СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИНСУЛЬТА
METHOD FOR TREATMENT OR PREVENTION OF STROKE

ДАННЫЕ ПО РОДСТВЕННОЙ ЗАЯВКЕ
[001] По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании заявки на патент Австралии №2014904606, озаглавленной как «Способ лечения или предотвращения инсульта», поданной 17 ноября 2014 года. Полное содержание заявки включено в настоящее описание посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
[002] Настоящая заявка подается с перечнем последовательностей в электронной форме. Полное содержание перечня последовательностей включено в настоящее описание посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[003] Настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения последствий инсульта у субъекта путем антагонизма фактора роста эндотелия сосудов (VEGF)-B.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[004] Инсульт является второй ведущей причиной смертности после заболевания сердечно-сосудистой системы и основной причиной инвалидности в Австралии. Это третья ведущая причина смерти в Соединенных Штатах, где каждый год от инсульта умирают более 140000 человек. Инсульт также является основной причиной серьезной и долгосрочной инвалидности в Соединенных Штатах. Предполагаемые расходы на инсульт в США за период с 2005 по 2050 год составляют 2,2 трлн. долларов США.
[005] Инвалидность затрагивает 75% выживших после инсульта, снижая возможность их трудоустройства. Инсульт может сказываться на физическом, умственном, эмоциональном состоянии субъектов или комбинации этих трех состояний.
[006] Некоторые из физических недостатков, которые могут возникнуть в результате инсульта, включают мышечную слабость, онемение, пролежни, пневмонию, недержание мочи, апраксию (неспособность выполнять уже освоенные движения), трудности, связанные с повседневной деятельностью, потерю аппетита, потерю речи, потерю зрения и боль. Если инсульт достаточно серьезный или произошел в определенном месте, таком как части ствола головного мозга, то он может привести к коме или смерти.
[007] Эмоциональные проблемы, возникающие после инсульта, могут быть результатом прямого повреждения эмоциональных центров в головном мозге или результатом расстройства и трудности адаптации к новым ограничениям. Постинсультные эмоциональные трудности включают депрессию, тревогу, панические атаки, уплощенный аффект (неспособность выражать эмоции), манию, апатию и психоз.
[008] Когнитивные расстройства, возникающие в результате инсульта, включают нарушения восприятия, проблемы с речью, слабоумие и проблемы со вниманием и памятью. Человек, перенесший инсульт, может не знать о своей заболевании - состояние, называемое анозогнозия. В состоянии, называемом односторонним пространственным игнорированием, пациент не способен следить за чем-либо в пространстве на стороне, противоположной поврежденному полушарию.
[009] Как правило, в ближайшую неделю после события, у до 10% всех пациентов с инсультом начинаются судороги. Тяжесть инсульта увеличивает вероятность судорог.
[0010] Инсульт представляет собой быстро развивающуюся потерю функции(-ий) головного мозга из-за нарушения его кровоснабжения. Это может быть следствием ишемии (недостаточного притока крови), вызванной закупоркой (тромбоз, артериальная эмболия), или кровоизлияния (истечение крови). В результате, пораженная область головного мозга не может функционировать, что может привести к неспособности субъекта двигать одной или более конечностями одной из сторон тела, неспособности понять или формулировать речь, или невозможности видеть одной из сторон поля зрения. Инсульт часто приводит к гибели нервных клеток и может привести к смерти.
[0011] Существуют два основных типа инсульта: (i) ишемический инсульт, вызванный временным или постоянным прекращением притока крови в головной мозг и составляющий 85% случаев инсульта, и (ii) кровоизлияние в мозг, вызванный разрывом кровеносного сосуда и составляющий большую часть остальных случаев. Наиболее распространенной причиной ишемического инсульта является окклюзия средней мозговой артерии (внутричерепной артерии лежащей ниже внутренней сонной артерии), которая повреждает головной мозг (например, кору головного мозга), например, моторную и сенсорную кору головного мозга. Такое повреждение приводит к гемиплегии, гемианестезии и, в зависимости от поврежденного полушария головного мозга, либо к речевому, либо к визуально-пространственному расстройству.
[0012] Некоторые нейропротективные агенты были исследованы на эффективность при лечении инсульта и не показали удовлетворительных результатов, в том числе антагонисты N-метил-D-аспартатного рецептора, включая лубелузол, налмефен, клометиазол, блокаторы кальциевых каналов (включая антагонисты α-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты, агонисты серотонина (например, репинотан) и модуляторы трансмембранных калиевых каналов), тирилазад, антитело против ICAM-I (молекулы межклеточной адгезии I), антилейкоцитарное антитело человека (Hu23F2G), антитромбоцитарное антитело (например, абциксимаб), цитихолин (экзогенная форма цитидин-5'-дифосфохолина) и основной фактор роста фибробластов.
[0013] Из вышеизложенного очевидно, что в области техники существует потребность в терапевтических средствах для лечения инсульта.
[0014] Фактор роста VEGF-B также изучали на предмет влияния на выживаемость нейронов, в том числе после инсульта. Sun et al., J. Cereb. Blood Flow and Metab., 24: 1146-1152, 2004 изучали инсульт у мышей, лишенных VEGF-В, и обнаружили, что отсутствие этого фактора роста приводит к значительно большему объему инфаркта и неврологическим нарушениям. Li et al., J. Clin. Invest., 118: 913-923, 2008 показали, что инъекция VEGF-B в головной мозг мышей, у которых был индуцирован инсульт, спасает нейроны от апоптоза, что вновь указывает на роль этого фактора роста в обеспечении терапевтического эффекта после инсульта. Расширяя эти исследования, Li et al., Cell Adhesion and Migration, 3: 322-327, 2009 предположили, что фактор VEGF-B защищает нейроны от апоптоза, и что данный фактор роста может иметь терапевтическое значение при лечении нейродегенеративных заболеваний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0015] При создании настоящего изобретения авторы изучали влияние ингибирования передачи сигналов VEGF-B на принятой мышиной модели инсульта, например ишемического инсульта. Авторами изучено влияние данного фактора роста путем введения антагониста VEGF-B (например, антагонистического антитела) до или после индуцирования инсульта. В противоречии с тем, что подразумевалось в исследованиях, описанных выше, авторам изобретения удалось уменьшить последствия инсульта, например, размер инфаркта, степень внутримозгового кровоизлияния или нарушение гематоэнцефалического барьера. Данный подход отличается от предотвращения возникновения инсульта. Авторам также удалось улучшить результаты тромболитической терапии в отношении инсульта, например, путем уменьшения размера инфаркта, кровоизлияний (например, внутримозговых кровоизлияний) и числа смертельных кровоизлияний. Авторами изобретения также обнаружено, что введение антагониста VEGF-B (например, антагонистического антитела) после инсульта увеличивает время, в течение которого тромболитический агент может быть безопасно введен субъекту.
[0016] Результаты, полученные авторами изобретения, обеспечивают основу для разработки способов уменьшения последствий инсульта у субъекта путем ингибирования передачи сигналов VEGF-B. Полученные данные также служат основой для разработки способов профилактики или лечения последствий инсульта у субъекта путем ингибирования передачи сигналов VEGF-B.
[0017] Например, настоящее изобретение относится к способу уменьшения последствия инсульта у субъекта, причем способ включает введение субъекту соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B.
[0018] Авторами изобретения также обнаружено, что можно уменьшить частоту возникновения кровоизлияния у субъекта, перенесшего инсульт. Соответственно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу уменьшения частоты возникновения кровоизлияния у субъекта, перенесшего инсульт, причем способ включает введение соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B. В одном примере способ дополнительно включает введение тромболитического соединения.
[0019] Указанный результат также обеспечивает основу для разработки способов продолжения лечения или начала лечения субъекта, перенесшего инсульт, для предотвращения кровоизлияния, например внутримозгового кровоизлияния, при этом способ включает введение соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B. Например, лечение субъекта соединением, ингибирующим передачу сигналов VEGF-B, может быть проведено повторно, после выполнения раскрытого в данном документе способа, для того чтобы уменьшить риск или предотвратить кровоизлияние, например внутримозговое кровоизлияние.
[0020] Авторами изобретения также обнаружено, что можно уменьшить вероятность смертельного кровоизлияния у субъекта, перенесшего инсульт. Соответственно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу уменьшения вероятности смертельного кровоизлияния у субъекта, перенесшего инсульт, при этом способ включает введение соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B. В одном примере способ дополнительно включает введение тромболитического соединения.
[0021] Авторами изобретения также обнаружено, что можно уменьшить степень нарушения или проницаемости гематоэнцефалического барьера. Таким образом, авторами также раскрыт способ предотвращения нарушения или увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера, при этом способ включает введение соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B. В одном примере нарушение или увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера связаны с отеком. В одном примере нарушение или увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера вызваны инсультом, например травмой, и/или ишемией.
[0022] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят до или после инсульта. Например, соединение вводят профилактически или терапевтически. В одном примере соединение вводят до инсульта. В одном примере соединение вводят после инсульта.
[0023] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение вводят перед инсультом и вводят субъекту с риском возникновения инсульта.
[0024] Приводимый в качестве примера субъект с риском возникновения инсульта страдает от сахарного диабета и/или ожирения. Например, сахарный диабет представляет собой сахарный диабет 2 типа.
[0025] Дополнительные или альтернативные характеристики субъекта с риском возникновения инсульта включают одну или более из следующих характеристик:
уже перенес инсульт и/или транзиторную ишемическую атаку,
есть случаи инсульта в семейном анамнезе,
страдает сердечно-сосудистым заболеванием,
имеет высокое кровяное давление,
имеет высокие уровни липопротеинов низкой плотности в плазме,
имеет метаболический синдром,
имеет нарушение сердечной деятельности, и/или
перенес операцию.
[0026] В одном примере дополнительно возраст субъекта достигает 55 лет или более, например 65 лет или более, или 75 лет или более.
[0027] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят после инсульта, и способ включает введение комбинации соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B, и тромболитического соединения. Соответственно, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят терапевтически.
[0028] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят через от приблизительно 1 до 10 часов после возникновения симптомов инсульта. Например, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят через от приблизительно 1 до 5 часов после возникновения симптомов инсульта. Соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят через от приблизительно 1 до 4 часов после возникновения симптомов инсульта. Соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят приблизительно через 1 час после возникновения симптомов инсульта.
[0029] Симптомы инсульта очевидны для специалиста в данной области техники и включают, например, один или более из слабости лицевой мускулатуры, слабости рук и/или трудности с речью.
[0030] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят до введения тромболитического соединения. Например, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят за от приблизительно 1 часа до приблизительно 10 часов до тромболитического соединения. Например, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят за от приблизительно 1 часа до приблизительно 6 часов до тромболитического соединения. Например, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят за от приблизительно 2 часов до приблизительно 6 часов до тромболитического соединения. Например, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят за от приблизительно 3 часов до приблизительно 5 часов до тромболитического соединения. Например, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят приблизительно за 4 часа до тромболитического соединения.
[0031] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят приблизительно через 1 час после возникновения симптомов инсульта и приблизительно за 4 часа до тромболитического соединения.
[0032] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, введение соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B, увеличивает время, в течение которого тромболитическое соединение может быть безопасно введено субъекту. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу увеличения времени, в течение которого тромболитическое соединение может быть безопасно введено субъекту, при этом способ включает введение соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B, и затем введение тромболитического соединения.
[0033] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, тромболитическое соединение вводят через более чем два часа после возникновения симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят через более чем три часа после возникновения симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят через более чем четыре часа после возникновения симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят через более чем пять часов после возникновения симптомов инсульта.
[0034] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, тромболитическое соединение вводят с приблизительно момента возникновения симптома инсульта до приблизительно десяти часов после возникновения симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят через от приблизительно четырех до десяти часов после возникновения симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят через от приблизительно четырех до восьми часов после возникновения симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят через от приблизительно трех до шести часов после появления симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят через от приблизительно четырех до шести часов после возникновения симптомов инсульта. Например, тромболитическое соединение вводят приблизительно через пять часов после возникновения симптомов инсульта.
[0035] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, вводят через приблизительно 1 час после возникновения симптомов инсульта и тромболитическое соединение вводят через приблизительно 5 часов после возникновения симптомов инсульта.
[0036] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, тромболитическое соединение выбрано из группы, состоящей из тканевого активатора плазминогена, ланетоплазы, ретеплазы, стафилокиназы, стрептокиназы, анистреплазы, десмотеплазы или урокиназы.
[0037] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, у субъекта повышены уровни глюкозы в крови натощак. Например, у субъекта уровень глюкозы в крови натощак превышает 150 мг/дл. Например, у субъекта уровень глюкозы в крови натощак превышает 180 мг/дл. Например, у субъекта уровень глюкозы в крови натощак превышает 200 мг/дл. Например, у субъекта уровень глюкозы в крови натощак превышает 300 мг/дл. Например, у субъекта уровень глюкозы в крови натощак превышает 400 мг/дл.
[0038] В одном примере симптом инсульта выбран из следующих:
размер инфаркта,
уменьшение частоты возникновения кровоизлияния у субъекта,
уменьшение вероятности смертельного кровоизлияния у субъекта, и/или
степень кровоизлияний, оцененная по шкале внутримозговых кровоизлияний у субъекта, и/или
нарушение или увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера у субъекта после инсульта.
[0039] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, нарушение или увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера у субъекта после инсульта может приводить к отеку головного мозга.
[0040] Способы оценки каждого из вышеизложенных показателей известны в данной области техники и/или описаны в данном документе.
[0041] Другие последствия инсульта известны в данной области техники и/или описаны в данном документе и включают, например, двигательное расстройство, такое как паралич, частичный паралич, невнятная речь, нескоординированное движение, мышечная слабость, гипотония, гипертония или непроизвольное аномальное движение.
[0042] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение(-ия) вводят в количестве, достаточном для проявления одного или более из следующих эффектов:
уменьшение размера инфаркта у субъекта,
уменьшение степени кровоизлияний, оцененной по шкале внутримозговых кровоизлияний у субъекта,
уменьшение степени нарушения или проницаемости гематоэнцефалического барьера у субъекта, и/или
уменьшение отека головного мозга у субъекта после инсульта.
[0043] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, инсульт представляет собой ишемический инсульт. Например, инсульт представляет собой ишемический инсульт головного мозга.
[0044] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, связывается c VEGF-B.
[0045] Например, соединение представляет собой белок, содержащий вариабельный участок антитела, который связывается или специфически связывается с VEGF-B и нейтрализует передачу сигналов VEGF-B.
[0046] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой антитело-миметик. Например, соединение представляет собой белок, содержащий антигенсвязывающий домен иммуноглобулина, например IgNAR, верблюжье антитело или Т-клеточный рецептор.
[0047] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой доменное антитело (например, содержащее только вариабельный участок тяжелой цепи или только вариабельный участок легкой цепи, который связывается с VEGF-B) или антитело, содержащее только тяжелые цепи (например, верблюжье антитело или IgNAR) или его вариабельный участок.
[0048] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой белок, содержащий Fv. Например, белок выбран из группы, состоящей из:
(i) одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv),
(ii) димерного scFv (ди-scFv), или
(iv) диатела,
(v) триатела,
(vi) тетратела,
(vii) Fab,
2
(viii) F(ab'),
(ix) Fv, или
H
H
(x) одного из от (i) до (ix), связанного с константным участком антитела, Fc или константным доменом тяжелой цепи (C)2 и/или C3.
[0049] В другом примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой антитело. Приводимые в качестве примера антитела представляют собой полноразмерные и/или голые антитела.
[0050] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой белок, который является рекомбинантным, химерным, CDR-привитым, гуманизированным, сингуманизированным, приматизированным, деиммунизированным или белком человека.
H
L
[0051] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой белок, содержащий вариабельный участок антитела, который конкурентно ингибирует связывание антитела 2Н10 с VEGF-B. В одном примере белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (V), содержащий последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи (V), содержащий последовательность SEQ ID NO: 4.
H
L
[0052] В одном примере соединение представляет собой белок, содержащий гуманизированный вариабельный участок антитела 2Н10. Например, белок содержит вариабельный участок, содержащий участки, определяющие комплементарность (CDR), V и/или V антитела 2Н10. Например, белок содержит:
H
(i) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 25-34 SEQ ID NO: 3,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 49-65 SEQ ID NO: 3, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 98-108, SEQ ID NO: 3 и/или
L
(ii) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 23-33 SEQ ID NO: 4,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 49-55 SEQ ID NO: 4, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 88-96 SEQ ID NO: 4.
H
L
H
L
[0053] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой белок, содержащий V и V, причем V и V, представляют собой гуманизированные вариабельные участки антитела 2Н10. Например, белок содержит:
H
(i) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 25-34 SEQ ID NO: 3,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 49-65 SEQ ID NO: 3, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 98-108 SEQ ID NO: 3, и
L
(ii) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 23-33 SEQ ID NO: 4,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 49-55 SEQ ID NO: 4, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 88-96 SEQ ID NO: 4.
[0054] Как будет очевидно специалисту в данной области техники, последовательность, кодируемая нуклеиновой кислотой, включает все варианты этой последовательности, которые могут быть спродуцированы во время экспрессии.
H
[0055] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, вариабельный участок или V в любом из вышеприведенных абзацев содержит последовательность SEQ ID NO: 5.
L
[0056] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, вариабельный участок или V в любом из вышеприведенных абзацев содержит последовательность SEQ ID NO: 6.
[0057] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой антитело.
H
L
[0058] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение представляет собой антитело, содержащее V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 5, и V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 6.
[0059] В одном примере белок или антитело представляет собой любую форму белка или антитела, кодируемую нуклеиновой кислотой, кодирующей любой из вышеперечисленных белков или антител.
[0060] В одном примере белок или антитело содержит:
H
(i) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 12, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18,
(b) CDR2, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 13, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 14 или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и/или
L
(ii) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 15, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21,
(b) CDR2, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 16, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 17, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.
[0061] В одном примере белок или антитело содержит:
H
(i) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 24, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30,
(b) CDR2, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 25, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 26, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и/или
L
(ii) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 27, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33,
(b) CDR2, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 28, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 29, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
[0062] В одном примере белок или антитело содержит:
H
(i) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 36, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42,
(b) CDR2, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 37, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 38, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, и/или
L
(ii) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 39, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45,
(b) CDR2, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 40, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, включающей SEQ ID NO: 41, или содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47.
H
L
[0063] В одном примере соединение входит с состав композиции. Например, композиция содержит белок, содержащий вариабельный участок антитела, или V, или V, или антитело, как описано в данном документе. В одном примере композиция дополнительно содержит один или более вариантов белка или антитела. Например, которая содержит вариант, где отсутствует кодированный С-концевой остаток лизина, деамидированный вариант, и/или гликозилированный вариант, и/или вариант, содержащий пироглутамат, например, на N-конце белка, и/или вариант, лишенный N-концевого остатка, например N-концевого глутамина в антителе или V-участке, и/или вариант, содержащий весь или часть сигнала секреции. Деамидированные варианты кодированных остатков аспарагина могут приводить к образованию изоформ изоаспарагиновой и аспарагиновой кислоты или даже сукцинамида, с участием смежных аминокислотных остатков. Деамидированные варианты кодированных остатков глутамина могут приводить к образованию глутаминовой кислоты. Композиции, содержащие гетерогенную смесь таких последовательностей и вариантов, предназначены для включения, когда делается отсылка на конкретную аминокислотную последовательность.
[0064] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, соединение, ингибирущее передачу сигналов VEGF-B, ингибирует или предотвращает экспрессию VEGF-B. Например, соединение выбирают из группы антисмысловой последовательности, миРНК, РНКи, рибозима и ДНКзима.
[0065] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, VEGF-B представляет собой VEGF-B млекопитающего, например VEGF-B человека.
[0066] В одном примере любого способа, описанного в данном документе, субъект представляет собой млекопитающее, например примата, такого как человек.
[0067] Способы лечения, описанные в данном документе, могут дополнительно включать введение другого соединения для уменьшения, лечения или предотвращения последствия инсульта.
[0068] Настоящее изобретение также относится к соединению, ингибирующему передачу сигналов VEGF-B, применяемому для уменьшения последствия инсульта.
[0069] Настоящее изобретение также относится к применению соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B, для получения лекарственного средства для уменьшения последствия инсульта.
[0070] Настоящее изобретение также относится к набору, включающему соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, в комплекте с инструкциями, применяемому для уменьшения последствия инсульта. Необязательно, набор дополнительно содержит тромболитическое соединение.
[0071] Настоящее изобретение также относится к набору, включающему соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, в комплекте с инструкциями, для введения соединения субъекту, перенесшему инсульт, в комбинации с тромболитическим соединением.
[0072] Настоящее изобретение также относится к набору, включающему тромболитическое соединение в комплекте с инструкциями, для введения соединения субъекту, перенесшему инсульт, в комбинации с соединением, ингибирующим передачу сигналов VEGF-B.
[0073] Приводимые в качестве примера последствия инсульта и соединения описаны в данном документе и должны быть приспособлены, с учетом необходимых изменений, к примерам изобретения, изложенным в предыдущих шести абзацах.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0074] На Фигуре 1A изображено графическое представление, демонстрирующее, что поглощение эндотелиальными клетками жирных кислот значительно увеличивается после 2 часов обработки белками VEGF-B, что измеряли с применением маркера BODIPY-C12. Значения представляют собой отношение поглощения, нормированное к контролю. *P менее 0,05, ***P менее 0,001 по сравнению с контролями.
[0075] На Фигуре 1B изображено графическое представление, демонстрирующее, что поглощение эндотелиальными клетками глюкозы значительно снижается после 2 часов обработки белками VEGF-B, что измеряли с применением флуоресцентного аналога глюкозы (2-NBDG). Значения представляют собой отношение поглощения, нормированное к контролю. *P менее 0,05, **P менее 0,01, ***P менее 0,001 по сравнению с контролями.
[0076] На Фигуре 1C изображено графическое представление, демонстрирующее, что первичные эндотелиальные клетки, подвергнутые воздействию жирных кислот (ЖК; 25 мкМ пальмитата натрия и 25 мкМ олеата натрия) в течение 2 часов или в течение ночи, показывают снижение способности к поглощению глюкозы (что измеряли с применением 2-NBDG). Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего. **P менее 0,01 по сравнению с контролями.
[0077] На Фигуре 2A изображено графическое представление, демонстрирующее повышенные уровни глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением (АО) по сравнению с мышами соответствующей возрастной группы на нормальном корме. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего. ***P менее 0,001 по сравнению с контролями.
[0078] На Фигуре 2B изображено графическое представление, демонстрирующее более крупные объемы инфаркта у мышей АО по сравнению с мышами соответствующей возрастной группы на нормальном корме после ишемического инсульта. Объемы инфаркта измеряли через 72 часа с помощью окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолхлоридом. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего, n равно 10 на группу. *P менее 0,01 по сравнению с контролями.
[0079] На Фигуре 2C изображено графическое представление, демонстрирующее увеличение степени кровоизлияния у мышей с АО по сравнению с мышами соответствующей возрастной группы на нормальном корме после ишемического инсульта. Кровоизлияние оценивали через 72 часа с помощью шкалы. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего, n равно 10 на группу. *P менее 0,01 по сравнению с контролями.
[0080] На Фигуре 2D изображено графическое представление, демонстрирующее, что экспрессия нейропилина 1 (NRP1), измеренная с помощью количественной ПЦР, увеличивается у мышей с АО через 3 часа после ишемического инсульта, в то время как уровни транскрипции VEGF-B и его рецептора VEGF-R1 (FMS-подобной тирозинкиназы 1 (FLT1)) значительно не отличаются от контралатеральных контролей. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего, n равно 3 на группу. **P менее 0,01 по сравнению с контролями.
18
18
[0081] На Фигуре 3A изображено графическое представление, демонстрирующее, что антагонизм VEGF-B с помощью 2Н10 улучшает поглощение аналога глюкозы F-дезоксиглюкозы (F-ДГ) в головном мозге мышей с АО по сравнению с мышами, обработанными изотипическим контролем IgG. Поглощение аналога глюкозы у мышей с алиментарным ожирением, обработанных 2Н10, было сопоставимо с таковым у обычных мышей. n равно 2-5/группа, среднее значение ± стандартная ошибка среднего. #p менее 0,05, **p менее 0,01.
[0082] На Фигуре 3B изображено графическое представление, демонстрирующее, что предварительная обработка антителом 2Н10, блокирующим VEGF-B, уменьшает объемы инфаркта у мышей с АО по сравнению с мышами соответствующей возрастной группы на нормальном корме после ишемического инсульта. Объемы инфаркта измеряли через 72 часа окрашиванием 2,3,5-трифенилтетразолхлоридом (ТТС). Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего, n равно 10 на группу. **P менее 0,01 по сравнению с контролями.
[0083] На Фигуре 3C изображено графическое представление, демонстрирующее, что предварительная обработка антителом 2Н10, блокирующим VEGF-B, уменьшает степень кровоизлияния у мышей с АО по сравнению с мышами соответствующей возрастной группы на нормальном корме после ишемического инсульта. Кровоизлияние оценивали через 72 часа с помощью шкалы. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего, n равно 10 на группу. **P менее 0,01 по сравнению с контролями.
[0084] На Фигуре 3D изображено графическое представление, демонстрирующее сохраненную экспрессию переносчика глюкозы GLUT-1 в области ишемической полутени через 1 час после ишемического инсульта после профилактической обработки антителами 2Н10 против VEGF-B. N равно 5/группа. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего, *p менее 0,05 по сравнению с контролем, #p менее 0,05 по сравнению с контролем.
[0085] На Фигуре 3E изображено графическое представление, демонстрирующее, что профилактическая обработка антителами 2Н10 против VEGF-B у мышей с АО уменьшает степень проницаемости гематоэнцефалического барьера (измеренную по экстравазации декстрана) через 1 час после ишемического инсульта. N равно 5/группа, среднее значение ± стандартная ошибка среднего, **p менее 0,01.
[0086] На Фигуре 3F изображено графическое представление, демонстрирующее, что профилактическая обработка антителом против VEGF-B уменьшает фосфорилирование окклюдина по серину (остаток серина 490) после ишемического инсульта у мышей с АО по сравнению с мышами, получавшими контроль IgG. Окрашивание специфическим к фосфосерину антителом против окклюдина в области контралатерального полушария и ипсилатеральной полутени оценивали количественно и выражали в виде пиксельной интенсивности. N равно 3, *p менее 0,05.
[0087] На Фигуре 3G изображено графическое представление, демонстрирующее, что накопление липидов (измеряли иммуноокрашиванием сосудистого адипофилина) в сосудах головного мозга спустя 3 часа после ишемического инсульта у мышей с АО блокируется профилактической обработкой антителом 2Н10 против VEGF-B по сравнению с обработкой изотипическим контролем (IgG). Среднее значение ± стандартная ошибка среднего, **p менее 0,01.
[0088] На Фигуре 4A изображено графическое представление, демонстрирующее, что ингибирование VEGF-B антителами 2Н10 значительно уменьшает объем инсульта после позднего тромболизиса у мышей с АО после ишемического инсульта. Объемы инфаркта измеряли через 72 часа после ишемического инсульта окрашиванием ТТС. N равно 6-10/группа, среднее значение + стандартная ошибка среднего, **p менее 0,01.
[0089] На Фигуре 4B изображено графическое представление, демонстрирующее, что ингибирование VEGF-B антителами 2Н10 значительно уменьшает степень кровоизлияния после позднего тромболизиса у мышей с АО после ишемического инсульта. Степень кровоизлияния оценивали гистологически через 72 часа после ишемического инсульта. N равно 6-10/группа, среднее значение + стандартная ошибка среднего, **p менее 0,01.
[0090] Фигура 4C представляет собой анализ выживаемости Каплана Мейера, демонстрирующий, что ингибирование VEGF-B антителами 2Н10 улучшает результаты выживаемости после позднего тромболизиса у мышей с алиментарным ожирением после ишемического инсульта. N равно 10/группа, среднее значение + стандартная ошибка среднего, *p менее 0,05.
ОПИСАНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
186
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность изоформы VEGF-B человека, содержащую N-концевую сигнальную последовательность из 21 аминокислоты.
167
SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность изоформы VEGF-B человека, содержащую N-концевую сигнальную последовательность из 21 аминокислоты.
H
SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность V антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность V антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность V гуманизированной формы антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность V гуманизированной формы антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность V антитела 4Е12.
L
SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность V антитела 4Е12.
H
SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность V антитела 2F5.
L
SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность V антитела 2F5.
SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного тканевого активатора плазминогена человека.
L
SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR1 антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR2 антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR3 антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR1 антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR2 антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 17 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR3 антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR1 антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR2 антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR3 антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR1 антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR2 антитела 2Н10.
H
SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR3 антитела 2Н10.
L
SEQ ID NO: 24 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR1 антитела 2F5.
L
SEQ ID NO: 25 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR2 антитела 2F5.
L
SEQ ID NO: 26 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR3 антитела 2F5.
H
SEQ ID NO: 27 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR1 антитела 2F5.
H
SEQ ID NO: 28 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR2 антитела 2F5.
H
SEQ ID NO: 29 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR3 антитела 2F5.
L
SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR1 антитела 2F5.
L
SEQ ID NO: 31 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR2 антитела 2F5.
L
SEQ ID NO: 32 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR3 антитела 2F5.
H
SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR1 антитела 2F5.
H
SEQ ID NO: 34 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR2 антитела 2F5.
H
SEQ ID NO: 35 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR3 антитела 2F5.
L
SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR1 антитела 4Е12.
L
SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR2 антитела 4Е12.
L
SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR3 антитела 4Е12.
H
SEQ ID NO: 39 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR1 антитела 4Е12.
H
SEQ ID NO: 40 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR2 антитела 4Е12.
H
SEQ ID NO: 41 представляет собой нуклеотидную последовательность V CDR3 антитела 4Е12.
L
SEQ ID NO: 42 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR1 антитела 4Е12.
L
SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR2 антитела 4Е12.
L
SEQ ID NO: 44 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR3 антитела 4Е12.
H
SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR1 антитела 4Е12.
H
SEQ ID NO: 46 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR2 антитела 4Е12.
H
SEQ ID NO: 47 представляет собой аминокислотную последовательность V CDR3 антитела 4Е12.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общее
[0091] Во всем данном описании, если специально не указано иное или контекст не требует иного, ссылка на отдельную стадию, композицию вещества, группу стадий или группу композиций вещества должны использоваться для того, чтобы охватить одну и множество (то есть одну или более) указанных стадий, композиций вещества, групп стадий или групп композиций вещества.
[0092] Специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение допускает изменения и модификации, отличные от раскрытых. Должно быть понятно, что изобретение включает все такие варианты и модификации. Изобретение также включает все стадии, признаки, композиции и соединения, упомянутые или указанные в данном описании, индивидуально или совместно, и любые и все комбинации любых двух или более указанных стадий или признаков.
[0093] Настоящее изобретение не ограничивается в объеме конкретными примерами, описанными в данном документе, которые предназначены только для иллюстративного описания. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы очевидно входят в объем настоящего изобретения.
[0094] Любой пример из настоящего изобретения должен быть приспособлен, с учетом необходимых изменений, к любому другому примеру изобретения, если конкретно не указано иное.
[0095] Если конкретно не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, должны использоваться с тем же значением, которое обычно понимается специалистом в данной области (например, в клеточной культуре, молекулярной генетике, иммунологии, иммуногистохимии, химии белка и биохимии).
[0096] Если не указано иное, рекомбинантный белок, клеточная культура и иммунологические методы, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой стандартные процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие способы раскрыты и объяснены в литературе в таких источниках, как, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, том 1 и 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, тома 1-4, IRL Press (1995 и 1996), и F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-lnterscience (1988, включая все обновления до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все обновления до настоящего момента).
[0097] Описание и определения вариабельных участков и их частей, иммуноглобулинов, антител и их фрагментов в данном документе могут быть дополнительно уточнены в Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 и/или Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997.
[0098] Подразумевается, что любое обсуждение белка или антитела, в данном документе включает любые варианты белка или антитела, полученные во время получения и/или хранения. Например, при получении или хранении, антитело может быть деамидировано (например, по остатку аспарагина или глутамина), и/или изменено гликозилированием, и/или может иметь остаток глутамина, превращенный в пироглутамат, и/или иметь N-концевой или C-концевой остаток удаленный или «отщепленный», и/или иметь часть или всю не полностью процессированную сигнальную последовательность и, как следствие, остающуюся на концевом участке антитела. Понятно, что композиция, содержащая конкретную аминокислотную последовательность, может представлять собой гетерогенную смесь указанной или кодированной последовательности и/или вариантов указанной или кодированной последовательности.
[0099] Термин «и/или», например, «X и/или Y» следует понимать, как означающий «X и Y» или «X или Y» и он должен использоваться для обозначения обоих значений или какого-то одного из указанных.
[0100] Во всем данном описании слова «содержать/включать» или их варианты, такие как «содержит/включает» или «содержащий/включающий», подразумевают включение указанного элемента, целого или стадии, или группы элементов, целых или стадий, но не исключение какого-либо другого элемента, целого или стадии, или группы элементов, целых или стадий.
[0101] Используемый в данном документе термин «полученный из» обозначает то, что определенное целое может быть получено из конкретного источника, хотя необязательно непосредственно из этого источника.
Определения
186
167
186
186
167
167
167
[0102] Известно, что VEGF-B существует в двух основных изоформах, называемых VEGF-B и VEGF-B. Только для целей номенклатуры, а не для ограничения, приводимые в качестве примера последовательности VEGF-B человека указаны в стандартной последовательности Национального центра биотехнологической информации (NCBI): NP_003368,1, в номерах доступа белковой последовательности NCBI NP_003368, P49765 и AAL79001 и в SEQ ID NO: 1. В контексте настоящего изобретения в последовательности VEGF-B может отсутствовать N-концевая сигнальная последовательность из 21 аминокислоты (например, аминокислоты от 1 до 21 SEQ ID NO: 1). Только для целей номенклатуры, а не для ограничения, приводимые в качестве примера последовательности VEGF-B человека указаны в стандартной последовательности NCBI: NP_001230662.1, в номерах доступа белковой последовательности NCBI AAL79000 и ААВ06274 и в SEQ ID NO: 2. В контексте настоящего изобретения в последовательности VEGF-B может отсутствовать N-концевая сигнальная последовательность из 21 аминокислоты (например, аминокислоты от 1 до 21 SEQ ID NO: 2). Дополнительную последовательность VEGF-B можно определить с использованием последовательностей, представленных в данном документе и/или в общедоступных базах данных и/или можно определить с использованием стандартных методов (например, как раскрыто в Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-lnterscience (1988, включая все обновления до настоящего времени) или Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Указание на VEGF-B человека может быть сокращено до hVEGF-B. В одном примере указание на VEGF-B в данном документе относится к изоформе VEGF-B.
10-108
[0103] Указание на VEGF-B в данном документе также охватывает пептид VEGF-B, как описано в WO 2006/012688.
[0104] Используемый в данном документе термин «инсульт» следует понимать, как потерю функции(-ий) головного мозга, как правило быстро развивающуюся, обусловленную нарушением притока крови к головному мозгу или стволу головного мозга. Нарушение может представлять собой ишемию (прекращение притока крови), вызванную, например, тромбозом или эмболией, или кровоизлиянием. В одном примере потеря функции головного мозга сопровождается гибелью нервных клеток. В одном примере инсульт вызван нарушением кровообращения или потерей крови в головном мозге или его участке. В одном примере инсульт представляет собой неврологическое расстройство цереброваскулярной причины, которое сохраняется спустя 24 часа или прерывается смертью в течение 24 часов (как определено Всемирной организацией здравоохранения). Устойчивость симптомов спустя 24 часа отделяет инсульт от транзиторной ишемической атаки (TIA), при которой симптомы сохраняются менее 24 часов. Симптомы инсульта включают гемиплегию (паралич одной стороны тела); гемипарез (слабость на одной стороне тела); мышечная слабость лица; онемение; снижение чувствительности; изменение обоняния, чувства вкуса, слуха или зрения; потеря обоняния, вкуса, слуха или зрения; опущение века (птоз); выявляемая слабость глазного нерва; уменьшенный рвотный рефлекс; снижение способности к глотанию; снижение реакции зрачка на свет; снижение чувствительности лица; нарушение равновесия; нистагм; изменение частоты дыхания; изменение частоты сердечных сокращений; слабость в грудино-ключично-сосцевидной мышце со сниженной способностью или невозможностью повернуть голову в одну сторону; слабость в языке; афазия (неспособность говорить или понимать речь); апраксия (измененные произвольные движения); выпадение поля зрения; нарушение памяти; геминеглект или одностороннее пространственное игнорирование (расстройство внимания по отношению к пространству на стороне поля зрения, противоположной поврежденному полушарию); дезорганизованное мышление; спутанность сознания; развитие гиперсексуальных жестов; анозогнозия (постоянное отрицание существования расстройства); трудности при ходьбе; изменение координации движения; головокружение; смещение равновесия; потеря сознания; головная боль; и/или рвота.
[0105] Подразумевается, что термин «последствие инсульта» включает один или более показатель размера инфаркта, степени кровоизлияния и/или нарушения или повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Однако, этот термин не ограничен указанными последствиями и охватывает любые изменения у субъекта, например, любые клинические изменения у субъекта, например, неврологические или физические изменения, которые являются результатом инсульта. Такие изменения или последствия включают двигательные нарушения, потерю мозговой функции или любые из описанных в данном документе симптомов.
[0106] Подразумевается, что термин «возникновение симптомов инсульта» относится ко времени, когда субъект или другое лицо признает один или более симптомов инсульта. Подходящие симптомы описаны в данном документе.
[0107] Следует понимать, что используемый в данном документе термин «частота возникновения кровоизлияния» означает количество или размер кровоизлияний, перенесенных субъектом или популяцией субъектов. Таким образом, уменьшение частоты возникновения кровоизлияний у субъекта может быть уменьшением количества или размера кровоизлияний у субъекта или уменьшением вероятности того, что у субъекта будет одно или более кровоизлияний в результате инсульта.
[0108] Следует понимать, что термин «вероятность смертельного кровоизлияния» означает, что субъект, которому вводили соединение(-ия), имеет меньше вероятности умереть в результате кровоизлияния, чем субъект, который также перенес инсульт и которому не вводили соединение(-ия). Очевидно, что такие вероятности могут быть рассчитаны на основе данных относительно популяции и не требуют параллельного сопоставления для каждого субъекта. Указанный термин также относится к уменьшению вероятности смерти в результате инсульта, то есть изобретение дополнительно относится к способам снижения вероятности смерти в результате инсульта. Все стадии способа, описанные выше в отношении уменьшения последствия инсульта, будут одинаково применимы к таким способам.
[0109] Следует понимать, что термин «гематоэнцефалический барьер» означает барьер высокоселективной проницаемости, который отделяет циркулирующую кровь от внеклеточной жидкости головного мозга в центральной нервной системе. Нарушение или повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера может привести к накоплению жидкости во внеклеточном пространстве головного мозга или к отеку головного мозга. Нарушение гематоэнцефалического барьера может быть результатом черепно-мозговой травмы или нетравматических причин, таких как ишемический инсульт, рак или воспаление мозга вследствие менингита или энцефалита.
[0110] Следует понимать, что термин «тромболитическое соединение» означает соединение, которое индуцирует, или опосредует, или усиливает расщепление одного или более сгустков крови для ограничения закупорки кровеносных сосудов. Тромболитическое соединение может действовать путем стимуляции вторичного тромболизиса плазмином. Типичные тромболитические агенты включают тканевый активатор плазминогена (tPA), анистреплазу (APSAC), стрептокиназу (SK), стафилокиназу (SAK), десмотеплазу или урокиназу (uPA).
[0111] В одном примере тромболитическое соединение представляет собой «тканевый активатор плазминогена» или tPA. tPA представляет собой сериновую протеазу, которая участвует в расщеплении сгустков крови, катализируя превращение плазминогена в плазмин. В одном примере тканевой активатор плазминогена (tPA) может быть получен с использованием рекомбинантных методов. Соответственно, это может быть рекомбинантный тканевый активатор плазминогена (r-tPA), содержащий, например, последовательность SEQ ID NO: 11. Типичные tPA включают альтеплазу, ретеплазу, ланотеплазу или тенектеплазу.
[0112] Используемое в данном документе указание на «эффективное введение» (или подобное) тромболитического соединения означает, что введение тромболитического соединения обеспечивает клинически эффективный результат, то есть уменьшение последствия инсульта, сравнимое с тем, которое наблюдается у субъекта или популяции субъектов, которым то же самое тромболитическое соединение вводят таким же образом (например, в то же самое время и/или пациентам со сходными уровнями глюкозы в крови) с введением ингибитора передачи сигналов VEGF-B.
[0113] Как будет очевидно специалисту в данной области на основании приведенного в данном документе описания, при обсуждении введения «комбинации» соединений, настоящее изобретение предполагает введение соединений в виде одной композиции, введение соединений в одно и то же время (но в виде отдельных композиции) или введения соединений последовательно.
[0114] Термин «рекомбинантный» следует понимать, как продукт искусственной генетической рекомбинации. Соответственно, в контексте рекомбинантного белка, содержащего вариабельный участок антитела, этот термин не охватывает антитело, встречающееся в природе в организме субъекта, которое является продуктом природной рекомбинации, которая происходит во время созревания В-клеток. Однако если такое антитело выделено, его следует рассматривать как выделенный белок, содержащий вариабельный участок антитела. Аналогичным образом, если нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, выделяют и экспрессируют с использованием рекомбинантных средств, полученный белок представляет собой рекомбинантный белок, содержащий вариабельный участок антитела. Рекомбинантный белок также включает белок, экспрессируемый искусственными рекомбинантными средствами, когда он находится внутри клетки, ткани или субъекта, например, в котором он экспрессируется.
[0115] Термин «белок» следует понимать, как включающий одиночную полипептидную цепь, то есть ряд смежных аминокислот, связанных пептидными связями, или ряд полипептидных цепей, ковалентно или нековалентно связанных друг с другом (т.е. полипептидный комплекс). Например, ряд полипептидных цепей может быть ковалентно связан с использованием подходящей химической или дисульфидной связи. Примеры нековалентных связей включают водородные связи, ионные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия.
[0116] Термин «полипептид» или «полипептидная цепь» в соответствии с предыдущим абзацем обозначает ряд смежных аминокислот, связанных пептидными связями.
L
H
H
L
1
2
3
4
1
2
[0117] Специалисту в данной области известно, что под «антителом» обычно подразумевают белок, который содержит вариабельный участок, состоящий из множества полипептидных цепей, например, полипептида, содержащего вариабельный участок легкой цепи (V), и полипептида, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи (V). Антитело также обычно содержит константные домены, некоторые из которых могут быть расположены в константной области, которая включает в себя константный фрагмент или кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (Fc), в случае тяжелой цепи. V и V взаимодействуют с образованием Fv, содержащего антигенсвязывающий участок, который способен специфически связываться с одним или более близкородственными антигенами. Как правило, легкая цепь млекопитающих представляет собой либо к легкую цепь, либо λ легкую цепь, а тяжелая цепь млекопитающих представляет собой α, δ, ε, γ или μ. Антитела могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA) или подкласса. Термин «антитело» также охватывает гуманизированные антитела, приматизированные антитела, антитела человека, сингуманизированные антитела и химерные антитела.
[0118] Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» или «целое антитело» используются взаимозаменяемо для обозначения антитела в его по существу интактной форме, в отличие от антигенсвязывающего фрагмента антитела. В частности, целые антитела включают антитела с тяжелыми и легкими цепями, включая участок Fc. Константные домены могут быть константными доменами последовательности дикого типа (например, константными доменами последовательности дикого типа человека) или их вариантами аминокислотной последовательности.
H
L
[0119] Используемый в данном документе термин «вариабельный участок» относится к участкам легкой и/или тяжелой цепей антитела, как определено в данном документе, который способен специфически связываться с антигеном, и включает аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDR); то есть CDR1, CDR2 и CDR3, и каркасные участки (FR). Типичные вариабельные участки содержат три или четыре FR (например, FR1, FR2, FR3 и необязательно FR4) вместе с тремя CDR. В случае, когда белок получен из IgNAR, белок может не иметь CDR2. V относится к вариабельному участку тяжелой цепи, V относится к вариабельному участку легкой цепи.
[0120] Используемый в данном документе термин «участки, определяющие комплементарность» (CDR, то есть CDR1, CDR2 и CDR3) относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которого необходимо для связывания антигена. Каждый вариабельный домен обычно имеет три участка CDR, определяемые как CDR1, CDR2 и CDR3. Положения аминокислот, отнесенные к CDR и FR, могут быть определены согласно Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991 или другим номенклатурам при осуществлении этого изобретения, например, канонической номенклатуре Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; и/или Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997; номенклатура IMGT Lefranc et al., Devel., Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003; или номенклатура AHO Honnegher and  J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001.
[0121] «Каркасные участки» (FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков CDR.
L
H
H
L
H
H
L
L
H
H
H
H
[0122] Используемый в данном документе термин «Fv» следует понимать, как любой белок, либо состоящий из множества полипептидов, либо из одного полипептида, где V и V связываются и образуют комплекс, имеющий антигенсвязывающий участок, то есть, способный специфически связываться с антигеном. V и V, которые образуют антигенсвязывающий участок, могут находиться в одной полипептидной цепи или в разных полипептидных цепях. Кроме того, Fv в соответствии с настоящим изобретением (а также любой белок в соответствии с настоящим изобретением) может иметь множество антигенсвязывающих участков, которые могут или не могут связывать один и тот же антиген. Подразумевается, что этот термин охватывает фрагменты, непосредственно полученные из антитела, а также белки, соответствующие такому фрагменту, полученные с использованием рекомбинантных средств. В некоторых примерах V не связан с константным доменом тяжелой цепи (C) 1 и/или V не связан с константным доменом легкой цепи (C). Типичные Fv, содержащие полипептиды или белки, включают Fab фрагмент, Fab' фрагмент, F(ab') фрагмент, scFv, диатело, триатело, тетратело или комплекс более высокого порядка, или любое из вышеприведенных соединений, связанных с константным участком или его доменом, например, C2 или C3 домен, например, миниантитело. «Fab-фрагмент» состоит из одновалентного антигенсвязывающего фрагмента антитела и может быть получен путем расщепления целого антитела ферментом папаин с получением фрагмента, состоящего из интактной легкой цепи и части тяжелой цепи, или может быть получен с применением рекомбинантных средств. «Fab' фрагмент» антитела может быть получен путем обработки целого антитела пепсином с последующим восстановлением с получением молекулы, состоящей из интактной легкой цепи и части тяжелой цепи, содержащей V и один константный домен. Для каждого антитела, обработанного таким образом, получают два Fab' фрагмента. Fab' фрагмент также можно получить рекомбинантными средствами. «F(ab')2 фрагмент» антитела состоит из димера из двух Fab' фрагментов, удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями, и его получают путем обработки целой молекулы антитела ферментом пепсином без последующего восстановления. «F(ab')2 фрагмент» представляет собой рекомбинантный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанных, например, лейциновой застежкой или C3 доменом. «Одноцепочечный Fv» или «scFv» представляет собой рекомбинантную молекулу, содержащую фрагмент вариабельного участка (Fv) антитела, где вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи ковалентно связаны подходящим гибким полипептидным линкером.
[0123] Используемый в данном документе термин «связывается» в отношении взаимодействия белка или его антигенсвязывающего участка с антигеном означает, что взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на антигене. Например, антитело распознает и связывается со специфической структурой белка, а не с белками в целом. Если антитело связывается с эпитопом «А», присутствие молекулы, содержащей эпитоп «А» (или свободный, немеченый «А»), в реакции, содержащей меченый «А» и белок, будет уменьшать количество меченого «А» связанного с антителом.
[0124] Используемый в данном документе термин «специфически связывается» или «связывается специфически» означает, что белок по изобретению взаимодействует или связывается более часто, более быстро, с большей продолжительностью и/или с большим сродством с конкретным антигеном или клеткой, проявляя те же свойства, что и в случае с альтернативными антигенами или клетками. Например, белок связывается с VEGF-B с существенно большим сродством (например, от 20-кратного, или 40-кратного, или 60-кратного, или 80-кратного до 100-кратного, или 150-кратного или 200-кратного), чем с другим фактором роста (например, VEGF-A) или с антигенами, обычно распознаваемыми полиреактивными природными антителами (то есть антителами, встречающимися в природе, которые связывают различные антигены, встречающиеся в природе у людей). Как правило, но не обязательно, указание на связывание означает специфическое связывание, и каждый термин следует понимать, как явное подтверждение другого термина.
[0125] Используемый в данном документе термин «нейтрализовать» следует понимать, как означающий, что белок способен блокировать, уменьшать или предотвращать передачу сигналов VEGF-B в клетке через VEGF-R1. Методы определения нейтрализации известны в данной области и/или описаны в данном документе.
[0126] Используемые в данном документе термины «предотвращение», или «предотвращать» подразумевают введение соединения согласно изобретению, для того чтобы тем самым остановить или воспрепятствовать развитию по меньшей мере одного симптома состояния.
[0127] Используемые в данном документе термины «лечение/обработка» или «лечить/обрабатывать» подразумевают введение описанного в данном документе белка, для того чтобы тем самым уменьшить или устранить по меньшей мере один симптом определенного заболевания или состояния или замедлить развитие заболевания или состояния.
[0128] Используемый в данном документе термин «субъект» означает любое животное, включая человека, например млекопитающее. Типичные субъекты включают, но не ограничиваются указанными, людей и не являющихся людьми приматов. Например, субъект представляет собой человека.
Уменьшение последствия инсульта
[0129] Данное изобретение относится, например, к способу, который уменьшает одно или более последствий инсульта у субъекта, включающему введение субъекту соединения, ингибирующего передачу сигналов VEGF-B.
[0130] В одном примере субъект страдает сахарным диабетом. Например, пациент, страдающий сахарным диабетом, имеет клинически признанный показатель сахарного диабета, такой как:
концентрация глюкозы в плазме натощак, превышающая или равная 7 нмоль/л или 126 мг/дл,
повседневная концентрация глюкозы в плазме (измеренная в любое время дня), превышающая или равная 11,1 нмоль/л или 200 мг/дл, с симптомами сахарного диабета,
значение перорального теста толерантности к глюкозе (OGTT), превышающее или равное 11,1 нмоль/л или 200 мг/дл, измеренное с двухчасовым интервалом. OGTT проводят в течение двух- или трехчасового временного интервала.
[0131] В одном примере, субъект страдает сахарным диабетом 1 типа.
[0132] В одном примере субъект страдает сахарным диабетом 2 типа.
[0133] Способы по настоящему изобретению могут легко применяться к любой форме ишемии центральной нервной системы. Например, субъект может иметь признак(и) и/или симптомы ишемии сетчатки. Таким образом, способы по настоящему изобретению будут применяться для уменьшения последствий ишемии центральной нервной системы, например ишемии сетчатки.
[0134] В одном примере субъект подвержен риску развития инсульта, но инсульт еще не произошел. Субъект подвержен риску, если он имеет более высокий риск развития инсульта, чем контрольная популяция. Контрольная популяция может включать один или более субъектов, выбранных случайным образом из общей популяции (например, подбираемых по возрасту, полу, расе и/или этнической принадлежности), которым не был поставлен диагноз или в их семейном анамнезе отсутствуют случаи инсульта. Субъект может считаться подверженным риску развития инсульта, если обнаружено, что связанный с инсультом «фактор риска» ассоциируется с субъектом. Фактор риска может включать любую активность, особенность, событие или свойство, связанные с данным расстройством, например, посредством статистических или эпидемиологических исследований популяции субъектов. Таким образом, субъект может быть классифицирован как подверженный риску развития инсульта, даже если конкретный субъект не был включен в исследования, определяющие основные факторы риска. Например, субъект, перенесший операцию на сердце, подвергается риску транзиторной ишемической атаки головного мозга (или инсульта), потому что частота транзиторной ишемической атаки головного мозга увеличивается в популяции субъектов, перенесших операцию на сердце, по сравнению с популяцией субъектов, у которых ее не было.
[0135] В одном примере субъект, подверженный риску инсульта, включает тех, кто перенес хирургическую вмешательство на головном мозге или центральной нервной системе, такую как эндоваскулярная хирургия, клипирование, стентирование или микрокатетеризация. Такие субъекты включают также тех, кто перенес хирургическое вмешательство на других частях тела, повлиявшее на кровеносные сосуды, снабжающие мозг (которые соединяют головной мозг с сердцем, например, сонные артерии и яремные вены), или артерии, снабжающие кровью сетчатку. Типичным классом субъектов являются те, которые подвергались эндоваскулярной хирургии для лечения аневризмы головного мозга. Субъекты, подвергшиеся этим типам хирургических вмешательств, имеют повышенный риск развития инсульта.
[0136] В одном примере субъекты, подверженные риску развития инсульта, также включают пациентов, которые являются курильщиками, страдающими гипертензией, диабетиками, имеют повышенный уровень холестерина в крови. Субъекты, у которых уже был инсульт, малый инсульт или транзиторная ишемическая атака, особенно подвержены высокому риску.
[0137] Как обсуждалось выше, способы по изобретению достигают одного или более из следующих эффектов:
уменьшение размера инфаркта у субъекта,
уменьшение степени кровоизлияний, оцененной по шкале внутримозгового кровоизлияния у субъекта, и/или
уменьшение степени нарушения или проницаемости гематоэнцефалического барьера у субъекта, и/или
уменьшение отека головного мозга у субъекта после инсульта.
[0138] Методы оценки размеров инфаркта известны в данной области и включают, например, однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (SPECT) с сестамиби, меченным технецием-99m, компьютерную томографию или магнитно-резонансную томографию.
[0139] Методы оценки степени внутримозгового кровоизлияния раскрыты, например, у Hemphil et al., Stroke, 32: 891-897, 2001. Наличие кровоизлияния, например внутримозгового кровоизлияния, может быть определено с помощью, например, МРТ или КТ сканирования.
[0140] Нарушение/повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера также могут быть обнаружено с использованием МРТ, необязательно с использованием маркера.
[0141] В одном примере способ по изобретению уменьшает любой симптом инсульта, известный в данной области техники или описанный в данном документе.
[0142] Как будет очевидно специалисту в данной области техники, «уменьшение» симптома или последствия инсульта у субъекта будут сравнивать с другим субъектом, который также перенес инсульт, но не получил лечения описанным в данном документе способом. При этом не обязательно требуется параллельное сравнение двух субъектов. Наиболее достоверными являются данные относительно популяции. Например, оценивают популяцию субъектов, перенесших инсульт, которые не получали лечение описанным в данном документе способом (необязательно популяцию субъектов, схожих, например, по возрасту, массе, диабетическому статусу, уровням глюкозы в крови, с субъектом, получившим лечение), и средние значения сравнивают с результатами для субъекта или популяции субъектов, которые получили лечение описанным в данном документе способом.
Ингибиторы передачи сигналов VEGF-B
Белки, содержащие вариабельные участки антител
[0143] Типичный ингибитор передачи сигналов VEGF-B содержит вариабельный участок антитела, например, представляет собой антитело или фрагмент антитела, который связывается с VEGF-B и нейтрализует передачу сигналов VEGF-B.
[0144] В одном примере вариабельный участок антитела специфически связывается с VEGF-B.
[0145] Подходящие антитела и белки, содержащие их вариабельные участки, известны в данной области техники.
[0146] Например, антитела против VEGF-B и их фрагменты раскрыты в WO 2006/012688.
H
L
[0147] В одном примере антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело, которое конкурентно ингибирует связывание 2Н10 с VEGF-B, или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном примере антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело 2Н10 или его химерную, CDR-привитую или гуманизированную версию, или его антигенсвязывающий фрагмент. В этой связи, антитело 2Н10 содержит V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 3, и V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 4. Типичные химерные и гуманизированные версии этого антитела раскрыты в WO 2006/012688.
H
L
[0148] В одном примере антитело против VEGF-B или его фрагмент содержит V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 5, и V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 6.
H
L
[0149] В одном примере антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело, которое конкурентно ингибирует связывание 4Е12 с VEGF-B, или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело 4Е12 или его химерную, CDR-привитую или гуманизированную версию, или его антигенсвязывающий фрагмент. В этой связи, антитело 4Е12 содержит V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 7, и V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 8.
H
L
[0150] В одном примере соединение представляет собой белок, содержащий гуманизированный вариабельный участок антитела 4Е12. Например, белок содержит вариабельный участок, содержащий участки, определяющие комплементарность (CDR) V и/или V антитела 4Е12. Например, белок содержит:
H
(i) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 25-34 SEQ ID NO: 7,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 49-65 SEQ ID NO: 7, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 98-105 SEQ ID NO: 7, и/или
L
(ii) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 24-34 SEQ ID NO: 8,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 50-56 SEQ ID NO: 8, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 89-97 SEQ ID NO: 8.
H
L
[0151] В одном примере антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело, которое конкурентно ингибирует связывание 2F5 с VEGF-B, или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном примере антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело 2F5 или его химерную, CDR-привитую или гуманизированную версию, или его антигенсвязывающий фрагмент. В этой связи, антитело 2Е5 содержит V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 9, и V, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10.
H
L
[0152] В одном примере соединение представляет собой белок, содержащий гуманизированный вариабельный участок антитела 2F5. Например, белок содержит вариабельный участок, содержащий участки, определяющие комплементарность (CDR) V и/или V антитела 2F5.
[0153] Например, белок содержит:
H
(i) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 25-34 SEQ ID NO: 9,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 49-65 SEQ ID NO: 9, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 98-107 SEQ ID NO: 9, и/или
L
(ii) V, содержащий:
(a) CDR1, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 24-34 SEQ ID NO: 10,
(b) CDR2, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 50-56 SEQ ID NO: 10, и
(c) CDR3, содержащий последовательность, представленную аминокислотами 89-96 SEQ ID NO: 10.
[0154] В другом примере антитело или белок, содержащий его вариабельный участок, получают с применением стандартного метода, например, известного в данной области техники или кратко описанного в данном документе.
Методы, основанные на иммунизации
[0155] Для получения антител, субъекту (например, животному, не являющемуся человеком, такому как мышь, крыса, курица и т.д.) вводят VEGF-B или его фрагмент или часть, несущие эпитоп, или его модифицированную форму, или нуклеиновую кислоту, кодирующую его («иммуноген»), необязательно в сочетании с любым подходящим или желательным адъювантом и/или фармацевтически приемлемым носителем, в форме инъецируемой композиции. Типичные животные, не являющиеся человеком, представляют собой млекопитающих, таких как животные, относящиеся к мышам (например, крысы или мыши). Инъекция может быть интраназальной, внутримышечной, подкожной, внутривенной, внутрикожной, внутрибрюшинной или может быть введена другим известным путем. Необязательно, иммуноген вводят многократно. Средства для получения и характеристики антител известны в данной области техники (см., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Способы получения антител против VEGF-B у мышей раскрыты в WO 2006/012688.
[0156] Получение поликлональных антител можно контролировать путем забора крови у иммунизированного животного в различные моменты после иммунизации. Вторая, бустерная инъекция может быть произведена, если требуется достижение желаемого титра антител. Процесс бустирования и титрования повторяют до достижения подходящего титра. При достижении желаемого уровня иммуногенности производят забор крови у иммунизированного животного и сыворотку выделяют и хранят, и/или животное используют для получения моноклональных антител (mAb).
[0157] Моноклональные антитела представляют собой типичные антитела, рассматриваемые в настоящем изобретении. Обычно получение моноклональных антител включает иммунизацию субъекта (например, грызуна, например, мыши или крысы) иммуногеном в условиях, достаточных для стимуляции клеток, продуцирующих антитела. В некоторых примерах мышей, полученных с помощью способов генетической инженерии для экспрессии антител человека и не экспрессирующих белки антител мыши, иммунизируют для получения антитела (например, как раскрыто в PCT/US2007/008231 и/или Lonberg et al., Nature 368 (1994): 856-859). После иммунизации соматические клетки, продуцирующие антитела (например, В-лимфоциты) сливаются с бессмертными клетками, например, с бессмертными клетками миеломы. Различные методы получения таких слившихся клеток (гибридом) известны в данной области и раскрыты, например, в Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975. Клетки гибридомы затем могут быть культивированы в условиях, достаточных для получения антител.
[0158] Настоящее изобретение раскрывает другие методы получения антител, например, метод ABL-MYC (как раскрыто, например, у Largaespada et al., Curr. Top. Microbiol., Immunol, 166, 91-96, 1990).
Методы, основанные на библиотеках
[0159] Настоящее изобретение также включает скрининг библиотек антител или белков, содержащих их антигенсвязывающие домены (например, содержащие их вариабельные участки) для идентификации связывающего VEGF-B антитела или белка, содержащего его вариабельный участок.
[0160] Примеры библиотек, рассматриваемых в настоящем изобретении, включают наивные библиотеки (от не вызывающих сомнений субъектов), иммунизированные библиотеки (от субъектов, иммунизированных антигеном) или синтетические библиотеки. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или их участки (например, вариабельные участки) клонируют обычными методами (например, как раскрыто в Sambrook and Russell, editors, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) и используют для кодирования и дисплея белков с использованием метода, известного в области техники. Другие методы получения библиотек белков раскрыты, например, в US 6300064 (например, библиотека HuCAL от Morphosys AG); US 5885793; US 6204023; US 6291158; или US 6248516.
[0161] Белки согласно изобретению могут быть растворимыми секретируемыми белками или могут быть представлены в виде слитого белка на поверхности клетки или частицы (например, фага или другого вируса, рибосомы или споры). В данной области техники известны различные форматы библиотек дисплея. Например, библиотека представляет собой библиотеку дисплея in vitro (например, библиотеку рибосомного дисплея, библиотеку ковалентного дисплея или библиотеку дисплея мРНК, например, как раскрыто в US 7270969). В еще одном примере библиотека дисплея представляет собой библиотеку фагового дисплея, где белки, содержащие антигенсвязывающие домены антител, экспрессируются на поверхности фага, например, как раскрыто в US 6300064; US 5885793; US 6204023; US 6291158; или US 6248516. Другие методы фагового дисплея известны в данной области техники и предусмотрены настоящим изобретением. Аналогично, методы клеточного дисплея предусмотрены настоящим изобретением, например, библиотеки бактериального дисплея, например, как раскрыто в US 5516637; библиотеки дрожжевого дисплея, например, как раскрыто в US 6423538, или библиотека дисплея млекопитающих.
[0162] Методы скрининга библиотек дисплея известны в данной области техники. В одном примере проводят скрининг библиотеки дисплея согласно настоящему изобретению с применением аффинной очистки, например, как раскрыто в Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Методы аффинной очистки обычно включают взаимодействие белков, содержащих антигенсвязывающие домены, отображенные библиотекой, с целевым антигеном (например, VEGF-B), и, после промывки, элюирование тех доменов, которые остаются связанными с антигеном.
[0163] Любые вариабельные участки или scFv, идентифицированные путем скрининга, при необходимости легко модифицируют в полноразмерное антитело. Примеры методов модификации или преобразования вариабельных участков или scFv в полноразмерное антитело раскрыты, например, в Jones et al., J Immunol Methods. 354:85-90, 2010; или Jostock et al., J Immunol Methods, 289: 65-80, 2004. Альтернативно или дополнительно, применяют стандартные методы клонирования, например, как описано в Ausubel et al. (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) и/или (Sambrook et al. (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001).
Деиммунизированные, химерные, гуманизированные, сингуманизированные, приматизированные и белки человека
[0164] Белки по настоящему изобретению могут представлять собой гуманизированный белок.
[0165] Термин «гуманизированный белок» относится к белку, содержащему человекоподобный вариабельный участок, который содержит CDR антитела видов, которые не относятся к человеку (например, мышь, или крыса, или примат, не являющийся человеком), привитые на или вставленные в FR антитела человека (такой тип антитела также называют «CDR-привитым антителам»). Гуманизированные белки также включают белки, в которых один или более остатков белка человека модифицированы одной или более аминокислотными заменами и/или один или более остатков FR белка человека заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Гуманизированные белки могут также содержать остатки, которые не обнаружены ни в антителе человека, ни в антителах, не являющихся человеческими. Любые дополнительные участки белка (например, участок Fc) обычно являются человеческими. Гуманизация может быть осуществлена с использованием метода, известного в данной области техники, например, US 5225539, US 6054297, US 7566771 или US 5585089. Термин «гуманизированный белок» также охватывает супергуманизированный белок, например, как раскрыто в US 7732578.
[0166] Белки по настоящему изобретению могут быть белками человека. Используемый в данном документе термин «белок человека» относится к белкам, имеющим вариабельные и необязательно константные участки антител, обнаруженные у людей, например, в клетках зародышевой линии человека или соматических клетках, или из библиотек, полученных с использованием таких участков. Антитела «человека» могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человека, например, мутации, полученные случайным образом или сайт-направленные мутации in vitro (в частности, мутации, которые включают консервативные замены, или мутации в небольшом количестве остатков белка, например, в 1, 2, 3, 4 или 5 остатках белка). Такие «антитела человека» необязательно должны генерироваться в результате иммунного ответа человека, скорее они могут быть получены с использованием рекомбинантных методов (например, скрининг библиотеки фагового дисплея) и/или трансгенных животных (например, мыши), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую константные и/или вариабельные участки антитела человека, и/или с использованием направленного отбора (например, как раскрыто в US 5565332). Этот термин также охватывает формы созревшей аффинности таких антител. В целях настоящего изобретения белок человека также будет включать белок, содержащий FR антитела человека или FR, содержащие последовательности консенсусной последовательности FR человека, и где один или более CDR являются произвольными или полупроизвольными, например, как раскрыто в US 6300064 и/или US 6248516.
[0167] Белки по настоящему изобретению могут быть сингуманизированными белками. Термин «сингуманизированный белок» относится к белку, полученному методом, описанным в WO 2007/019620. Сингуманизованный белок содержит вариабельный участок антитела, где вариабельный участок включает FR из вариабельного участка антитела приматов Нового Света, и CDR из вариабельного участка антитела приматов, не относящихся к Новому Свету. Например, сингуманизированный белок включает вариабельный участок антитела, где вариабельный участок включает FR из вариабельного участка антитела примата Нового Света и CDR из мышиного или крысиного антитела.
[0168] Белки по настоящему изобретению могут представлять собой приматизированные белки. «Приматизированный белок» содержит вариабельный участок(-ки) антитела, образованного после иммунизации примата, не являющегося человеком (например, яванский макак). Необязательно, вариабельные участки антитела примата, не являющегося человеком, связывают с константными участками человека для получения приматизированного антитела. Типичные методы получения приматизированных антител описаны в US 6113898.
H
L
[0169] В одном примере белок по изобретению представляет собой химерный белок. Термин «химерные белки» относится к белкам, в которых антигенсвязывающий домен происходит из конкретных видов (например, мышиных, таких как мышь или крыса), или принадлежит к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть белка представляет собой белок, полученный от другого вида (такого как, например, человек или примат, не являющийся человеком), или принадлежит к другому классу или подклассу антител. В одном примере химерный белок представляет собой химерное антитело, содержащее V и/или V антитела, не являющееся человеческим, (например, антитело мыши), а остальные участки антитела происходят из антитела человека. Получение таких химерных белков известно в области техники и может быть достигнуто стандартными средствами (как раскрыто, например, в US 6331415, US 5807715, US 4816567 и US 4816397).
[0170] Настоящее изобретение также относится к деиммунизированному белку, например, как раскрыто в WO 2000/34317 и WO 2004/108158. Деиммунизированные антитела и белки имеют один или более эпитопов, например, эпитопы В-клеток или эпитопы Т-клеток, удаленные (то есть мутированные), для того чтобы тем самым уменьшить вероятность того, что у субъекта будет повышаться иммунный ответ против антитела или белка.
Другие белки, содержащие вариабельные участки антител
[0171] Настоящее изобретение также относится к другим белкам, содержащим вариабельный участок или антигенсвязывающий домен антитела, такой как:
H
L
(i) однодоменное антитело, которое представлено одиночной полипептидной цепью, содержащей все или часть V или V антитела (см., например, US 6248516),
(ii) диатела, триатела и тетратела, например, как раскрыто в US 5844094 и/или US 2008152586,
(iii) scFv, например, как раскрыто в US 5260203,
(iv) миниантитела, например, как раскрыто в US 5837821,
(v) биспецифические белки «ключ и скважина», как раскрыто в US 5731168,
(vi) гетероконъюгатные белки, например, как раскрыто в US 4676980,
(vii) гетероконъюгатные белки, полученные с помощью химического сшивающего агента, например, как раскрыто в US 4676980,
(viii) фрагменты Fab'-SH, например, как раскрыто у Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225, 1992, или
3
(ix) Fab (например, как раскрыто в EP 19930302894).
Слияние константных доменов
H
H
[0172] Настоящее изобретение относится к белку, содержащему вариабельный участок антитела и константный участок или Fc или его домен, например, C2 и/или C3 домен. Подходящие константные участки и/или домены будут очевидны специалисту в данной области техники, и/или последовательности таких полипептидов легкодоступны из открытых для ознакомления баз данных. Kabat et al. также предоставляют описание некоторых подходящих константных участков/доменов.
[0173] Константные участки и/или их домены применимы для обеспечения биологических активностей, таких как димеризация, расширенный период полужизни в сыворотке крови, например, путем связывания с FcRn (неонатальный Fc-рецептор), антигензависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), комплементзависимая цитотоксичность (CDC, антигензависимый клеточный фагоцитоз (ADCP)).
[0174] Настоящее изобретение также относится к белкам, содержащим мутантные константные участки или домены, например, как раскрыто в US 7217797; US 7217798; или US 20090041770 (с увеличенным периодом полужизни) или US 2005037000 (увеличенная ADCC).
Стабилизированные белки
[0175] Нейтрализующие белки согласно настоящему изобретению могут содержать константный участок lgG4 или стабилизированный константный участок IgG4. Термин «стабилизированный константный участок IgG4» следует понимать, как константный участок IgG4, который был модифицирован для уменьшения обмена Fab-фрагментами, или способности к обмену Fab-фрагментами, или образования полуантитела, или способности к образованию полуантитела. «Обмен Fab-фрагментами» относится к типу модификации белка IgG4 человека, при котором тяжелая цепь IgG4 и прикрепленная легкая цепь (полумолекула) обмениваются на пару тяжелой-легкой цепи из другой молекулы IgG4. Таким образом, молекулы IgG4 могут приобретать два разных Fab-фрагмента, распознающих два различных антигена (что приводит к получению биспецифических молекул). Обмен Fab-фрагментами происходит естественным путем in vivo и может быть индуцирован in vitro очищенными клетками крови или восстанавливающими агентами, такими как восстановленный глутатион. «Полуантитело» образуется, когда антитело IgG4 диссоциирует с образованием двух молекул, каждая из которых содержит одну тяжелую цепь и одну легкую цепь.
[0176] В одном примере стабилизированный константный участок IgG4 содержит пролин в положении 241 шарнирной области в соответствии с системой Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 и/или 1991). Это положение соответствует положению 228 шарнирной области в соответствии с номенклатурой EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969). В IgG4 человека такой остаток обычно представляет собой серии. После замены серина на пролин шарнирная область IgG4 содержит последовательность СРРС. В этой связи, специалист будет знать, что «шарнирная область» представляет собой обогащенную пролином часть константного участка тяжелой цепи антитела, которая связывает участки Fc и Fab, которые обеспечивают мобильность на двух Fab-фрагментах антитела. Шарнирная область содержит остатки цистеина, которые участвуют в дисульфидных связях между тяжелыми цепями. Ее обычно определяют, как простирающуюся от Glu226 до Pro243 IgG1 человека в соответствии с номенклатурой Kabat. Шарнирные области других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG1 путем размещения первого и последнего остатков цистеина, образующих дисульфидные связи между тяжелыми цепями (S-S), в тех же положениях (см., например, WO 201/080538).
Дополнительные белковые ингибиторы передачи сигналов VEGF-B
[0177] Другие белки, которые могут препятствовать продуктивному взаимодействию VEGF-B с его рецептором, включают мутантные белки VEGF-B.
[0178] В одном примере ингибитор представляет собой растворимый белок, содержащий один или более доменов VEGF-R1, которые связываются с VEGF-B (и, например, по существу не связываются с VEGF-A). В одном примере растворимый белок дополнительно содержит константный участок антитела, такого как антитело IgG1. Например, растворимый белок дополнительно содержит участок Fc и необязательно шарнирную область антитела, например, антитела IgG1.
[0179] В одном примере ингибитор белка представляет собой антитело-миметик, например, белковый каркас, содержащий вариабельные участки, которые связываются с целевым белком способом, аналогичным связыванию антитела. Далее раскрыты типичные антитела-миметики.
Иммуноглобулины и фрагменты иммуноглобулинов
[0180] Примером соединения согласно настоящему изобретению является белок, содержащий вариабельный участок иммуноглобулина, такой как Т-клеточный рецептор, или иммуноглобулин, состоящий из тяжелой цепи (например, IgNAR, верблюжье антитело).
Иммуноглобулины, состоящие из тяжелой цепи
[0181] Иммуноглобулины, состоящие из тяжелой цепи, отличаются структурно от многих других форм иммуноглобулинов (например, антител), поскольку они содержат тяжелую цепь, и не содержат легкой цепи. Соответственно, эти иммуноглобулины также упоминаются как «антитела, содержащие только тяжелую цепь». Иммуноглобулины, состоящие из тяжелой цепи, встречаются, например, у верблюдов и хрящевых рыб (также их называют IgNAR).
HH
H
L
[0182] Вариабельные участки, присутствующие во встречающихся в природе иммуноглобулинах, состоящих из тяжелой цепи, обычно называют «доменами V» в верблюжьих Ig и V-NAR в IgNAR, чтобы отличать их от вариабельных участков тяжелой цепи, которые присутствуют в обычных 4-цепочечных антителах (которые называются «домены V») и вариабельных участков легкой цепи, которые присутствуют в обычных 4-цепочечных антителах (которые называются «домены V»).
[0183] Иммуноглобулины, состоящие из тяжелой цепи, не требуют присутствия легких цепей для того, чтобы связываться с высоким сродством и с высокой специфичностью с соответствующим антигеном. Это означает, что фрагменты связывания одного домена могут быть получены из иммуноглобулинов, состоящих из тяжелой цепи, которые легко экспрессируются и в целом являются стабильными и растворимыми.
[0184] Общее описание иммуноглобулинов, состоящих из тяжелой цепи, верблюдов и их вариабельных участков, а также методов их получения, и/или выделения, и/или применения может быть найдено среди прочего в следующих документах WO 94/04678, WO 97/49805 и WO 97/49805.
[0185] Общее описание иммуноглобулинов, состоящих из тяжелой цепи, хрящевых рыб и их вариабельных участков, и способов их получения и/или выделения и/или использования, может быть найдено среди прочего в WO 2005/118629.
V-подобные белки
[0186] Примером соединения согласно изобретению является Т-клеточный рецептор. Т-клеточные рецепторы имеют два V-домена, которые объединяются в структуру, сходную с модулем Fv антитела. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991 раскрывает, как два V-домена Т-клеточного рецептора (называемые альфа и бета) могут быть слиты и экспрессированы в виде одноцепочечного полипептида, и, дополнительно, как изменить поверхностные остатки для уменьшения гидрофобности, непосредственно аналогично участку scFv антитела. Другие публикации, описывающие получение одноцепочечных Т-клеточных рецепторов или мультимерных Т-клеточных рецепторов, содержащих два домена V-альфа и V-бета, включают WO 1999/045110 или WO 2011/107595.
[0187] Другие белки, не принадлежащие к антителу, содержащие антигенсвязывающие домены, включают белки с V-подобными доменами, которые обычно являются мономерными. Типичные белки, содержащие такие V-подобные домены, включают CTLA-4, CD28 и ICOS. Дополнительное раскрытие белков, содержащих такие V-подобные домены, включено в WO 1999/045110.
Аднектины
10
10
[0188] В одном примере соединением согласно изобретению является аднектин. Аднектины основаны на десятом домене фибронектина III типа (Fn3) фибронектина человека, в котором петлевые участки изменены для обеспечения связывания антигена. Например, могут быть созданы три петли на одном конце β-сэндвича домена Fn3, чтобы дать возможность аднектину специфически распознавать антиген. Подробнее см. US 20080139791 или WO 2005/056764.
Антикалины
[0189] В другом примере соединение согласно изобретению представляет собой антикалин. Антикалины получают из липокалинов, которые представляют собой семейство внеклеточных белков, которые транспортируют небольшие гидрофобные молекулы, такие как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Липокалины имеют жесткую β-складчатую вторичную структуру с множеством петель на открытом конце конической структуры, которые могут быть сконструированы для связывания с антигеном. Такие сконструированные липокалины известны как антикалины. Подробное описание антикалинов см. в US 7250297 B1 или US 20070224633.
Аффитела
[0190] В другом примере соединение согласно изобретению представляет собой аффитело. Аффитело представляет собой каркас, полученный из домена Z (антигенсвязывающего домена) белка A Staphylococcus aureus, который может быть сконструирован для связывания с антигеном. Домен Z состоит из трехспирального пучка, состоящего примерно из 58 аминокислот. Библиотеки были созданы путем рандомизации поверхностных остатков. Подробнее см. EP 1641818.
Авимеры
[0191] В другом примере соединение согласно изобретению представляет собой авимер. Авимеры представляют собой многодоменные белки, полученные из семейства белков с А-доменным каркасом. Нативные домены из приблизительно 35 аминокислот принимают определенную структуру, связанную дисульфидными связями. Разнообразие создается путем перетасовки природных вариантов, проявляемых семейством А-доменов. Подробнее см. WO 2002088171.
DARPin
[0192] В дополнительном примере соединение согласно изобретению представляет собой сконструированный белок с анкириновым повтором (DARPin). DARPin получают из анкирина, который представляет семейство белков, которые опосредуют присоединение интегральных мембранных белков к цитоскелету. Один анкириновый повтор представляет собой мотив из 33 остатков, состоящий из двух α-спиралей и β-поворота. Они могут быть сконструированы для связывания различных целевых антигенов путем рандомизации остатков в первой α-спирали и β-поворота каждого повтора. Их поверхность связывания может быть увеличена путем увеличения количества модулей (метод созревания аффинности). Подробнее см. US 20040132028.
Методы получения белков
Рекомбинантная экспрессия
[0193] В случае рекомбинантного белка кодирующая его нуклеиновая кислота может быть клонирована в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, дрожжевые клетки, клетки насекомых или клетки млекопитающих, такие как клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки эмбриональной почки человека (HEK) или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют антитела. Типичными клетками, применяемыми для экспрессии белка согласно настоящему изобретению, являются клетки CHO, клетки миеломы или клетки HEK. Методы молекулярного клонирования для достижения этих целей известны в данной области и раскрыты, например, в Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все обновления до настоящего времени) или Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Для создания рекомбинантных нуклеиновых кислот подходят самые разнообразные методы клонирования и in vitro амплификации. Методы получения рекомбинантных антител также известны в данной области. См. US 4816567 или US 5530101.
[0194] После выделения нуклеиновую кислоту встраивают функционально связанно с промотором в экспрессионную конструкцию или экспрессионный вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии в бесклеточной системе или в клетках.
[0195] Используемый в данном документе термин «промотор» следует употреблять в его самом широком контексте, и он включает транскрипционные регуляторные последовательности геномного гена, включая ТАТА-бокс или сигнальную последовательность, которая необходима для точной инициации транскрипции, с или без дополнительных регуляторных элементов (например, вышестоящие активирующие последовательности, сайты связывания фактора транскрипции, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию нуклеиновой кислоты, например, в ответ на развитие и/или внешний стимул, или тканеспецифическим образом. В контексте настоящего изобретения термин «промотор» также применяется для описания рекомбинантной, синтетической или слитой нуклеиновой кислоты или производного, которое запускает, активирует или усиливает экспрессию нуклеиновой кислоты, с которой он функционально связан. Типичные промоторы могут содержать дополнительные копии одного или более специфических регуляторных элементов для дальнейшего усиления экспрессии и/или изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии указанной нуклеиновой кислоты.
[0196] Используемый в данном документе термин «функционально связанный с» означает расположение промотора относительно нуклеиновой кислоты таким образом, что экспрессия нуклеиновой кислоты контролируется промотором.
[0197] Существует множество векторов для экспрессии в клетках. Компоненты вектора обычно включают, но не ограничиваются указанными, одну или более из следующих: сигнальную последовательность, последовательность, кодирующую антитело (например, полученную с помощью информации, представленной в данном документе), энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. Специалисту в данной области известны подходящие последовательности для экспрессии антитела. Типичные сигнальные последовательности включают прокариотические сигналы секреции (например, pelB, щелочная фосфатаза, пенициллиназа, Ipp или термостабильный энтеротоксин II), сигналы секреции дрожжей (например, лидерная последовательность инвертазы, лидерная последовательность фактора α или лидерная последовательность кислотной фосфатазы) или сигналы секреции млекопитающих (например, сигнал gD простого герпеса).
[0198] Типичные промоторы, активные в клетках млекопитающих, включают немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE), промотор 1-α фактора элонгации человека (EF1), промоторы малой ядерной РНК (U1a и U1b), промотор тяжелой цепи α-миозина, промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), поздний промотор аденовируса, промотор β-актина; гибридный регуляторный элемент, содержащий энхансер CMV/промотор β-актина, или промотор иммуноглобулина или его активного фрагмента. Примерами применяемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линии клеток почки обезьян CV1, трансформированные SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); линия клеток почки эмбриона человека (293 или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензионной культуре; клетки почки новорожденного хомяка (BHK, АТСС CCL 10) или клетки яичника китайского хомяка (CHO).
[0199] Типичные промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, таких как, например, дрожжевая клетка, выбранная из группы, включающей Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и S.pombe, включают, но не ограничиваются указанными, промотор ADH1, промотор GAL1, промотор GAL4, промотор CUP1, промотор PHO5, промотор nmt, промотор RPR1 или промотор TEF1.
[0200] Средства для введения выделенной нуклеиновой кислоты или экспрессионной конструкции, содержащей ее, в клетку для экспрессии известны специалистам в данной области техники. Метод, применяемый для конкретной клетки, зависит от известных успешных методов. Средства для введения рекомбинантной ДНК в клетки включают, среди прочего, микроинъекцию, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, трансфекцию, опосредованную липосомами, например, с применением липофектамина (Gibco, MD, США) и/или целфектина (Gibco, MD, США), PEG-опосредованное поглощение ДНК, электропорацию и бомбардировку микрочастицами, например, с применением покрытых ДНК частиц вольфрама или частиц золота (Agracetus Inc., WI, USA).
[0201] Клетки-хозяева, используемые для получения антитела, могут быть культивированы в различных средах в зависимости от используемого типа клеток. Для культивирования клеток млекопитающих пригодны коммерчески доступные среды, такие как среда Хэма FI0 (Sigma), минимальная питательная среда ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла модифицированная по способу Дульбекко ((DMEM), Sigma). Среды для культивирования других типов клеток, обсуждаемых в данном документе, известны в данной области техники.
Очистка белков
[0202] После получения/экспрессии, белок согласно изобретению очищают методом, известным в данной области техники. Такая очистка обеспечивает белок согласно изобретению, по существу не содержащий неспецифический белок, кислоты, липиды, углеводы и тому подобного. В одном примере белок будет находиться в растворе, где более 90% (например, 95%, 98% или 99%) белка в растворе представляет собой белок согласно изобретению.
[0203] Стандартные методы очистки пептидов применяют для получения выделенного белка согласно изобретению, включая, но не ограничиваясь указанными, различные протоколы выделения полипептидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а также отличные от ВЭЖХ протоколов, таких как эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография с гидрофобным взаимодействием, хроматография со смешанным режимом, методы разделения фаз, электрофоретическое разделение, методы осаждения, методы всаливания/высаливания, иммунохроматография и/или другие методы.
[0204] В одном примере метод аффинной очистки применяют для выделения слитого белка, содержащего метку. Методы выделения белка с использованием аффинной хроматографии известны в данной области и раскрыты, например, в Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Например, антитело или соединение, которое связывается с меткой (в случае полигистидиновой метки это может быть, например, никель-нитрилтрехуксусная кислота), иммобилизуется на твердом носителе. Затем образец, содержащий белок, подвергают взаимодействию с иммобилизованным антителом или соединением в течение времени и в условиях, достаточных для связывания. После промывки для удаления любого несвязанного или неспецифически связанного белка, белок элюируют.
γ
[0205] В случае белка, содержащего участок Fc антитела, белок А или белок G или их модифицированные формы могут быть использованы для аффинной очистки. Белок А применяют для выделения очищенных белков, содержащих γI, 2 или γ4 участки Fc тяжелой цепи человека. Белок G рекомендуется использовать для всех мышиных изотипов Fc и для γ3 человека.
Ингибиторы передачи сигналов VEGF-B на основе нуклеиновой кислоты
[0206] В одном примере согласно изобретению терапевтические и/или профилактические способы, раскрытые в данном документе в соответствии с любым примером изобретения, включают уменьшение экспрессии VEGF-B. Например, такой способ включает введение соединения, которое уменьшает транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты. В одном примере соединение представляет собой нуклеиновую кислоту, например, антисмысловой полинуклеотид, рибозим, ПНК, интерферирующую РНК, миРНК, микроРНК.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты
[0207] Термин «антисмысловая нуклеиновая кислота» следует понимать, как ДНК или РНК или их производные (например, МНК или ПНК) или их комбинацию, которая комплементарна по меньшей мере части молекулы специфической мРНК, кодирующей полипептид, как раскрыто в данном документе в любом примере изобретения, и способна вмешиваться в посттранскрипционное событие, такое как трансляция мРНК. Использование антисмысловых методов известно в данной области техники (см., например, Hartmann and Endres (editors), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)).
[0208] Антисмысловая нуклеиновая кислота согласно изобретению будет гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой в физиологических условиях. Антисмысловые нуклеиновые кислоты содержат последовательности, которые соответствуют структурным генам или кодирующим участкам, или последовательностям, которые влияют на контроль экспрессии или сплайсинга гена. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота может соответствовать целевому кодирующему участку нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF-B, или 5'-нетранслируемому участку (UTR), или 3'-UTR, или их комбинации. Она может быть частично комплементарна интронным последовательностям, которые могут быть сплайсированы во время или после транскрипции, например, только экзонным последовательностям целевого гена. Длина антисмысловой последовательности должна составлять по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, например, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF-B. Можно использовать полноразмерную последовательность, комплементарную всему генному транскрипту. Длина может составлять от 100 до 2000 нуклеотидов. Степень идентичности антисмысловой последовательности к целевому транскрипту должна составлять по меньшей мере 90%, например, от 95 до 100%.
[0209] Типичные антисмысловые нуклеиновые кислоты против VEGF-B раскрыты, например, в WO 2003/105754.
Каталитическая нуклеиновая кислота
[0210] Термин «каталитическая нуклеиновая кислота» относится к молекуле ДНК или ДНК-содержащей молекуле (также известной в данной области техники, как «дезоксирибозим» или «ДНКзим») или РНК или РНК-содержащей молекуле (также известной как «рибозим» или «РНКзим»), которая специфически распознает определенный субстрат и катализирует химическую модификацию этого субстрата. Основания нуклеиновых кислот в каталитической нуклеиновой кислоте могут представлять собой A, C, G, Т (и U для РНК).
[0211] Обычно каталитическая нуклеиновая кислота содержит антисмысловую последовательность для специфического распознавания целевой нуклеиновой кислоты, и обладает ферментативной активностью расщепления нуклеиновой кислоты (также называемую в данном документе «каталитическим доменом»). Типы рибозимов, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой рибозимы в виде головки молота и рибозимы, содержащие шпильку.
РНК интерференция
[0212] РНК интерференцию (РНКи) применяют для специфического ингибирования продукции конкретного белка. Не ограничиваясь теорией, этот подход основан на присутствии молекул двухцепочечной РНК, которые содержат последовательность, которая по существу идентична мРНК целевого гена или его части, в данном случае мРНК, кодирующей VEGF-B. Предпочтительно, двухцепочечная РНК может быть получена из одиночного промотора в клетке-хозяине рекомбинантного вектора, где смысловая и антисмысловая последовательности фланкированы несвязанной последовательностью, которая позволяет смысловой и антисмысловой последовательностям гибридизоваться с образованием молекулы двухцепочечной РНК, в которой несвязанная последовательность образует петлевую структуру. Разработка и получение подходящих молекул двухцепочечной РНК для настоящего изобретения находится в пределах возможностей специалиста в данной области техники, особенно учитывая WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029 и WO 01/34815.
[0213] Длина гибридизующихся смысловой и антисмысловой последовательностей должна составлять по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, например, по меньшей мере 30 или 50 нуклеотидов, например, по меньшей мере 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов. Можно использовать полноразмерную последовательность, соответствующую целому генному транскрипту. Длины могут составлять от 100 до 2000 нуклеотидов. Степень идентичности смысловой и антисмысловой последовательностей целевого транскрипта должна составлять по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 90%, например, от 95 до 100%.
[0214] Типичные молекулы малых интерферирующих РНК («миРНК») содержат нуклеотидную последовательность, которая идентична приблизительно 19-21 смежным нуклеотидам целевой мРНК. Например, последовательность миРНК начинающаяся с динуклеотида АА, содержит приблизительно от 30 до 70% GC (например, от 30 до 60%, например, от 40 от 60%, например, приблизительно от 45 до 55%), и не имеет высокой процентной идентичности по отношению к любой нуклеотидной последовательностью, отличной от целевой, в геноме млекопитающего, в который она должен быть введена, например, как определено стандартным поиском BLAST. Типичная миРНК, уменьшающая экспрессию VEGF-B, коммерчески доступна от Santa Cruz Biotechnology или Novus Biologicals.
[0215] Короткая шпилечная РНК (кшРНК), которая уменьшает экспрессию VEGF-B, также известна в данной области и коммерчески доступна от Santa Cruz Biotechnology.
Скрининговые анализы
[0216] Соединения, которые ингибируют передачу сигнала VEGF-B, могут быть идентифицированы с использованием методов, известных в данной области техники, например, как описано ниже. Аналогично, количества ингибиторов передачи сигналов VEGF-B, необходимых для применения в способе, раскрытом в данном документе, могут быть определены или оценены с использованием методов, известных в данной области, например, как раскрыто ниже.
Анализ нейтрализации
[0217] Для соединений, которые связываются с VEGF-B и ингибируют передачу сигналов, может быть применен анализ нейтрализации.
[0218] В одном примере анализ нейтрализации включает взаимодействие VEGF-B с соединением в присутствии или в отсутствие детектируемого меченого растворимого VEGF-R1, или взаимодействие детектируемого меченого VEGF-B с соединением в присутствии или в отсутствие клетки, экспрессирующей VEGF-R1 или растворимый VEGF-R1. Затем оценивают уровень VEGF-B, связанного с VEGF-R1. Уменьшенный уровень связанного VEGF-B в присутствии соединения по сравнению с отсутствием соединения указывает на то, что соединение ингибирует связывание VEGF-B с VEGF-R1 и, как следствие, передачу сигналов VEGF-B.
[0219] Другой анализ нейтрализации раскрыт в WO 2006/012688 и включает взаимодействие фрагмента VEGF-R1, содержащего второй Ig-подобный домен, иммобилизованный на твердом носителе, с субнасыщающей концентрацией рекомбинантного VEGF-B, предварительно инкубированного с соединением. После промывки для удаления несвязанного белка иммобилизованный белок подвергают взаимодействию с антителом против VEGF-B и определяют количество связанного антитела (указывающее на иммобилизованный VEGF-B). Соединение, которое снижает уровень связанного антитела по сравнению с уровнем в отсутствие соединения, считается ингибитором передачи сигналов VEGF-B.
[0220] В другом примере соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, идентифицируют с использованием клетки, пролиферация которой зависит от передачи сигналов VEGF-B, например, клетки BaF3, модифицированной, как описано в WO 2006/061688, для экспрессии химерного рецептора, содержащего внутриклеточный домен эритропоэтинового рецептора человека и внеклеточный домен VEGF-R1. Клетки культивируют в присутствии VEGF-B и в присутствии или в отсутствие соединения. Пролиферацию клеток затем оценивают с использованием стандартных методов, например, анализов образования колоний, включения тимидина или поглощения другого подходящего маркера клеточной пролиферации (например, анализа восстановления красителя MTS). Соединение, которое уменьшает уровень пролиферации в присутствии VEGF-B, считается ингибитором передачи сигналов VEGF-B.
[0221] Соединения также могут быть оценены по их способности связываться с VEGF-B с использованием стандартных методов. Методы оценки связывания с белком известны в данной области, например, как раскрыто в Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Такой метод обычно включает мечение соединения и его взаимодействие с иммобилизованным VEGF-B. После промывки для удаления неспецифического связанного соединения, определяют количество метки и, как следствие, связанного соединения. Конечно, соединение может быть иммобилизовано и VEGF-B помечен. Также могут быть применены анализы типа панорамирования. Альтернативно или дополнительно, могут быть применены анализы поверхностного плазмонного резонанса.
Анализы экспрессии
[0222] Соединение, которое уменьшает или предотвращает экспрессию VEGF-B, идентифицируют взаимодействием клетки с соединением и определением уровня экспрессии VEGF-B. Подходящие методы определения экспрессии генов на уровне нуклеиновой кислоты известны в данной области и включают, например, количественную полимеразную цепную реакцию (количественная ПЦР) или микроматричные анализы. Подходящие методы определения экспрессии на уровне белка также известны в данной области и включают, например, флуоресцентный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноферментный анализ (FLISA), иммунофлуоресценцию или Вестерн-блоттинг.
In vivo анализы
[0223] Активность соединений, раскрытых в данном документе, можно исследовать на моделях животных. В одном примере модель животного представляет собой модель метаболической дисфункции и гипергликемии. Например, модель мыши с алиментарным ожирением (АО). Это хорошо зарекомендовавшая себя экспериментальная парадигма, в которой у мышей развивается избыточное или эктопическое отложение липидов в периферических тканях, которое связано с нарушением чувствительности к инсулину и поглощения глюкозы, и у мышей наблюдаются ожирение, гиперинсулинемия, гипергликемия, дислипидемия и гипертония (Harberg, СЕ, et al. Nature 490, 426-430, Collins S. et al. Pysiology & Behavior 81, 243-248).
[0224] Существуют различные известные методы индуцирования ишемического инсульта у субъекта-животного, не являющегося человеком, такие как окклюзия аорты/полой вены, внешний шейный жгут или манжет, кровоизлияние или гипотония, внутричерепная гипертензия или окклюзия общей сонной артерии, окклюзия двух сосудов и гипотония, окклюзия четырех сосудов, окклюзия односторонней общей сонной артерии (только у некоторых видов), эндотелин-1-индуцированное сужение артерий и вен, окклюзия средней мозговой артерии (ОСМА), спонтанный инфаркт головного мозга (у спонтанно гипертензивных крыс), эмболизация макросферы, эмболизация кровяного сгустка или эмболизация микросфер. Кровоизлияние в мозг можно смоделировать путем вливания коллагеназы в головной мозг.
[0225] В одном примере модель инсульта включает окклюзию средней мозговой артерии (ОСМА) для возникновения ишемического инсульта, как ранее описано в Su et al Nature Medicine, 2008; 14: 731-737.
Фармацевтические композиции и способы лечения
[0226] Соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B (син. активный ингредиент), применяют для парентерального, местного, перорального или локального введения, аэрозольного введения или трансдермального введения для профилактического или терапевтического лечения. В одном примере соединение вводят парентерально, например, подкожно или внутривенно.
[0227] Композиция вводимого соединения будет варьироваться в зависимости от выбранного способа введения и лекарственной формы (например, раствора, эмульсии, капсулы). Подходящая фармацевтическая композиция, содержащая вводимое соединение, может быть получена в физиологически приемлемом носителе. Для растворов или эмульсий подходящие носители включают, например, водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферную среду. Носители для парентерального введения могут включать раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или нелетучие масла. Специалистам в данной области известно множество подходящих водных носителей, включая воду, буферную воду, буферный физиологический раствор, многоатомные спирты (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль), раствор декстрозы и глицин. Носители для внутривенного введения могут включать различные добавки, консерванты или жидкие, питательные или электролитные наполнители (см., как правило, Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980). Композиции необязательно могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приблизительного сближения физиологических условий, такие как регулирующие pH и буферные агенты и агенты, регулирующие токсичность, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и лактат натрия. Соединение можно лиофилизировать для хранения и восстановить в подходящем носителе перед применением согласно известным в данной области методами лиофилизации и восстановления.
[0228] Оптимальная концентрация активного ингредиента(-ов) в выбранной среде может быть определена эмпирически в соответствии с процедурами, известными специалисту в данной области, и будет зависеть от желаемой конечной фармацевтической лекарственной формы.
[0229] Диапазоны дозировок для введения соединения согласно изобретению представляют собой дозировки, достаточные для достижения желаемого эффекта. Например, композиция включает терапевтически или профилактически эффективное количество соединения.
[0230] В контексте настоящего документа термин «эффективное количество» следует понимать, как достаточное количество соединения для ингибирования/уменьшения/предотвращения передачи сигналов VEGF-B у субъекта. Специалисту в данной области известно, что такое количество будет варьироваться в зависимости, например, от соединения и/или конкретного субъекта и/или от типа и/или тяжести перенесенного инсульта. Соответственно, этот термин не следует истолковывать так, чтобы ограничивать изобретение конкретным количеством, например, массой или числом соединений.
[0231] В контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» следует понимать, как достаточное количество соединения для уменьшения или ингибирования одного или более симптомов инсульта.
[0232] В контексте настоящего документа термин «профилактически эффективное количество» следует понимать, как достаточное количество соединения для предотвращения или ингибирования или задержки возникновения одного или более обнаруживаемых симптомов инсульта.
[0233] В одном примере соединение вводят в количестве, эффективном для проявления одного или более из следующих эффектов:
уменьшение или предотвращение нарушения гематоэнцефалического барьера,
уменьшение или предотвращение сосудистой проницаемости в головном мозге,
уменьшение или предотвращение размера инфаркта в головном мозге, и/или
уменьшение или предотвращение внутричерепного кровоизлияния.
[0234] Дозировка не должна вызывать нежелательные побочные эффекты, такие как синдромы повышенной вязкости, отек легких, застойная сердечная недостаточность и тому подобное. Как правило, дозировка будет варьироваться в зависимости от возраста, состояния, пола и степени заболевания у пациента, и может быть определена специалистом в данной области. Дозировка может быть отрегулирована индивидуальным врачом в случае каких-либо осложнений.
[0235] Дозировку можно варьировать от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 300 мг/кг, например, от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 200 мг/кг, например, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг в одной или более дозах ежедневно, в течение одного или более дней.
[0236] В некоторых примерах соединение вводят в начальной (или ударной) дозе, которая выше, чем последующая (поддерживающая доза). Например, соединение вводят в начальной дозе от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг. Затем соединение вводят в поддерживающей дозе от приблизительно 0,0001 мг/кг до приблизительно 1 мг/кг. Поддерживающие дозы можно вводить каждые от 7 до 35 суток, например, каждые 14, или 21, или 28 суток.
[0237] В некоторых примерах применяют режим эскалации дозы, в котором соединение изначально вводят в более низкой дозе, чем в последующих дозах. Этот режим дозирования применим в случае, когда субъект изначально страдает от нежелательных явлений.
[0238] В случае субъекта, который неадекватно реагирует на лечение, можно вводить многократные дозы в течение недели. Альтернативно или дополнительно, могут быть введены возрастающие дозы.
[0239] В одном примере, соединение(-ия) согласно изобретению применяют в комбинации с по меньшей мере одним другим известным соединением, которое в настоящее время используется или разрабатывается для профилактики или лечения инсульта. Примеры таких известных соединений включают, но не ограничиваются указанными, обычные тромболитические агенты, такие как активаторы тканевого плазминогена (например, алтеплаза, ретеплаза, тенектеплаза), анистреплаза, стрептокиназа, урокиназа, ланотеплаза, десмотеплаза и стафилокиназа.
[0240] Кроме того, способы согласно изобретению могут также включать совместное введение по меньшей мере одного другого терапевтического агента для лечения другого заболевания, прямо или косвенно связанного с инсультом, включая, но не ограничиваясь указанными, дислипидемию, гипертонию, ожирение, невропатию и/или ретинопатии и т.д. Дополнительные примеры агентов, которые можно вводить совместно с соединением(-ями) в соответствии с изобретением, представляют собой кортикостероиды; иммунодепрессанты; антибиотики; антигипертензивные и мочегонные препараты (такие как ингибиторы АПФ); агенты, понижающие уровень липидов, такие как секвестранты желчных кислот, холестирамин, колестипол, никотиновая кислота и, в частности, лекарственные средства и лекарственные препараты, используемые для снижения уровня холестерина и триглицеридов (например, фибраты (например, Gemfibrozil™) и ингибиторы гидроксиметилглутарил-коэнзима А, такие как Lovastatin™, Atorvastatin™, Fluvastatin™, Lescol™), Lipitor™, Mevacor™), Pravachol™, Pravastatin™, Simvastatin™, Zocor™, Cerivastatin™), и т.д.); соединения, которые ингибируют кишечную абсорбцию липидов (например, эзетиминд); никотиновая кислота; и витамин D.
[0241] Как видно из вышеизложенного, настоящее изобретение относится к способам сопутствующего терапевтического лечения субъекта, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества первого соединения и второго соединения, где первый агент представляет собой соединение согласно изобретению (т.е. ингибитор передачи сигналов VEGF-B), а второй агент предназначен для профилактики или лечения инсульта.
[0242] В контексте настоящего документа термин «сопутствующее» во фразе «сопутствующее лечение» означает введение первого агента в присутствии второго агента. Сопутствующий терапевтический способ лечения включает способы, где первый, второй, третий или дополнительные агенты вводят совместно. Сопутствующий терапевтический способ лечения также включает способы, где первые или дополнительные агенты вводят в присутствии вторых или дополнительных агентов, где, возможно, ранее были введены вторые или дополнительные агенты. Сопутствующий терапевтический способ лечения можно выполнять постадийно различными участниками. Например, один участник может вводить субъекту первый агент, а второй участник может вводить субъекту второй агент, и стадии введения можно выполнять одновременно, или почти в одно и то же время, или в разное время, при условии что первый агент (и/или дополнительные агенты) вводят в присутствии второго агента (и/или дополнительных агентов). Участник и субъект могут быть одним и тем же лицом (например, человеком).
[0243] Время введения дополнительного терапевтического агента можно определить с момента введения соединения согласно настоящему изобретению. Интервал может составлять, например, от 5 минут до 24 или 48 часов. Интервал может составлять, например, от 15 минут до 6 часов, от 15 минут до 4,5 часов, от 15 минут до 3 часов, от 15 минут до 1 часа, от 30 минут до 6 часов, или от 30 минут до 3 часов, или от 30 минут до 4,5 часов, или от 1 до 3 часов, или от 1 до 4,5 часов, или от 1 до 5 часов, или от 1 до 6 часов, или от 1 до 7 часов, или от 1 до 8 часов, или от 1 до 9 часов, или от 1 до 10 часов.
[0244] В одном примере, настоящее изобретение также относится к способу уменьшения последствия инсульта или лечению инсульта у субъекта, включающему введение субъекту тромболитического агента, где субъект получает или ранее получил (например, с момента возникновения симптома инсульта) ингибитор передачи сигналов VEGF-B, относительно субъекта, страдающего от инсульта, и получающего другое лечение.
Наборы
[0245] Другой пример изобретения относится к наборам, включающим соединения, полезные для лечения инсульта, как описано выше.
[0246] В одном примере набор содержит (а) контейнер, содержащий соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B, как раскрыто в данном документе, и/или тромболитическое соединение, как раскрыто в данном документе, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе; и (b) листок-вкладыш, содержащий инструкцию по применению лекарственного средства для уменьшения последствия инсульта у субъекта.
[0247] В соответствии с этим примером изобретения листок-вкладыш находится на контейнере или ассоциирован с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер хранит или содержит композицию, которая эффективна для лечения инсульта и может иметь стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой соединение, ингибирующее передачу сигналов VEGF-B. На этикетке или в листке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения субъекта, нуждающегося в лечении, например, перенесшего или предрасположенного к инсульту, с обеспечением конкретного руководства в отношении дозировок и интервалов применения соединения и любого другого лекарственного средства. Набор может дополнительно включать дополнительный контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-буферный физиологический раствор, раствор Рингера и/или раствор декстрозы. Набор может дополнительно включать другие вещества, необходимые с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
[0248] Настоящее изобретение включает следующие не ограничивающие примеры.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Увеличение поглощения жирных кислот в первичных эндотелиальных клетках головного мозга человека in vitro со снижением поглощения глюкозы
Увеличение поглощения жирных кислот и снижение поглощения глюкозы в первичных эндотелиальных клетках, стимулированных VEGF-B
2
167
186
[0249] Первичные микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга человека, HBMEC, (количество пассажей менее 5), культивировали в 24-луночных планшетах в эндотелиальной минимальной среде с комплексом добавок, включающим 5% фетальную бычью сыворотку (FCS), в инкубаторе для клеточных культур при 37°C, 5% CO. За шесть часов до стимуляции эндотелиальные клетки подводили к истощению, заменяя FCS на не содержащий жирных кислот бычий сывороточный альбумин (FAF-BSA). Клетки стимулировали добавлением носителя (Контроль), 100 нг/мл VEGF-B (В167), 100 нг/мл VEGF-B (В186) или 2 мкг/мл антитела 2Н10 против VEGF-B в течение 2 часов.
[0250] После стимуляции измеряли поглощение меченных BODIPY жирных кислот (ЖК) или флуоресцентного аналога глюкозы (2-NBDG). 2-NBDG применяли в качестве маркера поглощения глюкозы. Клетки инкубировали с маркерами BODIPY-C12 или 2-NBDG в течение 5 или 20 минут, соответственно. Перед добавлением 2-NBDG клетки промывали в течение 10 минут буфером Кребса-Рингера для удаления глюкозы из культуральной среды. После инкубации с маркерами ЖК или глюкозы клетки промывали и фиксировали перед получением изображения и количественным определением.
167
186
[0251] Стимуляция с помощью 100 нг/мл изоформы VEGF-B (VEGF-B или VEGF-B) приводила к значительному увеличению поглощения жирных кислот (ЖК) и значительному снижению поглощения глюкозы. Обработка только антителом 2Н10, блокирующим VEGF-B, существенно не изменяла поглощение жирных кислот или глюкозы, однако наблюдалась тенденция к снижению поглощения ЖК и увеличению поглощения глюкозы, что свидетельствует об эндогенном продуцировании и секреции VEGF-B в культивируемых эндотелиальных клетках.
[0252] Эти данные показывают, что цереброваскулярные эндотелиальные клетки способны реагировать на VEGF-B с увеличением поглощения ЖК и снижением поглощения глюкозы, что предполагает, что поглощение липидов и глюкозы в эндотелии головного мозга может быть взаимосвязано.
[0253] На Фиг. 1A и 1B показано увеличенное поглощение ЖК и пониженное поглощение глюкозы в первичных эндотелиальных клетках головного мозга, обработанных белками VEGF-B.
Воздействие жирных кислот на первичные эндотелиальные клетки снижает поглощение глюкозы
[0254] Первичные эндотелиальные клетки человека выращивали в присутствии или в отсутствие смеси пальмитата натрия и олеата натрия (50 мкМ) в течение 2 часов или в течение ночи, и затем обрабатывали маркером 2-NBDG и исследовали в отношении поглощения глюкозы.
[0255] Эндотелиальные клетки, подвергшиеся воздействию среды, обогащенной ЖК, и липидной нагрузки, демонстрируют значительное снижение способности поглощать глюкозу in vitro. Это свидетельствует о том, что эндотелиальные клетки в высоколипидной среде in vivo, например, в модели с алиментарным ожирением (АО), могут реагировать аналогичным образом, и что это означает снижение поглощения глюкозы в тканях в условиях АО in vivo.
[0256] На Фиг. 1C показано снижение поглощения глюкозы в первичных эндотелиальных клетках, подвергшихся воздействию жирных кислот. Эндотелиальные клетки, подвергшиеся воздействию липидной нагрузки, демонстрируют значительное снижение способности к поглощению глюкозы, что указывает на то, что воздействие и поглощение ЖК в эндотелиальных клетках снижает поглощение глюкозы.
Пример 2: Мыши с алиментарным ожирением имеют повышенные уровни глюкозы в крови и увеличенную частоту возникновения ишемического инсульта
Мыши с алиментарным ожирением (АО) имеют повышенные уровни глюкозы в крови
[0257] Трехнедельных мышей C57BL/6 помещали на диету с высоким содержанием жиров (60% калорий из жира) или на контрольную диету с низким содержанием жиров (обычный корм, 10% калорий из жира) в течение 15 недель. Глюкозу в крови измеряли в то же время суток после отмены пищи на 2 часа в качестве средства стабилизации уровня глюкозы в крови. Кончик хвоста отрезали и каплю крови измеряли глюкометром.
[0258] Мыши с АО демонстрировали повышенные уровни глюкозы в крови по сравнению с мышами соответствующей возрастной группы на нормальном корме, что находится в соответствии с предыдущими исследованиями (Hagberg et al., Nature, Collins et al., Physiology and Behavior, 2004).
[0259] На Фиг. 2A показано, что мыши с АО имеют повышенные уровни глюкозы в крови по сравнению с мышами соответствующей возрастной группы на нормальном корме.
Мыши с АО переносят более тяжелые инсульты и имеют повышенную частоту возникновения спонтанного кровоизлияния и крупных инфарктов
[0260] Трехнедельных самцов мышей C57BL/6J помещали на диету с высоким содержанием жиров (60% калорий из жира) или на контрольную диету с низким содержанием жиров (обычный корм, 10% калорий из жира) в течение как минимум 12 недель перед индуцированием ишемии головного мозга (модель окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА)).
[0261] Чтобы индуцировать ишемию головного мозга, применяя модель ОСМА, мышей анестезировали хлоральгидратом (450 мг/кг) и надежно помещали под препаровальную лупу. Левую среднюю мозговую артерию (СМА) подвергали краниотомии, и лазерный допплеровский зонд для измерения кровотока помещали на поверхность коры головного мозга в 1,5 мм с тыльно-боковой стороны от бифуркации СМА. Зонд соединяли с измерителем кровотока, и относительный кровоток головного мозга (КГМ) определяли единицами тканевой перфузии (ЕТП), регистрируемыми с помощью программы непрерывного сбора данных. Лазер на 540 нм мощностью 3,5 мВт направляли на СМА с расстояния 6 см, и краситель бенгальский розовый (БР) (50 мг/кг) вводили через хвостовую вену. Стабильной окклюзии достигали, когда ЕТП падал до уровня менее 20% относительно уровня до окклюзии и не восстанавливался в течение 10 минут после прекращения воздействия лазера.
[0262] Для определения объемов инфаркта головной мозг удаляли, разрезали на коронарные срезы толщиной 2 мм и окрашивали 4% 2,3,5-трифенилтетразолхлоридом (ТТХ). Области инфаркта определяли на пяти коронарных уровнях по всему головному мозгу и измеряли объемы инфаркта и полушарий. Объем инфаркта рассчитывали путем измерения и вычитания объема не инфарктного ипсилатерального полушария из объема контралатерального полушария.
[0263] У мышей с АО наблюдались более тяжелые случаи инсульта, чем у обычных мышей, со значительно возросшей частотой возникновения спонтанного кровоизлияния и более крупных инфарктов. Последствия инсульта были значительно хуже в модели АО, чем у контрольных мышей с обычной диетой, как с точки зрения размера инфаркта, так и увеличения частоты возникновения спонтанных внутримозговых кровоизлияний (ВМК).
[0264] На Фиг. 2B и 2C показано, что мыши с АО имеют больший объем инсульта и увеличенную степень кровоизлияния после ишемического инсульта.
Мыши с АО имеют значительно увеличенную экспрессию рецептора VEGF-В Nrp1 после ишемии головного мозга
[0265] Мышей с АО подвергали ОСМА, как раскрыто выше. Через 3 часа после ишемии мышей перфузировали и умерщвляли, гомогенизировали ипси- и контралатеральные полушария и получали общую РНК. Уровень транскрипции Vegfb и его рецепторов Vegfr1 (Flt1) и Нейропилин 1 (Nrp1) определяли количественно с помощью количественной ПЦР.
[0266] Ни экспрессия Vegfb, ни Vegfr1 достоверно не увеличивалась за 3 часа ишемии по отношению к неишемическому контралатеральному полушарию, однако экспрессия Nrp1 была увеличена почти в 3 раза в ишемическом полушарии через 3 часа после ОСМА, что указывает на то, что передача сигналов VEGF-B может увеличиваться локально при ишемии головного мозга.
[0267] На Фиг. 2D показано, что экспрессия Nrp1, в отличие от эксперссии Vegf-b или Flt1, значительно возрастает у мышей с АО после ишемического инсульта.
Пример 3: Профилактическая обработка нейтрализующим антителом (2Н10) против VEGF-B предотвращает прогрессирование ишемического инсульта у мышей с АО
Антагонизм VEGF-B улучшает поглощение глюкозы в головном мозге мышей с АО
18
[0268] Мышей C57BL/6J кормили обычным кормом (обычные) или кормом с высоким содержанием жира (АО) и мышей с АО обрабатывали либо изотипическим контролем, либо антителами 2Н10 против VEGF-B (16 мг/кг) дважды в неделю в течение 30 недель с последующим получением изображений [F]-ДГ ПЭТ (позитронно-эмисионная томография с помощью фтордезоксиглюкозы).
[0269] Алиментарное ожирение уменьшало поглощение глюкозы (определено с использованием меченого аналога глюкозы) в головном мозге по сравнению с контрольными обычными мышами, а длительное ингибирование VEGF-B у мышей с АО значительно улучшало поглощение глюкозы в головном мозге. Эти данные показывают, что, подобно периферическим тканям, системные метаболические нарушения, связанные с АО, могут снижать способность головного мозга поглощать глюкозу из крови, и что передача сигналов VEGF-B может играть роль в регулировании метаболизма глюкозы, влияющего на ЦНС, в модели АО.
[0270] На Фиг. 3A показано, что антагонизм VEGF-B с помощью 2Н10 улучшает поглощение глюкозы в головном мозге мышей с АО.
Профилактическая обработка антителом против VEGF-B значительно уменьшает тяжесть ишемического инсульта у мышей с АО
[0271] Для непосредственной проверки того, стимулирует ли VEGF-B нейрососудистую дисфункцию и увеличивает ли тяжесть ишемического инсульта на фоне метаболического нарушения, у мышей с АО индуцировали тромботический инсульт, и повергали или не подвергали обработке моноклональным антителом 2Н10 к VEGF-B или изотипическим контролем.
[0272] Мышей обрабатывали в течение 1 недели тремя инъекциями (интраперитонеально) за -7, -3 суток и за 1 час до ОСМА с помощью 16 мг/кг антитела. Затем мышей подвергали фототромботической ОСМА и анализировали, как раскрыто выше. Обработка с помощью антитела 2Н10, блокирующего VEGF-B, на фоне АО, значительно уменьшает размер инфаркта и ВМК.
[0273] На Фиг. 3B и 3C показано, что профилактическая обработка антителом (2Н10), блокирующим VEGF-B, улучшает последствия ишемического инсульта у мышей с АО.
Мыши с АО, профилактически обработанные антителом против VEGF-B, сохраняют экспрессию переносчика глюкозы Glut-1 после ишемии головного мозга
[0274] Трехнедельных мышей C57BL/6J кормили кормом с высоким содержанием жиров в течение 17 недель, после чего их предварительно обрабатывали в течение 1 недели путем интраперитонеальной инъекции за -7, -3 суток и за 1 час до ОСМА с помощью 16 мг/кг либо изотипического контроля, либо антитела 2Н10 против VEGF-B.
[0275] Мышей с АО, предварительно обработанных контролем или антителами 2Н10, перфузировали и фиксировали в параформальдегиде в течение 1 часа после ОСМА и делали вибратомные срезы мозга. Срезы окрашивали антителами, направленными против Glut-1, и детектировали с помощью иммунофлуоресценции.
[0276] Окрашивание переносчика глюкозы Glut-1 в сосудах головного мозга мышей с АО показало, что на границе ишемической зоны уже через 1 час после ОСМА наблюдалась заметная потеря окрашивания Glut-1 по сравнению с аналогичными сосудами в неишемическом полушарии (контралатеральном).
[0277] Предварительная обработка антителом 2Н10, блокирующим VEGF-B в течение одной недели до ОСМА частично сохраняла антиген Glut-1 в сосудах полутени. Это говорит о том, что блокирование передачи сигналов VEGF-B с помощью 2Н10 может способствовать лучшему поглощению глюкозы сосудами в ишемической полутени путем сохранения функции переносчика глюкозы Glut-1, и что это, в свою очередь, позволяет сосудам в этой области уменьшенного кровотока лучше справляться с гипоксической и гипогликемической средой полутени.
[0278] На Фиг. 3D показано, что предварительно обработанные антителом 2Н10, блокирующим VEGF-B, мыши с АО, коррелировали с остаточной экспрессией Glut-1 в плазматической мембране в ишемическом полушарии головного мозга по сравнению с неишемическим контралатеральным полушарием. Нанесены относительные области иммунофлуоресценции.
Профилактическая обработка антителом против VEGF-B уменьшает проницаемость гематоэнцефалического барьера у мышей с АО после ишемии головного мозга
[0279] Мышей с АО предварительно обрабатывали 2Н10 или изотипическими контрольными антителами, как указано выше, с последующей ОСМА. Непосредственно перед индукцией ОСМА мышам вводили (внутривенно) 70 кДа флуоресцентного декстранового маркера для анализа проницаемости гематоэнцефалического барьера. Через 1 час после индукции ОСМА мышей перфузировали, затем слегка фиксировали и образцы головного мозга анализировали на проницаемость гематоэнцефалического барьера.
[0280] Еще через 1 час после ОСМА наблюдали резкую потерю целостности гематоэнцефалического барьера у мышей с АО, которую значительно уменьшала обработка антителом 2Н10, блокирующим VEGF-B. Это позволяет предположить, что блокирование VEGF-B улучшает цереброваскулярную функцию у мышей с АО в течение первого часа ишемии.
[0281] На Фиг. 3E показано, что у мышей с АО предварительная обработка антителом 2Н10, блокирующим VEGF-B, уменьшает проницаемость гематоэнцефалического барьера через 1 час после ишемического инсульта.
Профилактическая обработка антителом против VEGF-B уменьшает индукцию фосфорилирования окклюдина у мышей с АО после ишемии головного мозга
[0282] Мышей с АО предварительно обрабатывали в течение одной недели 2Н10 или изотипическими контрольными антителами, как указано выше, с последующей ОСМА. Через 3 часа после ишемии мышей перфузировали, собирали образцы головного мозга и немедленно замораживали. Полученные замороженные срезы подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию фосфосеринспецифическим антителом против окклюдина (сериновый остаток 490) и количественно определяли интенсивность флуоресценции.
[0283] Окклюдин представляет собой белок плотных контактов, который быстро фосфорилируется после ОСМА и ишемически-реперфузионного повреждения (Muthusamy et al Journal of cerebral blood flow and metabolism 2014). Ранее было показано, что фосфорилирование окклюдина по остатку серина 490 участвует в нарушении и повышении проницаемости гематоэнцефалического барьера (Murakami et al Diabetes 2012; Murakami et al The Journal of Biological Chemistry 2009).
[0284] У мышей с AO, обработанных изотипическим контролем (IgG), было обнаружено повышенное фосфорилирование окклюдина по серину (pS490) в полутени (ипси) по сравнению с контралатеральным полушарием (контра) через 3 часа после ОСМА, что свидетельствует об увеличении разборки эндотелиальных плотных контактов и сосудистой проницаемости в ишемическом полушарии. Обработка антителом 2Н10 против VEGF-B уменьшала индукцию фосфорилирования окклюдина в полутени ипсилатерального полушария, поддерживая гипотезу о том, что обработка антителом 2Н10 против VEGF-B повышает целостность гематоэнцефалического барьера.
[0285] На Фиг. 3F показано, что обработка антителом против VEGF-B уменьшает фосфорилирование окклюдина после ишемического инсульта у мышей с АО.
Профилактическая обработка антителом против VEGF-B блокирует накопление липидов в кровеносных сосудах головного мозга у мышей с АО после ишемии головного мозга
[0286] Поскольку передача сигналов VEGF-B подавляет поглощение глюкозы и увеличивает поглощение липидов (как показано выше), сосуды головного мозга исследовали в отношении накопления липидов после ОСМА у обычных мышей и мышей с ожирением, и у мышей с ожирением, обработанных антителом 2Н10.
[0287] Мышей с АО предварительно обрабатывали 2Н10 или изотипическими контрольными антителами, как описано выше, с последующей ОСМА. Мыши с АО без предварительной обработки и обычные контрольные образцы соответствующей возрастной группы также подвергались ОСМА. Через 3 часа после ишемии мышей перфузировали, собирали образцы головного мозга и немедленно замораживали. Получали замороженные срезы, окрашивали антителом к белку, покрывающему липидную каплю, представляющим собой адипофилин/перилипин2, и количественно определяли.
[0288] В течение 3 часов после ОСМА наблюдали значительное поглощение липидов сосудами головного мозга в ишемическом полушарии. По сравнению с неишемическим контралатеральным полушарием, где наблюдали очень небольшое окрашивание адипофилином, также обнаружили значительное поглощение липидов в околососудистой области в ишемическом полушарии обычных мышей. Однако оно было значительно меньше, чем у мышей с АО, и у данных страдающих ожирением мышей увеличение накопления липидов в околососудистой области было в значительной степени блокировано обработкой 2Н10.
[0289] Эти данные позволяют предположить, что даже у обычных мышей ОСМА быстро индуцирует поглощение липидов, возможно для удовлетворения метаболических потребностей в ишемической ткани, и что АО резко усиливает этот ответ. Однако чрезмерное и эктопическое накопление липидов в цереброваскулярном слое может быть вредным, особенно в контексте нехватки кислорода и глюкозы после ОСМА.
[0290] На Фиг. 3G показано, что накопление липидов в кровеносных сосудах головного мозга после ишемического инсульта блокируется профилактической обработкой антителом 2Н10 против VEGF-B.
Пример 4: Терапевтическая обработка антителом против VEGF-B в сочетании с тромболизисом с помощью tPA уменьшает размер инфаркта, кровоизлияний и увеличивает выживаемость у мышей с АО
[0291] Мышей с АО подвергали ОСМА и обрабатывали через 1 час после инсульта с помощью 2Н10 или изотипических контрольных антител (16 мг/кг), как подробно описано выше. Еще через 4 часа мышей подвергали тромболитической терапии путем внутривенной инфузии tPA (альтеплаза, 10 мг/кг) для растворения образовавшихся сгустков крови. Затем анализировали выделенные образцы головного мозга выживших животных, как раскрыто выше.
[0292] Как правило, эффективность тромболитического лечения tPA уменьшается со временем, в то время как риск геморрагической трансформации возрастает (Ahmed et al Lancet Neurology 2010). Полученные результаты показывают, что отсроченная на 1 час обработка 2Н10 после ОСМА с последующим тромболизисом с помощью tPA спустя 4 часа уменьшала размеры инфаркта, уменьшала кровоизлияния и предотвращала смертельные кровоизлияния, так как выживаемость животных, обработанных 2Н10, была значительно выше по сравнению с выживаемостью животных, обработанных изотипическими контролями, которые были подвергнуты позднему тромболизису с помощью tPA.
[0293] Результаты свидетельствуют о терапевтическом потенциале антагонистов VEGF-B при инсульте в качестве возможной адъювантной терапии к лечению tPA, которая может увеличить безопасность тромболизиса с помощью tPA путем уменьшения геморрагических осложнений и/или может расширить окно лечения для tPA. В клинических условиях расширение терапевтического окна является самым важным шагом на пути лечения большинства пациентов с помощью тромболитической терапии.
[0294] На Фиг. 4A-C показано, что ингибирование VEGF-B с помощью антитела 2Н10, блокирующего VEGF-B, улучшает результаты после позднего тромбозилиса.
--->
Перечень последовательностей
<110>  CSL Limited
B-Creative Sweden AB
<120>  СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИНСУЛЬТА
<130>  518558
<160>  47
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  207
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  SIGNAL
<222>  (1)..(21)
<223>  Signal sequence
<400>  1
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln
20                  25                  30
Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln
35                  40                  45
Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val
50                  55                  60
Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly
65                  70                  75                  80
Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
85                  90                  95
Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly
100                 105                 110
Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys
115                 120                 125
Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg
130                 135                 140
Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro
145                 150                 155                 160
Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala
165                 170                 175
His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala
180                 185                 190
Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala
195                 200                 205
<210>  2
<211>  188
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  SIGNAL
<222>  (1)..(21)
<223>  Signal sequence
<400>  2
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln
20                  25                  30
Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln
35                  40                  45
Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val
50                  55                  60
Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly
65                  70                  75                  80
Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
85                  90                  95
Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly
100                 105                 110
Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys
115                 120                 125
Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg
130                 135                 140
Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Arg Arg
145                 150                 155                 160
Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu
165                 170                 175
Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
180                 185
<210>  3
<211>  119
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence from a VH of antibody 2H10
<400>  3
Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp
20                  25                  30
Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
His Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50                  55                  60
Arg Met Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  4
<211>  106
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence from a VL of antibody 2H10
<400>  4
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu
20                  25                  30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  5
<211>  119
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence from a VH of a humanized form of antibody  2H10
<400>  5
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp
20                  25                  30
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
35                  40                  45
His Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50                  55                  60
Arg Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  6
<211>  107
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence of a VL of a humanized form of antibody 2H10
<400>  6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  7
<211>  116
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence from a VH of antibody 4E12
<400>  7
Val Gln Pro Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Asn Ser Trp
20                  25                  30
Ile Gly Trp Val Thr Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50                  55                  60
Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  8
<211>  107
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence of a VL of antibody 4E12
<400>  8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ser Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Cys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Ala Lys Leu Asp Leu Lys
100                 105
<210>  9
<211>  118
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence from a VH of antibody 2F5
<400>  9
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser
1               5                   10                  15
Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe Tyr
20                  25                  30
Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Leu Lys
50                  55                  60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Thr
85                  90                  95
Arg Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  10
<211>  107
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  amino acid sequence of a VL of antibody 2F5
<400>  10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Ala Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  11
<211>  527
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Recombinant human tissue plasminogen activator
<400>  11
Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln
1               5                   10                  15
Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
20                  25                  30
Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val
35                  40                  45
Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50                  55                  60
Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala
65                  70                  75                  80
Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
85                  90                  95
Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
100                 105                 110
Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
115                 120                 125
Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130                 135                 140
Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
165                 170                 175
Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
180                 185                 190
Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
195                 200                 205
Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
210                 215                 220
Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys
225                 230                 235                 240
Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
245                 250                 255
Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
260                 265                 270
Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro
275                 280                 285
Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg
290                 295                 300
Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala
305                 310                 315                 320
Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile
325                 330                 335
Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe
340                 345                 350
Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr
355                 360                 365
Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys
370                 375                 380
Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp
385                 390                 395                 400
Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys
405                 410                 415
His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His
420                 425                 430
Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn
435                 440                 445
Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly
450                 455                 460
Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly
465                 470                 475                 480
Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile
485                 490                 495
Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr
500                 505                 510
Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
515                 520                 525
<210>  12
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR1
<400>  12
agggcaagtc aggacattag caatttttta aac                                    33
<210>  13
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR2
<400>  13
tacacatcaa cattacactc a                                                 21
<210>  14
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR3
<400>  14
caacagggta aaacgcttcc tcccacg                                           27
<210>  15
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR1
<400>  15
ggctacactt tcactggctt ctggatacac                                        30
<210>  16
<211>  51
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR2
<400>  16
catattaatc ctggcaatgg tggcactaac tacaatgaga agttcaagag a                51
<210>  17
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR3
<400>  17
tcctatagta actacgtgcg ggctatggac tac                                    33
<210>  18
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Amino acid sequence of 2H10 VL CDR1
<400>  18
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn
1               5                   10
<210>  19
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2H10 VL CDR2
<400>  19
Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser
1               5
<210>  20
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2H10 VL CDR3
<400>  20
Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro Thr
1               5
<210>  21
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2H10 VH CDR1
<400>  21
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp Ile His
1               5                   10
<210>  22
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2H10 VH CDR2
<400>  22
His Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Arg
<210>  23
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2H10 VH CDR3
<400>  23
Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  24
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 2F5 VL CDR1
<400>  24
aaggccagtc aggatgtggg tactgctgta gcc                                    33
<210>  25
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 2F5 VL CDR2
<400>  25
tgggcatcca cccggcacac t                                                 21
<210>  26
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 2F5 VL CDR3
<400>  26
caacaatata gcagctctct cacg                                              24
<210>  27
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 2F5 VH CDR1
<400>  27
ggctacacct tcacaacctt ctatatacac                                        30
<210>  28
<211>  51
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 2F5 VH CDR2
<400>  28
tggttttatc ctggaaatgt taataccaac tacaatgaga agctcaaggg c                51
<210>  29
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 2F5 VH CDR3
<400>  29
tccccttact acggctacgt ttttgactac                                        30
<210>  30
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2F5 VL CDR1
<400>  30
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210>  31
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2F5 VL CDR2
<400>  31
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1               5
<210>  32
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2F5 VL CDR3
<400>  32
Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Thr
1               5
<210>  33
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2F5 VH CDR1
<400>  33
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe Tyr Ile His
1               5                   10
<210>  34
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2F5 VH CDR2
<400>  34
Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Leu Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  35
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 2F5 VH CDR3
<400>  35
Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  36
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 4E12 VL CDR1
<400>  36
aaggccagtc agaatgtgaa cactaatgta gcc                                    33
<210>  37
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 4E12 VL CDR2
<400>  37
tcggcatcct cccggtgcag t                                                 21
<210>  38
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 4E12 VL CDR3
<400>  38
cagcaatatc acagctttcc gctcacg                                           27
<210>  39
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 4E12 VH CDR1
<400>  39
ggcgacacct tcaccaactc ctggataggc                                        30
<210>  40
<211>  51
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 4E12 VH CDR2
<400>  40
gatatttttc ctgggagtgg tcatactaac tacaatgaga agttcaagaa c                51
<210>  41
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  nucleotide sequence of 4E12 VH CDR3
<400>  41
gagaattatg cctggtttgc ttat                                              24
<210>  42
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 4E12 VL CDR1
<400>  42
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn Val Ala
1               5                   10
<210>  43
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 4E12 VL CDR2
<400>  43
Ser Ala Ser Ser Arg Cys Ser
1               5
<210>  44
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 4E12 VL CDR3
<400>  44
Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr
1               5
<210>  45
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 4E12 VH CDR1
<400>  45
Gly Asp Thr Phe Thr Asn Ser Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  46
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 4E12 VH CDR2
<400>  46
Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>  47
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  amino acid sequence of 4E12 VH CDR3
<400>  47
Glu Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1               5
<---