Градиентный латеральный проточный иммуноанализ хорионического гонадотропина человека

УДК 616:612.017.1

ГРАДИЕНТНЫЙ ЛАТЕРАЛЬНЫЙ ПРОТОЧНЫЙ

ИММУНОАНАЛИЗ ХОРИОНИЧЕСКОГО

ГОНАДОТРОПИНА ЧЕЛОВЕКА

К.В. Серебренникова1*, Ж.В. Самсонова1, А.П. Осипов2

Предложен новый формат экспресс-метода визуального полуколичественного анализа, основанный на принципе градиентного латерального проточного им-муноанализа с наночастицами золота в качестве метки. В аналитической зоне тест-устройства сформировано несколько тестовых линий с увеличивающейся концентрацией иммобилизованных на мембране специфических антител. Полуколичественная оценка содержания антигена проводится визуально путем подсчета числа видимых окрашенных полос в аналитической зоне. На примере гормона хо-рионического гонадотропина человека показана возможность бесприборного полуколичественного определения антигена в области от 50 до 10 000 мЕд/мл в течение 5-10 мин в пяти диапазонах концентраций: менее 100 мЕд/мл, 100-300, 300-500, 500-800 и более 800 мЕд/мл. Разработанный полуколичественный экспресс-метод позволяет визуально по числу окрашенных линий определять диапазон концентраций хорионического гонадотропина человека в моче в целях диагностирования беременности и ее протекания.

Ключевые слова: градиентный латеральный проточный иммуноанализ, хорионический гонадотропин человека, наночастицы золота.

В настоящее время в клинической диагностике, мониторинге окружающей среды, пищевой промышленности и др. областях возрастает потребность в простых и быстрых методах анализа и тест-системах, не требующих использования дорогостоящих приборов для регистрации результатов. К таким методам относится латеральный проточный иммуноанализ (ЛПИА), известный также как иммунохрома-тографический анализ [1]. ЛПИА проводится с помощью специальных тест-полосок с заранее импрегнированными в них компонентами, которые активируются при нанесении жидкого образца. В результате в тестовой зоне появлет-ся окрашенная линия, интенсивность которой пропорциональна концентрации определяемого антигена в растворе. По сравнению с обычными аналитическими методами, ЛПИА обладает рядом преимуществ, такими как низкая стоимость, быстрота и простота проведения, а также возможность визуальной по принципу «да-нет» или приборной количественной оценки результатов [2]. В последние годы в ЛПИА предлагаются новые форматы аналитических устройств, которые позволяют определять не только одно или несколько соединений по принципу «да-нет», но и проводить количественный анализ по

измерению с помощью отражательного фотометра интенсивности окраски одной или нескольких тестовых полос, каждая из которых содержит специфические антитела против отдельного определяемого антигена [3].

В настоящей работе рассмотрен новый формат ЛПИА, обеспечивающий быстрое полуколичественное определение биомаркеров белковой природы без использования специальных приборов [4]. Основное отличие градиентного ЛПИА от традиционного состоит в формировании в аналитической зоне устройства нескольких параллельных тестовых линий с разной концентрацией специфических антител, возрастающей от линии к линии. Первоначально принцип проведения градиентного анализа был сформулирован и реализован нами ранее на примере аналогичной системы анализа с тонкой проточной кюветой, в которой находилась бумажная мембрана с ковалентно фотоиммоби-лизованными антителами в виде нескольких линий с увеличивающейся концентрацией антител [5]. Полуколичественную оценку результатов анализа проводили путем соотнесения числа проявившихся полос на мембране в тестовой зоне с диапазоном концентраций определяемого аналита. В качестве модельной системы для раз-

работки градиентного ЛПИА был выбран хори-онический гонадотропин человека (ХГЧ) - гормон, известный маркер беременности, широко использующийся при ее самодиагностике.

Экспериментальная часть

В работе использовали химические реактивы фирмы «Sigma» (США), неорганические соли фирмы «Helicon» (Россия), пять клонов моно-клональных антител к ХГЧ фирмы «Диатех-Эм» (Россия) и «Биалекса» (Россия), ХГЧ (ФГУП «Московский эндокринный завод») и мембраны фирмы «MDI» (Индия). В работе использовали 10 мМ фосфатный солевой буфер с рН 7,27,4 (ФБС) и ФБС, содержащий 0,1% Твин-20 (ФБСТ). Стандартные растворы ХГЧ готовили в ФБСТ или моче, не содержащей ХГЧ, из исходного раствора ХГЧ с концентрацией 500 МЕ/мл.

Синтез коллоидного золота размером 30 нм проводили по методу Френса [6]. Полученные наночастицы золота были охарактеризованы спектрально в диапазоне 400-900 нм на спектрофотометре «Thermo Scientific Multiscan GO» (США) и методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), «JEOL JEM-2100» (Япония).

Для получения специфических моноклональ-ных антител против ХГЧ, меченных наночасти-цами золота, раствор коллоидного золота (10 мл) доводили до рН 7,0-7,5, добавляли 1 мл антител с концентрацией 10 мкг/мл. Смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляли БСА, сахарозу и азид натрия до конечных концентраций 0,1; 10 и 0,01% соответственно. Для удаления несвязавшихся бел-

ков конъюгат центрифугировали (11000 g, 20 мин при 4 °С). Супернатант удаляли, а осадок перерастворяли в определенном объеме ФБС, содержащем 0,1% БСА, 10% сахарозы и 0,01% азида натрия. Полученный раствор с конъюга-том наносили на стекловолоконную мембрану для конъюгата РТ-Я5 («МБ1», Индия) размером 4^4 мм в концентрации, соответствующей А520 = 2 опт. ед., и высушивали при комнатной температуре.

Тест-полоску для ЛПИА формировали на узкой пластиковой подложке (4^80 мм) последовательным наклеиванием мембранных носителей для образца, конъюгата, аналитической и впитывающей мембраны («МЭ1», Индия), согласно схеме, представленной на рис. 1.

В тестовую зону аналитической нитроцеллю-лозной мембраны наносили растворы специфических антител с подобранными возрастающими концентрациями в диапазоне от 0,1 до 1,0 мг/мл с помощью автоматического диспен-сера «БюМОиапй 3000, БюЭог ХУ2 3050» («БюВоЪ», США). В качестве контрольной зоны на тест-полоске использовали белок А. Полоски высушивали в течение 24 ч при комнатной температуре и хранили при этой же температуре в герметичной упаковке. Раствор конъюгата специфических антител, меченных наночастицами золота, наносили на мембрану для конъюгата РТ-Я5 и высушивали при комнатной температуре. Для проведения градиентного ЛПИА на мембрану для образца тест-полоски наносили 120 мкл стандартных растворов с определенными концентрациями ХГЧ в ФБСТ или моче, не содержащей ХГЧ. Через 15 мин проводили

Рис. 1. Схема тест-полоски для проведения градиентного ЛПИА

визуальную и полуколичественную оценку результатов.

Результаты и обсуждение

В качестве модельного белка для проведения ЛПИА был выбран хорионический гонадотро-пин человека, вырабатываемый плацентой сразу после имплантации. Имплантация происходит в среднем через 9 дней после овуляции (диапазон составляет 6-12 дней) или примерно за 5 дней до начала менструации. Уровень ХГЧ выявляется в крови уже через 2-3 дня, а в моче - через 3-4 дня после имплантации. Уровень ХГЧ, превышающий 25 мЕд/мл, свидетельствует о наличии беременности. Каждые 72 ч уровень ХГЧ увеличивается в среднем вдвое и достигает пика в первые 8-11 недель беременности. До 15-й недели уровень ХГЧ снижается, а затем остается на постоянном уровне до конца срока беременности [7].

В качестве метки специфических антител для дальнейшего использования в иммуноанализе были получены коллоидные наночастицы золота. Анализ спектров поглощения (пик в области 530 нм) и результатов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) позволил сделать вывод о сферической форме наночастиц золота (средний диаметр 30±1,5 нм). Путем титрования было установлено, что для получения стабильных конъюгатов антител с золотом оптимальны растворы антител с рН 7,0-7,5 и минимальной концентрацией антител, необходимой для получения стабильного конъюгата (10-15 мкг/мл). В работе были использованы пять пар моно-клональных антител против ХГЧ. Подходящую пару антител (наилучшую комбинацию), проявляющую наиболее высокую чувствительность в анализе, выбирали путем изучения различных комбинаций имеющихся антител.

Для реализации метода градиентного ЛПИА в аналитической зоне мембраны сорбционно

иммобилизовали антитела в виде поперечных линий с увеличивающейся концентрацией антител. При нанесении образца на тест-полоску раствор взаимодействовал с конъюгатом нано-частиц золота с антителами. Следует учесть, что ввиду избытка антител на поверхности золотых наночастиц определяемый антиген должен находиться преимущественно в виде иммуноком-плекса. Дальнейшее образование иммуноком-плексов на носителе характеризуется константой равновесия между свободными антителами на носителе и свободным антигеном, поэтому по достижении зон с иммобилизованными антителами при образовании более сложного сэндвич-комплекса на мембране окрашенная линия появляется лишь при достижении и превышении определенной концентрации антител на носителе. На рис. 2 показаны результаты эксперимента при нанесении на тест-полоску приготовленных стандартных растворов ХГЧ в моче с градиентно иммобилизованными антителами в виде пяти линий. Область определяемых концентраций разработанной тест-системы составила 50-10 000 мЕд/мл, время анализа не превышало 10 мин. Полуколичественную оценку содержания антигена в узком диапазоне концентраций проводили визуально путем подсчета числа видимых окрашенных полос в аналитической зоне, при этом число (Ы) возможных диапазонов определяемых концентраций, где N > 2, соответствовало числу нанесенных линий антител (Ы - 1). В диапазоне концентраций 50-100 мЕд/мл в аналитической зоне проявлялись одна-две окрашенные линии, при концентрации 250-400 мЕд/мл видны три окрашенные линии, при концентрации 500-600 мЕд/мл - четыре окрашенные линии, а при концентрации выше 800 мЕд/мл - пять окрашенных линий.

Таким образом, в результате проведенного исследования был показана возможность использования предложенного нами метода градиентного ЛПИА для определения ХГЧ

IIII

Концентрация, мЕд/мл Рис. 2. Градиентный ЛПИА в образцах мочи с разной концентрацией ХГЧ

(модельного гормона, маркера беременности) использован для создания систем визуального путем подсчета числа окрашенных линий, со- самоконтроля протекания беременности без ответствующих разным диапазонам концентра- использования приборной оценки результатов ции ХГЧ в моче. Данный подход может быть анализа.

Работа выполнена в соответствии с госзаданием Минобрнауки «Организация проведения научных

исследований», соглашение №16.6548.2017/БУ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bahadir E.B., Sezgintürk M.K. // Trends Anal. Chem. 2016. Vol. 82. P. 286.

2. ОсиповА.П., СамсоноваЖ.В., Кондаков С.Э. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. Т. 56. № 3. С. 164.

3. Safenkova I.V., Pankratova G.K., Zaitsev I.A., Varit-sev Yu.A., Vengerov Yu.Yu., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // Anal. Bioanal. Chem. 2016. Vol. 408. N 22. P. 6009.

4. Осипов А.П., Григоренко В.Г., Андреева И.П., Кондаков С.Э. // Пат. РФ № 2510510.

5. Gorovitz B.M., Osipov A.P., Egorov A.M. // J. Immunol. Methods. 1993. Vol. 193. P. 157

6. Frens G. // Nature Phys. Sci. 1973. Vol. 241. P. 20.

7. Visconti K., Zite N. // Clin. Obstet. Gynecol. 2012. Vol. 55. P. 410.

Поступила в редакцию 10.06.17

GRADIENT LATERAL FLOW IMMUNOASSAY OF HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN

K.V. Serebrennikova1*, J.V. Samsonova1, A.P. Osipov2

A new format of visual semi-quantitative express method, which is based on the principle of gradient lateral flow immunoassay with gold nanoparticles as a label was proposed. Several test lines with increasing concentration of specific antybodies immobilized on the membrane were formed in the analytic zone of the test strip. Semiquantitative analysis of antigen was carried out visually by counting colored lines in analytic zone. As a model antigen the human chorionic gonadotropin was chosen and the possibility of semi-quantitative determination of analyte without any device in the range from 50 to 10000 mU/mL during 5-10 minutes in five concentration ranges: less than 100 mU/mL; 100-300; 300-500; 500-800 and more than 800 mU/mL was shown. The developed semi-quantitative express method allows to determine the concentration range of human chorionic gonadotropin in urine by number of colored lines for diagnosis of pregnancy and its course.

Key words: gradient lateral flow immunoassay; human chorionic gonadotropin; gold nanoparticles.

Сведения об авторах: Серебренникова Ксения Вячеславовна - аспирант кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (ksenijasereb@mail.ru); Самсонова Жанна Васильевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (jvsamsonova@gmail.com); Осипов Александр Павлович - ст. науч. сотр. кафедры ФНСиВТМ Национального исследовательского технологического университета «МИСиС», канд. хим. наук (aposipov@mail.ru).