ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИФУНГАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
PEPTIDE WITH ANTIFUNGAL ACTIVITY

Изобретение относится к биохимии, а именно к биологически активным пептидам, обладающим антифунгальным действием, которые могут найти применение в биотехнологии.
Ущерб, наносимый мировому сельскому хозяйству со стороны патогенов культурных растений (грибов, бактерий, вирусов и вироидов) и насекомых-вредителей (две главные причины ущерба), оценивается трлн рублей ежегодно. Потери нередко достигают 45% урожая. Современные методы, применяемые с целью снижения убытков, в основном сводятся к использованию синтетических пестицидов, многие из которых являются экологически агрессивными веществами. Использование химических средств защиты растений представляет значительную опасность для окружающей среды, биологические средства защиты растений являются более безопасными. Внедрение инсектицидов нового поколения позволило улучшить ситуацию лишь на 5-10% [Oerke Е.С., Dehne H.W., Schönbeck F., Weber A. Crop Production and Crop Protection: Estimated Losses in Major Food and Cash Crops. - 1994. - Elsevier, Amsterdam].
Применение методов генной инженерии для трансформации растений открывает новые возможности создания культур, обладающих широкой устойчивостью к патогенам, вредителям, а также абиотическому стрессу (засухе, засоленности почвы и др.). Впервые работы по получению резистентных сортов сельскохозяйственных культур с использованием технологий рекомбинантных ДНК были выполнены около 20 лет назад [Andrews R.E., Faust R.M., Wabiko H., Raymond K.C., Bulla L.A. The biotechnology of Bacillus thuringiensis. // Crit. Rev. Biotech. - 1987. - Vol.6. - P.163-232. Vaeck M., Reynaerts A., Höfte H., Jansens S., De Beuckeleer M., Dean C., Zabeau M., Van Montagu M., Leemans J. Transgenic plants protected from insect attack. // Nature - 1987. - Vol.328. - P.33-37]. С использованием гена инсектицидного белка бактерии Bacillus thuringiensis были получены трансгенные растения табака, устойчивые по отношению к паразитическим личинкам бабочки Manducta sexta. С тех пор, по крайней мере, 10 генов энтомотоксинов из Bacillus thuringiensis были перенесены и экспрессированы как минимум в 26 видах растений, приобретших устойчивость к некоторым вредителям [Schuler Т.Н., Poppy G.M., Kerry B.R., Denholm I. Insect-resistant transgenic plants. // Trends Biotech. - 1998. - Vol.16. - P.168-175]. Значительная часть мирового урожая приходится сегодня на долю Bt-трансформированных продуктов (информация взята с официального сайта Департамента сельского хозяйства США: www.aphis.usda.gov). Тем не менее до сих пор не решен вопрос о безопасности Bt-содержащих продуктов для человека, не совсем ясны экологические последствия глобального распространения трансгенных растений, содержащих гены энтомотоксинов Bacillus thuringiensis [Vazquez-Padron R.I., Moreno-Fierros L., Neri-Bazan L., de la Riva G.A., Lopez-Revilla R. Intragastric and intraperitoneal administration of Cry1Ac protoxin from Bacillus thuringiensis induces systemic and mucosal antibody responses in mice. // Life Sci. - 1999. - Vol.64. - P.1897-1912]. Кроме того, видимое нарушение межвидового барьера получает отрицательный отклик в современном обществе. На рынке практически не представлены другие генмодифицированные сорта с повышенной устойчивостью. Более того инженерия устойчивости к заболеваниям оказалась более сложной задачей, нежели повышение сопротивляемости насекомым.
Согласно современным представлениям наиболее перспективными подходами к получению устойчивых сортов являются те, что направлены на усиление собственных защитных свойств растительного организма. К соединениям, продуцируемым растениями для защиты от патогенов, относятся так называемые фитоалексины и фитоантисипины - вещества различной химической природы, а также некоторые белки и пептиды. Перспективным является получение устойчивых сортов с измененной экспрессией собственных защитных генов или же перенесение генов из одного растения в другое, например из дикорастущего в культурное, поскольку известно, что в ходе селекции и отбора сельскохозяйственные растения, приобретая одни полезные признаки, теряли другие. Наибольший интерес вызывают полипептидные соединения, обладающие защитными свойствами, ввиду возможности их прямого использования для получения трансгенных растений [Carlini C.R., Grossi-de-Sā M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. // Toxicon - 2002. - Vol.40. - P.1515-1539].
По структуре и антифунгальным свойствам к заявляемому пептиду наиболее близок пептид Ar-АМР из семян амаранта Amaranthus retroflexus [Lipkin A., Anisimova V., Nikonorova A., Babakov A., Krause E., Bienert M., Grishin E., Egorov T. An antimicrobial peptide Ar-АМР from amaranth (Amaranthus retroflexus L.) seeds. // Phytochemistry. - 2005. - Vol.66. - P.2426-2431]. Вещество относится к обширному семейству цистеин-богатых хитин-связывающих пептидов, ингибирует рост некоторых патогенных грибов в концентрациях 3,5-30 мкМ.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента пептидов растительного происхождения, обладающих антифунгальной активностью.
Поставленная задача решается за счет структуры нового пептида Sm-AMP-1.1a, имеющего следующую аминокислотную последовательность:
2
l
2
з
4
5
6
7
8
9
10
ll
l2
13
l4
l5
l6
l7
l8
l9
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
HN-Ser-Gly-Pro-Asn-Gly-Gln-Cys-Gly-Pro-Gly-Trp-Gly-Gly-Cys-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Cys-Ser-Gln-Tyr-Gly-Tyr-Cys-Gly-Ser-Gly-Pro-Lys-Tyr-Cys-Ala-His-OH
Заявляемый пептид проявляет выраженную антифунгальную активность в отношении следующих грибов-патогенов растений: Alternaria consortiale, Fusarium culmorum, Helminthosporium sativum (syn. Bipolaris sorokiniana, Drechslera sorokiniana), Thielatiopsis basicola. Для полного ингибирования роста перечисленных грибов in vitro необходимы микромолярные концентрации пептида. Техническим результатом предлагаемого изобретения является высокая антифунгальная активность заявляемого пептида.
Пептид Sm-AMP-1.1a состоит из 35 аминокислотных остатков и может быть получен химическим синтезом или биотехнологически.
Пептид Sm-AMP-1.1a получают из природного источника - семян сорного растения звездчатки средней, или мокрицы Stellaria media (L.) Vill., которая относится к семейству гвоздичные Caryophyllaceae, классу двудольные Dicotyledones (Magnoliopsida), отделу покрытосеменные или цветковые растения Magnoliophyta (Angiospermae).
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Выделение пептида Sm-AMP-1.1a
8
Семяна звездчатки измельчают в кофейной мельнице и проводят экстракцию 10-ю объемами 10%-ной (v/v) уксусной кислоты при комнатной температуре и перемешивании в течение 1 ч. Суспензию цетрифугируют при 22000 g в течение 15 мин при комнатной температуре, осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость далее обессоливают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Aquapore RP-300 C (10×30 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 7,5 мкм; Applied Biosystems, США). Используют следующие растворы: А - 0,1%-ная (v/v) трифторуксусная кислота в воде, Б - 80%-ный (v/v) ацетонитрил в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Колонку промывают 5-ю объемами раствора Б с последующим уравновешиванием 5-ю объемами раствора А со скоростью элюции 1,5 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению элюата при 214 нм. После нанесения кислотного экстракта на колонку ее промывают раствором А до тех пор, пока уровень поглощения элюата не приблизится к исходному. Пептиды и белки десорбируют раствором Б, элюат упаривают на водоструйном насосе для удаления ацетонитрила, затем лиофилизуют.
Полученный сухой остаток из 10 г исходного сырья растворяют в 4 мл раствора В (10 мМ Трис-HCl, рН 7,2) и разделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке размером 25×40 мм, заполненной носителем Heparin Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, США) и предварительно уравновешенной буферным раствором В. После нанесения образца и вымывания несорбировавшихся веществ пептиды и белки элюируют сначала 100-мМ NaCl в буфере В (фракция I), а затем 500-мМ NaCl в буфере В (фракция II) со скоростью 1 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению элюата при 280 нм (фиг.1). Полученные фракции обессоливают и высушивают, как описано выше, проводят тестирование их биологической активности.
Фракцию I растворяют в 1 мл раствора Г (5%-ный (v/v) ацетонитрил в 0,05%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте) и разделяют с помощью гель-фильтрации на колонке размером 2,5×90 см, заполненной носителем HiPrep Sephacryl S-100 HR (GE Healthcare, США) и предварительно уравновешенной раствором Г. Разделение ведут при скорости элюции 1 мл/мин и комнатной температуре. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 214 нм (фиг.2). Собирают фракции объемом 10 мл, высушивают, проводят тестирование их биологической активности.
18
18
Фракции со временем элюции 240-280 мин (фиг.2), для которых обнаружена антифунгальная активность, объединяют и разделяют с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Vydac Ci (4,6×250 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм; The Nest Group, Inc., США). Фракционирование проводят в линейном градиенте ацетонитрила: 5-40% раствора Б за 60 мин при скорости элюции 0,7 мл/мин и температуре 40°С. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 214 нм (фиг.3), проводят тестирование полученных фракций. Пептид Sm-AMP-1.1a элюируется со временем удерживания 41 мин. Проводят дополнительную стадию очистки в тех же условиях. В результате получают препарат искомого пептида с содержанием примесей менее 3%, что подтверждается хроматографией на аналитической колонке Luna C (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила: 5-40% раствора Б за 60 мин при скорости элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.
Пример 2.
Установление аминокислотной последовательности пептида Sm-AMP-1.1a
18
Для однозначной идентификации остатков цистеина в аминокислотной последовательности пептида проводят восстановление дисульфидных связей и алкилирование свободных тиольных групп. Восстановление и алкилирование осуществляют по модифицированной методике [Thomsen J., Bayne S. Microscale alkylation with 4-vinylpyridine. // J. Protein Chem. - 1988. - Vol.7. - P.295-296]. Пептид (1 нмоль) растворяют в 40 мкл буфера (6 М гуанидин-гидрохлорид и 2 мМ ЭДТА в 0,5 М Трис-HCl, рН 8,5), добавляют 2 мкл водного раствора, содержащего 1 мкмоль 1,4-дитиотреитола, тщательно продувают азотом, перемешивают, осаждают капли и оставляют при 40°С в течение 4 ч. Затем добавляют 2 мкл 50%-ного раствора 4-винилпиридина в 2-пропаноле, пробирку осторожно перемешивают, осаждают капли. Реакцию алкилирования проводят в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем смесь разбавляют в 4 раза 0,1%-ной трифторуксусной кислотой, наносят на колонку Vydac C (4,6×250 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм; The Nest Group, Inc., США), предварительно уравновешенную 4%-ным ацетонитрилом в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Реагенты и побочные продукты реакции отделяют промывкой колонки тем же раствором, пока уровень поглощения элюата не приблизится к исходному, далее хроматографию проводят в условиях, описанных в примере 1 для очистки пептида Sm-AMP-1.1a.
Определение N-концевой аминокислотной последовательности очищенного восстановленного и алкилированного пептида Sm-AMP-1.1a проводят методом ступенчатой деградации по Эдману на автоматическом секвенаторе Precise 492 (Applied Biosystems, США). В результате устанавливают полную аминокислотную последовательность Sm-AMP-1.1a, состоящую из 35 аминокислотных остатков:
2
l
2
3
4
5
6
7
8
9
10
ll
l2
l3
l4
l5
l6
l7
18
l9
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
HN-Ser-Gly-Pro-Asn-Gly-Gln-Cys-Gly-Pro-Gly-Trp-Gly-Gly-Cys-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Cys-Ser-Gln-Tyr-Gly-Tyr-Cys-Gly-Ser-Gly-Pro-Lys-Tyr-Cys-Ala-His
Пример 3.
Определение относительной молекулярной массы и числа свободных и дисульфидсвязанных остатков цистеина в пептиде Sm-AMP-1.1a
Полученную аминокислотную последовательность, а также индивидуальность очищенного пептида подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют дигидробензойную кислоту (10 мг/мл) в 50%-ном (v/v) ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную (v/v) трифторуксусную кислоту. Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов с диапазоном молекулярных масс 700-3500 Да (Sigma, США).
Измеренная моноизотопная молекулярная масса природного пептида Sm-AMP-1.1a составляет 3460,20 Да. Расчетная масса пептида со свободными тиольными группами у остатков цистеина составляет 3466,36 Да, т.е. отличается от измеренной на 6,16 Да. Расчетная масса пептида при условии образования трех дисульфидных связей составляет 3460,31 Да, т.е. отличается от измеренной на 0,11 Да. Таким образом, пептид Sm-AMP-1.1a не содержит свободных тиольных групп, а все 6 остатков цистеина вовлечены в образование 3 внутримолекулярных дисульфидных связей, пептид не содержит каких-либо дополнительных химических модификаций.
Пример 4.
Биологические свойства пептида Sm-AMP-1.1a
Для определения антигрибной активности фракций, полученных в ходе разделения кислотного экстракта семян звездчатки, а также очищенного пептида Sm-AMP-1.1a используют культуры следующих патогенных грибов из класса Deuteromycetes: Alternaria consortiale, Fusarium culmorum, Helminthosporium sativum (syn. Bipolaris sorokiniana, Drechslera sorokiniana), Thielatiopsis basicola.
Для изучения активности выделенные фракции замораживают в жидком азоте и высушивают лиофильно, перерастворяют в воде, снова высушивают. Наконец, сухие вещества растворяют в 50 мкл стерилизованной воды. Концентрацию определяют по спектру поглощения в УФ диапазоне. Активность изучают методом радиальной диффузии на питательной среде с агаром. Грибы выращивают двое суток на чашках Петри со средой, приготовленной из смеси крупяных хлопьев Nestle (20 г/л) и агара, при термостатировании (26°С). Затем вырезают блок гриба диаметром 3 мм и помещают в центр чашки Петри (диаметром 9 см) со средой так, чтобы мицелий прижимался к поверхности чашки, оставляют на 48 ч при той же температуре. Испытываемые образцы (50 мкл) помещают в лунки диаметром и глубиной 3 мм, вырезанные в агаре на расстоянии 3 см от центра чашки. На каждой чашке вырезают 4 лунки, одна из которых служит контролем - сюда помещают 50 мкл чистой стерилизованной воды. Чашки Петри инкубируют в термостате двое суток, после чего оценивают ингибирующую (фунгистатическую) активность образцов на рост гриба (по ширине зоны ингибирования в сравнении с контролем) и влияние их на морфологические изменения в развитии мицелия.
Определение минимальных концентраций пептидов, необходимых для подавления роста грибов (минимальных действующих концентраций), проводят методом двойного разбавления. Результаты для пептида Sm-AMP-1.1a приведены в таблице.
ТаблицаАнтигрибные свойства пептида Sm-AMP-1.1a
Гриб
Минимальная действующая концентрация, мкМ
Alternaria consortiale
0,7
Fusarium culmorum
2,1
Helminthosporium sativum
0,7
Thielatiopsis basicola
5,6