Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью
METHOD FOR PRODUCING AGENT EXHIBITING ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY

Изобретение относится к фармации, медицине, ветеринарии и касается способа получения средства в виде экстракта сухого шишек ели обыкновенной, обладающего противовоспалительным действием.
Ель обыкновенная - Picea abies (L. Karst.) является широко-распространенным древесным растением на территории Пермского края и других регионов Российской Федерации. Древесная зелень и шишки ели обыкновенной являются отходами лесозаготовок.
С одного кубометра древесины получается около 250 килограмм отходов древесной зелени и шишек, которые имеют большие перспективы для медицинского применения и разработке на их основе современных лекарственных средств.
Лекарственные средства противовоспалительного действия широко применяются для лечения множества заболеваний различных органов и тканей. Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) являются наиболее распространенной группой противовоспалительных средств в назначениях врачей разного профиля. Более 30 миллионов человек в мире ежедневно принимают НПВП [1]. Однако применение НПВП часто сопровождается развитием массы побочных эффектов, характерных для этой группы: НПВП-гастропатия, дестабилизация артериального давления, повышение риска кардиоваскулярных катастроф, нефротоксичность, гепатотоксичность, воздействие на систему крови и др. [1,2]. Для противовоспалительных средств большое значение имеет не только эффективность, но и безопасность применения. Особенно это актуально в случае длительного применения, когда повышается вероятность развития побочных эффектов терапии НПВП.
Препараты растительного происхождения обладают мягким действием на организм, не вызывают токсических эффектов даже при длительном применении. Поэтому, получение лекарственных средств на растительной основе является важной задачей современной медицины и фармации.
Ассортимент фито препаратов с противовоспалительным действием недостаточен для обеспечения нужд медицины. Из противовоспалительных средств растительного происхождения в настоящее время используются такие как: Ротокан, плантаглюцид, а также растительные экстракты, подорожника, солодки и др. [3], стоит отметить, что указанные препараты не обладают выраженной противовоспалительной активностью. Плантаглюцид используется в основном как спазмолитическое средство при лечении острых и хронических гастритов и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Противовоспалительный эффект обусловлен в основном полисахаридами и не является основным.
Известно средство "АБИСИЛ-1" (патент RU N2054945, А61K 35/78, опубликован 27.02.1996) обладающее противовоспалительной, антибактериальной и ранозаживляющей активностью на основе экстракта пихты сибирской. Однако описанное средство обладает недостаточно высокой противовоспалительной активностью.
Известно противовоспалительное средство (патент RU №2535155, А61K 36/80, B01D 11/02, А61Р 29/00, А61Р 31/04, опубликован 10.12.2014) представляющее собой сухой экстракт листьев и цветков аврана лекарственного, полученный путем измельчения их, экстракции спиртом 96% на водяной бане до кипения и кипячения, выпаривания, разведения выпаренного остатка сначала дистиллированной водой, затем добавления хлороформа, охлаждения до комнатной температуры и центрифугирования, с последующим отделением водной фракции и высушиванием ее, при определенных условиях. Авран лекарственный является ядовитым растением, поскольку содержит в составе алкалоиды. Данный способ позволяет снизить токсические действие алкалоидов аврана лекарственного, что доказано результатами определения острой токсичности, но при этом не ясно как будет переноситься экстракт, полученный из ядовитого растения при длительном применении. Недостатком данного способа также является использование при производстве экстракта спирта и хлороформа, что приводит к удорожанию производства, а также требует наличия специального оборудования.
Известен способ получения противовоспалительного средства (патент RU №2456015, А61K 36/76, А61K 127/00, B01D 11/02, А61Р 29/00, опубликован 20.07.2012), включающий следующее: 500 г листьев осины обыкновенной, заготовленные в конце июня и высушенные воздушно-теневым способом, измельчают до частиц размером 5-10 мм, загружают поровну по 100 г в пять диффузоров в 5-6 приемов для более плотной укладки. Спирт этиловый 40% в количестве 2000 мл порциями по 400 мл заливают в 5 приемов в 1 диффузор. Экстрагирование проводят при 20-22°С по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из 2 диффузора, направляется в 3, а из 3 в 4 и т.д. Экспозиция настаивания составляет 6 или 16 часов. Готовое извлечение получают из 5 диффузора в пять приемов. Дополнительно проводят промывание отработанного сырья (шрота) в 4 и 5 диффузорах чистым экстрагентом (250 мл), вводя его в 4 диффузор и выдерживая в течение 6 часов, после чего пропускают через 5 диффузор, выдерживая 16 часов, с последующим отжимом шрота для удаления удержанного извлечения. Общий объем извлечения составляет около 1200 мл.
Полученное извлечение отстаивают при температуре 8°С в течение 3 суток, затем фильтруют, сгущают под вакуумом при температуре 40-50°С, высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40-50°С до получения сухого экстракта и измельчают.
В указанном способе освобождение от сопутствующих неактивных веществ происходит путем отстаивания извлечения в течение 3-х суток при температуре 8°С. Это существенно увеличивает временные затраты на получение готового продукта.
Известен способ получения средства (патент RU №2557885, А61K 36/73, А61K 31/05, А61Р 29/00, опубликован 27.07.2015) путем экстракции измельченных плодов рябины обыкновенной 40% спиртом этиловым с последующим сгущением полученного водно-спиртового экстракта, добавлением 95% спирта этилового, центрифугированием осадка, фильтрованием и сгущением надосадочной жидкости при определенных условиях. В данном средстве противовоспалительный эффект обусловлен полифенольным комплексом, выделенным из водно-спиртового экстракта плодов рябины, путем добавления 95% спирта этилового.
Стоит отметить, что спирт этиловый является дорогостоящим органическим растворителем, требующим специальных условий хранения на производстве и специальных разрешений, что значительно повышает стоимость готового продукта и усложняет цикл производства. В предлагаемом нами способе на всех этапах используется только вода, что экономически более выгодно.
Задачей изобретения является расширение арсенала средств на основе природного сырья, разработка простого способа получения экстракта шишек ели обыкновенной, относящегося к классу малотоксичных веществ, обладающего выраженной противовоспалительной активностью.
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка способа получения экстракта из шишек ели без использования органических растворителей, освобожденного от веществ, обуславливающих повышение бактериальной и грибковой контаминации и обладающего противовоспалительным действием.
Указанный технический результат достигается тем, что измельченные шишки ели экстрагируют с водой в соотношении 1:30, затем экстракт отделяют от сырья фильтрованием, полученный экстракт упаривают и резко охлаждают при температуре минус 18°С в течение 15 минут, отделяют супернатант и упаривают надосадочную жидкость с последующей сушкой полученного экстракта.
На этапе очистки экстракта используется резкая смена температуры, путем охлаждения упаренного экстракта при температуре минус 18°С в течение 15 минут, в результате чего выпадает осадок, который отделяют центрифугированием, что приводит к освобождению экстракта от веществ, обуславливающих повышение бактериальной и грибковой контаминации, а отсутствие в предлагаемом способе органических растворителей позволяет исключить их влияние на биологически активные вещества и уменьшить затраты на производство готового продукта.
Пример 1. Изучение технологических параметров, влияющих на экстракцию.
Для получения экстракта, содержащего максимальное количество биологически активных веществ, нами изучены технологические параметры, влияющие на экстракцию: размер частиц сырья, соотношение сырье : экстрагент, время экстракции. Данные представлены в таблицах №1,2,3.
Экспериментальные данные показывают, что для получения шишек ели экстракта сухого оптимальным является размер частиц сырья 2 мм (Таблица 1).
Проведенный эксперимент показывает (Таблица 2), что при соотношении сырья и экстрагента 1:30, наблюдается наибольший выход биологически активных веществ.
Установлено, что для наибольшего выхода биологически активных веществ необходимо проводить экстракцию в течение 120 минут (Таблица 3). Однако прирост выхода экстракта за последние 30 минут составляет всего около 2%, что экономически не целесообразно, поэтому время экстракции ограничили 90 минутами.
Учитывая полученные результаты, разработан способ получения экстракта шишек ели.
Пример 2. Осуществление способа получения экстракта.
Около 50 г шишек ели, измельченных до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают в колбу, прибавляют 1,5 литра воды (гидромодуль 1:30) и экстрагируют при перемешивании в течении 1,5 часов при температуре 80-85°С. По окончании экстракции сырье отделяют от экстракта фильтрованием. Полученный экстракт сгущают под вакуумом при температуре 80-85°С в 10 раз от первоначального объема. Далее происходит отделение балластной, неактивной фракции путем охлаждения упаренного экстракта при температуре -18°С в течение 15 минут. При этом выпадает осадок, в который попадают: часть полисахаридного комплекса, белки, дубильные вещества, смолистые вещества. Осадок уплотняют центрифугированием и отбрасывают. Далее надосадочную жидкость, выпаривают в вакуум-выпарном аппарате до густой массы и высушивают в сушильном шкафу при температуре 50°С.
Выход полученного экстракта составляет около 10,4±1,45%.
Экстракт представляет собой аморфный порошок светло-коричневого цвета со специфическим запахом. Растворим в воде, частично растворим в 50 и 70% спирте этиловом, нерастворим в эфире, этилацетате, хлороформе.
Пример 3. Исследование микробиологической чистоты.
Растительные экстракты зачастую подвержены повышенной микробной и грибковой контаминации, поскольку могут являться благоприятной средой для их развития. Нами проведено сравнительное исследование, для доказательства влияния стадии резкого охлаждения при температуре - 18°С на показатели микробиологической чистоты экстракта. Для этого получены водный и водно-спиртовой экстракты, где экстракция проводилась в тех же условиях что и в предлагаемом способе, но, без проведения ключевой стадии с резким охлаждением упаренного извлечения. Вместо этой стадии водный и водно-спиртовой экстракты отстаивали при температуре 8°С в течение 3 суток, затем фильтровали, сгущали под вакуумом, высушивали в сушильном шкафу при температуре 50°С до получения сухого экстракта и измельчали.
В таблице 4 показана разницы выхода экстракта и уделенной фракции при использовании трех разных способов.
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что большой выход удаленной фракции при получении экстракта предлагаемым способом обусловлен тем, что идет полное осаждение смол, дубильных веществ и полисахаридов при резкой смене температуры. А в экстрактах, полученных без резкого осаждения, удаленная фракция этих групп БАВ меньше.
Исследования микробиологической чистоты проводили по стандартным методикам Государственной Фармакопеи Российской Федерации XIV издания. Результаты представлены в таблице 5.
В ходе исследования установлено (Таблица 5), что экстракт, полученный по предлагаемому нами способу, соответствует всем требованиям по показателю микробиологическая чистота.
Водный экстракт, полученный без стадии резкого охлаждения упаренного извлечения и водно-спиртовый экстракт, не соответствуют требованиям Государственной Фармакопеи XIV издания по показателю - «Дрожжевые и плесневые грибы».
Очистка экстракта путем резкого охлаждения упаренного извлечения приводит к тому, что удаляется фракция, содержащая вещества, которые обуславливают повышение бактериальной и грибковой контаминации.
Пример 4. Исследование острой токсичности экстракта.
50
Для исследования острой токсичности экстракта использовали экспресс метод определения средней летальной дозы Прозоровского В.В. [4]. Вещество вводили однократно в дозах от 1000 до 16000 мг/кг, перорально с помощью желудочного зонда. После введения вещества оценивали состояние животных в течение 6 ч непрерывно. Отмечали отсутствие или наличие случаев летальности животных. Острая токсичность экстракта шишек ели составила ЛД 10300 мг/кг перорально, что позволяет отнести его к классу малотоксичных веществ.
Пример 5. Определение противовоспалительной активности.
У экстракта ели обыкновенной шишек установлена выраженная противовоспалительная активность. Определение противовоспалительной активности проводили на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина. Модель экссудативного воспаления - каррагенинового отека лапы, моделировалась согласно руководящим документам в данной области доклинических исследований [5,6].
В эксперименте использовались белые лабораторные аутбредные крысы стока линии Wistar и белые лабораторные аутбредные мыши стока линии ICR (CD-I). Подготовка животных включала отбор по полу, возрасту и состоянию здоровья. В рамках выделенной субпопуляции был выполнен рандомизированный отбор с использованием генератора случайных чисел в экспериментальные группы по 6 животных (для крыс) и по 7 животных (для мышей) [7].
Увеличение объема стопы, свидетельствующее о развитии отека, оценивали с помощью жидкостной онкометрии, основанной на вытеснении лапой при погружении эквивалентного объема жидкости. Измерение проводили до введения и через 1, 3 и 5 часов после введения раствора каррагенина. Исследуемые вещества вводили перорально в дозах 100, 50 и 10 мг/кг за 30 минут до индукции воспаления. Контролем служили животные, не получавшие препарата. В качестве препарата сравнения использовали таблетки диклофенака 0,05 г, покрытые кишечнорастворимой оболочкой.
::
Так же использовали второй вариант с измерением объема лапы крыс с помощью безводного плетизмометра [http://www.openscience.ru/index.php?page=physio&item=001], где применяется оптическая трехмерная измерительная система, которая вычисляет объем лапы на основании изображений с нескольких цифровых камер. Встроенный в измерительный блок компьютер показывает результат на дисплее и одновременно сохраняет протокол всех измерений.
Для обработки данных экспериментов использовались непараметрические статистические методы во всех случаях, когда не выполнялись требования параметрических данных [8]. Основными методами обработки данных являлись различные реализации одномерного и многомерного дисперсионного анализа, в том числе устойчивые к выбросам [9]. В данном случае использовался непараметрический метод Вилкоксона. Исключение выбросов выполнялось по правилу «1,5 IQR» [10]
Результаты эксперимента свидетельствуют о ярко выраженной противовоспалительной активности экстракта шишек ели, подтвердившейся в скрининговых экспериментах на двух видах животных, при оценке объема отека двумя взаимно независимыми инструментальными методами.
Значения процента торможения в опыте на крысах на 1, 3 и 5 час после введения индуктора отека равны:
• 1 час. Гидрометрия - 87%, при р=0.0022; фотометрия - 113.1% (>95%), при р=0.0200
• 3 час. Гидрометрия - 101.9%) (>95%), при р=0.0022; фотометрия - 99.6%, при р=0.0043
• 5 час. Гидрометрия - 93.5%, при р=0.0022; фотометрия - 112.7%) (>95%), при р=0.0050
Значения процента торможения в опыте на мышах на 1 и 4 час после введения индуктора отека равны:
• 1 час. Фотометрия - 52,2%, при р=0.0021.
• 4 час. Фотометрия - 66%), при р=0.0021.
Экстракт шишек ели проявляет ярко выраженную противовоспалительную активность в дозировке 100 мг/кг. Однако результаты исследований свидетельствую о выраженной противовоспалительной активности экстракта шишек ели и в более низких дозировках (50 и 10 мг/кг). Результаты исследования представлены в таблице 8, и рисунках 4, 5.
Значения процента торможения в опыте с крысами (доза 50 мг/кг) на 1, 3 и 5 час после введения индуктора отека равны:
• 1 час. Гидрометрия - 103,7% (>95%), при р=0,0043; фотометрия - 98,5% (>95%), при р=0,0087
• 3 час. Гидрометрия - 108,1%) (>95%), при р=0,0095; фотометрия - 103,5%) (>95%), при р=0,0043
• 5 час. Гидрометрия - 108,6% (>95%), при р=0,0095; фотометрия - 101,8% (>95%), при р=0,0043
Значения процента торможения в опыте с крысами (доза 10 мг/кг) на 1, 3 и 5 час после введения индуктора отека равны:
• 1 час. Гидрометрия - 58,6%, при р=0,1265; фотометрия - 34,6%, при р=0,0303
• 3 час. Гидрометрия - 48,5%, при р=0,1320; фотометрия - 38,9%, при р=0,0043
• 5 час. Гидрометрия - 22,8%, при р=0,3939; фотометрия - 10,2%, при р=0,5887.
Результаты исследования поясняются графическими материалами.
На фиг. 1 показаны результаты эксперимента по примеру 5. Значения процента прироста. Крысы стока линии Wistar. Гидрометрия. Группы слева направо: контроль, диклофенак, экстракт шишек. Полужирные метки - медианы, «ящик» - межквартильный размах (IQR), «усы» - 1,5*IQR, точки - выбросы.
Фиг. 2 - Результаты эксперимента по примеру 5. Значения процента прироста. Крысы стока линии Wistar. Фотометрия. Группы слева направо: контроль, диклофенак, экстракт шишек. Полужирные метки - медианы, «ящик» - межквартильный размах (IQR), «усы» - 1,5*IQR, точки - выбросы.
Фиг. 3 - Результаты эксперимента по примеру 5. Значения процента прироста. Мыши стока линии CD-I. Фотометрия. Группы слева направо: контроль, диклофенак, экстракт шишек. Полужирные метки - медианы, «ящик» - межквартильный размах (IQR), «усы» - 1,5*IQR, точки - выбросы.
Фиг. 4. - Результаты эксперимента по примеру 5. Значения процента прироста. Крысы стока линии Wistar. Гидрометрия. Группы слева направо: контроль, диклофенак, экстракт шишек. Полужирные метки - медианы, «ящик» - межквартильный размах (IQR), «усы» - 1,5*IQR, точки - выбросы.
Фиг. 5. - Результаты эксперимента по примеру 5. Значения процента прироста. Крысы стока линии Wistar. Фотометрия. Группы слева направо: контроль, диклофенак, экстракт шишек. Полужирные метки - медианы, «ящик» - межквартильный размах (IQR), «усы» - 1,5*IQR, точки - выбросы.
Список литературы
1. Шостак Н.А., Клименко А.А. Нестероидные противовоспалительные препараты - современные аспекты их применения // Клиницист.2013. №3-4. С. 53-61.
2. Каратеев А.Е. Нестероидные противовоспалительные препраты в эпоху биологической терапии // Ревматология. 2008. №3. С. 3-8.
3. Регистр лекарственных средств в России / Гл. ред. И.Ф. Крылов. Ред. кол. Ю.В. Буров (зам.гл. ред.), Г.П. Вышковский, З.В. Догбайло, В.П. Падалкин, Г.С. Чернов. - М: ИНФАРМХИМ, 1993. - 1006 с.
4. Прозоровский, В.В., Прозоровская В.М. Экспресс метод определения средней летальной дозы / В.В. Прозоровский // Фармакология и токсикология. 1978. №4. С. 497-502.
5. Anglemyer A., Horvatch Н.Т., Bero L. Healthcare outcomes assessed with observational study designs compared with those assessed in randomized trials // Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2014. №4.
6. Миронов A.H., Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева - 2 изд., перераб. И доп.- М.: ОАО «Издательство медицина», 2005 - 832 с.
8. Hollander М., Wolfe D., Chicken Е. Nonparametric statistical methods. - John Wiley & Sons, 2013. - T. 751.
9. Anderson M.J., A new method for non-parametric multivariate analysis of variance // Austral ecology. - 2001. - T. 26. - №1. pp. 32-46.
10. ГОСТ: Статистические методы. Статистическое представление данных. Часть 4. Выделение и обработка выбросов. ГОСТ Р ИСО 16269-4-2017.