О филогенетических отношениях колюшек рода pungitius Дальнего Востока

2011

Известия ТИНРО

Tom 167

УДК 597.531:575.8

В.Н. Долганов, А.Ю. Кравченко*

Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17

О ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЯХ КОЛЮШЕК РОДА PUNGITIUS ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

Обсуждаются филогенетические отношения колюшек рода Pungitius. Предпринята попытка выяснить их филогенетические отношения при помощи секвени-рования фрагментов ДНК, их дальнейшей статистической обработки и сопоставления полученных результатов с морфологическими данными. Для наглядного представления генетического сходства были построены фенограммы с использованием различных методов реконструкции деревьев. Все деревья имеют сходную топологию и показывают приблизительно одинаковый эволюционный сценарий, по которому шло развитие группы колюшковых рыб в северо-западной части Тихого океана. Pungitius tymensis на всех фенограммах достоверно образует отдельный кластер, но картина разделения P. pungitius и P. sinensis получилась неоднозначной. Отмечено, что полученные генетические данные об относительно недавней дивергенции между P. sinensis и P. pungitius и значительно более раннем отделении от них P. tymensis полностью не согласуются с данными морфологических, кариологических и биохимических исследований, которые показывают, что наиболее близки друг к другу не P. sinensis и P. pungitius, а P. pungitius и P. tymensis. Объяснить такое несоответствие результатов, полученных методами молекулярной генетики и традиционными для ихтиологии, по-видимому, можно только обратившись к истории формирования рассматриваемых таксонов.

Ключевые слова: колюшки, филогенетические отношения, фенограмма, генетическое сходство, северо-западная часть Тихого океана.

Dolganov V.N., Kravchenko A.Yu. On phylogenetic relations between the sticklebacks of genus Pungitius from the Far East of Russia // Izv. TINRO. — 2011. — Vol. 167. — P. 120-127.

Phylogenetic relations between the sticklebacks of genus Pungitius from the Far East of Russia are considered by means of DNA fragments sequencing and statistical analysis of the results. Genetic similarity is visualized by phenograms drawn by various methods. All of them have similar topology and show almost identical evolutionary scenarios of stickleback species development in the North-West Pacific. Pun-gitius tymensis forms a separate cluster on all phenograms, but divergence between P. pungitius and P. sinensis is ambiguous. The new genetic data on relatively recent divergence of these species and considerably earlier separation of P. tymensis contradict completely with morphological, karyological, and biochemical results on closer relationship between P. pungitius and P. tymensis, as compared with P. sinensis and P. pungitius. This discordance between genetic and traditional methods could be accounted for history of the species formation.

* Долганов Владимир Николаевич, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, e-mail: vndolganov@mail.ru; Кравченко Александра Юрьевна, аспирант.

Key words: stickleback, phylogenetic relationship, phenogram, genetic similarity, North-West Pacific.

Введение

В водоемах Дальнего Востока известны три основные формы девятииглых колюшек рода Pungitius, таксономический статус которых вызывает споры. Наиболее южный ареал имеет китайская, или амурская, колюшка P. sinensis (Guichenot, 1869), обитающая в основном в пресных водоемах от северного Китая и южной Японии до западной Камчатки (рис. 1). Севернее, от восточного побережья Японии и Сахалина до Арктики, в прибрежных, морских и пресных водах встречается P. pungitius (Linne, 1758) (рис. 2). Сахалинская колюшка P. tymensis (Nikolsky, 1889) распространена только в пресных водоемах Сахалина и Хоккайдо (рис. 3). Ареалы этих форм значительно перекрываются в районе Сахалино-Японской островной дуги, где виды частично гибридизируют (Зюганов, 1991).

Pungitius sinensis (Guichenot), 1869 — китайская, или амурская, девятииглая колюшка (рис. 1). Боковая поверхность тела P. sinensis вдоль боковой линии покрыта вертикальными костными боковыми пластинами, образующими киль, который сильнее выражен на хвостовом стебле. Брюшные колючки длиннее, чем у P. pungitius. Последняя спинная колючка равна по высоте предыдущим. Хвостовой стебель несколько длиннее и тоньше, чем у P. pungitius. Пределы колебания числа боковых пластин (на теле + на киле) — 27—36. Тазовый пояс развит хорошо.

Рис. 1. Китайская девятииглая колюшка (по: Линдберг,

Легеза, 1965)

Fig. 1. Pungitius sinensis

Pungitius pungitius (Linne), 1758 — девятииглая колюшка (рис. 2). Спинных колючек обычно 8-10, они высокие, высота последней примерно равна высоте предыдущих или лишь слегка превышает их. Боковая поверхность тела голая или покрыта мелкими пластинами над грудным плавником. На хвостовом стебле имеется киль, сформированный 5-14 костными пластинами. Восходящий отросток тазовой кости хорошо развит и достигает верхней части основания грудного плавника. Вид подвержен многочисленным вариациям в отношении числа боковых пластин на теле и на киле, числа жаберных тычинок, степени развития брюшных колючек и тазового пояса, числа спинных колючек и окраски (Зюганов, 1991).

Рис. 2. Девятииглая колюшка

Fig. 2. Pungitius pungitius

Pungitius tymensis (Nikolsky), 1889 — сахалинская девятииглая колюшка. Тело голое или имеет 1-2 мелкие боковые пластинки над грудным плавником. Киль на хвостовом стебле выражен гораздо слабее, чем у P. pungitius, и состоит из 4-7 пластин. Спинные колючки очень короткие. Последняя спинная колючка в 2 раза длиннее предыдущих. Нет мягких лучей в брюшном плавнике. Тело и хвостовой стебель у P. tymensis короче и выше, чем у P. pungitius, а относительная длина и высота головы больше. Восходящие отростки тазовых костей частично редуцированы, едва достигают горизонтали нижнего конца основания грудного плавника.

121

Рис. 3. Сахалинская девя-тииглая колюшка

Fig. 3. Pungitius tymensis

Основные количественные морфологические данные этих видов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Морфологические данные P. sinensis, P. pungitius и P. tymensis

Таблица 1

Morphological data for P. sinensis, P. pungitius, and P. tymensis

Признак P. sinensis P. pungitius P. tymensis

Число колючек в D (7) 8-11 (1-6) 7-12 7-12

Число мягких лучей в D 8-13 9-12 9-12

Число колючек в V 1 (0) 1 (0) 1

Число мягких лучей в V 1-3 (0) 1 0

Число боковых пластин 27-36 с килем 0-5 + киль 5-14 0-2+ киль 4-7

Примечание. D — дорзальный плавник, V — вентральный плавник. В скобках — нормальное количество.

Таким образом, в ряду форм P. sinensis ^ P. pungitius ^ P. tymensis наблюдаются увеличение высоты тела, уменьшение относительной длины хвостового стебля и увеличение его высоты, а также уменьшение количества боковых пластин, высоты колючек и редукция мягких лучей в брюшных плавниках. P. pungitius и P. tymensis более близки друг к другу по упомянутым выше признакам, чем к P. sinensis (табл. 1).

При изучении электрофоретических вариантов глюкозо- и галактозо-6-фос-фатдегидрогеназ оказалось, что спектры обоих белков у P. sinensis резко отличаются от таковых P. pungitius и P. tymensis. Спектр же глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназ P. tymensis идентичен спектру P. pungitius (Muramoto et аі, 1969).

Все три вида имеют 2n = 42 хромосомы, но по структуре кариотипа P. tymensis и P. pungitius идентичны, а P. sinensis достоверно отличается от них по соотношению мета-, субмета-, субтело- и акроцентрических хромосом. P. pungitius и P. tymensis имеют 6 пар мета- и субметацентрических, 5 пар субтелоцентри-ческих и 10 пар акроцентрических хромосом, а P. sinensis — лишь 4 пары мета-и субметацентрических, 4 пары субтелоцентрических, но 13 пар акроцентрических хромосом (Muramoto et al., 1969).

Согласно результатам остеологических и меристических исследований Кей-вани и Нельсона (Keivany, Nelson, 2004), проведенных по 33 информативным признакам, P. pungitius и P. tymensis имеют между собой больше общих признаков, чем с P. sinensis.

Несмотря на приведенные выше данные, до сих пор нет единого мнения о таксономическом статусе этих видов. Если валидность P. tymensis в настоящее время не подвергается сомнению, то статус китайской колюшки трактуется довольно широко: от “пресноводного типа P. pungitius” (Hosoya, Nakabo, 2001) и подвида P. pungitius sinensis (Берг, 1949; Никольский, 1956; Линдберг, Легеза, 1965; и др.) до самостоятельного вида (Kobayashi, 1957; Ishigaki, 1967; Tanaka, 1982; Зюганов, 1991; Сафронов и др., 2005; и др.). Такая неоднозначность вызвана широкой экологической пластичностью P. sinensis и P. pungitius и сложным

характером распределения этих форм в зоне их совместного распространения (Зюганов, 1991).

В работе предпринята попытка выяснить филогенетические отношения трех видов рода Pungitius при помощи секвенирования фрагментов ДНК, их дальнейшей статистической обработки и сопоставления полученных результатов с морфологическими данными.

Материалы и методы

Для исследования были использованы сборы Т.В. Рязановой, сделанные в р. Большой близ пос. Октябрьский на Камчатке (P. pungitius) и сборы А.А. Се-менченко из р. Киевка Приморского края (P. sinensis) и р. Лангры на северо-западе о. Сахалин (P. tymensis).

Для молекулярно-генетического анализа использовалась часть туловищной мышцы рыб. Для выделения ДНК использовалась стандартная методика (Sambrook et al., 1989). Фрагмент митохондриального генома, включающий ген цитохромок-сидазы I, был амплифицирован методом полимеразной цепной реакции с использованием прямых FishF1 (5’-TCAACCAACCACaAaGACATTGgCaC3’), FishF2 (5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3’) и обратных праймеров FishR1 (5’-ТА-GACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA3’), FishR2 (5’-ACTTCAGGGTGACCGAAG-AATCAGAA3’) (Ward et al., 2005).

Для амплификации фрагмента, содержащего ген цитохрома b, использовались три пары праймеров: FishcytB-F (5’-aCcACCGTTGTTATTCAACTACAAGAAC-3’), THR-fish-R (5’-ACCTCCGATCTTCGGATTACAAGACC-3’); THR-fish2-R (5’-AACC TCCGACATCCGGCTTACAAGACCG-3’); TruccytB-R (5’-CCGACTTCCGGATTACAA GACCG-3’) (Sevilla et al., 2007).

Последовательности нуклеотидов определялись на автоматическом секвена-торе ABI 3130xl на базе лаборатории исследования геномов морских организмов кафедры генетики ДВФУ (г. Владивосток).

Выравнивание последовательностей проводилось с помощью программного пакета CLUSTAL-W, интегрированного с программным пакетом MEGA

4.0 (Kumar et al., 2004). Построение молекулярно-филогенетических деревьев с последующей статистической обработкой осуществлялось с помощью MEGA

4.0 (Kumar et al., 2004). Парные генетические расстояния между гаплотипа-ми гена цитохрома b и цитохромоксидазы I вычислялись при помощи двупараметрической модели Кимуры (Kimura, 1980). Филогенетические связи реконструировали с помощью методов ближайшего соседства (NJ — Neighbor-Joining), невзвешенного попарно-группового метода (UPGMA — Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean), метода минимальной эволюции (ME — Minimum Evolution) и максимальной парсимонии (MP — Maximum Parsimony). В качестве внешней группы были использованы последовательности генов Gasterosteus wheatlandi (EU524642-COI, AY283301-CytB), Culaea inconstans (EU524538-COI, DQ359794-CytB), Apeltes quadracus (EU524446-COI), Pungitius pungitius (EU524319-COI, EU524320-CytB) и Pungitius kaibarae (FJ197681-COI, AY787225-CytB), взятые из генного банка NCBI. Достоверность полученных реконструкций проверялась методом бутстреп-ана-лиза (Felsenstein, 1985).

Для оценки времени дивергенции по значениям попарных генетических дистанций использовалась зависимость, выявленная для гена цитохрома b и принимаемая многими исследователями. Эта зависимость основывается на теории молекулярных часов и заключается в том, что для данной группы рыб на каждый 1 млн лет приходится примерно 1,7 % дивергенции последовательностей мтДНК (Takahashi et al., 2001).

Результаты и их обсуждение

Результаты генетического анализа митохондриальных генов цитохромокси-дазы I и цитохрома b, выделенных из представителей трех выборок, позволяют судить о филогенетических отношениях внутри рассматриваемой группы.

Основываясь на полученных данных о генетических дистанциях (эволюционных расстояниях) между представителями разных видов (табл. 2), можно заключить, что P. tymensis отделился от основного ствола значительно раньше, чем разошлись P. sinensis и P. pungitius. При использовании рекомендованного для ко-люшковых рыб коэффициента количества нуклеотидных замен за 1 млн лет 1,7 % получается, что дивергенция P. tymensis от основного ствола произошла примерно 4 млн лет назад. Дивергенция видов P. pungitius и P. sinensis при таком же способе вычисления произошла совсем недавно, приблизительно 915 тыс. лет назад.

Таблица 2

Генетические дистанции между P. tymensis, P. sinensis, P. pungitius и внешними группами, рассчитанные по последовательностям, взятым из генного банка

Таблица 2

Genetic distances between P. tymensis, P. sinensis, P. pungitius, and outer groups calculated on sequences acquired from the bank of genes

Вид 1 2 3 4 5 6 7 8

P. sinensis

P. tymensis 0,068

P. pungitius 0,016 0,079

Pungitius kaibarae 0,086 0,077 0,094

Pungitius pungitius 0,012 0,070 0,017 0,086

Apeltes quadracus 0,184 0,183 0,197 0,181 0,180

Culaea inconstans 0,196 0,193 0,206 0,192 0,201 0,187

Gasterosteus wheatlandi 0,189 0,184 0,193 0,180 0,183 0,192 0,198

Для наглядного представления генетического сходства были построены фе-нограммы с использованием различных методов реконструкции деревьев: невзвешенного попарно-группового, ближайшего соседства, минимальной эволюции и максимальной парсимонии.

Все деревья имеют сходную топологию и показывают приблизительно одинаковый эволюционный сценарий, по которому шло развитие группы колюшко-вых рыб в северо-западной части Тихого океана (рис. 4-6). Однако следует отметить, что если P. tymensis на всех фенограммах достоверно образует отдельный кластер, то картина разделения P. pungitius и P. sinensis получилась неоднозначной, как и мнение ихтиологов. На UPGMA-фенограмме они не разделяются, образуя почти единый кластер. Фенограмма, построенная методом ближайшего соседства, разделяет кластеры P. pungitius и P. sinensis с поддержкой bootstrap 51 %, а фенограммы, построенные методами минимальной эволюции и максимальной парсимонии, показывают достоверное разделение P. pungitius и P. sinensis как видов (соответственно 100 и 99 поддержка bootstrap).

Интересно, что полученные генетические данные об относительно недавней дивергенции между P. sinensis и P. pungitius и значительно более раннем отделении от них P. tymensis полностью не согласуются с данными морфологических, кариологических и биохимических исследований, которые показывают, что наиболее близки друг к другу не P. sinensis и P. pungitius, а P. pungitius и P. tymensis. Это также не соответствует направленности морфологической изменчивости колюшек рода Pungitius (Долганов, Кравченко, 2009). Объяснить такое несоответствие результатов, полученных методами молекулярной генетики и традиционными для ихтиологии методами, по-видимому, можно только обратившись к истории формирования рассматриваемых таксонов.

96

36

100

100

28

100

P. sinensis2 P. sinensis3

-----Pungitius pungitius

P. pungitius1

P. pungitius2

----P. pungitius3

----P. tymensis3

____I P. tymensisl

100 I P. tymensis2

----Pungitius kaibarae

----Apeltes quadracus

----Gasterosteus wheatlandi

----Culaea inconstans

0,08

0,06

0,04

0,02

0,00

Рис. 4. UPGMA-фенограмма, иллюстрирующая генетические различия таксонов колюшек: 1-3 — здесь и далее номера выборок

Fig. 4. UPGMA-phenogram that explains genetic distances between taxa of sticklebacks: 1-3 — sample numbers, hereinafter

P. sinensis1

74

98

51

100

89

100

35

P. sinensis2

P. sinensis3

------P. pungitius3

- P. pungitius1

92

69 L P. pungitius2 — Pungitius pungitius — P. tymensis3

I P. tymensis1

100 1 P. tymensis2 Pungitius kaibarae ------Gasterosteus wheatlandi

58

Apeltes quadracus Culaea inconstans

0,02

Рис. 5. NJ-фенограмма Fig. 5. NJ-phenogram

В эволюционной истории видов P. sinensis и P. pungitius, видимо, не было столь сильной изоляции, чтобы эти виды смогли достаточно далеко дивергиро-вать. Данное предположение вовсе не говорит о том, что виды эти моложе, чем P. tymensis, который дивергировал, скорее всего, намного позже, но быстрее, в условиях более сильной и более продолжительной изоляции.

95

69 Г

П

53

100

100

98

------P. pungitius1

P. pungitius2 — P. pungitius3 Pungitius pungitius P. sinensis3 97 | P. sinensis1 76 P. sinensis2

----P. tymensis3

P. tymensis1

56

100 1 P. tymensis2 - Pungitius kaibarae

- Gasterosteus wheatlandi

Apeltes quadracus Culaea inconstans

0,02

Рис. 6. ME-фенограмма Fig. 6. ME-phenogram

Заключение

Таким образом, методы молекулярно-генетического анализа (так же как и морфо-экологический подход) не позволяют однозначно решить вопрос о таксономическом статусе видов рода Pungitius. Они не учитывают неравномерность хода эволюции и не отображают реальный эволюционный сценарий формирования этой интересной группы рыб, которая вследствие своей экологической и морфологической пластичности может служить “эталонной группой” для познания происхождения и расселения ихтиофауны Северного полушария.

Список литературы

Берг Л.С. Рыбы пресных вод СССР и сопредельных стран. Ч. 3 : монография. — Л. : АН СССР, 1949. — С. 929-1381.

Долганов В.Н., Кравченко А.Ю. О направленности морфологической изменчивости колюшек рода Pungitius (Gasterosteidae) // Изв. ТИНРО. - 2009. - Т. 159. - С. 204-207.

Зюганов В.В. Семейство колюшковых (Gasterosteidae) мировой фауны. Фауна СССР : Т. 5, Рыбы : Вып. 1 : монография. — Л. : Наука, 1991. — 257 с.

Линдберг Г.У., Легеза М.И. Рыбы Японского моря и сопредельных частей Охотского и Желтого морей. Ч. 2 : монография. — М.; Л. : Наука, 1965. — 391 с.

Никольский Г.В. Рыбы бассейна Амура : монография. — М. : АН СССР, 1956. — 551 с.

Сафронов С.Н., Никитин В.Д., Никифоров С.Н. и др. Видовой состав и распределение рыб в лагунах северо-восточного Сахалина // Вопр. ихтиол. — 2005. — Т. 45, вып. 2. — С. 168-179.

Черешнев И.А., Шестаков А.А., Скопец М.Б. Пресноводные рыбы анадырского бассейна : монография. - Владивосток : Дальнаука, 2001. - 335 с.

Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies : An approach using the bootstrap // Evolution. — 1985. - Vol. 39. — P. 783-791.

Hosoya K., Nakabo T. Family Gasterosteidae // Fishes of Japan with pectoral keys to the species, English edition. — 2001. — P. 512-514.

Ishigaki K. Distribution and morphological variation of eight-spined ticklebacks (genus Pungitius) in Kushiro and Nemuro districts, Hokkaido // Zool. Mag. — 1967. — Vol. 76, № 8. — Р. 249-254.

Keivany Y., Nelson J.S. Phylogenetic relationships of sticklebacks (Gasterosteidae), with emphasis on ninespine sticklebacks (Pungitius spp.) // Behaviour. — 2004. — Vol. 141, № 11. — P. 1485-1497.

Kimura M. А simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. of Molecular Evolution. — 1980. — Vol. 16. — P. 111-120.

Kobayashi H. Cross experiments with three species of sticklebacks, Pungitius pungitius, P. tymensis and P. sinensis, with references to the systematic relationship // Hokk. Gakugei Univ. — 1957. — Vol. 10, № 2. — P. 363-384.

Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA 3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment // Brief. in Bioinformatics. — 2004. — Vol. 5, № 2. — P. 150-163.

Muramoto J., Igarashi K., Itoh M., Makino S. А study of the chromosomes and enzymatic patterns of sticklebacks of Japan // Proc. Jap. Acad. — 1969. — Vol. 45, № 8. — P. 803-807.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. — N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. — 1626 p.

Sevilla R.G., Diez A., Noren M. et al. The fishtrace consortium and Bautista J.M. // Primers and polymerase chain reaction conditions for DNA barcoding teleost fish based on the mitochondrial cytochrome b and nuclear rhodopsin genes Molecular Ecology Notes. — 2007. — № 7. — P. 730-734.

Takahashi H., Takata K., Goto A. Phylogeny of lateral plate dimorphism in the freshwater type of ninespine sticklebacks, genus Pungitius // Ichthyol. research. — 2001. — Vol. 48. — P. 143-154.

Tanaka S. Variation in ninespine stickleback Pungitius pungitius and P. sinensis, in Honshu, Japan // Jap. J. Ichthyol. — 1982. — Vol. 29. — P. 203-212.

Ward R.D., Zemlak T.S., Innes B.H. et al. DNA barcoding Australia’s fish species // Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. — 2005. — № 360. — P. 1847-1857.

Поступила в редакцию 20.09.11 г.