Способ выявления активного деструктивного процесса в сетчатке в эксперименте
METHOD FOR DETECTING AN ACTIVE DESTRUCTIVE PROCESS IN THE RETINA IN AN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для выявления активного деструктивного процесса в сетчатке в эксперименте при моделировании глазной патологии для разработки новых способов диагностики и лечения и в дальнейшем позволит в клинической практике своевременно начинать лечение для более эффективного сохранения зрительных функций.
Патологические процессы в сетчатке широко распространены и занимают первое место среди причин инвалидности по зрению (25%) (Либман Е.С., Рязанов Д.П. Инвалидность вследствие нарушения зрения в населении России. В сб.: Федоровские чтения - 2014. М., 2014. С. 163). Ранняя диагностика патологии сетчатки представляет актуальную для офтальмологии проблему, поскольку патологический процесс в сетчатке выявляется на стадии уже наступивших структурно-функциональных нарушений, которые трудно поддаются лечению.
Несмотря на достигнутые за последние годы успехи в лечении патологии сетчатки, возможности восстановления и поддержания зрительных функций при этих заболеваниях остаются ограниченными. Поэтому широко проводятся экспериментальные исследования по изучению их патогенеза и разработке новых эффективных способов лечения. Для этого создаются модели заболеваний сетчатки и экспериментально апробируются новые способы лечения, для чего необходима оценка состояния сетчатки. Современные методы офтальмологического обследования (ОКТ, УЗИ, ЭФИ) высокоэффективны для диагностики глазной патологии, но выявляют ее уже на стадии структурных и функциональных нарушений, которым предшествуют метаболические сдвиги, свидетельствующие о том, что в сетчатке уже начались процессы альтерации. Более раннее выявление активного деструктивного процесса в сетчатке в экспериментальных исследованиях могут дать результаты гистологического или биохимического исследования ткани сетчатки, для проведения которых необходимо извлечение сетчатки из энуклеированных глаз.
Нервная и гуморальная регуляция слезопродукции находится в тесной взаимосвязи с регуляцией всех тканевых структур глаза, и поэтому изменение метаболических процессов в слезе отражает изменение метаболизма не только тканевых структур, омываемых слезой, но внутриглазных, в том числе и сетчатки (Нероев В.В., Чеснокова Н.Б., Охоцимская Т.Д. и др. Активность ангиотензин-превращающего фермента в крови и слезе больных с диабетической ретинопатией. Вестник офтальмологии. 2006, 122(3): 11 - 4. 11. Безнос О.В., Чеснокова Н.Б. Методические подходы и интерпретация биохимических исследований слезной жидкости в офтальмологии. Российский офтальмологический журнал 2012; 5(2): 101-106). Исследование слезной жидкости при глазной патологии можно приравнять к развиваемому в настоящее время направлению в клинической диагностике - жидкостной биопсии, когда для оценки патологического процесса во внутренних органах для того, чтобы не травмировать ткани органа, используется биологические жидкости, метаболизм которых связан с обменными процессами в этом органе.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ того же назначения, включающий морфологическую оценку состояния сетчатки с помощью гистологических методов post mortem (Нероева Н.В., Нероев В.В., Илюхин П.А., Кармокова А.Г., Лосанова О.А., Рябина М.В., Майбогин A.M. Моделирование атрофии ретинального пигментного эпителия. Российский офтальмологический журнал. 2020; 13 (4): 58-63 ссылка). Этот способ наглядно демонстрирует тончайшие изменения в строении ткани, но получение ткани сетчатки требует проведения энуклеации глаза, выведения животного из эксперимента, и оценка динамики процесса у одного и того же животного невозможна.
Белок альфа2-макроглобулин (α2-МГ) играет важную роль во множестве физиологических и патофизиологических процессов благодаря своей уникальной многофункциональности. Он относится к белкам острой фазы воспаления, является ингибитором всех классов протеолитических ферментов и поэтому участвует в регуляции всех каскадных протеолитических систем (ренин-ангиотензиновой, фибринолитической, системы свертывания крови и др.), в регуляции иммунных процессов, а также в нейродегенерации и нейровоспалении. Метаболические нарушения в сетчатке могут быть вызваны многими факторами, например, такими как ишемия, иммунные нарушения, воспаление и т.д., но все они неизбежно вызывают дистрофические процессы и в конечном итоге приводят к гибели ганглиозных клеток сетчатки и ухудшению зрения. α2-МГ играет важную роль в процессах, приводящих к нейродегенерации как в центральной нервной системе, так и в сетчатке (Shi Z, Rudzinski М, Meerovitch K, Lebrun-Julien F, Birman E, Di Polo A, Saragovi HU. Alpha2-macroglobulin is a Mediator of Retinal Ganglion Cell Death in Glaucoma. Journal of Biological Chemistry. 2008;283(43):29156-29165). Установлено, что повышение содержания α2-МГ в спинномозговой жидкости отражает характер течения нейродегенеративного процесса в центральной нервной системе при болезни Альцгеймера. Повышение содержания α2-МГ в спинномозговой жидкости предложено в качестве биомаркера нейродегенерации при болезни Альцгеймера, а также для контроля эффективности лечения этого заболевания (Varma VR, Varma S, An Y, Hohman TJ, Seddighi S, Casanova R, Beri A, Dammer EB, Seyfried NT, Pletnikova O, Moghekar A, Wilson MR, Lah JJ, O'Brien RJ, Levey AI, Troncoso JC, Albert MS, Thambisetty M. Alpha-2 macroglobulin in Alzheimer'sdisease: a marker of neuronal injury through the RCAN1 pathway. Mol Psychiatry. 2017 Jan;22(l):13-23). При болезни Паркинсона в слезной жидкости происходит изменение обмена катехоламинов, что оказывает влияние на активность α2-МГ. Поэтому повышение активности α2-МГ в слезной жидкости предлагается использовать в качестве раннего биомаркера болезни Паркинсона (Павленко Т.А., Чеснокова Н.Б., Нодель М.Р., Ким А.Р., Угрюмов М.В., Безнос О.В., Способ ранней диагностики болезни Паркинсона. Патент RU 2722666; 2020; Bogdanov V, Kim A, Nodel М, Pavlenko Т, Pavlova Е, Blokhin V, Chesnokova N, Ugrumov M. A Pilot Study of Changes in the Level of Catecholamines and the Activity of alpha-2-Macroglobulin in the Tear Fluid of Patients with Parkinson's Disease and Parkinsonian Mice. Int J Mol Sci. 2021 Apr 29;22(9):4736)
При поиске биомаркеров для выявления активной фазы деструктивных процессов в сетчатке, как было нами предположено, может служить изменение активности α2-МГ в слезной жидкости.
Основным фактором, приводящим к необратимой потери зрения при таких распространенных заболеваниях сетчатки как возрастная макулодистрофия, пигментный ретинит, врожденные дистрофии сетчатки и др., является нарушение функционирования и атрофия клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Для изучения патогенеза этих патологий и разработки новых методов лечения разработаны различные модели атрофии РПЭ.
Задачей предлагаемого способа является создание способа выявления активного деструктивного процесса в сетчатке в эксперименте. Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность неинвазивной оценки метаболических нарушений, отражающих активный деструктивный процесс в сетчатке в динамике.
Технический результат достигается за счет определения активности α2-МГ в слезной жидкости.
В предлагаемом способе повреждение сетчатки у кроликов моделировали путем субретинального введения в один глаз (OD) физиологического раствора (0,9% NaCl) (1 группа - 5 животных) или раствора бевацизумаба, содержащего 0,025 мг препарата (2 группа - 5 животных)), ранее описанным методом (Нероева Н.В., Нероев В.В., Илюхин П.А., Кармокова А.Г., Лосанова О.А., Рябина М.В., Майбогин A.M. Моделирование атрофии ретинального пигментного эпителия. Российский офтальмологический журнал. 2020; 13 (4): 58-63), парный глаз (OS) оставался интактным и служил контролем.
Слезную жидкость забирали через 3 месяца после воспроизведения модели из обоих глаз с помощью фильтровальной бумаги до моделирования атрофии РПЭ и через 3 месяца после операции. Для забора слезы кружки из фильтровальной бумаги 05 мм помещали за нижнее веко на 5 мин, затем компоненты слезы элюировали в течение 20 мин физиологическим раствором в соотношении 50 мкл на 1 кружок, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин и супернатант использовали для исследований. В элюате слезы определяли активность α2-МГ ферментативным методом (Веремеенко К.Н., Васильева Т.Г., Доброгорская Л.Н., Краева Л.Н., Гончарова В.П. α2-Макроглобулин в спинномозговой жидкости при нейрохирургических заболеваниях. Вопросы медицинской химии, 1989, № 6, с. 48-51; Chuang W.H., Liu Р.С., Hung C.Y., Lee K.K., Purification, characterization and molecular cloning of alpha-2-macroglobulin in cobia, Rachycentron canadum, Fish Shellfish Immunol. 2014 Dec;41(2):346-55. doi: 10.1016/j.fsi.2014.09.016). Определение активности α2-МГ основано на том, что комплекс α2-МГ с трипсином сохраняет протеолитическую активность по отношению к низкомолекулярным субстратам, и на эту активность не влияет ингибитор трипсина из бобов сои, в качестве такого субстрата был использован N-бензоил -DL-аргинин-п-нитроанилид (БАПНА) Расчет активности производили с помощью калибровочной кривой, построенной по окрашенному продукту реакции π-нитроанилину. Активность α2-МГ выражали в нмоль/мин*мл слезы Измерения проводили на фотометре для микропланшета Synergy MX (BioTek, США).
Предварительные исследования, проведенные на большом количестве кроликов без глазной патологии (30 глаз), показали, что среднее значение активности α2-МГ составляет в норме 4,9±0,6 нмоль/минхмл. У кроликов, которым воспроизводили модель атрофии РПЭ, забор слезы проводили через 1 и 3 месяца после операции, когда завершалась медикаментозная терапия, которая могла влиять на активность α2-МГ в слезной жидкости. Через 1 месяц после введения физиологического раствора активность α2-МГ в слезной жидкости опытного глаза составила 11±2,3 нмоль/мин×мл (р<0,001 по отношению к норме), а парного глаза -7±3,3 нмоль/мин×мл (р<0,01 по отношению к норме). Через 3 месяца после введения физиологического раствора в слезной жидкости опытного глаза активность α2-МГ была повышена в среднем вдвое и составляла 8,6±0,9 (р<0,001 по отношению к норме), в парном глазу отклонений активности α2-МГ в слезе от нормы не отмечено, и активность α2-МГ в слезной жидкости опытного глаза статистически достоверно превышала активность в парном глазу. Через 1 и 3 месяца после введения бевацизумаба активность α2-МГ в слезной жидкости не отличалась от нормы и составляла 5,6±0,8 и 4,8±0,7 нмоль/мин×мл, соответственно. Значения активности α2-МГ в слезной жидкости кроликов, превышающие 6,0 нмоль/мин×мл, нами рассматриваются как отклонение от нормы и свидетельствуют о наличии активно протекающей ответной реакции на альтерацию, то есть активного деструктивного процесса.
При проведении прижизненных методов исследования (ОКТ, аутофлюоресценция) в разные сроки наблюдения не было обнаружено существенных различий в состоянии сетчатки между группами кроликов, которым воспроизводили модель атрофии сетчатки с помощью введения бевацизумаба или физиологического раствора. При морфологическом исследовании через 16 и 30 дней после воспроизведения моделей отмечен существенно более выраженный негативный эффект на РПЭ, сетчатку и хориоидею в группе глаз, подвергшихся введению 0,9% раствора хлорида натрия, (Нероева Н.В., Нероев В.В., Илюхин П.А., Кармокова А.Г., Лосанова О.А., Рябина М.В., Майбогин A.M. Моделирование атрофии ретинального пигментного эпителия. Российский офтальмологический журнал. 2020; 13 (4): 58-63). Обнаружение нами высоких значений белка острой фазы воспаления α2-МГ в слезной жидкости кроликов даже через 3 месяца после введения 0,9% раствора хлорида натрия свидетельствует о продолжающемся процессе воспаления, тогда как при введении бевацизумаба воспалительный процесс, приводящий к деструкции тканей, завершен уже через 1 месяц. Для проведения гистологического исследования требуется энуклеация глаза, тогда как исследование биохимии слезы позволяет неинвазивно прижизненно и в динамике оценивать характер течения альтернативного процесса в сетчатке.
Способ осуществляют следующим образом.
В слезной жидкости кролика определяют активность α2-МГ. При значении α2-МГ более 6,00 нмоль/мин×мл выявляют активный деструктивный процесс.
Пример 1. Кролик № 95
В правый глаз кролику ввели субретинально 0,01 мл бевацизумаба. По данным ОКТ и аутофлюоресценции стойкая дегенерация РПЭ визуализировалась с 30-го дня после хирургического вмешательства. В этот срок, когда противовоспалительная терапия уже не проводилась, активность α2-МГ в слезной жидкости обоих глаз кроликов не отличалась от нормы и составляла в правом глаз 4,9 нмоль/мин×мл, а в левом 5,6 нмоль/мин×мл. Через 3 месяца активность α2-МГ в слезной жидкости правого глаза составила 4,1 нмоль/мин×мл, левого глаза - 4,6 нмоль/мин×мл. Таким образом, значение активности а2-МГ в слезной жидкости кролика через 1 и 3 месяца после введения бевацизумаба находилась в пределах нормы, что свидетельствует о завершении ответной реакция и активной фазы деструкции ткани сетчатки на введение бевацизумаба.
Пример 2. Кролик № 111
В правый глаз кролику ввели субретинально 0,01 мл NaCl 0,9%. По данным ОКТ и аутофлюоресценции стойкая дегенерация РПЭ визуализировалась с 30-го дня после хирургического вмешательства, и результаты этих исследований не выявили различий в характере наблюдаемых изменений в сравнении с кроликом № 95, которому вводили бевацизумаб. Через 30 дней после операции активность α2-МГ в слезной жидкости правого глаза составила 17,8 нмоль/мин×мл, левого глаза - 0,80 нмоль/мин×мл. Через 3 месяца активность α2-МГ в слезной жидкости правого глаза составила 15,1 нмоль/мин×мл, левого глаза - 0,48 нмоль/мин×мл. Трехкратное превышение активности α2-МГ в слезной жидкости кролика свидетельствует о незавершенности острой фазы ответной реакции ткани сетчатки через 1 и даже через 3 месяца после введения NaCl 0,9%. Полученный результат подтверждает данные гистологического исследования о наличии активного деструктивного процесса и более агрессивном действии NaCl 0,9% по сравнению с раствором бевацизумаба.
Пример 3. Кролик № 10. Интактный кролик
Активность α2-МГ в слезной жидкости правого глаза составила 5,1 нмоль/мин×мл, левого глаза - 4,8 нмоль/мин×мл, что соответствует значениям нормы.
Таким образом, определение активности α2-МГ в слезной жидкости позволяет при альтерации сетчатки проводить неинвазивную оценку состояния сетчатки и выявлять активный деструктивный процесс и оценивать динамику его течения. Способ в дальнейшем может быть использован в клинических условиях для раннего выявления метаболических изменений, а также для объективной оценки риска прогрессирования патологических изменений сетчатки и для оценки эффективности проводимой терапии.