КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ЛЕГКИХ, ПРЕЖДЕ ВСЕГО, НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКИХ (НМКРЛ)
COMPOSITION FOR TREATING LUNG CANCER, FIRST NON-SMALL CELLS LUNG CANCER (NSCLC)

Настоящее изобретение относится к активной (иммуностимулирующей) композиции, содержащей по меньшей мере одну РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно, различных) антигена, способных вызывать (приобретенный) иммунный ответ у млекопитающего. Настоящее изобретение также относится к вакцине, содержащей указанную активную (иммуностимулирующую) композицию, и к применению указанной активной (иммуностимулирующей) композиции (для получения вакцины) и/или вакцины для индукции (приобретенного) иммунного ответа с целью лечения рака легких, прежде всего немелкоклеточных форм рака легких (НМКРЛ), предпочтительно выбранных из трех основных подтипов: плоскоклеточная карцинома легких, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома легких или связанных с ними расстройств. В конечном счете, настоящее изобретение относится к наборам, прежде всего к наборам или к наборам компонентов, содержащим активную (иммуностимулирующую) композицию и/или вакцину.
В 25% случаев всех злокачественных опухолей зарегистрирована бронхиальная карцинома (карцинома легких). Во всем мире она является наиболее распространенной причиной смерти от рака у мужчин и второй по распространенности у женщин. В Германии этот тип рака является третьим по распространенности, затем карцинома предстательной железы и колоректальная карцинома. Карцинома легких является причиной 1,3 миллиона смертельных случаев во всем мире ежегодно. В Центральной Европе заболеваемость составляет приблизительно 60 на 100000 населения, а число пациентов с первичным диагнозом рака легких неуклонно растет (составляя в настоящее время в Германии приблизительно 50000 в год). После установления диагноза рака легких средняя выживаемость сроком 5 лет составляет менее 5%. Тем не менее, средняя продолжительность жизни каждого отдельного пациента полностью зависит от стадии заболевания (по классификации TMN) и установленного подтипа карциномы (рака легких) (см. ниже).
Основными подтипами рака легких, классифицируемыми по размеру и локализации злокачественных клеток, распознаваемых под микроскопом, являются мелкоклеточный рак легких (20%) и немелкоклеточный рак легких (НМКРЛ) (80%). Несмотря на то, что данная классификация основана на простом гистологическом критерии, она имеет чрезвычайно важное значение в клинической практике и прогнозировании развития заболевания, причем мелкоклеточный рак легких обычно лечат химиотерапией, в то время как для лечения немелкоклеточного рака легких в большинстве случаев в качестве лечения первого ряда используют хирургическое вмешательство.
Немелкоклеточные формы рака легких (НМКРЛ) объединяют на основании того, что их прогнозирование и лечение примерно одинаковы. Выделяют три основных подтипа: плоскоклеточная карцинома легких, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома легких. При этом основным лечением является хирургическое вмешательство, однако только четверть пациентов успешно переносят резекцию, при этом частота рецидивов составляет 50%. Способы лечения заболевания на поздней стадии включают, вслед за хирургическим вмешательством, вспомогательную химиотерапию и/или вспомогательную лучевую терапию, причем было установлено, что при использовании в качестве монотерпии (терапии первого ряда) наблюдались неудовлетворительные результаты. При сравнении четырех обычно используемых курсов комбинированной химиотерапии ни один не являлся достаточно эффективным. Эффективность терапии изменялась от 15% до 22%, при этом коэффициенты выживаемости составляли за первый год от 31% до 36% (см., например, статью O'Mahony D., S. Kummar и др., "Non-small-cell lung cancer vaccine therapy: a concise review", J. Clin. Oncol. 23(35); 9022-9028 (2005)). Таким образом, оказалось, что даже предоперационная химиотерапия не приводит к ожидаемому увеличению средней продолжительности жизни, а вспомогательная химиотерапия, применяемая также в комбинации с лучевой терапией, также не приводит к значительному увеличению средней продолжительности жизни.
Один из химиотерапевтических подходов, применяемых в настоящее время, представляет собой комбинации веществ на основе платина, например, с гемцитабином, применяемые даже в качестве терапии первой линии, при этом применяют, например, пеметрексед в качестве терапии второго ряда.
Другой вариант, применяемый для лечения НМКРЛ, представляет собой так называемую «направленную терапию», то есть попытку усилить эффективность классической цитотоксической химиотерапии при воздействии на специфические структуры-мишени в опухоли на молекулярном уровне. Применяемые при этом вещества включают бевацизумаб (ингибитор ангиогенеза) или эрлотиниб, который воздействует на рецепторные тирозинкиназы эпидермального фактора роста (РЭФР).
Даже несмотря на то, что, несомненно, наблюдается положительная динамика при применении современных терапевтических подходов к лечению рака легких, прежде всего НМКРЛ, все еще существуют серьезные трудности, связанные с высокими коэффициентами смертности, и настоятельная потребность в дельнейших, альтернативных или усовершенствованных способах лечения.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагается использовать иммунную систему при лечении НМКРЛ. Иммунная система играет важную роль в лечении и профилактике многочисленных заболеваний. В соответствии с современным состоянием науки млекопитающие обеспечены различными механизмами защиты организма, распознающими и убивающими, например, опухолевые клетки. Эти опухолевые клетки необходимо идентифицировать и распознавать от нормальных клеток и тканей организма.
Иммунная система позвоночных, таких как человек, состоит из многих типов белков, клеток, органов и тканей, которые взаимодействуют в сложной и динамичной системе. На одной из стадий этого чрезвычайно сложного иммунного ответа иммунная система в течение времени адаптируется к более эффективному распознаванию отдельных патогенов или опухолевых клеток. В результате адаптационного процесса создается иммунологическая память, что обеспечивает более эффективную защиту при последующих столкновениях с патогенами. Этот процесс адаптивного или приобретенного иммунитета формирует основу методик вакцинации.
Приобретенная иммунная система является антигенспецифичной и требует распознавания специфических «собственных» или «чужеродных» антигенов во время процесса, называемого презентацией антигена. Антигенная специфичность способствует формированию ответных реакций, направленных на специфические патогены или инфицированные патогеном клетки или опухолевые клетки. Способность формировать эти направленные ответные реакции поддерживается в организме так называемыми «клетками памяти». Если патоген инфицирует организм несколько раз, то эти специфические клетки памяти используются для быстрого устранения патогена. Таким образом, приобретенная иммунная система обеспечивает более сильный иммунный ответ, а также иммунологическую память, при этом каждый патоген или опухолевая клетка «запоминаются» в виде одного или более характерных антигенов.
Основные компоненты приобретенной иммунной системы у позвоночных преимущественно включают лимфоциты на клеточном уровне и антитела на молекулярном уровне. Лимфоциты в качестве компонентов приобретенной иммунной системы включают В-клетки и Т-клетки, которые происходят из гематопоэтических стволовых клеток в костном мозге. В-клетки принимают участие в гуморальном иммунном ответе, в то время как Т-клетки принимают участие в клеточном иммунном ответе. Как В-клетки, так и Т-клетки включают рецепторные молекулы, которые распознают специфические мишени. Т-клетки распознают «чужеродную» мишень, такую как патогенная структура-мишень, только после того, как образуются процессированные антигены (т.е. низкомолекулярные фрагменты патогена) и презентируются в комбинации с «собственным» рецептором, называемой главным комплексом гистосовместимости (ГКГ). Напротив, B-клеточный антигенспецифичный рецептор представляет собой молекулу антитела на поверхности В-клетки и распознает патогены как таковые в случае, когда антитела на их поверхности связываются со специфическим чужеродным антигеном. Такой комплекс антиген/антитело поглощается В-клеткой и подвергается процессингу-протеолизу с образованием пептидов. Затем В-клетка презентирует эти антигенные пептиды на своих поверхностных молекулах ГКГ класса II. Эта комбинация ГКГ и антигена привлекает соответствующую хелперную Т-клетку, которая высвобождает лимфокины и активирует В-клетку. Так как активированная В-клетка начинает затем делиться, ее потомки секретируют миллионы копий антител, которые распознают данный антиген. Эти антитела циркулируют в плазме крови и лимфе, связывают патогены или опухолевые клетки, экспрессирующие антиген, и маркируют их для последующего разрушения за счет активации комплемента или поглощения и разрушения фагоцитами.
+
Являясь клеточным компонентом приобретенной иммунной системы, цитотоксические Т-клетки, ЦТК (CD8+) могут формировать ЦТК-ответ. Цитотоксические Т-клетки (CD8+) могут распознавать пептиды из эндогенных патогенов и собственные антигены, связанные с молекулами ГКГ типа I. CD8-Т-клетки выполняют функцию киллеров при высвобождении цитотоксических белков в клетку.
Механизмы иммунной системы формируют мишени, предназначенные для лечения. Соответствующие способы, как правило, основаны на введении адъювантов для индукции врожденного иммунного ответа или на введении антигенов или иммуногенов для индукции приобретенного иммунного ответа. Так как антигенами обычно являются специфические компоненты патогенов (например, поверхностные белки) или их фрагменты, то введение пациенту нуклеиновых кислот, с последующей экспрессией требуемых полипептидов, белков или антигенов, можно рассматривать как перспективный способ лечения.
До настоящего времени стандартные способы индукции иммунного ответа, иммунизация или вакцинация, основаны на использовании ДНК с целью встраивания требуемой генетической информации в клетку. Разработаны различные методы введения ДНК в клетки, такие как трансфекция фосфатом кальция, трансфекция полипреном, слияние протопластов, электропорация, микроинъекция и липофекция, причем липофекция, как было установлено, является наиболее пригодным способом. Аналогичным образом можно использовать ДНК-содержащие вирусы в качестве переносчиков ДНК. Благодаря их инфицирующим свойствам, такие вирусы характеризуются чрезвычайно высокой скоростью трансфекции. Используемые вирусы генетически модифицированы таким образом, чтобы исключить образование функциональных инфекционных частиц в трансфектированной клетке. Однако, несмотря на такие меры предосторожности, невозможно исключить риск неконтролируемого размножения введенного гена и вирусных генов, например, из-за потенциально возможных случаев рекомбинации. Риск также заключается в возможности введения ДНК в здоровый ген в составе генома клетки-хозяина, например, в результате рекомбинации, с последующей мутацией этого гена, и, таким образом, происходит полная или частичная дезактивация гена, или он может содержать неверную информацию. Другими словами, существует возможность полного подавления синтеза генетического продукта, который жизненно необходим для клетки, или, напротив, возможность экспрессии измененного или неправильного генетического продукта. Особый риск возникает в случае, если ДНК вводят в ген, который принимает участие в регуляции клеточного роста. В этом случае клетка-хозяин может начать дегенерировать, что приводит к образованию рака или опухоли. Кроме того, если ДНК, введенная в клетку, должна экспрессироваться, возникает потребность в том, чтобы соответствующий переносчик ДНК содержал сильный промотор, такой как промотор вируса ЦМВ. Встраивание таких промоторов в геном подвергающейся воздействию клетки может привести к нежелательным отклонениям в регуляции экспрессии гена в клетке. Другой риск при использовании ДНК в качестве агента для усиления иммунного ответа (например, в форме вакцины) представляет собой индуцирование патогенных антител против ДНК у пациента, которому была введена чужеродная ДНК, что может индуцировать иммунный ответ (который может привести к летальному исходу).
В целом, таким образом, существует необходимость в разработке эффективной системы, которую можно использовать для эффективной стимуляции иммунной системы, обеспечивая лечение рака легких, прежде всего немелкоклеточного рака легких (НМКРЛ), исключая при этом проблемы, связанные с неконтролируемым размножением введенного гена при использовании композиций на основе ДНК.
Таким образом, целью настоящего изобретения является композиция, которая а) обеспечивает лечение рака легких в результате стимуляции иммунной системы и в то же время б) лишена вышеупомянутых недостатков.
Указанная цель достигается при разработке объекта настоящего изобретения, прежде всего активной (иммуностимулирующей) композиции, содержащей по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, выбранных из группы, содержащей антигены: hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин, MAGE-C1 и/или MAGE-C2.
Неожиданно было установлено, что специфическая комбинация по меньшей мере двух антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов из выше перечисленной группы, в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, может эффективно стимулировать (приобретенную) иммунную систему, обеспечивая лечение рака легких, прежде всего НМКРЛ. В данном контексте термины «антигены, антигенные белки или антигенные пептиды» используются в качестве синонимов. В контексте настоящего изобретения термин «активная» (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению обозначает композицию, которая вызывает иммунный ответ, предпочтительно, приобретенный иммунный ответ, как определено в данном контексте, при этом один из компонентов (или компоненты) содержится в композиции или кодируется компонентами активной (иммуностимулирующей) композиции, предпочтительно по меньшей мере одной РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей по меньшей мере два (предпочтительно, различных) антигена.
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может кодировать hTERT. В контексте настоящего изобретения термин «hTERT» обозначает теломеразу обратной транскриптазы человека, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «hTERT», в случае, если ее используют в активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.7 (SEQ ID NO:7), и еще более предпочтительно, на фиг.8 (SEQ ID NO:8). В статье Minev, В., J. Hipp и др., "Cytotoxic T cell immunity against telomerase reverse transcriptase in humans", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(9): 4796-4801 (2000) указано, что теломеразой является рибонуклеопротеиновый фермент, который связан со злокачественной трансформацией в клетках человека. Теломеразная активность возрастает в подавляющем большинстве опухолей человека, что приводит к тому, что ее генетический продукт становится основной молекулой, свойственной всем опухолям человека. Следовательно, накопление эндогенно процессированных теломеразных пептидов, связанных с молекулами ГКГ класса I, может направлять цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) к опухолям различного происхождения. Таким образом, согласно этим данным, указанный подход может представлять перспективный способ вакцинотерапии рака, что обеспечивается возможностью увеличения количества предшественника ЦТЛ, распознающего теломеразные пептиды у здоровых взрослых и раковых пациентов, в результате иммунизации. В указанной выше статье также описано, что у большинства здоровых субъектов и пациентов с раком предстательной железы, in vitro иммунизированных против двух пептидов HLA-A2.1, полученных в результате рестрикции теломеразы обратной транскриптазы (hTRT), вырабатываются hTRT-специфические ЦЛТ. В статье Carpenter E. L. и R. H. Vonderheide, "Telomerase-based immunotherapy of cancer", Expert. Opin. Biol. Ther. 6(10): 1031-1039 (2006) описаны прогрессивные исследования, начиная с клонирования теломеразы обратной транскриптазы человека (hTERT) в 1997 г. до первых клинических испытаний. Белок hTERT сверхэкспрессируется в подавляющем большинстве случаев рака человека, при этом он характеризуется ограниченной экспрессией в здоровых тканях человека. Он играет важную роль в онкогенезе и может экспрессироваться раковыми стволовыми клетками. Однако, несмотря на то, что он является собственным антигеном, hTERT проявляет иммуногенные свойства как in vitro, так и in vivo. Результаты нескольких клинических и иммунологических испытаний в первой фазе в ходе иммунотерапии с применением hTERT у пациентов с раком молочной железы, предстательной железы, легких и других форм рака, являются достаточно обнадеживающими. Иммунотерапия стимулировала у пациентов формирование функциональных противоопухолевых Т-клеток при отсутствии клинической токсичности. Существует также возможность вакцинации субъектов в качестве стратегии иммунопрофилактики в ходе лечения на основе hTERT. В статье Nair S. K., A. Heiser и др., "Induction of cytotoxic T cell responses and tumor immunity against unrelated tumors using telomerase reverse transcriptase RNA transfected dendritic cells", Nat. Med. 6(9): 1011-1017 (2000) описано развитие антимышиного TERT-иммунитета у мышей, вакцинированных дендритными клетками, трансфектированными мышиной TERT РНК. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген hTERT, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.7 (SEQ ID NO:7), и более предпочтительно, на фиг.8 (SEQ ID NO:8). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген hTERT, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности hTERT, как показано на фиг.7 (SEQ ID NO:7), и более предпочтительно, как показано на фиг.8 (SEQ ID NO:8).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать WTI. В контексте настоящего изобретения термин «WT1» обозначает опухоль Вильмса стадии 1 и предпочтительную последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующую «WT1», при условии ее использования в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, как показано на фиг.9 (SEQ ID NO:9), более предпочтительно, как показано на фиг.10 (SEQ ID NO:10), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.11 (SEQ ID NO:11). В статье Oka Y., A. Tsuboi и др., "Induction of WTI (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WTI peptide vaccine and the resultant cancer regression", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (38): 13885-13890 (2004) было установлено, что белок опухоли Вильмса сверхэкспрессируется при раке легких. В этой статье описана вакцинация 10 пациентов с раком легких пептидом из WT1. Было установлено, что клиническая ответная реакция коррелирует с антиопухолевой CD8+-T-клеточной активностью. Ген опухоли Вильмса WT1 сверхэкспрессируется при лейкозах и различных типах солидных опухолей, и было установлено, что белок WT1 является перспективным антигеном-мишенью для иммунотерапии против этих злокачественных новообразований. В статье Oka и др. (2004 г., см. выше) описаны результаты фазы I клинических испытаний в ходе иммунотерапии, основанной на применении пептида WT1 у пациентов с раком молочной железы и легких, миелодиспластическим синдромом или острым миелоидным лейкозом. У двенадцати из 20 пациентов, у которых можно было оценивать эффективность вакцинации WT1, наблюдалась клиническая ответная реакция, такая как уменьшение количества лейкозных бластных клеток или размера опухоли и/или онкомаркеров. Наблюдалась четкая корреляция между ростом частоты WT1-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов после вакцинации WT1 и клинической ответной реакцией. Таким образом, было установлено, что вакцинация WT1 может индуцировать выработку WT1-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и приводит к ремиссии рака при отсутствии повреждения нормальных тканей. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген WT1, выбранный из последовательности, как показано на фиг.9 (SEQ ID NO:9), и более предпочтительно, как показано на фиг.10 (SEQ ID NO:), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.11 (SEQ ID NO:11). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген WT1, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности WT1, как показано на фиг.10 (SEQ ID NO:10), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.11 (SEQ ID NO:11).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MAGE-A2. В контексте настоящего изобретения термин «MAGE-A2» обозначает меланомный антиген семейства А, 2В, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «MAGE-A2», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.14 (SEQ ID NO:14), и наиболее предпочтительно, на фиг.15 (SEQ ID NO:15). В статье Gillespie А. М. И R. Е. Coleman, "The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy", Cancer Treat. Rev. 25(4): 219-227 (1999) описана экспрессия при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, колоректальном раке, раке желудка, раке головы и шеи, раке легких, раке челюсти, меланоме, раке пищевода, остеосаркоме и раке яичника. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген MAGE-A2, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.14 (SEQ ID NO:14), и более предпочтительно, как показано на фиг.15 (SEQ ID NO:15). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MAGE-A2, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MAGE-A2, как показано на фиг.14 (SEQ ID NO:14), и более предпочтительно, как показано на фиг.15 (SEQ ID NO:15).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать 5Т4. В контексте настоящего изобретения, термин «5Т4» обозначает трофобластный гликопротеин, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «5Т4», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.3 (SEQ ID NO:3), и более предпочтительно, на фиг.4 (SEQ ID NO:4). В статье Harrop R., N. Connolly и др., "Vaccination of colorectal cancer patients with modified Vaccinia Ankara delivering the tumor antigen 5Т4 (TroVax) induces immune responses which correlate with disease control: a phase 1/11 trial", Clin. Cancer Res. 12 (11 Pt 1): 3416-3424 (2006) было установлено, что онкоэмбриональный антиген 5Т4 представляет собой мембранный гликопротеин с повышенным содержанием лейцина и массой 72 кДа, который экспрессируется на высоком уровне в плаценте, а также при целом ряде карцином человека, включая колоректальный рак, рак желудка, почки и яичников, но редко встречается в здоровых тканях. Сверхэкспрессия 5Т4 связана с неблагоприятным прогнозом у пациентов с колоректальным раком, раком желудка и яичников. Несмотря на такое сочетание факторов, 5Т4-специфический клеточный и/или гуморальный иммунный ответ был индуцирован у большинства пациентов (16 из 17, 94%), после иммунизации TroVax, которая считается перспективной по сравнению с результатами испытаний множества других способов иммунотерапии рака. Таким образом, в указанной выше статье описаны безопасность и иммуногенность доставки TroVax внутримышечным и внутрикожным способами введения. В статье Zhao Y. и Y. Wang, "5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors". Cell Mol. Immunol. 4(2): 99-104 (2007) указано, что онкотрофобластный гликопротеин 5T4 является трансмембранным белком, экспрессируемым в эмбриональной ткани и на поверхности клеток различных злокачественных опухолей. Он играет жизненно важную роль в многочисленных биологических и патологических процессах, включая весьма обширную миграцию клеток при эмбриогенезе, клеточную инвазию, вызываемую имплантацией, и метастазы опухоли в процессе онкогенеза. В статье Kopreski М. S., F. A. Benko и др., "Circulating RNA as a tumor marker: detection of 5T4 mRNA in breast and lung cancer patient serum", Ann. NY Acad. Sci. 945: 172-178 (2001) указано, что 5T4 является трофобластным гликопротеином, который сверхэкспрессируется с высокой частотой при эпителиальных злокачественных образованиях, что является потенциальной мишенью при лечении рака. Отбирали сыворотку у 19 пациентов с прогрессирующим раком молочной железы (5 пациентов) или немелкоклеточным раком легких (14 пациентов), а также у 25 здоровых добровольцев, использованных в качестве контрольных пациентов с амплифицируемой РНК. РНК, экстрагированную из сыворотки, амплифицировали методом ОТ-ПЦР с использованием полугнездовой двухстадийной реакции, при этом продукты детектировали методом электрофореза. 5T4 мРНК воспроизводимо детектировали в 8 из 19 (42%) сыворотках пациентов, больных раком, включая 2 из 5 сывороток пациентов, больных раком молочной железы и 6 из 14 сывороток пациентов, больных раком легких, но только в 3 из 25 (12%) здоровых контрольных сыворотках (р=0,035). Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген 5Т4, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.3 (SEQ ID NO:3), и более предпочтительно, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:4). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген 5Т4, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности 5Т4, как показано на фиг.3 (SEQ ID NO:3), и более предпочтительно, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:4).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MAGE-A3. В контексте настоящего изобретения термин «MAGE-A3» обозначает меланомный антиген семейства А, 3, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «MAGE-A3», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.16 (SEQ ID NO:16), и наиболее предпочтительно, на фиг.17 (SEQ ID NO:17). В статье Gillespie А. М. и R. Е. Coleman, "The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy". Cancer Treat. Rev. 25(4): 219-227 (1999) описана экспрессия при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, колоректальном раке, раке желудка, глиоме, раке головы и шеи, раке легких, раке челюсти, меланоме, нейробластоме, раке пищевода и раке яичников. В статье Sienel W., С. Varwerk и др., "Melanoma associated antigen (MAGE)-A3 expression in Stages I and II non-small cell lung cancer: results of a multi-center study", Eur. I. Cardiothorac. Surg. 25(1): 131-134 (2004) описаны результаты исследования, проведенного с целью определения степени экспрессии MAGE-A3 на ранней стадии НМКРЛ. Были отобраны образцы первичной опухоли от 204 пациентов с НМКРЛ на операбельных стадиях I и II, и определена стадия развития патологии. Экспрессию MAGE-A3 анализировали в образцах ткани при детектировании транскриптов MAGE-A3 методом ОТ-ПЦР. Экспрессию MAGE-A3 наблюдали в 80 из 204 (39,2%) исследованных образцов первичных опухолей на стадиях I и II. В статье Atanackovic D., N. К. Altorki и др., "Vaccine-induced CD4+ Т cell responses to MAGE-3 protein in lung cancer patients", J. Immunol. 1 72(5): 3289-3296 (2004) описано, что MAGE-A3 является опухоль-асоциированным антигеном, первоначально идентифицированным в меланоме, а также в опухолях при немелкоклеточном раке легких. В ходе клинического испытания 9 пациентов с НМКРЛ вакцинировали белком, при этом наблюдалось 3 детектируемых гуморальных иммунных ответа. У семи из 8 пациентов, которым вводили MAGE-A3 в комбинации с адъювантом ASO2B, вырабатывались антитела против MAGE-A3. У нескольких из этих пациентов также наблюдались Т-клеточные иммунные ответы против белка. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген MAGE-A3, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.16 (SEQ ID NO:16), и более предпочтительно, как показано на фиг.17 (SEQ ID NO:17). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MAGE-A3, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MAGE-A3, как показано на фиг.16 (SEQ ID NO:16), и более предпочтительно, как показано на фиг.17 (SEQ ID NO:17).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MUC1. В контексте настоящего изобретения термин «MUC1» обозначает муцин 1, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей «MUC1», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.1 (SEQ ID NO:1), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.2 (SEQ ID NO:2). Опухоль-ассоциированные муцины являются потенциальной мишенью при иммунотерапии. Эти молекулы, как полагают, способствуют метастазированию за счет ускорения адгезии злокачественных клеток к поверхности эндотелиальных клеток. В статье Denda-Nagai K. и Т. Lrimura, "MUC1 in carcinoma-host interactions", Glycoconj J., 17 (7-9): 649-658), описано, что MUC-I сверхэкспрессируется в 90% случаев всех аденокарцином, включая поражения молочной железы, легких, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, ободочной кишки и яичников. В статье Kontani K., О. Taguchi и др., "Modulation of MUC1 mucin as an escape mechanism of breast cancer cells from autologous cytotoxic T-lymphocytes", Br. J. Cancer. 84(9): 1258-1264 (2001) описано, что MUC-1 экспрессируется в 60% случаев рака легких, в то время как в статье Kontani K., О. Taguchi и др., "Dendritic cell vaccine immunotherapy of cancer targeting MUC1 mucin", Int. J. Mol. Med., 12(4): 493-502 (2003) описаны результаты исследований с использованием нагруженных MUC1 антигеном пульсирующих дендритных клеток (ДК) для индукции клеточного иммунитета в случаях MUC1-положительного рака, при этом клинически было установлено, что у семи из девяти MUC1-положительных пациентов наблюдается ответная реакция на соответствующее лечение, что выражается либо в уменьшении уровней онкомаркеров, либо в исчезновении злокачественного плеврального выпота. Причем у трех из этих пациентов с положительной ответной реакцией был установлен диагноз НМКРЛ. В статье Palmer M., J. Parker и др., "Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer", Clin. Lung Cancer, 3(1): 49-57 discussion 58 (2001) указано, что в фазе I клинических испытаний с применением пептида MUC1 на стадиях III/IV НМКРЛ, наблюдались безопасность и иммунность указанного агента. У 5 из 12 пациентов (42%) наблюдался иммунный ответ, у 4 из 12 пациентов (33%) наблюдалась стабилизация заболевания. Кроме того, в статье Wierecky J., M. Mueller и др., "Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1", Cancer Immunol. Lmmunother., 55(1): 63-67 (2006) описана идентификация двух HLA-A2-связывающих новых нонапептида из опухоль-ассоциированного антигена MUC1, который сверхэкспрессируется при различных гематологических и эпителиальных злокачественных образованиях. Цитотоксические Т-клетки, образующиеся под действием пульсирующих, нагруженных этими пептидами ДК, вызывали лизис опухолевых клеток, экспрессирующих MUC1 по антигенспецифичному и HLA-ограниченному механизму. По данным двух клинических испытаний было установлено, что при вакцинации пациентов с прогрессирующим раком с использованием ДК, нагруженных пептидами из MUC1, наблюдалась достаточно высокая переносимость без серьезных побочных эффектов, и формировался иммунный ответ. Из 20 пациентов с метастазирующей почечно-клеточной карциномой у 6 пациентов наблюдалась регрессия метастазов тремя объективными ответами (1 CR и 2 PR). Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген MUC1, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.1 (SEQ ID NO:1), и более предпочтительно, как показано на фиг.2 (SEQ ID NO:2). Согласно еще одному предпочтительному варианту настоящего изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MUC1, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MUC1, как показано на фиг.1 (SEQ ID NO:1), и более предпочтительно, как показано на фиг.2 (SEQ ID NO:2).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать Her-2/neu. В контексте настоящего изобретения термин «Her-2/neu» обозначает гомолог 2 вирусного онкогена эритробластного лейкоза, v-erb-b2, а предпочтительная последовательность РНК, кодирующая «Her-2/neu», предпочтительно, мРНК, кодирующая «Her-2/neu», при условии, что она используется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.5 (SEQ ID NO:5), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.6 (SEQ ID NO:6). В статье Baxevanis C.N., P.A. Sotiropoulou и др., "Immunobiology of HER-2/neu oncoprotein and its potential application in cancer immunotherapy". Cancer Immunol. Lmmunother., 53(3): 166-175 (2004) указано, что HER-2/neu (также известный как HER2 или c-erb-B2) представляет собой белковый рецептор массой 185 кДа, который характеризуется тирозинкиназной активностью и высокой степенью гомологии по сравнению с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР). HER-2/neu экспрессируется при многих эпителиальных опухолях и, как известно, сверхэкспрессируется, приблизительно, в 20-25% всех случаев рака яичников и рака молочной железы, 35-45% всех случаев аденокарциномы поджелудочной железы и до 90% случаев колоректальной карциномы. Сверхэкспрессия HER-2/neu является маркером неблагоприятного прогноза. Сверхэкспрессия HER-2/neu наблюдается при злокачественных опухолях молочной железы, яичников, поджелудочной железы, ободочной кишки, легких и других тканей. В норме Her-2 экспрессируется на низком уровне в различных тканях человека (в коже, эпителии пищеварительного тракта, молочной железе, яичниках, гепатоцитах). В статье Bernhard H., Salazar L. и др., "Vaccination against the HER-2/neu oncogenic protein", Endocr. Relat. Cancer, 9(1): 33-44 (2002) указано, что предварительные результаты клинических испытаний свидетельствуют о том, что у больных раком, активно иммунизированных против HER-2/neu, можно индуцировать иммунитет и что иммунный ответ сохраняется в течение некоторого периода времени. Современные клинические испытания вакцины направлены только на применение вакцин на основе эпитопов или пептидов, главным образом в связи с данными о том, что такая стратегия на основе пептидной вакцинации может исключить новую неспецифическую переносимость в моделях грызунов. Следующее поколение вакцин, как описано в статье Bernhard и др. (2002) (см. выше), будет, по-видимому, включать вакцины на основе белков, препаратов ДК, нагруженных антигеном HER-2/neu, и составов на основе нуклеиновых кислот. Доклинические испытания указанных подходов на модели грызунов оказались достаточно обнадеживающими. Рост HER-2/neu-специфических Т-клеток ex vivo после активной иммунизации или их культивирование in vitro с применением ДК, экспрессирующих HER-2/neu, считается, таким образом, перспективным методом лечения HER-2/neu-сверхэкспрессирующих опухолей на поздних стадиях. В статье Baxevanis C.N., N.N. Sotiriadou и др., "Immunogenic HER-2/neu peptides as tumor vaccines", Cancer Immunol. Lmmunother. 55(1): 85-95 (2006) было установлено, что у людей, несмотря на то, что были отмечены случаи иммунологического ответа на пептиды, использованные при вакцинации, не было описано случаев ответной реакции в ходе клинических испытаний. В статье Disis M.L., Т.A. Gooley и др., "Generation of Т-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neu peptide-based vaccines", J. Clin. Oncol. 20(11); 2624-2632 (2002) описано, что Her-2/neu является членом семейства рецепторов ЭФР. В большинстве случаев он сверхэкспрессируется при раке молочной железы, яичников, предстательной железы, колоректальном раке и раке легких. В фазе I клинических испытаний 38 пациентов (2 с диагнозом НМКРЛ) были вакцинированы пептидом Her-2/neu. У 92% пациентов наблюдалось развитие Т-клеточного иммунитета к Her-2/neu. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген Her-2/neu, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.5 (SEQ ID NO:5), и более предпочтительно, как показано на фиг.6 (SEQ ID NO:6). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген Her-2/neu, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности Her-2/neu, как показано на фиг.5 (SEQ ID NO:5), и более предпочтительно, как показано на фиг.6 (SEQ ID NO:6).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать NY-ESO-1. В контексте настоящего изобретения термин «NY-ESO-1» обозначает антиген 1 В тестикулярного рака, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей «NY-ESO-1», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.20 (SEQ ID NO:20), и наиболее предпочтительно, на фиг.21 (SEQ ID NO:21). В статье Chen Y.T., M.J. Scanlan и др., "A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(5): 1914-1918 (1997) описана опосредованная мРНК экспрессия NY-ESO-1 в различных опухолях человека, выявленных методом ОТ-ПЦР: меланома 23/67, рак яичников 2/8, рак молочной железы 10/33, рак щитовидной железы 2/5, рак предстательной железы 4/16, рак мочевого пузыря 4/5, колоректальный рак 0/16, лимфома Беркитта 1/2, глиома 0/15, базальноклеточная карцинома 0/2, рак желудка 0/12, лейомиосаркома 0/2, рак легких 2/12, прочие саркомы 0/2, рак почки 0/10, рак поджелудочной железы 0/2, лимфома 0/10, семинома 0/1, гепатома 2/7, опухоль спинного мозга 0/1. В статье Jager Е., J. Karbach и др., "Recombinant vaccinia/fowl pox NY-ESO-1 vaccines induce both humoral and cellular NY-ESO-1-specific immune responses in cancer patients", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(39): 14453-14458 (2006) указано, что NY-ESO-1 представляет собой антиген тестикулярного рака, экспрессируемый при ряде злокачественных образований у человека, и что разработаны многочисленные способы вакцинации, в которых в качестве мишени используются NY-ESO-1. В указанных испытаниях оценивали безопасность и иммуногенность рекомбинантной вакцины на основе NY-ESO-1 и рекомбинантной вакцины на основе куриной чумы-NY-ESO-1, с участием группы из 36 пациентов с различными типами опухолей. Каждый конструкт первоначально испытывали индивидуально, с использованием двух различных доз, и затем вторичной инъекции рекомбинантной вакцины NY-ESO-1, а затем рекомбинантной вакцины на основе куриной чумы-NY-ESO-1. Вакцины характеризовались достаточно высокой переносимостью, как после введения в отдельности, так и в смеси. Ответ, опосредованный NY-ESO-1-специфичными антителами, и/или специфические CD8 и CD4 Т-клеточный ответы, направленные против широкого набора NY-ESO-1 эпитопов, индуцируются по меньшей мере после курса из четырех вакцинаций с месячным интервалом у большинства пациентов. Было установлено, что клоны CD8 Т-клеток, полученных от пяти вакцинированных пациентов, лизируют клетки-мишени из NY-ESO-1-экспрессирующей меланомы. В некоторых случаях полученные результаты с участием ряда пациентов с меланомой свидетельствовали о том, что вакцинация оказывала благоприятное влияние на естественное течение болезни. В статье Davis I.D., W. Chen и др., "Recombinant NY-ESO-1 protein with ISCOMATRIX adjuvant induces broad integrated antibody and CD4(+) and CD8(+) Т cell responses in humans." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (29): 10697-10702 (2004) указано, что НLА-А2-рестрикционные пептиды NY-ESO-1 при внутрикожном введении характеризуются безопасностью и иммуногенностью. Несмотря на то, что данные испытания проводили только с целью оценки безопасности и иммуногенности, у некоторых пациентов наблюдали регрессию опухоли или стабилизацию течения заболевания. Кроме того, в статье Jager E., S. Gnjatic и др., "Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ Т lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1 + cancers", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(22): 12198-12203 (2000) указано, что выраженный NY-ESO-1-специфичный иммунный ответ, включая индуцированный антителами ответ, а также CD4 и CD8 Т-клеточный ответ наблюдался после иммунизации рекомбинантным белком NY-ESO-1 в комбинации с адъювантом ISCOMATRIX (CSL Ltd., Parkville, Victoria, Australia) у пациентов с удаленной NY-ESO-1-экспрессирующей меланомой. Было установлено, что указанный иммунный ответ на вакцинацию сопровождался длительным периодом ремиссии. Кроме того, в статье Odunsi K., F. Qian и др., "Vaccination with an NY-ESO-1 peptide of HLA class 1/11 specificities induces integrated humoral and Т cell responses in ovarian cancer", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(31): 12837-12842 (2007) указано, что вакцинация NY-ESO-1 пептида вызывает объединенный гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ при раке яичников. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген NY-ESO-1, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.20 (SEQ ID NO:20), и более предпочтительно, на фиг.21 (SEQ ID NO:21). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген NY-ESO-1, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности NY-ESO-1, как показано на фиг.20 (SEQ ID NO:20), и более предпочтительно, как показано на фиг.21 (SEQ ID NO:21).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать СЕА. В контексте настоящего изобретения термин «СЕА» обозначает эмбриональный опухолевый антиген (СЕСАМ5, т.е. молекула клеточной адгезии, связанная с эмбриональным опухолевым антигеном 5), а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «СЕА», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.12 (SEQ ID NO:12), и наиболее предпочтительно, на фиг.13 (SEQ ID NO:13). В статье Hammarstrom S., "The carcinoembryonic antigen (СЕА) family: structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues", Semin. Cancer Biol. 9(2): 67-81 (1999) указано, что СЕА является онкофетальным гликопротеином массой 180 кДа, который проявляет свойства молекулы клеточной адгезии и сверхэкспрессируется в 70% случаев НМКРЛ. В статье Berinstein N.L., "Carcinoembryonic antigen as a target for therapeutic anticancer vaccines: a review", J. Clin. Oncol. 20(8): 2197-2207 (2002) указано, что СЕА обладает рядом перспективных свойств для использования в качестве мишени при разработке способов активной вакцинации против рака. Он характеризуется пригодным механизмом экспрессии, и экспрессируется в более 50% случаев рака человека. Он может играть роль в онкогенезе сам по себе, и, таким образом, его экспрессию можно оценивать и останавливать в ходе прогрессирования рака. Имеются надежные данные о том, что СЕА подвергается процессингу и презентируется на различных молекулах ГКГ класса 1. Кроме того, иммунологическая переносимость СЕА не является абсолютной. Имеются многочисленные данные о том, что Т-клетки человека могут распознавать, активироваться и лизировать раковые клетки, которые экспрессируют СЕА. Оценивали несколько различных способов терапевтической вакцинации с использованием СЕА в качестве антигена-мишени, а также степень безопасности этих способов. Кроме того, регистрировали наличие гуморального и/или клеточного иммунного ответа на СЕА. Несмотря на то, что у большинства пациентов, выбранных для этих испытаний, был установлен диагноз прогрессирующего резистентного метастазирующего рака ободочной кишки, наблюдаются признаки клинической активности, т.е. приостановка развития заболевания и даже объективная ответная реакция у некоторых пациентов. Дендритные клетки, нагруженные пептидом, связывающимся с агонистом СЕА ГКГ класса I (CAPI -6D), и векторы на основе поксвируса с включенным СЕА, в присутствии или в отсутствие способствующих стимуляции молекул, проявляли наибольшую активность при активации CD8 Т-клеточного ответа. К сожалению, применение методов с использованием дендритных клеток ограничено трудностями при получении образцов дендритных клеток, специфичных к тканям пациента. Описаны результаты четырех испытаний фазы I с использованием системы вектора канарского поксвируса для воздействия на СЕА. Полученные результаты свидетельствовали о том, что данные способы безопасны и характеризуются легкой степенью токсичности 1 и 2, в зависимости от участка введения. Кроме того, в результате испытаний было установлено, что у большинства пациентов можно активировать специфический Т-клеточный ответ на присутствие СЕА. Такие ответы можно усилить включением в вектор совместно стимулирующей молекулы В7.1, или при добавлении рекомбинантного ГМКСФ (гранулоцито-макрофаго-колониестимулирующего фактора) в участок введения. Несмотря на то, что не наблюдались объективные клинические ответы, у значительной части пациентов в этой фазе I испытаний регистрировали случаи стабилизации заболевания. Были разработаны способы вакцинации для дальнейшего увеличения частоты распознавания СЕА Т-клетками с целью повышения клинической эффективности этих вакцин. Опубликованы данные, подтверждающие, что по меньшей мере некоторые из вакцин являются более эффективными на начальных стадиях заболевания. В статье Ueda Y., Т. Itoh и др., "Dendritic cell-based immunotherapy of cancer with carcinoembryonic antigen- derived, HLA-A24-restricted CTL epitope: Clinical outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas", Int. J. Oncol. 24(4): 909-917 (2004) описаны испытания, в которых 18 пациентам с метастазирующим раком желудочно-кишечного тракта или раком легких вводили собственные дендритные клетки, нагруженные пептидом, полученным из СЕА. Иммунные реакции, определяемые по кожной пробе и Т-клеточным анализом in vitro, наблюдались у большинства пациентов. Несмотря на отсутствие данных об объективном клиническом ответе, у некоторых пациентов наблюдалась стабилизация заболевания в ходе указанной иммунотерапии. Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген СЕА, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.12 (SEQ ID NO:12), и более предпочтительно, на фиг.13 (SEQ ID NO:13). Согласно еще одному предпочтительному варианту настоящего изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген СЕА, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности СЕА, как показано на фиг.12 (SEQ ID NO:12), и более предпочтительно, на фиг.13 (SEQ ID NO:13).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать сурвивин. В контексте настоящего изобретения термин «сурвивин» обозначает белок-ингибитор 5 апоптоза (IAP), включающий повторы бакуловирусного ингибитора (сурвивин), а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей «сурвивин», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.18 (SEQ ID NO:18), и наиболее предпочтительно, на фиг.19 (SEQ ID NO:19). В статье Grube M., S. Moritz и др., "CD8+ Т cells reactive to survivin antigen in patients with multiple myeloma", Clin. Cancer Res. 13(3): 1053-1060 (2007) описан сурвивин. Сурвивин является членом семейства ингибиторов апоптоза и сверэкспрессируется при развитии различных типов злокачественных новообразований. Цитотоксические Т-клетки, распознающие эпитопы сурвивина, можно получить in vitro или при вакцинации пациентов с диагнозом лейкоз, рак молочной железы и меланома. Исследовали уровень сурвивин-специфических CD8+-Т-клеток у пациентов с множественной миеломой, при этом были выявлены Т-клетки, распознающие пептид HLA-A2.1, связывающийся с сурвивином, у 9 из 23 пациентов и у 1 из 21 здорового добровольца. Сурвивин-реактивные Т-клетки были идентифицированы как терминально дифференцированные эффекторные Т-клетки (CD8+, CD45RA+ и CCR7-). Позитивная экспрессия сурвивина в миеломных клетках костного мозга наблюдалась у 7 из 11 пациентов. Сурвивин экспрессируется на высоком уровне в большинстве человеческих раковых клеток эпителиального или гематопоэтического происхождения, и его сверхэкспрессия связана с развитием рака, неблагоприятным прогнозом, резистентностью к лечению и низкой выживаемостью пациентов. В статье Duffy M.J., N. O'Donovan и др., "Survivin: a promising tumor biomarker". Cancer Lett. 249(1): 49-60 (2007) описан сурвиван, который является белком массой 16,5 кДа, сверхэкспрессируется при большинстве всех злокачественных новообразований, однако редко детектируется в здоровых дифференцированных взрослых тканях. Было установлено, что функционально сурвивин является ингибитором апоптоза, стимулирует пролиферацию клеток и усиливает ангиогенез. Принимая во внимание его значение в этих процессах, сурвивину приписывается основная роль в развитии рака. Благодаря значительному различию в его экспрессии в здоровых и злокачественных тканях и его важной роли в развитии рака, сурвивин в настоящее время интенсивно изучается в качестве потенциального опухолевого маркера. С учетом накопленных данных, полагают, что определение уровня сурвивина можно использовать при ранней диагностике рака мочевого пузыря, для прогнозирования развития различных типов рака и для предсказания иммунного ответа при выборе противораковой терапии. В статье Zeis M., S. Siegel и др., "Generation of cytotoxic responses in mice and human individuals against hematological malignancies using survivin-RNA-transfected dendritic cells", J. Immunol. 1 70(11): 5391-5397(2003) установлено, что сурвивин-специфические цитотоксичные Т-лимфоциты (ЦТЛ) человека, образующиеся из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) в результате стимуляции собственными дендритными клетками, трансфектированными сурвивин-РНК, проявляют цитотоксичность в отношении кроветворных злокачественных клеточных линий и первичных опухолевых клеток, выделенных из тканей пациентов с острым миелоидным лейкозом. Было также установлено, что вакцинация мышей сурвивин-РНК трансфецированными дендритными клетками приводит к продолжительной резистентности к сурвивин-экспрессирующей лимфоме, что свидетельствует о возможности использования сурвивина в качестве антигена отторжения опухоли. Доказано также, что сурвивин можно использовать в качестве структуры-мишени при разработке иммунотерапевтической стратегии лечения гематологических новообразований. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать сурвивин-антиген, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.18 (SEQ ID NO:18), и более предпочтительно, на фиг.19 (SEQ ID NO:19). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать сурвивин-антиген, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности сурвивина, как показано на фиг.18 (SEQ ID NO:18), и более предпочтительно, на фиг.19 (SEQ ID NO:19).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MAGE-C1. В контексте настоящего изобретения термин «MAGE-C1» обозначает меланомный антиген семейства С,1 и предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей «MAGE-C1», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.22 (SEQ ID NO:22), более предпочтительно, на фиг.23 (SEQ ID NO:23), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.24 (SEQ ID NO:24). Недавно в статье Lucas S., С. De Smet и др., "Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression by representational difference analysis", Cancer Res. 58(4): 743-752 (1998) описана идентификация MAGE-C1, по данным репрезентативного дифференциального анализа (РДА). MAGE-C1 не экспрессируется при тестировании на панели здоровых тканей, за исключением яичка. В числе опухолевых тканей, MAGE-C1 часто экспрессируется в семиномах, меланомах и карциномах мочевого пузыря. Он также экспрессируется во множестве случаев карциномы головы и шеи, при карциномах молочной железы, немелкоклеточных карциномах легких, аденокарциномах предстательной железы и саркомах. В статье Jungbluth A. A., Y. Т. Chen и др., "СТ7 (MAGE-C1) antigen expression in normal and neoplastic tissues", Int. J. Cancer 99(6): 839-845 (2002) описана экспрессия при раке молочной железы, раке яичников, раке печени, раке яичка, раке мочевого пузыря, меланоме и немелкоклеточном раке легких (39%). В статье Gure А.О., R. Chua и др., "Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer", Clin. Cancer Res. 11 (22): 8055-8062 (2005). Gure, Chua и др. (2005 г.) описан анализ опухолей у 523 пациентов с немелкоклеточным раком легких, по уровню экспрессии антигенов опухолей яичка (СТ-антигенов). MAGE-C1 выявлен в 18,8% случаев. В статье Scanlan M.J., N.K. Altorki и др., "Expression of cancer-testis antigens in lung cancer: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9", Cancer Lett. 150(2): 155-164 (2000) также описана экспрессия СТ-антигенов в 33 случаях немелкоклеточного рака легких, в том числе MAGE-C1 в 30% случаев. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать MAGE-C1 антиген, выбранный из последовательности, как показано на фиг.22 (SEQ ID NO:22), и более предпочтительно, на фиг.23 (SEQ ID NO:23), и наиболее предпочтительно, на фиг.24 (SEQ ID NO:24). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MAGE-C1, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MAGE-C1, как показано на фиг.22 (SEQ ID NO:22), и более предпочтительно, на фиг.23 (SEQ ID NO:23), и наиболее предпочтительно, на фиг.24 (SEQ ID NO:24).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MAGE-C2. В контексте настоящего изобретения термин «MAGE-C2» обозначает меланомный антиген семейства С2, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей «MAGE-C2», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.25 (SEQ ID NO:25), и наиболее предпочтительно, на фиг.26 (SEQ ID NO:26). Недавно в статье Lucas S., E. De Plaen и др., "MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, and MAGE-C3: four new members of the MAGE family with tumor-specific expression", Int. J. Cancer 87(1): 55-60 (2000) описана идентификация MAGE-C2 по данным репрезентативного дифференциального анализа (РДА) на клеточной линии меланомы (смотри). MAGE-C2 не экспрессируется при тестировании на панели набора здоровых тканей, за исключением яичка. В числе опухолевых тканей, MAGE-C2 часто экспрессируется в семиномах, меланомах и карциномах мочевого пузыря. Он также экспрессируется в большинстве случаев карциномы головы и шеи, при карциномах молочной железы, немелкоклеточных карциномах легких и саркомах. В статье Scanlan M.J., N.K. Altorki и др., "Expression of cancer-testis antigens in lung cancer: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9", Cancer Lett. 150(2): 155-164 (2000) описана экспрессия СТ-антигенов в 33 случаях немелкоклеточного рака, в том числе MAGE-C2, в 30% случаев. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген MAGE-C2, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.25 (SEQ ID NO:25), и более предпочтительно, на фиг.26 (SEQ ID NO:26). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MAGE-C2, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MAGE-C2, как показано на фиг.25 (SEQ ID NO:25), и более предпочтительно, на фиг.26 (SEQ ID NO:26).
Антигены, антигенные белки или антигенные пептиды, как определено выше, которые могут кодироваться по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, могут содержать фрагменты или варианты указанных последовательностей. Такие фрагменты или варианты, как правило, могут включать последовательность, которая характеризуется гомологией последовательности по сравнению с одним из упомянутых выше антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов или по сравнению с нуклеотидными последовательностями кодирующих их нуклеиновых кислот, при этом гомология составляет по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, также более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% или даже 97%, по сравнению с полноразмерной нуклеотидной и аминокислотной последовательностями дикого типа.
«Фрагменты» антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов в контексте настоящего изобретения могут включать последовательность антигена, антигенного белка или антигенного пептида, как определено выше, которая является укороченной по сравнению с аминокислотной последовательностью (или кодирующей ее нуклеотидной последовательностью нуклеиновой кислоты), по N-концевому, C-концевому и/или центральному участку последовательности, по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного (природного) белка (или нуклеотидной последовательностью кодирующей его нуклеиновой кислоты). Такие укороченные фрагменты, таким образом, относятся как к аминокислотным, так и, соответственно, нуклеотидным последовательностям. Следовательно, гомология последовательностей в отношении фрагмента, как было определено выше, может, предпочтительно, относиться к полноразмерному антигену, антигенному белку или антигенному пептиду, как было определено выше, или к полноразмерной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей такой антиген, антигенный белок или антигенный пептид.
Фрагменты антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов в контексте настоящего изобретения могут также включать последовательность антигена, антигенного белка или антигенного пептида, как определено выше, длиной, приблизительно, от 6 до 20 или даже более остатков аминокислот, например, длина фрагментов, которые образуются в результате процессинга и презентации на молекулах ГКГ класса I, предпочтительно, составляет от 8 до 10 аминокислотных остатков, например 8, 9 или 10 (или 6, 7, 11 или 12 аминокислотных остатков), или длина фрагментов, которые образуются в результате процессинга и презентации на молекулах ГКГ класса II, предпочтительно, составляет, приблизительно, 13 или более аминокислотных остатков, например 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже более аминокислотных остатков, при этом данные фрагменты могут быть выбраны из любого участка аминокислотной последовательности. Эти фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГ, т.е. фрагменты в нативной форме, как правило, не распознаются.
Фрагменты антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов в контексте настоящего изобретения могут также включать эпитопы этих антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов. Эпитопы (называемые также «антигенными детерминантами»), в контексте настоящего изобретения, являются, как правило, фрагментами, расположенными на внешней поверхности (нативных) антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов, как определено в данном контексте, предпочтительно, включающими от 5 до 15 аминокислотных остатков, более предпочтительно, включающими от 5 до 12 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно, включающими от 6 до 9 аминокислотных остатков, которые могут распознаваться антителами или рецепторами В-клеток в их нативной форме. Такие эпитопы антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов можно также выбрать из любого упомянутого в данном контексте варианта таких антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов. В данном контексте антигенные детерминанты могут обозначать конформационные или прерывистые эпитопы, которые состоят из сегментов антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов, как определено в данном контексте, которые представляют собой прерывистую аминокислотную последовательность антигенов, антигенных белков и антигенных пептидов, но при этом вместе составляют трехмерную структуру или непрерывные или линейные эпитопы, которые состоят из единой полипептидной цепи.
«Варианты» антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов, как определено выше, могут кодироваться по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, при этом нуклеиновые кислоты по меньшей мере одна (м)РНК, кодирующие антиген, антигенный белок или антигенный пептид, как определено выше, могут изменяться. Таким образом, могут образовываться антиген, антигенный белок или антигенный пептид, которые отличаются от исходной последовательности содержанием одной или более мутации, такой как одна или более замен, вставок и/или делеций аминокислоты (аминокислот). Предпочтительно, эти фрагменты и/или варианты должны обладать аналогичной биологической функцией или специфической активностью, по сравнению с полноразмерным нативным антигеном или антигенным белком, например специфическими антигенными свойствами.
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции в соответствии с настоящим изобретением может также кодировать антиген или антигенный белок, как определено выше, при этом кодируемая аминокислотная последовательность включает замену (замены) консервативных аминокислотных остатков, по сравнению с ее физиологической последовательностью. Эти кодируемые аминокислотные последовательности так же, как кодирующие их нуклеотидные последовательности, прежде всего, включены в термин «варианты», как определено выше. Консервативными заменами называются замены аминокислотного остатка на остаток аминокислоты одного и того же типа. Прежде всего, эти аминокислоты включают алифатические боковые цепи, положительно или отрицательно заряженные боковые цепи, ароматические группы в боковых цепях или остатки аминокислот, боковые цепи которых могут образовывать водородные связи, например боковые группы, содержащие гидроксильную функциональную группу. Такая консервативная замена обозначает, например, что аминокислота, содержащая полярную боковую цепь, заменена на другую аминокислоту, также содержащую полярную боковую группу, или, например, аминокислота, содержащая гидрофобную боковую группу, заменена на другую аминокислоту, также содержащую гидрофобную боковую группу (например, серин (треонин) на треонин (серин) или лейцин (изолейцин) на изолейцин (лейцин)). Вставки и замены можно осуществлять прежде всего в таких положениях в последовательности, которые не приводят к изменению трехмерной структуры или не влияют на участок связывания. Изменения в трехмерной структуре вследствие вставки(ок) или делеции(й) можно определять простым методом, например, по спектрам кругового дихроизма (КД) (спектры кругового дихроизма) (Urry, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, ред. Neuberger, Elsevier, Amsterdam (1985)).
Более того, варианты антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов, как определено выше, которые могут кодироваться по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, также могут содержать указанные последовательности, при этом нуклеиновые кислоты по меньшей мере одна (м)РНК, заменена, вследствие вырожденности генетического кода, причем в результате такой замены не происходит изменения соответствующей аминокислотной последовательности антигена, антигенного белка или антигенного пептида, т.е. аминокислотная последовательность или по меньшей мере ее часть не может отличаться от исходной последовательности на одну или более мутаций, в упомянутом выше значении.
С целью определения степени гомологии в % двух последовательностей (последовательностей нуклеиновой кислоты, например последовательностей РНК или мРНК, как описано в данном контексте, или аминокислотных последовательностей, предпочтительно, кодируемых ими аминокислотных последовательностей, например аминокислотных последовательностей антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов, как определено выше), эти последовательности можно накладывать друг на друга и сравнивать одну последовательность с другой. Таким образом, например, можно включить пробелы в первую последовательность и затем сравнивать компонент в соответствующем положении с компонентом во второй последовательности. Если в определенном положении в первой последовательности находится один и тот же аминокислотный остаток, что в том же положении во второй последовательности, то наблюдается гомология в двух последовательностях в данном положении. Степень гомологии (идентичности) в % двух последовательностей является функцией отношения числа идентичных положений к общему числу положений. Степень гомологии в % двух последовательностей можно рассчитывать с помощью математического алгоритма. Предпочтительный, но не ограничиваясь только им, пример математического алгоритма, который можно использовать для этого, приведен в статьях Karlin и др., PNAS USA, 90:5873-5877 (1993) или Altschul и др., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997). Такой алгоритм совместим с программой BLAST. Последовательности, идентичные последовательностям по настоящему изобретению, в определенной степени можно идентифицировать с помощью этой программы.
Активная (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению, как определено выше, содержит по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно, различных) антигена, выбранных из числа любых антигенов вышеуказанной группы, поскольку, согласно настоящему изобретению, специфическая комбинация по меньшей мере двух (предпочтительно, различных) антигенов в составе указанной выше группы способна эффективно стимулировать (приобретенную) иммунную систему, обеспечивая лечение рака легких, прежде всего немелкоклеточного рака легких (НМКРЛ). Однако в настоящем изобретении предлагаются также такие активные (иммуностимулирующие) композиции, содержащие по меньшей мере одну РНК, кодирующую три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или даже двенадцать (предпочтительно, различных) антигенов, выбранных из указанной выше группы, при этом возможна и предусмотрена любая комбинация указанных антигенов.
Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению кодирует по меньшей мере два антигена (предпочтительно различных), выбранных из любых антигенов следующей подгруппы:
hTERT,
WT1,
5Т4,
NY-ESO-1,
сурвивин и/или
MAGE-C2.
Более предпочтительно в настоящем изобретении предлагается также активная (иммуностимулирующая) композиция, включающая по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере три, четыре, пять или шесть антигенов (предпочтительно различных), выбранных из группы или подгруппы, описанных выше, при этом возможна любая комбинация указанных антигенов.
В другом предпочтительном варианте по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению кодирует по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, выбранных из любых антигенов из описанной выше группы (групп) или подгруппы (подгрупп), включающих (по меньшей мере) любую одну из следующих комбинаций антигенов:
hTERT и WT1 или
hTERT и 5Т4, или
hTERT и NY-ESO-1, или
hTERT и сурвивин, или
hTERT и MAGE-C2, или
WT1 и 5Т4,или
WT1 и NY-ESO-1, или
WT1 и сурвивин, или
WT1 и MAGE-C2, или
5Т4 и NY-ESO-1, или
5Т4 и сурвивин, или
5Т4 и MAGE-C2, или
NY-ESO-1 и сурвивин, или
NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1 и 5Т4, или
hTERT, WT1 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1 и сурвивин, или
hTERT, WT1 и MAGE-C2, или
hTERT, 5Т4 и NY-ESO-1, или
hTERT, 5Т4 и сурвивин, или
hTERT, 5Т4 и MAGE-C2, или
hTERT, NY-ESO-1 и сурвивин, или
hTERT, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
hTERT, сурвивин и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4 и NY-ESO-1, или
WT1, 5Т4 и сурвивин, или
WT1, 5Т4 и MAGE-C2, или
WT1, NY-ESO-1 и сурвивин, или
WT1, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
WT1, сурвивин и MAGE-C2, или
5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
5Т4, сурвивин и MAGE-C2, или
NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, 5Т4 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1, 5Т4 и сурвивин, или
hTERT, WT1, 5Т4 и MAGE-C2, или
hTERT, 5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
hTERT, 5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
hTERT, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4, сурвивин и MAGE-C2, или
5Т4, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
hTERT, WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, 5Т4, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2.
Более предпочтительно по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению кодирует по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, выбранных исключительно из любых антигенов из описанной выше группы (групп) или подгруппы (подгрупп), включающих (по меньшей мере) любую одну из следующих комбинаций антигенов:
hTERT и WT1 или
hTERT и 5Т4, или
hTERT и NY-ESO-1, или
hTERT и сурвивин, или
hTERT и MAGE-C2, или
WT1 и 5Т4, или
WT1 и NY-ESO-1, или
WT1 и сурвивин, или
WT1 и MAGE-C2, или
5Т4 и NY-ESO-1, или
5Т4 и сурвивин, или
5Т4 и MAGE-C2, или
NY-ESO-1 и сурвивин, или
NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1 и 5Т4, или
hTERT, WT1 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1 и сурвивин, или
hTERT, WT1 и MAGE-C2, или
hTERT, 5Т4 и NY-ESO-1, или
hTERT, 5Т4 и сурвивин, или
hTERT, 5Т4 и MAGE-C2, или
hTERT, NY-ESO-1 и сурвивин, или
hTERT, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
hTERT, сурвивин и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4 и NY-ESO-1, или
WT1, 5Т4 и сурвивин, или
WT1, 5Т4 и MAGE-C2, или
WT1, NY-ESO-1 и сурвивин, или
WT1, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
WT1, сурвивин и MAGE-C2, или
5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
5Т4, сурвивин и MAGE-C2, или
NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, 5Т4 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1, 5Т4 и сурвивин, или
hTERT, WT1, 5Т4 и MAGE-C2, или
hTERT, 5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
hTERT, 5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
hTERT, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4, сурвивин и MAGE-C2, или
5Т4, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и сурвивин, или
hTERT, WT1, 5Т4, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
WT1, 5Т4, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, 5Т4, NY-ESO-1, сурвивин и MAGE-C2.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается активная (иммуностимулирующая) композиция, включающая по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена:
а) где из группы, включающей по меньшей мере один предпочтительно по меньшей мере два, три, четыре, пять или даже шесть указанных антигенов по меньшей мере два антигена выбраны из:
5Т4,
NY-ESO-1,
MAGE-A2,
MAGE-A3,
MAGE-C1 и/или
MAGE-C2, и
б) при этом другой антиген (антигены) выбран (выбраны) из по меньшей мере одного антигена, описанного в контексте, предпочтительно из любой описанной в данном контексте комбинации, групп или подгрупп антигенов, например, другой антиген (антигены), выбран из, например,
hTERT,
WT1,
MAGE-A2,
5Т4,
MAGE-A3,
MUC1,
Her-2/neu,
NY-ESO-1,
СЕА,
сурвивина,
MAGE-C1 и/или
MAGE-C2.
Согласно другому предпочтительному варианту по меньшей мере один антиген (антигены) по пункту а) выбран (выбраны) из:
NY-ESO-1,
MAGE-C1 и/или
MAGE-C2.
Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере один антиген (антигены) по пункту а) выбран (выбраны) из:
MAGE-C1 и/или
MAGE-C2.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере один антиген (антигены) по пункту б) выбран (выбраны) из антигена (антигенов), указанных в одной из следующих комбинаций:
hTERT и WT1 или
hTERT и MAGE-A2, или
hTERT и 5Т4, или
hTERT и MAGE-А3, или
hTERT и MUC1, или
hTERT и Her-2/neu, или
hTERT и NY-ESO-1, или
hTERT и СЕА, или
hTERT и сурвивин, или
hTERT и МАОЕ-С1, или
hTERT и MAGE-C2, или
WT1 и MAGE-A2, или
WT1 и 5Т4, или
WT1 и MAGE-A3, или
WT1 и MUC1, или
WT1 и Her-2/neu, или
WT1 HNY-ESO-1, или
WT1 и СЕА, или
WT1 и сурвивин, или
WT1 и MAGE-С1, или
WT1 и MAGE-C2, или
MAGE-A2 и 5Т4, или
MAGE-A2 и MAGE-A3, или
MAGE-A2 и MUC1, или
MAGE-A2 и Her-2/neu, или
MAGE-A2 и NY-ESO-1, или
MAGE-A2 и СЕА, или
MAGE-A2 и сурвивин, или
MAGE-A2 и MAGE-C1, или
MAGE-A2 и MAGE-C2, или
5Т4 и MAGE-A3, или
5Т4 и MUC1, или
5Т4 и Her-2/neu, или
5Т4 и NY-ESO-1, или
5Т4 и СЕА, или
5Т4 и сурвивин, или
5Т4 и MAGE-C1, или
5Т4 и MAGE-C2, или
MAGE-A3 и MUC1, или
MAGE-A3 и Her-2/neu, или
MAGE-A3 и NY-ESO-1, или
MAGE-A3 и СЕА, или
MAGE-A3 и сурвивин, или
MAGE-A3 и MAGE-C1
MAGE-A3 и MAGE-C2
MUC1 и Her-2/neu, или
MUC1 и NY-ESO-1, или
MUC1 и СЕА, или
MUC1 и сурвивин, или
MUC1 и MAGE-C1, или
MUC1 и MAGE-C2, или
HER-2/NEU и NY-ESO-1, или
HER-2/NEU и СЕА, или
HER-2/NEU и сурвивин, или
HER-2/NEU и MAGE-C1, или
HER-2/NEU и MAGE-C2, или
NY-ESO-1 и СЕА, или
NY-ESO-1 и сурвивин, или
NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
СЕА и сурвивин, или
СЕА и MAGE-C1, или
СЕА и MAGE-C2, или
сурвивин и MAGE-C1, или
сурвивин и MAGE-C2, или
MAGE-C1 и MAGE-C2, или
hTERT, WT1 и MAGE-A2, или
hTERT, WT1 и 5Т4, или
hTERT, WT1 и MAGE-A3, или
hTERT, WT1 и MUC1, или
hTERT, WT1 и Her-2/neu, или
hTERT, WT1 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1 и СЕА, или
hTERT, WT1 и сурвивин, или
hTERT, WT1 и MAGE-C1, или
hTERT, WT1 и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2 и 5Т4, или
WT1, MAGE-A2 и MAGE-A3, или
WT1, MAGE-A2 и MUC1, или
WT1, MAGE-A2 и Her-2/neu, или
WT1, MAGE-A2 и NY-ESO-1, или
WT1, MAGE-A2 и СЕА, или
WT1, MAGE-A2 и сурвивин, или
WT1, MAGE-A2 и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2 и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5Т4 и MAGE-A3, или
MAGE-A2, 5Т4 и MUC1, или
MAGE-A2, 5Т4 и Her-2/neu, или
MAGE-A2, 5Т4 и NY-ESO-1, или
MAGE-A2, 5Т4 и СЕА, или
MAGE-A2, 5Т4 и сурвивин, или
MAGE-A2, 5Т4 и MAGE-C1, или
MAGE-A2, 5Т4 и MAGE-C2, или
5Т4, MAGE-A3 и MUC1, или
5Т4, MAGE-A3 и Her-2/neu, или
5Т4, MAGE-A3 и NY-ESO-1, или
5Т4, MAGE-A3 и СЕА, или
5Т4, MAGE-A3 и сурвивин, или
5Т4, MAGE-A3 и MAGE-C1, или
5Т4, MAGE-A3 и MAGE-C2, или
MAGE-A3, MUC1 и Her-2/neu, или
MAGE-A3, MUC1 и NY-ESO-1, или
MAGE-А3, MUC1 и СЕА, или
MAGE-A3, MUC1 и сурвивин, или
MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C1, или
MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C2, или
MUC1, Her-2/NEU и NY-ESO-1, или
MUC1, Her-2/NEU и СЕА, или
MUC1, Her-2/NEU и сурвивин, или
MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C1, или
MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C2, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1 и СЕА, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1 и сурвивин, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
NY-ESO-1, СЕА и сурвивин, или
NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C1, или
NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C2, или
СЕА, сурвивин и MAGE-C1, или
СЕА, сурвивин и MAGE-C2, или
сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и 5Т4, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и MAGE-A3, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и MUC1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и Her-2/neu, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и СЕА, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и сурвивин, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2 и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4 и MAGE-A3, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4 и MUC1, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4 и Her-2/neu, или
WT1, MAGE-A2, 5T4 и NY-ESO-1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4 и СЕА, или
WT1, MAGE-A2, 5T4 и сурвивин, или
WT1, MAGE-A2, 5T4 и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4 и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и MUC1, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и Her-2/neu, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и NY-ESO-1, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и СЕА, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и сурвивин, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и MAGE-C1, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и MAGE-C2, или
5T4, MAGE-A3, MUC1 и Her-2/neu, или
5T4, MAGE-A3, MUC1 и NY-ESO-1, или
5T4, MAGE-A3, MUC1 и СЕА, или
5T4, MAGE-A3, MUC1 и сурвивин, или
5T4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C1, или
5T4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C2, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и NY-ESO-1, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и СЕА, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и сурвивин, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C1, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C2, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и СЕА, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и сурвивин, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1, СЕА и сурвивин, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C1, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C2, или
NY-ESO-1, СЕА, сурвивин и MAGE-C1, или
NY-ESO-1, СЕА, сурвивин и MAGE-C2, или
СЕА, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и MAGE-А3, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и MUC1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и Her-2/neu, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и СЕА, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и сурвивин, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4 и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и MUC1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и Her-2/neu, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и NY-ESO-1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и СЕА, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и сурвивин, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и Her-2/neu, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и NY-ESO-1, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и СЕА, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и сурвивин, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C1, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C2, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и NY-ESO-1, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и СЕА, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и сурвивин, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C1, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C2, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и СЕА, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и сурвивин, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и сурвивин, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C1, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA и MAGE-C2, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C1, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C2, или
NY-ESO-1, CEA, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3 и MUC1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3 и Her-2/neu, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3 и CEA, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3 и сурвивин, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3 и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3 и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1 и Her-2/neu, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1 и NY-ESO-1, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1 и CEA, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1 и сурвивин, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и NY-ESO-1, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и CEA, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и сурвивин, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C1, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C2, или
5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и CEA, или
5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и сурвивин, или
5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA и сурвивин, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA и MAGE-C1, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA и MAGE-C2, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C1, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C2, или
HER-2/NEU, NY-ESO-1, CEA, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и Her-2/neu, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и СЕА, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и сурвивин, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и NY-ESO-1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и СЕА, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и сурвивин, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и СЕА, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и сурвивин, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и сурвивин, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C1, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C2, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин и MAGE-C1, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин и MAGE-C2, или
MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и NY-ESO-1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и СЕА, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1. Her-2/NEU и сурвивин, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/NEU и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и СЕА, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и сурвивин, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и сурвивин, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C1, или
MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C2, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин и MAGE-C1, или
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин и MAGE-C2, или
MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и СЕА, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и сурвивин, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1 и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и сурвивин,или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C1, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C2, или
5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA и сурвивин, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C1, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C2, или
MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C1, или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин и MAGE-C2, или
WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2,
или
hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, CEA, сурвивин, MAGE-C1 и MAGE-C2.
Согласно другому наиболее предпочтительному варианту по меньшей мере один антиген (антигены) по п. б) выбран (выбраны) из следующей конкретной комбинации антигенов:
сурвивин и 5Т4.
По меньшей мере, одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению обычно является любая РНК, предпочтительно, но, не ограничиваясь только ими, кодирующая РНК, кольцевая или линейная РНК, одно- или двухцепочечная РНК (которая может также включать РНК, которая образуется при нековалентной ассоциации двух одноцепочечных РНК) или частично двухцепочечной или частично одноцепочечной РНК, которые являются по меньшей мере частично самокомплементарными (обе из указанных частично двухцепочечных или частично одноцепочечных молекул РНК обычно образуются из более длинной или более короткой одноцепочечной молекулы РНК или из двух одноцепочечных молекул РНК одинаковой длины, при этом одна одноцепочечная молекула РНК частично комплементарна другой одноцепочечной молекуле РНК и обе таким образом формируют двухцепочечную РНК в указанной области, т.е. частично двухцепочечную или частично одноцепочечную РНК в отношении всей последовательности РНК). Более предпочтительно по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению является одноцепочечная РНК, еще более предпочтительно линейная РНК. Наиболее предпочтительно по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению является матричная РНК (мРНК). В данном контексте термин матричная РНК (мРНК) обычно обозначает РНК, которая состоит (по меньшей мере) из нескольких структурных элементов, например, необязательно 5'-UTR области, за которой расположен сайт связывания с рибосомой, затем кодирующий участок, необязательно 3'-UTR область, за которой может располагаться поли-А-концевой фрагмент (и/или поли-С-концевой фрагмент).
В одном предпочтительном варианте каждый по меньшей мере из двух (предпочтительно различных) антигенов активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению может кодироваться одной (моноцистронной) РНК, предпочтительно одной (моноцистронной) мРНК. Другими словами, активная (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере две (моноцистронные) РНК, предпочтительно мРНК, при этом каждая из указанных по меньшей мере двух (моноцистронных) РНК, предпочтительно мРНК, может кодировать только один (предпочтительно различный) антиген, выбранный из одной описанных выше групп или подгрупп, предпочтительно из одной описанных выше комбинаций.
Согласно другому наиболее предпочтительному варианту активная (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению включает (по меньшей мере) одну би- или даже полицистронную РНК, предпочтительно мРНК, т.е. (по меньшей мере) одну РНК, которая содержит две или более последовательностей, кодирующих по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, выбранных из одной из  описанных выше групп или подгрупп, предпочтительно из одной из  описанных выше комбинаций. Указанные последовательности, кодирующие по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена (по меньшей мере) в одной би- или даже мультицистронной РНК прерваны по меньшей мере одной последовательностью IRES (участок внутренней посадки рибосомы), как описано ниже. Таким образом, термин "кодирующая по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена" обозначает, не ограничиваясь только этим, что (по меньшей мере) одна (би- или даже полицистронная) РНК, предпочтительно мРНК, кодирует, например, по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать (предпочтительно различных) антигенов из описанной выше группы (групп) антигенов или их фрагментов или вариантов согласно определениям, описанным выше. Более предпочтительно, но, не ограничиваясь только этим, (по меньшей мере) одна (би- или даже полицистронная) РНК, предпочтительно мРНК, кодирует, например, по меньшей мере два, три, четыре, пять или шесть (предпочтительно различных) антигенов из указанной выше группы (групп) антигенов или их фрагментов или вариантов согласно определениям, описанным выше. В данном контексте последовательность IRES (участок внутренней посадки рибосомы), описанная выше, может проявлять функцию единственного сайта связывания рибосомы, но на его основе можно также получать би- или даже полицистронную РНК, как описано выше, которая кодирует различные белки, которые транслируются рибосомами независимо друг от друга. Примеры последовательностей IRES, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, включают последовательности из пикорнавирусов (например, FMDV), пестивирусов (CFFV), полиовирусов (PV), вирусов энцефаломиокардита (ECMV), вирусов ящура (FMDV), вирусов гепатита С (HCV), вирусов классической чумы свиней (CSFV), вируса лейкоза мышей (MLV), вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) или вирусов паралича сверчка (CrPV).
Согласно другому наиболее предпочтительному варианту активная (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению включает смесь по меньшей мере одной моноцистронной РНК, предпочтительно мРНК, как описано выше, и по меньшей мере одной би- или даже полицистронной РНК, предпочтительно мРНК, как описано выше. По меньшей мере одна моноцистронная РНК и/или по меньшей мере одна би- или даже полицистронная РНК предпочтительно кодирует различные антигены или их фрагменты или варианты согласно определениям, описанным выше, при этом антигены предпочтительно выбраны из одной из описанных выше групп или подгрупп антигенов, более предпочтительно из одной из описанных выше комбинаций. Однако по меньшей мере одна моноцистронная РНК и по меньшей мере одна би- или даже полицистронная РНК предпочтительно кодирует также (частично) аналогичные антигены, выбранные из одной из описанных выше групп или подгрупп антигенов, предпочтительно из одной из описанных выше комбинаций, при условии, что активная (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению в целом обеспечивает кодирование по меньшей мере двух (предпочтительно различных) антигенов, описанных выше. Указанный вариант является пригодным, например, для поочередного, например, зависимого от времени введения активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Компоненты указанной активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, прежде всего различные РНК, кодирующие по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, могут, например, входить в состав (в виде различных компонентов) набора, содержащего комбинацию компонентов, или их можно, например, вводить раздельно в виде компонентов различных активных (иммуностимулирующая) композиций по настоящему изобретению.
Предпочтительно по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, кодирующая по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, выбранных из описанной выше группы или подгруппы антигенов, более предпочтительно из одной из  описанных выше комбинаций, обычно содержат приблизительно от 50 до приблизительно 20000 или от 100 до приблизительно 20000 нуклеотидных остатков, предпочтительно приблизительно от 250 до приблизительно 20000 нуклеотидных остатков, более предпочтительно приблизительно от 500 до приблизительно 10000, еще более предпочтительно приблизительно от 500 до приблизительно 5000.
Согласно одному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, выбранных из описанной выше группы (групп) или подгруппы (подгрупп) антигенов, более предпочтительно из описанных выше комбинаций, можно модифицировать, причем по меньшей мере одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции можно модифицировать любым способом. Модификации, как описано в данном контексте, предпочтительно позволяют стабилизировать по меньшей мере одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению.
Согласно первому варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению может присутствовать в виде "стабилизированной РНК", предпочтительно в виде стабилизированной мРНК, то есть в виде (м)РНК, которая характеризуется чрезвычайно высокой устойчивостью к деградации в условиях in vivo (например, деградации под действием экзо- или эндонуклеаз). Указанная стабилизация достигается, например, за счет модификации фосфатных остатков в основной цепи НК по меньшей мере в одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению. Термин "модификация основной цепи", использованный в данном контексте, обозначает химическую модификацию фосфатных остатков в основной цепи РНК. В качестве предпочтительных модифицированных нуклеотидов используют, например, нуклеотиды, модифицированные фосфоротиоатом фосфатные остатки, предпочтительно нуклеотиды, в которых по меньшей мере один из атомов кислорода в фосфатном остатке заменен на атом серы. Стабилизированные (м)РНК могут также включать, например, неионогенные аналоги фосфатных остатков, такие как, например, алкил- и арилфорфонаты, при этом заряженный атом кислорода в составе фосфатного остатка заменен на алкильную или арильную группу, или могут включать фосфодиэфиры и алкилфосфотриэфиры, при этом заряженный атом кислорода в составе фосфатного остатка присутствует в алкилированной форме. Указанные модификации основной цепи обычно включают, но не ограничиваясь только ими, модификации за счет введения метилфосфонатов, фосфороамидов и фосфоротиоатов (например, цитидин-5'-O-(1-тиофосфата)).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению может дополнительно или в альтернативном варианте также содержать модифицированные остатки сахаров. Термин "модификация остатков сахара", использованный в данном контексте, обозначает химическую модификацию остатков сахара в составе нуклеотидов по меньшей мере в одной РНК и обычно включает, но не ограничиваясь только ими, модифицированные остатки сахара, выбранные из группы, включающей 2'-дезокси-2'-фторолигорибонуклеотид (2'-фтор-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат, 2'-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат), 2'-дезокси-2'-деаминоолигорибонуклеотид (2'-амино-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат, 2'-амино-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат), 2'-O-алкил-олигорибонуклеотид, 2'-дезокси-2'-С-алкил-олигорибонуклеотид (2'-O-метилцитидин-5'-трифосфат, 2'-метилуридин-5'-трифосфат), 2'-С-алкил-олигорибонуклеотид и их изомеры (2'-арацитидин-5'-трифосфат, 2'-арауридин-5'-трифосфат) или азидотрифосфат (2'-азидо-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат, 2'-азидо-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат).
По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению может дополнительно или в альтернативном варианте также содержать по меньшей мере одно модифицированное основание, причем такая РНК является пригодной предпочтительно для значительного повышения экспрессии белка, кодируемого по меньшей мере одной последовательностью РНК по сравнению с исходной, т.е. природной последовательностью РНК. Термин "значительное", использованный в данном контексте, обозначает повышение уровня экспрессии белка по сравнению с экспрессией природной последовательности РНК по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 40%, 50% или на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, 80%, 90% или даже на 100%, и более предпочтительно по меньшей мере на 150%, 200% или даже на 300% или более. Согласно настоящему изобретению указанный модифицированный нуклеотид предпочтительно выбран из группы модифицированных оснований, включающей 2-амино-6-хлорпуринрибозид-5'-трифосфат, 2-аминоаденозин-5'-трифосфат, 2-тиоцитидин-5'-трифосфат, 2-тиоуридин-5'-трифосфат, 4-тиоуридин-5'-трифосфат, 5-аминоаллилцитидин-5'-трифосфат, 5-аминоаллилуридин-5'-трифосфат, 5-бромцитидин-5'-трифосфат, 5-бромуридин-5'-трифосфат, 5-иодцитидин-5'-трифосфат, 5-иодуридин-5'-трифосфат, 5-метилцитидин-5'-трифосфат, 5-метилуридин-5'-трифосфат, 6-азацитидин-5'-трифосфат, 6-азауридин-5'-трифосфат, 6-хлорпуринрибозид-5'-трифосфат, 7-деазааденозин-5'-трифосфат, 7-деазагуанозин-5'-трифосфат, 8-азааденозин-5'-трифосфат, 8-азидоаденозин-5'-трифосфат, бензимидазолрибозид-5'-трифосфат, N1-метиладенозин-5'-трифосфат, N1-метилгуанозин-5'-трифосфат, N6-метиладенозин-5'-трифосфат, O6-метилгуанозин-5'-трифосфат, псевдоуридин-5'-трифосфат или пуромицин-5'-трифосфат, ксантозин-5'-трифосфат. Наиболее предпочтительные модифицированные нуклеотиды выбраны из группы, включающей 5-метилцитидин-5'-трифосфат, 7-деазагуанозин-5'-трифосфат, 5-бромцитидин-5'-трифосфат и псевдоуридин-5'-трифосфат.
Согласно другому варианту по меньшей мере одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению можно модифицировать аналогичным способом (и предпочтительно стабилизировать) за счет введения дополнительных нуклеотидов, модифицированных по остаткам рибозы или оснований. Обычно по меньшей мере одна (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению содержит любой природный нуклеотид, например гуанозин, урацил, аденозин и/или цитозин или их аналоги. Термин "аналоги нуклеотидов", использованный в данном контексте, обозначает неприродные варианты природных нуклеотидов. Таким образом, аналогами являются химически модифицированные нуклеотиды, содержащие неприродные функциональные группы, которые предпочтительно вводят или удаляют из природного нуклеотида или на которые заменяют природные функциональные группы нуклеотида. Соответственно, каждый компонент в составе природного нуклеотида можно модифицировать, а именно основание, остаток сахара (рибозу) и/или остаток фосфорной кислоты, образующих основную цепь (см. выше) РНК. Аналоги гуанозина, урацила, аденозина и цитозина включают, но не ограничиваясь только ими, любой природный или неприродный вариант гуанозина, урацила, аденозина, тимидина или цитозина, которые химически модифицируют за счет ацетилирования, метилирования, гидроксилирования и т.п., включая 1-метиладенозин, 1-метилгуанозин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанозин, 2,6-диаминопурин, Т-амино-2'-дезоксиаденозин, 2'-амино-2'-дезоксицитидин, 2'-амино-2'-дезоксигуанозин, 2'-амино-2'-дезоксиуридин, 2-амино-6-хлорпуринрибозид, 2-аминопурин-рибозид, 2'-арааденозин, 2'-арацитидин, 2'-арауридин, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозин, 2'-азидо-2'-дезоксицитидин, 2'-азидо-2'-дезоксигуанозин, 2'-азидо-2'-дезоксиуридин, 2-хлораденозин, 2'-фтор-2'-дезоксиаденозин, 2'-фтор-2'-дезоксицитидин, 2'-фтор-2'-дезоксигуанозин, 2'-фтор-2'-дезоксиуридин, 2'-фтортимидин, 2-метиладенозин, 2-метилгуанозин, 2-метилтио-N6-изопенениладенозин, 2'-O-метил-2-аминоаденозин, 2'-O-метил-2'-дезоксиаденозин, 2'-O-метил-2'-дезоксицитидин, 2'-O-метил-2'-дезоксигуанозин, 2'-O-метил-2'-дезоксиуридин, 2'-O-метил-5-метилуридин, 2'-O-метилинозин, 2'-O-метилпсевдоуридин, 2-тиоцитидин, 2-тиоцитозин, 3-метилцитозин, 4-ацетилцитозин, 4-тиоуридин, 5-(карбоксигидроксиметил)урацил, 5,6-дигидроуридин, 5-аминоаллилцитидин, 5-аминоаллилдезоксиуридин, 5-бромуридин, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, 5-хлор-арацитозин, 5-фторуридин,5-иодуридин,5-метоксикарбонилметилуридин,5-метоксиуридин,5-метил-2-тиоуридин, 6-азацитидин, 6-азауридин, 6-хлор-7-деазагуанозин, 6-хлорпуринрибозид, 6-меркаптогуанозин, 6-метилмеркаптопуринрибозид, 7-деаза-2'-дезоксигуанозин, 7-деазааденозин, 7-метилгуанозин, 8-азааденозин, 8-бромаденозин, 8-бромгуанозин, 8-меркаптогуанозин, 8-оксогуанозин, бензимидазолрибозид, β-D-маннозилквеозин, дигидроурацил, инозин, N1-метиладенозин, B6-([6-аминогексил]карбамоилметил)аденозин, N6-изопентениладенозин, N6-метиладенозин, N7-метилксантозин, метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, пуромицин, квеозин, урацил-5-оксиуксусная кислота, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, вибутоксозин, ксантозин и ксилоаденозин. Способы получения указанных аналогов известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в патентах US 4373071, US 4401796, US 4415732, US 4458066, US 4500707, US 4668777, US 4973679, US 5047524, US 5132418, US 5153319, US 5262530 и US 5700642. В случае аналогов, описанных выше, согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительными аналогами являются варианты, которые усиливают иммуногенность РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции и/или не влияют на дальнейшую модификацию РНК, предназначенной для введения.
Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению можно модифицировать при включении липида. Указанная липид-модифицированная РНК обычно представляет собой РНК, как описано в данном контексте, которая кодирует по меньшей мере два антигена, выбранных из группы или подгруппы антигенов, описанных выше, предпочтительно из описанных выше комбинаций. Указанная липид-модифицированная РНК обычно также включает по меньшей мере один линкер, ковалентно присоединенный к указанной РНК, и по меньшей мере один липид, ковалентно присоединенный к соответствующему линкеру. В другом варианте липид-модифицированная РНК включает по меньшей мере одну РНК, как описано в данном контексте, и по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно присоединенный (без линкера) к указанной РНК. Согласно третьему варианту липид-модифицированная РНК включает РНК, как описано в данном контексте, по меньшей мере один линкер, ковалентно присоединенный к указанной РНК, и по меньшей мере один липид, ковалентно присоединенный к соответствующему линкеру, а также по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с указанной РНК.
1
20
1
20
1
20
В качестве липида по меньшей мере в составе одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению (в виде комплекса или ковалентно присоединенного к РНК) обычно используют липид или липофильный остаток, который предпочтительно сам по себе проявляет биологическую активность. Указанные липиды предпочтительно включают природные вещества или соединения, такие как, например, витамины, например α-токоферол (витамин Е), включая RRR-α-токоферол (ранее D-α-токоферол), L-α-токоферол, рацемат D,L-α-токоферола, сукцинат витамина Е или витамин А и его производные, например ретиноевая кислота, ретинол, витамин D и его производные, например предшественники витамина D и эргостерола, витамин Е и его производные, витамин K и его производные, например витамин K и производные хинона или фитола, или стероиды, такие как желчные кислоты, например холевая кислота, дезоксихолевая кислота, дегидрохолевая кислота, кортизон, дигоксигенин, тестостерон, холестерин или тиохолестерин. Другие липиды или липофильные остатки согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваясь только ими, полиалкиленгликоли (см. статью Oberhauser и др., Nucl. Acids Res., 20, 533 (1992)), алифатические группы, такие как, например, С-Салканы, С-Салкены или С-Салканолы и т.д., такие как, например, производные додекандиола, гексадеканола или ундецильные остатки (см. статьи Saison-Behmoaras и др., EMBO J, 10, 111 (1991), Kabanov и др., FEBS Lett., 259, 327 (1990), Svinarchuk и др., Biochimie, 75, 49 (1993)), фосфолипиды, такие как, например, фосфатидилглицерин, диацилфосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, дигексадецил-рац-глицерин, сфинголипиды, цереброзиды, ганглиозиды или 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (см. статьи Manoharan и др., Tetrahedron Lett., 36, 3651 (1995), Shea и др., Nucl. Acids Res., 18, 3777 (1990)), полиамины или полиалкиленгликоли, такие как, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (см. статью Manoharan и др., Nucleosides & Nucleotides, 14, 969 (1995)), гексаэтиленгликоль (ГЭГ), пальмитин или пальмитиновые остатки (см. статью Mishra и др., Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229 (1995)), октадециламины или гексиламинокарбонилоксихолестериновые остатки (см. статью Crooke и др., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923 (1996)), a также воски, терпены, алициклические углеводороды, остатки насыщенных, а также моно- или полиненасыщенных жирных кислот и т.п.
По меньшей мере, одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению можно стабилизировать аналогичным образом с целью предотвращения деградации РНК in vivo с использованием различных способов. Известно, что неустойчивость и (быстрая) деградация мРНК или РНК in vivo обычно представляют серьезную проблему для применения композиций на основе РНК. Указанная нестабильность РНК обычно обусловлена действием ферментов, разрушающих РНК, "РНКаз" (рибонуклеаз), причем присутствие в образцах указанных примесей рибонуклеаз иногда может приводить к полной деградации РНК, присутствующей в растворе. Таким образом, деградация мРНК в естественных условиях в цитоплазме клеток очень точно отрегулирована, и перед применением указанных выше композиций примеси РНКз обычно можно в значительной степени удалить с использованием специальных способов обработки, прежде всего с использованием диэтилпирокарбоната (ДЭПК). Известно множество механизмов деградации указанных соединений в естественных условиях, которые можно также использовать. Например, структура концевого фрагмента мРНК обычно является чрезвычайно важной для ее функционирования in vivo. Например, 5'-концевой фрагмент природных мРНК обычно включает так называемую "кэп-структуру" (модифицированные остатки гуанозина), а 3'-концевой фрагмент обычно включает последовательность, содержащую до 200 остатков аденозина (так называемый поли-А-концевой фрагмент).
По меньшей мере, одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, прежде всего, в случае применения в форме мРНК, можно стабилизировать для предотвращения деградации под действием РНКаз за счет введения в ее структуру дополнительной так называемой "5'-кэп-структуры". Согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительными "5'-кэп-структурами" являются m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A или G(5')ppp(5')G. Однако указанную модификацию осуществляют только в том случае, если 5'-концевой фрагмент (м)РНК, входящей в состав иммуностимулирующей композиции по изобретению, ранее не модифицировали, например, липидом или указанная модификация не влияет на иммуностимулирующие свойства (немодифицированной или химически модифицированной) (м)РНК.
Согласно другому предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению может содержать, прежде всего, в случае применения в форме мРНК, в 3'-концевом фрагменте поли-А фрагмент, содержащий приблизительно от 10 до 200 остатков аденозина, предпочтительно приблизительно от 10 до 100 остатков аденозина, более предпочтительно приблизительно от 20 до 100 остатков аденозина или еще более предпочтительно приблизительно от 40 до 80 остатков аденозина.
Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению может содержать, прежде всего, в случае применения в форме мРНК, в составе 3'-концевого фрагмента поли-С фрагмент, содержащий приблизительно от 10 до 200 остатков цитозина, предпочтительно приблизительно от 10 до 100 остатков цитозина, более предпочтительно приблизительно от 20 до 70 остатков цитозина или еще более предпочтительно приблизительно от 20 до 60 или даже от 10 до 40 остатков цитозина.
Согласно другому варианту по меньшей мере одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению можно модифицировать и таким образом стабилизировать, прежде всего, в случае применения в форме мРНК, за счет изменения содержания G/C в составе РНК, предпочтительно в составе кодирующей области по меньшей мере в составе одной РНК.
В наиболее предпочтительном варианте настоящего изобретения содержание G/C в составе кодирующей области по меньшей мере одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению изменено, прежде всего увеличено, по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области (м)РНК дикого типа, т.е. немодифицированной (м)РНК. Аминокислотная последовательность, кодируемая по меньшей мере одной (м)РНК, предпочтительно является не модифицированной, т.е. аналогична аминокислотной последовательности, кодируемой (м)РНК дикого типа.
Указанную по меньшей мере одну (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению модифицируют с учетом того, что последовательность любой области транслируемой (м)РНК играет важную роль для эффективной трансляции указанной (м)РНК. Таким образом, состав и последовательность различных нуклеотидов играют важную роль. Прежде всего, последовательности с повышенным содержанием G (гуанозина)/С (цитозина) являются более устойчивыми по сравнению с последовательностями с повышенным содержанием А (аденозина)/U (урацила). Следовательно, согласно настоящему изобретению кодоны (м)РНК отличаются от кодонов (м)РНК дикого типа, но при этом сохраняется транслируемая аминокислотная последовательность, и они характеризуются повышенным содержанием нуклеотидов G/C. С учетом того, что различные кодоны кодируют одну и туже аминокислоту (так называемая вырожденность генетического кода), можно определить наиболее предпочтительные кодоны для обеспечения стабильности (так называемое альтернативное использование кодона).
В зависимости от аминокислоты, которая кодируется по меньшей мере одной (м)РНК, существуют различные методы модификации по меньшей мере одной последовательности (м)РНК, по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа. В случае если аминокислоты кодируются кодонами, которые содержат только G или С нуклеотиды, то никакой модификации кодона не требуется. Таким образом, кодоны для Pro (CCC или CCG), Arg (CGC или CGG), Ala (GCC или GCG) и Gly (GGC или GGG) не требуется модифицировать, так как в их составе отсутствуют нукдеотиды А или U.
Напротив, кодоны, которые содержат нуклеотиды А и/или U, можно модифицировать при замене на другие кодоны, которые кодируют те же самые аминокислоты, но не содержат нуклеотиды А и/или U. Например,
кодоны CCU или ССА (для Pro) можно заменить на CCC или CCG,
кодоны CGU или CGA или AGA или AGG (для Arg) можно заменить на CGC или CGG,
кодоны GCU или GCA (для Ala) можно заменить на GCC или GCG,
кодоны GGU или GGA (для Gly) можно заменить на GGC или GGG.
В других случаях, хотя нуклеотиды А или U нельзя исключить из состава кодонов, можно снизить их содержание, при использовании кодонов с меньшим содержанием нуклеотидов А и/или U. Например,
кодон UUU (для Phe) можно заменить на UUC,
кодоны UUA, UUG, CUU или CUA (для Leu) можно заменить на CUC или CUG,
кодоны UCU или UCA или AGU (для Ser) можно заменить на UCC, UCG или AGC,
кодон UAU (для Tyr) можно заменить на UAC,
кодон UGU (для Cys) можно заменить на UGC,
кодон CAU (для His) можно заменить на САС,
кодон САА (для Gln) можно заменить на CAG,
кодоны AUU или AUA (для Ile) можно заменить на AUC,
кодоны ACU или АСА (для Thr) можно заменить на АСС или ACG,
кодон AAU (для Asn) можно заменить на ААС,
кодон ААА (для Lys) можно заменить на AAG,
кодоны GUU или GUA (для Val) можно заменить на GUC или GUG,
кодон GAU (для Asp) можно заменить на GAC,
кодон GAA (для Glu) можно заменить на GAG,
стоп кодон UAA можно заменить на UAG или UGA.
С другой стороны, в случае кодонов для Met (AUG) и Trp (UGG) возможности модификации не существует.
Замены, указанные выше, можно использовать или в отдельности, или во всех возможных комбинациях с целью повышения содержания G/C по меньшей мере в одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению по сравнению с конкретной (м)РНК дикого типа (т.е. исходной последовательностью). Таким образом, например, все кодоны для Thr, присутствующие в последовательности дикого типа, можно заменить на АСС (или ACG). Однако предпочтительно используют комбинации описанных способов замен, например
замену всех кодонов, кодирующих Thr, в составе исходной последовательности ((м)РНК дикого типа) на АСС (или ACG) и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Ser, на UCC (или UCG или AGC),
замену всех кодонов, кодирующих Не, в составе исходной последовательности на AUC, и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Lys, на AAG, и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Tyr, на UAC,
замену всех кодонов, кодирующих Val, в составе исходной последовательности на GUC (или GUG) и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Glu, на GAG, и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Ala, на GCC (или GCG), и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Arg, на CGC (или CGG),
замену всех кодонов, кодирующих Val, в составе исходной последовательности на GUC (или GUG) и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Glu, на GAG, и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Ala, на GCC (или GCG), и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Gly, на GGC (или GGG), и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Asn, на ААС,
замену всех кодонов, кодирующих Val, в составе исходной последовательности на GUC (или GUG) и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Phe, на UUC, и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Cys, на UGC, и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Leu, на CUG (или CUC), и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Gln, на CAG, и
замену всех исходных кодонов, кодирующих Pro, на ССС (или CCG), и т.п.
Предпочтительно содержание G/C в кодирующей области по меньшей мере в одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению увеличено по меньшей мере на 7%, более предпочтительно по меньшей мере на 15%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 20%, по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области (м)РНК дикого типа, которая кодирует антиген, белковый антиген или пептидный антиген, описанные в данном контексте, или их фрагмент или их вариант. Согласно конкретному варианту по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%, 95% или даже 100% взаимозаменяемых кодонов в области, кодирующей антиген, белковый антиген или пептидный антиген, описанные в данном контексте, или их фрагмент или их вариант, или в полноразмерной последовательности (м)РНК дикого типа заменяют с целью повышения содержания G/C в указанной последовательности.
Как описано в данном контексте, наиболее предпочтительно максимально возможное повышение содержания G/C по меньшей мере в одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению (т.е. 100% взаимозаменяемых кодонов), прежде всего, в области, кодирующей белок, по сравнению с последовательностью дикого типа.
Согласно настоящему изобретению дальнейшая предпочтительная модификация по меньшей мере одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции основана на неожиданных данных, согласно которым эффективность трансляции определяется также различной частотой образования различных тРНК в клетках. Таким образом, если так называемые "редкие кодоны" присутствуют в составе по меньшей мере одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению в большей степени, то модифицированная соответствующим образом по меньшей мере одна последовательность (м)РНК транслируется в значительно меньшей степени по сравнению с кодирующей последовательностью, включающей кодоны, которые распознаются "часто встречаемыми" тРНК.
Согласно настоящему изобретению в модифицированной по меньшей мере одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению область, которая кодирует адъювантный белок, модифицирована по сравнению с соответствующей областью в составе (м)РНК дикого типа таким образом, что по меньшей мере один кодон из последовательности дикого типа, которому соответствует относительно "редко встречаемая" в клетке тРНК, заменен на кодон, которому соответствует "часто встречаемая" в клетке тРНК, которая переносит ту же аминокислоту, что и относительно "редко встречаемая" тРНК. При использовании указанной модификации последовательность по меньшей мере одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению модифицирована таким образом, что в ее состав включены кодоны, которым соответствуют "часто встречаемые" тРНК. Другими словами, согласно настоящему изобретению указанную модификацию используют для замены всех кодонов в составе последовательности дикого типа, которым соответствуют относительно "редко встречаемые" в клетке тРНК, на кодоны, которым соответствуют относительно "часто встречаемые" в клетке тРНК, которые в каждом случае переносят ту же самую аминокислоту, что и относительно "редко встречаемая" тРНК.
Специалисту в данной области техники известны тРНК, относительно "часто встречаемые" и наоборот относительно "редко встречаемые" в клетке, например, см. статью Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev., 11(6): 660-666 (2001). Наиболее предпочтительными кодонами являются кодоны, кодирующие конкретную аминокислоту, которым соответствуют "наиболее часто встречаемые" тРНК, например кодон, кодирующий Gly, которому соответствует тРНК, "наиболее часто встречаемая" в клетке (человека).
Согласно настоящему изобретению, прежде всего, предпочтителен вариант, в котором по меньшей мере одну (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению модифицируют за счет присоединения последовательно расположенных G/C, содержание которых является повышенным, прежде всего, до максимально возможного, к "часто встречаемым" кодонам, и при этом не изменяется аминокислотная последовательность белка, которая кодируется кодирующим фрагментом (м)РНК. В указанном предпочтительном варианте можно получить наиболее эффективно транслируемую стабильную (модифицированную) по меньшей мере одну (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению.
Конструирование модифицированной по меньшей мере одной (м)РНК, входящей в состав активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, как описано выше (повышенное содержание G/C, замена тРНК), можно проводить с использованием программного обеспечения, описанного в заявке WO 02/098443, которая включена в настоящее описание в полном объеме. При использовании указанного программного обеспечения нуклеотидную последовательность любой требуемой (м)РНК можно модифицировать с использованием генетического кода или его вырожденного типа таким образом, чтобы обеспечить максимальное содержание G/C, в комбинации с применением кодонов, которые распознаются тРНК, максимально часто встречаемыми в клетке, при этом аминокислотная последовательность, кодируемая модифицированной по меньшей мере одной (м)РНК, предпочтительно не изменяется по сравнению с немодифицированной последовательностью. В другом варианте РНК можно модифицировать только за счет повышения содержания G/C или только использования кодона по сравнению с немодифицированной последовательностью. Исходный код в программном обеспечении Visual Basic 6.0 (Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0, Servicepack 3) описан также в заявке WO 02/098443.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения содержание A/U в окружении участка связывания рибосомы по меньшей мере одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению повышено по сравнению с содержанием A/U в окружении участка связывания рибосомы соответствующей (м)РНК дикого типа. Указанная модификация (повышение содержания A/U в окружении участка связывания рибосомы) повышает эффективность связывания рибосомы по меньшей мере с одной (м)РНК. Эффективное связывание рибосом с участком связывания рибосомы (последовательность Козака: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID №27), AUG образует старт-кодон) в свою очередь повышает эффективность трансляции по меньшей мере одной (м)РНК.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одну (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению можно модифицировать с учетом элементов последовательности, потенциально дестабилизирующих РНК. Прежде всего, кодирующую область и/или 5' и/или 3' нетранслируемый участок указанной по меньшей мере одной (м)РНК можно модифицировать по сравнению с соответствующей (м)РНК дикого типа таким образом, чтобы она не содержала дестабилизирующих последовательность элементов, и при этом аминокислотная последовательность, кодируемая по меньшей мере одной модифицированной (м)РНК, предпочтительно не изменяется по сравнению с последовательностью, кодируемой соответствующей (м)РНК дикого типа. Известно, например, что в последовательностях РНК эукариотов встречаются дестабилизирующие последовательность элементы (ДПЭ), к которым присоединяются сигнальные белки и регулируют ферментативную деградацию РНК in vivo. Для дальнейшей стабилизации по меньшей мере одной модифицированной (м)РНК, необязательно в области, кодирующей антиген, белковый антиген или пептидный антиген, как описано в данном контексте, по сравнению с соответствующими областями в составе (м)РНК дикого типа, проводят одну или более таких модификаций, в результате РНК не содержит или практически не содержит элементов, дестабилизирующих ее структуру. Согласно настоящему изобретению при осуществлении указанных модификаций по меньшей мере в одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, из структуры нетранслируемых областей (3'- и/или 5'-UTR области) можно исключить ДПЭ.
Указанными дестабилизирующими последовательностями являются, например, последовательности с повышенным содержанием AU, которые присутствуют в 3'-UTR фрагментах множества нестабильных РНК (см. статью Caput и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1670-1674 (1986)). Следовательно по меньшей мере одну (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению модифицируют предпочтительно таким образом, чтобы по сравнению с (м)РНК дикого типа по меньшей мере одна (м)РНК не содержала указанных дестабилизирующих последовательностей. То же самое относится также к тем мотивам последовательности, которые могут распознаваться эндонуклеазами, например последовательность GAACAAG, которая содержится в 3'-UTR фрагменте гена, который кодирует трансфериновый рецептор (см. статью Binder и др., EMBO J., 13, 1969-1980 (1994)). Указанные мотивы последовательности также предпочтительно удалены по меньшей мере из последовательности одной (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению предпочтительно по меньшей мере одна (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению также включает в модифицированной форме по меньшей мере один фрагмент IRES, как описано выше, и/или по меньшей мере одну стабилизированную 5' и/или 3' последовательность в модифицированной форме, например, с целью повышения эффективности связывания рибосомы или для обеспечения экспрессии различных кодируемых антигенов, локализованных по меньшей мере в одной (би- или даже полицистронной) РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению.
x
x
Согласно настоящему изобретению по меньшей мере одна (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, кроме того, предпочтительно содержит по меньшей мере одну 5' и/или 3' стабилизирующую последовательность. Указанные стабилизирующие последовательности в составе 5' и/или 3' нетранслируемых областях позволяют повысить период полураспада по меньшей мере одной (м)РНК в цитозоле. Гомология указанных стабилизирующих последовательностей по сравнению с природными последовательностями РНК вирусов, бактерий и эукариотов может составлять 100%, однако они могут являться полностью или частично синтетическими последовательностями. В качестве примера стабилизирующих последовательностей, которые можно использовать согласно настоящему изобретению для стабилизации РНК, можно использовать нетранслируемые последовательности (UTR) гена глобина, например Homo sapiens или Xenopus laevis. Другим примером стабилизирующей последовательности является последовательность общей формулы (C/U)CCANCCC(U/A)PyUC(C/U)CC (SEQ ID №28), которая содержится в 3'UTR области в составе РНК, которая характеризуется очень высокой стабильностью, и кодирует глобин, коллаген I, 15-липоксигеназу или тирозингидроксилазу (см. статью. Holcik и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2410-2414 (1997)). Указанные стабилизирующие последовательности можно использовать в отдельности или в комбинации друг с другом, а также в комбинации с другими стабилизирующими последовательностями, известными специалисту в данной области техники. В связи с этим по меньшей мере одна (м)РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению присутствует в виде глобин UTR-(нетранслируемые области)-стабилизированной РНК, прежде всего в виде глобин UTR-стабилизированной РНК.

Тем не менее, замены, вставки или делеции оснований предпочтительно осуществляют по меньшей мере в одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, при этом по меньшей мере одну РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению получают на ДНК-матрице с использованием известных в данной области техники методов сайт-направленного мутагенеза или лигирования олигонуклеотидов (см., например, книгу Maniatis и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3-е изд., Cold Spring Harbor, Нью-Йорк (2001)). В указанном методе для получения по меньшей мере одной (м)РНК проводили транскрипцию соответствующей молекулы ДНК in vitro. Указанная ДНК-матрица предпочтительно включает промотор, например промотор Т7 или SP6, пригодный для транскрипции in vitro, за которым располагается требуемая нуклеотидная последовательность по меньшей мере одной РНК, которую необходимо получить, и терминальную сигнальную последовательность, пригодную для транскрипции in vitro. ДНК, формирующую матрицу по меньшей мере одной требуемой РНК, можно получить в препаративном масштабе методами пролиферации в ферментере с последующим выделением плазмиды и реплицировать в бактериях. Согласно настоящему изобретению пригодные плазмиды включают, например, плазмиды рТ7Т (идентификационный номер GenBank: U26404, см. статью Lai и др., Development, 121, 2349-2360 (1995)), плазмиды серии pGEM, например, pGEM-1 (идентификационный номер GenBank: X65300, фирмы Promega) и pSP64 (идентификационный номер GenBank: X65327), см. также статью Mezei и Storts, Purification of PCR Products, в книге PCR Technology: Current Innovation, под ред. Griffin и Griffin, издательства CRC Press, Бока Ратон, штат Флорида (2001).
Стабилизацию по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению можно осуществлять также за счет ассоциации или комплексообразования по меньшей мере одной РНК с катионным соединением, прежде всего поликатионным соединением, например (поли)катионным пептидом или белком. Наиболее эффективным является использование протамина, нуклеолина, спермина или спермидина в качестве поликатионного связывающегося с РНК белка. Кроме того, можно использовать также другие поликатионные пептиды или белки, такие как поли-L-лизин или гистоны. Указанные способы стабилизации РНК описаны в патенте ЕР-А-1083232, который включен в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылки. Другие предпочтительные катионные соединения, которые можно использовать для стабилизации РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, включают катионные полисахариды, например хитозан, полибрен, полиэтиленимин (ПЭИ) или поли-L-лизин (ПЛЛ), и т.п. Ассоциация или образование комплексов по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению, с катионными соединениями, например катионными белками или катионными липидами, например олигофектамином (в качестве липидного комплексообразующего реагента) предпочтительно позволяют улучшить перенос по меньшей мере одной РНК, используемой в качестве фармацевтически активного компонента, в клетки, нуждающиеся в такой обработке, или в организм пациента, нуждающегося в такой обработке. Описанные в данном контексте способы улучшения переноса по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению за счет комплексообразования можно также использовать для стабилизации РНК.
Согласно другому наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может дополнительно или альтернативно кодировать секреторный сигнальный пептид. Указанные сигнальные пептиды обычно состоят из приблизительно от 15 до 30 аминокислотных остатков и предпочтительно локализуются в N-концеом участке кодируемого пептида, но не ограничиваясь только этим. Сигнальные пептиды, описанные в данном контексте, предпочтительно предназначены для транспорта антигена, белкового антигена или пептидного антигена, кодируемого по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, в определенную часть клетки, предпочтительно на поверхность клетки, в эндоплазматический ретикулум (ЭР) или эндосомы, лизосомы. Примеры последовательностей секреторных сигнальных пептидов, описанных в данном контексте, включают, но не ограничиваясь только ими, сигнальные последовательности классического или неклассического ГКГ (например, сигнальные последовательности ГКГ класса I и II, например ГКГ класса I HLA-A*0201), сигнальные последовательности цитокинов или иммуноглобулинов, как описано в данном контексте, сигнальные последовательности консервативных (участков) цепей иммуноглобулинов или антител, как описано в данном контексте, сигнальные последовательности Lamp1, тапазина, Erp57, кальретикулина, калнексина, а также другие белки, ассоциированные с мембранами, или белки, ассоциированные с ЭР, или эндосомами, лизосомами. Согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительной сигнальной последовательностью является ГКГ класса I HLA-A*0201.
Любые из описанных выше модификаций можно применять по меньшей мере к одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, а также к любой другой (м)РНК, описанной в данном контексте, и при необходимости такие модификации можно использовать в любой комбинации при условии, что каждая модификация не оказывает отрицательного влияния на другие модификации по меньшей мере одной РНК. Специалист в данной области техники может выбрать соответствующую комбинацию модификаций.
3

Согласно другому варианту активная (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению может включать адъювант. Термин "адъювант", использованный в данном контексте, обозначает любое соединение, которое является пригодным для повышения эффективности введения и доставки активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению. Кроме того, предполагается, что указанный адъювант может инициировать или усиливать иммунный врожденный ответ, т.е. неспецифический иммунный ответ. Другими словами, введение активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению обычно инициирует приобретенный иммунный ответ по меньшей мере на два антигена, кодируемых по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению. Кроме того, активная (иммуностимулирующая) композиция по изобретению может вызывать врожденный иммунный ответ в ответ на адъювант, добавленный в состав активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению. Указанный адъювант можно выбрать из любого известного адъюванта, пригодного для указанной цели, т.е. который усиливает иммунный ответ в организме млекопитающего. Предпочтительно адъювант выбирают из группы, включающей, но не ограничиваясь только ими, ДМТ (дикориномиколат трегалозы,), МДП, мурамил дипептид, плюроники, раствор солей алюминия (квасцов), гидроксид алюминия, продукт ADJUMERTM (полифосфазен), гель фосфата алюминия, глюканы из водорослей, продукт алгаммулин, гель гидроксида алюминия (квасцы), гель гидроксида алюминия, характеризующийся высокой адсорбционной способностью в отношении белков, гель гидроксида алюминия с низкой вязкостью, адъювант AF или SPT (эмульсия сквалана (5%)), твина 80 (0,2%), плюроника L121 (1,25%), фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,4), продукт AVRIDINE™ (пропандиамин), продукт BAY R1005™ (гидроацетат (N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-b-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканоиламид), продукт CALCITRIOL™ (1-α,25-дигидроксивитамин D3), гель фосфата кальция, продукт САРТМ (наночастицы фосфата кальция), холерный голотоксин, гибридный белок холерный токсин А1-белок А-фрагмент D, субъединица В холерного токсина, продукт CRL 1005 (блоксополимер Р1205), цитокин-содержащие липосомы, ДДА (бромид диметилдиоктадециламмония), ДГЭА (дегидроэпиандростерон), ДМФХ (димиристоилфосфатидилхолин), ДМФГ (димиристоилфосфатидилглицерин), комплекс ДОХ/квасцы (натриевая соль дезоксихолевой кислоты), полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, γ-инулин, адъювант Гербу (смесь, включающая: 1) N-ацетилглюкозаминил-(Р1-4)-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутамин (ГМДП), 2) хлорид диметилдиоктадециламмония (ДДА), 3) комплекс цинк-L-пролин (ZnPro-8), GM-CSF), ГМДП (N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин), имихимод (1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин), продукт ImmTher™ (дипальмитат N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-изоGlu-L-Ala-глицерина), продукты DRV (иммунолипосомы, полученные дегидратацией/регидратацией везикул), γ-интерферон, интерлейкин-1β, интерлейкин-2, интерлейкин-7, интерлейкин-12, продукт ISCOMS™, продукт ISCOPREP 7.0.3.™, липосомы, продукт LOXORIBINE™ (7-аллил-8-оксогуанозин), пероральный адъювант LT (лабильный энтеротоксин-протоксин E.coli), микросферы и микрочастицы любого состава, продукт MF59™, (водная эмульсия сквалана), продукт MONTANIDE ISA 51™ (очищенный неполный адъювант Фрейнда), продукт MONTANIDE ISA 720™ (метаболизируемый масляный адъювант), MPL™ (3-Q-деацил-4'-монофосфориллипид А), липосомы из МТР-РЕ и МТР-РЕ ((мононатриевая соль N-ацетил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-(гидроксифосфорилокси))этиламида), продукт MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L- Ala-D-Gln-ОСН), продукт MURAPALMITINE™ и D-MURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-изоGIn-sn-глицериндипальмитоил), продукт NAGO (нейраминидаза-галактозоксидаза), наносферы или наночастицы любого состава, продукты NISV (визикулы из неионогенного ПАВ), продукт PLEURAN™ (β-глюкан), продукт PLGA, PGA и PLA (гомо- и со-полимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, микросферы/наносферы), плюроник L121™, ПММА (полиметилметакрилат), продукт PODDS™ (протеиноидные микросферы), производные полиэтиленкарбамата, поли-rA/поли-rU (комплекс полиадениловой и полиуридиновой кислот), полисорбат 80 (твин 80), белковые кохлеаты (фирмы Avanti Polar Lipids, Inc., Алабастер, штат Алабама), продукт STIMULON™ (QS-21), продукт Quil-A (сапонин Quil-A), продукт S-28463 (4-аминоотекдиметил-2-этоксиметил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-этанол), продукт SAF-1™ ("композиция адъювантов Syntex"), протеолипосомы вируса Сендай и липидные матрицы, на основе вируса Сендай, спан-85 (сорбитантриолеат), продукт Specol (эмульсия Marcol 52, спана 85 и твина 85), сквалан или продукт Robane (2,6,10,15,19,23-гексаметилтетракозан и 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексан), стеарилтирозин (гидрохлорид октадецилтирозина), продукт Theramid (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-изоGlu-L-Ala-дипальмитоксипропиламид), продукт Theronyl-MDP (Termurtide™ или [thr 1]-MDP, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглютамин), Ту-частицы (Ту-ВПЧ или вирусоподобные частицы), липосомы Уолтера-Рида (липосомы, содержащие липид А, адсорбированный на гидроксиде алюминия), и липопептиды, включая Pam3Cys, прежде всего, соли алюминия, такие как адъю-фос (Adju-phos), алгидрогель, регидрагель, эмульсии, включая CFA, SAF, IFA, MF59, провакс (Provax), TiterMax, монтанид (Montanide), ваксфектин (Vaxfectin), сополимеры, включая продукт оптивакс (Optivax, CRL1005), L121, полоаксмер 4010), и т.п., липосомы, включая продукт Stealth, кохлеаты, включая продукт BIORAL, адъюванты растительного происхождения, включая препарат QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM, адъюванты, пригодные для дополнительной стимуляции, включая томатин, биополимеры, включая PLG, РММ, инулин, адъюванты микробного происхождения, включая ромуртид, продукт детокс (DETOX), MPL, CWS, маннозу, последовательности CpG-нуклеиновых кислот, CpG7909, лиганды TLR 1-10 человека, лиганды TLR 1-13 мыши, ISS-1018, IC31, имидазохинолины, продукты Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIV, ВПЧ, холерный токсин, термолабильный токсин, Pam3Cys, флагеллин, мембраносвязывающие вещества на основе гликозилированного фосфатидилинозита, продукт LNFPIII/Lewis X, антимикробные пептиды, продукт UC-1V150, гибридный белок RSV, cdiGMP, и адъюванты, которые предпочтительно являются антагонистами, включая нейропептид CGRP.
14
Пригодные адъюванты можно выбирать также из катионных или поликатионных соединений, при этом адъювант предпочтительно получают при образовании комплекса по меньшей мере одной активной РНК по изобретению (входящей в состав иммуностимулирующей композиции) с катионным или поликатионным соединением. Ассоциация или комплексообразование РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, с катионными или поликатионными соединениями, как описано в данном контексте, предпочтительно придает композиции адъювантные свойства и приводит к повышению стабильности по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции. Указанные предпочтительные катионные или поликатионные соединения выбирают, прежде всего, из катионных или поликатионных пептидов или белков, включая протамин, нуклеолин, спермин или спермидин, или катионных пептидов или белков, таких как поли-L-лизин (ПЛЛ), полиаргинин, основные полипептиды, пептиды, проникающие в клетку (ППК), включая ВИЧ-связывающие пептиды, Tat, ВИЧ-1 Tat (ВИЧ), производные пептидов Tat, пенетратин, производные VP22 или аналоги пептидов, HSV VP22 (простой герпес), продукт MAP, продукт KALA или домены трансдукции белков (ДТБ, РрТ620, пептиды, обогащенные пролином, пептиды, обогащенные аргинином, пептиды, обогащенные лизином, MPG-пептид (пептиды), Рер-1, L-олигомеры, кальцитониновый пептид (пептиды), пептиды из сложного локуса (прежде всего, сложного локуса дрозофилы), pAntp, pIs1, FGF, лактоферрин, транспортан, буфорин-2, Вас715-24, SynB, SynB(1), pVEC, производные пептидов hCT, SAP, протамин, спермин, спермидин или гистоны. Предпочтительные катионные или поликатионные соединения могут также включать катионные полисахариды, например хитозан, полибрен, катионные полимеры, например полиэтиленимин (ПЭИ), катионные липиды, например DOTMA [1-(2,3-сиолеилокси)пропил)]-N,N,N-триметиламмонийхлорид), DMRIE, ди-С-амидин, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, СТАР, DOPC, DODAP, DOPE (диолеилфосфатидилэтаноламин), DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS (диоктадециламидоглицилспермин), DIMRI (димуристооксипропилдиметилгидроксиэтиламмонийбромид), DOTAP (диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан), DC-6-14 (хлорид O,O-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмониоацетил)диэтаноламина), CLIP 1 (рац-[(2,3-диоктадецилоксипропил)(2-гидроксиэтил)]диметиламмонийхлорид), CLIP6 (рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксиметилокси)этил]триметиламмоний), CLIP9 (рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксисукцинилокси)этил]триметиламмоний), олигофектамин или катионные или поликатионные полимеры, например модифицированные полиаминокислоты, такие как полимеры β-аминокислот или обращенные полиамиды, и т.п., модифицированные полиэтилены, такие как ПВП (бромид поли(N-этил-4-винилпиридиния)) и т.п., модифицированные акрилаты, такие как пДМАЭМА (поли(диметиламиноэтилметилакрилат)) и т.п., модифицированные амидоамины, такие как пАА (поли(амидоамин)) и т.п., модифицированные поли-β-аминовые сложные эфиры (П-β-АЭ), такие как модифицированные по диаминовому концевому фрагменту сополимеры 1,4-бутандиолдиакрилата и 5-амино-1-пентанола и т.п., дендримеры, такие как полипропиламиновые дендримеры или дендримеры на основе пАА и т.п., полиимин (полиимины), такие как ПЭИ (поли(этиленимин), поли(пропиленимин) и т.п., полиаллиламин, полимеры на основе сахаров, такие как полимеры на основе циклодекстрина, полимеры на основе декстрана, хитозан и т.п., полимеры на основе силанов, такие как сополимеры РМОХА-PDMS и т.п., блок-сополимеры, включающие комбинацию одного или более катионных блоков (например, выбранные из катионных полимеров, описанных выше) и одного или более гидрофильных или гидрофобных блоков (например, полиэтиленгликоль) и т.п.
l
m
n
o
x
7
8
9
7
3
9
9
3
3
9
3
9
4
2
Кроме того, предпочтительные катионные или поликатионные белки или пептиды, которые можно использовать в качестве адъюванта, образующего комплексы по меньшей мере с одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, можно выбирать из следующих белков или пептидов общей формулы (I): (Arg), (Lys), (His), (Orn), (Xaa), где l+m+n+о+х=8-15, и l, m, n или о независимо друг от друга равны числу, выбранному из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, при условии, что общее содержание Arg, Lys, His и Orn составляет по меньшей мере 50% всех аминокислотных остатков, входящих в состав олигопепдида, и Хаа обозначает любую аминокислоту, выбранную из природных или неприродных аминокислот за исключением Arg, Lys, His или Orn, и x равен любому числу, выбранному из 0, 1, 2, 3 или 4, при условии, что общее содержание Хаа не превышает 50% всех аминокислотных остатков, входящих в состав олигопептида. Согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительными являются олигоаргинины, например Arg, Arg, Arg, Arg, HR, RH, HRH, YSSRSSY, (RKH), Y(RKH)R и т.п.
l
m
n
Пригодные адъюванты можно выбирать также из нуклеиновых кислот общей формулы (II): GXG, где: G обозначает гуанозин, урацил или аналоги гуанозина или урацила, Х обозначает гуанозин, урацил, аденозин, тимидин, цитозин или аналоги нуклеотидов, описанных выше, l равно целому числу от 1 до 40, причем если l равно 1, то G обозначает гуанозин или его аналог, если l>1 по меньшей мере 50% нуклеотидов являются гуанозином или его аналогами, m равно целому числу, и равно по меньшей мере 3, причем если m равно 3, то Х обозначает урацил или его аналог, если m>3, то по меньшей мере 3 остатка урацила или его аналогов расположены последовательно друг за другом, n равно целому числу от 1 до 40, причем если n равно 1, то G обозначает гуанозин или его аналог, если n>1, по меньшей мере 50% нуклеотидов являются гуанозином или его аналогами.
l
m
n
Другие пригодные адъюванты можно выбирать также из нуклеиновых кислот общей формулы (III): CXC, где С обозначает цитозин, урацил или аналоги цитозина или урацила, Х обозначает гуанозин, урацил, аденозин, тимидин, цитозин или аналоги нуклеотидов, описанных выше, l равно целому числу от 1 до 40, причем если l равно 1, то С обозначает цитозин или его аналог, если l>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов являются цитозином или его аналогами, m равно целому числу, и равно по меньшей мере 3, причем если m равно 3, то Х обозначает урацил или его аналог, если m>3, то по меньшей мере 3 остатка урацила или его аналогов расположены последовательно друг за другом, n равно целому числу от 1 до 40, при этом если n равно 1, то С обозначает цитозин или его аналог, если n>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов являются цитозином или его аналогами.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается также вакцина, которая содержит активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению. Вакцина по изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или другие вспомогательные вещества или добавки и/или адъюванты. Согласно более предпочтительному варианту антигены, кодируемые по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, содержащейся в вакцине по изобретению, выбирают из групп или подгрупп, описанных выше. Согласно еще более предпочтительному варианту белковые антигены выбирают из любых антигенов следующей подгруппы, включающей NY-ES01 (идентификационный № NM_001327), hTERT (идентификационный № NM_198253), сурвивин (идентификационный № AF077350), 5Т4 (идентификационный № NM_006670) и WT1 (идентификационный № NM_000378), и/или из любых антигенов следующей подгруппы, включающей MAGE-C1 и MAGE-C2, как описано в данном контексте, и/или из любых антигенов следующей подгруппы, включающей MAGE-A2 и MAGE-A3, как описано в данном контексте.
Вакцина по изобретению обычно содержит безопасное и эффективное количество по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, как описано выше, которая кодирует по меньшей мере два антигена, как описано выше, более предпочтительно, кодирующей по меньшей мере два антигена, выбранные из любых описанных выше групп или подгрупп, еще более предпочтительно из любых описанных комбинаций. Термин "безопасное и эффективное количество", использованный в данной контексте, обозначает количество по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, входящей в состав вакцины, описанной выше, которое является достаточным для оказания значительного положительного действия на состояния (подлежащие лечению) при раке легких, предпочтительно немелкоклеточном раке легких (НМРЛ), более предпочтительно на состояния при трех основных подтипах НМРЛ, включая, но не ограничиваясь только ими, плоскоклеточную карциному легких, аденокарциному и крупноклеточную карциному легких. Однако в то же время термин "безопасное и эффективное количество" обозначает достаточно небольшое количество, при введении которого не наблюдаются тяжелые побочные эффекты, т.е. такое количество, при введении которого наблюдается приемлемое соотношение польза/риск. Указанное количество может определить специалист в данной области медицины. В отношении вакцины по настоящему изобретению термин "безопасное и эффективное количество" предпочтительно обозначает такое количество РНК (которая кодирует по меньшей мере два антигена), которое пригодно для стимуляции приобретенного иммунитета и при этом не должны развиваться избыточные или повреждающие иммунные ответные реакции, но предпочтительно указанные ответные реакции должны развиваться на детектируемом уровне. Кроме того, такое "безопасное и эффективное количество" по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, входящей в состав вакцины, описанной в данном контексте, можно выбрать в зависимости от типа РНК, например в зависимости от использования моноцистронной, би- или даже полицистронной РНК, так как би- или даже полицистронная РНК вызывает более эффективную экспрессию кодируемых антигенов (антигена) по сравнению с равным количеством моноцистронной РНК. Более того, термин "безопасное и эффективное количество" по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, описанной выше, может изменяться в зависимости от конкретного состояния, подлежащего лечению, а также от возраста и физического состояния пациента, нуждающегося в лечении, от тяжести состояния, продолжительности лечения, конкретного фармацевтически приемлемого носителя и аналогичных факторов, которые может оценить лечащий врач. Вакцину по настоящему изобретению можно использовать в медицине и в ветеринарии в виде фармацевтической композиции и в виде вакцины.
2
3
3
2
4
2
3
3
2
4
2
2
2
3
4
2
2
2
2
Вакцина по изобретению обычно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель", использованный в данном контексте, предпочтительно обозначает жидкие или нежидкие основы вакцины по изобретению. Если вакцина по изобретению представлена в жидкой форме, носителем обычно является апирогенная вода, изотонический солевой раствор или буферные (водные) растворы, например фосфатные, цитратные буферные растворы и т.п. Для инъекций и вакцины по изобретению, прежде всего, используют воду или предпочтительно буферный раствор, более предпочтительно водный буферный раствор, содержащий соль натрия, предпочтительно по меньшей мере 50 мМ соль натрия, соль кальция, предпочтительно по меньшей мере 0,01 мМ соль кальция, и необязательно соль калия, предпочтительно по меньшей мере 3 мМ соль калия. Согласно предпочтительному варианту в качестве солей натрия, кальция и необязательно калия используют галогениды, например хлориды, иодиды или бромиды, гидроксиды, карбонаты, гидрокарбонаты или сульфаты указанных металлов и т.п. Примеры солей, но не ограничиваясь только ими, включают, например, NaCl, NaI, NaBr, NaCO, NaHCO, NaSO, примеры необязательных солей калия включают, например, KCl, KI, KBr, KCO, KHCO, KSO, и примеры солей кальция включают, например, CaCl, CaI, CaBr, СаСО, CaSO, Ca(OH). Кроме того, буферный раствор может содержать органические соли указанных металлов. Согласно более предпочтительному варианту буферный раствор, пригодный для инъекций, как описано выше, может содержать соли, выбранные из хлорида натрия (NaCl), хлорида кальция (CaCl) и необязательно хлорида калия (KCl), при этом буферный раствор может содержать другие анионы в отличие от хлоридов. CaCl можно заменять на другую соль, например KCl. Обычно соли в составе буферного раствора для инъекций присутствуют в следующей концентрации по меньшей мере 50 мМ хлорид натрия (NaCl), по меньшей мере 3 мМ хлорид калия (KCl) и по меньшей мере 0,01 мМ хлорид кальция (CaCl). Буферный раствор для инъекций может представлять собой гипертонический, изотонический или гипотонический раствор по сравнению со средой, в которую вводят указанную вакцину, т.е. буферный раствор содержит повышенное, аналогичное или пониженное количество соли по сравнению со средой, в которую вводят указанную вакцину, при этом предпочтительно использовать такие концентрации указанных выше солей, которые не приводят к повреждению клеток за счет осмоса или других концентрационных эффектов. В качестве среды, в которую вводят указанную вакцину, можно рассматривать, например, жидкие среды, используемые в способах "in vivo", такие как кровь, лимфа, цитозоль и другие физиологические жидкости, или, например, жидкости, которые можно использовать в способах "in vitro", такие как стандартные буферные растворы или жидкости. Указанные стандартные буферные растворы или жидкости известны специалисту в данной области техники. Наиболее предпочтительной жидкой основой является лактатный раствор Рингера.
Можно также использовать один или более совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей или инкапсулирующих соединений, пригодных для введения в организм субъекта. Термин "совместимые", использованный в данном контексте, обозначает, что компоненты вакцины по изобретению пригодны для смешивания по меньшей мере с одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, кодирующей по меньшей мере два антигена, описанных выше, и при этом не происходит каких-либо взаимодействий между указанными компонентами, которые значительно снижают фармацевтическую эффективность вакцины по изобретению в стандартных условиях. Фармацевтически приемлемые носители, наполнители или разбавители должны характеризоваться достаточно высокой степенью чистоты и достаточно низкой токсичностью, т.е. являться приемлемыми для введения в организм субъекта, нуждающегося в лечении. Примеры соединений, которые можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей или компонентов вакцины, включают сахара, такие как, например, лактоза, глюкоза и сахароза, крахмалы, такие как, например, кукурузный крахмал или картофельный крахмал, целлюлоза и ее производные, такие как, например, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, порошкообразную трагантовую камедь, солод, желатин, твердые жиры, твердые скользящие вещества, такие как, например, стеариновая кислота, стеарат магния, сульфат кальция, растительные масла, такие как, например, арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао, полиолы, такие как, например, полипропиленгликоль, глицерин, сорбит, манит и полиэтиленгликоль, а также альгиновую кислоту.
В основном выбор фармацевтически приемлемого носителя определяется способом введения вакцины по изобретению. Вакцину по изобретению можно вводить, например, системным или местным способом. Способы системного введения обычно включают, например, чрескожное, пероральное, парентеральное введение, включая подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, внутрикожные и внутрибрюшинные инъекции и/или интраназальные способы введения. Способы для местного введения в основном включают, например, различные способы местного введения, но также внутрикожные, чрескожные, подкожные или внутримышечные инъекции или инъекции, вводимые непосредственно в пораженную ткань, внутричерепные, внутрилегочные, внутрисердечные и подъязычные инъекции. Более предпочтительно вакцины можно вводить внутрикожно, подкожно или внутримышечно. Следовательно, композиции/вакцины предпочтительно перерабатывают в жидкую или твердую форму. Пригодное количество вводимой вакцины по изобретению можно определить в стандартных экспериментах на моделях животных. Указанные модели включают, но не ограничиваясь только ими, модели кроликов, овец, мышей, крыс, собак и низших приматов. Предпочтительные стандартные лекарственные формы для инъекций включают стерильные водные растворы, физиологический раствор или их смеси. Указанные растворы характеризуются рН приблизительно 7,4. Пригодные носители для инъекций включают гидрогели, устройства для контролируемого или замедленного высвобождения лекарственного средства, полимолочную кислоту и коллагеновые матрицы. Пригодные фармацевтически приемлемые носители для местного применения включают носители, пригодные для применения в составе лосьонов, кремов, гелей и т.п. Если вакцину по изобретению вводят пероральным способом, то предпочтительными стандартными лекарственными формами являются таблетки, капсулы и т.п. В предшествующем уровне техники известны фармацевтически приемлемые носители для получения стандартных лекарственных форм. Выбор указанных носителей зависит от вторичных факторов, таких как вкус, стоимость и стабильность при хранении, и такие носители может выбрать специалист в данной области техники, при этом они не влияют на сущность настоящего изобретения.
Вакцина по изобретению может дополнительно содержать одно или более вспомогательных веществ, предназначенных для повышения иммунногенности. При этом предпочтительно достигается синергетический эффект при действии по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции, как описано выше, и вспомогательного вещества, которое необязательно также включено в состав вакцины по изобретению, как описано выше. В зависимости от типа используемых вспомогательных веществ можно рассматривать различные механизмы действия. Например, соединения, ускоряющие созревание дендритных клеток (ДК), например липополисахариды, α-ФНО или лиганд CD40, включены в первый класс пригодных вспомогательных веществ. В основном в качестве вспомогательного вещества можно использовать любой агент, который оказывает влияние на иммунную систему, по механизму "сигнала опасности" (LPS, GP96, и т.п.), или можно использовать цитокины, такие как ГМ-КСФ, которые позволяют целенаправленно усиливать иммунный ответ, вызванный иммуностимулирующим адъювантом по изобретению, или влиять на него. Наиболее предпочтительными вспомогательными веществами являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, которые кроме индукции приобретенного иммунитета кодируемыми по меньшей мере двумя антигенами, активируют врожденный иммунитет, такие как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-19, ИЛ-20, ИЛ-21, ИЛ-22, ИЛ-23, ИЛ-24, ИЛ-25, ИЛ-26, ИЛ-27, ИЛ-28, ИЛ-29, ИЛ-30, ИЛ-31, ИЛ-32, ИЛ-33, α-ИФ, β-ИФ, γ-ИФ, ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ, β-ЛТ или α-ФНО, факторы роста, такие как чГР.
Другими добавками, которые можно включать в состав вакцины по изобретению, являются эмульгаторы, такие как, например, твин, увлажняющие агенты, такие как, например, лаурилсульфат натрия, красители, вкусовые добавки, фармацевтические носители, наполнители для получения таблеток, стабилизаторы, антиоксиданты, консерванты.
Вакцина по изобретению дополнительно может содержать также другие соединения, иммуностимуляторы, которые в качестве лигандов специфически связываются с Toll-подобными рецепторами человека TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, или в качестве лигандов связываются с Toll-подобными рецепторами мыши TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13.
Другой класс соединений, которые дополнительно можно включать в состав вакцины по изобретению, как описано в данном контексте, включает CpG-нуклеиновые кислоты, прежде всего CpG-PHK или CpG-ДНК. CpG-PHK или CpG-ДНК могут включать одноцепочечную CpG-ДНК (оцСрО-ДНК), двухцепочечную CpG-ДНК (дцДНК), одноцепочечную CpG-PHK (оцСрО-РНК) или двухцепочечную CpG-PHK (дцСрО-РНК). CpG-нуклеиновой кислотой предпочтительно является указанная кислота в форме CpG-PHK, более предпочтительно в форме оцCpG-PHK. CpG-нуклеиновая кислота предпочтительно содержит по меньшей мере одну или более (митогенных) цитозин/гуаниндинуклеотидных последовательностей (CpG-мотив (мотивы)). Согласно первому предпочтительному варианту по меньшей мере один CpG-мотив, содержащийся в указанных последовательностях, другими словами С (цитозин) и G (гуанин) в составе CpG-мотива, является неметилированным. Все другие остатки цитозина или гуанина, необязательно содержащиеся в указанных последовательностях, являются метилированными или неметилированными. Однако согласно другому предпочтительному варианту С (цитозин) и G (гуанин) в составе CpG-мотива могут также присутствовать в метилированной форме.
Согласно другому предпочтительному объекту настоящего изобретения активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению или по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно) различных антигена, как описано в данном контексте, можно использовать (для получения вакцины по настоящему изобретению) для лечения рака легких, предпочтительно состояния, связанного с НМРЛ, более предпочтительно состояний, связанных с тремя основными подтипами НМРЛ, включая, но не ограничиваясь только ими, плоскоклеточную карциному легких, аденокарциному и крупноклеточную карциному легких.
Согласно другому предпочтительному объекту вакцину по изобретению или по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно) различных антигена, как описано в данном контексте, можно использовать для лечения рака легких, состояния, связанного предпочтительно с НМРЛ, более предпочтительно состояний, связанных с тремя основными подтипами НМРЛ, включая, но не ограничиваясь только ими, плоскоклеточную карциному легких, аденокарциному и крупноклеточную карциному легких.
В настоящем изобретении также предлагаются способы лечения рака легких, предпочтительно состояния, связанного с НМРЛ, более предпочтительно состояний, связанных с тремя основными подтипами НМРЛ, включая, но не ограничиваясь только ими, плоскоклеточную карциному легких, аденокарциному и крупноклеточную карциному легких, причем указанные способы заключаются в том, что пациенту, нуждающемуся в таком лечении, вводят фармацевтически эффективное количество вакцины по изобретению или фармацевтически эффективное количество активной (иммуностимулирующей) композиции. Указанный способ обычно заключается в том, что необязательно на первой стадии получают активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению, или вакцину по изобретению, и на второй стадии пациенту, нуждающемуся в таком лечении, вводят (фармацевтически эффективное количество) указанной активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению или указанной вакцины по изобретению. Пациента, нуждающегося в таком лечении, обычно выбирают из любых млекопитающих. Согласно настоящему изобретению млекопитающего предпочтительно выбирают из группы, включающей, но не ограничиваясь только ими, например, козу, крупный рогатый скот, свинью, собаку, кошку, осла, обезьян, приматов, грызунов, таких как мышь, хомяк, кролик и, прежде всего, человека, при этом млекопитающее обычно страдает от рака легких, состояния, связанного предпочтительно с НМРЛ, более предпочтительно состояний, связанных с тремя основными подтипами НМРЛ, включая, но не ограничиваясь только ими, плоскоклеточную карциному легких, аденокарциному и крупноклеточную карциному легких или состояния, связанные с ними.
В настоящем изобретении предлагается также применение активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению или по меньшей мере одной РНК, кодирующей по меньшей мере два (предпочтительно) различных антигена, как описано в данном контексте (для получения вакцины по изобретению), предпочтительно для индукции иммунного ответа у млекопитающего, предпочтительно для лечения рака легких, более предпочтительно для лечения состояния, связанного с НМРЛ, как описано в данном контексте.
В настоящем изобретении также предлагается применение вакцины по изобретению самой по себе или по меньшей мере одной РНК, кодирующей по меньшей мере два (предпочтительно) различных антигена, как описано в данном контексте, для индукции приобретенного иммунного ответа у млекопитающего, предпочтительно для лечения рака легких, более предпочтительно состояния, связанного с НМРЛ, как описано в данном контексте.
Профилактику или лечение рака легких у пациента, нуждающегося в таком лечении, предпочтительно состояния, связанного с НМРЛ, как описано в данном контексте, осуществляют при введении активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению и/или вакцины по изобретению в виде смеси или поочередно, например, в виде наборов указанных компонентов, при этом каждый компонент набора включает по меньшей мере один из антигенов, предпочтительно различных антигенов. Введение можно осуществлять любым способом, описанным выше. Например, можно лечить рак легких, предпочтительно состояние, связанное с НМРЛ, как описано в данном контексте, за счет индукции или усиления приобретенного иммунного ответа в ответ по меньшей мере на два (специально выбранных) антигена, кодируемых по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению. Введение активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению и/или вакцины по изобретению можно осуществлять перед введением, одновременно и/или после введения другой активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению и/или вакцины по изобретению, как описано в данном контексте, которая может содержать другую комбинацию РНК, кодирующих различные антигены, при этом каждый антиген кодируется по меньшей мере одной РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению и является предпочтительно пригодным для лечения рака легких, более предпочтительно для лечения состояния, связанного с НМРЛ, как описано в данном контексте. Термин "лечение", использованный в данном контексте, включает также модуляцию заболевания, ассоциированного с раком легких, предпочтительно заболевания, ассоциированного с НМРЛ, как описано в данном контексте.
В другом варианте осуществления изобретения предлагается применение активной (иммуностимулирующей) композиции (для получения вакцины по изобретению) для модуляции, предпочтительно для индукции или усиления иммунного ответа у млекопитающего, как описано выше, более предпочтительно для повышения эффективности лечения рака легких, прежде всего НМРЛ, как описано в данном контексте. Как указано в данном контексте, поддерживающую терапию рака легких, прежде всего, НМРЛ можно осуществлять с использованием любой комбинации стандартных курсов лечения рака легких, прежде всего НМРЛ, как описано в данном контексте, таких как лучевая терапия, химиотерапия, протонная терапия, гормональная терапия, лечение с использованием антител, вспомогательные лечебные мероприятия, способы лечения с использованием других вакцин, в отличие от вакцины по изобретению, способы лечения с использованием ингибиторов киназ или низкомолекулярных нуклеотидов и т.п., или некоторые комбинации указанных курсов лечения и способа лечения с использованием активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению или вакцины по изобретению, как описано в данном контексте. Поддерживающую терапию лечения рака легких, прежде всего НМРЛ, как описано в данном контексте, можно осуществлять с использованием любого другого варианта способа по изобретению, как описано в данном контексте.
Введение активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению или по меньшей мере одной РНК, кодирующей по меньшей мере два (предпочтительно) различных антигена, как описано в данном контексте, или вакцины по изобретению можно осуществлять поочередно, например, вводя активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению или по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно) различных антигена, как описано в данном контексте, или вакцину по изобретению перед лечением (одновременно с ним и/или после него) рака легких, прежде всего НМРЛ, например, при введении активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению или вакцины перед лечением (одновременно с ним и/или после него) или при введении лекарственного средства, пригодного для лечения рака легких, прежде всего НМРЛ, как описано в данном контексте. Указанное поочередное лечение можно осуществлять, используя, например, набор, предпочтительно набор компонентов, описанных ниже.
Поочередное лечение может дополнительно или альтернативно включать также введение активной (иммуностимулирующей) композиции или вакцины по изобретению, предпочтительно по меньшей мере одной РНК, кодирующей по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, как описано выше, в форме, в которой по меньшей мере одна РНК, кодирующая по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, как описано выше, предпочтительно является частью активной (иммуностимулирующей) композиции или вакцины по изобретению, которую вводят одновременно с введением, перед введением или после введения другой по меньшей мере одной РНК, кодирующей по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, как описано выше, которая является частью той же самой активной (иммуностимулирующей) композиции или вакцины по изобретению. Предпочтительно введение (по меньшей мере, одной из всех РНК) осуществляют в течение 1 ч, более предпочтительно в течение 30 мин, еще более предпочтительно в течение 15, 10, 5, 4, 3 или 2 мин или даже в течение 1 мин. Указанное поочередное лечение можно осуществлять, используя, например, набор, предпочтительно набор компонентов, описанных ниже.
В конечном варианте осуществления изобретения предлагается также набор, прежде всего набор компонентов, включающий активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению и/или вакцину по изобретению, а также необязательно инструкцию по применению, содержащую рекомендации по введению и дозировке активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению и/или вакцины по изобретению. Инструкция по применению может включать рекомендации по введению и дозировке активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению и/или вакцины по изобретению. Указанные наборы, предпочтительно наборы компонентов, можно использовать, например, в любых способах, описанных выше, предпочтительно для применения по меньшей мере одной активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению (для получения вакцины по изобретению) для лечения рака легких, прежде всего НМРЛ, как описано в данном контексте. Наборы можно использовать также для применения по меньшей мере одной активной (иммуностимулирующей композиции по изобретению (для получения вакцины по изобретению) для лечения рака легких, предпочтительно НМРЛ, как описано в данном контексте, при этом активная (иммуностимулирующая) композиция по изобретению и/или вакцина, кодирующая по меньшей мере два антигена, индуцирует или усиливает иммунный ответ у млекопитающего, как описано выше. Указанные наборы можно использовать также для применения по меньшей мере одной активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению (для получения вакцины по изобретению) для модуляции, предпочтительно для индукции, например для индукции или усиления иммунного ответа у млекопитающего, как описано выше, и предпочтительно для поддерживающего лечения рака легких, прежде всего НМРЛ. Наборы компонентов, как специальная форма наборов, могут содержать одну или более одинаковых или различных активных (иммуностимулирующих) композиций по изобретению и/или одну или более одинаковых или различных вакцин по изобретению в составе различных компонентов, входящих в состав набора. Наборы компонентов могут содержать также (например, одну) активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению, (например, одну) вакцину по изобретению и/или по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере один антиген, как описано выше, в составе различных компонентов набора, например, каждый компонент набора"включает по меньшей мере одну РНК, кодирующую различный антиген. Кроме того, можно использовать комбинацию обоих типов наборов. Наборы компонентов можно использовать, например, при проведении поочередного лечения, например, используя различные составы и/или увеличивающиеся концентрации активной (иммуностимулирующей композиции по изобретению, вакцины по изобретению и/или по меньшей мере одной РНК, кодирующей по меньшей мере один из антигенов, как описано выше, в ходе одного и того же курса лечения (in vivo). При необходимости (по техническим причинам) наборы компонентов можно использовать при введении отдельного состава или при введении различных антигенов, входящих в состав активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению (т.е. в составе различных компонентов), но при условии, что при этом достигается совместное присутствие различных агентов in vivo. Можно использовать, прежде всего, наборы компонентов, в качестве специальной формы наборов, в которых каждый компонент содержит по меньшей мере один антиген, предпочтительно различный антиген, как описано выше, при этом все компоненты набора предпочтительно образуют активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению или вакцину по изобретению, как описано в данном контексте. Указанные специфические наборы компонентов предпочтительно можно использовать, например, если различные антигены представлены в отдельности в составе различных компонентов набора, но затем их вводят одновременно или поочередно млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении. В последнем случае все различные компоненты указанного набора вводят в течение короткого промежутка времени, чтобы все антигены присутствовали в организме млекопитающего приблизительно в одно и то же время после введения последнего компонента набора. Любой из наборов, описанных выше, можно использовать для лечения, как описано выше.
Преимущества настоящего изобретения
В настоящем изобретении предлагается активная (иммуностимулирующая) композиция для лечения рака легких, прежде всего НМРЛ, при этом композиция содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, индуцирующих (приобретенный) иммунный ответ у млекопитающего, причем антигены выбраны из группы, включающей hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин, MAGE-C1 или MAGE-C2. Указанную активную (иммуностимулирующую) композицию можно использовать для эффективного лечения рака легких, прежде всего НМРЛ, или в качестве поддерживающей терапии в ходе стандартных курсов лечения. Предлагаемый в настоящем изобретении способ (то есть если для лечения используют РНК) позволяет исключить проблемы неконтролируемого продуцирования введенных последовательностей ДНК. РНК, входящие в состав активной (иммуностимулирующей) композиции по изобретению, характеризуются дополнительными существенными преимуществами по сравнению с экспрессирующими системами на основе ДНК, например, в отношении иммунного ответа, иммунизации или вакцинации. Указанные преимущества включают, кроме всего, тот факт, что РНК, проникающая в клетку, не интегрируется в ее геном. Это позволяет исключить мутации указанного гена, которые могут привести к полной или частичной его инактивации или приводить к ошибочной информации. Кроме того, это позволяет снизить риски, связанные с применением ДНК в качестве агента, индуцирующего иммунный ответ, (например, в качестве вакцины), такие как индукция патогенных анти-ДНК антител у пациента, которому вводят чужеродную ДНК, что может привести к (возможно, фатальному) иммунному ответу. Наоборот образование каких-либо анти-РНК антител к настоящему времени не установлено.
Фигуры
Следующие фигуры приводятся только для иллюстрации и не ограничивают объем и сущность настоящего изобретения.
Фиг.1. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №1) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая MUC1 (HsMUC1 - 5×VNTR (Обычно последовательность дикого типа содержит 40 тандемных повторов. Содержание таких повторов снижено до 5 в связи с условиями клонирования). Содержание GC составляет 61,27%, длина 1668 п.о.).
Фиг 2. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №2), кодирующая MUC1 (HsMUC1 GC - 5×VNTR, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 73,56%, длина 1668 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.1 (SEQ ID №1)) составляет 398/1668 оснований = 23,86%.
Фиг.3. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №3) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая 5Т4 (Hs5T4 (гликопротеин трофобластов TPBG), содержание GC составляет 61,60%, длина 1263 п.о.
Фиг.4. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №4), кодирующая 5Т4 (Hs5T4 GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 70,47%, длина 1263 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.3 (SEQ ID №3)) составляет 247/1263 оснований = 19,56%.
Фиг.5. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №5) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая Her-2/neu (HsHer2/neu (v-erb-b2 гомолог вирусного онкогена 2 эритробластного лейкоза)), содержание GC составляет 60,78%, длина 3768 п.о.
Фиг.6. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №6), кодирующая Her-2/neu (HsHer2/neu GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 70,54%, длина 3768 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.5 (SEQ ID №5)) составляет 772/3768 оснований = 20,49%.
Фиг.7. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №7) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая hTERT (HsTERT (обратная транскриптаза теломеразы), содержание GC составляет 66,08%, длина 3399 п.о.
Фиг.8. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №8), кодирующая hTERT (HsTERT GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 72,96%, длина 3399 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.7 (SEQ ID №7)) составляет 566/3399 оснований = 16,65%.
Фиг.9. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №9) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая WT1 (HsWT1 (опухоль Вильмса 1)), содержание GC составляет 61,78%, длина 1554 п.о.
Фиг.10.
Фиг.10А. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №10), кодирующая WT1 (HsWT1 (опухоль Вильмса 1)), последовательность характеризуется пониженным содержанием GC в участке 325-408 по сравнению с соответствующим участком в последовательности дикого типа.
На фиг.10Б, В и Г приводится сравнение соответствующих участков 325-408:
на фиг.10Б: последовательность дикого типа, соответствующая последовательности, представленной на фиг.9 (SEQ ID №9),
на фиг.10В: последовательность с максимально возможным содержанием GC, соответствующая последовательности, представленной на фиг.11 (SEQ ID №11), и
на фиг.10Г: последовательность со сниженным содержанием GC, соответствующая последовательности, указанной на фиг.10 (SEQ ID №10), все последовательности характеризуются различным составом GC.
Фиг.11. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №11), кодирующая WT1 (HsWT1 GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 72,59%, длина 1554 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.9 (SEQ ID №9)) составляет 322/1554 оснований = 20,72%.
Фиг.12. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №12) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая СЕА (СЕА (карциноэмбриональный антиген) HsCEACAM5), содержание GC составляет 52.20%, длина 2109 п.о.
Фиг.13. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №13), кодирующая СЕА (СЕАСАМ5 GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона, уже в известных положениях), содержание GC составляет 66,24%, длина 2109 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.12 (SEQ ID №12)) составляет 495/2109 оснований = 23,47%.
Фиг.14. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №14) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая MAGE-A2 (HsMAGE-А2 (меланомный антиген семейства А, 2) HsMAGE-A2B), содержание GC составляет 55,87%, длина 945 п.о.
Фиг.15. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №15), кодирующая MAGE-A2 (HsMAGE-A2B GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 68,57%, длина 945 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.14 (SEQ ID №14)) составляет 187/945 оснований = 19,79%.
Фиг.16. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №16) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая MAGE-A3 (MAGE-A3 (меланомный антиген семейства А, 3) MAGE-A3), содержание GC составляет 56,30%, длина 945 п.о.
Фиг.17. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №17), кодирующая MAGE-A3 (MAGE-A3 GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона, уже известное повышенное содержание GC), содержание GC составляет 69,00%, длина 945 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.16 (SEQ ID №16)) составляет 190/945 оснований = 20,11%.
Фиг.18. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №18) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая сурвивин (сурвивин (бакуловирусный IAP, содержащий 5 повторов, BIRC5) HsСурвивин (дикого типа)), содержание GC составляет 52,68%, длина 429 п.о.
Фиг.19. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №19), кодирующая сурвивин (HsСурвивин(GC), 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона, уже известное повышенное содержание GC), содержание GC составляет 65,27%, длина 429 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.18 (SEQ ID №18)) составляет 72/429 оснований = 16,78%.
Фиг.20. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №20) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая NY-ESO-1 (Homo sapiens NY-ESO-1 (NY-ESO-1 (дикого типа)), содержание GC составляет 67,4%.
Фиг.21. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №21), кодирующая NY-ESO-1 (NY-ESO-1(GC), содержание GC составляет 79,56%, (уже известное повышенное содержание GC), отличие от дикого типа (фиг.20 (SEQ ID №20)) составляет 112/543 оснований, 20,63%.
Фиг.22. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №22) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая MAGE-C1 (HsMAGEC1 (меланомный антиген семейства С, 1) HsMAGEC1 (дикий тип)), содержание GC составляет 51,86%, длина 3429 п.о.
Фиг.23. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №23), кодирующая MAGE-C1 (HsMAGEC1 (GC), 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 68,73%, длина 3429 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.22 (SEQ ID №22)) составляет 964/3429 оснований = 28,11%.
Фиг.24. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №24), кодирующая укороченный MAGE-C1 (HsMAGEC1(GC), 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), по сравнению с исходной последовательностью (фиг.22 (SEQ ID №22)) повторяющиеся области удалены и последовательность согласно фиг.24, следующая за старт-кодоном (ATG), начинается с аминокислотного остатка 613 последовательности дикого типа, с максимально возможным содержанием GC (фиг.23 (SEQ ID №23)).
Фиг.25. На схеме представлена последовательность РНК (SEQ ID №25) (стартовая последовательность дикого типа), кодирующая MAGE-C2 (HsMAGE-С2 (меланомный антиген семейства С, 2) HsMAGE-C2), содержание GC составляет 50,81%, длина 1122 п.о.
Фиг.26. На схеме представлена (GC) стабилизированная последовательность РНК (SEQ ID №26), кодирующая MAGE-C2 (HsMAGE-C2 GC, 1. Максимально возможное содержание GC, 2. Использование кодона), содержание GC составляет 66,58%, длина 1122 п.о., отличие от основной последовательности (фиг.25 (SEQ ID №25)) составляет 264/1122 оснований = 23,53%.
Фиг.27. На схеме представлены данные о присутствии IgG1 антител, специфичных в отношении опухолевого антигена NY-ESO-1 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Фиг.28. На схеме представлены данные о присутствии IgG2a антител, специфичных в отношении опухолевого антигена NY-ESO-1 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Фиг.29. На схеме представлены данные о присутствии IgG1 антител, специфичных в отношении опухолевого антигена MAGE-C1 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Фиг.30. На схеме представлены данные о присутствии IgG2a антител, специфичных в отношении опухолевого антигена MAGE-C1 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Фиг.31. На схеме представлены данные о присутствии IgG1 антител, специфичных в отношении опухолевого антигена MAGE-C2 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Фиг.32. На схеме представлены данные о присутствии IgG2a антител, специфичных в отношении опухолевого антигена MAGE-C2 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Фиг.33. На схеме представлены данные об индукции антигенспецифичных Т-лимфоцитов, направленных против опухолевого антигена 5Т4 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Фиг.34. На схеме представлены данные об индукции антигенспецифичных Т-лимфоцитов, направленных против опухолевого антигена NY-ESO-1 у мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, содержащей 5 компонентов, каждый из которых содержит мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4) в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Примеры
Следующие примеры приводятся только для иллюстрации настоящего изобретения, и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Пример 1
Получение кодирующих плазмид
Были получены экспериментальные последовательности ДНК, соответствующие типичным концевым последовательностям мРНК, кодирующим следующие антигены:
hTERT,
WT1,
MAGE-A2,
5Т4,
MAGE-A3,
MUC1,
Her-2/neu,
NY-ESO-1,
СЕА,
сурвивин,
MAGE-C1 или
MAGE-C2,
которые были использованы для транскрипции и трансфекции in vitro. При этом последовательность ДНК, соответствующая нативному антигену, кодируемому мРНК, характеризовалась повышенным содержанием GC и включала оптимизированные кодоны. Затем кодирующую последовательность включали в конструкт RNActive (фирмы CureVac GmbH, Тюбинген, Германия), который модифицировали метками поли-A-tag и a poly-C-tag (A70-C30).
Пример 2
Транскрипция in vitro

Последовательности РНК на основе рекомбинатных плазмидных ДНК, полученных в примере 1, получали методом транскрипции in vitro. При этом рекомбинантную плазмидную ДНК линеаризовали и затем проводили транскрипцию in vitro с использованием Т7 РНК-полимеразы. Затем ДНК-матрицы расщепляли дезоксирибонуклеазой I, РНК выделяли при осаждении LiCl, затем очищали методом ЖХВР (PUREMessenger, фирмы CureVac GmbH, Тюбинген, Германия).
Пример 3
Образование комплексов с протамином
Для трансфекции РНК в клетки и организмы РНК, полученные методом транскрипции in vitro, предпочтительно переводили в форму комплексов, более предпочтительно в форму комплекса с протамином, при смешивании РНК с протамином.
Пример 4
Вакцинация
Для проведения вакцинации РНК, полученные методом транскрипции in vitro, как описано выше (см. пример 2), трансфектировали в организм мышей (мыши: С57 BL/6), предпочтительно в виде комплекса с протамином (см. пример 3). Трансфекцию проводили с использованием различных групп животных, каждая группа включала 5 мышей (С57 BL/6), которых иммунизировали композицией мРНК по изобретению, композицию вводили внутрикожно 8 раз в течение 3 недель, т.е. вводили смесь мРНК в виде комплексов с протамином, при этом РНК кодировала по меньшей мере два антигена, выбранных из hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивина, MAGE-C1 или MAGE-C2.
Пример 5
Детектирование антигенспецифичного иммунного ответа (В-клеточный иммунный ответ)
Детектирование антигенспецифичного иммунного ответа (В-клеточный иммунный ответ) проводили с использованием антигенспецифичных антител. Через одну неделю после последней вакцинации у вакцинированных мышей отбирали образцы крови и получали образцы сыворотки крови. Планшеты MaxiSorb (фирмы Nalgene Nunc International) покрывали белковым антигеном, который кодируется композицией мРНК (0,5 мкг/лунку). После блокирования поверхности лунок буферным раствором 1×ФСБ, содержащим 0,05% твин-20 и 1% БСА, в лунки добавляли разбавленные образцы мышиной сыворотки (1:30, 1:90, 1:270, 1:810) и планшеты инкубировали в соответствующих условиях. Затем добавляли биотинилированные вторичные антитела (антимышиные IgG2a, фирмы Pharmingen). После промывки в лунки планшета добавляли коньюгат пероксидазы хрена и стрептавидина и инкубировали в соответствующих условиях, затем оценивали уровень конверсии субстрата ABTS (2,2'-азидо-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты).
Пример 6
Детектирование антигенспецифичного клеточного иммунного ответа (Т-клеточный иммунный ответ) методом элиспот (ELISPOT)
2
3
3
Через две недели после последней вакцинации мышей умерщвляли, затем удаляли селезенку, из которой выделяли спленоциты. Спленоциты повторно стимулировали, при их инкубации в течение 7 сут в присутствии пептидов из указанных выше антигенов (пептидная библиотека) или в ходе совместного культивирования с дендритными клетками, полученными из костного мозга нативных сингенных мышей, в которые была перенесена РНК, кодирующая антиген, методом электропорации. После повторной стимуляции оценивали антигенспецифичный клеточный иммунный ответ по секреции γ-ИФ. Для детектирования γ-ИФ в лунки планшета Coat Multiscreen (фирмы Millipore) добавляли буферный раствор, предназначенный для нанесения покрытия (0,1 М карбонатный-бикарбонатный буферный раствор, рН 9,6 (10,59 г/л NaCO, 8,4 г/л NaHCO)), содержащий антитела против γ-ИФ (фирмы BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия), и инкубировали в течение ночи. Стимуляторы и эффекторные клетки добавляли в лунки планшета в соотношении 1:20 и совместно инкубировали в течение 24 ч. Планшет промывали 1×ФСБ, в лунки добавляли биотинилированные вторичные антитела и инкубировали в соответствующих условиях. После промывки 1×ФСБ/О,05% твин-20 в лунки планшета добавляли субстрат (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитро-голубой тетразолий, жидкая смесь субстратов фирмы Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия), конверсию субстрата оценивали визуально.
Пример 7
Прививка опухоли
Иммунизация
Через одну неделю после последней иммунизации мышам подкожно вводили клетки меланомы 1 Mio В16 или клетки TRAMP-C1. Через 2 недели (В16) или 7 недель (TRAMP-C1), соответственно, оценивали объем образовавшейся опухоли.
Пример 8
Получение мРНК вакцины
Конкретную активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению, включающую комбинацию различных антигенов, предназначенную для применения в качестве вакцины для лечения немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), получали как описано выше. Например, активную (иммуностимулирующую) композицию по изобретению, включающую 5 компонентов, каждый из которых содержал мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4, соответственно РНК SEQ ID №4, 19, 21, 24 и 26 (последовательности с повышенным содержанием GC)), получали в виде комплекса с протамином (массовое соотношение 4:1).
Вакцинация
Мышей C57BL/6 вакцинировали, при этом мышам внутрикожно вводили мРНК-вакцину, содержащую 5 компонентов, каждый из которых содержал мРНК, кодирующую один антиген, связанный с НМРЛ (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и 5Т4, соответственно РНК SEQ ID №4, 19, 21, 24 и 26 (последовательности с повышенным содержанием GC)), в виде комплекса с протамином (64 мкг антигена/цикл, разделенные на 4 инъекции/цикл). Контрольную вакцинацию проводили, используя соответствующие суммарные дозы РНК, кодирующей LacZ (контрольная мРНК lacZ). Вакцинация включала три цикла вакцинации (неделя 1, 3 и 5). Группы, число мышей и штаммы мышей приводятся в следующей таблице.
Группы
Штамм мышей
Число мышей
мРНК вакцина
C57BL/6
10
5 для проведения анализа методом Elispot и 5 для детектирования антител в сыворотке крови методом ИФА
Контрольная мРНК lacZ
C57BL/6
5
3 для проведения анализа методом Elispot и все 5 для детектирования антител в сыворотке крови методом ИФА
Детектирование антигенспецифичных антител
Через 6 сут после последней вакцинации из ретроорбитального синуса отбирали образцы крови (200 мкл), и сыворотку анализировали в отношении наличия антигенспецифичных антител, подтипы IgG1 и IgG2a, методом ИФА. Лунки 96-луночного планшета для ИФА покрывали рекомбинантным белком (10 мкг/мл в буферном растворе для нанесения покрытия, инкубировали при 37°С в течение 4 ч) и блокировали, используя блокирующий буферный раствор (200 мкл/лунка) в течение ночи при 4°С. Затем в лунках получали серийные разведения объединенной сыворотки (от каждой группы мышей) в диапазоне от 1:3 до 1:48 и планшеты инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. После инкубации со специфическими антителами (в блокирующем буферном растворе, 1:300) против IgG1 или IgG2a мыши и инкубации со вторичными антителами, меченными ПХ (в блокирующем буферном растворе, 1:500), добавляли субстрат ТМВ. Калориметрическую реакцию регистрировали при 450 нм на ридере для ИФА (фирмы Tecan Deutschland GmbH, Крайльсхайм, Германия).
Анализ методом элиспот (ELISPOT)
Для детектирования ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) уровень секреции эффекторного цитокина γ-ИФ в ответ на специфическое стимулирующее воздействие можно регистрировать визуально методом ELISPOT (порог чувствительности вплоть до одной клетки).
Через 6 сут после последней вакцинации из мышей, вакцинированных антигенсодержащей и контрольной вакциной, выделяли спленоциты, которые переносили в 96-луночные планшеты ELISPOT, на поверхность которых предварительно наносили анти-γ-ИФ антитела (10 мкг/мл). Затем клетки стимулировали в течение 24 ч при 37°С в присутствии пептида из библиотеки антигенных пептидов или библиотеки ВИЧ или растворителя для пептидов, ДМСО, в качестве контроля использовали клетки, которые инкубировали в чистой среде. Все библиотеки использовали в концентрации 1 мкг пептида/мл. После инкубации клетки вымывали из планшета и γ-ИФ, секретируемый клетками, детектировали при добавлении биотинилированных вторичных антител против γ-ИФ мыши (1 мкг/мл), а затем стрептавидина-AKP. Пятна регистрировали визуально с использованием субстрата BCIP/NBT, количество определяли на автоматическом ридере ELISPOT (фирмы Immunospot Analyzer, CTL Analyzers LLC).
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5.01 (фирмы GraphPad Software, Inc.). Все результаты выражали в виде среднего значения (или медианы) ± стандартное отклонение. Для анализов методом Elispot, в связи с тем, что базовая активация в значительной степени зависит от организма особи, базовую линию корректировали для каждой индивидуальной мыши, вычитая число пятен в лунках с культуральной средой из всех других значений. Двухфакторный анализ по критерию Манна-Уитни использовали для анализа различия между исследуемыми группами (с доверительным интервалом 5%).
Результаты и обсуждение
Мышей вакцинировали мРНК-вакциной, содержащей пять компонентов, как описано выше, прежде всего, мРНК с повышенным содержанием GC, кодирующие ассоциированные с НМРЛ антигены NY-ESO-1, MAGE-C2, MAGE-С1, сурвивин и 5Т4, (соответственно последовательности SEQ ID №4, 19, 21, 24 и 26 (последовательности с повышенным содержанием GC)), при этом каждую РНК использовали в форме комплекса катионный пептид/протамин (массовое соотношение 4:1). Контрольных мышей вакцинировали другим типом РНК, кодирующей LacZ, в форме комплекса с протамином (в аналогичном соотношении, как указано для мРНК-вакцины).
В экспериментах использовали сыворотку, полученную из крови мышей, вакцинированных антигенсодержащей вакциной, и контрольных мышей, при этом оценивали уровень выработки специфических антител против антигенов. Для трех из пяти исследованных белков, MAGE-C1, MAGE-C2 и NY-ESO-1, детектировали антигенспецифичные антитела в сыворотке мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, таким образом было установлено, что мРНК проявляют иммуногенные свойства in vivo. Белки, необходимые для детектирования антител, получали в клетках Е.coli. Так как продуцирование белков в клетках E.coli может влиять на пост-трансляционные модификации и они практически не описаны для использованных антигенов, отсутствие ответа на остальные белки можно объяснить этими явлениями.
Исследовали активацию цитотоксичных Т-клеток в ответ на введение мРНК-вакцины. γ-ИФ является основным медиатором ответов Th1 и секретируется активированными ЦТЛ. В связи с этим исследовали присутствие антигенспецифичных цитотоксичных Т-клеток в составе спленоцитов, полученных из вакцинированных мышей, анализ проводили методом ELISPOT. В качестве антигенов, стимулирующих спленоциты, использовали библиотеки рестрикционных пептидов. Поскольку отличающиеся эпитопы используемых антигенов человека для мышиного ГКГ (Н-2Kb и H-2Db в мышах C57BL/6) не известны, пришлось использовать гипотетический выбор пептидов, выбранных из пептидов, которые характеризуются потенциальной аффинностью, с использованием базы данных SYFPEITHI. Из пептидных библиотек (15-членные пептиды с перекрыванием в 11 аминокислотных остатков), включающих полноразмерные последовательности белков, отбирали 15-членные пептиды, содержащие гипотетически наиболее эффективные эпитопы, в результате было выбрано 18 пептидов. Однако выбранные пептиды могли необязательно содержать корректные эпитопы, и таким образом детектирование иммунных ответов с использованием таких наборов может привести к ложноотрицательным результатам. Тем не менее, при стимуляции двумя указанными библиотеками, полученными из NY-ESO-1 и 5Т4, наблюдается высокий уровень секреции γ-ИФ у спленоцитов, полученных из мышей, вакцинированных мРНК-вакциной, в отличие от спленоцитов, полученных из контрольных мышей, которых вакцинировали мРНК, кодирующей неродственную β-галоктозидазу. Ни один тип спленоцитов не реагировал на контрольную библиотеку ВИЧ-пептидов. Число γ-ИФ пятен, полученных при использовании спленоцитов, инкубируемых в "чистой" среде, соответствовало базовой активации свежевыделенных клеток. Так как базовая активация в значительной степени зависит от конкретной особи, коррекцию базовой линии проводили для каждого конкретного случая, при этом вычитали число пятен в лунках со средой из всех остальных величин.
Результаты указанных экспериментов приводятся на фиг.27-34.