Получение клона клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли с признаками множественной лекарственной устойчивости и оценка его свойств

ой устойчивости

г.Р. хуснутдинов, аспирант кафедры общей патологии, ) А.Р. Галембикова, аспирант кафедры общей патологии

.м.н., профессор, зав. кафедрой общей патологии

ский государственный медицинский университет, Казань, Республика Татарстан, 420012, утлерова, 49

Цель исследования — получение клона опухолевых клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО), обладающего устойчивостью к химиопрепаратам различного механизма действия, и оценка его чувствительности к некоторым химиопрепа-ратам разных групп.

Материалы и методы. Для получения клона клеток ГИСО, резистентного к химиопрепаратам, использована клеточная линия ГИСО Т-1. Оценку жизнеспособности опухолевых клеток проводили в режиме реального времени на клеточном анализаторе iCEL-Ligence RTCA (ACEA Biosciences, США). С помощью колориметрического MTT-теста оценивали чувствительность клона клеток ГИСО T-1-29R к действию ингибиторов топоизомераз II типа (доксорубицина и этопозида); препаратов, влияющих на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (винбластина и паклитаксела); гидроксимочевины; цисплатина; таргетного препарата иматиниба. Экспрессию маркеров апоптоза, повреждений ДНК и химиорезистентности определяли методом иммуноблоттинга.

Результаты. Клон опухолевых клеток линии ГИСО Т-1 с признаками химиорезистентности (T-1-29R) был получен в результате 8-месячного культивирования опухолевых клеток ГИСО в присутствии постепенно увеличивающихся доз паклитаксела. Обнаружено, что клетки T-1-29R обладают резистентностью к паклитакселу, а также перекрестной резистентностью к доксорубицину и этопозиду. Чувствительность клеток клона к остальным химиопрепаратам, в том числе к иматинибу, не изменилась. В опухолевых клетках T-1-29R выявлено повышение уровня экспрессии некоторых белков множественной лекарственной устойчивости, например MDR-1.

Заключение. Клон клеток линии ГИСО T-1-29R обладает фенотипическими признаками множественной лекарственной устойчивости, что делает перспективным его использование для оценки химиочувствительности клеток ГИСО, а также при проведении скрининга новых соединений на предмет их цитотоксической и противоопухолевой активности in vitro и in vivo.

Ключевые слова: гастроинтестинальные стромальные опухоли; ГИСО; клонирование опухолевых клеток; паклитаксел; доксо-рубицин; этопозид; цитотоксичность; резистентность.

Как цитировать: Khusnutdinov R.R., Galembikova A.R., Boichuk S.V. Establishment of the clone of gastrointestinal stromal tumor cells with the signs of multiple drug resistance and assessment of its properties. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(4): 36-41, https://doi. org/10.17691/stm2016.8.4.05

English

Establishment of the Clone of Gastrointestinal Stromal Tumor Cells with the Signs of Multiple Drug Resistance and Assessment of Its Properties

R.R. Khusnutdinov, PhD Student, General Pathology Department; A.R. Galembikova, PhD Student, General Pathology Department; S.V. Boichuk, MD, DSc, Professor, Head of General Pathology Department

Kazan State Medical University, 49 Butlerova St., Republic of Tatarstan, Kazan, 420012, Russian Federation

Для контактов: Бойчук Сергей Васильевич, e-mail: boichuksergei@mail.ru

/////////////////////^^^^

36 СТМ J 2016 - том 8, №4 P.P. Хуснутдинов, А.Р. Галембикова, C.B. Бойчук

The aim of the investigation was to obtain a tumor cell clone of gastrointestinal stromal tumors (GISTs) possessing resistance to chemotherapeutic agents of different mode of action, and to assess its sensitivity to various groups of chemotherapeutic agents.

Materials and Methods. GIST cell line T-1 was used to obtain a clone of chemoresistant GIST cells. The viability assessment of tumor cells was carried out by using i-CELLigence RTCA cell analyzer (ACEA Biosciences, USA). The sensitivity of GIST T-1-29R cell clone to type II topoisomerase inhibitors (doxorubicin and etoposide); chemotherapeutic agents affecting the dynamic state of the spindle microtubules (vinblastine and paclitaxel); hydroxyurea; cisplatin; targeted drug imatinib were evaluated by using the MTT-based assay. Expression of apoptosis, the markers of DNA damage and chemoresistance was examined by immunoblotting.

Results. A clone of GIST T-1 tumor cell line with the signs of chemoresistance (T-1-29R) was obtained after 8-month of cultivation of GIST tumor cells in the presence of the gradually increasing doses of paclitaxel. T-1-29R cells were found to possess resistance to paclitaxel, and cross-resistance to doxorubicin and etoposide, as well. Sensitivity of T-1-29R cells to other chemotherapeutic agents, including imatinib, did not change. Some multiple drug resistance proteins, e.g. MDR-1, were revealed to have an increased expression level in T-1-29R tumor cells when compared to parent T-1 cells.

Conclusion. A clone of GIST T-1-29R cell line possesses phenotypical features of multiple drug resistance, that makes its perspective use for the assessment of GIST chemosensitivity, and for screening of new compounds for their cytotoxic and antitumor activities in vitro and in vivo, as well.

Key words: gastrointestinal stromal tumors; GISTs; tumor cell cloning; paclitaxel; doxorubicin; etoposide; cytotoxicity; resistance.

Несмотря на существовавшую на протяжении длительного времени точку зрения о низкой эффективности химиотерапии у больных с гастроинтести-нальными стромальными опухолями (ГИСО) [1, 2], в последнее время появились исследования, свидетельствующие об обратном. Например, показаны достаточно хорошие перспективы для использования отдельных химиопрепаратов в лечении больных с метастатическими и неоперабельными формами ГИСО [3, 4]. Результаты, полученные нашей научной группой, также свидетельствуют о том, что некоторые опухолевые клеточные линии ГИСО чувствительны к ингибиторам топоизомеразы II типа как in vitro, так и in vivo [5, 6]. Примечательно, что эффект химиопре-паратов данной группы был выявлен в отношении клеточных линий ГИСО — как чувствительных, так и резистентных к таргетному препарату иматинибу. Кроме того, мы обнаружили, что иматиниб способен вызывать сенситизацию опухолевых клеток ГИСО к химиопрепаратам данной группы [7]. Одним из потенциальных механизмов такого феномена является обнаруженная нами способность иматиниба ингибиро-вать процессы гомологичной рекомбинации ДНК и, как следствие, невозможность опухолевых клеток репари-ровать повреждения ДНК, возникшие под воздействием на них доксорубицина и этопозида [8]. Результаты этих экспериментальных данных коррелируют с результатами некоторых клинических исследований, показавших эффективность применения иматиниба в комбинации с малыми дозами доксорубицина у больных с ГИСО [9]. Примечательно, что эффективность использования вышеуказанной комбинации препаратов была показана в том числе в группе больных, у которых не определялись известные «традиционные» мутации KIT/PDGFRA.

Вышеизложенное свидетельствует о хороших перспективах применения отдельных химиопрепа-ратов для терапии больных с ГИСО. В то же время является очевидным факт неуклонного развития

химиорезистентности злокачественных новообразований после начала проведения химиотерапии онкологическим больным. Временной интервал, в течение которого опухоль остается восприимчивой к химиопрепаратам, зависит от многих факторов и может варьировать в каждом индивидуальном случае. Следовательно, представляется перспективной индивидуальная оценка чувствительности опухоли к химиопрепаратам и подбор индивидуальных схем химиотерапии онкологическим больным, в том числе больным с ГИСО.

Одним из критериев, используемых при поиске новых перспективных соединений с противоопухолевой активностью, является их способность индуцировать гибель опухолевых клеток с резистентностью к уже известным химиопрепаратам различных групп. Вследствие существовавшей длительное время ошибочной, на наш взгляд, точки зрения о низкой эффективности химиопрепаратов в лечении больных с ГИСО в настоящее время в арсенале исследователей не имеется клеточных линий ГИСО, обладающих фе-нотипическими свойствами множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).

Цель исследования — получение клона опухолевых клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей, обладающего устойчивостью к химиопрепаратам различного механизма действия, и оценка его чувствительности к некоторым химиопрепаратам разных групп.

Материалы и методы. В качестве объекта исследования была выбрана клеточная линия ГИСО Т-1, чувствительная к действию таргетного препарата иматиниба [10]. Для получения клона клеток ГИСО с признаками МЛУ опухолевые клетки культивировали с химиопрепаратом паклитакселом в течение 8 мес. Начальная доза химиопрепарата в культуре клеток составляла 0,4 нмоль, конечная — 24 нмоль. Клетки культивировали в стандартных условиях (37оС, 5% СО2) в культуральной среде RPMI-1640 с добавлени-

ем L-гпутамина, пенициллина и стрептомицина (все реагенты — «ПанЭКО», Россия), а также 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Каждые 2 мес проводили сравнительную оценку чувствительности клеток ГИСО и их клона к химиопрепаратам различных групп: доксорубицину, винбластину, пакли-такселу, иматинибу (Sigma-Aldrioh, США), этопозиду, гидроксимочевине (Calbiochem, США) и цисплатину. С этой целью опухолевые клетки засевали в лунки плоскодонного 96-луночного культурального планшета (Согптд, США) и культивировали в трех повторностях в течение 48-72 ч при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Цитотоксичность вышеуказанных препаратов оценивали колориметрически с помощью реагента CellTiter 96 AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Оценку пролиферативной способности клеток ГИСО в присутствии паклитаксела проводили методом измерения клеточного индекса в режиме реального времени с помощью клеточного анализатора iCELLigence RTCA (ACEA Biosciences, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

Уровень экспрессии белков, являющихся маркерами повреждений ДНК, апоптоза и химиорези-стентности, оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител.

Статистический анализ результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.

Результаты и обсуждение. Спустя 8 мес культивирования клеток ГИСО Т-1 в присутствии постепенно возрастающих концентраций паклитаксела (29-й пассаж) в них появились признаки резистентности к данному химиопрепарату — полученный клон опухолевых клеток ГИСО был обозначен как T-1-29R.

О наличии химиорезистентности клеток T-1-29R свидетельствовали результаты оценки их пролиферативной активности в режиме реального времени в присутствии паклитаксела. Например, было обнаружено, что пролиферативные способности «материнского» и «дочернего» клонов клеток в отсутствие химиопрепа-рата (контроль) не отличались друг от друга (рис. 1, а). При культивировании клеток T-1-29R в присутствии паклитаксела в дозах 1 и 10 нмоль (рис. 1, б, в соот-

Рис. 1. Оценка пролиферативной способности клеток ГИСО Т-1 и T-1-29R без присутствия препарата паклитаксела

/////////////////////^^^^^

38 СТМ J 2016 — том 8, №4 Р.Р. Хуснутдинов, А.Р. Галембикова, С.В. Бойчук

120

ветственно) скорость их пролиферации значительно превышала аналогичный показатель «материнского» клона ГИСО Т-1. Культивирование «материнских» и «дочерних» клеток ГИСО в присутствии высоких доз паклитаксела (100 нмоль) было губительным для обоих типов опухолевых клеток (рис. 1, г).

Результаты фотоколориметрического МТТ-теста также показали более высокую жизнеспособность клеток Т-1-29R по сравнению с «материнскими» опухолевыми клетками ГИСО Т-1 в присутствии данного химиопрепарата, что свидетельствовало в пользу имеющейся в клетках ГИСО T-1-29R устойчивости к паклитакселу (рис. 2).

Помимо резистентности к паклитакселу в клетках ГИСО T-1-29R была отмечена устойчивость к действию ингибиторов топоизомеразы II типа, например доксорубицина (рис. 3).

На основании проведенных исследований были определены эффективные концентрации химиопрепаратов, вызывающие 50% ингибирование выживаемости (1С50) опухолевых клеток Т-1 и T-1-29R. Сравнительные значения 1С50 химиопрепаратов (см. таблицу) свидетельствуют о том, что клон клеток ГИСО T-1-29R обладает перекрестной резистентностью к ингибиторам топоизомеразы II типа, а также к некоторым препаратам, влияющим на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (таксанам).

Учитывая тот факт, что основным механизмом гибели опухолевых клеток под действием вышеуказанных препаратов является апоптоз, было проведено сравнительное изучение их способности индуцировать гибель «материнских» (Т-1) и «дочерних» (T-1-29R) клеток ГИСО по механизму апоптоза. Установлено, что инкубация «материнских» клеток ГИСО Т-1 с паклитакселом приводит к значительному и дозозависимому повышению уровней экспрессии расщепленных форм каспазы-3 и поли-АДФ(рибоза)-полимеразы (PARP), являющихся общепризнанными маркерами апоптоза (рис. 4, а). Ожидаемо не выявлено повышения уровня экспрессии данных белков в клетках ГИСО T-1-29R, инкубированных с паклитакселом (рис. 4, б).

Аналогичным образом инкубация клеток ГИСО Т-1 (но не T-1-29R!) с ингибиторами топоизомеразы II типа приводила к дозозависимому повышению уровней экспрессии вышеуказанных маркеров апоптоза (рис. 5, а, б соответственно). Примечательно, что уровень

1 нмоль

0,1 нмоль

10 нмоль

100

нмоль

Щ

Контроль Ц ГИСО Т-1 [Ц| ГИСО Т-1-29Р

Рис. 2. Цитотоксическая активность паклитаксела в отношении клеток ГИСО Т-1 и Т-1-29К. Цитотоксичность определяли по результатам МТТ-теста. Статистически значимая разница значений между исследуемыми клеточными линиями: * — р<0,01; ** — р<0,001

Ез

о н

ю

о

о

о

120

100

80

60

40

20

0,0613 мкмоль

0,0306 мкмоль

0,125 мкмоль

0,25 мкмоль

Контроль Ц ГИСО Т-

1 Щ ГИСО Т-1-29Р

Рис. 3. Цитотоксическая активность доксорубицина в отношении клеток ГИСО Т-1 и Т-1-29К. Цитотоксичность определяли по результатам МТТ-теста. * — статистически значимая разница значений между исследуемыми клеточными линиями; р<0,001

Цитотоксические свойства химиопрепаратов в отношении клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли

химиопрепарат ГИСо т-1 ГИСо Т-1^

Паклитаксел, нмоль 0,67±0,09 21,47±1,03

Доксорубицин, мкг/мл 0,14±0,07 0,27±0,03

Этопозид, мкмоль 42,69±1,38 70,95±0,97

Цисплатин, мкмоль 5,34±0,24 6,4±0,4

**

*

ГИСО Т-1 ГИСО T-1-29R

^ РТХ

—— РАИР — —— —

• скСаБр-З

Н2АХ

— — ^ *

------ рН2АХ

• **а и. рР1_К-1

-а»'..... У^ .. РЬК-1 ' ' - ¿з ц

'V у

_____ Актин тт чшштщв

а б

Рис. 4. Паклитаксел (PTX) индуцирует апоп-тоз клеток ГИСО Т-1 (а), но не Т-1-29R (б). Маркеры апоптоза — расщепленные формы PARP и каспазы-3 (cl.Casp-3), маркеры М-фазы — повышение уровня экспрессии pH2AX и pPLK-1. Концентрации паклитак-села указаны в нмоль. В качестве контроля использовали уровень экспрессии актина

ГИСО Т-1 ГИСО Т-1 29R

^ ЕЬ Рох „о- ^ ЕЬ Рох

^ 110 20 40 11 0,25 0,5 11 ^ 110 20 40 11 0,25 0,5 11

РАРР __ _м м «к __

- г Тм II

скСаБр-З

Н2АХ — —

---в рН2АХ

1 "В1 1 '^1

——————— Актин ——— —— —

а б

Рис. 5. Доксорубицин (Dox) и этопозид (ЕЬ) индуцируют апоптоз преимущественно клеток ГИСО Т-1 (а), но не Т-1-29R (б). Маркеры апоптоза — расщепленные формы PARP и каспазы-3 (cl.Casp-3), маркер двунитевых разрывов ДНК — повышение уровня экспрессии рH2AX ^ег139). Концентрации этопозида указаны в мкмоль, доксорубици-на — в мкг/мл

12 3

МОБМ МРР-1 АВСС2 Актин

« « И

Рис. 6. Динамика уровней экспрессии белков химиорези-стентности (MDR-1, и

ABCG2) в клетках ГИСО Т-1 при их культивировании в присутствии паклитаксела: 1 — 2 мес, 2 — 5 мес, 3 — 8 мес культивирования

экспрессии гистона 2А, фосфорилиро-ванного по остаткам серина в положении 139 (БегШ) (рН2АХ), который является общепризнанным маркером двунитевых разрывов ДНК, значительно повышался в клетках ГИСО Т-1 после воздействия вышеназванных химиопрепаратов (см. рис. 5, а). В то же время отмечено лишь минимальное повышение уровня экс-прееоии pН2АХ в клетках Т-1-29Р после их инкубации с этопозидом (см. рис. 5, б). Эффект доксорубицина также был менее выраженным по сравнению с «материнскими» клетками ГИСО Т-1.

Снижение уровней экспрессии маркеров апоптоза на фоне снижения уровня повреждений ДНК (двунитевых разрывов) в клетках Т-1-29Р после воздействия на них ингибиторов топоизомеразы II типа могло являться следствием ряда факторов, например активации репара-тивных процессов ДНК после генотокси-ческого воздействия химиопрепаратов, усиления элиминации химиопрепаратов из опухолевых клеток и уменьшения тем самым времени их воздействия на ДНК и др. Учитывая выбранный нами временной интервал для оценки уровня экспрессии рН2АХ в опухолевых клетках, первое предположение следует признать маловероятным. В пользу усиления элиминации химиопрепаратов из опухолевых клеток Т-1-29Р свидетельствует значительное повышение в них уровня экспрессии Р-гликопротеина (MDR-1), ответственного

/////////////////////^^^^

40 СТМ | 2016 — ТОМ 8, №4 Р.Р. Хуснутдинов, А.Р. Галембикова, С.В. Бойчук

оригинальные исследования

за элиминацию цитостатиков из клеток и обусловливающего тем самым развитие МЛУ (рис. б). В то же время не было отмечено изменений в уровне экспрессии некоторых других белков-транспортеров, обусловливающих развитие МЛУ например ABCG2, уровень экспрессии которых был изначально высоким.

Заключение. Результатом проведенных исследований явилось получение клона клеток опухолевой линии ГИСО Т-1, обладающего устойчивостью к действию химиопрепаратов различных групп, а именно влияющих на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (паклитаксела), а также ингибиторов топоизомеразы II типа (доксорубицина и этопо-зида). Полученный клон клеток ГИСО с признаками множественной лекарственной устойчивости может быть использован при проведении скрининга наиболее эффективных в отношении ГИСО химиопрепаратов и вновь синтезированных соединений. Результаты исследования свидетельствуют о высокой чувствительности клеток ГИСО к действию ингибиторов топоизомеразы II типа и таксанов, что подтверждает необходимость пересмотра существующей точки зрения об их химиорезистентности.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант №14-15-00342).

Конфликт интересов у авторов отсутствует.

Литература/References

1. Verweij J., Casali P.G., Zalcberg J., LeCesne A., Reichardt P., Blay J.Y., Issels R., van Oosterom A., Hogendoorn P.C., Van Glabbeke M., Bertulli R., Judson I. Progression-free survival in gastrointestinal stromal tumours with high-dose imatinib: randomised trial. Lancet 2004; 3б4(9440): 1127-1134, https://doi.org/10.1016/s0140-6736(04)17098-0.

2. Dematteo R.P., Heinrich M.C., El-Rifai W.M., Demetri G. Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Hum pathol 2002; 33(5): 4бб-477, https:// doi.org/10.1053/hupa.2002.124122.

3. Pessetto Z.Y., Weir S.J., Sethi G., Browargd M.A., Godwin A.K. Drug repurposing for gastrointestinal stromal tumor. Mol Cancer Ther 2013; 12(7): 1299-1309, https://doi. org/10.1158/1535-7163.mct-12-0968.

4. Pessetto Z.Y., Ma Y., Hirst J.J., von Mehren M., Weir S.J., Godwin A.K. Drug repurposing identifies a synergistic

combination therapy with imatinib mesylate for gastrointestinal stromal tumor. Mol Cancer Ther 2014; 13(10): 2276-2287, https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-14-0043.

5. Boichuk S., Lee D.J., Mehalek K.R., Makielski K.R., Wozniak A., Seneviratne D.S., Korzeniewski N., Cuevas R., Parry J.A., Brown M.F., Zewe J., Taguchi T., Kuan S.F., Schoffski P., Debiec-Rychter M., Duensing A. Unbiased compound screening identifies unexpected drug sensitivities and novel treatment options for gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 2014; 74(4): 1200-1213, https://doi. org/10.1158/0008-5472.CAN-13-1955.

6. Галембикова А.Р., Дунаев П.Д., Бойчук С.В. Оценка чувствительности гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСТ) к химиопрепаратам различных групп. Современные проблемы науки и образования 2015; 6. Galembikova A.R., Dunaev P.D., Boichuk S.V. Sensitivity of gastrointestinal stromal tumors (GISTs) to the various chemotherapeutic agents. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya 2015; 6. URL: https://www.science-education.ru/ en/article/view?id=23728.

7. Boichuk S.V., Galembikova A.R., Ramazanov B.R., Duensing A. Imatinib enchances the sensitivity of gastrointestinal stromal tumors to topoisomerase II inhibitors. Advances in Molecular Oncology 2015; 2(1): 076, https://doi. org/10.17650/2313-805X.2015.2.1.076-081.

8. Бойчук С.В., Галембикова А.Р., Мартынова Е.В., Рамазанов Б.Р., Дусинг А. Иматиниб ингибирует процессы гомологичной рекомбинации и вызывает сенситизацию клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа. Цитология 2016; 58(3): 178-185. Boichuk S.V., Galembikova A.R., Martinova E.V., Ramazanov B.R., Duensing A. Imatinib effectively inhibits homologous recombination and sensitizes gastrointestinal stromal tumor cells to the topoisomerase type II inhibitors. Tsitologiya 2016; 58(3): 178-185.

9. Maurel J., Martins A.S., Poveda A., López-Guerrero J.A., Cubedo R., Casado A., Martínez-Trufero J., Ramón Ayuso J., Lopez-Pousa A., Garcia-Albeniz X., Garcia del Muro X., de Alava E. Imatinib plus low-dose doxorubicin in patients with advanced gastrointestinal stromal tumors refractory to high-dose imatinib. A phase I-II study by the Spanish Group for Research on Sarcomas. Cancer 2010; 116(15): 3692-3701, https://doi.org/10.1002/cncr.25111.

10. Taguchi T., Sonobe H., Toyonaga S., Yamasak Shuin T., Takano A., Araki K., Akimaru K., Yuri K. Cc and molecular cytogenetic characterizati human cell line, GIST-T1, establishec stromal tumor. Lab Invest 2002; org/10.1038/labinvest.3780461.