Характеристика промоторов протеиназ Bacillus pumilus

А. А. Тойменцева, А. М. Черёмин, Е. О. Михайлова,

М. Р. Шарипова

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОМОТОРОВ ПРОТЕИНАЗ BACILLUS PUMILUS

Ключевые слова: промотор, протеиназы, экспрессия, репортерный ген, факторы транскрипции, Bacilluspumilus.

С применением репортерных фьюжн конструкций исследованы 5’-фланкирующие регуляторные области (промоторы) генов внеклеточных протеиназ B. pumilus 3-19. Разработанные фьюжн конструкции исследовали в штаммах с мутациями по регуляторным белкам. Показано, что транскрипционные факторы DegU и SpoOA оказывают позитивное влияние на экспрессию генов протеолитических ферментов B. pumilus, однако их вклад в регуляцию различен.

Keywords: promoter, proteases, gene expression, reporter gene, transcription factors, Bacillus pumilus.

In this study, we characterized 5’-regulatory regions of protease genes from B. pumilus 3-19. To define the minimal size of protease gene promoters, we generated and analyzed expression of gfp fusion-reporter constructs harboring full-length and truncated promoters of different lengths. To find regulators which orchestrate the expression of serine proteases, activity of reporter constructs were further explored in recombinant B. subtilis mutants defective in regulatory genes. Our results indicate positive regulation of expression for all protease genes by DegU and SpoOA proteins but this regulation is different.

Введение

Продукция внеклеточных протеолитических ферментов в клетках бацилл является уникальной характеристикой этих бактерий. В классическом понимании функция протеиназ заключается в поставке питательных веществ в клетки для их роста и пролифрации [1]. Последние данные показывают, что инактивация протеолитических генов бацилл влияет на морфологию клеток, их биохимические и физиологические параметры, приводит к изменению уровня секреции других гидролаз [2, 3]. Более того, появляются данные, что получаемый в результате функционирования протеиназ набор пептидов не является простой суммой продуктов деградации белков, а вероятно отвечает за гомеостаз клеточной популяции. В результате чего возможно проявление эффекта «многоклеточности», когда в культуре часть клеток остается свободно живущими, часть образуют биопленки, другие приобретают способность принимать ДНК или переходить к спорообразованию [4]. Есть предположение (по аналогии с представителями энтеробактерий [5]), что протеиназы могут отвечать за вирулентность бактерий.

На уровне транскрипции позитивная регуляция протеолитических ферментов в клетках грамположительных бактерий происходит вследствие активации белков DegU и 8ро0Л [6, 7]. Выдвинута гипотеза, что активность белка DegU зависит от наличия в среде определенного стимула (осмотической концентрации среды, азотного, углеродного состава) [8, 9]. Активация

транскрипционного фактора 8ро0Л происходит в условиях нехватки питательных веществ, но основная функция этого белка сводится к запуску процессов спорообразования [10]. Оба белка в фосфорилированной форме запускают

транскрипцию протеолитических генов. Однако регулятор 8ро0Л способен не только напрямую связываться с промотороми, но и через белок-

белковое взаимодействие ингибировать активность репрессоров - SinR, ScoC, AbrB [11].

Описанная выше модель регуляции протеолитических генов установлена для клеток Bacillus subtilis и долгое время считалась надродовой характеристикой в регуляции гидролитических ферментов [12, 13]. Тем не менее, показано, даже внутри рода Bacillus транскрипция генов протеиназ происходит по-разному [14].

В работе исследованы регуляторные области генов протеиназ (промоторы) B. pumilus (субтилизиноподобной протеиназы,

глутамилэндопептидазы, металлопротеиназы) с целью выявления их минимальной необходимой протяженности и определения их активации с помощью транскрипционных факторов DegU и SpoOA.

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы B. pumilus 3-19, B. subtilis 168, Escherichia coli DH5a получены из собственной коллекции лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии Ферментов К(П)ФУ. Мутантные по генам degU и spoOA штаммы B. subtilis любезно предоставлены проф. Т. Машером (Mascher T., Германия).

Бактерии выращивали при температуре +37°C, с аэрацией, на питательной среде Luria-Bertani (LB) следующего состава (г/л): триптон - 10, дрожжевого экстракта - 5 и NaCl - 10 (pH 7.0). Антибиотики добавляли в среду в конечных концентрациях (мкг/мл): амипициллин (100 мкг/мл для клеток E. coli), хлорамфеникол (5 мкг/мл), канамицин (10 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл).

Плазмиды, рекомбинантные штаммы и олигонуклеотиды, использованные в работе, перечислены в таблице 1 и 2.

Для исследования промоторов генов протеиназ B. pumilus сконструированы репортерные фьюжн-конструкции с репортерным геном gfpmut3. Для этого регуляторные области расположенные upstream от структурной области генов

субтилизиноподобной протеиназы,

глутамилэндопептидазы и металлопротеиназы (PaprBp, PgseBp и PmprBp соответственно) были амплифицированы («Терцик», ДНК-технология, РФ) и клонированы в плазмиду pGFPamyE как описано в статье [15]. Полученные рекомбинантные плазмиды методом щелочного лизиса выделяли из клеток E. coli [16] и трансформировали в клетки B. subtilis [17]. Геномную ДНК мутантных штаммов (B. subtilis degU::kann, B. subtilis spo0A::tet) выделяли с помощью коммерческих растворов (QIAamp DNA Mini Kit, Германия) и трансформировали в рекомбинантные штаммы TMB1386 (PaprBp 445) и

TMB1337 (PgseBp_150) (PmprBp_256) (табл. 1).

Таблица 1 - Штаммы и плазмиды,

использованные в работе

промоторов в статье [18].

рассчитывали,

как

описано

Плазмида/Штамм Генотип/Свойства a

pGFPamyE amyE front... amyE back, gfpmut3, cat, ColEl, bla

pATFP111/TMB1386 W^ amyE::pATFP111

pATFP104/TMB1337 W^ amyE ::pATFP104

pATFP109/MR011 W^ amyE ::pATFP109

a Гены резистентности: bla, ампициллин; cat, хлорамфеникол; tet, тетрациклин; kann, канамицин.

Таблица 2 - Олигонуклеотиды, использованные в работе

Название

праймера

PaprBp_445_fw

PaprBp_310_fw

PaprBp_280_fw

PaprBp_rev

PgseBp_150_fw

PgseBp_122_fw

PgseBp_100_fw

PgseBp_rev

PmprBp_256_fw

PmprBp_200_fw

PmprBp_150_fw

PmprBp_rev

Последовательность

[LIC]-GAATGGAAGGTCCTTGAT

[LIC]-AAATAGATGCTAGACGTTT

[LIC]-TAAGGCTTTTCGGGTATC

[LIC]-TTTCACGCACAATCCACA

[LIC]-TCATAGAGAGAGATCAA

[LIC]-GTTGGAAAGATACAAAACACC

[LIC]-CACCTAATTTAAAAATG

[LIC]-CATCATATTCCTCCTTTATG

[LIC]-CTTATATTGAACAATTGA

[LIC]-GGGCTTTTTTTGTTTTTGTAAG

[LIC]-GTGTGCTGAAATATCCG

[LIC]-TTTCATTCCTATCCCTCCTTTG

LIC последовательности [14].

Контроль за ростом культуры и определение активности репортерного гена gfpmut3 проводили с использованием

многофункционального ридера для микропланшет (Synergy 2, BioTek, США). Для этого посевным материалом для инокуляции бациллярных штаммов служила 18-часовая ночная культура, которую разводили до значения оптической плотности - 0,05 (OD590) в 96-луночных планшетах (Sarstedt, Германия). Рост клеток проводили с постоянным средним качанием в общем объеме среды LB равном 150 мкл. Планшеты были накрыты крышками для предотвращения испарения среды. Рост клеток фиксировали при длине волны 600 нм, флюоресценцию клеток с использованием специальных фильтров - возбуждение при 485/20 нм, эмиссию при 528/20 нм. Измерения проводили каждые 10 мин на протяжении 30 часов. Активность

Определение минимального участка промотора для полноценной экспрессии генов протеиназ Bacillus pumilus

Нуклеотидная последовательность генов протеиназ (аргВр, gseBp и тргВр) В. ритИш 3-19 занесена в международную базу вепБаик (инвентарные номера ЛУ754946.2, У15136.1,

БШ78894.2, соответственно). Выравнивание межгенных 5'-фланкирующих регионов указанных генов В. ритИш 3-19 в системе МСБ1/БЬЛ8Т

показало, что все регионы обнаруживают высокую степень гомологии с нуклеотидными

последовательностями штамма В. ритИш ЗЛБЯ-032. В 5'-регуляторном регионе гена gseBp (1149...+1) была обнаружена протяжённая последовательность (905 п.о.) с высокой степенью гомологии к гену NADPH-редуктазы (угЫ, ЛМ СР000813.1, 91% гомологии). В 5'-регуляторных регионах генов аргВр и тргВр потенциальных

открытых рамок считывания не было обнаружено. На основании проведенного биоинформационного анализа мы предположили, что длина промотора гена аргВр может составлять до 445 п.о., гена gseBp - до 150 п.о., гена тргВр - до 256 п.о. Эти данные впоследствии подтвердили экспериментально. Для этого использовали репортерный ген зеленого флуоресцентного белка (^ртиИ), который клонировали (ЫС методом) под контроль потенциальных промоторов протеиназ (РаргВр, PgseBp и РтргВр) различной длины как описано в статье [15]. Использовали три варианта длины каждого промотора (включающие -445 п.о., -310 п.о., -280 п.о. для гена аргВр; -150 п.о., -122 п.о., -100 п.о. - для гена gseBp; 256 п.о., -200 п.о., -150 п.о., для гена тргВр). Рекомбинантные конструкции исследовали в клетках В. 'иЫШ'.

445 п.о.

150 п.о.

|310 п.о. І280 п.о

256 п.о.

122 п.о.

Ц00 п.о^И200/150 п.о.

РаргВр

PgseBp

PmprBp

Рис. 1 - Активность промоторов протеиназ B. pumilus 3-19 (аprBp, gseBp, mprBp) имеющих различную протяженность. Количество пар оснований (п.о.) в промоторах указано над столбцами

Все рекомбинантные штаммы имели одинаковую скорость роста на питательной среде ЬБ (отклонение в скорости роста не превышало 3%). На рисунке 1 показана активность промоторов протеиназ В. ритіїш' 3-19, выраженная через

активность репортерного белка вБР. Выявлено, что активность напрямую зависит от длины 5'-фланкирующего регуляторного региона во всех полученных конструкциях. При этом, максимальный уровень активности промотора РаргВр фиксировали когда его протяженность составляла 445 п.о. Сокращение регуляторного региона до 310 п.о. приводит к потери активности в 7 раз. Дальнейшее уменьшение промотора приводит к полной потери активности. Для конструкций с промотором PgseBp активность при длине промотора 1149 п.о. и 150 п.о. не отличалась и составляла 430 у.е. Однако уменьшение длины до 122 п.о. приводило к потери активности в 6 раз, а до 100 п.о. - к полной потере активности.

Минимальный детектируемый уровень активности промотора РтргВр наблюдали, если его длина составляла 256 п.о.

На основании полученных результатов можно заключить, что для полноценной экспрессии гена аргВр необходимая длина промотора составляет 445 п.о., для гена gseBp - 150 п.о., для гена тргВр - 256 п.о.

Влияния мутаций по генам беди и вроОА на функциональную активность промоторов протеиназ В. ритИиэ

Ранее показано, что межгенные 5’-регуляторные регионы (промоторы) генов протеиназ В. ритПш 3-19 содержат потенциальные сайты связывания с белками DegU (DegU~P) и 8ро0Л [1921]. Для того, чтобы достоверно оценить зависимость экспрессии протеолитических генов В. ритПш 3-19 от белков DegU и 8ро0Л, исследовали экспрессию репортерного гена gfpmut3 под контролем промоторов РаргВр_445, PgseBp_150 и РтргВр_256 в мутантных штаммах. Для этого геномную ДНК штаммов В. 'иЫШ', содержащих мутации по генам 5ро0А:'М и degU::kann, переносили в штаммы с рекомбинантными конструкциями РаргВр 445+gfpmut3 (рЛТТРШ), PgseBpJ50+gfpmut3 (рЛТБР104) и PmpгBp_256+g/pmut3 (рЛТЕР109) (Таблица 1).

Мы наблюдали для всех конструкций 100% подавление активности репортерного белка вБР в штаммах с мутацией по гену degU. Таким образом, экспрессия сериновых протеиназ в клетках В. ритПш (субтилизинопоодобной протеиназы, глутамилэндопептидазы и металлопротеиназы) напрямую зависит от функционирования двухкомпонентной системы DegS/U (рис. 2).

Мутация по гену 5ро0А приводила лишь к снижению активности репортерного белка вБР. Такой результат не доказывает прямого позитивного влияния системы Spo0A-фосфопередачи в регуляции экспрессии генов секреторных ферментов

В. ритПш, но, тем не менее, не исключает его влияния (рис. 2).

Таким образом, транскрипционные факторы DegU и Spo0A оказывают позитивное влияние на экспрессию генов протеолитических ферментов В. ритПш, однако их вклад в регуляцию различен.

~1Л

~ К desU::kan spo0A::tet

Рис. 2 - Влияние мутаций по генам degU и spo0A на экспрессию репортерного гена gfpmut3 под контролем промоторов субтилизиноподобной протеиназы (1), глутамилэндопептидазы (2) и металлопротеиназы (3) B. pumilus 3-19. К -контроль, активность промоторов (PaprBp_445, PgseBp_150 и PmprBp_256) в исходном штамме без мутаций

Полученные результаты свидетельствуют, что организация регуляторной области генов протеиназ B. pumilus различна: промотор гена доминирующей протеиназы - PaprBp более протяженный (445 п.о.) по сравнению с промоторами генов минорных протеиназ PgseBp (150 п.о.) и PmprBp (256 п.о.). Можно предположить, что такая структура промоторов коррелирует с биохимическими характеристиками и функцией ферментов в клетке. Доминирующая в протеолитическом пуле протеиназа AprBp, на которую приходится до 70% активности, неспецифически расщепляет пептиды, белковые субстраты [19] и, по-видимому, имеет более сложную организацию регуляторной области гена (например, для контроля высокой активности фермента). В тоже время, минорные секретируемые ферменты (глутамилэндопептидаза и

металлопротеиназа) активность которых в клетке не превышает 10%, гидролизуют гидрофильные пептиды по строго заданным сайтам [20, 21], вероятно, нуждаются в меньшем количестве транскрипционных регуляторов, которые могут связываться с промоторами. С другой стороны нами показано, что факторы транскрипции DegU и Spo0A имеют схожее влияние на активность промоторов протеиназ B. pumilus.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК№ 14.132.21.1766).

Литература

1. J.W. Veening, O.A. Igoshin, R.T. Eijlander, R. Nijland, L.W. Hamoen, O.P. Kuipers, MolSystBiol., 4, 184 (2008).

2. А.А. Тойменцева, А.И. Ахметова, М.Р. Каримова, Ч. Нямсурэн, Ю.О. Пономарева, Е.И. Шагимарданова, А.А. Ризванов, М.Р. Шарипова, Микробиология, 82, 1, 59 (2013).

3. L. Westers, H. Westers, G. Zanen, H. Antelmann, M. Hecker, D. Noone, K.M. Devine, J.M. van Dijl, W.J. Quax, Proteomics, 8, 13, 2704-2713 (2008).

4. D. Lopez, R. Kolter, FEMS Microbiol Rev, 34, 2, 134-149 (2010).

5. Н.М. Замалютдинова, И.Р. Галиева, А.О. Арапова, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, А.М. Марданова, Вестник

Казанского технологического университета, 16, 191195 (2013).

6. F.A. Davidson, C. Seon-Yi, N.R. Stanley-Wall, PLoS One, 7, 6, e38574 (2012).

7. M.K. Dahl, T. Msadek, F. Kunst, G. Rapoport, J. Biol. Chem., 267, 20, 14509-11454 (1992).

8. S.M. Ruzal, C. Sanchez-Rivas, Curr. Microbiol, 37, 368372 (1998).

9. F. Kunst, G. Rapoport, J. Bacteriol., 177, 2403-2407 (1995).

10. M. Fujita, J.E. Gonzalez-Pastor, R. Losick, J. Bacteriol., 187, 1357-1368 (2005).

11. V. Molle, M. Fujita, S.T. Jensen, P. Eichenberger, J.E. Gonzalez-Pastor, Mol. Microbiol, 50, 1683-1701 (2003).

12. A. Sanchez, J. Olmos Bacillus subtilis transcriptional regulators interaction, Biotechnol Lett., 26, 5, 403-407 (2004).

13. K. Tsukahara, M. Ogura, FEMS Microbiol. Lett., 280, 1, 8-13 (2008).

14. S. Abe, A. Yasumura, T. Tanaka, J. Bacteriol., 191, 9, 3050-3058 (2009).

15. C. Borgmeier, R. Biedendieck, K. Hoffmann, D. Jahn, F. Meinhardt,Microbiol. Biotechnol., 92, 3, 583-596 (2011).

16. P. Bisicchia, E. Botella, K.M., Plasmid, 64, 143-149 (2010).

17. H.C. Birnboim, J. Doly, Nucleic Acids Res, 7, 1513-1523 (1979).

18. C.R. Harwood, S.M. Cutting Molecular Biological Methods for Bacillus, Chichester: Wiley, England, 1990, 581 p.

19. E. Botella, M. Fogg, M. Jules, S. Piersma, G. Doherty, A. Hansen, E.L. Denham, L. Le Chat, P. Veiga, K. Bailey, P.J. Lewis, J.M. van Dijl, S. Aymerich, A.J. Wilkinson, K.M. Devine, Microbiology, 156, 1600-1608 (2010).

20. M. Sharipova, N. Balaban, A. Kayumov, Y. Kirillova, A. Mardanova, L. Gabdrakhmanova, I. Leshchinskaya, G. Rudenskaya, T. Akimkina, D. Safina, I. Demidyuk, S. Kostrov, Microbiol Res, 163, 1, 39-50 (2008).

21. M.R. Sharipova, E.I. Shagimardanova, I.B. Chastukhina, T.R. Shamsutdinov, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, G.N. Rudenskaya, I.V. Demidyuk, S.V. Kostrov, Mol. Biol. Rep., 34, 2, 79-87 (2007).

22. А.Р. Сабирова. Дисс. канд. биол. наук, К(П)ФУ, Казань, 2011. 150 с.

© А. А. Тойменцева - м.н.с. каф. микробиологии К(П)ФУ; А. М. Черёмин - асп. той же кафедры; Е. О. Михайлова - к.б.н., доц. каф. БСМЭ КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com; М. Р. Шарипова - д.б.н., проф. каф. микробиологии К(П)ФУ, marsharipova@gmail.com.