СПОСОБ ОЦЕНКИ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ
METHOD FOR EVALUATING OXIDATIVE STRESS IN METABOLIC SYNDROME

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии и эндокринологии, и может быть использовано для определения оксидативного стресса при метаболического синдроме и его кардиоваскулярных осложнениях, в частности, при гипертонической болезни и ишемической болезни сердца.
Повышение продукции производных свободно-радикального окисления и перекисного окисления липидов, равно как и истощение антиоксидантных защитных механизмов, приводит к развитию оксидативного стресса (Liguori I., Russo G., Curcio F., Bulli G., Aran L., Della-Morte D., Gargiulo G., Testa G., Cacciatore F., Bonaduce D., Abete P. Oxidative stress, aging, and diseases. Clinical Interventions in Aging. 2018; 13: 757-772). Проблема диагностики оксидативного стресса является достаточно актуальной (Beharry K.D., Cai C.L., Henry М.М., Chowdhury S., Valencia G.B., and Aranda J.V. Co Enzyme Q10 and n 3 Polyunsaturated Fatty Acid Supplementation Reverse Intermittent Hypoxia Induced Growth Restriction and Improved Antioxidant Profiles in Neonatal. Rats. Antioxidants (Basel). 2017; 16; 6(4):103.). В настоящее время для оценки оксидативного стресса используют отдельные показатели антиоксидантной системы, индексы свободно-радикальных реакций, интенсивность которых в организме чаще всего оценивают по уровню продуктов перекисного окисления в сыворотке крови, активных продуктов тиобарбитуровой кислоты. Тем не менее, определение выраженности оксидативного стресса затруднено из-за отсутствия четких критериев, что приводит к неадекватной оценке полученных данных и их интерпретации, снижает точность оценки.
Известны ряд индексов для оценки окислительного стресса при различных заболеваниях и состояниях (Колесникова Л.И., Мадаева И.М., Семенова Н.В., Гребенкина Л.А., Солодова Е.И. Оценка окислительного стресса у женщин с нарушениями в постменопаузе с использованием интегрального показателя. Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 12:29-32), (Колесникова Л.И, Толпыгина О.А., Курашова Н.А., Гребенкина Л.А., Долгих М.И, Дашиев Б.Г. Коэффициент окислительного стресса у мужчин репродуктивного возраста при бесплодии. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2011; 5 (81):72-75). При этом, в вышеприведенных способах используется большое количество показателей, оперирование сложными формулами, что требует больших временных затрат, нет возможности осуществлять экспресс-оценку, необходимую для контроля лечения и профилактики заболеваний, индуцированных оксидативным стрессом.
Известен способ оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме (Сорокина Ю.А., Ловцова Л.В. Коэффициенты окислительного стресса как способ персонифицирования фармакотерапии в дебюте СД 2 типа. Universum: Медицина и фармакология: электрон, научн. журн. 2015; 1(14) с. 4), включающий определение гликированного гемоглобина, С-пептида, уровней гликемии, показателей перекисного окисления липидов - малонового диальдегида, триеновых конъюгатов, диеновых конъюгатов и окислительной модификации альдегид-динитрофенилгидразона, кетон-инитрофенилгидразона, общей антиоксидантной активности, максимальной интенсивности индуцированной хемилюминесценции, активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы, с последующей оценкой полученных результатов по интегральному показателю функционирования ферментов антирадикальной защиты и спектрофотометрическим данным по формуле.
К недостаткам данного способа относятся следующие: малая информативность, не может широко использоваться в клинике, так как в большей степени диагностика ориентирована на больных сахарным диабетом и учитывает узкоспецифические показатели - гликированный гемоглобин, уровень гликемии, изменяющиеся только при данном заболевании, необходимость определения большого количества показателей увеличивает временные параметры оценки оксидативного стресса, не высокая точность, так как диеновые и триеновые конъюгаты являются нестойкими соединениями, что затрудняет их определение.
В качестве прототипа выбран способ оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме (Патент РФ №2436101; Опубл. 2011), включающий определение в комплексе активности супероксиддисмутазы (СОДi) и каталазы (KATi) в гемолизате, оценку изменения этих показателей относительно нормы, которая соответствует значениям СОДk=0,16±0,02 и KATk=115,55±9,41, и при значении соотношения этих показателей, равном 1,000±0,002, определяют отсутствие дисбаланса функционирования ферментов антирадикальной защиты, а при других значениях дополнительно определяют степень выраженности окислительного стресса по максимуму и площади вспышки хемилюминесценции, с последующей оценкой дисбаланса функционирования ферментов антирадикальной защиты, вычисляя интегральный показатель функционирования ферментов антирадикальной защиты ИПФФАРЗi обследуемого в единицах соотношения каталаза/супероксиддисмутаза по формуле, и при значении ИПФФАРЗi ниже 70,0 ед. определяют недостаточность каталазы, а при значении ИПФФАРЗi выше 130,0 ед. определяют недостаточность супероксиддисмутазы.
К недостаткам прототипа можно отнести такие, как длительность оценки, в связи с использованием большого количества показателей, не высокая информативность, так как супероксиддисмутаза и каталаза являются преимущественно внутриклеточными антиоксидантами, и не учитываются плазменные антиоксиданты, имеющие существенное значение в защите от свободных радикалов, что не позволяет полностью оценить все звенья антиоксидантной системы, приводящие к развитию и формированию оксидативного стресса, необходимость применения дополнительного оборудования при использовании метода люминесценции.
Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме с существенными признаками заявляемого способа.
Вышеописанный уровень техники свидетельствует о том, что при оценке оксидативного стресса при метаболическом синдроме проблемой является малоинформативность, низкая точность и длительность диагностики, что не позволяет своевременно корректировать лечебную тактику у больных с данной патологией, оптимизировать контроль терапии и проводить действенную профилактику.
Техническим результатом, достигаемым изобретением, является повышение эффективности и информативности оценки основных аспектов оксидативного стресса, возможность проведения ускоренного скрининга.
Разработка способа комплексной экспресс-оценки с учетом как внутриклеточных, так и внеклеточных звеньев оксидативного стресса во взаимодействии их с продуктами перекисного окисления липидов, позволяет решить вышеуказанную проблему.
Предлагается, как и в прототипе, определять активность ферментов антирадикальной защиты и интенсивность свободно-радикального окисления.
к
к
к
к
к
к
к
к
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе оценки оксидативного стресса при метаболического синдроме, включающем определение активности ферментов антирадикальной защиты и интенсивности свободно-радикального окисления, согласно изобретению, определяют уровень концентрации активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП), определяют уровень церулоплазмина (ЦП) и активность каталазы (KA), далее определяют коэффициент перекисного окисления липидов (ПОЛ) как отношение КА к ТБК-АП, затем вычисляют коэффициент антиоксидантной активности (АО) как отношение содержания ЦП к КА, и при значении коэффициента ПОЛ равном 3 у.е., а значении коэффициента АО равном 2,5 у.е. диагностируют баланс между свободными радикалами и антиоксидантами, при значении коэффициента ПОЛ менее 3 у.е. и значении коэффициента АО менее 2,5 у.е. диагностируют усиление свободно-радикального повреждения и недостаток антиоксидантов, а при увеличении значения коэффициента АО более 2,5 у.е. и значении коэффициента ПОЛ более 3 у.е. определяют адекватную реакцию антиоксидантной системы на свободно-радикальное повреждение.
Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в следующем: определение отношения КА, увеличивающейся при высоких концентрациях супероксидных радикалов, которые усиливают образование простагландинов из арахидоновой кислоты, к содержанию активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП), имеющей способность реагировать с малоновым альдегидом, промежуточным продуктом этапа энзиматического окисления арахидоновой кислоты и конечным продуктом окислительной деградации липидов, позволяет прослеживать все основные этапы перекисного окисления липидов (ПОЛ), а определение отношения содержания концентрации плазменного антиоксиданта ЦП, являющегося важнейшим представителем плазменной антиоксидантной системы, к КА позволяет характеризовать уровень состоятельности данной системы.
к
Использование комплексной оценки оксидативного стресса путем определения концентрации внеклеточных антиоксидантов плазменного антиоксиданта церулоплазмина и анализа соотношений внутри- и внеклеточных антиоксидантов, позволяет оценить количественные взаимосвязи основных звеньев антиоксидантной системы при развитии метаболического синдрома, а вычисление коэффициента ПОЛ, позволяет соотнести уровень антиоксидантной защиты со степенью перекисного окисления липидов и оценить степень свободно-радикального повреждения, что повышает достоверность полученных результатов, информативность оценки, дает возможность выполнения ускоренной диагностики и проведения мониторинга антиоксидантной терапии для своевременной ее коррекции.
Заявляемый способ оценки оксидативного стресса разработан впервые.
Способ заключается в следующем.
У обследуемых людей берут венозную кровь и общепринятым методом получают сыворотку крови, в которой определяют содержание активных продуктов тиобарбитуровой кислоты ТБК-АП, активность каталазы КА и уровень церулоплазмина ЦП.
3+
Интенсивность свободно-радикального окисления липидов в сыворотке крови оценивают по концентрации ТБК-АП. Уровень концентрации ТБК-АП определяют в нМ*МДА/мл по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в присутствии ионов Fe (Гаврилов В.Б. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой. Вопр. мед. химии, 1987; 1:118-122).
Активность каталазы КА определяют в мкМ*л/сек по остаточному количеству перекиси водорода после ее инкубации с биологическим материалом при рН 7,4 и 25°С (Павлюченко И.И., Луговая И.А., Федосов С.Р., Басов А.А., Быков М.И. Активность ферментов антирадикальной защиты в эритроцитах и в раневом отделяемом у больных с осложненным течением сахарного диабета // XIV международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Ялта-Гурзуф; 2006:281-287).
Определяют уровень церулоплазмина ЦП в мг/л модифицированным методом Ревина, основанным на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина с остановкой реакции раствором фтористого натрия и измерением оптической плотности при 540 нм. (Горячковский А.М. Клиническая биохимия. Одесса: Астропринт. 1998:395-397).
к
к
Далее определяют коэффициент перекисного окисления липидов ПОЛ. Для этого вычисляют отношение КА к ТБК-АП. По величине коэффициента ПОЛ прослеживают степень свободно-радикального повреждения.
к
к
Затем определяют коэффициент антиоксидантной активности АО путем вычисления отношения содержания ЦП к КА. По полученному значению коэффициента АО судят о состоятельности плазменной антиоксидантной системы.
к
к
к
к
к
к
У здоровых испытуемых для определения коэффициента ПОЛ и коэффициента АО в норме производили забор крови и определяли в сыворотке крови уровень концентрации ТБК-АП, КА и уровень ЦП для каждого донора. Находили среднестатистические значения ПОЛ и АО, которые принимали за норму, при этом величина коэффициента ПОЛ составила 3 у.е., а величина коэффициента АО составила 2,5 у.е., что свидетельствовало о балансе между свободными радикалами и антиоксидантами, а, следовательно, о нормальном состоянии антиоксидантной системы.
к
к
к
к
При получении значений коэффициента ПОЛ менее 3 у.е. и коэффициента АО менее 2,5 у.е. у обследуемых больных диагностируют усиление свободно-радикального повреждения и недостаток антиоксидантов. Увеличение значений коэффициента АО более 2,5 у.е. и коэффициента ПОЛ более 3 у.е. свидетельствует о благоприятном признаке адекватной реакции антиоксидантной системы, и указывает на включение церулоплазмина в систему антирадикальной защиты.
Заявляемый способ позволяет комплексно оценить и проанализировать выраженность оксидативного стресса, учитывая стадии его развития и формирования, а также проводить скрининг оксидативного стресса у различных групп обследуемых.
Способ был использован у 259 пациентов с гемодинамическими нарушениями при метаболическом синдроме, из них у 96 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и 163 пациентов с гипертонической болезнью (ГБ), подтвержденными ранее диагнозами в лечебных учреждениях. Пациенты были разделены на 2 группы: 1-я группа - пациенты с ИБС, 2-я группа - пациенты с ГБ.
к
к
У пациентов всех групп производили забор крови и определяли показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, вычисляли коэффициент ПОЛ и коэффициент АО.
После этого у больных ИБС и ГБ соответствующих групп проводили курс терапии длительностью 21 день, после чего вновь определяли указанные коэффициенты. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием вариационной статистики с вычислением средних величин (М), их стандартными отклонениями (m) и оценкой t-критерия Стьюдента, если распределение отличалось от нормального, то использовали U-критерий Манна-Уитни. Достоверными считали показатели при р<0,05. Данные расчеты выполняли в среде электронных таблиц Microsoft Office Excel.
к
к
к
к
В обеих группах до лечения коэффициент ПОЛ составил 1±0,003 у.е., а коэффициент АО составил 0,92±0,004 у.е. у больных ГБ и 0,85±0,002 у.е. у больных ИБС, что свидетельствует о выраженных расстройствах в антиоксидантной системе у данных групп больных, и приводит к изменениям изучаемых показателей и их соотношений - к снижению как коэффициента ПОЛ за счет увеличения ТБКА-АП, так и к снижению коэффициента АО.
к
После лечения у больных 1 и 2 групп наблюдался рост коэффициента ПОЛк, который составил 1,18±0,07у.е. у больных ГБ, и 1,76±0,09 у.е. у больных ИБС. Данное увеличение происходило за счет снижения уровня ТБК-АП, вследствие уменьшения концентрации липидных перекисей под влиянием терапии. Коэффициент АО оставался сниженным до конца курса терапии и не превышал 0,95±0,003 у.е. в группе больных с ГБ и 0,88±0,004 у.е. в группе больных с ИБС. При хронических заболеваниях происходит снижение уровня меди в тканях, вследствие этого нарушается синтез медьзависимой супероксиддисмутазы и происходит усиление процессов ПОЛ в тканях. Восстановление концентрации церулоплазмина нормализует уровень меди в тканях и снижает процессы ПОЛ. Установлено, что рост уровня церулоплазмина является относительно медленным процессом (Ващенко В.И., Ващенко Т.Н. Биология и фармакология церулоплазмина: от эксперимента до лекарственной терапии. Обзоры по клинич. фармакол. и лек. терапии. 2008; 1:1254-1269), в связи с чем коррекция оксидативного стресса должна носить длительный характер и проводиться повторяющимися курсами терапии.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1.
к
к
Пациент К., 37 лет. Жалоб нет, проходит плановую диспансеризацию. Пациентом было подписано добровольное информированное согласие на проведение диагностики по заявляемому способу. Была проведена оценка оксидативного стресса. Получены следующие результаты: КА составила 120,5 мкМ*л/сек., уровень ТБК-АП составил 39,9 нМ*МДА/мл, содержание ЦП было равно 302.2 мг/л. Коэффициент ПОЛ, составил 3,0 у.е., и коэффициент АО - 2.5 у.е.. У обследуемого пациента не наблюдалось дисбаланса между продуктами перекисного окисления липидов и антиоксидантами, что свидетельствовало об отсутствии нарушений в антиоксидантной системе.
Пример 2.
к
к
к
к
Пациент Л., 58 лет. Клинически установленный диагноз метаболического синдрома. Жалобы на увеличение массы тела, увеличение окружности живота. Пациентом было подписано добровольное информированное согласие на проведение диагностики по заявляемому способу. У пациента была проведена оценка оксидативного стресса. Активность каталазы КА составила 194,52 мкМ*л/сек., уровень ТБК-АП составил 137.56 нМ*МДА/мл, содержание ЦП - 158 мг/л. Коэффициент ПОЛ составил 1,41 у.е., коэффициент АО - 0,81 у.е. У пациента наблюдается усиление перекисного окисления липидов, на что указывает снижение ПОЛ меньше 3 и уменьшение плазменного звена антиоксидантной системы, на что указывает снижение коэффициент АО ниже 2,5 у.е. У пациента имеется дисбаланс работы ферментов антирадикальной защиты. Пример 3.
к
к
к
к
Пациент С., 38 лет. Клинически установленный диагноз гипертонической болезни I степени. Жалобы на снижение работоспособности, повышение артериального давления до 145/90 мм рт. ст. Пациентом было подписано добровольное информированное согласие на проведение диагностики по заявляемому способу. У пациента была проведена оценка оксидативного стресса. КА составила 125,03 мкМ*л/сек., уровень ТБК-АП составил 40.50 нМ*МДА/мл, содержание ЦП - 410 мг/л. Коэффициент ПОЛ составил 3,16 у.е., коэффициент АО - 3,3 у.е. Повышение коэффициентов ПОЛ и АО свидетельствовало об адекватной реакции антиоксидантной системы у пациента, и указывало на активизацию плазменного звена антирадикальной защиты.
Использование заявляемого способа дает возможность оценить выраженность оксидативного стресса при метаболическом синдроме и его кардиоваскулярных осложнениях, повышает скорость оценки и позволяет определять индивидуальный подход к медикаментозной коррекции, проводить скрининг терапии.