Исследование действия рифтала на фракционный состав белков семян и оптические свойства ХБК растений

12. Lau O.L., Yang S.F. Inhibition of ethylene production by cobaltous ion//Plant Physiology. 1976. 58. p. 114-117

13. Satoh S., Esashi Y. 6- aminoisobutyric acid, proppyl gallate and cobalt ion and the mode of inhibition of ethylene production by cotyledonary segments of cocklebur seeds//Physiol. Plant. 1982. 54. p.147-152

14. Hansen H., Grossman K. Auxin induced ethylene triggers abscisic acid biosynthesis and growth inhibition//Plant physiol. 2000, Vol.124, pp.1437-1448

15. Walker C.J., Willows R.D. Mechanism and regulation of Mg-chelatase// Biochemical journal 1997. 327, p. 321333.

16.Шалыго H.B., Колесникова H.B.; Воронецкая В.В.; Аверина Н.Г. Влияние катионов Mn2+, Fe2+, Co2+h Ni2+ на накопление хлорофилла и начальные этапы его образования в зеленеющих проростках ячменя //Физиология растений, 1999; Т.46, N 4, - С. 574-579

17.Kobayashi M., Shimizu S. Cobalt proteins//Europeanjournals of biochemistry. 1999. Vol. 261. p.1-9

18.Bandarian V, Ludviwig ML, Mattheews RG. Factors modulating conformational equilibria in large modular proteins: a case study with cobalamin-dependent metthionine synthase//Proc. Natl Acad Sci USA. 2003, 100(14), p.8156-8163.

19. Tyler G., Zohlen A. Plant Seeds as Mineral Nutrient Resource for Seedlings PA Comparison of Plants from Calcareous and Silicate Soils// Annals of Botany 1998. 81: p.455-459

20. Chaudhary M.T., Merrett M.J., Wainwright S.J., Ion accumulation in lucerne plants regenerated from salt-adapted suspension cultures compared with recultured cells from these plants // Plant Cell Reports, 1997, V. 17, № 2, p. 145-149.

21. Титов С.Е., Кочетов А.В., Коваль B.C., Шумный В.К. Трансгенез как способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам // Успехи современной биологии, 2003, том 123, № 5, с 487-494.

22. Баширова P.M., Касьянова А.Ю., Кудашкина Н.В. Влияние сульфата кобальта на содержание кумаринов и фталидов в корнях Angelica archangelica L. // Итоги биол. исследований Вып. 8. - Уфа: Сб.научных трудов.-Уфа: РИО БашГУ, 2004. -

23.Zobel A.M., March R.E. Autofluorescence reveals different histological localizations of furanocoumarins in fruits of some Umbelliferae and Leguminosae// Annals of botany № 71, 1993, p. 251-255.

24. Hortchandani S., Ozdemir U., Nasr C.et al. Redox characteristics of Schiff base manganese and cobalt complexes related to water-oxidizing complex of photosynthesis // Bioelectrochemistry and bioenergetics,1999, V. 1, № 48, p. 53-59.

25. Siatka T., Kaspranova M. YLIV auxinu produkci kumarinu v suspenzni culture Angelica archangelica L./Meska a slovenska farmacie. Roиnik LII-Chislo 4, 2003, p.186-188

26. Cornan J.E. et al. Measurement of ferrochelatase activity using a novel assay suggests that plastids are the major site of haem biosynhesis in both photosynthetic and non- photosynthetic cells of pea (Pisum sativum L.)//Biochem.J. 2002. 362, p.423-432

27. Santiago L.J., Ricardo P.L., De Poliveira D. Compartmentation of phenolic compounds and phenylalanine ammonia-lyase in leaves of Phyllanthus tenellus Roxb. and their induction by copper sulphate//Annals of Botany. 2000.86, p.1023-1032

Поступила в редакцию 19.04.04 г.

ББК 28.072 УДК 577

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ РИФТАЛА НА ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ СЕМЯН И ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ХБК РАСТЕНИЙ

Ямалеева А.А, Талипов Р.Ф, Ибрагимов Р.И, Сакаева А.Г.*

Изучали влияние рифтала на физиологические и биохимические показатели растений пшеницы и ячменя. Показано, что в семенах возрастает количество растворимых белков, увеличивается содержание проламинов и снижается уровень глютелинов. Изменения в составе электрофореграм проламинов не носят качественный характер.

Существует много путей увеличения количества белка и улучшения качества зерновой продукции. Применение для этих целей регуляторов роста открывает новые возможности, которые способствуют также и повышению урожайности культурных растений. Более полное понимание того, на какие процессы действуют регуляторы роста, должно способствовать разработке эффективной технологии их создания и применения. В связи с этим, актуальным

являются исследования по изучению биологической эффективности и целесообразности практического использования регуляторов роста и развития как более дешевых и экологически безопасных, созданных в Республике Башкортостан. Таким препаратом, обладающим фунгитоксическим и ростактивирую-щим свойством является регулятор роста и развития ауксинового типа 3 - гидроокситетрагидрофуран (рифтал) [1]. Было проведено изучение биологиче-

&Ямалеева Анна Александр овна - докт ор биологических наук, пр офесс ор кафедры биохимии и биотехнологии биофака БашГУ Талипов Рифкат Фаат ович — д.х.н., пр офесс ор, зав. кафедр ой био органической химии БашГУ.

Ибрагимов Ринат Исмагилович - докт ор биологических наук, пр офесс ор каф. биохимии и биотехнологии биофака БашГУ Сакаева Альфия Гайсиновна - с.н.с. лаб. Защиты растений БНСХ

ской эффективности препарата рифтал, влияния его на белковый состав семян, гемагглютинирующую активность лектинов и фотосинтетический аппарат листьев зерновых культур.

Фракционное выделение водо-

солерастворимых, спирто- и щелочерастворимых белков проводили по методике Осборна в модификации [2] путем последовательного извлечения их соответствующими растворами нейтральной соли, спиртом и щелочью. Гордеины экстрагируются посредством раствора, содержащего 20 % 2-

хлорэтанола, 18 % мочевины, 1 % монотиоглицеро-ла и 0,05 % пиронина Г. Лектины выделяли ацетатным буфером pH 3,8 [3] с последующей очисткой на колонке с овогелем методом аффинной хроматографии.

Для выделения мембраносвязанных лектинов в экстрагирующий ацетатный буфер добавляли тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1%. Добавление тритона Х-100 [4] улучшает растворимость белков и, в отличие от мочевины, не влечет за собой их денатурации, также сохраняет вторичную и третичную структуры белков и, следовательно, их биологическую активность. Гемагглютинирующая активность лектинов (РГА) выявляли с использованием 2% суспензии эритроцитов кроличьей крови в планшетах Такачи.

Электрофоретическое фракционирование спирторастворимых белков семян проводили в 7,5%-ном кислом полиакриламидном геле при pH 3,1.

Определение оптических свойств хлорофилл-белковых комплексов (ХБК) проводили по методике^] на лазерном спектрофотометре Лафот, регистрируя следующие показатели: лучи света, отраженные диффузно (Rd,%); лучи, отраженные зеркально (Rm, %); прошедшие через листовую пластину (Tr, %) и поглощенные ХБК (Ab, %).

Для изучения качественного состава и содержания белковых фракций из семян пшеницы и ячменя, обработанных рифталом, были выделены последовательной экстракцией водо-солерастворимые, спирто- и щелочерастворимые белковые фракции и определено их содержание. Известно, что соотношение этих фракций зависит от многих факторов, влияющих на продуктивность культуры. Как видно из рисунка, в опытных образцах происходит изменение содержания всех фракций белков в зерне.

Полученные данные свидетельствуют, что регулятор роста оказывает заметное, но не одинаковое влияние на соотношение белковых фракций в зерне. А именно, увеличивается содержание водо- солерастворимых и спирторастворимых белков и снижается количество глютелинов как в семенах Tr. аestivum, так и в семенах Hordeum sativum. Следует отметить, что содержание глиадинов и гордеинов под действием рифтала, по сравнению с альбуминами и глобулинами, увеличивается не столь значительно. Усиление синтеза растворимых белков и проламинов при действии экзогенных регуляторов роста могло ингибировать образование глютелинового комплекса, в состав которого, кроме собственных субъединиц, входят также компоненты глиадинов и водорастворимых белков. Как известно, проламины со-

ставляют преобладающую часть белков зерна злаковых культур. Отмеченные выше особенности накопления глиадинов и гордеинов в семенах, обработанных рифталом растений, представляют интерес с точки зрения формирования качества зерна пшеницы и ячменя, так как от глиадинового комплекса наряду с глютелином в значительной степени зависят и свойства клейковины.

По данным электрофоретического фракционирования глиадинов и гордеинов была получена следующая информация. Как показал анализ электро-фореграмм, спектры глиадинов пшеницы контрольных и опытных образцов включают все основные компоненты, характерные для а, Р , у и ю зон, выделенных в эталонных спектрах глиадинов (табл. 1).

В быстрой а - зоне пшеницы обнаружено а 5, а 6 и а 7 компоненты. В Р - зоне средней подвижности у глиадинов обнаруживаются Р 2, Р 3 и в у - зоне - у 1, у 2, у 3, у 4, у 5 компоненты, которые в обоих спектрах имеют одинаковую интенсивность. Зона медленной подвижности включает Ю 1, Ю 2, ю 8, ю 9 компоненты, из которых ю 8, ю 9 более интенсивны в спектре глиадинов контрольных образцов, а ю 1, ю 2 преобладают в спектре глиадинов, полученных из семян, обработанных рифталом растений.

Интересно отметить, что компоненты быстрой а - зоны и особенно а 6, а 7 интенсивно проявляются в спектре глиадинов семян, полученных из обработанных рифталом растений пшеницы. Спектры запасных белков ячменя - гордеины имеют более интенсивную быструю а - зону, в которой выявляются а 4, 6, 7 компоненты. Заслуживает внимания то, что компоненты б 6 и 7, как и в случае с глиадинами пшеницы, очень слабо проявляются в спектре контрольных образцов, тогда как в опытных образцах они весьма интенсивны.

Спектры гордеинов из семян опытных и контрольных образцов в зоне Р и у имеют идентичный характер. В медленной ю зоне присутствуют ю 2, ю 8, ю 10 компоненты, из которых ю 2 и 8 не только преобладают в спектре проламинов из семян обработанных рифталом растений.

Отсюда следует, что интенсивное образование глиадинов и гордеинов в формирующемся зерне, обработанных рифталом растений, превосходящее содержание глютелинов, обусловлено синтезом преимущественно быстродвижующейся низкомолекулярной а -фракции данного белка. Возможно, что компоненты а -фракции, характеризующиеся небольшой молекулярной массой принадлежат лекти-нам, т.е. к белкам с углеводсвязывающей активностью. В последнее время появилось доказательство того, что достаточно много фитогемагглютининов ведут себя точно так, как типичные запасные белки [6,7]. В связи с этим большой интерес представляет изучение влияния регуляторов роста на накопление и активность лектинов при формировании зерна. Нами были изучены содержание и гемагглютини-

рующая активность лектинов семян, полученных из обработанных рифталом растений пшеницы и ячменя. Как видно из табл. 2, уровень содержания лектинов в опытных образцах пшеницы и ячменя существенно выше, чем в контроле.

Под влиянием рифтала значительно повышается также гемагглютинирующая активность лектинов семян: титр лектинов семян пшеницы опытных образцов составил 1:15, в контроле - 1:8. Возможно, что увеличение содержания и активности лектинов напрямую связаны с увеличением количества запасных белков в семенах под действием рифтала. Лек-тины обеспечивают агрегацию и упаковку запасных белков семян в процессе их превращения в белковые тельца.

Определение оптических свойств листьев у растений после обработки рифталом позволило выявить положительную реакцию растений на действие этого препарата. В таблице 3 приведены основные оптические характеристики листьев пшеницы и ячменя при обработке растений рифталом.

Как видно из данных таблицы 3, под влиянием рифтала происходит уменьшение зеркального и диффузного отражений, снижается количество лучей, прошедших сквозь листовую пластинку, увеличивается абсорбция света хлорофилл-белковыми комплексами, что указывает на увеличение активности и эффективности использования энергии света ХБК при обработке растений данным регулятором роста и развития.

Выводы

1. В фазе формирования зерна у пшеницы и ячменя наиболее интенсивное накопление запасных белков происходит у растений, обработанных рифталом. В семенах резко возрастает количество растворимых белков, увеличивается содержание глиа-динов и гордеинов и снижается содержание глюте-линов.

2. Усиление синтеза проламинов и растворимых белков, при действии регулятора роста и развития рифтала ингибирует образование глютелинового комплекса и возможно, что это явление вторичное.

3. Изменение в компонентном составе элек-трофореграмм глиадина под влиянием экзогенного регулятора роста не связано с появлением новых белков, а может быть следствием молекулярных модификаций, приводящих к изменению подвижности и интенсивности электрофоретических компонентов.

4. Интенсивное накопление глиадина в семенах опытных образцов обусловлено синтезом а -фракции данного белка. Возможно, что именно компоненты а - фракции, характеризующиеся наименьшей молекулярной массой, высокой электрофоретической подвижностью принадлежат к белкам с углеводосвязывающей активностью - лектинам.

5. Установлено, что под влиянием рифтала содержание и геммагглютинирующая активность лектинов в семенах повышаются. Это связано с участием лектинов в агрегации и комплексообразова-нии запасных белков.

Tr.aestivum, Tr.aestivum, опыт Но rdeum sativum, Но rdeum sativum,

контроль контроль опыт

Водо-солерастворимые белки

1Проламины

Глютелины

Рис. №1 Влияние рифтала на содержание водо-солерастворимых белков, проламинов и глю-телинов семян Triticum aestivum L. и Hordeum sativum L.

Таблица 1

Идентификация электрофоретических фракций проламинов семян пшеницы и ячменя, полученных после обработки рифталом

Варианты а - зона Р - зона у - зона W - зона

Пшеница контроль 5 6(7) 2 3 1 2 3 4 5 12 8 9

опыт 567 2 3 1 2 3 4 5 12 8 9

Ячмень

Контроль 4 6(7) 12 3 3 4 5 2 8 10

опыт 467 12 3 3 4 5 2 8 10

Примечание: интенсивные компоненты подчеркиваются, слабые берутся в скобки.

Таблица 2.

Содержание и гемагглютинирующая активность лектинов семян, полученных из обработанных рифталом

растений

Варианты опытов Содержание лектинов в мг/100г белка В % к контролю РГ А лектинов

Пшеница контроль 25,0 ± 2,3 100 1 : 8

Пшеница опыт 37,8 ± 3,4 127 1 : 15

Ячмень Контроль 28,3 ± 1,7 100 1 : 6

Ячмень опыт 32,2 ± 2,8 113 1 : 9

значимо на 5 % уровне.

Таблица 3

Изменение оптических свойств ХБК зерновых культур под действием рифтала

Варианты Опыта Rd, % Rm, % Тг, % АЬ, %

Пшеница Контроль 11,5 ± 1,6 0,95 ± 0,4 10,87 ± 1,7 76,8 ± 2,3

Пшеница Опыт 10,4 ± 1,1 1,7 ± 0,6 9,31 ± 0,8 78,6 ± 2,8

Ячмень Контроль 11,6 ± 1,5 0,97 ± 0,4 10,7 ± 1,7 77,7 ± 2,3

Ячмень Опыт 10,8 ± 1,3 0,95 ± 0,2 11,1 ± 1,7 79,0 ± 2,1

значимо на 5% уровне

ЛИТЕРАТУРА

1. Талипов Р.Ф., Гайсин А.М., Сафаров М.Г., Сафиуллин З.Н и др. Патент РФ № 2127053 Стимулятор роста растений.

2. Конарев В.Г., Гаврилюк И.П., Губарева Н.К. О природе глютенина пшеницы по данным иммунохимическо-го анализа // Доклады ВАСХНИЛ.-1970.- 7.- С.16-18.

3. Ямалеева А.А. Лектины растений и их биологическая роль. Уфа, изд-во БГУ.-2001.- 201 п.

4. Остерман Л.Л. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование.-М.: Наука, 1981.-С7-120.

5. Лискер И. С. Устройство для измерения коэффициентов отражения и пропускания объектов // Патент РФ № 1673928.- 1990.

6. Romero J., Sun S.M, Mc Leester R.C, Bliss F.a. Heritable Variation in polypeptide subinit of the major storage proteines of the bean? Phaseolus vulgaris L/ // Plant. Physiol.-1975.-v.56.-p.775-778.

7. Лахтин В.М. Лектины в исследовании белков и углеводов II Итоги науки и техники. М.: ВНИИТИХ. 1987. -289с.

Поступила в редакцию 27.04.04 г.

100 раздел БИОЛОГИЯ