СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА
METHOD OF INCREASING ANTIBACTERIAL PROPERTIES OF SILVER NANOPARTICLES

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, фармацевтической промышленности, сельском хозяйству, рыбоводству и другим областям техники.
Способ представляет собой модель подготовки наночастиц-металлов при создании антисептических и бактерицидных препаратов на водной основе для повышения их антибактериальных свойств.
Внедрение нанотехнологий в различные области науки обусловлено их уникальными свойствами в отношении биологических объектов. Наночастицы, в частности наночастицы металлов и их соединений, в настоящее время нашли широкое применение в различных сферах деятельности, в том числе в биологии и медицине в качестве альтернативных антибактериальных препаратов [1-3]. В частности, наночастицы серебра характеризуются высокой антибактериальной активностью в отношении широкого ряда бактерий, в том числе возбудителей заболеваний человека и животных [4, 5]. Показан высокий бактерицидный эффект наночастиц серебра в отношении таких бактерий как: Bacillus cereus, Candida tropicalis, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas salmonicida и др., а также в отношении штаммов Staphylococcus aureus и Escherichia coli с множественной лекарственной устойчивостью (или мультирезистентных штаммов Staphylococcus aureus и Escherichia coli) [6-8].
В этой связи определенный интерес представляют исследования, направленные на повышение антибактериальных свойств наночастиц серебра.
Согласно литературным данным, бактерицидность наночастиц для живых систем зависит от многих параметров [9, 10]. Одним из направлений в вопросе совершенствования физико-химических свойств препаратов наночастиц металлов является уточнение размера наночастиц вещества. Установлены различия в биологических свойствах препаратов содержащих высокодисперсные частицы разного размера, уменьшение их размера повышает биодоступность, чем способствует более интенсивному проявлению бактерицидных свойств [11, 12]. В том числе и для наночастиц серебра было отмечено, что уменьшение размера частиц с 60 до 9 нм приводит к их увеличению антибактериального эффекта в отношении живых систем [13, 14].
Однако данный способ повышения интенсивности антибактериального воздействия наночастиц серебра на клетки микроорганизмов является трудоемким и требует повторного синтеза частиц.
В связи с этим альтернативным решением и целью нашей работы является создание препаратов наночастиц серебра предлагаемым размером 70,5 нм с улучшенными антибактериальными свойствами посредством их фотоактивация обработкой УФ-излучением. Известно, что воздействие ультрафиолета на ряд наночастиц металлов способно приводить к изменению их биологической активности [15, 16].
Задача исследования заключалась в определении оптимального временного режима УФ-обработки, позволяющего получить препарат наночастиц серебра с улучшенными антибактериальными свойствами.
Материалы и методы
Физико-химическая характеристика наночастиц серебра
Наночастицы серебра (70±0,5 нм), которые использовались в данном исследовании, были синтезированы в центре коллективного пользования Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения «Казанский национальный исследовательский университет им. А.Н. Туполева» (табл. 1).
Для проведения исследования по измерению размеров агрегатов наночастиц методом динамического рассеивания света на аналитических весах приготавливали навески наночастиц и суспендировали их в дистиллированной воде в ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т (Россия), при условиях f-35 кГц, N-300 Вт, А-10 мкА, в течение 30 мин. Суспензии выдерживались при комнатной температуре в течении 10 минут для стабилизации наночастиц в растворе, после чего проводили измерения среднего гидродинамического размера частиц на анализаторе наночастиц Photocor Compact («Фотокор», Россия). Определялось распределение частиц по размерам, среднее значение радиуса частиц и дзета-потенциал.
Для визуализации наночастиц использовали атомно-силовой микроскоп Certus Light (Nanoscan technology, Россия) экипированный кантилеверами NSG 10 с жесткостью балки 37,6 N/m и радиусом зонда <10 нм (Tips Nano, Estonia). Сканирование проводили в воздушной среде в режиме прерывистого контакта.
Подготовка штаммов
В качестве объекта исследования был использован штамм Е. coli К12 MG1655 (pXen7) на основе родительских клеток, который трансформирован плазмидой pXen7c конститутивным типом свечения. Она позволяет оценить токсическое влияние вещества по характеру биолюминесценции.
Методика биолюминесцентного анализа
Используемый штамм культивировали в течение суток на LB-arape (по Мюллеру) при 37°С, при этом в среду добавляли 100 мкг/мл ампициллина, который являлся селективным фактором. Далее клетки суспендировали в 0,9%-ном растворе NaCl до оптической плотности 0,5 отн. ед. при 450 нм, при этом измерения проводили в пластиковых прозрачных лунках на спектрофотометре StatFax 303+ ("Awareness", USA).
-4
Для изучения эффектов НЧ серебра при экспозиции УФ-светом в белых непрозрачных лунках планшета готовили разведения анализируемых веществ в конечной концентрации от 1М до 2.4*10 М в объеме 50 мкл. После этого разведения НЧ Ag были подвержены УФ-облучению с временными интервалами 0, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут. Для этих целей использовалась система УФ-дозирования «Bio-Link» (Viber), состоящая из 5 ламп по 8 Вт с длиной волны 254 nm.
Далее в опытные лунки вносили по 50 мкл бактериальной суспензии, после чего ко всем пробам добавляли по 100 мкл LB-бульона. В контрольные лунки вместо наночастиц вносили 50 мкл деионизированной воды.
После этого, планшет помещали в измерительный блок люминометра Infinite 200 (TECAN, Austria). Измерение проводили в кинетическом режиме в течение 120 минут. Эксперименты выполнены не менее чем в трех повторностях.
Полученные результаты первично обрабатывали с использованием программного обеспечения планшетного люминометра Magellan™, дальнейшую обработку полученных данных осуществляли с помощью компьютерной программы «Excel 2010» (Microsoft Inc.).
Расчет индекса ингибирования люминесценции проводили по следующему алгоритму [17].
где  - индекс свечения в опытной пробе на 120 минуте проведения эксперимента, (отн. ед);
- индекс свечения в опытной пробе на 0 минуте проведения эксперимента, (отн. ед);
- индекс свечения в контрольной пробе на 120 минуте проведения эксперимента, (отн. ед);
- индекс свечения в контрольной пробе на 0 минуте проведения эксперимента, (отн. ед).
Методика оценки бактерицидного действия
Для оценки бактерицидного действия применяли метод серийных разведений с последующим измерением плотности и определение динамики гибели микроорганизмов в среде с веществами. Для этого аналогично методике био-люминесцентного анализа культивировали используемые штаммы в течение 24 часов на LB-arape (по Мюллеру) при 37°С, с добавлением факторов селективности - 100 мкг/мл ампициллина. Далее клетки суспендировали в физиологическом растворе (0,9%-ном NaCl) до оптической плотности 0,5 отн. ед. при 450 нм, измерения проводили в пластиковых прозрачных лунках на фотометре StatFax 303+ («Awareness», США).
Затем параллельно готовили разведения НЧ Ag в прозрачных лунках планшета в объеме 50 мкл, подвергали УФ-облучению. В контрольные лунки добавляли 50 мкл воды, далее во все лунки планшета вносили по 50 мкл бактериальной суспензии и по 100 мкл LB-бульона. После проводили измерение оптической плотности при 630 нм на фотометре StatFax 303+ («Awareness», США). Затем инкубировали в термостате при 37°С в течение 120 минут, после чего вновь измеряли оптическую плотность при тех же условиях.
Статистическая обработка
Все эксперименты проводились в 3 повторностях. Результаты были обработаны с использование методов вариационной статистики с использованием программного обеспечения Statistica V10 (StatSoft Inc., USA).
При обработке результатов рассчитывали стандартную отклонения (Sx) и ошибку среднего значения (S).
Результаты биолюминесцентного тестирования
Перед оценкой влияния УФ-облучения на биологическую активность наночастиц серебра было проведено исследование, показывающее исходные свойства исследуемого вещества. Так, анализ результатов биолюминесцентного тестирования показал наличие токсичного действия НЧ Ag на клетки Е. coli K12 MG1655 pACXen. Высокие концентрации анализируемого вещества вызывали ингибирование свечения биосенсора с первых минут контакта (0.1-0.0025 М) и на протяжении всего периода. Это подтверждает высокую токсичность данного диапазона концентраций. Дальнейшие разведения исследуемого вещества не показали негативного действия и соответствовали фоновому свечению исследуемого штамма, а через 15 мин вызывали индукцию свечения, что может свидетельствовать об отсутствии отрицательного эффекта.
Результаты расчета «доза-эффект» показали, что параметр ЕС50, для которого характерно гибель 50% клеток микроорганизмов, соответствует концентрации 0.005 М. Максимальное подавление свечения зафиксировано при 0,1 М.
На втором этапе исследования было оценено влияние различного времени облучения УФ-светом (1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 минут) на биологическую активность наночастиц серебра по отношению к исследуемому штамму. Зависимость индекса нормализованной люминисценции от концентрации наночастиц серебра в различное время облучения УФ-светом представлена на фигуре 1.
Анализ результатов показал неоднозначную картину увеличения токсических эффектов по отношению к исследуемому штамму в зависимости от времени УФ-облучения. Так, при 1-5 минут УФ-облучения наблюдается увеличение бактерицидного действия по сравнению с образцами, не подвергавшимися воздействию этого физического фактора. При этом разница составила при высоких концентрациях (0,1-0,005 М) более 50%, при снижении концентраций - более 80%. Следует отметить, что высокие концентрации вещества (от 0,1 М до 0,005 М) до и после облучения одинаково летальны для тест-штамм, однако облученным наночастицам требуется более короткий временной период для формирования бактерицидного эффекта. В тоже время при снижении концентрации происходит снижение бактерицидный эффекта не облученных наночастиц, тогда как при воздействии УФ-облучением на наночастицы в течении 1, 2 и 5 мин снижения не наблюдалось.
10, 15 и 20 минут УФ-облучения анализируемого вещества не продемонстрировали ярко выраженного эффекта, уровень люминесценции незначительно отличался от контрольного образца (0 мин УФ). При этом, сравнение периодов экспозиции между собой также не выявили разницы. Так, при концентрациях от 0,1 М до 0,005М свечение биосенсора снизилось в среднем на 14,8% после облучения в вышеописанных диапозонах, при концентрациях от 0.0025 М до 0,0012 М уровень биолюминесценции соответствовал контрольному свечению. В диапозоне концентраций от 0,0006 М до 0,000025 М наблюдается незначительное ингибирование биолюминесценции порядка 25% в сравнении с контролем.
При увеличении воздействия УФ-излучением до 25 и 30 минут наблюдается снижение токсического эффекта в сравнении с образцами до облучения. Следует отметить, что снижение антибактриального действия наблюдается уже при начальных концентрациях вещества. Так, повышение уровня биолюминесценции по сравнению с образцами без УФ действия до 23% зафиксировано при концентрации 0,1 М, при уменьшении концентрации наблюдается снижение бактерицидного действия исследуемого вещества, а разница составила уже более 60% от контрольного уровня.
Результаты оценки выживаемости тест-штамма при действии НЧ серебра
С целью сравнения результатов воздействия исследуемого вещества на свечение штаммов на основе Е. coli K12 MG1655 pACXen с их выживаемостью было изучено влияние НЧ Ag с различным временем воздействия УФ-излучения на рост микроорганизмов. Данные оценки выживаемости подтверждают результаты биолюминесцентного тестирования (Таблица 2).
Так, количество живых клеток, контактирующих с наночастицами серебра до облучения, находилось в диапазоне от 11,2% при высоких концентрациях и до 90,4%- при минимальных в сравнении с контролем. Следует отметить, что значение параметра ЕС 50 соответствует концентрации 0.005 М. Небольшие периоды воздействия физического фактора (1, 2, 5 минут) подавляли жизнеспособность и рост микробных клеток на протяжении всего инкубационного периода. При оценке результатов было установлено, что при максимальной концентрации наночастиц серебра количество выживших клеток составляло 0-4%, а при минимальной - 36%. Следует отметить, что количество выживших щеток увеличивается с увеличением времени воздействия. Максимальные значения выживаемости достигаются при 25-30 минутах УФ-облучения. По сравнению с контролем, этот показатель увеличивается на 37% и 45,5% при 25 и 30 минутах соответственно. При этом, увеличение числа клеток наблюдается во всем диапазоне концентраций по сравнению с другими минутами облучения.
Таким образом, в результате исследования было установлено, что для достижения лучшего антибактериального эффекта наночастиц серебра рекомендуется использовать в качестве дополнительного фактора УФ-излучение (система УФ-дозирования «Bio-Link», 40 Вт, λ=254 нм), при этом наиболее оптимальным является диапазон от 1-5 минут воздействия.
Список литературы
1. Патент РФ №2542280. Способ получения пленок с наноструктурным серебром / О.А. Баранова, П.М. Пахомов. - Опубл. 20.02.2015. Бюлл. 5.;.
2. М.В. Самсонова. Наномедицина: современные подходы к диагностике и лечению заболеваний, вопросы безопасности // Пульмонология. 2008. №5. С. 5-13.
3. Dogra V, Kaur G, Kaur A, Kumar R, Kumar S. In vitro assessment of antimicrobial and genotoxic effect of metallosurfactant based nickel hydroxide nanoparticles against Escherichia coli and its genomic DNA. Colloids Surf В Biointerfaces. 2018. 170:99-108. doi: 10.1016/j.colsurfb. 2018.05.069.
4. М.Г. Григорьев, Л.Н. Бабич. Использование наночастиц серебра против социально значимых заболеваний // Молодой ученый. 2015. №9. С. 396-401.
5. Khatami М, Zafarnia N, Heydarpoor Bami М, Sharifi I, Singh H Antifungal and antibacterial activity of densely dispersed silver nanospheres with homogeneity size which synthesized using chicory: An in vitro study. J Mycol Med. 2018. pii: SI 156-5233(18)30054-4. doi: 10.1016/j.mycmed. 2018.07.007.
6. Singh H, Du J, Singh P,Yi TH. Extracellular synthesis of silver nanoparticles by Pseudomonas sp.THG-LS1.4 and their antimicrobial application. JPharm Anal. 2018. 8(4):258-264. doi: 10.1016/j.jpha.2018.04.004.
7. El-Sayed ASA, Ali D. Biosynthesis and comparative bactericidal activity of silver nanoparticles synthesized by Aspergillus flavus and Penicillium crustosum against the multidrug-resistant bacteria. J Microbiol Biotechnol. 2018. doi: 10.4014/jmb.l806.05089.
8. Shaalan M, El-Mahdy M, Theiner S, Dinhopl N, El-Matbouli M, Saleh M. Silver nanoparticles: Their role as antibacterial agent against Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Res Vet Sci. 2018. 119:196-204. doi: 10.1016/j.rvsc.2018.06.019.
9. De Stefano D., Carnuccio R., Maiuri M.C. Nanomaterials toxicity and cell death modalities. Journal of drug delivery. 2012; 167896: 1-10.
10. Суетина И.А., Мезенцева M.B., Гущина E.A., Лисицин Ф.А., Руссу Л.И., Лопатина О.А. и др. Влияние наночастиц металлов на жизнеспособность и морфофункциональные характеристики культивируемых клеток человека и животных. Клеточные культуры. 2016; 32: 43-53.
11. Hillyer JF, Albrecht RM. Gastrointestinal persorption and tissue distribution of differently sized colloidal gold nanoparticles. J Pharm Sci 2001. 90:1927-1936. Doi: 10.1002/jps.ll43.
12. Hadrup N, Loeschner K, Bergstrom A, Wilcks A, Gao X, Vogel U, Frandsen HL, Larsen EH, Lam HR, Mortensen A. Subacute oral toxicity investigation of nanoparticulate and ionic silver in rats. Arch Toxicol 2012. 86:543-51. https://doi.Org/10.1007/s00204-011 -0759-1.
13. Л.С. Сосенкова, E.M. Егорова. Наночастицы серебра малого размера для исследований биологических эффектов // Журнал физической химии. 2011. Т. 85. №2. С. 1-10.
14. Lok С., Но С., Chen R. et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities // J. Biological Inorg. Chem. 2007. Vol. 12, N 4. P. 527-534.
15. Kansal, S.K., Singh, M., Sudo, D. Studies on TiO2/ZnO photocatalysed degradation of lignin. J Hazard Mater. 2008. 153:412-417.
16. Han, O.B., Louis, K.M., Yang, S.P., Pedersen, J.A., Hamers, R.J., Peterson, R.E., Heideman, W. Titanium dioxide nanoparticles produce phototoxicity in the developing zebrafish. Nanotoxicology. 2012. 6(6):670-679.
17. Дерябин Д.Г., Алешина E.C., Дерябина Т.Д., Ефремова Л.В., 2011. Биологическая активность ионов, нано- и микрочастиц Cu и Fe в тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химий. №6. С. 31-36.).