Влияние фитолектинов на усвояемость микроэлементов в условиях in vivo

зитирующих в основном в мускулатуре морских рыб. К таким относятся многочисленные представители рода Kudoa, многие из которых поражают мускулатуру морских промысловых рыб. Миксоспо-ридии некоторых видов рода Kudoa способны вызывать разжижение мускулатуры рыб.

Паразитирующие у рыб миксоспоридии не способны развиваться у человека; ни они сами, ни измененные ими участки мускулатуры рыб для человека, насколько известно, никакой опасности не представляют. В отдельных случаях многочисленные цисты миксоспоридий могут портить товарный вид мяса рыбы. Если это не сопровождается разжижением мышечной ткани, то к таким цистам можно относиться как к безопасным посторонним включениям; решение вопроса о пищевой пригодности здесь целиком находится в сфере эстетики питания, так как какие-либо универсальные критерии допустимого количества цист предложить трудно [1, 4, 5].

Заключение. В результате проведенных исследований было установлено, что у обследованных нами салаки и скумбрии обнаружены 3 вида паразитов в разном количестве и сочетании. На поверхности внутренних органов салаки обнаружены личинки скребня Corynosoma strumosum, а в полости скумбрии обнаружены цисты миксоспоридий от единичных экземпляров до многочисленных, располагающихся тяжами. Также в полости скумбрии обнаружены личиночные стадии нематоды Anisakis simplex. Личинки скребня Corynosoma st. у салаки и нематоды Anisakis sp. у скумбрии были нежизнеспособны, поэтому опасности для здоровья человека не представляют.

ЛИТЕРАТУРА

1. Авдеева, Е. В. Ветеринарно-санитарная экспертиза рыб: уч. пособ. / Е. В. Авдеева - Нижний Новгород: Вектор-ТиС, 2007. - 104 с.

2. Авдеева, Е. В. Болезни морских рыб: уч. пособ. / Е. В. Авдеева, Т. Е. Буторина, Е. Б. Евдокимова. - Нижний Новгород: Вектор-ТиС, 2011. - 112 с.

3. Гаевская, А. В. Анизакидные нематоды и заболевания, вызываемые ими у животных и человека / А. В. Гаевская // Национальная академия наук Украины. Институт биологии южных морей им. А. О. Ковалевского. - Севастополь, 2005.- 223 с.

4. Гаевская, А. В. Паразиты и болезни морских и океанических рыб в природных и искусственных условиях / А. В. Гаевская. - Севастополь, 2004. - 236 с.

5. Грищенко, Л. И. Болезни рыб и основы рыбоводства / Л. И. Грищенко, Г. В. Васильева. - М.: Колос, 1999. - 456 с.

6. Ихтиопатология / Н. А. Головина, Ю. А. Стрелков, В. Н. Воронин [и др.]. - М.: Колос, 2010. - 511 с.

7. Методика паразитологического инспектирования морской рыбы и рыбной продукции (морская рыба сырец, рыба охлажденная и мороженая) / Ю. В. Курочкин, Л. И. Бисерова, В. Ю. Андреев [и др.]. // Инструкция по санитарно-паразитологической оценке рыбы и рыбной продукции. - М., 1989. - 41 с.

8. О порядке проведения ветерианрно-санитарной экспертизы рыбы и рыбной продукции. Постановление Министерства сельского хозяйства и продовольствия РБ от 27 апреля 2004 года № 30. - 35 с.

УДК 636:612.015.31

ВЛИЯНИЕ ФИТОЛЕКТИНОВ НА УСВОЯЕМОСТЬ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ

В УСЛОВИЯХ IN VIVO

Ю. К. КОВАЛЕНОК

УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»,

г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

Резюме. Установлено, что в условиях in vivo лектины кормов нарушают функционирование системы транспорта микроэлементов через апикальную мембрану энтероцитов, чем на 4,6 % снижают всасывание Co, на 11-12 % меди и цинка (Р<0,05), на 16,4 % - железа (Р<0,01), чтоможетявитъся одним из факторов развития гипомикроэлементозов у животных.

Ключевые слова: всасываемость микроэлементов, лектины кукурузы, эксперимент in vivo, крупный рогатый скот.

Summary. It has been established that in vivo feed lectins disturb the functioning of transport system of trace elements through apical membrane of enterocytes. The decrease in absorption of Co is 4,6 %, Cu and Zn - 11-12 % (P<0,05), Fe - 16,4 % (P<0,01), which can be one of the hypomicroelementosis developmentfactors in animals.

Key words: trace elements absorption, maize lectins, experiment in vivo, cattle.

Введение. Опыт изучения растений, использующихся для кормления животных, показывает, что корма в своем составе часто содержат вещества, именуемые как антипитательные - не выполняющие в организме никаких продуктивных функций и препятствующие оптимальному обмену веществ, спо-

собные привести к развитию различных болезней, главным образом обменного типа [1-7].

Исследованиями многих ученых сформирован определенный научный задел [1, 4, 7] в части формирования представлений о последствиях для животных высоких доз антипитательных веществ в растительных кормах.

Анализ источников стран Европейского Союза, США, Японии и др. показывает, что внимание ученых, занимающихся проблемами наличия антипитательных веществ в кормах, привлекает особая группа белков - лектинов. Вместе с тем работ, указывающих на возможную этиологическую роль лектинов в возникновении болезней, сравнительно немного, они главным образом сопряжены с медицинскими исследованиями и в основном зарубежного типа [8-15, 17, 18]. Возможная причинная роль соединений данного класса в возникновении болезней животных в современной литературе представлена весьма ограниченно [17, 18]. Собственные и литературные [1-3, 12, 17] данные указывают на широкое распространение и активность лектинов в кормах, используемых в современных условиях промышленного скотоводства Беларуси. Принимая во внимание наличие коррелятивных зави-симостей (г=0,5-0,8) между активностью лектинов в кормах и широтой распространения микроэлемен-тозов крупного рогатого скота научно и производственно значимым представляется изучение влияния соединений данного класса на всасывание минеральных веществ кишкой животных.

В серии предыдущих исследований [1, 3] нами установлено, что в условиях in vitro лектины избирательно, статистически значимо снижают всасываемость микроэлементов кишкой крупного рогатого скота, при этом гистохимически установлено выраженное взаимодействие эпителия тощей кишки бычков с лектинами кукурузы. Вместе с тем эффекты лектинов, установленные в модельных экспериментах, могут различаться с таковыми в условиях организма.

Цель работы - определить этиологическую роль лектинов в возникновении микроэлементозов у животных в условиях in vivo.

Материал и методика исследований. Исследования, положенные в основу настоящей работы, выполнены в УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» при техническом сотрудничестве РУП «Научно-практический центр НАЛ Беларуси по земледелию» (Республика Беларусь).

Методологию работы определили подходы системного анализа, сравнений и аналогий, обобщений, натурного наблюдения, экспертных оценок и др.

В данном кластере исследований мы усложнили опытную модель в сравнении с [1, 3], для чего провели изучение влияния лектинов на живых объектах - крысах, получавших с кормом выделенный нами из кукурузного силоса лектин, меченный пероксидазой хрена. Исследования выполнены на 78 разнополых беспородных лабораторных крысах в возрасте 5-6 месяцев постнатального развития. Масса крыс к началу эксперимента составила в среднем 220-250 г. Опыты выполнены в 2-кратной повторности.

Уход и содержание экспериментальных животных были стандартными и соответствовали требованиям СНИП для вивариев НИИ. Крысята выращивались в условиях вивария УО ВГАВМ в контролируемых условиях: 12-часовой период освещения, комнатная температура - 20±2 °С, влажность -50-70 %. Рацион и режим кормления стандартизированы, исходя из соответствующих рекомендаций и приказов, что определило нормальный биологический фон. При планировании опытов мы руководствовались правилами проведения работ с экспериментальными животными, предусматривающими соблюдение основных биоэтических принципов.

В исследованиях использованы растворы меди, цинка и кобальта сульфатов, железа лактата в расчетных профилактических дозах, а также модельный лектин в дозе 50 мг/кг (доза для приготовления срезов в гистохимии), а в дозе 600 мг/кг - расчетное количество лектина, в норме попадающее в организм крупного рогатого скота с кормом.

Серия экспериментов проводилась по схеме, состоящей из четырех опытов (с каждым из испытуемых элементов - Cu, Zn, Co и Fe) продолжительностью 7 суток. В рамках каждого опыта формировалось 6 групп лабораторных крыс: № 1 служила контролем - животные данных групп употребляли стандартный рацион (CP); № 2 - CP + соответствующий опыту элемент; № 3 - тоже, что ив№ 2 + лектин (6 суток лиофилизированный белок солевой вытяжки из кукурузного силоса, а в 7 день -только меченый пероксидазой хрена лектин) в дозе 50 мг/кг корма; № 4 - тоже, что и в № 2 + лектин в дозе 600 мг/кг корма; № 5 - тоже, что и в № 3 + N-ацетил-О-глюкозоамин; № 6 - тоже, что и в № 4 + N-ацетил-В-глюкозоамин.

В начале и конце эксперимента проводилось взятие крови для определения концентрации соответствующего опыту элемента. Из эксперимента все животные выводились путем эвтаназии после получения эфирного наркоза. Производилось вскрытие, и путем анатомического препарирования выде-

лялся участок тощей кишки для гистологического и ИСП-МС исследований.

Биометрический анализ полученных данных выполнен с помощью статистических пакетов SAS 9.2, STATISTICA 9 и SPSS-19.

Результаты исследований и их обсуждение. Усложнение модели построения опытов с использованием в качестве объекта исследований лабораторного животного (крысы) показало (таблица), что выявленные in vitro закономерности нарушения транспорта микроэлементов [1, 13] сохраняются и в условиях живого биологического объекта, однако выраженность этих реакций существенно ниже таковой, полученной в ходе реализации предыдущего кластера исследований.

Концентрация микроэлементов в крови крыс в начале и конце экспериментов с наличием в диете лектинов

Содержание элементов в крови, мг/кг Группы животных

1 2 3 4 5 6

Опыт № 1

В начале эксперимента 1,11±0,093 0,98±0,107 1,07±0,097 1,13±0,106 1,05±0,101 1,10±0,105

В конце эксперимента 1,12±0,130 1,13±0,123 0,952±0,112 0,944±0,062* 0,987±0,1217 0,990±0,066*

Опыт № 2

В начале эксперимента 4,92±0,340 5,14±0,498 5,03±0,506 4,83±0,446 5,11±0,432 5,26±0,429

В конце эксперимента 5,17±0,412 5,71±0,470 4,68±0,577 4,25±0,488 5,16±0,407 5,0±0,606

Опыт № 3

В начале эксперимента 0,0205±0,0017 0,0209±0,0021 0,020±0,0018 0,0196±0,0018 0,0202±0,0017 0,0194±0,0019

В конце эксперимента 0,0199±0,002 0,0219±0,002 0,0196±0,002 0,0187±0,002 0,0208±0,002 0,0190±0,001

Опыт № 4

В начале эксперимента 455±47,0 449±37,4 435±40,6 421±35,9 441±40,7 425±37,7

В конце эксперимента 469±54,6 489±40,1 400±32,1 373±34,1** 428±35,8 402±46,9

Примечание: *Р<0,05.

Так, полученные данные демонстрируют, что в первой группе крыс, получавших основной рацион без введения в него тех или иных микроэлементов, значимых изменений микроэлементного профиля крови не происходило, что логично демонстрирует стабильность внешних условий проведения эксперимента. Достаточно предсказуемы полученные результаты исследования крови грызунов второй группы - у этих животных введение солей испытуемых элементов повлекло 4,8-15,3 % увеличение концентрации испытуемых веществ. Надо отметить, что данный рост веществ в сравнении с исходным уровнем отмечался на уровне тенденций.

Введение же в состав рационов крыс выделенного нами лектина кукурузы повлекло уменьшение всасываемости микроэлементов из состава рациона. Обращает на себя внимание также и тот факт, что эффект уменьшения всасываемости зависит от дозы. Так, в 3-й опытной группе животных наличие лектинов в дозе 50 мг/кг корма практически не оказало значимого действия на усвояемость Со, несколько больше («7 %) отразившись на уровне кишечного поглощения 2п.

Вместе с тем уменьшение (в сравнении с исходными величинами) всасываемости меди и цинка составило 8-11 %. Наличие в составе рационов крыс 4 группы выделенных лектинов по их относительному уровню, соответствующему таковому в рационах бычков, опять-таки мало отразилась на показателях крови крыс по уровню кобальта в ней (-4,6 %), уменьшение всасываемости цинка констатировано на 12 %, а вот снижение всасываемости меди и железа (Р<0,05) варьировало в относительно близком по уровню диапазоне 11,3-16,4 %.

Необходимо отметить, что присутствие в составе рациона лектинспецифического углевода (группы № 5 и 6) уменьшает обсуждаемый негативный эффект фитолектинов. Более того интересен и тот выявленный факт, что наличие в диете крыс группы №6 К-ацетил-О-глюкозоамина повышает всасываемость цинка, меди и железа на 6-7 %.

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что исходя из известного научного факта о связывании лектинами Сахаров - вне зависимости от того, это свободный сахар или связанный (в случае экспериментов, проводившихся нами, - входящий в состав гликокаликса энтероцитов) - допустим вывод о том, что связывание лектина с сахарами энетероцитов является обязательным условием нарушения транспорта. Это подтверждается частичным восстановлением транспортных функций при предварительной инкубации лектина с сахарами (К-ацетил-О-глюкозоамином), хотя это и справедливо не для всех микроэлементов - весьма незначительный эффект сахара имели на кобальт, что объясняется специфическими функциями и механизмами всасываемости данного элемента в организме.

Констатированное нами в исследованиях уменьшение удельного влияния на всасываемость элементов от опытов in vitro [1, 13] к таковым in vivo, на наш взгляд, сопряжено с ферментативным воздействием на лектины в желудке. Вместе с тем полного переваривания белков обсуждаемого типа, как показывают наши исследования, не происходило. Эти результаты согласуются с данными, указывающими, что многие лектины имеют максимальную активность при низких рН [19], что позволяет им сохранить активность на уровне тонкого и даже толстого кишечника животных.

Справедливое для некоторых элементов взаимодействие с лектинами, когда для активации центра связывания сахара необходимо связывание 2-валентного металла, чаще всего в их роли выступают Са2+ и Mn2+, хотя и показана возможность связвания Zn2+ и Со2+ [16], наши данные (in vitro и in vivo) показывают, что если такое связывание и имеет место, то оно весьма незначительно.

Имеющиеся в литературе данные об образовании полимерных комплексов, образованных многими молекулами лектина и закрепленных на гликокаликсе, что данные комплексы участвуют в связывании ионов железа, не нашли подтверждения в наших исследованиях, что согласуется с результатами наблюдений других исследователей [9, 15], указывающих на такой низкий уровень данного связывания, что его нельзя считать значимым.

Заключение. В условиях in vivo лектины кормов нарушают функционирование системы транспорта микроэлементов через апикальную мембрану энтероцитов, чем на 4,6 % снижают всасывание Co, на 11-12 % меди и цинка (Р<0,05), на 16,4 % - железа (Р<0,01), что может явиться одним из факторов развития гипомикроэлементозов у животных.

ЛИТЕРАТУРА

1. Коваленок, Ю. К. Антипитательные вещества как причина микроэлементозов крупного рогатого скота / Ю. К. Ко-валенок // Механизмы и закономерности индивидуального развития организма млекопитающих: сб. ст. Междунар. науч.-практ. конф., посвященной памяти заслуженного деятеля науки РФ, доктора вет. наук, проф. Э. Ф. Ложкина: в 2 т. / под ред. Н. Ю. Парамоновой, Л. П. Соловьевой. - Караваево: Костромская ГСХА, 2013. - Т. 2: Ветеринарная патология и экология млекопитающих. - С. 47-54.

2. Коваленок, Ю. К. Микроэлементозы крупного рогатого скота и свиней в Республике Беларусь: монография / Ю. К. Коваленок. - Витебск: ВГАВМ, 2013. - 196 с.

3. Коваленок, Ю. К. Взаимодействие фитолектинов с мембранами энтероцитов тощей кишки как этиологический фактор гипомикроэлементозов / Ю. К. Коваленок // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства: сб. науч. трудов / гл. редактор А. П. Курдеко. - Горки: БГСХА, 2013. - Вып. 16. - Ч. 2. - С. 348-354.

4. Кучин с кий, М. П. Биоэлементы - фактор здоровья и продуктивности животных: монография / М. П. Кучинский. -Минск: Бизнесофсет, 2007. - 372 с.

5. Луцик, А. Д. Лектины: биологические свойства и применение в иммунологии / А. Д. Луцик // Биохимия человека и животных. - 1985. - Вып. 9. - С. 63-76.

6. Обмен микроэлементов и микроэлементозы животных: монография / А. П. Курдеко [и др.]. - Горки: БГСХА, 2009. - 139 с.

7. Пономаренко, Ю. А. Питательные и антипитательные вещества в кормах: монография / Ю. А. Пономаренко; Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь. - Минск: Экоперспектива, 2007. - 948 с.

8. Bunzel, M. Chemical Characterization of Klason Lignin Preparations from Plant-Based Foods / M. Bunzel, A. SchuBler, G. Tchetseubu Saha // J Agric Food Chem. - 2011. - Dec 14;59(23). - P. 12506-12513.

9. Effects of denaturation and amino acid modification on fluorescence spectrum and hemagglutinating activity of Hericium eri-naceum Lectin / M. Gong [et al.] // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). - 2004. - Vol. 36, part 5. - P. 343-350.

10. Goldstein, I. J. Isolation, physicochemical characterization, and carbohydrate-binding specificity of lectins / I. J. Goldstein, R. D. Porez // The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine / I. E. Liener, N. Sharon, I. J. Goldstein. -Orlando: Academic Press, 1986. - P. 33-243.

11. Higuchi, M. Growth inhibition and small intestinal lesions in rats after feeding with isolated winged bean lectin / M. Higu-chi, I. Tsuchiya, K. Iwai // Agrie. Biol. Chem. - 1984. - Vol. 48. - № 3. - P. 695-701.

12. Lectin-mediated drug delivery: influence of mucin on cytoadhesion of plant lectins in vitro / M. Wirth [et al.] // J. Control Release. - 2002. - Vol. 79, issues 1/3. - P. 183-191.

13. Lorenzsonn, V. In vivo responses of rat intestinal epithelium to intraluminal dietary lectins / V. A. Lorenzsonn, W. A. Olsen // Gastroenterology. - 1982. - Vol. 82 (5 Pt 1). - P. 838-848.

14. Maize -Glucosidase-aggregating Factor Is a Polyspecific Jacalin-related Chimeric Lectin, and Its Lectin Domain Is Responsible for -Glucosidase Aggregation / Farooqahmed S. Kittur [et al.] // Journal of biological chemistry. - 2007. - Vol. 282. - № 10. - P. 7299-7311.

15. Oliveira, A. C. Lesions of intestinal epithelium by ingestion of bean lectins in rats / A. C. Oliveira, B. C. Vidal, V. C. Sgarbier // J. Nutr. Sci. Vitaminol. - 1989. - Vol. 35. - № 4. - P. 315-322.

16. Sequential Structural Changes upon Zinc and Calcium Binding to Metal-free Concanavalin A / Julie Bouckaert [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. - 1996. - Vol. 271. - № 27, issue of July 5. - P. 16144-16150.

17. Soybean protein isolate and soybean lectin inhibit iron absorption in rats / Hisayasu Sanae [et al.] // J. Nutr. - 1992. -Vol. 122. - P. 1190-1196.

18. The interaction between plant lectins and the small intestinal epithelium: a primary cause of intestinal disturbance / M. J. Kik [et al.] // Vet Q. - 1989. - Apr;11(2). - P. 108-115.

19. Toshihiko, U. Receptor-mediated interaction of ricin with the lipid bilayer of ganglioside GM1-liposomes / U. Toshihiko, A. Yasuo, F. Gunki // FEBS Letters. - 1987. - Vol. 216, issue 1. - P. 99-103.