МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASMS

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для обнаружения экспрессии мРНК гена р16 (INK4a) в образцах ткани шейки матки, полученных путем соскоба, с различной патологией: рак шейки матки, CIN различной степени.
Рак шейки матки занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости женщин 15-39 лет в Российской Федерации (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). Установлено, что этиологическим агентом его развития являются вирусы папилломы человека группы «высокого риска заболевания» (ВПЧ 16, 18 и родственные им) (Zur Hausen Н., 1989, 2002). Только у части инфицированных женщин как результат персистенции вируса наблюдается развитие цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN). Пристального внимания заслуживает изучение факторов, способствующих развитию рака шейки матки у данной группы больных. Общеизвестно, что изолированное использование цитологического исследования не позволяет достоверно оценить прогностическую значимость диспластических процессов шейки матки.
Алгоритм обследования и лечения пациенток цервикальными интраэпителиальными неоплазиями тесно связан с выявлением прогностических молекулярно-биологических маркеров предраковых поражений и рака шейки матки.
Использование биомаркеров, которые позволяют идентифицировать потенциально опасные группы инфекции ВПЧ, может улучшить точность скрининга рака шейки матки. К ним относят обнаружение мРНК ВПЧ Е6/Е7 (APTIMA), иммуноцитохимическое выявление экспрессии р16 (INK4a), определение ДНК ВПЧ (НС2) для выявления женщин с высоким риском неоплазий шейки матки.
Сверхэкспрессия ингибитора циклинзависимой киназы p16INK4a (р16) в диспластических клетках эпителия шейки матки указывает на активное присутствие вирусных онкогенов Е7. Несмотря на сильную корреляцию между присутствием вирусных онкогенов Е7 и выраженной экспрессией p16 (INK4a), должны учитываться некоторые морфологические особенности при оценке цитологических препаратов. Так, при наличии цервикальной интраэпителиальной неоплазии в случае прогрессирования дисплазии при иммуноокрашивании с антителами к р16 отмечается постепенное увеличение доли позитивных клеток, начиная с базального и парабазальных слоев. Известно, что при иммуноцитохимическом окрашивании с антителами к р16 позитивное окрашивание выявляется не только в клетках с морфологическими признаками дисплазии, но и в клетках метаплазированного эпителия, что может привести к ложноположительным результатам. В препаратах может наблюдаться спорадическое физиологическое окрашивание неизмененного железистого эпителия шейки матки (P.Samarawardana, D.L. Dehn, M.Singh et al., 2010). Таким образом, из уровня техники известно, что, несмотря на стандартизованное получение монослойного препарата, оценка результатов иммуноцитохимического исследования с антителами к р16 осуществлялась полуколичественным способом.
Из описания к патенту US006709832B1 изобретение "Method of early diagnosis of carcinomas" (опубликовано 23.03.2004) известно, что одним из направлений диагностики предраковых процессов и рака шейки матки является определение мРНК белка р16 в материале парафиновых блоков при ретроспективном исследовании диагностического материала. Однако данная методика является инвазивной - на начальном этапе необходимо выполнение биопсии шейки матки с последующим гистологическим исследованием. Учитывая актуальность скрининга рака шейки матки и хорошие показатели известного из уровня техники подхода, заключающегося в количественном анализе экспрессии гена р16, задачей изобретения является расширение арсенала технических средств данного назначения. При этом технический результат заключается в реализации указанного назначения.
Следовательно, тестирование мРНК гена р16 (INK4a) по материалу соскоба шейки матки с использованием количественной ПЦР может быть использовано в качестве дополнительного маркера для повышения эффективности скрининга рака шейки матки и позволит прогнозировать распространенные поражения шейки матки.
Технический результат достигается благодаря тому, что способ определения мРНК гена р16 (INK4a) в материале соскоба шейки матки с использованием количественной ПНР включает забор исследуемого материала из шейки матки путем соскоба у пациенток с цитологически установленной цервикальной интраэпителиальной неоплазией, что не требует выполнения биопсии и достигается неинвазивным способом получения диагностического материала, анализ экспрессии мРНК гена р16 (INK4a) путем ПЦР как маркера присутствия вирусных онкогенов ВПЧ человека. Причем анализ исследуемого материала включает также анализ концентрации мРНК гена гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT-1). При этом сравнивают уровень экспрессии мРНК р16 (INK4a) с уровнем экспрессии мРНК HPRT-1. Экспрессия последнего осуществляется на достаточно постоянном уровне, что позволяет отнести этот ген к так называемой группе «генов домашнего хозяйства» и определять относительный уровень экспрессии функционально активных генов (в данном случае р16 (INK4a), опираясь на значения экспрессии HPRT-1. Подобный подход является общепринятым и позволяет обеспечить высокую воспроизводимость результатов (Боженко В.К., Васкевич Е.Ф., Чазова Н.Л. и соавт.2009).
Осуществление изобретения поясняется следующим примером.
Анализ экспрессии гена p16 (INK4a)
Выделение РНК
Образцы соскобов шейки матки вынимали из раствора для хранения материала, гомогенизировали на приборе (фирма Qiagen, Германия). Выделение РНК проводили согласно инструкции с помощью наборов "RNeasy mini kit" (фирма Qiagen, Германия). Метод основан на лизисе образцов в растворе гуанидинтиоционата сорбции РНК на колонках, отмывках РНК в спиртовых растворах и элюции РНК. Объем образцов после выделения составил 100 мкл.
Проведение обратной транскрипции
Реакцию обратной транскрипции ставили, используя реактивы фирмы «ЗАО НПФ ДНК-Технология» в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали специфические олигонуклеотиды. Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 30 минут с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ кДНК разводили в 10 раз в ТЕ-буфере.
Проведение ПЦР
Для постановки ПЦР использовали реактивы фирмы «ЗАО НПФ ДНК-Технология». Праймеры и зонды для ПЦР были подобраны с учетом структур генов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК исследуемых и нормировочных генов. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой на этапе выделения РНК. Контроль отсутствия реакции на геномной ДНК ставили с образцами, не прошедшими реакцию обратной транскрипции, которые разводили в ТЕ-буфере в конечной концентрации, эквивалентной конечной концентрации кДНК. ДНК-зонды, использовавшиеся для детекции продуктов амплификации исследуемых и нормировочных генов, были помечены FAM. Реакции амплификации генов ставили в разных пробирках в двух повторах. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен "горячий старт", который обеспечивался использованием парафина. Оптимальную температуру отжига праймеров и зондов подбирали экспериментально с использованием режима «градиент температур», для всех тест-систем температура была унифицирована и составила 64°С.
Амплификацию осуществляли в режиме "реального времени" в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80°С 30 сек, 94°С 1 мин; 50 циклов - 94°С 10 сек, 64°С 20 сек, использовали приборы "ДТ-322" и "ДТ-964" производства фирмы ЗАО "НПФ ДНК-Технология". Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64°С. Дополнительный контроль прохождения реакции осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле.
2
Для проведения одной реакции ПЦР использовали 10 мкл 2,5Х реакционной смеси; 1 мкл MgCl (25 мМ) («Syntol», Россия), 7,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл прямого праймера (10 pmol), 1 мкл обратного праймера (10 pmol) («Syntol», Россия), 0,5 мкл праймера «проба», содержащего флуорофор «Tag man», 5 мкл образца кДНК. В работе использовали следующие праймеры:
Для р16 (INK4a) использовались праймеры:
Ко второму экзону:
Прямой: 5_-CCCTGGCTCTGACCATTCTG-3_·
Обратный: 5_-ACCACCAGCGTGTCCAGGAA-3
Для контрольного гена HPRT:
Прямой: 5'-GCGTTAACTCGGCGTTTCAT и
Обратный: 5'-GCGCTCAGGTCAAATTCAGAC.
Критический цикл и исходное количество копий кДНК определяли с помощью компьютерной программы «ДТ-96», поставляемой вместе с прибором. Статистический анализ проводился в программе Статистика 6.0. Для оценки относительного содержания мРНК р16 в образцах использовали анализ содержания мРНК референтного гена HPRT-1 в том же образце, характеризующемся низким и стабильным уровнем экспрессии мРНК в клетке. При отношении экспрессии мРНК р16 (INK4a) к мРНК HPRT-1 меньше 1 предполагалось, что экспрессия мРНК р16 (INK4a) в образце практически отсутствует, а при отношении больше 1 - о наличии экспрессии р16 (INK4a) в образце.
Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин Ст х (где х-конкретный ген), получаемых для каждого гена на приборе ПЦР «реального времени» после проведения ПЦР реакции. Определение уровня экспрессии мРНК р16 (INK4a) относительно мРНК HPRT-1 считали методом дельта-дельта Си-ти (ΔΔCt) (Ребриков Д.Н. и соавт.2009).
[p16] (INK4a)/[HPRT1]=Е-(Ct1-Ct2),
где
[p16] (INK4a)/[HPRT1] - нормированное по HPRT1 значение экспрессии р16 (INK4a), измеряется в относительных единицах, показывает, сколько копий мРНК р16 (INK4a) приходится на 1 копию HPRT1;
Е - эффективность амплификации, показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение матрицы, поэтому Е=2;
Ct1 - значение порогового цикла в образце для р16 (INK4a);
Ct2 - значение порогового цикла в образце для HPRT1.
Проанализировано 19 образцов соскобов шейки матки больных, из которых с гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком шейки матки (3 случая), cin3 (рак in situ) (6 случаев), cin2 (3 случая), cin 1 (5 случаев) и реактивные изменения (2 случая). Материал получен путем соскоба с шейки матки при комплексном гинекологическом обследовании.
В образцах был проведен анализ экспрессии мРНК гена р16 (INK4a). Было проведено также цитологическое исследование. Критерием достоверности цитологического и молекулярно-генетического методов явились результаты сопоставления с гистологическим исследованием биопсийного и/или операционного материала.
В таблице 1 представлены полученные данные по количественному анализу мРНК для 19 образцов соскобов шейки матки, а также данные цитологического и гистологического анализов.
Сопоставление результатов цитологического исследования и уровня экспрессии р16 (INK4a) показало, что при реактивных изменениях эпителия шейки матки уровень экспрессии был незначительным и составил 20 и 32 отн. ед.. Повышенная экспрессия мРНК гена р16 (INK4a) наблюдалось при наличии CIN1 - 59±8,81 отн. нд. (М ± SD, где М-среднее, SD -стандартное отклонение), CIN2 67±21.3 отн. ед. или CIN3 147,7±48 отн. ед. Максимальные значения относительного уровня экспрессии р16 (INK4a) были характерны для плоскоклеточного рака - 251,0±37,7 отн. ед.
Пример 1
Пациентке Д. 28 лет (образец 11) выполнено цитологическое исследование соскоба шейки матки. Цитологически в соскобе шейки матки диагностирован "CIN2". В материале соскоба соотношение между уровнем экспрессии мРНК р16 (INK4a) и уровнем экспрессии мРНК HPRT-1 составило 93 отн.ед. - установлен диагноз CIN3 (рак in situ), который был подтвержден при гистологическом исследовании.
Пример 2
Пациентке Л. 43 лет (образец 17) при цитологическом исследовании диагностирован "CIN3(рак in situ)". В материале соскоба соотношение между уровнем экспрессии мРНК р16 (INK4a) и уровнем экспрессии мРНК HPRT-1 составило 201 отн.ед. - установлен диагноз плоскоклеточный рак, подтвержденный при гистологическом исследовании.