СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ДЛЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
METHOD FOR SPERM CELL SELECTION FOR EXTRACORPOREAL FERTILISATION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно к лечению бесплодия, и может быть использовано для отбора сперматозоидов в методах вспомогательных репродуктивных технологий.
Уровень техники
Из уровня техники известен ряд способов секции сперматозоидов из эякулята для использования во вспомогательных репродуктивных технологиях.
В настоящее время основными методами секции сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения является центрифугация эякулята в градиенте плотности и метод всплытия (Lessley, В.А., & Gamer, D.L. (1983). Isolation of motile spermatozoa by density gradient centrifugation in Percoll. Gamete Research, 7(1), 49-61).
Первый метод основан на том, что при центрифугировании сперматозоиды с наибольшей плотностью оказываются в осадке. Эта технология позволяет выделять фракцию подвижных сперматозоидов, очищенную от семенной плазмы, лейкоцитов и клеточного дебриса. В то же время центрифугация может оказывать негативное воздействие на оплодотворяющую способность сперматозоидов (Sills, E.S., Wittkowski, K.М., Tucker, M.J., Perloe, M., Kaplan, С.R., & Palermo, G.D. (2002). Comparison of centrifugation-and noncentrifugation-based techniques for recovery of motile human sperm in assisted reproduction. Systems Biology in Reproductive Medicine, 48(2), 141-145; Mahfouz, R.Z., du Plessis, S.S., Aziz, N., Sharma, R., Sabanegh, E., & Agarwal, A. (2010). Sperm viability, apoptosis, and intracellular reactive oxygen species levels in human spermatozoa before and after induction of oxidative stress. Fertility and sterility, 93(3), 814-821). Кроме того, не доказана связь плотности сперматозоидов с их оплодотворяющей способностью. Также, для реализации данного способа требуется дорогостоящее оборудование и реактивы.
Второй метод селекции - метод всплытия - основан на отборе сперматозоидов, которые переместились в культуральную среду, наслоенную на эякулят в пробирке. Данный метод также позволяет отбирать фракцию подвижных сперматозоидов. Тем не менее, к недостаткам этого способа можно отнести его малую эффективность при обработке спермы с низкими значениями концентрации и подвижности сперматозоидов. Также при селекции сперматозоидов методом всплытия возможно повреждение ДНК сперматозоидов реактивными формами кислорода (Mortimer, D. (2000). Sperm preparation methods. Journal of andrology, 21(3), 357-366). Источниками реактивных форм кислорода являются лейкоциты, мертвые сперматозоиды, а также клеточный дебрис.
2
2
Наиболее близким к заявляемому является способ отбора сперматозоидов, описанный Такеда и др., основанный на применении цервикальной слизи пациентки (Takeda, N., Yoshii, N., Hoshino, Y., Tanemura, K., Sato, E., & Odawara, Y. (2012). A New Human Spermatozoon Selection Method Based on Penetration of Cervical Mucus for Intracytoplasmic Sperm Injection. Journal of Mammalian Ova Research, 29(1), 65-74). Авторы предлагают размещать капли эякулята и культуральной среды на дне стеклянной чашки Петри. Между каплями размещается цервикальная слизь. Систему накрывают покровным стеклом, после чего на границе чашка - покровное стекло помещают дополнительную каплю культуральной среды, в которую должны проникать сперматозоиды. Чашка с каплями инкубируется в инкубаторе с 5% CO, 5% O, 37°C и влажностью 95% в течение 30-90 минут.
Однако использование цервикальной слизи имеет ряд недостатков. Во-первых, цервикальная слизь не обладает постоянной вязкостью в течение менструального цикла (Clift, A.F., & Hart, J. (1953). Variations in the apparent viscosity of human cervical mucus. The Journal of Physiology, 122(2), 358-365). Вязкость цервикальной слизи может варьироваться от 100 мПа·с до 10 Па·с, что является критичным для реализации этой технологии. Цервикальная слизь не подлежит замораживанию и достаточно быстро теряет свои свойства после аспирации из репродуктивного тракта пациентки (Kočevar-Nared, J., Kristl, J., & Šmid-Korbar, J. (1997). Comparative rheological investigation of crude gastric mucin and natural gastric mucus. Biomaterials, 18(9), 677-681). Во-вторых, извлечение цервикальной слизи также сопряжено с трудностями и рисками для пациента, поскольку данная жидкость находится в узком канале шейки матки, размеры которой в среднем 35 мм в длину и 5 мм в ширину. В-третьих, авторы в своей статье детально не описывают свою технологию и не показывают эффективность применения своей методики для отбора сперматозоидов по сравнению с существующими способами.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является создание технологии (способа), позволяющей отбирать сперматозоиды, обладающие наибольшей оплодотворяющей способностью для экстракорпорального оплодотворения.
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является повышение качества отбора сперматозоидов, обладающих наибольшей оплодотворяющей способностью для экстракорпорального оплодотворения.
Таким образом, имеется возможность повысить процент оплодотворения ооцитов, повысить качество эмбрионов и повысить процент наступления беременности.
Поставленная задача решается тем, что способ селекции сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения включает размещение в чашке капли спермы и капли культуральной среды на расстоянии друг от друга не более 5 см, и соединение капель полосой из вязкой среды с параметрами вязкости 1-4 Па·с с последующим инкубированием чашки с содержимым в течение 30-90 мин в условиях, моделирующих естественную среду цервикального канала женского репродуктивного тракта, после чего с поверхности чашки собирают культуральную среду со сперматозоидами, прошедшими через вязкую среду для последующего использования в экстракорпоральном оплодотворении, при этом перед размещением в чашке культуральную среду и вязкую среду инкубируют до достижения значений pH из диапазона 7.2-7.6.
2
2
Наилучший результат достигается при использовании вязкой среды с параметрами вязкости 1.5-2.5 Па·с, выполнении полосы из вязкой среды длиной 35 мм и шириной 5 мм с допустимой величиной погрешности ±2 мм. При этом в качестве чашки может быть использована чашка Петри диаметром 35 мм, при этом капли спермы и культуральной среды в чашке Петри располагают с диаметрально противоположных сторон. В качестве вязкой среды используют смесь из метилцеллюлозы и культуральной среды с получением раствора с конечной вязкостью, характеризующегося значением из интервала 1-4 Па·с. Сперму, вязкую жидкость и культуральную среду берут в количестве от 50 до 200 мкл соответственно. Наилучший результат достигается при использовании культуральной среды и спермы в равных объемах. В качестве культуральной среды может быть использована среда марки Quinn′s Advantage Fertilization HTF Universal Medium или любая другая среда, содержащая питательные элементы для поддержания жизнеспособности биологических клеток и моделирующая состав сред внутри женского репродуктивного тракта. Инкубирование чашки с содержимым и культуральной среды перед размещением ее в чашке осуществляют в течение 30-90 минут в 5% CO, при температуре 37°C и влажности 95%, в частности в течение 60 минут. Инкубирование вязкой среды перед размещением в чашке осуществляют в течение 5-7 часов в аналогичных условиях - 5% CO, при температуре 37°C и влажности 95%.
Т.о. селекцию сперматозоидов осуществляют посредством системы, содержащей вязкую среду, которая является непреодолимым барьером для малоподвижных и морфологически аномальных сперматозоидов, и культуральной среды с физиологическими условиями, в которую попадают сперматозоиды, прошедшие вязкую среду.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена Фотография чашки Петри с каплями эякулята (1), культуральной среды (3), расположенными по периферии чашки Петри и соединенными линией (полосой) из вязкой среды (2). Сперматозоиды, преодолевшие линию вязкой среды, оказываются в капле с культуральной средой и могут быть использованы в экстракорпоральном оплодотворении.
На фиг.2 представлен график зависимости концентрация сперматозоидов, отобранных предлагаемым методом, от концентрации сперматозоидов в сперме при нормозооспермии. Вертикальные полосы показывают стандартное отклонение от среднего значения, измеренного в эксперименте. Число образцов: 20 шт.
На фиг.3 представлен график зависимости концентрации сперматозоидов, отобранных предлагаемым методом, от концентрации сперматозоидов при сниженных параметрах спермы. Вертикальные полосы показывают стандартное отклонение от среднего значения, измеренного в эксперименте. Число образцов: 20 шт.
На фиг.4 представлена диаграмма распределений средних значений амплитуды колебаний головы сперматозоидов в сперме и во фракциях, отобранных методом вязкой среды и методом всплытия. Амплитуда колебаний головы сперматозоидов, отобранных методом вязкой среды, статистически больше (P<0.01) амплитуды колебаний головы сперматозоидов, отобранных методом всплытия. Число образцов: 23 шт.
На фиг.5 представлена диаграмма значений индекса тератозооспермии сперматозоидов в сперме, сперматозоидах, отобранных методом вязкой среды и методом всплытия. Индекс тератозооспермии сперматозоидов, отобранных методом вязкой среды статистически меньше (P<0.01), чем индекс тератозооспермии сперматозоидов, отобранных методом всплытия. Число образцов: 20 шт.
На фиг.6 представлена диаграмма отношений сигналов на длине волны 340 нм и 380 нм, характеризующая реакцию на прогестерон сперматозоидов, селектированных методом всплытия и методом вязкой среды. Статистически значимой разницы между двумя группами сперматозоидов не выявлено (P=0.31). Вертикальные полосы показывают стандартную ошибку измерений. Число образцов: 12 шт.
На фиг.7 представлена диаграмма, характеризующая процент связанных с гиалуроновой кислотой сперматозоидов в сперме, сперматозоидах, отобранных методами вязкой среды и всплытия. Фракция сперматозоидов, отобранных методом вязкой среды, имеет больший процент сперматозоидов, способных связаться с гиалуроновой кислотой, чем фракция сперматозоидов, отобранных методом всплытия (P<0.01). Вертикальные полосы показывают стандартное отклонение от среднего значения, измеренного в эксперименте. Число образцов: 20 шт.
Осуществление изобретения
2
Для осуществления селекции сперматозоидов предлагаемым методом необходимы следующие компоненты: пластиковая чашка Петри, вязкая среда, культуральная среда, инкубатор с возможностью задавать температуру, концентрацию CO и влажность, автоматическая пипетка. На фиг.1 представлены фотография и схема, поясняющие заявляемый способ. В частности, представлены изображения чашки Петри, в которой размещены капля эякулята (1), капля культуральной среды (3), и которые соединены между собой линией (полосой) из вязкой среды (2).
Метод реализуется следующим образом.
Линией из вязкой среды соединяют капли эякулята и культуральной среды, которые располагают на противоположных концах чашки Петри. Состав вязкой среды подобран таким образом, что данная среда приближена к составу и вязкости к цервикальной слизи в середине менструального цикла, когда происходит овуляция и вероятность наступления беременности in vivo наиболее высока. Вязкость данной среды составляет 1-4 Па·с.
При этом в наилучшем варианте исполнения длина линии вязкой среды соответствует средней длине шейки матки (примерно 35 мм). В оптимальном варианте выполнения способа соотношение объемов эякулята и вязкой среды составляет 1:1. Это соотношение также может составлять 2:1 или 1:2. При высокой разнице в вязкостях эякулята (~0.9 мПа·с), вязкой жидкости (1-4 Па·с) и культуральной среды (1 мПа·с) скорость диффузии между этими тремя видами сред очень низкая. Таким образом, сперматозоиды могут попасть в каплю с культуральной средой только лишь за счет собственной подвижности.
2
Чашка помещается в CO инкубатор. Часть сперматозоидов, способных преодолеть полосу из вязкой среды, оказывается в капле со средой. Сперматозоиды, оказавшиеся в капле с культуральной средой, можно извлечь пипеткой и использовать для оплодотворения ооцитов методами ЭКО, в т.ч. ИКСИ.
В качестве культуральной среды может быть использована бикарбонатная среда для оплодотворения ооцитов и культивации эмбрионов, которая доступна в коммерческой продаже. Также возможно приготовление этой среды с использованием следующих компонентов (табл.1).
Таблица 1
Компоненты культуральной среды
Компонент
Концентрация, ммоль
NaCl
97.8
KCl
4.69
NaHCO<sub>3</sub>
25
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.2
Глюкоза
2.7
CaCl<sub>2</sub>
2.04
Na pyruvate
0.33
Na lactate
21.4
BSA
0.3%
Допускается также создание культуральной среды на основе следующих компонентов (табл.2)
Таблица 2
Допустимые концентрации компонентов культуральных сред
Компонент
Среда 1, ммоль
Среда 2, ммоль
Среда 3, ммоль
NaCl
106
95
97.8
KCl
4.69
4.6
4.69
Na<sub>2</sub>PHO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
1.48
-
-
NaHCO<sub>3</sub>
10
25
4
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.2
1.2
0.2
Глюкоза
5.55
5.6
2.78
CaCl<sub>2</sub>
-
1.7
2.04
Na pyruvate
1
0.27
0.33
Na lactate
-
44
21.4
BSA
3%
0.3%
0.3%
Перечисленные примеры составов используемых культуральных сред не ограничивают настоящее изобретение. Возможно применение в заявляемой технологии культуральных сред с другим набором компонентов, обеспечивающим поддержание жизнеспособности биологических клеток.
2
После приготовления культуральной среды ее необходимо поместить в инкубатор с 5% CO, температурой 37°C на 30-90 минут до использования в предлагаемом методе для калибрации pH.
2
Для приготовления вязкой среды с вязкостью 2 Па·с может быть использована метилцеллюлоза (рекомендуется М0512, Sigma Aldrich, Великобритания), которую добавляют к культуральной среде в количестве 10 мг метилцеллюлозы на 1 мл культуральной среды (с получением 1% концентрации). После добавления метилцеллюлозы раствор перемешивают с помощью лабораторной мешалки в течение 2 часов, после чего помещают в холодильник и хранят 8-14 часов для полного растворения метилцеллюлозы. Перед использованием вязкой среды ее также помещают в инкубатор с 5% CO, температурой 37°C на 5-7 часов для калибрации pH.
После получения эякулята необходимо оценить концентрацию и подвижность сперматозоидов. Эксперименты показали, что при нормозооспермии, когда концентрация сперматозоидов превышает 15 М/мл, процент подвижных сперматозоидов больше 40%, и в среднем около 9% сперматозоидов могут преодолеть вязкую среду и оказаться в капле с культуральной средой (фиг.2). При сниженной концентрации и подвижности сперматозоидов в сперме до 7% способны преодолеть вязкий барьер (фиг.3).
При оплодотворении методом ИКСИ, когда количество сперматозоидов равно количеству зрелых ооцитов, полученных у пациента, достаточно приготовить только одну чашку, разместив 100 мкл эякулята, 100 мкл вязкой среды и 100 мкл культуральной среды вышеописанным способом. Даже при концентрации сперматозоидов 1 М/мл и проценте подвижных менее 40% найдется определенное количество (до нескольких тысяч) сперматозоидов, которые смогут преодолеть вязкую среду. Данного количества сперматозоидов достаточно для использования в ИКСИ.
При оплодотворении методом ЭКО необходимо руководствоваться результатами экспериментов для оценки количества чашек. Например, при концентрации сперматозоидов в сперме 50 М/мл, с помощью данного метода и одной чашки можно отобрать до 500 тыс. сперматозоидов. Таким образом, исходя из расчета 100 тыс. сперматозоидов на одну яйцеклетку, отобранной фракцией сперматозоидов можно оплодотворить до 5 яйцеклеток.
Эффективность предлагаемого метода была подтверждена экспериментально. В частности, был проведен ряд экспериментов по оценке характеристик сперматозоидов, селектированных заявляемым методом (методом вязкой среды). В качестве контрольной группы были выбраны сперматозоиды, отобранные методом всплытия. Исследовались характеристики сперматозоидов, которые имеют корреляцию с их оплодотворяющей способностью. Это такие характеристики, как: подвижность, морфология, реакция на прогестерон, связывание с гиалуроновой кислотой. В процессе экспериментов было показано, что сперматозоиды, отобранные предлагаемым способом, по ряду характеристик лучше, чем сперматозоиды из контрольной группы.
В частности, с помощью компьютерного анализа подвижности сперматозоидов было определено, что сперматозоиды, отобранные методом вязкой среды, обладают большей амплитудой колебаний головки при движении (см. фиг.4). Известно, что данная характеристика влияет на эффективность сперматозоида проникать через вязкую среду цервикальной слизи, а также через клетки куммулюса и блестящей оболочки, окружающей ооцит (Barratt, C.L.R., Tomlinson, M.J. and Cooke, I.D. (1993) Prognostic significance of computerized motility analysis for in vivo fertility. Fertil. Steril., 60, 520-525; Krause, W. (1995). Computer-assisted semen analysis systems: comparison with routine evaluation and prognostic value in male fertility and assisted reproduction. Human Reproduction, 10 (suppl 1), 60-66). Сперматозоиды с большей амплитудой способны эффективнее преодолевать вышеописанные барьеры и оплодотворять ооцит.
Морфология сперматозоидов оценивалась с помощью индекса тератозооспермии, который рассчитывается по формуле: общее количество дефектов/количество сперматозоидов с дефектами. Общее количество дефектов является суммой дефектов в головке, средней части, хвосте сперматозоида и наличие цитоплазматической капли. Данный индекс характеризует среднее количество патологий на один аномальный сперматозоид.
Было определено, что сперматозоиды, отобранные методом вязкой среды, имеют меньшее значение индекса тератозооспермии, а следовательно, меньше дефектов, чем сперматозоиды, отобранные методом всплытия (фиг.5).
Реакция сперматозоидов на прогестерон также является характеристикой, которая коррелирует с их оплодотворяющей способностью. Прогестерон, который присутствует в клетках куммулюса, окружающие ооцит, повышает уровень внутриклеточного кальция за счет активации катионных каналов (Lishko, Р.V., Botchkina, I.L., & Kirichok, Y. (2011). Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature, 471(7338), 387-391). Была определена положительная корреляция между увеличением внутриклеточного кальция после добавления данного гормона во фракцию со сперматозоидами и их оплодотворяющей способностью (Krausz, С., Bonaccorsi, L., Luconi, M., Fuzzi, В., Criscuoli, L., Pellegrini, S., Forti, G., & Baldi, E. (1995). Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction, 10(1), 120-124; Alasmari, W., Barratt, C.L., Publicover, S.J., Whalley, K.M., Foster, E., Kay, V., da Silva, S.M., & Oxenham, S.K. (2013). The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction, 28(4), 866-876). Реакция сперматозоидов на прогестерон измерялась флуоресцентным методом, с помощью прибора FLUOstar Omega. После обработки сперматозоидов методом всплытия и методом вязкой среды во фракции добавлялся краситель Fura2, который связывается с внутриклеточными ионами кальция. Прибор детектирует сигналы на длинах волн 340 нм и 380 нм. Источником излучения на длине волны 380 нм являются свободные молекулы Fura2. Источником излучения на длине волны 340 нм являются молекулы Fura2, связанные с внутриклеточными ионами кальция. При добавлении прогестерона во фракцию сперматозоидов данный гормон активирует катионные каналы и увеличивает поток ионов кальция из среды внутрь клетки. Таким образом, детектируется увеличение сигнала на длине волны 340 нм и уменьшение сигнала на длине волны 380 нм. Отношение сигналов до и после инъекции прогестерона показывает реакцию сперматозоидов на данный гормон. По результатам экспериментов не было выявлено статистически значимой разницы (P=0.31) в реакции на прогестерон между контрольной и изучаемой группами. Реакция сперматозоидов на прогестерон приведена на фиг.6.
С помощью стекол с нанесенным слоем гиалуроновой кислоты оценивался процент сперматозоидов, способных связаться с данной кислотой. Хотя эта характеристика до сих пор вызывает споры, было показано, что сперматозоиды, способные связаться с гиалуроновой кислотой, могут обладать меньшим процентом дефектов в хромосомном наборе и повреждении ДНК, чем сперматозоиды, которые не способны связаться с гиалуроновой кислотой (Ryu, Н.M., Lin, W.W., Lamb, D.J., Chuang, W., Lipshultz, L.I., & Bischoff, F.Z. (2001). Increased chromosome X, Y, and 18 nondisjunction in sperm from infertile patients that were identified as normal by strict morphology: implication for intracytoplasmic sperm injection. Fertility and sterility, 76(5), 879-883; Sun, F., Ко, E., & Martin, R.H. (2006). Is there a relationship between sperm chromosome abnormalities and sperm morphology. Reprod Biol Endocrinol, 4(1)). Было определено, что фракция сперматозоидов, отобранных методом вязкой среды, имеет больший процент сперматозоидов, способных связаться с гиалуроновой кислотой, чем сперматозоиды, отобранные методом всплытия (фиг.7).