ЭСТРОГЕННЫЕ КОМПОНЕНТЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ
ESTROGEN COMPONENTS FOR APPLICATION IN NEUROLOGICAL DISORDERS TREATMENT

Область техники
Настоящее изобретение принадлежит к области медицины. Более конкретно изобретение относится к новым медицинским применениям определенных эстрогенных компонентов, таких как эстетрол (1,3,5(10)-эстратриен-3,15α,16α,17β-тетрол).
Предшествующий уровень техники
Неврологические расстройства, в частности расстройства центральной нервной системы (ЦНС), охватывают многочисленные поражения, включая среди прочего острое повреждение ЦНС (например, гипоксически-ишемические энцефалопатии, удар, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, церебральный паралич), нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, лобно-височную деменцию) и большое число дисфункций центральной нервной системы (например, депрессию, эпилепсию и шизофрению).
Гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) новорожденных представляет собой неврологическое расстройство, вызывающее повреждение клеток в головном мозге новорожденных вследствие неадекватного снабжения кислородом. Гипоксия и ишемия головного мозга вследствие системной гипоксемии и уменьшенного церебрального кровотока (CBF - cerebral blood flow) является основной причиной, ведущей к ГИЭ новорожденных, сопровождающейся повреждениями серого и белого вещества, происходящими у новорожденных. ГИЭ новорожденных может вызвать смерть в период новорожденности или привести в результате к явлениям, впоследствии распознаваемым как задержка развития, задержка умственного развития или церебральный паралич (ЦП). Даже, несмотря на то, что в недавнее время разработаны различные терапевтические стратегии, ГИЭ новорожденных остается серьезным состоянием, вызывающим значительную смертность и заболеваемость у недоношенных и доношенных новорожденных и, следовательно, остается проблемой для перинатальной медицины.
В течение последних нескольких лет модель гипоксически-ишемического повреждения головного мозга на крысах стала чаще всего применяемой моделью в перинатальной медицине. На сутки 7 после рождения (Р7; сутки рождения = Р1) головной мозг крыс гистологически подобен головному мозгу плода человека на 32-34 неделе беременности или новорожденного ребенка, то есть формирование нейронного слоя коры головного мозга завершено, происходит инволюция зародышевого матрикса, и произошла небольшая миелинизация белого вещества. Чтобы вызвать гипоксически-ишемическое повреждение головного мозга у крысят 7-дневного возраста, проводят одностороннюю лигатуру головной артерии с последующей системной гипоксией, полученной в результате вдыхания 8% баланса кислорода/азота при постоянной температуре (37°С) (Vanucci et al. 2005. Dev Neurosci, vol. 27, 81-86).
Доказано, что модель на крысах обеспечивает важную информацию, касающуюся механизмов, лежащих в основе перинатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга, а также о том, как можно предотвратить или свести к минимуму повреждение тканей посредством терапевтического вмешательства. В частности, к модели перинатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга у крысят применены физиологические и терапевтические манипуляции, чтобы оценить потенциальные способы лечения, включающие гипотермию, обработку ксеноном и введение эритропоэтина.
Перспективные нейропротективные агенты включают противоэпилептические лекарственные средства, эритропоэтин, мелатонин и ксенон. Кроме того, данные, полученные на моделях асфиксии на животных, позволяют предположить, что неврологический исход после ГИЭ можно улучшить путем добавления вспомогательных терапий к гипотермии, начиная в течение от часов до суток после поражения. Теперь эти перспективные способы лечения необходимо оценивать в клинических испытаниях. Клинические исследования фазы 1-2 с использованием биомаркерных результатов, например, фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии, и включающие небольшое число новорожденных, являются ключевыми для оценки безопасности и потенциальной эффективности, прежде чем новые способы лечения принимают к практическим клиническим испытаниям. Испытания фазы 1-2 ксенона и эритропоэтина уже планируются или проходят.
Способы терапии неврологических расстройств, в частности, повреждений ЦНС или нейродегенеративных заболеваний, могут быть основаны на защите от повреждения головного или спинного мозга или восстановлении активности нервных клеток, например, посредством применения нейротрофических факторов. Нейротрофические факторы, такие как, например, эпидермальный фактор роста (EGF - epidermal growth factor) и трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α - transforming growth factor), представляют собой полипептиды, которые разнообразными путями поддерживают выживание, пролиферацию, дифференциацию, размер и функцию нервных клеток. Лечение неврологических расстройств может также включать введение стволовых клеток для замены нервных клеток, утраченных в результате естественной гибели клеток, повреждения или заболевания.
Проблемой, с которой сталкиваются при введении таких нейротрофических факторов или стволовых клеток, является гематоэнцефалический барьер, который может препятствовать их переносу из кровотока в ЦНС. Следовательно, терапевтические методы часто требуют прямого применения нейротрофического фактора или инфузии стволовых клеток в место травмы или повреждения ЦНС у субъекта, нуждающегося в таком лечении.
С учетом малочисленности успешных способов лечения неврологических расстройств в целом, существует потребность в дополнительных терапевтических агентах и способах, предпочтительно не основанных на инвазивных внутричерепных способах, или в веществах, обладающих улучшенным прохождением через гематоэнцефалический барьер.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на одну или более обсуждаемых выше потребностей в данной области техники.
Как показано в экспериментальном разделе, авторы изобретения обнаружили, что определенные эстрогенные компоненты, примером которых является эстетрол, обладают нейропротективными эффектами. Например, авторы изобретения неожиданно продемонстрировали, что получение крысятами эстетрола защищало их от повреждения головного мозга вследствие гипоксии-ишемии. Также примечательно, что, как было показано, получение крысятами определенных эстрогенных компонентов, примером которых является эстетрол, после (то есть впоследствии) гипоксии-ишемии приводит в результате к меньшему повреждению головного мозга, что подтверждает, что данные соединения проявляют благоприятные терапевтические эффекты. Кроме того, было показано, что получение крысятами определенных эстрогенных компонентов, примером которых является эстетрол, стимулирует нейрогенез и васкулогенез.
Эстетрол (Е4) представляет собой эстрогенное стероидное вещество, синтезируемое исключительно фетальной печенью во время беременности у женщин и попадающее в кровообращение матери через плаценту. Вещество обнаруживается в моче матери уже на 9 неделе беременности, постепенно возрастая по мере увеличения срока беременности (Holinka et al. 2008. J Steroid Biochem Mol Biol, vol. 1 10, 138-143). Неконъюгированный E4 также обнаруживается в амниотической жидкости. Эстетрол является основным метаболитом эстрадиола (Е2), образованного из его предшественников в результате гидроксилирования.
Считают, что Е4 менее эффективен по сравнению с Е2 в связи с его низким сродством связывания с рецептором эстрогена по сравнению с Е2. В исследованиях конкурентного связывания выявлено низкое сродство связывания Е4 с ядерным и цитоплазматическим рецепторами эстрогена относительно сродства Е2, показывающее значения связывания с цитоплазматическим рецептором эстрогена 1,0 и 0,015 для Е2 и Е4 соответственно (Holinka et al., см. выше). Е4 действует как слабый эстроген при стимуляции роста культивируемых клеток MCF-7, реагирующих на эстроген, по сравнению с Е2: было показано, что эффективность Е2 в 50 раз выше, чем Е4.
В Warmerdam et al. 2008 (Climacteric, vol. 11 (suppl. 1), 59-63) раскрыт коэффициент распределения этанол/вода (Pow - octanol-water partition), который является мерой липофильных или гидрофильных свойств соединения, выраженный в виде логарифма Pow или “Pow Log“, эстетрола, Pow Log=1,47 или 1,695 в зависимости от условий эксперимента. Поскольку Pow Log, равный 2,0, считают оптимальным, чтобы дать возможность прохождения соединений через гематоэнцефалический барьер (Warmerdam et al. 2008, см. выше), сильное нейропротективное действие эстетрола в крысиной модели ГИЭ новорожденных удивительно.
Недавние фармакологические и клинические данные подтверждают потенциальное клиническое применение Е4 для таких применений, как гормонотерапия, контрацепция, предупреждение остеопороза и менопаузальных горячих приливов, терапия рака и лечение или предупреждение сердечно-сосудистых патологий. Насколько известно, эффекты эстрогенных компонентов, иллюстративным примером которых является Е4, в центральной нервной системе до сих пор не описаны.
Соответственно, в аспекте изобретения предложен эстрогенный компонент, выбранный из группы, состоящей из следующих веществ:
эстрогенных веществ, имеющих формулу (I):
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
где R, R, R, R каждый независимо представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где каждый из R, R, R представляет собой гидроксильную группу; и где не более чем 3 из R, R, R, R представляют собой атомы водорода;
предшественников эстрогенных веществ; и
смесей одного или более эстрогенных веществ и/или предшественников;
для применения при лечении неврологического расстройства.
Предпочтительно в изобретении предложен эстрогенный компонент, выбранный из группы, состоящей из следующих веществ:
эстрогенных веществ, имеющих формулу (I):
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
где R, R, R, R каждый независимо представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где каждый из R, R, R представляет собой гидроксильную группу; и где не более чем 3 из R, R, R, R представляет собой атомы водорода;
предшественников эстрогенных веществ, являющихся производными эстрогенных веществ, в которых атом водорода по меньшей мере одной из гидроксильных групп замещен ацильным радикалом углеводородной карбоновой, сульфоновой или сульфаминовой кислоты имеющим от 1 до 25 атомов углерода; тетрагидрофуранил; тетрагидропиранил; либо гликозидный остаток с прямой или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 20 гликозидных звеньев на остаток; и
смесей одного или более эстрогенных веществ и/или предшественников;
для применения при лечении неврологического расстройства.
В изобретении также предложен способ лечения неврологического расстройства у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение этому пациенту терапевтически эффективного количества эстрогенного компонента, раскрытого в настоящем изобретении.
В изобретении также предложено применение эстрогенного компонента, раскрытого в настоящем изобретении, для получения лекарственного средства для лечения неврологического расстройства.
3
3
В предпочтительных воплощениях изобретения R представляет собой гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода, более предпочтительно R представляет собой гидроксильную группу.
1
2
3
4
1
2
4
В предпочтительных воплощениях изобретения по меньшей мере 2, более предпочтительно 3 из R, R, R и R представляет собой атомы водорода. В особенно предпочтительных воплощениях изобретения радикалы R, R и R представляют собой атомы водорода.
3
3
1
2
4
В определенных воплощениях изобретения R представляет собой гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода, более предпочтительно R представляет собой гидроксильную группу, и по меньшей мере 1, более предпочтительно по меньшей мере 2 и еще более предпочтительно все 3 группы R, R и R представляют собой атомы водорода.
1
2
4
3
5
6
7
В следующих предпочтительных воплощениях изобретения R, R и Rпредставляют собой атомы водорода, a R, R, R и R представляют собой гидроксильные группы; следовательно, эстрогенное вещество или эстрогенный компонент представляет собой 1,3,5(10)-эстратриен-3,15,16,17-тетрол. В особенно предпочтительном воплощении изобретения эстрогенное вещество или эстрогенный компонент представляет собой 1,3,5(10)-эстратриен-3,15α,16α,17β-тетрол (эстетрол).
В предпочтительных воплощениях изобретения предшественники представляют собой производные эстрогенных веществ, где атом водорода по меньшей мере одной из гидроксильных групп замещен ацильным радикалом углеводородной карбоновой, сульфоновой или сульфаминовой кислоты, имеющим от 1 до 25 атомов углерода; тетрагидрофуранил; тетрагидропиранил; либо гликозидным остатком с прямой или разветвленной цепью, содержащим 1-20 гликозидных звеньев на остаток.
Как отмечено, в настоящем изобретении предложен эстрогенный компонент, раскрытый в настоящем изобретении, применяемый при лечении неврологического расстройства.
В предпочтительных воплощениях изобретения в изобретении предложен эстрогенный компонент, раскрытый в настоящем изобретении, применяемый при терапевтическом лечении неврологического расстройства, то есть при лечении неврологического расстройства, где эстрогенный компонент вводят субъекту, у которого диагностировано неврологическое расстройство.
Под термином “неврологическое расстройство“ обычно подразумевают расстройство, поражающее нервную систему, включая центральную нервную систему и периферическую нервную систему.
В предпочтительных воплощениях изобретения неврологическое расстройство представляет собой повреждение, предпочтительно повреждение центральной нервной системы, более предпочтительно повреждение головного мозга, либо представляет собой нейродегенеративное заболевание. Предпочтительно неврологическое расстройство, таким образом, выбрано из группы, включающей повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга и нейродегенеративное заболевание, или состоящей из этих расстройств. Более предпочтительно неврологическое расстройство выбрано из группы, включающей повреждение головного мозга и нейродегенеративное заболевание, или состоящей из этих расстройств.
В предпочтительных воплощениях изобретения неврологическое расстройство выбрано из группы, включающей гипоксическое повреждение головного мозга, аноксическое повреждение головного мозга, травматическое повреждение головного мозга, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, или состоящей из этих расстройств.
В определенных воплощениях изобретения болезнь Альцгеймера представляет собой болезнь Альцгеймера ранней стадии, то есть доклинической стадии, или самые ранние клинические стадии болезни Альцгеймера.
В определенных воплощениях изобретения болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона ранней стадии без деменции или болезнь Паркинсона с умеренными когнитивными нарушениями.
Под терминами “гипоксическое повреждение“ или “аноксическое повреждение“ в данном изобретении подразумевают повреждение головного мозга в результате кислородного голодания, за счет либо гипоксического (то есть уменьшенного снабжения головного мозга кислородом), либо аноксического (то есть полного отсутствия поступления кислорода к головному мозгу) механизма соответственно. Гипоксические/аноксические повреждения могут поражать локализованную область (области) головного мозга или весь головной мозг. В определенных предпочтительных воплощениях изобретения гипоксические/аноксические/травматические повреждения головного мозга поражают по меньшей мере гиппокамп или кору головного мозга, например, по меньшей мере гиппокамп и кору головного мозга, предпочтительно по меньшей мере гиппокамп.
В предпочтительных воплощениях изобретения неврологическое расстройство представляет собой гипоксически-ишемическую энцефалопатию (ГИЭ).
Под терминами “гипоксически-ишемическая энцефалопатия“ или “ГИЭ“ в данном изобретении конкретно подразумевают состояние, встречающееся, когда весь головной мозг лишен адекватного снабжения кислородом, но это лишение является неполным. Неадекватное снабжение кислородом может быть гипоксическим по происхождению, то есть вследствие сниженного доступа кислорода, и/или ишемическим по происхождению, то есть вследствие кислородного голодания в результате прерывания кровотока. В определенных предпочтительных воплощениях изобретения ГИЭ поражает по меньшей мере гиппокамп или кору головного мозга, например, по меньшей мере гиппокамп и кору головного мозга, предпочтительно по меньшей мере гиппокамп.
В особенно предпочтительных воплощениях изобретения эстрогенный компонент, раскрытый в данном изобретении, применяют для лечения гипоксически-ишемической энцефалопатии (ГИЭ) новорожденных.
Как употреблено в данном описании, выражение “лечение ГИЭ новорожденных“ может включать защиту от повреждения головного мозга, и может дополнительно включать предупреждение, ослабление симптомов, облегчение ассоциированных симптомов или уменьшение степени расстройств, относящихся к ГИЭ новорожденных, таких как, например, задержка развития, задержка умственного развития или церебральный паралич (ЦП) (ослабление ЦП включает, например, улучшение двигательной, поведенческой и/или когнитивной функции). Как употреблено в данном описании, термин “церебральный паралич“ относится к группе состояний, характеризующихся хроническими расстройствами движения или позы. Церебральный паралич может сопровождаться судорожными расстройствами, сенсорными нарушениями и/или когнитивными ограничениями.
Описанные выше и дополнительные аспекты, предпочтительные воплощения и признаки изобретения раскрыты в приведенных ниже разделах и в прилагаемой формуле изобретения. Каждый аспект, воплощение или признак изобретения, раскрытый в данном описании, можно объединять с любым другим аспектом (аспектами), воплощением (воплощениями) или признаком (признаками) изобретения, если нет явных противоречащих указаний. В частности, любой признак, указанный в данном описании, и, в частности, любой признак, указанный как предпочтительный или преимущественный, может быть объединен с любым другим признаком (признаками), указанным в данном описании, и, в частности, с любым признаком, указанным как предпочтительный или преимущественный. Сущность прилагаемой формулы изобретения, таким образом, конкретно включена в данное описание.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Послеоперационные массы тела крысят. Послеоперационные массы тела крысят, которым инъецировали интраперитонеально с суток 4 по сутки 7 включительно после рождения: носитель (физиологический раствор) (Носитель), либо 5 мг/кг Е4 (Е4 5 мг/кг) или 50 мг/кг Е4 (Е4 50 мг/кг), либо не инъецировали (ложнооперированные). Показано среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) масс тела 7 крысят из группы ложнооперированных, 11 крысят из группы носителя, 7 крысят из группы Е4 5 мг/кг и 5 крысят из группы Е4 50 мг/кг.
Фиг. 2. Масса головного мозга крысят. Масса головного мозга крысят, которым инъецировали интраперитонеально с суток 4 по сутки 7 включительно после рождения: носитель (физиологический раствор) (Носитель), либо 5 мг/кг Е4 (Е4 5 мг/кг) или 50 мг/кг Е4 (Е4 50 мг/кг), либо не инъецировали (ложнооперированные). Показано среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) после умерщвления на сутки 14 после доставки 7 крысят из группы ложнооперированных, 11 крысят из группы носителя, 7 крысят из группы Е4 5 мг/кг и 5 крысят из группы Е4 50 мг/кг. Масштабная полоска: 2 мм.
Фиг. 3. Окрашивание гематоксилином-эозином срезов головного мозга области гиппокампа крысят. Головной мозг крысят извлекали после умерщвления на сутки 14 после доставки и фиксировали параформальдегидом, и образцы, заключенные в парафин, обрабатывали для получения срезов области гиппокампа и окрашивания гематоксилином-эозином. Крысятам инъецировали интраперитонеально с суток 4 по сутки 7 включительно после рождения: носитель (физиологический раствор) (Носитель), либо 5 мг/кг Е4 (Е4 5 мг/кг) или 50 мг/кг Е4 (Е4 50 мг/кг), либо не инъецировали (ложнооперированные).
Фиг. 4. Подсчет интактных клеток в срезах головного мозга крысят, окрашенных гематоксилином-эозином. Интактные клетки считали в гиппокампе в зоне зубчатой извилины (DG - dentate gyrus zone), субгранулярной зоне (SGZ - subgranular zone) и зоне Аммонова рога (СА1, СА2/СА3 - cornu ammonis) и в коре головного мозга на срезах головного мозга крысят, окрашенных гематоксилином-эозином. Интактные клетки считали при увеличении 400× в 3 полях соответствующей области головного мозга, и среднее выражали как число интактных клеток в поле зрения. Показано среднее ± SEM числа интактных клеток/поле зрения 7 крысят из группы ложнооперированных, 11 крысят из группы носителя, 7 крысят из группы Е4 5 мг/кг и 5 крысят из группы Е4 50 мг/кг.
Фиг. 5. Послеоперационные массы тела крысят, которые предварительно получали эстетрол. На каждые указанные сутки после рождения (ось X) 6 столбиков представляют собой, слева направо, послеоперационную массу тела (в г) крысят, которые были соответственно: не инъецированы ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=24), инъецированы интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения: носителем (группа носителя, n=14), инъецированы интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения 1 мг/кг Е4 (n=11), инъецированы интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения 5 мг/кг Е4 (n=14), инъецированы интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения 10 мг/кг Е4 n=(14) или инъецированы интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения 50 мг/кг Е4 (n=19). На сутки 7 после рождения, через 30 минут после последней инъекции крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. Ложнооперированных крысят подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения. Измерения выражены в виде среднего ± SEM.
Фиг. 6. Масса головного мозга крысят, которые предварительно получали эстетрол. Масса головного мозга (в г) крысят, которые не были инъецированы ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=24), или инъецированы интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения носителем (группа носителя, n=14), 1 мг/кг Е4 (n=11), 5 мг/кг Е4 (n=14), 10 мг/кг Е4 (n=14) или 50 мг/кг Е4 (n=19). На сутки 7 после рождения, через 30 минут после последней инъекции, крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. Ложнооперированных животных подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения. Измерения выражены в виде среднего ± SEM.
Фиг. 7. Окрашивание гематоксилином-эозином коронарных срезов головного мозга и подсчет интактных клеток у крысят, предварительно получавших эстетрол. Крысят (а) не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=14), либо инъецировали интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения: (b) носителем (группа носителя, n=16), (с) 1 мг/кг Е4 (n=10), (а) 5 мг/кг Е4 (n=13), (е) 10 мг/кг Е4 n=(10) или (f) 50 мг/кг Е4 (n=14). На сутки 7 после рождения, через 30 минут после последней инъекции, крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. Ложнооперированных животных подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения. Головной мозг извлекали после умерщвления на сутки 14 после рождения и фиксировали формальдегидом, и из образцов головного мозга, заключенных в парафин, получали коронарные срезы в области гиппокампа. Показано окрашивание гематоксилином-эозином (А) коронарных срезов головного мозга (масштабная полоска: 2 мм), (В) области гиппокампа (масштабная полоска: 100 мкм) и (С) коры головного мозга (масштабная полоска: 100 мкм) подопытных групп. (D) Интактные клетки подсчитывали в гиппокампе в зоне зубчатой извилины (DG), субгранулярной зоне (SGZ) и зоне Аммонова рога (СА1, СА2/СА3) и в коре головного мозга на коронарных срезах головного мозга крысят, окрашенных гематоксилином-эозином. Интактные клетки считали при увеличении 400× в 3 полях соответствующей области головного мозга, и среднее выражали как число интактных клеток в поле зрения. Для каждой указанной области головного мозга крысят (DG, SGZ, СА1, СА2/3, кора головного мозга на оси X) 6 столбиков представляют собой, слева направо, число интактных клеток в поле зрения, соответственно, крысят группы ложнооперированных, группы носителя, крысят, получавших 1 мг/кг Е4, крысят, получавших 5 мг/кг Е4, крысят, получавших 10 мг/кг Е4, или крысят, получавших 50 мг/кг Е4. Все измерения показаны в виде среднего ± SEM.
Фиг. 8. Окрашивание коронарных срезов головного мозга белком 2, ассоциированным с микротрубочками (МАР2 - microtubule-associated protein 2), крысят, предварительно получавших эстетрол. Крысят (а) не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных), либо инъецировали интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения (b) носителем (группа носителя), (с) 1 мг/кг Е4, (d) 5 мг/кг Е4, (е) 10 мг/кг Е4 или (f) 50 мг/кг Е4. На сутки 7 после рождения, через 30 минут после последней инъекции, крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. Ложнооперированных животных подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения. Головной мозг извлекали после умерщвления на сутки 14 после рождения и фиксировали формальдегидом, и из образцов головного мозга, заключенных в парафин, получали коронарные срезы в области гиппокампа. Для обнаружения нарушений цитоскелета нейронов срезы обрабатывали иммунологическим окрашиванием с антителом к МАР2. (А) Показано окрашивание МАР2 коронарных срезов головного мозга (масштабная полоска: 2 мм). (В) Долю МАР2-положительных областей вычисляли как площадь МАР2-положительной области ипсилатерального полушария, деленную на площадь МАР2-положительной области контралатерального полушария. Было проанализировано 10 образцов из каждой подопытной группы. Долю МАР2-положительной области в группе ложнооперированных по умолчанию считали равной 1.
Фиг. 9. Окрашивание даблкортином (DCX - Doublecortine) и фактором роста эндотелия сосудов (VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor) в гиппокампе и коре головного мозга крысят, предварительно получавших эстетрол. Крысят не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных), либо инъецировали интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения носителем (группа носителя), 1 мг/кг Е4, 5 мг/кг Е4, 10 мг/кг Е4 или 50 мг/кг Е4. На сутки 7 после рождения, через 30 минут после последней инъекции, крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. Ложнооперированных животных подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения. Головной мозг извлекали после умерщвления на сутки 14 после рождения и фиксировали формальдегидом, и из образцов головного мозга, заключенных в парафин, получали коронарные срезы в области гиппокампа. Срезы подвергали двойному окрашиванию антителом к DCX и антителом к VEGF. Процент клеток, положительных по DCX (А) и VEGF (В), количественно определяли как сумму клеток, положительно окрашенных либо DCX, либо VEGF, деленную на суммарное число клеток, положительно окрашенных 4',6-диамидин-2-фенилиндолом (ДАПИ). Количественные определения проводили в различных областях гиппокампа ((зубчатой извилины (DG), Аммонова рога (СА1), Аммонова рога 2/3 (СА2/СА3)) и в коре головного мозга. Было проанализировано 10 образцов в группах ложнооперированных, 1 мг/кг Е4, 5 мг/кг Е4, 10 мг/кг Е4, 50 мг/кг Е4 и сравнивали с 12 образцами из группы носителя. Для каждой указанной области головного мозга (DG, СА1, СА2/3, кора головного мозга на оси X) 6 столбиков представляют собой, слева направо, процент клеток, положительных по DCX (А) или VEGF (В), соответственно, в группе ложнооперированных, в группе носителя, в группе 1 мг/кг Е4, в группе 5 мг/кг Е4, в группе 10 мг/кг Е4 или в группе 50 мг/кг Е4. Все измерения показаны в виде среднего ± SEM.
Фиг. 10. Экспрессия S100B и глиофибриллярного кислого белка (GFAP - Glial Fibrillary Acidic Protein) в сыворотке крови крысят, предварительно получавших эстетрол. Крысят не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=20 и n=21 для S100B и GFAP, соответственно), или инъецировали интраперитонеально с суток 4 до суток 7 включительно после рождения носителем (группа носителя, n=13 и n=15 для S100B и GFAP, соответственно), 1 мг/кг Е4 (n=10 и n=11 для S100B и GFAP, соответственно), 5 мг/кг Е4 (n=11 и n=11 для S100B и GFAP, соответственно), 10 мг/кг Е4 (n=13 и n=10 для S100B и GFAP, соответственно) или 50 мг/кг Е4 (n=19 и n=18 для S100B и GFAP, соответственно). На сутки 7 после рождения, через 30 минут после последней инъекции, крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. Ложнооперированных животных подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения. Образцы крови брали после умерщвления на сутки 14 после рождения. Для исследования концентрации S100B (А) и GFAP (В) в сыворотке крови проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) на белки S100B и GFAP. Все измерения показаны в виде среднего ± SEM.
Фиг. 11. Послеоперационная масса тела крысят, которые получали эстетрол. На сутки 7 после рождения крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. После вывода из гипоксии крысят инъецировали интраперитонеально однократной дозой носителя (группа носителя, n=20), 1 мг/кг Е4 (n=16), 5 мг/кг Е4 n=19), 10 мг/кг Е4 (n=17) или 50 мг/кг Е4 (n=15). Ложнооперированных животных подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения и не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=29). На каждые указанные сутки после рождения (ось X) 6 столбиков представляют собой, слева направо, послеоперационную массу тела (в г) крысят, соответственно, из группы ложнооперированных, группы носителя, группы 1 мг/кг Е4, группы 5 мг/кг Е4, группы 10 мг/кг Е4 или группы 50 мг/кг Е4. Измерения выражены в виде среднего ± SEM.
Фиг. 12. Масса головного мозга крысят, получавших эстетрол. На сутки 7 после рождения крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. После вывода из гипоксии крысят инъецировали интраперитонеально однократной дозой носителя (группа носителя, n=20), 1 мг/кг Е4 (n=16), 5 мг/кг Е4 n=19), 10 мг/кг Е4 (n=17) или 50 мг/кг Е4 (n=15). Ложнооперированных животных подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения, и их не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=29). Показана масса головного мозга крысят (в г). Измерения выражены в виде среднего ± SEM.
Фиг. 13. Окрашивание гематоксилином-эозином коронарных срезов головного мозга и подсчет интактных клеток у крысят, которые получали эстетрол. На сутки 7 после рождения крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. После вывода из гипоксии крысят инъецировали интраперитонеально однократной дозой (b) носителя (группа носителя, n=10), (с) 1 мг/кг Е4 (n=10), (а) 5 мг/кг Е4 (n=10), (е) 10 мг/кг Е4 (n=10) или (f) 50 мг/кг Е4 (n=10). Ложнооперированных животных (а) подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения и не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=10). Головной мозг извлекали после умерщвления на сутки 14 после рождения и фиксировали формальдегидом, и образцы, заключенные в парафин, обрабатывали для получения коронарных срезов в области гиппокампа с последующим окрашиванием гематоксилином-эозином. Показано окрашивание гематоксилином-эозином (А) коронарных срезов головного мозга (масштабная полоска: 2 мм), (В) области гиппокампа (масштабная полоска: 100 мкм) и (С) коры головного мозга (масштабная полоска: 100 мкм). (D) Интактные клетки подсчитывали в различных областях гиппокампа: зубчатой извилины (DG), субгранулярной зоны (SGZ) и Аммонова рога (СА1, СА2/СА3) и в коре головного мозга на срезах головного мозга, окрашенных гематоксилином-эозином. Интактные клетки подсчитывали при увеличении 400х в 3 полях зрения соответствующей области головного мозга, и среднее значение выражено в виде числа интактных клеток на поле зрения. Для каждой указанной области головного мозга (DG, SGZ, СА1, СА2/3, кора головного мозга на оси X) 6 столбиков представляют собой, слева направо, число интактных клеток на поле зрения крысят, соответственно, из группы ложнооперированных, группы носителя, крысят, получавших 1 мг/кг Е4, крысят, получавших 5 мг/кг Е4, крысят, получавших 10 мг/кг Е4, или крысят, получавших 50 мг/кг Е4. Все измерения показаны в виде среднего ± SEM.
Фиг. 14. Окрашивание коронарных срезов головного мозга белком 2, ассоциированным с микротрубочками (МАР2), крысят, которые предварительно получали эстетрол. На сутки 7 после рождения крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. После вывода из гипоксии крысят инъецировали интраперитонеально однократной дозой (b) носителя (группа носителя, n=10), (с) 1 мг/кг Е4 (n=10), (а) 5 мг/кг Е4 (n=10), (е) 10 мг/кг Е4 (n=10) или (f) 50 мг/кг Е4 (n=10). Ложнооперированных животных (а) подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения и не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=10). Головной мозг извлекали после умерщвления на сутки 14 после рождения и фиксировали формальдегидом, и из образцов головного мозга, заключенных в парафин, получали коронарные срезы в области гиппокампа. Для обнаружения нарушений цитоскелета нейронов срезы иммунологически окрашивали с антителом к МАР2. (А) Показано окрашивание МАР2 коронарных срезов головного мозга (масштабная полоска: 2 мм). (В) Долю МАР2-положительных областей вычисляли как площадь МАР2-положительной области ипсилатерального полушария, деленную на площадь МАР2-положительной области контралатерального полушария. Было проанализировано 10 образцов из каждой подопытной группы. Долю МАР2-положительной области в группе ложнооперированных по умолчанию считали равной 1,0.
Фиг. 15. Окрашивание даблкортином (DCX) и фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) в гиппокампе и коре головного мозга крысят, предварительно получавших эстетрол. На сутки 7 после рождения крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. После вывода из гипоксии крысят инъецировали интраперитонеально однократной дозой носителя (группа носителя, n=10), 1 мг/кг Е4 (n=10), 5 мг/кг Е4 (n=10), 10 мг/кг Е4 (n=10) или 50 мг/кг Е4 (n=10). Ложнооперированных животных (а) подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения и не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=10). Головной мозг извлекали после умерщвления на сутки 14 после рождения и фиксировали формальдегидом, и из образцов головного мозга, заключенных в парафин, получали коронарные срезы в области гиппокампа. Срезы подвергали двойному окрашиванию антителом к DCX и антителом к VEGF. Процент клеток, положительных по DCX (А) и VEGF (В), количественно определяли как сумму клеток, положительно окрашенных либо DCX, либо VEGF, деленную на суммарное число клеток, положительно окрашенных 4',6-диамидин-2-фенилиндолом (ДАПИ). Количественные определения проводили в различных областях гиппокампа ((зубчатой извилины (DG), Аммонова рога (СА1), Аммонова рога 2/3 (СА2/CA3)) и в коре головного мозга. Было проанализировано 10 образцов для каждой подопытной группы. Для каждой указанной области головного мозга (DG, СА1, СА2/3, кора головного мозга на оси X) 6 столбиков представляют собой, слева направо, процент клеток, положительных по DCX (А) или VEGF (В), соответственно, в группе ложнооперированных, в группе носителя, в группе 1 мг/кг Е4, в группе 5 мг/кг Е4, в группе 10 мг/кг Е4 или в группе 50 мг/кг Е4. Все измерения показаны в виде среднего ± SEM.
Фиг. 16. Экспрессия S100B и глиофибриллярного кислого белка (GFAP) в сыворотке крови крысят, которые получали эстетрол. На сутки 7 после рождения крысят подвергали гипоксически-ишемическому повреждению. После вывода из гипоксии крысят инъецировали интраперитонеально однократной дозой носителя (группа носителя, n=14 и n=16 для S100B и GFAP, соответственно)), 1 мг/кг Е4 (n=13 и n=15 для S100B и GFAP, соответственно), 5 мг/кг Е4 (n=16 и n=15 для S100B и GFAP, соответственно), 10 мг/кг Е4 (n=13 и n=13 для S100B и GFAP, соответственно) или 50 мг/кг Е4 (n=15 и n=14 для S100B и GFAP, соответственно). Ложнооперированных животных (а) подвергали таким же процедурам без гипоксически-ишемического повреждения и не инъецировали ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных, n=20 и n=21 для S100B и GFAP, соответственно). Образцы крови брали после умерщвления на 14 сутки после рождения. Для исследования концентраций S100B (А) и GFAP (В) в сыворотке крови проводили ELISA на белки S100B и GFAP. Все измерения показаны в виде среднего ± SEM.
Подробное описание изобретения
Как употреблено в данном описании, формы единственного числа включают ссылки как на единственное, так и на множественное число, если контекстом явным образом не продиктовано иное.
Термины “содержащий“, “содержит“ и “состоит из“, как употреблено в данном описании, являются синонимами терминов “включающий“, “включает“ или “содержащий“, “содержит“ и являются включительными или неограничивающими и не исключают дополнительных, не перечисленных членов, элементов или стадий способа. Термин также охватывает “состоящий из“ и “состоящий по существу из“.
Указание числовых интервалов конечными точками включает как все целые числа и доли, включенные в соответствующие диапазоны, так и указанные конечные точки.
Термин “приблизительно“, как используют в данном описании при ссылке на измеримое значение, такое как параметр, количество, временная продолжительность и тому подобное, понимают как включающий вариации и вне и от указанного значения, в частности, вариации +/-10% или менее, предпочтительно +1-5% или менее, более предпочтительно +/-1% или менее, и еще более предпочтительно +/-0,1% или менее вне и от указанного значения, если такие вариации целесообразны для осуществления раскрытого изобретения. Следует понимать, что значение, к которому относится модификатор “приблизительно“, само также конкретно и предпочтительно раскрыто.
Хотя термин “один или более“, как, например, один или более членов группы, сам по себе понятен, в качестве дополнительной иллюстрации, этот термин включает среди прочего ссылку на любой из указанных членов, либо на любые два или более из указанных членов, как, например, любое число указанных членов более 3, более 4, более 5, более 6 или более 7 и т.д., и вплоть до всех указанных членов.
Все документы, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в него посредством ссылки.
Если не указано иное, все термины, используемые при раскрытии изобретения, включая технические и научные термины, имеют значение, общеизвестное обычным специалистам в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. В качестве дополнительного руководства, определения терминов могут быть включены для лучшего понимания идеи настоящего изобретения. Когда определенные термины объяснены или определены в связи с конкретным аспектом или воплощением изобретения, такое обозначение подразумевают как применимое на протяжении всего описания, то есть также для других аспектов или воплощений изобретения, если не указано иное, или если контекстом четко не продиктовано иное. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эстетрол и родственные эстрогенные компоненты обладают нейропротективными эффектами, как проиллюстрировано в достоверной модели гипоксически-ишемической энцефалопатии у новорожденных крысят. Авторами также выявлено, что эстетрол и родственные эстрогенные компоненты проявляют терапевтические эффекты, как показано в той же модели гипоксически-ишемической энцефалопатии новорожденных на крысах. Кроме того, ими обнаружено, что эстетрол и родственные эстрогенные компоненты индуцируют или стимулируют нейрогенез и васкулогенез в головном мозге крысят.
Как употреблено в данном описании, термин “эстрогенный компонент“ относится к эстрогенному веществу, раскрытому в данном изобретении, его предшественнику или к смеси одного или более эстрогенных веществ и/или предшественников.
В определенных воплощениях изобретения эстрогенный компонент выбран из группы, состоящей из следующих веществ:
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
эстрогенных веществ, имеющих формулу (I), где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой гидроксильную группу; где R представляет собой гидроксильную группу; где R представляет собой гидроксильную группу; и где не более 3 из R, R, R и R представляет собой атомы водорода;
предшественников эстрогенных веществ; и
смесей одного или более из эстрогенных веществ и/или предшественников.
В определенных воплощениях изобретения эстрогенный компонент выбран из группы, состоящей из следующих веществ:
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
эстрогенных веществ, имеющих формулу (I), где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой гидроксильную группу; где R представляет собой гидроксильную группу; где R представляет собой гидроксильную группу; и где по меньшей мере один из R, R, R и R представляет собой гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода;
предшественников эстрогенных веществ; и
смесей одного или более эстрогенных веществ и/или предшественников.
В воплощениях изобретения эстрогенный компонент выбран из группы, состоящей из:
эстрогенных веществ, имеющих формулу (III):
1
2
3
4
где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; где Rпредставляет собой атом водорода, гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода; и
1
2
3
4
где по меньшей мере один из R, R, R и R представляет собой гидроксильную группу или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 5 атомов углерода;
предшественников эстрогенных веществ; и
смесей одного или более эстрогенных веществ и/или предшественников.
1-5
1-5
1-5
1-5
a
a
Выражение “алкоксигруппа, имеющая от 1 до 5 атомов углерода“ может быть обозначено как “С-алкокси“ или “C-алкилокси“ и относится к радикалу, имеющему формулу: -OR, где R представляет собой C-алкил, как определено в данном описании. Неограничивающие примеры приемлемых C-алкилоксигрупп включают метилокси, этилокси, пропилокси, изопропилокси, бутилокси, изобутилокси, втор-бутилокси, трет-бутилокси и пентилокси.
Эстрогенные вещества, как раскрыто в настоящем изобретении, отличаются как от биогенных, так и от синтетических эстрогенов, обычно применяемых в фармацевтических препаратах, тем, что 5-членное кольцо в стероидном каркасе содержит вероятнее по меньшей мере 3 гидроксильных заместителя, чем 0-2.
Эстрогенные вещества также включают их стереоизомерные формы, их фармацевтически приемлемые соли присоединения, гидраты и сольваты.
5
6
7
Эстрогенные вещества, представленные формулами (I) и (III), включают различные энантиомеры, поскольку атомы углерода, несущие гидроксильные заместители, в частности, R, R и R, хирально активны. В предпочтительных воплощениях изобретения эстрогенное вещество является 15α-гидрокси-замещенным. В других предпочтительных воплощениях изобретения это вещество является 16α-гидрокси-замещенным. В других предпочтительных воплощениях изобретения это вещество является 17β-гидрокси-замещенным. Наиболее предпочтительно эстрогенные вещества являются 15α,16α,17β-гидрокси-замещенными. Другие хирально активные атомы углерода в стероидном каркасе эстрогенных веществ, как раскрыто в данном изобретении, предпочтительно имеют такую же конфигурацию, как соответствующие атомы углерода в 17β-эстрадиоле и других биогенных эстрогенах.
Предпочтительно эстрогенные вещества, как употреблено в данном описании, представляют собой, так называемые биогенные эстрогены, то есть эстрогены, естественно встречающиеся в организме человека. Поскольку биогенные эстрогены естественно присутствуют в организме плода и женщины, появление побочных эффектов не ожидается, особенно, если сывороточные уровни, являющиеся результатом экзогенного введения таких эстрогенов, существенно не превышают встречающихся в природе концентраций.
1
2
3
4
В предпочтительных воплощениях изобретения по меньшей мере один, более предпочтительно точно один из R, R, R, R представляет собой гидроксильную группу, что означает, что эстрогенное вещество содержит по меньшей мере 4, более предпочтительно точно 4 гидроксильные группы. В том случае, когда эстрогенное вещество содержит 4 гидроксильные группы, оно может быть также обозначено как тетрагидроксилированный эстроген.
Неограничивающими примерами коммерчески доступных эстрогенов, содержащих по меньшей мере 4 гидроксильные группы, или их предшественников являются: 1,3,5(10)-эстратриен-2,3,15α,16α,17β-пентол-2-метиловый эфир; 1,3,5(10)-эстратриен-2,3,15β,16α,17β-пентол-2-метиловый эфир; 1,3,5(10)-эстратриен-3,15α,16α,17β-тетрол; 1,3,5(10)-эстратриен-3,15α,16α,17β-тетрол тетраацетат; или 1,3,5(10)-эстратриен-3,15β,16β,17β-тетрол тетраацетат.
В особенно предпочтительных воплощениях изобретения эстрогенное вещество представляет собой 1,3,5(10)-эстратриен-3,15,16,17-тетрол.
В следующих особенно предпочтительных воплощениях изобретения эстрогенное вещество представляет собой эстетрол.
4
4
“Эстетрол“, “1,3,5(10)-эстратриен-3,15α,16α,17β-тетрол“ и “E” являются синонимами, и в данном описании их употребляют взаимозаменяемо как относящиеся к эстрогенному соединению, которое, как известно, продуцируется в природе только фетальной печенью человека во время беременности. Оно представляет собой тетрагидроксилированный эстроген, отличающийся присутствием четырех гидроксильных групп, следовательно, его сокращением является Е. Общая формула этого соединения представлена формулой (II):
Изобретение также включает применение предшественников эстрогенных веществ, как раскрыто в данном изобретении. Эти предшественники способны к высвобождению эстрогенных веществ, в частности, при применении в соответствии с изобретением, например, в результате метаболического преобразования. Предпочтительно эти предшественники являются производными эстрогенных веществ, где атом водорода по меньшей мере одной из гидроксильных групп замещен ацильным радикалом углеводородной карбоновой, сульфоновой или сульфаминовой кислоты, имеющим от 1 до 25 атомов углерода; тетрагидрофуранил; тетрагидропиранил; либо гликозидный остаток с прямой или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 20 гликозидных звеньев на остаток.
+
-
+
Неограничивающими примерами предшественников, которые можно целесообразно применять в соответствии с изобретением, являются сложные эфиры, которые могут быть получены путем взаимодействия гидроксильных групп эстрогенных веществ с веществами, содержащими одну или более карбоксигрупп (МООС), где Мпредставляет собой атом водорода или катион (щелочного) металла. Следовательно, особенно предпочтительными примерами предшественников являются производные эстрогенных веществ, где атом водорода по меньшей мере одной из гидроксильных групп в формуле (I), или (II), или (III) замещен -CO-R, где R представляет собой углеводородный радикал, содержащий 1-25 атомов углерода, предпочтительно R представляет собой атом водорода, либо алкильный, алкенильный, циклоалкильный или арильный радикал, содержащий 1-20 атомов углерода.
n
2n+1
1-5
1-5
Термин “алкил“, как группа или часть группы, в данном описании относится к нециклическому углеводородному радикалу формулы CH, где n представляет собой число в интервале от 1 до приблизительно 25. Предпочтительно алкильные группы, как подразумевают в данном описании, содержат от 1 до 20 атомов углерода, например, от 1 до 10 атомов углерода, от 1 до 5 атомов углерода, от 1 до 4 атомов углерода или от 1 до 3 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода. Алкильные группы могут быть нормальными или разветвленными и могут быть замещены, как указано в данном описании. В данном описании, где после атома углерода указан нижний индекс, этот нижний индекс относится к числу атомов углерода, которое может содержать названная группа. Так, например, C-алкил означает алкил из атомов углерода в количестве от одного до пяти. Примерами алкильных групп, в частности, C-алкильных групп, являются следующие группы: метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, 2-метилбутил, пентил, изоамил и его изомеры.
Термин “алкенил“, как группа или часть группы, относится к ненасыщенной углеводородной группе, которая может быть линейной или разветвленной, содержащей одну или более углерод-углеродную двойную связь. Алкенильные группы могут содержать по меньшей мере 2 атома углерода, например, от 2 до приблизительно 25 атомов углерода, и, как используют в данном описании, предпочтительно от 2 до приблизительно 20 атомов углерода, например, от 2 до 10 атомов углерода, от 2 до 5 атомов углерода, от 2 до 4 атомов углерода или от 2 до 3 атомов углерода. Примерами алкенильных групп являются следующие группы: этенил, 2-пропенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 2-пентенил и его изомеры, 2-гексенил и его изомеры, 2,4-пентадиенил и тому подобное.
Термин “циклоалкил“, как группа или часть группы, относится к насыщенному или частично ненасыщенному углеводородному радикалу, имеющему 1 (то есть к моноциклическому) или более, например, 2 (то есть к бициклическому) циклические структуры. Дополнительные кольца полициклических циклоалкильных радикалов могут быть либо конденсированными, либо связанными мостиковой связью и/или соединенными одним или более спиро-атомов. Циклоалкильные группы могут независимо содержать 3 или более атомов углерода в кольце, например, от 3 до 25 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 20 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода, например, 5, 6 или 7 атомов углерода. Предпочтительно циклоалкильные группы, как подразумевают в данном описании, относятся к моноциклическим циклоалкильным группам и содержат от 3 до 20 атомов углерода. Примеры моноциклических циклоалкильных радикалов включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и тому подобное.
Термин “арил“, как группа или часть группы, относится к полиненасыщенной, ароматической углеводородной группе, содержащей одно ароматическое кольцо (например, фенил) или множественные (например, два, три или четыре) ароматические кольца, конденсированные вместе (например, нафтил) или связанные ковалентно (например, дифенил). Арильные группы содержат по меньшей мере 6 атомов углерода, и предпочтительно от 6 до приблизительно 20 атомов углерода, более предпочтительно от 6 до 10 атомов углерода в кольце. Ароматическое кольцо в арильной группе может необязательно включать одно или два дополнительных кольца (циклоалкильных, гетероциклильных и/или гетероарильных), конденсированных с ним. Неограничивающие примеры арила включают фенил, дифенилил, 5- или 6-тетралинил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-азуленил, нафталин-1- или -2-ил, 4-, 5-, 6 или 7-инденил, 1-2-, 3-, 4- или 5-аценафтиленил, 3-, 4- или 5-аценафтенил, 1-, 2-, 3-, 4- или 10-фенантрил, 1- или 2-пенталенил, 4- или 5-инданил, 5-, 6-, 7- или 8-тетрагидронафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, 1,4-дигидронафтил, 1-, 2-, 3-, 4- или 5-пиренил.
Как отмечено, эстрогенные компоненты, как раскрыто в данном изобретении, полезны при лечении неврологических расстройств у субъектов.
Как употреблено в данном описании, термины “лечить“ или “лечение“ относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, где целью является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или расстройства, например, развития неврологического расстройства. Полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничены ими, предупреждение расстройства, снижение встречаемости расстройства, ослабление симптомов, обусловленных расстройством, уменьшение степени расстройства, стабилизацию (то есть не ухудшение) состояния расстройства, задержку или замедление прогрессирования расстройства, ослабление или облегчение состояния расстройства, ремиссию (либо частичную, либо полную), обнаруживаемую или необнаруживаемую, либо их комбинации. “Лечение“ может также означать продление жизни по сравнению с ожидаемым сроком жизни в отсутствие лечения.
В определенных воплощениях изобретения эстрогенные компоненты, как раскрыто в данном изобретении, можно применять для профилактического или превентивного лечения неврологического расстройства, то есть, где субъекту вводят эстрогенный компонент, когда у него не диагностировано (например, перед диагностикой) неврологическое расстройство. Например, субъекта могут считать обладающим риском приобретения/развития неврологического расстройства. Следовательно, такое лечение нацелено на предупреждение неврологического расстройства.
В предпочтительных воплощениях изобретения эстрогенные компоненты, как раскрыто в данном изобретении, можно применять для терапевтического лечения неврологического расстройства. Соответственно, в предпочтительных воплощениях изобретение относится к эстрогенному компоненту, как раскрыто в данном изобретении, применяемому при лечении неврологического расстройства, где эстрогенный компонент вводят субъекту, у которого диагностировано неврологическое расстройство. Следовательно, такое лечение нацелено на терапию существующего неврологического расстройства.
Как употреблено в данном описании, термины “терапевтическое лечение“ или “терапия“ и тому подобное относятся к способам лечения, целью которых является приведение организма субъектов или его элемента от нежелательного физиологического изменения или расстройства, такого как неврологическое расстройство, в желаемое состояние, такое как менее тяжелое или менее неблагоприятное состояние (например, ослабление или облегчение), или обратно к нормальному здоровому состоянию (например, восстановление здоровья, физической целостности или физического хорошего самочувствия субъекта), его поддержание (то есть отсутствии ухудшения) при данном нежелательном физиологическом изменении или расстройстве (например, стабилизации), либо предупреждение или замедление прогрессирования до более тяжелого или худшего состояния по сравнению с данным нежелательным физиологическим изменением или расстройством.
За исключением случаев, когда это отмечено, “субъект“ или “пациент“ употреблены взаимозаменяемо и относятся к животным, предпочтительно к теплокровным животным, более предпочтительно к позвоночным, еще более предпочтительно к млекопитающим, еще более предпочтительно к приматам, и конкретно включают пациентов-людей и млекопитающих и приматов, отличающихся от человека. Субъекты “млекопитающие“ относятся к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, и включают, но не ограничены ими, людей, домашних животных, коммерческих животных, сельскохозяйственных животных, животных зоопарков, спортивных животных, домашних питомцев и подопытных животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы; приматов, таких как высшие обезьяны, нечеловекообразные обезьяны, орангутаны и шимпанзе; псовых, таких как собаки и волки; кошачьих, таких как кошки, львы и тигры; непарнокопытных, таких как лошади, ослы и зебры; мясомолочный скот, такой как коровы, свиньи и овцы; копытных, таких как олени и жирафы; грызунов, таких как мыши, крысы, хомячки и морские свинки; и т.д. Предпочтительными пациентами являются люди.
Как употреблено в данном описании, такое выражение, как “субъект, нуждающийся в лечении“, включает субъектов, которые получили бы пользу от лечения, предпочтительно терапевтического лечения, указанного расстройства, в частности, неврологического расстройства. Такие субъекты могут включать без ограничения субъектов, у которых диагностировано данное расстройство, склонных к приобретению или развитию данного расстройства и/или субъектов, у которых нужно предупреждать данное расстройство. В частности, подразумевают пациентов, у которых диагностировано неврологическое расстройство, или пациентов, у которых нужно предупреждать неврологическое расстройство.
Как употреблено в данном описании, термин “диагноз“ относится к установлению и заключению, что субъект поражен указанным расстройством, в частности, неврологическим расстройством. Диагноз может быть основан на исследовании симптомов, обусловленных указанным расстройством (такой как, например, клинический диагноз). Альтернативно или дополнительно диагноз может быть поставлен до изучения симптомов (то есть доклинический диагноз), или в связи с тем, что симптомы являются слабыми и не подтверждающими указанное расстройство на основании, например, обнаружения биомаркеров, показательных для указанного расстройства, и/или способов визуализации.
Термин “терапевтически эффективное количество“, как используют в данном описании, относится к количеству эстрогенного компонента или фармацевтической композиции, как раскрыто в данном изобретении, эффективному для лечения неврологического расстройства у субъекта, то есть для получения локального или системного эффекта и проявления. Этот термин, таким образом, относится к количеству эстрогенного компонента или фармацевтической композиции, вызывающему биологический или клинический ответ в ткани, системе, у животного или у человека, ожидаемый исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом. В частности, этот термин относится к количеству эстрогенного компонента или фармацевтической композиции, как раскрыто в данном изобретении, необходимому для предупреждения, излечения, ослабления или по меньшей мере сведения к минимуму клинического ухудшения, симптомов или осложнений, обусловленных неврологическим расстройством, либо в однократной, либо в многократных дозах.
Как употреблено в данном описании, выражение “лечение неврологического расстройства“, такое как терапевтическое лечение неврологического расстройства, может включать защиту от повреждения головного мозга или его предупреждение, включающего нарушение целостности клеток головного мозга и/или утрату структуры или функции клеткой головного мозга, уменьшение степени повреждения головного мозга, отсутствие ухудшения повреждения головного мозга или восстановление после повреждения головного мозга, и может дополнительно включать индукцию или стимуляцию нейрогенеза и/или васкулогенеза.
В определенных воплощениях изобретения лечение неврологического расстройства, такое как терапевтическое лечение неврологического расстройства, включает защиту от повреждения головного мозга, уменьшение степени повреждения головного мозга, отсутствие ухудшения повреждения головного мозга или восстановление после повреждения головного мозга. В конкретных воплощениях изобретения терапевтическое лечение неврологического расстройства включает отсутствие ухудшения повреждения головного мозга или восстановление после повреждения головного мозга.
В воплощениях изобретения лечение неврологического расстройства, такое как терапевтическое лечение неврологического расстройства, включает стимуляцию нейрогенеза, васкулогенеза или нейрогенеза и васкулогенеза.
Неограничивающие примеры исследования повреждения головного мозга, нейрогенеза и васкулогенеза включают способы визуализации, в частности, способы нейровизуализации, а также обнаружение и измерение подходящих биологических маркеров, например, в сыворотке крови или в спинномозговой жидкости. Подходящие способы нейровизуализации включают магнитно-резонансную визуализацию (МРВ) и позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ). Подходящие биологические маркеры повреждения головного мозга включают, например, S100B и глиофибриллярный кислый белок (GFAP). Способы обнаружения и измерения биологических маркеров в жидкостях организма хорошо известны и включают, например, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA- enzyme-linked immunosorbent assays).
Как употреблено в данном описании, термин “неврологическое расстройство“ относится к любому неврологическому заболеванию, неврологическому состоянию, неврологическому поведению и/или любому симптому, связанному с этими расстройствами, влияющему на центральную нервную систему и/или на периферическую нервную систему.
Предпочтительно неврологическое расстройство может влиять на центральную нервную систему, включая головной мозг и спинной мозг, более предпочтительно оно может влиять по меньшей мере на головной мозг, еще более предпочтительно оно может влиять по меньшей мере на гиппокамп, например, по меньшей мере на гиппокамп и кору головного мозга.
Термины “гиппокамп“ и “гиппокампальная формация“ в данном изобретении употребляют как синонимы и относят к области головного мозга, локализованной в средней височной доле головного мозга, вовлеченной в память, а также в пространственную память и навигацию. Млекопитающие имеют два гиппокампа, на каждой стороне головного мозга, и этот термин охватывает оба гиппокампа. Как употреблено в данном описании, гиппокамп относится к зубчатой извилине (DG), Аммонову рогу (СА) и опорной структуре. Зубчатая извилина охватывает зубчатую фасцию гиппокампа, ворота, субгранулярную зону (SGZ), слой гранулярных клеток и молекулярный слой. Субгранулярная зона (SGZ) представляет собой узкий слой клеток, локализованный между слоем гранулярных клеток и воротами DG. Аммонов рог (СА) дифференцирован на поля Аммонова рога 1 (СА1), Аммонова рога 2 (СА2), Аммонова рога 3 (CA3) и Аммонова рога 4 (СА4). Неврологическое расстройство может влиять по меньшей мере на одну, более одной или на все эти области, например, в частности, по меньшей мере на одну, более одной или на все следующие области: зубчатую извилину, Аммонов рог 1, Аммонов рог 2, Аммонов рог 3 или субгранулярную зону.
Термины “кора“ и “кора головного мозга“ в данном изобретении употребляют как синонимы, и в целом они обозначают самый наружный слой нервной ткани головного мозга. Кора головного мозга может быть в целом видна как состоящая из сенсорных, моторных и ассоциативных областей.
Неврологическое расстройство может влиять на кору головного мозга, например, на любую область коры головного мозга, и, в частности, может влиять на первичную соматосенсорную кору головного мозга, более конкретно на первичную стволовую область первичной соматосенсорной коры головного мозга, присоединенную к первичной моторной коре головного мозга.
Неврологические расстройства, подлежащие лечению с применением эстрогенных компонентов или фармацевтических композиций, раскрытых в данном изобретении, могут включать дисфункцию и/или дегенерацию, повреждение или утрату нейронов. Предпочтительно неврологические расстройства, подлежащие лечению, включают дегенерацию, повреждение или утрату нейронов, такие как, в качестве примера и без ограничения, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга или нейродегенеративные заболевания.
Иллюстративные повреждения головного мозга включают, но не ограничены ими, гипоксические/аноксические повреждения головного мозга, включающие гипоксически-ишемическую энцефалопатию (ГИЭ), такую как предпочтительно ГИЭ новорожденных, и дополнительно ишемию головного мозга, либо удар, либо травматическое повреждение головного мозга.
Предпочтительно повреждение головного мозга, такое как гипоксическое повреждение головного мозга, аноксическое повреждение головного мозга или травматическое повреждение головного мозга, влияет по меньшей мере на гиппокамп, более предпочтительно повреждение головного мозга нарушает целостность клеток по меньшей мере в гиппокампе.
Иллюстративные повреждения спинного мозга и ассоциированных ганглиев включают, но не ограничены ими, постполиомиелитный синдром, травматическое повреждение, хирургическое повреждение или паралитические заболевания.
Под термином “нейродегенеративное заболевание или расстройство“ обычно подразумевают неврологическое расстройство, характеризующееся прогрессирующей утратой структуры или функции нейронов, включая гибель нейронов.
Предпочтительные иллюстративные нейродегенеративные заболевания включают, но не ограничены ими, заболевания, характеризующиеся прогрессирующей утратой структуры или функции нейронов в гиппокампе и/или коре головного мозга, такие как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), лобно-височная деменция (ЛВД) (охватывающая ряд состояний, включающих болезнь Пика, дегенерация лобной доли), боковой амиотрофический склероз (БАС); заболевания, характеризующиеся прогрессирующей утратой структуры или функции нейронов, включая гибель нейронов, в базальном ганглии (в частности, в субталамическом ядре, черной субстанции и бледном шаре), стволе головного мозга (в частности, в участке среднего мозга, отвечающем на надъядерное движение глазных яблок), зубчатом ядре мозжечка, например, прогрессирующий надъядерный паралич, стриатонигральную дегенерацию, кортикобазальную дегенерацию, оливопонтоцеребеллярную атрофию и тому подобное.
Другие примеры нейродегенеративных заболеваний включают, но не ограничены ими, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), лобно-височную деменцию (ЛВД), боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Гентингтона (БГ) и другие заболевания, обусловленные полиглутаминовой экспансией, болезнь Пика, прогрессирующий надъядерный паралич, стриатонигральную дегенерацию, кортикобазальную дегенерацию, оливопонтоцеребеллярную атрофию, болезнь Лея, инфантильную подострую некротическую энцефаломиопатию детей, болезнь Гунтера, мукополисахаридоз, различные лейкодистрофии (такие как болезнь Краббе, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера и тому подобное), амавротическую (семейную) идиотию, болезнь Куфса, болезнь Шпильмейера-Фогта, болезнь Тэя-Сакса, болезнь Баттена, болезнь Янского-Бильшовского, болезнь Рейе, церебральную атаксию, хронический алкоголизм, алиментарный полиневрит (бери-бери), синдром Галлервордена-Шпатца, церебеллярную дегенерацию и т.п.
Предпочтительно нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера (БА) или болезнь Паркинсона (БП).
При болезни Альцгеймера гиппокамп является одной из первых областей головного мозга, страдающих от повреждения (Hampel et al. 2008. Alzheimer & Dementia 4: 38-48). Эстрогенные компоненты или фармацевтические композиции, как раскрыто в данном изобретении, таким образом, в определенных воплощениях изобретения могут быть особенно подходящими для лечения, в частности, терапевтического лечения, субъектов на самых ранних стадиях БА, например, на доклинической стадии или на самых ранних клинических стадиях БА. Соответственно, в определенных предпочтительных воплощениях изобретения неврологическое расстройство, подлежащее лечению, представляет собой БА ранней стадии (то есть доклинической стадии или самой ранней клинической стадии БА).
Болезнь Паркинсона также коррелирует с повреждением гиппокампа. В частности, гиппокампальную атрофию наблюдали у пациентов с БП ранней стадии без деменции, проявляющих нарушенную память (Bruck et al. 2004. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75: 1467-1469), и у пациентов с БП, имеющих умеренные когнитивные нарушения или деменцию (Camicioli et al. 2003. Mov Disorder 18: 784-790). Соответственно, в определенных предпочтительных воплощениях изобретения неврологическое расстройство, подлежащее лечению, представляет собой БП ранней стадии без деменции или БП с умеренными когнитивными нарушениями (УКН).
Следующие предпочтительные иллюстративные неврологические расстройства, которые можно лечить применением эстрогенных компонентов или фармацевтических композиций, раскрытых в данном изобретении, могут включать, но не ограничены ими, следующие расстройства: демиелинизирующие аутоиммунные расстройства, такие как рассеянный склероз; неврологические дефициты, вызванные инфекцией воспалительных заболеваний или инфекционными вирусными заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), такие как СПИД-ассоциированная энцефалопатия, постэнцефалитический паркинсонизм, вирусный энцефалит, бактериальный менингит или другие ЦНС-эффекты инфекционных заболеваний; расстройства кортикальной сенсорной перцепции, такие как расстройства вестибулярной функции, расстройства равновесия и координации, головокружения, проблемы с походкой, дислексия, неуклюжесть, расстройства звуковой дискриминации и модуляции, проблемы со зрением, расстройства движения глазных яблок и координации или сенсорные нарушения как симптомы неврологических заболеваний; расстройства функции кишечника, такие как констипация или недержание; и расстройства контроля мочевого пузыря, такие как недержание мочи, как симптомы заболеваний ЦНС; дыхательные нарушения после церебрального паралича; расстройства автономной нервной функции, вызывающие аномальный прилив крови к коже, аномальную половую реакцию, эректильную дисфункцию, головные боли, боль в шее, боль в спине, энцефаломиелопатию в условиях травмы, постуральную ортостатическую тахикардию, ортостатическую неустойчивость, ортостатическую гипотензию, синкопе, неврогенную возбудимость кишечника и неврогенную возбудимость мочевого пузыря.
Иллюстративные неврологические расстройства, которые можно лечить применением эстрогенных компонентов или фармацевтических композиций, раскрытых в данном изобретении, могут включать, но не ограничены ими, следующие расстройства: демиелинизирующие аутоиммунные расстройства, такие как рассеянный склероз; неврологические дефициты, вызванные инфекцией воспалительных заболеваний, такие как Болезнь Крейцфельдта-Якоба, или другими инфекционными заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), вызванными вирусом с медленным инкубационным процессом, СПИД-ассоциированную энцефалопатию, постэнцефалитический паркинсонизм, вирусный энцефалит, бактериальный менингит или другие ЦНС-эффекты инфекционных заболеваний; расстройства кортикальной двигательной функции, такие как спастичность, парез, клонические судороги или гиперрефлексия; расстройства кортикальной сенсорной перцепции, такие как расстройства вестибулярной функции, расстройства равновесия и координации, головокружения, проблемы с походкой, дислексия, неуклюжесть, задержка развития, расстройства звуковой дискриминации и модуляции, расстройства, характеризующиеся замедленной и механической речью, проблемы со зрением, расстройства движения глазных яблок и координации или сенсорные нарушения; дисфункции нижних черепных нервов, такие как отсутствие координации между речью, глотанием или плавной артикуляцией; расстройства функции кишечника, такие как проблемы контроля нижнего пищеводного сфинктера; аномальное функционирование мочевого пузыря, такое как энурез, ночное недержание мочи, или расстройства контроля мочевого пузыря; дыхательные нарушения, такие как чрезмерный храп, обструктивное или центральное апноэ или аномальная дыхательная реакция на уровни кислорода и углекислого газа; нарушение дыхания во сне, такое как апноэ во сне, мышечная дисфункция или внезапная детская смертность; нарушения развития, такие как мальформация Арнольда-Киари; или врожденные заболевания, такие как синдром Дауна, мукополисахаридоз IV типа, спондилоэпифизарная дисплазия, ахондроплазия или остеогенез; неврологические поведенческие расстройства, такие как гиперактивное расстройство с дефицитом внимания, психологические проблемы, включающие тревогу, биполярное расстройство, шизофрению или депрессию, расстройства аутистического спектра, включающие аутизм, синдром Аспергера, и первазивные поведенческие расстройства без дополнительных уточнений; анатомические состояния, такие как платибазия, отогнутый назад одонтоид, базилярная инвагинация и стеноз большого затылочного отверстия; приобретенные остеомаляции, такие как рахит, болезнь Педжета или гиперпаратиреоз; метаболические костные расстройства; расстройства соединительной ткани, включающие расстройства, обусловленные гипермобильностью соединительной ткани, такие как синдром Эхлерса-Данлоса; цервико-медуллярный синдром; почечные, метаболические или эндокринные синдромы; расстройства автономной нервной функции, вызывающие аномальный прилив крови к коже, аномальную половую реакцию, гастроэзофагеальнорефлюксную болезнь (ГЭРБ), диспраксию, идиопатический сколиоз, головные боли, боль в шее, боль в спине, головную боль, энцефаломиелопатию в условиях травмы, неоплазию, позиционную ортостатическую тахикардию и бульбарные изменения.
Как показано в экспериментальном разделе, эстрогенные компоненты, как раскрыто в данном изобретении, оказывают терапевтические воздействия на повреждение головного мозга и стимулируют нейрогенез и васкулогенез после гипоксии-ишемии. Соответственно, эстрогенные компоненты или фармацевтические композиции, как раскрыто в данном изобретении, могут быть приемлемы для лечения гипоксического повреждения головного мозга, аноксического повреждения головного мозга и/или травматического повреждения головного мозга, где эстрогенный компонент или фармацевтическую композицию вводят после гипоксии, ишемии и/или травмы. В частности, эстрогенные компоненты или фармацевтические композиции, как раскрыто в данном изобретении, могут быть приемлемы для лечения гипоксически-ишемической энцефалопатии, такой как предпочтительно гипоксически-ишемическая энцефалопатия новорожденных, где эстрогенный компонент или фармацевтическую композицию вводят после гипоксии-ишемии (то есть терапевтического лечения ГИЭ). Предпочтительно эстрогенный компонент или фармацевтическую композицию вводят как можно раньше после гипоксии, ишемии, травмы или гипоксии-ишемии, например, в пределах 12 часов, 9 часов, или 6 часов после гипоксии, ишемии, травмы или гипоксии-ишемии, более предпочтительно в пределах 6 часов, например, в пределах 5 часов, 4 часов, 3 часов, 2 часов, 1 часа, 30 минут или 15 минут после гипоксии, ишемии, травмы или гипоксии-ишемии, субъектам, таким как субъекты-люди.
Как отмечено выше, эстрогенные компоненты или фармацевтические композиции, как раскрыто в данном изобретении, в частности могут также быть приемлемы для лечения БА. Например, эстрогенные компоненты или фармацевтические композиции, как раскрыто в данном изобретении, могут быть приемлемы для профилактического или превентивного лечения БА, где эстрогенный компонент или фармацевтическую композицию вводят женщинам в период менопаузы с семейной историей БА. Эстрогенные компоненты или фармацевтические композиции, как раскрыто в данном изобретении, могут также быть приемлемы для терапевтического лечения БА ранней стадии, где эстрогенный компонент или фармацевтическую композицию вводят пациенту, у которого диагностирована БА ранней стадии.
Диагноз БА ранней стадии может быть поставлен путем, например, нейровизуализации, такой как МРВ, в результате которой пациенты БА ранней стадии характеризуются атрофией гиппокампальной формации (Hampel et al. 2008, см. выше). Альтернативно или дополнительно диагноз БА ранней стадии может быть установлен на основании оценки биомаркеров, таких как, например, амилоид бета 42 (Аβ42), доля амилоида бета 40 (Аβ40), суммарный белок tau, гиперфосфорилированный белок tau, β-секретаза (ВАСЕ) или любая их комбинация, в спинномозговой жидкости (Hampel et al. 2008, см. выше).
Как отмечено выше, эстрогенные компоненты или фармацевтические композиции, как раскрыто в данном изобретении, в частности также могут быть приемлемы для лечения БП ранней стадии без деменции или БП с умеренными когнитивными нарушениями (УКН), более предпочтительно для терапевтического лечения БП ранней стадии без деменции или БП с умеренными когнитивными нарушениями, где эстрогенный компонент или фармацевтическую композицию вводят пациенту, у которого диагностирована БП ранней стадии без деменции, в частности, пациенту, у которого диагностирована БП ранней стадии без деменции, проявляющему нарушенную память, или пациенту, у которого диагностирована БП, имеющему УКН.
Диагноз у пациентов БП ранней стадии без деменции может быть основан на исследовании клинических симптомов БП, при котором у пациентов с БП ранней стадии без деменции имеется по меньшей мере два из симптомов БП, выбранных из группы, состоящей из тремора, ригидности и гипокинезии, необязательно в комбинации с методами нейровизуализации, таких как, например, МРВ. Волюметрическая визуализация МРВ может обеспечить ранний маркер деменции при БП, при которой пациенты с БП ранней стадии без деменции и пациенты, имеющие умеренные когнитивные нарушения, характеризуются атрофией гиппокампа. Нарушенную память можно оценивать посредством нейропсихологических тестов, таких как, например, тест проверки по шкале памяти Векслера (WEM - Wechsler Memory Scale).
Эстрогенные компоненты, раскрытые в данном изобретении, можно применять отдельно или в комбинации с любой из известных терапий неврологических расстройств (“комбинированная терапия“).
Комбинированные терапии, как рассмотрено в данном изобретении, могут включать введение по меньшей мере одного эстрогенного компонента, как раскрыто в данном изобретении, и по меньшей мере одного другого фармацевтически или биологически активного ингредиента. Данный эстрогенный компонент (компоненты) и данный фармацевтически или биологически активный ингредиент (ингредиенты) можно вводить либо в одной и той же, либо в отдельных фармацевтических композициях, одновременно, по отдельности или последовательно в любом порядке. По меньшей мере один “другой фармацевтически или биологически активный ингредиент“, в частности, относится к веществу, отличающемуся от эстрогенных компонентов, раскрытых в данном изобретении, эффективному для лечения неврологического расстройства, и которое может привести или не привести к синергетическому эффекту с эстрогенным компонентом. Неограничивающие примеры фармацевтически или биологически активных ингредиентов, приемлемых для комбинированного введения с эстрогенными компонентами, раскрытыми в данном изобретении, в частности, для применения при лечении ГИЭ, такой как предпочтительно ГИЭ новорожденных, включают противоэпилептические лекарственные средства, эритропоэтин, мелатонин и ксенон.
В данном изобретении также рассмотрена комбинация для введения по меньшей мере одного эстрогенного компонента, как раскрыто в данном изобретении, с умеренной гипотермией (то есть снижением температуры тела до 33°С-34°С). Такая комбинированная терапия в частности может быть приемлема для лечения, предпочтительно терапевтического лечения, гипоксически-ишемической энцефалопатии (ГИЭ), такой как предпочтительно ГИЭ новорожденных.
Эстрогенные компоненты, как раскрыто в данном изобретении, можно включать в фармацевтические композиции или препараты с одним или более фармацевтически приемлемым носителем/эксципиентом. Фармацевтические композиции могут содержать один или более эстрогенный компонент, как раскрыто в данном изобретении. Фармацевтические композиции могут также дополнительно содержать один или более другой фармацевтически или биологически активный ингредиент, как определено выше. Соответственно, в данном изобретении также раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая эстрогенный компонент, как раскрыто в данном изобретении.
Термин “фармацевтически приемлемый“, как употреблено в данном описании, соответствует данной области техники и означает совместимость с другими ингредиентами фармацевтической композиции и безвредность для ее реципиента.
Как употреблено в данном описании, “носитель“ или “эксципиент“ включает любые возможные растворители, разбавители, буферы (такие как, например, нейтральный буферный физиологический раствор, фосфатно-солевой буферный раствор или необязательно Трис-HCl, ацетатные или фосфатные буферы), солюбилизаторы (такие как, например, твин 80, полисорбат 80), коллоидные растворы, дисперсионные среды, носители, наполнители, хелатирующие агенты (такие как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или глутатион), аминокислоты (такие как, например, глицин), белки, разрыхлители, связующие вещества, смазывающие вещества, увлажняющие агенты, стабилизаторы, эмульгаторы, подсластители, красящие вещества, корригенты, ароматизаторы, загустители, средства для достижения депо-эффекта, покрытия, противогрибковые агенты, консерванты (такие как, например, тимеросал™, бензиловый спирт), антиоксиданты (такие как, например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), агенты, регулирующие тоничность, агенты, замедляющие всасывание, адъюванты, объемообразующие агенты (такие как, например, лактоза, маннит) и т.п. Применение таких сред и агентов для получения фармацевтических композиций хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какая-либо традиционная среда или агент несовместимы с активным ингредиентом (ингредиентами), может быть рассмотрено их применение в терапевтических композициях. Подходящие фармацевтические носители описаны среди прочего в кн. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).
Фармацевтическая композиция может быть получена способом, который как таковой известен специалистам в данной области техники. С этой целью по меньшей мере один эстрогенный компонент, как раскрыто в данном изобретении, один или более твердый или жидкий фармацевтический эксципиент и, при желании, в комбинации с одним или более другим фармацевтически или биологически активным ингредиентом, как определено выше, приводят в соответствующую форму введения или дозируемую форму, которую затем можно применять в качестве фармацевтического препарата в медицине или ветеринарии. Точная природа носителя или эксципиента, либо другого вещества зависит от пути введения. Такие подходящие формы введения, которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими в зависимости от пути введения, а также способы и носители, применяемые при их получении, известны специалистам в данной области техники; приведена ссылка на стандартные руководства, такие как Remington's Pharmaceutical Sciences (см. выше).
Например, фармацевтическую композицию, как раскрыто в данном изобретении, можно вводить парентерально (например, путем внутривенной, интрацеребральной, интрацеребровентрикулярной, внутримышечной или подкожной инъекции, либо внутривенной инфузии) в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и имеет подходящее значение рН, изотоничен и стабилен. Альтернативно фармацевтическую композицию, как раскрыто в данном изобретении, можно вводить перорально, например, в форме пилюль, таблеток, таблеток, покрытых глазурью, таблеток, покрытых сахарной оболочкой, гранул, твердых и мягких желатиновых капсул, водных, спиртовых или масляных растворов, сиропов, эмульсий или суспензий, либо ректально, например, в форме суппозиториев, чрескожным или местным путем (включая глазное введение), например, в форме мазей, настоек, распыляемых растворов или трансдермальных терапевтических систем (таких как, например, кожный пластырь), либо путем ингаляции в форме назальных распыляемых растворов или аэрозольных смесей, либо, например, в форме микрокапсул, имплантатов или стержней.
Для получения пилюль, таблеток, таблеток, покрытых сахарной оболочкой, и твердых желатиновых капсул возможно применение, например, лактозы, крахмала, например, кукурузного крахмала, или производных крахмала, талька, стеариновой кислоты или ее солей и т.д. Носителями для мягких желатиновых капсул и суппозиториев являются, например, жиры, воски, полутвердые и жидкие полиолы, натуральные или отвержденные масла и т.д. Подходящими носителями для получения растворов, например, растворов для инъекций, либо эмульсий или сиропов являются, например, следующие носители: вода, физиологический раствор хлорида натрия, спирты, такие как этанол, глицерин, полиолы, сахароза, инвертный сахар, глюкоза, маннит, растительные масла и т.д. Возможна также лиофилизация активного ингредиента (ингредиентов) и использование полученных в результате лиофилизатов, например, для получения препаратов для инъекции или инфузии. Приемлемыми носителями для микрокапсул, имплантатов или стержней являются, например, сополимеры гликолевой кислоты и молочной кислоты.
Для формы перорального введения композиции по настоящему изобретению можно смешивать с приемлемыми добавками, такими как эксципиенты, стабилизаторы или инертные разбавители, и приводить традиционными способами в подходящие формы введения, такие как таблетки, таблетки с покрытием, твердые капсулы, водные, спиртовые или масляные растворы. Примерами подходящих инертных носителей являются гуммиарабик, магнезия, карбонат магния, фосфат калия, лактоза, глюкоза или крахмал, в частности, кукурузный крахмал. В данном случае получение препарата может быть выполнено как в виде сухих гранул, так и в виде влажных гранул. Приемлемыми масляными эксципиентами или растворителями являются растительные или животные масла, такие как подсолнечное масло или рыбий жир. Приемлемыми носителями для водных или спиртовых растворов являются следующие носители: вода, этанол, сахарные растворы или их смеси. Полиэтиленгликоли и полипропиленгликоли также полезны в качестве дополнительных вспомогательных веществ для других форм введения. В качестве таблеток быстрого высвобождения эти композиции могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, дикальцийфосфат, крахмал, стеарат магния и лактоза и/или другие эксципиенты, связующие вещества, модифицирующие агенты, разрыхлители, разбавители и смазывающие вещества, известные в данной области техники.
Пероральное введение фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один эстрогенный компонент, как раскрыто в данном изобретении, целесообразно выполняют путем однородного и тщательного смешивания вместе приемлемого количества данного компонента в форме порошка, необязательно также включающего тонкоизмельченный твердый носитель, и инкапсуляции смеси, например, в твердую желатиновую капсулу. Твердый носитель может включать одно или более веществ, действующих в качестве связующих веществ, смазывающих веществ, разрыхлителей, красящих веществ и т.п. Приемлемые твердые носители включают, например, фосфат кальция, стеарат магния, тальк, сахара, лактозу, декстрин, крахмал, желатин, целлюлозу, поливинилпирролидон, легкоплавкие воски и ионообменные смолы.
Прессованные таблетки, содержащие фармацевтическую композицию, раскрытую в данном изобретении, можно получить путем однородного и тщательного смешивания активного ингредиента (ингредиентов) с твердым носителем, таким как описано выше, с получением смеси, обладающей необходимыми свойствами прессования, а затем прессования смеси в приемлемом аппарате до желаемой формы и размера. Формованные таблетки можно получить путем формования в приемлемом аппарате смеси порошкообразного активного ингредиента (ингредиентов), увлажненной инертным жидким разбавителем.
При введении с помощью назального аэрозоля или ингаляции эти композиции можно получить в соответствии со способами, хорошо известными в области получения фармацевтических препаратов, и можно получить их в виде раствора в физиологическом растворе, используя бензиловый спирт или другие приемлемые консерванты, стимуляторы всасывания для усиления биодоступности, фторуглероды и/или другие солюбилизирующие или диспергирующие агенты, известные в данной области техники. Приемлемыми фармацевтическими препаратами для введения в форме аэрозолей или распыляемых растворов являются, например, растворы, суспензии или эмульсии соединений по изобретению или их физиологически переносимых солей в фармацевтически приемлемом растворителе, таком как этанол или вода, или в смеси таких растворителей. При необходимости препарат может также дополнительно содержать другие фармацевтические вспомогательные вещества, такие как поверхностно-активные вещества, эмульгаторы и стабилизаторы, а также пропеллент.
Для подкожного или внутривенного введения эстрогенный компонент (компоненты), раскрытые в данном изобретении, при желании с веществами, традиционными для него, такими как солюбилизаторы, эмульгаторы или дополнительные вспомогательные вещества, приводят в раствор, суспензию или эмульсию. Активный ингредиент (ингредиенты) может быть также лиофилизирован, и полученные лиофилизаты применяют, например, для получения инъекционных или инфузионных препаратов. Приемлемыми растворителями являются, например, следующие растворители: вода, физиологический солевой раствор или спирты, например, этанол, пропанол, глицерин, кроме того, также растворы сахаров, таких как растворы глюкозы или маннита, или альтернативно смеси различных указанных растворителей. Препараты инъекционных растворов или суспензий можно получить в соответствии с известным уровнем техники, применяя приемлемые нетоксичные, парентерально приемлемые разбавители или растворители, такие как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия, либо подходящие диспергирующие или увлажняющие и суспендирующие агенты, такие как стерильные легкие фиксированные масла, включающие синтетические моно- или диглицериды, и жирные кислоты, включающие олеиновую кислоту.
При ректальном введении в форме суппозиториев эти препараты можно получить путем смешивания эстрогенного компонента, раскрытого в данном изобретении, с приемлемым нераздражающим эксципиентом, таким как масло какао, синтетические сложные эфиры глицеридов или полиэтиленгликолей, которые являются твердыми при обычной температуре, но переходят в жидкое состояние и/или растворяются в ректальной полости с высвобождением лекарственного средства.
Некоторые предпочтительные, но неограничивающие примеры таких препаратов включают таблетки, пилюли, порошки, лепешки, пакеты-саше, крахмальные облатки, эликсиры, суспензии, эмульсии, растворы, сиропы, аэрозоли, мази, кремы, лосьоны, мягкие и твердые желатиновые капсулы, суппозитории, капли, стерильные инъекционные растворы и стерильно упакованные порошки (которые обычно восстанавливают перед применением) для введения в виде болюса и/или для непрерывного введения, которые можно готовить с носителями, эксципиентами и разбавителями, которые сами по себе подходят для таких препаратов, такими как лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмалы, аравийская камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, целлюлоза, (стерильная) вода, метилцеллюлоза, метил- и пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния, пищевые масла, растительные масла и минеральные масла или их приемлемые смеси. Эти препараты могут при желании содержать другие фармацевтически активные вещества (которые могут приводить или не приводить к синергетическому эффекту с соединениями по изобретению) и другие вещества, которые обычно применяют в фармацевтических препаратах, такие как смазывающие вещества, увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, диспергирующие агенты, разрыхлители, объемообразующие агенты, наполнители, консервирующие вещества, подсластители, корригенты, регуляторы текучести, регуляторы высвобождения и т.д.
Фармацевтические композиции можно готовить таким образом, чтобы способствовать быстрому, пролонгированному или замедленному высвобождению активного ингредиента (ингредиентов), содержащегося в композиции, например, применяя липосомы или гидрофильные полимерные матриксы на основе натуральных гелей или синтетических полимеров.
Применяемая дозировка или количество эстрогенного компонента, как раскрыто в данном изобретении, возможно в комбинации с одним или более других фармацевтически или биологически активных ингредиентов, как определено выше, зависит от индивидуального случая и должна быть, как принято, адаптирована к индивидуальным обстоятельствам для достижения оптимального эффекта. Таким образом, она зависит от природы и тяжести расстройства, подлежащего лечению, а также от пола, возраста, массы тела, режима питания, общего состояния здоровья, индивидуальной реактивности человека или животного, подлежащего лечению, от эффективности, метаболической стабильности и продолжительности действия применяемых компонентов, от режима и времени введения, от скорости выведения, от того, является ли терапия острой, хронической или профилактической, или от того, вводят ли другие фармацевтически или биологически активные ингредиенты, как определено выше, применяют ли другие терапии в дополнение к эстрогенному компоненту.
Без ограничения, в зависимости от типа и тяжести расстройства, типичная суточная доза может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 250 мг/кг массы тела или более, например, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 0,4 мг/кг массы тела или от приблизительно 5 мкг/кг до приблизительно 0,4 мг/кг массы тела в зависимости от упомянутых выше факторов. Предпочтительно суточная доза может находиться в диапазоне от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, более предпочтительно от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, еще более предпочтительно от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг массы тела, например, приблизительно 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела.
Для повторных введений в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не происходит желаемое подавление симптомов заболевания. Предпочтительная доза эстрогенного компонента может находиться в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, более предпочтительно от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, еще более предпочтительно от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг массы тела. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг или 20 мг/кг (или любую их комбинацию).
Другие доступные дозы могут находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг, например, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Такие дозы можно вводить в виде однократной суточной дозы, разделенных на свыше одной или более суточных доз или по существу непрерывно, например, применяя капельную инфузию, или чередующимся путем, например, каждую неделю или каждые три недели.
Фармацевтические препараты, раскрытые в данном изобретении, предпочтительно находятся в стандартной дозируемой форме, и могут быть соответствующе упакованы, например, в коробку, блистер, флакон, бутылку, пакет-саше, ампулу или в любой другой приемлемый держатель или контейнер однократной дозы или многократных доз (который может содержать соответствующую этикетку); возможно с одним или более информационных листков, содержащих информацию о препарате и/или инструкции по применению. Как правило, такие стандартные дозы содержат от 1 до 1000 мг, например, от 5 до 500 мг, по меньшей мере одного эстрогенного компонента по изобретению, например, приблизительно 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мг на стандартную дозу.
В зависимости от режима введения фармацевтическая композиция предпочтительно содержит от 0,05 до 99 масс.%, более предпочтительно от 0,1 до 70 масс.%, еще более предпочтительно от 0,1 до 50 масс.% эстрогенного компонента, как раскрыто в данном изобретении, и от 1 до 99,95 масс.%, более предпочтительно от 30 до 99,9 масс.%, еще более предпочтительно от 50 до 99,9 масс.% фармацевтически приемлемого носителя, где все процентные содержания основаны на суммарной массе композиции.
Фармацевтические композиции можно вводить по отдельности в различное время в течение курса терапии или одновременно в разделенных или единых комбинированных формах. Настоящее изобретение охватывает все такие режимы одновременного или чередующегося лечения, и термин “введение“ следует интерпретировать соответственно.
Введение можно выполнять с пищей, например, с пищей с высоким содержанием жиров. Термин “с пищей“ означает употребление пищи либо во время, либо не более чем примерно за один час или через один час после введения фармацевтической композиции, как раскрыто в данном изобретении.
Примеры
Пример 1: Экспериментальные методы
Подопытные животные
Беременные крысы линии Спраг-Доули были получены из Janvier (Франция). После рождения новорожденных крысят держали с их матерями и выращивали нормально при комнатной температуре (25°С) при 12-часовом цикле дня и ночи. Все экспериментальные протоколы были одобрены этическим комитетом Льежского университета. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.
Манипуляции in vivo
Новорожденных крысят назначали в группу ложнооперированных, группу носителя или группу Е4.
Эстетрол (Е4) растворяли в физиологическом растворе при различных концентрациях, и равный объем (6 мкл/г) раствора инъецировали интраперитонеально крысятам из группы (групп) Е4. Крысятам из группы носителя инъецировали интраперитонеально физиологический раствор. Крысятам из группы ложнооперированных не инъецировали ничего.
Ишемию вызывали путем операции, включающей двойную лигатуру и разрез левой головной артерии; гипоксию вызывали путем вдыхания 11%-8% кислорода, сбалансированного азотом, при пониженной концентрации кислорода в течение 20 минут с последующим вдыханием 8% кислорода и 92% азота при постоянной концентрации в течение 35 минут. Группу ложнооперированных не подвергали гипоксически-ишемическому повреждению.
Все манипуляции проводили при 37°С.
Измерение ректальной температуры крысят
Ректальную температуру крысят измеряли многоцелевым термометром (BAT-10R, Physitemp Instruments Inc., Clifton, NJ, US) вместе с ректальным датчиком (RET-4, BioMedical Instruments, Zollnitz, Germany) через 0,2 и 4 часа после воздействия гипоксического повреждения. Чтобы поддерживать вариабельность температуры на низком уровне, измерения ректальной температуры проводили при комнатной температуре 25°С через 15 мин после извлечения крысят из гнезда (за исключением 1-го постгипоксического измерения, которое проводили немедленно). Показано, что ректальная температура очень хорошо соответствует внутренней температуре головного мозга (Thoresen et al. 1996. Arch Dis Child Fetal Neonatal 74: F3-F9, Yager et al. 1993. Pediatr Res 34: 525-529).
Получение образцов крови и головного мозга
Крысят умерщвляли на сутки 14 после рождения. Животных подвергали глубокой анестезии передозировкой пентобарбитала натрия (100 мг/кг, ip).
Кровь отбирали, центрифугировали, и образцы сыворотки хранили при -80°С.
Затем животных перфузировали транскардиально 0,9% физиологическим раствором при 4°С, а затем 4% параформальдегидом в 0,1 моль/л фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4) при 4°С. Головной мозг быстро извлекали, взвешивали и погружали в такой же фиксирующий раствор при 4°С на 24 часа, обезвоживали серией постепенно возрастающих концентраций этанола и ксилола и заключали в парафин.
Окрашивание гематоксилином-эозином (гистохимия)
th
Из фиксированных формальдегидом, заключенных в парафин образцов извлеченного головного мозга получали коронарные срезы на одном и том же уровне области гиппокампа в соответствии с атласом головного мозга крыс Paxinos (Paxinos and Watson 2007. В кн.: The rat brain in stereotaxic coordinates, 6 edition). Толщина срезов составляла 5 мкм. Проводили окрашивание гематоксилином-эозином. Кратко, срезы депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в постепенно снижающихся концентрациях этанола. Стекла окрашивали гематоксилином, ополаскивали в течение нескольких секунд в воде, затем помещали в 1% эозин и промывали, обезвоживали и накрывали покровными стеклами.
Подсчет интактных клеток
Подсчет интактных клеток выполняли на окрашенных гематоксилином-эозином срезах головного мозга крысят при увеличении 400х в 3 полях зрения соответствующей области головного мозга. Подсчеты проводили в коре головного мозга и гиппокампе (области: зубчатая извилина (DG), субгранулярная зона (SGZ), Аммонов рог (СА1, СА2/CA3)). Срезы анализировали с помощью микроскопа (Olympus ВХ51, Olympus, Tokyo, Japan), сканнера изображений (DotSlide Digital Virtual Microscopy, Olympus, Germany) и программы ImageJ (NIH, US).
Интактные клетки представляют собой неповрежденные клетки. Поврежденные клетки характеризуются бледным эозинофильным окрашиванием параллельно с неоднородными плотностями ядерного вещества, сморщенным, конденсированным или бледным и увеличенным.
Окрашивание ассоциированным с микротрубочками белком 2 (МАР2)
Срезы головного мозга обрабатывали для иммуногистохимического обнаружения нарушения цитоскелета нейронов. Для демаскирования антигена срезы нагревали в 10 ммоль/л цитратного буфера (рН 6,0) при 100°С в течение 10 минут. Эндогенную пероксидазную активность блокировали 3% перекисью водорода в течение 10 минут, и после второго блокирования 5% нормальной сывороткой козы срезы инкубировали с антителом против ассоциированного с микротрубочками белка 2 (МАР2), разведенным 1:1000 (мышиное моноклональное антитело; Sigma, St. Louis, Missouri, US), в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания добавляли биотинилированный иммуноглобулин G козы к мыши (Vector Laboratories, Burlingame, California), и обнаружение антитела осуществляли при помощи комплекса авидин-биотин (Vector Laboratories) с 3,3-диаминобензидином (ДАБ) в качестве хромогена. После реакции с ДАБ стекла промывали, обезвоживали и закрывали покровными стеклами.
Образцы анализировали с помощью сканера изображений (Nanozoomer Virtual Microscopy, Hamamatsu, Tokyo, Japan) и программы ImageJ (NIH, US). Измеряли площади МАР2-положительных областей в ипсилатеральном и контралатеральном полушарии. Долю МАР2-положительных областей вычисляли как площадь МАР2-положительной области ипсилатерального полушария, деленную на площадь МАР2-положительной области контралатерального полушария. Долю МАР2-положительной области в группе ложнооперированных по умолчанию считали за 1,0.
Двойное окрашивание даблкортином - фактором роста эндотелия сосудов
Срезы нагревали в 10 ммоль/л цитратном буфере (рН 6,0) при 100°С в течение 10 минут. Эндогенную пероксидазную активность блокировали 3% перекисью водорода в течение 10 минут, и после второго блокирования 5% нормальной сывороткой козы срезы инкубировали с антителом против даблкортина (DCX), разведенным 1:1000 (кроличье поликлональное антитело; Abeam, Cambridge, UK), и антителом против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), разведенным 1:100 (мышиное моноклональное антитело; Abeam, Cambridge, UK) в течение ночи при 4°С. После промывания добавляли меченое Alexa Fluor антитело козы к кролику, разведенное 1:1000, и меченое Alexa Fluor антитело козы к мыши, разведенное 1:1000 (Invitrogen Inc., Ghent, Belgium), и срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Для флуоресцентных исследований использовали заливочную среду, содержащую 4',6-диамино-2-фенилиндол (ДАПИ) (Vector Laboratories). Образцы анализировали с помощью микроскопа (Olympus Vanox АНВТ3, Olympus) и программы ImageJ (NIH). Процент положительно окрашенных клеток вычисляли как сумму положительно окрашенных клеток либо на DCX, либо на VEGF, деленную на суммарное число ДАПИ-положительных клеток, выраженную в процентах.
Определение SWOB и глиофибриллярного кислого белка (GFAP) в образцах сыворотки крови
Анализы ELISA на обнаружение маркеров повреждения головного мозга белка S100B (№по каталогу CSB-E08066r, Cusabio Biotech Co., LTD, China) и глиофибриллярного кислого белка (GFAP) (№ по каталогу E90068Ra, Uscn Life sciences Inc., China) в образцах сыворотки крови выполняли в соответствии с рекомендациями изготовителей.
Статистический анализ:
Анализ проводили, используя программу StatView (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, СА, US). Статистические сравнения проводили, используя ANOVA, с последующими апостериорными критериями наименьшего достоверного различия (PLSD; от англ. Protected Least Significant Difference) Фишера, Шеффе и Бонферрони-Данна, при которых Р<0,05 считали показателем достоверности. Все значения выражены в виде среднего ± SEM.
Пример 2: Нейропротективный эффект эстетрола в модели гипоксически-ишемической энцефалопатии новорожденных на животных
После рождения новорожденных крысят назначали в одну из следующих 4 групп: группу ложнооперированных, группу носителя, группу Е4 5 мг/кг/сутки и группу Е4 50 мг/кг/сутки. С суток 4 до суток 7 включительно крысятам инъецировали интраперитонеально либо носитель (группа носителя), либо Е4 (5 мг/кг или 50 мг/кг в соответствии с назначением в группу) или не инъецировали ничего (группа ложнооперированных). На сутки 7, через 30 минут после последней инъекции, животных из группы носителя и Е4 (5 мг/кг или 50 мг/кг) проводили операцию, включающую двойную лигатуру и разрез левой головной артерии; гипоксию вызывали путем вдыхания 11%-8% кислорода, сбалансированного азотом, при пониженной концентрации кислорода в течение 20 минут с последующим вдыханием 8% кислорода и 92% азота при постоянной концентрации в течение 35 минут. Группу ложнооперированных подвергали таким же процедурам без лигатуры левой головной артерии и гипоксии. Все манипуляции проводили при 37°С. Крысят возвращали матерям вплоть до умерщвления на сутки 14 после рождения.
Масса крысят
Измерения массы крысят проводили с суток 4 до суток 7 с целью определения количества носителя и Е4, необходимого для инъекции, и с суток 7 вплоть до суток 14 с целью мониторинга послеоперационного состояния здоровья крысят.
На сутки 13 и 14 после операции крысята, получавшие 5 мг/кг Е4, имели значимо более высокие массы тела, чем животные, получавшие носитель, тогда как на другие сутки после операции ложнооперированная группа имела значимо более высокие массы тела, чем другие группы: на сутки 8 (ложное получение против носителя и Е4 5 мг/кг), 10 (ложное получение против Е4 50 мг/кг), 12 (ложное получение против носителя), 13 (ложное получение против носителя) и 14 (ложное получение против носителя) (фиг. 1).
Масса головного мозга
Измерения масс головного мозга выявило, что они были значимо выше в группе Е4 5 мг/кг и ложнооперированной группе, чем в группе, получавшей носитель (фиг. 2).
Окрашивание гематоксилином-эозином (гистохимия)
Только срезы из группы, получавшей носитель, показали видимую дезорганизацию области гиппокампа, ипсилатеральной по отношению к повреждению (левая сторона), окруженной областями инфаркта, распространяющимися в область гиппокампа, контралатеральную по отношению к повреждению (правая сторона) (фиг. 3). Эти результаты показывают, что Е4 при обеих дозах обладает нейропротективным эффектом.
Подсчет интактных клеток
В области DG гиппокампа число интактных клеток на поле зрения было значимо выше в группах Е4 5 мг/кг и ложнооперированных животных, чем в группе носителя (фиг. 4). В SGZ число интактных клеток было значимо выше только в группе Е4 5 мг/кг по сравнению с группой ложнооперированных и группой носителя, тогда как в СА1 было обнаружено статистически недостоверное различие среди опытных групп. В области СА2/CA3 гиппокампа только в группе Е4 50 мг/кг число интактных клеток было значимо больше, чем в группе, получавшей носитель, и в группе Е4 5 мг/кг, тогда как в коре головного мозга группа Е4 50 мг/кг имела значимо большее число интактных клеток по сравнению с группой носителя. Эти результаты показывают, что эстетрол обладает нейропротективным эффектом.
Пример 3: Нейропротективный эффект эстетрола в модели гипоксически-ишемической энцефалопатии на животных
Новорожденных крысят назначали в одну из следующих 6 групп с суток 4 после рождения: группу ложнооперированных (n=24), группу носителя (n=14), группу Е4 1 мг/кг/сутки (n=11), Е4 5 мг/кг/сутки (n=14), Е4 10 мг/кг/сутки (n=14) или Е4 50 мг/кг/сутки (n=19). С суток 4 после рождения крысятам инъецировали интраперитонеально либо носитель (группа носителя), либо Е4 (1, 5, 10 или 50 мг/кг/сутки в соответствии с назначением в группу Е4) или ни носителем, ни Е4 (группа ложнооперированных). На сутки 7, через 30 минут после последней инъекции, животных анестезировали изофлураном (индукция, 3,0%; поддержание, 1,5%), и крысятам из групп носителя и Е4 проводили операцию, включающую двойную лигатуру и разрез левой головной артерии. После процедуры крысят возвращали матерям и давали возможность восстановиться в течение 1 часа. Затем крысят помещали в увлажненную гипоксическую камеру in vivo (CoyLab, Grass Lake, Ml, USA). Гипоксию вызывали путем вдыхания 11%-8% кислорода, сбалансированного азотом, при понижающихся концентрациях кислорода в течение 20 минут с последующим вдыханием 8% кислорода и 92% азота при постоянной концентрации в течение 35 минут. Все манипуляции проводили при 37°С. Группу ложнооперированных подвергали таким же процедурам без лигатуры левой головной артерии с последующей гипоксией и без инъекции. Крысят возвращали матерям и выращивали нормально вплоть до умерщвления на сутки 14 после рождения.
Ректальная температура
Ректальные температуры значимо не различались между подопытными группами, что указывает на то, что предварительное получение эстетрола не влияет на температуру тела (данные не представлены).
Массы тела
Для мониторинга послеоперационного состояния здоровья крысят вследствие проведенных операций и предварительного получения эстетрола проводили мониторинг массы тела с суток 7 до суток 14 после рождения включительно. На фиг. 5 показано, что на сутки 8 и 13 после рождения ложнооперированные и предварительно получавшие эстетрол крысята имели значимо более высокие послеоперационные массы тела, чем животные, предварительно получавшие носитель. Кроме того, на сутки 9 после рождения ложнооперированные животные и животные, предварительно получавшие 10 мг/кг эстетрола, имели значимо более высокие массы тела, чем группа носителя, тогда как на сутки 10, 11 и 12 после рождения ложнооперированные крысята и крысята, предварительно получавшие 1 мг/кг и 10 мг/кг эстетрола, показали значимо более высокие массы тела, чем группа носителя. На сутки 14 после рождения ложнооперированные животные и животные, предварительно получавшие 1 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг эстетрола, имели значимо более высокие массы тела, чем только группа носителя. Тем не менее, на сутки 8, 9, 10, 12 после рождения массы тела ложнооперированных животных были значимо выше, чем в группах, предварительно получавших 5 мг/кг и 50 мг/кг эстетрола, тогда как на сутки 11, 13, 14 ложнооперированные животные имели значимо более высокие массы тела, чем одна группа, предварительно получавшая 50 мг/кг эстетрола.
Масса головного мозга
Чтобы оценить возможное повреждение головного мозга, проводили измерение головного мозга крысят. На фиг. 6 продемонстрировано, что масса головного мозга была значимо выше в группе ложнооперированных (1,225±0,006 г) и в группах, предварительно получавших 1 мг/кг Е4 (1,155±0,022 г), 5 мг/кг Е4 (1,181±0,023 г), 10 мг/кг Е4 (1,179±0,012 г) и 50 мг/кг Е4 (1,163±0,016 г), чем в группе носителя (1,016±0,042 г).
Окрашивание гематоксилином-эозином и подсчет интактных клеток
Срезы головного мозга из крысят, предварительно получавших носитель, показывают видимую дезорганизацию и повреждение области гиппокампа, ипсилатеральной по отношению к повреждению (левая сторона), распространяющееся на кору головного мозга (фиг.7 А-С).
В области DG гиппокампа число интактных клеток на поле зрения было значимо выше у ложнооперированных животных (154,5±7,942) (фиг. 7 В(а)) и у животных, которым инъецировали 5 мг/кг Е4 (121,0±8,098) (фиг. 7B (d)), чем в группе носителя (84,563±5,954) (фиг. 7В (b)) (фиг. 7D). Кроме того, число интактных клеток SGZ было значимо выше в группе ложнооперированных (58,357±3,653) (фиг. 7В (а)), в группе 5 мг/кг Е4 (42,846±3,884) (фиг. 7B (d)) и в группе 10 мг/кг Е4 (47,6±4,672) (фиг. 7В (е)), чем в группе носителя (23,875±3,363) (фиг. 7В (b)) (фиг. 7D), тогда как в той же области группа ложнооперированных показала значимо большее число интактных клеток, чем группа 1 мг/кг Е4 (35,6±2,75) (фиг. 7 В(с)) и группа 50 мг/кг Е4 (30,714±3,615) (фиг. 7B (f)) (фиг. 7D). В области СА1 значимое различие было обнаружено среди группы ложнооперированных (70,714±4,819) (фиг. 7В (а)) и групп 1 мг/кг Е4 (43,2±2,435) (фиг. 7В (с)) и 10 мг/кг Е4 (57,4±4,566) (фиг. 7В (е)), тогда как другие группы не показали значимого различия (фиг. 7D). В области СА2/CA3 гиппокампа группы ложнооперированных (56,929±4,859) (фиг. 7В (а)) и 50 мг/кг Е4 (53,0±4,7) (фиг. 7B (f)) имели значимо большее число интактных клеток, чем группа носителя (29±3,543) (фиг. 7В (b)), тогда как только одна группа ложнооперированных имела значимо большее число интактных клеток, чем группа 1 мг/кг Е4 (32,8±2,808) (фиг. 7В (с)) (фиг. 7D). В коре головного мозга группа 50 мг/кг Е4 (76,286±3,962) (фиг. 7C (f)) показала значимо большее число интактных клеток, чем только одна группа носителя (51,938±5,304) (фиг. 7С (b)) (фиг. 7D).
Окрашивание МАР2
Утрату ипсилатерального окрашивания МАР2, определенную после гипоксии-ишемии (ГИ) на сутки 14 после рождения, рассматривали в качестве маркера ранней утраты области серого вещества. Область с интактными нейронами проявляла окрашивание МАР2, тогда как область инфаркта проявляла утрату окрашивания МАР2. В частности, в группе носителя наблюдали утрату окрашивания МАР2 в области гиппокампа полушария, ипсилатерального по отношению к повреждению, распространяющуюся на кору головного мозга (фиг. 8А (b)). Количественное определение доли МАР2-положительных областей выявило, что после предварительного получения эстетрола (фиг. 8В) доля МАР2-положительной области была значимо больше у ложнооперированных животных (по умолчанию 1,0) (фиг. 8А (а)) и в группах, предварительно получавших эстетрол (1 мг/кг Е4 (0,929±0.019) (фиг. 8А (с)), 5 мг/кг Е4 0,889±0,063 (фиг. 8A (d)), 10 мг/кг Е4 (0,898±0,022) (фиг. 8А (е)), 50 мг/кг Е4 (0,922±0,031) (фиг. 8A (f))), чем в группе носителя (0,675±0,046) (фиг. 8А (b)).
Двойное окрашивание даблкортином - Фактором роста эндотелия сосудов
Экспрессию DCX и VEGF на сутки 14 после рождения рассматривали в качестве маркера нейро- и васкулогенеза, соответственно. Предварительное получение эстетрола приводило в результате к тому, что в области DG гиппокампа процент DCX-положительно окрашенных клеток был значимо выше у животных, предварительно получавших 10 мг/кг Е4 (55,8±5,658%), чем в группе носителя (32,833±2,625%) (фиг.9А), тогда как в той же области процент VEGF-положительно окрашенных клеток был значимо выше в группе, предварительно получавших 1 мг/кг Е4 (43,5±2,083%), 5 мг/кг Е4 (46,0±4,361%), 10 мг/кг Е4 (47,0±5,362%) и 50 мг/кг Е4 (46,0±4,465%), чем в группе носителя (25,333±2,271%) (фиг. 9В). Кроме того, в области СА1 процент DCX-положительно окрашенных клеток был значимо выше в группах 5 мг/кг Е4 (35,2±3,309%) и 10 мг/кг Е4 (34,1±6,664%), чем в группе носителя (11±1,518%) (фиг. 9А), тогда как процент VEGF-положительно окрашенных клеток был значимо выше только в одной группе 10 мг/кг Е4 (37,4±7,645%) (фиг. 9В). В области СА2/CA3 процент DCX-положительно окрашенных клеток был значимо выше в группе 5 мг/кг Е4 (30,3±3,7%), чем в группе носителя (6,417±1,033%), тогда как процент VEGF-положительно окрашенных клеток достигал значимого отличия только в группе 1 мг/кг Е4 (34,1±6,855%) (фиг. 9В). В коре головного мозга процент DCX- и VEGF-положительно окрашенных клеток был значимо выше в группе 10 мг/кг Е4 (52,1±7,762% и 46,2±7,646%, соответственно), чем только в одной группе носителя (26,0±4,156% и 20,5±2,414%, соответственно) (фиг. 9А-В, соответственно).
Белок SWOB и глиофибриллярный кислый белок (GFAP) сыворотки крови
Белок S100B и глиофибриллярный кислый белок (GFAP) использовали в качестве маркеров повреждения головного мозга. Их концентрацию измеряли в сыворотке крови с помощью ELISA на белки S100B и GFAP. Как показано на фиг. 10А, после предварительного получения эстетрола концентрация S100B была значимо ниже у ложнооперированных животных (344,614±50,328 пг/мл) и в группе 50 мг/кг Е4 (361±32,914 пг/мл), чем у животных, предварительно получавших носителем (698,925±57,342 пг/мл), хотя в группе 10 мг/кг Е4 концентрация S100B была значительно выше, чем в группе ложнооперированных животных, 5 мг/кг Е4 и 50 мг/кг Е4.
На фиг. 10В показана значимо сниженная концентрация GFAP у ложнооперированных животных (407,567±49,258 пг/мл) и у животных, предварительно получавших 50 мг/кг Е4 (300,388±31,232 пг/мл), чем в группе носителя (1003,926±288,345 пг/мл).
Вывод
Представленные результаты демонстрируют, что эстетрол обладает нейропротективным дозозависимым эффектом в гиппокампальной формации и в коре головного мозга в модели ГИЭ на животных. Также в соответствии с представленными результатами предварительное получение эстетрола уменьшает раннюю утрату серого вещества и стимулирует нейро- и васкулогенез. Кроме того, предварительное получение эстетрола не оказывает негативных воздействий на массу тела, массу головного мозга или температуру тела.
Пример 4: Терапевтический эффект эстетрола в модели гипоксически-ишемической энцефалопатии на животных
Чтобы исследовать терапевтический эффект эстетрола, новорожденных крысят назначали в одну из следующих 6 групп на сутки 7 после рождения: группу ложнооперированных (n=29), группу носителя (n=20), группу 1 мг/кг Е4 (n=16), группу 5 мг/кг Е4 (n=19), группу 10 мг/кг Е4 (n=17) и группу 50 мг/кг Е4 (n=15). На сутки 7 после рождения животных анестезировали изофлураном (индукция, 3,0%; поддержания, 1,5%), и крысятам из групп носителя и Е4 проводили операцию, включающую двойную лигатуру и разрез левой головной артерии. После процедуры крысят возвращали матерям и давали возможность восстановиться в течение 1 часа. Затем крысят помещали в увлажненную гипоксическую камеру in vivo (CoyLab, Grass Lake, Ml, USA). Гипоксию вызывали путем вдыхания 11%-8% кислорода, сбалансированного азотом, при понижающихся концентрациях кислорода в течение 20 минут с последующим вдыханием 8% кислорода и 92% азота при постоянной концентрации в течение 35 минут. Все манипуляции проводили при 37°С.
После вывода из гипоксической камеры крысятам инъецировали интраперитонеально либо носитель (группа носителя), либо Е4 (1 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг или 50 мг/кг) в соответствии с назначением в группы. Животных из группы ложнооперированных подвергали тем же процедурам, но не проводили ни лигатуру и разрез левой головной артерии с последующей гипоксией, ни введение носителя или эстетрола. Крысят возвращали матерям вплоть до умерщвления на сутки 14 после рождения.
Ректальная температура
Ректальные температуры значимо не различались между подопытными группами, что указывает на то, что получение эстетрола не влияет на температуру тела (данные не представлены).
Массы тела
Для оценки послеоперационного состояния здоровья крысят вследствие проведенных операций и предварительного получения ими эстетрола послеоперационные массы тела измеряли с суток 7 до суток 14 после рождения. На фиг. 11 показано, что на сутки 14 после рождения ложнооперированные животные и животные из групп 1 мг/кг Е4, 5 мг/кг Е4, 10 мг/кг Е4 и 50 мг/кг Е4 имели значимо более высокие массы тела, чем группа носителя. Ложнооперированные животные показали значимо более высокие массы тела, чем группа, получавшая 5 мг/кг Е4.
Масса головного мозга
На фиг. 12 продемонстрировано, что масса головного мозга была значимо выше у ложнооперированных животных (1,214±0,007 г) и в группах 1 мг/кг Е4 (1,099±0,037 г), 5 мг/кг Е4 (1,06±0,035 г), 10 мг/кг Е4 (1,12±0,33 г) и 50 мг/кг Е4 (1,163±0,025 г), чем в группе носителя (0,937±0,022 г). Ложнооперированные животные показали значимо более высокую массу головного мозга, чем группа 5 мг/кг Е4. Данный паттерн результатов является таким же, как в примере 3. Окрашивание гематоксилином-эозином и подсчет интактных клеток В областях DG и SGZ гиппокампа число интактных клеток на поле зрения было значимо больше у ложнооперированных животных (фиг 13В (а)), чем у животных из группы носителя (фиг. 13В (b)) (160,8±7,074 против 88,2±19,477 и 60,8±4,635 против 28,3±6,73, соответственно) (фиг. 13D). В области СА1 число интактных клеток на поле зрения было значимо больше в группе ложнооперированных (69,4±5,256) (фиг. 13В (а)) и в группе 1 мг/кг Е4 (51,5±2,5) (фиг. 13В (с)), чем в группе носителя (28,4±6,997) (фиг. 13В (b)), и в группе ложнооперированных, чем в группе 5 мг/кг Е4 (45,3±2,989) (фиг. 13B (d)), в группе 10 мг/кг Е4 (46,0±3,19) (фиг.13 В(е)) и в группе 50 мг/кг Е4 (46,6±5,336) (фиг. 13B (f)) (фиг. 13D). В области СА2/CA3 гиппокампа ложнооперированные животные (57,1±6,192) (фиг. 13В (а)) и животные, получавшие 10 мг/кг Е4 (35,2±3,169) (фиг. 13В (е)), имели значимо большее число интактных клеток, чем группа носителя (13,8±3,018), тогда как группа ложнооперированных имела значимо большее число интактных клеток, чем группы 1 мг/кг Е4 (33,9±4,306), 5 мг/кг Е4 (33,8±4,704), 10 мг/кг Е4 (35,2±3,169) и 50 мг/кг Е4 (30,5±2,527) (фиг.13D). В коре головного мозга ложнооперированные животные (70,1±6,165) (фиг. 13С (а)) и животные, получавшие 5 мг/кг Е4 (57,1±7,012) (фиг. 13C (d)), 10 мг/кг Е4 (56,9±5,958) (фиг. 13С (е)) и 50 мг/кг Е4 (54,5±3,403) (фиг. 13C (f)), показали значимо большее число интактных клеток, чем группа носителя (23,2±3,872) (фиг. 13С (b)), тогда как группа ложнооперированных имела значимо большее число интактных клеток, чем группа 1 мг/кг Е4 (42,4±4,865) (фиг. 130 (c)) (фиг. 13D).
Окрашивание МАР2
Наблюдали такой же паттерн окрашивания МАР2, как в примере 3. Количественное определение доли МАР2-положительных областей (фиг. 14В) выявило, что доля МАР2-положительной области была значимо выше у ложнооперированных животных (по умолчанию 1,0) (фиг. 14А (а)) и в группах, получавших эстетрол (1 мг/кг Е4 (0,943±0,028) (фиг. 14А (с)), 5 мг/кг Е4 (0,89±0,037) (фиг. 143A (d)), 10 мг/кг Е4 (0,938±0,044) (фиг. 14А (е)), 50 мг/кг Е4 (0,966±0,036) (фиг. 14A (f))), чем в группе носителя (0,656±0,091) (фиг. 14А (b)).
Двойное окрашивание даблкортином - фактором роста эндотелия сосудов
В области DG гиппокампа ни окрашивание DCX, ни окрашивание VEGF значимо не различалось среди подопытных групп (фиг. 15). В области СА1 процент DCX-положительно окрашенных клеток было значимо выше в группах 10 мг/кг Е4 (37,1±3,84) и 50 мг/кг Е4 (37,3±4,784%), чем в группе носителя (12,8±2,947%) (фиг. 15А), тогда как процент VEGF-положительно окрашенных клеток было значимо выше в группе 5 мг/кг Е4 (37,4±4,833%), группе 10 мг/кг Е4 (37,1±3,84%) и группе 50 мг/кг Е4 (45,1±4,753%), чем у животных, получавших носитель (15,7±4,924%) (фиг. 15В). В области СА2/CA3 процент DCX-положительно окрашенных клеток было значимо выше в группе 10 мг/кг Е4 (42,5±5,986%), чем у животных, получавших носитель (10,4±2,868%) (фиг. 15А), тогда как процент VEGF-положительно окрашенных клеток значимо не различался между подопытными группами (фиг. 15В). В коре головного мозга процент DCX-положительно окрашенных клеток было значимо выше в группе 5 мг/кг Е4 (45,2±3,339%), группе 10 мг/кг Е4 (49,4±4,949%) и группе 50 мг/кг Е4 (49,6±3,11%), чем в группе носителя (23,3±4,74%) (фиг. 15А), тогда как процент VEGF-положительно окрашенных клеток было значимо ниже у ложнооперированных животных (24,6±3,7%), чем в группе, получавшей 10 мг/кг Е4 (49,4±4,949%) (фиг. 15В).
Белок SWOB и глиофибриллярный кислый белок (GFAP) в сыворотке крови
Как показано на фиг. 16, значимо сниженную экспрессию белков S100B и GFAP наблюдают у ложнооперированных животных и у животных, получавших эстетрол, чем у животных из группы носителя.
Вывод
Представленные результаты демонстрируют, что эстетрол обладает терапевтическим дозозависимым эффектом в гиппокампальной формации и в коре головного мозга в модели ГИЭ на животных. Также в соответствии с представленными результатами, получение эстетрола уменьшает раннюю утрату серого вещества и стимулирует нейро- и васкулогенез. Кроме того, получение эстетрола не оказывает негативных воздействий на массу тела, массу головного мозга или температуру тела.
Пример 5: терапевтический эффект эстетрола у новорожденных после перинатальной или неонатальной асфиксии
Новорожденным, пострадавшим от асфиксии и проявляющим по меньшей мере один из следующих симптомов: ослабленного сознания и ацидоза (рН менее 7,00 или дефицит основания не менее 12), 10-минутной шкалы Апгара менее 5 или продолжающегося оживления через 10 минут, лечат эстетролом.
Эстетрол вводят внутривенно в виде однократной инъекции или путем инфузии в течение 6 часов после рождения в дозе 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела. Дозы можно повторять.
Необязательно новорожденных можно одновременно подвергать гипотермии в течение 72 часов, начиная в пределах 6 часов после рождения.