Способ моделирования эпителиально-мезенхимальной трансформации опухолевого эпителия при экспериментальном раке желудка
METHOD FOR EPITHELIAL MESENCHYMAL TRANSFORMATION OF TUMOUR EPITHELIUM DURING EXPERIMENTAL GASTRIC CANCER

Изобретение относится к медицине, к экспериментальной онкологии и может быть использовано для изучения механизмов метастазирования и разработки новых методов лечения рака желудка в условиях эксперимента.
Изучение механизмов метастазирования злокачественных опухолей имеет приоритетное значение для фундаментальной и клинической онкологии. Полагают, что способность опухолевых клеток к инвазии и метастазированию связана с приобретением ими некоторых мезенхимальных свойств и утратой эпителиальных [1]. При данном процессе нарушаются межклеточные контакты, клетки становятся подвижными, меняется их форма на веретенообразную и вытянутую [2]. Наблюдается дедифференцировка клеток: способность синтезировать цитокератины уменьшается или утрачивается, но появляется способность синтезировать виментин. Данный процесс называется эпителиально-мезенхимальной трансформацией. Его изучение важно для понимания основных механизмов желудочного канцерогенеза и разработки новых методов лечения этой патологии.
Уровень техники
Моделирование эпителиально-мезенхимальной трансформации в опухолевых клетках связано с утратой ими свойств, присущих эпителиальным клеткам, и приобретением свойств, характерных для мезенхимальных. Известен способ моделирования эпителиально-мезенхимальной трансформации путем внутрибрюшного [3], подкожного [4, 5] или внутривенного [6] введения клеточных линий рака желудка бестимусным мышам. Недостатком данного способа является техническая сложность исполнения, необходимость культивирования опухолевых клеток и использования трансгенных (бестимусных) мышей. Кроме того, данный способ индукции рака желудка и эпителиально-мезенхимального перехода не встречается в естественных условиях.
Способ индукции эпителиально-мезенхимальной трансформации путем сокультивирования эпителиальных и опухолевых клеток с патогенными штаммами Н. pylori позволяет изучать механизмы данного явления на молекулярном и генетическом уровнях [7, 8, 9]. Недостатками указанного способа являются сложности работы с бактериальной культурой Н. pylori, а также невозможность изучать закономерности эпителиально-мезенхимальной трансформации и влияние различных эндогенных факторов на механизмы эпителиально-мезенхимальной трансформации в условиях живого организма.
Известен способ индукции эпителиально-мезенхимальной трансформации путем создания породы трансгенных мышей ("INS-GAS"), отличающихся сверхэкспрессией гастрина. Способ позволяет изучать механизмы эпителиально-мезенхимальной трансформации in vivo, однако его использование существенно ограничено как за счет технических сложностей получения трансгенных животных и необходимости использования для этих целей методов генной инженерии, так и за счет гипотетической опасности переноса «трансгенов» в другие организмы [10, 11].
Прототип
-5
2
В качестве прототипа выбран способ индукции эпителиально-мезенхимальной трансформации путем культивирования опухолевых клеток линии GES-1 в питательной среде с добавлением химического канцерогена N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин в концентрации 2×10 моль/л в течение 24 ч в темноте [12]. Предложенный способ позволяет получить клеточную культуру со способностью к миграции и эпителиально-мезенхимальной трансформации. Полученная культура клеток поддерживается культивированием in vitro в увлажненной камере с 5% CO при температуре 37°, в питательной среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Способ позволяет исследовать механизмы, связанные с индукцией эпителиально-мезенхимальной трансформации на клеточном, молекулярном и генетическом уровне. Однако существенными недостатками указанного способа являются искусственность моделируемых процессов, невозможность оценить влияние местных и общих реактивных изменений со стороны местных тканей и организма в целом на их течение, сложности технического характера, связанные с культивированием опухолевых клеток, и юридического характера, связанные с приобретением, использованием и хранением канцерогенных веществ.
Новизна исследования заключается в том, что моделируется эпителиально-мезенхимальная трансформация опухолевого эпителия при индукции экспериментального метастатического рака желудка.
Раскрытие изобретения
Принципиальным отличием предложенного способа является то, что моделирование эпителиально-мезенхимальной трансформации опухолевого эпителия при индукции экспериментального метастатического рака желудка достигается путем внутрижелудочного введения экспериментальным животным (крысам) в 1 и 3 день эксперимента по 1 мл раствора, полученного путем смешивания 0,05% суспензии карбоната кальция в 0,4% растворе формальдегида и 0,4% раствора перекиси водорода в соотношении 1:1.
Пример получения эксперимента. Основанием для предлагаемого способа являются результаты экспериментального исследования, выполненного на 20 белых беспородных крысах-самцах, массой 180-220 грамм. Животным по указанной выше методике проводилось внутрижелудочное введение по 1 мл раствора, полученного путем смешивания 0,05% суспензии карбоната кальция в 0,4% растворе формальдегида и 0,4% раствора перекиси водорода в соотношении 1:1.
Суспензия карбоната кальция готовилась из расчета 0,05 г карбоната кальция на 100 мл 0,4% раствора формальдегида. Две крысы погибли через 5-7 дней после второго введения смеси формалина и перекиси водорода от явлений острой дыхательной недостаточности, возможно, за счет того, что при введении смеси часть ее попадала в дыхательные пути. Все остальные крысы оставались живыми до конца эксперимента. Смертность животных составила 10%. Первые 6 крыс были забиты через 4 месяца от начала эксперимента. Оставшиеся животные (12 крыс) - через 6 месяцев. После наркотизации животных эфиром выполняли лапаротомию, острым путем извлекали желудок, который вскрывали по большой кривизне. Препараты преджелудка, тела и пилорического отдела желудка изучали гистологически с использованием световой микроскопии при увеличении x150 и x600. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином и иммуногистохимически (ИГХ) с использованием антител к цитокератину 18 и виментину. Контролем служили 5 интактных крыс, находившихся на обычном пищевом и водном режиме.
Через 4 месяца от начала эксперимента у 5 из 6 опытных крыс отмечены явления эпителиально-мезенхимальной трансформации на фоне опухолей железистого отдела желудка. Макроскопически опухоли были представлены участками с утолщенной стенкой и ригидными складками слизистой оболочки. В большинстве случаев отмечалось мультицентрическое поражение органа. Микроскопически опухоли локализовались в пределах слизистой оболочки тела и пилорического отдела желудка и были представлены железистыми структурами неправильной формы, с выраженной клеточной и ядерной атипией (Фиг. 1). Иногда встречались кистозно-измененные участки с сосочковым разрастаниями в просвете (Фиг. 2).
Характерной особенностью полученной модели является наличие в подслизистой основе слизистой оболочки желудка, мышечной (Фиг. 3) и серозной оболочке и сальнике (Фиг. 4) тяжей и разрастаний атипичных клеток. При ИГХ отмеченные клетки были негативны или слабо экспрессировали цитокератин 18 и интенсивно окрашивались виментином (Фиг. 5). Также отмечались вытянутые фибробластоподобные клетки, часто изогнутой формы (Фиг. 6). В подслизистой основе слизистой оболочки желудка и большом сальнике на уровне атипичных участков наблюдались дилятированные сосуды, в просвете которых часто обнаруживались опухолевые эмболы (Фиг. 7).
При ревизии у 4 из 6 крыс в мезентериальных лимфоузлах в паракортикальной и центральной области отмечены скопления полиморфных клеток со смещенным к периферии ядром и светлой цитоплазмой. Клетки были положительны на цитокератин 18 (Фиг. 8) и виментин (Фиг. 9).
Через 6 месяцев описанные изменения были выявлены у всех животных и носили более выраженный характер. У 8 из 12 оставшихся крыс были зафиксированы описанные выше изменения в лимфоузлах брюшной полости.
Технический результат
Таким образом, предложенный способ позволяет через 4 месяца от начала эксперимента у 83,3% животных, а через 6 месяцев - у всех животных моделировать эпителиально-мезенхимальную трансформацию опухолевого эпителия при индукции экспериментального метастатического рака желудка.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Василенко И.В., Кондратюк Р.Б., Кудряшов А.Г., Гульков Ю.К., Малашкевич А.С., Сургай Н.Н. Особенности эпителиально-мезенхимальной трансформации в раках различной локализации и гистологического строения //Клиническая онкология. - 2012. - №5 (1). - С. 163-167.
2. Nieto М.А. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives // Int. J. Dev. Biol. - 2009. - Vol. 53. - P. 1541-1547. doi:10.1387/ijdb.072410mn.
3. Zhu Y., Liu Y., Qian Y., Dai X., Yang L., Chen J. et al. Research on the efficacy of Celastrus Orbiculatus in suppressing TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition by inhibiting HSP27 and TNF-α-induced NF-κ B/Snail signaling pathway in human gastric adenocarcinoma // BMC Complement Altern Med. - 2014. - Vol. 14:433.doi:10.1186/1472-6882-14-433.
4. Wang Y., Wen M., Kwon Y., Xu Y., Liu Y., Zhang P. et al. CUL4A induces epithelial-mesenchymal transition and promotes cancer metastasis by regulating ZEB1 expression // Cancer Res. - 2014. - Vol. 74(2). - P. 520-31.
5. Xu W., Hu X., Chen Z., Zheng X., Zhang C., Wang G. et al. Normal Fibroblasts Induce E-Cadherin Loss and Increase Lymph Node Metastasis in Gastric Cancer //PLoS One. - 2014. - Vol. 9(5):e97306. doi:10.1371/journal.pone.0097306.
6. Liu Z., Chen L., Zhang X., Xu X., Xing H., Zhang Y. et al. RUNX3 regulates vimentin expression via miR-30a during epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer cells // Cell Mol Med. - 2014. - Vol. 18(4). - P. 610-23. doi:10.1111/jcmm.l2209.
7. Zhang Q., Ding J., Liu J., Wang W., Zhang F., Wang J. et al. Helicobacter pylori-infected MSCs acquire a pro-inflammatory phenotype and induce human gastric cancer migration by promoting EMT in gastric cancer cells // Oncol Lett. - 2016. - Vol 11(1). - P. 449-457.
8. Yu H., Zeng J., Liang X., Wang W., Zhou Y., Sun Y. et al. Helicobacter pylori promotes epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer by downregulating programmed cell death protein 4 (PDCD4) //PLoS One. - 2014. - Vol 9(8):e105306. doi:10.1371/journal.pone.010530.
9.  Staedel C.,  Nguyen P.H., Chambonnier L., Hatakeyama M. et al. Helicobacter pylori generates cells with cancer stem cell properties via epithelial-mesenchymal transition-like changes // Oncogene. - 2014. Vol. 33(32). - P. 4123 - 31. doi:10.1038/onc.2013.380.
10. Yin Y., Grabowska A.M., Clarke P.A., Whelband E., Robinson K., Argent R.H. et al. Helicobacter pylori potentiates epithelial:mesenchymal transition in gastric cancer: links to soluble HB-EGF, gastrin and matrix metalloproteinase-7 // Gut. - 2010. - Vol. 59(8). - P. 1037-45. doi:10.1136/gut.2009.199794.
11. Syu L.J., Zhao X., Zhang Y., Grachtchouk M., Demitrack E., Ermilov A. et al. Invasive mouse gastric adenocarcinomas arising from Lgr5 + stem cells are dependent on crosstalk between the Hedgehog/GLI2 and mTOR pathways // - Oncotarget. - 2016. - Vol. 7(9). - P. 10255-70. doi:10.18632/oncotarget.7182.
12. Shimada S., Mimata A., Sekine M., Mogushi K., Akiyama Y., Fukamachi H. et al. Synergistic tumour suppressor activity of E-cadherin and p53 in a conditional mouse model for metastatic diffuse-type gastric cancer // Gut. - 2012. - Vol. 61(3). - P. 344-53. doi:10.1136/gutjnl-2011-300050.
13. Cai J., Wang M., Zhu M., Zhang Q., Zhang X., Yan Y. et al. N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine induces the expression of CCR2 in human gastric epithelial cells promoting CCL2-mediated migration // Mol Med Rep. - 2016. - Vol. 13(2). - P. 1083-90. doi:10.3892/mmr.2015.4650.