СПОСОБЫ ОБРАБОТКИ СЕМЯН И КОМПОЗИЦИИ
METHODS OF TREATMENT OF SEEDS AND COMPOSITION

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Симбиоз между грамотрицательными почвенными бактериями, Rhizobiaceae и Bradyrhizobiaceae, и бобовыми растениями, такими как соя, имеет точное документальное подтверждение. Биохимическая основа для этих взаимоотношений включает обмен молекулярными сигналами, где сигнальные соединения растений с бактериями включают флавоны, изофлавоны и флаваноны, и сигнальные соединения бактерий с растениями, которые включают конечные продукты экспрессии nod-генов Bradyrhizobial и Rhizobial, известных как липохитоолигосахариды (LCO). Симбиоз между этими бактериями и бобовыми растениями способствует фиксации бобовыми растениями атмосферного азота, и, следовательно, росту в почве с низким уровнем усвояемого азота, таким образом, исключая необходимость применения азотных удобрений. Так как азотные удобрения могут значительно повысить стоимость урожая и связаны с рядом вредных воздействий, сельскохозяйственная промышленность продолжает усилия по использованию данной биологической взаимосвязи и разработке новых средств и способов для повышения урожайности растений без увеличения использования удобрений на основе азота.
В патенте США 6979664 предложен способ ускорения прорастания семени или появления всходов культурного растения, включающий этапы обеспечения композиции, содержащей эффективное количество, по меньшей мере, одного липохитоолигосахарида и сельскохозяйственно-приемлемого носителя, и применения композиции в непосредственной близости от семени или появления всходов в эффективном количестве для ускорения прорастания семени появившихся всходов по сравнению с необработанным семенем или всходами.
Дальнейшее развитие данной концепции предложено в заявке WO 2005/062899, относящейся к комбинациям, по меньшей мере, одного индуктора растения, а именно LCO, в комбинации с фунгицидом, инсектицидом или их сочетанием, для повышения качеств растения, таких как густота стояния, рост, активность роста и/или урожайность. Предлагаемые композиции и способы применимы как к бобовым, так и небобовым растениям, и их можно использовать для обработки семени (непосредственно перед посадкой), всходов, корня или растения.
Аналогично, в заявке WO 2008/085958 предложены композиции для улучшения роста растения и урожайности как бобовых, так и небобовых культур, которые содержат LCO в комбинации с другим активным средством, таким как хитин или хитозан, флавоноидное соединение или гербицид, и которые могут быть применимы для семян и/или растений одновременно или последовательно. Как в случае заявки ′899, в заявке ′958 предложена обработка непосредственно перед посадкой.
В ряде других публикаций описывается целесообразность использования LCO в процессе обработки семян, например, Kidaj et al., "Nod factors stimulate seed germination and promote growth and nodulation of pea and vetch under competitive conditions," Microbiol Res 25426 (2011) and Maj et al., "Pretreatment of Clover Seeds with Nod Factors Improves Growth and Nodulation of Trifolium pratense," J. Chem Ecol (2009) 35:479-487.
За последнее время в публикации Halford, ″Smoke Signals,″ в Chem. Eng. News (от 12 апреля 2010 года), на страницах 37-38, отмечается, что каррикины или бутенолиды, содержащиеся в дыме, проявляют себя в качестве стимуляторов роста и ускорителей прорастания семян после лесного пожара и способны оживлять семена таких ранее оставленных на хранение культур, как кукуруза, томаты, салат-латук и лук. Эти молекулы являются предметом патента США 7576213.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам улучшения роста растений и возделывания сельскохозяйственных культур, в которых положительное воздействие сигнальной молекулы растения (средства улучшения роста растений) можно получать без необходимости применения сигнальной молекулы растения (средства улучшения роста растений) к семени одновременно с посадкой. Настоящее изобретение частично основано на том открытии, что обработка семян с использованием сигнальной молекулы растения, такой как LCO, и последующее долгосрочное хранение перед посадкой приводит к росту растения, включая более высокую урожайность растения и/или увеличение площади листовой поверхности и/или числа, длины и массы корней, по сравнению с растениями, урожай которых собран от обоих необработанных семян. Настоящее изобретение также относится к способам улучшения роста растений и возделывания сельскохозяйственных культур, в которых дополнительные улучшения можно получать при урожае растений, полученных от семян, обработанных непосредственно перед посадкой или в течение или менее недели с начала посадки.
Первый аспект настоящего изобретения относится к способу улучшения роста растений, содержащему обработку семени за, по меньшей мере, один месяц (тридцать суток) до посадки с использованием эффективного количества сигнальной молекулы растения. В вариантах осуществления семя можно обрабатывать в соответствии с настоящим способом за 2 месяца до посадки, по меньшей мере, 3 месяца до посадки, по меньшей мере, 4 месяца до посадки, по меньшей мере, 5 месяцев до посадки, по меньшей мере, 6 месяцев до посадки, по меньшей мере, 9 месяцев до посадки, по меньшей мере, 1 год до посадки, по меньшей мере, 2 года до посадки и в некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 3 года до посадки.
Обработку используют для получения растения (сельскохозяйственной культуры), которое показывает, по меньшей мере, одну повышенную урожайность растения, измеренную в отношении бушель/акр, увеличение числа корней, увеличение длины и массы корня, увеличение корневого объема и увеличение площади листовой поверхности, по сравнению с растениями, урожай которых собран от необработанного семени. В конкретных вариантах осуществления обработку можно использовать для получения растения (сельскохозяйственной культуры), которое показывает, по меньшей мере, одну повышенную урожайность растения, измеренную в отношении бушель/акр, увеличение числа корней, увеличение длины и массы корня, увеличение корневого объема и увеличение площади листовой поверхности, по сравнению с растением (сельскохозяйственной культурой), урожай которой собран от семени, обработанного с использованием сигнальной молекулы непосредственно перед посадкой или в течение или менее недели с начала посадки.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения сигнальной молекулой растения является липохитоолигосахарид (LCO). В некоторых вариантах осуществления LCO является рекомбинантным. В других вариантах осуществления LCO является синтетическим. В других вариантах осуществления LCO получают из микроорганизма, например, вида Rhizobium, выбранного из вида Rhizobium, вида Bradyrhizobium, например, Bradyrhizobium japonicum, вида Sinorhizobium и вида Azorhizobium или из арбускулярного микоризного гриба.
В других вариантах осуществления сигнальной молекулой растения является хитиновое соединение, такое как хитоолигомер (CO). В некоторых вариантах осуществления CO является рекомбинантным. В других вариантах осуществления CO является синтетическим. В других вариантах осуществления CO получают из микроорганизма в соответствии с LCO.
В других вариантах осуществления сигнальной молекулой растения является флаваноид. В других вариантах осуществления сигнальной молекулой растения является жасмоновая, линолевая кислота, линоленовая кислота или их производные. В других вариантах осуществления сигнальной молекулой растения является каррикин.
Комбинации двух или более различных сигнальных молекул растения (или их типов) можно использовать для обработки семени.
В других вариантах осуществления обработка дополнительно содержит взаимодействие семени, по меньшей мере, c одним другим агрономически целесообразным средством, например, диазотрофом (микоризный инокулянт), микоризными грибами, фосфат-солюбилизирующим средством, гербицидом, инсектицидом или фунгицидом. В некоторых вариантах осуществления обработка влечет за собой опрыскивание композицией, содержащей сигнальную молекулу растения, семени, и в некоторых других вариантах осуществления обработка влечет за собой стекание по каплям композиции на семена.
Способ по настоящему изобретению применим как к бобовым, так и к небобовым растениям. В некоторых вариантах осуществления бобовым семенем является соевый боб. В некоторых других вариантах осуществления обрабатываемое семя является небобовым семенем, таким как семя полевой культуры, например, кукурузы, или семя овощной культуры.
Семя можно обрабатывать в соответствии с настоящим способом от одного месяца (тридцати суток) до 1 года, 2 лет и в некоторых вариантах осуществления даже до 3 лет до посадки, в зависимости от конкретных качеств семени (всхожести после хранения) или промышленных стандартов. Например, посадку семян соевых бобов обычно осуществляют в следующем сезоне, в то время как семя кукурузы можно хранить в течение намного более длительного периода времени, включая приблизительно 3 года до посадки.
Настоящее изобретение также относится к семенам, обработанным с использованием сигнальной молекулы растения/средства улучшения роста растений, такого как LCO или CO, которые хранили, по меньшей мере, от тридцати суток до 1 года, 2 лет и в некоторых вариантах осуществления даже до 3 лет до посадки.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к посаженному семени, которое обрабатывали с использованием сигнальной молекулы растения/средства улучшения роста растений, такого как LCO или CO, которые хранили, по меньшей мере, от тридцати суток до 1 года, 2 лет и в некоторых вариантах осуществления даже до 3 лет до посадки.
Соответствующий аспект настоящего изобретения относится к фасовке, содержащей обработанные семена по настоящему изобретению с целью посадки, последующей за обработкой.
Как показано на демонстрационных примерах, которые включают сравнительные эксперименты, проведенные как в теплице, так и в полевых условиях, благоприятное действие сигнальной молекулы/средства улучшения роста растений можно получать, даже несмотря на то, что сигнальные молекулы применимы к семени в значительной степени задолго до посадки и после длительного периода хранения.
Как далее показано на демонстрационных примерах, которые включают сравнительные эксперименты, проведенные как в теплице, так и в полевых условиях, варианты осуществления настоящего изобретения, которые влекут за собой обработку соевого семени с использованием LCO от Bradyrhizobium japonicum, показали увеличение урожайности растения, площади листовой поверхности, и увеличение длины корня и корневого объема по сравнению как с необработанным семенем, так и семенем, обработанным с использованием LCO непосредственно перед посадкой или в течение недели с момента посадки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 и 2 показаны химические структуры соединений липохитоолигосахарида (LCO), применимого в практическом осуществлении настоящего изобретения.
Фиг. 3 представляет собой линейчатую диаграмму, на которой показана средняя площадь поверхности первых тройчатых листьев на 19-дневных растениях соевых бобов, пророщенных от семени, обработанного в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения (например, за 55 суток до посадки) по сравнению с контрольным образцом (т.е., необработанным семенем и семенем, обработанным с использованием сигнальной молекулы за 7 суток до посадки).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В целях настоящего изобретения термин ″сигнальная молекула растения″, который можно использовать взаимозаменяемо со ″средством улучшения роста растения″, в широком смысле относится к любому средству, как природному в растениях или микробах, так и синтетическому (и которое может быть неприродным), которое прямо или косвенно активирует биохимический путь растения, приводя в результате к увеличению роста растения, измеряемого, по меньшей мере, в отношении, по меньшей мере, одной повышенной урожайности растения, измеренной в отношении бушель/акр, увеличенного числа корней, увеличенной длины корня, увеличенной корневой массы, увеличенного корневого объема и увеличенной площади листовой поверхности. Показательные примеры сигнальных молекул растения, которые могут быть применимы в практическом осуществлении настоящего изобретения, включают соединения липохитоолигосахарида (LCO), хитоолигосахариды (CO), хитиновые соединения, флавоноиды, жасмоновую кислоту, линолевую кислоту и линоленовую кислоту и их производные и каррикины.
Сигнальная молекула растения может быть изолированным и/или очищенным компонентом. Термин ″изолированный″ означает, что сигнальную молекулу удаляют из своего природного состояния и отделяют от других молекул, естественно связанных с ней. Термин ″очищенный″ означает, что концентрация сигнальной молекулы повышена (посредством процесса очистки) относительно других компонентов, например, нежелательных или низших компонентов.
LCO, также известные в данной области как симбиотические Nod-сигналы или Nod-факторы, состоят из олигосахаридного остова остатков β-1,4-связанного N-ацетил-D-глюкозамина (″GIcNAc″) с N-связанной ацильной цепью жирной кислоты, конденсированной на нередуцирующем конце. LCO различаются по числу остатков GIcNAc в остове, по длине и степени насыщенности ацильной цепи жирной кислоты, и по заменам остатков редуцирующего и нередуцирующего сахара. Пример LCO представлен ниже в виде формулы I:
в которой:
G является хетозамином, который может быть замещен, например, ацетильной группой на азоте, сульфатной группой, ацетильной группой и/или группой простого эфира на кислороде,
1
2
3
5
6
7
3
x
y
R, R, R, R, R и R, которые могут быть идентичны или различны, представляют собой H, CH CO--, C H CO--, где x является целым числом от 0 до 17, и y является целым числом от 1 до 35, или любую другую ацильную группу, такую как например, карбамил,
4
R представляет собой моно-, ди-, или триненасыщенную и тетраненасыщенную алифатическую цепь, содержащую, по меньшей мере, 12 атомов углерода, и n является целым числом от 1 до 4.
LCO можно получать (например, изолированные и/или очищенные) от бактерий, таких как Rhizobia, например, вида Rhizobium, вида Bradyrhizobium, вида Sinorhizobium и вида Azorhizobium. Структура LCO характерна для каждого такого бактериального вида, и каждый штамм может произвести множество LCO с различными структурами. Например, конкретные LCO от S. meliloti, также описанные в патенте США 5549718, имеют формулу II:
3
в которой R представляет собой H или CH CO--, и n равен 2 или 3.
3
Еще более конкретные LCO включают NodRM, NodRM-1, NodRM-3. При ацетилировании (R=CH CO--) они становятся AcNodRM-1 и AcNodRM-3, соответственно (патент США 5545718).
18:1
C
18:1
16:1
C
16:0
LCO из Bradyrhizobium japonicum описаны в патентах США 5175149 и 5321011. В широком смысле, они являются пентасахаридными фитогормонами, содержащими метилфукозу. Ряд этих LCO, выделяемых из B. Japonicum, описан: BjNod-V (C); BjNod-V (A, C), BjNod-V (C); и BjNod-V (A, C), где ″V″ обозначает присутствие пяти N-ацетилглюкозаминов; ″Ac″ - ацетилирование; число, следующее за ″C″, обозначает число атомов углерода в боковой цепи жирной кислоты; и число, следующее за ″:″ - количество двойных связей.
LCO, используемые в вариантах осуществления изобретения, могут быть извлечены из бактериальных штаммов, из которых получают LCO, таких как штаммы Azorhizobium, Bradyrhizobium (включая B. japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (включая R. leguminosarum), Sinorhizobium (включая S. meliloti), и генно-инженерные бактериальные штаммы для получения LCO.
LCO являются первичными детерминантами хозяинной специфичности в симбиозе бобовых растений (Diaz, et al., Mol. Plant-Microbe Interactions 13:268-276 (2000)). Таким образом, в рамках семейства бобовых у конкретного вида и вида микоризы развиваются симбиотические азотфиксирующие взаимоотношения с конкретным хозяином бобовой культуры. Эти комбинации растение-хозяин/бактерия описаны в Hungria, et al., Soil Biol. Biochem. 29:819-830 (1997). Примеры этих симбиотических отношений бактерии/бобовая культура включают S. meliloti/люцерна и донник; R. leguminosarum biovar viciae/горох и чечевица; R. leguminosarum biovar phaseoli/бобы; Bradyrhizobium japonicum/соевые бобы; и R. leguminosarum biovar trifolii/красный клевер. В Hungria приведен список эффективных флавоноидных индукторов Nod-генов микоризных видов и конкретных LCO структур, получаемых различными микоризными видами. Однако специфичность LCO необходима только для установления образования клубеньков в бобовых культурах. В практическом осуществлении настоящего изобретения использование определенного LCO не ограничивается обработкой семени его симбиотического партнера бобовой культуры, с целью достижения повышения урожайности растения, измеренной в отношении бушель/акр, увеличения числа корней, увеличения длины и массы корня, увеличения корневого объема и увеличения площади листовой поверхности, по сравнению с растениями, урожай которых собран от необработанных семян или по сравнению с растениями, урожай которых собран от семян, обработанных с использованием сигнальной молекулы непосредственно перед посадкой или в течение или менее недели с начала посадки. Таким образом, в качестве примера, LCO, получаемого от B. Japonicum, можно использовать для обработки бобового семени, за исключением семени соевого боба и небобовых культур, таких как кукуруза. В качестве другого примера, LCO гороха, получаемого от R. Leguminosarum, показанного на Фиг. 1 (указанного LCO-V (C18:1), SP104), можно использовать для обработки семени бобовой культуры, также за исключением гороха и небобовых культур.
Настоящее изобретение также охватывает использование LCO, полученных от (например, изолированных и/или очищенных) от арбускулярных микоризных грибов, таких как грибы группы Glomerocycota, например, Glomus intraradicus. Структуры представителей LCO, полученных от этих грибов, описаны в заявках WO 2010/049751 и WO 2010/049751 (описанные здесь LCO также обозначаются как ″Myc-факторы″).
Настоящее изобретение также охватывает использование синтетических LCO соединений, таких как те, которые описаны в заявке WO2005/063784, и рекомбинантных LCO, полученных путем генной инженерии. Основная природная LCO структура может содержать модификации или замены, найденные в природных LCO, таких как те, которые описаны в Spaink, Crit. Rev. Plant Sci. 54:257-288 (2000) и D′Haeze, et al., Glycobiology 12:79R-105R (2002). Предшественники олигосахаридных молекул (CO, которые, как описано ниже, также пригодны в качестве сигнальных молекул растения в настоящем изобретении) для образования LCO могут также быть синтезированы организмами генной инженерии, например, как в Samain, et al., Carb. Res. 302:35-42 (1997).
LCO можно также использовать в различных формах чистоты и можно использовать самостоятельно или в форме культуры LCO-продуцирующих бактерий или грибов. Например, OPTIMIZE (коммерчески доступны от Novozymes BioAg Limited) содержит культуру B. japonicum, которая производит LCO (LCO-V (C18:1, MeFuc), MOR116), показанную на Фиг. 2. Способы обеспечения по существу чистых LCO включают простое удаление микробных клеток из смеси LCO и микроба или продолжение изоляции и очищения LCO молекул с помощью фазового расслоения LCO растворителя после ВЭЖХ хроматографии, как описано, например, в патенте США 5549718. Очистка может быть усилена посредством повторной ВЭЖХ, и очищенные LCO молекулы могут быть высушены сублимацией для длительного хранения.
Хитины и хитозаны, которые являются основными компонентами клеточной стенки грибов и экзоскелеты насекомых и ракообразных, также состоят из GIcNAc остатков. Хитиновые соединения включают хитин (IUPAC: N-[5-[[3-ацетиламино-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-2-ил]метоксиметил]-2-[[5-ацетиламино-4,6-дигидрокси-2-(гидроксиметил)оксан-3-ил]метоксиметил]-4-гидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-3-ис]этанамид) и хитозан, (IUPAC: 5-амино-6-[5-амино-6-[5-амино-4,6-дигидрокси-2(гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-4-гидрокси-2-(гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-2(гидроксиметил)оксане-3,4-диол). Эти соединения можно получать коммерчески, например, от Sigma-Aldrich, или получать из насекомых, ракушек ракообразных или клеточных стенок грибов. Способы получения хитина и хитозана известны в данной области и описаны, например, в патенте США 4536207 (получение из ракушек ракообразных), Pochanavanich, et al., Lett. Appl. Microbiol. 35:17-21 (2002) (получение из клеточных стенок грибов), и патенте США 5965545 (получение из ракушек краба и гидролиза коммерческого хитозана). Деацетилизированные хитины и хитозаны можно получать в диапазоне от менее чем 35% до более чем 90% деацетилирования и охвате широкого спектра молекулярной массы, например, олигомеры хитозана с низкой молекулярной массой менее чем 15 кД и олигомеры хитина 0,5 до 2 кД; хитозан ″practical grade″ с молекулярной массой приблизительно 150 кД; и хитозан с высокой молекулярной массой до 700 кД. Композиции хитина и хитозана, образованные для обработки семени, также коммерчески доступны. Коммерческие продукты включают, например, ELEXA (Plant Defense Boosters, Inc.) и BEYOND™ (Agrihouse, Inc.).
8
13
5
5
11
4
Другие хитиновые соединения, являющиеся пригодными для использования в настоящем изобретении, включают CO (например, изолированные и/или очищенные). CO известны в данной области как структуры N-актилглюкозамина, соединенного β-1-4 связами, идентифицированные как олигомеры хитина, также как N-ацетилхитоолигосахариды. CO имеют уникальные и различные оформления боковой цепи, которые отличают их от молекул хитина [(CHNO)n, CAS No. 1398-61-4] и молекул хитозана [(CHNO)n, CAS No. 9012-76-4]. Примерами литературы, описывающей структуру и получение Co, являются следующие: Van der Hoist, et al., Current Opinion in Structural Biology, 11:608-616 (2001); Robina, et al., Tetrahedron 58:521-530 (2002); Hanel, et al., Planta 232: 787-806 (2010); Rouge, et al. Chapter 27, "The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates" in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science; Wan, et al., Plant Cell 21:1053-69 (2009); PCT/F100/00803 (9/21/2000); and Demont-Caulet, et al., Plant Physiol. 120 (1):83-92 (1999).
Два Co, пригодных для использования в настоящем изобретении, можно легко выделить из LCO, показанных на Фиг. 1 и 2 (минус цепи жирной кислоты), которые являются предшественниками CO до LCO, показанных на Фиг. 1 и 2. Способы получения рекомбинантных CO известны в данной области. См., например, Samain, et al. (supra.); Cottaz, et al., Meth. Eng. 7 (4)-311-1 (2005) and Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999).
Флавоноиды являются соединениями фенольной смолы, имеющими общую структуру из двух ароматических колец, связанных трехуглеродным мостиком. Флавоноиды получают из растений, и они имеют много функций, например, в качестве благоприятных сигнальных молекул и в качестве защиты от насекомых, животных, грибов и бактерий. Классы флавоноидов включают халконы, антоцианиды, кумарины, флавоны, флаванолы, флавонолы, флаваноны и изофлавоны. См., например, Jain, et al., J. Plant Biochem. & Biotechnol. 11:1-10 (2002); Shaw, et al., Environmental Microbiol. 11:1867-80 (2006).
Представители флавоноидов, которые могут быть пригодны в практическом осуществлении настоящего изобретения, включают генистеин, даидзеин, формононетин, нарингенин, гесперетин, лютеолин и апигенин. Флаваноидные соединения являются коммерчески доступными, например, от Natland International Corp., Research Triangle Park, NC; MP Biomedicals, г. Ирвин, штат Калифорния; LC Laboratories, г. Уоберн, штат Массачусетс. Флаваноидные соединения можно выделять из растений или семян, например, как описано в патентах США 5702752; 5990291 и 6146668. Флаваноидные соединения можно также получать с использованием организмов генной инженерии, таких как дрожжи, как описано в Ralston, et al., Plant Physiology 137:1375-88 (2005).
В других вариантах осуществления семя обрабатывают с использованием жасмоновой кислоты (JA, [1R-[1α,2β(Z)]]-3-оксо-2-(пентенил)циклопентануксусной кислоты) и ее производных, линолевой кислоты ((Z,Z)-9,12-октадекадиеновой кислоты) и ее производных и линоленовой кислоты ((Z,Z,Z)-9,12,15-октадекатриеновой кислоты) и ее производных. Жасмоновая кислота и ее сложный метиловый эфир, метил жасмонат (MeJA), вместе известные как жасмонаты, являются соединениями на основе октадеканоида, которые естественным образом возникают в растениях. Жасмоновую кислоту получают из всходов корней пшеницы и микроорганизмов грибов, таких как Botryodiplodia theobromae и Gibbrella fujikuroi, дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) и патогенных и непатогенных штаммов Escherichia coli. Линолевую кислоту и линоленовую кислоту получают в ходе биосинтеза жасмоновой кислоты. Отмечено, что жаснонаты, линолевая кислота и линолевая кислота (и их производные) являются индукторами экспрессии nod-гена или получения LCO с помощью rhizobacteria. См., например, Mabood, Fazli, Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum, May 17, 2001; and Mabood, Fazli, "Linoleic and linolenic acid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum," USDA 3, 17 мая 2001 года.
1
1
2
3
2
3
1
8
2
8
2
8
1
8
2
8
2
8
Пригодные производные линолевой кислоты, линоленовой кислоты и жасмоновой кислоты, которые могут быть применимы в практическом осуществлении настоящего изобретения, включают сложные эфиры, амиды, гликозиды и соли. Представителями сложных эфиров являются соединения, в которых карбоксильная группа линолевой кислоты, линоленовой кислоты или жасмоновой кислоты была заменена --COR группой, где R является --OR группой, в которой R является: алкильной группой, такой как C-C неразветвленная или разветвленная алкильная группа, например, метиловая, этиловая или пропильная группа; алкенильной группой, такой как C-C неразветвленная или разветвленная алкенильная группа; алкинильной группой, такой как C-C неразветвленная или разветвленная алкинильная группа группа; арильной группой, имеющей, например, 6 до 10 атомов углерода; или гетероарильной группой, имеющей, например, от 4 до 9 атомов углерода, где гетероатомами в гетероарильной группе могут быть, например, N, O, P или S. Представителями амидов являются соединения, в которых карбоксильная группа линолевой кислоты, линоленовый кислоты или жасмоновой кислоты заменена --COR группой, где R является NRR группой, в которой R и R являются независимо: водородом; алкильной группой, такой как C-C неразветвленная или разветвленная алкильная группа, например, метиловая, этиловая или пропильная группа; алкениловой группой, такой как C-C неразветвленная или разветвленная алкенильная группа; алкинильной группой, такой как C-C неразветвленная или разветвленная алкинильная группа; арильной группой, имеющей, например, от 6 до 10 атомов углерода; или гетероарильной группой, имеющей, например, от 4 до 9 атомов углерода, где гетероатомами в гетероарильной группе могут быть, например, N, O, P или S. Сложные эфиры можно получать известными способами, такими как кислотно-катализированное нуклеофильное присоединение, где карбоновая кислота вступает в реакцию со спиртом в присутствии каталитического количества неорганической кислоты. Амиды также можно получать известными способами, такими как реакция карбоновой кислоты с подходящим амином в присутствии связующего вещества, такого как дициклогексил карбодиимид (DCC) при нейтральных условиях. Подходящие соли линолевой кислоты, линоленовой кислоты и жасмоновой кислоты включают, например, соли присоединения оснований. Основания, которые можно использовать в качестве реагентов для получения метаболически приемлемых основных солей этих соединений, включают те, которые получены от катионов, таких как катионы щелочного металла (например, калия и натрия) и катионы щелочноземельного металла (например, кальция и магния). Эти соли можно быстро получить посредством смешивания раствора линолевой кислоты, линоленовой кислоты или жасмоновой кислоты с раствором основания. Соль можно осадить из раствора и собрать посредством фильтрации или ее можно регенерировать другими способами, таким как выпаривание растворителя.
В других вариантах осуществления семя обрабатывают винилогическим 4H-пироном, например, 2H-фуро[2,3-c]пиран-2-онами, включая их производные и аналоги, примеры которых представлены следующей структурой:
5
1
2
3
4
6
6
7
2
5
6
7
1
3
2
3
4
1
2
3
4
1
2
4
3
3
1
2
3
4
3
1
3
3
2
4
1
4
3
2
3
1
3
4
3
2
1
3
2
3
4
2
3
1
3
3
2
4
1
3
2
3
4
3
1
3
2
3
4
где; Z является O, S или NR; R, R, R и R каждый являются независимо H, алкилом, алкенилом, алкинилом, фенилом, бензилом, гидрокси, гидроксиалкилом, алкокси, фенилокси, бензилокси, CN, COR, COOR=, галогеном, NRR или NO; и R, R и R каждый являются независимо H, алкилом или алкенилом или их биологически приемлемой солью. Примеры биологически приемлемых солей этих соединений могут включать соли присоединения кислот, образованных биологически приемлемыми кислотами, примеры которых включают гидрохлорид, гидробромид, сульфат или бисульфат, фосфат или водород фосфат, ацетат, бензоат, сукцинат, фумарат, малеат, лактат, цитрат, тартрат, глюконат; метансульфонат, бензолсульфонат и п-толуолсульфоновую кислоту. Дополнительные биологически приемлемые соли металлов могут включать соли щелочных металлов, с основаниями, примеры которых включают натрий и калиевые соли. Примеры соединений, которые охвачены структурой и которые могут быть пригодны для использования в настоящем изобретении, включают следующие: 3-метил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R=CH, R, R, R=H), 2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R, R, R, R=H), 7-метил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R, R, R=H, R=CH), 5-метил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R, R, R=H, R=CH), 3,7-диметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R, R=CH, R, R=H), 3,5-диметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R, R=CH, R, R=H), 3,5,7-триметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R, R, R=CH, R=H), 5-метоксиметил-3-метил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R=CH, R, R=H, R=CHOCH), 4-бромо-3,7-диметил-2H-фуро[2,3-c]пиран-2-один (где R, R=CH, R=Br, R=H), 3-метилфуро[2,3-c]пиридин-2(3H)-один (где Z=NH, R=CH, R, R, R=H), 3,6-диметилфуро[2,3-c]пиридин-2(6H)-один (где Z=N--CH, R=CH, R, R, R=H). См. патент США 7576213. Эти молекулы также известны как каррикины. См. Halford, выше.
Семена можно обрабатывать с использованием сигнальной молекулы растения несколькими способами, но предпочтительно посредством опрыскивания или стекания по каплям. Обработку с помощью опрыскивания и стекания каплями можно проводить посредством составления рецептуры эффективного количества сигнальной молекулы растения в сельскохозяйственно-приемлемом носителе, как правило, водном по природе, и опрыскивания или стекания по каплям композиции на семя посредством непрерывной системы обработки (которую калибруют для применения обработки на заранее определенном уровне в пропорции к непрерывному потоку семян), такой как установка для обработки барабанного типа. Эти способы преимущественно используют относительно небольшие объемы носителя, чтобы способствовать относительно быстрой сушке обработанного семени. Таким образом, можно эффективно обрабатывать большие объемы семян. Также может быть использована установка групповой обработки, в которой предопределенный объем партии семян и композиции сигнальной молекулы доставлены в смеситель. Системы и аппараты для осуществления данных процессов являются коммерчески доступными от многочисленных поставщиков, например, Bayer CropScience (Gustafson).
В другом варианте осуществления обработка влечет за собой дражирование семян. Один такой процесс включает покрытие внутренней стенки круглого контейнера композицией, с добавлением семян, затем вращение контейнера для приведения семян в контакт со стенкой и композицией, этот процесс известен в данной области как ″покрытие контейнера″. Семена можно покрыть комбинациями способов нанесения оболочки. Пропитка, как правило, влечет за собой использование водного раствора, содержащего средство улучшения роста растения. Например, семена могут быть пропитаны приблизительно от 1 минуты до приблизительно 24 часов (например, в течение, по меньшей мере 1 минуты, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 40 минут, 80 минут, 3 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов). Некоторые виды семян (например, семена соевых бобов) обычно являются влагочувствительными. Таким образом, пропитка таких семян в течение длительного периода времени может быть нежелательной, в таком случае пропитка, как правило, проводится приблизительно от 1 минуты до приблизительно 20 минут.
Без намерения быть связанными конкретной теорией деятельности, заявители считают, что даже в том случае, если обработка не приведет к сохранению контакта сигнальной молекулы растения с поверхностью семени после обработки и в течение любой части периода хранения, сигнальная молекула может достигнуть целевого воздействия посредством феномена, известного как память семян или восприятие семян. См., Macchiavelli и Brelles-Marino, J. Exp. Bot. 55(408):2635-40 (2004). Заявители также считают, что после обработки сигнальная молекула, например, LCO, распространяется на молодой развивающийся зародышевый корень и активирует симбиотические гены и гены развития, что приводит к изменению в строении корня растения. Несмотря на это, композиции, содержащие сигнальную молекулу растения, могут также содержать склеивающее или покровное средство для содействия сцеплению сигнальной молекулы с семенем. В эстетических целях композиции могут также содержать полимер и/или краситель оболочки.
-5
-14
-5
-11
-7
-8
Как правило, диапазон эффективного количества используемой для обработки семени сигнальной молекулы растения, выраженного в единицах концентрации, составляет приблизительно от 10 до приблизительно 10M, и в некоторых вариантах осуществления - приблизительно от 10 до приблизительно 10M, и в некоторых других вариантах осуществления - приблизительно от 10 до приблизительно 10 M. Выражаемый в единицах массы диапазон эффективного количества обычно составляет приблизительно от 1 до приблизительно 400 мкг/центнер (центнер) семени, и в некоторых вариантах осуществления приблизительно от 2 до приблизительно 70 мкг/центнер, и в некоторых других вариантах осуществления приблизительно от 2,5 до приблизительно 3,0 мкг/центнер семени. Эффективное количество сигнальной молекулы растения, однако, можно получать подходящим анализом доза-ответ, предпочтительно, в теплице и/или полевом исследовании.
Обработка может также включать взаимодействие семени, происходящее перед, одномоментно с или последовательно со взаимодействием с сигнальной молекулой растения с сельскохозяйственно/агрономически целесообразным средством. В рамках изобретения и в данной области термин ″сельскохозяйственно или агрономически целесообразный″ относится к средствам, которые применительно к семенам приводят к улучшению (что может быть статистически значимо) качеств растения, таких как густота стояния, рост, активность роста или урожайность по сравнению с необработанными семенами. Показательные примеры таких средств, которые могут быть пригодны в практическом осуществлении настоящего изобретения, в качестве неограничивающих примеров включают, диазотрофы, микоризные грибы, гербициды, фунгициды, инсектициды и фосфат солюбилизирующие средства.
Подходящие гербициды включают бентазон, ацифлуорфен, хлоримурон, лактофен, кломазон, флуазифоп, глуфосинат, глифосат, сетоксидим, имазетапир, имазамокс, фомезафен, флумиклорак, имузакуин и клетодим. Коммерческие продукты, содержащие каждое из этих соединений, легкодоступны. Концентрация гербицида в композиции обычно соответствует обозначенной рабочей концентрации для конкретного гербицида.
″Фунгицидом″ в рамках изобретения и в данной области является средство, уничтожающее или ингибирующее рост грибов. В рамках изобретения фунгицид ″демонстрирует активность относительно″ конкретных видов грибов, если обработка с использованием фунгицида приводит к уничтожению или ингибированию роста популяции грибов (например, в почве) относительно необработанной популяции. Эффективные фунгициды по изобретению соответственно продемонстрируют активность относительно широкого диапазона патогенов, включая в качестве неограничивающих примеров Phytophthora, Ризоктония, Fusarium, Pythium, Phomopsis или Selerotinia и Phakopsora и их сочетания.
Коммерческие фунгициды могут быть пригодны для использования в настоящем изобретении. Подходящие коммерчески доступные фунгициды включают PROTÉGÉ, RIVAL или ALLEGIANCE FL или LS (Gustafson, Plano, TX), WARDEN RTA (Agrilance, St. Paul, штат Миннесота), APRON XL, APRON MAXX RTA или RFC, MAXIM 4FS или XL (Syngenta, Wilmington, штат Делавер), CAPTAN (Arvesta, Guelph, Онтарио) и PROTREAT (Nitragin Argentina, Buenos Ares, Аргентина). Активные ингредиенты в этих и других коммерческих фунгицидах в качестве неограничивающих примеров включают флудиоксонил, мефеноксам, азоксистробин и металаксил. Коммерческие фунгициды наиболее приемлемым образом используются в соответствии с инструкциями производителя инструкции в рекомендуемой концентрации.
В рамках изобретения инсектицид ″демонстрирует активность относительно″ конкретного вида насекомого, если обработка с использованием инсектицида приводит к уничтожению или ингибированию популяции насекомого относительно необработанной популяции. Эффективные инсектициды по изобретению соответственно продемонстрируют активность относительно широкого диапазона насекомых, включая в качестве неограничивающих примеров проволочники, совки, червовидные личинки, личинки, повреждающие корни кукурузы, личинки мухи, повреждающие семена кукурузы, земляные блошки, земляные клопы, тлю, листоеды и щитники.
Коммерческие инсектициды могут быть пригодны для использования в настоящем изобретении. Подходящие коммерчески доступные инсектициды включают CRUISER (Syngenta, Wilmington, штат Делавер), GAUCHO и PONCHO (Gustafson, Plano, штат Техас). Активные ингредиенты в этих и других коммерческих инсектицидах включают тиаметоксам, клотианидин и имидаклоприд. Коммерческие инсектициды наиболее приемлемым образом используются в соответствии с инструкциями производителя в рекомендуемой концентрации.
В рамках изобретения фосфат солюбилизирующие средства в качестве неограничивающих примеров включают фосфат солюбилизирующие микроорганизмы. В рамках изобретения ″фосфат солюбилизирующим микроорганизмом″ является микроорганизм, способный увеличить содержание фосфора, доступного для растения. Фосфат солюбилизирующие микроорганизмы включают штаммы грибов и бактерий. В одном из вариантов осуществления фосфат солюбилизирующий микроорганизм является спорообразующим микроорганизмом.
Неограничивающие примеры фосфат солюбилизирующих микроорганизмов включают виды из вида, выбранного из группы, состоящей из Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida Chryseomonas, Enterobacter, Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter и Xanthomonas.
Неограничивающие примеры фосфат солюбилизирующих микроорганизмов выбраны из группы, состоящей из Acinetobacter calcoaceticus, вида Acinetobacter, вида Arthrobacter, Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, вида Aspergillus, Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, вида Enterobacter, Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, вида Exiguobacterium, вида Klebsiella, Kluyvera cryocrescens, вида Microbacterium, Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, вида Streptomyces, вида Streptosporangium, Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis и Xanthomonas campestris.
Предпочтительно, фосфат солюбилизирующим микроорганизмом является штамм гриба Penicillium. Штаммы гриба Penicillium, которые могут быть пригодны в практическом осуществлении настоящего изобретения, включают P. bilaiae (официально известного как P. bilaii), P. albidum, P. aurantiogriseum, P. chrysogenum, P. citreonigrum, P. citrinum, P. digitatum, P. frequentas, P. fuscum, P. gaestrivorus, P. glabrum, P. griseofulvum, P. implicatum, P. janthinellum, P. lilacinum, P. minioluteum, P. montanense, P. nigricans, P. oxalicum, P. pinetorum, P. pinophilum, P. purpurogenum, P. radicans, P. radicum, P. raistrickii, P. rugulosum, P. simplicissimum, P. solitum, P. variabile, P. velutinum, P. viridicatum, P. glaucum, P. fussiporus и P. expansum.
Более предпочтительно, фосфат солюбилизирующим микроорганизмом вида Penicillium является P. bilaiae, P. gaestrivorus и/или их сочетание. Наиболее предпочтительно, штаммы P. bilaiae выбраны из группы, состоящей из ATCC 20851, NRRL 50169, ATCC 22348, ATCC 18309, NRRL 50162 (Wakelin, et al., 2004. Biol Fertil Soils 40:36-43) и штаммом P. gaestrivorus является NRRL 50170 (см., Wakelin, выше).
По изобретению предполагается, что можно использовать более чем один фосфат солюбилизирующий микроорганизм, такой как, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, включая любую комбинацию, Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida Chryseomonas, Enterobacter, Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter и Xanthomonas, включая один вид, выбранный из следующей группы: Acinetobacter calcoaceticus, вид Acinetobacter, вид Arthrobacter, Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, вид Aspergillus, Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, вид Enterobacter, Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, вид Exiguobacterium, вид Klebsiella, Kluyvera cryocrescens, вид Microbacterium, Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, вид Streptomyces, вид Streptosporangium, Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis и Xanthomonas campestris.
Диазотрофами являются бактерии и археи, которые фиксируют атмосферный газообразный азот в более употребляемую форму, такую как аммиак. Примеры диазотрофов включают бактерии из рода Rhizobium spp. (например, R. cellulosilyticum, R. daejeonense, R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, R. lupini, R. lusitanum, R. meliloti, R. mongolense, R. miluonense, R. sullae, R. tropici, R. undicola и/или R. yanglingense), Bradyrhizobium spp. (например, B. bete, B. canariense, B. elkanii, B. iriomotense, B. japonicum, B. jicamae, B. liaoningense, B. pachyrhizi и/или B. yuanmingense), Azorhizobium spp. (например, A. caulinodans и/или A. doebereinerae), Sinorhizobium spp. (например, S. abri, S. adhaerens, S. americanum, S. aboris, S. fredii, S. indiaense, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae, S. meliloti, S. mexicanus, S. morelense, S. saheli, S. terangae и/или S. xinjiangense), Mesorhizobium spp., (M. albiziae, M. amorphae, M. chacoense, M. ciceri, M. huakuii, M. loti, M. mediterraneum, M. pluifarium, M. septentrionale, M. temperatum и/или M. tianshanense) и их сочетания. В конкретном варианте осуществления диазотроф выбран из группы, состоящей из B. japonicum, R leguminosarum, R meliloti, S. meliloti и их сочетания. В другом варианте осуществления диазотрофом является B. japonicum. В другом варианте осуществления диазотрофом является R leguminosarum. В другом варианте осуществления диазотрофом является R meliloti. В другом варианте осуществления диазотрофом является S. meliloti.
Микоризные грибы образуют симбиотические связи с корнями сосудистого растения и обеспечивают, например, абсорбирующую способность для воды и минеральных питательных веществ, ввиду сравнительно большой площади поверхности мицелия. Микоризные грибы включают эндомикоризные грибы (также именуемые везикуолезная арбускулярная микориза, VAM, арбускулярная микориза или AM), эмикоризные грибы или их сочетание. В одном из вариантов осуществления микоризными грибами является эндомикориза вида Glomeromycota и рода Glomus и Gigaspora. В дополнительном варианте осуществления эндомикоризой является штамм Glomus aggregatum, Glomus brasilianum, Glomus clarum, Glomus deserticola, Glomus etunicatum, Glomus fasciculatum, Glomus intraradices, Glomus monosporum или Glomus mosseae, Gigaspora margarita или их сочетание.
Примеры микоризных грибов включают эктомикоризы типа Basidiomycota, Ascomycota и Zygomycota. Другие примеры включают штамм Laccaria bicolor, Laccaria laccata, Pisolithus tinctorius, Rhizopogon amylopogon, Rhizopogon fulvigleba, Rhizopogon luteolus, Rhizopogon villosuli, Scleroderma cepa, Scleroderma citrinum или их сочетание.
Микоризные грибы включают экроидные микоризы, арбутоидные микоризы или монотропоидные микоризы. Арбускулярные и эктомикоризы образуют эрикоидную микоризу со многими растениями, принадлежащим к порядку вересковых, в то время как некоторые вересковые образуют арбутоидные и монотропоидные микоризы. В одном из вариантов осуществления микориза может быть эрикоидная микориза, предпочтительно типа Ascomycota, такого как Hymenoscyphous ericae или вид Oidiodendron. В другом варианте осуществления микоризой также может быть арбутоидная микориза, предпочтительно типа Basidiomycota. В еще одном варианте осуществления микоризой может быть монотропоидная микориза, предпочтительно типа Basidiomycota. В еще одном варианте осуществления мизоризой может быть микориза орхидных, предпочтительно рода Ризоктония.
Способы по настоящему изобретению применимы к семени бобовых культур, показательные примеры которых включают соевый боб, люцерну, арахис, горох, чечевицу, боб и клевер. Способы по настоящему изобретению также применимы к семени небобовых культур, например, Poaceae, Cucurbitaceae, Malvaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae и Solonaceae. Показательные примеры семени небобовых культур включают полевые культуры, такие как кукуруза, зерновые культуры, такие как рис, ячмень и пшеница, хлопок и канола, и овощные культуры, такие как картофель, томаты, огурцы, свекла, салат-латук и канталупа.
После обработки и с целью хранения семя затем фасуют, например, в 50-фунтовые или 100-фунтовые мешки или навальные мешки или контейнеры, в соответствии со стандартными способами. Семя хранят в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев и даже дольше, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 месяцев или даже дольше при соответствующих условиях хранения, известных в данной области. В рамках изобретения термин ″месяц″ означает 30 суток. В рамках изобретения год означает 365 суток. В то время как посадка семени соевого боба может потребоваться в следующий сезон, семя кукурузы может храниться в течение намного более длительных периодов времени, включая приблизительно 3 года.
Сигнальная молекула растения может быть применима подходящим образом, таким как, в форме композиции обработки семени, содержащей, по меньшей мере, одну сигнальную молекулу растения и сельскохозяйственно-приемлемый носитель.
Можно использовать любой подходящий сельскохозяйственно-приемлемый носитель, например, твердый носитель, полутвердый носитель, жидкий носитель на водной основе, жидкий носитель на безводной основе, суспензию, эмульсию или эмульгируемый концентрат. Сельскохозяйственно-приемлемые носители могут включать, например, адъюванты, инертные компоненты, дисперсанты, поверхностно-активные вещества, реагенты, придающие клейкость, связывающие средства, стабилизаторы и/или полимеры.
Композиция обработки семени может также включать одно или несколько сельскохозяйственно/агрономически целесообразных средств (то есть в дополнение к сигнальной молекуле), таких как, один или несколько диазотрофов, микоризных грибов, гербицидов, фунгицидов, инсектицидов и/или фосфат солюбилизируюших средств.
Настоящее изобретение будет описано посредством следующих неограничивающих примеров. Они представлены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретение каким-либо образом.
Краткое изложение демонстрационных примеров
В примерах 1 и 2 описаны сравнительные полевые эксперименты с использованием семени соевого боба, которые демонстрируют, что описываемое в заявке изобретение достигает повышения урожайности растения. Семя обрабатывали в соответствии с настоящим изобретением за 5 месяцев до посадки с использованием коммерческого продукта Optimize, который является комбинацией инокулянта Bradyrhizobium japonicum и LCO-V (C18:1, MeFuc) (показано на Фиг. 2), и с помощью только LCO, и за 4,5 месяца до посадки с использованием некоммерческих (т.е., менее чистых) видов Optimize и одного только LCO, и с целью сравнения с использованием тех же сигнальных молекул растения во время посадки. Необработанное семя использовали как другой контрольный образец. Результаты, выраженные в отношении разницы в урожайности зерна, измеренной в единицах бушель/акр, показывают то, что способы описываемого в заявке изобретения достигают повышения урожайности соевого боба, относительно непатентоспособных способов (т.е., семя, обработанное во время посадки и необработанное семя).
В примерах 3 и 4 описаны сравнительные эксперименты, проведенные в теплице, в которых продемонстрировано, что описываемое в заявке изобретение достигает характеристик улучшенного роста растения. В примере 3 описан эксперимент, который включал обработку семени соевого боба чистым LCO-V (C18:1, MeFuc) за один месяц и один год до посадки. Культуры соевого боба (включая корни) собирали через десять суток после посадки. Согласно результатам, описанным в отношении различий между длиной и объемом корня, способы по настоящему изобретению достигают значительного улучшения этих качеств. Наконец, в примере 4 описаны эксперименты, проведенные с семенем соевого боба, обработанного с использованием Optimize за 55 суток до посадки и с целью сравнения, семенем соевого боба, обработанным за 7 суток до посадки необработанным семенем. Согласно результатам, выраженным в единицах средней площади поверхности первых тройчатых листьев, описываемое в заявке изобретение также усиливает рост растения в данном отношении.
ПРИМЕР 1
Испытание в полевых условиях проводили с целью оценки вариантов осуществления настоящего изобретения по урожайности зерна применительно к семени соевого боба. Участок полевого испытания находился вблизи г. Уайтуотер, штат Висконсин, и характеризуется по Милфорду почвой пылевато-иловатого суглинка. Согласно полевому анализу почвы, проведенному за шесть месяцев до посадки, pH почвы составил 6,8, содержание органических веществ - 5,3% и содержание фосфора и калия - 39 м.д. и 139 м.д., соответственно.
Сигнальными молекулами растения, использованными в испытании, являлись Optimize, некоммерческий вид Optimize (NI-50S-1), чистый LCO-V (C18:1, MeFuc) (NI-50GREN-1) и некоммерческий вид LCO-V (C18:1, MeFuc) (NI-50S-2CF). Семенем соевого боба, использованного в исследовании, являлось Stine S2118. Сигнальные молекулы растения были распылены на семена с/без разбавления на уровне 4,8 унции/центнер.
Исследование проводили в рандомизированном полноблочном плане, с размером делянки 10 футов на 50 футов (0,011 акра), с 7,5-дюймовой густотой посадки. Проводили четыре повторения. Семя обрабатывали с использованием сигнальных молекул растения за 4,5 или 5 месяцев до посадки и непосредственно перед посадкой и были посажены на глубину 1 дюйма и с нормой высева, составляющей 225000 семян на акр, с использованием зерновой сеялки John Deere 750 NT. Оба пестицида Extreme и AMPS были применены за 11 суток до посадки (перед прорастанием) на уровне 3,0 пинты и 2,5 фунта, соответственно. Assure II, Roundup WeatherMax и AMPS были применены спустя 46 суток после посадки (после прорастания), на уровне 6,0 унций, 21 унции и 2,5 фунтов, соответственно. Растения собирали через 4 месяца и 20 суток после посадки.
Контрольный образец семени обрабатывали количеством (масс.) воды, соответствующем количеству (масс.) экспериментальной композиции сигнальной молекулы (сигнальная молекула + носитель). Контрольный образец семени хранили в тех же условиях, что экспериментальный образец семени, до посадки и сажали одновременно с экспериментальным образцом семенем в ту же почву.
Результаты исследования представлены ниже в таблице 1.
Таблица 1
ГРУППА ОБРАБОТКИ
УРОЖАЙНОСТЬ ЗЕРНА @ 13%
1
Контрольная - неинокулированная
62,5
2
Optimize - при посадке
64,2
3
Optimize - 5 месяцев
65,7
4
NI-50GREN-1 - при посадке
62,2
5
NI-50GREN-1 - 5 месяцев
70,5
6
NI-50S-1 - 4,5 месяца
67,2
7
NI-50S-2CF - 4,5 месяца
69,6
Как отражено в сравнении сравнительной Группы 2 (непатентоспособной) и патентоспособной Группы 3, обработка семени соевого боба с использованием коммерческого вида Optimize за 5 месяцев до посадки привела к повышению урожайности соевого боба с 1,5 бушеля соевых бобов. Как отражено в сравнении Группы 4 и патентоспособной Группы 5, обработка семени соевого боба за 5 месяцев перед посадкой с использованием только чистого LCO-V (C18:1, MeFuc) привела к повышению урожайности соевого боба с 8,3 бушель/акр. Как отражено в сравнении Группы 2 и патентоспособной Группы 6, обработка семян соевого боба за 4,5 месяца до посадки с использованием некоммерческого вида Optimize привела к повышению урожайности соевого боба с 3,0 бушель/акр. Наконец, как показано на сравнении Группы 4 и патентоспособной Группы 7, обработка семян соевого боба с использованием только некоммерческого вида LCO-V (C18:1, MeFuc) за 4,5 месяца до посадки повысила урожайность соевого боба на 7,4 бушель/акр. Измерения урожайности зерна были произведены при уровне содержания влаги в зерне 13%.
ПРИМЕР 2
Испытание соевого боба проводили для оценки вариантов осуществления настоящего изобретения по урожайности зерна применительно к семени соевого боба. Участок полевого испытания находился вблизи г. Уайтуотер, штат Висконсин, и характеризуется по Милфорду почвой пылевато-иловатого суглинка. Согласно полевому анализу почвы, проведенному за шесть месяцев до посадки, pH почвы составил 6,6, содержание органических веществ - 4,8% и содержание фосфора и калия - 41 м.д. и 131 м.д., соответственно.
Сигнальные молекулы растения, использованные в испытании, были те же, что в примере 1. Семенем соевого боба, использованного в исследовании, было Stine S2118. Сигнальные молекулы растения распыляли на семена с/без разбавления на уровне 4,8 унция/центнер.
Исследование проводили в рандомизированном полноблочном плане, с размером делянки 10 футов на 50 футов (0,011 акра), с 7,5-дюймовой густотой посадки. Проводили четыре повторения. Семя обрабатывали с использованием сигнальных молекул растения за 4,5 или 5 месяца до посадки и непосредственно перед посадкой, и были посажены на глубине 1 дюйма и с нормой высева, составляющей 225000 семян на акр, с использованием зерновой сеялки John Deere 750 NT. Оба пестицида Extreme и AMPS были применены за 10 суток до посадки (перед прорастанием) на уровне 3,0 пинты и 2,5 фунта, соответственно. Assure II, Roundup WeatherMax и AMPS были применены спустя 45 суток после посадки (после прорастания), на уровне 6,0 унций, 21 унции и 2,5 фунтов, соответственно. Растения собирали через 4 месяца и 21 сутки после посадки.
Контрольный образец обрабатывали количеством (масс.) воды, соответствующем количеству (масс.) экспериментальной композиции сигнальной молекулы (сигнальная молекула + носитель). Контрольный образец семени хранили в тех же условиях, что экспериментальный образец семени, до посадки и сажали одновременно с экспериментальным образцом семенем в ту же почву.
Результаты исследования приведены ниже в таблице 2.
Таблица 2
ГРУППА ОБРАБОТКИ
УРОЖАЙНОСТЬ ЗЕРНА @ 13%
1
Контрольная - неинокулированная
62,4
2
Optimize - при посадке
64,1
3
Optimize - 5 месяца
68,6
4
NI-50GREN-1 - при посадке
65,8
5
NI-50GREN-1 - 5 месяцев
64,0
6
NI-50S-1 - 4,5 месяца
69,4
7
NI-50S-2CF - 4,5 месяца
66,6
Как отражено в сравнении сравнительной Группы 2 (непатентоспособной) и патентоспособной Группы 3, обработка семени соевого боба с использованием коммерческого вида Optimize за 5 месяцев до посадки привела к повышению урожайности соевого боба с показателем 4,5 бушеля соевых бобов. Как отражено в сравнении Группы 2 и патентоспособной Группы 6, обработка семени соевого боба за 4,5 месяца до посадки с использованием некоммерческого вида Optimize привела к повышению урожайности соевого боба с показателем 5,3 бушель/акр, как показано на сравнении Группы 4 и патентоспособной Группы 7, обработка семян соевого боба с использованием только некоммерческого вида LCO-V (C18:1, MeFuc) за 4,5 месяца до посадки повысила урожайность соевого боба на 0,8 бушель/акр. Единственный негативный ответ, как отражено на сравнении непатентоспособной Группы 4 и патентоспособной Группы 5, показал, что обработка семени соевого боба за 5 месяцев до посадки только чистым LCO привела к снижению до 1,8 бушель/акр, результат связан с необъяснимой вариабельностью, связанной с полевыми испытаниями. Измерения урожайности зерна были произведены при уровне содержания влаги в зерне 13%.
Эксперименты в теплице
ПРИМЕР 3
-7
Семена соевых бобов обрабатывали с использованием 10M чистого LCO-V (C18:1, MeFuc) и хранили при 15°C. Обработанные семена и необработанные семена (контрольные образцы) сажали спустя 1 и 12 месяцев после обработки в тепличных горшках, содержащих песок:перлит (смесь 1:1). Всходы выращивали в течение 10 суток после посадки семян, затем всходы собирали, их корни очищали и измеряли на сканере Winrhizo. Контрольный образец обрабатывали количеством (масс.) воды, соответствующем количеству (масс.) экспериментальной композиции сигнальной молекулы (сигнальная молекула + носитель). Контрольный образец семени хранили в тех же условиях, что экспериментальный образец семени, до посадки и сажали одновременно с экспериментальным образцом семенем в ту же почву. Результаты приведены в таблице 3.
ТАБЛИЦА 3
Обработка
1 месяц после обработки
1 год после обработки
Длина корня (см)
Объем корня (см<sup>3</sup>)
Длина корня (см)
Объем корня (см<sup>3</sup>)
Контрольный
128
0,455
115,5
0,403
LCO
135*
0,468
159,3*
0,540*
% увеличения
5,46
2,86
37,92
34
Результаты, достигнутые в обоих патентоспособных вариантах осуществления изобретения (семя, обработанное и использованием LCO за 1 месяц и 12 месяцев до посадки), и в частности результаты, полученные после 1-летней предварительной обработки, являются значительными, учитывая известный в данной области факт предрасположенности семян соевого боба к порче с течением времени.
ПРИМЕР 4
2
Семена соевых бобов, обработанные с использованием Optimize, хранили при 15°С в холодильнике. Семена сажали спустя 7 (обработанные за 7 суток до посадки) и 55 (обработанные за 55 суток до посадки) суток после обработки в корневые коробки, содержащие смесь торфа и перлита. Для измерения площади их листовой поверхности (см) были взяты первые тройчатые листья через 19 суток. Как показано на Фиг. 3 и в таблице 4, листья, собранные от семени, обработанного в соответствии с настоящим изобретением, имели увеличение среднего значения площади листовой поверхности на 50% больше по сравнению с непатентоспособным вариантом осуществления изобретения (42% против 28%).
Так как известно, что количество бактерий (Bradyrhizobium japonicum) на семени уменьшается с течением времени, увеличение средней площади поверхности, показанное на растениях, собранных от семени, обработанного за 55 суток до посадки, может быть также связано с микоризным LCO.
Вся патентная и непатентная литература, указанная в настоящем описании изобретения, является показателем уровня квалификации специалистов в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Все эти публикации включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно обозначена для включения посредством ссылки.
Хотя изобретение в настоящем документе описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, следует понимать, что эти варианты осуществления только показывают принципы и применения по настоящему изобретению. Таким образом, следует понимать, что к показательным вариантам осуществления могут быть осуществлены многочисленные модификации и что могут быть разработаны другие способы и методы реализации без отступления от существа и объема настоящего изобретения, как определено приложенной формулой изобретения.