СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN CELL THERAPY

Цель и область применения
Настоящее изобретение относится к способам для обеспечения клеточной терапии и их терапевтическому применению.
Предшествующий уровень техники изобретения
Иммунная система у высших позвоночных представляет собой первую линию защиты против различных антигенов, которые могут проникать в организм позвоночного, в том числе против микроорганизмов, таких как бактерии, грибы и вирусы, которые являются этиологическими факторами ряда заболеваний. Кроме того, иммунная система вовлечена в ряд других заболеваний или нарушений, включая аутоиммунные или иммунопатологические заболевания, синдромы иммунодефицита, атеросклероз и различные опухолевые заболевания. Хотя существуют способы для лечения этих заболеваний, многие современные способы лечения дают менее чем адекватные результаты. Среди возникающих новых стратегий терапии, стратегии, базирующиеся на клеточной терапии, по всей видимости, являются потенциально полезным инструментом для лечения большого числа заболеваний. Таким образом, в настоящее время исследователи прилагают большие усилия для достижения указанной цели.
АУТОИММУННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Аутоиммунные заболевания возникают, когда иммунная система организма, которая представляет собой защиту организма против бактерий, вирусов и всех остальных чужеродных продуктов, работает неправильно и вызывает патологический ответ против здоровых тканей, клеток и органов. Антитела, T-клетки и макрофаги обеспечивают полезную защиту, но также могут вызывать повреждающий или смертельный иммунный ответ.
Аутоиммунные заболевания могут быть органоспецифическими или системными и могут быть вызваны различными патогенными механизмами. Органоспецифическая аутоиммунизация характеризуется нарушенной экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC), антигенной мимикрией и аллельными вариациями в генах MHC.
Системные аутоиммунные заболевания включают в себя активацию поликлональных B-клеток и нарушения в иммунорегуляторных T-клетках, T-клеточных рецепторах и генах MHC. Примерами органоспецифических аутоиммунных заболеваний являются диабет, гипертиреоз, аутоиммунная надпочечниковая недостаточность, врожденная апластическая анемия, рассеянный склероз и ревмокардит. Типичными системными аутоиммунными заболеваниями являются системная красная волчанка, хроническое воспаление, синдром Шегрена, полимиозит, дерматомиозит и склеродермия.
Современное лечение аутоиммунных заболеваний включает введение иммуносупрессирующих средств, таких как кортизон, производные аспирина, гидроксихлорохин, метотрексат, азатиоприн и циклофосфамид или их сочетания. Дилемма, с которой сталкиваются при введении иммуносупрессирующих средств, однако, в том, что, чем более эффективно лечат аутоиммунное заболевание, тем более беззащитным остается пациент перед атаками инфекций, а также более предрасположенным к развитию опухолей. Таким образом, существует большая потребность в новых способах лечения аутоиммунных заболеваний.
ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ
Воспаление представляет собой процесс, при котором лейкоциты организма и секретируемые факторы защищают наши тела от заражения чужеродными субстанциями, такими как бактерии и вирусы. Секретируемые факторы, известные как цитокины и простагландины, контролируют этот процесс и высвобождаются в виде упорядоченного и самоограничивающегося каскада в кровь или пораженные ткани.
Воспалительное заболевание кишечника (IBD)
IBD представляет собой семейство хронических, идиопатических, рецидивирующих и разрушающих ткани заболеваний, которые характеризуются нарушением функций T-клеток слизистой, измененной выработкой цитокинов и клеточным воспалением, что, в конечном итоге, приводит к повреждению дистального тонкого кишечника и слизистой оболочки толстой кишки. IBD клинически подразделяют на два фенотипа: болезнь Крона (CD) и язвенный колит. CD в настоящее время является неизлечимым аутоиммунным заболеванием с распространенностью 0,05%, которое приводит к хроническому воспалению, вызывающему ряд желудочно-кишечных и внекишечных симптомов, в том числе боль в животе, ректальное кровотечение, диарею, потерю веса, поражения глаз и кожи и замедление роста и сексуального созревания у детей. Эти симптомы могут значительно влиять на самочувствие пациентов, их качество жизни и работоспособность. Поскольку CD является хронической и, как правило, возникает до 30-летнего возраста, пациентам, в основном, требуется пожизненное лечение. Хотя ее этиология остается неизвестной, существует косвенное доказательство связи CD с неспособностью иммунной системы слизистой оболочки ослабить иммунный ответ на эндогенные антигены.
Терапевтические средства, которые в настоящее время применяют при CD, в том числе аминосалицилаты, кортикостероиды, азатиоприн, 6-меркаптопурин, антибиотики и метотрексат, являются неспецифическими, не вполне эффективными и имеют множественные побочные эффекты. В большинстве случаев хирургическая резекция является последней альтернативой. Таким образом, существующая терапевтическая стратегия состоит в том, чтобы найти лекарственные средства или вещества, которые специфически изменяют оба компонента заболевания, т.е., воспалительный ответ и ответ, опосредованный T-клетками.
Недавно лекарственное средство инфликсимаб было одобрено для лечения умеренной и тяжелой болезни Крона, которая не отвечает на стандартную терапию, и для лечения открытых, дренирующих фистул. Инфликсимаб, первое лечение, утвержденное специально для болезни Крона, представляет собой антитело против фактора некроза опухоли (TNF). TNF представляет собой белок, который вырабатывается иммунной системой и может вызывать воспаление, связанное с болезнью Крона. Антитело против TNF удаляет TNF из кровотока прежде, чем он достигнет кишечника, и таким образом предотвращает воспаление. Однако, поскольку антитело имеет системное действие, и TNF является весьма плейотропным фактором, то довольно часты тяжелые побочные эффекты, и долгосрочная безопасность антитела еще предстоит определить. Также его эффективность ограничена, поскольку множество воспалительных процессов, которые возникают у пациентов, не зависят от передачи сигнала TNF.
Ревматоидный артрит (RA)
Ревматоидный артрит и юношеский ревматоидный артрит представляют собой типы воспалительного артрита. Артрит является общим термином, который описывает воспаление в суставах. Некоторые, но не все, типы артритов являются результатом неверно направленного воспаления. Ревматоидный артрит поражает и, по существу, делает нетрудоспособным приблизительно 1% мировой популяции. Ревматоидный артрит представляет собой аутоиммунное нарушение, при котором иммунная система организма ошибочно распознает синовиальные оболочки, которые секретируют смазывающую жидкость в суставах. Результатом является воспаление, и хрящ и ткани внутри и вокруг суставов повреждаются или разрушаются. Организм замещает поврежденную ткань рубцовой тканью, что приводит к сужению нормального пространства внутри сустава и срастанию костей.
При ревматоидном артрите существует аутоиммунный цикл постоянной презентации антигена, стимуляции T-клеток, секреции цитокинов, активации синовиальных клеток и разрушения суставов.
Современные терапии артрита сосредоточены на снижении воспаления суставов при помощи противовоспалительных или иммуносупрессирующих лекарственных средств. Первой линией терапии любого артрита являются, как правило, противовоспалительные средства, такие как аспирин, ибупрофен и ингибиторы Cox-2, такие как целекоксиб и рофекоксиб. Также применяют гуманизированные моноклональные антитела против TNF, такие как инфликсимаб, однако он имеет множество вторичных или побочных эффектов и достаточно низкую эффективность. "Вторая линия лекарственных средств" включает золото, метотрексат и стероиды. Хотя эти препараты представляют собой общепринятое лечение артрита, очень небольшое количество пациентов достигает ремиссии на этих линиях лечения в чистом виде, и для пациентов с ревматоидным артритом все еще остаются сложные вопросы лечения.
В основном, современные способы лечения хронических воспалительных нарушений имеют очень ограниченную эффективность, и многие из них имеют высокую частоту побочных эффектов или не способны полностью предотвратить прогрессирование заболевания. До сих пор нет идеального лечения и нет излечения от этого типа патологий. Таким образом, существует большая потребность в новых способах терапии для лечения воспалительных нарушений.
Сущность изобретения.
Настоящее изобретение относится к улучшенным способам клеточной терапии для пациентов, которые в ней нуждаются. Дополнительные аспекты изобретения относятся к наборам и композициям для применения в клеточной терапии, вводимой внутрилимфатически.
В одном из аспектов описывается способ для лечения или восстановления поврежденной ткани и/или для лечения, модуляции, профилактики и/или улучшения одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями с повреждением ткани и/или одним или более симптомами, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями; способ, который включает в себя введение в лимфатическую систему указанного субъекта профилактически или терапевтически эффективного количества композиции, содержащей стволовые клетки, регуляторные T-клетки и/или фибробласты. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу предупреждения, лечения или улучшения иммунного и/или воспалительного заболевания у субъекта, включающему прямую доставку клеточной терапии к лимфатическому органу. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточная терапия доставляется в комбинации с антигеном.
В другом аспекте описываются стволовая клетка, регуляторная T-клетка и/или фибробласт для применения в способе для:
i) лечения или восстановления поврежденной ткани; и/или
ii) лечения, модуляции, улучшения и/или профилактики одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями;
где клетку вводят в лимфатическую систему.
В еще одном аспекте описывается набор, причем указанный набор включает: i) лекарственное средство, содержащее стволовую клетку, регуляторную T-клетку и/или популяцию фибробластов, и ii) инструкции для способа лечения или восстановления поврежденной ткани и/или для лечения, модуляции, улучшения и/или профилактики одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями у нуждающегося в таком лечении субъекта; способ, который включает в себя введение в лимфатическую систему указанного субъекта профилактически или терапевтически эффективного количества композиции, содержащей стволовые клетки, регуляторные T-клетки и/или фибробласты.
В другом аспекте описывается применение стволовой клетки, регуляторной T-клетки и/или фибробласта для изготовления лекарственного средства для лечения или восстановления поврежденной ткани и/или для лечения, изменения, улучшения и/или профилактики одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями; указанное применение включает в себя введение стволовой клетки, регуляторной T-клетки и/или фибробласта в лимфатическую систему.
Другой аспект относится к стволовой клетке, регуляторной T-клетке или фибробласту для введения в лимфатическую систему. Еще один аспект относится к такой клетке для применения в терапии.
Еще один аспект относится к фармацевтической композиции для введения в лимфатическую систему, содержащей стволовую клетку, регуляторную T-клетку и/или фибробласт и антиген.
Другие аспекты, особенности и преимущества станут более очевидными из последующего раскрытия и формулы изобретения.
Определения
Для того чтобы облегчить понимание настоящего описания, ниже будет объяснен смысл некоторых терминов и выражений в контексте по изобретению. Дополнительные определения будут включены на всем протяжении описания по мере необходимости.
Термины "приспособленный для внутрилимфатической инъекции" или "приспособленный для внутриузловой инъекции" или "приспособленный для прямой инъекции в подмышечный и/или паховый лимфоузел" по изобретению означают, что клеточная терапия, предпочтительно включающая иммуномодулирующие клетки, наиболее предпочтительно включающая стволовые клетки, регуляторные T-клетки и/или фибробласты, а также содержащие их лекарственные средства и фармацевтические композиции, приспособленная для внутрилимфатической или внутриузловой инъекции, обладает физическими, химическими, биологическими и другими характеристиками, необходимыми или благоприятными для инъекции ее в качестве медицинского лечения в лимфатическую ткань индивидуума, в частности человека, даже более предпочтительно пациента-человека, для лечения или восстановления поврежденной ткани (предпочтительно мезенхимальной ткани) и/или для лечения, модуляции, улучшения и/или профилактики одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями, у нуждающегося в таком лечении субъекта. Кроме того, иммуномодулирующие клетки, а также содержащие их лекарственные средства и фармацевтические композиции, "приспособленные для внутрилимфатической инъекции" или "приспособленные для внутриузловой инъекции" по изобретению, содержат концентрации всех составляющих композиции, позволяющие применять подходящие количества всех составляющих в подходящем объеме в лимфатической ткани, предпочтительно в объеме до 0,01, предпочтительно до 0,05, предпочтительно до 0,1, предпочтительно до 0,2, предпочтительно до 0,3, предпочтительно до 0,4, предпочтительно до 0,6, предпочтительно до 0,8, предпочтительно до 1,0, предпочтительно до 2 мл. Кроме того, композиции, "приспособленные для прямой инъекции в подмышечный и/или паховый лимфоузел" не должны содержать или содержат только ограниченные количества потенциально опасных веществ, таких как растворители и адъюванты, которые могут повреждать лимфатическую ткань при нанесении в слишком больших количествах. Под повреждением лимфатической ткани понимают прямое повреждение, связанное с токсическим воздействием на клетки, связанное с химическим разрушением клеток, связанное с непрямым повреждением клеток, например, за счет индуцирования воспалительных реакций, некроза и т.д.
Кроме того, композиция, "приспособленная для внутрилимфатической или внутриузловой инъекции" по изобретению, в идеале имеет какой-то механизм безопасности, который предотвращает случайное системное воздействие иммуномодулирующих клеток, а также содержащих их лекарственных средств и фармацевтических композиций, в случае, когда инъекция не попадает в лимфатическую ткань, и в худшем случае, приводящем к прямой инъекции иммуномодулирующих клеток, а также содержащих их лекарственных средств и фармацевтических композиций в кровоток. Такой механизм безопасности включает короткое внеклеточное время полужизни биологически активных веществ.
Как применяют в настоящем документе, термин "инъекция" имеет значение, обычное в данной области, относящееся к доставке вещества в организм путем прокалывания части организма, как правило кожи. Термин включает применение полых шприцев и устройств для инъекций со струей высокого давления.
Как применяют в настоящем документе, термин "аллогенный" будет означать «от различных индивидуумов одного и того же вида». Говорят, что два или более индивидуумов являются аллогенными, когда гены одного или более локусов не идентичны.
Как применяют в настоящем документе, термин "аутологичный" будет означать «от одного и того же индивидуума».
Термин "иммунное заболевание" относится к состоянию субъекта, которое характеризуется клеточным, тканевым и/или органным повреждением, которое вызвано иммунной реакцией субъекта. Термин "аутоиммунное заболевание" относится к состоянию субъекта, которое характеризуется клеточным, тканевым и/или органным повреждением, которое вызвано иммунной реакцией субъекта на его собственные клетки, ткани и/или органы. Иллюстрирующие неограничивающие примеры аутоиммунных заболеваний, которые можно лечить иммуномодулирующими клетками по изобретению, включают очаговую алопецию, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечника, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунную тромбоцитопению, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, целиакию спру с дерматитом, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром Черджа-Строса, рубцовый пемфигоид, CREST-синдром, болезнь холодовой агглютинации, дискоидную волчанку, идиопатическую смешанную криоглобулинемию, фибромиалгию с фибромиозитом, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), IgA-нейропатию, юношеский артрит, лишай Вильсона, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет типа 1 или иммуноопосредованный, миастению гравис, обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, узелковый периартериит, полихондрию, полигландулярный синдром, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный биллиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, болезнь Рейно, синдром Рейтера, саркоидоз, склеродермию, прогрессирующую склеродермию, синдром Шегрена, синдром Гудпасчера, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку, красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулиты, такие как васкулит при герпетиформном дерматите, витилиго, гранулематоз Вегенера, анти-БМК нефрит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунные заболевания нервной системы, семейную средиземноморскую лихорадку, миастенический синдром Ламберта-Итона, симпатическую офтальмию, полиэндокринопатии, псориаз, и т.д.
Термин "иммуноопосредованное воспалительное заболевание" будет означать любое заболевание, которое характеризуется хроническим или острым воспалением, возникающим в результате нарушения регуляции или связанным с нарушением регуляции или вызванным нарушением регуляции нормального иммунного ответа, например болезнь Крона, сахарный диабет типа 1, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, системная красная волчанка, болезнь Хашимото, реакция «трансплантат против хозяина», синдром Шегрена, пернициозная анемия, болезнь Аддисона, склеродермия, синдром Гудпасчера, язвенный колит, аутоиммунная гемолитическая анемия, бесплодие, миастения гравис, рассеянный склероз, Базедова болезнь, тромбоцитопеническая пурпура, синдром Гийена-Барре, аллергия, астма, атопическое заболевание, атеросклероз, миокардит, кардиомиопатия, гломерулярный нефрит, гипопластическая анемия и отторжение после трансплантации органа.
"Глютеновая болезнь" альтернативно обозначается как целиакия, целиакия спру, не тропическая спру, эндемическая спру, глютеновая энтеропатия или глютенчувствительная энтеропатия и непереносимость глютена.
Для целей изобретения, описанных в настоящем документе, "иммунные нарушения" включают аутоиммунные заболевания и иммунологически опосредованные заболевания.
Термин "воспалительное заболевание" относится к состоянию субъекта, которое характеризуется воспалением, например хроническое воспаление. Иллюстрирующие неограничивающие примеры воспалительных нарушений включают глютеновую болезнь, ревматоидный артрит (RA), воспалительное заболевание кишечника (IBD), астму, энцефалит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), воспалительный остеолиз, аллергические нарушения, септический шок, легочный фиброз (например, идиопатический легочный фиброз), воспалительные васкулиты (например, узелковый периартериит, гранулематоз Вегенера, артериит Такаясу, височный артериит, и лимфоматоидный гранулематоз), посттравматическую сосудистую ангиопластику (например, рестеноз после ангиопластики), недифференцированную спондилоартропатию, недифференцированную артропатию, артрит, воспалительный остеолиз, хронический гепатит и хроническое воспаление, вызванное хроническими вирусными или бактериальными инфекциями.
Термин "выделенный", применяемый к популяции клеток, относится к популяции клеток, выделенной из организма человека или животного и по существу свободной от одной или более популяций клеток, которые связаны с указанной клеточной популяцией in vivo или in vitro. Термин "MHC" (главный комплекс гистосовместимости) относится к подклассу генов, которые кодируют клеточные поверхностные антигенпрезентирующие белки. У людей эти гены обозначают как гены лейкоцитарного антигена человека (HLA). В настоящем документе аббревиатуры MHC или HLA используют взаимозаменяемо. Термин "субъект" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, в том числе не примату (например, корове, свинье, лошади, кошке, собаке, крысе или мыши) и примату (например, обезьяне или человеку). В предпочтительном варианте осуществления субъект является человеком.
Термин "иммуномодулирующий" относится к ингибированию или уменьшению одного или более видов биологической активности иммунной системы, которое в качестве неограничивающих примеров включает негативную регуляцию иммунного ответа и воспалительных состояний, а также изменения цитокинового профиля, цитотоксической активности и выработки антител. Термин "антигенспецифический иммуномодулирующий" относится к ингибированию или уменьшению одного или более видов биологической активности иммунной системы, связанному с определенным антигеном или антигенами, включающими как аллоантигены, так и аутоантигены. Термин "иммуномодулирующий" следует понимать как включающий "антигенспецифический иммуномодулирующий".
Как применяют в настоящем документе, "негативный" или "-" в отношении поверхностных клеточных маркеров будет означать, что в популяции клеток менее чем 20%, 10%, предпочтительно менее чем 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0% клеток экспрессируют указанный маркер. Экспрессию поверхностных клеточных маркеров можно определить, например, при помощи способов проточной цитометрии для конкретного поверхностного клеточного маркера с использованием общепринятых способов и приборов (например, система Beckman Coulter Epics XL FACS, которая используется с коммерчески доступными антителами и стандартными протоколами, известными в данной области).
Как применяют в настоящем документе, термин "лимфатическая система" дан в обычном значении в данной области и относится к лимфатической ткани, соединенной посредством проводящей системы лимфатических сосудов и лимфатических капилляров. Термин "лимфатический орган" относится к лимфоузлам, наиболее предпочтительно к подмышечному или паховому лимфоузлу, или у тех индивидуумов, которые лишились лимфоузлов или имеют их дефекты, к лимфатической ткани или иммунной клетке.
Как применяют в настоящем документе, термин "мезенхимальная стволовая клетка" (также обозначается в настоящем документе как "MSC") будет означать клетку, которая способна давать развитие множеству различных типов клеток и изначально происходящую из мезенхимы. Термин относится к клетке, которая способна дифференцироваться по меньшей мере в один тип, выбранный из остеобласта, хондроцита, адипоцита или миоцита. MSCs можно выделять из любого типа ткани. В основном, MSC выделяют из костного мозга, жировой ткани, пупочного канатика или периферической крови. MSC, которые используют в изобретении, могут быть в некоторых вариантах осуществления выделены из костного мозга (BM-MSC) или жировой ткани (ASC). В предпочтительном аспекте по изобретению, MSC получают из жировых аспиратов, полученных из жировой ткани.
Как применяют в настоящем документе, выражение "значительная экспрессия" или эквивалентные ему термины "позитивный" и "+" при использовании по отношению к поверхностному клеточному маркеру будут означать, что в популяции клеток более чем 20%, предпочтительно более чем 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 98%, 99% или даже все клетки экспрессируют указанный маркер.
Экспрессию поверхностных клеточных маркеров можно определять, например, посредством проточной цитометрии для конкретного поверхностного клеточного маркера при помощи общепринятых способов и приборов (например, система Beckman Coulter Epics XL FACS, которая используется с коммерчески доступными антителами и стандартными протоколами, известными в данной области), которые показывают сигнал для конкретного поверхностного клеточного маркера в проточной цитометрии выше порогового сигнала с использованием общепринятых способов и приборов (например, система Beckman Coulter Epics XL FACS, которая используется с коммерчески доступными антителами и стандартными протоколами, известными в данной области). Пороговый сигнал определяют как интенсивность сигнала, который показывает неспецифическое антитело того же изотипа, что и специфическое антитело, которое используют для детекции каждого поверхностного маркера в общепринятом анализе FACS. Маркер считают позитивным, когда полученный специфический сигнал сильнее чем 20%, предпочтительно сильнее чем 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% или более, чем интенсивность порогового сигнала, полученная при помощи общепринятых способов и приборов (например, система Beckman Coulter Epics XL FACS, которая используется с коммерчески доступными антителами и стандартными протоколами, известными в данной области).
Кроме того, известные и коммерчески доступные моноклональные антитела против указанных поверхностных маркеров (например, клеточных рецепторов и трансмембранных белков) можно использовать для выявления соответствующих клеток.
Термин "соединительная ткань" относится к тканям, которые являются производными мезенхимы, и включает ткани, которые характеризуются тем, что их клетки входят в состав внеклеточного матрикса. Примеры соединительных тканей в качестве неограничивающих примеров включают жировую и хрящевую ткани.
Как применяют в настоящем документе, термин "фибробласт" будет включать фибробластоподобные синовиальные клетки.
Термин "T-клетка" относится к клеткам иммунной системы, которые представляют собой субпопуляцию лимфоцитов, экспрессирующих T-клеточный рецептор (TCR). Термин "регуляторные T-клетки" (также называемые в настоящем документе T-reg клетки) относится к T-клеточным субпопуляциям, которые активно подавляют активацию иммунной системы и предотвращают патологическую аутореактивность, т.е. аутоиммунное заболевание. Термин "регуляторные T-клетки" или "T-reg клетки" будет включать природные T-клетки (FoxP3+ T-reg клетки) и адаптивные T-клетки (также известные как Tr1 клетки или Th3 клетки), которые не экспрессируют молекулу FoxP3.
Термин "глютен" будет означать белок, который содержит глиадиновые и глютениновые компоненты.
Как применяют в настоящем документе, термины "лечить" и "лечение" по отношению непосредственно к пациенту или субъекту будут означать улучшение одного или более симптомов, связанных с нарушением, включающим в качестве неограничивающих примеров воспалительное нарушение, аутоиммунное заболевание или иммунологически опосредованное заболевание, в том числе отторжение трансплантированных органов и тканей, где указанное улучшение является результатом введения иммуномодулирующих клеток по изобретению или содержащей их фармацевтической композиции субъекту, который нуждается в указанном лечении.
Как применяют в настоящем документе, термины "восстанавливать" и "восстановление" по отношению непосредственно к поврежденным тканям будут означать улучшение такого повреждения как за счет прямых механизмов, таких как регенерация поврежденных тканей, так и путем непрямых механизмов, например снижения воспаления и, таким образом, создания возможности формирования ткани.
Термин "комбинированное лечение" относится к применению иммуномодулирующих клеток по настоящему изобретению или содержащих их фармацевтических композиций вместе с другими активными средствами или способами лечения, в способе по настоящему изобретению для уменьшения одного или более симптомов, связанных с нарушением, включающим в качестве неограничивающих примеров, воспалительное нарушение, аутоиммунное заболевание или иммунологически опосредованное заболевание, в том числе отторжение трансплантированных органов и тканей. Эти другие вещества или способы лечения могут включать известные лекарственные средства и способы терапии для лечения таких нарушений, такие как кортикостероиды и нестероидные противовоспалительные соединения, но не ограничиваться ими.
Иммуномодулирующие клетки по изобретению или содержащие их фармацевтические композиции можно также комбинировать с другими способами лечения, например кортикостероидами, нестероидными противовоспалительными соединениями или другими веществами, которые используют при лечении воспаления. Комбинированное применение веществ по настоящему изобретению с другими способами терапии или способами лечения может быть одновременным или происходить последовательно, т.е. два способа лечения могут быть разделены таким образом, что указанные иммуномодулирующие клетки или содержащую их фармацевтическую композицию можно давать до или после другой терапии или способа лечения. Лечащий врач может определить подходящую последовательность введения иммуномодулирующих клеток или содержащей их фармацевтической композиции в комбинации с другими агентами, терапией или способами лечения.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает, что введение наращенных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, уменьшает оценку артрита у мышиной модели артрита, индуцированного коллагеном, и что внутрилимфатическое введение является терапевтически более эффективным, чем внутривенное введение. Группа A: нелеченный контроль; Группа C: 1 миллион ASC вводили в/в в течение пяти последовательных дней; Группа D: 3 миллиона ASC вводили в первый день и 1 миллион ASC вводили на третий и пятый дни; Группа E: 320000 ASC вводили интралимфатически на первый и седьмой дни; Группа F: вводили интралимфатически носитель на первый и седьмой дни.
Описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения или восстановления поврежденной ткани (предпочтительно мезенхимальной ткани) и/или лечения, модуляции, профилактики и/или улучшения одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями у нуждающегося в таком лечении субъекта; способ включает введение в лимфатическую систему указанного субъекта профилактически или терапевтически эффективного количества композиции, содержащей клеточную терапию. Таким образом, в дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к клеточной терапии, предпочтительно включающей иммуномодулирующие клетки, наиболее предпочтительно включающей стволовые клетки, регуляторные T-клетки и/или фибробласты для применения для лечения или восстановления поврежденной ткани (предпочтительно мезенхимальной ткани) и/или для лечения, изменения, профилактики и/или улучшения одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями, где клеточную терапию вводят в лимфатическую систему. Внутрилимфатическое введение производят предпочтительно путем внутрилимфатической инъекции. Клеточная терапия приспособлена для внутрилимфатического введения, предпочтительно для внутрилимфатической инъекции.
Введение стволовых клеток, регуляторных T-клеток и/или фибробластов непосредственно в лимфатическую систему имеет несколько преимуществ перед известным уровнем техники, а именно перед стандартной подкожной инъекцией указанных стволовых клеток, регуляторных T-клеток и/или фибробластов, например достаточно меньшего количества иммуномодулирующих клеток; терапия не более болезненна для пациента, чем обычные подкожные инъекции; и меньше побочных эффектов. Кроме того, за счет прямого введения в лимфатическую ткань, например путем внутриузловой инъекции, иммуномодулирующие клетки доставляются ближе к месту лечения или восстановления поврежденной ткани.
Иммуномодулирующие клетки, а также содержащие их лекарственные средства и фармацевтические композиции, по настоящему изобретению, одновременно с внутрилимфатическим введением, можно вводить посредством общепринятых путей, таких как подкожное введение или сублингвальное введение, перорально, чрескожно (местная прививка), интрадермально, внутрь мозга, интратекально, внутрь желудочков, интраназально, конъюктивально, внутрибронхиально, трансдермально, интраректально, интраперитонеально, внутримышечно, внутрилегочно, вагинально, ректально или внутрь глаза.
Предпочтительно, чтобы клеточная терапия по настоящему изобретению содержала стволовые клетки, регуляторные T-клетки и/или фибробласты. Особенно предпочтительно, чтобы указанные стволовые клетки являлись мезенхимальными стволовыми клетками (далее в настоящем документе также обозначаемые как MSC), наиболее предпочтительно, мезенхимальными стволовыми клетками из жировой ткани (далее в настоящем документе также обозначаемые как ASC), и MSC происходят из жировой ткани, в основном из жировой ткани человека (hASC).
Фибробласты, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой соединительную ткань мезенхимального происхождения, которая связана с синтезом и поддержанием внеклеточного матрикса, и будут включать фибробластоподобные синовиальные клетки. Фибробласты можно получать от любого подходящего животного, наиболее предпочтительно от человека.
+
+
Регуляторные T-клетки (иногда называемые супрессорными T-клетки), применяемые в настоящем изобретении, можно получать из любого подходящего источника, такого как кровь или селезенка. Регуляторные T-клетки могут быть природными CD4Foxp3 клетками или они могут быть выделенными ex-vivo и/или наращенными регуляторными T-клетками. Способы для наращивания регуляторных T-клеток ex-vivo известны в данной области и включают выделение из цельной крови (например, как часть фракции PBMC) с последующим наращиванием с использованием, например, мезенхимальных стволовых клеток или рапамицина.
MSC, применяемые в способе по настоящему изобретению, предпочтительно получают из соединительной ткани. В предпочтительном варианте осуществления указанные MSC получают из жировой ткани и в дополнительном предпочтительном варианте осуществления - из стромальной фракции жировой ткани. В альтернативном варианте осуществления указанные MSC получают из хондроцитов гиалинового хряща. В дополнительном варианте осуществления указанные MSC получают из кожи. В другом варианте осуществления указанные MSC получают из костного мозга.
MSC можно получать из любого подходящего источника соединительной ткани от любого подходящего животного, наиболее предпочтительно от людей. Предпочтительно, чтобы указанные клетки получали из непатологических источников от млекопитающих, предпочтительно постнатальных источников (например, грызун или примат). В предпочтительном варианте осуществления MSC получают из источника соединительной ткани, такого как стромальная фракция жировой ткани, гиалиновый хрящ, костный мозг или кожа, но не ограничиваясь ими. Наиболее предпочтительно MSC для способов по настоящему изобретению получают из непатологической постнатальной стромальной жировой ткани человека.
По отношению к предполагаемому реципиенту иммуномодулирующие клетки, вводимые по способу по настоящему изобретению, MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты, применяемые в указанном вышеописанном способе, могут быть либо аллогенного (донор) или аутологичного (субъект) происхождения. В одном из вариантов осуществления способа, указанные MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты имеют аллогенное происхождение.
В одном из вариантов осуществления способа указанные MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты имеют аутологичное происхождение.
MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты, применяемые в способе по настоящему изобретению, предпочтительно характеризуются тем, что (i) они не экспрессируют маркеры, специфичные для антигенпредставляющих клеток, (ii) они не экспрессируют IDO (индоламин 2,3-диоксигеназа) постоянно, (iii) они экспрессируют IDO при стимуляции IFN-гамма, и в случае MSC (iv) они демонстрируют способность дифференцироваться по меньшей мере в две клеточные линии.
Стволовые клетки, регуляторные T-клетки и/или фибробласты по настоящему изобретению предпочтительно вводят в физиологически приемлемом носителе, подходящем для инъекции. Как правило, любой известный физиологически приемлемый носитель можно использовать в практическом осуществлении настоящего изобретения. Выбор таких носителей является легким для специалиста в данной области и в качестве неограничивающих примеров включает раствор Рингера, воду, стандартный физиологический раствор, растворы декстрозы и альбумина.
Необязательно, лимфатическая система или ее часть, например локализованная площадь лимфатического сосуда или лимфатического органа, предпочтительно лимфоузла, могут быть визуализированы в течение процедуры инъекции. Можно использовать ультразвуковые, радиологические или другие способы визуализации, такие как компьютерная аксиальная томография (CAT-сканирование), для визуализации лимфоузла и контроля за нахождением иглы и изменений в лимфоузле, таких как опухание. Инъекция в подмышечный и паховый лимфоузлы является предпочтительной в связи с легкостью определения местонахождения при помощи ультразвука и инъекции.
Способ, применяемый для инъекции, известен специалистам в данной области. Одним из способов является использование однокамерного шприца, содержащего клетки в жидком составе.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу для лечения или восстановления поврежденной ткани (предпочтительно мезенхимальной ткани) и/или для лечения, изменения, профилактики и/или улучшения одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями у нуждающегося в таком лечении субъекта; способ включает введение в лимфатическую систему указанного субъекта профилактически или терапевтически эффективного количества композиции, содержащей клеточную терапию (наиболее предпочтительно, содержащей MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты) и далее включает введение антигена непосредственно в лимфатическую систему указанного субъекта. Указанный антиген можно вводить до, одновременно или после введения клеточной терапии. Антиген можно вводить по меньшей мере за 1, 2, 3, 5 или 10 часов до или после введения клеточной терапии.
Антиген, применяемый в указанных способах, может быть выбранным антигеном, группой антигенов или типом клеток, экспрессирующих и/или презентирующих указанный антиген или антигены. В одном из вариантов осуществления антиген выбран из группы, включающей: смесь аутоантигенов, полученных у пациента с аутоиммунной патологией, пептидный антиген, нуклеиновую кислоту, измененный пептидный лиганд, рекомбинантный белок или его фрагменты. В одном из вариантов осуществления указанные антигены связаны с артритом (такие как антигены коллагена, но не ограничиваясь ими). В альтернативном варианте осуществления указанные антигены связаны с глютеновой болезнью. Антигены, связанные с глютеновой болезнью, являются членами глютенового семейства, включающего некоторые формы проламинов (такие как антигены глиадинов, гордеинов и/или секалинов, но не ограничиваясь ими). В дополнительном варианте осуществления указанные антигены связаны с рассеянным склерозом (такие как антигены миелина, но, не ограничиваясь ими). Способы выделения, очистки и получения таких антигенов известны специалисту в данной области.
Особенно предпочтительно, чтобы клеточную терапию по всем аспектам настоящего изобретения вводили непосредственно в лимфатический орган, наиболее предпочтительно в периферический лимфатический орган, включая в качестве неограничивающих примеров лимфоузлы, наиболее предпочтительно в подмышечный или паховый лимфоузел. У индивидуумов без лимфоузлов или с их дефектами клеточная терапия можно доставлять в лимфатическую ткань или к иммунной клетке.
Способы для внутрилимфатического введения известны в данной области и обычно осуществляются с помощью устройства для инъекций (например, шприца). Введение можно наблюдать и помогать ему при помощи устройств для получения изображений, таких как рентген, ультразвук и компьютерная аксиальной томографии (CAT-сканирование). Это дает возможность точного введения клеточной терапии, а также наблюдения за лимфатическими органами в отношении побочных эффектов. В одном из аспектов способа субъекта лечат множеством доз клеточной терапии, которые вводят интралимфатически. Предпочтительно вводят с интервалами по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10 или 15 доз. В дополнительном аспекте способа каждая из указанных доз содержит от 10000 до 5000000 клеток. В дополнительном варианте осуществления каждая из указанных доз содержит от 10000 до 100000 клеток; от 100000 до 500000 клеток; от 500000 до 1000000 клеток или от 1000000 до 5000000 клеток.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к стволовой клетке, регуляторным T-клеткам и/или фибробластам для введения в лимфатическую систему.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению стволовой клетки, регуляторной T-клетки и/или фибробласта в качестве лекарственного средства для лечения или восстановления поврежденной ткани (предпочтительно, мезенхимальной ткани) и/или для лечения, изменения, профилактики и/или улучшения одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями, посредством введения стволовой клетки, регуляторной T-клетки и/или фибробласта в лимфатическую систему.
В альтернативном аспекте настоящее изобретение относится к применению стволовой клетки, регуляторной T-клетки и/или фибробласта для производства лекарственного средства для лечения или восстановления поврежденной ткани (предпочтительно, мезенхимальной ткани) и/или для лечения, изменения, профилактики и/или улучшения одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями, посредством введения стволовой клетки, регуляторной T-клетки и/или фибробласта в лимфатическую систему.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для введения в лимфатическую систему, содержащей стволовые клетки, регуляторные T-клетки и/или фибробласты. Указанные фармацевтические композиции подходят для лечения, восстановления, профилактики и/или улучшения поврежденных тканей или одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями, такими как, но без ограничений, аутоиммунные заболевания, воспалительные нарушения и иммунологически опосредованные заболевания, в том числе отторжение трансплантированных органов и тканей. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция может дополнительно содержать антиген, группу антигенов или типы клеток, экспрессирующих и/или презентирующих указанные антиген или антигены. В одном из вариантов осуществления антиген выбран из группы, включающей: смесь аутоантигенов, полученных от пациента с аутоиммунной патологией, пептидный антиген, нуклеиновую кислоту, измененный пептидный лиганд, рекомбинантный белок или его фрагменты. В одном из вариантов осуществления указанные антигены связаны с артритом, такими как антигены коллагена, но не ограничиваясь ими. В альтернативном варианте осуществления указанные антигены связаны с глютеновой болезнью. Антигены, связанные с глютеновой болезнью, являются членами глютенового семейства, включающего некоторые формы проламинов (такие как антигены глиадинов, гордеинов и/или секалинов, но, не ограничиваясь ими). Глютен и его компоненты, глютанин и глиадин, являются предпочтительными антигенами, связанными с глютеновой болезнью. В дополнительном варианте осуществления указанные антигены связаны с рассеянным склерозом, такие как антигены миелина и антигены компонентов миелина, такие как основной белок миелина (MBP), миелиновый гликопротеин олигодендроцитов (MOG), протеолипидный белок (PLP) и гликолипиды миелина, например галактоцереброзид, но не ограничиваясь ими. Способы выделения, очистки и получения таких антигенов известны специалисту в данной области.
Фармацевтическая композиция по изобретению содержит профилактически или терапевтически эффективное количество стволовых клеток, регуляторных T-клеток и/или фибробластов, необязательно антиген, и фармацевтический носитель. Примеры дозировок и режимы дозировок для каждого из этих типов клеток приведены выше. Подходящие фармацевтические носители известны в данной области и предпочтительно представляют собой те, которые одобрены надзорным государственным органом Соединенных Штатов или правительством штата или перечислены в фармакопее США или в Европейской фармакопее или в другие общепризнанных фармакопеях для применения у животных и более конкретно у людей. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым вводят терапевтическое средство. Композиция, при желании, может также содержать незначительные количества веществ для создания pH. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington’s Pharmaceutical Sciences" EW Martin. Указанные композиции будут содержать профилактически или терапевтически эффективное количество профилактического или терапевтического средства, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя таким образом, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения индивидууму. Состав должен соответствовать способу введения. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции являются стерильными и имеют подходящую форму для введения индивидууму, предпочтительно животному, более предпочтительно млекопитающему и наиболее предпочтительно человеку.
Фармацевтическая композиция по изобретению может быть в виде ряда форм. Эти формы включают, например, полутвердую и жидкие лекарственные формы, такие как лиофилизированные препараты, жидкие растворы или суспензии, растворы для инъекций и инфузий и т.д. Как указано выше, фармацевтическая композиция представляет собой предпочтительно инъецируемое лекарственное средство.
Предпочтительно, чтобы способы, лекарственные средства, композиции и клетки по изобретению применяли для лечения или восстановления поврежденной ткани (предпочтительно, мезенхимальной ткани) и/или для лечения, модуляции, профилактики и/или улучшения одного или более симптомов, связанных с воспалительными и/или иммунными нарушениями. Таким образом, способы и клетки по изобретению применяют для лечения любого нарушения, которое характеризуется каким-либо или всеми указанными симптомами. Типичный неполный перечень таких нарушений приведен в разделе «Определения». Особенно предпочтительным является применение способов, лекарственных средств, композиций и клеток по изобретению для лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний. Дополнительно предпочтительным является применение способов, лекарственных средств, композиций и клеток по изобретению для лечения сахарного диабета, ревматоидного артрита (RA), воспалительного заболевания кишечника (IBD, включая болезнь Крона и/или язвенный колит) и рассеянного склероза (MS). Даже более особенно предпочтительным является применение способов, лекарственных средств, композиций и клеток по изобретению для лечения ревматоидного артрита.
Если способ или композиция по изобретению содержит один или более антигенов, предпочтительно, чтобы способ или композицию применяли для лечения нарушения, связанного с указанным антигеном или индуцированного указанным антигеном, например, если антиген представляет собой коллаген, способ или композицию можно использовать для лечения артрита; если антиген представляет собой компонент глютена, способы или композиции можно использовать для лечения глютеновой болезни; если антиген представляет собой компонент миелина, способы или композиции можно использовать для лечения рассеянного склероза. Предпочтительные композиции, таким образом, содержат: MSC, предпочтительно ASC, и коллаген для лечения артрита; MSC, предпочтительно ASC, и глютен и/или компонент глютена для лечения глютеновой болезни; MSC, предпочтительно ASC, и миелин и/или компонент миелина для лечения рассеянного склероза.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к набору, который содержит: i) лекарственное средство, содержащее стволовую клетку, регуляторную T-клетку и/или популяцию фибробластов и ii) инструкции для его применения согласно способам по настоящему изобретению.
В дополнительном варианте осуществления указанный набор может дополнительно содержать iii) один или более антигенов.
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ MSC
MSC, применяемые в предпочтительном способе по настоящему изобретению, предпочтительно являются негативными по маркерам, ассоциированным с фенотипами APC (антигенпредставляющая клетка). Таким образом, предпочтительно, чтобы указанные MSC являлись негативными по меньшей мере по одному, двум, трем, четырем или предпочтительно по всем следующим маркерам: CD 11b; CD 11c; CD14; CD45; HLAIl. Кроме того, MSC предпочтительно являются негативными по меньшей мере по одному, двум или предпочтительно по всем следующим поверхностным клеточным маркерам: CD31; CD34; CD133.
В конкретном варианте осуществления MSC, применяемые в настоящем способе, предпочтительно характеризуются тем, что они экспрессируют (т.е. являются позитивными) по меньшей мере один, два, три, четыре или предпочтительно все следующие поверхностные клеточные маркеры CD9, CD44, CD54, CD90 и CD105. Предпочтительно, MSC характеризуются тем, что они имеют значительные уровни экспрессии по меньшей мере одного, двух, трех, четырех и предпочтительно всех указанных поверхностных клеточных маркеров CD9, CD44, CD54, CD90 и CD105.
Необязательно, MSC могут также быть негативными по поверхностному клеточному маркеру CD 106 (VCAM-I).
Примеры MSC, подходящих для использования в способе по настоящему изобретению, описаны в данной области, например в WO 2007039150, который, таким образом, включен в качестве ссылки в полном объеме.
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
MSC, подходящие для использования в способе по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой мультипотентные или плюрипотентные стволовые клетки и демонстрируют способность к пролиферации и дифференцировке по меньшей мере в две, более предпочтительно три, четыре, пять, шесть, семь или более клеточных линий. Показательные не ограничивающие примеры клеточных линий, в которые могут дифференцироваться указанные MSC, включают остеоциты, адипоциты, хондроциты, теноциты, миоциты, кардиомиоциты, стромальные клетки, поддерживающие гемопоэз, эндотелиальные клетки, нейроны, астроциты и гепатоциты. MSC могут пролиферировать и дифференцироваться в клетки других линий общепринятыми способами. Способы выявления и последующей изоляции дифференцированных клеток от их недифференцированных аналогов могут осуществляться способами, хорошо известными в данной области.
ВЫДЕЛЕНИЕ MSC
Способы выделения MSC известны в данной области, и можно использовать любой подходящий способ. В одном из вариантов осуществления выделение ASC может включать этапы:
(i) приготовления клеточной суспензии из образца жировой ткани;
(ii) выделения клеток из указанной клеточной суспензии;
(iii) инкубирования указанных клеток в подходящей среде для культивирования клеток на твердой поверхности в условиях, которые позволяют клеткам прикрепляться к твердой поверхности и пролиферировать;
(iv) промывания указанной твердой поверхности после инкубации для удаления не прикрепившихся клеток;
(v) отбора клеток, которые после пересеивания по меньшей мере дважды в такой же среде, остались прикрепленными к указанной твердой поверхности; и
(vi) подтверждения того, что выбранная популяция клеток имеет интересующий фенотип.
Как применяют в настоящем документе, термин "твердая поверхность" относится к любому материалу, к которому могут прикрепляться ASC. В конкретном варианте осуществления указанный материал представляет собой пластик, обработанный для усиления адгезии клеток млекопитающих к его поверхности, например коммерчески доступные полистироловые планшеты, необязательно покрытые поли-D-лизином или другими реагентами.
Этапы (i)-(vi) можно проводить общепринятыми способами, известными специалистам в данной области. В кратком изложении, ASC можно получать общепринятыми способами из любого подходящего источника соединительной ткани от любого подходящего животного, как указано выше. Как правило, жировые клетки человека получают от живых доноров с использованием общепризнанных протоколов, таких как хирургическая или аспирационная липэктомия. Фактически, поскольку процедуры липосакции столь распространены, экссудат липосакции является особенно предпочтительным источником, из которого можно получать ASC. Таким образом, в конкретном варианте осуществления ASC происходят из стромальной фракции жировой ткани человека, полученной путем липосакции.
Ткань, предпочтительно, отмывают перед обработкой для отделения ASC от остального материала. В одном из широко используемых протоколов, образец ткани отмывают с помощью физиологически совместимого физиологического раствора (например, фосфатно-солевого буфера (PBS)), а затем сильно встряхивают и оставляют осаждаться, шаг, который удаляет неприкрепленное вещество (например, поврежденную ткань, кровь, эритроциты, и т.д.) из ткани. Таким образом, этапы отмывки и осаждения, как правило, повторяют до тех пор, пока супернатант не станет относительно чистым от дебриса. Оставшиеся клетки, как правило, будут присутствовать в виде скоплений разного размера, и протокол переходит к следующему этапу с использованием шагов, направленных на разрушение крупных структур с одновременной минимизацией повреждения клеток как таковых. Одним из способов достижения этой цели является обработка отмытых комков клеток ферментом, который ослабляет или разрушает связи между клетками (например, коллагеназой, диспазой, трипсином, и т.д.). Количество и длительность такой обработки ферментом могут варьировать в зависимости от применяемых условий, но использование таких ферментов, в основном, известно в данной области. Альтернативно, или в сочетании с такой ферментативной обработкой, комки клеток можно разрушить с использованием других воздействий, таких как механическое встряхивание, звуковая энергия, тепловая энергия и т.д. Если разрушение проводят с помощью ферментативных способов, желательно нейтрализовать фермент после необходимого периода для минимизации вредных воздействий на клетки.
На этапе разрушения, как правило, получают взвесь или суспензию клеточных агрегатов и жидкую фракцию, которая содержит, в основном, свободные стромальные клетки (например, эритроциты, гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты и стволовые клетки). Следующим этапом в процессе выделения является отделение клеточных агрегатов от ASC. Этого можно достичь посредством центрифугирования, которое заставляет клетки выпадать в осадок, покрытый супернатантом. Супернатант затем можно удалить и осадок ресуспендировать в физиологически совместимой жидкости. Кроме того, суспендированные клетки, как правило, включают эритроциты, и в большинстве протоколов желательно их разрушить. Способы для селективного лизиса эритроцитов известны в данной области, и можно использовать любой подходящий протокол (например, инкубацию в гипер- или гипотонической среде, лизис с использованием хлорида аммония и т.д.). Конечно, если эритроциты разрушают, оставшиеся клетки затем должны быть отделены от лизата, например, при помощи фильтрации, седиментации или фракционирования по плотности.
Вне зависимости от того, лизируют ли эритроциты, суспендированные клетки можно отмыть, снова центрифугировать и ресуспендировать один или более последующих раз для достижения большей чистоты. Альтернативно, клетки можно отделить на основании профиля поверхностных клеточных маркеров или на основании размеров и гранулярности клеток.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
После окончательного выделения и ресуспендирования, клетки можно культивировать и, при желании, анализировать количество и жизнеспособность для оценки выхода клеток. Предпочтительно, клетки культивируют без дифференцировки, на твердой поверхности с использованием подходящей среды для культивирования клеток при подходящих плотностях клеток и условиях культивирования. Таким образом, в конкретном варианте осуществления клетки культивируют без дифференцировки на твердой поверхности, как правило, сделанной из пластика, такой как чашки Петри или флаконы для клеточной культуры, в присутствии подходящей среды для культивирования клеток [например, DMEM, как правило, дополненной 5-15% (например, 10%) подходящей сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка или сыворотка человека], и инкубируют в условиях, которые позволяют клеткам прикрепляться к твердой поверхности и пролиферировать. После инкубации клетки отмывают для того, чтобы удалить не прикрепившиеся клетки и клеточные фрагменты. Клетки поддерживают в культуре в той же самой среде и в тех же условиях, до тех пор, пока они не достигнут подходящей конфлюэнтности, как правило, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90%, с заменой среды для культивирования клеток при необходимости. После достижения желаемой клеточной конфлюэнтности, клетки можно наращивать посредством последовательных пересевов с использованием отслаивающего вещества, такого как трипсин, и пересева на новую поверхность для культивирования клеток при подходящей плотности клеток (как правило, 2000-10000 клетки/см). Таким образом, клетки пересевают по меньшей мере два раза в такой среде без дифференцировки, в то же время сохраняя их фенотип развития, и более предпочтительно клетки можно пересевать по меньшей мере 10 раз (например, по меньшей мере 15 раз или даже по меньшей мере 20 раз) без потери фенотипа развития. Как правило, клетки высевают с желаемой плотностью, такой как приблизительно от 100 клеток/см до приблизительно 100000 клеток/см (такой как приблизительно от 500 клеток/см до приблизительно 50000 клеток/см, или, более конкретно, приблизительно от 1000 клеток/см до приблизительно 20000 клеток/см). Если высевать с более низкими плотностями (например, приблизительно 300 клеток см), можно более легко изолировать клоны клеток. Например, через несколько дней клетки, посеянные с такой плотностью, будут пролиферировать в гомогенную популяцию. В конкретном варианте осуществления плотность клеток составляет 2000-10000 клетки/см.
Выбирают клетки, которые остаются прикрепленными к твердой поверхности после такой обработки, включающей по меньшей мере два пересева, и анализируют интересующий фенотип при помощи общепринятых способов для того, чтобы подтвердить идентичность ASC, как будет сказано ниже. Клетки, которые остаются прикрепленными к твердой поверхности после первого пересева, имеют различное происхождение; таким образом, указанные клетки должны быть пересеяны по меньшей мере еще раз. В результате вышеописанного способа получают гомогенную популяцию клеток с интересующим фенотипом. Адгезия клеток к твердой поверхности после по меньшей мере двух пересевов составляет предпочтительный вариант осуществления изобретения для отбора ASC. Подтверждение интересующего фенотипа можно проводить с использованием общепринятых способов.
Предпочтительно, указанное наращивание проводят посредством удвоения или утроения указанной популяции по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 раз. В дополнительном варианте осуществления указанное наращивание переносит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 пересевов.
Поверхностные клеточные маркеры можно определять любым подходящим общепринятым способом, как правило, основанным на позитивной/негативной селекции; например, можно использовать моноклональные антитела против поверхностных клеточных маркеров, чье присутствие/отсутствие на клетках надо подтвердить; хотя также можно использовать другие способы. Таким образом, в конкретном варианте осуществления используют моноклональные антитела против одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или предпочтительно всех маркеров из CD 11b, CD 11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34 и CD133 для того чтобы подтвердить отсутствие указанных маркеров на отобранных клетках; и моноклональные антитела против одного, двух, трех, четырех или предпочтительно всех маркеров из CD9, CD44, CD54, CD90 и CD105 применяют для того, чтобы подтвердить их присутствие или обнаруживаемые уровни экспрессии по меньшей мере одного и предпочтительно всех из указанных маркеров. Указанные моноклональные антитела известны, коммерчески доступны или могут быть получены специалистом в данной области с использованием общепринятых способов.
2
Активность IDO, индуцированную IFN-γ, у выбранных клеток можно определять при помощи любого подходящего общепринятого анализа. Например, выбранные клетки можно стимулировать IFN-γ и анализировать экспрессию IDO; затем можно проводить общепринятый вестерн-блоттинг для анализа экспрессии белка IDO и можно измерять ферментативную активность IDO в выбранных клетках после стимуляции IFN-γ по конверсии триптофана в кинуренин с использованием, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и фотометрического определения концентрации кинуренина в супернатанте в виде считывания. Поскольку ASC экспрессирует IDO в определенных условиях, для селекции ASC можно использовать любой подходящий способ, который позволяет определять активность IDO после стимуляции IFN-γ. Количество произведенной IDO зависит от числа клеток на квадратный сантиметр, которое составляет предпочтительно уровень от 5000 клеток/см или больше, но не ограничивается этой концентрацией, и концентрации IFN-гамма, которая в идеале составляет 3 нг/мл или больше, но не ограничивается этой концентрацией. Активность произведенной IDO при описанных условиях будет приводить к определяемой выработке кинуренина на микромолярном уровне через 24 часа или более.
Способность выбранных клеток дифференцироваться по меньшей мере в две клеточные линии можно проанализировать при помощи общепринятых способов, известных в данной области.
ASC можно наращивать клонально, при желании, с использованием подходящего способа для клонирования клеточных популяций. Например, пролиферирующую популяцию клеток можно физически отделить и пересеять на отдельную поверхность (или в лунку мультилуночного планшета). Альтернативно, клетки можно субклонировать в мультилуночном планшете в статистическом соотношении для облегчения помещения одной клетки в каждую лунку (например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 1 клетки/лунку или даже приблизительно от 0,25 до приблизительно 0,5 клеток/лунку, например, 0,5 клеток/лунку). Конечно, клетки можно клонировать посредством посева их в низкой плотности (например, на чашку Петри или другой подходящий субстрат) и изоляцией их от других клеток с использованием устройств, таких как кольца для клонирования. Продуцирование клональной популяции можно наращивать в любой подходящей среде для культивирования. В любом случае, выделенные клетки можно культивировать до подходящей точки, когда можно оценивать их фенотип развития.
Показано, что можно достигнуть наращивания ASC ex vivo без стимуляции дифференцировки в течение длительных периодов времени, например, с использованием специально отобранных серий подходящей сыворотки (такой как эмбриональная телячья сыворотка или сыворотка человека). Способы для измерения жизнеспособности и выхода клеток известны в данной области (например, исключение трипанового синего).
Все этапы и процедуры по выделению клеток из клеточной популяции по изобретению можно проводить, при желании, вручную. Альтернативно, процесс выделения таких клеток можно облегчить и/или автоматизировать при помощи одного или более подходящих устройств, примеры которых известны в данной области.
КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА MSC
Указанные MSC также можно нарастить ex vivo. То есть, после выделения, указанные MSC можно поддерживать и позволять им пролиферировать ex vivo в среде для культивирования клеток. Такая среда содержит, например, модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) с антибиотиками (например, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицин) или без антибиотиков, и 2 мМ глутамин, и дополнена 2-20% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS). Специалист в данной области знает, как модифицировать или изменять концентрации среды и/или дополнительных компонентов среды по мере необходимости для используемых клеток. Сыворотка часто содержит клеточные и неклеточные факторы и компоненты, которые необходимы для жизнеспособности и наращивания. Примеры сывороток включают эмбриональную телячью сыворотку (FBS), бычью сыворотку (BS), телячью сыворотку (CS), эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), сыворотку новорожденных телят (NCS), козью сыворотку (GS), лошадиную сыворотку (HS), свиную сыворотку, овечью сыворотку, кроличью сыворотку, крысиную сыворотку (RS) и т.д. Также в пределах объема изобретения, если указанные MSC имеют человеческое происхождение, среду для культивирования клеток дополняют сывороткой человека, предпочтительно аутологичного происхождения. Следует понимать, что сыворотка должна быть инактивирована нагреванием при 55-65°C в случае необходимости инактивации компонентов каскада комплемента. Изменения концентраций сыворотки и/или удаление сыворотки из среды для культивирования также можно использовать для усиления выживания одного или более желаемых типов клеток. Предпочтительно, указанные MSC выигрывают от концентраций FBS приблизительно от 2% до приблизительно 25%. В другом варианте осуществления MSC можно наращивать в среде для культивирования клеток определенного состава, в котором сыворотка заменена комбинацией сывороточного альбумина, сывороточного трансферрина, селена и рекомбинантных белков, в том числе, в качестве неограничивающих примеров, инсулина, тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и основного фактора роста фибробластов (bFGF), известных в данной области.
Многие среды для культивирования клеток уже содержат аминокислоты, однако некоторые требуют дополнения перед культивированием клеток. Такие аминокислоты в качестве неограничивающих примеров включают, L-аланин, L-аргинин, L-аспарагиновая кислота, L-аспарагин, L-цистеин, L-цистин, L-глутаминовая кислота, L-глутамин, L-глицин и т.п.
Противомикробные средства, как правило, применяют на клеточной культуре для снижения бактериальной, микоплазменной и грибковой контаминации. Как правило, применяемые антибиотики или противогрибковые соединения представляют собой смеси пенициллин/стрептомицин, могут также в качестве неограничивающих примеров включать амфотерицин (Фунгизон(R)), ампициллин, гентамицин, блеомицин, гидромацин, канамицин, митомицин и т.д.
Гормоны могут также успешно применяться на клеточной культуре и в качестве неограничивающих примеров включают D-альдостерон, диэтилстилбестрол (DES), дексаметазон, b-эстрадиол, гидрокортизон, инсулин, пролактин, прогестерон, соматостатин/гормон роста человека (HGH) и т.д.
НАРАЩЕННЫЕ КЛЕТКИ
В одном из вариантов осуществления MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты могут быть наращены перед применением в способе по настоящему изобретению. Способы для наращивания клеток известны в данной области.
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ КЛЕТКИ
В другом варианте осуществления MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты могут являться генно-инженерными клетками (например, трансдуцированными или трансфицированными чужеродной нуклеиновой кислотой) или полученными из этих клеток.
Например, указанные клетки могут быть генетически сконструированы для постоянной экспрессии индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO), например, при помощи трансфекции соответствующей конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный фермент и необязательно подходящую промоторную последовательность. Генетическая инженерия клеток известна в данной области и может проводиться специалистом в данной области.
ОБЛУЧЕННЫЕ КЛЕТКИ
В еще одном варианте осуществления MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты могут быть облучены перед их применением в способе по настоящему изобретению. Облучение клеток снижает их способность к пролиферации и время выживания.
Облучение можно проводить с использованием подходящего контролируемого источника ионизирующей радиации, такого как прибор для гамма-излучения. Условия облучения должны быть подобраны экспериментально специалистом в данной области для того, чтобы определить требуемое время облучения для передачи дозы радиации, которая вызовет долговременную задержку пролиферации у MSC, регуляторных T-клеток и/или фибробластов. В одном из вариантов осуществления указанная доза радиации находится в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из 1-100 Гр, 5-85 Гр, 10-70 Гр, 12-60 Гр, однако особенно предпочтительная указанная доза радиации находится в диапазоне 15-45 Гр.
КЛЕТКИ, ОБРАБОТАННЫЕ АНТАГОНИСТОМ CD26
В другом варианте осуществления MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты могут быть обработаны антагонистом или ингибитором CD26 перед применением в способе по настоящему изобретению. Антагонисты и ингибиторы CD26 известны в данной области и в качестве неограничивающих примеров включают аминометилпиридин; P32/98; NVP DPP728; PSN9301; изолейцин тиазолидид; денаглиптин; ситаглиптин; вилдаглиптин; саксаглиптин; алоглиптин; дипротин A; такую обработку может проводить специалист в данной области.
КЛЕТКИ, СТИМУЛИРОВАННЫЕ IFN-ГАММА
В другом варианте осуществления MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты могут быть стимулированы интерфероном гамма перед применением в способе по настоящему изобретению. Обработка MSC IFN-гамма для их стимуляции известна в данной области и может проводиться специалистом в данной области.
КЛЕТКИ, СТИМУЛИРОВАННЫЕ АНТИГЕНОМ
В другом варианте осуществления MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты могут быть стимулированы антигенами перед применением в способе по настоящему изобретению. Обработка MSC антигеном для их стимуляции известна в данной области и может проводиться специалистом в данной области.
MSC, ОБРАБОТАННЫЕ МИТОМИЦИНОМ C
Еще в одном варианте осуществления MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты можно обрабатывать митомицином C перед применением в способе по настоящему изобретению. Обработка MSC митомицином C известна в данной области и может быть проведена специалистом в данной области.
Кроме того, при желании, MSC, регуляторные T-клетки и/или фибробласты перед применением в способе по настоящему изобретению можно подвергать воздействию комбинации из двух или трех обработок, выбранных из группы, которая состоит из облучения, стимуляции IFN-гамма и обработки митомицином C.
Условия поддержания культуры указанных MSC могут также включать клеточные факторы, которые позволяют клеткам оставаться в недифференцированной форме. Специалистам в данной области понятно, что перед дифференцировкой, дополнительные компоненты, которые ингибируют клеточную дифференцировку, следует удалить из среды для культивирования. Также понятно, что не всем клеткам требуются эти факторы. На самом деле, эти факторы могут вызывать нежелательные эффекты, в зависимости от типа клеток.
Признаки и преимущества по изобретению будут более полно проиллюстрированы при помощи следующих не ограничивающих примеров, где все части и процентные соотношения приведены по массе, кроме случаев, когда в прямой форме заявлено иное.
Пример 1:
Лечение артрита, индуцированного коллагеном (CIA), с использованием ASC
Материалы и Способы
Мышиная модель артрита, индуцированного коллагеном (CIA)
q
Экспериментальный артрит индуцировали у самцов мышей DBA1/(H-2) (возрастом 6-8 недель). В день начала исследования каждую мышь инъецировали подкожно в хвост (2-3 см от тела) первой дозой эмульсии куриного коллагена типа II (CII) (конечная концентрация 1 мг/мл) в полном адъюванте Фрейнда (туберкулезная микобактерия в конечной концентрации 1 мг/мл) (CFA) в объеме 0,1 мл/животное. Через 21 день после первой инъекции коллагена вторую инъекцию (повторную иммунизацию) CII (0,1 мл/животное) вводили каждому животному снова подкожно в хвост, но в другое место. В этом случае суспензия коллагена была приготовлена с использованием неполного адъюванта Фрейнда (IFA).
Когда индексная оценка артрита составляла примерно 2-4, животных лечили наращенными стволовыми клетками, полученными из жировой ткани, или носителем (раствором Рингера) в качестве контроля. За развитием CIA следили ежедневно (с понедельника по пятницу) с помощью измерения воспаления-покраснения-анкилоза суставов верхних и нижних конечностей по разработанной заранее системе оценки.
Объем обеих задних лап каждого животного измеряли ежедневно после введения исследуемого препарата или носителя и рассчитывали среднее для обеих лап. Кроме того, объем задней лапы, измеренный на первый день (до первой инъекции коллагена и взятый в качестве исходного объема) у каждого животного, вычитали из объема лапы, измеренного в каждый последующий день, для получения чистого увеличения объема лапы (или отека) для каждого животного. Дополнительно, оценивали тяжесть артрита с той же частотой и в то же время на передних и задних лапах по следующей системе индексной оценки артрита:
0: Нет признаков артрита
1: Опухание и/покраснение лапы или 1 пальца
2: Воспалены две группы суставов (опухание и/или покраснение)
3: Воспалены более чем две группы суставов (опухание и/или покраснение)
4: Воспаление всей лапы. Тяжелый артрит
Окончательная оценка представляла собой сумму оценок четырех лап. Максимальная оценка составляла 16.
Схема эксперимента
Контроль
Группа A = без лечения.
Внутривенное введение
Группа C=Внутривенная инъекция 1 миллиона клеток на дозу, одна доза каждый день. Всего 5 доз.
Группа D = Внутривенная инъекция 3 миллионов клеток с первой дозой и 1 миллиона клеток со второй и третьей дозами, одна доза через день. Всего 3 дозы.
Внутрилимфатическое введение
Группа E = Внутрилимфатическая инъекция 320000 клеток на дозу (160000 в правый паховый узел, 160000 - в левый). Всего 2 дозы, вторая доза через 7 дней после первой.
Контроль с носителем
Группа F = Внутрилимфатическая инъекция раствора Рингера. Всего 2 дозы, вторая доза через 7 дней после первой.
N = 12 мышей/в группе.
Внутривенное введение
Исследуемый препарат вводили внутривенно через хвостовую вену с использованием стерильной иглы-бабочки (25G). Животные получали 5 последовательных доз или 3 дозы через сутки (одну в сутки). Животные получали 0,2 мл исследуемого препарата в виде инфузии со скоростью 0,05 мл/мин внутривенно в хвостовую вену.
Внутрилимфатическое введение в паховые лимфоузлы
Мышей DBA1 анестезировали посредством ингаляции от 2,0 до 2,5% Изофлорана через носовую маску и укладывали на подогретую поверхность при 37°C. После депиляции (крем Veet для чувствительной депиляции) и дезинфекции паховой области 70% этанолом делали разрез от 6 до 8 мм в паховой области. Определяли местонахождение лимфоузлов в паховой жировой клетчатке и инъецировали 8 мкл носителя или носителя с ASC (с плотностью 20 миллионов клеток/мл) в лимфоузел с использованием шприца Гамильтона, шприц с шириной иглы 30. Разрез зашивали одним или двумя узлами и повторяли процедуру с паховым узлом на другой стороне. Мышам давали отойти от анестезии. Через семь суток процедуру повторяли.
Получение наращенных стволовых клеток из жировой ткани
Жировую ткань человека получали посредством липосакции, под местной анестезией и общей седацией. Полую канюлю с тупым наконечником вводили в подкожное пространство через небольшой разрез (менее чем 0,5 см в диаметре). Вместе с легким отсасыванием канюлю продвигали через жировую ткань брюшной стенки для механического разрушения жировой ткани. Физиологический раствор и сосудосуживающий препарат эпинефрин инъецировали в жировую ткань для того, чтобы уменьшить кровопотерю. Таким образом, получали от 80 до 100 мл неочищенного липоаспирата от каждого пациента, которого собирались лечить.
4
3
2
Неочищенный липоаспират тщательно отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS; Gibco BRL, Paisley, Scotland, UK) для удаления клеток крови, физиологического раствора и местного анестетика. Внеклеточный матрикс расщепляли раствором коллагеназы типа II (0,075%; Gibco BRL) в сбалансированном солевом растворе (5 мг/мл; Sigma, St. Louis, USA) в течение 30 минут при 37°C для высвобождения клеточной фракции. Затем инактивировали коллагеназу добавлением равного объема среды для культивирования клеток (модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM; Gibco BRL), которая содержала 10% эмбриональную телячью сыворотку (FBS; Gibco BRL). Суспензию клеток центрифугировали при 250×g в течение 10 минут. Клетки ресуспендировали в 0,16M NHCl и оставляли в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) для лизиса эритроцитов. Смесь центрифугировали при 250×g, и клетки ресуспендировали в DMEM с 10% FBS и 1% смесью ампициллин/стрептомицин (Gibco BRL), а затем фильтровали через 40 мкм сито и высевали в флаконы для тканевых культур в концентрации 10-30×10 клетки/см.
2
3
2
Клетки культивировали в течение 24 часов при 37°C в атмосфере 5% CO в аэробных условиях. Затем флаконы для культивирования отмывали при помощи PBS для удаления не прикрепившихся клеток и клеточных фрагментов. Клетки поддерживали в культуре в той же самой среде и в тех же условиях до тех пор, пока они не достигали приблизительно 80% конфлюэнтности, с заменой среды для культивирования каждые 3-4 суток. Клетки пересевали с трипсином-ЭДТА (Gibco BRL) в разведении 1:3, что соответствовало плотности клеток приблизительно 5-6×10 клеток/см.
Для экспериментов клетки при удвоении популяции в 12-16 раз трипсинизировали и ресуспендировали в носителе (раствор Рингера) до желаемой плотности клеток. Затем переносили в шприц и инъецировали мышей.
Статистический анализ
Статистическую значимость результатов оценивали с использованием статистической программы GraphPadInstat 3. Результаты выражали в виде среднего ± стандартная ошибка среднего, где (n) является количеством животных.
Фигура 1 снабжена примечаниями для пояснения значений p при сравнении Группы A с Группой E. Значимые отличия отмечены как: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Различия между группами оценивали с помощью теста Крускалл-Уоллис для непарных данных с апостериорным тестом Данна для множественных сравнений. Значимой считали величину P<0,05.
Результаты
Индуцировали артрит у мышей DBA1 с помощью инъекции куриного коллагена II. Когда мыши демонстрировали показатель артрита 2-4, их лечили наращенными ASC посредством внутривенного или внутрилимфатического введения. Для контроля внутрилимфатического введения мышам вводили носитель. Показатель артрита контролировали ежедневно (см. таблицу 1). В то время как нелеченные мыши или мыши, которых лечили носителем, демонстрировали высокий уровень воспаления лап, который повышался в зависимости от времени, мыши, которых лечили интралимфатически введенными наращенными ASC, демонстрировали значительное снижение воспаления. Кроме того, терапевтический эффект внутрилимфатического введения был выше, чем внутривенного введения (см. фигуру 1).
Вывод
Настоящее исследование показывает, что внутрилимфатическое введение ASC человека мышам DBA1 приводит к статистически значимому уменьшению тяжести артрита (на что указывает индексная оценка артрита).
Кроме того, терапевтический эффект внутрилимфатического введения всех 640000 ASC (в двух дозах) был значительно выше, чем внутривенное введение всех 5 миллионов клеток. Эти результаты указывают, что внутрилимфатический путь введения является более эффективным, поскольку более сильный терапевтический эффект достигается при помощи меньшего количества клеток.
Таким образом, поскольку изобретение было описано в настоящем документе по отношению к конкретным аспектам, признакам и иллюстративным вариантам осуществления изобретения, следует понимать, что полезность изобретения, таким образом, не ограничена, а скорее охватывает многие другие аспекты, признаки и варианты осуществления и распространяется на них. Таким образом, формула изобретения, изложенная далее, предназначена для соответствующего широкого истолкования как включающая все указанные аспекты, признаки и варианты осуществления в пределах их объема и сущности.
Таблица 1Оценка артрита у мышей с CIA (Пример 1)
День
Группа
Показатель оценки артрита
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
A
Среднее
3,75
5,5
7,67
7,75
7,83
8
8,92
8,83
9,25
9,33
9,5
9,58
9,58
9,67
10,4
10,9
10,9
0
0
11,8
12,3
12,7
13
13,5
SD
0,45
2,65
2,61
2,53
2,55
2,49
2,57
2,66
2,18
2,23
2,24
2,15
2,15
2,06
1,98
1,68
1,68
0
0
2,04
1,76
1,83
1,76
1,98
SEM
0,13
0,76
0,75
0,73
0,74
0,72
0,74
0,77
0,63
0,64
0,65
0,62
0,62
0,59
0,57
0,48
0,48
0
0
0,59
0,51
0,53
0,51
0,57
C
Среднее
2,42
2,67
2,5
2,75
3,08
3,67
4,17
5,83
6,5
0
0
7,25
7,58
8,33
8,83
8,83
SD
0,67
0,78
1,09
1,29
1,44
1,37
1,75
2,72
3,48
0
0
4,18
4,19
4,31
4
4,13
SEM
0,19
0,22
0,31
0,37
0,42
0,4
0,51
0,79
1
0
0
1,21
1,21
1,25
1,15
1,19
D
Среднее
2,92
3,88
4,75
4,88
5,75
6,63
6,63
7,5
7,5
7,75
7,88
8,13
0
0
9,38
9,75
9,75
9,88
9,88
SD
0,79
1,73
1,49
1,96
1,75
2,39
2,39
2,27
2,27
2,19
2,17
1,89
0
0
1,3
1,58
2,19
2,47
2,47
SEM
0,23
0,61
0,53
0,69
0,62
0,84
0,84
0,8
0,8
0,77
0,77
0,67
0
0
0,46
0,56
0,77
0,88
0,88
E
Среднее
3,08
3
4
4,5
5
5,33
5,75
6,17
6,25
6,45
6,55
6,82
6,91
6,64
7,18
7,18
0
0
6,36
7,09
7,27
7,45
7,64
SD
1
1,13
1,48
1,62
1,91
2,06
2,05
2,33
1,96
1,81
1,81
2,04
2,07
1,86
2,32
2,36
0
0
1,91
2,26
2,41
2,54
2,38
SEM
0,29
0,33
0,43
0,47
0,55
0,59
0,59
0,67
0,57
0,55
0,55
0,62
0,62
0,56
0,7
0,71
0
0
0,58
0,68
0,73
0,77
0,72
F
Среднее
3,5
3,82
4,64
5,36
6,2
7
7,6
8,4
8,7
8,7
8,9
10,1
10,7
10,8
11
0
0
11,5
12
12,3
12,2
12,7
SD
0,8
0,75
1,43
1,57
1,55
1,63
0,97
0,97
0,95
0,82
1,29
2,13
2,31
2,44
2,31
0
0
2,27
1,94
1,89
1,81
2
SEM
0,23
0,23
0,43
0,47
0,49
0,52
0,31
0,31
0,3
0,26
0,41
0,67
0,73
0,77
0,73
0
0
0,72
0,61
0,60
0,57
0,63