ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Be ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ
USE OF Cry1Da COMBINED WITH Cry1Be FOR CONTROLLING INSECT RESISTANCE

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Люди выращивают кукурузу для использования при производстве пищи и энергии. Люди также выращивают большое количество других видов зерновых, включая сою и хлопок. Насекомые поедают и повреждают растения и тем самым подрывают усилия людей. Миллиарды долларов ежегодно тратятся на контроль насекомых-вредителей, и помимо этого миллиарды долларов теряются в виде ущерба, нанесенного насекомыми. Синтетические органические химические инсектициды являются основным инструментом контроля насекомых-вредителей, но биологические инсектициды, например обладающие инсектицидным действием белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), играют важную роль в тех же областях применения. Возможность получения устойчивых к насекомым растений путем трансформации генами обладающих инсектицидным действием Bt белков совершила революцию в современном сельском хозяйстве и повысила важность и ценность обладающих инсектицидным действием белков и их генов.
Несколько Bt белков были использованы для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые к настоящему времени успешно зарегистрированы и выведены на рынок. Указанные белки включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry3Bb у кукурузы, Cry1Ac и Cry2Ab у хлопка и Cry3A у картофеля.
Коммерческие продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют один белок за исключением случаев, когда желателен комбинированный инсектицидный спектр действия двух белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb у кукурузы комбинируют для обеспечения устойчивости, соответственно, к чешуекрылым насекомым-вредителям и корневым червям) или когда независимое действие белков позволяет использовать их в качестве средства, замедляющего развитие устойчивости в целевой популяции насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab у хлопка комбинируют для обеспечения контроля развития устойчивости у табачной листовертки-почкоеда). См. также публикацию заявки на патент США № 2009/0313717, относящуюся к белку Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A для контроля Helicoverpa zea или armigerain. WO 2009/132850 относится к использованию Cry1F или Cry1A и Vip3Aa для контроля Spodoptera frugiperda. Публикация заявки на патент США №2008/0311096 частично относится к использованию Cry1Ab для контроля ECB, устойчивого к Cry1F.
Таким образом, некоторые свойства трансгенных растений, устойчивых к насекомым, которые привели к быстрому и широкому внедрению этой технологии, также вызвали опасения, что популяции насекомых-вредителей выработают устойчивость к обладающим инсектицидным действием белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения утилитарности связанных с устойчивостью к насекомым признаков, основанных на Bt, которые включали введение белков в высоких дозах в комбинации с организацией убежищ (рефугий), и поочередное или одновременное введение различных токсинов (McGaughey et al. (1998), “B.t. Resistance Management”, Nature Biotechnol, 16:144-146).
Белки, выбранные для использования в наборе для управления устойчивостью насекомых (IRM), должны проявлять свое инсектицидное действие независимо таким образом, чтобы устойчивость, развившаяся к одному белку, не вызывала появления устойчивости ко второму белку (т.е. чтобы отсутствовала перекрестная устойчивость к белкам). Например, если популяция насекомого-вредителя, которая отобрана на устойчивость к “Белку А”, является чувствительной к “Белку В”, можно сделать вывод, что перекрестная устойчивость отсутствует и что комбинация Белка А и Белка В будет эффективной для замедления развития устойчивости к Белку А, применяемому изолированно.
При отсутствии обладающих устойчивостью популяций насекомых может быть проведен анализ на основе других характеристик, которые, как предполагается, связаны с механизмом действия и потенциалом развития перекрестной устойчивости. Были выдвинуты предположения, согласно которым для идентификации обладающих инсектицидным действием белков, которые, вероятно, не обладают свойством перекрестной устойчивости, можно использовать опосредованное рецептором связывание (van Mellaert et al., 1999). Ключевой прогнозирующий параметр отсутствия перекрестной устойчивости, естественно присущий такому подходу, заключается в том, что обладающие инсектицидным действием белки не конкурируют за рецепторы у чувствительных к ним видов насекомых.
Если два Bt токсина конкурируют за один и тот же рецептор, то в случае мутации этого рецептора у насекомого, при которой один из токсинов больше не связывается с этим рецептором и, следовательно, больше не обладает инсектицидным действием в отношении этого насекомого, это насекомое может стать устойчивым также и ко второму токсину (который конкурентно связывается с тем же рецептором). При этом насекомое рассматривается как обладающее перекрестной устойчивостью к обоим Bt токсинам. Однако если два токсина связываются с различными рецепторами, это может служить указанием на то, что насекомое может не быть одновременно устойчивым к этим двум токсинам.
Например, белок Cry1Fa применим для контроля многих чешуекрылых насекомых-вредителей, включая мотылька кукурузного (ECB; Ostrinia nubilalis (Hűbner)) и FAW, и проявляет активность в отношении огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, вырабатываемый в трансгенных растениях кукурузы, содержащих фактор TC1507, является ответственным за развитие устойчивости к доминирующим в данной отрасли насекомым, т.е. для контроля FAW. Cry1Fa также используется в продуктах Herculex, SmartStax™ и WideStrike™.
Способность проводить исследования (конкурентного или гомологичного) опосредованного рецептором связывания с использованием белка Cry1Fa ограничена, поскольку большинство доступных методик мечения белков для их обнаружения в анализе опосредованного рецептором связывания инактивируют инсектицидную активность белка Cry1Fa.
Дополнительные Cry токсины перечислены на веб-сайте официального комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время существует примерно 60 основных групп “Cry” токсинов (Cry1-Cry59) с дополнительными Cyt токсинами, VIP токсинами и т.п. Многие группы с числовыми обозначениями имеют подгруппы, обозначенные заглавными буквами, а обозначенные заглавными буквами подгруппы имеют подгруппы, обозначенные прописными буквами. (Например, Cry1 имеет подгруппы A-L, а Cry1A имеет подгруппы a-i.)
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, заключающемуся в том, что Cry1Da и Cry1Be не конкурируют за участки связывания в мембранных препаратах, полученных из клеток кишечника кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Специалист в данной области техники поймет, с учетом настоящего раскрытия, что растения, вырабатывающие оба этих белка (включая части полноразмерных белков, обладающих инсектицидным действием), могут замедлить или предотвратить развитие устойчивости к данным обладающим инсектицидным действием белкам по отдельности. Кукуруза и соя представляют собой предпочтительные растения.
Таким образом, настоящее изобретение частично относится к применению белка Cry1Da в комбинации с белком Cry1Be. Растения (и площадь угодий, засеянных такими растениями), которые вырабатывают оба этих белка, включены в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к пакетам или “пирамидам” из трех (или более) токсинов, в которых Cry1Da и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид комбинация выбранных токсинов обеспечивает активность по отношению к FAW в трех местах действия. Некоторые предпочтительные комбинации-пирамиды с “тремя местами действия” включают основную пару белков плюс Cry1Fa, Vip3Ab или Cry1E в качестве третьего белка, воздействующего на FAW. Эти конкретные тройные пакеты согласно настоящему изобретению неожиданно обеспечивают три места действия в отношении FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования к площади убежищ.
Согласно настоящему изобретению также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa вводят в пакет вместе с парой белков по изобретению (оба белка Cry1Fa и Cry1Be проявляют активность как по отношению к FAW, так и по отношению к мотыльку кукурузному (ECB)), добавление двух дополнительных белков в этот тройной пакет, в котором два дополнительных белка нацелены на ECB, обеспечит три места действия в отношении FAW и три места действия в отношении ECB. Этот добавленный белок (четвертый белок) может быть выбран из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I, DIG-3 и Cry1Ab, что дает в результате пакет из четырех белков, имеющих по три места действия у двух насекомых (ECB и FAW).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, заключающемуся в том, что Cry1Da и Cry1Be не конкурируют друг с другом за участки связывания в мембранных препаратах, полученных из клеток кишечника кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким образом, белок Cry1Da может быть использован в комбинации с белком Cry1Be в трансгенной кукурузе (и других растениях, например хлопке и сое) для замедления или предотвращения развития у FAW устойчивости к каждому из указанных белков по отдельности. Рассматриваемая пара белков может быть эффективной при защите растений (таких растений, как маис и соя) от повреждений, наносимых кукурузной листовой совкой, устойчивой к Cry. Другими словами, одна из областей применения настоящего изобретения относится к защите кукурузы и других экономически важных видов растений от повреждений и потери урожая, вызванных популяциями кукурузной листовой совки, у которых может развиться устойчивость к Cry1Da или Cry1Be.
В настоящем изобретении, таким образом, раскрывается пакет для управления устойчивостью насекомыми (IRM), содержащий Cry1Da и Cry1Be, предназначенный для предотвращения или ослабления развития у FAW устойчивости к каждому или обоим этим белкам.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, содержащих клетки, продуцирующие обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da и обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be.
Изобретение также относится к хозяину, трансформированному для продуцирования как обладающего инсектицидным действием белка Cry1Da, так и обладающего инсектицидным действием белка Cry1Be, причем указанный хозяин представляет собой микроорганизм или клетку растения. Рассматриваемый полинуклеотид(ы) предпочтительно находится в генетической конструкции под управлением промотора(ов), не принадлежащих Bacillus thuringiensis. Рассматриваемые полинуклеотиды могут содержать кодоны, используемые для усиленной экспрессии в растениях.
Дополнительно предполагается, что изобретение обеспечивает способ контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, содержащий приведение в контакт указанных насекомых-вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит белок, содержащий ядро токсина Cry1Da, и белок, содержащий ядро токсина Cry1Be.
Один из вариантов осуществления изобретения содержит растение маиса, содержащее экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da.
Другой вариант осуществления изобретения содержит растение маиса, в котором экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da, были введены в указанное растение маиса путем интрогрессии.
Как описано в Примерах, исследования конкурентного связывания с рецептором с использованием меченных радиоактивным изотопом белков Cry1Da и Cry1Be показали, что белок Cry1Be не конкурирует за связывание в тканях FAW, в которых происходит связывание Cry1Da. Эти результаты также указывают на то, что комбинация белков Cry1Da и Cry1Be может представлять собой эффективное средство для ослабления развития устойчивости в популяциях FAW к каждому из этих белков. Таким образом, частично основываясь на данных, представленных в настоящем документе, можно предположить, что совместное продуцирование (пакетирование) белков Cry1Be и Cry1Da может быть использовано для получения IRM пакета с высокими дозами для FAW.
К этой паре могут быть добавлены другие белки. Например, рассматриваемое изобретение также частично относится к тройным пакетам или “пирамидам”, состоящим из трех (или более) токсинов, где Cry1Da и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамиды, выбранные токсины имеют три отдельных места действия у FAW. Некоторые предпочтительные комбинации-пирамиды с “тремя местами действия” включают основную пару белков плюс Cry1Fa, Vip3Ab или Cry1E в качестве третьего белка, воздействующего на FAW. Эти конкретные тройные пакеты согласно настоящему изобретению неожиданно обеспечивают три места действия у FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования о площадях убежищ. Под “отдельными местами действия” подразумевается то, что каждый из данных белков не вызывает развития перекрестной устойчивости с другими белками.
Согласно настоящему изобретению также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa вводят в пакет вместе с парой белков по изобретению (оба белка Cry1Fa и Cry1Be проявляют активность как по отношению к FAW, так и по отношению к мотыльку кукурузному (ECB)); при этом добавление одного дополнительного белка в этот тройной пакет, в котором четвертый дополнительный белок нацелен на ECB, обеспечит три места действия в отношении FAW и три места действия в отношении ECB. Эти добавленные белки (четвертый белок) могут быть выбраны из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I, DIG-3 (см. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009) и US 2010 00269223) и Cry1Ab (US 2008 0311096). Это дает в результате пакет из четырех белков, имеющих по три места действия в отношении двух насекомых (ECB и FAW).
Таким образом, одна из возможных схем обработки представляет собой использование рассматриваемой пары белков в комбинации с третьим токсином/геном и использование этого тройного пакета для ослабления развития у FAW устойчивости к каждому из этих токсинов. Соответственно, рассматриваемое изобретение также относится к тройным пакетам или “пирамидам”, состоящим из трех (или более) токсинов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамиды, выбранные токсины имеют три отдельных места действия в отношении FAW.
Среди прочих схем обработки по настоящему изобретению могут быть использованы два, три или более белков из рассматриваемых белков в регионах произрастания кукурузы, в которых FAW может формировать популяции с развившейся устойчивостью. Например, что касается использования Cry1Fa плюс Cry1D, в заявке на патент США № 61/284252 (подана 16 декабря 2009) показано, что Cry1D активен по отношению к FAW, устойчивой к Cry1F. В этой заявке показано, что Cry1D не конкурирует с Cry1F за связывание в мембранных препаратах FAW. Для рекомендаций в отношении использования Cry1Fa и Cry1Be см. заявку на патент США № 61/284294, а в отношении использования с Vip3Ab см. одновременно поданную заявку, озаглавленную “COMBINED USE OF Vip3Ab AND Cry1Fa FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS”. С учетом того, что Cry1Fa активен по отношению к FAW (и мотыльку кукурузному (ECB)), Cry1Da плюс Cry1Ca плюс Cry1Fa неожиданно обеспечивают согласно настоящему изобретению три места действия в отношении FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования к площади убежищ.
Cry1Fa содержится в продуктах Herculex, SmartStax™ и WideStrike™. Рассматриваемая пара генов (Cry1Da и Cry1Be) может быть скомбинирована, например, с содержащим Cry1Fa продуктом, таким как Herculex, SmartStax™ и WideStrike™. Соответственно, рассматриваемая пара белков может играть значительную роль в уменьшении давления отбора на эти и другие коммерчески доступные белки. Рассматриваемая пара белков может быть использована в комбинациях из трех генов для кукурузы и других растений (например, хлопка и сои).
Как уже указывалось выше, согласно настоящему изобретению также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Для воздействия на ECB может быть использован Cry2A, Cry1I и/или DIG-3. См. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009). В отношении использования Cry1Ab (для контроля ECB) см. публикацию заявки на патент США № 2008/0311096. В отношении использования Cry1E (для контроля FAW) см. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009).
Растения (и площади угодий, засеянные такими растениями), которые вырабатывают любую из рассматриваемых комбинаций белков, включены в объем настоящего изобретения. Также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены; однако обсуждаемые выше конкретные пакеты неожиданно обеспечивают множество мест действия против FAW и ECB. Это может способствовать смягчению или устранению требования о площадях убежищ. Следовательно, поле, засеянное таким образом, площадь которого превышает десять акров, входит в объем настоящего изобретения.
Для получения последовательностей любых генов и белков, обсуждаемых в настоящем документе, также может быть использован GENBANK. См. Приложение А ниже. В патентах также раскрываются релевантные последовательности. Например, патент США № 5188960 и патент США № 5827514 описывают белки, содержащие ядро токсина Cry1Fa, которые являются подходящими для осуществления настоящего изобретения. Патент США № 6218188 описывает оптимизированные для растений последовательности ДНК, кодирующие белки, содержащие ядро токсина Cry1Fa, которые подходят для использования в настоящем изобретении.
Комбинации белков, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей. Взрослые чешуекрылые, например бабочки и мотыльки, в основном питаются цветочным нектаром и являются важными опылителями. Практически все личинки чешуекрылых, т.е. гусеницы, питаются растениями, и многие из них являются важными насекомыми-вредителями. Гусеницы поедают внутреннюю часть листвы, корни или стебель растения, лишая растение возможности получать питательные вещества и часто разрушая физическую опорную структуру растения. Помимо этого гусеницы поедают плоды, ткани и хранящиеся зерно и муку, придавая этим продуктам нетоварный вид или серьезно снижая их ценность. Как используется в настоящем документе, под чешуекрылыми насекомыми-вредителями подразумеваются различные стадии жизненного цикла насекомого-вредителя, включая стадии личинки.
Некоторые химерные токсины по настоящему изобретению содержат полную N-концевую часть ядра токсина Bt, и в некоторой точке от конца части, содержащей ядро токсина, белок переходит в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевая часть токсина Bt, обладающая инсектицидной активностью, называется “ядром” токсина. Переход от сегмента ядра токсина к сегменту гетерологичного протоксина может находиться приблизительно в месте соединения токсин/протоксин, или в качестве альтернативы, может быть сохранена часть естественного протоксина (простирающаяся за пределы части ядра токсина) с переходом в гетерологичную часть, протоксин, расположенную далее.
В качестве примера, один из химерных токсинов по настоящему изобретению представляет собой часть, относящуюся к ядру токсина Cry1Da (приблизительно от 1 до 601 аминокислоты) и/или гетерологичный протоксин (аминокислоты от 602 до С-конца). В одном из предпочтительных вариантов осуществления часть химерного токсина, содержащую протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab. В предпочтительном варианте осуществления часть химерного токсина, содержащую протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab.
Специалист в данной области техники признает, что Bt токсины, даже в рамках определенного класса, такого как Cry1Be, немного различаются по длине и точному положению перехода от ядра токсина к части, относящейся к протоксину. Обычно токсины Cry1Be имеют длину от примерно 1150 до примерно 1200 аминокислот. Переход от части, относящейся к ядру токсина, к части, относящейся к протоксину, обычно находится в пределах от 50% до 60% полной длины токсина. Химерный токсин рассматриваемого изобретения полностью включает указанную N-концевую часть ядра токсина. Таким образом, химерный токсин содержит по меньшей мере 50% полной длины белка-токсина Cry1Be, что обычно составляет по меньшей мере 590 аминокислот. Что касается части, относящейся к протоксину, то полная длина части, относящейся к протоксину Cry1Ab, простирается от конца части, относящейся к ядру токсина, до С-конца молекулы.
Гены и токсины
. Гены и токсины, используемые по настоящему изобретению, включают не только раскрытые последовательности полной длины, но также фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют характеристики пестицидной активности токсинов, примеры которых приведены в настоящем документе. В настоящем документе термин “варианты” или “вариации” генов относится к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют одни и те же токсины или которые кодируют токсины-эквиваленты, обладающие пестицидной активностью. В настоящем документе термин “токсины-эквиваленты” относится к токсинам, имеющим такую же или по существу такую же биологическую активность по отношению к целевым насекомым-вредителям, что и заявленные токсины.
В настоящем документе используются следующие ограничительные признаки: примерно 95% (для Cry1Da и Cry1Be), 78% (для Cry1D и Cry1B) и 45% (для Cry1) идентичность последовательностей согласно “Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”, N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62:807-813. Эти ограничения применимы только в отношении ядра токсинов.
Для специалиста в данной области техники очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Конкретные гены или части генов, проиллюстрированные в настоящем документе, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитарии культур. Эти гены или их части или варианты также могут быть сконструированы синтетически, например с использованием синтезатора генов. Вариации генов могут быть легко сконструированы стандартными методами для осуществления точечных мутаций. Фрагменты этих генов также могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз согласно стандартным процедурам. Например, для последовательного отщепления нуклеотидов от концов этих генов могут быть использованы такие ферменты, как Bal31, или сайт-направленный мутагенез. Гены, кодирующие активные фрагменты, также могут быть получены с использованием различных рестрикционных ферментов. Для непосредственного получения активных фрагментов указанных белков-токсинов могут быть использованы протеазы.
Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность проиллюстрированных токсинов, также находятся в пределах объема настоящего изобретения. В силу избыточности генетического кода аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем документе, могут кодироваться множеством различных ДНК-последовательностей. Специалисту в данной области техники не составит труда создать альтернативные ДНК-последовательности, кодирующие такие же или по существу такие же токсины. Такие варианты ДНК-последовательностей находятся в пределах объема настоящего изобретения. В настоящем документе “по существу такие же” последовательности обозначают последовательности, имеющие замены, делеции, добавления или вставки, которые существенно не влияют на пестицидную активность. Это определение также охватывает фрагменты генов, кодирующие белки, которые сохраняют пестицидную активность.
Еще один способ идентификации генов, кодирующих токсины, и частей генов, пригодных согласно настоящему изобретению, состоит в использовании олигонуклеотидных зондов. Такие зонды представляют собой детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности могут быть детектируемыми в силу наличия соответствующей метки или могут быть выполнены с возможностью их естественной флуоресценции, как описано в международной заявке WO93/16094. Как известно из уровня техники, если зонд и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются, формируя сильную связь между двумя указанными молекулами, можно сделать достаточно обоснованное предположение, что зонд и образец являются по существу гомологичными. Предпочтительно гибридизацию проводят в жестких условиях методом, хорошо известным из уровня техники, например, описанным в Keller, G. FL, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., p. 169-170. Некоторые примеры комбинаций концентрации соли и температуры являются следующими (в порядке возрастания жесткости): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 65°C. Детектирование зонда обеспечивает средство для определения известным способом, произошла ли гибридизация. Такой зондовый анализ обеспечивает быстрый способ идентификации кодирующих токсин генов по настоящему изобретению. Нуклеотидные сегменты, используемые в качестве зондов, согласно изобретению могут синтезироваться в ДНК-синтезаторе и с помощью стандартных процедур. Данные нуклеотидные последовательности также могут использоваться в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов по изобретению.
Варианты токсинов
. В настоящем документе, в частности, приведены примеры некоторых токсинов по изобретению. Поскольку эти токсины являются всего лишь примерами токсинов по изобретению, очевидно, что настоящее изобретение содержит варианты или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), имеющие пестицидную активность, такую же или аналогичную пестицидной активности токсина, приведенного в качестве примера. Эквивалентные токсины обладают гомологией по аминокислотам с приведенным в качестве примера токсином. Такая гомология по аминокислотам обычно превышает 75%, предпочтительно превышает 90% и наиболее предпочтительно превышает 95%. Гомология по аминокислотам является наибольшей в критических областях, которые ответственны за биологическую активность или участвуют в определении трехмерной конфигурации, которая в конечном счете и отвечает за биологическую активность. В этом отношении определенные аминокислотные замены являются приемлемыми и допустимыми, если эти замены находятся в областях, которые не являются критичными для активности или представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые не влияют на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты могут быть отнесены к следующим классам: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Консервативные замены, в которых аминокислота одного класса заменяется аминокислотой из того же класса, находятся в пределах объема настоящего изобретения при условии, что такая замена не изменяет существенно биологическую активность соединения. Ниже приводится список примеров аминокислот, принадлежащих каждому классу.
Класс аминокислот
Примеры аминокислот
неполярные
Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
незаряженные полярные
Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
кислые
Asp, Glu
основные
Lys, Arg, His
В некоторых примерах также могут быть использованы неконсервативные замены. При этом критическим фактором является то, что такие замены не должны существенно ухудшать биологическую активность токсина.
Рекомбинантные хозяева
. Гены, кодирующие токсины по настоящему изобретению, могут быть введены во множество различных микроорганизмов-хозяев или растений-хозяев. Экспрессия гена токсина приводит в результате, прямо или опосредованно, к внутриклеточному продуцированию и поддержанию пестицида. Для создания штамма Bt, экспрессирующего оба токсина по изобретению, могут быть использованы конъюгационный перенос и рекомбинантный перенос. Один или оба гена токсинов могут быть перенесены также в другие организмы-хозяева, которые могут затем использоваться для получения синергического эффекта. При использовании подходящих микроорганизмов-хозяев, например Pseudomonas, такие микроорганизмы можно применять в местах нахождения насекомого-вредителя, где они будут размножаться и попадать в кишечник насекомого, что приведет в результате к контролю насекомого-вредителя. В качестве альтернативы, микроорганизмы, содержащие ген токсина, могут быть обработаны в условиях, продлевающих активность токсина и стабилизирующих клетку. Затем обработанные клетки, которые сохраняют токсическую активность, вносят в среду обитания целевого насекомого-вредителя.
Если ген Bt токсина вводят с помощью подходящего вектора в микроорганизм-хозяин, а указанный хозяин затем вводят в среду обитания в живом состоянии, то принципиальным моментом является использование определенных микроорганизмов-хозяев. Выбираются такие микроорганизмы-хозяева, в отношении которых известно, что они обитают в “фитосфере” (филлоплане, филлосфере, ризосфере и/или ризоплане) одной или более представляющих интерес зерновых культур. Такие микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они обладали способностью успешно конкурировать в конкретной среде обитания (зерновой культуре или других местах обитания насекомых) с дикими типами микроорганизмов, обеспечивали стабильное поддержание и экспрессию полипептида-пестицида и, желательно, обеспечивали улучшенную защиту пестицида от разложения и инактивации под действием окружающей среды.
В отношении огромного количества микроорганизмов известно, что они обитают в филлоплане (поверхности листьев растений) и/или в ризосфере (почве, окружающей корневую систему растения) множества важных зерновых культур. Эти микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, например, относящиеся к родам Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, в частности дрожжи, например, относящиеся к видам Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды обитающих в фитосфере бактерий, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii, такие виды обитающих в фитосфере дрожжей, как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.
Существует широкий спектр способов введения Bt генов, кодирующего токсин, в микроорганизм-хозяин в условиях, обеспечивающих стабильную поддержку и экспрессию этого гена. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5135867, который включен в настоящий документ в виде ссылки.
Обработка клеток
. Клетки Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие Bt токсины, могут быть обработаны с целью продления активности токсина и стабилизации клетки. Формируемая микрокапсула с пестицидом содержит Bt токсин или токсины внутри клеточной структуры, которая была стабилизирована и защищает токсин при внесении микрокапсулы в среду обитания целевого насекомого-вредителя. Подходящие клетки-хозяева могут включать либо клетки прокариот, либо эукариот и обычно ограничены только теми клетками, которые не вырабатывают вещества, токсичные для высших организмов, таких как млекопитающие. Тем не менее могут быть использованы организмы, вырабатывающие вещества, токсичные для высших организмов, если эти токсичные вещества являются нестабильными или вносимое количество является достаточно низким, настолько, что при этом отсутствует какая-либо вероятность интоксикации млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.
При обработке клетки обычно являются интактными и по существу находятся в пролиферативной форме, а не в форме спор, хотя в некоторых случаях могут быть использованы споры.
Обработка клеток микроорганизмов, т.е. клеток, содержащих ген или гены Bt токсина, может выполняться с использованием химических или физических средств или с использованием комбинации химических и/или физических средств при условии, что эти методы не оказывают негативного влияния на свойства токсина, а также не ухудшают способность клетки защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенирующие агенты, в частности галогены с атомными номерами 17-80. Более точно, можно использовать йод в мягких условиях в течение времени, достаточного для достижения желаемых результатов. Другие подходящие методы включают обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными средствами, такими как зефиран хлорид и цетилпиридинхлорид; спиртами, такими как изопропиловый спирт и этанол; различными гистологическими фиксаторами, такими как Люголь-йод, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Helly (См. Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); или комбинацией физических (тепло) и химических агентов, которые защищают и способствуют пролонгированию активности токсина, продуцируемого в клетке при введении этой клетки животному-хозяину. Примерами физических средств являются коротковолновое излучение, такое как гамма-излучение и рентгеновское излучение, заморозка, УФ-облучение, лиофилизация и прочие. Способы обработки клеток микроорганизмов описаны в патентах США № 4695455 и 4695462, которые включены в настоящий документ в виде ссылки.
Клетки обычно имеют повышенную структурную стабильность, что увеличивает их устойчивость к условиям окружающей среды. Если пестицид находится в проформе, способ обработки клетки следует выбирать таким образом, чтобы патогеном целевого насекомого-вредителя не подавлялся процессинг от проформы к зрелой форме пестицида. Например, формальдегид будет сшивать белки и может подавлять процессинг проформы полипептида-пестицида. Способ обработки клетки должен способствовать сохранению по меньшей мере существенной доли биодоступности или биоактивности токсина.
Представляющие особый интерес характеристики при выборе клетки-хозяина с целью продуцирования включают легкость введения Bt гена или генов в клетку хозяина, доступность экспрессирующей системы, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в клетке-хозяине и наличие вспомогательных генетических возможностей. Представляющие особый интерес характеристики в случае использования в виде пестицидной микрокапсулы включают защитные свойства в отношении пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или формирование включений; выживание в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающего; привлекательность для поглощения насекомыми-вредителями; легкость в уничтожении и фиксации без повреждения токсина и тому подобное. Также может рассматриваться легкость в создании и обращении, экономичность, стабильность при хранении и тому подобное.
Выращивание клеток
. Клетку-хозяина, содержащую инсектицидный Bt ген или гены можно выращивать в любой подходящей питательной среде, в которой ДНК-конструкция обеспечивает селективное преимущество, обеспечивая такую селективную среду, что все или по существу все клетки сохраняют Bt ген. Затем эти клетки могут быть собраны известными методами. С другой стороны, клетки можно обрабатывать до их сбора.
Bt клетки, продуцирующие токсины по изобретению, могут быть культивированы с использованием стандартных сред и методов ферментации, известных в данной области техники. После завершения цикла ферментации бактерии могут быть собраны сначала путем выделения спор и кристаллов Bt из ферментационного бульона способами, хорошо известными в данной области. Восстановленные споры и кристаллы Bt могут быть представлены в составах в виде смачиваемого порошка, жидкого концентрата, гранул или в виде других составов с добавлением поверхностно-активных веществ, диспергирующих веществ, инертных наполнителей и других компонентов для облегчения обращения с ними и их применения по отношению к конкретным целевым насекомым-вредителям. Такие составы и процедуры нанесения хорошо известны в данной области.
Составы
. Сформированные гранулы-приманки, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и токсины Bt изолятов, или рекомбинантные микробы, содержащие гены, полученные из Bt изолятов, раскрытых в настоящем документе, могут быть внесены в почву. Сформированный продукт также может наноситься в виде покрытия на семена или в процессе обработки корней или обработки всего растения на поздних стадиях цикла развития кукурузы. Обработка растений и почвы Bt клетками может производиться с использованием смачиваемых порошков, гранул или пудры путем смешивания с различными инертными материалами, такими как неорганические минералы (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и т.п.) или растительными материалами (измельченной сердцевины кукурузного початка, рисовой шелухой, ореховой скорлупой и т.п.). Составы могут включать адгезивные адъюванты, стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или поверхностно-активные вещества. Жидкие составы могут быть водными или неводными и могут применяться в виде пен, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов и т.п. Ингредиенты могут включать реологические агенты, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы или полимеры.
2
4
Как хорошо известно специалисту в данной области, пестицидная концентрация может варьировать в широких пределах в зависимости от природы конкретной композиции, в частности от того, будет ли она представлять собой концентрат или будет использоваться непосредственно. Пестицид может присутствовать по меньшей мере в количестве 1 вес.% и может составлять 100% веса композиции. Сухие композиции могут содержать пестицид в количестве примерно от 1 до 95 вес.%, в то время как жидкие составы, как правило, могут содержать примерно от 1 до 60 вес.% твердого вещества в жидкой фазе. Композиции, как правило, могут содержать примерно от 10 до 10 клеток/мг. Эти составы применяются в количестве от примерно 50 мг (в жидком или сухом виде) до 1 кг или более на гектар.
Составы могут наноситься на среде обитания чешуекрылого насекомого-вредителя, например на листву или на почву, путем орошения, опыления, обрызгивания и т.п.
Трансформация растений
. Предпочтительным рекомбинантным хозяином для продуцирования обладающих инсектицидным действием белков по изобретению является трансформированное растение. Гены, кодирующие белки Bt токсина, как это раскрыто в настоящем документе, могут быть введены в клетки растения множеством различных методов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, для подготовки к введению чужеродных генов в высшие растения доступно множество клонирующих векторов, содержащих репликационную систему Escherichia coli и маркер, который обеспечивает возможность отбора трансформированных клеток. В число таких векторов входят, помимо прочих, pBR322, pUC серия, M13mp серия и pACYC184. Соответственно, фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую белок Bt токсина, может быть вставлен в вектор в подходящем сайте рестрикции. Полученная в результате плазмида используется для трансформации в E. coli. Клетки E. coli культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют. Плазмиды выделяют. В качестве способов анализа обычно используют секвенирование, рестрикционный анализ, электрофорез и другие биохимические и молекулярно-биологические способы. После каждой операции использованная ДНК-последовательность может быть отщеплена и присоединена к следующей ДНК-последовательности. Каждая плазмидная последовательность может быть клонирована в тех же или других плазмидах. В зависимости от способа введения в растение желаемых генов также могут быть необходимы другие ДНК-последовательности. Например, если для трансформации клетки растения используются плазмиды Ti или Ri, то по меньшей мере правый конец, а часто как правый, так и левый концы Ti или Ri плазмидной Т-ДНК, должны быть присоединены в качестве фланкирующих областей предназначенных для вставки генов. Использование Т-ДНК для трансформации клеток растений подробно исследовано и исчерпывающе раскрыто в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al. (1986) и An et al. (1985) и является хорошо известным в данной области техники.
После того как введенная ДНК интегрируется в геном растения, она становится относительно стабильной. Трансформационный вектор обычно содержит обеспечивающий возможность отбора маркер, который обеспечивает устойчивость трансформированной клетки растения к биоциду или антибиотику, такому как, например, Биалафос, Канамицин, G418, Блеомицин или Гигромицин. Отдельно используемый маркер должен, соответственно, обеспечивать отбор трансформированных клеток, а не тех клеток, которые не содержат вводимую ДНК.
Существует множество способов введения ДНК в растительную клетку-хозяина. Эти способы включают трансформацию с помощью Т-ДНК, используя Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего агента, слияние, инъекцию, биолистику (бомбардировку микрочастицами) или электропорацию, а также другие возможные способы. Если для трансформации используются Agrobacteria, предназначенные для введения ДНК должна быть клонирована в специальные плазмиды, а именно либо в промежуточный вектор, либо в бинарный вектор. Промежуточные векторы могут быть встроены в Ti или Ri плазмиду методом гомологичной рекомбинации благодаря последовательностям, которые гомологичны последовательностям в Т-ДНК. Ti или Ri плазмиды также сдержат vir-область, необходимую для переноса Т-ДНК. Промежуточные векторы не могут самореплицироваться в Agrobacteria. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium tumefaciens с помощью плазмиды-хелпера (конъюгация). Бинарные векторы могут самореплицироваться как в E. coli, так и в Agrobacteria. Они содержат ген маркера селекции и линкер или полилинкер, который ограничен областями правой и левой границ Т-ДНК. Они могут быть трансформированы непосредственно в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). Agrobacteria, используемые в качестве клетки-хозяина, должны содержать плазмиду, несущую vir-область. Vir-область необходима для переноса Т-ДНК в клетку растения. Также могут содержаться дополнительные Т-ДНК. Трансформированные таким образом бактерии используются для трансформации клеток растения. Для переноса ДНК в клетку растения растительные эксплантанты можно преимущественно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes. Затем из инфицированного растительного материала (например, частей листьев, сегментов стебля, корней, а также из протопластов или клеток, культивированных в суспензии) в подходящей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды для селекции, может быть регенерировано целое растение. Полученные таким образом растения затем могут быть исследованы на наличие внедренной ДНК. В случае инъекции или электропорации к плазмидам не предъявляется никаких дополнительных требований. Возможно использование обычных плазмид, таких как, например, производные от pUC.
Трансформированные клетки растут в растениях обычным образом. Они могут формировать зародышевые клетки и передавать трансформированный признак(и) растениям-потомкам. Такие растения можно выращивать обычным способом и скрещивать с растениями, которые имеют такие же трансформированные наследственные факторы или другие наследственные факторы. Полученные в результате гибридные особи обладают соответствующими фенотипическими свойствами.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растения трансформируют генами, в которых использование кодона оптимизировано для растений. См., например, патент США № 5380831, включенный в настоящий документ в виде ссылки. Хотя в настоящем документе в качестве примеров приведены укороченные токсины, в области использования Bt хорошо известно, что 130 кДа (полноразмерные) токсины имеют N-концевую половину, которая является ядром токсина, и С-концевую половину, которая представляет собой “хвост” протоксина. Таким образом, с укороченными/ядерными токсинами по настоящему изобретению можно использовать подходящие “хвосты”. См., например, патент США № 6218188 и патент США № 6673990. Помимо этого способы создания синтетических Bt генов для использования в растениях известны в данной области техники (Stewart and Burgin, 2007). Одним из неограничивающих примеров трансформированного растения является плодоносное растение маиса, содержащее экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry1Da, и дополнительно содержащее экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry1Be.
Перенос (или интрогрессия) признака(ов) определяемого Cry1Da и Cry1Be в инбредные линии маиса может достигаться путем выведения растения на основе рекуррентного отбора, например, путем обратного скрещивания. В этом случае желаемый рекуррентный родитель сначала скрещивается с донорной инбредной особью (нерекуррентным родителем), несущей подходящий ген(ы) для признаков, определяемых Cry1D и Cry1Be. Затем потомство от этого обратного скрещивания спаривают с рекуррентным родителем с последующим отбором полученного потомства на предмет желаемого признака(ов), который должен быть перенесен от нерекуррентного родителя. После трех, предпочтительно четырех, более предпочтительно пяти или более поколений, полученных методом обратного скрещивания с рекуррентным родителем и в результате отбора по желаемому признаку(ам), потомство становится гетерозиготным по локусу, контролирующему переносимый признак(и), но остается подобным рекуррентному родителю по большинству или почти по всем остальным генам (см., например, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).
Стратегии управления устойчивостью насекомых (IRM)
Например, Roush et al. описывает стратегии с двумя токсинами, что также называется созданием “пирамид” или “пакетов”, для управления трансгенными растениями, обладающими инсектицидными свойствами (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
На другом веб-сайте Агентство США по защите окружающей среды (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) опубликовало следующие требования для обеспечения нетрансгенных (т.е. не содержащих Bt генов) убежищ (рефугий) (раздел зерновые культуры/кукуруза, не содержащие Bt генов) для использования с трансгенными зерновыми культурами, продуцирующими один Bt белок, активный по отношению к целевым насекомым-вредителям. “Конкретные структурированные требования к кукурузе, защищенной от мотылька кукурузного Bt белками (Cry1Ab или Cry1F), являются следующими:
структурированные убежища: 20% убежище из кукурузы, не имеющей Bt защиты от чешуекрылых в областях, где кукуруза является основной культурой;
50% убежище из растений, не имеющих Bt защиты от чешуекрылых, в областях, где хлопок является основной культурой;
Блоки
Внутренние (т.е. внутри Bt поля).
Внешние (т.е. отдельные поля в пределах 1/2 мили (1/4 мили, если возможно) от Bt поля для обеспечения максимального объема случайного спаривания).
Расположенные на поле полосы
Полосы должны иметь по меньшей мере 4 ряда в ширину (предпочтительно 6 рядов) для уменьшения эффекта перемещения личинок”.
Помимо этого Национальная Ассоциация Производителей Кукурузы на своем веб-сайте (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)  также представила похожие рекомендации в отношении требований к убежищам. Например:
“Требования в отношении IRM для мотылька кукурузного:
- засевать по меньшей мере 20% от площади посева кукурузы под гибриды-убежища;
- в регионах, выращивающих хлопок, убежища должны составлять 50%;
- посевы необходимо высаживать в пределах 1/2 мили от гибридов-убежищ;
- убежища можно засевать в виде полос внутри Bt поля; полосы-убежища должны составлять по меньшей мере 4 ряда в ширину;
- убежища могут обрабатываться обычными пестицидами только в случае достижения экономического порога, достигаемого для целевого насекомого;
- основанные на Bt распыляемые инсектициды нельзя использовать в отношении кукурузы-убежища;
- подходящие убежища необходимо высаживать на каждой ферме с Bt кукурузой”.
Как указано у Roush et al. (например, на стр. 1780 и 1784, правая колонка), создание пакетов или пирамид из двух различных белков, каждый из которых является активным в отношении целевого насекомого-вредителя, и с малой или без перекрестной устойчивости может обеспечивать возможность использования меньших убежищ. Roush указывает, что для успешно разработанного пакета размер убежища менее чем 10% может обеспечить эффект по управлению устойчивостью, сопоставимый с 50% убежищем для одиночного (на организованного в виде пирамиды) признака. Для доступных в настоящее время Bt продуктов кукурузы Агентство Защиты Окружающей Среды США требует существенно меньшего объема (обычно 5%) высаженных структурированных убежищ кукурузы, не содержащей Bt гены, чем в случае продуктов с единственным признаком (обычно 20%).
Существуют различные способы обеспечения IRM эффектов убежищ, включая различные геометрические паттерны посадок на полях (как уже упоминалось выше) и смешивание семян перед посевом, как обсуждалось у Roush et al. (см. выше) и в патенте США № 6551962.
Приведенные выше процентные соотношения или близкие к ним соотношения убежищ могут использоваться для рассматриваемых двойных и тройных пакетов или пирамид. Для тройных пакетов и тремя местами действия против одного целевого насекомого-вредителя целевым значением является нулевая площадь убежища (или убежище с площадью, например, менее 5%). Это в особенности верно для коммерческих посевных площадей, например, более чем 10 акров.
Все патенты, заявки на патент, предварительные заявки и публикации, на которые приведены ссылки или которые цитируются в настоящем документе, включены в виде ссылки во всей своей полноте в той части, в которой они не противоречат сведениям, в явном виде приводимым в настоящем описании.
За исключением случаев, когда это специально оговорено или следует из контекста, грамматические формы единственного числа следует понимать как означающие “по меньшей мере один”.
Ниже приведены примеры, которые иллюстрируют способы осуществления изобретения. Эти примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих. Все процентные соотношения указаны по массе, а соотношения в растворах указаны по объему. Все температуры указаны в градусах Цельсия.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 -
I мечение Cry белков
125
Йодирование Cry токсинов
125
125
125
. Очищенные укороченные Cry токсины йодировали, используя йодогранулы Iodo-beads или IODOGEN (Pierce). Вкратце, две йодогранулы дважды промывали 500 мкл забуференного фосфатом рассола, PBS (20 мМ фосфата натрия, 0,15 M NaCl, pH 7,5), и помещали в 1,5 мл центрифужную пробирку за свинцовым экраном. Добавляли 100 мкл PBS. В тубус, используя соответствующие способы работы с радиоактивными веществами, в PBS раствор с йодогранулой добавляли 0,5 мКи NaI (17,4 Ки/мг, Lot 0114, Amersham). Реакцию между компонентами проводили в течение 5 минут при комнатной температуре, затем в этот раствор добавляли 2-25 мкг укороченного Cry белка высокой чистоты и проводили реакцию в течение следующих 3-5 минут. Реакцию завершали путем удаления раствора из йодогранул и введения его в 0,5 мл центрифужную колонку Zeba для обессоливания (InVitrogen), уравновешенную PBS. Йодогранулу дважды промывали по 10 мкл PBS и промывочный раствор также вносили в колонку для обессоливания. Радиоактивный раствор элюировали, используя колонку для обессоливания, центрифугированием при 1000x g в течение 2 мин. В случае Cry1Da для выполнения процедуры по введению радиоактивной метки использовали способ IODOGEN. Используя эту процедуру, токсин Cry в 100 мМ фосфатном буфере (pH 8) сначала очищали от липополисахаридов (ЛПС), пропуская его несколько раз через небольшую 0,5 мл колонку на основе полимиксина. В пробирку IODOGEN (Pierce Chem. Co.) добавляли 20 мкг Cry1Da токсина, не содержащего ЛПС, а затем 0,5 мКи NaI. Реакционную смесь встряхивали в течение 15 мин при 25°C. Раствор из пробирки удаляли и для завершения реакции добавляли 50 мкл 0,2 М нерадиоактивного NaI. Белок диализовали против PBS 3-ды, меняя буфер, для удаления любого несвязанного I.
Радиочистоту йодированных Cry белков определяли методами ДСН-ПААГ электрофореза, формирования изображения на люминесцентном покрытии и подсчета гамма событий. Вкратце, 2 мкл радиоактивного белка выделяли методом ДСН-ПААГ электрофореза. После выделения гели сушили в устройстве для сушки гелей BioRad согласно инструкции производителя. Изображение высушенных гелей получали путем обертывания их пленкой Mylar (толщиной 12 мкм) и экспонирования под люминесцентным экраном с длительным послесвечением Molecular Dynamics (35 см × 43 см) в течение 1 часа. Пластины проявляли на люминесцентном устройстве визуализации Molecular Dynamics Storm 820, и изображения анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant™. Радиоактивную полосу вместе с областями, расположенными непосредственно выше и ниже этой полосы, вырезали из геля лезвием бритвы и осуществляли подсчет событий с помощью гамма-счетчика. Радиоактивность детектировали только в полосе, соответствующей Cry белку, и в областях, расположенных ниже этой полосы. Отсутствие радиоактивности в областях, расположенных выше полосы, указывало на то, что все радиоактивные вещества состояли из компонентов белка, более мелких по сравнению с укороченным Cry белком. Эти компоненты, наиболее вероятно, представляли собой продукты распада.
Пример 2 - Протокол получения BBMV
2
2
2
Получение и фракционирование растворенного BBMV. Личинок Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis или Heleothis zea на последней возрастной стадии выдерживали без пищи всю ночь, а затем утром препарировали после охлаждения на льду в течение 15 минут. Из полости тела удаляли ткань средней кишки, оставляя расположенную сзади заднюю кишку, прикрепленную к наружному покрову. Среднюю кишку помещали в 9X объем охлажденного льдом буфера для гомогенизации (300 мМ маннита, 5 мМ EGTA, 17 мМ основания Трис, pH 7,5), дополненного коктейлем ингибиторов протеаз (Sigma P-2714), разбавленным согласно рекомендациям поставщика. (Конечная концентрация компонентов коктейля (в мкМ) составляет AEBSF (500), ЭДТА (250 мМ), бестатин (32), Е-64 (0,35), лейпептин (0,25) и апротинин (0,075).). Ткань гомогенизировали 15 ударами, используя стеклянный гомогенизатор тканей. BBMV получали преципитацией MgCl по методу Wolfersberger (1993). Вкратце, равный объем 24 мМ раствора MgCl в 300 мМ маннита смешивали с гомогенатом средней кишки, перемешивали в течение 5 минут и выстаивали на льду в течение 15 мин. Раствор центрифугировали при 2500x g в течение 15 мин при 4°C. Супернатант сохраняли, а осадок суспендировали в исходном объеме 0,5-X разведенного буфера для гомогенизации и снова центрифугировали. Два супернатанта объединяли, центрифугировали при 27000x g в течение 30 мин при 4°C для получения фракции BBMV. Осадок суспендировали в 10 мл буфера для гомогенизации, добавляли к ингибиторам протеаз и снова центрифугировали при 27000x g в течение 30 мин при 4°C для промывки BBMV. Полученный осадок суспендировали в буфере для хранения BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10% глицерина, pH 7,4) до получения концентрации белка примерно 3 мг/мл. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976), используя бычий сывороточный альбумин (BSA) в качестве стандарта. Перед заморозкой образцов определяли активность щелочной фосфатазы методом анализа Sigma согласно инструкции производителя. Удельная активность маркерного фермента во фракции BBMV, как правило, в 7 раз превышала активность, определенную во фракции гомогената средней кишки. BBMV фасовали по 250 мкл образцов, быстро замораживали в жидком N и хранили при -80°C.
Пример 3 - Способ измерения связывания
I Cry белков с BBMV белками
125
125
125
125
4
2
4
Связывание I Cry белка с BBMV. Для определения оптимального количества белка BBMV для использования в анализе связывания строили кривую насыщения. I-меченный Cry белок (0,5 нМ) инкубировали в течение 1 часа при 28°C с различными количествами белка BBMV в пределах от 0 до 500 мкг/мл в буфере для связывания (8 мМ NaHPO, 2 мМ KHPO, 150 мМ NaCl, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, pH 7,4). Общий объем составлял 0,5 мл. Связанный I Cry белок отделяли от несвязанного путем переноса 150 мкл образца реакционной смеси в трех экземплярах из 1,5 мл центрифужной пробирки в 500 мкл центрифужную пробирку и центрифугирования образцов при 14000x g в течение 6 минут при комнатной температуре. Супернатант бережно удаляли, а осадок бережно промывали три раза охлажденным льдом буфером для связывания. Дно центрифужной пробирки с находящимся в нем осадком отрезали и помещали в 13×75-мм стеклянную культуральную пробирку. В каждом образце подсчитывали события гамма-счетчиком в течение 5 минут. Число событий, определенных в образце, вычитали из количества фоновых событий (реакция без какого-либо белка) и наносили на график в зависимости от концентрации белка BBMV. Оптимальное для использования количество белка было определено как равное 0,15 мг/мл BBMV белка.
125
Для определения кинетических характеристик связывания строили кривую насыщения. Вкратце, BBMV (150 мкг/мл) инкубировали в течение 1 часа при 28°C с I Cry токсином с концентрацией, увеличивающейся в пределах от 0,01 до 10 нМ. Общее связывание определяли путем троекратного отбора по 150 мкл каждой концентрации, центрифугирования и подсчета событий, как описано выше. Неспецифическое связывание определяли таким же способом, при этом в реакционную смесь добавляли 1000 нМ гомологичного трипсинизированного нерадиоактивного Cry токсина до насыщения всех неспецифических сайтов связывания с рецепторами. Специфическое связывание вычисляли в виде разницы между общим связыванием и неспецифическим связыванием.
125
125
Анализ конкурентного гомологичного и гетерологичного связывания выполняли, используя 150 мкг/мл BBMV белка и 0,5 нМ Cry белка с радиоактивной I меткой. Конкурентный немеченный Cry токсин добавляли в реакционную смесь в концентрациях, меняющихся от 0,045 до 1000 нМ, и в то же самое время добавляли радиоактивный лиганд для обеспечения истинного конкурентного связывания. Инкубировали в течение 1 часа при 28°C и измеряли количество I Cry белка, связанного с рецептором токсина, как описано выше, с вычитанием неспецифического связывания. Стопроцентное общее связывание определяли в отсутствие всех конкурентных лигандов. Результаты представлены в виде графика с использованием полулогарифмической шкалы в виде зависимости выраженного в процентах общего специфического связывания от концентрации добавленного конкурентного лиганда.
Пример 4 - Краткий обзор результатов
125
125
На Фиг. 1 показано выраженное в процентах общее специфическое связывание I Cry1Be (0,5 нМ) с BBMV, выделенным из FAW, в зависимости от степени конкуренции с немеченными гомологичным Cry1Be (●) и гетерологичным Cry1Da (○). Кривая замещения для гомологичной конкуренции с Cry1Be имеет вид сигмоидальной кривой, показывающей 50% замещение радиоактивно меченного лиганда при примерно 2 нМ Cry1Be. Cry1Da при концентрации 1000 нМ (в 2000 раз больше, чем концентрация замещаемого I Cry1Be) дает в результате замещение менее 50%. Указанные ошибки представляют диапазон значений, полученных при тройном определении.
125
125
125
На Фиг. 2 показано выраженное в процентах общее специфическое связывание I Cry1Da (0,5 нМ) с BBMV, выделенным из FAW, в зависимости от степени конкуренции с немеченными гомологичным Cry1Da (○) и гетерологичным Cry1Be (●). Кривая замещения для гомологичной конкуренции с Cry1Da имеет вид сигмоидальной кривой, показывающей 50% замещение радиоактивно меченного лиганда при примерно 1,5 нМ Cry1Da. Cry1Be не смещает специфическое связывание I Cry1Da ни при какой из исследованных концентраций, вплоть до 1000 нМ, что в 2000 раз больше концентрации I Cry1Da, использованной в анализе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ