СПОСОБ АДРЕСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ЭКЗОСОМЫ
METHOD FOR TARGETED IMPACT ON EXOSOMES

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящее изобретение испрашивает приоритет согласно предварительной заявке США №62/554,530, поданной 5 сентября 2017, предварительной заявке США №62/554,533, поданной 5 сентября 2017, предварительной заявке США №62/569,403, поданной 6 октября 2017, предварительной заявке США №62/569,411, поданной 6 октября 2017, предварительной заявке США №62/584,565, поданной 10 ноября 2017, предварительной заявке США №62/593,014, поданной 30 ноября 2017, причем каждая из указанных заявок полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, представленный электронно через EFS-web, который одновременно служит как бумажной копией, так и машиночитаемой формой (CRF), и состоит из файла, названного «ST-CT7-PCT_sequence.txt», созданного 5 сентября 2018, имеющего размер 9,823 байта и полностью включенного в настоящую заявку посредством ссылки.
[0001] Настоящее изобретение относится к способу адресного воздействия на внеклеточные везикулы, в котором используется молекула, содержащая домен GLA, и внеклеточные везикулы, которые получают или которые могут быть получены способом, описанным в настоящем документе.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Внеклеточные везикулы (также известные как микровезикулы или микрочастицы) исторически считались несущей средой для удаления отходов из клеток. Однако в последнее время установлено, что на самом деле внеклеточные везикулы участвуют в жизненно важной межклеточной коммуникации.
[0003] Показано, что внеклеточные везикулы можно получать из почти всех клеток млекопитающих, в том числе здоровых клеток, стволовых клеток и больных клеток, например, раковых клеток. Внеклеточные везикулы чрезвычайно стабильны и могут существовать практически во всех биологических жидкостях, включая плазму крови, слюну, мочу, желчь, синовиальную жидкость, сперму и грудное молоко.
[0004] Считается, что больные клетки, например, раковые клетки, используют внеклеточные везикулы, например, экзосомы, для подготовки и обсеменения областей метастазирования. Клетки, ннфицированные патогеном, могут использовать внеклеточные везикулы для распространения инфекции. Кроме того, известно, что бактериальные клетки высвобождают внеклеточные везикулы.
[0005] Существует большой интерес к исследованию, пониманию и использованию этих внеклеточных везикул, особенно вовлеченных в патологические процессы. Предполагается, что эти везикулы можно применять в терапии в качестве альтернативы стволовым клеткам.
in vivo
.
in vivo
[0006] Тем не менее существуют определенные практические трудности, поскольку везикулы имеют небольшие размеры и присутствуют в низких концентрациях Кроме того, существует небольшое количество маркеров, позволяющих отличить внеклеточные везикулы, полученные из больных клеток, от внеклеточных везикул, полученных из нормальных клеток. Еще одним осложнением является то, что эти небольшие объекты находятся  в сложном окружении, включающем смесь биологических молекул, факторов, ионов, минералов и т.д. Поэтому даже выделение и/или мониторинг этих внеклеточных везикул является сложной задачей.
[0007] Для выделения везикул может потребоваться семь или более этапов, причем основным используемым параметром обычно является размер. Поскольку диаметр внеклеточных везикул может быть менее 300 нм, и поскольку они характеризуются низким показателем преломления, многие используемые в настоящее время способы не позволяют обнаруживать внеклеточные везикулы. Для упрощения анализа внеклеточных везикул разработан ряд миниатюрных систем, использующих нанотехнологии и микрожидкостные технологии. Эти новые системы включают устройство микро-ЯМР, наноплазмонный чип и магнито-электрохимической датчик для определения белкового профиля; а также встроенный жидкостной картридж для обнаружения РНК. Проточная цитометрия представляет собой оптический способ обнаружения внеклеточных везикул в суспензии. Тем не менее, применимость проточной цитометрии для обнаружения одиночных внеклеточных везикул по-прежнему недостаточна из-за ограниченной чувствительности и потенциальных артефактов измерения, например, обнаружения скоплений. Другие способы обнаружения одиночных внеклеточных везикул представляют собой атомно-силовую микроскопию, анализ отслеживания наночастиц, рамановскую микроспектроскопию, обнаружение настраиваемых резистивных импульсов и трансмиссионную электронную микроскопию.
[0008] Помимо возможности выделения внеклеточных везикул для изучения и/или диагностики, считается, что эти внеклеточные везикулы могут быть пригодны для использования в качестве естественных носителей для загрузки полезными веществами, адресного воздействия и/или лечения ряда заболеваний. Тем не менее, в настоящее время существуют серьезные проблемы в отношении реализации возможности загрузки полезных веществ и фрагментов для адресного воздействия:
• в эти внеклеточные везикулы -
например, белков, нуклеиновых кислот (как природных, так и неприродных олигонуклеотидов), низкомолекулярных соединений, ферментов, зондов для определения содержимого внеклеточных везикул для терапевтических, диагностических/прогностических целей и т.д.;
• и на эти внеклеточные везикулы -
для разработки, изменения или усиления адресного воздействия, дисплея терапевтических белков, мечения и, например, сборки внеклеточных везикул для анализа или манипуляции,
• показано, что некоторые микроРНК проникают в везикулы, однако до настоящего времени не существует надежного механизма для включения материала внутрь везикулы,
например, повреждение в результате электропорации, введения реагентов для трансфекции может снизить коммерческую применимость внеклеточных везикул,
неэффективная трансдукция вирусными векторами, загрузка или выделение с помощью средств, изменяющих внеклеточные везикулы, также могут снизить диагностический или терапевтический потенциал и т.д. (обзор в Vader et al., Adv Drug Delivery Rev 106: 148-156, 2016, Sutaria et al., Pharm Res 34: 1053-1066, 2017, Lu et al., Eur J Pharm and Biopharm 119: 381-395, 2017),
в качестве реагентов для повышения проницаемости внеклеточных везикул также предлагали применять сапонины. Однако сапонины обладают сложной биологической активностью, в том числе гемолитической. Фракции сапонинов Quil A и QS-21 используются в качестве вакцинных адъювантов для усиления иммунного ответа на антиген. Поэтому сапонины нельзя использовать непосредственно.
[0009] В-третьих, может быть полезным адресное воздействие на патогенный материал и сигнальные молекулы во внеклеточных везикулах с целью ослабления распространения патологического процесса.
[0010] В настоящем описании рассматриваются вышеуказанные проблемы.
[0011] Как ни странно, эти внеклеточные везикулы, высвобождаемые из патогенных клеток, например, раковых клеток, бактериальных клеток и т.д. содержат фосфатидилсерин, экспонированный на поверхности. Экспонированный фосфатидилсерин может, например, подавлять иммунные реакции на «патогенные» везикулы. Безотносительно к теоретическим представлениям, «патогенные внеклеточные везикулы» могут характеризоваться наличием экспонированного фосфатидилсерина в отличие от нормальных здоровых внеклеточных везикул, не содержащих фосфатидилсерина, экспонированного на поверхности.
[0012] Фосфатидилсерин может являться мишенью GLA-компонентов, содержащих GLA-домен без каталитического домена. Эти молекулы можно применять для адресного воздействия на везикулы, полученных из апоптозных клеток, например, патологических, больных/инфицированных клеток.
[0013] Еще более странно, что авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что GLA-компоненты также связывают стволовые клетки (например, здоровые стволовые клетки). Безотносительно к теоретическим представлениям, эти клетки могут презентировать фосфатидилсерин на своей поверхности, что может способствовать иммуносупрессивному и воспалительному действию стволовых клеток.
[0014] Внеклеточные везикулы, полученные из клеток с экспонированным на поверхности фосфатидилсерином, также содержат фосфатидилсерин, экспонированный на их внешней поверхности. Таким образом, GLA-компоненты также можно использовать для адресного воздействия на внеклеточные везикулы из стволовых клеток.
[0015] GLA-домен может быть связан или присоединен к полезной нагрузке, например, метке, грануле, диагностической молекуле, мотиву для адресного воздействия и/или терапевтическому средству. Это позволяет выделять, идентифицировать, отслеживать и/или выполнять терапевтическое вмешательство на эти внеклеточные везикулы или их посредством.
[0016] В качестве альтернативы или дополнения, полезная нагрузка может представлять собой терапевтическое, например, лекарственное средство, биологическое терапевтическое средство, полимер или токсин, например, терапевтический вирус, онколитический вирус, вирусный вектор, противовирусное лекарственное средство, антибактериальное лекарственное средство, антипаразитарное средство, противораковое лекарственное средство, противораковое терапевтическое средство или химиотерапевтический агент, вирус или вирусный вектор (например, онколитический вирус).
[0017] Таким образом, GLA-компоненты можно применять для фиксации полезной нагрузки на поверхности внеклеточных везикул посредством GLA-домена, связывающего фосфатидилсерин, экспонированный на поверхности.
[0018] Кроме того, у авторов настоящего изобретения есть данные, позволяющие предположить, что компонент GLA согласно настоящему изобретению может переносить полезную нагрузку, присоединенную к нему, внутрь внеклеточной везикулы. Таким образом, компонент GLA можно применять для доставки полезной нагрузки внутрь внеклеточной везикулы.
[0019] Это имеет важное значение для терапевтических и/или диагностических целей, так как известные и существующие способы и молекулы эффекторов/репортеров можно переориентировать и применять для мониторинга, выделения и терапевтического вмешательства посредством везикул.
in vivo
[0020] После маркировки везикулы можно отслеживать, например, , или выделять с использованием известных способов, например, проточной цитометрии, магнитной сортировки и т.п.
[0021] Кроме того, становится очевидным, что наличие конкретных типов везикул можно использовать в качестве средства неинвазивной диагностики некоторых патологий.
[0022] Кроме того, учитывая предположение, что при раке везикулы используются для обсеменения и стимуляции метастазирования, уничтожение, удаление или адресное воздействие терапевтического средства на эти пузырьки может представлять собой способ профилактики или ослабления метастазирования; например, при РНК-интерференции можно транспортировать нуклеотиды во внеклеточные везикулы для нокаута активных микроРНК, переносимых в везикуле.
[0023] Везикулы, выделенные из инфицированных клеток, например, клеток, инфицированных вирусом, содержат клеточный материал, например РНК, белок, липиды и углеводы из инфицированной клетки, а также нуклеиновые кислоты вирусного происхождения. Эти везикулы могут играть определенную роль в инфицировании здоровых клеток. Altan-Bonnet N. 2016. Extracellular vesicles are the Trojan horses of viral infection. Curr Opin Microbiol 32:77-81; Schorey JS, Cheng Y, Singh PP, Smith VL. 2015, Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions; EMBO Rep 16:24-43, Schorey JS, Harding CV. 2016; и Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest 126:1181-9.
[0024] Везикулы, например, экзосомы, обладают несколькими свойствами, которые делают их идеальным средством для доставки материала в клетки и включают их небольшой размер (например, позволяющий проходить через гематоэнцефалический барьер), естественную способность к слиянию с плазматической мембраной клеток для доставки их содержимого, стабильная внутренняя среда и способность доставлять в клетку-реципиент функциональные молекулы, в том числе нуклеиновые кислоты (ДНК, мРНК и микроРНК), липиды и белки.
[0025] Недавние подходы направлены на разработку внеклеточных везикул для терапевтического применения. Эти подходы включают изменение содержимого везикул или манипулирование их миграционными путями. В частности, продемонстрировано, что внеклеточные везикулы могут выполнять роль терапевтических везикул для лечения рака путем снижения инвазии, миграции и пролиферации опухолевых клеток, повышения чувствительности к химиотерапии и могут вызывать усиление иммунных реакций и гибель клеток.
[0026] Кроме того, выясняется, что везикулы могут быть пригодны для применения в качестве вакцины. Везикулы, высвобождаемые из инфицированных вирусом клеток, представляют собой уникальный источник вирусного материала, прошедшего надлежащий фолдинг и процессинг и идеально подходящего для использования в качестве антигена при вакцинации. В то же время вакцины обычно требуют присутствия адъюванта для усиления иммунного ответа на антигенный компонент.
[0027] Предыдущие попытки манипулировать содержимым внеклеточных везикул с использованием классических подходов инкубирования, электропорации и трансфекции имели ограничения из-за низкой эффективности переноса, ограниченного размера полезной нагрузки, наличия остаточного вспомогательного вещества в мембране и ограничений по типу возможной полезной нагрузки. Таким образом, все еще существуют некоторые проблемы для реализации потенциала этих везикул. Следовательно, существует потребность в разработке новых способов, способных эффективно доставлять содержимое на внеклеточные везикулы и в них.
[0028] Настоящее изобретение облегчает использование потенциала внеклеточных везикул, обеспечивая их выделение, применение для диагностических целей, в качестве мишеней для терапевтического вмешательства и для доставки, например, посредством присоединения или генетического слияния, терапевтических средств, в том числе молекул, например, нуклеотидов, в том числе РНК и ДНК в клетки.
[0029] Что в большей степени, чем экспрессия фосфатидилсерина на поверхности везикул, подавляет иммунные реакции на везикулы. Компонент GLA (без присоединенной полезной нагрузки), связывающий фосфатидилсерин на поверхности внеклеточной везикулы, снимает маскировку везикулы от иммунной системы. Таким образом, компонент GLA согласно настоящему изобретению можно применять для улучшения видимости внеклеточных везикул для иммунной системы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0030] Краткое описание настоящего изобретения приведена в следующих абзацах:
1a. Способ адресного воздействия на внеклеточные везикулы с фосфатидилсерином, экспонированным на поверхности, причем указанный способ включает этап введения молекулы, содержащей:
компонент гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (GLA-компонент), причем указанный компонент GLA содержит домен GLA или его активный фрагмент и не содержит активного каталитического домена белка GLA,
в жидкость, которая может содержать внеклеточные везикулы, например, микровезикулы, апоптозные тельца и экзосомы.
1b. Молекула, содержащая полезную нагрузку, связанную с компонентом гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (GLA-компонентом),
причем указанный компонент GLA содержит домен GLA или его активный фрагмент и не содержит активного каталитического домена белка GLA для применения при обработке или диагностике внеклеточной везикулы.
1c. Молекула, содержащая полезную нагрузку, связанную с компонентом гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (GLA-компонентом),
причем указанный компонент GLA содержит домен GLA или его активный фрагмент и не содержит активного каталитического домена белка GLA для применения при производстве лекарственного средства для обработки или диагностики внеклеточной везикулы
2. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 1а, 1b или 1с, причем диаметр указанной внеклеточной везикулы находится в диапазоне от 10 до 1000 нм.
3. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 1a, 1b, 1c или 2, причем внеклеточная везикула является экзосомой.
4. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 1-3, причем диаметр указанной внеклеточной везикулы (например, экзосомы) составляет 1000 нм или менее, например, от 1 нм до 10 мкм, например, от 10 нм до 5 мкм, в частности, от 10 мкм до 1 мкм, конкретнее, от 20 нм до 100 нм, конкретнее, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нм
5. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 4, причем плотность указанной везикулы находится в диапазоне от 1 до 1,5 г/мл, например, от 1 до 1,2 г/мл, в частности, от 1,13 до 1,19 г/мл.
6. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b, 1c до 5, причем указанная везикула содержит один или более из трансмембранных белков, независимо выбранных из Lamp-1, Lamp-2, CD 13, CD86, флотиллина, синтаксина-3, CD2, CD36, CD40, CD40L, CD41a, CD44, CD45, ICAM-1, интегрина альфа 4, LiCAM, LFA-1, Mac-1 альфа и бета, Vti-IA и B, CD3 эпсилон и дзета, CD9, CD18, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82, CXCR4, FcR, GluR2/3, HLA-DM (MHC II), иммуноглобулинов, компонентов MHC-I или MHC-II, TCR-бета, тетраспанинов и комбинации двух или более из этих белков.
7. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b, 1c до 6, причем указанная везикула высвобождена из нездоровой клетки, например апоптозной клетки, некротической клетки, раковой клетки, клетки, инфицированной патогеном (например, клетки, инфицированной вирусом, клетки, инфицированной бактериями, или клетки, инфицированной паразитом).
8. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 7, причем указанная клетка представляет собой раковую клетку.
9. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 8, причем указанная клетка представляет собой раковую стволовую клетку.
10. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 1-6, причем указанная внеклеточная везикула получена из здоровой стволовой клетки.
ex vivo
11. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b, 1c до 10, причем указанная жидкость включает образец пациента , например, образец крови, жидкость, взятую из кисты или опухоли, гомогенизированный биоптат и т.п.
in vivo
12. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из пунктов 1-10, причем указанный компонент GLA вводят .
13. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 12, причем домен GLA или его активный фрагмент независимо выбран из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка C, белка S, белка Z, остеокальцина, белка GLA матрикса, GAS6, транстретина, периостина, GLA 1, богатого пролином, GLA 2, богатого пролином, GLA 3, богатого пролином, и GLA 4, богатого пролином.
14. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 13, причем домен GLA или его активный фрагмент независимо выбран из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка C, белка S, белка Z и GAS6, например, белка S, в частности, содержащего последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1
15. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 1-11, причем компонент домена GLA дополнительно содержит домен EGF, например, кальций-связывающий домен EGF.
16. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 15, причем конструкт содержит домен EGF, выбранный из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка C, белка S, белка Z, остеокальцина, белка GLA матрикса, GAS6, транстретина, периостина, GLA 1, богатого пролином, GLA 2, богатого пролином, GLA 3, богатого пролином, и GLA 4, богатого пролином.
17. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 16, причем конструкт содержит домен EGF, выбранный из доменов, независимо выбранных из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка C, белка S, белка Z и GAS6, например, домен EGF белка S.
18. Способ или молекула для применения в соответствии с одним из абзацев от 1a, 1b или 1c до 17, причем компонент GLA содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, или ее производное, где отсутствует His-метка, в частности, последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6.
19. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 14, причем компонент домена GLA дополнительно содержит домен Kringle.
20. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 19, причем домен Kringle получен из белка, выбранного из группы, содержащей активирующий фактор транскрипции 2 (ATF); фактор XII (F12); тромбин (F2); гиалуронан-связывающий белок 2 (HABP2); фактор роста гепатоцитов (HGF); активатор фактора роста гепатоцитов (HGFAC); белок Kremen 1 (KREMEN1); KREMEN2 ; липопротеин (а) (LPA); LPAL2; белок, стимулирующий макрофаги (MSP или  MST1); белок 1, взаимодействующий с фосфоинозитид-3-киназой (PIK3IP1); тканевый активатор плазминогена (PLAT); урокиназу (PLAU);  плазмин (PLG); PRSS12; трансмембранный рецептор ROR1 тирозин-протеинкиназы (ROR1); и трансмембранный рецептор ROR2 тирозин-протеинкиназы (ROR2).
21. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 20, причем компонент GLA связан с полезной нагрузкой.
22. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 21, причем компонент GLA конъюгирован с полезной нагрузкой.
23. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 22, причем компонент GLA является частью полезной нагрузки.
24. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 23, причем полезная нагрузка содержит обнаружимую метку.
99m
25. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 24, причем указанная метка выбрана из флуоресцентной молекулы (включая флуоресцентный зонд (например, родаминовый краситель, FITC, FAM, CY5), биотина, фермента, метки (например, HIS-метки, FLAG-метки, myc-метки), радионуклида (в частности, радиоактивного иода, радиоизотопов, например, Tc), люминесцентных меток или соединений, которые можно обнаружить с помощью ЯМР- или ЭПР-спектроскопии, включая случаи, когда обнаружимая метка находится в молекулярном маяке.
26. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 25, причем полезная нагрузка представляет собой гранулу, планшет или метку, например, выделяемую гранулу, например, магнитную гранулу.
27. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацами 21-26, причем полезная нагрузка связана с GLA-компонентом через линкер.
28. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 27, причем линкер является расщепляемым.
29. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 21-28, причем компонент GLA и полезная нагрузка являются диагностическими.
30. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 29, причем указанный способ включает дополнительную стадию получения обогащенной популяции внеклеточных везикул.
31. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 30, причем указанный способ включает этап выделения внеклеточных везикул.
in vitro
32. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 31, причем указанный способ осуществляют .
Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев от 1a, 1b или 1c до 32, причем молекула, содержащая компонент GLA, является терапевтической.
34. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 21-25 и 33, причем полезная нагрузка содержит лекарственное средство, химиотерапевтическое средство, пептид (включая сшитые пептиды) или биологическое терапевтическое средство, например, противовирусное лекарственное средство, антибактериальное лекарственное средство, антипаразитарный агент, противораковое лекарственное средство, противораковое терапевтическое средство.
35. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 21-25, 33 и 34, причем полезная нагрузка содержит токсин, полимер (например, синтетические или встречающиеся в природе полимеры), биологически активные белки (например, ферменты, другое антитело или фрагменты антител, например, интраантитела), лекарственное средство (низкомолекулярное соединение (химическую структуру), нуклеиновые кислоты и их фрагменты (например, ДНК, РНК и их фрагменты), агент, образующий хелаты с металлами, наночастицы или комбинацию двух или более из них.
36. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 35, причем токсин выбран из ауристатина (например, MMAE (монометилауристатина E), MMAF (монометилауристатина F)), пирролбензодиазепина (PBD), доксорубицина, дуокармицина, майтансиноида (например, N2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансина (DM1), N2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-1-оксопентил)-майтансина (DM3) и N2'-деацетил-N2'-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтансина (DM4)), калихеамицина, доластатина, майтансина, α-аманитина, экзотоксина Pseudomonas (PE38), цепи A рицина, дифтерийного токсина, противовирусного белка Pokeweed (PAP), сапорина, гелонина и тубулизина.
37. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 34-36, причем химиотерапевтическое средство выбрано из темозоломида, эпотилонов, мелфалана, кармустина, бусульфана, ломустина, циклофосфамида, дакарбазина, полифепрозана, ифосфамида, хлорамбуцила, мехлорэтамина, бусульфана, циклофосфамида, карбоплатина, цисплатина, тиотепы, капецитабина, стрептозоцина, бикалутамида, флутамида, нилутамида, ацетата лейпролида, гидрохлорида доксорубицина, сульфата блеомицина, гидрохлорида даунорубицина, дактиномицина, липосомального цитрата даунорубицина, липосомального гидрохлорида доксорубицина, гидрохлорида эпирубицина, гидрохлорида идарубицина, митомицина, доксорубицина, валрубицина, анастрозола, цитрата торемифена, цитарабина, фторурацила, флударабина, флоксуридина, интерферона α-2b, пликамицина, меркаптопурина, метотрексата, интерферона α-2а, ацетата медроксипрогестерона, фосфата эстрамустина-натрия, эстрадиола, ацетата лейпролида, ацетата мегестрола, ацетата октреотида, дифосфата диэтилстилбестрола, тестолактона, ацетата гозерелина, фосфата этопозида, сульфата винкристина, этопозида, винбластина, этопозида, сульфата винкристина, тенипозида, трастузумаба, гемтузумаба озогамицина, ритуксимаба, экземестана, гидрохлорида иринотекана, аспарагиназы, гидрохлорида гемцитабина, альтретамина, гидрохлорида топотекана, гидроксимочевины, кладрибина, митотана, гидрохлорида прокарбазина, тартрата винорелбина, пентростатина натрия, митоксантрона, пегаспаргазы, денилейкина дифтитокса, альтретиноина, порфимера, бексаротена, паклитаксела, доцетаксела, триоксида мышьяка, третиноина и комбинации двух или более из них.
38. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 34-37, причем химиотерапевтическое средство выбрано из алкилирующего агента, антиметаболита, включая ингибиторы тимидилатсинтазы, таксана, антрациклина, агента, оказывающего влияние на микротрубочки, включая растительные алкалоиды, и комбинации из двух или более из них.
39. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 38, причем химиотерапевтическое средство выбрано из паклитаксела, доцетаксела, абраксана, карбазитаксела, производных любого из них и комбинаций двух или более из любого из них.
40. Способ или молекула для применения в соответствии с пунктом 38 или 39, причем алкилирующий агент выбран из аналога азотистого иприта, производного нитрозомочевины, тетразина, азиридина , соединения платины и их производных, неклассического алкилирующего агента и комбинации двух или более из них.
41. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 40, причем соединение платины выбрано из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, сатраплатина, пикоплатина, недаплатина, триплатина, липоплатина и комбинации двух или более из них.
42. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 38-41, причем алкилирующий агент представляет собой антиметаболит, выбранный из антифолатов (например, метотрексата и пеметрекседа), аналогов пурина (например, тиопуринов, например, азатиопурина, меркаптопурина, тиопурина, флударабина (включая фосфатную форму), пентостатина и кладрибина), аналогов пиримидина (например, фторпиримидинов, например, 5-фторурацила и его пролекарств, например, капецитабина [Xeloda]), флоксуридина, гемцитабина, децитабина, гидрохлорида ралтитрекседа (томудекса), кладрибина и 6-азаурацила и комбинации двух или более из них.
43. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 40-42, причем антрациклин выбран из даунорубицина (дауномицина), даунорубицина (липосомального), доксорубицина (адриамицина), доксорубицина (липосомального), эпирубицина, идарубицина, митоксантрона и комбинации двух или более из них, в частности, доксорубицина.
44. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 34-43, причем лекарственное средство представляет собой противораковое лекарственное средство, например, выбранное из ингибитора топоизомеразы, ингибитора PARP и их комбинации или нескольких из них.
45. Способ или молекула для применения в соответствии с любым из абзацев 34-44, причем противораково терапевтическое средство представляет собой радионуклид, например, выбранный из Y-90, P-32, I-131, In-111, Sr-89, Re-186, Sm-153, Sn-117m и комбинации двух или более из них.
46. Способ или молекула для применения по любому из пунктов от 1а, 1b или 1с до 25 и 27-45, включающий введение молекулы, содержащей компонент GLA и полезную нагрузку, пациенту, страдающему от рака.
47. Способ или молекула для применения в соответствии с абзацем 46, причем рак представляет собой эпителиальный рак, например рак оболочной и прямой кишки, рак яичка, рак печени, рак желчных путей, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак матки, рак желудка, рак пищевода, рак щитовидной железы, рак почки, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак головы и шеи или рак легких или, в качестве альтернативы, рак может представлять собой гемобластоз, например, лейкоз, лимфому, миелому и хронические миелопролиферативные заболевания, например, ОМЛ.
В одном варианте реализации способ согласно настоящему изобретению не предусматривает адресного воздействия на апоптозное тело.
[0031] Таким образом, в одном варианте реализации молекулы в соответствии с настоящим изобретением применяют при лечении патогена, например, вирусных, бактериальных, протозойных, паразитарных инфекций, в том числе их внутриклеточных форм.
[0032] Настоящее изобретение также распространяется на применение компонента GLA, содержащего домен GLA или его активный фрагмент, причем указанный компонент GLA не содержит активного каталитического домена белка GLA, для адресного воздействия и доставки внутри везикулы (включая доставку полезной нагрузки внутри везикулы).
[0033] Настоящее изобретение также распространяется на применение компонента GLA, содержащего домен GLA или его активный фрагмент, причем указанный компонент GLA не содержит активного каталитического домена белка GLA, для производства лекарственного средства для адресного воздействия и доставки внутри клетки (включая доставку полезной нагрузки внутри везикулы, в частности, если полезная нагрузка содержит терапевтический объект/молекулу).
in vitro
[0034] Таким образом, в одном аспекте предложен способ получения/выделения везикул  из клеток линий человека, инфицированных патогеном, использующий способ, описанный в настоящем документе, например, клеток Нер-2, клеток А549, клеток Calu-3, клеток HEK и клеток почки Madin Darby (MDCK), например, для применения в составе вакцины.
in vitro,
[0035] В одном варианте реализации везикулы, полученные/выделенные загружают полезной нагрузкой, например, олигонуклеотидом или полинуклеотидом, например, ДНК или РНК, например, CPG, используя компонент гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (компонент GLA), содержащий домен GLA или его активный фрагмент и не содержащий активного каталитического домена белка GLA.
in vitro,
[0036] В одном варианте реализации везикулы, полученные/выделенные загружают молекулой иммуностимулятора, используя компонент гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (компонент GLA), содержащий домен GLA или его активный фрагмент и не содержащий активного каталитического домена белка GLA.
[0037] Миметик внеклеточных везикул можно получить in vitro путем разрушения клеток посредством последовательной экструзии, см., например, Jang et al Nano 2013, 7, 7698. Эти миметики содержат фосфатидилсерин на своей поверхности, если они получены из апоптозных или стволовых клеток.
[0038] В одном варианте реализации олигонуклеотид или полинуклеотид конъюгирован с компонентом GLA.
[0039] Настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей внеклеточные везикулы из клетки, инфицированной патогеном, и загруженные экзогенной иммуностимулирующей молекулой, например, выбранной из адъюванта, например, агониста TLR9, например, CPG, C3b, ICAM-1; и компонента GLA согласно настоящему изобретению.
in vivo
in vitro.
in vitro
[0040] Везикулы в вакцинах можно получать  или  Везикулы можно получить  в линии клеток человека, инфицированных патогеном, например, выбранной из клеток HEp-2, клеток A549, клеток Calu-3, клеток HEK и клеток почки Madin Darby (MDCK).
[0041] Экзогенную иммуностимулирующую молекулу можно загружать: на наружную поверхность и/или внутрь везикулы, "имеющей патогенное происхождение".
[0042] Компонент GLA можно загружать: на наружную поверхность и/или внутрь везикулы, "имеющей патогенное происхождение".
[0043] В одном варианте реализации иммуностимулирующая молекула не связана с компонентом GLA, т.е. их загружают по отдельности, например, иммуностимулирующая молекула может быть представлена в виде плазмиды, которую можно трансфицировать в везикулу, а компонент GLA представлен в виде белка.
[0044] Загрузка везикулы как компонентом GLA, так и иммуностимулирующими молекулами обеспечивает два отдельных механизма действия, при которых компонент GLA связывает фосфатидилсерин на поверхности везикулы, тем самым обнаруживая присутствие везикулы для иммунной системы. Затем иммуностимулирующая молекула усиливает реакцию иммунной системы на патогенный материал в везикуле.
[0045] Экзогенный иммуностимулирующая молекула может быть связана с доменом GLA, например, конъюгированным с компонентом GLA, или может представлять собой гибрид (экспрессирующий конструкт) с компонентом GLA.
[0046] Иммуностимулирующая молекула, связанная с компонентом GLA, обладает преимуществами, поскольку компонент GLA может связывать фосфатидилсерин на поверхности везикулы, тем самым загружая себя, а также иммуностимулирующую молекулу на везикулу. Кроме того, в некоторых случаях компонент GLA может интернализироваться на везикуле и вытягивать за собой иммуностимулирующую молекулу.
[0047] В одном варианте реализации патоген является бактериальным или вирусным, например, перечисленным в настоящем документе, в частности, вирусом гриппа, например, гриппа A, B, C или D. У вируса гриппа A есть подтипы гемагглютинина H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18 и подтипы нейраминидазы N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, N11, например, штамм, выбранный из вируса гриппа A: (H1N1) H1N2, H2N1, H911,H3N1, H3N2 и H2N3, новый вирус гриппа A H1N1 (веб-сайт гриппа H1N1 CDC 2009).
[0048] Технология согласно настоящему изобретению может быть пригодна для получения универсальной вакцины против гриппа.
[0049] Однако даже при использовании для приготовления сезонной вакцины против гриппа настоящая технология, вероятно, будет более эффективна и удобна, чем культивирование вакцин, доступных в настоящее время, в яйцах.
[0050] В настоящем изобретении также предложены везикулы "патогенного происхождения" в соответствии с настоящим изобретением для лечения, в частности, для применения в качестве вакцины.
[0051] Кроме того, предложена везикула “патогенного происхождения” в соответствии с настоящим изобретением для производства медикамента, в частности, для производства вакцины.
[0052] Как обсуждалось выше, компонент GLA можно применять для переноса полезной нагрузки, например, терапевтической полезной нагрузки, во внутреннее пространство внеклеточной везикулы. Терапевтическая полезная нагрузка может воздействовать на саму везикулу или доставляться к клетке с помощью везикулы и воздействовать на клетку, или используют сочетание этих двух сценариев.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0053] В одном варианте реализации 1, 2, 3, 4 или 5 полезных нагрузок связаны с одним компонентом GLA.
[0054] Компонент GLA (также называемый в настоящем документе компонентом гамма-карбоксиглутаминовой кислоты) относится к полипептиду, содержащему домен GLA в отсутствие каталитического домена белка GLA, например, белку S. Полипептид может дополнительно содержать домен EGF и/или домен kringle, например, белка S. В одном варианте реализации компонент GLA содержит от 30 до 300 аминокислотных остатков, например, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или 300 остатков. В одном варианте реализации масса компонента GLA находится в диапазоне от 4,5 до 30 кДа. В одном варианте реализации компонент GLA содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1. В одном варианте реализации компонент GLA содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, или ее производное, за исключением His-метки.
[0055] Домены GLA (витамин К-зависимого карбоксилирования/гамма-карбоксиглутаминовой кислоты) в настоящем документе представляют собой белковые домены, модифицированные посредством витамин К-зависимого посттрансляционного карбоксилирования остатков глутамата в аминокислотной последовательности с получением гамма-карбоксиглутамата (Gla). В одном варианте реализации домен GLA, используемый в молекулах согласно настоящему изобретению, содержит от 30 до 45 последовательных остатков нативного домена GLA (дикого типа). В одном варианте реализации домен GLA содержит 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 остатков GLA.
[0056] В одном варианте реализации изобретения 30% или менее компонента GLA составляют остатки GLA.
[0057] В одном варианте реализации компонент GLA содержит от 1 до 5 дисульфидных связей, например, 1, 2, 3, 4 или 5 дисульфидных связей.
[0058] Домен GLA связывает кальций, образуя его хелаты между двумя остатками карбоновой кислоты. Эти остатки являются частью области, которая начинается на N-конце зрелой формы белков Gla и заканчивается консервативным ароматическим остатком. Это приводит к сохранению мотива Gla-x(3)-Gla-x-Cys, который находится в середине домена и который, по-видимому, важен для распознавания субстрата карбоксилазой.
[0059] Домены GLA содержатся в ряде белков, например, тромбине, факторе VII, факторе IX, факторе X, белке С, белке S (PrS), белке Z, остеокальцине, белке GLA матрикса, GAS6, транстиретине, периостине, GLA 1, богатом пролином, GLA 2, богатом пролином, GLA 3, богатом пролином, и GLA 4, богатом пролином.
in
vitro
[0060] В настоящем документе термин "домен GLA" также распространяется на белки, где от 1 до 10 процентов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%) аминокислот в нативном домене GLA могут быть замещены и/или удалены при условии, что модифицированный домен сохраняет по меньшей мере 70% (например, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) нативной активности нативного (немодифицированного домена GLA) в подходящем анализе . В одном варианте реализации домен представляет собой полноразмерный нативный домен.
[0061] В настоящем документе термин "домен EGF" относится к консервативному домену белка. Он содержит от 30 до 40 аминокислотных остатков и обнаруживается в большом количестве в основном животных белков. В большинстве случаев EGF-подобный домен находится во внеклеточном домене мембраносвязанных белков или белков, заведомо являющихся секретируемыми. EGF-подобный домен включает 6 остатков цистеина. Основная структура EGF-подобных доменов состоит из двуцепочечного β-листа, за которым располагается петля к короткому С-концевому двуцепочечному β-листу. Эти два β-листа обычно обозначают как основной (N-концевой) и вспомогательный (C-концевой) листы. EGF-подобные домены часто встречаются в многочисленных тандемных копиях в белках: эти повторы обычно сложены друг с другом с образованием единого линейного соленоидного доменного блока в качестве функциональной единицы. В одном варианте реализации используемый домен представляет собой полноразмерный нативный домен.
in
vitro
[0062] В настоящем документе термин "домен EGF" также распространяется на белки, где от 1 до 10 процентов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%) аминокислот в нативном домене EGF могут быть замещены и/или удалены при условии, что модифицированный домен сохраняет по меньшей мере 70% (например, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) нативной активности нативного (немодифицированного домена EGF) в подходящем анализе . В одном варианте реализации домен представляет собой полноразмерный нативный домен.
[0063] В настоящем документе домен термин «домен Kringle» относится к автономным белковым доменам, подвергаемым фолдингу в большие петли, стабилизированные 3 дисульфидными связями. Они характеризуются структурой из трех петель и 3 дисульфидных мостиков, конформация которой определяется количеством водородных связей и небольшими фрагментами антипараллельного бета-листа. Они встречаются в белках, участвующих в свертывании крови и фибринолизе, в разном количестве копий, в некоторых белках плазмы, включая активатор плазминогена протромбинового типа и урокиназного типа, которые представляют собой сериновые протеазы, принадлежащие к семейству пептидаз MEROPS S1A.
in
vitro
[0064] В настоящем документе термин "домен Kringle" также распространяется на белки, где от 1 до 10 процентов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%) аминокислот в нативном домене Kringle могут быть заменены и/или удалены при условии, что модифицированный домен сохраняет по меньшей мере 70% (например, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) нативной активности нативного (немодифицированного домена Kringle) в подходящем анализе . В одном варианте реализации используемый домен представляет собой полноразмерный нативный домен.
in
vitro
[0065] В настоящем документе активный фрагмент белка меньше цельного нативного белка (или соответствующего домена) и сохраняет по меньшей мере 50% (например, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) активности нативного полноразмерного домена или белка в соответствующем анализе .
[0066] В настоящем документе каталитический домен представляет собой домен (или фрагмент), располагающийся за доменом EGF в направлении С-конца, например, как показано на фиг. 1А.
in vitro
[0067] В настоящем документе термин " " относится к лабораторной работе, выполняемой не в теле человека или животного.
in vivo"
[0068] В настоящем документе термин " относится к работе/проведению испытания/лечению в живом организме, в частности, человека или животного, в частности, человека.
[0069] Внеклеточные везикулы (EV) являются важными медиаторами дальней межклеточной коммуникации и участвуют в разнообразных биологических процессах как у прокариотических, так и у эукариотических организмов (см. обзор Arenaccio and Federico, Adv Exp Med Biol 998: 3-19, 2017, Lu et al., Eur J Pharm Biopharm 119: 381-195, 2017, Vader et al., Adv Drug Delivery Rev 106:148-156, 2016, Lefebvre and Lecuyer, Front Microbiol 8: 377, 2017).
[0070] Внеклеточные везикулы отделяются из инфицированных (вирусом, бактерией или паразитом) клеток и содержат материал этих инфекционных агентов (см. обзор Schorey et al., EMBO Rep. 16: 24-43, 2015, Schorey and Harding, J. Clin Invest. 126: 1181-1189, 2016). Этот материал может варьироваться от токсинов до факторов вирулентности и инфекционного вируса (как оболочечного, так и безоболочечного; см. обзор Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77-81, 2016) и может являться новым средством для более эффективной доставки вирусной популяции, а не отдельных вирусных частиц (Chen YH et al., Cell 160: 619-630, 2015). Следовательно, их выделение может обеспечить быстрое получение диагностического представления о заболевании.
[0071] Внеклеточные везикулы - это широкий термин для описания всех секретируемых мембранных везикул. В настоящем документе этот термин включает экзосомы, микровезикулы (также называемые микрочастицами), эктосомы, везикулы матрикса, кальцинирующие везикулы, простасомы, онкосомы, ретровирусоподобные частицы, бактериальные внеклеточные везикулы, внутрипросветные везикулы и апоптозные тела.
in situ
[0072] Кроме того, внеклеточные везикулы, содержащие белки, РНК и углеводы, специфичные по отношению к данному инфекционному агенту и клетке, также могут являться системами для вакцинации . В этой ситуации предполагается, что использование и нейтрализация иммуносупрессорных молекул фосфатидилсерина за счет домена GLA позволяет иммунной системе обнаруживать и удалять соответствующие антигены и является новым и более эффективным способом специфической вакцинации против инфекционного заболевания.
[0073] В настоящем документе внеклеточные везикулы включают микровезикулы, апоптозные тела и экзосомы. Диаметр внеклеточных везикул обычно находится в диапазоне от 10 нм до 5000 нм.
[0074] В настоящем документе микровезикулы относятся к везикулам, высвобожденным после образования путем отпочковывания от мембраны клетки, и их диаметр, например, обычно находится в диапазоне от 100 нм до 1000 нм.
[0075] Экзосомы образуются внутри мультивезикулярных тел и высвобождаются после слияния мультивезикулярного тела с мембраной клетки. Как правило, диаметр экзосом находится в диапазоне от 30 до 100 нм.
[0076] В настоящем документе апоптозные тела относятся к везикулам, отделяющимся во внеклеточную среду от апоптозных клеток. Апоптозные тела не могут вовлекаться во внутриклеточную коммуникацию. Обычно диаметр апоптозных тел находится в диапазоне от 800 нм до 5000 нм.
Tao et al
Rani et al.
www.moleculartherapy.org
Sutaria et al
[0077] См., например, Modularized Extracellular Vesicles: The Dawn of Prospective Personalized and Precision Medicine,  Adv. Sci. 2018, 5, 1700449; Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles: Towards Cell-free Therapeutic Applications , vol. 23 no. 5, 812-823 May 2015; и Achieving the Promise of Therapeutic Extracelluar Vesicles: The Devil is in the Detail of Therapeutic Loading , Pharma Res. 2017 May; 34(5) 1053-1066, включенные в настоящий документ посредством ссылок.
[0078] Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение внеклеточных везикул для диагностики, например, инфекции патогеном, например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции и/или паразитарной инфекции.
[0079] Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение внеклеточных везикул для лечения, например, инфекции патогеном, например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции и/или паразитарной инфекции, в частности, в случае, когда внеклеточную везикулу обрабатывают с целью нейтрализации или устранения патогенного материала и/или внеклеточную везикулу загружают терапевтическим материалом для доставки в клетку-мишень.
[0080] Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение внеклеточных везикул для диагностики инфекции патогеном, например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции и/или паразитарной инфекции.
[0081] Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение внеклеточных везикул для лечения, например, инфекции патогеном, например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции и/или паразитарной инфекции, в частности, в случае, когда внеклеточную везикулу обрабатывают с целью нейтрализации или устранения патогенного материала и/или внеклеточную везикулу загружают терапевтическим материалом для доставки в клетку.
[0082] Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение внеклеточных везикул для диагностики рака.
[0083] Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение внеклеточных везикул для лечения рака, в частности, в случае, когда внеклеточную везикулу обрабатывают с целью нейтрализации или устранения патогенного материала и/или внеклеточную везикулу загружают терапевтическим материалом для доставки в клетку.
[0084] Внеклеточные везикулы и способы в соответствии с настоящим изобретением, в частности, внеклеточные везикулы из стволовых клеток также можно применять при диагностике и/или лечении аутоиммунных заболеваний.
[0085] В одном варианте реализации внеклеточные везикулы согласно настоящему изобретению получают из клетки человека.
[0086] В одном варианте реализации внеклеточные везикулы получают из стволовых клеток (в частности, здоровых стволовых клеток). Эти везикулы можно применять аналогично терапии стволовыми клетками.
[0087] В одном варианте реализации внеклеточные везикулы согласно настоящему изобретению получают из патогенной клетки, например, бактериальной клетки.
et al
[0088] Клетки могут секретировать различные типы EV, и их классифицируют в соответствии с субклеточным происхождением (Colombo ., Annu Rev Cell Dev Biol 30: 255-289, 2014). Несмотря на различное происхождение и размер, единой номенклатуры EV не существует из-за совпадения размеров везикул и отсутствия специфичных для подтипа маркеров. В результате очистка и, следовательно, различение типов везикул остается сложной задачей. Например, наиболее популярные протоколы очистки экзосом, которые исторически использовались в литературе (дифференциальное ультрацентрифугирование, 220-нм фильтрация (Thery et al., Curr Protoc Cell Bioil, глава 3, блок 3.22, 2006) и в недавно выпущенных коммерческих наборах, позволяют совместно выделять различные типы EV (см. обзор Tkach and Thiery, Cell 164: 1226-1232, 2016). Таким образом, такие термины, как «экзосома», обычно относятся к смешанной популяции малых EV, и, следовательно, для данного изобретения мы решили использовать общий термин "EV" для обозначения всех подтипов везикул.
et al
et al
et al
[0089] Как правило, внеклеточные везикулы содержат липидный бислой, содержащий керамиды, холестерин, фосфоглицериды и сфинголипиды (Subra 2010, Trajkovic  2008, Vlassov  2012)
et al
[0090] Все внеклеточные везикулы несут поверхностные молекулы, обеспечивающие адресное воздействие на клетки-реципиенты, где они взаимодействуют с сигнальным путем и/или доставляют свое содержимое в цитозоль рядом способов (например, посредством эндоцитоза и/или фагоцитоза, слияния и т.д.), тем самым изменяя физиологическое состояние клетки-реципиента. Поскольку они являются естественными средствами доставки белка, липидов и генетического материала, они представляют собой уникальный био-вектор, возможность применения которого для визуализации, диагностики и/или в качестве терапевтического носителя активно исследуется при ряде показаний (см. обзор Rufino-Ramos et al., J. Control Release 262: 247-258, 2017, Vader et al., Adv Drug Deliv. Rev 106: 148-156, 2016, Sutaria et al., Pharm Res. 34: 1053-1066, 2017, Ingato ., J. Control Release 241: 174-185, 2016).
[0091] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой экзосому. Экзосомы обычно находятся в диапазоне от 30 до 150 нм, например от 30 до 100 нм, и, например, могут иметь один или несколько поверхностных маркеров, выбранных из трансферрина, CD9, CD63, CD61, CD81, TSG101, LAMPS и Alix.
[0092] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой микровезикулу (также называемую микрочастицей) и включает эндотелиальные микрочастицы. Как правило, диаметр микровезикул находится в диапазоне от 50 до 2000 нм, и они, например, могут нести один или более из поверхностных маркеров, выбранных из VCAMP3 и ARF6. Хотя циркулирующие эндотелиальные микрочастицы обнаруживаются в крови здоровых людей, увеличение количества циркулирующих эндотелиальных микрочастиц выявлено у лиц с определенными заболеваниями, в том числе гипертензией и сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также преэклампсией и различными формами васкулита. Показано, что эндотелиальные микрочастицы при некоторых из этих болезненных состояний содержат массивы поверхностных молекул, отражающие состояние дисфункции эндотелия. Таким образом, эндотелиальные микрочастицы можно применять в качестве индикатора или показателя функционального состояния эндотелия при заболевании, и они могут играть ключевую роль в патогенезе некоторых заболеваний, в том числе ревматоидного артрита.
[0093] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой эктосому. Как правило, диаметр эктосом находится в диапазоне от 100 до 1000 нм, например, от 350 до 400 нм, и они, например, могут нести один или более из поверхностных маркеров, выбранных из TyA и C1a.
[0094] В одном варианте реализации везикула представляет собой кальцинирующую внеклеточную везикулу. Эти везикулы высвобождаются из клеток в атеросклеротических бляшках. В последнее время кальцинирующие EV, происходящие из макрофагов и гладкомышечных клеток (SMC), подвергаются повышенному вниманию из-за их роли в кальцинозе сосудов. Считается, что эти везикулы играют опосредующую роль в кальцинозе сосудов, который является основным прогностическим фактором заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний.
[0095] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой матриксную везикулу. Матриксные везикулы, упомянутые в настоящем документе, участвуют в развитии кости, причем везикулы, происходящие из остеобластов, образуют кристаллы гидроксиапатита вдоль волокон коллагена в развивающейся кости. Они также служат в качестве зародышей кристаллизации для формирования микрокальциноза внутри фиброзных колпачков атеросклеротических бляшек, что приводит к нестабильности бляшки, ее разрыву и последующему инфаркту миокарда и инсульту.
2+
2+
2+
[0096] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой простасому. Термин "простасома" в настоящем документе относится к везикулам, секретируемым эпителиальными клетками предстательной железы в семенную жидкость. Их диаметр обычно находится в диапазоне от 40 до 500 нм. Они обладают необычным липидным составом и плотной и высокоупорядоченной структурой липопротеиновых мембран, напоминающей липидный плот. Физиологическая роль простасом подразумевает улучшение подвижности сперматозоидов и защиту от атак со стороны женской иммунной защиты при прохождении к яйцеклетке. Исследования показали, что клетки рака предстательной железы и низкодифференцированные клетки предстательной железы продолжают продуцировать и секретировать простасомы. Высокая частота рака предстательной железы у пожилых мужчин может быть обусловлена защитой от иммунной системы, поддерживаемой простасомами. Иммунорегулирующие белки, обнаруженные в простасомах, включают: аминопептидазу N (CD13); дипептидилпептидазу IV (CD26); энкефалиназу (нейтральную эндопептидазу, CD10); ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, CD143); тканевый фактор TF (CD142, тромбопластин); стимулятор гемолиза (CD55); протектин (CD59, ингибитор MAC) и комплемент-регулирующий мембранный кофакторный белок (CD46). Простасомы также содержат высокие концентрации двухвалентных катионов: Zn, Ca и Mg.
[0097] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой онкосому. В настоящем документе термин «онкосома» относится к крупным внеклеточным везикулам диаметром от 1 до 10 мкм. В контексте опухолей головного мозга существуют EV, высвобождающиеся из клеток глиомы и экспрессирующие EGFRvIII, мутированную форму рецептора. Показано, что эти везикулы способны переносить онкопротеин EGFRvIII на мембрану опухолевых клеток, лишенных этого рецептора, тем самым распространяя материал, способствующий образованию опухоли, и вызывая трансформацию. Показано, что крупные онкосомы, положительные по Cav-1, отличают пациентов с локализованным раком предстательной железы от пациентов с кастрационно-устойчивым и метастатическим заболеванием.
[0098] В одном варианте реализации внеклеточные частицы представляют собой ретровирус-подобные частицы. Их диаметр обычно находится в диапазоне от 75 до 100 нм, и они могут нести поверхностный маркер Gag.
[0099] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой бактериальную внеклеточную везикулу. Диаметр этих везикул обычно находится в диапазоне от 10 до 300 нм, и они могут содержать на поверхности PAMP.
[0100] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой внутрипросветную везикулу. В настоящем документе этот термин относится к везикуле, находящейся в клетке.
[0101] Обратное слияние представляет собой слияние внутренних (внутрипросветных) везикул в мультивезикулярных тельцах или поздних эндосомах с пограничной мембраной эндосомы. Считается, что этот процесс опосредован лизобифосфатидной кислотой (LBPA), фосфатидилинозит-3-фосфатом, Alix и, очевидно, зависит от кислого рН.MHC 2 класса и другие белки (CD63 и MPR) используют такой процесс для эффективной транспортировки к определенным местоположениям в цитозоле и обратно к плазматической мембране. Тем не менее, патогены также используют этот механизм для эффективного проникновения в цитозоль клетки (например, VSV, возбудитель сибирской язвы). В отличие от обычного слияния в клетке между эндосомами и органеллами, обратное слияние требует наличия листков экзоплазмы внутренних везикул и наружной мембраны, аналогично слиянию сперматозоида и яйцеклетки.
[0102] В одном варианте реализации внеклеточная везикула представляет собой апоптозное тело. В настоящем документе диаметр апоптозных тел обычно находится в диапазоне от 500 до 5000 нм, например, от 500 до 4000 нм, и они высвобождаются клетками, подвергающимися запрограммированной гибели клеток.
Стволовые клетки и маркеры
[0103] В одном варианте реализации внеклеточные везикулы в соответствии с настоящим изобретением происходят от стволовой клетки.
[0104] В одном варианте реализации стволовые клетки являются эмбриональными стволовыми клетками. В одном варианте реализации клетки не являются эмбриональными стволовыми клетками.
[0105] В одном варианте реализации стволовая клетка представляет собой взрослую стволовую клетку, например, в том числе, клетки-предшественники, и гемопоэтические стволовые клетки, миогенные стволовые клетки, остеопрогениторные стволовые клетки, нейральные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, например, клетки-сателлиты, лучевые глиальные клетки, клетки стромы костного мозга, надкостницы, клетки-предшественники поджелудочной железы, клетки-предшественники эндотелия, бластные клетки и трофобластные стволовые клетки.
[0106] В одном варианте реализации стволовая клетка представляет собой раковую стволовую клетку.
SSEA-1
SSEA-3
SSEA-4
CD324
CD90
CD117
CD326
CD9
CD24
CD29
CD59
CD133
CD31
TRA-1-60
TRA-1-81
Frizzled5
фактор стволовых клеток
Cripto
[0107] В одном варианте реализации способ относится к стволовым клеткам млекопитающих, например, стволовым клеткам человека. Стволовые клетки, обсуждаемые в настоящем документе, представляют собой в основном стволовые клетки человека. Вместе с тем, специалист в данной области при необходимости способен выявить относящуюся к рассматриваемому вопросу или соответствующую популяцию стволовых клеток для других млекопитающих. Например,  является маркером эмбриональных стволовых клеток мыши, клеток зародышевой линии человека и клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток приматов, эмбриональных клеток зародышевой линии человека, эмбриональных стволовых клеток человека и клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток приматов, эмбриональных клеток зародышевой линии человека, стволовых клеток человека, клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, эмбриональных раковых клеток;  является маркером клеток эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, гемопоэтических стволовых клеток, клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, гемопоэтических стволовых клеток-предшественников, меланоцитов, происходящих из нервного гребня, примордиальных клеток, клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, клеток эмбриональной карциномы, гемопоэтических стволовых клеток;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека, теракарциномы, эмбриональных клеток зародышевой линии, клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека, теракарциномы, эмбриональных клеток зародышевой линии, клеток эмбриональной карциномы;  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  (SCF) является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, гемопоэтических стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток, клеток эмбриональной карциномы; а  является маркером эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, кардиомиоцитов и клеток эмбриональной карциномы.
[0108] Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) или гемоцитобласты - это стволовые клетки, которые дают начало всем другим клеткам крови посредством гемопоэза. Они происходят из мезодермы и расположены в красном костном мозге, который содержится в сердцевине большинства костей.
[0109] Термин "раковые стволовые клетки" в настоящем документе относится к опухолеобразующим клеткам (т.е. раковым клеткам, встречающимся внутри опухолей или при гемобластозах), обладающих характеристиками, ассоциированными с нормальными стволовыми клетками, конкретно, способностью давать начало всем видам клеток, встречающимся в конкретном образце рака. См., например, статью Identification and Targeting of Cancer Stem Cells, BioessayS 2009 Oct; 31 (10) 1038-1049, включенную в настоящий документ посредством ссылки. Раковые стволовые клетки определяют по трем различным свойствам: i) избирательной способности инициировать опухоль и стимулировать неопластическую пролиферацию: ii) способности создавать бесконечные копии себя посредством самообновления, и iii) способности давать начало более зрелому потомству раковых клеток посредством дифференцировки. Раковые стволовые клетки необязательно происходят от здоровых стволовых клеток, они могут происходить от дифференцированной клетки.
[0110] CD34 также известен как антиген CD34 гемопоэтических клеток-предшественников и обладает функцией фактора межклеточной адгезии. Его можно применять в качестве маркера для обогащения популяций стволовых клеток.
[0111] Стволовые клетки, как правило, отрицательны по поверхностным маркерам, специфичным для ростков (т.е. Lin -ve), например, стволовая клетка является Lin -ve, CD34 +ve, CD38 -ve, CD45RA -ve, CD90-положительными. и CD49f _+ve.
[0112] Гемопоэтические стволовые клетки могут экспрессировать поверхностный маркер из CD48, CD150, CD244, CD34, CD38, SCA-1, Thy1.1, C-kit, lin, CD135, slam1/CD150, Mac-1. (CD11b), CD4, фактор стволовых клеток (SCF) и комбинацию двух или более из них.
[0113] Остеопрогениторные клетки могут экспрессировать поверхностный маркер , выбранный из Gremlin-1, ТФР-бета, bFGF, BMP-2, ALPP, MCAM, коллаген I, коллаген 1 альфа-1, коллаген II, RUNX2, декорин и комбинации двух или более из них (например, всех указанных маркеров).
[0114] Остеобласты или их предшественники могут экспрессировать поверхностный маркер, выбранный из Runx2, щелочной фосфатазы/ALPP/ALPI, остеокальцина, BAP1, OPN, BAP31, коллагена I, SCUBE3, фибронектина, SPARC, IGFBP-3 и комбинации из двух или более из них.
[0115] Остеоциты или их предшественники могут экспрессировать поверхностный маркер, выбранный из:
i) ТФР-бета, RANKL, MCSF, склеростина, DKK и комбинации двух или более из них (например, всех указанных маркеров) и/или
ii) Osterix +ve, CD90 +ve, остеокальцин +ve, коллаген I +ve, сиалопротеин кости +ve и комбинации двух или более из них (например, всех указанных маркеров) и/или
iii) щелочная фосфатаза/ALPP (плацентарная щелочная фосфатаза)/ALPI +ve, коллаген I +ve, коллаген II +ve, декорин +ve, MCAM/CD146 +ve, MEPE/OF45 +ve, osterix +ve, CD90 +ve, osterix/Sp7 +ve, RUNX2/CBFA1 +ve, тромбопоэтин/Tpo +ve и комбинации двух или более из них (например, всех указанных маркеров)
Миогенные стволовые клетки могут экспрессировать маркер, выбранный из CD56, CD146, VE-кадгерина, альфа-актина гладких мышц, FABP3, интегрина альфа 7, десмина, тяжелой цепи миозина, рецептора UEA-1 и комбинаций двух или более из них (например, всех указанных маркеров).
[0116] Нейрональные стволовые клетки могут экспрессировать маркер, выбранный из:
i) CD133, CD15, CD24 low или -ve, GCTM-2, CD45, CD34, нестина, Sox-2, ABCG2, FGF R4, Frizzled-9 и комбинации двух или более из них (например, всех указанных маркеров), и/или
ii) маркера CD24, экспрессируемого на низком уровне или -ve, и/или
iii) комбинации маркеров CD133 +ve, 5E12 +ve, CD34 -ve, CD45 -ve и CD24 low или -ve
[0117] Мезенхимальные стволовые клетки могут экспрессировать поверхностный маркер, выбранный из CD10, CD13, CD73, CD105, CD271, CD140b, CD240, frizzled-9, CD29, CD90, CD146, oct4, SSEA4, STRO-1 фактора стволовых клеток (SCF) и комбинации двух или более из них.
Стволовая клетка, происходящая из жировой ткани, может экспрессировать поверхностный маркер, выбранный из:
i) K15, CD34, нестина, фоллистатина, p63, интегрина альфа 6, танасцина C, EGFR, IGFR, факторов frizzled и комбинации двух или более из них, и/или
i) iCD44, ICAM/CD54, CD34, членов семейства интегринов и комбинаций двух или более из них.
[0118] Стволовая клетка из эпителиальных стволовых клеток яичников и маточных труб может экспрессировать поверхностный маркер, выбранный из Gremlin 1, Lrig1, Lgr5, Bmi1, Tert, HopX и комбинации двух или более из них.
[0119] Эмбриональные стволовые клетки могут содержать один или более из поверхностных маркеров, выбранных из CD24, CD29, CD31, CD59, CD90, CD117, CD133, CD324, CD326, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, frizzled5, фактора стволовых клеток, crypto (TDGF-1).
[0120] Внеклеточные везикулы из стволовых клеток можно выявлять на основе маркеров клетки, от которой они произошли.
Другие определения
[0121] Термин "полезная нагрузка" в настоящем документе относится к молекуле, связанной с доменом GLA, в частности, для доставки в везикулу. Полезная нагрузка может включать лекарственное средство, токсин, химиотерапевтическое средство, полимер, биологически активный белок, пептид (например, стабильный пептид), полинуклеотид (например, ДНК и РНК, в том числе, микроРНК, кшРНК, РНКи и т.п., включая молекулярные маяки), радионуклиды, агент, образующий хелат металла, онколитические вирусы, вирусные векторы, метки и/или репортерную группу. В настоящем документе термин «связанный» относится к любому способу связывания полезной нагрузки с GLA-доменом, включая образование гибридного белка (например, с использованием амидной связи) или химическое конъюгирование (например, с использованием химических реакций, характерных для малеимидов, клик-химии и т.п.). Термин "полезная нагрузка" также можно использовать для обозначения материала, доставляемого внутрь внеклеточной везикулы, причем указанный материал не связан с GLA-компонентом.
[0122] GLA-домен является уникальной платформой для обнаружения и доставки, которая использует экспонированный фосфатидилсерин (PS) для адресного воздействия и доступа к выбранной клетке. Фосфатидилсерин является основным сигналом для распознавания и поглощения апоптозных клеток. Апоптоз является эволюционно консервативным и строго регулируемым способом гибели клеток (Poon IK et al., Nat Rev Immunol 14: 166-180, 2014). Поглощение апоптозных клеток известно как эффероцитоз, который служит для немедленного и эффективного удаления апоптозных клеток до потери целостности мембраны и высвобождения воспалительного содержимого и, таким образом, уравновешивает вредные воспалительные эффекты апоптоза. Экспрессия PS позволяет ингибировать индуцированные TLR и цитокинами сигнальные каскады и иммуногенное созревание ДК (Poon IK et al., Nat Rev Immunol 14: 166-180, 2014, Birge RB Celll Death Differ 23: 962-978, 2016). Следовательно, в физиологических условиях экстернализованный фосфатидилсерин функционирует как доминантный и эволюционно консервативный иммуносупрессивный сигнал, способствующий толерантности и предотвращающий локальную и системную активацию иммунной системы. В условиях патологии врожденный иммуносупрессивный эффект фосфатидилсерина используется многочисленными вирусами, другими микроорганизмами и паразитами для облегчения инфекции и, во многих случаях, установления латентного состояния (Birge RB et al., Cell Death Differ 23: 962-978, 2016, Amara A and Mercer J, Nat Rev Microbiol 13: 461-469, 2015, Moller-Tank, S and Maury W Virology 468-470: 565-580, 2014). Регуляция фосфатидилсерина нарушается в микроокружении опухоли, что противодействует развитию противоопухолевого иммунитета, а экзосомы, экспрессирующие фосфатидилсерин, в настоящее время исследуют в качестве средства ранней диагностики при борьбе с раком (Birge RB et al., Cell Death Diff. 23:962-978, 2016, Lea et al., Oncotarget 8: 14395-14407, 2017, Li X and Wang X, Mol Cancer 16: 92, 2017). Безотносительно к теоретическим представлениям, авторы настоящего изобретения считают, что не все молекулы фосфатидилсерина эквивалентны с биологической точки зрения. Авторы изобретения полагают, что фосфатидилсерин, подвергающийся воздействию фермента TMEM16F, участвует в подавлении иммунитета и "видим" для молекул в соответствии с настоящим изобретением.
[0123] Термин "онколитический вирус" в настоящем документе относится к вирусу, который:
• предпочтительно инфицирует и уничтожает раковые клетки, или
• избирательно реплицируется в раковых клетках (например, поскольку его репликация зависит от гена, который активируется в раковых клетках, например, р53.
[0124] Термин "вирусный вектор" в настоящем документе относится к вирусу, дефектному по репликации, как правило, кодирующему трансген.
in vitro
[0125] В настоящем документе термин  относится к лабораторной работе, выполняемой не в теле человека или животного.
in vivo"
[0126] В настоящем документе термин " относится к работе/тестированию/лечению в живом организме, в частности, человека или животного.
[0127] В настоящем документе термин "молекула" используется в самом широком смысле и включает синтетические химические молекулы, а также макромолекулы, например, белки, полимеры (природные или иные), молекулы рибонуклеиновой кислоты, метки и т.д.
[0128] Молекулярный маяк представляет собой олигонуклеотидный зонд для гибридизации, способный сообщать о присутствии специфических нуклеиновых кислот в гомогенных растворах. Он представляет собой молекулу в форме шпильки с флуорофором, погашенным за счет внутренней структуры, флуоресценция которого восстанавливается при связывании с нуклеотидной последовательностью-мишенью.
[0129] Термин "сшитый пептид" в настоящем документе относится к нескольким тандемным пептидам, удерживаемым синтетической скобкой, предназначенной для повышения фармакологической эффективности пептидов.
[0130] Термин "лекарственное средство" в настоящем документе, если контекст не указывает иное, предназначен для обозначения небольшого химического объекта, например, синтезированного способами органического синтеза, в частности, молекулой, одобренной или лицензированной, или находящейся в процессе получения лицензии на терапевтическое применение, особенно на людях. В настоящем документе термин "лекарственное средство" включает противовирусное соединение, антибиотик и противораковое терапевтическое средство.
[0131] В настоящем документе термин "противовирусное соединение" (противовирусный агент) относится к классу лекарственных средств, используемых специально для лечения вирусных инфекций, включая противовирусные агенты широкого спектра действия, а также «узкого» спектра, специфичных по отношению к конкретному вирусу или конкретному семейству вирусов.
[0132] В настоящем документе термин "антибиотик" относится к лекарственному средству или агенту, ингибирующему рост бактерий или уничтожающему бактерии. Термины "антибактериальное средство" и "антибиотик" используются в настоящем докуенте взаимозаменяемо, если в контексте не указано иное.
[0133] В настоящем документе термин "антипаразитарное средство" относится к лекарственному средству или агенту, ингибирующему рост паразита, уничтожающему паразита или удаляющему паразитов из организма-хозяина.
[0134] "Противораковое терапевтическое средство" представляет собой широкий термин, который включает противораковые лекарственные средства, химиотерапию, лучевую терапию, иммунно-онкологическую терапию и т.д.
[0135] В настоящем документе противораковое лекарственное средство, как правило, относится к низкомолекулярному средству для терапии рака.
[0136] В настоящем документе термин "химиотерапия", как правило, относится к цитотоксическому агенту и включает противоопухолевые средства.
[0137] Биологическое терапевтическое средство (также называемое биофармацевтическим или биологическим средством) представляет собой терапевтический продукт, имеющий биологическое «происхождение», например, рекомбинантные белки и фрагменты, в том числе молекулы антител, в том числе антитела, связывающие фрагменты антител и молекулы полиспецифических антител, полинуклеотиды, терапевтические вирусы, онколитические вирусы, вирусные векторы и сложные комбинации таких материалов. Биологически активный белок представляет собой подгруппу биологических терапевтических средств и включает рекомбинантные белки и их активные фрагменты (включая молекулы антител).
et al
[0138] В настоящей заявке молекулы антител включают полноценное антитело, содержащее полноразмерные тяжелые и легкие цепи или их фрагменты, и молекулу, содержащую любой из этих фрагментов, например, Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab’)2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, однодоменные антитела (например, VH или VL или VHH), scFv, интратела, двух-, трех- или четырехвалентные антитела, бис-scFv, диатела, триатела, тетратела и эпитоп-связывающие фрагменты любого из них (см., например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Способы создания и изготовления этих фрагментов антител хорошо известны в данной области техники (см., например, Verma ., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Другие фрагменты антител для использования в настоящем изобретении включают фрагменты Fab и Fab', описанные в международных заявках на патент WO2005/003169, WO2005/003170 и WO2005/003171. Поливалентные антитела могут быть специфичными с нескольким веществам, например, могут являться биспецифичными или моноспецифичными (см., например, WO 92/22853 и WO05/113605). Варианты биспецифичных и полиспецифичных антител специально рассматриваются в настоящем примере, поскольку целью является нейтрализация двух независимых белков-мишеней. Вариабельные области антител, описанных в настоящем документе, можно сконфигурировать с целью получения одного варианта антитела, способного связываться с двумя антигенами-мишенями и нейтрализовать их.
[0139] Антитела и их связывающие фрагменты, в частности, небольшие фрагменты антител, например, доменные антитела, VHHs, одноцепочечные Fv (scFv), двуцепочечные scFv, dsFv и интратела можно доставлять внутрь клетки с использованием технологии согласно настоящему изобретению.
[0140] В одном варианте реализации молекула антитела представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело.
[0141] Токсин представляет собой ядовитое вещество, в особенности имеющее природное происхождение, например, белок. Многие токсины, например, калихеамицин, используются при лечении рака. Кроме того, химиотерапевтические агенты можно считать токсичными (или токсинами). Таким образом, определение токсина частично совпадает с другими определениями в настоящем документе. В то же время нейротоксины, например, змеиный яд, являются токсинами, но не химиотерапевтическими средствами. Однако специалисты в данной области техники знакомы с этими техническими определениями и способны понять значение контекста настоящего изобретения.
[0142] В настоящем документе термин «диагностическое средство» представляет собой средство, используемое при анализе или визуализации для диагностики или мониторинга или понимания статуса заболевания. Диагностическое средство обычно содержит репортерную молекулу, например, метку и т.п., которую можно визуализировать, измерить или контролировать каким-либо образом.
[0143] Радионуклиды, пригодные для применения в настоящем изобретении, включают таллий-201, технеций-99m, иод-123, иод-131, иод-125, фтор-18 и кислород-15.
[0144] Термин "аномальная клетка" или "патогенная клетка" в настоящем документе относится к клетке, отличающейся от нормальной здоровой клетки, в частности, за счет мутаций или активации маркера или маркеров, например, ненормальности, связанной с предрасположенностью к или развитием состояния или заболеваний; с состоянием или заболеванием, например, предраковая клетка, раковая клетка, клетка, инфицированная патогеном, клетка при серповидноклеточной анемии и т.п.
[0145] В настоящем документе апоптоз представляет собой путь гибели клеток, который является нормальной и контролируемой частью роста организма. Гибель клеток в результате апоптоза менее вредна для окружающей ткани, чем такие механизмы гибели клеток, как некроз.
[0146] В настоящем документе термин "некроз" представляет собой гибель клеток от заболевания или травмы. При нем в окружающую ткань выделяются цитокины и факторы, которые могут повредить окружающие клетки. Гангрена является примером некротической гибели клеток.
Химиотерапевтические агенты
[0147] В настоящем документе термины "химиотерапевтический агент", "химиотерапия" или "цитотоксический агент" используются взаимозаменяемо, если не указано иное.
[0148] В настоящем документе термин «химиотерапия» предназначен для обозначения специфических противоопухолевых химических агентов или лекарственных средств, которые «избирательно» разрушают злокачественные клетки и ткани, например, алкилирующих агентов, антиметаболитов, в том числе ингибиторов тимидилатсинтазы, антрациклинов, агентов, оказывающих воздействие на микротрубочки, в том числе растительных алкалоидов, ингибиторов топоизомеразы, ингибиторов PARP и других противоопухолевых агентов. "Выборочно" в этом контексте используется в широком смысле, поскольку, разумеется, многие из этих агентов обладают серьезными побочными эффектами.
[0149] Предпочтительную дозу может выбрать практикующий врач в зависимости от природы подвергаемого лечению ракового заболевания.
[0150] Примеры алкилирующих агентов, которые можно применять в способе согласно настоящему изобретению, включают алкилирующие агенты - аналоги азотистого иприта, производные нитрозомочевины, тетразины, азиридины, препараты платины и их производные и неклассические алкилирующие агенты.
[0151] Пример химиотерапевтического агента, содержащего платину (также называемого платином) представляет собой цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, сатраплатин, пикоплатин, недаплатин, триплатин и липоплатин (липосомальный вариант цисплатина), в частности, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин.
2
2
[0152] Доза цисплатина составляет от примерно 20 до примерно 270 мг/м в зависимости от конкретного ракового заболевания. Часто доза находится в диапазоне от приблизительно 70 до приблизительно 100 мг/м.
[0153] Аналоги азотистого иприта включают мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид и бусульфан.
[0154] Производные нитрозомочевины включают N-нитрозо-N-метилмочевину (MNU), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU) и семустин (MeCCNU), фотемустин и стрептозотоцин. Тетразины включают дакарбазин, митозоломид и темозоломид.
[0155] Азиридины включают тиотепу, митомицини диазиквон (AZQ).
[0156] Примеры антиметаболитов, которые можно применять в способе согласно настоящему изобретению, включают антифолаты (например, метотрексат и пеметрексед), аналоги пурина (например, тиопурины, например, азатиопурин, меркаптопурин, тиопурин, флударабин (включая фосфатную форму), пентостатин и кладрибин), аналоги пиримидина (например, фторпиримидины, например, 5-фторурацил и его пролекарства, например, капецитабин [Xeloda]), флоксуридин, гемцитабин, цитарабин, децитабин, ралтитрексед (томудекс) гидрохлорид, кладрибин и 6-азаурацил.
Примеры антрациклинов, которые можно применять в способе согласно настоящему изобретению, включают даунорубицин (дауномицин), даунорубицин (липосомальный), доксорубицин (адриамицин), доксорубицин (липосомальный), эпирубицин, идарубицин, валрубицин в настоящее время используемый только для лечения рака мочевого пузыря, и митоксантрон, аналог антрациклина, в частности, доксорубицин.
[0157] Примеры агентов, оказывающих влияние на микротрубочки, которые можно применять в способе согласно настоящему изобретению, включают алкалоиды барвинка и таксаны.
[0158] Алкалоиды барвинка включают полностью природные химические вещества, например, винкристин и винбластин, а также полусинтетические алкалоиды барвинка, например, винорелбин, виндезин и винфлунин.
[0159] Таксаны включают паклитаксел, доцетаксел, абраксан, карбазитаксел и их производные. В настоящем документе производные таксанов включают измененные таксаны, например, таксол, например, в мицеллярных составах; производные также включают химические производные, в которых химический синтез используют для модификации исходного материала, который представляет собой таксан.
[0160] Ингибиторы топоизомеразы, которые можно применять в способе согласно настоящему изобретению, включают ингибиторы топоизомеразы I типа, ингибиторы топоизомеразы II типа и яды, действующие на топоизомеразу II типа. Ингибиторы I типа включают топотекан, иринотекан, индотекан и индимитекан. Ингибиторы II типа включают генистеин и ICRF 193, обладающий следующей структурой:
[0161] Яды II типа включают амсакрин, этопозид, фосфат этопозида, тенипозид, доксорубицин и фторхинолоны.
[0162] В одном варианте реализации химиотерапевтическое средство представляет собой ингибитор PARP.
Вирусы, пригодные для использования в качестве полезной нагрузки в настоящем изобретении
[0163] В одном варианте реализации вирус, используемый в настоящем изобретении, представляет собой оболочечный вирус, например, выбранный из герпесвируса (например, вируса простого герпеса 1), поксвируса (например, вируса осповакцины), гепаднавируса, флавивируса, тогавируса, коронавируса, вируса гепатита D, ортомиксовируса, парамиксовируса (например, вируса кори или вируса болезни Ньюкасла), рабдовируса, буньявируса, филовируса и Rhabdoviridae (например, вируса везикулярного стоматита, штамм Indiana (VSV).
[0164] В одном варианте реализации вирус, используемый в настоящем изобретении, представляет собой безоболочечный вирус, например, выбранный из Adenoviridae (например, аденовируса), Papilomaviridae, Picornaviridae (например, вируса Коксаки или вируса Сенека Вэлли (например, сенекавируса)), реовируса.
[0165] В одном варианте реализации вирус представляет собой аденовирус, например, аденовирус человека, например, выбранный из вируса группы В (в частности, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 или химерного вируса на их основе, например, Enadenotucirev), вируса группы C (в частности, Ad1, 2, 5, 6 или химерного вируса на их основе), вируса группы D (в частности, Ad8, Ad10, Ad13, Ad15, Ad17, Ad19, Ad20, Ad22, Ad30, Ad32, Ad33, Ad36, Ad37, Ad38, Ad39, Ad42, Ad43, Ad44, Ad45, A46, Ad47, Ad48, Ad49, Ad50 или химерного вируса на их основе), вируса группы E (в частности, Ad4), вируса группы F (в частности, Ad40, Ad41 или химерного вируса на их основе) и химерного вируса на основе двух или более вирусов группы B, C, D, E или F.
[0166] Подавляющее большинство вирусов содержит подробно описанные белки, ассоциированные с распознаванием и поглощением клетками-мишенями. Их тропизм для перенаправления или обеспечения более селективного адресного воздействия онколитических вирусов на опухоли можно модифицировать с использованием способов, описанных в обзоре Verheije and Rottier, Adv. Virology 2012: 798526, 2012.
[0167] Дополнительные вирусные белки клеточной поверхности, не участвующие в адресном воздействии нативного вируса, могут содержать мотивы для адресного воздействия, искусственно внедренные в них (например, минорный белок IX оболочки вириона Ad, Salisch et al., PLoS One 12: e0174728, 2017).
[0168] Оболочечные вирусы содержат внешнюю мембрану (оболочку), покрывающую капсид вируса. Оболочка обычно происходит от частей мембран клетки-хозяина (фосфолипидов и белков) и, кроме того, включает некоторые вирусные белки. Гликопротеины на поверхности оболочки служат для идентификации и связываются с рецепторными сайтами на мембране хозяина. Затем оболочка вируса сливается с мембраной хозяина, позволяя капсиду и вирусному геному проникнуть в клетку и заразить хозяина.
[0169] Различные онколитические вирусы описаны в заявке WO2014/13834, включенной в настоящий документ посредством ссылки.
dls
d
RL1
UL48
RL2
[0170] Вирус простого герпеса (ВПГ) проникает в клетки с помощью четырех основных гликопротеинов - gD, gH/gL, gB, активируемых каскадным образом путем связывания gD с одним из его рецепторов, нектином 1 и HVEM. Перенацеливание ВПГ достигалось путем введения лигандов и scFv в белок gC и/или gD или gH (Campadelli-Fiume, G et al., Rev in Med Virol 21: 213-226, 2011, Gatta, V PLoS Pathog 11: e1004907, 2015). Разработаны онколитические векторы на основе вируса простого герпеса 1 типа для клинического применения. Эти вирусы способны к репликации и содержат мутации в генах, влияющих на репликацию вируса, нейропатогенность и уклонение от иммунитета, и, например, включают вирусы первого поколения, например, NV1020 (R7020), ptk, d18.36tk, hrR3, R3616, 1716, вирусы второго поколения, например, G207 (MGH-1), 3616UB, SUP, NV1023, вирусы третьего поколения, например, G47Δ, транскрипционные экспрессирующие векторы, например, G92A, 12.CALP, Myb34.5, векторы, экспрессирующие трансген, например, rRP450, и другие вирусы, например, Talimogene laherparepvec (T-Vec). Считается, что векторы на основе ВПГ-1 можно применять при лечении широкого спектра солидных опухолей, например, глиомы, меланомы, рака молочной железы, предстательной железы, толстой кишки, яичников и поджелудочной железы. Вирус ВПГ-1 инфицирует широкий спектр типов и видов клеток, он является цитолитическим по своей природе, репликативный жизненный цикл вируса приводит к разрушению клетки-хозяина, он характеризуется хорошо охарактеризованным и большим геномом (152K), но содержит много генов, не являющихся незаменимыми, что обеспечивает до 30 КБ места для введения терапевтических генов. Как правило, вирусы ВПГ не мутируют по гену тимидинкиназы по соображениям безопасности. Talimogene laherparepvec является онколитическим герпесвирусом, утвержденным для использования при лечении меланомы. Другие вирусы на основе герпесвирусов включают G207, SEPREHVIR (HSV-1716) разработки Virttu Biologics, мутанта ВПГ-1 R3616, мутанта ВПГ-1 1716, NV1020 (R7020), мутанта R3616 (с удаленным ), мутанта KM100 с инсерциями в  (кодирует трансактиваторный белок оболочки pUL48 [VP16]) и гены , G92A, мутантов, Myb34.5 и rQNestin34.5.
поксвирус -
[0171] Можно применять  вирус осповакцины, например, модифицированный вирус осповакцины Ankara (MVA) (Galmiche MC et al., J Gen Virol 78: 3019-3027, 1997); MVA можно заменить гибридной молекулой p14, несущей вставленный scFv против опухоль-ассоциированного антигена MUC-1 (Paul, S. et al., Viral Immunol. 20: 664-671, 2007). См. также обзор Liang L et al., Viruses 6: 3787-3808, 2014, Hsiao JC et al., J Virol 73: 8750-8761, 1999, обзор Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 и Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008. JX-594, созданный Jennerex, представляет собой вирус осповакцины с делецией тимидинкиназы и добавлением ГМКСФ. GL-ONC1 представляет собой аттенуированный вирус осповакцины (штамм Lister), который вызывает регрессию и устранение широкого спектра солидных опухолей в доклинических исследованиях на моделях мышей.
Парамиксовирус
[0172]  (например, вирус кори или болезни Ньюкасла).
[0173] Вирус кори (MeV) представляет собой одноцепочечный (содержащий минус-цепь) оболочечный (несегментированный) РНК-вирус рода Morbillivirus, семейства Paramyxoviridae. Вирус кори содержит два гликопротеина оболочки: белок присоединения гемагглютинин (H) и белок слияния (F). Присоединение, проникновение и последующее межклеточное слияние опосредуют через 2 рецептора вируса кори - CD46 и сигнальная молекула активации лимфоцитов (SLAM). См., например, обзор Msaouel P et al., Methods Mol Biol 797: 141-162, 2012, Robinson S. and Galanis, E. Expert Opin Biol Ther. 17: 353-363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii:E294, 2016); (обзор Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 и Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008) и (Russell SJ and Peng KW, Curr Topic Microbiol. Immunol 330: 213-241, 2009, Robinson S and Galanis, E Expert Opin Biol. Ther 17: 353-363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii: E294, 2016). Вирус кори, кодирующий натрий-иодидный симпортер щитовидной железы человека или МВ-NIS, представляет собой аттенуированный онколитический штамм Edmonston (Ed) вируса кори. Визуализация радиоактивного иода обеспечивает новый способ мониторинга экспрессии гена NIS.
[0174] Кроме того, можно использовать вирус болезни Ньюкасла.
Adenoviridae.
[0175]  Аденовирусы являются одними из наиболее широко изученных вирусов, используемых в качестве онколитических агентов. В вирусные белки, ассоциированные с вирионом, встроили ряд пептидов и белков с целью модификации нативного тропизма вируса (обзор Verheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012). Однако все они зависят от сборки вируса в ядре, что создает значительные проблемы.
[0176] Другие безоболочечные вирусы включают вирус Коксаки, полиовирус и реовирус. См., например, обзор Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77-81, 2016 и Chen YH et al., Cell 160: 619-630, 2015, обзор Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 и Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008 и обзор Verheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012).
[0177] Существует множество аденовирусов, например, Ad5-YCD/mutTKSR39rep-hIL12, который начали использовать для лечения рака предстательной железы, CGTG-102 (Ad5/3-D24-GMCSF), созданный Oncos Therapeutics, например, для лечения сарком мягких тканей, Oncorine (H101), CG0070, Enadenotucirev (EnAd) WO2005/118825, OvAd1 и OvAd2, описанные в WO2008/080003, ONCOS-102, например, для лечения неоперабельной злокачественной плевральной мезотелиомы, и DNX-2401, например, для лечения глиомы.
[0178] Cavatak представляет собой торговое название препарата вируса Коксаки дикого типа А21, который можно применять для лечения злокачественной меланомы. Вирус Сенека-Вэлли (NTX-010) и (SVV-001), например, для лечения мелкоклеточного рака легкого и нейробластомы.
Реовирус -
[0179]  Reolysin (пелареореп; реовирус дикого типа; серотип 3 Dearing; Oncolytics Biotech), например, для лечения различных видов рака и расстройств пролиферации клеток.
Вирус везикулярного стоматита (VSV).
[0180]  VSV - это еще один оболочечный вирус, исследуемый как онколитический агент. См., например, Betancourt D et al., J Virol 89: 11786-11800, 2015) и обзор Hastie E and Grdzelishvili VZ J Gen Virol 93: 2529-2545, 2012).
Белки, кодируемые вирусом
[0181] В одном варианте реализации вирус или вектор, используемый в способе согласно настоящему изобретению, содержит трансген, например, трансген, заменяющий дефектный генетический материал в клетке с целью придания клетке новой или расширенной функции, повышения чувствительности клетки к лечению, блокирования функции в клетке или экспрессии терапевтического белка или пептида. В одном варианте реализации вирус, используемый в качестве полезной нагрузки согласно настоящему изобретению, содержит трансген или трансгены, например, кодирующие агент, независимо выбранный из последовательности РНКи, белка, полипептида или пептида (например, молекулы антитела или его связывающего фрагмента, хемокина, цитокина, иммуномодулятора, флуоресцентной метки или фермента).
[0182] Сюда входят, в числе прочего, уникальные форматы, продемонстрировавшие перспективность в доклинических исследованиях, но не обладавшие эффективным и экономичным средством доставки, например, пептиды, интратела и альтернативные каркасы (обзор Boldicke T, Protein Sci 26: 925-945, 2017, Marschall and Dubel, Comput Struct Biotechnol J 14: 304-308, 2016, Miersch and Sidhu F1000Res 5.pii.F1000 Faculty Rev. 1947, 2016, Peptides, Tsomaia Eur J Med Chem 94:459-470, 2015, Marschall ALJ et al, Mabs 7: 1010-1035, 2015, AlDeghaither D et al., J Clin Pharmacol. 55: S4-S20, 2015))), включая агенты, оказывающие терапевтическое воздействие на опухолевые клетки, опухолевые стволовые клетки, эндотелий, ассоциированный с опухолью, и строму, ассоциированную с опухолью. Особый интерес представляют молекулы, которые могут выполнять несколько функций, например, использоваться в качестве терапевтических средств, биомаркеров и/или средств диагностики. Ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (ВПГ-TK) является хорошо зарекомендовавшим себя ферментом, преобразующим пролекарство, для которого разработано клинически одобренное пролекарство (ганцикловир-GCV), см., например, Holder et al., Cancer Res. 53: 3475-3485, 1993, Touraine RL et al., Gene Therapy 5: 1705-1711, 1998),
[0183] Кроме того, экспрессию белка тимидинкиназы также можно применять для визуализации и отслеживания активности виротерапии в течение курса лечения. Позитронно-эмиссионная томография и однофотонная эмиссионная компьютерная томография представляют собой способы, обычно применяемые для обнаружения, мониторинга и лечения рака; оба эти способа можно использовать для обнаружения экспрессии белка тимидинкиназы при введении соответствующего субстрата тимидинкиназы (Wang JQ et al., Bioorg Med Chem 13: 549-556, 2005, Tjuvajev JG et al, J Nucl Med 43: 1072-1083, 2002). В качестве альтернативы, ген NIS можно использовать и исследуют в качестве агента для диагностических и терапевтических целей при применении онколитических вирусов, во многом аналогично TK (Miller A and Russell S Expert Opin Biol Ther 16: 15-32, 2016, Ravera S et al., Annu Rev Physiol 79: 261-289, 2017, Portulano et al., Endocr Rev. 35: 106-149, 2014).
RAS
HRAS
NRAS
KRAS
[0184] В одном варианте реализации антитела, взаимодействующие с RAS или белками сигнального пути RAS и ингибирующие их, кодируют в вирусе согласно настоящему изобретению, например, в виде гибридного белка с GLA-компонентом. Гены  составляют мультигенное семейство, которое включает  ,  и . См., например, Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989; и Cetin M et al., J Mol Biol. 429: 562-573, 2017.
Метки
[0185] В одном варианте реализации полезная нагрузка содержит флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, радиоактивную метку, фермент, краситель или лиганд.
[0186] В настоящем изобретении метка представляет собой любую группу, которую можно обнаружить с использованием анализа. Неограничивающие примеры репортерных молекул включают ферменты, радиоактивные метки, гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, хромофоры, фотоаффинные молекулы, цветные частицы или лиганды, например, биотин. Термин "метка" в настоящем документе также включает такие метки, как His-метки, Flag-метки и т.п. Метки включают биотин, который является субстратом для авидина.
[0187] Метки могут быть связаны с GLA-компонентами путем конъюгации или присоединения. Метка может быть единственной полезной нагрузкой или использоваться в дополнение к другому объекту, например, терапевтической полезной нагрузке.
in vitro
in vivo
[0188] Конъюгаты меток обычно являются предпочтительными для применения в качестве диагностических агентов. Диагностические агенты, как правило, подразделяются на два класса: используемые для диагностики  и используемые для протоколов диагностики , обычно называемые «направленной визуализацией». В данной области техники известно много подходящих агентов для визуализации, а также способы их присоединения к пептидам и полипептидам (см., например , патенты США 5021236, 4938948 и 4472509). Используемые группы для визуализации могут представлять собой парамагнитные ионы, радиоактивные изотопы, флуорохромы, вещества, обнаруживаемые с помощью ЯМР, и агенты для рентгеновской визуализации.
[0189] В случае парамагнитных ионов можно упомянуть в качестве примера такие ионы, как хром (III), марганец (II), железо (III), железо (II), кобальт (II), никель (II), медь (II), неодим (III), самарий (III), иттербий (III), гадолиний (III), ванадий (II), тербий (III), диспрозий (III), гольмий (III) и/или эрбий (III), причем гадолиний является особенно предпочтительным. Ионы, полезные в других контекстах, например, рентгеновской визуализации, включают лантан (III), золото (III), свинец (II) и особенно висмут (III), но не ограничиваются ими.
211
14
51
36
57
58
67
152
67
3
123
125
131
111
59
32
186
188
75
35
99m
90
125
99m
111
99m
2
[0190] В случае радиоактивных изотопов для терапевтического и/или диагностического применения можно упомянуть астат,углерод, хром, хлор, кобальт, кобальт, медь, Eu, галлий, водород, иод, иод, иод, индий, железо, фосфор, рений, рений, селен, серу, технеций и/или иттрий. I подходит для применения в определенных вариантах реализации, а технеций и/или индий в особенности подходят из-за их низкой энергии и пригодности для обнаружения на большом расстоянии. Пептиды и полипептиды с радиоактивной меткой можно получать в соответствии с хорошо известными в данной области техники способами. Например, пептиды и полипептиды можно иодировать путем контакта с иодидом натрия и/или калия и химическим окислителем, например, гипохлоритом натрия, или ферментативным окислителем, например, лактопероксидазой. Пептиды можно метить технецием посредством обмена лигандами, например, путем восстановления пертехната раствором олова, хелатирования восстановленного технеция на колонке с сефадексом и нанесения пептида на эту колонку. В качестве альтернативы, можно применять способы прямого мечения, например, путем инкубирования пертехната, восстановителя, например, SNCl, буферного раствора, например, раствора фталата натрия-калия, и пептида. Промежуточными функциональными группами, которые часто используются для связывания радиоактивных изотопов, существующих в виде ионов металлов, с пептидом, являются диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) или этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
[0191] Флуоресцентные метки, подходящие для применения в качестве полезной нагрузки, включают Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-Р6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascad Blue, Cy3, Cy5, 6-FAM, изотиоцианат флуоресцеина, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, родаминовый зеленый, родаминовый красный, ренографин, ROX, TAMRA, TET, тетраметилродамин и/или Texas Red.
in vitro
[0192] Другой тип полезной нагрузки, подходящий для использования , представляет собой вариант, когда пептид связан с вторичным связывающим лигандом и/или с ферментом (ферментной меткой), который образует окрашенный продукт при контакте с хромогенным субстратом. Примеры подходящих ферментов включают уреазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу водорода (хрена) или глюкозооксидазу. Подходящими вторичными связывающими лигандами являются соединения биотина и авидина и стрептавидина. Использование таких меток хорошо известно специалистам в данной области техники и описано, например, в патентах США 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241.
[0193] В данной области техники известны другие способы присоединения для связывания пептида с его "партнером по конъюгированию". Некоторые способы присоединения включают использование хелатного комплекса металла с использованием, например, органического хелатирующего агента, например, ангидрида диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA); этилентриаминтетрауксусной кислоты; N-хлор-п-толуолсульфонамида; и/или тетрахлор-3α-6α-дифенилгликурила-3, присоединенного к антителу (патенты США 4472509 и 4938948). Пептиды или полипептиды также могут реагировать с ферментом в присутствии связующего агента, например, глутаральдегида или периодата. Конъюгаты с флуоресцеиновыми маркерами получают в присутствии этих связующих агентов или путем реакции с изотиоцианатом.
[0194] В одном варианте реализации метка может окрашивать или метить ядро стволовой клетки.
Комбинированная терапия
[0195] В одном варианте реализации применяют комбинацию химиотерапевтических агентов, например, препарата, содержащего платину, и 5-FU или его пролекарства, например, цисплатина или оксалиплатина и капецитабина или гемцитабина, например, FOLFOX.
[0196] В одном варианте реализации химиотерапевтическое средство включает комбинацию химиотерапевтических агентов, в частности, цитотоксических химиотерапевтических агентов.
[0197] В одном варианте реализации химиотерапевтическая комбинация включает препарат, содержащий платину, например, цисплатин и фторурацил или капецитабин.
[0198] В одном варианте реализации химиотерапевтическая комбинация включает капецитабин и оксалиплатин (Xelox).
[0199] В одном варианте реализации химиотерапевтическое средство представляет собой комбинацию из фолиниевой кислоты и 5-FU, необязательно в комбинации с оксалиплатином.
2
2
2
2
2
[0200] В одном варианте реализации химиотерапевтическое средство представляет собой комбинацию из фолиниевой кислоты, 5-FU и иринотекана (FOLFIRI), необязательно в комбинации с оксалиплатином (FOLFIRINOX). Схема состоит из: иринотекана (180 мг/м в/в в течение 90 минут) одновременно с фолиниевой кислотой (400 мг/м [или 2×250 мг/м] в/в в течение 120 минут); затем фторурацил (400-500 мг/м в/в болюсно), затем фторурацил (2400-3000 мг/м в/в в течение 46 часов). Этот цикл обычно повторяют каждые две недели. Показанные выше дозировки могут варьироваться от цикла к циклу.
[0201] В одном варианте реализации химиотерапевтическая комбинация включает ингибитор микротрубочек, например, сульфат винкристина, эпотилон А, N-[2-[(4-гидроксифенил)амино]-3-пиридинил]-4-метоксибензолсульфонамид (АВТ-751), химиотерапевтический агент-производное таксола, например, паклитаксел, абраксан или доцетаксел или их комбинацию.
[0202] В одном варианте реализации в химиотерапевтической комбинации используют ингибитор mTor. Примеры ингибиторов mTor включают: эверолимус (RAD001), WYE-354, KU-0063794, папамицин (сиролимус), темсиролимус, дефоролимус (МК-8669), AZD8055 и BEZ235 (NVP-BEZ235).
[0203] В одном варианте реализации в комбинированной терапии используют ингибитор MEK. Примеры ингибиторов MEK включают: AS703026, CI-1040 (PD184352), AZD6244 (селуметиниб), PD318088, PD0325901, AZD8330, PD98059, U0126-EtOH, BIX 02189 или BIX 02188.
[0204] В одном варианте реализации в химиотерапевтической комбинации используют ингибитор AKT. Примеры ингибиторов AKT включают: MK-2206 и AT7867.
[0205] В одном варианте реализации в комбинации используют ингибитор aurora-киназы. Примеры ингибиторов aurora-киназы включают: ингибитор Aurora А I, VX-680, AZD1152-HQPA (барасертиб), мезилат SNS-314, PHA-680632, ZM-447439, CCT129202 и гесперадин.
N
трет
р
1Н-
[0206] В одном варианте реализации в комбинированной терапии используют ингибитор р38, например, описанный в заявке WO2010/038086, например, -[4-({4-[3-(3--бутил-1--толил-пиразол-5-ил)уреидо]нафталин-1-илокси}метил)пиридин-2-ил]-2-метоксиацетамид.
[0207] В одном варианте реализации в комбинации используют ингибитор Bcl-2. Примеры ингибиторов Bcl-2 включают: обатоклакс-мезилат, ABT-737, ABT-263 (навитоклакс) и TW-37.
[0208] В одном варианте реализации химиотерапевтическая комбинация содержит антиметаболит, например, капецитабин (xeloda), флударабин фосфат, флударабин (fludara), децитабина, ралтитрексед (tomudex), гидрохлорид гемцитабина и кладрибин.
[0209] В одном варианте реализации химиотерапевтическая комбинация содержит ганцикловир, который может способствовать контролю иммунных реакций и/или васкуляризации опухоли.
[0210] В одном варианте реализации химиотеравтическое средство включает ингибитор PARP.
[0211] В одном варианте реализации комбинированная терапия включает ингибитор метаболизма рака, специфично ингибирующий активность фермента DHODH.
В одном варианте реализации один или несколько видов лечения, применяемых в способе согласно настоящему изобретению, являются метрономными, то есть представляют собой непрерывное или частое применение низких доз противораковых лекарственных средств, часто назначаемых одновременно с другими способами лечения.
[0213] В одном варианте реализации предложено применение нескольких циклов лечения (например, химиотерапии), например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
[0214] В одном варианте реализации химиотерапию применяют в 28-дневном цикле.
Acinetobacter baumannii
Actinomyces israelii, Actinomyces gerencseriae и Propionibacterium propionicus
Trypanosoma bruce
Entamoeba histolytica
Anaplasma species
Angiostrongylus
Anisakis
Bacillus anthracis
Arcanobacterium haemolyticum
вирус Джунин
Ascaris lumbricoides
Aspergillus
Astroviridae
Babesia
Bacteroides
Balantidium coli
Bartonella
Baylisascaris
Piedraia hortae
Blastocystis
Blastomyces dermatitidi
Clostridium botulinum
Brucella
Enterobacteriaceae
Mycobacterium ulcerans
Caliciviridae
Campylobacter
Candida
Capillaria philippinensis,
Capillaria hepatica
Capillaria aerophila
Bartonella henselae
Streptococcus
Staphylococcus
Trypanosoma cruzi
Chlamydia trachomatis
Chlamydophila pneumoniae
Vibrio cholerae
Fonsecaea pedrosoi
Batrachochytrium dendrabatidis
Clostridium difficile
Coccidioides immitis
Coccidioides posadasii
Cryptococcus neoformans
Cryptosporidium
Ancylostoma braziliense
Enterobacteriaceae
Enterococcus
Fasciola hepatica
Fasciola gigantica
Fasciolopsis buski
Clostridium perfringens
Giardia lamblia
Burkholderia mallei
Gnathostoma spinigerum
Gnathostoma hispidum
Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus agalactiae
Haemophilus influenzae
Helicobacter pylori
Escherichia coli
Ancylostoma duodenale
Necator americanus
Ehrlichia ewingii
Anaplasma phagocytophilum
Hymenolepis nana
Hymenolepis diminuta
Orthomyxoviridae
Isospora belli
Kingella kingae
Leishmania
Mycobacterium leprae
Mycobacterium lepromatosis
Leptospira
Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii
Borrelia afzelii
Wuchereria bancrofti
Brugia malayi
Plasmodium
Burkholderia pseudomallei
Metagonimus yokagawai
Microsporidia phylum
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Nocardia
N. asteroides
Opisthorchis viverrini
Opisthorchis felineus
Paracoccidioides brasiliensis
Paragonimus
westermani
Pasteurella
Bordetella pertussis
Yersinia pestis
treptococcus pneumoniae
Pneumocystis jirovecii
Naegleria fowleri
Chlamydophila psittaci
Coxiella burnetii
Borrelia
B. hermsii
B. recurrentis
Rhinosporidium seeberi
Rickettsia
Rickettsia rickettsii
Salmonella
Schistosoma
Shigella
Sporothrix schenckii
Staphylococcus
Staphylococcus
Treponema pallidum
Taenia
Clostridium tetani
Trichophyton
Trichophyton tonsurans
Trichophyton
Epidermophyton floccosum
Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes
Trichophyton rubrum
Hortaea werneckii
Trichophyton
Trichophyton
Toxocara canis
Toxocara cati
Chlamydia trachomatis
Toxoplasma gondii
Trichinella spiralis
Trichomonas vaginalis
Trichuris trichiura
Mycobacterium tuberculosis
Francisella tularensis
Salmonella enterica subsp. enterica, serovar typhi
Ureaplasma urealyticum
Coccidioides immitis или Coccidioides posadasii
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolitica
[0215] GLA-компоненты согласно настоящему изобретению можно адаптировать для лечения одной или более из следующих инфекций путем адресного воздействия на внеклеточные везикулы, происходящие из клеток, инфицированных возбудителями: инфекций Acinetobacter (), актиномикоза (), африканской сонной болезни, также известной как африканский трипаносомоз (i) СПИД - синдрома приобретенного иммунодефицита (ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)), амебиаза (), анаплазмоза (), ангиостронгилидоза (), анизакиаза (), сибирской язвы (), инфекции Arcanobacterium haemolyticum (), аргентинской геморрагической лихорадки (), аскаридоза (), аспергиллоза (виды ), астровирусной инфекции (семейство ), бабезиоза (виды ), инфекции Bacillus cereus (Bacillus cereus), бактериальной пневмонии (различные бактерии), бактериального вагиноза (микробиота бактериального вагиноза), инфекции Bacteroides (), балантидиаза (), бартонеллеза (), инфекции Baylisascaris (), BK-вирусной инфекции (BK-вирус), чёрной пьедры (), бластоцистоза (), бластомикоза (s), боливийской геморрагической лихорадки (вирус Мачупо), ботулизма и детского ботулизма (; примечание: ботулизм - это не инфекция Clostridium botulinum, он вызывается попаданием в организм ботулинического токсина), бразильской геморрагической лихорадки (вирус Сабиа), бруцеллеза (), бубонной чумы (), инфекции Burkholderia (Burkholderia), язвы Бурули (), калицивирусной инфекции ( (Norovirus и Sapovirus)), кампилобактериоза (), кандидоза, также известного как молочница (), капилляриоза (заболевание кишечника, вызываемое  заболевание печени, вызываемое , и заболевание легких, вызываемое ), лихорадки Карриона(Bartonella bacilliformis), болезни кошачьей царапины (), целлюлита (обычно группы A и ), болезни Шагаса, также известной как американский трипаносомоз (), мягкого шанкра (Haemophilus ducreyi), ветряной оспы (вирус ветряной оспы), лихорадки чикунгунья (Alphavirus), хламидиоза (), инфекции Chlamydophila pneumoniae, также известной как TWAR (), холеры (), хромобластомикоза (), хитридиомикоза (), клонорхоза (Clonorchis sinensis), колита, вызываемого Clostridium difficile (), кокцидиоидоза (и ), колорадской клещевой лихорадки (вирус колорадской клещевой лихорадки), простудных заболеваний/острого вирусного ринофарингита/острой вирусной инфекции верхних дыхательных путей (обычно риновирусы и коронавирусы), геморрагической лихорадки Конго-Крым (вирус геморрагической лихорадки Конго-Крым), криптококкоза (), криптоспоридиоза (), кожной формы синдрома larva migrans (обычно  и ряд других паразитов), циклоспориоза (Cyclospora cayetanensis), цистицеркоза (Taenia solium), цитомегаловирусной инфекции (Cytomegalovirus), лихорадки денге (вирусы денге, например, DEN-1, DEN-2, DEN-3 и DEN-4), диэнтамебиаза (Dientamoeba fragilis), дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), дифиллоботриоза (Diphyllobothrium), дракункулеза (Dracunculus medinensis), геморрагической лихорадки Эбола (Ebolavirus), эхинококкоза (Echinococcus), эрлихиоза (Ehrlichia), Enterobacteriaceae (карбапенем-устойчивые ), энтеробиоза (Enterobius vermicularis), инфекции Enterococcus (), энтеровирусной инфекции (Enterovirus), эпидемического сыпного тифа (Rickettsia prowazekii), инфекционной эритемы (парвовирус B19), детской розеолы (герпесвирус-6 человека (HHV-6) и герпесвирус-7 человека (HHV-7)), фасциолеза ( и ), фасциолопсиаза (), филяриоза (Filarioidea), пищевого отравления, вызванного Clostridium perfringens (), инфекции свободноживущими амебами (различные патогены), инфекции Fusobacterium (Fusobacterium), газовой гангрены (обычно Clostridium, например, perfringens), геотрихоза (Geotrichum candidum), лямблиоза (), сапа (), гнатостомоза ( и ), гонореи (), паховой гранулёмы (Klebsiella granulomatis), инфекции стрептококком группы A (Streptococcus pyogenes), инфекции стрептококка группы B (), инфекции Haemophilus influenzae (), энтеровирусного везикулярного стоматита (энтеровирусы, в основном вирус Коксаки A и энтеровирус 71 (EV71)), хантавирусного легочного синдрома (вирус Син Номбре), заболевания, вызванного вирусом Хартленд (вирус Хартленд), инфекции Helicobacter pylori (), гемолитико-уремического синдрома (, например, O157:H7, O111 и O104:H4), геморрагической лихорадки с почечным синдромом (семейство Bunyaviridae), гепатита A (вирус гепатита A), гепатита B (вирус гепатита B), гепатита C (вирус гепатита C), гепатита D (вирус гепатита D), гепатита E (вирус гепатита E), простого герпеса (вирус простого герпеса 1 и 2 (ВПГ-1 и ВПГ-2), гистоплазмоза (Histoplasma capsulatum), анкилостоматоза (и ), инфекции бокавируса человека (бокавирус человека), эрлихиоза человека, вызываемого Ehrlichia ewingii (), гранулоцитарного анаплазмоза человека (), инфекции метапневмовируса человека (метапневмовирус человека), моноцитарного эрлихиоза человека (Ehrlichia chaffeensis), инфекции папилломавируса человека (папилломавирус человека), инфекции вируса парагриппа человека (вирусы парагриппа человека), гименолепидоза ( и ), инфекционного мононуклеоза вызываемого вирусом Эпштейна-Барр (вирус Эпштейна-Барр), гриппа (), изоспороза (), болезни Кавасаки, кератита (различные патогены), инфекции Kingella kingae (), лихорадки Ласса (вирус Ласса), легионеллеза, также известного как болезнь легионеров (Legionella pneumophila), легионеллеза, также известного как понтиакская лихорадка (Legionella pneumophila), лейшманиоза (), проказы (и ), лептоспироза (), листериоза (Listeria monocytogenes), болезни Лайма ( и ), лимфатического филяриатоза ( и ), лимфоцитарного хориоменингита (вирус лимфоцитарного хориоменингита), малярии (), геморрагической лихорадки Марбург (вирус Марбург), кори (вирус кори), ближневосточного респираторного синдрома (коронавирус ближневосточного респираторного синдрома), мелиоидоза (), менингита (различные возбудители), менингококковой инфекции (Neisseria meningitidis), метагонимоза (обычно ), микроспоридиоза (), контагиозного моллюска (вирус контагиозного моллюска), оспы обезьян (вирус оспы обезьян), инфекционного паротита (вирус инфекционного паротита), крысиного сыпного тифа (Rickettsia typhi), микоплазменной пневмонии (), мицетомы (актиномицетомы) и грибковой эумицетомы), миаза (личинки паразитических двукрылых-мух), конъюнктивита новорождённых (чаще всего и ), норовирусной инфекции (норовирус), нокардиоза (, например, ), онхоцеркоза (Onchocerca volvulus), описторхоза ( и ), паракокцидиоидомикоза (), парагонимоза (, например, ), пастереллеза (), воспалительного заболевания тазовых органов (различные патогены), коклюша (), чумы (), пневмококковой инфекции (S), пневмоцистной пневмонии (), пневмонии (различные патогены), полиомиелита (полиовирус), инфекции Prevotella (Prevotella), первичного амёбного менингоэнцефалита (обычно ), прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии (JC-вирус), орнитоза (), лихорадки Ку (), бешенства (вирус бешенства), возвратного тифа (, например, и ), инфекции респираторного синцитиального вируса (респираторный синцитиальный вирус), риноспоридиоза (), риновирусной инфекции (риновирус), риккетсиозной инфекции (виды ), везикулезного риккетсиоза (Rickettsia akari), лихорадки долины Рифт (вирус лихорадки долины Рифт), пятнистой лихорадки Скалистых гор (), ротавирусной инфекции (ротавирус), краснухи (вирус краснухи), сальмонеллеза (), тяжелого острого респираторного синдрома (коронавирус ТОРС), шистозоматоза (), сепсиса (различные патогены), шигеллеза (), опоясывающего герпеса (вирус ветряной оспы), натуральной оспы (Variola major или Variola minor), споротрихоза (), пищевого отравления, вызванного стафилококками (), стафилококковой инфекции (), стронгилоидоза (Strongyloides stercoralis), подострого склерозирующего панэнцефалита (вирус кори), сифилиса (), тениоза (), столбняка (), дерматомикоза бороды и усов (обычно ), стригущего лишая (), дерматофитии туловища (обычно ), пахового дерматомикоза (обычно ,  и ), дерматофитии кистей (), чёрного лишая (обычно ), дерматофитии стоп (обычно ), дерматофитного онихомикоза (обычно ), отрубевидного лишая (Malassezia), токсокароза ( или ), трахомы (), токсоплазмоза (), трихинеллёза (), трихомоноза (), трихоцефалёза (), туберкулеза (обычно ), туляремии (), брюшного тифа (), сыпного тифа (Rickettsia), инфекции Ureaplasma urealyticum (), кокцидиоидальной гранулёмы (), венесуэльского энцефалита лошадей (вируса венесуэльского энцефалита лошадей), венесуэльской геморрагической лихорадки (вирус Гуанарито), инфекции Vibrio vulnificus (Vibrio vulnificus), энтерита, вызванного Vibrio parahaemolyticus (), вирусной пневмонии (различные вирусы), лихорадки Западного Нила (вирус лихорадки Западного Нила), белой пьедры (Trichosporon beigelii), инфекции Yersinia pseudotuberculosis (Yersinia pseudotuberculosis), иерсиниоза (), желтой лихорадки (вирус желтой лихорадки) и зигомикоза (Zygomycetes).
Внутриклеточные патогены
[0216] Внутриклеточные патогены могут быть одними из наиболее трудно поддающихся лечению болезнетворных агентов, поскольку нахождение патогена внутри клетки обеспечивает ему некоторый уровень защиты в клеточной среде.
[0217] Патогены могут являться вирусами, бактериями, грибками, простейшими и т.д. Молекулы согласно настоящему изобретению в особенности пригодны для лечения внутриклеточных патогенов, в частности, описанных в настоящем документе.
Bartonella henselae, Francisella tularensis, Listeria monocytogenes, Salmonell typhi, Brucella, Legionella, Mycobacterium (например, Mycobacterium tuberculosis), Nocardia, Rhodococcus equi, Yersinia, Neisseria meninggitidis
[0218] Известные внутриклеточные бактерии включают .
[0219] Один или более из антибиотиков выбирают из эритромицина, доксициклина, азитромицина, рифампицина, стрептомицина, гентамицина, доксициклина, ципрофлоксацина, ампициллина, триметоприм-сульфаметоксазола, хлорамфеникола, TMP-SMZ (триметоприм-сульфаметоксазола), левофлоксацина, моксифлоксацина, кларитромицина, тетрациклинов, глицилциклинов, этамбутола, рифабутина, имипенема, цефотаксима, амикацина, ванкомицина, миноциклина, пенициллина G, ампициллина, фторхинолонов, азотреона и комбинаций двух или более из них.
Mycobacterium tuberculosis
[0220] Инфекция , как известно, трудно поддается лечению. В одном независимом аспекте настоящего изобретения предложена молекула для лечения скрытого и/или активного туберкулеза, в которой одно или более из лекарственных средств для лечения туберкулеза конъюгированы в качестве полезной нагрузки с GLA-компонентом, описанным в настоящем документе.
[0221] Молекулы согласно настоящему изобретению могут значительно увеличить эффективность современных лекарственных средств путем доставки их внутрь клетки, где находятся микобактерии.
[0222] Лечение туберкулеза зависит от целого ряда факторов, в том числе того, является ли туберкулез скрытым или активным, является ли пациент взрослым, ребенком, беременной женщиной, ВИЧ-положительным или имеет место комбинация вышеперечисленного. Приведенные ниже подробности относятся ко всем аспектам настоящего изобретения, например, виду получаемых молекул и способу их применения для лечения пациентов.
[0223] Лечение скрытого туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов и детей в возрасте от 2 до 11 представляет собой ежедневный прием изониазида в течение 6-9 месяцев. Беременные пациентки могут получать лечение два раза в неделю, а не ежедневно.
[0224] Таким образом, в одном варианте реализации в молекуле согласно настоящему изобретению GLA-компонент связан с полезной нагрузкой, включающей изониазид или его эквивалент.
При лечении скрытого туберкулеза у пациентов в возрасте 12 лет и старше без осложняющих факторов можно вводить изониазид и рифапентин раз в неделю в течение 3 месяцев. В качестве альтернативы, можно ежедневно вводить рифампин в течение 4 месяцев.
[0225] Таким образом, в одном варианте реализации полезная нагрузка дополнительно содержит рифапентин.
[0226] В качестве альтернативы можно предложить молекулу, в которой GLA-домен, описанный в настоящем документе, связан с полезной нагрузкой, содержащей рифапентин. Для применения при лечении можно предложить комбинацию молекул в соответствии с настоящим изобретением.
[0227] Лекарственные средства первой линии для лечения активного туберкулеза часто выбирают из изониазида, рифампина, этамбутола, пиразинамида и комбинации двух или более из них.
[0228] Таким образом, предложена молекула в соответствии с настоящим изобретением, содержащая GLA-компонент, описанный в настоящем документе и связанный с полезной нагрузкой, содержащей рифампин.
[0229] Кроме того, предложена молекула в соответствии с настоящим изобретением, содержащая GLA-компонент, описанный в настоящем документе и связанный с полезной нагрузкой, содержащей этамбутол.
[0230228] В дополнительном варианте реализации предложена молекула в соответствии с настоящим изобретением, содержащая GLA-компонент, описанный в настоящем документе и связанный с полезной нагрузкой, содержащей пиразинамид.
[0231] Явным образом предусмотрено, что полезная нагрузка, применяемая при лечении туберкулеза с применением внеклеточных везикул, описанных в настоящем дкументе, может содержать два или более, например, три или четыре лекарственных средства, например: изониазид и рифамицин, изониазид и пираксинамид, изониазид и этамбутол, рифамицин и пираксинамид, рифамицин и этамбутол, пираксинамид и этамбутол, изониазид и рифамицин и пираксинамид, изониазид и рифамицин и этамбутол, а также изониазид и рифамицин и пираксинамид и этамбутол.
[0232] Вирусные патогены включают вирус гриппа, вирус иммунодефицита человека, денге, вирус Западного Нила, вирус натуральной оспы, респираторно-синцитиальный вирус, вирус корейской геморрагической лихорадки, вирус ветряной оспы, вирус простого герпеса 1 или 2, вирус Эпштейна-Барр, вирус Марбург, хантавирус, вирус желтой лихорадки, вирусы гепатита А, В, С или Е, вирус Эбола, вирус папилломы человека, риновирус, вирус Коксаки, полиовирус, вирус кори, вирус краснухи, вирус бешенства, вирус болезни Ньюкасла, ротавирус, ВИЧ (например, HTLV-1 и -2).
[0233] Противовирусные препараты можно связывать с GLA-компонентом и независимо выбирать из одного или более из: абакавира, ацикловира, ацикловира, адефовира, амантадина, ампренавира, амплигена, арбидола, атазанавира, Atripla, боцепревира, цидофовира, комбивира, дарунавира, делавирдина, диданозина, докозанола, эдоксудина, эфавиренца, эмтрицитабина, энфувиртида, энтекавира, ингибиторов проникновения, фамцикловира, фомивирсена, фосампренавира, фоскарнета, сфосонета, ганцикловира, ибацитабина, иммуновира, идоксуридина, имиквимода, индинавира, инозина, ингибитора интегразы, интерферона III типа, интерферона II типа, интерферона I типа, интерферона, ламивудина, лопинавира, ловирида, маравирока, мороксидина, метизазона, нелфинавира, невирапина, нексавира, аналогов нуклеозидов, осельтамивира, ПЭГ-интерферона альфа-2, пенцикловира, перамивира, плеконарила, подофиллотоксина, ингибитора протеазы, ралтегравира, ингибитора обратной транскриптазы, рибавирина, римантадина, ритонавира, пирамидина, саквинавира, ставудина, синергетического энхансера (антиретровирусного средства), масла чайного дерева, телапревира, тенофовира, дизопроксила тенофовира, типранавира, трифлуридина, тризивира, тромантадина, трувады, валацикловира, валганцикловира, викривирока, видарабина, вирамидина, залцитабина, занамивира и зидовудина.
[0234] В данной области техники хорошо известно, что противовирусные препараты можно применять в комбинации, например, для увеличения эффективности.
[0235] Таким образом, в одном варианте реализации предложена молекула согласно настоящему изобретению с полезной нагрузкой для лечения протозойных заболеваний, например, малярии, африканской сонной болезни и т.п.
[0236] Известные паразитические простейшие включают паразитов, аналогичных плазмодию, например, возбудителя малярии. Для лечения малярии применяют лекарственные средства, например, хинин и родственные агенты, холорохин, амодиахин, пириметамин, прогуанил, сульфонамиды, мефлохин, атовахон, примахин, аремизинин и его производные, галофантрин, доксициклин, клиндамицин, сульфадиазин и комбинацию двух или более из них.
[0237] В одном варианте реализации предложена молекула согласно настоящему изобретению в виде фармацевтической композиции, содержащей вспомогательное вещество, разбавитель и/или носитель. В одном варианте реализации композиция представляет собой парентеральную композицию.
[0238] "Парентеральный состав" означает состав, предназначенный для доставки не через желудочно-кишечный тракт. Типичные пути парентеральной доставки включают инъекцию, имплантацию или вливание.
[0239] В одном варианте реализации парентеральный состав находится в форме инъекции. Инъекция включает внутривенную, подкожную, внутричерепную, подоболочечную, внутриопухолевую или внутримышечную инъекцию. "Инъекция" в настоящем документе означает введение жидкости в организм через шприц.
[0239] В одном варианте реализации парентеральный состав находится в форме вливания.
[0241] "Вливание" в настоящем документе означает введение жидкостей с замедленной скоростью с помощью капельницы, инфузионного насоса, шприцевой помпы или эквивалентного изделия. Согласно одному варианту реализации вливание осуществляют в течение периода времени в диапазоне от 1,5 минут до 120 минут, например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 или 115 минут.
[0242] В одном варианте реализации состав предназначен для внутривенного (в/в) введения. Этот путь особенно эффективен, поскольку обеспечивает быстрый доступ к большинству органов и тканей и особенно полезен для лечения метастазов, например, развившихся метастазов, особенно расположенных в областях с высокой васкуляризацией, например, в печени и легких.
[0243] Терапевтические составы обычно являются стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другого парентерального состава, подходящего для введения человеку, и может быть приготовлена в виде предварительно заполненного устройства, такого как шприц или флакон, особенно в виде однократной дозы.
[0244] Как обсуждалось выше, такой состав, как правило, содержит фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, например, нетоксичный изотонический носитель, совместимый с вирусом, в котором вирус стабилен в течение необходимого периода времени.
[0245] Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования диспергирующего или поверхностно-активного вещества, например, лецитина, или неионогенного поверхностно-активного вещества, например, полисорбата 80 или 40. Поддержанию необходимого размера частиц в дисперсиях может способствовать присутствие поверхностно-активного вещества. Примеры изотонических агентов включают углеводы, полиспирты, например, маннит, сорбит или хлорид натрия в композиции.
[0246] Таким образом, в варианте реализации предложена молекула в соответствии с настоящим изобретением, где GLA-компонент, описанный в настоящем документе, связан с полезной нагрузкой, содержащей одно или более из противомалярийных лекарственных средств.
[0247] Подразумевается, что «содержащий» в контексте настоящей заявки означает «включающий».
[0248] При технической целесообразности можно объединять варианты реализации настоящего изобретения.
[0249] В настоящем документе описаны варианты реализации, содержащие определенные характеристики/элементы. Настоящее изобретение также распространяется на отдельные варианты реализации, состоящие или по существу состоящие из указанных признаков/элементов.
[0250] Технические ссылки, например, патенты и заявки, включены в настоящий документ посредством ссылок.
[0251] Уровень техники являются частью технического описания настоящей заявки и может использоваться в качестве основы для поправок, поскольку обсуждение в нем не ограничивается обсуждением предшествующего уровня техники и также включает обсуждение технических проблем, встречающихся на местах, и применения настоящего изобретения.
[0252] Любые варианты реализации, конкретно и явно указанные в настоящем документе, могут составлять основу отказа от ответственности по отдельности либо в сочетании с одним или несколькими дополнительными вариантами реализации.
[0253] Настоящая заявка испрашивает приоритет заявок на патент США с серийными номерами: 62/554530, 62/569403, 62/554533, 62/569411, 62/584565 и 62/593014. Каждая из этих заявок включена в настоящий документ посредством ссылки. Эти заявки можно использовать в качестве основы для исправления настоящей заявки.
[0254] Далее приведено описание настоящего изобретения со ссылками на следующие примеры, которые являются исключительно иллюстративными и не должны никоим образом трактоваться как ограничивающие сущность настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
фигуре 1A-D
На  показаны различные представления структур белка GLA.
фигуре 1Е
На  показан вариант реализации GLA-компонента в соответствии с настоящим изобретением.
фигуре 2
А
B
C
D
E
F
На  продемонстрировано окрашивание белком S (PrS) и аннексином линий клеток рака молочной железы, обработанных пероксидом для индукции апоптоза. , клетки MDA-231 человека, обработанные пероксидом и окрашенные FITC-PrS. , необработанные клетки MDA-231, окрашенные аналогично A. , обработанные клетки MDA-231, окрашенные аннексином. , клетки MCF-7 человека, обработанные пероксидом и окрашенные PrS. , клетки MET-1 мыши, обработанные аналогично D. , клетки 4T1 мыши, обработанные аналогично D.
фигуре 3
А
КРАСНЫЕ
ЗЕЛЕНЫЕ
B
С
На  продемонстрирована перекрывающаяся, но не совпадающая локализация PrS и аннексина в клетках. , клетки 4Т1 мыши, обработанные пероксидом и окрашенные Cy5-PrS () и FITC-аннексином (). Светлая стрелка - совместно локализованные сигналы; красные стрелки - клетки, окрашенные PrS, а не аннексином; зеленая стрелка - клетки, относительно более ярко окрашенные аннексином и менее ярко - PrS, что указывает на четкую картину связывания (на вставках отдельно показано окрашивание PrS и аннексином). , обработанные клетки 4T1, окрашенные FITC-PrS и Cy5-аннексином. Зеленые стрелки - клетки, окрашенные PrS, а не аннексином. , окрашивание Cy5-аннексином обработанных клеток 4Т1, предварительно инкубированных с 1000-кратным избытком холодного аннексина.
фигуре 4
На  показано окрашивание апоптозных клеток COS-1 PrS и аннексином. Клетки обрабатывали t-BHP в соответствии с описанием и окрашивали FITC-аннексином (слева) и Cy5-PrS (справа). Стрелки указывают на субклеточные структуры, предположительно являющиеся апоптозными тельцами.
фигуре 5
На  показано дифференциальное окрашивание внеклеточных везикул PrS и аннексином. Внеклеточные везикулы получали из клеток 4T1 и окрашивали FITC-PrS (ЗЕЛЕНЫЙ) и Cy5-аннексином (КРАСНЫЙ). Стрелки указывают на везикулы, окрашенные только аннексином (КРАСНАЯ стрелка), только PrS (ЗЕЛЕНАЯ стрелка) и обоими белками (светлая стрелка).
фигуре 6
А
В
С
На  показана субклеточная локализация PrS и аннексина. , , апоптозные клетки 4Т1 окрашивали FITC-PrS (ЗЕЛЕНЫЕ стрелки) и Cy5-аннексином (КРАСНЫЕ стрелки); светлые стрелки - совместная локализация. , возможные апоптозные тельца.
фигуре 7
A
B
На  показана интернализация PrS в течение 5 минут. Апоптозные клетки 4Т1 окрашивали FITC-PrS (зеленый) и Cy5-аннексином (красный) и визуализировали в течение 10 минут после добавления белков. , объединенное изображение. , только окрашивание ядер Hoescht.
фигуре 8
На  показаны изображения BLI опухолей 4T1 у мышей.
Фигура 9
ОФЭКТ-визуализация влияния доксорубицина на опухоли 4T1 с использованием радиоактивно меченного PrS и аннексина. Мышей с опухолями рака молочной железы 4Т1 визуализировали с использованием 99mTc PrS (A и B) или аннексина (C и D) до (A и C) и через 24 часа после добавления доксорубицина (B и D).
фигуре 10
A
C)
B
D
A
B
C
D
99m
На  показана ОФЭКТ-визуализация мышей, обработанных циклогексамидом. Показаны по пять мышей на панель до ( и  и через 24 ч после ( и ) обработки. Мышей визуализировали с использованием Tc PrS ( и ) или аннексина ( и ), стрелами показан усиленный сигнал печени.
фигуре 11
А
С
B
D
Listeria
На  показана локализация Cy5 PrS в инфицированной селезенке. Мышей CD1 инфицировали биолюминесцентной бактерией  и визуализировали на 2 день после заражения. Мышам вводили Cy5 PrS за 30 мин до умерщвления, селезенки удаляли и замораживали. Показаны умеренно инфицированные () и контрольные неинфицированные () мыши. Показаны участки инфицированной () и неинфицированной () селезенки каждой мыши по каналу Cy5, объединенные с фазово-контрастными изображениями.
фигуре 12
На  показана локализация Cy5 PRS в опухолях, обработанных доксорубицином. Мышей с имплантированными опухолями рака молочной железы 4Т1 лечили доксорубицином (снимки справа) или оставляли необработанными (снимки слева). Через 24 часа мышам внутривенно вводили Cy5 PrS и умерщвляли их через 30 минут. Опухоли удаляли, замораживали и делали срезы для флуоресцентной микроскопии. Показаны объединенные Cy5/фазово-контрастные изображения от четырех разных мышей.
фигуре 13
На  показана дифференцировка TSC. TSC культивировали в присутствии (слева) или в отсутствие (справа) факторов роста. Стрелки на правой панели указывают на гигантские клетки, характерные для дифференцировки.
фигуре 14
На  показано PrS-окрашивание стволовых клеток трофобласта и дифференцированных трофобластов. Стволовые клетки трофобласта (слева) дифференцировали в гигантские клетки трофобласта (справа) путем удаления факторов роста. Клетки окрашивали Cy5-PrS и визуализировали.
фигуре 15
На  показана дифференцировка МСК. МСК обрабатывали, как описано в тексте, для дифференцировки в адипоциты (верхние снимки) или остеобласты (нижние снимки). Дифференцированные клетки в каждом случае демонстрировали ожидаемую морфологию.
фигуре 16
На  показаны МСК, окрашенные PrS (зеленый), аннексином (красный) и Hoechst (синий). Клетки визуализировали в течение 10 минут после добавления смеси красителя.
фигуре 17
На  показаны TSC, окрашенные PrS (зеленый, самая светлая область), аннексином (красный, светлые области вокруг клеточной мембраны) и Hoechst (синий). Клетки визуализировали в течение 5 минут после добавления смеси красителя.
фигуре 18
фигуре 17
На  показано дифференциальное окрашивание везикул TSC. TSC окрашивали, как на . Группа клеток секретировала крупные везикулы, окрашивавшиеся аннексином (красный), но не PrS (зеленый).
фигуре 19
На  показано PrS-окрашивание клеток-предшественников нейронов C17.2. Клетки окрашивали PrS-FITC и визуализировали с помощью стандартной (неконфокальной) микроскопии.
фигуре 20
На  показана интернализация PrS в TSC при 4C. FITC-PrS (зеленый) и Cy5-аннексин (красный) добавляли к TSC при 4°С и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии.
фигуре 21
На  показаны клетки костного мозга мыши, отрицательные по маркерам ростков и окрашенные с использованием набора SCA-1/c. В данный момент анализа клетки не окрашивали ни PI (иодидом пропидия; для обнаружения мертвых клеток), ни PrS. Отсутствие окрашивания по маркерам гемопоэтических ростков (левая панель) и окрашивания c-kit и SCA1 (правая панель) определяет популяцию ГСК, показанную зеленым цветом (самые светлые области).
Фигура 22
PrS-окрашивание долгоживущих ГСК. ГСК выделяли, как на фигуре 1, и окрашивали FITC-PrS. Характер SLAM определяли с использованием Cy7 (ось X).
Фигура 23
PrS-окрашивание короткоживущих ГСК. ГСК выделяли, как на фигуре 1, и окрашивали FITC-PrS. Характер SLAM определяли с использованием Cy7 (ось X).
фигуре 24
На  показана интернализация PrS в долгоживущие ГСК. ГСК получали в соответствии с описанием, окрашивали PrS и исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Зеленый (самые светлые области) - FITC-PrS; синий - окрашивание ядер Hoescht; красный - PI. Обратите внимание, что окрашивание PI отсутствует в ядрах, что указывает на то, что клетки живы.
фигуре 25
На  показан пример мертвой ГСК с PI в ядре.
Фигура 26
GLA-опосредованная доставка нетоксична для клеток
Настоящая заявка также включает последовательности 1-6 в соответствующем списке последовательностей.
Данный проект инициировал тестирование меченого рекомбинантного PrS в качестве визуализирующего агента in vivo для ОФЭКТ (однофотонной компьютерной томографии). Неожиданно было обнаружено, что эту молекулу быстро интернализуют апоптозные клетки. Это неожиданное открытие привело к дальнейшему изучению данного явления, после чего было обнаружено, что PrS также интернализуют несколько видов неапоптозных стволовых клеток.
PrS представляет собой GLA-домен белка S и EGF-домен белка S, показанные в SEQ ID NO: 6.
Способы
4
4
2
2
Для обеспечения флуоресценции выполняли конъюгирование Cy5 и FITC с использованием наборов для мечения Amersham (GE Heathcare) и Molecular Probes (Invitrogen), соответственно, согласно инструкциям производителей. Оба набора содержали колонки для удаления неконъюгированного флуорофора. Первоначально 0,77 мг PrS (фракция 2) в 1 мл и 0,77 мг аннексина в 1 мл метили FITC для проверки специфичности связывания с апоптозными клетками. Для исследований совместной локализации и конкуренции 0,68 мг PrS (фракция 3) в 1 мл и 0,68 мг аннексина метили Cy5. Для конфокальной микроскопии 0,76 мг PrS из второй партии метили FITC и использовали ранее меченный Cy5-конъюгированный аннексин. Следует отметить, что точную эффективность мечения не определяли, а извлечение из колонок предполагали равным 85% в соответствии с инструкциями производителей наборов для мечения. Таким образом, относительная интенсивность окрашивания двух белков в любом случае может отражать эти неучтенные факторы. Первоначально клетки окрашивали в течение 30 минут, но впоследствии выяснили, что достаточное время составляет менее 5 минут. Для проверки специфичности PrS к апоптозным клеткам первоначально использовали четыре линии клеток рака молочной железы; MDA-231 и MCF7 человека и 4T1 и MET-1 мыши. Кроме того, впоследствии использовали клетки почки обезьяны COS-1. Апоптоз индуцировали пероксидом водорода или трет-бутилгидропероксидом (t-BHP). Клетки высевали в 24-луночные планшеты по 6×10 клеток на лунку или предметные стекла Eppendorf по 1×10 клеток на лунку, и на следующий день вызывали апоптоз, используя 2 мМ HO или t-BHP в моменты времени от 30 мин до 2 часов. После индукции лунки промывали аннексин-связывающим буфером (AB; Santa Cruz Biotech) и окрашивали меченым белком. Исходя из прошлого опыта и литературных данных, для окрашивания использовали 5.5 μг/мл белка аннексина. Это количество корректировали для эквимолярного добавления PrS из расчета, что молекулярная масса аннексина составляет 36 кДа, а рекомбинантного PrS - 30 кДа на основании предоставленных изображений гелей. Клетки окрашивали в течение 15 мин. Краситель Hoechst 33342 использовали для визуализации нуклеиновой кислоты. Затем лунки промывали AB и наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа EVOS при сохранении жизнеспособности. Для конфокальной микроскопии использовали микроскоп Leica SP8 в научном центре клеточной визуализации Стэнфордского университета. Затем лунки промывали AB и наблюдали с использованием микроскопа Leica sp8. Краситель Hoechst 33342 использовали для визуализации ядер. Для исследований токсичности к трофобластным стволовым клеткам (TSC) добавляли PrS и тестировали жизнеспособность с трипановым синим с использованием Nexcelom Cellometer.
4
Для проверки способности меченых белков обнаруживать опухоли 5 × 10 клеток 4T1-luc имплантировали группам из 5 самцов мышей BALB/c в жировую подушку левой подмышечной впадины. Мышей визуализировали с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI) in vivo каждый день для мониторинга роста опухоли, начиная с 1 недели после имплантации. Затем мышей лечили на 11 день после имплантации путем внутрибрюшинного (в/б) введения доксорубицина в дозе 13 мг/кг массы тела, и на следующий день выполняли BLI. Контрольных мышей с опухолями не лечили доксорубицином. Через 48 часов после обработки мышей визуализировали через 1 ч после внутривенной инъекции индикатора (анестезия 1,3 г/кг уретана в/б) с помощью гамма-камеры A-SPECT (Gamma Medica) с одной головкой, коллиматором с точечным отверстием диаметром 1 мм, за 128 этапов на 128×128 матрице визуализации, 15 секунд на этап, 2,7 см ROR; ПЗ = верхняя часть груди/шея. Вводимая доза каждого белка составляла 160 мкл (800 мкКи). Затем животных умерщвляли и оценивали биораспределение. В эксперименте по лечению циклогексамидом группы из 5 молодых (7-недельных) самцов мышей Swiss Webster анестезировали (1,3 г/кг уретана в/б) и внутривенно вводили 50 мг/кг циклогексимида. Через 1 час 45 минут после введения циклогексимида вводили индикатор (PrS = 180 мкл/1,2 мКи на дозу; аннексин V = 170 мкл/1,05 мКи на дозу). Через 45 минут после введения индикатора мышей визуализировали с получением 10-минутных статических изображений всего тела с использованием коллиматора с одной головкой с параллельными отверстиями (128×128 матрица) на гамма-камере A-SPECT.
Listeria monocytogenes
5
Для проверки специфической локализации флуоресцентного PrS в областях апоптоза вследствие инфекции у живых животных мышам CD1 внутривенно вводили биолюминесцентные бактерии  . Этот бактериальный патоген поражает многие органы, включая селезенку, в которой происходит обширный апоптоз моноцитов и гранулоцитов. В определенные периоды времени после заражения селезенка является основной областью репликации бактерий, поэтому сигналы BLI от бактерий в селезенке можно соотносить с локализацией зондов апоптоза. Мышей инфицировали и визуализировали каждый день. При выявлении сигналов селезенки (2 день после инфекции 2×10 колониеобразующих единиц бактерий у 8-недельных мышей CD1) мышам вводили 300 мг/кг массы тела Cy5-PrS, через 30 минут животных умерщвляли, извлекали селезенки, замораживали их в ОКТ и получали срезы для флуоресцентной микроскопии. Использовали неинфицированных контрольных мышей.
Выполняли проточную цитометрию. Использовали свежеприготовленный FITC-PrS, полученный в соответствии с описанием, приведенным выше. В этой лаборатории обычно выделяли гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) мыши. Клетки выделяли из костного мозга здоровой мыши путем окрашивания c-Kit+, отрицательных по маркерам ростков клеток. Для дальнейшего исследования характеристик клеток их также окрашивали маркерами SLAM. Эти маркеры окрашивают самообновляющиеся и дифференцирующиеся клетки, тогда как неокрашенные ГСК могут только дифференцироваться. Последующее окрашивание FITC-PrS выявило процент положительных SLAM-окрашивающихся клеток, показанный в результатах. Затем клетки сортировали по FITC и исследовали с помощью конфокальной микроскопии, используя Hoechst 33342 для визуализации ядер.
Результаты
фигуре 2
фигуре 2
фигуре 3
фиг. 3
фиг. 3А
фиг. 3C
фиг. 4
фигуре 4
фиг. 5
Для оценки специфичности связывания PrS в контексте апоптоза в клеточной культуре авторы изобретения использовали несколько линий клеток рака молочной железы человека и мыши. Апоптоз индуцировали пероксидом, как описано выше, и оценивали связывание FITC-PrS. Примеры этих экспериментов показаны на . Необработанные клетки демонстрировали минимальное связывание, как показано на панели B на . Концентрации пероксида и время инкубирования выбирали таким образом, чтобы обработать небольшую часть клеток, поскольку при более высоких концентрациях и/или более длительных временах инкубирования клетки отделялись и окрашивание и микроскопия были невозможны. Кроме того, наличие большого количества необработанных клеток служило внутренним отрицательным контролем в каждом поле. FITC-аннексин проявлял специфичность к апоптозу аналогично PrS, являясь внутренним положительным контролем. Затем проверили два белка на совместную локализацию и конкурентное связывание. Для совместной локализации готовили PrS и аннексин, меченные как FITC, так и Cy5. Клетки 4T1 обрабатывали пероксидом и окрашивали Cy5- и FITC-меченными PrS и аннексином, используя обе комбинации флуорофоров. Затем клетки визуализировали в флуоресцентном микроскопе EVOS. Результаты показаны на . В условиях тестирования все ярко окрашенные клетки демонстрировали окрашивание обоими белками. Однако при использовании Cy5 или FITC PrS, по-видимому, окрашивал (хотя и слабо) некоторые клетки, которые не окрашивались аннексином (). Относительная интенсивность окрашивания различных клеток каждым белком иногда различалась между двумя зондами, т.е. иногда аннексин окрашивал две клетки с одинаковой интенсивностью, а PrS - нет, и наоборот (, зеленая стрелка и вставка). Таким образом, хотя оба зонда, как правило, окрашивали одни и те же клетки, они, по-видимому, незначительно различались. При конкурентном анализе возрастающие избыточные количества немеченого аннексина предварительно инкубировали с апоптозными клетками 4Т1 в течение 15 минут, а затем клетки окрашивали Cy5-PrS. Как ни странно, окрашивание PrS не блокировал даже 1000-кратный избыток аннексина (максимальное протестированное избыточное количество, ), хотя считается, что эти белки связываются с одной и той же молекулой-мишенью, экспонирующей PS. Совместное окрашивание аннексина и PrS наблюдалось со многими типами клеток. Хотя эти два белка обычно окрашивали одни и те же клетки при использовании каждого типа клеток, стали очевидными другие различия. В частности, по-разному окрашивались некоторые объекты, меньшие, чем клетки (). Эти объекты, которые присутствовали в повышенном количестве после обработки пероксидом, интерпретировались как апоптозные тельца; мембраносвязанные фрагменты клеток, образующиеся при фрагментации апоптозных клеток. Как показано на , PrS окрашивал эти объекты, в то время как аннексин - нет, хотя некоторые из этих объектов окрашивались обоими белками. Это наблюдение было неожиданным. Для дальнейшего изучения дифференциального окрашивания субклеточных объектов получили внеклеточные везикулы (EV) из опухолевых клеток мыши 4T1 с использованием стандартного протокола центрифугирования. Эти два белка также по-разному окрашивали данные везикулы (), что может иметь биологические и терапевтические последствия.
Предполагается, что EV, в частности, экзосомы, микровезикулы (MV) и апоптозные тельца (AB) играют ключевую роль в межклеточной коммуникации посредством передачи биомолекул между клетками. Биогенез EV этих типов различен, и они образуются из эндосомной (экзосомы) или плазматической мембраны (MV) или являются продуктами запрограммированной гибели клеток (AB). Считается, что все клетки млекопитающих секретируют EV. EV каждого типа могут передавать молекулярный груз как соседним, так и отдаленным клеткам, влияя на поведение клеток, например, вовлеченное в развитие и прогрессирование опухоли. EV фактически могут участвовать в проявлении почти всех отличительных признаков рака, включая поддержание пролиферативных сигнальных путей, уклонение от подавления роста, сопротивление гибели клеток, перепрограммирование энергетического метаболизма, утрату стабильности генома и развитие опухолевого микроокружения. Они также участвуют в индукции ангиогенеза, контроле инвазии, инициировании преметастатических ниш, поддержании воспаления и уклонении от иммунного контроля. Иммунные клетки, по-видимому, также осуществляют коммуникацию посредством EV и могут распознавать EV как сигналы опухолевых клеток, инфицированных тканей и ран. Более глубокое понимание биологии EV и их вклада в проявление отличительных признаков рака приводит к появлению новых возможностей для диагностики и лечения рака. Разработка дополнительных поверхностных маркеров EV важна для развития этой области, и PrS может быть такой детерминантой.
4
2
2
фиг. 6
После этих исследований с использованием флуоресцентной микроскопии оценивали субклеточную локализацию окрашивания PrS и аннексином с помощью конфокальной микроскопии. Клетки мыши 4T1 (без репортеров Luc-GFP) высевали на 8-камерные предметные стекла из расчета 1×10 клеток на камеру и индуцировали апоптоз воздействием 2 мМ HO или t-BHP (в течение 2 часов) на следующий день. Затем клетки промывали и окрашивали в течение 15 минут PrS и аннексином. Краситель Hoechst 33342 использовали для окрашивания нуклеиновой кислоты. Во всех случаях наиболее ярко окрашенные клетки были окрашены обоими зондами. Однако во многих клетках меченый PrS наблюдался в цитоплазме, а меченый аннексин - нет (). Хотя аннексин интернализировался и появлялся в везикулах некоторых клеток, интернализованный аннексин не наблюдался в одной и той же клетке вместе с локализованным на поверхности PrS. Эти результаты были неожиданными, поскольку предполагалось, что оба белка связывают PS.
фиг. 7
фигуре 7,
-
фигурах 3A
B,
фигуре 8
фигуре 9
99m
В то же время ясно, что эти два белка по-разному реагировали на протестированные ингибиторы. Для дальнейшего изучения интернализации PrS выполнили эксперимент по определению зависимости от времени. Апоптозные клетки 4T1 окрашивали в течение 5 минут Cy5-аннексином и FITC-PrS и наблюдали в течение 5 минут после добавления зондов. PrS появлялся в цитоплазме этих клеток сразу, что указывало на интернализацию в течение 5 минут (). Изображения зависимости от времени также показали, что PrS и аннексин не всегда одинаково окрашивали одни и те же клетки в ранние моменты времени. Клетки на повидимому, находятся на разных стадиях апоптоза, так как в клетке слева видно неконденсированное ядро, окруженное, по-видимому, неповрежденной ядерной мембраной, тогда как правая клетка демонстрирует сильное окрашивание, часто характерное для конденсации хроматина, которая происходит на более поздних этапах апоптоза. Такая картина окрашивания может указывать на то, что PrS связывается при апоптозе раньше, чем аннексин. Хотя это на данный момент лишь предположение, такое предпочтение объясняет многие различия между этими белками, наблюдавшиеся до сих пор. Например, окрашивание некоторых клеток PrS, а не аннексином, например, на  и  может быть связано со связыванием PrS на более ранних стадиях апоптоза. Для изучения локализации PrS у живых животных выполнили несколько экспериментов. В этих исследованиях использовали химическую и инфекционную индукцию апоптоза in vivo, а также локализацию PrS в опухолях, обработанных доксорубицином, который, как известно, вызывает апоптоз. ОФЭКТ-визуализацию с использованием HYNIC-меченого PrS и аннексина выполнили у животных с имплантированными опухолямии молочной железы 4T1luc, получавших доксорубицин. Поскольку опухоли 4Т1 были мечены люциферазой, их можно было визуализировать у мышей с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo (BLI). Одно из изображений, полученных в этом эксперимента, показано на . Этот способ можно применять для оценки имплантации опухоли и отслеживания прогрессирования у отдельных животных с течением времени. Затем PrS и аннексин, меченые Tc, использовали для ОФЭКТ-визуализации животных, получавших доксорубицин, и контрольных животных. Пример результатов показан на . Изображения головы и грудной клетки двух животных демонстрировали неспецифическое накопление зонда PrS в слюнной железе и низкое отношение сигнал/шум при использовании этого зонда. Поэтому порог отображения на показанных изображениях PrS был снижен с целью более эффективного выявления фонового сигнала, что привело к завышенной яркости окрашивания изображений. Низкое отношение сигнал/шум, вероятно, связано с мечением HYNIC лишь 1 мг белка, что является неоптимальным, а также из-за невозможности проведения контролируемых исследований соотношения "метка HYNIC: белок".
фиг. 10
фигуры 10
фиг. 11
фигуре 11
Listeria monocytogenes
Кроме того, выполнили ОФЭКТ-визуализацию мышей, получавших циклогексамид, который вызывает апоптоз в печени (). На каждой панели  показаны изображения всего тела 5 мышей. Как и для многих зондов, меченных радиоактивной меткой, виден фоновый сигнал в почках. Обработка мышей циклогексамидом усиливала ОФЭКТ-сигнал аннексина в печени. PrS вновь демонстрировал низкий сигнал по сравнению с аннексином. Аннексин был способен обнаруживать апоптоз в печени у мышей, обработанных циклогексамидом, тогда как PrS демонстрировал лишь незначительное увеличение сигнала в печени из-за лекарственного препарата. Для проверки локализации PrS в апоптозных тканях и обработанных опухолях независимо от ОФЭКТ-визуализации и сопутствующих осложнений HYNIC-мечения мышам, инфицированным бактериями, которые вызывают апоптозные реакции, и мышам, несущим опухоли, вводили Cy5-PrS. Для инфекции использовали , бактериальный патоген, меченый люциферазой и хорошо охарактеризованный для BLI. Характерные BLI-сигналы в селезенке обеспечивают превосходные исследования совместной локализации. Мышей CD1 инфицировали, как описано выше, и визуализировали с помощью BLI на 2 день после инфекции. Затем мышам вводили Cy5-PrS и через 30 минут умерщвляли их, а селезенки извлекали для получения срезов и флуоресцентной микроскопии (). Во всех случаях срезы селезенки инфицированных мышей демонстрировали гораздо более высокие сигналы флуоресценции Cy5, чем контрольные срезы. На  инфицированная мышь демонстрировала небольшое количество фотонов, что указывает на то, что инфекция у этого животного прогрессировала еще не очень далеко. В этот день у многих мышей интенсивность сигнала селезенки была в 10 раз выше. Однако флуоресценция по каналу Cy5 все же была очень сильной по сравнению с показанным неинфицированным контролем. Этот результат может отражать текущий врожденный иммунный ответ на инфекцию, поскольку показано, что гранулоциты и макрофаги являются основным источником сигнала аннексина у таких животных (эти клетки запрограммированы на апоптоз для ограничения разрушения ткани).
фигуре 12
Затем протестировали локализацию флуоресцентного PrS в опухолях 4T1, обработанных доксорубицином. Мышей с имплантированными опухолями обрабатывали доксорубицином, как описано выше, а Cy5-PrS внутривенно вводили за 30 мин до умерщвления и удаления опухолей для получения срезов и флуоресцентной микроскопии. Результаты показаны на . У обработанных животных наблюдались области интенсивного окрашивания, в то время как на срезах необработанных опухолей наблюдался более скромный сигнал. Хотя в некоторых необработанных опухолях действительно были небольшие области с сигналом, превышавшим фоновый, сигналов, аналогичных интенсивности в обработанных опухолях, не наблюдали ни в одном из необработанных срезов.
фиг. 13
фиг. 14
фигуре 15
Стволовые клетки отличаются по фенотипу от дифференцированных клеток и могут экспрессировать PS без апоптоза, избегая индукции иммунного ответа. Трофобластные стволовые клетки (TSC) дифференцируются в культуре в несколько типов трофобластов. TSC получают из соскобов матки мыши, выращенных в присутствии фактора роста фибробластов, активина и гепарина. При удалении этих факторов из среды TSC спонтанно дифференцируются в гигантские клетки (). TSC окрашивали PrS, в то время как дифференцированные трофобласты, полученные из этих клеток в культуре, не окрашивали (). Кроме того, определили, что PrS интернализуется в стволовые клетки без индукции апоптоза. Этот результат подтверждает наблюдения, сделанные на линиях опухолевых клеток с индуцированным апоптозом. Без индукции апоптоза в опухолевых клетках наблюдалось минимальное окрашивание. Для проверки интернализации в стволовые клетки использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и TSC. MSC получали из костного мозга мыши. Костный мозг мышей отмывали и культивировали в течение 6 дней в отсутствие факторов роста. Во время этого инкубирования МСК и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) реплицировались, тогда как фибробласты прилипали, но не увеличивались в числе в течение нескольких поколений. Через 6 дней монослой становился видимым. При пересеве с трипсинизацией адгезивные МСК сохранялись, в то время как ГСК, растущие в суспензии, терялись. Фибробласты не поддерживались из-за отсутствия факторов роста и также не сохранялись. Таким образом, эта простая процедура позволяла получить почти однородную популяцию МСК. Чтобы подтвердить идентичность этих клеток, культуры по отдельности обрабатывали дексаметазоном и глицерофосфатом (для индукции дифференцировки в остеобласты) или дексаметазоном и индометацином (для индукции дифференцировки в адипоциты). Результаты показаны на . В ответ на вышеуказанную обработку среди дифференцированных клеток появились соответствующие клетки. В адипоцитах содержались крупные жировые везикулы, а остеобласты были темными клетками с характерным внутриклеточным коллагеном и минерализацией.
фигуре 16
фигуре 17
фигуре 18
фигура 19
фиг. 20
Для оценки картины субклеточного окрашивания недифференцированные МСК окрашивали PrS и аннексином, а также реактивом для окрашивания ядер Hoechst и наблюдали с помощью конфокальной микроскопии. Результаты наблюдений показаны на . PrS быстро интернализовался. В случае МСК приблизительно 1 из 20 клеток окрашивалась PrS, что согласуется с предыдущими данными, однако точный процент окрашивания не определяли. Морфология МСК неоднородна, и клетки секретируют в среду большое количество вещества, часть которого прилипает к поверхности предметного стекла, в результате чего на некоторых изображениях образуется фон. Тем не менее, данные четко демонстрировали интернализованный PrS через 5 минут после добавления и аннексин на поверхности. TSC также окрашивали и визуализировали аналогично МСК. Наблюдения также подтверждают интернализацию в эти клетки, которая также происходила в течение 5 минут после добавления белка. Результаты показаны на . TSC морфологически достаточно вариабельны и могут быть многоядерными в отсутствие дифференцировки, как видно на рисунке. Как и в случае с МСК, эти первичные клетки выделяют в среду большое количество вещества, некоторую часть которого авторы изобретения определили как внеклеточные везикулы (предыдущие данные). Этот материал также затруднял визуализацию. Некоторые EV окрашивались аннексином, а не PrS, и это явление можно наблюдать в TSC на . На этом изображении кластера TSC везикулы, выделяемые клетками, окрашены аннексином, а не PrS, который интернализовался. Эти закономерности поднимают интересные вопросы, касающиеся специфичности и мишеней связывания PrS и аннексина. Считается, что оба эти белка связывают PS. Тем не менее, дифференциальное связывание с EV, а также различная картина субклеточной локализации указывает, что их механизмы связывания не являются полностью одинаковыми. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить основу этого различия, которое может иметь важное значение. Кроме того, наблюдали окрашивание PrS линии нейрональных клеток-предшественников C17.2 (), которая представляет собой трансформированную линию клеток, способную дифференцироваться in vitro в астроциты и другие нейрональные клетки. Примерно 5% этих трансформированных клеток окрашивались, хотя это процентное значение является оценочным. Примечательно, что проникновение в TSC происходило даже при охлаждении клеток до 4 °C (). Вместе с тем следует отметить, что камеру было невозможно постоянно охлаждать после размещения на микроскопе. Тем не менее, температура не могла сильно повыситься за 5 минут процедуры визуализации. Хотя этот результат является интересным, он нуждается в явном воспроизведении в более контролируемых условиях. Если этот результат будет подтвержден, механизм действительно должен быть весьма интересным.
фиг. 21
фиг. 22
фиг. 23
Авторам изобретения удалось окрасить гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) PrS. Используя проточную цитометрию, авторы изобретения определили, что ГСК окрашивались PrS, и наблюдали интернализацию PrS в этих клетках с помощью конфокальной микроскопии. ГСК идентифицировали и выделяли с использованием сортировки клеток с флуоресцентной активацией (FACS). Клетки идентифицировали в костном мозге как отрицательные по маркерам ростка SCA/c-kit-положительные клетки (). Затем их окрашивали FITC-PrS. По картине окрашивания маркером SLAM можно выявить две популяции ГСК - коротко- и долгоживущие. Маркеры SLAM (сигнальная молекула активации лимфоцитов) CD48, CD150, CD229 и CD244 дифференциально окрашивали ГСК с получением различной картины, так что положительное окрашивание SLAM по определенному шаблону свидетельствует о способности как самообновляться, так и дифференцироваться, тогда как ГСК, отрицательно окрашивающиеся по шаблону SLAM, могли только дифференцироваться. PrS окрашивал субпопуляцию долгоживущих ГСК ( ), а также короткоживущих ГСК (). Клетки демонстрировали отрицательное окрашивание иодидом пропидия (PI), что означает, что все они являются живыми клетками. Этот результат подтверждает предыдущие эксперименты, демонстрирующие, что субпопуляция стволовых клеток окрашивалась PrS без индукции апоптоза.
фиг. 24
фигуре 25
Затем приступили к тестированию интернализации PrS в ГСК. Этот эксперимент был осложнен многими факторами. Пожалуй, самым сложным было выживание ГСК в культуре, которые в больших количествах погибали в среде в течение ночи. Поэтому пришлось рассчитать время эксперимента таким образом, чтобы выполнить анализ с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии в один и тот же день. Кроме того, клетки являлись неадгезивными, что затрудняло микроскопию. Для повышения эффективности микроскопии клетки ресуспендировали в небольшой капле среды. Наконец, нужно было убедиться, что окрашенные PrS клетки, проанализированные путем микроскопии, сохраняли жизнеспособность. Многие ГСК погибали во время анализа и выделения. Поэтому в дополнение к ядерному красителю Hoescht добавляли PI и выполняли сканирование, используя другой канал. Наличие PI-светлых ядер указывало на мертвые клетки. Несмотря на эти трудности и сложности с временными рамками, авторы изобретения смогли выполнить эксперимент и подтвердили интернализацию PrS в живых ГСК (). Жизнеспособность клеток подтверждали по отсутствию окрашивания ядер PI. Вместе с тем, некоторые клетки были мертвы или умирали, как показано на . Несмотря на сложность и продолжительность показанного эксперимента, результаты демонстрировали наличие интернализации.
фигуре 26
Наконец, на  показаны предварительные исследования токсичности на TSC; установлено, что через 30 минут при концентрации 135 мкг/мл жизнеспособность снижалась лишь в минимальной степени (с 78% до 74%) по сравнению с PBS. Учитывая, что на этом уровне 10% объема культуры составлял PrS-содержащий раствор, этот результат подтвердил качественные выводы о том, что PrS в основном нетоксичен для стволовых клеток, и наблюдаемая незначительная токсичность вполне может быть связана с загрязнением самого препарата. Более низкие концентрации PrS не влияли на жизнеспособность. Самый высокий уровень протестированного белка более чем в 1000 раз превышал концентрацию, используемую для окрашивания. Хотя полные исследования токсичности, которые формально не являлись частью этого проекта, потребуют гораздо более обширных испытаний, в данных экспериментах PrS проявлял очень небольшую токсичность.
Сводная информация
фигурах 3
7,
[0275] Приведенные выше результаты показали, что PrS быстро интернализовался рядом клеток, экспрессирующих PrS, в том числе стволовыми клетками многих видов, что указывает на уникальные характеристики PrS, поддающиеся манипулированию с целью разработки терапевтического агента. Кроме того, различие в специфичности PrS и аннексина, например, продемонстрированное на  и  указывает на различия в механизме связывания этих двух белков. Тот факт, что аннексин является тетрамером, а PrS - мономером, не может объяснить эти различия, и эти данные указывают, что в связывании PrS может участвовать какой-то другой компонент на клеточной поверхности. Механизм связывания, специфичность и интернализация PrS, а также возможность модульных манипуляций обеспечивают множество возможностей.
ПРИМЕР 2
[0276] Стволовые клетки отличаются по фенотипу от дифференцированных клеток и могут экспрессировать PS без апоптоза, избегая индукции иммунного ответа. Стволовые клетки окрашивали молекулой, несущей GLA-домен согласно настоящему изобретению и содержащей флуоресцентную метку в качестве полезной нагрузки, без индукции апоптоза.
(фиг. 14)
in vivo
in vitro
[0277] Трофобластные стволовые клетки , дифференцирующиеся в несколько видов клеток трофобласта в плаценте, окрашивались белком S, тогда как дифференцированные трофобласты, полученные из этих клеток в культуре, не окрашивались им. Это окрашивание позволяло различать стволовые клетки, дифференцированные , и клетки, дифференцированные .
in vivo
ex vivo
[0278] Указанные молекулы согласно настоящему изобретению можно применять для адресного воздействия на клетки  или в образцах .
Выводы
[0279] Внеклеточные везикулы представляют собой прекрасную возможность для диагностики и лечения множества заболеваний. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что Gla-домен распознает экспрессию фосфатидилсерина. Это свойство можно использовать для: выявления внеклеточных везикул, экспрессирующих фосфатидилсерин, выделения внеклеточных везикул, адресного воздействия на внеклеточные везикулы и/или загрузки везикул, например, терапевтическими материалами. Эти результаты являются неожиданными, поскольку внеклеточные везикулы представляют собой мелкие субклеточные объекты.
Библиография
Estimates of US influenza-associated deaths made using four different methods.
3
1. Thompson, W.W., et al.,  Influenza Other Respir Viruses, 2009. (1): p. 37-49.
Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis.
12
2. Osterholm, M.T., et al.,  Lancet Infect Dis, 2012. (1): p. 36-44.
Emergence of oseltamivir resistance: control and management of influenza before, during and after the pandemic.
13
3. Dixit, R., et al.,  Infect Disord Drug Targets, 2013. (1): p. 34-45.
Oseltamivir for influenza in adults and children: systematic review of clinical study reports and summary of regulatory comments.
348
4. Jefferson, T., et al.,  BMJ, 2014. : p. g2545.
Delivery is key: lessons learnt from developing splice-switching antisense therapies.
9
5. Godfrey, C., et al.,  EMBO Mol Med, 2017. (5): p. 545-557.
Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.
9
6. Kaczmarek, J.C., P.S. Kowalski, and D.G. Anderson,  Genome Med, 2017. (1): p. 60.
Non-coding RNAs: Therapeutic Strategies and Delivery Systems.
937
7. Ling, H.,  Adv Exp Med Biol, 2016. : p. 229-37.
Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.
14
8. Poon, I.K., et al.,  Nat Rev Immunol, 2014. (3): p. 166-80.
Phosphatidylserine is a global immunosuppressive signal in efferocytosis, infectious disease, and cancer.
23
9. Birge, R.B., et al.,  Cell Death Differ, 2016. (6): p. 962-78.
Viral apoptotic mimicry.
13
10. Amara, A. and J. Mercer,  Nat Rev Microbiol, 2015. (8): p. 461-9.
Phosphatidylserine receptors: enhancers of enveloped virus entry and infection.
468-470
11. Moller-Tank, S. and W. Maury,  Virology, 2014. : p. 565-80.
MEK inhibition impairs influenza B virus propagation without emergence of resistant variants.
561
12. Ludwig, S., et al.,  FEBS Lett, 2004. (1-3): p. 37-43.
Detection of phosphatidylserine-positive exosomes for the diagnosis of early-stage malignancies.
117
13. Sharma, R., et al.,  Br J Cancer, 2017. (4): p. 545-552.
Liver-specific gamma-glutamyl carboxylase-deficient mice display bleeding diathesis and short life span.
9
14. Azuma, K., et al.,  PLoS One, 2014. (2): p. e88643.
Factor VIIa binding and internalization in hepatocytes.
3
15. Hjortoe, G., et al.,  J Thromb Haemost, 2005. (10): p. 2264-73.
Host gene targets for novel influenza therapies elucidated by high-throughput RNA interference screens.
26
16. Meliopoulos, V.A., et al.,  FASEB J, 2012. (4): p. 1372-86.
Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the Raf/MEK/ERK signalling cascade.
3
17. Pleschka, S., et al.,  Nat Cell Biol, 2001. (3): p. 301-5.
Human microRNAs profiling in response to influenza A viruses (subtypes pH1N1, H3N2, and H5N1).
241
18. Makkoch, J., et al.,  Exp Biol Med (Maywood), 2016. (4): p. 409-20.
MicroRNA Regulation of Human Genes Essential for Influenza A (H7N9) Replication.
11
19. Wolf, S., et al.,  PLoS One, 2016. (5): p. e0155104.
Perspective of Use of Antiviral Peptides against Influenza Virus.
7
20. Skalickova, S., et al.,  Viruses, 2015. (10): p. 5428-42.
Sialic acid-mimic peptides as hemagglutinin inhibitors for anti-influenza therapy.
53
21. Matsubara, T., et al.,  J Med Chem, 2010. (11): p. 4441-9.
Identification of a PA-binding peptide with inhibitory activity against influenza A and B virus replication.
4
22. Wunderlich, K., et al.,  PLoS One, 2009. (10): p. e7517.
Preclinical and clinical development of siRNA-based therapeutics.
87
23. Ozcan, G., et al.,  Adv Drug Deliv Rev, 2015. : p. 108-19.
Pseudo-Ligandless Click Chemistry for Oligonucleotide Conjugation.
8
24. Mack, S., et al.,  Curr Protoc Chem Biol, 2016. (2): p. 83-95.
Click chemistry for rapid labeling and ligation of RNA.
12
25. Paredes, E. and S.R. Das,  Chembiochem, 2011. (1): p. 125-31.
Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.
26
26. Zheng, Y. and P.A. Beal,  Bioorg Med Chem Lett, 2016. (7): p. 1799-802.
Current ADC Linker Chemistry.
32
27. Jain, N., et al.,  Pharm Res, 2015. (11): p. 3526-40.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  GLAdiator BioSciences Inc
<120>  СПОСОБ АДРЕСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ЭКЗОСОМЫ
<130>  P000229_WO
<150>  US 62/584,565
<151>  10.11.2017
<150>  US 62/593,014
<151>  30.11.2017
<160>  6
<170>  Версия PatentIn 3.5
<210>  1
<211>  45
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221> разное
<222>  (6)..(7)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (14)..(14)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (16)..(16)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (19)..(20)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (25)..(26)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (29)..(29)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (32)..(32)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (36)..(36)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  1
Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa
20                  25                  30
Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu
35                  40                  45
<210>  2
<211>  46
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221> разное
<222>  (7)..(8)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (11)..(11)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (15)..(15)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (17)..(17)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (20)..(21)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (26)..(27)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (30)..(30)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (33)..(33)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (35)..(35)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (40)..(40)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  2
Ala Gly Ser Tyr Leu Leu Xaa Xaa Leu Phe Xaa Gly Asn Leu Xaa Lys
1               5                   10                  15
Xaa Cys Tyr Xaa Xaa Ile Cys Val Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe
20                  25                  30
Xaa Asn Xaa Val Val Thr Asp Xaa Phe Trp Arg Arg Tyr Lys
35                  40                  45
<210>  3
<211>  45
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221> разное
<222>  (6)..(7)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (14)..(14)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (16)..(16)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (19)..(20)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (25)..(26)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (29)..(29)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (32)..(32)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  3
Ala Asn Thr Phe Leu Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Val Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa
20                  25                  30
Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr
35                  40                  45
<210>  4
<211>  45
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221> разное
<222>  (6)..(7)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (14)..(14)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (16)..(16)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (19)..(20)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (25)..(26)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (29)..(29)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (35)..(35)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  4
Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys
20                  25                  30
Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser
35                  40                  45
<210>  5
<211>  45
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221> разное
<222>  (6)..(7)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (14)..(14)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (16)..(16)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (19)..(20)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (25)..(26)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (29)..(29)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (32)..(32)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (35)..(35)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  5
Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gln Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Xaa
20                  25                  30
Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser
35                  40                  45
<210>  6
<211>  250
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221> разное
<222>  (6)..(7)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (14)..(14)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (16)..(16)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (19)..(20)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (25)..(26)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (29)..(29)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (32)..(32)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221> разное
<222>  (36)..(36)
<223>  X - остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  6
Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa
20                  25                  30
Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Val Cys Leu
35                  40                  45
Arg Ser Phe Gln Thr Gly Leu Phe Thr Ala Ala Arg Gln Ser Thr Asn
50                  55                  60
Ala Tyr Pro Asp Leu Arg Ser Cys Val Asn Ala Ile Pro Asp Gln Cys
65                  70                  75                  80
Ser Pro Leu Pro Cys Asn Glu Asp Gly Tyr Met Ser Cys Lys Asp Gly
85                  90                  95
Lys Ala Ser Phe Thr Cys Thr Cys Lys Pro Gly Trp Gln Gly Glu Lys
100                 105                 110
Cys Glu Phe Asp Ile Asn Glu Cys Lys Asp Pro Ser Asn Ile Asn Gly
115                 120                 125
Gly Cys Ser Gln Ile Cys Asp Asn Thr Pro Gly Ser Tyr His Cys Ser
130                 135                 140
Cys Lys Asn Gly Phe Val Met Leu Ser Asn Lys Lys Asp Cys Lys Asp
145                 150                 155                 160
Val Asp Glu Cys Ser Leu Lys Pro Ser Ile Cys Gly Thr Ala Val Cys
165                 170                 175
Lys Asn Ile Pro Gly Asp Phe Glu Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Arg
180                 185                 190
Tyr Asn Leu Lys Ser Lys Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu
195                 200                 205
Asn Met Cys Ala Gln Leu Cys Val Asn Tyr Pro Gly Gly Tyr Thr Cys
210                 215                 220
Tyr Cys Asp Gly Lys Lys Gly Phe Lys Leu Ala Gln Asp Gln Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Glu Ser Arg His His His His His His
245                 250
<---