ТЕХНОЛОГИЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМЫ С СОХРАНЕНИЕМ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ФАКТОРОВ TGF PDGF VEGF
TECHNIQUE OF PLATELET-RICH PLASMA LYOPHILISATION WITH PRESERVING TGF PDGF VEGF FACTOR VIABILITY

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, позволяет изготовлять биологически активный препарат из аутокрови для ускорения процессов регенерации тканей организма.
Известна технология приготовления и использования богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) для стимуляции процессов регенерации живых тканей (Robert E. Marx Platelet-reach plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? // Implant dentistry, Vol.10 No.4 2001). БоТП получают путем центрифугирования цельной крови с последующим отбором слоя плазмы над отсепарованными эритроцитами с концентрацией тромбоцитов не менее 1 млн/мкл.
Известны факторы роста - полипептиды с молекулярной массой 5-50 кДа, обладающие широким спектром биологического действия. Факторы роста, как правило, продуцируются неспециализированными клетками, в том числе тромбоцитами. К ним относятся трансформирующий фактор роста (TGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF). TGF подавляет синтез воспалительных цитокинов, усиливает синтез белков межклеточного матрикса, способствует заживлению ран, оказывает анаболическое действие, стимулирует фибробласты, развитие эндотелия, участвует в регуляции пролиферации клеток. PDGF участвует в регуляции процессов острого воспаления, заживления ран и образования рубца (найдено: http://laboratory.rusmedserv.com/files/39_Faktory_Rosta.pdf).
В доступной литературе обсуждается вопрос об активности этих факторов в живых тканях или сразу после выделения их из клеток и/или тканей, но не обнаружено сведений о сохранении активности после замораживания и последующего высушивания сыворотки крови.
Известен препарат, представляющий собой концентрат тромбоцитов факторов роста и способ их приготовления (WO/2009/087560 от 16.07.2009; PCT/IB2009/000013 GWO REI). Препарат предназначен для терапевтического и/или косметического применения, содержит факторы роста PDGF, TGF-β, IGF, EGF, CTGF, bFGF и VEGF. Способ получения концентрата тромбоцитов факторов роста в соответствии с изобретением включает в себя стадии контактирования концентрата тромбоцитов с растворителем и/или поверхностно активными веществами, инкубирование тромбоцитов с растворителем и/или поверхностно активными веществами на срок не менее 5 минут до 6 часов. При этом кислотность (рН) поддерживается в диапазоне от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, и при температуре в диапазоне от 2°С до 50°С, предпочтительно в диапазоне от 25°С до 45°С.
Недостатки способа: для получения факторов роста необходимо использование других активных веществ, не желательных для введения в организм пациента, способных вызвать аллергические реакции. Нет сведений о возможности длительного хранения полученных по такой технологии факторов роста PDGF, TGF-β, IGF, EGF, CTGF, bFGF и VEGF.
Известна заявка JP 2011120763 «MATERIAL FOR REGENERATION TREATMENT» 23.06.2011; A61L 15/16; 2009281382. Разработка направлена на получение материалов для регенерации тканей, использующих богатую тромбоцитами плазму и не требующих подготовки перед использованием или криоконсервации. Материал для регенерации лечения содержит богатую тромбоцитами плазму, замороженную и высушенную. Материал наносят на твердые поверхности инструментов, предназначенных для остеосинтеза, используют после хранения в холодильной камере по крайней мере, в течение одного дня, замораживания и высушивания. Материал для регенерации может быть использован после того, как обогащенная тромбоцитами плазма хранилась в холодильнике, по крайней мере тридцать дней, после замораживания и высушивания. Инструменты для остеосинтеза могут быть выбраны из группы текстильных изделий, пористых материалов, сыпучих материалов, пены. Для моделирования конструкций сплошной поддержки возможно изготовление из биоразлагаемых материалов, покрытых лигандом клеточного субстрата рецепторов адгезии перед нанесением богатой тромбоцитами плазмы.
Недостатки способа: нет сведений о степени сохранности факторов роста после замораживания и высушивания богатой тромбоцитами плазмы.
Технический результат: разработка технологии лиофилизации обогащенной тромбоцитами плазмы, позволяющей сохранить жизнеспособность таких факторов, как TGF PDGF VEGF. Отличительная особенность технологии - отсутствие воздействия химических агентов для высвобождения факторов роста из тромбоцитов,
Для осуществления методики производят забор цельной крови в количестве примерно в три раза большем, чем диагностированный объективными методами объем дефекта живой ткани. В стерильные пробирки с соблюдением правил асептики набирают кровь, предварительно добавив антикоагулянт, например, цитрат натрия, гепарин или любой другой. После заполнения пробирки кровью ее закрывают стерильной пробкой и тщательно, плавно, несколько раз переворачивают для перемешивания антикоагулянта и крови. Далее кровь подвергают центрифугированию со скоростью 1000-1200 оборотов в минуту как минимум три минуты в условиях гипотермии в диапазоне температур от 0C° до 6C°. В стерильных условиях производят отбор среднего слоя плазмы таким образом, чтобы исключить попадание эритроцитов. Полученные в результате центрифугирования тромбоцитарный концентрат представляет собой вязкую жидкость соломенно-желтого цвета с содержанием тромбоцитов около 800 тысяч в микролитре. Далее концентрат замораживают в холодильной камере при температуре ниже, чем минус 1C°.
Замороженный тромбоцитарный концентрат подвергают высушиванию в течении как минимум трех минут в диапазоне температур от 2C° до 52C°. Полученный в результате высушивания лиофилизат помещают в герметичный контейнер, хранят в сухих условиях. Перед применением лиофилизат подвергают стерилизации, например, озонированию или облучению гамма-лучами.
Перед непосредственным применением стерильному лиофилизату придают форму соответствующую дефекту ткани, в случае, если замещению подлежит костная ткань, либо наносят на повязку для наложения на раны на поверхности тела, либо на металлоконструкции, предназначенные для остеосинтеза или другие вспомогательные конструкции и материалы, предназначенные для регенерации тканей. Возможен вариант разведения в растворах, предназначенных для растворения лекарственных средств с целью инъекционного введения, например, в физиологическом растворе натрия хлорида, новокаине. Полученный раствор вводят в зону с дефицитом регенеративных процессов костной ткани.
Способ апробирован с использованием девяти образцов донорской крови, взятой у трех практически здоровых доноров, трех пациентов ожогового отделения с термическим ожогом не менее 23% поверхности тела; трех пациентов реанимационного отделения с множественными повреждениями опорно-двигательного аппарата в результате дорожно-транспортного происшествия (ДТП). Результаты представлены в таблице.
Таблица
Протокол оценки содержания факторов роста в лиофилизате богатой тромбоцитами плазмы
Состояние пациента
Содержание факторов роста
TGF
PDGF
VEGF
Практически здоров
1,386894
1,37987
1,934476
Практически здоров
2,694681
0,649351
2,418347
Практически здоров
1,451694
0,844156
1,952621
Ожог 38% поверхности тела
4,373597
3,766234
3,761089
Ожог 33% поверхности тела
2,229298
1,477273
2,977823
Ожог 29% поверхности тела
3,301447
2,621753
3,369456
Множественные повреждения (ДТП)
1,61075
0,381494
2,599798
Множественные повреждения (ДТП)
1,098238
0,698052
2,642137
Множественные повреждения (ДТП)
1,354494
0,539773
2,620968
Приготовленный по нашей технологии лиофилизат богатой тромбоцитами плазмы был использован в виде аппликаций в повязках для лечения дефектов кожных тканей и виде инъекций в места переломов костей в сроки от двух недель до полутора месяцев с момента забора крови. С каждым пациентом и его родственниками предварительно проведена беседа о сути метода, заключен договор об информированном согласии. Заживление ран наступило быстрее, чем предусмотрено контрольными сроками для такого объема и вида повреждений тканей.
Предложенная нами технология приготовления лиофилизата тромбоцитарных факторов роста позволяет получить новый, не известный из уровня техники эффект: сохранение жизнеспособности факторов роста TGF, PDGF, VEGF полученных их богатой тромбоцитами плазмы в течение как минимум полутора месяцев с момента забора крови у пациента.