Экспрессия фактора foxp3 и соотношение его изоформ в Т-клетках на разных стадиях дифференцировки

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2012

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.438.014.017.1

А. Н. Митин, М. М. Литвина, Н. И. Шарова, В. Т. Селиваненко,

М. А. Мартаков, С. В. Латышев, А. А. Ярилин

ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА FOXP3 И СООТНОШЕНИЕ ЕГО ИЗОФОРМ В Т-КЛЕТКАХ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, ГУ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского, Москва

Анализировали экспрессию транскрипционного фактора регуляторных Т-клеток (Treg) FOXP3 в лимфоцитах тимуса и периферической крови у людей методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, отличающихся по эпитопной специфичности, — PCH101 и 150D/E4 (специфичны соответственно к продуктам экзонов 1 и 2). Это позволило дифференцированно выявлять целую молекулу FOXP3 и продукты сплайсинга, затрагивающие экзон 2 (А2 и А2А7). Показано, что в различных фракциях тимуса и субпопуляции CD4+CD8- Т-клеток крови лишь часть FOXP3+-клеток содержит полномасштабную молекулу. В тимусе доля клеток, не имеющих в составе молекулы FOXP3 продукт экзона 2, возрастает в ряду клеточных фракций: CD4-CD8- (6%) > CD4+CD8+ (43%) > CD4+CD8- (75%) > CD4-CD8+ (93%). Доля этих клеток в составе субпопуляций CD4+CD8--клеток тимуса и крови одинакова. Во фракции CD4+CD8+-тимоцитов коэкспрессия молекул FOXP3 и CD25, рассматриваемая как признак истинных регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), свойственна 43% FOXP3+-клеток, во фракции CD4+CD8--клеток она почти в 2 раза выше. Коэкспрессия молекул FOXP3 и CD25, возрастающая по мере созревания Т-клеток, выражена в равной степени в Treg, экспрессирующих полномасштабную или лишенную экзона 2 молекулу FOXP3. Поскольку продукт экзона 2 отвечает за взаимодействие с транскрипционными факторами семейства ROR, ответственными за дифференцировку Tl'117-клеток, предполагается, что наличие или отсутствие этого участка в молекуле FOXP3 определяет функциональные взаимосвязи и взаимопревращения Treg и Tl'117-клеток.

Ключевые слова: регуляторные Т-клетки, тимус, фактор FOXP3, изоформы, дифференцировка

Mitin A.N., LytvynaM.M., Sharova N.I., Selivanenko V.T., MartakovM.A., Latyshev S.L., Yarilin A.A.

THE EXPRESSION OF THE FACTOR FOXP3 AND THE RATIO OF ITS ISOFORMS IN T-CELLS AT DIFFERENT STAGES OF DIFFERENTIATION

We analyzed the expression of transcription factor regulatory T cells (Treg), FOXP3 in the thymus lymphocytes and peripheral blood of people by flow cytometry using monoclonal antibodies of different epitope specificity — РСН101 and 150D/ E4 (specific, respectively, to the products of exons 1 and 2). This allowed to identify differentially a single molecule FOXP3 and products splicing, affecting the exon 2 (Д2 and Д2Д7). It is shown that in the various factions of thymus and subpopulations of CD4+CD8- T cells of the blood of the only part of the FOXP3+ cells contains a full-scale molecule. In the share of cells, not having in the composition of molecules FOXP3 product of exon 2, increases in the number of cellular fractions: CD4-CD8- (6%) > CD4+CD8+ (43%) > CD4+CD8- (75%) > CD4-CD8+ (93%). The share of these cells in the subpopulation structure of CD4+CD8 cells of thymus and blood is the same. In the fraction of CD4+CD8+ timosites coexpression molecules FOXP3 and CD25, considered as a sign of a true regulatory T cells (Treg), are characterized by 43% FOXP3+ cells, in a fraction of CD4+CD8 cells she almost in 2 times above. Coexpression molecules FOXP3 and CD25, increasing as maturing T cells expressed equally in the Treg, expressing full-scale or devoid of the 2-nd of exon molecule FOXP3. Because the product of exon 2 is responsible for interaction with the family of transcription factors ROR, responsible for the differentiation of t H17 cells, it is assumed that the presence or absence of this site in a molecule of FOXP3 defines the functional relationships and interconversion Treg and t H17 cells.

Key words: regulatory T-cells, the thymus, the factor FOXP3, isoforms, differentiation

Транскрипционный фактор FOXP3 относится к семейству FOX (Forkhead box), представители которого участвуют в контроле морфогенеза различных органов и тканей. Этот фактор обеспечивает дифференцировку и функционирование регуляторных Т-клеток (Treg) [16, 17], описанных в 1995 г. как CD4+CD25hi Т-лимфоциты [1, 13]. Следствием мутаций гена FOXP3 и вызываемого ими дефицита Treg у мыши и человека является развитие летального аутоиммунного процесса, затрагивающего различные органы и ткани и сопровождающегося доброкачественной лимфопролиферацией [3, 4]. У мышей дифференцировка Treg однозначно связана с экспрессией гена

Ярилин Александр Александрович — д-р мед. наук, проф., тел. 8(499)617-79-19

FOXP3, причем нокаут этого гена приводит к утрате развития этих клеток, а повышенная экспрессия вследствие трансфекции гена в Т-клетки — к приобретению ими супрессорной активности и фенотипа Treg [7, 8]. У человека взаимосвязь между активностью FOXP3 и диффе-ренцировкой Treg не столь однозначна: экспрессия FOXP3 является необходимым, но не достаточным условием диф-ференцировки этих клеток [2, 17].

Если у мышей фактор FOXP3 существует в единственной молекулярной форме, то у человека описано по крайней мере четыре изоформы данной молекулы, одна из которых является полномасштабной, а три другие формируются в результате сплайсинга отдельных экзонов — экзона 2 [2], экзона 7 [10] или одновременно экзонов 2 и 7 [11]. Экзон 2 кодирует домен молекулы FOXP3, ответственной за взаи-

- 172 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

модействие с транскрипционными факторами семейства ROR — а и у. Одна из функций этих факторов — индукция дифференцировки ТЪ17-клеток [6, 9], с которыми Treg тесно связаны сходными условиями дифференцировки и возможностью взаимных превращений. В связи с этим в отсутствие продуктов экзона 2 невозможна передифферен-цировка Treg в Тй17-клетки. Экзон 7 кодирует последовательность, ответственную за димеризацию молекулы [13]. Treg, экспрессирующие укороченные изоформы FOXp3, лишенные продуктов экзона 2, способны выполнять свою основную функцию [15], тогда как относительно изоформ, лишенных продуктов экзонов 2 и 7, в литературе имеются разногласия. Первоначально показано, что молекула FOXP3, не содержащая продуктов экзонов 2 и 7, способна подавлять проявления активации Т-клеток [15]. Однако затем установлено, что такая молекула при сохраненной способности к димеризации и взаимодействию с рядом транскрипционных факторов не обеспечивает выполнение функций Treg; предполагается, что эта изоформа участвует в регуляции активности других изоформ FOXP3 [11].

Таким образом, функции изоформ Treg поняты лишь в самых общих чертах. Отсутствуют данные о становлении спектра изоформ FOXP3 на разных этапах развития Treg, в частности об особенностях этого спектра у естественных и адаптивных Treg, имеющих различный генез и выполняющих не вполне идентичные функции [5]. Не изучены патологические последствия усиленной и ослабленной экспрессии неполных изоформ FOXP3. Задача по изучению особенностей экспрессии изоформ FOXP3 на разных этапах дифференцировки Т-клеток решалась нами в данной работе в отношении изоформ, содержащих продукт экзона 2 и лишенных его. Выбор объекта изучения был продиктован методическими возможностями. Ранее изоформы молекулы FOXP3 выявляли в полимеразно-цепной реакции по наличию двух продуктов амплификации, отличающихся по электрофоретической подвижности, а также путем подбора праймеров, позволяющих получить продукты, содержащие конкретный экзон [2]. Существует также возможность определения различий в доменном составе FOXP3 с использованием моноклональных антител, специфичных к различным участкам его молекулы [12]. Мы воспользовались этим подходом для изучения методом проточной цитометрии особенностей экспрессии молекулы FOXP3 и ее вариантов, лишенных продуктов экзона 2, благодаря доступности коммерческих моноклональных антител (АТ) ("eBioscience", США), специфически распознающих продукты экзонов 1 и 2 (рис. 1).

Материалы и методы. Исследовали кровь 16 практически здоровых лиц обоего пола в возрасте от 20 до 40 лет и три тимуса детей, которые удаляли хирургически в ходе операций по поводу врожденных пороков сердца в отделении кардиохирургии ГУ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского. Из крови общепринятым методом выделяли мононуклеар-

1-69 70-105 106-190

Экзон 1 PR Экзон 2

Взаимодействие с ROR Взаимодействие с HDAC

РСН101 FJK-16S 236А/Е7

150D/E4 eBio7979

ную фракцию. Тимус измельчали и суспензированные клетки, более 95% которых представляли собой тимоциты, использовали в работе. Клетки суспензировали в среде RPMI 1640 ("Sigma", США) с добавлением 0,02 М HEPES-буфера, L-глутамина (300 мкг/мл, "Sigma", США) и 10% сыворотки эмбрионов телят ("Gibco", США).

В работе использовали моноклональные АТ, меченные флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), перидинин-хлорофилл протеин-цианином 5.5 (PerCP-Cy5.5), фикоэритрином цианином-7 (PE-Cy7) и алофикоцианином (APC): анти-CD4-PerCP-Cy5.5 или -FITC, анти-CD8-FITC или -PerCP-Cy5.5, анти-CD25-APC или -PE-Cy75 ("eBioscience", США, и "Сорбент", Россия), а также два типа моноклональных АТ к FOXP3 ("eBioscience", США) — PCH101-APC или -PCH101-PE, специфичные к продуктам экзона 1, и 150D/E4-PE, направленные против экзона 2 молекулы FOXP3 (см. рис. 1).

После окрашивания клеток АТ к мембранным антигенам CD4, CD8 и CD25 клетки фиксировали и пермеабилизирова-ли с помощью Foxp3 Staining Buffer Set (Cat. No00-5523-00; "eBioscience", США) для выявления внутриклеточных молекул FOXP3. Клетки ресуспендировали и добавляли в пробирку по 1000 мкл раствора для фиксации и пермеабилизации на 20 мин при 4°C. Далее клетки дважды отмывали однократным буфером для пермеабилизации, ресуспендировали в 100 мкл того же буфера с добавлением оптимальной концентрации АТ к FOXP3, инкубировали 40—60 мин в темноте при комнатной температуре и дважды отмывали. Далее клетки дважды отмывали однократным пермеабилизирующим буфером.

В качестве изотипического контроля использовали Rat IgG2a kappa Isotype Control-APC или Rat IgG2a kappa-PE для FOXP3 (клон PCH101) и Mouse IgG1 к Iso Control-PE для FOXP3 (клон 150D/E4).

Проточную лазерную цитометрию осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II ("Becton Dickinson", США) в стандартном режиме. Данные анализировали с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.

Фракционирование тимоцитов проводили с использованием ферромагнитных шариков фирмы "DYNAL" CD4 Positive Isolation Kit и CD8 Positive Isolation Kit в соответствии с рекомендацией фирмы.

Данные статистически обрабатывали с помощью общепринятых методов вариационной статистики с использованием /-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Алгоритм цитофлюорометрического определения экспрессии FOXP3+ в клетках крови отражен на рис. 2. Мононуклеары крови анализировали методом светорассеяния (см. рис. 2, а). Выделяли гейт лимфоцитов, в которых определяли экспрессию CD4 и CD8 (см. рис. 2, б). Фракцию CD8+-лимфоцитов использовали в качестве внутреннего отрицательного контроля: поскольку эти клетки практически не экспрессируют FOXP3, на их дот-плоте определяли область (гейт) FOXP3+-клеток (см. рис. 2, в), границы ко-

200-223 240-261 338-341

Димеризация Связывание с ДНК,

супрессорная

функция

Рис. 1. Схема молекулы FOXP3, локализации в ней доменов и сайтов связывания различных моноклональных АТ к молекуле FOXP3 человека [14 и сайт http://www.ebioscience.com/].

Линии соответствуют участкам связывания указанных АТ. PR (Prolin-rich) — домен, богатый пролином, ROR (Retimoid-like orphan receptor) — семейство транскрипционных факторов; HDAC — деацетилаза гистонов; ZF (Zink finger) — "цинковые пальцы" (обозначение домена); LZ (Leucin zipper) — "лейциновая застежка" (обозначение домена, ответственного за димеризацию); FOX (Forkhead box — "вильчатая голова") — обозначение домена, ответственного за основную функцию FOXP3 как транскрипционного фактора Treg.

- 173 -

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2012

торого использовали для подсчета содержания FOXP3+-клеток в лимфоцитах (см. рис. 2, г). Затем гейт FOXP3+-клеток анализировали на распределение по CD4+- и СБ8+-фракциям (см. рис. 2, д), а также на экспрессию CD25 (см. рис. 2, е) или CD127 (не представлено). Аналогично изучали клетки тимуса (рис. 3): вначале анализировался гейт CD4—клеток (внутренний отрицательный контроль), в котором очерчивалась область практически отсутствующих FOXP3+-клеток, затем оценивалось количество этих клеток в популяции CD4+-тимоцитов. Экспрессию FOXP3 в клетках крови и тимуса оценивали параллельно с использованием АТ PCH101, специфичных к продукту экзона 1, и 150D/E4, специфичных к продукту экзона 2.

С помощью АТ PCH101 определили, что содержание клеток, экспрессирующих все молекулярные формы фактора FOXP3, составило 2,38 ± 0,67% (M ± SD) общего количества мононуклеаров крови. Из них 90,5 ± 3% несут на поверхности CD4. Доля FOXP3+CD4+-клеток от общего количества мононуклеаров крови составляет 2,15 ± 0,64%, от уровня CD4+ Т-лимфоцитов — 4,86 ± 1,3%. Процент FOXP3+-клеток имеет тенденцию к некоторому увеличению с возрастом: у лиц 20—22 лет он составляет (от количества мононуклеаров) 1,81 ± 0,13%, у лиц 35—40 лет — 2,13 ± 0,76%. При этом доля FOxP3+CD4+-клеток от уровня FOXP3+-клеток достоверно (р < 0,05) снижается — с 92,6 ± 0,89 до 87,0 ± 0,7%. В тимусе доля FOXP3+-клеток составляет 7,66 ± 2,03% суммы CD4+-клеток и 10,4 ± 2,75% количества зрелых CD4+CD8--тимоцитов. В других популяциях тимуса (CD4-CD8-, CD4-CD8+) содержание FOXP3+-клеток обычно не превышает 1—2%.

Поскольку у человека экспрессия FOXP3 не является столь однозначным признаком Treg, как у мышей, в ка-

а

честве истинных Treg у человека можно рассматривать Т-клетки, одновременно экспрессирующие обе молекулы (FOXP3 — внутри клетки, CD25 — на ее поверхности). Содержание FOXP3+ CD4+CD25+-клеток от общего количества мононуклеаров составляет 1,68 ± 0,46%, от уровня CD4+ Т-лимфоцитов крови — 3,98 ± 0,78%. Молекулу CD25 экспрессирует 77,6 ± 10,5% FOXP3+-клеток крови. Коэкспрессия FOXP3 и CD25 присуща около 45% FOXP3+CD4+CD8+-тимоцитов, тогда как во фракции более зрелых FOXP3+CD4+CD8--тимоцитов и CD4+ Т-клеток крови уровень коэкспрессии FOXP3 и CD25 почти в 2 раза выше (рис. 4). Соотношение FOXP3+CD25+/FOXP3+CD25-для CD4+8--тимоцитов составляет 2:1, а для CD4+8--клеток крови — 4:1. Это может быть истолковано как свидетельство того, что экспрессия CD25 реализуется на определенных стадиях созревания естественных Treg.

При параллельном использовании моноклональных АТ PCH101 и 150D/E4, выявляющих соответственно все варианты молекулы FOXP3 и молекулы, несущие продукты экзона 2, содержание FOXP3+-клеток от количества CD4+ Т-лимфоцитов крови составило 4,86 ± 1,3 и 1,09 ± 0,4%, т. е. лишь 24% клеток экспрессировала молекулу FOXP3, содержащую продукт экзона 2 (далее — FOXP3/2+). Вычитая процент клеток, определяемых с помощью АТ 150D/E4 (FOXP3.2+-клетки), из процента клеток, выявленных с помощью АТ PCH101 (все FOXP3+-клетки), получали величину, характеризующую процент FOXP3+-клеток, лишенных продукта экзона 2 (FOXP3.2--клеток). По расчетным данным, уровень FOXP3.2--клеток составлял 3,76 ± 1,31% количества CD4+ Т-лимфоцитов крови. Соотношение вариантов FOXP3 2+ и 2- в крови составило в среднем 0,29, а доля клеток, экспрессирующих б в

1024

0 ------------------------

0 256 512 768 1024

FSC-A

CD4- РэгСР- Су 5- 5

Рис. 2. Алгоритм определения количества клеток (на примере мононуклеаров крови), экспрессирующих молекулы FOXP3. а — вычленяют гейт лимфоцитов; б — определяют клетки, экспрессирующие молекулы CD4 и CD8; в — в гейте CD8+-лимфоцитов выявляют область клеток, практически не экспрессирующих FOXP3 (экспрессия которого не характерна для этих клеток), — внутренний отрицательный контроль; г — в суммарном гейте лимфоцитов просматривается эта область для определения общего содержания FOXP3+-клеток; д — устанавливают распределение FOXP3+-клеток по фракциям CD4+CD8--, CD4+CD8+-, CD4'CD8+- и CD4'CD8'-клеток; е — распределяют FOXP3+-клетки по фракциям CD25-- и CD25+-клеток. На схемах типа дот-плот по осям отражена интенсивность свечения (в усл. ед.) соответствующими АТ. На гистограммах по оси абсцисс — интенсивность свечения, по оси ординат — количество клеток с соответствующей интенсивностью свечения. FSC — прямое светорассеяние, SSC — боковое.

- 174 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Рис. 3. Пример цитофлюорометрического выявления экспрессии клетками тимуса молекулы FOXP3, выявляемой с помощью двух вариантов моноклональных АТ.

Экспрессия FOXP3 в клетках определяют с помощью моноклональных АТ PCH101 и 150D/E4, распознающих продукты соответственно экзонов 1 и 2 в молекуле FOXP3. FOXP3+-клетки определяются в CD4--фракции (внутренний отрицательный контроль) и фракциях CD4+-клеток (суммарной и CD4+CD8-). По осям отражена интенсивность свечения (в усл. ед.) клеток. FSC-A — прямое светорассеяние; PE — окрашиваемость моноклональными АТ 150D/E4 и PCH101.

полномасштабную молекулу, — 24%

(табл. 1).

При определении с помощью вышеназванных моноклональных АТ распределения изоформ FOXP3 в CD4+CD25+-клетках выявили такое же соотношение FOXP3.2+- и FOXP3.2--клеток: содержание первых составило 0,9 ± 0,28%, вторых — 3,08 ± 0,84%. Их соотношение составило 0,29, а доля клеток, экспрессирующих полномасштабную изоформу FOXP3, составила 23%, т. е. практически столько же, сколько во всей популяции CD4+-клеток (см. табл. 1).

При анализе экспрессии двух вариантов молекулы FOXP3 в субпопуляциях тимоцитов в сопоставлении с CD4+ Т-клетками крови обнаружили различия между фракциями тимо-цитов. В суммарной фракции CD4+-тимоцитов, включающей CD4+CD8+-и CD4+CD8--клетки, из 7,66%

FOXP3+-клеток 4,1%, а во фракции CD4+CD8--тимоцитов 6,96% клеток не экспрессировали продукт экзона 2.

Таким образом, доля FOXP3.2+-клеток от общего количества FOXP3+-тимоцитов уменьшается при диффе-ренцировке дубльположительных в CD4+CD8--клетки с 64,9 до 33,2%.

Более детальный анализ распределения изоформ FOXP3 в субпопуляциях тимоцитов осуществили в опытах с фракционированием клеток тимуса методом магнитной сепарации (табл.

2). Во фракции CD4-CD8--тимоцитов, содержащей самые юные клетки тимуса, практически все немногочисленные FOXP3+-лимфоциты содержали экзон

2. Однако эти клетки могли оказаться в данной фракции в виде примеси. Во фракции CD4+CD8+-тимоцитов экзон 2 определяли более чем в половине (57,2%) FOXP3+-клеток. Во фракции CD4+CD8--тимоцитов на долю FOXP3.2+-клеток приходилось в 2 раза меньше клеток — всего 25,5%. Еще меньшая доля FOXP3.2+-клеток (7,1%) содержится во фракции CD4-CD8+-клеток тимуса, однако нет уверенности в том, что это не примесь клеток из других фракций. Параллельно определявшаяся доля FOXP3.2+-клеток в популяции CD4+CD8- FOXP3+-клеток крови примерно такая же, как и в соответствующей фракции тимоцитов, — 27,2%.

Во фракции CD4+CD8+-тимоцитов коэкспрессия FOXP3 и CD25 в равной степени свойственна FOXP3.2+-и FOXP3.2--клеткам, во фракции CD4+CD8--клеток тимуса коэкспрессия несколько преобладает на FOXP3.2--ктлетках, а в субпопуляции CD4+CD8—клеток крови это преобладание становится весьма значительным (см. рис. 4). Таким образом, для Treg, экспрессирующих укороченный вариант фактора FOXP3, более свойствен полноценный фенотип FOXP3+CD25+, чем для Treg, несущих полномасштабную молекулу FOXP3. Однако соотношение

Рис. 4. Доля CD25+-клеток во фракциях FOXP3+-тимоцитов и Т-клеток крови, содержащих различные варианты молекулы FOXP3. CD4+8+ Тц — CD4+8+'Tимоциты; CD4+8- Тц — CD4+8''Tимоциты; CD4+8-Ткр — CD4+8- T- клетки крови; по оси ординат — процент CD25+'Kлеток в FOXP3+'фракции указанных популяций.

Таблица 1

Соотношение изоформ молекулы FOXP3 в популяции CD4+ FOXP3+ Т-клеток крови

Популяция Все FOXP3+, % FOXP3.2+, % FOXP3.2-, % Доля FOXP3.2+ от всех FOXP3+, % FOXP3.2+/ FOXP3.2-

FOXP3+ FOXP3+CD25+ 4,86 ± 1,3 3,98 ± 0,78 1,09 ± 0,41 0,90 ± 0,28 3,76 ± 1,31 3,08 ± 0,84 23,6 ± 9,1 23,3 ± 7,8 0,29 0,29

Примечание. Представлено процентное содержание клеток (M ± SD) в популяции CD4+ T- лимфоцитов крови (п = 8).

- 175 -

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2012

Таблица 2

Содержание РОХР3+-клеток и соотношение изоформ, содержащих продукт экзона 2 и лишенных его в субпопуляциях тимоцитов и CD4+ Т-лимфоцитах крови

Происхождение клеток Фенотип клеток Сумма FOXP3+, % FOXP3.2+, % FOXP3.2-, % Доля FOXP3.2+, % FOXP3.2+/ FOXP3.2-

Тимус CD4-CD8- 1,33 1,25 0,08 94 15,6

CD4+CD8+ 11,89 6,80 5,09 57,2 1,34

CD4+CD8- 10,14 2,59 7,55 25,5 0,34

CD4-CD8+ 2,10 0,15 1,95 7,1 0,08

Периферическая кровь CD4+CD8- 6,17 1,68 4,49 27,2 0,26

Примечание. Представлен процент РОХР3+-клеток от общего количества клеток в указанных популяциях.

FOXP3.2+- и БОХР3.2--клеток в исследованных субпопуляциях практически не различается в СВ25+СБ25~фрак-циях, составляя примерно 1,3 для СВ4+СВ8+-тимоцитов, 0,33 для СБ4+СШ--тимоцитов и 0,29 для CD4+CD8-Т-клеток крови.

Характерное для Treg ослабление экспрессии а-цепи рецептора для интерлейкина-7 (CD127) менее свойственно FOXP3+-клеткам, выявляемым с помощью АТ к экзо-ну 2 (150D/E4), т. е. содержащим FOXP3.2, чем клеткам, определяемым АТ PCH101. Так, средняя интенсивность флюоресценции (MFI) при связывании с клетками меченых АТ к CD127 для CD4+CD8- Treg, определяемых с помощью АТ PCH101 (сумма FOXP3+-клеток), составляет для клеток тимуса 162 усл. ед., для фенотипически аналогичных клеток крови 326 усл. ед., а для CD4+CD8- Treg, выявляемых с помощью АТ 150D/E4 (FOXP3.2+), соответственно 251 и 412 усл. ед. Из этого следует, что FOXP3.2--клетки содержат на своей поверхности меньше молекул CD127, чем FOXP3.2+-клетки (т. е. FOXP3.2--клетки в большей степени, чем FOXP3.2+-клетки, соответствуют критериям принадлежности к Treg).

Итак, для FOXP3+-клеток тимуса и периферической крови свойственна гетерогенность по наличию вариантов молекул FOXP3, содержащих продукт экзона 2 и лишенных его вследствие сплайсинга по экзону 2 или одновременно по экзонам 2 и 7. Доля клеток, которые экспрессируют молекулы FOXP3, содержащие продукт экзона 2 (условно говоря — полные молекулы), выше во фракции CD4+CD8+-тимоцитов, чем в субпопуляциях CD4+CD8--клеток тимуса и крови. Можно предположить, что в CD4+CD8+-фракции содержатся более молодые Treg, в которых интенсивность сплайсинга мРНК, кодирующей FOXP3, выражена слабее, чем в более зрелых CD4+CD8--клетках. Поскольку доля FOXP3.2+-клеток во фракции CD4+CD8- Treg крови и тимуса практически не различается, можно допустить, что эта изоформа в одинаковой степени представлена в естественных (присутствующих и в тимусе, и в крови) и индуцированных (присутствующих в крови, но не в тимусе) Treg. Соотношение изоформ FOXP3 в конкретных субпопуляциях Т-клеток практически не зависит от наличия или отсутствия на клетках мембранной молекулы CD25.

Пока трудно оценить функциональную значимость вариаций соотношения 2+/2--изоформ FOXP3. Поскольку экзон 2 FOXP3 ответствен за взаимодействие с факторами RORa и RORy [10], а последние обусловливают дифферен-цировку Th17-клеток, можно допустить, что 2+/2--статус имеет значение для взаимодействия и взаимных превращений Treg и ^П-клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ярилин А. А., Донецкова А. Д. Естественные регуляторные

Т-клетки и фактор FOXP3 // Иммунология. — 2006. — Т. 37,

№ 3. — С. 176—188.

2. Allan S. E., PasseriniL., Bacchetta R. et al. The role of 2 FOXP3 isoforms in the generation of human CD4+ Tregs // J. Clin. Invest. — 2005. — Vol. 115. — P. 3276—3284.

3. Bennett C. L., Christie J., Ramsdell F. et al. The immune dys-regulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3 // Nature Genet. — 2001. — Vol. 27. — P. 20—21.

4. ClarkL. B., Appleby M. W., Brunkow M. et al. Cellular and molecular characterization of the scurfy mouse mutant // J. Immunol. — 1999. — Vol. 162. — P. 2546—2554.

5. Curotto de Lafaille M. A., Lafaille1 J. J. Natural and adaptive FOXP3+ regulatory T cells: More of the same or a division of labor? // Immunity. — 2009. — Vol. 30. — P. 629—635.

6. Du J., Huang C., Zhou B., Ziegler S. F. Isoform-specific inhibition of RORa-mediated transcriptional activation by human FOXP3 // J. Immunol. — 2008. — Vol. 180. — P. 4785—4792.

7. Fontenot J. D., Gavin M. A., Rudensky A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells // Nature Immunol. — 2003. — Vol. 4. — P. 330—336.

8. Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 // Science. — 2003. — Vol. 299. — P. 1057—1061.

9. Ichiyama K., Yoshida H., Wakabayashi Y. et al. Foxp3 inhibits RORyt-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORyt // J. Biol. Chem. — 2008. — Vol. 283. — P. 17003—17008.

10. Kaur G., Goodall J. C., Jarvis L. B., Gaston J. S. H. Characterisation of Foxp3 splice variants in human CD4+ and CD8+ T cells — Identification of Foxp3delta7 in human regulatory T cells // Mol. Immunol. — 2010. — Vol. 48. — P. 321—332.

11. Mailer R. K. W., Kirsten Falk K., Rotzschke O. Absence of leucine zipper in the natural FOXP3D2D7 iso form does not affect dimerization but abrogates suppressive capacity // PLoS ONE. — 2009. — Vol. 4. — P. 1—17.

12. Presicce P., Moreno-FernandezM. E., Lages C. S. et al. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3 // Cytometry A. — 2010. — Vol. 77. — P. 571—579.

13. Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M. et al. Immunologic sell-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor а-chains (CD25) // J. Immunol. — 1995. — Vol. 155. — P. 1151—1164.

14. Sakaguchi S., Finney H. M., Nesbitt A. M. et al. FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system // Nature Rev. Immunol. — 2010. — Vol. 10. — P. 490—500.

15. Smith E. L., Finney H. M., Nesbitt A. M. et al. Splice variants of human FOXP3 are functional inhibitors of human CD4+ T-cell activation // Immunology. — 2006. — Vol. 119. — P. 203—211.

16. Weigel D., Jurgens G., Kuttner F. et al. The homeotic gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo // Cell. — 1989. — Vol. 57. — P. 645—658.

17. ZieglerS. F. FOXP3: of mice and men //Annu. Rev. Immunol. — 2006. — Vol. 24. — P. 209—226.

Поступила 17.05.12

- 176 -