КОНЪЮГАТЫ СВЯЗУЮЩЕГО И АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (ADC), ИМЕЮЩИЕ ФЕРМЕНТАТИВНО РАСЩЕПЛЯЕМЫЕ ГРУППЫ
CONJUGATES OF BINDER AND ACTIVE SUBSTANCE (ADC) HAVING ENZYMATICALLY CLEAVABLE GROUPS

Введение и уровень техники
Настоящее изобретение относится к новым конъюгатам связующего и активного вещества(ADC) с улучшенными свойствами, активным метаболитам этих ADC и способу их получения. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению этих конъюгатов для лечения и/или профилактики заболеваний, а также к применению этих конъюгатов для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний, в частности гиперпролиферативных и/или ангиогенных заболеваний, таких как, например, рак. Такое лечение может проводиться как монотерапия, а также в сочетании с другими лекарственными средствами путем дополнительных терапевтических мероприятий. Связующим согласно настоящему изобретению предпочтительно является антитело.
Раковые заболевания являются следствием неконтролируемого клеточного роста различных тканей. Во многих случаях, новые клетки проникают в существующие ткани (инвазивный рост), или они метастазируют в отдаленные органы. Раковые заболевания встречаются в различных органах и часто имеют ткани-специфическое происхождение заболевания. Поэтому «рак» в качестве общего термина описывает большую группу определенных заболеваний различных органов, тканей или клеточных типов.
Опухоли на ранних стадиях можно удалять посредством хирургических и радио-терапевтических мер. Метастазированные опухоли, как правило, можно лечить только паллиативно посредством химиотерапии. Задачей является достижение оптимальной комбинации улучшения качества и увеличения срока жизни.
Конъюгаты связующих белков с одной или более молекулами активного соединения известны, в частности в форме так называемых «конъюгатов антитело-лекарственное средство» (ADC), в которых интернализирующее антитело, направленное против опухоль-связанного антигена, ковалентно присоединяется посредством связывающей единицы ("линкера") к цитотоксическому агенту. После введения ADC в опухолевую клетку и последующего диссоциирования конъюгата, либо цитотоксический агент сам по себе, либо цитотоксический метаболит, образованный из него, высвобождается внутри опухолевой клетки и может развивать свое действие в ней непосредственно и селективно. В этом случае, в отличие от обычной химиотерапии, повреждение нормальной ткани происходит в значительно более узких пределах [смотрите, например, J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu и P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry и B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)]. Таким образом, в WO 2012/171020 описываются ADC, в которых множество токсофорных молекул присоединяются посредством полимерного линкера к антителу. В качестве возможных токсофоров в WO 2012/171020 упоминаются среди прочего вещества SB 743921, SB 715992 (Испинесиб), MK-0371, AZD8477, AZ3146 и ARRY-520.
Вещества, упомянутые последними, представляют собой ингибиторы кинезинового белка веретена. Кинезиновый белок веретена (KSP, также известный как Eg5, HsEg5, KNSL1 или KIF11) представляет собой кинезин-подобный моторный белок, который является существенным для функции биполярного митотического веретена. Ингибирование KSP приводит к митотическому блоку и, через относительно длительный период, к апоптозу (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59). После открытия первого проникающего в клетку ингибитора KSP, Монастрол, ингибитор KSP были признаны как класс новых химиотерапевтических средств (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999), и они стали объектом ряда заявок на патент (например, WO 2006/044825; WO 2006/002236; WO 2005/051922; WO 2006/060737; WO 03/060064; WO 03/040979; и WO 03/049527). Однако, поскольку KSP активен только в течение короткого периода митотической фазы, ингибиторы KSP должны присутствовать в достаточно высокой концентрации в течение этой фазы. В WO 2014/151030 раскрыты ADC с определенными ингибиторами KSP. Заявки на патент WO 2015/096982 и WO 2016/096610 раскрывают ADC с ингибиторами KSP, которые также содержат ферментативно расщепляемые линкеры, но которые не имеют оптимального профиля активности.
Легумаин является ассоциированной с опухолью аспарагинилэндопептидазой (S. Ishii, Methods Enzymol., 1994, 244, 604; JM Chen и др., J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) и используется для процессинга пролекарств небольших цитотоксических молекул, такие как, например, среди прочего, производные доксорубицина и этопозида (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L. Stern et al. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri et al. ChemMedChem 2011, 6, 54).
Другие лизосомальные ферменты представляют собой, например, катепсин или гликозидазы, такие как, например, β-глюкуронидазы, которые также используются для высвобождения активных ингредиентов путем ферментативного расщепления пролекарств. Ферментативно расщепляемые группы, в частности, представляют собой 2-8-олигопептидные группы или гликозид. Сайты пептидного расщепления раскрываются в Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, а также Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346, а также Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. Сюда относятся, например, валин-аланин, валин-лизин, валин-цитруллин, аланин-лизин и фенилаланин-лизин (необязательно с дополнительной амидной группой).
Сущность изобретения
В предшествующем уровне техники описаны различные конъюгаты антитело-активное вещество с ферментативно расщепляемыми линкерами, которые, однако, не имеют оптимального профиля активности, например, как показано с точки зрения их широкой активности на разных клетках. Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение более эффективных соединений, которые после введения в относительно низкой концентрации проявляют длительный апоптотический эффект и, таким образом, полезны для терапии рака. С одной стороны, профиль метаболитов, высвобождаемых внутриклеточно из ADC, играет решающую роль. Часто метаболиты, образующиеся из ADC, являются субстратами эффлюксных насосов и/или имеют высокую проницаемость через клеточные мембраны. Оба явления могут способствовать короткому времени пребывания и, следовательно, субоптимальному апоптическому эффекту в опухолевой клетке.
Следовательно настоящее изобретение обеспечивает конъюгаты связующего и активного вещества(ADC) с конкретной композицией токсофор-линкер, которая в сочетании с антителом имеет особенно интересный профиль действия с точки зрения эффективности и широты действия. Для дальнейшего повышения селективности ADC в отношении опухолей и их метаболитов, конъюгаты связующего были снабжены пептидными линкерами, которые могут высвобождаться лизосомальными ассоциированными с опухолью ферментами, такими как легумин и катепсин. Таким образом, селективность в отношении опухоли определяется не только выбором антител, но также ферментативным расщеплением пептидного производного, например, ассоциированным с опухолью ферментом, таким как определяется. Метаболиты, высвобождаемые в опухолевых клетках из конъюгатами связующего и активного вещества(ADC) согласно настоящему изобретению, дополнительно характеризуются особенно интересным профилем свойств. Они показывают низкий эффлюкс из опухолевой клетки и приводят к высокой экспозиции активного вещества в опухолях. Таким образом, достигается высокий эффект в опухолевой клетке, в то время как из-за плохой проницаемости наблюдается незначительный системный цитотоксический эффект, что приводит к меньшей нецелевой токсичности.
Ингибиторы кинезинового белка веретена, используемые в соответствии с настоящим изобретением, имеют аминогруппу, которая необходима для активности. Модифицируя эту аминогруппу производными пептидов, блокируют действие на кинезиновый белок веретена, и, таким образом, ингибируют развитие цитотоксического эффекта. Эти пептидные производные также могут быть составными частями линкера для антитела. Однако, если этот пептидный остаток или пептидный линкер могут быть отщеплены от активного вещества ассоциированными с опухолью ферментами, такими как, например, легумин и катепсин, этот эффект может быть выборочно восстановлен в опухолевой ткани. Профиль специфических свойств метаболитов, образующихся в опухоли, обеспечивается дальнейшей модификацией ингибитора кинезинового белка веретена в положении, отличном от аминогруппы в молекуле, что, однако, не влияет на высокую активность в отношении мишени.
Кроме того, структура ADC в соответствии с настоящим изобретением для определенных вариантов выполнения настоящего изобретения обеспечивает высокую загрузку лекарственного средства (называемое DAR, соотношение лекарственного средства и антитела), что неожиданно не оказывает отрицательного влияния на физико-химическое и фармакокинетическое поведение ADC.
Неожиданно было обнаружено, что конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I)
в которых
1
X представляет собой N,
2
X представляет собой N и
3
X представляет собой С;
или
1
X представляет собой N,
2
X представляет собой С и
3
X представляет собой N;
или
1
X представляет собой CH или CF,
2
X представляет собой С и
3
X представляет собой N;
или
1
X представляет собой NH,
2
X представляет собой С и
3
X представляет собой С;
или
1
X представляет собой CH,
2
X представляет собой N и
3
X представляет собой С.
1
R представляет собой водород или метил,
2
2
3
2
2
R представляет собой метил, этил, -CH-CH(CH), -CH-C(=O)OH или изо-пропил,
3
2
3
2
2
2
R представляет собой метил, этил, -CH-CH(CH) или -CH-C(=O)-NH,
M представляет собой группу
3
2
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH(##)-COOH,
3
2
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH(##)-CH-COOH,
3
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-CH-W,
2
2
#-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH(##)-COOH,
2
2
#-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH(##)-CH-COOH,
2
#-C(=O)-CH-W,
3
2
2-8
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH) -C(=O)-###,
2
3
#-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
3
2
5
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-W,
3
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-## или
3
2
2
1-8
2
2
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH-CH-O)-(CH)-NH-C(=O)-CH-##,
W представляет собой группу
n представляет собой целое число от 1 до 50,
AK представляет собой связующее или его производное, предпочтительно представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент,
# обозначает связь с соединением,
## обозначает связь с S-атомом цистеиновой боковой цепи связующего,
### обозначает связь с N-атомом лизиновой боковой цепи связующего,
а также их соли, сольваты и соли этих сольватов, обладают превосходными свойствами по сравнению с известными конъюгатами.
Предпочтительными являются такие конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I),
в которых
1
X представляет собой CH,
2
X представляет собой С,
3
X представляет собой N;
1
R представляет собой водород или метил,
2
2
3
2
2
R представляет собой метил, -CH-CH(CH), -CH-C(=O)OH или изопропил,
3
2
3
2
2
2
R представляет собой метил, -CH-CH(CH) или -CH-C(=O)-NH,
M представляет собой группу
3
2
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH(##)-COOH,
3
2
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH(##)-CH-COOH,
3
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-CH-W,
2
2
#-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH(##)-COOH,
2
2
#-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH(##)-CH-COOH,
2
#-C(=O)-CH-W,
3
2
2-8
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
2
3
#-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
3
2
5
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-W,
3
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-## или
3
2
2
1-8
2
2
2
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH-CH-O)-(CH)-NH-C(=O)-CH-##,
представляет собой группу
n представляет собой целое число от 1 до 50,
AK представляет собой связующее или его производное, предпочтительно представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент,
# обозначает связь с соединением,
## обозначает связь с S-атомом цистеиновой боковой цепи связующего,
### обозначает связь с N-атомом лизиновой боковой цепи связующего, а также их соли, сольваты и соли этих сольватов.
Особенно предпочтительными являются такие конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I),
в которых
1
R представляет собой водород или Метил,
2
R представляет собой метил или изопропил,
3
2
2
R представляет собой метил или -CH-C(=O)-NH,
M представляет собой группу
3
2
3
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
n представляет собой целое число от 1 до 50,
AK представляет собой связующее или его производное, предпочтительно представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент,
# обозначает связь с соединением,
### обозначает связь с N-атомом лизиновой боковой цепи связующего, а также их соли, сольваты и соли этих сольватов.
Наиболее предпочтительными являются такие конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I), в которых
1
R представляет собой метил,
2
R представляет собой метил,
3
2
2
R представляет собой -CH-C(=O)-NH,
M представляет собой группу
3
2
3
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
n представляет собой целое число от 1 до 50,
AK представляет собой связующее или его производное, предпочтительно представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент,
# обозначает связь с соединением,
### обозначает связь с N-атомом лизиновой боковой цепи связующего, а также их соли, сольваты и соли этих сольватов.
Особенно предпочтительными являются такие конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I),
в которых
1
R представляет собой метил,
2
R представляет собой метил,
3
2
2
R представляет собой -CH-C(=O)-NH,
M представляет собой группу
3
2
3
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
n представляет собой число от 1 до 20,
AK представляет собой связующее или его производное, предпочтительно представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент,
# обозначает связь с соединением,
### обозначает связь с N-атомом лизиновой боковой цепи связующего, а также их соли, сольваты и соли этих сольватов.
Выделяют такие конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I),
в которых
1
R представляет собой метил,
2
R представляет собой метил,
3
2
2
R представляет собой -CH-C(=O)-NH,
M представляет собой группу
3
2
3
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
n представляет собой число от 1 до 20 и
AK представляет собой анти-CD123 антитело, анти-CXCR5 антитело, анти-B7H3 антитело, анти-TWEAKR антитело, анти-Her2 антитело или анти-EGFR антитело или представляет собой антиген-связывающие фрагменты этих антител,
# обозначает связь с соединением,
### представляет собой связь с N-атомом лизиновой боковой цепи антител (АК) или антиген-связывающего фрагменты этих антител,
а также их соли, сольваты и соли этих сольватов.
Особенно выделяют конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I),
в которых
1
R представляет собой метил,
2
R представляет собой метил,
3
2
2
R представляет собой -CH-C(=O)-NH,
M представляет собой группу
3
2
3
#-C(=O)-CH(CH)-NH-C(=O)-(CH)-C(=O)-###,
n представляет собой число от 1 до 20 и
AK представляет собой анти-CD123 антитело, выбранное из группы, состоящей из TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 и TPP-6013, представляет собой анти-CXCR5 антитело, выбранное из группы, состоящей из TPP-9574 и TPP-9580, представляет собой анти-B7H3 антитело TPP-8382, представляет собой анти-TWEAKR антитело, выбранное из группы, состоящей из TPP-7006 и TPP-7007, представляет собой анти-Her2 антитело TPP-1015, или представляет собой анти - EGFR антитело TPP-981 или представляет собой антиген-связывающие фрагменты этих антител,
# обозначает связь с соединением,
### представляет собой связь с N-атомом лизиновой боковой цепи антител (АК) или антиген-связывающего фрагменты этих антител,
а также их соли, сольваты и соли этих сольватов.
Предпочтительными являются конъюгаты связующего и активного вещества вышеуказанных формул, в которых AK представляет собой связующее, которое специфически связывается с внеклеточными молекулами-мишенями рака. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения после связывания с его внеклеточной целевой молекулой на клетке-мишени связующее интернализуется клеткой-мишенью посредством связывания. Предпочтительно связующее представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения внеклеточная молекула-мишень рака выбрана из группы, состоящей из молекулы-мишени рака EGFR, CD123, HER2, B7H3, TWEAKR и CXCR5, особенно предпочтительными являются CD123, CXCR5, и B7H3.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения AK связующее представляет собой анти-CD123 антитело, анти-CXCR5 антитело, анти-B7H3 антитело, анти-TWEAKR антитело, анти-Her2 антитело или анти-EGFR антитело, или их антиген-связывающие фрагменты.
1
2
Особенно предпочтительными являются те конъюгаты связующего и активного вещества указанных формул, в которых AK (AK, AK) представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из TPP-8382 (анти B7H3), TPP-6013 (анти-CD123), TPP-8987 (анти-CD123), TPP-8988 (анти-CD123), TPP 9476 (анти-CD123), TPP-9574 (анти-CXCR5) и TPP 9580 (анти-CXCR5), или представляет собой их антиген-связывающие фрагменты. При этом предпочтительным является антитело TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 и TPP-9476 (в каждом случае анти-CD123). Точная структура (последовательность) этих антител показана в таблице: Последовательности белков антител следуют из следующего теста таблицы и перечня последовательностей.
Особенно предпочтительными являются те конъюгаты связующего и активного вещества формулы (I), в которых AK представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из TPP-8382 (анти-B7H3), TPP-6013 (анти-CD123), TPP-8987 (анти-CD123), TPP-8988 (анти-CD123), TPP 9476 (анти-CD123), TPP-9574 (анти-CXCR5) TPP 9580 (анти-CXCR5). При этом особенно предпочтительными являются антитела (AK) TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 и TPP-9476 (в каждом случае анти-CD123).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: Аннотированные последовательности предпочтительных антител для конъюгатов связующего и активного вещества. Показаны последовательности белков тяжелых и легких цепей IgG, а также VH и VL-области этих антител. Подчеркиванием последовательностей обозначены важные области (области VH и VL в IgG и области CDR (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3)).
Фиг. 2: Перечень последовательностей предпочтительных антител для конъюгатов связующего и активного вещества и последовательностей белка-мишени.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает конъюгаты связующего или его производного с одной или более молекулами активного вещества, где молекула активного вещества представляет собой ингибитор кинезинового белка веретена (ингибитор KSP).
Далее описаны связующие, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, ингибиторы KSP, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, а также линкеры, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, которые можно использовать без ограничения в комбинации. В частности, связующие, которые в каждом случае описаны как предпочтительные или особенно предпочтительные, могут использоваться в сочетании с ингибиторами KSP, соответственно показанными как предпочтительные или особенно предпочтительные, если это целесообразно, в сочетании с линкерами, соответственно показанными как предпочтительные или особенно предпочтительные.
Особенно предпочтительные конъюгаты ингибитора KSP (Конъюгаты связующего и активного вещества)
1
2
1
2
В соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительными являются следующие конъюгаты ингибитора KSP, в которых AK (AK, AK) представляет собой связующее или его производное (предпочтительно представляет собой антитело), и n представляет собой число от 1 до 50, предпочтительно от 1 до 20, особенно от 1 до 8, более предпочтительно от 4 до 8. AK предпочтительно представляет собой антитело, которое связывается через цистеиновый остаток с ингибитором KSP; AK предпочтительно представляет собой антитело, которое связывается через лизиновый остаток с ингибитором KSP. Связующие вещества или антитела, используемые здесь, предпочтительно представляют собой связующие вещества или антитела, описанные как предпочтительные в описании.
При этом особенно предпочтительными являются следующие конъюгаты связующего и активного вещества:
и
1
2
Предпочтительными являются те конъюгаты связующего и активного вещества вышеуказанных формул, в которых AK (AK, AK) представляет собой связующее, которое специфически связывается с внеклеточными молекулами-мишенями рака. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения после связывания с его внеклеточной целевой молекулой на клетке-мишени связующее интернализуется путем связывания клеткой-мишенью.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения внеклеточные молекулы-мишени рака выбраны из группы, состоящей из молекул-мишений рака EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR и CXCR5, особенно CD123, CXCR5, и B7H3.
1
2
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения связующее AK (AK, AK) представляет собой анти-CD123 антитело, анти-CXCR5 антитело, анти-B7H3 антитело, анти-TWEAKR антитело, анти-Her2 антитело или анти-EGFR антитело, или их антиген-связывающие фрагменты.
1
2
Особенно предпочтительными являются те конъюгаты связующего и активного вещества вышеуказанных формул, в которых AK (AK, AK) представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из TPP-8382 (анти B7H3), TPP-6013 (анти-CD123), TPP-8987 (анти-CD123), TPP-8988 (анти-CD123), TPP-9476 (анти-CD123), TPP-9574 (анти-CXCR5) и TPP-9580 (анти-CXCR5), или представляет собой его антиген-связывающий фрагмент. При этом предпочтительными являются антитело TPP-6013, TPP-8987, TPP-8988 и TPP-9476 (в каждом случае анти-CD123). Точная структура (последовательность) этих антител показана в таблице: Последовательности белков антител следуют из следующего теста таблицы и перечня последовательностей.
Промежуточные соединения ингибитор KSP - Линкер и получение конъюгатов
Конъюгаты согласно настоящему изобретению получают путем сначала обеспечения низкомолекулярного ингибитора KSP с линкером. Промежуточное соединение, полученное таким образом, затем вступает в реакцию со связующим (предпочтительно антителом).
Для промежуточного связывания с остатком лизина и последующего связывания с антителом реакцию можно проиллюстрировать следующим образом:
1
2
3
2
1
2
3
4
На приведенной выше схеме реакции X, X, X, R, R, R и AK имеют значения, указанные для формулы (I), и R представляет собой метил, и n равно 0 или 1.
Синтез структурного звена A был описан в WO 2015/096982. Пептидные производные B и C были получены классическими методами химии пептидов. Промежуточные соединения C и D были связаны с помощью HATU в DMF в присутствии N,N-диизопропилэтиламина при комнатной температуре. Затем бензилоксикарбонильную защитную группу, а также бензиловый сложный эфир удаляли гидрированием над 10% палладием на активированном угле. Промежуточное соединение с полностью удаленной защитой затем подвергли взаимодействию с 1,1'-[(1,5-Диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дионом в DMF в присутствии N,N-диизопропилэтиламина при комнатной температуре до молекулы E предшественника ADC. Этот активный эфир затем связывали с соответствующими антителами, как описано в главе B-5.
Для промежуточного связывания с остатком цистеина и последующего связывания с антителом реакция может быть проиллюстрирована следующим образом:
1
2
3
1
1
2
3
На приведенной выше схеме реакции X, X, X, R, R, R и AK имеют значения, указанные для формулы (I), и R4 представляет собой метил, и n равно 1.
Аналогичным образом также возможно получить те соединения, в которых n равно 0.
Синтез структурного звена A был описан в WO 2015/096982. Пептидные производные B и C были получены классическими методами химии пептидов. Промежуточные соединения C т D связаны посредством HATU в DMF в присутствии N,N-диизопропилэтиламина при комнатной температуре. Затем бензилоксикарбонильную защитную группу, а также бензиловый сложный эфир удаляли гидрированием над 10% палладием на активированном угле. Промежуточное соединение с полностью удаленной защитой затем подвергли взаимодействию с1-{6-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1H-пиррол-2,5-дионом в DMF в присутствии N,N-Диизопропилэтиламина при комнатной температуре до молекулы E предшественника ADC. Это активное производное малеинимида затем связывали с соответствующими антителами, как описано в главе B-4.
В зависимости от линкера, сукцинимид-связанные ADC могут, после конъюгации, быть превращены в сукцинамиды с открытой цепью, которые имеют предпочтительный профиль стабильности.
Реакция (открытие кольца) может проводиться при pH 7.5-9, предпочтительно при pH 8, при температуре от 25°C до 37°C, например, посредством перемешивания. Предпочтительное время перемешивания составляет от 8 до 30 часов.
Для промежуточного связывания с остатком цистеина и последующего связывания с антителом с последующим раскрытием кольца сукцинимидного кольца реакция может быть проиллюстрирована следующим образом:
1
2
3
1
1
2
3
4
На приведенной выше схеме реакции X, X, X, R, R, R и AK имеют значения, указанные для формулы (I), и R представляет собой метил, и n равно 0 или 1.
Синтез структурного звена A был описан в WO 2015/096982. Пептидные производные B и C были получены классическими методами химии пептидов. Промежуточные соединения C и D связаны с помощью HATU в DMF в присутствии N,N-диизопропилэтиламина при комнатной температуре. Затем бензилоксикарбонильную защитную группу, а также бензиловый сложный эфир удаляли гидрированием над 10% палладием на активированном угле. Промежуточное соединение с полностью удаленной защитой затем подвергли взаимодействию с 1-{2-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1H-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина при комнатной температуре до молекулы Е предшественника ADC. Это активное производное малеинимида затем связывали с соответствующими антителами, как описано в главе B-4 в разделе «Связывание в небольшом масштабе» и «Связывание в среднем масштабе».
Связующее
В самом широком смысле термин "связующее", как понимается, означает молекулу, которая связывается с целевой молекулой, присутствующей при определенной целевой клеточной популяции, на которую направлен конъюгат связующее/активное соединение. Термин «связующее», как понимается в его самом широком значении, также охватывает, например, лектины, белки, способные связываться с определенными цепями сахаров, и фосфолипид-связывающие белки. Такие связующие включают, например, высокомолекулярные белки (связывающие белки), полипептиды или пептиды (связывающие пептиды), непептидные (например, аптамеры (US5,270,163) обзор Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550), или витамины) и все другие связывающиеся с клеткой молекулы или вещества. Связывающими белками являются, например, антитела и фрагменты антител или миметики антител, такие как, например, аффитела, аднектины, анти-калины, дарфины, авимеры, нанотела (обзор Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617). Связывающими пептидами являются, например, лиганды пары лиганд/рецептор, такие как, например, VEGF пары лиганд/рецептор VEGF/KDR, как например трансферин пары лиганд/рецептор трансферин/трансфериновый рецептор, или цитокин/цитокиновый рецептор, как например TNFalpha пары лиганд/рецептор TNFalpha/TNFalpha.
Связующее может представлять собой связывающий белок. Предпочтительными вариантами выполнения связующих являются антитело, антиген-связывающий фрагмент антитела, мультиспецифическое антитело или миметик антитела.
В литературе также раскрываются различные варианты ковалентного связывания (конъюгации) органических молекул со связующими и особенно антителами. Предпочтительной согласно настоящему изобретению является конъюгация токсофоров с антителом посредством одного или более атомов серы цистеиновых остатков антитела и/или посредством одной или более NH групп лизиновых остатков антитела. Однако также возможно связывать токсофор с антителом посредством свободных карбоксильных групп или посредством остатков сахаров антитела.
Термин "целевая молекула" в самом широком смысле, как понимается, означает молекулу, которая присутствует в целевой клеточной популяции и которая может представлять собой белок (например, рецептор фактора роста) или непептидную молекулу (например, сахар или фосфолипид). Предпочтительно она представляет собой рецептор или антиген.
Термин "внеклеточная" целевая молекула описывает целевую молекулу, присоединенную к клетке, которая локализуется вне клетки, или часть целевой молекулы, которая локализуется вне клетки, т.e. связующее может связываться на интактной клетке с ее внеклеточной целевой молекуле. Внеклеточная целевая молекула может быть заякорена в клеточной мембране или быть компонентом клеточной мембраны. Специалисту в данной области техники известны способы идентификации внеклеточных целевых молекул. Для белков это может осуществляться посредством определения трансмембранного домена (доменов) и ориентации белка в мембране. Эти данные, как правило, имеются в базах данных белков (например, SwissProt).
Термин "раковая целевая молекула" описывает целевую молекулу, которая в большем количестве присутствует при одном тили более видах раковых клеток, чем при нераковых клетках того же типа ткани. Предпочтительно, раковая целевая молекула селективно присутствует при одном тили более видах раковых клеток, по сравнению с нераковыми клетками того же типа ткани, где селективность означает двукратное обогащение при раковых клетках по сравнению с нераковыми клетками того же типа ткани ("селективная раковая целевая молекула"). Применение раковых целевых молекул обеспечивает селективную обработку раковых клеток с применением конъюгатов согласно настоящему изобретению.
Связующее может быть присоединено к линкеру через связь. Присоединение связующего может осуществляться через гетероатом связующего. Гетероатомами связующего, согласно настоящему изобретению, которые могут применяться для присоединения, являются сера (в одном варианте выполнения настоящего изобретения, через сульфгидрильную группу связующего), кислород (в одном варианте выполнения настоящего изобретения, через карбоксильную или гидроксильную группу связующего) и азот (в одном варианте выполнения настоящего изобретения, через первичную или вторичную аминную группу или амидную группу связующего). Эти гетероатомы могут присутствовать в связующем естественным путем или могут вводиться посредством химических способов или способов молекулярной биологии. Согласно настоящему изобретению, присоединение связующего к токсофору оказывает только незначительный эффект на связывающую активность связующего в отношении целевой молекулы. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, присоединение не оказывает эффекта на связывающую активность связующего в отношении целевой молекулы.
Согласно настоящему изобретению термин "антитело" понимается в его самом широком значении и охватывает иммуноглобулиновые молекулы, например, интактные или модифицированные моноклональные антитела, поликлональные антитела или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела). Иммуноглобулиновая молекула предпочтительно содержит молекулу, имеющую четыре полипептидные цепи, две тяжелые цепи (H цепи) и две легкие цепи (L цепи), которые, как правило, связаны дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи (аббревиатура VH) и константный домен тяжелой цепи. Константный домен тяжелой цепи может, например, содержать три домена CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (аббревиатура VL) и константный домен. Константный домен легкой цепи содержит домен (аббревиатура CL). VH и VL домены могут подразделяться далее на области, имеющие гипервариабельность, также упоминаемые как комплементарность-определяющие области (аббревиатура CDR), и области, имеющие низкую вариабельность последовательности (каркасная область, аббревиатура FR). Как правило, каждая VH и VL область состоит из трех CDR и до четырех FR. Например, от аминоконцов до карбокси концов в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Антитело может быть получено из любых подходящих видов, например, кролика, ламы, верблюда, мыши или крысы. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, антитело является человеческого или мышиного происхождения. Антитело может, например, быть человеческим, гуманизированным или химерным.
Термин "моноклональное" антитело относится к антителам, полученным из популяции по существу гомогенных антител, т.e. отдельные антитела популяции являются идентичными, за исключением мутаций природного происхождения, которые могут присутствовать в небольшом количестве. Моноклональные антитела распознают один антигенный сайт связывания с высокой специфичностью. Термин "моноклональное" антитело не относится к конкретному способу получения.
Термин "интактное" антитело относится к антителам, содержащим как антиген-связывающий домен, так и константный домен легкой и тяжелой цепи. Константным доменом может быть домен природного происхождения или его вариант, имеющий ряд модифицированных аминокислотных положений, т он также может быть гликозилирован.
Термин "модифицированное интактное" антитело относится к интактным антителам, сопряженным по их аминоконцам или карбоксильным концам посредством ковалентной связи (например, пептидная связь) с другим полипептидом или белком, не происходящим из антитела. Кроме того, антитела могут быть модифицированы таким образом, что в желательных положениях, реакционноспособные цистеины вводятся для усиления связывания с токсофором (смотрите Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8): 925-32).
Под «аминокислотной модификацией» или «мутацией» в настоящем документе подразумевается аминокислотная замена, вставка и/или делеция в полипептидной последовательности. Предпочтительной аминокислотной модификацией здесь является замена. Под «аминокислотной заменой» или «заменой» здесь подразумевается замена аминокислоты в данном положении в последовательности белка на другую аминокислоту. Например, замена Y50W описывает вариант исходного полипептида, в котором тирозин в положении 50 заменен триптофаном. «Вариант» полипептида описывает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по существу идентична эталонному полипептиду, обычно нативному или «родительскому» полипептиду. Вариант полипептида может иметь одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок в определенных положениях нативной аминокислотной последовательности.
Термин "человеческое" антитело относится к антителам, которые могут быть получены у человека, или которые представляют собой синтетические человеческие антитела. "Синтетическое" человеческое антитело представляет собой антитело, которое является частично или полностью получено in silico из синтетических последовательностей, на основе анализа последовательностей человеческих антител. Человеческое антитело может быть кодировано, например, нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения. Пример такого антитела можно найти в Sderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856. Такие «человеческие» и «синтетические» антитела также включают агликозилированные варианты, полученные либо дегликозилированием посредством PNGaseF, либо мутацией N297 (нумерация по Кабату) тяжелой цепи в любую другую аминокислоту.
Термин "гуманизированное" или "химерное" антитело описывает антитела, состоящие из нечеловеческой и человеческой части последовательности. В этих антителах, часть последовательностей человеческого иммуноглобулина (реципиент) замещена на части последовательностей нечеловеческого иммуноглобулина (донор). Во многих случаях, донором является мышиный иммуноглобулин. В случае гумманизированных антител, аминокислоты CDR реципиента замещаются на аминокислоты донора. Иногда аминокислоты каркасного участка также замещаются на соответствующие аминокислоты донора. В некоторых случаях гуманизированное антитело содержит аминокислоты, не присутствующие ни у реципиента, ни у донора, которые были введены в ходе оптимизации антитела. В случае химерных антител, вариабельные домены донорного иммуноглобулина сливаются с константными областями человеческого антитела. Такие «гуманизированные» и «химерные» антитела также включают агликозилированные варианты, полученные либо дегликозилированием посредством PNGaseF, либо мутацией N297 (нумерация по Кабату) тяжелой цепи в любую другую аминокислоту.
Термин «участок, определяющий комплементарность» (CDR), как применяется в настоящей заявке, относится к тем аминокислотам вариабельного домена антитела, которые необходимы для связывания с антигеном. Как правило, каждая вариабельная область имеет три CDR области, обозначаемые как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждая CDR область может охватывать аминокислоты согласно определению Kabat и/или аминокислоты гипервариабельной петли, определенные согласно Chotia. Определение согласно Kabat содержит, например, область аминокислотных положений 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) вариабельной легкой цепи/ домена (VL), и 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) вариабельной тяжелой цепи/ домена (VH) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Определение согласно Chotia содержит, например, область аминокислотных положений 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) и 91-96 (CDR3) вариабельной легкой цепи (VL), и 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) и 96-101 (CDR3) вариабельной тяжелой цепи (VH) (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). В некоторых случаях, CDR может содержать аминокислоты из CDR области, определенной согласно Kabat и Chotia.
В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи, антитела могут распределяться в различные классы. Существует пять различных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть поделены на дополнительные подклассы. (Изотипы), например, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам, упоминаются как [альфа/α], [дельта/δ], [эпсилон/ε], [гамма/γ] и [my/μ]. Известны как трехмерные структуры, так и структуры субъединиц антител.
Термин "функциональный фрагмент" или "антиген-связывающий фрагмент антитела" антитела/иммуноглобулина определяется как фрагмент антитела/иммуноглобулина (например, вариабельные домены IgG), который все еще содержит антиген-связывающие домены антитела/иммуноглобулина. "Антиген-связывающий домен" антитела, как правило, содержит одну или более гипервариабельных областей антитела, например, область CDR, CDR2 и/или CDR3. Однако участок "рамки" или "скелет" антитела может также играть роль в ходе связывания антитела с антигеном. Участок рамки образует скелет областей CDR. Предпочтительно, антиген-связывающий домен содержит по меньшей мере аминокислоты 4-103 вариабельной легкой цепи и аминокислоты 5-109 вариабельной тяжелой цепи, более предпочтительно аминокислоты 3-107 вариабельной легкой цепи и 4-111 вариабельной тяжелой цепи, особенно предпочтительно полные вариабельные легкие и тяжелые цепи, т.e. аминокислоты 1-109 VL и 1-113 VH (нумерация согласно WO 97/08320).
"Функциональные фрагменты" или "антиген-связывающие фрагменты антител" согласно настоящему изобретению охватывают, не окончательно, Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты, диатела, антитела с одним доменом (DAb), линейные антитела, отдельные цепи антител (одноцепочечный Fv, аббревиатура scFv); и мультиспецифичные антитела, такие как би- и три-специфичные антитела, например, образованные из фрагментов антител C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag. Антитела, отличные от "мультиспецифичных" или "мультифункциональных" антител представляют собой имеющие идентичные сайты-связывания. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными для различных эпитопов антигена или могут быть специфичными для эпитопов более одного антигена (смотрите, например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; или Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Молекула F(ab')2 или Fab может быть сконструирована так, что число межмолекулярных дисульфидных взаимодействий, происходящих между ChI и CL доменами, может быть уменьшено или даже полностью предотвращено.
"Эпитопы" относятся к белковым детерминантам, способным к специфичному связыванию с иммуноглобулином ил T-клеточными рецепторами. Эпитопные детерминанты, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров или их комбинации, и, как правило, имеют специфические 3-мерные структурные свойства, а также специфические свойства заряда.
"Функциональные фрагменты" или "антиген-связывающие фрагменты антител" могут быть слиты с другим полипептидом или белком, не происходящим из антитела, через их аминоконцы или карбоксильные концы, посредством ковалентной связи (например, пептидной связи). Кроме того, антитела и антиген-связанные фрагменты могут быть модифицированы посредством введения реакционноспособных цистеинов в определенных положениях, чтобы облегчить связывание с токсофором (смотрите Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).
Поликлональные антитела могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники. Моноклональные антитела могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Человеческие и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 или Cabilly et al. US 4,816,567 или Boss et al. US 4,816,397).
Специалистам в данной области техники известны различные способы получения человеческих антител и их фрагментов, такие как, например, посредством трансгенных мышей (N Lonberg and D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1):65-93) или методом фаговых отображений (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены из библиотек рекомбинантных антител, состоящих, например, из аминокислотных последовательностей множества антител, составленных на основе большого числа клинически здоровых добровольцев. Антитела также могут быть получены посредством известных методик рекомбинантной ДНК. Последовательность нуклеиновой кислоты антитела может быть получена стандартным образом или является доступной из общедоступных баз данных.
"Выделенное" антитело или связующее очищено с удалением других составляющих клетки. Загрязняющие составляющие клетки, которые могут мешать диагностическому или терапевтическому применению, представляют собой, например, ферменты, гормоны, или другие пептидные или непептидные составляющие клетки. Предпочтительным антителом или связующим является то, которое было очищено до степени более 95 мас. %, относительно антитела или связующего (определено, например, посредством метода Фолина-Чикальтеу, спектроскопии в УФ-видимом свете или SDS капиллярного гель-электрофореза). Более того, антитело, которое было очищено до такой степени, что возможно определить по меньшей мере 15 аминокислот аминоконцов или внутренней аминокислотной последовательности, или которое было очищено до гомогенности, причем гомогенность определяется посредством SDS PAGE при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях (обнаружение может быть определено посредством Coomassie - Blau окрашивания или предпочтительно посредством окрашивания серебром). Однако антитело, как правило, получают посредством одной или более стадий очистки.
-7
-7
-8
-9
-11
Термин "специфическое связывание" или "связывается специфически" относится к антителу или связующему, которое связывается с предопределенным антигеном/целевой молекулой. Специфическое связывание антитела или связующего, как правило, описывает антитело или связующее, имеющее аффинность по меньшей мере 10-7 M (в виде значения Kd; т.e. предпочтительны имеющие значения Kd, меньшие чем 10-7 M), с антителом или связующим, имеющим по меньшей мере в два раза более высокую аффинность для предопределенного антигена/целевой молекулы, чем для неспецифического антигена/целевой молекулы (например, бычий сывороточный альбумин или казеин), который не представляет собой предопределенный антиген/целевую молекулу или тесно связанный антиген/целевую молекулу. Специфическое связывание антитела или связующего не препятствует связыванию антитела или связующего с несколькими антигенами/молекулами-мишенями (например, ортологами разных видов). Антитела предпочтительно имеют аффинность, равную по меньшей мере 10 M (в виде значения Kd; другими словами предпочтительны имеющие значения Kd менее 10 M), предпочтительно по меньшей мере 10 M, более предпочтительно в интервале от 10 M до 10 M. Значения Kd могут быть определены, например, посредством поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии.
-11
-7
Конъюгаты антитело-активное вещество, подобным образом, показывают аффинности в этих диапазонах. На аффинность предпочтительно существенно не влияет конъюгация с активным веществом (в общем, аффинность уменьшается на менее чем один порядок величины, другими словами, например, самое большее от 10 M до 10 M).
Антитела согласно настоящему изобретению также очень предпочтительны с точки зрения высокой селективности. Высокая селективность существует, когда антитело согласно настоящему изобретению проявляет аффинность для целевого белка, которая лучше на фактор, равный по меньшей мере 2, предпочтительно на фактор, равный по меньшей мере 5, или более предпочтительно на фактор, равный по меньшей мере 10, чем для другого независимого антигена, например, человеческого сывороточного альбумина (аффинность может быть определена, например, посредством поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии).
Кроме того, антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, предпочтительно являются перекрестнореагирующими. Для облегчения и лучшей интерпретации преклинических исследований, например, токсикологических или исследований активности (например, на ксенотрансплантатных мышах), предпочтительно, когда антитело, применяемое согласно настоящему изобретению, не только связывается с человеческим целевым белком, но также связывается со специфическим целевым белком в видах, применяемых для исследований. В одном варианте выполнения настоящего изобретения антитело, применяемое согласно настоящему изобретению, в дополнение к человеческому целевому белку, перекрестно реагирует с целевым белком по меньшей мере одного другого вида. Для токсологических исследований и исследований активности предпочтительно применять виды семейства грызунов, собак и нечеловекообразных приматов.
Предпочтительными видами грызунов являются мыши и крысы. Предпочтительными нечеловекообразными приматами являются макаки-резус, шимпанзе и длиннохвостые макаки. В одном варианте выполнения настоящего изобретения антитело, применяемое согласно настоящему изобретению, которое в дополнение к человеческому целевому белку, является перекрестно-реагирующим с целевым белком по меньшей мере одного другого вида, выбранного из группы видов, состоящей из мышей, крыс и длиннохвостых макак (Macaca fascicularis). Особенно предпочтительными являются антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, которые в дополнение к человеческому целевому белку являются по меньшей мере перекрестнореагирующими с мышиным целевым белком. Предпочтительными являются перекрестнореагирующие антитела, аффинность которых для целевого белка нечеловеческого вида отличается на фактор не более 50, более предпочтительно на фактор не более 10, от аффинности для человеческого целевого белка.
Антитела, направленные против целевой молекулы раковой клетки
Целевая молекула, в отношении которой связующее, например антитело или его антиген-связывающий фрагмент, направлено, предпочтительно представляет собой целевую молекулу раковой клетки. Термин "целевая молекула раковой клетки" описывает целевую молекулу, которая более предпочтительно присутствует на одном или более видах раковых клеток того же типа ткани. Предпочтительно, целевая молекула раковой клетки селективно присутствует на одном или более видах раковых клеток, по сравнению с нераковыми клетками того же типа ткани, причем селективно описывается по меньшей мере двукратное обогащение на раковых клетках по сравнению с нераковыми клетками того же типа ткани ("селективная целевая молекула раковой клетки"). Применение целевых молекул раковых клеток обеспечивает селективное лечение раковых клеток с применением конъюгатов согласно настоящему изобретению.
Антитела, которые являются специфическими против антигена, например, антигена раковых клеток, могут быть получены специалистом в данной области техники посредством способов, которые им известны (такие как, рекомбинантная экспрессия, например), или могут быть получены коммерческим путем (как например, от Merck KGaA, Germany). Примерами известных коммерчески доступных антител для раковой терапии являются Erbitux (цетуксимаб, Merck KGaA), Avastin (бевацизумаб, Roche) и Herceptin (Трастузумаб, Genentech). Трастузумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело типа IgGikappa, которое в анализе на основе клетки (Kd = 5 нМ) связывается с внеклеточными доменами рецептора человеческого эпидермального фактора роста с высокой аффинностью. Антитело получают рекомбинантно в CHO клетках. Все эти агенты также могут быть получены в виде агликозилированных вариантов этих антител, либо путем дегликозилирования посредством ПНГазы FILI, либо путем мутации в положении N297 (нумерация по Кабату) тяжелой цепи в любую аминокислоту.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, целевой молекулой является селективная раковая целевая молекула.
В особенно предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, целевой молекулой является белок.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения целевой молекулой является внеклеточная целевая молекула. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, внеклеточной целевой молекулой является белок.
Целевые раковые молекулы известны специалистам в данной области техники. Примеры перечислены далее.
Примерами целевых молекул раковых клеток являются:
(1) EGFR (EGF-Рецептор, NCBI-Ссылочная последовательность NP_005219.2, NCBI-ген ID: 1956)
(2) Мезотелин (SwissProt ссылка Q13421-3), причем мезотелин кодирован аминокислотами 296-598. Аминокислоты 37-286 кодируют "мегакариоцитпотентирующий фактор". Мезотелин заякорен в клеточной мембране посредством GPI якоря и локализуется внеклеточно.
(3) карбоангидраза IX (CA9, SwissProt ссылка Q16790), NCBI-ген ID: 768)
(4) C4.4a (NCBI -Ссылочная последовательность NP_055215.2; синоним LYPD3, NCBI-ген ID: 27076)
(5) CD52 (NCBI-Ссылочная последовательность NP_001794.2)
(6) Her2 (ERBB2; NCBI-Ссылочная последовательность NP_004439.2; NCBI-ген ID: 2064)
(7) CD20 (NCBI-Ссылочная последовательность NP_068769.2)
(8) Лимфоцит-активирующий антиген CD30 (SwissProt ID P28908)
(9) адгезионная молекулами лимфоцитов CD22 (SwissProt ID P20273; NCBI-ген ID: 933)
(10) поверхностный антиген миелоидных клеток CD33 (SwissProt ID P20138; NCBI-ген ID: 945)
(11) трансмембранный гликопротеин NMB (GPNMB, SwissProt ID Q14956, NCBI-Gene ID: 10457)
(12) адгезионная молекула CD56 (SwissProt ID P13591)
(13) поверхностная молекула CD70 (SwissProt ID P32970, NCBI-ген ID: 970)
(14) поверхностная молекула CD74 (SwissProt ID P04233, NCBI-ген ID: 972)
(15) антиген B-лимфоцитов CD19 (SwissProt ID P15391, NCBI-ген ID: 930)
(16) поверхностный белок муцин-1 (MUC1, SwissProt ID P15941, NCBI-ген ID: 4582)
(17) поверхностный белок CD138 (SwissProt ID P18827)
(18) интегрин альфа V (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_002201.1, NCBI-ген ID: 3685)
(19) происходящего из тератокарциномы фактора роста 1 белок TDGF1 (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_003203.1, NCBI-ген ID: 6997)
(20) предстательная железа-специфический мембранный антиген PSMA (Swiss Prot ID: Q04609; NCBI-ген ID: 2346)
(21) тирозин-протеинкиназа EPHA2 (Swiss Prot ID: P29317, NCBI-ген ID: 1969)
(22) поверхностный белок SLC44A4 (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_001171515.1, NCBI-ген ID: 80736)
(23) поверхностный белок BMPR1B (SwissProt: O00238) (24) транспортный белок SLC7A5 (SwissProt: Q01650)
(25) эпителиальный антиген простаты STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8, ген ID: 26872)
(26) антиген овариальной карциномы MUC16 (SwissProt: Q8WXI7, ген ID: 94025)
(27) транспортный белок SLC34A2 (SwissProt: O95436, ген ID: 10568)
(28) поверхностный белок SEMA5b (SwissProt: Q9P283)
(29) поверхностный белок LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)
(30) эндотелиальный рецептор типа B EDNRB (SwissProt: P24530, NCBI-ген ID: 1910)
(31) Кольцевой белок "цинковый палец" RNF43 (SwissProt: Q68DV7)
(32) карцинома предстательной железы-ассоциированный белок STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)
(33) катионный канал TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)
(34) комплементарный рецептор CD21 (SwissProt: P20023)
(35) комплекс B-клеточный рецептор антигена-ассоциированный белок CD79b (SwissProt: P40259, NCBI-ген ID: 974)
(36) клеточный адгезионный антиген CEACAM6 (SwissProt: P40199)
(37) дипептидаза DPEP1 (SwissProt: P16444)
(38) интерлейкиновый рецептор IL20Ralpha (SwissProt: Q9UHF4, NCBI-ген ID: 3559)
(39) протеогликан BCAN (SwissProt: Q96GW7)
(40) эфриновый рецептор EPHB2 (SwissProt: P29323)
(41) стволовые клетки предстательной железы - ассоциированный белок PSCA (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_005663.2 )
(42) поверхностный белок LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)
(43) рецепторный белок TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)
(44) комплекс B-клеточный рецептор антигена-ассоциированный белок CD79a (SwissProt: P11912)
(45) рецепторный белок CXCR5 (CD185; SwissProt: P32302; NCBI-ген ID 643, NCBI -Ссылочная последовательность: NP_001707.1)
(46) ионный канал P2X5 (SwissProt: Q93086)
(47) антиген лимфоцитов CD180 (SwissProt: Q99467)
(48) рецепторный белок FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)
(49) рецепторный белок FCRL5 (SwissProt: Q96RD9)
(50) MHC класс II молекула Ia антиген HLA-DOB (NCBI - Ссылочная последовательность: NP_002111.1)
(51) T-клеточный белок VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3)
(52) TWEAKR (FN14, TNFRSF12A, NCBI - Ссылочная последовательность: NP_057723.1, NCBI-ген ID: 51330)
(53) антиген лимфоцитов CD37 (Swiss Prot: P11049, NCBI-ген ID: 951)
(54) FGF рецептор 2; FGFR2 (ген ID: 2263; официальное обозначение: FGFR2). FGFR2 рецептор встречается в различных (альфа, бета, IIIb, IIIc). Все сплайс-варианты могут действовать в качестве целевой молекулы.
(55) трансмембранный гликопротеин B7H3 (CD276; NCBI-ген ID: 80381 NCBI -Ссылочная последовательность: NP_001019907.1, Swiss Prot: Q5ZPR3-1)
(56) B-клеточный рецептор BAFFR (CD268; NCBI-ген ID: 115650)
(57) рецепторный белок ROR 1 (NCBI-ген ID: 4919)
(58) поверхностный рецептор CD123 (IL3RA; NCBI-ген ID: 3563; NCBI -Ссылочная последовательность: NP_002174.1; Swiss-Prot: P26951)
(59) рецепторный белок синцитин (NCBI-ген ID 30816)
(60) аспартат бета-гидроксилаза (ASPH; NCBI-ген ID 444)
(61) гликопротеин клеточной поверхности CD44 (NCBI-ген ID: 960)
(62) CDH15 (Cadherin 15, NCBI-ген ID: 1013)
(63) гликопротеин клеточной поверхности CEACAM5 (NCBI-ген ID: 1048)
(64) L1-подобные молекулы клеточной адгезии (CHL1, NCBI-ген ID: 10752)
(65) тирозинкиназный рецептор c-Met (NCBI-ген ID: 4233)
(66) Notch лиганд DLL3 (NCBI-ген ID: 10683)
(67) Ephrin A4 (EFNA4, NCBI-ген ID: 1945)
(68) эктонуклеотидная пирофосфатаза/фосфодиэстераза 3 (ENPP3, NCBI-ген ID: 5169)
(69) фактор коагуляции III (F3, NCBI-ген ID: 2152)
(70) FGF Рецептор 3 (FGFR3, NCBI-ген ID: 2261)
(71) фолатная гидролаза FOLH1 (NCBI-ген ID: 2346)
(72) фолатный рецептор 1 (FOLR1; NCBI-ген ID: 2348)
(73) гуанилатная циклаза 2C (GUCY2C, NCBI-ген ID: 2984)
(74) KIT протоонкогенные тирозинкиназные рецепторы (NCBI-ген ID: 3815)
(75) лизосомально связанный мембранный белок 1 (LAMP1, NCBI-ген ID: 3916)
(76) комплекс лимфоцитного антигена 6, локус E (LY6E, NCBI-ген ID: 4061)
(77) белок NOTCH3 (NCBI-ген ID: 4854)
(78) белковая тирозинкиназа 7 (PTK7, NCBI-ген ID: 5754)
(79) нектиновая молекула клеточной адгезии 4 (PVRL4, NECTIN4, NCBI-ген ID: 81607)
(80) трансмембранный белок Syndecan 1 (SDC1, NCBI-ген ID: 6382)
(81) член 7 семейства SLAM (SLAMF7, NCBI-ген ID: 57823)
(82) транспортный белок SLC39A6 (NCBI-ген ID: 25800)
(83) член 6 SLIT- и NTRK-подобного семейства (SLITRK6, NCBI-ген ID: 84189)
(84) рецептор клеточной поверхности TACSTD2 (NCBI-ген ID: 4070)
(85) рецептурный белок TNFRSF8 (NCBI-ген ID: 943)
(86) рецепторный белок TNFSF13B (NCBI-ген ID: 10673)
(87) гликопротеин TPBG (NCBI-ген ID: 7162)
(88) рецептор клеточной поверхности TROP2 (TACSTD2, NCBI-ген ID: 4070)
(89) галанин-подобный G белок-связанный рецептор KISS1R (GPR54, NCBI-ген ID: 84634)
(90) транспортный белок SLAMF6 (NCBI-ген ID: 114836)
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения целевая молекула раковых клеток выбирается из группы, состоящей из целевых молекул раковых клеток EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR и CXCR5, особенно CD123, CXCR5, и B7H3.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения связующее связывается с внеклеточной целевой молекулой раковых клеток, которая выбирается из группы, состоящей из целевых молекул раковых клеток EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR и CXCR5, особенно CD123, CXCR5, и B7H3.
В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения связующее специфически связывается с внеклеточной целевой молекулой раковых клеток, которая выбирается из группы, состоящей из целевых молекул раковых клеток EGFR, CD123, Her2, B7H3, TWEAKR и CXCR5, особенно CD123, CXCR5, и B7H3. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения связующее, после связывания с его внеклеточной целевой молекулой на целевой клетке, интернализуется целевой клеткой в результате связывания. Это приводит к конъюгату связующее-активное соединение, который может представлять собой иммуноконъюгат или ADC, образуемый посредством целевой клетки. Связующее затем обрабатывается, предпочтительно внутриклеточно, предпочтительно лизосомально.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения связующее представляет собой связующий белок. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения связующее представляет собой антитело, антиген-связывающий фрагмент антитела, мультиспецифическое антитело или миметическое антитело.
Предпочтительное миметические антитела представляют собой аффитела, аднектины, антикалины, дарфины, авимеры или нанотела. Предпочтительными мультиспецифическими антителами являются биспецифические и триспецифические антитела.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения связующее представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, более предпочтительно выделенное антитело или выделенный антиген-связывающий фрагмент антитела.
Предпочтительными антиген-связывающими фрагментами антител являются Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты, диатела, DAbs, линейные антитела и scFv. Особенно предпочтительными являются Fab, диатела и scFv.
В особенно предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения связующим является антитело. Особенно предпочтительными являются моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты. Кроме того, особенно предпочтительными являются человеческие гуманизированные антитела или их антиген-связывающие фрагменты.
Антитела или антиген-связывающие фрагменты антител, которые связываются с целевыми молекулами раковых клеток, могут быть получены специалистом в данной области техники известными способами, такими как, например, химический синтез или рекомбинантная экспрессия. Связующие для целевых молекул раковых клеток могут быть приобретены коммерческим путем или могут быть получены специалистом в данной области техники, применяя известные способы, такие как, например, химический синтез или рекомбинантная экспрессия. Другие способы получения антител или антиген-связывающих фрагментов антител описываются в WO 2007/070538 (смотрите стр. 22 "Antibodies"). Специалистам в данной области техники известно как, так называемые, библиотеки фагофых отображений (например, Morphosys HuCAL Gold) могут быть составлены и применяться для открытия антител и антиген-связывающих фрагментов антител (смотрите WO 2007/070538, стр. 24 ff и Пример АК 1 на стр. 70, Пример АК 2 на стр. 72). Другие способы получения антител, в которых применяются библиотеки ДНК из B клеток, описываются, например, на стр. 26 (WO 2007/070538). Способы гуманизации антител описываются на стр. 30-32 WO 2007070538 и подробно в Queen, et al., Pros. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989, или в WO 90/0786. Кроме того, способы рекомбинантной экспрессии белков в общем и в частности антител известны специалистам в данной области техники (смотрите, например, в Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988, Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Специалисту в данной области техники известны соответствующие векторы, промоторы и сигнальные пептиды, которые необходимы для экспрессии белка/антитела. Стандартные способы также описываются в WO 2007/070538 на стр. 41-45. Способы получения IgGI антитела описываются, например, в WO 2007/070538, в Примере 6, на стр. 74 ff. Способы, которые позволяют определять интернализацию антитела после связывания с его антигеном известны специалистам в данной области техники и описываются, например, в WO 2007/070538 на стр. 80Специалист в данной области техники способен применять способы, описанные в WO 2007/070538, которые применялись для получения антител карбоангидразы IX (Mn), аналогично получению антител с другой специфичностью к целевым молекулам.
Бактериальная экспрессия
Специалистам в данной области техники известны пути, посредством которых антитела, их антиген-связывающие фрагменты или варианты могут быть получены посредством бактериальной экспрессии.
Подходящие экспрессионные векторы для бактериальной экспрессии желаемых белков конструируют путем вставки последовательности ДНК, кодирующей желаемый белок, в функциональную рамку считывания вместе с подходящими сигналами инициации трансляции и терминации трансляции и с функциональным промотором. Вектор должен содержать один или более фенотипически селектируемые маркеры и сайт инициации репликации, чтобы гарантировать поддержания вектора и, если требуется, обеспечить амплификацию в клетке-хозяине. Подходящие прокариотические хозяева для трансформации включают Е.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и различные виды в родах Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. Бактериальные векторы могут базироваться, например, на бактериофагах плазмидах или фагмидах. Эти векторы могут содержать селектируемый маркер и бактериальный сайт инициации репликации, полученный из коммерчески доступных плазмид, как правило, содержащих элементы известного вектора для клонирования pBR322 (ATCC 37017).
После трансформации подходящего штамма хозяина и роста штамма-хозяина до соответствующей плотности клеток селектируемый промотор дерепрессируется/индуцируется подходящим способом (например, изменением температуры или химической индукцией), и клетки культивируются в течение дополнительного периода. Клетки, как правило, отделяются центрифугированием, разрушаются физическими или химическими средствами и получающийся первичный экстракт сохраняется для дополнительной очистки.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является экспрессионный вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует новое антитело согласно настоящему изобретению.
Антитела согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты или их варианты включают естественно очищенные продукты, продукты методик химического синтеза, и продукты, полученные рекомбинантными методиками из прокариотического хозяина, включая, например, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и различные виды в пределах родов Pseudomonas, Streptomyces, и Staphylococcus, предпочтительно, из клеток E. coli.
Экспрессия у млекопитающих
Специалистам в данной области техники известны пути, посредством которых антитела, их антиген-связывающие фрагменты или варианты могут быть получены посредством экспрессии в клетках млекопитающих.
Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках- хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Экспрессия антитела может быть конститутивной или регулируемой (например, индуцируемой добавлением или удалением индукторов малой молекулы, таких как тетрациклин в сочетании с системой Тет).
Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей смотрите, например, патент США 5,168,062 от Stinski, патент США 4510245 от Bell et al. и патент США 4,968,615 от Schaffner et al. Рекомбинантные экспрессионные векторы могут также включать точки начала репликации и селективные маркеры(смотрите например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017). Подходящие селективные маркеры включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, как например G418, пуромицин, гигромицин, бластицидин, цеоцин/блеомицин или метотрексат, или селективный маркер, которые используют ауксотрофии, как например глютаминсинтетаза (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb; 10(2):169-75), на клетке-хозяине, в которую был введен вектор.
Например, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) придает устойчивость к метот-рексату, ген neo обеспечивает устойчивость к G418, ген bsd из Aspergillus terreus придает устойчивость к бластидину, пуромицин-N-ацетилтрансферазу придает устойчивость к пуромицину, продукт гена Sh ble придает устойчивость к цеоцину, а устойчивость к гигромицину обеспечивается геном устойчивости к гигромицину E.coli (hyg или hph). Выбираемые маркеры, такие как DHFR или глютаминсинтетаза, также полезны для методов амплификации в сочетании с MTX и MSX.
Трансфекцию экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно проводить с использованием стандартных методов, таких как электропорация, нуклеофекция, кальций-фосфатная преципитация, липофекция, трансфекция на основе поликатиона, такая как трансфекция на основе поликатиона, такая как трансфекция на основе полиэтиленимина (PEI) и трансфекция DEAE-декстраном.
Подходящие клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии антител, их антиген-связывающих фрагментов или их вариантов, обеспечиваемые согласно настоящему изобретению, включают яичник китайского хомячка (CHO клетки), такие как CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV [включая dhfr- CHO клетки, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 и Urlaub et al., Cell. 1983 Jun; 33(2):405-12, с применением DHFR селектируемого маркера, например, как описано в R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621; и другие нокаутные клетки, примеры которых приведены в Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr; 109(4):1007-15], NS0 миеломные клетки, COS клетки, HEK293 клетки, HKB11 клетки, BHK21 клетки, CAP клетки, EB66 клетки, и SP2 клетки.
Экспрессия антител, их внтиген-связывающих фрагментов или их вариантов, также может быть временной или полустабильной в системах экспрессии, таких как HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293-Freestyle, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 или CAP-T-клетки (например, Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9).
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения экспрессионный вектор сконструирован таким образом, что экспрессированный белок секретируется в культуральную среду, в которой растут клетки-хозяева. Антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или их варианты могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка.
Очистка
Антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или их варианты могут быть выделены и очищены из рекомбинантных клеточных культур известными методами включающими, но не ограниченные этим: осаждением сульфатом аммония или этанолом, экстракцией кислотой, хроматография с использованием белка А, хроматография с использованием белка G, анионная или катионная ионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, гидрофобная хроматография (HIC), аффинная хроматография, хроматография на гидроксиапатите и хроматография с использованием белка лектина. Высокоэффективная жидкостная хроматография ("ВЭЖХ") может также использоваться для очистки. См., например, Colligan, Current Protocols in Immunology или Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), например, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты или их варианты включают естественно очищенные продукты, продукты химических синтетических процессов и продукты, произведенные рекомбинантными методиками из прокариотического или эукариотического хозяина. Эукариотические хозяева включают, например, клетки дрожжей, клетки высших растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. В зависимости от клетки-хозяина, выбранной для рекомбинантной экспрессии, экспрессированный белок может быть гликозилированным и негликозилированным.
В предпочтительных вариантах осуществления антитело очищалось (1) больше чем 95% по массе антитела как определяется, например, по методу Лоури, спектроскопией в УФ и видимой областях спектра или капиллярным SDS гель-электрофорезом (например, на устройстве Caliper LabChip GXII, GX 90 или Biorad Bioanalyzer), и в дополнительно предпочтительных вариантах осуществления больше чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной, чтобы получить по меньшей мере 15 остатков N-терминальных или внутренней аминокислотной последовательности, или (3) до гомогенности, определенной с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси-синего или, предпочтительно окрашиванием серебром.
Как правило, выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки белка.
анти-CD123 антитело
Согласно настоящему изобретению могут применяться анти-CD123 антитела.
Термин «анти-CD123 антитело», «антитело, которое специфически связывается с CD123», относится к антитело, нацеленному на раковую молекулу CD123 (IL3RA; NCBI-ген ID: 3563; NCBI -Ссылочная последовательность: NP_002174.1; Swiss - Prot: P26951; SEQ ID NO: 111), предпочтительно с аффинностью, достаточной для диагностического и/или терапевтического применения. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения антитело связывается с CD123 с константой диссоциации(KD) ≤ 1мкмМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0.1 нМ, ≤ 0.01 нМ, или ≤ 0.001 нМ.
Получение и свойства моноклонального антитела 7G3, которое связывается с N-концевым доменом IL-3Rα, CD123, описаны Sun et al. (Sun et al., 1996, Blood 87 (1): 83-92). Патент США №6,177,078 (Lopez) относится к анти-CD123-антителу 7G3. Химерный вариант этого антитела (CSL360) описан в WO 2009/070844, а гуманизированный вариант (CSL362) описан в WO 2012/021934. Последовательность антитела 7G3 была раскрыта в ЕР2426148. Эта последовательность представляет собой исходную точку гуманизированных антител, полученных с помощью CDR прививания.
Антитело, которое интернализуется особенно хорошо после связывания антигена клеточной поверхности, представляет собой анти-CD123 антитело 12F1, описанное Kuo et al. (Kuo et al., 2009, Bioconjug Chem. 20 (10): 1975-82). Антитело 12F1 связывается с CD123 с более высокой аффинностью, чем антитело 7G3, и интернализуется значительно быстрее, чем 7G3, после связывания антигена клеточной поверхности. Биспецифичные scFv иммунофузионные белки на основе 12F1 раскрыты в WO 2013/173820. Антитело TPP-6013 представляет собой химерный вариант 12F1.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к конъюгатам с антителами или их антигенсвязывающими фрагментами и их вариантами, происходящими из мышиных антител 7G3 (Sun et al., 1996, Blood 87 (1): 83-92) и 12F1 (Kuo et al. 20 (10): 1975-82), к конъюгатам с антителами или их антигенсвязывающими фрагментами и их вариантами, происходящими из мышиного антитела 12F1 (Kuo et al., 2009, Bioconjug Chem. 20 (1999) Bioconjug Chem. 10): 1975-82)
Гуманизированные варианты мышиного антитела 7G3 и мышиного антитела 12F1 были получены на основе привития CDR в человеческий каркас и последующей оптимизации и являются предпочтительными примерами в рамках данного изобретения.
Особенно предпочтительными в контексте настоящего изобретения являются анти-CD123 антитела TPP-9476, TPP-8988, TPP-8987 и TPP-6013.
анти-CXCR5 антитело
Согласно настоящему изобретению возможно применять анти-CXCR5 антитела. Выражение „анти-CXCR5 антитело“ или „антитело, которое специфически связывается с CXCR5“ относится к антителу, которое связывается с целевой раковой молекулой CXCR5 (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_001707.1; SEQ ID NO: 112), предпочтительно с аффинностью, достаточной для диагностического и/или терапевтического применения. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения антитело связывается с CXCR5 с константой диссоциации (KD) ≤ 1мкмМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0.1 нМ, ≤ 0.01 нМ, или ≤ 0.001 нМ.
Примеры антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с CXCR5, известны специалистам в данной области техники и раскрываются, например, в EP2195023.
Клетки гибридомы для крысиного антитела RF8B2 (ACC2153) были получены из DSMZ, а последовательность антител была идентифицирована стандартными методами. Эта последовательность представляет собой исходную точку для гуманизированных антител, полученных с помощью прививания CDR
Гуманизированные варианты этого антитела были получены посредством прививания CDR в последовательностях зародышевой линии.
Эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Особенно предпочтительными в контексте настоящего изобретения являются анти-CXCR5 антитела TPP-9574 и TPP-9580.
анти-B7H3 антитело
Согласно настоящему изобретению можно использовать анти-B7H3 антител.
Выражение „анти-B7H3 антитело“ или „антитело, которое специфически связывается с B7H3“ относится к антителу, которое связывается с целевой раковой молекулой B7H3 (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_001019907.1 SEQ ID NO: 113), предпочтительно с аффинностью, достаточной для диагностического и/или терапевтического применения. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения антитело связывается с B7H3 с константой диссоциации (KD) ≤ 1мкмМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0.1 нМ, ≤ 0.01 нМ, или ≤ 0.001 нМ.
Примеры антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с B7H3, известны специалистам в данной области техники и раскрываются, например, в WO 201109400, EP 1773884 и WO 2014061277. EP 2121008 описывает анти-B7H3 антитело 8H9, а также его CDR последовательности.
Эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Предпочтительный вариант выполнения анти-B7H3 антител был получен путем скрининга библиотеки фагового дисплея антител на клетки, экспрессирующие рекомбинантный B7H3 от мыши (CD276 мыши, ID гена: 102657) и B7H3 человека (CD276 человека, ID гена: 80381). Полученные антитела были преобразованы в человеческий формат IgG1. Анти-B7H3 анти-TPP-8382 является предпочтительным примером
Особенно предпочтительными в контексте настоящего изобретения являются анти-B7H3 антитело TPP-8382.
анти-TWEAKR-Антитело
Согласно настоящему изобретению возможно применять анти-TWEAKR антитела.
Выражение „анти-TWEAKR антитело“ или „антитело, которое специфически связывается с TWEAKR“ относится к антителу, которое связывается с целевой раковой молекулой TWEAKR (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_057723.1; SEQ ID NO: 114), предпочтительно с аффинностью, достаточной для диагностического и/или терапевтического применения. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения антитело связывается с TWEAKR с константой диссоциации (KD) ≤ 1мкмМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0.1 нМ, ≤ 0.01 нМ, или ≤ 0.001 нМ.
Примеры антител, которые связываются с TWEAKR, раскрываются, например, в WO 2009/020933 (A2), WO 2009/140177 (A2), WO 2014/198817 (A1) и WO 2015/189143 (A1). Эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
ITEM-4 представляет собой анти-TWEAKR-антитело, которое описано Nakayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Гуманизированные варианты этих антител на основе CDR-привития описаны Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4):1052-62), а также в WO 2009/020933. Эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Особенно предпочтительными в контексте настоящего изобретения являются анти-TWEAKR антитело TPP-7006 и TPP-7007. Это гуманизированные варианты антитела ITEM-4. Эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты являются предпочтительными в контексте настоящего изобретения.
анти-HER2-Антитело:
Согласно настоящему изобретению возможно применять анти-HER2 антитело. Выражение „анти- HER2 антитело“ или „антитело, которое специфически связывается с HER2“ относится к антителу, которое связывается с целевой раковой молекулой HER2 (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_004439.2; SEQ ID NO: 115), предпочтительно с аффинностью, достаточной для диагностического и/или терапевтического применения. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения антитело связывается с HER2 с константой диссоциации (KD) ≤ 1мкмМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0.1 нМ, ≤ 0.01 нМ, или ≤ 0.001 нМ.
Примером антитела, связывающегося с целевой молекулой раковых клеток Her2, является Трастузумаб (Genentech). Трастузумаб представляет собой гуманизированное антитело, применяемое, среди прочего, для лечения рака молочной железы.
Другими примерами антител, связывающихся с HER2, являются, в дополнение к Трастузумабу (INN 7637, CAS NR: RN: 180288-69-1) и Пертузумабу (Cas NR: 380610-27-5), также антитела, описанные в WO 2009/123894-A2, WO 200/8140603-A2 или в WO 2011/044368-A2. Примером конъюгата анти-HER2 является Трастузумаб-эмтанзин (INN номер 9295). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Другими примерами антител, связывающихся с HER2, являются, в дополнение к Трастузумабу (INN 7637, CAS NR: RN: 180288-69-1) и Пертузумабу (Cas NR: 380610-27-5), также антитела, описанные в WO 2009/123894-A2, WO 200/8140603-A2 или в WO 2011/044368-A2. Примером конъюгата анти-HER2 является Трастузумаб-эмтанзин (INN номер 9295). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в рамках настоящего изобретения.
Особенно предпочтительным в рамках настоящего изобретения является анти- HER2 антитело TPP-1015 (аналог Трастузумаб).
анти-EGFR-антитела
Согласно настоящему изобретению возможно применять анти-EGFR антитело.
Выражение „анти-EGFR антитело“ или „антитело, которое специфически связывается с EGFR“ относится к антителу, которое связывается с целевой раковой молекулой EGFR (NCBI -Ссылочная последовательность: NP_005219.2; SEQ ID NO: 116), предпочтительно с аффинностью, достаточной для диагностического и/или терапевтического применения. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения антитело связывается с EGFR с константой диссоциации (KD) ≤ 1мкмМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0.1 нМ, ≤ 0.01 нМ, или ≤ 0.001 нМ.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения анти-EGFR антитело выбрано из группы, состоящей из TPP-981, Цетуксимаб, Панитумумаб, Нимотузумаб. Особенно предпочтительным вариантом выполнения настоящего изобретения является анти-EGFR антитело TPP-981.
Другие варианты выполнения антител EGFR являются следующими:
Залутумумаб / 2F8 / HuMax-EGFR, Компания Genmab A/S (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN-номер 8605)
Нецитумумаб / 11F8, ImClone / IMC-11F8, Компания ImClone Systems Inc [Eli Lilly & Co] (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1, US 2007/0264253-A1, US 7,598,350, WO 2005/090407-A1), INN- номер 9083)
Матузумаб / анти-EGFR MAb, Merck KGaA / анти-EGFR MAb, Takeda / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 и EMD-55900 / MAb 425 / моноклональное антитело 425, Компания Merck KGaA / Takeda ( WO 92/15683, INN-номер 8103 (Матузумаб))
RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO-5083945 / RO4858696 / RO5083945, Компания Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO 2010/112413-A1, WO 2010/115554)
GT-MAB 5.2-GEX / CetuGEX, Компания Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (EP 01900750-A1, EP 01911766-A1, EP 02073842-A2, US 2010/0028947-A1)
ISU-101, Компания Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd) / Scancell (WO 2008/004834-A1)
ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / анти-EGFR моноклональное антитело 806, Компания Ludwig Institute for Cancer Research / Abbott / Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771, WO 2005/081854 и WO 2009/023265)
SYM-004 (состоит из двух химерных антител IgG1 (992 и 1024)), Компания Symphogen A/S (WO 2010/022736-A2)
MR1-1 /MR1-1KDEL, Компания IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) (Duke University), (патент: WO 2001/062931-A2)
Антитело против мутанта с делецией, EGFRvIII, Компания Amgen/Abgenix (WO 2005/010151, US 7,628,986)
SC-100, Компания Scancell Ltd (WO 01/088138-A1)
MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA, Компания Bristol-Myers Squibb (US) / Merck KGaA (DE) / Takeda (JP), (WO 91/05871, WO 92/15683)
Анти-EGFR-Mab, Компания Xencor (WO 2005/056606)
DXL-1218 / анти-EGFR моноклональное антитело (рак), InNexus, Компания InNexus Biotechnology Inc, Pharmaprojects PH048638
Анти-карбоангидраза IX антитело
Примеры антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток карбоангидразой IX, описываются в WO 2007/070538-A2 (например, пункты 1-16).
Анти-C4.4a антитело:
Примеры антител C4.4a и их антиген-связывающих фрагментов описываются в WO 2012/143499 A2. Последовательности антител приводятся в Таблице 1 в WO 2012/143499 A2, где в каждой строке показаны соответствующие CDR аминокислотные последовательности вариабельной легкой цепи или вариабельной тяжелой цепи антитела, приведенного в столбце 1.
Анти-CD20 антитела:
Примером антитела, связывающегося с целевой молекулой раковых клеток CD20 является Ритуксимаб (Genentech). Ритуксимаб (CAS номер: 174722-31-7) представляет собой химерное антитело, применяемое для лечения неходжкинской лимфомы. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-CD52 антитела:
Примером антитела, связывающегося с целевой молекулой раковых клеток CD52 является Алемтузумаб (Genzyme). Алемтузумаб (CAS номер: 216503-57-0) представляет собой гуманизированное антитело, применяемое для лечения хронической лимфоцитарной лейкемии. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-Мезотелин-Антитело:
Пример анти-Мезотелин-антител описаны, например, в. WO 2009/068204. Все раскрытые в WO 2009/068204 антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения, описанного в настоящей заявке. Особенно предпочтительным является раскрытое в WO 2009/068204 антитело MF-T.
Анти-CD30 антитела
Примерами антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток CD30 и могут применяться для лечения рака, например, неходжкинской лимфомы, являются брентуксимаб, иратумумаб и Антитела, описанные в WO 2008/092117, WO 2008/036688 или WO 2006/089232. Примером анти-CD30 Конъюгата является Брентуксимаб-Ведотин (INN номер 9144). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-CD22 антитела
Примерами антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток CD22 и могут применяться для лечения рака, например, лимфомы, являются инотузумаб или эпратузумаб. Примером анти - CD22 Конъюгата является инотузумаб-озагамицин (INN номер 8574), или анти-CD22-MMAE и анти-CD22-MC-MMAE (CAS RN: 139504-50-0 или 474645-27-7). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-CD33 антитела
Примерами антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток CD33 и могут применяться для лечения рака, например, лейкемии, являются гемтузумаб или линтузумаб (INN 7580). Примером анти-CD33 Конъюгата является гемтузумаб-озагамицин. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-NMB антитела
Примером антитела, которое связывается с целевой молекулой раковых клеток NMB и может применяться для лечения рака, например, меланомы или рака молочной железы, является глембатумумаб (INN 9199). Примером анти-NMB Конъюгата является глембатумумаб - ведотин (CAS RN: 474645-27-7). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-CD56 антитела
Примером антитела, которое связывается с целевой молекулой раковых клеток CD56 и может применяться для лечения рака, например, множественной миеломы, немелкоклеточной карциномы, MCC или рака яичников, является лорвотузумаб. Примером анти-CD56 Конъюгата является лорвотузумаб - мертанзин (CAS RN: 139504-50-0). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-CD70 антитела
Примеры антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток CD70 и могут применяться для лечения рака, например, неходжкинской лимфомы или почечно-клеточного рака, описываются в WO 2007/038637-A2 или WO 2008/070593-A2. Примером анти-CD70 Конъюгата является SGN-75 (CD70 MMAF). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-CD74 антитела
Примером антитела, которое связывается с целевой молекулой раковых клеток CD74 и может применяться для лечения рака, например, множественной миеломы, является милатузумаб. Примером анти-CD74 Конъюгата является милатузумаб-доксорубицин (CAS RN: 23214-92-8). Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти-CD19 антитела
Примеры антитела, которое связывается с целевой молекулой раковых клеток CD19 и может применяться для лечения рака, например, неходжкинской лимфомы, описываются в WO 2008/031056-A2. Другие антитела и примеры анти-CD19 конъюгатов (SAR3419) описываются в WO 2008/047242-A2. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -муцин антитела
Примерами антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток Mucin-1 и могут применяться для лечения рака, например, неходжкинской лимфомы, является кливатузумаб, или эти антитела описываются в WO 2003/106495- A2, WO 2008/028686-A2. Примеры анти-муцин конъюгатов описываются в WO 2005/009369-A2. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -CD138 антитела
Примеры антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток CD138, и их конъюгатов, которые могут применяться для лечения рака, например, множественной миеломы, описываются в WO 2009/080829-A1, WO 2009/080830-A1. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -интегрин-alphaV антитела
Примерами антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток интегрин alphaV и могут применяться для лечения рака, например, меланомы, саркомы или карциномы, являются интетумумаб (Cas RN: 725735-28-4), абциксимаб (Cas-RN: 143653-53-6), этарацизумаб (Cas-RN: 892553-42-3), или эти антитела описываются в US 7,465,449, EP 719859-A1, WO 2002/012501-A1 или WO 2006/062779-A2. Примерами анти-интегрин AlphaV конъюгатов являются интетумумаб -DM4 и ADC, описанные в WO 2007/024536-A2. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -TDGF1 антитела
Примерами антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток TDGF1 и могут применяться для лечения рака, являются антитела, описанные в WO 02/077033-A1, US 7,318,924, WO 2003/083041-A2 и WO 2002/088170-A2. Примеры анти-TDGF1 конъюгатов описываются в WO 2002/088170-A2. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -PSMA антитела
Примерами антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток PSMA и могут применяться для лечения рака, например, карциномы предстательной железы, являются антитела, описанные в WO 97/35616-A1, WO 99/47554-A1, WO 01/009192-A1 и WO2003/034903. Примеры анти-PSMA конъюгатов описываются в WO 2009/026274-A1 и WO 2007/002222. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -EPHA2 антитела
Примеры антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток EPHA2, для получения конъюгатов и для лечения рака, описываются в WO 2004/091375-A2. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти - SLC44A4 антитела
Примеры антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток SLC44A4, для получения конъюгатов и для лечения рака, например, карциномы поджелудочной железы или предстательной железы, описываются в WO 2009/033094-A2 и US 2009/0175796-A1. Эти антитела и их антиген-связывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -HLA-DOB антитела
Примером антитела, которое связывается с целевой молекулой раковых клеток HLA-DOB, является антитело Lym-1 (Cas-RN: 301344-99-0), которое может применяться для лечения рака, например, неходжкинской лимфомы. Примеры анти-HLA-DOB конъюгатов раскрываются, например, в WO 2005/081711-A2. Эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -VTCN1 антитела
Примеры антител, которые связываются с целевой молекулой раковых клеток VTCN1, которые могут применяться для получения конъюгатов и для лечения рака, например, рака яичников, рака поджелудочной железы, легких или молочной железы, описываются в WO 2006/074418-A2. Эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут применяться в контексте настоящего изобретения.
Анти -FGFR2-Антитело
Примеры анти-FGFR2 антител и антигенсвязывающих фрагментов описаны в WO 2013076186. Последовательности антител показаны в Таблице 9 и Таблице 10 в WO 2013076186. Предпочтительными являются антитела, антигенсвязывающие фрагменты и варианты антител, полученные из антител, обозначенных как M048-D01 и M047-D08.
Предпочтительные антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител для конъюгатов связующее-активное вещество согласно настоящему изобретению
В настоящей заявке в контексте конъюгата связующего и активного вещества ссылка делается на следующие предпочтительные антитела, как показано в следующей таблице: TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 und TPP-9580.
TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 и TPP-9580 представляют собой антитела, содержащие одну или более последовательностей CDR, указанных в таблице выше (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) в вариабельной области тяжелой цепи (VH) или вариабельной области легкой цепи (VL). Предпочтительно, антитело включает указанную вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL). Предпочтительно, антитела содержат указанную область тяжелой цепи (IgG тяжелой цепи) и/или указанную область легкой цепи (IgG легкой цепи).
TPP-981 представляет собой анти-EGFR антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 2, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 3, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 4, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 6, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 7 и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 8.
TPP-1015 представляет собой анти-HER2 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 12, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 13, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 14, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 16, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 17 и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 18.
TPP-6013 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 22, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 23, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 24, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 26, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 27 и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 28.
TPP-7006 представляет собой анти-TWEAKR антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 32, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 33, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 34, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 36, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 37 и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 38.
TPP-7007 представляет собой анти-TWEAKR антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 42, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 43, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 44, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 46, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 47 и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 48.
TPP-8382 представляет собой анти-B7H3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 52, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 53, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 54, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 56, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 57, и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 58.
TPP-8987 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 62, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 63, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 64, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 66, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 67, и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 68.
TPP-8988 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 72, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 73, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 74, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 76, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 77, и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 78.
TPP-9476 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 82, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 83, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 84, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 86, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 87, и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 88.
TPP-9574 представляет собой анти-CXCR5 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 92, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 93, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 94, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 96, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 97, и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 98.
TPP-9580 представляет собой анти-CXCR5 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую вариабельную CDR1-последовательность тяжелой цепи (H-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 102, вариабельную CDR2-последовательность тяжелой цепи (H-CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 103, и вариабельную CDR3-последовательность тяжелой цепи (H-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 104, а также вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую вариабельную CDR1-последовательность легкой цепи (L-CDR1), как показано посредством SEQ ID NO: 106, вариабельную CDR2-последовательность легкой цепи (L- CDR2), как показано посредством SEQ ID NO: 107, и вариабельную CDR3-последовательность легкой цепи (L-CDR3), как показано посредством SEQ ID NO: 108.
TPP-981 представляет собой анти-EGFR антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 1, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 5.
TPP-1015 представляет собой анти-HER2 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 11, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 15.
TPP-6013 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 21, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 25.
TPP-7006 представляет собой анти-TWEAKR антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 31, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 35.
TPP-7007 представляет собой анти-TWEAKR антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 41, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 45.
TPP-8382 представляет собой анти-B7H3 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 51, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 55.
TPP-8987 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 61, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 65.
TPP-8988 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 71, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 75.
TPP-9476 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 81, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 85.
TPP-9574 представляет собой анти-CXCR5 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 91, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 95.
TPP-9580 представляет собой анти-CXCR5 антитело, содержащее предпочтительно вариабельную область тяжелой цепи (VH), как показано посредством SEQ ID NO: 101, а также вариабельную область легкой цепи (VL), как показано посредством SEQ ID NO: 105.
TPP-981 представляет собой анти-EGFR антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 9, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 10.
TPP-1015 представляет собой анти- HER2 антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 19, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 20.
TPP-6013 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 29, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 30.
TPP-7006 представляет собой анти-TWEAKR антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 39, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 40.
TPP-7007 представляет собой анти-TWEAKR антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 49, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 50.
TPP-8382 представляет собой анти-B7H3 антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 59, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 60.
TPP-8987 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 69, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 70.
TPP-8988 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 79, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 80.
TPP-9476 представляет собой анти-CD123 антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 89, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 90.
TPP-9574 представляет собой анти-CXCR антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 99, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 100.
TPP-9580 представляет собой анти-CXCR антитело, содержащее предпочтительно область тяжелой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 109, а также область легкой цепи, как показано посредством SEQ ID NO: 110.
Изотопы, соли, сольваты, изотопные варианты
Настоящее изобретение также охватывает все подходящие изотопные варианты соединений согласно настоящему изобретении. Изотопный вариант соединения согласно настоящему изобретению как понимается в контексте настоящего изобретения означает соединение, в котором по меньшей мере один атом в соединении согласно настоящему изобретению заменяется на другой атом с таким же атомным числом, но с атомной массой, отличной от атомной массы, которая как правило или преимущественно встречается в природе. Примерами изотопов, которые могут быть включены в соединение согласно настоящему изобретению, являются изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, серы, фтора, хлора, брома и иода, как например 2H (дейтерий), 3H (тритий), 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36Cl, 82Br, 123I, 124I, 129I и 131I. Конкретные изотопные варианты соединения согласно настоящему изобретению, особенно те, в которых были включены один или более радиоактивных изотопов, могут быть предпочтительными, например, для изучения механизма действия или распределения активного соединения в организме; благодаря сравнительно легкому получению и определению, соединения, помеченные 3H- или 14C-изотопами, являются особенно подходящими в этих целях. Кроме того, включение изотопов, например дейтерия, может привести к особенным терапевтическим преимуществам, благодаря большей метаболической стабильности соединения, например, увеличению периода полураспада в организме или уменьшению требуемой активной дозы; поэтому такие модификации соединений согласно настоящему изобретению могут, в некоторых случаях, также представлять собой предпочтительный вариант выполнения настоящего изобретения. Изотопные варианты соединений согласно настоящему изобретению могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники, например, способами, описанными далее, и методиками, описанными в рабочих примерах, посредством применения соответствующих изотопных модификаций соответствующих реагентов и/или исходных соединений.
Предпочтительными солями в контексте настоящего изобретения являются физиологически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению. Также охватываются соли, которые сами по себе не являются подходящими для фармацевтических применений, но могут применяться, например, для выделения или очистки соединений согласно настоящему изобретению.
Физиологически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению включают соли кислотного добавления минеральных кислот, карбоновых кислот и сульфоновых кислот, например, соли хлорводородной кислоты, бромводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты и бензойной кислоты.
Физиологически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению также включают соли обычных оснований, например и предпочтительно соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, соли кальция и магния) и аммониевые соли, полученные из аммиака и органических аминов, имеющих от 1 до 16 атомов углерода, например и предпочтительно этиламин, диэтиламин, триэтиламин, этилдиизопропиламин, моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, дициклогексиламин, диметиламиноэтанол, прокаин, дибензиламин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, аргинин, лизин и 1,2-этилендиамин.
Сольваты в контексте настоящего изобретения описываются как формы соединений согласно настоящему изобретению, которые образуют комплекс в твердом или жидком состоянии посредством координации с молекулами растворителя. Гидраты представляют собой специфическую форму сольватов, в которой происходит координация с водой. Предпочтительными сольватами в контексте настоящего изобретения являются гидраты.
Терапевтическое применение
Гиперпролиферативные заболевания, для лечения которых могут применяться соединения согласно настоящему изобретению, в частности включают группу раковых и опухолевых заболеваний. В контексте настоящего изобретения, как понимается, это означает следующие заболевания, но без ограничения к этому: карциномы молочной железы и опухоли молочной железы (карциномы молочной железы включают протоковую и дольковую формы, а также in situ), опухоли желудочно-кишечного тракта (мелкоклеточная и немелкоклеточная карцинома, бронхиальная карцинома), опухоли головного мозга (например, мозгового ствола и гипоталамуса, астроцитома, эпендимома, глиобластома, глиома, медуллобластома, менингиома и нейроэктодермальные и пинеальные опухоли), опухоли органов пищеварительной системы (карциномы пищевода, желудка, желчного пузыря, тонкого кишечника, толстой кишки, карцинома прямой кишки и анальная карцинома), опухоли печени (среди прочего, гепатоклеточная карцинома, холангиокарцинома и смешанная гепатоклеточная холангиокарцинома), опухоли головы и шеи (гортани, гипофаринкса, носоглоточной полости, мезофаринкса, губ и карциномы полости рта, пероральные меланомы), опухоли кожи (базалиома, спиналиома, плоскоклеточный рак, саркома Капоши, злокачественная меланома, немеланоматозный рак кожи, кожный рак клеток Меркеля, тучноклеточные опухоли), опухоли мягких тканей (среди прочего, саркомы мягких тканей, остеосаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитоксантома, хондросаркома, фибросаркома, гемангиосаркома, лейомиосаркома, липосаркома, лимфосаркома и рабдомиосаркома), опухоли глаз (среди прочего, внутриглазная меланома и ретинобластома), опухоли эндокринных и экзокринных желез (например, тироидных и паратироидных желез, карциномы поджелудочной железы и слюнных желез, аденокарциномы), опухоли мочевыводящих путей (опухоли мочевого пузыря, полового члена, почек, почечной лоханки и мочеточника) и опухоли репродуктивных органов (карциномы эндометрия, шейки матки, яичников, влагалища, женских наружных половых органов и матки у женщин и карциномы предстательной железы и яичек у мужчин). Сюда также относятся пролиферативные заболевания крови, лимфатической системы и спинного мозга, в твердой форме и в виде циркулирующих клеток, как например лейкемия, лимфома и миелопролиферативные заболевания, например, острые миелоидные, острые лимфобластные, хронические лимфоцитарные, хронические миелогенные и волосатоклеточный лейкоз, и AIDS-корреляционная лимфома, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, кожная T-клеточная лимфома, лимфома беркитта и лимфомы центральной нервной системы.
Эти хорошо охарактеризованные заболевания у людей могут также встречаться со сравнительной этиологией у других млекопитающих, и их можно подобным образом лечить соединениями согласно настоящему изобретению.
Описанные в настоящем документе CD123-направленные конъюгаты связующееактивное вещество или антитело-активное вещество (ADC), предпочтительно, могут быть использованы для лечения CD123-экспрессирующих нарушений, таких как CD123-экспрессирующий рак. Как правило, такие раковые клетки демонстрируют измеримые уровни CD123, измеряемые уровнем РНК белка (например, посредством иммуноанализа). Некоторые из этих раковых тканей демонстрируют повышенный уровень CD123 по сравнению с нераковыми тканями того же типа, предпочтительно измеренный у одного и того же пациента. Необязательно, уровень CD123 измеряют до начала лечения рака с помощью конъюгата антитела и активного вещества согласно настоящему изобретению (ADC) (стратификация пациента). Направленные против CD123 конъюгаты связывающего и активного вещества(ADC) могут быть использованы преимущественно для лечения CD123-экспрессирующих расстройств, таких как CD123-экспрессирующие раковые заболевания, такие как опухоли гематопоэтической и лимфоидной ткани или гематопоэтические и лимфоидные злокачественные опухоли. Примеры раковых заболеваний, связанных с экспрессией CD123, включают миелоидные заболевания, такие как острый миелолейкоз (AML) и миелодиспластический синдром (MDS). Другие раковые заболевания включают В-клеточный острый лимфобластный лейкоз (B-ALL), волосатоклеточный лейкоз, бластную опухоль из плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), лимфому Ходжкина, незрелый Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (незрелый T-ALL), лимфому Беркитта, фолликулярную лимфому, хронический лимфолейкоз (CLL), мантийноклеточную лимфому (MCL). Способы согласно настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, включают лечение пациентов с CD123-экспрессирующим раком, где способ включает введение конъюгата антитело-активное вещество согласно настоящему изобретению (ADC).
Лечение упомянутых выше раковых заболеваний с помощью соединений согласно настоящему изобретению включает как лечение твердых опухолей, так и лечение их метастазирующих или циркулирующих форм.
В контексте настоящего изобретения термин "лечение" или "лечить" применяется в его стандартном понимании и означает оказание помощи, заботу и уход за пациентом с целью лечения, уменьшения, затухания или облегчения заболевания или нарушения здоровья, и улучшение условий жизни, нарушенных этим заболеванием, как например, в случае рака.
Настоящее изобретение, таким образом, также обеспечивает применение соединений согласно настоящему изобретению для лечения и/или профилактики нарушений, в частности указанных выше нарушений.
Настоящее изобретение, таким образом, также обеспечивает применение соединений согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики нарушений, в частности указанных выше нарушений.
Настоящее изобретение, таким образом, также обеспечивает применение соединений согласно настоящему изобретению в способе лечения и/или профилактики нарушений, в частности указанных выше нарушений.
Настоящее изобретение, таким образом, также обеспечивает способ лечения и/или профилактики нарушений, в частности упомянутых выше нарушений, с применением эффективного количества по меньшей мере одного из соединений согласно настоящему изобретению.
Соединения согласно настоящему изобретению могут применяться сами по себе или, если необходимо, в комбинации с одним или более другими фармакологически активными веществами, при условии, что эта комбинация не приводит к нежелательным и неприемлемым побочным эффектам. Настоящее изобретение, таким образом, также обеспечивает лекарственные средства, содержащие по меньшей мере одно из соединений согласно настоящему изобретению и одно или более дополнительных активных соединений, в частности для лечения и/или профилактики упомянутых выше нарушений.
Например, соединения по настоящему изобретению можно комбинировать с известными антигиперпролиферативными, цитостатическими, цитотоксическими и иммунологическими терапевтическими агентами для лечения рака. Примерами подходящих комбинаций активных ингредиентов являются:
131I-chTNT, абареликс, абиратерон, акларубицин, адалимумаб, адо-трастузумаб эмтанзин, афатиниб, афиберцепт, альдеслейкин, алемтузумаб, алендроновая кислота, алитретиноин, альтретамин, амифостин, аминоглютетимид, гексил-5-аминолевулинат, амбрубицин, амсакрин, анастрозол, анцестим, анетол дитиолетион, анетумаб равтанзин, ангиотензин II, антитромбин III, апрепитант, арцитумомаб, арглабин, арментриоксид, аспаргиназа, атезолизумаб, авелумаб акситиниб, азацитидин, белотекан, бендамустин, бесилезомаб, белиностат, бевацизумаб, бексаротен, бикалутамид, бисантрен, блеомицин, блинатумомаб, бортезомиб, бузерелин, бозутиниб, брентуксимаб ведотин, бузулфпн, кабазитаксел, кабозантиниб, кальцитонин, кальциумфолинат, кальциумлевофолинат, капецитабин, капромаб, карбамазепин, карбоплатин, карбоквион, карфилзомиб, кармофур, кармустин, катумаксомаб, целекоксиб, целмолейкин, цетиниб, цетуксимаб, хлорамбуцил, хлормадинон, хлорметин, цидофовир, цинакальцет, цисплатин, кладрибин, клодроновая кислота, клофарабин, кобиметиниб, копанлизиб, кризантаспаза, кризотиниб, циклофосфамид, ципротерон, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даратумумаб, дабрафениб, даролутамид, дазатиниб, даунорубицин, децитабина, дегареликс, денилейкин-дифтитокс, деносумаб, депреотид, деслорелин, дексразоксан, диброспидия хлорид, диангидрогалактикол, диклофенак, доцетаксел, доласетрон, доксифлуридин, доксорубицин, доксорубицин + эстрон, дронабинол, дурвальмаб эдреколомаб, эллиптиния ацетат, эндостатин, эноцитабин, энзалутамид, эпакадостат, эпирубицин, эпитиостанол, эпоэтин-альфа, эпоэтин-бета, эпоэтин-зета, эптаплатин, эрибулин, эрлотиниб, эзомепразол, эстамустин, этопозид, этинилэстрадиол, эверолимус, экземестан, фадрозол, фентанил, флуоксиместерон, флоксуридин, флударабин, флуорурацил, флутамид, фолиновая кислота, форместан, фосапрепитант, фотемустин, фулвестрант, гадобутрол, гадотеридоол, гадотериновой кислоты меглуминовая соль, гадоверсетамид, динатриевая соль гадоксетической кислоты (Gd-EOB-DTPA динатриевая соль), нитрат галлия, ганиреликс, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб, глюкарпидаза, глютоксим, гозерелин, гранисетрон, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гистамина дигидрохлорид, гистрелин, гидроксикарбамид, I-125-Seeds, ибандроновая кислота, ибритумомаб-тиуксетан, ибутиниб, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, имиквимод, импросульфан, индисетрон, инкадроновая кислота, ингенолмебутат, интерферональфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, иобитридол, иобенгуан (123I), иомепрол, ипилимумаб, иринотекан, итраконазол, иксабепилон, иксазомиб, ланреотид, лансопразол, лансопразол, лапатиниб, лазохолин, леналидомид, ленватиниб, ленограстим, лентинан, летрозол, леупрорелин, левамизол, левоноргестрел, левотироксин натрия, липегфильграстим, лизурид, лобаплатин, ломустин, лонидамин, масопрокол, медроксипрогестерон, мегестрол, меларсопрол, мелфалан, мепитиостан, меркаптопурин, месна, метадон, метотрексат, метокссален, метиламинолевулинат, метилпреднизолон, метилитестостерон, метирозин, мифамуртид, милтефозин, мириплатин, митобронитол, митогуазон, митолактол, митомицин, митотан, митоксантрон, могамулизумаб, молграмостим, мопидамол, гидрохлорид морфина, сульфат морфина, набилон, набиксимол, нафарелин, налоксон + пентазоцин, налтрексон, нартограстим, нецитумумаб, недаплатин, неларабин, неридроновая кислота, нетупитант/палоносетрон, ниволумаб, ниволумабпентетреотид, нилотиниб, нилутамид, ниморазол, нимотузумаб, нимустин, нинтеданиб, нитрацин, ниволумаб, обинутузумаб, октреотид, офатумумаб, олапарид, оларатумаб, омацетаксин-мепесукцинат, омепразол, ондансетрон, орготеин, орилотимод, осимертиниб, оксалиплатин, оксикодон, оксиметолон, озогамицин, генная терапия р53, паклитаксел, пальбоциклиб, палифермин, палладия-103-затравка, палоносетрон, памидроновая кислота, панитумумаб, панобиностат, пантопразол, пазопаниб, пегаспаргаз, пембролизумаб, пег-интерферон-альфа-2b, пембролизумаб, пеметрексед, пентостатин, пепломицин, перфлубутан, перфосфамид, пертузумаб, пицибанил, пилокарпин, пирарубицин, пиксантрон, плериксафор, пликамицин, полиглусам, полиэстрадиолфосфат, поливинилпирролидон + гиалуронат натрия, полисахарид-K, помалидомид, понатиниб, порфимер-натрий, пралатрексат, преднимустин, преднизон, прокарбазин, прокодазол, пропранолол, квинаголид, рабепразол, ракотумомаб, радий-223-хлорид, радотиниб, ралоксифен, радтитрексед, рамосетрон, рамукирумаб, ранимустин, расбуриказа, разоксан, рефаметиниб, регорафениб, ризедроновая кислота, этидронат рения-186, ритуксимаб, рогаратиниб, ролапитант, ромидепсин, ромуртид, рониклиб, самарий (153Sm) лексидронан, сатумомаб, секретин, силтуксимаб, сипулейцин-T, сизофиран, собусоксан, натрия глицидидазол, сонидегиб, сорафениб, станозолол, стрептозоцин, сунитиниб, талапорфин, талимоген лахерпарепвек, тамибаротен, тамоксифен, тапентадол, тазонермин, тецелейкин, технеций (99mTc), нофетумомаб, мерпентан, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-октреотид, тегафур, тегафур + гимерацил + отерацил, темопорфин, темозоломид, темсиролимус, тенипозид, тестостерон, тетрофосмин, талидомид, тиотепа, тимальфазин, тиротропин альфа, тиогуанин, тоцилизумаб, топотекан, торемифен, тозитумомаб, трабектидин, траметиниб, трамадол, трастузумаб, треосульфан, третиноин, трифлуотдтн + типирацил, траметиниб, трилостан, трипторелин, трофосамид, тромбопоиэтин, убенимекс, вальрубицин, вандетаниб, вапреотид, валатиниб, вемурафениб, винбластин, винкристин, виндезин, винфлунин, винорелбин, висмодегиб, вориностат, стеклянные микросферы иттрия-90, циностатин, циностатин стималамер, золедроновая кислота, зорубицин.
Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению можно комбинировать, например, со связующими веществами (например, анионными), которые могут, например, связываться со следующими мишенями: OX-40, CD137/4-1BB, DR3, IDO1/IDO2, LAG-3, CD40.
Поскольку не проницаемый в клетки метаболит токсофора конъюгата связующего и активного вещества(ADC) может оказывать вредное воздействие на клетки адаптивной иммунной системы, настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает комбинацию конъюгата и активного вещества(ADC) согласно настоящему изобретению с иммунотерапией для применения при лечении рака и опухолей. Внутренний механизм действия конъюгатов цитотоксического связующего и активного вещества включает прямую инициацию гибели клеток опухолевых клеток и, следовательно, высвобождение опухолевых антигенов, которые могут стимулировать иммунный ответ. Кроме того, имеются данные о том, что класс токсофоров-ингибиторов KSP индуцирует маркеры так называемой, иммуногенной гибели клеток (ICD) in vitro. Таким образом, комбинация комбинация конъюгатов связующего-активного вещества (ADC) по настоящему изобретению с одним или более терапевтическими подходами иммунотерапии рака или с одним или более активными ингредиентами, предпочтительно антителами, направленными против молекулярной мишени иммунотерапии рака, является предпочтительным способом лечения рака или опухолей. i) Примеры терапевтических подходов иммунотерапии рака включает иммуномодулирующие моноклональные антитела и низкомолекулярные вещества, направленные против мишеней противоопухолевой иммунотерапии, вакцины, CAR-клетки, биспецифические антитела, рекрутирующие T-клетки, онколитические вирусы, подходы вакцинации на основе клеток. ii) Пример выбранных мишеней иммунотерапии рака, подходящих для иммуномодулирующих моноклональных антител, содержат CTLA-4, PD-1/PDL-1, OX-40, CD137, DR3, IDO1, IDO2, TDO2, LAG-3, TIM-3 CD40.,ICOS / ICOSL,TIGIT; GITR/GITRL, VISTA, CD70, CD27, HVEM/BTLA, CEACAM1, CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3, TLR. Соответственно, комбинация конъюгата и активного вещества(ADC) согласно настоящему изобретению с иммунотерапией рака может с одной стороны делать опухоли со слабоиммуногенными свойствами более иммуногенными и повышать эффективность противораковой иммунотерапии, а также развивать длительный терапевтический эффект.
Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению могут применяться в комбинации с радиотерапией и/или хирургическим вмешательством.
В общем, следующие цели могут быть достигнуты посредством комбинации соединений согласно настоящему изобретению с другими цитостатически, цитотоксически или иммунотерапевтически активными средствами:
Улучшенная эффективность замедления роста опухоли, уменьшения ее размера или даже полного ее удаления, по сравнению с лечением отдельным активным соединением;
Возможность применения применяемой химиотерапии в более низкой дозе, чем в случае монотерапии;
Возможность применения более мягкой терапии с меньшими побочными эффектами по сравнению с индивидуальным введением;
Возможность лечения более широкого спектра опухолевых заболеваний;
Достижение более высокого уровня ответа на терапию; более высокой продолжительности жизни пациента по сравнению с имеющейся на сегодняшний день стандартной терапией.
Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению могут применяться в комбинации с радиотерапией и/или хирургическим вмешательством.
Настоящее изобретение также обеспечивает лекарственные средства, которые содержат по меньшей мере одно соединение согласно настоящему изобретению, как правило, вместе с одним или более инертными, нетоксичными, фармацевтически приемлемыми эксципиентами, и их применение в вышеуказанных целях.
Соединения согласно настоящему изобретению могут действовать системно и/или местно. Для этой цели они могут вводиться подходящим образом, например, парентерально, возможно ингаляционно или в виде имплантатов или стентов.
Соединения согласно настоящему изобретению могут вводиться в виде подходящих форм введения для этих путей введения.
Парентеральное введение может не содержать стадию абсорбции (например, внутривенно, внутриартериально, внутрисердечно, интраспинально или эндолюмбально) или включать абсорбцию (например, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, чрескожно или интраперитонеально). Формы введения, подходящие для парентерального введения, включают препараты для инъекции и инфузии в форме растворов, суспензий, эмульсий или лиофилизатов. Предпочтительным является парентеральное введение, особенно внутривенное введение.
В общем, было обнаружено как предпочтительное в случае парентерального введения вводить количества от около 0.1 до 20 мг/кг, предпочтительно от около 0.3 до 7 мг/кг массы тела, для достижения эффективных результатов.
Тем не менее, может быть необходимо, когда это является подходящим, отклониться от установленных количеств, в частности в виде функции от массы тела, пути введения, индивидуального ответа на активное соединение, природы получения и времени или интервала, за который происходит введение. Таким образом, в некоторых случаях может быть достаточно количество, более низкое чем вышеупомянутое минимальное количество, тогда как в других случаях упомянутый верхний предел должен быть превышен. В случае введения больших количеств, может быть разумно делить их на несколько отдельных доз в день.
Примеры
Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Настоящее изобретение не ограничивается примерами.
Если иного не указано, проценты в следующих примерах и тестах представляют собой проценты по массе; части представляют собой массовые части. Соотношения растворителя, соотношения разбавителя и данные концентрации для растворов жидкость/жидкость в каждом случае основаны на объеме.
Пути синтеза:
Показанные далее в качестве примерных для рабочих примеров схемы показывают примерные пути синтеза, приводящие к рабочим примерам:
Схема 1: Синтез лизин-связанных ADC с легумаин-расщепляемым линкером
1
2
3
2
На приведенной выше схеме реакции X, X, X, n и AK имеют значения, приведенные для формулы (I).
a): HATU, DMF, N,N-диизопропилэтиламин, комнатная температура; b) H2, 10% Pd-C, метанол 1.5 ч, комнатная температура; c) 1,1'-[(1,5-Диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дион, N,N-Диизопропилэтиламин, DMF, перемешивание всю ночь при комнатной температуре; d) AK2 в PBS, в атмосфере аргона добавлением 3-5 экв. активного сложного эфира, растворенного в DMSO, 60 мин перемешивание при комнатной температуре в атмосфере аргона, добавление еще 3-5 экв. активного сложного эфира, растворенного в DMSO, 60 мин перемешивание при комнатной температуре в атмосфере аргона, затем очищение на уравновешенных PBS буфером (pH 7.2) на PD 10-колонках (SephadexÒ G-25, GE Healthcare), и затем концентрирование посредством ультрацентрифугирования и установление желаемой концентрации с помощью PBS буфера (pH 7.2)]. В случае in vivo партий, их необязательно далее подвергают стерильной фильтрации.
Схема 2: Синтез цистеин-связанных ADC
1
2
3
1
На приведенной выше схеме реакции X, X, X, n и AK имеют значения, как показано в формуле (I) выше.
a): HATU, DMF, N,N-Диизопропилэтиламин, комнатная температура; b): хлорид цинка, трифторэтанол, 50°C, EDTA c): HATU, DMF, N,N-Диизопропилэтиламин, комнатная температура; d) H2, 10% Pd-C, метанол 1.5 ч, комнатная температура; e) 1-{6-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1H-пиррол-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, DMF, перемешивание при комнатной температуре; f) AK1 в PBS растворе, в атмосфере аргона добавили 3-4 эквивалентов TCEP в PBS-буфере, и около 30 мин перемешивали при комнатной температуре, затем добавили 5-10 эквивалентов соединения E, растворенного в DMSO, около 90 мин перемешивали при комнатной температуре, затем очистили с помощью уравновешенных PBS буфером (pH 7.2) PD 10-колонок (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и затем концентрировали посредством уьтрацентрифугирования и установили желаемую концентрацию с помощью PBS буфера (pH 7.2)]. В случае in vivo партий, их необязательно далее подвергают стерильной фильтрации.
Схема 3: Синтез цистеин-связанных ADC через сукцинимиды с открытым кольцом
1
2
3
1
На приведенной выше схеме реакции X, Х, Х, n и AK имеют значения, как показано в формуле (I) выше.
a): HATU, DMF, N,N-Диизопропилэтиламин, комнатная температура; b): хлорид цинка, трифторэтанол, 50°C, EDTA c): HATU, DMF, N,N-диизопропилэтиламин, комнатная температура; d) H2, 10% Pd-C, метанол 1.5 ч, комнатная температура; e) 1-{2-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1H-пиррол-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, DMF, перемешивание при комнатной температуре; f) AK1 в PBS растворе, в атмосфере аргона добавление 3-4 эквивалентов TCEP в PBS буфере и около 30 мин перемешивание при комнатной температуре, затем добавление 5-10 эквивалентов соединения E, растворенного в DMSO, перемешивание около 90 мин при комнатной температуре, затем очищение посредство уравновешенных доведенным до pH 8 PBS буфером (pH 8) PD 10-колонок (SephadexÒ G-25, GE Healthcare),затем перемешивание всю ночь при комнатной температуре; затем необязательно очищение посредством уравновешенных PBS буфером (pH 7.2) PD 10-колонок (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и затем концентрирование посредством ультрацентрифугирования и установление желаемой концентрации с помощью PBS буфера (pH 7.2)]. В случае in vivo партий, их необязательно далее подвергают стерильной фильтрации.
A. Примеры
Аббревиатуры и акронимы:
ABCB1
ATP-связывающая кассета подсемейство B член 1 (синоним P-gp и MDR1)
abs.
Абсолютный
Ac
Ацетил
ACN
Ацетонитрил
aq.
водный, водный раствор
ATP
Аденозинтрифосфат
BCRP
Белок резистентности рака молочной железы, эффлюкс - транспортер
BEP
2-Бром-1-этилпиридиния-Тетрафторборат
Boc
трет.-Бутоксикарбонил
расш.
Расширенный (при ЯМР)
Пр.
Пример
BxPC3
линия опухолевых клеток человека
C
концентрация
ок.
около, приблизительно
CI
Химическая ионизация (пример MS)
DAR
Соотношение лекарственного средства и антитела
d
Дублет (при ЯМР)
Д
День (дни)
DC
Тонкослойная хроматография
DCI
Прямая химическая ионизация (при MS)
DCM
дихлорметан
Dd
Дублет дублетов (при ЯМР)
DMAP
4-N,N-Диметиламинопиридин
DME
1,2-диметоксиэтан
DMEM
модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (стандартизированная питательная среда для клеточной культуры)
DMF
N,N-Диметилформамид
DMSO D/P
диметилсульфоксидсоотношение краситель (флуорисцентный краситель)/белок
DPBS, D-PBS, DSMZ
фосфатно-солевой раствор Дульбекконемецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур
PBS
PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, от Sigma, No D8537состав:0,2 г KCl0,2 г KH2PO4 (безводный)8,0 г NaCl1,15 г Na2HPO4 (безводный)Добавка H2O до 1 л
dt
Дублет триплетов (при ЯМР)
DTT
DL-Дитиотреитол
теор.
теоретический (химический выход)
EDC
N'-(3-Диметиламинопропил)-N-этилкрбодиимид-Гидрохлорид
EGFR
Рецептор эпидермального фактора роста
EI
ионизация электронным ударом (при MS)
ELISA
экв.
Эквивалент (эквиваленты)
ESI
ионизация электрораспылением (при MS)
ESI-MicroTofq
ESI- MicroTofq (название масс-спектрометрии, где Tof = время прохождения, и q = квадруполь)
FCS
фетальная телячья сыворотка
Fmoc
(9H-Флуорен-9-илметокси)карбонил
нас.
Насыщенный
GTP
Гуанозин-5'-трифосфат
Ч
Час (часы)
HATU
O-(7-Азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония-гексафторфосфат
HEPES
4-(2-Гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота
HOAc
Уксусная кислота
HOAt
1-Гидрокси-7-азабензотриазол
HOBt
1-Гидрокси-1H-бензотриазол-Гидрат
HOSu
N-Гидроксисукцинимид
ВЭЖХ
Высокого давления-, высокоэффективная жидкостная хроматография
IC50
Полумаксимальная ингибирующая концентрация
i.m.
внутримышечно, введение в мышцу
i.v.
Внутривенно, введение в вену
конц.
концентрированный
KPL-4
человеческая опухолевая клеточная линия
KU-19-19
человеческая опухолевая клеточная линия
LC-MS
Жидкостная хроматография - масс-спектрометрия
LLC-PK1-клетки
Клеточная линия свиной почки с карциномой легкого Льюис
L-MDR
Человеческие MDR1 трансфицированные LLC-PK1 клетки
LoVo
человеческая опухолевая клеточная линия
M
мультиплет (по ЯМР)
Me
Метил
MDR1
Белок 1 резистентности к множеству лекарственных средств
MeCN
Ацетонитрил
Min
минут
MOLM-13
человеческая опухолевая клеточная линия
MS
масс-спектрометрия
MTT
3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид
MV-4-11
человеческая опухолевая клеточная линия
NB4
человеческая опухолевая клеточная линия
NCI-H292
человеческая опухолевая клеточная линия
NMM
N-Метилморфолин
NMP
N-Метил-2-пирролидинoн
ЯМР
ядерно-резонансная спектрометрия
NMRI
Мышиный штамм, обнаружен в Naval Medical Research Institute (NMRI)
Голые мыши
Голые мыши (экспериментальные животные)
NSCLC
Немелкоклеточный рак легких
PBS
фосфат-буферизованный солевой раствор
Pd/C
Палладий на активированном угле
P-gp
P-гликопротеин, транспортный белок
PNGaseF
Фермент для расщепления сахара
Колич.
количественный (выход)
Кварт.
квартет (при ЯМР)
Квинт.
квинтет (при ЯМР)
Rec-1
человеческая опухолевая клеточная линия
Rf
индекс удерживания (при ТСХ)
RT
Комнатная температура
Rt
Время удерживания (при ВЭЖХ)
С
синглет (при ЯМР)
s.c.
подкожно, введение под кожу
SCID мышь
Экспериментальная мышь с серьезной комбинированной иммунонедостаточностью
SK-HEP-1
человеческая опухолевая клеточная линия
t
триплет (при ЯМР)
TBAF
тетра-н-бутиламмонияфторил
TCEP
три(2-карбоксиэтил)фосфин
TEMPO
(2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-ил)оксил
Teoc
триметилсилилэтоксикарбонил
tert.
трет
TFA
трифторуксусная кислота
THF
тетрагидрофуран
T3P
2,4,6-трипропил-1,3,5,2,4,6-триоксатрифосфинан-2,4,6-триоксид
U251
человеческая опухолевая клеточная линия
UV
УФ спектр
об/об
Отношение объема к объему (раствора)
Z
Бензилоксикарбонил
ВЭЖХ и LC-MS способы:
Способ 1 (LC-MS):
Устройство: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8мкм 50 × 1 мм; Элюент A: 1 л вода + 0.25 мл 99%-ой муравьиной кислоты, Элюент B: 1 л ацетонитрил + 0.25 мл 99%-ой муравьиной кислоты; Градиент: 0.0 мин 90% A → 1.2 мин 5% A → 2.0 мин 5% A Печь: 50°C; Скорость потока: 0.40 мл/мин; УФ обнаружение: 208-400 нм.
Способ 2 (LC-MS):
Тип устройства MS: Waters Synapt G2S; тип устройства UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Колонка: Waters, BEH300, 2.1 × 150 мм, C18 1.7 мкм; Элюент A: 1 л вода + 0.01% муравьиная кислота; Элюент B: 1 л ацетонитрил + 0.01% муравьиная кислота; Градиент: 0.0 мин 2% B → 1.5 мин 2% B → 8.5 мин 95% B → 10.0 мин 95% B; Печь: 50°C; Скорость потока: 0.50 мл/мин; УФ обнаружение: 220 нм
Способ 3 (LC-MS):
Устройство MS: Waters (Micromass) QM; Устройство ВЭЖХ: Agilent 1100 Serie; Колонка: Agient ZORBAX Extend-C18 3.0×50 мм 3.5-микрон; Элюент A: 1 л вода + 0.01 моль карбоната аммония, Элюент B: 1 л ацетонитрил; Градиент: 0.0 мин 98% A → 0.2 мин 98% A → 3.0 мин 5% A→ 4.5 мин 5% A; Печь: 40°C; Скорость потока: 1.75 мл/мин; УФ обнаружение: 210 нм
Способ 4 (LC-MS):
Тип устройства MS: Waters Synapt G2S; Тип устройства UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Колонка: Waters, HSST3, 2.1 × 50 мм, C18 1.8 мкм; Элюент A: 1 л вода + 0.01% муравьиная кислота; Элюент B: 1 л ацетонитрил + 0.01% муравьиная кислота; Градиент: 0.0 мин 10% B → 0.3 мин 10% B → 1.7 мин 95% B → 2.5 мин 95% B; Печь: 50°C; Скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ обнаружение: 210 нм
Способ 5 (LC-MS):
Устройство: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мкм 50 × 1 мм; Элюент A: 1 л вода + 0.25 мл 99%-ой муравьиной кислоты, Элюент B: 1 л ацетонитрил + 0.25 мл 99%-ой муравьиной кислоты; Градиент: 0.0 мин 95% A → 6.0 мин 5% A → 7.5 мин 5% A Печь: 50°C; Скорость потока: 0.35 мл/мин; УФ обнаружение: 210-400 нм.
Способ 6 (LC-MS):
Устройство: Micromass Quattro Premier с Waters UPLC Acquity; Колонка: Thermo Hypersil GOLD 1.9 мкм 50 × 1 мм; Элюент A: 1 л вода + 0.5 мл 50%-ой муравьиной кислоты, Элюент B: 1 л ацетонитрил + 0.5 мл 50%-ой муравьиной кислоты; Градиент: 0.0 мин 97% A → 0.5 мин 97% A → 3.2 мин 5% A → 4.0 мин 5% A Печь: 50°C; Скорость потока: 0.3 мл/мин; УФ обнаружение: 210 нм.
Способ 7 (LC-MS):
Устройство: Agilent MS Quad 6150; ВЭЖХ: Agilent 1290; Колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мкм 50 × 2.1 мм; Элюент A: 1 л вода + 0.25 мл 99%-ой муравьиной кислоты, Элюент B: 1 л ацетонитрил + 0.25 мл 99%-ой муравьиной кислоты; Градиент: 0.0 мин 90% A → 0.3 мин 90% A → 1.7 мин 5% A → 3.0 мин 5% A Печь: 50°C; Скорость потока: 1,20 мл/мин; УФ обнаружение: 205-305 нм.
Способ 8 (LC-MS):
Тип устройства MS: Waters Synapt G2S; Тип устройства UPLC: Waters Acquity I- CLASS; Колонка: Waters, HSST3, 2.1 × 50 мм, C18 1.8 мкм; Элюент A: 1 л вода + 0.01% муравьиная кислота; Элюент B: 1 л ацетонитрил + 0.01% муравьиная кислота; Градиент: 0.0 мин 2% B → 2.0 мин 2% B → 13.0 мин 90% B → 15.0 мин 90% B; Печь: 50°C; Скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ обнаружение: 210 нм
Способ 9: (LC-MS-Prep способ очистки)
Устройство MS: Waters, Устройство ВЭЖХ: Waters (Колонка Waters X-Bridge C18, 19 мм × 50 мм, 5 мкм, Элюент A: вода + 0.05% аммиак, Элюент B: ацетонитрил (ULC) с Градиентом; Скорость потока: 40 мл/мин; УФ обнаружение: DAD; 210-400 нм).
или:
Устройство MS: Waters, Устройство ВЭЖХ: Waters (Колонка Phenomenex Luna 5мкм C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 × 21.2 мм, Элюент A: вода + 0.05% муравьиная кислота, Элюент B: ацетонитрил (ULC) с Градиентом; Скорость потока: 40 мл/мин; УФ обнаружение: DAD; 210-400 нм).
Способ 10: (LC-MS аналитический способ)
Устройство MS: Waters SQD; Устройство ВЭЖХ: Waters UPLC; Колонка: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 мм × 2.1 мм, 1.8 мкм; Элюент A: вода + 0.025% муравьиная кислота, Элюент B: ацетонитрил (ULC) + 0.025% муравьиная кислота; Градиент: 0.0 мин 98%A - 0.9 мин 25%A - 1.0 мин 5%A - 1.4 мин 5%A - 1.41 мин 98%A - 1.5 мин 98%A; Печь: 40°C; Скорость потока: 0.600 мл/мин; УФ обнаружение: DAD; 210 нм.
Способ 11 (ВЭЖХ):
Инструмент: HP1100 Serie
Колонка: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4,6 мм, Best.- Nr.1.51450.0001, преколонка Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4,6 мм, Best. номер 1.51470.0001
Градиент: скорость потока 5 мл/мин
Впрыскиваемый объем 5 мкл
Растворитель A: HCLO4 (70%-ый) в Воде (4 мл/л)
Растворитель B: ацетонитрил
начало 20% B
0.50 мин 20% B
3.00 мин 90% B
3.50 мин 90% B
3.51 мин 20% B
4.00 мин 20% B
Температура колонки: 40°C
Длина волны: 210 нм
Способ 12 (LC-MS):
Устройство MS: Thermo Scientific FT-MS; Тип устройства UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; колонка: Waters, HSST3, 2.1 × 75 мм, C18 1.8 мкМ; Элюент A: 1 л воды + 0.01% муравьиная кислота; Элюент B: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиная кислота; градиент: 0.0 мин 10% B → 2.5 мин 95% B → 3.5 мин 95% B; печь: 50°C; скорость потока: 0.90 мл/мин; УФ-обнаружение: 210 нм/ Оптимальный путь интеграции 210-300 нм.
Способ 13: (LC-MS):
Устройство MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Устройство Waters UPLC Acquity; колонка: Waters BEH C18 1.7 мкм 50 × 2.1 мм; Элюент A: 1 л воды + 0.01 мол муравьиной кислоты, Элюент B: 1 л ацетонитрила; градиент: 0.0 мин 95% A → 0.1 мин 95% A → 2.0 мин 15% A → 2.5 мин 15% A→ 2.51 мин 10% A → 3.0 мин 10% A; печь: 40°C; скорость потока: 0.5 мл/мин; УФ-обнаружение: 210 нм.
Способ 14: (LC-MS) (MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10 мин)
Устройство MS: ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL; Тип устройства HPLC: Agilent 1200SL; колонка: Agilent, POROSHELL 120, 3 x 150 мм, SB - C18 2.7 мкМ; Элюент A: 1 л воды + 0.1% трифторуксусной кислоты; Элюент B: 1 л ацетонитрила + 0.1% трифторуксусной кислоты; градиент: 0.0 мин 2% B → 0.3 мин 2% B → 5.0 мин 95% B → 10.0 мин 95% B; печь: 40°C; скорость потока: 0.75 мл/мин; УФ-обнаружение: 210 нм
Для всех реактантов и реагентов, получение которых явно не описано ниже, они коммерчески доступны из общедоступных источников. Для всех других реактантов и реагентов, получение которых также не описано ниже и которые не были коммерчески доступны из общедоступных источников, делается ссылка на опубликованную литературу, описывающую их получение.
Исходные соединения и промежуточные соединения:
Промежуточное соединение C52
(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин
10,00 г (49,01 ммоль) метил-4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилат растворили в 100,0 мл DMF и смешали с 20,76 г (63,72 ммоль) карбоната цезия и 9,22 г (53,91 ммоль) бензилбромида. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы высушили над сульфатом магния и растворитель выпаривали в вакууме. Реакцию повторили с 90,0 г Метил-4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата.
Очистка объединенных двух партий проводилась с помощью препротивной ОФ- ВЭЖХ (колонка: Daiso 300X100, 10 мкм, поток: 250 мл/мин, MeCN/вода). Растворители выпаривали в вакууме, и остаток высушивали в высоком вакууме. Было получено 125,15 г (87% от теоретического выхода) соединения метил-1-бензил-4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилат.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.18 мин; MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H]+.
В атмосфере аргона 4.80 г (16.32 ммоль) метил-1-бензил-4-бром-1H-пиррол-2- карбоксилата растворили в DMF и смешали с 3.61 г(22.85 ммоль) (2,5-дифторфенил)бороновой кислоты и 19.20 мл насыщенного раствора карбоната натрия и 1.33 г (1.63 ммоль) [1,1'-бис-(дифенилфосфино)-ферроцен]-дихлорпалладия(II):дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали всю ночь при 85°C. Реакционную смесь отфильтровали через целит, и осадок на фильтре промывали этилацетатом. Органическую фазу экстрагировали водой и затем промывали насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу высушили над сульфатом магния и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью силикагеля (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат 100: 3). Растворители выпаривали в вакууме и остаток высушивали в высоком вакууме. Это дало 3,60 г (67% от теоретического выхода) соединения метил-1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H- пиррол-2-карбоксилат.
LC-MS (Способ 7): Rt = 1.59 мин; MS (ESIpos): m/z = 328 [M+H]+.
3.60 г (11.00 ммоль) метил-1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-карбоксилата растворили в 90.0 мл THF и при 0°C смешали с 1.04 г (27.50 ммоль) литийалюминия гидрида (2.4 M в THF). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°C. Насыщенный раствор калия натрия тартрата добавили при 0°C, и затем реакционную смесь смешали с этилацетатом. Органическую фазу трижды экстрагировали насыщенным раствором тартрата калия-натрия. Органическую фазу промывали один раз насыщенным раствором NaCl и высушили над сульфатом магния. Растворитель выпаривали в вакууме и остаток растворяли в 30,0 мл дихлорметана. Добавляли 3,38 г (32,99 ммоль) оксида марганца (IV) и перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре. Добавляли еще 2,20 г (21,47 ммоль) оксида марганца (IV) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали через целит и осадок на фильтре промывали дихлорметаном. Растворитель выпаривали в вакууме и остаток 2,80 г (1-бензол-4-(2,5-диэтилфенил)-1H-пиррол-2-карбальдегида) использовали без дальнейшей очистки на следующей стадии синтеза.
LC-MS (Способ 7): Rt = 1.48 мин; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]+.
28.21 г (94.88 ммоль) 1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-карбальдегида вместе с 23.00 г (189.77 ммоль) (R)-2-метилпропан-2-сульфинамида растворили в 403.0 мл абсолютного THF и смешали с 67.42 г (237.21 ммоль) изопропилата титана (IV) и перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Добавили 500.0 мл насыщенного раствора NaCl и 1000.0 мл этилацетата и перемешивали 1 час при комнатной температуре. Отфильтровали через диатомовую землю и фильтрат дважды с промыли насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу высушили над сульфатом магния, и растворитель выпаривали в вакууме, и остаток очищали с помощью Biotage Isolera (силикагель, колонка 1500 + 340 г SNAP, расход 200 мл/мин, этилацетат/циклогексан 1:10). LC-MS (Способ 7): Rt = 1.63 мин; MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+.
25.00 г (62.42 ммоль) (R)-N-{(E/Z)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]метилен}-2-метилпропан-2-сульфинамида растворили в абсолютном THF в атмосфере аргона и охладили до -78°C. Затем добавили 12.00 г (187.27 ммоль) трет-бутиллития (1.7 M раствор в пентане) при -78°C и перемешивали 3 часа при этой температуре. Затем при -78 С 71,4 мл метанола и 214,3 мл насыщенного раствора хлорида аммония добавляли последовательно и реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Ее разбавляли этилацетатом и промывали водой. Органическую фазу высушили над сульфатом магния и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток (R)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2- диметилпропил}-2-метилпропан-2-сульфинамида применяли на следующей стадии синтеза без дальнейшей очистки.
LC-MS (Способ 6): Rt = 2.97 мин; MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]+.
28.00 г (61.05 ммоль) (R)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-метилпропан-2-сульфинамида растворили в 186.7 мл 1,4-диоксана и затем смешали с 45.8 мл HCl в растворе 1,4-диоксана (4.0 M). Реакционную смесь перемешивали 2 ч при комнатной температуре, и затем растворитель удалили в вакууме. Остаток очистили посредством препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Kinetix 100X30, поток: 60 мл/мин, MeCN/вода). Ацетонитрил выпаривали в вакууме, и к водному остатку добавили дихлорметан. Органическую фазу промыли раствором бикарбоната натрия и высушили над сульфатом магния. Растворитель выпарили в вакууме, и остаток высушили в высоком вакууме. Было получено 16,2 г (75% от теоретического выхода) указанного в заголовке соединения.
LC-MS (Способ 6): Rt = 2.10 мин; MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH2]+, 709 [2M+H]+.
1H-NMR (400 МГц, DMSO-d6): d [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H).
Промежуточное соединение C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановая кислота
4.3 г (12.2 ммоль) промежуточного соединения C52 растворили в 525 мл DCM и смешали с 3.63 г (17.12 ммоль) триацетоксиборгидрида натрия, а также с 8.4 мл уксусной кислоты. Через 5 мин перемешивания при комнатной температуре добавили 8.99 г (24.5 ммоль) промежуточного соединения L57, растворенного в 175 мл DCM, и реакционную смесь перемешивали еще 45 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь затем подвергли взаимодействию с 300 мл DCM и дважды промыли с помощью 100 мл раствора гидрокарбоната натрия и еще один раз насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу высушили над сульфатом магния, растворитель выпаривали в вакууме, и остаток высушили в высоком вакууме. Затем остаток очищали препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex C18). После объединения соответствующих фракций растворитель выпарили в вакууме и остаток высушили в высоком вакууме. Таким образом, получили 4,6 г (61% от теоретического выхода) метил-(2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноата.
LC-MS (Способ 12): Rt = 1.97 мин; MS (ESIpos): m/z = 614 (M+H)+.
2.06 г (3.36 ммоль) этого промежуточного соединения растворили в 76 мл DCM и ацилировали с помощью 0.81 мл (7.17 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата в присутствии 2.1 мл триэтиламина. Через 20 ч перемешивания при комнатной температуре добавили еще 0.36 мл 2-хлор-2-оксоэтилацетата и 0.94 мл триэтиламина, и реакционную смесь перемешивали еще 15 мин при комнатной температуре. Затем ее разбавляли 500 мл этилацетата и последовательно дважды экстрагировали 300 мл 5% лимонной кислоты, дважды 300 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия и один раз 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия, затем высушили над сульфатом магния и концентрировали. После сушки в высоком вакууме было получено 2,17 г (79% от теоретического выхода) защищенного промежуточного соединения.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.48 мин; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
2.17 г (2.64 ммоль) этого промежуточного соединения растворили в 54 мл THF и 27 мл воды, и смешали с 26 мл 2-х молярного раствора гидроксида лития. Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем с помощью 1.4 мл TFA довели до значения pH между 3 и 4. Смесь концентрировали в вакууме. После отгонки THF водный раствор дважды экстрагировали DCM и затем концентрировали в вакууме досуха. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (колонка: Chromatorex C18). После объединения соответствующих фракций растворитель выпаривали в вакууме, и остаток лиофилизировали из ацетонитрила/воды. Таким образом, было получено 1,1 г (63% от теоретического выхода) указанного в заголовке соединения.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.34 мин; MS (ESIpos): m/z = 656 (M-H)-.
1H-NMR (400 МГц, DMSO-d6): d [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.58 (m, 1H), 0.74-0.92 (m, 11H), 1.40 (m, 1H), 3.3 (m, 2H), 3.7 (m, 1H), 3.8-4.0 (m, 2H), 4.15 (q, 2H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 5.61 (s, 1H), 6.94 (m, 2H), 7.13-7.38 (m, 7H), 7.48 (s, 1H), 7.60 (m, 1H), 12.35 (s, 1H).
Промежуточное соединение C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-бета-аланин
Указанное в названии соединение получали посредством связывания 60 мг (0.091 ммоль) промежуточного соединения C58 с β-аланинметиловым сложным эфиром и затем путем отщепления сложного эфира с помощью 2М раствора гидроксида лития. Это дало 67 мг (61% от теоретического выхода) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.29 мин; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+.
Промежуточное соединение C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}бутановая кислота
Сначала промежуточное соединение С52 было алкилировано бензил- (2S) -2 -{[(бензилокси) карбонил] амино}-4-оксобутаноатом по аналогии с промежуточным соединением С2. Затем вторичную аминогруппу ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом и, наконец, проводили гидролиз двух сложноэфирных групп с помощью 2 М раствора гидроксида лития в метаноле.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.31 мин; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)-.
Промежуточное соединение C110(D)
Дибензил-N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-глутамат
Указанное в названии соединение получали посредством связывания дибензил-D-гдутамата, предварительно высвобожденного из его соли п-толуолсульфоновой кислоты путем распределения между этилацетатом и 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия, с промежуточным соединением C61 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим удалением защитной группы Teoc с помощью хлорида цинка в трифторэтаноле.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.08 мин; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+.
Промежуточное соединение C111
Ди-трет-бутил-N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H- пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-гдутамат
Сначала дипептид, производный от ди-трет-бутил-бета-аланил-D-глутамат, получили посредством классических способов пептидной химии путем сочетания коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-бета аланина и ди-трет-бутил-D-глутамат гидрохлорида (1:1) в присутствии HATU и последующего гидрогенолитического отщепления Z-защитной группы. Указанное в названии соединение затем получали путем связывания этого промежуточного соединения с промежуточным соединением С102 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления Z-защитной группы с помощью гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM/метаноле 1:1 при комнатной температуре при нормальном давлении водорода.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.06 мин; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+.
Промежуточное соединение C117
Трифторуксусной кислоты дибензил-N-{(2S)-2-(L-аспарагиниламино)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-глутаматная соль
Промежуточное соединение C110D и 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-N2-(трет-бутоксикарбонил)-L-аспарагинат (251 мг, 764 мкмоль) растворили в 21 мл DMF и смешали с N,N-диизопропилэтиламином (363 мкл, 2.01 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре и затем очистили непосредственно путем ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex C18-10). Растворители выпарили при пониженном давлении, и остаток лиофилизировали.
Полученное промежуточное соединение (578 мг, 52 мкмоль) растворили в 20.0 мл трифторэтанола. Реакционную смесь смешали с хлоридом цинка (426 мг, 3.13 ммоль) и затем перемешивали 40 мин при 50°C. Смесь смешали с этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислотой (914 мг, 3.13 ммоль), разбавили 20 мл воды, добавили TFA (200 мкл) и быстро перемешали. Смесь отфильтровали и очистили посредством препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex C18-5, 125×40; расход: 100 мл/мин, MeCN/вода, 0.1% TFA градиент). После лиофилизации получили указанное в заглавии соединение.
Промежуточное соединение L57
Метил-(2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноат
500,0 мкг (2,72 ммоль) гидрохлорида метилового сложного эфира L-аспарагиновой кислоты и 706,3 мкг (2,72 ммоль) 2-(триметилсилил)этил-2,5-диоксопирролидин-1-карбоксилата помещали в 5,0 мл 1,4-диоксана и обрабатывали 826,8 мкг (8,17 мл). ) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь непосредственно очищали посредством препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250 × 40, 10 мкм, поток: 50 мл/мин, MeCN/вода, 0,1% TFA). Затем растворители выпарили в вакууме, и остаток высушили в высоком вакууме. Было получено 583,9 мкг (74% от теоретического выхода) соединения (3S)-4-метокси-4-оксо-3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино) бутановой кислоты.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.89 мин; MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H)-.
592.9 мг (3S)-4-метокси-4-оксо-3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановой кислоты растворили в 10.0 мл 1,2-диметоксиэтана и охладили до -15°C и смешали с 205.8 мг (2.04 ммоль) 4-метилморфолина и 277.9 мг (2.04 ммоль) изобутилхлорформиатом. Осадок отфильтровали с отсасыванием через 15 мин и дважды промыли 10,0 мл 1,2-диметоксиэтана в каждом случае. Фильтрат охладили до -10°С и добавили 115,5 мг (3,05 ммоль) боргидрида натрия, растворенного в 10 мл воды, при интенсивном перемешивании. Фазы разделили, и органическую фазу промыли один раз насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу высушили над сульфатом магния, и растворитель выпаривали в вакууме, а остаток высушили в высоком вакууме. Было получено 515,9 мкг (91% от теоретического выхода) соединения метил-N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-гомосеринат.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.87 мин; MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)+.
554.9 мг (2.00 ммоль) метил-N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-гомосерината растворили в 30.0 мл дихлорметана и смешали с 1.27 г (3.0 ммоль) периодинана Десс-Мартина и 474.7 мг (6.00 ммоль) пиридина. Перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Через 4 ч реакционную смесь разбавили дихлорметаном, и органическую фазу промыли в каждом случае трижды 10%-ым раствором Na2S2O3, 10%-ым раствором лимонной кислоты и насыщенным раствором гидрокарбоната натрия. Органическую фазу высушили над сульфатом магния, и растворитель выпарили при пониженном давлении. Получили 565.7 мг (97 % от теоретического выхода) указанного в названии соединения.
1H-NMR (400 МГц, DMSO-d6): d [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1H).
Промежуточное соединение L95
N-[(Бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланин
Промежуточное соединение получали исходя из N-[(бензилокси)карбонил]-L-валина и трет-бутил-L-аланинат гидрохлорида посредством обычных методов пептидной химии.
LC-MS (Способ 12): Rt = 1.34 мин; MS (ESIpos): m/z = 323.16 (M+H)+.
Промежуточное соединение L103
N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-L-аспарагина трифторацетат
Указанное в названии соединение получали посредством классических способов пептидной химии, начиная с сочетания 4-пиридинуксусной кислоты с коммерчески доступным трет-бутил-L-аланил-L-аланинатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, с последующим удалением защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты, сочетанием с трет-бутил-L-аспарагинатом и последующим удалением защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.15 мин; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+.
Промежуточное соединение L116
N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-N-метил-L-аланин
Указанное в названии соединение получали из коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланина посредством классических способов пептидной химии, посредством сочетания с трет-бутил-N-метил-L-аланинат гидрохлоридной солью в присутствии HATU, и затем посредством удаления трет-бутилсложноэфирной защитной группы с помощью TFA.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.68 мин; MS (ESIpos): m/z = 309 [M+H]+
Промежуточное соединение L117
N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-N-метил-L-аланил-L-аспарагин-трифторуксусной кислоты соль
Указанное в названии соединение получали из коммерчески доступного 4 трет- бутил-L-аспаргината посредством классических способов пептидной химии, посредством сочетания с N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-N-метил-L-аланином (промежуточное соединение L116) в присутствии HATU, и затем посредством удаления трет-бутилсложноэфирной защитной группы с помощью TFA.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.57 мин; MS (ESIneg): m/z = 421 [M-H]-
Промежуточное соединение L118
N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-N-метил-L-аланил-L-аланин
Указанное в названии соединение получали из коммерчески доступной трет- бутил-L-аланинат гидрохлоридной соли посредством классических способов пептидной химии, посредством сочетания с N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-N-метил-L-аланином (Промежуточное соединение L116) в присутствии HATU, и затем посредством удаления трет-бутилсложноэфирной защитной группы с помощью TFA.
LC-MS (Способ 12): Rt = 1.25 мин; MS (ESIneg): m/z = 378 [M-H]-
Промежуточное соединение L121
N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-N-метил-L-аланил-L-лейцин
Указанное в названии соединение получали из коммерчески доступной трет-бутил-L-лейцинат гидрохлоридной соли посредством классических способов пептидной химии, посредством сочетания с N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-N-метил-L-аланином (Промежуточное соединение L116) в присутствии HATU, и затем посредством удаления трет-бутилсложноэфирной защитной группы с помощью TFA.
LC-MS (Способ 12): Rt = 0.83 мин; MS (ESIneg): m/z = 420 [M-H]-
Промежуточное соединение L122
(5S,8S,11S)-11-(2-Амино-2-оксоэтил)-8-[2-(бензилокси)-2-оксоэтил]-5-метил-3,6,9-триоксо-1-фенил-2-окса-4,7,10-триазадодекан-12-овая кислота
Указанное в названии соединение получали из коммерчески доступного 4-Бензил-1-трет-бутил-L-аспартатгидрохлорида (1:1) посредством классических способов пептидной химии, сначала посредством сочетания с 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланината, затем путем удаления трет.-бутилсложноэфирной защитной группы с помощью TFA, затем последующего связывания с 4 трет-бутил-L-аспаргинатом в присутствии HATU, и наконец посредством еще одного удаления трет-бутилсложноэфирной защитной группы с помощью TFA.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.76 мин; MS (ESIpos): m/z = 543 [M+H]+
Промежуточное соединение L138
1-бром-2-оксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-овая кислота
Указанное в названии соединение получали посредством связывания 1-амино-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овой кислоты с бромуксусным ангидридом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.
LC-MS (Способ 5): Rt = 1.05 мин; MS (ESIpos): m/z = 386 und 388 (M+H)+.
Промежуточное соединение Q1
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацеитл]-L-аланил-N-метил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L117 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ым палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1H-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина превращали в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 12): Rt = 1.66 мин; MS (ESIneg): m/z = 1119 [M-H]-.
Промежуточное соединение Q2
N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)oxy]-5-оксопентаноил}-L-аланил-N-метил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L117 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 1,1'-[(1,5-Диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина превращали в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.93 мин; MS (ESIpos): m/z = 1195 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q3
N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-аланил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C117 сначала посредством сочетания с N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланил-L-аланином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем промежуточное соединение растворяли в трифторэтаноле, и при перемешивании при 50°C в присутствии хлорида цинка высвобождали три-бутоксикарбонил-защищенный амин. На следующей стадии все защитные бензильные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством реакции с 1,1'-[(1,5-Диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.90 мин; MS (ESIneg): m/z = 1181 [M-H]-.
Промежуточное соединение Q4
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-аланил-N-метил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L117 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 1-{6-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1H-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-Диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 3.2 мин; MS (ESIpos): m/z = 1177 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q5
N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-аланил-N-метил-L-аланил-N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аланинамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L118 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 1,1'-[(1,5-диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дионом в присутствии N,N- диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.96 мин; MS (ESIpos): m/z = 1152 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q6
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(N-{5-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-валил-L-аланил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-глутаминовая кислота
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L95 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтилами. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 1,1'-[(1,5-диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.98 мин; MS (ESIpos): m/z = 1095 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q7
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил}амино)бутаноил]-бета-аланил-D-глутаминовая кислота
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L95 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1H-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.98 мин; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q8
N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-аланил-N-метил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-лейцинамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L121 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в этаноле при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 1,1'-[(1,5-диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.02 мин; MS (ESIpos): m/z = 1194 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q9
N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-аланил-N-метил-L-альфа-аспартил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L122 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в метаноле при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством взаимодействия с 3 экв. 1,1'-[(1,5-диоксан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидином-2,5-дионом в присутствии 3 экв. N,N-диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.89 мин; MS (ESIpos): m/z = 1225 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q10
N-(бромацетил)-L-аланил-N-метил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид
Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения C110D сначала посредством связывания с промежуточным соединением L117 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли посредством гидрирования в течение 1 часа над 10%-ным палладием на активированном угле в DCM-метаноле 1:1 при нормальном давлении водорода при комнатной температуре, и промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем превращали посредством реакции с бромуксусным ангидридом в присутствии 3 экв. N,N-диизопропилэтиламина в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.95 мин; MS (ESIpos): m/z = 1104 und 1106 [M+H]+.
Промежуточное соединение Q11
N-(18-бром-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азаоктадекан-1-оил)-L-аланил-N-метил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1R)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид
Синтез указанного в заголовке соединения осуществляли сначала путем сочетания промежуточного соединения C111 с Промежуточным соединением L117 в DMF в соответствии с 1,5 экв. HATU и 3 экв. N,N-диизопропилэтиламина. Затем Z-защитную группу удаляли гидрированием в течение 2 часов над 10% -ным палладием на активированном угле в этаноле при нормальном давлении водорода при комнатной температуре. Промежуточное соединение с удаленной защитной группой затем подвергали взаимодействию с промежуточным соединением L138 в DMF в присутствии 1.5 экв. HATU и 3 экв. N,N-диизопропилэтиламина. На последней стадии указанное в заголовке соединение получали путем расщепления трет-бутиловых сложноэфирных групп путем перемешивания в течение 2 ч при 50°C с 8 эквивалентами хлорида цинка в трифторэтаноле.
LC-MS (Способ 8): Rt = 4.06 мин; MS (ESI-pos): m/z = 1353 [M+H]+.
B: Получение конъюгатов антитело- активное вещество (ADC)
B-1. Общий способ получения антител
Последовательность белка (аминокислотная последовательность) используемого антитела, например, TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 и TPP-9580, была преобразована в последовательность ДНК, кодирующую соответствующий белок, способами, известными специалистам в данной области, и вставлена в вектор экспрессии, подходящий для переходной культуры клеток млекопитающих (как описано в Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007).
B-2. Общий способ экспрессии антител в клетках млекопитающих
Антитела, например, TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 и TPP-9580, были получены в переходных культурах клеток млекопитающих, как описано в Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007.
B-3. Общий способ очистки антител от клеточных супернатантов.
Антитела, например, TPP-981, TPP-1015, TPP-6013, TPP-7006, TPP-7007, TPP-8382, TPP-8987, TPP-8988, TPP-9476, TPP-9574 и TPP-9580, были получены из супернатантов клеточной культуры. Супернатанты клеток осветляли центрифугированием клеток. Затем клеточный супернатант очищали аффинной хроматографией на хроматографической колонке MabSelect Sure (GE Healthcare). Для этой цели колонку уравновешивали в DPBS pH 7,4 (Sigma / Aldrich), наносили клеточный супернатант и колонку промывали примерно 10 объемами колонки DPBS pH 7,4 + 500 мМ хлорида натрия. Антитела элюировали в 50 мМ ацетате натрия, рН 3,5, + 500 мМ хлорида натрия, а затем дополнительно очищали гель-фильтрационной хроматографией на колонке Superdex 200 (GE Healthcare) в DPBS, рН 7,4.
Коммерчески доступные антитела очищали от коммерческих продуктов с использованием стандартной хроматографической спектроскопии (хроматография на белке A, препаративная гель-фильтрационная хроматография (SEC), эксклюзионная хроматография).
B-4. Общая методика связывания с боковыми цепями цистеина
Следующие антитела применяли в реакциях связывания:
Пример a: TPP-981 цетуксимаб (анти EGFR AK)
Пример c: TPP-6013 (Анти-CD123 AK)
TPP-8987 (Анти-CD123 AK)
TPP-8988 (Анти-CD123 AK)
TPP-9476 (Анти-CD123 AK)
Пример h: TPP-8382 (Анти-B7H3 AK)
Пример e: TPP-1015 (Анти-Her2 AK)
Пример k: TPP-7006 (Анти-TWEAKR AK)
TPP-7007 (Анти-TWEAKR AK)
Пример x: TPP-9574 (Анти-CXCR5 AK)
TPP-9580 (Анти-CXCR5 AK)
Реакции связывания, как правило, и проводили в атмосфере аргона.
От 2 до 5 эквивалентов трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорида (TCEP), растворенного в PBS буфере, добавили к раствору соответствующего антитела в PBS буфере в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 20 мг/мл, предпочтительно в интервале от 10 мг/мл до 15 мг/мл, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. С этой целью раствор соответствующего применяемого антитела может применяться при концентрациях, установленных в рабочих примерах, или при необходимости может быть разбавлен PBS буфером до около половины установленных исходных концентраций, чтобы достичь предпочтительного диапазона концентраций. Затем, в зависимости от предполагаемой загрузки от 2 до 12 эквивалентов, предпочтительно около 5-10 эквивалентов малеинимидного предшественника или галогенидного предшественника для связывания может быть добавлен в виде раствора в DMSO. Согласно настоящему изобретению количество DMSO не должно превышать 10% от общего объема. Реакционную смесь перемешивали в случае малеинимидных предшественников в течение 60-240 минут при комнатной температуре и в случае галогенидных предшественников от 8 до 24ч при комнатной температуре и затем наносили на PBS- уравновешанные колонки PD 10 (Sephadex G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером. В общем, если иного не указано, 5 мг рассматриваемого антитела в PBS буфере применяли для редукции и последующего связывания. Таким образом, посредством очистки на колонке PD10, в каждом случае получили растворы соответствующих ADC в 3.5 мл PBS буфера. Образец затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования и при необходимости разбавили PBS буфером. Если требуется, для лучшего удаления низкомолекулярных компонентов, концентрирование ультрацентрифугированием повторили после разбавления PBS буфером. Для биологических тестов, если необходимо, концентрации конечных образцов ADC при необходимости довели до диапазона 0.5-15 мг/мл посредством повторного разбавления. Соответствующие концентрации белка, установленные в рабочих примерах, растворов ADC были определены. Кроме того, загрузку антитела (отношение лекарственное средство/mAb) определили с применением способов, описанных в B-7.
В зависимости от линкера, ADC, показанные в примерах, могут также присутствовать в меньшей или большей степени в форме гидролизованных сукцинамидов с открытой цепью, присоединенных к антителам.
В частности KSP-I-ADC, присоединенное через линкерную структуру
к тиольным группам антител, может при необходимости также быть получен нацеленным образом посредством повторной буферизации после связывания и перемешивания при pH 8 в течение около 20-24 ч согласно схеме 28 при ADC, присоединенным через сукцинамиды с открытой цепью.
#1 обозначает серный мостик с антителом, и #2 обозначает точку присоединения к модифицированному ингибитору KSP.
Такие ADC, в которых линкер присоединен к антителам через гидролизованные сукцинамиды с открытой цепью, могут также при желании быть получены селективно в соответствии с мелкомасштабными и крупномасштабными связыванием, приведенными в качестве примера здесь:
К раствору 2-5 мг рассматриваемого антитела в буфере PBS в диапазоне концентраций от 1 мкг/мл до 20 мкг/мл, предпочтительно в диапазоне от около 5 мкг/мл до 15 мкг /мл, обваляли от 2 до 7 эквивалентов трис (2)карбоксиэтил)фосфин гидрохлорида (ТСЕР), растворенного в буфере PBS, и перемешивали в течение 30 мин. Затем, в зависимости от желаемой загрузки, от 2 до 20 эквивалентов, предпочтительно около 5-10 эквивалентов соединения-предшественника малеимида, которое должно быть присоединено, добавляли в виде раствора в DMSO. Для достижения более высоких значений DAR можно использовать 15-20 эквивалентов. Количество DMSO не должно превышать 10% от общего объема. Смесь перемешивали при перемешивании 60-240 мин при комнатной температуре. Элюат разбавляли буфером PBS pH8 до концентрации 1-5 мкг/мл и затем наносили на колонку PD 10, уравновешенную буфером PBS pH8 (Sephadex G-25, GE Healthcare), и элюировали буфером PBS pH8. Элюат перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона всю ночь. Впоследствии раствор концентрировали ультрацентрифугированием и повторно разбавляли буфером PBS(pH 7.2).
Связывание среднего масштаба:
20-200 мг рассматриваемого антитела в PBS-буфере (c~5-15 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 2-7 эквивалентов, предпочтительно 3 эквивалентов TCEP в PBS-буфере (c~0.2-0.8 мг/мл предпочтительно 0.5 мг/мл). Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем добавили 2-20, предпочтительно 5-10 эквивалентов соединения] малеимидного предшественника, растворенного в DMSO. Для достижения более высоких значений DAR можно использовать 15-20 эквивалентов. После дополнительного перемешивания в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре партию разбавляли буфером PBS, предварительно доведенным до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонки PD 10, уравновешенных буфером PBS, pH8 (Sephadex G-25, GE Healthcare), и элюировали буфером PBS pH8. Элюат разбавляли буфером PBS pH 8 до концентрации 2-7 мкг/мл. Этот раствор перемешивали в атмосфере аргона в течение ночи при комнатной температуре. Затем, если необходимо, его снова забуферовали до рН 7,2. Раствор ADC концентрировали ультрацентрифугированием, повторно разбавляли с помощью PBS-буфера (pH 7,2) и затем, при необходимости, снова концентрировали до концентрации около 10 мг/мл.
В показанных структурных формула AK1 имеет следующие значения
Пример a: TPP-981 цетуксимаб (частично усеченное)- S§1
Пример c: NPP-6013 (Анти-CD123 AK) (частично усеченное)- S§1
TPP-8987 (Анти-CD123 AK) (частично усеченное)- S§1
TPP-8988 (Анти-CD123 AK) (частично усеченное)- S§1
TPP-9476 (Анти-CD123 AK) (частично усеченное)- S§1
Пример e: TPP-1015 (Анти-Her2 AK) (частично усеченное)- S§1
Пример h: TPP-8382 (Анти-B7H3 AK) (частично усеченное)- S§1
Пример k: TPP-7006 (Анти-TWEAKR AK) (частично усеченное)- S§1
TPP-7007 (Анти-TWEAKR AK) (частично усеченное)- S§1
Пример x: TPP-9574 (Анти-CXCR5 AK) (частично усеченное)- S§1
TPP-9580 (Анти-CXCR5 AK) (частично усеченное)- S§1
причем
§1 представляет собой связь с сукцинимидной группой или с любыми изомерно гидролизованными сукцинамидами с открытой цепью или происходящими из них алкиленовыми радикалами,
и
S представляет собой атом серы цистеинового остатка частично усеченного антитела.
B-5. Общие методики связывания с лизинговыми боковыми цепями
Следующие антитела применяли для реакций связывания:
Пример a: TPP-981 цетуксимаб (анти- EGFR AK)
Пример c: TPP-6013 (Анти-CD123 AK)
TPP-8987 (Анти-CD123 AK)
TPP-8988 (Анти-CD123 AK)
TPP-9476 (Анти-CD123 AK)
Пример e: TPP-1015 (Анти-Her2 AK)
Пример k: TPP-7006 (Анти-TWEAKR AK)
TPP-7007 (Анти-TWEAKR AK)
Пример x: TPP-9574 (Анти-CXCR5 AK)
TPP-9580 (Анти-CXCR5 AK)
Реакции связывания, как правило, проводили в атмосфере аргона.
К раствору рассматриваемого антитела в PBS в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 20 мг/мл, предпочтительно около 10 мг/мл, в зависимости от желаемой загрузки, добавляли от 2 до 8 эквивалентов соединения-предшественника, которое необходимо связать, в виде раствора в DMSO. После перемешивания от 30 мин до 6 ч при комнатной температуре снова добавляли такое же количество соединения-предшественника в DMSO. Количество DMSO не должно превышать 10% от общего объема. После дополнительного перемешивания в течение 30 мин-6 ч при комнатной температуре партию пропускали через колонки PD 10, уравновешенные PBS (Sephadex G-25, GE Healthcare), и элюировали буфером PBS. После очистки на колонке PD10 в каждом случае получали растворы соответствующего ADC в буфере PBS. Впоследствии концентрацию осуществляли с помощью ультрацентрифугирования, и образец необязательно разбавляли буфером PBS. При необходимости концентрацию повторяли ультрафильтрацией после повторного разбавления буфером PBS для лучшего разделения низкомолекулярных компонентов. Для биологических испытаний концентрации в диапазоне 0,5-15 мкг/мл устанавливали по мере необходимости в конечных образцах ADC, при необходимости путем повторного разбавления.
Для растворов ADC определяли концентрацию белка, указанную в каждом случае. Кроме того, загрузку антитела (соотношение активное вещество/mAb) определяли с применением способов, описанных в разделе B-6.
В показанных структурных формулах AK2 имеет значение
Пример a: TPP-981 цетуксимаб (анти EGFR AK) - NH§2
Пример c: TPP-6013 (Анти-CD123 AK) - NH§2
TPP-8987 (Анти-CD123 AK) - NH§2
TPP-8988 (Анти-CD123 AK) - NH§2
TPP-9476 (Анти-CD123 AK) - NH§2
Пример e: TPP-1015 (Анти-Her2 AK) - NH§2
Пример k: TPP-7006 (Анти-TWEAKR AK) - NH§2
TPP-7007 (Анти-TWEAKR AK) - NH§2
Пример x: TPP-9574 (Анти-CXCR5 AK) - NH§2
TPP-9580 (Анти-CXCR5 AK) - NH§2
причем
§2 представляет собой связь с карбонильной группой,
и
NH представляет собой аминогруппу боковой цепи лизинового остатка антитела.
Дальнейшая очистка и характеризация конъюгатов согласно настоящему изобретению
После реакции в некоторых случаях реакционную смесь концентрировали, например, ультрафильтрацией, а затем обессоливали и очищали хроматографией, например, с помощью Sephadex G-25. Элюирование проводили, например, фосфатно-солевым буфером (PBS). Затем раствор стерильно фильтровали и замораживали. Альтернативно, конъюгат может быть лиофилизирован.
B-6. Определение антитела, загрузки токсофора и доли открытых аддуктов цистеина
Для идентификации белка, в дополнение к определению молекулярной массы после дегликозилирования и/или денатурации, проводили расщепление трипсином, которое после денатурации, восстановления и дериватизации подтверждает идентичность белка на основе обнаруженных триптических пептидов.
Из растворов конъюгатов в буфере PBS, описанных в рабочих примерах, загрузку токсофором (в таблицах, соотношение лекарственного средства и антитела, называемое DAR) определяли следующим образом:
Определение токсофорной загрузки лизин-связанных ADC проводили масс- спектрометрическим определением молекулярных масс отдельных видов конъюгатов. Перед этим конъюгаты антител дегликозилировали с помощью PNGaseF, образец подкисляли и после ВЭЖХ разделения/обессоливания анализировали с помощью масс-спектрометрии с использованием ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik). Все спектры сигнала в TIC (общая ионная хроматограмма) были сложены вместе, и молекулярная масса различных видов конъюгатов была рассчитана на основе деконволюции MaxEnt. После интеграции сигналов различных видов рассчитывали DAR (= соотношение лекарственное средство/антитело). Для этого сумма числа взвешенных по токсофору результатов интеграции всех видов была разделена на сумму простых взвешенных результатов интеграции всех видов.
Концентрацию токсофора в цистеин-связанных конъюгатах определили посредством обращено-фазовой хроматографии редуцированных и денатурированных ADC. Гидрохлорид гуанидиния (GuHCl) (28.6 мг) и раствор DL-дитиотреитола (DTT) (500 мМ, 3 мкл) добавили к раствору ADC (1 мг/мл, 50 мкл). Смесь инкубировали при 55 0C в течение одного часа и проанализировали посредством ВЭЖХ.
Анализ ВЭЖХ проводили на системе ВЭЖХ Agilent 1260 с детектированием при 220 нм. Использовали колонку Polymer Laboratories PLRP-S с полимерной обращенной фазой (номер по каталогу PL1912-3802) (2,1 × 150 мм, размер частиц 8 мкм, 1000 ) при скорости потока 1 мл/мин со следующим градиентом: 0 мин, 25% B; 3 минуты, 25% В; 28 мин, 50% В. Элюент A состоял из 0,05% трифторуксусной кислоты (TFA) в воде, элюент B из 0,05% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле.
Обнаруженные пики были определены путем сравнения времени удерживания с легкой цепью (L0) и тяжелой цепью (H0) неконъюгированного антитела. Пики, обнаруженные только в конъюгированном образце, были отнесены к легкой цепи с одним токсофором (L1) и тяжелым цепям с одним, двумя и тремя токсофорами (H1, H2, H3).
Среднее значение загрузки лекарственное средство-антитело (DAR) определяли по площадям пиков, определяемых интеграцией, как двойная сумма загрузки HC и загрузки LC, причем загрузка LC была вычислена из суммы результатов интеграции средневзвешенного токсофора всех пиков LC, поделенной на сумму простых взвешенных результатов интеграции всех пиков LC, и где загрузка HC представляет собой сумму результатов интеграции средневзвешенного токсофора всех пиков HC, разделенную на сумму единичных взвешенных результатов интеграции всех пиков HC. В отдельных случаях было возможно, что загрузку токсофором нельзя было точно определить из-за совместного элюирования некоторых пиков.
В тех случаях, когда достаточное разделение ВЭЖХ легкой и тяжелой цепей было невозможно, определение токсофорной загрузки цистеин-связанных конъюгатов определяли масс-спектрометрическим определением молекулярной массы каждого из видов конъюгатов легкой и тяжелой цепи.
Для этой цели гидрохлорид гуанидиния (GuHCl) (28,6 мг) и раствор DL-дитиотреитола (DTT) (500 мМ, 3 мл) добавляли к раствору ADC (1 мг / мл, 50 мл). Смесь инкубировали в течение одного часа при 55°C и анализировали масс-спектрометрией после обессоливания в режиме онлайн с использованием ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik).
Для определения DAR (отношение лекарственное средство к антителу) все спектры добавляли по сигналу в TIC (общая ионная хроматограмма), и молекулярную массу различных видов конъюгатов легких и тяжелых цепей рассчитывали на основе деконволюции MaxEnt. Среднюю загрузку антител токсофором определяли по площадям пиков, определяемым интеграцией, как двойная сумма загрузки HC и загрузки LC. Здесь загрузка LC была рассчитана из общая суммы результатов интеграции для всех пиков LC, взвешенных по количеству токсофора, разделенных на общую сумму простых взвешенных результатов интеграции всех пиков LC, и загрузки HC из общей суммы результатов интеграции для всех взвешенных по токсофору пиков HC, поделенной на общую сумму простых взвешенных результатов интеграции для всех пиков HC.
В открытых конструкциях соотношение площади молекулярной массы закрытого и открытого аддукта цистеина (молекулярная масса дельта 18 Дальтон) для всех однократно конъюгированных вариантов легкой и тяжелой цепей было определено для определения доли открытого аддукта цистеина. Среднее значение по всем вариантам дает долю открытого аддукта цистеина.
B-7. Оценка связывания антигена с ADC
Способность связывания связующего вещества с целевой молекулой проверяли после связывания. Для этой цели в данной области техники известны различные способы, например, проверяется сродство конъюгата по методике ELISA или проводится анализ поверхностного плазмонного резонанса (измерения BIAcore™). Специалист в данной области может измерить концентрацию конъюгата, используя стандартный способ, например, для конъюгатов антител. (смотрите также Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21:778-784 und Polson et al., Blood 2007; 1102:616-623).
Рабочие примеры метаболитов
Пример M1
N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-глутаминовая кислота
Промежуточное соединение C110D посредством гидратирования в течение 1 часа над 10%-ым палладием на активированном угле в этаноле при нормальном давлении водорода при комнатной температуре превращали в указанное в названии соединение.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.78 мин; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+.
ADC, приведенные в качестве примера ниже, могут высвобождать предпочтительный метаболит M1, который обладает предпочтительными фармакологическими свойствами.
Рабочие примеры ADC
ADC, показанные в структурных формах согласно настоящему изобретению, которые связаны через остатки малеимида с боковыми цепями цистеина антител, преимущественно присутствуют в формах с открытым или закрытом кольцом, в зависимости от линкера и реакции связывания. В небольшой степени, однако, другая форма может быть включена в препарат.
Реакции связывания проводили в атмосфере аргона добавили. Все большие партии для in vivo тестов были стерильно отфильтрованы в конце получения.
Пример 1
Примерная методика A:
5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS (c=10 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 0.029 мг TCEP in 0.05 мл PBS буфера. Смесь перемешивали 30min при комнатной температуре и затем добавили 0.26 мг (0.00023 ммоль) промежуточного соединения Q1, растворенного в 50 мкл DMSO. После перемешивания в течение еще 90 мин при комнатной температуре смесь разбавили PBS буфером, который был доведен до pH 8, до объема 2.5 мл, затем нанесли на уравновешенную PBS буфером, pH 8, колонку PD (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером pH 8. Элюат перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона всю ночь. Затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования и повторно разбавили PBS буфером (pH 7.2).
Примерная методика B:
30 мг рассматриваемого антитела в 3 мл PBS (c=10 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 0.172 мг TCEP в 0.3 мл PBS буфера. Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем добавили 1.57 мг (0.0014 ммоль) промежуточного соединения Q1, растворенного в 300 мкл DMSO. После перемешивания в течение еще 90 мин при комнатной температуре смесь разбавили PBS буфером, который был доведен до pH 8, до объема 5 мл и затем пропустили через уравновешенную PBS буфером с pH 8 колонку PD 10 (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером pH 8. Элюат разбавили PBS буфером, pH 8, до объема 7.5 мл, и перемешивали всю ночь при комнатной температуре в атмосфере аргона. Этот раствор затем нанесли на уравновешенную PBS-буфером, pH7.2, колонку PD 10 (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером, pH7.2. Затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, повторно разбавили с помощью PBS буфера (pH 7.2) и повторно концентрировали и снова стерильно отфильтровали.
Следующие ADC получили аналогично этим методикам и охарактеризовали, как указано в Таблице:
Пример 2
Примерная методика A:
К 5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 5 экв (0.2 мг) промежуточного соединения Q2, растворенного в 50мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 2.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, и повторно разбавили PBS (pH7.2).
Примерная методика B:
К 30 мг рассматриваемого антитела в 3 мл PBS буфера (pH7.2) (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 4 экв (1 мг) промежуточного соединения Q2, растворенного в 50мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, повторно разбавили с помощью PBS (pH7.2) и повторно концентрировали и снова стерильно отфильтровали.
Примерная методика C:
К 50 мг рассматриваемого антитела в 5 мл PBS буфера (pH7.2) (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 2.5 экв (1 мг) промежуточного соединения Q2, растворенного в 250 мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 7.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, повторно разбавили с помощью PBS (pH7.2) и повторно концентрировали и снова стерильно отфильтровали.
Примерная методика D:
К 1000 мг рассматриваемого антитела in 150 мл PBS буфера (pH7.2) (c = 6.7 мг/мл)
в атмосфере аргона добавили 4.5 экв (36 мг) промежуточного соединения Q2, растворенного в 7.5мл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь очистили посредством фильтрации с перекрестным потоком, повторно концентрировали и стерильно отфильтровали.
Пример 3
Примерная методика A:
К 5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 5 экв (0.2 мг) промежуточного соединения Q3, растворенного в 50мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 2.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, и повторно разбавили PBS (pH7.2).
Примерная методика B:
К 30 мг рассматриваемого антитела in 3 мл PBS буфера (pH7.2) (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 4 экв (1 мг) промежуточного соединения Q3, растворенного в 50 мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 2.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, повторно разбавили с помощью PBS (pH7.2) и повторно концентрировали и снова стерильно отфильтровали.
Пример 4
Примерная методика A:
5 мг рассматриваемого антитела в 0.4 мл PBS буфера (pH 7.2) (c=12.5 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 0.029 мг TCEP в 0.05 мл PBS буфера. Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем добавили 0.275 мг (0.00023 ммоль) промежуточного соединения Q4, растворенного в 50 мкл DMSO. После перемешивания в течение еще 90 мин при комнатной температуре реакционную смесь разбавили с помощью PBS буфера до общего объема 2.5 мл. Этот раствор затем нанесли на уравновешенную PBS-буфером (pH 7.2) PD 10-колонку (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером (pH 7.2). Затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования и повторно разбавили PBS буфером (pH 7.2).
Пример 5
Примерная методика A:
К 5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 5 экв (0.2 мг) промежуточного соединения Q5, растворенного в 50мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 2.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, и повторно разбавили PBS (pH7.2).
Пример 6
Примерная методика A:
К 5 мг рассматриваемого антитела в 0.4 мл PBS (c = 12.5 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 5 экв (0.18 мг) промежуточного соединения Q6, растворенного в 50 мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 2.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, и повторно разбавили PBS (pH7.2).
Пример 7
Примерная методика A:
5 мг рассматриваемого антитела в 0.4 мл PBS (c=12.5 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 0.029 мг TCEP в 0.05 мл PBS буфера. Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем добавили 0.24 мг (0.00023 ммоль) промежуточного соединения Q7, растворенного в 50 мкл DMSO. После перемешивания в течение еще 90 мин при комнатной температуре смесь разбавили PBS буфером, который был доведен до pH 8, до объема 2.5 мл и затем пропустили через уравновешенную PBS буфером с pH 8 колонку PD 10 (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером pH 8. Элюат перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона всю ночь. Затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования и повторно разбавили PBS буфером (pH 7.2).
Пример 8
Примерная методика A:
К 5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 5 экв (0.2 мг) промежуточного соединения Q8, растворенного в 50мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 2.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, и повторно разбавили PBS (pH7.2).
Пример 9
Примерная методика A:
К 5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS (c = 10 мг/мл) в атмосфере аргона добавили 5 экв (0.2 мг) промежуточного соединения Q9, растворенного в 50мкл DMSO. После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре такое же количество добавили еще раз, и смесь перемешивал при комнатной температуре в течение еще одного часа. Затем смесь разбавили PBS буфером (pH7.2) до 2.5 мл, очистили на колонке Sephadex, и затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования, и повторно разбавили PBS (pH7.2).
Пример 10
Примерная методика A:
5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS буфера (pH 7.2) (c=10 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 0.029 мг TCEP в 0.05 мл PBS буфера. Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем добавили 0.295 мг (0.00023 ммоль) промежуточного соединения Q10, растворенного в 50 мкл DMSO. Через еще 20 ч перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь разбавили с помощью PBS буфера до общего объема 2.5 мл. Этот раствор затем нанесли на уравновешенную PBS-буфером (pH 7.2) PD 10-колонку (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером (pH 7.2). Затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования и повторно разбавили PBS буфером (pH 7.2).
Примерная методика C для получения более высокого DAR:
5 мг рассматриваемого антитела в 0.5 мл PBS буфера (pH 7.2) (c=10 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 0.057 мг TCEP в 0.05 мл PBS буфера. Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем добавили 0.59 мг (0.00053 ммоль) промежуточного соединения Q10, растворенного в 50 мкл DMSO. Через еще 20 ч перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь разбавили с помощью PBS буфера до общего объема 2.5 мл. Этот раствор затем нанесли на уравновешенную PBS-буфером (pH 7.2) PD 10-колонку (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером (pH 7.2). Затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования и повторно разбавили PBS буфером (pH 7.2).
Пример 11
Примерная методика A:
5 мг рассматриваемого антитела в 0.4 мл PBS буфера (pH 7.2) (c=12.5 мг/мл) в атмосфере аргона смешали с раствором 0.029 мг TCEP в 0.05 мл PBS буфера. Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем добавили 0.32 мг (0.00023 ммоль) промежуточного соединения Q11, растворенного в 50 мкл DMSO. Через еще 20 ч перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь разбавили с помощью PBS буфера до общего объема 2.5 мл. Этот раствор затем нанесли на уравновешенную PBS-буфером (pH 7.2) PD 10-колонку (SephadexÒ G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером (pH 7.2). Затем концентрировали посредством ультрацентрифугирования и повторно разбавили PBS буфером (pH 7.2).
В целях сравнения получили следующие ADC:
Ссылочный пример R1:
Такие ADC перечислены в WO 2015/096982 и в WO 2016/096610 с различными антителами, включая, например, цетуксимаб и трастузумаб. В целях сравнения, предшественник промежуточное соединение F194, раскрытое в настоящей заявке, далее также реагировало с TPP-6013 (анти-CD123 AK). Следующие ADC применяли в целях сравнения:
Ссылочный пример R2:
Такие ADC перечислены в WO 2016/096610 с агликозилированным анти-TWEAKR антителом. Для сравнения, предшественник промежуточное соединение F291, раскрытое в настоящей заявке, также дополнительно реагировало с TPP-9574 (анти-CXCR5 AK), TPP-981 (анти-EGFR) и TPP-1015 (анти-HER2 AK). Следующие ADC применяли для сравнительных целей:
Для ссылочного примера R1 в WO 2015/096982 раскрывается пример метаболита 98, происходящего из него. Для ссылочного примера R2 в WO 2016/096610 раскрывается пример идентичного метаболита M9, который перечислен здесь в качестве ссылочного примера R3M.
Ссылочный пример R3M:
N-(3-Аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид
Получение раскрыто в WO 2015/096982 в качестве примера 98.
Биологические данные для этих ссылочных соединений, раскрытых в указанных заявках, или полученные для новых ссылочных соединений, описаны в главе С.
C: Оценка биологической активности
Биологическая активность соединений согласно настоящему изобретению может быть продемонстрирована с помощью анализов, описанных ниже:
C-1a Определение цитотоксического эффекта ADC
Анализ цитотоксического эффекта ADC проводили с различными клеточными линиями:
NCI-H292: клетки мукоэпидермоидной карциномы легких человека, ATCC-CRL-1848, Стандартная среда: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стабильный глютамин) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-положительные; EGFR-положительные.
BxPC3: раковые клетки поджелудочной железы человека, ATCC-CRL-1687, Стандартная среда: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стабильный глютамин) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-положительные
LoVo: человеческие колоректальные раковые клетки, ATCC No. CCL-229, культивирование для MTT-анализа: Стандартная среда: Kaighn's + L-Глютамин (Invitrogen 21127) + 10% инактивированная теплом FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064). Культивирование для CTG-анализа: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стабильный глютамин) + 10% FCS (Sigma #F2442). TWEAKR-положительные.
KPL4: клеточная линия рака молочной железы человека, Bayer Pharma AG (идентичность проверена и подтверждена на 19.7.2012 рот DSMZ), Стандартная среда: RPMI 1640 (Fa. Gibco; #21875- 059, стабильный L-Глютамин) + 10% инактивированная теплом FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); HER2-положительные.
SK-HEP-1: клеточная линия рака печени человека, ATCC No. HTB-52, Стандартная среда: MEM с солями Эрла + Glutamax I (Invitrogen 41090) + 10% инактивированная теплом FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); EGFR-положительные, TWEAKR- положительные
MOLM-13: клетки острой моноцитарной лейкемии человека (AML-M5a), DSMZ, No. ACC 554, Стандартная среда: RPMI 1640 (Fa. Gibco; #21875- 059, стабильный L-Глютамин) + 20% инактивированная теплом FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); CD123-положительные.
MV-4-11: бифенотипические миеломоноцитарные лейкозные клетки человека, полученные из периферической крови, ATCC-CRL-9591, Стандартная среда: IMDM (ATCC: 30-2005), + 10% инактивированная теплом FCS (Gibco, No. 10500-064); CD123-положительные.
NB4: клетки острого промиелоцитарного лейкоза человека, полученные из костного мозга, DSMZ, No. ACC 207, Стандартная среда: RPMI 1640 + GlutaMAX I (Invitrogen 61870) + 10% инактивированная теплом FCS (Gibco, No. 10500-064) + 2.5 г глюкозы (20% раствор глюкозы, Gibco, No.19002) + 10 мМ Hepes (Invitrogen 15630) + 1 мМ пируват натрия (Invitrogen 11360); CD123-отрицательные
Rec-1: человеческие клетки лимфомы клеток мантии (-клеточная неходжкинская лимфома) ATCC CRL-3004, Стандартная среда: RPMI 1640 + GlutaMAX I (Invitrogen 61870) + 10% инактивированная теплом FCS (Gibco, No. 10500-064) + 10 мМ) CXCR5-положительные
U251: клетки глиобластомы человека, Стандартная среда: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стабильный глютамин) + 10% FCS (Biochrom; #S0415);B7H3-положительные
HBL-1: человеческие клетки B-клеточной лимфомы (Диффузная крупная B- клеточная лимфома) ATT CRL- RRID (Resource Identification Initiative): CVCL_4213, впервые описаны в Abe et al. Cancer 61:483-490(1988), получены из Prof. Lenz, Universität Münster; Стандартная среда: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стабильный глютамин) + 10% FCS (Biochrom; #S0415), культивирование аналогично клеткам Rec-1; CXCR5 положительные
Культивирование клеток проводят в соответствии со стандартным способом, как указано Американской коллекцией тканевых культур (ATCC) или Институтом Лейбница DSMZ-Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DSMZ) для соответствующих клеточных линий.
CTG-анализ
Тест осуществили путем отделения клеток с помощью раствора трипсина (0.05%) и EDTA (0.02%) в PBS (Biochrom AG #L2143), осаждения, ресуспендирования клеточной среды, подсчета и высеивания на 96-луночный культуральный планшет с белым дном (Costar #3610) (при 75 мкл/лунка, со следующим числом клеток на лунку: NCI-H292: 2500 клеток/лунка, BxPC3 2500 клеток/лунка, LoVo 3000 клеток/лунка) и инкубировали в инкубаторе при 37°C и 5% диоксида углерода. Клетки суспензии подсчитывали и высевали в 96-луночный планшет для культивирования с белым планшетом (Costar # 3610) (при 75 мкл/лунка, подсчет клеток на лунку: Rec-1: 3000 клеток/лунка, HBL-1: 6000 клеток/лунка). Через 24 ч добавили конъюгаты антитело-активное вещество в 25 мкл культуральной среды при концентрации от 3 × 10-7M до 3 × 10-13M к клеткам (трипликаты) и инкубировали в инкубаторе при 37°C и 5% диоксида углерода. Клетки затем инкубировали при 37°C и 5% диоксида углерода. На параллельном планшете активность клеток в начале обработки активным соединением (день 0) определили, применяя Cell Titer Glow (CTG) люминесцентный анализ жизнеспособности клеток (Promega #G7573 и #G7571). В конце, на порцию клеток добавили 100 мкл субстрата, планшеты затем накрыли алюминиевой фольгой, встряхнули на планшетном шейкере при 180 оборотах в минуту в течение 2 минут, затем оставили на лабораторном столе на 8 минут и затем измерили, применяя люменометр (Victor X2, Perkin Elmer). В субстрате обнаружили ATP содержание живых клеток, генерирующих люминесцентный сигнал, люминесцентность которых пропорциональна жизнеспособности клеток. Через 72 ч инкубации с конъюгатами антитело-активное вещество, жизнеспособность этих клеток также определили, применяя люминесцентный анализ жизнеспособности клеток Cell Titer Glow, как описано выше. На основе измеренных данных вычислили IC50 ингибирования роста по сравнению на день 0, применяя анализ электронных таблиц DRC (кривая доза-ответ) по 4 параметрам. Анализ электронных таблиц DRC представляет собой электронные таблицы био- книги, разработанные Bayer Pharma AG и Bayer Business Services на платформе IDBS E-WorkBook Suite (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK).
MTT-анализ
Культивирование клеток осуществляли стандартным методом, причем среда для выращивания обозначена как C-1. Для проведения испытания клетки отделяли с помощью раствора Accutase в PBS (Biochrom AG # L2143), осаждали, ресуспендировали в культуральной среде, подсчитывали и высевали в 96-луночный белый планшет для культивирования (Costar # 3610) (NCI H292): 2500 клеток/лунка; SK-HEP-1: 1000 клеток/лунка; KPL-4: 1200 клеток/лунка; в общем объеме 100 мкл). Затем клетки инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% углекислом газе. Через 48 ч замена среды была выполнено. Затем конъюгаты с активным веществом пипетировали в клетки (трижды) в 10 мл культуральной среды при концентрациях 10-5M - 10-13M, и затем инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% диоксида углерода. Клетки суспензии подсчитывали и высевали в 96-луночный планшет для культивирования с белым планшетом (Costar # 3610) (# 3610) (MOLM-13: 2000 клеток/лунка, NB4: 7000 клеток/лунка, MV-4-11: 5000 клетки/лунка общим объемом 100 мкл). После инкубации в инкубаторе при 37°С и 5% диоксиде углерода в течение 6 часов среду поменяли, и конъюгаты антитело-активное вещество или метаболиты добавили посредством пипетки в 10 мл культуральной среды при концентрациях 10-5M - 10-13M в клетки (трижды) в 90 мл. Инкубацию партии в инкубаторе проводили при 37°С и 5% диоксиде углерода. Через 96 часов пролиферацию клеток определяли с использованием анализа MTT (ATCC, Manassas, Virginia, № по каталогу 30-1010K). Для этого реагент МТТ инкубировали с клетками в течение 4 часов, после чего в течение ночи происходил лизис клеток путем добавления детергента. Обнаружение образовавшегося красителя происходило при 570 нм (Infinite M1000 pro, Fa. Tecan). По измеренным данным вычисляли IC50 ингибирования роста с использованием DRC (кривая обратной дозы). Пролиферация клеток без тестируемого вещества, но которые были иным образом идентично обработана, определяется как 100%-ное значение.
В Таблицах 1a и 1b ниже приведены значения IC50 для соответствующих рабочих примеров из этих анализов:
В Таблице 1c приводятся значения IC50 пример ссылочных примеров из этих анализов.
Приведенные данные по активности относятся к варианту осуществления, описанному в настоящей экспериментальной части, с указанными соотношениями активное вещество/mAB. Значения могут отличаться для других соотношений активное вещество/mAB. Значения IC50 представляют собой средние значения для нескольких независимых экспериментов или представляют собой отдельные значения. Эффект конъюгатов антитела и активного вещества был селективным по сравнению с соответствующим контролем изотипа, содержащим соответствующий линкер и токсофор. В AD12, нацеленных на CD123, специфичность в отношении мишени была дополнительно продемонстрирована путем тестирования на CD123-отрицательной клетке.
В общем ADC согласно настоящему изобретению проявляют значительно улучшенную цитотоксическую эффективность про сравнению с соответствующими ссылочными примерами.
C-1b Определение ингибирования кинезинового белка веретена KSP/ Eg5 посредством выбранных примеров
Моторный домен кинезинового белка веретена человека KSP/Eg5 (Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc, No. 027EG01-XL) инкубировали при концентрации 10 нМ с микротрубочками (бычьи или свиные, Fa. tebu-bio/Cytoskeleton Inc), стабилизированными 50 мкг/мл токсола (Sigma № T7191-5MG) в течение 5 мин при комнатной температуре в 15 мМ PIPES, pH 6,8 (5 мМ MgCl2 и 10 мМ DTT от Sigma). Свеже-приготовленную смесь аликвотировали в 384 МТР (от Corning). За этим последовало добавление исследуемых ингибиторов при концентрации от 1,0 × 10-6 М до 1,0 × 10-13 М и АТФ (конечная концентрация 500 мкМ, Sigma). Инкубация проходила в течение 2 ч при комнатной температуре. Активность АТФазы детектировали путем обнаружения образующегося в результате неорганического фосфата с малахитовым зеленым (от Biomol). После добавления реагента проводилась 50- минутная инкубация при комнатной температуре до обнаружения поглощения при длине волны 620 нм. В качестве полистирольных контролей использовали Monastrol (Sigma, M8515-1 мг) и Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience A10486). Отдельные данные кривой доза-ответ представляют восьмикратные определения. Значения IC50 представляют собой средние значения на двух независимых экспериментов. Образец, не обработанный ингибиторами, служил в качестве 100% контроля.
В Таблице 2 перечислены значения IC50 для соответствующих рабочих примеров из описанного примеры и приведены соответствующие данные по цитотоксичности (MTT-анализ):
Приведенные данные по активности относятся к рабочим примерам, описанным в экспериментальной части в настоящей заявке.
C-1c Ферментативные анализы
a: Анализ на основе катепсина B
Для каждого тестируемого пролекарства, расщепляемого катепсином В, анализ проводили в сосуде для микрореакции (0,5 мл, Eppendorf). Используемый здесь фермент был получен из ткани печени человека. 2 мкг катепсина В (Sigma C8571 25 мкг) первоначально загружали и заполняли 50 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6,0, 2 мМ DTT до общего объема 200 мл. Затем 50 мкл исследуемого раствора субстрата добавляли пипеткой. Партию инкубировали в термоблоке (Thermo Fisher Scientific) при 40°С с постоянным встряхиванием при 300 об/мин. Ферментативную реакцию контролировали кинетически. Для этого брали образец объемом 10 мкл в разные моменты времени. Отобранный образец немедленно добавляли в 20 мкл ледяного метанола для остановки ферментативной реакции и затем замораживали при -20°С. Выбранные моменты времени для отбора проб были через 10 минут, 2 часа, 4 часа и 24 часа. Образцы анализировали методом ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая ВЭЖХ, Agilent Technologies 1200 Series). Определение высвобожденного токсофора позволило определить период полувыведения t1/2 ферментативной реакции.
b: Анализ на основе легумаина
Анализ на основе легумаина проводили с рекомбинантным человеческим ферментом. Раствор фермента rhLegumain (№ по каталогу 2199-CY, R & D Systems) разбавляли до желаемой концентрации в 50 мМ Na-ацетатном буфере/100 мМ NaCl, рН 4,0 и предварительно инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем rhLegumain доводили до конечной концентрации 1 нг/мл в 50 мМ буфере MES, 250 мМ NaCl, рН 5,0. Для каждого тестируемого расщепляемого легумаином пролекарства проводили анализ в сосуде для микрореакции (0,5 мл, Eppendorf). Для этого раствор субстрата с 50 мМ MES-буфером, 250 мМ NaCl, рН 5,0 доводили до желаемой концентрации (2-кратная концентрация). Для кинетического измерения ферментативной реакции первоначально вводили 250 мкл раствора легумаина и начинали ферментную реакцию, добавляя 250 мкл раствора субстрата (конечная концентрация, простая концентрация, 3 мкл). В разное время отбирали 50 мкл каждого образца. В этот образец сразу добавляли 100 мкл ледяного метанола для остановки ферментативной реакции, а затем замораживали при -20°С. Выбранные моменты времени для отбора проб были через 0,5 часа, 1 час, 3 часа и 24 часа. Затем образцы анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ-анализа и ЖХ-МС-анализа. Определение высвобожденного токсофора позволило определить период полувыведения t1/2 ферментативной реакции.
В качестве репрезентативных примеров, показывающих опосредованное легумаином расщепление, модельные соединения A и B были приготовлены в качестве субстратов в анализе на основе легумаина.
Ссылочный пример модельное соединение A
N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-(метиламино)-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид
Сначала трифторуксусной кислоты--(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-метилбутанамид получили, как описано в WO 2015096982 A1. Затем промежуточное соединение применяли для получения указанного в названии соединения путем сочетания с промежуточным соединением L103 в DMF в присутствии HATU и N,N-Диизопропилэтиламина.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.86 мин; MS (ESIpos): m/z = 902 [M+H]+.
Ссылочный пример модельное соединение B
N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-N-метил-L-аланил-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2- диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-(метиламино)-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид
Сначала трифторуксусной кислоты (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-метилбутанамид получили, как описано в WO 2015096982 A1. Затем промежуточное соединение применяли для получения указанного в названии соединения путем сочетания с промежуточным соединением L118 в DMF в присутствии HATU и N,N-Диизопропилэтиламина.
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.83 мин; MS (ESIpos): m/z = 916 [M+H]+.
Модельное соединение A расщеплялось при условиях, описанных выше для легумаина, с получением целевого соединения с периодом полувыведения 0.4 ч.
Модельное соединение B расщеплялось при условиях, описанных выше для легумаина, с получением целевого соединения с периодом полувыведения 0.5 ч.
C-2 Анализ интернализации
краситель
белка
280
краситель
краситель
Интернализация является ключевым процессом для обеспечения специфической и эффективной доставки цитотоксической полезной загрузки в антиген-экспрессирующие раковые клетки с помощью конъюгатов антитело-активное вещество (ADC). Этот процесс сопровождается флуоресцентным мечением специфических антител и контролем над изотипом. Для этой цели сначала проводили конъюгирование флуоресцентного красителя с лизинами антитела. Конъюгирование проводили с двойным 10-кратным молярным избытком сложного моноэфира NHS CypHer 5E (партия 357392, GE Healthcare) при рН 8,3. После того как связывание имело место, реакционную смесь очищали гель-хроматографией (обессоливающие колонки Zeba, 40K, Thermo Scientific, № 87768, элюирующий буфер: PUL DULBECCO, Sima-Aldrich, № D8537) для удаления избытка красителя и установления рН. Концентрирование белкового раствора осуществляли с помощью колонок VIVASPIN 500 (Sartorius stedim biotec). Загрузка красителя антитела была определена с помощью спектрофотометрического анализа (NanoDrop) с последующим расчетом (D/P = A ε : (A-0,16A)ε).
Загрузка красителем исследуемых в настоящей заявке антител и изотипического контроля была сходной по величине. В анализах связывания клеток было проверено, что связывание не приводит к изменению аффинности антител.
Меченые анититела использовали в анализах интернализации. Перед началом обработки клетки (2×104/лунка) высевали в 100 мкл среды на 96-луночном МТР (жирный, черный, прозрачное дно № 4308776, от Applied Biosystems). После 18 ч инкубации при 37°C/5% CO2 среду меняли и добавляли меченные антитела в различных концентрациях (10, 5, 2,5, 1, 0,1 мкг/мл). Та же схема обработки была проведена с меченым изотопическим контролем (отрицательный контроль). Выбранное время инкубации составляло 0 ч, 0,25 ч, 0,5 ч, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 3 ч, 6 ч и 24 ч. Измерение флуоресценции проводили с помощью InCellAnalyzer 1000 (GE Healthcare). Кинетическую оценку осуществляли путем измерения параметров количества гранул на клетку и общей интенсивности гранул на клетку.
Антитела были проверены на способность к интернализации после связывания с рецептором. Для этой цели были выбраны клетки с различными уровнями экспрессии рецептора. Опосредованная мишенью специфическая интернализация может наблюдаться с антителами, тогда как изотипический контроль не показал интернализации.
C-2b Анализ интернализации с суспендированными клетками
Связывание флуоресцентного красителя осуществляли, как описано в разделе C2. Тестируемое антитело экспрессируется гемопоэтическими суспензионными клетками, поэтому интернализацию изучали в анализе интернализации на основе FACS.
Клетки с различными уровнями экспрессии мишени исследовали - клетки (5×104/лунку) высевали в 96-луночный MTP (Greiner bio-one, CELLSTAR, 650 180, U-bottom) с общим объемом 100 мкл. После добавления мишень-специфического антитела при конечной концентрации 10 мкг/мл смеси инкубировали при 37°С в течение разных периодов времени (1 ч, 2 ч, 6 ч, трижды). Изотипический контроль обрабатывали в идентичных условиях. Параллельную обрабатывали и инкубировали непрерывно при 4°С (отрицательный контроль). Анализ FACS проводили с использованием проточного цитометра Guava (Millipore). Кинетическую оценку проводили путем измерения интенсивности флуоресценции, и оценку проводили с использованием программного обеспечения guavaSoft 2.6 (Millipore). Для мишеней и специфических для мишений антител, описанного здесь, значительная и специфическая интернализация может быть обнаружена в разных клетках. Изотипические контроли не показали никакой интернализации.
C-2c Анализы соинтернализации анти-CD123 антител
Благодаря линкеру получают активный метаболит конъюгата антитела-активного вещества посредством лизосомальной деградации. Соответственно, внутриклеточный трафик необходим после интернализации. Исследования совместной локализации антитела с маркерами, специфичными для лизосомальной органеллы (например, поверхностные молекулы или малые GTPазы), позволяют выделить антитела с желаемым профилем. Для этой цели мишень-положительные клетки (5×104/лунку) высевали при общем объеме 100 мкл на 96-луночный MTP (Greiner bio-one, CELLSTAR, 650 180, U-bottom). После добавления CypHer5E-меченного анти-мишень антитела (конечная концентрация 20 мкг/мл) партии (дубликаты на момент времени) инкубировали при 37°C в течение 30 минут, 2 часа и 6 часов в инкубаторе (5% CO2). За 30 минут до окончания выбранного инкубационного периода к исследуемым партиям добавляли специфичный для лизосомы маркер. Лизосомы окрашивали индикаторным реагентом CytoPainter LysoGreen (конечная концентрация 1:2000; abcam, ab 176826). После инкубации 200 мкл ледяного буфера FACS (PBS DULBECCO, Sigma-Aldrich, № D8537 + 3% FBS инактивированной теплом FBS, Gibco, № 10500-064) добавили, и суспензию клеток центрифугировали при 400 g, 4°С в течение 5 минут. Осадок клеток ресуспендировали в 300 мкл ледяного буфера FACS и повторно центрифугировали (4 мин, 400 × g при 4°C). После центрифугирования супернатант отбрасывали, и осадок клеток помещали в 30 мкл ледяного буфера FACS. Затем образцы подвергали немедленному анализу FACS/изображение (FlowSight amnis, Millipore). Совместная локализация была оценена с помощью специального программного обеспечения (программное обеспечение совместной локализации IDEAS Application v6.1). В таблице 3 приведены результаты этого анализа в качестве примера для анти-CD123 антитела.
Гуманизированные антитела TPP-9476 и TPP-8987 показывают заметно улучшенный профиль по сравнению с родительским мышиным антителом.
C-3 In vitro тесты для определения клеточной проницаемости
Клеточная проницаемость вещества может быть оценена посредством in vitro тестирования с проточном анализе с применением Caco-2 клеток [M.D. Troutman and D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. С этой целью клетки культивировали в течение 15-16 дней на 24-луночных фильтровальных планшетах. Для определения проницаемости соответствующие рабочие примеры нанесли в HEPES буфере на клетки, либо апикально (A), либо базально (B), и инкубировали в течение двух часов. Через 0 часов и через 2 часа, образцы взяли из цис и транс компартаментов. Образцы отделили посредством ВЭЖХ (Agilent 1200, B6blingen, Germany), применяя обращено-фазные колонки. ВЭЖХ систему совместили посредством Turbo Ion Spray Interface с масс-спектрометром с тремя квадрупольными линзами API 4000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Germany). Проницаемость оценивали по значению Papp, которое получали, применяя формулу, опубликованную Schwab et al. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Вещество оценивали как активно транспортирующее, когда отношение Papp (B-A) к Papp (A-B) (эффлюксное отношение) было >2 или <0.5.
Критически важным для токсофоров, которые высвобождаются внутриклеточно, является проницаемость B через A [Papp (B-A)] и отношение Papp (B-A) к Papp (A-B) (эффлюксное отношение): процессы вещества через монослой Caco-2 клеток, так что вещество дольше задерживается в клетке после внутриклеточного высвобождения. Это внутриклеточное удержание метаболита увеличивает вероятность взаимодействия с биохимической мишенью (здесь: кинезиновый белок веретен, KSP/Eg5), что приводит к улучшению цитотоксического эффекта.
Следующая таблица 4 показывает данные о проницаемости примерных рабочих примеров из этого анализа:
Метаболит M1, который может быть образован из конъюгата связующего и активного вещества согласно настоящему изобретению демонстрирует как значительно сниженный транспорт из клетки, так и пониженный коэффициент эффлюкса по сравнению с эталонным метаболитом R3M, который может образовываться из конъюгатов связующего и активного вещества согласно ссылочному примеру.
C-4 In vitro тесты для определения субстратных свойств для P-гликопротеина (P-gp)
Многие опухолевые клетки экспресссируют транспортные белки для лекарственных средств, и, таким образом, часто способствуют развитию резистентности в отношении цитостатиков. Вещества, которые не являются субстратами для таких транспортных белков, такие как P-гликопротеин (P-gp) или BCRP, например, могли бы поэтому проявлять улучшенный профиль активности.
Субстратные свойства вещества для P-gp (ABCB 1) определяли посредством проточного анализа с LLC-PK1 клетками, которые сверхэкспрессируют P-gp (L-MDR1 клетки) [A.H. Schinkel et al., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. С этой целью LLC-PK1 клетки или L MDR1 клетки культивировали на 96-луночных фильтровальных планшетах в течение 3-4 дней. Для определения проницаемости соответствующие тестовые вещества, сами по себе или в присутствии ингибитора (такого как инвермектин или верапамил, например), примеры нанесли в HEPES буфере на клетки, либо апикально (A), либо базально (B), и инкубировали в течение двух часов. Через 0 часов и через 2 часа, образцы взяли из цис и транс компартаментов. Образцы отделили посредством ВЭЖХ, применяя обращено-фазные колонки. ВЭЖХ систему совместили посредством Turbo Ion Spray Interface с масс-спектрометром с тремя квадрупольными линзами API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Germany). Проницаемость оценивали по значению Papp, которое получали, применяя формулу, опубликованную Schwab et al. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Вещество оценивали как P=gp субстрат, когда эффлюксное отношение Papp (B-A) к Papp (A-B) было >2.
В качестве следующего критерия для оценки P-gp субстратных свойств, эффлюксное отношение в L-MDR1 и LLC-PK1 клетках или эффлюксное отношение в присутствии или отсутствии ингибитора могут сравниваться. Если эти значения различаются на фактор более 2, рассматриваемое вещество является P-gp субстратом.
C-5 Фармакокинетика
После i.v. введения 5 мг/кг примеров 2c-9476 (DAR 6.3) и примера 2c-9476 (DAR 3.4) самцам крыс Wistar концентрации в плазме ADC измеряли посредством ELISA, фармакокинетические параметры, такие как очистка (CL), площадь под кривой (AUC) и время полувыведения (t1/2) вычисляли.
В Таблице 5 приведены фармакокинетические параметры для Примеров 2c-9476 с DAR 6.3 и DAR 3.4.
В этом ориентирующем исследовании РК на крысах для обоих примеров типичный профиль IgG наблюдался после i.v. введения. Не было никаких существенных различий между примером 2c-9476 с DAR 6.3 и с DAR 3.4.
Количественный анализ применяемых ADC
Часть антитела в ADC определяли, определяли посредством анализа связывания лиганда (ELISA) в виде общей концентрации IgG в образцах плазмы и лизатах опухоли. Согласно настоящему изобретению применялся сэндвич-формат ELISA. Такой анализ был оценен и утвержден для определения в плазме и образцах опухоли. Пластины ELISA покрывали анти-человеческий IgG козлиными Fc антителами. После инкубации с образцом, пластины промывали и инкубировали с детекторным конъюгатом обезьяньего анти-человеческого IgG(H+L) антитела и пероксидазы хрена (HRP). После следующей стадии промывки, субстрат HRP добавили к OPD, и развитие цвета контролировали посредством поглощения при 490 нм. Стандартные образцы, имеющие известную концентрацию IgG, нанесли, применяя уравнение с 4 параметрами. В предел нижнего (LLOQ) и верхнего (ULOQ) количественных пределов, неизвестные концентрации определили посредством интерполяции.
C5a: Идентификация метаболитов ADC после интернализации in vitro
Описание способа:
Исследования интернализации с иммуноконъюгатами проводят для анализа внутриклеточных метаболитов. Клетки опухоли легкого человека NCI H292 (3X105/лунка) высевают в 6-луночные планшеты и инкубируют в течение ночи (37°С, 5% CO2). Клетки обрабатывали 10 мкг/мл (66 нМ) ADC для тестирования. Интернализацию проводили при 37°С и 5% CO2. В разное время (0, 4, 24, 48, 72 ч) отбирались образцы клеток для дальнейшего анализа. Сначала собирали супернатанты (около 5 мл) и после центрифугирования (2 мин, комнатная температура, 1000 об/мин, Heraeus Variofuge 3.0R) хранили при -80°C. Клетки промывали PBS, отделяли аккутазой и определяли количество клеток. После повторной промывки определенное количество клеток (2×105) обработали с 100 мл лизисного буфера (набор для лизиса млекопитающих клеток (Sigma MCL1) и инкубировали при непрерывном встряхивании (Thermomixer, 15 мин, 4°С, 650 об/мин) в пробирках с белком LoBind (eppendorf Cat.No. 0030 108.116). После инкубации лизат центрифугировали (10 мин, 4°С, 12000 g, eppendorf 5415R), и супернатант собирали. Собранный супернатант хранили при -80°С. Затем все образцы анализировали следующим образом.
Для обработки 50 мкл супернатанта культуры/клеточного лизата, 150 мкл реагента осаждения (метанола) добавляли, и смесь встряхивали в течение 10 секунд. Осаждающий реагент имеет внутренний стандарт (ISTD) в подходящей концентрации (в общем в интервале 20-100 мкг/мл). После центрифугирования при 1881 g в течение 10 минут супернатант переносили в ампулу с помощью пробоотборника, заполняли 300 мкл буфера, соответствующего подвижной фазе, снова встряхивали и центрифугировали при 1881 g в течение 10 минут.
Наконец, измерение образцов клеточного лизата и супернатанта проводят на тройном квадрупольном масс-спектрометре API6500 Kopromia AB SCIEX Deutschland GmbH в сочетании с ВЭЖХ.
Для калибровки пустой лизат или пустой супернатант смешивали с подходящими концентрациями (0,1-1000 мкг/л). Предел обнаружения (LLOQ) составляет примерно 0,2 мкг/л.
Контроли качества для проверки включали 4 и 40 мкг/л.
C5b: Идентификация ADC метаболитов in vivo
После i.v. введения 3-30 мг/кг различных ADC концентрации ADC, а также любых встречающихся метаболитов в опухоли и плазме могут быть измерены, и фармакокинетические параметры, такие как очищение (CL), площадь под кривой (AUC) и время полувыведения (t1/2) могут быть вычислены.
Количественный анализ потенциальных метаболитов
Измерение соединений в плазме, опухоли, печени и почках проводят после осаждения белков обычно метанолом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии(ВЭЖХ), связанной с тройным квадрупольным масс- спектрометром (МС).
Для обработки 50 мкл плазмы их смешивают с 150 мкл осаждающего реагента (обычно метанола) и встряхивают в течение 10 с. Реагент для осаждения содержит внутренний стандарт (ISTD) в подходящей концентрации (обычно в диапазоне 20-100 мкг/л). После центрифугирования при 1881 g в течение 10 минут супернатант переносят во флакон с помощью пробоотборника, заполняют 300 мл буфера, соответствующего подвижной фазе, и снова встряхивают.
При обработке материала опухоли или органа к соответствующему материалу добавляют в 3-20 раз большее количество экстракционного буфера. Буфер для экстракции содержит 50 мл реагента для экстракции тканевого белка (Pierce, Rockford, IL), два гранулы полного коктейля с ингибитором протеазы (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) и фенилметилсульфонилфторид (Sigma, St. Louis, MO) при конечной концентрации 1 мМ. В зависимости от типа ткани (твердая: опухоль, мягкая: печень, почка) выбирается лизис и программа гомогенизации Prescellys 24 и система гомогенизации (Bertin Technologies) (www.prescellys.com). Гомогенизированные образцы оставляют на ночь при 4°С. 50 мкл гомогената переносят в ампулу с помощью пробоотборника и наполняют 150 мкл метанола, включая ISTD, встряхивают в течение 10 с и оставляют на 5 мин. После добавления 300 мкл аммоний-ацетатного буфера (pH 6,8) и кратковременного встряхивания образец центрифугируют при 1881 g в течение 10 минут.
Для калибровки добавляются образцы плазмы и соответствующий образцам ткани контрольный матрикс с концентрацией 0,6-1000 мкг/л. Предел обнаружения (LOQ) составляет от 1 до 20 мкг/л в зависимости от типа пробы или типа ткани.
Наконец, измерение образцов плазмы и матрицы проводят на тройном квадрупольном масс-спектрометре API4500 в сочетании м ВЭЖХ, от Kopanie AB SCIEX Deutschland GmbH.
Контроли качества для проверки тестирования включали 4, 40 и 400 мкг/л.
В таблице 6 показаны концентрации метаболитов на мышиной модели ксенотрансплантата MOLM-13, измеренные в опухоли, печени, почках и плазме через 24 часа после применения 5 мг/кг ADC примеров 2c-9476 (n = 3). Измеренным метаболитом был: метаболит М1. n.c. = не вычислено; LOQ: предел количественного определения.
Введение примеров ADC 2c-9476 согласно настоящему изобретению, имеющих легумаин-расщепляемый линкер привело к заметно селективному обогащению активным соединением целевой ткани (опухоли) по сравнению с другими здоровыми органами/тканями.
C-6 Тест на активность in vivo
Активность конъюгатов согласно настоящему изобретению протестировали, например, применяя ксенотрансплантатные модели. Специалиста в данной области техники известны способы из уровня техники, которые позволяют протестировать активность соединений согласно настоящему изобретению (смотрите, например, WO 2005/081711; Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358-64). С этой целью, опухолевую клеточную линию, экспрессирующую целевую молекулу связующего инокулировали грызуну (например, мыши). Конъюгат согласно настоящему изобретению, изотипический контрольный конъюгат, контрольное антитело или изотипический соляной раствор вводили животным инокулированием. Введение осуществляли один или более раз. После инкубации в течение нескольких дней, размер опухоли определяли путем сравнения конъюгат-обработанных животных и контрольной группы. Конъюгат-обработанные животные показали меньший размер опухоли.
C-6a. Ингибирование роста / регрессия экспериментальных опухолей у мышей
Человеческие опухолевые клетки, экспрессирующие антиген для конъюгата антитело-активное вещество инокулировали подкожно в бок иммунодепрессивным мышам, например NMRi голые мыши или SCID мыши. 1-10 миллионов клеток отделили от клеточной культуры, центрифугировали и ресуспендировали в среде или среде / матригеле. Клеточную суспензию инъецировали подкожно мышам.
В течение нескольких дней опухоль росла. Обработку начали, когда опухоль достигла размера опухоли около 40 мм2. Чтобы исследовать эффект на большие опухоли, обработку можно начать только при размере опухоли 50-100 мм2.
Обработку с APDC и ADC осуществляли внутривенным путем (i.v.) в хвостовую вену мыши. Вводили в объеме 5 мл/кг.
Режим лечения зависит от фармакокинетики антитела. В соответствии с настоящим значением конъюгаты стандартно вводят один раз в неделю в течение 2 или
3 недель. Для быстрой оценки, может применяться протокол с однократной обработкой. Однако обработка может также быть продолжена, или второй цикл дней трехкратной обработки может быть позднее проведен.
Стандартным образом, 8 животных применялось в группе обработки. В дополнение к группам, которым активные вещества вводились, одну группу обрабатывали в качестве контрольной группы только буфером, согласно такому же протоколу.
В ходе эксперимента, площадь опухоли регулярно измеряли по двум размерам (длина / ширина), применяя циркуль. Площадь опухоли определяли как длину, умноженную на ширину. Отношение средней площади опухоли обработанной группы к средней площади опухоли контрольной группы обозначается как площадь T/C.
Когда после завершения эксперимента все группы эксперимента умерщвляются в одно и тоже время, опухоли могут быть удалены и взвешены. Отношение средних масс обработанной группы к средним массам контрольной группы обозначается как масса T/C.
C-6b. Эффективность ADC согласно настоящему изобретению на различных моделях опухоли
2
Опухолевые клетки (например, NCI-H292, REC-1, MOLM-13 und MV-4-11) подкожно инокулируют в бок самки NMRI-голых мышей (Janvier). При размере опухоли ~ 40 мм требуется внутривенное лечение конъюгатом антитело-активное вещество. После лечения может проводить контроль роста опухоли, если требуется.
Лечение с ADC согласно настоящему изобретению приводит к значительному, а иногда и длительному ингибированию роста опухолей по сравнению с контрольной группой и конъюгированным изотипическим контрольным антителом. В таблице 7 приведены значения T/C, определенные по площади опухоли на соответствующий день окончания эксперимента, рассчитанные после начала лечения.
--->
Перечень последовательностей
<110> Bayer Pharma Aktiengesellschaft
<120> КОНЪЮГАТЫ СВЯЗУЮЩЕГО И АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (ADC), ИМЕЮЩИЕ
ФЕРМЕНТАТИВНО РАСЩЕПЛЯЕМЫЕ ГРУППЫ
<130> BHC 16 1 067
<160> 116
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 1
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1                5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20                 25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                   40                 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50                   55                 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 2
Asn Tyr Gly Val His
1                5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 3
Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser
1               5                    10                 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 4
Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr
1                5                  10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 5
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                    10                 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                   55                 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                   75                 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85                 90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His
1                5                  10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 7
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1                5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 8
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
1                5
<210> 9
<211> 449
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 9
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1                5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20                 25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                   40                 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50                  55                 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65                  70                   75                 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 10
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1                5                   10                 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20                  25                 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                   55                 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85                   90                 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                   55                 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 12
Asp Thr Tyr Ile His
1                         5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 13
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                    10                  15
Gly
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 14
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                    10
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                    10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20                  25                 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                   55                 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85                   90                 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1               5                    10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 17
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1                5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 18
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1               5
<210> 19
<211> 450
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                   55                 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                    10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20                  25                 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                   55                 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85                   90                 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                    10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20                  25                 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35                  40                 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                   55                 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ser Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 22
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1                         5
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 23
Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1               5                    10                  15
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 24
Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser
1               5
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 25
Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1               5                    10                  15
Glu Lys Phe Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly
20                  25                 30
Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Met Pro Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                   90                 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 26
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                    10                  15
Ala
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 27
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 28
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr
1               5
<210> 29
<211> 446
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                    10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20                  25                 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35                  40                 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                   55                 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ser Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 30
<211> 220
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 30
Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1               5                    10                  15
Glu Lys Phe Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly
20                  25                 30
Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Met Pro Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                   90                 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20                  25                 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50                   55                 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                   90                 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 32
Asp Phe Ile Ile Ala
1                       5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 33
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1               5                    10                  15
Gly
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 34
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1               5                    10
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1               5                    10                  15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85                   90                 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 36
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1               5                    10                  15
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 37
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1                           5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 38
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1                5
<210> 39
<211> 449
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20                  25                 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50                   55                 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                   90                 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210> 40
<211> 219
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1               5                    10                  15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85                   90                 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                215
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20                  25                 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50                   55                 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                   90                 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 42
Asp Phe Ile Ile Ala
1                      5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 43
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1               5                    10                  15
Gly
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 44
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1               5                    10
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85                   90                 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 46
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1               5                    10                  15
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 47
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1                           5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 48
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1                           5
<210> 49
<211> 449
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20                  25                 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50                   55                 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                   90                 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85                   90                 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210> 51
<211> 117
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 51
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50                   55                 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ala Lys Leu Thr Gly Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 52
Ser Tyr Ala Met Ser
1                          5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 53
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                    10                  15
Gly
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 54
Leu Thr Gly Thr Ser Phe Asp Tyr
1                          5
<210> 55
<211> 109
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 55
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                    10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                   55                 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu
85                   90                 95
Lys Lys Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 56
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn
1               5                    10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 57
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1                           5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 58
Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Lys Lys Val
1               5                    10
<210> 59
<211> 446
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50                   55                 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ala Lys Leu Thr Gly Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 60
<211> 215
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 60
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                    10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                   55                 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu
85                  90                  95
Lys Lys Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100                 105                 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115                 120                 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130                 135                 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165                 170                 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180                 185                 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195                 200                 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210> 61
<211> 120
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                   55                 60
Lys Gly Gln Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 62
Asp Tyr Tyr Met Lys
1                          5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 63
Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                    10                  15
Gly
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 64
Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr
1               5                    10
<210> 65
<211> 113
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 65
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                    10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20                  25                 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                   90                 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 66
Glu Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                    10                  15
Thr
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 67
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1                         5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 68
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1                5
<210> 69
<211> 449
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                   55                 60
Lys Gly Gln Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210> 70
<211> 220
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 70
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                    10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20                  25                 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                   90                 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210> 71
<211> 118
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20                  25                 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35                  40                 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                   55                 60
Lys Asn Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                   90                 95
Cys Ala Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 72
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1                         5
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 73
Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1               5                    10                  15
Gly
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 74
Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser
1                          5
<210> 75
<211> 113
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 75
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly
20                  25                 30
Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                   90                 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 76
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                    10                  15
Ala
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 77
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1                         5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 78
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr
1                          5
<210> 79
<211> 447
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 79
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20                  25                 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35                  40                 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                   55                 60
Lys Asn Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                   90                 95
Cys Ala Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 80
<211> 220
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Gly
20                  25                 30
Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                   90                 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210> 81
<211> 120
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                   55                 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 82
Asp Tyr Tyr Met Lys
1                          5
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 83
Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                    10                  15
Gly
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 84
Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210> 85
<211> 113
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 85
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                    10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20                  25                 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                   90                 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 86
Glu Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                    10                  15
Thr
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 87
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1                         5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 88
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1                           5
<210> 89
<211> 449
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                    10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                   55                 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                   90                 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210> 90
<211> 220
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 90
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                    10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20                  25                 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                   55                 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                   90                 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210> 91
<211> 113
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser
20                  25                 30
Gly Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys
50                   55                 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                   90                 95
Arg Ser Glu Ala Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 92
Thr Ser Gly Met His
1                          5
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 93
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly
1               5                    10                  15
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 94
Ser Glu Ala Ala Phe
1                5
<210> 95
<211> 112
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 95
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg
20                  25                 30
Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85                   90                 95
Leu Glu Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 96
Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn
1               5                    10                  15
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 97
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1                5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 98
Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro Pro Thr
1                5
<210> 99
<211> 442
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser
20                  25                 30
Gly Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys
50                   55                 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                   90                 95
Arg Ser Glu Ala Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115                 120                 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130                 135                 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165                 170                 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180                 185                 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195                 200                 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225                 230                 235                 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260                 265                 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275                 280                 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290                 295                 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305                 310                 315                 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325                 330                 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
340                 345                 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355                 360                 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370                 375                 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385                 390                 395                 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405                 410                 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420                 425                 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440
<210> 100
<211> 219
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 100
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg
20                  25                 30
Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85                   90                 95
Leu Glu Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210> 101
<211> 113
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser
20                  25                 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys
50                   55                 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                   90                 95
Arg Ser Glu Ala Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 102
Thr Ser Gly Met His
1                5
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 103
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly
1               5                    10                  15
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 104
Ser Glu Ala Ala Phe
1                5
<210> 105
<211> 112
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 105
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg
20                  25                 30
Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85                   90                 95
Leu Glu Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 106
Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn
1               5                    10                  15
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 107
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1                5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 108
Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro Pro Thr
1               5
<210> 109
<211> 442
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                    10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser
20                  25                 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys
50                   55                 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                   90                 95
Arg Ser Glu Ala Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115                 120                 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130                 135                 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165                 170                 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180                 185                 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195                 200                 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225                 230                 235                 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260                 265                 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275                 280                 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290                 295                 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305                 310                 315                 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325                 330                 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
340                 345                 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355                 360                 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370                 375                 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385                 390                 395                 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405                 410                 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420                 425                 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440
<210> 110
<211> 219
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность антитела
<400> 110
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                    10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg
20                  25                 30
Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                   55                 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85                   90                 95
Leu Glu Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210> 111
<211> 378
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu
1               5                    10                  15
Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met
20                  25                 30
Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr
35                  40                 45
Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn
50                   55                 60
Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe
85                   90                 95
Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys
100                 105                 110
Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro
115                 120                 125
Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn
130                 135                 140
Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly
145                 150                 155                 160
Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly
165                 170                 175
Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly
180                 185                 190
Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu
195                 200                 205
Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met
210                 215                 220
His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu
225                 230                 235                 240
Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp
245                 250                 255
Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile
260                 265                 270
Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro
275                 280                 285
Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp
290                 295                 300
Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys
305                 310                 315                 320
Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro
325                 330                 335
Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp
340                 345                 350
Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu
355                 360                 365
Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr
370                 375
<210> 112
<211> 372
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp
1               5                    10                  15
Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu
20                  25                 30
Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser
35                  40                 45
Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu
50                   55                 60
Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg
65                  70                  75                  80
Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala
85                   90                 95
Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser
100                 105                 110
Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu
115                 120                 125
His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala
130                 135                 140
Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His
145                 150                 155                 160
Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val
165                 170                 175
Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln
180                 185                 190
Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn
195                 200                 205
Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val
210                 215                 220
Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly
225                 230                 235                 240
Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys
245                 250                 255
Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp
260                 265                 270
Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys
275                 280                 285
Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val Ala Ile
290                 295                 300
Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met
305                 310                 315                 320
Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu
325                 330                 335
Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe
340                 345                 350
Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser
355                 360                 365
Leu Thr Thr Phe
370
<210> 113
<211> 534
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1               5                    10                  15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20                  25                 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35                  40                 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50                   55                 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65                  70                  75                  80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85                   90                 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100                 105                 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115                 120                 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130                 135                 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165                 170                 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180                 185                 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195                 200                 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210                 215                 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225                 230                 235                 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245                 250                 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260                 265                 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275                 280                 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290                 295                 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305                 310                 315                 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325                 330                 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340                 345                 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355                 360                 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370                 375                 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385                 390                 395                 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405                 410                 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420                 425                 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435                 440                 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450                 455                 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465                 470                 475                 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485                 490                 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500                 505                 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515                 520                 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala
530
<210> 114
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly
1               5                    10                  15
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly
20                  25                 30
Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys
35                  40                 45
Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys
50                   55                 60
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro
65                  70                  75                  80
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser
85                   90                 95
Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr
100                 105                 110
Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile
115                 120                 125
Gln
<210> 115
<211> 1255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1               5                    10                  15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20                  25                 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35                  40                 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50                   55                 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65                  70                  75                  80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85                   90                 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100                 105                 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115                 120                 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130                 135                 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145                 150                 155                 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165                 170                 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180                 185                 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195                 200                 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210                 215                 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225                 230                 235                 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245                 250                 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260                 265                 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275                 280                 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290                 295                 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305                 310                 315                 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325                 330                 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340                 345                 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355                 360                 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370                 375                 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385                 390                 395                 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405                 410                 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420                 425                 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435                 440                 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450                 455                 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465                 470                 475                 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485                 490                 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500                 505                 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515                 520                 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530                 535                 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545                 550                 555                 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565                 570                 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580                 585                 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595                 600                 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610                 615                620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625                 630                 635                 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645                 650                 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660                 665                 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675                 680                 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690                 695                 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705                 710                 715                 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725                 730                 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740                 745                 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755                 760                 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770                 775                 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785                 790                 795                 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805                 810                 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820                 825                 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835                 840                 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850                 855                 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865                 870                 875                 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885                 890                 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900                 905                 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915                 920                 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930                935                 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945                950                  955                 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965                 970                 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
970                 975                 980
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu   Asp Ser Thr Phe Tyr   Arg Ser Leu
995                1000                  1005
Leu Glu   Asp Asp Asp Met Gly   Asp Leu Val Asp Ala   Glu Glu Tyr
1010                  1015                 1020
Leu Val   Pro Gln Gln Gly Phe   Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro   Gly
1025                 1030                   1035
Ala Gly   Gly Met Val His His Arg His   Arg Ser Ser   Ser Thr Arg
1040                  1045                 1050
Ser Gly   Gly Gly Asp Leu Thr   Leu Gly Leu Glu Pro   Ser Glu Glu
1055                  1060                  1065
Glu Ala   Pro Arg Ser Pro Leu   Ala Pro Ser Glu Gly   Ala Gly Ser
1070                  1075                  1080
Asp Val   Phe Asp Gly Asp Leu   Gly Met Gly Ala Ala   Lys Gly Leu
1085                  1090                  1095
Gln Ser   Leu Pro Thr His Asp   Pro Ser Pro Leu Gln   Arg Tyr Ser
1100                  1105                  1110
Glu Asp   Pro Thr Val Pro Leu   Pro Ser Glu Thr Asp   Gly Tyr Val
1115                  1120                  1125
Ala Pro   Leu Thr Cys Ser Pro   Gln Pro Glu Tyr Val   Asn Gln Pro
1130                  1135                  1140
Asp Val   Arg Pro Gln Pro Pro   Ser Pro Arg Glu Gly   Pro Leu Pro
1145                  1150                  1155
Ala Ala   Arg Pro Ala Gly Ala   Thr Leu Glu Arg Pro   Lys Thr Leu
1160                   1165                  1170
Ser Pro   Gly Lys Asn Gly Val   Val Lys Asp Val Phe   Ala Phe Gly
1175                   1180                  1185
Gly Ala   Val Glu Asn Pro Glu   Tyr Leu Thr Pro Gln   Gly Gly Ala
1190                   1195                  1200
Ala Pro   Gln Pro His Pro Pro   Pro Ala Phe Ser Pro   Ala Phe Asp
1205                   1210                  1215
Asn Leu   Tyr Tyr Trp Asp Gln   Asp Pro Pro Glu Arg  Gly Ala Pro
1220                  1225                  1230
Pro Ser  Thr Phe Lys Gly Thr   Pro Thr Ala Glu Asn   Pro Glu Tyr
1235                  1240                  1245
Leu Gly   Leu Asp Val Pro Val
1250                 1255
<210> 116
<211> 1210
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1               5                    10                  15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20                  25                 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35                  40                 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50                   55                 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85                   90                 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100                 105                 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115                 120                 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130                 135                 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165                 170                 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180                 185                 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195                 200                 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210                 215                 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225                 230                 235                 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245                 250                 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260                 265                 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275                 280                 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290                 295                 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325                 330                 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340                 345                 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355                 360                 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370                 375                 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385                 390                 395                 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405                 410                 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420                 425                 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435                 440                 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450                 455                 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465                 470                 475                 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485                 490                 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500                 505                 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515                 520                 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530                 535                 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545                 550                 555                 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565                 570                 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580                 585                 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595                 600                 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610                 615                 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625                 630                 635                 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645                 650                 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660                 665                 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675                 680                 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690                 695                 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705                 710                 715                 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725                 730                 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740                 745                 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755                 760                 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770                 775                 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785                 790                 795                 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805                 810                 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820                 825                 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835                 840                 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850                 855                 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865                 870                 875                 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885                 890                 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900                 905                 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915                 920                 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930                 935                 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945                 950                 955                 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965                 970                 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980                 985                 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995                 1000               1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe
1010                1015                1020
Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu
1025                1030               1035
Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn
1040                1045               1050
Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg
1055                1060               1065
Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp
1070                1075               1080
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro
1085                1090               1095
Lys Arg   Pro Ala Gly Ser Val   Gln Asn Pro Val Tyr   His Asn Gln
1100                 1105                  1110
Pro Leu   Asn Pro Ala Pro Ser   Arg Asp Pro His Tyr   Gln Asp Pro
1115                  1120                 1125
His Ser   Thr Ala Val Gly Asn   Pro Glu Tyr Leu Asn   Thr Val Gln
1130                  1135                 1140
Pro Thr    Cys Val Asn Ser Thr   Phe Asp Ser Pro Ala    His Trp Ala
1145                  1150                  1155
Gln Lys   Gly Ser His Gln Ile   Ser Leu Asp Asn Pro   Asp Tyr Gln
1160                  1165                 1170
Gln Asp   Phe Phe Pro Lys Glu   Ala Lys Pro Asn Gly   Ile Phe Lys
1175                  1180                 1185
Gly Ser   Thr Ala Glu Asn Ala   Glu Tyr Leu Arg Val   Ala Pro Gln
1190                  1195                 1200
Ser Ser   Glu Phe Ile Gly Ala
1205                  1210
<---