Генотипирование а1-протеобактерий в иксодовых клещах в Российской Федерации и Республике Казахстан

реплицироваться и пройти отбор. Некоторым подтверждением этого может служить то, что в опытах с адаптацией вируса клещевого энцефалита к клеткам BHK-21 было отмечено возникновение в процессе адаптации как несинонимичных (меняющих строение белка), так и синонимичных замен, меняющих только вторичную структуру РНК (Mandl et al., 2001).

Дальнейшее сопоставление местоположения выявленных корреляций при возникновении мутаций в разных частях РНК флавивирусов с положением сохраняющихся структур РНК, обнаруживаемых различными методами, поможет составить представление о взаимодействиях этих структур друг с другом и их функционировании в вирусном геноме.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ а1-ПРОТЕОБАКТЕРИЙ В ИКСОДОВЫХ КЛЕЩАХ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ И РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН

С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, P-E. Fournier, D. Raoult

ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора,

ГБОУВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России,

Université de la Méditerranée, Marseille, France

Представители семейств Rickettsiaceae (в составе родов Rickettsia и Orientia) и Anaplasmataceae (рода Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia и Wolbachia) из порядка Rickettsiales являются а1-протеобактериями и принадлежат к классу Proteobacteria. Они растут и размножаются только в эукариотических клетках преимущественно млекопитающих и членистоногих.

В последние годы появились данные о распространении представителей родов Rickettsia, Anaplasma и Ehrlichia в иксодовых клещах на некоторых территориях Российской Федерации (Rydkina E. et al., 1999; Alek-seev A.N. et al., 2001; Telford 3 S.R. и др., 2002; Morozova O.V. et al., 2002, Eremeeva et al., 2006; Иголкина и др., 2006, Нефедова и др., 2008, Chausov et al., 2009, Рар и др., 2010, и др.).

В период с 2000 по 2005 г. ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора и Средиземноморский университет (Марсель, Франция) осуществили совместные молекулярно-биологические исследования иксодовых клещей, собранных с территорий Российской Федерации (РФ) и Республики Казахстан (РК), на наличие а1-протеобактерий из родов Ri-ckettsia, Anaplasma и Ehrlichia.

Материал и методы. Имаго иксодовых клещей четырех родов (Dermacentor, Ixodes, Haemaphysalis и Hya-lomma) в количестве 940 экземпляров были собраны с растительности в апреле - мае 2000-2003 гг. на 11 административных территориях РФ и 3 территориях РК (табл. 1). Идентификация клещей была осуществлена по морфологическим признакам (Б.И. Померанцев, 1950; Н.А. Филиппова, 1977). Исследование иксодовых клещей осуществлялось индивидуально.

Фрагмент ompA гена, специфичный для всех рик-кетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) 590 пар оснований (п.о.), был амплифицирован и секве-нирован с использованием праймеров Rr190.70p и Rr190.701n (Fournier PE et al., 1998). Две пары праймеров CS1d - CS535r и CS409d - RP1258n были использованы для амплификации гена цитрат-синтазы (gltA) (Roux et al., 1997). ДНК анаплазм и эрлихий была ампли-фицирована в ПЦР с применением прямого праймера

16SEHRD (5' GGTACCYACAGAAGAAGTCC 3') и обратного праймера 16SEHRR (5' TAGCACTCATCGTTTACAGC 3'), которые амплифицируют фрагмент 345 п.о. 16S рРНК известных анаплазм и эрлихий (Parola et al., 2001).

ПЦР осуществляли в термоциклере Peltier PTC-200 (MJ Research, Inc, Watertown, MA), как описано (Roux et al., 1997). В качестве положительного контроля использовали ДНК Rickettsia montanensis и Ehrlichia canis, в качестве отрицательного контроля - дистиллированную воду. Положительные ПЦР-продукты были очищены с применением QIAquick PCR purification kit (Qiagen) и секвенированы с использованием d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) на автоматическом секвенато-ре ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems). Полученные ну-клеотидные последовательности были идентифицированы в режиме прямого доступа в GenBank.

Результаты и обсуждение. Проведенный скрининг позволил выявить в иксодовых клещах несколько видов патогенных для человека микроорганизмов, среди них «классический» патоген - Rickettsia sibirica и риккетсии, отнесенные к «новым» патогенам: «R. heilongjiangensis», R. slovaca, R. helvetica, R. aeschlimannii, а также A. pha-gocytophilum (табл. 1, 2).

ДНК R. sibirica была выявлена у 4 из 33 экземпляров клещей Dermacentor. nuttaUi, собранных на территории Красноярского края (сбор D.nuttalli был осуществлен только на этой административной территории) в очагах клещевого риккетсиоза (КР). Ранее этот вид риккетсий был генотипирован в 12 % клещей D.nuttalli, собранных в очагах КР на территории Республики Алтай (Rydkina et al., 1999).

R.heilongjiangensis была выявлена у 7 из 91 (7,7 %) экземпляров клещей Haemaphysalis concinna, собранных на территориях Алтайского (4 из 20), Красноярского (2/56/3,57 %) и Приморского (2 из 15) краев. Этот вид риккетсий также обнаружен в 1 из 33 экземпляров клещей D.nuttalli, собранных на территории Красноярского края. Это первое выявление «Rickettsia heilongjiangensis» в клещах H. concinna на территории РФ. В Хабаровском крае в 2002 г. у 13 пациентов с клинической картиной,

напоминающей КСТ, в образцах крови и биоптатах с места первичного аффекта была генотипирована «R.hei-longjiangensis» (Mediannikov et al., 2004).

ДНК R.slovaca выявлена в двух пробах клещей D.marginatus, собранных в европейской части РФ на территориях Ставропольского края (1 из 3) и Воронежской области (1 из 2). R.slovaca недавно отнесена к патогенным для человека риккетсиям, вызывает синдром «TIBOLA» (от англ. tick-borne lymphadenopathy), характеризующийся первичным аффектом в волосистой части головы и увеличением затылочных лимфоузлов (Ra-oult et al., 1997).

При исследовании 122 экземпляров клещей Ixodes persulcatus, собранных на территории Омской области, в 1 (0,82 %) пробе была генотипирована риккетсия, имеющая 99,7 % соответствия по гену gltA с R. helvetica. R. helvetica была впервые описана в Швейцарии в 1979 г. (Burgdorfer et al., 1979) и в дальнейшем была генотипирована в клещах этого рода в ряде стран Европы, однако ее патогенность для человека была продемонстрирована только в 1997 г. (Fournier et al., 2000).

ДНК риккетсии, имеющей высокую степень гомологии с R.aeschlimannii по gltA (99,8 %) и ompA (99,8 %) генам, впервые выявлена в европейской части РФ в Ставропольском крае (R.aeschlimannii штамм Stavropol) в 8 из 40 исследованных экземпляров клещей Hyalomma marginatum marginatum. В Алма-Атинской области РК Rickettsia aeschlimannii была обнаружена в 2 из 36 экземпляров клещей Haemaphysalis punctata.

Первое документальное подтверждение инфекции, вызываемой R.aeschlimannii, было получено у пациента, вернувшегося во Францию из Марокко (Raoult et al., 2002), и риккетсией, близкой R.aeschlimanni (99 % гомологии по ompA гену), у охотника в ЮАР (Pretorius and Birtles, 2002) в 2000 г.

В результате проведенного скрининга риккетсий в иксодовых клещах на территории РФ удалось установить географическое распространение R.raoultii (гено-вариант RpA4, DnS14 и DnS28). R.raoultii (геновариант RpA4) была впервые выявлена в клещах R.pumilio в Астраханской области (Rydkina et al., 1999). ДНК Rickettsia raoultii (геновариант RpA4) была выявлена в клещах D. reticulatus на территории Воронежской и Челябинской областей, в клещах D.marginatus и D.reticulatus - на территориях Оренбургской, Омской и Новосибирской областей. На территории Алтайского края эта риккетсия была выявлена в клещах D.reticulatus, D.marginatus, H.concinna и I.persulcatus.

R.raoultii (геновариант DnS14 и DnS28) была впервые выявлена в Республике Алтай в клещах D.nuttalli (Rydkina et al., 1999). ДНК R.raoultii (геновариант DnS14) была выявлена в клещах D.marginatus на территории Оренбургской области и Алтайского края, в клещах D.nuttalli - на территории Красноярского, Приморского краев и Республики Бурятия, в клещах D.silvarum - на территории Приморского края и Республики Бурятия. Находки ДНК R.raoultii (геновариант DnS28) были ограничены территориями Красноярского края и Республики Бурятия, где эта риккетсия обнаружена в клещах D. nuttalli и D.silvarum соответственно.

В Республике Казахстан R.raoultii RpA4 была генотипирована в Карагандинской области в клещах D.niveus и D.marginatus, там же R.raoultii DnS14 была выявлена в клещах D.niveus. В Восточно-Казахстан-

ской области R.raoultii RpA4 была выявлена в клещах D.marginatus.

R.raoultii была описана в последние годы (Mediannikov et al., 2008) и включила в себя три генотипа риккетсий: Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28, описанных ранее (Rydkina et al., 1999). Патоген-ность этих генотипов риккетсий для человека окончательно не установлена, однако в последние годы выяснено не только широкое распространение этих риккет-сий в Европе, но и их вероятная роль в возникновении синдрома TIBOLA (Parola et al., 2009).

До настоящего времени отсутствовали данные о выявлении риккетсий в клещах рода Ixodes в РФ. Нами впервые выявлен новый вид риккетсий в клещах I.persulcatus, собранных на различных территориях РФ (Shpy-nov et al., 2003). Эта риккетсия имела 98 % соответствия по гену 16S рибосомальной РНК и 96 % гомологии по гену gltA (номера GenBank AF503168 и AF503167 соответственно) с R. canadensis и была названа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae». «Candidatus Rickettsia tarasevi-chiae» имеет широкое распространение на территории РФ в зоне тайги и лесостепи. Этот риккетсиальный агент был обнаружен у 81 из 317 (25,5 %) исследованных клещей I.persulcatus, собранных на территориях Челябинской, Тюменской, Омской и Новосибирской областей, Алтайского, Красноярского и Приморского краев.

Новый генотип риккетсий, имеющий 86 % соответствия по гену ompA с R.tamurae, был выявлен в клещах этого вида, собранных на территории Алтайского и Красноярского краев.

Проведенные исследования позволили установить, что на территории РФ в иксодовых клещах имеют распространение четыре представителя семейства Anaplas-mataceae (табл. 2), два из них относятся к роду Anaplasma - A.phagocytophilum и A.bovis, два к роду Ehrlichia -E.muris и «Ehrlichia-like» 'Schotti variant', который генетически наиболее близок к C.ruminantium и группе моноцитарных эрлихий (Dumler et al., 2001). В клещах I. persulcatus были выявлены A.phagocytophilum (Алтайский и Приморский края), E.muris (Тюменская, Омская, Новосибирская области и Алтайский край) и «Ehrlichia-like» 'Schotti variant' (Омская область), а A.bovis (Приморский край) была генотипирована в клещах H. concinna). Три из четырех вышеперечисленных видов бактерий являются признанными патогенами теплокровных, передающимися клещами. Четвертый - «Ehrlichia-like» 'Schotti variant' - был описан при исследовании клещей I.ricinus, собранных в природных очагах гранулоцитар-ного эрлихиоза в Нидерландах, данные о его патогенно-сти для теплокровных отсутствуют (Schouls et al., 1999).

Нуклеотидная последовательность, имеющая 100 % гомологии с ДНК некультивируемой бактерии «Montezuma», была выявлена в клещах I.persulcatus, собранных на территориях Омской и Новосибирской областей, Алтайского и Приморского краев. На основании изучения нуклеотидных последователдьностей 16S рРНК этот микроорганизм был отнесен к порядку Rickettsiales (О.Ю. Медянников и др., 2004), а его филогенетическая позиция находится между представителями семейств Rickettsiaceae и Anaplasmataceae.

В результате выполненного молекулярно-биологи-ческого скрининга установлено присутствие 13 а1-про-теобактерий из родов Rickettsia, Anaplasma и Ehrlichia в иксодовых клещах, собранных на территориях

Таблица 1

Результаты генотипирования риккетсий в иксодовых клещах в Российской Федерации и Республике Казахстан

Территория Вид клещей Количество положительных проб/ общее количество исследованных клещей Секвени-рован. ген Идентификация

Российская Федерация

Ставропольский край D. marginatus D. reticulatus H. marginatum marginatum 1/3 0/3 8/40 ompA gltA ompA gltA Rickettsia slovaca Rickettsia aeschlimannii

Воронежская область D. marginatus D. reticulatus 1/2 1/1 ompA gltA ompA gltA Rickettsia slovaca Rickettsia raoultii RpA4

Оренбургская область D. marginatus D. reticulatus 5/24 3/24 3/14 ompA gltA ompA gltA ompA gltA Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia raoultii DnS14 Rickettsia raoultii RpA4

Челябинская область D. reticulatus I. persulcatus 7/38 8/39 ompA gltA gltA Rickettsia raoultii RpA4 «Candidatus rickettsia tarasevichiae»

Тюменская область I. persulcatus 1/19 gltA «Candidatus rickettsia tarasevichiae»

Омская область D. reticulatus D. marginatus I. persulcatus 1/5 3/17 41/122 1/122 ompA gltA ompA gltA gltA gltA Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia raoultii RpA4 «Candidatus rickettsia tarasevichiae» Rickettsia helvetica

Новосибирская область D. reticulatus D. marginatus I. persulcatus 36/67 3/41 1/26 ompA gltA ompA gltA gltA Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia raoultii RpA4 «Candidatus rickettsia tarasevichiae»

Алтайский край D. marginatus D. reticulatus I. persulcatus H. concinna 9 /27 3/27 17/41 3/47 1/47 1/47 6/20 4/20 ompA gltA ompA gltA ompA gltA gltA ompA ompA gltA ompA gltA ompA gltA Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia raoultii DnS14 Rickettsia raoultii RpA4 «Candidatus rickettsia tarasevichiae» Rickettsia tamurae 86 % гомологии Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia heilongjiangensis

Красноярский край D. nuttalli I. persulcatus H. concinna 4/33 7/33 1/33 1/33 2/20 1/20 2/56 ompA gltA ompA gltA ompA gltA ompA gltA gltA ompA ompA gltA Rickettsia sibirica Rickettsia raoultii DnS28 Rickettsia raoultii DnS14 Rickettsia heilongjiangensis «Candidatus rickettsia tarasevichiae» Rickettsia tamurae 86 % гомологии Rickettsia heilongjiangensis

Бурятия D. silvarum D. nuttalli 5/16 5/16 1/2 ompA gltA ompA gltA ompA gltA Rickettsia raoultii DnS14 Rickettsia raoultii DnS28 Rickettsia raoultii DnS14

Приморский край D. silvarum I. persulcatus H. concinna 23/30 25/44 2/44 2/15 ompA gltA gltA ompA gltA ompA gltA Rickettsia raoultii DnS14 «Candidatus rickettsia tarasevichiae» Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia heilongjiangensis

Республика Казахстан

Карагандинская область (Центральный Казахстан) D. niveus D. marginatus 3/5 1/5 5/22 ompA gltA ompA gltA Rickettsia raoultii RpA4 Rickettsia raoultii DnS14 Rickettsia raoultii RpA4

Алма-Атинская область Hyalomma asiaticum H. punctata 0/47 2/36 ompA gltA Rickettsia aeschlimannii

Восточно- Казахстанская область D. marginatus 6/18 ompA gltA Rickettsia raoultii RpA4

Таблица 2

Результаты генотипирования анаплазм и эрлихий в иксодовых клещах на территории Российской Федерации

Количество

Территория Вид клещей положительных проб/общее Идентификация

количество клещей

Тюменская область Ixodes persulcatus 1/19 Ehrlichia muris

Омская область Dermacentor reticulatus 0/5/0

Dermacentor marginatus 0/17

Ixodes persulcatus 4/122 Ehrlichia muris

2/122 «Ehrlichia-like» 'Schotti variant'

21/122 Бактерия «Montezuma»

Новосибирская Dermacentor reticulatus 0/67

область Dermacentor marginatus 0/41

Ixodes persulcatus 1/26 Ehrlichia muris

1/26 Бактерия «Montezuma»

Алтайский край Dermacentor marginatus 0/27

Dermacentor reticulatus 0/41

Ixodes persulcatus 1/47 Anaplasma phagocytophila

4/47 Ehrlichia muris

3/47 Бактерия «Montezuma»

Haemaphysalis concinna 0/20

Приморский край Dermacentor silvarum 0/30

Ixodes persulcatus 2/44 Anaplasma phagocytophila

5/44 Бактерия «Montezuma»

Haemaphysalis concinna 2/15 Anaplasma bovis

Российской Федерации и Республики Казахстан. Среди выявленных а1-протеобактерий R.sibirica является «классическим» патогеном, R.heilongjiangensis, R.slovaca, R.helvetica, R.aeschlimannii, Rickettsia raoultii и A.phagocytophilum были описаны как патогены человека в различных регионах мира в последнее десятилетие.

Необходимо продолжение исследований по моле-кулярно-биологической идентификации в иксодовых клещах возбудителей инфекционных заболеваний человека в различных регионах Российской Федерации и Республики Казахстан с учетом выявления в клещах ряда «новых» патогенов, список которых пополняется.

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПОЗИЦИЯ IXODES PERSULCATUS SCHULZE, 1930 -РЕЗЕРВУАРА И ВЕКТОРА МИКРООРГАНИЗМОВ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

С.Н. Шпынов

ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, Омск

В соответствии с классификационной схемой, принятой в Российской Федерации (Н.А. Филиппова, 1984), семейство Ixodidae подразделяется на два подсемейства -Ixodinae (Prostriata) и АтЫуошштае (Metastriata). По схеме, ранее принятой на Западе (Hoogstraal Н., 1985) и реклассифицированной в настоящее время с применением комплекса молекулярно-биологических, филоге-

нетических и морфологических методов (Klompen et al., 2002; Barker & Murrell, 2004, Nava et al., 2009), в группе Metastriata выделены подсемейства Amblyomminae, Hae-maphysalinae, Rhipicephalinae и Bothriocrotoninae.

Группа Prostriata включает один род Ixodes, подразделяющийся на 20 подродов с 220 видами (Колонин, 1985; Балашов, 2008), по другим данным - 242 видами