Способ оптимизации криоконсервации овариальной ткани для долгосрочного хранения
METHOD FOR OPTIMIZING CRYOPRESERVATION OF OVARIAN TISSUE FOR LONG-TERM STORAGE

Изобретение относится к медицине, в частности к репродуктологии и онкологии и может быть использовано для подготовки овариальной ткани к долгосрочному хранению в условиях глубокой заморозки для сохранения фертильности пациенток, получающих гонадотоксичное лечение.
В настоящее время для подготовки биологических образцов к криоконсервации используются различные подходы. В первую очередь, это продиктовано отличиями в гистологическом строении. Вместе с тем, даже при работе с одним биологическим объектом, исследователи используют различающиеся методологические подходы, при этом параметры последних зачастую подбираются эмпирически.
Известно, из исследования 364 пациенток, прошедших процедуру криоконсервации овариальной ткани, что долгосрочного восстановления овариальной функции удается достичь у более чем 95% женщин [Gellert, S.Е. et al. Transplantation of frozen-thawed ovarian tissue: an update on worldwide activity published in peer-reviewed papers and on the Danish cohort. J Assist Reprod Gen 35, 561-570 (2018)].
Технология медленной заморозки не претерпела значительных изменений с момента первого ее описания Gosden et al. [Gosden, R. G., Baird, D. Т., Wade, J. C. & Webb, R. Restoration of fertility to oophorectomized sheep by ovarian autografts stored at-196°C. Hum Reprod 9, 597-603 (1994)]. При этом способе отделенный кортикальный слой яичника разделяется на фрагменты, размерами 1×2×0.1 см и после переносятся в криовиалы, содержащие 1.5 ммоль/л 1,2-пропандиола/этиленгликоля или диметисульфоксида с добавлением 0.1 моль/л сахарозы и 10% синтетическим заменителем сыворотки при температуре 37°С на 30 минут. После этого образцы переносятся в раствор с более высокой концентрацией сахарозы - 0.2 моль/л на 5 минут. Затем начинается этап программируемого охлаждения по схеме:
1. Охлаждение до - 9°С со скоростью -2°С/мин.
2. Механическая инициация кристаллизации с использованием зажима, погруженного перед этим в жидкий азот.
3. Охлаждение до - 40°С со скоростью 0.3°С/мин.
4. Охлаждение до -140°С со скоростью 10°С/мин.
5. Перенос в криорезервуар с жидким азотом с температурой -196°С для дальнейшего хранения.
Известен также способ криоконсервированной ткани яичника [Donnez, J. et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 364, 1405-1410 (2004)], позволивший впервые в истории достигнуть живорождения после трансплантации. При этом способе овариальная ткань, полученная в ходе лапароскопической операции, помещается в предварительно охлажденные криовиалы, объемом 2 мл. В известном способе криовиалы содержат раствор, состоящий из питательной среды Лейбовица с добавлением сывороточного альбумина человека - 4 мг/мл и диметилсульфоксида -1.5 ммоль/л. Криовиалы помещаются в программируемый охладитель, выполняющий охлаждение образцов по следующей схеме:
1. Охлаждение от 0 до -8°С со скоростью -2°С/мин.
2. Механическая инициация кристаллизации с использованием зажима, погруженного перед этим в жидкий азот.
2. Охлаждение до - 40°С со скоростью 0.3°С/мин.
3. Охлаждение до -150°С со скоростью 30°С/мин.
4. Перенос в криорезервуар с жидким азотом с температурой -196°С для дальнейшего хранения.
Недостатком этих способов является их трудозатратность и дороговизна. Использование метода медленной заморозки предполагает необходимость наличия программируемого охладителя, стоимость которого может быть достаточно высокой. Кроме того, охлаждение происходит в течение нескольких часов, что требует непосредственного участия оператора на разных этапах. Важно также отметить, что исследования последних лет демонстрируют, что медленное замораживание снижает сохранность морфологической целостности стромальных клеток в кортикальном слое яичников. Как следствие, это может приводить к сокращению времени жизни аутотрансплантата, а значит неизбежному снижению конечной эффективности способа [Silber, S., Kagawa, N., Kuwayama, M. & Gosden, R. Duration of fertility after fresh and frozen ovary transplantation. Fertil Steril 94, 2191-2196 (2010)].
В качестве альтернативы вышеуказанным способам, другими авторами, было предложено использовать технологию витрификации, то есть альтернативный подход к криоконсервации, который позволяет охлаждать гидратированные живые клетки до криогенных температур и избегать при этом формирование кристаллов льда. Согласно исследованиям in vitro витрификация не приводит к снижению числа ооцитов, при этом при медленном замораживании их потеря может достигать 50%. Даже при сопоставимом числе морфологически нормальных первичных фолликулов, витрификация приводит к меньшему повреждению их ДНК, что безусловно благоприятно влияет на восстановление репродуктивной функции [Shi, Q., Xie, Y., Wang, Y. & Li, S. Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep-uk 7, 8538 (2017)].
Из известных аналогов в качестве прототипа к заявляемому способу выбран способ [Keros, V. et al. Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue. Hum Reprod 24, 1670-1683 (2009)], который ранее продемонстрировал состоятельность в сохранении нормальной морфологической структуры овариальной ткани. Суть метода состоит в следующем. Посыле промывания образцов овариальной ткани в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) с добавлением 10 мг/мл альбумина сыворотки человека, они погружались последовательно в следующие три раствора возрастающих концентраций:
1. 0.35 М диметилсульфоксида+0.38 М пропандиола+0.38 М этиленгликоля
2. 0.7 М диметилсульфоксида+0.75 М пропандиола+0.75 М этиленгликоля
3. 1.4 М диметилсульфоксида+1.5 М пропандиола+1.5 М этиленгликоля+10% поливинилпирролидона
Обработанные таким образом образцы овариальной ткани располагались на фрагменте криосоломинки, предварительно вырезанной стерильным скальпелем из соответствующего коммерческого продукта. После этого образцы помещались в жидкий азот, а затем - в предохлажденную криопробирку. Следует отметить, что в ходе хранения образцы продолжали распологаться на подложке из криосоломинки.
В таком виде образцы хранились до востребования. При необходимости использования, образцы размораживались по следующей схеме (каждый этап длится 5 минут):
1. Криосоломинка с образцами погружалась в подогретый (37°С) раствор, содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) с добавлением 10 мг/мл альбумина сыворотки человека и 0.5 М сахарозы.
2. Оттаявшие от подложки образцы яичниковой ткани затем переносились в раствор, содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) с добавлением 10 мг/мл альбумина сыворотки человека и 0.25 М сахарозы.
3. Затем - в раствор, содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) с добавлением 10 мг/мл альбумина сыворотки человека и 0.125 М сахарозы.
4. На последнем этапе образцы переносились в раствор содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) с добавлением 10 мг/мл альбумина сыворотки человека без сахарозы.
В основу изобретения положена задача, заключающаяся в повышении эффективности криоконсервации овариальной ткани за счет оптимизации параметров криопротокола.
Кардинальный показатель эффективности данного способа - сохранение максимально возможного числа фолликулов, а также нормального строения окружающей ткани, что в конечном счете способствует пролонгации репродуктивной функции аутореципиента. Исходя из этого, предлагаемые технические решения направлены с одной стороны на полноценный и эффективный процесс заморозки овариальной ткани, обеспечивающий его долговременное хранение, с другой стороны - на бережное отношение к овариальной ткани, исключающее ненужные негативные воздействия.
Этапы криопротокола выполняются последовательно в следующем порядке. Овариальная ткань забирается в ходе хирургической операции. При этом предпочтителен выбор в пользу малоинвазивных доступов (лапароскопический, робот-ассистированный), а также отказ, по возможности, от высокоэнергетических воздействий на яичниковую ткань, которые, как известно, отрицательно влияют на жизнеспособность фолликулов. Полученная таким образом ткань промывается в подогретом до 37°С стерильном физиологическом растворе. Основная цель данного этапа в удалении остатков биологических жидкостей, в первую очередь крови.
Следующий шаг - получение фрагментов овариальной ткани. Чаще всего его отделяют вручную, используя стерильные скальпель и пинцет. В качестве альтернативного подхода, мы предлагаем использовать одноразовые инструменты для панч-биопсии, диаметром 8 мм. Этот подход обладает следующими преимуществами. Во-первых, это сокращает время получения образцов кортекса, они могут быть быстрее заморожены, а значит лучше сохранены. Кроме того, униформные размеры полученных образцов обеспечивают их сопоставимое и равномерное насыщение криопротекторами и охлаждение. Это исключает ситуацию, при которых часть образцов, будучи слишком массивными не насыщаются за отведенное время в достаточной степени криопротекторами, в то время как другие, слишком маленькие, испытывают избыточное токсичное воздействие.
На следующем этапе, который справедливо считается краеугольным, образцы кортикального слоя следует насытить криопротекторами. При этом в отличие от многих других биологических объектов, сложный гистологический состав овариальной ткани - кортекса (фолликулы, гранулезные и стромальные клетки) обуславливает необходимость тщательного подбора оптимальных параметров криопротокола. В качестве основного способа мы предлагаем использовать витрификацию/быстрое оттаивание. Витрификация предотвращает образование кристаллов льда, снижая риск механического повреждения клеток [Donner, J. et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril 99, 1503-1513 (2013)]. По сравнению с медленным замораживанием, витрификация имеет преимущества, заключающиеся в том, что это простой и быстрый процесс, не требующий специального или дорогостоящего оборудования.
Финальная рецептура раствора для криоконсервация является предметом изучения, нередко эмпирического. Оптимальным представляется использование не отдельных криопротекторов, а их комбинации, что позволяет снизить конечные концентрации, а значит минимизировать токсичность раствора [Fabbri, R. et al. Good Preservation of Stromal Cells and No Apoptosis in Human Ovarian Tissue after Vitrification. Biomed Res Int 2014, 1-7 (2014)]. В качестве проникающих криопротекоров могут использоваться этиленгликоль, пропандиол-1,2 и диметилсульфоксид. Представляется оптимальным использование комбинации диметилсульфоксида и пропандиола-1,2, который, по-видимому, более благоприятно влияет на жизнеспособность фолликулов, чем этиленгликоль [Bafrani, Н. Н. et al. Comparison of 1,2-Propanediol and Ethylene Glycol for Cryopreservation of Slow-Cooled Mouse Zygotes and Their Subsequent Development. J Assist Reprod Gen 20, 234-240 (2003)]. Кроме того, наряду с проникающими криопротекторами следует использовать и непроникающие. Последние, при этом, оказываются менее цитотоксичны, а их добавление способствует повышению вязкости, позволяя использовать более низкие концентрации проникающих криопротекторов без ущерба для самого процесса витрификации [Amorim, С.A., Curaba, М., Langendonckt, А. V, Dolmans, М.-М. & Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue. Reprod Biomed Online 23, 160-186 (2011)]. Ряд исследований продемонстрировали, что именно комбинация проникающих и непроникающих криопротекторов обеспечивает повышение жизнеспособности и функциональных возможностей верифицированных эмбрионов и тканей яичников после оттаивания [Zeng, Y. et al. Assessment of the effect of different vitrification solutions on human ovarian tissue after short term xenotransplantation onto the chick embryo chorioallantoic membrane. Mol Reprod Dev 83, 359-369 (2016)], [Mouttham, L. & Comizzoli, P. The preservation of vital functions in cat ovarian tissues during vitrification depends more on the temperature of the cryoprotectant exposure than on the sucrose supplementation. Cryobiology 73, 187-195 (2016)].
В отличие от прототипа, в котором в качестве непроникающего криопротектора использовался поливинилпирролидон, мы предлагаем использование сахарозы. Выбор в ее пользу обусловлен следующими преимуществами. Как известно, сахара обеспечивают защиту клеток, стабилизируя плазматические мембраны посредством водородных связей во время замораживания. Кроме того, сахара защищают ткани и клетки от интенсивного осмотического шока во время оттаивания и удаления криопротекторов [Amorim, С.A., Curaba, М., Langendonckt, А. V., Dolmans, М.-М. & Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue. Reprod Biomed Online 23, 160-186 (2011)]. Исследования последних лет демонстрируют что высокомолекулярные соединения, типа поливинилпирролидона, обладают по сравнению с сахарами ограниченными функциями при выполнении витрификации [Yong, К. W., Laouar, L., Elliott, J. A. W. & Jomha, N. M. Review of non-permeating cryoprotectants as supplements for vitrification of mammalian tissues. Cryobiology 96, 1-11 (2020)].
Кроме того, мы не считаем необходимым добавление компонентов крови, в том числе белков плазмы к раствору криопротекторов. Их включение в смесь было оправдано при использовании методов медленного замораживания, когда было необходимо обеспечить ткань энергетическим субстратом на продолжительное время, в течение которого происходит постепенное охлаждение. При использовании витрификации, напротив, охлаждение образцов происходит со скоростью от нескольких сотен до тысячи градусов в минуту, что обесценивает использование протеиновых субстратов. Этот вывод подтверждается исследованиями, в которых проводилось прямое сравнение растворов для криоконсервации, отличающихся лишь наличием или отсутствием в своем составе сыворотки/белков. При их отсутствии, не наблюдалось сколько-нибудь заметного снижения жизнеспособности и/или функциональности тканей [Magalhaes, R. et al. Vitrification Successfully Preserves Hepatocyte Spheroids. Cell Transplant 17, 813-828 (2008)], [Kuleshova, L. L. et al. Effective Cryopreservation of Neural Stem or Progenitor Cells Without Serum or Proteins by Vitrification. Cell Transplant 18, 135-144 (2009)]. В целом, отказ от использования компонентов крови снижает риск инфекционных и иммуногенных реакций, а также конечную стоимость процедуры.
Кроме того, мы считаем благоприятным отказ от использования подложки (пластиковые криосоломинки, стальные детали) для образцов в ходе витрификации. Было продемонстрировано, что участки овариального кортекса, верифицированные в капельках среды демонстрируют более высокие показатели жизнеспособности фолликулов после оттаивания, чем при использовании подложки [Amorim, С.A., David, A., Langendonckt, А. V, Dolmans, М.-М. & Donnez, J. Vitrification of human ovarian tissue: effect of different solutions and procedures. Fertil Steril 95, 1094-1097 (2011)]. По-видимому, это связано с более высокой скоростью охлаждения, обеспечиваемой каплями среды, по сравнению с пластиковыми соломинками и устройствами из нержавеющей стали.
Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в повышении эффективности криоконсервации овариальной ткани, что достигается путем снижения токсичности используемых криопротекторов, исключение этапов, потенциально негативно влияющих на сохранности важных клеточных элементов, в первую очередь ооцитов и стромы. Вместе, эти шаги направлены на сохранение максимального числа интактных ооцитов, а значит пролонгации репродуктивного потенциала.
Способ оптимизации криоконсервации овариальной ткани для долгосрочного хранения осуществляются следующим образом. Суммируя вышеизложенное, конечная схема проводки образцов овариальной ткани выглядит следующим образом:
1. Полученные образцы овариальной ткани помещаются на 10 минут в стерильную пробирку типа Фалькон (объем 15 мл) с раствором комнатной температуры, содержащим 7,5% пропандиола-1,2+7,5% диметилсульфоксида в натрий-фосфатной буферной среде.
2. Затем образцы переносятся на 5 минут в стерильную пробирку типа Фалькон (объем 15 мл) с предохлажденным раствором (4°С), содержащим 20% пропандиола-1,2+20% диметилсульфоксида+0.5 М сахарозы в натрий-фосфатной буферной среде.
3. После этого овариальная ткань переносится в криовиалы (объем 1.8 мл) с добавлением 1 мл раствора для витрификации - 20% пропандиола-1,2+20% диметилсульфоксида+0.5 М сахарозы в натрий-фосфатной буферной среде.
4. Криовиала с образцами овариального кортекса, маркированная соответствующим образом, располагается в криобоксе и хранится в среде жидкого азота при температуре -196°С до востребования.
Способ разморозки образцов овариальной ткани после криоконсервации осуществляется следующим образом.
При возникновении необходимости разморозки, криовиалы с образцами достаются из сосуда с жидким азотом и немедленно помещаются в водяную баню с температурой 37°С на 5 секунд. Затем овариальная ткань погружаются последовательно в растворы с температурой 37°С с убывающей концентрацией сахарозы по следующей схеме:
1. 1М сахарозы в натрий-фосфатной буферной среде (1 минута)
2. 0.5М сахарозы в натрий-фосфатной буферной среде (1 минута)
3. 0.25М сахарозы в натрий-фосфатной буферной среде (1 минута)
4. Затем образцы окончательно отмываются в подогретом (37°С) физиологическом растворе (15 секунд). После этого образцы могут быть аутотрансплантированы.
Был проведен эксперимент на животных. В качестве экспериментальной модели были выбраны 10 крыс породы Wistar, в возрасте 6 недель, средней массой 308.7±35.2 гр.
Примеры, подтверждающие эффективность изобретения иллюстрированы фотографиями, на которых представлены срезы овариальной ткани крыс, где:
на фиг. 1 - показана группа исследования (аутореплантация криоконсервированной ткани);
на фиг. 2 - контрольная группа. Окраска гематоксилин/эозин, 1.10x1.6.
Ход эксперимента:
1. Лапаротомия. Оофорэктомия.
2. Криоконсервация ткани яичника.
3. Релапаротомия. Реплантация яичника.
4. Послеоперационное наблюдение.
5. Возвращение крыс в общую группу.
6. Получение потомства.
Разморозка и ортотопическая реплантация яичников проводилась спустя 22 дня после забора и криоконсервации. Срок хранения считается приемлемым, поскольку по достижению температуры хранения (-196°С) в животных тканях перестают происходить значимые изменения. Достижение температуры хранения при использовании витрификации происходило в предельно короткое время (охлаждение ткани происходило со скоростью от нескольких сотен до тысячи градусов в минуту). В таком состоянии ткань потенциально может хранится бессрочно.
По истечении послеоперационного периода (5 дней) крыс вернули в их привычную социальную среду, и они были допущены к разведению. В течение следующих 3 месяцев после реплантации яичника у 6 крыс из 10 наступила беременность. Родившиеся крысята имели нормальный вес при рождении и не демонстрировали видимых аномалий развития при дальнейшем наблюдении. По окончании эксперимента крысы из группы исследования были подвергнуты плановой эвтаназии. Реплантированная ткань яичника была исследована патоморфологически, для сравнения использовалась нативная ткань яичника крыс, не проходивших процедуру реплантации криоконсервированной ткани. При сравнении не было обнаружено значимых морфологических различий, реплантированная ткань яичника демонстрировала нормальное строение с сохранением фолликулов и стромальных элементов.
Эксперимент демонстрирует состоятельность данного изобретения и возможность его имплементации в клиническую практику. Использование способов позволит сохранить репродуктивную функцию у пациенток, получающих гонадотоксичное лечение.