СРЕДА ДЛЯ ЗАКЛЮЧЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ
MEDIUM FOR MAKING HISTOLOGICAL SECTIONS

Изобретение относится к медицине, биологии, ветеринарии и может быть использовано в практике работы гистологических лабораторий для заключения и хранения гистологических препаратов.
Большинство известных сред для заключения гистологических срезов в виде различных синтетических смол, например, трикапрат целлюлозы, пластифицированный малеиновый полимер, циклопарафиновый полимер, полистирол нейтральны (Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - М.: «Медицина», 1969. - С. 132.). В данных средах хорошо сохраняются основные анилиновые красители, показатели преломления света оптимальны для микроскопии, но в то же время они нейро- и нефротоксичные, требуют дополнительного введения растворителя при повторном использовании и способствуют выцветанию ряда красителей. Для хранения стекол с заключенными в смолы срезами необходимо иметь специальные коробки, кроме того, такие среды не всегда могут применяться для заключения и исследования замороженных срезов для гистохимических исследований, а также в паразитологии.
Известна среда для заключения гистологических срезов, часто используемая в отечественной практике - канадский или пихтовый бальзамы, представляющие собой растворы натуральных смол в ксилоле (Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника - М.: Советская наука, 1957. - 469 с.). Однако в процессе высыхания среды за счет улетучивания растворителя под покровное стекло нередко поступают пузырьки воздуха, что создает оптические искажения при исследование препарата. Нередко смола с краев попадает на верхнюю поверхность покровного стекла и, засыхая, образует неровности, что может повредить объектив микроскопа. При длительном хранении бальзамы желтеют, трескаются, кристаллизуются, тем самым разрушая препарат, что часто наблюдается при заключении и хранении толстых срезов. К тому же, основные анилиновые красители в таких препаратах обесцвечиваются, а берлинская лазурь, окрашивание по ван Гизону и эозином довольно быстро выцветают.
Известна среда для заключения гистологических срезов (Патент РФ №2117273), содержащая 19-21%-ный раствор пенопласта в ксилоле, стабилизированный диметилфталатом из расчета 1:100, причем после нанесения капли раствора на срез и высыхания, последний оказывается заключенным в прозрачный и устойчивый при хранении материал в виде пленки.
К недостаткам данной среды относятся следующие: при нагревании пенопласт выделяет пары формальдегида, предложенный раствор не предполагает использование покровных стекол, что снижает устойчивость препарата к внешним воздействиям, а следовательно и объективность морфологических изменений в срезе; среда не обладает достаточной прозрачностью для изучения срезов, полностью высыхает в течение 20-24 часов, что не позволяет применять ее для исследований срочных операционных биопсий, а также данная среда не может применяться для заключения замороженных срезов при проведении гистохимических исследований, которые в процессе их заключения в данную среду могут коробиться, ломаться или даже плавиться, необходимы особые условия хранения: без доступа прямых солнечных лучей.
Известна также среда для заключения гистологических срезов (Роскин Г.И. Микроскопическая техника. - М.: «Рипол Классик», 1951. - c. 165) в виде нетоксичной водорастворимой среды из глицерин-желатина, для приготовления которой 7 г желатина размачивают 2-3 часа в воде, затем после слива воды добавляют 42 мл горячей дистиллированной или кипяченой воды, 50 г глицерина и 0,5 г кристаллической карболовой кислоты, далее полученную смесь нагревают на водяной бане, фильтруют через ткань или вату и остужают, при этом глицерин-желатин застывает. При приготовлении препарата кусочек глицерин-желатина кладут на предметное стекло, которое слегка нагревают на спиртовке. В расплавившийся глицерин-желатин переносят объект из глицерина и накрывают покровным стеклом. Недостатками данной среды при ее использовании является недолговечность препаратов, быстрое засыхание среды и поражение препаратов плесневыми грибками.
В качестве прототипа заявляемого изобретения выбрана среда для заключения гистологических срезов (Э. Пирс. Гистохимия теоретическая и прикладная (пер. с англ.). - М.: Изд. Иностр. лит. - 1962), содержащая 10 г сухого гуммиарабика, 10 мл дистиллированной воды, 5 г сахарозы и 0,01-0,02 г растолченного тимола, причем первоначально заливают гуммиарабик дистиллированной водой тщательно перемешивая стеклянной палочкой, полученный раствор во флаконе закрывают пробкой и оставляют на 24 часа при комнатной температуре, затем в него высыпают сахарозу и не размешивая, выдерживают 2-3 часа в термостате при температуре 55°С до полного растворения сахарозы, далее в горячий раствор добавляют 0,01-0,02 г растолченного тимола и аккуратно помешивают до получения густого опалесцирующего раствора.
Основными недостатками данной среды являются ее чрезмерная вязкость, что приводит к образованию при помешивании долго неисчезающих пузырьков, которые создают погрешности при проведении оптических исследований и, соответственно, нарушают объективность морфологических изменений в срезе, преждевременная порча препаратов плесневыми грибками при отсутствии дополнительной восковой или парафиновой окантовки.
В настоящее время, исходя из вышеприведенных составов сред для заключения гистологических срезов, проблемой является улучшение качества среды для прочной и длительной фиксации окрашенных гистологических срезов за счет использования небольшого количества исходных химически материалов, быстрого приготовления среды, низкой токсичности и низкой себестоимости используемых реагентов, высокой прозрачности, длительного срока хранения и возможности повторного использования без добавления растворителя.
Техническим результатом, достигаемым изобретением, является разработка нетоксичной среды для заключения гистологических срезов, устойчивой к грибковым поражениям, пластичной, препятствующей выцветанию и деформации гистологических срезов, прозрачной, лишенной пузырьков воздуха и допускающей многократное использование после изготовления, что позволит повысить качество гистологического препарата при сохранении окраски тканей.
Для этого, как и в прототипе, предлагается использовать в составе среды для гистологических срезов гуммиарабик, сахарозу и дистиллированную воду.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что среда для заключения гистологических срезов, включающая гуммиарабик, сахарозу и дистиллированную воду, дополнительно содержит глицерин и фенол, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
гуммиарабик
35-37
сахароза
12-14
глицерин
2-5
фенол
2-3,
дистиллированная вода
до 100%,
причем для приготовления среды флакон с взвесью гуммиарабика в дистиллированной воде в соотношении масс. 1:1 помещают в термостат при температуре 60°С, периодически помешивая раскатыванием флакона в горизонтальной плоскости, через 12-14 часов добавляют оставшуюся дистиллированную воду, затем добавляют сахарозу в виде мелкодисперсного порошка и перемешивают с содержимым флакона, экспонируют в термостате при температуре 60°С до полного растворения сахарозы, после чего добавляют расплавленный фенол и глицерин, экспонируют в термостате при температуре 60°С, периодически раскатывая флакон до получения однородной желтоватой опалесцирующей жидкости.
Использование приведенных выше компонентов среды в отличном от данного сочетании при осуществлении изобретения не позволяет достигнуть ожидаемый технический результат, так как только данное сочетание обеспечивает получение максимального положительного эффекта.
По сравнению с прототипом заявляемая среда характеризуется новым составом компонентов, что подтверждает соответствие заявляемого изобретения критерию "новизна".
Приведенные выше отличительные признаки заявляемого изобретения, по мнению авторов, являются существенными, так как именно такое сочетание отличительных признаков, выполненных в определенной последовательности, позволяет получать среду с высокой прозрачностью, низкой токсичностью, длительным сроком хранения, возможностью повторного использования без добавления растворителя для заключения и хранения окрашенных гистологических срезов, и может применяться в патологоанатомической практике при морфологическом исследовании различного рода биопсий и операционного материала, а также при проведении лабораторных научных исследований в области медицины, биологии, ветеринарии, а также паразитологии, зоологии, ботаники.
В отечественных и в зарубежных информационных источниках использование указанных отличительных признаков для получения заявляемого технического результата авторами не выявлено. Совокупность признаков авторы применили впервые, а полезность доказали экспериментальным путем.
Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом состоит в следующем: добавление в состав среды глицерина позволяет придать ей пластичность, предупреждает деформацию гистологических структур, обеспечивает возможность повторного использования, добавление в среду фенола придает ей противогрибковые свойства, а за счет увеличения количества дистиллированной воды в составе среды уменьшается ее вязкость, что способствует изгнанию пузырьков воздуха и повышает точность проведения оптических исследований, а также способствует защите среды от высыхания при длительном хранении.
В результате проведенных исследований определены оптимальные диапазоны содержания компонентов в заявляемой среде, обеспечивающие высокое качество гистологического препарата при сохранении окраски тканей, и являющиеся достаточными для получения среды высокого качества для прочной и длительной фиксации гистологических срезов.
При добавлении в среду количества глицерина менее заявляемого диапазона свойства среды ухудшаются за счет снижения пластичности, что может приводить к деформации замороженных срезов и выцветанию препаратов, а добавление в состав среды глицерина в большем количестве, чем заявлено, нецелесообразно, так как при этом достижение технического результата проявляется либо в меньшей степени, либо вообще практически неосуществимо.
При добавлении в среду фенола в количестве менее заявляемого диапазона могут наблюдаться грибковые поражения препаратов, а добавление фенола в количестве соответственно предлагаемого диапазона достаточно для получения среды с противогрибковыми свойствами.
Изобретение осуществляют следующим образом.
Емкость 100 мл из светлого стекла, например, флакон, наполняют дистиллированной водой и постепенно добавляют гуммиарабик в соотношении масс. 1:1. Флакон с полученной взвесью гуммиарабика в дистиллированной воде помещают в термостат при температуре 60°С, при этом периодически помешивают аккуратным раскатыванием флакона в горизонтальной плоскости. Затем через 12-14 часов добавляют оставшуюся дистиллированную воду, раскатывают флакон до полного растворения гуммиарабика. Далее отвешивают сахарозу в виде мелкодисперсного порошка и добавляют, аккуратно перемешивая ее с содержимым флакона. Экспонируют в термостате при температуре 60°С до полного растворения сахарозы. После полного растворения сахарозы добавляют расплавленный фенол и глицерин, экспонируют в термостате при температуре 60°С, периодически раскатывая флакон. После получения однородной желтоватой опалесцирующей жидкости во флаконе экспонирование в термостате прекращают.
Для заключения гистологических срезов каплю разогретой среды наносят стеклянной палочкой на влажный окрашенный промытый срез и накрывают покровным стеклом, оставляя до полного высыхания в строго горизонтальном положении.
Перед применением полученную среду повторно разогревают до 60°С.
Сущность изобретения поясняется на следующем примере, показывающем повышение качества гистологического препарата при сохранении окраски тканей.
Пример.
В посуду емкостью 50-100 мл из светлого стекла добавляют 20 мл дистиллированной воды, отвешивают 20 г гуммиарабика, постепенно добавляя его в воду. Полученную взвесь помещают в термостат при температуре 60°С, периодически помешивая аккуратным раскатыванием флакона в горизонтальной плоскости, через 12-14 часов добавляют еще 5 мл дистиллированной воды, раскатывают флакон до полного растворения гуммиарабика. Затем отвешивают 7,2 г сахарозы в виде мелкодисперсного порошка, аккуратно перемешают ее с содержимым флакона и экспонируют в термостате при температуре 60°С до полного растворения сахарозы. После полного растворения сахарозы добавляют 1,3 мл расплавленного фенола и 1,5 мл глицерина, экспонируют в термостате при температуре 60°С, периодически раскатывая флакон. После получения однородной желтоватой опалесцирующей жидкости экспонирование в термостате прекращают.
Возможна микроскопия препарата сражу же после его заключения под покровное стекло при условии удаления избытка среды. Через сутки среда полностью высыхает, обеспечивая прочную фиксацию покровного стекла. Готовые срезы просматривают в световой микроскоп. Перед повторным применением флакон со средой разогревают в термостате при температуре 55°-60°С в течении 10-15 мин.
На рис. 1 показано выцветание гистологических препаратов при использовании среды, выбранной в качестве прототипа.
На рис. 2 показана сохранность окраски гистологических препаратов при использовании заявляемой среды.
Заявляемая среда для заключения гистологических срезов обладает низкой токсичностью, низкой стоимостью, простотой в применении, не содержит экологически вредных веществ. При классическом изготовлении гистологического препарата перед заключением в данную среду отпадает потребность в дегидратации среза ткани в спиртах, просветлении и обработке в бензоле и ксилоле.
Среда для заключения гистологических срезов может быть использована при проведении срочных гистологических исследований, включая интраоперационные биопсии, поскольку позволяет изучать гистологический срез сразу после его заключения в среду.