СПОСОБ КАРИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ КУЛЬТУР МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

1. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток заключается в подготовке клеточных культур, подготовке микропрепаратов, методике окрашивания микропрепаратов, кариотипирования и оценки анеуплоидии в интерфазных ядрах
2
2. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга или жировой ткани, высаживают в культуральные вентилируемые флаконы, содержащие ростовую среду DMEM с 10-20% эмбриональной телячьей сыворотки, и через 24-48 ч неприкрепленные клетки удаляют со сменой среды, в дальнейшем культуры инкубируют до достижения 75-90%-ной конфлюентности, культивирование проводят при температуре 37°С в условиях абсолютной влажности и 5% СО, начиная с 3-го пассажа, культуры МСК имеют мономорфный вид и состоят из клеток веретенообразной формы.
3. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что фиксацию МСК для цитогенетического анализа проводят на 2-3-й день после последнего пассажа, при этом плотность культуры в день фиксации не должна превышать значения 60% конфлюентности.
4. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что на 1-м этапе получают митотические клетки, которые используются для кариотипического анализа с помощью орбитального шейкера (скорость 100 об/мин, 30 мин), после чего проводят фиксацию.
5. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что на 2-м этапе после трипсиновой обработки снимают со дна флакона все остальные клетки и используют их для оценки частоты анеуплоидии в интерфазных ядрах с применением FISH-метода.
6. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что в пробирки, полученные на первом и втором этапах, добавляют 0,55%-ный раствор KCl и инкубируют в термостате при 37°С в течение 8-9 мин, для остановки гипотонизации перед центрифугированием в пробирки добавляется 3-5 капель фиксатора, далее проводят фиксацию смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1).
7. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что для получения цитогенетических препаратов раскапывание клеточной суспензии проводят над водяной баней или во влажной камере, затем подсушивают на твердотельной плитке при температуре 55-65°С.
8. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что окраску препаратов для кариотипирования проводят с применением GTG-метода, при этом препараты обрабатывают 10-20 с в растворе трипсина, а затем в растворе GKN, также каждое стекло обрабатывают свежей порцией красителя (Гимза на фосфатном буфере) в течение 1-2 мин, затем краску смывают проточной водой и сушат препарат на воздухе.
9. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что подготовка препаратов для FISH-исследования заключается в обработке раствором пепсина при температуре 37°С в течение 10 мин, затем отмывают раствором PBS, далее проводят постфиксацию 1%-ным раствором параформальдегида, нанося его под покровное стекло на 10 мин, после чего препараты погружают в PBS на 5 мин, отмывают дистиллированной водой и обезвоживают в спиртах восходящей концентрации спиртов (70, 95, 100%), далее препараты денатурируют с 70%-ным формамидом при температуре 73°С в течение 3 мин, после чего быстро погружают стекла в охлажденный до -20°С 70%-ных этиловый спирт и последовательно обезвоживают в 95 и 100%-ных этиловых спиртах.
10. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что препарат, гибридизационную смесь и влажную камеру подогревают до 37°С непосредственно перед началом гибридизации.
11. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что на предварительно выбранную зону стекла, содержащую достаточное количество ядер, не соприкасающихся друг с другом, наносят 3-10 мкл гибридизационной смеси и накрывают покровным стеклом, для обеспечения герметичности края покровного стекла заклеивают резиновым клеем.
12. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что для анализа цитогенетических препаратов необходим световой и люминесцентный микроскоп с комплектом интерференционных фильтров и иммерсионным объективом.
13. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что для каждой культуры МСК анализируют не менее 15 метафаз.
14. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что оценка анеуплоидии в интерфазных ядрах производится с использованием метода двухцветного или трехцветного интерфазного FISH-анализа и позволяет исключать из регистрации ядра с нерезультативной гибридизацией, при этом просматривают не менее 800-1000 интерфазных ядер и учитывают ядра с одним, двумя, тремя и более сигналами.
15. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что сигналы, расположенные на расстоянии друг от друга менее чем один диаметр ядра, но по размеру и интенсивности свечения равные другим сигналам в поле зрения, считают за два, при этом два сигнала, находящиеся на расстоянии более чем один диаметр ядра, но соединенные между собой, считают репликой одной хромосомы.
16. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что результаты молекулярно-цитогенетического исследования заносятся в специальные протоколы, которые позволяют судить о первичных событиях в клетке, а также дают возможность оценить сочетаемость анеуплоидии по разным хромосомам в каждой аномальной клетке.
17. Способ кариологической оценки безопасности культур мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по п.1, характеризующийся тем, что культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток, в которых выявлены аберрантные клоны, не используются при трансплантации.