НАБОР АНТИГЕНОВ ДЛЯ РАЗДЕЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К СТРУКТУРНЫМ И НЕСТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА ГЕПАТИТА С
ANTIGEN SET FOR SEPARATE DETECTION OF ANTIBODIES TO STRUCTURAL AND NON-STRUCTURAL PROTEINS OF HEPATITIS C VIRUS

Область техники
Изобретение относится к диагностическим средствам медицинского назначения, применяемым в диагностических лабораториях и банках крови с целью выявления антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита C, направленного на определение ложноположительных результатов твердофазного иммуноферментного анализа в ходе первичного скрининга на наличие антител к вирусу гепатита C.
Уровень техники
Для раздельного выявления антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита C (ВГС) применяются в качестве подтверждающих следующие тест-системы: CHIRON RIBA HCV 3.0 (Chiron Corporation, USA), Deciscan anti-HCV (Bio Rad), INNO-LIA HCV Ab III update (Innogenetics).
Все указанные выше тест-системы выполнены в формате иммуноблота. Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются набор антигенов для определения антител к вирусу гепатита C «ДС-НСV-Антигены», разработанный ООО НПО «Диагностические системы» (патент RU 2262704 C1), и тест-система фирмы Innogenetics. В состав последней тест-системы, согласно Cramp ME Hepatitis C virus (HCV) specific immune responses in anti-HCV positive patients without hepatitis C viraemia. Gut. 1999 Mar; 44 (3): 424-9, в качестве антигенов включены следующие компоненты.
Синтетические пептиды:
- Core: аминокислоты 1-32 и 31-74
- NS4: аминокислоты 1696-1944 и 1916-1944
- NS5: аминокислоты 2263-2318
- Е2: аминокислоты 386-409
Рекомбинантный белок:
- NS3: аминокислоты 1188-1465
Как и в настоящем изобретении, в последовательностях, представляющих белки Core и NS3, представлены иммуногенные детерминанты, являющиеся общими для всех генотипов вируса гепатита C. Однако последовательности, представляющие белок NS4, не содержат иммуногенных детерминант, характерных для генотипов 2 и 5 вируса гепатита C, а последовательность аминокислот, представляющая белок NS5, содержит имуногенные детерминанты, характерные только для генотипа 1. В определенных случаях этот недостаток может существенным образом повлиять на специфичность тест-системы.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является повышение специфичности подтверждающего теста на основе иммуноблота для выявления антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита C в сыворотке крови.
Сущность изобретения как технического решения. Важной особенностью ВГС является его генетическая неоднородность. Особенно много субтипов ВГС регистрируется в Африке и Юго-Восточной Азии. Считается, что для клинической практики достаточно разграничивать 5 субтипов ВГС: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a (Zein N.N., Persing D.H., 1996). Установлены существенные географические различия в распространении разных генотипов. Так, в Японии, на Тайване, частично в Китае, регистрируются преимущественно генотипы 1b, 2a, 2b. В США преобладает 1a генотип. В Европейских странах преобладает генотип ВГС 1a, в Южной Европе заметно возрастает доля генотипа 1b. В России чаще регистрируется генотип ВГС 1b, далее с убывающей частотой - 3a, 1a, 2a.
Международная практика предусматривает в качестве тестов первичного обследования и скрининга определение антител к ВГС. В тест-системах последнего поколения в качестве антигенов используется смесь рекомбинантных и синтетических фрагментов структурных и неструктурных белков вируса гепатита C (core, NS3, NS4, NS5). Положительные и сомнительные результаты первичного серологического исследования на наличие антител к гепатиту C должны быть проверены другим, более специфичным (подтверждающим) серологическим исследованием или определением вирусной РНК. В основе подтверждающего серологического теста должно лежать раздельное выявление антител к белкам вируса гепатита C.
Таким образом, чувствительный и специфичный подтверждающий тест должен выявлять антитела к разным белкам вируса гепатита C генотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6 в широком диапазоне концентраций и отсеивать ложноположительные результаты первичного скрининга на антитела к ВГС. При положительном результате первичного скрининга методом иммуноферментного анализа, его проводят еще два раза. Если хотя бы в одном из повторных определений результат будет положительным, общий результат считается положительным. Иммуноферментный анализ обеспечивает специфичность не менее 99%. Однако, в группах с низкой частотой носительства, даже при столь высокой специфичности ложноположительных результатов оказывается слишком много. Среди лиц со сниженным иммунитетом (например, у больных на гемодиализе), доля ложноположительных результатов составляет около 15%. Среди лиц с сохранным иммунитетом и частотой носительства менее 10% (доноры, военнослужащие, работники здравоохранения, больные венерологических лечебных учреждений) эта доля еще выше - в среднем 35%. Следовательно, целиком полагаться на первичное определение нельзя. Это не более чем предварительный результат, который необходимо подтвердить более специфичным методом. В качестве подтверждающего метода используют еще один серологический метод - иммуноблоттинг с рекомбинантными и синтетическими вирусными антигенами. Отрицательный результат иммуноблоттинга говорит об отсутствии антител к вирусу гепатита C. Результат первичного определения в этом случае считается ложноположительным, обследованному о нем не сообщают.
Целевое назначение настоящего изобретения (повышение специфичности подтверждающего теста на основе иммуноблота для выявления антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита C в сыворотке крови) реализовано следующим образом: каждый антиген, используемый в составе тест-системы, а именно рекомбинантные белки, содержащие иммунодоминантные регионы неструктурных белков ВГС NS3, NS4 и NS5 и структурного белка core, представлены аминокислотными последовательностями, содержащими одновременно иммуногенные детерминанты, характерные для различных генотипов вируса гепатита C. Повышение специфичности в этом случае происходит за счет увеличения «удельного веса» иммунодоминантных регионов в антигене.
Выявление участков, содержащих иммуногенные детерминанты, характерные для всех / большинства генотипов вируса гепатита C, было выполнено in silico с применением следующих информационных ресурсов:
1. HCV immunology database: База иммунологических данных по вирусу гепатита C (http://hcv.lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html). С помощью этой базы данных были выявлены все возможные эпитопы структурных и неструктурных белков вируса гепатита C.
2. HCV sequence database / HCV BLAST search: База данных сиквенса вируса гепатита C / Программа поиска похожих последовательностей (http://hcv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html). С помощью этих базы данных и программы были выявлены эпитопы, общие для большинства генотипов вируса гепатита C, и найдены последовательности с наиболее высокой плотностью таких эпитопов.
Выявленные для каждого антигена последовательности аминокислот с наибольшей плотностью общих для всех (большинства в случае NS5 антигена) генотипов вируса гепатита C представлены на фиг.1. Подчеркнутые участки являются наилучшими антигенами для раздельного выявления антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита C.
Краткое описание чертежей
На фиг.1А показана аминокислотная последовательность (аминокислоты с 1 по 191) белка core. Подчеркнутые участки содержат иммуногенные детерминанты, представленные во всех генотипах вируса гепатита C.
На фиг.1В показан участок аминокислотной последовательности (аминокислоты с 1192 по 1459) белка NS3. Подчеркнутые участки содержат иммуногенные детерминанты, представленные в 1, 2, 4, 5 и 6 генотипах вируса гепатита C; более крупным, жирным шрифтом выделены иммуногенные участки, представленные во всех генотипах вируса гепатита C.
На фиг.1C показан участок аминокислотной последовательности (аминокислоты с 1676 по 1947) белка NS4. Подчеркнутые участки содержат иммуногенные детерминанты, представленные во всех генотипах вируса гепатита C.
На фиг.1D показан участок аминокислотной последовательности (аминокислоты с 2691 по 2830) белка NS5. Подчеркнутые участки содержат иммуногенные детерминанты, представленные в 1, 2, 3 и 6 генотипах вируса гепатита C.
Осуществление изобретения
Раздельное определение антител к белкам вируса гепатита C с помощью разработанного набора антигенов осуществляется в описанной ниже последовательности.
Для анализа используется нитроцеллюлозная мембрана с адсорбированными в виде отдельных полос антигенами.
Образец (плазма или сыворотка) инкубируется с мембраной. Взаимодействие антител с антигенами проявляется с помощью меченных ферментом антител против IgG человека с последующей детекцией при помощи субстратного комплекса.
Для контроля успешного прохождения реакции на каждую полоску наносится античеловеческий иммуноглобулин (контрольная полоска «Уровень 2+» на фиг.2), для контроля нижней границы положительной реакции на полоску наносится иммуноглобулин человека (контрольная полоска «Уровень 1+» на фиг.2).
Оценка результатов производится визуально по представленной ниже методике. Параллельно с каждой серией исследуемых образцов исследуется отрицательная сыворотка и положительная сыворотка. Исследование считается успешным в случае одновременного выполнения следующих условий:
- полоска, инкубированная с отрицательной сывороткой, должна показать окрашивание только полос контроля прохождения реакции;
- полоска, инкубированная с положительной сывороткой, должна показать четкое окрашивание полос положительного контроля и антигенов. В случае успешного протекания всех контрольных реакций исследуемые образцы сравниваются с контрольными и оцениваются как положительные, отрицательные или неопределенные. Для получения достоверного результата все положительные образцы необходимо протестировать еще раз. В случае неопределенного результата через четыре недели необходимо провести анализ новых образцов крови пациента.
Положительным считается результат, показавший две или больше полоски с интенсивностью окраски +1 и больше.
Неопределенным считается результат, показавший только одну полоску с интенсивностью окрашивания +1 и больше.