Апоптоз лимфоцитов и факторы его регуляции у больных рассеянным склерозом

Апоптоз лимфоцитов и факторы его регуляции у больных рассеянным склерозом

Вострякова С.А.\ Алифирова В.М.2, Иванова С.А.3

Apoptosis cells and regulation factors in patients with multiple sclerosis

Vostryakova S.A., Alifirova V.M., Ivanova S.A.

1 Томская областная клиническая больница, г. Томск

2 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

3 НИИ психического здоровья СО РАМН, г. Томск

© Вострякова С.А., Алифирова В.М., Иванова С.А.

Изучение апоптоза лимфоцитов крови и факторов его регуляции у больных рассеянным склерозом в стадиях обострения и ремиссии представляет актуальную проблему неврологии. Обследован 91 пациент с рассеянным склерозом. Определяли показатели апоптоза лимфоцитов крови. Абсолютное количество лимфоцитов с признаками апоптоза в обострении ниже, чем в ремиссию. Повышение фактора некроза опухоли-а наблюдается при обострении.

Ключевые слова: апоптоз, рассеянный склероз, фактор некроза опухоли-а.

Study process apoptosis cells in relaption and remittion in 91 patients with multiple sclerosis. Study apoptosis cells in patients with multiple sclerosis. Absolut apoptosis cells in remittion high.

Key words: apoptosis, multiple sclerosis, tumor necrosis factor а.

УДК 616.832-004.2:616.155.32-091.818:57.053

Введение

Апоптоз, или программированная клеточная смерть, является важным механизмом поддержания корректного числа клеток в многоклеточном организме.

Предполагается, что развитие аутоиммунных заболеваний выступает результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и программированной клеточной смертью.

Апоптоз осуществляется и контролируется иммунными механизмами [1, 4].

В патогенезе рассеянного склероза лежат дегенеративные и аутоиммунные процессы, которые отражают взаимодействие иммунной и нервной систем.

С одной стороны, у больных рассеянным склерозом (РС) наблюдается индукция апоптоза, в частности, апоптоз в олигодендроцитах, запущенный на определенном этапе развития, резко тормозит процессы ремиелинизации, подготавливая почву гибели миелина. Одним из механизмов усиления гибели нервных клеток вы-

ступает нарушение синтеза регуляторных факторов, например фактора некроза опухоли-а (ФНО-а), который является основным проапо-птогенным цитокином и на системном уровне приводит к индукции апоптоза клеток периферической крови. С другой стороны, аутоиммунные процессы задействуют чрезвычайно сложные и многообразные эффекторные механизмы, лежащие в основе нарушения нейроиммунного взаимодействия и развития характерного для РС неврологического дефицита. При этом аутоиммунные процессы характеризуются угнетением процессов апоптоза тех клеток, которые должны в норме погибать. Возможно, снижение апоптоза наблюдается именно для аутоиммунных Т-клеток, в то время как для других субпопуляций лимфоцитов или для всех иммуно-компетентных клеток в целом характерна индукция программированной клеточной гибели.

Около 10 лет назад был открыт на цито-плазматической мембране клеток первый специализированный рецептор из семейства TNF-

рецепторов для индукции апоптоза - CD95 (Fas/ Apo-i). Описан соответствующий индукторный фактор Fas-лиганд. Fas-лиганд экспрессируется на поверхности глиальных клеток (микроглии, астроцитах) и лимфоцитах больных РС. Экспрессия Fas-рецептора на клеточной мембране означает готовность клетки уйти в апоптоз, однако для запуска процесса необходимо действие индукторов. Известна группа физиологических активаторов и ингибиторов апопто-за [3, 7, 9]. В качестве индуцирующих апоптоз факторов выступают провоспалительные цито-кины (ФНО-а, у-интерферон). Этот показатель был предложен в качестве субклинического предвестника активизации иммунопатологического процесса. Концентрация ФНО-а связана с клинически выраженной активностью болезненного процесса при pc

[15].

Рассеянный склероз, в патогенезе которого лежат иммунологические нарушения, представляет собой адекватную модель для изучения процесса апоптоза.

Актуальность данного исследования объясняется все большим распространением в последнее время РС и возникающей в связи с этим необходимостью изучения патогенетических механизмов заболевания.

Цель исследования - изучить процесс апо-птоза лимфоцитов крови и факторы его регуляции у больных рассеянным склерозом в стадиях обострения и ремиссии.

Материал и методы

Проведено обследование 91 пациента с РС, которые находились на стационарном лечении в неврологической клинике Сибирского государственного медицинского университета (СибГМУ) (г. Томск), а также наблюдались амбулаторно на кафедре неврологии и нейрохирургии СибГМУ. Диагноз устанавливался в соответствии с критериями Мак-Дональда (2005). Проведен анализ показателей лейкоцитов и спонтанного апоптоза клеток крови у больных рассеянным склерозом в зависимости от стадии заболевания и у здоровых лиц.

Пациенты в стадии обострения составили группу из 43 (47,25%) человек, в ремиссии находилось 48 (52,75%) человек. Иммуномодулирую-щая терапия была назначена 46 (50,54%) больным: ребиф получали 14 (15,38%) человек, аво-некс - 10 (10,98%), копаксон - 22 (24,17%). При развитии обострения больные по показаниям проходили курс гормонотерапии. Курсы симптоматической терапии назначались 45 (49,45%) пациентам. Ремиттирующий тип течения наблюдался у 69,23% больных, вторично прогрессирующий тип течения у 26,37%, первично прогрессирующий

у 4,39%.

Средний возраст пациентов составил

(39,95 ± 2,56) года, женщин было 68,19%, мужчин -31,81%. средний возраст начала заболевания (28,47 ± 2,1) года, медиана Ме = 30 (от 15 до 44 лет). У пациентов с ремиттирующим и вторично прогрессирующим течением длительность первой ремиссии составляла (3,12 ± 0,79) года (Ме = 2; от 1 до 6 лет). Среднегодовая частота обострений в течение всего периода болезни составила 0,62 ± 0,11 (Ме = 0,5; от 0,1 до 2,0). Средний балл по шкале EDss у пациентов до начала наблюдения составил 3,42 ± 0,91 (Ме = 3,5; от 2,0 до 5,0 балла). Сумма неврологического дефицита составила 8,71 ± 0,78 (Ме = 8; от 3 до 19). Скорость прогрессирования заболевания (отношение балла EDss к длительности болезни) составила 0,49 ± 0,19 (Ме = 0,5; от 0,1 до 1,0). Среднее количество курсов терапии кортикосте-роидами было 1,78 ± 1,77 (Ме = 1,5; от 1,0 до 5,0). В группу сравнения вошли 20 здоровых лиц, соответствующих по полу и возрасту группе больных. Средний возраст составил (31,9 ± 1,7) года.

Проводилась комплексная оценка апоптоза: рецепторный уровень (выявление рецептора апоптоза на лимфоцитах методом люминесцентной микроскопии), клеточный уровень (оценка морфологических изменений в лейкоцитах методом световой микроскопии). Наиболее информативным методом изучения апопто-за остается оценка структурных изменений клеток с помощью светового микроскопа. Осуществлялось определение морфологических изменений нейтрофилов и лимфоцитов. Готовили мазки, фиксировали 5 мин в азур-эозине мети-

леновом синем по Май-Грюнвальду и окрашивали 40 мин по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали количество клеток с морфологическими признаками апоптоза в процентах от доли ней-трофилов и лимфоцитов в общей лейкоцитарной формуле. Для оценки содержания клеток с маркером апоптоза (экспрессия cD95-рецептора на лимфоцитах) использовали непрямой имму-нофлюоресцентный метод и моноклональные антитела к антигену CD95 ^-рецептор) («Сорбент», Россия). Концентрацию ФНО-а в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с использованием соответствующих наборов («Протеиновый контур», г. Санкт-Петербург).

Все количественные показатели обрабатывались статистически с вычислением степени достоверности по {-критерию Стьюдента для независимых выборок. Различия оценивали как достоверные при р < 0,05. Предварительно оценивали нормальность генеральной совокупности с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и равенство генеральных дисперсий с помощью Р-критерия Фишера.

Результаты и обсуждение

У больных рассеянным склерозом относительное содержание лимфоцитов в кровотоке составило (22,30 ± 0,20)%, что ниже по сравнению с контрольной группой - (30,06 ± 1,73)%, р < 0,05. Абсолютное содержание лимфоцитов у пациентов с РС оказалось равным (1,22 ± 0,01) • 106 клеток на 1 л (кл/л) (у здоровых лиц (1,96 ± 0,04) • 10, р < 0,05). Относительное содержание нейтрофилов у пациентов с РС составило (68,76 ± 0,18)% против (66,28 ± 0,25)% у здоровых лиц, р < 0,05. Абсолютное содержание ней-трофилов у пациентов с РС имело значение (3,84 ± 0,04) • 106, а у здоровых лиц (4,32 ± 0,04) • 10 кл/л, р < 0,05. Показано, что в периферической крови у больных РС содержание лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, находилось в пределах (20,26 ± 0,08)%, а у здоровых лиц в пределах (13,52 ± 0,27)%, р < 0,05. Абсолютное содержание cD95-лимфоцитов у больных РС

составило (145,37 ± 3,22) X

х 106 кл/л, что ниже по сравнению с таковыми в

контрольной группе - (268,25 ± 12,45) • 106, р < 0,05. Относительное содержание нейтрофилов с морфологическими признаками апоптоза у пациентов с РС (2,13 ± 0,04)%, у здоровых лиц -(0,18 ± 0,07)%, р < 0,05. Абсолютное содержание апоптотических нейтрофилов у пациентов с РС оказалось равным (201,15 ± 4,83) • 106 ((290,35 ± ± 11,95) • 10 кл/л у здоровых лиц), р < 0,05. Относительное содержание лимфоцитов с признаками спонтанного апоптоза у пациентов с РС имело значение (4,38 ±

± 0,04)% ((1,08 ± 0,27)% в группе контроля), р < 0,05. Абсолютное содержание апоптотических лимфоцитов у пациентов с РС оказалось равным

(29,09 ± 0,63) • 106 кл/л ((38,35 ± 0,84) • 10 у здоровых лиц), р < 0,05.

Рассчитан индекс реализации апоптоза, т.е. доля клеток с морфологическими признаками апоптоза в процентах от общего числа клеток, экспрессирующих рецепторы готовности к апо-птозу. Установлено, что индекс реализации апоптоза у больных РС (21,69 ± ± 0,2)% ((8,48 ± 2,16)% в группе контроля), р < 0,05.

У больных рассеянным склерозом в стадии обострения относительное содержание в кровотоке лимфоцитов составило (21,51 ± 0,28)%, в стадии ремиссии данный показатель выше -(23,31 ± 0,27)%, р < 0,05. Абсолютное содержание лимфоцитов у пациентов с РС в стадии обострения ниже ((1,15 ± 0,02) • 106 кл/л), чем в ремиссию ((1,31 ± 0,02) • 106), р < 0,05. Относительное содержание лимфоцитов с признаками спонтанного апоптоза у пациентов с РС в стадии обострения выше ((4,55 ± 0,06)%), чем в стадии ремиссии ((4,17 ± 0,04)%), р < 0,05. Абсолютное содержание апоптотических нейтрофилов у пациентов с РС в стадии обострения оказалось равным (197,38 ± 6,67) • 106, при ремиссии -(206,14 ± 6,92) • 10 кл/л, р < 0,05. Абсолютное содержание апоптотических лимфоцитов у пациентов с РС в стадии обострения составило (926,54 ± 0,82) • 106, а в стадии ремиссии (32,19 ± 0,86) • 10 кл/л, р < 0,05. Доля нейтрофи-лов с признаками апоптоза у пациентов с РС равна (2,16 ± 0,05)% в стадии обострения и снижена в стадии ремиссии - (2,09 ± 0,06)%, р < 0,05.

17

У больных рассеянным склерозом относительное содержание в кровотоке лимфоцитов, экспресси-рующих рецепторы готовности к Fas-зависимому апоптозу №95), в стадии обострения оказалось равным (20,61 ± 0,11)%, в стадии ремиссии данный показатель ниже - (19,83 ± 0,11)%, р < 0,05.

Обнаружено, что индекс реализации апопто-за у больных РС в стадии обострения имел

Показатели содержания лейкоцитов и спонтанного апоптоза клеток крови у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом

в зависимости от стадии заболевания

значение (22,12 ± 0,29)%, в стадии ремиссии -(21,10 ± 0,26)%, р < 0,05. Показатели лейкоцитов и спонтанного апоптоза клеток крови у пациентов с рассеянным склерозом в зависимости от стадии заболевания и у здоровых лиц представлены в таблице.

Показатель Здоровые лица Стадия рассеянного склероза

Обострение | Ремиссия

Лейкоциты, • 10 кл/л 6,42 0,06 6,41 0,18" 5,69 0,19

Лимфоциты, X 30,06 1,73 21,51 0,28" 23,31 0,27

Лимфоциты, абс. 1,96 0,04 1,15 0,02" 1,31 0,02

Нейтрофилы, x 66,28 0,25 69,33 0,25 67,98 0,27

Нейтрофилы, абс. 4,32 0,04 3,79 0,06 3,89 0,05

Доля нейтрофилов с признаками апоптоза, % 0,18 0,07 2,16 0,05" 2,09 0,06

Абсолютное количество нейтрофилов с признаками апоптоза, кл/ 290,35 11,95 197,38 6,67 206,14 6,92

Доля лимфоцитов с фрагментированным ядром, % 1,08 0,27 4,55 0,06" 4,17 0,04

Абсолютное количество лимфоцитов с фрагментированным 38,35 0,84 26,54 0,82" 32,19 0,86

ядром, кл/л

Лимфоциты, экспрессирующие Fas-рецептор, % 13,52 0,27 20,61 0,11" 19,83 0,11

Абсолютное количество CD95, кл/л 268,25 12,45 130,59 4,23" 163,04 4,24

Индекс реализации апоптоза, % 8,48 2,16 22,12 0,29" 21,10 0,26

* Достоверные различия с ремиссией.

У 38 больных РС и у здоровых лиц проведена оценка ФНО-а. Учитывая большую индивидуальную вариабельность значений продукции цитокинов, были выделены две группы лиц в зависимости от концентрации ФНО-а.

В первую группу вошли 4 (10,52%) человека, у которых наблюдалось повышение концентрации ФНО-а. Среднее значение концентрации ФНО-а у больных РС составило ( 768,50 ± 313) пг/мл. Для представителей первой группы характерен более выраженный неврологический дефицит. Средний балл по шкале EDss равнялся 3,80 ± 2,11. Пациенты этой группы находились в стадии обострения.

Во второй группе было 32 (89,47%) человека с показателями концентрации ФНО-а в пределах нормы - от 0 до 50 пг/мл. Пациенты находились в стадии ремиссии. Средний балл по шкале EDss составил 2,65 ± 1,43.

В группе контроля концентрация ФНО-а была в пределах нормы.

Заключение

Проведенные исследования показали снижение абсолютного количества нейтрофилов и лимфоцитов с признаками апоптоза у пациентов с РС в сравнении с группой здоровых лиц. При РС снижена элиминация клеток, которые в норме уничтожаются процессом апоптоза. Показатели запрограммированной клеточной смерти изменяются в стадиях обострения и ремиссии. Абсолютное количество нейтрофилов и лимфоцитов с признаками апоптоза при обострении ниже, чем при ремиссии. В стадии обострения уменьшается уничтожение клеток посредством апоптоза. И, наоборот, в ремиссию повышается механизм уничтожения клеток с помощью апо-птоза. Изменение показателей апоптоза при РС говорит о том, что запрограммированная клеточная смерть играет роль в патогенезе РС. Концентрация ФНО-а в сыворотке крови у больных рассеянным склерозом зависит от тяжести заболевания и стадии клинического течения. Повы-

шение ФНО-а наблюдается при обострении патологического процесса.

Литература

1. Барышникова А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. 2002. С. 32-40.

2. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Гибель нейрона -кардиальная проблема неврологии и психиатрии // Журн. неврологии и психиатрии.

1999. С. 28-33.

3.Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 2003. 188 с.

4. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами // Иммунология. 2002.

№ 4. С. 237-243.

5. Рассеянный склероз. Избранные вопросы теории и практики / Под ред. И.А. Завалишина, В.И. Головкина. М., 2000. С. 9-15.

6. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996. № 6. С. 10-23.

7. Fas S.C., Fritzsching B., Suri-Payer E., Krammer P.H.

Death receptor signaling and its function in the immune system // Curr. Dir. Autoimmun. 2006. V. 9. P. 1.

8. Fox E.J. Immunopathology of multiple sclerosis // Neurology. 2004. V. 63. № 12. P. 3-7.

9. Hovelmeyer N., Hao Z., Kranidioti K. et al. Apoptosis of

oligodendrocytes via Fas and TNF-R1 is a key event in the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis // J. Immunol. 2005. V. 175. № 9. P. 5875-5884.

10. Okuda Y., Apatoff B.R., Posnett D.N. Apoptosis of T cells

in peripheral blood and cerebrospinal fluid is associated with disease activity of multiple sclerosis // Neuroimmunol. 2006. V. 171. P. 163170.

11. Pender M.P. Oligodendrocyte apoptosis before immune attack in multiple sclerosis? // Ann. Neurol. 2005. V. 57. № 1. P. 158.

12. Petelin Z., Brinar V., Petravic D. et al. CD95/Fas expression

on peripheral blood T lymphocytes in patients with multiple sclerosis: effect of high-dose methylprednisolone therapy // Clin. Neurol. Neurosurg. 2004. V. 106. № 3. P. 259-262.

13. Ponomarev E.D., Dittel B.N. Gamma delta T cells regulate the extent and duration of inflammation in the central nervous system by a Fas ligand-dependent mechanism // J. Immunol. 2005. V. 174. № 8. P. 4678-4687.

14.Prieto A., Diaz D., Barcenilla H. et al. Alvarez-Mon Increased spontaneous ex vivo apoptosis and subset alterations in peripheral blood T cells from patients with multiple sclerosis // J. Clin. Immunol. 2006. V. 26. P. 101-112.

15.Ruffini F., Chojnacki A., Weiss S., Antel J.P. Immunobio-

logy of oligodendrocytes in multiple sclerosis // Adv. Neurol. 2006. V. 98. P. 47-63.

16. Vanderlocht J., Hellings N., Hendriks J.J. et al. Leukemia inhibitory factor is produced by myelin-reactive T cells from multiple sclerosis patients and protects against tumor necrosis factor-alpha-induced oligodendrocyte apoptosis // J. Neurosci Res. 2006. V. 83. P. 763774.

Поступила в редакцию 16.04.2009 г.

Сведения об авторах

С.А. Вострякова — врач-невролог отделения неврологии инсультного центра Томской ОКБ (г. Томск).

B.М. Алифирова — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой неврологии и нейрохирургии СибГМУ (г. Томск).

C.А. Иванова — д-р мед. наук, профессор, зав. лабораторией клеточного и молекулярных исследований НИИ психического здоровья

СО РАМН (г. Томск).

Для корреспонденции

Вострякова Светлана Анатольевна, тел. 8-913-100-76-50, e-mail: vostryakova@inbox.ru.