Влияние природных соединений на окислительное фосфорилирование и перекисное окисление липидов в печени мышей при интоксикании тетрахлорметаном

Петрова З.В., Коршунов Д.А., Хазанов В.А.

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ И МЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИМИДОВ В МЕЧЕНИ МОГШЕЙ МРИ ИНТОКСИКАЦИИ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, г. Томск

Патогенез многих заболеваний связан с повреждением мембран клеток, которое приводит к нарушению их функциональной активности. Изменение целостности мембран сопровождается нарушением энергетического обмена. Это связано с изменением физико-химических свойств мембран митохондрий, а также активности энзиматических систем, имеющих внутримембранную локализацию (сукцинатдегидрогеназа, цитохромоксидаза, аденозинтрифосфатаза, аденилаттранслоказа и многие др.). Поскольку энергетический обмен является базисным, обеспечивающим функционирование всех систем живого организма, то нарушения в каком-либо звене системы энергопродукции могут привести к истощению энергетических ресурсов, а это в свою очередь способствует развитию патологических

реакций, возникновению заболеваний и даже гибели организма [8]. Поэтому патогенетически обоснованным является применение средств, оказывающих восстанавливающее и регенерирующее действие на структуру и функции клеточных мембран, тормозящих деструкцию клеток. В связи с этим разработка препаратов, способных поддерживать структурно - функциональную целостность мембран клетки и в частности митохондрий, является важнейшей задачей современной медицины и в том числе экспериментальной фармакологии. К таким препаратам относятся средства, обладающие мембранопротекторными свойствами, которые представлены флавоноидсодержащими соединениями и фосфолипидами [2].

Целью исследования являлось изучение влияния природных фосфолипидов, экстракта виноградной косточки и бадана толстолистного на функциональное состояние системы энергопродукции печени мышей при интоксикации тетрахлорметаном.

Работа выполнена на 70 беспородных белых мышах-самцах в возрасте 1,5-2 месяца, массой 2030 г. Животные находились в стандартных условиях вивария, в параллельно исследуемых группах (по 6 мышей), имели одинаковую массу тела, контролируемую ежедневным взвешиванием для коррекции вводимой дозы препаратов. В предварительном эксперименте была определена доза тетрахлорметана (ТХМ), вызывающая гибель 50% животных (ЛД ), составившая 1,28 мл/кг. Исследуемые препараты вводили мышам профилактически внутрижелудочно курсом 5 дней: экстракт природных фосфолипидов из биотехнологического материала - в виде масляного раствора, а экстракты виноградной косточки и бадана толстолистного - в виде суспензии в 1% слизи картофельного крахмала. Данные экстракты использовали в дозе 50 мг/кг. На 6-ой день животные получали однократные внутрибрюшинные инъекции 10% масляного раствора ТХМ в полулетальной дозе.

Функциональное состояние митохондрий гомогената печени оценивали полярографическим методом с помощью анализатора «Эксперт-001-4», имеющего амперометрический датчик растворенного в воде кислорода, по скорости потребления кислорода в различных метаболических состояниях по Чансу [9]. В качестве субстратов окисления использовали 5 мМ янтарную кислоту (ЯК), ЯК 5 мМ с активатором сукцинатдегидрогеназы (СДГ) изоцитратом 1,5 мМ, а также глутамат и малат в концентрации по 3 мМ каждый. В работе использовали ингибитор аминотрансфераз -аминооксиацетат (АОА) 2 мМ, а также ингибитор СДГ - малонат 2 мМ. Регистрировали скорости дыхания митохондрий до (У4п), во время (У3) и после (У40) цикла фосфорилирования добавленной АДФ и время фосфорилирования АДФ (?Тф). Для оценки энергетического статуса рассчитывали коэффициенты

стимуляции дыхания (СД=У3/У4п), дыхательного контроля (ДК=У3/У4о) и сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О). Антиоксидантные свойства экстрактов оценивали

спектрофотометрически по содержанию малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в гомогенате печени мышей [6]. Статистическую обработку результатов проводили при помощи непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Известно, что в основе повреждающего действия ТХМ лежит сильный прооксидантный эффект. В наших опытах однократное внутрибрюшинное введение животным ССЬ4 в дозе 1,28 мл/кг сопровождалось значительным повышением содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени отравленных мышей по сравнению с группой интактных животных: концентрации МДА, диеновых конъюгатов и оснований Шиффа возрастали в 3,3 раза.

Курсовое профилактическое введение природных фосфолипидов в дозе 50 мг/кг животным до моделирования токсического гепатита ограничивало накопление первичных и вторичных продуктов липопероксидации. Содержание МДА снижалось в 2,3 раза, диеновых конъюгатов в 2 раза и оснований Шиффа в 1,8 раза по отношению к показателям в группе мышей, подвергнутых интоксикации ТХМ, но не достигало при этом уровня концентрации продуктов ПОЛ в контрольной группе. Восстанавливая нормальную структуру мембран, гепатопротекторы фосфолипидной природы уменьшают доступ свободным радикалам и реакционным метаболитам -продуктам биотрансформации гепатотоксинов, а также активным формам кислорода вглубь мембран, к полиеновым жирным кислотам, что позволяет остановить цепной свободнорадикальный процесс повреждения мембран [5].

Экстракт виноградной косточки также способствовал снижению интенсивности процессов липопероксидации в печени при интоксикации ТХМ, уменьшая содержание МДА, диеновых конъюгатов и оснований Шиффа соответственно в 2,2, 2,5 и 2 раза.

Несмотря на то, что экстракт бадана толстолистного содержит в своем составе вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, процессы липопероксидации на модели острого токсического гепатита в группе животных, защищенных данным экстрактом, были значительно усилены, что выражалось в увеличении содержания диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в 1,3 раза и МДА в 1,7 раза по сравнению с показателями животных с ССЬ4-гепатитом.

Изучение функционального состояния митохондрий печени мышей при интоксикации ТХМ показало существенное ингибирование как НАД-, так и сукцинатзависимой энергопродукции, что подтверждалось снижением скоростей дыхания митохондрий во всех метаболических состояниях при

окислении как эндогенных, так и экзогенных субстратов.

Наличие кинетического энергодефицита и ингибирование сукцинатзависимой энергопродукции в исследуемой группе животных подтверждалось сохранением значительного замедления времени фосфорилирования добавленной АДФ относительно контроля. Известно, что развитие активации СДГ при экстремальных и патологических воздействиях на организм может сопровождаться компенсаторным ограничением активности СДГ [3]. Использование изолимонной кислоты, являющейся активатором СДГ, уменьшило торможение фермента (У3 возрастало на 21 %).

Ингибиторный анализ с применением конкурентного ингибитора СДГ малоната и ингибитора аминотрансфераз - АОА показал под действием ТХМ увеличение вклада окисления эндогенной ЯК и реакций переаминирования в дыхательную активность органелл при окислении НАД-зависимых субстратов. Вероятно, процесс преимущественного окисления эндогенной ЯК носит компенсаторный характер и отражает особенность метаболической регуляции цикла Кребса в условиях измененного под влиянием интоксикации состояния митохондрий [3]. При этом при утилизации субстратов всех типов одновременно отмечалось разнонаправленное изменение величин ДК, АДФ/О, что свидетельствует о нарушении метаболического контроля дыхания и разобщении окислительного фосфорилирования. Судя по полученным данным, выбранная нами модель интоксикации формирует в системе энергопродукции печени истощение адаптивных реакций [1, 4].

Исследование функциональной активности митохондрий печени мышей, защищенных экстрактом природных фосфолипидов до моделирования токсического гепатита, выявило нормализацию как НАД-, так и сукцинатзависимой энергопродукции, что подтверждалось увеличением скоростей дыхания митохондрий во всех метаболических состояниях и снижением времени фосфорилирования добавленной АДФ относительно значений группы отравленных животных. Однако увеличение скоростей дыхания не достигало нормальных показателей, и сохранялась некоторая разобщенность окислительного фосфорилирования.

Хотя флавоноидсодержащие экстракты обладают антиоксидантными свойствами, это не обеспечивало полноценную сохранность функционирования митохондрий печени при интоксикации ТХМ. Так, несмотря на укорочение времени фосфорилирования добавленной АДФ и увеличение коэффициента ДК, наблюдалось значительное повышение скоростей дыхания при низкой степени сопряженности окислительного фосфорилирования, что было особенно выражено при профилактической терапии экстрактом виноградной косточки. Возможно, падение сопряженности окислительного фосфорилирования

компенсируется высокими скоростями дыхания. Характер выявленных изменений в системе энергопродукции печени указывает на развитие низкоэнергетического сдвига (V4(<V4ii), связанного с повышение проницаемости мембран митохондрий к Н+ и разобщением окислительного

фосфорилирования [7].

Таким образом, экстракт виноградной косточки обеспечивает антирадикальную защиту, предупреждая развитие специфического действия ТХМ; мембранопротектор фосфолипидной природы, оказывая стабилизирующее действие на мембраны, способствует нормализации биоэнергетических процессов. Результаты проведенного исследования указывают на целесообразность комплексного применения препаратов с различными механизмами действия, при котором можно ожидать более эффективной защиты при токсическом поражении печени.

Литература

1. Актуальные проблемы экспериментальной и клинической. фармакологии / Под ред. В.А. Хазанова. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2001.

2.Блюгер А.Ф., Майоре А.Я. // Успехи гепатологии. Рига, 1986. вып 7. С. 11-16.

3.Кондрашова М.Н. // Биохимия. 1991. №3. С. 388-405.

4.Регуляторы энергетического обмена. Клиникофармакологические аспекты / Под ред. В.А. Хазанова. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2002.

5.Регуляторы энергетического обмена. Клиникофармакологические аспекты / Под ред. В.А. Хазанова. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004.

6.Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1978.

7.Хазанов В.А. Роль системы окисления янтарной кислоты в энергетическом обмене головного мозга: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Томск, 1993.

8.Хазанов В.А., Трифонова О.Ю., Смирнова Н.Б. Препараты - регуляторы энергетического обмена: Теоретическое обоснование и опыт клинического применения в кардиологии. Томск, 2002.

9.Chance B.C., Williams G.R. // Adv. Enzymol. - 1956. -Vol. 17. - P. 65-134.