ИНГИБИТОРЫ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ
METASTASIS INHIBITORS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 61/808966, поданной 5 апреля 2013 года, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к композициям и готовым формам, включающим в себя антитела, молекулы нуклеиновых кислот, полинуклеотиды и пептиды, и способам их применения для профилактики и лечения метастатического рака, особенно для уменьшения, блокирования или ингибирования пролиферации раковых клеток, метастазирования и/или ангиогенеза.
ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
Содержание текстового файла, представленного настоящим в электронном виде, включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте: копия списка последовательностей машиночитаемого формата (имя файла: BMRK_006_01WO_SubSeqList_ST25.txt, зарегистрированная дата: 12 мая 2014 года, размер файла 58 килобит).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Белок MARCKS (белок, содержащий повышенное количество миристоилированных остатков аланина) представляет собой часто встречающуюся мишень фосфорилирования протеинкиназой C (PKC) (Li et al., Journal of Biological Chemistry 276; 40982 (2002)). MARCKS имеет три эволюционно консервативных области (Aderem et al., Nature 1988; 332:362-364; Thelen et al., Nature 1991; 351:320-322; Hartwig et al., Nature 1992; 356:618-622; Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271:18797-18802): N-конец, домен сайта фосфорилирования (или PSD; также известный как эффекторный домен) и домен множественной гомологии 2 (MH2). N-конец, альфа-аминокислотная последовательность, включающая в себя 24 аминокислотных остатка, вместе с молекулой миристиновой кислоты, присоединенной посредством амидной связи к N-концевому глициновому остатку, участвует в связывании MARCKS с клеточными мембранами (Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271:18797-18802) и, возможно, с кальмодулином (Matsubara et al., J Biol Chem 2003; 278:48898-48902). Данная последовательность из 24 аминокислот известна как пептид MANS. Пептид MANS и родственные пептиды раскрыты в Патентах США №№ 7265088; 7529926; 7544772; 8492518; 8501911; 7918293870 и 8563689; содержание каждого из которых включено посредством ссылки во всей своей полноте.
В данной области существует потребность в новой, безопасной терапии, направленной на профилактику, лечение и ингибирование рака, включая ингибирование метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухоли и/или ангиогенеза. Настоящее изобретение решает вопросы, связанные с данными и другими потребностями.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способам и композициям, пригодным для профилактики или лечения рака. В одном варианте осуществления предоставлены способы и композиции для ингибирования метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухоли или ангиогенеза. В одном варианте осуществления предоставлены способы и композиции для предотвращения и ингибирования метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухоли или ангиогенеза, включая ингибирование белка, содержащего повышенное количество миристоилированных остатков аланина (MARCKS). В одном варианте осуществления композиции включают в себя соединения, ингибирующие MARCKS, включая пептиды, полипептиды, антитела или их фрагменты, и молекулы нуклеиновых кислот, такие как антисмысловые полинуклеотиды, аптамеры, малые интерферирующие РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и короткая шпилечная РНК (shRNA). «Молекулы нуклеиновых кислот, ингибирующие MARCKS», как используется в данном документе, относится к полинуклеотидам или молекулам нуклеиновых кислот, таким как siRNA, miRNA, shRNA или антисмысловые полинуклеотиды, которые подавляют экспрессию и/или функцию MARCKS. В одном варианте осуществления композиции включают в себя один или более MARCKS-связанных пептидов. В другом варианте осуществления MARCKS-связанные пептиды соответствуют MH2-домену MARCKS. В другом варианте осуществления пептиды представляют собой пептиды, связанные с миристоилированной N-концевой последовательностью (пептид MANS, который представляет собой фрагмент MARCKS из 24 аминокислот) (т.е., «MANS-связанные пептиды»). В дополнительном варианте осуществления MANS-связанные пептиды выбраны из группы, состоящей из: пептида MANS; незамещенных фрагментов MANS, которые содержат четыре или более аминокислот и которые включают в себя такую же последовательность, как и обнаруженная в N-концевой аминокислотной последовательности в пептиде MANS; пептидов, включающих в себя последовательность, по существу идентичную последовательности, обнаруженной в пептиде MANS или фрагменте пептида MANS; пептида MANS или фрагментов пептида MANS с идентичной или по существу идентичной аминокислотной последовательностью, как у пептида MANS, которые представляют собой N-конец, миристоилированный, или N-конец, ацилированный, например, ацетильной группой; и пептида MANS или фрагментов пептида MANS с идентичной или по существу идентичной аминокислотной последовательностью, как у пептида MANS, которые представляют собой химически модифицированный C-конец. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды представляют собой химически модифицированные как N-конец, так и C-конец. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, представляют собой антитела или их фрагменты. В одном варианте осуществления антитело или его фрагмент ингибирует функции белка MARCKS. В другом варианте осуществления антитело или его фрагмент связывается с N-концом белка MARCKS или MH2-последовательностью белка MARCKS. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что применение различных типов соединений, ингибирующих MARCKS, демонстрирует ингибирующее действие на миграцию раковых клеток in vitro и ингибирует метастазирование in vivo. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, демонстрируют ингибирующее действие на миграцию клеточных линий агрессивного рака. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, ингибируют метастазирование раковых клеток в опухоль у млекопитающего. В дополнительном варианте осуществления опухоль представляет собой солидную опухоль. В другом варианте осуществления опухоль представляет собой несолидную опухоль. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, ингибируют метастазирование раковых клеток, ассоциированных с лимфомой или лейкозом.
В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, включают в себя полинуклеотиды, ингибирующие MARCKS, или молекулы нуклеиновых кислот, ингибирующие MARCKS. В дополнительном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой полинуклеотиды антисмысловой РНК, siRNA, shRNA или microRNA, которые ингибируют экспрессию и/или функцию MARCKS. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой имитаторы белков или полинуклеотидов, которые регулируют экспрессию MARCKS, такие как имитаторы miR21.
В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой MARCKS-связанные или MANS-связанные пептиды. В другом варианте осуществления MARCKS-связанные пептиды соответствуют N-концевому миристоилированному домену MARCKS. Таким образом, в одном варианте осуществления, MARCKS-связанные пептиды представляют собой MANS-связанные пептиды. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды и определенные химически модифицированные MANS-связанные пептиды блокируют миграцию клеточных линий агрессивного рака. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды применяют, чтобы оказать ингибирующее действие на метастазирование раковых клеток. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, демонстрируют блокирующее действие на метастазирование раковых клеток in vivo. Участки ингибирования метастатической болезни in vivo включают по меньшей мере легочную ткань, ткань сердца, ткань селезенки, ткань кишки и ткань диафрагмы. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды применяют для лечения или профилактики метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухолевых клеток или ангиогенеза.
В одном аспекте предоставлены композиции и способы лечения или профилактики рака, включающие введение соединения, ингибирующего MARCKS, в раковые клетки или клетки, которые играют роль в развитии, поддержании, пролиферации или метастазировании раковых клеток. В одном варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток, включающий введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества соединения, ингибирующего MARCKS. В одном варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток, включающий введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества MANS-связанного пептида. В другом варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток в опухоли, включающий введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 231 (включительно), SEQ ID NO: 234 и SEQ ID NO: 235; при этом N-концевая и/или C-концевая аминокислота пептидной последовательности является необязательно химически модифицированной. В другом варианте осуществления предоставлен способ лечения рака у нуждающегося в этом больного, при этом способ включает введение больному терапевтически эффективного количества MANS-связанного пептида. В другом варианте осуществления предоставлен способ лечения рака у нуждающегося в этом больного, при этом способ включает введение больному терапевтически эффективного количества пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 231 (включительно), SEQ ID NO: 234 и SEQ ID NO: 235; при этом N-концевая и/или C-концевая аминокислота пептидной последовательности является необязательно химически модифицированной.
В одном варианте осуществления N-концевая аминокислота пептида химически модифицирована посредством ацилирования N-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:
2
24
амида C (ацетил)-C алифатической карбоновой кислоты, которая может быть линейной, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной,
амида трифторуксусной кислоты,
амида бензойной кислоты, и
1
24
амида C-C алифатической алкилсульфоновой кислоты; или
N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида может быть алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:
1
24
C-C алифатической алкильной группы,
1
24
линейной 2-(C-C алифатической алкильной)оксиэтильной группы,
омега-метокси-поли(этиленокси)n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10.
В дополнительном варианте осуществления N-концевой амид выбран из группы, состоящей из ацетила и миристоила.
В другом варианте осуществления C-концевая аминокислота пептида химически модифицирована за счет образования амида в C-концевой группе карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:
амида аммиака,
1
24
амида C-C алифатического алкильного амина,
2
24
амида гидроксилзамещенного C-C алифатического алкильного амина,
1
24
амида линейной 2-(C-Cалифатической алкильной)оксиэтиламиногруппы, и
амида омега-метокси-поли(этиленокси)n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10.
2
В одном варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток или лечения рака, включающий введение MANS-связанного пептида в раковые клетки или больному, соответственно. В одном варианте осуществления пептид выбран из группы, состоящей из N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID No: 2); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID No: 4); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID No: 7); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID No: 11); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID No: 16); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID No: 22); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No: 29); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID No: 37); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID No: 46); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID No: 56); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID No: 67); N-миристоил-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID No: 79); N-миристоил-GAQFSKTAAKG (SEQ ID No: 92); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-миристоил-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-миристоил-GAQFSKTA (SEQ ID No: 137); N-миристоил-GAQFSKT (SEQ ID No: 154); N-миристоил-GAQFSK (SEQ ID No: 172), N-миристоил-GAQFS (SEQ ID No: 191), N-миристоил-GAQF (SEQ ID No: 211), N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RAKGE (SEQ ID NO: 235) и их комбинации.
2
2
В одном варианте осуществления пептид выбран из группы, состоящей из N-ацетил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11006); N-миристоил-AKGE (SEQ ID No: 219; BIO-91200); N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 106; BIO-11002); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11000); N-ацетил-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121; BIO-10901); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 121; BIO-10900) и N-ацетил-GAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 106). В одном варианте осуществления определенные аминокислоты присутствуют в d-конфигурации. Например, в одном варианте осуществления пептид представляет собой N-ацетил-GAQFS(d)KTAA(d)K (SEQ ID NO: 106; BIO-11037), в котором лизин (K) в позициях 6 и 10 пептида имеют d-конфигурацию.
В некоторых вариантах осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют свойства, которые делают их пригодными для применения в терапевтических целях, например, в лечении рака. Например, в одном варианте осуществления определенные MANS-связанные пептиды, раскрытые в данном документе, демонстрируют улучшенную растворимость по отношению к пептиду MANS или пептидам, не являющимся MANS-связанными пептидами. В другом варианте осуществления определенные MANS-связанные пептиды, предоставленные в данном документе, демонстрируют более длительный период полувыведения из плазмы, чем пептид MANS или пептиды, не являющимся MANS-связанные пептидами.
В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток. Например, в одном варианте осуществления предварительная обработка раковых клеток MANS-связанным пептидом (например, BIO-11006, BIO11002, BIO10901, BIO10900, BIO11000 или BIO-91200) может редуцировать миграцию раковых клеток, если клетки предварительно обработаны от приблизительно 10 мкм пептида до приблизительно 200 мкм пептида; или предварительно обработаны от приблизительно 20 мкм до приблизительно 200 мкм; или предварительно обработаны от приблизительно 25 мкм пептида до приблизительно 75 мкм пептида. В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток при введении в концентрациях от приблизительно 1 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 250 мкм, или от приблизительно 10 мкм до приблизительно 200 мкм. В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток при введении в концентрациях, составляющих приблизительно 1 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 25 мкм, приблизительно 50 мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 150 мкм, приблизительно 200 мкм или приблизительно 500 мкм. В одном варианте осуществления для определения действия пептида раковые клетки обрабатывают пептидом in vitro. В одном варианте осуществления раковые клетки являются производными пациента. В дополнительном варианте осуществления раковые клетки обрабатывают пептидом in vitro, чтобы определить, может ли пациент реагировать на лечение пептидом.
В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженное метастазирование раковых клеток при введении пациенту в концентрациях от приблизительно 0,01 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженное метастазирование раковых клеток при введении пациенту в концентрациях от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 5,0 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженное метастазирование раковых клеток при введении пациенту в концентрациях от приблизительно 0,5 мг/кг/день до приблизительно 2,5 мг/кг/день. Например, MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток при введении пациенту в концентрациях, составляющих приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2,0, приблизительно 2,25, приблизительно 2,5, приблизительно 2,75, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, приблизительно 10,0 или более мг/кг/день.
В одном варианте осуществления пептид вводят посредством ингаляции жидкого раствора или суспензии, или посредством ингаляции лекарственной формы сухого порошка пептида. В другом варианте осуществления пептид вводят с помощью инъекции жидкой лекарственной формы или суспензии пептида. В дополнительном варианте осуществления инъекцию выполняют в область первичной опухоли, при этом область содержит раковые клетки. В дополнительном варианте осуществления раковые клетки находятся в опухоли у млекопитающего. В одном варианте осуществления опухоль представляет собой солидную опухоль. В другом варианте осуществления опухоль представляет собой несолидную опухоль. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, ингибируют метастазирование раковых клеток, ассоциированных с лимфомой или лейкозом. В другом варианте осуществления жидкая лекарственная форма является изотонической. В другом варианте осуществления жидкая лекарственная форма содержит буферный раствор.
В одном варианте осуществления ингибирующее метастазирование количество пептида находится в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 микромоль на милилитр. В дополнительном варианте осуществления ингибирующее метастазирование количество пептида находится в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 10 микромоль на милилитр. В другом варианте осуществления пептид находится в лекарственной форме, включающей в себя дополнительное лекарственное вещество, пригодное для лечения рака, или приготовлен в виде лекарственной формы для введения с дополнительным лекарственным веществом.
В одном аспекте предоставлен способ лечения или предотвращения рака или ингибирования метастазирования раковых клеток у млекопитающего, при этом способ включает введение указанному млекопитающему соединения, ингибирующего MARCKS. В одном варианте осуществления соединение, ингибирующее MARCKS, представляет собой полинуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты, которая снижает экспрессию или активность MARCKS. В дополнительном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, представляет собой антисмысловую РНК, siRNA, shRNA или miRNA. В одном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, вводят в количестве от приблизительно 10 нМ до 10 мкм, или от приблизительно 20 нМ до приблизительно 500 нМ, или от приблизительно 30 нМ до приблизительно 300 нМ, или от приблизительно 40 нМ до приблизительно 200 нМ, или от приблизительно 50 нМ до приблизительно 100 нМ. В одном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, представляет собой имитатор miRNA, который регулирует экспрессию MARCKS. Например, в одном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, представляет собой имитатор miR21. В одном варианте осуществления полинуклеотиды и молекулы нуклеиновых кислот вводят вместе со средством доставки, таким как пептид, белок, липид, стерол, полимер, трансфицирующий реагент или любое полинуклеотидное или нуклеиновокислотное средство доставки, известное в данной области.
В одном аспекте предоставлен способ лечения или предотвращения рака или ингибирования метастазирования раковых клеток у млекопитающего, при этом способ включает введение указанному млекопитающему MANS-связанного пептида, при этом указанный пептид демонстрирует индекс миграции, составляющий по меньшей мере приблизительно 1,5, по меньшей мере приблизительно 1,6, по меньшей мере приблизительно 1,7, по меньшей мере приблизительно 1,8, по меньшей мере приблизительно 1,9, по меньшей мере приблизительно 2,0, по меньшей мере приблизительно 2,1, по меньшей мере приблизительно 2,2, по меньшей мере приблизительно 2,3, по меньшей мере приблизительно 2,4, по меньшей мере приблизительно 2,5, по меньшей мере приблизительно 2,6, по меньшей мере приблизительно 2,7, по меньшей мере приблизительно 2,8 по меньшей мере приблизительно 2,9, по меньшей мере приблизительно 3,0 или более, после предварительной обработки клеток немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC). В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 или 200 мкмоль указанного пептида. В другом варианте осуществления период миграции составляет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 15, 20, 21, 22, 23, или 24 часа. В одном варианте осуществления MANS-связанный пептид демонстрирует индекс миграции, составляющий по меньшей мере приблизительно 1,5 после предварительной обработки клеток NSCLC указанным пептидом в концентрации 50 мкмоль, и период миграции, составляющий приблизительно 12 часов. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид демонстрирует индекс миграции, составляющий по меньшей мере приблизительно 2,0 после предварительной обработки клеток NSCLC указанным пептидом в концентрации по меньшей мере приблизительно 100 мкмоль, и период миграции, составляющий приблизительно 12 часов.
В одном аспекте предоставлен способ лечения или профилактики рака, включая метастазирование рака у нуждающегося в этом больного, при этом способ включает введение MANS-связанного пептида больному в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид вводят в концентрациях от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 5,0 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид вводят в концентрациях от приблизительно 0,5 мг/кг/день до приблизительно 2,5 мг/кг/день. Например, MANS-связанный пептид вводят в дозе, составляющей приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2,0, приблизительно 2,25, приблизительно 2,5, приблизительно 2,75, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, приблизительно 10,0 или более мг/кг/день для лечения или профилактики рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 показывает область подсчета клеток отрицательного контроля после времени миграции, составляющего 12 часов.
Фигура 2A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 2B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 3A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 3B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 4A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 4B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 5A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 5B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 6A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 6B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 7A графически изображает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS, BIO11002, BIO10901, BIO91200 или пептида RNS, или без пептида (контроль).
Фигура 7B графически изображает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки 100 мкмоль пептида MANS, BIO11002, BIO10901, BIO91200 или пептида RNS, или без пептида (контроль).
Фигура 8A графически изображает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, при этом большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидами изобретения при 50 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом.
Фигура 8B графически изображает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, при этом большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидами изобретения при 100 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом.
Фигура 9 графически изображает соответствующее количество клеток (левая панель) и показатель индекса миграции (правая панель) для MANS, RNS, BIO-11000 или BIO-11006 или контроля (без пептида) в экспериментах с применением 50 мкмоль указанного пептида и клеточной линии агрессивного NSCLC человека.
Фигура 10 графически изображает соответствующее количество клеток (левая панель) и показатель индекса миграции (правая панель) для MANS, RNS, BIO-11000, BIO-11006, BIO-91200 или контроля (без пептида) в экспериментах с применением 100 мкмоль указанного пептида и клеточной линии агрессивного NSCLC человека.
Фигура 11 демонстрирует количества мигрировавших клеток через 12 часов после предварительной обработки клеток A549 без пептида или указанным тестируемым пептидом (MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200 или BIO-10901) при 10 мкмоль (верхняя левая панель), при 25 мкмоль (верхняя правая панель) или при 50 мкмоль (нижняя панель) пептида.
Фигура 12 демонстрирует среднее количество опухолей на мышь в левом легком, правом легком, сердце и диафрагме у животных, обработанных BIO-11006. BIO-11006 (100 мкм в PBS) вводили один раз в день ежедневно в течение 22 дней, начиная с 3 дней после инокуляции раковых клеток, посредством интраперитонеальной инъекции (50 мкл) или ингаляции (30 мин, Nebulizer Delivery System, Aeroneb Lab).
Фигура 13 демонстрирует среднее количество опухолей на мышь в левом легком, правом легком, сердце и диафрагме у мыши с введенным BIO-11006 (100 мкм в PBS) посредством ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 дней, один раз в день ежедневно, начиная с 15 дня или с 4 дня относительно инъекции клеток аденокарциномы человека (PC-9).
Фигура 14 демонстрирует общее количество опухолей у мыши с введенным BIO-11006 (100 мкм в PBS) посредством ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 дней, один раз в день ежедневно, начиная с 15 дня или с 4 дня относительно инъекции клеток PC-9.
Фигура 15 отображает количество метастатических узелков, обнаруженных у мыши, обработанной через день контролем средой, аэрозольным BIO-11006, начиная с дня -1 или дня +3 относительно инъекции раковых клеток A549, или аэрозольным MANS, начиная с дня -1 или дня +3 относительно инъекции раковых клеток A549. Аэрозольные пептиды (100 мкм в PBS) вводили посредством ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab). *, p<0,05, статистически достоверная по сравнению с контрольной группой; a, статистически недостоверная в сравнении с группами.
Фигура 16 демонстрирует уровень белка MARCKS после введения 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA в клетки PC9.
Фигура 17 демонстрирует уровень белка MARCKS после введения 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA в клетки A549.
Фигура 18 демонстрирует миграцию раковых клеток PC9 после обработки 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA.
Фигура 19 демонстрирует миграцию раковых клеток A549 после обработки 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA.
Фигура 20 демонстрирует экспрессию MARCKS в клетках PC9 посредством вестерн-блоттинга после обработки 50 нМ отрицательного контроля (Среда HiPerfect; полоса A) или 50 нМ ингибитора miR21 (полоса B).
Фигура 21 демонстрирует миграцию раковых клеток PC9 после ингибирования miR21 (50 нМ или 100 нМ ингибитора mir-21) или активации miR21 (50 нМ или 100 нМ имитатора miR-21).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Миристоилированный, богатый аланином субстратный белок протеинкиназы С (MARCKS) ранее был вовлечен в разнообразные клеточные процессы. Например, было показано, что белок MARCKS неотъемлемо задействован в клеточной секреции, дегрануляции, миграции и экспрессии генов. Данные исследования основаны на способности пептида, идентичного миристоилированной N-концевой последовательности белка MARCKS (т.е., пептида MANS) влиять на процессы в разнородных типах клеток, когда клетки предварительно обрабатывали пептидом MANS перед стимуляцией. Во всех этих случаях миссенс-контрольный пептид (состоящий из случайной аминокислотной последовательности аминокислот пептида MANS, и который называется в данном документе пептид RNS) был неэффективным по отношению к активности, продемонстрированной пептидом MANS.
В одном варианте осуществления композиции включают в себя соединения, ингибирующие MARCKS, например, любой тип ингибиторующего соединения, известного в данной области, включая пептиды, полипептиды, антитела или их фрагменты и полинуклеотиды или молекулы нуклеиновых кислот, такие как антисмысловые полинуклеотиды, аптамеры, малая интерферирующая РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и короткая шпилечная РНК (shRNA). В одном варианте осуществления композиции включают в себя один или более пептидов, связанных с миристоилированным, богатым аланином субстратом протеинкиназы С (MARCKS). В другом варианте осуществления MARCKS-связанные пептиды соответствуют домену MH2 MARCKS. В другом варианте осуществления композиции включают в себя пептиды, ингибирующие MARCKS, включая пептиды, соответствующие N-концевой последовательности.
В одном варианте осуществления соединение, ингибирующее MARCKS, предоставленное в данном документе, представляет собой антитело. Как используется в данном документе, термин «антитело» относится к связывающему белку, имеющему по меньшей мере один антиген-связывающий домен, и включает в себя моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты и/или варианты антител, включая рекомбинантные полипептиды, белки слияния и иммуноконъюгаты. Примеры фрагментов антител изобретения включают, но без ограничения, Fab фрагмент, Fc фрагмент, Fv фрагмент, dAb фрагмент, изолированные CDR участки, F(ab')2 фрагменты, бивалентные фрагменты, включающие в себя два связанных Fab фрагмента, и одноцепочечные Fv молекулы (scFv). Специалисту в данной области известно, что антитела или фрагменты, предоставленные в данном документе, могут быть получены от любого вида, включая, но без ограничения, мышь, крысу, кролика, примата, ламу и человека. Специалисту в данной области дополнительно известно, что антитела или фрагменты, предоставленные в данном документе, могут быть химерными, гуманизированными или полностью человеческими.
В одном аспекте предоставлены композиции и способы лечения или профилактики рака. Способы лечения или профилактики рака, раскрытые в данном документе, включают лечение или предотвращение всех аспектов рака, включая, но без ограничения, метастазирование, рост опухоли, пролиферацию раковых клеток и ангиогенез. В одном варианте осуществления предоставлены композиции и способы лечения или профилактики рака, включая введение соединения, ингибирующего MARCKS, в раковую клетку или в клетку, которая играет роль в развитии, поддержании, пролиферации или метастазировании раковых клеток, такую как, например, эндотелиальная клетка.
В одном аспекте предоставлены композиции и способы ингибирования метастазирования раковых клеток, при этом способ включает введение соединений, ингибирующих MARCKS. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой пептиды, ингибирующие MARCKS, антитела или их фрагменты, которые связываются с MARCKS или пептидами MARCKS, или полинуклеотиды или молекулы нуклеиновых кислот, включая антисмысловые полинуклеотиды, аптамеры, siRNA, miRNA и shRNA, которые ингибируют функции белка MARCKS. В дополнительном варианте осуществления пептиды представляют собой MANS-связанные пептиды, в котором пептиды ингибируют метастазирование раковых клеток. В одном варианте осуществления предоставлены пептиды, ингибирующие MARCKS, которые ингибируют метастазирование раковых клеток. В другом аспекте предоставлены способы лечения рака, используя композиции, раскрытые в данном документе. В одном варианте осуществления предоставленные способы включают в себя контактирование раковых клеток с пептидом, ингибирующим MARCKS. В дополнительном варианте осуществления раковые клетки присутствуют в опухоли. В одном варианте осуществления пептид, ингибирующий MARCKS, представляет собой MANS-связанный пептид. Как используется в данном документе, термин «MANS-связанный пептид» относится к пептиду MANS или пептиду, по существу идентичному MANS; или фрагменту пептида MANS, который содержит по меньшей мере четыре заменимые аминокислоты, обнаруженные в пептиде MANS, или является по существу идентичным пептиду, содержащему по меньшей мере 4 заменимые аминокислоты, обнаруженных в пептиде MANS. Таким образом, MANS-связанные пептиды имеют от 4 до 24 аминокислот в длину. Как используется в данном документе, термин «по существу идентичный» обозначает, в отношении сравнения аминокислотных последовательностей двух пептидов или сравнения аминокислотных последовательностей двух сегментов пептидов (напр., сегментов контрольной аминокислотной последовательности пептида), что аминокислотная последовательность пептидов или сегментов пептидов имеет по меньшей мере приблизительно 75% идентичность последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичность последовательности или по меньшей мере приблизительно 95% идентичность последовательности. Предпочтительно, аминокислотная последовательность пептидов имеет по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности с пептидом MANS или фрагментом пептида MANS. В одном варианте осуществления MANS-связанный пептид может включать в себя пептид от 4 до 24 аминокислот в длину, который является идентичным или по существу идентичным пептиду MANS и может дополнительно включать в себя одну или более дополнительных аминокислот. Например, в одном варианте осуществления MANS-связанный пептид включает в себя от 4 до 24 заменимые аминокислот, идентичных или по существу идентичных пептиду MANS и дополнительно включает в себя по меньшей мере одну N-концевую аминокислоту, которая не присутствует в пептиде MANS, такую как, например, аргинин.
В одном варианте осуществления пептид, ингибирующий MARCKS, является химически модифицированным. В одном варианте осуществления пептид, ингибирующий MARCKS, представляет собой MANS-связанный пептид, который ацилирован в N-концевой позиции. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид ацилирован ацетильной группой в N-концевой позиции. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид миристоилирован в N-концевой позиции. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид является химически модифицированным в С-концевой позиции. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид является химически модифицированным в С-концевой позиции посредством образования амида с амином (напр., аммиаком). В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид является химически модифицированным и в N-концевой, и в C-концевой позиции. Таблица 1 перечисляет пептиды, имеющие отношение к настоящему изобретению, которые являются миристоилированными в их N-концевой позиции, но незамещенными в их C-концевой позиции. Определенные контрольные пептиды (RNS пептиды) перечислены в Таблицах 1 и 2, и являются миристоилированными. Однако, не следует, считать, что пептиды RNS находятся в пределах объема правовых притязаний настоящего изобретения.
Таблица 1MANS-связанные пептиды изобретения, которые являются миристоилированными на N-конце и которые могут быть дополнительно химически модифицированны в С-концевой позиции, как описано в данном документе
Пептид №
N–миристоил Аминокислотные последовательности
SEQ ID No:
пептид 1
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 1
MANS
пептид 2
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 2
пептид 4
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 4
пептид 7
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 7
пептид 11
GAQFSKTAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 11
пептид 16
GAQFSKTAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 16
пептид 22
GAQFSKTAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 22
пептид 29
GAQFSKTAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 29
пептид 37
GAQFSKTAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 37
пептид 46
GAQFSKTAAKGEAAA
SEQ ID NO: 46
пептид 56
GAQFSKTAAKGEAA
SEQ ID NO: 56
пептид 67
GAQFSKTAAKGEA
SEQ ID NO: 67
пептид 79
GAQFSKTAAKGE
SEQ ID NO: 79
пептид 92
GAQFSKTAAKG
SEQ ID NO: 92
пептид 106
GAQFSKTAAK
SEQ ID NO: 106
пептид 121
GAQFSKTAA
SEQ ID NO: 121
пептид 137
GAQFSKTA
SEQ ID NO: 137
пептид 154
GAQFSKT
SEQ ID NO: 154
пептид 172
GAQFSK
SEQ ID NO: 172
пептид 191
GAQFS
SEQ ID NO: 191
пептид 211
GAQF
SEQ ID NO: 211
Пептид 232
GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF
SEQ ID NO: 232
RNS
2
2
Таблица 2 перечисляет фрагменты MANS-связанных пептидов изобретения, которые могут быть замещенными или химически модифицированными в N-концевой и/или C-концевой позиции. В одном варианте осуществления данные активные фрагменты пептида MANS могут быть миристоилированными в N-концевой позиции, как фрагменты в Таблице 1. В другом варианте осуществления химическое модифицирование в С-концевой позиции включает в себя амидирование, например, образование амида с амином, таким как, например, аммиак. Пептид 234 (SEQ ID NO: 234) представляет собой N-концевой аргинин-замещенный пептидный гомолог пептида 106 (SEQ ID NO: 106; RGAQFSKTAAK), который может быть химически модифицирован на N-конце (напр., N-концевой ацетиловый аналог, Ac-RGAQFSKTAAK), и который также может быть химически модифицирован на его N-конце и его C-конце (напр., N-концевой ацетил-, -C-концевой амид с аналогом аммиака, Ac-RGAQFSKTAAK-NH). Пептид 235 (SEQ ID NO: 235) представляет собой N-концевой аргинин-замещенный пептидный гомолог пептида 219, (SEQ ID NO: 219; RAKGE), который может быть химически модифицирован на N-конце (напр., N-концевой ацетиловый аналог, Ac-RAKGE) и который также может быть химически модифицирован на его N-конце и его C-конце (напр., N-концевой ацетил-, -C-концевой амид с аналогом аммиака, Ac-RAKGE-NH). Предпочтительные N-концевые модификации или замещения включают миристоиловые и ацетильные группы, а также N-концевые аргининовые группы, N-концевые ацетил-аргининовые группы и N-концевые миристоил-аргининовые группы. Предпочтительная C-концевая модификация включает в себя амидную группу из аммиака.
Таблица 2Последовательности MARCKS-связанного пептида, которые могут быть химически модифицированными в N-концевой и/или C-концевой позиции, как описано в данном документе
Таблица 2
Пептид MANS и активные фрагменты MANS-связанного пептида
Пептид №
Аминокислотная последовательность
SEQ ID No:
пептид 1
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 1
MANS
пептид 2
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 2
пептид 3
AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 3
пептид 4
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 4
пептид 5
AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 5
пептид 6
QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 6
пептид 7
GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 7
пептид 8
AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 8
пептид 9
QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 9
пептид 10
FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 10
пептид 11
GAQFSKTAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 11
пептид 12
AQFSKTAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 12
пептид 13
QFSKTAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 13
пептид 14
FSKTAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 14
пептид 15
SKTAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 15
пептид 16
GAQFSKTAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 16
пептид 17
AQFSKTAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 17
пептид 18
QFSKTAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 18
пептид 19
FSKTAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 19
пептид 20
SKTAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 20
пептид 21
KTAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 21
пептид 22
GAQFSKTAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 22
пептид 23
AQFSKTAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 23
пептид 24
QFSKTAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 24
пептид 25
FSKTAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 25
пептид 26
SKTAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 26
пептид 27
KTAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 27
пептид 28
TAAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 28
пептид 29
GAQFSKTAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 29
пептид 30
AQFSKTAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 30
пептид 31
QFSKTAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 31
пептид 32
FSKTAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 32
пептид 33
SKTAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 33
пептид 34
KTAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 34
пептид 35
TAAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 35
пептид 36
AAKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 36
пептид 37
GAQFSKTAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 37
пептид 38
AQFSKTAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 38
пептид 39
QFSKTAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 39
пептид 40
FSKTAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 40
пептид 41
SKTAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 41
пептид 42
KTAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 42
пептид 43
TAAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 43
пептид 44
AAKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 44
пептид 45
AKGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 45
пептид 46
GAQFSKTAAKGEAAA
SEQ ID NO: 46
пептид 47
AQFSKTAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 47
пептид 48
QFSKTAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 48
пептид 49
FSKTAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 49
пептид 50
SKTAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 50
пептид 51
KTAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 51
пептид 52
TAAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 52
пептид 53
AAKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 53
пептид 54
AKGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 54
пептид 55
KGEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 55
пептид 56
GAQFSKTAAKGEAA
SEQ ID NO: 56
пептид 57
AQFSKTAAKGEAAA
SEQ ID NO: 57
пептид 58
QFSKTAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 58
пептид 59
FSKTAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 59
пептид 60
SKTAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 60
пептид 61
KTAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 61
пептид 62
TAAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 62
пептид 63
AAKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 63
пептид 64
AKGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 64
пептид 65
KGEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 65
пептид 66
GEAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 66
пептид 67
GAQFSKTAAKGEA
SEQ ID NO: 67
пептид 68
AQFSKTAAKGEAA
SEQ ID NO: 68
пептид 69
QFSKTAAKGEAAA
SEQ ID NO: 69
пептид 70
FSKTAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 70
пептид 71
SKTAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 71
пептид 72
KTAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 72
пептид 73
TAAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 73
пептид 74
AAKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 74
пептид 75
AKGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 75
пептид 76
KGEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 76
пептид 77
GEAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 77
пептид 78
EAAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 78
пептид 79
GAQFSKTAAKGE
SEQ ID NO: 79
пептид 80
AQFSKTAAKGEA
SEQ ID NO: 80
пептид 81
QFSKTAAKGEAA
SEQ ID NO: 81
пептид 82
FSKTAAKGEAAA
SEQ ID NO: 82
пептид 83
SKTAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 83
пептид 84
KTAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 84
пептид 85
TAAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 85
пептид 86
AAKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 86
пептид 87
AKGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 87
пептид 88
KGEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 88
пептид 89
GEAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 89
пептид 90
EAAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 90
пептид 91
AAAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 91
пептид 92
GAQFSKTAAKG
SEQ ID NO: 92
пептид 93
AQFSKTAAKGE
SEQ ID NO: 93
пептид 94
QFSKTAAKGEA
SEQ ID NO: 94
пептид 95
FSKTAAKGEAA
SEQ ID NO: 95
пептид 96
SKTAAKGEAAA
SEQ ID NO: 96
пептид 97
KTAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 97
пептид 98
TAAKGEAAAER
SEQ ID NO: 98
пептид 99
AAKGEAAAERP
SEQ ID NO: 99
пептид 100
AKGEAAAERPG
SEQ ID NO: 100
пептид 101
KGEAAAERPGE
SEQ ID NO: 101
пептид 102
GEAAAERPGEA
SEQ ID NO: 102
пептид 103
EAAAERPGEAA
SEQ ID NO: 103
пептид 104
AAAERPGEAAV
SEQ ID NO: 104
пептид 105
AAERPGEAAVA
SEQ ID NO: 105
пептид 106
GAQFSKTAAK
SEQ ID NO: 106
пептид 107
AQFSKTAAKG
SEQ ID NO: 107
пептид 108
QFSKTAAKGE
SEQ ID NO: 108
пептид 109
FSKTAAKGEA
SEQ ID NO: 109
пептид 110
SKTAAKGEAA
SEQ ID NO: 110
пептид 111
KTAAKGEAAA
SEQ ID NO: 111
пептид 112
TAAKGEAAAE
SEQ ID NO: 112
пептид 113
AAKGEAAAER
SEQ ID NO: 113
пептид 114
AKGEAAAERP
SEQ ID NO: 114
пептид 115
KGEAAAERPG
SEQ ID NO: 115
пептид 116
GEAAAERPGE
SEQ ID NO: 116
пептид 117
EAAAERPGEA
SEQ ID NO: 117
пептид 118
AAAERPGEAA
SEQ ID NO: 118
пептид 119
AAERPGEAAV
SEQ ID NO: 119
пептид 120
AERPGEAAVA
SEQ ID NO: 120
пептид 121
GAQFSKTAA
SEQ ID NO: 121
пептид 122
AQFSKTAAK
SEQ ID NO: 122
пептид 123
QFSKTAAKG
SEQ ID NO: 123
пептид 124
FSKTAAKGE
SEQ ID NO: 124
пептид 125
SKTAAKGEA
SEQ ID NO: 125
пептид 126
KTAAKGEAA
SEQ ID NO: 126
пептид 127
TAAKGEAAA
SEQ ID NO: 127
пептид 128
AAKGEAAAE
SEQ ID NO: 128
пептид 129
AKGEAAAER
SEQ ID NO: 129
пептид 130
KGEAAAERP
SEQ ID NO: 130
пептид 131
GEAAAERPG
SEQ ID NO: 131
пептид 132
EAAAERPGE
SEQ ID NO: 132
пептид 133
AAAERPGEA
SEQ ID NO: 133
пептид 134
AAERPGEAA
SEQ ID NO: 134
пептид 135
AERPGEAAV
SEQ ID NO: 135
пептид 136
ERPGEAAVA
SEQ ID NO: 136
пептид 137
GAQFSKTA
SEQ ID NO: 137
пептид 138
AQFSKTAA
SEQ ID NO: 138
пептид 139
QFSKTAAK
SEQ ID NO: 139
пептид 140
FSKTAAKG
SEQ ID NO: 140
пептид 141
SKTAAKGE
SEQ ID NO: 141
пептид 142
KTAAKGEA
SEQ ID NO: 142
пептид 143
TAAKGEAA
SEQ ID NO: 143
пептид 144
AAKGEAAA
SEQ ID NO: 144
пептид 145
AKGEAAAE
SEQ ID NO: 145
пептид 146
KGEAAAER
SEQ ID NO: 146
пептид 147
GEAAAERP
SEQ ID NO: 147
пептид 148
EAAAERPG
SEQ ID NO: 148
пептид 149
AAAERPGE
SEQ ID NO: 149
пептид 150
AAERPGEA
SEQ ID NO: 150
пептид 151
AERPGEAA
SEQ ID NO: 151
пептид 152
ERPGEAAV
SEQ ID NO: 152
пептид 153
RPGEAAVA
SEQ ID NO: 153
пептид 154
GAQFSKT
SEQ ID NO: 154
пептид 155
AQFSKTA
SEQ ID NO: 155
пептид 156
QFSKTAA
SEQ ID NO: 156
пептид 157
FSKTAAK
SEQ ID NO: 157
пептид 158
SKTAAKG
SEQ ID NO: 158
пептид 159
KTAAKGE
SEQ ID NO: 159
пептид 160
TAAKGEA
SEQ ID NO: 160
пептид 161
AAKGEAA
SEQ ID NO: 161
пептид 162
AKGEAAA
SEQ ID NO: 162
пептид 163
KGEAAAE
SEQ ID NO: 163
пептид 164
GEAAAER
SEQ ID NO: 164
пептид 165
EAAAERP
SEQ ID NO: 165
пептид 166
AAAERPG
SEQ ID NO: 166
пептид 167
AAERPGE
SEQ ID NO: 167
пептид 168
AERPGEA
SEQ ID NO: 168
пептид 169
ERPGEAA
SEQ ID NO: 169
пептид 170
RPGEAAV
SEQ ID NO: 170
пептид 171
PGEAAVA
SEQ ID NO: 171
пептид 172
GAQFSK
SEQ ID NO: 172
пептид 173
AQFSKT
SEQ ID NO: 173
пептид 174
QFSKTA
SEQ ID NO: 174
пептид 175
FSKTAA
SEQ ID NO: 175
пептид 176
SKTAAK
SEQ ID NO: 176
пептид 177
KTAAKG
SEQ ID NO: 177
пептид 178
TAAKGE
SEQ ID NO: 178
пептид 179
AAKGEA
SEQ ID NO: 179
пептид 180
AKGEAA
SEQ ID NO: 180
пептид 181
KGEAAA
SEQ ID NO: 181
пептид 182
GEAAAE
SEQ ID NO: 182
пептид 183
EAAAER
SEQ ID NO: 183
пептид 184
AAAERP
SEQ ID NO: 184
пептид 185
AAERPG
SEQ ID NO: 185
пептид 186
AERPGE
SEQ ID NO: 186
пептид 187
ERPGEA
SEQ ID NO: 187
пептид 188
RPGEAA
SEQ ID NO: 188
пептид 189
PGEAAV
SEQ ID NO: 189
пептид 190
GEAAVA
SEQ ID NO: 190
пептид 191
GAQFS
SEQ ID NO: 191
пептид 192
AQFSK
SEQ ID NO: 192
пептид 193
QFSKT
SEQ ID NO: 193
пептид 194
FSKTA
SEQ ID NO: 194
пептид 195
SKTAA
SEQ ID NO: 195
пептид 196
KTAAK
SEQ ID NO: 196
пептид 197
TAAKG
SEQ ID NO: 197
пептид 198
AAKGE
SEQ ID NO: 198
пептид 199
AKGEA
SEQ ID NO: 199
пептид 200
KGEAA
SEQ ID NO: 200
пептид 201
GEAAA
SEQ ID NO: 201
пептид 202
EAAAE
SEQ ID NO: 202
пептид 203
AAAER
SEQ ID NO: 203
пептид 204
AAERP
SEQ ID NO: 204
пептид 205
AERPG
SEQ ID NO: 205
пептид 206
ERPGE
SEQ ID NO: 206
пептид 207
RPGEA
SEQ ID NO: 207
пептид 208
PGEAA
SEQ ID NO: 208
пептид 209
GEAAV
SEQ ID NO: 209
пептид 210
EAAVA
SEQ ID NO: 210
пептид 211
GAQF
SEQ ID NO: 211
пептид 212
AQFS
SEQ ID NO: 212
пептид 213
QFSK
SEQ ID NO: 213
пептид 214
FSKT
SEQ ID NO: 214
пептид 215
SKTA
SEQ ID NO: 215
пептид 216
KTAA
SEQ ID NO: 216
пептид 217
TAAK
SEQ ID NO: 217
пептид 218
AAKG
SEQ ID NO: 218
пептид 219
AKGE
SEQ ID NO: 219
пептид 220
KGEA
SEQ ID NO: 220
пептид 221
GEAA
SEQ ID NO: 221
пептид 222
EAAA
SEQ ID NO: 222
пептид 223
AAAE
SEQ ID NO: 223
пептид 224
AAER
SEQ ID NO: 224
пептид 225
AERP
SEQ ID NO: 225
пептид 226
ERPG
SEQ ID NO: 226
пептид 227
RPGE
SEQ ID NO: 227
пептид 228
PGEA
SEQ ID NO: 228
пептид 229
GEAA
SEQ ID NO: 229
пептид 230
EAAV
SEQ ID NO: 230
пептид 231
AAVA
SEQ ID NO: 231
Пептид 232
GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF
SEQ ID NO: 232
RNS
Пептид 233
GKASQFAKTA
SEQ ID NO: 233
RNS2
Пептид 234
RGAQFSKTAAK
SEQ ID NO: 234
Пептид 235
RAKGE
SEQ ID NO: 235
Пептид MANS является миристоилированным (обозначено как MA) и содержит последовательность из 24 аминокислот MA-GAQFSKTAAKGEAAARPGEAAVA. Не желая связывать себя теорией, пептид, как оценивается теоретически, препятствует естественному прикреплению полноразмерного белка MARCKS к клеточной мембране и препятствует фосфорилированию белка MARCKS с помощью протеинкиназы C (PKC).
Пептид MANS, как было показано, обеспечивает значительное уменьшение дегрануляции бокаловидных клеток как in vitro, так и in vivo. MANS также влияет на скорость миграции нейтрофилов и мезенхимальных стволовых клеток. Дегрануляция лейкоцитов человека также ингибируется MANS. В одном аспекте данного изобретения, обработка определенных клеточных линий рака MANS-связанными пептидами уменьшает миграцию данных клеточных линий рака. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют ингибирование метастазирования раковых клеток. Таким образом, в одном варианте осуществления предоставленные MANS-связанные пептиды можно применять для лечения или предотвращения метастатического рака у нуждающегося в этом больного. В некоторых вариантах осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют свойства, которые делают их пригодными для использования в терапевтических вариантах применения, например, при лечении рака. Например, в одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют улучшенную растворимость по отношению к пептиду MANS. В другом варианте осуществления некоторые MANS-связанные пептиды демонстрируют более длительный период полувыведения из плазмы, чем пептид MANS или по отношению к пептидам, не являющимся MANS-связанными пептидами. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды могут быть использованы для лечения пролиферации раковых клеток. Например, в одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды могут ингибировать пролиферацию и/или миграцию раковых клеток. В другом варианте осуществления некоторые MANS-связанные пептиды могут предоставить более выраженное ингибирование пролиферации и/или миграции раковых клеток в меньших концентрациях, чем пептид MANS или чем другие MANS-связанные пептиды.
В одном аспекте, MANS-связанный пептид выбран из группы, состоящей из:
N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11000)
N-ацетил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11006);
N-миристоил-AKGE (SEQ ID No: 219; BIO-91200);
2
N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 106; BIO-11002);
N-ацетил-GAQFSKTAA (SEQ ID № 121; BIO-10901);
2
N-ацетил-GAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 106; BIO-11026);
N-ацетил-GAQFS(d)KTAA(d)K (SEQ ID No: 106; BIO-11037) (Lys в позициях 6 и 10 пептида относятся к d-конфигурации;
N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234; BIO-11027);
2
N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 234; BIO-11028); и
N-ацетил-RAKGE (SEQ ID NO: 235; BIO-91204).
В одном аспекте пептиды, имеющие 4-24 аминокислоты и которые имеют аминокислотные последовательности, которые являются идентичными или по существу идентичными аминокислотным последовательностям, обнаруженным в пептиде MANS, могут быть использованы в одном или более аспектах данного изобретения. Данные пептиды в данном документе именуются MANS-связанные пептиды, и иллюстративные MANS-связанные пептиды перечислены в Таблице 2 как SEQ ID №№ 1-231, 234 и 235. Таблица 2 также включает аминокислотную последовательность пептида № 232 (SEQ ID NO: 232) со случайной последовательностью (RNS), который применяется в качестве контрольного и для демонстрации, что порядок аминокислотной последовательности может иметь отношение к эффективности в данном изобретении, а также контрольного пептида 233 (RNS2; SEQ ID NO: 233) со второй случайной последовательностью. Пептиды 234 и 235 (SEQ ID NO: 234 и 235) представляют собой N-концевые аргинин-замещенные пептидные гомологи пептидов 106 и 219, соответственно. Аргинин может быть ацилированным, например, ацетильной группой или миристоиловой группой.
В одном варианте осуществления пептиды, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических пептидов, имеющих аминокислотные последовательности, перечисленные в Таблице 2 (за исключением пептидов случайной последовательности 232 и 233).
В другом варианте осуществления пептиды, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть выбраны из пептидов аминокислотных последовательностей, как перечисленных в Таблице 2 (SEQ ID NO: 1-231 (включительно), 234 и 235), так и которые необязательно являются химически модифицированными на N-конце и/или C-конце.
Предпочтительные независимые N-концевые химические модификации пептидов, перечисленных в Таблице 2, включают модификацию N-концевой аминогруппы посредством ацилирования N-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранной из группы, состоящей из:
2
24
амида C (ацетил)-C алифатической карбоновой кислоты, которая может быть линейной, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной,
амида трифторуксусной кислоты,
амида бензойной кислоты, и
1
24
амида C-C алифатической алкилсульфоновой кислоты; или
N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида может быть алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:
1
24
C (метил)-C алифатической алкильной группы,
1
24
линейной 2-(C-C алифатической алкильной)оксиэтильной группы,
омега-метокси-поли(этиленокси)n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10.
Предпочтительные независимые C-концевые химические модификации пептидов, перечисленные в Таблице 2, включают образование амида в C-концевой группе карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:
амида аммиака,
1
24
амида C-C алифатического алкильного амина,
2
24
амида гидроксилзамещенного C-C алифатического алкильного амина,
1
24
амида линейной 2-(C-Cалифатической алкильной)оксиэтиламиногруппы, и
амида омега-метокси-поли(этиленокси)n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10.
В дополнение, C-концевая группа карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты пептида необязательно находится в форме сложного эфира, выбранного из группы, состоящей из:
1
24
сложного эфира C-C алифатического алкилового спирта,
сложного эфира 2-(омега-метокси-поли(этиленокси)n)-этанольной группы, где n составляет от 0 до 10, и
сложного эфира линейного PEG-амина, PEG компонент молекулярной массы от 1000 до 25000 Дальтон.
3
В одном варианте осуществления, алифатические участки групп такие как группы карбоновых кислот и группы сульфоновых кислот и спиртовые и аминогруппы могут содержать кольцо по меньшей мере из C (т.е., по меньшей мере циклопропиловое кольцо).
2
2
2
В одном варианте осуществления, пептид может быть модифицирован на N-конце, например, ацетильной группой или миристоиловой группой, как N-концевой амид, такой как ацетил-GAQFSKTAAK (N-концевой ацетил SEQ ID No: 106) и миристоил-GAQFSKTAAK (N-концевой миристоил SEQ ID No: 106), соответственно. В другом варианте осуществления пептид может быть модифицирован на С-конце (например, амидом с аммиаком), таким как GAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 106 C-концевой амид). В другом варианте осуществления пептид может быть модифицирован на N-конце и модифицирован на С-конце, например, в виде N-ацетил-пептид-C-амида (с аммиаком), такого как Ацетил-GAQFSKTAAK-NH, (N-концевой ацетил SEQ ID No: 106 C-концевой амид), и Миристоил-GAQFSKTAAK-NH (N-концевой миристоил SEQ ID No: 106 C-концевой амид). Данные пептиды могут использоваться в способах данного изобретения и чтобы определить их способность ингибировать метастазы раковых клеток.
В одном варианте осуществления пептид, который может найти применение в данном изобретении, может быть выбран из группы пептидов, которые имеют в своем составе аминокислотную последовательность AKGE (SEQ ID No: 219). Такие пептиды содержат SEQ ID No: 1 - SEQ ID No: 54, SEQ ID No: 56 - SEQ ID No: 64, SEQ ID No: 67 - SEQ ID No: 75, SEQ ID No: 79 - SEQ ID No: 87, SEQ ID No: 93 - SEQ ID No: 100, SEQ ID No: 108 - SEQ ID No: 114, SEQ ID No: 124 - SEQ ID No: 129, SEQ ID No: 141 - SEQ ID No: 145, SEQ ID No: 159 - SEQ ID No: 162, SEQ ID No: 178 - SEQ ID No: 180, SEQ ID No: 198, SEQ ID No: 199, SEQ ID No: 219, и SEQ ID NO: 235. В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления, данные пептиды миристоилированы или ацетилированы в N-концевой аминогруппе.
В одном варианте осуществления данное изобретение раскрывает способ ослабления метастазирования раковых клеток в сторону увеличения градиента концентрации хемотаксического агента в текучей среде или ткани, при этом способ включает обработку указанных раковых клеток ингибирующим миграцию количеством модулирующего миграцию пептида и инкубирование указанных клеток с указанным пептидом для образования раковых клеток с ингибированной миграцией, при этом пептидом является MANS-связанный пептид.
В одном аспекте модулирующий миграцию пептид выбран из группы, состоящей из MANS-связанных пептидов. В другом аспекте MANS-связанный пептид включает в себя аминокислотную последовательность GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106).
2
В другом аспекте MANS-связанный пептид выбран из группы, состоящей из N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID No: 1) N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID No: 2); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID No: 4); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID No: 7); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID No: 11); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID No: 16); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID No: 22); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No: 29); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID No: 37); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID No: 46); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID No: 56); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID No: 67); N-миристоил-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID No: 79); N-миристоил-GAQFSKTAAKG (SEQ ID No: 92); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-миристоил-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-миристоил-GAQFSKTA (SEQ ID No: 137); N-миристоил-GAQFSKT (SEQ ID No: 154); N-миристоил-GAQFSK (SEQ ID No: 172), N-миристоил-GAQFS (SEQ ID No: 191), N-миристоил-GAQF (SEQ ID No: 211), N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RAKGE (SEQ ID NO: 235) и их комбинаций.
В другом аспекте MANS-связанный пептид выбран из группы, состоящей из:
N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID No: 1; пептид MANS);
N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11000);
N-ацетил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11006);
2
N-ацетил-GAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 106; BIO-11026);
N-миристоил-AKGE (SEQ ID No: 219; BIO-91200);
2
N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 106; BIO-11002);
N-ацетил-GAQFSKTAA (SEQ ID № 121; BIO-10901)
N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234; BIO-11027)
2
N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH (SEQ ID No: 234; BIO-11028), и
N-ацетил-RAKGE (SE Q ID NO: 235; BIO-91204).
В одном аспекте ингибирующая метастазирование доза пептида данного изобретения может быть в диапазоне от приблизительно 0,01 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления ингибирующая метастазирование доза пептида составляет от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 5,0 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления, ингибирующая метастазирование доза пептида составляет от приблизительно 0,5 мг/кг/день до приблизительно 2,5 мг/кг/день. Например, ингибирующая метастазирование доза пептида данного изобретения составляет приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2,0, приблизительно 2,25, приблизительно 2,5, приблизительно 2,75, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, приблизительно 10,0 или более мг/кг/день.
В одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет способ ингибирования метастазирования раковых клеток, в котором введение происходит посредством перорального, внутривенного, интраперитонеального, внутримышечного, ингаляционного путей или посредством суппозиториев. В другом варианте осуществления данное изобретение раскрывает способ ингибирования метастазирования раковых клеток, в котором введение происходит посредством ингаляции лекарственной формы соединения, ингибирующего MARCKS, в виде жидкого раствора или суспензии или сухого порошка. В одном варианте осуществления предоставлен способ лечения рака, в котором соединение, ингибирующее MARCKS, вводят нуждающемуся в этом больному посредством ингаляции лекарственной формы соединения, ингибирующего MARCKS, в виде жидкого раствора или суспензии или сухого порошка. Например, в одном варианте осуществления, MANS-связанный пептид вводят нуждающемуся в этом больному посредством ингаляции лекарственной формы MANS-связанного пептида в виде жидкого раствора или суспензии или сухого порошка. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид вводят посредством внутривенного, интраперитонеального введения или посредством внутримышечной инъекции или посредством перорального введения или посредством суппозиториев.
В другом аспекте данное изобретение раскрывает способ ингибирования метастазирования раковых клеток или лечения рака у нуждающегося в этом больного, в котором MANS-связанный пептид вводят с помощью инъекции жидкой лекарственной формы пептида, и в котором жидкая лекарственная форма является изотонической, и в котором жидкая или суспензионная лекарственная форма содержит буферный раствор, и в котором инъекции выполняют больному систематически. В другом варианте осуществления инъекцию выполняют в область опухоли. В другом варианте осуществления инъекцию выполняют в опухоль.
В другом аспекте данное изобретение раскрывает способ ингибирования метастазирования раковых клеток, в котором раковые клетки находятся в млекопитающем. В одном варианте осуществления предоставлен способ лечения рака, в котором MANS-связанный пептид вводят нуждающемуся в этом больному, и в котором у больного имеется опухоль. Пептиды данного изобретения могут быть приготовлены в виде лекарственной формы с применением одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов или ингредиентов для предоставления фармацевтических композиций, пригодных для введения в раковые клетки, такие как раковые клетки в первичной опухоли. Такие композиции могут представлять собой как растворы, так и суспензии в жидком, преимущественно в буферном растворе, в котором фосфатный буфер является пригодным, когда введение с помощью инъекции или посредством ингаляции является пригодным. Изотонические растворы или суспензии являются предпочтительными вариантами осуществления.
Ожидается, что введение композиции антител, полинуклеотидов, молекул нуклеиновой кислоты или пептидов данного изобретения млекопитающим, таким как собачьи, кошачьи и пациенты-люди, может быть эффективным, если оно проводится с помощью инъекции в область первичной опухоли (напр., непосредственно в первичную опухоль, или в край первичной опухоли, или в кровеносный сосуд, питающий первичную опухоль) у млекопитающего, при этом инъекция делают через равные интервалы (например, от каждого 1 до каждых 72 часов), необязательно в комбинации или раздельно с одним или более другими или дополнительными химиотерапевтическими препаратами.
В дополнение к лекарственной форме с антителами, ингибирующими MARCKS, полинуклеотидами, молекулами нуклеиновой кислоты или пептидами перед, во время или после введения пептида могут быть введены один или более дополнительных терапевтических агентов, включая химиотерапевтические препараты и раковоспецифические антитела. Иллюстративные химиотерапевтические препараты включают, но без ограничения, карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид, дакарбазин, темозоломид, гемцитабин, капецитабин, кладрибин, клофарабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гидроксимочевина, метотрексат, пеметрексед, пентостатин, тиогуанадин, даунорубицин, доксирубицин, эпирубицин, идарубицин, топотекан, иринотекан, этопозид, энипозид, колхицин, винкристин, винбластин, винорелбин, паклитаксел и доцетаксел. Иллюстративные раковоспецифические агенты и антитела включают, но без ограничения, Афатиниб, Альдеслейкин, Алемтузумаб, Акситиниб, Белимумаб, Бевацизумаб, Бортезомиб, Босутиниб, Брентуксимаб ведотин, Кабозантиниб, Канакинумаб, Карфилзомиб, Цетуксимаб, Кризотиниб, Дабрафениб, Дазатиниб, Деносумаб, Эрлотиниб, Эверолимус, Гефитиниб, Ибритумомаб тиуксетан, Ибрутиниб, Иматиниб, Ипилимумаб, Лапатиниб, Нилотиниб, Обинутузумаб, Офатумумаб, Панитумумаб, Пазопаниб, Пертузумаб, Понатиниб, Регорафениб, Ритуксимаб, Ромидепсин, Руксолитиниб, Сипулейцел-T, Сорафениб, Темсиролимус, Тоцилизумаб, Тофацитиниб, Тозитумомаб, Траметиниб, Трастузумаб, Вандетаниб, Вемурафениб, Висмодегиб, Вориностат и Зив-афлиберцепт.
Введение может происходить, например, посредством ингаляции в виде аэрозоля или спрея, жидкости или сухого порошка, например, в дыхательные пути больного раком, причем данный спрей может сформировать покрытие на ткани, содержащей раковые клетки, или в виде жидкости для инъекции в текучую среду или ткань, содержащую или контактирующую с раковыми клетками перед метастазированием. Для содействия солюбилизации и трасмембранному поглощению MANS-связанного пептида предусматривается применение мягкого поверхностно-активного агента, такого как фосфолипид. Введение может также происходить, например, посредством сухого порошка, предпочтительно состоящего из наночастиц или микрочастиц порошка, применяемого посредством распыления на ткань, содержащую раковые клетки. Добавление в препарат пептида микрогранулированного углеводного носителя будет облегчать ингаляционную доставку наночастиц пептида в зону дыхательных путей и эпителиальной ткани.
Предпочтительный способ применения композиции антитела, ингибирующего MARCKS, полинуклеотида, молекулы нуклеиновой кислоты или пептида включает в себя инъекцию в ткань в опухоль или проксимальнее опухоли, причем данная опухоль содержит раковые клетки перед метастазированием.
Как используется в данном документе, фраза «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к нетоксическому, но достаточному количеству композиций, применяемому при осуществлении изобретения, которое является эффективным для достижения желаемого эффекта, т.е., ингибирования метастазирования и/или пролиферации раковых клеток, и/или для ингибирования, лечения или предотвращения рака у нуждающегося в этом больного. Таким образом, активность, предполагаемая настоящими способами включает в себя как медицинское терапевтическое, так и/или профилактическое лечение, в зависимости от ситуации, включая, например, уменьшение и/или облегчение признаков, симптомов или случаев рака. Терапевтически эффективным количеством соединения данного изобретения обычно является такое количество, что при его введении в композиции с физиологически приемлемыми эксципиентами, оно является эффективным для достижения эффективной внутриклеточной концентрации и локальной концентрации в ткани.
"Рак" в данном документе относится к или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое типично характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому (включая липосаркому, остеогенную саркому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, фибросаркому, миксосаркому, хондросаркому), остеокластому, нейроэндокринные опухоли, мезотелиому, хордому, синовиому, шванному, менингиому, аденокарциному, меланому и лейкоз или лимфонеоплазии. Более конкретные примеры данных видов рака включают плоскоклеточный рак (напр., эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, включая гастроинтестинальный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочных желез, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, карциному эндомметрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек, или ренальный рак, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному ануса, карциному полового члена, рак яичек, рак пищевода, опухоли билиарного тракта, опухоль Юинга, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечноклеточную карциному, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, опухоль Вильмса, опухоль яичка, карциному легкого, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, лейкоз, лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, миелодиспластическую болезнь, болезнь тяжелых цепей, нейроэндокринные опухоли, шванному и другие карциномы, рак головы и шеи, миелоидные неоплазии, такие как острые миелоидные лейкозы, включая AML с созреванием, AML без дифференцировки, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз и острые моноцитарные лейкозы, миелодиспластические синдромы и хронические миелопролиферативные заболеваниы, включая хронический миелогенный лейкоз, опухоли центральной нервной системы, напр., опухоли головного мозга (глиому, нейробластому, астроцитому, медуллобластому, эпендимому и ретинобластому), солидные опухоли (назофарингеальный рак, базальноклеточную карциному, рак поджелудочной железы, рак желчных протоков, саркому Капоши, рак яичек, матки, влагалища или рак шейки матки, рак яичников, первичной рак печени или рак эндометрия, опухоли сосудистой системы (ангиосаркому и гемангиоперицитому), гематологические новообразования и опухолеподобные состояния например, ходжкинскую лимфому; неходжкинские лимфомы (лимфому Беркитта, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому/ хронический лимфоцитарный лейкоз, фунгоидный микоз, лимфому из клеток мантии, фолликулярную лимфому, диффузную гигантскую В-клеточную лимфому, лимфому маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз и лимфоплазмоцитарный лейкоз), опухоли клеток-предшественников лимфоцитов, включая B-клеточный острый лимфобластный лейкоз/лимфому, и T-клеточный острый лимфобластный лейкоз/лимфому, тимому, опухоли зрелый T- и NK-клеток, включая периферические T-клеточные лейкозы, Т-клеточный лейкоз взрослых /T-клеточные лимфомы и лейкоз из больших зернистых лимфоцитов, остеолитический рак кости и метастазирование в кость.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрировано посредством ссылки на следующие примеры. Однако следует заметить, что данные примеры, подобно вариантам осуществления, описанным выше, являются иллюстративными и никоим образом не должны истолковываться в качестве ограничения объема правовых притязаний изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. Влияние пептидов на миграцию клеточных линий рака
Протокол анализа миграции
2
5
Клетки CL1-5, клеточная линия с агрессивным метастазированием, полученная из аденокарциномы человека, культивировали в среде RPMI 1640 с 10% FBS, 37°C при 95% Кислорода/5% CO до готовности для применения. Для проведения анализа миграции использовали планшеты трансвел (24-луночные, с размером пор 8 мкм; Costar, Cambridge, MA, USA). Нижние камеры планшетов трансвел наполняли 600 мкл базовой среды, содержащей 10% FBS. Клетки (1×10) предварительно обрабатывали 50 или 100 мкм указанного тестируемого пептида в течение 30 мин, а затем суспендировали в 100 мкл базовой среды, содержащей 1% BSA и добавляли в верхнюю камеру, а затем клетки инкубировали при 37°C в течение 12 часов. Клетки на верхней поверхности фильтров удаляли с использованием ватных тампонов, а клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, промывали, фиксировали и окрашивали гематоксилином и подсчитывали под микроскопом. Процентное изменение миграции определяли посредством подсчета количества клеток, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров. На мембрану обсчитывали по меньшей мере 3 отдельных поля зрения микроскопа (n=4).
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПОСОБ ТРАНСВЕЛ
5
Первичные клетки CL1-5 происходили из аденокарциномы рака легкого человека. Для проведения анализа миграции использовали планшеты трансвел с 24 лунками, размером пор 8 мкм (Costar, Cambridge, MA, USA). Нижние камеры планшетов трансвел наполняли 600 мкл базовой среды, содержащей 10% FBS. Клетки (1-2×10) суспендировали в 100 мкл базовой среды, содержащей 1% BSA. Тестируемый пептид добавляли в верхнюю камеру в необходимой концентрация непосредственно или после предварительного инкубирования с раковыми клетками. Затем планшеты инкубировали при 37°C в течение 12 часов. Клетки на верхней поверхности фильтров удаляли с использованием ватных тампонов. Клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, промывали, фиксировали и окрашивали гематоксилином и подсчитывали под микроскопом. По меньшей мере пять отдельных полей зрения микроскопа подсчитывали на мембрану (n=3). Процентное изменение миграции определяли посредством подсчета количества клеток, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров.
Подсчет означает фактическое количество клеток, которые мигрировали в нижнюю камеру, и подсчитывали с помощью светового микроскопа при 40× увеличении, представляли в виде среднего количества клеток в 10 случайно выбранных полях для каждой обработки.
«Индекс» вычисляли посредством деления количества клеток, которые мигрировали в присутствии пептидов, на количество клеток, которые мигрировали случайно (контрольная группа). Индекс = количество контрольных клеток/количество обработанных клеток. Данный расчет может отражать степень, в которой миграция клеток была заблокирована 30 минутной предварительной обработкой MANS-связанными пептидами.
Фигура 1 показывает область подсчета клеток отрицательного контроля после времени миграции, составляющего 12 часов.
Фигура 2A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 2B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 3A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 3B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
2
Фигура 4A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 (N-миристоил – SEQ ID NO: 106 – NH) с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 4B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 5A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 (N-ацетил – SEQ ID NO: 121) с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 5B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 6A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 (N-миристоил – SEQ ID NO: 219) с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 6B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.
Фигура 7A показывает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS, пептида RNS и MANS-связанных тестируемых пептидов BIO-11002 (SEQ ID NO: 6), BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) и BIO-9120 (SEQ ID NO: 219), и контроля (без пептида). Для пептида MANS количество клеток составляло приблизительно 40; для пептида RNS количество клеток составляло приблизительно 95; для BIO-11002 (SEQ ID NO: 106) количество клеток составляло приблизительно 50); для BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) количество клеток составляло приблизительно 60; и для BIO-91200 (SEQ ID NO: 219) количество клеток составляло приблизительно 65. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно сниженные количества мигрировавших клеток клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5) по отношению к контролю и к пептиду RNS со случайной последовательностью.
Фигура 7B показывает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки при 100 мкмоль пептида MANS, пептида RNS и MANS-связанных тестируемых пептидов BIO-11002 (SEQ ID NO: 106), BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) и BIO-91200 (SEQ ID NO: 219), и контроля (без пептида). Для пептида MANS количество клеток составляло приблизительно 20); для пептида RNS количество клеток составляло приблизительно 90; для BIO-11002 (SEQ ID NO: 106) количество клеток составляло приблизительно 25; для BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) количество клеток составляло приблизительно 35; и для BIO-91200 (SEQ ID NO: 219) количество клеток составляло приблизительно 40; для контроля (без пептида) количество клеток составляло приблизительно 90. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно сниженные количества мигрировавших клеток клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5) по отношению к контролю и к пептиду RNS со случайной последовательностью.
Фигура 8A показывает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, в которых большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидом или пептидной композицией изобретения при 50 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом. Далее приведены значения индексов миграции: контроль = 1; пептид MANS = приблизительно 2,5; пептид RNS = приблизительно 1,1; BIO-11002 = приблизительно 2,7; BIO-10901 = приблизительно 1,75; и BIO-91200 = приблизительно 1,7. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.
Фигура 8B показывает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, в которых большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидом или пептидной композицией изобретения при 100 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом. Далее приведены изображенные значения индексов миграции: контроль = 1; пептид MANS = приблизительно 4,3; пептид RNS = приблизительно 1; BIO-11002 = приблизительно 3,8; BIO-10901 = приблизительно 2,7; и BIO-91200 = приблизительно 2,4, Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.
Фигура 9 графически изображает расположенные рядом соответствующие количества клеток и результаты показателей индекса миграции предварительной обработки пептидом при 50 мкмоль в экспериментах с использованием клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5). Контроль без предварительной обработки пептидом дает количество клеток приблизительно 105; а показатель индекса миграции = 1,0. Результаты после предварительная обработка пептидом MANS при 50 мкмоль с последующими 12 часами в соответствии с протоколом дают количество клеток приблизительно 45; а индекс миграции приблизительно 2,5. Результаты после предварительной обработки пептидом RNS при 50 мкмоль дают количество клеток приблизительно 90; а индекс миграции приблизительно 1,3. Результаты после предварительной обработки BIO-11000 при 50 мкмоль дает количество клеток приблизительно 70; а индекс миграции приблизительно 1,5. Результаты после предварительной обработки BIO-11006 при 50 мкмоль дают количество клеток приблизительно 50; а индекс миграции приблизительно 2. Результаты демонстрируют, что большие значения индекса миграции связаны с меньшей миграцией, а меньшая миграция связана с большими значениями индекса миграции. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11000 и BIO-11006 продемонстрировал уменьшенные количества мигрировавших клеток и повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.
Фигура 10 графически изображает расположенные рядом соответствующие количества клеток и результаты показателей индекса миграции в течение предварительной обработки пептидом при 100 мкмоль в экспериментах с использованием клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5). Контроль без предварительной обработки пептидом дает количество клеток приблизительно 105; а показатель индекса миграции = 1,0, Результаты после предварительной обработки пептидом MANS при 100 мкмоль с последующими 12 часами в соответствии с протоколом дает количество клеток приблизительно 35; а индекс миграции приблизительно 3,5. Результаты после предварительной обработки пептидом RNS при 100 мкмоль дает количество клеток приблизительно 95; а индекс миграции приблизительно 1,2. Результаты после предварительной обработки BIO-11000 при 100 мкмоль дают количество клеток приблизительно 50; а индекс миграции приблизительно 2,3. Результаты после предварительной обработки BIO-11006 при 100 мкмоль дают количество клеток приблизительно 50; а индекс миграции приблизительно 2,1. Результаты после предварительной обработки BIO-91200 при 100 мкмоль дает количество клеток приблизительно 55; а индекс миграции приблизительно 2,1. Результаты демонстрируют, что большие значения индекса миграции связаны с меньшей миграцией клеток, и меньшая миграция клеток связана с большими значениями индекса миграции. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11000, BIO-11006 и BIO-91200 продемонстрировал уменьшенные количества мигрировавших клеток и повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.
ПРИМЕР 2. Ингибирование метастазирования рака легкого с помощью пептида MANS или BIO-11006 с использованием ортотопической ксенографической модели инъекции в легкое.
Метастатическую активность раковых клеток in vivo после обработки пептидом MANS или BIO-11006 оценивали в ортотопической ксенографической модели инъекции в легкое. После предварительной обработки либо PBS, либо PBS+MANS, либо BIO-11006 (SEQ ID NO: 106), либо контрольным пептидом RNS при 100 мкм в течение 4 часов клетки PC-9 инъецировали в левую долю легкого бестимусной мыши. Спустя семь дней этих мышей подвергали системной обработке либо только PBS (Con), RNS (дополнительный контрольный пептид), MANS, либо BIO-11006 при 50 наномоль на интраперитонеальную инъекцию один раз каждые три дня. На 25 день (6 инъекций) после посева данных опухолевых клеток мышей умерщвляли и подсчитывали количество метастазированных опухолевых узлов в противоположном легком и других органах. Как показано ниже в таблице 3, обработанные MANS, RNS или BIO-11006 группы не показали отличия в среднем размере опухоли на участке инъекции по сравнению с обработанными PBS или друг с другом, предполагая, что данные обработки не влияют на онкогенез. Однако у мышей, обработанных MANS и BIO-11006, отмечалось значительное уменьшение метастатических узелков в противоположном легком и в других органах по сравнению с группами, обработанными PBS или RNS; в действительности, лечение пептидами MANS или BIO-11006 по существу полностью блокировало все метастазы от опухоли в другие участки легкого, а также в другие органы.
Таблица 3Ингибирующее действие MARCKS-связанных пептидов на метастазирование рака in vivo
Группа
Размер Опухоли(мм)
№ метастатических узелков в легких
Метастазы (пораженных мышей/всего мышей)
Среднее ±СО
Среднее ±СО(L’t; R’t)
Сердце
Селезенка
Кишечник
Диафрагме
PBS (n=3)
1,50±0,26
1,67±0,29; 5,67±0,77
1/1
2/3
1/3
2/3
RNS (n=4)
1,72±0,41
1,00±0,40; 5,75±2,01
3/4
2/4
1/4
3/4
MANS (n=4)
1,48±0,54
0;0
0/4
0/4
0/4
0/4
BIO-11006 (n=2)
1,61±0,37
0;0
0/2
0/2
0/2
0/2
Данные результаты in vivo подтверждают концепцию, что ингибирование функции MARCKS MANS-связанными пептидами может уменьшить распространение метастазов раковых клеток легкого in vivo.
ПРИМЕР 3. Влияние пептидов на миграцию раковых клеточных линий A549
2
2
Альвеолярную эпителиальную клеточную линию A549, полученную из аденокарциномы человека (инвазивную клеточную линию), получили из американской коллекции типовых культур (ATCC) и культивировали в RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, в 75 см колбах с тканевой культурой. Клетки достигали слияния на третий день культивирования при 37°C в атмосфере из 95% воздуха и 5% CO и поддерживали посредством серийного пассажа.
Тестируемые пептиды (MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200 и BIO-10901) растворяли в PBS при pH, равном 7,0; медленно перемешивая с завихрениями в течение приблизительно двух часов помогали растворяемости.
5
2
Для проведения анализа миграции использовали планшеты трансвел (24-луночные, с размером пор 8 мкм; Costar, Cambridge, MA, USA). Нижние камеры планшетов трансвел наполняли 600 мкл базовой среды, содержащей 10% FBS. Клетки (1×10) суспендировали в 100 мкл базовой среды, содержащей 1% BSA, и добавляли в верхнюю камеру, и планшеты инкубировали при 37°C с 5% CO в течение 12 часов в PBS (контроль), или указанные тестируемые пептиды при 10, 25 или 50 мкм. Клетки на верхней поверхности фильтров удаляли с использованием ватных тампонов. Клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, промывали, фиксировали и окрашивали гематоксилином и подсчитывали под микроскопом. Процентное изменение миграции определяли посредством подсчета количества клеток, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров. По меньшей мере четыре отдельных поля зрения микроскопа подсчитывали на мембрану, всего с тремя параллельными экспериментами для каждой концентрации. Для анализа данных использовали статистическое программное обеспечение «Prizm».
Как показано на фигуре 11, лечение каждым из тестируемых пептидов привело к уменьшенному количеству клеток после обработки относительно контроля (без пептида) или пептида RNS. При 50 мкм, каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200 и BIO-10901 продемонстрировал уменьшенные количества мигрировавших клеток и повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS. В меньших концентрациях действие нескольких MANS-связанных пептидов значительно различалось даже по сравнению с пептидом MANS. В частности, при 25 мкм, лечение BIO-11006, BIO-11002 или BIO-91200 приводило к значительно сниженным количествам клеток по сравнению с контролем (без пептида) или с контрольным пептидом RNS, а также по сравнению с пептидом MANS (Фигура 11).
Взятые вместе, результаты исследований показали, что MANS-связанные пептиды могут блокировать миграцию клеточных линий агрессивного рака, и что несколько различных MANS-связанных пептидов продемонстрировали воздействие на миграцию по меньшей мере трех различных клеточных линий рака. Результаты исследований также показали, что по меньшей мере два различных MANS-связанных пептида были способны блокировать или ингибировать метастазирование раковых клеток, инъецированных млекопитающим (т.е. мышам).
ПРИМЕР 4. Воздействия пептида BIO-11006 на имплантацию рака легкого
5
В данном исследовании оценивали ингибирование метастазирования рака легкого с помощью пептида BIO-11006 в ортотопической модели имплантации рака легкого у мышей SCID. Клетки аденокарциномы человека (PC-9) (1-2×10) суспендировали в 40 мкл PBS, pH 7,4, содержащей 0,5 мг/мл Matrigel™ (BD Bioscience), и инъецировали в левое легкое мышей SCID (n=3) с использованием шприца с иглой 29 калибра. BIO-11006 (100 мкм, в PBS) вводили либо (a) посредством интроперитонеальной инъекции (50 мкл) ежедневно в течение 22 дней, начиная с 3 дня после инокуляции раковых клеток, либо (b) посредством аэрозольной ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 мин ежедневно в течение 22 дней, начиная с 3 дня после инокуляции раковых клеток. Результаты исследования отображены на фигуре 12, которая графически изображает среднее количество опухолей в правом легком, сердце и диафрагме в качестве функции пути введения тестируемого соединения (интроперитонеальная инъекция против ингаляции). Как интроперитонеальная, так и аэрозольное введение BIO-11006 понижало метастазирование раковых клеток более чем на 50% в правом легком и сердце и на 100% в диафрагме. Таким образом, оба пути введения имели значительное ингибирующее действие на метастазирование раковых клеток.
ПРИМЕР 5. Ингибирование метастазирования рака легкого
5
В данном исследовании ингибирование метастазирования рака легкого посредством BIO-11006 исследовали в ортотопической модели ималнтации рака легкого у мышей SCID. Клетки аденокарциномы человека (PC-9) (1-2×10) суспендировали в 40 мкл PBS, содержащего 0,5 мг/мл Matrigel™ (BD Bioscience) и инъецировали в левое легкое мышей SCID (n=3) с использованием иглы 29 калибра. BIO-11006 вводили, начиная либо с 4 дней, либо 15 дней после инокуляции раковых клеток посредством аэрозоля с использованием 100 мкм раствора в PBS с помощью Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 мин ежедневно в течение 25 дней после инокуляции раковых клеток. В конце эксперимента мышей умерщвляли и собирали ткани легких, сердца и диафрагмы и измеряли количество опухолевых узлов в каждой ткани. Результаты данного эксперимента графически представлены на фигурах 13 и 14. Фигура 13 демонстрирует, что, когда лечение начинали через 4 дня после инокуляции раковых клеток, метастазирование опухоли ингибировалось на 60-90% в левом легком, сердце и диафрагме, и на 100% в правом легком. Когда лечение инициировали через 15 дней после инокуляции раковых клеток, ингибирование метастазирования опухоли в легких, сердце и диафрагме составляло приблизительно 50%. Фигура 14 отображает общее количество опухолевых узлов, обнаруженных во всех тканях, когда лечение пептидом начинали через 15 дней после инокуляции раковых клеток или 4 дней после инокуляции раковых клеток. Как показано на фигуре 14, лечение пептидом, начиная с 15 дней после инокуляции раковых клеток, привело к уменьшению опухолевых узлов, а лечение пептидом, начиная с 4 дней после инокуляции, привело даже к дополнительному уменьшению опухолевых узлов.
ПРИМЕР 6. Антиметастатическая эффективность пептидов
6
Данный пример демонстрирует антиметастатическую эффективность тестируемого соединения изобретения у мышей SCID, имеющих клетки аденокарциномы легких человека. Самок мышей Mus musculus NOD.CB17-Prkdcscid/NCrHsd (Harlan, Netherlands), посаженных в отдельно вентилируемые камеры, рандомизировали на шесть групп по восемь мышей в каждой. Клетки A549 (2,5×10) инъецировали мышам через хвостовую вену. Контрольная группа получала аэрозольный носитель PBS; тогда как группы 2 и 3 получали аэрозольное тестируемое соединение BIO-11006 либо от -1 дня перед инъекцией раковых клеток (группа 2), либо от +3 дня после инъекции раковых клеток (группа 3) через день в течение 7 недель через небулайзер (Aeroneb Lab). Группы 4 и 5 получали аэрозольное тестируемое соединение пептида MANS либо от -1 дня перед инъекцией клеточной линии рака (группа 4), либо от +3 дней после инъекции клеточной линии (группа 5) через день в течение 7 недель через небулайзер (Aeroneb Lab). Для аэрозольной доставки готовили раствор каждого тестируемого соединения (100 мкм) в PBS, pH 7,0. Для каждой обработки 5 мл раствора тестируемого соединения распыляли в виде аэрозоля в течение 30 минут в камеру, содержащую четыре мыши одновременно. Мониторинг массы тела мышей проводили через день в течение 7 недель.
Одна группа мышей (n=7) служила в качестве здоровой контрольной группы. Это были необработанные мыши, ранее не подвергавшиеся экспериментам, используемые для проведения мониторинга состояния здоровья мышей во время периода исследования. Все животные из всех групп были умерщвлены на 53 день. Результаты предоставлены в таблице 4 и фигуре 15. Фигура 15 сравнивает количество метастатических узелков в легких после соответствующего введения BIO-11006 и пептида MANS на 53 день после инъекции клеток A549. Таблица 4 демонстрирует количество метастатических узелков в легких, а также количество животных с фокальными опухолевыми узлами и/или отдаленных метастазов. В общем, тестируемые пептиды продемонстрировали значительное ингибирование метастазирования опухоли (70-80%) у животных при введении им BIO-11006 или пептида MANS, начиная с дня -1 или дня +3 относительно инъекции клеток A549 (Фигура 15). Более того, количество метастатических узелков у обработанных мышей было значительно снижено относительно реципиентов контрольной среды, и ни одна из обработанных мышей не продемонстрировала достоверные отдаленные метастазы (Таблица 4). Имелось несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 мышей, обработанных пептидом BIO-11006, начиная либо с дня -1, либо дня +3 по отношению к инъекции клеток A549.
Таблица 4Метастатические узлы и отдаленные метастазы у мышей, обработанных BIO-11006 или MANS
Группа
№ метастатических узелков в легкихСреднее ± SEM
Примечания
Контроль средой
97±21
Мультифокальные опухолевые узлы у всех животных (8/8)Достоверность отдаленных метастазов в диафрагме и грудине(2/8)
Пептид BIO-11006(группа обработкидень -1)
34±14
Несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 животныхНет отдаленных метастазов
Пептид BIO-11006(группа обработкидень +3)
21±6
Несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 животныхНет отдаленных метастазов
Пептид MANS(группа обработкидень -1)
22±7
Несколько фокальных опухолевых узлов у 4/8 животныхНет отдаленных метастазов
Пептид MANS(группа обработкидень +3)
13±4
Несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 животныхНет отдаленных метастазов
ПРИМЕР 7. Антиметастатическая активность MANS-связанных пептидов при меланоме у мышей
6
В данном исследовании определяли относительную антиметастатическую активность MANS-связанных пептидов, вводимых посредством четырех различных путей введения, с применением сингенной мышиной модели. Клетки клеточной линии меланомы мышей B16F10 2×10 в 200 мкл суспензии клеток в среде DMEM инъецировали в подушечки лап или между кожей и хрящом на задней стороне уха либо с помощью внутривенной, внутримышечной, либо интраперитонеальной инъекции.
Через два дня после инокуляции клеток животных рандомизировали и разделили на группы, состоящие из n=10 в каждой группе. Животным в различных группах вводили MANS-связанный пептид посредством интраперитонеального (ip), внутривенного (iv) или внутримышечного (im) способа введения соответственно в дозе, составляющей приблизительно 6,25 мг/кг. В некоторых группах животных обрабатывали посредством ингаляционного пути введения (5 мл 0,1 мМ MANS-связанного пептида в PBS) с применением профилактического небулайзера (Aeroneb Lab; Aerogen). Одна группа мышей служила в качестве контрольной группы, получающей среду, и ее обрабатывали PBS посредством im способа введения. Пептиды вводили через день в течение 6 недель.
Еженедельно делали бальную оценку опухоли. После 6 недель лечения всех животных гуманно умертвили, а образцы лимфатических узлов & других тканей собрали, зафиксировали в формалине и подвергли патогистологическому анализу для оценки присутствия метастатических меланомных клеток. Клинические неблагоприятные признаки и симптомы оценивали в течение 6 недель периода введения. Опухолевую массу и летальность оценивали в конце периода исследования. Результаты исследования покажут, что MANS-связанные пептиды ингибируют метастазирование опухоли в модели меланомы мышей.
ПРИМЕР 8: siRNA нокдаун MARCKS в раковых клетках
Данное исследование провели, чтобы определить действие нокдауна siRNA экспрессии MARCKS на миграцию раковых клеток. Клетки рака легких человека PC-9 или A-549 засеяли в пластиковые лунки и культивировали, пока клетки не достигали 70% слияния. Затем клетки транфицировали 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA (100 нМ) от Ambion (Austin, TX) посредством применения реагента DharmaFECT DuoTransfection (Dharmacon, Lafayette, CO). После 72 часов клетки собирали и отделяли эквивалентные количества белков посредством SDS/PAGE для иммуноблот-анализа с использованием MARKS-специфических антител. Вестерн-блоттинг выполняли для подтверждения siRNA-индуцированной угнетающей регуляции эндогенного MARCKS. Как показано на фигурах 16 и 17, активность белка MARCKS была изменена приблизительно на 60% в клетках PC9 (Фигура 16) и приблизительно на 50% в клетках A549 (Фигура 17) по сравнению с клетками, обработанными контрольной siRNA.
2
5
Действие нокдауна MARCKS посредством siRNA на миграцию клеток определяли с использованием трансвел анализа. После siRNA нокдауна клетки PC-9 или A549 культивировали в среде RPMI 1640 с 10% FBS при 37°C, с 5% CO. Для анализа миграции использовали Трансвел планшеты (24-луночные, размер пор 8 мкм). Нижние камеры содержали 600 мкл базовой среды+10% FBS. Клетки (1×10) суспендировали в 100 мкл базовой среды+1% BSA и добавляли в верхнюю камеру; планшеты инкубировали в течение 12 часов. Клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, окрашивали гематоксилином и подсчитывали. На мембрану обсчитывали по меньшей мере 3 отдельных поля зрения микроскопа.
Результаты исследования показаны на Фигурах 18 и 19. Обработка MARCKS siRNA в значительной степени ингибировало миграцию как клеток PC-9, так и A549. siRNA нокдаун MARCKS привел к 90%-ному уменьшению миграции клеток для клеточной линии PC9 (Фигура 18) и привело приблизительно к 50%-ному умньшению миграции клеток для клеточной линии A549 (Фигура 19). Вследствие этого ингибирование экспрессии MARCKS приводит к значительному уменьшению миграции раковых клеток.
ПРИМЕР 9. Ингибирование microRNA21 повышает MARCKS и усиливает миграцию раковых клеток
MicroRNA21 (miR21) регулирует уровни MARCKS в клетках. В данных исследованиях PC9 клетки рака легких человека трансфицировали 50 нМ или 100 нМ ингибитора miR21 или имитатора mir21 или отрицательным контролем только со средой. Уровни MARCKS измеряли через 48 часов посредством вестерн-блоттинга. Лечение ингибитором miR21 (50 нМ) повышало уровни MARCKS в клетках в ~2,5 раза (Фигура 20). Данные значения коррелируют со способностью к миграции клеток при помещении в миграционные камеры в течение 12-часового периода. Клетки, обработанные 50 или 100 нМ ингибитора miR21, показали улучшенную миграцию, коррелирующую с повышенными уровнями MARCKS, тогда как клетки, обработанные имитатором miR21, показали уменьшенную миграцию, коррелирующую с уменьшенными уровнями MARCKS (Фигура 21). Клетки, обработанные контрольной средой HiPerfect, продемонстрировали такой же уровень миграции по отношению к необработанным клеткам PC9 (Фигура 21). Результаты исследования показали, что повышение экспрессии MARCKS через ингибирование miR21 повышает миграцию раковых клеток. Более того, активация miR21 привела к уменьшению миграции клеток PC9.
Взятые вместе, исследования показали, что миграция раковых клеток и метастазирование раковых клеток могут быть ингибированы посредством выделения MARCKS с использованием нескольких различных средств ингибирования MARCKS, включая MANS-связанные пептиды и ингибиторы microRNA, т.е., имитатор miR21.
Eсли не определено иное, все технические и научные термины в данном документе имеют такие же значения, которые обычно понимаются квалифицированным специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что в практике или тестировании настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данном документе, здесь описаны предпочтительные способы и материалы. Все публикации, процитированные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки с целью раскрытия и описания конкретных аспектов изобретения, для которых цитируется публикация.
Несмотря на то, что изобретение описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, должно быть понятно, что оно допускает дополнительные модификации, и данная заявка предназначена охватывать любые варианты, способы применения и адаптации изобретения, в целом следующие принципам изобретения, и в том числе такие отклонения от представленного раскрытия, которые попадают в пределы известной или общепринятой практики в области техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применимы к существенным признакам, изложенным ранее, и как следует в объеме правовых притязаний приложенной формулы изобретения.