Перспективы использования клеток пуповинной крови для терапии негематологических заболеваний

Обзоры

Перспективы использования клеток пуповинной крови для терапии негематологических заболеваний

А.В. Берсенев

Thomas Jefferson University, Philadelphia, USA

Обзор посвящен поиску новых [негемопоэтических] стволовых и прогениторных клеточных популяций пуповинной крови человека, возможностей их выделения и терапевтического применения. Для удобства обзор разбит на несколько глав, в конце каждой из которых приводится отдельный список литературы.

Введение

Активный поиск новых стволовых и прогениторных клеточных популяций в пуповинной крови [ПК] человека обусловлен тем, что этот источник рассматривается как альтернатива костному мозгу. В последние годы, подобно изучению «взрослых» стволовых клеток костного мозга, были исследованы различные клеточные популяции, обладающие признаками

«стволовости», в пуповинной крови [ПК] человека. Так, кроме гемопоэтических клеток, были описаны мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки ПК [1, 2] и стенки канатика [3], CD133+ популяция [4], эндотелиальные проге-ниторные клетки [5, 6]. Несколькими группами исследователей было показано наличие плюрипотентной популяции клеток ПК, способной образовывать как мезенхимальные диффероны (остео-, хондро-, адипо- и миобластический] так и экспрессировать нейрональные и гепатоцитарные маркёры in vitro и in vivo [7-9].

Накопленные знания позволили перейти к экспериментам по изучению терапевтической эффективности различных клеточных популяций ПК на моделях у животных.

42

ЛИТЕРАТУРА:

1. Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br. J. Haematol. 2000; 109(1]: 235-42.

2. Bieback K., Kern S., Kluter H., Eichler H. Critical parametres for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells 2004; 22: 625-34.

3. Romanov Y.A., Svintsitskaya V.A., Smirnov V.N. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord. Stem Cells 2003; 21(1]: 105-10.

4. Gallacher L., Murdoch B., Wu D.M. et al. Isolation and characterization of human CD34[-]Lin[-] and CD34[+)Lin[-) hematopoietic stem cells using cell surface markers AC133 and CD7. Blood 2000; 95: 2813-20.

5. Aoki M., Yasutake M., Murohara T. Derivation of functional endothelial

progenitor cells from human umbilical cord blood mononuclear cells isolated by a novel cell filtration device. Stem Cells 2004; 22(6): 994-1002.

6. Murohara T., Ikeda H., Duan J. et al. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J. Clin. Invest. 2000; 105(11): 1527-36.

7. Goodwin H.S., Bicknese A.R., Chien S.N. et al. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers. Biol. Blood Marrow Transplant. 2001; 7(11): 581-8.

8. Lee O.K., Kuo T.K., Chen W.M. et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood 2004; 103(5): 1669-75.

9. Kogler G., Sensken S., Airey J.A. et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J. Exp. Med. 2004; 200 (2): 123-35.

Нейрональная дифференцировка и применение клеток ПК в неврологии

По лечебному потенциалу клеток ПК в экспериментальной неврологии к настоящему времени уже написаны обзоры [19, 20]. Подоплёкой к исследованиям по терапевтической эффективности трансплантации клеток ПК в неврологии послужили работы по выделению и характеристике нейрональных клеток из «стволовых популяций» ПК.

Из различных популяций клеток ПК in vitro несколькими группами исследователей были получены все виды нервных клеток. Пионерские работы по получению нейрональных клеток из ПК были выполнены группами Sanchez-Ramos и Buzanska [1 -3]. Пластик-адгезивные клетки и CD34-/CD45-клетки были размножены и подвергнуты дифференцировке под влияниям ретиноевой кислоты [RA] и других факторов роста [EGF, BDNF] [1-4]. Причём ретиноевая кислота выступает в данном случае основным нейроиндуктором [1]. Другие группы исследователей подвергали дифференци-ровке CD45- [5], CD133+ [6] и мезенхимальные клетки ПК [7, 8].

Исходя из результатов этих исследований, было констатировано, что различные популяции стволовых и прогениторных клеток ПК могут быть подвергнуты дифференцировке in vitro во все виды нервных клеток. Это было показано не только исследованием их иммунофенотипа, но и данными по экспрессии генов [мРНК] и характерных транскрипционных факторов [1 -8]. Однако наблюдается недостаток экспериментов in vivo на различных неврологических моделях, которые могли бы подтвердить функциональную значимость полученных клеток.

Одна из таких работ, демонстрирующая дифференци-ровку клеток ПК in vivo, была выполнена группой Zigova [9]. Пластик-адгезивную мононуклеарную предифференциро-ванную фракцию ПК пересаживали унилатерально в желудочки головного мозга новорожденых крысят без иммуносупрессии. Через месяц после трансплантации было выявлено, что около 20% выживших клеток оказывались в субвентрикулярной зоне и только 2% из них экспрессировали GFAP [маркёр микроглии]. Миграции клеток, характерной для

Тема выпуска: пуповинная кровь

нейрональных стволовых, не наблюдали. Возможной причиной низкой выживаемости, отсутствия миграции и дифференци-ровки в нейроны, является трансплантация весьма гетерогенной популяции клеток в иммунокомпетентный мозг крысы [9].

Таким образом, результаты экспериментов in vitro пока не подтверждены данными in vivo. Вопрос об истинной диф-ференцировке, отсутствии артефактов [12] и ложноположительных результатах остаётся открытым. Самый часто применяемый индуктор - ретиноевая кислота, возможно, не обладает «достаточной нейроспецифичностью» и вместе с другими индукторами может вызывать плеойтропные эффекты на повышение уровня экспрессии генов других поверхностных маркёров в культуре. Так известно, что как ге-мопоэтические клетки, так и мезенхимальные стромальные клетки костного мозга спонтанно экспрессируют нейрональные маркёры [10, 11]. Различные добавки в виде факторов роста в культуру могут лишь усиливать экспрессию этих генов, не вызывая прямой дифференцировки в функциональнополноценный нейрон.

Результаты экспериментов по нейрональной дифферен-цировке клеток ПК изложены в таблице 1.

Терапевтические эффекты, вызываемые трансплантацией клеток ПК, были изучены на нескольких моделях неврологического дефицита. В одной из ранних работ было показано, что внутривенная трансплантация гемопоэтических CD34+ клеток [77-95% в трансплантате] ПК крысам с моделью ишемического инсульта приводит к значимому функциональному восстановлению неврологического дефицита. Клетки мигрировали в головной мозг, преимущественно - в зону поражения, и дифференцировались в нейроны и клетки глии [GFAP+, NeuN+, MAP-2+] [13]. В исследовании,

опубликованном в Journal Clinical Investigation, также была показана эффективность трансплантации CD34+ клеток, выделенных из ПК для лечения ишемического инсульта у иммунодефицитных мышей [14]. Группа Willing сравнила внутривенный и интрастриальный способы трансплантации клеток ПК [на фоне иммуносупрессии] крысам с моделью ишемического инсульта [15]. По результатам некоторых функциональных тестов исследователи заключили, что внутривенное введение клеток может быть даже терапевтически выгоднее интрастриального [15]. При изучении эффектов трансплантации мононуклеарных человеческих клеток ПК на модели ишемического инсульта у крыс наблюдали дозозависимый эффект достоверного улучшения поведенческих реакций и двигательной активности животных через 2 и 4 недели после трансплантации. Оказалось, что максимально эффективно введение клеток ПК в дозе 1 и 10 миллионов. Введённые клетки обнаруживали в головном мозге в периин-сультной зоне эпсилатеральной стороны. Клеточная трансплантация значимо «уменьшала» область повреждения [16].

Интересное исследование, выполненное Borlongan [17], показывает, что клетки ПК не мигрируют через гемато-энцефалический барьер [ГЭБ], а только стимулируют эндогенный нейро- и ангиогенез. В подтверждение этого было выявлено повышение концентрации GDNF [glial cell line-derived neurotrophic factor] на 68% в головном мозге инсультных животных после введения клеток и маннитола [повышающего проницаемость ГЭБ]. Концентрация 3 нейротрофических факторов [GDNF, NGF, BDNF] повышалась и в периферической крови приблизительно на 15% в группе животных, получавших клеточную трансплантацию с маннитолом. В остальных группах уровень этих факторов был недетектабелен [17].

Таблица 1. Характеристика основных экспериментов по нейрональной дифференцировке клеток ПК

Ссылка Тип клетки ПК до индукции дифференцировки Индукторы дифференцировки Тип клеток после индукции дифференцировки

Sanchez-Ramos J.R., et al. Exp Neurol 2001; 171: 109-115 Мононукпеарные, пластик-адгезивные RA + NGF Musashi-1+; P-tubulin III+/NeuN+; GFAP+

Buzanska L., et al. J. Neurochem 2001; 78 (Suppl. 1): 58 CD34-/CD45-пластик-адгезивные, несколько пассажей, Nestin+ RA (4 дня), BDNF, кокультура с нейрональными клетками эмбриона крысы 4-8 дней III P-tubulin+ ; GFAP+/MAP2+; PLP+/DM-20+; GalC+

Bicknese A.R., et al. Cell Transplant 2002; 11; 3: 261-264 CD45(-), мононукпеарные bFGF + EGF, 7 дней P-tubulin III+; GFAP+; GalC+

Jang Y.K., et al. J. Neurosci Res 2004; 75; 4: 573-584 CD133+ RA Musashi-1+ ; P-tubulin-IN+; NSE+, GFAP+ MAP-2+, MBP+, PLP+; NF-L, -M, -H Otx2, Pax6, Wnt1, Olig2, Hash1 and NeuroD1

Jeong Ju. Ah., et al. Neuroreport 2004; 15; 11: 1731-1734 Пластик-адгезивные (мезенхимальные) SH2+/CD13+/CD29+/ CD105+/ASMA+ bFGF, DMSO, butylated hydroxyanisole (BHA)... 1-4 дня Tuj1+, TrkA+, GFAP+, CNPase+, MAP-2+, NeuroD1 +

Zigova T., et al. Cell Transplant. 2002; 11; 3: 265-274 «Стромальные» пластик-адгезивные клетки RA+NGF TuJ-1+, GFAP+ in vivo

44

Обзоры

Т аким образом, лечение экспериментального ишемического инсульта трансплантацией клетками ПК эффективно за счёт стимуляции эндогенного нейро- и ангиогенеза. Неясной остаётся способность миграции клеток в повреждённый головной мозг через ГЭБ. Способно ли радикальное повышение количества [как показано в первом исследовании] вводимых клеток вызвать их миграцию через ГЭБ? Если экстраполировать дозозависимую терапию на человека, то для достижения эффекта понадобится около 20 доз размороженных проб ПК [согласно первому исследованию].

Различные работы продемонстрировали примерно схожие эффекты трансплантации клеток ПК при экспериментальном инсульте, несмотря на разницу в количестве вводимых клеток [1-10 миллионов или 200 тысяч] и степени очистки трансплантата (мононуклеарные или CD34+ клетки]. Отсюда можно сделать вывод, что терапевтический эффект, по-видимому, обусловлен факторами, выделяемыми мононуклеарными

клетками ПК в условиях неврологического дефицита in vivo, вне зависимости от событий прямой дифференцировки или слияния какой-либо конкретной стволовой или прогенитор-ной популяции трансплантата. Схожие результаты [функциональное восстановление и данные по дифференцировке] были получены и при внутривенной трансплантации клеток ПК в модели повреждения головного мозга у крыс [18].

Складывается впечатление, что терапевтическое действие клеток ПК при неврологическом дефиците неспецифично и не обусловлено их нейрональной дифференцировкой. Тем не менее, базируясь на данных экспериментальных исследований, несколько групп в разных странах приступили к клиническим испытаниям такого метода клеточной терапии. Совсем недавно появилось первое сообщение о восстановлении моторной функции [ходьбы] через 17 лет после травмы спинного мозга у парализованной женщины, после трансплантации клеток ПК [21].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Sanchez-Ramos J.R., Song S., Kamath S.G. et al. Expression of neural markers in human umbilical cord blood. Exp. Neurol. 2001; 171: 109 -15.

2. Buzanska L., Machaj E.K., Zablocka B. et al. Human cord blood derived neurons, astrocytes and oligodendrocytes. J. Neurochem. 2001; 78[Suppl. 1]: 58.

3. Buzanska L., Machaj E.K., Zablocka B. et al. Human cord blood-derived cells attain neuronal and glial features in vitro. J. Cell Sci. 2002; 115[Pt. 10]: 2131-8.

4. Machaj E.K., Buzanska L., Gajkowska A. et al. Cord blood derived stem cells differentiates in vitro into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Exp. Hematology 2001; 29[Suppl. 1]: 4.

5. Bicknese A.R., Goodwin H.S., Quinn C.O. et al. Human umbilical cord blood cells can be induced to express markers for neurons and glia. Cell Transplant. 2002; 11[3]: 261-4.

6. Jang Y.K., Park J.J., Lee M.C. et al. Retinoic acid-mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord-derived hematopoietic stem cells. J. Neurosci. Res. 2004;.75[4]: 573-84.

7. Fu Y.S., Shih Y.T., Cheng Y.C., Min M.Y. Transformation of human umbilical mesenchymal cells into neurons in vitro. J. Biomed. Sci. 2004; 11: 652-60.

8. Jeong J.A., Gang E.J., Hong S.H. et al. Rapid neural differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells. Neuroreport. 2004; 15[11]: 1731 -4.

9. Zigova T., Song S., Willing A.E. et al. Human umbilical cord blood cells express neural antigens after transplantation into the developing rat brain. Cell Transplant. 2002; 11[3]: 265-74.

10. Goolsby J., Marty M.C., Heletz D. et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2003; 100[25]: 14926-31.

11. Tondreau T., Lagneaux L., Dejeneffe M. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation. Differentiation 2004; 72[7]: 319-26.

12. Lu P., Blesch A., Tuszynski M.H. Induction of bone marrow stromal cells to neurons: Differentiation, transdifferentiation, or artifact? J. Neurosci. Res. 2004; 77: 174-91.

13. Chen J., Sanberg P.R., Li Y. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682.

14. Taguchi A., Soma T., Tanaka H. et al. Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesisin a mouse model. J. Clin. Invest. 2004; 114: 330-8.

15. Willing A.E., Lixian J., Milliken M. et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J. Neurosci. Res. 2003; 73(3): 296-307.

16. Vendrame M., Cassady J., Newcomb J. et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390.

17. Borlongan C.V., Hadman M., Sanberg C.D., Sanberg P.R. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke. Stroke 2004; 35: 2385.

18. Lu D., Sanberg P.R., Mahmood A. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant. 2002; 11(3): 275-81.

19. Newman M.B., Davis C.D., Borlongan C.V. et al. Transplantation of human umbilical cord blood cells in the repair of CNS diseases. Expert. Opin. Biol. Ther. 2004; 4(2): 121-30.

20. Peterson D.A. Umbilical cord blood cells and brain stroke injury: bringing in fresh blood to address an old problem. J. Clin. Invest. 2004; 114(3): 312-4.

21. Kang K.-S., Kim S.W., Oh Y.H. et al. A 37-year-old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood, with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: a case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-73.

Дифференцировка клеток ПК в гепатоциты и репопуляция печени

3 года назад появились первые работы, показывающие возможность дифференцировки клеток ПК человека в клетки печени. Способность к энграфтингу и дифференцировке ПК в печени изучали на модели ксенотрансплантации мышам с врождённым иммунодефицитом - SCID. Модель позволяет проводить ксенотрансплантации без иммуносупрессии.

В пилотной работе Beeгheide [1] пластик-адгезивную фракцию клеток ПК, культивированную в течение 2-3 недель, пересаживали под капсулу регенерирующей [после частичной гепатэктомии] печени SCID-мышей. Через неделю после трансплантации наблюдали епдгаЛте^ меченых человеческих клеток и экспрессию ими человеческого альбумина [чего не наблюдали до трансплантации]. В контроле введение нефракционированной мононуклеарной фракции ПК не приводило к экспрессии ни одного человеческого маркёра [1].

В нескольких работах [2, 6, 9] нефракционированные ядросодержащие клетки ПК пересаживали облучённым NOD/SCID мышам без нарушения функции [2] или с повреждением печени [токсический гепатит, гепатэктомия] [6,9]. Энграфтинг в печень наблюдали от одной до нескольких недель после трансплантации. В работе Newsome [2] дифференцировавшиеся клетки человека в криосрезах печени идентифицировали через 4 недели по специфическим антителам - HepPar1, связывающимся только с гепатоцита-ми человека [перекрёстные реакции были исключены]. Все используемые методы подтвердили наличие человеческих клеток, морфологически выглядевших как гепатоциты в печени мышей-реципиентов. Маркёры холангиоцитов и эндотелиальных клеток, содержащих человеческую ДНК идентифицированы не были [2]. Kakinuma [6] показал, что при внутрипортальной трансплантации свежевыделенных ЯСК

А

Тема выпуска: пуповинная кровь

ПК SCID-мышам с частичной гепатэктомией и токсическим гепатитом было показано их долговременное [более года] приживление и дифференцировка в альбумин-продуциру-ющие гепатоциты.

Более детальное изучение клеточных популяций ПК, способных к репопуляции печени и дифференцировке в гепа-тоциты, подтвердило, что это могут быть совершенно различные по природе и функции клетки. В исследовании Ishikawa [3] мышам вводили очищенные CD34+ клетки ПК. Через 4-5 месяцев иммуногистохимически в печени идентифицировали гепатоциты человека по мРНК человеческого альбумина. Интересно, что степень химеризации костного мозга мышей-реципиентов составила 21-46% человеческих гемопоэтических клеток [3]. Однако, в другой работе на модели Fas-лиганд-опосредованного повреждения печени не было показано никакой разницы в химеризме печени и способности к экспрессии маркёров гепатоцитов между CD34+ и CD34- клетками ПК после их ксенотранспланта-ции [10]. Аналогичные результаты были получены Danet при трансплантации субпопуляций Lin-/CD45+/CD38-/CD34+0Г-/ C1qR(p)+ [4]. При ксенотрансплантации CD34+/CD38-/ CD7- гемопоэтических клеток ПК в условиях токсического

гепатита наблюдали энграфтинг и появление альбумин [м-РНК]-позитивных клеток человека в печени мышей. Как и в работе [1], человеческий альфа-фетопротеин не определялся, однако у некоторых животных экспрессировался человеческий цитокератин-19 [CK-19] - маркёр холангиоцитов. В сыворотке крови определяли человеческий альбумин. У контрольных животных [с гепатитом, без клеточной терапии] человеческий альбумин ни в печени, ни в сыворотке не выявлялся. Эффект трансплантации усиливался введением человеческого фактора роста гепатоцитов через 48 ч после моделирования острого токсического гепатита [5].

В некоторых работах [2, 3] методом FISH-гибридизации авторы исключают феномен слияния донорских клеток с хозяйскими. Однако в других работах были получены явные признаки клеточного слияния [9, 11]. Ряд авторов этот феномен не изучали, однако не исключают такой механизм маскировки трансдифференцировки клеток ПК в гепатоциты [10, 12]. Таким образом, недавние более детальные морфологические исследования [11 ] ставят под сомнение возможность трансдифференцировки клеток ПК в гепатоциты in vivo.

Таким образом, во всех этих работах было показано, что клетки ПК встраиваются в печень мышей и экспрессируют

Таблица 2. Характеристика основных экспериментов по дифференцировке клеток ПК в гепатоцитов

Авторы, ссылка

Beerheide W. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 294: 1052

Newsome P.N. et al. Gastroenterol. 2003;

124: 1891

Danet G.H. et al.

Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2002; 99: 10441

Wang X. et al.

Blood 2003; 101(10): 4201

Kakinuma S. et al.

Stem Cells 2003; 21(2): 217

Sharma A.D. et al.

Am. J. Pathol. 2005; 167: 555

Lee K.D. et al.

Hepatology 2004; 40(6): 1275

Nonome K. et al.

Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005; 289: G1091

Hong S.H. et al.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 330: 1153

Клетки ПК до индукции/ трансплантации

Пластик-адгезивная культура, p2-microglobulin+ /a1-antitrypsin+

Свежие нефракциониро-ванные мононуклеарные клетки

Lin-/CD45+/CD38-/CD34+or-

/C1qR(p)+

CD34+/CD38-/CD7-

Свежие нефракциониро-ванные мононуклеарные клетки

Свежие нефракциониро-ванные мононуклеарные клетки

Пластик-адгезивные CD13-/ CD34/CD45/CD133+/SH2+/ SH3+/CD29+/CD44+/CD73+/ CD90+/CD105+ клетки

CD34+ и CD34-

Пластик-адгезивные Thy-1 + /Flt3-/c-Kit-

Модель

Частичная гепатэктомия

NOD/SCID-мыши

без нарушения функции

печени

NOD/SCID-мыши

без нарушения функции

печени

Токсический гепатит

Токсический гепатит + частичная гепатэктомия

Токсический гепатит

In vitro HGF + bFGF, без сыворотки

Fas-повреждение печени

In vitro + HGF

Ha6.nroAeHMfl, pe3y^bTaT

P2-microglobulin-/a1-antitrypsin+/Albumin+ 3Hrpa$THHr BBe,qeHHbix KneTOK

3Hrpa$TMHr, HepPar1 +

KneTKn nenoBeKa, wiMero^wie THnHHHyro Mop^onornro renaTOi4MTOB

3Hrpa$TMHr, Human Albumin+ renaTOi4MTbi

Human Albumin+ renaTO^Tbi, Human CK-19+ xonaHrnoi4MTbi, Human Albumin b CbiBopoTKe kpobm

Human Albumin+ renaTO^Tbi, Human Albumin B CblBOpOTKe KpOBM

Human HepPar1+/human Albumin+/mouse CK-18+ renaTOi4HTbi

renaTOi4HTono,qo6Hbie KneTKM, 3Kcnpeccnpyro^ne pnq xapaKTepHbx reHOB w MapKepoB (Albumin, HNF-4, P450), npofly^wa rnwKoreHa

W MOHeBHHbl

Albumin+/AFP+ reпaтoцмтbl, yBenwneHwe BbXMBaeMOCTM WHBOTHblX

Thy-1+/Flt3+/c-Kit+/Albumin+ /AFP+/CK-18+/CK-19+ reпaтoцмтoпo1цo6нble KneTKw

Обзоры

маркёры гепатоцитов. Кроме того, такие клетки функционировали и синтезировали альбумин [5, 6]. Энграфтинг человеческих клеток в печень мышей обеспечивала иммунонекомпетентность организма реципиента. Для этого использовали SCID мышей [1-7] или преиммунные стадии развития эмбрионов [8].

В ряде работ показана возможность генерации клеток печени in vitro из различных популяций ПК. Kakinuma использовал комбинацию из 5 факторов роста для стимуляции дифференцировки ЯСК ПК. Через 3 недели культивирования до 50% клеток экспрессировали альбумин и коэкспресси-ровали ещё 5 других печёночных маркёров, включая маркёры зрелых гепатоцитов, овальных клеток и холангиоцитов [6]. Были получены гепатоцитоподобные клетки и из пластик-адгезивной «мезенхимальной» фракции ПК [13, 14]. Основным фактором индукции, используемым всеми исследователями являлся фактор роста гепатоцитов [HGF]. В работе Nonome [10] стимулировали экспрессию маркёров различных клеток печени в культуре гемопоэтических CD34+ и CD34- клеток ПК. Результаты основных исследований по дифференцировке клеток ПК в клетки печени и её репопуляции представлены в таблице 2.

Вероятность дифференцировки клеток ПК в гепатоциты in vivo остаётся крайне низкой и, видимо, мало зависит от

степени повреждения-регенерации органа и фракционирования трансплантата. Так, в эксперименте [4] внутривенно вводили очищенные CD45+/cDз8-/CD34+oг-/c1qRp клетки ПК и выявляли популяцию человеческих HLA-ABC+ гепатоцитов, которая составляла 0,05-0,1% от общего количества клеток печени мыши-реципиента [3]. С другой стороны, внутрипортальная трансплантация нефракциони-рованных ЯСК, но уже в модели повреждения печени, приводила к максимальной 0,1-1% репопуляции органа [6]. А в работе [2] энграфтинг в печень мышей составлял только 0,017% от общего количества введённых клеток. Неизвестно, достаточно ли такого низкого уровня энграфтинга и химеризма для достижения значимого терапевтического эффекта? Только единичные работы [7, 10] показывают значимое снижение летальности на фоне терапии токсического гепатита клетками ПК. Тем не менее, недавно было опубликовано первое клиническое исследование по эффективности клеточной терапии клетками ПК вирусных гепатитов [16]. Показано, что аллогенная трансплантация клеток ПК приводит к улучшению функции печени и иммунной системы у больных с вирусными гепатитами. К сожалению, в сообщении отсутствует информация о подготовке клеток трансплантата и степени их совместимости с реципиентом [16].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Beerheide W., von Mach M.A., Ringel M. et al. Downregulation of b2-microglobulin in human cord blood somatic stem cells after transplantation into livers of SCID-mice: an escape mechanism of stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 294: 1052-63.

2. Newsome P.N., Johannessen I., Boyle S. et al. Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocytes in the mouse liver with no evidence of cellular fusion. Gastroenterol. 2003; 124[7]: 1891-900.

3. Ishikawa F. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice. Ann. N-Y Acad. Sci. 2003; 996: 174-85.

4. Danet G.H., Luongo J.L., Butler G. et al. C1qRp defines a new human stem cell population with hematopoietic and hepatic potential. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2002; 99: 10441-5.

5. Wang X., Ge S., McNamara G. et al. et al. Albumin-expressing hepatocyte-like cells develop in the livers of immune-deficient mice that received transplants of highly purified human hematopoietic stem cells. Blood 2003; 101[10]: 4201 -8.

6. Kakinuma S., Tanaka Y., Chinzei R. et al. Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells. Stem Cells 2003; 21 [2]: 217-27.

7. Di Campli C., Piscaglia A.C. et al. A human umbilical cord stem cell rescue therapy in a murine model of toxic liver injury. Dig. Liver. Dis. 2004; 36[9]: 603-13.

8. Turrini P., Monego G., Gonzalez J. et al. Human hepatocytes in mice receiving pre-immune injection with human cord blood cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 326: 66-73.

9. Sharma A.D., Cantz T., Richter R. et al. Human cord blood stem cells generate human cytokeratin 18-negative hepatocyte-like cells in injured mouse liver. Am. J. Pathol. 2005; 167(2): 555-64.

10. Nonome K., Li X.K., Takahara T. et al. Human umbilical cord blood-derived cells differentiate into hepatocyte-like cells in the Fas-mediated liver injury model. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 2005; 289(6): G1091-9.

11. Kashofer K., Siapati E.K., Bonnet D. In vivo formation of unstable heterokaryons following liver damage and HSC/Progenitor transplantation. Stem Cells. 2005;10; Epub.

12. Tanabe Y., Tajima F., Nakamura Y. et al. Analyses to clarify rich fractions in hepatic progenitor cells from human umbilical cord blood and cell fusion. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324(2): 711-8.

13. Hong S.H., Gang E.J., Jeong J.A. et al. In vitro differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 330(4): 1153-61.

14. Lee K.D., Kuo T.K., Whang-Peng J. et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology 2004; 40(6): 1275-84.

15. Wang Y., Nan X., Li Y. et al. Induction of umbilical cord blood-derived beta2m-c-Met+ cells into hepatocyte-like cells by coculture with CFSC/HGF cells.

Liver Transpl. 2005; 11(6): 635-43.

16. Tang X.P., Yang X., Tan H. et al. Clinical and experimental study on therapeutic effect of umbilical cord blood transplantation on severe viral hepatitis. World J. Gastroenterol. 2003; 9(9):1999-2003.

Экспериментальные модели лечения заболеваний с неясным или преимущественно аутоиммунным патогенезом

Сахарный диабет

До настоящего момента не опубликовано работ по получению инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы из стволовых популяций ПК. Однако была изучена эффективность трансплантации клеток ПК при экспериментальном сахарном диабете. Все эти исследования были опубликованы группой Reddi-Ende из New Jersey School of Medicine [University of Medicine and Dentistry, Newark, USA]. Во всех работах [1-3] авторы внутривенно вводили моно-нуклеарные клетки ПК без иммуносупрессии. Для изучения эффективности терапии использовали мышиные модели I и II типов сахарного диабета [NOD и B6.Y-Lep-obese]. Во всех исследованиях, однократное введение клеток приводило к значимому долговременному [более 9 месяцев [2]]

снижению концентрации глюкозы крови и увеличению выживаемости животных экспериментальных групп без реакции отторжения.

При изучении морфологии почек было выявлено, что на фоне клеточной трансплантации значительно менее были выражены клубочковая гипертрофия и дилатация канальцев. Интересно, что контрольные животные значительно быстрее набирали лишний вес, чем экспериментальные [2]. Т акже было установлено, что клеточная трансплантация значительно снижает вероятность и интенсивность аутоиммунных инсулинитов в модели диабета I типа [3]. Оказалось, что поддержание близкой к норме гликемии, выживаемость животных и состояние аутоиммунной агрессии поджелудочной железы прямо пропорционально зависит от дозы вводимых

Тема выпуска: пуповинная кровь

47

клеток. Так, при введении 200 млн клеток положительные эффекты были выражены более значимо, чем при трансплантации 100 миллионов [3].

Механизмы действия введённых мононуклеарных клеток [МНК] ПК в моделях сахарного диабета остаются невыясненными. Исследователи предполагают, что одна из клеточных фракций трансплантата может предупреждать или снижать интенсивность аутоиммунного ответа к клеткам островков, т.е. обладать иммуномодулирующим действием [3]. Однако, эта концепция подлежит проверке в последующих работах.

Пожалуй, главным результатом экспериментов этой группы исследователей явилась демонстрация того, что трансплантация клеток ПК способна приводить к долговременному снижению [9 месяцев] уровня глюкозы до субнормальных цифр после однократного введения клеток. В отличие от этого, например, при трансплантации инсулин-продуцирующих клеток, выделенных из эмбриональных стволовых [мышам со стрептозотоциновой моделью], наблюдали снижение уровня гликемии до нормы уже через неделю. Однако, через 12 недель у 40% животных изученные показатели возвращались на прежний [высокий] уровень [8].

Боковой амиотрофический склероз

Эффективность внутривенной инфузии мононуклеарной фракции ПК была также испытана на модели бокового амиотрофического склероза [БАС] у мышей. SOD-1 мыши служат моделью БАС человека и у них развиваются параличи в первые 4-5 месяцев жизни. Средняя ожидаемая продолжительность жизни таких мышей - 130 дней. В пилотных исследованиях было показано, что трансплантация предварительно криоконсервированных мононуклеарных клеток ПК после суб-летального облучения приводит к увеличению выживаемости экспериментальных животных [4, 5]. Продолжительность жизни мышей экспериментальных групп была достоверно выше [148 дней [4] и 162 [5] дня] по сравнению с контролем и

сингенной трансплантацией костного мозга [5]. Доза клеток для трансплантации составляла в среднем 70 млн.

Способность к миграции и дифференцировке МНК ПК была изучена группой Garbuzova-Davis на другой модели БАС - G93A мышах [6]. В этой работе показано, что после внутривенного введения клетки ПК мигрируют в различные органы, преимущественно - в селезёнку. Также, клетки были обнаружены через 10-12 недель после трансплантации в локусах деградации мотонейронов головного и спинного мозга. Они экспрессировали нейрональные маркёры -Nestin, III Beta-Tubulin [TuJ1], glial fibrillary acidic protein [GFAP]. Превентивная клеточная трансплантация приводила к задержке развития заболевания как минимум на 2-3 недели и увеличивала продолжительность жизни заболевших животных [6].

Таким образом, первые исследования эффективности трансплантации МНК ПК на моделях БАС показали значимое увеличение выживаемости животных. Механизмы действия клеток остаются неизученными.

Системная красная волчанка

Одна из первых работ группы Ende была посвящена возможности коррекции системной красной волчанки [СКВ] -заболевания, имеющего аутоиммунный компонент патогенеза. Эффективность трансплантации МНК ПК была изучена на MRL-lpr/lpr мышах, являющихсяся моделью СКВ человека. У таких мышей в течение 6 месяцев развивается тяжёлый аутоиммунный процесс с генерализованной лимфа-денопатией. Трансплантация клеток ПК, также как и костного мозга, приводила к двукратному увеличению выживаемости животных [11 месяцев, при средней продолжительности жизни контрольных животных - 5 месяцев], снижению интенсивности лимфаденопатии и снижению количества аутоагрессивных Т-лимфоцитов. Однако, в группе трансплантации ПК наблюдался грануломатозный васкулит, чего не отмечалось у животных в группе трансплантации костного мозга.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ende N., Chen R., Mack R. NOD/LtJ type 1 diabetes in mice and the effect of stem cells [Berashis] derived from human umbilical cord blood. J. Med. 2002; 33: 181-7.

2. Ende N., Chen R., Reddi A.S. Transplantation of human umbilical cord blood cells improves glycemia and glomerular hypertrophy in type 2 diabetic mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 321: 168-71.

3. Ende N., Chen R., Reddi A.S. Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 325: 665-9.

4. Ende N., Weinstein F., Chen R., Ende M. Human umbilical cord blood effect on sod mice [amyotrophic lateral sclerosis]. Life Sci. 2000; 67[1]: 53-9.

5. Chen R., Ende N. The potential for the use of mononuclear cells from human umbilical cord blood in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis in SOD-1 mice. J. Med. 2000; 31: 21-30.

6. Garbuzova-Davis S., Willing A.E., Zigova T. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J. Hematother. Stem Cell Res. 2003; 12: 255-70.

7. Ende N., Czarneski J., Raveche E. Effect of human cord blood transfer on survival and disease activity in MRL-Lpr/Lpr mice. Clin. Immunol. Immunopath. 1995; 75: 190-5.

8. Soria B., Roche E., Berna G. et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes. 2000; 49(2): 157-62.

Терапевтический ангиогенез

Предпосылками к применению клеток ПК для целей терапевтического ангиогенеза послужили работы по выделению предшественников эндотелия и ангиобластов. Среди кандидатов в эндотелиальные прогениторные клетки [ЭПК] ПК рассматриваются СD34+ [1], CD133-/CD14+ [2], CD133+/VEGFR-2+ [3], CD34+KDR+ [7] и т.д. В последнее время были опубликованы протоколы выделения ЭПК [4] и с помощью аппаратов [5]. Эффективность терапевтического ангиогенеза клетками ПК испытывалась на моделях инфаркта миокарда и ишемии нижних конечностей. Вопросы терапевтического ангиогенеза при ишемическом инсульте также рассматривались в разделе «Нейрональная

дифференцировка и применение клеток ПК в неврологии» данного обзора.

Инфаркт миокард

Г руппа немецких исследователей [6] изучала влияние внутривенной трансплантации мононуклеарной фракции ПК на ангиогенез в миокардае после инфаркта у NOD/SD-мышей. Клетки мигрировали и встраивались только в поврежденный участок миокарда. Плотность капилляров в периинфар-ктной зоне в группе клеточной трансплантации оказалась на 20% выше, чем в контрольной. Эндотелий капилляров был химеризован человеческими клетками [6]. У свиней

А

Обзоры

был показан энграфтинг и терапевтическая эффективность нефракционированных ЯСК ПК «под прикрытием» иммуносупрессии [11]. Аналогичные клетки ПК применяла группа Henning [12]. Интересно, что авторы не сообщают о каких-либо иммунных реакциях после прямого интармиокардиаль-ного введения одного миллиона ЯСК ПК обычным крысам без иммуносупрессии [12]. В работе Hirata была показана эффективность трансплантации CD34+ клеток ПК [13]. Клетки ПК с фенотипом CD34+KDR+ пересаживали в инфарктный миокард мышей. Оказалось, что только клетки с данным фенотипом эффективно стимулировали ангиогенез, в отличие от СD34+/KDR- и мононуклеарной фракции [7]. СD133+ клетки ПК встраивались в поврежденный миокард бестимусных крыс и превращались в миофибробласты [10], что, однако, приводило к ремоделированию миокарда и улучшению функции левого желудочка.

Ишемия конечностей

В эксперименте МигоЬ|ага, внутримышечные инъекции CD34+ клеток крысам с моделью ишемии конечностей приводили к значительному улучшению кровотока и увеличению плотности капилляров [1]. Оказалось, что внутримышечная трансплантация СD34+ клеток приводит не только к увеличению числа артериол в очаге ишемии, но и стимуяции регенерации скелетной мышцы [8].

Таким образом, трансплантация клеток ПК может применяться с целью терапевтического ангиогенеза. Однако остаётся неясным, какая именно популяция клеток является предшественником эндотелия, ангиобластов и способна эффективно формировать собственную капиллярную сеть. Более перспективным направлением может стать локальное введение ЭПК в зоны ишемии миокарда и нижних конечностей.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Murohara T., Ikeda H., Duan J. et al. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J. Clin. Invest. 2000; 105[11]: 1527-36.

2. Kim S.Y., Park S.Y., Kim J.M. et al. Differentiation of endothelial cells from human umbilical cord blood AC133[-]CD14[+] cells. Ann. Hematol. 2005; 84[7]:417-22.

3. Yang C., Zhang Z.H., Li Z.J. et al. Enhancement of neovascularization with cord blood CD133+ cell-derived endothelial progenitor cell transplantation. Thromb. Haemost. 2004; 91[6]: 1202-21

4. Larrivee B., Karsan A. Isolation and culture of primary endothelial cells. Methods Mol. Biol. 2005; 290: 315-29.

5. Aoki M., Yasutake M., Murohara T. Derivation of functional endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood mononuclear cells isolated by a novel cell filtration device. Stem Cells 2004; 22[6]: 994-1002.

6. Ma N., Stamm C., Kaminski A. et al. Human cord blood cells induce angiogenesis following myocardial infarction in NOD/scid-mice. Cardiovasc. Res. 2005; 66[1]: 45-54.

7. Botta R., Gao E., Stassi G. et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic

vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells and low dose CD34+KDR+ cells. FASEB J. 2004; 18(12): 1392-4.

8. Pesce M., Orlandi A., Iachininoto M.G. et al. Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues. Circ. Res. 2003; 93(5): e51-62.

9. Murohara T. Therapeutic vasculogenesis using human cord blood-derived endothelial progenitors. Trends Cardiovasc. Med. 2001; 11(8): 303-7.

10. Leor J., Guetta E., Feinberg M.S. et al. Human umbilical cord blood-derived CD133+ cells rnhance function and repair of the infarcted myocardium. Stem Cells 2005; Oct 6; Epub.

11. Kim B.O., Tian H., Prasongsukarn K. et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circ. 2005; 112(9 Suppl): I96-204.

12. Henning R.J., Abu-Ali H., Balis J.U. et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for the treatment of acute myocardial infarction. Cell Transplant. 2004; 13(7-8): 729-39.

13. Hirata Y., Sata M., Motomura N. et al. Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 327(2):.609-14.

Заключение

Целью данного обзора было ознакомление с современными сведениями по пластичности и дифференцировке различных популяций стволовых и прогениторных клеток ПК человека в преломлении их потенциального клинического применения. История изучения стволовых популяций ПК в точности повторяет историю исследования взрослых стволовых клеток костного мозга. Однако, если в изучении стволовых клеток костного мозга уже наступил период переоценки результатов, то с клетками ПК всё ещё наблюдается период избыточных ожиданий. Стремление исследователей быстрее изучить терапевтический эффект, во многом обусловлено развитием бизнеса криобанкирова-ния ПК. Стремительно расширяющаяся сеть коммерческих криобанков, предоставляющих сервис по хранению ПК,

финансирует многие фундаментальные исследования потенциала пластичности клеток пуповинной крови. Однако остаются абсолютно неясными механизмы дифференци-ровки и функционирования клеток после трансплантации. Не исключены артефакты при идентификации клеток в культуре [спонтанная экспрессия ткане-специфичных генов, неспецифические изменения структуры] и после трансплантации [феномен слияния]. Нет единого мнения по фенотипированию негемопоэтических стволовых популяций ПК.

Таким образом, представленный материал раскрывает возможные перспективы применения клеток ПК для лечения негематологических заболеваний. Однако, чтобы перейти к клиническим испытаниям, необходимы дополнительные фундаментальные исследования

А

Тема выпуска: пуповинная кровь

Трансплантация двух ^А-совместимых единиц пуповинной крови как современный подход к решению проблемы малого количества клеток и альтернатива аллогенной трансплантации костного мозга при лейкемии у взрослых пациентов

A.B. Берсенёв

Thomas Jefferson University, Philadelphia, USA

Трансплантация клеток пуповинной крови [ПК], как альтернатива неродственной трансплантации костного мозга [ТКМ], уже прочно заняла свои позиции в онкогематологии. К основным преимуществам трансплантации ПК, по сравнению с ТКМ, относят более низкую частоту развития «реакции трансплантат-против-хозяина» [РТПХ] и более либеральный подход к степени HLA-совместимости трансплантата при равном посттрансплантационном прогнозе. Однако, при трансплантации ПК отмечают более низкий engraftment и повышенную вероятность рецидива [1, 2].

Если в детской онкогематологии трансплантация ПК вместо ТКМ стала уже рутинной процедурой, то основной проблемой такой трансплантации во «взрослой клинике» является недостаточное количество клеток в одном трансплантате для полного энграфтинга и восстановления нормального гемопоэза. Менее 30% взрослых пациентов, находящихся в ожидании трансплантата, могут рассчитывать на подходящий [по дозе клеток и HLA-совместимости] образец ПК. Богатая клиническая практика трансплантации костного мозга показала решающее значение дозы ядросодержащих [ЯСК] и гемопоэтических [CD34+] клеток в трансплантанте для успешного прогноза - энграфтинга и выживаемости пациентов с лейкемией. Так, известно, что трансплантация ПК в дозе менее 180 млн/кг ядросодержащих клеток и меньше 170 тыс/кг CD34+ клеток ассоциирована с их крайне низким приживлением и высокой летальностью пациентов [3].

Вопрос о ретрансплантации гемопоэтических клеток [костного мозга, ПК и/или обогащённой фракции мобили-зированной крови] обычно возникает при острой недостаточности и отторжении трансплантата, рецидиве лейкемии [4, 5, 6]. Проблема недостаточной дозы клеток [как ядросодержащих в целом, так и CD34+ гемопоэтических - в частности] в онкогематологической клинике не нова. Ещё в 1969 г. были описаны попытки увеличения дозы клеток в трансплантате методом использования второго неродственного донора костного мозга [7]. В настоящее время предлагаются два основных пути решения проблемы «недостаточной дозы трансплантата» - экспансия гемопоэтических клеток [ГК] in vitro перед трансплантацией и трансплантация смеси ядросодержащих клеток [ЯСК] из двух разных образцов ПК.

Ранее уже сообщалось об успешном клиническом применении кратковременной экспансии ГК in vitro перед трансплантацией размороженного образца ПК [8]. В 2000 г. была успешно осуществлена трансплантация клеток ПК, подвергшихся предварительной экспансии ex vivo [AastromReplicell System] 2-м взрослым пациентам с хронической миелоидной

лейкемией [9]. Другим подходом при недостаточности первого трансплантата ПК могла бы стать «пожарная трансплантация» второго в «щадящем режиме». О клиническом успехе такого подхода сообщила совсем недавно японская группа Ohwada [4]. Для профилактики ранних осложнений, связанных с трансплантацией низкой дозы ПК у взрослых, Fernandez предлагает прибегать к котрансплантации низкой дозы пурифицированных CD34+ клеток, мобилизирован-ных в периферический кровоток здоровых гаплоидентичных родственных доноров [10]. Первые попытки инфузии смеси нескольких образцов ПК от разных доноров онкологическим больным были осуществлены ещё в 60-70-е годы, но не увенчались успехом и относились к разряду «пробных» [11, 12]. В 1994 году Shen выполнил трансплантацию смеси нескольких несовместимых образцов ПК 4-м пациентам с солидным раком, показав возможность полной ремиссии [3 из 4 пациентов] и отсутствие РТПХ [13].

Экспериментальные данные по трансплантации 2 проб человеческой ПК в организм преиммунных овец подтвердили отсутствие иммунного конфликта [17]. После трансплантации lineage- гемопоэтических клеток 2 образцов ПК в NOD/SCID мышей был показан хороший ко-энграфтинг и отсутствие ингибирования иммунологически различных клеток донора друг другом [18]. Однако, совсем недавно в экспериментальной работе был показан высококонкурентный [между пробами] энграфтинг клеток и «ассимметричный химеризм» после трансплантации 2 единиц ПК, одна из которых была нефракционирована, а вторая обогащена CD34+ методом lineage-деплеции [19]. Неожиданно исследователи наблюдали развитие «реакции трансплантат-против-трансплантата», что было ассоциировано с наличием CD34-/linage+ клеток [19]. De Lima описывает наблюдение ко-энграфтинга обоих донорских образцов ПК с достижением полной ремиссии у пациента с острой формой лейкемии [20]. Таким образом, механизмы конкурентного энграфтинга при одномоментной трансплантации 2 образцов ПК остаются до конца не ясными и дискутабельными.

Пионерами по разработке современного метода «двух-дозной» трансплантации ПК стала группа Juliet Barker из University of Minnesota. Разработка метода и первые клинические наблюдения были описаны в предшествующих публикациях группы [14, 15, 16, 23]. В первом клиническом сообщении наблюдался неконкурентный энграфтинг обеих единиц в первые 60 дней после трансплантации [14]. Недавно были опубликованы результаты клинического исследования по изучению эффективности трансплантации двух единиц ПК [для решения проблемы малого количества клеток]

Обзоры

взрослым пациентам с лейкемией [21]. Группа Barker из University of Minnesota проанализировала результаты деятельности центра за последние 3 года и подвела итоги II фазы клинических испытаний метода [21, 22, 23]. На результатах этого исследования хотелось бы остановиться подробнее.

В исследование было включено 23 пациента с острыми и хроническими формами лейкемии. Критериями отбора к трансплантации 2 доз ПК считались: невозможность родственной трансплантации костного мозга при HLA-совместимости < 5-6/6 [HLA-A, B, DRB1 ], отсутствие совместимого неродственного трансплантата, совместимость < 4-6/6 HLA при наличии одного адекватного образца ПК и неадекватная клеточная доза в ПК-трансплантате. Все пациенты подвергались различным режимам миелоабляции перед трансплантацией. Оба образца ПК подбирали по HLA-совместимости [> 4-6/6 HLA-A, B, DRB1]. Минимальной дозой для трансплантации считали > 15 млн ЯСК/кг веса.

Все пациенты продемонстрировали устойчивый энграф-тинг с выходом из нейтропении в течение 23 дней [в среднем] после трансплантации. В 76% наблюдался энграфтинг образца одного донора и в 24% - обоих. Смешанный донорский гемопоэз наблюдали только в 2 случаях на 60-й день после трансплантации. Острая «реакция трансплантат-против-хозяина» II-IV и III-IV степеней наблюдалась в 65 и 13% соответственно. Одногодичная выживаемость с переходом в ремиссию составила 57% и 72% в группе пациентов, которым была выполнена трансплантация.

Интересно, что дозы ЯСК [180 против 190 млн/кг] и CD34+ [150 против 200 тыс/кг] клеток в доминантных образцах оказывались несколько ниже, чем в «проигравших» при одинаковом % [60-61] жизнеспособных клеток после разморозки. Напротив, количество CD3+ клеток [зрелые Т-лимфоциты] в доминантных образцах оказывалось выше, чем в «проигравших» энграфтинг [6 против 4 млн/кг]. Эти данные согласуются с результатами, полученными в экспериментальной работе группы Kim [18]. То есть, «выигрышный» донорский энграфтинг, как и вероятность развития «реакции трансплантат-против-трасплантата», зависит от содержания зрелых Т-клеток [в частности, CD3+] и не зависит от степени HLA-совместимости между образцами. В недавней экспериментальной работе Nauta [24] было подтверждено, что один образец выигрывает конкурентный энграфтинг у второго. Было показано, что энграфтинг значительно усиливает добавление второго образца, что, однако, нельзя однозначно объяснить увеличением количества CD34+ клеток, а может происходить за счёт влияния каких-либо факторов из «проигравшего» образца [24].

Таким образом, данные I-II фаз клинических испытаний в University of Minnesota продемонстрировали безопасность и эффективность метода 2-дозной трансплантации ПК для лечения лейкемии. Статистические данные

соответствуют таковым при неродственной трансплантации костного мозга.

Недавно было описано первое клиническое наблюдение по трансплантации 2 образцов ПК мальчику 12 лет с хронической миелоидной лейкемией в Тайване. Наблюдали энграфтинг только одного несовместимого образца, выигрывавшего и по общему количеству ЯСК [25]. Интересное клиническое исследование было проведено в Китае [26]. Шести пациентам с лейкемией пересаживали смесь 2 образцов ПК. Ни у одного из них не наблюдали смешанного химеризма, что не согласуется с данными других авторов [14, 20]. Время восстановления гемопоэза было сравнимо с таковым при трансплантации одного образца ПК от неродственного донора, однако у 2 пациентов вообще не наблюдали энграфтинга. У 2 пациентов была достигнута полная ремиссия [время наблюдения - 52 и 48 месяцев]. Авторы также отмечают снижение частоты и интенсивности РТПХ [26]. Следует отметить, что образцы ПК для одной трансплантации были несовместимы между собой, в отличие от исследования Barker [21].

В заключение, по результатам проведённых экспериментальных и клинических исследований можно сделать ряд выводов:

1. Трансплантация 2 образцов ПК является достойной альтернативой аллогенной трансплантации костного мозга у взрослых пациентов с лейкемией и решает проблему недостаточного количества гемопоэтических клеток [14-16, 20-23, 26];

2. Преимуществами подхода с трансплантацией 2 доз ПК является более низкая частота развития «реакции транс-плантат-против-хозяина» [21, 26] и ускоренный энграфтинг с восстановлением гемопоэза [18, 21, 24] по сравнению с результатами обычных неродственных трансплантаций ПК [3];

3. Остаётся неясным механизм донорского энграфтин-га и конкуренции между «выигравшим» и «проигравшим» образцами [18, 19, 21, 24]. Основы конкуренции за энг-рафтинг между двумя образцами - иммунологические и зависят от содержания негемопоэтических клеток [например, зрелых Т-клеток]. Более равномерный ко-энграф-тинг, по-видимому, можно получить при lineage-деплеции клеток, исключающей «реакции трансплантат-против-трансплантата» [18, 19, 24].

Перспективным направлением является разработка схемы двухдозной трансплантации ПК с немиелоаблятивным протоколом кондиционирования реципиента. После III фазы испытаний станет окончательно ясно о распространении и приживлении метода в широкой клинической мировой практике. Трансплантация двух доз ПК даёт шанс на излечение многим онкогематологическим пациентам, выписанным из центров трансплантации костного мозга по причине отсутствия подходящего трансплантата.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Румянцев А.Г., Масчан А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей. - М., 2003, 921.

2. Rocha V., Sanz G., Gluckman E. Eurocord and European Blood and Marrow Transplant Group. Umbilical cord blood transplantation. Curr. Opin. Hematol. 2004; 11[6]: 375-85.

3. Wagner J.E., Barker J.N., DeFor T.E. et al. Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood 2002; 100: 1611-8.

4. Ohwada C., Nakaseko C., Ozawa S. et al. Second cord blood transplantation [CBT] with reduced-intensity conditioning for graft failure after the first CBT for AML. Bone Marrow Transplant. 2004; 34[11]: 999-1000.

5. Wolff S. Second hematopoietic stem cell transplantation for the treatment of graft failure, graft rejection of relapse after allogenic transplantation. Bone Marrow Transplant. 2002; 29: 545-52.

6. Tanaka T., Matsubara H., Adachi S. et al. Second transplantation from HLA 2-loci-mismatched mother for graft failure due to hemophagocytic syndrome after cord blood transplantation. Int. J. Hematol. 2004; 80(5): 467-9.

7. Mathe G., Amiel J.L., Schwarzenberg L. et al. Bone marrow transplantation in man. Transplant. Proc. 1969; 1: 16-24.

8. Kogler G., Nurnberger W., Fischer J. et al. Simultaneous cord blood transplantation of ex vivo expanded together with non-expanded cells for high risk leukemia. Bone Marrow Transplant. 1999; 24(4): 397-403.

9. Pecora A.L., Stiff P., Jennis A. et al. Prompt and durable engraftment in two older adult patients with high risk chronic myelogenous leukemia (CML) using ex vivo expanded and unmanipulated unrelated umbilical cord blood. Bone Marrow Transplant. 2000; 25: 797-9.

10. Fernandez M.N., Regidor C., Cabrera R. et al. Unrelated umbilical cord blood transplants in adults: Early recovery of neutrophils by supportive cotransplantation of a low number of highly purified peripheral blood CD34+ cells from an HLA-haploidentical donor. Exp. Hematol. 2003; 31(6): 535-44.

Тема выпуска: пуповинная кровь

11. Ende M. Lymphangiosarcoma. Report of a case. Pac. Med. Surg. 1966; 74(2): 80-2.

12. Ende M. Hematopoietic transplantation by means of fetal (cord) blood. A new method. Va. Med. Mon. 1972; 99(3): 276-80.

13. Shen B.J., Hou H.S., Zhang H.Q., Sui X.W. Unrelated, HLA-mismatched multiple human umbilical cord blood transfusion in four cases with advanced solid tumors: initial studies. Blood Cells 1994; 20: 285-92.

14. Barker J.N., Weisdorf D.J., Wagner J.E. Creation of a double chimera after the transplantation of umbilical-cord blood from two partially matched unrelated donors. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 1870-1.

15. Barker J.N., Weisdorf D.J., DeFor T.E. et al. Rapid and complete donor chimerism in adult recipients of unrelated donor umbilical cord blood transplantation after reduced intensity conditioning. Blood 2003; 102: 1915-19.

16. Barker J.N., Weisdorf D.J., DeFor T.E. et al. Multiple unit unrelated donor umbilical cord blood transplantation in high risk adults with hematologic malignancies: impact on engraftment and chimerism. Blood 2002; 100: 41a.

17. Zanjani E., Almeida-Porada G., Hangoc G., Broxmeyer H.E. Enhanced short term engraftment of human cells in sheep transplanted with multiple cord bloods: implications for transplantation of adults. Blood 2000; 96: 552a (abstract).

18. Kim D.W., Chung Y.J., Kim T.G. et al. Cotransplantation third-party mesenchymal stromal cells can alleviate single-donor predominance and increase engraftment from double cord transplantation. Blood 2004; 103: 1941-8.

19. Yahata T., Ando K., Miyatake H. et al. Competitive repopulation assay of two gene-marked cord blood units in NOD/SCID/gammac(null) mice. Mol. Ther. 2004; 10(5): 882-91.

20. De Lima M., St John L.S., Wieder E.D. et al. Double-chimaerism after transplantation of two human leucocyte antigen mismatched, unrelated cord blood units. Br. J. Haematol. 2002; 119: 773-6.

21. Barker J.N., Weisdorf D.J., DeFor T.E. et al. Transplantation of two partially HLA-matched umbilical cord blood units to enhance engraftment in adults with hematologic malignancy. Blood 2005; 105(3):1343-7.

22. Barker J. Double cord blood transplants in adult recipients. 7th Int Congress Cell Transplant Society. Nov. 17-20, Boston, USA. Book of abstracts; abs. 236; 59.

23. Barker J.N., DeFor T., Davies S.M. et al. Impact of multiple unit unrelated donor umbilical cord blood transplantation in adults: preliminary analysis of safety and efficacy. Blood 2004; 98: 666a.

24. Nauta A.J., Kruisselbrink A.B., Lurvink E. et al. Enhanced engraftment of umbilical cord blood-derived stem cells in NOD/SCID mice by cotransplantation of a second unrelated cord blood unit. Exp. Hematol. 2005; 33(10): 1249-56.

25. Hung G.Y., Chiou T.J., Chang C.Y. et al. Double-unit unrelated cord blood transplantation for chronic myelogenous leukemia. Int. J. Hematol. 2005; 82(2): 159-61.

26. Wang F.R., Huang X.J., Zhang Y.C. et al. Successful transplantation of double unit umbilical-cord blood from unrelated donors in high risk leukemia with a long follow-up. Chin. Med. J. 2005; 118(9): 772-6.

А