СПОСОБЫ, КОМПОЗИЦИИ И НАБОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ)
METHODS, COMPOSITIONS AND KITS FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS (HIV)

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Представленное изобретение касается ВИЧ и включает способы, композиции и наборы для его обнаружения.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является генетически многообразным вирусом из-за частых мутаций в генетическом материале. Существует два основных генотипа и их обозначают 1 и 2. ВИЧ типа 1 (ВИЧ-1) является наиболее распространенным по всему миру и делится на группы и подтипы, среди которых группа М, подтип В является наиболее распространенным. В Соединенных Штатах, другими распространенными подтипами ВИЧ-1 группы М являются: А, С, D, F и G. Кроме того, геномные рекомбинации данных подтипов встречаются в природе, создавая циркулирующие рекомбинантные формы вируса (ВИЧ CRF). Двумя наиболее распространенными CRF являются CRF01 (АЕ) и CRF02 (АГ). Считается, что ВИЧ-1 группы О является менее распространенным, чем группа М, и ВИЧ-2 встречается редко.
Одним из общих практикуемых подходов к достижению обнаружения нескольких генетических вариантов является создание зондов из геномных областей, которые сохраняются, или, если это невозможно, создание несколько зондов каждый с отдельной специфичностью. Последний подход, однако, может снизить чувствительность анализа.
Способность биологического теста обнаружить широкий спектр патогенных генетических вариантов определяют, как специфичность. Тесты с высокой специфичностью могут обнаружить большое количество генетических вариантов за один пробег теста и, таким образом, являются желательными, поскольку они предлагают высокий уровень патогенной безопасности и снижение себестоимости. Чувствительность теста определяют как наименьшую концентрацию патогена, которая может быть обнаружена на единицу образца, и часто выражают численно как LOD (предела обнаружения). Чем ниже LOD, тем более чувствительный тест. Чувствительность теста и специфичность часто считается исключительной, поскольку он может быть трудным для разработки биологического испытания, который одновременно является как высоко чувствительным, так и специфичным.
Таким образом, существует еще потребность в композициях и способах для обнаружения ВИЧ.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время предусматривается, в одном аспекте, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, или его комплемент, как изложено в:
5′-agg ccc tgc atg tac tgg gtg-3′ (SEQ ID NO:1);
5′-agg tcc tgc ctg tac tgg atg-3′ (SEQ ID NO:2);
5′-agg ccc tgc ctg ctg tgg atg-3′ (SEQ ID NO:3);
5′-agg tcc tgc atg cac tgg atg-3′ (SEQ ID NO:4);
5′-agg ccc tgc atg tac tgg atg-3′ (SEQ ID NO:5); или
5′-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3′ (SEQ ID NO:6).
В другом аспекте, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в:
5′-agg pcc tgc mtg pwc tgg atg-3′ (SEQ ID NO:7);
где p = универсальный нуклеотид; m=а или с; и w=а или t.
В некоторых аспектах, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в:
5′-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3′ (SEQ ID NO:8); или
5′-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3′ (SEQ ID NO:9);
где p = универсальный нуклеотид и n = цитидин или аналог цитидина, который имеет модификацию С-5.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в:
5′-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3′ (SEQ ID NO:10); или
5′-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3′ (SEQ ID NO:11);
где p = универсальный нуклеотид и n = аналог цитидина, имеющий модификацию С-5.
В еще следующих аспектах, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в:
5′-agg pcc tgc atg рас tgg atg-3′ (SEQ ID NO:12); или
5′-agg pcc tgc ctg ptc tgg atg-3′ (SEQ ID NO:13);
где p = универсальный нуклеотид.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в:
5′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3′ (SEQ ID NO:14);
5′-agt agt tcc tgc tat gtc act tc-3′ (SEQ ID NO:15);
5′-gag gac atc aag ggg ctt tac a-3′ (SEQ ID NO:16);
5′-cag caa tgt cac ttc ctg ttg-3′ (SEQ ID NO:17);
5′-ggc aga ggt agt gcc ag-3′ (SEQ ID NO:18);
5′-ggt cgc cca cac aat taa gc-3′ (SEQ ID NO:19);
5′-agg cac tct cag aag gct gca cg-3′ (SEQ ID NO:20).
5′-acc atc aat gag gaa gct gca gaa tgg gat-3′ (SEQ ID NO:21); или
5′-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3′ (SEQ ID NO:22).
В одном аспекте, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени. Способ включает контактирование композиции с последовательностью-мишенью в условии ПЦР, в котором композиция содержит первый олигонуклеотид, имеющий последовательность, представленную в (SEQ ID NO:10), и второй олигонуклеотид, имеющий последовательность, представленную в (SEQ ID No:11), где p = универсальный нуклеотид и n = аналог цитидина, имеющий модификацию С-5, где композиция дополнительно содержит первый прямой праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14 и первый обратный праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, где каждый первый прямой и обратный праймер способен к гибридизации с последовательностью-мишенью в условии ПЦР, чтобы посредством этого амплифицировать последовательность-мишень.
В другом аспекте, представленное изобретение предусматривает способ определения ВИЧ в образце. Способ включает:
а. выполнения ПЦР с матричной нуклеиновой кислотой в образце, используя прямой праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, и обратный праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:15; и
б. контактирование ампликона, который генерируется прямым и обратным праймером с первым олигонуклеотидом, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, со вторым олигонуклеотидом, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, где обнаружение ампликона указывает на присутствие ВИЧ в образце.
В еще следующих аспектах, представленное изобретение предусматривает набор, включающий композиции и/или одну или больше молекул нуклеиновой кислоты, согласно представленному изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время предусматривается, в одном аспекте, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, как изложено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6, или его комплемент.
В другом аспекте, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в SEQ ID NO:7, где p = универсальный нуклеотид; m=а или с; и w=а или t.
В некоторых аспектах, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в SEQ ID NO:8 или 9, где p = универсальный нуклеотид и n = цитидин или аналог цитидина, имеющий модификацию С-5.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в SEQ ID NO:10 или 11, где p = универсальный нуклеотид и n = аналог цитидина, имеющий модификацию С-5.
В еще следующих аспектах, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в SEQ ID NO:12 или 13, где p = универсальный нуклеотид.
В одном варианте осуществления, универсальный нуклеотид представляет собой 3-нитропиррол, 2′-дезоксинуклеозид и 5-нитроиндол. В других вариантах осуществления, универсальный нуклеотид представляет собой 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-он.
В других вариантах осуществления, аналог цитидина, имеющий модификацию С-5 представляет собой С-5-пропиновый или метальный аналог dC. Например, в предпочтительных вариантах осуществления, аналог цитидина, имеющий модификацию С-5 представляет собой С-5-пропиновый аналог dC (например, [5-(1-пропинил)-2′-дезоксицитидин (pdC)].
В некоторых вариантах осуществления, выделенные молекулы нуклеиновых кислот представленного изобретения имеют длину не больше, чем приблизительно 100 нуклеотидов, иллюстративно, не больше чем приблизительно: 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 и 10 нуклеотидов.
В других вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из или состоящую по существу из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1-22, или их комплементов.
Термин "молекула нуклеиновой кислоты" в данном документе включает полимеры, состоящие из встречающихся в природе нуклеотидных оснований, Сахаров и ковалентных межнуклеозидных (скелетных) связей, а также молекул нуклеиновых кислот, имеющих части не встречающиеся в природе, которые функционируют аналогичным образом. Кроме того, термин "молекула нуклеиновой кислоты" также включает полимеры, которые являются двухцепочечными, одноцепочечными, содержащими РНК, ДНК, модифицированную РНК или ДНК, РНК или ДНК миметики или какую-либо их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления, олигонуклеотидные праймеры и зонды могут быть получены из последовательностей нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе. В различных вариантах осуществления, праймеры и зонды используются в сочетании друг с другом. Представленное изобретение находит использование в варианте различных применений, включая, но не ограничиваясь этим, исследовательские, медицинские и диагностические применения для ВИЧ. Например, молекулы нуклеиновых кислот могут предусматривать реагенты для использования в, например, анализе обнаружения ВИЧ или набор, посредством которого расширяют спектр ВИЧ вариантов, которые могут быть обнаружены с помощью анализа или набора.
Как правило, зонд представляет собой олигонуклеотид, который является комплементарным или, по существу комплементарным к нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Зонды являются подходящими для различных применений, включая, но не ограничиваясь этим, обнаружение или захват нуклеиновой кислоты-мишени или ампликона, соответствующего мишени. Например, зонды, пригодные для использования в амплификации на основе способов обнаружения, могут быть сконструированы из какой-либо последовательности, расположенной внутри и/или содержащей последовательность продукта амплификации, которые будут получены с использованием двух выбранных праймеров.
В других вариантах осуществления, зонд содержит нуклеотидную последовательность, как изложено в SEQ ID NO:1-12, или ее комплемент.
В одном варианте осуществления, зонд содержит SEQ ID NO:6, или ее комплемент.
В других вариантах осуществления, зонд содержит SEQ ID NO:10 или 9, где p = универсальный нуклеотид и n = аналог цитидина, имеющий модификацию С-5. В одном варианте осуществления, p представляет собой 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-он; и n представляет собой [5-(1-пропинил)-2′-дезоксицитидин (pdC).
Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что выделенные молекулы нуклеиновых кислот согласно представленному изобретению, включая праймеры и/или зонды, могут быть получены, используя стандартные способы молекулярной биологии, описанные в текущих протоколах в молекулярной биологии (1999. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, editors. John Wiley & Sons, Inc.) или, используя химический синтез, или с помощью аналогов нуклеиновой кислоты. Способы, включая химический синтез, могут быть автоматизироваными и коммерчески доступными, и могут включать, например, фосфодиэфирные, фосфотриэфирные или фосфорамидитиновые способы. Патенты США №№4,458,066; 4,415,732; и Meth. Enzymol. 1979 68:90 и 109, которые включены в данный документ в качестве ссылки, раскрывают примеры химических способов синтеза. Химический синтез нуклеиновой кислоты позволяет включение неприродных или модифицированных оснований, а также различных маркирующих остатков, в молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, модифицированный скелет химических веществ, таких как, например, пептидные соединения, фосфоротиоаты, фосфороамидаты, фосфотриэфиры, 2′-O- метил РНК, 2′-O- Mt РНК, Р-этокси ДНК, и Р-этокси 2′-O- Mt РНК, также легко доступны и известны в данной области. Кроме того, использования поперечно-сшиваемых зондов в гибридизационных анализах нуклеиновой кислоты для поперечного сшивания с последовательностями-мишенями, хорошо известны в данной области техники. Например, соединения на основе фурокумарина или псоралена, прикрепленного к молекулам нуклеиновых кислот, путем образования аддукта, описаны в патенте США №4,826,967 и патенте США №5,082,934, оба включены в данный документ в качестве ссылки, описывают способность к фотоактивации аналога нуклеозида, содержащего кумариновую часть, присоединенную посредством его фенильного кольца в 1-положение рибозы или дезоксирибозы сахарного фрагмента при отсутствии промежуточного основного фрагмента.
Аналоги нуклеиновых кислот и мимики химические структуры подобные к нативным молекулам нуклеиновых кислот, но с уникальными модификациями. Аналоги нуклеиновых кислот, такие как блокированные нуклеиновые кислоты (LNA), пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), и морфолины, улучшают способности традиционных молекул нуклеиновых кислот за пределами ограничений, связанных со стандартной химией нуклеиновых кислот (Karkare S and Bhatnagar D. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 71:575-586.) Такие аналоги нуклеиновых кислот значительно расширяют и улучшают способности для обнаружения и идентификации родственных последовательностей нуклеиновых кислот.
В некоторых аспектах, выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно представленному изобретению дополнительно содержит один или больше гетерологичных нуклеотидов. Термин "гетерологичные нуклеотиды" в данном документе касаются нуклеотида или нуклеотидов, которые не являются природной частью выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, но которые естественно или искусственно связываются с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты. Примеры гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты включают, но не ограничиваются этим, вектор последовательности, последовательность, которая является комплементарной к основной последовательности зонда очистки, и последовательности, которые содержат один или больше сайтов рестрикции фермента.
В одном варианте осуществления один или больше гетерологичных нуклеотидов содержат последовательность, которая является комплементарной к основной последовательности, зонда очистки. Зонд очистки может быть связан с твердыми подложками, такими как, например, матрицы или свободные частицы в растворе. Неограничивающие примеры твердой подложки включают нитроцеллюлозу, нейлон, стекло, полиакрилат, смешанные полимеры, полистирол, силана полипропилен и магнитно-притягиваемые частицы. Например, зонд очистки, который может содержать ДНК или РНК-последовательность, может быть помечен аминными или биотиновыми тегами посредством кросс-линкера. Данные меченные биотином или амином зонды очистки затем подвергают иммобилизации и обнаружению стратегий, которые позволяют взаимодействия in vitro нуклеиновая кислота:нуклеиновая кислота или протеин:нуклеиновая кислота. Таким образом, гибридизация гетерологичного сегмента выделенной молекулы нуклеиновой кислоты с ее комплементарной основной последовательностью зонда очистки могут облегчить очистку образца, который гибридизует вирус-специфический сегмент последовательности выделенной молекулы нуклеиновой кислоты. Патент США №6,534,273, включенный в данный документ в качестве ссылки, описывает способ захвата молекулы-мишени нуклеиновой кислоты в образце на твердой подложке.
В одном варианте осуществления, выделенные молекулы нуклеиновых кислот согласно представленному изобретению связывают с твердой подложкой, такой как те, что описаны выше.
n
n
n
n
n
n
В некоторых вариантах осуществления, один или больше гетерологичных нуклеотидов содержат одну или больше повторяющихся основных последовательностей, например, одну или больше повторяющихся основных последовательностей, которые являются комплементарными к одной или больше повторяющимся основным последовательностям зонда очистки. Повторяющиеся основные последовательности могут быть регулярно повторяющимися основными последовательностями, такими как те, которые образуются, например, с помощью гомополимеров нуклеиновой кислоты поли-аденина (A), поли-тимина (T), поли-цитозина (C), поли-гуанина (G), и поли-уридина (U). Повторяющиеся последовательности, кроме того, могут включать смешанные полимеры, такие как AT повторы ([AT]), и тому подобное.
пл.
Количество оснований в повторяющихся основных последовательностях одного или больше гетерологичных нуклеотидов выделенной молекулы нуклеиновой кислоты может быть равно, или больше чем, или меньше чем количество оснований в повторяющихся основных последовательностях зонда очистки. Длина комплементарных повторяющихся последовательностей может определять температуру плавления (Т) комплекса гетерологичный сегмент:зонд очистки. В одном варианте осуществления, повторяющаяся основная последовательность гетерологичного сегмента длиннее, чем комплементарная повторяющаяся основная последовательность зонда очистки. В других вариантах осуществления, повторяющаяся основная последовательность гетерологичного сегмента зонда очистки может составлять, по меньшей мере, приблизительно 5 оснований в длину, иллюстративно от приблизительно 5 до приблизительно 40, от приблизительно 10 до приблизительно 30, или от приблизительно 15 до приблизительно 20, и тому подобное.
В других вариантах осуществления, один или больше гетерологичные нуклеотиды содержат функционально связанную контрольную последовательность. В одном варианте осуществления, контрольная последовательность представляет собой энхансер или промоторную последовательность, которая специфически распознается РНК полимеразой, которая связывается с такой последовательностью и инициирует транскрипцию, чтобы получить РНК транскрипт. Неограничивающие примеры промоторов, распознаваемых РНК-полимеразой включают промоторы, такие как Т3, Т7 или SP6. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть использована в ряде основных анализов нуклеиновой кислоты, включая анализы, которые используют РНК полимеразу для получения разнородных РНК транскриптов, такие как, например, анализ транскрипция-опосредованной амплификации (ТМА), как описано в Nature 350:91-92 (1991); и патенте США №5,399,491, оба включены в данный документ в качестве ссылки.
3
6
7
9
12
18
2
125
131
35
14
32
33
3
В одном варианте осуществления, последовательности выделенных нуклеиновых кислот согласно представленному изобретению являются меченными, например, меченными радиоактивно, химилюминесцентно, флуоресцентно, фосфоресцентно или инфракрасными красителями, или с меткой поверхностно усиленного рамановского рассеяния, или с плазмон резонансной частицей (PRP). Например, модификации нуклеотидов включают добавления акридина или его производных, Acrydite™, амина, биотина, BHQ-1™, BHQ-2™, BHQ-3™, борана dNTPs, углеродных спейсеров (например, С, С, C, C, С или C), каскадного синего, холестерина, кумарина или его производных, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 DABCYL, дансилхлорида, дигоксигенина, динитрофенила, двойного биотина, EDANS, 6-FAM, флуоресцеина, 3′-глицерила, HEX, IAEDANS, инвертированного dA, инвертированного dG, инвертированного dC, инвертированного dG, IRD-700, IRD-800, JOE, La Jolla Blue, металлических кластеров, таких как наночастицы золота, фенилбороновая кислота, фосфат псоралена, 3′- или 5′-фосфорилирование, пирена, 3′-рибо-аденозина, 3′-рибо-гуанозина, 3′ рибо-цитидина, (LC)Red640, (LC)Red705, родимина, ROX, тиол (SH), спейсеров, TAMRA, ТЕТ, AMCA-S, SE, BODIPY, Marina Blue, Oregon Green, Pacific Blue, QSY7™, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Rhodol Green, тетраметилродамина, Texas Red, Uni-Link NH-модификатора, радиометок (например, I, I, S, C, P, P, H) и наночастиц. Различные способы введения метки известны квалифицированному специалисту в данной области с уровня техники.
Метки могут быть присоединены непосредственно или не напрямую к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты. Введение метки нуклеиновой кислота могут осуществлять, используя ковалентное присоединение детектируемых групп (меток), например, или во внутреннее, или терминальное положение. Квалифицированный специалист в данной области с уровня техники знает, что существует ряд способов дериватизации олигонуклеотидов реакционно-способными функциональными группами, что позволяет введение метки. Ряд подходов являются доступными для непосредственного присоединения меток к молекулам нуклеиновых кислот и для биотинилирования зондов, таким образом, что радиоактивные, флуоресцентные, химилюминисцентные ферментные или с электронной плотностью метки могут присоединяться через авидин. Неограничивающие примеры ссылок, описывающих метки и способы введения меток нуклеиновых кислот включают патент США №. 4,605,735; патент США №. 4,757,141; патент США №. 6,965,020; Nucl. Acids Res. 5:363 (1978); Nucl. Acids Res. 13:1529 (1985); Nucl. Acids Res. 15:3131 (1987); Nucl. Acids Res. 15:6455 (1987); Nucl. Acids Res. 13:4485 (1985); Nucl. Acids Res. 15:4837 (1987); и Anal. Biochem. 169:1-25 (1988), которые включены в данный документ в качестве ссылки, которые раскрывают относящиеся к введению метки в нуклеиновые кислоты.
В некоторых вариантах осуществления, выделенные молекулы нуклеиновых кислот метят для способов детектирования, используя флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET). FRET включает два красителя, донорный и акцепторный краситель. FRET может быть детектирован с помощью или флуоресценции акцепторного красителя ("сенсибилизированная флуоресценция"), если указанный акцептор имеет собственную флуоресценцию, или путем гашения донорного красителя флуоресценции, если указанный акцептор является гасителем нефлуоресцентного красителя. FRET может быть задержана, если донорный краситель испускает свою флуоресценцию с течением времени. Данный процесс называется "TR-FRET" или "FRET разрешенным во времени". Донорные и акцепторные красители, кроме того, могут быть такими же, как и в случае, в котором FRET обнаруживается с помощью результирующей флуоресцентной деполяризации. Кроме того, красители могут быть ковалентно связанными, чтобы образовать тандем флуоресцентного красителя, или тандем красителя, или тандем конъюгата. Например, одинарный донорный краситель потом являются способными к возбуждению одновременно двух акцепторных красителей, что приводит к излучению света кратных длин волн. Предпочтительно, профиль длины волны излучения донор должен, по меньшей мере, частично перекрываться с профилем длины волны поглощения акцептора.
Флуоресцентные красители, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются этим, Quasar (например, Quasar 670), BODIPY FL, Cy3, Cy3.5, Cy5.RTM., Cy5.5, EDANS, FAM, флуоресцеин, HEX, IAEDANS, JOE, Oregon Green, (LC)Red640, (LC)Red705, ROX, TAMRA, TET, тетраметилродамин и Texas Red.
Quasar 670 (Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA) представляет собой индодикарбоцианин, который флуоресцирует в красной области видимого спектра.
Гасители люминисценции - красители включают, но не ограничиваются этим, BHQ-1™, BHQ-2™, BHQ-3™, DABCYL, металлические кластеры, такие как наночастицы золота и QSY7™.
Донорные/акцепторные пары, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются этим, FAM/BHQ-1, Quasar/BHQ-2, TET/BHQ-1, JOE/BHQ-1, HEX/BHQ-1, Oregon Green/BHQ-1, TAMRA/BHQ-2, ROX/BHQ-2, Cy3/BHQ-2, Cy3.5/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Cy5/BHQ-3, Cy5.5/BHQ-3 флуоресцеин/тетраметилродамин, флуоресцеин/флуоресцеин, флуоресцеин/QSY7, флуоресцеин/LC RED640, флуоресцеин/LC Red705 IAEDANS/флуоресцеин, EDANS/DABCYL и BODIPY FLI/BODIPY FL.
В одном варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в SEQ ID NO:5, 9 или 10, или ее комплемент, где молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит способную к обнаружению метку.
В некоторых вариантах осуществления, метка, способная к обнаружению, соответствует донорно/акцепторной паре, приемлемой для обнаружения, используя FRET.
В других вариантах осуществления, донорно/акцепторной парой является FAM/BHQ-1.
В других вариантах осуществления, донорно/акцепторной парой является Quasar 670/BHQ-2.
В еще следующих вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в (SEQ ID NO:6), или ее комплемент, где молекула нуклеиновой кислоты содержит Quasar 670 на 5′ конце и BHQ-2 на 3′ конце.
В одном варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, как изложено в (SEQ ID NO:10) или (SEQ ID NO:11), где p представляет собой 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-он и n представляет собой [5-(1-пропинил)-2′-дезоксицитидин (pdC), где молекула нуклеиновой кислоты содержит FAM на 5′ конце и BHQ-1 на 3′ конце.
В других вариантах осуществления, молекулы нуклеиновых кислот согласно представленному изобретению могут предусматривать одновременное использование двух или больше зондов, которые используют донорно-акцепторный перенос энергии посредством чего, например, получают молекулярные маяки, которые имеют по-разному окрашенные флуорофоры, что позволяет проводить анализы для одновременного обнаружения различных мишеней в одной и той же реакции. Например, мультиплекс анализы могут содержать ряд различных наборов праймеров, каждый набор которого позволяет амплификацию уникальной последовательности гена из другого ВИЧ, и соответствующее количество молекулярных маяков могут присутствовать, каждый из которых содержит последовательность зонда, специфическую для одного из ампликонов, и каждый помечен флуорофором другого цвета. Цвет полученной в результате флуоресценции, если таковая присутствует, идентифицирует ВИЧ в образце, и количество циклов амплификации, которые необходимы для генерации детектируемой флуоресценции, обеспечивает количественную меру присутствующего количества организмов-мишеней. Если больше, чем один тип ВИЧ присутствует в образце, флуоресцентные цвета, которые встречаются, определяют какие из них присутствуют.
Как правило, пара праймеров, содержащих прямой праймер и обратный праймер может обеспечить специфическую амплификацию (например, посредством ПЦР) нуклеиновой кислоты-мишени, фланкированной праймерами для получения продукта амплификации (также называемый как "ампликон"). В связи с этим, каждый праймер связывается со своей комплементарной или по существу комплементарной последовательностью-мишенью, таким образом, обеспечивая место для полимеразы, чтобы связывать и продлевать 3′ конец каждого праймера путем добавления нуклеотидов, тем самым обеспечивая комплементарную копию последовательности-мишени.
В одном варианте осуществления, пара праймеров содержит прямой праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, и обратный праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:15.
В других вариантах осуществления, пара праймеров содержит прямой праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, и обратный праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:17.
В других вариантах осуществления, пара праймеров содержит прямой праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и обратный праймер, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:19.
В одном варианте осуществления, нуклеиновая кислота-мишень, по меньшей мере, представляет собой сегмент кДНК, полученный из обратно транскрибирующейся РНК ВИЧ (например, ВИЧ-1 группа М, ВИЧ-1 группа О, ВИЧ-2). Квалифицированному специалисту в данной области с уровня техники будет понятно, что РНК может быть обратно транскрибирована с использованием способов, известных в данной области, чтобы обеспечить матрицы для амплификации с помощью праймеров.
В других вариантах осуществления, нуклеиновая кислота-мишень, по меньшей мере, представляет собой сегмент ВИЧ (например, ВИЧ-1 группа М, ВИЧ-1 группа О, ВИЧ-2) провирусной ДНК, интегрированной в ДНК клетки-хозяина (например, Т-лимфоцит, макрофаг, дендритная клетка). Получение клеточной ДНК, в том числе провирусной ДНК, известно в данной области с уровня техники.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает композицию, содержащую одну или больше из выделенных молекул нуклеиновых кислот согласно представленному изобретению. В некоторых вариантах осуществления, композиция представляет собой буферный раствор. В других вариантах осуществления, композиция является лиофилизированной.
В одном варианте осуществления, композиция содержит пару праймеров, имеющую последовательность, представленную в (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15); (SEQ ID NO:16 / SEQ ID NO:17); или (SEQ ID NO:18 / SEQ ID NO:19). В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит две пары праймеров. В других вариантах осуществления, композиция содержит все три пары олигонуклеотидов.
В других вариантах осуществления, композиция содержит зонд нуклеиновой кислоты, имеющий последовательность, представленную в (SEQ ID NO:6), (SEQ ID NO:10), или (SEQ ID NO:11), где композиция дополнительно содержит пару праймеров, имеющую последовательность, представленную в (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15) или (SEQ ID NO:16 / SEQ ID NO:17).
В других вариантах осуществления, предусматривается композиция, содержащая первую, вторую и третью пару праймеров, в которой первая пара праймеров имеет последовательность, представленную в (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15), в которой вторая пара праймеров имеет последовательность, представленную в (SEQ ID NO:16 / SEQ ID NO:17), в которой третья пара праймеров имеет последовательность, представленную в (SEQ ID NO:18 / SEQ ID NO:19). В одном варианте осуществления, композиция дополнительно содержит первый, второй и третий зонд, где первый, второй и третий зонд, соответственно, содержат последовательность, представленную в (SEQ ID NO:6), (SEQ ID NO:10), и (SEQ ID NO:11), где первый, второй и третий зонд каждый содержит детектируемую метку, пригодную для использования в мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно содержит четвертый зонд, имеющий последовательность, представленную в (SEQ ID NO:20).
В одном варианте осуществления, композиция содержит, кроме того, одну или больше молекул нуклеиновой кислоты согласно представленному изобретению, дополнительные реагенты, такие как ДНК-полимеразу, кофакторы и дезоксирибонуклеозид-5′-трифосфаты в подходящих концентрациях, чтобы обеспечить амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени. В качестве примера, в некоторых вариантах осуществления, где композиция представляет собой раствор ПЦР, минимальное количество ДНК-полимеразы может составлять, по меньшей мере, приблизительно 0,5 единиц/100 мкл раствора, иллюстративно, от приблизительно 0,5 до приблизительно 25 единиц/100 мкл раствора и приблизительно 7 до приблизительно 20 единиц/100 мкл раствора. Другие количества могут быть пригодными для данной реакции или системы амплификации. "Единица" может быть определена как количество активности фермента необходимое, чтобы включить 10 нмоль общих нуклеотидов (dNTP′s) в расширяющуюся цепь нуклеиновой кислоты в течение 30 минут при 74°С. В качестве другого примера, в других вариантах осуществления, количество каждого праймера, используемого в амплификации, может составлять, по меньшей мере, приблизительно 0,075 мкмоль, иллюстративно, от приблизительно 0,075 до приблизительно 2 мкмоль, но для данной реакции или системы амплификации могут быть пригодны и другие количества. В качестве еще одного примера, в некоторых вариантах осуществления, количество каждого dNTP в растворе может составлять, от приблизительно 0,25 до приблизительно 3,5 ммоль, но для данной реакции или системы амплификации могут быть пригодны и другие количества.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, соответствующий ВИЧ. Например, в некоторых вариантах осуществления, последовательность-мишень может представлять собой клеточную ДНК, содержащую ВИЧ провирусную ДНК, или последовательность-мишень может представлять собой кДНК, полученную из РНК ВИЧ. Например, выполняя ПЦР с последовательностью-мишенью и, по меньшей мере, прямым праймером и обратным праймером, каждый из которых способен к гибридизации с последовательностью-мишенью в приемлемых ПЦР условиях, может обеспечить амплификацию последовательности-мишени.
В одном варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, где способ включает: выполнение ПЦР с последовательностью-мишенью в качестве матрицы, где выполнение включает обеспечение ПЦР с прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, и обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:15. В одном варианте осуществления, последовательность-мишень соответствует кДНК, полученной из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, последовательность-мишень соответствует провирусной ДНК ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М.
В других вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, где способ включает: выполнение ПЦР с последовательностью-мишенью в качестве матрицы, где выполнение включает обеспечение ПЦР с прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, и обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:17. В одном варианте осуществления, последовательность-мишень соответствует кДНК, полученной из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, последовательность-мишень соответствует провирусной ДНК ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы О.
В одном варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, где способ включает: выполнение ПЦР с последовательностью-мишенью в качестве матрицы, где выполнение включает обеспечение ПЦР с прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:19. В одном варианте осуществления, последовательность-мишень соответствует кДНК, полученной из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, последовательность-мишень соответствует провирусной ДНК ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-2.
В других вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, где способ включает: выполнение ПЦР с последовательностью-мишенью в качестве матрицы, где выполнение включает обеспечение ПЦР с первым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, первым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, вторым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, и вторым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:17. В одном варианте осуществления, последовательность-мишень соответствует кДНК, полученной из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, последовательность-мишень соответствует провирусной ДНК ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М и/или ВИЧ-1 группы О.
В других вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, где способ включает: выполнение ПЦР с последовательностью-мишенью в качестве матрицы, где выполнение включает обеспечение ПЦР с первым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, первым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, вторым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и вторым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:19. В одном варианте осуществления, последовательность-мишень соответствует кДНК, полученной из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, последовательность-мишень соответствует провирусной ДНК ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М и/или ВИЧ-2.
В других вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, где способ включает: выполнение ПЦР с последовательностью-мишенью в качестве матрицы, где выполнение включает обеспечение ПЦР с первым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, первым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, вторым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и вторым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:19. В одном варианте осуществления, последовательность-мишень соответствует кДНК, полученной из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, последовательность-мишень соответствует провирусной ДНК ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы О и/или ВИЧ-2,
В других вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает способ амплификации последовательности-мишени, где способ включает: выполнение ПЦР с последовательностью-мишенью в качестве матрицы, где выполнение включает обеспечение ПЦР с первым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, первым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, вторым прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, вторым обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, третьим прямым праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и третьим обратным праймером, содержащим последовательность, представленную в SEQ ID NO:19. В одном варианте осуществления, последовательность-мишень соответствует кДНК, полученной из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, последовательность-мишень соответствует провирусной ДНК ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М, ВИЧ-1 группы О, и/или ВИЧ-2.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает способ определения ВИЧ в образце. Например, образец может содержать ВИЧ РНК и/или провирусную ДНК, или может предполагаться, что образец содержит тоже самое.
В одном варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает способ определения ВИЧ в образце, где способ включает:
а. выполнение ПЦР с матрицей нуклеиновой кислоты в образце, используя прямой праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14 и обратный праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:15; и
б. обнаружение ампликона, образованного прямым и обратным праймером, где присутствие ампликона определяет ВИЧ в образце.
В одном варианте осуществления, матрица представляет собой кДНК, полученную из РНК образца, содержащего ВИЧ. В других вариантах осуществления, матрица содержит провирусную ДНК ВИЧ.
В некоторых вариантах осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М. В одном варианте осуществления, ВИЧ-1 группы М имеет последовательность нуклеиновой кислоты такую, как раскрыто, например, GENBANK с номерами доступа AF033819, AY173953 или AY214024, каждая из которых включена в данный документ в виде ссылки в полном объеме.
В других вариантах осуществления, прямой праймер содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, и обратный праймер содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:17. В одном варианте осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы О. В других вариантах осуществления, ВИЧ-1 группы О имеет последовательность нуклеиновой кислоты такую, как раскрыто, например, GENBANK с номерами доступа AY169802, АВ485669.1, или GQ351296.2, каждая из которых включена в данный документ в виде ссылки в полном объеме.
В других вариантах осуществления, прямой праймер содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и обратный праймер содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:19. В одном варианте осуществления, ВИЧ представляет собой ВИЧ-2. В других вариантах осуществления, ВИЧ-2 имеет последовательность нуклеиновой кислоты такую, как раскрыто, например, GENBANK с номерами доступа Х52223, AJ011222.1, каждая из которых включена в данный документ в виде ссылки в полном объеме.
Стадию обнаружения могут проводить несколькими способами, известными квалифицированному специалисту в данной области с уровня техники. В одном варианте осуществления, ампликон может быть обнаружен, используя зонд, который является помеченным для обнаружения, и может быть непосредственно или косвенно гибридизированным с ампликоном. Зонд может быть растворимым или присоединенным к твердой подложке.
В одном варианте осуществления, зонд содержит детектируемую метку, соответствующую донорно/акцепторной паре, подходящей для обнаружения, используя FRET, где зонд содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:20, или их комплементы. Например, в некоторых вариантах осуществления, донорно/акцепторная пара представляет собой FAM/BHQ-1, Quasar/BHQ-2, или какую-либо их комбинацию.
В других вариантах осуществления, один или больше праймеров, используемых для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени могут быть помечены, например, специфическим связывающим фрагментом. Полученный в результате продукт с расширенным праймером, в который введен меченный праймер, может быть захвачен зондом. Обнаружение амплифицированной мишени, гибридизированной с зондом, может быть достигнуто путем обнаружения присутствия меченого зонда или меченой амплифицированной мишенью, используя соответствующее оборудование и методики, которые хорошо известны в данной области с уровня техники.
В других вариантах осуществления, один или больше праймеров, используемых для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, метят биотином, и биотинилированные амплифицированные нуклеиновые кислоты-мишени гибридизируют с зондами, прикрепленными к твердой подложке. Связанные мишени затем детектируют путем контактирования их со стрептавидин-пероксидазным конъюгатом в присутствии окислителя, такого как перекись водорода, и подходящей краситель-образующей композиции.
Другие способы известны квалифицированному специалисту в данной области для обнаружения, включая, но не ограничиваясь этим, способы, включающие саузерн-блоттинг, дот-блот методики или неизотопное обнаружение захвата с меченым зондом.
В других вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает способ определения ВИЧ-1 группы М, ВИЧ-1 группы О, и/или ВИЧ-2 в образце, где способ включает:
а. выполнение единичной ПЦР с образцом, используя (I) первый прямой праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, и первый обратный праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:15; (II) второй прямой праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, и второй обратный праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:17; и (III) третий прямой праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, и третий обратный праймер, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:19; и
б. обнаружение ампликона, созданного (I) первым прямым и первым обратным праймерами, (II) вторым прямым и вторым обратным праймерами и/или (III) третьим прямым и третьим обратным праймерами, где присутствие ампликона определяет ВИЧ в образце.
В одном варианте осуществления, стадия обнаружения включает, в том числе в ПЦР, олигонуклеотидный зонд, содержащий детектируемую метку, соответствующую донорно/акцепторной паре, подходящей для обнаружения, используя FRET, где зонд содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, или их комплементы. Например, в некоторых вариантах осуществления, донорно/акцепторная пара представляет собой FAM/BHQ-1, Quasar/BHQ-2, или какую-либо их комбинацию.
В других вариантах осуществления, стадия обнаружения включает, в том числе в ПЦР, первый зонд, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, второй зонд, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, и третий зонд, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:11. В одном варианте осуществления, первый, второй и третий зонд каждый содержит одни и те же донорно/акцепторные пары, как метку. Например, донорно/акцепторная пара может быть, но не ограничивается этим, FAM/BHQ-1. В других вариантах осуществления, первый, второй и третий зонд каждый содержит разные донорно/акцепторные пары, как метку. Например, в некоторых вариантах осуществления, донорно/акцепторная пара первого зонда представляет собой Quasar/BHQ-2, где второй и третий зонд каждый содержит FAM/BHQ-1.
Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот согласно представленному изобретению могут быть использованы отдельно или в комбинации в различных способах амплификации и/или обнаружения ВИЧ. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, композиции, способы и наборы согласно представленному изобретению обеспечивают мультиплексный ПЦР анализ в режиме реального времени, которые содержат один, два или три набора праймеров и зондов, как описано в данном документе, каждый специфичный для одной мишени ВИЧ, в таком же ПЦР мастер-миксе. Например, мультиплексный ПЦР анализ в режиме реального времени в соответствии с представленным изобретением может обнаруживать 3 генотипа ВИЧ (то есть, ВИЧ-1 группа М, ВИЧ-1 группа О, ВИЧ-2) используя один тест. В связи с этим, праймеры и зонды способны взаимодействовать только с их специфической мишенью, но не с другими праймерами и зондами, присутствующими в мастер-микс (например, не образуют димеров праймеров) тем самым обеспечивая для эффективной мишени амплификацию и обнаружение в ПЦР, например, мультиплексном ПЦР.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает набор, содержащий выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, включая праймеры и зонды согласно представленному изобретению. Набор может быть разработан, используя последовательности нуклеиновых кислот, раскрытые в данном документе. Данные последовательности могут быть использованы, как праймеры в реакциях амплификации нуклеиновых кислот, и/или как зонды в способе гибридизации нуклеиновой кислоты. Наборы являются подходящими для определения присутствия ВИЧ, в частности ВИЧ-1 группы М, ВИЧ-1 группы О, и/или последовательности нуклеиновой кислоты ВИЧ-2 в образце. Компоненты в наборе могут быть получены или коммерчески, или сделаны в соответствии с хорошо известными в данной области способами. Кроме того, компоненты набора могут быть в виде раствора или лиофилизированными, в случае необходимости. В одном варианте осуществления, компоненты находятся в одном отсеке, и в других вариантах осуществления, компоненты находятся в отдельных отсеках. В некоторых вариантах осуществления, набор дополнительно содержит инструкции по применению.
В одном варианте осуществления, набор содержит прямой праймер, обратный праймер и зонд, где прямой праймер содержит последовательность прямого праймера нуклеиновой кислоты, как изложено в (SEQ ID NO:14), (SEQ ID NO:16) или (SEQ ID NO:18), где обратный праймер содержит последовательность обратного праймера нуклеиновой кислоты, как изложено в (SEQ ID NO:15), (SEQ ID NO:17) или (SEQ ID NO:19), где зонд содержит последовательность зонда нуклеиновой кислоты, как изложено в (SEQ ID NO:6), (SEQ ID NO:10), (SEQ ID NO:11) или (SEQ ID NO:20).
В других вариантах осуществления, набор содержит первый праймер пары для использования в комбинации с первым и вторым зондом для определения ВИЧ-1 группы М, второй праймер пары для использования в комбинации с третьим зондом для обнаружения ВИЧ-1 группы О, и третий праймер пары для использования в комбинации с четвертым зондом для определения ВИЧ-2, где первый праймер пары содержит последовательность, представленную в (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15), где первый и второй зонд, соответственно, последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11, где второй праймер пары содержит последовательность, представленную в (SEQ ID NO:16 / SEQ ID NO:17), где третий зонд содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, где третий праймер пары содержит последовательность, представленную в (SEQ ID NO:18 / SEQ ID NO:19), где четвертый зонд содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:20.
Следующие примеры приведены только для иллюстрации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Определение ВИЧ, используя мультиплексный ПЦР
Чтобы определить присутствие РНК ВИЧ в образце плазмы, проводили одновременный анализ ПЦР с использованием праймеров и зондов, посредством чего праймеры, предусмотренные для амплификации матрицы кДНК, полученные из ВИЧ-1 группы М, ВИЧ-1 группы О, и/или РНК ВИЧ-2, которые могут присутствовать в образце, и в результате ампликоны были обнаружены в режиме реального времени путем гибридизации ампликона со специфическими зондами, которые метили для обнаружения путем FRET.
Три совместимые набора праймер/зонд были выбраны для обеспечения эффективной амплификации и обнаружения РНК ВИЧ-1 группы М, ВИЧ-1 группы О, и/или ВИЧ-2. Для обнаружения, каждый зонд содержит донор на 5′ конце; и акцептор на 3′ конце.
Для определения присутствия ВИЧ-1 группы М в образце, были использованы праймеры и зонды детекции, имеющие следующие последовательности:
Прямой праймер 1: 5′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3′ (SEQ ID NO:14);
Обратный праймер 2: 5′-agt agt tcc tgc tat gtc act tc-3′ (SEQ ID NO:15);
Зонд 1: 5′-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3′ (SEQ ID NO:10); и
Зонд 2: 5′-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3′ (SEQ ID NO:11);
где p представляет собой 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-он; и n Для обнаружения [5-(1-пропинил)-2′-дезоксицитидин (pdC).
Для определения присутствия ВИЧ-1 группы О в образце, были использованы праймеры и зонд, имеющие следующие последовательности:
Прямой праймер 3: 5′-gag gac atc aag ggg ctt tac a-3′ (SEQ ID NO:16);
Обратный праймер 4: 5′-cag caa tgt cac ttc ctg ttg-3′ (SEQ ID NO:17); и
Зонд 3: 5′-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3′ (SEQ ID NO:6).
Для определения присутствия ВИЧ-2 в образце, были использованы праймеры и зонд, имеющие следующие последовательности:
Прямой праймер 5: 5′-ggc aga ggt agt gcc ag-3′ (SEQ ID NO:18);
Обратный праймер 6: 5′-ggt cgc cca cac aat taa gc-3′ (SEQ ID NO:19); и
Зонд 4: 5′- agg cac tct cag aag gct gca cg-3′ (SEQ ID NO:20).
2
Мультиплексный ПЦР мастер-микс (ММХ) получали, включая следующее: 1х ПЦР-буфер (50 мМ бицин, 115 мМ калия ацетат, 8% глицерин, рН 8,2) (альтернативно может быть использован Tris-основный буфер); 300 мкМ dNTPs; 3% ДМСО, 3,5 мМ MgCl; 1х ROX эталонный краситель (0,5 мкМ) (ROX эталонный краситель подают в 50х концентрации. Он состоит из глицинового конъюгата 5-карбокси-Х-родамина, сукцинимидильного сложного эфира (25 мкМ) в 20 мМ Tris-HCl (pH 8,4), 0,1 мМ ЭДТА, 0,01% Tween 20 (Invitrogen, Carlsbad, CA)) (альтернативно другой препарат ROX-эталона может быть использован под называнием "низкий ROX" (Eurogentec, Seraing, Belgium)); 100 нМ прямого праймера ВИЧ-1 группы М (прямого праймера 1); 300 нМ обратного праймера ВИЧ-1 группы М (обратного праймера 2); 100 нМ зонда ВИЧ-1 группы М (зонда 1); 100 нМ зонда ВИЧ-1 группы М (зонда 2); 100 нМ прямого праймера ВИЧ-1 группы О (прямого праймера 3); 300 нМ обратного праймера ВИЧ-1 группы О (обратного праймера 4); 100 нМ зонда ВИЧ-1 группы О (зонда 3); прямого праймера ВИЧ-2 (прямого праймера 5); обратного праймера ВИЧ-2 (обратного праймера 6); 100 нМ зонда ВИЧ-2 (зонда 4); 100 нМ зонда внутреннего контроля; 20 единиц/реакцию обратной транскриптазы (RT), и 2,5 единиц/реакцию Taq ДНК-полимеразы.
ММХ комбинировали с вирусной РНК, выделенной из образцов плазмы, содержащих вирус, используя способ экстракции вируса, известный в данной области с уровня техники. Комбинированные ВИЧ РНК+ММХ подвергали на одной стадии ПЦР, где обратная транскрипция, амплификация кДНК и обнаружение, выполненное в одной и той же пробирке, используя коммерческий ПЦР инструмент в режиме реального времени (Applied Biosystems 7300 или 7500). Термические условия циклических режимов показаны в таблице 1:
Таблица 1
Условие для ПЦР циклирования
Стадия
Температура
Время
Циклы
Обратная транскрипция (RT)
55°С
60 минут
1
Taq активация
95°С
2 минуты
1
Денатурация
90°С
15 секунд
15
Гибридизация/Расширение
52°С
1 минута
Денатурация
90°С
15 секунд
30
Гибридизация/Расширение
58°С
1 минута
T
После ПЦР-амплификации сгенерированные сигналы анализировали, используя инструментальное SDS программное обеспечение. Результаты показывают сильные кривые амплификации с C значениями ниже, чем 30. Таким образом, мы смогли обнаружить все три генотипа ВИЧ, ВИЧ-1 группу М, ВИЧ-1 группу О и ВИЧ-2, от обогащенных образцов плазмы. В зонды, присутствующие в анализе для обнаружения ВИЧ-1 группы М и ВИЧ-2, вводили метки с тем самым флуоресцентным красителем и в этом случае были обнаружены два генотипа, но не дифференцированы. В зонд для обнаружения ВИЧ-1 группы О вводили метки с отличным флуоресцентным красителем, позволяющим дифференцирование ВИЧ группы О из группы М и ВИЧ-2.
Таблица 2 представляет выравнивание последовательностей на основе геномных областей различных подтипов группы М ВИЧ-1 и CRF.
Зонды 1 и 2, для обнаружения ВИЧ-1 группы М, имеют две вставки универсального пиримидина (таблица 2, в положениях 4 и 13), 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-она, которые функционируют как ′участки′ в последовательности зонда, локализуя сайты рассогласования (полиморфизм) между вариантами ВИЧ-1 группы М. Данные два специфические сайты полиморфизмов, которые соответствуют комплементу положений 4 и 13 последовательностей в таблице 2, соответствуют сайтам полиморфизма в геноме ВИЧ, как определено, которые являются пуриновым основанием (А или G). Расположение универсального пиримидина в зонде на данных сайтах позволяет обнаруживать какое-либо основание, таким образом, расширяя специфичность анализа. Зонды 1 и 2 конструируют из той же геномной последовательности, однако, зонд 1 имеет большую гомологию с подтипами А, В, С, D, F группы М ВИЧ-1 и CRF01, в то время как зонд 2 имеет большую гомологию с подтипом G и CRF02. Используя оба зонда в одном и том же тесте, может обеспечить обнаружение всех 6 подтипов группы М, а также CRF01 и CRF02.
Зонды 1 и 2, кроме того, имеют все цитидиновые основания, замещенные на пропин-dC, которые являются аналогом цитидина с пропинильной группой, присоединенной к 5-ому углероду цитидина. Данная модификация повышает стабильность зонда/комплекса-мишени, которая компенсирует дестабилизирующий эффект ′участков′, и повышает формирование двойной спирали, таким образом, повышая, как специфичность анализа, так и чувствительность анализа. Оба зонда 1 и 2 метят FAM и BHQ1 для обнаружения ПЦР в режиме реального времени и обнаруживают на том же фильтре инструмента ПЦР в режиме реального времени.
Зонд 3, для обнаружения ВИЧ-1 группы О, метят, используя Quasar 670 и BHQ2, и обнаруживают на другом фильтре. Данное разделение зондов между разными фильтрами дополнительно повышает чувствительность анализа путем понижения путем понижения флуоресцентного фона и улучшения соотношения сигнал к шуму в каждом фильтре.
Условия амплификации для ПЦР анализа представляют собой набор временных и температурных параметров, которые изменяются циклически во время ПЦР пробега. Условия амплификации обычно включают стадию денатурации, в течение которой матрица нуклеиновой кислоты денатурируется до одноцепочечного состояния и является доступной для праймеров и зондов, чтобы гибридизировать, стадию гибридизации в течение которой праймеры и зонды гибридизируют к матрице, и стадию расширения, в течение которой из матрицы синтезируются новые копии ДНК. В случае РНК-матриц, стадию обратной транскрипции (RT) добавляют перед ПЦР, чтобы транскрибировать РНК в кДНК. В ПЦР в режиме реального времени гибридизация и расширение объединяются в одну стадию. Температура на стадии гибридизации/расширения может быть выбрана на основе температуры плавления (Tm) праймеров и желаемой жесткости реакции. Более низкие температуры являются более толерантными к несоответствиям в праймерах и/или зондах и могут расширять специфичность анализа. С другой стороны, слишком низкая температура гибридизации/расширения может снизить чувствительность обнаружения, если нет несоответствия между праймерами и/или зондом и матрицей из-за недостаточного расплавления вторичной структуры нуклеиновой кислоты. Представленный пример использует комбинацию более низкой и более высокой температуры гибридизации/расширения, чтобы увеличить обнаружение вариантов с несоответствиями (увеличивает специфичность анализа) и обеспечить чувствительное обнаружение вариантов без каких-либо несоответствий (увеличение чувствительности анализа).