СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ВЭБ-АССОЦИИРОВАННЫХ ОПУХОЛЕЙ У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРОЙ ВЭБ-ИНФЕКЦИЕЙ
METHOD FOR PREDICTION OF THE RISK OF DEVELOPING WEB-ASSOCIATED TUMORS IN THE PATIENTS WITH ACUTE EBV-INFECTION

Изобретение относится к лабораторным исследованиям и может быть использовано для прогнозирования риска развития опухолей среди пациентов с острой ВЭБ-инфекцией.
Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ, Human gammaherpesvirus 4) является представителем семейства Herpesviridae. Вирус обладает тропностью к лимфоидным и эпителиальным клеткам. Преимущественно ВЭБ инфицирует В-лимфоциты и слизистый эпителий ротоглотки и слюнных желез, но также поражает Т-лимфоциты, моноциты, NK-клетки, фолликулярные дендритные клетки, клетки эпителия желудка и кишечника, миоциты гладкой мышечной ткани и другие ткани [Филатова Е.Н., Уткин О.В. Современные подходы к моделированию герпесвирусной инфекции // Журнал Медиаль. - 2014. - №2 (12). - С. 172-197.]. После первичного инфицирования ВЭБ сохраняется в организме пожизненно, преимущественно пребывая в латентном состоянии. В латентном состоянии экспрессия вирусных генов ограничена, новые вирионы не производятся. Периодически ВЭБ может реактивироваться, выходить из латентного состояния и возобновлять литическую репликацию. В литической фазе производится вирусное потомство, которое инфицирует как собственные клетки организма, так и передается новому хозяину преимущественно воздушно-капельным путем [Волянський А.Ю., Колотова Т.Ю., Романова Е.А. и др. Молекулярные основы персистенции вируса Эпштейна-Барр в организме человека // Annals of Mechnikov Institute. - 2014. - №4. - С. 17-26; Human Herpesviruses: biology, therapy and immunoprophylaxis / Editors A. Arvin, G. Campadelli-Fiume, E. Mocarski et al. // Cambridge: Cambridge University Press, 2007. - 1408 pp.].
ВЭБ повсеместно распространен, его носителями является более 90% населения. В большинстве случаев как первичная ВЭБ-инфекция, так и реактивация вируса протекает бессимптомно или вызывает инфекционный мононуклеоз. У пациентов с хронической реактивацией вируса повышается риск возникновения различных ВЭБ-ассоциированных новообразований, в связи с чем IARC относит ВЭБ к 1-ой группе канцерогенов. Прежде всего, онкогенный потенциал ВЭБ обусловливается его способностью инфицировать и трансформировать лимфоидные и эпителиальные клетки (таблица).
Связь между заболеванием инфекционным мононуклеозом и последующим риском развития лимфогранулематоза установлена как в когортных проспективных исследованиях, так и в исследованиях методом «случай-контроль». Лимфогранулематоз развивается примерно у 0,1% больных, перенесших инфекционный мононуклеоз.
В настоящее время в качестве наиболее перспективных для общей диагностики онкологических заболеваний рассматриваются методы, основанные на определении опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма. Опухолевые маркеры являются веществами, количество которых уменьшается или увеличивается при генных мутациях или в результате вариации экспрессии генов в процессе клеточного канцерогенеза.
Обычно опухолевые маркеры включают в себя антигены и другие биологически активные вещества, которые могут быть использованы для раннего детектирования злокачественных опухолей, а также для мониторинга прогрессии заболевания и реакции на лечение (ASCO, 1996). Применимость большей части опухолевых биомаркеров, используемых в настоящее время в клинике, более или менее ограничена в силу недостаточной чувствительности и специфичности, а также корреляции с опухолями определенной локализации из-за строгих требований к выбору тканеспецифичного гена сравнения (референсного гена). Так, опухолевый антиген СА-125 имеет повышенную чувствительность, но лишен специфичности, а опухолевый биомаркер СА15-3 в крови, показатель злокачественной опухоли молочной железы, трудно использовать для ранней диагностики ввиду его низкой чувствительности. Группа онкофетальных антигенов - раковоэмбриональный антиген (РЭА) и тканевый полипептидный антиген (TPA) - также не являются специфичными к опухолевым клеткам, их определение используют только для оценки прогноза и ранней диагностики отдаленных метастазов. В качестве онкомаркера может выступать и мРНК: микроРНK miR-129-2, miR-125b1, miR-137 и miR-375 являются опухолевыми биомаркерами немелкоклеточного рака легкого [патент РФ №2507268, 2012. Бюл. №5.], мРНК гена KIFC1 - рака мочевого пузыря [патент РФ №2470301, 2012 Бюл. №35.].
Механизм канцерогенеза, ассоциированный с ВЭБ, достаточно сложен и мало изучен. Онкогенное действие ВЭБ связано с латентной инфекцией, точнее, со способностью ряда его вирусных белков, кодируемых генами латентной инфекции, оказывать модифицирующее действие на сигнальные пути клетки. В частности, LMP1, локализуясь в мембране, имитирует функцию конститутивно активированного рецептора CD40 и частично замещает эту функцию. Привлекая адаптерные молекулы TRAF, LMP1 через домены активации CTAR1 и CTAR2 активирует транскрипционные факторы АР-1 и NFkB и таким образом индуцирует экспрессию генов, регулируемую этими факторами (рецептор эпидермального фактора роста, EGFR, CD40, поверхностные активационные маркеры, молекулы адгезии и т.д.). Кроме того, LMP1 взаимодействует с Jak3-киназой и таким образом активирует STAT-сигнальные пути, стимулирующие размножение и передвижение клеток. LMP2A активирует киназу Akt/PBK, вызывая ряд эффектов, наиболее ярким из которых является подавление апоптоза. EBNA2 имитирует транскрипционную функцию процессированной формы Notch (трансмембранный белок, преобразующий контакты с окружающими клетками в генетические программы, регулирующие судьбу клетки), конститутивная активность которого ведет к развитию лимфоидных и эпителиальных опухолей.
В качестве маркера развития ВЭБ-ассоциированных неоплазий предлагалось использовать вирусные белки, в частности варианты онкогена латентного мембранного белка LMP1 [Mainou В.A., Raab-Traub N.J. LMP1 strain variations: biological and molecular properties // J. Virol. - 2006. Vol. 80. - P. 6458-6468.]. Однако не удалось получить четкую корреляцию между выявлением различных типов ВЭБ (и соответствующих им вариантов LMP1) и конкретной злокачественной патологией, возникающей у пациентов с ВЭБ-инфекцией. В качестве биомаркера ВЭБ-ассоциированных назофарингеальных карцином (NPC) был предложен белок СОХ-2. Выявлена корреляция между повышением уровня СОХ-2 и прогрессией NPC [Soo R., Tao A. et al. Overexpression of COX-2 in NPC and association with epidermal growth factor receptor expression // Arch. Otolaryngol. - 2005. V. 131. - P. 147-152.]. Однако детальные исследования показали, что синтез СОХ-2 в трансформированных эпителиальных клетках индуцируется LMP1 [Fendri A., Khabir R., Hadhri-Guigo В. et al. Overexpression of COX-2 and LMP1 are correlated with lymph node in Tunisian NPC-patients // Oral Oncolog. - 2008. Vol. 44. - P. 710-715; Muromo S., Inive H., Tanaba T. et al. Induction of COX-2 by EVB LMP1is involved in vasicular endothelial growth factor production in NPC cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 2001. Vol. 98. - Р. 6905-6910].
Задачей изобретения является создание способа прогнозирования риска развития ВЭБ-ассоциированных опухолей у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией.
Техническим результатом является прогностический критерий факторов риска развития опухолей у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией.
Настоящим изобретением предлагается способ прогнозирования риска развития ВЭБ-ассоциированных опухолей у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией, основанный на анализе уровней экспрессии мРНК рецепторов TGFB1 и компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей, с помощью микрочипа.
TGFB1 (ransforming growth factor beta 1) является членом суперсемейства белков TGF-β. Этот протеин регулирует клеточную пролиферацию, дифференцировку и рост, а также способен модулировать экспрессию и активацию других факторов роста. TGFB1 обладает способностью подавлять пролиферацию и активацию, а также стимулировать апоптоз иммунокомпетентных клеток (в частности, Т- и В-лимфоцитов). С другой стороны, в большом количестве клеточных линий различного происхождения наблюдали TGFB1-опосредованную стимуляцию пролиферации и подавление клеточной гибели. Бифункциональная роль TGFB1 обеспечивается благодаря его способности активировать множество разнонаправленных сигнальных путей в клетке, а также функциональным разнообразием транскрипционных вариантов членов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей.
+
+
+
Классический TGFB1/Smad сигнальный каскад включает фосфорилирование рецепторного комплекса TGFBR1-TGFBR2, инактивацию Smad2 и Smad3, их гетеромеризацию с участием Smad4 и индукцию апоптоза [Yan X. et. al. Feedback regulation of TGF-β signaling // Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai). - 2018. V. 50. №1. - P. 37-50.]. Исследования последних лет показали, что TGFB1 может активировать не только канонический каскад Smad белков, но и другие альтернативные сигнальные пути. Описана TGFB1-зависимая активация митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK), экстрацеллюлярной сигнал-регулируемой киназы 1 и 2 (ERK1/2), TGF-β1-активируемой киназы-1 (ТАК1), а также фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и гипоксия-индуцибельного фактора-1 (HIF-1) [Moustakas A. et al., The regulation of TGFbeta1 signal traduction // Development. - 2009. Vol. 131. №22. - P. 399-714; Zhang Y.E., Non-SMAD pathways in TGFbeta1 signaling // Cell Res. - 2009. V. 19. №1. - P. 128-29; Freudlsperger C. et al. TGF-β and NF-κВ signal pathway cross-talk is mediated through TAK1 and SMAD7 in a subset of head and neck cancers // Oncogene. - 2013. Vol. 32. №12. - P. 1549-1559.]. Показана возможная связь изменений активности различных компонентов TGFB1 сигнального пути с рядом наследственных нарушений соединительной ткани, в частности синдромом Марфана [Dietz Н.С. Recent progress towards molecular understanding of Marfan syndrome // Amer. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. - 2005. - №139. - P. 4-9.], синдромом Льюиса-Дитца 1 и 2 типа [Loyes B.L. et al. A syndrome of altered cardiovascular, craniofacial, neurocognitive and skeleton development caused by mutation in TGF-βR1 and TGF-βR2 // Nat. Genet. - 2005. Vol. 37. №2. - P. 275-81], а также неопластической трансформацией, метастазированием и прогрессией рака молочной железы [М.А. Таипов, З.Н. Никифорова, О.М. Павлова и др. Роль TGFB1/Smad-сигнального каскада в регуляции экспрессии циклооксигеназы-2 в клетках молочной железы человека // Мамалогия. - 2013. - №1-2. - С. 6-12]. Определение TGFB1 в периферической крови рекомендуется при диагностике заболеваний, связанных с хроническим воспалительным процессом (болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, синдром приобретенного иммунодефицита, болезнь Паркинсона, заболевания костного мозга и костной ткани, гломерулонефриты, нефропатия, диабет, гломерулосклероз, системная волчанка, аутоиммунный гепатит, синдром хронической усталости, сепсис, инсульт, опухоли различных тканей и др.). Повышенные уровни TGFB1 определяются при синдроме хронической усталости и у пациентов при синдроме Гийена-Барре-Штроля [ Redondo-Horcajo М.,  N. et al. Signaling by ALK5 mediates TGFβ1-induced ET-1 expression in endothelial cells: a role for migration and proliferation // J. Cell Science. - 2007. Vol. 120. - P. 1256-1266; Dumont N., Arteaga C.L. Targeting the TGF beta signaling network in human neoplasia // Cancer Cell. - 2003. - Vol. 3. - P. 531-536; Francis J.M., Heyworth С.М., Spooncer E. et al. Transforming growth factor-beta 1 induces apoptosis independently of p53 and selectively reduces expression of Bcl-2 in multipotent hematopoietic cells // J. Biol. Chem. - 2000. Vol. 275. - P. 39137-39145]. Установлено, что определение уровня TGFB1 в сыворотке и спинномозговой жидкости при множественном склерозе имеет большое значение для мониторинга ремиссии и активной фазы заболевания [Derynck R., Akhurst R.J., Balmain A. TGF signaling in tumor suppression and cancer progression // Nat. Genet. - 2001. Vol. 29. - P. 117-129.]. TGFB1 играет важную роль в метаболизме костного мозга, его рассматривают как маркер при остеопорозе [Deshpande P.L., King I.L., Segal В.М. Cutting edge: CNS CD11ccells from mice with encephalomyelitis polarize Th17 cells and support CD25CD4 T cell-mediated immunosuppression, suggesting dual roles in the disease process // J. Immunol. - 2007. Vol. 178. - P. 6695-6699]. Обнаружено изменение набора транскрипционных вариантов мРНК членов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей в некоторых злокачественных новообразованиях. Транскрипционный вариант 2 мРНК TGFBR2 детектируется в клетках лейкемии [Wu Y. et. al. Abnormal expression of TGF-beta type II receptor isoforms contributes to acute myeloid leukemia // Oncotarget. - 2016. V. 8. №6. - P. 10037-10049.], пониженный уровень экспрессии транскрипционного варианта 2 мРНК PRKCB выявляется у пациентов с колоректальным раком [Dowling С.М. et. al. Protein kinase С beta II suppresses colorectal cancer by regulating IGF-1 mediated cell survival // Oncotarget. - 2016. V. 7. №15. - P. 20919-20933].
Технический результат достигается способом прогнозирования риска развития ВЭБ-ассоциированных опухолей у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией, заключающимся в том, что в лейкоцитах периферической крови детектируют экспрессию транскрипционных вариантов мРНК рецепторов и компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей: TGFB1, TGFBR1, TGFBR2, Smad2, Smad3, Smad4, PRKCB, MAP3K7, MAP3K11, MAP3K1, MAPK1, MAP2K4, MAPK8, JUN, TRAF6, IKBKG, IKBKB, CHUK, ELP1, NFKBI-α, NFKBI-β, NFKB1, RELA с помощью микрочипа с нанесенными на него олигонуклеотидными зондами, комплементарными последовательностям указанных мРНК. Повышение уровней экспрессии мРНК транскрипционного варианта 1 Smad2, транскрипционного варианта 4 IKBKG, транскрипционного варианта 1 IKBKG и суммарного уровня мРНК NFKBI, а также снижение уровня экспрессии мРНК транскрипционного варианта 2 PRKCB рассматривают как фактор риска развития ВЭБ-ассоциированных опухолей.
Сущность изобретения иллюстрируется рисунками и примерами.
ФИГ. 1 - Уровни экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей в лейкоцитах крови пациентов с острой ВЭБ-инфекцией (ВЭБинф.) и выздоровевших (ВЭБрек.) в сравнении с показателями здоровых доноров. * - статистически значимые различия по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). tr var - транскрипционный вариант.
ФИГ. 2 - Уровни экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей в лейкоцитах крови пациентов с острой ВГЧ-6-инфекцией (ВГЧ6инф.) и выздоровевших (ВГЧ6рек.) в сравнении с показателями здоровых доноров. * - статистически значимые различия по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05). tr var - транскрипционный вариант.
ФИГ. 3 - Экспрессия мРНК компонентов TGFβ1-ассоциированных сигнальных путей в лейкоцитах крови пациентов с острой ВЭБ-инфекцией. Жирные стрелки показывают изменение уровней экспрессии мРНК отдельных компонентов TGFβ1-ассоциированных сигнальных путей у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией в сравнении со здоровыми донорами.
Пример 1. Использование микрочипа для анализа уровней экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей. Разработан дизайн и сконструированы сплайсинг-ориентированные биочипы, включающие в себя две группы олигонуклеотидных зондов. Первая группа детектирует отдельные сплайсированные варианты мРНК ключевых участников TGFB1-опосредованного сигналинга (уникальные зонды), а другая позволяет оценивать суммарную экспрессию кодирующих генов (групповые зонды). Синтез зондов осуществлен с применением модифицированного амидофосфитного метода на приборе CustomArray В3 Synthesizer (США) на слайдах CustomArrayBlankSlide 12K (США).
Пример 2. Уровни экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией. Для анализа уровней экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей подбирали группу пациентов в возрасте 7-18 лет с диагнозом «инфекционный мононуклеоз». Острая ВЭБ-инфекция была подтверждена клиническими и лабораторными исследованиями (иммуноферментный анализ, ПЦР). Контроль - здоровые доноры. Пробы крови отбирали в острой фазе инфекции до начала курса симптоматической терапии ибупрофеном, ацетаминофеном и ксилометазолином. Проведенные исследования выявили повышенные уровни экспрессии суммарного уровня мРНК TGFB1 и транскрипционного варианта 1 TGFB1, суммарного уровня мРНК TGFβR2 и транскрипционного варианта 2 TGFβR2, транскрипционного варианта 1 Smad2, суммарного уровня мРНК PRKCB, суммарного уровня мРНК МАР3К7, суммарного уровня мРНК IKBKG и транскрипционных вариантов 3 и 4 IKBKG, транскрипционных вариантов 1 и 2 NFKBIB, суммарного уровня мРНК NFKB1 и транскрипционного варианта 1 IKBKG, суммарного уровня мРНК RELA; пониженные уровни экспрессии транскрипционного варианта 2 PRKCB, суммарного уровня мРНК TRAF6 и транскрипционных вариантов 1 и 2 TRAF6, транскрипционного варианта 3 NFKBIB, транскрипционного варианта 3 NFKB1. Полученные результаты свидетельствовали об изменении паттерна экспрессии мРНК TGFB1 и TGFB1-ассоциированных сигнальных путей.
Пример 3. Уровни экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей у выздоровевших пациентов. Провели анализ уровней экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей у пациентов с подтвержденным диагнозом «инфекционный мононуклеоз», прошедших курс симптоматической терапии, через 2 месяца после клинического выздоровления в сравнении со здоровыми донорами. Проведенные исследования показали, что у выздоровевших пациентов сохранялись повышенные уровни экспрессии мРНК транскрипционного варианта 1 Smad2, транскрипционного варианта 4 IKBKG, транскрипционного варианта 1 NFKB1, суммарного уровня мРНК NFKB1, а также снижение уровня экспрессии мРНК транскрипционного варианта 2 PRKCB.
Пример 4. Учитывая сходство клинических симптомов и особенностей патогенеза ВГЧ-6-инфекции с ВЭБ-инфекцией, исследованы уровни экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей у пациентов с подтвержденной острой ВГЧ-6-инфекцией и выздоровевших пациентов. Для анализа уровней экспрессии мРНК компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей подбирали группу пациентов в возрасте 7-18 лет с подтвержденной ВГЧ-6-инфекцией. Паттерны экспрессии мРНК при ВГЧ-6-инфекции и ВЭБ-инфекции не совпадали.
Проведенные исследования подтвердили, что изменения уровней экспрессии мРНК TGFB1 и компонентов TGFB1-ассоциированных сигнальных путей (повышение уровней экспрессии мРНК транскрипционного варианта 1 Smad2, транскрипционного варианта 4 IKBKG, транскрипционного варианта 1 IKBKG и суммарного уровня мРНК NFKBI, а также снижение уровня экспрессии мРНК транскрипционного варианта 2 PRKCB) можно использовать в качестве фактора риска развития опухолей у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией.