Влияние «Миелопида» на фагоцитарную активность клеток периферической крови человека in vitro

Медицинская иммунология 2000, Т. 2, № 3, стр 339-344 © 2000, СПб РО РА АКИ

Краткие сообщения

ВЛИЯНИЕ МИЕЛОПИДА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

Лихачева Н.С., Бахметьев Б.А., Черешнева М. В.*

Институт экологии и генетики микроорганизмов, УрОРАН, Пермь *Пермская медицинская академия, Пермь, Россия

Резюме. Миелопид - иммуномодулятор, использующийся в клинической практике при лечении заболеваний, сопровождаемых иммунодефицитным состоянием. Целью настоящего исследования был анализ действия Мие-лопида на фагоцитарную активность клеток периферической крови человека in vitro. Клетки крови инкубировали с Миелопидом в диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл в течение часа при 37°С. В качестве объектов фагоцитоза были использованы формалинизированные эритроциты барана. Кроме традиционных общих показателей фагоцитоза были отдельно учтены число эозинофилов, нейтрофилов, моноцитов, фагоцитирующих и нефагоцитирующих эритроциты барана, а также процентное распределение каждого типа фагоцитирующих клеток в зависимости от их активности среди суммы всех фагоцитов в 1 мм3 крови. Установлено, что Миелопид оказывает стимулирующее действие на общую фагоцитарную активность лейкоцитов. При этом действие Миелопида неодинаково сказывается на разных типах клеток. Наибольшее действие добавление препарата в концентрации 0,1 и 1 мкг/мл оказывает на моноциты, увеличивая процент фагоцитоза и фагоцитарное число этих клеток, нейтрофи-лы увеличивают только процент фагоцитоза при добавлении Миелопида в концентрации 0,1 мкг/мл, показатели фагоцитоза эозинофилов не изменяются. Концентрации 10 и 100 мкг/мл не оказывают влияния на эти показатели для всех типов клеток. Изучение влияние Миелопида на изменение активности фагоцитоза отдельных популяций лейкоцитов показало, что в концентрациях 0,1, 1 и 10 мкг/мл препарат увеличивает роль малоактивных эозинофилов и моноцитов, поглощающих по 1 объекту фагоцитоза, и уменьшает роль малоактивных нейтрофилов. Т. о. можно говорить о разнонаправленное™ действия Миелопида на отдельные популяции фагоцитирующих лейкоцитов периферической крови человека.

Ключевые слова: фагоцитоз, миелопид, нейтрофилы, эозииофилы, моноциты.

Likhacheva N.S., Bachmetyev В.A., Chereshneva М. V.

THE INFLUENCE OF MYELOPIDUM ON PHAGOCYTIC ACTIVITY

OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD CELLS

Abstract. Myelopidum is the immunomodulator that is used in clinical applications for people with immune deficiencies. The aim of the present study was to analyze the effect of different doses of Myelopidum in vitro on phagocytic activity of various populations ofhuman leukocytes. Blood cells were incubated in medium 199 with final concentrations of Myelopidum varying from 0,1 to 100 mkg/ml for 1 h at 37°C. The number of eosinophils, neutrophils, monocytes phagocytizing and nonphagocytizing formalinized sheep red blood cells were separately considered. It was shown that Myelopidum addition increased the total phagocytic activity of leukocytes. Myelopidum stimulated various cell types differently. Phagocytic activity of monocytes increased in the highest degree

Адрес для переписки: B настоящее время в клинической практике

Лихачева Надежда Сергеевна ПРИ лечении заболеваний, сопровождаемых им-

614087, гЛермь, ул.Голева, д.13, ИЭГМ, мунодефицитным состоянием, эффективно ис-

Тел  (22) 64-71-34 Факс (22) 64-67-11 пользуется препарат Миелопид [14, 2]. Его деи-

МШмсо™ет смесь "иелопепти-

дов, выделенная из супернатанта культуры клеток костного мозга свиньи. Препарат обладает иммуностимулирующим, иммунокорригирующим и дифференцировочным эффектами [10]. Он предотвращает развитие постхирургических и пост-травматических осложнений, эффективен при сепсисе, лечении ожогов и некоторых форм лейкозов [8]. В последние годы выделены и структурно охарактеризованы 6 индивидуальных низкомолекулярных миелопептидов, не обладающих видовой специфичностью. Каждый из них проявляет определенную выраженную регуляторную активность, воздействуя на соответствующую клетку - мишень, и воспроизводит один из эффектов Миелопида. Так, миелопептид-1 нормализует CD4/CD8 баланс, специфически связываясь с CD4+ - клеткой [4, 13]. Миелопептид-2 обладает противоопухолевым действием [7, 17]. Миелопеп-тид-3 стимулирует фагоцитарную активность макрофагов мыши [8]. Миелопептид-4 индуцирует терминальную дифференцировку лейкозных клеток человека HL-60 по моноцитарному ряду [9]. В настоящее время проводятся исследования миелопептидов 5 и 6 [8].

Учитывая широкое клиническое использование Миелопида, а также данные о стимулирующем действии входящего в его состав миелопептида-3 на фагоцитоз перитониальных макрофагов мыши, представляет особый интерес изучение действия данного препарата на функциональную активность всего комплекса клеток периферической крови, способных к фагоцитозу.

Целью настоящей работы была оценка эффекта препарата Миелопид на поглотительную функцию нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов человека in vitro.

Материалы и методы

ПРЕПАРАТ

В работе использовали препарат Института иммунологии Минздрава России Миелопид (0,003г), серия 217, в конечных концентрациях: 0,1,1,10 и 100 мкг/мл. Инкубация проб с Миелопидом проходила в течение 60 минут.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась in vitro на венозной крови 10 здоровых мужчин в возрасте от 20 до 50 лет.

МЕТОДЫ

Для изучения поглотительной активности клеток периферической крови человека использовали

тест, основанный на регистрации поглощения объектов фагоцитоза [3]. Особенностями разработанной в ИЭГМ УрО РАН модификации метода оценки фагоцитарной активности лейкоцитов являлись: 1) учет фагоцитарной активности для суммы всех типов фагоцитирующих клеток (нейтрофилы, эозино-филы, моноциты); 2) использование в качестве объектов фагоцитоза тщательно отмытых несенси-билизированных формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ) [И]. Реакцию проводили при оптимальной концентрации ФЭБ (108 клеток/мл) в условиях выхода интенсивности реакции на плато (20 мин, 37"С). Приготовленные мазки для подсчета фагоцитоза фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому - Гимзе. Подсчет вели среди 300 клеток, потенциально способных к фагоцитозу, отдельно для нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА

Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерных пакетов программ “Excel” и “Statistica”. Достоверность вычисляли по критерию Стыодента при р<0,05. Все данные в таблицах представлены в виде М±т.

Результаты

Добавление Миелопида оказывает стимулирующее действие на общую (суммарную) фагоцитарную активность лейкоцитов (табл.1). Увеличиваются процент общего фагоцитоза и фагоцитарное число лейкоцитов при концентрациях препарата 0,1,10 и 100 мкг/мл. При этом активность поглощения ФЭБ не изменяется.

Дифференциальный подсчет фагоцитоза показал, за счет каких клеток из общего пула фагоцитов может реализоваться стимулирующее действие Миелопида. Добавление препарата в концентрациях 0,1, 1 и 10 мкг/мл снижает процентное число фагоцитирующих нейтрофилов среди всех фагоцитов в 2,6 раза по сравнению с контролем (р<0,05). Данный эффект направлен в основном на малоактивные нейтрофилы, поглотившие только по 1 или 2 объекта фагоцитоза (табл.2). В то же время, минимальная концентрация препарата увеличивает процент нейтрофильного фагоцитоза, не изменяя фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.

Миелопид в концентрациях 0,1, 1, 10 мкг/мл увеличивает процент фагоцитирующих эозинофилов среди всех лейкоцитов в 5-6 раз по сравнению с контролем, при этом не изменяя для них процент фагоцитоза, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс. По-видимому, действие препарата не направлено напрямую на эозинофилы, и увеличение их роли в общем фагоцитозе связано

с перераспределением в нем доли разных типов клеток (табл. 3).

Наибольшее действие добавление Миелопида оказывает на моноциты, концентрации препарата 0,1 и 1 мкг/мл увеличивают процент фагоцитоза и фагоцитарное число данного типа клеток, а среди них и процент малоактивных моноцитов, поглощающих по 1 объекту (табл. 4). При этом вклад фагоцитирующих моноцитов в общий фагоцитоз увеличивается в 6-8 раз, что происходит, с одной стороны, за счет

снижения участия нейтрофилов в фагоцитарном процессе, и, с другой стороны, за счет непосредственного увеличения их фагоцитарной активности моноцитов.

Обсуждение результатов

Добавление препарата “Миелопид” в венозную кровь in vitro в целом оказывает стимулирующее действие на общую фагоцитарную активность здоровых доноров. Отсутствие различий между

Табл.1. ВЛИЯНИЕ “МИЕЛОПИДА" НА ОБЩИЙ ФАГОЦИТОЗ.

Концентрация Миелопида (мкг/мл) Количество фагоцитов Фагоцитарный индекс Фагоцитарное число

Относительное

контроль 24,4+1,2 1079,6±118,3 1,15± 0,04, 0,28± 0,02

0,1 шжжашus пй 1436,8 ±371,1 1,13 ± 0,027 шжм

1 28,22 ± 1,56 1206,9 ± 206,4 1,146 ± 0,026 0,324 ± 0,02

10 29,25 ±1,09 1251,2 ± 246,4 1,164 ± 0,039 .0,339 ±0,014 Ц

100 ... 30,18 ±1,85 1297,2± 44,48 1,252 ± 0,069 0,372 ± 0,оГ11

Цветом обозначены достоверные отличия от контроля по критерию Стьюдента при Р<0,05.

Количество фагоцитов - процент и абсолютное число клеток, захвативших объекты фагоцитоза из, 100 подсчитанных лейкоцитов, способных к фагоцитозу

Фагоцитарное число - количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 100 подсчитанных фагоцитирующих лейкоцитов.

Фагоцитарный индекс - количество объектов фагоцитоза, которое приходится на один фагоцит, поглотивший объекты.

Табл.2. ВЛИЯНИЕ МИЕЛОПИДА НА ФАГОЦИТОЗ НЕЙТРОФИЛОВ

Концентрация Миелопида Количество фагоцитов Фагоцитарный индекс Фагоцитарное число Роль* 1

Контроль 27,34± 1,67 972,8 ±110,4 1,177± 0,053 0,326±0,030 76,278+ 3,706 10,563+ 2,93 2,749+ 1,326 0

0,1 1282,42+136,38 1,132+ 0,029 0,414+ 0,033 32,91 ± 13,45 ішшржшіивм 0,471 + 0,345 0,083+ 0,083

1 30,05+2,32 1059,79+187,11 1,14±0,03 0,35± 0,03 ЯШ Ю1.Ш 0,887+ 0,46 0

10 30,86 + 1,4 1100,88±229,4 1,158+ 0,0267 0,355± 0,014 29,363+12,11 ЯМИШВ 3,947+ 1,70 0,762+0,424 0,328±0,224

100 31,93+ 1,81 1124,732+113,13 1,269± 0,66 0,398± 0,0168 71,621 ± 3,673 9,447+ 1,995 6,169+ 2,528 0,592± 0,432

Цветом обозначены достоверные отличия от контроля по критерию Стьюдента при Р<0,05.

* Роль - процентное число нейтрофилов, поглотивших 1 (2,3,4) объектов фагоцитоза, от общего абсолютного количества фагоцитирующих лейкоцитов

Табл.З ВЛИЯНИЕ МИЕЛОПИДА НА ФАГОЦИТОЗ Э03ИН0ФИЛ0В

Концентрация Миелопида

Относительное

Контроль 16,128±1,428 69,161±15,785 1,033±0,033 0,167+0,0161 6,489±1,497 0,171±0,171 0 0

0,1 24,032+ 5,131 87,869±19,298 1,108± 0,055 0,284±0,068 0,53±0,223 0 0,0868± 0,0969

1 20,335±4,294 72,669± 14,000 1,07±0,0517 0,231 ±0,059 34.01±7.989І 0,574±0,470 0 0

10 21,71+3,79 90,36±22,15 1,15±0,106 0,275±0,074 0,28±0,28 0 0,384±0,267

100 23,561 ±3,97 102,341 ±24,52 1,239±0,142 0,308±0,0717 6,532±1,286 0,354±0,183 0 0,31±0,254

Цветом обозначены достоверные отличия от контроля по критерию Стьюдента при Р<0,05.

* Роль - процентное число эозинофилов, поглотивших 1 (2,3,4) объектов фагоцитоза от общего абсолютного количества фагоцитирующих лейкоцитов

Табл.4. ВЛИЯНИЕ МИЕЛОПИДА НА ФАГОЦИТОЗ МОНОЦИТОВ

Концентрация Миелопида

Относительное

Контроль 14,627±1,617 37,72±5,04 1,025±0,025 0,15±0,017 3,671 ±0,574 0,078±0,078 0 0

0,1 23 27+2,93 66,69±16,17 1,1 ±0,08 0,259±0 038 29,996.7,52 0,158±0,114 0 0,05+0,01

1 24,26—3,45 74,413+21,398 1,084±0,04 0,274±0 049 30,698*7,057 0,642±0,334 0 0

10 19,87±4,002 59,099±16,880 1,13±0,07 0,248+0,068 23,72±5,88 0,358±0,210 0 0,158±0,105

100 23,48+3,96 70,147±21,489 1,15±0,09 0,294±0,069 4,528±0,955 0,228±0,120 0 0,221 ±0,152

Цветом обозначены достоверные отличия от контроля по критерию Стьюдента при Р<0,05.

* Роль - процентное число моноцитов, поглотивших 1 (2,3,4) объектов фагоцитоза от общего абсолютного количества фагоцитирующих лейкоцитов

ответами лейкоцитов на разные концентрации Миелопида, возможно, является следствием неоднородной природы препарата и, как следствие этого, возможностью аддитивизма, антагонизма и/или синергизма взаимодействий индивидуальных пептидов при влиянии на поглотительную способность клеток периферической крови человека.

Литературные данные свидетельствуют, что особенностью проявления биологических эффектов индивидуальных миелопептидов является направленное действие на определенный тип клеток иммунной системы, включающее и/или повышающее их активность при недостаточности соответствующей функции в процессе развития иммунной реакции [8]. Так, направленное стимулирующее действие миело-пептида - 3 на сниженную активность макрофагов в

отношении опухолевой линии мышиных фибробла-стов L-929 in vitro проявляется лишь при малом количестве макрофагов по сравнению с количеством опухолевых клеток [17].

Полученные нами результаты свидетельствуют, что действие Миелопида на фагоцитарную активность клеток периферической крови человека in vitro, по-видимому, отличается от эффектов отдельных миелопептидов, входящих в его состав. В отличие от последних, добавление препарата стимулирующе воздействует на неповрежденную поглотительную способность фагоцитирующих клеток.

Анализ активности отдельных популяций лейкоцитов позволил выяснить, на какой тип клеток из общего пула фагоцитов предпочтительно направлено действие Миелопида. Снижение роли фагоцитирующих нейтрофилов на фоне стимуля-

ции моноцитарного звена обусловлено, по-видимому, действием миелопептида - 3, входящего в состав препарата и известного своим стимулирующим действием на фагоцитарную активность макрофагов. В исследованиях Михайловой А.А. миелопептид - 3 in vivo оказывал стимулирующее влияние на фагоцитоз макрофагов мыши, проявляя выраженный протективный эффект при заражении животных патогенными микроорганизмами [14]. In vitro данный пептид усиливал фагоцитоз опсонизированных эритроцитов барана, причем уровень фагоцитоза достигал 230%, а зависимость доза-эффект имела бимодальный характер с максимальным эффектом в диапазоне концентраций пептида 10'8 - 10'э г/мл [1].

Какие же механизмы лежат в основе подобной модуляции? Прежде всего, это, по-видимому, взаимодействие регуляторного пептида или пептидов со специфическими рецепторами на поверхности клеток - мишеней. Кроме того, нельзя исключить опосредованного действия препарата на поглотительную активность клеток за счет стимуляции выброса клетками крови активирующих агентов, в качестве которых могут выступать IFN-y, IL-1, IL-6, ФНО - а. Однако, следует отметить, что в исследованиях in vitro миелопептид - 3, входящий в состав Миелопида, не изменяет продукции цитокинов макрофагами, но при этом участвует в сложной цепи реакций, вызывающих экспрессию 1а антигенов на поверхности макрофагов при их активации [1].

Другим механизмом воздействия Миелопида на поглотительную активность клеток может быть модуляция рецепторного аппарата на поверхности фагоцитирующих клеток. В качестве гипотезы можно предположить заинтересованность в этих процессах таких молекул, как ICAM-1/LFA-1, VLA-1, VLA-5, VLA-6, CD36 [12], которые экспрессируются на моноцитах и отсутствуют на нейтрофилах и эозинофи-лах. В пользу справедливости этой гипотезы свидетельствует отсутствие прямого эффекта добавления данного препарата на эозинофильный фагоцитоз.

Таким образом исследуемый нами in vitro препарат может изменять поглотительную активность лейкоцитов периферической крови человека, при этом разные типы фагоцитирующих клеток по-разному отвечали на действие препарата.

Способность Миелопида в течение часа in vitro изменять поглотительную способность клеток периферической крови дает возможность применять соответствующий нагрузочный тест для оценки индивидуальной чувствительности к миелопиду конкретных пациентов.

Список литературы

1. Белевская Р.Г., Михайлова А.А., Фонина JI.A., Ефремов М.А., Петров Р.В. //Докл. РАН - 1998. -Т. 358.-№6.- С. 1-3.

2. Волик Е.Г., Колесникова Н.В. Влияние нейт-рофильных гранулоцитов в условиях экспериментальной травмы глаза// Иммунология. - 1998. - №1.

- С. 63.

3. Каплин В.Н., Кузнецов В.Ф., Орнебесова Т.П. Методические аспекты изучения фагоцитоза // I съезд иммунологов России: Тезисы докладов (23-25 июня 1992 г.). - Новосибирск, 1992. - С.200-201.

4. Кирилина Е.А., Михайлова А. А., Малахов А.В., Гурьянов С.А., Ефремов М.А. // Иммунология. -1998. -Т. 4. -С.26-29.

5. Михайлова А.А. // Итоги науки и техники, серия “Иммунология”, М.ВИНИТИ, 1988. - № 22. -С.68-91.

6. Михайлова А.А. Миелопиды и иммунореабилитация // Международный журнал по иммунореабилитации. - 1997. - № 4. - С.5.

7. Михайлова А.А., Герасимова Г.К., Трещалина Е.М., Стрелков Л.А., Фонина Л.А., Гурьянов С.А. // Российский хим. журн. - 1998. - Т. XLII. - С. 176-178.

8. Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А. Эндогенные иммунорегуляторные пептиды (миело-пептиды): структура, функция, механизм действия // Биоорганическая химия. - 1999. - Т.25. - № 11. -С.811-815.

9. Стрелков Л.А., Михайлова А.А., Гурьянов С.А., Ефремов М.А., Петров Р.В. // Докл. РАН. - 1998. -Т. 358.-С. 134-136.

10. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Андронова Т.М./ / Лечащий врач. - 1998. - № 4. - С.46-51.

11. BachmetyevB.A,. Likhacheva N.S, Kharitonova А. V. Effects of thyroxine and somatothropin on phagocytosis of different blood cells populations// Immunology Letters. -1997. - Vol.56. - N.l-3. - P.117-118.

12. Franc N., White K., Ezekowitz R.A. Phagocytosis and development: back to the future.// Current Opinion in Immunology. - 1999. - Vol.l 1. - P.47-52.

13. Mikhailova A., Fonina L., Kirilina E., Shanurin S., Gur’yanov S., Malakhov A., Nesmeyanov V., Petrov R. // Reg. Peptides. - 1994. - Vol. 53.- P. 203-209.

14. Mikhailova A.A, Shamurin S.Yu., Petrov R.V. // Immunol. Letters. - 1995. - V. 47. - P. 199-203.

15. Petrov R.V.//Ann.N.Y.Acad.Sci. - 1993.-Vol.685.

- P.351-361.

16. Petrov R.V., Mikhailova A.A., Zakharova L.A. // Scand. J. Immunol. - 1986. - Vol. 24.- P. 237-244.

17. Strelkov L. A., Mikhailova A. A., Sapozhnikov A.M., Fonina L.A., Petrov R.V. // Immunol. Letters. - 1996. - V. 50. - P. 143-147.

поступила в редакцию 19.04.2000 принята к печати 25.09.2000