Изучение противовирусной активности Ингавирина® в отношении возбудителя гриппа a (H3N2) in vitro

Є

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Изучение противовирусной активности Ингавирина в отношении возбудителя гриппа A (H3N2) in vitro

С. Я. ЛОГИНОВА1, С. В. БОРИСЕВИЧ1, И. В. СЕМЕНОВА1, В. А. МАКСИМОВ1, В. П. БОНДАРЕВ1, В. Е. НЕБОЛЬСИН2

' Филиал федерального государственного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации» — «Вирусологический центр», Сергиев Посад;

2 Открытое акционерное общество «Валента Фармацевтика», Москва

Investigation of in vitro Activity of Ingavirin

Against Influenza Virus A

S. YA. LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, I. V. SEMENOVA, V. A. MAKSIMOV, V. P. BONDAREV, V. E. NEBOLSIN

Virological Centre of the Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad Valenta Pharmacevtica, Moscow

Проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина и этиотропных химиопрепаратов (Арбидол и Ремантадин) в отношении вируса гриппа А (Н3Ш) в чувствительных постоянных культурах клеток свидетельствует о том, что исследуемый препарат в изученных концентрациях эффективно подавляет цитопатическую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению).

Ключевые слова: грипп А, Ингавирии, противовирусная эффективность, культура клеток.

The comparative analysis of the efficacy of Ingavirin and etiotropic chemotherapeutics, such as Arbidol and Remantadin, against the influenza virus A (H3N2) performed with the use of susceptible permanent cell cultures showed that in the used concentrations Ingavirin was efficient in inhibition of the virus cytopathic activity , formation of the specific hemagglutinin and repro- ^

duction of the virus (by the accumulation). j

Key words: influenza virus A, Ingavirin, antiviral efficacy, cell culture.

Одним из первых этапов доклинического исследования новых лекарственный противовирусныгх препаратов является оценка их активности в чувствительных культурах клеток в отношении вируса гриппа. В связи с тем, что различные типы и линии клеток обладают разной чувствительностью к воздействию противовирусных препаратов, оценку их эффективности нередко проводят с использованием нескольких типов и линий клеток [1]. Использование нескольких культур клеток позволяет более достоверно осуществлять оценку активности существующих и новык лекарственных соединений.

Целью наших исследований являлось изучение эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин в отношении экспериментальной гриппозной инфекции in vitro.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали адаптированный к лёгким белыгх мышей вирус гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), по© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, ул. Нагатинская, д. 3а. ГНЦА

лученный из ГУ «НИИ вирусологии» им. Д. И. Ивановского РАМН. Штамм A/Aichi/2/68 вируса гриппа, подтип H3N2, является прототипным по отношению к основным подтипам, циркулирующим в настоящее время (H3N2 и H1N1). Он широко используется отечественными и зарубежными специалистами при оценке защитной эффективности лекарственный: средств (химиопрепаратов, интерферона и его индукторов) и медицинских иммунобиологических препаратов (вакцин, иммуноглобулинов).

Штамм хранится в Специализированной коллекции Филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ».

Культуры клеток. Использованы постоянные культуры клеток почек зелёный; мартышек — GMK-AH-ЦД), почек свиньи — СПЭВ и почек собаки — MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно.

Исследуемые препараты. Ингавирин — производства ОАО «Валента Фарм», Россия; Арбидол — производства ЗАО «Мастерлек», Россия; Ремантадин — производства ООО «РОЗФАРМ», Россия. В исследованиях использовались коммерческие препараты с гарантированным производителем сроком годности.

Противовирусную эффективность препаратов in vitro оценивали по следующим показателям:

— снижение уровня накопления вируса под воздействием препарата (A, lg);

e

Таблица 1. Сравнительная эффективность Ингавирина по подавлению цитопатической активности вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (^N2), в постоянных культурах клеток

Препарат Концентрация препарата, мкг/мл Культура клеток Коэффициент подавления ЦПД, %

Ингавирин 200 GMK-AH-ЦД) 66,7+3,3

100 50,0+0,0

Арбидол 25,0 33,3+3,3

Ремантадин 50,0 80,0+5,7

Ингавирин 200 MDCK 64,0+1,3

100 58,0+3,3

Арбидол 25,0 40,0+3,1

Ремантадин 50,0 86,0+2,4

Ингавирин 200 СПЭВ 70,0+0,0

100 60,0+5,8

Арбидол 25,0 36,7+3,3

Ремантадин 50,0 83,3+3,3

Примечание. Здесь и в табл. 2: Количество опытов при изучении эффективности ингавирина и арбидола в культуре клеток MDCK составило 27, а в культурах клеток СПЭВ и GMK-AH-КД) — по 3 соответственно. На каждое разведение использовалось по 10 пробирок. Здесь и в табл. 2 и 3 препараты вносили через 2 часа после инфицирования. Здесь и в табл. 2 и 3 инфицирующая доза составляла 0,01 ЦПД/клетку.

— коэффициент ингибирования (Ки), %;

— подавление цитотоксической активности вируса, %. Уменьшение уровня накопления вируса под влиянием

препарата (А, ^) определяли по формуле:

А = Ак- Ао, (1);

где Ак — уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата (^ ЦПД50/МЛ); Ад — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (^ ЦПД50/мл).

Коэффициент ингибирования (Ки, %) рассчитывали по формуле:

Ku (Ако]

- Аоп)/Аконтр X 100% (2);

1контр ' уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата, (ЦПД5о/мл); Адп — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (ЦПД5о/мл).

Оценка противовирусной эффективности используемыгх лекарственный; препаратов осуществлена в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета РФ [1]. Статистическую обработку экспериментальным данныгх проводили по Стьюденту [2]

Результаты и обсуждение

Исследования препаратов проводили по нескольким направлениям: изучение подавления цитотоксичности вируса, формирования специфичного гемагглютинина и репродукции вируса в монослое культуры клеток.

Результаты оценки токсичности Ингавирина для постоянных культур клеток ОМК-ЛИ-1(Д), СПЭВ и МБСК свидетельствуют, что в концентрациях от 20 до 1000 мкг/мл препарат не вызывает визуально наблюдаемых изменений во всех использованных культурах клеток [3].

В работе использовали максимально эффективные дозы Ремантадина и Арбидола (1/2 от максимально переносимой концентрации),

составляющие 50 и 25 мкг/мл соответственно. Более высокие их концентрации токсичны для исследуемых культур клеток, а более низкие менее эффективно ингибируют репродукцию вируса гриппа [3]. В то же время Ингавирин использовали в концентрации 200 мкг/мл, составляющей 1/5 от максимально переносимой концентрации.

При изучении влияния препаратов на цито-токсическую активность вируса в культурах клеток МБСК, ОМК-ЛИ-1(Д) и СПЭВ (табл. 1) было установлено, что Ингавирин в концентрации 200 мкг/мл подавляет способность вируса гриппа, штамм Л/Л1еЫ/2/68 (Н3Ш), вызывать цитопатический эффект в монослое культур клеток (через 72 ч после инфицирования) на 64—70%. Изучение влияния Ингавирина на динамику (через 12, 24, 48, 72 ч после инфицирования) репродукции вируса в культурах клеток свидетельствует о том, что в первые двое суток после инфицирования препарат полностью ингибирует цитопатическую активность возбудителя и формирование специфического гемагглютинина.

Наименее эффективно подавляет цитотокси-ческую активность вируса Арбидол, коэффициент ингибирования — 33—40%.

Результаты исследования по выявлению специфического гемагглютинина в поддерживающей среде культур клеток ОМК-ЛН-1(Д), МБСК и СПЭВ (табл. 2) в присутствии лекарственных препаратов свидетельствуют о том, что Ингавирин подавляет формирование гемагглютинина (через 72 ч после инфицирования) соответственно на 87,5, 85,0 и 87,5%; Ремантадин — на 97,9, 96,9 и 96,7%; Арбидол — на 33,3, 50,0 и 58,3% соответственно.

Исследования по изучению подавления репродукции вируса в культурах клеток МБСК и

О

е

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 2. Сравнительная эффективность Ингавирина по подавлению образования специфического гемагглютинина вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в постоянных культурах клеток

Пpeпapaт Kощeнтpaция п|)єп;і|);іт;і, мкг/мл ^AK^pa клеток Kоэффициeнт подавления TA, %

Ингавирин 200,0 GMK-AH-ЦД) 87,5+0,0

100,0 75,0+0,0

ApG^n^ 25,0 33,3+16,7

Ремантадин 50,0 97,9+2,1

Ингавирин 200,0 MDCK 85,0+1,3

100,0 80,0+1,1

ApG^n^ 25,0 50,0+0,0

Ремантадин 50,0 96,9+0,0

Ингавирин 200,0 СТЭВ 87,5+0,0

100,0 75,0+0,0

ApG^n^ 25,0 58,3+8,3

Ремантадин 50,0 96,7+0,0

Примечание. В реакции гемагглютинации использовали эритроциты морской свинки.

Таблица S. Сравнительная эффективность Ингавирина в отношении вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68

Пpeпapaт ^н^трация п|)єп;і|);іт;і, мкг/мл клеток Уpовeнь подавления накопления виpуca, А, lg

Ингавирин 200 GMK-AH-ЦД) 2,3+0,1 99,1+0,1

100 1,4+0,2 92,2+0,2

ApG^n^ 25 1,5+0,1 92,5+0,2

Ремантадин 50,0 4,8+0,1 99,99+0,1

Ингавирин 200 MDCK 2,2+0,1 99,4+0,1

100 1,4+0,1 96,0+0,1

ApG^n^ 25 1,8+0,1 98,4+0,1

Ремантадин 50,0 4,9+0,1 99,99+0,2

Примечание. Инфекционный титр вируса определяли титрованием на 9-суточных куриных эмбрионах (ЭИД50/мл).

GMK-AH-ЦД) исследуемыми препаратами выявили, что препарат Ингавирин эффективно подавляет репродукцию вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в культурах клеток через 72 ч после инфицирования. Референс-препарат Ремантадин также эффективно подавляет репродукцию вируса in vitro, в отличие от препарата Арбидол (табл. 3). Учитывая результаты изучения цитотоксичности Ингавирина и противовирусной эффективности можно сделать вывод о том, что величина ХТИ (химиотерапевтический индекс) для этого препарата более 10.

Исторически Ремантадин является эталонным препаратом, эффективным в отношении вируса гриппа А, применяющийся для сравнительной оценки противовирусных средств in vitro и in vivo на модельных штаммах вируса гриппа, чувствительных к нему [4, 5]. Однако проблема быстрого появления резистентных штаммов к Ремантадину (в США в сезон 2005—2006 г. цир-

кулировало более 90% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (Н3Ш), а в Российской Федерации в сезон 2007—2008 г. — до 77% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (Н3Ш)) на фоне проводимого лечения гриппозной инфекции определила запрет на применение препаратов адамантанового ряда в ряде стран мира на протяжении последних трёх эпидемических сезонов [6].

Таким образом, проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина в отношении вируса гриппа А (Н3М2) в чувствительных постоянных культурах клеток в сравнении с референс-препаратами (Ремантадин и Арбидол), свидетельствует о том, что Ингавирин эффективно подавляет цитопати-ческую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению) и может быть рекомендован в качестве средства выбора противовирусной терапии при гриппе.

е

ЛИТЕРАТУРА

1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: 2005.

2. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: 1990.

3. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А., Бондарев В. П. Оценка токсичности неспецифических медицинских противовирусных средств, предназначенных для профилактики и лечения опасных и особо опасных вирусных инфекций. Антибиотики и химиотер 2009; 54: 3—4: 11—14.

4. Saelens X., Vanlandschoot P., Martinet W. et al. Protection of mice against a lethal influenza virus challenge after immunization with yeast-

derived secreted influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem 1999; 260: 1: 166—175.

Yingsakmongkon S., Miyamoto D., Sriwilaijaroen N. et al. In vitro inhibition of human influenza A virus infection by fruit-juice concentrate of Japanese plum (Prunus mume SIEB. et ZUCC). Biol Pharm Bull 2008; 31: 3: 511—515.

Бурцева E. И., Шевченко E. С., Белякова H. В. и др. Мониторинг чувствительности выделенных в России эпидемических штаммов вирусов гриппа к этиотропным химиопрепаратам. Вопр. вирусол 2009; 5: 25—28.

-Q-