СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИОННОГО ПРЕПАРАТА БРОМЕЛАЙНА И АЛЬГИНАТА НАТРИЯ В ВИДЕ ГУСТОГО РАСТВОРА
METHOD FOR OBTAINING COMPOSITE PREPARATION OF BROMELAIN AND SODIUM ALGINATE IN THE FORM OF A DENSE SOLUTION

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии и исследовательских целях. Изобретение может применяться при создании гибридных лекарственных препаратов в виде густых растворов ранозаживляющего и противоожогового назначения.
Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический фермент, содержащий одну сульфгидрильную группу, его получают из стеблей ананаса (Ananas comosus). Обладает ранозаживляющими, противовоспалительными, противоотечными, фибринолитическими и антитромботическими свойствами. Бромелайн используется для лечения остеоартрита, зубного налета и гингивита, применяется в качестве терапевтического средства при отеке пазух и носа, является важным муколитическим средством при рините, риносинусите, обладает противодиарейным действием, доказана его эффективность при лечении язвы желудка у животных, а также при лечении рака, [A.J. Chakraborty, S. Mitra Т.Е Tallei et al. Bromelain a Potential Bioactive Compound: A Comprehensive Overview from a Pharmacological Perspective // Life. - 2021. V. 11. - P. 26].
Ферменты - это биологические катализаторы, которые все чаще используются в промышленных процессах благодаря их способности проводить реакции с высокой специфичностью и эффективностью. Однако применение свободных форм ферментов затруднено в связи с их низкой стабильностью, высокой стоимостью и невозможностью повторного использования. Данные проблемы можно решить с помощью иммобилизации, которая позволяет экономично расходовать ферменты в промышленном биокатализе. Иммобилизация - прикрепление молекул ферментов к высокомолекулярной подложке, обеспечивает возможность их повторного использования, но при этом изменяет их каталитическую активность и стабильность. [М. Naveed, F. Nadeem, Т. Mehmood et al. Protease - A Versatile and Ecofriendly Biocatalyst with Multi-Industrial Applications: An Updated Review // Catalysis Letters. - 2021. - V. 151. - P. 307-323].
Альгинат натрия является полисахаридом с гидрофильными свойствами. Его можно растворять как в холодной, так и в горячей воде. Молекулярная масса колеблется от 12 до 18 кДа. Наиболее перспективным свойством альгината натрия является способность вступать в реакцию с катионами металлов, в основном с ионами кальция, используемыми при инкапсулировании лекарств и ферментов, а также в пищевой и биотехнологической промышленности. Альгинат натрия является биоразлагаемым, биосовместимым, нетоксичным и неиммуногенным полисахаридом. Альгинат натрия входит в состав абсорбирующих и кровоостанавливающих повязок на раны со средней и высокой экссудацией. Кроме того, альгинат натрия ускоряет регенерацию слизистой оболочки желудка и уменьшает воспаление. Сферы его использования охватывают также косметологию, стоматологию и тканевую инженерию [В. Jadach,  А. Froelich Sodium Alginate as a Pharmaceutical Excipient: Novel Applications of a Well-known Polymer // Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2022. - P. 12].
В косметологии альгинат натрия чаще всего применяется при изготовлении масок для лица с многочисленными косметическими эффектами. Такая маска может оказывать местное иммунокоррегирующее действие, т.к. альгинат натрия способен связывать иммуноглобулины класса Е, провоцирующие возникновение аллергических реакций кожи. Кроме того, маска с альгинатом в составе, накладываемая на пораженные места, эффективно заживляет кожу, способна выводить тяжелые металлы, хорошо увлажняет, придает коже здоровый цвет и бархатистую текстуру [Патент RU 2702907 С1, МПК А61K 8/73, А61K 8/92, А61K 8/67, А61K 8/97, А61K 8/9706, А61K 8/23, А61K 8/27, A61Q 19/08, опубл. 14.10.2019, Бюл. №29].
Существует способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2677343 С2, МПК A61L 15/38, А61K 38/56, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 16.01.2019, Бюл. №2], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором бромелайна, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,05 М глициновый буфер (рН 9,0-10,5) или 0,05 М боратный буфер без добавления KСl (рН 8,0), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,2 М ацетатный буфер (рН 5,0) в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2770208 С1, МПК C12N 11/10, C12N 9/50, опубл. 14.04.2022, Бюл. №11], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер (рН 11,0), инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5).
Существует способ получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана [Патент RU 2677232 С2, МПК А61K 38/48, А61K 47/36, А61Р 17/02 опубл. 10.01.2019, Бюл. №1], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу среднемолекулярного хитозана или высокомолекулярного хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5-9,0) для среднемолекулярного или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; инкубация проводится в течение 4 часов для среднемолекулярного и 5 часов для высокомолекулярного хитозана.
В данных способах иммобилизация бромелайна проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 2 мг/мл и 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, что не позволяет полностью автоматизировать процесс. Кроме того, получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.
Известен способ получения препарата полибромелайна с применением глутарового альдегида [Патент RU 2711790 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий растворение бромелайна в 0,05 М трис-глициновом буфере (рН 9,0) в концентрации 1 мг/мл; затем проводят сополимеризацию с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента в концентрации 2% или 10% в объеме, равном объему трис-глицинового буферного раствора; инкубация проводится до образования пленки промывку осуществляли 0,05 М трис-HCl буферным раствором (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.
Существует способ получения гетерогенного препарата бромелайна, ковалентно связанного с матрицей хитозана [Патент RU 2711786 С1, МПК C12N 11/10, C12N 9/50 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу среднемолекулярного хитозана (200 кДа) или высокомолекулярного хитозана (350 кДа) в соотношении 18 мл раствора бромелайна в концентрации 1 мг/мл на 900 мг носителя; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 9,0) для среднемолекулярного хитозана или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; затем добавляют 10 мл глутарового альдегида с 15% концентрацией для среднемолекулярного или 10% концентрацией для высокомолекулярного хитозана; инкубацию проводят с периодическим перемешиванием в течение 1 часа; далее суспензию центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.
Недостатком изобретений является использование глутарового альдегида, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.
Известен способ стабилизации протеаз для использования в косметологических целях [US 2011/0177052 А1]. Авторы стабилизировали 1%-ный раствор папаина 0,1%-ным раствором альгината натрия. Особенностью изобретения является получение препарата протеазы и жидкой фазе. Кроме того, авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с полисахаридом белок, т.е. получали смесь стабилизированной и нестабилизированной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата.
Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2750377 С1, МПК А61K 38/00, А61K 38/56, А61K 47/36, C12N 11/08, А61Р 17/02 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Использование альгината натрия позволит сократить расходы.
В качестве прототипа служил способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана [Патент RU 2691611 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 14.06.2019, Бюл. №17], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6 для пищевого хитозана или с рН 9,0-9,5 для сукцината хитозана; либо 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,5 для пищевого хитозана или 5,0 для сукцината хитозана; инкубация проводится в течение 2 часов.
В отличие от прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный бромелайн в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке простого в исполнении, не требующего предварительной активации носителя способа получения композиционного препарата иммобилизованного бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 400-500 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, при этом в ходе иммобилизации активный центр бромелайна защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.
Технический результат достигается тем, что в способе получения композиционного препарата бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата бромелайна в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию бромелайна проводят путем комплексообразования в густой раствор альгината натрия в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах бромелайна в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KСl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) бромелайна в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KСl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) бромелайна в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KСl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителя для комплексообразования применяли альгинат натрия фирмы «100ing», 1%-ный масс. раствор которого в дистиллированный воде при 20°С имеет абсолютную вязкость 400-500 МПа×с.
Комплексообразование бромелайна и альгината натрия осуществляли следующим образом. К 1 г альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл 0,05 М глицинового буфера с рН 8,6, добавляли 10 мл раствора бромелайна в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в 0,05 М глициновом буфере с рН 8,6, содержащем цистеин в концентрации 0,04 М для предотвращения процессов окисления активного центра бромелайна; инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора очищали от несвязанного фермента с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 400 мл свежего и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна. Для промывки 21 мл полученного препарата использовали 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.
Содержание белка в композиционных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. -V. 193. - P. 265-275].
Определение протеазной активности бромелайна проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin rnetalloproteinase from Bacillus intermedius // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг комплексообразованного образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс. в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С.Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс.), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (фермент в комплексе с носителем в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество бромелайна, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
A=D*1000/120/200/С,
где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения композиционного препарата бромелайна в виде густого раствора альгината натрия в качестве среды для комплексообразования мы использовали следующие буферы: 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KСl с рН 8,0-10,0, 0,05 М ацетатный с рН 4,0-5,8, 0,05 М глициновый с рН 8,6-10,5, 0,05 М трис-глициновый с рН 8,5-9,0, 0,05 М фосфатный с рН 5,8-7,5. Результаты отражены на фиг. 1-3.
Анализ содержания белка в композиционных препаратах показал, что наибольшее количество бромелайна (в мг на г носителя) наблюдается при использовании 0,05 М трис-глицинового буфера с рН 8,5 и 9,0 в качестве среды для комплексообразования (фиг. 1). Общая активность (в ед на мл раствора) бромелайна оказалась выше при использовании 0,05 М боратного буфера с добавлением 0,1 М KСl с рН 8,5 и 9,0 (фиг. 2). Наибольшую удельную активность показали препараты бромелайна, полученные при использовании 0,05 М боратного буфера с добавлением 0,1 М KСl с рН 8,5 (фиг. 3).
Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для композиционных препаратов бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) получено при создании препарата бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора при использовании 0,05 М боратного буфера с добавлением 0,1 М KСl с рН 9,0.
Таким образом, была разработана методика получения композиционного препарата бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 400-500 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, т.к. после диализа 21 мл препарата против 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 исключается переход фермента из фазы носителя в раствор, что позволяет проводить реакции, получая продукт, не "загрязненный" ферментом. Кроме того, в ходе иммобилизации активный центр бромелайна защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.