Изучение плазмидных ДНК, выделенных из клинических штаммов микроорганизмов

УДК 577.1:576.8

ИЗУЧЕНИЕ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

© 2006 г. В.Б. Бородулин, И.А. Горошинская, И.В. Бабушкина, Е.Г. Чеботарева, Н.Ю. Фомина, А.А. Свистунов

147 bacterial strains: Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Citrobacter, E. coli, Serratia plymuthica, have expressed stability to a wide spectrum of antibiotics. In 78 strains are found out plasmid DNA with molecular weights from 1,4 up to 88 МДа. Similarity in electrophoresis structures of restriction fragments of plasmid DNA pBN-345 and pBN-662, allocated of strains Pseudomonas aeruginosa and Serratia plymuthica, concerning to various taxonomic units is revealed. Studying electrophoresis structures of plasmid DNA, and also them restriction fragments, allows to draw a conclusion on an opportunity of use of plasmid DNA as an additional marker at revealing and identification of hospital microorganisms strains.

Введение

Изучение механизмов возникновения и распространения нозокомиальных (госпитальных) инфекций -одна из актуальных проблем как теоретической медицины, так и практического здравоохранения. Одним из важных показателей, характеризующих такого рода инфекции, является резистентность бактериальных клеток к широкому кругу антибиотиков и химиотера-певтических средств, которые повсеместно используются для лечения в профилактических и лечебных учреждениях [1-3].

Согласно [4-6], в 50-80 % случаев антибиотико-резистентность условнопатогенных бактерий обусловлена R-плазмидами, которые обнаружены более чем у 45 родов бактерий и способны нести устойчивость одновременно к 20 антибиотикам.

Следует отметить, что необходимость разработки и внедрения методов получения и очистки плазмид-ных ДНК определяется возможностью использовать плазмидные ДНК в качестве эпидемиологического маркера для изучения процессов возникновения и распространения внутрибольничных инфекций в условиях клинического стационара.

Цель настоящей работы - выделение и очистка плазмидных ДНК из клинических грамотрицательных условнопатогенных микроорганизмов для использования плазмид в качестве дополнительного эпидемиологического маркера госпитальных инфекций.

Экспериментальная часть

В работе использовали культуры грамотрицательных штаммов бактерий, полученных из бактериологической лаборатории Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИТО).

Исследование по изучению клинических культур выполнено на 147 штаммах грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas и семейства Enterobacteri-aceae, выделенных от 140 больных с различными гнойными осложнениями.

Для выделения плазмидной ДНК применялась стандартная методика Birnboim и Doli [7, 8].

Использовались реактивы фирм «Sigma», «Che-mopol». Центрифугирование проводилось на микроцентрифуге фирмы «Eppendorf».

Молекулярную массу плазмидной ДНК определяли при помощи электрофореза, который проводился в стандартных условиях: 1-процентный агарозный гель с объемом заполненной лунки 20 мкл, горизонтальный предфорез - 30 мин при 20 В; основной гель-форез - 4-5 ч при 40 В.

В качестве маркеров молекулярных масс использовали следующие плазмиды: pUC-19 (1,8 МДа), pBR-332 (2,9 МДа), pBR-325 (4 МДа), pcK411 (6 МДа), pSA (23 МДа), pR-368 (78 МДа), pRTS1 (120 МДа).

Для контроля хромосомной ДНК использовали бесплазмидный штамм E. coli HB-101. Электрофоре-тическая камера заливалась трисборатным буфером (ТВЕ) с конечной концентрацией бромистого этидия 0,5 мкг/мл.

Рестрикционный анализ проводили по Маниатису [9], использовав следующие рестриктазы: BspI, BspRI, BcnI.

Анализ рестрикционных фрагментов проводился в полиакриламидных гелях (6, 10, 12, 15 %) в ТВЕ буфере и в агарозных гелях (1,2 и 2 %) в трисацетатном буфере (ТАЕ). Фотографирование полученных результатов было осуществлено при наличии оранжевого светофильтра фотоаппаратом «Зенит» (Россия), с выдержкой 10 мин.

Статистическую обработку численных данных проводили сравнением линии пробега в агарозном геле маркерных плазмид и плазмидных ДНК, выделенных из клинических штаммов, с применением метода наименьших квадратов [10].

Результаты и их обсуждение

Исследования были проведены на 147 грамотрица-тельных культурах с последующим выделением и очисткой плазмидных ДНК. Рис.1 демонстрирует электрофореграмму выделенных плазмидных ДНК; 116 культур были антибиотикорезистентны. Большинство штаммов обладало множественной устойчивостью к антибиотикам.

Линия старта

Хромосомная ДНК

Плаз-

милная

ДНК

плазмидных ДНК. Возможно, эти штаммы содержат несколько плазмид, либо это различные формы одной и той же плазмидной ДНК. Штамм Enterobacter № 68 не имеет плазмидную ДНК. Линия хромосомной ДНК есть у всех штаммов.

Молекулярные массы плазмидных ДНК определялись после совместного электрофореза с маркерами плазмид.

Все плазмиды, у которых определялась молекулярная масса, были от 1,4 до 88 МДа. На рис. 3 представлено графическое изображение молекулярных масс плазмидных ДНК.

Рис.1. Электрофореграмма плазмидных ДНК, выделенных в системе ПЕГ - декстран:

1. Klebsiella crystallitica LG-31;

2. Proteus vulgaris LG-161;

3. Pseudomonas aeruginosa LG-345;

4. Serratiaplymuthica LG-662;

5. pUC-19;

6. E.coli DH5a (pGEM-3Z (+));

7. E.coli DH5a (pET-28a (+))/

Выделенная плазмидная ДНК подвергалась элек-трофоретическому исследованию. Электрофорез всегда проводился в стандартных условиях. На рис. 2 представлены плазмидные ДНК, выделенные из штаммов E. coli и Enterobacter.

s §

и &

ц

50

^Линия старта

Хромосомная ДНК

Плазмидная ДНК

РНК

120 110 -100 90 80

70 60

40

зо -20 10

0 1

HR TSi

Pr -386

2

3

4

5

6 lga

Рис. 2. Электрофореграммы ДНК из штаммов с 1-12 (справа налево): 1-6 - № 95, 98, 186, 345, 433, 593 (E.coli); 7- X фаг; 8-11 - № 57, 68, 98, 125 (Enterobacter); 12-маркерный штамм pUC-19

В качестве маркера использовали плазмиду pUC-19 и Х-фаг (институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН). У штаммов E. coli № 95, 98, Pseudomonas aeruginosa № 345, E. coli № 433 и штамма En -terobacter № 98 выявлены полосы плазмидных ДНК. У штаммов E. coli № 186, 593 видны несколько линий

Рис. 3. Корреляция между величиной молекулярных масс плазмидных ДНК и длиной пробега плазмид в агарозном геле (условия стандартные) а - длина пробега плазмидных ДНК в агарозном геле, мм;

<3) - эталонные плазмидные ДНК; О - исследуемые плазмидные ДНК

В таблице представлены молекулярные массы исследованных плазмидных ДНК.

Все выявленные плазмидные ДНК можно разделить на 3 большие группы. Первая с молекулярной массой от 1,4 до 10 МДа, вторая - от 18 до 47, третья-от 58 до 88 МДа. Плазмидные ДНК с другими молекулярными массами встречаются реже.

11

9 8 7

6 5

4 3

2

Таблица 1

Бактериальные штаммы и профили плазмидных ДНК

Бактериальные штаммы Антибиотикоустойчивость бактериальных Источник штамма Молекулярная мас-

штаммов са, МДа

Pseudomonas

LG-203 (pBN-203) a 2

LG-348 (pBN-348) Pol+, Gen+, Str+, Laev+, Neo+, Tetr+. a 30

LG-645 (pBN-645) Pol+, Gen+, Neo+, Tetr+, Str+. a 35

Pol+, Gen+, Str+, Laev+, Neo+, Tetr+ , Kan+,

LG-656 (pBN-656) Amp+, Lin+ a 35

*"4 Cef+, Pol+, Gen+, Str+, Laev+, Neo+, Tetr+ ,

LG-6771 (pBN-6771) Kan+, Amp+, Lin+ a 30

LG-6772 (pBN-6772) f Cef+, Laev+, Str+, Rist+, Neo+, Carb+, Fus+, 5

LG-678 (pBN-678) Gen+, Doxyc+, Pol+. a

LG-116 (pBN-116) Cef+, Carb+ , Kan+, Amp+, Lin+. a -

Cef+, Pol+, Kan+, Amp+, Lin+, Olean+, Oxas+,

LG-195 (pBN-195) Doxic+, Gen+, Neo+, Rist+, Str+, Tetr+,. a 78

Kan+, Amp+, Lin+, Olean+,Oxas+, Doxic+,

LG-205 (pBN-205) Gen+, Rist+, Str+, Tetr+, Eryth+. a 75

LG-208 (pBN-203) Neo+, Str+, Pol+, Gen+, Carb+. a 2

LG-242 (pBN-242) Kan+, Amp+, Lin+, Olean+,Oxas+. 30

LG-3451 (pBN-3451) 1 Cef+, Laev+, Str+, IRist+, Neo+, Carb+, Fus+, а 1.4

LG-3452 (pBN-3452) Gen+, Doxyc+, Pol+. Gen+, Carb+, Laev+, Str+, a 1.9

LG-3453 (pBN-3453) J Kan+, Amp+, Lin+, Olean+,Oxas+, Tetr+. a 22

LG-355 (pBN-355) a -

LG-540 (pBN-540) Neo+, Str+, Kan+, Amp+, Lin+, Tetr+, . a 2

LG-6991 (pBN-6991) -4 Pol+, Gen+, Str+, Laev+, Neo+, Cef. Rist+. a 45

LG-6992 (pBN-6992) L Neo+, Str+, Pol+, Gen+, Pol+. a 3

LG-704 (pBN-704) Gen+, Neo+, Rist+, Pen+, Str+. Gen+, Carb+, a 2

Laev+, Str+, Kan+.

Proteus

LG-664 (pBN-664) Neo+, Str+, Laev+, Kan+, Amp+, Gen+, Carb+. a 8

LG-2441 (pBN-2441) Neo+, Kan+, Rist+, Pol+, Laev+. a 8

LG-2442 (pBN-2442) a 19

LG-2443 (pBN-2443) | a 25

LG-2444 (pBN-2444) J a 30

LG-422 (pBN-422) Neo+, Gen+, Pol+, Str+, Tetr+, Amp+, Laev+. a -

LG-1371 (pBN-1371) 1 Carb+, Amp+, Str+, Rist+, Cef, Neo+. a 2

LG-1372 (pBN-1372) a 24

LG-1373 (pBN-1373) a 42

LG-1374 (pBN-1374) a 58

LG-1611 (pBN-1611) Cef, Laev+, Str+, Rist+, Neo+, a 19

LG-1612 (pBN-1612) Carb+, Amp+, Gen+. a 38

LG-173 (pBN-173) Gen+, Carb+, Amp+, Str+, Neo+. Laev+, Cef, a -

LG-216 (pBN-216) Carb+, Rist+, Fus+. a 4.5

Serratia

LG-333 (pBN-333) Neo+, Pol+, Gen+, Laev+, Cef. a 72

LG-495 (pBN-495) Pol+, Cef, Carb+, Gen+, Neo+, Tetr+. a 68

LG-663 (pBN-663) >- Pol+, Eryth+.

LG-35 (pBN-35) Cef, Gen+, Str+, Tetr+, Laev+, Neo+. a 19

LG-330 (pBN-330) Carb+, Cef, Gen+, Pol+, Str+, Tetr+, Laev+, a 4.6

Neo+.

LG-332 (pBN-332) Cef, Pol+, Laev+, Doxyc+. a 4.8

Gen+, Carb+, Laev+,Rist+, Fus+.

LG-690 (pBN-690) Pol+. a 4.2

LG-750 (pBN-750) Cef, Carb+, Gen+, Neo+, Tetr+, Laev+, Pol+ , a 4.4

LG-761 (pBN-761) Doxyc+, Amp+. a 68

LG-6621 (pBN-6621) a 4.4

LG-6622 (pBN-6622) a 22

LG-6623 (pBN-6623) a 36

Citrobacter

LG-300 (pBN-300) Gen+, Cef, Amp+, Pol+, Carb+. a -

LG-351 (pBN-351) Neo+, Str+, Tetr+, Laev+, Amp+, Gen+, Carb+, a 62

Cef, Pol+.

LG-421 (pBN-421) Neo+, Str+, Gen+, Oxac+, Olean+, Tetr+. a 78

LG-419 (pBB-419) Gen+, Carb+, Pol+, Cef, Tetr+, Neo+. a 28

Окончание таблицы

Бактериальные штаммы Антибиотикоустойчивость бактериальных Источник штамма Молекулярная мас-

штаммов са, МДа

E.coli

LG-3741 (pBN-3741) Pol+, Doxyc+, Str+, Tetr+, Laev+, Eryth+. a 2

LG-3742 (pBN-3742) 1 Pol+, Laev+, Amp+, Tetr+, Gen+. a 9

LG-356 (pBN-356) Pol+, Laev+, Gen+, Amp+, Neo+, Carb+. a 6.1

LG-675 (pBN-675) a -

Klebsiella

LG-295 (pBN-295) Carb+, Pol+, Str+ , Tetr+, Neo+. a 74

LG-311 (pBN - 311) L Laev+, Amp+, Str+, Rist+, Gen+, a 3

LG-312 (pBN - 312) \ Pol+, Kan+. a 6

LG-313 (pBN - 313) a 22

E.coli

Hb101 (pUC-19) Amp+, Tetr+. b 1.8

Hb101 (pBr-322) Pol+, Laev+, Amp+, Gen+. b 2.9

Hb101 (pRTS1) Amp+. b 120

Hb101 (pR-386) Amp+, Tetr+. b 78

Hb101 (pSA) Amp+, Tetr+. b 23

HB 101 (pRP-4) Amp+, Tetr+. b 36

HB 101 (pCK11) Amp+, Tetr+. b 6

Примечание. а - Бактериальная лаборатория травматологического стационара, Саратов, Россия; Ь - Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия.

Все выявленные плазмидные ДНК можно разделить на 3 большие группы. Первая с молекулярной массой от 1,4 до 10 МДа, вторая - от 18 до 47, третья-от 58 до 88 МДа. Плазмидные ДНК с другими молекулярными массами встречаются реже.

Особый интерес представляли плазмидные ДНК, выделенные от больных, которые длительное время находились на лечении в СарНИИТО. У бактерий № 345, 662, 31 электрофоретические профили подобны. Поэтому мы провели рестриктный анализ этих плазмидных ДНК.

Для рестрикционного анализа препаративно выделено ДНК [11] и их очистку провели при помощи полиэтилена - гликоля-6000. Все штаммы имели линию хромосомной и плазмидной ДНК, РНК после очистки отсутствовала [11].

Рестрикционный анализ, осуществленный по наборам фрагментов, полученных после обработки ре-стриктазами BspRI, Bcnl, BspI, показал, что одна из плазмид Pseudomonas aeruginosa pBN-345 полностью совпадает с плазмидой pBN-662, выделенной из Serratia plymuthica.

На рис. 4 представлен рестрикционный анализ исследуемых плазмид, проведенный в 10%-м полиакри-ламидном геле.

Наличие одной и той же плазмиды у двух генетически столь далеких друг от друга бактериий, по-видимому, связано с горизонтальным генетическим обменом между ними. Это явление, широко изучаемое в настоящее время [12, 13], значительно снижает эффективность антибиотикотерапии.

В связи с этим плазмидная ДНК может являться своего рода дополнительным эпидемиологическим маркером, который можно использовать для выявления и идентификации микроорганизмов, несущих признаки госпитальных штаммов. Целесообразно со средоточить усилия биохимиков на разработке и внед-

501 bp 489 bp 404 bp 331 bp

242 bp

190 bp 147 bp 110 bp

67 bp

Рис.4. Рестрикционный анализ профилей плазмидной ДНК, выделенных из клинических бактериальных штаммов, после гидролиза BspRI в 10%-м ПААГ:

1. pGEM-3Z(+)/BspI'

2. X/Pst I'

3. Klebsiella crystallitica LG-31'

4. Proteus vulgaris LG-161'

5. Pseudomonas aeruginosa LG-345;

6. Serratia plymuthica LG-662;

рении новых методов получения и очистки плазмид-ных ДНК, которые можно применить в условиях кли-нико-бактериологических лабораторий.

1

2

3

4

5

6

7

Выводы

1. Из 147 бактериальных штаммов: Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Citrobacter, E. œli, Serratia plymuthica с выраженной устойчивостью к широкому спектру антибиотиков в 78 обнаружены плазмидные ДНК с молекулярными массами от 1,4 до 88 МДа.

2. Обнаружено сходство в электрофоретических профилях рестрикционных фрагментов плазмидных ДНК pBN-345 и pBN-662, выделенных из штаммов Pseudomonas aeruginosa и Serratia plymuthica, относящихся к различным таксономическим единицам.

3. Изучение электрофоретических профилей плазмидных ДНК, а также их рестрикцион-ных фрагментов позволяет сделать вывод о возможности использования плазмидных ДНК в качестве дополнительного маркера при выявлении и идентификации госпитальных штаммов микроорганизмов.

Литература

1. Мельникова В.М., Беликов Г.П., Богомолова Н.С. // Профилактика внутрибольничной инфекции. М., 1993. С.205 - 211.

2. Навашин С.М., Фомина И. П. Рациональная анти-биотикотерапия. М., 1982.

3. Lowbury E. J. S. Control of Hospital Infection. L., 1981.

4. Влодавец В.В. Этиология // Профилактика внутри-больничной инфекции. М., 1993. С.6-11.

5. Габисония Т.Г., Чанишвили Т.Г., Макаридзе М.Р. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1993. Т. 38. № 6. С.30-34.

6. Tardif G., Grant R.B. // Antimocrob. Agents Chemother. 1983. Vol. 24. Р.201-208.

7. Birnboim H.C., Doli S. // Nucleic Acids Res. 1979. Vol. 7. P. 1513 - 1523.

8. Hardy K.G. Plasmid. A practical approach. Washington, 1990. Р.5 - 12, 90 -92.

9. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook S. // Molecular Cloning. 1982. A. Laboratory Manual, N.-Y., 1982.

10. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск, 1973.

11. Nikiforov V.V., Aistov I.A., Fedorova L.S. // Roumanian Biotechnological Letters. 1999. Vol. 4. № 5. P. 431 - 438.

12. Dowson C.G., Barcus V., King S. // J. Appl. Microbiol. Symp. Supplement. 1997. Vol. 83. P.42S - 51S.

13. Meyer T.F., Barten R. Horizontal genetic exchange by pathogenetic Neisseriae // Abstracs of 13th European Meeting on Bacterial Transformation (Kaiserslautern, Germany, 14-18th Sept. 1999). Р. 35.

Саратовский государственный медицинский университет, Саратовский государственный университет,

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт -_1 марта 2006 г.