ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БЕЛОК ПЕРТАКТИН, ВЕКТОР, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ТАКУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, И ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ БЕЛОК ПЕРТАКТИНА ИЛИ ВЕКТОР
POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE CODING STRUCTURED PERTACTIN PROTEIN; VECTOR INCLUDING SUCH SEQUENCE; AND VACCINE COMPOSITIONS CONTAINING PERTACTIN PROTEIN OR VECTOR

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Bordetella pertusis.
B. pertussis
Настоящее изобретение относится к области биомедицины. Оно включает получение сконструированного белка Пертактина (Prn) и его применение в качестве части противобактериальных вакцин, а более конкретно, в качестве части бесклеточных вакцин против Сконструированные молекулы Prn включают в своей структуре полиморфизмы из различных штаммов  и индуцируют иммунные ответы с повышенной защитной способностью и опсонофагоцитирующей активностью, при тестировании в качестве вакцин, превышающими соответствующие показатели предшествующих вакцин.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Pertussis
Bordetella pertussis
Коклюш или  является острым, крайне инфекционным заболеванием дыхательных путей, вызываемымбактерией , микроорганизмом, впервые выделенным Борде и Жангув 1906 году [Bordet, J. and O. Gengou. Ann Inst Pasteur (Paris), 1906. 20: p.731-41]. Недавно ежегодную заболеваемость данной инфекцией во всем мире оценивали на уровне 48,5 миллионов. Заболевание особенно тяжело протекает у детей младше шести месяцев, причем с данной возрастной группой связано 90% смертельных случаев (300000-400000) [Crowcroft, N.S., et al. Lancet Infect Dis, 2003. 3(7): p. 413-8].
B. pertussis
B. pertussis
Против доступно несколько вакцин, которые относятся к двум основным группам согласно их типу: клеточные вакцины и недавно появившиеся бесклеточные вакцины. Вакцинация существенно уменьшает частоту возникновения болезни, сдвигая ее от детей к подросткам и взрослым. В ряде исследований подростки указаны в качестве основного резервуара  и главного источника для распространения данного заболевания среди частично защищенных детей. Таким образом, коклюш остается нерешенной проблемой здравоохранения, которая требует разработки новых вакцин для лучшего контроля эпидемий и внезапных вспышек, а также возможной ликвидации данного заболевания в эндемичных областях [Cherry, J.D. Pediatrics, 2005. 115(5): p. 1422-7; Singh, M. and K. Lingappan, Chest, 2006. 130(5): p. 1547-53].
Bordetella
B. holmesii
B. bronchiseptica
B. parapertussis
B. pertussis
Bordetella
Род включает девять видов, четыре из которых ассоциированы с инфекциями у млекопитающих (,, и), причем последние два ответственны за инфекции у людей [Mattoo, S., et al. Front Biosci, 2001. 6: p. E168-86]. Большинство их факторов вирулентности регулируется на транскрипционном уровне двухкомпонентной системой, называемой BvgA/S (Активатор/Сенсор генов вирулентности ) [Stibitz, S., et al. Nature, 1989, 338(6212): p. 266-9]. Среди них наиболее важными факторами являются токсиныкоклюша (PT), фактор трахеальной колонизации, аденилатциклаза, а также адгезины - филаментозный фитогемагглютинин (PHA), фимбрии (Fim) и пертактин (Prn), причем последний является целью настоящего изобретения.
B
bronchiseptica
B
pertussis
B
parapertussis
B.
pertussis
Prn является наружным мембранным белком, принадлежащим к семейству аутотранспортных белков типа V. Он отличается тем, что катализирует свой собственный транспорт через наружную бактериальную мембрану [Henderson, I.R.Trends Microbiol, 2000, 8(12): p. 534-5]. Зрелый Prn представляет собой белок массой 68 кДа у . [Henderson, I.R. Trends Immun, 2001. 69 (3): p. 1231-43], 69 кДа у . [Charles, I.G., et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(10): p. 3554-8] и 70 кДа у . [Li, L.J., et al. Mol Microbiol, 1991, 5(2): p. 409-17], соответственно. Его структура состоит из 16 параллельных нитей, формирующих β-спираль и поперечную секцию V-образной формы [Emsley, P., et al. Nature, 1996. 381(6577): p. 90-2]. Из данного геликоидального ядра выступают многочисленные петли. Одной из них является триплет Arg-Gly-Asp (RGD), мотив, ассоциируемый с адгезией к тканям [Leininger, E., et al. Infect Immun, 1992, 60(6): p. 2380-5; Emsley, P., et al. Nature, 1996, 381(6577): p.90-2]. Присутствие указанного мотива и многочисленных богатых пролином областей связано с функциями Prn в процессе адгезии. Эксперименты показали, что Prn может опосредовать адгезию к клеткам респираторного эпителия [Everest, P., et al. Microbiology, 1996, 142 (Pt 11): p. 3261-8]. Однако тесты на ингибирование при воздействии человеческой сыворотки адгезии  к культивируемым клеткам A549 (альвеолярного эпителия человека) не подтвердили роль Prn как ключевого компонента в ходе указанного процесса в условиях теста [Rodriguez, M.E., et al. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006, 46(1): p. 39-47].
Белок Prn является частью бесклеточных вакцин, состоящих из трех или более компонентов. Бесклеточные вакцины могут состоять из: 1) одного компонента - PT, 2) двух компонентов - PT и PHA, 3) трех компонентов - PT, PHA и Prn и 4) пяти компонентов, включая вышеуказанные три компонента, а также фимбриальные белки 2 (Fim2) и 3 (Fim3). У людей уровни антител к Prn, Fim2 и PT коррелируют с уровнями защиты против болезни [Cherry, J.D., et al. Vaccine, 1998, 16(20): p. 1901-6; Storsaeter, J., et al. Vaccine, 2003, 21(25-26): p. 3542-9].
B. pertussis
B
bronchiseptica
B. pertussis.
B. pertussis
Активная иммунизация с применением Prn и . вызывает специфичный иммунный ответ против Prn, обеспечивающий защиту в различных моделях на животных [Charles, I.G., et al. Eur J Immunol, 1991, 21(5): p. 1147-53; Roberts, M., et al. Vaccine, 1992, 10(1): p. 43-8]. Аналогично, пассивное введение моноклональных антител против Prn (mAbs) защищало мышей в модели респираторного заражения [King, A.J., et al. Microbiology, 2001, 147(Pt 11): p. 2885-95]. Уровни защиты у мышей, подвергнутых тесту с интраназальным заражением (INCA), были увеличены при добавлении Prn к вакцинам, содержащим PT и PHA [Guiso, N., et al. Vaccine, 1999, 17(19): p. 2366-76]. Недавно было показано, что Prn является единственным компонентом бесклеточных вакцин, который индуцирует выработку антител такого уровня, который коррелирует с опсонофагоцитирующей активностью [Hellwig, S.M., et al. J Infect Dis, 2003, 188(5): p. 738-42]. Несмотря на доступные эффективные вакцины и общепринятые программы вакцинации, коклюш все еще является эндемичным в некоторых областях Америки, Европы и Азии и рассматривается как повторно возникающее заболевание [Raguckas, S.E., et al. Pharmacotherapy, 2007, 27(1): p. 41-52]. Одна из гипотез, пытающихся объяснить это явление, основана на потере эффективности в результате появления резистентных штаммов [Mooi, F.R. et al. Emerg Infect Dis, 2001, 7(3 Suppl): p. 526-8]. Prn является одним из наиболее полиморфных белков в Он содержит две вариабельные области, обозначенные как область 1 (R1) и 2 (R2), соответственно, которые содержат повторяющиеся аминокислотные последовательности, богатые пролинсодержащими мотивами Gly-Gly-X-X-Pro (GGXXP) и Pro-Gln-Pro (PQP). Область R1 расположена в выступающей петле, расположенной вблизи аминоконцевой последовательности (N-концевой) и рядом с RGD мотивом, тогда как область R2 расположена вблизи карбокси-конца (C-конца) [Hijnen, M., et al. Infect Immun, 2004, 72(7): p. 3716-23]. В идентифицировали до 12 различных вариантов Prn (Prn1, Prn2, Prn3...Prn12), которые можно найти в базе данных Национального центра биотехнологической информации Соединенных Штатов Америки (NCBI). Штаммы, несущие Prn1, Prn2 и Pm3, распространены во всем мире. В различных регионах Америки, Европы, Азии и Австралии проводили многочисленные исследования свойств штаммов или ретроспективные анализы штаммов, циркулирующих в настоящее время, которые показали тенденцию к прогрессирующей персистенции штаммов Prn2 по сравнению со штаммами Prn1, причем штаммы Prn2 преобладали в большинстве стран, в которых проводили исследования [Mooi, F.R., et al. Infect Immun, 1998, 66(2): p. 670-5; Cassiday, P et al. J Infect Dis, 2000, 182(5): p. 1402-8; Weber, С et al. J Clin Microbiol, 2001, 39(12): p. 4396-403; Hallander, H.O., et al. J Clin Microbiol, 2005, 43(6): p. 2856-65; van Amersfoorth, S.C., et al. J Clin Microbiol, 2005, 43(6): p. 2837-43; Byrne, S, et al. BMC Infect Dis, 2006, 6: p. 53].
B.
pertussis
prn, ptxC, ptxA
tcfA2
Bordetella
B. pertussis
Текущие различия в аминокислотной последовательности Prn между клеточными (DTPc) или бесклеточными вакцинами (DPTa) и циркулирующими штаммами служат одним из факторов, поддерживающих гипотезу потери эффективности доступных вакцин, обусловленной появлением новых штаммов. Исследования, проведенные в Нидерландах и Италии, в популяциях, вакцинированных DPTc или DTPa, а также в невакцинированных популяциях, показали, что данные типы вакцин защищают лучше против циркулирующих штаммов, аналогичных штамму, на основе которого получены вакцины [Mooi, F.R., et al. Infect Immun, 1998, 66(2): p. 670-5; Mastrantonio, P., et al. Microbiology, 1999, 145 (Pt 8): p. 2069-75]. В соответствии с указанными данными, в модели на мышах было показано, что вакцинация DPTc дифференцированно защищает против штаммов, несущих Prn1 и Prn2, что указывает на то, что изменения в R1 области Prn могут придавать резистентность [King, A.J., et al. Microbiology, 2001. 147(Pt 11): p. 2885-95]. Впрочем, обширные исследования с распределением штаммов в зависимости от страны происхождения, статуса вакцинации и типа вакцин (DPTc и DPTa) не выявили существенных различий в частотеаллелей  или для циркулирующих штаммов и программ вакцинации [van Amersfoorth, S.C., et al. J Clin Microbiol, 2005, 43(6): p. 2837-43]. Высокий уровень распространения штаммов Prn2 во многих странах является показателем преимущественной передачи указанных штаммов все еще неизвестными путями, хотя полученные данные, упомянутые выше, едва ли связаны с возникновением новых вариантов вакцинации. Примечательно, что в вышеупомянутом исследовании [van Amersfoorth, S.C., et al. J Clin Microbiol, 2005, 43(6): p. 2837-43] три клинически выделенных штамма, несущих аллели, подобные аллелям в используемых вакцинах, были найдены лишь у невакцинированных детей. Является ли это случайным, или нет, это указывает, что Prn1 штаммы преобладают в нишах, лишенных специфического иммунитета. С другой стороны, недавняя идентификация фага, инфицирующего (BPP-1) при использовании Prn в качестве первичного рецептора, позволяет предположить, что изменения в данном белке могли быть вызваны селективным прессом, отличным от воздействия иммунной системы [Liu, M., et al. Science, 2002, 295(5562): p. 2091-4]. Не исключены также возможные влияния обоих явлений в сочетании с другими неизвестными факторами, что ведет к согласованным изменениям в.
Развитие эпидемиологии коклюша моделировали с помощью математической модели, независимо объединяя частоту возникновения болезни и передачу патогена [Aguas, R., et al. Lancet Infect Dis, 2006, 6(2): p. 112-7]. Данная модель прогнозирует, что регулярные растущие дозы не способны к устранению тяжелых форм заболевания, наблюдаемых в текущих эпидемиях. Весьма вероятно, что это обусловлено короткой продолжительностью защиты, обеспечиваемой доступными бесклеточными вакцинами (4-12 лет), а также изменчивостью иммунного ответа и различными типами вакцин. Данная модель в наиболее оптимистическом сценарии прогнозирует, что если вакцины могут обеспечить иммунитет, превосходящий естественный, то доступные клеточные и бесклеточные вакцины эталона все еще не достигают.
Главная цель настоящего изобретения состоит в содействии разработке более эффективных бесклеточных вакцин против коклюша. Основная работа, предшествующая настоящему изобретению, была основана на введении иммуногенных препаратов, полученных посредством смешивания белков Prn (Nicole Guiso et al., WO 01/90143 A2 и US 2006/0008474 A1) или синтетических пептидов R1 области Prn (Frederik Mooi et al., WO 02/00695 A2). Таким образом, разработка более эффективных бесклеточных вакцин является важной проблемой, решение которой позволит предотвратить коклюш.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
prnA
B. pertussis
Настоящее изобретение способствует решению вышеперечисленных проблем и включает конструированиегена, кодирующего наружный мембранный белок, называемый пертактином (Prn). Настоящее изобретение удовлетворяет потребности, существующие в уровне техники, делая возможным получение различных вариантов сконструированного Prn таким способом, что они включают в своей структуре две различных полиморфных домена R1 области Prn. Универсальность изобретения также охватывает создание новых молекул Prn, дополнительно включающих три или более различных полиморфных доменов R1 области Prn.
Предметом настоящего изобретения является полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный белок Prn, который включает до 300 первых аминокислот, ближайших к N-концу природного, зрелого Prn данного типа (PrnX300), и аминокислотную последовательность, включающую до 620 аминокислот, ближайших к C-концу природного, зрелого Prn данного типа (PrnY620), формирующие сконструированный белок PrnX300-PrnY620Prn.
В рамках настоящего изобретения термин "сконструированный Prn" относится к белку, получаемому в результате присоединения, с непосредственным примыканием или нет, фрагмента, включающего до 300 первых аминокислот, ближайших к N-концу данного природного, зрелого белка Prn, к другому фрагменту, включающему последние 620 аминокислот, ближайших к C-концу природного, зрелого белка Prn.
Новые сконструированные варианты Prn получены посредством молекулярного мутагенеза, путем непосредственного присоединения последовательностей, включающих до 300 первых аминокислот, ближайших к N-концу природного, зрелого Prn данного типа, к последовательностям, включающим до 620 последних аминокислот, ближайших к C-концу природного, зрелого Prn данного типа. Новые варианты сконструированного Prn включают последовательности из одного или из различных типов Prn в одной молекуле, без воздействия на защитный иммунный ответ.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получают различные варианты сконструированного Prn, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот, определенных в SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:6. При иммунизации мышей различными вариантами сконструированного Prn были получены высокозначимые уровни защиты и опсонофагоцитирующей активности, превышающие соответствующие уровни, полученные с природными молекулами Prn, включенными в композицию отдельно или в виде смесей. Иммунный ответ, индуцированный сконструированным Prn, был одинаково эффективен против штаммов, экспрессирующих различные типы Prn.
Bordetella.
B. pertussis
B. parapertussis
B. pertussis.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент, включающий первые 300 аминокислот, ближайших к N-концу природного, зрелого Prn данного типа, обозначенный PrnX300, соответствует Prn изрода В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный фрагмент соответствует молекулам Prn из или, предпочтительно Prn1, Prn2 и Prn3 вариантам
Bordetella.
B. pertussis
B. parapertussis
B. pertussis.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения последние 620 аминокислот, ближайших к C-концу природного, зрелого Prn данного типа, обозначенного PrnY620, соответствуют Prn изрода В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный фрагмент соответствует молекулам Prn изили, предпочтительно Prn1, Prn2 и Prn3вариантам
Полинуклеотидная последовательность настоящего изобретения кодирует полипептидную последовательность, включающую любую возможную комбинацию типов Prn в формате PrnX300-PrnY620.
Аминокислотные последовательности PrnX300 и PrnY620, кодируемые полинуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, соединены непосредственно или с использованием аминокислотной последовательности IDNATWVMTDN или IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN.
В настоящем изобретении аминокислотные последовательности PrnX300 и PrnY620 могут быть лишены повторяющихся последовательностей, предпочтительно GGXXP, и последовательностей PQP из областей R1 и R2. Основания, подтверждающие данную конструкцию, являются следующими: Область 1 (R1), включающая повторяющуюся последовательность GGXXP, слабо узнается человеческой и кроличьей сыворотками, что указывает на то, что данная область не является антигенной детерминантой [Hijnen, M., F. R. Mooi, et al. (2004), Infect Immun 72(7): 3716-23]. С другой стороны, в недавно опубликованной работе сообщали о мутантах Prn, в которых повторяющиеся последовательности GGXXP и PQP, или области, содержащие указанные последовательности, были делетированы. Делеции GGXXP не затрагивали физико-химические свойства полученных мутантных молекул Prn, как свидетельствуется в подобных методах, используемых для экспрессии и очистки мутантных и немутантных белков Prn [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005), Protein Expr Purif 41(1): 106-12]. Аналогичным образом, делеции последовательностей GGXXP существенно не затрагивали структурные свойства, так как молекулы Prn, мутированные в R1, хорошо узнавались mAbs, индуцированными против конформационных эпитопов в природных молекулах Prn, а также не узнавались mAbs к GGXXP, направленными против линейных эпитопов GGXXP. Кроме того, наблюдали, что некоторые мутации внутри R1 могут увеличивать способность связывания с некоторыми mAbs против конформационных эпитопов. Наконец, были свидетельства, указывающие, что R1 (GGXXP) и R2 (PQP) формируют один эпитоп [Hijnen, M., R. de Voer, et al. (2007), Vaccine 25(31): 5902-14].
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные полинуклеотидные последовательности кодируют сконструированный Prn, где указанные аминокислотные последовательности PrnX300 и PmY620 включают гетерологичные пептиды, способные функционировать как эпитопы для T-хелперных клеток, выделенные из дифтерии, столбняка, вируса гепатита B (HBV), полиовирусов, осповакцины, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вируса гриппа человека. Специалистам, квалифицированным в данной области, известно, что иммунный ответ против данного антигена может быть усилен при включении в него эпитопов указанного типа.
Дополнительный предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает полинуклеотидные последовательности по п. 1, которые могут быть оптимизированы по оптимальному применению кодонов с целью повышения экспрессии кодируемого белка в бактериях, дрожжах, клетках насекомых или млекопитающих. Достигаемое с помощью генно-инженерных методов повышение экспрессии кодируемых молекул хорошо известно специалистам, квалифицированным в данной области техники. В другом предпочтительном варианте осуществления новый белок, являющийся объектом настоящего изобретения, может являться одним из многих компонентов новой комбинированной вакцины, подчеркивая, что ни одно из предшествующих изобретений, не включало получение минимального количества молекулярных объектов, удовлетворяющих существующим требованиям в данной области техники.
B. pertussis
B. parapertussis
Bordetella
Bordetella
Наконец, потребность в препаратах вакцин, способных обеспечивать перекрестный иммунитет между и, более чем очевидна в уровне техники. Настоящее изобретение также включает создание сконструированных молекул Prn, включающих в одной структуре различные полиморфные области различных видов, на основании высокого уровня гомологии, существующих между белками Prn различных видов.
B. pertussis
Неожиданно, сконструированный Prn, являющийся объектом настоящего изобретения, не только способен индуцировать эффективный иммунный ответ против различных Prn1- и Prn2-экспрессирующихштаммов, но также индуцирует иммунные ответы, более эффективные по сравнению с иммунными ответами, индуцируемыми другими, не сконструированными рекомбинантными белками Prn, о чем свидетельствует модель респираторного заражения на мышах и анализ опсонофагоцитирующей активности. Неожиданно, иммунный ответ, индуцированный сконструированным Prn, превосходил иммунный ответ, индуцированный эквимолярной смесью Prn1 и Prn2 (Prn1+Prn2).
Вакцинные композиции, полученные путем смешивания различных белков Prn одних и тех же или различных видов, охватывая также полиморфизмы, приводят к техническим сложностям, связанным с новыми способами производства, таким как повышение концентрации нежелательных примесей и производственное различие между партиями. Существенным аспектом является разработка комбинированных вакцин, состоящих из множества антигенов с совершенно разными свойствами, которые могут ухудшить системную иммуногенность композиции. С другой стороны ожидается, что стратегии, основанные на синтетических пептидах R1 области, могут привести к вакцинам, обладающим меньшей эффективностью, чем вакцины, доступные в настоящее время, в результате исключения других эпитопов, присутствующих в природном Prn, из антигена, подходящего для развития иммунного ответа.
Bordetella
B. pertussis.
Для выполнения указанного нерешенного требования в данной области техники, настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, включающую один или более сконструированных Prn, кодируемых полинуклеотидными последовательностями по пп. 1-13, в количествах, достаточных для развития гуморального и клеточного иммунных ответов, эффективных против видов, при введении, с применением методик иммунизации, млекопитающим и предпочтительно, людям. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция, включающая сконструированные варианты одного или более Prn, индуцирует гуморальный и клеточный иммунные ответы, эффективные против Кроме того, целью настоящего изобретения является живая или атенуированная вакцина, включающая один или более сконструированных вариантов Prn, кодируемых последовательностями по пп.1-13, где указанные сконструированные варианты Prn экспрессируются в наружной мембране живого или атенуированного организма. В указанной живой или атенуированной вакцине указанные полинуклеотидные последовательности по пп. 1-13 включены в плазмидный вектор или бактериальную хромосому.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные полинуклеотидные последовательности по пп. 1-13, которые кодируют сконструированные варианты Prn, включены в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный вектор экспрессии, который содержит полинуклеотидные последовательности по пп. 1-13, является основой для вакцины, содержащей нуклеиновые кислоты.
Bordetella
Bordetella
В другом варианте осуществления изобретения полипептидные последовательности, кодируемые указанными полинуклеотидными последовательностями по пп. 1-13, могут применяться для обнаружения инфекции. Кроме того, целью настоящего изобретения также является диагностический набор, предназначенный для обнаружения присутствия или отсутствия антител против, который включает полипептидные последовательности, кодируемые полинуклеотидными последовательностями, по пп. 1-13.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
B. pertussis
Фигура 1. Тест на защитные антитела в мышах Balb/c, вакцинированных различными вариантами сконструированного Prn. При заражении использовали штаммы Tohama I (Prn1) и клинический изолят CH53 (Prn2). Столбцы представляют средний логарифм снижения жизнеспособных бактериальных клеток в легких.
Фигура 2. Опсонофагоцитоз, опосредованный сыворотками из мышей Balb/c, вакцинированных различными сконструированными вариантами Prn. На диаграмме показано различие во флуоресценции (фикоэритрин, PE) в относительных единицах (AU) клеток, окрашенных флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) при двух режимах инкубирования (PE 4°C-PE 37°C).
Фигура 3. Гуморальный иммунный ответ IgG против Prn1 и Prn2CCPrn1, индуцированный в мышах, иммунизированных плазмидами, экспрессирующими сконструированные варианты Prn1, Prn2, Prn2CCPrn1 и Prn2CLPrn1.
Подробное описание вариантов осуществления/Примеры
Escherichia
coli
Пример 1. Конструирование векторов для внутриклеточной экспрессии в  различных сконструированных вариантов Prn и их очистка
prnA1
pmA2
Bordetella
B. pertussis
Гены  ииз штамма Tohoma I (Prn1) и CH53 (Prn2) амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) из геномной ДНК с использованием олигонуклеотидов, описанных ранее 1 и 2 [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005), Protein Expr Purif 41(1): 106-12].
Nde
Bam
Полученные фрагменты клонировали в вектор pET-28a (Novagen) по сайтам I и HI. Сконструированные варианты Prn получали с использованием метода ПЦР с обратной транскрипцией, описанного ранее Imai и сотрудниками в 1991 [Imai, Y., et al. Nucleic Acids Res, 1991, 19(10): p. 2785]. Нуклеотиды, используемые для амплификации различных полинуклеотидных последовательностей, представлены в Таблице 1. Пару олигонуклеотидов 1,2 использовали при линеаризации векторов pET28aprn1 и pETaprn2, соответствующих Prn1 и Prn2, соответственно. Фрагменты DomR1 получали посредством амплификации с олигонуклеотидами 3 и 4. Кроме того, указанную область амплифицировали с использованием нуклеотидных пар 3,5 и 3,6 для добавления последовательностей, кодирующих короткие и длинные линкеры, соответственно. Условия, используемые для амплификации ПЦР фрагментов, используемых в настоящем изобретении, приведены в Таблице 2.
Таблица 1Олигонуклеотиды, использованные для амплификации различных последовательностей
Номер
Название олигонуклеотида
Последовательность 5'→3'
Результат ПЦР амплификации
1
pET28aprn1 1401-30 LinVect
AGCGTGGAGCTCGCCCA GTCGATCGTCGAG
Линеаризовавший вектор с тупыми концами
2
pET28aprn1 1431-60 LinVect
GGAGCCCGATACGTCCA CGCCATACCAGCC
3
pET28aprn1 1975-97 DomR1
GTCAAGGCCGGCAAGCT GGTCGC
Домен R1 (DomR1) любого типа Prn
4
pET28aprn1 1431-53 DomR1
GGAGCCCGATACGTCCA CGCCAT
5
pET28aprn1 1431-53 DomR1 CC-Nt
ATCGACAACGCCACCTG GGTCATGACGGACAACG TCAAGGCCGGCAAGCTG GTCGC
Амплифицирует DomR1 из любого типа Prn, а также добавляет линкер из 11 аминокислот к N-концу
6
pET28aprn1 1431-53 DomR1 CL-Nt
ATCGACAACGCCACCTG GGTCATGACGGACAACA TCGACAACGCCACCTGG GTCATGACGGACAACGT CAAGGCCGGCAAGCTG
Амплифицирует DomR1 из любого типа Prn, а также добавляет линкер из 22 аминокислот к N-концу
Таблица 2Условия ПЦР-амплификации различных фрагментов, используемых в настоящем изобретении
Пара олигов
Темп. гибридизации (°C).
Матрица ДНК (мкг)
Время элонгации (мин)
Полимераза (Единицы)
Кол-во циклов
Продукт амплиф.
Размерамплиф.продукта(пн)
1,2
65
pET28aprn1 (1)
7,5
Pfx (2,5)
5
Линейный вектор
7370
1,2
65
pET28aPrn2 (1)
7,5
Pfx (2,5)
5
Линейный вектор
7385
3,4*
67
pET28aprn1 (0,1)
0,6
Pfu (2,5)
30
DomR1 prnl
567
3,4*
67
pET28aprn2 (0,1)
0,6
Pfu (2,5)
30
DomR1 prn2
582
3,5*
67
DomR1 prn1 (0,1)
0,6
Pfu (2,5)
30
CC-DomR1Prn1
600
3,6*
67
DomR1 prnl (0,1)
0,6
Pfu (2,5)
30
CL-DomR1Prn1
633
3,5*
67
DomR1 prn2 (0,1)
0,6
Pfu (2,5)
30
CC-DomR1prn2
620
3,6*
67
DomR1 prn2 (0,1)
0,6
Pfu (2,5)
30
CL-DomR1prn2
648
* фосфорилированные олигонуклеотиды, СС: Короткий линкер, CL: Длинный линкер
E. coli
Линеаризованные векторы pET28aprn1 и pET28aprn2, полученные обратным ПЦР, лигировали с различными фрагментами, кодирующими домены, содержащие область 1 из Prn1 и Prn2. В данных векторах новые сконструированные гены находятся под транскрипционным контролем индуцируемого T7 промотора. Клоны, несущие правильные последовательности, вводили в штамм  BL21-Codonplus (DE3)-RP для экспрессии соответствующих белков в виде телец включения [Hijnen, M., et al. Protein Expr Purif, 2005, 41(1): p. 106-12].
Уровни экспрессии рекомбинантных Prn1 и Prn2, также как и других вариантов, достигали 15-20% от количества суммарного белка, что подтверждали денситометрией в полиакриламидных гелях, окрашенных Кумасси синим.
Различные белки очищали суспендированием бактериальной пасты для каждого варианта в буфере для разрушения (при концентрации клеток 100 мг/мл), после чего клетки разрушали ультразвуком. Осадки разрушенных клеток растворяли в 8 М мочевине и фракционировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ, 12,5%). Гель окрашивали обратным цинк-имидазольным окрашиванием, затем вырезанную полоску геля, содержащую полосу, соответствующую целевому белку, пропускали через сито из нержавеющей стали с ячейками 100 мкм в присутствии экстракционного буфера. Затем белок экстрагировали, ренатурировали и концентрировали с помощью ультрафильтрации через концентратор Amicon с мембраной 50 кДа, и определяли конечную концентрацию с помощью бихинолинового кислотного метода. При анализе 15 мкг каждого белка, очищенного из гелей аналитического ДСН-ПААГ, окрашенных Кумасси синим, примесей не обнаружили, что свидетельствует о том, что препараты белков были чистыми более чем на 95%. Характеристики различных конструкций и полученных сконструированных вариантов Prn представлены в Таблице 3.
Таблица 3Характеристики различных конструкций Prn и сконструированных вариантов Prn
Название плазмиды
ЛинкермеждуDomR1
Название сконструированного Prn
Тип Prn
Характеристики сконструированного Prn
pET28aprn1
Нет
Prn1
1
-
pET28aPrn2
Нет
Prn2
2
-
pETprn DomR1 (1-2)
Нет
Prn1-Prn2
1,2
Nt..DomR1(Prn1)-D-DomR1(Prn2)..Ct
pETprn DomR1 (1-CC-2)
IDNATWVMTDN
Prn1-CC-Prn2
1,2
Nt..DomR1(Prn1)-СС-DomR1(Prn2)..Ct
pETprn DomR1 (1-CL-2)
IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN
Prn1-CL-Prn2
1,2
Nt..DomR1(Prn 1)- CL-DomR1(Prn2)..Ct
pETprn DomR1 (2-1)
-
Prn2-Prn1
1,2
Nt..DomR1(Prn 2)-DomR1 (Prn 1)..Ct
pETprn DomR1 (2-CC-1)
IDNATWVMTDN
Prn2-CC-Prn1
1,2
Nt..DomR1(Prn 2)- СС-DomR1(Prn1)..Ct
pETprn DomR1 (2-CL-1)
IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN
Prn2-CL-Prn1
1,2
Nt..DomR1(Prn 2)- CL-DomR1(Prn1)..Ct
Пример 2. Активная иммунизация, ответ антитела и защита в модели на мышах

3
4
.
Мышей иммунизировали 0,2 мкг или 0,02 мкг сконструированного Prn1 и Prn2, PBS, эквимолярной смесью Prn1 и Prn2 (Prn1+Prn2) и шестью сконструированными вариантами Prn (показанными в Таблице 3). Все белки вводили в форме препарата в квасцах. Дозы соответствовали 1/40 и 1/400 частям дозы, обычно применяемой на людях (Infanrix, 8мкг) Мышей иммунизировали подкожным введением в объеме 100 мкл. Сыворотки от иммунизированных мышей оценивали с помощью иммуноферментного анализа по типу ELISA. Титры антител достигали средних значений от 1,2×10 до 4,6×10. Средние значения титров, соответствующих максимальным дозам, значительно отличались от титров, достигнутых с минимальными использованными дозами во всех случаях (p<0,05, критерий Крускала-Уоллиса-Данна). В иммунном ответе, полученном с Prn1, Prn2 или эквимолярной смесью Prn1+Prn2, различий не наблюдали. Аналогично, не наблюдали каких-либо различий между средними титрами различных сконструированных вариантов Prn. Неожиданно, титры, полученные со сконструированными вариантами Prn, значительно превышали титры, полученные с не сконструированными рекомбинантными белками Prn (p<0,01, критерий Крускала-Уоллиса-Данна).
8
6
Штамм Tohama I (Prn1) и клинический изолят CH53 (Prn2) использовали для интраназального заражения. Бактерии культивировали на чашках, содержащих агар Борде-Жангу (Sigma) с добавкой 1% глицерина и 14% дефибринированной крови козы. Чашки инкубировали в течение 24 ч при 37°C, а полученные колонии суспендировали в среде Stainer-Scholte до концентрации 10 клеток/мл. Полученную суспензию использовали для интраназального заражения. Иммунизированных мышей заражали через 15 дней после последней иммунизации путем инстилляции 50 мкл бактериальной суспензии (5×10 клеток). Через пять дней после заражения мышей умерщвляли и в асептических условиях извлекали и гомогенизировали легкие с целью определения бактериальной массы [Denoel, P., et al. Vaccine, 2005, 23(46-47): p. 5333-41]. Различные варианты показали уровни защиты, значительно превышавшие уровни у невакцинированных контрольных животных (p<0,001). Неожиданно, сконструированные варианты Prn показали более высокие уровни защиты при сравнении с рекомбинантными белками Prn или эквимолярной смесью Prn1+Prn2 для обоих штаммов (p<0,001).
Сконструированные варианты Prn показали аналогичные уровни защиты против обоих штаммов при минимальной введенной дозе, эффект, не достигнутый с белками Prn1 или Prn2. Полученные результаты свидетельствуют, что указанные сконструированные варианты Prn обладают иммунологическими свойствами, отличными от свойств, показанных рекомбинантными белками Prn1 и Prn2, и превышающими их, при анализе обоих в отдельности, или в виде эквимолярной смеси (Фигура 1).
Пример 3. Опсонофагоцитирующая активность в сыворотках
B. pertussis
6
Опсонофагоцитирующая активность, опосредуемая сыворотками против Prn, как было показано, является ключевым параметром в ответе людей, вакцинированных бесклеточными вакцинами [Hellwig, S.M., et al. J Infect Dis, 2003, 188(5): p. 738-42]. В настоящем изобретении показано, что различные сконструированные варианты Prn способны индуцировать антитела с подобными свойствами. Опсонофагоцитирующую активность анализировали с помощью ранее упомянутого метода, адаптированного к модели на мышах. Штаммы Tohama I и CH53 выращивали на агаре Борде-Жангу и окрашивали клетки с использованием ФИТЦ (2×10 колониеобразующих единиц). Затем меченые бактерии опсонизировали в течение 30 минут при 37°C в планшетном шейкере с сыворотками мышей, иммунизированных рекомбинантными Prn1, Prn2, Prn1+Prn2 и двумя вариантами сконструированных белков Prn (Prn2-CC-Prn1 и Prn2-CL-Prn1). В ходе стадии адгезии опсонизированные бактерии и неопсонизированный контроль инкубировали с полиморфноядерными клетками (ПМЯ). Затем образцы разделяли на две равные подгруппы клеток, одни инкубировали в течение еще 45 минут при 4°C, а другие - при 37°C. После этого все образцы инкубировали еще в течение 30 минут при 4°C с меченым PE козьим конъюгатом против антитела мыши. Образцы анализировали с помощью проточной цитометрии (PARTEC PAS III). Интенсивность флюоресценции окрашенных в зеленый и красный цвет клеток, инкубированных при 4°C, использовали в качестве контроля адгезии. Различие красной флюоресценции окрашенных в зеленый цвет клеток использовали для подтверждения фагоцитной активности, опосредованной сыворотками.
Сконструированные варианты Prn демонстрировали опсонофагоцитирующую активность (Фигура 2). Неожиданно, наблюдали существенные различия только в группах, иммунизированных сконструированными вариантами Prn, при сравнении с мышами, которым вводили PBS (p<0,05, Крускал-Уоллис-Данн). Опсонофагоцитирующая активность сывороток, индуцированных рекомбинантным, несконструированным белком Prn, в отдельности или в комбинации, достигла значений, превышающих в 6 раз контроль PBS, хотя указанные различия не были существенными. Наконец, полученные результаты подтверждали, что сконструированные варианты Prn способны индуцировать антитела с существенной опсонофагоцитирующей активностью, независимо от типа Prn, присутствующего в бактерии.
Пример 4. Конструирование векторов для экспрессии в клетках млекопитающих сконструированных вариантов Prn и оценка полученного гуморального иммунного ответа
prnA1
prnA2
prn2CCprn1
prn2CLprn1
Nde
Bam
Bam
Гены и, а также вариантыгенов  и амплифицировали ПЦР из их соответствующих векторов экспрессии (см. таблицу 3) с использованием олигонуклеотидов 1 и 2, описанных ранее [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005), Protein Expr Purif 41(1): 106-12]. В данном случае олигонуклеотид 1 был модифицирован с заменой сайта рестрикцииI сайтом HI. Полученные фрагменты клонировали по сайтам рестрикцииHI в плазмидный вектор pAEC-SPE3 [Herrera AM, Rodriguez EG, et al. (2000) BBRC, 279, 548-551]. Указанный вектор разработан для внеклеточной экспрессии антигенов в клетках млекопитающих. Полученные конструкции очищали с использованием коммерческого набора для очистки плазмидной ДНК Endo-free plasmid Giga (Qiagen). Группы 6-7-недельных самок мышей Balb/c иммунизировали трижды 100мкг ДНК в 100 мкл PBS с трехнедельным интервалом, внутрибрюшинно. Контрольную группу иммунизировали пустым вектором без вставки (pAEC-SPE3). Через пятнадцать дней после последней иммунизации мышей умерщвляли и забирали кровь для анализа сывороток. Ответы с выработкой специфичных антител IgG оценивали методом ELISA в разведении 1/1000 на планшетах, покрытых эквимолярными количествами белков Prn1 (2 мкг/мл) и Prn2CCPrn1 (2,4 мкг/мл). Как показано на Фигуре 3, животные, иммунизированные различными плазмидами, экспрессирующими Prn1, Prn2, Prn2CCPrn1 и Prn2CLPrn1, вырабатывали специфичные антитела IgG со значительно более высоким уровнем (p<0,001), чем животные, иммунизированные пустым вектором pAEC-SPE3. Подобно сывороткам, полученным в мышах, иммунизированных белком и квасцами (данные не показаны), сыворотки иммунизированных мышей предпочтительно узнавали сконструированный вариант Prn Prn2CCPrn1 (p<0,05) в большей степени, чем природный белок Prn1, что могло быть обусловлено лучшей доступностью общих эпитопов в Prn2CCPrn1 по сравнению с Prn1.