АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ В МЕДЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ В РТ

ЗАКОНОМЕРНОСТИ СТАНОВЛЕНИЯ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ СЕРДЦА У МЕЛКИХ ЛАБОРОТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ В ПРОЦЕССЕ ЕСТЕСТВЕННОГО РОСТА И

РАЗВИТИЯ

Вахитов И.Х., Волков А.Х., Чинкин С.С., Сафин Р.С.

Резюме

Проведены исследования по изучению динамики становления сократительной функции сердца мелких лабораторных животных. Экспериментально установлено, что у белых беспородных лабораторных крыс с первого дня жизни и до 70-дневного возраста показатели сердца изменяются гетерохронно. Периоды наибольшего изменения частоты сердечных сокращений крыс чередуются с этапами значительных прироста ударного объема крови. В механизмах регуляции ударного объема крови у крыс симпатическое регуляторное влияние проявляется значительно раньше, чем парасимпатическое. В дальнейшем, по мере естественного роста и развития животных их соотношение несколько изменяется: более выраженное симпатическое регуляторное влияние на УОК сохраняется вплоть до 70-дневного возраста, тогда как с 8-недельного возраста парасимпатическое влияние существенно снижается.

REGULARITIES OF FORMATION OF THE REDUCED FUNCTION OF THE HEART IN SMALL LABORATORY ANIMALS IN THE PROCESS OF NATURAL GROWTH AND

DEVELOPMENT

Vakhitov I.Kh., Volkov A.Kh., Chinkin S.S., Safin R.S.

Summary

Conducted research on the dynamics of the formation of the contractile function of the heart of small laboratory animals. It was established experimentally that in white outbred laboratory rats from the first day of life and up to 70 days of age, the heart indices change heterochronically. The periods of the greatest change in the heart rate of rats alternate with stages of a significant increase in stroke volume. In the mechanisms of regulation of stroke blood volume in rats, the sympathetic regulatory effect appears much earlier than the parasympathetic one. Later, as the animals grow and develop naturally, their ratio changes somewhat: a more pronounced sympathetic regulatory effect on the CRI lasts up to the age of 70 days, whereas from 8 weeks of age the parasympathetic effect decreases significantly.

DOI 10.31588/2413-4201-1883-238-2-50-57 УДК 619:615.33.637

АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ В МЕДЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ В РТ

*Галяутдинова Г.Г. - к.б.н., *Босяков В.И. - вед. инженер, *Егоров В.И. - к.б.н., Юсупова Г.Р. - д.б.н., Аминова Л.Р. - студент

*ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана»

Ключевые слова: антибиотики, тетрациклиновая группа, мед, высокоэффективная жидкостная хроматография

Key words: antibiotics, tetracycline group, honey, high performance liquid chromatography

Пчелиный мед полезный, много- компонентный, уникальный продукт, яв-

50

ляющийся альтернативой сахара и сахаро-содержащих продуктов как более здоровый продукт питания. Однако мед может быть полезным лишь в случае натуральности и абсолютной доброкачественности [3, 7, 9]. В натуральном меде не должны содержаться вещества, не свойственные его природному составу: остатки лекарственных препаратов. Для стимулирования пчелиных семей, профилактики и борьбы с болезнями пчел широко используют антибиотики. Их остаточные количества, по имеющимся сведениям, переносятся пчелами в мед и длительное время сохраняются. Такой продукт может вызывать аллергические реакции, нарушать баланс кишечной микрофлоры.

На рынках нашей страны мед реализуют практически без исследования на наличие антибиотиков. Отсутствие необходимого контроля нередко способствует необоснованному использованию различных антибиотиков в пчеловодстве и значительному превышению предусмотренных доз препаратов. Поэтому крайне важно контролировать остаточное содержание антибиотиков, использованных для обработки и лечения пчел. Но выполнить это требование крайне сложно. Необходимо высокочувствительное оборудование, с возможностью проверки и обнаружения для антибиотиков тетрациклиновой группы - менее 10 мкг/кг меда.

На сегодняшний день наиболее распространенным методом определения антибиотиков в меде является иммунофер-ментный [4, 6]. Этот метод отличается недостаточной специфичностью и воспроизводимостью, плохо поддается стандартизации. Одним из наиболее перспективных методов оптимизации качественного и количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-детектированием [5, 8, 10]. Однако существенным недостатком данного способа является использование дорогостоящего и сложного в освоении жидкостного хроматографа с масс-детектором, что затрудняет широкое применение известного способа анализа.

Нами на базе ФГБНУ «Казанского

Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности» разработан легко воспроизводимый, прецизионный способ выделения и концентрирования антибиотиков тетрацикли-новой группы в меде с последующим их количественным определением методом обращено фазовой ВЭЖХ [1, 2].

В нашей республике нет обязательного контроля над количеством антибиотиков в меде. В связи с чем, перед нами была поставлена цель апробировать разработанный нами способ одновременного определения антибиотиков тетрациклино-вой группы методом ВЭЖХ на образцах меда, поступивших из различных районов республики Татарстан.

Материал и методы исследований. Исследования проводились на жидкостном хроматографе Agilent 1260 Infiniti. Разделение осуществлялось на колонке (250:4 мм) Reprosil ODS-AC 18 (5 мкм) в режиме градиентного элюирования подвижной фазы. Концентрирование и очистку экстрактов проводили методом ТФЭ, позволяющий эффективно устранять мешающее влияние компонентов матрицы без использования большого количества органических растворителей. Контролем служил мед искусственно затравленный стандартными растворами антибиотиков согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 в концентрации для тетрациклиновой группы (тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, хлортетрациклин) - 0,01 мг/кг.

Опытные образцы меда - 5 проб меда из 5 районов республики Татарстан (Аксубаевский, Нурлатский, Буинский, Тюлячинский, Тетюшский).

Результаты исследований. Принцип метода определения антибиотиков тетрациклиновой группы (тетрациклин гидрохлорид, окстетрациклин, хлортет-рациклин) заключается в следующем. Навеску меда 2 г помещали в полипропиленовую тубу для центрифугирования и растворяли в 10 мл буферного раствора Mcllvaine. Раствор перемешивали 20 мин на шейкере.

Затем тубу помещали в центрифугу на 10 мин при 3000 об/мин. Раствор

фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Полученный фильтрат загружали в картридж Oasis HLB 3 см х 60 мг со скоростью 2 капли в секунду. Предварительно картридж конденцировали 3 мл метанола и 3 мл

воды. Образец промывали 15 мл воды, элюировали 6 мл метанола. Собранный элюат выпаривали в токе азота досуха и перерастворяли в 5 мл 0,1% водного раствора муравьиной кислоты и пропускали через мембранный фильтр.

Рисунок 1 - Выделенные пики антибиотиков окситетрациклина, тетрациклина гидрохлорида и хлортетрациклина в меде при искусственной затравке в дозе 0,01 мг/кг с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infiniti с УФ-детектором. Колонка Reprosil ODS -AC 18 250*4 мм, температура колонки 250С, скорость потока 0,5 мл/мин, элюент - ацетонитрил, метанол, водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0), детектирование при 254 нм

В ходе работ подобрана оптимальная мобильная фаза на основе ацетонит-рила/метанола/водного раствора КН2РО4 (0,05М, рН=6,0) (15:45:40 у/у/у) с включением 0,1 М раствора соли динатриевой этилендиаминтетрауксусной кислоты

водной части подвижной фазы для по-

вышения эффективности разделения пиков хроматограмм в образцах и повышения чувствительности анализа.

При использовании данного режима хроматографирования наблюдали отсутствие асимметрии пиков и хвостов.

Таблица 1 - Данные хроматограммы при определении антибиотиков окситетрациклина, тетрациклина гидрохлорида и хлортетрациклина в меде при искусственной затравке в дозе 0,01 мг/кг на длине волны 254 нм_

Время Тип Ширина Площадь, Площадь, Название антибиотика

выхода пика (мин) [mAU*s] %

пика

4.069 VV 0.1483 214.69307 14.8401 Окситетрациклин

4.331 VB 0.1534 149.34583 10.3231 Тетрациклин гидрохлорид

4,642 BB 0.6087 104.27613 7.2078 Хлортетрациклин

В таблице 1 представлена расшифровка хроматограммы с указанием времени выхода, типа, ширины и площади (в

абсолютном и процентном отношении) пиков идентифицированных антибиотиков (окситетрациклина, тетрациклина гидро-

хлорида, хлортетрациклина).

На рисунках 2-6 представлены хро-матограммы образцов меда, поступивших из различных районов РТ и исследованные

на наличие остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1260 Infiniti с УФ-детектором.

Рисунок 2 - Хроматограмма образца меда из Аксубаевского района РТ. Колонка Reprosil ODS —AC 18 250*4 мм, температура колонки 250С, скорость потока 0,5 мл/мин, элюент - ацетонитрил, метанол, водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0), детектирование при 254 нм

В диапазоне идентификации антибиотиков тетрациклиновой группы в меде из Аксубаевского района методом ВЭЖХ

(рис. 2) при соблюдении контрольных условий характерных пиков не зафиксировано.

ацетонитрил, метанол, водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0), детектирование при 254 нм

В диапазоне идентификации антибиотиков тетрациклиновой группы в меде из Буинского района методом ВЭЖХ

(рис. 3) при соблюдении контрольных условий характерных пиков не зафиксировано.

ODS -AC 18 250*4 мм, температура колонки 250С, скорость потока 0,5 мл/мин, элюент -ацетонитрил, метанол, водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0), детектирование при 254 нм

В диапазоне идентификации ВЭЖХ (рис. 4) при соблюдении

антибиотиков тетрациклиновой группы в контрольных условий характерных пиков

меде из Нурлатского района методом не зафиксировано.

ODS -AC 18 250*4 мм, температура колонки 250С, скорость потока 0,5 мл/мин, элюент -ацетонитрил, метанол, водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0), детектирование при 254 нм

В диапазоне идентификации антибиотиков тетрациклиновой группы в меде из Тетюшского района методом ВЭЖХ

(рис. 5) при соблюдении контрольных условий характерных пиков не зафиксировано.

Рисунок 6 - Хроматограмма образца меда из Тюлячинского района РТ. Колонка Reprosil ODS —AC 18 250*4 мм, температура колонки 250С, скорость потока 0,5 мл/мин, элюент - ацетонитрил, метанол, водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0), детектирование при 254 нм

В диапазоне идентификации антибиотиков тетрациклиновой группы в меде из Тюлячинского района методом ВЭЖХ (рис. 6) при соблюдении контрольных условий характерных пиков не зафиксировано. На хроматограммах 2-6 отражены пики состава подвижной фазы и остаточные количества органических соединений свойственные меду. По времени выхода данные пики не совпадают с временами выхода искомых антибиотиков, что доказывает их отсутствие в исследуемых образцах. На основании проведенных анализов в представленных образцах меда из Аксубаевского, Буинского, Тетюшс-кого, Нурлатского и Тюлячинского районов присутствие лекарственных препаратов не обнаружено.

На хроматограммах 2-6 не выявлены характерные пики свойственные антибиотикам тетрациклиновой группы, что доказывает отсутствие антибиотических средств в исследуемых образцах меда.

Заключение. Разработана схема пробоподготовки одновременного опреде-

ления антибиотиков тетрациклиновой группы в меде с последующей индикацией методом ВЭЖХ, включающая жидкостную и твердофазную экстракции.

Метод одновременного анализа антибиотиков тетрациклиновой группы в меде позволяет определить их на уровне МДУ (0,01 мг/кг) согласно СанПиН 2.3.2.1078-01. Разработанный ВЭЖХ метод сочетанного определения антибиотиков окситетрациклина, тетрациклина гидрохлорида и хлортетрациклина в меде апробирован на продукции пчеловодства из 5 районов республики Татарстан. Полученные результаты исключают возможность контаминации меда антимикробными средствами. Однако для получения экологически чистого меда необходим мониторинг состояния окружающей среды, исключение использования химических высокотоксичных и лекарственных препаратов. Для достижения этой цели необходима государственная поддержка пчеловодства как одной из развивающихся и перспективной отрасли сельского хозяйства. Разработанная методика при условии

внесения ее в ГОСТ может применяться в различных производственных лабораториях и лабораториях контролирующих организаций.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Галяутдинова, Г.Г. Модификация метода определения антибиотика тетрациклина гидрохлорида в меде с использованием ВЭЖХ / Г.Г. Галяутдинова, Н.Г. Шангараев, В.И. Егоров // Ветеринарный врач. - 2016. - №6. - С.24-27.

2. Галяутдинова, Г.Г. Идентификация антибиотика тетрациклина гидрохлорида в меде методом ВЭЖХ с УФ, ФЛД и МС детекторами / Г.Г. Галяутдинова, В.И. Босяков, А.М. Сайфутдинов, В.И. Егоров // Матер. науч.-практич.конф. «Актуальные проблемы аграрной науки Республики Татарстан», Казань 28 июня 2018 г. - С. 161-168.

3. ГОСТ Р 53601-2009. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. -«Стандартинформ», 2009. - 23 с.

4. ГОСТ 53912-2010. Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков. - М., 2011. - 6с.

5. ГОСТ Р 54655-2011. Мед натуральный. -Стандартинформ, 2012. - 14 с.

6. ГОСТ 31694-2012. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детек-тором.-«Стандартинформ».-2012.-20с.

7. Звягина, А.П. Пищевая ценность сахара и меда / А.П. Звягина, Н.М. Алтухов // Пчеловодство. - 2010. - №1. - С.52-53.

8. МУ 3049-84. Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства.-«Стандартинформ».-1984. - 24с.

9. Романов, А.В. Определение состава и качества меда методом ВЭЖХ / А.В. Романов // автореф. дис. ... к-та хим. наук. -Москва, 2009. - 25с.

10. Singh, S.P. Validation of an analytical methodology for determination of tetracyclines residues in honey by UPLC - MS / MS detection Indian Journal of Natural Products and Resources / S.P. Singh // Natural Products and Resources. - 2015. - Vol 6(4). - C. 293-298.

АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ В МЕДЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ В РТ

Галяутдинова Г.Г., Босяков В.И., Егоров В.И., Юсупова Г.Р., Аминова Л.Р.

Резюме

Разработан алгоритм пробоподготовки и отобраны условия хроматографирования одновременного определения антибиотиков (тетрациклина гидрохлорида, окситетрациклина, хлортетрациклина) в меде на уровне МДУ (0,01 мг/кг) согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 при искусственной затравке с использованием жидкостного хроматографа «А§Пеп1;1260 Хпйшй», оснащенного термостатом колонок, градиентным насосом и ультрафиолетовым детектором.

По результатам проведенных исследований установлено, что наиболее оптимальным условием одновременного определения антибиотиков (окситетрациклин, тетрациклин гидрохлорид, хлортетрациклин) в меде методом ВЭЖХ с УФ детектированием являлась длина волны 254 нм, скорость потока - 0,5 мл/мин, температура колонки 250С. При данных условиях установлено время удержания антибиотиков, которое составило для окситетрациклина - 4,069 мин, тетрациклина гидрохлорида- 4,331 мин, хлортетрациклина-4,642 мин.

Разработанный ВЭЖХ метод одновременного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в меде апробирован на продукции пчеловодства из 5 районов

республики Татарстан. Полученные результаты исключают возможность контаминации меда антимикробными средствами.

APPROBATION OF A DEVELOPED METHOD FOR DETERMINING ANTIBIOTICS OF A TETRACYCLINE GROUP IN HONEY BY METHOD OF HPLC IN RT

Galyautdinova G.G., Bosyakov V.I., Egorov V.I., Yusupova, G. R., Aminova L. R.

Summary

An algorithm is developed for sample preparation and selected conditions chromatographically the simultaneous determination of antibiotics (tetracycline hydrochloride, oxytetracycline, chlortetracycline) in honey at the level of the MRL (0.01 mg/kg) according to SanPiN 2.3.2.1078-01 in artificial condition, using a liquid chromatograph "Agilent1260 Infiniti", equipped with a thermostat column, gradient pump and UV detector.

According to the results of the studies it was found that the most optimal condition for the simultaneous determination of antibiotics (oxytetracycline, tetracycline hydrochloride, chlortetracycline) in honey by HPLC with UV detection was the wavelength of 254 nm, flow rate -0.5 ml/min, column temperature 250C. Under these conditions, the retention time of antibiotics, which was for oxytetracycline - 4,069 min, tetracycline hydrochloride - 4,331 min, chlortetracycline - 4,642 min.

The developed HPLC method of simultaneous determination of tetracycline antibiotics in honey was tested on bee products from 5 districts of the Republic of Tatarstan. The obtained results exclude the possibility of honey contamination with antimicrobial agents.

DOI 10.31588/2413-4201-1883-238-2-57-61 УДК 619:616.1

ДИНАМИКА МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ СЕРДЦА ПРИ ПАТОЛОГИИ МИОКАРДА У КОШЕК ПОРОДЫ МЕЙН КУН

Гирфанов А.И. - к.в.н., доцент, Ахмадеева К.Э. - аспирант ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: кошки, кардиомиопатия, патогенез, патология сердца, эхокардиография

Keywords: cats, cardiomyopathy, pathogenesis, heart disease, echocardiography

В настоящее время в современной отечественной и иностранной литературе имеется большое количество данных посвященных исследованию различных структур организма продуктивных животных [1, 2], в то время как работы, посвященные декоративным животным не так многочисленны [5]. Особенно мало в отечественной литературе трудов, посвященных кардиомиопатии у кошек. В связи с этим мы поставили перед собой цель изучить динамику изменений структур сердца при гипертрофической кардиомиопатии у кошек породы Мейн Кун.

Гипертрофическая кардиомиопатия

является одним из наиболее часто встречающихся заболеваний сердца у кошек. Это заболевание характеризуется аномальным утолщением одного или нескольких участков стенок сердца, обычно левого желудочка. У кошек это заболевание чаще встречается среди таких пород, как рэ-гдолл, мейн-кун, восточных пород (гималайская, бирманская, сфинкс, персидская), но также часто диагностируется у домашних короткошерстных кошек. У рэдголлов и мейн-кунов был выявлен специфический генетический дефект, связанный с сократительным белком: миозин-связывающим белком [7]. Влияние утолщения стенки