ШТАММ STREPTOMYCES COERULEORUBIDUS - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ДАУНОРУБИЦИНА
STREPTOMYCES COERULEORUBIDUS STRAIN - ANTIBIOTIC DAUNORUBICIN PRODUCER

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика даунорубицина, принадлежащего к основной группе антилейкемических препаратов и применяемого также в терапии многих видов рака мягких тканей, рака молочной железы, рака легкого. Кроме того, даунорубицин является исходным сырьем для полусинтетического противоопухолевого препарата доксорубицина.
Известен штамм Streptomyces coeruleorubidus 2679 - продуцент антибиотика даунорубицина [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 500 мкг/мл).
60
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент даунорубицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина и гамма-лучей Со на исходный штамм №2679 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и карминомицин в качестве селективных агентов.
Полученный новый штамм - продуцент даунорубицина депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП Ас-890.
Штамм ВКМП Ас-890 обладает повышенной продуктивностью даунорубицина (2000 мкг в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКМП Ас-890. Температура 28°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал приготовлен с поверхности десятидневной культуры штамма, выращенного на гороховом агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (Таблица 1).
Морфологические признаки. Цепочки спор спиральные. Споры продолговатые и шаровидные, поверхность спор шиповатая, шипы средней величины; спороносцы спиральные, вытянутые.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С и в диапазонах значений рН (5,0-10,0) с оптимумом роста при рН 7,0. Молоко пептонизирует, сахарозу инвертирует, крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу и сахарозу; умеренно - рафинозу, рамнозу; слабо - ксилозу, манит, не использует арабинозу.
Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.
Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозонитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.
Штамм ВКПМ Ас-890 поясняется следующим примером.
Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКПМ Ac-890 выращивают в течение (7-10) суток при 28°С на среде №2 Гаузе следующего состава, %:
Глюкоза
1,0
Пептон
0,5
Бульон Хоттингера (28-30) мг %
3,0
NaCl
0,5
Вода
Водопроводная
рН до стерилизации
7,0-7,2
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении в 1,0 атм и 120°С.
2
Для получения посевного мицелия споры культуры засевают агаровым блочком 2 см на жидкую питательную среду следующего состава, %:
Соевая мука
1,0
Глюкоза
2,0
Кальция карбонат
0,3
Натрий хлористый
0,5
Вода
Водопроводная
рН до стерилизации
6,8-7,0
Посевную культуру выращивают при 28°С в течение 48 ч в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл с наполнением среды 100 мл. Скорость вращения качалки (280-320) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - 7%.
Ферментация проводится на качалке при 28°С на среде (100 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:
Соевая мука
3,0
Глюкоза
3,0
NaCl
0,3
СаСО<sub>3</sub>
0,3
Вода
Водопроводная
рН до стерилизации
6,8-7,0
Антибиотическая активность, определенная методом ВЭЖХ через 144-168 ч биосинтетического процесса, составляет 2500 мкг/мл, при этом содержание даунорубицина в дауномициновом комплексе - 2000 мкг/мл (80%).
Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является в 4 раза повышенная продуктивность даунорубицина, а именно содержание даунорубицина в ферментационной жидкости штамма-прототипа 500 мкг/мл, а в новом штамме - 2000 мкг/мл, что составляет 80% от его содержания в дауномициновом комплексе. Антибиотическая активность дауномицинового комплекса, накапливаемого к концу ферментации, увеличена более чем в два раза по сравнению с прототипом (Таблица 2) - 2500 и 950, соответственно.
Даунорубицин, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма, представляет собой кристаллический порошок красного цвета, легко растворимый в метаноле, хлороформе, растворимый в ацетоне и этаноле и нерастворимый в воде. По физико-химическим свойствам, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует требованиям ФС.
Полученный новый штамм может быть использован как микробиологическая основа в промышленном производстве противоопухолевого антибиотика даунорубицина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фомичева Е.В. Изучение компонентного состава рубомициновых комплексов, продуцируемых промышленными штаммами S.coeruleorubidus Ч-157 и 2679 и усовершенствование метода получения рубомицина С. // Дисс.канд. хим. наук. М., (1993 г.).
Таблица 1.
Культурально-морфологические признаки штамма Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКПМ Ac-890
Агаровая среда
Рост воздушного мицелия
Цвет мицелия
Растворимый пигмент
Воздушного
Субстрактного
№1 Гаузе
Хороший паутинистый
Бледно-розовый (Н 5)
Фиолетовый (А 3)
+
Овсяная
Хороший
Розовый (Ж 3)
Красно-бурый (З 5)
+
Чапека (глюкозо-аспарагиновая)
Хороший
От розового до голубовато-серого (Ж 3-Н 7)
Светло-фиолетовый (А 5)
+
Линденбайна (глицерин-нитратная)
Скудный
Бледно-розовый (Н 5)
Темно-фиолетовый (Б 2)
+
Глюкозо-нитратная №2 Гаузе
Скудный
Бледно-розовый (Н 5)
Буровато-красный (Б 4)
+
Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом)
Образуются меланоидные пигменты
+
Таблица 2.
Сравнительная антибиотическая активность нового штамма ВКПМ Ас-890 и штамма-продуцента прототипа
Штамм-продуцент
Антибиотическая активность культуральной жидкости, мкг/мл
Даунорубицин
Антрациклиновый комплекс
Новый штамм
2000
2500
Штамм-прототип
500
950