Способ оценки эндометриальной дисфункции у женщин с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием
METHOD FOR EVALUATING ENDOMETRIAL DYSFUNCTION IN FEMALES WITH PRIMARY ENDOMETRIOSIS-ASSOCIATED INFERTILITY

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии, акушерству и гинекологии, и предназначено для оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» у женщин с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием. Изобретение обеспечивает возможность коррекции тактики высокотехнологичных репродуктивных технологий (ВРТ) у женщин с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
Эндометриоз поражает миллионы женщин являясь основной причиной бесплодия и хронической тазовой боли (Endometriosis and infertility: a committee opinion. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertil Steril. 2012 Sep; 98(3):591-8.). Женщины с эндометриозом в два раза чаще имеют бесплодие и невынашивание беременности (Lessey BA, Kim JJ. Endometrial receptivity in the eutopic endometrium of women with endometriosis: it is affected, and let me show you why. Fertil Steril. 2017;108(1):19–27. doi:10.1016/j.fertnstert.2017.05.031).
Эндометрий поддерживает сложную аутокринную, паракринную и эндокринную передачу сигналов, включающую половые стероиды, цитокины и хемокины, и внутриклеточную передачу сигналов, достигающую максимума к периоду «окна имплантации» (Embryo implantation. Carson DD, Bagchi I, Dey SK, Enders AC, Fazleabas AT, Lessey BA, Yoshinaga K Dev Biol. 2000 Jul 15; 223(2):217-37.). Если беременность не наступает  эндометрий претерпевает сложные изменения, в том числе развитие острой воспалительной реакции, что требуется для полноценного отторжения слизистой матки (Inflammation, leukocytes and menstruation. Evans J, Salamonsen LA Rev Endocr Metab Disord. 2012 Dec; 13(4):277-88, Role of inflammatory mediators in human endometrium during progesterone withdrawal and early pregnancy. Critchley HO, Jones RL, Lea RG, Drudy TA, Kelly RW, Williams AR, Baird DT J Clin Endocrinol Metab. 1999 Jan; 84(1):240-8.). Тем не менее, острое воспаление требуется и для успешной имплантации эмриона, а хроническое воспаление становится основной причиной бесплодия. Клинические исследования, проведенные рядом зарубежных ученых подтверждают взаимосвязь между эндометриозом и бесплодием  (Incidence, symptoms, and signs of endometriosis in fertile and infertile women. Verkauf BS J Fla Med Assoc. 1987 Sep; 74(9):671-5.); снижение v частоты успеха  ВРТ у женщин с эндометриозом в том числе при внутриматочной инсеминации (IUI) (Vassilopoulou L, Matalliotakis M, Zervou MI, et al. Endometriosis and in vitro fertilisation. Exp Ther Med. 2018;16(2):1043–1051. doi:10.3892/etm.2018.6307), высокой распространенностью эндометриоза среди женщин с бесплодием, необъяснимым иным образом (High prevalence of endometriosis in infertile women with normal ovulation and normospermic partners. Meuleman C, Vandenabeele B, Fieuws S, Spiessens C, Timmerman D, D'Hooghe T Fertil Steril. 2009 Jul; 92(1):68-74.).
Низкая точность и высокая стоимость существующих способов оценки рецептивности эндометрия делает актуальным поиск новых простых и информативных маркеров данного состояния.
Аналогами данного изобретения являются описанные в научно-медицинской и патентной литературе следующие способы оценки рецептивности эндометрия.
B.A. Lessey et.al. (1994) предложили считать маркером нарушения рецептивности эндометрия у бесплодных женщин anb3-интегрин, экспрессия которого совпадает с «окном имплантации». Скорость синтеза одной из субъединиц anb3-интегрина находится под прямым контролем фактора транскрипции HOXA10. (Lessey BA, Castelbaum AJ, Sawin SW, Buck CA, Schinnar R, Bilker W, Strom BL. Aberrant integrin expression in the endometrium of women with endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1994;79:643-649).
Позже M. Szczepanska et.al. (2010) доказали, что экспрессия как HOXA10, так и anb3-интегрина снижается в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом (Szczepanska M, Wirstlein P, Luczak M, Jagodzinski PP, Skrzypczak J. Reduced expression of HOXA10 in the midluteal endometrium from infertile women with minimal endometriosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 2010;64:697-705).
P.  Díaz-Gimeno et. Al. (2011) предложили  способ оценки рецептивности эндометрия  с использованием определенной транскриптомной сигнатуры.  Он включает в себя анализ 238 генов, которые экспрессируются на разных стадиях цикла эндометрия, и связаны с вычисляемым  предиктором, который может идентифицировать  рецептивность  образца эндометрия и оценить персонализированный риск  неудач имплантации у пациента.  По данным авторов, данный способ  является более точным, чем гистология эндометрия, и, что важно, эти результаты были воспроизводимы у тех же пациентов  через 29-40 месяцев после первого теста (Díaz‐Gimeno P, Horcajadas JA, Martínez‐Conejero JA, et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertil Steril. 2011;95:50‐60).
А.В. Шуршалиной выявлено, что важным маркером рецептивности эндометрия является соотношение прогестерона (ПР) и  эстрогена альфа (ЭРα )в среднюю секреторную фазу менструального цикла, при этом определяющим прогностическим фактором является соотношение ПР/ЭРα в  клетках стромы эндометрия. Наиболее благоприятный прогноз соответствует соотношению ПР/ЭРα в интервале от 2 до 3 (Шуршалина А.В., Демура Т.А. Морфофункциональные перестройки эндометрия в «окно имплантации» // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 7–2. – С. 9–13.).
Несмотря на очевидные достоинства, вышеуказанные способы имеют некоторые недостатки: дорогостоящее оборудование, сложность выполнения методики, оценка прогностического порогового уровня по нескольким показателям, без использования комплексного подхода и математического моделирования снижает эффективность данных способов прогноза.
Наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемого изобретения является «Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии»  (патент на изобретение RU 2706683 C1, опубликован: 20.II.20l9 Бюл. № 32), позволяющий оценить рецептивность эндометрия по значениям площади и высоты пиноподий, площади сосудистого русла, определяемых с помощью компьютерной морфометрии, с вычислением прогностического индекса.
Недостатком данного способа является его неспецифичность в отношении заболевания, обуславливающего маточную форму бесплодия.
Задачей
изобретения является разработка способа оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» у женщин с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием на основании данных иммуногистохимического исследования в эндометрии уровня экспрессии основных молекул, отвечающих за осуществление имплантации эмбриона – фосфотазы с двойной субстратной специфичностью, определяемой на хромосоме 10 (PTEN) и белка p53 – транскрипционного фактора, регулирующего клеточный цикл, с последующим вычислением прогностического индекса (PI).
Технический результат:
способ позволяет с высокой долей вероятности определять восприимчивость эндометрия к имплантации бластоцисты в период «имплантационного окна» у женщин с первичным бесплодием, обусловленным эндометриозом.
Указанный технический результат достигается тем, что заявляется способ оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» у женщин с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием, отличающийся тем, что на 20-22 день менструального цикла производят пайпель-биопсию эндометрия. Далее при использовании иммуногистохимического двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода определяют экспрессию PTEN и белка p53, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI = = Х1×-0,54+0,233×Х2-0,165×Х3+29,2, где
Х1 – количество p53+ клеток в строме;
Х2 – балл H-score экспрессии PTEN в строме;
Х3 – балл H-score экспрессии PTEN в строме;
29,2– Const
При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ.
При PI менее 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ
Чувствительность, предлагаемого способа – 100%, специфичность – 83%, диагностическая эффективность = 90%.
Способ осуществляют следующим образом: Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, полученных методом пайпель-биопсии на 20-22 день 28-дневного менструального цикла (в период предполагаемого «окна имплантации»), проводилось с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Bond RTU Primary» (Германия) и «DAКO» (Дания). На парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигенов и использованием соответствующих стандартных антител выявляли следующие маркеры: PTEN и р53.
Проявление реакции осуществлялось системой визуализации «Dako Cytomation». Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex, США).
Результаты реакции рецепторов к PTEN идентифицировались по ядерному и мембранному окрашиванию клеток по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени). Для анализа результатов ИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS=1а+2b+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Для оценки уровня экспрессии р53 в железах и стороме подсчитывались индексы пролиферации и апоптоза - отношение количества окрашенных ядер клеток к общему числу ядер в процентах при подсчете не менее 400 ядер, при этом изучали не менее 10 полей зрения.
Методом пошагового дискриминантного анализа определены наиболее значимые иммуногистохимические параметры функционального состояния эндометрия, определяющие рецептивность эндометрия с вычислением прогностического индекса по формуле:
PI =  Х1×-0,54+0,233× Х2-0,165× Х3+29,2, где
Х1 – количество p53+ клеток в строме;
Х2 – количество p53+ клеток в железах;
Х3 – балл H-score экспрессии PTEN в строме;
29,2– Const
При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ.
При PI менее 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ
Чувствительность метода составляет – 100%, специфичность – 83%, диагностическая эффективность = 90%.
Клинические примеры.
Пример 1.
Пациентка Х.39 лет (диагноз, эндометриоз, первичное бесплодие 1 в течение 5 лет, попыток ЭКО в анамнезе нет). Жалоб пациентка не предъявляла, Соматически не отягощена. При УЗИ яичников обнаружена киста желтого тела небольших размеров. Материал получен методом Пайпель биопсии на 21 день менструального цикла. При гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют ранней стадии фазы секреции. При ИГХ исследовании: % p53 в клетках стромы- 5; % p53 в клетках желез -0; балл H-score экспрессии PTEN в строме - 140
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = =5×-0,54+0,233×0-0,165×140+29,2=3,2
PI > 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ.
Однако участие в программе ВРТ не понадобилось, в течение наблюдения беременность наступила спонтанно.
Пример 2.
Пациентка Т. .40 лет (диагноз: эндометриоз матки, первичное бесплодие 1 в течение 8 лет, 4 попытки ЭКО в анамнезе). Жалоб пациентка не предъявляла, Соматически не отягощена. В анамнезе удаление кисты яичника. Материал получен методом Пайпель биопсии на 22 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют ранней стадии фазы секреции, отдельные железы соответствуют средней стадии. При ИГХ исследовании: % p53 в клетках стромы- 5; % p53 в клетках желез -3; балл H-score экспрессии PTEN в строме - 155
PI = =5×-0,54+0,233×3-0,165×155+29,2=3,2
PI > 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ.
В течение последующего наблюдения в результате ЭКО наступила беременность, на данный момент срок 25 недель.
Пример 3
. Пациентка Ю. 42 года (диагноз: эндометриоз, первичное бесплодие 1 в течение 10 лет, 3 попытки ЭКО в анамнезе). Жалоб пациентка не предъявляла, В анамнезе удаление простой кисты яичника. Материал получен методом Пайпель биопсии на 22 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют ранней стадии фазы секреции. При ИГХ исследовании: процент p53 в клетках стромы- 10; % p53 в клетках желез -10; балл H-score экспрессии PTEN в строме – 185
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = =10×-0,54+0,233×10-0,165×185+29,2=-4,59
При PI менее 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ. В течение наблюдения, лечение не проводилось, женщина была направлена в программу ВРТ в результате 2 неудачные попытки ЭКО.
Таким образом, прогнозирование развития репродуктивных неудач предлагаемым способом позволит уменьшить количество неэффективных протоколов лечения и циклов ЭКО.
Заявляемый способ прогнозирования наступления беременности у женщин с маточной формой бесплодия и эндометриозом с использованием программ компьютерной морфометрии: способ прост в исполнении, включает объективную оценку морфометрических параметров, не требует дорогостоящего оборудования. Таким образом, предложенный нами способ компьютерной морфометрии экспрессии PTEN и оценки экспресии p53+, позволяет изучить рецептивность эндометрия в период имплантации у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
Источники информации
1. Carson D.D., Bagchi I., Dey S.K., Enders A.C., Fazleabas A.T., Lessey B.A., Yoshinaga K. Embryo implantation. Dev Biol. –  2000. – Vol. 15; 223(2) . – P. 217-37.
2. Critchley H.O., Jones R.L., Lea R.G., Drudy T.A., Kelly R.W., Williams A.R., Baird D.T. Role of inflammatory mediators in human endometrium during progesterone withdrawal and early pregnancy. J Clin Endocrinol Metab. –  1999. – Vol. 84(1) . – P. 240-8.
3. Díaz‐Gimeno P., Horcajadas J.A., Martínez‐Conejero J.A. et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertil Steril. 2011. – Vol. 95. – P. 50‐60
4. Evans J., Salamonsen L.A. Inflammation, leukocytes and menstruation. Rev Endocr Metab Disord. –  2012. – Vol. 13(4) . – P. 277-88
5. Lessey B.A., Kim J.J. Endometrial receptivity in the eutopic endometrium of women with endometriosis: it is affected, and let me show you why. Fertil Steril. –  2017. – Vol. 108(1) . – P. 19–27.
Rulle U.6. , Tsourti Z., Casanova R. et. Al. Computer-Based Intensity Measurement Assists Pathologists in Scoring Phosphatase and Tensin Homolog Immunohistochemistry - Clinical Associations in NSCLC Patients of the European Thoracic Oncology Platform Lungscape Cohort. J Thorac Oncol. –  2018. – Vol. 13(12) . – P. 1851-1863.
7.  Патент РФ № RU 2706683, 20.11.2019, Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии Чистякова Г.Н., Гришкина А.А., Ремизова И.И., Данькова И.В.
8. Шуршалина А.В., Демура Т.А. Морфофункциональные перестройки эндометрия в «окно имплантации» // Акушерство и гинекология. – 2011. – Том. 7–2. – С. 9–13