Возможные направления дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

95

сборник Трудов

института фундаментальной медицины и биологии казанского (Приволжского) федерального университета

Возможные направления дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс

Д.И. Андреева 12, И.М. Газизов 1 г, Т.С. Йылмаз 1, М.С. Калигин12,

А.А. Гумерова 2, А.П. Киясов 2

1 Казанский государственный медицинский университет

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет

Possible directions of human cord blood mononuclear cells differentiation in the regenerating rat liver

Andreeva D.1.12, GazizovI.M.12, Ylmaz T.S.1, Kaligin M.S.12, Gumerova A.A.2, Kiyasov A.P.2

1 Kazan State Medical University, Kazan

2 Kazan Federal University, Kazan

Известно, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) пуповинной крови человека способны дифференцироваться в гепатоциты. Эта способность может быть широко использована в лечении различных заболеваний печени. Однако трансплантация аутогенных стволовых клеток в случае наследственных заболеваний печени весьма ограничена. В таком случае необходима разработка методов генетической модификации, и при этом необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства ГСК.

Белым беспородным крысам-самцам проводили операцию частичной гепатэктомии и интраоперационно внутриселезеночно вводили мононуклеары пуповинной крови человека, трансфицированные геном зелёного флуоресцентного белка (GFP). Парафиновые срезы печени окрашивали с антителами к рецептору фактора стволовых клеток, антигену лейкоцитов человека, а-гладкомышечному актину, усиленному GFP, цитокератину 19, специфическому антигену ге-патоцитов человека, а-фетопротеину. Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления возможности экспрессии в одной клетке рецептора фактора стволовых клеток и десмина, GFP и цитокератина 19.

Было показано, что трансплантированные в селезенку мононуклеары пуповинной крови человека, трансфицированные геном gfp, мигрируют в печень крыс после частичной гепатэктомии и приобретают фенотип гепатоцитов, синусоидных клеток и холангиоцитов. При этом не происходит дифференцировка трансплантированных клеток в миофи-бробласты. Гепатобласты и гепатоциты, обнаруженные в печени крыс после трансплантации, экспрессировали специфический антиген гепатоцитов человека и а-фетопротеин, а значит являлись функционально активными клетками.

Ключевые слова: печень, гемопоэтические стволовые клетки, пуповинная кровь, трансфекция.

Трансплантация печени — единственный эффективный метод лечения в случаях, когда внутритканевые источники регенерации органа исчерпаны [1]. Однако доступность донорских органов не соответ-

e-mail: goober@mail.ru

It is known that human cord blood hematopoietic stem cells (HSC) are able to differentiate into hepatocytes. This ability can be widely used in treatment of various liver diseases. However, there are some genetic diseases of liver, when the application of autologous stem cells is not possible. So it could be very helpful to develop methods of genetic modification of stem/progenitor cells. However, it should be proved that genetic modification does not change the properties of HSC.

We performed partial hepatectomy for the white mongrel male rats and injected human umbilical cord blood mononuclear cells transfected by gene of green fluorescent protein (GFP) into the spleen. Paraffin sections of the liver were stained with antibodies to stem cell factor receptor, human leukocyte antigen, а-smooth muscle actin, enhanced GFP, cytokeratin 19, hepatocyte specific antigen, human а-fetoprotein. Also we used a double-immunohistochemical staining to detect expression of stem cell factor receptor and desmin, enhanced GFP and cytokeratin 19.

Our study showed that human cord blood mononuclear cells transfected by gfp transplanted into the spleen of rats after partial hepatectomy migrated to the liver and acquired the phenotype of hepatocytes, cholangiocytes and sinusoidal cells. At the same time the differentiation of such transplanted cells into myofibroblasts, as it was previously shown, does not occur. Hepatoblasts and hepatocytes found in the liver of rats after transplantation of genetically modified and native cells express human hepatocyte specific antigen and а-fetoprotein that means they are functionally active.

Key words: liver, hematopoietic stem cells, transfection, umbilical cord blood.

ствует реальной потребности, к тому же существует риск отторжения трансплантированного органа и неизбежная необходимость пожизненного приёма иммуносупрессивных препаратов. В качестве

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

96

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

альтернативы трансплантации печени могут быть разработаны и внедрены методы «регенеративной медицины» и, в частности, трансплантация стволо-вых/прогениторных клеток. Возможность образования гепатоцитов из стволовых клеток костного мозга впервые была показана в работе B.E. Petersen и со-авт. еще в 1999 г. [2]. В то же время миграция, возможности дифференцировки клеток пуповинной крови (ПК) и их участие в восстановлении печени ещё не исследованы в полной мере. Безусловно, именно ПК может стать перспективным источником стволовых клеток для трансплантации, так как обладает такими преимуществами, как абсолютно нетравматичный и безопасный как для матери, так и для ребенка способ выделения клеток, а также высокая способность клеток к пролиферации и низкая иммуногенность [3].

Механизм образования гепатоцитов из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) до сих пор является предметом бурного обсуждения. Предполагается, что возможна как прямая дифференцировка стволовых клеток [4], так и слияние зрелых клеток мие-лоидной линии с резидентными гепатоцитами [5]. В результате слияния образуются гибридные клетки, которые экспрессируют специфические печёночные маркеры, но до конца не ясно, обладают ли они полным спектром функциональной активности гепа-тоцитов.

В регенеративной медицине возможно применение как алло-, так и аутогенных клеток для лечения ряда заболеваний печени. Однако существуют болезни печени, например наследственные метаболические нарушения, такие как болезнь Вильсона — Коновалова, наследственные гликогенозы, в отношении которых применение аутогенных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетической модификации стволовых и прогениторных клеток и трансплантация таким больным генетически «вылеченных» клеток. В ходе разработки методов трансплантации генетически модифицированных клеток, необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства ГСК и их способность мигрировать в орган-мишень и дифференцироваться в клетки печени.

Материал и методы

Пуповинная кровь была забрана специально обученным персоналом роддома, по инструкции Банка стволовых клеток Казанского медицинского университета (лицензия №99-01-001961 от 13.10.2005), после подписания матерями информированного согласия. Выделение фракции мононуклеаров из пуповинной крови (МПК) человека проводили методом седиментации в градиенте плотности фиколла [6]. Подсчет количества и определение жизнеспособности ядросодержащих клеток осуществляли путем окрашивания трипановым синим. Во всех полученных образцах количество жизнеспособных клеток было не менее 97%.

Генетическую модификацию мононуклеаров ПК человека проводили методом электропорации [7]. В качестве трейсерной метки был использован усиленный зеленый флуоресцентный белок — EGFP. Полученные результаты выявили наилучший результат электропорации клеток пуповинной крови человека при вольтаже 300 В, ёмкости 1500 мкФ.

Эксперимент выполнен на крысах (n = 30). Операция частичной гепатэктомии (ЧГ) проведена по методике, описанной G.M. Higgins и R.M. Anderson [8]. Животным 1 группы (n = 9) проводили классическую гепатэктомию без последующей трансплантации клеток. Крысам 2 группы (n = 9) после удаления долей печени в селезенку вводили 3 млн. МПК человека в 500 мкл среды RPMI. Животным 3 группы (n = 9) после ЧГ в селезенку вводили по 6х105 МПК человека, трансфицированных геном EGFP, в 500 мкл среды RPMI. Контрольной группе животных (n = 3) после ЧГ в селезенку вводили 500 мкл физиологического раствора. Объем удаленных долей составлял 68% от общей массы печени.

Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом декапитацией через 2, 5, 7 сут. после операции. Ткань печени фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Окрашивание проводили с антителами к рецептору фактора стволовых клеток С-kit (клон T595, Novocastra, Великобритания), антигену лейкоцитов человека HLA-ABC (клон W6/32, Dako, Дания), a-гладкомышечному актину, a-ГМА (клон 1A4, DAKO, Дания), усиленному зеленому флуоресцентному белку, EGFP (клон GSN24, Sigma, США), цитокератину 19 (клон BA17, Dako, Дания), специфическому антигену гепатоцитов человека, HSA (клон OCH1E5, Novokastra, Великобритания), а-фетопротеину, AFP (клон С3, Dako, Дания). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии С-kit и десмина (клон D33, DAKO, Дания), EGFP и цитокератина 19.

Результаты

Многие исследователи, занимающиеся вопросом регенерации печени, считают, что активации стволовых клеток после ЧГ не происходит [9]. Однако исследование срезов печени крыс после классической ЧГ на экспрессию рецептора к фактору стволовых клеток C-kit, который считается наиболее удачным маркером для выявления стволовых клеток, показало, что через 2 сут. после операции экспрессия С-kit наблюдалась в синусоидных клетках, достигала максимума к 5 сут. и составляла 8-10 клеток в поле зрения (рис. 1А). Экспрессию C-kit, которая увеличивалась вплоть до 5 сут. и составляла 4—5 клеток в поле зрения, наблюдали и в гепатоцитах (рис. 1Б). При этом двойное иммуногистохимическое окрашивание срезов печени животных экспериментальных групп с антителами к С-kit и десмину показало, что на всех сроках после ЧГ экспрессирующие С-kit синусоидные клетки относятся к популяции перисину-соидальных клеток (рис. 1В).

В образцах печени крыс после ЧГ и трансплантации мононуклеаров ПК человека С-kit экспрессировался гепатоцитами и мелкими клетками с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы уже на ранних экспериментальных сроках (рис. 2). Максимальное количество С-kit+-гепатоцитов, которое составляло 4—5 клеток в поле зрения, наблюдали через 5 сут. после операции, на 7 сут. происходило постепенное снижение числа этих клеток. При этом С-kit^-синусоидных клеток мы практически не наблюдали. Очевидно, что трансплантация МПК после ЧГ меняет характер активации стволового компартмента. Возможно, что в случае трансплантации МПК нет необходимости в паракринных влияниях со стороны

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

97

перисинусоидальных клеток печени для активации регенераторного ответа гепатоцитов. Достижение печенью массы, необходимой для выполнения ее функции как органа, обеспечивается в этом случае не перисинусоидальными клетками, а трансплантированными МПК человека. Кроме того, МПК человека, мигрировавшие в регенерирующую печень крысы, могут сами дифференцироваться в гепатоциты.

Маркер клеток человека HLA-ABC, который является антигеном главного комплекса гистосовместимости, определялся в синусоидных клетках (рис. 3А) и гепатоцитах (рис. 3Б) уже на 2 сут. эксперимента. На 5 сут. нами были обнаружены также небольшие HLA-позитивные клетки, находящиеся в структуре портальных трактов, вблизи желчных протоков. Более того, на 7 сут. HLA-ABC позитивные холангиоци-ты находились в структуре мелких новообразующихся протоков (рис. 3В). Обнаруженные нами клетки, экспрессирующие HLA-ABC и расположенные в синусоидах печени, имели веретенообразную форму и напоминали перисинусоидальные клетки. Ранее было показано образование миофибробластов после трансплантации клеток костного мозга, на основании чего авторами был сделан вывод о том, что такая трансплантация способствует развитию фиброза [10]. В результате нашего исследования экспрессия маркера миофибробластов a-SMA была обнаружена только в гладкомышечных клетках стенки сосудов на всех экспериментальных сроках, но не в синусоидах печени, что свидетельствует о безопасности проведенной трансплантации с точки зрения риска развития фиброза печени.

Эффективность трансфекции определяли по экспрессии трэйсерного гена — EGFP. При исследовании образцов печени экспериментальной группы 3 методом флуоресцентной микроскопии уже на 2 сут. после операции было выявлено интенсивное свечение EGFP (рис. 4). На всех последующих иссле-

дованных сроках, т.е. на 5 и 7 сут., интенсивность свечения EGFP в печени не снижалась. По данным иммуногистохимического исследования в печени крыс после ЧГ и трансплантации МПК человека на всех исследованных сроках также были обнаружены ЕGFP+-клетки. На 2 сут. эти клетки имели фенотип гепатобластов и гепатоцитов и располагались вокруг портальных трактов (рис. 5А). В это же время были обнаружены и ЕGFP+-синусоидные клетки (рис. 5Б). Кроме того, на 5 сут. эксперимента в печени крыс после ЧГ и трансплантации генетически модифицированных МПК человека появлялись холангиоциты, экспрессирующие EGFP (рис. 5В). Эти клетки находились в структуре мелких новообразующихся протоков. Полученные результаты распределения генетически модифицированных клеток человека в регенерирующей печени крыс напрямую коррелируют с результатами иммуногистохимического исследования с антителами к HLA-ABC.

Одними из открытых вопросов до сих пор остаются механизмы восстановления поврежденного органа трансплантированными столовыми клетками: происходит это путем слияния или прямой трансдиф-ференцировки? Обнаруженные нами уже на вторые сутки EGFP+-гепатобласты, находящиеся вокруг портальных трактов и желчных протоков, навели нас на мысль о том, что эти гепатобласты являются промежуточной формой в дифференцировке гепатоцитов и холангиоцитов из ГСК. На более поздних сроках количество EGFP+-гепатобластов уменьшалось, но при этом увеличивалось число клеток с фенотипом гепатоцитов и появлялись EGFP+-холангиоциты. При этом были выявлены не только СК19+-холангиоциты (рис. 6А), но и мелкие СК19+-клетки с фенотипом гепатобластов (рис. 6Б). Известно, что зрелые гепатоциты не экспрессируют СК19, но была показана его экспрессия гепатобластами в ходе внутриутробного развития [11].

% • б  v

*

Рис. 1.

Печень крысы после частичной гепатэктомии [ЧГ]: А - C-kity-синусоидные клетки [красного цвета],

5 сут. после ЧГ;

Б - C-kity-гепатоциты [красного цвета],

2 сут. после ЧГ;

В - С-кИ+/десмин+-синусоидная клетка [С-kit синего цвета, десмин - красного],

2 сут. после ЧГ.

Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: х400

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

98

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

Рис. 2.

Печень крысы через 2 сут. после частичной гепатэктомии и трансплантации МПК человека. Гепатобласт, экспрессирующий С-kit (красный цвет]. Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: x40D

Рис. 3.

Печень крысы после частичной гепатэктомии (ЧГ] и трансплантации МПК человека.

Экспрессия HLA-ABC различными видами клеток (красный цвет]:

А - синусоидными клетками, 5 сут. после ЧГ;

Б - гепатоцитами, 2 сут. после ЧГ;

В - холангиоцитами, 7 сут. после ЧГ. Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: х400

Рис. 4.

ЕGFP+-клетки печени крысы через 2 сут. после частичной гепатэктомии и трансплантации генетически модифицированных МПК человека, трансфицированных геном egfp. Флуоресцентная микроскопия.

Ув.: х400

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

99

Рис. 5.

Печень крысы после частичной гепатэктомии (ЧГ] и трансплантации генетически модифицированных МПК человека. Экспрессия EGFP различными видами клеток (красный цвет]:

А - гепатоцитами, 2 сут. после ЧГ;

Б - синусоидными клетками, 2 сут. после ЧГ;

В - холангиоцитами, 7 сут. после ЧГ. Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: х400

%

* *

* \ 9* *

,* v #

* * V-

w " * »'

*

9 * * v< ц" *

j * * • V * * *

* л * ж* * Ф Г. M. л л

*•

* *6

'* л

•W

• <4» *' *А

О . W

Рис. 6.

Печень крысы после частичной гепатэктомии (ЧГ] и трансплантации генетически модифицированных МПК человека:

А - СК19+-холангиоциты (красный цвет],

2 сут. после ЧГ;

Б - СК19+-мелкие клетки с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы (красный цвет], 7 сут. после ЧГ;

В - СК19+/EGFP+-холангиоциты

(СК19 красного цвета, EGFP - синего], 5 сут. после ЧГ.

Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: х400

Более того, двойное окрашивание с антителами к СК19 и EGFP выявило холангиоциты и единичные гепатобласты (рис. 6В), экспрессирующие оба этих маркера, что свидетельствует о том, что окрашенные клетки являются потомками трансплантированных ГСК пуповинной крови человека. По-видимому, обнаруженные нами СК19+/EGFP+-гепатобласты диф-

ференцируются в зрелые гепатоциты и холангиоциты и восстанавливают поврежденную структуру печени, повторяя процессы, происходящие в ходе внутриутробного развития печени. В некоторых исследованиях уже была продемонстрирована дифференцировка клеток костного мозга в гепатоциты через промежуточную форму незрелого гепатобласта [12].

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

100

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

Полученные нами данные не оставляют сомнений, что генетически модифицированные МПК человека, так же как и нативные клетки, мигрируют в печень крысы и дифференцируются в гепатобласты, гепато-циты, синусоидные клетки и холангиоциты. Открытым остается вопрос, являются ли эти клетки функционально активными или они лишь фенотипически подобны тем или иным клеткам печени крыс? Установ-

ленная нами экспрессия а-фетопротеина человека (показателя секреторной активности гепатобластов) (рис. 7) и специфического антигена гепатоцитов человека (HSA) (рис. 8) в печени крыс экспериментальных групп 2 и 3 не только подтверждает их происхождение из трансплантированных клеток пуповинной крови человека, но и говорит о зрелости этих клеток и сохранении их функциональной активности.

Рис. 7. Печень крысы после частичной гепатэктомии (ЧГ] и трансплантации генетически модифицированных МПК человека. Гепатобласты, экспрессирующие а-фетопротеин (красный цвет], 2 сут. после ЧГ. Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: x40D

Рис. 8. Печень крысы после частичной гепатэктомии (ЧГ] и трансплантации генетически модифицированных МПК человека. Гепатоциты, экспрессирующие HSA (красный цвет], 7 сут. после ЧГ. Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: х400

Таким образом, трансплантация генетически модифицированных МПК человека может стать перспективным методом лечения болезней печени, связанных с нарушением экспрессии генов, таких как болезнь Вильсона — Коновалова, дефицит а1-антитрипсина, гемохроматоз, гликогенозы и т.д.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Wiemann S.U., Satyanarayana A., Tsahuridu M. et al. Hepatocyte telomere shortening and senescence are general markers of human liver cirrhosis. FASEB 2002; 16: 935—42.

2. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science 1999; 284: 1168— 70.

3. Cardoso A.A., Li M.L., Batard P. et al. Release from quiescence of CD 34+38- human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults. PNAS USA 1993; 90: 8707-11.

4. Terai S., Sakaida I., Yamamoto N. et al. An in vivo model for monitoring trans-differentiation of bone marrow cells into functional hepatocytes. Biochem. 2003; 134: 551-8.

5. Vassilopoulos G., Wang P.R., Russel D.W. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. Nature 2003; 422: 901-4.

6. Hawley T.S., Hawley R.G., Totowa N.J. Methods in molecular biology: flow cytometry protocols, 2nd ed.: Humana Press Inc.; 2004.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП № 02.512.11.2052.

7. Rizvanov A.A., Kiyasov A.P., Gaziziov I.M. et al. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF, L1CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro-trophic factors to support neuro-genesis - a novel approach in stem cell therapy. Neurochemistry International 2008; 53: 389-94.

8. Higgins G.M., Anderson R.M. Experimental pathology of the liver: I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 1931; 12: 186-202.

9. Michalopoulos G.K. Liver Regeneration. J. Cell. Physiol. 2007; 213: 286-300.

10. Forbes S.J., Russo F.P., Rey V. et al. A significant proportion of myofibroblasts are of the bone marrow origin in human liver fibrosis. Gastroenterology 2004; 126: 955-63.

11. Киясов А.П. Экспрессия десмина и цитокератинов № 8 и 18 в некроветворных клетках печени крыс. Онтогенез 1997; 28 (3): 217-22.

12. Ishikawa T., Terai S., Urata Y. et al. Fibroblast growth factor 2 facilitates the differentiation of transplanted bone marrow cells into hepatocytes. Cell Tissue Res. 2006; 323: 221-32.

Поступила 01.09.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013