Способ получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов
METHOD FOR PRODUCTION OF TETRAETHYL-4(OR 5)-RHODAMINEISOTHIOCYANATES

Предлагаемое изобретение относится к органической химии, к классу ксантеновых красителей и непосредственно касается группы алкилродаминов, применяемых в аналитической химии, биотехнологии флуоресцентной микроскопии для приготовления люминесцирующих сывороток и в медицине в качестве флуоресцентных метчиков белка для быстрой диагностики вирусных инфекций.
Известно, что в медицине для быстрой диагностики вирусных инфекций применяется иммунофлуоресцентное окрашивание, которое основано на взаимодействии антигена с антителами, мечеными флуорохромом, находящимся в клетках и тканях.
Аминородамины являются исходным сырьем для получения флуоресцентных метчиков белка, таких как тетраметилродаминизотилцианат (ТМРИТЦ), тетраэтилродаминизотиоцианат (РИТЦ), применяемых для получения люминесцирующих антител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., Руководство по иммуногисстохимической диагностике опухолей человека, Казань, 2004, 456 с; Coons A.N., Creech N.I., Jonts R.N. Immunoljgical properties of antibody, containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp.Biol. Med., 1941-vol. 77, p.200-202].
К данному классу соединений относится и тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианат (РИТЦ), имеющий следующую структурную формулу:
Получение данного соединения обработкой тетраэтиламинородамина тиофосгеном в среде ацетона описано ранее (Скляр Ю.Е., Афанасьева А.В., Михайлов Г.И Методы получения химических реактивов и препаратов, вып.22, стр. 167. М., 1970 г.; Riggs, J.L., et al. "Isothiocyanate compounds as fluorescent labeling agents for immune serum." The American journal of pathology 34.6 (1958): 1081].
Процесс синтеза в цитированных выше методах получения химических реактивов и препаратов описан детально и включает следующие стадии: к нагретой до 40°С смеси 6,86 г (0,015 моль) тетраэтиламинородамина и 350 мл ацетона прибавляют раствор 7,55 г (0,067 моль) тиофосгена в 50 мл ацетона, реакционную массу перемешивают при 40°С 4 часа, растворитель отгоняют, к остатку приливают 50 мл хлороформа и вновь отгоняют растворитель. Операцию повторяют трижды, после чего остаток растворяют в 50 мл хлороформа и выливают его в 600 мл петролейного эфира, а выпавший осадок отфильтровывают и сушат. Получают 5-6 г тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианата, что составляет 62-70% от теоретического количества. Коэффициент экстинции  измеренный в этиловом спирте, равняется 49400. Однако описанный метод имеет два существенных недостатка. Во-первых, получаемый данным способом тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианат содержит значительное количество примеси 2-(2-окси-4-диэтиламинобензоил)-4(5)-изотиоцианобензойной кислоты. Это препятствует применению конечного продукта в флуоресцентной микроскопии, поскольку данное соединение способно соединяться с аминогруппой белка, что приводит к некорректным результатам. И во-вторых, при осуществлении известного способа используется токсичный тиофосген, что отрицательно сказывается на возможность промышленного осуществления данного метода синтеза.
Для получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов технологичным способом, обеспечивающим высокий выход и необходимую чистоту конечного продукта, соответствующую требованиям, предъявляемым к реагентам для флуоресцентной микроскопии, и исключающим использование токсичных реагентов предлагается способ получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов взаимодействием тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов с серосодержащим соединением и последующим выделением целевого продукта.
Сущность способа получения тетраэтил-4(или5)-родамин-изотиоцианатов взаимодействием тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов с серосодержащим соединением и последующим выделением целевого продукта заключается в том, что в качестве серосодержащего соединения используется сероуглерод, а исходный тетраэтиламинородамин первоначально подвергается аммиачной обработке водным раствором аммиака, насыщенным газообразным аммиаком при мольном содержании аммиака, равном 0,040-0,050 моль на 0,040 моль тетраэтиламинородамина, проводимой при температуре 0-4°С и до установления рН 9-10, после чего осуществляют обработку реакционной массы сероуглеродом из расчета мольного соотношении тетраэтиламинородамина к сероуглероду, равного 0,040:0,063-0,076, затем выдерживают полученную реакционную массу при температуре 0-4°С в течение 1,5-2,5 часов и вводят ее в одномолярный водный раствор соли тяжелого металла, выбранного из группы: железо, медь, свинец, и образовавшийся осадок соответствующей соли тяжелого металла подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1, после чего осуществляют фильтрацию, сушку, экстракцию ацетоном, затем хлороформом, пропускание через слой силикагеля и упаривание.
Оптимально в качестве солей тяжелых металлов используют соединения, выбранные из группы: хлорид железа, сульфат меди, нитрат свинца.
При получении тетраэтил-4-родамин-изотиоцианата в качестве исходного соединения используется тетраэтил-4-аминородамин.
При получении тетраэтил-5-родамин-изотиоцианата в качестве исходного соединения используется тетраэтил-5-аминородамин.
При получении смеси тетраэтил-4 (или 5)-родаминизотиоцианатов в качестве исходного соединения используется смесь тетраэтил-4(или 5)-аминородаминов.
В основе предлагаемого способа получения тетраэтилродаминизотиоцианата лежит известная реакция взаимодействия тетраэтиламинородамина с серосодержащим соединением, но в котором в качестве серосодержащего соединения вместо тиофосгена используется сероуглерод. Ниже приводится механизм и схема синтеза тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов предлагаемым способом:
Согласно приведенной схеме, тетраэтиламинородамин реагирует с сероуглеродом в присутствии аммиака с образованием аммонийной соли родаминдитиокарбаминовой кислоты, которая под действием соли тяжелого металла превращается тетраэтилродамин изотиоцианат.
Существенными признаками данного способа являются количественные соотношения реагентов (мольное соотношение тетраэтиламинородамина к сероуглероду, равное 0,040:0,063-0,076), а также временные и температурные режимы (выдерживание реакционной массы при температуре 0-4°С в течение 1,5-2,5 часов), а также последовательность стадий обработки и выделения конечного продукта.
В результате предлагаемого способа получается тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианат более высокого качества, чем по известной методике. Получаемые продукты не содержат примеси, мешающие в дальнейшем применению при приготовлении люминесцирующих сывороток и обеспечивают получение чистых сывороток. Предлагаемый процесс технологичен и более безопасен ввиду исключения из синтеза токсичного тиофосгена.
В результате предлагаемого способа получаются либо отдельные изомеры: тетраэтил-4-родаминизотиоцианат (РИТЦ-4), тетраэтил-5-родаминизотиоцианат (РИТЦ-5), либо смесь изомеров тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов.
Качество данных продуктов подтверждено следующими показателями (коэффициентом экстинции  измеренным в этиловом спирте и в диметилформамиде, и связываемостью с белком):
Тетраэтил-4-родаминизотиоцианат - (РИТЦ-4):
Коэффициент экстинции  в диметилформамиде,  в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.
Тетраэтил-5-родаминизотиоцианат-(РИТЦ-5):
Коэффициент экстинции  в диметилформамиде,  в этиловом спирте. Связываемость с белком 90%.
Смесь изомеров тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов:
в диметилформамиде,  в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.
Кроме того, сам процесс получения тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов технологичен и более безопасен ввиду исключения из синтеза токсичного тиофосгена, как в прототипе и замена его на сероуглерод.
Ниже изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ получения тетраэтил-4-родаминизотиоцианата (РИТЦ-4): В колбу загружают 18,0 г (0,040 моль) тетраэтил-4-аминородамина и 100 мл водного аммиака, реакционную массу охлаждают до 0°С и пропускают 900 мл (0,68 г, 0,040 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 3,8 мл (4,8 г, 0,063 моль) сероуглерода и выдерживают реакционную смесь при температуре 0-4°С в течение двух часов. Реакционную массу выливают в 500 мл одномолярного водного раствора хлорного железа, содержащий 82 г хлорного железа в 500 мл воды, подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном (3 раза по 200 мл), к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 15 г тетраэтил-4-родаминизотиоцианата (72%). При  в диметилформамиде,  в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.
Пример 2. Способ получения смеси тетраэтил-4(или 5)-родаминизотиоцианатов.
В колбу загружают 18 г (0,040 моль) тетраэтил-4(или 5)-аминородамина и 100 мл водного аммиака. Реакционную массу охлаждают до 0°С и в течение 30 минут пропускают 1115 мл (0,85 г, 0,050 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 4,5 мл (5,6 г, 0,076 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С в течение 2,5 часов. Реакционную массу выливают при температуре 0-4°С в течение двух часов в 500 мл одномолярного водного раствора сульфата меди, содержащий, 80 г сульфата меди в 500 мл воды, подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 16 г тетраэтилродамин-4(или 5)-изотиоцианата. Выход 77,6%.
Пример 3. Способ получения тетраэтил-4-родаминизотиоцианата. В колбу загружают 18 г (0,040 моль) тетраэтил-4-аминородамина и 100 мл водного аммиака, охлаждают до 0°С и пропускают 1115 мл (0,85 г, 0,050 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 4,5 мл (5,6 г, 0,076 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С 1,5 часа. Реакционную массу выливают в 500 мл одномолярного раствора азотнокислого свинца (116 г азотнокислого свинца в 500 мл воды), подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 15,5 г тетраэтил-4-родаминизотиоцианата. Выход 75,2%. При  в диметилформамиде,  в этиловом спирте. Связываемость с белком 85%.
Пример 4. Способ получения тетраэтил-5-родаминизотиоцианата (РИТЦ-5). В колбу загружают 18 г (0,040 моль) тетраэтил-5-аминородамина и 100 мл водного аммиака. Охлаждают до 0°С и в течение 30 минут пропускают 1115 мл 0,85 г, 0,050 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 4,5 мл (5,6 г, 0,076 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С в течение 2,5 часов. Реакционную массу выливают в 500 мл (80 г сульфата меди в 500 мл воды), подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 14 г тетраэтил-5-родаминизотиоцианата. Выход 67,2%.
Пример 5. Способ получения тетраэтил-5-родаминизотиоцианата (РИТЦ-5). В колбу загружают 18,0 г (0,040 моль) тетраэтил-5-аминородамина и 100 мл водного аммиака. Охлаждают до 0°С и пропускают 900 мл (0,68 г, 0,040 моль) газообразного аммиака, затем прибавляют 3,8 мл (4,8 г, 0,063 моль) сероуглерода и выдерживают при температуре 0-4°С в течение двух часов. Реакционную массу выливают в 500 мл одномолярного водного раствора хлорного железа (82 г хлорного железа в 500 мл воды), подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и отфильтровывают выпавший осадок. Полученный осадок экстрагируют ацетоном 3 раза по 200 мл, к экстракту прибавляют 1200 мл хлороформа и пропускают раствор через слой силикагеля. Экстракт упаривают и получают 16,5 г тетраэтилродамин-5-изотиоцианата. Выход 80%. При  в диметилформамиде,  в этиловом спирте. Связываемость с белком 90%.