Перспективы создания тканеинженерных легких с использованием методов регенеративной медицины

перспективы создания тканеинженерных легких с использованием методов регенеративной медицины

Е.В. Куевда 1, Е.А. Губарева 1, А.С. Сотниченко 1, И.В. Гилевич1, И.С. Гуменюк1, П. Маккиарини 12

1 Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Россия

2 Каролинский институт, Стокгольм, Швеция

Prospects of the tissue engineering lung development with the methods of regenerative medicine

E.V. Kuevda 1, Е.А. Gubareva 1, A.S.Sotnichenko 1, I.V. Gilevich 1, I.S. Gumenyuk 1, P. Macchiarini12

1 Kuban State Medical University, Krasnodar, Russia

2 Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden

Дефицит донорских органов, необходимость проведения пожизненной иммуносупрессивной терапии даже в случае успешной трансплантации легких, высокие риски летального исхода в послеоперационном периоде заставляют искать новые способы лечения терминальных стадий заболеваний, требующих пересадки органов . В последнее десятилетие большое внимание уделяется методам регенеративной медицины для восстановления или замещения функции поврежденных тканей и органов . Создание функционально полноценных легких в лабораторных условиях позволит в значительной мере решить проблемы с нехваткой донорских органов . Изучение морфологических свойств «биологических каркасов» органов и более глубокое понимание поведения стволовых клеток и клеток-предшественниц привели к идее использования методов децеллюляризации с последующей рецеллюляризацией аутогенными клетками для проведения трансплантации трахеи, легких, сердца, почек . Рецеллюляризированные солидные органы на настоящий момент могут функционировать в течение некоторого времени в условиях in vitro, что свидетельствует о потенциальной возможности клинического применения указанных методов В настоящем обзоре представлены современные данные о децеллюляризации и рецеллюляризации легких, способы повышения эффективности и улучшения качества получаемого биологического каркаса, также обсуждаются основные аспекты трансплантации на животных моделях и перспективы биоинженерии легких в целом

Ключевые слова: регенеративная медицина, тканевая инженерия легких, децеллюляризация, рецеллюляризация, биологические каркасы, стволовые клетки

Deficit of donor organs, the need for lifelong immunosuppressive therapy, even in the case of successful lung transplantation, high risk of death in the postoperative period are forced to look for the new ways to treat terminally ill patients, requiring organ transplants . In the last decade, much attention is given to methods of regenerative medicine to repair or replace the function of damaged tissues and organs . Creating functional lungs in the laboratory will hopefully solve the problem of donor organs shortage . The study of morphological properties of biological scaffolds, deeper understanding of stem cells and progenitor cells behavior led to the idea of using decellularization methods followed by recellularization with autologous cells for tissue engineered trachea, lungs, heart and kidney creation Recellularized solid organs can perform organ-specific function in vitro conditions, indicating the potential clinical use of these methods This review presents the current data about lung decellularization and recellularization methods to increase efficiency and improve the quality of the biological scaffold and discusses the main aspects of lung transplantation in animal models and perspectives of lung bioengineering

Keywords: regenerative medicine, tissue engineering lungs, decellularization, recellularization, biological scaffolds, stem cells

Введение

В настоящий момент клиническое использование методов регенеративной медицины вызывает большой интерес . Применение полученных знаний в области лечения заболеваний дыхательных путей особенно актуально с учетом возрастающей доли патологии дыхательной системы в структуре летальности . Так, например, более 1 млрд людей страдают от хронических респираторных заболеваний во всем мире, из которых около 4 млн ежегодно умирают . Рак легких и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) в совокупности вызывают около 280 тыс . летальных исходов ежегодно [1, 2], при этом ХОБЛ занимает пятое место в общей структуре летальных исходов с прогнозом выхода на третье место к 2030 г .

Существующие на настоящий момент хирургические вмешательства при хронических заболеваниях дыхательных путей носят преимущественно паллиативный характер с сохраняющимся высоким риском летального исхода в раннем послеоперационном периоде [3, 4]. Основным методом лечения паци-

е-таП: g_lena82@list. ги

ентов в терминальной стадии заболеваний остается аллогенная трансплантация легких [5]. Однако и этот метод не лишен недостатков [6], касающихся функционального состояния донорского органа и его пригодности к пересадке . Часто трансплантируемый орган имеет признаки отека, ателектаза, ишемии или пневмонии в связи с длительностью нахождения на ИВЛ самого донора или наличием у него функциональных системных расстройств [6]. Другим немаловажным недостатком проведения трансплантации является необходимость пожизненного назначения реципиентам иммуносупрессивной терапии, способствующей увеличению рисков развития вторичной инфекции и онкологических заболеваний [7]. Наибольшей проблемой остается дефицит донорских органов и этические проблемы их использования [8, 9]. Общеизвестно, что увеличение периода ожидания органа для трансплантации увеличивает риск развития осложнений у пациента и интраопераци-онных осложнений [10]. Все вышеперечисленное заставляет искать новые пути решения проблемы восстановления или замены поврежденных легких

В этой связи определенным потенциалом обладают тканеинженерные каркасы, созданные на основе децеллюляризированных нативных органов с последующим заселением аутогенными стволовыми клетками реципиента [10—19]. Созданием подобных каркасов с использованием различных протоколов воздействия детергентами и энзимами занимается несколько лабораторий по всему миру . В представленном обзоре рассматриваются несколько стратегий создания тканеинженерных легких, начиная от характеристики самой концепции проведения децел-люляризации и рецеллюляризации легких до основных клеточных популяций, используемых для заселения полученных биологических каркасов

Децеллюляризация легких для создания

биологического каркаса: методы,

преимущества, недостатки

Для создания функционирующих тканеинженер-ных легких основополагающую роль играет снижение иммуногенности внеклеточного матрикса (ВКМ) при максимальном сохранении его биохимического состава, морфологических и биомеханических свойств . Биологические каркасы легких после полного удаления клеток должны сохранять трехмерность структуры [20]. В связи с этим особое внимание следует уделять технике проведения децеллюляризации . Различают физические, ферментативные и химические способы удаления клеток [10, 20]. Физические методы децеллюляриза-ции включают в себя: механическое воздействие,

температурную и ультразвуковую обработку . При ферментативной обработке используются трипсин, эндонуклеазы, экзонуклеазы [11, 13, 20]. Эффективность проведенной децеллюляризации оценивается путем количественного определения содержания нуклеиновых кислот, которое должно составлять менее 50 нг двухцепочечной ДНК в 1 мг сухого веса ВКМ, при этом фрагменты ДНК должны быть менее 200 пар нуклеотидов длиной [21, 22]. Многие исследования демонстрируют, что использование детергентов при проведении децеллюляризации приводит к повреждению ВКМ с уменьшением содержания коллагена, эластина и гликозаминогли-канов на 30%, 60% и 90%, соответственно [11, 23]; при проведении иммуногистохимического окрашивания полученных образцов отмечено снижение таких компонентов ВКМ, как фибронектин, ламинин и эластических волокон [23, 24]. Выбор метода децеллюляризации, в целом, определяется морфологической структурой и свойствами исследуемого органа Перспективы использования биологических каркасов зависят от разработки протоколов децеллюляризации, сводящих к минимуму структурное повреждение тканей Наиболее часто в качестве детергентов используются Triton-X100, натриевая соль дезоксихолевой кислоты, додецил сульфат натрия или 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS) [10] (табл . 1). По результатам исследований ряда авторов, сочетание Triton-X100 и дезоксихолата натрия является более щадящим методом воздействия на нативные легкие [11, 12, 15, 16, 23, 24].

Таблица. Протоколы проведения децеллюляризации легких

Авторы протокола,год Доноры каркаса Детергенты Путь введения детергента

T.H. Petersen et al., 2010 Крысы (Fisher 344) 8mM CHAPS Перфузия через ЛА

H.C. Ott et al., 2010 Крысы (Sprague Dawley) 0,1% SDS, 0,1% Triton X-100 Перфузия через ЛА

A.P. Price et al., 2010 Мыши (C57BL/6) 0,1% Triton X-100, 2% SDC Перфузия через трахею и ПЖ

J. Cortiella et al., 2010 Крысы (Sprague Dawley) 1% SDS Через трахею однократно, далее - погружной метод

J.J. Song et al., 2011 Крысы (Sprague Dawley) 0,1% SDS, 0,1% Тритон X-100 Перфузия через ЛА

J.M. Wallis et al., 2011 Мыши (BALB/C) 3 протокола: (1) 0,1% Triton X-100, 2% SDC; (2) 0,1% SDS, 0.1% Triton X-100. (3) 8mM CHAPS. Перфузия через трахею и ПЖ

A.B. Daly et al., 2011 Мыши (C57BL/6, BALB/C) 0,1% Тритон X-100, 2% SDC Перфузия через трахею и ПЖ

T. Jensen et al., 2012 Мыши (C57BL/6) 0,1% Triton X-100, 2% SDC Перфузия через трахею

R.W. Bonvillain et al., 2012 Макаки-резус 0,1% Triton X-100, 2% SDC Перфузия через трахею и ЛА

Nichols et al., 2013 Свиньи 2% SDS, 1% SDS Перфузия через ЛА

CHAPS — 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат; SDS — додецил сульфат натрия (анионный сурфактант для лизиса клеток и расщепления белковых цепей); SDC — натриевая соль дезоксихолевой кислоты(водорастворимый ионный детергент, используемый для разрушения белковых связей); Triton X-100 — неионный детергент для растворения белков; ЛА — легочная артерия; ПЖ — правый желудочек .

Резидуальные клеточные и ядерные фрагменты, образующиеся в процессе децеллюляризации, могут повлиять на развитие иммунного ответа Существующие критерии оценки качества проведенной децеллюляризации определяют в большей степени денуклеаризацию тканей, а не собственно децеллюляризацию [20]. ДНК в данном случае является индикатором наличия иных, сопряженных с нуклеиновыми кислотами, внутриклеточных или мембранных молекул [25]. Например, протеомный анализ с использованием масс-спектрометрии показал присутствие широкого диапазона остаточных ядерных белков и белков цитоскелета даже после успешно проведенной децеллюляризации легких [10, 16, 17].

В связи с тем, что детергентно-энзиматический метод децеллюляризации вызывает определенного рода повреждения барьерной функции легких, существует необходимость разработки протоколов, сохраняющих волокна ВКМ при завершении децел-люляризации Ряд авторов предлагают изменять кислотность растворов детергентов [10, 11] для снижения потерь эластической составляющей каркасов легких и содержания в них гликозаминогли-канов Другой метод предлагает покрывать децел-люляризированный каркас коллагеном или МаШде! для улучшения биомеханических свойств каркаса и адгезии клеток [18]. Однако убедительных данных о том, что предпринятые меры улучшают архитектонику каркаса легких в процессе децеллюляризации, получено не было [10, 18].

Способ введения растворов детергентов также влияет на степень микроструктурных повреждений легких Методы децеллюляризации с проведением перфузии легочных сосудов повреждают аэрогема-тический барьер, что проявляется наличием крови в воздушных путях после имплантации рецеллюляри-зированного легкого [26, 27]. Проведение децеллю-ляризации через трахею более эффективно и легко доступно по сравнению с сосудистой перфузией, так как общая площадь дыхательной поверхности легких составляет в среднем 120 м2 [28]. Был проведен ряд исследований по изучению результатов интер-миттирующей децеллюляризации для сохранения микроархитектоники легочных мембран [29] Однако предварительные данные морфологического и иммуногистохического анализов, проведенных в том числе и в нашем исследовании, позволяют заключить, что при перфузии сосудистого русла снижение качественного и количественного состава ВКМ, включая протеогликаны, эластин, фибронектин и ла-минин, происходит в меньшей степени, чем при использовании децеллюляризации через дыхательные пути [10, 30].

Рецеллюляризация легких:

методы и клеточные популяции

Концепция рецеллюляризации легких, подобно иным органам, включает в себя заселение децел-люляризированного каркаса клетками, способными прикрепляться, мигрировать, пролиферировать, выполнять специализированные функции для воссоздания свойств нативных тканей органа . Имеющиеся данные экспериментальных и клинических исследований подтверждают тропность клеток к биологическому каркасу [10, 31, 32]. Так, описаны успешные трансплантации децеллюляризированных клапанов

аорты и сосудов, когда биоискусственные графты ре-целлюляризировались миграцией клеток реципиента через каркас с последующей дифференцировкой в клетки, подобные эндотелиальным [32, 33]. Подобного успеха удалось достичь и при проведении клинических исследований в отношении трахеи, мочевого пузыря и клапанов сердца [34-38]. Безусловно, определенную трудность проведения рецеллюляри-зации представляет собой трехмерность структуры легких по сравнению с более простыми по строению кожей, костью или клапанами сердца . В настоящий момент проводятся исследования по заселению каркаса легких через трахею и статической рецеллюля-ризации фрагментов легких клетками альвеолярного эпителия I и II типов [39]. Основными клеточными ресурсами при рецеллюляризации каркаса легких в эксперименте также считаются эндотелиальные клетки, эмбриональные стволовые клетки, мульти-потентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки [10].

Эпителиальные клетки

Альвеолярный эпителий представлен в основном двумя типами специализированных клеток: альвеолярным эпителием типа I (AET I) в стадии терминальной дифференцировки и сурфактант продуцирующим кубическим эпителием типа II (AET II) [39]. Последние представляют особую значимость ввиду важности производимого ими сурфактанта для снижения поверхностного натяжения жидкости и, таким образом, предотвращения спадания альвеол

В 1986 г . J . S . Lwebuga-Mukasa c соавт . продемонстрировали возможность трансформации крысиных клеток AET II в AET I на децеллюляризированном матриксе легких человека [40]. A . P . Price c соавт . (2010) удалось доказать, что децеллюляризиро-ванный матрикс поддерживает рост фетальных AET II [13]. Более того, через неделю после инъекции фетальных AET II в альвеолах отмечалось наличие клеток, прикрепленных к каркасу и позитивно окрашивающихся на содержание цитокератина-18 и предшественников сурфактант ассоциированных белков группы С [13]. Следовательно, каркас после обработки детергентами сохраняет структурные компоненты, влияющие на дифференцировку клеток альвеолярного эпителия, при этом указанное влияние является органоспецифичным, так как рецеллю-ляризация теми же клетками-предшественницами децеллюляризированного каркаса печени не способствовала синтезу специфических белков [10, 41]. Неслучайно большинство исследователей считают эпителиальные клетки наиболее перспективным источником для репопуляции каркаса легких [10, 13, 32-38].

Различные виды стволовых клеток

Стволовые клетки негемопоэтического ряда обладают иммуномодулирующим и регенеративным потенциалом, что широко используется при ре-целлюляризации биологических каркасов легких [10-12]. ММСК представляют собой наиболее доступный клеточный ресурс, обладают выраженной пролиферативной активностью, способны выделять ряд факторов роста и противовоспалительных цито-кинов для регулирования эндотелиальной и эпители-

альной проницаемости и уменьшения выраженности воспалительного процесса [16, 42—45]. A . B . Daly (2012) с соавт . продемонстрировали в эксперименте, что ММСК, введенные через трахею, способны к пролиферации и миграции в ткани с высоким содержанием ламинина и коллагена I и IV типов [16]. Указанная тропность к коллагену в условиях сохранности компонентов базальной мембраны каркаса после децеллюляризации легких является одним из преимуществ использования ММСК В то же время, способность ММСК дифференцироваться в клетки эпителиального ряда на децеллюляризированном каркасе подвергается сомнению рядом авторов [10, 15, 17, 19].

Децеллюляризированный каркас легких при сохранности белков ВКМ также поддерживает диф-ференцировку in vitro эмбриональных стволовых клеток в различные специфичные клеточные линии для репопуляции легких, что широко используется многими исследователями [19, 46, 47]. Так, R . W . Bonvillain с соавт . (2012) подтвердили способность мышиных эмбриональных стволовых клеток дифференцироваться в эпителиальные и эндотели-альные клеточные линии [19]. В целом, возможность использования стволовых клеток для индукции различных структур дыхательных путей представляется перспективным направлением . Однако клиническое применение клеточной терапии требует проведения более продолжительных фундаментальных исследований с обязательным изучением отдаленных результатов и противопоказаний к проведению лечения

Эндотелиальные клетки

Эндотелиальные клетки обеспечивают функционирование процессов газообмена и барьерной функции легких, поддерживая нормальный метаболизм эпителиальных клеток и клеток-предшественниц, а также обеспечивая протекание не респираторных метаболических процессов . Рецеллюляризация каркасов легких эндотелиальными клетками, несмотря на многократные попытки, приводит к неравномерному их распределению в сосудистом русле и повышению риска развития тромбозов и органной недостаточности [14, 48].

Разветвленная сеть кровеносных сосудов и бронхов в легких позволяет использовать комбинированный способ введения клеток при проведении ре-целлюляризации в эксперименте . Так, через трахею целесообразно вводить эпителиальные клетки и фе-тальные AET II для регенерации альвеолярного эпителия, в то время как для эндотелиальных и стволовых клеток оптимальна перфузия в виде суспензии через сосудистое русло [11—18]. Последние исследования по изучению способности эндотелиальных клеток-предшественниц использовать молекулы клеточной адгезии для запуска неоваскулогенеза подтверждают данную гипотезу [10].

Рецеллюляризация легких:

основные трудности проведения

Технические трудности вентиляции легких в биореакторе требуют оптимизации процессов рецеллю-ляризации, а также сокращения времени выполнения протоколов Собственные исследования авторов в области разработки протоколов децеллюляризации

и рецеллюляризации легких крысы подтверждают необходимость соблюдения условий, максимально приближенных к физиологическим, на протяжении всего эксперимента, а также важность мониторинга частоты дыхания, общего объема, функциональной и остаточной жизненной емкости при вентиляции графта [30].

Для формирования функционирующих легких особенно важен период внутриутробного развития, когда дыхательные движения способствуют попаданию амниотической жидкости в трахеобронхиальное дерево плода, играя значительную роль в процессе роста и созревания легких [49]. Попытки воссоздать in vitro указанные физиологические условия механическим растяжением незначительно повысили эффективность синтеза белков ВКМ [10]. При создании тканеинженерных легких также необходимо иметь в виду, что альвеолярная структура каркаса повреждается при уменьшении содержания белков ВКМ, неизбежном при проведении децеллюляризации и рецеллюляризации . Снижение содержания фибронектина и ламинина в базальных мембранах легочных альвеол препятствует полноценной клеточной адгезии и ухудшает биомеханические свойства каркаса [50, 51]. Любое чрезмерное механическое воздействие повреждает микроструктуру органа, что потенциально снижает функциональные способности тканеинженерного каркаса [50].

Трансплантация тканеинженерных легких

животным: исходы и перспективы

На данный момент известно о двух трансплантациях тканеинженерных легких мелким лабораторным животным (крысам). Оба вмешательства были выполнены в 2010 г . в США с использованием биореактора на подготовительном этапе для рецел-люляризации легких суспензией эпителиальных и эндотелиальных клеток [11, 12]. Полученные тка-неинженерные графты были ортотопически пересажены крысам и вовлечены в процесс газообмена в течение 120 мин . и 30 мин . , соответственно . Легкие вентилировались атмосферным воздухом с положительным давлением на выдохе (PEEP). Физиологическая поддержка заключалась в проведении гиперос-молярной перфузии до проведения трансплантации, аспирация секретируемой слизи выполнялась через эндотрахеальную трубку [14]. Несмотря на предпринятые превентивные меры, сохранность и гомеостаз каркаса были сильно ограничены . После трех дней вентиляции каркаса отмечалась дилатация дыхательных путей, наличие разрушенных клеток в просвете Кроме того, вентиляция атмосферным воздухом вызывала деструкцию альвеолярного эпителия и дилатацию периферических альвеол, что приводило к нарушениям микроархитектоники каркаса [51]. Однако пригодность созданных in vitro тканеинже-нерных легких к длительному функционированию в организме реципиента оценить сложно, так как ни один эксперимент не продолжался более 6 ч от момента проведения трансплантации [11,12].

Необходимо учитывать, что для создания рецел-люляризированных легких, пригодных для пересадки, одним из важнейших аспектов является выбор донора для проведения первого этапа исследования — децеллюляризации . При помощи методов иммуногистохимии и масс-спектрометрии было показано, что возраст донора легких, состояние

донорских органов и тип клеток, выбранных для проведения рецеллюляризации существенно влияют на состояние получаемого тканеинженерного каркаса

[52] Это исключает использование для проведения децеллюляризации органов с патологией, например, эмфиземой и легочным фиброзом В качестве модели для создания тканеинженерных легких человека рассматриваются низшие приматы и свиньи Однако различия в составе ВКМ, особенно коллагеновых волокон, у животных и человека порождает сложности в интерпретации данных экспериментов . ВКМ, полученный при децеллюляризации легких свиньи, содержит небольшое количество a-галактозильного эпитопа, который способствует развитию реакции отторжения через активацию системы комплемента

[53]. В то же время, несмотря на присутствие данного эпитопа в матриксе после децеллюляризации, не удалось привести убедительные доказательства развития неблагоприятного иммунного ответа и ремо-делирования тканей при проведении доклинических исследований [54—56], что позволяет использовать животных, в частности, свиней для изучения рецел-люляризации каркасов легких животных клетками человека . Возможно также проведение генной модификации свиней перед проведением эксперимента для снижения вероятности отторжения ксеногенных каркасов [57—59]. Использование низших приматов для данной цели во многих странах ограничивается сложностью законодательного регулирования, большими экономическими затратами на содержание животных, а также возможностью развития перекрестных зоонозов [1Ш.

Одним из наиболее сложных моментов в создании функционирующих тканеинженерных легких является проведение операции по пересадке рецеллюля-ризированного легкого с наложением бронхиальных и сосудистых анастомозов Согласно стандартной технике, операция включает в себя наложение анастомоза на главный бронх, легочную вену и ствол легочной артерии В связи с повреждением каркаса легких и снижением содержания белков ВКМ, в различной степени происходящих во время проведения децеллюляризации, механические свойства тканеинженерного легкого нарушаются . Это предполагает модификацию применяемой хирургической тактики в сторону максимальной защиты тканей от повреждения и превентивные меры, направленные на укрепление анастомоза и предотвращение его несостоятельности Той же стратегии необходимо придерживаться и при трансплантации ксеногенного тканеинженерного каркаса легких, когда ряд анатомических структур подвергается резекции в силу видовой специфичности строения организмов (например, трахеальный бронх краниальной доли правого легкого свиньи резецируется при пересадке) Более того, у различных видов формы легких значительно отличаются в зависимости от объема грудной

ЛИТЕРАТУРА:

1. Lim M . L ., Jungebluth P ., Macchiarini P . The Implications of stem cell applications for diseases of the respiratory system . Adv . Biochem . Eng . Biotechnol . 2^13; 13^:39-54 .

2 . Calle E .A. , Petersen T. H ., Niklason L. E . Procedure for lung engineering . J . Vis . Exp . 2^11; 49: 26-51.

3 . Wang D ., Morales J . E ., Calame D . G . et al . Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice . Mol . Ther . 2^12; 18t3):625-34 .

4 . Takahashi K ., Yamanaka S . Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors . Cell 2Ш6; 126(4): 663-76 .

клетки, что также нужно учитывать при проведении трансплантации ксеногенных каркасов, рецеллюля-ризированных аллогенными клетками [60, 61]. Эта проблема, наряду с упомянутыми выше, предполагает проведение дополнительных исследований для достижения конечной цели — получения функционирующих тканеинженерных легких

Заключение

В последние десятилетия широко изучаются различные подходы для решения проблемы нехватки донорских органов для проведения трансплантации легких пациентам в терминальных стадиях болезни Основные перспективы в этой области связывают с использованием методов регенеративной медицины: клеточной терапии для регенерации легких, в том числе с использованием индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток, дифференцирующихся в клетки легочного эпителия, и тканевой инженерии для создания каркаса легких после последовательного проведения децеллюляризации и рецеллюляризации . Децеллюляризация легких с сохранением компонентов ВКМ и сложной микроархитектоники органа является «золотым стандартом» для получения неиммуногенного каркаса легких для последующего заселения аутогенными клетками реципиента Таким образом, рецеллюляризация как основа регенерации легких может оказаться перспективной альтернативой лечения заболеваний легких в будущем . Однако, несмотря на имеющиеся плюсы применения методов регенеративной медицины в лечении заболеваний легких, остается ряд вопросов, которые должны быть решены до применения биоинженерных легких в клинической практике К вопросам, требующим проведения дополнительных исследований для их решения, относится, например, проблема проведения децеллюляризации легких с сохранением механических и функциональных свойств получаемого каркаса, выбор идеального животного — донора для создания и исследования модели легких человека in vivo, а также проблема выбора оптимального типа и количества клеток для заселения биологического каркаса Решение упомянутых вопросов приведет к получению тканеинженерных легких, которые в перспективе позволят решить проблемы трансплантологии и органного донорства .

Благодарности

Работа финансирована грантом Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования от 19 октября 2011 г. № 11.G34.31.0065.

5 . Hoshiba T ., Lu H ., Kawazoe N . et al . Decellularized matrices for tissue engineering . Expert Opin . Biol . Ther . 2010; 10(12): 1717-28 .

6 . Kotsimbos T., Williams T .J ., Anderson G . P . Update on lung transplantation: programmes, patients and prospects . Eur . Respir. Rev . 2012; 21: 271-305 .

7 . Zafar S .Y ., Howell D . N . , Gockerman J . P . Malignancy after solid organ transplantation: an overview . Oncologist 2008; 13:769-78 .

8 . Valapour M . , Paulson K ., Smith J . M . et al . Annual Data Report: lung . Am . J . Transplant . 2013; 13(Suppl 1):149-77 .

9 . Oto T ., Okada Y., Bando T. et al . Japanese society of lung and heart—lung transplantation . Registry of the Japanese society of lung and heart-lung transplantation: the official Japanese lung

transplantation report 2012 . Gen . Thorac . Cardiovasc . Surg . 2013; 61:208-11.

10 . Tsuchiya T ., Sivarapatna A ., Rocco K . et al . Future prospects for tissue engineered lung transplantation . Decellularization and recellularization-based whole lung regeneration . Organogenesis 2014; 10(2): 196-207 .

11. Petersen T . H ., Calle E .A ., Zhao L . et al . Tissue-engineered lungs for in vivo implantation . Science 2010; 329: 538-41.

12 . Ott H . C ., Clippinger B ., Conrad C . et al . Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung . Nat . Med . 2010; 16: 927-33

13 . Price A . P ., England K .A ., Matson A . M . et al . Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded . Tissue Eng . Part A 2010; 16: 2581-91.

14 . Song J . J . , Kim S . S ., Liu Z . et al . Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats . Ann . Thorac . Surg . 2011; 92: 998-1005 .

15 . Cortiella J ., Niles J ., Cantu A. et al . Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation . Tissue Eng . Part A 2010; 16:2565-80 .

16 . Daly A. B ., Wallis J . M ., Borg Z. D . et al . Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells . Tissue Eng . Part A 2012; 18:1-16 .

17 . Wallis J . M . , Borg Z . D ., Daly A . B . et al . Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung decellularization and recellularization . Tissue Eng . Part C Methods 2012; 18: 420-32 .

18 . Jensen T ., Roszell B ., Zang F . et al . A rapid lung decellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation . Tissue Eng . Part C Methods 2012; 18: 632-46

19 . Bonvillain R . W ., Danchuk S ., Sullivan D . E . et al . A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells Tissue Eng Part A 2012; 18: 2437-52

20 . Gilbert T.W ., Sellaro T . L., Badylak S . F . Decellularization of tissues and organs Biomaterials 2006; 27: 3675-83

21 McDevitt C A , Wildey G M , Cutrone R M Transforming growth factor-beta1 in a sterilized tissue derived from the pig small intestine submucosa . J . Biomed . Mater. Res . A 2003; 67: 637-40 .

22 Crapo P M , Gilbert T W , Badylak S F An overview of tissue and whole organ decellularization processes . Biomaterials 2011; 32: 3233-43

23 Petersen T H , Calle E A , Colehour M B et al Matrix composition and mechanics of decellularized lung scaffolds Cells Tissues Organs 2012; 195: 222-31.

24 . Wallis J . M ., Borg Z . D ., Daly A . B . et al . Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung decellularization and recellularization Tissue Eng Part C Methods 2012; 18: 420-32

25 Nagata S , Hanayama R , Kawane K Autoimmunity and the clearance of dead cells . Cell 2010; 140(5): 619-30 .

26 . Franzdottir S . R ., Axelsson I .T., Arason A.J . et al . Airway branching morphogenesis in three dimensional culture Respir Res 2010; 11: 162-72 .

27 Huh D , Matthews B D , Mammoto A et al Reconstituting organ-level lung functions on a chip . Science 2010; 328:1662-8 .

28 Gehr P , Bachofen M , Weibel E R The normal human lung: ultrastructure and morphometric estimation of diffusion capacity Respir . Physiol . 1978; 32: 121-40 .

29 Maghsoudlou P , Georgiades F , Tyraskis A et al Preservation of micro-architecture and angiogenic potential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment Biomaterials 2013; 34: 6638-48

30 Kuevda E , Gubareva E , Sotnichenko A et al Best decellularization protocol for tissue-engineered lungs Proceedings of the World Conference on Regenerative Medicine; 2013 Oct 23-25; Leipzig; Germany . Regenerative Medicine 2013; 8 (Suppl 6): s21.

31. Sayk F ., Bos I . , Schubert U . et al . Histopathologic findings in a novel decellularized pulmonary homograft: an autopsy study Ann Thorac Surg 2005; 79: 1755-8

32 . Takagi K ., Fukunaga S ., Nishi A . et al . In vivo recellularization of plain decellularized xenografts with specific cell characterization in the systemic circulation: histological and immunohistochemical study Artif Organs 2006; 30: 233-41

33 . Friedrich L . H ., Jungebluth P . , Sjöqvist S . et al . Preservation of aortic root architecture and properties using a detergent-enzymatic perfusion protocol . Biomaterials 2014; 35(6): 1907-13 .

34 Baiguera S , Jungebluth P , Burns A , et al Tissue engineered human tracheas for in vivo implantation . Biomaterials 2010; 31: 8931-38 .

35 . Macchiarini P ., Jungebluth P ., Go T . et al . Clinical transplantation of a tissue-engineered airway . Lancet 2008; 372: 2023-30 .

36 . Atala A., Bauer S . B . , Soker S . et al . Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty Lancet 2006; 367: 1241-6 .

37 . Biancosino C ., Zardo P . , Walles T. et al . Generation of a bioartificial fibromuscular tissue with autoregenerative capacities for surgical reconstruction . Cytotherapy 2006; 8: 178-83 .

38 . Cebotari S . , Lichtenberg A., Tudorache I . et al . Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells . Circulation 2006; 114(Suppl I): 132-7 .

39 . Hermanns M . I . , Unger R . E . , Kehe K . et al . Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro Lab Invest 2004; 84: 736-52 .

40 . Lwebuga-Mukasa J . , Inggar D ., Madri J . Repopulation of a human alveolar matrix by adult rat type II pneumocytes in vitro . A novel system for type II pneumocyte culture Exp Cell Res 1986; 162: 423-35

41. Cortiella J ., Niles J ., Cantu A . et al . Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation . Tissue Eng . Part A 2010; 16: 2565-80 .

42 . Ingenito E . P ., Tsai L ., Murthy S . et al . Autologous lung derived mesenchymal stem cell transplantation in experimental emphysema Cell Transplant . 2012; 21(1): 175-89 .

43 Collas P , Hakelien A M Teaching cells new tricks Trends Biotechnol . 2003; 21 (8): 354-361.

44 Ambrosi D J , Rasmussen T P Reprogramming mediated by stem cell fusion J Cell Mol Med 2005; 9(2): 320-330

45 . Takahashi K . , Yamanaka S . Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors . Cell . 2006; 126(4): 663-76 .

46 Petersen T H , Calle E A , Colehour M B et al Bioreactor for the long-term culture of lung tissue . Cell Transplant . 2011; 20: 1117-26 .

47 . Longmire T . A ., Ikonomou L ., Hawkins F . et al . Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells Cell Stem Cell 2012; 10: 398-411.

48 . Shamis Y . , Hasson E ., Soroker A . et al . Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells . Tissue Eng . Part C Methods 2011; 17: 861-70 .

49 Inanlou M R , Baguma-Nibasheka M , Kablar B The role of fetal breathing-like movements in lung organogenesis Histol Histopathol 2005; 20: 1261-6 .

50 Petersen T H , Calle E A , Colehour M B et al Matrix composition and mechanics of decellularized lung scaffolds Cells Tissues Organs 2012; 195: 222-31.

51. Badylak S . F . Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction Transpl Immunol 2004; 12: 367-77

52 Sokocevic D , Bonenfant N R , Wagner D E et al The effect of age and emphysematous and fibrotic injury on the recellularization of decellularized lungs . Biomaterials 2013; 34: 3256-69 .

53 Daly K A , Stewart-Akers A M , Hara H et al Effect of the alphaGal epitope on the response to small intestinal submucosa extracellular matrix in a nonhuman primate model Tissue Eng Part A 2009; 15: 3877-88 .

54 . McPherson T . B ., Liang H . , Record R . D . et al . Galalpha(1,3) Gal epitope in porcine small intestinal submucosa Tissue Eng 2000; 6: 233-9

55 . Badylak S . , Kokini K ., Tullius B . et al . Morphologic study of small intestinal submucosa as a body wall repair device J Surg Res 2002; 103: 190-202 .

56 Nuininga J E , van Moerkerk H , Hanssen A et al Rabbit urethra replacement with a defined biomatrix or small intestinal submucosa Eur urol 2003; 44: 266-71

57 Cantu E , Parker W , Platt J L et al Pulmonary xenotransplantation: rapidly progressing into the unknown Am J Transplant . 2004; 4(Suppl 6): 25-35 .

58 Toledo-Pereyra L H , Lopez-Neblina F Xenotransplantation: a view to the past and an unrealized promise to the future Exp Clin Transplant 2003; 1: 1-7 .

59 Ekser B , Rigotti P , Gridelli B et al Xenotransplantation of solid organs in the pig-to-primate model . Transpl . Immunol . 2009; 21: 87-92

60 Nakakuki S Bronchial tree, lobular division and blood vessels of the pig lung . J . Vet . Med . Sci . 1994; 56: 685-9 .

61. Daggett C .W . , Yeatman M ., Lodge A. J . et al . Total respiratory support from swine lungs in primate recipients J Thorac Cardiovasc Surg . 1998; 115: 19-27 .

Поступила: 18.02.2015