Влияние цитостатиков, вводимых по схеме САР, на редокс-зависимые процессы в плазме крови крыс с экспериментальным раком яичников

ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ БИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА

УДК 615.036.8:57.089.24

ВЛИЯНИЕ ЦИТОСТАТИКОВ, ВВОДИМЫХ ПО СХЕМЕ САР, НА РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ РАКОМ ЯИЧНИКОВ*

Е.Ю. Насырова, Д.Р. Долгова, Т.В. Абакумова, Т.П. Генинг, И.И. Антонеева, А.Ю. Тузеева, А.А. Михеенко

ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»

С целью оценки влияния цитостатиков на редокс-зависимые процессы в плазме крови крысам с экспериментальным раком яичников вводили в монорежиме и по схеме САР цисплатин (50 мг/м2), доксорубицин (50 мг/м2) и циклофосфан (500 мг/м2) внутривенно. Через 3 и 8 дней после введения в плазме крови оценивали значимость различий вариационных рядов продуктов окислительной модификации белков кетонного и основного характера, липопероксидации (диеновые конъюгаты, кетодиены, основания Шиффа, малоновый диальдегид), активность антиоксидантов - каталазы и глутатион^-транс-феразы. Установили, что в первые 8 дней после перевивки асцитной опухоли яичников в сыворотке крови крыс возрастает активность процессов липопероксидации, окислительной модификации белков, каталазы при одновременном снижении активности глутати-он^-трансферазы. Моновведение циклофосфана, цисплатина и доксорубицина, а также введение этих химиопрепаратов по схеме САР у животных с экспериментальной асцит-ной опухолью яичников вызывает значительно менее выраженные изменения параметров редокс-зависимых процессов, чем у интактных животных. Введение химиопрепаратов по схеме САР вызывает у животных с асцитной опухолью яичников через 3 дня после введения выраженный оксидативный стресс, не возникающий после моновведения цик-лофосфана, цисплатина и доксорубицина.

Ключевые слова: асцитная опухоль яичников, полихимотерапия, редокс-зависмые процессы.

Введение. Показано, что редокс-зависимые процессы предполагают образование активных форм кислорода (АФК), перекисное окисление липидов (ПОЛ), окислительную модификацию белков (ОМБ) и антиокси-дантную защиту (АОЗ). При этом интенсификация свободнорадикальных процессов и снижение буферной емкости АОЗ рассматриваются как оксидативный стресс и являются

* Работа выполнена при поддержке государственного задания Минобрнауки России.

патогенетическим звеном онкозаболеваний [7, 13, 14, 18].

Рак яичников (РЯ), по данным Международного агентства по изучению рака (JARC), занимает 7-е место в структуре общей онкологической заболеваемости, 5-е место среди причин смерти от всех злокачественных опухолей у женщин и лидирующее место среди онкогинекологических заболеваний [1].

Химиотерапия является вторым основным компонентом лечения РЯ [6]. На поздних стадиях и у ряда больных она становится

главным методом лечения [3]. Противоопухолевая химиотерапия сопровождается многочисленными побочными эффектами. Образующиеся при этом АФК и продукты ПОЛ вызывают токсическое повреждение органов и тканей. Следует также учитывать, что химиотерапия проводится у больных с уже активированными неоплазмой свободноради-кальными процессами [17]. Установлено, что проведение нескольких курсов полихимиотерапии (ПХТ) приводит у ряда больных к накоплению токсических продуктов свободно-радикального окисления и нарушению структуры мембран [4]. В соответствии с этим большинство авторов указывает на способность антиоксидантов улучшать переносимость и отдаленные результаты лечения [12, 16, 17]. В то же время существует мнение о нецелесообразности использования антиок-сидантов при химиотерапии цитостатиками.

Цель исследования. Изучение влияния цитостатиков, вводимых по схеме САР, на редокс-зависимые процессы в плазме крови крыс с экспериментальным раком яичников.

Материалы и методы. Экспериментальная группа состояла из 228 белых беспородных самок крыс массой 180-200 г в возрасте 2,5-3,0 мес. с асцитной опухолью яичников (АОЯ) (банк штаммов РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина, г. Москва). Животным внутрибрюшин-но перевивали асцит со средой 199 (1:1) из расчета 0,5 мл асцитической жидкости с опухолевыми клетками и 0,5 мл среды. Животные содержались в стандартных условиях вивария, имели полноценный рацион питания, свободный доступ к воде и пище. На основании практических рекомендаций по лекарственному лечению больных раком яичников от 2014 г. (www.rosoncoweb.ru) к первой линии относится 3-компонентный режим платиновой химиотерапии - САР (цисплатин (ЦП) 50 мг/м2, доксорубицин (ДР) 50 мг/м2, циклофосфан (ЦФ) 500-750 мг/м2 в/в). Жи-вотным-опухоленосителям на 8-е сут после перевивки опухоли вводились в боковую вену хвоста препараты в дозе: цисплатин -2,18 мг, доксорубицин - 1,164 мг, циклофос-фамид - 17,46 мг. При введении препаратов по схеме CAP брались половинные дозы на 3-й и 8-й дни после введения.

Контрольную группу составили 20 ин-тактных крыс.

В плазме крови оценивали уровень ОМБ по Е.В. Дубининой [8]. Результаты регистрировали при ^=346 нм и ^=370 нм (альдегидные и кетонные группы нейтрального характера), при А=430 нм и А=530 нм (соответственно альдегидные и кетонные группы основного характера) в ед. опт. плотности на 1 мг белка. Для оценки ПОЛ в плазме крови по И.А. Вол-чегорскому определяли количество диеновых конъюгатов (ДК) при А=232/220 нм, кетодие-нов (КД) при ^=278/220 нм, шиффовых оснований (ШО) при ^=400/220 нм [16]. Содержание вторичных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) - оценивали по А.И. Андреевой [11]. Для оценки ферментативного звена антиоксидантной системы (АОС) в плазме крови и Эр определяли активность ка-талазы, глутатион^-трансферазы (GST) по А.И. Карпищенко [5].

При обработке полученных данных использовались методы непараметрической статистики. Значимость различий вариационных рядов в связанных попарно выборках оценивалась с помощью U-критерия Вилкок-сона-Манна-Уитни, корреляция показателей вычислялась по методу Спирмена. Анализ данных проводился с помощью пакета прикладных программ (Statistica 6). Достоверными считали различия при р< 0,05.

Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований была выявлена значимая активация окислительной модификации белков и уровня КД в плазме крови животных-опухоленосителей по сравнению с интактными животными. При этом содержание альдегидных групп нейтрального характера при 346 нм у животных с РЯ составило 4,956±0,326 против 2,330±0,517 ед./мг белка в контроле. Количество кетонных групп нейтрального характера, регистрируемое при 370 нм, составило 4,333±0,796 против 1,802±0,404 ед./мг белка в контроле. Содержание карбонильных производных основного характера (^=530 нм) составило 0,825±0,104 против 0,124±0,049 ед./мг белка в контроле. Повышение уровня продуктов ОМБ может свидетельствовать о возникновении карбонильного стресса у животных с АОЯ. Из всех

изученных параметров ПОЛ достоверным было возрастание уровня КД (0,108±0,014 против 0,099±0,018 ед. опт. плот./мл в контроле). Это не противоречит данным литературы, согласно которым в первые 20 дней после трансплантации опухоли активность процессов ПОЛ в сыворотке крыс может как возрастать, так и снижаться [2]. Исследования на животных также свидетельствуют о фазности изменения антиокислительной активности сыворотки крови: вначале она может повышаться, а затем падать ниже уровня нормы. Обращает на себя внимание разнонаправленное изменение активности GST и ка-талазы в динамике прогрессирования опухоли. Повышение активности каталазы может быть объяснено с точки зрения данных о том, что продукция Н2О2 опухолевыми клетками выше, чем нормальными [15].

При введении ЦП, ЦФ и ДР в монорежиме и в комбинации по схеме САР интактным животным было установлено, что наименьшее влияние на редокс-зависимые процессы имеет введение ЦФ. При этом на 8-е сут после введения значимо возрастал уровень МДА (5,647±0,947 против 3,418±0,559 мкмоль/л в контроле). Наиболее выраженное влияние на систему ПОЛ-АО и ОМБ имело введение ДР. При этом уже на 3-и сут после введения снижалась и оставалось сниженной на 8-е сут активность GST (0,0269±0,0097 и 0,0516± ±0,0124 мкмоль/мин/л соответственно против 0,0967±0,0190 в контроле). Одновременно повышался уровень продуктов ПОЛ (ДК 0,980±0,043 ед. опт. плот./мл на 3-и и 0,925±0,0093 ед. опт. плот./мл на 8-е сут против 0,856±0,011 ед. опт. плот./мл в контроле), уровень МДА (6,1530±1,0626 мкмоль/л на 8-й день против 3,418±0,559 мкмоль/л в контроле) и усиливалась ОМБ (при ^=346 нм на 8-й день - 4,621±1,668 против 2,330± ±0,517 ед./мг белка в контроле; при ^=370 нм на 3-й день - 4,674±0,817 ед./мг белка, на 8-й день - 6,423±1,806 против 1,802±0,404 ед./мг белка в контроле; при А,=430 нм на 3-й день -1,275±0,545 ед./мг белка, на 8-й день -2,387±0,543 против 0,589±0,090 ед./мг белка в контроле; при ^=530 нм на 3-й день -0,334±0,083 ед./мг белка, на 8-й день -1,107±0,128 против 0,124±0,049 ед./мг белка в

контроле). Подобная динамика позволяет предполагать возможность развития оксида-тивного и карбонильного стресса при введении ДР интактным животным.

Введение интактным крысам ЦП также вызывало снижение активности GST (0,047±0,009 мкмоль/мин/л на 3-й день, 0,078±0,007 мкмоль/мин/л на 8-й день после введения против 0,096±0,019 мкмоль/мин/л в контроле) при одновременном возрастании уровня МДА (18,347±2,295 мкмоль/л на 8-й день после введения против 3,418± ±0,559 мкмоль/л в контроле). Также усиливалась ОМБ на 3-й день после введения (при ^=370 нм - 2,838±0,784 против 1,802± ±0,404 ед./мг белка в контроле; при ^=430 нм - 1,254±0,338 против 0,589± ±0,090 ед./мг белка в контроле, при ^=530 нм - 0,452±0,094 против 0,124± ±0,049 ед./мг белка в контроле).

Введение комбинации цитостатиков по схеме САР интактным животным вызывало снижение активности GST (0,029± ±0,009 мкмоль/мин/л на 3-й и 0,021± ±0,003 мкмоль/мин/л на 8-й дни после введения против 0,096±0,019 мкмоль/мин/л в контроле) и повышение активности каталазы (0,190±0,081 ммоль/мин/л на 3-й день и 0,183±0,014 ммоль/мин/л на 8-й день против 0,034±0,007 ммоль/мин/л в контроле). Также имело место повышение уровня МДА (7,436±1,719 против 3,418±0,559 мкмоль/л в контроле) и уровня ШО (0,063±0,010 против 0,013±0,009 ед. опт. плот./мл в контроле). Обращает внимание значимое снижение показателей ОМБ уже на 3-й день после введения, сохраняющееся и на 8-й день (^=346 нм - 0,622±0,093 ед./мг белка на 3-й день, 0,874±0,176 ед./мг белка на 8-й день против 2,330±0,517 ед./мг белка в контроле; ^=370 нм - 0,704±0,097 ед./мг белка на 3-й день, 0,742±0,235 ед./мг белка на 8-й день против 1,802±0,404 ед./мг белка в контроле; ^=430 нм - 0,403±0,052 ед./мг белка на 3-й день, 0,420±0,114 ед./мг белка на 8-й день против 0,589±0,090 ед./мг белка в контроле; ^=530 нм - 0,187±0,021 ед./мг белка на 3-й день, 0,207±0,075 ед./мг белка на 8-й день против 0,124±0,049 ед./мг белка в контроле).

При введении ЦП, ЦФ и ДР в монорежиме и в комбинации по схеме САР животным с экспериментальным РЯ было установлено, что ЦФ и ДР в использованных дозах через 3 сут после введения значимо не изменяют показатели свободнорадикального окисления в плазме крови по сравнению с показателями до введения. На 8-й день после введения ЦФ в плазме крови возрастал уровень КД (0,126±0,012 против 0,108±0,014 ед. опт. плот./мл в контроле). После введения ДР на 8-й день снижался уровень ДК (0,750±0,045 против 0,809±0,031 ед. опт. плот./мл в контроле) и возрастала активность GST (0,127±0,029 против 0,048±0,004 мкмоль/мин/л). Введение ЦП вызвало снижение уровня ДК (0,425± ±0,038 ед. опт. плот./мл через 3 дня и 0,406±0,038 ед. опт. плот./мл через 8 дней против 0,809±0,030 ед. опт. плот./мл в контроле) и увеличение уровня ОМБ при ^=530 нм (1,210±0,320 ед./мг белка через 3 дня и 1,108±0,268 ед./мг белка через 8 дней против 0,825±0,204 ед./мг белка в контроле).

При введении химиопрепаратов по схеме САР резко и значимо возрастала через 3 дня после введения в плазме крови живот-ных-опухоленосителей активность каталазы (0,209±0,071 против 0,117±0,071 ммоль/мин/л) и уровень продуктов ПОЛ (КД 0,161±0,037 против 0,108±0,014 ед. опт. плот./мл в контроле; ШО 0,052±0,010 против 0,013± ±0,002 ед. опт. плот./мл в контроле). Уровень ДК был снижен по сравнению с таковым до введения весь период наблюдения (0,503±0,159 ед. опт. плот./мл через 3 дня и 0,651±0,018 ед. опт. плот./мл через 8 дней против 0,809±0,031 ед. опт. плот./мл в контроле). Через 8 дней после введения повысился уровень МДА (8,003±1,219 против 5,105±1,688 мкмоль/л в контроле).

Полученные результаты позволяют предполагать возникновение состояния окислительного и карбонильного стресса у животных с экспериментальным раком яичников. Карбонильные производные белков плазмы крови стабильнее и специфичнее, чем продукты перекисного окисления липидов. Их повышенное образование считается одним из ранних и надежных индикаторов нарушения ре-докс-гомеостаза [9]. Согласно полученным ре-

зультатам, выраженный карбонильный стресс имеет место через 3 дня после введения ЦП и в течение всего периода наблюдения после введения ДР интактным животным. Введение химиопрепаратов по схеме САР у интактных животных, напротив, вызывает снижение уровня продуктов ОМБ на фоне усиления ПОЛ на всех сроках наблюдения. Введение химиопрепаратов как в монорежиме, так и комбинированно по схеме САР животным с экспериментальным РЯ вызывает значимо меньше изменений параметров редокс-зави-симых процессов по сравнению с изменениями у интактных животных. Так, введение ЦФ и ДР не вызывает значимых изменений изучаемых параметров через 3 дня после введения. Введение ЦП сопровождалось возрастанием ОМБ при ^=530 нм и снижением ДК на 3-и и 8-е сут. Введение химиопрепаратов по схеме САР вызывало значимое повышение уровня продуктов ПОЛ: ШО, КД и МДА.

Выводы:

1. В первые 8 дней после перевивки АОЯ в сыворотке крови крыс возрастает активность процессов ПОЛ, ОМБ, каталазы при одновременном снижении активности GST.

2. Моновведение ЦФ, ЦП и ДР, а также введение этих химиопрепаратов по схеме САР у животных с экспериментальной АОЯ вызывает значительно менее выраженные значимые изменения параметров редокс-зависимых процессов, чем у интактных животных.

3. Введение химиопрепаратов по схеме САР вызывает у животных с АОЯ через 3 дня после введения выраженный оксидативный стресс, не возникающий после моновведения ЦФ, ЦП и ДР.

1. Аксель Е. МСтатистика злокачественных новообразований женской половой сферы / Е. М. Аксель // Онкогинекология. - 2012. -№ 1. - С. 18-23.

2. Барабой В. А. Спонтанная хемилюминис-ценция сыворотки крови в норме и при воздействии ионизирующей радиации / В. А. Барабой, В. Э. Орел // Биохемилюминисценция. - М. : Наука, 1983. - С. 220-240.

3. Бохман Я. В. Руководство по онкогине-кологии / Я. В. Бохман. - Л. : Медицина, 1989. -493 с.

4. Горошинская И. В. Влияние аутомиело-химиотерапии на показатели эндогенной интоксикации, свободнорадикального окисления и состояния мембран у больных с рецидивами рака яичников / И. В. Горошинская, Л. А. Немашкало-ва // Российский онкологический журн. - 2007. -№ 2. - С. 27-31.

5. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) : справочник / под ред. проф. А. И. Карпищенко. - СПб. : Интермедика, 2001. - 544 с.

6. Ретроспективный анализ эффективности химиотерапии при платинорезистентном и плати-норефрактерном раке яичников / И. А. Покатаев // Вестн. РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2009. -Т. 20, № 2. - С. 34-39.

7. Chiarugi P. Redox regulation of protein tyrosine phosphatases during receptor tyrosine kinase signal transduction / P. Chiarugi, P. Cirri // Trends Biochem Sci. - 2003. - Vol. 28, № 9. - Р. 509-514.

8. Comparison of various approaches to the determination of the products of lipid peroxidation in heptane-isopropanol extracts of blood / I. A. Vol-chegorskii [et al.] // Vopr. Med Khim.- 1989. -Vol. 35, № 1. - Р. 127-131.

9. Dröge W. The plasma redox state and ageing / W. Dröge // Ageing Res. Rev. - 2002. - Vol. 1, № 2. - Р. 257-278.

10. Gutteridge J. M. The characterisation of thi-obarbituric acid reactivity in human plasma and urine / J. M. Gutteridge, T. R. Tickner // Anal. Biochem. -1978. - Vol. 91, № 1. - Р. 250-257.

11. Ilouno L. E. An improved technique for the assay of red blood cell superoxide dismutase

activity / L. E. Ilouno, E. N. Shu, G. E. Igbokwe // Clin. Chim. Acta. - 1996. - Vol. 247, № 1-2. -P. 1-6.

12. Impact of antioxidantsupplementation on chemotherapeutic toxicity: a systematic review of the evidence from randomized controlled trials / K. I. Block [et al.] // Int. J. Cancer. - 2008. -Vol. 123, № 6. - P. 1227-1239.

13. Kinnula V. L. Superoxide dismutases in malignant cells and human tumors / V. L. Kinnula, J. D. Crapo // Free Radic. Biol. Med. - 2004. -Vol. 36, № 6. - P. 718-744.

14. Linnane A. W. Cellular redox regulation and prooxidant signaling systems: a new perspective on the free radical theory of aging / A. W. Linnane, H. Eastwood // Ann. NY Acad. Sci. - 2006. -Vol. 1067. - P. 47-55.

15. Mitochondrial contributions to cancer cell physiology: redox balance, cell cycle, and drug resistance / A. Dorward [et al.] // J. Bioenerg. Biomembr. -1997. - Vol. 29, № 4. - P. 385-392.

16. Moss R. W. Should patients undergoing chemotherapy and radiotherapy be prescribed anti-oxidants? / R. W. Moss // Integr. Cancer Ther. -2006. - Vol. 5, № 1. - P. 63-82.

17. Oxidative damage and antioxidant status in patients with cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma of the cervix / M. L. Looi [et al.] // Eur. J. Cancer. Prev. - 2008. - Vol. 17, № 6. - P. 555-560.

18. Zhang Y. Reactive oxygen species (ROS), troublemakers between nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) and c-Jun NH(2)-terminal kinase (JNK) / Y. Zhang, F. Chen // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64, № 6. - P. 1902-1905.

INFLUENCE CYTOSTATICS ADMINISTERED BY THE SCHEME CAP ON REDOX-DEPENDENT PROCESSES IN BLOOD PLASMA OF RATS WITH EXPERIMENTAL OVARIAN CANCER

E.Yu. Nasyrova, D.R. Dolgova, T.V. Abakumova, T.P. Gening, I.I. Antoneeva, A.Yu. Tuzeeva, A.A. Mikheenko

Ulyanovsk State University

To assess the cytostatic effecton the redox-dependent processes in blood plasmais rats with experimental ovarian administeredin mono and CAP schemecisplatin (50 mg/m2), doxorubicin (50 mg/m2) and cyclophosphamide (500 mg/m2) intravenously. After 3 and 8 days after the administration of blood plasma significance of differences was assessed variation series of oxi-dative modification of proteins and ketonebasic character lipoperoxidation (dieneconjugates, ketodienes, Schiff bases, malondialdehyde), the activity of antioxidants-catalase and glu-tathione-Sv-transferase. Found that in the first 8 days after transplantation of ovarianas cites tumorin the blood serum of rats increased activity of lipid peroxidation, oxidative modification of proteins, catalase, while reducing theactivity of glutathione-Sv-transferase. Monoinfiltration cyclophosphamide, cisplatin and doxorubicin as well as the introduction of the sechemotherapy drugsscheme CAP in animals with experimental as cites of ovarian tumorsis significantlyless marked significant changes in the parameters of the redox-dependent processes than in intact animals. Administering chemotherapy scheme CAP animals causes ovarian as cites tumor 3 days after injection of oxidant stress does not occur after mono infiltration cyclophosphamide, doxorubicin and cisplatin.

Keywords: ascetic tumorovarian, polychemotherapy, redox-dependent processes.