Способ получения белковой кормовой биомассы
METHOD FOR PRODUCING PROTEIN FODDER BIOMASS

Изобретение относится к области биотехнологии, комбикормовой и перерабатывающей промышленности при переработке растительных отходов путем биоконверсии базидиальными грибами, в том числе Pleurotus pulmonarius, и может быть использовано для получения белковой кормовой биомассы на основе пшеничной соломы.
Известно, что растительные отходы сельского хозяйства, в том числе солома пшеницы имеют низкую питательную ценность и усвояемость. Проведение биодеструкции этих отходов химическими или биологическими методами значительно повышает возможность использования их в качестве кормовых добавок. В отличие от химических методов в результате биоконверсии базидиомицетами происходит не только изменение структуры углеводно-лигнинного комплекса растительной биомассы, но и отмечается увеличение содержания в ней белковых веществ, а также повышение ферментной, витаминной и минеральной ценности, что способствует повышению кормовой ценности получаемой продукции.
При проведении процесса твердофазной ферментации растительных субстратов высшими базидиальными грибами условия роста для грибного мицелия на поверхности субстратного блока и в его глубине значительно отличаются. Вследствие повышения температуры и недостаточного поступления кислорода в глубину блока, развитие мицелия гриба происходит в основном на поверхности субстратного блока. Контроль роста в глубине субстратного блока (температуры, рН, влажности) является затруднительным. В отличие от твердофазного культивирования при жидкофазном процессе условия роста мицелия гриба одинаковы по всему объему питательной среды и легко могут быть скорректированы в процессе культивирования.
4
3
2
4
4
4
Известен способ получения кормовой добавки [1]. В твердый остаток после спирто-щелочной экстракции коры лиственницы сибирской (одубины) вносят питательные соли, г/л: (NH)NO 1-1,5; KHPO 0,5-0,7; KCl 0,1-0,3; MgSO 0,1-0,5; FeSO 0,001-0,005, рН 4-5. Жидкостный модуль 3-7. Пропаривают острым паром в течение 20 мин, охлаждают, засевают грибом Pleurotus ostreatus в количестве 3-5% и выращивают при температуре 28-30°С в течение 5-10 сут. Полученный продукт высушивают до воздушно-сухого состояния. Прирост протеина составляет 3-9,5%. Выход продукта 90-95%.
Недостатком данного способа является использование в качестве субстрата твердого остатка коры лиственницы после спирто-щелочной экстракции. Кормовая добавка, полученная на данном субстрате, представляется грубодисперсным и трудноусвояемым кормом для животных. В связи, с этим ее рекомендуют добавлять в количестве не более 5% от массы основных кормов.
4
7
Известен способ выращивания плодовых тел съедобных грибов из рода Pleurotus [2], включающий приготовление субстрата на основе лузги подсолнечника или пшеничной соломы. Перед внесением посевного материала к субстрату добавляют суспензию дрожжей Cryptococcus albidus, Hanseniaspora uvarum или Saccharomyces cerevisiae в концентрации 10-10 жизнеспособных клеток в 1 мл на 100 г субстрата. Количество посевного мицелия, выращенного на зерне, составляет 5 г на 150 г субстрата. Зарастание основного субстрата (лузга подсолнечника или пшеничная солома) происходит в термостате при 22-26°С в течение 10-13 суток. Затем засеянные емкости помещают в термостатируемую камеру для выгонки плодовых тел при температуре 20°С, влажности 85-95%. Способ обеспечивает сокращение сроков культивирования на 7 дней и увеличение урожайности.
Недостатком данного способа является использование в качестве посевного материала зернового мицелия, что создает дополнительные трудности при соблюдении условий стерильности на стадии засева.
Известен способ выращивания плодовых тел вешенки [3]. Этот способ включает приготовление питательного субстрата и заполнение им культивационных сосудов с перфорированными стенками, что осуществляют поэтапно. Культивационные сосуды плотно размещены внутри крупногабаритной емкости, инокулируют субстрат зерновым посевным материалом и размещают их так, чтобы непророщенный мицелием субстрат в каждом культивационном сосуде имел контакт с предварительно пророщенным субстратом в другом сосуде. Культивирование продолжают до прорастания субстрата мицелием во всех культивационных сосудах, после чего питательным субстратом заполняют культивационные сосуды до полного объема, выдерживают их в крупногабаритной емкости до прорастания субстрата. После извлечения из крупногабаритной емкости часть их отправляют в камеру плодоношения, а часть отбирают для использования в качестве посевного материала в очередном технологическом цикле.
Недостатком способа является применение нестерильных условий производства, что существенно повышает риск контаминации нежелательными видами грибов, а также высокая трудоемкость при использовании в качестве посевного материала мицелия выращенного на зерне. Длительность процесса приготовления субстрата в данном способе достигает 15 суток.
4
4
2
4
2
4
+
2
Наиболее близким к заявленному способу по технической сущности и достигаемому результату является способ переработки отходов растительного сырья с использованием глубинной биомассы мицелия Pleurotus pulmonarius для выращивания плодовых тел [4]. В данном способе мицелиальную биомассу, выращивают в глубинных условиях на питательной среде, которая содержит в своем составе источник азота (NH), источник углерода (крахмал) и комплекс минеральных солей (KCl, NaCl, CaCl, MgSO, КНРО, KHPO). В качестве растительного субстрата используют измельченную солому, предварительно простерилизованную в автоклаве в течение 1 часа при 0,5 кгс/см. Засев проводят в стерильных условиях методом впрыска полученной мицелиальной биомассы в подготовленный субстратный блок шприцом Жане с объемом впрыска 150 мл. Расход культивируемой жидкости для засева 1 дм субстратного блока составляет 100±10 мл. Инкубирование засеянных блоков проводят при температуре 25-27°С и влажности воздуха 60-65% до полного прорастания субстрата мицелием. После полной колонизации субстрата «белые блоки» устанавливают в помещение с температурой 18-20°С для получения плодовых тел.
Недостатком способа является длительность процесса инкубирования субстратного блока мицелием, невысокое качество белковой кормовой биомассы, ввиду того, что рост мицелия происходит в поверхностных слоях блока.
Задачей настоящего изобретения является повышение качества полученной белковой кормовой биомассы и сокращение сроков ее получения за счет создания благоприятных условий роста грибного мицелия.
Технический результат, достигаемый заявляемым способом, заключается в создании благоприятных условий роста грибного мицелия, что позволяет сократить сроки получения белковой кормовой биомассы и повысить ее качество.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения белковой кормовой биомассы, включающем выращивание посевного материала из штамма РР-3.2 базидиального гриба P.pulmonarius жидкофазным культивированием в глубинных условиях при непрерывном перемешивании за счет барботажа воздуха на крахмал-аммонийной среде и последующее твердофазное культивирование на растительном субстрате, согласно изобретению жидкофазное глубинное негомогенное культивирование P.pulmonarius проводят крахмал-аммонийной среде, содержащей измельченную пшеничную солому, находящуюся в динамических условиях в течение 72 часов, а затем после отделения культуральной жидкости проводят окончательное твердофазное культивирование при температуре 23-25°С. Благоприятные условия роста грибного мицелия создаются за счет его иммобилизации на частицах растительного субстрата, находящегося в питательной среде. Процесс иммобилизации мицелия после отделения культуральной жидкости позволяет сократить продолжительность стадии твердофазного культивирования в сравнении с прототипом.
Предлагаемый способ получения белковой кормовой биомассы обладает следующими преимуществами:
- более равномерное распределение посевного материала по всему объему растительной биомассы;
- сокращаются сроки получения продукта;
- создаются оптимальные условия для сохранения стерильности при засеве и при проведении первой стадии глубинно-твердофазного культивирования;
- мицелий гриба в готовом продукте равномерно распределен по всему объему растительного субстрата;
- на первой стадии глубинного жидкофазного негомогенного культивирования происходит иммобилизация мицелия, адаптация культуры к используемому субстрату и прирост биомассы.
Повышение качества белковой кормовой биомассы достигается за счет равномерного распределения грибного мицелия по всему объему субстратного блока, что обеспечивает постоянство белкового состава по всему объему продукта.
Предлагаемый способ может быть применен и для других мицелиальных грибов, относящихся к экологической группе лигнинотрофных сапрофитов.
Способ получения белковой кормовой биомассы проводят в две стадии.
На первой стадии проходит процесс жидкофазного негомогенного культивирования P.pulmonarius в глубинных условиях на синтетической среде с применением способа иммобилизации мицелия на растительном субстрате (измельченная пшеничная солома), находящимся в питательной среде в незафиксированном состоянии. В процессе проведения первой стадии культивирования происходит иммобилизация мицелия на частицах субстрата, а также адаптация культуры к используемому субстрату и прирост биомассы, так как используемая питательная среда содержит в своем составе все необходимые компоненты для роста мицелия гриба, а процесс культивирования проводят в оптимальных условиях роста глубинной культуры гриба.
Первая стадия культивирования в глубинных условиях протекает с использованием способа иммобилизации мицелия на растительном субстрате (измельченная пшеничная солома). В качестве продуцента используют штамм P.pulmonarius РР-3.2, процесс жидкофазного культивирования в глубинных условиях проводят на крахмал-аммонийной среде при температуре 23-26°С и рН 5,5-5,8 в течение 72 часов. После отделения культуральной жидкости растительный субстрат с иммобилизованным мицелием поступает на вторую стадию технологического процесса - твердофазного культивирования.
На второй стадии проходит более глубокая переработка растительного субстрата мицелием P.pulmonarius до полной колонизации субстратного блока грибным мицелием.
Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что первую стадию культивирования проводят в глубинных условиях на крахмал-аммонийной среде, содержащей измельченную пшеничную солому, которая находится в динамических условиях при постоянном перемешивании за счет барботажа воздуха через питательную среду. В результате этого рост глубинной культуры происходит в контролируемых условиях. В процессе культивирования мицелий P.pulmonarius фиксируется на частицах растительного субстрата.
4
4
4
+
+
+
2+
2+
2-
-
3-
Способ осуществляется следующим образом. Выращивают чистую культуру гриба P.pulmonarius на сусловом агаре в чашках Петри. Затем полученный поверхностный мицелий переносят в емкость с подготовленной крахмал-аммонийной питательной средой, в которой проводят процесс выращивания посевного материала в глубинных условиях с перемешиванием и подачей стерильного воздуха. Питательная среда содержит в своем составе источник углерода (крахмал), источник азота (NH), и комплекс минеральных солей, содержащий все необходимые для роста мицелия анионы (К, Na, Mg, Са, SO, Cl, РО). Далее посевной материал засевается в коническую двухлитровую колбу с аналогичной питательной средой объемом 1,3-1,5 л в которой содержится измельченная солома. Питательная среда с содержащейся в ней измельченной соломой предварительно стерилизуется путем автоклавирования в течение 1 часа при давлении 0,05-0,06 МПа. Процесс культивирования проводят при температуре 23-26°С и рН 5,5-5,8 при непрерывном барботаже воздуха.
По окончании культивирования и отделения культуральной жидкости - растительный субстрат и с иммобилизованным на нем грибным мицелием поступает на стадию твердофазного культивирования.
Твердофазное культивирование проводят в растительной камере при температуре 23-25°С и влажности воздуха 60% до полной колонизации субстрата грибным мицелием.
Полученный продукт может быть использован в качестве кормовой добавки в рационе питания сельскохозяйственных животных. Полученный продукт может храниться при 5°С (в течение 12 месяцев) и использоваться в качестве посевного материала при выращивании плодовых тел, как по интенсивному, так и экстенсивному способу культивирования, а также в качестве готовых засеянных блоков при выращивании грибов на грибоводческих фабриках.
4
2
4
2
4
2
4
4
2
Пример 1. Штамм РР-3.2 базидиального гриба P.pulmonarius выращивают в чашке Петри на агаризованном сусле в течение 7 суток. Из краевой зоны роста семисуточной культуры вырезают агаровые блоки воздушного мицелия пробойным сверлом диаметром 8 мм, которые в стерильных условиях переносят в конические колбы вместимостью 250 мл с объемом питательной среды 150 мл в каждой. Питательная среда содержит в своем составе, г/л: картофельный крахмал - 20; (NH)SO - 7,0; KHPO - 0,2; KHPO - 1,3; MgSO - 0,5; CaCl - 0,1; NaCl - 0,1. Выращивание посевного материала проводят методом жидкофазного культивирования в глубинных условиях на лабораторном шейкере при 220 об/мин в течение 7 суток. Выращенный инокулят в дальнейшем используют в качестве посевного материла.
В качестве растительного субстрата используют измельченную пшеничную солому. Размер частичек растительного субстрата составляет 3-5 мм, количество растительного субстрата составляет - 7 г на 1 литр питательной среды. Используемая питательная среда аналогична питательной среде, используемой при выращивании инокулята. Подготовленную колбу с объемом питательной среды 1,3 л и находящейся в ней измельченным растительным субстратом стерилизуют в автоклаве в течение 1 часа при 0,05 МПа. После охлаждения до комнатной температуры в стерильных условиях производят засев глубинной культуры P.pulmonarius в объеме 300 мл.
Культивирование проводят при непрерывном перемешивании и подаче воздуха в течение 72 часов. Расход воздуха составляет 1,6 л/л среды в мин. Температура культивирования 23°С, рН 5,8.
По окончанию культивирования растительный субстрат с иммобилизованным на нем грибным мицелием поступает на стадию твердофазного культивирования. Культивирование проводят в растильной камере при температуре 25°С и влажности воздуха 60% до стадии образования «белого блока».
После сушки при 35-40°С и упаковки полученный продукт может использоваться в качестве кормовой добавки в рационе питания сельскохозяйственных животных.
Также культуральная жидкость с растительным субстратом после первой стадии культивирования может быть использована как посевной материал и после смешения с измельченной и простерилизованной соломой в соотношении 1:25 поступает на стадию твердофазного культивирования.
Пример 2. Аналогично примеру 1. Температура культивирования 26°С, рН среды 5,5.
В таблице 1 приведены результаты выращивания биомассы P.pulmonarius при различных параметрах процесса культивирования (примеры 1 и 2).
Как видно из данных таблицы 2 в предлагаемом способе белковую кормовую биомассу получают при проведении глубинного жидкофазного негомогенного культивирования P.pulmonarius (глубинно-твердофазного культивирования с добавлением в жидкую фазу измельченного растительного сырья) на питательной среде, содержащей измельченные частицы субстрата. В процессе культивирования P.pulmonarius в динамических условиях происходит иммобилизация мицелия на частицах субстрата, его адаптация к используемому субстрату, что создает благоприятные условия роста мицелия как на стадии глубинно-твердофазного, так и на последующей стадии твердофазного культивирования P.pulmonarius. В прототипе продукт получают при твердофазном культивировании P.pulmonarius на измельченной пшеничной соломе, используя в качестве посевного материала мицелий, выращенный в глубинных условиях.
В таблице 2 приведены сравнительные режимы получения белковой кормовой биомассы по способу прототипу и предлагаемому способу.
Полученная предложенным способом белковая кормовая биомасса может быть использована в сельском хозяйстве и комбикормовой промышленности в качестве добавки в рацион кормления жвачных животных и птиц. Она содержит в своем составе белки, ненасыщенные жирные кислоты и обладает витаминной и минеральной ценностью.
Предлагаемый способ может быть использован для получения белковой кормовой биомассы и с использованием других грибов относящихся к экологической группе лигнинотрофных сапрофитов или с использованием другого растительного сырья.
Источники информации
1. Способ получения кормовой добавки. Величко Н.А., Репях С.М. Патент RU 2093041 С12Р21, C12N 1/14 A01G 1/04, A01H 15/00 A23K1 A23L 1/211 от 20.10.1997 г.
2. Способ выращивания съедобных грибов из рода Pleurotus. Дьяков М.Ю., Кудрявцева О.А., Новоселова Д.Н., Камзолкина О.В. Патент RU 2442823 C12N 1/16 C12N 1/14 A01G 1/04 А01Н 15/00 от 10.07. 2009 г.
3. Способ выращивания вешенки. Ковалева В.С., Мануковский Н.С., Рыгалов В.Е. Патент RU 2086101 A01G 1/04 94042309/13 от 10.08. 1997 г.
4. Мельникова Е.А., Тарченкова Т.М., Миронов П.В. Использование глубинной биомассы мицелия Pleurotus pulmonarius в качестве посевного материала для выращивания плодовых тел, Хвойные бореальной зоны, 2013, Красноярск, Т. XXXI, №3-4, стр. 97-100.