Способ получения биомодифицированного белкового продукта из тритикалевых отрубей
METHOD FOR OBTAINING BIOMODIFIED PROTEIN PRODUCT FROM TRITICALE BRAN

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к получению белкового продукта из зернового сырья, и может быть использовано при производстве обогащенных белком пищевых продуктов с повышенной пищевой ценностью, а также продуктов, обладающих определенными функционально-технологическими свойствами.
Зерно злаковых культур, в т.ч. и зерно тритикале, аккумулировало в себе громадный биопотенциал, который в настоящее время используется далеко не в полной мере.
Ферментативная модификация биополимеров зерна и продуктов его переработки проводится с целью получения компонентов с заданными функционально-технологическими свойствами, которые могут быть использованы в различных отраслях пищевой промышленности (хлебопекарная, кондитерская, пищеконцентратная и др.)
В настоящее время широко изучаются возможности использования ферментов целлюлолитического комплекса в композиции с амилолитическими и протеолитическим ферментами для комплексной глубокой переработки зернового сырья и вторичных продуктов переработки зерна.
Известен (RU, патент 2063144, опубл. 10.07.1996) способ получения белкового продукта из пшеничных отрубей. Согласно известному способу проводят щелочное экстрагирование сырья, отделение экстракта от шрота отрубей и последовательное выделение из экстракта крахмало-белковой фракции и целевого продукта, причем экстрагирование сырья проводят в присутствии тиосульфата натрия, взятого в количестве 0,05-1% от массы сырья, при рН 10-11 и температуре 50-60°С, а выделение целевого продукта при рН 4,0-4,5.
Недостатком данного способа является использование агрессивных химических реагентов (гидроксид натрия) и трудоемкость процесса.
Известен (В.В. Колпакова, А.П. Нечаев, А.В. Смирнова). Белок из пшеничных отрубей. Влияние технологических факторов на выход и биологическую ценность. Хранение и переработка сельхозсырья, 1994, №6. С. 34-42), также способ получения белковых продуктов из пшеничных отрубей и их гранулометрической фракции, включающий щелочное экстрагирование сырья при рН 10-11, отделение экстракта от шрота отрубей, выделение из него крахмало-белковой фракции сепарированием и выделение белкового продукта доведением рН оставшегося раствора до 4,0-4,5 и последующим центрофугированием.
Недостатком данного способа является получение белковых препаратов, содержащих повышенные количества тяжелых металлов (свинца, меди, цинка и, особенно, кадмия) при условии неудовлетворительного качества исходного зернового сырья.
Известен способ (Production and characterization of an extensive rapessed protein hydrolysate / Vioque Javier, Sanchez-Vioque Raul, Clemente Alfonso, Pedrockt Justto, Bautiste Juan, Milan Francisso // J. Amer. Oil Chem. Soc. - 1999. - 76, №7, - p. 819-823) получения белкового гидролизата из семян рапса с использованием эндопептидазы (алкалазы 2,4 L FG) -фермента, продуцируемого штаммом Bacillus licheniformis, и экзопептидазы (Flovourzyme-1000 MG), представляющих собой комплекс экзопротеаз из Aspergillus orysae.
Недостатком данного способа является необходимость использования серии ферментных препаратов в довольно больших концентрациях для достижения высокой производительности, что приводит к удорожанию продукта.
Известен (RU, патент 2562146, опубл.2015) способ производства кормового белкового продукта, предусматривающий подготовку зернового сырья, в том числе и отрубей, путем размалывания его до частиц размером 1-20 мкм, приготовление водной суспензии зернового сырья с концентрацией сухих веществ 15-16% при соотношении зернового сырья и воды 1:5, проведение ферментолиза зернового сырья последовательно с помощью жидких α-амилазы и глюкоамилазы, внесение в полученный ферментолизат источников азота и фосфора с получением питательной среды, внесение в питательную среду культуры-продуцента, в качестве которой используют штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585, непрерывное выращивание в многосекционном аппарате с подачей питательной среды одновременно по нескольким секциям, последующее концентрирование суспензии на вакуум-выпарке и сушку, причем влагу, высвобождающуюся на стадиях вакуум-выпарки и сушки, используют для приготовления водной суспензии зернового сырья.
Недостатком известного способа следует признать его сложность.
Известен (RU, патент 2250026, опубл. 29.11.2010) способ получения белкового продукта из отрубей, включающий щелочное экстрагирование сырья, отделение экстракта от шрота отрубей и последовательное выделение из экстракта крахмало-белковой фракции и целевого продукта, причем отруби перед щелочным экстрагированием подвергают ферментной обработке, ферменты вносят последовательно: вначале пектолитического действия 2,0…5,0 ед. пектолитической активности на 1 г отрубей, затем ксиланазного действия 30…60 ед. ксиланазной активности на 1 г отрубей, и целлюлолитического действия 4,0…9,0 ед. целлюлолитической активности на 1 г отрубей, при этом время обработки каждым ферментным препаратом составляет 40…60 мин при температуре 50±2°С, гидромодуле 10-1…12-1 и нейтральных значениях рН.
Недостатком данного способа является длительность процесса экстрагирования, использование щелочной экстракции и соляной кислоты для осаждения белков, использования серии ферментных препаратов в довольно больших концентрациях для достижения высокой производительности, трудоемкость процесса, что приводит к удорожанию продукта.
Наиболее близким к заявляемому способу можно признать (RU, патент 2604194 С1, опубл. 10.12.2016) способ получения структурно модифицированного продукта из тритикале - гидролизованной тритикалевой муки, предусматривающий модификацию белкового комплекса сырья путем ферментативного гидролиза протеолитическими ферментными препаратами с последующей его остановкой, перед проведением ферментативного гидролиза проводят измельчение зерна тритикале до размера, характеризующегося 100%-ным проходом через сито диаметром 1 мм, смешивание измельченного сырья с водой при гидромодуле 1:4, проведение процесса гидролиза в течение 2 часов при температуре 50-60°С и рН 5,0-6,0, остановку гидролиза нагреванием суспензии при температуре 80-85°С в течение 10-15 мин, разделение полученной суспензии на твердый остаток и жидкую фракцию структурно модифицированного продукта, при этом в качестве протеолитических ферментных препаратов используют Нейтразу 0,8 L или Протеазу GC-106 в количестве 0,5-1,0 ед. ПС/г измельченного сырья.
Недостатком известного способа следует признать использование в качестве сырья муки хлебопекарного качества.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного технического решения, состоит в разработке принципиально нового способа получения биомодифицированных отрубей из зерна тритикале.
Техническим результатом заявленного способа является получение пищевого биомодифицированного продукта гидролизованных тритикалевых отрубей, высокой биологической ценности, а также повышение выхода белка, глубины и степени его гидролиза, с заданными функционально-технологическими свойствами (водопоглотительной, пенообразующей способностью, жиросвязывающей и жироэмульгирующей способностью, а также стабильностью эмульсии и стойкостью пены).
Для достижения заявленного технического результата предложено использовать разработанный способ получения биомодифицированных отрубей из зерна тритикале, характеризуемый тем, что проводят модификацию сначала некрахмальных полисахаридов, затем белкового комплекса сырья путем ферментативного гидролиза целлюлолитическими и протеолитическими ферментными препаратами с последующей его остановкой, перед проведением ферментативного гидролиза проводят смешивание измельченного сырья с водой, гидролиз проводят при насыщающих концентрациях субстрата, остановку гидролиза осуществляют нагреванием суспензии с последующим разделением полученной суспензии на твердый остаток и жидкую фракцию биомодифицированного продукта, при этом гидролиз проводят в два этапа, причем на первом этапе вносят целлюлолитический ферментный препарат, а на втором этапе вносят протеолитический ферментный препарат, а время проведения каждого этапа составляет 1,5 часа.
Обычно смешивание измельченного сырья с водой проводят при гидромодуле 1:4.
Предпочтительно нагревание суспензии осуществляют до температуры 80±5°С с выдерживанием в течение 10-15 мин.
Состав конкретного зернового субстрата может оказывать влияние на характер протекания процесса протеолиза и изменять оптимальные значения температуры и рН. Кроме того, при действии ферментного препарата, а не высокоочищенного фермента на сложный гетерогенный субстрат (отруби из зерна тритикале), возможны отклонения от классической зависимости начальной скорости реакции гидролиза от концентрации фермента (дозировки ферментного препарата). Указанные отклонения, в свою очередь, связаны с различного рода факторами, например ингибирующим действием отдельных компонентов зернового субстрата - отрубей тритикале.
В связи с этим, были разработаны условия для действия целлюлолитических и протеолитических ферментных препаратов, позволяющие получить продукт с высоким выходом, провести гидролиз некрахмальных полисахаридов и протеолиз белковых веществ конкретного зернового субстрата (зерна тритикале), получить продукты с разным соотношением высоко-, средне- и низкомолекулярных фракций пептидов и количеством аминокислот и, как следствие, с различными функционально-технологическими свойствами.
В состав мультиэнзимных комплексов (МЭК-1) входили ферментные препараты Шеарзим 500 L + Нейтраза 0,8 L; МЭК-2 соответственно Вискоферм L + Дистицим Протацид Экстра. Выбор ферментных препаратов обусловлен различной специфичностью действия и примерно одинаковыми оптимумами действия: оптимум температуры - 50°С; рН 5,5-6,0 для МЭК-1 и 40°С; рН 3,5 для МЭК-2. Оптимальной дозировкой ферментного препарата «Шеарзим 500 L» является 0,30 ед. КС/г отрубей, а ферментного препарата «Вискоферм L» - 0,40 ед. ЦС/г отрубей; оптимальные условия проведения ферментативной реакции при действии препаратов микробных протеаз «Нейтраза 0,8 L» и «Дистицим Протацид Экстра» на белки отрубей тритикале - оптимальная дозировка 0,5 и 0,75 ед. ПС/г отрубей соответственно, концентрация субстрата 100 мг/мл.
Способ осуществляют следующим образом.
Перед проведением ферментативного гидролиза тритикалевые отруби с вымольных систем (сход сита 450 микрон) смешивали с водой при гидромодуле 1:4, вносили ферментные препараты целлюлолитического и протеолитического действия в 2 этапа. На первом этапе вносили целлюлолитический ферментный препарат. На втором этапе - протеолитический ферментный препарат, останавливали гидролиз термообработкой суспензии при температуре 80±5°С в течение 10-15 минут с последующим разделением полученной суспензии на твердый остаток и жидкую фракцию структурно модифицированного продукта. Полученный продукт дополнительно может быть высушен.
Заявляемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1. Тритикалевые отруби с вымольных систем (сход сита 450 мкм) смешивали с водой при гидромодуле 1:4, вносили ферментный препарат Шеарзим 500 L в количестве 0,3 ед. КС/г отрубей. Далее проводили гидролиз при температуре 50°С и рН 5,5-6,0 в течение 1,5 часа. Выход РВ и растворимого белка увеличивается в 2 раза по сравнению с исходными значениями. На следующем этапе вносили ферментный препарат Нейтраза 0,8 L в количестве 0,5 ед. ПС/г отрубей и проводили гидролиз в течение 1,5 ч при тех же условиях. Остановку гидролиза проводят при 80±5°С в течение 10 минут. Далее суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Выход белка 80% от его исходного содержания в сырье.
Пример 2. Тритикалевые отруби с вымольных систем (сход сита 450 мкм) смешивали с водой при гидромодуле 1: 4, вносят ферментный препарат Вискоферм L в количестве 0,4 ед. ЦС/г отрубей. Далее проводили гидролиз при температуре 40°С и рН 3,5 в течение 1,5 часа. Выход РВ и растворимого белка увеличивается в 1,5 и 2,5 раза соответственно по сравнению с исходными значениями. На следующем этапе вносили ферментный препарат Дистицим Протацид Экстра в количестве 0,75 ед. ПС/г отрубей и проводили гидролиз в течение 1,5 ч при тех же условиях. Остановку гидролиза проводили при 80±5°С в течение 10 минут. Далее суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Выход белка 83% от его исходного содержания в сырье.
Дополнительно был проведен хроматографический анализ образцов по примерам 1 и 2 с целью выявления степени гидролиза. Для этого на колонку, заполненную гелем с Toyopearl gel HW-55 F наносили 5 мл супернатанта. Элюцию проводили дистиллированной водой. Объем собираемых фракций - 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм. В качестве контроля использовали водный экстракт тритикалевой муки, полученный при соотношении мука:вода 1:20. Полученные данные приведены в таблицы 1.
Таблица 1 - Распределение по молекулярной массе продуктов протеолиза белков тритикалевых отрубей с использованием МЭК
Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что значительную часть анализируемых белков составляют агломераты белков с молекулярной массой 700000÷350000. При ферментативной модификации их количество снижается примерно в 1,5 и 2,0 раза соответственно для МЭК-1 и МЭК-2. Фракция с молекулярной массой 100000÷50000 Да (IV пик) в образцах с модифицированными белками тритикалевых отрубей полностью отсутствует, хотя в контрольном варианте на ее долю приходится 13,26%. Также в варианте с использованием МЭК-2 отсутствует фракция пептидов с массой 25000÷1500 Да (VI пик). Обращает на себя внимание и резкое снижение количества низкомолекулярных белков и высокомолекулярных пептидов с массой 50000÷25000 Да примерно в 2-5 раз, а также средне- и низкомолекулярных пептидов с массой 25000÷1500 Да. Полученные данные свидетельствуют о высокой степени и глубине гидролиза белков тритикалеых отрубей с использованием композиций целлюлолитических и протеолитических ферментов. Так, доля низкомолекулярных азотистых соединений (≤1000) увеличилась в результате ферментативной модификации в 4-5 раз.
Таким образом методом гель-хроматографии показано, что при использовании МЭК1 (Шеарзим 500 L + Нейтраза 0,8 L) во всех гидролизатах преобладают высоко- и средне- молекулярные продукты протеолиза; а при использовании МЭК2 (Вискоферм 500 L + Дистицим Протацид Экстра) низкомолекулярные пептиды и аминокислоты. Модифицированные отруби, представляющие собой пасту, подсушивали при температуре 30-45°С, с конечной влажностью 10-12%.
Кроме того, дополнительно была проведена оценка образцов, полученных по примерам 1-2 по функционально-технологическим свойствам. В таблицах 2, 3 представлены значения водосвязывающей способности (ВВС); жиросвязывающей способности (ЖСС); жироэмульгирующей способности (ЖЭС); стабильности эмульсии (СЭ); пенообразующей способности (ПОС); стойкости пены (СП).
Таблица 2 - Функциональные свойства модифицированных тритикалевых отрубей
*) Контроль К 1 - отруби; Опыт 1 - отруби + МЭК1; Опыт 2 - отруби + МЭК2
Функциональные свойства отрубей из зерна тритикале и гидролизованных образцов, полученных с применением МЭК1 и МЭК2, отличаются между собой. Так, водосвязывающая способность гидролизованных отрубей в первом варианте увеличивается на 16%, в варианте 2 - наоборот снижается на 12,6% по отношению к негидролизованным тритикалевым отрубям. Аналогичная закономерность прослеживается для пенообразующей способности (опыт 1: увеличение на 18,0%; опыт 2: снижение на 16,1%). Жиросвязывающая и жироэмульгирующая в обоих опытных вариантах увеличивается на 13,6% и 6,1% и на 19,2% и 7,7% соответственно.
Стабильность эмульсии и пены модифицированных тритикалевых отрубей снижается: СЭ на 8,7%; СП на 12,5%) (опыт 1) и СЭ на 20,7%; СП на 25,0%) (опыт 2).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование МЭК на основе целлюлолитических и протеолитических ферментных препаратов позволяет проводить глубокую деструкцию белков продуктов переработки зерна тритикале; получать продукты с различной степенью гидролиза и соотношением компонентов по молекулярной массе, что приводит к изменению функциональных свойств исходной муки и позволит найти новые области ее применения в продуктах питания
По результатам, представленным в таблице 2, можно сделать вывод, что целенаправленный гидролиз ферментными препаратами целлюлолитического и протеолитического действия позволяет получить целевой продукт, обладающий характерными функционально-технологическими свойствами, улучшенными относительно исходных продуктов, обладающий повышенной биологической ценностью, без использования кислотных и щелочных реагентов.