СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОБНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДНОЙ СРЕДЫ ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
METHOD OF IDENTIFYING MICROBIAL CONTAMINATION OF AN AQUEOUS MEDIUM BY ANALYZING ENZYME DEHYDROGENASE ACTIVITY

Изобретение относится к области геоэкологии и может быть использовано для идентификации микробного загрязнения водной среды, например, из навоза скота, на территориях пастбищного скотоводства посредством анализа активности фермента дегидрогеназы, продуцируемого различными микробами. При этом учитывается то, что в результате просачивания через навоз дождевых и/или талых вод и образования поверхностных и внутрипочвенных стоков, может происходить микробное загрязнение поверхностных и подземных водоисточников, используемых местным населением для питьевых целей, что согласно санитарно-гигиеническим нормативам не допускается.
Заявляемый способ повышает оперативность, точность и качество оценки эпидемиологической ситуации, которая может быть вызвана патогенными микробами на территориях пастбищного скотоводства, первичным очагом которых, как правило, является навоз больных животных. Соответственно, способ позволяет обосновать принятие профилактических и/или ремедиационных мер для исключения инфицирования местного населения через загрязненные поверхностные и подземные водоисточники, используемые для питьевых целей.
Особую значимость заявляемый способ может приобрести для контроля ситуации, связанной с эпидемией сибирской язвы, возбудителем которой является спорообразующая бактерия Bacillus anthracis. Первичными очагами инфекции, как правило, является навоз больных оленей на пастбищах, а вторичные очаги данной бактерии создаются в результате просачивания через навоз дождевых и талых вод, которые образуют поверхностные и внутрипочвенные стоки. Пример - вспышка эпидемии сибирской язвы летом 2016 г. в Ямало-Ненецком автономном округе, на полуострове Ямал с развитым пастбищным оленеводством. В результате эпидемии заболело 2650 оленей и 36 человек с одним летальным исходом [см. журнал «Проблемы особо опасных инфекций». 2016. Вып. 4. С. 42-46; «Журнал инфектологии». 2016. Том 8. №3. С. 5-27.]. Одним из факторов передачи Bacillus anthracis человеку могло быть употребление сырой и/или недостаточно термически обработанной воды из озер - мест водопоев оленей, среди которых могли быть и больные животные.
4
n
2
Известен способ определения микробного загрязнения водной среды (Патент РФ на изобретение №2286565), включающий отбор проб воды, ее пропускание через бактерицидный фильтр, доведение рН пробы до значений 5-6 и определение микробного загрязнения водной среды по концентрации йода, выделившегося после взаимодействия пробы с бактерицидом формулы RNI((n-1)/2)HO.
Существенными недостатками известного способа являются:
- использование устройства сложной конструкции для определения микробного загрязнения водной среды, включающего источник оптического излучения, кювету для исследуемой среды, фотоприемник, бактерицидный фильтр и реакционную камеру;
- отсутствие единообразия в определении микробного загрязнения водной среды, т.е. определение концентрации выделившегося из бактерицида йода, пропорциональной микробному заражению воды;
- использование недостаточно корректного, весового метода, требующего предварительного выделения и осаждения йода.
0
1
2
A
B
C
Известен способ определения микробного загрязнения водной среды (Патент РФ на изобретение №2476876), включающий измерение на анализаторе жидких проб - интенсивности люминолозависимой хемилюминесценции натуральной пробы (J) и фильтратов натуральной пробы после ее тонкой фильтрации (J) и ультрафильтрации (J) через прозрачные аналитические трековые мембраны, определение процентного содержания непосредственно участвующих в образовании светосуммы реакции основных компонентов водной среды в виде микропланктона с микровзвесями (А), бактерий (В) и растворов органических и неорганических соединений (С) исходя из замеренных значений световыхода люминесцентной реакции (J, J, J) по соответствующим формулам.
Существенными недостатками известного способа являются:
- использование сложного прибора в виде хемилюминесцентного анализатора (люминометра) жидких проб и вакуумной фильтрационной установки с прозрачными аналитическими трековыми мембранами и вакуумным насосом;
- необходимость фильтрационной подготовки анализируемых проб воды;
- сложность формирования аналитических данных для расчета результатов определения микробного загрязнения водной среды.
фл
флк
фл
фл
флк
фла
фла
флк
фла
флк
ап
ап
Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ определения микробного загрязнения воды (Патент РФ на изобретение №2576030), включающий использование проб с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий. При освещении проб ультрафиолетовым излучением определяют интенсивность флуоресценции I каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции I контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду при длине волны λ=415±10 нм. Затем строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением I-I в каждой пробе, определяют флуоресценцию I анализируемой пробы и значение I-I, и, наконец, по калибровочной кривой вычисляют соответствующую I-I концентрацию КОЕ в анализируемой пробе. В случае превышения КОЕ допустимого значения более чем на заданную величину микробную загрязненность оценивают, как опасную.
Существенными недостатками известного способа являются:
- обязательное использование проб с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерии кишечной палочки Escherichia coli, культивирование которой на питательной среде (агаре) занимает продолжительное время - несколько суток;
- сложность подготовки аналитических данных к расчетам микробного загрязнения воды;
- необходимость дополнительного сравнительного анализа тех же проб воды с использованием сложной технологии, представленной в другом способы (Патент РФ на изобретение №2078138).
Целью предлагаемого изобретения является решение технической задачи оперативной (в течение 1 суток) и доступной для региональных лабораторий идентификации на территории пастбищного скотоводства микробного загрязнения водной среды, например, из навоза скота, посредством анализа активности фермента дегидрогеназы в сухих пробах навоза и водных пробах из навоза, получаемых методом центрифугирования.
Данная техническая задача решается благодаря тому, что на территории пастбищного скотоводства, по карта-схеме крупного масштаба, М 1:200000 и крупнее, определяют место выпаса скота. Затем с места выпаса скота отбирают усредненный репрезентативный образец навоза, который высушивают (при комнатной температуре) и просеивают (через сито диаметром ячеек 3 мм) для получения сухого образца. Из этого образца берут пробы массой по 1 г в количестве 5 партий по 6 штук в каждой, т.е. всего 30 проб. Первая партия представляет собой сухие пробы навоза и идет под номером №1 (соотношение навоз: вода в ней равно 1:0). Остальные 4 партии сухих проб навоза помещают в центрифужные пробирки на фильтровальную бумагу с размером пор 12-15 мкм (например, марки "Черная лента" по международной классификации). Затем в пробирки добавляют дистиллированную воду без перемешивания с пробой в соотношениях навоз: вода, равных 1:1 для второй партии, 1:2 для третьей партии, 1:3 для четвертой партии и 1:4 для пятой партии. Таким образом имитируется низкообъемная влажность навоза, характерная в случае выпадения дождя (соотношение навоз: вода в пределах 1:1÷1:2), и высокообъемная влажность навоза, характерная в случае таяния снега (соотношение навоз: вода в пределах 1:3÷1:4). Центрифужные пробирки с пробами вставляют в ротор центрифуги и тут же центрифугируют не менее 5 минут для получения из них водных проб навоза соответственно под номерами №2, №3, №4 и №5. После этого каждую пробу первой партии и каждую водную пробу остальных партий помещают в индивидуальные модифицированные колбы Эрленмейера с добавлением необходимых реагентов и инкубируют их в термостате при +30°С в течение одних суток. По завершению инкубирования анализируют активность фермента дегидрогеназы в пробах №1, №2, №3, №4 и №5 спектрофотометрическим методом с необходимой математической обработкой полученных результатов для каждой партии проб.
На фиг. 1 приведена схема дюралюминиевой центрифужной пробирки (в разрезе) для получения водных проб из навоза и в ней использованы следующие обозначения:
1 - цилиндр;
2 - проба навоза;
3 - кружок фильтровальной бумаги;
4 - дюралюминиевое ситечко;
5 - внешняя резьба;
6 - внутренняя резьба;
7 - накопитель;
8 - водная проба навоза.
На фиг. 2 приведено оборудование и устройство для анализа активности фермента дегидрогеназы сухой пробы навоза и водных проб из навоза с использованием следующих обозначений:
9 - термостат;
10 - модифицированная колба Эрленмейера;
11 - реакционная смесь;
12 - коленчатый отросток колбы Эрленмейера с насыщенным щелочным раствором пирогаллола.
Способ идентификации микробного загрязнения водной среды посредством анализа активности фермента дегидрогеназы реализуют следующим образом.
На территории пастбищного скотоводства, по карта-схеме крупного масштаба М 1:200000 или крупнее, определяют место выпаса скота и намечают точки, в которых будут отобраны образцы навоза. Определение этих точек и их число производится с учетом того, чтобы в конечном итоге был получен усредненный репрезентативный образец навоза. Отобранные образцы навоза высушивают (при комнатной температуре), просеивают (через сито диаметром ячеек 3 мм) и тщательно перемешивают для получения сухого образца. Из этого, полученного таким образом образца, берут пробы массой по 1 г в количестве 5 партий по 6 штук в каждой, т.е. всего 30 проб.
Первая партия представляет собой сухие пробы навоза и идет под номером №1 (соотношение навоз: вода в ней равно 1:0).
Для получения водных проб из навоза используют метод центрифугирования с применением, например, центрифуги марки К-24 с холодильным устройством. Для этого остальные 4 партии сухих проб навоза, т.е. всего 24 штуки проб, помещают в цилиндры (1) отдельных дюралюминиевых центрифужных пробирок на кружки фильтровальной бумаги (3) с размером пор 12-15 мкм (например, марки "Черная лента" по международной классификации). Эти кружки фильтровальной бумаги предварительно укладываются на дюралюминиевые ситечки (4), лежащие на выступах цилиндров, фиг. 1. Затем в пробы в центрифужных пробирках добавляют дистиллированную воду без перемешивания в соотношениях навоз: вода, равных 1:1 для второй партии, 1:2 для третьей партии, 1:3 для четвертой партии и 1:4 для пятой партии. Таким образом имитируется низкообъемная влажность навоза, характерная в случае выпадения дождя (соотношение навоз: вода в пределах 1:1÷1:2), и высокообъемная влажность навоза, характерная в случае таяния снега (соотношение навоз: вода в пределах 1:3÷1:4). Центрифужные пробирки с пробами вставляют в ячейки ротора центрифуги, плотно завинчивают крышку ротора и тут же центрифугируют для получения из них водных проб навоза соответственно под номерами №2, №3, №4 и №5. Процедуру центрифугирования производят при 10000 оборотах в минуту не менее 5 минут при температуре около 12°С для получения водных проб навоза (8) в их накопителе (7), т.е. отвинчивающейся нижней части центрифужной пробирки. В накопителе (7), благодаря внешней (5) и внутренней (6) резьбе центрифужной пробирки происходит, без каких-либо потерь, сбор отдельных водных проб навоза.
6
12
6
19
15
4
6
3
3
Затем в сухой пробе навоза №1 и водных пробах из навоза №2, №3, №4 и №5 анализируют активность фермента дегидрогеназы спектрофотометрическим методом, фиг. 2. Для этого каждую пробу первой партии и каждую водную пробу остальных партий помещают в индивидуальные модифицированные колбы Эрленмейера (10). В эти колбы последовательно добавляют по 1 мл 1%-х водных растворов глюкозы (СНО) и 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида (CHNCl), и всю эту реакционную смесь (11) перемешивают. Далее в коленчатый отросток колбы Эрленмейера (12) с помощью шприца вводят насыщенный щелочной раствор пирогаллола (СН(ОН)) в гидроксиде калия (КОН) для создания анаэробных условий. Колбы герметизируют стеклянными шлифованными пробками, дополнительно используя вакуумную смазку, и ставят на инкубирование в термостат (9) при +30°С на одни сутки.
19
16
4
2
5
19
16
4
19
16
4
19
16
4
После завершения инкубирования проб в течение 1 суток, производят экстракцию, образующегося в них 2,3,5-трифенилформазана (CHN) с помощью этанола (СНОН) - 5 раз по 4 мл. Экстракты каждой отдельной пробы объединяют, доводят этанолом до объема 25 мл и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре (при длине волны λ=490 им). Затем по заранее подготовленному калибровочному графику для различных количеств CHN в этаноле (например, 1-30 мкг/л), рассчитывают количество образованного вещества, выражаемое в единицах мкг или мг CHN/(г⋅сут) для сухого навоза. Для водных проб навоза количество образованного вещества пересчитывают на 1 мл и выражают единицах мкг или мг CHN/(мл⋅сут), различающиеся в различных вариантах. По результатам анализа активности фермента дегидрогеназы идентифицируют микробное загрязнение водной среды из навоза скота, происходящее в результате просачивания через навоз дождевых и/или талых вод, которые образуют поверхностные и внутрипочвенные стоки.
Например, были проведены опыты с усредненным репрезентативным образцом навоза, отобранным с места выпаса крупного рогатого скота на территории пастбищного скотоводства в Московской области. Образец прошел операции последующего высушивания, просеивания с перемешиванием. Из него были получены сухие пробы навоза и водные пробы из навоза. После проведения описанных и дополнительных процедур лабораторных анализов было установлено статистически доказанное микробное загрязнение воды, которое определяется посредством анализа активности фермента дегидрогеназы, табл. 1.
19
16
4
9
При этом значения активности фермента дегидрогеназы были подтверждены, результатами анализа количества микробов, продуцирующих данный фермент в различных пробах, проведенного по общепринятой методике [см. Звягинцев Д.Г., Асеева И.В., Бабьева И.П., Мирчинк Т.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. С. 15-20, 34-38]. Из этих, сравнительных исследований и полученных аналитических данных, видно, что проба сухого навоза №1, как первичного очага микробов, характеризуется максимальными значениями активности фермента дегидрогеназы, 667 мкг CHN/(г⋅сут), и количеством микробов, 2,2⋅10 клеток/г, продуцирующих данный фермент. В водных пробах навоза №2, №3, №4 и №5, как вторичного очага микробов, при расширении соотношения навоз: вода в ряду - 1:1, 1:2, 1:3 и 1:4, активность фермента оказалась в прямо пропорциональной зависимости от количества микробов, т.е. чем ниже была активность дегидрогеназы, тем меньшее количество микробов идентифицировалось в водной пробе и наоборот. Следует отметить, что если результаты анализа показывают нулевое значение активности фермента дегидрогеназы, то означает полное отсутствие микробного загрязнения водной среды из навоза.
Способ позволяет оперативно (в течение 1 суток):
- идентифицировать микробное загрязнение водной среды из навоза скота, происходящее в результате просачивания через навоз дождевых и талых вод, которые образуют поверхностные и внутрипочвенные стоки;
- обеспечить высокую точность и качество оценки эпидемиологической ситуации, вызванной патогенными микробами на территориях пастбищного скотоводства, первичным очагом которых может быть навоз больных животных;
- обосновать принятие профилактических или ремедиационных мер, чтобы избежать инфицирования местного населения через загрязненные поверхностные и подземные водоисточники, используемые для питьевых целей.