СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ И ИШЕМИЧЕСКОГО-РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ СЕРДЦА
METHODS FOR TREATMENT OF HEART FAILURE AND ISCHEMIC-REPERFUSION INJURY OF HEART

Настоящее изобретение относится к применению экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца для лечения или профилактики заболевания сердца, в частности, сердечной недостаточности и ишемического-реперфузионного повреждения сердца. Более конкретно, изобретение относится к агентам, в частности к ингибиторам дипептидилпептидазы-4 (ингибиторы DPP-4), и фармацевтическим композициям, содержащим указанные агенты, и к их применению в комбинации с ударно-волновой терапией для лечения или профилактики сердечных нарушений, таких как сердечная недостаточность и ишемическое-реперфузионное повреждение сердца. Указанные агенты можно применять в отдельности или в комбинации с другими терапевтически активными агентами, такими как агенты, мобилизующие стволовые клетки, в частности, паракринные факторы, такие как паратиреоидный гормон, и стволовые клетки, такие как мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга, в частности гемопоэтические прогениторные клетки. Также предложены способы терапии, которые включают проведение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца в отдельности или в комбинации с введением указанных агентов для вышеуказанных способов применения. Указанные агенты также можно применять для производства или получения лекарственных средств для вышеуказанных способов лечения.
От сердечной недостаточности страдает 1-2% населения Великобритании, и это количество увеличивается с возрастом (1% младше 65 лет, 6-7% в возрасте 75-84 лет, 12-22% старше 85 лет). Основной причиной сердечной недостаточности в Великобритании является ишемическая болезнь сердца (примерно у 70% пациентов с сердечной недостаточностью), и средняя ожидаемая продолжительность жизни составляет 3 года после постановки диагноза, что значительно хуже по сравнению со многими формами злокачественных образований, и примерно 14% пациентов с сердечной недостаточностью умирают в течение 6 месяцев после постановки диагноза.
Сердечная недостаточность является причиной 5% случаев госпитализации и расходует 1-2% бюджета Национальной службы здравоохранения Великобритании (англ. National Health Service - NHS). Этот синдром не только является значительным бременем с точки зрения здоровья и затрат, но также нежелательным образом влияет на качество жизни. Ожидается, что с ростом среднего возраста населения в ближайшие 25 лет количество случаев посещения лечебных учреждений по причине сердечной недостаточности увеличится на 50%.
Ишемическая болезнь сердца обычно приводит к инфаркту миокарда (сердечный приступ), и несмотря на то, что первичная ангиопластика и использование стентов для лечения пациентов с сердечными приступами повысили шанс их выживания, число случаев сердечной недостаточности фактически увеличивается. Полагают, что такое увеличение числа случаев сердечной недостаточности отчасти может быть связано с тем фактом, что реперфузионное повреждение на 50% определяет конечный размер инфаркта и является причиной 25% случаев острой сердечной недостаточности.
Несмотря на развитие способов медикаментозной терапии и электрофизиологического вмешательства, у многих пациентов с застойной (хронической) сердечной недостаточностью сохраняются симптомы, связанные с понижением качества жизни и неприемлемо плохим прогнозом. В некоторых случаях может рассматриваться радикальное лечение, такое как трансплантация сердца или имплантация аппарата вспомогательного кровообращения, но количество доступных органов ограничено, и уровень 10-летней выживаемости среди пациентов с трансплантированным сердцем составляет только 50%.
У субъектов, страдающих от сердечных приступов, инфаркт миокарда приводит к тяжелому кислородному голоданию сердечной ткани, и последующее лечение (например, удаление или обход блокады) обеспечивает реперфузию ткани и последующую реоксигенацию клеток сердца. Тем не менее, если клетки находятся в условиях тяжелой кислородной недостаточности, а после этого происходит их реоксигенация, то у части клеток в ткани может быть превышен стрессовый порог, в результате чего запускается необратимый процесс запрограммированной гибели клеток, называемый апоптозом. Несмотря на то что структура клеток может оставаться неизменной, они удаляются из организма контролируемым образом по причине потери жизнеспособности. Таким образом, указанные «стрессовые» условия являются общими у субъектов, страдающих от сердечных приступов, и кардиомиоциты в сердечной мышце, у которых превышено пороговое значение стресса в результате кислородного голодания/реоксигенации, заменяются рубцовой тканью, что и называют ишемическим-реперфузионным повреждением сердца. Утрата жизнеспособной мышечной ткани сердца нарушает способность сердца прокачивать кровь, а в наиболее тяжелых случаях приводит к сердечной недостаточности. Как отмечалось выше, прогноз для таких пациентов является плохим.
Гомеостаз сердца поддерживается мультипотентными стволовыми клетками сердца, и их способность к пластичности развития является многообещающей для предупреждения и лечения сердечной недостаточности у человека за счет восстановления пораженной инфарктом ткани жизнеспособными прогениторными клетками. Клеточная терапия действительно может приводить к функциональному улучшению после инфаркта миокарда. Например, стволовые клетки вводят при сердечной недостаточности напрямую в сердце различными хирургическими способами, включая внутривенную, внутрикоронарную, трансэндокардиальную и внутримиокардиальную инъекцию. Тем не менее, на момент подачи заявки таким образом достигалось лишь незначительное улучшение функции сердца. Это может быть связано с плохим удерживанием клеток в сердце, низкой выживаемостью клеток и/или с тем фактом, что однократная доза может быть недостаточной для устойчивого улучшения функции левого желудочка. Кроме того, такие инвазивные процедуры имеют многочисленные недостатки, в частности, возможные смертельно опасные осложнения, связанные с инвазивной хирургией сердца. Действительно, хирургическое введение стволовых клеток является дорогостоящим и затратным по времени, причиной чему отчасти является процесс получения стволовых клеток.
Таким образом, существует потребность в новом терапевтическом подходе при сердечной недостаточности. В частности, способы подавления гибели кардиомиоцитов у пациентов с сердечными приступами могут эффективно снижать вероятность сердечной недостаточности и улучшать прогноз у пациентов, имеющих сердечную недостаточность или риск ее появления.
При работе над настоящим изобретением неожиданно было обнаружено, что апоптоз подверженных гипоксии кардиомиоцитов можно предотвращать путем воздействия на клетки низкоэнергетическими ударными волнами. Важно отметить, что автор настоящего изобретения установил, что лечение подверженных гипоксии кардиомиоцитов ударными волнами увеличивает фосфорилирование, т.е. активацию, протеинкиназы В (также называемой Akt). Akt является ключевым регулятором апоптоза, и активированная Akt фосфорилирует и ингибирует различные проапоптотические белки, включая члены семейства BcI-2, Bad, Вах, каспазу-9, GSK-3 и FoxOL Тем не менее, применение ингибитора пути PI3K/Akt (LY294002) не влияло на антиапоптотическое действие, оказываемое воздействием ударных волн, т.е. антиапоптотическое действие лечения с использованием ударных волн не зависит от пути PI3K/Akt (см. пример 5). Кроме того, автор настоящего изобретения продемонстрировал, что экспрессия SDF1, который, как известно, является антиапоптотическим, не увеличивается в кардиомиоцитах при воздействии ударных волн. Тем не менее, интересно отметить, что воздействие ударными волнами на сердечную ткань в целом приводит к увеличению уровня различных антиапоптотических белков, включая SDF1, МСР1, ANG1, VEGF-A, NOS3 и ТАС-1. Эти факты позволили автору настоящего изобретения предложить новые способы терапии для лечения различных сердечных расстройств с использованием ударно-волновой терапии, в частности, для лечения повреждения, вызванного гипоксией и последующей нормоксией, т.е. ишемического-реперфузионного повреждения сердца.
Таким образом, настоящее изобретение в целом относится к способам и агентам для снижения или минимизации апоптоза (т.е. гибели) клеток сердечной ткани (например, кардиомиоцитов). Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению ударно-волновой терапии (т.е. экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца) в отдельности или в комбинации с другими способами терапии, в частности, с фармацевтическими или фармакологическими способами терапии (называемому в настоящем документе комбинационным способом терапии или комбинированным способом терапии), для подавления, предупреждения или минимизации апоптоза клеток сердца, в частности кардиомиоцитов. Кроме того, указанные способы терапии и фармацевтические агенты можно применять в комбинации с клеточной терапией для исправления и/или восстановления тканей и функций сердца.
Например, в настоящем изобретении предложены способы лечения субъектов, страдающих от острого инфаркта миокарда, путем проведения экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца, в частности, в качестве вспомогательного лечения при коронарной ангиопластике и стентировании. Экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца согласно настоящему изобретению предпочтительно следует начинать как можно раньше после инфаркта миокарда. Тем не менее, у пациентов, которые не сразу посещают лечебное учреждение и которые не удовлетворяют критериям проведения неотложной реваскуляризации или имеют противопоказания для данной процедуры, экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца согласно настоящему изобретению можно проводить отдельно. Не желая быть связанными теорией, полагают, что экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца согласно настоящему изобретению может задерживать прогрессирующую утрату оставшихся кардиомиоцитов за счет предупреждения апоптоза, что может быть особенно предпочтительным у пациентов с подтвержденным инфарктом, т.е. для предупреждения, снижения или минимизации возможного появления сердечной недостаточности.
Таким образом, в самом широком смысле можно считать, что в настоящем изобретении предложен способ снижения, предупреждения или минимизации клеточного апоптоза в сердечной ткани, включающий проведение ударно-волновой терапии указанной сердечной ткани. В частности, в изобретении предложен способ снижения, предупреждения или минимизации апоптоза кардиомиоцитов в сердечной ткани (например, в сердце), включающий проведение ударно-волновой терапии указанной сердечной ткани (например, сердца).
В качестве альтернативы настоящее изобретение относится к ударно-волновой терапии для применения в снижении, предупреждении или минимизации клеточного апоптоза в сердечной ткани. В частности, настоящее изобретение относится к ударно-волновой терапии для применения для снижения, предупреждения или минимизации апоптоза кардиомиоцитов в сердечной ткани (например, в сердце), включающей проведение ударно-волновой терапии указанной сердечной ткани (например, сердца).
Как отмечалось выше, было обнаружено, что ударно-волновая терапия согласно настоящему изобретению является эффективной антиапоптотической терапией кардиомиоцитов in vitro, например, для предупреждения, снижения или минимизации апоптоза кардиомиоцитов in vitro. Соответственно, можно считать, в настоящем изобретении предложены новые способы и средства для предупреждения, снижения или минимизации апоптоза кардиомиоцитов in vitro (например, в культуре, при выращивании кардиомиоцитов для получения искусственных или синтетических тканей) или ex vivo (например, в сердечной ткани, удаленной у субъекта, например, в сердце или сердечной ткани, например, в клапане, для трансплантации).
Согласно особенно предпочтительному аспекту в изобретении предложены новые способы и средства для предупреждения, снижения или минимизации апоптоза кардиомиоцитов in vivo, т.е. у субъекта. Например, предложены способы и средства для предупреждения, снижения или минимизации апоптоза кардиомиоцитов для применения для лечения субъекта после инфаркта миокарда, например, для снижения, предупреждения или минимизации ишемического-реперфузионного повреждения сердца и/или сердечной недостаточности или в качестве альтернативы для улучшения прогноза пациентов с сердечной недостаточностью. Таким образом, очевидно, что ударно-волновую терапию необязательно следует проводить in vivo для обеспечения действия на жизнеспособность клеток (например, кардиомиоцитов) in vivo (т.е. в организме субъекта, которого лечат). Таким образом, в предпочтительных вариантах реализации изобретения ударно-волновую терапию проводят вне организма субъекта, т.е. ударно-волновая терапия является неинвазивной. Другими словами, ударно-волновая терапия согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца.
Таким образом, можно считать, что в некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ лечения, предупреждения или минимизации ишемического-реперфузионного повреждения сердца, включающий проведение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца субъекту, нуждающемуся в этом. Таким образом, можно считать, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ улучшения прогноза для субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления, включающий проведение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца указанному субъекту. Как отмечалось выше, указанный способ можно применять в комбинации с терапией для ангиопластики и стентирования.
В качестве альтернативы в изобретении предложена экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца для применения для лечения, предупреждения или минимизации ишемического-реперфузионного повреждения сердца. Таким образом, можно считать, что в некоторых вариантах реализации в изобретении предложена экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца для применения в улучшении прогноза у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления.
В другом варианте реализации в изобретении предложено применение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца для лечения, предупреждения или минимизации ишемического-реперфузионного повреждения сердца. Таким образом, можно считать, что в некоторых вариантах реализации в изобретении предложено применение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца для улучшения прогноза у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления.
Как отмечалось выше, автор настоящего изобретения установил, что воздействие на сердечную ткань ударными волнами увеличивает секрецию различных хемокинов, в частности, способствующих выживанию хемокинов, таких как SDF-1 (фактор стромальных клеток 1, также называемый хемокином с мотивом С-Х-С 12 (CXCL12), МСР1 (моноцитарный хемоаттрактантный белок 1, также называемый CCL2), субстанция Р и IGF1 (инсулиноподобный фактор роста 1), т.е. ударные волны увеличивают уровень способствующего выживанию «секретома» в сердечной ткани. Важно отметить, что секретом предположительно может иметь форму одной или более экзосом, например, выделенных из клеток везикул, содержащих один или более хемокинов. Несмотря на то, что увеличение уровня способствующего выживанию секретома (или экзосом) не объясняет антиапоптотическое действие ударных волн на кардиомиоциты, предполагается, что увеличение указанных способствующих выживанию хемокинов может увеличивать выживаемость клеток сердца в условиях стресса, связанных с ишемией-реперфузией сердца. Тем не менее, важно отметить, что быстрое расходование хемокинов означает, что повышение уровня способствующего выживанию секретома, вызванное ударно-волновой терапией, может быть временным, а это значит, что для максимизации эффектов ударно-волновой терапии, описанных выше может требоваться повторное лечение ударными волнами. Тем не менее, в некоторых случаях повторное проведение ударно-волновой терапии может быть непрактичным или становится таким. В общем случае, необходимость повторного и регулярного посещения клиники предпочтительно должна быть устранена, так как это создает дополнительную нагрузку для пациента и специалистов в области здравоохранения. Кроме того, повторное проведение лечения ударными волнами может вызывать дискомфорт, что приводит к пропуску лечебных процедур и понижению общей эффективности лечения.
Быстрое расходование цитокинов является результатом их разрушения и/или инактивации. В разрушении хемокинов in vivo участвуют различные ферменты, такие как дипептидилпептидаза-IV (DPP-IV или DPP-4), которую также называют белком, образующим комплекс с аденозиндеаминазой, 2 или кластером дифференцировки 26 (CD26). DPP-4 представляет собой антигенный фермент, экспрессируемый на поверхности большинства типов клеток. Он представляет собой внутримембранный гликопротеин и является сериновой экзопептидазой, которая отщепляет Х-пролиновые дипептиды от N-конца полипептидов. Таким образом, DPP-4 имеет разнообразные субстраты, включая SDF-1, МСР1, субстанцию Р и IGF1.
Соответственно, автор настоящего изобретения определил, что ударно-волновую терапию можно эффективно объединять с введением одного или более ингибиторов протеаз для снижения, предупреждения или минимизации разрушения и/или инактивации хемокинов, за пускаемо го (-ой) ударно-волновой терапией, т.е. для продления периода полужизни способствующего выживанию секретома (который может иметь форму одной или более экзосом) сердечной ткани, возникающего в результате ударно-волновой терапии (называемой в настоящем документе комбинационной терапией или комбинированной терапией). Например, ингибиторы DPP-4 хорошо известны в данной области техники, и их можно легко применять в комбинации со способами ударно-волновой терапии, описанными выше. Таким образом, ингибиторы DPP-4 могут усиливать действие ударно-волновой терапии в рамках способов и применений, описанных выше, т.е. они могут усиливать или увеличивать антиапоптотическое действие ударных волн в сердечной ткани, в частности, в кардиомиоцитах, в результате чего увеличивается эффективность лечения ишемического-реперфузионного повреждения сердца или минимизируется или предупреждается повреждение сердечной ткани, в частности, сердечной мышцы, вызванное ишемией-реперфузией сердца, например, дополнительно улучшается прогноз у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления. Важно отметить, что действие комбинированной терапии (комбинационной терапии) может заключаться в уменьшении размера конечного инфаркта и/или предупреждении, сдерживании или задержке прогрессирования до сердечной недостаточности. Соответственно, в некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ лечения или предупреждения сердечной недостаточности или лечения ишемического-реперфузионного повреждения сердца, включающий проведение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца и введение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный(-ую) ингибитор или композицию вводят до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии. Таким образом, в некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ улучшения прогноза у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления, включающий проведение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца и введение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный(-ую) ингибитор или композицию вводят до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
В качестве альтернативы в изобретении предложен(-а) ингибитор DPP-4 или фармацевтическая композиция, содержащая указанный ингибитор, для применения в:
(a) лечении или предупреждении сердечной недостаточности; или
(b) лечении ишемического-реперфузионного повреждения сердца,
у субъекта, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанный(-ая) ингибитор или композиция предназначен(-а) для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии. Таким образом, в изобретении предложен(-а) ингибитор DPP-4 или фармацевтическая композиция, содержащая указанный ингибитор, для применения в улучшении прогноза у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанный ингибитор или композиция предназначен(-а) для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
В дополнительном варианте реализации в изобретении предложено применение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, для получения лекарственного средства для:
(a) лечения или предупреждения сердечной недостаточности; или
(b) лечения ишемического-реперфузионного повреждения сердца,
у субъекта, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанное лекарственное средство предназначено для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии. Таким образом, в изобретении предложено применение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, для получения лекарственного средства для улучшения прогноза у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанный ингибитор или композиция предназначен(-а) для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
Автор настоящего изобретения также определил, что комбинация лечения ударными волнами и терапии с использованием ингибитора DPP-4 также предпочтительно действует посредством усиления ангиогенеза в сердечной ткани, которое может быть особенно благоприятным при лечении субъектов с сердечной недостаточностью (например, хронической ишемической болезнью сердца или хронической ишемий миокарда) или ишемическим-реперфузионным повреждением сердца.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ запуска (например, усиления или улучшения) ангиогенеза в сердечной ткани у субъекта, включающий проведение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца и введение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, указанному субъекту, где указанный(-ую) ингибитор или композицию вводят до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии. В особенно предпочтительных вариантах реализации у субъекта имеется сердечная недостаточность (например, хроническая ишемическая болезнь сердца или хроническая ишемия миокарда) или ишемическое-реперфузионное повреждение сердца.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ лечения или предупреждения сердечной недостаточности (например, хронической ишемической болезни сердца или хронической ишемии миокарда) или лечения ишемического-реперфузионного повреждения сердца у субъекта путем запуска ангиогенеза в сердечной ткани указанного субъекта, включающий проведение экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца и введение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный(-ую) ингибитор или композицию вводят до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
В качестве альтернативы в изобретении предложен(-а) ингибитор DPP-4 или фармацевтическая композиция, содержащая указанный ингибитор, для применения в запуске ангиогенеза в сердечной ткани у субъекта (например, субъекта с сердечной недостаточностью (например, с хронической ишемической болезнью сердца или хронической ишемией миокарда) или ишемическим-реперфузионным повреждением сердца), где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанный(-ая) ингибитор или композиция предназначен(-а) для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии. Таким образом, в изобретении предложен(-а) ингибитор DPP-4 или фармацевтическая композиция, содержащая указанный ингибитор, для применения для лечения или предупреждения сердечной недостаточности (например, хронической ишемической болезни сердца или хронической ишемии миокарда) или лечения ишемического-реперфузионного повреждения сердца у субъекта путем запуска ангиогенеза в сердечной ткани у указанного субъекта, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанный(-ая) ингибитор или композиция предназначен(-а) для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
В дополнительном варианте реализации в изобретении предложено применение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, для получения лекарственного средства для запуска ангиогенеза в сердечной ткани у субъекта (например, субъекта с сердечной недостаточностью (например, с хронической ишемической болезнью сердца или хронической ишемией миокарда) или ишемическим-реперфузионным повреждением сердца), где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию, и указанное лекарственное средство предназначено для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии. Таким образом, в изобретении предложено применение ингибитора DPP-4 или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения сердечной недостаточности (например, хронической ишемической болезни сердца или хронической ишемии миокарда) или лечения ишемического-реперфузионного повреждения сердца у субъекта путем запуска ангиогенеза в сердечной ткани у указанного субъекта, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанный(-ая) ингибитор или композиция предназначен(-а) для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
Очевидно, что способы и применения, описанные выше для запуска ангиогенеза в сердечной ткани субъекта, также можно использовать для улучшения прогноза у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления.
Также известно, что стволовые клетки секретируют паракринные факторы, которые обладают антиапоптотическим эффектом и оказывают благоприятное действие у пациентов, страдающих от сердечных приступов и/или сердечной недостаточности, в частности, от сердечной недостаточности, вызванной ишемическим-реперфузионным повреждением. Тем не менее, как обсуждалось выше, введение стволовых клеток в сердце является крайне инвазивным, дорогостоящим и связано с плохим удерживанием клеток. Кроме того, несмотря на то, что способы ударно-волновой терапии, описанные выше (включая комбинированную терапию), могут минимизировать повреждение сердечной ткани, вызванное инфарктом миокарда, например, ишемическое-реперфузионное повреждение сердца, они не обеспечивают какой-либо функциональный благоприятный эффект в сердце с точки зрения улучшения фракции выброса, т.е. способы ударно-волновой терапии, описанные выше, не восстанавливают функцию сердца или не устраняют повреждения, вызванные инфарктом миокарда, например, ишемическое-реперфузионное повреждение сердца.
Таким образом, автор настоящего изобретения дополнительно определил, что эффективность способов и применений согласно настоящему изобретению, описанных выше, может быть дополнительно увеличена путем обеспечения у субъектов стволовых клеток или прогениторных клеток, которые могут заменять клетки сердца, в частности, кардиомиоциты, погибшие в результате стрессовых условий, связанных с инфарктом миокарда, например, ишемического-реперфузионного повреждения. С этой точки зрения предполагается, что способствующий выживанию секретом (который может иметь форму одной или более экзосом), образующийся в сердечной ткани при воздействии ударных волн, может действовать посредством привлечения или рекрутинга стволовых клеток в поврежденную ткань и тем самым увеличивать количество клеток, удерживаемых в сердце и обеспечивать эффективное восстановление поврежденной ткани (т.е. восстановление, по меньшей мере в некоторой степени, утраченной функции сердца). Другими словами, можно считать, что ударно-волновая терапия согласно настоящему изобретению может обеспечивать среду, которая способствует удерживанию стволовых клеток в сердечной ткани и последующее приживление указанных клеток в сердечной ткани или усиливает их. Несмотря на то, что стволовые клетки можно вводить в сердечную ткань напрямую, например, путем внутривенной, внутрикоронарной, трансэндокардиальной и/или внутримиокардиальной инъекции, как описано выше, из последующего обсуждения будет очевидно, что настоящее изобретение устраняет необходимость инвазивного введения стволовых клеток.
В этом отношении, помимо обеспечения среды, которая способствует удержанию стволовых клеток в сердечной ткани или усиливает его, секретом в сердечной ткани (который может иметь форму одной или более экзосом), возникающий в результате ударно-волновой терапии согласно настоящему изобретению, может действовать посредством привлечения или рекрутинга стволовых клеток из участков, отличных от сердца, например, стволовых клеток, присутствующих в крови. Другими словами, способ согласно настоящему изобретению может способствовать хомингу стволовых клеток в сердце. Это может позволить неинвазивно вводить стволовые клетки, т.е. путем инъекции в участок, отличный от сердца, например, инъекции в периферический кровоток. Таким образом, настоящее изобретение устраняет необходимость открытой хирургии сердца, и прямая инъекция стволовых клеток в сердечную ткань, например, с введением катетеров в коронарную кровеносную систему, становится необязательной.
В настоящем изобретении предпочтительно предполагается применение эндогенных стволовых клеток, например, стволовых клеток, присутствующих в крови субъекта, которого лечат. Таким образом, в некоторых вариантах реализации ударно-волновая терапия согласно настоящему изобретению может обеспечивать неинвазивный хоминг (т.е. рекрутинг и последующее приживление) стволовых клеток из периферического кровотока в сердечную ткань. В этом отношении полезно увеличивать количество стволовых клеток в крови, например, с использованием фармакологического мобилизатора стволовых клеток, такого как паратиреоидный гормон, что более подробно обсуждается ниже.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать введение фармакологического мобилизатора стволовых клеток, например, паратиреоидного гормона или его фрагмента, указанному субъекту (в рамках так называемой комбинационной терапии).
В качестве альтернативы, ингибитор (например, ингибитор DPP-4) или фармацевтическая композиция, содержащая указанный ингибитор, обеспечен(-а) в виде комбинированного препарата совместно с фармакологическим мобилизатором стволовых клеток, например, паратиреоидным гормоном или его фрагментом, для раздельного, одновременного или последовательного применения или введения субъекту (в рамках так называемой комбинационной терапии). Таким образом, в дополнительных вариантах реализации в изобретении предложено применение ингибитора (например, ингибитора DPP-4) или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, для получения комбинированного препарата совместно с фармакологическим мобилизатором стволовых клеток, например, паратиреоидным гормоном или его фрагментом, для раздельного, одновременного или последовательного применения или введения субъекту (в рамках так называемой комбинационной терапии).
Для некоторых субъектов (т.е. пациентов) предпочтительно можно собирать стволовые клетки у субъекта (например, перед началом лечения) и вводить указанные клетки субъекту (например, путем инъекции в периферический кровоток) в наиболее подходящий момент времени, например, перед проведением ударно-волновой терапии, что более подробно обсуждается ниже. Например, сбор или получение стволовых клеток у субъекта может быть необходимым, если субъект невосприимчив к агентам, применяемым для мобилизации стволовых клеток, например, паратиреоидному гормону, или если данные агенты противопоказаны. В некоторых вариантах реализации выращивание популяции стволовых клеток in vitro (т.е. выращивание эндогенных стволовых клеток субъекта in vitro) перед введением может быть эффективным. Указанные способы выращивания хорошо известны в данной области техники.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать введение стволовых клеток указанному субъекту (в рамках так называемой комбинационной терапии). В частности, способ может включать стадию получения или сбора стволовых клеток у субъекта (например, субъекта, которого лечат) и необязательного выращивания популяции стволовых клеток in vitro перед введением.
В качестве альтернативы ингибитор (например, ингибитор DPP-4) или фармацевтическая композиция, содержащая указанный ингибитор, обеспечен(-а) в виде комбинированного препарата совместно со стволовыми клетками для раздельного, одновременного или последовательного применения или введения субъекту (в рамках так называемой комбинационной терапии). Таким образом, в дополнительных вариантах реализации в изобретении предложено применение ингибитора (например, ингибитора DPP-4) или фармацевтической композиции, содержащей указанный ингибитор, для получения комбинированного препарата совместно со стволовыми клетками для раздельного, одновременного или последовательного применения или введения субъекту (в рамках так называемой комбинационной терапии).
Таким образом, в некоторых вариантах реализации стволовые клетки получают у указанного субъекта и необязательно выращивают in vitro перед введением. Таким образом, в некоторых вариантах реализации стволовые клетки представляют собой экзогенные стволовые клетки, например, аутогенные стволовые клетки.
В дополнительных вариантах реализации стволовые клетки можно применять в комбинации с фармакологическими агентами, подходящими для мобилизации стволовых клеток, такими как паратиреоидный гормон или его фрагмент (в рамках так называемой комбинационной терапии).
В некоторых случаях использование стволовых клеток субъекта-донора может быть желательным или необходимым. Таким образом, в некоторых вариантах реализации способ может включать стадию получения или сбора стволовых клеток у субъекта-донора и необязательно выращивания популяции стволовых клеток in vitro перед введением субъекту для лечения. Таким образом, в некоторых вариантах реализации, стволовые клетки представляет собой экзогенные донорские стволовые клетки, т.е. аллогенетические стволовые клетки.
Следует понимать, что стволовые клетки, полученные или собранные у субъекта, могут не подходить для непосредственного введения, т.е. предпочтительно перед введением может требоваться модификация стволовых клеток. Например, как отмечалось выше, выращивание или культивация стволовых клеток in vitro может быть эффективным(-ой) для увеличения количества стволовых клеток, предназначенных для введения. Кроме того, или в качестве альтернативы, может быть эффективным выделение или разделение различных типов стволовых клеток перед введением. Кроме того, в некоторых вариантах реализации можно обрабатывать стволовые клетки для их дифференцировки, чтобы сделать их более эффективными для применения в способах согласно настоящему изобретению, например, для дифференцировки клеток в типы клеток, которые могут быть особенно предпочтительными в терапии согласно настоящему изобретению, например, в клетки-макрофаги М2 с, что обсуждается ниже. Например, стадия сбора или получения стволовых клеток может включать выделение прогениторных клеток крови у субъекта (например, субъекта, которого лечат, или субъекта-донора), таких как мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга, и выращивание указанных клеток in vitro в условиях, подходящих для предпочтительных стволовых клеток или популяций стволовых клеток, более подробно описанных ниже. Тем не менее, в некоторых вариантах реализации прогениторные клетки крови не претерпевают дифференцировку in vitro, т.е. в некоторых вариантах реализации стволовые клетки, предназначенные для введения в рамках способа или применения согласно настоящему изобретению, представляют собой прогениторные клетки крови, например, мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга.
Как будет более подробно обсуждаться ниже, автор настоящего изобретения определил, что воздействие на клетки эндотелия сосудов ударными волнами приводит к быстрому и временному увеличению экспрессии гена SDF-1. Максимальная экспрессия SDF-1 наблюдается в период 2-6 часов, т.е. примерно через 4 часа после воздействия ударных волн, и возвращается к исходному уровню через 24 часа. Схожий профиль экспрессии наблюдали для VEGFA и МСР1 в фибробластах сердца, для которых максимальную экспрессию отмечали примерно через 3 часа после воздействия ударных волн. Тем не менее, несмотря на то, что воздействие ударных волн увеличивает экспрессию SDF-1 в фибробластах, экспрессия происходит с задержкой, в результате чего максимальная экспрессия не достигается по меньшей мере примерно 24 часа после воздействия ударных волн.
Как обсуждалось выше, предполагается, что секретом (который может иметь форму одной или более экзосом), возникающий в результате ударно-волновой терапии, может действовать посредством рекрутинга стволовых клеток в сердечную ткань и усиливать их удерживание в указанной ткани. Соответственно, в некоторых вариантах реализации предпочтительно можно вводить стволовые клетки и/или фармакологический мобилизатор стволовых клеток перед ударно-волновой терапией. Например, стволовые клетки и/или фармакологический мобилизатор стволовых клеток можно вводить (т.е. они предназначены для введения) по меньшей мере за 8 часов перед ударно-волновой терапией, например, по меньшей мере за 12, 16, 20, 24 часа перед ударно-волновой терапией. В некоторых вариантах реализации стволовые клетки и/или фармакологический мобилизатор стволовых клеток можно вводить (т.е. они предназначены для введения) по меньшей мере за 24, 30, 36, 42 или 48 часов перед ударно-волновой терапией.
В некоторых вариантах реализации может быть эффективным введение стволовых клеток и/или фармакологического мобилизатора стволовых клеток непосредственно после ударно-волновой терапии, т.е. в кратчайшие сроки после ударно-волновой терапии. Такое введение можно осуществлять в дополнение к предшествующему введению, описанному выше, или в качестве альтернативного варианта реализации, т.е. в некоторых вариантах реализации стволовые клетки и/или фармакологический мобилизатор стволовых клеток не вводят перед ударно-волновой терапией. Непосредственное введение или введение в кратчайшие сроки после ударно-волновой терапии означает введение через несколько минут или часов после завершения ударно-волновой терапии, например, через 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 или 120 минут после завершения ударно-волновой терапии, т.е. завершения воздействия дозы ударно-волновой терапии, например, в 500-2000 импульсов. Например, введение можно проводить через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов после завершения ударно-волновой терапии. Как будет дополнительно обсуждаться ниже, в некоторых вариантах реализации при ударно-волновой терапии дозу (например, в 500-2000 импульсов) можно вводить более чем за одну процедуру, т.е. введение дозы можно прерывать. Таким образом, в некоторых вариантах реализации стволовые клетки и/или фармакологический мобилизатор стволовых клеток можно вводить во время ударно-волновой терапии, например, во время перерыва между дозами ударных волн.
Термины «ударно-волновая терапия» и «экстракорпоральная ударно-волновая терапия» (ЭУВТ), которые используют в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к воздействию высокоамплитудными импульсами механической энергии (волны звукового давления), схожими со звуковыми волнами, как правило, вырабатываемыми в электромагнитной катушке. В частности, ЭУВТ относится к применению «низкоэнергетических» ударных волн. В этом смысле «высокоэнергетические» ударные волны могут быть определены как волны, используемые в «экстракорпоральной ударно-волновой литотрипсии» (ЭУВЛ), которая является неинвазивным способом лечения камней в почках. Таким образом, «низкоэнергетические» ударные волны для применения в настоящем изобретения отличаются от ударных волн, применяемых в ЭУВЛ.
2
2
2
2
2
Таким образом, низкоэнергетические ударные волны могут быть определены как ударные волны, имеющие энергию примерно 0,01-0,50 мДж/мм (примерно 0,1-5 бар (10-500 кПа)). В противоположность этому, высокоэнергетические ударные волны могут быть определены как ударные волны, имеющие энергию по меньшей мере 0,85 мДж/мм(примерно 8,5 бар (850 кПа)). Таким образом, в предпочтительном варианте реализации низкоэнергетические ударные волны для применения в настоящем изобретении имеют энергию примерно 0,01-0.45 мДж/мм, например, 0,02-0,40, 0,03-0,35, 0,04-0,30 или 0,05-0,25 мДж/мм (примерно 0,1-4,5 бар, например, 0,2-4, 0,3-3,5, 0,4-3,0 или 0,5-2,5 бар (10-450 кПа, например, 20-400, 30-350, 40-300 или 50-250 кПа, соответственно)). Например, низкоэнергетические ударные волны для применения в настоящем изобретении имеют энергию примерно 0,05, 0,10, 0,15, 0,2 или 0,25 мДж/мм (примерно 0,5, 1, 1,5, 2 или 2,5 бар (50, 100, 150, 200 или 250 кПа, соответственно)).
Воздействие низкоэнергетическими ударными волнами можно проводить с использованием любых подходящих средств, известных в данной области техники. Например, ударно-волновую терапию можно проводить с использованием электрогидравлического экстракорпорального ударно-волнового литотриптера, такого как литотриптер DUOLITH SD1.
В примерах описано воздействие ударными волнами in vitro с использованием устройства, которое вырабатывает радиальные ударные волны. Радиальные ударные волны распространяются по большой площади поверхности и, таким образом, не проникают в глубокие ткани. Таким образом, радиальные ударные волны, как правило, находят применение в лечении приповерхностных патологий, таких как миофасциальный болевой синдром. Соответственно, радиальные ударные волны особенно подходят для экспериментов in vitro, при которых глубокое проникновение не требуется. В противоположность этому, в способах и применениях согласно настоящему изобретению, как правило, используют устройство, которое может вырабатывать сфокусированные ударные волны, которые могут проникать в глубокие ткани, такие как сердце. Сфокусированные ударные волны имеют узкую фокусную точку, которая обеспечивает направленное воздействие на конкретный участок ткани. Как радиальные, так и сфокусированные ударные волны, представляют собой «волны давления», которые обеспечивают схожие биологические ответы, т.е. схожие ответы в клетках и тканях. Таким образом, основное отличие между радиальными и сфокусированными ударными волнами в контексте настоящего изобретения относится к глубине проникновения в ткани. Соответственно, согласно предпочтительному аспекту изобретения ударные волны, используемые в способах и применениях согласно настоящему изобретению, представляют собой сфокусированные ударные волны.
Термин «экстракорпоральный» означает, что ударные волны вырабатываются вне организма и передаются, например, из подушки, через кожу.
Ударно-волновая терапия включает воздействие серией низкоэнергетических ударно-волновых импульсов. Например, в некоторых вариантах реализации ударно-волновая терапия (т.е. доза низкоэнергетических ударных волн) включает воздействие по меньшей мере 500 ударно-волновых импульсов, например, по меньшей мере 750, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 ударно-волновых импульсов. Таким образом, в некоторых вариантах реализации ударно-волновая терапия включает воздействие примерно 500-2000 импульсов, например, 600-1900, 700-1800, 800-1700, 900-1600 или 1000-1500 импульсов.
Ударно-волновая терапия для применения в настоящем изобретении представляет собой экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, это означает, что ударные волны фокусируют на сердечной ткани, что более подробно описано ниже. В частности, доставку (т.е. воздействие) ударно-волновых импульсов проводят в периоды изоволюметрического сокращения и/или изоволюметрического расслабления сердечного цикла. Таким образом, в некоторых вариантах реализации ударно-волновая терапия включает воздействие ударно-волновыми импульсами (т.е. одним или более импульсами) в период изоволюметрического сокращения и/или изоволюметрического расслабления сердца.
Период изоволюметрического сокращения представляет собой временной интервал ранней систолы, во время которого желудочки сокращаются без изменения объема (изоволюметрически). Этот краткосрочный период сокращения происходит в тот момент, когда все сердечные клапаны закрыты.
Период изоволюметрического расслабления (IVRT) относится к интервалу сердечного цикла от закрытия аортального клапана до начала заполнения при открытии митрального клапана.
Должно быть очевидно, что в зависимости от частоты сердечных сокращений более чем один ударно-волновой импульс может доставляться за время каждого периода изоволюметрического сокращения и/или изоволюметрического расслабления. Соответственно, продолжительность лечения (т.е. временной промежуток, требуемый для доставки (воздействия) ударных волн в виде дозы, например, в 500-2000 импульсов) зависит от частоты сердечных сокращений субъекта, которого лечат. Тем не менее, в некоторых вариантах реализации все ударно-волновые импульсы (например, 500-2000 импульсов) предпочтительно следует доставлять в течение 4 часов, предпочтительно в течение 3 часов или 2 часов, например, в течение 1 часа. В некоторых случаях воздействие всеми ударно-волновыми импульсами (т.е. дозой ударно-волновых импульсов) за одну процедуру невозможно, например, из-за дискомфорта у пациента. Таким образом, в некоторых вариантах реализации воздействие ударно-волновыми импульсами проводят более чем за одну процедуру, т.е. воздействие 500-2000 импульсами проводят в рамках нескольких процедур. Предпочтительно все процедуры проводят в течение периода времени, указанного выше, т.е. в течение 4 часов.
Доставку (т.е. воздействие) ударно-волновых импульсов проводят в пораженные заболеванием сегменты или участки сердца (например, в пораженную инфарктом ткань) и окружающую сердечную ткань. В некоторых вариантах реализации фокусная точка ударно-волновых импульсов может быть направлена в конкретную область сердечной ткани, т.е. в пораженные заболеванием сегменты.
В некоторых случаях, например, в острых случаях, если у субъекта случился инфаркт миокарда, времени для определения точного расположения пораженных заболеванием (инфарктом) сегментов, т.е. для составления карты пораженных заболеванием сегментов, может и не быть. Таким образом, в некоторых вариантах реализации расположение подверженных заболеванию или пораженных (например, инфарктом) сегментов можно определять в целом путем расшифровки электрокардиограммы (ЭКГ) и/или эхокардиографической (эхо) визуализации (т.е. эхо сердца, которое представляет собой сонограмму сердца). Таким образом, в некоторых вариантах реализации область сердца (т.е. сердечную ткань), в которой следует проводить ударно-волновую терапию (т.е. область, в которую направляют фокусную точку ударно-волновых импульсов), определяют путем эхокардиографической (эхо) визуализации и/или расшифровки ЭКГ.
В некоторых случаях, например, в хронических случаях (например, при лечении субъекта с сердечной недостаточностью) или после стабилизации состояния пациента с инфарктом миокарда, расположение пораженных заболеванием сегментов в сердце (например, пораженной инфарктом и/или рубцовой ткани) можно точно определять при помощи магнитно-резонансной визуализации (МРВ) сердца. В частности, МРВ сердца можно применять для определения зоны риска, индекса спасенного миокарда и измерения других функциональных индексов. МРВ сердца в идеальном варианте следует проводить в кратчайшие сроки после инфаркта миокарда, например, в течение одной недели после инфаркта миокарда.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации область сердца (т.е. сердечной ткани), в которой следует проводить ударно-волновую терапию (т.е. область, в которую направляют фокусную точку ударно-волновых импульсов), определяют путем МРВ. Другими словами, изобретение может включать стадию определения размера пораженного заболеванием сегмента сердечной ткани, т.е. определения или оценки площади и/или объема пораженной инфарктом ткани, например, рубцовой ткани.
МРВ сердца можно применять для оценки эффективности способов терапии согласно настоящему изобретению. Таким образом, в некоторых вариантах реализации способ может дополнительно включать стадию МРТ сердца у субъекта после проведения способа лечения согласно настоящему изобретению для определения эффективности лечения и/или определения прогноза для субъекта. Указанные стадии можно проводить с соответствующими временными интервалами, например, раз в день, в неделю, в месяц и/или в год.
Как будет более подробно обсуждаться ниже, сердечная недостаточность представляет собой прогрессирующее заболевание. Таким образом, повторяющиеся процедуры лечения ударными волнами необязательно в комбинации с фармакологическими способами лечения, описанными в настоящем документе, могут оказывать благоприятное действие у некоторых субъектов (например, субъектов с хронической сердечной недостаточностью). Например, в некоторых вариантах реализации лечение ударными волнами (т.е. дозами ударно-волновых импульсов) можно проводить чаще чем раз в неделю, например, два или три раза в неделю. Кроме того, еженедельную(-ые) процедуру(-ы) лечения можно повторять или проводить циклически, например, каждую неделю, каждые две недели, каждый месяц или каждые два месяца в течение периода до 6 месяцев. Кроме того, указанные циклы можно повторять, например, раз в квартал, два раза в год, раз в год и т.д., например, для поддержания благоприятных эффектов, в частности, у пациентов с завершенным инфарктом, при котором сохраняются риски для жизнеспособности оставшихся кардиомиоцитов. Как отмечалось выше, эффективность лечения можно отслеживать при помощи МРТ сердца, и выбор соответствующей схемы лечения зависит от субъекта, которого лечат, и входит в рамки компетенции специалистов в данной области техники.
Ингибитор DPP-4 для применения в комбинированной терапии согласно настоящему изобретению можно вводить до, во время и/или после проведения ударно-волновой терапии. В особенно предпочтительных вариантах реализации введение ингибитора DPP-4 начинают перед ударно-волновой терапией и продолжают на протяжении курса ударно-волновой терапии. Таким образом, например, если ударно-волновую терапию проводят в течение нескольких недель или месяцев, то ингибитор DPP-4 вводят субъекту непрерывно в течение указанного периода, например, дозы ингибитора DPP-4 вводят субъекту раз в день или раз в неделю в течение периода лечения ударными волнами. Предпочтительно ингибитор DPP-4 следует вводить до начала ударно-волновой терапии и продолжать вводить после завершения ударно-волновой терапии для максимизации эффектов. Например, введение ингибитора DPP-4 можно начинать за несколько недель, например, 1-4, 1-3 или 1-2 недели, перед воздействием первой дозы ударно-волновых импульсов и можно продолжать в течение нескольких недель или месяцев после воздействия последней дозы ударно-волновых импульсов, например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев после воздействия последней дозы ударно-волновых импульсов.
Термин «ингибитор DPP-4» или «антагонист DPP-4» относится к агентам, которые могут напрямую или опосредованно ингибировать, снижать или блокировать активность или функцию DPP-4. Например, прямые ингибиторы включают агенты, которые напрямую взаимодействуют с DPP-4 и ингибируют, снижают или блокируют активность или функцию DPP-4. Указанные агенты могут действовать путем конкурентного ингибирования, неконкурентного ингибирования, бесконкурентного ингибирования или смешанного ингибирования. Непрямые ингибиторы не взаимодействуют напрямую с DPP-4. Таким образом, например, непрямые ингибиторы могут ингибировать, снижать или блокировать активность или функцию DPP-4 путем снижения экспрессии гена, кодирующего фермент DPP-4. В предпочтительном варианте реализации ингибитор DPP-4 напрямую ингибирует, снижает или блокирует активность или функцию DPP-4.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации термин «ингибитор DPP-4» относится к классу пероральных гипогликемических лекарственных средств, которые напрямую блокируют активность DPP-4. Ингибиторы DPP-4, как правило, используют для блокирования разрушения глюкагоноподобного пептида 1 (GLP1) и применяют для лечения диабета. Примеры ингибиторов DPP-4 включают ситаглиптин, линаглиптин, вилдаглиптин, саксаглиптин, гемиглиптин, анаглиптин, тенелиглиптин, алоглиптин, трелаглиптин, дутоглиптин, омариглиптин и лупеол. Таким образом, в некоторых вариантах реализации ингибитор DPP-4 для применения в изобретении может представлять собой ситаглиптин, линаглиптин, вилдаглиптин, гемиглиптин, анаглиптин, тенелиглиптин, трелаглиптин, дутоглиптин, омариглиптин, лупеол или их комбинацию. В особенно предпочтительном варианте реализации ингибитор DPP-4 для применения в изобретении может представлять собой ситаглиптин, линаглиптин или их комбинацию. В некоторых особенно предпочтительных вариантах реализации ингибитор DPP-4 для применения в изобретении не является алоглиптином или саксаглиптином.
Также включены соли указанных соединений, включая органические и неорганические соли (например, с щелочными и щелочно-земельными металлами, аммонием, этаноламином, диэтаноламином и меглумином, хлоридным, гидрокарбонатным, фосфатным, сульфатным и ацетатным противоионами). Соответствующие фармацевтически и/или физиологически приемлемые соли хорошо описаны в фармацевтической литературе. Кроме того, некоторые из указанных солей могут образовывать сольваты с водой или органическими растворителями, такими как этанол. Указанные сольваты также включены в объем настоящего изобретения.
Термины «стволовая клетка» и «прогениторная клетки» в настоящем документе относятся к недифференцированным биологическим клеткам, которые могут дифференцироваться в специальные клетки, т.е. к тотипотентным, плюрипотентным и мультипотентным клеткам. В предпочтительных вариантах реализации стволовые клетки представляют собой неэмбриональные стволовые клетки. В частности, стволовые клетки или прогениторные клетки для применения в настоящем изобретении способны дифференцироваться в стволовые клетки сердца и/или кардиомиоциты. В тех вариантах реализации, где субъектам вводят агент, который мобилизует стволовые клетки, стволовые клетки или прогениторные клетки могут быть получены или рекрутированы из периферического кровотока, т.е. крови. Аналогично, в тех вариантах реализации, где стволовые клетки или прогениторные клетки собирают или получают у субъекта перед введением, стволовые клетки или прогениторные клетки, как правило, могут быть собраны или получены из периферического кровотока, т.е. крови, субъекта, которого лечат, или субъекта-донора. Тем не менее, должно быть очевидным, что стволовые клетки или прогениторные клетки можно собирать или получать из других соответствующих тканей, таких как костный мозг. Таким образом, в некоторых вариантах реализации стволовые клетки или прогениторные клетки получены из мононуклеарных клеток, выделенных из костного мозга, или содержат их.
Термин «мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга» (КМ-МНК) относится к популяции клеток, которая включает гемопоэтические прогениторные клетки, лимфоидные клетки (лимфоциты (например, Т-клетки) и клетки плазмы), моноциты и макрофаги. Не желая быть связанными теорией, полагают, что макрофаги М2 и гемопоэтические прогениторные клетки могут действовать в комбинации для спасения, восстановления или ускорения замены поврежденных или погибших кардиомиоцитов, например, после ишемического-реперфузионного повреждения. Также установлено, что Т-клетки привлекаются (рекрутируются) в сердечную ткань после ударно-волновой терапии согласно настоящему изобретению (включая комбинированную терапию), которая может создавать благоприятную среду для выживания клеток.
Таким образом, в предпочтительных вариантах реализации можно эффективно применять популяцию или комбинацию стволовых клеток, т.е. стволовых клеток или прогениторных клеток, которые содержат популяцию клеток, содержащую гемопоэтические прогениторные клетки и необязательно один или более типов клеток, выбранных из лимфоидных клеток (лимфоцитов, например, Т-клеток), моноцитов и макрофагов. В некоторых случаях можно эффективно применять подгруппу КМ-МНК. Таким образом, в некоторых вариантах реализации стволовые клетки или прогениторные клетки представляют собой гемопоэтические прогениторные клетки и необязательно макрофаги, в частности, макрофаги М2 или содержат их.
Термин «макрофаги М2» (также называемый альтернативно активированными макрофагами) в широком смысле относится к макрофагам, которые действуют при конструктивных процессах, таких как заживление ран и восстановление тканей. Макрофаги М2 также могут гасить вызывающую повреждения активацию иммунной системы за счет выработки противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10. Макрофаги М2 вырабатывают высокий уровень IL-10, TGF-бета и низкий уровень IL-12. Важно отметить, что макрофаги М2 не являются однородной популяцией, и их часто дополнительно разделяют на категории М2а, М2b и М2с. Макрофаги М2а участвуют в иммунном ответе типа Th2, например, в отношении паразитов. Макрофаги М2b, которые, как считается, регулируют иммунитет, индуцируются IL-1, ЛПС и иммунными комплексами. Макрофаги М2с индуцируются в присутствии IL-10 и TGF-b. Их часто называют деактивированными или противовоспалительными, и, как известно, они задействованы при восстановлении и ремоделировании тканей. Они вырабатывают большие количества IL-10 и TGF-бета и экспрессируют множество рецепторов, таких как: CD163, CD206, RAGE и другие фагоцитарные рецепторы. Таким образом, в некоторых вариантах реализации макрофаги М2 представляют собой макрофаги М2с.
Термин «фармакологический мобилизатор стволовых клеток» относится к агентам, которые могут напрямую или косвенно индуцировать, активировать или увеличивать количество стволовых клеток в периферическом кровотоке субъекта. В частности, фармакологический мобилизатор стволовых клеток может представлять собой мобилизатор гемопоэтических стволовых клеток. В данной области техники известны различные агенты, такие как паратиреоидный гормон, Г-КСФ, анцестим, мозобил, плериксафор и стемген, и любой из указанных агентов можно применять в способах согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте реализации фармакологический мобилизатор стволовых клеток представляет собой паратиреоидный гормон или его фрагмент.
Паратиреоидный гормон (ПТГ), также называемый паратгормоном или паратирином, представляет собой гормон, секретируемый паращитовидными железами. ПТГ секретируется главными клетками паращитовидных желез в виде полипептида, содержащего 84 аминокислоты, который является прогормоном. Важно отметить, что для эффективного взаимодействия гормон-рецептор требуются исключительно 34-N-концевые аминокислоты в прогормоне. Таким образом, фрагмент ПТГ для применения в изобретении содержит по меньшей мере 34-N-концевые аминокислоты ПТГ. В некоторых вариантах реализации фрагмент содержит или состоит из терипаратида. Терипаратид представляет собой рекомбинантную форму ПТГ, состоящую из 34-N-концевых аминокислот ПТГ.
Термин «приживление» относится к внедрению прививаемой ткани в организм хозяина. Таким образом, в контексте настоящего изобретения приживление относится к внедрению стволовых клеток в сердечную ткань субъекта, которого лечат. Стволовые клетки могут представлять собой эндогенные клетки субъекта, которого лечат, например, мобилизованные в результате введения мобилизатора стволовых клеток, такого как паратиреоидный гормон. В качестве альтернативы, стволовые клетки могут быть экзогенными, т.е. их вводят отдельно, например, получают или собирают у субъекта, которого лечат, или субъекта-донора, необязательно модифицируют in vitro и затем вводят субъекту, которого лечат.
Термин «сердечная недостаточность» в настоящем документе включает любое состояние, характеризующееся нарушением сердечной функции, в частности, нарушением функции желудочков (дисфункция желудочка), вызванное снижением насосной функции (систолическая дисфункция) или пониженным заполнением (диастолическая дисфункция). Систолическая дисфункция может быть описана как состояние сократительной дисфункции желудочка. Наблюдается недостаточное опустошение желудочков. Диастолическая дисфункция может быть описана как устойчивость к заполнению желудочков. Таким образом, сердечную недостаточность можно рассматривать как состояние желудочков или состояние желудочковой недостаточности.
Сердечная недостаточность может быть левосторонней (поражение или дисфункция левого желудочка) или правосторонней (поражение или дисфункция правого желудочка) или может поражать обе стороны сердца (одновременно правый и левый желудочки). Сердечная недостаточность подразумевает нарушение функции миокарда сердца. Таким образом, в некоторых вариантах реализации терапевтические способы и применения согласно настоящему изобретению можно рассматривать как способы терапии для улучшения функции миокарда сердца. Тем не менее, важно отметить, что у некоторых пациентов, особенно с ранней фазой сердечной недостаточности, фракция выброса (обсуждается ниже) может быть в пределах нормы, например, составлять 50% или более, т.е. 50-70%. Например, различные компенсаторные механизмы могут увеличивать ударный объем, в результате чего фракция выброса не снижается мгновенно (например, за счет изменения преднагрузки, постнагрузки, системного сосудистого сопротивления или другого компенсаторного механизма). Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения терапевтические способы и применения можно рассматривать в качестве способов терапии для поддержания функции миокарда сердца.
В частности, рассматриваются хронические формы сердечной недостаточности (т.е. хроническая сердечная недостаточность).
Таким образом, сердечная недостаточность может быть определена как нарушение, которое может возникать в результате состояния, которое снижает способность сердца прокачивать кровь. Частой причиной является снижение сократительной способности миокарда, вызванное снижением коронарного кровотока (например, сердечная недостаточность, вызванная ишемической болезнью сердца (ИБС) или коронарной ишемической болезнью), но неспособность прокачивать достаточные количества крови также может быть вызвана повреждением сердечных клапанов, сдавливанием в области сердца, первичными заболеваниями сердечной мышцы (например, идиопатической дилатационной кардиомиопатией) или любым другим расстройством, которое снижает эффективность сердца как насоса. Как отмечалось выше, особый интерес представляет хроническая сердечная недостаточность.
Таким образом, в объем изобретения включена сердечная недостаточность, вызванная или являющаяся результатом ишемической болезни сердца (ишемической кардиомиопатии), в частности, хронической ишемической болезни сердца (например, хронической ишемии миокарда). Таким образом, сердечная недостаточность для лечения при помощи способов и применений согласно настоящему изобретению представляет собой хроническую или ишемическую сердечную недостаточность. В особенно предпочтительных вариантах реализации сердечная недостаточность для лечения при помощи способов и применений согласно настоящему изобретению является результатом ишемического-реперфузионного повреждения сердца, например, вызванного инфарктом миокарда.
Как было описано выше, ишемическое-реперфузионное повреждение сердца относится к повреждению сердечной ткани, вызванному восстановлением поступления крови в сердечную ткань после периода ишемии или недостатка кислорода (аноксия, гипоксия). При отсутствии кислорода и питательных веществ крови в период ишемии возникает состояние, при котором восстановление кровотока и быстрое повышение уровня кислорода (т.е. нормоксия или гипероксия) приводят к воспалению и окислительному повреждению за счет запуска окислительного стресса, но не восстановления нормальной функции. Это, в свою очередь, может приводить к апоптозу кардиомиоцитов и последующему нарушению миокарда в сердце.
2
2
2
«Гипоксия» относится к состоянию с низким напряжением кислорода, как правило, в диапазоне 1-5% О, и она часто наблюдается в центральных областях опухолей из-за низкой васкуляризации. «Аноксия» относится по существу к отсутствию кислорода, например, к напряжению кислорода менее 0,5% О, такому как менее 0,1% О. «Нормоксия» относится к напряжению кислорода 10-21%. «Гипероксия» относится к напряжению кислорода более 21%.
Сердечная недостаточность может проявляться двумя путями: (1) как снижение сердечного выброса или (2) как застой крови в венах позади левого или правого отделов сердца. Может происходить нарушение работы сердца в целом, или же нарушения могут происходить в левом отделе или правом отделе независимо друг от друга. В любом случае, сердечная недостаточность может приводить к застою кровотока, и в последнее время это явление называют застойной сердечной недостаточностью.
Сердечная недостаточность может быть разделена на две фазы, острую сердечную недостаточность (краткосрочную и нестабильную) и хроническую сердечную недостаточность (долгосрочную и относительно стабильную). Четкие различия между этими двумя формами трудно определить, но, в целом, острая сердечная недостаточность соответствует стадии недостаточности, которая протекает непосредственно после повреждения сердца (т.е. быстро появляется и имеет низкую продолжительность) и связана с нестабильностью функции сердца и кровотока, например, с внезапным снижением сердечного выброса. Если острая фаза является недостаточно тяжелой, чтобы приводить к смерти, то происходит немедленная активация симпатических рефлексов организма, которые могут компенсировать внезапную утрату сердечной функции. Указанная компенсация часто может быть настолько эффективной и быстрой, что у субъекта, если он сохраняет спокойствие, какие-либо значительные эффекты могут и не проявляться.
По прошествии нескольких минут после острого сердечного приступа наступает продолжительное вторичное состояние. Оно характеризуется удерживанием жидкостей в почках и прогрессирующим восстановлением сердца в течение периода от нескольких недель до нескольких месяцев до того момента, когда происходит стабилизация состояния сердца. Эта фаза поддержания стабильности известна как хроническая сердечная недостаточность. Несмотря на то, что в сердце произошла компенсация и стабилизация, оно все еще является слабым, и его состояние может постепенно ухудшаться.
Таким образом, несмотря на то, что острая фаза сердечной недостаточности завершается достаточно быстро, для приобретения стабильности на хронической фазе сердечной недостаточности могут потребоваться месяцы. В общем случае, пациента, ощущающего симптомы сердечной недостаточности более 3 месяцев или более предпочтительно более 6 месяцев, можно рассматривать как имеющего хроническую сердечную недостаточность при условии, что у него не наблюдались дополнительные симптомы острой сердечной недостаточности на протяжении указанного 3-месячного или 6-месячного периода.
Таким образом, это означает, что, несмотря на то, что симптомы у субъектов значительно различаются, у субъектов с сердечной недостаточностью, в частности, с хронической сердечной недостаточностью, имеется характерное снижение сердечной функции, и, в частности, снижение функции желудочка. Наиболее распространенным проявлением пониженной сердечной функции является систолическая дисфункция. Таким образом, сердечная недостаточность может представлять собой систолическую сердечную недостаточность. Например, у указанных субъектов наблюдается снижение фракции выброса желудочка, в частности, снижение фракции выброса левого желудочка (ФВЛЖ) по сравнению с «нормальным» субъектом, который не страдает от сердечной недостаточности. У нормальных индивидуумов фракция выброса левого желудочка обычно составляет более 60% (как правило, 55-70%), и при этом фракция выброса менее 45%, в частности, менее 40% характеризует систолическую дисфункцию. Таким образом, ФВЛЖ менее 45%, в частности, менее 40% характерна для пониженной сердечной функции у субъектов с сердечной недостаточностью, в частности, с хронической сердечной недостаточностью. Как правило, фракция выброса 35%-45% может быть охарактеризована как слабое нарушение функции сердца. Фракция выброса 25%-35% может быть охарактеризована как умеренное нарушение функции сердца. Фракция выброса менее 25% может быть охарактеризована как тяжелое нарушение функции сердца. Субъекты с фракцией выброса менее 15% могут быть охарактеризованы как субъекты с сердечной недостаточностью в терминальной стадии и являться кандидатами для трансплантации сердца. Ожидаемая выживаемость субъектов, имеющих фракцию выброса менее 5%, является непродолжительной.
Реже по сравнению с систолической дисфункцией возникает диастолическая дисфункция, при которой фракция выброса в целом сохраняется (например, ФВ левого желудочка>40%) или находится в пределах нормы, но заполнение желудочка, например, заполнение левого желудочка, понижается.
Предпочтительные субъекты для проведения лечения согласно настоящему изобретению включают субъектов, имеющих ФВЛЖ менее 40% (ФВЛЖ <0,40). В некоторых вариантах реализации субъекты могут определены как субъекты, имеющие ФВЛЖ менее 35% (ФВЛЖ <0,35). Тем не менее, как отмечалось выше, некоторые субъекты на ранней фазе сердечной недостаточности могут иметь нормальную ФВЛЖ, например, 45% или более. Таким образом, в некоторых вариантах реализации субъекты для способа лечения согласно настоящему изобретению включают субъектов, имеющих ФВЛЖ менее 60% (ФВЛЖ <0,60), предпочтительно менее 55% (ФВЛЖ <0,55), например, менее 50% (ФВЛЖ <0,50) или менее 45% (ФВЛЖ <0,45).
Другие параметры снижения сердечной функции, которые могут наблюдаться при сердечной недостаточности, включают снижение фракции выброса правого желудочка, снижение способности переносить физические нагрузки и отклонения гемодинамических переменных, такие как снижение сердечного выброса, повышение легочного артериального давления и повышение частоты сердечных сокращений и низкое кровяное давление.
Согласно системе классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) заболевания сердца разделены на четыре класса в зависимости от тяжести заболевания. Класс I NYHA: пациенты, которые имеют сердечное заболевание, которое не приводит к ограничениям физической активности, например, одышке, усталости или учащенному сердцебиению при обычной физической активности; класс II: пациенты, которые имеют сердечное заболевание, приводящее к незначительному ограничению физической активности, например, одышке, усталости или учащенному сердцебиению при обычной физической нагрузке, но чувствуют себя нормально в состоянии покоя. Класс III: пациенты, которые имеют сердечное заболевание, которое приводит к выраженным ограничениям физической деятельности, например, одышке, усталости или учащенному сердцебиению при незначительной физической активности, но чувствуют себя нормально в состоянии покоя. Класс IV: пациенты, имеющие сердечное заболевание, которое приводит к неспособности выполнять какую-либо физическую активность в отсутствие дискомфорта, например, одышки, усталости или учащенного сердцебиения при любых физических нагрузках, при этом симптомы могут проявляться даже в состоянии покоя.
Изобретение можно применять для лечения или профилактики всех классов сердечной недостаточности, но, в частности, классов II-IV или субъектов, имеющих классы III-IV. Таким образом, пациент или субъект может принадлежать к любому одному или более из классов I-IV, но предпочтительно он принадлежит к классам II-IV или III-IV.
Таким образом, настоящее изобретение можно применять для лечения или предупреждения (профилактики) любого вида сердечной недостаточности независимо от ее причины или этиологии. Может повышаться устойчивость сердца к сердечной недостаточности. Таким образом, настоящее изобретение можно применять для лечения установленной или симптоматической или клинически выраженной сердечной недостаточности, в частности, хронической сердечной недостаточности, включая также острую сердечную недостаточность или сердечную недостаточность, которая прогрессирует или развивается, включая сердечную недостаточность в начальной стадии или сердечную недостаточность, которая протекает без симптомов. Его также можно применять для предупреждения или задержки проявления сердечной недостаточности или для предупреждения, ограничения или замедления развития сердечной недостаточности, например, для снижения или ограничения уровня или степени, до которого(-ой) развивается сердечная недостаточность, или для снижения подверженности сердца сердечной недостаточности. Таким образом, например, может происходить задержка развития сердечной недостаточности до терминальной стадии. Таким образом, в качестве альтернативы, изобретение можно применять для улучшения прогноза у субъекта, имеющего сердечную недостаточность или риск ее появления.
Как отмечалось выше, сердечная недостаточность, в частности, хроническая сердечная недостаточность, для лечения согласно настоящему изобретению может быть вызвана любыми причинами, например, может являться результатом первичного заболевания или возникать в результате другого заболевания. В одном из вариантов реализации изобретения сердечная недостаточность, подвергающаяся лечению, представляет собой хроническую сердечную недостаточность, вызванную идиопатической дилатационной кардиомиопатией (IDCM) и/или коронарной ишемической болезнью (ишемическая болезнь сердца - ИБС).
В частности, в дополнительном предпочтительном варианте реализации сердечная недостаточность для лечения согласно настоящему изобретению представляет собой постинфарктную сердечную недостаточность или ишемическую сердечную недостаточность.
Другие типы сердечной недостаточности, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают сердечную недостаточность, вызванную продолжительной повышенной постнагрузкой, такую как гипертензивная сердечная недостаточность. Сердечная недостаточность, возникающая по любым другим причинам, например, таким как указано выше, включена в объем настоящего изобретения.
Как отмечалось выше, субъекты, проходящие лечение согласно настоящему изобретению, могут иметь симптоматическую сердечную недостаточность. Симптомы сердечной недостаточности перечислены выше и могут включать набор веса, отек стоп и лодыжек или живота, набухание шейных вен, потерю аппетита, несварение желудка, тошноту и рвоту, одышку при физической активности и в положении лежа, расстройства сна, усталость, слабость или истощение, учащенное сердцебиение, неровный или учащенный пульс, снижение внимания или концентрации, кашель, сниженный диурез и необходимость ночного мочеиспускания, хотя при сердечной недостаточности могут присутствовать не все указанные симптомы или ни один из них.
Другие возможные проявления сердечной недостаточности включают понижение фракции выброса (ЛЖ и/или ПЖ), снижение способности переносить физические нагрузки и отклонения гемодинамических переменных таких как те, что перечислены выше.
Субъектам можно проводить стандартный(-ые) способ(-ы) лечения сердечной недостаточности, включая стандартные фармакологические способы лечения, такие как использование одного или более бета-блокаторов, ингибиторов АСЕ, БРА, антагонистов альдостерона, мочегонных средств, средств против гипертензии, сердечных гликозидов, ингибиторов рецепторов ангиотензина-неприлизина (ARNI), комбинационная терапия (например, валсартан/сакубитрил) и т.д. В частности, субъекты могут получать или не получать бета-блокаторы. Например, субъекту можно проводить лечение агонистом NPR-А, таким как BNP, например, рекомбинантный BNP или его аналог или производное, или другим натрийуретическим пептидом или его аналогом или производным.
Развитие или прогрессирование сердечной недостаточности может быть связано с ремоделированием желудочка, в частности, с ремоделированием левого желудочка, которое проявляется как постепенное увеличение конечно-диастолического и конечно-систолического объема левого желудочка, истончение стенки и изменение геометрии камеры до более сферической и менее продолговатой формы. Этот процесс, как правило, связан с непрерывным снижением фракции выброса. В одном из вариантов реализации изобретения понижается или предупреждается ремоделирование и, в частности, ремоделирование желудочка, предпочтительно левого желудочка.
Ремоделирование может приводить к дисфункции желудочка, в частности, к дисфункции левого желудочка. В другом варианте реализации изобретения предотвращается или предупреждается дисфункция желудочка.
В настоящем документе «лечение» относится к ограничению, облегчению, ослаблению или устранению заболевания (этот термин включает любое заболевание, состояние или нарушение), которое подвергают лечению (например, сердечной недостаточности или ее симптома), или одного или более его симптомов по сравнению с заболеванием или симптомом до начала лечения. Лечение может включать улучшение или усиление сердечной функции или деятельности и, в частности, функции или работы желудочков, более конкретно функции или работы левого желудочка.
«Профилактика» или «предупреждение» в настоящем документе относится к задержке, ограничению или ослаблению заболевания или появления заболевания или одного или более его симптомов, например, по сравнению с заболеванием или симптомом до начала профилактического или предупредительного лечения. Профилактика, таким образом, явным образом включает предупреждение появления или развития заболевания или симптома в полной мере или ослабление или ограничение развития или прогрессирования заболевания или симптома.
Субъект или пациент, которому проводят лечение или профилактику, может представлять собой любого субъекта-человека или животное, отличное от человека, но предпочтительно является млекопитающим, например, представляет собой человека, или домашний скот или домашнее животное, например, мышей, крыс, свиней, кошек, собак, овец, кроликов, лошадей, коров или мартышек. Наиболее предпочтительно субъект представляет собой субъекта-человека.
С учетом природы большинства форм заболеваний сердца нельзя ожидать, что «лечение» согласно настоящему изобретению приведет к полному исцелению рассматриваемого случая сердечной недостаточности. Напротив, «лечение» согласно настоящему изобретению включает улучшение или ослабление какого-либо из симптомов, связанных с сердечной недостаточностью, а также улучшение качества жизни пациента и, в конечном итоге, увеличение продолжительности жизни и выживаемости, т.е. улучшение прогноза.
«Лечение» согласно настоящему изобретению также включает улучшение или увеличение функциональной деятельности сердца или, другими словами, долгосрочное улучшение или увеличение сердечной функции или деятельности. В частности, лечение согласно настоящему изобретению может приводить к улучшению одного или более симптомов или увеличению функциональных параметров, связанных с сердечной недостаточностью, в частности, симптомов и параметров, связанных с функцией желудочка и, в частности, левого желудочка.
Важным симптомом и параметром, связанным с улучшением сердечной функции при сердечной недостаточности, является увеличение фракции выброса желудочка и, в частности, фракции выброса левого желудочка (ФВЛЖ). Ее оценку можно проводить стандартными способами, хорошо известными и описанными в данной области техники, например, при помощи эхокардиографии («эхо», т.е. эхо сердца, которое представляет собой сонограмму сердца), электрокардиограммы (ЭКГ), радионуклидной вентрикулографии с ЭКГ-синхронизацией (MUGA-сканирование), ангиографии или магнитно-резонансной визуализации (МРВ), обычно ее проводят, когда субъект находится в состоянии покоя. Было показано, что увеличение ФВЛЖ связано с улучшением выживаемости у пациентов с сердечной недостаточностью. Таким образом, она является важным и предпочтительным параметром, который необходимо улучшать у субъектов, проходящие лечение согласно настоящему изобретению. Также может увеличиваться ФВПЖ.
Несмотря на то, что увеличение ФВЛЖ особенно важно для общего улучшения сердечной функции, согласно настоящему изобретению можно улучшать ряд других параметров, связанных с сердечной деятельностью. Одним из них является значительное улучшение общего клинического статуса и, таким образом, клинической картины при оценке функционального класса NYHA. Другими словами, функциональный класс NYHA у пациента может быть уменьшен после лечения согласно настоящему изобретению. Указанную клиническую оценку обычно проводит квалифицированный кардиолог.
Другие параметры включают способность переносить физические нагрузки, например, измеренную по максимальному потреблению кислорода и максимальную рабочую нагрузку. Как указано выше, снижение способности переносить физические нагрузки является вызывающим неудобства и изнуряющим симптомом у многих пациентов с сердечной недостаточностью. Способы измерения способности переносить физические нагрузки хорошо известны и описаны в данной области техники. Например, испытание физической нагрузкой можно проводить на велоэргометре с электронными тормоами. Типовой протокол может включать начальную мощность 20 Вт, которую увеличивают на 20 Вт каждые две минуты до утомления (которое определяют как неспособность поддерживать постоянную скорость педалирования 60 об./мин). Потребление кислорода (VO2) можно измерять, например, на системе EOS/SPRINT. Максимальное VO2 определяют как наивысшее наблюдаемое значение VO2. Другим примером испытания физической нагрузки является тест с 6-минутной ходьбой, в котором пациента просят пройти максимально возможную дистанцию за 6 минут в стандартизированных условиях, и пройденная дистанция является мерой способности переносить физические нагрузки.
Гемодинамические эхокардиографические параметры и переменные также можно оценивать для определения улучшения сердечной функции. Например, улучшение сердечной функции может быть определено по снижению давления заклинивания легочных капилляров и/или легочного артериального давления и/или по увеличению максимальной частоты сердечных сокращений, максимального систолического кровяного давления и времени замедления кровотока через митральный клапан. Эхокардиографические переменные могут быть эффективно измерены путем эхокардиографии квалифицированным кардиологом, а гемодинамические переменные могут быть эффективно оценены путем правосторонней катетеризации сердца согласно стандартным способам.
Другой важной переменной, которую можно оценивать, является уровень в плазме Nt-proANP или Nt-proBNP. Повышенный или в целом высокий уровень Nt-proANP или Nt-proBNP рассматривают как маркер сердечной дисфункции. Кроме того, недавно было показано, что уровень Nt-proANP коррелирует с легочным артериальным давлением при сердечной недостаточности и является источником важной прогностической информации у пациентов с сердечной недостаточностью. Уровень Nt-proANP или Nt-proBNP в пробе крови можно измерять различными способами, хорошо известными и описанными в данной области техники, например, путем радиоиммунологического анализа. Перед проведением радиоиммунологического анализа из пробы крови, взятой у пациента, отделяют плазму способами, хорошо известными и описанными в данной области техники.
Описанное выше «улучшение» или «увеличение» симптомов, параметров и/или прогноза у субъекта включает любое поддающееся измерению улучшение или увеличение данного параметра по сравнению с эквивалентным параметром у индивидуума, которому не проводили лечение, или данного параметра по сравнению с эквивалентным параметром у того же индивидуума, который был определен в более ранний момент времени (например, по сравнению с «исходным уровнем»). Предпочтительно улучшение или увеличение является статистически значимым. Особенно предпочтительно улучшение или увеличение симптомов, параметров и/или прогноза связано с улучшением состояния здоровья данного пациента и более предпочтительно с продлением выживания.
Способы определения статистической значимости различий параметров хорошо известны и описаны в данной области техники. Например, в настоящем документе параметр в целом рассматривают как значимый, если при статистическом сравнении при помощи двустороннего критерия значимости, такого как t-критерий Стьюдента или ранговый U-критерий Манна-Уитни, получено вероятностное значение <0,05.
Таким образом, способы согласно настоящему изобретению можно применять для улучшения сердечной функции, в частности, сердечной функции при сердечной недостаточности. Более конкретно, в долгосрочной перспективе способы согласно настоящему изобретению можно применять для улучшения функции желудочков, в частности, функции левого желудочка (например, ФВЛЖ), более конкретно, при сердечной недостаточности.
Настоящее изобретение может обеспечивать снижение уровня Nt-proANP или Nt-proBNP в плазме. Как отмечалось выше, снижение уровня Nt-proANP или Nt-proBNP в плазме является показателем улучшения сердечной функции и деятельности. «Снижение» в настоящем документе включает любое поддающееся измерению снижение данного параметра по сравнению с эквивалентным параметром у индивидуума, которому не проводили лечение, или данного параметра по сравнению с эквивалентным параметром у того же индивидуума, который был определен в более ранний момент времени (например, по сравнению с «исходным уровнем»). Предпочтительно снижение является статистически значимым, что обсуждалось выше. Особенно предпочтительно снижение уровня Nt-proANP или Nt-proBNP связано с улучшением состояния здоровья данного пациента и более предпочтительно с продлением выживания.
Согласно одному из аспектов необходимость лечения или профилактики сердечной недостаточности у пациента или субъекта (например, страдающего от сердечной недостаточности или имеющего риск развития или подверженного сердечной недостаточности) определяют перед проведением ударно-волновой терапии (включая комбинированную терапию) согласно настоящему изобретению.
Указанное определение можно проводить на основании симптомов и/или параметров, которые являются показателями сердечной недостаточности или риска сердечной недостаточности, что обсуждалось выше.
Как обсуждалось выше, сердечная деятельность может улучшаться после проведения ударно-волновой терапии (включая комбинированную терапию) согласно настоящему изобретению. Соответственно, различные аспекты настоящего изобретения, такие как описано и обсуждается выше, могут дополнительно включать оценку наличия у субъекта, которого лечат, улучшения сердечной деятельности или облегчения сердечной недостаточности или ее симптома после проведения ударно-волновой терапии (включая комбинированную терапию) согласно настоящему изобретению. Как обсуждалось выше, указанная оценка может представлять собой оценку улучшения сердечной деятельности или функции, в частности, работы или функции желудочка, особенно левого желудочка, или улучшения какого-либо симптома или параметра при сердечной недостаточности, что обсуждалось выше.
Если субъект имеет риск развития сердечной недостаточности или подвержен сердечной недостаточности, то у субъекта можно проводит оценку одного или более факторов, которые являются факторами риска при сердечной недостаточности. Например, они могут представлять собой ишемическую болезнь или состояние, например, ишемическую болезнь сердца, кардиомиопатию, гипертензию, порок клапана, врожденные дефекты сердца или любое другое предрасполагающее(-ий) состояние или фактор, известное(-ый) в данной области техники или описанное(-ые) или указанное(-ый) выше.
После проведения ударно-волновой терапии (включая комбинированную терапию) согласно настоящему изобретению у субъекта можно проводить оценку развития сердечной недостаточности или одного или более факторов риска сердечной недостаточности.
Если ударно-волновую терапию согласно настоящему изобретению применяют в комбинации с фармакологическим агентом, например, с ингибитором DPP-4 и/или мобилизатором стволовых клеток (например, паратиреоидным гормоном), то фармакологический агент для удобства включают в состав фармацевтической композиции для применения согласно настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция относится к композиции, содержащей фармакологический агент (т.е. фармакологически активный агент или ингредиент), например, ингибитор DPP-4 и/или мобилизатор стволовых клеток (например, паратиреоидный гормон) совместно с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. Таким образом, например, можно считать, что в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения или предупреждении (профилактике) сердечной недостаточности или для лечения ишемического-реперфузионного повреждения сердца у субъекта, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанная композиция содержит ингибитор DPP-4 совместно с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем и предназначена для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
Соответствующее содержание активного ингредиента (фармакологического агента, т.е. фармакологически активного агента или ингредиента) в указанных композициях может быть определено согласно принципам и процедурам, общепринятым в данной области техники, и может быть легко установлено квалифицированным специалистом. Таким образом, например, активный ингредиент в указанных композициях может составлять от 0,05% до 99% по массе состава, например, от 0,1% до 1,0% или примерно 0,5%. Концентрация активного ингредиента в составе зависит от типа состава. Например, кишечнорастворимые продукты (например, таблетки и капсулы), как правило, могут содержать от 5% до 50% активных ингредиентов по массе, при этом парентеральные составы, как правило, имеют более низкую концентрацию активного соединения, например, от 0,1% до 3% активного ингредиента по массе, например, в виде инъекционного раствора.
Под «фармацевтически приемлемым» понимают, что ингредиенты должны быть совместимыми с другими ингредиентами композиции, а также должны быть физиологически приемлемыми для потребителя.
Фармацевтическая композиция может быть получена согласно любым традиционным способам, известным в данной области техники и подробно описанным в литературе. Таким образом, активный ингредиент (например, ингибитор DPP-4) можно включать в состав необязательно совместно с другими активными веществами, с одним или более традиционными носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами, для получения традиционных галеновых препаратов, которые подходят или после обработки могут подходить для перорального, подкожного, внутримышечного, внутривенного или любого другого способа введения, таких как порошки, сашеты, крахмальные капсулы, эликсиры, суспензии, эмульсии, растворы, сиропы, мази, стерильные инъекционные растворы, стерильно упакованные порошки и т.д. Фармацевтическая композиция, содержащая активный ингредиент (например, паратиреоидный гормон), может быть получена в форме, подходящей для инфузии или инъекции пациенту. Указанная инфузия или инъекция предпочтительно является внутримышечной (в.м.), но также ее можно проводить подкожно (п.к.) или внутривенно (в.в.).
Предпочтительно композиции, содержащие ингибитор DPP-4, могут быть обеспечены в форме, предназначенной для перорального введения. Например, фармацевтические формы могут включать плоские или покрытые оболочкой таблетки, капсулы, суспензии и растворы, содержащие активный компонент (например, ингибитор DPP-4) необязательно совместно с одним или более инертными традиционными носителями и/или разбавителями.
Предпочтительно композиции, содержащие фармакологический агент для мобилизации стволовых клеток (например, паратиреоидный гормон), могут быть обеспечены в форме, предназначенной для парентерального введения, в частности, внутримышечного или внутрибрюшного введения. Например, фармацевтические формы могут включать стерильные инъекционные растворы или суспензии, необязательно содержащие один или более инертных традиционных носителей и/или разбавителей.
Примерами подходящих носителей, вспомогательных веществ и разбавителей являются лактоза, декстроза, сахароза, мальтоза, глюкоза, сорбит, маннит, крахмалы, аравийская камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, целлюлоза, водный сироп, вода, вода/этанол, вода/гликоль, вода/полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлоза, метил гидроксибензоаты, пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния, минеральное масло или жирные вещества, такие как твердый жир, или их подходящие смеси. Композиции могут дополнительно включать смазывающие агенты, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, консерванты, подсластители, вкусоароматические добавки и т.д. Композиции согласно настоящему изобретению можно получать для обеспечения быстрого, замедленного или отсроченного высвобождения активного ингредиента после введения пациенту способами, хорошо известными в данной области техники.
Также можно применять агенты, увеличивающие растворимость, и/или стабилизаторы, например, цикподекстрины (CD) α, β, γ и НР-β-циклодекстрин.
Подходящие дозы могут быть различными для каждого пациента и могут быть определены лечащим врачом с учетом массы тела, возраста и пола пациента, режима введения и тяжести состояния, а также конкретного активного ингредиента, применяемого для лечения. Типовые стандартные дозы для перорального введения (например, ингибитора DPP-4) могут содержать от 1 до 250 мг активного ингредиента, хотя следует понимать, что это количество, безусловно, может изменяться в зависимости от конкретного применяемого антагониста и т.д. Например, стандартная доза ситаглиптина может составлять порядка 100 мг, например, 75-125 мг, при этом стандартная доза линаглиптина может составлять порядка 5 мг, например, 1-10 мг. Дневная доза для перорального введения может, например, находиться в диапазоне от примерно 0,01 до 10 мг/кг/день, например, от 0,1 до 5 мг/кг/день, например, от 0,1 до 2 мг/кг/день. Например, взрослому с массой тела 70 кг следует вводить дневную дозу от 1 до 700 мг или от 0,7 до 700 мг, чаще от 1 до 350 мг или от 7 до 350 мг, например, от 7 до 140 мг. Для парентерального (например, внутривенного или внутримышечного) введения (например, паратиреоидного гормона) типовые стандартные дозы могут составлять от 0,1 мкг до 100 мкг, например, от 0,1 мкг до 50 мкг, т.е. 1-40, 2-35, 3-40, 4-35 или 5-25 мкг, например, 20 мкг. Дневная доза для парентерального введения может, например, находиться в диапазоне от примерно 0,001 до 1 мкг/кг/день, например, от 0,001 до 0,5 мкг/кг/день, например, от 0,001 до 0,3 мкг/кг/день. Например, взрослому с массой тела 70 кг следует вводить дневную дозы от 0,01 до 70 мкг или от 0,07 до 70 мкг, чаще от 0,07 до 35 мкг или от 0,7 до 35 мкг, например, от 0,7 до 21 мкг.
Улучшения у пациентов, проходящих лечение согласно настоящему изобретению, могут наблюдаться через несколько дней, недель или месяцев в зависимости от конкретного пациента. После достижения начального улучшения также может наблюдаться непрерывное улучшение в течение последующих недель или месяцев. Как было указано выше, лечение можно продолжать так долго, насколько это требуется или необходимо.
Ударно-волновую терапию (включая комбинационную терапию) согласно настоящему изобретению можно проводить вместо применения других лекарственных средств для лечения сердечной недостаточности или совместно (т.е. в комбинации) с ними. Таким образом, другие известные лекарственные средства для лечения сердечной недостаточности могут быть включены в фармацевтические композиции, описанные выше, или их можно вводить отдельно способом, подходящим для данного лекарственного средства.
Подходящие дополнительные или вспомогательные лекарственные средства или агенты для лечения сердечной недостаточности хорошо известны и описаны в данной области техники и включают известные лекарственные средства, применяемые для лечения сердечных нарушений. Например, можно применять мочегонные средства, сосудорасширяющие средства, инотропные средства, такие какдигоксин или дигитоксин, или другие соединения, такие как антикоагулянты, β-блокаторы, блокаторы ангиотензина II, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, ингибиторы рецепторов ангиотензина-неприлизина (ARNI), комбинационные способы терапии (например, валсартан/сакубитрил) или антагонисты альдостерона.
В некоторых вариантах реализации субъектам, проходящих лечение, можно эффективно вводить сахар, например, глюкозу. В частности, при комбинационной терапии согласно настоящему изобретению применяют ингибиторы DPP-4, которые блокируют разрушение глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1). GLP-1 увеличивает секрецию инсулина и при этом подавляет высвобождение глюкагона, что тем самым понижает уровень глюкозы в плазме. Соответственно, в некоторых вариантах реализации вспомогательный или дополнительный агент для введения субъекту, которого лечат, представляет собой глюкозу.
Дополнительные или вспомогательные лекарственные средства или агенты можно включать в отдельные составы для совместного введения, например, одновременно или последовательно или с различными интервалами, с активными агентами для применения в комбинированной ударно-волновой терапии согласно настоящему изобретению (например, с ингибитором DPP-4 и/или фармакологическим мобилизатором стволовых клеток, например, паратиреоидным гормоном).
Дополнительные или вспомогательные лекарственные средства или агенты, таким образом, могут быть обеспечены совместно с активными агентами для применения в комбинированной ударно-волновой терапии согласно настоящему изобретению в форме набора. Указанный набор может содержать, например, отдельные контейнеры для активных агентов (содержащие или включающие их) для применения в комбинированной ударно-волновой терапии согласно настоящему изобретению и дополнительных или вспомогательных лекарственных средств или агентов, соответственно, необязательно совместно с инструкциями по применению.
Например, можно считать, что в настоящем изобретении предложен набор или продукт, содержащий:
(i) ингибитор DPP-4 или фармацевтическую композицию, содержащую указанный ингибитор и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество; и
(ii) фармакологический агент для мобилизации стволовых клеток, такой как паратиреоидный гормон или его фрагмент, или фармацевтическую композицию, содержащую указанный фармакологический агент и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество; и необязательно
(iii) дополнительный агент, например, агент для лечения сердечной недостаточности или глюкозу, или фармацевтическую композицию, содержащую указанный дополнительный агент и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
В некоторых вариантах реализации компоненты, определенные в пунктах (i)-(iii), в составе набора или продукта, описанного выше, обеспечены в виде комбинированного препарата для одновременного, последовательного или раздельного применения в:
(a) лечении или предупреждении сердечной недостаточности; или
(b) лечении ишемического-реперфузионного повреждения сердца,
у субъекта, где указанному субъекту проводят экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца, и указанные (i), (ii) и необязательно (iii) предназначены для введения до, во время и/или после проведения указанной ударно-волновой терапии.
Для исключения неопределенности, термин «ударно-волновая терапия согласно настоящему изобретению» в настоящем документе относится к способам лечения, в которых экстракорпоральную ударно-волновую терапию сердца проводят отдельно, и к комбинационным способам лечения (т.е. к проведению экстракорпоральной ударно-волновой терапии сердца в комбинации с введением ингибитора DPP-4 и/или мобилизатора стволовых клеток, например, ПТГ, и/или стволовыми клетками), если конкретно не указано иное.
Изобретение будет дополнительно описано при помощи следующих неограничивающих примеров со ссылками на следующие чертежи, где:
На фигуре 1 приведена столбчатая диаграмма, на которой показано процентное количество жизнеспособных кардиомиоцитов крыс в различных условиях лечения (усы соответствуют стандартному отклонению, **** р≤0,001, "н.з." не значимый).
На Фигуре 2 приведены столбчатые диаграммы относительного уровня (кратность изменения) (А) экспрессии гена SDF-1 и (В) экспрессии гена МСР-1 в желудочковой ткани человека через четыре часа после проведения различных способов ударно-волнового лечения (* р>0,05, ** р≤0,05, *** р≤0,001 и **** р≤0,0001).
На Фигуре 3 приведены столбчатые диаграммы относительного уровня (кратность изменения) (А) экспрессии гена ANGP-1 (ангиопоэтин) и (В) экспрессии гена VEGFA (фактор роста эндотелия сосудов А) в желудочковой ткани человека через четыре часа после проведения различных способов ударно-волнового лечения (* р>0,05, ** р≤0,05, *** р≤0,001 и **** р≤0,0001).
На Фигуре 4 приведены столбчатые диаграммы относительного уровня (кратность изменения) (А) экспрессии гена NOS-3 (синтаза оксида азота 3) и (В) экспрессии гена ТАС-1 (предшественник тахикинина 1) в желудочковой ткани человека через четыре часа после проведения различных способов ударно-волнового лечения (* р>0,05, ** р≤0,05, *** р≤0,001 и **** р≤0,0001).
На фигуре 5 приведены графики зависимости относительного уровня (кратность изменения) экспрессии гена SDF-1 от времени в (А) эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) и (В) сердечных фибробластах человека после различных способов ударно-волнового лечения (* р>0,05, ** р≤0,05, *** р≤0,001 и **** р≤0,0001).
На фигуре 6 приведены графики зависимости относительного уровня (кратность изменения) (А) экспрессии гена VEGFA и (В) экспрессии гена МСР-1 (моноцитарный хемотаксический белок 1) от времени в сердечных фибробластах человека после различных способов ударно-волнового лечения (* р>0,05, ** р≤0,05, *** р≤0,001 и **** р≤0,0001).
На фигуре 7 приведены столбчатые диаграммы относительного уровня (кратность изменения) фосфорилирования AKT в кардиомиоцитах крыс в различных условиях, где на (А) показано относительное изменение нормированного уровня р-АКТ308 и на (В) показано относительное изменение отношения р-AKT308 к нефосфорилированному AKT.
На фигуре 8 приведены столбчатые диаграммы относительного уровня (кратность изменения) (А) экспрессии гена SDF-1 и (В) экспрессии гена VEGFA в кардиомиоцитах крыс через четыре часа после проведения различных способов ударно-волнового лечения.
На Фигуре 9 показаны микрофотографии замороженных срезов тканей сердца крыс, которым проводили следующее лечение: (А) не проводили лечение; (В) экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца и ежедневное введение воды через зонд; (С) экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца и ежедневное введение DPP4i через зонд; и (D) ежедневное введение DPP4i через зонд, как описано в примере 7. Кружками отмечены участки коричневых отложений, которые свидетельствуют о наличии SDF-1.
На Фигуре 10 показаны фотографии фиксированных сердец крыс, которым проводили следующее лечение: (А) не проводили лечение; (В) экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца и ежедневное введение воды через зонд; (С) экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца и ежедневное введение DPP4i через зонд; и (D) ежедневное введение DPP4i через зонд, как описано в примере 7.
Усы на фигурах 2-6 и 8 соответствуют 95% доверительному интервалу (ДИ).
Примеры
Пример 1: Влияние ударно-волнового лечения на апоптоз кардиомиоцитов крыс, вызванный гипоксией
Первичные кардиомиоциты крыс выделяли способом Лангендорффа, в котором проводили ретроградную перфузию эксплантированных сердец через аорту с использованием оксигенированных растворов с низким содержанием кальция и растворов коллагеназы. Затем измельчали сердца и перемешивали в растворах коллагеназы для высвобождения клеток. Промывали клетки и затем проводили позитивный отбор кардиомиоцитов путем низкоскоростного центрифугирования посредством их фиксации на культуральные чашки с покрытием ламинина (чашки Петри).
2
Кардиомиоциты крыс вводили в условия тяжелой гипоксии на 30 минут (0% О2,100% N). Группы, в которых проводили ударно-волновое лечение (1000 импульсов в 1 бар или 2 бар), обрабатывали непосредственно после возвращения кнормоксии. Доставку ударных волн проводили через нижнюю часть чашек Петри посредством прямого контакта с генератором ударных волн через наконечник ударно-волновой системы Swiss Dolarclast (EMS) с использованием ультразвукового геля. Важно отметить, что в группе, в которой вводили экзогенный SDF, не проводили ударно-волновую обработку после возвращения к нормоксии. Жизнеспособность клеток оценивали путем подсчета количества стержневидных клеток и круглых клеток (где стержневидные клетки являются жизнеспособными) в трех повторностях через 24 часа после обработки ударными волнами или SDF. Результаты, которые показаны на фигуре 1, демонстрируют, что проведение ударно-волновой терапии непосредственно после гипоксии увеличивает жизнеспособность кардиомиоцитов по сравнению с необработанным контролем, это позволяет предположить, что ударно-волновая терапия может ослаблять ишемическое-реперфузионное повреждение.
Пример 2: Влияние ударно-волнового лечения на экспрессию генов в желудочковой ткани человека
2
Эксплантированную желудочковую ткань сердца человека мелко нарезали и выращивали по отдельности в 24-луночных планшетах в среде М199. Воздействие ударными волнами в различных условиях проводили путем временного размещения фрагментов тканей в 1,5 мл пробирки Эппендорф в среде М199. Генератор ударных волн, описанный в примере 1, напрямую присоединяли к пробиркам с использованием ультразвукового геля. Затем возвращали фрагменты тканей в соответствующую питательную среду в инкубаторе (37°С и 5% СO) на 4 часа, после чего хранили в RNA-Later при -80°С. По частям образцы полностью гомогенизировали в тризоле с использованием мощного гомогенизатора. Очищали РНК с использованием хлороформа и коммерческих центрифужных колонок. Качество РНК изучали на спектрофотометре Nanodrop и проводили реакции обратной транскрипции. Экспрессию генов SDF1 (фактор стромальных клеток 1), VEGFA (фактор роста эндотелия сосудов А), МСР1 (моноцитарный хемотаксический белок 1), ANGP1 (ангиопоэтин), ТАС1 (предшественник тахикинина 1) и NOS3 (синтаза азотной кислоты 3) оценивали при помощи зондов Taqman в смеси TaqMan Gene Expression Master Mix, нормированной с использованием ГАФДГ, в системе ПЦР в реальном времени Applied Biosystems™ 7900НТ Fast Real-Time PCR System. Кратность изменения вычисляли способом ΔΔСТ. Результаты, которые показаны на фигурах 2-4, демонстрируют, что существуют статистически значимые различия между необработанным контролем и образцами через 4 часа после обработки для всех исследуемых генов.
Пример 3: Влияние ударно-волнового лечения на экспрессию гена SDF-1 в клетках эндотелия и сердечных фибробластах человека
Желудочковые ткани сердца человека расщепляли с использованием коллагеназы и промывали суспензии отдельных клеток, помещали планшеты и выращивали в среде DMEM, дополненной 10% FCS. Собирали HUVEC из пуповины человека и выращивали в EGM2. Для экспериментов использовали клетки из пассажей 3-5.
Сердечные фибробласты человека и HUVEC обрабатывали ударными волнами, как описано в примере 1, и после достижения заданных временных точек удаляли среду и проводили лизис клеток в тризоле. Экспрессию гена SDF1 измеряли в различные моменты времени после воздействия ударными волнами согласно способу, описанному в примере 2. Результаты показаны на фигуре 5.
В сердечных фибробластах человека экспрессия гена SDF1 продолжала увеличиваться и через 24 часа, тогда как экспрессия гена SDF1 в HUVEC достигала максимального значения через 2-6 часов и возвращалась к исходному уровню через 24 часа после обработки ударными волнами. Полученные результаты демонстрируют, что обработка ударными волнами запускала продолжительную экспрессию гена SDF1, в частности в сердечных фибробластах.
Пример 4: Влияние ударно-волнового лечения на экспрессию генов в сердечных Фибробластах человека
Сердечные фибробласты человека получали согласно способу, описанному в примере 3, и проводили обработку ударными волнами, как описано в примере 1. Экспрессию генов VEGFA и МСР1 измеряли в различные моменты времени после обработки ударными волнами согласно способу, описанному в примере 2. Результаты, которые приведены на фигуре 6, показывают, что в отличие от SDF1 экспрессия генов VEGFA и MCP1 быстро увеличивалась уже через 3 часа и возвращалась к исходному уровню через 24 часа. Полученные данные демонстрируют, что экспрессия SDF1 в фибробластах происходит с 24-часовой задержкой после экспрессии SDF1 в клетках эндотелия, что создает временный и пространственный градиент между внутрисосудистыми и сердечными тканями.
Пример 5: Влияние ударно-волнового лечения на фосфорилирование AKT в кардиомиоцитах крыс
Кардиомиоциты крыс выращивали в стандартных условиях и обрабатывали: ударными волнами (1000 импульсами по 1 бар); экзогенным SDF; или ингибитором PI3 киназы (LY294002). Фосфорилирование AKT измеряли в различные моменты времени при помощи вестерн-блоттинга, нормировку проводили с использованием антител pan-AKT и СОХ IV в качестве контроля нагрузки.
Результаты, которые приведены на фигуре 7, показывают, что фосфорилирование AKT увеличивается в клетках, обработанных ударными волнами. Тем не менее, этот эффект не блокировался ингибитором PI3 киназы (LY294002), это указывает на то, что фосфорилирование AKT под действием ударных волн не зависит от фосфатидилинозитол-3-киназы, активатора пути АКТ.
Пример 6: Влияние ударно-волнового лечения на экспрессию гена SDF-1 в кардиомиоцитах крыс
Кардиомиоциты крыс выращивали согласно способу, описанному в примере 1, и обрабатывали ударными волнами (1000 импульсов по 1 бар или 2 бар). Экспрессию генов SDF1 и VEGFA измеряли через 4 часа после обработки, как описано в примере 2. Результаты, которые показаны на фигуре 8, демонстрируют отсутствие статистически значимых различий экспрессии генов SDF1 и VEGFA между необработанным контролем и образцами, обработанными ударными волнами. Это указывает на то, что антиапоптотическое действие ударных волн в кардиомиоцитах не зависит от антиапоптотических факторов, таких как SDF1 и VEGFA.
Пример 7: Действие лечения ударными волнами и ингибитором DPP-4 (DPP4D в сердце крыс
Самцам крыс линии Льюис (250-275 г) проводили следующее лечение в течение четырех дней: (1) не проводили лечение; (2) экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца во 2 день из 4 и ежедневное пероральное введение воды через зонд; (3) экстракорпоральная ударно-волновая терапия сердца во 2 день из 4 и ежедневное пероральное введение DPP4i через зонд; и (4) ежедневное пероральное введение DPP4i через зонд.
2
2
Ударно-волновую терапию (импульсы 0,25 мДж/мм × 1000 с частотой 4 Гц на устройстве Storz Medical DUOLITH SD1) проводили под общей анестезией (1,5-2% изофлурана в 100% O). Ударные волны непрерывно направленно доставляли в сердце, расположение которого определяли путем пальпации, одновременно проводили эхокардиографию с использованием ультразвукового геля.
Ингибитор DPP4 (линаглиптин, 3 мг крысе, доставляли в виде 1 мг/мл раствора) или воду вводили напрямую в желудок через иглу желудочного зонда.
Умерщвляли животных и эксплантировали сердца через 4 дня после начала эксперимента. Вымывали кровь из сердец фосфатным буферным раствором, фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи, проводили криозащиту в 30% сахарозе в течение ночи, а затем погружали в ОСТ для получения криосрезов с использованием Cryostat.
Проводили иммуногистохимию срезов, блокированных в 1% БСА в Tris-буферном солевом растворе + Tween с использованием кроличьих антикрысиных первичных антител к SDF1 и козьих антикроличьих вторичных антител, конъюгированных с HRP (конъюгированных с пероксидазой хрена). Срезы тканей контрастно окрашивали гематоксилином и использовали 3,3'-диаминобензидин (DAB) в качестве субстрата для хромогенного детектирования HRP. DAB приводит к образованию коричневого нерастворимого продукта в присутствии HRP. Проводили дегидратацию срезов при помощи набора растворов этанола, фиксировали в DPX-new и заменяли растворитель на ксилол. Для визуализации срезов использовали светлопольную микроскопию.
Результаты показаны на фигуре 9, причем способы лечения 1-4 изображены на фигурах 9A-D, соответственно. Для удобства поиска отложения коричневого нерастворимого продукта реакции, которые подтверждают наличие SDF-1, отмечены кружками. Было обнаружено, что SDF-1 индуцировался под действием экстракорпоральной ударно-волновой терапии (см. фигуры 9В и 9С); коричневые отложения отсутствовали в сердечной ткани крыс, которым не проводили лечение (фигура 9А), или крыс, которым вводили только DPP4i (фигура 9D). Кроме того, у крыс, которым вводили DPP4i, наблюдали значительное увеличение уровня SDF-1 по сравнению с крысами, которых лечили только ударными волнами или DPP4L Полученные результаты указывают на то, что комбинация ударных волн и введения DPP4i обеспечивает эффект, превышающий аддитивный показатель, в отношении наличия SDF-1 в сердечной ткани.
На фигуре 10 показан внешний вид сердец крыс после ночной инкубации с 4% параформальдегидом: А) необработанный нормальный контроль, В) только ударные волны; С) ударные волны и DPP4i, и D) только DPP4i. Было обнаружено, что в сердцах крыс, которых лечили ударными волнами и DPP4i, наблюдались крайне выраженные кровяные сосуды по сравнению с сердцами крыс, которых лечили только ударными волнами. Сердца крыс, которым не проводили лечение, и крыс, которым вводили только DPP4i, были очень похожими. Был сделан вывод о том, что DPP4i усиливает процесс ангиогенеза, запускаемый ударными волнами, a DPP4i сам по себе оказывал нейтральное действие.