ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ
NUTRIENT MEDIUM TO CULTIVATE FRESH-WATER MOLLUSC CELLS AND TISSUES

Изобретение относится к биологии, в частности к клеточной биологии, и может быть использовано при культивировании тканей и клеток моллюсков и других беспозвоночных животных, для оптимизации процессов биокристаллизации in vitro, проведении диагностических исследований функциональной активности и процессов биокристаллизации арагонита с использованием тканей пресноводных моллюсков.
Известны различные стандартные питательные среды культивирования клеток млекопитающих и беспозвоночных животных [1]. Однако такие среды не обеспечивают длительное культивирование с отсутствием контаминации плесневыми грибами рода Aspergillus, Mucor и др. и процессы биокристаллизации, которые могут протекать при длительном культивировании тканей.
Известно использование стандартных питательных сред F-12 [3], L-15 [4, 5] для культивирования тканей пресноводных или морских моллюсков. Однако такие питательные среды не обеспечивают отсутствие плесневых грибов и полноценный процесс биокристаллизации арагонита in vitro, а предназначены для культивирования не контаминированных бактериями и грибами культур клеток или тканей в основном млекопитающих животных.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому составу питательной среды для культивирования клеток и тканей пресноводных моллюсков относится стандартная питательная среда DMEM/ F-12 [2].
Питательная среде DMEM/F-12 представляет собой смесь 1:1 питательной среды DMEM и F-12, рН 7.0-7.4, осмолярность 260-320 мосмоль/кг. Препарат - прозрачная жидкость, красновато-оранжевого цвета, без опалесценции и осадка. Не содержит антибиотиков. Стандартная питательная среда содержит солевой состав, приближающийся к составу естественной среды ткани при соответствующем рН, заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, производные нуклеиновых кислот, углеводы, жиры и их производные. Питательная среда содержит все ионы, обнаруженные в мантийных тканях моллюсков при наличии у них биологической активности. Среда DMEM/F-12 содержит феноловый красный, как индикатор концентрации гидроксильных ионов.
Применяемые в известной питательной среде растворы аминокислот заменимых - аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, глицин, пролин, серии, и незаменимых - аргинин, лейцин, цистин, изолейцин, изолейцин, метионин, тирозин, фенилаланин, лизин, гистидин, треонин, триптофан, валин.
Питательная среде DMEM/F-12 также может содержать эмбриональную телячью сыворотку.
Эмбриональная телячья сыворотка без консерванта, нативная, лишена форменных элементов крови. Представляет собой слегка опалесцирующую жидкость желтоватого цвета. Допускается осадок серо-белого цвета, который разбивается при встряхивании в равномерную муть. Является источником ростовых факторов, гормонов и других стимулирующих компонентов. Осмолярность 280-340 мосмоль/кг, рН 7.0 -7.5, альбумин 1.7-3.4 г/дцл, белки 3.0-4.5 г/дцл. Используется в конечной концентрации 10%. Инактивацию факторов комплемента проводят нагреванием при 56°С в течение 30 минут.
Питательная среде DMEM/F-12 также может содержать антибиотики - стрептомицина сульфат, бензпенициллина натриевая соль, канамицина сульфат, гентамицин сульфат.Стрептомицин и бензпенициллина натриевая соль являются антибиотиками широкого спектра антимикробного действия. Активность стрептомицина сульфата проявляется в отношении большинства грамотрицательных микроорганизмов. Активность бензпенициллина натриевой соли проявляется в отношении большинства грамположительных микроорганизмов.
Канамицина сульфат и гентамицин - бактерицидные антибиотики широкого спектра действия. Канамицина сульфат активен преимущественно к грамотрицательным организмам, устойчивым к другим антибиотикам. Гентамицина сульфат активен по отношению к грамотрицательным микроорганизмам, и устойчивость к нему развивается крайне медленно.
Общим недостатком известных питательных сред является то, что такие среды не обеспечивают длительное культивирование с отсутствием контаминации плесневыми грибами рода Aspergillus, Mucor и др. и процессы биокристаллизации, которые могут протекать при длительном культивировании тканей.
Задача изобретения - обеспечить удлинение сроков культивирования тканей и клеток моллюсков для нормального протекания процесса биокристаллизации в условиях отсутствия роста плесневых грибов.
Для решения поставленной задачи используют питательную среду для культивирования клеток и тканей пресноводных моллюсков, включающую стандартную питательную среду DMEM/F-12, содержащую эмбриональную телячью сыворотку 100 мл/л, антибиотики 1090 мг/л, при этом среда дополнительно содержит флуконазол в количестве 100-130 мг/л.
Флуконазол - 2-(2,4-дифторфенил)-1,3-бис(1,2,4-триазол-1-ил)-пропан-2-ол. Представитель нового класса триазольных противогрибковых средств является селективным ингибитором синтеза стеролов в клетке грибов. Препарат активен при микозах, вызванных Candida spp., Micosporum spp., Trichoptiton spp. и другими грибами (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., 2001, стр 356).
На предлагаемой питательной среде сроки культивирования тканей и клеток моллюсков увеличиваются в 4 раза и более по сравнению со стандартными средами. В известных источниках патентной и научно-технической информации не описано питательных сред для длительного культивирования тканей пресноводных моллюсков с полной элиминацией образования и роста плесневых грибов.
Пример 1. Приготовление питательной среды
Процесс приготовления питательной среды заключается в дополнении к основной среде DMEM/F-12 эмбриональной телячьей сыворотки 100 мл/л, антибиотиков 1090 мг/л и раствора флуконазола в количествах, соответствующих изобретению.
Растворение компонентов питательной среды проводили в стерильных условиях, в ламинаре, при комнатной температуре. Порядок и приоритет добавления компонентов в питательную среду не существенен.
Эмбриональную телячью сыворотку, термически инактивированную, добавляли в питательную среду до 10% содержания. После механического перемешивания питательного раствора при покачивании бутыли добавляли растворы антибиотиков и флуконазол в необходимых концентрациях.
Состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов представлен ниже, мг/л.
Стандартная питательная среда DMEM/F-12 содержит тотальное количество компонентов: неорганические соли 10066 мг/л, аминокислоты 1100 мг/л, витамины 33,6 мг/л и прочие компоненты, а именно (мг/л) неорганические соли:
CaCl<sub>2</sub>
116,6
Fe(NO<sub>3</sub>)*9H<sub>2</sub>O
0,05
FeSO<sub>4</sub>*7Н<sub>2</sub>О
0,417
MgCl<sub>2</sub>
28,64
MgSO<sub>4</sub>
48,84
KCl
311,8
NaHCO<sub>3</sub>
2438
NaCl
6995,5
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
71,02
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
54,35
ZnSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
0,432
CuSO<sub>4</sub>*5H<sub>2</sub>O
0,0012
Аминокислоты:
Глицин
18,75
Алании
4,45
Аргинин * HCl
147,5
Аспарагин * Н<sub>2</sub>О
7,5
Аспарагиновая кислота
6,65
Цистеин гидрохлорид * Н<sub>2</sub>О
17,56
Цистеин * HCl
22,24
Глютаминовая кислота
7,35
Глютамин
365
Гистидин гидрохлорид * Н<sub>2</sub>О
31,48
Изолейцин
54,47
Лейцин
59,05
Лизин гидрохлорид
91,25
Метионин
17,24
Фенилаланин
35,48
Пролин
17,25
Серин
26,25
Треонин
53,45
Триптофан
9,02
Тирозин 2Na * 2Н<sub>2</sub>О
55,79
Валин
52,85
Витамины:
Биотин
0,0035
Холин хлорид
8,98
D-пантотенат кальция
2,24
Фолиевая кислота
2,65
И-инозитол
12,6
Ниациамид
2,02
Пиридоксин гидрохлорид
2,031
Рибофлавид
0,219
Тиамин гидрохлорид
2,17
Витамин В12
0,68
Прочие:
D-глюкоза
3151
Гипоксантин натрия
2,04
Линолевая кислота
0,042
Липоевая кислота
0,105
Феноловый красный
8,1
Путресцин 2HCl
0,081
Пируват натрия
55
Тимидин
0,365
К стандартной питательной среде добавили антибиотики - 1090 мг/л, а именно:
Стрептомицина сульфат
500 мг/л
Бензенициллина, натриевая соль
500 мг/л
Гентамицин сульфат
40 мг/л
Канамицина сульфат
50 мг/л
10% эмбриональную телячью сыворотку и Флуконазол 120 мг/л.
Аналогично была приготовлена питательная среда с добавлением 100 мг/л и 130 мг/л Флуконазола.
Пример 2. Использование питательной среды для получения первичной культуры ткани мантии пресноводного моллюска.
После извлечения из раковины моллюска ткани мантии ее промывают и стерилизуют стандартным способом.
Образцы тканей мантии моллюска переносят в стерильные чашки Петри 6 см в диаметре для дальнейшего культивирования и добавляют по 3-5 мл стерильной, питательной среды, приготовленной по примеру 1.
2
В контрольную группу ткани мантии моллюска добавляли известную питательную среду по прототипу (без флуконазола). Культивирование ткани мантии проводят в 5% СО при температуре 22-25°С. Уже в первые сутки после инициации культуры ткани мантии моллюска происходила миграция разных типов клеток: эпителиальных, клеток Лейдига, фибробластов. Цвет ткани мантии моллюска в норме светло-кремовый и при культивировании in vitro является показателем жизнеспособности. При отмирании ткани мантии приобретают темно-коричневый или серый цвета. Таким образом, экспланты ткани мантии в количестве 20 штук культивировали в течение 21 дня.
За время культивирования опытной группы не было отмечено ни бактериальная, ни особенно грибковая контаминации, в 8 образцах была обнаружена начальная стадия процесса биокристаллизации арагонита.
В отличие контрольная группа эксплантов ткани мантии моллюска в количестве 20 штук, за время культивирования в течение 3-8 дня была поражена плесневыми грибами в 14 из 20 вариантов эксплантов ткани мантии. В образцах не была обнаружена начальная стадия процесса биокристаллизации арагонита.
Затем использовали питательную среду для получения первичной культуры ткани мантии пресноводного моллюска при добавлении 100 мг/л и 130 мг/л флуконазола. Были плучены аналогичные результаты.
Таким образом, заявляемая питательная среда, используемая для культивирования тканей и клеток мантии пресноводного моллюска, позволяет значительно сократить риск появления в культуре плесневых грибов и тем самым увеличить продолжительность культивирования тканевых эксплантов, что является необходимым условием для процесса биокристаллизации арагонита in vitro при получении полиморфов карбоната кальция.
Технический результат достигнут введением в состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов, представленных в формуле.
Источники информации
1. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. Под ред. Пинаева Г.П. Ленинград. «Наука», 1988, с.44-62.
3
2. Bank S.K., Jena J.K., and Janaki Ram. СаСО crystallization in primary culture of mantle epithelial cells of freshwater pearl mussel. Science, vol.86, NO.5, 2004, p.730-733.
3. Gardner D.В., Turner F.S., Myers J.M., Dietz T.H., and Silveiman H. Long-term culture of freshwater mussel gill strips: use of serotonin to affect aseptic condition. Biol. Bull., 1991, vol.181, p.-175-180.
4. Chen S.N., Wen C.M. Establishment of cell lines derived from oyster, Crassostrea gigas Thunberg and hard clam, Meretrix lusoria Roding. Methods Cell Sci. 1999; 21:183-192.
5. Endon M., Hasegawa Y. Culture of mantle epithelial cells expressing shell matrix proteins from scallop Patinopecten yessoensis. Fisheries Science 2006; 72, p.1277-1285.