Неинвазивный метод изучения агрегационной активности тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов

Стандартизация процесса приготовления мазков крови привела не только к ускорению работы автоматической системы, но и к повышению производительности работы сотрудников лаборатории (табл. 4). Врач, работающий с установкой, после окончания формирования галереи изображений должен визуально проверить правильность распределения клеток по галереям и при необходимости в режиме ручной коррекции внести изменения. Низкое количество артефактов не отвлекает внимание сотрудника, утверждающего полученные результаты, от оценки морфологии лейкоцитов и уменьшает процент ручной коррекции полученных результатов. Это сократило время, затрачиваемое врачом на утверждение полученных результатов, почти в 3 раза (см. табл. 4).

Таким образом, предложенная стандартизация процедуры подготовки мазка крови повышает эффективность работы системы автоматического анализа крови Vision Hema.

Выводы. 1. При выполнении общего анализа крови качество приготовления мазка достоверно влияет на эффективность работы автоматических систем анализа крови.

2. Стандартизация процедуры приготовления мазков крови является важным фактором, повышающим эффективность их автоматического анализа. Она приводит к увеличению скорости работы системы за счет ускорения сбора галереи изображений и ускорения валидации полученных результатов анализа врачом.

3. Использование ЭДТА-стабилизованной венозной крови, штрих-кодированных одноразовых тщательно обезжиренных стекол и автоматизированного приготов-

ления мазков крови уменьшает количество артефактов в 5 раз и позволяет получать мазки крови с отсутствием агрегатов тромбоцитов и низким содержанием разрушенных лейкоцитов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. М.: Практика; 1999.

2. Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е., Долгов В. В. Лабораторная гематология. М.; Тверь: Триада-Х; 2006.

3. Медовый B. C., Парпара А. А., Пятницкий A. M., Соколинский Б. З., Демьянов В. Л. Обзор методик автоматизированной микроскопии биоматериалов. Клиническая лабораторная диагностика. 2006; 7: 15-20.

4. Меньшиков В. В. Клиническая лабораторная аналитика. Лабинформ-РАМЛД; 1999. 352 с.

5. Bacus J. W. The development of automated differential systems. In: Koepke J. A., ed. Differential leukocyte counting. Aspen: College of American Pathologist; 1977: 95-117.

6. Tatsumi N., Pierre R. V. Automated image processing. Past, present and future of blood cell morphometry identification. Clin. Lab. Med. 2002; 22: 299-315.

7. Angulo J., Flandrin G. Automated detection of working area of peripheral blood smears using mathematical morphology. Anal. Cell. Pathol. 2003; 25: 37-49.

8. Swolin В., Simonson P., Backman S., Lofqvist I., Bredin I., Johnsson M. Differential counting of blood leukocytes using automated microscopy and a decision support system based on artificial neural networks - evaluation of DiffMaster T M Octavia. Clin. Lab. Haematol. 2003; 25: 139-47.

Поступила 10.10.12

коагулология

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.111/.112.117.083

Б. И. Кузник1, И. А. Файн2, A. B. Каминский2, О. Г. максимова1, E. M. Кустовская1, Ю. В. Богданова1, Н. Г. Жданович1, О. С. Роднина1, Н. В. хасанова1

неинвазивный метод изучения агрегационной активности тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов

1ГБОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия; 2ELFI-TECH LTD, Rehovot, Israel

Предложен неинвазивный метод исследования агрегационной активности тромбоцитов и образования лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов, а также некоторых показателей системы гемостаза, основанный на спекл-анализе характера рассеяния когерентного света с поверхности движущихся в искусственно изолированном отрезке сосуда эритроцитов. Получены высокие корреляционные отношения между индексом рассеяния света и спонтанной, АДФ-, адреналин- и коллагениндуцированной агрегацией тромбоцитов, образованием лейкоцитарно-эритроцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных агрегатов. Установленные факты позволяют считать, что с помощью неинвазивного метода исследования можно ориентировочно судить об агрегационной активности форменных элементов крови.

Ключевые слова: неинвазивный метод исследования гемостаза, агрегация тромбоцитов, лейкоцитарно-эритроцитарные и тромбоцитарно-эритроцитарные агрегаты

B.I. Kuznik, I.A. Faiyn, A.V. Kaminskiy, O.G. Maksimova, Ye.M. Kustovskaya, Yu.V. Bogdanova, N.G. Jdanovitch, O.S. Rodnina, N.V. Khasanova

THE NONINVASIVE TECHNIQUE OF ANALYSIS OF AGGREGATION ACTIVITY OF THROMBOCYTES, LEUKOCYTES AND ERYTHROCYTES

The article considers the noninvasive technique of analysis of aggregation activity of thrombocytes and formation of leukocytic-erythrocytic-thrombocytic aggregates and .some particular indicators of hemostasis system. The speckle-analysis of characteristics of coherent light dispersion from surface of erythrocytes moving in artificially isolated vessel section. The study established high correlation ratio between light dispersion index and spontaneous ADP-, adrenalin- and collagen-induced aggregation of thrombocytes, formation of leukocytic-erythrocytic and thrombocytic-erythrocytic aggregations. The established facts permits to consider that analysis noninvasive technique makes it possible to estimate approximately the aggregation activity of blood corpuscles.

Key words: noninvasive technique, analysis, hemostasis, aggregation of thrombocytes, leukocytic-erythrocytic and thrombocytic-erythrocytic aggregations

Исследование оптических неинвазивных методов для характеристики крови и тканей находит широкое применение в различных областях экспериментальной и клинической медицины. При этом в основном используются специфические свойства поглощения и рассеяния света тканью.

Израильская компания ELFI-TECH LTD ("Rehovot", Израиль) разработала и запатентовала методику, позволяющую при помощи оптической технологии, основанной на методах спекл-анализа, определять отдельные параметры, характеризующие процесс гемокоагуляции [4-9]. Этот способ базируется на комбинации окклюзи-онной спектроскопии и методики динамического рассеяния света (ДРС). Последняя связана с определением размеров дисперсных частиц, находящихся во взвесях, и оценки их вязкости. В случае мутных сред принято говорить об анализе интерференционных спеклов. В соответствии с ДРС хаотическое броуновское движение дисперсных частиц (в нашем случае эритроцитов) приводит к локальным оптическим флюктуациям. При прохождении лазерного луча через такую среду часть света будет рассеяна на этих движущихся с хаотически меняющейся скоростью эритроцитах. Соответствующие пространственные и временные изменения оптического сигнала отражают процесс диффузионного перемещения эритроцитов в суспензии. Напомним, что в случае броуновского движения скорость диффузии частиц обратно пропорциональна их размеру (гидродинамический диаметр) и вязкости окружающей среды.

Известно, что сигнал ДРС применяется как оптический метод для измерения подвижности рассеивающих частиц в суспензии. В классической методике ДРС измеряется временем затухания автокорреляционной функции. При использовании методики ДРС с целью измерения подвижности эритроцитов in vivo учитывается тот факт, что качественное описание автокорреляционной функции затруднено из-за ограниченного времени измерения и двигательных помех. Вот почему с этой целью используется более грубая, но устойчивая интегральная характеристика Фурье-спектра сигнала S. Эта величина служит показателем, отражающим движение эритроцитов.

Как было установлено ранее [8, 10], величина сигнала s линейным образом связана с логарифмическим

Для корреспонденции:

Кузник Борис Ильич, д-р мед. наук, засл. деятель науки РФ, проф.

каф. нормальной физиологии

Адрес: 672000, Чита, почтамт, а/я 187

Телефон: 8(3022)35-31-33

E-mail: bi_kuznik@mail.ru

показателем возраста людей. Следовательно, логарифм возраста коррелирует с предлагаемым нами коэффициентом SKF (по фамилии авторов - Shenkman, Kuznik, Fine), равным а • S + в, где методом наименьших квадратов определяются величины а и в, дающие минимальную ошибку между логарифмом возраста и коэффициентом SKF. Показатели а и в фиксируются после калибровки; таким образом, коэффициент SKF - это прямая и однозначная функция величины сигнала S, являющейся неким биологическим эквивалентом подвижности эритроцитов, выраженным в логарифмических единицах возраста. В то же время коэффициент SKF более удобен для использования, чем s, поскольку ему можно приписать вполне определенный биологический смысл. В наших исследованиях коэффициент SKF отражает подвижность эритроцитов в искусственно замкнутом отрезке сосуда.

Задача наших исследований заключалась в том, чтобы установить, в какой степени коэффициент SKF зависит от агрегационных свойств тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов.

Измерительная система. Измерительный прибор включает управляющее устройство с компьютером и сенсор, состоящий из оптико-электронного устройства и пневматической подушки в виде кольца. Оптико-электронное устройство включает полупроводниковый лазер (850 нм), детектор и предусилитель сигнала. Измеренный сигнал передается на усилительный комплекс, в результате чего происходит аналого-цифровое преобразование, сохраняющееся в памяти компьютера для дальнейшей обработки. Пневматическая система предназначена для остановки кровотока в области измерения. Уровень давления в системе контролируется управляющим устройством через компьютер.

Материалы и методы. Наблюдения проведены на 40 здоровых и 125 больных детях разного возраста (от момента рождения до 18 лет). Среди детей, страдающих различными заболеваниями, 60 имели врожденные пороки сердца (у 30 из них диагностирован острый инфекционный эндокардит), у 20 зарегистрирован острый лимфобластный лейкоз и у 35 - острая пневмония.

Кроме того, исследованию подверглись 188 больных сахарным диабетом (СД) 1-го и 2-го типов (77 мужчин и 111 женщин в возрасте от 18 до 73 лет), а также 61 больной с стабильной и 20 - с нестабильной стенокардией (61 мужчина и 20 женщин в возрасте от 29 до 70 лет).

Основной целью исследования явилось решение вопроса, можно ли с помощью описанной методики не-инвазивным способом определить содержание в крови тромбоцитов, их агрегационную функцию, а также способность лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов взаимодействовать между собой, образуя агрегаты. Иными

словами, необходимо было установить, в какой степени в качестве ориентировочных тестов неинвазивный способ исследования системы гемостаза может заменить аналогичные лабораторные инвазивные методы.

Исследование гемограммы проводили с помощью гематологического анализатора АВХ Micros 60 ОТ 8. Все используемые методы изучения свертывающей системы крови вошли в современное руководство по исследованию системы гемостаза [1] и не нуждаются в детальном описании.

Определяли общее количество тромбоцитов (камерным методом и на гемоанализаторе), а также спонтанную агрегацию тромбоцитов и агрегацию, вызываемую АДФ (10 мкг/мл), адреналином (10 мг/мл) и коллагеном (10 мл/мл), по среднему размеру радиуса агрегатов на агрегометре "Биола" в относительных единицах (отн. ед.) [1]. Одновременно определяли количество лейкоцитов и эритроцитов и по методу Д. И. Бельченко и др. [2, 3] в мазке крови оценивали число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов (ЛЭА) и тромбоцитарно-эритроцитарных агрегатов (ТЭА).

У всех испытуемых с помощью прибора ELFI-3 параллельно были проведены измерения оптического спекл-сигнала отраженного света, которые сводятся к следующим действиям. Больной может находиться в положении сидя или лежа. Сенсор прикрепляют к основанию среднего или указательного пальца. Оператор активирует начало измерения через компьютер и на пневматическое кольцо подает давление 280 мм рт. ст. В течение 0,1 с происходит сдавление сосудов в месте измерения и оптическая система начинает освещать пережатый участок пальца. Измеренный сигнал сохраняется в памяти компьютера для дальнейшей обработки. По истечении 25 с давление сбрасывают до нуля. Через 15 с после перерыва выполняют повторное измерение. Всего производят 5 последовательных определений.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью специальной программы, реализующей быстрое преобразование Фурье полученного сигнала таким образом, что конечный результат измерения превращается в вектор S (f - частота, t - время), описывающий изменение спектра плотности измеренного сигнала ДРС как функцию времени. При этом векторы измерений для всех больных сведены в единую матрицу.

Для вычисления оптического эквивалента того или иного исследуемого параметра системы гемостаза была использована модель множественной линейной регрессии, в которой предполагалось, что зависимая переменная (например, ЛТА), является линейной функцией независимых переменных из вектора измерения S (f, t).

Для обработки данных используют специальную программу, с помощью которой вычисляют оптический эквивалент для каждого из измеренных параметров и корреляцию между лабораторными параметрами и соответствующим оптическим эквивалентом.

Результаты и обсуждение. Прежде всего необходимо было выяснить, как изменяется содержание ЛЭА и ТЭА у детей с различными заболеваниями. Полученные данные приведены в табл. 1.

Оказалось, что у здоровых детей содержание ЛЭА в капиллярной крови составляет 2,1±0,2%. Особенно значительно количество ЛЭА увеличивается у детей с врожденными пороками сердца с цианозом, а также у неоперированных детей с пороками сердца. В основном ЛЭА представлены нейтрофилами и моноцитами. Содержание ТЭА при всех исследуемых заболеваниях значительно меньше, чем ЛЭА. Появление ЛЭА сопро-

Таблица 1

Содержание лейкоцитарно-эритроцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных агрегатов у здоровых и больных детей

Группа детей Число ЛЭА ТЭА, %

детей абс. %

Здоровые 20 2,1±0,2 100±12 0,4±0,01

Больные:

с врожденными 30 - 23±3,0* 1,0±0,1*

пороками сердца:

с цианозом 5 - 32,6±3,5* -

неоперирован- 5 - 30,8±7,2* -

ные

оперированные 45 - 20,4±3,0* -

инфекционным 15 - 19,3±1,4* 17,7+1,6*

эндокардитом

острым лим-фобластным 40 - 4,6±2,4 1,0±0,1*

лейкозом

гриппом АН1 N1, 5 2800±115 20,7±1,4* 7,5±3,1*

осложненным

пневмонией

другой внеболь- 29 1700±90* 17,2±2,5 7,2±1,6*

ничной острой

пневмонией

ОРВИ 8 1400±112* 16,8±2,4* 7,2±1,6*

Примечание. Здесь и в табл. 2: * - р < 0,05 по сравнению с показателем у здоровых обследованных.

вождается деструкцией эритроцитов путем экзоцитарного лизиса, что обусловлено цитотоксическими свойствами контактирующих клеток. При этом в месте травмы происходит вывобождение эритроцитарных прокоагулянтов, что способствует усилению свертывания крови. Интенсивность этого процесса более выражена при контакте с тромбоцитами и встречается в 100% случаев, в меньшей степени с лейкоцитами (77%). Количество лейкоцитов, вступающих в адгезию с одним, двумя, тремя эритроцитами, в среднем составляет 4,6±0,8%, наполовину меньше агрегатов из четырех и более эритроцитов. Число одиночных тромбоцитов, присоединяющихся к эритроциту, оказалось больше, чем ТЭА из трех и более кровяных пластинок.

В следующей серии исследований было изучено, как изменяется агрегационная активность тромбоцитов (ра-

Таблица 2

Агрегационная активность тромбоцитов при СД 1-го и 2-го типов

Обследованные Спонтанная агрегация Индуцированная агрегация

АДФ коллаген адреналин

Здоровые 1,23±0,24 7,92±0,44 4,97±0,81 5,22±1,13

Больные:

СД 1-го типа 2,11±0,24* 5,98±0,35* 3,73±0,33* 2,45±0,08*

СД 2-го типа 1,68±0,46 8,36±0,51 6,58±1,8* 7,35±2,58*

со стабильной 1,91±0,75* 8,47±3,4 8,8±3,2* 6,41±2,2*

стенокардией

с нестабильной 1,73±0,34* 9,86±3,8* 6,99±2,9* 7,26±2,4*

стенокардией

Примечание. Здесь и в табл. 2: телем у здоровых обследованных.

- p < 0,05 по сравнению с показа-

*

Таблица 3

Сравнительный анализ показателей лабораторных тестов исследования агрегационной активности крови и неинвазивных измерений [параметр S (^

Показатель Диапазон X SD R

Тромбоциты, • 109/л 78-568 270 79 0,42

ЛЭА:

на 1 мл 40-431 237 67 0,42

% 1-24 10,4 4,9 0,32

ТЭА, на 1 мл 186-4361 2620 1276 0,6

Спонтанная агрегация тромбоцитов 0,08-13,56 1,82 2,04 0,6

Индуцированная агрегация:

АДФ 1,78-18,62 8,2 4,05 0,44

коллаген 1,58-17,4 6,2 5,4 0,26

адреналин 1,69-12,5 7,0 2,1 0,26

диус в отн. ед.) у больных СД 1-го и 2-го типов и со стабильной и нестабильной стенокардией (табл. 2).

Оказалось, что у больных СД 1-го типа (см. табл. 2) спонтанная агрегация тромбоцитов была повышенной, при использовании всех исследуемых лигандов (АДФ, коллагена, адреналина) - сниженной. Нет никакого сомнения, что уменьшение лигандиндуцированной агрегации кровяных пластинок связано с их высокой способностью образовывать спонтанные агрегаты. При этом в естественных условиях такие агрегаты тромбоцитов могут застревать в капиллярном русле, благодаря чему в кровотоке остается меньше тромбоцитов, способных взаимодействовать между собой при действии агрегирующих агентов.

Иное отмечалось при СД 2-го типа. В этой группе больных только агрегация, индуцированная коллагеном и адреналином, лишь слегка возрастала.

Можно предполагать, что столь значительная разница агрегационной активности тромбоцитов объясняется тем, что СД 2-го типа возникает в более позднем возрасте. Следовательно, изменения тромбоцитарного гемостаза при СД 2-го типа, по всей видимости, менее зависимы от сопутствующих заболеваний, так как они выявляются значительно позже, чем появляются первые признаки нарушения углеводного обмена. Этим в основном и объясняется сохранение компенсаторных реакций со стороны агрегации тромбоцитов у больных СД 2-го типа.

При стабильной и нестабильной стенокардии спонтанная агрегация оказалась повышенной. При исполь-

зовании АДФ, коллагена и адреналина агрегация по сравнению с таковой у здоровых лиц также оказалась усиленной (разница статистически значима), хотя и незначительно отличалась от нормы.

Особый интерес представляла возможность оценить неинвазивным методом способность форменных элементов крови взаимодействовать между собой, образуя агрегаты (табл. 3).

Полученные нами данные позволяют утверждать, что с помощью предлагаемого неинвазивного метода исследования можно ориентировочно судить об абсолютном содержании ЛЭА и ТЭА, а также о спонтанной агрегации кровяных пластинок, определяемой по радиусу агрегатов. Об этом свидетельствуют довольно высокие коэффициенты корреляции и высокая значимость полученных результатов. С меньшей степенью точности с помощью неинвазивного метода можно судить о количестве тромбоцитов, АДФ-, адреналин- и коллагенинду-цированной агрегации.

Полученные данные свидетельствуют о том, что предлагаемый метод исследования может быть использован в качестве ориентировочных в экстренных ситуациях для оценки состояния сосудисто-тромбоцитарного и взаимодействия лейкоцитов и тромбоцитов с эритроцитами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Баркаган З. С., Момот А. П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед; 2008.

2. Бельченко Д. И., Есипова А. В., Кривошеина Е. Л. Активация межклеточных взаимодействий в циркулирующей крови и микроциркуляция. Региональное кровообращение и микроциркуляция. 2005; 4: 53-7.

3. Бельченко Д. И., Есипова А. В., Кривошеина Е. Л. Особенности взаимодействий клеток циркулирующей крови детей при неотложных состояниях. Педиатрия. 2007; 5: 137-40.

4. Кузник Б. И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии. Чита: Экспресс изд-во; 2010.

5. Кузник Б. И., Файн И. А., Ройтман Е. В., Каминский А. В. Не-инвазивные методы исследования системы гемостаза. Тромбоз, гемостаз, реология. 2011; 1: 40-8.

6. Fine I., Kaminsky A. In vivo dynamic light scattering measurements of red blood cell agregation. Proc. SPIE. 2007; 6436: 1605-22.

7. Fine L., Kaminsky A. speckle-based measurement of the light scattering by red blood cells. Proc. SPIE. 2011; 7898; 7898A: 1-14.

8. Fine J., Kaminsky A., Kuznik В., Shenkman L. A non-invasive method for the assessment of hemostasis in vivo by using dynamic light scattering. Laser Physics. 2012; 22 (2): 1-7.

9. Kuznik B. I., Fine I. W., Kaminsky A. V. Non-invasive method of the examination of the hemostatis system. Bull. Exp. Biol. Med. 2011; 151 (5): 594-7.

10. Efron B. Bootstrap methods: Another look at the jackknife. Ann. Statist. 1979; 7 (1): 1-26.

Поступила 28.03.12