 30(25): 8376-8382 (2010), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. В определенных вариантах осуществления вкус вызван "тастантом". В определенных вариантах осуществления тастант может являться синтетическим тастантом. В определенных вариантах осуществления тастант получают из природного источника.
В рамках изобретения термин "вкусовой профиль" относится к комбинации вкусов, таких как, например, один или несколько из сладкого, кислого, соленого, горького, умами, кокуми и вкуса свободных жирных кислот. В определенных вариантах осуществления вкусовой профиль вызван одним или несколькими тастантами, присутствующими в композиции в одинаковых или разных концентрациях. В определенных вариантах осуществления термин "вкусовой профиль" относится к интенсивности вкуса или комбинации вкусов, например, сладкого, кислого, соленого, горького, умами, кокуми и вкуса свободных жирных кислот, как определено индивидуумом или определяют посредством любого анализа, известного в этой области. В определенных вариантах осуществления модификация, изменение или варьирование комбинации тастантов во вкусовом профиле может изменять процесс восприятия индивидуума.
В рамках изобретения термин "вкус и аромат" относится к одному или несколько сенсорным стимулам, таким как, например, один или несколько из вкуса (вкусового), запаха (ольфакторного), прикосновения (тактильного) и температуры (термического) стимулов. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления процесс восприятия индивидуума, подвергнутого воздействию вкуса и аромата, можно классифицировать как характерный опыт для конкретного вкуса и аромата. Например, индивидуум может идентифицировать вкус и аромат как, в качестве неограничивающих примеров, цветочный, цитрусовый, ягодный, ореховый, карамельный, шоколадный, перечный, дымный, сырный, мясной и т.д. вкус и аромат. В рамках изобретения вкусоароматическую композицию можно выбирать из жидкости, раствора, порошка, спрея, пасты, суспензии и любой их комбинации. Вкусоароматическая композиция может являться природной композицией, искусственной композицией, идентичной натуральной, или любой их комбинацией.
Как взаимозаменяемо используют в настоящем описании, термины "аромат" и "запах" относятся к ольфакторному ответу на стимул. В качестве неограничивающего примера, аромат может продуцироваться ароматическими веществами, воспринимаемыми ольфакторными рецепторами ольфакторной системы.
В рамках изобретения термин "вкусоароматический профиль" относится к комбинации сенсорных стимулов, например, вкусов, таких как сладкий, кислый, горький, соленый, умами, кокуми, вкус свободных жирных кислот, и/или ольфакторных, тактильных и/или термических стимулов. В определенных вариантах осуществления вкусоароматические профили включают один или несколько вкусов и ароматов, вносящих свой вклад в процесс восприятия индивидуумом. В определенных вариантах осуществления модификация, изменение или варьирование комбинации стимулов во вкусоароматическом профиле может изменять процесс восприятия индивидуума.
В рамках изобретения термин "вкусовая привлекательность" может относиться к общему желанию животного есть конкретный пищевой продукт. Повышение "вкусовой привлекательности" корма для домашних животных может приводить к увеличению удовольствия и приемлемости корма для домашнего животного для животного-компаньона для обеспечения того, чтобы животное съедало "полезное для здоровья количество" корма для домашних животных. В рамках изобретения термин "полезное для здоровья количество" корма для домашних животных относится к количеству, позволяющему животному-компаньону поддерживать потребление или достигать потребления, обеспечивающего его общее здоровое состояние в терминах питательных микроэлементов, макронутриентов и калорий, таких, как указано в "Mars Petcare Essential Nutrient Standards". В определенных вариантах осуществления термин "вкусовая привлекательность" может означать относительное предпочтение животным одного пищевого продукта относительно другого. Например, если животное демонстрирует предпочтение одного из двух или более кормов, предпочтительный корм является более "вкусным" и имеет "повышенную вкусовая привлекательность". В определенных вариантах осуществления относительную вкусовую привлекательность одного корма по сравнению с одним или несколькими другими кормами можно определять, например, посредством параллельного сравнения свободного потребления, например, относительного потребления кормов, или другого подходящего определения предпочтения, свидетельствующего о вкусовой привлекательности. Вкусовую привлекательность можно определять стандартным способом тестирования, при котором животное имеет равный доступ к обоим кормам, таким как тест под названием "тест двух мисок" или "тест сравнения". Такое предпочтение может являться результатом любого из ощущений животного, но может быть связано, помимо прочего, со вкусом, послевкусием, запахом, ощущением во рту и/или текстурой.
Felis domesticus
Canis lupus familiaris
Термин "корм для домашних животных" означает продукт или композицию, предназначенные для потребления животным-компаньоном, таким как кошки, собаки, морские свинки, мыши, кролики, птицы и лошади. Например, в качестве неограничивающего примера, животное-компаньон может являться "домашней" кошкой, такой как . В определенных вариантах осуществления животное-компаньон может являться "домашней" собакой, например,. Термин "корм для домашних животных" может включать любой корм, закуску, пищевую добавку, жидкость, напиток, лакомство, игрушку (жевательную и/или съедобную игрушку), заменитель пищи.
В рамках изобретения термин "питательно полный" относится к кормам для домашних животных, содержащим все известные необходимые питательные вещества для предполагаемого реципиента корма для домашних животных в подходящих количествах и долях с учетом, например, рекомендаций известных или компетентных авторитетных специалистов в области питания животных-компаньонов. Таким образом, такие корма могут служить в качестве единственного источника пищевого рациона для поддержания жизни без использования дополнительных источников питательных веществ.
В рамках изобретения термин "вкусоароматическая композиция" относится по меньшей мере к одному соединению или его биологически приемлемой соли, модулирующим, например, усиливающим, потенциирующим, снижающим, подавляющим или индуцирующим, вкусы, запахи и/или текстуры природного или синтетического тастанта, ароматизатора, вкусового профиля, вкусоароматического профиля и/или профиля текстуры у животного или человека. В определенных вариантах осуществления вкусоароматическая композиция содержит комбинацию соединений или его биологически приемлемых солей. В определенных вариантах осуществления вкусоароматическая композиция включает один или несколько эксципиентов.
in silico
in vitro
in vivo
В рамках изобретения термины "модулирует" или "модифицирует" относятся к повышению или снижению степени, качества или эффекта конкретной активности рецептора и/или повышению или снижению экспрессии, активности или функции рецептора. В рамках изобретения термин "модуляторы" относится к любым ингибиторным или активирующим соединениям, идентифицированным с использованием анализов ,  и/или , например,агонистам, антагонистам и их гомологам, включая фрагменты, варианты и миметики.
В рамках изобретения термин "ингибиторы" или "антагонисты" относится к модулирующим соединениям, снижающим, блокирующим, предотвращающим, замедляющим активацию, инактивирующим, десенсибилизирующим или отрицательно регулирующим биологическую активность и/или экспрессию интересующих рецепторов или пути.
В рамках изобретения термины "индукторы", "активаторы" или "агонисты" относятся к модулирующим соединениям, повышающим, индуцирующим, стимулирующим, открывающим, активирующим, содействующим, усиливающим активацию, сенсибилизирующим или положительно регулирующим интересующий рецептор или путь.
В определенных вариантах осуществления "активное соединение" является соединением, модулирующим, т.е. активным в отношении, рецептора GPR92. Например, активное соединение может являться активным в отношении рецептора GPR92 как агонист, антагонист, положительный аллостерический регулятор (PAM), отрицательный аллостерический регулятор, или как соединение, демонстрирующее сочетание активностей, например, агонистическую активность, а также активность положительного аллостерического регулятора, или агонистическую активность, а также активность отрицательного аллостерического регулятора.
В рамках изобретения термины "вектор" и "экспрессирующий вектор" относятся к молекулам ДНК, являющимся линейными или кольцевыми, в которые можно встраивать другой фрагмент последовательности ДНК подходящего размера. Такие фрагменты ДНК могут включать дополнительные сегменты, обеспечивающие транскрипцию гена, кодируемого фрагментом последовательности ДНК. Дополнительные сегменты могут включать, в качестве неограничивающих примеров, промоторы, терминаторы транскрипции, энхансеры, внутренние участки связывания рибосом, нетранслируемые области, сигналы полиаденилирования, селективные маркеры, участки начала репликации и т.п. Экспрессирующие векторы часто получают из плазмид, космид, вирусных векторов и искусственных дрожжевых хромосом. Векторы часто являются рекомбинантными молекулами, содержащими последовательности ДНК из нескольких источников.
Термин "функционально связанный" в отношении последовательностей ДНК, например, в экспрессирующем векторе, свидетельствует о том, что последовательности расположены таким образом, что они функционируют совместно для достижения намеченной цели, т.е. последовательность промотора делает возможной инициацию транскрипции, затрагивающей связанную с ней кодирующую последовательность до сигнала терминации.
in vitro
В рамках изобретения термины "молекула нуклеиновой кислоты" и "нуклеотидная последовательность" относятся к одно- или двухцепочечной, ковалентно связанной последовательности нуклеотидов, в которой 3'- и 5'-концы каждого нуклеотида соединены фосфодиэфирными связями. Молекула нуклеиновой кислоты может включать дезоксирибонуклеотидные основания или рибонуклеотидные основания, и их можно получать синтетически  или выделять из природных источников.
Термины "полипептид", "пептид", "аминокислотная последовательность" и "белок", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к молекуле, образованный посредством связывания по меньшей мере двух аминокислот. Связь между одним аминокислотным остатком и следующим является амидной связью, и иногда ее обозначают как пептидную связь. Полипептид можно получать подходящим, известным в этой области способом, включая выделение из природных источников, экспрессию в рекомбинантной системе экспрессии, химический синтез или ферментативный синтез. Термины можно использовать по отношению к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственными химическими миметиками соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам и неприродным аминокислотным полимерам.
В рамках изобретения термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, функционирующим аналогично природным аминокислотам. Природные аминокислоты являются аминокислотами, кодируемыми генетическим кодом, а также аминокислотам, подвергнутым дальнейшей модификации, например, гидроксипролину, гамма-карбоксиглутамату и O-фосфосерину. Термины "аналоги" и "производные" аминокислот могут относиться к соединениям, имеющим ту же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, т.е. углерод, связанный с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и R-группу, например,гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид и метилметионин-сульфоний. Такие аналоги могут содержать модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и природная аминокислота. Термин "миметики" аминокислот означает химические соединения, имеющие структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но функционирующую аналогично природной аминокислоте.
В рамках изобретения термин "гидролизаты белков" относится к продуктам распада белков, например, гидролиза белков. Гидролизаты белков можно получать посредством ферментативного, кислотного или щелочного гидролиза белка. Гидролизаты белков могут включать пептиды, в частности, короткоцепочечные пептиды и пептоны, и аминокислоты, составляющие белок. Гидролизаты белков также могут включать жиры, например, свободные жирные кислоты, и другие продукты распада мяса (т.е. продукты животного происхождения).
Термины "выделенный" или "очищенный", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к нуклеиновой кислоте, полипептиду или другому биологическому веществу, отделенному от компонентов, с которыми оно ассоциировано в природе. Термин "выделенный" может относиться к полипептиду, отделенному от целого организма, в котором молекулу обнаруживают в природе, или в котором она присутствует, по существу, в отсутствие других биологических макромолекул того же типа. Термин "выделенный" в отношении полинуклеотида может относиться к молекуле нуклеиновой кислоты, лишенной полностью или частично последовательностей, с которыми она, как правило, ассоциирована в природе; или последовательности в том виде, в котором она существует в природе, но содержащей гетерологичные последовательности, связанные с ней; или молекуле, отделенной от хромосомы.
В рамках изобретения термин "рекомбинантный" можно использовать для описания молекулы нуклеиновой кислоты, и он относится к полинуклеотиду геномного, РНК, ДНК, кДНК, вирусного, полусинтетического или синтетического происхождения, который благодаря своему происхождению или манипуляции не ассоциирован со всем полинуклеотидом или его частью, с которыми он ассоциирован в природе.
В рамках изобретения термин "слияние" относится к соединению разных пептидных или белковых сегментов генетическими или химическими способами, где соединенные концы пептидных или белковых сегментов могут быть непосредственно смежными друг относительно друга, или их можно разделять линкером или спейсером, таким как аминокислотные остатки или другие связывающие группы.
2. Рецепторы GPR92
Настоящее изобретение относится к рецептору GPR92 для использования в описываемых способах. Рецептор GPR92 по настоящему изобретению может являться рецептором млекопитающего, в качестве неограничивающих примеров, таким как рецептор кошки, собаки или человека.
В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в настоящем изобретении включает GPR92 кошки, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, и/или аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, включая их фрагменты (например, их функциональные фрагменты) и варианты.
В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в настоящем изобретении включает GPR92 собаки, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и/или аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, включая их фрагменты (например, их функциональные фрагменты) и варианты.
В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в настоящем изобретении включает GPR92 человека, имеющую нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и/или аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, включая их фрагменты (например, их функциональные фрагменты) и варианты.
В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в настоящем изобретении может включать рецептор, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности по отношению к SEQ ID NO: 1, 2 или 3.
В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в настоящем изобретении может включать рецептор, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности по отношению к SEQ ID NO: 4, 5 или 6.
Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей можно определять, выравнивая последовательности в целях оптимального сравнения (например, можно включать пропуски в первую последовательность для лучшего выравнивания с последовательностью) и сравнивая аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях. Процент идентичности можно определять по количеству идентичных аминокислотных остатков или нуклеотидов в сравниваемых последовательностях (например, % идентичности=количество идентичных положений/общее количество положений × 100).
Определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с использованием математического алгоритма, известного специалистам в этой области. Неограничивающим примером математического алгоритма для сравнения двух последовательностей является алгоритм Karlin и Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 2268, модифицированный по Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Программы NBLAST и XBLAST по Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410 включают такой алгоритм. Поиски нуклеотидов BLAST можно осуществлять с использованием программы NBLAST, баллы=100, длина слова=12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидным последовательностям по изобретению. Поиски белков BLAST можно осуществлять с использованием программы XBLAST, баллы=50, длина слова=3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных аминокислотной последовательности по изобретению. Для получения выравнивания с пропусками в целях сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 3402, описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Альтернативно, можно использовать PSI Blast для осуществления итеративного поиска, с помощью которого определяют отдаленные взаимосвязи между молекулами. При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI Blast можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Дополнительным неограничивающим примером математического алгоритма, используемым для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller, CABIOS (1989), описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Программа ALIGN (версия 2.0), являющаяся частью пакета программ для выравнивания последовательностей CGC, включает такой алгоритм. Другие неограничивающие примеры алгоритмов для анализа последовательностей, известных в этой области, включают ADVANCE и ADAM, как описано в Torellis и Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3 5; и FASTA, описанный в Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 8, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В FASTA ktup является контрольной опцией, с помощью которой задают чувствительность и скорость поиска.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению выделенного или очищенного рецептора GPR92 и/или его вариантов и фрагментов. Настоящее изобретение также включает применение вариантов последовательности. В определенных вариантах осуществления могут иметь место изменения в кодирующих и некодирующих областях нуклеотидной последовательности GPR92. Варианты могут включать, по существу, гомологичный белок, кодируемый тем же генетическим локусом в организме, т.е. аллельным вариантом. Варианты также включают белки, полученные из других генетических локусов в организме, например, кошки, но имеющие существенную гомологию с GPR92, т.е. гомологи. Варианты также могут включать белки, по существу, гомологичные GPR92, но полученные из другого организма, т.е. ортологи. Варианты также включают белки, по существу, гомологичные GPR92, полученные посредством химического синтеза. Варианты также включают белки, по существу, гомологичные GPR92, полученные рекомбинантными способами.
Ортологи, гомологи и аллельные варианты можно идентифицировать способами, хорошо известными в этой области. Эти варианты могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую рецептор, по меньшей мере на приблизительно 60-65%, приблизительно 65-70%, приблизительно 70-75, приблизительно 80-85%, приблизительно 90-95%, приблизительно 95-99% или более гомологичный нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, 2 или 3, или ее фрагментам. Такие молекулы нуклеиновой кислоты легко можно идентифицировать по способности гибридизоваться в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, 2 или 3, или ее фрагментом. В определенных вариантах осуществления два полипептида (или их области), по существу, гомологичны, если аминокислотные последовательности по меньшей мере на приблизительно 60-65%, приблизительно 65-70%, приблизительно 70-75, приблизительно 80-85%, приблизительно 90-95%, приблизительно 95-99% или более гомологичны аминокислотным последовательностям, приведенным в SEQ ID NO: 4, 5 или 6, или их фрагменту. По существу, гомологичная аминокислотная последовательность по настоящему изобретению будет кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с последовательностью нуклеиновой кислоты или ее частью, нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, 2 или 3, в строгих условиях.
Рецептор GPR92 для использования в способах по настоящему изобретению может содержать добавления, делеции или замены аминокислотных остатков (варианты), по существу, не изменяющие биологическую активность рецептора. Эти отдельные участки или области рецепторов, которые можно изменять, не влияя на биологическую активность, можно определять, например, посредством исследования структуры внеклеточного домена рецептора. Альтернативно и/или дополнительно, можно эмпирически определять эти области рецептора, которые могут выдерживать замены аминокислот посредством аланин-сканирующего мутагенеза (Cunningham et al., 244 Science 1081-1085 (1989), описание которой, таким образом, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). В способе аланин-сканирующего мутагенеза выбранные аминокислотные остатки по-отдельности заменяют нейтральной аминокислотой (например, аланином) для определения эффектов в отношении биологической активности.
Общеизвестно, что маловероятно, что консервативные замены аминокислот будут нарушать структуру и/или функцию полипептида. Таким образом, настоящее изобретение включает одну или несколько консервативных замен аминокислот в GPR92. Консервативные замены аминокислот, как правило, включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой, схожей по структуре и/или функции (например, аминокислоты с боковыми цепями, схожими по размеру, заряду и форме). В этой области известны семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В определенных вариантах осуществления один или несколько аминокислотных остатков в GPR92 можно заменять другими аминокислотными остатками из одного семейства боковых цепей и можно тестировать измененный белок на сохраненную функцию с использованием функциональных анализов, представленных в настоящем описании. Модификации в GPR92 по настоящему изобретению можно вносить стандартными способами, известными в этой области, такими как сайт-специфический мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Если замены приводят к сохранению биологической активности, то можно вносить больше существенных изменений, и/или можно осуществлять другие добавления/делеции, и подвергать полученный продукт скринингу. В определенных вариантах осуществления делеции или добавления могут включать 5-10 остатков, альтернативно - 2-5 аминокислотных остатков или 1-2 остатка.
Настоящее изобретение также относится к слитым белкам, содержащим GPR92 или его фрагмент. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к слитым белкам GPR92 или его функциональных фрагментов и константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления слитый белок по настоящему изобретению может включать детектируемый маркер, функциональную группу, такую как носитель, метку, стабилизирующую последовательность или механизм, посредством которого можно определять связывание агониста GPR92. Неограничивающие варианты осуществления метки включают метку FLAG, метку His, метку MYC, мальтозо-связывающий белок и другие метки, известные в этой области. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие слитые белки, векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие слитый белок, и клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты или векторы. В определенных вариантах осуществления слияние можно осуществлять по амино-концу (N-концу) GPR92 или карбокси-концу (C-концу) GPR92.
В определенных вариантах осуществления GPR92, как представлено в настоящем описании, может содержать дополнительные аминокислоты на N-конце и/или C-конце последовательностей, например, при использовании в способах по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления дополнительные аминокислоты могут способствовать иммобилизации полипептида в целях скрининга, или позволять полипептиду быть частью слитого белка, как описано выше, для простоты детекции биологической активности.
3. Способы идентификация GPR92-модулирующих соединений
in silico
in vitro
Настоящее изобретение также относится к способам идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию рецептора GPR92. В качестве неограничивающих примеров, модулятор может являться агонистом или антагонистом. Настоящее изобретение относится к способам  и  идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию рецептора GPR92, описанного выше.
in silico
3.1 Способы
in silico
Настоящее изобретение также относится к способам  идентификации соединений, которые потенциально могут взаимодействовать с рецептором GPR92 и/или модулировать активность и/или экспрессию рецептора GPR92.
В определенных вариантах осуществления способ может включать прогнозирование трехмерной структуры (3D) GPR92 и скрининг предсказанной 3D-структуры с использованием предполагаемых GPR92-модулирующих соединений (т.е. тестируемых соединений). Способ дополнительно может включать прогнозирование того, будет ли предполагаемое соединение взаимодействовать с участком связывания рецептора посредством анализа потенциальных взаимодействий с использованием предполагаемого соединения и аминокислот рецептора. Способ дополнительно может включать идентификацию тестируемого соединения, которое может связываться и/или модулировать биологическую активность GPR92, посредством определения соответствия 3D-структуры соединения участку связывания 3D-структуры рецептора.
В определенных вариантах осуществления GPR92 для использования в описываемом способе может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 5 или 6 или ее фрагмент или вариант. В определенных вариантах осуществления GPR92 для использования в настоящем изобретении может включать рецептор, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности по отношению к SEQ ID NO: 4, 5 или 6 или ее фрагменту или варианту. В определенных вариантах осуществления GPR92 для использования в описанном способе может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 3 или ее фрагмент или вариант. В определенных вариантах осуществления GPR92 для использования в настоящем изобретении может включать рецептор, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности по отношению к SEQ ID NO: 1, 2 или 3 или ее фрагменту или варианту.
Неограничивающие примеры соединений (например, потенциальных модуляторов GPR92), которые можно тестировать с использованием описываемых способов, включают любое небольшое химическое соединение или любое биологическое вещество, такое как пептиды, соли и аминокислоты, известные в этой области. В определенных вариантах осуществления тестируемое соединение может являться небольшой химической молекулой. В определенных вариантах осуществления тестируемое соединение может являться белковым гидролизатом. В определенных вариантах осуществления тестируемое соединение может являться известным агонистом GPR92, в качестве неограничивающих примеров, NAG (N-арахидонилглицином), FPP (3,7,11-триметил-2,6,10-додекатриен-1-ил пирофосфатом), LPA (18:0) (1-стеароил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфатом), CPA (18:1) (1-олеоил-sn-глицеро-2,3-циклофосфатом), LPA (14:0) (1-миристоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфатом), LPA (16:0) (1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфатом) и LPA (18:1) (1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфатом). В определенных вариантах осуществления тестируемое соединение может являться фарнезил монофосфатом (FMP), алкил-глицерофосфатом (AGP, также известным как алкил-LPA), циклической фосфатидной кислотой (CPA); карбо-CPA (CCPA), 2-карбо-CPA (2CCPA) или 3-карбо-CPA (3CCPA). В определенных вариантах осуществления тестируемое соединение может являться любым агонистом GPR92, описанным в Williams, et al., The Journal of Biological Chemistry VOL. 284, NO. 25, pp. 17304-17319, June 19, 2009.
,
in silico
В определенных вариантах осуществления структурные модели рецептора GPR92 можно строить с использованием кристаллических структур других GPCR в качестве матрицы для гомологического моделирования. В качестве неограничивающих примеров, структурные модели можно получать с использованием кристаллических структур других GPCR класса A. В определенных вариантах осуществления структурная модель GPR92 может быть основана на известной кристаллической структуре GPCR класса A или комбинации известных кристаллических структур GPCR класса A (см.например, Lee et al., Eur. J Pharmacol. 2015 May 14. pii: S0014-2999(15)30012-1, и Berman et al., Nucleic Acids Research, 28: 235-242 (2000), каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Примеры кристаллических структур других GPCR класса A включают 4N6H дельта-опиоидного рецептора человека; и/или 4MBS рецептора хемокинов CCR5; и/или 4PHU GPR40 человека. На фигурах 11-18 приведены структурные модели GPR92, которые можно использовать в описываемых способах. Можно использовать любое подходящее программное обеспечение для моделирования, известное в этой области. В определенных вариантах осуществления для получения трехмерной структуры белка можно использовать пакет программ Modeller (Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5,6.1-5,6.30 (2006)) и/или пакет программ I-TASSER (Yang et al., Nature Methods, 12: 7-8 (2015)).
in silico
В определенных вариантах осуществления способы  идентификации соединения, связывающегося с GPR92, включают определение того, взаимодействует ли тестируемое соединение с одной или несколькими аминокислотами взаимодействующего домена GPR92, как представлено в настоящем описании.
in silico
in vitro,
Соединения, идентифицированные описываемыми способами , можно дополнительно тестировать способами  представленными в настоящем описании.
3.2 Участок связывания рецептора GPR92
in silico
Настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений, модулирующих активность рецептора GPR92, например, GPR92 кошки, собаки или человека, где соединения взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами рецептора. В определенных вариантах осуществления участок связывания рецептора GPR92 содержит аминокислоты в трансмембранном домене 7 (7TM) рецептора, и его можно идентифицировать, получая карту взаимодействий рецептора с использованием моделирования , как представлено в настоящем описании. В одном из неограничивающих примеров наличие аминокислоты на карте взаимодействий 7TM означает, что остаток находится вблизи лиганд-связывающей среды и взаимодействует с лигандом.
in silico
В определенных вариантах осуществления взаимодействие между соединением и одной или несколькими аминокислотами рецептора GPR92, представленного в настоящем описании, может включать одну или несколько водородных связей, ковалентных связей, нековалентных связей, солевых мостиков, физических взаимодействий и их комбинаций. Взаимодействия также могут являться любым взаимодействием, характерным для взаимодействия лиганд-рецептор, известного в этой области. Такие взаимодействия можно определять посредством, например, сайт-специфического мутагенеза, рентгеновской кристаллографии, рентгеновской или другой спектроскопии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), оценки перекрестного сшивания, масс-спектроскопии или электрофореза, криомикроскопии, анализа смещения на основе известных агонистов, определения структуры и их комбинаций. В определенных вариантах осуществления взаимодействия определяют , например, теоретическими средствами, такими как докинг соединения в связывающий карман GPR92 кошки или собаки, как представлено в настоящем описании, например, с использованием молекулярного докинга, молекулярного моделирования, молекулярной симуляции или других средств, известных специалистам в этой области.
В определенных вариантах осуществления взаимодействие является взаимодействием посредством соляного мостика.
В определенных вариантах осуществления взаимодействие является взаимодействием посредством водородной связи.
В определенных вариантах осуществления взаимодействие является гидрофобным взаимодействием.
В определенных вариантах осуществления соединения, идентифицированные способами, представленными в настоящем описании, модулирующие активность рецептора GPR92, взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами в трансмембранном домене рецептора GPR92, например, трансмембранном домене 7 (7TM). В определенных вариантах осуществления соединения взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами в активном центре GPR92, содержащем гидрофобную область, локализованную между спиралями.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют соединения, содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или больше из Arg83 на спирали 2; Gly103, Phe106, Gln107, Met110 и/или Cys114 на спирали 3; Thr161 и/или His165 на спирали 4; Ala200, Gly204 и/или Pro208 на спирали 5; Phe248, Phe252, Tyr255, Asn256 и/или Leu259 на спирали 6; Arg281, Met285 и/или Val288 на спирали 7; и/или Glu182 на второй внеклеточной петле (EC2) рецептора GPR92, например, рецептора GPR92 кошки, например, как представлено в SEQ ID NO: 4.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют соединения, содержат одну или несколько из Arg83, Arg281, Tyr255 и их комбинаций из рецептора GPR92, например, рецептора GPR92 кошки, например, как представлено в SEQ ID NO: 4. В определенных вариантах осуществления соединения дополнительно взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из Gly103, Phe106, Gln107, Met110 и/или Cys114 на спирали 3; Thr161 и/или His165 на спирали 4; Ala200, Gly204 и/или Pro208 на спирали 5; Phe248, Phe252, Asn256 и/или Leu259 на спирали 6; Met285 и/или Val288 на спирали 7; и/или Glu182 на второй внеклеточной петле (EC2) и их комбинаций из рецептора GPR92, например, рецептора GPR92 кошки, например, как представлено в SEQ ID NO: 4.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют соединения, содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19 или больше из Arg76 на спирали 2; Gly96, Phe99, Gln100, Met103 и/или Cys107 на спирали 3; Thr154 и/или His158 на спирали 4 (His158 является концом спирали 4); Ala193, Gly197 и/или Pro201 на спирали 5; Phe241, Phe245, Tyr248, Asn249 и/или Leu252 на спирали 6; Arg274, Met278 и/или Val281 на спирали 7; и/или Glu175 на петле EC2 рецептора GPR92, например, GPR92 собаки, например, как представлено в SEQ ID NO: 5.
В определенных вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют соединения, содержат одну или несколько из Arg76, Arg274, Tyr248 и их комбинаций из рецептора GPR92, например, рецептора GPR92 собаки, например, как представлено в SEQ ID NO: 5. В определенных вариантах осуществления соединения дополнительно взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из Gly96, Phe99, Gln100, Met103 и/или Cys107 на спирали 3; Thr154 и/или His158 на спирали 4 (His158 является концом спирали 4); Ala193, Gly197 и/или Pro201 на спирали 5; Phe241, Phe245, Asn249 и/или Leu252 на спирали 6; Met278 и/или Val281 на спирали 7; и/или Glu175 на петлей EC2 и их комбинаций, из рецептора GPR92, например, GPR92 собаки, например, как представлено в SEQ ID NO: 5.
В определенных вариантах осуществления соединения связываются с аминокислотными остатками в рецепторе GPR92, гомологичными остаткам, представленным в настоящем описании, например, в GPR92 вида, иного, чем кошка или собака, или из кошки или собаки, экспрессирующей вариант аминокислотной последовательности и/или последовательности нуклеиновой кислоты GPR92, представленной в настоящем описании.
in vitro
3.3 Способы
in vitro
Настоящее изобретение также относится к способам  идентификации соединений, которые могут модулировать активность и/или экспрессию рецептора GPR92.
Рецептор GPR92 для использования в способах по настоящему изобретению может включать выделенный или рекомбинантный GPR92 или клетки, экспрессирующие GPR92, представленный в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в описываемых способах может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 5 или 6 или ее фрагмента или варианта. В определенных вариантах осуществления GPR92 для использования в описываемом способе может иметь по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 или 6 или ее фрагменту или варианту. В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в описываемом способе может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 3 или ее фрагмента или варианта. В определенных вариантах осуществления рецептор GPR92 для использования в настоящем изобретении может включать рецептор, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности по отношению к SEQ ID NO: 1, 2 или 3 или ее фрагменту или варианту.
В определенных вариантах осуществления способ идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию рецептора GPR92, включает измерение биологической активности GPR92 в отсутствие и/или присутствие тестируемого соединения. В определенных вариантах осуществления способ может включать измерение биологической активности GPR92 в присутствие различных концентраций тестируемого соединения. Способ может дополнительно включать идентификацию тестируемых соединений, приводящих к модуляции активности и/или экспрессии рецептора GPR92 по сравнению с активностью и/или экспрессией рецептора GPR92 в отсутствие тестируемого соединения.
В определенных вариантах осуществления соединения, идентифицированные способами, представленными в настоящем описании, повышают биологическую активность рецептора GPR92 по меньшей мере на приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более по сравнению с биологической активностью рецептора GPR92, когда соединение отсутствует.
В определенных вариантах осуществления способ может дополнительно включать анализ двух или более, трех или более или четырех или более тестируемых соединений в комбинации. В определенных вариантах осуществления два или более, три или более или четыре или более тестируемых соединения могут принадлежать разным классам соединений, например, аминокислотами, небольшим химическим соединениям и/или белковым гидролизатам. В качестве неограничивающих примеров, способ может включать анализ эффекта одного или нескольких небольших тестируемых химических соединений в отношении биологической активности и/или экспрессии GPR92 в присутствие одного или нескольких тестируемых аминокислотных соединений. В определенных вариантах осуществления способ идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию рецептора GPR92, включает анализ эффекта тестируемого соединения в отношении биологической активности и/или экспрессии GPR92 в присутствие агониста GPR92, например, NAG (N-арахидонилглицина), FPP (3,7,11-триметил-2,6,10-додекатриен-1-ил пирофосфата), LPA (18:0) (1-стеароил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата), CPA (18:1) (1-олеоил-sn-глицеро-2,3-циклофосфата), LPA (14:0) (1-миристоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата), LPA (16:0) (1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата) и LPA (18:1) (1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфата). В определенных вариантах осуществления тестируемое соединение может являться фарнезил монофосфатом (FMP), алкил-глицерофосфатом (AGP, также известным как алкил-LPA), циклической фосфатидной кислотой (CPA); карбо-CPA (CCPA), 2-карбо-CPA (2CCPA) или 3-карбо-CPA (3CCPA). В определенных вариантах осуществления тестируемое соединение может являться любым агонистом GPR92, описанным в Williams, et al., The Journal of Biological Chemistry VOL. 284, NO. 25, pp. 17304-17319, June 19, 2009.
В определенных вариантах осуществления способ идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию рецептора GPR92, включает определение того, модулирует ли соединение рецептор напрямую, например, как агонист или антагонист. В определенных вариантах осуществления способ включает определение того, модулирует ли соединение активность рецептора косвенно (например, как аллостерический регулятор), например, повышая или снижая эффект других соединений в отношении активирующей или ингибирующей рецептор активности.
В определенных вариантах осуществления способ идентификации соединений, модулирующих активность и/или экспрессию рецептора GPR92, включает экспрессию рецептора GPR92 в линии клеток и измерение биологической активности рецептора в присутствие и/или отсутствие тестируемого соединения. Способ может дополнительно включать идентификацию тестируемых соединений, модулирующих активность рецептора, посредством определения того, есть ли различие в активации рецептора в присутствие тестируемого соединения по сравнению с активностью рецептора в отсутствие тестируемого соединения. В определенных вариантах осуществления селективность предполагаемого модулятора GPR92 можно оценивать посредством сравнения его эффектов в отношении других GPCR или вкусовых рецепторов, например, рецепторов умами, жирных кислот, T1R, CaSR и т.д.
Активацию рецептора в описываемых способах можно определять с использованием соединения-метки и/или средства. В определенных вариантах осуществления активность рецептора GPR92 можно определять посредством детекции вторичных мессенджеров, в качестве неограничивающих примеров, таких как, цАМФ, цГМФ, IP3, DAG или кальция. В определенных вариантах осуществления активность рецептора можно определять посредством детекции уровней внутриклеточного кальция. Мониторинг можно осуществлять посредством детекции люминесценции или флуоресценции, например, с помощью кальций-чувствительного флуоресцентного красителя. В определенных вариантах осуществления уровни внутриклеточного кальция можно определять с использованием клеточного красителя, например, флуоресцентного индикатора кальция, такого как Calcium 4. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления кальций-чувствительный флуоресцентный краситель выбран из группы, состоящей из Fura-2 AM, Fura-2 пентакалия, Fura Red AM, Indo-1 AM, Indo-1 пентакалия, Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8, Calcium Green-1, Calcium 3, Calcium 4, Calcium 5, Rhod-2, их производных и их комбинаций. В определенных вариантах осуществления уровни внутриклеточного кальция можно определять посредством измерения уровня связывания кальция с кальций-связывающим белком, например, кальмодулином. Альтернативно и/или дополнительно, активность рецептора GPR92 можно определять посредством детекции фосфорилирования, уровней транскрипта и/или уровней белка одного или нескольких нижележащих в каскаде белков-мишеней рецептора GPR92.
Линия клеток, используемая в описываемых способах, может включать любой тип клеток, способных экспрессировать GPR92. Неограничивающие примеры клеток, которые можно использовать в описываемых способах, включают клетки HeLa, клетки яичника китайского хомяка (клетки CHO), клетки почки африканской зеленой мартышки (клетки COS), ооциты шпорцевой лягушки, клетки HEK-293 и фибробласты 3T3 мыши. В определенных вариантах осуществления способ может включать экспрессию GPR92 в клетках HEK-293. В определенных вариантах осуществления способ может включать экспрессию GPR92 в клетках COS. В определенных вариантах осуществления клетки конститутивно экспрессируют GPR92. В другом варианте осуществления экспрессия GPR92 клетками является индуцибельной.
Clytia gregarium
Aequorea victoria
Obelia longissima
В определенных вариантах осуществления клетка экспрессирует кальций-связывающий фотобелок, где фотобелок люминесцирует после связывания кальция. В определенных вариантах осуществления кальций-связывающий фотобелок содержит белок клитин. В определенных вариантах осуществления клитин является рекомбинантным клитином. В определенных вариантах осуществления клитин содержит выделенный клитин, например, клитин, выделенный из . В определенных вариантах осуществления кальций-связывающий фотобелок содержит белок экворин, например, рекомбинантный экворин или выделенный экворин, такой как экворин, выделенный из . В определенных вариантах осуществления кальций-связывающий фотобелок содержит белок обелин, например, рекомбинантный обелин или выделенный обелин, такой как обелин, выделенный из .
В определенных вариантах осуществления экспрессию GPR92 в клетке можно осуществлять посредством встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей GPR92 в клетке. В качестве неограничивающих примеров, в клетку можно встраивать нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, 2 или 3, или ее фрагмент. В определенных вариантах осуществления встраивание нуклеиновой кислоты в клетку можно осуществлять любым известным в этой области способом, включая, в качестве неограничивающих примеров, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, инфицирование вирусным или бактериофаговым вектором, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, слияние клеток, опосредованный хромосомами перенос генов, опосредованный микроклетками перенос генов, слияние сферопластов и т.д. В этой области известно множество способов встраивания чужеродных генов в клетки (см.,например, Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)), описания которых включены, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме), и их можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. В определенных вариантах осуществления способ может обеспечивать стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, таким образом, что нуклеиновая кислота экспрессируется в клетке и наследуется и экспрессируется ее потомством. В определенных вариантах осуществления способ может обеспечивать транзиторный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, таким образом, что нуклеиновая кислота экспрессируется клеткой, где наследование и экспрессируемость снижаются в последующих поколениях потомства клетки.
В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая рецептор GPR92, содержится в клонирующем векторе, например, векторе pcDNA3.1 или векторе pcDNA5 TO, который встраивают в клетку.
В определенных вариантах осуществления способ может включать идентификацию соединений, связывающихся с GPR92. Способ может включать приведение рецептора GPR92 в контакт с тестируемым соединением и измерение связывания между соединением и рецептором GPR92. В качестве неограничивающих примеров, способы могут включать получение выделенного или очищенного рецептора GPR92 в бесклеточной системе и приведение рецептора в контакт с тестируемым соединением в бесклеточной системе для определения того, связывается ли тестируемое соединение с рецептором GPR92. В определенных вариантах осуществления способ может включать приведение рецептора GPR92, экспрессирующегося на поверхности клетки, в контакт с соединением-кандидатом и определение связывания соединения-кандидата с рецептором GPR92. Связывание можно измерять напрямую, например, с использованием меченого тестируемого соединения, или косвенно. В определенных вариантах осуществления детекция включает определение физиологического события в клетке, вызванного связыванием соединения с рецептором GPR92, например, повышения уровней внутриклеточного кальция. В качестве неограничивающих примеров, детекцию можно осуществлять посредством детекции флуоресценции, например, кальций-чувствительного флуоресцентного красителя, детекции люминесценции, или любым другим способом детекции, известным в этой области. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления кальций-чувствительный флуоресцентный краситель выбран из группы, состоящей из Fura-2 AM, Fura-2 пентакалия, Fura Red AM, Indo-1 AM, Indo-1 пентакалия, Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8, Calcium Green-1, Calcium 3, Calcium 4, Calcium 5, Rhod-2, их производных и их комбинаций.
in vitro
in vitro
В конкретных неограничивающих вариантах осуществления анализ  включает клетки, экспрессирующие GPR92, нативный для клеток. Примеры таких клеток, экспрессирующих нативный GPR92, включают, в качестве неограничивающих примеров, вкусовые клетки (например, первичные клетки вкусовых рецепторов) собаки и/или кошки. В определенных вариантах осуществления вкусовые клетки собаки и/или кошки, экспрессирующие GPR92, выделяют из собаки и/или кошки и культивируют . В определенных вариантах осуществления клетки вкусовых рецепторов можно иммортализовывать, например, таким образом, что клетки, выделенные из собаки и/или кошки, можно выращивать в культуре.
В определенных вариантах осуществления экспрессию GPR92 в клетке можно индуцировать посредством редактирования генов, например, с использованием системы редактирования генов CRISPR для встраивания гена GPR92 в геном клетки или для редактирования или модификации гена GPR92, нативного для клетки.
in vitro
В определенных вариантах осуществления способы  идентификации соединения, связывающегося с рецептором GPR92, включают определение того, взаимодействует ли тестируемое соединение с одной или несколькими аминокислотами взаимодействующего домена GPR92, как представлено в настоящем описании.
in vivo
В определенных вариантах осуществления соединения, идентифицированные как модуляторы GPR92, можно дополнительно тестировать другими аналитическими способами, включая, в качестве неограничивающих примеров, анализы , для подтверждения или количественного анализа их модулирующей активности.
В определенных вариантах осуществления способы, представленные в настоящем описании, могут включать определение того, является ли модулятор GPR92 соединением, усиливающим вкус, например, агонистом GPR92.
В определенных вариантах осуществления способы идентификации модулятора GPR92 могут включать сравнение эффекта тестируемого соединения с агонистом GPR92. Например, тестируемое соединение, повышающее активность рецептора по сравнению с активностью рецептор при контакте с агонистом GPR92, можно выбирать в качестве GPR92-модулирующего соединения (например,агониста).
В определенных вариантах осуществления способы идентификации модулятора GPR92 могут включать определение того, модулирует ли тестируемое соединение активность рецептора, когда рецептор приводят в контакт с агонистом, или может ли тестируемое соединение модулировать активность положительного аллостерического регулятора (PAM). Тестируемые соединения, повышающие или снижающие эффект указанного агониста или PAM в отношении рецептора, можно выбирать в качестве GPR92-модулирующего соединения (например, аллостерического регулятора).
-
-
2-,
-
-
-
3-
2-
-
-
2-
3+
2+
+
+
2+
+
3+
2+
+
+
3
3
3
4
4
3
2
4
4
3
В определенных вариантах осуществления модуляторы рецептора GPR92 по настоящему изобретению содержат соль модулятора GPR92, в качестве неограничивающих примеров, ацетат или формиат. В определенных вариантах осуществления соль модулятора GPR92 содержит анион (-) (в качестве неограничивающих примеров, Cl, Br, CO HCO, OH, NO, PO, SO, CHCOO, HCOO и CO), связанный посредством ионной связи с катионом (+) (в качестве неограничивающих примеров, Al, Ca, Na, K, Cu, H, Fe, Mg, NH и HO). В других вариантах осуществления соль агониста GPR92 содержит катион (+), связанный посредством ионной связи с анионом (-).
in silico
in silico
in silico,
В определенных вариантах осуществления модуляторы GPR92 по настоящему изобретению идентифицируют посредством моделирования  рецептора GPR92, например, GPR92 кошки, собаки или человека, где агонисты GPR92 по настоящему изобретению содержат структуру, соответствующую участку связывания рецептора GPR92. В определенных вариантах осуществления способ  включает способы  описанные выше и в разделе примеров в настоящей заявке.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro,
В определенных вариантах осуществления модуляторы GPR92 по настоящему изобретению идентифицируют способом, где соединения агонистов GPR92 активируют и/или модулируют рецептор GPR92, представленный в настоящем описании, экспрессируемый клетками . В определенных вариантах осуществления способ  включает способы  описанные выше и в разделе примеров в настоящей заявке.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение будет более понятным при использовании следующих примеров, представленных в качестве примеров изобретения, а не для ограничения.
in silico
Пример 1 - Идентификация модуляторов GPR92 с использованием анализов .
В настоящем примере описывают вычислительное моделирование GPR92 кошки и собаки для идентификации предполагаемых модуляторов GPR92.
Вычислительные подходы использовали для анализа трехмерной структуры рецептора GPR92 для идентификации полипептидных областей, которые можно использовать для селективной модуляции рецептора GPR92. Модель структурной гомологии трансмембранного домена 7 рецептора GPR92 получали с учетом структур GPCR класса A из Protein Data Bank (PDB) (см.Berman et al., Nucleic Acids Research, 28: 235-242 (2000), включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Гомологичные модели строили с использованием пакета программ I-TASSER (см. Yang et al., Nature Methods, 12: 7-8 (2015), включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) и пакета программ Modeller (см.Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5,6.1-5,6.30 (2006), включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) из пакета программ DiscoveryStudio (DS) от Dassault Systemes (BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA).
in silico
Моделирование "" использовали для идентификации аминокислот в трансмембранном домене 7 (7TM) рецептора GPR92 кошки и собаки, взаимодействующего с соединениями, подвергнутыми докингу в активный центр рецептора. Рецепторы GPCR класса A включают трансмембранный домен 7 (7TM). Осуществляли выравнивание аминокислотной последовательности рецепторов GPR92 кошек (fGPR92), собак (cGPR92) и людей (hGPR92) и получали общую идентичность последовательности 77% (фигура 7). Домен 7TM GPR92 состоит из семи трансмембранных спиралей. На фигурах 8-10 представлены схемы спиралей, на которых показаны начало, конец и длина последовательности для каждой из семи спиралей в fGPR92, cGPR92 и hGPR92, соответственно.
Остатки в активном центре GPR92 кошки включают: Arg83 на спирали 2; Gly103, Phe106, Gln107, Met110 и Cys114 на спирали 3; Thr161 и His165 на спирали 4; Ala200, Gly204 и Pro208 на спирали 5; Phe248, Phe252, Tyr255, Asn256 и Leu259 на спирали 6; Arg281, Met285 и Val288 на спирали 7; а также Glu182 на второй внеклеточной петле (EC2). В частности, как описано ниже, Arg83, Arg281 и Tyr255 играют ключевую роль в моделях гомологии, образуя соляные мостики и водородные связи для координации отрицательно заряженных концевых групп и полярных частей соединений, связанных с активным центром.
Остатки в активном центре GPR92 собаки включают: Arg76 на спирали 2; Gly96, Phe99, Gln100, Met103 и Cys107 на спирали 3; Thr154 и His158 на спирали 4 (His158 является концом спирали 4); Ala193, Gly197 и Pro201 на спирали 5; Phe241, Phe245, Tyr248, Asn249 и Leu252 на спирали 6; Arg274, Met278 и Val281 на спирали 7; а также Glu175 на петле EC2. В частности, как описано ниже, Arg76, Arg274 и Tyr248 играют ключевую роль в моделях гомологии, образуя соляные мостики и водородные связи для координации отрицательно заряженных концевых групп и полярных частей соединений, связанных с активным центром.
Четыре известных соединения, связывающих GPR92 человека, подвергали докингу в активный центр домена 7TM каждого из GPR92 кошки и собаки. Для моделирования докинга соединений в активном центре рецептора использовали программу для докинга BioDock от BioPredict, Inc. (Oradell, NJ, USA).
Наблюдали, что FPP (3,7,11-триметил-2,6,10-додекатриен-1-ил пирофосфат) создает потенциальные соляные мостики и водородные связи с Arg83 и Arg281, а также водородные связи с Tyr255 в GPR92 кошки (фигура 11). Аналогично, наблюдали, что FPP создает потенциальные соляные мостики и водородные связи с Arg76 и Arg274, а также водородные связи с Tyr248 в GPR92 собаки (фигура 12). Дополнительно, хвост FPP образовывал обширную сеть гидрофобных контактов с GPR92 кошки и собаки.
Наблюдали, что LPA (18:0) (1-стеароил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфат), известный мощный агонист GPR92 (см.Choi et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292: G98-G112 (2007), включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) создает потенциальные соляные мостики и водородные связи с Arg83 и Arg281, а также водородные связи с Tyr255 в GPR92 кошки (фигура 13). Аналогично, наблюдали, что LPA (18:0) создает потенциальные соляные мостики и водородные связи с Arg76 и Arg274, а также водородные связи с Tyr248 в GPR92 собаки (фигура 14). Кроме того, хвост LPA (18:0) проникал глубоко в гидрофобное дно активного центра, образуя обширную сеть гидрофобных контактов с GPR92 кошки и собаки.
Наблюдали, что NAG (N-арахидонилглицин) создает потенциальные соляные мостики с Arg83 и Arg281, а также водородные связи с Tyr255 в GPR92 кошки (фигура 15). Аналогично, наблюдали, что NAG создает потенциальные соляные мостики с Arg76 и Arg274, а также водородные связи с Tyr248 в GPR92 собаки (фигура 16). Дополнительно, хвост NAG проникал глубоко в гидрофобное дно активного центра, образуя обширную сеть гидрофобных контактов с GPR92 кошки и собаки.
Наблюдали, что CPA (18:1) (1-олеоил-sn-глицеро-2,3-циклофосфат) создает потенциальные соляные мостики и водородные связи с Arg83 и Arg281, а также водородные связи с Tyr255 в GPR92 кошки (фигура 17). Аналогично, наблюдали, что CPA (18:1) создает потенциальные соляные мостики с Arg76 и Arg274, а также водородные связи с Tyr248 в GPR92 собаки (фигура 18). Кроме того, хвост CPA (18:1) проникал глубоко в гидрофобное дно активного центра, образуя обширную сеть гидрофобных контактов с GPR92 кошки и собаки.
in vitro
Пример 2 - Идентификация модуляторов GPR92 с использованием анализов .
in vitro
В настоящем примере описывают анализ  для идентификации соединений, модулирующих активность GPR92 кошки.
Краткое описание. Полноразмерный рецептор лизофосфатидной кислоты 5 кошки (fLPAR5, GPR92) синтезировали и субклонировали в экспрессирующий вектор pcDNA3. С помощью конструкции, параллельно с пустым вектором, трансфицировали репортерную линию клеток CHO/natClytin. Затем трансфицированные клетки подвергали селекции с антибиотиком и осуществляли 2 раунда предельных разведений. Положительные клоны анализировали с использованием считывания люминесценции и референсных активаторов лизофосфатидной кислоты (LPA), 14:0 LPA, 16:0 LPA и 18:1 LPA. Клон CHO/natClytin/fGPR92 с лучшими свойствами, K1.4, полностью оптимизировали для анализа фармакологии лиганда и надежности анализа. Полученные результаты показали, что функциональный клеточный анализ fGPR92 подходит для целей HTS.
TETRA
Результаты. Линию клеток CHO/natClytin/fGPR92 получали после стабильной трансфекции клеток CHO/natClytin с использованием экспрессирующей конструкции, кодирующей рецептор GPR92 кошки, и охарактеризовывали ее с помощью устройства FLIPR с использованием лигандов лизофосфатидной кислоты (LPA).
Два лучших клона после второго предельного разведения, K1.2 и 1.4, оптимизировали для подтверждения EC50 агониста, эффекта DMSO, стабильности сигнала с течением времени, замораживания/размораживания. K1.4 выбирали в качестве конечного клона для анализа, а затем охарактеризовывали на надежность и воспроизводимость анализа в мультипланшетном тесте (фигура 19).
Способы: Последовательность ДНК fGPR92 синтезировали в GeneArt (конструкция 16AA4JVP_fGPR92_pMK-RQ) с последовательностью Козак и концами 5'BamHI, 3'XhoI. fGPR92 выделяли с использованием BamHI/XhoI и однонаправленно клонировали в экспрессирующий вектор pcDNA3.1, расщепленный теми же ферментами рестрикции. Анализ для скрининга положительных клонов осуществляли с использованием PvuI и из клонов с правильным фрагментированием ДНК(4179+2324 п.н.) выбирали клон K3 и подтверждали посредством секвенирования всей области инсерции.
TETRA
Полноразмерную кодирующую последовательность LPAR5 кошки клонировали в экспрессирующий вектор pcDNA3.1. С помощью конструкции pcDNA3.1_fLPAR5 стабильно трансфицировали линию клеток CHO/natClytin параллельно с пустым вектором pcDNA3.1. Трансфицированные клетки выращивали в присутствие 2 мг/мл G418. После селекции с использованием антибиотика и тестирования совокупности клонов осуществляли 1-ое предельное разведение трансфицированных мишеней и ложных совокупностей, а затем анализировали посредством инкубации клеток с коэлентеразином. Селекцию положительных клонов осуществляли посредством стимуляции клеток агонистами LPA 14:0 и 16:0. Рецептор-зависимую люминесценцию измеряли с использованием устройства FLIPR.
10 выбранных клонов после 1-го предельного разведения параллельно с 4 ложными клонами анализировали на их ответ на различные агонисты: 14:0 LPA, 16:0 LPA и 18:1 LPA. Клоны, выбранные после 1-го предельного разведения, демонстрировали хорошие и специфические ответы на дозы со всеми тестируемыми лигандами.
3 лучше всех отвечающих клонов подвергали 2-му предельному разведению. Селекцию клонов осуществляли с использованием считывания люминесценции после стимуляции агонистами 14:0 LPA и 16:0 LPA. 6 лучших клонов после 2-го предельного разведения дополнительно охарактеризовывали с использованием разных агонистов: 14:0 LPA, 16:0 LPA и 18:1 LPA.
Два лучших клона после 2-го предельного разведения, K1.2 и 1.4, оптимизировали для подтверждения EC50 агониста, эффекта DMSO, стабильности сигнала с течением времени и замораживания/размораживания. K1.4 выбирали в качестве конечного клона для анализа, а затем охарактеризовывали на надежность и воспроизводимость анализа в мультипланшетном тесте.
Надежность и воспроизводимость анализа HTS оценивали с использованием 14:0 LPA и 16:0 LPA и конечного клона K1.4. Высевали 10000 клеток/лунку, 6-кратные 384 MTP и через 24 часа клетки инкубировали в буфере Тироде с 10 мкМ коэлентеразина (20 мкл/лунку) в течение 3 часов при 37°C и в течение 1 часа при RT. Измерение люминесценции в течение 1 минуты осуществляли при 280000 увеличении чувствительности после однократной инъекции (2-кратная конечная концентрация, 20 мкл/лунку) следующим образом:
Ответ на дозу 14:0 LPA (3 мкМ, 1 мкМ, 0,3 мкМ, 0,1 мкМ, 30 нМ, 10 нМ, 3 нМ, 1 нМ) в буфере Тироде с 0,5% DMSO.
100
Буфер Тироде с 0,5% DMSO (Control Ref) и значение EC14:0 LPA (3 мкМ, сигнал) в буфере Тироде с 0,5% DMSO.
Ответ на дозу 16:0 LPA (10 мкМ, 3 мкМ, 1 мкМ, 0,3 мкМ, 0,1 мкМ, 30 нМ, 10 нМ, 3 нМ) в буфере Тироде с 0,5% DMSO.
100
Буфер Тироде с 0,5% DMSO (контроль) и значение EC16:0 LPA (10 мкМ, сигнал) в буфере Тироде с 0,5% DMSO.
TETRA
©
Измерения с помощью FLIPR анализировали с использованием программного обеспечения Screenworks (Molecular Devices, Version 3,0.1,4) и данные экспортировали как максимальную статистику абсолютного ответа (RLU), вычисленную после инъекции соединения. RLU получают, используя "вычитание ошибки на выборке n" (где n=временная точка инъекции соединения).

Значения среднего и стандартного отклонения вычисляли с использованием экспортированных данных и программного обеспечения Microsoft Excel, затем значения использовали для получения сигмовидных кривых доза-эффект (изменяемый наклон) или гистограмм с использованием программного обеспечения GraphPad PRISM (версия 7).
50
Полученные значения использовали для вычисления значений EC по следующей формуле:
X
50
EC=[(X/100-X)1/наклон]*EC
Z-фактор (rZ'), дисперсию результатов одного анализа и дисперсию результатов разных анализов вычисляли с использованием минимальных (контроль, CR) сигналов и максимальных (сигнал, SR) сигналов по следующей формуле:
Линии клеток, среды и условия культивирования.
Клетки CHO/natClytin культивировали в среде DMEM F-12 (1:1) MIXTURE (BioWittaker, кат. № BE04-687F/U1), дополненной 5 мл 100 мМ пирувата натрия (BioWittaker, кат. № BE13-115E), 25 мл 7,5% бикарбоната натрия (BioWittaker, кат. № BE17-613E), 6,5 мл 1 M Hepes (BioWittaker, кат. № BE17-737E), 5 мл 100-кратного пенициллина/стрептомицина (BioWittaker, кат. № DE17-602E), 50 мл эмбриональной телячьей сыворотки (Euroclone, кат. № ECS 0180L) и 0,25 мл 10 мг/мл пуромицина (InvivoGen, кат. № Ant-pr-1) для проверки резистентности клеток с фотобелком natClytin.
Клетки CHO/natClytin/fLPAR5 подвергали селекции с использованием стандартной среды, дополненной 2 мг/мл G418 (InvivoGen, кат. № Ant-gn-5), а затем поддерживали их в стандартной среде, дополненной 1 мг/мл G418.
Поддержание и выращивание клеток.
5
6
Стандартные условия выращивания состоят в высевании 3×10 клеток во флакон T75, выделении приблизительно 8-10×10 клеток/флакон T75 (через 3-4 дня). Альтернативно, 70-80% конфлюэнтной популяции клеток можно разводить в соотношении 1:20-1:30 каждые 3-4 дня. Стандартные условия высевания для экспериментов в 384 MTP состояли в том, что высевали 10000 клеток/лунку и анализировали их через 24 часа. Клетки разделяли, осторожно промывая PBS, затем инкубировали 5 мин при 37°C с раствором трипсин-ЭДТА. Отделившиеся клетки разводили полной средой, подсчитывали с использованием устройства BECKMAN COULTER Z1TM Particle Counter и желаемое количество клеток высевали в новый флакон или использовали для экспериментов.
6
2
Среду для замораживания получали следующим образом: 90% FBS+10% DMSO. Условия замораживания являлись следующими: 8-10×10 клеток (конфлюэнтность 70-80%) в 1 мл среду для замораживания. Размораживание осуществляли следующим образом: клетки быстро размораживали, удаляя из жидкого азота и сразу погружая в водяную баню при 37°C. Сразу после размораживания льда внешнюю часть сосуда стерилизовали 70% этанолом или его эквивалентном: содержимое сосуда переносили во флакон T75, содержащую полную среду. Флакон помещали во влажную камеру при 37°C с 5% CO. На следующий день проверяли восстановление и субкультивировали, когда прикрепившиеся клетки достигали конфлюэнтности 80%.
Буферы и лиганды.
2
2
3
Буфер Тироде: раствор собственного производства (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl, 1 мМ MgCl, 5 мМ NaHCO, 20 мМ Hepes в воде при pH 7,4; стерилизованный посредством фильтрации и автоклавированный).
Лиганды LPA: 14:0 LPA (1-миристоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфат, натриевая соль), Avanti Polar Lipids, кат. № 857120P; 16:0 LPA (1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфат, натриевая соль), Avanti Polar Lipids, кат. № 857123P; 18:1 LPA (1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфат, натриевая соль), Avanti Polar Lipids, кат. № 857130P.
5 мМ стоковый раствор получали в 100% DMSO, затем нагревали при 37°C и обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут с использованием соникатора с водяной баней Branson 3200. Аликвоты хранили в стеклянных бутылях при -20°C. Образцы для анализа ответа на дозу получали в буфере Тироде, дополненном 0,01% BSA без жирных кислот, и сразу использовали. Бычий сывороточный альбумин (BSA) без жирных кислот: Sigma, кат. № A8806, 1%, свежеполученный в буфере Тироде. Коэлентеразин: PharmaTech Int., кат. № CAS 55779-48-1, 10 мМ стоковый раствор, полученный в DMSO-глутатионе, хранящийся в аликвотах при -20°C. Рабочие растворы получали в буфере Тироде.
Устройства и расходные материалы.
TETRA
2
Эксперименты осуществляли с использованием камеры ICCD FLIPR (Molecular Devices). Анализ осуществляли в 384-луночных полистироловых планшетах. Флакон для культивирования клеток: 75 см флакон CORNING, кат. № 430641. Планшеты для тестирования: 384-луночные обработанные микропланшеты для культивирования тканей (MTP), планшеты с черным/прозрачным дном: MATRIX, кат. № 4332. Планшеты для анализа соединений: 384-луночные полипропиленовые планшеты, V-образное дно: MATRIX, кат. № 4312.
***
Хотя настоящее изобретение и его преимущества описаны подробно, следует понимать, что можно осуществлять различные изменения настоящего изобретения без отклонения от сущности и объема изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления способов, устройств, производства и композиций по настоящему изобретению, средствами, способами и стадиями, описанными в настоящем описании. Как будет понятно специалисту в этой области из описания настоящего изобретения, способы, устройства, производство и композиции по настоящему изобретению, средства, способы и стадии, существующие в настоящее время или разработанные позже, позволяющие осуществлять, по существу, ту же функцию или достигать, по существу, того же результата, что и соответствующие варианты осуществления, представленные в настоящем описании, можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, прилагаемая формула изобретения должна включать такие способы, устройства, производство и композиции по настоящему изобретению, средства, способы и стадии.
Патенты, патентные заявки, публикации, описания продуктов и протоколы процитированы на всем протяжении настоящей заявки, их описания включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для всех целей.