Усиление экспрессии факторов патогенности и персистенции микроорганизмов, выделенных от больных гриппом, в условиях межбактериальных взаимодействий

Усиление экспрессии факторов патогенности и персистенции микроорганизмов, выделенных от больных гриппом, в условиях межбактериальных взаимодействий

А.С. Паньков

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, Государственная медицинская академия, г. Оренбург

Резюме

Изучены особенности экспрессии факторов патогенности и персистенции микроорганизмов в условиях межбактериальных взаимодействий. Выявлено усиление гемолитической активности (ГА) микроорганизмов в ассоциациях у больных гриппом в парах условно-патогенных - патогенных микроорганизмов. Патогенные микроорганизмы усиливали ГА условно-патогенных в два раза чаще, чем условно-патогенные у патогенных. В микросимбиоценозе больных гриппом антилизоцимная активность микроорганизмов усиливалась как у патогенов под влиянием условно-патогенной микрофлоры, так и в парах условно-патогенных микроорганизмов. Отмечено взаимное усиление лизоцимной активности в парах условно-патогенных - патогенных микроорганизмов и лецитовителлазной активности в парах патогенов, выделенных от больных гриппом. Усиление экспрессии факторов патогенности и персистенции условно-патогенной и патогенной микрофлоры у больных при гриппе, вероятно, объясняет дисбиоз микрофлоры и развитие бактериальных осложнений после гриппа.

Ключевые слова: грипп, межмикробные взаимодействия, усиление факторов патогенности

Intensifying Expression Factors of Pathogenicity

and of Persistens the Microorganisms Allocated from Sick

Flu in the Conditions of Interbacteriemic Interactions

A.S. Pankov

Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis of Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, State Medical Academy, Orenburg Abstract

Features factors of pathogenicity and persistens microorganisms in the conditions of interbacterial interactions are studied. Strengthening of haemolytic activity (HA) of microorganisms in associations from sick of flu in steams «conditional-pathogenic and pathogenic microorganisms»is revealed. Pathogenic microorganism strengthened HA is conditional-pathogenic in 2 times more often, than is conditional-pathogenic at the pathogenic. In microsymbiocenosis sick of flu antilisozym activity amplified as at pathogenic microorganisms under the influence of is conditional-pathogenic microflora, and is mutual in steams of is conditional-pathogenic microorganisms. Mutual strengthening lisozym activity in steams is conditional-pathogenic - pathogenic microorganisms and letsitovitellaz activity in steams патогенов, allocated from sick of flu isn'ted. Strengthening of an expression of factors of pathogenicity and persistens is conditional-pathogenic and pathogenic microflora at flu, possibly, explains disbiosis microflorae and of bacterial complications after flu to development.

Key words: flu, intermicrobic interactions, intensifying patho-genicity factors

Введение

Микросимбиоценоз - экологическая система, в которой происходят взаимодействия микроорганизмов, вызывающие изменения свойств симбионтов [2]. Происходящее в определенном биотопе человека взаимодействие условно-патогенных и патогенных микроорганизмов может приводить к усилению патогенности и в связи с этим - к развитию инфекционного процесса [3]. Известен ряд исследований вирусо-бактери-ального взаимодействия при гриппозной инфекции [4]. При этом представляет несомненный интерес изучение особенностей этого взаимодействия.

Цель исследования - изучение особенностей изменения факторов патогенности и персистенции микроорганизмов в условиях межбактериальных взаимодействий при гриппе.

Материалы и методы

Исследовано 77 и 78 ассоциативных пар микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей соответственно больных гриппом и здоровых людей. Выделение и идентификацию бактерий проводили по общепринятым схемам, используя тест-системы фирмы Lachema (Чехия). Для исследования брался мазок со слизистых оболочек носа и миндалин утром натощак

стерильным ватным тампоном, смоченным в стерильном физиологическом растворе. Исследуемый материал доставлялся в лабораторию в течение 30 минут от момента забора, затем осуществлялся посев на 5%-ный кровяной агар в чашке Петри. Посевной материал втирался прокатыванием тампона по поверхности среды у края чашки. Дно чашки расчерчивалось на секторы,затем прокаленной в пламени спиртовки петлей проводился рассев параллельными штрихами по поверхности среды в каждом секторе. Посевы инкубировались в термостате при температуре 37 °C в течение 24 часов. Оценку показателя микробной обсемененности каждого симбионта, а также общего показателя микробной обсемененности проводили по количеству колоний на секторах с использованием таблицы, предложенной Ю.М. Фельдманом и соавт. (1984) [6]. У выделенных микроорганизмов были определены факторы патогенности: гемолитическая (ГА), лецитовителлазная (ЛецА) активности [1]; факторы персистенции и колонизации: лизоцим-ная (ЛА) и антилизоцимная (АЛА) активности чашечным методом [2].

При изучении микросимбиоценоза верхних дыхательных путей у больных гриппом выделенная микрофлора была поделена на условно-патогенную и патогенную [8, 9]. Взаимодействие анализировалось в следующих ассоциативных парах микроорганизмов: условно-патогенный - условно-патогенный (усл.-пат. - усл.-пат.), условно-патогенный - патогенный (усл.-пат. - пат.) и патогенный - патогенный (пат. - пат.). Данные варианты взаимодействия оценивались в микросимбиоцено-зах верхних дыхательных путей больных гриппом и здоровых людей.

Для изучения модификации факторов патогенности в условиях межбактериальных взаимодействий был использован чашечный метод перекрестного посева штаммов-симбионтов [7]. Степень прочности ассоциации оценивали с помощью корреляционного анализа.

Варианты взаимодействия микроорганизмов в ассоциациях оценивались в микросимбиоценозах верхних дыхательных путей больных гриппом и здоровых людей. По направлению взаимодействия выделялись пары с односторонним усилением и пары с взаимным усилением. Характер взаимодействия микроорганизмов в ассоциациях оценивали следующим образом: взаимное усиление факторов в паре симбионтов (синергизм), однонаправленное усиление факторов (один симбионт усиливает экспрессию факторов у другого). Все представленные микроорганизмы находились в ассоциациях, и у них были изучены факторы патогенности и персистен-ции в условиях межбактериальных взаимодействий.

К условно-патогенной микрофлоре относили коагулазоотрицательные стафилококки (КОС): S. hominis, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. capitis, S. saprophyticus, S. xylosus, S. caseolyticus, S. klosii, S. arlettae, S. pisifermentans, S. warneri;

стрептококки: S. mitis, S. salivarius, S. oralis, S. sanguis, S. mutans, S. anginosus, S. vestibularis, S. pneumoniae; коагулазоположительные стафилококки (КПС): S. hyicus, S. intermedius; микрококки: Micrococcus spp.; нейссерии: Neisseria spp.; аэрококки: Aerococcus viridans [9]; энтерококки: E. faecium, E. faecalis; клебсиеллы: K. pneumoniae, K. oxytoca; кишечную палочку: E. coli; грибы рода Candida: C. albicans [9]. К патогенным микроорганизмам - S. aureus и S. pyogenes. В качестве критерия бактериальных ассоциаций рассматривались корреляционные связи между качественными (встречаемость) и количественными (показатель микробной обсемененности) показателями [5]. Учету подлежали только связи с коэффициентом корреляции (r) более 0,35.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Biostat, Statistica 6,0 и SPSS 11.0.

Результаты и обсуждение

Взаимодействие микроорганизмов в ассоциации может приводить к усилению или подавлению факторов патогенности и персистенции, а также не быть индифферентным. В связи с этим была изучена модификация факторов патогенности в условиях межбактериальных взаимодействий. Изменения факторов патогенности оценивались с точки зрения усиления экспрессии признака. Результаты такого взаимодействия показаны на рисунках 1 и 2.

Как видно на рисунке 1, в парах «усл.-пат.- усл. пат.» у штаммов, выделенных от больных гриппом, усиление экспрессии гемолитической активности происходит в 7,7 раза чаще, чем у выделенных от здоровых людей (20,0 ± 1,9% против 2,6 ± 1,4% при P < 0,01). В ассоциации «усл.-пат. - пат.», выделенной от больных гриппом, условно-патогенные микроорганизмы усиливали гемолитическую активность патогенных микробов в 5,1 раза (6,7 ± 1,2%), у здоровых людей - в 1,3 ± 1,0% (P < 0,05). Патогенные микроорганизмы в свою очередь усиливали ГА условно-патогенных микроорганизмов в 10 раз чаще в ассоциациях, выделенных от больных гриппом, чем у здоровых людей (13,3 ± 1,6% против 1,3 ± 1,0% при P < 0,01).

В ассоциациях патогенных микроорганизмов в обеих группах усиления ГА не выявлено.

Как видно на рисунке 2, усиление лецитовителлаз-ной активности обнаружено в единичных парах микроорганизмов «усл.-пат. - усл.-пат.» и «пат. - усл.-пат.», выделенных от здоровых людей, а у больных гриппом - усиление признака в ассоциации «пат. - пат.». Увеличение лизоцимной активности и антилизоцим-ной активности выявлено только в ассоциативных парах от больных гриппом. ЛА усиливалась у патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при взаимодействии между ними. АЛА возрастала у условно-патогенных микроорганизмов при их взаимодействии, а также у патогенных микроорганизмов под влиянием условно-патогенных микроорганизмов.

Рисунок 1.

Частота усиления ГА при межбактериальных взаимодействиях

Рисунок 2.

Частота усиления ЛепА, ЛА, АЛА при межбактериальных взаимодействиях

Проведенные исследования показали, что микроорганизмы, выделенные со слизистых оболочек верхних дыхательных путей от больных гриппом, активно вступали во взаимодействие друг с другом, приводя к усилению всех изученных факторов патогенности и персистенции, при этом наибольшие изменения выявлены в модификации ГА.

Активность микроорганизмов по усилению факторов патогенности и персистенции проявилась у больных гриппом в определенных парах штаммов-симбионтов (табл. 1).

Взаимное усиление ГА в ассоциациях, выделенных от больных гриппом людей, отмечено в парах условно-патогенных микроорганизмов: E. coli - S. mitis (11,4 ± 1,5%), S. hyicus - S. mitis (5,1 ± 1,0%), S. mutans - S. saprophyticus (3,8 ± 0,9%); патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: S. aureus - S. oralis (6,3 ± 1,1%). Одностороннее увеличение ГА при гриппе отмечено как в парах патогенных - условно-патогенных микроорганизмов: S. aureus усиливал ГА S. mitis (10,1 ± 1,4%), - так

и в парах условно-патогенных микроорганизмов: S. hominis повышал ГА S. agalactiae (3,2 ± 0,8%). Взаимное усиление ЛецА при гриппе выявлено при взаимодействии штаммов S. aureus между собой (6,7 ± 1,2%). Взаимное увеличение ЛА и АЛА выявлено только при гриппе, усиление ЛА - в ассоциациях «патогенный - условно-патогенный микроорганизм»: S. aureus - S. mitis (6,7 ± 1,2%) - и АЛА - в парах условно-патогенных микроорганизмов: S. mutans - S. saprophyticus (6,7 ± 1,2%). При гриппе условно-патогенный микроорганизм S. oralis увеличивал АЛА патогенного S. aureus (6,7 ± 1,2%).

В ассоциациях, выделенных от здоровых людей, взаимное усиление ГА отмечено в редких случаях в отдельных парах условно-патогенных микроорганизмов: S. bovis - S. haemolyticus (1,7 ± 1,2%), S. sanguis - S. acidominimus (1,7 ± 1,2%), S. bovis - S. haemolyticus (1,7 ± 1,2%). Однонаправленное усиление ГА выявлено в ассоциациях: A. viridans усиливал ГА S. hyicus (1,7 ± 1,2%), а S. caseolyticus - ГА S. pneumoniae

Таблица 1.

Наиболее активные пары штаммов-симбионтов по усилению факторов патогенности и персистенции у больных гриппом

Пары симбионтов Частота модификации

ГА ЛецА ЛА АЛА

больные здоровые больные здоровые больные здоровые больные здоровые

S. mutans - S. saprophyticus 3,8 ± 0,9 - - - - - 6,7 ± 1,2 -

S. hyicus - S. mitis 5,1 ± 1,0 - - - - - - -

E. coli - S. mitis 11,4 ± 1,5 - - - - - - -

E. coli - S. haemolyticus - - - - - - - -

S. aureus - S. oralis 6,3 ± 1,1 - - - - - - -

S. aureus - S. aureus - - 6,7 ± 1,2 - - - - -

S. aureus - S. mitis - - - - 6,7 ± 1,2 - - -

S. oralis - S. aureus - - - - - - 6,7 ± 1,2 -

S. hominis - S. agalactiae 3,2 ± 0,8 - - - - - - -

S. aureus - S. mitis 10,1 ± 1,4 - - - - - - -

S. bovis - S. haemolyticus - 1,7 ± 1,2 - - - - - -

S. sanguis - S. acidominimus - 1,7 ± 1,2 - - - - - -

A. viridans - S. hyicus - 1,7 ± 1,2 - - - - - -

S. caseolyticus - S. pneumoniae - 1,7 ± 1,2 - - - - - -

K. oxytoca - S. warneri - - - - - - - 1,7 ± 1,2

Примечание: «-» - нет пар симбионтов.

(1,7 ± 1,2%). В модификации АЛА условно-патогенный микроорганизм K. oxytoca усиливал АЛА условно-патогенного микроорганизма S. warneri (1,7 ± 1,2%).

Выявленное в редких случаях (1,7%) увеличение экспрессии факторов патогенности в ассоциациях микроорганизмов у здоровых людей, очевидно, свидетельствует о потенциальной опасности перехода в патологическое состояние (группа риска).

Полученные результаты показали, что усиление факторов патогенности и персистенции преобладало в ассоциативных парах, выделенных от больных гриппом людей, причем дисбаланс микрофлоры привел к изменению патогенных и персистентных характеристик как патогенной, так и условно-патогенной микрофлоры. У здоровых людей усиление признаков было единичным, зачастую обусловленным односторонним усилением фактора под влиянием условно-патогенного либо патогенного микроорганизма. Наиболее активные пары в отношении усиления ГА: E. coli (условно-патогенный микроорганизм) - S. mitis (условно-патогенный микроорганизм - представитель нормофлоры) и S. aureus (патогенный микроорганизм) - S. mitis (10,1 - 11,4%).

В условиях микросимбиоценоза верхних дыхательных путей при гриппе происходит взаимодей-

ствие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В ассоциациях создаются условия, благодаря которым условно-патогенная микрофлора также вовлекается в патологический процесс, усиливая патогенный потенциал, что приводит к дисбиозу и способствует развитию бактериальных осложнений. При клиническом исследовании было установлено, что у больных гриппом с осложнениями экспрессия ГА была в 2 раза больше (4,3 ± 0,4 мм против 2,4 ± 0,1 мм при Р < 0,01), а АЛА - в 1,1 раза (4,23 мкг/мл против 3,78 мкг/мл при P < 0,01).

Выводы

1. Изучение факторов патогенности в ассоциациях микроорганизмов показало, что происходит усиление экспрессии гемолитической активности в парах «усл.-пат. - усл.-пат.» у штаммов, выделенных от больных гриппом, и незначительно - у выделенных от здоровых людей; аналогичная картина - в парах «усл.-пат. - пат.» (P < 0,05). Патогенные микроорганизмы усиливали ГА условно-патогенных микроорганизмов (P < 0,01). При этом в ассоциациях патогенных микроорганизмов в обеих группах усиления ГА не выявлено.

2. Усиление лецитовителлазной активности обнаружено в единичных парах микроорганиз-

мов «усл.-пат. - усл.-пат.» и «пат. - усл.-пат.», выделенных от здоровых людей, а от больных гриппом - усиление признака в ассоциации «пат. - пат.». Увеличение лизоцимной и анти-лизоцимной активности выявлено только в ассоциативных парах от больных гриппом. ЛА усиливалась у патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при взаимодействии

между ними. АЛА возрастала у условно-патогенных микроорганизмов при их взаимодействии, а также у патогенных микроорганизмов под влиянием условно-патогенных микроорганизмов.

3. Усиление факторов патогенности и персистен-ции проявилась у больных гриппом в определенных парах штаммов-симбионтов.

Литература

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982. -462 с.

2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина, 1999. - 367 с.

3. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. - Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 264 с.

4. Бухарин О.В., Паньков А.С., Усвяцов Б.Я., Скворцов В.О. Модификация свойств вируса гриппа и Staphylococcus aureus в условиях ассоциации // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2011. № 3. С. 24 - 28.

5. Несвижский Ю.В., Воробьев А.А., Белоносов С.С. и др. Анализ простых межмикробных взаимоотношений в микробиоценозе толстой кишки человека // Вестник РАМН. 1997. № 3. С. 23 - 26.

6. Фельдман Ю.М., Маханева Л.Г., Шапиро А.В. и др. Количественное определение бактерий в клинических материалах // Лаб. дело. 1984. № 10. С. 616 - 619.

7. Хуснутдинова Л.М. Межбактериальные взаимодействия на слизистой оболочке миндалин человека: Автореф. дис. ... к.м.н. - Оренбург, 2004. - 23 с.

8. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. , М. 1998. - 288 с.

9. Щербаков П.Л., Нижевич А.А., Логиновская В.В. и др. Микроэкология кишечника у детей и ее нарушения // Фарматека. 2007. № 14. С. 28 - 34.

ИНФОРМАЦИЯ РОСПОТРЕБНАДЗОРА

Об эпидемиологической ситуации по кори в Российской Федерации

Письмо от 9.06.2012 года № 01/6597-12-32

В последние годы эпидемиологическая ситуация по заболеваемости корью в мире существенно осложнилась.

По данным ВОЗ, в 2011 году в 43 странах Европы и Азии было зарегистрировано более 32 тыс. случаев кори. Из них более 15 тыс. случаев - во Франции, более 5 тыс. - в Италии, более 2,8 тыс. случаев - в Румынии. Заболеваемость корью зарегистрирована также в Кыргызстане (221 случай), Узбекистане (468 случаев), Беларуси (55 случаев), Украине (173 случая), Казахстане (30 случаев).

В связи с ростом заболеваемости корью и возобновлением циркуляции эндемичных для ряда стран Европы вирусов кори, решением 60-й сессии Европейского регионального комитета ВОЗ срок достижения элиминации кори и краснухи в Европейском регионе перенесен на 2015 год.

В 2011 году практически в два раза увеличился завоз кори в Российскую Федерацию: с 28 в 2010 до 55 случаев в 2011 году (8,8% от всех зарегистрированных случаев), из них наибольшее число случаев кори импортировано из Франции (13 случаев) и Узбекистана (9 случаев). Завозы кори в Россию зарегистрированы также из Австрии, Германии, Англии, Испании, Италии, США, Польши, Азербайджана, Украины, Таджикистана, Турции, Южной Кореи, Индии, Китая, Индонезии, Таиланда. При этом 58,2% от всех импортированных в 2011 году в страну случаев кори зарегистрировано в Москве - 32 случая.

Данные молекулярно-генетических исследований, проведенных на базе Национального научно-методического центра по надзору за корью и краснухой, Референс-лаборатории ВОЗ по кори и краснухе (ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора), подтверждают преимущественно завозной характер кори: в 2011 году на территории Российской Федерации отме-

чалась циркуляция штаммов вируса кори генотипов D4, B3, G3 и D9, не эндемичных для Российской Федерации.

Штамм генотипа D4 «Enfield» в январе - мае 2011 года импортирован в ряд субъектов европейской части страны из стран Западной Европы (в первую очередь из Франции). Штамм генотипа D4 «Iran» с начала 2011 года импортирован из Узбекистана (в города Томск, Красноярск, Москва, Санкт-Петербург, Владивосток). В январе - мае местное распространение штаммов данной группы носило ограниченный характер. С июля 2011 года на фоне роста заболеваемости корью в ряде регионов (Москва, субъекты Северо-Кавказского федерального округа) наблюдалась активная местная циркуляция штаммов генотипа D4, что обусловлено повторным импортированием кори на территорию страны.

В нескольких случаях кори, зарегистрированных в Москве и Санкт-Петербурге, были выделены штаммы генотипов G3 и B3, импортированные из Франции и Испании, однако продолжительная циркуляция указанных генотипов не наблюдалась.

Штаммы вируса кори генотипа D9, выделенные во Владивостоке и Москве, близкородственны штаммам указанного генотипа, циркулирующим в регионе Юго-Восточной Азии.

По данным Референс-лаборатории ВОЗ по кори и краснухе, рост заболеваемости корью в странах СНГ, в том числе в Казахстане и Кыргызстане, обусловлен циркуляцией группы штаммов вируса генотипа D4 «Iran 2010», а вспышки кори в западных и центральных областях Украины - циркуляцией штамма генотипа D4 группы «Enfield 2007». Так как ранее местная циркуляция штаммов вируса кори генотипа D4 установленных групп не наблюдалась, данные штаммы, вероятно, были импортированы из региона Западной Европы и Ирана соответственно. <...>