Способ моделирования распространенного гнойного перитонита у кроликов
METHOD FOR SIMULATING PREVALENT PURULENT PERITONITIS IN RABBITS

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии.
Перитонит как проблема занимает ведущее место в гнойной хирургии, высокая летальность при распространенных формах перитонита, которая по оценкам разных авторов составляет от 12% до 84% [Савельев В.С. Перитонит: практ. рук. / В.С. Савельев, Б.Р. Гельфанд, М.И. Филимонов. - М.: Литтерра, 2006. - 205 с.], побуждает исследователей к поискам эффективных методов лечения и разработке адекватных моделей для изучения патогенеза.
В литературе приводится множество способов моделирования перитонита. Большинство исследователей вводят в брюшную полость животных монокультуру или каловую взвесь, что имеет, на наш взгляд, ряд недостатков, которые заключаются в непостоянном качественном и количественном составе микрофлоры, длительной сенсибилизации (не менее двух недель), низкой воспроизводимости и высокой летальностью в ранние сроки заболевания от так называемого «перитонеального сепсиса»
Иные модели перитонита созданы путем выполнения оперативных вмешательств на кишечнике животных, однако клиническая картина в данном случае усугубляется дополнительной травматизацией организма.
За последние десятилетия сделан значительный прогресс в изучении распространенного гнойного перитонита. Тем не менее, многие вопросы патогенеза и эффективности различных подходов к лечению распространенного перитонита остаются нерешенными.
Известен способ моделирования острого перитонита (патент РФ №2151427 опубл. 20.06.2000, Бюл. №17), заключающийся в пункционном введении в брюшную полость патогенной микрофлоры, отличающийся тем, что бактериальное загрязнение брюшной полости осуществляется комбинированной взвесью микробных тел, представленной стафилококками, кишечной палочкой, палочкой сине-зеленого гноя и пептококками в равных соотношениях, которое распределяется по всем отделам брюшной полости с помощью предварительно проведенных через пункционные отверстия в передней брюшной стенке катетеров, установленных в правом и левом поддиафрагмальных пространствах, правом и левом боковых каналах - живота, малом тазу, и центральной части брюшной полости, при этом указанная взвесь микробных тел вводится через 24 ч после предварительного введения в брюшную полость через указанные катетеры аутокрови в суммарном объеме 7-10 мл/кг массы тела экспериментального животного в три этапа, при этом на первом этапе взвесь микробных тел вводится в объеме 50-55 млрд. микробных тел/кг массы тела животного, на втором и третьем - по 20-25 млрд. микробных тел/кг через 6-часовые промежутки.
Основным недостатком данного метода является его сложность и трудоемкость, ввиду необходимости выращивания культур микроорганизмов, сложной их дозировки, затрудненный подсчет точного количества микробных тел, а также нестабильность. Также еще одним недостатком является а также многократность введения, что увеличивает продолжительность эксперимента.
Также известен способ моделирования перитонита у крыс (патент РФ №2376648, опубл. 20.12.2009, Бюл. №35) включающий перфорацию в бессосудистой зоне купола слепой кишки, отличающийся тем, что перфорацию слепой кишки выполняют в бессосудистой зоне в 6-8 местах на различных сторонах кишки и резецируют сальник.
Приведенный способ моделирования перитонита обладает существенным недостатком. Он воспроизводит, в основном, модель хирургическим, "кровавым" путем, со вскрытием брюшной полости, что само по себе технически трудоемко, предусматривает использование наркоза и значительно "смазывает" клиническую картину перитонита у подопытного животного.
Описан метод моделирования распространенного гнойного перитонита в котором использовали микробную смесь, состоящую из равных количеств аэробов (Е. coli, штамм 0111 К58 НИ С 130-53) и анаэробов (B. Fragilis, штамм 323). Микробную смесь вводили в брюшную полость животных стерильным шприцем из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Эксперимент выполнен на 25 кроликах-самцах породы шиншилла (масса 2500-3000 г). [В.А. Косинец с соавт. «Структурные изменения в тонкой кишке при гнойном перитоните» // Новости хирургии. - Том 19. - №5. - 2011. - С. 9-16].
Также известен способ моделирования отграниченного перитонита у нелинейных лабораторных мышей (патент РФ №2567602, опубл. 10.11.2015, Бюл. №31), включающий однократное внутрибрюшинное введение каловой взвеси, отличающийся тем, что мышей массой 20-22 г инфицируют 10% каловой взвесью из свежих крысиных фекалий, приготовленной на изотоническом растворе хлорида натрия и однократно профильтрованной через двойной слой марли, через одну точку вкола по средней линии в пупочной области живота на глубину 2 мм, в дозах 0,3-0,4 мл - для использования модели более 13 дней и 0,5 мл - для использования модели не более 13 дней.
Главным недостатком данного способа является моделирование только отграниченного перитонита, в анатомической области, соответствующей месту вкола.
Данный способ нами выбран за прототип.
Известен способ моделирования острого перитонита (патент РФ №2338265, опубликован 10.11.2008, Бюл. №31), отличающийся тем, что лабораторному животному в брюшную полость вводят профильтрованную 10%-ную взвесь содержимого слепой кишки животного того же вида в изотоническом растворе хлорида натрия из расчета 1 мл на 100 г массы тела не позднее чем через 20 мин после приготовления взвеси.
Недостатком данного способа является то, что для его использования необходимо предварительно забивать одно из животных для получения содержимого слепой кишки и последующего приготовления инфицирующей смеси. Кроме того, травматичность введения пункционным способом из одного вкола (в центре белой линии живота) в правое и левое подреберья, в правую и левую подвздошные области требует применения наркоза, что еще более повышает трудоемкость и затратность данного метода. При таком способе возрастает риск травмирования органов брюшной полости. Это в значительной степени изменяет течение перитонита и приводит к преждевременной гибели животных.
Таким образом, известные способы моделирования гнойного перитонита не могут обеспечить стабильную, развернутую, клиническую картину, схожую с естественной патологией распространенного гнойного перитонита и повысить воспроизводимость способа.
Задача изобретения - создание более простого и стабильного этиопатогенетически обоснованного способа моделирования распространенного гнойного перитонита, близкого к тому, что развивается у пациента в условиях клиники.
Данная задача решается тем, что лабораторному животному, в частности кролику, на первом этапе создают предварительную сенсибилизацию для развития участка некроза париетальной брюшины, путем предбрюшинного введения в пупочной области 1,5 мл 10% CaCl2. В последующем, через сутки, животного располагают вертикально, каудальным концом вверх и выполняют внутрибрюшинно инсталляцию в 4-х точках: правое и левое подреберье, правая и левая паховая область микробной взвеси из эндотоксина E.coli в объеме 1 мл/кг массы и 10% каловой взвесью из свежих фекалий этих же кроликов, приготовленной на изотоническом растворе хлорида натрия и однократно профильтрованной через двойной слой марли в объеме по 2,0 мл на каждую из 4-х точек.
Технический результат - упрощение способа, снижение трудоемкости, приближение модели к естественной патологии, повышение воспроизводимости. Также техническим результатом является стабильное получение в эксперименте четкой, развернутой клиники распространенного гнойного перитонита.
Данный результат был достигнут нами за счет следующих приемов изобретения. Предварительно выполняется увеличение сенсибилизации организма, снижение его резистентности, за счет развития очага некроза париетальной брюшины, путем предбрюшинного введения, в пупочной области 10% CaCl2 в объеме 1,5 мл. В последующем данный участок некроза инфицируется введенным эндотоксином E.coli в объеме 1 мл/кг массы и 10% каловой взвесью из свежих фекалий этих же кроликов, приготовленной на изотоническом растворе хлорида натрия и однократно профильтрованной через двойной слой марли в объеме по 2,0 мл на каждую из 4-х точек: правое и левое подреберье, правую и левую паховая область.
В ходе наших исследований выявлено, что именно обкалывание образовавшегося некроза париетальной брюшины с выбранных нами 4-х точек, приводит к стабильному развитию распространенного гнойного перитонита в эксперименте - в отличие, к примеру, от способа прототипа или способа аналога - патент РФ №2567602, патент РФ №2338265, где происходит развитие отграниченного перитонита.
Именно для полноценного инфицирования брюшной полости вокруг образовавшегося после введения, в пупочной области 10% CaCl2 очага некроза париетальной брюшины, мы широко задействуем анатомические области правой и левой передней области живота, правой и левой задней области живота, вводя эндотоксин кишечной палочки и фекалий в указанных 4-х точках. Животных в нашем методе располагают вертикально, каудальным концом вверх для избежания повреждения внутренних органов при введении в брюшную полость инфицирующей смеси.
Подробное описание способа и примеры его практического выполнения.
Для моделирования перитонита используются половозрелые кролики без признаков заболеваний, прошедшие карантин и содержащиеся на стандартном пищевом и питьевом рационе в условиях вивария. Моделирование распространенного гнойного перитонита осуществляют в 2 этапа. На первом этапе создают предварительную сенсибилизацию, развитие участка некроза центральной части париетальной брюшины, путем предбрюшинного введения в области мезогастрия 1,5 мл 10% CaCl2. Из свежих фекалий кроликов готовят 10% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия и однократно фильтруют через двойной слой марли. В последующем, через сутки, выполняют внутрибрюшинно инсталляцию в 4-х точках (правое и левое подреберье, правая и левая паховая область) микробной взвеси из эндотоксина E.coli в объеме 1 мл/кг массы и 10% каловой взвесью из свежих фекалий этих же кроликов, приготовленной на изотоническом растворе хлорида натрия и однократно профильтрованной через двойной слой марли в объеме по 2,0 мл на каждую из 4-х точек. Во избежание повреждения внутренних органов при введении в брюшную полость смеси животные располагаются вертикально, каудальным концом вверх.
После развития РГП (через 48-72 часа), осуществляют забой животных. 100% случаев происходило развитие клинической картины распространенного гнойного перитонита. Способ позволяет воспроизводить в условиях опыта близкую к клинике патологическую ситуацию.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующим клиническим примером.
Пример 1.
Экспериментальному здоровому кролику (вес 2200 г), без применения наркотических препаратов, в предбрюшинную клетчатку в области мезогастрия ввели 10% CaCl2 в объеме - 1,5 мл. Через сутки с момента введения 10% CaCl2, готовили каловую взвесь из свежих фекалий этих же кроликов, в изотоническом растворе хлорида натрия путем фильтрования через двойной слой марли. Кролика располагали вертикально, каудальным концом вверх. Осуществляли внутрибрюшинно инсталляцию в 4-х точках (правое и левое подреберье, правая и левая паховая область) микробной взвеси из эндотоксина E.coli в объеме 1 мл/кг массы и профильтрованной 10% каловой взвеси в объеме по 2,0 мл на каждую из 4-х точек. Спустя 48 ч с момента заражения, животное стало малоподвижным, перестало принимать пищу. Через 48 часов развился распространенный гнойный перитонит.Осуществили забой животного.
При ревизии в брюшной полости обнаружена мутная жидкость, петли кишечника вздуты, гиперемированы, отечны, сосуды брыжейки расширены. Передняя брюшная стенка, петли кишечника изымались для гистологического исследования с последующим изготовлением парафиновых срезов и их окраской гематоксилин-эозином и пикро-сириус-красным, изучением под световым микроскопом. Из перитонеальной жидкости готовился мазок и окрашивался по Романовскому-Гимзе.
При изучении окрашенных срезов отмечались признаки острого воспаления в органах и тканях брюшной полости: явления отека, полнокровие и стаз в сосудах микроциркуляторного русла, массивная клеточная инфильтрация полиморфноклеточного характера.
В перитонеальной жидкости были обнаружены сегментоядерные нейтрофилы, лимфоциты, единичные макрофаги, детрит эукариотических клеток и микробные ассоциации, которые представляли собой две группы микроорганизмов: множество кокков, окрашенных в темно-синий цвет, располагающихся гроздьями во всех полях зрения, предположительно стафилококков, и палочковидные микроорганизмы, которые по Романовскому-Гимзе окрашивались в розовый цвет и были представлены как в виде единичных микроорганизмов, так и в парах.
Опыты на животных выполнялись в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), приказ №708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики»; правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.1984 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.1985 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных», а также основывались на положениях Хельсинской Декларации Всемирной Медицинской Ассоциации.
Заявленный способ был апробирован на 50 половозрелых кроликах без признаков заболеваний, прошедших карантин и содержащихся на стандартном пищевом и питьевом рационе в условиях вивария. У всех экспериментальных животных в течение 48-72 часов произошло развитие распространенного гнойного перитонита.
Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере PC Intel Core i3 1,7 GHz с использованием программного пакета Statistica 6.1 for Windows, а также программы Microsoft Excel 2007. В каждой выборке проверялась гипотеза о нормальности распределения. Вычисляли в каждом числовом ряду среднюю арифметическую (М), ошибку средней арифметической (m), среднеквадратичное отклонение (δ). Для сравнения качественных показателей использовали точный критерий Фишера с поправкой на множественные сравнения по Холму. Средние уровни непрерывных количественных показателей сравнивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса.
Таким образом, разработанная нами новая легковоспроизводимая модель распространенного гнойного перитонита, выгодно отличается от известных простотой выполнения, стабильностью, сходностью клинико-лабораторных и патоморфологических изменений у всех экспериментальных животных, что позволяет наиболее адекватно воспроизводить в условиях опыта близкую к клинике патологическую ситуацию с последующей разработкой и экспериментальной апробацией методов лечения распространенного гнойного перитонита.