СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ ТОКСИНОВ ПОСРЕДСТВОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР С ПОСЛЕДУЮЩИМ СЕКВЕНИРОВАНИЕМ

1. Способ создания мультиплексной панели для выявления генов токсинов микроорганизмов:
Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum и Clostridium tetani - в исследуемых образцах посредством мультиплексной ПЦР с целью таргетного обогащения образца целевыми последовательностями для последующего секвенирования следующего поколения, основанной на выборе олигонуклеотидов для таргетной амплификации по следующим критериям:
длина олигонуклеотидов должна быть не менее 17 нуклеотидов;
размер амплифицируемых фрагментов: от 200 до 600 нуклеотидов;
праймеры не должны образовывать димеры и вторичные структуры;
праймеры на разные мишени не должны образовывать димеров и должны быть собраны в мультиплексную панель.
2. Способ выявления генов токсинов микроорганизмов на основании мультиплексной панели по п. 1, отличающийся тем, выполняют разработку на основании критериев по п. 1 олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена дифтерийного токсина (Diphtheria toxin), получены праймеры - DiphtoxF1 TGGTGCTCTTTCGATACTTCC и DiphtoxR1 CGAATCTTCAACAGTGTTCC с длиною фрагмента 309 н.п., затем выполнили разработку олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена стрептококкового токсина группы A (Exotoxin type А speA), получены праймеры SpeAF - TACGGAGGGGTAACAAATCAT и SpeAR - GTTGTTAGGTAGACTTCAATTTG с длиною фрагмента 361 н.п., выполнили разработку олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы A (Cholera enterotoxin subunit А), получены праймеры CtxA-F GACCTCCTGATGAAATAAAGCA и CtxA-R TCTCTGTAGCCCCTATTACGAT с длиною фрагмента 408 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы В (Cholera enterotoxin subunit В), получены праймеры CtxB-F CAGTTTTACTATCTTCAGCATATG и CtxB-R TTAATTTGCCATACTAATTGCGG, с длиною фрагмента 347 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа A (Botulinum neurotoxin type А), получены праймеры BotntA-F TATCAACTTCAAGTGACTCCT и BotntA-R CACCAGAAGCAAAACAAGTTC, с длиною фрагмента 425 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа В (Botulinum neurotoxin type В), получены праймеры BotntB-F AAGAGGGAATGTATAAGGCT и BotntB-R ACCTTTGCCCCATATCCTGA, с длиною фрагмента 507 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа С1 (Botulinum neurotoxin type С1), получены праймеры - BotntC-F1 AATCTCGGAAGCAATGAATAATA и BotntC-R1 CTCACTTCTGCGTTATATCCTGAT, с длиною фрагмента 369 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа D (Botulinum neurotoxin type D), получены праймеры BotntD-F CTTAGTTCAGAAAGTGTAGTAGAT и BotntD-R TGCTATAACCTAATGCTTCTTCA, с длиною фрагмента 468 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа E (Botulinum neurotoxin type E), получен праймер BotntE-F TATAATGGGAGCAGAGCCTG и BotntE-R CCGCTAGCATCTTTATCTAATCCAT, с длиною фрагмента 497 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа F (Botulinum neurotoxin type F), получены праймеры BotntF-F TATAATGGGAGCAGAGCCTG и BotntF-R TTTTCGGCTATCATAAGAGGT, с длиною фрагмента 326 н.п., разработаны олигонуклеотиды для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа G (Botulinum neurotoxin type G), получены праймеры BotntG-F1 GACCAGGACCAGTTCTAAGT и BotntG-R GTACAGGATCGCTATGTTGC, с длиною фрагмента 339 н.п., разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена столбнячного токсина (Tetanus toxin (ТхТ)), получены праймеры Cltxt-FTTATTTGTCTAACTTCTCCCGC и Cltxt-R GTAATAACATATCCAGATGCTCA, с длиною фрагмента 325 н.п., далее, с помощью выбранных олигонуклеотидов были амплифицированы соответствующие участки генома микроорганизмов - Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum и Clostridium tetani, после чего полученные фрагменты используют для создания плазмид, которые используют как положительные контрольные образцы для определения генов токсинов в исследуемых образцах.