ИНСЕКТИЦИДНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ БОРЬБЫ С ЛИЧИНКАМИ ДВУКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ
INSECTICIDE AGENT TO CONTROL LARVAE OF FLIES

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к инсектицидным средствам, используемым для борьбы с личинками двукрылых насекомых.
Насекомые - самые разнообразные и многочисленные формы жизни на земле. В то время как большинство из около одного миллиона известных разновидностей насекомых являются полезными, около от 1% до 5%, как полагают, являются вредителями.
Эти насекомые-вредители наносят огромный ущерб здоровью человека и животных, так как нередко являются переносчиками возбудителей вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний (малярия, туляремия, японский энцефалит, желтая лихорадка, сибирская язва и др.). Кроме того, насекомые-вредители наносят большой ущерб сельскому хозяйству, так их личинки, нередко, находятся в земле, подгрызают корни и нарушают нормальный рост культурных растений (огурцы, томаты, лук, морковь, зерновые и др.). Борьба с насекомыми-вредителями имеет большое социальное, экологическое и экономическое значение, так как их массовое распространение угрожает нормальному развитию жизни человека и животных.
Существует несколько способов борьбы с вредными насекомыми: механические, физические, химические, биологические, а также их комбинированное применение.
Наибольшее применение в современных условиях имеют химические методы борьбы. Но их широкомасштабное использование приводит к загрязнению окружающей среды, гибели полезных организмов и нарушению равновесия в экологических системах. Кроме того, со временем у насекомых вырабатывается устойчивость к таким химическим препаратам.
Использование биоинсектицидов для борьбы с насекомыми-вредителями является наиболее выгодным с экологической и экономической точки зрения.
Специфическими возбудителями болезней насекомых являются многие бактерии, грибы, вирусы, простейшие, гельминты. Эти агенты вызывают эпизоотии среди насекомых и при внесении их в среду обитания насекомых могут стать естественными сочленами биоценоза, обусловливая снижение их численности.
В качестве действующих агентов биоинсектицидов могут быть использованы бактерии и грибы. Бактериальные инсектициды, в основном, основаны на спорокристаллической биомассе бактерий Bacillus thuringiensis [RU 2199214], которые способны в ходе споруляции образовывать кристаллоподобные включения, состоящие из энтомоцидных белков - дельта-эндотоксинов (также называемых Cry-белками). Известны способы получения бактериальных инсектицидов, содержащих в качестве действующего начала дельта-эндотоксин в чистом виде, выделенного из бактерий Bacillus thuringiensis [RU 2264100 - RU 2264103].
Грибные инсектициды основаны на спорово-мицелиальной биомассе различных микроскопических грибов, обладающих энтомопатогенной активностью, например, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Verticillium lecanii, Tolypocladium cylindrosporum, Paecilomyces farinosus и др. [US 7122176].
Известны энтомопатогенные препараты, содержащие в качестве действующего начала дельта-эндотоксин в чистом виде, выделенный из бактерий Bacillus thuringiensis [RU 2264100 - RU 2264103]. Несмотря на высокую эффективность, данные препараты характеризуются сложностью их получения, высокой стоимостью и непродолжительным периодом действия.
Известно инсектицидное средство против личинок комаров на основе бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis H-14 ВКПМ В-7572, содержащее в качестве действующего начала спорокристаллический комплекс бактерий с добавлением консерванта и стабилизатора [ЕА000295].
Основным недостатком данного средства является непродолжительное время его действия (обычно не более 1 месяца), после чего требуется повторная обработка. Кроме того, при обработке водоемов количество вносимого средства (доза) напрямую зависит от глубины обрабатываемого водоема: чем больше глубина, тем больше доза. Обработка глубоких водоемов может привезти к резкому увеличению количества вносимого средства.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является инсектицидное средство против личинок комаров, содержащее бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis и добавки, которые иммобилизованы в гранулы альгинатного геля. В качестве добавок используют овсяную и кукурузную муку. [Заявка на патент Мексики. МХРА02005713, Suero Monserrat Ramirez "Formulation of corn flour or grits pellets using the mixture spore-crystal of the Bacillus thuringiensis israelensis variety encapsulated with sodium alginate and calcium chloride for the mosquito's larvae control" Опубликован 2004 г.]
Недостатком данного средства является то, что оно обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых непродолжительное время после обработки мест выплода насекомых (50-60 дней).
Технической задачей данного изобретения является создание инсектицидного средства, обладающего более длительным сроком воздействия на личинки двукрылых насекомых после обработки мест их выплода (подвальных помещений, луж, метрополитенов, водной поверхности и т.д.).
Поставленная задача решается тем, что инсектицидное средство, содержащее иммобилизованные бактерии Bacillus thuringiensis и добавки, дополнительно содержит иммобилизованные клетки грибов, обладающих энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, а в качестве добавок содержит питательные вещества для грибов и бактерий и вещества, придающие гранулам средства плавучесть.
В качестве грибов, обладающих энтомопатогенной активностью, могут быть использованы микроскопические грибы Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Verticillium lecanii, Tolypocladium cylindrosporum, Paecilomyces farinosus и др.
Предпочтительно, в качестве грибов, обладающих энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, используют клетки гриба Tolypocladium cylindrosporum.
В качестве питательных веществ могут быть использованы крахмал, желатин и другие высокомолекулярные вещества природного происхождения в количестве, достаточном для обеспечения жизнедеятельности микроорганизмов в течение всего срока действия средства.
8
20
В качестве добавок, придающих гранулам плавучесть, могут быть использованы различные растительные масла (подсолнечное, рапсовое и др.), алканы С-С, а также другие вещества природного происхождения, не токсичные для живых организмов, плотность которых меньше плотности воды.
Иммобилизация микроорганизмов в смеси с добавками может быть осуществлена различными известными способами, в том числе, методами, подробно описанными в книге А.П.Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Спасов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Издательство Московского Университета, Университетское издательство им. Св. Климента Орхидского, 1994, стр.157-170.
В частности, иммобилизация может быть осуществлена путем прикапывания (погружения) мелких жидких капель смеси альгината натрия, клеток микроорганизмов и добавок к водному раствору, содержащему 0,5-8% хлористого кальция.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Примеры 1-9 иллюстрируют методику получения инсектицидного средства, содержащего клетки бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis, клетки различных типов грибов и различные добавки.
Пример 1
3
2
4
4
4
9
В коническую колбу емкостью 750 мл вносят 250 мл среды Чапека (глюкоза - 30 г/л, NaNO - 2 г/л, КНРO - 1 г/л, MgSO - 0,5 г/л, КСl - 0,5 г/л, FeSO - 0,01 г/л, вода - 1000 мл) стерилизуют в автоклаве 30 минут при давлении 0,5 атм и после охлаждения вносят 2 мл посевной культуры микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum. Культуру инокулируют в течение 6 суток при комнатной температуре на микробиологической роторной качалке при скорости 140 об/мин до концентрации клеток 10 КОЕ/мл.
10
Параллельно аналогичным способом выращивают клетки бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis на среде L-бульон в течение 48 часов до получения концентрации клеток бактерии, равной 10 КОЕ/мл.
Отдельно в стеклянном стакане емкостью 250 мл смешивают 1 г ионотропного блок-сополимера - природного альгината натрия с водой (99 мл) до получения гелеобразной массы, к которой также при перемешивании добавляют 10 г питательной добавки - крахмала и 10 г подсолнечного масла.
К полученной смеси альгината натрия, крахмала, подсолнечного масла и воды добавляют 5 мл приготовленной культурой клеток микроорганизмов микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum и 5 мл клеток бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis и перемешивают до получения однородной массы.
В отдельной емкости объемом 500 мл готовят 2%-ный водный раствор сшивающего агента (кросс-агента) - хлористого кальция.
Иммобилизацию осуществляют следующим образом. Однородную смесь альгината натрия, крахмала, подсолнечного масла с клетками микроорганизмов под давлением (1-5 бар) пропускают через инжекторную установку под давлением, а в область отрыва капель подают поток воздуха. Образующиеся при отрыве от сопла инжекторной установки капли раствора с клетками попадают в раствор хлористого кальция (кросс-агента), где происходит полимеризация альгината натрия с образованием плотных гранул биополимера с заключенными внутри клетками микроорганизмов. Полимеризация происходит за счет химической реакции между полимером и солью металла. Размер гранул может варьироваться в зависимости от напора воздушной струи, подаваемой в область распыла гелеобразной массы.
9
10
Всего для приготовления инсектицидного средства было взято 5 мл клеток гриба (концентрация клеток 10 КОЕ/мл) и 5 мл клеток бактерии (концентрация клеток бактерий 10 КОЕ/мл). Тогда отношение количества клеток гриба к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве равно 1:10.
Полученные гранулы инсектицидного средства, содержащие иммобилизованные клетки гриба Tolypocladium cylindrosporum и клетки бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis, отфильтровывают от раствора соли, сушат и смешивают с раствором консервирующего агента (лактоза) и хранят до их использования. Срок хранения инсектицидного средства - 1 год.
Пример 2
Клетки бактерии и гриба выращивают аналогично примеру 1.
К 120 г смеси альгината натрия, крахмала и подсолнечного масла, полученной аналогично примеру 1, добавляют 10 мл приготовленной культуры микроорганизмов микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum. Иммобилизацию микроскопического гриба осуществляют аналогично примеру 1, при этом в качестве кросс-агента используют предварительно приготовленный 4%-ный водный раствор хлористого кальция.
Полученные гранулы, содержащие иммобилизованные микроорганизмы гриба Tolypocladium cylindrosporum, отфильтровывают от раствора соли и сушат.
К 120 г смеси альгината натрия, крахмала и подсолнечного масла, полученной аналогично примеру 1, добавляют 10 мл приготовленной культуры бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis. Иммобилизацию клеток бактерии осуществляют аналогично примеру 1, при этом в качестве кросс-агента используют предварительно приготовленный 3%-ный водный раствор хлористого кальция.
Полученные гранулы, содержащие иммобилизованные клетки бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis, отфильтровывают от раствора соли и сушат.
Полученные гранулы иммобилизованных клеток гриба Tolypocladium cylindrosporum смешивают с гранулами иммобилизованных клеток бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis в массовом соотношении 3:1. Отношение количества клеток гриба к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве равно 1:3.33.
Полученная смесь представляет собой готовую форму инсектицидного средства, которое используют для обработки мест выплода комаров (подвальных помещений, луж, метрополитенов, водной поверхности и т.д.). Срок хранения - 10 мес.
Пример 3
Процесс получения инсектицидного средства осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве грибов используют Beauveria bassiana, в качестве питательного вещества - желатин; в качестве вещества, придающего гранулам плавучесть, - додекан. Отношение количества клеток гриба к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве = 1:10.
Полученная смесь представляет собой готовую форму инсектицидного средства, которое используют для обработки мест выплода комаров (подвальных помещений, луж, метрополитенов, водной поверхности и т.д.). Срок хранения полученного инсектицидного средства - 1 год.
Пример 4
Процесс получения инсектицидного средства осуществляют аналогично примеру 2, но в качестве грибов используют Metarhizium anisopliae, в качестве питательных веществ - сахар, в качестве веществ, придающих гранулам плавучесть, - кукурузное масло.
Полученные гранулы иммобилизованных микроорганизмов гриба Metarhizium anisopliae смешивают с гранулами иммобилизованных бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis в массовом соотношении 1:3. Отношение количества клеток гриба к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве = 1:30.
Полученная смесь представляет собой готовую форму инсектицидного средства, которое используют для обработки мест выплода комаров (подвальных помещений, луж, метрополитенов, водной поверхности и т.д.).
Срок хранения полученного инсектицидного средства - 1 год.
Пример 5
Процесс получения иммобилизованных клеток гриба осуществляют аналогично примеру 2, но в качестве гриба используют Verticillium lecanii, в качестве питательных веществ - смесь крахмала и желатина (1:1 масс), в качестве веществ, придающего гранулам плавучесть - воск.
Полученные гранулы иммобилизованных микроорганизмов гриба Verticillium lecanii смешивают с гранулами иммобилизованных бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis в массовом соотношении 1:1.
Отношение количества клеток гриба к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве = 1:10.
Полученная смесь представляет собой готовую форму инсектицидного средства, которое используют для обработки мест выплода комаров (подвальных помещений, луж, метрополитенов, водной поверхности и т.д.).
Срок хранения полученного инсектицидного средства - 1 год.
Пример 6
9
Клетки микроскопического гриба Beauveria bassiana инокулируют аналогично примеру 1 в течение 7 суток при комнатной температуре на микробиологической роторной качалке при скорости 140 об/мин до концентрации клеток 10 КОЕ/мл.
Отдельно в стеклянном стакане емкостью 250 мл смешивают 1 г ионотропного блок-сополимера - природного альгината натрия с водой (99 мл) до получения гелеобразной массы, к которой также при перемешивании добавляют 10 г питательной добавки - крахмала и 5 г подсолнечного масла и 2 г додекана.
К полученной смеси альгината натрия, крахмала, подсолнечного масла, додекана и воды добавляют 5 мл приготовленной культурой клеток микроорганизмов микроскопического гриба Beauveria bassiana.
В отдельной емкости объемом 500 мл готовят 2.5%-ный водный раствор сшивающего агента (кросс-агента) - хлористого кальция.
Иммобилизацию клеток гриба осуществляют аналогичного примеру 1.
Полученные гранулы, содержащие иммобилизованные клетки гриба Beauveria bassiana, отфильтровывают от раствора соли и сушат.
Аналогично получают сухие гранулы иммобилизованных клеток гриба Metarhizium anisopliae.
Сухие гранулы, содержащие клетки гриба Beauveria bassiana, смешивают с гранулами, содержащими содержащие иммобилизованные микроорганизмы гриба Tolypocladium cylindrosporum (полученными в примере 2), гранулами, содержащими клетки гриба Metarhizium anisopliae, и гранулами, содержащими содержащие иммобилизованные бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis, (полученными в примере 2) в массовом соотношении 1:1:1:1.
Отношение суммарного количества клеток грибов к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве = 1:3.3.
Пример 7
Полученные в примере 2 сухие гранулы, содержащие иммобилизованные микроорганизмы гриба Tolypocladium cylindrosporum, и сухие гранулы (полученные также в примере 2), содержащие иммобилизованные клетки бактерии Bacillus thuringiensis var. Israelensis, смешивают в массовом соотношении 1:10.
Отношение количества клеток гриба к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве = 1:100.
Полученная смесь представляет собой готовую форму инсектицидного средства, которое используют для обработки мест выплода комаров (подвальных помещений, луж, метрополитенов, водной поверхности и т.д.).
Срок хранения полученного инсектицидного средства - 1 год.
Пример 8
Сухие гранулы, содержащие иммобилизованные микроорганизмы гриба Tolypocladium cylindrosporum (полученные в примере 2), и сухие гранулы, содержащие иммобилизованные клетки бактерии Bacillus thuringiensis var. Israelensis (полученные также в примере 2), смешивают в массовом соотношении 1000:1.
Отношение количества клеток гриба к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве = 100:1.
Полученная смесь представляет собой готовую форму инсектицидного средства, которое используют для обработки мест выплода комаров (подвальных помещений, луж, метрополитенов, водной поверхности и т.д.).
Срок хранения полученного инсектицидного средства - 1 год.
Пример 9 (сравнительный)
Процесс получения инсектицидного средства осуществляют аналогично примеру 1, но не используя при этом добавки питательных веществ и веществ, придающих плавучесть гранулам.
Срок хранения полученного инсектицидного средства - 30 дней.
Примеры 10-19 иллюстрируют эффективность инсектицидных средств, полученных по примерам 1-9 и прототипу.
Оценку эффективности инсектицидных средств проводили путем сравнения обилия (численности) личинок в нескольких рядом расположенных, не сообщающихся водоемах, приблизительно одинаковой площади около 50 м каждый, до и после обработки. Один водоем обрабатывали инсектицидным средством, полученным по примерам 1-9, другой инсектицидным средством по прототипу. Один водоем (контрольный) не обрабатывали.
Обилие личинок насекомых в толще воды определяли согласно методическим указаниям МУ 3.1.1027-01 «Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций», утвержденным главным санитарным врачом Российской Федерации 6 апреля 2001 г.
2
Обработку водоемов инсектицидным средством проводили путем распыления предварительно полученной суспензии гранул инсектицидного средства в воде, содержащей 1 мас.% гранул, исходя из расчета - 1 мл суспензии на 1 м поверхности водоема. Для распыления суспензии гранул использовали ранцевые опрыскиватели.
Перед обработкой, а также через 24 ч после обработки водоема определяли количество живых личинок в каждом из водоемов. В дальнейшем, определение количества живых личинок в водоемах проводили 1-2 раза в неделю в течение 3-5 месяцев. На основании полученных результатов определяли численность личинок в % от первоначальной (исходной численности).
Пример 10
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 1. Динамика изменения численности живых личинок в водоемах во времени до и после обработки (в % от первоначальной численности) приведена на чертеже.
Как видно из приведенного графика, заявленное инсектицидное средство обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, по крайней мере, в течение 90 дней (3 месяца). В тоже время, средство по прототипу теряет свою эффективность через 50-60 дней.
Пример 11
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 2. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 2 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 120 дней (4 месяца).
Пример 12
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 3. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 3 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 90 дней (3 месяца).
Пример 13
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 4. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 4 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 100 дней (более 3 месяцев).
Пример 14
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 5. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 5 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение ПО дней (более 3 месяцев).
Пример 15
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 6. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 6 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 120 дней.
Пример 16
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 7. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 7 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 70 дней.
Динамика изменения численности живых личинок в водоемах во времени до и после обработки (в % от первоначальной численности) приведена на чертеже.
Несмотря на то, что при использовании инсектицидного средства по примеру 7 поставленная цель достигается (средство обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 80 дней), однако, из-за незначительного увеличения срока работы данного средства, использование средства такого состава экономически нецелесообразно.
Пример 17
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, состава по примеру 8. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 8 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 140 дней.
Динамика изменения численности живых личинок в водоемах во времени до и после обработки (в % от первоначальной численности) приведена на чертеже.
Несмотря на то, что при использовании инсектицидного средства по примеру 8 поставленная цель достигается (средство обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 140 дней), однако, при этом, в первые дни после обработки наблюдается медленное падение численности живых личинок в обработанном водоеме, и использование средства такого состава экономически нецелесообразно.
Пример 18 (сравнительный)
Обработку проводили, используя суспензию гранул инсектицидного средства, полученного в примере 9 и не содержащего добавок веществ. Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по примеру 9 обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 64 дней.
Использование такого инсектицидного средства (не содержащего добавок питательных веществ и веществ, придающих гранулам плавучесть) позволяет очень незначительно увеличить срок его действия, при этом срок хранения такого средства не превышает 30 суток. Применение и использование такого средства экономически нецелесообразно.
Пример 19 (по прототипу)
Обработку проводили, используя суспензию гранул, содержащих только клетки бактерии Bacillus thuringiensis var. Israelensis, полученных в примере 2.
Экспериментально установлено, что инсектицидное средство по прототипу обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых в течение 60 дней. Динамика изменения численности живых личинок в водоемах во времени до и после обработки (в % от первоначальной численности) приведена на чертеже.
Таким образом, предлагаемое инсектицидное средство обладает энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых по отношению к личинкам двукрылых насекомым в течение 70-140 дней практически при любом соотношении клеток грибов и бактерии. Однако лучшие результаты достигаются при соотношениях количества клеток грибов к количеству клеток бактерии в инсектицидном средстве, равном 1:3.3÷30.