Влияние аллелей KitW-V и KitW-Y мутации dominant spotting на продолжительность стадий дробления и жизнеспособность ранних эмбрионов мышей

iL_____________

ГЕНЕТИКА

БИОМЕДИЦИНА • № 6 2007, с. 126-135

Влияние аллелей KitW-V и KitW-Y мутации dominant spotting на продолжительность стадий дробления и жизнеспособность ранних эмбрионов мышей

Н.Ю.Сахарова, 11А.М.Малашенко21 Е.Ф.Вихлянцева1, Ю.А.Ковалицкая3

1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Моск. обл.,

2 Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

3 Филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино, Моск. обл.

Исследовано влияние аллелей мутаций dominant spotting Kitw-v и Kitw-y на раннее развитие мышей. Эмбрионов получали от спаривания гетерозиготных животных между собой (Kitw-v/+ х Kitw-v/+) и (Kitw-y/+ х Kitw-y/+) и в результате реципрокного спаривания с мышами дикого типа C57BL/6 (+/+). На второй день после оплодотворения собирали эмбриональный материал из яйцеводов и анализировали соотношение эмбрионов и неразви-вающихся яйцеклеток. У мышей Kitw-v значительное количество неразвивающихся яйцеклеток было найдено только при спаривании Kitw-v/+ х Kitw-v. У мышей Kitw-y высокую частоту неразвивающихся яйцеклеток наблюдали при любом типе спаривания. Кроме того, мы установили, что эмбрионы полученные от гетерозиготных животных были не только на стадии двух бластомеров (как в контроле +/+), но также на более поздних стадиях 4-8 бластомеров. Мы показали, что развитие 2-х клеточных эмбрионов in vitro, полученных от спаривания Kitw-v/+ и Kitw-v/+ с мышами +/+ не отличается от развития +/+ эмбрионов, но эмбрионы от спариваний Kitw-v/+ х Kitw-v и Kitw-y/+ х Kitw-y/+ большей частью погибают на стадии бластоцисты.

Ключевые слова: мыши, эмбриогенез, мутации гена Kit dominant spotting.

Оптимальный выбор адекватной биомодели является краеугольным камнем современной биомедицины [4]. В этом отношении мыши, несущие определенные мутации, являются незаменимой биомоделью для выяснения механизмов патологии, вызванной аналогичными мутациями у человека. Одна из таких мутаций широко известна как феномен «пегости». У человека она характеризуется врожденным светлым локоном или белым пятном на лбу и депигментацией кожи на животе, руках и ногах. Изучение молекулярных основ этого явления выявило мутацию в К1Т-гене, расположенном в хромосоме 4 [27]. Она нарушает строение и функцию тирозинкиназного рецептора, встроенного в клеточную мембрану [6]. У мышей существует мутация со сходной фенотипической картиной —

Dominant Spotting (W). Её определяет изменение в c-kit-гене, расположенного в хромосоме 5 [8, 27]. Эта мутация является уникальной моделью для изучения механизмов тирозинкиназной сигнализации, так как известны лиганд этой системы — фактор дифференцировки стволовых клеток (SCF) и мутации гена, кодирующего этот лиганд [13, 26]. Локус W, в котором расположен единичный структурный ген — c-kit протоонкоген [7], характеризуется тем, что в нем с необычайно высокой частотой происходят доминантные мутации [3]. Первая мутация в этом локусе была обнаружена в 1908г [23], а в настоящее время известно более 70 мутантных аллелей. Большинство мутаций серии W легальны в гомозиготном состоянии и жизнеспособны в гетерозиготном. У гетерозиготных животных на шерсти появ-

ляются белые пятна и ослабляется пигментация окрашенных участков. Эти аллели интенсивно изучаются, так как помимо влияния на окраску шерсти вызывают нарушения эритропоэза и гаметогенеза [23]. Они оказывают сходное влияние на окраску шерсти, но при этом могут не влиять на эритропоэз или на гаметогенез. Нарушения дифференцировок в различных клеточных линиях, подверженных действию этих аллелей, не зависят друг от друга и не являются результатом единичного физиологического повреждения во время развития [23].

Важное внимание обращено на роль мутаций е-кй-гена в функционировании репродуктивной системы [11]. В настоящее время на мышах наиболее интенсивно изучается роль е-кй рецепторной тиро-зинкиназы в сперматогенезе [12,18]. Известно, что е-кй рецепторы находятся в постакросомальной области сперматозоидов [19]. В отношение оогенеза было показано, что в ооцитах, начиная со стадии малого роста и до стадии зрелого фолликула, идет накопление е-кй транскриптов. Можно предположить, что они играют важную роль в созревании [9,15]. Рецепторные тирозинкиназы активны при оплодотворении и запускают многоступенчатый механизм реакции активации, начало которой соответствует моменту взаимодействия яйцеклетки и сперматозоида [10]. Показано, что в активации яйцеклетки играет роль усеченная форма е-кй киназы, которая экспрессируется во время спермиогенеза [20].

Представляет большой интерес выяснение проявления этого гена в раннем эмбриогенезе, так как в этот период на жизнеспособность ранних доимплантацион-ных зародышей большое влияние оказывают ростовые факторы, действующие через рецепторы тирозинкиназного типа [21, 10], к которым и относятся е-кй мембранные рецепторы. В отношение раннего эмбриогенеза известно, что экспрессия е-кй-

гена у зародышей мышей выявляется на стадии 8 бластомеров [9]. Хотя специфический фактор роста SCF не был обнаружен на ранних стадиях развития, возможно, что c-kit рецепторы клеток ранних зародышей связываются с другим фактором роста — PAF (Plateled activaing factor), который синтезируется в этот период [25]. Информация о роли с-kit лигандной системы может быть получена при наблюдении за развитием мутантных зародышей. В связи с этим мы исследовали развитие ранних зародышей, полученных от гетерозиготных мышей линий C57BL/6-KitW-V/+ и C57BL/6-KitW-Y/+, несущих аллель KitW-V или KitW-Y и сравнивали его с развитием зародышей мышей C57BL/6, несущими нормальный (дикий) c-kit ген.

Материалы и методы

Для получения эмбрионального материала были использованы гетерозиготные мыши KitW-V и KitW-Y, и мыши C57BL/6 (+/+) в возрасте 8 — 10 недель. Аллель Kit W-V — dominant spotting viable — одна из самых известных мутаций этой серии. Некоторые гомозиготы KitW-V выживают и вырастают черноглазыми белыми мышами. Молодые мыши плодовиты, но с возрастом становятся бесплодными. [23]. Аллель KitW-Y — dominant spotting Yurlovo [3, 14] была получена в 1962 г. в питомнике «Столбовая» и сохраняется в НЦБМТ РАМН. Гомозиготы KitW-Y всегда погибают сразу после рождения. Обе мутации поддерживаются в гетерозиготном состоянии на генотипе C57BL/6 [2].

Самцов и самок в отношении 1:3 ссаживали в вечерние часы

самок забивали путем цервикальной дислокации. Эмбриональный материал получали при промывании яйцеводов. Всего было получено 999 яйцеклеток от мутантных мышей и 425 яйцеклеток от мышей +/+(контроль).

Было проведено 2 серии опытов. В 1-й серии сравнивали состояние in vivo яйцеклеток и зародышей, полученных от мышей KitW-V/+, KitW-Y/+ и +/+ на 2-й день после оплодотворения; во 2 серии — влияние этих аллелей на развитие 2-клеточных эмбрионов в течение 72 часов in vitro в модифицированной среде Виттена [1]. В 1-й серии подсчитывали соотношение нераз-вивающихся и развивающихся яйцеклеток, полученных при промывании яйцеводов, при скрещивании гетерозиготных мышей между собой, реципрокном скрещивании гетерозиготных мышей с мышами +/+ и мышей +/+ между собой. К не-развивающимся относили неоплодотво-ренные, разрушенные, фрагментирован-

ные яйцеклетки, а также зиготы. Во 2-й серии были использованы 2-клеточные зародыши, полученные от скрещивания мутантных мышей между собой и от скрещивания самок +/+ с гетерозиготными самцами. Контролем служило развитие зародышей, полученных от мышей +/+.

Достоверность результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты

1 серия

Результаты, полученные на 2 день после оплодотворения и представленные в табл. 1, показывают, что при реципрокном скрещивании мышей KitW-V/+ с мышами +/+, т.е. в группах (KitW-V/+ x +/+) и (+/+ x KitW-V/+), количество неразвивающихся яйцеклеток сопоставимо с соответствующим показателем в контрольной группе (21,5%; 28,0% и 26,8%, соответственно).

Таблица 1

Состав эмбрионального материала, полученного при промывании яйцеводов самок на 2-й день беременности при различных вариантах скрещивания мышей, несущих аллель Кй^ или Кії^'

Вариант скрещивания Общее количество яйцеклеток и эмбрионов Неразвивающиеся яйцеклетки

число %

KitW-V/+ х KitW-V/+ 332 143* 43,1

KitW-V / + х +/+ 135 29 21,5

+/+ х KitW-V /+ 100 28 28,0

KitW-Y/+ х KitW-Y/+ 212 109* 51,4

KitW-Y/+ х +/+ 54 28* 51,9

+/+ х KitW-Y/+ 166 99* 59,6

+/+ х +/+ 425 114 26,8

* - достоверное различие по отношению к контролю, p<0,001

Однако, при скрещивании гетерозиготных мышей между собой (К11^7+ х К1^7+) доля неразвивающихся яйцеклеток (43,1%) достоверно выше контрольных показателей (р<0,001). В контрольной группе (+/+ х +/+) число неразвива-ющихся яйцеклеток не превышает показателей доимплантационной гибели эмбрионов мышей С57В1/6, приведенных в литературе [3].

У мышей, несущих аллель КИ^У+, значительное количество неразвиваю-щихся яйцеклеток было обнаружено при всех вариантах скрещивания. Независимо от того, кто был носителем мутации, доля неразвивающихся яйцеклеток была одинакова во всех группах: (КИ^У+ х КИ^-7+), (К1^7+ х +/+), (+/+ х К1^7+) - и составляла 51,4%, 51,8% и 59,6%, соответственно. Эти показатели достоверно выше количества неразвивающихся яйцеклеток в контрольной группе (р<0,001).

Анализ эмбрионов, полученных из яйцеводов (рис.1), показал, что на 2-й день беременности на время получения эмбрионального материала (13-14 ч) все эмбрионы в контрольной группе (+/+ х +/+) находились на стадии 2 бластомеров.

Рис. 1. Стадии развития эмбрионов, полученных из яйцеводов самок на 2-й день беременности. Варианты скрещивания: 1 - +/+, 2 -

Это полностью соответствует временным параметрам развития мышей, согласно которым первое деление зиготы происходит через 36 часов после оплодотворения, а следующее деление бластомеров — через 12 часов [5]. При всех вариантах скрещивания мутантных мышей Kit W-V/+ и KitW-Y/+ помимо 2-клеточных были обнаружены эмбрионы, находящиеся на стадиях 4-8 бластомеров. Режим подсадки самок к самцам и проверки результатов спаривания строго соблюдался. Даже учитывая неизбежную временную гетерогенность зародышей вследствие того, что самки могли быть оплодотворены в разное время после подсадки к самцам, разброс по времени не мог превышать 12 часов. Это позволяет думать, что наличие у мутантных мышей на 2-й день после спаривания зародышей на более поздних стадиях дробления скорее всего связано с бол ее быстрым прохождением этого периода развития. Как видно на рис. 1, доля зародышей на стадиях 4-8 бластомеров могла составлять от 7,5% до 42,3%.от общего количества зародышей.

2 серия

а) влияние аллеля KitW-V на развитие эмбрионов мыши in vitro

Было использовано 73 эмбриона, полученных от скрещивания между собой мышей KitW-V/+ (группа KitW-V/+ х KitW-V/+). Через 24 часа культивирования стадии 4 бластомеров достигло 91,8% эмбрионов. Через 48 часов развитие продолжили 72,3% от начального количества зародышей, большая часть которых находились на стадии начала компактизации, т.е. ранней мо-рулы, и некоторые — на стадии 8 бластомеров. Через 72 часа на стадии многоклеточной морулы были 30,1% эмбрионов, а на конечной стадии доимплантационного развития — стадии бластоцисты — 28,9% зародышей. Некоторые зародыши на стадии морулы и особенно бластоцисты имели

100:

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

I I 2-х клеточные зародыши

4-8-ми клеточные зародыши * - достоверное различие по отношению к контролю, р<0,001

82 1 87,5 72,5 * 78'6

92,5

27,

17,9

I

12,5

61,5

22,

Ї

7,5

Ц

1 2 3 4 5 6 7

Вариант скрещивания

Таблица 2

Развитие in vitro 2-х клеточных эмбрионов, полученных при различных вариантах скрещивания гетерозиготных мышей, несущих аллель KitW-V или KitW-Y

Вариант скрещи- вания кол-во эмбри- онов количество развивающихся эмбрионов на разных сроках культивирования

24 ч 48 ч 72 ч

стадия кол-во % стадия кол-во % кол-во бл-ст %

1 cерия

KitW-v+ х KitW-v+ 73 4 бл. 67 91,8 8 бл., ранние морулы 55 75,3 21 28,8*

+/+ х KitW-ї/+ 31 4 бл. 30 96,8 8 бл., ранние морулы 26 83,9 15 48,4

+/+ х +/+ 70 4 бл. 67 95,7 ранние морулы, 48 68,6 30 42,9

2 серия

KitW-Y/+ х KitW-Y/+ 90 4-8 бл. 78 86,7 8 бл, ранние морулы, бластоцисты 58 64,4 35 38,9V

+/+ х KitW-Y/+ 62 4-8 бл. 55 88,7 8 бл, ранние морулы, бластоцисты 42 67,7 38 61,3

+/+ х +/+ 67 4-8 бл. 64 95,5 ранние морулы 50 74,6 45 67,2

V результаты достоверны по отношению к контролю, р<0,001 * результаты достоверны по отношению к контролю, р<0,05 (контроль выделен жирным шрифтом) Обозначания: бл. - бластомер,бл-ст - бластоциста

уродливый вид — морулы состояли из клеток разной величины и были неполностью компактизованы, а у бластоцист трофоб-ласт состоял из крупных клеток, не было четкой дифференцировки внутренней клеточной массы, и нарушалось формирование единой полости бластоцисты (рис. 2а).

От скрещивания самок +/+ с самцами К^_у/+ (группа+/+ х Кк№у/+) был получен 31 зародыш. Через 24 часа культивирования 96,7% зародышей были на стадии

4 или 8 бластомеров, через 48 ч 88,6% от исходного количества зародышей достигли стадии 8 бластомеров или ранней мо-рулы. Через 72 часа стадии бластоцисты достигли 48,3% зародышей. В этом случае морфологических аномалий в развитии практически не было (рис. 2б).

Рис. 2. Влияние аллеля KitW-V на развитие эмбрионов мыши in vitro: а) KitW-V/+ х KitW-V/+; б) +/+ х KitW-V/+.

Масштаб 100 мкм.

В контрольной группе, состоящей из 70 зародышей, полученных от мышей +/+ (группа+/+ х +/+), через 24 ч. 95,7% эмбрионов были на стадии 4 бластомеров, через 48 часов развивающиеся зародыши (68,6%) имели вид компактных ранних морул, а через 72 часа стадии бластоцисты достигли 42,8% от начального количества зародышей.

При сравнении результатов, полученных в разных группах зародышей (табл. 2), видно, что наличие мутантного гена KitW-V у родителей не влияет на переход эмбрионов со стадии 2 бластомеров на стадию 4 бластомеров. Во всех группах большинство зародышей прошли одно деление. Стадии 8 бластомеров и ранней компактной морулы также достигает почти одинаковое число зародышей в подопытных и в контрольной группах. Однако в группе (KitW-V/+ х KitW-V/+) формируется значительно меньше бластоцист (28,9% по сравнению с 42,85% в контроле, p<0,001), в то время как в группе (+/+ х KitW-V/+) до стадии бластоцисты развилось 48,3% зародышей.

б) влияние аллеля KitW-Y на развитие зародышей мышей in vitro.

Результаты исследования влияния этой мутации на развитие ранних зародышей in vitro представлены в табл. 2. Было обнаружено, что через 24 ч. культивирования 2-клеточные зародыши полученные от скрещивания между собой мышей KitW-Y/+ (группа KitW-Y/+ х KitW-Y/+) или от одного гетерозиготного родителя (группа+/+ х KitW-Y/+), в основном, находились на стадии 4-8 бластомеров (86,5% и 88,7%), что близко к соответствующему показателю в контрольной группе (93,5%). Через 48 ч. в группе (KitW-Y/+ х KitW-Y/+) свое развитие продолжили 64,9%, в группе (+/+ х KitW-Y/+) — 67,3%, а в контрольной (+/+ х +/+) — 84,0% от исходного количества зародышей.

В обеих подопытных группах через 48 часов помимо зародышей на стадии

8 бластомеров и ранней морулы были обнаружены ранние бластоцисты, составившие 2,8% — 4,8% от общего числа зародышей. В это время контрольные зародыши находились на стадии ранней морулы. Через 72 часа в группе (KitW-Y/+ х KitW-Y/+) стадии бластоцисты достигли 38,9 % зародышей, а в группе (+/+ х KitW-Y/+) — 66,1%. В контрольной группе до стадии бластоцисты к этому времени развилось 67,2% зародышей. Различие между результатами в группе (KitW-Y/+ х KitW-Y/+) и в контроле достоверно (р<0,001).Эти результаты указывают на то, что способность развиваться до стадии бластоцисты значительно снижена только у зародышей, полученных от скрещивания мышей KitW-Y/+ между собой.

Анализ результатов этой серии показывает, что в условиях in vitro, у зародышей, которые получены от одного или обоих мутантных родителей, несущих аллель KitW-V или аллель KitW-Y, второе деление дробления происходит так же, как и у контрольных зародышей. Однако, в последний период доимплантационного развития у зародышей как группы (KitW-V/+ х KitW-V/+), так и группы (KitW-Y/+ х KitW-Y/+) выявлено резкое снижение способности формировать бластоцисты.

Обсуждение результатов

Проведенные нами исследования обнаружили отрицательное влияние аллелей Kit W-V и KitW-Y на доимплантационное развитие мышей. Наличие большого количества неразвивающихся яйцеклеток, обнаруженных на вторые сутки после оплодотворения (первая серия опытов), позволяет предположить, что гибель яйцеклеток может быть связана как с нарушениями в гаметогенезе у мутантных животных, так и с нарушениями в самом процессе оплодотворения. По-видимому, изменения,

вызванные аллелем КИ^ в гаметогенезе, могут быть скомпенсированы при оплодотворении гаметами дикого типа, так как в этих случаях количество неразвиваю-щихся яйцеклеток не превышает такового при скрещивании мышей, несущих дикий с-кИ ген. Высокая доля неразвивающихся яйцеклеток, полученных при скрещивании гетерозиготных животных КИ№-у/+ между собой, вероятно определяется нарушениями в самом процессе оплодотворения. Можно думать, что у гамет с измененными с-кИ рецепторными тирозинки-назами, ослабляется способность взаимодействовать между собой.

В случае аллеля большое количество неразвивающихся яйцеклеток, наблюдаемое при любых вариантах скрещивания гетерозиготных мышей, говорит о том, что этот аллель вызывает более сильные нарушения и в оогенезе, и в сперматогенезе, чем аллель КИ^у, и эти нарушения гораздо реже могут быть скомпенсированы при взаимодействии с гаметами дикого типа. То, что аллель КИ^ вызывает более сильные нарушения в оогенезе и сперматогенезе, проявляется и в том, что относительное количество неразвиваю-щихся яйцеклеток при реципрокных скрещиваниях мышей КИЙ'-У+ с мышами +/+ было значительно выше, чем при аналогичных скрещиваниях мышей КИ^у/+ (р<0,001).

Оба изученных аллеля, по-видимому, оказывают более сильное влияние на оогенез, чем на сперматогенез, так как по нашим наблюдениям самки Ю1^у/+ и КИЧГ"У+ при скрещивании их с самцами +/+ дают гораздо меньше потомства, чем самки +/+ при скрещивании их с самцами КИ№У/+ или КИ»У+.

Таким образом, наши результаты согласуются с данными о том, что продукты с-кИ гена важны для нормального протекания оогенеза, сперматогенеза и оплодотворения (Ног1е е! а1., 1991, Агсес е! а1.,

1992, Kissel et al., 2000), и изменения в строении рецепторных белков, вызванные мутациями KitW-V и KitW-Y ведут к значительным нарушениям вышеуказанных процессов. Известно, что у гетерозиготных животных, несущих мутации в c-kit гене, происходит взаимодействие между мутантными белками и белками дикого типа [13]. Высокий показатель гибели яйцеклеток гетерозиготных животных по-видимому отражает особенности взаимодействия мутантных белков KitW-V и KitW-Y с c-kit белком дикого типа. Можно думать что, как и в случае аллеля с-kit W42 (24), мутантные белки KitW-V и KitW-Y значительно уменьшают количество функциональных с-kit рецепторов на клеточной поверхности гамет.

Анализ эмбрионального материала, извлеченного из яйцеводов на 2-й день после оплодотворения, показал опережение развития эмбрионов, полученных от мутантных животных, по сравнению с контрольными эмбрионами. Можно предположить, что обнаруженная «возрастная» неоднородность эмбрионов, полученных от мутантных животных, связана с тем, что эти мутации как-то влияют на пролиферацию клеток.

Результаты наблюдения за развитием в условиях in vitro 2-клеточных эмбрионов (2-я серия опытов) показывают, что на ранних стадиях дробления жизнеспособность зародышей, полученных от гетерозиготных мышей KitW-V и KitW-Y, независимо от того, один или оба родителя несут мутантный ген, такая же, как и у зародышей +/+. Вероятно, присутствие мутантных рецепторов в клеточной мембране в это время не влияет на внутриклеточные процессы, определяющие возможность развития на начальных стадиях дробления, и не снижают их жизнеспособность. Однако, на поздних стадиях доимпланта-ционного периода мы наблюдали резкое уменьшение количества бластоцист в

группах зародышей, полученных от обоих гетерозиготных родителей. По видимому, в условиях in vitro на этой стадии гибнет часть зародышей, гомозиготных по мутантным аллелям. Известно, что на стадии морулы и образования бластоцисты уже экспрессируются собственные c-kit гены [9]. Образующиеся у гомозиготных зародышей аномальные c-kit рецепторы полностью нарушают функционирование c-kit киназной системы. Выживание гетерозиготных зародышей, по-видимому, связано с тем, что экспрессирующееся у них какое-то количество нормальных c-kit рецепторов достаточно для обеспечения их развития в условиях in vitro. Показано, что у гетерозиготных мышей KitW-V функциональные с-kit рецепторы сохраняются на клеточной поверхности, хотя и в уменьшенном количестве [16].

Результаты, полученные в опытах in vitro, подтверждают наше предположение

о том, что мутантные аллели KitW-V и KitW-Y оказывают влияние на протекание первых стадий дробления, возможно ускоряя деление зародышей.

Это позволяет предположить, что механизм отсчета времени в дробящемся зародыше может быть как-то связан с активностью c-kit гена. Одной из загадок раннего развития млекопитающих являются очень медленные асинхронные деления бластомеров, что не имеет аналогии с делениями дробления ни одного из типов многоклеточных. Такое необычное поведение клеток раннего зародыша послужило основанием для предположения, что замедленные деления, которые следуют сразу после оплодотворения, вовсе не являются эмбриональными, и скорее относятся к гаметогенезу [17]. Авторы этой гипотезы полагают, что замедленные события раннего эмбриогенеза млекопитающих вызваны эволюционным сдвигом времени оплодотворения. На основании наших данных можно предположить, что

механизм отсчета времени в дробящемся зародыше связан с функциональной активностью c-kit гена.

Таким образом полученные нами сведения показали, что экспрессия c-kit гена важна не только для оо- и сперматогенеза, но и для раннего эмбриогенеза. Можно думать, что c-kit рецепторы, встроенные в поверхностную мембрану зиготы и передаваемые при дроблении образующимся бластомерам, принимают участие в регуляции дробления. Нарушенная собственная экспрессия c-kit гена у гомозиготных зародышей KitW-V и KitW-Y приводит к снижению жизнеспособности и гибели значительной части зародышей на стадии бластоцисты.

Литература

1. Березовская О.П., Межевикина Л.М., Ве-принцев Б.Н. Метод культивирования ранних эмбрионов линейных мышей. // Онтогенез. Т.17. С.553-555. 1986.

2. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко А.М. и др. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. — М.: Наука. 190 с. 1983.

3. Бландова З.К., Вахрушева М.П., Малашенко А.М. и др. Пятнистые стерильные самцы — новая мутация Dominant Spotting в 5 хромосоме мыши. // Генетика. Т. 22. С.1025-32. 1986.

4. Каркищенко Н.Н. Концептуальное пространство и топологические структуры биомедицины. // Биомедицина. № 1, с.5-16, 2005.

5. Пратт Х. Эксперименты с предым-плантационными эмбрионами мышей. Биология развития млекопитающих. Методы. — М.: Мир. С. 27-64, 1990.

6. Fleischman R.A. Human piebald trait resulting from a dominant negative mutant allel of the c-kit membrane receptor gene. // J.Clin.Invest. V 89. P. 1713-1717. 1992.

7. Geissler E.N., McFarland E.C., Russel E.S. Analysis of pleiotropism at the dominant white-spotting (W) locus of the house mouse: a description of ten new W alleles. // Genetics. V.97. P.337-361. 1981.

8. 8.Geissler E.N., Ryan H.A., Housman D.E. The dominant White-spotting (W) locus of the mouse encoded the c-kit protooncogene. // Cell. V.55. P.185-192. 1988.

9. Horie K., Takahura K., Taii Sh., et al. The expression of c-kit protein during oogenesis and early embryonic development. // Biology of reprod. V. 45. P. 547-552. 1991.

10. Kinsey W.H., Schlesinger J. Tyrosine kinase signalling of fertilization. // J. BBRC. V.240. P.519-522. 1997.

11. Kissel H., Timochina I., Hardy M.P. et al. Point mutation in Kit receptor tyrosine kinase reveals essential roles for kit signalling in spermatogenesis and oogenesis without affecting other Kit responses. // EMBO J. V 12. P.1312-1326. 2000.

12. Koshimizu U., Watanabe D., Tajima Y. et al. Effects of W (c-kit) gene mutation on gametogenesis in male mice: agametic tubular segments in Wf/Wf testes. // Development. V. 114. P. 861-7. 1992.

13. Lev S., Bechman J.M., Gival D., Yarden Y. Steel factor and c-kit protooncogene: genetic lesions in signal transduction. // Crit.Rev. Oncog. V 5. P.141-168. 1994.

14. Malashenko A. Yurlovo W suggested symbol WY . // Mouse News Letters. V. 37. P.61. 1967.

15. Nishina Y., Kobarai Y., Sumi T. et al. Expression of c-kit protooncogen is stimulated by cAMP in differentiated F9 mouse teratocarcinoma cells. // Exp.Cell Res. V. 198. P. 352-356. 1992.

16. Nocka K., Buck J., Levi E, et al. Gonadal expression of c-kit encoded at the W locus of the mouse. // EMBO J. V. 9. P. 3287-94. 1990.

17. O’FarrellP.H., StumpffJ., Su T.T. Embryonic cleavage cycles: how is a mouse like a fly? // Curr Biol. V. 14. P. 35-45. 2004.

18. Rossi P., Sette C., Dolci S. et al. Role of c-kit in mammalian spermatogenesis. // Endocrynol. Invest. V. 23. P.609-615. 2000.

19. Sandlow J.I., Feng H.L., Sandra A. Localization and expression of the c-kit receptor protein in human and rodent testis and sperm. // Urology. V. 49. P. 494500. 1997.

20. Sette C., Bevilaqua A., Mangia F. et al. Parthenogenotic activation of mouse eggs by microinjection of a truncated c-kit tyrosine kinase present in spermatogonia. // Development. V 124. P.2267-2273. 1997.

21. Sette C., Dolci S., Geremia R et al. The role of stem cell factor and of alternative c-kit gene products in the establishment, maintenance and function of germ cells. // Int. J. Dev.Biol. V 44. P.599-608. 2000.

22. Shrivastava C., Rad-Ziejemski C., Campbel E. et al. An orphan receptor tyrosine kinase family whole members serve as

nonintegrin collagen receptors. // Mol. Cell. V. 1. P. 25-34. 1997.

23. Silvers W.K. //In “The coat color of mice. A model for mammalian gene action and interaction”. — Spring-Verlag. N-Y. Heidelberg. Berlin. P.206-223. 1979.

24. Tan J.C., Nocka K., Ray P. et al. The dominant W42 spotting phenotype results from missense mutation in the c-kit receptor kinase. // Science. V 247. P. 209-212.1990.

25. Wells X.E., O’Neill C. Biosynthesis of platelet-activating factor by two-cell mouse embryos. // J. Reprod. Fertil. V. 96. P. 61-71. 1992.

26. Williams D.E., Lyman S.D. Characterization of the gene product of the Steel locus. // Prog. Growth Factor Res. V. 3. P. 235-342. 1991.

27. Yang-Feng T.L., Ullrich A., Francke U. The oncogene c-kit (KIT) is located on human chromosome 4 and mouse chromosome 5. // Cytogenet. And cell genet. V.46. P. 723. 1987.

INFLUENCE OF MUTANT ALLELS DOMINANT SPOTTING KITW'V AND KITW'Y ON CLEAVAGE STAGES AND VIABILITY OF EARLY MOUSE EMBRYOS N.Yu. Sakharova1, IA.M.Malashenko2L E.F.Vikhlyantseva2, Yu.A.Kovalitskaya3

institute of Theoretical and Experimenal Biophysics of RAS, Pushchino, Moscow region 2The Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow 3Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (Pushchino Branch) ofRAN, Moscow region

Key words: mise, embryogenesis, mutation of Kit-gene — dominant spotting.

Influence of allels KitW-V and KitW-Y of mutation Dominant spotting on mouse early development has been studied. Embryos were obtained as a result of mating heterozygous animals between themselves (KitW-V/+ x KitW-V/+) and (KitW-Y/+ x KitW-Y/+) and as a result of reciprocal mating with the wild type C57BL/6 (+/+). On the second day post fertilization embryonic material from oviducts was obtained and embryo-undeveloped eggs ratio was analysed. As for mice KitW-V/+ considerable amount of undeveloped eggs was found only in case of (KitW-V/+ x KitW-V/+) mating. As fore mice KitW-Y/+ high contents of undeveloped egg cells was observed in case of any type of mating. Besides we found that embryos obtained from heterozygous animals were not only on the stage of two blas-tomeres ( as in control +/+) but also on the more later stages (4-8 blastomeres). We showed that in vitro development of 2-cell embryos obtained from mating of KitW-V/+ and KitW-Y/+ with +/+ animals don’t differ from that of +/+ embryos; but embryos from (KitW-V/+ x KitW-V/+) and (KitW-Y/+ x KitW-Y/+) mating mostly died on the blastocyst stage.