СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНОГО ДЕЙСТВИЯ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
METHOD OF ANTICHOLINESTERASE SUBSTANCE ASSAY IN SOLUTIONS

Изобретение относится к измерениям или испытаниям, использующим фермент холинэстеразу, конкретно к измерению концентрации веществ антихолинэстеразного действия (АХД), например фторангидрида O-изопропилового эфира метилфосфоновой кислоты (ИМФК), путем определения остаточной ферментативной активности.
Известен способ обнаружения фосфорорганических веществ (ФОВ) АХД в воздушной среде с помощью комплекта средств индикаторного плоского элемента ИПЭ ФОВ путем смачивания фильтра раствором фермента, прокачивания через него пробы воздуха, добавления субстрата с красителем, выполнения временной выдержки в течение 3 минут и сравнения полученной окраски с эталоном /1/.
Недостатком способа является возможность только обнаружения ФОВ и установления уровня зараженности, что в значительной мере обусловлено визуальной регистрацией аналитического эффекта, имеющего неоднородную форму по мере распределения цветореагентов на площади фильтрующего элемента, и не позволяет проводить количественный анализ.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к предлагаемому является способ определения ФОВ АХД путем добавления к исследуемой пробе воды раствора индикатора бромтимолового синего, раствора холинэстеразы в буфере, проведения инкубации, добавления субстрата бутирилхолинйодида, измерения времени визуального сравнения окраски анализируемой пробы с эталоном, расчета процента угнетения ферментативной активности, определения по калибровочному графику содержания вещества антихолинэстеразного действия в пробе воды /2/.
Недостаток способа состоит в невысокой производительности и точности определения, достигающей +/-25%.
Цель изобретения - повышение производительности, снижение вероятности субъективной ошибки при регистрации аналитического эффекта и одновременно уменьшение погрешности выполнения измерения.
Поставленная цель достигается способом регистрации аналитического эффекта видеоизмерительными средствами, выбором наиболее значимого показателя цветности красного R, по его изменению во времени рассчитывается остаточная ферментативная активность холинэстеразы, строится калибровочный график, по которому определяется концентрация ФОВ, например ИМФК, в растворе.
Последовательное осуществление всех вышеописанных стадий является отличительным признаком способа. Инструментальная регистрация изображений, получаемых в процессе прохождения колориметрических реакций, обработка полученных данных на ПЭВМ и определение величины изменения за фиксированный интервал времени (240 секунд) наиболее значимого показателя цветности красного R дают возможность получить зависимости процента угнетения ферментативной активности от концентрации ФОВ, что позволяет повысить производительность и точность получения результатов.
В табл.1 представлены результаты анализа ФОВ АХД ИМФК и фторангидрида пинаколинового эфира метилфосфоновой кислоты (ПМФК). Процент угнетения ферментативной активности рассчитывался по формуле 1:
k
где R - абсолютное значение изменения показателя красного цвета за фиксированный интервал времени в контрольном анализе;
x
R - абсолютное значение изменения показателя красного цвета за фиксированный интервал времени, полученное при анализе пробы.
Таблица 1
Зависимость угнетения ферментативной активности от концентраций С для ФОВ АХД ИМФК и ПМФК (n=3)
№ п/п
С, мг/мл
J<sub>имфк</sub>, %
J<sub>пмфк</sub>, %
1
1·10-<sup>6</sup>
-
19
2
2·10-<sup>6</sup>
20
23
3
5·10-<sup>6</sup>
30
28
4
8·10<sup>-6</sup>
36
31
5
1·10<sup>-5</sup>
38
33
6
2·10<sup>-5</sup>
44
35
7
5·10<sup>-5</sup>
52
40
8
8·10<sup>-5</sup>
54
41
9
1·10<sup>-4</sup>
56
44
10
2·10<sup>-4</sup>
60
48
11
5·10<sup>-4</sup>
63
54
12
8·10<sup>-4</sup>
65
58
13
1·10<sup>-3</sup>
-
60
По результатам табл.1 получены кубические зависимости, представленные формулами 2, 3, характеризующиеся величинами критерия Фишера - F и коэффициентом корреляции - r, подтверждающими их значимость, что позволяет увидеть возможность проведения количественного анализа.
F=1798, r=0.999
F=1211, r=0.999
Способ количественного определения ФОВ заключается в следующем. Проведение измерения основано на количественной оценке скорости биохимической реакции, протекающей в гетерогенной среде пористой подложки, на которой проявляется изображение, регистрируемое инструментальными видеоизмерительными средствами, например цифровой видеокамерой, с последующим определением показателя цветности красного R.
Пример
Определение ФОВ АХД в растворах проводят с использованием комплекта принадлежностей, входящих в состав ИПЭ ФОВ, видеокамеры и вычислительной техники.
Исследуемая проба в виде водного раствора ФОВ в объеме 0.1±0.01 мл помещается на пористую подложку ИПЭ. Параллельно проводятся работы с контрольной пробой, не содержащей ФОВ. Производится вскрытие пакета с раствором фермента, отбор содержимого пакета в шприц и нанесение 1±0.1 мл на поверхность пористой подложки, смоченной раствором пробы. Одновременно с добавлением фермента включается секундомер и проводится регистрация времени инкубации в течение 5 минут. После завершения инкубации фермента и пробы вскрываются путем раздавливания ампулы с субстратом и красителем, находящиеся внутри пористой подложки ИПЭ. Проводится инструментальная регистрация изображения цветового перехода пробы и контрольного образца в течение 4 минут с помощью видеокамеры, размещенной на расстоянии 15-20 см напротив регистрируемого изображения с подсветкой внешним источником света накаливания мощностью 40-60 Вт, находящимся на расстоянии от регистрируемого изображения 25-30 см под углом 45±5°. Полученная информация в виде видеофрагментов обрабатывается на ПЭВМ с помощью прикладных программных продуктов, с помощью которых определяется значение абсолютной величины изменения параметра цветности красного R для анализируемой и контрольной пробы за фиксированный интервал времени 240±1 секунда. По формуле 1 проводится расчет процента угнетения ферментативной активности с последующим определением по соответствующей калибровочной зависимости 2 или 3 концентрации от процента угнетения и преобразованием ее в единицы миллиграмм в единице объема пробы.
Установление калибровочной зависимости проводится путем приготовления растворов заданной концентрации, представленных в табл.1, проведения анализа в последовательности, приведенной выше в примере, обработки результатов с помощью статистического пакета SPSS 13.0 и установления зависимостей, представленных формулами 2, 3 для ПМФК и ИМФК. С использованием этих зависимостей проведен анализ проб и найдены значения концентраций (табл.2, 3), на примере которых рассчитан коэффициент вариации V по формуле 4, характеризующий погрешность выполнения измерения, что позволило сравнить предлагаемый способ с ранее известным (табл.4).
ср
где Х - среднее арифметическое значение измерения;
x
S - среднеквадратическое отклонение.
Таблица 2
Результаты определения содержания ИМФК
Введена концентрация ИМФК, мг/мл
Найдено ИМФК, мг/мл (n=5)
Х<sub>ср</sub>, мг/мл
Sx
V,%
1
2
3
4
5
2·10<sup>-6</sup>
1,90·10<sup>-6</sup>
1,99·10<sup>-6</sup>
3,02·10<sup>-7</sup>
15,13
2,22·10<sup>-6</sup>
1,80·10<sup>-6</sup>
1,66·10<sup>-6</sup>
2,39·10<sup>-6</sup>
5·10<sup>-6</sup>
5,12·10<sup>-6</sup>
4,65·10<sup>-6</sup>
7,91·10<sup>-7</sup>
16,99
4,00·10<sup>-6</sup>
5,81·10<sup>-6</sup>
4,00·10<sup>-6</sup>
4,33·10<sup>-6</sup>
8·10<sup>-6</sup>
6,86·10<sup>-6</sup>
8,23·10<sup>-6</sup>
1,16·10<sup>-6</sup>
14,09
7,13·10<sup>-6</sup>
9,44·10<sup>-6</sup>
8,67·10<sup>-6</sup>
9,03·10<sup>-6</sup>
1·10<sup>-5</sup>
9,23·10<sup>-6</sup>
9,12·10<sup>-6</sup>
6,67·10<sup>-7</sup>
7,32
9,03·10<sup>-6</sup>
9,73·10<sup>-6</sup>
8,03·10<sup>-6</sup>
9,58·10<sup>-6</sup>
1
2
3
4
5
2·10<sup>-5</sup>
2,34·10<sup>-5</sup>
1,99·10<sup>-5</sup>
3,29·10<sup>-6</sup>
16,46
2,34·10<sup>-5</sup>
1,63·10<sup>-5</sup>
1,79·10<sup>-5</sup>
1,86·10<sup>-5</sup>
5·10<sup>-5</sup>
4,26·10<sup>-5</sup>
4,46·10<sup>-5</sup>
2,42·10<sup>-6</sup>
5,42
4,21·10<sup>-5</sup>
4,39·10<sup>-5</sup>
4,71·10<sup>-5</sup>
4,72·10<sup>-5</sup>
8·10<sup>-5</sup>
9,48·10<sup>-5</sup>
8,28·10<sup>-5</sup>
9,99·10<sup>-6</sup>
12,06
8,29·10<sup>-5</sup>
7,87·10<sup>-5</sup>
8,89·10<sup>-5</sup>
6,86·10<sup>-5</sup>
1·10<sup>-4</sup>
1,05·10<sup>-4</sup>
1,03·10<sup>-4</sup>
1,44·10<sup>-5</sup>
13,98
9,91·10<sup>-5</sup>
8,03·10<sup>-5</sup>
1,15·10<sup>-4</sup>
1,14·10<sup>-4</sup>
2·10<sup>-4</sup>
2,32·10<sup>-4</sup>
1,98·10<sup>-4</sup>
3,69·10<sup>-5</sup>
18,60
2,38·10<sup>-5</sup>
1,64·10<sup>-5</sup>
1,60·10<sup>-4</sup>
1,95·10<sup>-4</sup>
5·10<sup>-4</sup>
4,81·10<sup>-4</sup>
5,29·10<sup>-4</sup>
5,19·10<sup>-5</sup>
9,79
5,69·10<sup>-5</sup>
5,39·10<sup>-5</sup>
4,71·10<sup>-4</sup>
5,87·10<sup>-4</sup>
8·10<sup>-4</sup>
8,62·10<sup>-4</sup>
8,12·10<sup>-4</sup>
6,83·10<sup>-5</sup>
8,41
7,99·10<sup>-5</sup>
8,24·10<sup>-5</sup>
8,72·10<sup>-4</sup>
7,01·10<sup>-4</sup>
Таблица 3
Результаты определения содержания ПМФК
Введена концентрация ПМФК, мг/мл
Найдено ПМФК, мг/мл
Х<sub>ср</sub>, мг/мл
S<sub>x</sub>
V,%
1
2
3
4
5
1·10<sup>-6</sup>
1,05·10<sup>-6</sup>
1,03·10<sup>-6</sup>
6,30·10<sup>-7</sup>
13,98
9,91·10<sup>-7</sup>
1,15·10<sup>-6</sup>
1,14·10<sup>-6</sup>
8,03·10<sup>-7</sup>
2·10<sup>-6</sup>
2,32·10<sup>-6</sup>
1,98·10<sup>-6</sup>
3,69·10<sup>-7</sup>
18,60
2,38·10<sup>-6</sup>
1,64·10<sup>-6</sup>
1,60·10<sup>-6</sup>
1,95·10<sup>-6</sup>
5·10<sup>-6</sup>
4,81·10<sup>-6</sup>
5,29·10<sup>-6</sup>
5,19·10<sup>-7</sup>
9,79
5,69·10<sup>-6</sup>
5,39·10<sup>-6</sup>
4,71·10<sup>-6</sup>
5,87·10<sup>-6</sup>
8·10<sup>-6</sup>
8,62·10<sup>-6</sup>
8,12·10<sup>-6</sup>
6,83·10<sup>-6</sup>
8,41
7,99·110<sup>-6</sup>
8,24·10<sup>-6</sup>
8,72·10<sup>-6</sup>
7,01·10<sup>-6</sup>
1·10<sup>-5</sup>
1,16·10<sup>-5</sup>
1,02·10<sup>-5</sup>
1,43·10<sup>-6</sup>
14,06
1,04·10<sup>-5</sup>
1,14·10<sup>-5</sup>
9,23·10<sup>-6</sup>
8,27·10<sup>-6</sup>
2·10<sup>-5</sup>
2,10·10<sup>-5</sup>
2,06·10<sup>-5</sup>
2,88·10<sup>-6</sup>
13,98
1,98·10<sup>-5</sup>
1,60·10<sup>-5</sup>
2,30·10<sup>-5</sup>
2,29·10<sup>-5</sup>
5·10<sup>-5</sup>
5,82·10<sup>-5</sup>
4,96·10<sup>-5</sup>
9,22·10<sup>-6</sup>
18,60
5,97·10<sup>-5</sup>
4,11·10<sup>-5</sup>
4,00·10<sup>-5</sup>
4,88·10<sup>-5</sup>
1
2
3
4
5
8·10<sup>-5</sup>
7,69·10<sup>-5</sup>
8,47·10<sup>-5</sup>
8,30·10<sup>-6</sup>
9,79
9,10·10<sup>-5</sup>
8,63·10<sup>-5</sup>
7,54·10<sup>-5</sup>
9,40·10<sup>-5</sup>
1·10<sup>-4</sup>
1,07·10<sup>-4</sup>
1,01·10<sup>-4</sup>
8,54·10<sup>-6</sup>
8,41
9,99·10<sup>-5</sup>
1,03·10<sup>-4</sup>
1,09·10<sup>-4</sup>
8,77·10<sup>-5</sup>
2·10<sup>-4</sup>
1,84·10<sup>-4</sup>
1,82·10<sup>-4</sup>
1,33·10<sup>-5</sup>
7,32
1,80·10<sup>-4</sup>
1,94·10<sup>-4</sup>
1,60·10<sup>-4</sup>
1,91·10<sup>-4</sup>
5·10<sup>-4</sup>
5,87·10<sup>-4</sup>
4,99·10<sup>-4</sup>
8,22·10<sup>-5</sup>
16,46
5,86·10<sup>-4</sup>
4,09·10<sup>-4</sup>
4,48·10<sup>-4</sup>
4,66·10<sup>-4</sup>
8·10<sup>-4</sup>
6,82·10<sup>-4</sup>
7,13·10<sup>-4</sup>
3,87·10<sup>-5</sup>
5,42
6,74·10<sup>-4</sup>
7,03·10<sup>-4</sup>
7,53·10<sup>-4</sup>
7,55·10<sup>-4</sup>
1·10<sup>-3</sup>
1,18·10<sup>-3</sup>
1,03·10<sup>-3</sup>
1,24·10<sup>-4</sup>
12,06
9,84·10<sup>-4</sup>
1,03·10<sup>-3</sup>
1,11·10<sup>-3</sup>
8,57·10<sup>-4</sup>
В табл.4 представлены сравнительные характеристики известного и предлагаемого способов.
Таблица 4
Сравнительные характеристики известного и предлагаемого способов
Известный способ
Предлагаемый способ
1. Отбор пробы объекта окружающей среды.
1. Отбор пробы объекта окружающей среды.
2. Транспортировка пробы в лабораторию.
3. Помещение аликвоты пробы в пробирку для проведения анализа.
2. Помещение аликвоты пробы на фильтр ИПЭ ФОВ.
4. Добавление аликвоты холинэстеразы.
3. Смачивание фильтра раствором холинэстеразы из комплекта ИПЭ ФОВ.
5. Проведение инкубации фермента и ингибитора в течение 5 минут.
4. Проведение инкубации фермента и ингибитора в течение 5 минут.
6. Добавление аликвоты субстрата.
5. Вскрытие ампул с субстратом и красителем внутри ИПЭ ФОВ.
7. Визуальная регистрация сравнения окраски анализируемой пробы с эталоном и регистрация интервала времени до наступления этого события.
6. Инструментальная регистрация изображения цветового перехода пробы и контрольного образца в течение 4 минут.
7. Передача информации в лабораторию, например, по каналу радиосвязи с помощью сотового телефона в виде MMS сообщения.
8. Расчет процента угнетения ферментативной активности с последующим определением по калибровочному графику концентрации и преобразование ее в единицы миллиграмм в единице объема пробы.
8. Расчет процента угнетения ферментативной активности с последующим определением по калибровочному графику концентрации и преобразование ее в единицы миллиграмм в единице объема пробы.
9. Время анализа с учетом доставки пробы 1 проба в час (8 анализов за смену 8 часов)
9. Время анализа с учетом передачи данных в лабораторию 10 минут
10. Диапазон измеряемых концентраций без дополнительных разбавлений - один порядок.
10. Диапазон измеряемых концентраций без дополнительных разбавлений - 2.5 порядка.
11. Погрешность измерения концентраций 25%.
11. Погрешность измерения концентраций 19%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить анализ непосредственно на месте отбора пробы, более производителен, менее трудоемок, превосходит прототип по точности определений и может быть рекомендован подразделениям ликвидации аварий на объектах хранения и уничтожения химического оружия при проведении химической разведки, а также при проведении мероприятий производственного экологического мониторинга объектов УХО, что позволит повысить оперативность получения информации и ее достоверность.
Источники информации
1. Инструкция по применению индикаторных плоских элементов для обнаружения фосфорорганических веществ, разработка Санкт-Петербург ООО «Лаборатория биохимических методов».
2. Руководство по работе в автомобильной радиометрической и химической лаборатории АЛ-4М. М.: «Военное издательство» 1988 г., 144 с.