СПОСОБЫ ДИАГНОСТИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КЛАПАНОВ
METHODS FOR DIAGNOSING CHRONIC VALVULAR DISEASE

Перекрестная ссылка на смежные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/117189, поданной 17 февраля 2015 г., описание которой включено в настоящий документ путем данной ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится, по существу, к способам диагностирования и прогнозирования хронического заболевания клапанов и, в частности, к способам диагностирования и прогнозирования хронического заболевания клапанов посредством измерения микроРНК (миРНК), связанной с хроническим заболеванием клапанов.
Уровень техники
Заболевание сердца является одним из наиболее распространенных расстройств у собак. Хроническое заболевание клапанов (CVD), также известное как дегенеративное заболевание митрального клапана (DMVD), поражает приблизительно 9% всех собак. Заболеваемость растет с возрастом, так что общий суммарный уровень заболеваемости составляет более 40%. CVD характеризуется прогрессирующей дегенерацией и деформацией предсердно-желудочковых клапанов, чаще всего митрального клапана, что приводит к ранней стадии недостаточности митрального клапана. Это, в свою очередь, приводит к появлению систолических шумов сердца из-за митральной регургитации, когда неправильное закрытие митрального клапана вызывает отток крови обратно в левое предсердие. У больных собак, в конечном счете, развивается объемная перегрузка левых камер сердца, отек легких, предсердная дилатация и наджелудочковые аритмии.
Возможно оперативное или медикаментозное лечение дисфункции клапанов, но для владельцев домашних животных предпочтительным является изменение рациона животных. Раннее выявление и лечение имеют первостепенное значение, однако выявление может быть затруднено ввиду отсутствия симптомов. В заявке на патент (PCT/US201344011) описаны способы диагностирования CVD с использованием дифференциально экспрессируемых генов и метаболитов. Однако способы, основанные на экспрессии генов, требуют сбора сердечных тканей, что считается инвазивным вмешательством. Кроме того, мРНК не очень стабильна, и работа с ней в условиях эксперимента может быть затруднена. Кроме того, измерение метаболитов в сыворотке крови может осложняться в зависимости от биохимической природы и стабильности соединений.
Таким образом, остается необходимость в диагностировании и прогнозировании CVD у животных для обеспечения наиболее подходящего и эффективного уровня лечения.
Раскрытие изобретения
Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение способов диагностирования и прогнозирования хронического заболевания клапанов у животных.
Эта и другие цели достигаются с использованием способов диагностирования и прогнозирования хронического заболевания клапанов у животного, которые включают получение образца от животного; анализ образца для определения количества миРНК, связанной с хроническим заболеванием клапанов; сравнение количества миРНК, выявленного в образце, с соответствующим количеством миРНК, присутствующим в образце, полученном от одного или более сопоставимых контрольных животных, которые не страдают хроническим заболеванием клапанов; и диагностирование у животного хронического заболевания клапанов, если миРНК, обнаруженная в образце животного, дифференциально экспрессируется в образце контрольного животного.
Другие и дополнительные цели, функции и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области.
Осуществление изобретения
Определения
Термин «животное» означает любое животное, имеющее предрасположенность к хроническому заболеванию клапанов или страдающее данным заболеванием, включая животных, относящихся к человеку, птицам, коровьим, собачьим, лошадиным, кошачьим, козьим, волчьим, мышиным, овечьим или свиным.
Термины «миРНК» или «биомаркер» означают небольшую молекулу одноцепочечной некодирующей РНК, включая содержащие около 21–25 нуклеотидов, уровни которой измеряются в биологическом образце и могут использоваться как маркеры для диагностики состояния заболевания.
Термин «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемая» означает возрастание или повышенный уровень экспрессии миРНК или означает снижение или пониженный уровень экспрессии миРНК, что выявляется по отсутствию, наличию или изменению количества миРНК в образце.
Термин «сопоставимое контрольное животное» означает животное того же вида и типа или особь животного, оцениваемые в два разных момента времени.
Термин «соответствующее количество» означает количество миРНК от сопоставимого контрольного животного, которое соответствует миРНК для животного с диагнозом хронического заболевания клапанов, где миРНК связана с хроническим заболеванием клапанов.
Термин «животные-компаньоны» означает одомашненных животных, таких как собаки, кошки, птицы, кролики, морские свинки, хорьки, хомяки, мыши, песчанки, прогулочные лошади, коровы, козы, овцы, ослы, свиньи и более экзотические виды, которых люди держат для компании, развлечения, психологической поддержки, коммуникативных проявлений и любых других функций, в отношении которых люди имеют потребность разделить с животными других видов. В одном аспекте животным-компаньоном может быть собака или кошка. В одном конкретном аспекте животным-компаньоном может быть собака.
Термин «диагностирование» означает определение того, страдает ли животное хроническим заболеванием клапанов, или прогнозирование того, имеет ли животное предрасположенность к развитию данного заболевания.
Термин «ранняя стадия» означает сердечную недостаточность (СН) стадии B с увеличением сердца легкой или умеренной степени, но без клинических проявлений сердечной недостаточности (СН), в соответствии с руководством по диагностике СН, разработанным Американским ветеринарным колледжем медицины внутренних болезней (ACVIM).
Термин «терминальная стадия» означает СН стадии C с клиническими проявлениями СН умеренной степени в соответствии с руководством ACVIM.
Диапазоны в настоящем документе указаны сокращенно, чтобы избежать необходимости перечислять и описывать все и каждое значение в пределах диапазона. При необходимости можно выбирать любое соответствующее значение в пределах диапазона в качестве верхнего значения, нижнего значения или граничного значения диапазона.
В настоящем документе единственное число слова включает в себя множественное число и наоборот, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, указание на единственное число, по существу, включает в себя множественное число соответствующих терминов. Например, использование термина «способ» включает множество таких «способов». Аналогичным образом слова «содержать», «содержит» и «содержащий» следует истолковывать во включающем, а не исключающем смысле. Аналогично, термины «включать», «включающий» и «или» следует толковать во включающем смысле, если такое толкование явно не запрещено контекстом.
Способы и композиции, а также другие достижения, описанные в настоящем документе, не ограничены конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку, как очевидно специалистам в данной области, они могут изменяться. Кроме того, используемая в настоящем документе терминология служит только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не должна ограничивать, и не ограничивает объем, который описан или указан в формуле изобретения.
Если не определено иное, все технические и научные термины, специальные термины и сокращения, используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно понятные специалисту в области (-ях), к которой (-ым) относится изобретение, или в области (-ях), в которой (-ых) используется термин.
Все патенты, заявки на патенты, публикации, технические и/или научные статьи и другие ссылки, приведенные или упомянутые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ путем ссылки в объеме, разрешенном законодательством. Обсуждение этих ссылок служит только для обобщения утверждений, сделанных в настоящем документе. Не делается каких-либо допущений, что любые такие патенты, заявки на патенты, публикации или ссылки, или какая-либо их часть являются важными, существенными или относятся к предшествующему уровню техники. Специально сохранено право ставить под вопрос точность и уместность любых утверждений о том, что такие патенты, заявки на патенты, публикации и другие ссылки являются важными, существенными или относятся к предшествующему уровню техники.
Изобретение
Авторы настоящего изобретения установили, что описанная в настоящем документе миРНК может присутствовать в биологическом образце, полученном от животного, и что количество миРНК в образце может служить биохимическим индикатором для диагностирования хронического заболевания клапанов путем выявления или прогнозирования порогового уровня для хронического заболевания клапанов. Таким образом, настоящее изобретение позволяет ветеринарам и другим клиническим специалистам выполнять анализы на эти биомаркеры в образце и определять, имеет ли животное предрасположенность к хроническому заболеванию клапанов или страдает ли данным заболеванием и существует ли необходимость в дополнительной диагностике или лечении. Установив необходимость в дополнительной диагностике или лечении, можно оценить стоимость и риски такой дополнительной диагностики или лечения.
В соответствии с вышесказанным в изобретении предложены способы диагностирования хронического заболевания клапанов у животного. Способы включают в себя получение биологического образца от животного; анализ образца для определения количества микроРНК (миРНК), связанной с хроническим заболеванием клапанов; сравнение количества миРНК, выявленного в образце, с соответствующим количеством миРНК, присутствующим в образце, полученном от одного или более сопоставимых контрольных животных, которые не страдают хроническим заболеванием клапанов; и диагностирование у животного хронического заболевания клапанов, если количество миРНК, обнаруженное в образце животного, дифференциально экспрессируется в образце контрольного животного.
В одном варианте осуществления способ диагностирования хронического заболевания клапанов у животного может включать в себя получение биологического образца от животного; анализ образца для определения количества миРНК, связанной с хроническим заболеванием клапанов; сравнение количества миРНК, выявленного в образце, с соответствующим количеством миРНК, присутствующим в образце, полученном от одного или более сопоставимых контрольных животных, которые не страдают хроническим заболеванием клапанов; и диагностирование у животного хронического заболевания клапанов, если количество миРНК, обнаруженное в образце животного, выше, чем количество миРНК, присутствующее в образце контрольного животного.
В другом варианте осуществления способ диагностирования хронического заболевания клапанов у животного может включать в себя получение биологического образца от животного; анализ образца для определения количества миРНК, связанной с хроническим заболеванием клапанов; сравнение количества миРНК, выявленного в образце, с соответствующим количеством миРНК, присутствующим в образце, полученном от одного или более сопоставимых контрольных животных, которые не страдают хроническим заболеванием клапанов; и диагностирование у животного хронического заболевания клапанов, если количество миРНК, обнаруженное в образце животного, ниже, чем количество миРНК, присутствующее в образце контрольного животного.
В различных вариантах осуществления одно или более сопоставимых контрольных животных, которые не являются животным, подлежащим оценке на предмет хронического заболевания клапанов, и у которых было установлено отсутствие хронического заболевания клапанов, могут оценивать для определения миРНК, а результаты таких оценок используют как базовое значение для сравнения с результатами животного, у которого определяют миРНК. В некоторых вариантах осуществления базовое значение миРНК можно определять посредством оценки целого ряда сопоставимых контрольных животных.
В другом варианте осуществления количество миРНК можно определять у животного в различные моменты времени жизни животного, а результаты можно использовать для определения того, имеет ли животное предрасположенность к хроническому заболеванию клапанов или страдает ли данным заболеванием, например, если количество миРНК увеличивается или уменьшается с возрастом животного, то у животного может быть диагностирована предрасположенность к хроническому заболеванию клапанов или наличие данного заболевания. В некоторых вариантах осуществления животное можно периодически оценивать и регистрировать результаты для миРНК. После этого, если последующая оценка показывает, что количество миРНК увеличилось или уменьшилось со времени последней (их) оценки (-ок), то у животного может быть диагностирована предрасположенность к хроническому заболеванию клапанов или наличие данного заболевания. В некоторых аспектах конкретные изменения в количестве миРНК могут быть соотнесены с ранней стадией или терминальной стадией хронического заболевания клапанов.
В настоящем изобретении может использоваться любой образец биологического происхождения. Примеры включают, без ограничений, кровь (сыворотку/плазму), спинномозговую жидкость (СМЖ), мочу, кал, выдыхаемый воздух, слюну или образец какой-либо ткани, взятый методом биопсии. В одном из вариантов осуществления образец может представлять собой образец сыворотки крови. Хотя в настоящем документе употребляется термин «сыворотка крови», специалистам в данной области будет понятно, что также можно использовать плазму крови или цельную кровь, или субфракцию цельной крови.
Повышение или понижение экспрессии можно измерять на уровне миРНК с использованием любых хорошо известных в данной области способов количественного определения полинуклеотидов, таких как, например, ПЦР (включая, без ограничений, ПЦР с обратной транскрипцией и количественную ПЦР), секвенирование, Нозерн-блоттинг, микроматричный анализ или другие гибридизационные методы.
Хотя для диагностирования хронического заболевания клапанов достаточно использовать одну миРНК, в объем изобретения входит использование одной или более, двух или более, трех или более или четырех или более таких миРНК. МиРНК можно оценивать и использовать для диагностики в любой комбинации. Таким образом, настоящие способы могут включать в себя диагностирование CVD на основании повышенного уровня миРНК и пониженного уровня миРНК.
В одном варианте осуществления диагноз может основываться на установлении того факта, что количество миРНК, обнаруженное в образце животного, выше, чем количество миРНК, присутствующее в образце контрольного животного. В одном аспекте миРНК может включать miR-103, miR-98, let-7c или let-7b.
В одном варианте осуществления диагноз может основываться на установлении того факта, что количество миРНК, обнаруженное в образце животного, ниже, чем количество миРНК, присутствующее в образце контрольного животного. В одном аспекте миРНК может включать miR-302d, miR-380, miR-874, miR-582, miR-490, miR-329b или miR-487b.
Дифференциальная экспрессия миРНК может быть статистически значимой, как продемонстрировано в настоящем документе. В некоторых аспектах статистическая значимость может включать p < 0,05, p < 0,01 или даже p < 0,001.
В различных вариантах осуществления животное может представлять собой человека или животное-компаньона. В одном аспекте животное-компаньон может представлять собой животное из семейства собачьих, такое как собака, или животное из семейства кошачьих, такое как кошка. В одном конкретном аспекте животное может относиться к семейству собачьих.
ПРИМЕРЫ
Изобретение можно дополнительно проиллюстрировать следующими примерами, но следует понимать, что эти примеры включены исключительно для целей иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, если особо не указано иное.
Пример 1
МиРНК выявляли посредством исследования профилей дифференциальной экспрессии, в котором сравнивали образцы сыворотки крови больных и здоровых животных. Собак классифицировали как имеющих здоровое сердце или страдающих CVD по результатам эхокардиографии, которую выполнял или оценивал сертифицированный ветеринар-кардиолог, по результатам патологического исследования сердца или по результатам обоих исследований. Собак определяли в одну из трех групп на основании стадии сердечной недостаточности (СН), используя схему определения стадии заболевания, разработанную Американским ветеринарным колледжем медицины внутренних болезней (ACVIM) или Европейским ветеринарным колледжем медицины внутренних болезней (ECVIM): группа А (стадия А, подверженные риску, но здоровые, 6 собак), группа B (стадия B, с увеличением сердца легкой или умеренной степени, но без клинических проявлений сердечной недостаточности, 6 собак) или группа C (стадия C, с клиническим проявлением сердечной недостаточности умеренной степени, 6 собак) (таблица 1). Эти три группы собак были эквивалентны по возрасту, размерам тела и полу. У каждой группы собак брали сыворотку крови и хранили ее при -80 °C до момента использования.
Таблица 1. Образцы сыворотки крови, используемые в исследовании миРНК
Группа
Количество
Классификация по стадии заболевания
A
6
Стадия А согласно ACVIM. Подверженные риску, но здоровые
B
6
Стадия B согласно ACVIM. Увеличение сердца легкой или умеренной степени, но без клинических проявлений СН
C
6
Стадия C согласно ACVIM. Клиническое проявление СН умеренной степени
Образцы были предоставлены компании Qiagen для экстракции миРНК и количественного определения методом ПЦР с использованием матричной системы для ПЦР миРНК Qiagen miScript. Всего было исследовано 277 известных миРНК собачьих. Анализ данных выполняли с помощью дисперсионного анализа (ANOVA). В P-значения, используемые в дисперсионном анализе, вносили поправку для множественных сравнений и рассчитывали ожидаемую долю ложных отклонений (FDR) с использованием метода Беньямини — Хохберга. Рассчитывали кратность изменения экспрессии между группами B и A (FC_BvA), а также между группами C и A (FC_CvA). Дифференциально экспрессируемые миРНК выбирали с использованием порогового значения FDR < 0,05. Всего было выбрано 11 миРНК (таблица 2).
Таблица 2. Дифференциально экспрессируемые миРНК
миРНК
P<sup>a</sup>
FDR<sup>b</sup>
FC<sup>c</sup>_BvA
FC<sup>c</sup>_CvA
miR-302d
0,0010
0,0378
-2,7
-3,51
miR-380
0,0001
0,0119
-2,48
-4,76
miR-874
0,0016
0,0434
-2,37
-3,69
miR-582
0,0000
0,0004
-2,28
-4,71
miR-490
0,0005
0,0261
-2,24
-4,03
miR-329b
0,0019
0,0490
-1,96
-2,36
miR-487b
0,0012
0,0427
-1,45
-3,08
miR-103
0,0002
0,0140
1,29
3,81
miR-98
0,0014
0,0428
2,15
4,07
let-7c
0,0003
0,0218
2,28
4,67
let-7b
0,0006
0,0269
2,38
4,03
a
b
c
номинальные P-значения в дисперсионном анализе;  ожидаемая доля ложных отклонений;  положительные величины кратности изменения указывают на повышенный уровень экспрессии относительно контрольных образцов; отрицательные величины указывают на пониженный уровень экспрессии относительно контрольных образцов.
В данном описании были описаны типичные предпочтительные варианты осуществления изобретения. Хотя используются конкретные термины, они применяются только в общем и описательном смысле, а не для целей ограничения. Объем изобретения представлен в формуле изобретения. В свете вышеуказанных идей возможны многие модификации и варианты изобретения. Таким образом, следует понимать, что в рамках объема приложенной формулы изобретения изобретение может быть реализовано на практике способами, отличными от конкретно описанных способов.