Разработка алгоритма идентификации культур возбудителя бруцеллеза методом MALDI-TOF масс-спектрометрии

УДК 616.98:579.841.93

Д.В.Ульшина, Д.А.Ковалев, О.В.Бобрышева, Г.И.Лямкин, А.А.Худолеев, Ю.В.Сирица, А.Н.Куличенко

разработка алгоритма идентификации культур возбудителя бруцеллеза методом maldi-tof масс-спектрометрии

ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт», Ставрополь,

Российская Федерация

В работе приведены результаты прямого белкового профилирования коллекции штаммов бруцелл с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS). Стандартизована методика обеззараживания культур возбудителя бруцеллеза и последующего анализа при использовании MALDI-TOF MS. Получены 59 репрезентативных белковых профилей представителей шести основных видов бруцелл (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae), которые включены в электронную базу данных масс-спектров в среде программы Biotyper v 3.0 (Bruker Daltonics, Германия). При анализе масс-спектров исследованных штаммов бруцелл выявлены 17 родоспецифичных фрагментов в диапазоне масс 2000-20000 Да, совокупность которых в MALDI-TOF масс-спектрах может использоваться при идентификации Brucella spp. В работе также описаны фрагменты, специфичные для отдельных видов и штаммов бруцелл, представляющие интерес в качестве маркеров для внутривидовой дифференциации возбудителя. На основании полученных данных разработан стандартизированный алгоритм идентификации и дифференциации культур возбудителя бруцеллеза методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Ключевые слова: масс-спектрометрия, белковое профилирование, возбудитель бруцеллеза.

D.V.Ul'shina, D.A.Kovalev, O.V.Bobrysheva, G.I.Lyamkin, A.A.Khudoleev, Yu.V.Siritsa, A.N.Kulichenko

Development of Algorithm for Identification of Brucellosis Agent Cultures Using MALDI-TOF Mass-Spectrometry

Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol, Russian Federation

Given are the results of direct protein profiling of brucella strain collection using matrix laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS). Standardized is the method for brucellosis agent culture disinfection and subsequent assessment. Obtained are 59 representative protein profiles of six major species (B. melitensis, B. abortus, B. canis, B. ovis, B. neotomae), which are included into electronic database of mass-spectra, integrated in Biotyper v 3.0 software (Bruker Daltonics, Germany). Analysis of mass-spectra of brucella strains under investigation revealed 17 genus-specific fragments within the mass range of 200020000 Da, the combination of which can be used for Brucella spp. identification. In addition, described are the fragments, specific for certain brucella species and strains, promising as markers for intraspecific differentiation. Based on the data received developed is a standardized algorithm of identification and differentiation of brucellosis agent cultures applying MALDI-TOF mass spectrometry.

Key words: mass-spectrometry, protein profiling, brucellosis agent.

Материалы и методы

Штаммы бруцелл, питательные среды, реактивы. В работе использовали 59 культур бруцелл шести видов (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae) из коллекции микроорганизмов Ставропольского противочумного института, в том числе 11 референсных штаммов: B. abortus 19 BA (вакцинный), B. abortus 544 (1 биовар, рефе-ренсный), B. abortus 1552, B. abortus 870 (6 биовар, референсный), B. abortus C-68 (9 биовар, референс-ный), B. abortus 63-75 (7 биовар, референсный), B. abortus B-3196 (5 биовар, референсный), B. abortus Tulya (3 биовар, референсный), B. abortus C-548 (6 биовар), B. abortus C-549 (6 биовар), B. abortus C-550 (3 биовар), B. abortus 19 (1 биовар), B. abortus C-497, B. abortus C-551 (3 биовар), B. abortus С-499 (3 биовар), B. melitensis 16-M (1 биовар, референсный), B. melitensis 63/9 (2 биовар), B. melitensis 548 (1 биовар), B. melitensis C-554 (3 биовар), B. melitensis Rev-1 (1 биовар, вакцинный), B. melitensis C-555 (3 биовар), B. melitensis C-556 (1 биовар), B. meliten-

sis C-557 (1 биовар), B. melitensis C-558 (3 биовар), B. melitensis C-559 (1 биовар), B. melitensis Ether 706 (3 биовар, референсный), B. melitensis C-560, B. melitensis C-561, B. melitensis C-562, (3 биовар), B. ovis 707, B. suis 61, B. suis 513, B. suis 1330 (1 биовар, референсный), B. suis Thomsen (2 биовар, референсный), B. suis 40, B. suis 686 (3 биовар, референсный), B. suis 484, B. suis 539, B. suis 513, B. suis S-705, B. suis 68-86, B. suis 68 (4 биовар), B. suis 323 (4 био-вар), B. suis 324, B. canis 6/66, B. canis 1066 (1 биовар), B. canis H-966, B. neotomae 65/198, B. neotomae 65/196, B. neotomae 325 (1 биовар), B. neotomae 66/2 (1 биовар), B. neotomae 5K33, B. suis И-72, B. suis 2-1/20-2, B. suis И-299, B. suis И-200, B. ovis 712, B. ovis C-440 (№ 6), B. ovis 722; воду ультрачистую (тип I по ASTM) (система Millipore, США), спирт этиловый 96 % (ГОСТ Р 51723-2001), кислоту муравьиную, ~ 98 % (Sigma-Aldrich, США), ацетонитрил (степень чистоты «для ВЭЖХ-МС») (Sigma-Aldrich, США), а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (степень чистоты для масс-спектрометрии) (Sigma-Aldrich, США), трифторуксусную кислоту, > 99 %

(Sigma-Aldrich, США), бактериальный тест-стандарт MBT для внутренней калибровки масс-спектрометра (Bruker Daltonics, Германия). Культуры выращивали на агаре Альбими (рН 7,2, прочность 300-380 г по Валенту, содержание аминного азота 100-120 мг %).

Обеззараживание. В качестве объектов исследования использовали культуры 59 штаммов бруцеллеза шести основных патогенных видов (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae). Пробоподготовку и обеззараживание образцов выполняли по методике, описанной ранее F.Lista et al. [4]. Инактивированные образцы возбудителя бруцеллеза ресуспендировали в 100 мкл 70 % муравьиной кислоты и 100 мкл ацетонитрила с последующим осаждением центрифугированием в течение 4 мин при 14000 об/мин при температуре 10 °С. Приготовленные белковые экстракты вносили в ячейки стального планшета для MALDI-TOF масс-спектрометрии (Bruker Daltonics, германия) в объеме 1 мкл. Планшет сушили на открытом воздухе в течение нескольких минут с последующим нанесением поверх раствора матрицы, состоящего из а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в растворе, содержащем 500 мкл ацетонитрила, 475 мкл ультрачистой воды и 25 мкл трифторуксусной кислоты. Плашку высушивали на воздухе до образования кристаллов в течение 5 мин.

Получение масс-спектров. Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) при следующих параметрах: частота лазера 60 Гц, интенсивность лазера 10-50 %, время задержки экстракции 110 нс PIE, напряжение первого источника ионов 19,4 kV, второго - 17,3 kV, напряжение фокусирующей линзы - 8 kV, напряжение линейного детектора - 2,500 kV, диапазон масс - 2000-20000 Да. суммарный масс-спектр генерировали из 22 слу-

чайно выбранных позиций каждой капли мишени (всего по 4000 выстрелов лазера). Для управления масс-спектрометром использовали программный пакет Daltonics flexControl v 3.3.64 (Bruker Daltonics, Германия), для предварительной оценки интенсивности и разрешения пиков в спектре - flexAnalysis v 3.3.65. Визуализацию и анализ полученных масс-спектров осуществляли в программе mMass v 5.5.0 (http://www.mmass.org/).

Статистическая обработка данных. Для математико-статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica v 10.0 (Statsoft Inc., США). Экспериментальные данные представлены в виде среднего значения (M) ± стандартное отклонение (SD). Анализ групповых различий оценивали по t-критерию Стьюдента для несвязанных выборок при 95 % уровне значимости. Различия между выборками считали достоверными при p <0,05.

Результаты и обсуждение

Нами разработан протокол MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа образцов бруцелл, включающий пробоподготовку и параметры формирования масс-спектров, который был апробирован с использованием вирулентного штамма B. melitensis 548. Типичный масс-спектр образца, содержащего инактивированную в стандартизированных условиях культуру возбудителя бруцеллеза, представлен на рисунке.

воспроизводимость масс-профилей отдельных образцов культур бруцелл была подтверждена серией повторных измерений. При проведении масс-спектрометрического анализа проб, хранившихся до 3 сут при температуре -76 °С, изменений основных характеристик сигналов масс-спектров не выявле-

Типичный MALDI-TOF масс-спектр образца Brucella abortus 1552

но. Полученные данные белкового профилирования штаммов возбудителя бруцеллеза согласуются с результатами более ранних работ [4].

Один из ключевых факторов обеспечения достоверности результата анализа методом MALDI-TOF MS - качество масс-спектров. На основании полученных экспериментальных данных нами были определены следующие критерии качества полученных данных: разрешение пиков масс-спектра, соотношение сигнал/шум, общее число идентифицированных пиков в пик-листе, их интенсивность и диапазон значений m/z, регистрируемых в ходе анализа.

Из литературных источников [2, 3] известно, что при сравнительном анализе идентичных фрагментов в целевой области полученных масс-спектрометрических данных наблюдается дрейф -отклонение по величине m/Z. Основные причины отклонения гомологичных сигналов могут быть связаны с калибровкой прибора (аппаратный дрейф) и с изменениями, появившимися в ходе субкультивирования и роста культуры (морфологический дрейф).

непостоянство изотопного состава белков клеток бактерий может служить причиной увеличения дрейфа сигнала до нескольких дальтон. При анализе полученных масс-спектров возбудителя бруцеллеза для диапазона измерений от 2000 до 20000 Да были отмечены различные отклонения по величине m/Z. Минимальные отклонения от среднего значения масс-ионов зафиксированы в начале установленной зоны в интервале 2000-5000 Да (до ±5 Да), максимальный дрейф значений m/Z зарегистрирован для конечной области рабочего диапазона (до ±20 Да).

В результате проведенного анализа полученных пик-листов были определены следующие оптимальные значения характеристик валидного масс-спектра при анализе образцов, содержащих культуры возбудителя бруцеллеза: абсолютная интенсивность пиков I > 500, разрешение R > 150, общее число идентифицированных пиков от 65 до 100, отношение сигнал/шум - 15.

нами были отобраны характеристические спектры инактивированных образцов бруцелл для последующего включения в базу данных в среде программы Biotyper v 3.0 (Bruker Daltonics, Германия). Полученные данные проанализированы и сопоставлены с масс-спектрами из электронной библиотеки Bruker Daltonics.

При интерпретации результатов идентификации и дифференциации микроорганизмов с помощью MALDI-TOF MS в среде программы Biotyper часто возникают затруднения, связанные, в первую очередь, с отсутствием в базе данных информации о штаммах возбудителей инфекций, в том числе циркулирующих на территории России, а также сложностью однозначной трактовки конкретных значений Score. В связи с этим следует отметить, что для проведения точной идентификации и типирования возбудителя бруцеллеза методом масс-спектрометрии с помощью программы Biotyper необходимо формиро-

вание представительной базы данных, содержащей масс-спектры высокого качества, полученные в стандартизированных условиях.

Анализ полученных спектров в базе данных Biotyper DB v 3.1.2 показал низкие значения Score (менее 1,397) для всех штаммов возбудителя бруцеллеза относительно других микроорганизмов (общее количество включает более 4600 штаммов (2185 видов, 364 родов) бактерий, микобактерий и др.), на основании чего был сделан вывод о высокой специфичности исследуемых белковых профилей. С другой стороны, сравнение коллекции масс-спектров штаммов бруцелл между собой подтвердило высокую степень родства изучаемых бактерий (Score в интервале 1,946-2,845). Наблюдаемые незначительные различия качественного состава масс-спектров исследуемых бруцелл подтверждают известные факты о консервативности рибосомальных белков микроорганизмов [1], в том числе рода Brucella.

На всех изученных спектрах установлено наличие 17 идентичных сигналов, отличающихся по интенсивности (m/z (±5 Да): 2422, 2581, 3025, 3268, 3336, 3523, 3696, 3754, 5036, 4545, 4770, 5170, 5360, 6672, 7048, 9085, 16068).

Кроме того, в пик-листах характеристичных масс-спектров исследованных штаммов было установлено наличие общих (групповых) фрагментов для штаммов B. abortus, B. melitensis, B. suis (m/z (±5 Да)): 2245, 2253, 2286, 2455, 3408, 3825, 4066, 4407, 4498, 5537, 6030, 6215, 6745, 6945, 7650, 8110, 8667, 8810, 10073, 10317.

Масс-спектры большинства исследуемых штаммов содержали фрагменты, специфичные для представителей двух видов бруцелл. В частности, для представителей видов B. melitensis и B. сanis были отмечены следующие общие фрагменты (m/z (±5 Да)): 2328, 2410, 2756; B. melitensis и B. suis (m/z (±5 Да)): 2554, 2680, 4372, 4960, 5230, 5555, 5810, 5840, 6443, 7720, 7848, 9426, 9516, 9647; B. abortus и B. neotomae (m/z (±5 Да)): 2300, 2387, 2961, 3749, 4107, 4515, 5920, 5940; B. suis и B. ovis (m/z (±5 Да)): 2266, 2712, 2862, 2918, 3125, 3300, 3320, 4007, 4440, 4871, 5132, 5631.

Наряду с существующей высокой стабильностью родо- и видоспецифичных групп фрагментов, масс-спектры возбудителя бруцеллеза, в ряде случаев (до 30 % исследованных штаммов), содержат значительное количество штаммоспецифичных сигналов, анализ которых позволяет проводить идентификацию патогена до уровня штамма при наличии комплекса родоспецифичных маркеров. Количество уникальных фрагментов в отдельных масс-спектрах варьировало от 1 (B. abortus 870) до 10 (B. melitensis C-561).

Полученные в результате проведенного исследования данные послужили основанием для разработки алгоритма идентификации возбудителя бруцеллеза с использованием MALDI-TOF MS. Алгоритм включает следующие этапы:

- культивирование микроорганизма на агаре Альбими с соответствующими параметрами в тече-

ние 48 ч;

- обеззараживание образца и пробоподготовка в стандартизированных условиях: одну бактериологическую петлю 48-часовой культуры микроорганизма, выращенной на агаре Альбими, эмульгируют в 300 мкл ультрачистой воды; к полученной суспензии добавляют 900 мкл спирта этилового 96 % и перемешивают, смесь инкубируют при температуре 30 °С в течение 90 мин; после проведенной инактивации образец суспензии дважды центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин, супернатант отбрасывают (дальнейшие исследования проводятся, как с обеззараженным материалом);

- белковая экстракция с использованием муравьиной кислоты: образец ресуспендируют в 100 мкл кислоты муравьиной 70 % и 100 мкл ацетонитрила с последующим осаждением центрифугированием в течение 4 мин при 14000 об/мин при температуре 10 °С; супернатант используют для проведения масс-спектрометрического анализа;

- регистрация суммарного масс-спектра образца на масс-спектрометре МюгоАех (Вгикег Daltonics, США);

- оценка качества масс-спектра образца на основании анализа значений абсолютной интенсивности (I), разрешения общего числа идентифицированных пиков, отношения сигнал/шум в программе Вгикег Daltonics АехСоП;го1 (или аналогичной);

- анализ пик-листа полученного масс-спектра образца с целью выявления совокупности родо-специфичных фрагментов в интервале масс 200020000 Да;

- поиск видо- и штаммоспецифичных фрагментов в интервале масс 2000-20000 да в случае обнаружения комплекса родоспецифичных фрагментов;

- заключение о результатах идентификации исследуемого микроорганизма.

Таким образом, в настоящее время внедрение MALDI-TOF масс-спектрометрии в систему экспресс-идентификации патогенных микроорганизмов представляет актуальную задачу лабораторной диагностики особо опасных инфекций, требующую разработки стандартизированных подходов к пробоподготовке, формированию и оценке масс-спектров, интерпретации полученных результатов, а также подготовки соответствующего нормативно-методического документа, регламентирующего проведение всех этапов масс-спектрометрического анализа.

В результате проведенных исследований были оптимизированы и стандартизированы параметры

анализа культур возбудителя бруцеллеза методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, определены критерии качества масс-спектров, в среде программы В^урег V 3.0 сформирована база характерных (эталонных) масс-спектров для 59 культур возбудителя бруцеллеза из коллекции ставропольскиого противочумного институат.

Семейство ВгисеНасеае включает 6 близких в эволюционном отношении родов микроорганизмов. в связи с этим также представляет интерес сравнительный масс-спектрометрический анализ образцов, содержащих бактерии семейства ВгисеНасеае, с целью уточнения дискриминирующей способности метода.

Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. М. Мир; 1993. Т. 2. 415 с.

2. Wilkins C.L., Lay J.O. Identification of microorganisms by mass spectrometry. Wiley-Blackwell; 2006. 376 p.

3. Ferreira L., Vega S., Sanchez-Juanes F., Gonzalez M., Herrero A., Muniz M.C., Gonzalez-Buitrago J.M., Munoz J.L. Identifying bacteria using a matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight (MALDI-TOF) mass spectrometer. Comparison with routine methods used in clinical microbiology laboratories. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2010; 28:492- 7.

4. Lista F., Reubsaet F., De Santis R., Parchen R., de Jong A., Kieboom J., van der Laaken A., Voskamp-Visser I., Fillo S., Jansen H-J., van der Plas J., Paauw A. Reliable identification at the species level of Brucella isolates with MALDI-TOF-MS. BMC Microbiology. 2011; 11:267. DOI: 10.1186/1471-2180-11-267.

References

1. Marry R., Grenner D., Meyes P., Roduell V. [Human Biochemistry]. M.: "Mir"; 1993. Vol. 2. 415 p.

2. Wilkins C.L., Lay J.O. Identification of microorganisms by mass spectrometry. Wiley-Blackwell; 2006. 376 p.

3. Ferreira L., Vega S., Sanchez-Juanes F., Gonzalez M., Herrero A., Muniz M.C., Gonzalez-Buitrago J.M., Munoz J.L. Identifying bacteria using a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometer. Comparison with routine methods used in clinical microbiology laboratories. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2010; 28:492- 7.

4. Lista F., Reubsaet F., De Santis R., Parchen R., de Jong A., Kieboom J., van der Laaken A., Voskamp-Visser I., Fillo S., Jansen H-J., van der Plas J., Paauw A. Reliable identification at the species level of Brucella isolates with MALDI-TOF-MS. BMC Microbiology. 2011; 11:267. DOI: 10.1186/14712180-11-267.

Authors:

Ul'shina D.V., KovalevD.A., Bobrysheva O.V., Lyamkin G.I., Khudoleev A.A., Siritsa Yu.V., KulichenkoA.N. Stavropol Research Anti-Plague Institute. 13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation. E-mail: snipchi@mail.stv.ru

об авторах:

Ульшина Д.В., Ковалев Д.А., Бобрышева О.В., Лямкин Г.И., Худолеев А.А., Сирица Ю.В., Куличенко А.Н. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15. E-mail: snipchi@mail.stv.ru

Поступила 07.04.15.