Исследование физиологических свойств дрожжей, выделенных из перги

ИННОВАЦИОННЫЕ ПРОДУКТЫ

УДК 663.13

Исследование физиологических свойств дрожжей, выделенных из перги

И. В. Васильева,

аспирант; И. А. Еремина,

канд. техн. наук, доцент; В. А. Помозова,

д-р техн. наук, профессор Кемеровский технологический институт пищевой промышленности

Ключевые слова:

дрожжи; классификация; слабоалкогольные напитки. Keywords: yeast; classification; low-alcohol beverages.

Реферат

Изучены физиологические свойства дрожжей, выделенных из продукта пчеловодства — перги, на основании чего они относены к виду Zygosac-charomyces bailii и Zygosaccharomyces forentinus. Показана высокая осмофильность дрожжей и устойчивость к спирту, благодаря чему они способны сбраживать среды с высокой концентрацией сахаров. Показана возможность использования выделенных из перги дрожжей в производстве медового кваса из высокоплотного сусла. Дрожжи, выделенные из перги, сбраживали медовое сусло с большей скоростью, чем хлебопекарные дрожжи, лучше осаждались при охлаждении.

Abstracts

Studied the physiological properties of yeast selected their product bee — pollen, on the basis of which they belong to the species Zygosaccharomyces bailii and Zygosaccharomyces florentinus. Demonstrated high osmophilic yeast and alcohol resistance, whereby they are capable of fermenting a medium with a high concentration of sugars. The possibility of using pollen extracted from yeast in the production of high-honey kvass wort. Yeasts isolated from pollen, honey fermented wort with greater speed than baker's yeast, preferably precipitated upon cooling.

В последние годы в питании населения России все большее значение приобретают соки, сокосодержащие напитки, морсы, квасы, слабоалкогольные напитки. Значительно расширился ассортимент напитков функционального назначения, к которым можно отнести напитки, приготовленные с использованием мёда и других продуктов пчеловодства. Тем не менее, несмотря на обилие и разнообразие напитков, выпускаемых в промышленных масштабах, слабоалкогольные медовые напитки на потребительском рынке России в настоящее время встречаются довольно редко. Это связано с тем, что для сбраживания медового сусла применяются дрожжи, не приспособленные к жизнедеятельности в средах специфического состава, с большим содержанием легкоусвояемых углеводов, при различных значениях концентрации сухих веществ.

Цель данной работы — изучение свойств дрожжей, выделенных из продуктов пчеловодства, для оценки возможности использования их в производстве напитков брожения.

Объекты исследования — образцы перги, отобранные в частных пчеловодческих хозяйствах Кемеровской области и Алтайского края, и дрожжи, выделенные из них.

Микроскопические исследования проводили общепринятыми методами микробиологического анализа с использованием специальных сред [1].

Анализ физико-химических показателей сусла, напитков проводили

методами, принятыми в пивобезал-когольной промышленности [2].

Перга — продукт, приготовляемый пчелами из цветочной пыльцы и мёда с добавлением секретов своих желез. Ценность перги заключается в том, что в ней содержатся все незаменимые аминокислоты, необходимые и для организма позвоночных. Благодаря высокому содержанию белков, витаминов и микроэлементов она находит применение в пчеловодстве в качестве подкормки пчел в ранневесенний период, в пищевой промышленности, перспективно ее применение в косметике и медицине [3, 4].

Перга — хорошая питательная среда для отдельных групп микроорганизмов, в частности дрожжей. Не зря издавна на Руси при приготовлении медовухи для интенсификации процесса спиртового брожения использовали пергу [5].

Для выделения дрожжей из перги готовили медовое сусло с концентрацией сухих веществ 15 и 25%.

Далее проводили культивирование при температуре 32±1 °С в течение 7 сут. По окончании этого периода делали посев различных разведений сусла в чашки Петри на сусло-агар и среду Сабуро для получения чистых культур дрожжей. Для получения изолированных колоний проводили пересев в чашки Петри на те же питательные среды методом истощающего штриха.

Затем сделали пересев в пробирки со скошенной плотной средой (среда Сабуро) и после культивирования этих посевов получали чистые культуры данных микроорганизмов.

48 ПИВО и НАПИТКИ 3 • 2013

По результатам исследований были выделены семь вариантов дрожжей. Дрожжи варианта 1 мелкие и имеют овальную форму; варианта 2 — средней величины, форма круглая; вариантов 3 и 4 — средней величины, овальной и круглой формы; варианта 5 — крупные продолговатой и круглой формы; вариантов 6 и 7 — крупные круглой формы. Известно, что малые размеры дрожжевых клеток указывают на их принадлежность к диким дрожжам, которые, как правило, плохо сбраживают сахара и получают энергию в результате полного их окисления.

Полученные культуры дрожжей далее исследовали с точки зрения возможности получения напитков брожения на основе мёда.

В результате проведенных исследований были выбраны колонии дрожжей, представляющих интерес в плане производства медовых напитков.

Морфологические свойства полученных чистых культур дрожжей изучали в препаратах типа «раздавленная капля». Размеры клеток дрожжей измеряли с помощью винтового окулярного микрометра МОВ-1-15Х.

Для определения систематической принадлежности дрожжей, выделенных из перги, пользовались систематикой дрожжей В. И. Кудряв-

цева и рекомендациями И. П. Бабье-вой [6].

Одно из важных свойств для определения систематической принадлежности дрожжей — осмофиль-ность. Среда для выращивания осмо-фильных дрожжей имела следующий состав (г/дм3): глюкозный сироп — 1000 (50%-ный раствор); пептон — 5; агар — 20.

Среду разливали по пробиркам и готовили скошенный агар. Далее пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и проводили культивирование при температуре 32±1 °С в течение трех, шести, девяти и 12 сут. Осмофильность определяли по способности дрожжей расти на среде данного состава за определенное количество суток. Результаты определения осмофильности дрожжей приведены в табл. 1.

Дрожжи вариантов 1, 2, 3 и 6 обладали наилучшей осмофильностью. Уже через трое суток был заметен хороший рост данных вариантов дрожжей. Дрожжи вариантов 4, 5 и 7 также способны расти на среде с высокой концентрацией сахара, но хороший рост заметен лишь на девятые сутки.

Способность дрожжей окислять и сбраживать различные сахара — один из основных признаков для их идентификации и дифференциации.

Таблица 1

Время, Вариант

сут 1 2 3 4 5 6 7

3 + + + ± ± + ±

6 + + + ± ± + ±

9 + + + + + + +

12 + + + + + + +

Примечание: «+» — хороший рост дрожжей; «±» — дрожжи растут, но очень слабо.

Таблица 2

Сахар Вариант

1 2 3 4 5 6 7

Лактоза ------ -

Галактоза ------ -

Мальтоза - - + + + + +

Глюкоза Арабиноза Рамноза + + + + + + +

- - - - + + +

Фруктоза + + + + + + +

Раффиноза - - + + + + +

Сахароза - - - + + + +

Примечание: «+» — дрожжи сбраживают сахара; рода их не сбраживают; «-» — дрожжи на исследуемых источниках угле-

Способность дрожжей вызывать брожение углеводов определяли на дрожжевой воде с 2% исследуемого сахара. Дрожжевую воду готовили следующим образом: автокла-вировали при 121 °С в течение 15 мин суспензию прессованных дрожжей (200 г на 1 дм3 водопроводной воды) с небольшим количеством яичного белка. После стерилизации еще горячую воду дважды фильтровали через бумажный фильтр.

При изучении брожения в пробирки вначале вносили поплавок, затем 8 см3 среды и 1 см3 суспензии дрожжей. Пробирки закрывали резиновыми пробками (для создания анаэробных условий) и проводили культивирование при температуре 32±1 °С в течение трех-семи суток. Результаты исследований способности дрожжей сбраживать сахара представлены в табл. 2.

Дрожжи вариантов 1 и 2 сбраживали фруктозу и глюкозу; не сбраживали галактозу, мальтозу, раффинозу, рамнозу, арабинозу, сахарозу и лактозу. Дрожжи варианта 3 сбраживали глюкозу, мальтозу, фруктозу и раффинозу; не сбраживали галактозу, сахарозу, рамнозу, арабинозу и лактозу. Дрожжи варианта 4 сбраживали глюкозу, мальтозу, фруктозу, раффинозу, сахарозу; не сбраживали лактозу, галактозу, рамнозу, арабинозу. Дрожжи вариантов 5 и 7 сбраживали глюкозу, рамнозу, мальтозу, фруктозу, раффинозу, сахарозу; не сбраживали лактозу, галактозу, арабинозу. Дрожжи варианта 6 сбраживали мальтозу, глюкозу, арабинозу, сахарозу, фруктозу и раффинозу; не сбраживали лактозу, галактозу и рамнозу.

Способность дрожжей усваивать углеводы путем окисления исследовали на среде следующего состава (г/дм3): сульфат аммония — 5,0; сульфат магния — 0,5; дигидрофос-фат калия — 1; автолизат — 1; исследуемый сахар — 10; агар — 20.

При изучении влияния различных источников углерода на размножение дрожжей в аэробных условиях и способности дрожжей окислять различные сахара среду разливали по пробиркам и готовили скошенный агар. Далее пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и проводили культивирование при температуре 32±1 °С в течение трех-четырех суток. Способность окислять сахара оценивали по способности дрожжей

расти на средах с различными источниками углерода.

Результаты исследований способности чистых культур дрожжей, выделенных из перги, окислять различные сахара представлены в табл. 3.

Дрожжи варианта 1 окисляли глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу; очень слабо — арабинозу и рамнозу, не окисляли галактозу и лактозу. Дрожжи вариантов 2 окисляли глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу; очень слабо — галактозу и рамнозу; не окисляли арабинозу и лактозу. Дрожжи варианта 3 не окисляли лактозу и очень слабо — галактозу, раффинозу и арабинозу, хорошо росли и окисляли мальтозу, глюкозу, фруктозу, рамнозу и сахарозу. Дрожжи варианта 4 и 5 не окисляли лактозу, и очень слабо — арабинозу и рамнозу, окисляли мальтозу, глюкозу, фруктозу, раффинозу, галактозу и сахарозу. Дрожжи варианта 6 не окисляли только лактозу. Дрожжи варианта 7 не окисляли лактозу, слабо — галактозу, арабинозу, рамнозу, хорошо окисляли мальтозу, глюкозу, фруктозу, раффинозу и сахарозу.

Обращает на себя внимание тот факт, что все исследованные дрожжи были способны окислять и сбраживать сахара, которые имеются в медовом сусле, а именно продук-

ты инверсии сахарозы — глюкозу и фруктозу.

Исследованные дрожжи не способны окислять и сбраживать такой сахар, как лактоза, также не сбраживали галактозу, но достаточно хорошо окисляли ее варианты 4, 5 и 6. Мальтозу данные дрожжи окисляли хорошо и сбраживали ее все варианты исследованных дрожжей, кроме 1-го и 2-го. Дрожжи плохо сбраживали арабинозу и рамнозу и слабо окисляли данные сахара. Исследованные дрожжи вариантов 4, 5, 6 и 7 хорошо сбраживали и окисляли сахарозу и раффинозу.

В результате проведенных исследований с помощью систематики спорогенных дрожжей И. П. Бабье-вой [6] была установлена родовая принадлежность выделенных из продуктов пчеловодства дрожжей. Эти дрожжи были идентифицированы как род Zygosaccharomyces. Для видовой идентификации пользовались систематикой дрожжей В. И. Кудрявцева [7].

Практическое распознавание вида дрожжей не представляет трудностей и осуществляется по способности дрожжей сбраживать вышеуказанные сахара [7].

В результате проведенных исследований можно сделать вывод, что дрожжи вариантов 1, 2, 3 и 6 от-

Таблица3

Сахар Вариант

1 2 3 4 5 6 7

Лактоза - - - - - - -

Галактоза - ± ± + + + ±

Мальтоза + + + + + + +

Глюкоза + + + + + + +

Арабиноза ± - ± ± ± + ±

Рамноза ± ± + ± ± + ±

Фруктоза + + + + + + +

Раффиноза + + ± + + + +

Сахароза + + + + + + +

Примечание: «+» — дрожжи окисляют сахара; «-» — дрожжи на исследуемых источниках углерода не растут и их не окисляют; «±» — дрожжи на исследуемых источниках углерода растут и их окисляют, но очень слабо.

Таблица 4

Время, Вариант

сут 1 2 3 4 5 6 7

1 - - - - - - -

2 - - ± + + + +

5 + - + + + + +

7 + + + + + + +

Примечание: «+» — образовался газ; «-» — нет газообразования; «±» — маленький пузырек газа.

носятся к виду Zygosaccharomyces bailii, а дрожжи варианта 4,5и7 — к виду Zygosaccharomyces florentinas.

На следующем этапе изучали свойства дрожжей, выделенных из перги, для выбора наиболее перспективных в производстве напитков штаммов.

Для этого определяли отношение дрожжей к концентрации хлорида натрия, спиртоустойчивость и влияние молочной кислоты на рост дрожжей в процессе культивирования.

Отношение дрожжей к концентрации хлорида натрия (галотолерант-ность) определяли на среде следующего состава (г/дм3): глюкоза — 2,0; дрожжевой автолизат — 0,5 мл; хлорид натрия — 0-10,0 (0; 2,5 и 6,5); вода — до 100 см3.

При изучении галотолерантно-сти в пробирки вначале вносили поплавок, затем 8 см3 среды и 1 см3 суспензии дрожжей. Культивирование проводили при температуре 32±1 °С в течение десяти суток. При использовании среды с 2,5% соли на вторые сутки был зарегистрирован рост дрожжей, кроме вариантов 2 и 6. Добавление 6,5% соли привело к торможению роста всех изучаемых образцов дрожжей, однако все же был отмечен рост дрожжей вариантов 4, 5 и 7. Это указывает на то, что дрожжи данных вариантов обладают высокой галотолерантно-стью, а варианты 1, 2 и 6 — дрожжи с низкой галотолерантностью.

Этиловый спирт действует токсично на все дрожжевые расы, но его ин-гибирующая концентрация варьирует в широком диапазоне. Присутствие в сусле незначительного количества спирта оказывает слабое стерилизующее действие на размножение клеток. Но с увеличением концентрации спирта до 1,5-2,0% размножение клеток тормозится, а при 5,0% прекращается полностью. Токсические свойства этого соединения — результат нарушения пористости и проницаемости клеточной мембраны, что, естественно, приводит к проблемам транспорта питательных веществ и дефициту доступной цитоплазме воды [8].

В большинстве случаев расы, обладающие высокой спиртообразую-щей способностью, являются и спир-тоустойчивыми.

Для определения спиртоустойчи-вости рас дрожжей готовили развод-

50 ПИВО и НАПИТКИ 3 • 2013

ки исследуемых рас на стерильной среде, содержащей 10,5% спирта и 2,0% глюкозы, при температуре 25 °С. Через 5 сут разводку каждого варианта дрожжей вносили в количестве 1% в автоклавированную среду, содержащую 10,5% спирта и 2,0% глюкозы. Посев выдерживали при температуре 25 °С и отмечали, на какие сутки в среде размножились дрожжи и начали бродить. О положительном результате свидетельствовали помутнение среды и газообразование (табл. 4).

Наибольшей спиртоустойчиво-стью обладали дрожжи вариантов 4, 5, 6 и 7. Газообразование в процессе сбраживания глюкозы в присутствии 10,5% спирта в этих вариантах было обнаружено уже на вторые сутки. Наименьшей спиртоустойчивостью обладали дрожжи вариантов 1 и 2.

Для отбора кислотоустойчивых культур определяли их бродильную способность в сусле с содержанием молочной кислоты в количестве 0,5 и 2,0% и 2,0% глюкозы. Посев выдерживали при температуре 25 °С и отмечали сутки начала размножения и брожения. О положительном результате свидетельствовали помутнение среды и газообразование.

Газообразование дрожжей на среде с молочной кислотой в количестве 0,5% было обнаружено на вторые сутки у вариантов 4, 5 и 7. В варианте 3 газообразование наблюдали на четвертые сутки, у дрожжей вариантов 2 и 6 — на шестые. Дрожжи варианта 1 в среде с 0,5% молочной кислоты не росли, о чем свидетельствовало отсутствие газообразования.

Влияние 2,0% молочной кислоты более заметно. Образование газа было обнаружено только на шестые сутки у вариантов 4 и 5. Это говорит о том что молочная кислота действует губительно на дрожжи, несмотря на то, что все дрожжи являются аци-дофилами. Дрожжи вариантов 1, 2, 3 и 6 обладают наименьшей кислотоу-стойчивостью.

В результате проведенных исследований были изучены свойства дрожжей, выделенных из перги. Установлено, что для дальнейших исследований перспективно использовать дрожжи варианта 5 (дрожжи вида Zygosaccharomyces florentinus), так как они способны окислять и сбраживать большее количество различных сахаров, что благопри-

Таблица 5

Показатель Опыт

Массовая доля сухих веществ, % 5,0 5,2

Кислотность, к. ед. 2,7 1,1

Содержание аминного азота, мг/ 100см3 сусла 5,5 8,4

Объемная доля спирта, % 0,55 0,48

ятно сказывается при производстве напитков, а также обладают высокой кислото- и спиртоустойчивостью.

Следующий этап работы был посвящен исследованию возможности применения дрожжей, выделенных из перги, в производстве медовых напитков типа кваса из высокоплотного сусла. В качестве контрольного варианта использовали сухие хлебопекарные дрожжи «Саф-момент».

Сусло готовили следующим образом. Необходимое количество мёда (рассчитанное для приготовления 16%-ного сусла) растворяли в горячей воде, вносили подкормку для дрожжей и молочнокислых бактерий в количестве 10 г/гл сусла (препарат «Хай-Вит» фирмы Нуёгако, который использовали в качестве источника аминного азота) и кипятили в течение 1-3 мин для стерилизации сусла и вносимого препарата. Затем горячее сусло охлаждали до температуры брожения и вносили медовые дрожжи и препарат молочнокислых бактерий «Бифилакт Д». Физико-химические показатели сусла: массовая доля сухих веществ — 16,0%; кислотность — 0,15 к. ед.; содержание аминного азота — 9,8 мг/100 см3 сусла.

Норма задачи медовых дрожжей и дрожжей «Саф-момент» в сусло составляла 35 млн кл./ см3. «Бифилакт Д» вносили в сусло из расчета 0,0056 г / 100 см3 сусла, что составляло 4% молочнокислых бактерий от общего объема закваски. Хлебопекарные дрожжи и «Бифилакт Д» предварительно разбраживали на медовом сусле при температуре 30 °С в термостате в течение 3 ч.

Брожение проводили в термостате при температуре 32±1 °С в течение 20-24 ч до снижения массовой доли сухих веществ на 5%. После брожения напитки охлаждали до температуры 0...2 °С и выдерживали при этой температуре в течение 12 ч. Затем охлажденный квас снимали с дрожжевого осадка и разбавляли водой, насыщенной диоксидом углерода,

в 2,5 раза. Физико-химические показатели готового напитка представлены в табл. 5.

Дрожжи, выделенные из перги, сбраживали медовое сусло с большей скоростью, чем хлебопекарные дрожжи, лучше осаждались при охлаждении.

Квас, полученный сбраживанием дрожжами, выделенными из перги, по органолептическим показателям превосходил контрольный вариант, имел более гармоничный, освежающий вкус с легким медово-фруктовым оттенком, хорошее насыщение диоксидом углерода.

Таким образом, показана возможность использования выделенных из перги дрожжей в производстве медового кваса из высокоплотного сусла.

ЛИТЕРАТУРА

1. Еремина, И. А. Лабораторный практикум по микробиологии: сборник лабораторных работ/И. А. Еремина, О. В. Кригер. — Кемерово: КемТИПП, 2005. — 116 с.

2. Ермолаева, Г. А. Справочник работника лаборатории пивоваренного предприятия/Г. А. Ермолаева. — СПб.: Профессия, 2004. — 546 с.

3. Кривцов, Н.И. Пчеловодство / Н.И. Кривцов, В. И. Лебедев. — М.: Колос, 1999. — 399 с.

4. Экспертиза продуктов пчеловодства. Качество и безопасность: учебно-справочное пос./Е. Б. Ивашевская [и др.]; под общ. ред. В. М. Позняковского. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2007. — 208 с.

5. Кривцов, Н. И. Получение и использование продуктов пчеловодства: учебник/ Н. И. Кривцов, В. И. Лебедев. — М.: Кива России, 1993. — 285 с.

6. Бабьева, И. П. Методы выделения и идентификации дрожжей: справочное пособие/И. П. Бабьева, В. И. Голубев. — М.: Пищевая промышленность, 1979. — 273 с.

7. Кудрявцев, В. И. Систематика дрожжей/ В. И. Кудрявцев. — М.: Издательство академии наук СССР, 1954. — 659 с.

8. Кунце, В. Технология солода и пива: пер. с нем./В. Кунце, Г. Мит. — СПб.: Издательство «Профессия», 2001. — 912 с.