СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11БЕТА-ГИДРОКСИ-9БЕТА,10АЛЬФА-СТЕРОИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК AMYCOLATOPSIS MEDITERRANEI
METHOD OF PREPARING 11-BETA-HYDROXY-9-BETA, 10-ALPHA STEROIDS WITH USING AMYCOLATOPSIS MEDITERRANEI CELLS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к использованию бактериальных штаммов вида Amycolatopsis mediterranei для микробиологической трансформации 9β,10α-стероидов (ретростероидов) в их соответствующие 11β-гидроксил аналоги, а также к специфичным штаммам этого вида. Настоящее изобретение относится также к способу превращения 9β,10α-стероидов в их соответствующие 11β-гидроксил производные при использовании бактериальных штаммов вида Amycolatopsis mediterranei, и последующему отделению 11β-гидроксил производных от среды, содержащей бактериальную культуру. Образующиеся 11β-гидроксилированные продукты представляют собой полезные промежуточные соединения (интермедиаты) для получения новых стероидных веществ с 9β,10α-строением, несущих различные заместители в 11β-положении.
Уровень техники.
Публикации и другие сведения, использованные здесь для освещения предпосылок создания изобретения, и, в частности, представление дополнительной информации, относящейся к технологии, включены сюда в качестве ссылочного материала и не относятся к предшествующему уровню техники.
Ретростероиды
Ретростероиды, то есть стероиды с 9β,10α-конформацией, хорошо известны из уровня техники. Коммерчески доступное соединение Дидрогестерон ((9β,10α)-прегна-4,6-диен-3,20-дион) следующей формулы (I-1)
представляет собой активный при приеме внутрь прогестативный гормон и в основном используется для восполнения нехватки прогестерона в организме. Синтез Дидрогестерона облучением и фотохимической реакцией описаны в Европейских патентах ЕР 0152138 В1 (US 4601855) и ЕР 0558119 В1 (US 5304291).
4,6
4,6
Широко известными ретростероидами являются также, к примеру, 1,2-метилен-3-кето-Δ-бисдегидро-6-гало-9β,10α-стероиды, как это раскрыто US 3937700 и 3-кето-Δ-бисдегидро-6-гало-9β,10α-стероиды, как это раскрыто BE 652597 и US 3304314. Далее патент US 3555053 описывает получение 6-гало- или 6-алкил-9β,10α-стероидов. Некоторые 6,7-дегидро-9β,10α-стероиды описаны Westerhof и Hartog [1965]. Дальнейший синтез ретростероидов раскрыт Hartog и др. [1972] для некоторых 16-метилен-17α-ацетокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион производных и Halkes и др. [1972] для 1,2β-метилен-17α-ацетокси-9β,10α-прегнанов. Производные 18-алкил-9β,10α-прегнанов раскрыты Van Moorselaar и Halkes [1969]. Однако все до сих пор известные ретростероидные вещества обладали прогестативной активностью, то есть являлись агонистами прогестеронового рецептора.
Новые ретростероиды, обладающие гормональной активностью, несущие гидроксильную или этерифицированную гидроксильную группу в C11 положении, были описаны в GB 1111320. Специально описанные соединения или промежуточные соединения представляют собой:
11β-гидрокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион (CAS No. 22413-62-3),
11β-гидрокси-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион (CAS No. 10007-43-9), и
11β-17α-дигидрокси-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион (CAS No. 4076-89-5),
которые так же, как и их 11β-ацетокси производные, были получены из соответствующих 11β-гидрокси соединений химической модификацией.
Так как вещества, являющиеся агонистами, частичными агонистами (т.е. частичными активаторами и/или тканеспецифичными активаторами) и/или антагонистами прогестероновых рецепторов, преимущественно демонстрирующими сбалансированный агонистический/антагонистический профиль, являются исключительно ценными продуктами для улучшения женского здоровья, то существует необходимость разработки новых соединений, которые терапевтически модулируют прогестероновый рецептор, оказывая агонистическое и/или антагонистическое действие, которое проявляется с более высокой рецепторной специфичностью для прогестерона (по сравнению с другими рецепторами стероидных гормонов), чем для уже известных веществ, и которые обладают высокой тканеспецифичностью (например, избирательность в отношении ткани матки перед тканью молочной железы). Ретростероидные соединения, несущие разные заместители в 11β-положении, могут выполнить эту задачу. Однако, несмотря на соединения, раскрытые в GB 1111320, никакие другие производные ретростероидов, несущие заместители в C11β-положении, до сих пор не были раскрыты.
Главный аспект настоящего изобретения заключается в том, чтобы раскрыть ключевые соединения-интермидиаты, которые полезны для получения новых стероидных соединений с 9β,10α-конформацией, несущих различные заместители в C11β-положении, так же как и способ получения этих интермедиатов с высоким выходом и качеством. Эти ключевые интермедиаты несут гидроксильную группу в C11β-положении стероидного ядра и включают в себя 11β-гидрокси-дидрогестерон, 11β-гидрокси-9β,10α-прогестерон их производные.
Микробиологическое превращение - гидроксилирование стероидного ядра по C11 положению.
Микробиологическое превращение стероидных соединений, включающее гидроксилирование стероидного ядра по C11 положению, является хорошо известным из уровня техники процессом. Обычно, штаммы грибов видов Aspergillus или Rhizopus используются для 11α-гидроксилирования стероидов с 9β,10α-конформацией (как раскрыто, например, в Европейском патенте ЕР 0028309, и патенте США No. 6046023). 11β-Гидроксилирование стероидов с 9β,10α-конформацией достигается использованием грибов рода Curvularia (патент США No. 4353985), или в особенности Curvularia lunata (патент США No. 4588683) или Cochliobolus lunatus [Zakelj-Mavric и др., 1990].
Гидроксилирование ретростероидов.
Публикации van der Sijde и др. [1966] посвящены С11-гидроксилированию ретростероидов, например 9β,10α-прогестерона, с помощью грибного штамма Aspergillus ochraceus NRRL405. Однако гидроксилирование ретростероидного ядра затрагивает 11α-положение.
Другая публикация Saucy и др. [1966] также описывает микробиологическое гидроксилирование ретростероидов по C11 положению с помощью грибного штамма Aspergillus ochraceus для 11α-гидроксилирования, но не было описано микроорганизма для 11β-гидроксилирования.
Описание изобретения GB 1111320 раскрывает микробиологическое гидроксилирование некоторых специфических ретростероидов по C11 положению. В частности, изобретение относится к способу производства некоторых 11β-гидрокси-ретростероидов, включающему переработку соответствующего незамещенного по 11 положению ретростероида микроорганизмом из таксономических подгрупп несовершенных грибов, аскомицетов, фитомицетов, базидиомицетов или актиномицетов. Специфические штаммы вышеупомянутых таксономических подгрупп, наиболее пригодные для процесса гидроксилирования, включают: Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Helicostylum piriforme, Penicillium canescens, Mucor griseocyanus, Mucor corymbifer, Choanephora circinans, Nocardia lurida (=Amycolatopsis orientalis subsp. lurida), Streptomyces rimosus и Streptomyces fradiae. Приведенные примеры демонстрируют гидроксилирование 9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона (дидрогестерона), 9β,10α-прегна-4-ен-3,20-диона (9β,10α-прогестерона) или 17α-гидрокси-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-диона, т.е. ретростероидов, относящихся к дидрогестерону или наиболее близких к нему, при использовании следующих штаммов: Nocardia lurida, Penicillium canescens, Gliocladium catenulatum, Helicostylum piriforme, Choanephora circinans, Streptomyces fradiae, Mucor griseocyanus, и Streptomyces rimosus. Главным недостатком описанного процесса ферментации являлся сравнительно малый выход целевого продукта ферментации, который обычно лежит между 2 и 10%, в одном примере выше 30%.
Amycolatopsis mediterranei
Бактериальный вид Amycolatopsis mediterranei также известен, как Streptomyces mediterranei и Nocardia mediterranei [Margalith и Beretta, 1960, и Lechevalier и др. 1986]. Amycolatopsis mediterranei принадлежит к классу актинобактерий, к таксономической подгруппе актиномицетов, к роду Amycolatopsis. Несколько штаммов этого вида доступны из коллекций культур "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", DSMZ (адрес: Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany), известные как DSM 43304 (также депонируются в других коллекциях культур как АТСС 13685, CBS 121.63, CBS 716.72, DSM 40501, IFO 13415, IMET 7651, ISP 5501, JCM 4789, KCC S-0789, LBG A 3136, NBRC 13142, NBRC 13415, NCIB 9613, NRRL B-3240, RIA 1376, или VKM Ac-798), DSM 40773 и DSM 46096 (также депонируются в других коллекциях под названиями АТСС 21411, IMET 7669).
Штаммы Amycolatopsis mediterranei широко применимы для микробиологического производства рифамицина В, вещества, активного как антибиотик; однако эти виды до сих пор не были описаны для гидроксилирования стероидных соединений и, в частности, для C11β-гидроксилирования ретростероидов.
Способ очистки стероидов от микробиологических культур
Продукт ферментативного процесса обычно отделяется от среды, содержащей культуру, с помощью многостадийного процесса фильтрации (устранение мицелия), экстракции, необязательно, хроматографической очистки, кристаллизации и последующей перекристаллизации с целью получения чистого соединения. Например, продукты микробиологического гидроксилирования по патенту GB 1111320 выделяются из порции ферментатирующей среды путем тщательно разработанной процедуры, включающей несколько жидкость-жидкостных экстракций и последующую колоночную хроматографию или перекристаллизацию для более глубокой очистки с использованием токсичных и/или вредных для здоровья органических растворителей, таких как бензол или четыреххлористый углерод.
Следовательно, существует необходимость оптимизации способа микробиологического 11β-гидроксилирования ретростероидных соединений, и, в частности, идентификации бактериального вида и соответствующих штаммов, которые способны производить процесс гидроксилирования с высокой производительностью и эффективностью.
Раскрытие изобретения.
Цель данного изобретения состояла в том, чтобы разработать новый микробиологический способ простого и количественного получения ретростероидных соединений, несущих C11β-гидроксильную группу, которые являются ключевыми интермедиатами для синтеза новых соединений, модуляторов прогестеронового рецептора, на основе ретростероидного ядра известного агониста прогестерона Дидрогестерона. Поэтому одним из объектов настоящего изобретения является идентификация микробиологического вида, который способен к C11β-гидроксилированию идентичных и сходных с Дидрогестероном ретростероидов с высокой производительностью и выходом.
Неожиданно было обнаружено, что при использовании бактериального микроорганизма вида Amycolatopsis mediterranei 9β,10α-стероидное (ретростероидное) соединение общей формулы (I)
где
R1 и R4 вместе представляют собой кислород, или
1
4
1
4
R4 представляет собой β-ацетильную группу и R1 выбрана из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу, может быть превращено в его соответствующий 11β-гидроксил аналог.
В одном из вариантов, 9β,10α-стероидное (ретростероидное) соединение, используемое в вышеупомянутом превращении, представлено соединением с формулой (II)
где
1
4
1
4
R1 выбран из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу.
Другой вариант относится к использованию для вышеупомянутой трансформации бактериальных микроорганизмов вида Amycolatopsis mediterranei, штаммы которого выбраны из группы, содержащей Amycolatopsis mediterranei LS30, DSM 43304 (соответствующих АТСС 13685, CBS 121.63, CBS 716.72, DSM 40501, IFO 13415, IMET 7651, ISP 5501, JCM 4789, KCC S-0789, LBG A 3136, NBRC 13142, NBRC 13415, NCIB 9613, NRRL B-3240, RIA 1376 или VKM Ac-798), DSM 40773 и DSM 46096 (соответствующих АТСС 21411, IMET 7669). Предпочтительно использовать бактериальный штамм Amycolatopsis mediterranei LS30, депонированный как DSM 17416 в "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", DSMZ (адрес: Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany).
Микроорганизм, использованный для указанного микробиологического превращения, является бактериальным штаммом Amycolatopsis mediterranei LS30, который был впервые идентифицирован и не был ранее описан в литературе. Бактериальный штамм Amycolatopsis mediterranei LS30 был охарактеризован как принадлежащий к виду Amycolatopsis mediterranei, основываясь на макроскопических и микроскопических признаках (морфология колоний), на хемотаксономической классификации (строение жирных кислот) и на сравнении последовательности 16S рРНК. Следовательно, настоящее изобретение также относится к бактериальному штамму Amycolatopsis mediterranei LS30, депонированному как DSM 17416 в "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", DSMZ (адрес: Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany).
При превращении ретростероидного соединения с общей формулой (I), его 11β-гидроксильный аналог будет получен в качестве продукта превращения, представленного следующей общей формулой (IV)
где
1
4
1
4
R1 и R4 вместе представляют собой кислород, или R4 представляет собой β-ацетильную группу и R1 выбран из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу.
Если превращению подвергается ретростероидное соединение общей формулы (II), то его 11β-гидроксильный аналог будет получен в качестве продукта превращения, представленного следующей общей формулой (V)
где
1
4
1
4
R1 выбран из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу.
Указанные соединения с общими формулами (IV) и (V) представляют собой требуемые ключевые интермедиаты, удобные для получения новых стероидных соединений с 9β,10α-конформацией, несущих различные виды заместителей в C11β положении.
Некоторые конкретные соединения, подпадающие под общую формулу (V), уже известны, например 11β-гидрокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион (CAS No. 22413-62-3), 11β-гидрокси-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион (CAS No. 10007-43-9), и 11β-17α-дигидрокси-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион (CAS No. 4076-89-5); однако остальные соединения с общей формулой (V) являются новыми и представляют собой часть настоящего изобретения.
Следовательно, еще одним объектом настоящего изобретения является получение 11β-гидрокси-ретростероидных соединений общей формулы (V)
где
1
4
1
4
а) R1 выбран из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и R2 и R3 вместе формируют метиленовую группу, или
1
4
1
4
б) R1 выбран из группы, состоящей из -O-(C-C)алкил и -O-CO-(C-C)алкил, и R2 и R3 оба представляют собой водород, или
в) R1 представляет собой -ОН, R2 и R3 оба представляют собой водород, и соединение представляет собой 4,6-диен.
В одном из вариантов, 11β-гидрокси-ретростероидное соединение-интермедиат выбрано из группы, состоящей из
11β-гидрокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона,
17α-этокси-11β-гидрокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона,
17α-этокси-11β-гидрокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона,
11β-17α-дигидрокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона,
11β-17α-дигидрокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона,
11β-гидрокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-диона,
17α-этокси-11β-гидрокси-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-диона,
17α-этокси-11β-гидрокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-диона, и
11β-17α-дигидрокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-диона.
Так как целью настоящего изобретения является разработка нового и улучшенного способа выработки указанных соединений-интермедиатов, еще одним аспектом настоящего изобретения является способ микробиологического превращения in vitro ретростероидного соединения общей формулы (I)
где
R1 и R4 вместе представляют собой кислород, или
1
4
1
4
R4 представляет собой β-ацетильную группу и R1 выбран из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу;
в его соответствующий 11β-гидроксильный аналог, в процессе которого осуществляется взаимодействие в среде, в которой происходит культивирование, соединения формулы (I) с бактерией вида Amycolatopsis mediterranei, способной к осуществлению превращения соединения формулы (I) в соответствующий 11β-гидроксильный аналог.
В одном из вариантов настоящее изобретение относится к способу микробиологического превращения in vitro ретростероидного соединения общей формулы (II)
где
1
4
1
4
R1 выбран из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу,
в соответствующий 11β-гидроксильный аналог, в процессе которого осуществляется взаимодействие соединения формулы (II) в (подходящей) среде, в которой происходит культивирование, с бактерией вида Amycolatopsis mediterranei, способной к осуществлению превращения соединения формулы (II) в соответствующий 11β-гидроксильный аналог.
В одном из вариантов настоящее изобретение относится к способу микробиологического превращения in vitro ретростероидного соединения общей формулы (III)
где
1
4
R1 выбран из группы, состоящей из -O-(C-C)алкил; и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу,
в соответствующий 11β-гидроксильный аналог, в процессе которого осуществляется взаимодействие соединения формулы (III) в (подходящей) среде, в которой происходит культивирование, с бактерией вида Amycolatopsis mediterranei, способной к осуществлению превращения соединения формулы (III) в соответствующий 11β-гидроксильный аналог.
Кроме того, настоящее изобретение позволяет оптимизировать метод отделения целевых 11β-гидрокси-ретростероидных соединений с общими формулами (IV) и/или (V), как указано выше, от жидкой среды, содержащей культуру. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу отделения указанного 11β-гидроксильного аналога от ферментирующей смеси (среды, содержащей культуру) после превращения ретростероидных соединений с общими формулами (I), (II) или (III), как указано выше, с участием бактерий вида Amycolatopsis mediterranei, в соответствии с чем 11β-гидроксильный аналог отделяют от ферментирующей смеси в несколько этапов, состоящих из
а) получения надосадочной жидкости из ферментирующей среды, свободной от бактериальных клеток, фрагментов бактериальных клеток, слизистых субстанций и твердых остатков,
б) контактирования надосадочной жидкости, выбранной из группы, состоящей из надосадочной жидкости, полученной на стадии (а), концентрированной посредством уменьшения объема указанной надосадочной жидкости, и концентрата (ретентата), полученного мембранной фильтрацией указанной надосадочной жидкости, с достаточным количеством неионной семиполярной полимерной адсорбирующей смолы для адсорбции 11β-гидроксильного аналога, содержащегося в надосадочном материале, так что неионная семиполярная полимерная адсорбирующая смола нагружается полученным 11β-гидроксильным аналогом и затем отделяется от остатков надосадочной жидкости;
в) промывания нагруженной адсорбирующей смолы водным раствором с pH по меньшей мере 12, предпочтительно от 12,5 до 14;
г) необязательного промежуточного этапа промывания смолы, при котором нагруженная адсорбирующая смола промывается водой; и
д) контактирования промытой адсорбирующей смолы с достаточным количеством элюента для десорбции адсорбированного на ней 11β-гидроксильного аналога, указанный элюент включает в себя по меньшей мере один смешивающийся с водой органический сольвент, выбранный из группы, состоящей из смешивающихся с водой эфиров, низших алканолов, низших алифатических кетонов или смесей с водой, которые имеют щелочную реакцию и содержат по меньшей мере один смешивающийся с водой органический сольвент, выбранный из группы, состоящей из смешивающихся с водой эфиров, низших алканолов, низших алифатических кетонов, и
е) отделения элюата, содержащего 11β-гидроксильный аналог, от адсорбирующей смолы и концентрации элюата путем уменьшения объема.
Осуществление изобретения
Определения.
Следующие термины, употребляемые здесь, обладают следующими значениями, если иное не оговорено.
Употребляемые здесь термины "включающий" и "содержащий" используются в их открытом, неограниченном смысле.
Слово "соединение" должно пониматься как любые и все изомеры (например, энантиомеры, стериоизомеры, диастереомеры, ротомеры, таутомеры) или любые смеси изомеров, предшественники лекарств, и любые фармакологически приемлемые соли названных соединений, если не оговорено иное.
Если для соединений, солей и подобного употреблено множественное число, это также означает единичное соединение, соль и подобное.
Соединения, описанные в настоящем изобретении, могут содержать по меньшей мере один асимметричный центр в молекуле, например хиральный атом углерода, в зависимости от природы различных заместителей. В случае такого асимметричного центра соединение может быть представлено в виде двух оптически активных стереоизомерных форм или в виде рацемата. Настоящее изобретение включает и рацемические смеси, и изомерно чистые вещества, за исключением случаев, специально оговоренных, или при специальном указании структурной формулы, например для 9β,10α-конформации или для C11β конформации или для C17β-ацетильной группы. Соединения, описанные в настоящем изобретении, могут содержать больше асимметрических центров в молекуле в зависимости от природы различных заместителей. В некоторых случаях асимметрия также может быть обусловлена ограниченным вращением относительно связи, примыкающей к двум ароматическим кольцам специфических соединений. Подразумевается, что все изомеры (включая энантиомеры и диастереомеры), как имеющие асимметричный центр, так и обладающие ограниченным вращением, как описано выше, как отделенные, очищенные или частично очищенные, так и их рацемические смеси, включены в объем настоящего изобретения.
Любые асимметрические атомы углерода могут быть представлены в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации, предпочтительно в (R)- или (S)-конфигурации, которая является наиболее активной. Заместители при двойной связи или кольце могут находится в цис- (=Z-) или транс- (=E-) положении.
Термин "ретростероид" относится к стероидному соединению с 9β,10-конформацией.
Термин "замещенный" означает, что специфическая группа или остаток несет один или более заместителей. Если какая-либо группа может нести несколько заместителей и предусмотрено множество возможных заместителей, заместители независимо выбираются и не должны быть одинаковыми. Термин "незамещенный" означает, что специфическая группа не несет заместителей. Термин "необязательно замещенный" означает, что специфическая группа незамещена или замещена одним или более заместителями.
Термин "гидроксил" или "гидрокси"относится к OH-группе.
1
4
1
4
1
4
3
4
1
4
Термин "алкил" относится к углеводородному радикалу, который может быть линейным, циклическим или разветвленным, с единственным или множественным разветвлением, который может содержать от 1 до 12 атомов углерода. В одном варианте термин "алкил" относится к линейным или разветвленным (с единственным или множественным разветвлением) алкильным цепочкам из 1-4 углеродных атомов и обозначается термином (C-C)алкил. Термин (C-C)алкил относится к таким группам как метил; этил; н-пропил; изопропил; н-бутил; втор-бутил; изобутил и трет-бутил. Алкильная или (C-C)алкильная группа может быть ненасыщенной, образуя такие группы, как, например, винильная, 1-пропенильная, 2-пропенильная (аллильная) и бутенильная. Термин "алкил" относится также циклоалкильным группам, преимущественно цикло(C-C)алкильным, которые относятся к циклопропильным или циклобутильным, и их изомерным формам, таким как метилциклопропильная группа. Циклоалкильная группа также может быть ненасыщенной. Более того, термин (C-C)алкил также включает цикропилметильную группу.
2
Термин "метилен" относится к -CH- руппе.
3
Термин "ацетил" относится к -CO-CH группе.
Нумерация в соединении (номенклатура).
Кроме того, для сохранения единообразия обозначения соединения одинаковой структуры, но с разными заместителями, описанные здесь вещества называются согласно следующим главным принципам. Предусмотрена система нумерации для расположения заместителей в подобных соединениях.
Атомы углерода стероидного ядра производных прегнана нумеруются согласно следующей схеме:
Дидрогестерон - 9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион - обладает следующей формулой (I-1):
Ретропрогестерон - 9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион - обладает следующей формулой (I-3):
Общие структурные формулы обозначены римскими цифрами I, II, III и так далее. Интермедиаты обозначены той же римской цифрой, как их соответствующие общие структуры, и дополнительно буквой или цифрой, например I-2 представляет собой производное, находящееся в рамках общей формулы I. Соединения по настоящему изобретению обозначены №1, №2 и т.д.
Аббревиатуры и акронимы
BV - объем слоя
D - дни(ей)
DCM - дихлорметан
DDQ - 2,3-дихлор-5,6-дицианохинон
DM - сухой материал
DMSO - диметилсульфоксид
DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур)
h - ч (час(ы))
HPLC - ВЭЖХ (высокопроизводительная жидкостная хроматография)
LAH - алюмогидрид лития
Min - мин (минуты)
NMMO - N-метилморфолин-N-оксид
rpm - оборотов в минуту
Реагент с общей формулой (I)
9β,10α-стероидное (ретростероидное) соединение с общей формулой
где
R1 и R4 вместе представляют собой кислород, или
1
4
1
4
R4 представляет собой β-ацетильную группу, и R1 выбран из группы, состоящей из водорода, -OH, -O-(C-C)алкил, и -O-CO-(C-C)алкил, и
R2 и R3 оба представляют собой водород или вместе формируют метиленовую группу,
и используемое в качестве исходного материала в способе, описанном в настоящем изобретении, может быть получено из известных ретростероидов при помощи известных химических реакций и процедур. Тем не менее, следующие основные препаративные методы, используемые в настоящем изобретении, представлены с целью облегчения синтеза вещества. Все возможные сочетания этих методов идентичны описанным, если обратное специально не отмечено ниже.
Очевидно, что некоторые из указанных в изобретении веществ, с их заявленными возможными функциональными группами не могут быть получены каждым из указанных ниже методов. В рамках каждого метода возможные заместители могут появиться в реагентах или интермедиатах, которые могут играть роль защитных или принимающих другое участие в синтезе групп. Используемые методы хорошо известны из уровня техники, эти группы вводятся и/или удаляются в схемах синтеза, по которым получают соединения настоящего изобретения.
Последовательность стадий главной схемы синтеза соединений настоящего изобретения показана ниже. В каждой из схем R группы (например, R1, R2 и так далее) относятся к специфическим заместителям, структура которых указана в описании и примерах.
Схема I
Схема I демонстрирует удобную реакцию замещения коммерчески доступного дидрогестерона (9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона) формулы (I-1) по положению 1,2 метиленовой группой. Введение 1,2-метиленовой группы осуществлено с помощью хорошо известной процедуры, как описано Halkes и др. [1972] и в патенте США No. 3937700 для 17α-гидрокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона, с помощью дегидрирования и последующей реакции с метилидом диметилсульфония.
Схема II
По Схеме II, 1,2 метилен замещенный 9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион общей формулы 1-1,2; превращают в соответствующий 9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион (9β,10α-прогестерон) общей формулы 1-3,4; в восстанавливающих условиях, как это раскрыто в патенте США No. 3555053.
Схема III
1
4
1
4
Введение дополнительной боковой цепи в С17 положение - как показано на Схеме III - с целью получения соединений общей формулы (I-А), где R11 представляет собой -H, -(C-C)алкил, или -CO-(C-C)алкил, может быть осуществлено по методам и процедурам, описанным Halkes и van Moorselaar [1969] и в патентах США №№ 3555053 и 3937700 путем введения 17α-гидроксигруппы и последующего образования простого или сложного эфира с гидроксильной группе при 17 атоме углерода. С целью получения соединений общей формулы (I-B), двойная связь в C6-C7 положении может быть повторно образована дегидрированием.
Функционализация C17 положения начинается с введения -OH группы в C17-альфа положение: например, (9β,10α)-прегна-4-ен-3,20-дион формулы I-3 или I-4 может быть восстановлен с использованием подходящих восстановительных агентов, таких как алюмогидрид лития (LAH), для получения соответствующего 3,20-диола. Позже 3-гидроксильная группа может быть окислена с использованием селективного окислительного агента, такого как 2,3-дихлор-5,6-дицианохинон (DDQ) в ароматическом растворителе или диоксидом марганца. Образующийся 20-гидрокси-(9β,10α)-прегна-4-ен-3-он далее дегидратируется путем тозилирования тозилхлоридом в пиридине. Последующая обработка полученного тозильного производного кипячением в пиридине приводит к смеси цис- и транс-изомеров 17,20 ненасыщенных производных. Последнее соединение далее окисляется под действием аминоксида, такого как N-метилморфолин-N-оксид (NMMO), в качестве стехиометричного окислительного агента с добавлением перекиси водорода и в присутствии тетраоксида осмия, взятого в каталитическом количестве, для получения соответствующего 17α-гидрокси-9β,10α-прегна-4-ен-3,20-диона.
2
Дальнейшая модификация данного соединения подчинена реакциям образования простого или сложного эфира по гидроксильной группе при C17, в соответствии с описанием в патенте Бельгии BE 577615 или в патенте США No. 3937700. Удобными ацилирующими агентами являются карбоновые кислоты, ангидриды карбоновых кислот, галогенангидриды карбоновых кислот в присутствии таких катализаторов, как п-толуолсульфоновая кислота, ангидрид трифторуксусной кислоты, гидрохлорид пиридина или в присутствии связывающего вещества, такого как органическое основание, например коллодий. Реакция ацилирования проводится в присутствии углеводородных растворителей, таких как бензол или толуол. Температура, при которой происходит реакция, может варьировать от комнатной до температуры кипения используемого растворителя. Если исходное соединение содержит, кроме 17-OH группы, одну или более OH-групп, то они тоже будут этерифицированы, поэтому эти OH-группы должны быть предварительно защищены. Альтернативно реакция алкилирования может проводиться при использовании алкилгалогенов в присутствии AgO или при использовании дигидропирана или дигидрофурана в слабо кислой, слабо щелочной или нейтральной среде.
Наконец, полученные соединения могут быть снова дегидрированы с получением 4,6 ненасыщенных производных общей формулы I-B.
Схема IV
По Схеме IV 1,2 метилен замещенный 9β,10α-прегна-4-(6-ди)-ен-3,20-дион общей формулы I-1,2,3,4 может быть далее превращен в соответствующий 18-метил-9β,10α-андро-4-(6-ди)-ен-3,17-дион общей формулы I-C последовательным восстановлением, окислением и элиминированием, следующим за озонолизом 18-метил-9β,10α-прегна-4,6,17(20)-триен-3-он интермедиата, как описано Halkes и van Moorselaar [1969].
Процесс микробиологического 11β-гидроксилирования
Главная характеристика
Процесс протекает по обычному пути. С этой целью готовится стерилизованная питательная смесь (=среда) для данного бактериального штамма, и на данную смесь высевается бактериальный штамм, обычно путем отделения некоторого количества колоний от агара и получения их суспензии, и последующей культивации. Обычно вторичная прекультура может быть приготовлена заражением (инокуляцией) новой питательной смеси аликвотой суспензии, содержащей культуру. Прекультуру, приготовленную таким способом, затем добавляют в ферментер, который также содержит подходящую питательную смесь. Предпочтительно добавить исходное вещество - соединение общей формулы I - в ферментер по окончании фазы роста культуры штамма так, чтобы могла происходить реакция - согласно изобретению - превращения соединения общей формулы I в соответствующее 11-гидроксилированное соединение общей формулы IV. После окончания реакции, смесь веществ очищается обычным способом или способом согласно данному изобретению с целью отделения искомого 11β-гидроксилированного ретростероида.
Штаммы Amycolatopsis mediterranei
Способ по настоящему изобретению основан на открытии способности микроорганизмов вида Amycolatopsis mediterranei к введению 11β-гидроксильной группы в 11-незамещенные 9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион и 9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион производные. Эти бактериальные штаммы, получаемые из природных материалов, таких как почва, также доступны из открытых коллекций культур, способны использовать ретростероиды в качестве источника углерода или игнорировать эти стероиды в присутствии других ассимилируемых источников углерода.
Следовательно, способ производства ретростероидов формул IV или V по настоящему изобретению, как описано выше, включает ферментацию соответствующего 11-незамещенного ретростероида бактериями вида Amycolatopsis mediterranei. Примерами специфических штаммов Amycolatopsis mediterranei, которые удобны для осуществления способа, описанного в данном изобретении, могут служить, как новый открытый штамм LS30, так и доступные из открытых коллекций культур штаммы, такие как DSM 43304 (соответствующий АТСС 13685, CBS 121.63, CBS 716.72, DSM 40501, IFO 13415, IMET 7651, ISP 5501, JCM 4789, КСС S-0789, LBG А 3136, NBRC 13142, NBRC 13415, NCIB 9613, NRRL В-3240, RIA 1376, VKM Ас-798), DSM 40773, и DSM 46096 (соответствующий АТСС 21411, IMET 7669). В одном из вариантов штамм Amycolatopsis mediterranei LS30 представляет собой штамм Amycolatopsis mediterranei, депонированный в DSMZ ("Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen") под обозначением DSM 17416.
Мутанты штаммов Amycolatopsis mediterranei, полученные методами молекулярной биологии, химическими методами (например, с помощью обработки нитритами) или физическими методами (например, облучением) также могут быть использованы в способе по данному изобретению. В другом случае фермент или ферменты, которые осуществляют ферментацию 11-незамещенных ретростероидов, также могут быть взяты из бактериальной культуры или из питательной среды и приведены в контакт со стероидным субстратом в отсутствие живых клеток. Предпочтительно использование бактериальных штаммов как таковых во избежание дополнительных производственных стадий. Бактериальные штаммы или изолированные от них ферменты при желании могут быть иммобилизованы на подходящем субстрате.
Способ по настоящему изобретению осуществляется в условиях, подходящих для 11β-гидроксилирования с помощью актиномицетов; например, как это описано в патенте GB 1111320.
Питательный раствор (питательная среда)
Штаммы Amycolatopsis mediterranei, используемые в способе по настоящему изобретению, могут культивироваться на твердых и жидких питательных растворах (средах), которые содержат источник ассимилируемого азота, источник ассимилируемого углерода и неорганические соли.
Удобными источниками ассимилируемого азота являются соединения животного, растительного, микробного происхождения, а также неорганические вещества; такие как мясные экстракты, пептоны, зерновые настои, экстракты дрожжей, глицин и нитрат натрия или их смеси. Удобными источниками ассимилируемого углерода являются все сахара и их полимеры (например, крахмал, декстран, сахароза, мальтоза и глюкоза) и аминокислоты, протеины, пептоны, жирные кислоты, жиры и стероиды (особенно ретростероиды) также как и их смеси. Предпочтительно, чтобы питательная смесь содержала экстракт дрожжей в количестве до 2,5% (по массе), предпочтительно от 0,2-2% источника азота и глюкозу в количестве до 20% (по массе), предпочтительно от 5-10% источника углерода.
3+
3
3
Смесь может содержать элементы в следовых количествах (присутствующих естественно или добавленных), которые доступны из минеральных или органических ингредиентов. Особенно желательно присутствие железа. Предпочтительно, чтобы питательная смесь содержала железо в форме ионов Fe в концентрации от 0 до 200 мг/мл (FeCl), предпочтительно около 50 мг/мл FeCl. Сера может быть представлена в форме органических или неорганических соединений, которые представлены в других компонентах смеси или могут быть специально добавлены. То же верно для фосфора, но в основном он представлен в виде неорганической соли.
Исходя из потребностей или желания, к смеси могут быть добавлены дополнительные факторы роста или стимуляторы, такие как витамины (например, биотин или пиридоксин) или ауксины (например, индолилуксусная кислота).
С целью защиты от инфекций среда может быть стерилизована, и, дополнительно, содержать материалы, которые могут подавлять рост, к примеру, бактерий.
Для больших объемов смеси, содержащих культуру, особенно в ферментерах, в смесь может быть добавлен агент, препятствующий образованию пены. Возможно измерение уровня пены антипенным электродом и автоматическое добавление антипенного агента. В качестве антипенных агентов можно использовать антипенные агенты на основе кремния или такие сурфактанты, как PEG (полиэтиленгликоль) или PPG (полипропиленгликоль).
Культуральные условия (уровень pH, температура, время инкубации)
Перед высеванием уровень pH питательной смеси желательно поддерживать на определенном уровне: для роста Amycolatopsis mediterranei оптимален уровень pH от 5 до 8, предпочтительно от 7,0 до 7,5. Температура культивации совпадает с предпочтительной температурой роста Amycolatopsis mediterranei, которая составляет 18-40°C, предпочтительно 25-35°C и наиболее предпочтительно 28-32°C.
Как правило, однако, Amycolatopsis mediterranei требуется определенный предростовый период перед началом процесса микробиологического превращения. Обычно бактерии культивируются до 96 часов, предпочтительно примерно от 12 до 72 часов, еще более предпочтительно примерно от 24 то 48 часов. Однако действительная фаза роста может варьировать в зависимости от объема и возраста прекультуры, использованной для высевания, и от объема культуральной смеси. Предпочтительно, чтобы бактерии находились в средней или поздней фазах их экспоненциального роста, когда начинается процесс трансформации, вызванный добавлением соединения формулы (I).
Может быть использована техника погруженной ферментации. Предпочтительно, чтобы культуры росли в условиях аэрации (в том числе встряхиванием емкости, содержащей ферментирующую смесь, роторной мешалкой на некоторой скорости, или - в ферментере - нагнетанием и пропусканием стерильного воздуха через ферментирующую смесь).
Добавление 11-незамещенного ретростероида (9β,10α-стероида) (="реагент" или "субстрат")
11-Незамещенный ретростероид формулы I может быть добавлен в партию ферментирующей смеси на любом этапе роста Amycolatopsis mediterranei. Предпочтительно, однако, дать Amycolatopsis mediterranei некоторый предростовый период, как указано выше, и в первый раз добавить 11-незамещенный ретростероид через 12 или 96 часов после начала ферментации. Предназначенный для превращения 11-незамещенный ретростероид может быть добавлен любым подходящим образом, но предпочтительно таким путем, чтобы была обеспечена максимальная площадь соприкосновения между 11-незамещенным ретростероидом и бактериями. Например, 11-незамещенный ретростероид может быть добавлен в культуру в виде порошка при механическом диспергировании среды или в форме эмульсии, полученной при помощи диспергирующих агентов; или он может быть добавлен в растворе с органическим растворителем, смешивающимся с водой (например, ацетон, пропиленгликоль, гликольмонометиловый эфир, диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид и спирты, такие как метанол или этанол). Однако необходимо следить за тем, чтобы уровень любого растворителя, использованного далее, из-за его вредного воздействия на бактерии, был ниже 1 процента по объему. Получение эмульсии 11-незамещенного ретростероидного субстрата может быть осуществлено, например, путем его распыления в микронизированной форме или его введения в смешивающемся с водой растворителе (таком как метанол, этанол, ацетон, гликомонометиловый эфир, диметилформамид, диметилсульфоксид) под сильной турбулентностью в воду (преимущественно декальцинированную), которая содержит обычные вспомогательные эмульгирующие агенты. Используемые вспомогательные эмульгирующие агенты включают неионные эмульгаторы, такие как, например, аддукты этиленоксида, эфиры жирных кислот, или полигликоли, но не ограничиваются ими. Предпочтительно растворить реагент (11-незамещенный ретростероид) в ДМСО в концентрации до 40 мг/мл, и затем после стерилизации добавить в среду в стерильных условиях.
Концентрация добавленного 11-незамещенного ретростероида оказывает огромное влияние на выход и эффективность реакции ферментации. Вследствие сравнительно низкой растворимости соединений общих формул (I) и (II) в воде концентрация реагентов и продуктов не должны превышать некоторый уровень. В зависимости от возраста бактериальной культуры и растворимости используемого реагента можно добавить около 1 грамма реагента на литр питательного раствора; однако предпочтительно добавить от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг реагента на литр питательной среды, и еще более предпочтительно между 100-250 мг на литр. Наиболее предпочтительно, чтобы количество изначального стероидного соединения не превышало уровня 150 мг на литр ферментирующей среды. Следовательно, необходимо также следить, чтобы количество требуемого гидроксилированного продукта не превышало уровень в 1 г на литр питательной среды; предпочтительно, чтобы продукт находился в количестве от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг на литр и еще более предпочтительно между 100-250 мг на литр ферментирующего раствора. Наиболее предпочтительно, чтобы количество гидроксилированного продукта не превышало уровня в 150 мг на литр ферментирующего раствора.
В одном из вариантов, все количество 11-незамещенного ретростероидного соединения было добавлено сразу или за период времени от 1 до 5 часов (то есть за небольшой период времени) в начале процесса превращения.
В альтернативном варианте, количество 11-незамещенного ретростероидного соединения добавлялось в течение продолжительного времени полного периода превращения. Например, 11-незамещенный ретростероид добавляли при культивации в концентрации от 1 до 20 мг в час на литр питательного раствора (мг/ч/л). Предпочтительно при культивации добавлять 11-незамещенный ретростероид в концентрации от 2 до 5 мг в час на литр питательного раствора (мг/ч/л).
Условия трансформации.
Превращение обычно происходит при тех же значениях pH и той же температуре, которые требуются Amycolatopsis mediterranei для роста. Однако, в некоторых случаях, оптимум температуры и/или pH для роста может не быть оптимальными для гидроксилирования 11-незамещенных ретростероидов и должен быть адаптирован. Время, необходимое для превращения 11-незамещенного ретростероида до некоторой степени меняется, в зависимости от порции ферментирующей смеси, режима операции и индивидуальных особенностей используемых штаммов Amycolatopsis mediterranei, но в общем счете период лежит в рамках от 2 до 172 часов. Предпочтительно, время превращения лежит между приблизительно 12 и 96 часами, и еще более предпочтительно между 36 и 60 часами.
2
2
2,max
Процесс ферментации обычно протекает в аэробных условиях, предпочтительно, чтобы относительное насыщение смеси кислородом (O) pO/pO регулировалось в интервале от приблизительно 5% до приблизительно 95%, предпочтительно от приблизительно 20% до приблизительно 80%, еще более предпочтительно от приблизительно 30% до приблизительно 75%, и наиболее предпочтительно от приблизительно 40% до приблизительно 70%.
2
Ход превращения может быть определен для каждой порции ферментирующей смеси с помощью обычных аналитических методов, таких как тонкослойная хроматография, ультрафиолетового поглощения или HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) для проб, отбираемых из порции ферментирующей смеси. Более того, ход процесса превращения отслеживается с помощью анализа таких параметров, как значение pH, температура, относительное насыщение O, содержание глюкозы и т.д.
Специфические детали фазы роста и процесса превращения, приводящего к 11β-гидрокси-ретростероиду общей формулы IV или V приведены в примерах ниже. Оптимальная концентрация субстрата, время добавления субстрата и длительность превращения зависят от структуры 11β-незамещенного ретростероида формулы I, II или III и в конце концов также от индивидуальности штамма Amycolatopsis mediterranei, использованного для реакции гидроксилирования. Эти изменяющиеся факторы могут быть легко определены в каждой конкретной реакции гидроксилирования с помощью обычной предварительной экспериментальной экспертизы, очевидной среднему специалисту в данной области техники.
Индукция
Скорость превращения и выход продукта могут быть увеличены путем индуцирования требуемых ферментов перед добавлением 11-незамещенного ретростероида. Любой стероид, включая нормальные стероиды, такие как эстрадиол и тестостерон, могут быть использованы в качестве индукторов ферментов. Однако, те стероиды, которые являются более водорастворимыми, чем предназначенный для превращения субстрат, предпочтительны в качестве индукторов ферментов. Количество и время добавления индукторов не критично, хотя обычно добавляют от приблизительно 1 до 10 процентов по весу от нормального количества стероидов в смеси.
Дополнительная возможность для увеличения выхода 11β-гидрокси ретростероидов формул IV или V состоит в добавлении цитотоксичных веществ, таких как 2,4-динитрофенола, или цианида калия, или антибиотиков, таких как хлоромицетин, в порцию ферментирующей смеси, в которой уже присутствуют ферменты, необходимые для 11β-гидроксилирования.
Отделение гидроксилированного ретростероидного продукта
После полного превращения гидроксилированный ретростероид отделяется от порции ферментирующей смеси. Предпочтительно, чтобы порция ферментирующей смеси прежде всего разделялась на надосадочную жидкость и клеточный материал, остатки разрушенных бактерий, и другие твердые частицы с помощью известных способов разделения, таких как седиментация и декантация, разделение, фильтрация или центрифугирование, которые более детально описаны ниже. Возможным методом эффективного отделения является экстракция с помощью растворителя для стероидов, который способен смешиваться с водой (например, этилацетат, метиленхлорид, хлороформ, метилизобутилкетон, тетрахлорметан, диэтиловый эфир, трихлорэтилен, спирты, бензол и гексан). Клеточная субстанция также может быть разделена с помощью растворителей, указанных выше, и также экстрагирована с помощью смешивающихся с водой растворителей (например, ацетон, диметилсульфоксид и этанол). Стероиды, полученные в результате экстрагирования, могут быть очищены перекристаллизацией, хроматографией или с помощью противоточного распределения и отделены от нежелательных побочных продуктов процесса ферментации.
Предпочтительно, чтобы 11β-гидрокси-ретростероиды формул IV или V отделялись от порции ферментирующей смеси с помощью колоночной хроматографии на полуполярной (семиполярной) неионной адсорбирующей смоле. Сходный метод для отделения сопряженных эстрогенов из мочи беременной кобылы (PMU) был раскрыт в международной заявке WO 98/08526 и был адаптирован для применения в данном изобретении.
На первом этапе ферментирующий бульон очищается известным способом от любых твердых частиц, бактериальных клеток и их компонентов, и любых слизистых веществ. Преимущественно, твердые частицы отделяются с помощью известных методов, например декантации, расслаивания и/или фильтрации. Ферментирующий бульон может быть, например, пропущен через известную разделительную аппаратуру, например сепаратор, фильтрующий прибор или седиментатор. В качестве разделяющей аппаратуры могут быть использованы коммерчески доступные сепараторы, например камерный или форсуночный сепараторы. При желании также могут быть использованы аппараты для микрофильтрации или ультрафильтрации, и при их использовании возможно получить свободную от бактерий и одновременно фильтрованную надосадочную жидкость. В другом случае для разделения можно использовать центрифугирование.
Надосадочная жидкость стадии а), полученный из нее путем уменьшения объема концентрат или полученный после мембранной фильтрации концентрат (ретентат) могут быть использованы в качестве первоначальной надосадочной жидкости для очистки по способу данного изобретения.
Вместо надосадочной жидкости может быть использован концентрированный ретентат, который может быть получен из надосадочной жидкости известным способом мембранной фильтрации. Твердые частицы, содержащиеся в концентрированной жидкости, и ее состав могут варьироваться в зависимости от специфики использованной ферментирующей культуры и мембраны, использованной для мембранной фильтрации, например от диаметра ее пор и условий фильтрации. Например, при использовании нанофильтрационной мембраны может быть достигнуто содержание стероидов в фильтрате практически без потери концентрации в надосадочной концентрированной жидкости с непрерывным удалением до 50% по весу низкомолекулярных веществ, содержащихся в ферментирующем бульоне. Концентрированная надосадочная жидкость, которая была концентрирована до соотношения приблизительно 1:10, например до соотношения около 1:7, и объем которой может быть уменьшен до приблизительно 1/10, например до 1/7 от начального объема надосадочной жидкости, может быть использована по способу данного изобретения.
2
2
тм
тм
Удобными адсорбентами, используемыми для очистки по настоящему изобретению, являются полимерные адсорбционные смолы. Предпочтительно использовать адсорбционные полуполярные смолы, в частности неионные полуполярные полимерные адсорбционные смолы. Неионные полуполярные полимерные адсорбционные смолы, которые могут быть использованы в этом методе на стадии б), являются пористыми неионными органическими полимерами, которые, в отличие от неполярных гидрофобных полимерных адсорбционных смол, имеют промежуточную полярность (например, с дипольным моментом удельной поверхности смолы в пределах от 1,0 до 3,0, в частности от 1,5 до 2,0 Дебаев) и до некоторой степени более гидрофильную структуру, например полиэфирные смолы. Предпочтительны полуполярные смолы с большими порами, имеющие предпочтительно макросетчатую структуру и приблизительный диаметр пор в промежутке от 50 до 150, предпочтительно от 70 до 100 ангстрем, с удельной поверхностью в промежутке от 300 до 900 м/г, предпочтительно в промежутке от 400 до 500 м/г. Удобно использовать смолы на основе поперечно сшитых алифатических сложных эфиров поликарбоновых кислот, обладающих большими порами, в частности смолы на основе поперечно сшитых полиакриловых эфиров, такие как Amberlite XAD-7, или Amberlite XAD-7-НР, произведенные Rohm и Haas.
По изобретению, адсорбция гидроксилированных ретростероидов на полуполярной адсорбирующей смоле может быть осуществлена контактированием надосадочной жидкости, полученных из нее концентрата или ретентата, полученного из нее мембранной фильтрацией, с адсорбирующей смолой, в этом случае надосадочная жидкость вводится в реактор, содержащий адсорбционную смолу, и приводится там в контакт с адсорбирующей смолой на достаточное для адсорбции стероидного компонента время. После осуществления адсорбции 11β-гидрокси замещенного ретростероида на полуполярной адсорбирующей смоле, адсорбционная смола, нагруженная 11β-гидрокси замещенным ретростероидом, может быть отделена от остатков надосадочной жидкости известным способом. Предпочтительно пропускать надосадочную жидкость через колонку, содержащую адсорбционную смолу, с такой интенсивностью подачи, чтобы время контакта было достаточным для адсорбции стероидного компонента. Подходящей интенсивностью подачи является, например, такая, при которой пропускается от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7, объемных частей надосадочной жидкости на одну объемную часть адсорбирующей смолы в час. Преимущественно проводить адсорбцию при комнатной температуре. Предпочтительно, чтобы подача надосадочной жидкости в реактор контролировалась созданием незначительного повышенного или пониженного давления (то есть по отношению к внешнему давлению). Количество используемой неионной полуполярной адсорбирующей смолы зависит в широких пределах от типа используемой адсорбирующей смолы и количества твердых частиц, содержащихся в надосадочном материале. Например, через одну объемную часть адсорбирующей смолы, например смолы на основе поперечно сшитых полиакриловых эфиров, может быть попущено до 80, предпочтительно от приблизительно 30 до 50 объемных частей неочищенной надосадочной жидкости, без обнаружения заметных количеств стероидов в элюате (прошедшей фракции). При использовании концентрата надосадочной жидкости или ретентата жидкости, несущая способность адсорбирующей смолы уменьшается настолько, насколько была концентрирована надосадочная жидкость. Например, одна объемная часть адсорбирующей смолы на основе поперечно сшитых алифатических сложных эфиров поликарбоновых кислот может быть нагружена количеством концентрированной надосадочной жидкости в отношении от 20 к 80, предпочтительно от 30 к 50, объемных частей неконцентрированной надосадочной жидкости.
Полуполярная адсорбционная смола, нагруженная 11β-гидрокси замещенными ретростероидами, отмывается по стадии в) водным раствором с pH по меньшей мере 12,0, в частности от 12,5 до 14, предпочтительно от 13,5 до 14. Водный раствор инертных основных веществ, растворенных в надосадочной жидкости, достаточно сильных для достижения уровня pH в 12,5, может быть использован как жидкость для промывания. Удобными водорастворимыми основаниями, которые являются инертными по отношению к полуполярной полимерной адсорбирующей смоле, являются преимущественно водорастворимые неорганические основания, такие как гидроксиды щелочных и щелочноземельных металлов, в частности гидроксид натрия. В предпочтительном варианте раствор, используемый для отмывания, содержит только некоторое количество основания, которое требуется для достижения желаемого уровня pH, предпочтительно приблизительно pH 13 или 14. Количество щелочного раствора для отмывания выбирается таким образом, чтобы его было достаточно для отделения всех прочих компонентов, присутствующих в ферментирующем бульоне, без заметного количества 11β-гидрокси замещенных ретростероидов, отмытых с ним. Например, использование от 2 до 10, в частности от 4 до 6, объемов жидкости на объем слоя адсорбирующей смолы признано предпочтительным. В этом случае раствор для отмывания преимущественно пропускается через реактор, содержащий адсорбирующую смолу, с пропускной скоростью от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7, объемных частей раствора для промывания на одну объемную часть адсорбирующей смолы в час.
По стадии г), неионная полуполярная адсорбционная смола, нагруженная 11β-гидрокси замещенными ретростероидами, подвергается вторичному промежуточному отмыванию водой по стадии в). Количество воды для промывания устанавливается индивидуально. Предпочтительно использовать от 2 до 10, более предпочтительно от 4 до 6, объемов жидкости для отмывания на объем слоя адсорбирующей смолы. В этом случае раствор для отмывания преимущественно пропускается через реактор, содержащий адсорбирующую смолу, с пропускной скоростью от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7, объемных частей раствора для промывания на одну объемную часть адсорбирующей смолы в час.
В предпочтительном варианте стадия отмывания г) оптимально проходит при температуре ниже комнатной, в частности при температуре между 0°C и 10°C, так как было показано, что это может значительно уменьшить потери 11β-гидрокси замещенного ретростероида, происходящие на стадии вторичного промежуточного отмывания. Обычно внешняя температура указывается как "комнатная", например, этот термин обозначает температуру между 20°C и 30°C. Очень целесообразно осуществлять данный метод при температурах 0°C или около 0°C. На практике по этой причине рекомендуется работать при температурах немного выше 0°C и удостоверяться путем измерений, что температура соответствует вышеназванной. Могут быть использованы обычные меры для понижения температуры, например использование охлаждаемого реактора, охлажденных материалов и/или охлажденной надосадочной жидкости. С практической точки зрения значения температуры от 0°C до приблизительно 5°C, в частности от 0°C до приблизительно 3°C, могут считаться как температура 0°C или около 0°C.
С целью сделать потери 11β-гидрокси замещенного ретростероидного соединения во время промежуточного отмывания как можно меньше, вода на промежуточной стадии отмывания и/или также вода для отмывания, содержащая щелочь, которая используется на стадии в) процесса, предварительно охлаждается до температур, ниже комнатных, в частности до температуры между 0°C и 10°C. Наиболее подходящими и предпочтительными являются температуры, как сказано выше, от 0°C до приблизительно 5°C, в частности от 0°C до приблизительно 3°C. Предпочтительно работать при температуре 0°C или около 0°C, то есть вода для отмывания, которая содержит щелочь и используется на стадии г), предварительно охлаждается до температур, немного выше 0°C. Охлаждением воды для отмывания, которая содержит щелочь и используется на стадии в), а также предварительным охлаждением или поддержанием охлажденного состояния адсорбирующей смолы, которое уже было достигнуто, предупреждается нежелательное повторное нагревание воды, имеющее место при использовании охлажденной воды для промежуточного отмывания. Предпочтительно, чтобы стадия промежуточного отмывания и процесс в) оба проходили в одних температурных рамках, например при температуре ниже комнатной, в частности при температуре между 0°C и 10°C, или предпочтительно в тех же температурных рамках, что указаны выше.
В вышеуказанном варианте, который осуществляется при температуре ниже комнатной, при желании можно использовать все аппараты, такие как реакторы для получения полуполярной адсорбционной смолы, или реакторы, уже содержащие ее и/или используемую надосадочную жидкость, охлажденные до температуры ниже комнатной, в частности до температуры между 0°C и 10°C, или до температуры, указанной выше в качестве предпочтительной.
На стадии д), отмытая адсорбционная смола, нагруженная 11β-гидрокси замещенными ретростероидами, обрабатывается жидкостью для элюирования в количестве, достаточном для элюирования 11β-гидрокси замещенных ретростероидов, и на стадии е) получается элюат, содержащий 11β-гидрокси замещенные ретростероиды. Жидкость для элюирования, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно содержит главным образом смешивающиеся с водой органические растворители, выбранные из группы, содержащей смешивающиеся с водой эфиры, низшие спирты и низшие алифатические кетоны или смеси смешивающегося с водой органического растворителя и воды, из которой по возможности была добавлена щелочь. Удобными эфирными компонентами жидкости для элюирования могут быть смешивающиеся с водой циклические эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан, но также и смешивающиеся с водой эфиры с открытой цепью, такие как этиленгликольдиметиловый эфир (=моноглим), диэтиленгликольдиметиловый эфир (=диглим) или этилоксиэтилоксиэтанол (=карбитол). Удобными низшими алканолами, включающими смешивающиеся с водой спирты с алкильным радикалом, содержащим от 1 до 4, предпочтительно от 1 до 3, углеродных атомов, являются в частности этанол и изопропанол. Удобными низшими алифатическими кетонами являются смешивающиеся с водой кетоны, содержащие от 3 до 5 углеродных атомов, в частности ацетон. Жидкость для элюирования, в которой в качестве органического растворителя присутствует этанол, является предпочтительной. Предпочтительно использовать в качестве жидкостей для элюирования смеси вышеупомянутых смешивающихся с водой органических растворителей с водой, в которую, по возможности, была добавлена щелочь. Уровень pH таких содержащих воду элюентов находится в промежутках от нейтрального до щелочного уровня вплоть до pH 13 и преимущественно составляет приблизительно от 10 до 12. Растворитель, стабильный при используемом уровне pH, выбирается для использования в жидкости для элюирования. В содержащих воду щелочных жидкостях для элюирования, имеющих pH приблизительно от 10 до 12, низшие алканолы, предпочтительно этанол, наиболее удобны в качестве растворителя. Желаемый уровень pH содержащих воду жидкостей для элюирования достигается путем добавления соответствующего количества водорастворимого инертного основания, предпочтительно неорганического, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, в частности гидроксида натрия. В содержащих воду жидкостях для элюирования отношение объемов смешивающегося с водой органического растворителя к воде может быть от 40:60 до 20:80, предпочтительно приблизительно 30:70. Количество используемого элюента может составлять приблизительно 3 к 10, в частности приблизительно 4 к 6, объемов слоя жидкости для элюирования к объему слоя адсорбирующей смолы. Предпочтительно пропускать жидкость для элюирования через реактор, содержащий адсорбирующую смолу, нагруженную 11β-гидрокси замещенными ретростероидами, с такой скоростью подачи, чтобы время контакта было достаточным для элюирования 11β-гидрокси замещенных ретростероидов. При использовании смеси этанола с водой в объемном отношении 30:70 скорость подачи оптимально составляет, например от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7, объемных частей жидкости для элюирования на 1 объемную часть адсорбирующей смолы в час. При использовании этанола в качестве жидкости для элюирования скорость подачи оптимально составляет, например от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7, объемных частей жидкости для элюирования на 1 объемную часть адсорбирующей смолы в час.
Предпочтительно производить элюирование при температуре от комнатной до приблизительно 60°C, предпочтительно при комнатной температуре. При желании, скорость подачи регулируется при помощи незначительного повышения давления, например при повышении давления на 0,2 бар (относительно внешнего давления), и элюат может собираться в несколько фракций. Содержание искомого 11β-гидрокси замещенного ретростероида и возможное содержание соответствующих 11 незамещенных ретростероидов в индивидуальных фракциях элюата может быть определено известным образом с помощью ВЭЖХ (HPLC).
После элюирования предварительно получается практически свободная от стероидов предварительная фракция, количество которой главным образом соответствует одному объемному слою. В случае осуществления промежуточного этапа отмывания д) уже первая полученная фракция может содержать заметные количества 11β-гидрокси замещенного ретростероида. Однако, большая часть 11β-гидрокси замещенных ретростероидов, например между 80 и 99%, присутствуют в последующих фракциях элюата, количество которых составляет главным образом от 2 до 4. В последующих фракциях содержатся главным образом только следовые количества стероидов. Если следующие фракции все еще имеют значительное содержание стероидов, они могут быть объединены с основным элюатом, содержащим 11β-гидрокси замещенный ретростероид, для дальнейшей обработки.
После этого адсорбционная колонка может быть регенерирована промыванием от 5 до 10 объемами воды.
Основной элюат, отделенный от адсорбирующей смолы ранее описанным способом содержит 11β-гидрокси замещенные ретростероиды. При желании, объем элюата может быть далее уменьшен известным способом, например выпариванием, с целью получить свободный от органического растворителя концентрат. Обычно, 11β-гидрокси замещенный ретростероид выпадает в осадок из концентрированного элюата. В противном случае объем концентрированного элюата может быть далее уменьшен до тех пор, пока 11β-гидрокси замещенные ретростероиды не будут получены в твердом состоянии. Обычно выпавшие в осадок ретростероиды отделяются путем фильтрации и могут быть далее промыты водой. После высушивания, твердые вещества могут быть использованы в последующих реакциях превращения без дополнительной очистки. Однако, при желании, полученные соединения могут быть опять растворены в подходящем органическом растворителе и кристаллизованы из него. В другом варианте, дальнейшая очистка может быть осуществлена посредством флэш-хроматографии.
11β-гидрокси-9β,10α-стероиды (11β-гидрокси-ретростероиды) формулы IV: выход, идентификация и использование.
Выход 11β-гидрокси-ретростероидов формулы IV меняется в зависимости от условий инкубации и ферментации, но, в общем случае, выход желаемого продукта по окончании ферментации составляет более 40%, предпочтительно более 50%, еще более предпочтительно более 60% и в наиболее предпочтительном варианте более 70% от теоретического выхода. Специалист, сведущий в данной области техники, может, используя рутинные экспериментальные приемы, выбрать оптимальные условия, включая выбор наилучшего бактериального штамма и оптимальную концентрацию субстрата, чтобы достичь наилучшего выхода.
Включая предварительный процесс отделения 11β-гидрокси ретростероидов формул IV и V от порции ферментирующей смеси и дополнительную очистку при использовании флэш-хроматографии, суммарный выход 11β-гидрокси ретростероидов формул IV и V лежит в промежутке от приблизительно 40% до приблизительно 60% от теоретически рассчитанного выхода.
Отделение и идентификация продуктов ферментации (то есть 11β-гидрокси ретростероидов формул IV и V) могут быть достигнуты с помощью тонкослойной хроматографии. Удобной цветной реакцией для идентификации является обрызгивание концентрированной серной кислотой после обработки 3% ванилином в этаноле. Различные стероидные продукты дают с серной кислотой цветную реакцию при нагревании. Окрашивание с ванилином в этаноле также является характеристическим. Альтернативно продукты ферментации идентифицируются и количественно определяются с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии).
11β-Гидрокси ретростероиды формул IV и V, полученные в результате ферментации, представляют собой предпочтительные интермедиаты для синтеза новых ретростероидных соединений с заместителями в 11-положении, которые обладают активностью, аналогичной прогестерону и/или противоположной активностью.
Следующие примеры приведены, чтобы проиллюстрировать суть изобретения в деталях без каких-либо ограничений его объема.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Синтез реагентов
1.1. Синтез 1,2-метилен-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона
Коммерчески доступный Дидрогестерон (9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион) формулы I-1 превращался в соответствующий 1,2-метилен-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион (1,2-метилен-дидрогестерон) формулы I-3 с помощью дегидрирования и последующей реакции с диметилсульфоний метилидом, как описано в патенте США No. 3937700.
1.2. 9β,10α-Прегна-4-ен-3,20-дион (9β,10α-прогестерон)
Коммерчески доступный Дидрогестерон (9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион) формулы I-1 превращался в соответствующий 9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион (9β,10α-прогестерон) формулы 1-3 в условиях восстановления.
3
2
2
20
3
Через суспензию 0,75 г Pd/CaCO (5% Pd) в 100 мл толуола был пропущен H. Затем был добавлен раствор 50 г дидрогестерона (160 ммолей) в 550 мл толуола; остатки дидрогестерона были смыты двумя порциями толуола по 50 мл. Гидрогенизация проводилась при сильном взбалтывании, пока не адсорбировалось 3,6 л H (приблизительно 1 ч). Суспензия была отфильтрована через диатомовую землю и промыта толуолом. Сольвент был помещен под вакуум, и получившийся остаток был вновь растворен в приблизительно 90 мл дихлорметана (DCM). Продукт был кристаллизован добавлением 900 мл гексана. Образовавшиеся кристаллы были отделены фильтрацией и промыты 100 мл 10% DCM/гексан. Вакуумная сушка дает до 36,9 г (I-3)([α]D=-60 (с=1, CHCl)). Сольвент был полностью удален из исходного раствора и остаток (приблизительно 13 г) был растворен в приблизительно 20 мл DCM. Кристаллизация была инициирована добавления 150 мл гексана. После фильтрации просачиванием и промывания было получено 7,3 г вторичных кристаллов вещества I-3. Общий выход вещества I-3 составил 44,2 г (88%).
1.3. Синтез 17α-этокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-диона
9β,10α-прегна-4-ен-3,20-дион (9β,10α-прогестрон) формулы I-3, полученный по примеру 1.2, затем превращался в соответствующий 17α-этокси-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион формулы I-5 путем многостадийной реакции, как описано в общем разделе.
1.4. Синтез 17α-этокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20 диона
1,2-метилен-дидрогестерон (полученный в примере 1.2) формулы I-2 превращался в соответствующий 17α-этокси-1,2-метилен-9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион формулы I-6, как описано в примерах 1.2 и 1.3.
1.5.Синтез 18-метил-9β,10α-андро-4-ен-3,17-диона
Коммерчески доступный дидрогестерон (9β,10α-прегна-4,6-диен-3,20-дион) формулы I-1 превращали в соответствующий 18-метил-9β,10α-андрост-4-ен-3,17-дион (дес-ацетил-9β,10α-прогестерон) формулы 1-7 последовательным восстановлением, окислением и элиминированием, следующим за озонолизом промежуточного 18-метил-9β,10α-прегна-4,17(20)-диен-3-она, как это описано в общем разделе.
2. Биотрансформация с помощью Amycolatopsis mediterranei
Определение реагентов и продуктов.
Ход или результат реакции ферментации может быть прослежен с помощью ВЭЖХ проб, взятых из ферментирующей смеси или из проб элюата, взятых после экстракции продукта.
Хроматография была осуществлена с помощью аппарата (от Shimadzu), оснащенного насосом LC-10 AT VP, детектором длин волн SPD-10 A VP UV-VIS, SCL-10 A VP контролирующей системой, FCV-10 10 AL VP устройством контроля за растворителем и a SIL-10 AD-VP сборщиком образцов. Стероиды и продукты превращения были отделены с помощью С18 обратнофазной ET 250/4 Nucleosil 120-5 колонки (Machery & Nagel) и системы растворителей метанол/вода (75:25 по объему). Объем образца составлял 20 микролитров, скорость потока составляла 0,5 мл/мин, длина волны в УФ диапазоне составляла 298 нм при давлении 92 бар.
Питательная среда
2
4
2
4
2
Для культивации Amycolatopsis mediterranei в водной смеси, содержащей 80 г/л глюкозы, 2 г/л экстракта дрожжей, были добавлены 1,3 г/л KHPO×3HO и 1 г/л MgSO×7HO. Уровень pH поддерживался в интервале 7,0-7,2 с помощью 0,1 М HCl. В больших объемах (то есть больше 5 л) рН не регулировался; уровень pH смеси был приблизительно 7,5 без регулирования. Смесь стерилизовали при 121°C в течение 20 минут (в зависимости от объема).
2.1. Биотрансформация дидрогестерона с помощью Amycolatopsis mediterranei LS30 (маленький объем культуры)
2
4
Колонии бактерий Amycolatopsis mediterranei LS30 были перемещены с агаровых подложек и выращены во флаконах Эрленмейера с 100 мл питательной среды. Культуру инкубировали на вращающейся мешалке при 200 об/мин и 30°C (Certomat, В.Braun, Германия). После 3-4 дней культивации в данных условиях, полученная таким образом прекультура, содержащая бактерии в форме гранул (то есть в агрегированной форме), была мягко гомогенизирована с помощью гомогенизатора Стомахер. 1-10% (по объему) посевного материала, обычно 2% (по объему), гомогенизированной прекультуральной среды были использованы для высевания в 500 мл флаконы, содержащие 100 мл такой же питательной среды. Культуру снова инкубировали, как описано выше, в течение 46-50 часов. Потом добавили 15 мг дидрогестерона в виде раствора в ДМСО с концентрацией 20 мг/мл к вторичной культуральной среде, чтобы первоначальная концентрация стероида составляла 0,015% (по весу). Полученную суспензию инкубировали при 30°C и 200 об/мин в течение 46-50 часов, как описано выше, для гидроксилирования дидрогестерона. Потом культуральную среду центрифугировали (20 мин при 17,000×g). Аликвоту надосадочной жидкости исследовали с помощью ВЭЖХ. Надосадочную жидкость дважды экстрагировали 1/4 объема этилацетата при добавлении твердого NaCl. Органические фазы были объединены, высушены над NaSO и анализированы с помощью ВЭЖХ, как показано выше. Результаты трех независимых экспериментов показаны в таблице 1.
Таблица 1
Выход ферментации дидрогестерона во флаконах Эрленмейера
1. Флакон
2. Флакон
3. Флакон
Количество добавленного дидрогестерона [мг]
15
15
15
11-OH-дидрогестерон в надосадочной жидкости [мг]
12,8
9,6
11,5
Выход продукта
81,2%
60,9%
72,9%
11-OH-дидрогестерон в органической фазе после экстракции [мг]
9,6
7
9,4
Выход экстракции
75,0%
72,9%
81,7%
Общий выход
60,9%
44,4%
59,6%
2.2. Биотрансформация дидрогестерона с помощью Amycolatopsis mediterranei LS30 (большая ферментирующая порция)
2
2
2,макс
Колонии Amycolatopsis mediterranei LS30 были перенесены с агара и выращивались в 500 мл флаконах Эрленмейера, используя 100 мл питательной среды. Культуру инкубировали при 30°C и 200 об/мин. После 4 дней культивирования в указанных условиях, 1 мл аликвоты первичной прекультуры был использован для посева в два 500 мл флакона, содержащих 80 мл питательной среды (=зараженная культура). Культуру повторно инкубировали, как описано выше, в течение 28-32 часов. Потом однодневные прекультуры объединяли и добавляли в стерильный ферментер (размер: 15 л, B.Braun, Германия), наполненный 6 - 8 л стерилизованной питательной среды - объем, использованный для заражения, составлял приблизительно 2% (объем/объем) от объема ферментера. Бактериям позволяли расти в течение 40-44 часов при возможном добавлении PPG 2000 в качестве антипенного агента при 30°C и аэрации (3 л/мин в 15 литровом ферментере) и перемешивании (300 об/мин в 15 литровом ферментере, в начале). Скорость перемешивания по возможности регулируется в сторону более высоких скоростей с целью достичь относительного насыщения O (pO/pO), по меньшей мере в 50%. Затем осуществляют добавление дидрогестерона: либо дидрогестерон непрерывно добавляли в течение всего периода трансформации в виде раствора в ДМСО с концентрацией 20 мг/мл при общей концентрации приблизительно 3-3,5 мг на литр питательной среды в час культивации, до тех пор, пока не было добавлено определенное количество дидрогестерона (см. таблицу 2 для точных значений) и потом трансформацию прекращали; либо все количество дидрогестерона добавляли в течение 1 часа и потом превращение продолжалось в течение 46-50 часов. По окончании установленного периода времени, превращение прекращалось и бактерии отделялись от ферментирующего бульона путем микрофильтрации. Полученную надосадочную жидкость анализировали с помощью ВЭЖХ. Гидроксилированный дидрогестерон отделили от надосадочной жидкости, как описано ниже в Примере 3. Результаты четырех независимых ферментации сведены в таблицу 2.
Таблица 2
Выход дидрогестерона
1.
2.
3.
4.
Объем ферментирующей смеси
6,6 л
8 л
8,2 л
8 л
Изменяемые условия превращения:
23,4 мг/ч300-340 >50%
25,3 мг/ч290-360 >50%
25,5 мг/ч300 >40%
(все в 1 ч)290-420 >50%
- добавление дидрогестерона
- скорость перемешивания [об/мин]
- pO<sub>2</sub>/pO<sub>2,макс</sub>
1.
2.
3.
4.
Общее количество добавленного дидрогестерона [г]
1,12
1,22
1,19
1,2
Общее количество 11-OH-дидрогестерона в надосадочной жидкости [г]
0,86
0,79
0,83
0,77
Выход продукта
73,0%
61,9%
66,4%
61,0%
2.3. Биотрансформация 17-этокси-1,2-метилен-дидрогестерона с помощью Amycolatopsis mediterranei LS30
А) Ферментация в 500 мл флаконе
В способе, аналогичном процедуре, описанной в примере 2.1, при использовании 15 мг 17-этокси-1,2-метилен-дидрогестерона в качестве реагента, было получено 4 мг 17-этокси-11-гидрокси-1,2-метилен-дидрогестерон (Выход: 26%).
1
Н ЯМР (501 МГц, ХЛОРОФОРМ-d): δ ppm 0,87 (s, 3 H) 0,89-0,93 (m, 1 H) 1,13-1,18 (m, 3 H) 1,30-1,36 (m, 1 H) 1,39 (s, 3 H) 1,40-1,49 (m, 1 H) 1,69-1,83 (m, 3 H) 1,87-1,94 (m, 1 H) 1,95-2,01 (m, 1 H) 2,11-2,17 (m, 4 H) 2,39-2,47 (m, 1 H) 2,49-2,55 (m, 1 H) 2,59 (dd, J=14,5, 4,4 Гц, 1 H) 2,70-2,77 (m, 1 H) 2,98-3,06 (m, 1 H) 3,39-3,47 (m, 1 H) 4,70-4,75 (m, J=2,4 Гц, 1 H) 5,51-5,53 (m, 1 H) 6,08-6,10 (m, 2 H)
13
С ЯМР (126 МГц, ХЛОРОФОРМ-d): δ ppm 13,8 (q, 1 C) 15,6 (q, 1 C) 16,4 (q, 1 C) 23,3 (t, 1 C) 24,2 (t, 1 C) 25,4 (d, 1 C) 26,5 (q, 1 C) 26,7 (d, 1 C) 28,6 (q, 1 C) 34,9 (d, 1 C) 36,9 (s, 1 C) 37,9 (t, 1 C) 44,2 (d, 1 C) 47,6 (s, 1 C) 48,1 (d, 1 C) 59,9 (t, 1 C) 69,3 (d, 1 C) 95,8 (s, 1 C) 120,3 (d, 1 C) 127,2 (d, 1 C) 139,0 (d, 1 C) 156,2 (s, 1 C) 198,3 (s, 1 C) 210,3 (s, 1 C)
Б) Ферментация в 15 л ферментере
Аналогично процедуре, описанной в примере 2.2, 17-этокси-1,2-метилен-дидрогестерон был использован в качестве реагента для получения соответствующего 17-этокси-11-гидрокси-1,2-метилен-дидрогестерон производного.
2
2
2,макс
Колонии бактерий Amycolatopsis mediterranei LS30 были перенесены с агара и выращивались в 500 мл флаконах Эрленмейера, используя 100 мл питательной среды. Культуры инкубировали на роторной мешалке при скорости вращения 200 об/мин и температуре 30°C. После 4 дней культивирования в указанных условиях 1 мл аликвоты первичной прекультуры был использован для посева в два 500 мл флакона, содержащих 80 мл питательной среды (=зараженная культура). Культуру повторно инкубировали, как описано выше, в течение 24-30 часов. Потом однодневные прекультуры объединяли и добавляли в стерильный ферментер (размер: 15 л), наполненный 8 л стерилизованной питательной среды. Бактериям позволяли расти в течение 44-50 часов при возможном добавлении PPG 2000 в качестве антипенного агента, при 30°C и аэрации (3 л/мин) и перемешивании (290 об/мин). Скорость перемешивания по возможности регулируют в сторону более высоких скоростей с целью достичь относительного насыщения O (pO/pO), по меньшей мере в 50%. Потом 0,578 г 17-этокси-1,2-метилен-дидрогестерона непрерывно добавляли в виде раствора в ДМСО с концентрацией приблизительно 8 мг/мл, при общей концентрации приблизительно 22,7 мг на литр питательной смеси в час культивации. После 24-28 часов ферментации, превращение прекращалось и бактерии отделялись от ферментирующего бульона путем микрофильтрации. Полученную надосадочную жидкость анализировали с помощью ВЭЖХ. Надосадочная жидкость содержала 0,187 г 17-этокси-11-гидрокси-1,2-метилен-дидрогестерона, что соответствует выходу 31%. 17-этокси-11-гидрокси-1,2-метилен-дидрогестерон отделяли от надосадочной жидкости по методу, описанному в Примере 3.
2.4. Биотрансформация 17-этокси-дидрогестерона с помощью Amycolatopsis mediterranei LS30
По аналогичном процедуре, описанной в примере 2.1, при использовании 10, 15 или 20 мг 17-этокси-дидрогестерона в качестве реагента, был получен 17-этокси-11-гидрокси-дидрогестерон с выходом 32, 37 и 30% соответственно.
1
Н ЯМР(400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d): δ ppm 0,86 (s, 3 H) 1,15 (t, J=6,9 Гц, 3 H) 1,28 (s, 3 H) 1,37-1,52 (m, 1 H) 1,64-1,94 (m, 5 H) 2,15 (s, 3 H) 2,27-2,68 (m, 6 H) 2,70-2,79 (m, 1 H) 2,97-3,07 (m, 1 H) 3,39-3,52 (m, 1 H) 4,48-4,54 (m, 1 H) 5,70-5,73 (m, 1 H) 6,18-6,26 (m, 2 H)
13
С ЯМР(101 МГц, ХЛОРОФОРМ-d): δ ppm 15,6 (q, 1 С) 16,3 (q, 1 С) 21,5 (q, 1 С) 23,3 (t, 1 С) 24,2 (t, 1 С) 26,4 (q, 1 С) 33,8 (t, 1 С) 35,1 (d, 1 С) 35,4 (t, 1 С) 35,7 (s, 1 С) 38,0 (d, 1 С) 44,7 (t, 1 С) 47,0 (s, 1 С) 50,1 (d, 1 С) 59,8 (t, 1 С) 68,2 (d, 1 С) 95,7 (s, 1 С) 124,1 (d, 1 С) 127,0 (d, 1С) 140,6 (d, 1 С) 162,5 (s, 1 С) 199,1 (s, 1 С) 210,3 (s, 1 С)
2.5. Биотрансформация 18-метил-9β,10α-андрост-4-ен-3,17-диона с помощью Amycolatopsis mediterranei LS30.
По аналогичной процедуре, описанной в примере 2.1, при использовании 10, 15 или 20 мг 18-метил-9β,10α-андрост-4-ен-3,17-диона в качестве реагента, соответствующий 18-метил-11β-гидрокси-9β,10α-андрост-4-ен-3,17-дион получали с выходом 27, 39 и 36% соответственно.
13
С ЯМР (126 МГц, ХЛОРОФОРМ-d): δ ppm 15,4 (q, 1 С) 22,0 (t, 1 С) 22,3 (q, 1 С) 27,2 (t, 1 С) 29,0 (t, 1 С) 31,1 (d, 1 С) 33,5 (t, 1 С) 35,1 (t, 1 С) 37,8 (t, 1 С) 38,2 (s, 1 С) 38,3 (t, 1 С) 43,0 (d, 1 С) 47,3 (s, 1 С) 55,0 (d, 1 С) 68.6 (d, 1 С) 124,4 (d, 1 С) 170,7 (s, 1 С) 199,2 (s, 1 С) 219,4 (s, 1 С)
2.6. Биотрансформация дидрогестерона с помощью Amycolatopsis mediterranei DSM 43304
С целью продемонстрировать способность других штаммов Amycolatopsis mediterranei к трансформации ретростероидов общей формулы (I) в соответствующие 11-гидроксилированные соединения, ферментация по Примеру 2.1 была повторена со штаммами, доступными из открытых коллекций.
4
Колонии бактерий Amycolatopsis mediterranei DSM 43304 были перенесены с агара и выращивались во флаконах Эрленмейера объемом 500 мл, заполненных 100 мл питательной среды. Культуру инкубировали на роторной мешалке на скорости 200 об/мин при 30°C. После 2 дней инкубации к культуральной среде было добавлено 15 мг дидрогестерона в виде раствора в ДМСО с концентрации 20 мг/мл. Получившуюся смесь подвергали ферментации при 30°C и перемешивании при 200 об/мин в течение 46-50 часов, как описано выше, для гидроксилирования дидрогестерона. Потом культуральную среду центрифугировали (20 мин 17,000×g). Аликвоту надосадочной жидкости анализировали с помощью ВЭЖХ. Надосадочную жидкость дважды экстрагировали 1/4 объема этилацетата с добавлением твердого NaCl. Органические фазы объединяли, высушивали над NaSO и анализировали с помощью ВЭЖХ, как указано выше. В результате двух независимых экспериментов было получено приблизительно 5,7 мг 11-OH-дидрогестерона (выход: 36% без какой-либо оптимизации).
3. Отделение 11β-OH дидрогестерона от бактериальной культуральной среды
Три индивидуальных реакции ферментации дидрогестерона были осуществлены в объемах 22 л, 8,8 л и 8,8 л, как описано в Примере 2.2. Взятые вместе, 5,88 г дидрогестерона были добавлены к питательной смеси. После окончания реакции ферментации (после приблизительно 47 часов) смесь, содержащая целевой 11β-гидрокси дидрогестерон, была немедленно очищена с помощью микрофильтрации (размер пор в мембране 0,2-0,3 мкм). Методом ВЭЖХ было показано, что выход 11β-OH дидрогестерона в трех ферментативных порциях составлял от приблизительно 28 до 64%, где наименьшее значение относится к ферментирующей порции с исключительно низкой производительностью. Полученный фильтрат (=надосадочную жидкость) трех порций объединяли и получали надосадочную жидкость в количестве 37,9 л, содержащую 0,07 мг/мл 11β-OH дидрогестерона.
3.1. Адсорбция стероидного компонента ферментирующей надосадочной жидкости на полуполярной полиэфиракрилатной адсорбирующей смоле.
тм
Колонку с высотой 27 см и диаметром 6,5 см заполнили 1000 мл полуполярной полиэфиракрилатной адсорбирующей смолой (=Амберлит XAD-7 НР, произведенной Rohm и Haas), набухшей в воде. Колонка была приведена в равновесие 4 объемами слоя (BV) из 99% этанола и 5 объемами слоя (BV) воды. 37,9 литров ферментирующей надосадочной жидкости (содержание сухого материала (=DM) и также содержание 11-гидрокси-дидрогестерона, 9-гидрокси-дидрогестерона, и дидрогестерона были определены с помощью ВЭЖХ) были пропущены через колонку при комнатной температуре и скорости подачи приблизительно 110 мл/мин (=примерно 6,5 объемов слоя в час). Стероидный компонент ферментирующей смеси полностью адсорбировался на полуполярной адсорбирующей смоле колонки. Стероидный компонент в элюате был определен с помощью ВЭЖХ, и было показано практически полное отсутствие стероидов в элюате. Полученная в конце процесса часть продукта была забракована.
3.2. Щелочное отмывание (промывание) колонки с нагруженной адсорбирующей смолой.
Колонка с нагруженной стероидами смолой была промыта 5 л 2% водного раствора гидроксида натрия, имеющего уровень pH приблизительно 14. С этой целью водный щелочной раствор для отмывания пропускали через колонку со скоростью 90-95 л/мин (=приблизительно 5,5-5,7 объемов слоя в час). Содержание различных ретростероидов в элюате анализировали с помощью ВЭЖХ. Анализ показал, что менее 1% адсорбированных на колонке ретростероидов было смыто во время фазы отмывания.
3.3. Промежуточное отмывание колонки с нагруженной адсорбирующей смолой.
Промытая и нагруженная стероидами колонка с адсорбирующей смолой была промыта 5 л воды. С этой целью воду пропускали через колонку со скоростью 95 л/мин (=приблизительно 5,7 объемов слоя в час). Содержание различных ретростероидов в элюате анализировали с помощью ВЭЖХ. Анализ показал, что из адсорбированных на колонке ретростероидов почти ничего не было смыто во время фазы отмывания.
3.4. Десорбция связанных эстрогенов с промытой адсорбирующей смолы колонки.
Через колонку при комнатной температуре и скорости подачи приблизительно 95 мл/мин было пропущено 6 л жидкости для элюирования (99% этанол). Полученный элюат был собран в виде 6 фракций. Каждая фракция составляла приблизительно 1000 мл (=примерно 1 объем слоя). Содержание индивидуальных ретростероидов во фракциях определялось с помощью ВЭЖХ. Приблизительно 92% от общего количества адсорбированного на колонке 11β-OH дидрогестерона содержалось во фракциях 2 и 3. При необходимости, остальные фракции могут быть возвращены на стадию г) после того, как растворитель будет удален путем дистилляции.
Содержание безводного материала в процентах по весу и соответствующее содержание 11-гидрокси-дидрогестерона, 9-гидрокси-дидрогестерона, и дидрогестерона были определены с помощью ВЭЖХ и приведены в таблице 3 (на следующей странице).
3.5. Регенерация колонки с адсорбирующей смолой.
С целью регенерации колонки, она была промыта 5 л (=5 объемам слоя) воды. Колонка может быть использована и регенерирована много раз, например, более 40 раз.
Таблица 3
Хроматографический анализ продуктов разделения
Объем
M
DM
дидро
9-OHдидро
11-OH дидро
11-OH дидро
11-OH дидро
[л]
[г]
% по весу
[мг/л]
[мг/л]
[мг/л]
[мг]
Выход %*
Ферментирующая смесь
37,9
~37,9
6,1
0,002
0,07
2.653
43.99
Отмывание щелочью
А1
1,0
-
0,0
0,0
0,16
15.7
А2
1,0
-
0,0
0,0
A3
1,0
-
0,0
0,0
А4
1,0
-
0,0
0,0
А5
1,0
-
0,0
0,0
Промежуточное отмывание
I1
1,0
-
0,0
0,0
0,0
0.0
0.0
I2
1,0
-
0,0
0,0
0,001
1.0
0.02
I3
1,0
-
0,0
0,0
0,001
0.7
0.01
I4
1,0
-
0,0
0,0
0,001
0.7
0.01
I5
1,0
-
0,0
0,0
0,001
0.6
0.01
Элюирование
0.00
Е1
1,0
970,95
0,25
0,003
0,040
0,095
95.5
1.58
Е2
1,0
813,82
0,80
0,101
0,636
2,007
2,007.4
33.29
Е3
1,0
764,80
0,05
0,032
0,103
0,269
268.7
4.46
Е4
1,0
765,35
0,02
0,010
0,029
0,059
58.9
0.98
Е5
1,0
0,01
0,003
0,009
0,012
12.4
0.21
Е6
1,0
0,01
0,001
0,001
0,003
2.6
0.04
Е1-4**
4,0
3314,92
0,28
0,036
0,202
0,608
2,430.5
40.30
* в сравнении с начальным количеством дидрогестерона в 5,88 г (=18,8 ммоль)** вычислено
3.6. Дальнейшая обработка фракций элюата.
Фракции элюата с 1 по 4 (Е1=970,95 г, Е2=813,82 г, Е3=764,80 г, Е4=765,35 г) были объеденены и их масса была уменьшена с 3314,92 г (DM=0,26%) до 355,12 г выпариванием при 60°C. Стероиды выпали в осадок из полученной суспензии (DM надосадочной жидкости=2,0%) и были отделены с помощью фильтрации (выход: приблизительно 2,2 г сухого осадка). Из остаточной надосадочной жидкости можно добиться повторного выпадения осадка путем дальнейшего уменьшения объема путем выпаривания до 50,0 г.
Объединенные осадки (приблизительно 4 г) далее очищались с помощью флэш-хроматографии (элюент: этилацетат:циклогексан 2:1, сменяющийся чистым этилацетатом). Содержащуюся в осадке примесь можно идентифицировать как 9-гидрокси-дидрогестерон. В результате было получено 2,15 г 11-гидрокси-дидрогестерона (общий выход: 35%).
13
С ЯМР (101 МГц, ХЛОРОФОРМ-d): δ ppm 14,7 (q, 1 С) 21,7 (q, 1 С) 22,6 (t, 1 С) 24,8 (t, 1 С) 31,2 (q, 1 С) 33,7 (t, 1 С) 35,2 (d, 2 С) 35,7 (s, 1 С) 43,4 (s, 1 С) 46,2 (t, 1 С) 49,7 (d, 1 С) 49,9 (d, 1 С) 63,6 (d, 1 С) 67,6 (d, 1 С) 124,2 (d, 1 С) 126,9 (d, 1 С) 140,2 (d, 1 С) 162,2 (s, 1 С) 199,1 (s, 1 С) 208,6 (s, 1 С)
1
Н ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d): δ ppm 0,9 (s, 3 Н) 1,2 (s, 3 Н) 1,4-1,5 (m, 1 Н) 1,7-2,0 (m, 6 Н) 2,2 (s, 3 Н) 2,2-2,3 (m, 1 Н) 2,3-2,4 (m, 2 Н) 2,4-2,6 (m, 3 Н) 2,7 (ddd, J=12,0, 5,8, 5,6 Гц, 1 Н) 4,4-4,5 (m, 1 Н) 5,7-5,7 (m, 1 Н) 6,2-6,2 (m, 2 Н)
Описание и примеры только иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его. Так как возможные изменения описанных вариантов, включенных в предмет и существо изобретения, понятны специалисту в данной области, изобретение должно быть истолковано столь широко, чтобы включить все эти варианты, подпадающие под объем формулы изобретения и ее эквиваленты.
Литература
- Патент Бельгии 577615
- Патент Бельгии 652597
- Европейский Патент 0028309
- Европейский Патент 0152138 В1 (=Патент США 4601855)
- Европейский Патент 0558119 В1 (=Патент США 5304291)
- Патент Великобритании 1111320
- Halkes SJ, Hartog J, Morsink L, de Wachter AM. (1972) "Investigations on sterols. 38. Synthesis of 1,2-methylene-17a-acetoxy-9β,10α-pregnanes, a class of potent progestational agents" Journal of Medicinal Chemistry, 15(12):1288-92
- Halkes SJ & Van Moorselaar R (1969) "Investigations on Sterols XXXIV: Synthesis of 18-methyl-9β,10α-androstanes" Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 1969, 88(7):752-765
- Hartog J, Wittelaar J1, Morsink L, de Wachter AM (1972) "Investigations on sterols. 39. Synthesis and progestational activities of some 16-methylene-17α-acetoxy-9β,10α-pregna-4,6-diene-3,20-dione derivatives" J Med Chem. 1972 Dec; 15(12):1292-7
- Lechevalier, M.P., Prauser, H., Labeda, D.P., and Ruan, J.S. (1986) "Two new genera of nocardioform actinomycetes: Amycolata gen. nov. and Amycolatopsis gen. nov." Int. J. Syst. Bacteriol. 36:29-37.
- Margalith, P., and Beretta, G. (1960) "Rifamycin. IX. Taxonomic study on Streptomyces mediterranei sp.nov." Mycopathol. Appl. 13:321-330.
- Saucy G, EIs H, Mikesch F, Fürst A (1966) Uber 9β,10α-Steroide: Strukturaufklarung von mikrobiologischen Umsetzungsprodukten mit Sauerstoff-Funktion in Stellung 11" Helv Chim Acta 49(5): 1529-1542.
- Патент США 3304314
- Патент США 3555053
- Патент США 3937700
- Патент США 4353985
- Патент США 4588683
- Патент США 6046023
- van der Sijde D, de Flines J, van der Waard WF (1966) "Microbial transformation of 9β,10α-Steroids: III. 11-Hydroxylation and side chain degradation of 9β,10α-Steroids" Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 85:721-730.
- Van Moorselaar R. & Halkes SJ (1969) "Investigations on Sterols XXXIII: Synthesis of 18-alkyl-9β,10α-pregnane derivatives" Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 88(7):737-51
- Westerhof P. & Hartog J. (1965) "Investigations on Sterols XXIX: Synthesis and properties of some 6,7-dehydro-9β,10α-steroids" Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 84(7):918-31.
- Westerhof P., Hartog J. & Halkes SJ (1965) "Investigations on Sterols XXVI: Synthesis and properties of 6-substituted 9β,10α-steroids" Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 84:863-884.
- Заявка WO 98/08526
- Zakelj-Mavric M, Plemenitas A, Komel R, Belie I. (1990) "11 beta-hydroxylation of steroids by Cochliobolus lunatus." J Steroid Biochem. 35(5):627-9.