Гепатопротекторное действие низкомолекулярного миметика NGF
HEPATOPROTECTIVE EFFECT OF LOW MOLECULAR WEIGHT MIMETICS NGF

Область изобретения
Изобретение относится к медицине и фармакологии, и касается средства для лечения неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).
Уровень техники
В последние десятилетия в мире регистрируется стабильно высокий уровень заболеваемости НАЖБП. Данная патология чаще встречается среди лиц с ожирением, дислипидемией и метаболическим синдромом [Hamaguchi М., Koima Т., Takeda N., et al. The metabolic syndromes a predictor of nonalcoholic fatty liver disease / Ann. Intern. Med. 2005; 143: 772-8]. Естественное течение процессов в измененной паренхиме печени может приводить к развитию терминальных стадий заболевания - циррозу и раку печени [Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Буличенко М.А. и соавт. Неалкогольная жировая болезнь печени в клинике внутренних болезней / РМЖ. 2011; 6: 11-17].
В прогрессировании НАЖБП, независимо от ее этиологии, ведущим фактором является накопление свободных жирных кислот, являющихся высокоактивным субстратом перекисного окисления липидов (ПОЛ). На фоне снижения активности ферментов антиоксидантной защиты ПОЛ приводит к повреждению мембран и некрозу клеток. Такие продукты ПОЛ, как 4-гидроксиноненал и малоновый диальдегид, способны активировать звездчатые клетки печени, являющиеся основными продуцентами коллагена, а также вызывать перекрестное связывание цитокератинов с формированием телец Мэллори и стимулировать хемотаксис нейтрофилов. Супероксид анионы индуцируют повышение продукции цитокинов - TNF-α, TGF-β и интерлейкина-8. TNF-α, истощая систему антиоксидантной защиты. Они взаимодействуют с митохондриальными реактивными радикалами кислорода, что приводит к гибели гепатоцитов [Donnelly K.L., Smith С.I., Schwarzenberg S.J., et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with non-alcoholic fatty liver disease / J. Clin. Invest. 2005; 115(5): 1343-51].
Существующая медикаментозная терапия НАЖБП базируется на применении антиоксидантов, главным образом, растительного происхождения, производных аминокислот и препаратов с мембраностабилизирующими свойствами [ Е., Madrigal-Bujaidar Е.,  et al. Review of natural products with hepatoprotective effects / World J. Gastroenterol. 2014; 20(40): 14787-14804]. Несмотря на широкий арсенал используемых гепатопротекторных препаратов, большинство из них не лишены недостатков. Ряд гепатопротекторов имеют крайне низкую биодоступность: у S-аденозилметионина она составляет 2-3% [Goren J.L., Stoll A.L., Damico K.E., et al. Bioavailability and lack of toxicity of S-adenosyl-L-methionine (SAMe) in humans / Pharmacotherapy. 2004; 24(11): 1501-1507], силимарина - 13% (при пероральном введении у крыс) [Morazzoni P., Montalbetti A., Malandrino S., Pifferi G. Comparative pharmacokinetics of silipide and silymarin in rats / Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet. 1993; 18(3):289-97]. Препараты флавонолигнанов (силимарин) и эссенциальных фосфолипидов усиливают холестаз и обладают высоким аллергогенным потенциалом [Морозов С.В. Гепатопротекторы в клинической практике: рациональные аспекты использования: пособие для врачей / С.В. Морозов, Ю.А. Кучерявый. М.: 4ТЕ Арт, 2011. 28 с].
Данные об эффективности антиоксидантов для профилактики и лечения НАЖБП неоднозначны [Оковитый С.В., Суханов Д.С., Романцов М.Г. Гепатотропные средства: современное состояние проблемы / Тер. архив. 2012; 2: 62-68]. Несмотря на относительно большой спектр средств для подавления реакций свободнорадикального окисления, их применение сдерживается такими проблемами, как токсичность некоторых фенольных антиоксидантов и вытеснение эндогенных антиоксидантов при использовании синтетических соединений [Александрова А.Е. Антигипоксическая активность и механизмы действия некоторых синтетических и природных соединений / Эксп. клин, фарм. 2005; 68(5): 72-78]. Широкое применение одного из известных антиоксидантных препаратов, α-липоевой кислоты, ограничено возникновением таких нежелательных явлений, как гастро- и нефротоксичность, головная боль при приеме внутрь, раздражение кожи и зуд при парентеральном введении [Spain R.I., Andeen N.K., Gibson Р.С. Lipoic acid supplementation associated with neural epidermal growth factor-like 1 (NELLl)-associated membranous nephropathy / Kidney Int. 2021; 100(6):1208-1213. Polat S.,  F.T. Alpha-lipoic acid intoxication in an adolescent girl: Case report and review of the literature / Case Reports Turk. Pediatri. Ars. 2020; 55(3): 328-330]. Терапевтическая доза α-липоевой кислоты достигает 600 мг/сут; уже при 1200 мг/сут наблюдаются токсические эффекты, что свидетельствует о низком терапевтическом индексе соединения [Han Т., Bai J., Liu W., Hu Y. A systematic review and meta-analysis of α-lipoic acid in the treatment of diabetic peripheral neuropathy / Eur. J. Endocrinol. 2012, 167: 465-471]. Указанные факторы определяют целесообразность поиска альтернативных эффективных и безопасных средств для лечения НАЖБП.
Фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF) является важнейшим представителем группы нейротрофинов. Известно, что NGF экспрессируется не только в нейронах, но и в клетках различных периферических органов, включая печень. Имеются данные о способности NGF защищать гепатоциты от оксидативных повреждений, вызванных ксенобиотиками. Этот эффект устраняется антителами к NGF, которые усиливают повреждающий эффект оксидативного стресса в отношении клеток печени [Valdovinos-Flores С., Gonsebatt М.Е. Nerve growth factor exhibits an antioxidant and an autocrine activity in mouse liver that is modulated by buthionine sulfoximine, arsenic, and acetaminophen / Free Radic. Res. 2013; 47(5): 404-412]. Однако ввиду низкой энзиматической устойчивости нативных нейротрофинов и неспособности в условиях системного введения проникать через биологические барьеры, их практическое использование невозможно. Влияние NGF на печень исследовалось только в условиях его локальной аппликации к первичным культурам гепатоцитов или при внутрибрюшинном введении рекомбинантной молекулы.
93
94
95
96
В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова в течение ряда лет разрабатывается оригинальная стратегия, заключающаяся в конструировании системно-активных низкомолекулярных миметиков отдельных петель нейротрофинов [Gudasheva Т.А., Antipova Т.А., Seredenin S.B. Novel low-molecular-weight mimetics of the nerve growth factor / Dokl. Biochem. Biophys. 2010; 434: 262-265. Gudasheva T.A., Ostrovskaya R.U., Seredenin S.B. Novel technologies for dipeptide drugs design and their implantation / Curr. Pharm. Des. 2018; 24(26): 3020-3027]. На основе последовательности Asp-Glu-Lys-Gln β-изгиба 4-й петли NGF сконструирован дипептидный миметик - гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) [Патент РФ №2410392, 2010; Патент US 9.683.014 В2, 2017; Патент CN 102365294 В, 2016]. Нейропротективная активность гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) изучена in vitro как на иммортализованных, так и на первичных клеточных культурах. Показано, что гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина в микро- и наномолярных концентрациях повышает выживаемость нейрональных клеток в условиях токсического воздействия пероксида водорода, глутаминовой кислоты, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином [Гудашева Т.А., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Новые низкомолекулярные миметики фактора роста нервов / ДАН. 2010; 434: 4: 262-265]. Убедительные доказательства нейропротективного действия гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) получены также в опытах in vivo. Показана эффективность данного соединения на различных моделях болезни Альцгеймера, а также фокальной и глобальной церебральной ишемии и геморрагического инсульта [Середенин С.Б., Гудашева Т.А. Создание фармакологически активной малой молекулы, обладающей свойствами фактора роста нервов / Ж. невр. и псих. им. С.С. Корсакова 2015; 115(6): 63-70].
Одним из наиболее часто применяемых и эффективных способов моделирования НАЖБП у лабораторных животных является использование высокожировой диеты (ВЖД), которая имитирует поступление избыточного количества свободных жирных кислот и холестерина [Zhang М., Lv X.Y., Li J., et al. The characterization of high-fat diet and multiple low-dose streptozotocin induced type 2 diabetes rat model / Exp. Diab. Res. 2008; ID 704045.  et al. Biochemical and nutritional overview of diet-induced metabolic syndrome models in rats: what is the best choice? / Nutr. and Diab. 2020; 10: 24]. Исходя из этого, представляется важным оценить эффективность гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) на модели НАЖБП, развивающейся при использовании ВЖД.
Сущность изобретения
Сущностью изобретения является использование гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в качестве средства для лечения НАЖБП, проявляющего активность в дозе 5 мг/кг при пероральном введении в отношении функционального и морфологического состояния печени.
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала лекарственных средств для лечения НАЖБП, получение более эффективного, безопасного, нетоксичного, пригодного для перорального использования средства.
Изобретение поясняется чертежом, подробно описанным в примере 3, где показано влияние гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) на морфологическую структуру печени: фиг. 1 - Микрофотографии гистологических препаратов ткани печени крыс. А - контрольная группа (стандартный корм); В - группа ВЖД+ФР; С - группа ВЖД+А (гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)). Окраска гематоксилин-эозином.
Ниже приводятся конкретные примеры, которые иллюстрируют, но не ограничивают данное изобретение.
Пример 1.
Как следует из материалов, приведенных в таблице 1, гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) обладает рядом преимуществ в сравнении с существующими гепатопротекторными средствами.
50
Таким образом, среди существующих гепатопротекторных средств, гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) имеет самую низкую терапевтическую дозу (5 мг) при пероральном введении и самую высокую токсическую дозу LD (714 мг/кг), что свидетельствует о большой широте его терапевтического действия. Экспериментально установлено, что биодоступность гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) у крыс при внутрибрюшинном введении составляет 84,6%.
Пример 2. Влияние гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) на уровень холестерина и триглицеридов.
Эксперименты выполнены на взрослых крысах-самцах линии Wistar с исходной массой тела 250-270 г, полученных из питомника «Столбовая». Животные содержались в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 и ГОСТ 33215-2014 при соблюдении светового режима (12 ч свет и 12 ч темнота), средней температуре 22±2°С и 60% влажности воздуха. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями ГОСТ 33044-2014 и Директивой Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.
Животных (n=24) случайным образом делили на три равные группы, одна из которых оставалась на стандартном корме калорийностью 290 ккал/100 г (n=8, контроль), а две другие группы содержались на диете с высоким содержанием жиров в течение 12 недель. ВЖД готовилась ex tempore по описанной методике [Shaykhutdinova E.R., Palikov V.A., Palikova Y.A., et al. Effect of standard and high-fat diets during modeling of streptozotocin-induced diabetes in Rats on the development of complications / Bull. Exp. Biol. Med. 2021; 170(6): 737-740] посредством добавления к 450 г стандартного корма 150 г растопленного свиного смальца, 5 г поваренной соли и 15 г глутамата натрия. Данный рацион характеризуется содержанием 45% жиров, 35% углеводов, 20% белков и общей калорийностью 516 ккал/100 г. Одной группе крыс (n=8), находящейся на ВЖД, с 9-й по 12-ю недели эксперимента ежедневно перорально вводили 0,9% раствор NaCl (ВЖД+ФР), другой группе (n=8) в этом же режиме перорально гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 5 мг/кг (ВЖД+А). Животные имели свободный доступ к корму (за исключением 12 ч, предшествующих измерению холестерина и триглицеридов в крови) и к питьевой воде ad libitum. Определение уровня холестерина и триглицеридов в крови осуществляли с использованием экспресс-анализатора Accutrend Plus (Roche, Германия) в первый и последний день терапии.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Biostat. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий между группами оценивали тестом ANOVA с последующим тестом Бонферрони. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M±SEM). Различие показателей считалось достоверным при р<0,05.
У животных группы ВЖД+ФР уровень холестерина был на 80%, а триглицеридов -почти на 95% выше, чем у животных, получавших стандартный корм. Введение гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) способствует снижению уровня холестерина на 30% по сравнению с группой ВЖД+ФР. Уровень триглицеридов в крови у крыс с ВЖД, леченных соединением по изобретению, был ниже на 28% ниже, чем у крыс группы ВЖД+ФР (табл. 1).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о нарушении липидного обмена в условиях применения ВЖД и о нормализующем влиянии гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) на его показатели.
Пример 3. Влияние гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) на морфологическую структуру печени
Эксперименты выполнены на взрослых крысах-самцах линии Wistar с исходной массой тела 250-270 г, полученных из питомника «Столбовая». Животные содержались в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 и ГОСТ 33215-2014 при соблюдении светового режима (12 ч свет и 12 ч темнота), средней температуре 22±2°С и 60% влажности воздуха. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями ГОСТ 33044-2014 и Директивой Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.
Животных (n=24) случайным образом делили на три равные группы, одна из которых оставалась на стандартном корме калорийностью 290 ккал/100 г (n=8, контроль), а две другие группы содержались на диете с высоким содержанием жиров в течение 12 недель. ВЖД готовилась ex tempore по описанной методике [Shaykhutdinova E.R., Palikov V.A., Palikova Y.A., et al. Effect of standard and high-fat diets during modeling of streptozotocin-induced diabetes in Rats on the development of complications / Bull. Exp. Biol. Med. 2021; 170(6): 737-740] посредством добавления к 450 г стандартного корма 150 г растопленного свиного смальца, 5 г поваренной соли и 15 г глутамата натрия. Данный рацион характеризуется содержанием 45% жиров, 35% углеводов, 20% белков и общей калорийностью 516 ккал/100 г. Одной группе крыс (n=8), находящейся на ВЖД, с 9-й по 12-ю недели эксперимента ежедневно перорально вводили 0,9% раствор NaCl (ВЖД+ФР), другой группе (n=8) в этом же режиме перорально вводили гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 5 мг/кг (ВЖД+А). Животные имели свободный доступ к корму и к питьевой воде ad libitum. Животных умерщвляли декапитацией под эфирным наркозом. Фрагменты из центральных участков печени размером до 1 см фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН=7,4) (Sigma, США) на 24 ч, обезвоживали и заливали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с помощью микротома (Micritome Jung RM2035, Германия). Полученные срезы окрашивали гематоксилин-эозином по методике производителя (Блик MedicalProduction, Россия), после чего препараты обезвоживали и заключали под покровные стекла.
Микроскопический анализ проводили по 10 полям зрения каждого препарата с использованием микроскопа Olympus СХ 31 с цифровой камерой Olympus ХС 30 (Olympus, Япония), персонального компьютера и программного обеспечения Arstek Image View (Arstek, Россия) при увеличении окуляра х10 и объективов х10, х40. Оценивали архитектонику органа, состояние сосудов, признаки воспалительного процесса, наличие двухъядерных гепатоцитов. Для оценки распространенности воспалительно-дистрофических реакций в паренхиме органа использовали оценочную шкалу, предложенную J. Zhao et al. [Zhao J., Zhang Y., Wan Y., et al. Pien Tze Huang Gan Bao attenuates carbon tetrachloride-induced hepatocyte apoptosis in rats, associated with suppression of p53 activation and oxidative stress / Mol. Med. Rep. 2017; 16(3): 2611-2619]:
0 - отсутствуют признаки воспалительной реакции и дистрофических явлений гепатоцитов;
+ - воспалительный процесс и дистрофия охватывают не более 33% паренхимы печени;
++ - воспалительный процесс и дистрофические явления в гепатоцитах распространяются на площадь, равную 33-66% паренхимы органа;
+++ - более 66% площади паренхимы печени вовлечены в воспалительно-дистрофический процесс.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Biostat. Различия в выраженности морфологических изменений в структуре печени анализировались с помощью критерия хи-квадрат.
Морфологический анализ печени, проведенный по окончании эксперимента, показал, что у крыс, получавших стандартный корм, морфологическая структура печени соответствовала норме. Портальные тракты умеренно выражены, стенки сосудов четкие, тонкие. Агрегации эритроцитов и сладжа не обнаружено. Установлена дольковая структура и балочное строение паренхимы. Гепатоциты полигональной формы с четкими овальными или сферическими ядрами, расположенными в центре клетки, эозинофильной цитоплазмой. Печеночные пластинки начинаются от центральной вены, дольки печени располагаются веерообразно от центра к периферии (фиг. 1А).
В микропрепаратах печени крыс группы ВЖД+ФР отмечено полнокровие ткани с расширением сосудов и синусоид, агрегация и частичный внутрисосудистый гемолиз эритроцитов. Дольчатое строение печеночной ткани размыто, структура печеночных балок нарушена. Отмечены двухъядерные гепатоциты. Выявлена баллонная дистрофия гепатоцитов, характеризующаяся набуханием и заметным увеличением клеток с разряженной цитоплазмой, ацидофильными гранулами и сгустками промежуточных филаментов. Данные изменения, являющиеся характерными для НАЖБП, затрагивали более 2/3 паренхимы печени. На периферии дольки встречаются бесструктурные гепатоциты, между которыми видны явления лейко- и лимфоцитарной инфильтрации (фиг. 1В).
В микропрепаратах печени крыс, находящихся на ВЖД и терапии гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизином), отмечено умеренное полнокровие сосудов с менее выраженными по сравнению со здоровыми животными явлениями агрегации эритроцитов в их просветах. Сохранялась дольковая структура и балочное строение печеночной дольки. Портальные тракты расширены незначительно, со слабой очаговой лимфоидной инфильтрацией. Количество двухъядерных гепатоцитов уменьшено (фиг. 1С). На фоне терапии также было снижено количество лейкоцитарных инфильтратов, выраженность баллонной дистрофии (табл. 3).
Таким образом, если у крыс, находящихся на стандартном корме, полностью отсутствуют признаки воспалительной реакции и дистрофических явлений гепатоцитов, то в условиях содержания на ВЖД отмечаются значимые дистрофические изменения, затрагивающие от 1/3 до 2/3 паренхимы печени. На фоне терапии гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизином) отмечено достоверное снижение количества животных со значимым (более 2/3 площади органа) поражением печени, что свидетельствует о гепатопротекторном действии соединения.
Пример 4. Влияние гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) на показатели абдоминального ожирения
Эксперименты выполнены на взрослых крысах-самцах линии Wistar с исходной массой тела 250-270 г, полученных из питомника «Столбовая». Животные содержались в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 и ГОСТ 33215-2014 при соблюдении светового режима (12 ч свет и 12 ч темнота), средней температуре 22±2°С и 60% влажности воздуха. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями ГОСТ 33044-2014 и Директивой Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.
Животных (n=24) случайным образом делили на три равные группы, одна из которых оставалась на стандартном корме калорийностью 290 ккал/100 г (n=8, контроль), а две другие группы содержались на диете с высоким содержанием жиров в течение 12 недель. ВЖД готовилась ex tempore по описанной методике [Shaykhutdinova E.R., Palikov V.A., Palikova Y.A., et al. Effect of standard and high-fat diets during modeling of streptozotocin-induced diabetes in Rats on the development of complications / Bull. Exp. Biol. Med. 2021; 170(6): 737-740] посредством добавления к 450 г стандартного корма 150 г растопленного свиного смальца, 5 г поваренной соли и 15 г глутамата натрия. Данный рацион характеризуется содержанием 45% жиров, 35% углеводов, 20% белков и общей калорийностью 516 ккал/100 г. Одной группе крыс (n=8), находящейся на ВЖД, с 9-й по 12-ю недели эксперимента ежедневно перорально вводили 0,9% раствор NaCl (ВЖД+ФР), другой группе (n=8) в этом же режиме перорально вводили гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 5 мг/кг (ВЖД+А). Животные имели свободный доступ к корму и к питьевой воде ad libitum. По окончании эксперимента проводили оценку массы тела и его длины от кончика носа до начала хвоста. Эти показатели использовались для расчета индекса массы тела (ИМТ), а также окружности грудной клетки (ОГ) и живота (ОЖ) для расчета соотношения ОЖ/ОГ [Novelli E.L., Diniz Y.S., Galhardi С.М., et al. Anthropometrical parameters and markers of obesity in rats / Lab. Anim. 2007; 41(1): 111- 119].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Biostat. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий между группами оценивали тестом ANOVA с последующим тестом Бонферрони. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M±SEM). Различие показателей считалось достоверным при р<0,05.
ВЖД способствовала росту массы жировой ткани и абдоминальному ожирению, что отражалось в увеличении соотношения ОЖ/ОЕ на 11% у животных, находящихся на ВЖД, по сравнению с контролем. ИМТ у животных, находящихся на ВЖД, на 14% превышал ИМТ животных, получавших стандартный корм. ИМТ и ОЖ/ОЕ крыс, леченных гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизином), достоверно не отличался от ИМТ здоровых животных (табл. 3).
Таким образом, ВЖД вызывала развитие абдоминального ожирения, характеризующееся ростом ИМТ и соотношением ОЖ/ОГ, а применение гексаметилендиамид (бис-N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) способствовало нормализации данных показателей.