Влияние оксидаз клеточных стенок на содержание Н2О2 в апопласте проростков кукурузы

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1

Т. Е. Билова, Е. И. Шарова

ВЛИЯНИЕ ОКСИДАЗ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК НА СОДЕРЖАНИЕ Н2О2

В АПОПЛАСТЕ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ*

Пероксид водорода в апопласте является ключевым компонентом окислительного взрыва в системе адаптивного ответа растений на стресс, а также вовлечен в контроль растяжимости клеточной стенки во время роста растений. Вопрос о роли окислительных процессов, происходящих с участием Н2О2, в регуляции растяжения растительных клеток в настоящее время очень актуален. Значительный интерес к этой теме объясняется тем, что Н2О2 участвует в двух противоположных процессах: 1) способствующих ужесточению клеточных стенок и 2) вызывающих их размягчение [9, 13]. Ригидифи-кация клеточных стенок опосредована участием Н2О2 в окислительных реакциях поперечного связывания полимеров и сополимеризации монолигнолов, катализируемых пероксидазами [14]. Размягчение клеточных стенок может быть вызвано разрывом полимеров •ОН-радикалами — продуктами окислительных реакций между О—• и Н2О2 (реакция Хабера—Вайса) [6, 11].

Поскольку пероксид водорода — единственная относительно устойчивая активная форма кислорода (АФК), исследования динамики его генерации и утилизации представляют особый интерес. Баланс Н2О2 в апопласте очень динамичен и поддерживается клеткой посредством регуляции сложного комплекса быстро протекающих окислительно-восстановительных реакций. Появление АФК в апопласте связывают с работой, по крайней мере, четырех ферментных систем.

НАД(Ф)-Н-оксидаза плазматической мембраны растений поставляет О—• в клеточную стенку за счет окисления внутриклеточного пула НАД(Ф)-Н. Этот фермент имеет частичное сходство с НАДФ-Н-оксидазным комплексом плазмалеммы фагоцитов [13, 17]. Исследованию НАД(Ф)-Н-оксидазы посвящено значительное количество работ, и многими исследователями она рассматривается как наиболее мощный генератор АФК. Будучи индуцибельным ферментом, НАД(Ф)-Н-оксидаза опосредует быстрое развитие окислительного стресса в ответ на действие ряда стрессоров — патогенную инфекцию, засуху [17]. В то же время есть сведения, доказывающие ее участие в регуляции таких физиологических процессов, как рост клеток растяжением и закрывание устьиц [5, 13].

* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №08-04-00566а).

© Т. Е. Билова, Е. И. Шарова, 2010

Полагают, что растительные экстраклеточные секреторные пероксидазы способны катализировать генерацию Н2О2 при окислении различных ароматических соединений [9] и НАД(Ф)-Н молекулярным кислородом [13]. У разных видов растений доказано участие этих ферментов в индукции окислительного стресса в ответ на патогенную атаку [9, 13]. Некоторые исследователи считают, что как пероксидазная, так и оксидаз-ная активность пероксидаз вовлечены в регуляцию растяжимости полимерной стенки во время быстрого роста клетки [9, 11, 14]. Альтернативными источниками пероксида водорода в клеточной стенке являются оксалатоксидазы и аминооксидазы.

Оксалатоксидазы, катализирующие окисление оксалата с образованием СО2 и Н2О2, обнаружены в основном у злаков. Этот фермент содержит в активном центре 6 атомов Мп, обладает высокой термостабильностью и устойчивостью к действию различных протеаз, что, вероятно, обусловлено особенностями его вторичной структуры, представленной в основном в-слоем [10, 19]. Подобная стабильная структура свойственна и некоторым джермин-подобным белкам, распространенным среди многих растений, однако не проявляющим оксалатоксидазной активности [10]. Оксидазная активность этих ферментов традиционно ассоциирована с началом роста злаков, поскольку она максимальна при прорастании семян и снижается по мере развития растений. В связи с этим оксалатоксидазы злаков часто называют джерминами (от англ. germination — прорастание). Синтез оксалатоксидаз также активируется при патогенезе и в ответ на действие некоторых абиотических факторов [10].

Важным источником Н2О2 в апопласте являются аминооксидазы, включающие ди-и полиаминооксидазы. Диаминооксидазы особенно активны в клеточных стенках бобовых, содержат в активном центре атом меди и окисляют молекулярным кислородом полиамины по первичной аминогруппе с образованием соответствующих аминоальдеги-дов, NH3 и Н2О2. Путресцин и кадаверин, вероятно, являются основными субстратами этих ферментов в клеточных стенках [4]. Полиаминооксидазы (ПАО) — ФАД-зависи-мые ферменты, катализирующие окисление полиаминов по вторичной аминогруппе. Продуктами этой реакции являются аминоальдегиды, 1,3-диаминопропан и Н2О2 [3, 4]. ПАО в отличие от диаминооксидаз наиболее активны в клеточных стенках однодольных [16]. Литературные источники свидетельствуют о вовлеченности аминооксидаз в регуляцию таких физиологических процессов, как ригидификация клеточных стенок и их лигнификация [3], защитные реакции на поранение и проникновение патогенов, программируемая гибель клеток [16].

Следует отметить, что наибольшее внимание в течение последних 10 лет уделяется роли апопластных АФК в патогенезе и выяснению ключевых источников АФК, обусловливающих быстрое развитие окислительного стресса в клеточных стенках. В этом контексте обсуждаются в основном генераторы О--: НАДФ-Н — оксидаза плазматической мембраны и НАД-Н-оксидазная активность пероксидаз. На фоне достижений в этой области, хорошо представленных в обзорах [9, 13], участие АФК-генерирующих систем в регуляции развития растений остается практически неизученным. В данное время в литературе можно найти лишь отрывочные сведения об участии отдельных ферментов в регуляции быстрого роста растяжением. Этого явно не достаточно для оценки вклада всех АФК-генерирующих ферментных систем в поддержание баланса Н2 О2 в апопласте — параметра, который входит в число факторов, способных изменять рост, так как он влияет на растяжимость клеточной стенки. Практически полностью отсутствуют данные о том, как изменяется активность этих ферментов при торможении роста, которое сопровождает начало дифференцировки или в некоторых случаях старение клеток.

В связи с изложенной проблемой цель настоящего исследования — оценить участие оксидаз, локализованных в клеточных стенках, в регуляции содержания пероксида водорода в апопласте при снижении скорости роста клеток. Торможение роста изолированных колеоптилей кукурузы в результате их ускоренного старения было выбрано нами в качестве удобной модели для данного исследования. В предыдущей работе с использованием подобной модели было показано, что старение колеоптилей сопровождается значительным увеличением пероксида водорода в апопласте, несмотря на одновременное возрастание активности пероксидаз — основных ферментов, утилизирующих Н2О2 [1].

Объект и методы исследования

В работе использовали проростки кукурузы, выращенные при 27°С в темноте. Суб-апикальные десятимиллиметровые отрезки колеоптилей вырезали из четырехсуточных проростков, отступив на 4 мм от верхушки, и инкубировали в течение 20-24 ч в вертикальном положении во влажной камере (27°С), залитыми на 1/3 высоты 1 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,0) с 0,5%-ной сахарозой. Эти стареющие отрезки сравнивали с отрезками колеоптилей, свежесрезанными из пятисуточных проростков.

Для получения фракций клеточной стенки 15-20 отрезков колеоптилей гомогенизировали в 7-8 мл калий-фосфатного буфера рН 6,0 (10 мМ). Осадок отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 1700 g, отмывали от мембранных компонентов встряхиванием в буфере (7 мл), содержащем 0,2% детергента тритона Х-100 в течение 30 мин, затем отделяли центрифугированием при тех же условиях и вновь промывали буфером. Промытый осадок заливали 3 мл 1 М МаС1 и выдерживали 30 мин для экстракции ионосвязанных ферментов клеточной стенки. Экстракт отделяли центрифугированием в тех же условиях. Осадок ресуспендировали в 3 мл буфера и использовали для исследования ферментов, ковалентносвязанных с клеточной стенкой. Всю процедуру проводили при 4°С.

При определении НАД-Н-оксидазной активности пероксидаз реакцию окисления НАД-Н молекулярным кислородом инициировали внесением в среду общим объемом 5 мл аликвоты (40 мкл) солевого экстракта. Реакция проходила в реакционной среде следующего состава: К-фосфатный буфер рН 6,0 (20 мМ), 2,4-дихлорфенол (0,05 мМ), Мп804 (0,1 мМ) и НАД-Н (0,2 мМ).

Оксидазную активность пероксидаз определяли по количеству пероксида водорода, образующегося в ходе данной реакции. Для этого через 1, 2 и 3 мин от момента инициации реакции отбирали порции реакционной среды, которые фиксировали в равном объеме чувствительного к Н2О2 реактива ЕОХ, содержащего сорбит (200 мМ), ^ЭО4 (50 мМ), ксиленовый оранжевый (0,2 мМ), Ее8О4 (0,5 мМ) и (МН4)28О4 (0,5 мМ). Через 45 мин после смешивания с реактивом ЕОХ растворов, содержащих Н2О2, измеряли экстинкцию при Л = 560 нм. Чувствительность данного метода к пероксиду водорода основана на том, что в присутствии Н2О2 в кислой среде при окислении Ее11 до Ее111 индикатор ксиленовый оранжевый изменяет цвет, поскольку образует комплекс с Ее111 [12].

Активность полиаминоокидаз определяли по скорости генерации Н2О2 в ходе реакции окисления спермидина молекулярным кислородом, которая инициировалась внесением аликвоты (0,2 мл) солевого экстракта в 4,8 мл раствора, содержащего калий-фосфатный буфер (рН 6,0) и спермидин, конечная концентрация которых в реакционной среде составляла 20 и 2 мМ соответственно. Порции реакционной среды, как и в

предыдущем методе, отбирали через 1, 2 и 3 мин от начала реакции и фиксировали в равном объеме реактива FOX.

Для определения активности оксалатоксидаз инициировали реакцию окисления ок-салата смешиванием суспензии клеточных стенок (3 мл) с раствором (2 мл), содержащим янтарный буфер рН 3,4 (100 мМ), щавелевую кислоту (5 мМ), ЭДТА (5 мМ). Активность оксалатоксидаз оценивали по скорости накопления Н2О2 в реакционной среде. Для этого аликвоты среды (1,5 мл) отбирали через каждые 10 мин в течение 30 мин и смешивали с раствором (0,75 мл) следующего состава: калий-фосфат-ный буфер рН 6,5 (348 мМ), 3-диметиламинобензойная кислота (11,6 мМ), 3-метил-2-бензотиазолингидразон (0,65 мМ), пероксидаза хрена (0,28 U/мл). Окраска раствора развивалась в течение 3 мин, ее интенсивность измеряли при А = 590 нм.

На рисунках приведены средние результаты 3-5 опытов и их среднеквадратические ошибки.

Результаты исследований и их обсуждение

В предыдущем исследовании было показано, что при ускоренном старении изолированных колеоптилей уровень пероксида водорода в апопласте возрастал более чем в два раза. Это происходило на фоне возрастания в три раза активности пероксидаз, утилизирующих Н2О2 в реакциях окислительного поперечного связывания полимеров клеточных стенок, что, в свою очередь, способствовало снижению растяжимости клеточных стенок и роста клеток [1]. Как известно, уровень пероксида водорода в клеточных стенках определяется сбалансированной работой ферментов его продуцирующих и утилизирующих. Следовательно, эти данные косвенно свидетельствуют о возрастании активности ферментов, продуцирующих Н2О2 в апопласте колеоптилей при их старении.

Для изучения динамики изменения оксидазной активности пероксидаз и полиами-нооксидаз мы впервые воспользовались реактивом FOX. Этот метод значительно чувствительнее, чем распространенный метод определения активности вырабатывающих Н2О2 ферментов посредством пероксидазной реакции [3, 4]. Тем не менее следует обратить внимание на то, что чувствительность метода FOX к Н2О2 может изменяться в ту или иную сторону в зависимости от веществ, присутствующих в реакционной смеси. Так, из рис. 1, представляющего калибровочные кривые, видно, что компоненты реакции окисления НАД-Н увеличивают чувствительность реактива FOX к Н2О2 (кривая 1), в то время как спермидин — субстрат, используемый полиаминооксидазой, снижает ее (кривая 2). Более того, реактив FOX полностью терял свою чувствительность к Н2О2 в присутствии компонентов, необходимых для реакции окисления оксалата (данные не представлены). В последнем случае для определения накопления Н2О2 —продукта ок-салатоксидазы применяли пероксидазную реакцию.

Для оценки потенциальной оксидазной активности пероксидаз мы использовали известную реакцию окисления НАД-Н молекулярным кислородом, которая, согласно литературным данным, протекает при кислых и нейтральных значениях рН в присутствии Мп2+ и определенных фенолов [7, 8]. Дискуссия по поводу механизма этой реакции продолжается более чем 40 лет. Результаты многих экспериментов находят наиболее полное объяснение с позиции гипотезы I. Yamazaki и K. Yokota, предложенной еще в 1973 г. [20]. Эти исследователи впервые предположили, что радикалы, генерируемые в классическом пероксидазном цикле при окислении пероксидазой восстановителей, могут быть вовлечены в неферментативные реакции. Способность пероксидаз

1 2 3 4 5 6 7

Концентрация Н202 в пробе, мкмоль

Рис. 1. Калибровочные кривые для определения Н2О2 методом FOX

Концентрацию Н2О2 измеряли в пробе, которую смешивали в соотношении 1:1 с FOX-реагентом. Проба также содержала 20 мМ К-фосфат-ный буфер, рН 6,0 (контрольная кривая) либо тот же буфер, 0,1 мМ MnSO4, 0,05 мМ дихлорфенол,

0,2 мМ НАД-Н

изолированных клеточных стенок продуцировать как О--, так и Н2О2 в присутствии молекулярного кислорода, НАД-Н и монофенолов была подтверждена в 1977-1978 гг. в работах G. G. Gross и соавторов [7] и B. Halliwell [8].

Ранее нами было установлено, что активность ионносвязанных пероксидаз многократно превышала активность растворенного в апопласте фермента, и эта разница еще больше увеличивалась при старении изолированных колеоптилей, что, по-видимому, обусловлено переходом части фермента в ионосвязанную форму [1]. Некоторые исследователи предполагают существование взаимосвязи между развитием в матриксе клеточных стенок окислительного стресса и переходом ферментов в нерастворимое состояние, механизм которого до сих пор не известен [4]. В данной работе мы ограничились оценкой потенциальной оксидазной активности только преобладающей в клеточных стенках ионосвязанной фракции пероксидаз.

На рис. 2, А представлена динамика развития НАД-Н-оксидазной реакции ионосвязанных пероксидаз, в которой можно различить 2 фазы: медленную, продолжительностью 1 мин (так называемый лаг-период), и следующую быструю фазу, во время которой скорость реакции возрастает. При старении колеоптилей НАД-Н-оксидазная

Свежесрезанные

колеоптили

Стареющие

колеоптили

Рис. 2. НАД-Н-оксидазная активность пероксидаз, ионносвязанных с клеточными стенками колеоптилей

кукурузы:

А — кинетика реакции; Б — изменение активности при старении колеоптилей

активность ионносвязанных пероксидаз возрастала почти на 60% по сравнению с контролем (рис. 2, Б). В целом оксидазная активность пероксидаз была в несколько раз ниже соответствующей пероксидазной активности этих ферментов.

Результаты, представленные на рис. 2, демонстрируют работу фермента в оптимальных условиях, что в первую очередь подразумевает избыток субстрата НАД-Н в реакционной среде. Тем не менее в литературе вопрос о содержании НАД-Н в матриксе клеточных стенок до сих пор остается открытым. Некоторые сведения указывают на содержание НАД+ в апопласте в микромолярных концентрациях [15]. В клеточных стенках источником НАД-Н может быть связанная с полимерами малатдегидрогеназа [7]. В связи с тем, что содержание НАД-Н в клеточных стенках безусловно невелико, многие исследователи полагают, что пероксидазы вырабатывают Н2О2, используя другие восстановители, природа которых до сих пор не установлена [11, 13].

Известно, что полиаминооксидазы у злаков локализованы в первичных и вторичных клеточных стенках ксилемы, ксилемной паренхимы, эндодермы и эпидермиса. Причем значительно более высокая активность этого фермента обнаруживается в стеле по сравнению с наружными тканями. Эти ферменты присутствуют в сопоставимых количествах в ионно- и ковалентносвязанной фракциях. Имеются данные о том, что увеличение активности ПАО в клеточных стенках наружных тканей (эндодермы и эпидермиса) связано с постепенным торможением роста осевых органов. Это явление объясняют усилением пероксидазозависимой ригидификации клеточных стенок с использованием Н2О2, который вырабатывается в апопласте при окислении полиаминов ПАО [3]. В клеточных стенках одновременно присутствуют как спермидин, так и спермин — полиамины, которые могут быть окислены полиаминооксидазой. Поскольку, согласно литературным данным, содержание в апопласте спермидина более чем в 20 раз выше, чем спермина [21], мы использовали спермидин для оценки активности ПАО.

Представленная на рис. 3, А кинетика образования Н2О2 в течение реакции окисления спермидина имеет нелинейный характер, так как скорость катализируемой ПАО реакции постепенно снижается. В серии предварительных экспериментов на колеоптилях и мезокотилях кукурузы было показано, что активность ионно- и ковалентносвязанных ПАО была примерно одинаковой (данные не приведены). При старении колеоптилей активность ионносвязанных ПАО возрастала на 26% относительно контроля (рис. 3, Б),

Время, мин

Рис. 3. Полиаминооксидазная активность, ионносвязанная с клеточными стенками колеоптилей кукуруз

А — кинетика реакции; Б — изменение активности при старении колеоптилей

тогда как активность ковалентносвязанных ПАО увеличивалась лишь незначительно (данные не приведены).

Известно, что при развитии окислительного стресса, особенно в ответ на патогенную атаку, усиливается секреция полиаминов в клеточную стенку. Поскольку полиамины мультифункциональны и способны влиять на многие клеточные процессы, долгое время пытались объяснить связь полиаминов с развитием окислительного стресса. В настоящее время полагают, что важная роль полиаминов в развитии окислительного стресса состоит как раз в том, что, являясь субстратами ПАО, они представляют собой источник пероксида водорода в клеточной стенке. В связи с этим полагают, что фактическая активность ПАО in muro может также регулироваться скоростью синтеза и секреции полиаминов в апопласт [21].

Полиаминооксидазы кукурузы, активность которых была исследована в настоящей работе, являются наиболее изученными ферментами среди остальных аминооксидаз. Полная аминокислотная последовательность этого белка уже известна [16]. При исследовании трехмерной структуры ПАО кукурузы на внешней ее стороне было выявлено значительное число сайтов фосфорилирования [2]. А. Cona и соавторы [4] показали, что работа этого фермента сильно зависит от активности фосфатаз, так ингибирование их с помощью кантаридина и каликулина способствовало увеличению активности ПАО [4]. В этом контексте интересно заметить, что Н2О2 также способствует снижению активности фосфатаз [18], и, вероятно, опосредованно через этот механизм может способствовать возрастанию активности ПАО.

Способность оксалатоксидазы участвовать в поддержании высокого уровня пероксида водорода в матриксе клеточных стенок колеоптилей мы оценивали по скорости накопления Н2О2 в результате О2-зависимого окисления оксалата, катализируемого ковалентносвязанной фракцией фермента. Количество пероксида водорода, генерируемое оксалатоксидазой, определяли ферментативным методом (см. раздел «Объекты и методы исследования» и рис. 4). Количество пероксида водорода, генерируемое оксалатоксидазой, определяли ферментативным методом [4]. Кинетика окисления оксалата кислородом представлена на рис. 5, А. Видно, что скорость продукции Н2О2 со временем снижается. В отличие от ранее рассмотренных пероксидаз и аминооксидаз, активность оксалатоксидазы не обнаруживалась в растворимой и ионносвязанной фермент-

0 5 10 15

Концентрация Н202 в пробе, мкмоль

Рис. 4. Калибровочная кривая для определения Н2О2 ферментативным методом

Концентрацию Н2О2 измеряли в пробе, которую смешивали в соотношении 2:1 с реагентом, содержащим пероксидазу хрена и ароматические амины

Свежесрезанные

колеоптили

Стареющие

колеоптили

О 10 20 30

Рис. 5. Активность оксалатоксидаз, ковалентносвязанных с клеточными стенками колеоптилей кукурузы:

А — кинетика реакции; Б — изменение активности при старении колеоптилей

ных фракциях (данные не приведены). Похожие результаты на проростках кукурузы и пшеницы были получены B.Lane [10]. Он показал, что, несмотря на отсутствие активности, количество растворимого фермента практически не отличается от его содержания в нерастворимой фракции. Этот факт дал основание полагать, что растворимая оксалатоксидаза связана с ингибитором, который, вероятно, имеет белковую природу, поскольку после обработки пепсином активность фермента этой фракции многократно возрастала. Кроме того, растворимую оксалатоксидазу активировал глюкуроноара-биноксилан, а белковый ингибитор подавлял его действие. По-видимому, доступность оксалата не является важным фактором в регуляции активности оксалатоксидазы, поскольку его содержание в злаках поддерживается на уровне 0,1 мкг/мг сырой массы (1-2 мМ) даже во время быстрого роста. Активность оксалатоксидазы может сильно (более чем в 500 раз) различаться в разных частях проростков, достигая наибольшего значения в мезокотиле, а наименьшего — в листьях [10].

Обнаруженная в настоящей работе активность оксалатоксидаз была многократно ниже активности других изученных нами ферментов (см.: рис. 2, Б, 3, Б ; 5, Б ). При старении изолированных колеоптилей активность ковалентносвязанных оксалатокси-даз снижалась почти в 2 раза по сравнению с контролем. Эти результаты соответствуют литературным данным, согласно которым активность оксалатоксидаз снижается по мере развития растений [10].

Полученные результаты дают основание полагать, что в процессе старения ко-леоптилей кукурузы оксидазная активность пероксидаз и полиаминооксидаз клеточных стенок способствует накоплению пероксида водорода в апопласте. Вклад оксалатоксидаз в поддержание уровня апопластного Н2О2 снижается.

Литература

1. Билова Т. Е., Шарова Е. И. Участие пероксидазных реакций в снижении растяжимости клеточных стенок при старении колеоптилей кукурузы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2006. Вып. 2. С. 68-76.

2. Blom N., Gammeltoft S., Brunak S. Sequence- and structure-based prédiction of eukaryotic protein phosphorylation sites // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 294. P. 1351-1362.

3. Cona A., Cenci F., Cervelli M., Federico R., Mariottini P., Moreno S., Angelini R. Polyamine oxidase, a hydrogen peroxide-producing enzyme, is up-regulated by light and down-regulated by auxin in the outer tissues of the maize mesocotyl // Plant Physiol. 2003. Vol. 131. P. 803-813.

4. Cona A., Rea G., Botta M., Corelli F., Federico R., Angelini R. Flavin-containing polyamine oxidase is a hydrogen peroxide source in the oxidative response to the protein phosphatase inhibitor cantharidin in Zea mays L. // J. Exp. Botany. 2006. Vol. 57. P. 2277-2289.

5. Foreman J., Demidchik V., Bothwell J.H.F., Mylona P., Miedema H., Torresk M.A., Lin-stead P., Costa S., Brownlee C., Jonesk J. D. G., Davies J. M., Dolan L. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth // Nature. 2008. Vol. 422. P. 442-446.

6. Fry S. C. Oxidative scission of plant cell wall polysaccharides by ascorbate-induced hydroxyl radicals // Biochem. J. 1998. Vol. 332. P. 507-515.

7. Gross G. G., Janse C., Elstner E.F. Involvement of malate, monophenols, and the superoxide radical in hydrogen peroxide formation by isolated cell walls from horseradish (Armoracia lapathifolia Gilib.) // Planta. 1977. Vol. 136. P. 271-276.

8. Halliwell B. Lignin synthesis: the generation of hydrogen peroxide and superoxide by horseradish peroxidases and its stimulation by manganese (II) and phenols // Planta. 1978. Vol. 140. P. 81-88.

9. Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction // Plant Cell Rep. 2003. Vol. 21. P. 829-837.

10. Lane B. G. Oxalate oxidases and differentiating surface structure in wheat: germins // Biochem. J. 2000. Vol. 349. P. 309-321.

11. Liszkay A., van der Zalm E., Schopfer P. Production of reactive oxygen intermediates (О--, Н2О2, and •OH) by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth // Plant Physiol. 2004. Vol. 136. P. 3114-3123.

12. Marre M. T., Amicucci E., Zingarelli L., Albergoni F., Marre E. The respiratory burst and electrolyte leakage induced by sulfhydryl blockers in Egeria densa leaves are associated with H2O2 production and are dependent on Ca2+ influx // Plant Physiol. 1998. Vol. 118. P. 1379-1387.

13. Mika A., Minibayeva F., Beckett R., Luthje S. Possible function of extracellular peroxidases in stress-induced generation and detoxification of active oxygen species // Phytochem. Rev. 2004. Vol. 3. P. 173-193.

14. Schopfer P. Hydrogen peroxide-mediated cell-wall stiffening in vitro in maize coleoptiles // Planta. 1996. Vol. 199. P. 43-49.

15. Shinkle J. R., Swoap S. J. Simon P., Jones R. Cell wall free space of Cucumis hypocotyls contains NAD and a blue light-regulated peroxidase activity // Plant Physiol. 1992. Vol. 98. P. 13361341.

16. Tavladoraki P., Schinina M. E., Cecconi F., Agostino S. D., Manera F., Rea G., Mariottini P., Federico R., Angelini R. Maize polyamine oxidase: primary structure from protein and cDNA sequencing // FEBS Lett. 1998. Vol. 426. P. 62-66.

17. Torres M. A., Dangl J. L., Jones J. D. G. Arabidopsis gp91phox homologues AtrbohD and AtrbohF are required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense response // PNAS. 2002. Vol. 99. P. 523-528.

18. van Monfort R. L., Congreve M., Tisi D., Carr R., Jhoti H. Oxidation state of the activate-site cysteine in protein tyrosine phosphatase 1B // Nature. 2003. Vol. 423. P. 773-777.

19. Woo E.-J., Dunwell J. M., Goodenough P. W., Marvier A. C., Pickersgill R. W. Germin is a manganese containing homohexamer with oxalate oxidase and superoxide dismutase activities // Nature Struct. Mol. Biol. 2000. Vol. 7. P. 1036-1040.

20. Yamazaki I., Yokota K. Oxidation states of peroxidases // Mol. Cell Biochem. 1973. Vol. 2. P. 39-52.

21. YodaH., Yamaguchi Y., Sano H. Induction of hypersensitive cell death by hydrogen peroxide produced through polyamine degradation in tobacco plants // Plant Physiol. 2003. Vol. 132. P. 19731981.

Статья поступила в редакцию 5 апреля 2010 г.