Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью
AGENT HAVING IMMUNOMODULATORY ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений иммунной системы при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).
Антигенпрезентирующие клетки, прежде всего макрофаги, принадлежат к системе врожденного иммунитета и играют ключевую роль в защите организма от патогенов. Активированные макрофаги имеют два разных фенотипа M1 (классически активированный) и М2 (альтернативно активированный). Поляризация классически активированных провоспалительных макрофагов, обусловленная липополисахаридом (ЛПС), либо его сочетанием с Th-1 цитокинами, такими как интерферон-гамма (ИФН-γ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), характеризуется продукцией провоспалительных цитокинов, интерлейкина-1β (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-23 и фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α), реактивных форм азота и кислорода, способствует элиминации микроорганизмов и опухолевых клеток. В то время М2, которые являются противовоспалительными и иммунорегуляторными, поляризованы Th2-цитокинами (ИЛ-4 и ИЛ-13) продуцируют противовоспалительные цитокины, такие как ИЛ-10 и транформирующий фактор роста бета (ТФР-β), участвуют в реализации воспаления посредством фагоцитоза апоптотических нейтрофилов, снижают выработку провоспалительных цитокинов и усиливают синтез медиаторов, необходимых для ремоделирования тканей, ангиогенеза и заживления ран. Макрофаги обеспечивают презентацию антигенов клеткам иммунной системы, направляют поляризацию Th и поддерживают протекание Th1/Th2-зависимых реакций. При тяжелых формах воспаления макрофаги сначала проявляют фенотип M1, продуцируя провоспалительные цитокины, но, если фаза M1 затягивается и воспаление может приводить к повреждению ткани М2 начинают секретировать большое количество ИЛ-10 и ТФР-β для подавления воспаления, что способствует восстановлению тканей, ремоделированию, васкулогенезу и сохранению гомеостаза [1, 2]. Таким образом, баланс M1 (ИЛ-12 и ФНО-α) и М2 (ИЛ-10) опосредованных цитокинов является определяющим для направления поляризации иммунного ответа по Th1 или Th2 типу, а секреция антигенпрезентирующими клетками ИЛ-12 и ФНО-α необходимым условием эффективного противомикробного и противоопухолевого иммунитета [3].
Известно, что водорастворимые полисахариды, выделенные из ряда высших цветковых растений, обладают иммуномоделирующими свойствами, могут связываться практически со всеми рецепторами антигенпрезентирующих клеток, через их активацию оказывать влияние на поляризацию лимфоцитов и способствовать развитию как Th1 - так и Th2-зависимого иммунного ответа [4, 5]. Ряска многокорневая (Lemna polyrrhiza L. (синоним Многокоренник обыкновенный Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid.)) - многолетнее мелкое водное растение относится к группе растений из семейства рясковых, семейства Ароидные (Araceae), растет в застойных водоемах повсеместно в европейской части России, на Кавказе, в Сибири, на Дальнем Востоке, в Средней Азии, Китае и Японии. В народной медицине, как правило, используют, заготовленное во время цветения растение, в качестве жаропонижающего, потогонного и мочегонного средства. Полезные свойства ряски многокорневой, обусловлены высоким содержанием в листьях солей брома и йода, протеина, однако, в этой траве практически нет аскорбиновой кислоты [6].
Задачей данного изобретения является расширение арсенала эффективных иммуномодулирующих средств растительного происхождения, обладающих способностью к избирательной стимуляции продукции иммунокомпетентными клетками интерлейкина-1 бета, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и интерферона гамма.
Поставленная задача решается путем применения водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1053 кДа, 628 кДа и 35 кДа, полученных из травы водного растения ряски многокоренной (Lemna polyrrhiza L.), в качестве стимулятора продукции макрофагами ИЛ-β, ИЛ-12 и ФНО-α и лимфоцитами ИФН-γ, следствием чего является активация Th1-зависимого типа иммунного ответа.
Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства комплекса водорастворимых полисахаридов с молекулярными массами 1053 кДа, 628 кДа и 35 кДа с относительным содержанием 61,24; 5,37; и 33,39%, соответственно, выделенных из травы ряски многокоренной.
Новое свойство водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1053 кДа, 628 кДа и 35 кДа, полученных из травы ряски многокоренной, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники и описание этих свойств не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания. Водорастворимые полисахариды выделяли из травы ряски многокоренной (LP), которую заготавливали в местах естественного произрастания в середине вегетационного сезона, высушивали до воздушно-сухого состояния (влажность менее 6%). Навеску 20,0 г полученного сырья при нагревании на кипящей водяной бане экстрагировали раствором 400 мл очищенной воды и 2 мл концентрированной HCl (рН=4,0) в соотношении сырье: экстрагент - 1:20 при периодическом перемешивании в течение 3-4 ч. Образовавшийся раствор отделяли фильтрованием через многослойный тканевый фильтр, полученный фильтрат упаривали до 1/5 от исходного объема на роторном испарителе при температуре не более 50°С, добавляли трехкратный объем 96% этанола и отстаивали 24 ч при температуре 2-4°С. Затем жидкую часть отфильтровывали через бумажный фильтр и осадок растворяли в 100 мл очищенной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре. Для удаления не растворившегося остатка (мельчайшие частицы сырья, денатурированный белок и пр.) раствор центрифугировали (4000 об/мин, в течение 30 мин), центрифугат диализировали через полупроницаемую мембрану с диаметром пор 15 кДа в течение 48 ч в 50-кратном объеме очищенной воды при комнатной температуре и перемешивании на магнитной мешалке, меняя воду через 24 ч. После диализа раствор замораживали и лиофильно высушивали. Выход водорастворимых ПС из травы ряски многокоренной составлял 2,78% от массы воздушно-сухого сырья (табл. 1). Полученный образец полисахаридный комплекс был стандартизован по содержанию углеводов (спектрофотометрический метод [7]), белка (метод Брэдфорда [8]) и нуклеиновых кислот [9]
Анализ молекулярно-массового распределения ПС LP, проведенного на жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Германия, «Dionex») в колонке TSK GMPWXL 300×78 mm, 13 μm, подвижная фаза - вода, скорость потока 1 мл/мин, детектирование рефрактометрическое, температура ячейки детектора 40°С (калибровочная прямая по растворам декстранов молекулярной массой 1000, 17000, 40000, 250000, 500000, 1200000 Да при тех же условиях хроматографирования) выявил, что полученное вещество состоит из трех полисахаридов с молекулярными массами 1053 кДа, 628 кДа и 35 кДа с относительным содержанием 61,24; 5,37; и 33,39% (табл. 2).
Хроматограмма силилированного образца гидролизата ПС ряски многокоренной, разделение которого проводили на газовом хроматографе Agilent 7890А (США) в колонке 1 MS 30 м, внутренний диаметр капилляра 0,25 мкм, скорость потока газа-носителя (Не) 1 мл/мин, в градиенте температур: 70 град. - 2 минуты, далее 10 градусов в минуту (до 300 град.), температура инжектора 280 град., затем детектировали на масс-спектрометре Agilent 5975S (США), ионизация электронным ударом, сканирование m/z 33-600, температура ионного источника 120 град, показала, что полученный из травы ряски многокоренной полисахаридный комплекс является глюкоуронаном с небольшим содержанием арабинозы, галактозы и фруктозы. ПС, полученные из травы ряски многокоренной, относятся к кислым полисахаридам (содержание глюкуроновой кислоты около 30,28%), отличительным моносахаридом является арабиноза (табл. 3).
Эксперименты проведены на линейных мышах C57BL/6 в возрасте 8-10 недель, полученных из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томский НИМЦ.
6
6
6
6
2
2
Для выделения макрофагов (МФ) животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим, затем помещали в пластиковые чашки Петри (1,5-2,0×10клеток/мл), культивировали 2 ч (при 37°С в атмосфере 5% СО и абсолютной влажности) в полной культуральной среде, содержащей 10% ЭТС, после чего собирали прилипшую к пластику фракцию клеток. Спленоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе в стерильных условиях. Полученную суспензию клеток фильтровали через 4-слойный капрон, промывали холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде в экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Мононуклеары получали наслаивая цельную кровь здоровых доноров с добавлением гепарина (10 ЕД/мл) на жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich»), центрифугировали 15 минут при 400 g. Клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности, собирали, отмывали холодным ФР, ресуспендировали в полной культуральной среде, оценивали жизнеспособность. Полученные МФ (3,0×10 клеток/мл), спленоциты (2,5×10 клеток/мл) или мононуклеары (2,5-3,0×10 клеток/мл) помещали в 96-луночные планшеты и культивировали в среде, состоящей из RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyc1one»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина («Sigma»Pyn) и 2 мМ L-глютамина («Sigma») при 37°С в атмосфере с 5% СО и абсолютной влажности, в присутствии 20 мкг/мл ПС, выделенных из ряски многокоренной; 4 мкг/мл конканавалина А (Кон А); 5 мкг/мл митогена лаконоса (МЛ); 1 мкг/мл липополисахарида (ЛПС, серотип O111:В4, «Sigma»). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок, разливали на аликвоты и хранили при 20°С, твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем измеряли в нем концентрацию цитокинов мышей (ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ФНО-α, ИФН-γ («eBioscience», «InVitroGen»)) или человека (ИЛ-12, ИЛ-10 и ИФН-Y («R@D Systems»), ФНО-α, ИЛ-4 («Вектор-Бэст»)) согласно прилагаемым протоколам на автоматическом анализаторе ChemWellCombo.
8
Водорастворимые полисахариды, выделенные из ряски многокоренной, вводили мышам по 7,5 мг/кг массы тела ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней в 0,1 мл ФР (животным контрольной группы вводили 0,1 мл ФР). Th1-зависимый тип иммунного ответа у животных моделировали иммунизацией эритроцитами барана (1×10 клеток) внутрибрюшинной инъекцией в 0,1 мл ФР через 5 дней от начала введения веществ.
8
Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [10]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10 эритроцитов барана в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия). В «контрольную» контрлатеральную лапу вводили 0,05 мл стерильного ФР. Через 24 часа животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости выше пяточного сустава и ниже сочленения мало- и большеберцовой кости, взвешивали, местную воспалительную реакцию оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап.
Для оценки действия исследуемого вещества на гуморальное звено иммунитета использовали реакцию антителообразования по методу Ерне [11]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации (на пике IgM-AOK и IgG-AOK), в предварительно нагретых до 49-53°С пробирках смешивали 0,2 мл взвеси спленоцитов, полученных как описано выше, 0,9 мл среды для культивирования (0,7% агар «Difco» в среде 199), 0,2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана и 0,1 мл комплемента (ФГУП «НПО «Микроген»), полученную смесь помещали во влажную камеру Горяева, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа. Уровень гемагглютининов в сыворотке крови определяли по способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, агглютинировать эритроциты барана, используемые в качестве антигена. Для этого к 0,025 мл сыворотки крови мышей, полученной на 5-е сутки после иммунизации, прогретой для инактивации комплемента при 56°С, раститрованной в 96-луночном круглодонном планшете с шагом 1/2, добавляли 0,025 мл 1% суспензии эритроцитов барана, инкубировали при 37°С 2 часа, затем оценивали реакцию. За титр принимали последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором наблюдается агглютинация антигена. Титр выражали величиной log2 [10].
Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0. Для каждой выборки вычислялось среднее арифметическое (X), ошибка среднего арифметического (m), среднее арифметическое отклонение (σ). Проверка на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборочных средних осуществлялось по критерию Даннета для сравнения нескольких экспериментальных выборок с одной контрольной в случае нормального распределения или по критерию Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к>2) и критерия Данна в случае распределения, отличающегося от нормального.
Пример 1.
Инкубация мононуклеаров периферической крови здоровых доноров с водорастворимыми полисахаридами с молекулярной массой 1053 кДа, 628 кДа и 35 кДа, полученными из ряски многокоренной, приводила многократному усилению их Th-1 цитокин-секретирующей активности: концентрация ИЛ-12 в супернатанте клеток возрастала относительно интактного контроля в 13,4 раза, ФНО-α и ИФН-γ в 166 и 363 раза, соответственно (табл. 4). Кроме того, было показано, что на фоне ЛПС стимуляции клетки усиливали также продукцию ФНО-α, достоверно превышая в 1,2 раза значения показателя митогенстимулированного контроля. При этом ПС значительно снижали ЛПС-стимулированную продукцию ключевого Th-2 цитокина ИЛ-10 в 1,3 раза и не влияли на активированную митогеном локоноса продукцию ИЛ-4.
На модели клеток мышей показано, что водорастворимые ПС ряски многокоренной также усиливали синтез провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-12 и ФНО-α перитонеальными макрофагами и ИФН-γ лимфоцитами селезенки в 11,3, 1,5, 50 и 103,6 раза, соответственно (табл. 5). Митоген-стимулированная продукция ИФН-γ иммунокомпетентными клетками также усиливалась при инкубации с ПС в 6,5 раз. На фоне выявленного повышения концентрации Th-1 цитокинов ПС LP снижали в 2,5 раза секрецию противоспалительного ИЛ-4 на фоне стимуляции митогеном локоноса, митогенстимулированная продукция ИЛ-10 не изменялась.
Пример. 2.
Водорастворимые полисахариды, с молекулярной массой 1053 кДа, 628 кДа и 35 кДа, полученные из травы ряски многокоренной, оказывали значительное влияние на показатели гуморального и клеточного Th1-зависимого иммунного ответа. Курсовое введение ПС ряски многокоренной приводило к значительному в 2,6 раза усилению активности антителообразующих клеток в 2,6 раза с 36,4±3,0 тыс/селезенку в контроле до 96,4±12,9 тыс/селезенку. Титр синтезируемых ими гемагглютининов не изменялся (табл. 6). Также в 5,9 раза усиливало реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей C57/BL6, с практически нулевых значений до 4,75±1,75 мг.
Таким образом, в ходе исследования установлено, что водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 1053, 628 и 35 кДа, выделенные из травы ряски многокоренной (Lemna polyrrhiza L.), обладают способностью активировать показатели Th1 типа иммунного ответа, а именно, на фоне стимуляции выработки антигенпрезентирующими клетками ключевых провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-12, ФНО-α и лимфоидными клетками ИФН-γ снижать продукцию противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10, стимулировать протекание иммунного ответа, вызванного эритроцитами барана.
Выявленные свойства водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1053, 628 и 35 кДа, выделенных из травы ряски многокоренной (Lemna polyrrhiza L.), можно использовать в качестве средств, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах и онкологических заболеваниях.
Литература
1. Stow, J.L. Cytokine secretion in macrophages and other cells: pathways and mediators / J.L. Stow et al. // Immunobiology. - 2009. - V. 214. - Is. 7. - P. 601-612.
2. Laria, A. The macrophages in rheumatic diseases / A. Laria et al. // J. Inflamm. Res. - 2016. - V. 9. - P. 1-11.
3. Ma, X. TNF-a and IL-12: a balancing act in macrophage functioning / X. Ma. // Microbes and Infection. - 2001. - V. 3. - P. 121-129.
4. Schepetkin, LA. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential /1.A.Schepetkin, M.T. Quinn // Int. Immunopharmacol. - 2006. - V. 6. - Is. 3. - P. 317-733.
5. Данилец, М.Г. Фармакологическая регуляция функционального состояния макрофагов при иммунном ответе: автореф... дисс.докт.биол.наук - 2011. - Томск. - 43 стр.
6. Буданцев, А.Л. Дикорастущие полезные растения России / А.Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская // СПб.: СПХФА. - 2001. - с. 358-361.
7. Dubois, М. Colorimetric method for determination of sugar and related substances / M. Dubois et. al. // Anal.Chem. - 1956. - V. 28. - Is. 3. - P. 350-356.
8. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.
9. Спирин, A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот / А.С.Спирин // Биохимия. - 1958. - Т.23. - Вып.5. - С.656-661.
10. Хаитов, P.M. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации) / P.M. Хаитов и др. // Ведомости Фармакологического Комитета. - 1999. - №1. - С.31-36.
11. Ierne, N.K. Plaque formation in agar by single antibody production cells / N.K. Ierne, A.A. Nordin // Science. - 1963. - V. 140. - Is. 3565. - P. 405-408.