Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
REASSORTANT STRAIN OF INFLUENZA VIRUS A/17/SYDNEY/2019/156 (H3N2) FOR THE PRODUCTION OF LIVE INTRANASAL INFLUENZA VACCINE FOR ADULTS AND CHILDREN

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.
В сентябре 2019 ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) рекомендовала заменить A (H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин для Южного полушария на 2020 гг.эпидемический сезон на А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2)-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 southern hemisphere influenza season. 27 September 2019. https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2020_south/en/]. Выбранный для подготовки гриппозных вакцин штамм А/Сидней/53/2019 (H3N2) является антигенно родственным рекомендованному ВОЗ вирусу гриппа А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2).
В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) - прототип [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Киселева И.В., Котомина Т.С., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2732610 от 20.09.2020 - Опубл. БИ 2020. - №27] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может быть использован для формирования протективного иммунитета во время эпидемии, вызванной А/Южная Австралия/34/2019 - подобными штаммами вируса гриппа.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического А/Южная Австралия/34/2019-подобного вируса А/Сидней/53/2019 (H3N2).
Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik, S.; Pearce, N.; Kiseleva, I.; Larionova, N.; Rudenko, L.; Xu, X.; Wentworth, D.E.; Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses. J Virol Methods 2016, 227, 33-39, doi: 10.1016/j.jviromet.2015.10.009].
Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].
Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.
Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Сидней/53/2019 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.
Антигенная характеристика вакцинного штамма. Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) показало, что:
- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в перекрестной постановке РТГА с гомологичными сыворотками антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Сидней/53/2019 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) и родительского штамма А/Сидней/53/2019 (H3N2) с крысиными антисыворотками, полученными к вирусу А/Сидней/53/2019 (H3N2) и вакцинному штамму А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) полностью совпадали (табл.1). Кроме того, перекрестная постановка РТГА с вирусами А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), А/Сидней/53/2019 (H3N2) и А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) в качестве антигенов с соответствующими гипериммунными крысиными сыворотками подтвердила полное антигенное соответствие этих вирусов (табл. 1).
- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом секвенирования полной последовательности сегмента генома, в ходе которого было показано, что ген нейраминидазы идентичен соответствующему гену вируса А/Сидней/53/2019 (H3N2).
Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Сидней/53/2019 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) представлены в табл. 2.
Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2). При этом гены, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу, унаследованы от штамма А/Сидней/53/2019 (H3N2).
Секвенирование всех сегментов генома вакцинного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) показало, что все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2). Также было показано отсутствие дополнительных замен в генах, кодирующих внутренние белки, унаследованных от донора аттенуации.
Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design.
На фиг. 1. приведен пример результата пиросеквенирования фрагмента гена РВ1, содержащего необходимую для аттенуации замену G-819-T, приводящую к замене Lys-265-Asn в РВ1. Чтение нуклеотидов происходит с комплементарной цепи. Наличие замены характеризуется отсутствием пика в первой позиции и присутствием пика во второй позиции. Фрагмент А - пиросеквенирование гена РВ1 «дикого» варианта вируса, не содержащего замены. Фрагмент Б - пиросеквенирование гена РВ1 донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57. Фрагмент В - пиросеквенирование гена РВ1 вакцинного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2).
10
50/мл
10
50/мл
Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Сидней/2019/156 (H3N2), в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадапти-рованным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 log ЭИД, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 6.2 log ЭИД, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.
Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.:2010. 39 с.] и с правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04.2016. https://cdnimg.rg.ru/pril/130/25/64/43232.pdf]
50
Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0.5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.
Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.
В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Сидней/53/2019 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.
Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) прилагается.
Таким образом, вакцинный штамм А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.
Полученный штамм А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) депонирован 11.11.2020 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2960 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
10
50
Инфекционная активность штамма А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.0 log ЭИД/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024
Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Сидней/2019/156 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.