СПОСОБ ОКРАСКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ТРИХИНЕЛЛЕЗА
METHOD FOR STAINING THE HISTOLOGICAL CUTS IN DIAGNOSING TRICHINOSIS

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к способу окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза, и может быть использовано в гистологии при морфологических исследованиях в патологической анатомии, цитологии, судебной медицине.
Известен способ окраски мазков крови по Романовскому-Гимза, заключающийся в однократном помещении мазков крови в раствор красителя с дальнейшим промыванием дистиллированной водой и высушиванием на открытом воздухе (см. Меркулов Г.А. «Курс патологогистологической техники». Издательство Медицина - Ленинградское отделение, 1969, с. 423).
Недостатками данного способа являются:
- рабочий раствор не долго сохраняет свои свойства красителя, быстро портится и не может быть использован для повторного окрашивания;
- качество и скорость окрашивания зависят от температуры окружающей среды, т.е., чем ниже температура, тем продолжительнее окрашивание.
Известен способ окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином, включающий использование основного красителя гематоксилина, окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителя эозина Υ, окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом, при этом базофильные структуры, как правило, это те, которые содержат нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК): клеточное ядро, рибосомы и РНК-богатые участки цитоплазмы (см. Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. Гистологическая и микроскопическая техника. Смоленск: САУ, 2000, с. 190-191).
Недостатками данного способа является то, что раствор красителя наносится на гистологический срез, содержащий известковую капсулу, внутри которой находятся трихинеллы, раствор красителя не проникает через известковую капсулу, что может служить причиной получения некачественно окрашенных препаратов, в этом случае проводят декальцинацию известковой капсулы, воздействуя 5-8%-ными растворами органических кислот: соляной, или азотной, или уксусной и другими. В процессе декальцинации раствор красителя проникает к трихинеллам, но кислоты разрушают ткани, окружающие капсулу, вызывают структурные изменения трихинелл, что затрудняет дифференциальную диагностику трихинеллеза и других паразитов, например, саркоцистоза животных и проведение объективной оценки уровня гистоморфологических изменений в местах локализации паразитов (в тканях, окружающих капсулу с паразитами, трихинеллами).
Известен также способ окраски гистологических препаратов, заключающийся в окраске гистологических срезов метиловым зеленым и пиронином, при этом дополнительно используют 2%-ный водный раствор соли прочного синего ББ, которым предварительно протравливают препарат до нанесения смеси красителя, через 5 мин сливают раствор и на срез наносят по 2 капли 2%-ного водного раствора соли прочного синего ББ и смеси красителя следующего состава: 0,6 г метилового зеленого, 0,4 г пиронина, 20 мл глицерина и 80 мл дистиллированной воды; для дифференцировки ядер используют 96° этиловый спирт (см. пат. RU №2202776, МПК G01N 1/30, опубл. 20.04.2003 г.).
Недостатком данного способа является нестабильное окрашивание клеток и клеточных структур.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятым авторами за прототип является способ окраски гематоксилин-эозином, включающий удаление парафина из срезов в орто-ксилоле или толуоле, проведение по спиртам нисходящей концентрации, доведение до воды (две порции ксилола или толуола - 3-5 минут, 96° этанол - 3 минуты, 80° этанол - 3 минуты, 70° этанол - 3 минуты, дистиллированная вода - 5 минут), окрашивание гематоксилином 7-10 минут (в зависимости от зрелости красителя), промывание в дистиллированной воде - 5 минут, дифференцирование в 1%  соляной кислоты на 70° этаноле до побурения срезов, промывание дистиллированной водой, а затем слабым (0,5%) раствором аммиака до посинения срезов, окрашивание водным раствором эозина 0,5-1 минуту (в зависимости от желаемой окраски), промывание в трех порциях дистиллированной воды для удаления избытка эозина, удаление воды из срезов в одной порции 70° этанола, двух порциях 96° этанола, экспозиция в каждой порции спирта - 2 минуты просветление срезов в двух порциях карболксилола (смесь расплавленного фенола и ксилола либо толуола в соотношении 1:4 или 1:5) - 1 минута, затем производят окончательное обезвоживание срезов в двух порциях ксилола или толуола, пребывание срезов 2 минуты, с последующим заключением срезов в канадский бальзам или синтетическую среду для заключения гистологических срезов (см. Большая медицинская энциклопедия).
Недостатком данного способа является то, что некоторые структуры плохо прокрашиваются гематоксилином и эозином (как правило гидрофобные) и требуют иных методов окраски, например, участки клеток, богатые липидами и миелином, остаются неокрашенными: адипоциты, миелиновая оболочка аксонов нейронов, мембрана аппарата Гольджи и др.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза, обладающего стабильностью окрашивания клеток и клеточных структур, исключающего необходимость декальцинации известковой капсулы вокруг трихинеллы, повреждение трихинеллы и создание предпосылок для проведения объективной диагностики.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к стабильности окрашивания клеток и клеточных структур, исключению необходимости декальцинации известковой капсулы вокруг трихинеллы, повреждению трихинеллы и созданию предпосылок для проведения объективной диагностики.
Технический результат достигается с помощью способа окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза.
Таким образом, например, в лабораториях ветеринарной - санитарной экспертизы на рынках для диагностики трихинеллез применяют компрессорную трихинеллоскопию (см. Методические указания МУК 4.2.2747-10 (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 11 октября 2010 г.), однако в замороженном мясе животных (например, медведь, барсук) обнаружить трихинелл трудно, так как при его консервировании низкими температурами вода из капсул паразита вымораживается, а после дефростации они заполняются мясным соком. Мясной сок имеет цвет мяса, поэтому трихинеллы становятся незаметными, а с помощью предлагаемого способа именно добавлением диметилсульфоксида исключается декальцинация известковой капсулы вокруг трихинеллы, повреждение трихинеллы и создаются предпосылки для проведения объективной диагностики, при этом диметилсульфоксид (ДМСО) представляет собой вязкую бесцветную жидкость почти без запаха, при смешивании с водой сильно нагревается и является важным биполярным апротонным растворителем, менее токсичен, чем другие представители этой группы, такие как диметилформамид, диметилацетамид, N-метилпирролидон, благодаря своей сильной растворяющей способности, ДМСО часто используют как растворитель в химических реакциях с участием неорганических солей, в частности в реакциях нуклеофильного замещения, кислотные свойства ДМСО выражены слабо, поэтому он стал важным растворителем в химии карбоанионов, из-за высокой температуры кипения ДМСО крайне медленно испаряется при нормальном атмосферном давлении, это делает его очень удобным растворителем для проведения реакций при нагревании, в то же время довольно высокая температура плавления ограничивает его применение в области низких температур.
Спецификация на ДМСО: содержание основного вещества ДМСО не менее, %: 99,90; температура кристаллизации, °С: 18,20; кислотность, мгр/гр: 0,02; коэффициент светопропускания ДМСО в кювете 400 мм, %: 96; коэффициент преломления при 20 °С: 1.4778-1.4790.
Сущность способа окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза заключается в следующем.
Проводят приготовление гистологических срезов, затем окрашивание проводят двумя красителями, в качестве которых берут гематоксилин Эрлиха и эозин - натрий, при этом сначала срез окрашивают гематоксилином, проводят промывку окрашенных срезов и располагают на предметном стекле, затем проводят окрашивание раствором эозина, слив эозина, промывание водопроводной водой, расположение на предметном стекле, удаление воды с последующими размещением в 96° спирт, выдержкой, сливом спирта, добавлением просветляющего средства, промывкой ксилолом, заключение в бальзам с покрытием покровным стеклом, при этом при окрашивании гематоксилином, дополнительно добавляют 2-3 капли 10%-ного диметилсульфоксида, а гематоксилин используют профилированный квасцовый в количестве 5-7 капель, окрашивание гематоксилином в течение 1-5 мин, а промывание в воде - в течение 3-5 мин до посинения среза, затем срез располагают на предметном стекле и проводят окрашивание раствором эозина в количестве 2-3 капель в течение 1-3 мин, слив раствора эозина и промывание водопроводной водой в течение 1 мин, выдержку в спирте проводят в течение 3-5 мин, его слив и на влажный срез наливают просветляющее средство, выдержку в просветляющем средстве ведут в течение 1-5 мин до полной прозрачности среза, затем проводят 2-3 раза в течение 1 мин промывку ксилолом, удаляют его остатки, кладут 1 каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
Примеры конкретного выполнения способа окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза.
Пример 1. Готовят гистологические срезы в количестве 24, а при расследовании вспышек трихинеллеза необходимо увеличить количество срезов до 72, при этом толщина срезов не должна превышать 1,5-2,0 мм. Гистологические срезы (целлоидиновые сразу, а замороженные после обезжиривания) переносят в чашки бактериологические с водой, затем извлекают на предметное стекло в расправленном виде лучший срез, для ориентировки в выборе среза пользуются черным фоном стола, наливают на срез 2 капли профильтрованного квасцового гематоксилина с фильтра с помощью воронки, окрашивают в течение 0,5 мин в зависимости от качества и зрелости гематоксилина, дополнительно добавляют 1 каплю 10%-ного диметилсульфоксида (ДМСО), придерживают срез на стекле препаровальной иглой, сливают краску обратно в рабочую склянку, а препарат со стекла спускают в большую чашку с водой, промывают в воде 2 мин до посинения среза, при этом только что окрашенные гематоксилином срезы, а следовательно, и ядра клеток имеют красновато-фиолетовый тон, который при достаточном промывании в воде благодаря ее щелочности переходит в синий. Синие ядра клеток будут более контрастными при сочетании с эозином, хорошо помытый и посиневший срез извлекают опять из воды (в расправленном виде) на предметное стекло и наливают на него 2 капли раствора эозина, окрашивают в течение 0,5 мин в зависимости от красящей способности того или иного эозина, сливают эозин, придерживая срез иглой, промывают в большой чашке с водопроводной водой в течение 0,5 мин, на этом окраска препарата заканчивается, затем извлекают срез из воды на предметное стекло, удаляют вокруг него, по возможности, всю воду и осторожно, чтобы срез не свернулся, наливают 96° спирт, выдерживают в спирте различное время, примерно до 2 мин, т.к., помимо обезвоживающего, он имеет и дифференцирующее действие в отношении эозина, сливают спирт, придерживая срез иглой, быстро удаляют салфеткой остатки его вокруг среза и, не давая ему подсохнуть, наливают просветляющее средство (креозот, эфирное масло/карболксилол, скипидар и прочее), выдерживают в последнем до момента полной прозрачности среза до 3 мин, при медленном просветлении среза применяют отжимание фильтровальной бумагой, контролируют ход просветления на черном фоне, на котором хорошо выделяются непросветленные беловатые участки, затем быстро в течение 1 мин промывают ксилолом, повторно 1 раз наливая и сливая его, удаляют остатки ксилола вокруг среза, кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом, причем покровное стекло опускают осторожно, придерживая правое ребро его препаровальной иглой, так как при быстром накладывании под стекло могут попасть пузырьки воздуха.
Результат: анализ полученных данных показал недостаточную окрашенность ядер и включений из-за недостаточной выдержки срезов по времени, поэтому диагностика трихинеллеза затруднена.
Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но был проведен по следующим параметрам. Гистологические срезы переносят в чашки с водой, затем извлекают на предметное стекло в расправленном виде лучший срез, наливают на срез 5 капель профильтрованного квасцового гематоксилина, окрашивают в течение 1 мин, дополнительно добавляют 2 капли 10%-ного ДМСО, придерживают срез на стекле препаровальной иглой, сливают краску, а препарат со стекла спускают в большую чашку с водой, промывают в воде 3 мин до посинения среза, при этом только что окрашенные гематоксилином срезы, а следовательно, и ядра клеток имеют красновато-фиолетовый тон, который при достаточном промывании в воде благодаря ее щелочности переходит в синий. Синие ядра клеток будут более контрастными при сочетании с эозином, хорошо помытый и посиневший срез извлекают опять из воды на предметное стекло и наливают на него несколько капель раствора эозина, окрашивают в течение 1 мин, сливают эозин, придерживая срез иглой, промывают в большой чашке с водопроводной водой в течение 1 мин, на этом окраска препарата заканчивается, затем извлекают срез из воды на предметное стекло, удаляют вокруг него, по возможности, всю воду и осторожно, чтобы срез не свернулся, наливают 96° спирт, выдерживают в спирте различное время, примерно до 3 мин, сливают спирт, придерживая срез иглой, быстро удаляют салфеткой остатки его вокруг среза и, не давая ему подсохнуть, наливают просветляющее средство, выдерживают в последнем до момента полной прозрачности среза до 3 мин, при медленном просветлении среза применяют отжимание фильтровальной бумагой, контролируют ход просветления на черном фоне, на котором хорошо выделяются непросветленные беловатые участки, затем быстро в течение 1 мин промывают ксилолом, повторно 2 раза наливая и сливая его, удаляют остатки ксилола вокруг среза, кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
Результат: анализ полученных данных показал достаточную окрашенность ядер и включений, вследствие чего диагностика трихинеллеза не затруднена и проведена объективная диагностика.
Пример 3. Проводят аналогично примеру 1. Но был проведен по следующим параметрам. Гистологические срезы переносят в чашки с водой, затем извлекают на предметное стекло в расправленном виде лучший срез, наливают на срез 7 капель профильтрованного квасцового гематоксилина, окрашивают в течение 5 мин в зависимости от качества и от зрелости гематоксилина, дополнительно добавляют 3 капли 10%-ного ДМСО, придерживают срез на стекле препаровальной иглой, сливают краску обратно в рабочую склянку, а препарат со стекла спускают в большую чашку с водой, промывают в воде 10 мин до посинения среза, при этом только что окрашенные гематоксилином срезы, а следовательно, и ядра клеток имеют красновато-фиолетовый тон, который при достаточном промывании в воде благодаря ее щелочности переходит в синий. Синие ядра клеток будут более контрастными при сочетании с эозином, хорошо помытый и посиневший срез извлекают опять из воды (в расправленном виде) на предметное стекло и наливают на него несколько капель раствора эозина, окрашивают в течение 3 мин в зависимости от красящей способности того или иного эозина, сливают эозин, придерживая срез иглой, промывают в большой чашке с водопроводной водой в течение 1 мин, на этом окраска препарата заканчивается, затем извлекают срез из воды на предметное стекло, удаляют вокруг него, по возможности, всю воду и осторожно, чтобы срез не свернулся, наливают 96° спирт, выдерживают в спирте различное время, примерно до 5 мин, сливают спирт, придерживая срез иглой, быстро удаляют салфеткой остатки его вокруг среза и, не давая ему подсохнуть, наливают просветляющее средство, выдерживают в последнем до момента полной прозрачности среза до 5 мин, при медленном просветлении среза применяют отжимание фильтровальной бумагой, контролируют ход просветления на черном фоне, на котором хорошо выделяются непросветленные беловатые участки, затем быстро в течение 1 мин промывают ксилолом, повторно 3 раза наливая и сливая его, удаляют остатки ксилола вокруг среза, кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
Результат: анализ полученных данных показал достаточную окрашенность ядер и включений, вследствие чего диагностика трихинеллеза не затруднена и проведена объективная диагностика.
Пример 4. Проводят аналогично примеру 1. Но был проведен по следующим параметрам. Гистологические срезы переносят в чашки с водой, затем извлекают на предметное стекло в расправленном виде лучший срез, наливают на срез 8 капель профильтрованного квасцового гематоксилина, окрашивают в течение 5,5 мин в зависимости от качества и от зрелости гематоксилина, дополнительно добавляют 4 капли 10%-ного ДМСО, придерживают срез на стекле препаровальной иглой, сливают краску обратно в рабочую склянку, а препарат со стекла спускают в большую чашку с водой, промывают в воде 11 мин до посинения среза, при этом только что окрашенные гематоксилином срезы, а следовательно, и ядра клеток имеют красновато-фиолетовый тон, который при достаточном промывании в воде благодаря ее щелочности переходит в синий. Синие ядра клеток будут более контрастными при сочетании с эозином, хорошо помытый и посиневший срез извлекают опять из воды на предметное стекло и наливают на него несколько капель раствора эозина, окрашивают в течение 3,5 мин в зависимости от красящей способности того или иного эозина, сливают эозин, придерживая срез иглой, промывают в большой емкости с водопроводной водой в течение 1 мин, на этом окраска препарата заканчивается, затем извлекают срез из воды на предметное стекло, удаляют вокруг него, по возможности, всю воду и осторожно, чтобы срез не свернулся, наливают 96° спирт, выдерживают в спирте различное время, примерно до 5,5 мин, сливают спирт, придерживая срез иглой, быстро удаляют салфеткой остатки его вокруг среза и, не давая ему подсохнуть, наливают просветляющее средство, выдерживают в последнем до момента полной прозрачности среза до 6 мин, при медленном просветлении среза применяют отжимание фильтровальной бумагой, контролируют ход просветления на черном фоне, на котором хорошо выделяются непросветленные беловатые участки, затем быстро в течение 1 мин промывают ксилолом, повторно 4 раза наливая и сливая его, удаляют остатки ксилола вокруг среза, кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
Результат: анализ полученных данных показал достаточную окрашенность ядер и включений, вследствие чего диагностика трихинеллеза не затруднена, но временные рамки увеличились и экономические затраты также.
Таким образом, наиболее оптимальными являются примеры 2 и 3 способа окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза.
Таким образом, добавление ДМСО исключает необходимость декальцинации известковой капсулы вокруг трихинеллы, не повреждает трихинеллу, создает благоприятные предпосылки для проведения объективной диагностики. Анализ полученных данных позволил сделать вывод о том, что предложенный способ окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза превосходит, например, наиболее часто применяемый по Романовскому-Гимза, позволяет получить качественно окрашенные гистологические срезы за более короткое время 6-9 мин в зависимости от срока выдержки раствора гематоксилина.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- стабильность окрашивания клеток и клеточных структур;
- исключение необходимости декальцинации известковой капсулы вокруг трихинеллы и повреждение трихинеллы;
- создание предпосылок для проведения объективной диагностики;
- сокращение времени окрашивания;
- дает возможность многократного использования рабочих растворов красителей;
- не требует наличия специального лабораторного оборудования;
- позволяет сотрудникам ветеринарных и медицинских лабораторий экономить временные и материальные ресурсы.