Роль катализаторов обмена нуклеотидов ГТФаз семейства Rho в передаче сигналов от микротрубочек к актиновому цитоскелету

М. Крендель

РОЛЬ КАТАЛИЗАТОРОВ ОБМЕНА НУКЛЕОТИДОВ ГТФаз СЕМЕЙСТВА Rho В ПЕРЕДАЧЕ СИГНАЛОВ ОТ МИКРОТРУБОЧЕК К АКТИНОВОМУ ЦИТОСКЕЛЕТУ

Йельский Университет, Нью-Хейвен, США

Микротрубочки играют важную роль в координации разных видов активности акгинового цитоскелета во время миграции клеток. Нами показано, что активатор регуляторного белка Rho GEF-H1, экспрессированный в культуральных клетках, колокализуется с микротрубочками. Версии GEF-H1, которые содержат делеции, нарушающие взаимодействие с микротрубочками, имеют более высокую активность по отношению к Rho in vivo и вызывают сокращение клеток и образование стресс-фибрилл. Эти наблюдения показывают, что взаимодействие с микротрубочками ингибирует активность GEF-H1 и GEF-H1 может участвовать в активации Rho, вызванной разборкой микротрубочек. Таким образом, активаторы регуляторных белков семейства Rho (GEF) могут играть важную роль в передаче сигналов от микротрубочек к актину и миозину.

Ключевые слова: микротрубочки, актиновый цитоскелет, малые ГТФазы.

Microtubules play an important role in coordination of actin skeleton activities during cell migration. We demonstrated CEF-H1, a Rho regulatory protein activator expressed on cultured cells, to localize to microtubules. CEF-H1 versions that contain deletions affecting the interaction with microtubules have a higher Rho activating capacity in vivo and induce cell contraction and stress fiber generation. These observations demonstrate that the interaction with microtubules inhibits CEF-H1 activity and that the CEF-Hl may contribute to Rho-activation due to microtubule disruption. Therefore, the Rho regulatory protein activators (CEFs) may mediate cross-talk of microtubules with actin and myosin.

Key words: microtubules, actin cytoskeleton, small GTPases.

Актиновые филаменты и связанные с ними молекулы миозина обеспечивают сократительную активность, которая необходима для миграции эукариотических клеток. Для того чтобы клетки могли двигаться в определенном направлении, например к источнику химического стимула во время хемотаксиса, полимеризация актина и сократительная активность миозина в разных частях клетки должны точно регулироваться. В мигрирующих клетках полимеризация актина происходит наиболее активно у ведущего края, где сборка новых актиновых филаментов приводит к образованию ламеллоподий. Сократительная активность миозина, напротив, наиболее высока в хвосте клетки. Еще в начале 70-х гг. была выдвинута гипотеза, что микротрубочки играют важную роль в координации разных видов активности актинового цитоскелета во время миграции клеток [1]. Фиб-робласты, в которых микротрубочки деполимеризованы, образуют новые ламеллоподии вдоль всего свободного края, вместо того чтобы выбрасывать ламеллоподии только на

© Крендель М., 2003 УДК 577.155.2:576.3/.7

ведущем крае [16], что приводит к потере способности к направленному перемещению. Скорость образования ламеллоподий в фибробластах, в которых разобраны микротрубочки, понижена [1]. Ингибирование ламеллоподиальной активности наблюдается также в клетках, обработанных но-кодазолом в низкой концентрации, которая не вызывает полной разборки микротрубочек, но предотвращает рост и укорочение существующих микротрубочек [10]. Таким образом, присутствие динамичных (растущих и укорачивающихся) микротрубочек, по-видимому, необходимо для поддержания ламеллоподиальной активности в фибробластах и других поляризованных клетках. Помимо регуляции сборки актиновых филаментов на ведущем крае микротрубочки также участвуют в регуляции активности миозина в теле клетки, поскольку разборка микротрубочек вызывает увеличение клеточной сократимости и способствует образованию актиновых стресс-фибрилл [2]. Микротрубочки также влияют на общую организацию актиновых филаментов в эпителиальных клетках, где разборка микротрубочек вызывает образование радиальных пучков актиновых филаментов вместо кольцевых актиновых пучков, которые наблюдаются

в контрольных клетках [6]. В отличие от фибробластов и других поляризованных клеток образование ламеллоподий в эпителиальных клетках не зависит от микротрубочек [5].

Недавние исследования показали, что взаимодействие между микротрубочками и актином может быть опосредовано ГТФ-связывающими белками семейства Rho. Рост микротрубочек приводит к активации белка Rae, который вызывает образование ламеллоподий [17]. Разборка микротрубочек вызывает активацию Rho, который в свою очередь активирует миозин и вызывает образование стресс-фибрилл [3; 11; 13]. Неизвестно, каким образом изменения в динамике микротрубочек вызывают активацию белков Rho. Недавно было показано, что несколько активаторов обмена нуклеотидов (GEF), белков семейства Rho, взаимодействуют с микротрубочками или с белками, ассоциированными с микротрубочками [4; 8; 14]. Таким образом, GEF могут участвовать в передаче сигналов от микротрубочек к актиновому цитоскелету.

Активаторы обмена нуклеотидов, взаимодействующие с Rho

В настоящее время известны три активатора обмена нуклеотидов, которые вызывают связывание ГТФ с Rho и колока-лизуются с микротрубочками: человеческие белки GEF-H1 [14] и pl90RhoGEF [15] и мышиный гомолог GEF-H1, называемый Lfc [4]. Эти белки, как и все другие активаторы обмена нуклеотидов малых ГТФаз Rho, принадлежат к семейству белков Dbl и содержат два белковых домена DH и PH, которые необходимы для катализа обмена нуклеотидов. Помимо доменов DH и PH, GEF-Hl, pl90RhoGEF и Lfc содержат цинковый палец на N-конце. Белок pl90RhoGEF также содержит N-концевой участок, богатый лейцинами.

GEF-H1, экспрессированный в культуральных клетках, колокализуется с микротрубочками [9]. Делеция N- или С-конца вызывает потерю взаимодействия GEF-H1 с микротрубочками. Такой же эффект имеет инактивирующая мутация в цинковом пальце. Таким образом, цинковый палец и С-концевой домен GEF-H1, по-видимому, необходимы для взаимодействия с микротрубочками. Версии GEF-H1, которые содержат делеции, нарушающие взаимодействие с микротрубочками, имеют более высокую активность по отношению к Rho in vivo и вызывают сокращение клеток и образование стресс-фибрилл. Эти наблюдения показывают, что взаимодействие с микротрубочками ингибирует активность GEF-H1 и что GEF-H1 может участвовать в активации Rho, вызванной разборкой микротрубочек. В соответствии с этой гипотезой, доминантно-негативный мутант GEF-H1 предотвращает активацию Rho в клетках, обработанных нокодазолом. Интересно, что продукт альтернативного сплайсинга мРНК GEF-H1 (белок KIAA-0651) не содержит цинкового пальца, не способен связываться с микротрубочками и обладает высокой активностью in vivo. Следовательно, помимо организации микротрубочек уровень активации Rho в клетке может также регулироваться посредством альтернативного сплайсинга.

GEF-H1 может играть важную роль в регуляции активности Rho в мигрирующей клетке. Рост микротрубочек на переднем крае клетки может привести к снижению активности GEF-H1 и Rho, уменьшая активность миозина и позволяя клетке выбрасывать новые ламеллоподии. В то же время

разборка микротрубочек в хвосте клетки может способствовать освобождению и активации GEF-H1, приводя к сокращению миозина и подтягиванию хвоста. Подобный регуляторный механизм может действовать и во время цитокинеза, когда микротрубочки митотического веретена регулируют расположение и сокращение борозды дробления, которая состоит из актиновых и миозиновых филаментов.

Пока неизвестно, оказывает ли связывание с микротрубочками какой-либо эффект на активность pl90RhoGEF. Недавно было установлено, что pl90RlioGEF взаимодействует с белками JIP, которые в свою очередь связываются с моторным белком кинезином, отвечающим за транспорт вдоль микротрубочек [12]. Таким образом, микротрубочки могут отвечать не за регуляцию активности pl90RhoGEF, а за внутриклеточную локализацию этого белка.

Активаторы обмена нуклеотидов, взаимодействующие с Rae

Недавно было установлено, что активатор Rae, белок, называющийся Asef, может связываться с белком АРС [8]. АРС взаимодействует с быстро растущими (плюс) концами микротрубочек и часто локализуется на периферии клеток. Связывание АРС с Asef приводит к активации Asef и повышенной активности Rae, выражающейся в раффлинге и образовании ламеллоподий. Взаимодействие комплекса АРС и Asef с плюс-концами микротрубочек может приводить к периферийной локализации активированного Asef и образованию ламеллоподий на ведущем крае клетки. В настоящее время неизвестно, играет ли взаимодействие АРС и Asef с микротрубочками какую-либо роль в регуляции активности Asef. Поскольку одна из фунидай АРС — это супрессия образования опухолей, интересно отметить, что некоторые из онкогенных мутантов АРС не могут связываться с микротрубочками и взаимодействие подобных мутантов с Asef приводит к активации Asef и повышенной подвижности клеток [7].

Заключение

Гипотеза о том, что микротрубочки могут регулировать организацию и активность актинового цитоскелета, была впервые предложена более 30 лет назад. Недавние исследования показали, что активаторы регуляторных белков семейства Rho (GEF) могут играть важную роль в передаче сигналов от микротрубочек к актину и миозину. Будущие исследования могут привести к выяснению роли активаторов Rho в таких процессах, как клеточная миграция, цитокинез и морфологическая поляризация клеток, а также к более подробному описанию молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию активности белков GEF микротрубочками.

ЛИТЕРА ТУРА

1. Bershadsky A. D., Vaisberg E. A., VasilievJ.M. Pseudopodial activity at the active edge of migrating fibroblast is decreased after drug-induced microtubule depolymerization // Cell Motil. Cytoskeleton. — 1991. — Vol. 19.-P. 152-158.

2. Danowski B. A. Fibroblast contractility and actin organization are stimulated by microtubule inhibitors // J. Cell Sei. — 1989. — \Ы. 93. — P. 255—266.

3. Enomoto T. Microtubule disruption induces the formation of actin stress fibers and focal adhesions in cultured cells: possible involvement of the rho signal cascade // Cell Struct. Funct. — 1996. — Vol. 21. — P. 317—326.

4. Glaven J. A., Whitehead I., Bagrodia S., Kay R., Cerione R. A. The Dbl-related protein, Lfc, localizes to microtubules and mediates the activation of Rac signaling pathways in cells//J. Biol. Chem. —

1999. - Vol. 274. - P. 2279-2285.

5. Gloushankova N. A, KrendelM. P., Sirotkin V. A, Bonder E. M.,

Peder H. H., Vasiliev J. M., Gelfand I. M. Dynamics of active lamellae in cultured epithelial cells: effects of expression of exogenous N -ras oncogene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1995. - \fol. 92. - P. 5322-5325.

6. Gloushankova N. A., Lyubimova A. V., Tint I. S., Feder H. H.,

Vasiliev J. M., Gelfand I. M. Role of the microtubular system in morphological organization of normal and oncogene-transfected epithelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1994. — Vol. 91. —

P. 8597-8601.

7. Kawasaki Y., Sato R., Akiyama T. Mutated APC and Asef are involved in the migration of colorectal tumour cells // Nat. Cell Biol. — 2003. — Vol. 5.-P. 211-215.

8. Kawasaki Y, Senda T., Ishidate T., Koyama R., Morishita T., Iwayama Y., Higuchi O., Akiyama T. Asef, a link between the tumor suppressor APC and G-protein signaling I I Science. — 2000. — Vol. 289. — P. 1194—1197.

9. Krendel M., Zenke F. T., Bokoch G. M. Nucleotide exchange factor GEF-H1 mediates cross-talk between microtubules and the actin cytoskeleton // Nat. Cell Biol. - 2002. - Vol. 4. - P. 294-301.

10. Liao G., Nagasaki T., Gundersen G. G. Low concentrations of nocoda-zole interfere with fibroblast locomotion without significantly affecting microtubule level: implications for the role of dynamic microtubules in cell locomotion //J. Cell Sci. — 1995. — Vol. 108. — P. 3473—3483.

11. Liu B. P., Chrzanowska-Wodnicka M., Burridge K. Microtubule depolymerization induces stress fibers, focal adhesions, and DNA synthesis via the GTP-binding protein Rho I I Cell Adhes. Commun. —

1998. - Vol. 5. - P. 249-255.

12. Meyer D., Liu A, MargolisB. Interaction of c-Jun amino-terminal kinase interacting protein-1 with pl90 rhoGEF and its localization in differentiated neurons // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. —

P. 35 113-35 118.

13. Ren X. D., Kiosses W. B., Schwartz M. A. Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton // Embo. J. —

1999.-Vol. 18. - P. 578-585.

14. Ren Y, Li R., Zheng Y, Busch H. Cloning and characterization of GEF-H1, a microtubule-associated guanine nucleotide exchange factor for Rac and Rho GTPases //J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 273. —

P. 34954-34 960.

15. van Horck F. P., Ahmadian M. R., HaeuslerL. C., Moolenaar W. H., Kranenburg O. Characterization of pl90RhoGEF, a RhoA-specific guanine nucleotide exchange factor that interacts with microtubules //

J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 4948-4956.

16. Vasiliev J. M., Gelfand I. M., Domnina L. V., Ivanova O. Y., Komm S. G., Olshevskaja L. V. Effect of colcemid on the locomotory behaviour of fibroblasts // J. Embryol. Exp. Morphol. — 1970. — Vol. 24. —

P. 625-640.

17. Waterman-Storer C. M., Worthylake R. A., LiuB. P., Burridge K,

Salmon E. D. Microtubule growth activates Racl to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts // Nat. Cell Biol. — 1999. — \bl. 1. — P. 45—50.