СПОСОБ ОТБОРА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОПРЯЖЕННЫХ С G-БЕЛКОМ РЕЦЕПТОРОВ

1. Способ определения, является ли кандидатное соединение агонистом G-белоксопряженного рецептора (GPCR) пролонгированного действия, включающий:
(а) контактирование GPCR с соединением, причем GPCR находится в RG форме;
(б) количественное определение (измерение) аффинности соединения к RG форме GPCR;
0
(в) контактирование GPCR с соединением, причем GPCR находится в R форме; и
0
0
(г) количественное определение (измерение) аффинности соединения к R форме GPCR, причем соединение, которое (i) обладает аффинностью к RG форме GPCR, составляющей по меньшей мере 10% от аффинности эндогенного агониста к GPCR, и (ii) обладает более высокой аффинностью к R форме GPCR, чем эндогенный агонист, идентифицируется как агонист пролонгированного действия GPCR.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадии:
(д) введение кандидатного соединения животному, и
(е) количественное определение (измерение) по меньшей мере одной физиологической реакции (ответа, отклика) животного на соединение.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что рецептор представляет собой человеческий рецептор.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что GPCR представляет собой рецептор семейства секретинов.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что рецептор представляет собой РТН/PTHrP рецептор.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что РТН/PTHrP рецептор представляет собой человеческий РТН/PTHrP рецептор.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что стадию количественного определения (б) проводят, измеряя уровни кальция внутри клетки или в крови.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию количественного определения (б) или стадию (г) проводят, используя анализ конкурентного связывания.
0
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в анализе конкурентного связывания используют лиганд, специфический к RG форме или специфический к R форме GPCR.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию количественного определения (б) проводят, используя замедленный анализ цАМФ.
0
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что R форму GPCR обогащают, используя негидролизуемый нуклеотидный аналог.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что нуклеотидный аналог представляет собой GTPγS.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что RG форму GPCR обогащают, используя доминантно-негативный G-белок.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что рецептор находится на клетке или в мембране.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что кандидатное соединение содержит пептид.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что кандидатное соединение является соединением из библиотеки, полученной химическим синтезом (химической библиотеки), или из библиотеки природных продуктов.
17. Способ определения, является ли кандидатное соединение агонистом G-белоксопряженного рецептора (GPCR) кратковременного действия, включающий:
(а) контактирование GPCR с соединением, причем GPCR находится в RG форме;
(б) количественное определение (измерение) аффинности соединения к RG форме GPCR;
0
(в) контактирование GPCR с соединением, причем GPCR находится в R форме; и
0
0
(г) количественное определение (измерение) аффинности соединения к R форме GPCR, причем соединение, которое (i) обладает аффинностью к RG форме GPCR, составляющей по меньшей мере 10% от аффинности эндогенного агониста к GPCR, и (ii) обладает более низкой аффинностью к R форме GPCR, чем эндогенный агонист, идентифицируется как агонист кратковременного действия GPCR.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что рецептор представляет собой человеческий рецептор.
19. Способ по п.17, дополнительно включающий стадии:
(д) введение кандидатного соединения животному, и
(е) количественное определение (измерение) по меньшей мере одного физиологического отклика животного на соединение.
20. Способ по п.16, отличающийся тем, что GPCR представляет собой рецептор семейства секретинов.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что рецептор представляет собой РТН/PTHrP рецептор.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что РТН/PTHrP рецептор представляет собой человеческий рецептор.
23. Способ по п.21, отличающийся тем, что стадию количественного определения (б) проводят, измеряя уровни кальция внутри клетки или в крови.
24. Способ по п.17, отличающийся тем, что стадию количественного определения (б) или стадию (г) проводят, используя анализ конкурентного связывания.
0
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что в анализе конкурентного связывания используют лиганд, специфический к RG форме или специфический к R форме GPCR.
26. Способ по п.17, отличающийся тем, что стадию количественного определения (б) проводят, используя замедленный анализ цАМФ.
0
27. Способ по п.17, отличающийся тем, что R форму GPCR обогащают, используя негидролизуемый нуклеотидный аналог.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что нуклеотидный аналог представляет собой GTPγS.
29. Способ по п.17, отличающийся тем, что RG форму GPCR обогащают, используя доминантно-негативный G-белок.
30. Способ по п.17, отличающийся тем, что рецептор находится на клетке или в мембране.
31. Способ по п.17, отличающийся тем, что кандидатное соединение содержит пептид.
32. Способ по п.17, отличающийся тем, что кандидатное соединение является соединением из библиотеки, полученной химическим синтезом, или из библиотеки природных продуктов.
0
33. Полипептид, обладающий аффинностью к РТН RG и низкой аффинностью к РТН R.
34. Полипептид по п.33, имеющий аминокислотную последовательность, модифицированную с помощью замены, делеции и/или добавления одной или более аминокислот по сравнению с дикого типа последовательностью РТН или PTHrP.
35. Полипептид по п.34, отличающийся тем, что аминокислота содержит гистидин в положении 5 или аланин в положении 23.
23
5
5
36. Полипептид по п.33, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с дикого типа последовательностью в пептидах, представленных следующими формулами AlaPTH, His-PTH и His-PTHrP, или его фрагмент.
37. Полипептид по п.34, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность обладает пониженной аффинностью к аминоконцевому внеклеточному домену PTHrP по сравнению с дикого типа РТН.
38. Полипептид по п.37, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из аланина в положении 20, аланина в положении 23, аланина в положении 24 и аланина в положении 28 последовательности РТН или PTHR.
39. Полипептид по п.33, выбранный из группы, состоящей из любых полипептидов, идентифицированных в таблице на фигуре 26В как RG-селективные.
40. Полипептид по п.34 или 37, содержащий аминокислотную последовательность:
X1-Val-X2-Glu-His-Gln-Lys-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7,
где
X1 обозначает Ser, Ala, Gly или Aib;
Х2 обозначает Ser, Ala или Aib;
Х3 обозначает Ala, Asn, Glu, Val, Asp или Gln;
X4 обозначает Leu, Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg или Har;
X5 обозначает Gly, His, Arg, Ala или Aib;
X6 обозначает Lys, Gln, Leu, His, Trp, Ala, Arg или Aib; и
X7 обозначает His, Arg, Leu, Phe, Trp или Aib,
или его фрагмент, содержащий аминокислоты 1-10, 1-11, 1-12 или 1-13,
или его фармацевтически приемлемая соль.
41. Полипептид по п.40, отличающийся тем, что полипептид имеет аминокислотную последовательность длиной менее 20 аминокислот.
42. Полипептид по п.41, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность имеет длину от 10 до 14 аминокислот.
43. Полипептид по п.40, состоящий практически из указанной аминокислотной последовательности, или его фрагмент.
44. Полипептид по п.43, состоящий из указанной аминокислотной последовательности, или его фрагмент.
45. Полипептид по п.33, содержащий аминокислотную последовательность:
X1-Val-X2-Glu-X3-Gln-Leu-Met-His-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-X9-Val-Glu-X10-X11-Arg-Lys-Lys-X12,
где
X1 обозначает Ser, Ala или Aib;
X2 обозначает Ser, Ala, или Aib;
Х3 обозначает Ile или His;
X4 обозначает Asn, Glu, Val, Asp или Gln;
X5 обозначает Leu, Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys, Arg или Har;
X6 обозначает Gly, His, Arg или Ala;
X7 обозначает Lys, Gln, Leu, Trp, Ala или Arg;
X8 обозначает His, Arg, Leu, Phe или Trp;
X9 обозначает Arg или Ala;
X10 обозначает Trp, Phe или Ala;
X11 обозначает Leu или Ala; и
X12 обозначает Leu или Ala;
его фрагмент, содержащий аминокислоты 1-24, 1-25, 1-26 или 1-27 указанной аминокислотной последовательности, или его фармацевтически приемлемая соль, причем аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из His в положении Х3, Ala в положении X9, Ala в положении X10, Ala в положении X11 и Ala в положении Х12.
46. Полипептид по п.45, отличающийся тем, он имеет длину менее 50 аминокислот.
47. Полипептид по п.46, отличающийся тем, что он имеет длину 24-28 аминокислот.
48. Полипептид по п.45, состоящий практически из указанной аминокислотной последовательности, или его фрагмент.
49. Полипептид по п.48, состоящий из указанной аминокислотной последовательности, или его фрагмент.
50. Полипептид по пп.45-49, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из аминокислот Х9, X10, X11 или X12 представляет собой аланин.
51. Композиция, содержащая полипептид по пп.33-50 и фармацевтически приемлемый носитель.
52. Способ лечения остеопороза у субъекта, заключающийся во введении полипептида или композиции по любому из пп.33-51 нуждающемуся в этом субъекту в количестве, достаточном для лечения остеопороза.
53. Способ лечения перелома, остеомаляции, артрита, тромбоцитопении, гипопаратиреодизма или гиперфосфатемии или повышения мобилизации стволовых клеток у субъекта, заключающийся во введении полипептида по любому из пп.33-51 субъекту в количестве, достаточном для лечения указанного заболевания или для повышения мобилизации стволовых клеток.
54. Способ по п.52 или 53, отличающийся тем, что путь введения выбирают из группы, состоящей из подкожного, внутривенного, интраназального, чрезлегочного, трансдермального и перорального пути введения.
0
55. Полипептид, который связывает РТН рецептор и обладает высокой аффинностью к R форме РТH рецептора.
56. Полипептид по п.55, отличающийся тем, что он имеет аминокислотную последовательность, модифицированную с помощью замены, делеции и/или добавления одной или более аминокислот по сравнению с дикого типа последовательностью РТН или PTHrP.
50
1
3
1
3
5
57. Полипептид по п.55, отличающийся тем, что он выбран из группы, состоящей из пептидов на фигуре 26В, имеющих величину IC ниже 7,9 нМ, Ala, Aib[M]PTH(1-28), Ala, Aib[M]PTH(1-34) и I-hPTHrP(1-36) (#1208).
58. Полипептид по п.55, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность обладает более высокой аффинностью к аминоконцевому внеклеточному домену PTHR по сравнению с РТН.
59. Полипептид по п.55 или 58, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность содержит аргинин в положении 19 или изолейцин в положении 5.
60. Полипептид по п.55, отличающийся тем, что он содержит аминокислотную последовательность формулы:
X1-Val-X2-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7-Leu-Asn-Ser-Met-Arg-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu,
где
X1 обозначает Ser, Ala или Aib;
Х2 обозначает Ser, Ala или Aib;
Х3 обозначает Asn, Glu, Val, Asp или Gln;
X4 обозначает Leu, Val, Ala, Trp, Ile, Met, Lys или Arg;
X5 обозначает Gly, His, Arg или Ala;
X6 обозначает Lys, Gin, Leu, His, Trp, Ala или Arg; и
X7 обозначает His, Arg, Leu, Phe или Trp,
или его фрагмент, содержащий аминокислоты 1-24, 1-25, 1-26 или 1-27 указанной аминокислотной последовательности, или его фармацевтически приемлемая соль.
61. Полипептид по п.60, отличающийся тем, что он имеет длину менее 50 аминокислот.
62. Полипептид по п.61, отличающийся тем, что он имеет длину 24-28 аминокислот.
63. Полипептид по п.60, отличающийся тем, что он состоит практически из указанной аминокислотной последовательности, или его фрагмент.
64. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по пп.60-63 и фармацевтически приемлемый носитель.
65. Способ лечения заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из гипопаратиреодизма, гиперфосфатемии, опухолевого кальциноза и остеопороза у субъекта, включающий введение полипептида по любому из пп.55-57 нуждающемуся в этом субъекту в количестве, достаточном для лечения данного заболевания или состояния.
66. Способ лечения субъекта, нуждающегося в репарации перелома, или больного остеомаляцией, артритом, тромбоцитопенией, или нуждающегося в мобилизации стволовых клеток, заключающийся во введении полипептида по любому из пп.55-57 субъекту в количестве, достаточном для репарации перелома, для лечения указанного заболевания или для мобилизации стволовых клеток.
67. Способ по п.65 или 66, отличающийся тем, что путь введения выбирают из группы, состоящей из подкожного, внутривенного, интраназального, чрезлегочного, трансдермального и перорального пути введения.
68. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность формулы:
Ala-Val-Ser-Glu-His-Glu-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-X1-Arg-Arg-Arg-X2-Phe-Leu-X3-X4-Leu-Ile-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Glu-Ile,
где
X1 обозначает Leu, Ala, Ser, Met, Phe или Glu;
X2 обозначает Phe, Ala, Ser, Leu, Asn, Trp, Glu или Lys;
Х3 обозначает His, Leu, Arg, Lys, Trp, Ile или Phe;
X4 обозначает His, Ala, Ser, Asn, Lys или Arg;
X5 обозначает Ala, Gly, Ser, Asn, Gln, Trp, Glu или Lys;
X6 обозначает Glu, Gly, Ser, Leu, Asn, Asp, Lys или Ala;
X7 обозначает Ile, Leu, Val, Lys или Ala;
X8 обозначает His или Ala;
X9 обозначает Thr, Asn или Ala; и
X10 обозначает Ala или Phe,
или его фрагмент, содержащий аминокислоты 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-29, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34 или 1-35 указанной аминокислотной последовательности, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с соответствующей дикого типа PTHrP последовательностью или ее фрагментом; или его фармацевтически приемлемая соль.
69. Полипептид по п.68, отличающийся тем, что он имеет в длину менее 50 аминокислот.
70. Полипептид по п.69, отличающийся тем, что он или его фрагмент имеет в длину 28-36 аминокислот.
71. Полипептид по п.68, отличающийся тем, что он имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из:
X1 обозначает Ala или Glu;
Х2 обозначает Ala;
Х3 обозначает Leu; и
Х4 обозначает Lys.
72. Полипептид по п.68, отличающийся тем, что он содержит аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1.
18
22
25
26
18
22
25
26
73. Полипептид по п.71 или 72, отличающийся тем, что он содержит аминокислотную последовательность [Ala, Ala, Leu, Lys]-PTHrP(1-28) или [Glu, Ala, Leu, Lys]-PTHrP(1-28).
18
22
25
26
18
22
25
26
74. Полипептид по п.73, отличающийся тем, что он состоит из аминокислотной последовательности [Ala, Ala, Leu, Lys]-PTHrP(1-28) или [Glu, Ala, Leu, Lys]-PTHrP(1-28).
75. Полипептид по п.68, отличающийся тем, что он содержит гидроксильную группу на С-конце или амидирован по С-концу.
76. Полипептид по п.68, отличающийся тем, что он состоит практически из указанной аминокислотной последовательности или ее фрагмента.
0
77. Полипептид по п.68, отличающийся тем, что он является RG селективным или обладает низкой аффинностью связывания с R формой РТН рецептора.
78. Фармацевтическая композиция, содержащая любой из полипептидов по пп.68-77 и фармацевтически приемлемый носитель.
79. Способ лечения остеопороза у субъекта, заключающийся во введении полипептида или композиции по любому из пп.68-78 нуждающемуся в этом субъекту в количестве, достаточном для лечения остеопороза.
80. Способ лечения перелома, остеомаляции, артрита, тромбоцитопении, гипопаратиреодизма или гиперфосфатемии или повышения мобилизации стволовых клеток у субъекта, заключающийся во введении полипептида по любому из пп.68-78 субъекту в количестве, достаточном для лечения указанного заболевания или для повышения мобилизации стволовых клеток.
81. Способ по п.79 или 80, отличающийся тем, что путь введения выбирают из группы, состоящей из подкожного, внутривенного, интраназального, чрезлегочного, трансдермального и перорального пути введения.
82. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп.33-50, 55-63 и 68-77.
83. Нуклеиновая кислота по п.82, функционально связанная с промотором.
84. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.83.
85. Клетка, содержащая вектор по п.84.
86. Способ получения полипептида, заключающийся в выращивании клетки по п.85 в условиях, в которых полипептид экспрессируется.