Глюкозостимулированной секреции инсулина в -клетках при усилении гликолиза и подавлении митохондриального метаболизма

болевания отмечалось значительное повышение концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1в и ИЛ-6 (табл. 1). На 7-е сутки заболевания у больных 1-й группы отмечено значительное снижение медианы ИЛ-1в (р=0,041) в 1,9 раза в сравнении с исходным уровнем, которое продолжилось и на 14-е сутки до 2 раз (р=0,001).

Что касается второй группы больных, то у них отмечалась противоположная тенденция к дальнейшему повышению медианы ИЛ-1в на 7-е сутки до 1,2 раз, и лишь к 14-м суткам отмечалось некоторое снижение его медианы до уровня в 1,1 раз выше исходных. Анализируя изменения динамики ИЛ-6 (табл. 2) было отмечено, что у обеих групп также на 1-е сутки отмечалось увеличение его показателей, а на 7-е сутки был выявлен рост медианы данного цитокина в 1,2 раза выше исходных у больных обеих групп. На 14-е сутки было отмечено значимое снижение медианы ИЛ-6 у больных первой группы в 1,4 раза (р < 0,001), в то время как у больных второй группы продолжился рост медианы данного цитокина в 1,5 раза выше исходного уровня.

В литературе имеются данные о том, что высокий уровень цитокинов ИЛ-1в и ИЛ-6 в плазме крови является значимым и независимым предиктором развития инфаркта миокарда, а максимальное увеличение их концентраций связывают с летальным исходом [9]. Выявленное в нашем исследовании положительное влияние раннего применения тромболитической терапии на снижение показателей ИЛ-1в и ИЛ-6 позволяет сделать заключение о том, что тромбо-литическая терапия оказывает также и противовоспалительный эффект у больных с острым инфарктом миокарда и имеет четкий времязависи-мый эффект.

Таким образом, у больных острым инфарктом миокарда с зубцом О отмечается повышение активности системного воспаления, что отражается в увеличении концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1в и ИЛ-6. Снижение содержания ИЛ-1в и ИЛ-6 свидетельствует об эффективности тром-болизиса, что проявляется в подавлении системного воспаления. Динамическое определение сывороточной концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1в и ИЛ-6 на 1-е, 7-е и 14-е сутки у больных инфарктом миокарда с зубцом О может быть применено в клинической практике в качестве дополнительного диагностического критерия, свидетельствующего об эффективности тромболизиса.

Таблица 2

Выраженность изменений показателей ИЛ-6 в зависимости от времени начала тромболитической терапии

Время от начала тромболитической терапии Уровень ИЛ-6 (медиана и интерквадратильный размах), пкг/мл р,-2 р,-3

1 Исходно 2 Через 7 суток 3 Через 14 суток

До 90 минут 23 (12-39) 29 (18-38) 16 (9-29) НД 0,001

До 3-х часов 28 (16-37) 35 (19-36) 42 (28-49) НД НД

ЛИТЕРАТУРА

1. Городецкий В.В. Инфаркт миокарда // Consilium medicum. - 2000. - Т. 2. №9. - С.5-9.

2. Крыжановский В.А. Тромболизис при инфаркте миокарда // Кардиология. - 2001. - Т. 41. № 6. - С.67-79.

3. Пархоменко А.Н., Соколов Ю.Н., Иркин О.И. и др. Острый коронарный синдром с подъемом сегмента ST: новые возможности восстановления коронарной и тканевой перфузии // Сб. Института кардиологии им. Н.Д. Стражеско АМН Украины. - Киев, 2003. - С.15-19.

4. Руда М.Я. Что нужно знать практическому врачу о тромболитической терапии при инфаркте миокарда // Сердце. - 2002. - №1. - С.9-12.

5. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. - СПб.: ВМедА, 2002. - 266 с.

6. Martins T.B., Anderson J.L., Muhlestein J.B., et al. Risk factor

analysis of plasma cytokines in patients with coronary artery disease by a multiplexed fluorescent immunoassay // Am. J. Clin. Pathol. - 2006. - Vol. 125. №6. - P.906-913.

7. Ridker P.M. Inflammatory biomarkers and risks ofmyocardial infarction, stroke, diabetes, and total mortality: implications for longevity // Nutr. Rev. - 2007. - Vol. 65. - P.253-259.

8. Srinivas G., Anversa P., Frishman W.H. Cytokines and myocardial regeneration: a novel treatment option for acute myocardial infarction // Cardiol.Rev. - 2009. - Vol. 17. №1. -P.1-9.

9. Turner N.A., Mughal P., Warburton R.S., et al. Mechanism of TNFa-induced IL-1a, IL-1p and IL-6 expression in human cardiac fibroblasts: Effects of statins and thiazolidinediones // Cardiovascular Research. - 2007. - №76. - P.81-90.

10. Van de Werff, Ardissiono D., Betrin A. Management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation // Eur. Heart J. - 2003. - Vol. 24. - P.28-66.

Информация об авторах: 644010, г. Омск, ул. Масленникова, д. 21, кв. 11; e-mail: traschenko@bk.ru; Тращенко Андрей Сергеевич - ассистент, Ахмедов Вадим Адильевич - д.м.н., профессор кафедры.

© ШАРОЙКО В.В., ЧУРКИН В.А., КЕРШЕНГОЛЬЦ Б.М. - 2010

ГЛЮКОЗОСТИМУЛИРОВАННОЙ СЕКРЕЦИИ ИНСУЛИНА В В-КЛЕТКАХ ПРИ УСИЛЕНИИ ГЛИКОЛИЗА И ПОДАВЛЕНИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА

В.В. Шаройко, В.А. Чуркин, Б.М. Кершенгольц

Резюме. Молекулярные механизмы, лежащие в основе глюкозостимулированной секреции в панкреатических в-клетках, до конца не выяснены. С целью обнаружения метаболических нарушений, ослабляющих глюкозостимулированную секрецию инсулина, мы провели сравнительный анализ клональных в-клеток линии ШБ-1 - глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительных (832/2). Были измерены следующие параметры: глюкозостимулированная секреция инсулина, скорость утилизации глюкозы (т.е. гликолиз), скорость клеточного дыхания, отражающая активность электронно-транспортной цепи, скорость митохондриальной продукции АТФ, активность комплексов I, III и IV электронно-транспортной цепи. Было установлено, что сопряженная метаболическая регуляция, усиливающая митохондриальный метаболизм и ограничивающая гликолиз в в-клетках 832/13, требуется для стабильной глюкозозависимой секреции инсулина в-клетки. в-клеточные линии 832/13 и 832/2 могут быть также информативной моделью для изучения метаболических нарушений, развивающихся при СД2.

Ключевые слова: в-клетки, гликолиз, метаболизм, секреция инсулина.

INTERSIFICATION OF GLYCOLISIS AND SUPPRESSION OF MITOCHONDRIAL METABOLISM CAUSE THE LOSS OF GLUCOSE-STIMULATED INSULIN SECRETION IN B-CELLS

V.V. Sharoyko, V. A. Churkin, B.M. Kershengolts

Summary. The molecular mechanisms underlying glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic в-cells are not completely understood. To identify metabolic disturbances in в-cells that impair glucose-stimulated insulin secretion, we compared two INS-1-derived clonal в-cell lines, which are glucose-responsive (832/13) or glucose-unresponsive (832/2). We analysed insulin secretion, stimulated by glucose; rates of glucose utilization and glycolysis; rates of respiration reflecting electron transport chain activity; rates of mitochondrial ATP production; activities of complexes I, III and IV of the electron transport chain. We conclude that tight metabolic regulation enhancing mitochondrial metabolism and restricting glycolysis in 832/13 cells is required for clonal в-cells to secrete insulin in response to glucose. The 832 в-cell lines may be helpful tools to resolve metabolic perturbations occurring in Type 2 Diabetes.

Key words: в-cells, glycolisis, metabolism, insulin secretion.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе глюкозостимулированной секреции инсулина в панкреатических в-клетках. до конца не выяснены. Для исследования метаболических нарушений в в-клетках, которые ослабляют глюкозостимулированную секрецию инсулина мы сравнили две клональные линии в-клеток INS-1: глюкозочувствительные (832/13) и глюкозоне-чувствительые (832/2). Данные клоны были получены из одного родительского клона инсулиномы крысы INS-1 путем трансфекции плазмиды, стабильно эспрес-сирующей кДНК человеческого инсулина под контролем цитомегаловирусного промотора. Впоследствии были изолированы клоны INS-1 832/13 и INS-1 832/2 с использованием маркера - гена резистентности к нео-мицину [3]. Целью работы было выяснить как глико-литический и митохондриальный метаболизм в глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительых (832/2) в-клеток влияют на глюкозостимулированную секрецию инсулина.

Материалы и методы

Клетки линии INS-1 (клоны 832/13 и 832/2) культивировались в инкубаторе при 37°С во влажной атмосфере воздуха 95% и концентрацией СО2 5%, в среде RPMI1640. Среда RPMI 1640 содержала 11 мМ D-глюкозы, 10% эмбриональной сыворотки теленка, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 50 мкМ в-меркаптоэтанола [3].

Секреция инсулина в в-клетках 832/13 и 832/2, достигших плотности >90%, измерялась в 24-луночных планшетах. Для измерения секреции инсулина клетки в течение 2 ч инкубировались в буфере, содержащем 114 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ KH2PO4, 1,16 мМ MgSO4, 20 мМ HEPES, 2,5 мМ CaCl2, 25,5 мМ NaHCO3, 0,2% БСА; pH 7,2 и 2,8 мМ глюкозы. Затем добавлялся буфер того же состава, содержащий 2,8 или 16,7 мМ глюкозы для измерения глюкозостимулированной секреции инсулина в течение 1 ч.

Концентрация инсулина в супернатантах измерялась радиоиммунным методом, используя набор реактивов Coat-a-Count

[3].

Выделение и очистка интактных митохондрий в-клеток проводились с использованием метода дифференциального центрифугирования [4].

Измерение активности комплексов I, III, и IV цепи переноса электронов в присутствии субстратов НАДН/ убихинона1, цитохрома С(Ш)/убихинола1 и цитохрома

С(П), соответственно, осуществлялась по методу [1].

Скорость потребления кислорода (клеточное дыхание) измерялась на приборе Seahorse Extracellular Flux Analyzer XF24.

Измерение скорости утилизации глюкозы проводилось с использованием [5-3Н]-глюкозы [2].

Концентрация лактата измерялась спектрофотометрическим методом (Biovision, Mountain view, CA, USA).

Кинетика накопления АТФ регистрировалась люми-нометрическим методом с использованием люцифера-зы светляков [5].

Концентрации белка измерялась с помощью бицин-хониновой кислоты (Thermo, Rockford, USA).

Сатирическая обработка данных проводилась с вычислением t-критерия Стьюдента и использованием пакета программ Sigma Plot для Windows (версия 7.101б SPSS, INC), Statistica (версия 5.0, Statsoft, Inc). Корреляционный анализ проводился, используя непараметрический тест Спирмена. Результаты представлены как среднее ± SE для указанного числа экспериментов. Разницу между средними считали значимой при p< 0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты, представленные таблице 1, показывают, что глюкозостимулированная секреция инсулина значительно отличается между двумя клонами в-клеток. Глюкозочувствительные клетки (832/13) в 11,9 раз увеличивают секрецию инсулина при повышении концентрации глюкозы с 2,8 мМ до 16,7 мМ (р<0,01), тогда как глюкозонечувствительные клетки (832/2) не секретиру-ют инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы.

Гликолиз оценивался по скорости продукции [3H] OH из D-[5-3H]-глюкозы; одна молекула [3H]OH образуется, когда 2-фосфоглицерат превращается в фосфое-

нолпируват под действием енолазы. Примечательно, что базальная скорость утилизации D-[5-3H]-глюкозы (2,8 мМ глюкозы) в 832/2 клетках была уже в 11,6 раза больше, чем в 832/13 клетках (табл. 1; р<0,001). Более того, в

Таблица 1

Секреция инсулина и активность гликолиза в глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительных (832/2) в-клетках

Параметры 2,8 мМ глюкозы 16,7мМ глюкозы

832/13 832/2 832/13 832/2

Секреция инсулина, нг/ч/мг белка 9,1±2,4 13,1±2,5 101,8±14,2 12,3±2,3

Активность гликолиза, нмоль/ч/мг белка 21,7±3,4 236,0±28,6 76,7±12,2 276,2±36,0

Лактат, нмоль/ч/мг белка не обнаружен 130,3±35,2 не обнаружен 142,8±37,3

Время, мин

Результаты четырех независимых экспериментов представлены как среднее±стандартная ошибка (*р<0,05 относительно 2,8 мМ глюкозы в клетках 832/13).

Рис. 1. Скорость поглощения кислорода (дыхание) в 832/13 р-клетках возрастает с увеличением концентрации глюкозы, а в 832/2 р-клетках скорость поглощения кислорода не изменяется с увеличением концентрации глюкозы.

832/2 клетках, стимуляция глюкозой далее не увеличивала скорость утилизации глюкозы, как это происходило в 832/13 клетках; при 16,7 мМ глюкозы 832/13 клетки использовали в 3,8 раза больше глюкозы, чем при 2,8 мМ (табл. 1). Высокая скорость гликолиза в 832/2 клетках, требующая регенерации НАД+ для поддержания гликолиза (т.е. превращение глицеральдегид-3-фосфата

Таблица 2

Активность митохондриального метаболизма в глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительных (832/2) р-клетках

Параметры 832/13 832/2

Продукция митохондриальной АТФ, нмоль/мин/мг белка 15,4+2,1 6,5±1,5

Активность комлекса I, мкмоль НАДН/мин/мг белка 5,6±0,9 2,2±0,2

Активность комлекса III, мкмоль цитохрома С (Ш)/мин/мг белка 12,5±0,3 4,7±1,1

Активность комлекса IV, мкмоль цитохрома С (И)/мин/мг белка 33,3+2,4 11,6+1,4

в 1,3-бифосфоглицерат), может сопровождаться восстановлением пирувата в лактат, катализируемое лак-татдегидрогеназой. Действительно, было обнаружено образование лактата, который высвобождался в инкубационную среду в 832/2 клетках, но не детектировался в 832/13 клетках (табл. 1). В 832/2 клетках продукция

лактата отражает скорость утилизации глюкозы и поэтому, активность гликолиза в этих клетках.

Было измерено клеточное дыхание как следующая стадия клеточного метаболизма, относящееся к секреции инсулина. Глюкозочувствительные клетки 832/13 продемонстрировали прогрессирующее увеличение клеточного дыхания после добавления 16,7 мМ глюкозы по сравнению с базальной скоростью потребления кислорода при 2,8 мМ глюкозы. Это свидетельствует об увеличении доступности субстратов, образовавшихся в ходе гликолиза, для ЦТК и стимуляции окислительного фосфорилирования (рис. 1; р<0,05). С другой стороны, глюкозонечувствительные клетки 832/2 демонстрировали повышение базальной скорости клеточного дыхания в 1,6 раза (р<0,05), а увеличения скорости дыхания не наблюдалось при повышении концентрации глюкозы до 16,7 мМ (рис. 1).

В ^-клетках важной функцией митохондриального метаболизма является продукция АТФ - главного триггера секреции инсулина. Для оценки способности клеток 832/13 и 832/2 синтезировать АТФ, была измерена скорость митохондриальной продукции АТФ в пермебиализованных дигитоном клетках в присутствии 15 мМ глутамата и 15 мМ сукцината. При таких условиях не учитываются респираторные ограничения ввиду лимитирующих концентраций субстратов. Таким образом, была измерена стадия 3 синтеза АТФ, которая была в 2,5 раза выше в глюкозочувствительных клетках 832/13 по сравнению с глюкозонечувствительными 832/2 (табл. 2; р<0,05).

Для выяснения причины различий в скоростях митохондриальной продукции АТФ были измерены активности комплексов I, III и IV электроннотранспортной цепи в выделенных митохондриях. С ослаблением респираторного ответа на повышение концентрации глюкозы в глюкозонечувствительных клетках 832/2 активность комплексов была в 2,7-, 3,0- и 2,9-раза, соответственно, ниже по сравнению с глюкозочувствительными клетками 832/13 (табл. 2; р<0,05, р<0,001, р<0,01, соответственно).

В результате исследования было показано, что митохондриальный метаболизм играет ключевую роль в секреции инсулина. Сопряженная метаболическая регуляция, усиливающая митохондриальный метаболизм и ограничивающая гликолиз в ^-клетках, требуется для стабильной глюкозозависимой секреции инсулина. Приоритизация митохондриального метаболизма необходима для функционирования здоровой ^-клетки. в-клеточные линии 832/13 и 832/2 могут быть также информативной моделью для изучения метаболических нарушений, развивающихся при СД2.

ЛИТЕРАТУРА

1. Birch-Machin M.A., Turnbull D.M. Methods in molecular biology // Clifton, N.J. - 2001. - Vol. 65. - P.97-117.

2. Hirose H., Lee Y.H., Inman L.R., et al. Defective fatty acid-mediated beta-cell compensation in Zucker diabetic fatty rats. Pathogenic implications for obesity-dependent diabetes // The Journal of biological chemistry. - 1996. - Vol. 271. №10. - P5633-5637.

3. Hohmeier H.E., Mulder H., Chen G., et al. Isolation of

INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion // Pharmacol Ther. - 2000. - Vol. 49. №3. - P424-430.

4. Rabilloud T. Methods in molecular biology // Clifton, N.J. -2008. - Vol. 432. - P83-100.

5. Wibom R., Hagenfeldt L., Dobeln U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples // Anal. Biochem. - 2002. - Vol. 311. - P139-151.

Информация об авторах: 677000, г. Якутск, пр. Ленина, 41; e-mail: sharoyko@gmail.com; Шаройко Владимир Владимирович - к.б.н., научный сотрудник лаборатории экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны ЯНЦ СО РАН; Чуркин Владимир Александрович - доцент кафедры анатомии медицинского института при Якутском государственном университете, к.м.н.; Кершенгольц Борис Моисеевич - зав. лабораторией экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических

проблем криолитозоны СО РАН, д.б.н., профессор.