КОНСТРУКЦИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА КОМПЛЕКСЫ ПЕПТИДА AFP/МНС, И ВИДЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
STRUCTURES AIMED AT AFP/MHC PEPTIDE COMPLEXES AND TYPES OF THEIR USE

Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 62/142.958, зарегистрированной 3 апреля 2015 года, предварительной заявки США № 62/244.653, зарегистрированной 21 октября 2015 года, и предварительной заявки США № 62/304.915, зарегистрированной 7 марта 2016 года, каждая из которых полностью включена, таким образом, посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Настоящее изобретение относится к конструкциям антител, которые специфически связываются с молекулами MHC, образующими комплекс с пептидами AFP, и к их использованию, включая лечение и диагностику заболеваний.
Предоставление списка последовательностей в текстовом файле в формате ASCII
[0003] В настоящее описание посредством ссылки полностью включено содержание следующей подачи текстового файла в формате ASCII: машиночитаемая форма (CRF) списка последовательностей (имя файла: 750042000140SEQLIST.txt, дата записи: 1 апреля 2016 года, размер: 65 KB).
Уровень техники, предшествующий изобретению
in vivo
[0004] Белки клеточной поверхности составляют только небольшую долю белков клетки, и такие белки, как правило, не являются опухолеспецифическими. Вследствие их неспособности легко проникать в клетки доступные на рынке терапевтические моноклональные антитела (mAb) распознают такие белки клеточной поверхности, большая часть которых является антигенами линий или дифференцировки (Milenic E.D., Curr. Pharm. Des. 8:1794-1764, 2002; Grillo-Lopez A.J., Expert Rev. Anticancer Ther. 2(3):323-329, 2002; Jones K.L. & Buzdat A.U., Lancet Oncol. 10(12):1179-1187, 2009). В противоположность этому, мутантные или онкогенные опухолеассоциированные белки, как правило, являются ядерными, цитоплазматическими или секретируемыми, на которые в настоящее время направлены низкомолекулярные лекарственные средства, или в случае секретируемых белков, использование которых в качестве мишеней для лекарственных средств против злокачественных опухолей, вызывает затруднение (Reddy et al., Expert Opin. Ther. Targets 3:313-324, 2012; Takeuchi K. & Ito F., Biol. Pharm. Bull. 34(12):1774-1780; Roychowdhury S. & Talpaz, M, Blood Rev. 6:279-290, 2011). Однако большая часть внутриклеточных белков может подвергаться протеасомному разрушению, процессингу и презентации молекулами MHC на поверхности клеток в виде T-клеточных пептидных эпитопов в случае молекул MHC, которые распознают T-клеточные рецепторы (TCR) (Morris et al., Blood Rev. 20:61-69, 2006; Konnig R., Curr. Opin. Immunol. 14(1):75-83, 2002). Таким образом, получение терапевтических mAb, которые распознают секретируемые или внутриклеточные получаемые из опухолевого антигена комплексы пептид/MHC на поверхности клеток, обеспечит преимущество повышенной специфичности и терапевтической активности, предоставляемой mAb. Последние достижения в использовании фагового дисплея для получения mAb позволили выбирать средства с превосходной специфичностью к определенным эпитопам из больших репертуаров антитела. Из библиотек фагового дисплея успешно выбрали ряд таких mAb, специфичных к антигенам солидной опухоли, по отношению к HLA-A01 и HLA-A02 (Noy et al., Expert Rev. Anticancer Ther. 5(3):523-536, 2005; Chames et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7969-7974, 2000; Held et al., Eur. J. Immunol. 34:2919-2929, 2004; Lev et al., Cancer Res. 62:3184-3194, 2002; Klechevsky et al., Cancer Res. 68(15):6360-6367, 2008). В последние годы было показано, что mAb человека, специфическое к комплексу WT1/HLA-A02 человека, широко описанный как T-клеточный эпитоп, ингибирует многие линии злокачественных клеток и первичные злокачественные клетки посредством Fc-опосредованной функции эффекторных клеток (Dao et al., Sci. Transl. Med. 5:176ra33, 2013; Veomett et al., Clin. Cancer Res. doi: 10.1158/1078-0432, 2014) в клеточных анализах и на моделях .
[0005] Альфа-фетопротеин (AFP) представляет собой гликопротеин 69 кДа, образующийся в желточном мешке и печени эмбриона и секретируемый в кровяное русло. Синтез AFP резко снижается после рождения, и в печени взрослого присутствуют только следовые количества. В нормальной сыворотке крови взрослого человека концентрация AFP, как правило, доходит до уровня 5-7 нг/мл (Terentiev A.A. & Moldogazieva N.T., Tumour Biol. 34(4):2075-2091, 2013). Однако экспрессия гена AFP вновь активируется у взрослых во время регенерации печени, гепатоканцерогенезе, эмбрионально-клеточной опухоли или в некоторых случаях вирусной инфекции (HBV/HCV). Таким образом, измерение AFP в сыворотке играет важную роль в диагностике и мониторинге реакций на лечение AFP-положительных злокачественных опухолей. В настоящее время AFP считают "золотым стандартом" среди опухолеспецифичных молекулярных биомаркеров. Однако вследствие того, что AFP не является белком клеточной поверхности, направленная доставка к AFP не являлась очень активной областью разработки противораковых лекарственных средств на основе антител.
Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol
[0006] Первичный рак печени является пятой наиболее распространенной формой злокачественной опухоли во время мире и второй наиболее распространенной причиной случаев смерти, связанных со злокачественными опухолями. В 2012 году отмечали приблизительно 782000 новых случаев злокачественных опухолей во всем мире и приблизительно 746000 случаев смерти, связанных с раком печени (http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx). 90-95% случаев рака печени представляют собой печеночноклеточную карциному (HCC). Хроническое повреждение печени, такое как повреждение, вызываемое хроническим гепатитом, циррозом печени и жировой дистрофией печени, тесно связано с частотой возникновения HCC. Инфекция вируса гепатита (например, HBV, HCV), воздействие афлатоксина B, употребление алкоголя и другие метаболические заболевания (например, ожирение и диабет) являются хорошо известными факторами риска HCC. Частота возникновения HCC в странах Восточной Азии и Африки является высокой вследствие распространенности HBV и HCV в этих регионах (Shibata T. & Aburatani H., Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11(6):340-349, 2014). Однако число пациентов, инфицированных HCV, быстро уменьшается в западных странах, особенно в USA, где инфекция вируса гепатита является частично опосредованной злоупотреблением лекарственных средств. При этом в западных странах также повышается частота возникновения цирроза вследствие неалкогольного стеатогепатита (NASH) и ожирения. В США HCC является 9-й наиболее распространенной злокачественной опухолью (Vallanueva et al., . 10(1):34-42).
[0007] Средняя продолжительность жизни пациентов с HCC составляет 3 месяца после постановки диагноза. Однако это тесно связано со стадией опухоли и степенью основного заболевания печени. Поскольку считают, что только незначительная часть пациентов с HCC является подходящей для резекции и трансплантации во время диагностики, лечение большей части пациентов с HCC в основном является паллиативным. Было показано, что нехирургические виды лечения, такие как трансартериальная химиоэмболизация (TACE/TAE), радиочастотная абляция и системные средства направленного действия, такие как сорафениб, снижают опухолевую нагрузку и улучшают коэффициент выживаемости, но эти виды лечения не устраняют злокачественные клетки, и у пациентов часто случаются рецидивы. Таким образом, разработка более эффективных видов терапии остается актуальной областью исследования (Behboudi et al., Liver Int. 30(4):521-526, 2010).
in vitro
[0008] Экспрессия AFP повторно активируется приблизительно в 80% случаев HCC. В иммунотерапевтических исследованиях, проводимых для индукции специфических к AFP цитотоксических ответов T-клеток CD8, которые распознают пептиды, презентируемые белками MHC I класса на поверхности злокачественных клеток HCC, сообщали, что многие пептиды AFP человека являются T-клеточными эпитопами (Butterfield et al., J. Immunol. 166:5300-5308, 2001; Pardee A.D. & Butterfield L.H., OncoImmunol. 1:48-55, 2012; Butterfield et al., J. Trans. Med. 12:86, 2014; Liu et al., J. Immunol. 177(1):712-721, 2006; Mizukoshi et al., Int. J. Cancer, 118(5):1194-1204, 2006). Среди этих пептидов FMNKFIYEI (AFP158) представляет собой иммунодоминантный T-клеточный эпитоп, ограниченный HLA-A*02:01. Комплекс AFP/HLA-A*02:01 индуцировал специфические к пептиду T-клетки  у нормальных доноров HLA-A*02:01. Такие специфические к AFP158 T-клетки распознавали положительные по HLA-A*02:01 и положительные по AFP опухолевые клетки в анализах цитотоксичности и анализа ELISPOT IFNγ. AFP158 идентифицировали масс-спектроскопическим анализом пептидов поверхности из HLA-A*02:01-положительной линии клеток HCC, HepG2, но не HLA-A*02:01-отрицательной линии злокачественных клеток, Hep3B (Butterfield et al., J. Immunol. 166:5300-5308, 2001). Эти данные подтверждают, что AFP158 фактически процессируется и презентируется молекулами HLA-A*02:01 в AFP-положительных злокачественных клетках. Таким образом, AFP158/HLA-A*02:01 является хорошим кандидатом-мишенью для разработки лекарственных средств на основе mAb против злокачественных опухолей.
in vitro
[0009] Общепринятые подходы использования AFP в качестве терапевтической мишени для лечения злокачественных опухолей, которые экспрессируют на повышенном уровне AFP, были основаны на использовании антител, которые направлены на белок AFP, или вакцинации различными пептидами AFP. Антитела, направленные на белок AFP, обладают низкой терапевтической эффективностью, т.к. AFP не является белком клеточной поверхности, и может содержаться на высоких циркулирующих в крови уровнях, таким образом, снижая любое специфическое направленное действие антитела на клетки, экспрессирующие AFP. Несмотря на то, что наблюдали, что вакцинация различными ограниченными MHC пептидами AFP и их вариантами приводит к активации специфических к AFP T-клеток и к повышенной цитотоксичности презентирующих AFP клеток , все еще не наблюдали клинически значимое терапевтическое действие.
[0010] Описания всех публикаций, патентов, патентных заявок и опубликованных патентных заявок, указываемых в настоящем описании, таким образом, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Краткое описание сущности изобретения
[0011] Настоящее изобретение в одном из аспектов относится к конструкциям (таким как выделенные конструкции), которые связываются с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса (обозначаемый в настоящем описании как "комплекс AFP/MHC I класса" или "AMC"). В некоторых вариантах осуществления конструкции ("конструкции к AMC") содержат фрагмент молекулы антитела (обозначаемый в настоящем описании как "фрагмент молекулы антитела к AMC"), который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса.
[0012] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC (такая как выделенная конструкция к AMC), содержащая фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления комплекс AFP/MHC I класса присутствует на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления комплекс AFP/MHC I класса присутствует на поверхности злокачественной клетки.
[0013] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где белок MHC I класса представляет собой HLA-A. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой подтип HLA-A*02:01 аллеля HLA-A02.
[0014] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC) конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела дает перекрестную реакцию с комплексом, содержащим пептид AFP и втор белок MHC I класса, содержащий другой аллель HLA по сравнению с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела дает перекрестную реакцию с комплексом, содержащим межвидовой вариант пептида AFP и белок MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела дает перекрестную реакцию с комплексом, содержащим вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная аминокислотная замена) и белок MHC I класса.
.
[0015] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC) конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где длина пептида AFP составляет приблизительно от 8 приблизительно до 12 (такая как приблизительно любая из 8, 9, 10, 11 или 12) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP получают из AFP человека. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-13 и 16 В некоторых вариантах осуществления пептид AFP содержит аминокислотную последовательность FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 4).
[0016] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC) конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела представляет собой полноразмерное антитело, Fab, Fab', (Fab')2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv). В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела является полностью принадлежащим человеку, полусинтетическим с каркасными областями антитела человека или гуманизированным.
d
d
.
[0017] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC), конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела связывается с комплексом AFP/MHC I класса с равновесной константой диссоциации (K) приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любой из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления выделенная конструкция к AMC связывается с комплексом AFP/MHC I класса с K приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любой из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями)
[0018] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела содержит: i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HC-CDR), содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LC-CDR), содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, где X может представлять собой любую аминокислоту.
[0019] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела содержит: i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3 содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3 содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0020] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела содержит: i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий (и в некоторых вариантах осуществления состоящий из) HC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66, HC-CDR2, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76, и HC-CDR3, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в областях HC-CDR; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99, LC-CDR2, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109, и LC-CDR3, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в областях LC-CDR.
[0021] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела содержит a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий (и в некоторых вариантах осуществления состоящий из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (такой как по меньшей мере приблизительно любой из 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 17-26; и b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий (и в некоторых вариантах осуществления состоящий из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (такой как по меньшей мере приблизительно любой из 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 27-36. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий (и в некоторых вариантах осуществления состоящий из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи содержащий (и в некоторых вариантах осуществления состоящий из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36.
[0022] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC содержит первый фрагмент молекулы антитела, который конкурирует за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса со вторым фрагментом молекулы антитела в соответствии с любым из фрагментов молекулы антитела, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент молекулы антитела связывается с тем же или по существу с тем же эпитопом, что и второй фрагмент молекулы антитела. В некоторых вариантах осуществления связывание первого фрагмента молекулы антитела с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса ингибирует связывание второго фрагмента молекулы антитела с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса по меньшей мере приблизительно на 70% (такое как по меньшей мере приблизительно на любой из 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) или наоборот. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент молекулы антитела и второй фрагмент молекулы антитела перекрестно конкурирует за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса, например, каждый из первого и второго фрагмента молекулы антитела конкурирует с другим за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса.
[0023] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC), выделенная конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления выделенная конструкция к AMC является моноспецифической. В некоторых вариантах осуществления выделенная конструкция к AMC является полиспецифической. В некоторых вариантах осуществления выделенная конструкция к AMC является биспецифической. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула к AMC представляет собой тандемный scFv, диатело (Db), одноцепочечное диатело (scDb), переориентирующееся антитело с двойной аффинностью (DART), антитело с двойным вариабельным доменом (DVD), антитело "выступ во впадину" (KiH), антитело "замок на причале" (dock and lock) (DNL), химически сшитое антитело, гетеромультимерное антитело или гетероконъюгированное антитело. В некоторых вариантах осуществления выделенная конструкция к AMC представляет собой тандемный scFv, содержащий два scFv, связанных пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотную последовательность GGGGS.
[0024] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC), конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где выделенная конструкция к AMC дополнительно содержит второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается со вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент молекулы антитела. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой антиген на поверхности T-клетки. В некоторых вариантах осуществления T-клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической T-клетки, хелперной T-клетки, естественной киллерной T-клетки. В некоторых вариантах осуществления второй антиген выбран из группы, состоящей из CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L и HVEM. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3ε, и выделенная конструкция к AMC представляет собой тандемный scFv, содержащий на N-конце scFv, специфический к комплексу AFP/MHC I класса, и scFv на C-конце, специфический к CD3ε. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой антиген на поверхности естественной киллерной клетки, нейтрофила, моноцита, макрофага или дендритной клетки.
[0025] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC), конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где выделенная конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность представляет собой внутриклеточная сигнальная последовательность CD28.
[0026] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из описанных выше конструкций к AMC (таких как выделенные конструкции к AMC), конструкция к AMC содержит фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где выделенная конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат, содержащий фрагмент молекулы антитела и эффекторную молекулу. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из лекарственного средства, токсина, радиоактивного изотопа, белка, пептида и нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой лекарственное средство или токсин. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой метку.
[0027] В других вариантах осуществления предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая конструкцию к AMC (такую как выделенная конструкция к AMC) в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления предоставлена клетка-хозяин, экспрессирующая или связанная с конструкцией к AMC или ее полипептидным компонентом. В некоторых вариантах осуществления предоставлена нуклеиновая кислота, кодирующая конструкцию к AMC или ее полипептидный компонент. В некоторых вариантах осуществления предоставлен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления предоставлена эффекторная клетка, экспрессирующая или связанная с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой T-клетку.
[0028] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ детекции клетки, презентирующей комплекс, содержащий пептид AFP и белок MHC I класса на ее поверхности, включающий приведение клетки в контакт с конструкцией к AMC (такой как выделенная конструкция к AMC) в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления, содержащей a) фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) метку, и детекцию присутствия метки на клетке.
[0029] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий введение индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей конструкцию к AMC (такую как выделенная конструкция к AMC) в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с выделенной конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий введение индивидууму эффективного количества эффекторной клетки, экспрессирующей любой из описанных выше CAR к AMC. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой T-клетку. В некоторых вариантах осуществления введение проводят в участке инъекции, ближайшем к первому участку заболевания у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую опухоль, ближайшую к первому участку заболевания. В некоторых вариантах осуществления первый участок заболевания представляет собой AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному или эмбрионально-клеточную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и ингибируют метастазирование. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному.
[0030] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики у индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий: a) введение эффективного количества выделенной конструкции к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления индивидууму; и b) определение уровня метки у индивидуума, где уровень метки выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает AFP-положительным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики у индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий: a) приведение образца, выделенного у индивидуума, в контакт с выделенной конструкцией к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления; и b) определение числа клеток, связанных с выделенной конструкцией к AMC, в образце, где значение числа клеток, связанных с выделенной конструкцией к AMC выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает AFP-положительным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному или эмбрионально-клеточную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и ингибируют метастазирование. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному.
[0031] Также предоставлены способы получения любой из конструкций, описываемых в настоящем описании, промышленных изделий, и наборов, которые являются подходящими для способов, описываемых в настоящем описании.
Краткое описание чертежей
[0032] На фиг. 1 представлена хроматограмма эксклюзионной хроматографии (SEC) комплекса пептид AFP158/HLA-A*02:01 после концентрирования ультрафильтрацией. Правильно свернутые мономеры комплекса пептид/MHC: 212,49 мл; неправильно свернутые агрегаты: 111,27 мл; свободный β2M: 267,21 мл.
[0033] На фиг. 2 представлен анализ SDS-PAGE в восстановительных условиях для определения чистоты комплекса AFP158/HLA-A*02:01, выделяемого после SEC. Основные полосы соответствуют субъединицам HLA-A*02:01 и β2M.
[0034] На фиг. 3 представлены результаты ELISA фаговых клонов на специфическое связывание биотинилированного пептида AFP158/HLA-A*02:01 (Bio-AFP158) в сравнении с биотинилированным контрольным пептидом/HLA-A*02:01 (био-контроль).
[0035] На фиг. 4 представлены результаты анализы связывания FACS фаговых клонов на связывание нагруженных β2M, нагруженных β2M/пептид AFP158 и нагруженных β2M/пептид hTERT клеток T2.
[0036] На фиг. 5 представлены результаты анализы связывания FACS фаговых клонов в отношении перекрестной реактивности с нагруженными β2M/пептид AFP158 человека клетками T2 и нагруженными β2M/пептид AFP158 мыши клетками T2 в сравнении с нагруженными β2M клетками T2.
[0037] На фиг. 6 представлены результаты анализы связывания FACS фагового клона №52 для клеток T2, нагруженных пептидом AFP158, содержащим замены одного аланина в различных положениях.
[0038] На фиг. 7 представлены результаты анализы связывания FACS фаговых клонов на связывание нагруженных β2M пептид AFP158 клеток T2, клеток T2, нагруженных β2M и смесью пептидов, получаемых из нормально экспрессируемых эндогенных белков, или нагруженных β2M клеток T2.
[0039] На фиг. 8 представлен анализ SDS-PAGE по определению молекулярной массы очищенных биспецифических антител против AFP158/MHC.
[0040] На фиг. 9 представлены хроматограммы SEC иллюстративных очищенных биспецифических антител AFP158 для оценки уровня агрегации. Мономер биспецифического антитела к AFP158/MHC: ~15,8 мл.
[0041] На фиг. 10 представлен лизис T-клеток многих линий злокачественных клеток, опосредованный биспецифическими антителами (BsAb) к AFP158/MHC в различных концентрациях. Для каждой концентрация столбики слева направо представляют собой линии клеток HEPG2, SK-HEP1, Hela, HEP3B, Raji, Jurkat, Daudi и K562.
[0042] На фиг. 11 представлено схематическое представление конструкции химерного антигенного рецептора.
[0043] На фиг. 12 представлен цитолиз линий клеток HEPG2, SK-HEP1 и SK-HEP1-MiniG, опосредованный T-клетками, экспрессирующими панель CAR к AFP158/MHC.
[0044] На фиг. 13 представлен лизис панели линий злокачественных клеток положительных или отрицательных по AFP158 и HLA-A*02:01, опосредованный T-клетками, экспрессирующими иллюстративный CAR к AFP158/MHC. В таблице указаны ткань происхождения каждой линии клеток, экспрессия AFP/пептид AFP158, и будет ли клетки экспрессировать аллель HLA-A02.
[0045] На фиг. 14A представлено высвобождение IL-2, IL-4, IL-6 и IL-8 после совместной инкубации трансформированных CAR к AFP158 T-клеток или трансдуцированных в условиях имитации T-клеток с линиями злокачественных клеток, положительных или отрицательных по AFP158 и HLA-A*02:01.
[0046] На фиг. 14B представлено высвобождение IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α после совместной инкубации трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток или трансдуцированных в условиях имитации T-клеток с линиями злокачественных клеток, положительных и отрицательных по AFP158 и HLA-A*02:01.
[0047] На фиг. 15A представлен рост опухоли у мышей с подкожным ксенотрансплантатом HepG2, которых обрабатывали внутривенной инъекцией трансдуцированных в условиях имитации T-клеток или трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток, или оставляли без обработки.
[0048] На фиг. 15B представлен рост опухоли у мышей с подкожным ксенотрансплантатом HepG2, которых обрабатывали внутриопухолевой инъекцией трансдуцированных в условиях имитации T-клеток или трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток, или оставляли без обработки.
[0049] На фиг. 16A представлено изменение испускания фотонов у мышей с интраперитонеальным ксенотрансплантатом мыши HepG2 (HepG2-Luc2), меченным люциферазой на сутки 70 после обработки интраперитонеальной инъекцией трансдуцированных в условиях имитации T-клеток или трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток, или при отсутствии обработки.
[0050] На фиг. 16B представлены изображения испускания фотонов у мышей, несущих опухоль HepG2-Luc2, на сутки 70.
[0051] На фиг. 17 представлен рост опухоли у мышей с подкожным ксенотрансплантатом SK-Hep1-MiniG, которых обрабатывали внутривенной или внутриопухолевой инъекцией трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток или внутривенной инъекцией трансдуцированных в условиях имитации T-клеток.
[0052] На фиг. 18 представлен анализ SDS-PAGE для определения чистоты полноразмерных химерных антител IgG1 мыши к AFP158/MHC.
[0053] На фиг. 19 представлен анализ FACS связывания полноразмерного химерного IgG1 мыши к AFP158/MHC (черная линия) или отрицательного контроля (только вторичное антитело, серая линия) с клетками SK-HEP1-miniG, презентирующими AFP158/HLA-A*02:01.
[0054] На фиг. 20 представлены результаты ELISA для связывания полноразмерного химерного IgG1 мыши к AFP158/MHC с комплексом AFP158/HLA-A*02:01, рекомбинантным белком AFP или свободным пептидом AFP158. Левая панель: дозозависимая кривая полноразмерного химерного IgG1 мыши к AFP158/MHC; правая: OD450 связывания антитела при 100 нг/мл для пептида AFP158/MHC (MHC), белка AFP (AFP) и пептида AFP158 (пептид).
[0055] На фиг. 21 представлены измерения массы тела в течение длительного периода времени (до 35 суток после 1-ой дозы) для мышей, которым инъецировали в опухоль T-клетки с CAR к AFP158 или контроли.
[0056] На фиг. 22 представлена кинетика роста опухоли у мышей с двусторонним подкожным ксенотрансплантатом SK-Hep1-MiniG, которых обрабатывали внутривенной или внутриопухолевой инъекцией трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток, внутриопухолевой инъекцией трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток в комбинации с APC или внутриопухолевой инъекцией трансдуцированных в условиях имитации T-клеток. Внутриопухолевые инъекции инъецировали в опухоли в правой боковой поверхности.
[0057] На фиг. 23 представлено иммуногистохимическое окрашивание CD3 человека в срезах опухоли у мышей с двусторонним подкожным ксенотрансплантатом SK-Hep1-MiniG, которых обрабатывали внутриопухолевой инъекцией трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток в комбинации с APC в опухоли с правой стороны. L, левая опухоль; R, правая опухоль.
[0058] На фиг. 24 представлен анализ проточной цитометрии лимфоцитов периферической крови, трансдуцированных CAR к AFP158; клетки окрашивали тетрамерами AFP158/HLA-A*02:01 и окрашивали совместно с антителом к CD3, антителом к CD4 или антителом к CD8. В качестве контролей включали трансдуцированные в условиях имитации клетки и клетки без окрашивания.
[0059] На фиг. 25 представлен анализ проточной цитометрии дегрануляции трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток после совместного культивирования с клетками-мишенями (HepG2, SK-HEP-1 или SK-Hep1-MiniG); устанавливали дискриминационное окно для трансдуцированных T-клеток по экспрессии CAR и CD8 и окрашивали антителами к CD107a.
[0060] На фиг. 26 представлено распределение CAR на поверхности клеток в клетках, трансдуцированных для экспрессии характерного CAR к AFP158; клетки окрашивали тетрамером AFP158/HLA-A*02:01-PE.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0061] Настоящее изобретение относится к выделенным конструкциям (обозначаемым в настоящем описании как "конструкции к AMC"), которые содержат фрагмент молекулы антитела (обозначаемый в настоящем описании как "фрагмент молекулы антитела к AMC"), который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса (обозначаемым в настоящем описании как "комплекс AFP/MHC I класса" или "AMC"). Конструкции к AMC специфически распознают комплексы AFP/MHC I класса (такие как презентируемые MHC пептиды AFP на поверхности клеток, экспрессирующих AFP), в противоположность циркулирующему белку AFP или свободным пептидам AFP. В случае использования в качестве биспецифических антител к CD3 или содержания в химерном антигенном рецепторе (CAR), экспрессируемым T-клеткой, фрагмент молекулы антитела к AMC специфически перенаправлял T-клетки человека вызывать лизис презентирующих AMC клеток-мишеней, таких как презентирующие AMC злокачественные клетки. Эта стратегия обеспечивает значительное техническое преимущество по сравнению с использованием антител, направленных против белка AFP, которые не могут специфически направленно воздействовать на презентирующие AMC клетки (например, клетки, презентирующие на своей поверхности пептид AFP, связанный с молекулой MHC класса I). Кроме того, в случае слияния с детектируемой группой, фрагмент молекулы антитела к AMC обеспечивает возможность диагностики и прогноза AFP-положительных заболеваний или нарушений с высокой чувствительностью к изменениям числа и распределения презентирующих AMC клеток, вероятно более подходящей мере прогрессирования заболевания, чем циркулирующие уровни AFP.
[0062] С использованием технология фагового дисплея авторы получили многие моноклональные антитела, которые являются специфическими и высокоаффинными к комплексу пептид AFP158 человека/HLA-A*02:01, а также комплексам AFP158/MHC, образуемым в случае других подтипов аллеля HLA-A02. Анализы проточной цитометрии и опосредованной T-клетками цитотоксичности демонстрировали, что антитела распознавали пептид активированные AFP клетки T2 и презентирующие AMC линии злокачественных клеток ограниченным по AFP и HLA-A*02:01 образом. В случае использования в качестве биспецифических антител к CD3 или CAR T-клеток антитела перенаправляли T-клетки человека вызывать лизис AFP-положительных и HLA-A*02:01-положительных злокачественных клеток-мишеней. Данные, предоставленные в настоящем описании, демонстрируют, что антитела к секретируемому антигену злокачественной опухоли в случае комплекса HLA, могут являться эффективными терапевтическими средствами для показаний злокачественной опухоли, таких как показания солидной опухоли.
[0063] Таким образом, настоящее изобретение относится к конструкциям (таким как выделенные конструкции), содержащим фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса. Конструкция может представлять собой, например, полноразмерное антитело к AMC, полиспецифическую молекулу к AMC (такую как биспецифическое антитело к AMC), химерный антигенный рецептор к AMC ("CAR") или иммуноконъюгат к AMC.
[0064] В другом аспекте предоставлены нуклеиновые кислоты, кодирующие конструкции к AMC или часть фрагмента молекулы антитела к AMC конструкций.
[0065] В другом аспекте предоставлены композиции, содержащие конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим AFP-пептид и белок MHC I класса. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, содержащую конструкцию к AMC или эффекторную клетку, экспрессирующую конструкцию к AMC или связанную с ней, (например, T-клетку, экспрессирующую CAR к AMC).
[0066] Также предоставлены способы получения и использования конструкций к AMC (или клеток, экспрессирующих конструкции к AMC или связанных с ними) для лечебных или диагностических целей, а также наборы и промышленные изделия, пригодные для таких способов.
Определения
[0067] Как используют в настоящем описании, "лечение" представляет собой способ получения благоприятного действия или желаемых результатов, включая клинические результаты. Для целей настоящего изобретения благоприятное действие или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, один или более из следующих ниже: ослабление одного или более симптомов, возникающих в результате заболевания, уменьшение тяжести заболевания, стабилизация заболевания (например, профилактика или замедление ухудшения состояния заболевания), профилактика или замедление распространения (например, метастазирования) заболевания, профилактика или замедление рецидива заболевания, отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания, улучшение состояния болезни, обеспечение ремиссии (частичной или полной) заболевания, уменьшение дозы одного или более других лекарственных препаратов, необходимых для лечения заболевания, замедления прогрессирования заболевания, повышения или улучшения качества жизни, увеличения прироста массы и/или увеличения выживаемости. Также в "лечение" входит уменьшение патологического последствия злокачественной опухоли (такой как, например, объема опухоли). В способах по изобретению предусматривают любой один или более из этих аспектов лечения.
[0068] Термины "повторное появление", "рецидив" или "рецидивирующий" относится к возвращению злокачественной опухоли или заболевания после клинической оценки исчезновения заболевания. Диагностику отдаленного метастаза или местного рецидива можно считать рецидивом.
[0069] Термин "рефрактерный" или "резистентный" относится к злокачественной опухоли или заболеванию, которое не реагировало на лечение.
[0070] Как используют в настоящем описании, "активация" по отношению к T-клеткам, относится к состоянию T-клетки, которую подвергли достаточной стимуляции для индукции детектируемой пролиферации клеток. Активация также может быть связана с индуцируемой продукцией цитокинов и детектируемыми эффекторными функциями.
[0071] Термин "фрагмент молекулы антитела" включает полноразмерные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Полноразмерное антитело содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи. Вариабельные области легких и тяжелых цепей обеспечивают связывание антигена. Вариабельные области в обеих цепях, как правило, содержит три высоковариабельные петли, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) (CDR легкой цепи (LC), включая LC-CDR1, LC-CDR2 и LC-CDR3, CDR тяжелой цепи (HC), включая HC-CDR1, HC-CDR2 и HC-CDR3). Границы CDR для антител и антигенсвязывающих фрагментов, описываемых в настоящем описании, можно определять или идентифицировать в соответчики с общепринятыми соглашениями Kabat, Chothia или Al-Lazikani (Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991). Три CDR тяжелых или легких цепей располагаются между фланкированными участками, известными как каркасные области (FR), которые являются в большей степени высококонсервативными, чем CDR и образуют каркас для поддержки гипервариабельных петель. Константные области тяжелых и легких цепей не участвуют в связывании антигена, но обладают различными эффекторными функциями. Антитела относят к классам на основании аминокислотной последовательности константной области их тяжелой цепи. Пять основных классов или изотипов антител представляют собой IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, которые характеризуются наличием тяжелых α-, δ-, ε-, γ- и μ-цепей, соответственно. Несколько из основных классов антител разделяют на подклассы, такие как IgG1 (тяжелая γ1-цепь), IgG2 (тяжелая γ2-цепь), IgG3 (тяжелая γ3-цепь), IgG4 (тяжелая γ4-цепь), IgA1 (тяжелая α1-цепь) или IgA2 (тяжелая α2-цепь).
[0072] Как используют в настоящем описании, термин "антигенсвязывающие фрагмент" относится к фрагменту антитела, включая, например, диатело, Fab, Fab', F(ab')2, фрагмент Fv, стабилизированный дисульфидными связами фрагмент Fv (dsFv), (dsFv)2, биспецифический dsFv (dsFv-dsFv'), стабилизированными дисульфидными связями диатело (ds-диатело), одноцепочечную молекулу антитела (scFv), димер scFv (двухвалентное диатело), полиспецифическое антитело, образованное частью антитела, содержащего одну или более CDR, камелизированное однодоменное антитело, нанотело, доменное антитело, двухвалентное доменное антитело или любой другой фрагмент антитела, который связывается с антигеном, но не содержит полную структуру антитела. Антигенсвязывающий фрагмент способен связываться с тем же антигеном, с которым связывается исходное антитело или фрагмент исходного антитела (например, исходный scFv). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может содержать одну или более CDR из конкретного антитела человека, пересаженного в каркасную область из одного или более различных антител человека.
[0073] Как используют в настоящем описании, термин "эпитоп" относится к конкретной группе атомов или аминокислот на антигене, с которым связывается антитело или фрагмент молекулы антитела. Два антитела или фрагменты молекулы антитела могут связываться с тем же эпитопом в антигене, если они характеризуются конкурентным связыванием с антигеном.
[0074] Как используют в настоящем описании, первый фрагмент молекулы антитела "конкурирует" за связывание с AMC-мишенью со вторым фрагментом молекулы антитела, где первый фрагмент молекулы антитела ингибирует связывание AMC второго фрагмента молекулы антитела по меньшей мере приблизительно на 50% (таким образом как по меньшей мере приблизительно на любые из 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) в присутствии эквимолярной концентрации первого фрагмента молекулы антитела, или наоборот. Высокопроизводительный способ "сортировки" антител в зависимости от их перекрестного конкурентного связывания описан в публикации PCT № WO 03/48731.
[0075] Как используют в настоящем описании, термин "специфически связывается" или "является специфическим к" относится к измеряемым и воспроизводимым взаимодействиям, таким как связывание мишени и антитела или фрагмента молекулы антитела, которое является определяющим фактором наличия мишени в присутствии гетерогенной популяции молекул, включая биологические молекулы. Например, антитело или фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с мишенью (которая может являться эпитопом), представляет собой антитело или фрагмент молекулы антитела, который связывается с такой мишенью с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью, чем он связывается с другими мишенями. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с антигеном, взаимодействует с одной или более антигенных детерминант антигена (например, комплекса пептид AFP/белок MHC I класса) с аффинностью связывания, которая является по меньшей мере приблизительно в 10 раз больше его аффинности связывания с другими мишенями.
[0076] Как используют в настоящем описании, "выделенная" конструкция к AMC относится к конструкции к AM, которая (1) не является связанной с белками, встречающимися в природе, (2) не содержит другие белки из того же источника, (3) экспрессируется клеткой от другого вида, или (4) не встречается в природе.
[0077] Как используют в настоящем описании, термин "выделенная нуклеиновая кислота" предназначен означать нуклеиновую кислоту геномной, кДНК или синтетического происхождения, или некоторое их сочетание, где в силу своего происхождения "выделенная нуклеиновая кислота" (1) не является связанной с полным или частью полинуклеотида, в котором "выделенная нуклеиновая кислота" встречается в природе, (2) является функционально связанной с полинуклеотидом, с которым она не является связанной в природе, или (3) не встречается в природе в виде части более крупной последовательности.
[0078] Как используют в настоящем описании, термин "CDR" или "определяющая комплементарность область" предназначен означать несмежные антигенсвязывающие участки, встречающиеся в вариабельной области обоих полипептидов тяжелых и легких цепей. Эти конкретные области были описаны Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996),, где определения включают перекрывания или подпопуляции аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Однако применение любого определения в отношении CDR антитела или привитых антител антитела или их вариантов предназначен входить в объем термина, как определяют и используют в настоящем описании. Аминокислотные остатки, которые входят в CDR, как определяют по каждой из указанных выше цитируемых ссылок, указаны ниже в таблице 1 как сравнение.
ТАБЛИЦА 1: ОПРЕДЕЛЕНИЯ CDR
Kabat<sup>1</sup>
Chothia<sup>2</sup>
MacCallum<sup>3</sup>
V<sub>H</sub> CDR1
31-35
26-32
30-35
V<sub>H</sub> CDR2
50-65
53-55
47-58
V<sub>H</sub> CDR3
95-102
96-101
93-101
V<sub>L</sub> CDR1
24-34
26-32
30-36
V<sub>L</sub> CDR2
50-56
50-52
46-55
V<sub>L</sub> CDR3
89-97
91-96
89-96
1
Нумерация остатков по номенклатуре Kabat et al., выше
2
Нумерация остатков по номенклатуре Chothia et al., выше
3
Нумерация остатков по номенклатуре MacCallum et al., выше.
[0079] Термин "химерные антитела" относится к антителам, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям в антителах, получаемых от конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, при этом оставшаяся часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, получаемых от другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они обладают биологической активностью по настоящему изобретению (см. патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).
[0080] Термин "полусинтетическое" по отношению к антителу или фрагменту молекулы антитела означает, что антитело или фрагмент молекулы антитела содержит одну или более природных последовательностей и одну или более неприродных (например, синтетических) последовательностей.
[0081] "Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Этот фрагмент состоит из димера одного домена вариабельной области тяжелой и одного домена вариабельной области легкой цепи в тесной нековалентной связи. В результате сворачивания этих двух доменов образуется шесть гипервариабельных петель (3 петли, где каждая из тяжелой и легкой цепей), которые вносят вклад в аминокислотные остатки, обеспечивающие связывания антигена, и придают специфичность связывания антигена антителу. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные к антигену) обладает способностью распознавать и связываться с антигеном, хотя с более низкой аффинностью, чем полный участок связывания.
[0082] "Одноцепочечный Fv", также сокращенно обозначаемый как "sFv" или "scFv", представляет собой фрагменты антител, которые содержат домены VH и VL антитела, соединенные в одну полипептидную цепь. В некоторых вариантах осуществления полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который обеспечивает scFv возможность формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
H
L
H
L
[0083] Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител, получаемым конструированием фрагментов scFv (см. предшествующий параграф), как правило, с короткими линкерами (такими как приблизительно от 5 приблизительно до 10 остатков) между доменами V и V, таким образом, чтобы получать межцепьевое, но не внутрицепьевое спаривание V-доменов, с образованием двухвалентного фрагмента, например, фрагмента, содержащего два антигенсвязывающих участка. Биспецифические диатела являются гетеродимерами двух "перекрестно связанных" фрагментов scFv, в которых домены V и V двух антител содержатся на разных полипептидных цепях. Диатела более подробно описаны, например, в EP 404.097; WO 93/11161 и у Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
[0084] "Гуманизированные" формы не принадлежащих человеку антител (например, грызуна) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, получаемую из не принадлежащего человеку антитела. Преимущественно гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в котором остатки из гипервариабельной области (HVR) реципиента заменяют остатками из гипервариабельной области от не являющихся человеком видов (донорного антитела), таких как мышь, крыса, кролик или не являющий человеком примат, обладающей желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью антитела. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации проводят для дополнительного улучшения характеристик антитела. В основном, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, константной области иммуноглобулина человека. Более подробно см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
[0085] "Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" или "гомология" в отношении полипептидных последовательностей и последовательностей антител, идентифицируемых в настоящем описании, определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными аминокислотным остаткам в полипептиде, сравниваемом после выравнивания последовательностей с учетом любых консервативных замен как часть идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно проводить различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) или MUSCLE. Специалисты в данной области могут определять подходящие параметры для измерения выравнивания, включая алгоритмы, необходимые для получения максимального выравнивания на всем протяжении сравниваемых полноразмерных последовательностей. Однако для целей настоящего описания величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей MUSCLE (Edgar R.C., Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004).
[0086] Термины "Fc-рецептор" или "FcR" используют для описания рецептора, который связывается с Fc-область антитела. В некоторых вариантах осуществления FcR по настоящему изобретению представляет собой FcR, который связывается с антителом IgG (γ-рецептором) и содержит рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые содержат схожие аминокислотные последовательности, которые отличаются преимущественно своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см. обзор M. у Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Термин включает аллотипы, такие как аллотипы FcγRIIIA: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 и/или FcγRIIA-H131. Обзор FcR приведен у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, входят в термин "FcR" в настоящем описании. Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который обеспечивает перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
[0087] Термин "FcRn" относится к неонатальному Fc-рецептору (FcRn). FcRn является структурно аналогичным главному комплексу гистосовместимости (MHC) и состоит из α-цепи, нековалентно связанной с β2-микроглобулином. Обзор многих функций неонатального Fc-рецептора FcRn приведен у Ghetie and Ward (2000), Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn играет роль в пассивной доставке иммуноглобулинов IgG от матери ребенку и регуляции уровней IgG в сыворотке. FcRn может действовать как рецептор спасения, связывающий и транспортирующий подвергающиеся пиноцитозу IgG в интактной форме в клетки и из них, и спасая их от общего пути разрушения.
[0088] "Домен CH1" Fc-области IgG человека (также обозначаемый как "C1" домена "H1"), как правило, располагается приблизительно от аминокислоты 118 приблизительно до аминокислоты 215 (система нумерации EU).
[0089] "Шарнирную область", как правило, определяют как простирающуюся от Glu216 до Pro230 IgG1 человека (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). Шарнирные области других изотипов IgG можно выравнивать с последовательностью IgG1 путем замены первого и последнего остатков цистеина, образующих связи S-S между тяжелыми цепями в тех же положениях.
[0090] "Домен CH2" Fc-области IgG человека (также обозначаемый как "C2" домена "H2"), как правило, располагается приблизительно от аминокислоты 231 приблизительно до аминокислоты 340. Домен CH2 является уникальным тем, что он не связан тесно с другим доменом. Наоборот, два N-связанных разветвленных углеводных цепи располагаются между двумя доменами CH2 интактной молекулы нативного IgG. Предполагали, что углевод может обеспечивать замену спаривания домен-домен и способствовать стабилизации домена CH2. Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985).
[0091] "Домен CH3" (также обозначаемый как "C2" или домен "H3") содержит участок остатков C-конца домена CH2 в Fc-области (например, приблизительно от аминокислотного остатка 341 до C-конца последовательности антитела, как правило, при аминокислотном остатке 446 или 447 IgG).
[0092] "Функциональный фрагмент Fc" обладает "эффекторной функцией" нативной последовательности Fc-области. Иллюстративные "эффекторные функции" включают связывание C1q; обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов на клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Для таких эффекторных функций, как правило, необходимым является объединение Fc-области со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценивать с использованием различных известных в данной области анализов.
d
50
d
50
[0093] Антитело с вариантом Fc IgG с "измеренной" аффинностью связывания FcR или активностью ADCC представляет собой антитело, которое обладает повышенной или пониженной активность связывания FcR (например, FcγR или FcRn) и/или авидностью ADCC, сравнимой с исходным полипептидом или с полипептидом, содержащим нативную последовательность Fc-область. Вариант Fc, который "обладает повышенным связыванием" с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с большей аффинностью (например, с меньшим значением кажущейся K или IC), чем исходный полипептид или нативная последовательность Fc IgG. По определенным вариантам осуществления улучшение связывания по сравнению с исходным полипептидом составляет увеличение приблизительно в 3 раза, такое как приблизительно любое из 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200 или до 500 раз или приблизительно от улучшение связывания от 25% до 1000%. Вариант полипептида, который "обладает пониженным связыванием" с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с меньшей аффинностью (например, в более высоким значением кажущейся K или более высоким значением IC), чем исходный полипептид. Снижение связывания по сравнению с исходным полипептидом может представлять собой снижение связывания приблизительно 40% или более.
in vitro
in vivo
[0094] "Антителозависимая клеточная цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствует на определенных цитотоксических клетках (например, естественных киллерных (NK) клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью, а затем вызывают цитолиз клетки-мишени посредством цитотоксинов. Антитела "вооружают" цитотоксические клетки и является совершенно необходимыми для такого цитолиза. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR гемопоэтическими клетками обобщена в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Для оценки ADCC действия представляющей интерес молекулы можно проводить анализ ADCC, такой как анализ, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, ADCC действие представляющей интерес молекулы можно оценивать , например, на модели на животных, такой как описано у Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
in vitro
in vivo
in vitro
[0095] Полипептид, содержащий вариант Fc-области, который "обладает повышенной ADCC" или опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно, чем полипептид, содержащий Fc IgG дикого типа или исходный полипептид, представляет собой полипептид, который  или  является по существу более эффективным при опосредовании ADCC, когда количества полипептида с вариантом Fc-области и полипептида с Fc-областью дикого типа (или исходного полипептида) в анализе являются по существу одинаковыми. Как правило, такие варианты идентифицируют с использованием любого известного в данной области анализа ADCC, такого как анализы или способы определения ADCC действия, например, на модели на животных и т.д. В некоторых вариантах осуществления вариант является приблизительно от 5 раз приблизительно до 100 раз, например, приблизительно от 25 приблизительно до 50 раз более эффективным при опосредовании ADCC по сравнению с Fc дикого типа (или исходного полипептида).
[0096] "Обусловленная комплементом цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (подходящего подкласса), которые связываются со своим когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано у Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и повышенной или сниженной способностью связывания C1q описаны в патенте США № 6194551B1 и WO99/51642. Содержание этих патентных публикацией конкретно включено в настоящее описание посредством ссылки. См. также Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[0097] Если не указано иное, "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга, и которые кодируют ту же аминокислотную последовательность. Фраза нуклеотидная последовательность, кодирующая белок или РНК, также может включать интроны в тех случаях, когда такая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в некоторых вариант содержать интрон(ы).
[0098] Термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, являющейся результатом экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если промотор оказывает влияние на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК, являются смежными и при необходимости соединяют две кодирующие белок области в той же рамке считывания.
[0099] "Гомологичный" относится к сходству последовательности или идентичности последовательности двух полипептидов или двух молекул нуклеиновой кислоты. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей заняты одинаковым основанием или мономерной субъединицей, аминокислоты например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то молекулы являются гомологичными в этом положении. Процент гомологии двух последовательностей зависит от числа совпадений или гомологичных положений, которые принадлежат двум последовательностям, делимого на число положений, умноженного на 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, то две последовательности являются на 60% гомологичными. В качестве примера, последовательности ДНК ATTGCC и TATGGC обладают 50% гомологией. Как правило, сравнение проводят, когда две последовательности выравнивают для получения максимальной гомологии.
[0100] "Эффективное количество" конструкции к AMC или композиции, как описано в настоящем описании, представляет собой количество, достаточное для обеспечения конкретно указанной цели. "Эффективное количество" можно определять эмпирически и известными способами, относящимися к указанной цели.
[0101] Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству конструкции к AMC или композиции, как описано в настоящем описании, эффективному для "лечения" заболевания или нарушения у индивидуума. В случае злокачественной опухоли терапевтически эффективное количество конструкции к AMC или композиции, как описано в настоящем описании, может уменьшать количество злокачественных клеток; уменьшать размер опухоли или массы; ингибировать (например, замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию злокачественных клеток в периферические органы; ингибировать (например, замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, связанных со злокачественной опухолью. В тех случаях, когда конструкция к AMC или композиция, как описано в настоящем описании, может предотвращать рост и/или вызывать цитолиз существующих злокачественных клеток, оно может являться цитостатическим и/или цитотоксическим. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой ингибирующее рост количество. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое увеличивает продолжительность жизни пациента. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое улучшает продолжительность жизни пациента без прогрессирования заболевания.
[0102] Как используют в настоящем описании, под "фармацевтически приемлемым" или "фармакологически совместимым" подразумевают вещество, которое не является биологически или иным образом нежелательным, например, вещество можно вводить в фармацевтическую композицию, вводимую пациенту, не вызывая каких-либо существенного нежелательного биологического действия или взаимодействия отрицательным образом с любыми другими компонентами композиции, в которой оно содержится. Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты предпочтительно соответствуют требуемым стандартам токсикологических и производственных испытаний и/или включены в Руководство по неактивным ингредиентам (Inactive Ingredient Guide), подготовленным Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США.
[0103] Термин "метка" при использовании в настоящем описании относится к детектируемому соединению или композиции, которую можно конъюгировать непосредственно или опосредованно с фрагментом молекулы антитела к AMC. Метка может являться детектируемой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или в случае ферментативной метки может катализировать химическое изменение субстратное соединение или композицию, которая является детектируемой.
[0104] Следует понимать, что варианты осуществления изобретения, описываемые в настоящем описании, включают "состоящие" и/или "по существу состоящие" варианты осуществления.
[0105] Ссылка на "приблизительно" значение или параметр в настоящем описании включает (и описывает) изменения, которые детектируют по отношению к этому значению или параметру как таковому. Например, описание, указывающее на "приблизительно X", включает описание "X".
[0106] Как используют в настоящем описании, ссылка на "не" значение или параметр, как правило, означает и описывает "отличное" значение или параметр. Например, способ не используют для лечения злокачественной опухоли типа X, означает, что способ используют для лечения злокачественной опухоли типов, отличных от X.
[0107] Как используют в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа определяемых объектов, если из контекста явно не следует иное.
Конструкции к AMC
d
d
d
[0108] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к специфическим к комплексу AFP/MHC I класса конструкциям (конструкциям к AMC), которые содержат фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса ("комплекс AFP/MHC I класса" или "AMC"). Специфичность конструкции к AMC обусловлена фрагментом молекулы антитела к AMC, таким как полноразмерное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с AMC. В некоторых вариантах осуществления ссылка на фрагмент (такой фрагмент молекулы антитела), который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, означает, что фрагмент связывается с AMC с a) аффинностью, которая является по меньшей мере приблизительно в 10 (включая например, по меньшей мере приблизительно любое из 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 или более) раз больше его аффинности связывания для такого полноразмерного AFP, free пептид AFP, белка MHC I класса, не связанного с пептидом, и белка MHC I класса, связанного с непептидом AFP; или b) K не более чем приблизительно 1/10 (такая как не более, чем приблизительно любое из 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 или менее) раз больше его K связывания с каждым из полноразмерного AFP, свободного пептида AFP, белка MHC I класса, не связанного с пептидом, и белка MHC I класса, связанного с непептидом AFP. Аффинность связывания можно определять известными в данной области способами, такими как ELISA, анализ активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) или анализ радиоиммунопреципитации (RIA). K можно определять известными в данной области способами, такими как анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием, например, устройств Biacore, или анализ кинетического исключения (KinExA) с использованием, например, устройств Sapidyne.
[0109] Предусматриваемые конструкции к AMC включают, например, полноразмерные антитела к AMC, полиспецифические (такие как биспецифические) молекулы к AMC, химерные антигенные рецепторы (CAR) к AMC и иммуноконъюгаты к AMC.
d
[0110] Например, в некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC (такая как выделенная конструкция к AMC), содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01 (номер доступа GeneBank: AAO20853). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекула. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC связывается с AMC с K приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любым из 2, 3, 4, 5 или 6) комплексом, содержащим белок MHC I класса и вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная аминокислотная замена). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любым из 2, 3, 4 или 5) комплексом, содержащим пептид AFP и другой подтип белка MHC I класса.
d
[0111] В некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC связывается с AMC с K приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любой из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4, 5 или 6) комплексом, содержащим белок MHC I класса и вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная аминокислотная замена). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4 или 5) комплексом, содержащим пептид AFP и другой подтип белка MHC I класса.
d
[0112] В некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC связывается с AMC с K приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4, 5 или 6) комплексом, содержащим белок MHC I класса и вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная аминокислотная замена). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4 или 5) комплексом, содержащим пептид AFP и другой подтип белка MHC I класса.
[0113] В некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2 содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC связывается с AMC с Kd приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4, 5 или 6) комплексом, содержащим белок MHC I класса и вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная аминокислотная замена). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4 или 5) комплексом, содержащим пептид AFP и другой подтип белка MHC I класса.
[0114] В некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC связывается с AMC с Kd приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4, 5 или 6) комплексом, содержащим белок MHC I класса и вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная аминокислотная замена). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4 или 5) комплексом, содержащим пептид AFP и другой подтип белка MHC I класса.
[0115] В некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MCH I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий (и в некоторых вариантах осуществления состоящий из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержащий (и в некоторых вариантах осуществления состоящую из) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC связывается с AMC с Kd приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4, 5 или 6) комплексом, содержащим белок MHC I класса и вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная аминокислотная замена). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (таким как по меньшей мере любой из 2, 3, 4 или 5) комплексом, содержащим пептид AFP и другой подтип белка MHC I класса.
[0116] В некоторых вариантах осуществления предоставлена конструкция к AMC, содержащая первый фрагмент молекулы антитела к AMC, который конкурирует за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса со вторым фрагментом молекулы антитела к AMC в соответствии с любым из фрагментов антитела к AMC, описываемых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент молекулы антитела к AMC, связывается с тем же или по существу с тем же эпитопом что и второй фрагмент молекулы антитела к AMC. В некоторых вариантах осуществления связывание первого фрагмента молекулы антитела к AMC с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса ингибирует связывание второго фрагмента молекулы антитела к AMC с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса по меньшей мере приблизительно на 70% (таким образом, как по меньшей мере приблизительно на любые из 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) или наоборот. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент молекулы антитела к AMC и второй фрагмент молекулы антитела к AMC перекрестно конкурирует за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса, например, каждый из первого и второго фрагментов молекулы антитела конкурирует друг с другом за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса.
[0117] Различные аспекты более подробно описаны в различных разделах ниже.
Фрагмент молекулы антитела к AMC
[0118] Конструкции к AMC содержат фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса.
[0119] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с AMC, присутствующим на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления на поверхности клетки содержатся аномально высокие уровни AFP. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой злокачественную клетку. В некоторых вариантах осуществления злокачественная клетка находится в солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная клетка представляет собой метастатическую злокачественную клетку.
[0120] В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой ограниченный MHC I класса пептид. В некоторых вариантах осуществления длина пептида AFP составляет приблизительно от 8 приблизительно до 12 (такая как приблизительно любая из 8, 9, 10, 11 или 12) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP получают из AFP человека (hAFP), AFP мыши (mAFP) или AFP крысы (rAFP).
[0121] В некоторых вариантах осуществления пептид AFP получают из hAFP. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) последовательность аминокислот 137-145 hAFP (PLFQVPEPV, SEQ ID NO: 3), аминокислот 158-166 hAFP (FMNKFIYEI, SEQ ID NO: 4, также обозначаемых в настоящем описании как "AFP158"), аминокислот 325-334 hAFP (GLSPNLNRFL, SEQ ID NO: 5) или аминокислот 542-50 hAFP (GVALQTMKQ, SEQ ID NO: 6).
[0122] В некоторых вариантах осуществления пептид AFP получают из mAFP. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP содержит последовательность аминокислот 154-162 mAFP (FMNRFIYEV, SEQ ID NO: 16).
[0123] В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F или HLA-G. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A. В некоторых вариантах осуществления HLA-A представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления HLA-A02 представляет собой HLA-A*02:01.
[0124] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, например, антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, фрагмент Fv, стабилизированный дисульфидными связями фрагмент Fv (dsFv) и одноцепочечную молекулу антитела (scFv). В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим.
[0125] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с N-концевым участком пептида AFP в комплексе. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с C-концевым участком пептида AFP в комплексе. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с серединным участком пептида AFP в комплексе.
[0126] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним комплексом, содержащим пептид AFP и аллельный вариант белка MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления аллельный вариант содержит приблизительно до 10 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) замен аминокислот по сравнению с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления аллельный вариант относится к тому же серотипу, что и белок MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления аллельный вариант относится к другому серотипу по сравнению с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC не дает перекрестной реакции с комплексом, содержащим пептид AFP и какой-либо аллельный вариант белка MHC I класса.
[0127] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним комплексом, содержащим белок MHC I класса и вариант пептида AFP, содержащий одну замену аминокислоты (такую как консервативная замена). В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC не дает перекрестную реакцию с комплексом, содержащим белок MHC I класса и какой-либо вариант пептида AFP.
[0128] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним комплексом, содержащим белок MHC I класса и межвидовой вариант пептида AFP. В некоторых вариантах осуществления например, пептид AFP представляет собой пептид AFP человека, и межвидовой вариант пептида AFP представляет собой его вариант мыши или крысы. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC не дает перекрестной реакции с комплексом, содержащим белок MHC I класса и какой-либо межвидовой вариант пептида AFP.
d
d
[0129] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC (или конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC) связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с аффинностью, которая является по меньшей мере приблизительно в 10 (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 или более) раз большей его аффинности связывания для каждого из полноразмерного AFP, свободного пептида AFP, белка MHC I класса, не связанного с пептидом, и белка MHC I класса, связанного с непептидом AFP. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC (или конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC) связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с K не более чем приблизительно в 1/10 (такой как не более чем приблизительно любая из 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 или менее) раз большей своей K связывания с каждым из полноразмерного AFP, свободного пептида AFP, белка MHC I класса, не связанного с пептидом, и белка MHC I класса, связанного с непептидом AFP.
[0130] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC (или конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC) связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с Kd приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC (или конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC) связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с Kd приблизительно от 1 пМ приблизительно до 250 пМ (такой как приблизительно любую из 1, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 пМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC (или конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела к AMC) связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с Kd приблизительно от 1 нМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любую из 1, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями).
[0131] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с комплексом, содержащим AFP158 (SEQ ID NO: 4) и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01). В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC дополнительно связывается по меньшей мере с одним (включая по меньшей мере приблизительно любой из 2, 3, 4, 5, 6 или 7) из: комплекса, содержащего пептид AFP of SEQ ID NO: 7 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 8 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 9 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP of SEQ ID NO: 10 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 11 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 12 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01), и комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 13 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01).
[0132] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с: комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 4 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 10 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 11 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 12 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01), и комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 13 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01).
[0133] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с: комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 4 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 7 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01), и комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 8 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01).
[0134] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с: комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 4 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 8 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 10 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 11 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 12 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01), и комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 13 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01).
[0135] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с: комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 4 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 7 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01), и комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 13 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01).
[0136] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с: комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 4 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 7 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 9 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01); комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 11 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01), и комплексом, содержащим пептид AFP SEQ ID NO: 13 и белок MHC I класса (такой как HLA-A02, например, HLA-A*02:01).
[0137] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с комплексом, содержащим AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC дает перекрестную реакцию по меньшей мере с одним (включая по меньшей мере приблизительно любой из 2, 3, 4, 5 или 6) из: комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:02 (номер доступа GeneBank: AFL91480), комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:03 (номер доступа GeneBank: AAA03604), комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:05 (номер доступа GeneBank: AAA03603), комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:06 (номер доступа GeneBank: CCB78868), комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:07 (номер доступа GeneBank: ACR55712), и комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:11 (номер доступа GeneBank: CAB56609). В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC дает перекрестную реакцию с каждым из комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:02, комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:03, и комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:11. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC дает перекрестную реакцию с каждым из комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:02, комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:05, комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:06, комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:07, и комплекса, содержащего AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:11.
[0138] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой полусинтетический фрагмент молекулы антитела, содержащий полностью принадлежащие человеку последовательности и одну или более синтетических областей. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой полусинтетический фрагмент молекулы антитела, содержащий полностью принадлежащий человеку вариабельный домен легкой цепи и полусинтетический вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий полностью принадлежащие человек области FR1, HC-CDR1, FR2, HC-CDR2, FR3 и FR4 и синтетическую HC-CDR3. В некоторых вариантах осуществления полусинтетический вариабельный домен тяжелой цепи содержит полностью синтетическую HC-CDR3, содержащую последовательность длиной приблизительно от 5 приблизительно до 25 (такую как приблизительно любую из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полусинтетический вариабельный домен тяжелой цепи или синтетическую HC-CDR3 получают из полусинтетической библиотеки (такой как полусинтетическая библиотека человека), содержащей полностью синтетические HC-CDR3, содержащие последовательность длиной приблизительно от 5 приблизительно до 25 (такой как приблизительно любую из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) аминокислот, где каждая аминокислота в последовательности случайным образом выбрана из стандартных аминокислот человека минус цистеин. В некоторых вариантах осуществления длина синтетической HC-CDR3 составляет приблизительно от 10 приблизительно до 19 (таких как приблизительно любую из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19) аминокислоты.
[0139] Фрагменты молекулы антитела к AMC в некоторых вариантах осуществления содержат конкретные последовательности или определенные варианты таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления замены аминокислот в варианте последовательности по существу не снижают способность фрагмента молекулы антитела к AMC связываться с AMC. Например, можно проводить изменения, которые значительно не снижают аффинность связывания с AMC. Также предусматривают изменения, которые значительно улучшают аффинность связывания с AMC или оказывают влияние на некоторые другие свойства, такие как специфичность и/или перекрестная реактивность с соответствующими вариантами AMC.
[0140] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту.
[0141] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту.
[0142] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту.
[0143] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту.
[0144] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR; где X может представлять собой любую аминокислоту.
[0145] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту. Последовательности CDR, указанные в настоящем описании приведены в таблице 2 ниже.
ТАБЛИЦА 2
Консенсусная HC-CDR1
SEQ ID NO: 87
G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W
Консенсусная HC-CDR2
SEQ ID NO: 88
I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T
Консенсусная HC-CDR3
SEQ ID NO: 89
A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D
Консенсусная LC-CDR1
SEQ ID NO: 120
S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y
Консенсусная LC-CDR3
SEQ ID NO: 121
Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S
[0146] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0147] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119.
[0148] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0149] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119.
[0150] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0151] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, где замены аминокислот находятся в HC-CDR1 или HC-CDR2; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, где замены аминокислот находятся в HC-CDR1 или HC-CDR2.
[0152] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119. Последовательности HC-CDR, указанные в настоящем описании, приведены в таблице 3 ниже, и LC-CDR, указанные в настоящем описании приведены в таблице 4 ниже.
ТАБЛИЦА 3
17 HC-CDR1 SEQ ID NO: 57
GYTFTSYG
17 HC-CDR2 SEQ ID NO: 67
ISAYNGNT
17 HC-CDR3 SEQ ID NO: 77
ARYQDWWYLGQFDQ
33 HC-CDR1 SEQ ID NO: 58
VSSNSAAWN
33 HC-CDR2 SEQ ID NO: 68
YRSKWYN
33 HC-CDR3 SEQ ID NO: 78
ARGSYYSGRYDA
44 HC-CDR1 SEQ ID NO: 59
GGTFSSYA
44 HC-CDR2 SEQ ID NO: 69
IIPIFGTA
44 HC-CDR3 SEQ ID NO: 79
AREIRGYYYYYGMDV
48 HC-CDR1 SEQ ID NO: 60
GFTFDDYA
48 HC-CDR2 SEQ ID NO: 70
ISWNSGRI
48 HC-CDR3 SEQ ID NO: 80
ARADDYGAPYYYYGMDV
50 HC-CDR1 SEQ ID NO: 61
GGSISSSNW
50 HC-CDR2 SEQ ID NO: 71
IYHSGST
50 HC-CDR3 SEQ ID NO: 81
ATGYGGYFDY
52 HC-CDR1 SEQ ID NO: 62
GYTFTSYG
52 HC-CDR2 SEQ ID NO: 72
ISAYNGNT
52 HC-CDR3 SEQ ID NO: 82
ARDSYYYYYGMDV
61 HC-CDR1 SEQ ID NO: 63
GYSFPNYW
61 HC-CDR2 SEQ ID NO: 73
IDPGDSYT
61 HC-CDR3 SEQ ID NO: 83
ARYYVSLVDI
76 HC-CDR1 SEQ ID NO: 64
GFTFSNAW
76 HC-CDR2 SEQ ID NO: 74
IRSKAYGGTT
76 HC-CDR3 SEQ ID NO: 84
ARDGLYSSSWYDSDY
79 HC-CDR1 SEQ ID NO: 65
GFTFDDYA
79 HC-CDR2 SEQ ID NO: 75
ISWNSGSI
79 HC-CDR3 SEQ ID NO: 85
AKDIHSGSYYGLLYYAMDV
17-13 HC-CDR1 SEQ ID NO: 66
GYTFTSYG
17-13 HC-CDR2 SEQ ID NO: 76
ISAYNGNT
17-13 HC-CDR3 SEQ ID NO:86
ARFQDWWYLGQFDQ
ТАБЛИЦА 4
17 LC-CDR1 SEQ ID NO: 90
GSDVGVYYY
17 LC-CDR2 SEQ ID NO: 100
DVG
17 LC-CDR3 SEQ ID NO: 110
ASYTNRNSLGYV
33 LC-CDR1 SEQ ID NO: 91
SGSIASNY
33 LC-CDR2 SEQ ID NO: 101
EDN
33 LC-CDR3 SEQ ID NO: 111
QSYDSSTVV
44 LC-CDR1 SEQ ID NO: 92
NIGTKS
44 LC-CDR2 SEQ ID NO: 102
YDT
44 LC-CDR3 SEQ ID NO: 112
QVWDSSSDHPV
48 LC-CDR1 SEQ ID NO: 93
SSNIGAGYD
48 LC-CDR2 SEQ ID NO: 103
GNS
48 LC-CDR3 SEQ ID NO: 113
QSYDSSLSGSV
50 LC-CDR1 SEQ ID NO: 94
NIGSKS
50 LC-CDR2 SEQ ID NO: 104
YDS
50 LC-CDR3 SEQ ID NO: 114
QVWDSSSDHVV
52 LC-CDR1 SEQ ID NO: 95
TGAVTSGHY
52 LC-CDR2 SEQ ID NO: 105
DAS
52 LC-CDR3 SEQ ID NO: 115
LLSYSDALV
61 LC-CDR1 SEQ ID NO: 96
SSDVGGYNY
61 LC-CDR2 SEQ ID NO: 106
DVN
61 LC-CDR3 SEQ ID NO: 116
SSYTTGSRAV
76 LC-CDR1 SEQ ID NO: 97
SSNIGNNY
76 LC-CDR2 SEQ ID NO: 107
DNN
76 LC-CDR3 SEQ ID NO: 117
GTWDGSLYTML
79 LC-CDR1 SEQ ID NO: 98
SSNIGAGYD
79 LC-CDR2 SEQ ID NO: 108
GNS
79 LC-CDR3 SEQ ID NO: 118
QSYDSSLSGSGV
17-13 LC-CDR1 SEQ ID NO: 99
GSDVGVYYY
17-13 LC-CDR2 SEQ ID NO: 109
DVD
17-13 LC-CDR3 SEQ ID NO:119
ASYTNRNSLGYV
[0153] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности.
[0154] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36.
[0155] Вариабельные домены тяжелых и легких цепей можно комбинировать в различных попарных комбинациях для получения ряда фрагментов молекулы антитела к AMC.
[0156] Например, в некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0157] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0158] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110.
[0159] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0160] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0161] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111.
[0162] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0163] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0164] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112.
[0165] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0166] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0167] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113.
[0168] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0169] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0170] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114.
[0171] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0172] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0173] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115.
[0174] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0175] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0176] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116.
[0177] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0178] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0179] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117.
[0180] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0181] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0182] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118.
[0183] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот.
[0184] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR.
[0185] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119.
[0186] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность указанную в ID NO: 27.
[0187] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28.
[0188] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29.
[0189] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30.
[0190] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31.
[0191] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32.
[0192] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33.
[0193] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 34, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 34.
[0194] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 25, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 25 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35.
[0195] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (включая, например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36.
[0196] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC конкурирует за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса со вторым фрагментом молекулы антитела к AMC в соответствии с любым из фрагментов молекулы антитела к AMC, описываемым в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC связывается с тем же или по существу с тем же эпитопом, как второй фрагмент молекулы антитела к AMC. В некоторых вариантах осуществления связывание фрагмента молекулы антитела к AMC с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса ингибирует связывание второго фрагмента молекулы антитела к AMC с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса по меньшей мере приблизительно на 70% (таким образом как по меньшей мере приблизительно на любое из 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) или наоборот. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC и второй фрагмент молекулы антитела к AMC перекрестно конкурируют за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса, например, каждый из фрагментов молекулы антитела конкурирует друг с другом за связывание с комплексом-мишенью AFP/MHC I класса.
Полноразмерные антитела к AMC
[0197] Конструкции к AMC в некоторых вариантах осуществления представляют собой полноразмерные антитела содержащие фрагмент молекулы антитела к AMC (также обозначаемый в настоящем описании как "полноразмерное антитело к AMC"). В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело представляет собой моноклональное антитело.
[0198] В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело к AMC содержит последовательность Fc из иммуноглобулина, такого как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело к AMC содержит последовательность Fc IgG, такого как любого из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело к AMC содержит последовательность Fc иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело к AMC содержит последовательность Fc иммуноглобулина мыши. В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело к AMC содержит последовательность Fc, которую преобразовывали или иным образом изменяли таким образом, чтобы она обладала повышенной эффекторной функцией антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC).
[0199] Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC, содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0200] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит Fc последовательность IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0201] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC, содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89), и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0202] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC, содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0203] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR, и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0204] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC, содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0205] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC, содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности; и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0206] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полноразмерное антитело к AMC, содержащее a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36; и b) Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит последовательность Fc IgG1 мыши.
[0207] В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело к AMC связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с Kd приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления полноразмерное антитело к AMC связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с Kd приблизительно от 1 пМ приблизительно до 250 пМ (таких как приблизительно любую из 1, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 пМ, включая любые диапазоны между этими значениями).
Полиспецифические молекулы к AMC
[0208] Конструкции к AMC в некоторых вариантах осуществления содержат полиспецифическую молекулу к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, и второй связывающий фрагмент молекулы (такой как второй антигенсвязывающий фрагмент). В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая молекула к AMC содержит фрагмент молекулы антитела к AMC и второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0209] Полиспецифические молекулы представляют собой молекулы, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными антигенами или эпитопами (например, биспецифические антитела обладают специфичностью связывания с двумя антигенами или эпитопами). Также предусматривают полиспецифические молекулы более чем с двумя валентностями и/или специфичностями. Например, триспецифические антитела можно получать. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). Следует принимать во внимание, что специалист в данной области может выбирать подходящие признаки отдельных полиспецифических молекул, описываемых в настоящем описании для объединения друг с другом с получением полиспецифической молекулы к AMC по изобретению.
[0210] Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая (например, биспецифическая) молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй связывающий фрагмент молекулы (такой как антигенсвязывающий фрагмент молекулы). В некоторых вариантах осуществления второй связывающий фрагмент молекулы специфически связывается с комплексом, содержащим другой пептид AFP, связанный с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP, связанный с другим белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий фрагмент молекулы специфически связывается другим эпитопом на комплексе, содержащим пептид AFP, связанный с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий фрагмент молекулы специфически связывается с другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий фрагмент молекулы специфически связывается с антигеном на поверхности клетки, такой как цитотоксическая клетка. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий фрагмент молекулы специфически связывается с антигеном на поверхности лимфоцита, такого как T-клетка, NK клетка, нейтрофил, моноцит, макрофаг или дендритная клетка. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий фрагмент молекулы специфически связывается с эффекторной T-клеткой, такой как цитотоксическая T-клетка (также известная как цитотоксический T-лимфоцит (CTL) или киллерная T-клетка).
[0211] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD3. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с агонистическим эпитопом CD3ε. Термин "агонистический эпитоп", как используют в настоящем описании, означает (a) эпитоп, который при связывании полиспецифической молекулы, необязательно при связывании нескольких полиспецифических молекул на той же клетке, позволяет указанным полиспецифическим молекулам активировать путь передачи сигналов TCR и индуцировать активацию T-клеток, и/или (b) эпитоп, который состоит только из аминокислотных остатков эпсилон-цепи CD3 и является доступным для связывания полиспецифическими молекулами, когда презентируется в его естественном состоянии на T-клетках (например, окруженный TCR, CD3γ-цепью и т.д.), и/или (c) эпитоп, который при связывании полиспецифической молекулы не приводит к стабилизации пространственного положения CD3ε относительн CD3γ.
[0212] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с антигеном на поверхности эффекторной клетки, включая, например, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, CD16a, CD56, CD68 и GDS2D.
[0213] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с компонентом системы комплемента, таким как C1q. C1q представляет собой субъединицу ферментативного комплекса C1, который активирует систему комплемента сыворотки.
[0214] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с Fc-рецептором. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается c Fcγ-рецептором (FcγR). FcγR может представлять собой FcγRIII, присутствующий на поверхности естественных киллерных клеток или одного из FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIBI, FcγRIIB2 и FcγRIIIB, присутствующего на поверхности макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и/или дендритных клеток. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fc-область или ее функциональный фрагмент. "Функциональный фрагмент", как используют в этом контексте, относится к фрагменту Fc-области антитела, который все еще способен связываться с FcR, в частности с FcγR, с достаточной специфичностью и аффинностью, чтобы позволять несущей FcγR эффекторной клетке, в частности макрофагу, моноциту, нейтрофилу и/или дендритной клетке вызывать цитолиз клетки-мишени посредством цитотоксического лизиса или фагоцитоза. Функциональный Fc-фрагмент способен конкурентно ингибировать связывание исходного, полноразмерного Fc-участка с FcR, такого как активирующий FcγRI. В некоторых вариантах осуществления функциональный Fc-фрагмент сохраняет по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% аффинности к активирующему FcγR. В некоторых вариантах осуществления Fc-область или ее функциональный фрагмент представляет собой усиленную Fc-область или ее функциональный фрагмент. Термин "усиленная Fc-область", как используют в настоящем описании, относится к Fc-области, которую модифицировали для усиления опосредованных Fc-рецептором эффекторных функций, в частности антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC) и опосредованного антителом фагоцитоза. Это можно получать так, как известно в данной области, например, изменяя Fc-область таким образом, который приводит к повышенной аффинности, для актвиации рецептора (например, FcγRIIIA (CD16A), экспрессируемого естественными киллерными (NK) клетками), и/или пониженного связывания с ингибирующим рецептором (например, FcγRIIB1/B2 (CD32B)). В других вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с FcR в частности с FcγR с достаточной специфичностью и аффинностью, позволяя несущей FcγR эффекторной клетке в частности макрофага, моноцита, нейтрофила и/или дендритной клетке вызывать цитолиз клетки-мишени посредством цитотоксического лизиса или фагоцитоз.
50
in vitro
[0215] В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая молекула к AMC обеспечивает цитолиз презентирующих AMC клеток-мишени и/или могут эффективно перенаправлять CTL, чтобы лизировать презентирующие AMC клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления для полиспецифической (например, биспецифической) молекулы к AMC по настоящему изобретению демонстрируют EC в диапазоне от 10 до 500 нг/мл, и она способна индуцировать перенаправленный лизис приблизительно 50% клеток-мишени посредством CTL в отношении CTL к клеткам-мишеням приблизительно от 1:1 приблизительно до 50:1 (таком как приблизительно от 1:1 приблизительно до 15:1 или приблизительно от 2:1 приблизительно до 10:1).
[0216] В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая (например, биспецифическая) молекула к AMC способна перекрестно связывать стимулированные или нестимулированные CTL и клетку-мишень, таким образом, что клетка-мишень лизируется. Это обеспечивает преимущество, которое заключается в том, что для осуществления желаемого действия полиспецифической молекулы к AMC не является необходимым образование специфических к мишени клонов T-клеток или общей презентации антигена дендритными клетками. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая молекула к AMC по настоящему изобретению способна перенаправлять CTL для лизиса клеток-мишеней в отсутствие других активирующих сигналов. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент полиспецифической молекулы к AMC специфически связывается с CD3 (например, специфически связывается с CD3ε), и для перенаправления CTL на лизис клеток-мишеней путь передачи сигналов через CD28 и/или IL-2 не является необходимым.
+
-
-
+
[0217] Специалисту в данной области известны способы измерения предпочтения полиспецифической молекулы к AMC одновременно связываться с двумя антигенами (например, антигенами на двух различных клетках). Например, когда второй связывающий фрагмент молекулы специфически связывается с CD3, полиспецифическую молекулу к AMC можно приводить в контакт со смесью CD3/AFP клеток и CD3/AFP клеток. Количество положительных к полиспецифической молекуле к AMC отдельных клеток и количество клеток, перекрестно связывающихся полиспецифическими молекулами к AMC, можно затем оценивать микроскопией или активируемой флуоресценцией сортировкой клеток (FACS), как известно в данной области.
[0218] Например, в некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с комплексом, содержащим другой пептид AFP, связанный с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP, связанный с другим белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с другим эпитопом на комплексе, содержащем пептид AFP, связанный с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с антигеном на поверхности клетки, таким как презентирующая AMC клетка. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с антигеном на поверхности клетки, которая не экспрессирует AFP. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с антигеном на поверхности цитотоксической клетки. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с антиген на поверхности лимфоцита, такого как T-клетка, NK клетка, нейтрофил, моноцит, макрофаг или дендритная клетка. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с антигеном на поверхности эффекторной T-клетки, такой как цитотоксическая T-клетка. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с антигеном на поверхности эффекторной клетки, включая, например, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, CD16a, CD56, CD68 и GDS2D. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент молекулы антитела. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент молекулы антитела человека, гуманизированные или полусинтетический фрагмент молекулы антитела. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая молекула к AMC дополнительно содержит по меньшей мере один (такой по меньшей мере приблизительно любой из 2, 3, 4, 5 или более) дополнительных антигенсвязывающих фрагментов молекулы.
[0219] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, и b) второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0220] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0221] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0222] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и b) второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0223] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR; и b) второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0224] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; и b) второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0225] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности; и b) второй scFv.
[0226] В некоторых вариантах осуществления предоставлена полиспецифическая молекула к AMC, содержащая a) фрагмент молекулы антитела к AMC, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36; и b) второй антигенсвязывающий фрагмент.
[0227] В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая молекула к AMC представляет собой, например, диатело (Db), одноцепочечное диатело (scDb), тамдемное scDb (Tandab), линейное димерное scDb (LD-scDb), кольцевое димерное scDb (CD-scDb), ди-диатело, тандемный scFv, тандемный ди-scFv (например, привлекающий T-клетки биспецифический активатор), тандемный три-scFv, три(а)боди, биспецифический Fab2, диминиантитело, тетратело, слияние scFv-Fc-scFv, переориентирующееся антитело с двойной аффинностью (DART), антитело с двойным вариабельным доменом (DVD), IgG-scFab, scFab-ds-scFv, Fv2-Fc, слияние IgG-scFv, "антитело замок на причале" (DNL), антитело выступ во впадину (KiH) (биспецифический IgG, получаемый технологией KiH), DuoBody (биспецифический IgG, получаемый технологией Duobody), гетеромультимерное антитело или гетероконъюгированное антитело. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая молекула к AMC представляет собой тандемный scFv (например, тандемный ди-scFv, такой как привлекающий T-клетки биспецифический активатор).
Тандемное scFv
[0228] Полиспецифическая молекула к AMC в некоторых вариантах осуществления представляет собой тандемный scFv, содержащий первый scFv, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, и второй scFv (также обозначаемый в настоящем описании как "полиспецифическое антитело к AMC с тандемным scFv"). В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело к AMC с тандемным scFv дополнительно содержит по меньшей мере один (такой как по меньшей мере приблизительно любой из 2, 3, 4, 5 или более) дополнительный scFv.
[0229] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй scFv. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с комплексом, содержащим другой пептид AFP, связанный с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP, связанный с другим белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с другим эпитопом на комплексе, содержащем пептид AFP, связанный с белком MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном на поверхности клетки, таким как презентирующая AMC клетка. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном на поверхности клетки, который не экспрессируется AFP. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном на поверхности цитотоксической клетки. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном на поверхности лимфоцита, таким как T-клетка, NK клетка, нейтрофил, моноцит, макрофаг или дендритная клетка. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном на поверхности эффекторной T-клетки, такой как цитотоксическая T-клетка. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном на поверхности эффекторной клетки, включая, например, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, CD16a, CD56, CD68 и GDS2D. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело к AMC с тандемным scFv дополнительно содержит по меньшей мере один (такой как по меньшей мере приблизительно любой из 2, 3, 4, 5 или более) дополнительный scFv.
[0230] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, и b) второй scFv.
[0231] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, которое специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащее i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй scFv.
[0232] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй scFv.
[0233] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и b) второй scFv.
[0234] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR; и b) второй scFv.
[0235] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; и b) второй scFv.
[0236] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности; и b) второй scFv.
[0237] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36; и b) второй scFv.
[0238] В некоторых вариантах осуществления предоставлено полиспецифическое (например, биспецифическое) антитело к AMC с тандемным scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй scFv, где полиспецифическое антитело к AMC с тандемным scFv представляет собой тандемный ди-scFv или тандемный три-scFv. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело к AMC с тандемным scFv представляет собой тандемный ди-scFv. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело к AMC с тандемным scFv представляет собой привлекающий T-клетки биспецифический активатор.
[0239] Например, в некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном на поверхности эффекторной T-клетки, такой как цитотоксическая T-клетка. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с антигеном, выбранным, например, из группы, состоящей из CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L и HVEM. В некоторых вариантах осуществления второй scFv специфически связывается с агонистическим эпитопом на антигене на поверхности T-клетки, где связывание второго scFv с антигеном усиливает активацию T-клетки. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0240] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0241] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0242] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0243] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0244] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR, и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0245] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0246] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0247] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, и b) второй scFv, который специфически связывается с антигеном на поверхности T-клетки.
[0248] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такая как приблизительно любая из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0249] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такая как приблизительно любая из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0250] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такая как приблизительно любая из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0251] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такую как приблизительно любую из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0252] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такую как приблизительно любую из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0253] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такую как приблизительно любую из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0254] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такую как приблизительно любую из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотную последовательность GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0255] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (ттакую как приблизительно любую из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0256] В некоторых вариантах осуществления предоставлено биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv, содержащее a) первый scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, и b) второй scFv, который специфически связывается с CD3ε. В некоторых вариантах осуществления первый scFv является слитым со вторым scFv через связь пептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления длина пептидного линкера составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 (такую как приблизительно любую из 5, 10, 15 или 20, включая любые диапазоны между этими значениями) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер содержит (и в некоторых вариантах осуществления состоит из) аминокислотной последовательности GGGGS. В некоторых вариантах осуществления первый scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления второй scFv принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим. В некоторых вариантах осуществления первый scFv и второй scFv принадлежат человеку, являются гуманизированными или полусинтетическими.
[0257] В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с Kd приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ (такой как приблизительно любая из 0,1 пМ, 1,0 пМ, 10 пМ, 50 пМ, 100 пМ, 500 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело к AMC с тандемным ди-scFv связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, с Kd приблизительно от 1 нМ приблизительно до 500 нМ (таких как приблизительно любой из 1, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 нМ, включая любые диапазоны между этими значениями).
Химерный антигенный рецептор (CAR) и эффекторные клетки с CAR
[0258] Конструкция к AMC в некоторых вариантах осуществления представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, (также обозначаемая в настоящем описании как "CAR к AMC"). Также предоставлена эффекторная клетка с CAR (например, T-клетка), содержащая CAR, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, (также обозначаемая в настоящем описании как "эффекторная клетка с CAR к AMC", например, "T-клетка с CAR к AMC").
[0259] CAR к AMC содержит a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) внутриклеточный сигнальный домен. Трансмембранный домен может содержаться между внеклеточным доменом и внутриклеточным доменом.
[0260] Между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом CAR к AMC или между внутриклеточным доменом и трансмембранным доменом CAR к AMC может содержаться спейсерный домен. Спейсерный домен может представлять собой любой олиго- или полипептид, который функционирует так, чтобы связывать трансмембранный домен с внеклеточным доменом или внутриклеточным доменом в полипептидной цепи. Спейсерный домен может содержать приблизительно до 300 аминокислот, включая, например, приблизительно от 10 приблизительно до 100 или приблизительно от 25 приблизительно до 50 аминокислот.
[0261] Трансмембранный домен можно получать из природного или синтетического источника. В случае, когда источник является природным, домен можно получать из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Представляющие интерес трансмембранные области в настоящем изобретении можно получать (например, содержит по меньшей мере трансмембранную область(и)) из α, β, δ или γ-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может являться синтетическим, в этом случае он может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых вариантах осуществления триплет фенилаланина, триптофана и валина можно найти на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления короткий олиго- или полипептидный линкер длиной, например, приблизительно от 2 и приблизительно до 10 (такой как приблизительно любой из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) аминокислот может образовывать связь между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом CAR к AMC. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой дублет глицин-серин.
[0262] В некоторых вариантах осуществления используют трансмембранный домен, который естественным образом связан с одной из последовательностей во внутриклеточном домене CAR к AMC (например, если внутриклеточный домен CAR к AMC содержит костимулирующую последовательность CD28, трансмембранный домен CAR к AMC получают из трансмембранного домена CD28). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен можно выбирать или модифицировать заменой аминокислот для устранения связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или отличных мембранных белков поверхности, чтобы сводить к минимуму взаимодействия с другими представителями рецепторного комплекса.
[0263] Внутриклеточный сигнальный домен CAR к AMC обеспечивает активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую помещали CAR к AMC. Эффекторная функция T-клетки, например, может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин "внутриклеточный сигнальный домен" относится к участку белка, который трансдуцирует сигнал эффекторной функции и направляет клетку к выполнению специализированной функции. При этом, как правило, можно применять полный внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях необязательно использовать полную цепь. В тех случаях, когда используют укороченный участок внутриклеточного сигнального домена, такой укороченный участок можно использовать вместо интактной цепи при условии, что он трансдуцирует сигнал эффекторной функции. Таким образом, термин "внутриклеточная сигнальная последовательность" предназначен включать любой укороченный участок внутриклеточного сигнального домена, достаточный для трансдукции сигнала эффекторной функции.
[0264] Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR к AMC по изобретению включают цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR) и корецепторы, которые совместно действуют, инициируя передачу сигнала после активации антигенного рецептора, а также любое производное или вариант таких последовательностей и любую синтетическую последовательность, которая обладает аналогичной функциональной способностью.
[0265] Известно, что сигналы, генерируемые только TCR, являются недостаточными для полной активации T-клетки, и что необходимым также является вторичный или костимулирующий сигнал. Таким образом, активация T-клетки может быть опосредована двумя отдельными классами внутриклеточной сигнальной последовательности: сигнальными последовательностями, которые инициируют антигензависимую первичную активацию посредством TCR (первичные сигнальные последовательности), и сигнальными последовательностями, которые действуют в зависимости от антигена, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (костимулирующие сигнальные последовательности).
[0266] Первичные сигнальные последовательности регулируют первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом или ингибирующим образом. Первичные сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Конструкции CAR к AMC в некоторых вариантах осуществления содержат один или более ITAM.
[0267] Примеры ITAM, содержащие первичные сигнальные последовательности, которые представляют интерес по изобретению, включают сигнальные последовательности, получаемые из TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d.
[0268] В некоторых вариантах осуществления CAR к AMC содержит первичную сигнальную последовательность, получаемую из CD3ζ. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ саму по себе или в комбинации с любой другой желаемой внутриклеточной сигнальной последовательностью(ями), пригодными в отношении CAR к AMC по изобретению. Например, внутриклеточный домен CAR к AMC может содержать внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и костимулирующую сигнальную последовательность. Костимулирующая сигнальная последовательность может представлять собой участок внутриклеточного домена костимулирующей молекулы, включая, например, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, функционально-связанный антиген лимфоцитов 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83, и т.п.
[0269] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR к AMC содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR к AMC содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR к AMC содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточные сигнальные последовательности CD28 и 4-1BB.
[0270] Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0271] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0272] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0273] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); b) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0274] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0275] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0276] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; b) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0277] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0278] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36; b) внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен способен активировать иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичную сигнальную последовательность и костимулирующую сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первичная сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная последовательность содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0279] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01.
[0280] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0281] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0282] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0283] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0284] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0285] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0286] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0287] В некоторых вариантах осуществления предоставлен CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0288] В настоящем описании также предоставлены эффекторные клетки (такие как лимфоциты, например, T-клетки), экспрессирующие CAR к AMC.
[0289] Также предоставлен способ получения эффекторной клетки, экспрессирующей CAR к AMC, где способ включает введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR к AMC, в эффекторную клетку. В некоторых вариантах осуществления введение вектора в эффекторную клетку включает трансдукцию эффекторной клетки вектором. В некоторых вариантах осуществления введение вектора в эффекторную клетку включает трансфекцию эффекторной клетку вектором. Трансдукцию или трансфекцию вектора в эффекторную клетку можно проводить любым известным в данной области способ.
Иммуноконъюгаты
[0290] Конструкции к AMC в некоторых вариантах осуществления содержат иммуноконъюгат, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, присоединенный к эффекторной молекуле (также обозначаемый в настоящем описании как "иммуноконъюгат к AMC"). В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой терапевтическое средство, такое как терапевтическое средство против злокачественной опухоли, которое является цитотоксическим, цитостатическим или иным образом обеспечивает определенный терапевтический эффект. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой метку, которая может генерировать детектируемый сигнал непосредственно или опосредованно.
[0291] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC и терапевтическое средство (также обозначаемый в настоящем описании как "конъюгат антитело-лекарственное средство" или "ADC"). В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой токсин, который является цитотоксическим, цитостатическим или иным образом предотвращает или снижает способность клеток-мишеней разделяться. Использование ADC для местной доставки цитотоксических или цитостатических средств, например, лекарственных средств для того, чтобы вызывать цитолиз или ингибировать опухолевые клетки при лечении злокачественной опухоли (Syrigos and Epenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999); Niculescu-Duvaz and Springer, Adv. Drg. Del. Rev. 26:151 -172 (1997); патент США № 4975278) обеспечивает направленную доставку лекарственной молекулы в клетки-мишени и внутриклеточное накопление в ней, в случае, когда системное введение таких неконъюгированных терапевтических средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток, а также клетки-мишени, которые необходимо устранять (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986):603-605 (1986); Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475- 506). Таким образом достигают максимальной эффективности с минимальной токсичностью. Следует отметить, что вследствие того, что большая часть нормальных клеток не презентирует AMC на своей поверхности, они не могут связываться иммуноконъюгатом к AMC, и защищены от цитолитического действия токсина или других терапевтических средств.
[0292] Терапевтические средства, используемые в иммуноконъюгатах к AMC, включают, например, дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187 (1986)). Токсины, используемые в иммуноконъюгатах к AMC, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительный токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al., J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)) и калихимицин (Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)). Токсины могут осуществлять свои цитотоксические и цитостатические эффекты посредством механизмов, включая связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некторые цитотоксические лекарственные средства, как правило, становятся неактивными или менее актвиными при конъюгации с большими антителами или лигандами белкового рецептора.
Pseudomonas aeruginosa
Aleurites fordii
Phytolaca americana
Momordica charantia
Sapaonaria officinalis
[0293] Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают, например, A-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (из ), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модецина, α-сарцин, белки , диантиновые белки, белки  (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор из , курцин, кротин, ингибитор из , гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецины. См., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 года.
[0294] В настоящем описании также предусматривают иммуноконъюгаты к AMC фрагмента молекулы антитела к AMC и одного или более низкомолекулярных токсинов, таких как калихимицин, майтанзиноиды, доластатины, ауростатины, трихотецен и CC1065, и производные этих токсинов, которые обладают активностью токсинов.
[0295] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий терапевтическое средство, которое обладает активностью внутри клетки. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC интернализуется, и терапевтическое средство представляет собой цитотоксин, который блокирует синтез белка клетки, таким образом, приводя к гибели клеток. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой цитотоксин, содержащий полипептид, обладающий инактивирущей рибосомы активностью, включая, например, гелонин, буганин, сапорин, рицин, A-цепь рицина, бриодин, дифтерийный токсин, рестриктоцин, экзотоксин A Pseudomonas и их варианты. В некоторых вариантах осуществления, в случае, когда терапевтическое средство представляет собой цитотоксин, содержащий полипептид, обладающий инактивирующей рибосомы активностью, иммуноконъюгат к AMC должен интернализоваться при связывании с клеткой-мишенью для того, чтобы белок являлся цитотоксическим для клеток.
[0296] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий терапевтическое средство, которое действует, вызывая разрыв ДНК. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство, которое действует, вызывая разрыв ДНК, например, выбрано из группы, состоящей из ендииновых (например, калихимицина и эсперамицина) и неендииновых низкомолекулярных средств (например, блеомицина, метидиумпропил-EDTA-Fe(II)). Другие терапевтические средства против злокачественной опухоли, пригодные по настоящему изобретению, включают без ограничения даунорубицин, доксорубицин, дистамицин A, цисплатин, митомицин C, эктинэсайдины, дуокармицин/CC-1065 и блеомицин/пеплеомицин.
[0297] Настоящее изобретение дополнительно предусматривает иммуноконъюгат к AMC, образованный фрагментом молекулы антитела к AMC и соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).
[0298] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC содержит средство, которое действует, разрушая тубулин. Такие средства могут включать, например, ризоксин/майтазин, паклитаксел, винкристин и винбластин, колхицин, ауристатин, доластатин, 10 MMAE и пелорузид A.
[0299] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC содержат алкилирующее средство, включая, например, асалей NSC 167780, AZQ NSC 182986, BCNU NSC 409962, бусульфан NSC 750, карбоксифталатоплатина NSC 271674, CBDCA NSC 241240, CCNU NSC 79037, CHIP NSC 256927, хлорамбуцил NSC 3088, хлорзотоцин NSC 178248, цисплатин NSC 119875, кломезон NSC 338947, цианоморфолинодоксорубицин NSC 357704, циклодисон NSC 348948, диангидрогалактит NSC 132313, фтордопан NSC 73754, гепсульфам NSC 329680, гикантон NSC 142982, мелфалан NSC 8806, метил CCNU NSC 95441, митомицин C NSC 26980, митозоламид NSC 353451, азотистый иприт NSC 762, PCNU NSC 95466, пиперазин NSC 344007, пиперазиндион NSC 135758, пипоброман NSC 25154, порфиромицин NSC 56410, спирогидантоин иприт NSC 172112, тероксирон NSC 296934, тетраплатин NSC 363812, тиотепа NSC 6396, триэтиленмеламин NSC 9706, азотистый урацилиприт NSC 34462 и Yoshi-864 NSC 102627.
[0300] В некоторых вариантах осуществления часть терапевтического средства против злокачественной опухоли иммуноконъюгата к AMC по настоящему изобретению может содержать антимитотическое средство, включая без ограничения, alloколхицин NSC 406042, галихондрин B NSC 609395, колхицин NSC 757, производное колхицина NSC 33410, доластатин 10 NSC 376128 (NG-производное ауристатина), майтазин NSC 153858, ризоксин NSC 332598, таксол NSC 125973, производное таксола NSC 608832, тиоколхицин NSC 361792, тритилцистеин NSC 83265, винбластина сульфат NSC 49842 и винкристина сульфат NSC 67574.
[0301] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC содержит ингибитор топоизомеразы I, включая без ограничения, камптотецин NSC 94600, камптотецин, Na соль NSC 100880, аминокамптотецин NSC 603071, производное камптотецина NSC 95382, производное камптотецина NSC 107124, производное камптотецина NSC 643833, производное камптотецина NSC 629971, производное камптотецина NSC 295500, производное камптотецина NSC 249910, производное камптотецина NSC 606985, производное камптотецина NSC 374028, производное камптотецина NSC 176323, производное камптотецина NSC 295501, производное камптотецина NSC 606172, производное камптотецина NSC 606173, производное камптотецина NSC 610458, производное камптотецина NSC 618939, производное камптотецина NSC 610457, производное камптотецина NSC 610459, производное камптотецина NSC 606499, производное камптотецина NSC 610456, производное камптотецина NSC 364830, производное камптотецина NSC 606497 и морфолинодоксорубицин NSC 354646.
[0302] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC содержит ингибитор топоизомеразы II, включая без ограничения, доксорубицин NSC 123127, амонафид NSC 308847, m-AMSA NSC 249992, производное антрапиразола NSC 355644, пиразолоакридин NSC 366140, бизантрен HCL NSC 337766, даунорубицин NSC 82151, дезоксидоксорубицин NSC 267469, митоксантрон NSC 301739, меногарил NSC 269148, N,N-дибензилдауномицин NSC 268242, оксантразол NSC 349174, рубидазон NSC 164011, VM-26 NSC 122819 и VP-16 NSC 141540.
[0303] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC содержит антиметаболит РНК или ДНК, включая без ограничения, L-аланозин NSC 153353, 5-азацитидин NSC 102816, 5-фторурацил NSC 19893, ацивицин NSC 163501, производное аминоптерина NSC 132483, производное аминоптерина NSC 184692, производное аминоптерина NSC 134033, антифолат NSC 633713, антифолат NSC 623017, растворимый антифолат Бейкера NSC 139105, дихлораллил лавсом NSC 126771, бреквинар NSC 368390, фторафур (пролекарство) NSC 148958, 5,6-дигидро-5-азацитидин NSC 264880, метотрексат NSC 740, производное метотрексата NSC 174121, N-(фосфоноацетил)-L-аспартат (PALA) NSC 224131, пиразофурин NSC 143095, триметрексат NSC 352122, 3-HP NSC 95678, 2'-дезокси-5-фторуридин NSC 27640, 5-HP NSC 107392, α-TGDR NSC 71851, глицинат афидиколина NSC 303812, ара-C NSC 63878, 5-аза-2'-дезоксицитидин NSC 127716, β-TGDR NSC 71261, циклоцитидин NSC 145668, гуаназол NSC 1895, гидроксимочевина NSC 32065, инозингликодиальдегид NSC 118994, макбецин Il NSC 330500, пиразолоимидазол NSC 51143, тиогуанин NSC 752 и тиопурин NSC 755.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
[0304] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC содержит высокорадиоактивный атом. Ряд радиоактивных изотопов доступен для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают At,I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu.
[0305] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC можно конъюгировать с "рецептором" (таким как стрептавидин) для использования для предварительной направленной доставки в опухоль, где конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту после удаления несвязанного конъюгата из кровяного русла с использованием просветляющего средства, а затем введения "лиганда" (например, авидина), который является конъюгированным с цитотоксическим средством (например, радионуклеотида).
[0306] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC может содержать фрагмент молекулы антитела к AMC, конъюгированный с активирующим пролекарством ферментом. В некоторых таких вариантах осуществления активирующий пролекарство фермент преобразует пролекарство (например, химиотерапевтическое средство на основе пептидила, см. WO 81/01145) в активное лекарственное средство, такое как лекарственное средство против злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления такие иммуноконъюгаты к AMC являются пригодными для антителозависимой опосредованной ферментом пролекарственной терапии ("ADEPT"). Ферменты, которые можно конъюгировать с антителом, включают, но не ограничиваются ими, щелочные фосфатазы, которые являются пригодными для преобразования содержащих фосфат пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазы, который являются пригодными для преобразования содержащих сульфат пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминазу, которая является пригодной для преобразования нетоксического 5-фторцитозина в лекарственное средство против злокачественной опухоли, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза из серрации, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины B и L), которые являются пригодными для преобразования содержащих пептид пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, которые являются пригодными для преобразования пролекарств, которые содержат заместители D-аминокислот; расщепляющие углеводы ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, которые являются пригодными для преобразования гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамазу, которая является пригодной для преобразования лекарственных средств, дериватизированных β-лактамами, в свободные лекарственные средства, и пенициллинамидазы, такие как пенициллин-V-амидаза и пенициллин-G-амидаза, которые являются пригодными для преобразования лекарственных средств, дериватизированных по аминным азотам феноксиацетильными или фенилацетильными группами, соответственно, в свободные лекарственные средства. В некоторых вариантах осуществления ферменты можно ковалентно связывать с фрагментами молекул антител хорошо известными в данной области технологиями рекомбинантной ДНК. См., например, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).
[0307] В некоторых вариантах осуществления терапевтическая часть иммуноконъюгатов к AMC может представлять собой нуклеиновую кислоту. Нуклеиновые кислоты, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими антисмысловую РНК, гены или другие полинуклеотиды, включая аналоги нуклеиновой кислоты, такие как тиогуанин и тиопурин.
in vivo
3
14
32
35
123
125
131
99
123
[0308] Настоящее изобретение дополнительно относится к иммуноконъюгатам к AMC, содержащим фрагмент молекулы антитела к AMC, присоединенный к эффекторной молекуле, где эффекторная молекула представляет собой метку, которая может непосредственно или опосредованно генерировать детектируемый сигнал. Такие иммуноконъюгаты к AMC можно использовать для исследовательских или диагностически применений, таких как для детекции  злокачественной опухоли. Предпочтительно метка может производить непосредственно или опосредованно детектируемый сигнал. Например, метка может представлять собой рентгеноконтрастный или радиоактивный изотоп, такой как H, C, P, S, I, I, I; флуоресцентное (флуорофор) или хемилюминесцентное (хромофор) соединение, такое как флуоресцеинизотиоцианат, родамин или люциферин; фермент, такой как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или пероксидаза хрена; визуализирующее средство или ион металла. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Tc или I, или спиновую метку для визуализации ядерным магнитным резонансом (ЯМР) (также известным как магнитно-резонансная визуализация, MRI), таким как цирконий 89, йод 123, йод 131, индий 111, фтор 19, углерод 13, азот 15, кислород 17, гадолиний, марганец или железо. Цирконий 89 может входить в состав комплекса с различными хелатирующими средствами на основе металлов и являться конъюгированным с антителами, например, для визуализации PET (WO 2011/056983).
[0309] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат к AMC можно детектировать опосредованно. Например, вторичное антитело, которое является специфическим к иммуноконъюгату к AMC и содержит детектируемую метку, можно использовать для детекции иммуноконъюгата к AMC.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
3
14
32
35
123
125
131
[0310] Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, и b) эффекторную молекулу. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула является ковалентно связанным с фрагментом молекулы антитела к AMC. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой терапевтическое средство, выбранное, например, из группы, состоящей из лекарственного средства, токсина, радиоактивного изотопа, белка, пептида и нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой терапевтическое средство против злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство против злокачественной опухоли является химиотерапевтическим. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство против злокачественной опухоли представляет собой высокорадиоактивный атом, выбранный, например, из группы, состоящей из At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P и Pb. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой метку, которая может генерировать детектируемый сигнал непосредственно или опосредованно. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой радиоактивный изотоп, выбранный, например, из группы, состоящей из H, C, P, S, I, I и I. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
3
14
32
35
123
125
131
[0311] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, и b) эффекторную молекулу. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула является ковалентно связанной с фрагментом молекулы антитела к AMC. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой терапевтическое средство, выбранное, например, из группы, состоящей из лекарственного средства, токсина, радиоактивного изотопа, белка, пептида и нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой терапевтическое средство против злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство против злокачественной опухоли является химиотерапевтическим. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство против злокачественной опухоли представляет собой высокорадиоактивный атом, выбранный, например, из группы, состоящей из At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P и Pb. В некоторых вариантах осуществления эффекторная молекула представляет собой метку, которая может генерировать детектируемый сигнал непосредственно или опосредованно. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой радиоактивный изотоп, выбранный, например, из группы, состоящей из H, C, P, S, I, I и I. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим.
[0312] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) эффекторную молекулу.
[0313] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса содержащее i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, и b) эффекторную молекулу.
[0314] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содрежащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и b) эффекторную молекулу.
[0315] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR, и b) эффекторную молекулу.
[0316] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119, и b) эффекторную молекулу.
[0317] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и b) эффекторную молекулу.
[0318] В некоторых вариантах осуществления предоставлен иммуноконъюгат к AMC, содержащий a) фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, b) эффекторную молекулу.
Нуклеиновые кислоты
[0319] Также предусматривают молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие конструкции к AMC или фрагменты молекулы антитела к AMC. В некоторых вариантах осуществления предоставлена нуклеиновая кислота (или набор нуклеиновых кислот), кодирующих полноразмерное антитело к AMC. В некоторых вариантах осуществления предоставлена нуклеиновая кислота (или набор нуклеиновых кислот), кодирующих полиспецифическую молекулу к AMC (например, полиспецифическое антитело к AMC, биспецифическое антитело к AMC или антитело к AMC на основе привлекающего T-клетки биспецифического активатора) или ее полипептидный участок. В некоторых вариантах осуществления предоставлена нуклеиновая кислота (или набор нуклеиновых кислот), кодирующая CAR к AMC. В некоторых вариантах осуществления предоставлена нуклеиновая кислота (или набор нуклеиновых кислот), кодирующая иммуноконъюгат к AMC, или ее полипептидный участок.
[0320] Настоящее изобретение также включает варианты этих последовательностей нуклеиновой кислоты. Например, варианты включают нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими конструкции к AMC или фрагменты молекулы антитела к AMC по настоящему изобретению по меньшей мере в условиях гибридизации с умеренной жесткостью.
[0321] Настоящее изобретение также относится к векторам, в которые вводят нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
[0322] В кратком изложении, экспрессию конструкции к AMC (например, CAR к AMC) или ее полипептидного участка природной или синтетической нуклеиновойя кислотой, кодирующей конструкцию к AMC, или ее полипептидным участком можно получать введением нуклеиновой кислоты в подходящий экспрессирующий вектор, таким образом, что нуклеиновая кислота является функционально связанной с 5'- и 3'-регуляторными элементами, включая, например, промотор (например, специфический к лимфоцитам промотор) и 3'-нетранслируемую область (UTR). Векторы могут являться подходящими для репликации и интеграции в эукариотические клетки-хозяева. Характерные клонирующие и экспрессирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициирующие последовательности и промоторы, пригодные для регуляции экспрессии желаемой последовательности нуклеиновой кислоты.
[0323] Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению также можно использовать иммунизации и генотерапии нуклеиновой кислотой с использованием стандартных протоколов доставки генов. Способы доставки генов известны в данной области. См., например, патенты США № 5399346, 5580859, 5589466, полностью введенные в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к генотерапевтическому вектору.
[0324] Нуклеиновую кислоту можно клонировать в различные типы векторов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включая, но, не ограничиваясь ими, плазмиду, фагмиды, производное фага, вирус животного и космиду. Представляющие особый интерес векторы включают экспрессирующие векторы, реплицирующиеся векторы, образующие зонд векторы и секвинирующие векторы.
[0325] Кроме того, экспрессирующий вектор можно предоставлять в клетку в форме вирусного вектора. Технология вирусного вектора хорошо известна в данной области и описана, например, у Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), и в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые являются пригодными в качестве векторов, включают, но не ограничиваются ими, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. В основном подходящий вектор содержит участок начала репликации, функциональный по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, подходящие участки узнавания рестрикционных эндонуклеаз и один или более селектируемых маркеров (см., например, WO 01/96584; WO 01/29058 и патент США № 6326193).
in vivo
ex vivo
[0326] Был разработан ряд систем на основе вирусов для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, ретровирусы обеспечивают подходящую платформу для системы доставки генов. Выбранный ген можно вводить в вектор и упаковывать в ретровирусные частицы с применением известных в данной области способов. Рекомбинантный вирус можно затем выделять и доставлять в клетки индивидуума  или . В данной области известен ряд систем на основе ретровирусов. В некоторых вариантах осуществления используют аденовирусные векторы. В данной области известен ряд аденовирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления используют лентивирусные векторы. Векторы, получаемые из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими средствами для получения длительного переноса генов, т.к. они обеспечивают длительную, стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы обладают дополнительным преимуществом по сравнению с векторами, получаемыми из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мышей, которое заключается в том, что они могут трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также обладают дополнительным преимуществом, которое заключается в низкой иммуногенности.
[0327] Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту начала транскрипции. Как правило, они располагаются в области 30-110 п.н. выше участка начала, хотя недавно было показано, что ряд промоторов также содержит функциональные элементы ниже участка начала. Расстояние между промоторными элементами часто является переменным, таким образом, что функция промотора сохраняется, когда элементы переставляют или двигают относительно друг друга. В тимидинкиназном (tk) промоторе расстояние между промоторными элементами можно увеличивать до 50 п.н., перед тем как активность начинает снижаться.
[0328] Один из примеров подходящего промотора представляет собой последовательность предраннего промотора цитомегаловируса (CMV). Эта последовательность промотора представляет собой последовательность сильного конститутивного промотора, способную направлять высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней. Другой пример подходящего промотора представляет собой ростовой фактор элонгации-1α (EF-1α). Однако также можно использовать другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но, не ограничиваясь ими, ранний промотор вируса обезьян 40 (SV40), вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза птиц, предранний промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, но, не ограничиваясь ими, промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. Кроме того, изобретение не ограничено использованием конститутивных промоторов. Также предусматривают индуцибельные промоторы в качестве части изобретения. Использование индуцибельного промотора обеспечивает молекулярный переключатель, способный включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он является функционально связанным, когда такая экспрессия является желательной, или выключать экспрессию, когда экспрессия не является желательной. Примеры индуцибельных промоторов включают, но не ограничиваются ими, промотор металлотионина, промотор глюкокортикоида, промотор прогестерона и промотор тетрациклина.
[0329] Для оценки экспрессии полипептида или его участков экспрессирующий вектор, вводимый в клетку, также может содержать ген селективного маркера или репортерный ген, или оба для облегчения идентификации и отбора экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые должны являться трансфицированными или инфицированными посредством вирусных векторов. В других аспектах отдельный участок ДНК может нести селектируемый маркер, и его можно использовать в способе котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. Пригодные селектируемые маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т.п.
[0330] Репортерные гены используют для идентификации возможно трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательности. В основном, репортерный ген представляет собой ген, который не содержится или не экспрессируется организмом-реципиентом или тканью-реципиентом и кодирует полипептид, экспрессия которого можно обнаруживать по определенному легко определяемому свойству, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена оценивают в подходящий момент времени после того, как ввели ДНК в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, β-галактозидазу, хлорамфеникол-ацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tel et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Подходящие экспрессирующие системы хорошо известны, и их можно получать с использованием известных техник или получать коммерческим путем. В основном, конструкцию с минимальной 5'-фланкирующей областью, для которой демонстрируют наиболее высокий уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные области можно связывать с репортерным геном и использовать для оценки средств на способность модулировать управляемую промотором транскрипцию.
[0331] В данной области известны способы введения и экспрессии генов в клетку. Что касается экспрессирующего вектора, вектор можно легко вводить в клетку-хозяина, например, млекопитающую, бактериальную, дрожжевую или клетку насекомого любым способом в данной области. Например, экспрессирующий вектор можно трансфицировать в клетку-хозяина физическими, химическими или биологическими средствами.
[0332] Физические способы введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и т.п. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). В некоторых вариантах осуществления введение полинуклеотида в клетку-хозяина проводят трансфекцией фосфатом кальция.
[0333] Биологические способы введения представляющего интерес полинуклеотида в клетку-хозяина включают использование ДНК- и РНК-векторов. Вирусные векторы и особенно ретровирусные векторы стали наиболее широко используемым способом введения генов в клетки млекопитающих, например, в клетки человека. Другие вирусные векторы можно получать из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса 1, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т.п. См., например, патенты США № 5350674 и 5585362.
in vitro
in vivo
[0334] Химические средства введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают системы коллоидальных дисперсий, такие как комплексы макромолекул, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, содержащие эмульсии "масло-в-воде", мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Иллюстративная коллоидная система для применения в качестве носителя для доставки  и  представляет собой липосому (например, искусственную мембранную везикулу).
in vitro
ex vivo
in vivo
[0335] В случае, когда используют систему доставки не на основе вирусов, иллюстративный носитель представляет собой липосому. Для введения нуклеиновых кислот в клетку-хозяина (,  или ) предусматривают использование липидных составов. В другом аспекте нуклеиновая кислота может быть связана с липидом. Нуклеиновую кислоту, связанную с липидом, можно инкапсулировать в водном внутреннем содержимом липосомы, чередуемым с липидным бислоем липосомы, присоединенном к липосоме посредством связывающей молекулы, которая является связанной с липосомой и олигонуклеотидом, заключенным в липосому, образует комплекс с липосомой, является диспергированной в растворе, содержащем липид, смешанной с липидом, объединенной с липидом, содержащейся в виде суспензии в липиде, содержащейся или образующей комплекс с мицеллой, или иным образом связанной с липидом. Связанные с липидом, липид/ДНК- или липид/экспрессирующим вектором композиции не являются ограниченными какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут содержаться в бислойной структуре в виде мицелл или с "разрушенной" структурой. Они также могут просто быть рассеянными в растворе, возможно, образуя агрегаты, которые не являются однородными по размеру или форме. Липиды представляют собой жировые вещества, которые могут быть природными или синтетическими липидами. Например, липиды включают жировые капли, которые естественным образом встречаются в цитоплазме, а также класс соединений, который включает длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, амино спирты и альдегиды.
[0336] Независимо от способа, используемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина или иным образом подвергания клетки действию ингибитора по настоящему изобретению, для подтверждения присутствия последовательности рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине можно проводить различные анализы. Такие анализы включают, например, "молекулярные биологические" анализы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как саузерн- и "нозерн"-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; "биохимические" анализы, такие как детекция присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, иммунологическими способами (виды ELISA и вестерн-блоттинга) или анализами, описываемыми в настоящем описании для идентификации средств, входящих в объем изобретения.
Белки AFP и MHC I класса
[0337] Альфа-фетопротеин (AFP, α-фетопротеин; также обозначаемый как альфа-1-фетопротеин, альфа-фетоглобулин или фетальный белок альфа) представляет собой гликопротеин длиной 591 аминокислота, который кодируется у людей геном AFP. Ген AFP локализован на плече q хромосомы 4 (4q25). AFP является основным белком плазмы, продуцируемым желточным мешком и печенью во время развития плода. Полагают, что он является эмбриональной формой сывороточного альбумина. AFP связывает медь, никель, жирные кислоты и билирубин и встречается в мономерной, димерной и тримерной формах. AFP является преобладающим белком плазмы, встречающимся у плода человека. Уровни в плазме быстро снижаются после рождения, но начинают уменьшаться в пренатальный период, начиная с конца первого триместра. Нормальные уровни взрослого организма, как правило, устанавливаются к возрасту от 8 до 12 месяцев. Функция AFP у взрослых людей неизвестна; однако у грызунов он связывает эстрадиол, предотвращая транспортировку этого гормона через плаценту к плоду. Основная функция этого заключается в предотвращении вирилизации плода женского пола. Вследствие того, что AFP человека не связывает эстроген, его функция у людей остается менее очевидной.
[0338] Некоторые из заболеваний, при которых AFP повышается у индивидуума, включают, например, печеночноклеточную карциному/гепатому, эмбрионально-клеточную опухоль, метастатический рак печени, эмбриональную грыжу, дефект нервной трубки, опухоль желточного мешка и атаксия атаксия-телеангиэктазия.
[0339] Белки MHC I класса относятся к одному из двух основных классов молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) (где другой является MHC II класса) и встречаются практически в каждой ядросодержащей клетке организма. Их функция заключается в предоставлении фрагментов белков из клетки T-клеткам; здоровые клетки будут проигнорированы, тогда как клетки, содержащие чужеродные белки подвергнутся атаке иммунной системой. Вследствие того, что белки MHC I класса презентируют пептиды, получаемые из цитозольных белков, путь презентации MHC I класса часто называют цитозольным или эндогенным путем. Молекулы MHC I класса связывают пептиды, образуемые в основном в результате разрушения цитозольных белков протеасомой. Затем комплекс MHC I:пептид встраивается в плазматическую мембрану клетки. Пептид является связанным с внеклеточной частью молекулы MHC I класса. Таким образом, функция MHC I класса заключается в предоставлении внутриклеточных белков цитотоксическим T-клеткам (CTL). Однако MHC I класса также презентирует пептиды, образуемые экзогенными белками, в процессе, известном как перекрестная презентация.
[0340] Белки MHC I класса состоят из двух полипептидных цепей, α- и β2-микроглобулина (β2M). Две цепи являются нековалентно связанными в результате взаимодействия b2m и домена α3. Только α-цепь является полиморфной и кодируется геном HLA, тогда как субъединица b2m не является полиморфной и кодируется геном микроглобулинаβ-2. Домен α3 является трансмембранным и взаимодействует с корецептором CD8 T-клеток. Взаимодействие α3-CD8 удерживает молекулу MHC I на месте, тогда как T-клеточный рецептор (TCR) на поверхности цитотоксической T-клетки связывается со своим гетеродимерным лигандом α1-α2 и проверяет связанный пептид на антигенность. Домены α1 и α2 сворачиваются с образованием бороздки для связывания пептидов. Белки MHC I класса связывают пептиды, длина которых составляет 8-10 аминокислот.
[0341] Гены лейкоцитарного антигена человека (HLA) являются вариантами генов MHC. Три основных белка MHC I класса у людей представляют собой HLA-A, HLA-B и HLA-C, при этом 3 минорных класса представляют собой HLA-E, HLA-F и HLA-G. HLA-A входит в число генов у людей с быстро эволюционирующей кодирующей последовательностью. На декабрь 2013 года было известно 2432 аллелей HLA-A, кодирующих 1740 активных белков и 117 молчащих белков. Ген HLA-A локализован на коротком плече 6 хромосомы и кодирует большую, α-цепь, составляющую HLA-A. Изменение α-цепи HLA-A является важным для функции HLA. Такое изменение способствует генетическому разнообразию в популяции. Вследствие того, что каждый HLA обладает разной аффинностью к пептидам определенных структур, большее разнообразие HLA означает большее разнообразие антигенов, "презентируемых" на клеточной поверхности, что увеличивает вероятность того, что подгруппа популяции будет устойчивой к любому данному чужеродному агенту. Это снижает вероятность того, что единственный патоген обладает способностью полностью уничтожить популяцию человека. У каждого индивидуума может экспрессироваться до двух типов HLA-A, где один тип из каждого принадлежит его родителям. Некоторые индивидуумы наследуют тот же HLA-A от обоих родителей, что снижает их индивидуальное разнообразие HLA; однако большая часть индивидуумов получает две различные копии HLA-A. Этот же паттерн прослеживается для всех групп HLA. Другими словами, у индивидуума может экспрессироваться только один или два из 2432 известных аллелей HLA-A.
[0342] Все аллели получают по меньшей мере четырехзначную классификацию, например, HLA-A*02:12. A означает, к какому аллелю принадлежит ген HLA. Существует много аллелей HLA-A, таким образом, такая классификация по серотипу облегчает распределение по категориям. Следующая пара цифр указывает на это присваивание. Например, HLA-A*02:02, HLA-A*02:04 и HLA-A*02:324 всея являются представителями серотипа A2 (обозначаемого префиксом *02). Эта группа является основным фактором, обеспечивающим совместимость HLA. Все числа после этого невозможно определять серотипированием, и их обозначают по результатам секвенирования генов. Вторая группа цифр указывает на то, какой белок HLA продуцируется. Их присваивают в порядке открытия, и на декабрь 2013 года известно 456 различных белков HLA-A02 (с присвоенными названиями от HLA-A*02:01 до HLA-A*02:456). Возможное сокращенное название HLA включает оба вида этой информации. Каждое расширение за эти пределы означает изменение нуклеотида, которое может или не может изменять белок.
[0343] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где белок MHC I класса представляет собой HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, или HLA-G. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A, HLA-B, или HLA-C. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-B. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-C. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74 или HLA-A80. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой любой из HLA-A*02:01-555, такой как HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02:17, HLA-A*02:18, HLA-A*02:19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22 или HLA-A*02:24. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. HLA-A*02:01 экспрессируется у 39-46% всех представителей европеоидной расы и, таким образом, является подходящим выбором белка MHC I класса для использования в настоящем изобретении.
[0344] Пептиды AFP, пригодные для использования при получении фрагментов молекулы антитела к AMC, можно определять, например, на основании наличия связывающих HLA-A*02:01 мотивов и участков расщепления протеасом и иммунных протеасом с использованием компьютерных моделей прогнозирования, известных специалистам в данной области. Для прогнозирования участков связывания MHC, такие модели включают, но не ограничиваются ими, IEDB (Vita et al., The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 2014 Oct 9. pii: gku938), ProPred1 (описанную более подробно у Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237, 2001) и SYFPEITHI (см. Schuler et al., SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. в Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93, 2007).
[0345] После идентификации подходящих пептидов, можно проводить пептидный синтез в соответствии с хорошо известными специалистам в данной области протоколами. Вследствие их относительно небольшого размера пептиды по изобретению можно непосредственно синтезировать в растворе или на твердой подложке в соответствии с общепринятыми техниками пептидного синтеза. Различные автоматические синтезаторы являются коммерчески доступными, и их можно использовать в соответствии с известными протоколами. Синтез пептидов в жидкой фазе стал общепринятым способом крупномасштабного производства синтетических пептидов и, таким образом, является подходящим альтернативным способом получения пептидов по изобретению (см. например, Solid Phase Peptide Synthesis by John Morrow Stewart and Martin et al. Application of Almez-mediated Amidation Reactions to Solution Phase Peptide Synthesis, Tetrahedron Letters Vol. 39, pages 1517-1520, 1998).
[0346] Активность связывания пептидов-кандидатов AFP можно тестировать с использованием линии клеток T2 с дефектом процессинга антигена, которая увеличивает экспрессию HLA-A при стабилизации пептидом в презентирующей антиген бороздке. Клетки T2 сенсибилизируют пептидом-кандидатом в течение периода времени, достаточного для стабилизации экспрессии HLA-A на клеточной поверхности, которую можно измерять любыми известными в данной области способами, такими как иммуноокрашиванием флуоресцентно-меченным моноклональным антителом, специфическим к HLA-A (например, BB7.2) с последующим анализом активируемой флуоресценцией сортировкой клеток (FACS).
Получение антител к AMC и фрагментов молекул антитела к AMC
[0347] В некоторых вариантах осуществления антитело к AMC или фрагмент молекулы антитела к AMC представляет собой моноклональное антитело. Моноклональные антитела можно получать, например, гибридомными способами, такими как способы, описанные Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) и Sergeeva et al., Blood, 117(16):4262-4272, способами фагового дисплея, описываем в настоящем описании и в примерах ниже, или способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567).
in vitro
[0348] В гибридомном способе хомяка, мышь или другое подходящее животное-хозяина, как правило, иммунизируют иммунизирующим средством для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфически связываются с иммунизирующим средством. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать . Иммунизирующее средство может включать полипептид или слитый белок представляющего интерес белка или комплекс, содержащий по меньшей мере две молекулы, такие как комплекс, содержащий пептид AFP и белок MHC I класса. Как правило, используют лимфоциты периферической крови ("PBL"), если желательными являются клетки, относящиеся к человеку по своему происхождению, или используют клетки селезенки или клетки лимфоузлов, если желательными являются не принадлежащие человеку источник клеток млекопитающих. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной линией клеток с использованием подходящего средства, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки. См., например, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Иммортализованные линии клеток, как правило, представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности миеломные клетки грызуна, крупного рогатого скота и человека. Как правило, применяют линии миеломных клеток крысы или мыши. Гибридомные клетки можно культивировать в подходящей среде для культивирования, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, которые ингибируют рост или выживаемость неслитых иммортализованных клеток. Например, если родительские клетки не содержат фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT или HPRT), среда для культивирования гидбридом, как правило, содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("среда HAT"), которая предотвращает рост клеток с недостаточностью HGPRT.
[0349] В некоторых вариантах осуществления иммортализованные линии клеток эффективно сливаются, поддерживают стабильную экспрессию антитела на высоком уровне посредством выбранных продуцирующих антитело клеток, и являются чувствительными к среде, такой как среда HAT. В некоторых вариантах осуществления иммортализованные линии клеток представляют собой линии миеломы мышей, которые можно получать, например, от Центра распределения клеток имени Солка, Сан-Диего, Калифорния (the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California) и Американской коллекции типовых культур, Манассас, Виргиния (the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia). Для получения моноклональных антител человека также описаны линии миеломных клеток человека и гетеролинии миеломных клеток мыши-человека. Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987), pp. 51-63.
in vitro
[0350] Затем, среду для культивирования, в которой культивируют гибридомные клетки можно анализировать на содержание моноклональных антител, направленных на полипептид. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, можно определять иммунопреципитацией или посредством анализа связывания, таким как радиоиммунологический анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). В данной области известны такие техники и анализы. Аффинность связывания моноклонального антитела можно определять, например, анализом Скэтчарда Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
in vivo
[0351] После идентификации желаемых гибридомных клеток, клоны можно субклонировать путем серийных разведений и растить стандартными способами. Goding, выше. Подходящие среды для культивирования для этой цели включают, например, модифицированную Дульбекко среду Игла и среду RPMI-1640. Альтернативно, гибридомные клетки можно выращивать  в виде асцита у млекопитающего.
[0352] Моноклональные антитела, секретируемые субклонами можно выделять или очищать от среды для культивирования или асцитной жидкости общепринятыми способами очистки иммуноглобулина, такими как, например, белок A-сефароза, хроматографии на гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ или аффинная хроматография.
[0353] Антитела к AMC или фрагменты молекулы антитела также можно идентифицировать скринингом комбинаторных библиотек на антитела с желаемой активностью или видами активности. Например, известны различные способы в данной области получения библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие желаемыми характеристиками связывания. Такие способы описаны, например, у Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001) и дополнительно описаны, например, у McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
in vitro
[0354] В определенных способах фагового дисплея репертуары генов VH и VL клонируют отдельно полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и снова объединяют в случайном порядке в фаговые библиотеки, которые можно затем подвергать скринингу на антигенсвязывающий фаг, как описано у Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг, как правило, предоставляет фрагменты антител, в виде одноцепочечных фрагментов Fv (scFv) или в виде фрагментов Fab. Библиотеки от иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости конструкции гибридом. Альтернативно, нативный репертуар можно клонировать (например, от человек) с получением одного источника антител к широкому спектру чужеродных, а также аутоантигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки также можно получать синтетически клонированием не подвергавшихся перегруппировке сегментов V-гена из стволовых клеток и с использованием праймеров для ПЦР, содержащих случайную последовательность для кодирования высоковариабельных областей CDR3 и для проведения перегруппировки , как описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, в которых описаны фаговые библиотеки антител человека, включают, например: патент США № 5750373 и Патентные публикации США № 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
9
9
9
9
9
10
10
10
10
11
[0355] Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно получать с использованием фагового дисплея для скрининга библиотек на антител, специфические к комплексу, содержащему пептид AFP и белок MHC I класса. Библиотека может представлять собой библиотеку фагового дисплея scFv человека с разнообразием по меньшей мере одного ×10 (такого как по меньшей мере приблизительно любого из 1 ×10, 2,5×10, 5×10, 7,5×10, 1×10, 2,5×10, 5×10, 7,5×10 или 1×10) уникальных фрагментов антитела человека. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой наивную библиотеку человека, конструируемую из ДНК, экстрагируемой из PMBC человека и селезенки от здоровых доноров, охватывающей все подсемейства тяжелых и легких цепей. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой наивную библиотеку человека, конструируемую из ДНК, экстрагируемой из PBMC, выделенных от пациентов с различными заболеваниями, такими как пациенты с аутоиммунными заболеваниями, пациенты со злокачественными опухолями и пациенты с инфекционными заболеваниями. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой полусинтетическую библиотеку человека, где тяжелая цепь CDR3 является полностью рандомизированной, со всеми аминокислотами (за исключением цистеина), равновероятно представленными в любом заданном положении (см., например, Hoet R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005). В некоторых вариантах осуществления длина тяжелой цепи CDR3 полусинтетической библиотеки человека составляет приблизительно от 5 приблизительно до 24 (такая как приблизительно любая из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24) аминокислот. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой не принадлежащую человеку библиотеку фагового дисплея.
E. coli
+
[0356] Фаговые клоны, которые связываются с AMC с высокой аффинностью, можно выбирать по итерационному связыванию фага с AMC, который является связанным с твердой подложкой (такой как, например, гранулы для пэннинга в растворе или клетки млекопитающих для пэннинга клеток), с последующим удалением несвязанного фага и элюированием специфически связанного фага. В примере пэннинга в растворе AMC можно подвергать биотинилированию для иммобилизации на твердой подложке. Биотинилированные AMC смешивают с фаговой библиотекой и твердой подложкой, такой как конъюгированные со стрептавидином Dynabead M-280, а затем выделяют комплексы AMC-фаг-гранула. Затем элюируют связанные с фагом клоны и используют для инфицирования соответствующей клетки-хозяина, такой как  XL1-Blue, для экспрессии и очистки. В примере пэннинг клеток клетки T2 (клеточная линия лимфобластов HLA-A*02:01 с недостаточностью TAP), нагруженный пептидом AFP AMC, смешивают с фаговой библиотекой, после чего клетки собирают и элюируют связанные клоны, и используют для инфекции подходящей клетки-хозяина для экспрессии и очистки. Пэннинг можно проводить в течение многих (таких как приблизительно любой из 2, 3, 4, 5, 6 или более) циклов с пэннингом в растворе, пэннингом клеток или комбинацией обоих типов пэннинга для обогащения фаговых клонов, связывающихся с AMC. Обогащенные фаговые клоны можно тестировать на специфическое связывание с AMC любыми известными в данной области способами, включая, например, ELISA и FACS.
[0357] Моноклональные антитела также можно получать способами рекомбинантных ДНК, такими как способы, описанные в патенте США № 4816567. ДНК, кодирующую моноклональные антитела по изобретению, можно легко выделять и секвенировать общепринятыми способами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Гибридомные клетки, как описано выше, или специфические к AMC фаговые клоны по изобретению могут служить в качестве источника такой ДНК. После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомяка (CHO) или миеломные клетки, которые не продуцируют иным образом иммуноглобулин белок, с получением синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также можно модифицировать, например, заменой кодирующей последовательности константных доменов и/или каркасных областей тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичных не принадлежащих человеку последовательностей (патент США № 4816567; Morrison et al., выше) или ковалентным присоединением к кодирующей иммуноглобулин последовательности полной или части кодирующей последовательности для не являющегося иммуноглобулином полипептида. Такой не являющийся иммуноглобулином полипептид можно заменять константными доменами антитела по изобретению или можно заменять вариабельными доменами одного антигенсвязывающего участка антитела по изобретению с получением химерного двухвалентного антитела.
[0358] Антитела могут представлять собой моновалентные антитела. В данной области известны способы получения моновалентных антител. Например, один из способов включает рекомбинантную экспрессию легкой цепи и модифицированной тяжелой цепи иммуноглобулина. Тяжелую цепь, как правило, укорачивают по любой точке в Fc-области, таким образом, чтобы предотвращать перекрестное связывание тяжелых цепей. Альтернативно, соответствующие остатки цистеина заменяют другим аминокислотным остатком или удаляют, таким образом, чтобы предотвращать перекрестное связывание.
in vitro
[0359] Также подходящими для получения моновалентных антител являются способы . Расщепление антител с получением их фрагментов, в частности фрагментов Fab, можно проводить любым известным в данной области способом.
[0360] Вариабельные домены антитела с желаемой специфичностью связывания (антитело-антигенсвязывающими участками) можно сливать с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние предпочтительно проводить с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, областей CH2 и CH3. В некоторых вариантах осуществления первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи, содержится по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующую слияния тяжелых цепей иммуноглобулина и при желании легких цепей иммуноглобулина, вводят в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Более подробно о получении биспецифических антител, см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Гуманизированные антитела и антитела человека
2
[0361] Антитела к AMC или фрагменты молекулы антитела могут представлять собой гуманизированные антитела или антитела человека. Гуманизированные формы не принадлежащих человеку антител (например, мыши) представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFv или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые, как правило, содержат минимальную последовательность, получаемую из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из CDR реципиента заменяют остатками из CDR от не являющихся человеком видов (донорного антитела), таких как мышь, крыса или кролик, обладающей желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях, каркасные остатки Fv иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе, ни в импортируемых последовательностях CDR или каркаса. В основном, гуманизированное антитело может содержать по существу все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или по существу все FR-области представляют собой FR-области консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, участок константной области иммуноглобулина человека. См., например, Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
[0362] Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более аминокислотных остатков, вводимых в него из источника, который не принадлежит человеку. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки, как правило, обозначают как "импортируемые" остатки, которые, как правило, получают из "импортируемого" вариабельного домена. По определенным вариантам осуществления гуманизацию можно по существу проводить следующим способом по Winter и соавторов (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), заменой CDR грызуна или последовательностей CDR соответствующими последовательностями антитела человека. Таким образом, такие "гуманизированные" антитела представляют собой антитела (патент США № 4816567), где по существу менее чем один интактный вариабельный домен человека заменяли соответствующей последовательностью от не являющихся человеком видов. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменяют остатками из аналогичных участков в антителах грызунов.
[0363] В качестве альтернативы гуманизации можно получать антитела человека. Например, в настоящее время возможно получать трансгенных животных (например, мышей), которые могут при иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека при отсутствии продукции эндогенного иммуноглобулина. Например, описано, что гомозиготная делеция гена соединяющей области (JH) тяжелой цепи антитела у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию образования эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулина зародышевой лини человека таким мутантным по зародышевой линии мышам приводит к образованию антител человека при стимуляции антигеном. См., например, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); патенты США № 5545806, 5569825, 5591669, 5545807 и WO 97/17852. Альтернативно, антитела человека можно получать введением локусов иммуноглобулина человека трансгенным животным, например, мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивировали. При стимуляции наблюдают образование антител человека, которое является очень сходным с той, которую наблюдают у люди во всех отношениях, включая перестановку генов, сборку и репертуар антител. Такой подход описан, например, в патентах США № 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016, и у Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg и Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).
in vitro
[0364] Антитела человека также можно получать посредством активированных B-клеток  (см. патенты США 5567610 и 5229275) или различными известными в данной области способами, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Также доступными для получения моноклональных антител человека являются способы Cole et al. и Boerner et al. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) и Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991).
Полиспецифические антитела
[0365] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическое антитело. Подходящие способы получения полиспецифических (например, биспецифических) антител хорошо известны в данной области. Например, получение биспецифических антител может быть основано на коэкспрессии двух пар тяжелых цепей/легких цепей иммуноглобулина, где каждая из двух пар обладает различными специфичностями и при связывании приводит к гетеродимерному антителу (см., например, Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983); WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)). Вследствие случайного распределения тяжелых и легких цепей иммуноглобулина такие гибридомы (квадромы) продуцируют возможную смесь десяти различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифической структурой. Выделение правильной молекулы, как правило, проводят посредством этапов аффинной хроматографии. Аналогичные способы описаны в WO 93/08829 и у Traunecker et al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991). Альтернативно, объединением тяжелых и легких цепей можно управлять путем использования преимущества ограниченного по видам спаривания (см., например, Lindhofer et al., J. Immunol., 155:219-225 (1995)), и спариванием тяжелых цепей можно управлять с использованием конструкции "выступ во впадину" доменов CH3 (см., например, патент США № 5731168; Ridgway et al., Protein Eng., 9(7):617-621 (1996)). Полиспецифические антитела также можно получать конструированием с использованием эффекта электростатического взаимодействия с получением Fc антитело-гетеродимерных молекулы (см., например, WO 2009/089004A1). В еще одном другом способе стабильные биспецифические антитела можно получать контролируемым обменом плеча Fab, где два исходных антитела, обладающих различной антигенной специфичностью и совпадающими точечными мутациями в доменах CH3, смешивают в восстановительных условиях для обеспечения разделения, повторной сборки и повторного окисления с образованием биспецифических антител с высокой степенью чистоты. Labrigin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 110(13):5145-5150 (2013). Такие антитела, содержащие смесь пар тяжелой цепи/легкой цепи, также обозначают в настоящем описании как "гетеромультимерные антитела".
in vitro
[0366] Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, обладающие различными специфичностями, также можно химически сшивать с получением полиспецифических гетероконъюгированных антител. Например, две молекулы F(ab')2, каждая из которых обладает специфичностью к отличному антигену, можно химически связывать. Pullarkat et al., Trends Biotechnol., 48:9-21 (1999). Такие антитела, например, были предложены для направленной доставки клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (патент США № 4676980), и для лечения инфекции ВИЧ. WO 91/00360, WO 92/200373, EP 03089. Предусмотрено, что антитела можно получать  с применением известных способов химии синтеза белок, включая способы, включающие сшивающие средства. Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием реакции обмена дисульфидами или посредством образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и реагенты, описанные, например, в патенте США № 4676980.
[0367] В некоторых вариантах осуществления полиспецифические антитела можно получать с использованием технологий рекомбинантной ДНК. Например, биспецифическое антитело можно конструировать путем слияния двух scFv, таким образом, как путем их слияния посредством пептидного линкера, что приводит к тандемному scFv. Одним из примеров тандемного scFv является привлекающий T-клетки биспецифический активатор. Привлекающие T-клетки биспецифические активаторы получают связыванием scFv против CD3 с scFv, специфическим к поверхностному антигену клетки-мишени, такому как опухолеассоциированный антиген (TAA), что приводит к перенаправлению T-клеток к клеткам-мишеням. Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025 (1995); Brischwein et al., Mol. Immunol., 43(8):1129-1143 (2006). Уменьшая длину пептидного линкера между двумя вариабельными доменами, можно предотвращать их самосборку и способствовать спариванию с доменами на втором полипептиде, что приводит к компактному биспецифическому антителу, называемому диатело (Db). Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448 (1993). Каждый из двух полипептидов Db содержит VH, соединенный с VL линкером, который является слишком коротким, чтобы обеспечивать спаривание двух доменов на одной и той же цепи. Таким образом, домены VH и VL одного полипептида вынуждены спариваться с комплементарными доменами VL и VH другого полипептида, таким образом формируя два антигенсвязывающих участка. В модификации этого формата два полипептида являются связанными другим пептидным линкером, что приводит к одноцепочечному диателу (scDb). В еще одной другой модификации формата Db переориентирующиеся биспецифические антитела с двойной аффинностью (DART) можно получать введением дисульфидной связи между остатками цистеина на C-конце каждого полипептида, необязательно включая домены перед остатками цистеина на C-конце, которые направляют сборку желаемой гетеродимерной структуры. Veri et al., Arthritis Rheum., 62(7):1933-1943 (2010). В данной области также известны иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig™), в которых связывающие мишень вариабельные домены двух моноклональных антител объединяют посредством природных линкеров с получением четырехвалентного, биспецифического антитела. Gu and Ghayur, Methods Enzymol., 502:25-41 (2012). В еще одном другом формате Dock и Lock (DNL), биспецифические антитела получают с использованием преимущества димеризации пептида (DDD2), получаемого из регуляторной субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы (PKA) человека, с пептидом (AD2), получаемым из якорных доменов of якорных белков A-киназы человека (AKAP). Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 103:6841-6846 (2006).
[0368] Также описаны различные способы получения и выделения фрагментов биспецифического антитела непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с использованием лейциновой застежки. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Этот способ также можно использовать для получения гомодимеров антител.
Варианты антител к AMC
[0369] В некоторых вариантах осуществления предусматривают варианты аминокислотной последовательности антител, предоставленных в настоящем описании. Например, желательным может являться улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получать введением соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Можно использовать любое сочетание делеции, вставки и замены для получения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, антигенсвязывающими.
[0370] В некоторых вариантах осуществления предоставлены варианты антител, содержащие одну или более замен аминокислот. Участки, представляющие интерес для замещающего мутагенеза, включают HVR и FR. Замены аминокислот можно вводить в представляющее интерес антитело, и проводить скрининг продуктов на желаемую активность, например, сохраняемое/улучшенное связывание антигена, желаемую иммуногенность или улучшенную ADCC или CDC.
[0371] Консервативные замены приведены в таблице 5 ниже.
Таблица 5: Консервативные замены
<b>Исходный остаток</b>
<b>Иллюстративные замены</b>
<b>Предпочтительные замены</b>
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp, Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gln (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Asp
Gly (G)
Ala
Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин
Leu
Leu (L)
норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Val; Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин
Leu
[0372] Аминокислоты можно группировать в различные классы в соответствии с общими свойствами боковой цепи:
a. гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b. нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. кислые: Asp, Glu;
d. основные: His, Lys, Arg;
e. остатки, которые оказывают влияние на ориентацию цепи: Gly, Pro;
f. ароматические: Trp, Tyr, Phe.
[0373] Неконсервативные замены включают замену представителя одного из этих классов на другой класс.
[0374] Иллюстративный вариант замены представляет собой аффинно зрелое антитело, которое можно получать подходящим способом, например, с применением способом созревания аффинности на основе фагового дисплея. В кратком изложении один или более остатков CDR подвергают мутации, и вариант антитела предоставляется фагом, и проводят скрининг на конкретную биологическую активность (например, аффинность связывания). В HVR можно проводить изменения (например, замены), например, для улучшения аффинность антитела. Такие изменения можно проводить в "горячих точках" HVR, например, остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или определяющих специфичность остатках (SDR) с получением варианта VH или VL, который тестируют на аффинность связывания. Описано созревание аффинности конструированием и повторным отбором из вторичных библиотек, например, у Hoogenboom et al. в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)).
[0375] В некоторых вариантах осуществления созревания аффинности в различные гены, выбранные для созревания, вносят разнообразие любым из различных способов (например, ПЦР со сниженной точностью, перестановкой цепей или сайт-специфическим мутагенезом). Затем создают вторичную библиотеку. Затем проводят скрининг библиотеки для идентификации любых вариантов антител с желаемой аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает направленные на HVR подходы, в которых случайным образом распределяют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один раз). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно конкретно идентифицировать, например, с применением аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. В частности часто направленно воздействуют на CDR-H3 и CDR-L3.
[0376] В некоторых вариантах осуществления замены, вставки, или делеции могут происходить в одно или более HVR при условии, что такие изменения по существу не снижают способность антитела связывать антиген. Например, в HVR можно проводить консервативные изменения (например, консервативные замены, как предоставлено в настоящем описании), которые по существу не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут находиться вне границ "горячих точек" HVR или SDR. В некоторых вариантах осуществления варианта последовательностей VH и VL, предоставленных выше, каждая из HVR является неизменной или содержит не более одной, двух или трех замен аминокислот.
[0377] Пригодный способ идентификации остатков или областей антитела, которые можно подвергать мутагенезу, называется "аланин-сканирующим мутагенезом", как описано Cunningham and Wells, (1989) Science, 244:1081-1085. В этом способе идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения, существует ли влияние на взаимодействие антитела с антигеном. Можно вводить дополнительные замены в расположения аминокислот, для которых показана функциональная чувствительность к исходным заменам. Альтернативно или дополнительно, можно определять кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта антитела и антигена. Такие участвующие в контакте остатки и соседние остатки можно подвергать направленному воздействию или исключать в качестве кандидатов на замену. Варианты можно подвергать скринингу для определения, обладают ли они желаемыми свойствами.
[0378] Вставки в аминокислотную последовательность включают слияния амино- и/или карбоксильных концов с длиной в диапазон от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или многих аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина. Другие варианты вставок молекулы антител включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полувыведения из сыворотки антитела.
Варианты Fc-области
[0379] В некоторых вариантах осуществления одну или более модификаций аминокислоты можно вводить в Fc-область полноразмерного антитела к AMC, предоставленного в настоящем описании, таким образом получая вариант Fc-области. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc-области обладает повышенной эффекторной функцией антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), как правило, относящейся к связыванию с Fc-рецепторами (FcR). В некоторых вариантах осуществления вариант Fc-области обладает пониженной эффекторной функцией ADCC. Существует много примеров изменений или мутаций для последовательностей Fc, которые могут изменять эффекторную функцию. Например, в WO 00/42072 и у Shields et al., J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описаны варианты антител с улучшенным или пониженным связыванием с FcR. Содержание этих публикаций конкретно включено в настоящее описание посредством ссылки.
[0380] Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) представляет собой механизм действия терапевтических антител против опухолевых клеток. ADCC является опосредованной клетками иммунной защитой, при которой эффекторная клетка иммунной системы активно лизирует клетку-мишень (например, злокачественную клетку), поверхностные антигены на мембране которой были связаны специфическими антителами (например, антителом к AMC). Характерная ADCC включает активацию NK клеток антителами. NK клетка экспрессирует CD16, который является Fc-рецептором. Этот рецептор распознает и связывается с Fc-участком антитела, связанного с поверхностью клетки-мишени. Наиболее распространенным Fc-рецептором на поверхности NK клетки называют CD16 или FcγRIII. Связывание Fc-рецептора с Fc-областью антитела приводит к активации NK клетки, высвобождению цитолитических гранул и последующему апоптозу клетки-мишени. Вклад ADCC в цитолиз опухолевых клеток можно измерять с использованием конкретного теста, в котором используют клетки NK-92, которые трансфицировали высокоаффинным FcR. Результаты сравнивают клетками NK-92 дикого типа, которые не экспрессируют FcR.
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
in vivo
in vivo
Int
l. Immunol
[0381] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к варианту конструкции к AMC, содержащему FC-область, которая обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желаемым кандидатом для применений, при которых важным является время полужизни конструкции к AMC , а определенные эффекторные функции (такие как CDC и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Для подтверждения снижения/элиминации активностей CDC и/или ADCC можно проводить анализы цитотоксичности и/или . Например, анализы связывания Fc-рецептора (FcR) можно проводить для подтверждения того, что антитело не обладает способностью связываться с FcγR (таким образом, вероятно, не обладает активностью ADCC), но сохраняет способность связываться с FcRn. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR гематопоэтическими клетками обобщена в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры анализов для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы описаны в патенте США № 5500362 (см., например, Hellstrom I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom I et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); патенте США № 5821337 (см. Bruggemann M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Альтернативно, можно применять нерадиоактивные способы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif., и анализ нерадиоактивный цитотоксичности CytoTox 96™ (Promega, Madison, Wis.). Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы можно оценивать , например, на модели на животных, такой как модель, описанная у Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Также можно проводить анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не способно связываться с C1q и, таким образом, не обладает активностью CDC. См., например, ELISA связывания C1q и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003) и Cragg M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Определения связывания FcRn и клиренса/времени полужизни  также можно проводить известными в данной области способами (см., например, Petkova S.B. et al., '. 18(12):1759-1769 (2006)).
[0382] Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более остатков Fc-области 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (патент США № 6737056). Такие мутанты Fc включают мутанты Fc с заменами в двух или более положений аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc "DANA" с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США № 7332581).
[0383] Описаны определенные варианты антител с улучшенным или пониженным связыванием FcR. (См., например, патент США № 6737056; WO 2004/056312 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
[0384] В некоторых вариантах осуществления предоставлен вариант конструкции к AMC (например, полноразмерное антитело к AMC), содержащий вариант Fc-области, содержащей одну или более замен аминокислот, которые улучшают ADCC. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc-области содержит одну или более замен аминокислот, которые улучшают ADCC, где замены находятся в положениях 298, 333 и/или 334 варианта Fc-области (нумерация EU остатков). В некоторых вариантах осуществления вариант конструкции к AMC (например, полноразмерное антитело к AMC) содержит следующую замену аминокислоты в варианте Fc-области: S298A, E333A и K334A.
[0385] В некоторых вариантах осуществления изменения проводят в Fc-области, что приводит к измененному (например, улучшенному или пониженному) связыванию C1q и/или обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC), например, как описано в патент США № 6194551, WO 99/51642 и у Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[0386] В некоторых вариантах осуществления предоставлен вариант конструкции к AMC (например, полноразмерное антитело к AMC), содержащий вариант Fc-области, содержащий одну или более замен аминокислот, которые увеличивают время полужизни и/или улучшают связывание с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Антитела с увеличенным временем полужизни и улучшенным связыванием с FcRn описаны в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Такие антитела содержат Fc-область с одной или более замен в ней, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами в одном или более остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 Fc-области (патент США № 7371826).
[0387] Касательно других примеров вариантов Fc-области также см. Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988), патент США № 5648260, патент США № 5624821 и WO 94/29351.
[0388] Предусматривают конструкции к AMC (такие как полноразмерные антитела к AMC), содержащие любой из вариантов Fc, описываемых в настоящем описании, или их сочетания.
Варианты гликозилирования
[0389] В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC, предоставленную в настоящем описании, изменяют для увеличения или уменьшения степени, с которой конструкция к AMC является гликозилированной. Добавление или делеция участков гликозилирования к конструкции к AMC может являться подходящим способом, проводимым путем изменения аминокислотной последовательности конструкции к AMC или ее полипептидного участка, таким образом, что создают или удаляют один или более участков гликозилирования.
[0390] В случае когда конструкция к AMC содержит Fc-область, можно изменять углевод, присоединенный к ней. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный, биантенарный олигосахарид, который, как правило, присоединен N-связью к Asn297 домена CH2 Fc-области. См., например, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединению к GlcNAc в "стебле" биантенарной структуры олигосахарида. В некоторых вариантах осуществления можно проводить модификации олигосахарида в конструкции к AMC по изобретению для получения вариантов конструкций к AMC с определенными улучшенными свойствами.
[0391] В некоторых вариантах осуществления предоставлены варианты конструкции к AMC (такой как полноразмерное антитело к AMC), содержащие Fc-область, где углеводная структура, присоединенная к Fc-области, содержит пониженные количества фукозы или не содержит фукоза, что может приводить к улучшению функции ADCC. В частности, в настоящем описании предусматривают конструкции к AMC, которые содержат пониженное количество фукозы относительно количества фукозы в такой же конструкции к AMC, продуцируемой в клетке CHO дикого типа. Другими словами, они характеризуются тем, что содержат меньшее количество фукозы, чем они содержали бы, если бы продуцировались нативными клетками CHO (например, клеткой CHO, которая продуцирует нативный профиль гликозилирования, такой как, клетка CHO, содержащая нативный ген FUT8). В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой конструкцию, где менее приблизительно 50%, 40%, 30%, 20%, 10% или 5% N-связанных гликанов в ней содержат фукоза. Например, количество фукозы в такой конструкции к AMC может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой конструкцию, где ни один из N-связанных гликанов в ней содержат фукоза, например, где конструкция к AMC является полностью без фукозы или не содержит фукозу, является афукозилированной. Количество фукозы определяют подсчетом среднего количества фукозы в сахарной цепи при Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексные, гибридные и структуры с высоким содержанием маннозы), как измеряют масс-спектрометрией MALDI-TOF, например, как описано в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, локализованному приблизительно в положении 297 в Fc-области (нумерация остатков Fc-области EU); однако Asn297 также может располагаться приблизительно ±3 аминокислоты выше или ниже положения 297, например, между положениями 294 и 300 вследствие незначительных изменений последовательности в антителах. Такие фукозилированные варианты могут обладать улучшенной функцией ADCC. См., например, патентные публикации США № US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, относящихся к "дефукозилированным" или "дефицитным по фукозе" вариантам антител, включают: US 2003/0157108, WO 2000/61739, WO 2001/29246, US 2003/0115614, US 2002/0164328, US 2004/0093621, US 2004/0132140, US 2004/0110704, US 2004/0110282, US 2004/0109865, WO 2003/085119, WO 2003/084570, WO 2005/035586, WO 2005/035778, WO2005/053742, WO2002/031140, Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004). Примеры линий клеток способных продуцировать дефукозилированные антитела включают клетки CHO Lec13 с недостаточностью фукозилирования белка (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 249:533-545 (1986); патентная заявка США № US 2003/0157108 A1, Presta L., и WO 2004/056312 A1, Adams et al., в частности в примере 11), и нокаутные линии клеток, такие как клетки CHO с нокаутом гена α-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006) и WO2003/085107).
[0392] Далее приведены варианты конструкции к AMC (такой как полноразмерное антитело к AMC) с симметрично разветвленные олигосахариды, например, в которых биантенарный олигосахарид, присоединенный к Fc-области конструкции к AMC, разделен на симметричные части GlcNAc. Такие варианты конструкции к AMC (такой как полноразмерное антитело к AMC) могут характеризоваться пониженным фукозилированием и/или улучшенной функцией ADCC. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.), патенте США № 6602684 (Umana et al.), US 2005/0123546 (Umana et al.) и Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006). Также предоставлены варианты конструкции к AMC (такой как полноразмерное антитело к AMC) по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Варианты таких конструкций к AMC могут обладать улучшенной функцией CDC. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.), WO 1998/58964 (Raju S.) и WO 1999/22764 (Raju S.).
[0393] В некоторых вариантах осуществления варианты конструкции к AMC (такой как полноразмерное антитело к AMC), содержащие Fc-область, способны связываться с FcγRIII. В некоторых вариантах осуществления варианты конструкции к AMC (такой как полноразмерное антитело к AMC), содержащие Fc-область, обладают активностью ADCC в присутствии эффекторных клеток человека или обладают повышенной активностью ADCC в присутствии эффекторных клеток человека по сравнению с другой такой же конструкцией к AMC (такой как полноразмерное антитело к AMC), содержащей Fc-область дикого типа IgG1 человека.
Варианты, сконструированные с использованием цистеина
[0394] В некоторых вариантах осуществления желательным может являться получение конструкций к AMC (таких как полноразмерные антитела к AMC), сконструированных с использованием цистеина, в которых один или более аминокислотных остатков заменяют остатками цистеина. В некоторых вариантах осуществления заменяемые остатки располагаются на доступных участках конструкции к AMC. При замене таких остатков цистеином реакционноспособные тиоловые группы, таким образом, располагают на доступных участках конструкции к AMC, и их можно использовать для конъюгации конструкции к AMC с другими молекулами, так какими молекулы лекарственного средства или молекулы линкер-лекарственное средство с получением иммуноконъюгата к AMC, как описано далее в настоящем описании. Сконструированные с использованием цистеина конструкции к AMC (такие как полноразмерные антитела к AMC) можно получать, как описано, например, в патенте США № 7521541.
Производные
[0395] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC, предоставленная в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать так, чтобы она содержала дополнительные небелковые молекулы, которые являются известными в данной области и легкодоступными. Молекулы, подходящие для дериватизации конструкции к AMC, включают, но не ограничиваются ими, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилен/малеиновый ангидрид, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может обеспечивать преимущество при производстве вследствие своей стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может являться разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к конструкции к AMC, может изменяться, и если присоединен более чем один полимер, они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В основном, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, можно определять на основании рассматриваемых факторов, включая, но, не ограничиваясь ими, конкретных свойств или функций конструкции к AMC, которые необходимо улучшать, независимо от того, будет ли производное конструкции к AMC использовано для терапии определенных состояний и т.д.
[0396] В некоторых вариантах осуществления предоставлены конъюгаты конструкции к AMC и небелковой молекулы, которые можно избирательно нагревать путем воздействия облучением. В некоторых вариантах осуществления небелковая молекула представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 11600-11605 (2005)). Длина волны облучения может являться любой, и включает, но не ограничивается ими, длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковую молекулу до температуры, при которой клетки, расположенные близко к конструкции к AMC-небелковой молекуле, погибают.
Получение эффекторных клеток с CAR
[0397] Настоящее изобретение в одном из аспектов относится к эффекторным клеткам (таким как лимфоциты, например, T-клетки), экспрессирующим CAR к AMC. Иллюстративные способы получения эффекторных клеток (таких как T-клетки), экспрессирующих CAR к AMC (эффекторный клетки с CAR к AMC, такие как T-клетки с CAR к AMC) предоставлены в настоящем описании.
in vivo
[0398] В некоторых вариантах осуществления эффекторную клетку с CAR к AMC (такую как T-клетка) можно получать введением вектора (включая, например, лентивирусный вектор), содержащего CAR к AMC (например, CAR, содержащего фрагмент молекулы антитела к AMC и внутриклеточные сигнальные последовательности CD28 и CD3ζ) в эффекторную клетку (такую как T-клетка). В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки с CAR к AMC (такие как T-клетки) по изобретению способны реплицироваться , что приводит к длительной персистенции, которая приводит к поддерживаемой борьбе с AFP-положительным заболеванием (таким как злокачественная опухоль, например, HCC).
[0399] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к введению генетически модифицированной T-клетки, экспрессирующей CAR к AMC, для лечения пациента, страдающего AFP-положительным заболеванием или подвергающегося риску развития AFP-положительного заболевания, с использованием инфузии лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления в лечении используют инфузию аутологичных лимфоцитов. Аутологичные PBMC собирают у нуждающегося в лечении пациента и активируют и размножают T-клетки способами, описываемыми в настоящем описании и известными в данной области, а затем вводят обратно посредством инфузии пациенту.
in vivo
in vivo
in vivo
[0400] В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC экспрессирует CAR к AMC, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, (также обозначаемая в настоящем описании как "T-клетка с CAR к AMC"). В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC экспрессирует CAR к AMC, содержащий внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, и внутриклеточный домен, содержащий внутриклеточные сигнальные последовательности CD3ζ и CD28. T-клетки с CAR к AMC по изобретению могут проходить стадию быстрого размножения  T-клеток и могут устанавливать память клетки, специфические к AMC, которые сохраняются на высоких уровнях в течение длительного периода времени в крови и костном мозге. В некоторых вариантах осуществления T-клетки с CAR к AMC по изобретению, вводимые посредством инфузии пациенту, могу устранять презентирующие AMC клетки, такие как презентирующие AMC злокачественные клетки,  у пациентов, страдающих AFP-положительным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления T-клетки с CAR к AMC по изобретению, вводимые посредством инфузии пациенту, могут устранять презентирующие AMC клетки, такие как презентирующие AMC злокачественные клетки,  у пациентов, страдающих AFP-положительным заболеванием, которое является рефрактерным по меньшей мере к одному виду общепринятого лечения.
ex vivo
[0401] В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC экспрессирует CAR к AMC с четным распределением на клеточной поверхности. Четное распределение на клеточной поверхности может характеризоваться, например, профилями окрашивания с непрерывным видом и одинаковой толщиной или интенсивностью сигнала. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция, такая как фармацевтической композиции, содержащая T-клетки с CAR к AMC, содержит менее приблизительно 10% (таким образом, как менее приблизительно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%) клеток с агрегацией CAR к AMC на клеточной поверхности. Агрегация может характеризоваться, например, профилями окрашивания с неодинаковой толщиной или интенсивностью сигнала, или прерывистыми, бугристыми, точечными и/или неравномерными профилями распределения. В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC экспрессирует CAR к AMC менее чем приблизительно с 10% (таким образом, как менее чем приблизительно с 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%) агрегации CAR к AMC на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC характеризуется низким уровнем независящей от антигена активацией CAR к AMC. В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC характеризируется низким уровнем истощения T-клеток. Истощение T-клеток возникает естественным образом во время состояний длительной иммунной активации, таких как при злокачественной опухоли или хронической инфекции, где T-клетки становятся дисфункциональными. Истощение T-клеток может характеризоваться ослабленной эффекторной функцией, длительной экспрессией ингибирующих рецепторов и/или именным транскрипционным состоянием по сравнению с функциональными эффекторными T-клетки или T-клетками памяти. Истощение T-клеток препятствует оптимальному клиренсу опухолевых клеток и инфекций. Истощение T-клеток T-клетки с CAR к AMC можно характеризовать любыми известными в данной области способами, например, определением ее функционального и/или фенотипического профиля (Wherry E. J., Nature immunology 12(6): 492-499, 2011; Jiang Y., et al., Cell death & disease 6(6): e1792, 2015). Например, в некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC экспрессирует низкие уровни одного или более маркеров истощения T-клеток, включая, например, PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, BTLA и TIGIT. В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR к AMC сохраняет уровни продукции IL-2, продукции TNF-α, продукции IFN-γ и продукции гранзима B, характерные для неистощенных T-клеток, и/или сохраняет цитолитическую способность  в присутствии клетки-мишени, что подтверждает, что T-клетка с CAR к AMC не претерпевает самоактивацию и преждевременное истощение.
2+
2+
[0402] Перед размножением и генетической модификацией T-клеток получают источник T-клеток от индивидуума. T-клетки можно получать из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфоузлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из участка инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно использовать любое количество линий T-клеток, доступных в данной области. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения T-клетки можно получать из единицы крови, получаемой от индивидуума с применением любого числа техник, известных специалисту в данной области, таких как разделение на Ficoll™. В некоторых вариантах осуществления клетки из циркулирующей крови индивидуума получают посредством афереза. Продукт афереза, как правило, содержит лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В некоторых вариантах осуществления клетки, собираемые аферезом, можно промывать для удаления фракции плазмы и для помещения клеток в подходящий буфер или среду для последующих этапов обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления промывной раствор не содержит кальций и может не содержать магний, или может не содержать многие, если не все, двухвалентные катионы. Как специалистам в данной области несложно понять этап промывания можно проводить способами, известными специалистам в данной области, такими как с использованием полуавтоматической "фильтрационной" центрифуги (например, устройства для обработки клеток Cobe 2991, Baxter CytoMate, или Haemonetics Cell Saver 5) по инструкциям производителя. После промывания клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как не содержащий Ca, Mg PBS, PlasmaLyte A или другие физиологические растворы с буфером или без него. Альтернативно, можно удалять нежелательные компоненты образца афереза и непосредственно ресуспендировать клетки в средах для культивирования.
+
+
+
+
+
+
+
[0403] В некоторых вариантах осуществления T-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови лизисом эритроцитов и обеднением моноцитов, например, посредством центрифугирования в градиенте PERCOLL™ или проточным элютриационным центрифугированием. Можно дополнительно выделять конкретную субпопуляцию T-клеток, таких как CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA и CD45RO T-клетки, способами положительного или отрицательного отбора. Например, в некоторых вариантах осуществления T-клетки выделяют инкубацией с конъюгированными с антителами к CD3 CD28 (например, 3×28) гранулами, такими как DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T, в течение периода времени, достаточного для положительного отбора желаемых T-клеток. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет приблизительно 30 минут. В некоторых вариантах осуществления период времени находится в диапазоне от 30 минут до 36 часов или более и все целые числа в этом интервале. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет по меньшей мере один, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет от 10 до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления время период инкубации составляет 24 часов. Для выделения T-клеток у пациентов с лейкозом использование более длительных периодов времени инкубации, такого как 24 часа, может увеличивать выход клеток. Более длительные периоды времени инкубации можно использовать для выделения T-клеток в любой ситуации, когда содержится небольшое число T-клеток по сравнению с другими типами клеток, такой как при выделении проникающих в опухоль лимфоцитов (TIL) из опухолевой ткани или у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Кроме того, использование более длительных периодов времени инкубации может увеличивать эффективность захвата CD8 T-клеток. Таким образом, простым сокращением или увеличением времени обеспечивают связывание T-клеток с гранулами CD3/CD28 и/или увеличением или уменьшением отношения гранул к T-клеткам можно предпочтительно проводить положительный или отрицательный отбор субпопуляции T-клеток в начале культивирования или в другие моменты времени во время процесса. Кроме того, увеличением или уменьшением отношения антител к CD3 и/или к CD28 на гранулах или другой поверхности субпопуляции T-клеток можно предпочтительно проводить положительный или отрицательный отбор субпопуляции T-клеток в начале культивирования или в другие желаемые моменты времени. Специалисту в данной области будет понятно, что в контексте настоящего изобретения также можно использовать многие этапы отбора. В некоторых вариантах осуществления желательным может являться проведение процедуры отбора и использование "не подвергавшихся отбору" клеток в процессе активации и размножения. "Не подвергавшиеся отбору" клетки также можно подвергать дополнительным этапам отбора.
+
+
+
+
[0404] Обогащение популяции T-клеток путем отрицательного отбора можно проводить с использованием комбинации антител, направленных на маркеры поверхности, уникальные для отрицательно отобранных клеток. Один из способов представляет собой сортировку и/или отбор клеток путем отрицательной магнитной иммунной адгезии или проточной цитометрии, в которой используют смесь моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, прошедших отрицательный отбор. Например, для обогащения в отношении CD4+-клеток отрицательным отбором смесь моноклональных антител, как правило, содержит антитела к CD 14, CD20, CD11b, CD 16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления желательным может являться обогащение или положительный отбор регуляторных T-клеток, которые, как правило, экспрессируют CD4, CD25, CD62Lhi, GITR и FoxP3. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления проводят истощение регуляторных T-клеток с использованием гранул, конъюгированных с антителами к CD25, или другими аналогичными способами отбора.
+
[0405] Для выделения желаемой популяции клеток положительным или отрицательным отбором можно изменять концентрацию клеток и поверхность (например, частицы, такие как гранулы). В некоторых вариантах осуществления желательным может являться значительное уменьшение объема, в котором гранулы и клетки смешивают друг с другом (например, увеличение концентрации клеток), для обеспечения максимального контакта клеток и гранул. Например, в некоторых вариантах осуществления используют концентрацию приблизительно 2 биллиона клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию приблизительно 1 биллион клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют более чем приблизительно 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию клеток приблизительно любую из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию клеток приблизительно любую из 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию приблизительно 125 или приблизительно 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может приводить к повышенному выходу клеток, активации клеток и размножению клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток обеспечивает более эффективный захват клеток, которые могу слабо экспрессировать представляющие интерес антигены-мишени, таких как CD28-отрицательные T-клетки, или из образцов, в которых присутствуют многие опухолевые клетки (например, кровь больного лейкозом, опухолевая ткань и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и их получение является желательным. Например, использование высокой концентрации клеток обеспечивает более эффективный отбор CD8 T-клеток, которые обычно характеризуются более слабой экспрессией CD28.
ex vivo
ex vivo
in vivo
[0406] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения T-клетки получают от пациента непосредственно после лечения. В отношении этого наблюдали, что после определенных видов лечения злокачественных опухолей, в частности видов лечения лекарственными средствами, которые повреждают иммунную систему, непосредственно после лечения во время периода, когда пациенты нормально восстанавливаются после лечения, качество получаемых T-клеток может являться оптимальным или его можно улучшать для их способности размножаться . Аналогично, после манипуляции  способами, описываемыми в настоящем описании, эти клетки могут находиться в предпочтительном состоянии для ускоренного приживления и размножения . Таким образом, в контексте настоящего изобретения предусматривают сбор клеток крови, включая T-клетки, дендритные клетки или другие клетки гематопоэтической линии, во время фазы восстановления. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления можно использовать режимы мобилизации (например, мобилизации GM-CSF) и кондиционирования для создания состояния у индивидуума, где репопуляция, рециркуляция, регенерация и/или размножение конкретных типов клеток является благоприятным, особенно во время определенного временного окна после терапии. Иллюстративные типы клеток включают T-клетки, B-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.
[0407] Вне зависимости от состояния до или после генетической модификации T-клеток для экспрессии желаемого CAR к AMC T-клетки можно активировать и размножать, как правило, способами как описано, например, в патентах США № 6352694, 6534055, 6905680, 6692964, 5858358, 6887466, 6905681, 7144575, 7067318, 7172869, 7232566, 7175843, 5883223, 6905874, 6797514, 6867041 и в публикации патентной заявки США № 20060121005.
+
+
[0408] Как правило, T-клетки по изобретению размножают путем приведения в контакт с поверхностью с прикрепленным к ней средством, которое стимулирует ассоциированный с комплексом CD3/TCR сигнал, и лигандом, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности T-клеток. В частности, популяции T-клеток можно стимулировать, таким образом, как приведением в контакт с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или приведением в контакт с активатором протеинкиназы C (например, бриостатином) в сочетании с кальций-ионофором. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности T-клеток используют лиганд, который связывается с вспомогательной молекулой. Например, популяцию T-клеток можно приводить в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации T-клеток. Для стимуляции пролиферации CD4 T-клеток или CD8 T-клеток антитело к CD3 и антитело к CD28. Примеры антитела к CD28 включают 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, , France), которые можно использовать в качестве других общеизвестных способов в данной области (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
Получение
ммуноконъюгатов
и
[0409] Иммуноконъюгаты к AMC можно получать любыми известными в данной области способами. См., например, WO 2009/067800, WO 2011/133886 и публикацию патентной заявки США № 2014322129, полностью включенные в настоящее описание посредством ссылки.
[0410] Фрагмент молекулы антитела к AMC иммуноконъюгата к AMC можно "присоединять к" эффекторной молекуле любыми способами, которыми фрагмент молекулы антитела к AMC можно связывать или соединять с эффекторной молекулой. Например, фрагмент молекулы антитела к AMC иммуноконъюгата к AMC можно присоединять к эффекторной молекуле химическими или рекомбинантными способами. Химические способы получения слияний или конъюгатов в данной области известны, и их можно использовать для получения иммуноконъюгата к AMC. Способ, используемый для конъюгации фрагмента молекулы антитела к AMC и эффекторной молекулы, должен связывать связывающий белок к эффекторной молекуле без нарушения способности связывающего белка связываться с антигеном на клетке-мишени.
[0411] Фрагмент молекулы антитела к AMC иммуноконъюгата к AMC можно связывать опосредованно с эффекторной молекулой. Например, фрагмент молекулы антитела к AMC иммуноконъюгата к AMC можно связывать непосредственно с липосомой, содержащей эффекторную молекулу одного из нескольких типов. Эффекторную молекулу(ы) и/или фрагмент молекулы антитела к AMC также можно связывать с твердой поверхностью.
[0412] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC иммуноконъюгата к AMC и эффекторная молекула представляют собой белки, и их можно конъюгировать с применением техник, хорошо известных в данной области. Существует несколько сотен доступных кросслинкеров, которые могут конъюгировать два белка. (См., например, "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking". 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). Как правило, кросслинкер выбирают в зависимости от реакционноспособных функциональных групп, доступных или вводимых в фрагмент молекулы антитела к AMC и/или эффекторной молекулы. Кроме того, если не существует реакционноспособных групп, можно использовать фотоактивируемый кросслинкер. В определенных случаях желательным может являться введение спейсер между фрагментом молекулы антитела к AMC и эффекторной молекулой. Известные в данной области сшивающие средства включают гомобифункциональные средства: глутаральдегид, диметиладипимидат и бис(диазобензидин), и гетеробифункциональные средства: м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимид и сульфо-м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимид.
[0413] В некоторых вариантах осуществления фрагмент молекулы антитела к AMC иммуноконъюгата к AMC можно конструировать с конкретными остатками для химического присоединения эффекторной молекулы. Известные в данной области конкретные остатки, используемые для химического присоединения молекулы, включают лизин и цистеин. Кросслинкер выбирают в зависимости от реакционноспособных функциональных групп, вводимых в фрагмент молекулы антитела к AMC и доступных на эффекторной молекуле.
[0414] Иммуноконъюгат к AMC также можно получать с использованием технологии рекомбинантной ДНК. В этом случае последовательность ДНК, кодирующую фрагмент молекулы антитела к AMC, сливают с последовательностью ДНК, кодирующей эффекторную молекулу, что приводит к химерной молекуле ДНК. Химерную последовательность ДНК трансфицируют в клетку-хозяина, которая экспрессирует слитый белок. Слитый белок можно выделять из культуры клеток и очищать с применением известных в данной области способов.
[0415] Примеры присоединения эффекторной молекулы, которая представляет собой метку, со связывающим белком включают способы, описанные у Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); Nygren J. Histochem and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel and Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983), и Colcher et al., "Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice", Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986).
99
123
186
188
111
[0416] Радиоизотопные или другие метки можно вводить в иммуноконъюгат известными способами. Например, пептид можно биосинтезировать или можно синтезировать химическим синтезом аминокислот с использованием подходящих предшественников аминокислот, включая, например, фтор 19 вместо водорода. Метки, такие как Tc или I, Re, Re и In можно присоединять через остаток цистеина в пептиде. Иттрий 90 можно присоединять через остаток лизина. Для введения йода 123 можно использовать способ IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978)). Другие способы подробно описаны в "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989).
[0417] Иммуноконъюгаты фрагмента молекулы антитела и цитотоксического средства можно получать с использованием ряда бифункциональных связывающих белок средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCI), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бисазидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получать, как описано у Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом 14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является иллюстративным хелатирующим средством для конъюгации радионуклеотида с антителом. См., например, WO94/11026. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или содержащий дисульфид линкер (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); патент США № 5208020).
[0418] В явной форме предусматривают иммуноконъюгаты к AMC по изобретению, но они не ограничены ADC, получаемым с использованием сшивающих реагентов: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A). См. страницы 467-498, 2003-2004 Справочника по использованию и каталога.
Фармацевтические композиции
[0419] В настоящем описании также предоставлены композиции (такие как фармацевтические композиции, также обозначаемые в настоящем описании как составы), содержащие конструкцию к AMC. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка, например, T-клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая конструкцию к AMC и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка, например, T-клетка), связанную с конструкцией к AMC.
th
[0420] Подходящие составы конструкций к AMC получают смешиванием конструкции к AMC, обладающей желаемой степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16 edition, Osol A. Ed. (1980)) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный, и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как оливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; образующие соль противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG). Иллюстративные составы описаны в WO98/56418, явным образом включенной в настоящее описание посредством ссылки. Лиофилизированные составы, адаптированные для подкожного введения, описаны в WO97/04801. Такие лиофилизированные составы можно восстанавливать подходящим разбавителем до высокой концентрации белка и восстановленные состав можно вводить подкожно индивидууму, подлежащему лечению в настоящем описании. Для доставки конструкций к AMC по настоящему изобретению в клетки можно использовать липофектины или липосомы.
[0421] Состав в настоящем описании также может содержать одно или более активных соединений в дополнение к конструкции к AMC по мере необходимости для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно активные соединения с комплементарными видами активности, которые не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Например, желательным может являться дополнительное предоставление противоопухолевого средства, ингибирующего рост средства, цитотоксического средства или химиотерапевтического средства в дополнение к конструкции к AMC. Такие молекулы соответствующим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемых целей. Эффективное количество таких других средств зависит от количества конструкции к AMC, присутствующей в составе, типа заболевания или нарушения, или лечения и других факторов, описанных выше. Их, как правило, используют в тех же дозах и со способами введения, как описано в настоящем описании, или приблизительно от 1 до 99% от ранее используемых доз.
[0422] Конструкции к AMC также можно заключать в микрокапсулы, получаемые, например, способами коацервации или интерфазной полимеризацией, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатиновые микрокапсулы и микрокапсулы из поли(метилметакрилата), соответственно, в коллоидальных системах доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсиях. Такие техники s описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Можно получать препараты с длительным высвобождением.
[0423] Можно получать препараты с длительным высвобождением конструкций к AMC. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело (или его фрагмент), где матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с длительным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамината, неразрушаемый этиленвинилацетат, разрушаемые сополимеры молочная кислота-гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT TM (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочная кислота-гликолевая кислота и лейпролида ацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. При том, что полимеры, такие как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота обеспечивают высвобождение молекул в течение 100 суток, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. В случае инкапсулирования антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут подвергаться денатурации или агрегации в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Можно разрабатывать рациональные стратегии для стабилизации конструкций к AMC в зависимости от вовлеченного механизма. Например, если выявляют, что механизмом агрегации является образование межмолекулярной связи S-S в результате тиодисульфидного обмена, стабилизацию можно проводить путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, с регуляцией содержания влаги с использованием подходящих добавок, и разрабатывая конкретные полимерные композиции матрицы.
[0424] В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC формулируют в буфере, содержащем цитрат, NaCl, ацетат, сукцинат, глицин, полисорбат 80 (Tween 80) или любую комбинацию указанных выше соединений. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC формулируют в буфере, содержащем приблизительно от 100 мМ приблизительно до 150 мМ глицина. В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC формулируют в буфере, содержащем приблизительно от 50 мМ приблизительно до 100 мМ NaCl. В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC формулируют в буфере, содержащем приблизительно от 10 мМ приблизительно до 50 мМ ацетата. В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC формулируют в буфере, содержащем приблизительно от 10 мМ приблизительно до 50 мМ сукцината. В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC формулируют в буфере, содержащем приблизительно от 0,005% приблизительно до 0,02% полисорбата 80. В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC формулируют в буфере с pH приблизительно от 5,1 и 5,6. В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC формулируют в буфере, содержащем 10 мМ цитрата, 100 мМ NaCl, 100 мМ глицина и 0,01% полисорбата 80, где состав имеет pH 5,5.
in vivo
[0425] Составы, используемые для введения , должны являться стерильными. Это легко получают, например, фильтрованием через стерильные фильтрационные мембраны.
Способы лечения с использованием конструкций к AMC
[0426] Конструкции к AMC и/или композиции по изобретению можно вводить индивидуумам (например, млекопитающим, таким как люди) для лечения заболевания и/или нарушения, включая аномально высокую экспрессию AFP (также обозначаемую в настоящем описании как "AFP-положительное" заболевание или нарушение), включая, например, злокачественную опухоль (такую как печеночноклеточная карцинома, эмбрионально-клеточная опухоль и рак молочной железы). Таким образом настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления относится к способу лечения AFP-положительного заболевания (такого как злокачественная опухоль) у индивидуума, включающему введение индивидууму эффективного количества композиции (такой как фармацевтическая композиция), содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, такой как любой из конструкций к AMC, описываемых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль выбрана, например, из группы, состоящей из печеночноклеточной карциномы, эмбрионально-клеточной опухоли и рака молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека.
[0427] Например, в некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциномау, эмбрионально-клеточнаую опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0428] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0429] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0430] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0431] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0432] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (например, приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0433] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит: i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0434] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MCH I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0435] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC, содержащую фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MCH I класса, где фрагмент молекулы антитела к AMC содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетку (такую как эффекторная клетка), связанную с конструкцией к AMC. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0436] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения метастатической печеночноклеточной карциномы у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0437] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ ингибирования (такой как предотвращение) метастазирования печеночноклеточной карциномы у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конструкцию к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0438] В некоторых вариантах осуществления любого из способов лечения AFP-положительного заболевания, описанного выше, конструкция к AMC является конъюгированной с клеткой (такой как иммунная клетка, например, T-клетка) до введения индивидууму. Таким образом, например, предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий a) конъюгацию любой из конструкций к AMC, описываемых в настоящем описании, с клеткой (такой как иммунная клетка, например, T-клетка) с образованием конъюгата конструкция к AMC/клетка, и b) введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей конъюгат конструкцию к AMC/клетка. В некоторых вариантах осуществления клетку получают от индивидуума. В некоторых вариантах осуществления клетку не получают от индивидуума. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC является конъюгированной с клеткой посредством ковалентной связи с молекулой на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC является конъюгированной с клеткой посредством нековалентной связи с молекулой на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC является конъюгированной с клеткой посредством вставки участка конструкции к AMC в наружную мембрану клетки. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC не является природной. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой полиспецифическую (такую как биспецифическая) молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0439] В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее (например, человека, не являющего человеком примата, крысу, мышь, корову, лошадь, свинью, овцу, козу, собаку, кошку и т.д.). В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является менее приблизительно 60 лет (включая, например, менее приблизительно любого из 50, 40, 30, 25, 20, 15 или 10 лет). В некоторых вариантах осуществления возраст индивидуума является более приблизительно 60 лет (включая, например, более приблизительно любого из 70, 80, 90 или 100 лет). В некоторых вариантах осуществления у индивидуума диагностируют, или он является наследственно предрасположенным к одному или более заболеваний или нарушений, описываемых в настоящем описании (таким как печеночноклеточная карцинома, эмбрионально-клеточная опухоль и рак молочной железы). В некоторых вариантах осуществления индивидуум подвергается одному или более факторам риска, связанным с одним или более заболеваний или нарушений, описываемых в настоящем описании.
[0440] в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу доставки конструкции к AMC (такой как любая из конструкций к AMC, описываемых в настоящем описании) в клетку, презентирующую на своей поверхности комплекс, содержащий пептид AFP и белок MHC I класса, у индивидуума, где способ включает введение индивидууму композиции, содержащей конструкцию к AMC. В некоторых вариантах осуществления конструкция к AMC, которую необходимо доставлять, является связанной с клеткой (такой как эффекторная клетка, например, T-клетка).
in situ
[0441] В данной области известны многие способы диагностики злокачественной опухоли (такой как печеночноклеточная карцинома, эмбрионально-клеточная опухоль и рак молочной железы) или любого другого заболевания, при котором наблюдают аномальную экспрессию AFP, и в данной области известна клиническая дифференцировка таких заболеваний. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, например, иммуногистохимию, ПЦР и флуоресцентную гибридизацию (FISH).
[0442] В некоторых вариантах осуществления конструкции к AMC и/или композиции по изобретению вводят в комбинации со вторым, третьим или четвертым средством (включая, например, антинеопластическое средство, ингибирующее рост средство, цитотоксическое средство или химиотерапевтическое средство) для лечения заболеваний или нарушений, включая аномальную экспрессию AFP. В некоторых вариантах осуществления конструкцию к AMC вводят в комбинации со средством, которое повышает экспрессию белков MHC I класса и/или увеличивает презентацию на поверхности пептидов AFP белками MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления средство включает, например, агонисты рецептора IFN, ингибиторы Hsp90, энхансеры экспрессии p53 и химиотерапевтические средства. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой агонист рецептора IFN, включая, например, IFNγ, IFNβ и IFNα. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибитор Hsp9, включая, например, танеспимицин (17-AAG), альвеспимицин (17-DMAG), ретаспимицин (IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932 (CUDC-305), PU-H71, ганетаспиб (STA-9090), NVP-AUY922 (VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248 и XL888. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой энхансер экспрессии p53, включая, например, 5-фторурацил и нутлин 3. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой химиотерапевтическое средство, включая, например, топотекан, этопозид, цисплатин, паклитаксел и винбластин.
[0443] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, где клетки, экспрессирующие AFP обычно не презентируют или презентируют на относительно низких уровнях комплекс, содержащий белок AFP и белок MHC I класса, на своей поверхности (такие как клетки эмбрионально-клеточной опухоли), где способ включает введение индивидууму композиции, содержащей конструкцию к AMC, в комбинации со средством, которое повышает экспрессию белков MHC I класса и/или увеличивает презентацию на поверхности пептиды AFP белками MHC I класса. В некоторых вариантах осуществления средство включает, например, агонисты рецептора IFN, ингибиторы Hsp90, энхансеры экспрессии p53 и химиотерапевтические средства. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой агонист рецептора IFN, включая, например, IFNγ, IFNβ и IFNα. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибитор Hsp9, включая, например, танеспимицин (17-AAG), альвеспимицин (17-DMAG), ретаспимицин (IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932 (CUDC-305), PU-H71, ганетаспиб (STA-9090), NVP-AUY922 (VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248 и XL888. В некоторых вариантах осуществления средство, представляет собой энхансер экспрессии p53, включая, например, 5-фторурацил и нутлин 3. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой химиотерапевтическое средство, включая, например, топотекан, этопозид, цисплатин, паклитаксел и винбластин.
[0444] Виды лечения злокачественных опухолей можно оценивать, например, по регрессии опухоли, массе опухоли или уменьшению размера, времени до прогрессирования, продолжительности выживания, выживаемости без прогрессирования заболевания, частоте общего ответа, продолжительности ответа, качеству жизни, экспрессии и/или активности белка. Моно применять подходы определения эффективности терапии, включая, например, измерение ответа посредством рентгеновской визуализации.
[0445] В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения измеряют в виде процента ингибирования роста опухоли (% TGI), рассчитываемого по уравнению 100-(T/C×100), где T представляет собой средний относительный объем подвергающейся лечению опухоли, и C представляет собой средний относительный объем не подвергающейся лечению опухоли. В некоторых вариантах осуществления % TGI составляет приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95% или более 95%.
Дозирование и способ введения композиций конструкции к AMC
[0446] Доза композиций конструкций к AMC, вводимая индивидууму (такому как человек) может изменяться в зависимости от конкретной композиции, способа введения и типа заболевания, подлежащего лечению. В некоторых вариантах осуществления количество композиции является эффективным для того, чтобы приводить к целевому ответу (такому как частичный ответ или полный ответ). В некоторых вариантах осуществления количество композиции конструкции к AMC является достаточным для того, чтобы приводить к полному ответу у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления количество композиции конструкции к AMC является достаточным для того, чтобы приводить к частичному ответу у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления количество вводимой композиции конструкции к AMC (например, при введении отдельно) является достаточным для того, чтобы приводить к общей частоте ответа более чем приблизительно любого из 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% в популяции индивидуумов, получающих лечение композицией конструкции к AMC. Ответы индивидуума на лечение способами, описываемыми в настоящем описании, можно определять, например, на основании уровней RECIST.
[0447] В некоторых вариантах осуществления количество композиции является достаточным для длительного выживания индивидуума без прогрессирования заболевания. В некоторых вариантах осуществления количество композиции является достаточным для длительного общего выживания индивидуума. В некоторых вариантах осуществления количество композиции (например, при введении отдельно) является достаточным для обеспечения клинического преимущества более чем приблизительно любого из 50%, 60%, 70% или 77% в популяции индивидуумов, получающих лечение композицией конструкции к AMC.
in vitro
[0448] В некоторых вариантах осуществления количество композиции отдельно или в комбинации со вторым, третьим и/или четвертым средством представляет собой количество, достаточное для уменьшения размера опухоли, уменьшения числа злокачественных клеток или уменьшения скорости роста опухоли по меньшей мере на приблизительно любой из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% по сравнению с соответствующим размером опухоли, количеством злокачественных клеток или скоростью роста опухоли у того же индивидуума до лечения или по сравнению с соответствующей активностью у других индивидуумов, не получавших лечение. Для измерения величины такого эффекта можно использовать стандартные способы, такие как анализы  с очищенным ферментом, клеточные анализы, модели на животных или тестирование на человеке.
[0449] В некоторых вариантах осуществления количество конструкции к AMC (например, полноразмерного антитела к AMC, полиспецифической молекулы к AMC, CAR к AMC или иммуноконъюгата к AMC) в композиции является ниже уровня, который вызывает токсикологическое действие (например, действие, превышающее клинически приемлемый уровень токсичности), или находится на уровне, при котором возможный побочный эффект может являться контролируемым или переносимым, когда композицию вводят индивидууму.
[0450] В некоторых вариантах осуществления количество композиции является близким к максимальной переносимой дозе (MTD) композиции после аналогичного режима дозирования. В некоторых вариантах осуществления количество композиции составляет более приблизительно любого из 80%, 90%, 95% или 98% от MTD.
[0451] В некоторых вариантах осуществления количество конструкции к AMC (например, полноразмерного антитела к AMC, полиспецифической молекулы к AMC, CAR к AMC или иммуноконъюгата к AMC) в композиции находится в диапазоне приблизительно от 0,001 мкг приблизительно до 1000 мкг.
[0452] В некоторых вариантах осуществления любого из указанных выше аспектов эффективное количество конструкции к AMC (например, полноразмерного антитела к AMC, полиспецифической молекулы к AMC, CAR к AMC или иммуноконъюгата к AMC) в композиции находится в диапазоне приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 100 мг/кг общей массы тела.
[0453] Композиции конструкций к AMC можно вводить индивидууму (такому как человек) различными путями, включая, например, внутривенный, внутриартериальный, интраперитонеальный, внутрилегочный, пероральный, ингаляцию, внутрипузырный, внутримышечный, внутритрахеальный, подкожный, внутриглазной, интратекальный, трансмукозальный и трансдермальный. В некоторых вариантах осуществления можно использовать состав с длительным непрерывным высвобождением композиции. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят интрапортально. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят внутриартериально. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят интраперитонеально. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят в печень. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством печеночной артериальной инфузии.
Терапия эффекторными клетками с CAR к AMC
[0454] Настоящее изобретение также относится к способам использования CAR к AMC для перенаправления специфичности эффекторной клетки (такой как первичная T-клетка) к комплексу, содержащему пептид AFP и белок MHC I класса. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу стимуляции опосредованного эффекторной клеткой ответа (такого как опосредованный T-клеткой иммунный ответ) на популяцию клеток-мишеней или ткани, содержащей презентирующие AMC клетки у млекопитающего, включающему этап введения млекопитающему эффекторной клетки (такой как T-клетка), которая экспрессирует CAR к AMC.
in vivo
[0455] Эффекторные клетки с CAR к AMC (такие как T-клетки), экспрессирующие CAR к AMC, можно вводить инфузией нуждающемуся в этом реципиенту. Вводимая инфузией клетка способна вызывать цитолиз презентирующих AMC клеток у реципиента. В некоторых вариантах осуществления в отличие от видов терапии антителами эффекторные клетки с CAR к AMC (такие как T-клетки) способны реплицироваться , что приводит к длительному сохранению, что может приводить к устойчивой борьбе с опухолью.
in vivo
[0456] В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки с CAR к AMC представляют собой T-клетки с CAR к AMC, которые могут проходить стадию быстрого размножения  T-клеток и могут сохраняться в течение длительного периода времени. В некоторых вариантах осуществления T-клетки с CAR к AMC по изобретению переходят в специфические T-клетки памяти, которые могут повторно активироваться, ингибируя любое дополнительной образование или рост опухоли.
ex vivo
in vivo
[0457] T-клетки с CAR к AMC по изобретению также могут служить в качестве типа вакцины для иммунизации  и/или терапии  у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека.
ex vivo
in vitro
[0458] В отношении иммунизации  перед введением клетки млекопитающему  происходит по меньшей мене одно из следующего ниже: i) размножение клеток, ii) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR к AMC, в клетки и/или iii) криоконсервация клеток.
ex vivo
in vitro
[0459] Способы  хорошо известны в данной области и более подробно описаны ниже. В кратком изложении, клетки выделяют у млекопитающего (предпочтительно человека) и генетически модифицируют (например, трансдуцируют или трансфицируют ) вектором, экспрессирующим CAR к AMC, описываемый в настоящем описании. Клетку с CAR к AMC можно вводить являющемуся млекопитающим реципиенту для обеспечения терапевтического эффекта. Являющийся млекопитающим реципиентом может представлять собой человека, и клетка с CAR к AMC может являться аутологичной по отношению к реципиенту. Альтернативно, клетки могут являться аллогенными, изогенными или ксеногенными по отношению к реципиенту.
ex vivo
ex vivo
ex vivo
ex vivo
+
[0460] Способ размножения  гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, описанный в патент США № 5199942, включенном в настоящее описание посредством ссылки, можно применять для клеток по настоящему изобретению. В данной области известны другие подходящие способы, таким образом, настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным способом размножения клеток . В кратком изложении культивирование  и размножение T-клеток включает: (1) сбор CD34 гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников у млекопитающего из образца периферической крови или эксплантатов костного мозга; и (2) размножение таких клеток . В дополнение к факторам росту клеток, описанным в патенте США № 5199942, для культивирования и размножения клеток можно использовать другие факторы, такие как flt3-L, IL-1, IL-3 и лиганд c-kit.
ex vivo
in vivo
[0461] В дополнение к использованию вакцин на основе клеток в отношении иммунизации  настоящее изобретение также относится к композициям и способам иммунизации для индукции иммунного ответа, направленного на антиген, у пациента.
[0462] Эффекторные клетки с CAR к AMC (такие как T-клетки) по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или с другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины, или популяциями клеток. В кратком изложении, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать эффекторные клетки с CAR к AMC (такие как T-клетки) в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или эксципиентами. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. В некоторых вариантах осуществления композиции эффекторных клеток с CAR к AMC (таких как T-клетки) формулируют для внутривенного введения.
4
9
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
[0463] Точное количество композиций эффекторных клеток с CAR к AMC (таких как T-клетки) по настоящему изобретению, которые необходимо вводить, может определять врач, принимая во внимание различия в возрасте, массе, размере опухоли, степени инфекции или метастазирования индивидуума, и состояние пациента (индивидуума). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию, содержащую эффекторные клетки с CAR к AMC (такие как T-клетки), вводят в дозе приблизительно от 10 приблизительно до 10 клеток/кг массы тела, такой как любой из приблизительно от 10 приблизительно до 10, приблизительно от 10 приблизительно до 10, приблизительно от 10 приблизительно до 10, приблизительно от 10 приблизительно до 10, или приблизительно от 10 приблизительно до 10 клеток/кг массы тела, включая все целочисленные значения в этих диапазонах. Композиции эффекторных клеток с CAR к AMC (таких как T-клетки) также можно вводить многократно в этих дозах. Клетки можно вводить с применением техник инфузии, которые являются общеизвестными в иммунотерапии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). Специалист в данной области медицины может легко определять оптимальное дозирование и схему лечения для конкретного пациента путем мониторинга признаков заболевания у пациента и, таким образом, коррекции лечения.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
[0464] В некоторых вариантах осуществления желательным может являться введение активированных T-клеток с CAR к AMC индивидууму, а затем проводят забор крови (или проводят аферез), активируют в ней T-клетки по настоящему изобретению и вводят повторно инфузию такими активированными и размноженными T-клетками пациенту. Этот способ можно проводить много раз каждые несколько недель. В некоторых вариантах осуществления T-клетки можно активировать из заборов крови от 10 см до 400 см. В некоторых вариантах осуществления T-клетки активируют из заборов крови 20 см, 30 см, 40 см, 50 см, 60 см, 70 см, 80 см, 90 см или 100 см.
[0465] Введение эффекторных клеток с CAR к AMC (таких как T-клетки) можно проводить любым удобным способом, включая посредством аэрозольной ингаляции, инъекции, приема внутрь, трансфузии, имплантации или трансплантации. Описываемые в настоящем описании композиции можно вводить пациенту подкожно, внутрикожно, в опухоль, в узел, интрамедуллярно, внутримышечно, посредством внутривенной (в/в) инъекции или интраперитонеально. В некоторых вариантах осуществления композиции эффекторных клеток с CAR к AMC (таких как T-клетки) по настоящему изобретению вводят пациенту посредством внутрикожной или подкожной инъекции. В некоторых вариантах осуществления композиции эффекторных клеток с CAR к AMC (таких как T-клетки) по настоящему изобретению вводят посредством в/в инъекции. Композиции эффекторных клеток с CAR к AMC (таких как T-клетки) можно инъецировать непосредственно в опухоль, лимфоузел или участок инфекции.
[0466] Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0467] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0468] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0469] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса содержащее i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0470] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0471] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0472] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса содержащее i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0473] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0474] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0475] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль, и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления пептид AFP представляет собой AFP158 (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A02. В некоторых вариантах осуществления белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0476] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP158 (SEQ ID NO: 4) и HLA-A*02:01, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль, и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0477] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (например, приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот; где X может представлять собой любую аминокислоту, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0478] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87), HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88), и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89); и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120), и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); где X может представлять собой любую аминокислоту, b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0479] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; и ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 (таких как приблизительно любую из 1, 2 или 3) замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0480] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях HC-CDR; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 (таких как приблизительно любую из 1, 2, 3, 4 или 5) замен аминокислот в последовательностях LC-CDR; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0481] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса содержащее i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66; HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76; и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86; и ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99; LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109; и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0482] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% (например, по меньшей мере приблизительно любой из 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36, или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0483] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения AFP-положительного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, содержащий a) внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела к AMC, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид AFP и белок MHC I класса, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36; b) трансмембранный домен и c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28, где введение включает местную инъекцию композиции на участке инъекции, дистальном по отношению к участку AFP-положительного заболевания (такого как AFP-положительная опухоль). В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль (например, введение проводят интратуморальным путем). В некоторых вариантах осуществления участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления участок инъекции представляет собой первую AFP-положительную опухоль и участок AFP-положительного заболевания представляет собой вторую AFP-положительную опухоль. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, и лечение предусматривает предотвращение распространения злокачественной опухоли, например, ингибирование (такое как предотвращение) метастазирования злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0484] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения метастатической печеночноклеточной карциномы у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0485] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ ингибирования (такого как предотвращения) метастазирования печеночноклеточной карциномы у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC, в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0486] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ праймирования T-клеток у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей эффекторную клетку (такую как T-клетка), экспрессирующую CAR к AMC в соответствии с любым из CAR к AMC, описанным выше. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает AFP-положительным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным, интраперитонеальным или интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят внутривенным путем. В некоторых вариантах осуществления введение проводят интратуморальным путем. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
ex vivo
12:265-277, 2012
[0487] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов, описанных выше, способ дополнительно включает введение антигенпрезентирующих клеток или APC (таких как моноциты или дифференцированные из моноцитов дендритные клетки) индивидууму. Дендритные клетки можно получать  культивированием моноцитов со специфическими цитокинами (Palucka and Banchereau, Nature Reviews Cancer, ). В некоторых вариантах осуществления APC вводят одномоментно с композицией эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления APC вводят одновременно с композицией эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления APC вводят последовательно с композицией эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления APC вводят тем же путем что и композицию эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления APC вводят в тот же участок, что и композицию эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления композицией эффекторных клеток содержит APC.
Злокачественные опухоли
[0488] Конструкции к AMC и CAR к AMC клетки в некоторых вариантах осуществления могут являться пригодными для лечения злокачественной опухоли. Злокачественные опухоли, которые можно любым из способов, описываемых в настоящем описании, включает опухоли, которые не являются васкуляризованными или пока еще по существу васкуляризованными, а также васкуляризованные опухоли. Злокачественные опухоли могут включать несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли, например, лейкозы и лимфомы) или могут включать солидные опухоли. Типы злокачественных опухолей, подлежащих лечению конструкциями к AMC и клетками с CAR к AMC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, карциному, бластому и саркому, и определенные лейкозы или злокачественные новообразования лимфоидной ткани, доброкачественные и злокачественные опухоли и злокачественные новообразования, например, саркомы, карциномы и меланомы. Также включены опухоли/злокачественные опухоли взрослых и опухоли/злокачественные опухоли детей.
[0489] Гематологические злокачественные опухоли представляют собой злокачественные опухоли крови или костного мозга. Примеры гематологических (или гематогенных) злокачественных опухолей включают лейкозы, включая острые лейкозы (такие как острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз и эритролейкоз), хронические лейкозы (такие как хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), истинную полицитемию, лимфому, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому (невыраженные формы и формы высокой степени), множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, миелодиспластический синдром, волосатоклеточный лейкоз и миелодисплазию.
[0490] Солидные опухоли представляет собой аномальные массы ткани, которая, как правило, не содержит цист или областей жидкости. Солидные опухоли могут являться доброкачественными или злокачественными. Различные типы солидных опухолей называют по типу клеток, которые их образуют (такие как саркомы, карциномы и лимфомы). Примеры солидных опухолей, такие как саркомы и карциномы, включают фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеосаркому и другиие саркомы, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, злокачественное новообразование лимфоидной ткани, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, различные вида рака легких, рак яичника, рак предстательной железы, печеночноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному, базально-клеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, медуллярную карциному щитовидной железы, папиллярную карциному щитовидной железы, феохромоцитомы, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, медуллярную карциномау, бронхогенную карциному, почечноклеточную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, семиному, карциному мочевого пузыря, меланому и опухоли ЦНС (такие как глиома (такая как глиома ствола головного мозга и смешанные глиомы), глиобластому (также известную как многоформная глиобластома), астроцитому, лимфому ЦНС, герминому, медуллобластому, шванному, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, неврому слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, нейробластому, ретинобластому и метастазы головного мозга).
[0491] В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой HCC. В некоторых вариантах осуществления HCC представляет собой HCC на ранней стадии, неметастатическую HCC, первичную HCC, HCC на поздних сроках, местнораспространенную HCC, метастатическую HCC, HCC в ремиссии или рецидивирующую HCC. В некоторых вариантах осуществления HCC локализована доступным для резекции образом (например, опухоли, которые являются ограниченными частью печени, что позволяет полное хирургическое удаление), локализована недоступным для резекции образом (например, локализованные опухоли могут являться нерезектабельный вследствие того, что вовлечены критические структуры кровеносных сосудов, или вследствие того, что повреждена печень), или является нерезектабельной (например, опухоли поражают все доли печени и/или распространились так, что поражают другие органы (например, легкое, лимфоузлы, кости). В некоторых вариантах осуществления HCC согласно классификациям TNM представляет собой опухоль на I стадии (одиночную опухоль без прорастания сосудов), опухоль на II стадии (одиночную опухоль с прорастанием сосудов или множественные опухоли не более 5 см), опухоль на III стадии (множественные опухоли, любая более 5 см или опухоли, поражающие основную ветвь портальных или почечных вен), опухоль на IV стадии (опухоли с непосредственным прорастанием в смежные органы, отличные от желчного пузыря или перфорацией висцеральной брюшины), опухоль N1 (метастазы в регионарных лимфоузлах) или опухоль M1 (отдаленные метастазы). В некоторых вариантах осуществления HCC в соответствии с критериями определения стадии AJCC (American Joint Commission on Cancer) представляет собой HCC на стадии T1, T2, T3 или T4. В некоторых вариантах осуществления HCC представляет собой любую из печеночноклеточных карцином, фиброламеллярных вариантов HCC и смешанных гепатоцеллюлярных холангиокарцином.
[0492] В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой эмбрионально-клеточную опухоль.
[0493] Лечение злокачественных опухолей можно оценивать, например, по регрессии опухоли, уменьшению массы или размера опухоли, времени до прогрессирования, продолжительности выживаемости, выживаемости без прогрессирования заболевания, общей частоте ответа, продолжительности ответа, качества жизни, экспрессии и/или активности белка. Можно применять подходы для определения эффективности терапии, включая, например, измерение ответа посредством рентгеновской визуализации.
Способы диагностики и визуализации с использованием конструкций к AMC
in situ, in vivo, ex vivo
in vitro
[0494] Меченые фрагменты молекулы антитела к AMC и их производные и аналоги, которые специфически связываются с AMC на поверхности клетки, можно использовать в целях диагностики для детекции, диагностики или мониторинга заболеваний и/или нарушений, связанных с экспрессией, аберрантной экспрессией и/или активностью AFP, включая любой из описанных выше заболеваний и нарушений, таких как злокачественная опухоль (например, печеночноклеточная карцинома, эмбрионально-клеточная опухоль или рак молочной железы). Например, фрагменты молекулы антитела к AMC по изобретению можно использовать в анализах , и  диагностики или анализах с визуализацией.
[0495] Дополнительные варианты осуществления изобретения включают способы диагностики заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или аберрантной экспрессией AFP у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек). Способы включают детекцию презентирующих AMC клеток у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или аберрантной экспрессией AFP у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек), включающий (a) введение эффективного количества меченого фрагмента молекулы антитела к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления индивидууму и (b) определение уровня метки у индивидуума, таким образом, что уровень метки выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает заболеванием или нарушением. Пороговый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем детекции метки описанными выше способом диагностики в первой группе индивидуумов, которые страдают заболеванием или нарушением, и во второй группе индивидуумов, которые не страдают заболеванием или нарушением, и установления порогового уровня по уровню, который позволяет проводить различие между первой и второй группами. В некоторых вариантах осуществления пороговый уровень равен нулю, и способ включает определение наличия или отсутствия метки у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает ожидание в течение периода времени после проведения этапа (a) для того, чтобы позволить меченому фрагменту молекулы антитела к AMC преимущественно сконцентрироваться в участках у индивидуума, где экспрессируется AMC (и для выведения несвязанного меченого фрагмента молекулы антитела к AMC). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает вычитание фонового уровня метки. Фоновый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем детекции метки у индивидуума перед введением меченого фрагмента молекулы антитела к AMC или путем детекции метки описанным выше способом диагностики у индивидуума, который не страдает заболеванием или нарушением. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль выбрана, например, из группы, состоящей из печеночноклеточной карциномы, эмбрионально-клеточной опухоли и рака молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному, и способ дополнительно включает определение уровня метки в крови индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0496] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики метастатической печеночноклеточной карциномы у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек), включающий (a) введение эффективного количества меченого фрагмента молекулы антитела к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления индивидууму и (b) определение уровня метки в крови индивидуума, таким образом, что уровень метки выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает метастатической печеночноклеточной карциномой. Пороговый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем детекции метки описанным выше способом диагностики в первой группе индивидуумов, которые страдают метастатической печеночноклеточной карциномой, и во второй группе индивидуумов, которые не страдают метастатической печеночноклеточной карциномой, и установления порогового уровня по уровню, который позволяет проводить различие между первой и второй группами. В некоторых вариантах осуществления пороговый уровень равен нулю, и способ включает определение наличия или отсутствия метки в крови индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает ожидание в течение периода времени после проведения этапа (a) для того, чтобы позволить меченому фрагменту молекулы антитела к AMC преимущественно сконцентрироваться в участках у индивидуума, где экспрессируется AMC (и для выведения несвязанного меченого фрагмента молекулы антитела к AMC). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает вычитание фонового уровня метки. Фоновый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем детекции метки у индивидуума перед введением меченого фрагмента молекулы антитела к AMC, или путем детекции метки описанным выше способом диагностики у индивидуума, который не страдает метастатической печеночноклеточной карциномой. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0497] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или аберрантной экспрессией AFP у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек), включающий (a) приведение меченого фрагмента молекулы антитела к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления в контакт с образцом (таким как цельная кровь или гомогенизированная ткань), получаемым от индивидуума; и (b) определение числа клеток связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC в образце, таким образом, что величина числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает заболеванием или нарушением. Пороговый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем определения числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC описанным выше способом диагностики в первой группе индивидуумов, которые страдают заболеванием или нарушением, и во второй группе индивидуумов, которые не страдают заболеванием или нарушением, и установления порогового уровня по уровню, который позволяет проводить различие между первой и второй группами. В некоторых вариантах осуществления пороговый уровень равен нулю, и способ включает определение наличия или отсутствия клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC в образце. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает вычитание фонового уровня из числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC. Фоновый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем определения числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC у индивидуума перед введением меченого фрагмента молекулы антитела к AMC, или путем определения числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC описанным выше способом диагностики у индивидуума, который не страдает заболевание или нарушение. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль выбрана, например, из группы, состоящей из печеночноклеточной карциномы, эмбрионально-клеточной опухоли и рака молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному, и образец представляет собой образец крови (такой как цельная кровь). В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
[0498] В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики метастатической печеночноклеточной карциномы у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек), включающий (a) приведение меченого фрагмента молекулы антитела к AMC в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления в контакт с образцом (таким как цельная кровь), получаемым от индивидуума; и (b) определение числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC в образце, таким образом, что величина числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает метастатической печеночноклеточной карциномой. Пороговый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем определения числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC описанным выше способом диагностики в первой группе индивидуумов, которые страдают метастатической печеночноклеточной карциномой, и во второй группе индивидуумов, которые не страдают метастатической печеночноклеточной карциномой, и установления порогового уровня по уровню, который позволяет проводить различие между первой и второй группами. В некоторых вариантах осуществления пороговый уровень равен нулю, и способ включает определение наличия или отсутствия клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC в образце. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает вычитание фонового уровня из числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC. Фоновый уровень можно определять различными способами, включая, например, путем определения числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC у индивидуума перед введением меченого фрагмента молекулы антитела к AMC, или путем определения числа клеток, связанных с меченым фрагментом молекулы антитела к AMC описанным выше способом диагностики у индивидуума, который не страдает метастатической печеночноклеточной карциномой. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой кровь (такую как цельная кровь). В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.
131
125
123
121
14
35
3
115m
113m
112
111
99
99m
201
68
67
103
99
133
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
[0499] Фрагменты молекулы антитела к AMC по изобретению можно использовать для анализа уровней презентирующей AMC клетки в биологическом образце способами известными специалистам в данной области. Подходящие антитела-метки известны в данной области и включают ферментативные метки, такие как, глюкозооксидаза; радиоактивные изотопы, такие как йод (I, I, I, I), углерод (C), сера (S), тритий (H), индий (In, In, In, In), технеций (Tc, Tc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Mo), ксенон (Xe), фтор (F), самарий (Sm), лютеций (Lu), гадолиний (Gd), прометий (Pm), лантан (La), иттербий (Yb), гольмий (Ho), иттрий (Y), scandium (Sc), рений (Re, Re), празеодимий (Pr), родий (Rh) и рутений (Ru); люминол; флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин; и биотин.
in vivo
ex vivo
[0500] Для меченых фрагментов молекулы антитела к AMC по изобретению можно применять техники, известные в данной области. Такие техники включают, но не ограничиваются ими, использование бифункциональных конъюгирующих средств (см., например, патенты США № 5756065, 5714631, 5696239, 5652361, 5505931, 5489425, 5435990, 5428139, 5342604, 5274119, 4994560 и 5808003). Наряду с указанными выше анализами для специалиста в данной области доступными являются различные анализы  и . Например, можно подвергать клетки в организме индивидуума действию фрагмента молекулы антитела к AMC, который необязательно является меченным детектируемой меткой, например, радиоактивным изотопом, и связывание фрагмента молекулы антитела к AMC с клетками можно оценивать, например, поверхностным сканированием радиоактивности или анализом образца (например, биопсии или другого биологического образца) получаемого от индивидуума, ранее подвергаемого действию фрагмента молекулы антитела к AMC.
Промышленные изделия и наборы
[0501] Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к промышленному изделию, содержащему вещества, пригодные для лечения AFP-положительного заболевания, такого как злокачественная опухоль (например, печеночноклеточная карцинома, эмбрионально-клеточная опухоль или рак молочной железы), для доставки конструкции к AMC в клетку, презентирующую AMC на своей поверхности, или для выделения или детекции презентирующих AMC клеток у индивидуума. Промышленное изделие может содержать контейнер и этикетку или вкладыш в упаковку на контейнере или вложенным в контейнер. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластик. Как правило, контейнер содержит композицию, которая является эффективной для лечения заболевания или нарушения, описываемого в настоящем описании, и может содержать стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон, содержащий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой конструкцию к AMC по изобретению. На этикетке или вкладыше в упаковку указано, что композицию используют для лечения конкретного состояния. Этикетка или вкладыш в упаковку дополнительно содержит инструкции по введению композиции конструкции к AMC пациенту. Также предусматривают промышленные изделия и наборы, предусматривающие комбинаторные виды терапии, описываемые в настоящем описании.
[0502] Вкладыш в упаковку относится к инструкциям, обычно входящим в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, использовании, дозировании, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся использования таких терапевтических продуктов. В некоторых вариантах осуществления на вкладыше в упаковку указывают, что композицию используют для лечения злокачественной опухоли (такой как печеночноклеточная карцинома, эмбрионально-клеточная опухоль или рак молочной железы).
[0503] Кроме того, промышленное изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно содержать другие вещества, желаемые с коммерческой и потребительской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
[0504] Также предоставлены наборы, которые являются пригодными для различных целей, например, для лечения AFP-положительного заболевания или нарушения, описываемого в настоящем описании, для доставки конструкции к AMC в клетку, презентирующую AMC на своей поверхности, или для выделения или детекции презентирующих AMC клеток у индивидуума, необязательно в комбинации с промышленными изделиями. Наборы по изобретению содержат один или более контейнеров, содержащих композицию конструкции к AMC (или стандартную лекарственную форму и/или промышленное изделие), и в некоторых вариантах осуществления дополнительно содержат другое средство (такое как средства, описываемые в настоящем описании) и/или инструкции для применения в соответствии с любым из способов, описываемых в настоящем описании. Набор могут дополнительно содержать описание отбора индивидуумов, подходящих для лечения. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, представляют собой, как правило, письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, бумажный лист, вкладываемый в набор), но также приемлемыми являются машиночитаемые инструкции (например, инструкции, хранимые на магнитном или оптическом запоминающем устройстве).
[0505] Например, в некоторых вариантах осуществления набор содержит композицию, содержащую конструкцию к AMC (например, полноразмерное антитело к AMC, полиспецифическую молекула к AMC (такую как биспецифическое антитело к AMC), или иммуноконъюгат к AMC). В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) композицию, содержащую конструкцию к AMC, и b) эффективное количество по меньшей мере одного другого средства, где другое средство увеличивает экспрессию белков MHC I класса и/или повышает презентацию на поверхности пептидов AFP белками MHC I класса (например, IFNγ, IFNβ, IFNα или ингибитора Hsp90). В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) композицию, содержащую конструкцию к AMC, и b) инструкции по введению композиции конструкции к AMC индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания, такого как HCC. В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) композицию, содержащую конструкцию к AMC, b) эффективное количество по меньшей мере одного другого средства, где другое средство увеличивает экспрессию белков MHC I класса и/или повышает презентацию на поверхности пептидов AFP белками MHC I класса (например, IFNγ, IFNβ, IFNα или ингибитора Hsp90), и c) инструкции по введению композиции конструкции к AMC и другого средства(в) индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания, такого как HCC. Конструкция к AMC и другое средство(а) могут содержаться разных контейнерах или в одном контейнере. Например, набор может содержать одну отдельную композицию или две или более композиций, где одна композиция содержит конструкция к AMC, и другая композиция содержит другое средство.
[0506] В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) композицию, содержащую конструкцию к AMC (например, полноразмерное антитело к AMC, полиспецифическую молекулу к AMC (такую как биспецифическое антитело к AMC) или иммуноконъюгат к AMC), и b) инструкции по объединению конструкции к AMC с клетками (такими как клетки, например, иммунные клетки, получаемые от индивидуума) для получения композиции, содержащей конъюгаты конструкция к AMC/клетка, и введению композиции конъюгата конструкция к AMC/клетка индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания (такого как HCC). В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) композицию, содержащую конструкцию к AMC, и b) клетку (такую как цитотоксическая клетка). В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) композицию, содержащую конструкцию к AMC, b) клетку (такую как цитотоксическая клетка) и c) инструкции по объединению конструкции к AMC с клеткой для получения композиции, содержащей конъюгаты конструкция к AMC/клетка, и введению композиции конъюгата конструкция к AMC/клетка индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания, такого как HCC. В некоторых вариантах осуществления набор содержит композицию, содержащую конструкцию к AMC, связанную с клеткой (такой как цитотоксическая клетка). В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) композицию, содержащую конструкцию к AMC, связанную с клеткой (такой как цитотоксическая клетка), и b) инструкции по введению композиции индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания, такого как HCC. В некоторых вариантах осуществления связь получают конъюгацией конструкции к AMC с молекулой на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления связь получают вставкой части конструкции к AMC в наружную мембрану клетки.
[0507] В некоторых вариантах осуществления набор содержит нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую конструкцию к AMC (например, полноразмерное антитело к AMC, полиспецифическую молекулу к AMC (такую как биспецифическое антитело к AMC), CAR к AMC или иммуноконъюгат к AMC) или ее полипептидные участки. В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую конструкцию к AMC, или ее полипептидные части, и b) клетку-хозяина (такую как эффекторная клетка) для экспрессии нуклеиновой кислоты (или набора нуклеиновых кислот). В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую конструкцию к AMC, или ее полипептидные части, и b) инструкции по i) экспрессии конструкции к AMC в клетке-хозяине (таком как эффекторная клетка, например, T-клетка), ii) получению композиции, содержащей конструкцию к AMC, или клетки-хозяина, экспрессирующей конструкцию к AMC, и iii) введению композиции, содержащей конструкцию к AMC, или клетки-хозяина, экспрессирующей конструкцию к AMC, индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания, такого как HCC. В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяина получают от индивидуума. В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) нуклеиновую кислоту (или набор нуклеиновых кислот), кодирующую конструкцию к AMC, или ее полипептидные части, b) клетку-хозяина (такую как эффекторная клетка) для экспрессии нуклеиновой кислоты (или набора нуклеиновых кислот), и c) инструкции по i) экспрессии конструкции к AMC в клетке-хозяине, ii) получению композиции, содержащей конструкцию к AMC, или клетки-хозяина, экспрессирующей конструкцию к AMC, и iii) введению композиции, содержащей конструкцию к AMC, или клетку-хозяина, экспрессирующую конструкцию к AMC, индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания, такого как HCC.
[0508] В некоторых вариантах осуществления набор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR к AMC. В некоторых вариантах осуществления набор содержит вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR к AMC. В некоторых вариантах осуществления набор содержит a) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR к AMC, и b) инструкции по i) введению вектора в эффекторные клетки, такие как T-клетки, получаемые от индивидуума, ii) получению композиции, содержащей эффекторные клетки с CAR к AMC, и iii) введению композиции эффекторной клетки с CAR к AMC индивидууму для лечения AFP-положительного заболевания, такого как HCC.
[0509] Наборы по изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается ими, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые мешки) и т.п. Наборы могут необязательно содержать дополнительные компоненты, такие как буферы и пояснительная информация. Таким образом, настоящее изобретение также относится к промышленным изделиям, которые включают флаконы (такие как герметичные флаконы), бутылки, банки, гибкая упаковка и т.п.
[0510] Инструкции, касающиеся использования композиций конструкций к AMC, как правило, включают информацию относительно дозирования, схемы дозирования и пути введения предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, большие упаковки (например, многодозовые упаковки) или субстандартные дозы. Например, могут быть предоставлены наборы, которые содержат достаточные дозы конструкции к AMC (например, полноразмерного антитела к AMC, полиспецифической молекулы к AMC (такие как биспецифическое антитело к AMC), CAR к AMC или иммуноконъюгат к AMC), как описано в настоящем описании, для обеспечения эффективного лечения индивидуума в течение длительного периода времени, такого как любого из недели, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток, 12 суток, 13 суток, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 6 недель, 8 недель, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев или более. Наборы также могут содержать многократные стандартные дозы конструкции к AMC и фармацевтических композиций, и инструкции по использованию и упакованные в количествах, достаточных для хранения и использования в аптеках, например, больничных аптеках и производственных аптеках.
[0511] Специалистам в данной области понятно, что в рамках объема и сущности настоящего изобретения возможными являются несколько вариантов осуществления. Ниже изобретение описано более подробно посредством ссылки на следующие ниже неограничивающие примеры. Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но, конечно, их не следует интерпретировать как ограничивающие каким-либо образом его объем.
Иллюстративные варианты осуществления
[0512] Вариант осуществления 1. В некоторых вариантах осуществления предоставлена выделенная конструкция к AMC, содержащая фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается с комплексом, содержащим пептид альфа-фетопротеин (AFP) и белок главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса (комплекс AFP/MHC I класса или AMC).
[0513] Вариант осуществления 2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 1 комплекс AFP/MHC I класса презентируется на клеточной поверхности.
[0514] Вариант осуществления 3. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 1 комплекс AFP/MHC I класса презентируется на поверхности злокачественной клетки.
[0515] Вариант осуществления 4. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-3 белок MHC I класса представляет собой лейкоцитарный антиген человека (HLA)-A.
[0516] Вариант осуществления 5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 4 белок MHC I класса представляет собой HLA-A02.
[0517] Вариант осуществления 6. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 5 белок MHC I класса представляет собой HLA-A*02:01 подтип of HLA-A02 аллель.
[0518] Вариант осуществления 7. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-6 фрагмент молекулы антитела дает перекрестную реакцию с комплексом, содержащим пептид AFP и вторым белком MHC I класса, содержащим другую аллель HLA чем белок MHC I класса.
[0519] Вариант осуществления 8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-7 длина пептида AFP составляет от 8 до 12 аминокислот.
[0520] Вариант осуществления 9. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-8 пептид AFP получают из AFP человека.
[0521] Вариант осуществления 10. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-9 пептид AFP содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-13 и 16.
[0522] Вариант осуществления 11. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 9 пептид AFP содержит аминокислотную последовательность FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 4).
[0523] Вариант осуществления 12. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-11 выделенная конструкция к AMC дает перекрестную реакцию с комплексом, содержащим межвидовой вариант пептида AFP и белок MHC I класса.
[0524] Вариант осуществления 13. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-12 фрагмент молекулы антитела принадлежит человеку, является гуманизированным или полусинтетическим.
[0525] Вариант осуществления 14. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-13 фрагмент молекулы антитела представляет собой полноразмерное антитело, Fab, Fab', (Fab')2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv).
[0526] Вариант осуществления 15. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-14 фрагмент молекулы антитела связывается с комплексом AFP/MHC I класса с равновесной константой диссоциации (Kd) приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ.
[0527] Вариант осуществления 16. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-15 выделенная конструкция к AMC связывается с комплексом AFP/MHC I класса с Kd приблизительно от 0,1 пМ приблизительно до 500 нМ.
[0528] Вариант осуществления 17. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-16 фрагмент молекулы антитела содержит:
i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий определяющая комплементарность область тяжелой цепи (HC-CDR) 1, содержащую аминокислотную последовательность G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W (SEQ ID NO: 87) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T (SEQ ID NO: 88) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D (SEQ ID NO: 89) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 замен аминокислот; и
ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий определяющая комплементарность область легкой цепи (LC-CDR) 1, содержащую аминокислотную последовательность S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y (SEQ ID NO: 120) или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S (SEQ ID NO: 121); или ее вариант, содержащий до 3 замен аминокислот, где X может представлять собой любую аминокислоту.
[0529] Вариант осуществления 18. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-16 фрагмент молекулы антитела содержит:
i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 замен аминокислот, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 замен аминокислот, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 замен аминокислот; и
ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 замен аминокислот, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109 или ее вариант, содержащий приблизительно до 3 замен аминокислот, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 замен аминокислот.
[0530] Вариант осуществления 19. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-16 фрагмент молекулы антитела содержит:
i) вариабельный домен тяжелой цепи (HC), содержащий HC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 57-66, HC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 67-76, и HC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 77-86 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 замен аминокислот в областях HC-CDR; и
ii) вариабельный домен легкой цепи (LC), содержащий LC-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 90-99, LC-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 100-109, и LC-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 110-119 или ее вариант, содержащий приблизительно до 5 замен аминокислот в областях LC-CDR.
[0531] Вариант осуществления 20. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 18 или 19 фрагмент молекулы антитела содержит a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 17-26; и b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36 или ее вариант, обладающий по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 27-36.
[0532] Вариант осуществления 21. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 20 фрагмент молекулы антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 17-26, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-36.
[0533] Вариант осуществления 22. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-21 выделенная конструкция к AMC представляет собой полноразмерное антитело.
[0534] Вариант осуществления 23. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-22 выделенная конструкция к AMC является моноспецифической.
[0535] Вариант осуществления 24. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-22 выделенная конструкция к AMC является полиспецифической.
[0536] Вариант осуществления 25. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 24 выделенная конструкция к AMC является биспецифической.
[0537] Вариант осуществления 26. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 24 или 25 выделенная конструкция к AMC представляет собой тандемный scFv, диатело (Db), одноцепочечное диатело (scDb), переориентирующееся антитело с двойной аффинностью (DART), антитело с двойным вариабельным доменом (DVD), выступ во впадину (KiH) антитело, «замок на причале» (DNL) антитело, химически связанное антитело, гетеромультимерное антитело или гетероконъюгированное антитело.
[0538] Вариант осуществления 27. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 26 выделенная конструкция к AMC представляет собой тандемный scFv, содержащий два scFv, связанных пептидным линкером.
[0539] Вариант осуществления 28. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 27 пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS.
[0540] Вариант осуществления 29. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 24-28 выделенная конструкция к AMC дополнительно содержит второй фрагмент молекулы антитела, который специфически связывается со вторым антигеном.
[0541] Вариант осуществления 30. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 29 второй антиген представляет собой антиген на поверхности T-клетки.
[0542] Вариант осуществления 31. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 30 второй антиген выбран из группы, состоящей из CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L и HVEM.
[0543] Вариант осуществления 32. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 30 второй антиген представляет собой CD3ε, и выделенная конструкция к AMC представляет собой тандемный scFv, содержащий N-концевой scFv, специфический к комплексу AFP/MHC I класса, и C-концевой scFv, специфический к CD3ε.
[0544] Вариант осуществления 33. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 30 T-клетка выбрана из группы, состоящей из цитотоксической T-клетки, хелперной T-клетки и естественной киллерной T-клетки.
[0545] Вариант осуществления 34. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 29 второй антиген представляет собой антиген на поверхности естественной киллерной клетки, нейтрофила, моноцита, макрофага или дендритной клетки.
[0546] Вариант осуществления 35. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-21 выделенная конструкция к AMC представляет собой химерный антигенный рецептор.
[0547] Вариант осуществления 36. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 35 химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный домен, содержащий фрагмент молекулы антитела, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий внутриклеточную сигнальную последовательность CD3ζ и внутриклеточную сигнальную последовательность CD28.
[0548] Вариант осуществления 37. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 1-21 выделенная конструкция к AMC представляет собой иммуноконъюгат, содержащим фрагмент молекулы антитела и эффекторную молекулу.
[0549] Вариант осуществления 38. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 36 эффекторная молекула представляет собой терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из лекарственного средства, токсина, радиоактивного изотопа, белка, пептида и нуклеиновой кислоты.
[0550] Вариант осуществления 39. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 38 терапевтическое средство представляет собой лекарственное средство или токсин.
[0551] Вариант осуществления 40. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 37 эффекторная молекула представляет собой метку.
[0552] Вариант осуществления 41. В некоторых вариантах осуществления предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая выделенную конструкцию к AMC любого из вариантов осуществления 1-39.
[0553] Вариант осуществления 42. В некоторых вариантах осуществления предоставлена клетка-хозяин, экспрессирующая выделенную конструкцию к AMC любого из вариантов осуществления 1-40.
[0554] Вариант осуществления 43. В некоторых вариантах осуществления предоставлена нуклеиновая кислота, кодирующая полипептидные компоненты выделенной конструкции к AMC любого из вариантов осуществления 1-40.
[0555] Вариант осуществления 44. В некоторых вариантах осуществления предоставлен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту варианта осуществления 43.
[0556] Вариант осуществления 45. В некоторых вариантах осуществления предоставлена эффекторная клетка, экспрессирующая выделенную конструкцию к AMC варианта осуществления 35 или 36.
[0557] Вариант осуществления 46. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 45 эффекторная клетка представляет собой T-клетку.
[0558] Вариант осуществления 47. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ детекции клетки, презентирующей комплекс, содержащий пептид AFP и белок MHC I класса на своей поверхности, включающий приведение клетки в контакт с выделенной конструкцией к AMC варианта осуществления 40 и детекцию наличия метки на клетке.
[0559] Вариант осуществления 48. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий введение индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции варианта осуществления 41.
[0560] Вариант осуществления 49. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий введение индивидууму эффективного количества эффекторной клетки вариантов осуществления 45 или 46.
[0561] Вариант осуществления 50. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 48 или 49 введение проводят внутривенным путем.
[0562] Вариант осуществления 51. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 48 или 49 введение проводят интратуморальным путем.
[0563] Вариант осуществления 52. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 48 или 49 введение проводят на участке инъекции, дистальном по отношению к первому участку заболевания.
[0564] Вариант осуществления 53. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 52 участок инъекции представляет собой первую опухоль, дистальную по отношению к первому участку заболевания.
[0565] Вариант осуществления 54. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 52 или 53 первый участок заболевания представляет собой AFP-положительную опухоль.
[0566] Вариант осуществления 55. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики у индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий:
a) введение эффективного количества выделенной конструкции к AMC варианта осуществления 40 индивидууму; и
b) определение уровня метки у индивидуума, где уровень метки выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает AFP-положительным заболеванием.
[0567] Вариант осуществления 56. В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ диагностики у индивидуума, страдающего AFP-положительным заболеванием, включающий:
a) приведение образца, выделенного у индивидуума, в контакт с выделенной конструкцией к AMC варианта осуществления 40; и
b) определение числа клеток, связанных с выделенной конструкцией к AMC в образце, где величина числа клеток, связанных с выделенной конструкцией к AMC, выше порогового уровня указывает на то, что индивидуум страдает AFP-положительным заболеванием.
[0568] Вариант осуществления 57. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 48-56 AFP-положительное заболевание представляет собой злокачественную опухоль.
[0569] Вариант осуществления 58. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 57 злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному, эмбрионально-клеточную опухоль или рак молочной железы.
[0570] Вариант осуществления 59. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 58 злокачественная опухоль представляет собой печеночноклеточную карциному.
[0571] Вариант осуществления 60. В некоторых дополнительных вариантах осуществления варианта осуществления 59 злокачественная опухоль представляет собой метастатическую печеночноклеточную карциному.
[0572] Вариант осуществления 61. В некоторых дополнительных вариантах осуществления любого из вариантов осуществления 48-54 AFP-положительное заболевание представляет собой печеночноклеточную карциному, и ингибируют метастазирование.
Примеры
Материалы
Образцы клеток, линии клеток и антитела
2
[0573] Линии клеток HepG2, SK-Hep1, MCF7, Malme-3M, CA46, THP-1, Colo205, ASPC1, OVCAR3, LnCAP, A498 и Hela получали от American Type Culture Collection. SK-Hep1-MiniG (или SK-Hep1 AFP МГ), MCF7-MiniG и Hela-MiniG (или Hela-MG) получали трансдукцией соответствующих исходных линий клеток пептидом AFP158, экспрессирующим кассету минигенов, что приводит к высокому уровню экспрессии на клеточной поверхности комплекса AFP158/HLA-A*02:01 в клетках SK-Hep1 и MCF7. Hela является HLA-A03- и HLA-A68-положительной и HLA*A02:01-отрицательной, и, таким образом, Hela-MiniG служила в качестве экспрессирующей минигены AFP158, но AFP158/HLA*A02:01 отрицательной контрольной линией клеток. Линии клеток культивировали в RPMI 1640, дополненной 10% FBS, 2 мМ глутамина при 37°C/5% CO.
2
2
[0574] Приобретали следующие ниже антитела: моноклональное Ab против HLA-A02 человека (клон BB7.2), конъюгированное с FITC или APC, и его изотипический контроль IgG2b/FITC мыши или APC к CD3, CD 19, CD56, CD33, CD34 человека или мыши (BD Biosciences, San Diego), F(ab) козы против IgG человека, конъюгированный с PE или FITC, и F(ab) козы против IgG (Invitrogen).
[0575] Все пептиды синтезировали в Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, Tex.). Чистота пептидов составляла >90%. Пептиды растворяли в DMSO и разбавляли в физиологическом растворе при 5 мг/мл и замораживали при -180°C. Биотинилированный одноцепочечный пептид AFP/HLA-A*02:01 и контрольные комплексы пептид/HLA-A*02:01 синтезировали путем рефолдинга пептидов с рекомбинантным HLA-A*02:01 и микроглобулином β-2 (β2M). 19 контрольных пептидов (SEQ ID NO: 122-140), которые связываются с HLA-A*02:01, получали из следующих 15 генов: BCR, BTG2, CALR, CD247, CSF2RA, CTSG, DDX5, DMTN, HLA-E, IFI30, IL7, PIM1, PPP2R1B, RPS6KB1 и SSR1.
Пример 1. Получение биотинилированного мономера комплекса AFP158/HLA-A*02:01
E.coli
[0576] Биотинилированные мономеры комплекса AFP158/HLA-A*02:01 получали по стандартным протоколам (Altman, J.D. & Davis, M.M., Current Protocols in Immunology 17.3.1-17.3.33, 2003). В кратком изложении, ДНК, кодирующую полноразмерный β-2 микроглобулин (β2M) человека синтезировали в Genewiz и клонировали в вектор pET-27b. К C-концу внеклеточного домена (ECD) HLA-A*02:01 добавляли пептид-субстрат BirA (BSP). ДНК, кодирующую ECD-BSP HLA-A*02:01, также синтезировали в Genewiz и клонировали в вектор pET-27b. Векторы, экспрессирующие человек β2M и ECD-BSP HLA-A*02:01, трансформировали в клетки BL21  раздельно и выделяли в виде телец включения из бактериальной культуры. Пептидный лиганд AFP158 подвергался рефолдингу с β2M человека и ECD-BSP HLA-A*02:01 с образованием мономера комплекса AFP158/HLA-A*02:01. Свернутые мономеры пептид/HLA-A*02:01 концентрировали ультрафильтрацией и дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией. HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR уравновешивали 1.5 объемами колонки фосфатно-солевого буфера Дульбеко Hyclone (Thermo Scientific, каталожный номер SH3002802). Неочищенный образец нагружали и элюировали 1 объемом колонки. Первый пик, соответствующий неправильно свернутым агрегатам, элюировали приблизительно 111,3 мл, пик, соответствующий правильно свернутому комплексу MHC, наблюдали при 212,5 мл и пик, соответствующий свободному β2M, наблюдали при 267,2 мл (фиг. 1). Для определения чистоты белка проводили SDS-PAGE очищенного комплекса AFP158/MHC. В кратком изложении, 1 мкг белкового комплекса смешивали с 2,5 мкл буфера для внесения образца NuPAGE LDS (Life Technologies, NP0008) и доводили до 10 мкл деионизированной водой. Образец нагревали при 70°C в течение 10 минут, а затем вносили в гель. Электрофорез в геле проводили при 180 В в течение 1 часа. Субъединицы HLA-A*02:01 и β2M наблюдали в виде больших полос на геле (фиг. 2). Мономеры пептид/HLA-A*02:01 биотинилировали посредством опосредованной BirA ферментативной реакции, а затем очищали анионообменной хроматографией с высоким разрешением. Биотинилированные мономеры пептид/HLA-A*02:01 хранили в PBS при -80°C.
Пример 2. Отбор и характеристика scFv, специфического к комплексам AFP158/HLA-A*02:01
10
+
E.coli
E.coli
[0577] Набор библиотек фагового дисплея scFv антител человека (разнообразие=10×10), конструируемые Eureka Therapeutics использовали для отбора mAb человека, специфических к AFP158/HLA-A*02:01. 15 фаговых библиотек полностью принадлежащих человеку scFv использовали для пэннинга против комплекса AFP158/HLA-A*02:01. Для уменьшения конформационного изменения комплекса MHC1, вводимого путем иммобилизации белкового комплекса на пластиковых поверхностях, использовали пэннинг в растворе и пэннинг клеток вместо общепринятого пэннинга планшетов. При пэннинге в растворе биотинилированные антигены сначала смешивали с фаговой библиотекой scFv человека после длительного промывания буфером PBS, а затем вытягивали фаговые комплексы антиген-scFv антитело посредством конъюгированных со стрептавидином Dynabead M-280 через магнитную подставку. Затем элюировали связанны клоны и использовали для инфицирования клеток XL1-Blue. При пэннинге клеток клетки T2, нагруженные пептидом AFP158, сначала смешивали с фаговой библиотекой scFv человека. Клетки T2 являются линией лимфобластов HLA-A*02:01 с недостаточностью TAP. Для нагрузки пептида клетки T2 сенсибилизировали пептидами (50 мкг/мл) в среде RPMI1640, не содержащей сыворотки, в присутствии 20 мкг/мл β2M в течение ночи. После длительного промывания PBS нагруженные пептидом клетки T2 со связанным фагом с scFv антитела центрифугировали. Затем связанные клоны элюировали и использовали для инфицирования клеток XL1-Blue . Затем очищали фаговые клоны, экспрессируемые в бактериях. Проводили 3-4 цикла пэннинга с применением пэннинга в растворе, пэннинга клеток или сочетания пэннинга в растворе и пэннинга клеток для обогащения фаговых клонов scFv, которые специфически связываются с AFP158/ HLA-A*02:01.
[0578] Планшеты со стрептавидином ELISA покрывали биотинилированным мономером комплекса AFP158/HLA-A*02:01 (Bio-AFP158) или биотинилированным мономером контрольного пептида/HLA-A*02:01 (Bio-control) соответственно. В покрытых планшетах инкубировали индивидуальные фаговые клоны из обогащенных объединений пэннинга фагового дисплея против комплекса AFP158/HLA-A*02:01. Связывание фаговых клонов детектировали посредством конъюгированных с HRP антител к M13 и проявляли с использованием субстрата HRP. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм. Идентифицировали 605 положительных клонов скринингом ELISA из 1260 фаговых клонов, обогащенных в результате пэннинга фагов. На фиг. 3 приведен пример фагового клона, связывающегося с биотинилированным мономером AFP158/HLA-A*02:01 в анализе ELISA. Идентифицировали 82 уникальных клона секвенированием ДНК из 605 положительных в ELISA фаговых клонов. Положительные клоны определяли стандартным ELISA против биотинилированного мономера комплекса AFP158/HLA-A*02:01. Затем идентифицировали уникальные клоны антитела путем секвенирования ДНК положительных в ELISA клонов. Конкретные и уникальные клоны дополнительно тестировали на их связывание с комплексами HLA-A2/пептид на поверхностях живых клеток проточной цитометрией (анализ FACS) с использованием нагруженных AFP158 живых клеток T2. Клетки T2, нагруженные различными пептидами и β2M, сначала окрашивали очищенными фаговыми клонами scFv с последующим окрашиванием mAb к M13 мыши, и в заключении конъюгированным с R-PE антителом лошади против IgG мыши от Vector Labs. Каждый этап окрашивания проводили 30-60 минут на льду и клетки дважды промывали между окрашиванием. Из 82 клонов 44 специфически распознавали нагруженные AFP158 клетки T2. На фиг. 4 приведен пример специфического связывания фагового клона AFP158/HLA-A*02:01 с нагруженными пептидом клетками T2 с использованием FACS. Фаговые клоны специфически связываются с нагруженными AFP158 клетками T2 и не распознают клетки T2, нагруженные получаемым из hTERT пептидом ILAKFLHWL (hTERT540, SEQ ID NO: 141) в случае HLA-A*02:01, или клетки T2 с b2M, но без нагруженного пептида.
Пример 3. Характеристика положительных по FACS специфических к AFP158 фаговых клонов
Перекрестная реактивность к пептиду AFP158 мыши
[0579] Клоны, выбранные из анализа связывания FACS против нагруженных AFP158 клеток T2, дополнительно характеризовали в отношении перекрестной реактивности к комплексу пептид AFP158 мыши/HLA-A*02:01 на поверхности живых клеток анализом FACS с использованием нагруженных AFP158 мыши живых клеток T2. Пептид AFP158 мыши отличается от пептида AFP158 человека двумя аминокислотами в положении 4 и положении 9. Последовательность пептида AFP158 мыши представляет собой FMNRFIYEV (SEQ ID NO: 16), тогда как последовательность пептида AFP158 человека представляет собой FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 4). Антитела, перекрестно реагирующие как с комплексом AFP158 человека/MHC, так и с комплексом пептид AFP158 мыши/MHC являются пригодными для оценки токсичности лекарственного средства на основе антитела в трансгенных мышах HLA-A*02:01. Из тестируемых фаговых клонов 4 клона (№17, №33, №48 и №76) распознавали как нагруженные AFP158 человека клетки T2, так и нагруженные AFP158 мыши клетки T2 (фиг. 5). Клоны №52 и №79 также связывались с нагруженными AFP158 мыши клетками T2, но с меньшей степенью.
Картирование эпитопов посредством "прогулки" аланином
[0580] Для исследования точного эпитопа для распознавания mAb пептидами AFP158 человека с заменами аланином в положениях 1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 (SEQ ID NO: 7-13) сенсибилизировали клетки T2. Затем тестировали фаговые клоны антитела на связывание с этими нагруженными пептидом клетками T2 анализом FACS. Несмотря на то, что антитела распознавали небольшой конформационный эпитоп, образуемый пептидом AFP158 и его окружающие остатки цепи MHCα, ключевые пептидные остатки, взаимодействующие с различными антителами, оставались отличными. Например, прогнозировали, что клон №52 связывается с половиной со стороны N-конца пептида AFP158, вследствие того, что замена аланином в положении 1 или 3 значительно снижала связывание с нагруженными пептидом клетками T2, и замена аланином в положении 4 полностью подавляла связывание клона №52. В противоположность этому, замены аланинином в положении 5, 6, 7 или 8 не изменяли связывание клона №52. С другой стороны, клон №17-13 не реагировал на замену аланином в положении 4, но реагировал на замены в положениях 3, 5 и 7. На фиг. 6 приведен пример анализа FACS, демонстрирующий связывание фагового клона №52 с клетками T2, нагруженными различными пептидами AFP. В таблице 6 обобщено связывание нескольких клонов специфического к AFP158/HLA-A*02:01 антитела клетками T2, нагруженными пептидом AFP158 человека с заменой аланином.
Таблица 6
Пептид
Положение Ala
ET1402-52
ET1402-61
ET1402-76
ET1402-79
AM1402-17-13
FMNKFIYEI
37900
30400
14400
30100
83300
<u>A</u>MNKFIYEI
1
468
12300
5458
21000
55600
FM<u>A</u>KFIYEI
3
4470
38600
38200
786
2914
FMN<u>A</u>FIYEI
4
20,9
15,1
38,3
79,2
50800
FMNK<u>A</u>IYEI
5
21800
3719
49300
34,4
1500
FMNKF<u>A</u>YEI
6
18800
169
40300
27,7
28800
FMNKFI<u>A</u>EI
7
42500
1110
29300
907
572
FMNKFIY<u>A</u>I
8
38500
1748
53300
16100
43200
Положение, чувствительное к замене
4, 1, 3
4, 6, 7,8, 5
4, 1
5, 6, 4, 3, 7
7, 5, 6
Оценка специфичности связывания антитела с эндогенными пептидами
[0581] В среднем каждая ядросодержащая клетка в организме человека экспрессирует приблизительно половину миллиона различных комплексов пептид/MHC I класса. Для разработки антител к комплексу пептид/MHCI в лекарственных средствах против злокачественной опухоли с высокой специфичностью и терапевтическим индексом, важным для антител является специфическое распознавание комплекса-мишени пептид/MHCI, а не самой молекулы MHCI или молекул MHCI, связанных с другими пептидами, презентируемыми на клеточных поверхностях. Для настоящего исследования соответствующая молекула MHCI представляет собой HLA-A*02:01. Во время начальных стадий пэннинга и скрининга фагов, авторы исключали антитела, которые связываются только с молекулой HLA-A*02:01 (см., например, фиг. 3 и 4). Отобранные фаговые клоны также подвергали скринингу против 19 эндогенных пептидов HLA-A*02:01, которые получали из белков, обычно экспрессируемых во многих типах ядросодержащих клеток человека, таких как α-цепь глобина, β-цепь глобина, ядерный белок p68 и т.п. Совокупность эндогенных пептидов (P19, SEQ ID NO: 122-140) помещали в клетки T2 и определяли связывание антитела анализом FACS. Как представлено на фиг. 7, фаговые клоны специфического к AFP158/HLA-A*02:01 антитела связываются с клетками T2, нагруженными пептидом AFP158, но не с клетками T2, нагруженными эндогенными пептидами. Авторы делают заключение, что идентифицированные антитела являются специфичными к комплексам пептид AFP158/HLA-A*02:01 и не распознают молекулы HLA-A*02:01, связанные с другими тестируемыми пептидами HLA-A*02:01.
Пример 4. Конструирование биспецифических антител
[0582] Биспецифические антитела (BsAbs) получали с использованием последовательностей scFv фаговых клонов, специфических к AFP158/HLA-A*02:01. BsAb представляют собой одноцепочечные биспецифические антитела, содержащие на N-конце последовательность scFv фагового клона, специфического к AFP158/HLA-A*02:01, и моноклональный scFv мыши к CD3ε человека на C-конце (Brischwein K. et al., Mol. Immunol. 43:1129-1143, 2006). Фрагменты ДНК, кодирующие scFv AFP158 и scFv к CD3ε человека, синтезировали в Genewiz и субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающего pGSN-Hyg Eureka с использованием стандартной технологии ДНК. Гексгистаминовую метку вводили на C-конце для очистки и детекции антитела. Клетки яичника китайского хомяка (CHO) трансфицировали экспрессирующим вектором BsAb, а затем культивировали в течение 7 суток для продукции BsAb антитела. Собирали супернатанты клеток CHO, содержащие секретируемые молекулы BsAb AFP158. Антитела BsAb очищали с использованием колонки HisTrap HP (GE healthcare) посредством системы FPLC AKTA. В кратком изложении, культуру клеток CHO отстаивали и помещали в колонку с низкой концентрацией имидазола(20 мМ), а затем использовали изократический элюирующий буфер с высокой концентрацией имидазола (500 мМ) для элюирования связанных белков BsAb. Молекулярные массы очищенных антител BsAb AFP158 измеряли в невосстановительных условиях электрофорезом в геле. 4 мкг белка смешивали с 2,5 мкл буфера для образца NuPAGE LDS (Life Technologies, NP0008) и доводили до 10 мкл деионизированной водой. Образец нагревали при 70°C в течение 10 минут, а затем вносили в гель. Электрофорез в геле проводили при 180 В в течение 1 часа. В качестве основных полос в геле наблюдают полосы ~50 кДа (фиг. 8). Агрегацию антител оценивали эксклюзионной хроматографией (SEC). 50 мкл образца инъецировали в колонку SEC (Agilent, BioSEC-3,300A, 4,6×300 мм), при этом буфер, состоящий из фосфатно-солевого буфера Дульбеко (Fisher Scientific, SH30028.FS) и 0,2M аргинина доводили до pH 7,0. BsAb наблюдали как основной пик при времени удержания ~15,8 мл. (фиг. 9). Для дополнительной характеристики BsAb использовали с агрегацией высокомолекулярных соединений менее 10%.
Пример 5. Характеристика антител BsAb к AFP158
Аффинность связывания антител BsAb к AFP158
a
d
d
[0583] Аффинность связывания антител BsAb к AFP158 с рекомбинантным комплексом AFP158/HLA-A*02:01 измеряли поверхностным плазмонным резонансом (BiaCore). Параметры связывания BsAb к AFP158 с комплексом AFP158/HLA-A*02:01 измеряли с использованием набора His Capture (GE Healthcare, кат. № 28995056) на Biacore X100 (GE Healthcare) по протоколу производителя для многоцикловых измерений кинетики. Все белки, используемые в анализе, разбавляли с использованием буфера HBS-E. В кратком изложении, 1 мкг/мл BsAb к AFP158 иммобилизовали на сенсорном чипе, предварительно функционализированном антителом к гистидину путем пропускания раствора через проточную кювету 2 при 2 мкл/мин в течение 2 минут. Связывание с комплексом AFP158/A*02:01 анализировали при 0,19, 0,38, 7,5, 15 и 30 мкг/мл, где каждый этап состоял из ассоциации в течение 3 минут и диссоциации в течение 3 минут при 30 мкл/мин. В конце цикла проводили регенерацию поверхности с использованием регенерирующего буфера из набора His Capture. После измерений кинетики проводили регенерацию поверхности с использованием регенерирующего раствора из набора. Данные анализировали с использованием режима участка связывания 1:1 с использованием программного обеспечения для оценки BiaCore X-100. Рассчитывали параметры связывания (константу ассоциации k, константу диссоциации k и равновесную константу диссоциации K). Аффинности связывания антител к AFP158 в формате одновалентного scFv находятся в диапазоне 10-500 нМ. (Примеры приведены в таблице 7).
Таблица 7
№ клона
k<sub>a</sub> [1/мс]
k<sub>d</sub> [1/с]
K<sub>d</sub> [нМ]
№52
2,63E+05
1,71E-2
65
№61
8,92E+04
3,08E-3
34
№76
9,94E+04
1,42E-2
143
№79
7,88E+04
2,51E-2
318
№17-13
7,36E+04
3,45E-3
47
Анализ цитолитической активности T-клеток
+
[0584] Цитотоксичность в отношении опухоли анализировали анализом цитотоксичности LDH (Promega). T-клетки человека, приобретаемые от AllCells, активировали и размножали с использованием Dynabead CD3/CD28 (Invitrogen) по протоколу производителя. Активированные T-клетки (ATC) культивировали и поддерживали в среде RPMI1640 с 10% FBS плюс 100 Ед/мл IL-2 и использовали на сутки 7-14. T-клетки составляли >99% CD3 по результату анализа FACS. активированные T-клетки (эффекторные клетки) и клетки-мишени кокультивировали в отношении 5:1 с различными концентрациями антител к BsAb в течение 16 часов. Затем определяли цитотоксичность измерением активности LDH в супернатантах культур.
[0585] Антитела BsAb к AFP158 вызывали цитолиз злокачественных клеток зависимым от AFP и HLA-A*02:01 образом. Из всех тестируемых линий клеток HEPG2 (положительные AFP и HLA-A*02:01) наиболее эффективно подвергались цитолитическому действию T-клеток, перенаправленных посредством BsAb AFP158. Другие тестируемые линии клеток, которые являлись отрицательными по AFP или отрицательными по HLA-A02, или отрицательными по AFP и LA-A02 не вызывали цитолиза так же эффективно в аналогичных экспериментальных условиях (фиг. 10).
Перекрестная реактивность антител BsAb к AFP158 против множественных аллелей HLA-A02
[0586] Молекулы MHCI человека состоят из 6 классов изоформ HLA-A, -B, -C, -E, -F и G. Гены тяжелой цепи HLA-A, -B и -C являются высоко полиморфными. Для каждой изоформы гены HLA дополнительно классифицируют в соответствии со сходством последовательностей тяжелой цепи. Например, HLA-A подразделяют на различные аллели, такие как HLA-A01, -A02, -A03 и т.д. Для аллеля HLA-A02 существует много подтипов, таких как HLA-A*02:01, A*02:02 и т.д. Между различными подтипами группы HLA-A02 различия последовательностей ограничены только несколькими аминокислотами. Таким образом, во многих случаях пептиды, которые связываются с молекулой HLA-A*02:01, также могут образовывать комплексы со многими подтипами аллеля HLA-A02. Как продемонстрировано в таблице 8 (http://www.allelefrequencies.net/), несмотря на то, что HLA-A*02:01 является преобладающим подтипом HLA-A02 в популяциях европеоидной расы, в Азии и Африке A*02:03, A*02:05, A*02:06, A*02:07 и A*02:11 также являются распространенными подтипами HLA-A02. Способность антител к AFP158 распознавать не только пептид AFP158 в случае HLA-A*02:01, а также другие подтипы HLA-A02, увеличивает популяцию пациентов, для которой лечение лекарственным средством на основе антитела к AFP158 может оказаться эффективным. Таким образом, авторы получали рекомбинантные комплексы AFP158/MHCI с другими подтипами аллеля HLA-A02 и тестировали аффинность связывания антител, специфических к AFP158/HLA-A*02:01, к таким другим комплексам. Аффинность связывания определяли с использованием ForteBio Octet QK. 5 мкг/мл биотинилированного комплекса HLA-A02 MHC различных подтипов наносили на биосенсор со стрептавидином. После отмывания избытка антигена антитела BsAb тестировали при 10 мкг/мл на связывание и диссоциацию. Параметры связывания рассчитывали с использованием участка связывания 1:1, модель частичного совпадения. В таблице 9 приведены аффинности связывания нескольких BsAb AFP158 для многих комплексов AFP158/HLA-A02 с различными подтипами. Было выявлено, что все тестируемые антитела распознают AFP158, связанный со многими подтипами аллеля HLA-A02.
Таблица 8
Австралия
Китай
Европа
Индия
Северная Африка
Африка к югу от Сахары
Тайвань
США
A*02:01
97,8%
39,5%
94,0%
53,9%
73,3%
56,3%
35,1%
79,4%
A*02:02
0,0%
0,1%
0,3%
0,9%
9,7%
24,1%
0,0%
3,6%
A*02:03
0,0%
15,3%
0,2%
4,9%
0,0%
0,4%
19,3%
2,2%
A*02:04
0,0%
0,1%
0,0%
0,3%
2,6%
0,4%
0,0%
0,2%
A*02:05
1,1%
0,9%
3,2%
5,8%
13,8%
15,9%
0,1%
4,5%
A*02:06
0,0%
16,0%
0,9%
10,6%
0,0%
0,7%
12,8%
5,5%
A*02:07
1,1%
26,1%
0,4%
0,4%
0,0%
0,0%
32,7%
2,4%
A*02:08
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
A*02:09
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
A*02:10
0,0%
1,1%
0,0%
0,0%
0,0%
0,2%
0,0%
0,1%
A*02:11
0,0%
0,1%
0,1%
22,3%
0,0%
1,5%
0,0%
1,7%
другие подтипы A02 (A*02:12-A*02:93)
0,0%
0,7%
0,8%
0,9%
0,5%
0,5%
0,0%
0,6%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
Таблица 9
HLA-A02 подтип
№17-13 K<sub>d</sub>(нМ)
№52 K<sub>d</sub>(нМ)
№61 K<sub>d</sub>(нМ)
№76 K<sub>d</sub>(нМ)
№79 K<sub>d</sub>(нМ)
A*02:02
233
16,8
394
16,8
115
A*02:03
212
25,7
204*
25,7*
--
A*02:05
183
18,6
2000
18,6
686
A*02:06
26,4
9,4
2200*
9,4*
63,8
A*02:07
373
6,9
3200*
6,9*
387
A*02:11
11,3
10,4
433
10,4
68,5
* наименьшее доверительное подобранное значение.
Пример 6. Получение T-клеток (CAR-T), презентирующих специфический к AFP158/HLA-A*02:01 химерный антигенный рецептор
[0587] Терапия на основе химерного антигенного рецептора (терапия CAR-T) является новой формой направленной иммунотерапии. Она объединяет the превосходную направленную специфичность моноклональных антител с эффективной цитотоксичностью и длительной устойчивостью, обеспечиваемой цитотоксическими T-клетками. Такая технология обеспечивать то, что T-клетки приобретают длительную новую антигенную специфичность, независящую от эндогенного TCR. Клинические испытания продемонстрировали клинически значимую противоопухолевую активность терапии на основе CAR-T при нейробластоме (Louis C.U. et al., Blood 118(23):6050-6, 2011), B-ALL (Maude S.L. et al., N Engl J Med. 371(16):1507-1517, 2014), CLL (Brentjens R.J. et al., Blood. 118(18):4817-4828, 2011) и B-клеточной лимфоме (Kochenderfer J.N. et al., Blood. 116(20):4099-4102, 2010). В одном из исследований сообщали о 90% пациентов с полной ремиссией среди 30 пациентов с B-ALL, получавших лечение терапией на основе CD19-CAR T (Maude et al., выше).
cis
[0588] Для дополнительного исследования активности специфических к AFP158/HLA-A*02:01 антител авторы конструировали scFv к AFP158/HLA-A*02:01, экспрессирующие CAR, и трансдуцировали T-клетки такими CAR. Специфические к AFP158/HLA-A*02:01 CAR конструировали с использованием лентивирусного экспрессирующего CAR вектора. scFv к AFP158/HLA-A*02:01 пересаживали во второе поколение CAR (Mackall C.L. et al., Nat. Rev. Clin. Oncol. 11(12):693-703, 2014) с сигнальным доменом CD28 и TCRζ, конструированным в -ориентации для обеспечения внутриклеточных стимулирующих сигналов T-клеток и для активации T-клеток. На фиг. 11 приведена схематическая иллюстрация конструкций CAR к AFP158/HLA-A*02:01.
Пример 7. Характеристика T-клеток с CAR к AFP158
CAR к AFP158, экспрессируемые в первичных CD4+ и CD8+ T-клетках
+
+
[0589] У здоровых доноров выделяли лимфоциты периферической крови и трансдуцировали конструкцией CAR к AFP158, кодирующей связывающий фрагмент молекулы антитела к AFP158/HLA-A*02:01. Через пять суток после трансдукции T-клетки с CAR к AFP158 и трансдуцированные в условиях имитации клетки совместно окрашивали тетрамером AFP158 и одним из антител к CD3, CD4 или CD8 и анализировали проточной цитометрией. На фиг. 24 представлены результаты проточной цитометрии для тарнсфицированных CAR к AFP158 и трансфицированных в условиях имитации клеток, свидетельствующие о том, что CAR к AFP158 можно экспрессировать в первичных CD4 и CD8 T-клетках.
Равномерное распределение CAR к AFP158 на поверхности T-клеток
in vitro
in vivo
in vivo
[0590] Было продемонстрировано, что CAR-T-клетки с равномерным распределением на клеточной поверхности CAR уничтожают опухолевые клетки более эффективно  и , чем CAR-T-клетки с неравномерным распределением на клеточной поверхности CAR, и они легче подвергаются истощению после цитолиза. Неравномерное распределение, такое как агрегация, CAR может приводить к независящей от антигена активации CAR, преждевременному истощению T-клеток и отсутствию противоопухолевой активности . Таким образом, желательным является равномерное распределение CAR на поверхности T-клеток. Для определения распределения scFv к AFP158/HLA-A*02:01, экпрессирующих CAR на мембране T-клеток, авторы использовали конъюгат пептида AFP158-HLA-A2 и тетрамера-PE для окрашивания трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток, как описано выше. Первичные CD3 человека+ T-клетки сначала активировали гранулами с антителами к CD3 и к CD28, а затем трансдуцировали лентивирусом с CAR к AFP158. На 8 сутки после вирусной трансдукции трансдуцированные CAR к AFP158 T-клетки окрашивали пептидом AFP158-HLA-A2-тетрамер-PE при 2 нг/мл в присутствии ингибитора транспорта белков в течение 30 минут при комнатной температуре. Изображения получали с использованием флуоресцентного микроскопа Olympus. Авторы выявили, что распределение CAR к AFP158 на мембране T-клеток является равномерным и однородным. Не наблюдали точечное распределение CAR. Характерное изображение приведено на фиг. 26.
Исследование цитотоксичности in vitro T-клеток с CAR к AFP158
[0591] Лентивирусы, содержащие химерный антигенный рецепторы, специфические к AFP158/HLA-A*02:01, получали трансфекцией клеток 293T векторами с CAR. T-клетки человека использовали для трансдукции через 1 сутки стимуляции гранулами CD3/CD28 (Dynabeads, Invitrogen) в присутствии интерлейкина 2 при 100 Ед/мл. Концентрированные лентивирусы наносили на T-клетки в покрытых ретронектином (Takara) 6-луночных планшетах в течение 72 часов. Функциональную оценку трансдуцированных T-клеток (T-клеток с CAR к AFP158) проводили с использованием анализа цитотоксичности с LDH. Используемые отношения эффектор к мишени составляли 5:1.
[0592] Панель клонов CAR к AFP158, трансдуцированных в T-клетки, тестировали против линий клеток-мишеней HEPG2, SK-HEP1 и SK-HEP1-MiniG. T-клетки, трансдуцированные клонами CAR к AFP158, специфически вызывали цитолиз положительных по AFP158/HLA*A02:01 линий клеток HEPG2 и SK-HEP1-MiniG (фиг. 12). Экспрессирующие CAR к AFP158 T-клетки вызывали цитолиз положительных по мишени злокачественных клеток специфическим и высокоэффективным способом для большинства тестируемых клонов антитела. Однако те же T-клетки слабо распознавали отрицательные по мишени клетки SK-HEP1 дикого типа, за исключением T-клеток, трансдуцированных клоном №44, для которых демонстрировали определенный неспецифический цитолиз клеток SK-HEP1 дикого типа.
[0593] Тестировали большую панель линий злокачественных клеток положительных и отрицательных по AFP158 и HLA*A02:01 в отношении цитолиза T-клетками с CAR к AFP158. Первичные T-клетки, которые трансдуцировали в условиях имитации или трансдуцировали CAR к AFP158 (конструкцией CAR, кодирующей иллюстративное антитело к AFP158/HLA*A02:01), тестировали на их способность специфически вызывать цитолиз положительных по AFP158/HLA*A02:01 злокачественных клеток при отношении эффектор к мишени 5:1. Как приведено на фиг. 13, T-клетки с CAR к AFP158 специфически вызывали цитолиз положительных по AFP158/HLA*A02:01 линий клеток HepG2 и SK-Hep1-MiniG, но ни одной из других линий клеток, которые являлись отрицательными по AFP или отрицательными по HLA*A02:01. Следует отметить, что эти данные демонстрируют, что исследуемое авторами антитело является высокоспецифичным к экспрессирующим AFP клеткам и не опосредует неспецифический цитолиз большой панели линий клеток с HLA-A02 во многих типах тканей, которые не экспрессируют AFP.
Трансдуцированные CAR к AFP158 T-клетки подвергаются дегрануляции при стимуляции антигеном
[0594] Для дополнительной характеристике видов биологической активности в трансдуцированных CAR к AFP158 T-клетках авторы использовали анализ проточной цитометрии для детекции экспрессии на поверхности CD107a в качестве измерения активности дегрануляции. Трансдуцированные CAR к AFP158 T-клетки инкубировали совместно с клетками HepG2, SK-HEP-1 и SK-Hep1-MiniG в течение 4 часов в присутствии разбавленного 1:200 антитела к CD107a и смеси ингибиторов транспорта белков (eBioscience). После совместной инкубации с клетками-мишенями трансдуцированные T-клетки окрашивали тертамерами AFP158/HLA и антителом к CD8. Дегрануляция в положительных по тетрамеру, положительных по CD8 T-клетках приведена на фиг. 25. Наибольший уровень дегрануляции, как измеряют по экспрессии CD107a, наблюдали при совместной инкубации с SK-Hep1-MiniG с последующей HepG2 инкубацией, при этом не наблюдали дегрануляции с исходными отрицательными по антигену SK-HEP-1. Это соответствует указанным выше данным об опосредованным T-клетками лизисе клеток.
Высвобождение цитокинов
[0595] Также анализировали профиль высвобождения цитокинов при лечении активированными T-клетками с CAR к AFP158. T-клетки трансдуцировали в условиях имитации или трансдуцировали иллюстративным CAR к AFP158 и инкубировали совместно с клетками-мишенями, как указано. Высвобождение IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α в среду измеряли через 16 часов с использованием мультиплексной системы Magpix (Luminex) с использованием анализа Bio-plex Pro Human Cytokine 8-plex (BioRad). Концентрации цитокинов определяли по стандартной кривой после вычитания значений из среды, клетки-мишени отдельно и трансдуцированные CAR к AFP158 T-клетки отдельно. Как приведено на фиг. 14A и 14B, высвобождение цитокинов детектировали только, когда T-клетки с CAR к AFP158 инкубировали совместно с положительными по AFP158/HLA*A02:01 клетками: SK-Hep1-MiniG, MCF7-MiniG и HepG2, но не с отрицательными по AFP158/HLA*A02:01 клетками: SK-Hep1 и MCF7. T-клетки с CAR к AFP158 высвобождали гораздо более выской уровень цитокинов, когда их подвергали воздействию SK-Hep1-MiniG и MCF7-MiniG. Это соответствует трансдуцированным минигеном AFP158 злокачественным клеткам, экспрессирующим гораздо более высокие уровни AFP158/HLA*A02:01 на клеточной поверхности по сравнению с HepG2. Трансдуцированные в условиях имитации T-клетки высвобождали только следовые количества цитокинов, при их наличии, при присутствии положительных по AFP158/HLA*A02:01 злокачественных клеток. Высвобождение IL-6 после совместной инкубации с трансдуцированными в условиях имитации (отрицательными по AFP) SK-Hep1 обусловлено эндогенной экспрессией IL-6 в этих клетках (на основании данных, которые не показаны).
Исследование эффективности in vivo T-клеток с CAR к AFP158 на модели ксенотрансплантата HCC человека
in vivo
6
3
7
[0596] Противоопухолевую активность  T-клеток с CAR к AFP158 тестировали на нескольких установленных моделях ксенотрансплантата HCC человека на мышах SCID Beige с ослабленным иммунитетом. HepG2 имплантировали подкожно (п/к) выше правого бока в концентрации 2,5×10 клеток на мышь. Когда объемы опухолей достигали в среднем 100 мм, мышей случайным образом распределяли в зависимости от объема опухоли на четыре группы: 1) без обработки, 2) внутривенное (в/в) введение трансдуцированных в условиях имитации, совместимых донорных T-клеток (условия имитации), 3) внутривенное (в/в) введение иллюстративных трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток, и 4) внутриопухолевая (в/о) инъекция трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток. Все виды обработки проводили в дозе 10 клеток на мышь и повторяли каждые 2 недели в целом для 3 доз.
[0597] Контрольные T-клетки и T-клетки с CAR к AFP158 хорошо переносились в данных дозе и режиме дозирования; во время исследования не наблюдали связанных с обработкой неблагоприятных ответов. Опухоли у не получавших обработку мышей, а также у мышей, которых обрабатывали контрольными T-клетками, росли непрерывно то тех пор, пока они не достигали размера, при котором требуется эвтаназия. Как приведено на фиг. 15A, внутривенное введение T-клеток с CAR к AFP158 у несущих опухоль HepG2 мышей приводило к замедленному росту опухоли, начиная через 28 суток после первой дозы. На сутки 35 после первой дозы наблюдали приблизительно 25% ингибирование роста опухоли (фиг. 15A). В отличие от отсроченных эффектов в/в введения, в/о инъекции T-клеток с CAR к AFP158 вызывают быструю, абсолютную и длительную регрессию опухоли у всех мышей, где для 80% (6/8) демонстрировали полную регрессию (фиг. 15B).
6
7
6
7
[0598] Обсеменение брюшины HCC происходит в подгруппе пациентов, которые в результате имеют очень ограниченные варианты лечения. Таким образом, противоопухолевую активность T-клеток с CAR к AFP158 дополнительно тестировали на установленной интраперитонеальной модели ксенотрансплантата HCC. В этом исследовании меченные люциферазой клетки HepG2 (HepG2-luc2) имплантировали интраперитонеально (и/п) в дозе 2,5×10 клеток на мышь. Опухолевую нагрузку оценивали каждую неделю путем измерения биолюминесценции опухоли. Через одну неделю после имплантации опухоли животных разделяли случайным образом в зависимости от общего потока биолюминесценции на четыре группы: 1) без обработки, 2) обработка и/п инъекцией 10 контрольных T-клеток, обработка и/п инъекцией 10 T-клеток с CAR к AFP158 и 4) обработка и/п инъекцией 10 T-клеток с CAR к AFP158 (n=6 мышей в группе). В каждой группе вводили две дозы T-клеток, две недели в разные моменты времени.
6
7
[0599] Как наблюдают при в/в и в/о путях введения, не наблюдали клинических признаков неблагоприятных реакций в результате и/п инъекций контрольных T-клеток или T-клеток с CAR к AFP158. Как приведено на фиг. 16A (изменение испускания фотонов у несущих опухоль мышей на сутки 70 после обработки) и 16B (изображения испускание фотонов у несущих опухоль HepG2-Luc2 мышей на сутки 70), для опухолевой нагрузки у обрабатываемых контрольными T-клетками животных не демонстрировали отличия от опухолевой нагрузки, наблюдаемой в контрольной группе без обработки. В противоположность этому, у мышей, получавших обработку T-клетками с CAR к AFP158, при 10 или 10 клеток на мышь демонстрировали устойчивую регрессию опухоли. Не наблюдали зависящую от дозы противоопухолевую активность, что указывает на то, что обе дозы превышают максимальную эффективную дозу в этой модели. Таким образом, и/п обработка T-клетками с CAR к AFP158 на модели перитонеальной HCC является безопасной, действующей и эффективно устраняет опухоли.
in vivo
6
3
7
[0600] Также оценивали активность T-клеток с CAR к AFP158  на модели п/к ксенотрансплантата SK-Hep1-MiniG. SK-Hep1-MiniG имплантировали подкожно (п/к) выше правого бока при 2,5×10 клеток на мышь. Когда объем опухоли достигал в среднем 100 мм, мышей случайным образом разделяли в зависимости от объема опухоли на три группы: 1) внутривенная (в/в) обработка трансдуцированными в условиях имитации совпадающими донорными T-клетками (условия имитации), 2) внутривенная (в/в) обработка иллюстративными трансдуцированными CAR к AFP158 T-клетками и 3) внутриопухолевая (в/о) инъекция аналогичных трансдуцированных CAR к AFP158 T-клеток. Все виды обработки вводили в дозе 10 клеток на мышь и повторяли один раз через 2 недели после первой обработки. На этой модели опухоли в/в введение T-клеток с CAR к AFP158 приводило к немедленному ингибированию роста опухоли, замедлению роста опухоли приблизительно на 28% на сутки 31 после первой дозы (фиг. 17). Это позволяет предположить, что отсроченное действие ингибирования роста опухоль в/в введения T-клеток с CAR к AFP158 при опухолях HepG2 является характерным для модели явлением. Аналогично для результатов, получаемых при опухолях HepG2, в/о инъекция T-клеток с CAR к AFP158 на модели SK-Hep1-MiniG на мышах приводило к устойчивой и длительной регрессии опухоли непосредственно после первой дозы (фиг. 17).
Пример 8. Получение и Характеристика полноразмерных антител IgG1 к AFP158
[0601] Полноразмерный IgG1 человека из отобранных фаговых клонов получали в линии клеток HEK293 и линии клеток яичника китайского хомяка (CHO), как описано (Tomimatsu K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 73(7):1465-1469, 2009) (данные не показаны). В кратком изложении, вариабельные области антитело субклонировали в экспрессирующие векторы млекопитающего с соответствующими последовательностями константной области легкой ламба- или каппа-цепи человека и константной области IgG1 человека. Применяя аналогичную стратегию клонирования, авторы также получали химерные полноразмерные антитела к AFP158 с константными областями тяжелой цепи и легкой цепи IgG1 мыши. Молекулярную массу очищенных полноразмерных антител IgG измеряли в восстановительных и невосстановительных условиях электрофорезом. Для определения чистоты белка проводили SDS-PAGE очищенных химерных антител IgG1 мыши к AFP158. В кратком изложении, 2 мкг белка смешивали с 2,5 мкл буфера для образца NuPAGE LDS (Life Technologies, NP0008) и доводили до 10 мкл деионизированной водой. Образец нагревали при 70°C в течение 10 минут, а затем наносили на гель. Электрофорез в геле проводили при 180 В в течение 1 часа. Примеры SDS-PAGE приведены на фиг. 18.
d
d
[0602] Химерное антитело IgG1 к AFP158 тестировали на связывание с презентирующими AFP158 клетками SK-HEP1 проточной цитометрией. SK-HEP1 являются положительной по HLA-A*02:01 и отрицательной по AFP линией клеток. Кассету минигена AFP158 трансфицировали в клетки SK-HEP1 с получением презентирующих AFP158 клеток SK-HEP1-miniG. Добавляли 10 мкг/мл антитела к клеткам на льду в течение 1 часа. Для детекции связывания антитела после промывания добавляли конъюгированное с R-PE антитело против IgG(H+L) мыши (Vector Labs №EI-2007). Было выявлено, что антитела к AFP158 связываются с трансфицированными минигеном клетками SK-HEP1-miniG, при этом вторичное контрольное антитело отдельно не связывалось с теми же клетками (фиг. 19). Аффинность связывания химерных антител IgG1 мыши к AFP158 определяли посредством ForteBio. Преобразование антител из одновалентных BsAb в двухвалентные антитела IgG существенно увеличивало аффинность связывания антител к AFP158 с антигеном-мишенью. Определяли, что K полноразмерных антител находилась в пикомолярном диапазоне, от 100 до 1000 раз выше по сравнению с форматом BsAb. В таблице 10 приведены примеры данных K.
Таблица 10
№ клона
k<sub>a</sub> [1/мс]
k<sub>d</sub> [1/с]
K<sub>d</sub> [нМ]
1402-52
1,17E+06
2,35E-04
0,201
1402-61
5,13E+05
1,31E-05
0,0255
1402-76
6,32E+05
1,10E-04
0,173
1402-79
4,60E+05
5,33E-05
0,116
[0603] Специфический к AFP158 и отрицательный контрольный (ET901) химерный IgG1 мыши тестировали на связывание с AFP158/HLA-A*02:01, рекомбинантным белком AFP и свободным пептидом AFP158 в анализе ELISA. Антитела тестировали при 3× серийном разведении, начиная с 100 нг/мл в целом для 8 концентраций. Планшеты со стрептавидином покрывали биотинилированным AFP158/A*02:01 MHC при 2 мкг/мл, покрывали белком AFP при 2 мкг/мл и пептидом AFP158 при 40 нг/мл. Подтверждали, что полноразмерные антитела AFP158 распознают пептид AFP158 только в условиях HLA-A02 и не связываются с рекомбинантным белком AFP или свободным пептидом AFP158 (фиг. 20).
Пример 9. Эффективность AFP158-CART на модели п/к ксенотрансплантата отдаленной SK-Hep1-MiniG
[0604] Пример 7 продемонстрировал, что внутриопухолевое введение T-клеток CAR к AFP158 на модели подкожной (п/к) опухоли печени значительно ингибирует рост обрабатываемых опухолей на многих моделях ксенотрансплантата. Целью исследования, описанного в этом примере, являлась оценка, также ли эффективно внутриопухолевая обработка влияет на рост отдаленных п/к опухолей.
[0605] В одном репрезентативном исследовании использовали следующие ниже материалы и способы:
[0606] 1. Исследуемая линия опухолевых клеток SK-Hep1-MiniG (также известная как SK-Hep1-MG): линия клеток SK-Hep1 HCC человека, экспрессирующая HLA-A*02:01 и миниген пептида AFP158.
[0607] 2. Животное: носители SCID Beige без T- и B-клеток. Обладают функциональными NK клетками, моноцитами/макрофагами, гранулоцитами и дендритными клетками.
[0608] 3. Исследование на животных проводили в лаборатории, получившей контракт на проведение исследования.
+
[0609] 4. CAR-T-клетки: T-клетки человека активировали на сутки 0; b) активированные T-клетки трансдуцировали лентивирусом на сутки 1; c) лентивирус и гранулы удаляли на сутки 5; d) CAR T-клетки культивировали и размножали IL-2 при 100 Ед/мл; e) клетки APC выделяли путем истощения CD3 T-клетки из PBMC. Клетки представляют собой в основном моноциты и B-клетки.
2
6
[0610] 5. Исследование на животных. В этом исследовании использовали самок мышей SCID Beige в возрасте 6-8 недель. Линию клеток SK-Hep1-MiniG культивировали в среде DMEM+10% FBS и 1% L-глутамина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клетки SK-Hep1-MiniG ресуспендировали в 50% PBS плюс 50% Matrigel и подкожно имплантировали в правый и левый бока 40 мышам при 5×10 клеток/100 мкл/участок инъекции.
3
[0611] Когда опухоли достигали 100 мм в среднем, мышей случайным образом разделяли в зависимости от размера опухоли в правом боку на 6 групп, описанных ниже, по 6 мышей в группе, и инъецировали образцы в опухоли в правый бок каждой мыши. Для групп AFP158-CART (группы 4-6) в различных экспериментах использовали различные клоны антитела, как описано выше. Результаты эксперимента с использованием характерного клона приведены ниже. С другими клонами получали аналогичные результаты (данные не показаны).
[0612] Группа 1: Носитель (PBS), 100 мкл/ мышь, в/о в правый участок п/к опухоли, однократная доза.
[0613] Группа 2: T-клетки в условиях имитации* 7 миллионов/100 мкл/мышь, в/о в правый участок п/к опухоли, однократная доза. (T-клетки в условиях имитации представляют собой T-клетки без трансдукции CART)
в/о в правый участок п/к опухоли
[0614] Группа 3: Клетки APC в условиях имитации 7 миллионов (70% Mock+30% APC) /100 мкл/ мышь , однократная доза.
[0615] Группа 4: T-клетки с CAR к AFP158 7 миллионов/100 мкл/ мышь, в/в через хвостовую вену, однократная доза.
[0616] Группа 5: T-клетки с CAR к AFP158 7 миллионов/100 мкл/ мышь, в/о в правый участок п/к опухоли, однократная доза.
[0617] Группа 6: T-клетки с CAR к AFP158 с APC, 7 миллионов (70% CART+30% APC)/100 мкл/мышь, в/о в правый участок п/к опухоли, однократная доза.
AFP158-CART является безопасным при текущей дозе/режиме дозирования
[0618] После дозирования внимательно следили за массой тела и другими клиническими признаками. Как приведено на фигуре 21, не наблюдали потерю массы тела в любой из групп. Не наблюдали другие клинические признаки токсичности, связанной с лекарственным средством.
Однократная в/о доза приводила к регрессии локальных опухолей и ингибированию отдаленных опухолей
[0619] Как приведено на фигуре 22, однократная в/о доза AFP158-CART, инъецируемых только в правый бок, приводила к значительному ингибированию опухолей, имплантированных в правый бок и левый бок (сторона, в которую AFP158-CAR-T-клетки непосредственно не инъецировали). Анализ путем определения площади под кривой, отражающей общие показатели кинетики роста опухоли, демонстрировал, что в/о инъекция AFP158-CART отдельно приводила к 42% ингибированию роста опухоль на правой стороне (критерий Даннета p<0,01) и к 33% ингибированию роста опухоль на левой стороне (p>0,05).
AFP158-CART+APC усиливали противоопухолевую активность на обеих сторонах
[0620] Как приведено на фигуре 22, в/о инъекция AFP158-CART плюс APC вызывала регрессию опухолей в правом боку при общем ингибировании опухоли 68% по сравнению с группой, обрабатываемой носителем (p<0,001). Также наблюдали более выраженное ингибирование отдаленной опухоли в левом боку по сравнению с соответствующей группой, обрабатываемой носителем (47%, p<0,01). Это подтверждает возможное участие примирование перекрестнореагирующим антигеном T-клеток в дополнительном ингибировании как опухоли с правой стороны, так и опухоли с левой стороны.
CD3-положительные клетки наблюдали в опухолях с правой и левой сторон у животных, которых обрабатывали AFP158-CART+APC
[0621] В конце исследования (34 сутки после дозирования) опухоли собирали и проводили гистологическое окрашивание CD3 (T-клеточный маркер). Как приведено на фигуре 23, CD3-положительные клетки выявляли в опухолях с правой и левой сторон от в/о инъекции AFP158-CART плюс клетки APC. Это подтверждает вовлеченность T-клеток человека в ингибирование роста опухоли.
Список последовательностей
Белок hAFP (SEQ ID NO: 1)
MKWVESIFLIFLLNFTESRTLHRNEYGIASILDSYQCTAEISLADLATIFFAQFVQEATYKEVSKMVKDALTAIEKPTGDEQSSGCLENQLPAFLEELCHEKEILEKYGHSDCCSQSEEGRHNCFLAHKKPTPASIPLFQVPEPVTSCEAYEEDRETFMNKFIYEIARRHPFLYAPTILLWAARYDKIIPSCCKAENAVECFQTKAATVTKELRESSLLNQHACAVMKNFGTRTFQAITVTKLSQKFTKVNFTEIQKLVLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAENDEKPEGLSPNLNRFLGDRDFNQFSSGEKNIFLASFVHEYSRRHPQLAVSVILRVAKGYQELLEKCFQTENPLECQDKGEEELQKYIQESQALAKRSCGLFQKLGEYYLQNAFLVAYTKKAPQLTSSELMAITRKMAATAATCCQLSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGVGQCCTSSYANRRPCFSSLVVDETYVPPAFSDDKFIFHKDLCQAQGVALQTMKQEFLINLVKQKPQITEEQLEAVIADFSGLLEKCCQGQEQEVCFAEEGQKLISKTRAALGV
CDS hAFP (SEQ ID NO: 2)
ATGAAGTGGGTGGAATCAATTTTTTTAATTTTCCTACTAAATTTTACTGAATCCAGAACACTGCATAGAAATGAATATGGAATAGCTTCCATATTGGATTCTTACCAATGTACTGCAGAGATAAGTTTAGCTGACCTGGCTACCATATTTTTTGCCCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTTACAAGGAAGTAAGCAAAATGGTGAAAGATGCATTGACTGCAATTGAGAAACCCACTGGAGATGAACAGTCTTCAGGGTGTTTAGAAAACCAGCTACCTGCCTTTCTGGAAGAACTTTGCCATGAGAAAGAAATTTTGGAGAAGTACGGACATTCAGACTGCTGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGACATAACTGTTTTCTTGCACACAAAAAGCCCACTCCAGCATCGATCCCACTTTTCCAAGTTCCAGAACCTGTCACAAGCTGTGAAGCATATGAAGAAGACAGGGAGACATTCATGAACAAATTCATTTATGAGATAGCAAGAAGGCATCCCTTCCTGTATGCACCTACAATTCTTCTTTGGGCTGCTCGCTATGACAAAATAATTCCATCTTGCTGCAAAGCTGAAAATGCAGTTGAATGCTTCCAAACAAAGGCAGCAACAGTTACAAAAGAATTAAGAGAAAGCAGCTTGTTAAATCAACATGCATGTGCAGTAATGAAAAATTTTGGGACCCGAACTTTCCAAGCCATAACTGTTACTAAACTGAGTCAGAAGTTTACCAAAGTTAATTTTACTGAAATCCAGAAACTAGTCCTGGATGTGGCCCATGTACATGAGCACTGTTGCAGAGGAGATGTGCTGGATTGTCTGCAGGATGGGGAAAAAATCATGTCCTACATATGTTCTCAACAAGACACTCTGTCAAACAAAATAACAGAATGCTGCAAACTGACCACGCTGGAACGTGGTCAATGTATAATTCATGCAGAAAATGATGAAAAACCTGAAGGTCTATCTCCAAATCTAAACAGGTTTTTAGGAGATAGAGATTTTAACCAATTTTCTTCAGGGGAAAAAAATATCTTCTTGGCAAGTTTTGTTCATGAATATTCAAGAAGACATCCTCAGCTTGCTGTCTCAGTAATTCTAAGAGTTGCTAAAGGATACCAGGAGTTATTGGAGAAGTGTTTCCAGACTGAAAACCCTCTTGAATGCCAAGATAAAGGAGAAGAAGAATTACAGAAATACATCCAGGAGAGCCAAGCATTGGCAAAGCGAAGCTGCGGCCTCTTCCAGAAACTAGGAGAATATTACTTACAAAATGCGTTTCTCGTTGCTTACACAAAGAAAGCCCCCCAGCTGACCTCGTCGGAGCTGATGGCCATCACCAGAAAAATGGCAGCCACAGCAGCCACTTGTTGCCAACTCAGTGAGGACAAACTATTGGCCTGTGGCGAGGGAGCGGCTGACATTATTATCGGACACTTATGTATCAGACATGAAATGACTCCAGTAAACCCTGGTGTTGGCCAGTGCTGCACTTCTTCATATGCCAACAGGAGGCCATGCTTCAGCAGCTTGGTGGTGGATGAAACATATGTCCCTCCTGCATTCTCTGATGACAAGTTCATTTTCCATAAGGATCTGTGCCAAGCTCAGGGTGTAGCGCTGCAAACAATGAAGCAAGAGTTTCTCATTAACCTTGTGAAGCAAAAGCCACAAATAACAGAGGAACAACTTGAGGCTGTCATTGCAGATTTCTCAGGCCTGTTGGAGAAATGCTGCCAAGGCCAGGAACAGGAAGTCTGCTTTGCTGAAGAGGGACAAAAACTGATTTCAAAAACTCGTGCTGCTTTGGGAGTTTAA
hAFP137-145 (SEQ ID NO: 3)
PLFQVPEPV
hAFP158-166 (SEQ ID NO: 4)
FMNKFIYEI
hAFP325-334 (SEQ ID NO: 5)
GLSPNLNRFL
hAFP542-550 (SEQ ID NO: 6)
GVALQTMKQ
hAFP158 A1 (SEQ ID NO: 7)
AMNKFIYEI
hAFP158 A3 (SEQ ID NO: 8)
FMAKFIYEI
hAFP158 A4 (SEQ ID NO: 9)
FMNAFIYEI
hAFP158 A5 (SEQ ID NO: 10)
FMNKAIYEI
hAFP158 A6 (SEQ ID NO: 11)
FMNKFAYEI
hAFP158 A7 (SEQ ID NO: 12)
FMNKFIAEI
hAFP158 A8 (SEQ ID NO: 13)
FMNKFIYAI
Белок mAFP (SEQ ID NO: 14)
MKWITPASLILLLHFAASKALHENEFGIASTLDSSQCVTEKNVLSIATITFTQFVPEATEEEVNKMTSDVLAAMKKNSGDGCLESQLSVFLDEICHETELSNKYGLSGCCSQSGVERHQCLLARKKTAPASVPPFQFPEPAESCKAHEENRAVFMNRFIYEVSRRNPFMYAPAILSLAAQYDKVVLACCKADNKEECFQTKRASIAKELREGSMLNEHVCSVIRKFGSRNLQATTIIKLSQKLTEANFTEIQKLALDVAHIHEECCQGNSLECLQDGEKVMTYICSQQNILSSKIAECCKLPMIQLGFCIIHAENGVKPEGLSLNPSQFLGDRNFAQFSSEEKIMFMASFLHEYSRTHPNLPVSVILRIAKTYQEILEKCSQSGNLPGCQDNLEEELQKHIEESQALSKQSCALYQTLGDYKLQNLFLIGYTRKAPQLTSAELIDLTGKMVSIASTCCQLSEEKWSGCGEGMADIFIGHLCIRNEASPVNSGISHCCNSSYSNRRLCITSFLRDETYAPPPFSEDKFIFHKDLCQAQGKALQTMKQELLINLVKQKPELTEEQLAAVTADFSGLLEKCCKAQDQEVCFTEEGPKLISKTRDALGV
CDS mAFP (SEQ ID NO: 15)
ATGAAGTGGATCACACCCGCTTCCCTCATCCTCCTGCTACATTTCGCTGCGTCCAAAGCATTGCACGAAAATGAGTTTGGGATAGCTTCCACGTTAGATTCCTCCCAGTGCGTGACGGAGAAGAATGTGCTTAGCATAGCTACCATCACCTTTACCCAGTTTGTTCCGGAAGCCACCGAGGAGGAAGTGAACAAAATGACTAGCGATGTGTTGGCTGCAATGAAGAAAAACTCTGGCGATGGGTGTTTAGAAAGCCAGCTATCTGTGTTTCTGGATGAAATTTGTCATGAGACGGAACTCTCTAACAAGTATGGACTCTCAGGCTGCTGCAGCCAAAGTGGAGTGGAAAGACATCAGTGTCTGCTGGCACGCAAGAAGACTGCTCCGGCCTCTGTCCCACCCTTCCAGTTTCCAGAACCTGCCGAGAGTTGCAAAGCACATGAAGAAAACAGGGCAGTGTTCATGAACAGGTTCATCTATGAAGTGTCAAGGAGGAACCCCTTCATGTATGCCCCAGCCATTCTGTCCTTGGCTGCTCAGTACGACAAGGTCGTTCTGGCATGCTGCAAAGCTGACAACAAGGAGGAGTGCTTCCAGACAAAGAGAGCATCCATTGCAAAGGAATTAAGAGAAGGAAGCATGTTAAATGAGCATGTATGTTCAGTGATAAGAAAATTTGGATCCCGAAACCTCCAGGCAACAACCATTATTAAGCTAAGTCAAAAGTTAACTGAAGCAAATTTTACTGAGATTCAGAAGCTGGCCCTGGATGTGGCTCACATCCACGAGGAGTGTTGCCAAGGAAACTCGCTGGAGTGTCTGCAGGATGGGGAAAAAGTCATGACATATATATGTTCTCAACAAAATATTCTGTCAAGCAAAATAGCAGAGTGCTGCAAATTACCCATGATCCAACTAGGCTTCTGCATAATTCACGCAGAGAATGGCGTCAAACCTGAAGGCTTATCTCTAAATCCAAGCCAGTTTTTGGGAGACAGAAATTTTGCCCAATTTTCTTCAGAGGAAAAAATCATGTTCATGGCAAGCTTTCTTCATGAATACTCAAGAACTCACCCCAACCTTCCTGTCTCAGTCATTCTAAGAATTGCTAAAACGTACCAGGAAATATTGGAGAAGTGTTCCCAGTCTGGAAATCTACCTGGATGTCAGGACAATCTGGAAGAAGAATTGCAGAAACACATCGAGGAGAGCCAGGCACTGTCCAAGCAAAGCTGCGCTCTCTACCAGACCTTAGGAGACTACAAATTACAAAATCTGTTCCTTATTGGTTACACGAGGAAAGCCCCTCAGCTGACCTCAGCAGAGCTGATCGACCTCACCGGGAAGATGGTGAGCATTGCCTCCACGTGCTGCCAGCTCAGCGAGGAGAAATGGTCCGGCTGTGGTGAGGGAATGGCCGACATTTTCATTGGACATTTGTGTATAAGGAATGAAGCAAGCCCTGTGAACTCTGGTATCAGCCACTGCTGCAACTCTTCGTATTCCAACAGGAGGCTATGCATCACCAGTTTTCTGAGGGATGAAACCTATGCCCCTCCCCCATTCTCTGAGGATAAATTCATCTTCCACAAGGATCTGTGCCAAGCTCAGGGCAAAGCCCTACAGACCATGAAACAAGAGCTTCTCATTAACCTGGTGAAGCAAAAGCCTGAACTGACAGAGGAGCAGCTGGCGGCTGTCACTGCAGATTTCTCGGGCCTTTTGGAGAAGTGCTGCAAAGCCCAGGACCAGGAAGTCTGTTTCACAGAAGAGGGTCCAAAGTTGATTTCCAAAACTCGTGATGCTTTGGGCGTTTAA
mAFP154-162 (SEQ ID NO: 16)
FMNRFIYEV
Клон 17 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 17)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYQDWWYLGQFDQWGQGTLVTVSS
Клон 33 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 18)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGSYYSGRYDAWGQGTLVTVSS
Клон 44 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 19)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREIRGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
Клон 48 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 20)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADDYGAPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
Клон 50 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 21)
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYGGYFDYWGQGTLVTVSS
Клон 52 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 22)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
Клон 61 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 23)
EVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKASGYSFPNYWITWVRQMSGGGLEWMGRIDPGDSYTTYNPSFQGHVTISIDKSTNTAYLHWNSLKASDTAMYYCARYYVSLVDIWGQGTLVTVSS
Клон 76 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 24)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKAYGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNNLKTEDTAVYYCARDGLYSSSWYDSDYWGQGTLVTVSS
Клон 79 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 25)
QMQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIHSGSYYGLLYYAMDVWGQGTTVTVSS
Клон 17-13 вариабельный домен тяжелой цепи, белок (SEQ ID NO: 26)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARFQDWWYLGQFDQWGQGTLVTVSS
Клон 17 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 27)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTATGSDVGVYYYVSWYQQHPGKAPKVMIYDVGNRPPGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYTNRNSLGYVFGTGTKVTVLG
Клон 33 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 28)
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSTVVFGGGTKLTVLG
Клон 44 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 29)
SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIGTKSVTWYQQRPGQAPMMVIYYDTVRPSGIPERLSGSNSGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVFGGGTKLTVLG
Клон 48 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 30)
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGTGTKVTVLG
Клон 50 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 31)
QSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLG
Клон 52 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 32)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGHYPYWFQQKPGQAPRTLIYDASDKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCLLSYSDALVFGGGTKLTVLG
Клон 61 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 33)
QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSEVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTGSRAVFGGGTKLTVLG
Клон 76 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 34)
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDGSLYTMLFGGGTKLTVLG
Клон 79 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 35)
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIFGNSNRPSGVPDRFSGFKSGTSASLAITGLQAEDEADYFCQSYDSSLSGSGVFGTGTKVTVLG
Клон 17-13 вариабельный домен легкой цепи, белок (SEQ ID NO: 36)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTATGSDVGVYYYVSWYQQHPGKAPKVMIYDVDNRPPGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYTNRNSLGYVFGTGTKVTVLG
Клон 17 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 37)
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACCAGGACTGGTGGTACCTGGGTCAGTTCGATCAGTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
Клон 33 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 38)
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATTTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGGTTCTTACTACTCTGGTCGTTACGATGCTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
Клон 44 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 39)
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAAATTAGGGGCTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Клон 48 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 40)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAACAGTGGTAGAATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGCCGATGACTACGGCGCCCCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Клон 50 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 41)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCATAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGACCGGTTATGGGGGGTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGNCACCGTCTCCTCA
Клон 52 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 42)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATTCCTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Клон 61 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 43)
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGACCATCTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCCCCAACTACTGGATCACCTGGGTGCGCCAGATGTCCGGCGGAGGCCTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCGGCGACAGCTACACAACCTACAACCCCAGCTTCCAGGGCCACGTGACCATCAGCATCGACAAGAGCACCAATACCGCCTACCTGCACTGGAACAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGGTACTATGTGTCCCTGGTGGATATCTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGC
Клон 76 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 44)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTAGGTTTCATTAGAAGCAAAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACGCCGCCTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGCATCGCCTATCTGCAAATGAACAACCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCTAGAGATGGGCTGTATAGCAGCAGCTGGTACGATTCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
Клон 79 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 45)
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATATCCATAGTGGGAGCTACTACGGCCTACTCTACTACGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Клон 17-13 вариабельный домен тяжелой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 46)
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCAGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACGGCATCAGCTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAGCGCCTACAACGGCAATACCAACTACGCCCAGAAACTGCAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTTCCAGGACTGGTGGTATCTGGGCCAGTTCGACCAGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGC
Клон 17 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 47)
CAATCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGCAACCGGCAGTGACGTTGGTGTTTATTACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAAGTGATGATTTATGATGTCGGTAATCGGCCCCCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCGCCTCATATACAAACAGGAACAGTCTCGGCTATGTCTTCGGAACCGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGG
Клон 33 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 48)
AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATAACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAGCAGCACCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
Клон 44 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 49)
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCTGGCAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGTGACAACATTGGAACTAAAAGTGTGACCTGGTACCAACAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTATGATGGTCATCTATTATGATACCGTCCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGACTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCACCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
Клон 48 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 50)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCGGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGTTCAGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
Клон 50 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 51)
CAGTCTGTGTTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATTATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
Клон 52 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 52)
CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCCTCACTGACTGTGTCCCCAGGAGGGACAGTCACTCTCACCTGTGGCTCCAGCACTGGAGCTGTCACCAGTGGTCATTATCCCTACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCCAAGCCCCCAGGACACTGATTTATGATGCAAGCGACAAACACTCCTGGACACCTGCCCGGTTCTCAGGCTCCCTCCTTGGGGGCAAAGCTGCCCTGACCCTTTCGGGTGCGCAGCCTGAGGATGAGGCTGAGTATTACTGCTTGCTCTCCTATAGTGATGCTCTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
Клон 61 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 53)
CAGAGCGTGCTGACACAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCTCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCTCCGACGTGGGCGGCTACAATTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGAACAACCGGCCCAGCGAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCAGCAGCTACACCACCGGCAGCAGAGCCGTGTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTGGGC
Клон 76 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 54)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTACTACTGCGGAACATGGGATGGCAGCCTCTATACTATGTTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
Клон 79 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 55)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTTTGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTTCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGACTATTTCTGCCAGTCGTATGACAGTAGCCTGAGTGGTTCGGGGGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
Клон 17-13 вариабельный домен легкой цепи, нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 56)
CAGAGCGCCCTGACACAGCCTGCCTCCGTGTCTGGATCTCCCGGCCAGAGCATCACCATCAGCTGCACAGCCACCGGCTCCGACGTGGGCGTGTACTACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAAGTGATGATCTACGACGTGGACAACCGGCCTCCCGGCGTGTCCAATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGATTACTACTGCGCCAGCTACACCAACCGGAACAGCCTGGGCTACGTGTTCGGCACCGGCACCAAAGTGACAGTGCTGGGC
Клон 17 HCDR1 (SEQ ID NO: 57)
GYTFTSYG
Клон 33 HCDR1 (SEQ ID NO: 58)
VSSNSAAWN
Клон 44 HCDR1 (SEQ ID NO: 59)
GGTFSSYA
Клон 48 HCDR1 (SEQ ID NO: 60)
GFTFDDYA
Клон 50 HCDR1 (SEQ ID NO: 61)
GGSISSSNW
Клон 52 HCDR1 (SEQ ID NO: 62)
GYTFTSYG
Клон 61 HCDR1 (SEQ ID NO: 63)
GYSFPNYW
Клон 76 HCDR1 (SEQ ID NO: 64)
GFTFSNAW
Клон 79 HCDR1 (SEQ ID NO: 65)
GFTFDDYA
Клон 17-13 HCDR1 (SEQ ID NO: 66)
GYTFTSYG
Клон 17 HCDR2 (SEQ ID NO: 67)
ISAYNGNT
Клон 33 HCDR2 (SEQ ID NO: 68)
YRSKWYN
Клон 44 HCDR2 (SEQ ID NO: 69)
IIPIFGTA
Клон 48 HCDR2 (SEQ ID NO: 70)
ISWNSGRI
Клон 50 HCDR2 (SEQ ID NO: 71)
IYHSGST
Клон 52 HCDR2 (SEQ ID NO: 72)
ISAYNGNT
Клон 61 HCDR2 (SEQ ID NO: 73)
IDPGDSYT
Клон 76 HCDR2 (SEQ ID NO: 74)
IRSKAYGGTT
Клон 79 HCDR2 (SEQ ID NO: 75)
ISWNSGSI
Клон 17-13 HCDR2 (SEQ ID NO: 76)
ISAYNGNT
Клон 17 HCDR3 (SEQ ID NO: 77)
ARYQDWWYLGQFDQ
Клон 33 HCDR3 (SEQ ID NO: 78)
ARGSYYSGRYDA
Клон 44 HCDR3 (SEQ ID NO: 79)
AREIRGYYYYYGMDV
Клон 48 HCDR3 (SEQ ID NO: 80)
ARADDYGAPYYYYGMDV
Клон 50 HCDR3 (SEQ ID NO: 81)
ATGYGGYFDY
Клон 52 HCDR3 (SEQ ID NO: 82)
ARDSYYYYYGMDV
Клон 61 HCDR3 (SEQ ID NO: 83)
ARYYVSLVDI
Клон 76 HCDR3 (SEQ ID NO: 84)
ARDGLYSSSWYDSDY
Клон 79 HCDR3 (SEQ ID NO: 85)
AKDIHSGSYYGLLYYAMDV
Клон 17-13 HCDR3 (SEQ ID NO: 86)
ARFQDWWYLGQFDQ
Консенсусная HCCDR1 (SEQ ID NO: 87)
G-F/Y-S/T-F-D/S/T-D/N/S-Y/A-A/G/W
Консенсусная HCCDR2 (SEQ ID NO: 88)
I/S-K/S-X-H/Y-X-G-X-T
Консенсусная HCCDR3 (SEQ ID NO: 89)
A/G-X-W/Y-Y-X-X-X-F/Y-D
Клон 17 LCDR1 (SEQ ID NO: 90)
GSDVGVYYY
Клон 33 LCDR1 (SEQ ID NO: 91)
SGSIASNY
Клон 44 LCDR1 (SEQ ID NO: 92)
NIGTKS
Клон 48 LCDR1 (SEQ ID NO: 93)
SSNIGAGYD
Клон 50 LCDR1 (SEQ ID NO: 94)
NIGSKS
Клон 52 LCDR1 (SEQ ID NO: 95)
TGAVTSGHY
Клон 61 LCDR1 (SEQ ID NO: 96)
SSDVGGYNY
Клон 76 LCDR1 (SEQ ID NO: 97)
SSNIGNNY
Клон 79 LCDR1 (SEQ ID NO: 98)
SSNIGAGYD
Клон 17-13 LCDR1 (SEQ ID NO: 99)
GSDVGVYYY
Клон 17 LCDR2 (SEQ ID NO: 100)
DVG
Клон 33 LCDR2 (SEQ ID NO: 101)
EDN
Клон 44 LCDR2 (SEQ ID NO: 102)
YDT
Клон 48 LCDR2 (SEQ ID NO: 103)
GNS
Клон 50 LCDR2 (SEQ ID NO: 104)
YDS
Клон 52 LCDR2 (SEQ ID NO: 105)
DAS
Клон 61 LCDR2 (SEQ ID NO: 106)
DVN
Клон 76 LCDR2 (SEQ ID NO: 107)
DNN
Клон 79 LCDR2 (SEQ ID NO: 108)
GNS
Клон 17-13 LCDR2 (SEQ ID NO: 109)
DVD
Клон 17 LCDR3 (SEQ ID NO: 110)
ASYTNRNSLGYV
Клон 33 LCDR3 (SEQ ID NO: 111)
QSYDSSTVV
Клон 44 LCDR3 (SEQ ID NO: 112)
QVWDSSSDHPV
Клон 48 LCDR3 (SEQ ID NO: 113)
QSYDSSLSGSV
Клон 50 LCDR3 (SEQ ID NO: 114)
QVWDSSSDHVV
Клон 52 LCDR3 (SEQ ID NO: 115)
LLSYSDALV
Клон 61 LCDR3 (SEQ ID NO: 116)
SSYTTGSRAV
Клон 76 LCDR3 (SEQ ID NO: 117)
GTWDGSLYTML
Клон 79 LCDR3 (SEQ ID NO: 118)
QSYDSSLSGSGV
Клон 17-13 LCDR3 (SEQ ID NO: 119)
ASYTNRNSLGYV
Консенсусная LCCDR1 (SEQ ID NO: 120)
S/T-G/S-D/N-I/V-A/G-A/S/V-X-H/Y
Консенсусная LCCDR3 (SEQ ID NO: 121)
Q-S/T-Y/W-D/T-S/T-A/S
Контроль IFI30 (SEQ ID NO: 122)
LLDVPTAAV
Контроль BTG2 (SEQ ID NO: 123)
TLWVDPYEV
Контроль BCR (SEQ ID NO: 124)
FLLDHLKRV
Контроль IFI30 (SEQ ID NO: 125)
LLLDVPTAAV
Контроль SSR1 (SEQ ID NO: 126)
VLFRGGPRGLLAV
Контроль PPP2R1B (SEQ ID NO: 127)
SLLPAIVEL
Контроль DDX5 (SEQ ID NO: 128)
YLLPAIVHI
Контроль CTSG (SEQ ID NO: 129)
FLLPTGAEA
Контроль CD247 (SEQ ID NO: 130)
LLDPKLCYLL
Контроль DMTN (SEQ ID NO: 131)
SLPHFHHPET
Контроль CALR (SEQ ID NO: 132)
MLLSVPLLLG
Контроль PIM1 (SEQ ID NO: 133)
LLYDMVCGDIP
Контроль IFI30 (SEQ ID NO: 134)
LLLDVPTAAVQ
Контроль IFI30 (SEQ ID NO: 135)
LLLDVPTAAVQA
Контроль SSR1 (SEQ ID NO: 136)
VLFRGGPRGLLAVA
Контроль HLA-E (SEQ ID NO: 137)
MVDGTLLLL
Контроль RPS6KB1 (SEQ ID NO: 138)
YMAPEILMRS
Контроль CSF2RA (SEQ ID NO: 139)
FIYNADLMNC
Контроль IL7 (SEQ ID NO: 140)
KQYESVLMVSI
Контроль hTERT540 (SEQ ID NO: 141)
ILAKFLHWL
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Liu, Cheng
Liu, Hong
Xu, Yiyang
Xiang, Jingyi
Long, Li
<120> КОНСТРУКЦИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА КОМПЛЕКСЫ ПЕПТИДА AFP/MHC, И ВИДЫ
ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
<130> 750042000140
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/142,958
<151> 2015-04-03
<150> US 62/244,653
<151> 2015-10-21
<150> US 62/304,915
<151> 2016-03-07
<160> 141
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 609
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr
1               5                  10                  15
Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu
20                  25                  30
Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr
35                  40                  45
Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser
50                  55                  60
Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp
65                  70                  75                  80
Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu
85                  90                  95
Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp
100                 105                 110
Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His
115                 120                 125
Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro
130                 135                 140
Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn
145                 150                 155                 160
Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro
165                 170                 175
Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys
180                 185                 190
Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr
195                 200                 205
Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys
210                 215                 220
Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val
225                 230                 235                 240
Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln
245                 250                 255
Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly
260                 265                 270
Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile
275                 280                 285
Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys
290                 295                 300
Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp
305                 310                 315                 320
Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp
325                 330                 335
Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala
340                 345                 350
Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser
355                 360                 365
Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys
370                 375                 380
Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu
385                 390                 395                 400
Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys
405                 410                 415
Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu
420                 425                 430
Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met
435                 440                 445
Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu
450                 455                 460
Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile
465                 470                 475                 480
Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly
485                 490                 495
Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500                 505                 510
Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp
515                 520                 525
Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala
530                 535                 540
Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys
545                 550                 555                 560
Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser
565                 570                 575
Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe
580                 585                 590
Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly
595                 600                 605
Val
<210> 2
<211> 1830
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgaagtggg tggaatcaat ttttttaatt ttcctactaa attttactga atccagaaca 60
ctgcatagaa atgaatatgg aatagcttcc atattggatt cttaccaatg tactgcagag 120
ataagtttag ctgacctggc taccatattt tttgcccagt ttgttcaaga agccacttac 180
aaggaagtaa gcaaaatggt gaaagatgca ttgactgcaa ttgagaaacc cactggagat 240
gaacagtctt cagggtgttt agaaaaccag ctacctgcct ttctggaaga actttgccat 300
gagaaagaaa ttttggagaa gtacggacat tcagactgct gcagccaaag tgaagaggga 360
agacataact gttttcttgc acacaaaaag cccactccag catcgatccc acttttccaa 420
gttccagaac ctgtcacaag ctgtgaagca tatgaagaag acagggagac attcatgaac 480
aaattcattt atgagatagc aagaaggcat cccttcctgt atgcacctac aattcttctt 540
tgggctgctc gctatgacaa aataattcca tcttgctgca aagctgaaaa tgcagttgaa 600
tgcttccaaa caaaggcagc aacagttaca aaagaattaa gagaaagcag cttgttaaat 660
caacatgcat gtgcagtaat gaaaaatttt gggacccgaa ctttccaagc cataactgtt 720
actaaactga gtcagaagtt taccaaagtt aattttactg aaatccagaa actagtcctg 780
gatgtggccc atgtacatga gcactgttgc agaggagatg tgctggattg tctgcaggat 840
ggggaaaaaa tcatgtccta catatgttct caacaagaca ctctgtcaaa caaaataaca 900
gaatgctgca aactgaccac gctggaacgt ggtcaatgta taattcatgc agaaaatgat 960
gaaaaacctg aaggtctatc tccaaatcta aacaggtttt taggagatag agattttaac 1020
caattttctt caggggaaaa aaatatcttc ttggcaagtt ttgttcatga atattcaaga 1080
agacatcctc agcttgctgt ctcagtaatt ctaagagttg ctaaaggata ccaggagtta 1140
ttggagaagt gtttccagac tgaaaaccct cttgaatgcc aagataaagg agaagaagaa 1200
ttacagaaat acatccagga gagccaagca ttggcaaagc gaagctgcgg cctcttccag 1260
aaactaggag aatattactt acaaaatgcg tttctcgttg cttacacaaa gaaagccccc 1320
cagctgacct cgtcggagct gatggccatc accagaaaaa tggcagccac agcagccact 1380
tgttgccaac tcagtgagga caaactattg gcctgtggcg agggagcggc tgacattatt 1440
atcggacact tatgtatcag acatgaaatg actccagtaa accctggtgt tggccagtgc 1500
tgcacttctt catatgccaa caggaggcca tgcttcagca gcttggtggt ggatgaaaca 1560
tatgtccctc ctgcattctc tgatgacaag ttcattttcc ataaggatct gtgccaagct 1620
cagggtgtag cgctgcaaac aatgaagcaa gagtttctca ttaaccttgt gaagcaaaag 1680
ccacaaataa cagaggaaca acttgaggct gtcattgcag atttctcagg cctgttggag 1740
aaatgctgcc aaggccagga acaggaagtc tgctttgctg aagagggaca aaaactgatt 1800
tcaaaaactc gtgctgcttt gggagtttaa                                  1830
<210> 3
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 3
Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val
1               5
<210> 4
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 4
Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile
1               5
<210> 5
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu
1               5                  10
<210> 6
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln
1               5
<210> 7
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 7
Ala Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile
1               5
<210> 8
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
Phe Met Ala Lys Phe Ile Tyr Glu Ile
1               5
<210> 9
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 9
Phe Met Asn Ala Phe Ile Tyr Glu Ile
1               5
<210> 10
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 10
Phe Met Asn Lys Ala Ile Tyr Glu Ile
1               5
<210> 11
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 11
Phe Met Asn Lys Phe Ala Tyr Glu Ile
1               5
<210> 12
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 12
Phe Met Asn Lys Phe Ile Ala Glu Ile
1               5
<210> 13
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 13
Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Ala Ile
1               5
<210> 14
<211> 605
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 14
Met Lys Trp Ile Thr Pro Ala Ser Leu Ile Leu Leu Leu His Phe Ala
1               5                  10                  15
Ala Ser Lys Ala Leu His Glu Asn Glu Phe Gly Ile Ala Ser Thr Leu
20                  25                  30
Asp Ser Ser Gln Cys Val Thr Glu Lys Asn Val Leu Ser Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ile Thr Phe Thr Gln Phe Val Pro Glu Ala Thr Glu Glu Glu Val Asn
50                  55                  60
Lys Met Thr Ser Asp Val Leu Ala Ala Met Lys Lys Asn Ser Gly Asp
65                  70                  75                  80
Gly Cys Leu Glu Ser Gln Leu Ser Val Phe Leu Asp Glu Ile Cys His
85                  90                  95
Glu Thr Glu Leu Ser Asn Lys Tyr Gly Leu Ser Gly Cys Cys Ser Gln
100                 105                 110
Ser Gly Val Glu Arg His Gln Cys Leu Leu Ala Arg Lys Lys Thr Ala
115                 120                 125
Pro Ala Ser Val Pro Pro Phe Gln Phe Pro Glu Pro Ala Glu Ser Cys
130                 135                 140
Lys Ala His Glu Glu Asn Arg Ala Val Phe Met Asn Arg Phe Ile Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Val Ser Arg Arg Asn Pro Phe Met Tyr Ala Pro Ala Ile Leu Ser
165                 170                 175
Leu Ala Ala Gln Tyr Asp Lys Val Val Leu Ala Cys Cys Lys Ala Asp
180                 185                 190
Asn Lys Glu Glu Cys Phe Gln Thr Lys Arg Ala Ser Ile Ala Lys Glu
195                 200                 205
Leu Arg Glu Gly Ser Met Leu Asn Glu His Val Cys Ser Val Ile Arg
210                 215                 220
Lys Phe Gly Ser Arg Asn Leu Gln Ala Thr Thr Ile Ile Lys Leu Ser
225                 230                 235                 240
Gln Lys Leu Thr Glu Ala Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Ala Leu
245                 250                 255
Asp Val Ala His Ile His Glu Glu Cys Cys Gln Gly Asn Ser Leu Glu
260                 265                 270
Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Val Met Thr Tyr Ile Cys Ser Gln Gln
275                 280                 285
Asn Ile Leu Ser Ser Lys Ile Ala Glu Cys Cys Lys Leu Pro Met Ile
290                 295                 300
Gln Leu Gly Phe Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Gly Val Lys Pro Glu
305                 310                 315                 320
Gly Leu Ser Leu Asn Pro Ser Gln Phe Leu Gly Asp Arg Asn Phe Ala
325                 330                 335
Gln Phe Ser Ser Glu Glu Lys Ile Met Phe Met Ala Ser Phe Leu His
340                 345                 350
Glu Tyr Ser Arg Thr His Pro Asn Leu Pro Val Ser Val Ile Leu Arg
355                 360                 365
Ile Ala Lys Thr Tyr Gln Glu Ile Leu Glu Lys Cys Ser Gln Ser Gly
370                 375                 380
Asn Leu Pro Gly Cys Gln Asp Asn Leu Glu Glu Glu Leu Gln Lys His
385                 390                 395                 400
Ile Glu Glu Ser Gln Ala Leu Ser Lys Gln Ser Cys Ala Leu Tyr Gln
405                 410                 415
Thr Leu Gly Asp Tyr Lys Leu Gln Asn Leu Phe Leu Ile Gly Tyr Thr
420                 425                 430
Arg Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ala Glu Leu Ile Asp Leu Thr Gly
435                 440                 445
Lys Met Val Ser Ile Ala Ser Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Glu Lys
450                 455                 460
Trp Ser Gly Cys Gly Glu Gly Met Ala Asp Ile Phe Ile Gly His Leu
465                 470                 475                 480
Cys Ile Arg Asn Glu Ala Ser Pro Val Asn Ser Gly Ile Ser His Cys
485                 490                 495
Cys Asn Ser Ser Tyr Ser Asn Arg Arg Leu Cys Ile Thr Ser Phe Leu
500                 505                 510
Arg Asp Glu Thr Tyr Ala Pro Pro Pro Phe Ser Glu Asp Lys Phe Ile
515                 520                 525
Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Lys Ala Leu Gln Thr Met
530                 535                 540
Lys Gln Glu Leu Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Glu Leu Thr
545                 550                 555                 560
Glu Glu Gln Leu Ala Ala Val Thr Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu
565                 570                 575
Lys Cys Cys Lys Ala Gln Asp Gln Glu Val Cys Phe Thr Glu Glu Gly
580                 585                 590
Pro Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Asp Ala Leu Gly Val
595                 600                 605
<210> 15
<211> 1818
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<400> 15
atgaagtgga tcacacccgc ttccctcatc ctcctgctac atttcgctgc gtccaaagca 60
ttgcacgaaa atgagtttgg gatagcttcc acgttagatt cctcccagtg cgtgacggag 120
aagaatgtgc ttagcatagc taccatcacc tttacccagt ttgttccgga agccaccgag 180
gaggaagtga acaaaatgac tagcgatgtg ttggctgcaa tgaagaaaaa ctctggcgat 240
gggtgtttag aaagccagct atctgtgttt ctggatgaaa tttgtcatga gacggaactc 300
tctaacaagt atggactctc aggctgctgc agccaaagtg gagtggaaag acatcagtgt 360
ctgctggcac gcaagaagac tgctccggcc tctgtcccac ccttccagtt tccagaacct 420
gccgagagtt gcaaagcaca tgaagaaaac agggcagtgt tcatgaacag gttcatctat 480
gaagtgtcaa ggaggaaccc cttcatgtat gccccagcca ttctgtcctt ggctgctcag 540
tacgacaagg tcgttctggc atgctgcaaa gctgacaaca aggaggagtg cttccagaca 600
aagagagcat ccattgcaaa ggaattaaga gaaggaagca tgttaaatga gcatgtatgt 660
tcagtgataa gaaaatttgg atcccgaaac ctccaggcaa caaccattat taagctaagt 720
caaaagttaa ctgaagcaaa ttttactgag attcagaagc tggccctgga tgtggctcac 780
atccacgagg agtgttgcca aggaaactcg ctggagtgtc tgcaggatgg ggaaaaagtc 840
atgacatata tatgttctca acaaaatatt ctgtcaagca aaatagcaga gtgctgcaaa 900
ttacccatga tccaactagg cttctgcata attcacgcag agaatggcgt caaacctgaa 960
ggcttatctc taaatccaag ccagtttttg ggagacagaa attttgccca attttcttca 1020
gaggaaaaaa tcatgttcat ggcaagcttt cttcatgaat actcaagaac tcaccccaac 1080
cttcctgtct cagtcattct aagaattgct aaaacgtacc aggaaatatt ggagaagtgt 1140
tcccagtctg gaaatctacc tggatgtcag gacaatctgg aagaagaatt gcagaaacac 1200
atcgaggaga gccaggcact gtccaagcaa agctgcgctc tctaccagac cttaggagac 1260
tacaaattac aaaatctgtt ccttattggt tacacgagga aagcccctca gctgacctca 1320
gcagagctga tcgacctcac cgggaagatg gtgagcattg cctccacgtg ctgccagctc 1380
agcgaggaga aatggtccgg ctgtggtgag ggaatggccg acattttcat tggacatttg 1440
tgtataagga atgaagcaag ccctgtgaac tctggtatca gccactgctg caactcttcg 1500
tattccaaca ggaggctatg catcaccagt tttctgaggg atgaaaccta tgcccctccc 1560
ccattctctg aggataaatt catcttccac aaggatctgt gccaagctca gggcaaagcc 1620
ctacagacca tgaaacaaga gcttctcatt aacctggtga agcaaaagcc tgaactgaca 1680
gaggagcagc tggcggctgt cactgcagat ttctcgggcc ttttggagaa gtgctgcaaa 1740
gcccaggacc aggaagtctg tttcacagaa gagggtccaa agttgatttc caaaactcgt 1800
gatgctttgg gcgtttaa                                               1818
<210> 16
<211> 9
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 16
Phe Met Asn Arg Phe Ile Tyr Glu Val
1               5
<210> 17
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Gln Asp Trp Trp Tyr Leu Gly Gln Phe Asp Gln Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 18
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50                  55                  60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Arg Tyr Asp Ala Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 19
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Ile Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 20
<211> 124
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Asp Asp Tyr Gly Ala Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 21
<211> 117
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Gly Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 23
<211> 117
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                  10                  15
Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe
50                  55                  60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 124
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Leu Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Asp Ser Asp
100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 25
<211> 126
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 25
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Asp Ile His Ser Gly Ser Tyr Tyr Gly Leu Leu Tyr Tyr Ala
100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210> 26
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Gln Asp Trp Trp Tyr Leu Gly Gln Phe Asp Gln Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 27
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 27
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                  10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Ala Thr Gly Ser Asp Val Gly Val Tyr
20                  25                  30
Tyr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Gly Asn Arg Pro Pro Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Thr Asn Arg
85                  90                  95
Asn Ser Leu Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
Gly
<210> 28
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 28
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1               5                  10                  15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35                  40                  45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85                  90                  95
Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210> 29
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 29
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Thr Lys Ser Val
20                  25                  30
Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Met Met Val Ile Tyr
35                  40                  45
Tyr Asp Thr Val Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser
50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85                  90                  95
Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105
<210> 30
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 30
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85                  90                  95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210> 31
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 31
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1               5                  10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35                  40                  45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85                  90                  95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105
<210> 32
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 32
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1               5                  10                  15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20                  25                  30
His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Tyr Ser Asp
85                  90                  95
Ala Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210> 33
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 33
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                  10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly
85                  90                  95
Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210> 34
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 34
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                  10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Ser Leu
85                  90                  95
Tyr Thr Met Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210> 35
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 35
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Phe Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Phe Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85                  90                  95
Leu Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
Gly
<210> 36
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 36
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                  10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Ala Thr Gly Ser Asp Val Gly Val Tyr
20                  25                  30
Tyr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Asp Asn Arg Pro Pro Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Thr Asn Arg
85                  90                  95
Asn Ser Leu Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
Gly
<210> 37
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 37
gaggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gcgctaccag 300
gactggtggt acctgggtca gttcgatcag tggggtcaag gtactctggt gaccgtctcc 360
tca                                                               363
<210> 38
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 38
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tttccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg 300
cgcggttctt actactctgg tcgttacgat gcttggggtc aaggtactct ggtgaccgtc 360
tcctca                                                            366
<210> 39
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 39
caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaatt 300
aggggctact actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca                                                            366
<210> 40
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 40
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga acagtggtag aataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagccgat 300
gactacggcg ccccctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca                                                     372
<210> 41
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<221> misc_feature
<222> 338
<223> n = A,T,C или G
<400> 41
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gaccggttat 300
ggggggtact ttgactactg gggccaggga accctggnca ccgtctcctc a          351
<210> 42
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 42
gaagtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagattcc 300
tactactact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 43
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 43
gaggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgagag cctgaccatc 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcttcccc aactactgga tcacctgggt gcgccagatg 120
tccggcggag gcctggaatg gatgggcaga atcgaccccg gcgacagcta cacaacctac 180
aaccccagct tccagggcca cgtgaccatc agcatcgaca agagcaccaa taccgcctac 240
ctgcactgga acagcctgaa ggcctccgac accgccatgt actactgcgc ccggtactat 300
gtgtccctgg tggatatctg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag c          351
<210> 44
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 44
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtaggtttc attagaagca aagcttatgg tgggacaaca 180
gaatacgccg cctctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240
gcctatctgc aaatgaacaa cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtgctaga 300
gatgggctgt atagcagcag ctggtacgat tctgactact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca                                                     372
<210> 45
<211> 378
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 45
cagatgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatc 300
catagtggga gctactacgg cctactctac tacgctatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctca                                               378
<210> 46
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 46
gaggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacggca tcagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggctgg atcagcgcct acaacggcaa taccaactac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actattgcgc ccggttccag 300
gactggtggt atctgggcca gttcgaccag tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtct 360
agc                                                               363
<210> 47
<211> 338
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 47
caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg caaccggcag tgacgttggt gtttattact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa agtgatgatt tatgatgtcg gtaatcggcc cccaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc gcctcatata caaacaggaa cagtctcggc 300
tatgtcttcg gaaccgggac caaggtcacc gtcctagg                         338
<210> 48
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 48
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcag caccgtggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt                              333
<210> 49
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 49
tcctatgagc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc ctggcaagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gtgacaacat tggaactaaa agtgtgacct ggtaccaaca gaggccaggc 120
caggccccta tgatggtcat ctattatgat accgtccggc cctcagggat ccctgagcga 180
ctctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcaccagggt cgaagccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcatcc ggtgttcggc 300
ggagggacca agctgaccgt cctaggt                                     327
<210> 50
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 50
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cggggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttca 300
gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc ctaggt                           336
<210> 51
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 51
cagtctgtgt tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
caggcccctg tgctggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcatgt ggtattcggc 300
ggagggacca agctgaccgt cctaggt                                     327
<210> 52
<211> 330
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 52
caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60
acctgtggct ccagcactgg agctgtcacc agtggtcatt atccctactg gttccagcag 120
aagcctggcc aagcccccag gacactgatt tatgatgcaa gcgacaaaca ctcctggaca 180
cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240
cagcctgagg atgaggctga gtattactgc ttgctctcct atagtgatgc tctggtgttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt                                  330
<210> 53
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 53
cagagcgtgc tgacacagcc tgcctccgtg tctggctctc ctggccagtc catcaccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc cgacgtgggc ggctacaatt acgtgtcctg gtatcagcag 120
catcccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcgaggtg 180
tccaacagat tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgacaat cagcggactg 240
caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctaca ccaccggcag cagagccgtg 300
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctg ggc                              333
<210> 54
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 54
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ctactgcgga acatgggatg gcagcctcta tactatgtta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt                              333
<210> 55
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 55
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tttggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctt caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ctatttctgc cagtcgtatg acagtagcct gagtggttcg 300
ggggtcttcg gaactgggac caaggtcacc gtcctaggt                        339
<210> 56
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 56
cagagcgccc tgacacagcc tgcctccgtg tctggatctc ccggccagag catcaccatc 60
agctgcacag ccaccggctc cgacgtgggc gtgtactact acgtgtcctg gtatcagcag 120
catcccggca aggcccccaa agtgatgatc tacgacgtgg acaaccggcc tcccggcgtg 180
tccaatagat tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgacaat cagcggactg 240
caggccgagg acgaggccga ttactactgc gccagctaca ccaaccggaa cagcctgggc 300
tacgtgttcg gcaccggcac caaagtgaca gtgctgggc                        339
<210> 57
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 57
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
1               5
<210> 58
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 58
Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1               5
<210> 59
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 59
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210> 60
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 60
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1               5
<210> 61
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 61
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp
1               5
<210> 62
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 62
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
1               5
<210> 63
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 63
Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr Trp
1               5
<210> 64
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 64
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp
1               5
<210> 65
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 65
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1               5
<210> 66
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 66
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
1               5
<210> 67
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 67
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
1               5
<210> 68
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 68
Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1               5
<210> 69
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 69
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1               5
<210> 70
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 70
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile
1               5
<210> 71
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 71
Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr
1               5
<210> 72
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 72
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
1               5
<210> 73
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 73
Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr
1               5
<210> 74
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 74
Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr
1               5                  10
<210> 75
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 75
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile
1               5
<210> 76
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 76
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
1               5
<210> 77
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 77
Ala Arg Tyr Gln Asp Trp Trp Tyr Leu Gly Gln Phe Asp Gln
1               5                  10
<210> 78
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 78
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Arg Tyr Asp Ala
1               5                  10
<210> 79
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 79
Ala Arg Glu Ile Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                  10                  15
<210> 80
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 80
Ala Arg Ala Asp Asp Tyr Gly Ala Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
1               5                  10                  15
Val
<210> 81
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 81
Ala Thr Gly Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr
1               5                  10
<210> 82
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 82
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                  10
<210> 83
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 83
Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile
1               5                  10
<210> 84
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 84
Ala Arg Asp Gly Leu Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Asp Ser Asp Tyr
1               5                  10                  15
<210> 85
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 85
Ala Lys Asp Ile His Ser Gly Ser Tyr Tyr Gly Leu Leu Tyr Tyr Ala
1               5                  10                  15
Met Asp Val
<210> 86
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 86
Ala Arg Phe Gln Asp Trp Trp Tyr Leu Gly Gln Phe Asp Gln
1               5                  10
<210> 87
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<221> вариант
<222> 2
<223> Xaa = F или Y
<220>
<221> вариант
<222> 3
<223> Xaa = S или T
<220>
<221> вариант
<222> 5
<223> Xaa = D или S или T
<220>
<221> вариант
<222> 6
<223> Xaa = D или N или S
<220>
<221> вариант
<222> 7
<223> Xaa = Y или A
<220>
<221> вариант
<222> 8
<223> Xaa = A или G или W
<400> 87
Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210> 88
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<221> вариант
<222> 1
<223> Xaa = I или S
<220>
<221> вариант
<222> 2
<223> Xaa = K или S
<220>
<221> вариант
<222> 3
<223> Xaa = любая аминокислота
<220>
<221> вариант
<222> 4
<223> Xaa = H или Y
<220>
<221> вариант
<222> 5
<223> Xaa = любая аминокислота
<220>
<221> вариант
<222> 7
<223> Xaa = любая аминокислота
<400> 88
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr
1               5
<210> 89
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<221> вариант
<222> 1
<223> Xaa = A или G
<220>
<221> вариант
<222> 2, 5, 6, 7
<223> Xaa = любая аминокислота
<220>
<221> вариант
<222> 3
<223> Xaa = W или Y
<220>
<221> вариант
<222> 8
<223> Xaa = F или Y
<400> 89
Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Asp
1               5
<210> 90
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 90
Gly Ser Asp Val Gly Val Tyr Tyr Tyr
1               5
<210> 91
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 91
Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr
1               5
<210> 92
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 92
Asn Ile Gly Thr Lys Ser
1               5
<210> 93
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 93
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1               5
<210> 94
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 94
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1               5
<210> 95
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 95
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr
1               5
<210> 96
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 96
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1               5
<210> 97
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 97
Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr
1               5
<210> 98
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 98
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1               5
<210> 99
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 99
Gly Ser Asp Val Gly Val Tyr Tyr Tyr
1               5
<210> 100
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 100
Asp Val Gly
1
<210> 101
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 101
Glu Asp Asn
1
<210> 102
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 102
Tyr Asp Thr
1
<210> 103
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 103
Gly Asn Ser
1
<210> 104
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 104
Tyr Asp Ser
1
<210> 105
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 105
Asp Ala Ser
1
<210> 106
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 106
Asp Val Asn
1
<210> 107
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 107
Asp Asn Asn
1
<210> 108
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 108
Gly Asn Ser
1
<210> 109
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 109
Asp Val Asp
1
<210> 110
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 110
Ala Ser Tyr Thr Asn Arg Asn Ser Leu Gly Tyr Val
1               5                  10
<210> 111
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 111
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Val Val
1               5
<210> 112
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 112
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Pro Val
1               5                  10
<210> 113
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 113
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val
1               5                  10
<210> 114
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 114
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val
1               5                  10
<210> 115
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 115
Leu Leu Ser Tyr Ser Asp Ala Leu Val
1               5
<210> 116
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 116
Ser Ser Tyr Thr Thr Gly Ser Arg Ala Val
1               5                  10
<210> 117
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 117
Gly Thr Trp Asp Gly Ser Leu Tyr Thr Met Leu
1               5                  10
<210> 118
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 118
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Gly Val
1               5                  10
<210> 119
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 119
Ala Ser Tyr Thr Asn Arg Asn Ser Leu Gly Tyr Val
1               5                  10
<210> 120
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<221> вариант
<222> 1
<223> Xaa = S или T
<220>
<221> вариант
<222> 2
<223> Xaa = G или S
<220>
<221> вариант
<222> 3
<223> Xaa = D или N
<220>
<221> вариант
<222> 4
<223> Xaa = I или V
<220>
<221> вариант
<222> 5
<223> Xaa = A или G
<220>
<221> вариант
<222> 6
<223> Xaa = A или S или V
<220>
<221> вариант
<222> 7
<223> Xaa = любая аминокислота
<220>
<221> вариант
<222> 8
<223> Xaa = H или Y
<400> 120
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210> 121
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<221> вариант
<222> 2
<223> Xaa = S или T
<220>
<221> вариант
<222> 3
<223> Xaa = Y или W
<220>
<221> вариант
<222> 4
<223> Xaa = D или T
<220>
<221> вариант
<222> 5
<223> Xaa = S или T
<220>
<221> вариант
<222> 6
<223> Xaa = A или S
<400> 121
Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210> 122
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 122
Leu Leu Asp Val Pro Thr Ala Ala Val
1               5
<210> 123
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 123
Thr Leu Trp Val Asp Pro Tyr Glu Val
1               5
<210> 124
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 124
Phe Leu Leu Asp His Leu Lys Arg Val
1               5
<210> 125
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 125
Leu Leu Leu Asp Val Pro Thr Ala Ala Val
1               5                  10
<210> 126
<211> 13
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 126
Val Leu Phe Arg Gly Gly Pro Arg Gly Leu Leu Ala Val
1               5                  10
<210> 127
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 127
Ser Leu Leu Pro Ala Ile Val Glu Leu
1               5
<210> 128
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 128
Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile
1               5
<210> 129
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 129
Phe Leu Leu Pro Thr Gly Ala Glu Ala
1               5
<210> 130
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 130
Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
1               5                  10
<210> 131
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 131
Ser Leu Pro His Phe His His Pro Glu Thr
1               5                  10
<210> 132
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 132
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly
1               5                  10
<210> 133
<211> 11
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 133
Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys Gly Asp Ile Pro
1               5                  10
<210> 134
<211> 11
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 134
Leu Leu Leu Asp Val Pro Thr Ala Ala Val Gln
1               5                  10
<210> 135
<211> 12
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 135
Leu Leu Leu Asp Val Pro Thr Ala Ala Val Gln Ala
1               5                  10
<210> 136
<211> 14
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 136
Val Leu Phe Arg Gly Gly Pro Arg Gly Leu Leu Ala Val Ala
1               5                  10
<210> 137
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 137
Met Val Asp Gly Thr Leu Leu Leu Leu
1               5
<210> 138
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 138
Tyr Met Ala Pro Glu Ile Leu Met Arg Ser
1               5                  10
<210> 139
<211> 10
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 139
Phe Ile Tyr Asn Ala Asp Leu Met Asn Cys
1               5                  10
<210> 140
<211> 11
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 140
Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile
1               5                  10
<210> 141
<211> 9
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 141
Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu
1               5
<---