Метод оценки инвазивной активности опухолевых клеток в отборе потенциальных ингибиторов метастазирования

1 1

66 ДИАГНОСТИКА

к УДК 616-006-033.2:576.385.5 S. M. Kiselev1, A. V. Akleev2, A. M. Kozlov1 THE METHOD OF ESTIMATION OF TUMOR CELLS’ INVASIVE ACTIVITY FOR CHOICE THE POTENTIAL INHIBITORS OF METASTASIS 1N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2Ural Research Practice Center of Radiation Medicine, Chelyabinsk ABSTRACT Contemporary understandings of cellular and molecular mechanisms of tumor invasion and metastatic dissemination validate a possibility for rational search of metastasis dissemination inhibitors with pathogenetic function. The effectiveness of such work depends substantially on the adequate choice of model systems in vitro corresponding to the integral process of metastatic dissemination in vivo. However, most of the methodologies in use are far from being perfect. We have improved the test system for assessment of tumor cell invasive activity based on the cell ability to penetrate through artificial basal membrane of connective tissue proteins. In particular, we developed conditions for modeling connective tissue barrier, determined the choice of optimal chemo-attractant and performed optimization of parameters for quantitative interpretation of data obtained. Based on modified methodology we have studied the anti-invasive activity of agent Ilomastat. Our findings indicate that Ilomastat posses anti-invasive activity correlating with its activity in inhibiting metal-proteinase function. Therefore, the test system based on assessment of tumor cell invasive activity can be used for searching potential inhibitors of metastasis dissemination with pathogenetic function. Key words: metastatic dissemination, invasion test, matrigel. С. М. Киселев,1 А. В. Аклеев,2 А. М. Козлов1 МЕТОД ОЦЕНКИ ИНВАЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В ОТБОРЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ 1ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2ФГУ Уральский научно-практический центр радиационной медицины, Челябинск РЕЗЮМЕ Современные представления о клеточных и молекулярных механизмах инвазии и метастазирования злокачественных опухолей обосновывают возможность рационального поиска ингибиторов метастазирования с патогенетической направленностью действия. Эффективность этой работы в большой степени зависит от степени адекватности модельных систем in vitro интегральному процессу метастатической диссеминации in vivo. Однако большинство используемых в настоящее время методических подходов к решению этой задачи далеки от совершенства. Нами усовершенствована тест-система для оценки инвазивной активности опухолевых клеток, основанная на их способности проникать через искусственную базальную мембрану из белков соединительной ткани. В частности, разработаны условия моделирования соединительнотканного барьера, осуществлен выбор оптимального хемоаттрактанта, оптимизированы параметры количественной интерпретации результатов теста. С использованием модифицированной методики изучена антиинвазивная активность препарата иломастат. Получены данные, свидетельствующие о наличии антиинвазивной активности иломастата, коррелирующие с его способностью подавлять активность металлопротеиназ. Таким образом, тест-система, основанная на оценке инвазивной активности опухолевых клеток, может быть использована для поиска потенциальных ингибиторов метастазирования с патогенетической направленностью действия. Ключевые слова: метастазирование, инвазивный тест, матригель. ч

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

ДИАГНОСТИКА 67

>- ВВЕДЕНИЕ активность — кадгерин-катенинового комлекса, опреВ последнее время получены важные научные дан- деляющего адгезионные взаимодействия между опу-ные, конкретизирующие представления о клеточных холевыми клетками эпидермального происхождения; и молекулярных механизмах метастатической диссе- миграционный тест в камере Боудена, позволяющий минации злокачественных новообразований. На их ос- оценить действие соединений на миграцию опухоле-нове разрабатываются способы селективного влияния вых клеток к хемоаттрактанту; адгезивный тест, осно-препаратов на биологические процессы, лежащие в ос- ванный на изучении способности тестируемых соеди-нове феномена метастазирования. Средства, обладаю- нений влиять на процесс прикрепления опухолевых щие способностью избирательно регулировать эти клеток к подложке из полимеризованных белков сопроцессы, рассматриваются как потенциальные инги- единительной ткани [7; 9; 13]. биторы метастазирования. На последующих этапах Особый интерес представляет моделирование сис-они изучаются на моделях метастазирующих опухолей тем, позволяющих проводить интегральную оценку in vivo, но уже на рациональной основе, с учетом дан- тестируемых соединений на совокупность биологиче-ных о молекулярных аспектах механизма их действия. ских процессов, задействованных в метастатическом Сведения, получаемые с использованием тест-систем каскаде. С этих позиций более адекватной моделью яв-in vitro, необходимы для построения рациональных ляется инвазивный тест, заключающийся в оценке вли-схем применения терапевтических средств с патогене- яния тестируемых соединений на способность опухо-тической направленностью действия при монотерапии, левых клеток проникать через барьер из белков соеди-а также в режимах сочетанного применения с традици- нительной ткани. онными методами терапии злокачественных новообра- Правомочность применения инвазивного теста зований. для поиска и отбора ингибиторов метастазирования Учитывая комплексный характер процесса мета- с патогенетической направленностью действия обус-стазирования злокачественных новообразований, ловлена рядом причин. Во-первых, способность опу-при отборе антиметастатических средств наиболее ос- холевых клеток к инвазивному росту является одним тро встает вопрос о выборе адекватной модельной си- из ключевых свойств клеток злокачественной опухо-стемы in vitro, наиболее полно отражающей биологи- ли, обусловливающих распространение опухолевых ческие процессы, опосредующие основные этапы ме- клеток в прилежащие нормальные ткани, сопровож-тастатического каскада in vivo. дающееся разрушением и замещением их опухолью. Несмотря на индивидуальные особенности мета- Во-вторых, процесс инвазии является комплексным стазирования разных типов опухолей, можно выде- событием, включающим адгезию клеток к субстрату, лить следующие характерные этапы развития метаста- локальный протеолиз соединительнотканного мат-тического процесса: появление в популяции опухоле- рикса и миграцию клеток по градиенту концентра-вых клеток первичного очага клеток с выраженным ции хемоаттрактанта. Это позволяет, как отмечалось метастатическим фенотипом, характеризующихся, выше, провести интегральную оценку активности в частности, высокой инвазивной активностью, про- соединений в отношении совокупности биологичес-никновение опухолевых клеток в кровь и лимфу, за- ких процессов, участвующих в процессе метастази-держка опухолевых клеток в капиллярной сети орга- рования [1]. на-мишени, проникновение в ткань органа и возник- Цель настоящей работы — модифицикация тест-новение вторичных опухолевых образований. системы для оценки инвазивной активности опухолеСпецифические адгезивные взаимодействия меж- вых клеток и отбора на ее основе потенциальных инду опухолевыми клетками и клетками стромы в пер- гибиторов метастазирования с патогенетической на-вичном очаге опухолевого роста являются важными правленностью действия. звеньями процесса метастазирования. При метастатической диссеминации характер адгезивных свойств МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ опухолевых клеток обусловливает особенности их вза- Клеточные линии и условия их культивирования имодействия с микроокружением здоровой ткани-ми- В работе использованы клеточные линии фибро-шени и определяет вероятность формирования мета- саркомы человека HT1080 и фибробластов мыши 3T3. статического узла. Клетки фибросаркомы человека HT1080 и фибро-В связи с этим изучение влияния тестируемых со- бластов мыши 3T3 культивировали в среде DMEM, соединений на особенности адгезивных взаимодействий держащей 10% ТЭС (Eurobio), L-глутамин (1мМ), пе-между опухолевыми клетками, с одной стороны, нициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100мкг/мл), пии опухолевыми клетками и компонентами соедини- руват и комплекс аминокислот и витаминов (Eurobio). тельной ткани, с другой, является одним из наиболее Подготовка опухолевых клеток для проведения частых предметов исследования в системе in vitro для инвазивного теста оценки потенциальной антиметастатической активно- Клетки культивировали до достижения 50-60 % мости препаратов. В качестве примера применяемых нослоя и трипсинизировали (0,05%-ным раствором в настоящее время таких тест-методов можно привес- трипсин-версена). Жизнеспособность клеток оценивали ти следующие: аггрегационный тест, основанный на с помощью красителя Трипанового синего (0,1%-ный изучении действия соединений на функциональную раствор трипанового синего в ФСБ). Для проведения —(

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

68 ДИАГНОСТИКА

к инвазивного теста уровень жизнеспособности культу- Оценка инвазивной активности опухолевых клеток ры должен составлять не менее 95 %. Клетки считали Инвазивную активность опухолевых клеток оце-в камере Горяева и высевали на предварительно подго- нивали по формуле: товленную мембрану с матригелем. Кинвазии = И/М*100%, Приготовление кондиционированной среды где Кинвазии — коэффициент инвазии; фибробластов мыши 3T3 И — количество опухолевых клеток, прошедших Клетки растили до достижения неплотного моно- через мембрану, покрытую матригелем; слоя в культуральных флаконах (162 см2), удаляли ро- М — количество опухолевых клеток, прошедших стовую среду, промывали дважды фосфатно-солевым через мембрану, не покрытую матригелем [15]. буфером и предынкубировали в течение 4 ч в 30 мл Оценка антиинвазивного эффекта тестируемых бессывороточной среды. После этого меняли новую соединений порцию бессывороточной среды (30 мл) иинкубирова- Эффективность тестируемого соединения оценили в течение 72 ч. Среду центрифугировали при 1500 g вали по степени ингибирования инвазии опухолевых в течение 10 мин, супернатант отбирали и заморажи- клеток по сравнению с контролем, которым являются О вали до -20 С. клетки, культивированные без добавления препарата. Инвазивный тест Количественную оценку ингибирования инвазии тес-Постановку теста осуществляли в 24-луночных тируемыми соединениями проводили по формуле: планшетах со вставочными ячейками, разделяющими КИ* = ((A-B)/A)*100 %, лунку на 2 части полупроницаемой полимерной мем- где А — количество опухолевых клеток, прошед-браной с диаметром пор 8 мкм. Для покрытия мембран ших через мембрану, покрытую матригелем, без до-использовали матригель (Matrigel GFR, Becton бавления тестируемого соединения; Dickinson) [11]. Вставочные ячейки помещали в 24-лу- В — количество опухолевых клеток, прошедших че-ночный планшет, заполненный культуральной средой рез барьер с добавлением тестируемого соединения [12]. без сыворотки и вакуумировали в течение 10 мин для Статистическую обработку результатов проводили удаления воздуха из пор мембаны. Матригель с использованием программы Origin 6.0. (10мг/мл) разбавляли на холоду ТРИС- буфером и наносили на полупроницаемую мембрану. Ячейки с на- РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ несенным слоем матригеля инкубировали в термоста- В литературе встречаются различные варианты О те при 37 С в течение 2 ч при 40-60 % влажности (для проведения инвазивного теста, в большинстве своем аггрегации соединительнотканных белков на мембра- различающиеся составом полимерной матрицы, фор- не) с последующим высушиванием мембран в течение мирующей искусственный барьер. В качестве основО сут при 30 С и 50 % влажности. Перед непосредстве- ного компонента для его формирования используют ным проведением инвазивного теста проводили реги- различные белки, входящие в состав экстрацеллюляр-дратацию полимеризованного на мембране матригеля. ного матрикса: коллаген I, IV-типа, фибронектин, ла-Для этого вставочные ячейки с нанесенным матриге- минин и др. [3; 5; 12]. Выбор белкового компонента, лем помещали в 24-луночный планшет, заполняли бес- используемого для покрытия мембран, обусловлен ха-сывороточной культуральной средой (DMEM, 0,1 % рактером исследуемых соединений. В некоторых рабо- О БСА) и инкубировали в С02 — термостате при 37 С тах для создания условий, наиболее приближенных в течение 2 ч. Непосредственно перед проведением те- к системе in vivo, при моделировании соединительно-ста нижнюю камеру заполняли хемоаттрактантом. тканного барьера используют экстракты из различных Клетки высевали на мембрану с матригелем и инку- тканей: амниона, хориоаллантоисной мембраны, стен- О бировали в С02- инкубаторе (5 % С02 37 С) в течение ки мочевого пузыря и др. [10; 14]. времени, подобранного экспериментально. Опыт про- В настоящей работе для покрытия полимерных водили в 3 параллелях. мембран был использован коммерческий препарат — Количественная интерпретация результатов матригель, представляющий собой стандартизован-инвазивного теста ную смесь из белков внеклеточного матрикса: ламини-По окончании инкубационного периода клетки, не на, коллагена IV типа, гепарансульфатпротеогликанов, прошедшие через барьер, снимали с внешней поверх- энтактина и нидогена, получаемую из экстракта мы-ности мембраны ватной палочкой, смоченной культу- шиной саркомы EHS, обогащенную белками соедини-ральной средой. Операцию проводили дважды для эф- тельной ткани. Особый интерес представляет тот факт, фективного удаления клеток. что при полимеризации матригеля в соответствующих Вставочные ячейки поочередно помещали в лун- условиях формируется структура, сходная по составу ки с раствором Лейшмана на 5 мин для фиксации и свойствам с базальной мембраной [2]. Выполняю-клеток с дистиллированной водой для отмывки фик- щая опорную, разграничительную и барьерную функ-сирующего раствора и растовором азур-эозина (по ции, она представляет собой тонкофибриллярную Романовскому) для окрашивания клеток. Окраску пористую полупроницаемую мембрану толщиной проводили в течение 30 мин. Клетки считали в 5 ран- 30-35 нм, в состав которой входят коллаген IV и V ти-домизированных полях площадью 1мм2 в каждой из пов, гликопротеины, а также фибронектин, ламинин 3 параллельных лунок. и сульфосодержащие протеогликаны. Одним из клю- ч

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

ДИАГНОСТИКА 69

>- чевых моментов механизма метастазирования являет- грегацию матригеля существенно влияет кислотность ся преодоление опухолевыми клетками барьера — ба- среды. Данный процесс проходит преимущественно зальной мембраны. Таким образом, применение мат- в щелочной области pH. В связи с этим для приготов-ригеля в качестве субстрата для формирования соеди- ления раствора матригеля нами была выбрана буфер-нительнотканного барьера в тесте на оценку ная система на основе Трис соли (pH=8,0). Дляпредот-инвазивной активности опухолевых клеток является вращения спонтанной аггрегации белков в процессе наиболее оправданным. полимеризации в раствор нанесения был добавлен Продажный матригель встречается в 2 вариантах, хлорид натрия. Для равномерной кристаллизации со-различающихся содержанием ростовых факторов лей в процессе высушивания мембраны была добавле-(bFGF, EGF, IGF-1, PDGF, NGF, TGF-b). Для покрытия на сахароза. Для контроля равномерности распределе-мембран мы использовали матригель с пониженным ния аггрегированного матригеля на поверхности мем-содержанием ростовых факторов (Matrigel GFR, браны ее окрашивали раствором красителя Кумасси Becton Dickinson). Подобный выбор обусловлен тем, (0,25г кумасси R-250, 10 мл метанола, 30 мл уксусной что содержание ростовых факторов в матригеле может кислоты). Использование вышеуказанного буфера для значительно влиять на хемотаксические свойства опу- разведения матригеля позволяет добиться равномер-холевых клеток (уменьшать их) и приводить к низкой ного распределения матригеля в виде однородной эффективности инвазии опухолевых клеток в направ- пленки по всей поверхности мембраны. лении хемоаттрактанта. К тому же некоторые росто- Определение оптимального количества матригеля вые факторы могут существенным образом влиять на для формирования соединительнотканного барьера пролиферативную (bFGF, EGF, IGF-1) и миграцион- Основными критериями, которыми мы руководную (PDGF, TGF-b) активность опухолевых клеток ствовались при выборе количества матригеля, наносив процессе эксперимента и тем самым вносить допол- мого на мембрану, являлись эффективность формирова-нительные трудности в трактовку результатов теста. ния соединительнотканного барьера, исключающего Оптимизация методики покрытия полупрони- прямую миграцию опухолевых клеток в направлении цаемой мембраны матригелем хемоаттрактанта, а также длительность постановки ин-Ключевым моментом тест-системы является стан- вазивного теста. дартно-воспроизводимое моделирование искусствен- Выбор оптимальной концентрации матригеля оп-ного барьера из белков экстрацеллюлярного матрикса, ределяли экспериментально, изучая инвазию клеток которое заключается в равномерном распределении фибросаркомы человека HT1080. Опухолевые клетки полимеризованных соединительнотканных белков на данной линии отличаются высокой степенью биологи-поверхности мембраны и в ее порах. ческой агрессивности и широко используются для те-Перед непосредственным нанесением матригеля стирования соединений на антиинвазивную актив-проводили предварительную подготовку мембраны. ность [16]. В качестве отрицательного контроля для Для этого вставочные ячейки в 24-луночном планше- оценки эффективности формирования соединитель-те, заполненном дистилированной водой, помещали нотканного барьера использовали иммортализованные в эксикатор и вакуумировали в течение 10 мин. Эта фибробласты мыши 3T3. операция позволяет удалить воздух из внутренних пор Матригель (исходный раствор 10мг/мл) разбавля-мембраны, обеспечивая эффективную смачиваемость ли на холоде модифицированным буфером для посад-внутренней поверхности пор и более эффективное за- ки до концентрации 1 мг/мл. Снижать рабочую кон-полнение их раствором матригеля. центрацию матригеля не рекомендуется, поскольку Обычно в качестве буферной системы для приго- это может ухудшить способность матригеля к аггрега-товления рабочей концентрации матригеля использу- ции и полимеризации. Абсолютное количество матри-ют среду для культивирования опухолевых клеток. Од- геля варьировали путем изменения объема нанесения нако, как показали наши исследования, распределение в диапазоне — 20 до 150мкл. матригеля на мембране в данном случае носит очаго- При низких объемах нанесения — 20 и 30 мкл вый характер с формированием областей, не покрытых происходит преимущественное концентрирование белком. Подобное наблюдение можно объяснить не- белка на периферии мембраны, что приводит к нерав-равномерной кристаллизацией солей, содержащихся номерному распределению матригеля на поверхности в культуральной среде при высушивании мембраны. мембраны и формированию частично покрытых бел-Для приготовления раствора матригеля мы ис- ком центральных зон, что не исключает возможности пользовали буферную систему на основе три-(гидро- проникновения клеток через поры по механизму пря-ксиметил)-аминометана (ТРИС), содержащую в качес- мой миграции к хемоаттрактанту (рис. 1). Доказатель-тве дополнительных компонентов сахарозу и хлорид ством этому служат отсутствие существенных разли-натрия. Выбор компонентов буфера разведения обус- чий между инвазивной активностью исследуемых кле-ловлен следующими причинами. Для равномерной по- точных линий. лимеризации матригеля на мембране необходимо При объеме нанесения 50 мкл матригель покрыва-обеспечить оптимальную скорость аггрегации белка ет мембрану равномерным слоем. При этом выявляют-для предотвращения образования белковых конгломе- ся существенные различия в способности клеток ис-ратов на поверхности мембраны. Известно, что на аг- следуемых линий проникать через соединительно- —(

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

IВ клетки фибросаркомы человека НТ1080 ] О клетки фибробластов мыши ЗТЗ

(инсулин-селенит-трансферрин, 100мкг ИСТ на 1 мл среды), культуральная среда ЯРМ1-1640 с добавлением 10 % ТЭС, 20 % ТЭС, кондиционированная среда фибробластов мыши (3Т3). Показано, что применение среды ОМБМ, 20 % ТЭС и кондиционированной среды фибробластов 3Т3 позволяет на 25-30 % снизить время проведения инвазивного теста (рис. 3).

40 60 80

объем нанесения, мкл

Рис. 1. Влияние количества наносимого на мембрану матригеля на эффективность формирования соединительнотканного барьера

тканный барьер, характеризующие различия в их инвазивной активности (см. рис. 1).

При объемах нанесения матригеля в диапазоне от 50 до 150 мкл выявленная тенденция сохраняется, однако при этом существенно возрастает время проведения эксперимента (рис. 2).

10% тэс

20%ТЭС

ксЗТЗ

ИТС

50 60 70 80 90 100

количество матригеля наносимого на мембрану, мкг

Рис. 2. Временная зависимость проведения теста от количества наносимого на мембрану матригеля

Изучение временного интервала, за который Кинв для клеток фибросаркомы человека НТ1080 достигает значимого уровня — 30%, показало, что оптимальный объем нанесения матригеля составляет 50 мкл (154 мкг белка/ см2).

Выбор хемоаттрактанта

Для оптимизации условий проведения инвазивного теста исследовали влияние различных хемоаттрак-тантов на временнЫе характеристики процесса инвазии опухолевых клеток линии НТ1080. В качестве хе-моаттрактантов были использованы культуральная среда ОМБМ с добавлением смеси белковых факторов

Рис. 3. Влияние хемоаттрактанта на временные характеристики проведения теста

Однако наиболее предпочтительным, по нашему мнению, является использование в качестве хемоаттрактанта для проведения инвазивного теста культуральной среды с 20 % сывороткой вследствие стандартизации ее компонентов.

Оценка антиинвазивной активности препарата Иломастат

На основе разработанных условий проведения инвазивного теста была изучена антиинвазивная активность препарата иломастат. Иломастат (галардин) является ингибитором коллагеназ. Было показано, что данный препарат проявляет выраженную активность в отношении ингибирования активности с ряда матричных металлопротеиназ (ММП-1, ММП-2, ММП-3, ММП-8, ММП-9) — протеолитических ферментов, играющих важную роль в процессе опухолевой инвазии [8]. Выявленная исследователями активность иломас-тата обосновывает целесообразность его изучения на предмет выявления антиинвазивной активности в эксперименте.

Тестировали антиинвазивную активность иломас-тата на опухолевых клетках фибросаркомы НТ1080. Одной из особенностей данной клеточной линии, определяющей ее высокий инвазивный потенциал, является высокий уровень экспрессии матричных металлопротеиназ ММР-2 и ММР-9 [4; 6]

Диапазон рабочих концентраций для тестирования антиинвазивной активности выбирали на основе литературных данных по дозозависимому ингибированию активности металлопротеиназ [8].

Важную роль при оценке антиинвазивной активности играют временные параметры инкубации кле-

ток с тестируемым соединением. Принципиально возможны 2 схемы. 1-я предполагает предварительную инкубацию клеток с тестируемым соединением. При 2-й изучаемые вещества добавляют непосредственно в культуральную среду клеток в момент постановки инвазивного теста.

Одним из недостатков 2-й схемы является невозможность поддержания постоянной концентрации препарата в процессе проведения теста вследствие их диффузии через мембрану с матригелем. Учитывая, что антиинвазивная активность тестируемого соединения может быть обусловлена различными механизмами, требующими для реализации ожидаемого эффекта определенного времени инкубации, нами была выбрана 1-я схема, предполагающая 24-ч предынкуба-

концентрация вещества,мкМ

Рис. 4. Ингибирование инвазивной активности клеток фибросаркомы человека иломастатом. Инвазивный тест, 72 ч

Рис. 5. Микрофотографии опухолевых клеток фибросаркомы человека на внутренней поверхности полупроницаемой мембраны после проведения инвазивного теста: А-контроль; В-клетки, инкубированные с иломастатом

Результаты инвазивного теста показали, что иломастат в диапазоне концентраций от 5 до 25 мкМ дозозависимо ингибирует инвазивную активность клеток фибросаркомы (рис. 4 и 5). Наибольший антиинвазив-ный эффект иломастата составил 57 % при концентрации 25мкМ. Полученные результаты коррелируют с литературными данными, свидетельствующими о способности иломастата к дозозависимому ингибированию активности металлопротеиназ.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована тест-система для оценки инвазивной активности опухолевых клеток, основанная на их способности проникать через исскуствен-ную базальную мембрану из белков соединительной ткани.

2. С применением модифицированной тест-системы изучена антиинвазивная активность препарата иломастат. Выявлена прямая корреляция между способностью иломастата подавлять процесс инвазии опухолевых клеток и ингибирующей активностью данного соединения в отношении металлопротеи-

наз — протеолитических ферментов, играющих важную роль в процессе опухолевой инвазии.

3. Тест-система может быть использована для рационального поиска новых потенциальных ингибиторов метастазирования с патогенетической направленностью действия. Кроме того, данные, полученные с применением инвазивного теста, могут быть полезны для корректировки терапевтических схем применения препаратов в качестве ингибиторов метастазирования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Albini A., Iwamoto Y., Kleinman H. K. et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells // Cancer Res. — 1987. — Vol. 47. — P.3239-3245.

2. Albini A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms // Pathol Oncol Res. — 1998. — Vol. 4. — P. 230-241.

3. Armstrong P. B., Armstrong M. T. Intercellular invasion and the organizational stability of tissues: a role

for fibronectin // Biochim Biophys Acta. — 2000. — Vol. 27. — P. 9-20.

4. Atkinson S. J., English J. L., Holway N., Murphy G Cellular cholesterol regulates MT1 MMP dependent activation of MMP 2 via MEK-1 in HT1080 fibrosarcoma cells // FEBS Lett. — 2004. — Vol. 21. — P. 65-70.

5. Berndt A., Hyckel P., Konneker A. et al. Oral squamous cell carcinoma invasion is associated with a laminin-5 matrix reorganization but independent of basement membrane and hemidesmosome formation. clues from an in vitro invasion model // Invasion Metastasis. — 1997. — Vol. 17. — P. 251-258.

6. Cha H.J., Bae S.K., Lee H. Y. et al. Anti-invasive activity of ursolic acid correlates with the reduced expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in HT1080 human fibrosarcoma cells // Cancer Res. — 1996. — Vol. 15. — P. 2281-2284.

7. Erdel M., Speiss E., Trifz G. et al. Cell interactions and motility in human lung tumor cell lines HS-24 and SB-3 under the influence of extracellular matrix components and protease inhibitors // Anticancer Res. — 1992. — Vol. 12. — P. 349-360.

8. Galardy R. E., Cassabonne M. E., Giese C. et al. Low molecular weight inhibitors in corneal ulceration // Ann. NY. Acad. Sci. — 1994. — Vol. 732. — P. 315-323.

9. Grotendorst G. Spectrophotometric assay for the quantitation of cell migration in the Boyden chamber chemotaxis assay // Methods Enthymol. — 1987. — Vol. 147. — P. 144-152.

10. Hendrix M. J. C., Seftor E. A., Seftor R. E. B. et al. Comparison of tumor cell invasion assay: human amnion verus reconstituted basement membrane barrier // Invasion Metastasis. — 1989. — Vol. 9. — P. 278-297.

11. Kleinman H. K., McGarvey M. L., Hassell J. R. et al. Basement membranes complexes with biological activity // Biochemistry. — 1986. — Vol. 25. — P. 312-318.

12. Nabeshima K., Kataoka H., Koita H. et al. A new long-term in vitro invasion assay using fibrous connective tissue matrices maintaining architectural characteristics of connective tissue // Invasion Metastasis. — 1988. — Vol.

8. — P. 301-316.

13. Noe V., Willems J., Vandekerckhove J. et al. Inhibition of adhesion and induction of epithelial cell invasion by HAV-containing E-cadherin containing peptides // J. Cell. Sci. — 1999. — Vol. 112. — P. 127-135.

14. Poste G., Fidler I. J. The pathogenesis of cancer metastasis // Nature. — 1980. — Vol. 283. — P. 139-146.

15. Sieuwerts A. M., Klijn J. G., Foekens J. A. Assessment of the invasive potential of human gynecological tumor cell lines with the in vitro Boyden chamber assay: influences of the ability of cells to migrate through the filter membrane // Clin Exp Metastasis. — 1997. -Vol. 15. — P. 53-62.

16. Yan C., Han R. Effects of genistein on invasion and matrix metalloproteinase activities of HT1080 human fibrosarcoma cells // Chin Med Sci J. — 1999. — Vol. 14. — P. 129-133.

Поступила 20.02.2006.

4