От трансплантации органов к репаративным сфероидам и «Микротканям» в суспензионной 3D культуре

ДИСКУССИОННЫЕ И ОБЩЕТЕОРЕТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

От трансплантации органов к репаративным сфероидам и «микротканям» в суспензионной 30-культуре

В.С. Репин, И.Н. Сабурина

НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва

From organ transplantation to reparative spheroids and «microtissues» in suspension 3D-culture

V.S. Repin, I.N. Saburina

Institute of General Pathology and Pathophysiology RAMS, Moscow

В мире предложено 4 экспериментальные трансплантации органов. 1. Клеточная терапия, в виде введения неорганизованной суспензии стволовых и (или) дифференцированных клеток. 2. Тканевая инженерия в виде пересадки дифференцированных клеток на Эй-матрице для компенсации (восстановления) поврежденных тканей и органов, а следовательно и их функций. Э. Трансляционной медицины — персонализированного введения аутоклеток для индукции морфогенеза и физиологической регенерации в тканях. 4. Пересадка Эй-организованных мини-тканей (тканевых сфероидов), полученных высокопроизводительными поточными производственными линиями. Особенностям последних и посвящено настоящее эссе (По материалам доклада, выполненного на Х Международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» Бенидорм, Испания 22—29 октября 2011).

Ключевые слова: клеточная трансплантация, «микроткани», репаративные сфероиды, Эй-культура.

4 experimental alternatives has been developed for organ transplantation: 1. Cell therapy as a suspension of disorganized somatic and stem cells. 2. The Grafts of well differentiated cells on 3D-matrix to compensate (restore) the damaged function. 3. Translational medicine — single selected pilot project of personalized medicine of auto- stem cell sphere transplantation with a new emergent potential for tissue morphogenesis and regeneration. 4. High throughput cellular serial fabrics for multiple generation of standard micro-tissues and 3D-mini-tissues. They are especially devoted to this essay.

Key words: cellular transplantation, micro-tissues,

reparative spheroids, 3D-culture.

Предпосылки

Изучение стволовых клеток выросло из мощного социального заказа от огромных контингентов пожилого населения всех высокоразвитых стран, не получающих качественного лечения по страховке. Например, в США более 2 млн пациентов с комбинированной терминальной недостаточностью органов не получают адекватного лечения. Как известно, медикаментозное лечение таких тяжелых состояний лишь частично улучшает симптоматику, не изменяя ни основных причин, ни сроков наступления смерти. Каждый год в США регистрируется 650 000 «свежих» инфарктов миокарда и 550 000 повторных инфарктов миокарда. В неврологической практике регистрируется 600 000 «свежих» инсультов и 600 000 микроинсультов. Каждый год появляются 10—15 тыс. новых пациентов с сахарным диабетом, около 6 млн новых травм костно-мышечной системы. 6 млн пожилых американцев страдают остеопорозом [1].

В США около 25 000 пациентов с острой и хронической печеночной недостаточностью постоянно находятся «на листе ожидания» спасительной операции трансплантации печени. Только 10% из них дожидаются пересадки. Остальные погибают или прибегают к экстраординарным операциям, чтобы дождаться пересадки органа.

e-mail: vadim.repin@gmail.com

В кардиологии около 40 000 пациентов с терминальным кардиосклерозом и декомпенсированной сердечной недостаточностью ожидают пересадку сердца. Только 1000—1500 пациентов в год в США получают новое сердце. Потребности детей с летальной недостаточностью органов также покрываются всего лишь на 10%. Остальные остаются без реального лечения и погибают. Выдающийся молекулярный биолог Сидней Бреннер писал по этому поводу еще в начале этого века: «Мы не можем назвать современную медицину гуманной, если миллионы людей остаются без страховой медицины и адекватных средств помощи» [2, Э].

Подсчитано, что пролонгирование жизни обреченным пациентам хотя бы на год в США привело бы к серьезным финансовым проблемам для медицинских страховых компаний. В том числе и в связи с этим, развитие новых клеточных технологий пробивает дорогу в обстановке многочисленных «нет».

За историю трансплантологии были разработаны 4 альтернативы пересадкам органов:

1. Клеточная терапия, в виде введения неорганизованной суспензии стволовых и (или) дифференцированных клеток.

2. Тканевая инженерия в виде пересадки дифференцированных клеток на Эй-матрице для компенса-

ции (восстановления) поврежденных тканей и органов, а следовательно и их функций.

3. Трансляционной медицины — персонализированного введения аутоклеток для индукции морфогенеза и физиологической регенерации в тканях.

4. Пересадка 3D-организованных мини-тканей (тканевых сфероидов), полученных высокопроизводительными поточными производственными линиями [4, 5].

В 2010 г. суммарное количество операций по трансплантации ауто- и алло клеток в США превысило число операций по пересадке органов [6]. Несмотря на то, что более 22 крупнейших компаний соучаствуют в научно-практических разработках вокруг стволовых клеток человека, по ряду причинам в этой сфере достигнуты лишь скромные результаты. Во-первых, не предложено общей концепции действия трансплантата на клеточном уровне. Во-вторых, отсутствуют FDA-разрешенные и апробированные клеточные линии ЭСК или иные линии клеток для массового применения. Кроме того, отсутствуют подходы к объективной дозировке терапевтически эффективного клеточного трансплантата. Отсутствуют однозначные взгляды на оценку эффективных путей васкуляризации в зоне повреждения и области трансплантации. Остается неясным, как отдельные донорские клетки взаимодействуют с тканями реципиента. Недостаточно стандартных воспроизводимых моделей для воспроизведения всего спектра повреждений и болезней человека. Сохраняются проблемы с эффективной и безопасной экспансией клеток in vitro (аномалии гено- и фенотипа, про- и эукариотическая контаминация, гетерохронность и гетерогенность морфо-функциональных признаков в культуре). Несмотря на трудности и ограничения, в США, Европе и Азии начинает действовать трансляционная медицина пересадок ауто-, аллоклеток в обход страховой медицины.

Протоколы трансляционной медицины отличаются от классических протоколов клинических GCP-исследований на больших, относительно однородных выборках пациентов следующими особенностями: каждый проект сориентирован на одного пациента — т.е. является персонифицированным; операция осуществляется в масштабе одного университета (института, госпиталя и т.д.), имеющего лабораторию клеточной биологии (источник клеток) и одной клиники, где выбранному пациенту осуществляют пересадку аутоклеток; разрешение на проведение новой клеточной операции даётся локальным Ученым Советом и этическим (биоэтическим) комитетом; движущей силой проекта являются интересы обреченного пациента (не этично не лечить!) и возможность получить новые научные результаты; лечение бесплатное за счет средств университета.

Участники проекта трансляционной медицины стремятся использовать так называемые эмерж-дентные линии ауто-ММСК или прогениторные линии, наделенные способностью к самоорганизован-ному коллективному клеточному поведению [7—9].

Эмерджентные линии стволовых клеток.

В дифференцированных клетках, например, в миоцитах или в кардимиоцитах, минимальные софт-программы поддерживают химический (метаболический) гомеостаз в ходе сокращения, в то время, как доминирующие софт-программы стволовых клеток

подготавливают появление нового фенотипа и функций. При этом они в 2D-культуре не способны генерировать новое коллективное клеточное поведение (в монослое). Однако только в эмерджентных линиях стволовых клеток спонтанно возникает новый уровень сложности и комплексного организованного поведения. В суспензии без сыворотки и чашках с антиадгезивной поверхностью, стволовые клетки быстро формируют агрегаты-сфероиды за счет межклеточных контактов. Клетки сфероидов репрограм-мируются до уровня зародышевых листков и эмбриональных зачатков. Перестраиваясь эпигенетически, клетки сфероидов демонстрируют способность к новому коллективному организованному поведению.

Другая важная особенность сфероидов — пластичность цитоскелета шаровидных клеток, управляемая активностью короткоцепочечных ГТФ-аз семейства RhoА/Rac1, включая ингибитор Rock — Y-27632 [10—11]. Так, этот ингибитор увеличивал сферои-догенез ММСК предстательной железы человека in vitro [12], сфероидогенез и синхронное образование мез- энтодермы и дефинитивной энтодермы из агрегатов ЭСК человека [13]. Мозаика активированных и ингибированных Rho-ГТФ-аз селективно направляла кооперативную дифференцировку ММСК- сфер in vitro [14, 15].

3D-структура цитоскелета шаровидных клеток в сферах обустроена более динамично, чем цитоскелет дифференцированных соматических клеток. 3D-перестройки цитоскелета вызывают быструю и синхронную смену линкеров/кадгеринов плазматический мембраны и линкеров ядерной мембраны. Новые кластеры плазматических рецепторов через динамичную сеть цитоскелета доставляют информацию к новым областям хроматина за счет перестройки линкеров ядерной мембраны.

Генетика и эпигенетика регенерации

Бурное развитие клеточной биологии стволовых клеток в последнее время происходило под влиянием медицины, эпигеномики и системной биологии. Было установлено, что поддержание клеточного гомеостаза и репаративные процессы базируются на универсальных 6 R-механизмах:

1R — renewal (самообновление клеток и внутриклеточных структур);

2R — repair (починка поврежденной ткани);

3R — replace (замена утраченных клеток новыми);

4R — restore (восстановление утраченной функции новой тканью в новом участке);

5R — rejuvenate (частичное «омоложение» клеток или ткани);

6R — regenerate (образование специализированной регенерационной ткани) [16].

Исследования на стыке с эпигеномикой показали, что ткани взрослого человека и млекопитающих содержат множество эпигенетических факторов, блокирующих 6R-механизмов [17—19], так, в геноме человека существует более 5000 генов, участвующих в возрастной модификации хроматина [20, 21]. Вс взаимном обмене информацией между стволовыми клетками и их нишами (а глобально — организмом) огромную роль играет аппарат микровезикул, переносящих регуляторные некодирующие и микро-РНК [22]. В результате этого обмена подавляющая часть стволовых клеток в тканях взрослого организма

остается неактивной, хотя в условиях in vitro их способности могут проявляться. Более того, в культуре прослежены множественные альтернативные пути активации стволовых клеток.

В зоне повреждения стволовые клетки способны к ограниченной аккумуляции, диффренцировке и встраиванию в востанавливающуюся ткань. В патологически измененных или поврежденных тканях большая часть супрессорных сигналов подавляет активность стволовых клеток in situ. В дополнение к этому факторы острого или хронического воспаления, вирусной и микробной инфекции, иммунной реакции блокируют активацию донорских и эндогенных стволовых клеток; в том числе и из за этого вместо регенерирующей паренхиматозной ткани образуется рубцовая (фиброзная) ткань.

Благодаря подходам системной биологии удалось заняться «инвентаризацией» молекулярного аппарата стволовых клеток. Полная библиотека молекул индивидуальных ЭСК выглядит следующим образом:

1) число активных генов варьирует от 18 000 до 24 000;

2) число молекул мРНК — от 30 000 до 40 000;

3) некодирующие регуляторные РНК — от 60 000 до 70 000;

4) микро-РНК — от 18 000 до 19 000;

5) среднее число белков — 1800 [23].

Большинство регуляторных РНК участвуют в пролиферации, самообновлении и дифференцировке стволовых клеток за счет блокирующих кластеров молекул [24]. По-видимому, микро-РНК в клетках образует плотную сеть, регулирующую активность генов на пост-транскрипционном уровне. Афферентная

ЛИТЕРАТУРА:

1. Genuis S.J. Medical practice and community health care in the 21 century: a time of change. Public. Health. 2008; 122: 671—80.

2. Brenner S. Editorial: humanity as the model system. Science 2003; 302: 533.

3. Perpich J.G. The dawn of genomic and regenerative medicine: new paradigm for medicine, the public health and society. Technol. in Society. 2004; 26: 405-14.

4. Rivron N.C., Rouwkewa J., Truckenmuller R. et al. Tissue assembly and organization: developmental mechanisms in microfabricated tissues. Biomaterials 2009; 30: 4851-8.

5. Mironov V., Visconti R.R., Kasjanov V. et al. Organ printing: tissue spheroids as a building blocks. Biomaterials 2009; 30: 2164-74.

6. Koch T.G., Berg L.C., Betts D.H. et al. Current and Future Regenerative Medicine. Can. Vet. J. 2009; 50: 155-65.

7. Cohen I.R., Harel D. Explaining a complex living system: dynamics, multiscaling and emergence. J. R. Soc. Interface. 2007; 4: 175-82.

8. Milotti E., Chignola R. Emergent properties of tumor microenvironment in a real life model of multicellular tumor spheroids. PlosONE 2010; 5: e3942-e52.

9. Wolkenhauer O., Shibata D.K., Mesarovich M. A stem cell niche microdominance theorem. BMC System Biol. 2011; 54: 1-16.

10. Khademhosseini A., Langer R., Borenstein J. et al. Microscale technologies for tissue engineering and biology. PNAS USА 2006; 103: 2480-7.

11. Sakamoto K., Nakahara T., Ishii T. Rho-Rho kinase are involved in the protective effect of of early ischemic preconditioning in the rat heart. Biol. Pharm. Bull. 2011; 34: 156-9.

12. Zhang L., Valdez J.M., Zhang B. et al. ROCK inhibitor Y-27632 suppresses dissociation-induced apoptosis of murine prostate stem/ progenitor cells and increases their cloning efficiency. PlosONE 2011; 6: e18271-e81.

13. Ohayosumrit M., Tuch B., Sidhu K. et al. Alginate microcapsules for propagation and directed differentiation of hESCs to definive endoderm. Biomaterials 2010; 31: 505-19.

14. Ruiz S.A., Chen C.S. Emergence of patterned stem cell differentiation within multicellular structures. Stem Cells 2008; 26: 2921-7.

часть сети локализована в виде кластеров микро-РНК с другими сигнеальными молекулами. Эфферентная часть сети состоит из кластеров транскрипционных факторов и микро-РНК. В виде плотной сети микро-РНК регулирует активность тысячи локусов [25].

Почему «глобальная инвентаризация» молекулярного мира клеток оказалась столь актуальной? Например, были идентифицированы 600 генов необластов (дефинитивных стволовых клеток) у планарий. Гены регенерации затем «переупаковали» в пределах одной матрицы - чипа. С помощью такой тест-системы удалось быстро выявить отсутствие генов регенерации необластов у человека и млекопитающих [26]. Другое направление поисков - выявление глобального полиморфизма генов, мРНК, регуляторных РНК, белков в популяции на предмет связи этих различий с региональными эпидемиями заболеваний [26]. Оказалось, что наборы регуляторных РНК, локализованных в 21-й хромосоме, «путают» (вносят шумы) в экспрессию и синтез белков нервных клеток у пациентов с Даун-сндромом [27].

Именно глобальный анализ позволил предсказать, как двигается эволюция главных классов информационных молекул в человеческой популяции. Общее число генов в популяции остается неизменным, тогда как новодел белков достигает 10 млн (в нервных клетках библиотеки белков достигают нескольких млрд). На фоне эволюционной экспансии белков мир регуляторных РНК развивается значительно медленней. Этот глобальный high throughput скрининг позволил выявить стратегию главных эволюционных перемен, в том числе в стволовых клетках [23].

15. Lund A.W., Yener B., Stegeman J.P. et al. The natural and engineered 3D microenvironment as a regulatory cue during stem cell fatr determination. Tissue Eng. 2009; 15: 371-80.

16. Nelson T.I., Behfar A., Terzic A. Strategies for therapeutic repair: The 6 R regenerative medicine paradigm. CTS 2008; 1: issue 2: 168-88.

17. Sedivy J.M., Banumathy G., Adams P.D. Aging by epigenetics -a consequence of chromatin damage? Exp. Cell Res. 2008; 314: 1909-17.

18. Sinclair D., Oberdoerffer P. The aging epigenome: damage beyond repair? Aeing. Res. Rev. 2009; 8: 189-98.

19. Fraga M.F. Genetic and epigenetic regulation of aging. Curr. Opin. Imuunol. 2009; 21: 446-53.

20. Turchinsky A.L., Turner B., Borja R.C. DAnCER: disease annotated chromatin epigenetics. Nucleic Acid Res. 2011; 39: D789-98.

21. Ernst J., Kellis M. Discovery and characterization of chromatin states for systemic annotation of the human genome. Nature Biotechnol. 2010; 28: 817-30.

22. Collino F., Deregibus M.C., Bruno S. Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific MSCs shuttle selected patterns of micro-RNAs. PlosONE 2010; 5: e11803-e13.

23. Naylor S., Chen J.Y. Unraveling human complexity and disease with system biology and personalized medicine. Per. Med. 2010; 7: 275-89.

24. Hime G.R., Samers W.G. Micro-RNA-mediayed regulation of proliferation, self-renewal and differentiaton of mammalian stem cells. Cell Adhes. Migrat. 2009; 3: 425-32.

25. Shalgi R., Lieber D., Oran M. et al. Global and local architecture of the mammalianmicro-RNAs - transcriptional factor regulation network. PloS Comput. Biol. 2007; 3: e1310-e41.

26. Li J., Liu Y., Kim T. et al. Gene expression variability within and between human populatons and implications toward disease susceptibility. Plos. Comput. Biol. 2010; 6: e1000910-e945.

27. Kuhn D.E., Nuovo G.J., Terry A.V. et al. Chromosome-2'1-derived micro-RNAs provide an ethiological basis for aberrant protein expression in human Dawn syndrome brain. J. Biol. Chem. 2010; 285: 1529-43.

Поступила: 25.01.2012