Способ очистки рекомбинантного ферментного препарата фосфолипазы А2 из штамма продуцента Pichia pastoris
METHOD FOR PURIFYING A RECOMBINANT ENZYME PREPARATION OF PHOSPHOLIPASE A2 FROM A PRODUCER STRAIN PICHIA PASTORIS

Изобретение относится к области биотехнологии. Фосфолипаза А2 является гидролазой, позволяющей гидролизовать фосфолипиды по положении sn-2 эфирной связи, с оптимумом активности при 55°С, рН 5.5. Предложен способ получения и очистки рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber из штамм-продуцента Pichia pastoris. Изобретение позволяет получать рекомбинантную секреторную фосфолипазу А2 Streptomyces violaceoruber с высокой концентрацией и степенью очистки более 90%.
Изобретение относится к области индустриальной биотехнологии и может быть использовано в агропромышленной области для получения высокоочищенного препарата фосфолипазы А2 для ферментативного дегумирования растительного масла, в пищевой промышленности для получения лизо-фосфолипидов. Лизо-фосфолипиды активно применяются в пищевой промышленности в качестве эмульгаторов и при производстве майонеза.
Фосфолипаза А2 (ФЛА2) является фосфолипид-2-ацил гидролазой (Е.С.3.1.1.4), которая специфично катализирует гидролиз глицерофосфолипидов по sn-2 положению эфирной связи. ФЛА2 играет важную роль в передаче клеточного сигнала и катаболизме жирных кислот.
ФЛА2 присутствует практически во всех живых организмах, встречается в различных клеточных компартментах, белок присутствует, как и внутри клетки, так и во внеклеточном виде. Секреторная фосфолипаза А2 в виду ее хорошей стабильности является удобным объектом для промышленной биотехнологии.
На данный момент разработаны различные экспрессионные системы для синтеза секреторной фосфолипазы А2 в Streptomyces violaceoruber. Первые системы экспрессии рекомбинантной свиной ФЛА2 были созданы для Saccharomyces cerevisiae. В дальнейшем была экспрессирована человеческая секреторная ФЛА2 в Е. coli. Затем была разработана система для промышленного производства человеческой фосфолипазы А2 в системе клеток СНО.
Ранее была охарактеризована рекомбинантная ФЛА2 из Streptomyces, экспрессированная в P. pastoris. Для повышения эффективности производства были разработаны штаммы-продуценты с высокой копийностью гена, позволившие увеличить продукцию фермента в 1.4 раза.
Из уровня техники известны следующие решения для очистки фосфолипазы А2:
1) Получение фосфолипазы А2 в тельцах включения, т.е. агрегированной неактивной форме, при экспрессии в Е. coli [Purification and characterization of the second Streptomyces phospholipase A2 refolded from an inclusion body. Jovel S, Kumagai T, Danshiitsoodol N, Matoba Y, Nishimura M, Sugiyama M. Protein Expr Purif. 2006; 50(1):82-8. Epub 2006 May 26.], [Extracellular production of phospholipase A2 from Streptomyces violaceoruber by recombinant Escherichia coli. Takemori D, Yoshino K, Eba C, Nakano H, Iwasaki Y. Protein Expr Purif. 2012; 81(2): 145-50. doi: 10.1016/j.pep.2011.10.002. Epub 2011 Oct 14.]. После получения телец включения производился рефолдинг, при этом происходили большие потери и выходы свернутого активного белка были сравнительно небольшими, менее 27%.
2) Получение фосфолипазы А2 при экспрессии с последующей секрецией в Е. coli из культуральной жидкости. Последующие этапы очистки включают переосаждение сульфатом аммония, диализ, колоночную анионообменную хроматографию. Использование переосаждения сульфатом аммония приводило к частичной потери активности [A novel prokaryotic phospholipase А2. Characterization, gene cloning, and solution structure. Sugiyama M1, Ohtani K, Izuhara M, Koike T, Suzuki K, Imamura S, Misaki H. J Biol Chem. 2002;277(22):20051-8. Epub 2002 Mar 15.].
2
3) Получение фосфолипазы A2 при экспрессии с последующей секрецией в Е. coli из культуральной жидкости [Патент № CN 104328095 А Phospholipase А2 with most appropriate pH being in acid range and application thereof. Epub 2014.]. Белок из культуральной жидкости преципитировали ацетоном, преципитат перерастворяли в 10 мМ Tris-HCl, 20 мМ CaCl рН=8.0, переводили при помощи гель-фильтрационной хроматографии на G-25 в 10 мМ цитрат натрия, рН=5.0. Далее фермент доочищался на катионообенной хроматографии на CM-Sepharose в градиенте 0-0,5М KCl.
4) Наиболее близким к заявленному способу является способ получение препарата фосфолипазы А2 при экспрессии в Pichia pastoris при помощи ультрафильтрации культуральной жидкости [Патент № RU 2676321 C1. Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV. Epub 2018.]. Культуральная жидкость подвергается ультрафильтрации последовательно на 100 кДа и 10 кДа мембране. Использование этого метода сопряжено с недостаточной степенью очистки и высокими потерями при очистке.
Основными недостатками известных методов очистки фосфолипазы А2 являются:
- высокая стоимость используемых реактивов и сорбентов, что отражается на себестоимости финального продукта;
- нетехнологичность приведенных методов очистки, их немасштабируемость и сложность;
- высокие потери при очистке или невысокая степень очистки полученного продукта.
Целью создания изобретения являлось создание альтернативного трехстадийного метода очистки, позволяющего получить концентрированную фосфолипазу А2 с высокой степенью очистки.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение высокоочищенной рекомбинантной фосфолипазы А2 с высокой (более 90%) степенью очистки с выходом более 50% от начального содержания белка в культуральной жидкости.
Способ выделения рекомбинантной фосфолипазы А2 из Streptomyces violaceoruber основан на использовании последовательных этапов очистки культуральной жидкости. Каждый из этих этапов играет свою роль и именно их последовательное применение и совместное использование позволяет достигать заявленного технического результата. Данные этапы включают в себя:
1) Концентрирование культуральной жидкости на керамических фильтрах TAMI (10 кДа) с концентрированием объема культуральной жидкости в 5 раз;
2) Разбавление культуральной жидкости в 10 кратным объемом буфера 20 мМ Tris-HCl рН=8.0;
3) Нанесение разбавленного раствора культуральной жидкости на анионобменную хроматографическую колонку с пришитыми к носителю четвертичными аминами и элюцию в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 в градиенте 0-1М NaCl; фракции, содержащие рекомбинантную фосфолипазу А2 не связываются с хроматографической колонкой;
4) Добавление хлорида натрия до 2М к фракциям, не связавшимся с анионообменной хроматографической колонкой;
5) Нанесение объединенных фракции на хроматографическую колонку с носителем для хроматографии гидрофобных взаимодействий, содержащими бутил-группы,
6) Элюцию в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, в градиенте хлорида натрия от 2М до нуля, понижая содержания хлорида натрия, сбор фракций в диапазоне 65-100% раствора Б; фракции после хроматографии гидрофобных взаимодействий объединяют; объединенные фракции являются конечным продуктом и содержат высокоактивную высокоочищенную фосфолипазу А2.
Пример №1. Очистка методом анионообменной хроматографии.
Культуральная жидкость объемом 4 л была сконцентрирована до объема 0,75 л на керамических фильтрах TAMI (10 кДа). Полученный после тангенциальной фильтрации раствор ФЛА2 разбавляли 10-кратным объемом буфера 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 и наносили на хроматографическую колонку Sepharose Q Fast Flow. Элюцию проводили 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 в градиенте 0-1М NaCl. Эффективность разделения была значительно лучше, чем при разделении на катионообменной смоле, чистота препарата составила ~70-75%.
При 10х кратном разбавлении раствора фосфолипазы А2 после тангенциальной фильтрации целевой продукт выходил в не адсорбировавшихся фракциях. Для увеличения выхода фосфолипазы А2 в не адсорбировавшихся фракциях в качестве раствора А использовали 20 мМ Tris-HCl, 20 мМ NaCl, рН=8.0. При этом примеси адсорбировались на хроматографическую колонку. Чистота фракций, содержащий целевой продукт была ~80% по белку.
Фосфолипаза А2 не связывалась с колонкой, при этом примеси адсорбировались на хроматографической колонке.
Пример №2. Очистка методом хроматографии гидрофобных взаимодействий.
С помощью анионообменной хроматографии препарат ФЛА2 удалось избавить от более крупных белковых примесей. После проведения анионообменной хроматографии использовали хроматографию гидрофобных взаимодействий. Был использован носитель Butyl-Sepharose Fast Flow. Не адсорбировавшиеся фракции после анионообменной хроматографии объединяли, добавляли 8,7 г NaCl на 50 мл фракций (до 3М NaCl) и наносили при скорости потока 1 мл/мин на хроматографическую колонку. Элюцию проводили 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, понижая содержания хлорида натрия. Фракции собирали в диапазоне 65-100% раствора Б. Эти фракции содержали высокоочищенный препарат фосфолипазы А2.
Гидрофобная хроматография позволила избавиться от подавляющего большинства примесных продуктов, добиться высокой (~90% по данным денситометрического анализа) степени очистки, а также сконцентрировать образец. После очистки активность полученной фосфолипазы А2 соответствовала ферментативной активности в 210 ед./мл.
Пример №3. Определение фосфолипазной активности.
2
max
max
Фосфолипазную активность определяли с использованием флуоресцентного субстрата 1 -пальминтоил-2-(10-пиренилдеканоил)-зп-глицеро-3-фосфорилхолина (10-pyrene PC, Molecular probes, Голландия). Для измерения флуоресценции к 1 мл буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl, рН=7.5, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA добавляли 10 мкл субстрата (конечная концентрация 2 мкМ), 10 мкл 10% раствора БСА (конечная концентрация 0,1%), и 6 мкл 1М CaCl (конечная концентрация 6 мМ). Реакцию инициировали добавлением 5 мкл раствора 0.5 мг/мл ФЛА2. В качестве положительного контроля использовали кислую ФЛА2 СМ2 из яда кобры N. kaouthia. Флуоресценцию детектировали на флуоресцентном спектрофотометре Fluoromax-4(HORIBA Scientfic, UK) (λex=345 нм, λeм=395 нм).
-4
0
Активность фосфолипаз А2 рассчитывали по формуле A=2×10×(S-S)×V/Fmax и приводили в мг белка, где S - увеличение интенсивности флуоресценции в минуту в присутствии фосфолипазы; S0 - увеличение интенсивности флуоресценции в минуту в контроле; V - объем добавляемого 0,2 мМ 10-pyrene PC, мкл; Fmax - максимальная интенсивность флуоресценции при добавлении 5 мкг кислую ФЛА2 СМ2 из яда кобры N. kaouthia.