Способ получения средства, способного блокировать развитие экспериментального паркинсонизма
METHOD FOR OBTAINING AN AGENT FOR BLOCKING EXPERIMENTAL PARKINSONISM

Изобретение относится к изысканию средства для профилактики и лечения болезни Паркинсона и способа его получения.
Болезнь Паркинсона - хроническое прогрессирующее дегенеративное заболевание центральной нервной системы, клинически проявляющееся, в частности, нарушением произвольных движений. Болезнь Паркинсона относится к первичному, или идиопатическому, паркинсонизму. Различают также вторичный паркинсонизм, который может быть обусловлен различными причинами, например энцефалитом, избыточным приемом некоторых лекарственных препаратов, атеросклерозом сосудов головного мозга. Понятие "паркинсонизм" применяется к любому синдрому, при котором наблюдаются характерные для болезни Паркинсона неврологические нарушения.
Лекарственная терапия болезни Паркинсона направлена на восполнение дефицита дофамина, развивающегося при болезни Паркинсона в результате гибели определенных клеток мозга, а также на затормаживание прогрессирования болезни, или гибели нейронов головного мозга - нейропротекторная терапия.
Для фармакотерапии паркинсонизма применяют холинолитические средства, производные аминоадамантана, ДОФА-содержащие средства, ингибиторы моноаминоксидазы (МАО) типа В, ингибиторы катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) и агонисты дофаминовых рецепторов.
Известно средство для профилактики и/или лечения болезни Паркинсона или синдрома Паркинсона, включающее в качестве активного ингредиента (R)-2-пропилоктановую кислоту, ее нетоксичную соль или гидрат. RU 2275906 С2, 10.05.2006.
Известен нейропротекторный эффект морина (3,5,7,2',4'-пентагидроксифлавона, природного флавоноида, получаемого экстракцией из растений семейства тутовых, а также присутствующий во многих травах, фруктах и вине) при экспериментальном развитии болезни Паркинсона у самцов мышей линии B57/BL. Zhen-tao ZHANG, Xue-bing CAO, Nian XIONG, Hong-cai WANG, Jin-sha HUANG, Sheng-gang SUN, Tao WANG Morin exerts neuroprotective actions in Parkinson disease models in vitro and in vivo, Acta Pharmacologica Sinica. 2010, 31, p. 900-906.
Несмотря на достаточно широкий спектр реально применяемых и находящихся в стадии исследования препаратов для терапии болезни Паркинсона продолжает оставаться актуальной задача отыскания новых средств этого назначения, что обусловлено не только недостаточной эффективностью известных средств, но и их побочными эффектами.
Насекомые давно привлекают внимание исследователей как источник биологически активных веществ. Анализ химического состава некоторых видов показал, что пчела Apis mellifera, Бакулин А.В., Велешко И.Е., Румянцева Е.В., Левов А.Н. и др. Получение хитин-меланиновых комплексов из Apis mellifera и изучение возможности их использования в качестве сорбентов радионуклидов. Доклады РАСХН. 2011, №5, с. 48-52, личинки восковой моли (Galleria mellonella), Mak P., Chmiel D., Gasek G.J. Antibacterial peptides of the moth Galleria mellonella Acta Biohim. Pol. 2001, v. 48, №4, p. 1191-1195, личинки и взрослые особи большого мучного хрущака (Tenebrio molitor), падальной мухи семейства каллифорид (Calliphoridae), черной львинки (Hermetia illucens), восковой моли, шелкопряда и др., Finke Mark D. Complete nutrient composition of commercially raised invertebrates used as food for insectivores. Zoo Biology. 2002, v. 21, p. 269-285, содержат не только протеины, жиры, но и хитин, минералы, аминокислоты, полиненасыщенные жирные кислоты и витамины, эфирные масла, другие биологически активные вещества, включая новые антимикробные пептиды. Жуки семейства Чернотелковых используются в народной медицине для лечения различных заболеваний, в том числе одной из наиболее социально значимых - болезни Паркинсона. Жук-знахарь - нетрадиционный метод лечения тяжелых заболеваний или уловка шарлатанов? 25.03.2013 [найдено 21.01.2015]. Найдено в Интернете <http://fb.ru/article/52951/juk-znahar>.
В научной литературе имеются единичные сведения о возможности медицинского применения соединений, выделенных из экстрактов жука-чернотелки Ulomoides dermestoides из семейства Tenebrionidae, являющихся источником антиоксидантных соединений, обладающих противовоспалительным и иммуномодулирующим эффектом, в качестве нутрицевтиков при лечении бронхиальной астмы и ревматоидного артрита, Santos RC, Lunardelli A, Caberlon Е, Bastos CM et al. Inflammation. 2010, v. 33, №3, p. 173-179, обладающих цитотоксичностью по отношению к клеткам А549 опухолей легочной аденокарциномы. Villaverde ML, Girotti JR, , , de Bravo MG. J Ethnopharmacol. 2011, v. l36. №l, p. 204-209.
Авторы предположили, что водный экстракт биомассы жука-чернотелки Alphitobius diaperinus из семейства Tenebrionidae может обладать активностью против токсинов на примере пронейротоксина МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин), вызывающего проявления болезни Паркинсона у героин-зависимых наркоманов и экспериментальный паркинсонизм у черных мышей линии С57. На черных мышах линии С57 разработана и валидирована международными организациями экспериментальная модель болезни Паркинсона, вызванная подкожной инъекцией МФТП. При введении 1×40 мг/кг МФТП у мышей формируется начальная стадия болезни Паркинсона. Ugrumov M.V., Khaindrava V.G., Kozina Е.А., Kucheryanu V.G., et al. Modeling of preclinical and clinical stages of Parkinson's disease in mice. Neuroscience. 2011. v. 181, p. 175-188.
Наиболее близким аналогом к заявленному является способ получения препарата, обладающего способностью блокировать развитие экспериментального паркинсонизма, из гомогената биомассы взрослого жука чернотелки Alphitobius diaperinus, полученного с использованием лабораторного блендера Waring 800S ("Waring", США). Полученный гомогенат жука иммобилизовали на специально приготовленном сорбенте. В качестве сорбента использовали стерильные пищевые пшеничные отруби, увлажненные 1%-ным молоком до 50% влажности массы, на поверхности которых молочнокислые бактерии Enterococcus и Leuconostoc образовали биопленку в процессе твердофазной ферментации отрубей. Препарат хранится в холодильнике не более недели Н.А. Ушакова, В.М. Ковальзон, А.И. Бастраков, А.А. Козлова и др. Способность гомогената жука чернотелки Alphitobius diaperinus. иммобилизованного на фитоносителе, блокировать развитие экспериментального паркинсонизма. Биохимия, биофизика. Молекулярная биология. Доклады академии наук, 2015, т. 461, №3, с. 358-361.
К недостаткам способа следует отнести наличие компонентов жука, присутствующих в гомогенате, создающих излишний объем препаративной формы, но не являющихся активными в отношении блокирования болезни Паркинсона. Кроме того, такая форма имеет малый срок хранения.
Технической задачей заявленного изобретения является разработка способа получения средства с повышенной физиологической эффективностью, способного блокировать развитие экспериментального паркинсонизма, вызванного введением токсина МФТП.
Технический результат, достигаемый от реализации изобретения, заключается в извлечении водорастворимых биологически активных компонентов из сырья, обеспечивающих блокирование развития мышиного паркинсонизма, вызванного введением пронейротоксина МФТП, повышении физиологической эффективности средства и срока его хранения.
Технический результат достигается тем, что гомогенизированную биомассу тел жука-чернотелки Alphitobius diaperinus подвергают водной экстракции в два этапа, на первом из которых 1 часть биомассы тел жука Alphitobius diaperinus заливают 2 частями дистиллированной воды, настаивают в течение суток, центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин и отделяют фугат, на втором этапе полученный осадок заливают 1 частью дистиллированной воды, настаивают не менее 2 ч, центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин, отделяют фугат, полученные фугаты объединяют, пропускают объединенный фугат через бактериальный фильтр Миллипор с диаметром пор 0,22 мкм, получают водный экстракт тел жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, содержащий: урацил, тимин, изолейцин, пролин, фенилаланин, эумеланин, а иммобилизацию проводят нанесением водного экстракта на измельченный стерильный фитоноситель до достижения влажности не более 12 масс. %. В качестве фитоносителя используют пшеничные отруби, ржаные отруби или свекловичный жом.
Пример осуществления изобретения
Проводят дробную мацерацию (ремацерацию), построенную на разности концентраций в сырье и экстрагенте, обеспечивающую максимальное извлечение активов из сырья.
1 этап. Готовят гомогенизированную сырую биомассу тел жука Alphitobius diaperinus, 1 часть которой - 5 г заливают 2 частями - 10 мл дистиллированной воды и настаивают сутки. После суток экстрагирования смесь центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин. Фугат, образующийся после центрифугирования, отделяют.
2 этап. Оставшийся осадок заливают 1 частью экстрагента - 5 мл дистиллированной воды. Настаивают не менее 2 ч. Центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин и сливают образовавшийся фугат Полученные фугаты объединяют и пропускают объединенный фугат через бактериальный фильтр Миллипор с диаметром пор 0,22 мкм. В полученном водном экстракте определяют качественно содержание веществ, которые удалось идентифицировать как урацил, тимин, изолейцин, пролин, фенилаланин, эумеланин. Полученный водный экстракт иммобилизуют нанесением на поверхность измельченных стерильных пищевых отрубей следующим образом:
12 мл водного экстракта жука Alphitobius diaperinus тщательно смешивают с 120 г измельченных стерильных пищевых отрубей (дробным смешением) до достижения влажности не более 12 масс. %. Полученная лабораторная препаративная форма средства сохранила свою активность по крайней мере в течение месяца при хранении в холодильнике.
Аналогично готовят препаративную форму средства, используя водный экстракт жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, а в качестве твердого носителя - фитоноситель - ржаные отруби или свекловичный жом. Выбор фитоносителя обусловлен тем, что полученное средство используют как биологически активную добавку к кормосмеси для мышей.
Эффективность средства, полученного заявленным способом, представляющего собой водный экстракт тел жука Alphitobius diaperinus, иммобилизованный на измельченных пшеничных отрубях, показана на мышиной МФТП-модели болезни Паркинсона. Модель паркинсонического синдрома, вызванного введением пронейротоксина МФТП (4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина), является одной из наиболее адекватных моделей паркинсонизма, поскольку МФТП избирательно повреждает дофаминергические нейроны черной субстанции. Пронейротоксин под действием фермента МАО-В в астроцитах превращается в 1-метил-4-фенилпиридиний (МФП+), который с помощью дофаминового транспортера захватывается ДА-ергическими нейронами. Эффекты МФТП обусловлены токсическим действием МФП+, вызывающим энергетическую недостаточность за счет ингибирования комплекса-1 митохондриальной дыхательной цепи. Этот эффект наиболее выражен у приматов, а у мышей - в линии C57BI/6. Feldman R.S., Meyer J.S., Quenzer L.F. Parkinson's disease and Alzheimer's disease. In: Principles of Neuropsychopharmacology, Sinauer Associates, Inc., Publishers, Massachusetts, 1997, 861-909.
5 г полученного средства вносят в 1 кг кормосмеси для мышей из расчета 40 г кормосмеси в день на 1 мышь массой 25-30 г. Кормосмесь состоит из каши, включающей отваренные овес и горох, с добавлением проса в сыром виде и растительного масла.
Методом весовых аналогов были составлены 4 группы лабораторных мышей (молодые половозрелые самцы линии C57BL/6Jsto; N=15): К1 - контрольная, без воздействия (животным не вводили токсин и они не получали средство в составе кормосмеси); К2 - контрольная с токсином, но без средства (мыши, которым была сделана инъекция токсина, но в их рационе не было средства); О (Средство + токсин) (мыши, в рацион которых вводили средство и которым была сделана инъекция токсина); Гомогенат + токсин (мыши, в рацион которых вводили гомогенат жука, согласно ближайшему аналогу, и которым была сделана инъекция токсина)
В течение первой недели мыши группы О (Средство + токсин) и Гомогенат + токсин получали средство с обычным кормом. Животные контрольных групп К1 и К2 получали аналогичный корм без препарата. Затем животным групп О (Средство + токсин), Гомогенат + токсин и группы К2 был введен подкожно токсин МФТП в дозе 40 мг/кг, после чего в течение последующих двух недель мыши получали такой же корм, как и до инъекции (опытные продолжали получать средство, контрольные - нет). Группа К1 в течение всего опыта содержалась на обычном рационе, и этим мышам не вводили токсин. Спустя две недели после введения токсина оценивали координацию движений и физическую выносливость мышей с использованием аппарата «вращающийся стержень» (ротарод, Rota-Rod, фирма TSE. Швейцария/Германия). Скорость вращения стержня устанавливали 6 об/мин, продолжительность экспозиции - 10 мин. Результаты обсчитывали методами непараметрической статистики (дисперсионный анализ Крускал-Уоллиса, критерий Манна-Уитни, критерий знаков).
Средство, приготовленное к началу опыта, использовали в течение всего опыта, длившегося три недели, в то время как Гомогенат жука, согласно ближайшему аналогу, готовили еженедельно.
Результаты опытов на мышах представлены в таблице 1. У 93% мышей группы О (Средство + токсин) наблюдалось сохранение координации движений и физической выносливости в тесте вращающегося стержня, как и у всех контрольных животных (группа К1), которым не был введен токсин. Наоборот, в группе мышей, не получавших с пищей «антидот» в виде средства, но получивших токсин (группа К2), лишь 3 животных из 12 сумели продержаться на вращающемся стержне более 10 мин. Для сравнения в группе мышей, получавших Гомогенат + токсин удержались на Ротароде 87% мышей.
При оценке координации движений и физической выносливости с использованием аппарата «вращающийся стержень» (Ротарод) наивысшие результаты продемонстрировала группа О, получавшая средство - водный экстракт, иммобилизованный на пшеничных отрубях, влажностью не более 12 масс. %. Эти результаты были близки к тем, которые продемонстрировала группа контрольных мышей (группа К1, без токсина) и выше, чем результаты, полученные на группе мышей, в рационе которых применялся Гомогенат + токсин, согласно ближайшему аналогу. При этом количество дофамин-содержащих нейронов в компактной части черной субстанции головного мозга мышей группы К2+токсин почти в 2 раза меньше, чем у мышей группы К1, О (Средство + токсин) и Гомогенат + токсин. Однако показатель числа дофамин-содержащих нейронов у мышей группы О (Средство + токсин) был выше, чем у мышей группы Гомогенат + токсин, что коррелировало с более высоким числом мышей, удержавшихся на Ротароде более 10 мин.
* - число мышей, продержавшихся >10 мин на ротароде/общее число мышей в выборке (в скобках); р <0.05 при сравнении с группой "К2".
Кроме опыта с удерживанием на Ротароде, мышей тестировали также на вертикальном стрежне. В начале тестирования в клетку с мышью ставили вертикальный шест высотой 50 см и диаметром 1 см. Близко от вершины шеста на него помещали мышь так, чтобы ее голова была ориентирована вертикально вверх. Оказавшись на шесте, мышь переориентирует положение своего тела головой вертикально вниз и начинает спуск с шеста на дно клетки. С помощью секундомера фиксировали время спуска на дно клетки. С каждой мышью проводили 3 теста. Для статистического анализа отбирали максимальное для каждой мыши время спуска с шеста. Результаты экспериментов обработаны с помощью программного статистического пакета "UNISTAT 6.5.04" с использованием рангового критерия Краскела-Уоллиса; при попарных апостериорных множественных сравнениях использовался тест Коновера-Инмана. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.
*Р≤0,05
Результаты показали наличие достоверных различий между экспериментальными группами К1 и К2. Медиана времени спуска с шеста у мышей из группы К2 (контрольная + токсин) достоверно превышала этот показатель в группе К1 (контрольные мыши без воздействия) и в группе О (Средство + токсин), т.е. введение пронейротоксина МФТП значительно и достоверно снижало двигательную координацию мышей в тесте вертикального стрежня. Сравнение группы К1 с группой О (Средство + токсин) показало, что примененный экстракт оказывал выраженное противодействие пронейротоксину, сглаживая эффекты МФТП. Таким образом, иммобилизованный на фитоносителе водный экстракт жука Alphitobius diaperinus продемонстрировал способность «нейтрализовать» действие на мышей пронейротоксина МФТП, моделирующее начальную стадию болезни Паркинсона. Выраженные сенсомоторные нарушения в тесте с вертикальным шестом, возникавшие у мышей через 2 недели после системного введения 40 мг/кг МФТП, отсутствовали, если животные получали с пищей «антидот» в виде водного экстракта биомассы жука-чернотелки, иммобилизованного на фитоносителе.
Результаты оценки координации движений, физической выносливости мышей с использованием аппарата Ротарод в тесте с вертикальным шестом и гистохимических исследований мозга на мышиной МФТП-модели болезни Паркинсона подтверждают возможность предотвращения развития моторной симптоматики мышиного паркинсонизма средством, полученным заявленным способом.