Кормовая добавка для сельскохозяйственной птицы
FEED ADDITIVE FOR POULTRY

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности, к кормовым добавкам для сельскохозяйственных птиц с целью повышения их иммунобиологической резистентности. Работы проведены с использованием оборудования ЦКП «Протеомный анализ» ФИЦ ФТМ, поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение №075-15-2021-691).
6
8
Известна кормовая добавка для птицеводства и способ выращивания птицы, содержащая комплекс биологически активных веществ и состоящая из биомассы и/или культуральной жидкости, полученной при культивировании гриба Medusomyces Gisevii Lindau в смеси с пробиотиком "Бифидобактерин", взятым в концентрации 10-10 КОЕ/мл (г) в хитинсодержащей питательной среде, содержащей в качестве источника хитина порошок подмора пчел. Скармливание кормовой добавки птице обеспечивает повышение физиологического и иммунного статуса организма птицы, устраняет дефицит аминокислот, витаминов и микроэлементов в рационе кормления птицы, обеспечивает повышение усвояемости кормов, стимулирование привесов и повышение продуктивности птицы. Несмотря на заявленное в техническом результате повышение иммунного статуса организма птицы, эффект стимуляции иммунной системы в описании изобретения не показан [патент на изобретение РФ №2574691 «Кормовая добавка для птицеводства и способ выращивания птицы». МПК А23К 1/16, опубл. 10.02.2016 Бюл. №4].
Известна кормовая композиция для животных и птицы (в том числе для цыплят-бройлеров), включающая биологически активный комплекс в качестве бесклеточного пробиотика, содержащего смесь стерильных культуральных жидкостей бактерий Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ (ВКПМ № В-11007) и Bacillus subtilis штамм М-8 (ВКПМ № В-1948), взятых в объемном соотношении 1:1, в качестве пребиотика - жидкий стерильный автолизат мицелия гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3 (ВКПМ № F-867), а в качестве сухой биологически активной добавки - сухую биомассу гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3 (ВКПМ № F-867) [патент РФ №2538116 «Биологически активный комплекс на основе бесклеточного пробиотика, кормовая композиция его содержащая, и способ кормления молодняка сельскохозяйственных животных и птицы». МПК А23К 1/16, опубл. 10.01.2015 Бюл. №1]. Заявленная композиция позволяет повысить сохранность цыплят бройлеров, индекс продуктивности, однако, несмотря на заявленное в техническом результате повышение иммунного статуса, в описании изобретения отсутствуют данные о достижении указанного результата.
Известна кормовая добавка для птицеводства, включающая в качестве комплекса биологически активных веществ биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма гриба Fusarium sambucinum ВКПМ № F-867, или биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма гриба Fusarium sambucinum ВКПМ № F-867, в смеси с пробиотиком Авилакт-1K. [патент РФ №2286066 «Кормовая добавка для птицеводства и способ выращивания птиц». МПК А23К 1/16, опубл. 27.10.2006 Бюл. №30]. Указанная кормовая добавка повышает прирост живой массы на 12-14%, увеличивает сохранность поголовья на 5-7%, улучшает мясные и убойные качества цыплят, повышает в 2-3 раза приживляемость лактобактерий в кишечнике птицы, однако заявленное в техническом результате повышение иммунного статуса организма птицы не подтверждено материалами описания изобретения.
Известна кормовая добавка для сельскохозяйственной птицы, включающая в качестве растительного стимулятора организма при пониженном иммунитете крапиву двудомную, анисовое масло, тимьяновое масло, корень горечавки, чеснок. В качестве связующего звена кормовая добавка содержит пшеничные отруби. Все компоненты взяты в определенном соотношении [патент РФ №2549295 «Кормовая добавка для сельскохозяйственной птицы». МПК А23К 1/16, А23К 1/00, опубл. 27.04.2015 Бюл. №12]. Кормовая добавка обеспечивает неспецифическое иммуностимулирующее действие и повышение резистентности животных к различным возбудителям инфекционных заболеваний (вирусам, бактериям, грибам и гельминтам). Технический результат заключается в повышении иммунного статуса. Недостатком известного средства является то, что о показателе иммунного статуса судили по размеру тимуса, что является лишь косвенной оценкой иммунного статуса птицы.
Наиболее близкой к заявленной является биологически активная добавка к кормам сельскохозяйственных животных и птицы и способ повышения резистентности животных к различным возбудителям вирусных и бактериальных заболеваний. Биологически активная добавка содержит: "Споровит" - 99,97-99,94%; левамизол (соединение из группы имидазола, обладающее противогельминтным и иммуномодулирующим действием) - 0,03-0,06%. "Споровит" является пробиотиком, включающим взвесь живых бактерий Bacillus subtilis штамма 12В, обладает комплексным, в том числе иммуностимулирующим действием. Левамизол - соединение из группы имидазола, обладающее противогельминтным и иммуномодулирующим действием. Способ включает применение биологически активной добавки в количестве от 50 до 100 мл на 1 кг комбикорма используют в течение от 2-х недель до 2-х месяцев [патент RU 2310339 «Биологически активная добавка к кормам сельскохозяйственных животных и птицы и способ повышения резистентности животных к различным возбудителям вирусных и бактериальных заболеваний». МПК А61К 1/00, А61К 35/66, А61К 31/00, А61Р 37/00, опубл. 20.11.2007 Бюл. №32]. Известное средство повышает массу тела птиц, стимулирует неспецифические механизмы иммунитета, заключающиеся в повышении активности комплемента, фагоцитарного индекса. Недостатком кормовой добавки, описанной в патенте-прототипе, является ее недостаточное влияние на иммунную систему. В частности, при стимулирующем эффекте на активность комплемента фагоцитарный индекс, отражающий поглотительную способность фагоцитов, не превышает 30,77% в сравнении с 22,30% в контроле. Кроме того, левамизол обладает нежелательными побочными эффектами.
Изобретательской задачей является повышение иммунобиологической резистентности кормовой добавки для цыплят.
Техническим результатом является стимуляция системы гуморального и клеточного иммунитета, выражающаяся в повышении фагоцитарной активности нейтрофилов, повышении экспрессии гена NF-kB, контролирующего иммунный ответ, снижении экспрессии интерлейкина 6, что профилактирует развитие воспалительных реакций.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве кормовой добавки для цыплят используют 2% водный раствор окисленного декстрана с м.М. 40 кДа. («Декстраналь»).
Раскрытие сущности изобретения
Кормовая добавка для сельскохозяйственной птицы включает окисленный декстран с м.М. 40 кДа в виде водного раствора с концентрацией 2% («Декстраналь»).
Окисленный декстран представляет собой декстран, содержащий карбонильные группы. Он может быть получен известными способами на основе химического или радиационного окисления декстрана. В частности, окисленный декстран может быть получен химическим путем, например, путем окисления декстрана ("Fluka", Швейцария) периодатом натрия и осаждения окисленного декстрана этанолом [патент на изобретение РФ №2125451 «Способ получения конъюгата изониазид-декстран», дата публикации 27.01.1999].
Окисленный декстран может быть также получен путем окисления декстрана перманганатом калия в кислой среде при нагревании (80-100°С), после чего примеси удаляют путем отделения жидкости от осадка, выпавшего на стадии окисления декстрана и содержащего двуокись марганца; окисленный декстран осаждают из надосадочной жидкости этанолом [Евразийский патент на изобретение №011718 «Способ получения диальдегиддекстрана», дата публикации 28.04.2009].
В качестве исходного продукта для получения заявленного средства используют декстран с молекулярной массой 10-50 кДа в виде водного или водно-солевого раствора концентрации 1-10%.
В качестве фармацевтически приемлемого растворителя может быть использована вода для инъекций.
Перечень фигур
Фиг. 1. Динамика изменения живой массы цыплят в опыте, г.
Фиг. 2. Уровни удельной экспрессии генов интерлейкинов у птицы опытной и контрольной групп.
Осуществление изобретения
Сравнительные исследования эффективности заявленной кормовой добавки проводили на суточных цыплятах бройлерах.
Опыт проводили на суточных цыплятах кросса Шавер, разделенных по принципу аналогов на две группы (n=20). Цыплятам первой опытной группы, начиная с первого дня жизни, орально через систему поения, применяли препарат «Декстраналь» в дозе 0,06 мг/кг пятикратно с перерывом в 72 часа. Цыплятам второй группы (контрольная группа) препарат не давался.
Для определения среднесуточного прироста живой массы раз в три дня производили взвешивание цыплят.
На 15 сутки опыта для проведения опсоно-фагоцитарной реакции (ОФР) произвели взятие проб крови с помощью вакуумных пробирок с ЭДТА.
Оценку фагоцитарной активности нейтрофилов проводили согласно методике Горчакова A.M., Кручинского Н.Г. [Горчаков A.M., Кручинский Н.Г., Горчакова Ф.Т., Коростелеваи И.Н. Метод комплексной оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови. Инструкция по применению. НИИЭиПП, Беларусь. 2003. 15 с].
На 16 сутки опыта осуществляли убой птицы методом цервикально-церебральной дислокации.
Проводили патологоанатомическое вскрытие птиц. Кусочки органов фиксировали в забуференном 10% формалине.
РНК из патологического материала выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. На основании особенностей постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводился синтез кДНК с использованием олигонуклеотида N7.
Для проведения ПЦР в режиме реального времени методом обратной транскрипции одноцепочечная молекула РНК была переведена в комплементарную ДНК (кДНК). Метод постановки ПЦР с проведением обратной транскрипции РНК в кДНК носит название ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
ОТ-ПЦР проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 67 мМ трис.-HCl (рН 8,9), 16 мМ (NH4)2SO4; 2,4 мМ MgCl2; 0,01% Твин 20; 0,2 mM дНТФ; 0,3 mкМ растворы олигонуклеотидных праймеров 5`-atgctcaaccttgtccctagca-3` 5`tcaaactgcggatcatcacgt-3` и зонда FAM-tggaagtagagtgacgcccaaac-BHQ, 1-2 ед. HotStart Taq-ДНК полимеразы. ПЦР проводили на амплификаторе CFX (BioRad) по следующей программе: начальная денатурация - 95°С 15 мин., далее 40 циклов: денатурация - 95°С 10 сек, отжиг - 60°С 30 секунд.
Контроль выделяемости РНК из образцов проводили с использованием ПЦР в режиме реального времени специфичного в отношении мРНК гена домашнего хозяйства glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) по протоколу указанному выше, с использованием праймеров 5`cgtgaccccagcaacatcaa3` и 5` acttaccccagccttctccat3` taqman зонда ROX- tggagtccactggtgtcttcacc- BHQ2.
Экспрессию генов: интерлекина 6, NFkB оценивали методом дельта-дельта Ct относительно уровня экспрессии генов домашнего хозяйства (табл. 1).
Влияние препарата «Декстраналь» на прирост живой массы цыплят.
Для изучения влияния орального применения препарата «Декстраналь» на прирост живой массы, с интервалом 72 часа производили взвешивание цыплят опытной и контрольной групп. Результаты представлены в таблице 2.
Как видно из представленных данных, живая масса цыплят опытной группы уже на 3 сутки опыта выше аналогичного показателя контроля на 3,22%. К 15 суткам опыта разница составила 4,27% (фиг. 1).
Среднесуточный прирост живой массы цыплят в опытной группе составил 5,52 г/сут, что на 5,07% выше показателя контрольной группы (5,24 г/сут).
Полученные результаты указывают на то, что оральное применение препарата «Декстраналь» в дозе 0,06 мг/кг пятикратно с перерывом в 72 часа, оказывает стимулирующее действие на прирост живой массы, увеличивая данный показатель к 15 суткам жизни на 5,07% по сравнению с контролем.
Влияние препарата «Декстраналь» на показатели естественной резистентности цыплят
Для оценки влияния орального применения препарата «Декстраналь» на фагоцитарную активность нейтрофилов крови цыплят на 15 сутки опыта у всех животных были взяты пробы периферической крови.
Активность фагоцитарной активности нейтрофилов крови цыплят оценивали путем постановки опсоно-фагоцитарной реакции (ОФР) в модификации Горчакова A.M., Кручинского Н.Г. (табл. 3).
Несмотря на то, что в опытной группе показатель фагоцитарной активности ниже показателя контроля на 26,6%, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число оказались выше на 45,7% и 147,8% соответственно. Данные результаты указывают на то, что в целом оральное применение препарата «Декстраналь» оказывает выраженное стимулирующее действие на систему фагоцитоза увеличивая как активность фагоцитов, так и общее количество фагоцитированных бактерий на единицу объема крови. Заявленное средство повышает фагоцитарный индекс до 76,5%, что значительно превышает аналогичный показатель по прототипу, равный 30,77%.
Влияние препарата «Декстраналь» на выработку интерлейкинов.
Для оценки влияния препарата «Декстраналь» на выработку интерлейкинов в организме птицы, оценивали экспрессию генов IL6, NF-kB.
IL6 - интерлейкин, который может действовать как провоспалительный цитокин, является маркером воспалительных реакций в желудочно-кишечном тракте птицы.
NF-kB играет важную роль во врожденном и адаптативном иммунном ответе. Он необходим для нормальной дифференцировки некоторых клеток крови и формирования структуры вторичных лимфойдных органов.
Оценка влияния препарата «Декстраналь» на экспрессию генов данных интерлейкинов позволяет более глубоко раскрыть механизм иммуностимулирующего действия препарата.
Полученные результаты представлены в таблице 4.
Как следует из представленных данных, у цыплят опытной группы после применения препарата «Декстраналь» удельная экспрессия генов IL6 статистически ниже аналогичного показателя контрольной группы на 64,34%. Учитывая что интерлейкин IL6 является медиатором острой фазы воспаления и является одним из маркеров оценки состояния организма при инфекционных патологиях, можно сделать вывод, что препарат «Декстраналь» профилактирует развитие воспалительных реакций в желудочно-кишечном тракте птицы вызванных в том числе бактериальными агентами [Tanaka Т., Narazaki М, Kishimoto Т. IL-6 in inflammation, immunity, and disease (неопр.) // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2014. - T. 6, №10. - C. a016295. - doi:10.1101/cshperspect.a016295. - PMID 25190079] (фиг. 2).
Удельная экспрессия гена NF-kB у цыплят опытной группы выше контрольных значений на 42,55%. Так как одной из функций интерлейкина NF-kB является контроль экспрессии генов иммунного ответа, можно предположить что активизация экспрессии гена NF-kB является одним из механизмов действия препарата «Декстраналь» при повышении естественной резистентности организма животных и птицы [Kang S., Tanaka Т., Narazaki М., Kishimoto Т. Targeting Interleukin-6 Signaling in Clinic (англ.) // Immunity. - Cell Press, 2019. - Vol. 50, no. 4. - P. 1007-1023. - doi:10.1016/j.immuni.2019.03.026. - PMID 30995492; Hoffmann A., Baltimore D. Circuitry of nuclear factor kappaB signaling (неопр.) // Immunol. Rev.. - 2006. - April (т. 210). - С. 171-186. - doi:10.1111/j.0105-2896.2006.00375.x. - PMID 16623771].
В результате проведенной работы установлено, что применение препарата «Декстраналь» в дозе 0,06 мг/кг пятикратно с перерывом в 72 часа, положительно сказывается на показателях естественной резистентности при наличии прироста живой массы суточных цыплят. К 15 суткам опыта масса цыплят опытной группы была выше показателя контрольной группы на 4,27%.
В системе клеточного иммунитета отмечено выраженное стимулирующее действие препарата «Декстраналь», заключающееся в увеличении активности фагоцитов на 45,7% и общего количества фагоцитированных бактерий на единицу объема крови на 147,8% по сравнению с контролем.
В системе гуморального иммунитета повышается экспрессия NF-kB, играющего важную роль во врожденном и адаптативном иммунном ответе, а также снижается на 64,3% экспрессия ИЛ-6, что профилактирует развитие воспалительных реакций в желудочно-кишечном тракте птицы.