Характеристика иммунного статуса крыс при витаминно-минеральной недостаточности

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ

Для корреспонденции

Требух Марина Дмитриевна - аспирант, лаборант-исследователь лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-64 E-mail: trebukh@ion.ru

Требух М.Д., Садыкова Э.О., Голомидова А.К., Ригер Н.А., Тимонин А.Н., Мустафина О.К., Тышко Н.В.

Характеристика иммунного статуса крыс при витаминно-минеральной недостаточности

Characteristic of the rats' immune status during vitamin and mineral deficiency

Trebukh M.D., Sadykova E.O., Golomidova A.K., Riger N.A., Timonin A.N., Mustafina O.K., Tyshko N.V.

ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety,

Moscow

В статье представлены результаты исследования иммунного статуса крыс в условиях различных уровней обеспеченности витаминами группы В (В1, В2, В3, В6) и минеральными веществами (¥е3+ и Mg2+). Самцы крыс линии Вистар (с исходной массой тела 90-110 г) в течение 65 дней получали модельные рационы с 75, 30 и 19% содержанием этих эссенциальных веществ, самки (с исходной массой тела 56 -76 г) - рационы с 75, 28 и 18% содержанием. Были изучены некоторые показатели гуморального и клеточного звеньев иммунитета, включавшие подсчет лейкоцитарной формулы, измерение лизоцимной активности сыворотки крови, определение содержания иммуноглобулинов ^С, %Е, анализ цитокинового профиля сыворотки крови, а также определение массы органов иммунной системы. Показано, что снижение содержания витаминов группы В, железа и магния в рационе не вызывает комплексных изменений иммунного статуса крыс, поэтому предложенная модель изменения адаптационного потенциала не является оптимальной для изучения состояния системы иммунитета. Проведенные масштабные исследования иммунного статуса крыс (изучено 18 показателей, выборка из 90 самцов и 90 самок) позволяют установить диапазон физиологических колебаний этих показателей у крыс линии Вистар соответствующего пола и возраста.

Ключевые слова: крысы, иммунный статус, адаптационный потенциал, вита-минно-минеральный состав рационов, гуморальный и клеточный иммунитет

The article presents the results of rats' immune status evaluation in conditions of different levels of B vitamins (B1, B2, B3, B6) and minerals (Fe3+ andMg2+) supplying. Male Wistar rats (with initial body weight 90-110 g) within 65 days received model diets with 75, 30 and 19% content of the essential substances, females (with initial body weight 56-76 g) received diets with 75, 28 and 18% content. Some indicators of humoral and cellular

Для цитирования: Требух М.Д., Садыкова Э.О., Голомидова А.К., Ригер НА., Тимонин АН., Мустафина ОК., Тышко Н.В. Характеристика иммунного статуса крыс при витаминно-минеральной недостаточности // Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 6. С. 36-41. Статья поступила в редакцию 24.07.2017. Принята в печать 07.11.2017.

For citation: Trebukh MD., Sadykova E.O., Golomidova A.K., Riger N.A., Timonin A.N., Mustafina O.K., Tyshko N.V. Characteristic of the rats' immune status during vitamin and mineral deficiency. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (6): 36-41. (in Russian) Received 24.07.2017. Accepted for publication 07.11.2017.

immunity, including leukocyte count, lysozyme serum activity, IgG and IgE level, cytokine profile of blood serum and of the masses of the immune system internal organs have been examined. It has been shown that the decrease in the content of B vitamins, iron and magnesium in the diet didn't cause complex changes of the rats' immune status, therefore, the proposed model of adaptive potential change is not optimal for studying of immune system condtion. The extensive research of the immune status of rats (18 studied indicators, a sample of 90 males and 90 females) allows to set the range of physiological fluctuations of these indexes in Wistar rats of the corresponding gender and age. Keywords: rats, immune status, adaptive potential, vitamin-mineral ration composition, humoral and cellular immunity

Авторы статьи разработали модификацию вита-минно-минерального состава рациона крыс, которая может быть использована в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсикологических исследованиях при изучении объектов с неизвестной токсичностью, в частности новых видов пищевой продукции [1]. Принимая во внимание, что иммунный статус является одной из составляющих адаптационного потенциала организма, были проведены исследования некоторых показателей гуморального и клеточного иммунитета у крыс линии Вистар, получавших модельные рационы с разными уровнями обеспеченности витаминами группы В (тиамином, рибофлавином, ниа-цином и пиридоксином), солями железа и магния. Следует отметить, что различные модификации моделей витаминной недостаточности были использованы в экспериментах по оценке безопасности наноматери-алов [2], по выявлению наиболее чувствительных показателей репродуктивной функции крыс [3] и др. [4-6]. Однако разработанная нами модель в значительной степени отличалась от ранее использованных, поэтому потребовалось проведение дополнительных исследований, направленных на изучение возможности данной модели при исследовании иммунного статуса крыс.

Цель настоящей работы - оценка иммунного статуса самцов и самок крыс в условиях оптимальной, маргинальной и субмаргинальной обеспеченности витаминами (В1, В2, В3, В6) и минеральными веществами (Fe3+ и Mg2+).

Материал и методы

Эксперимент длительностью 65 дней проводили на крысах линии Вистар с исходной массой тела самцов 90-110 г и самок - 56-76 г возраст крыс в начале эксперимента составлял 30 дней. Самцы и самки были разделены на 3 группы (по 30 самцов и 30 самок в каждой группе). Всего в эксперименте было использовано 180 животных. Крысы получали полусинтетический казеиновый рацион с оптимальной (75%) дозировкой эс-сенциальных веществ (витаминов В1, В2, В3, В6 и минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+), с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозировками эссенци-

альных веществ (табл. 1). Экспериментальные рационы животные получали на протяжении всего срока исследований.

Крыс содержали в пластиковых клетках (по 2 особи в клетке) с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим 21-23 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. В течение экспериментов вели наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, постмортальную некропсию, взвешивание внутренних органов и отбор материала для гематологических и иммунологических исследований проводили на 65-й день эксперимента. Эвтаназию проводили в соответствии с Правилами лабораторной практики, утвержденными приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 193н. За 12 ч до эвтаназии животных лишали пищи.

Оценка иммунного статуса включала подсчет лейкоцитарной формулы, измерение лизоцимной активности сыворотки крови, определение содержания иммуноглобулинов IgG, IgE, анализ цитокинового профиля сыворотки крови, а также определение массы органов иммунной системы (селезенки и тимуса).

Подсчет лейкоцитарной формулы выполнен с использованием гематологического анализатора «Coulter А^Ттм 5 diff OV» («Beckman Coulter», США). Содержание иммуноглобулинов IgG, IgE определяли методом иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного ридера «Anthos 2020» и стандартных иммуноферментных наборов (Rat IgG, кат. № E-EL-RO518; Rat IgE, кат. № E-EL-RO517, «Elabscience Biotechnology Co.Ltd», Китай). Лизоцимную активность сыворотки крови определяли нефелометрическим методом по О.В. Бухарину, 1971 [7], основанным на изменении оптической плотности среды в результате способности лизоцима сыворотки крови лизировать тест-культуру Micrococcus lysodeikticus. Цитокиновый профиль крыс определяли с помощью наборов (Bio-Plex ProTM Rat Cytokine Th1/Th2 Assay, кат. 171-K1002M, «Bio-Rad», США). Исследования проведены на мультиплексном проточном анализаторе Luminex 200 («Luminex Corporation», США).

Статистическую обработку проводили с использованием пакета прикладных программ MS Excel 2007. Характер распределения количественных признаков определяли с помощью х2-критерия, равенство дисперсий -

с помощью Р-критерия. Оценку статистической значимости различий средних величин проводили методом однофакторного дисперсионного анализа. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05 [8].

Результаты и обсуждение

На протяжении эксперимента не отмечено гибели крыс, общее состояние животных было удовлетворительным. По внешнему виду, качеству шерстного покрова и поведению крысы 3 групп не различались между собой. Еженедельный прирост массы тела самцов и самок, получавших рационы с оптимальным содержанием эссенциальных веществ (группа «75»), был несколько выше, чем у крыс маргинальной группы (группа «30» для самцов и «28» для самок), в конце эксперимента на 4% у самцов и на 1% у самок (р>0,05), у субмаргинальной группы (группа «19» для самцов и «18» для самок) -на 18% у самцов и 10% у самок (р<0,05) (см. рисунок).

Таблица 1. Модификация витаминно-минерального состава рационов

На этапе постмортальной некропсии были выделены и взвешены внутренние органы, в данной статье приведены массы органов иммунной системы - тимуса и селезенки (табл. 2). Относительная масса тимуса у крыс субмаргинальной и маргинальной групп была несколько ниже, чем у крыс оптимальной группы: на 14 (р<0,05) и 8% (р>0,05) у самцов; на 8 и 2% (р>0,05) у самок соответственно. Относительная масса селезенки у самцов субмаргинальной и маргинальной групп была на 11 (р>0,05) и 15% (р<0,05) ниже, чем у самцов оптимальной группы, тогда как у самок колебания массы селезенки не превышали 2% (р>0,05) между группами, и самая высокая масса была отмечена у животных маргинальной группы. Анализ полученных данных позволил выявить определенную тенденцию к снижению относительной массы тимуса в зависимости от снижения обеспеченности эссенциальными веществами, в большей степени это проявлялось на примере массы тимуса у самцов, в меньшей - у самок. Масса селезенки самцов в группах, получавших маргинальные и субмаргинальные дозы витаминов и мине-

Компонент Группы, % от обеспеченности некоторыми эссенциальными веществами относительно стандартного ПКР*, [1]

оптимальная 75% (для самцов и самок) маргинальная субмаргинальная

30%

Витамины, г/кг витаминной смеси

Тиамин (В!) 3 1,2 1,12 0,76 0,72

Рибофлавин (В2) 2,25 0,9 0,84 0,57 0,54

Ниацин (В3) 11,3 4,5 4,2 2,85 2,7

Пиридоксин (В6) 3,75 1,5 1,4 0,95 0,9

Минеральные вещества, г/кг солевой смеси

Магния окись 18 7,2 6,72 4,56 4,32

Железо лимоннокислое 4,545 1,818 1,6968 1,1514 1,0908

* - ПКР - полусинтетический казеиновый рацион.

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

опп

0-й 7-й 14-й 28-й 35-й 42-й 49-й 56-й 63-й 70-й Дни эксперимента

0-й 7-й 14-й 28-й 35-й 42-й 49-й 56-й 63-й 70-й Дни эксперимента

-о-19% 30% Динамика массы тела самцов

75%

18%

28% 75%

А

Б

Таблица 2. Относительные массы некоторых органов иммунной системы крыс, г/100 г (М±т)1

Орган Самцы Самки

19% 30% 75% 18% 28% 75%

Тимус 0,164±0,006* 0,174±0,007 0,190±0,008 0,190±0,007 0,204±0,007 0,207±0,009

Селезенка 0,392±0,015 0,374±0,016* 0,439±0,019 0,448±0,015 0,466±0,015 0,458±0,017

П р и м е ч а н и е.-1 - здесь и в табл. 3-6 представлены средние данные от п=30; * - здесь и в табл. 3-6 отличия от показателя животных оптимальной группы статистически значимы (р<0,05).

Таблица 3. Лейкоцитарный профиль крыс

Показатель Самцы Самки Норма по данным ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» [9] Норма по [10-12]

19% 30% 75% 18% 28% 75%

Лейкоциты, 109/л 10,57±0,69 10,27±0,64 11,79±0,96 11,65±0,92 9,76±0,52 11,41 ±0,74 4,30-26,70 1,4-34,3

Базофилы, % 0,585±0,089 0,568±0,050 0,514±0,050 0,655±0,089 0,813±0,070 0,852±0,118 0,10-0,70 0-1

Эозинофилы, % 2,00±0,16 2,08±0,14 1,96±0,16 2,97±0,33 3,01 ±0,29 2,78±0,29 1,00-6,10 0,0-5,5

Нейтрофилы, % 25,84±1,84 26,71±1,31 25,99±1,16 24,24±1,44 23,62±1,23 22,70±1,07 13,00-34,00 0,4-53,8

Лимфоциты, % 61,34±1,64 59,24±1,99 60,33±1,42 65,10±1,53 65,31 ±1,54 63,70±1,62 55,00-77,70 42,3-98,0

Моноциты, % 8,73±0,69 9,43±0,70 10,02±0,54 7,06±0,48* 7,22±0,49* 9,20±0,56 4,80-18,00 0,0-7,9

Таблица 4. Лизоцимная активность сыворотки крови

Показатель Самцы Самки

19% 30% 75% 18% 28% 75%

ЛАСК, % 38,2±0,6 38,6±0,6 37,7±0,7 26,8±2,5* 16,4±1,7 15,3±1,7

Таблица 5. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови (М±т), нг/мл

Показатель Самцы Самки

19% 30% 75% 18% 28% 75%

IgG

IgE

ральных веществ, также демонстрировала снижение, однако взаимосвязи с дозами не прослеживалось и значение этого показателя в группе с субмаргинальной обеспеченностью было выше, чем в группе с маргинальной обеспеченностью.

Лейкоцитарный профиль самцов и самок всех групп не демонстрировал значимых различий, которые можно было бы связать с составом рационов (табл. 3). Тем не менее отмечено снижение содержания моноцитов: у самок субмаргинальной и маргинальной групп -на 23 и 22% (р<0,05) по сравнению с уровнем у крыс оптимальной группы; у самцов соответственно на 13 и 6% (р>0,05). Вместе с тем все показатели лейкоцитарной формулы не выходили за пределы физиологических колебаний, характерных для крыс [9-12].

Лизоцимная активность сыворотки крови (табл. 4) у самцов 3 групп не имела существенных различий, зна-

чения колебались в сравнительно узком диапазоне от 32 до 50%. У самок аналогичный показатель характеризовался более высокой вариабельностью значений в диапазоне от 1 до 60%, отмечено повышение показателя у самок субмаргинальной и маргинальной групп по сравнению с оптимальной группой на 75 (p<0,05) и 7% (p>0,05) соответственно.

Концентрация иммуноглобулинов у крыс всех групп не имела статистически значимых различий и не демонстрировала очевидной зависимости от состава рационов (табл. 5). Содержание IgG у самцов варьировало в диапазоне 0,661-5,763 нг/мл, у самок - в диапазоне 0,489-8,688 нг/мл; содержание IgE у самцов - в диапазоне 35,3-296,6 нг/мл, у самок 106,8-293,8 нг/мл. Следует отметить, что у самцов диапазон колебаний уровня IgE был несколько выше, чем у самок, а диапазон колебаний IgG, напротив, ниже чем у самок. Сравнитель-

Показатель Самцы Самки

19% 30% 75% 18% 28% 75%

ИЛ-1а

ИЛ-1 р

ИЛ-2

ИЛ-4

ИЛ-5

Таблица 6. Уровень интерлейкинов (ИЛ) в сыворотке крови (М+m), пг/мл

ная оценка содержания иммуноглобулинов у самцов и самок выявила половые различия, что подтверждается результатами исследований [13], на основании которых были сделаны выводы о том, что половые различия иммунной системы определяются кариотипом и влиянием стероидных половых гормонов: эстрогенов, прогестинов и андрогенов.

Определение уровня интерлейкинов (ИЛ) не выявило статистически достоверных различий между группами, получавшими рационы с разными уровнями обеспеченности эссенциальными микронутриентами (табл. 6). Вместе с тем выявлены определенные половые различия, более выраженные у самок и самцов, получавших оптимальные рационы (в среднем у самцов в 10 раз выше содержание ИЛ-1а, ИЛ-2 и ИЛ-4), тогда как у крыс с маргинальными и субмаргинальными уровнями обеспеченности половые различия были менее значительными (в 2-2,5 раза выше у самцов, чем у самок).

Таким образом, не выявлено комплексных изменений иммунного статуса крыс в зависимости от уровня обес-

Сведения об авторах

печенности эссенциальными веществами, все отмеченные различия не являлись бесспорным свидетельством взаимосвязи содержания витаминов группы В - тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина (В3), пиридоксина (В6) и дефицита минеральных веществ - железа ^е3+) и магния (Мд2+) в рационе. Предложенная модель изменения адаптационного потенциала не является оптимальной для изучения иммунного статуса. Вместе с тем проведенные масштабные исследования иммунного статуса крыс (изучено 18 показателей, выборка из 90 самцов и 90 самок) позволяют с определенной долей условности установить диапазон физиологических колебаний этих показателей у крыс линии Вистар соответствующего пола и возраста. Поскольку уровень ИЛ у крыс на таком объеме выборки был изучен впервые, полученные данные, вне всяких сомнений, уникальныи будут в дальнейшем использованы в экспериментальных исследованиях.

Исследование проведено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00124).

ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):

Требух Марина Дмитриевна - аспирант, лаборант-исследователь лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: trebukh@ion.ru

Садыкова Эльвира Олеговна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: seo@ion.ru

Голомидова Алла Константиновна - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: alla_golomidova@mail.ru

Ригер Николай Александрович - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии E-mail: riger@ion.ru

Тимонин Андрей Николаевич - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории иммунологии E-mail: andrey8407@mail.ru

Мустафина Оксана Константиновна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории

иммунологии

E-mail: mustafina@ion.ru

Тышко Надежда Валерьевна - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: tnv@ion.ru

Литература

1. Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин А.Н., Шестакова С.И., Требух М.Д., Пашорина В.А. Модификация витаминно-минераль-ного состава рационов как модель снижения адаптационного 7. потенциала крыс для токсикологических исследований // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. C. 64-71.

2. Гмошинский И.В., Вржесинская О.А., Шумакова А.А., Шипелин

B.А., Коденцова В.М., Хотимченко С.А. Воздействие наноразмер- 8. ного диоксида кремния аморфного на усвояемость витаминов

В1, В2 и В6 у крыс // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 72-79.

3. Тышко Н.В., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Пашорина В.А., 9. Жминченко В.М. Оценка репродуктивной функции крыс

при раздельном и сочетанном воздействии алиментарного и токсического факторов // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 1.

C. 33-43.

4. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. 10. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигипови- 11. таминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10.

С. 439-442. 12.

5. Коденцова В.М. Витамины. М. : МИА, 2015. 408 с.

6. Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В. и др. Вли- 13. яние поливитаминной недостаточности на активность фермен-

тов метаболизма ксенобиотиков в печени крыс // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 2. С. 28-33.

Бухарин О. В. Применение таблицы для определения количества лизоцима в сыворотке крови // Материалы межкафедр. совещ. «Вопросы неспецифического иммунитета». Оренбург, 1971. С. 162-163.

Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. М. : Медиа Сфера, 2006. 312 с.

Мустафина О.К., Трушина Э.Н., Шумакова А.А., Арианова Е.А., Тышко Н.В., Пашорина В.А. Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе // Вопр. питания. 2013. № 2. С. 10-16.

Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam : Elsevier, North-Holland Biochemical, 1981. 358 p. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington : Elsevier Academic Press, 2006. 912 p. Tucker M.J. Diseases of the Wistar Rat. London : Taylor and Francis, 1997. 272 p.

Klein S. L., Roberts C. W. Sex Hormones and Immunity to Infection. Berlin, Heidelberg : Springer, 2010. 329 p.

References

5.

6.

Tyshko N.V., Sadykova E.O., Timonin A.N., Shestakova S.I., Trebukh M.D., Pashorina V.A. Modification of vitamin-mineral diet composition as a model of adaptive potential reducing in laboratory animals. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85

Gmoshinsky I.V., Vrzhesinskaya O.A., Shumakova A.A., Shipelin V.A., Kodentsova V.M., Khotimchenko S.A. Influence of nanosized amorphous silica on assimilation of vitamins B1, B2 and B6 in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85

Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Beketova N.A., Soto S.H., et al. Biochemistry of blood plasma and some parameters of antioxidant status in rats with polyhypovitaminosis of varying severity. Byul-leten' eksperimental'noi biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2012; 10: 439-42. (in Russian) Kodentsova V.M. Vitamins. Moscow: MIA, 2015: 408 p (in Russian) Kravchenko L.V., Aksenov I.V., Trusov N.V., Guseva G.V., et al. The effect of multivitamin deficiency in the activity of enzymes metabo-

10.

12.

13.

lism of xenobiotics in rat liver. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2012; 81

Buharin O.V. Applying a table to determine the amount of lysozyme in serum. In: Materialy mezhkafedr. soveshh. «Voprosy nespeci-ficheskogo immuniteta» [Materials of interdepartmental meeting «Questions of Nonspecific Immunity»]. Orenburg, 1971: 162-3.

Rebrova O.Yu. Statistical analysis of medical data. Application of software package Statistica. Moscow: Media Sfera, 2006: 312 p.

Mustafina O.K., Trushina EH.N., Shumakova A.A., Arianova E.A., Tyshko N.V., Pashorina V.A. Hematologic indices in different age Wistar rats, receiving a balanced semi-synthetic vivary diet. Voprosy pitaniia. [Problems of Nutrition] 2013; (2): 10-6. (in Russian) Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam: Elsevier, North-Holland Biochemical, 1981: 358 p. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The laboratory rat. Burlington: Elsevier Academic Press, 2006: 912 p. Tucker M.J. Diseases of the Wistar rat. London: Taylor and Francis, 1997: 272 p.

Klein S. L., Roberts C. W. Sex hormones and immunity to infection. Berlin, Heidelberg: Springer, 2010: 329 p.

1.

7.

2

8

3

9

4