Комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения болевых синдромов
COMBINATION OF FLUPIRTINE AND CYCLOBENZAPRINE FOR TREATMENT OF PAIN SYNDROMES

Изобретение относится к области медицины, фармакологии, а именно к комбинации флупиртина и циклобензаприна или их фармацевтически приемлемых солей для лечения различных типов боли. Такая комбинация применяется для лечения болевых синдромов, особенно предпочтительно, болевых синдромов, сопровождающихся выраженной спастичностью мышц, в частности:
- болевого синдрома, связанного со статическими и функциональными заболеваниями позвоночника (шейный и поясничный синдромы);
- болевого синдрома после травм и хирургических вмешательств (например, по поводу грыжи межпозвонкового диска или остеоартроза тазобедренного сустава);
- спастичности скелетных мышц при неврологических заболеваниях, например, при рассеянном склерозе, хронической миелопатии, нейродегенеративных заболеваниях;
- при головной боли;
- при болях, сопряженных со злокачественным процессом;
- при дисменореях, альгоменореях.
Боль относится к наиболее частым жалобам, с которыми имеют дело врачи самых разных специальностей в повседневной практике. Распространенность болевых синдромов в системе первичной медицинской помощи колеблется от 11 до 40% [Gureje O., Simon G. E., Van Korff M. “A cross–national study of the course of persistent pain in primary care” // Pain. 2001. Vol. 92. P. 195-200]. По данным ВОЗ в развитых странах мира боль по масштабам своего распространения вполне сопоставима с пандемией.
Для достижения успеха в лечении важно разделение боли на острую и хроническую. Острая боль неразрывно связана с вызвавшим ее повреждением и обычно является симптомом какого–либо заболевания. Она, как правило, исчезает при устранении повреждения и/или истечении периода заживления. Хроническая боль продолжается в течение длительного времени даже после устранения причины, вызвавшей острую боль, и часто приобретает статус самостоятельной болезни. Международная ассоциация по изучению боли определяет ее как «боль, которая продолжается сверх нормального периода заживления». Главным отличием хронической боли от острой является не временной фактор, а качественно иные нейрофизиологические, биохимические, психологические и клинические соотношения [Коржавина В.Б., Данилов А.Б. “Новые возможности и перспективы терапии болевых синдромов” // РМЖ. 2010. С. 31].
Окончательное восприятие боли является результатом взаимодействия ноцицептивной и антиноцицептивной систем. Формирование болевого ощущения у человека опосредуется структурами ноцицептивной системы, которая осуществляет восприятие, проведение и обработку информации о различных раздражителях. Нисходящий ингибиторный цереброспинальный контроль над проведением болевой импульсации является функцией антиноцицептивной системы. В физиологических условиях антиноцицептивная система обеспечивает оптимальную модуляцию перцепции болевых стимулов, защищая от боли и поддерживая болевые пороги на определенном уровне. Однако длительно повторяющиеся повреждающие воздействия часто приводят к сенситизации болевой системы (устойчивой длительной деполяризации нейронов), что дает начало ее патофизиологическим изменениям [“Болевые синдромы в неврологической практике” // Под ред. чл.-корр. РАМН А.М. Вейна. М.: МЕДпресс-информ, 2001].
Кратковременные болевые стимулы вызывают непродолжительную активацию ноцицептивных нейронов задних рогов спинного мозга за счет воздействия глутамата, выделяемого А-дельта и С-афферентами, на АМРА-рецепторы. Этот механизм лежит в основе проведения нормальных ноцицептивных стимулов.
+
2+
В случае повторяющейся и более продолжительной стимуляции С-волокон происходит не только усиление выброса глутамата, но и секреция нейропептидов (субстанция Р, кальцитонин ген-связанный пептид, нейрокинин А), которые как самостоятельно возбуждают ноцицептивные нейроны, так и потенцируют возбуждающее действие глутамата на NMDA-рецепторы. Последние содержат Na/Ca- ионные каналы, обладающие наибольшей пропускной способностью для ионов кальция по сравнению с другими ионными каналами, связанными с рецепторами к другим возбуждающим аминокислотам. В норме эти каналы неактивны, поскольку блокированы ионами магния. Выделение центральными терминалями первичных афферентов вместе с глутаматом субстанции Р активирует нейрокининовые рецепторы I типа, в результате чего развиваются медленные постсинаптические потенциалы действия (длящиеся десятки секунд), временная суммация и исчезновение магниевого блока NMDA-рецепторов. В результате активации NMDA-рецепторов через открывшиеся потенциал-зависимые каналы кальций начинает активно поступать внутрь клетки, повышая возбудимость постсинаптической мембраны с развитием стойкой деполяризации. Кроме того, поступление в клетку ионов кальция приводит к активации синтетазы оксида азота, протеинкиназы С, фосфорилированию и стойкой активации NMDA-рецепторов. Все указанные процессы лежат в основе развития так называемого феномена «взвинчивания» (wind up), который характеризуется резким увеличением частоты потенциалов действия на мембране чувствительных нейронов заднего рога спинного мозга.
Вследствие увеличения возбудимости чувствительных нейронов задних рогов спинного мозга, связанных с зоной иннервации поврежденного нерва, происходит сенсибилизация близлежащих интактных нейронов с расширением рецептивной зоны. Поэтому раздражение неповрежденных чувствительных волокон, которые иннервируют окружающие зону повреждения здоровые ткани, вызывает активацию вторично сенсибилизированных нейронов, что проявляется болью – вторичной гипералгезией.
Сенсибилизация нейронов задних рогов ведет к снижению болевого порога и развитию аллодинии – появлению болевых ощущений на раздражение, которое в норме ими не сопровождается (например, тактильное). Изменения возбудимости центральных отделов ноцицептивной системы, связанные с развитием вторичной гипералгезии и аллодинии, описываются термином «центральная сенситизация».
Учитывая особенности патогенеза развития как невропатической, так и ноцицептивной боли, перспективным методом лечения представляется воздействие на NMDA-рецепторы мембран нейронов заднего рога. Блокада NMDA-рецепторов может вызываться как воздействием непосредственно на глутамат-связывающие области рецептора (конкурентные антагонисты – кетамин, декстрометорфан), так и, реже, за счет связи с другими его областями (неконкурентный, непрямой антагонизм).
Таким образом, в механизмах развития сенситизации ноцицептивных нейронов выделяют несколько этапов: активация АМРА-рецепторов (α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислота) в ответ на кратковременную стимуляцию болевых афферентов, затем возбуждение NMDA-рецепторов (N-метил-D-аспартат) глутаматом при нанесении повторного или длительного повреждающего воздействия. Это приводит к удалению ионов магния, блокирующих NMDA-рецепторные каналы, в результате чего происходит внутриклеточное вхождение ионов кальция. В условиях усиленного поступления в нейроны кальция происходит экспрессия генов раннего реагирования c–fos, c–jun, jun B, которые, активируя эффекторные гены, изменяют клеточный фенотип и формируют длительную гипервозбудимость нейронов. Посредством таких механизмов центральная сенситизация может существовать даже после того, как будут устранены начальные инициирующие факторы [Кукушкин М.Л., Хитров Н.К. “Общая патология боли”. – М.: Медицина, 2004. – 144 с].
Поэтому принципиально важным является своевременное и адекватное лечение острого болевого синдрома с целью предупреждения хронизации патологического состояния.
Среди препаратов, применяемых в клинической практике для лечения острой боли, наиболее широко используются анальгетики, нестероидные противовоспалительные препараты и миорелаксанты. Именно на этом этапе с помощью традиционных нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) возможно воздействовать на периферические компоненты, способствующие формированию боли, – устранение воспаления, отека, подавление нейрохимических стимуляторов болевых рецепторов.
В случае развития хронической боли, когда включаются центральные патофизиологические механизмы боли, необходимо применение лекарственных средств, воздействующих на формирование центральной сенситизации:
– применение противосудорожных препаратов (карбамазепин, ламотриджин, вальпроаты), тормозящих проведение возбуждающих нервных импульсов посредством блокирования потенциалзависимых натриевых и кальциевых каналов периферических нервов;
– использование блокаторов обратного захвата норадреналина и серотонина, повышающих концентрацию этих нейротрансмиттеров в ядрах ретикулярной формации мозгового ствола, из которых исходят нисходящие тормозящие пути, воздействующие на интернейроны заднего рога (флуоксетин, амитриптилин, сертралин, дулоксетин и др.);
– использование антагонистов NMDA–рецепторов, «стирающих» болевую память (кетамин, декстрометорфан);
– электростимуляцию и другие методы физической стимуляции (физиопроцедуры, акупунктура, чрескожная электронейростимуляция, массаж и др.), вызывающие торможение ноцицептивных нейронов заднего рога путем активации энкефалинергических нейронов [Баринов А.Н. “Комплексное лечение боли” // РМЖ, 2007, том 15, №4, с. 215–220].
Принципиально новым классом препаратов для лечения болевых синдромов являются селективные активаторы нейрональных калиевых каналов – SNEPCO (Selective Neuronal Potassium Channel Opener), оказывающие воздействие на процессы сенситизации нейронов заднего рога за счет стабилизации мембранного потенциала покоя.
Флупиртин был синтезирован в 70–х годах [von Bebenburg W., Thiel K., Engel J., Sheldrick W.S. “Synthese und Molekulstruktur des konstitutionell neuartigen analgetikum Flupirtin” // Chem Z, 1981, 105: 77-81]. В 1986 г. он был разрешен для лечения в Федеративной Республике Германии. С тех пор он начал активно использоваться в клинической практике, а полученные при этом новые сведения о его лечебном действии и особенных свойствах способствовали его более широкому применению.
Флупиртин (катадолон) является первым представителем нового класса лекарственных средств, относящихся к группе селективных активаторов нейрональных калиевых каналов. Это препарат с центральным механизмом действия, но в отличие от наркотических анальгетиков он не вызывает зависимости и привыкания. Важно подчеркнуть, что кроме обезболивающего действия он обладает миорелаксирующими и нейропротективными свойствами.
[2-амино-6-[[(4-фторфенил)метил]амино]-3-пиридинил]карбаминовойкислоты этиловый эфир (флупиртин)
+
2+
2+
1
2
1
2
Флупиртин – неопиоидный анальгетик центрального действия, селективный активатор нейрональных K-каналов. За счет непрямого антагонизма по отношению к NMDA-рецепторам, активирующим нисходящие механизмы модуляции боли и ГАМКергические процессы, оказывает анальгезирующее, миорелаксирующее и нейропротективное действие. Анальгетическое действие флупиртина обусловлено селективной активацией нейрональных калиевых каналов, при этом прекращается дальнейшее поступление ионов кальция внутрь клетки, ионы магния вновь блокирует NMDA–рецептор, что приводит к стабилизации мембранного потенциала и снижению возбудимости нейронов. В терапевтических концентрациях не связывается с альфа и альфа адренорецепторами, 5-HT и 5-HT серотониновыми, дофаминовыми, бензодиазепиновыми, опиоидными, а также центральными холинергическими рецепторами. В терапевтических дозах активирует потенциалнезависимые K+-каналы, что приводит к стабилизации мембранного потенциала нервной клетки. При этом происходит торможение активности NMDA-рецепторов (N-метил-D-аспартат-рецепторов) и как следствие блокада нейрональных Ca-каналов, снижение внутриклеточного тока Ca, торможение возбуждения нейронов в ответ на ноцицептивные стимулы (анальгезия). В результате этих процессов сдерживается формирование ноцицептивной (болевой) чувствительности и феномена "wind up" ("взвинчивания" – нарастания нейронального ответа на повторные болевые стимулы), что предотвращает усиление боли, переход ее в хроническую форму, а при уже имеющемся хроническом болевом синдроме ведет к снижению его интенсивности. Установлено также, что модулирующее влияние флупиртина на перцепцию (восприятие) боли осуществляется через нисходящую норадренергическую систему.
Миорелаксирующее действие связано с блокированием передачи возбуждения на мотонейроны и промежуточные нейроны, приводящим к ослаблению мышечного напряжения. Этот эффект флупиртина важен для пациентов с хроническими заболеваниями, сопровождающимися болезненными мышечными спазмами. Препарат воздействует практически только на те мышцы организма, которые находятся под дополнительным напряжением.
2+
2+
2+
Нейропротективные свойства препарата обусловливают защиту нервных структур от токсического действия высоких концентраций внутриклеточного Ca, что связано с его способностью вызывать блокаду нейрональных Ca-каналов и снижать внутриклеточный ток Ca. Флупиртин имеет лучшую переносимость, чем трамадол и пентазоцин [Devulder J. “Flupirtine in pain management: pharmacological properties and clinical use” // CNS Drugs. 2010,  24(10): 867-81; Knost В., Flor H., Braun C. and Birbaumer N. “Cerebral processing of words and the development of chronic pain” // Psychophysiology.  1997.  Vol. 34.  P. 474-481].
Флупиртин плохо растворим в воде, поэтому применяется в виде солей: малеата, глюконата, а также солей других карбоновых кислот и солей сульфоновых кислот и их полиморфов, которые включают в фармацевтические композиции, содержащие соли и полиморфы флупиртина. для лечения расстройств нервной системы, боли, опорно-двигательного аппарата, а также других заболеваний и состояний [US2012028930, 02.02.2012].
Применение флупиртина, а также его соли малеата при хронических скелетно-мышечных, ревматических и онкологических болевых синдромах показало его высокую эффективность и хорошую переносимость. Устранение боли улучшает эмоциональное состояние пациентов и нормализует сон, этим может объясняться легкая сонливость, возникающая в первые сутки применения препарата. Простота назначения препарата (по 1 капсуле 100 мг 3 раза в день) и его отмены (можно прекращать прием одномоментно, не опасаясь развития синдрома отмены) делают его удобным и простым в применении для врача любой специальности. Длительность приема препарата составляет: 10 дней – для купирования острых болевых синдромов и предотвращения их хронизации и 1-2 месяца – для лечения хронической боли. В процессе лечения не возникает необходимости увеличивать дозу препарата, наоборот – наблюдается нарастание анальгетической активности. Флупиртин лишен негативных психологических или моторных функций и не влияет на репродуктивную функцию [Singal, R., Parveen G., Nidhi J., Samita G. // "Role of Flupirtine in the Treatment of Pain - Chemistry and its Effects". Mædica – a Journal of Clinical Medicine. 2012, 7(2): 163-166]. Это позволяет широко использовать флупиртин и малеат флупиртина в клинической практике для лечения хронических болевых синдромов различной этиологии [Harish S., Bhuvana K., Bengalorkar G.M., Kumar T. // "Flupirtine: Clinical pharmacology". Journal of anaesthesiology, clinical pharmacology. 2012, 28 (2): 172-7] и предотвращения хронизации острых болевых синдромов.
Также флупиртин был отмечен своими нейропротективными свойствами и был исследован для возможного использования при болезни Крейтцфельдта-Якоба, болезни Альцгеймера и рассеянного склероза. [Klawe C., Maschke M. "Flupirtine: pharmacology and clinical applications of a nonopioid analgesic and potentially neuroprotective compound" // Expert opinion on pharmacotherapy. 2009, 10(9): 1495-1500]. Он также был предложен в качестве возможного препарата для лечения болезни Баттена [Dhar S., Bitting R.L., Rylova S.N., et al. "Flupirtine blocks apoptosis in batten patient lymphoblasts and in human postmitotic CLN3- and CLN2-deficient neurons". // Ann. Neurol. 2002, 51(4): 448-466] и проходит клинические испытания в качестве препарата для лечения рассеянного склероза и фибромиалгии [Pipex Pharmaceuticals (PPXP) Oral Flupirtine Receives IND With FDA for Phase II Clinical Trial for Fibromyalgia 4/21/2008].
Наиболее масштабным исследованием по оценке анальгетического действия, нормализации мышечного тонуса, а также переносимости флупиртина в лечении острой и хронической боли, ассоциированной с мышечным напряжением, является открытое мультицентровое исследование, выполненное в Германии [Mueller-Schwefe G. “Flupirtine in Acute and Chronic Pain Associated with Muscle Tenseness. Results of a Postmarketing Surveillance Study” // Fortschr. Med. 2003. Vol. 121. P. 3–10].
В исследовании приняло участие 7806 пациентов (мужчины – 43%, женщины – 57%), страдающих различными вариантами мышечно-скелетной боли в спине, шее, головной болью напряжения (ГБН) и миофасциальным болевым синдромом другой локализации. Средний возраст пациентов составил 52,3±15,3 года. Преимущественно отмечались хронические формы боли (44,8%). В 29,4% случаев заболевание было острым, в 25,8% – подострым. Обезболивающую медикаментозную терапию ранее получали 64,5% пациентов, в 28,8% случаях анальгетическая терапия комбинировалась с миорелаксантами. Только 1,8% пациентов получали монотерапию миорелаксантами. До исследования медикаментозного лечения не получали 23,5% пациентов, из них только 5% имели хронические формы болезни.
Проводили оценку интенсивности боли, степени мышечного напряжения, боли при надавливании и ограничения повседневной деятельности по 5-балльной шкале со следующими степенями нарушения описанных параметров: 0 – отсутствие нарушений, 1 – легкие, 2 – умеренные, 3 – сильные, 4 – очень сильные нарушения. Кроме того, участвующие в исследовании врачи и пациенты оценивали эффективность и переносимость флупиртина также по 5-балльной шкале (отлично/хорошо/удовлетворительно/неудовлетворительно/не поддается оценке).
Наблюдение за динамикой процесса проводилось в течение 4 недель, при этом делали записи о первом посещении врача и двух диспансерных наблюдениях – через одну и четыре недели после начала терапии. Начальная и поддерживающая дозы при лечении Катадолоном составляли преимущественно 200–300 мг в день (2–3 капсулы). Дозы, превышающие 300 мг в сутки, применяли только у 19,4% пациентов в начале лечения и у 4,5% пациентов в качестве поддерживающей дозы.
Уже на первой неделе лечения острой и хронической форм отмечали значительное снижение (р<0,01) интенсивности боли с продолжающимся ее снижением в ходе дальнейшего лечения. Улучшение было более выраженным и клинически развивалось быстрее в случаях острого заболевания по сравнению с пациентами с хронической болью (р<0,01)
Боль при надавливании при терапии флупиртином также уменьшилась статистически значимо (р<0,01) и существенно с клинической точки зрения.
Клинически существенная и статистически значимая (р<0,01) эффективность флупиртина в отношении нормализации тонуса выявлена для всех исследованных патологий. Положительная динамика была статистически значимой для всех форм боли, особенно быстрое и отчетливое развитие эффекта отмечено для острых форм заболевания.
Для оценки качества жизни исследовали ограничение повседневной деятельности и нарушения сна, связанные с болью и мышечным напряжением. После терапии флупиртином наблюдалось клинически и статистически значимое (р<0,01) улучшение по обоим параметрам. Сообщено о побочных эффектах у приблизительно 70 пациентов (0,9%). Все наблюдавшиеся побочные эффекты были ранее известны. Наиболее часто отмечали слабость (16 случаев) и головокружение (9 случаев). Опасные побочные эффекты отмечены не были. Это свидетельствует о хорошей переносимости Катадолона (флупиртина) при лечении мышечно-скелетной боли.
Таким образом, результаты этого исследования подтверждают эффективность флупиртина в отношении купирования боли и нормализации мышечного тонуса при лечении острой и хронической боли, связанной с мышечным напряжением, и демонстрируют хорошую переносимость флупиртина, что обосновывает целесообразность применения флупиртина при лечении этих расстройств.
Болевой синдром у больных с остеопорозом становится все более значимой проблемой в современной геронтологии  [Ferrell B.A. “Pain management in elderly people” // J. Am. Geriatr. Soc. 1991. Vol. 39(1). P. 64-73; Lynch D. “Geriatric Pain” // Curr. Rev. Pain.  1999. Vol. 3(5). P. 388-399]. Основным показанием к приему анальгетиков пожилыми пациентами является скелетно-мышечная боль преимущественно на фоне таких заболеваний, как ревматоидный артрит, остеоартроз и остеопороз [Sorkin B.A., Rudy T.E. et al. “Chronic pain in old and young patients: differences appear less important than similarities” // J. Gerontol. 1990. Vol. 45(2). P. 64-68]. Установлено, что целевые результаты терапии болевого синдрома у значительной части этой группы пациентов не достигаются. Такое состояние проблемы может быть связано с недостаточной осведомленностью лечащих врачей о текущих рекомендациях по анальгетической терапии, а также с сомнениями при назначении надлежащих анальгетиков пожилым пациентам, которые так или иначе могут повлиять на общее состояние пациентов ввиду сопутствующей патологии
Нередко у пожилых пациентов болевые синдромы формируются на фоне остеопороза. Индивидуальный подбор систематической обезболивающей терапии для больных с остеопорозом очень важен также и потому, что позволяет предотвратить дальнейшую деминерализацию костей, неизбежно наступающую при иммобилизации пациента. Болевой синдром при остеопорозе почти всегда сопровождается мышечной болью, поэтому особый интерес представляют анальгетики с миорелаксирующим компонентом, к которым относится флупиртин.
Для большой когорты пациентов с болями на фоне остеопороза, в условиях, максимально приближенных к повседневной врачебной практике, была доказана эффективность и безопасность ежедневного применения флупиртина независимо от возраста, локализации боли, ее силы и времени начала лечения. Было показано, что включение флупиртина в схему лечения хронического болевого синдрома при остеопорозе является рациональным решением для участкового терапевта и может быть применимым к широкому спектру пациентов [Ringe J.D., Miethe D., Pittrow D., Wegscheider K. “Аnalgesic efficacy of flupirtine in primary care of patients with osteoporosis related pain. A multivariate analysis” // Arzneimittelforschung. 2003. Vol. 53(7). P. 496-502].
В источнике [Riethmüller-Winzen H. “Flupirtine in the treatment of postoperative pain” // Postgrad. Med. J. 1987. Vol. 63, Suppl. 3. P. 61-65] опубликован обзор нескольких двойных слепых рандомизированных контролируемых испытаний с ведением параллельных групп, в которых была показана безопасность и эффективность флупиртина при послеоперационной боли. В исследованиях участвовали пациенты после тиреоидэктомии, тонзиллэктомии, лапаротомии, гистерэктомии, эпизиотомии, трансуретральной резекции предстательной железы, операций по поводу переломов.
В рассмотренных исследованиях флупиртин показал хорошую анальгетическую активность в ситуациях с болью интенсивностью до 4 из 5 баллов. Переносимость препарата также была хорошей. Флупиртин показал не меньшую анальгетическую активность, чем известные анальгетики, с которыми он сравнивался (парацетамол, метамизол, напроксен, кодеин, пентазоцин).
В исследовании [Mazzarella B., Ceccarelli M.G. & Bianchi F. “Analgesic activity of flupirtine maleate” // J. Int. Med. Res. 1988. Vol. 16. P. 338-348] флупиртин сравнивали с кетопрофеном в лечении боли после эпизиотомии. Исследование проводили двойным слепым методом с ведением параллельных групп. Рандомизацию проводили по сбалансированной схеме. Авторами сделан вывод, что для лечения боли после эпизиотомии флупиртин может быть применен наравне с известными анальгетиками, такими как кетопрофен.
Контролируемое исследование с ведением параллельных групп для оценки анальгетической активности флупиртина в сравнении с диклофенаком натрия описано в источнике [Mastronardi P., D'Onofrio M., Scanni E. et al. “Analgesic activity of flupirtine maleate: a controlled double-blind study with diclofenac sodium in orthopaedics” // J. Int. Med. Res. 1988. Vol. 16(5). P. 338-348]. В исследовании участвовали 40 пациентов старше 18 лет, госпитализированных с целью проведения планового ортопедического оперативного вмешательства. Исследование было рандомизированным, с применением компьютерного генератора случайных чисел. Участники исследования начинали получать по 100 мг флупиртина или 50 мг диклофенака натрия в ближайшем послеоперационном периоде. Был сделан вывод о том, что применение 100 мг флупиртина, по крайней мере, так же эффективно, как применение 50 мг диклофенака натрия для обезболивания больных после ортопедических операций. Комплексная оценка эффективности препарата, включая вербальную оценку боли пациентами и обобщающую оценку по окончании терапии, показала достаточность достигаемой аналгезии. Показатели скорости наступления и длительности эффекта флупиртина в дозе 100 мг статистически значимо выше таковых для диклофенака натрия в дозе 50 мг.
При болевых синдромах спазм в мышцах развивается при двух принципиально отличающихся друг от друга групп заболеваний:
неврологические болезни;
дегенеративно-дистрофические поражения суставов и позвоночника – остеохондроз, спондилёз, спондилоартроз, артроз суставов конечностей.
Две вышеперечисленные патологии принципиально отличаются друг от друга. При заболеваниях нервной системы развивается болезненный мышечный спазм или тоническое напряжение мышечных волокон при нанесении болевого раздражения.
Характеристика боли при болезненном мышечном спазме: боль носит локальный характер в пределах спазмированной мышцы; провоцируется раздражением поражённой мышцы; при прощупывании мышечных волокон определяется интенсивная боль; тонус мышцы повышен.
Основные черты боли при дегенеративно-дистрофических поражениях или миофасциальном болевом синдроме: отраженная или региональная боль, которая всегда находится далеко от спазмированной мышцы; при пальпации болезненной мышцы боль значительно усиливается; резкий диффузный мышечный спазм с включениями участков уплотнения, которые играют роль спускового крючка, при нажатии на эти зоны развивается очень интенсивная боль и в мышце и на отдалении.
Спазмированные и болезненные мышцы – это неспецифический симптом. Прежде чем приступать к его лечению, надо исключить серьёзную патологию, например, метастазы, переломы, инфекции, которые на первых порах могут проявляться только этой симптоматикой.
Существуют миорелаксанты, действующие исключительно на первую или вторую группы заболеваний, например, только на болезни нервной системы, или системные заболевания соединительной ткани.
Циклобензаприн относится к миорелаксантам центрального действия, эффективным в отношении обеих проблем.
3-(5H-дибензо[а,d]циклогептен-5-илиден)-N,N-диметил-1-пропанамина гидрохлорид
(циклобензаприн)
Циклобензаприн (Flexeril, прогептатриен, МК-130) принадлежит к группе миорелаксантов периферического действия. Эта группа лекарственных препаратов снижает напряжение, вызванное спазмом мускулатуры.  Миорелаксанты воздействуют непосредственно на те отделы головного мозга, которые регулируют мышечный тонус. Миорелаксанты вместе с нестероидными противовоспалительными средствами, анальгетиками и спазмолитиками входят в комплексную терапию острой и хронической стадии остеохондроза и других заболеваний опорно-двигательной системы [Goodnick P.J., Sandoval R. “Psychotropic treatment of chronic fatigue and related disorders” // J Clin Psychiatry 1993, 54: 13-20]. Циклобензаприн, продаваемый под брендом Flexeril, среди прочих, является средством для расслабления мышц, используемым для облегчения спазма скелетных мышц и связанной с ним боли при острых скелетно-мышечных патологиях [Chou R., Peterson K., Helfand M. "Comparative efficacy and safety of skeletal muscle relaxants for spasticity and musculoskeletal conditions: a systematic review". Journal of Pain Symptom Management. 2004, 28 (2): 140-175].
После травматического поражения могут возникать болезненные мышечные спазмы, направленные на стабилизацию пораженной части тела и предотвращения дальнейшего повреждения. Циклобензаприн используется для лечения таких мышечных спазмов, связанных с острыми, болезненными мышечно-скелетными состояниями. Он уменьшает боль в первые две недели [van Tulder M.W., Touray T., Furlan A.D., Solway S., Bouter L.M. "Muscle relaxants for non-specific low back pain" // Cochrane Database of Systematic Reviews. 2003, 2 (1-2): 91-9]. При этом в источнике [Browning R., Jackson J.L., O’Malley P.G. "Cyclobenzaprine and back pain: a meta-analysis". Archives of Internal Medicine. 2001, 161 (13): 1613-1620] говорится об эффективности препарата только в первые дни, но через две недели польза от него не доказана и терапию нельзя продолжать долговременно. Это может привести к состоянию повышенного мышечного тонуса, что приводит к трудности и скованности мышц и мешает нормальным движениям, походке и речи из-за неврологических состояний, таких как церебральный паралич. [Ashby P., Burke D., Rao S. "Assessment of cyclobenzaprine in the treatment of spasticity" // J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1972, 35 (5): 599-605.]
Циклобензаприн также показал эффективность при лечении симптомов фибромиалгии для уменьшения боли, но без изменений усталости или тендерных точек. [Tofferi J.K., Jackson J.L., O'Malley P.G. "Treatment of fibromyalgia with cyclobenzaprine: A meta-analysis" // Arthritis Rheum. 2004, 51 (1): 9-13] Он также может использоваться наряду с другими методами лечения столбняка [Smith, Blaine T. (2014). “Pharmacology for Nurses”. Jones & Bartlett Publishers. p. 122].
Также отмечено седативное действие циклобензаприна, что вероятно связано с его антагонистическим действием на гистаминовые, серотониновые и мускариновые рецепторы, причём также отмечен такой побочный эффект как ажитация, наблюдаемый особенно часто у пожилых людей. В целом, рекомендуется избегать использование циклобензаприна у пожилых людей из-за возможности более серьезных побочных эффектов ["High risk medications". National Committee for Quality Assurance. 1 February 2010], свойственных для любых трициклических антидепрессантов [Chabria, Shiven B. "Rhabdomyolysis: a manifestation of cyclobenzaprine toxicity" // Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 2006, 1 (1): 16]. В отличие от дантролена, циклобензаприн не может использоваться для лечения мышечного спазма, вторичного по отношению к заболеванию мозга или спинного мозга.
2
Как и другие трициклические антидепрессанты, циклобензаприн проявляет антихолинергическую активность, при этом непосредственно не действует на нервно-мышечный узел или мышцу, но снимает мышечные спазмы через центральное действие, возможно, на уровне ствола мозга. Циклобензаприн связывается с рецептором серотонина и считается антагонистом 5-НТ-рецепторов, который уменьшает мышечный тонус, уменьшая активность нисходящих серотонинергических нейронов [US9636408, 02.05.2017].
Циклобензаприн наиболее легко вводится в виде соли с нетоксичной кислотой. Такие соли получают способами, известными в данной области. Один из таких способов используется при получении предпочтительной соли циклобензаприна гидрохлорида и включает осаждение соли из раствора циклобензаприна в хлороформе путем насыщения раствора сухим хлористым водородом и охлаждения раствора. Известны и другие фармацевтически приемлемые соли циклобензаприна [US3409640, 05.11.1968].
«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные (Подробное описание свойств таких солей дано в Berge S.M., et al. “Pharmaceutical Salts” // J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1-19). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезированы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты – лизин, орнитин и аргинин.
Распространенность болевых синдромов, связанных с ними спастических явлений в мышцах, вызванных невралгическими или инфекционными заболеваниями, дегенеративно-дистрофическими поражениями суставов и позвоночника объективно ухудшает качество жизни людей, поэтому поиск новых препаратов и комбинаций, позволяющих эффективно бороться с острыми болевыми синдромами и при этом не обладающих известными побочными явлениями, является важной и актуально задачей.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что поставленная задача решается уникальной новой комбинацией для терапии острых болевых синдромов, которая позволяет удерживать седативный и миорелаксантный эффекты в течение 6 – 8 часов за счет циклобензаприна и анальгезию в течение 24 часов за счет флупиртина.
Сила анальгетического действия новой комбинации соответствует силе опиоидных анальгетиков (например, трамадола), но нежелательные явления, связанные с приёмом опиоидов, отсутствуют.
Как было указано выше, в уровне техники известно использование анальгетиков совместно с миорелаксантами, но при этом не известно использования комбинации флупиртина и циклобензаприна, или их фармацевтически приемлемых солей, для лечения болевых синдромов, в том числе сопровождающихся выраженной спастичностью мышц. При этом не всегда совместное использование анальгетика и миорелаксанта является очевидным в виду их различных побочных действий и ограничений при взаимодействии с другими лекарственными средствами, поэтому их подбор является важной технической и экспериментальной задачей.
Так частыми побочными действиями флупиртина являются головокружение, изжога, тошнота, рвота, запор или диарея, метеоризм, абдоминальная боль, сухость слизистой оболочки полости рта, анорексия, депрессия, нарушения сна, потливость, беспокойство, нервозность, тремор, головная боль, диарея. Более редкими побочными действиями флупиртина являются спутанность сознания, нарушения зрения и аллергические реакции (гипертермия, крапивница и зуд).
Флупиртин усиливает действие этанола, седативных лекарственных средств и миорелаксантов.
В связи с тем, что флупиртин связывается с белками плазмы крови, следует учитывать возможность вытеснения его др. одновременно принимаемыми лекарственными средствами (так показано, что варфарин и диазепам вытесняются флупиртином из связи с белком, что при одновременном их приеме может привести к усилению их действия). При одновременном назначении флупиртина и производных кумарина рекомендуется регулярно контролировать показатель Квика (протромбиновый индекс).
При одновременном применении флупиртина и лекарственных средств, также метаболизирующимися в печени, требуется регулярный контроль активности печеночных ферментов.
Следует избегать комбинированного применения флупиртина и лекарственных средств, содержащих парацетамол и карбамазепин (трициклический аналог циклобензаприна).
Циклобензаприн может спровоцировать следующие нежелательные побочные действия: диспепсию, апатию, бессонницу; нарушения в координации движений; спутанность сознания; нестабильное эмоциональное состояние; частичную или полную потерю работоспособности.
В силу замедленного обмена веществ и особенностей метаболизма у пожилых людей препарат медленнее выводится из организма. Поэтому назначение его в средних терапевтических дозировках может привести к токсическому эффекту и отравлению.
Токсичность циклобензаприна объясняется его способностью вызывать центральную и периферическую холинергическую блокаду (антимускариновый эффект). В опытах на животных он блокирует мускариновые рецепторы, повышает активность вводимого извне норадреналина, стимулируя высвобождение эндогенных катехоламинов из пресинаптических нейронов (а в высоких дозах, вероятно, ослабляя их обратное поглощение), и действует как антигистаминное средство. У лабораторных животных внутривенное введение циклобензаприна купирует ригидность при межхолмиковой и анемической децеребрации (гамма- и альфа-ригидность соответственно) и ослабляет ее при ишемии спинного мозга.
Основываясь на структурной схожести с трициклическими антидепрессантами, циклобензаприн может иметь опасные для жизни взаимодействия с ингибиторами MAO, также может усиливать действие алкоголя, барбитуратов и других депрессантов ЦНС. Может повышать риск развития судорог у пациентов, принимающих трамадол, также может блокировать антигипертензивное действие гуанетидина и аналогичным образом действующих соединений.
Имелись случаи серотонинового синдрома, во время комбинированного применения циклобензаприна и других лекарственных средств, таких как селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, селективные ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина, трициклические антидепрессанты, трамадол, бупропион, тримеперидин, верапамил или ингибиторы MAO.
В связи с этим существует мнение, что препараты на основе циклобензаприна можно применять только в комплексе с другими медикаментами. Сам по себе он может нанести вред здоровью, поэтому медикамент не стоит принимать самостоятельно.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что использование комбинации флупиртина и циклобензаприна, или их фармацевтически приемлемых солей, позволяет снизить побочные эффекты, связанные с монотерапией каждого из препаратов, что позволяет расширить её использование, и добиться неожиданного синергетического эффекта в лечении болевых синдромов, в том числе сопровождающихся выраженной спастичностью мышц.
Поставленная задача осуществляется, а технический результат достигается получением комбинации для лечения болевых синдромов, содержащая в эффективных количествах флупиртин и циклобензаприн, или их фармацевтически приемлемые соли.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический ре-зультат также достигается тем, что:
–  введение комбинация, которой осуществляется перорально;
– флупиртин и циклобензаприн присутствуют в виде таблеток замедленного высвобождения;
– действующие вещества содержатся в предпочтительных суточных дозировках:
флупиртин
–  25 – 600 мг/сут;
циклобензаприн
–  1,25 – 30 мг/сут;
– действующие вещества содержатся в предпочтительных массовых соотношениях:
флупиртин : циклобензаприн от 1 : 1,2  до 480 : 1.
Поставленная задача также осуществляется, а технический результат достигается получением фармацевтической композиции для лечения болевых синдромов, содержащей в эффективных количествах комбинацию флупиртина и циклобензаприна, или их фармацевтически приемлемых солей, а также по меньшей мере одно вспомогательное вещество и/или по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический результат также достигается тем, что:
–  введение упомянутой композиции осуществляется перорально;
– действующие вещества содержатся в предпочтительных суточных дозировках:
флупиртин
–  от 25 до 600 мг/сут;
циклобензаприн
–  от 1,25 до 30 мг/сут;
– действующие вещества содержатся в предпочтительных массовых соотношениях:
флупиртин : циклобензаприн от 1 : 1,2  до 480 : 1.
Поставленная задача также осуществляется, а технический результат достигается получением набора для лечения болевых синдромов, который содержит инструкцию по применению и фармацевтическую композицию, содержащую в эффективном количестве циклобензаприн или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере одно вспомогательное вещество и/или по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, и фармацевтическую композицию, содержащую в эффективном количестве флупиртин или его фармацевтически приемлемую соль и, по меньшей мере одно вспомогательное вещество и/или по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический ре-зультат также достигается тем, что:
Поставленная задача также осуществляется, а технический результат достигается применением комбинации или фармацевтической композиции, или набора согласно настоящему изобретению для лечения болевого синдрома, выбранного из группы, включающей:
болевой синдром, связанный со статическими и функциональными заболеваниями позвоночника;
болевой синдром после травм и хирургических вмешательств;
болевой синдром, связанный со спастичностью скелетных мышц;
болевой синдром, сопряженный со злокачественным процессом;
головная боль; дисменорея и альгоменорея.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический ре-зультат также достигается тем, что:
–  введение комбинации, композиции или набора осуществляется перорально;
– действующие вещества вводят в предпочтительных суточных дозировках:
флупиртин
–  от 25 до 600 мг/сут;
циклобензаприн
–  от 1,25 до 30 мг/сут.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя новую комбинацию веществ по настоящем изобретению, или их фармацевтически приемлемых солей, и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих агентов, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, диспергирующие агенты, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы действующих веществ, способа введения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, таких как моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами диспергирующих и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.
Фармацевтические композиции могут включать фармацевтически приемлемые эксципиенты. Под фармацевтически приемлемым эксципиентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители. Фармацевтическая композиция наряду с действующими веществами по настоящем изобретению, или их фармацевтически приемлемыми солями, может включать и другие активные субстанции, в том числе обладающие активностью, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов.
При необходимости использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.
Носители, используемые в фармацевтических композиций по настоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты.
Лекарственные средства и фармацевтические композиции могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно). Клиническая дозировка средства, содержащего новую комбинацию флупиртина и циклобензаприна по настоящему изобретению, у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10 - 1000 мг флупиртина, предпочтительно, 25 - 600 мг флупиртина, и 0,5 – 50 мг циклобензаприна, предпочтительно 1,25 – 30 мг циклобензаприна. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции лекарственного средства по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 5 - 500 мг флупиртина и 0,25 – 50 мг циклобензаприна. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно – от одного до шести раз).
Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.
Пример 1. Оценка эффективности комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения болевого синдрома, связанного со статическими и функциональными заболеваниями позвоночника.
Для оценки эффективности препаратов для лечения болевого синдрома, связанного со статическими и функциональными заболеваниями позвоночника (например, шейный и поясничный синдромы), была выбрана модель перерезки двух из трех ветвей седалищного нерва у крыс [Bennett G.J., Xie Y.K. “A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man” // Pain. 1988, 33: 87-107. Decosterd I., Woolf C.J. “Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain” // Pain. 2000, 87: 149-158. Kim S.H., Chung J.M. “An experimental-model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat” // Pain. 1992, 50: 355-363].
Крысы: в экспериментах использовали 55 взрослых самцов крыс линии Спрег-Доули, имеющих массу тела 250-330 граммов. Крысы содержались по пять особей в терморегулируемых боксах (с температурой в среднем 21°С) при 12-часовом цикле дня и ночи и с достаточным количеством воды и пищи.
Описание модели: через 10 дней после операции по перерезки нервов у крыс, в ходе которой имитировалось функциональное или статическое заболевание позвоночника, на фоне возникшего болевого синдрома, на крысах исследовали эффективность приема тестируемых препаратов для лечения данного болевого синдрома.
Хирургическая операция. Крыс анестезировали изофлураном (Sigma, США). Кожу на боковой поверхности бедра крысы разрезали и далее делали разрез на двуглавой мышце бедра, чтобы открыть доступ к седалищному нерву и трем его терминальным ветвям: икроножному, общему малоберцовому и большеберцовому нервам. Аксотомии и перевязке подвергались только большеберцовый и общий малоберцовый нервы, тогда как икроножный нерв оставался неповрежденным. Указанные нервы перевязывали 5.0 шелковыми нитями и перерезали дистально от места перевязки, оставляя культю нерва размером 2±4 мм. Мышцы и кожу зашивали по-отдельности.
Формирование групп исследования: крыс случайным образом распределяли на 11 равных по составу групп (по 5 особей в каждой), отличающихся типом вводимого препарата и его дозировкой.
Вводимые препараты и дозы: исследование проводилось для 3 препаратов (флупиртин, циклобензаприн и диклофенак), которые вводили перорально через 10 дней после операции и за 30 минут до проведения поведенческих тестов в указанных дозах и комбинациях: флупиртин, 25 мг/сутки (группа №1); флупиртин, 300 мг/сутки (группа №2); флупиртин, 600 мг/сутки (группа №3); циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №4); циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №5); циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №6); флупиртин, 25 мг/сутки + циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №7); флупиртин, 300 мг/сутки + циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №8); флупиртин, 600 мг/сутки + циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №9); и диклофенак, 50 мг/сутки (группа №10). Контролем служила группа крыс, получающих только носитель (группа плацебо). Все дозы приведены в пересчете на человека.
Поведенческие тесты
Выраженность боли в разных группах животных оценивали с помощью двух тестов, фиксирующих развитие холодовой или механической аллодинии. Животных тестировали на 10 день после операции, через 30 минут после введения исследуемых препаратов.
Механическая аллодиния. Животных помещали в приподнятую над землей акриловую камеру (15х15х15 см) с проволочной сеткой на дне. Перед началом тестирования животных оставляли в камере на 5-10 минут для адаптации. Далее подошвенную поверхность лапы животного стимулировали калиброванными филаментами (или нитями) фон Фрея (BIOSEB, США). Филаменты представляли собой набор из 10 стандартных пластиковых нитей, увеличивающихся в диаметре. Жесткость нитей, выражаемая как минимальное усилие необходимое для сгибания волоска, возрастала при такой калибровке логарифмически с абсолютными значениями от 0,6 граммов до 26 граммов. У каждой крысы порог чувствительности поочередно определяли на каждой лапе в трех повторах (всего 6 прикладываний с интервалом в 10 секунд для каждого филамента; интервал между последовательным прикладыванием разных филаментов составлял 2 минуты). Кончиком нити прикасались к середине подошвенной поверхности лапы с усилием, необходимым для сгибания волоска, и удерживали волосок в таком положении 6-8 секунд. Положительный ответ регистрировали, если животное резко отдергивало лапу во время касания. Порог чувствительности определяли по минимальному давлению, вызывающему рефлекторную реакцию отдергивания лапы (4 раза из 6 прикладываний).
Холодовая аллодиния. Для оценки холодовой аллодинии в данном исследовании использовали специальную тест-камеру с горячей/холодной пластиной (Ugo Basile, Италия). Тест проводили в камере с акриловыми стенками высотой 30 см на охлажденной до 0°С металлической пластине размером 30х30 см. Здоровые животные способны в течение длительного времени выдерживать данную температуру, опираясь всеми конечностями на охлажденный пол, тогда как при повреждении нерва время контакта конечности с холодной пластиной значительно сокращается. Для количественной оценки данного параметра регистрировали время удержания конечности на весу в течение 1 минуты пребывания животного в тест-камере. Тест проводили на 10 сутки после операции; каждое животное тестировалось трижды с интервалом в 5 минут между измерениями; полученные значения усредняли.
Статистический анализ: для каждой группы исследования (n=5) рассчитывали среднюю оценку, полученную в соответствующем тесте, и стандартную ошибку среднего для каждого значения. Достоверность различий между группами оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (при уровне значимости p<0,05).
Результаты: полученные результаты приведены в таблице 1 ниже.
Таблица 1. Влияние флупиртина и циклобензаприна, применяемых по-отдельности или в комбинации, на поведение крыс с болевым синдромом, имитирующим статические и функциональные заболевания позвоночника.
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
выраженность механической аллодинии, г (среднее ± стандартная ошибка среднего)
выраженность холодовой аллодинии, сек (среднее ± стандартная ошибка среднего)
носитель
-
плацебо
2,6±0,46
6,3±0,89
флупиртин
25
1
9,0±0,45
12,3±1,85
300
2
10,2±1,06
12,5±0,88
600
3
11,3±1,18
13,7±2,02
циклобензаприн
1,25
4
8,7±0,42
11,5±1,76
15
5
9,3±0,42
12,6±1,2
30
6
10,5±0,94
13,0±1,15
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7*
20,5±2,45
25,6±2,33
300 + 15
8*
22,3±2,33
27,3±2,18
600 + 30
9*
26,0±0
29±3,46
диклофенак
50
10
16,0±2,16
20,0±1,53
* достоверное отличие от ожидаемого (расчётного) аддитивного эффекта комбинации флупиртин + циклобензаприн (уровень значимости р<0,05).
Вывод: в группах, получающих комбинацию флупиртина и циклобензаприна, показатели механической и холодовой аллодинии значительно снижены, что свидетельствует об эффективности их использования для лечения функциональных и статических заболеваний позвоночника. Но помимо этого также обнаружен синергический эффект действия данной комбинации на всех тестируемых уровнях доз.
Пример 2. Оценка эффективности комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения болевого синдрома после травм и хирургических вмешательств.
Тестирование эффективности препаратов для лечения болевого синдрома после травм и хирургических вмешательств (например, по поводу грыжи межпозвонкового диска или остеоартроза тазобедренного сустава) проводили на модели послеоперационной боли у крыс, сформированной с помощью перерезки стопы задней лапы, сделанной через кожу, фасции и мышцы [Brennan T.J., Vandermeulen E.P., Gebhart G.F. “Characterization of a rat model of incisional pain” // Pain. 1996, 64: 493–501. Pogatzki E.M., Niemeier J.S., Brennan T.J. “Persistent secondary hyperalgesia after gastrocnemius incision in the rat” // Eur J Pain. 2002, 6: 295-305].
Крысы: в экспериментах использовали 55 взрослых самцов крыс линии Спрег-Доули, имеющих массу тела 250-300 граммов. Крысы содержались по пять особей в терморегулируемых боксах (с температурой в среднем 21°С) при 12-часовом цикле дня и ночи и с достаточным количеством воды и пищи.
Описание модели: через 3 дня после операции по перерезки стопы задней лапы, в результате которой у крыс возник болевой синдром, на крысах исследовали эффективность приема тестируемых препаратов для лечения данного болевого синдрома.
Хирургическая операция: Крыс анестезировали изофлураном (Sigma, США). Подошвенную часть задней лапы обрабатывали 10% раствором повидон-йода. Далее с помощью лезвия (номер 11) делали 1 см продольный разрез через кожу и фасции, начиная на 0,5 см ниже проксимального конца пятки в направлении пальцев. Подошвенную мышцу приподнимали и также разрезали в продольном направлении. Места прикрепления мышц оставались интактными. На рану накладывали 2 матрацных шва, используя найлоновые нити 5-0 и иглу FS-2. Рану обрабатывали смесью антибиотиков. После операции животные восстанавливались в своих клетках. Швы снимали под анестезией приблизительно через 30 часов после операции. Раны заживали, как правило, через 5-6 дней.
Формирование групп исследования: крыс случайным образом распределяли на 11 равных по составу групп (по 5 особей в каждой), отличающихся типом вводимого препарата и его дозировкой.
Вводимые препараты и дозы: исследование проводилось для 3 препаратов (флупиртин, циклобензаприн и диклофенак), которые вводили перорально через 3 дня после операции и за 30 минут до проведения поведенческих тестов в указанных дозах и комбинациях: флупиртин, 25 мг/сутки (группа №1); флупиртин, 300 мг/сутки (группа №2); флупиртин, 600 мг/сутки (группа №3); циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №4); циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №5); циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №6); флупиртин, 25 мг/сутки + циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №7); флупиртин, 300 мг/сутки + циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №8); флупиртин, 600 мг/сутки + циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №9); и диклофенак, 50 мг/сутки (группа №10). Контролем служила группа , получающих только носитель (группа плацебо). Все дозы приведены в пересчете на человека.
Поведенческие тесты: для оценки болевого поведения использовали тест с филаментами фон Фрея (возникновение механической аллодинии). Тестирование проводили, как описано в примере 1 выше за исключением того, что филаменты прикладывали только к поврежденной ноге.
Статистический анализ: для каждой группы исследования (n=5) рассчитывали среднюю оценку, полученную в тесте, и стандартную ошибку среднего для каждого значения. Достоверность различий между группами оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (при уровне значимости p<0,05).
Результаты: приведены в таблице 2 ниже.
Таблица 2. Влияние флупиртина и циклобензаприна, применяемых по-отдельности или в комбинации, на поведение крыс с болевым синдромом после хирургического вмешательства.
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
выраженность механической аллодинии, граммы (среднее ± стандартная ошибка среднего)
носитель
-
плацебо
4,8±1,54
флупиртин
25
1
11,4±1,27
300
2
12,7±0,44
600
3
14,1 ±2,21
циклобензаприн
1,25
4
13,2±2,04
15
5
14,5±0,52
30
6
15,6±1,02
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7*
24,8±1,72
300 + 15
8*
25,2±2,13
600 + 30
9*
25,8±1,33
диклофенак
50
10
17,2±1,86
* достоверное отличие от ожидаемого (расчётного) аддитивного эффекта комбинации флупиртин + циклобензаприн (уровень значимости р<0,05).
Выводы: в группах, получающих комбинацию флупиртина и циклобензаприна, показатель механической аллодинии значительно снижен, что свидетельствует об эффективности их использования для лечения болевого синдрома после хирургического вмешательства. В эксперименте также был обнаружен синергический эффект действия комбинации флупиртина и циклобензаприна.
Пример 3. Оценка эффективности комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения спастичности скелетных мышц при неврологических заболеваниях.
Эффективность препаратов для лечения спастичности скелетных мышц при неврологических заболеваниях (например, при рассеянном склерозе, хронической миелопатии, дегенеративных заболеваниях) исследовали на модели перерезки крестцового отдела спинного мозга крысы (формирование спастичности мышц хвоста) [Bennett D.J., Sanelli L., Cooke C.L., Harvey P.J., Gorassini M.A. “Spastic long-lasting reflexes in the awake rat after sacral spinal cord injury” // J Neurophysiol. 2004, 91: 2247-2258. Li Y., Gorassini M.A., Bennett D.J. // Role of persistent sodium and calcium currents in motoneuron firing and spasticity in chronic spinal rats. J. Neurophysiol. 2004, 91: 767-783. Li X., Murray K., Harvey P.J., Ballou E.W., Bennett D.J. “Serotonin facilitates a persistent calcium current in motoneurons of rats with and without chronic spinal cord injury” // J Neurophysiol. 2007, 97: 1236-1246].
Крысы: в экспериментах использовали 55 взрослых самцов крыс линии Спрег-Доули, имеющих массу тела 250-330 граммов. Крысы содержались по пять особей в терморегулируемых боксах (с температурой в среднем 21°С) при 12-часовом цикле дня и ночи и с достаточным количеством воды и пищи.
Описание модели: на 15 день после операции по перерезке крестцового отдела спинного мозга оценивали спастичность хвоста у бодрствующих животных при механической стимуляции.
Формирование групп исследования: крыс случайным образом распределяли на 11 равных по составу групп (по 5 особей в каждой), отличающихся типом вводимого препарата и его дозировкой.
Вводимые препараты и дозы: исследование проводилось для 3 препаратов (флупиртин, циклобензаприн и диклофенак), которые вводили за 30 минут до стимуляции перорально в указанных дозах и комбинациях: флупиртин, 25 мг/сутки (группа №1); флупиртин, 300 мг/сутки (группа №2); флупиртин, 600 мг/сутки (группа №3); циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №4); циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №5); циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №6); флупиртин, 25 мг/сутки + циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №7); флупиртин, 300 мг/сутки + циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №8); флупиртин, 600 мг/сутки + циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №9); и диклофенак, 50 мг/сутки (группа №10). Контролем служила группа крыс, получающих только носитель (группа плацебо). Все дозы приведены в пересчете на человека.
Хирургическая операция: экспериментальную перерезку крестцового отдела спинного мозга осуществляли на уровне S2 под наркозом (изофлуран, Sigma, США) в стерильных условиях, как было описано раннее [Bennett, et al., 1999]. Кратко, разрезали мягкие ткани на дорзальной стороне позвоночника, проводили ламинэктомию на уровне L2 поясничного позвонка. Подобранный по размеру крючок подводили под спинной мозг, который полностью перерезали ножницами, избегая повреждения вен и артерий. Слои мягких тканей плотно пришивали к спинному мозгу.
Оценка спастичности хвоста: крыс помещали в плексигласовый цилиндр так, чтобы хвост был высунут наружу и мог свободно двигаться в вертикальном направлении. Хвост стимулировали вручную следующим образом: основание хвоста зажимали левой рукой, а в правой руке, удерживая хвост между большим и указательным пальцами, быстро проводили вдоль хвоста от основания к кончику, плотно прилегая к нему, и высвобождая хвост по окончании движения. Процедуру повторяли трижды. Этим достигалось продольное выпрямление хвоста. Ответной реакцией на такую стимуляцию являлось скручивание хвоста с отведением его под тело крысы (или в дорсальном направлении у крыс с более тяжелыми повреждениями). Для оценки спастичности хвоста использовали описанную ниже шкалу.
0-1 балл: очень слабое или несущественное скручивание кончика хвоста в ответ на растяжение (под углом меньше 90°, длительностью всего несколько секунд), слабый мышечный тонус или его отсутствие, отсутствие клонуса, отсутствие реакции на легкое прикосновение к коже или шерсти.
2-3 балла: сильный спазм (сгибание) хвоста в ответ на стимуляцию растяжением, кончик загибается под углом 180-360°, длительностью 3-10 секунд. Повторяющиеся скручивания и клонус хвоста длятся больше 10 минут, гипертонус, высокая чувствительность к легкому прикосновению.
4-5 баллов: аналогично предыдущей оценке, но чаще повторяются сгибания и изгибания хвоста, в результате чего хвост часто приобретает S-образную форму, при этом проксимальная часть хвоста загибается под крысу, а дистальная часть – в противоположном направлении; более выраженные клонус, гипертонус и движения из стороны в сторону.
Для каждой крысы выставляли балл по шкале спастичности хвоста, которые далее усредняли в пределах одной группы.
Статистический анализ: для каждой группы исследования (n=5) рассчитывали средний балл по шкале спастичности и стандартную ошибку среднего для каждого значения. Полученные средние значения далее сравнивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (при уровне значимости p<0,05) для выявления статистических различий между группами.
Результаты: полученные результаты приведены в таблице 3 ниже.
Таблица 3. Влияние флупиртина и циклобензаприна, применяемых по-отдельности или в комбинации, на поведение крыс, испытывающих боль в результате спастичности скелетных мышц.
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
Средний балл по шкале спастичности ± стандартная ошибка среднего
носитель
-
плацебо
4,8±0,19
флупиртин
25
1
2,9±0,14
300
2
2,6±0,23
600
3
2,5±0,24
циклобензаприн
1,25
4
2,7±0,21
15
5
2,4±0,23
30
6
2,2±0,2
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7*
1,0±0
300 + 15
8*
0,8±0,19
600 + 30
9*
0,7±0,21
диклофенак
50
10
0,9±0,14
* достоверное отличие от ожидаемого (расчётного) аддитивного эффекта комбинации флупиртин + циклобензаприн (уровень значимости р<0,05).
Выводы: степень спастичности хвоста у животных, получающих комбинацию флупиртина и циклобензаприна, была выражена слабее всего, что свидетельствует о возможности использования данной комбинации для лечения спастичности скелетных мышц при неврологических заболеваниях. В эксперименте также был обнаружен синергический эффект действия комбинации флупиртина и циклобензаприна.
Пример 4. Оценка эффективности комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения головной боли.
Для данного исследования была выбрана модель мигрени на крысах, индуцированная введением нитроглицерина [Sufka K.J., Staszko S.M., Johnson A.P., Davis M.E., Davis R.E., Smitherman T.A. “Clinically relevant behavioral endpoints in a recurrent nitroglycerin migraine model in rats” // J Headache Pain. 2016, 17: 40].
Крысы: в экспериментах использовали 55 взрослых самцов крыс линии Спрег-Доули, имеющих массу тела 250-330 граммов. Крысы содержались по пять особей в терморегулируемых боксах (с температурой в среднем 21°С) при 12-часовом цикле дня и ночи и с достаточным количеством воды и пищи.
Формирование групп исследования: крыс случайным образом распределяли на 11 равных по составу групп (по 5 особей в каждой), отличающихся типом вводимого препарата и его дозировкой.
Описание модели: мигрень у крыс вызывали внутрибрюшинным введением раствора нитроглицерина (Copperhead Chemical, США) в дозе 10 мг/2мл/кг массы тела животного в течение 2 недель с периодичностью раз в 3 дня (всего 5 инъекций). Через 30 минут после каждого введения нитроглицерина животные получали исследуемый препарат в указанных дозах. Через 90 минут после последнего пятого введения состояние животных оценивали в описанных ниже поведенческих тестах.
Вводимые препараты и дозы: исследование проводилось для 3 препаратов (флупиртин, циклобензаприн и диклофенак), которые вводили через 30 минут после каждого введения нитроглицерина перорально в указанных дозах и комбинациях: флупиртин, 25 мг/сутки (группа №1); флупиртин, 300 мг/сутки (группа №2); флупиртин, 600 мг/сутки (группа №3); циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №4); циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №5); циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №6); флупиртин, 25 мг/сутки + циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №7); флупиртин, 300 мг/сутки + циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №8); флупиртин, 600 мг/сутки + циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №9); и диклофенак, 50 мг/сутки (группа №10). Контролем служила группа крыс, получающих только носитель (группа плацебо). Все дозы приведены в пересчете на человека.
Поведенческие тесты: выраженность головной боли в каждой группе крыс исследовали с помощью двух тестов: избегание света в темно-светлой камере и оценка по шкале гримас, составленной для крыс.
Шкала гримас для крыс учитывает 4 заметных изменения мимики крыс: сужение глаз, выпячивание щек, изменение формы ушей, направление вибриссов. Каждый из параметров оценивается по фотографиям крыс, как подробно описано ранее [Sotocinal S., Sorge R., Zaloum A. et al. “The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions” // Mol Pain, 2011, 7: 55] по шкале от 0 (признак отсутствует) до 2 (признак явно выражен). Общая сумма баллов определяет степень испытываемой крысой боли. Максимально возможный балл равен 8. Для получения фотографий крыс помещали в плексигласовую камеру размером 31х22х26 см и использовали цифровой фотоаппарат (Olympus Camedia C-5050 Zoom, Япония).
Тест «темно-светлая камера» проводился с использованием установки «темно-светлая камера», которая состоит из двух отсеков – темного (освещенность внутри ≤5 люкс) и светлого (освещенность внутри ≥635 люкс), разделенных перегородкой с отверстием для перемещения крыс. Параметры каждого отсека 30х30х30 см. Темный отсек камеры закрыт крышкой. Животных помещали в ярко освещенный отсек на 5 мин и регистрировали время, проведенное в светлом и темном отсеках. Ход эксперимента записывали на цифровую видеокамеру (HDR-PJ820E, Sony, Япония). Чем больше времени проводит животное в светлом отсеке, тем менее выражена у него светобоязнь, сопровождающая мигрень.
Статистический анализ: для каждой группы исследования (n=5) рассчитывали среднюю оценку, полученную в тесте с темно-светлой камерой, средний балл по шкале гримасы, а также стандартную ошибку среднего для каждого значения. Полученные средние значения далее сравнивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (при уровне значимости p<0,05) для выявления статистических различий между группами.
Результаты: полученные результаты (средние по группам) приведены в таблице 4 ниже.
Таблица 4. Влияние флупиртина и циклобензаприна, применяемых по-отдельности или в комбинации, на поведение крыс с головной болью.
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
Время, проведенное в светлом отсеке, сек (среднее ± стандартная ошибка среднего)
Балл по шкале гримас (среднее ± стандартная ошибка среднего)
носитель
-
плацебо
15,1±0,68
7,4±0,4
флупиртин
25
1
23,5±0,45
3,6±0,6
300
2
25,6±1,1
3,4±0,51
600
3
24,9±1,9
3,2±0,49
циклобензаприн
1,25
4
21,8±0,69
3±0,63
15
5
22,3±0,54
2,8±0,48
30
6
24,4±0,86
2,6±0,4
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7*
42,1±0,58
1,4±0,6
300 + 15
8*
45,6±0,76
1,2±0,58
600 + 30
9*
50,9±0,32
0,8±0,49
диклофенак
50
10
46,8±1,0
2±0,45
* достоверное отличие от ожидаемого (расчётного) аддитивного эффекта комбинации флупиртин + циклобензаприн (уровень значимости р<0,05).
Выводы: в поведенческих тестах в группе крыс, получающих комбинацию флупиртина и циклобензаприна, выраженность головной боли была значительно ниже, чем во всех группах моновведения и группе плацебо. Помимо этого, был отмечен синергический эффект действия комбинации флупиртина и циклобензаприна.
Пример 5. Оценка эффективности комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения боли, сопряженной со злокачественным процессом.
Оценка эффективности препаратов для лечения боли, сопряженной со злокачественными процессом, проводилась на модели боли, вызванной раком костей, на крысах.
Крысы: в экспериментах использовали 55 взрослых самок крыс линии Спрег-Доули, имеющих массу тела 150-180 граммов. Крысы содержались по пять особей в терморегулируемых боксах (с температурой в среднем 21°С) при 12-часовом цикле дня и ночи и с достаточным количеством воды и пищи.
Описание модели: в данной модели боль возникает вследствие развития рака кости. Рак кости у крыс вызывали имплантацией клеток карциномы молочной железы (линия клеток MRMT-1) в большеберцовую кость [Medhurst S.J., Walker K., Bowes M., Kidd B.L., Glatt M., Muller M., Hattenberger M., Vaxelaire J., O’Reilly T., Wotherspoon G., Winter J., Green J., Urban L. “A rat model of bone cancer pain” // Pain. 2002, 96: 129-140]. Через определенное время после имплантации в поведенческих тестах фиксировали изменения ответов на механические раздражители вследствие возникновения боли.
Формирование групп исследования: крыс случайным образом распределяли на 11 равных по составу групп (по 5 особей в каждой), отличающихся типом вводимого препарата и его дозировкой.
Вводимые препараты и дозы: исследование проводилось для 3 препаратов (флупиртин, циклобензаприн и диклофенак), которые вводили перорально на 15 день после хирургического вмешательства в указанных дозах и комбинациях: флупиртин, 25 мг/сутки (группа №1); флупиртин, 300 мг/сутки (группа №2); флупиртин, 600 мг/сутки (группа №3); циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №4); циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №5); циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №6); флупиртин, 25 мг/сутки + циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №7); флупиртин, 300 мг/сутки + циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №8); флупиртин, 600 мг/сутки + циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №9); и диклофенак, 50 мг/сутки (группа №10). Контролем служила группа крыс, получающих только носитель (группа плацебо). Все дозы приведены в пересчете на человека.
4
Клетки: клетки карциномы молочной железы крыс MRMT-1 культивировали в среде, содержащей RPMI 1640 (Sigma, США; 500 мл), 10% (50 мл) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, инактивированная нагреванием), 1% (5 мл) L-глутамина и 2% (10 мл) пенициллина/стрептомицина. Непосредственно перед инъекцией клетки открепляли от пластика кратковременным воздействием 0,1% (масса/объем) трипсина и собирали центрифугированием 10 мл среды в течение 3 минут при 1200 rpm. Полученный осадок дважды промывали 10 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS; Sigma, США), не содержащего кальций, магний или феноловый красный, и повторно центрифугировали в течение 3 минут при 1200 rpm. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Хенкса, и подсчитывали число клеток в нем с помощью гемоцитометра. Клетки разбавляли до финальной концентрации 3х10 клеток/инъекцию и держали на льду до момента введения крысам.
Хирургическая операция: крыс анестезировали изофлураном (Sigma, США), после чего помещали в положение животом вверх, лежа на спине. С левой задней лапы крысы сбривали шерсть, а кожу дезинфицировали 70% (объем/объем) этанолом. Далее делали рострокаудальный разрез по коже, длиной 1 см, начинающийся от верхней половины голени. Большеберцовую кость аккуратно высвобождали, стараясь не повредить мышцы и кровеносные сосуды. Используя иглу 23-го калибра, кость протыкали на расстоянии 5 мм ниже коленного сустава, дистально по отношению к эпифизарной пластинке роста. Иглу при этом держали под углом, чтобы она могла достигнуть интрамедуллярного канала кости. Затем иглу удаляли и заменяли длинной тонкой тупоконечной иглой (Hamilton, стандартная, навинчиваемая металлическая тупая игла), прикрепленной к 10-миллилитровому шприцу Hamilton, содержащему вводимые клетки. Таким способом в костную полость вводили 3 мл раковых клеток. Одновременно с надавливанием на поршень шприца иглу медленно вытаскивали из кости, чтобы клетки могли заполнить пространство в полости кости и не вытекали за ее пределы. По окончании процедуры место инъекции закрывали костным воском (Ethicon, США). Рану закрывали с помощью металлических зажимов для кожи (Becton Dickinson, США) и обрабатывали антибиотиком ауреомицином. Животных помещали на нагретый матрасик, пока они не приходили в сознание, после чего возвращали в их клетки.
Поведенческий тест (распределение веса между задними конечностями): боль, возникающая у крыс вследствие развития у них рака кости, влияет на поведение животных в описанном ниже тесте. Измерения проводили на 15 день после имплантации клеток карциномы молочной железы крыс в полость кости экспериментальных животных и через 30 минут после введения исследуемых препаратов.
Распределение веса тела между задними конечностями измеряли с помощью специального устройства (тестер инвалидности, Columbus Instruments, США), представляющего собой плексигласовую камеру небольшого размера, в которой животное находится в неподвижном положении, и двух пластинок с датчиками на дне камеры, на каждую из которых помещается одна задняя лапа животного. Датчики в течение 3 секунд регистрировали давление, создаваемое на них соответствующей лапой. Данные о распределении веса на интактную и поврежденную конечности (в граммах) выражали в процентах от общего веса животного. Для каждой крысы было сделано по 2 измерения (с разницей в 10 минут). Развивающийся при раке болевой синдром сопровождался уменьшением нагрузки на поврежденную конечность.
Статистический анализ: для каждой группы исследования (n=5) рассчитывали среднее значение нагрузки на каждую лапу, выраженное в процентах от общего веса тела животного, а также стандартную ошибку среднего. Полученные средние значения далее сравнивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (при уровне значимости p<0,05) для выявления статистических различий между группами.
Результаты: полученные данные приведены в таблице 5 ниже. Менее активное использование интактной конечности наблюдалось во всех исследуемых группах по сравнению с группой плацебо. При этом животные в группах, получающих комбинацию флупиртина и циклобензаприна, распределяли вес практически симметрично с незначительным предпочтением в использовании неповрежденной лапы.
Таблица 5. Влияние флупиртина и циклобензаприна, применяемых по-отдельности или в комбинации, на поведение крыс, страдающих болевым синдромом, сопряженным с раком кости.
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
Распределение веса тела между задними конечностями (средняя нагрузка по группе (в % от веса тела животного), приходящаяся на интактную лапу ± стандартная ошибка среднего)
носитель
-
плацебо
75,7±1,57
флупиртин
25
1
65,2±2
300
2
62,3±1,68
600
3
61,4±1,3
циклобензаприн
1,25
4
66,4±1,79
15
5
63,3±1,56
30
6
62,5±1,74
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7*
55,4±1,83
300 + 15
8*
53,6±1,2
600 + 30
9*
52,9±2
диклофенак
50
10
67,9±1,8
* достоверное отличие от ожидаемого (расчётного) аддитивного эффекта комбинации флупиртин + циклобензаприн (уровень значимости p<0,05)
Выводы: в поведенческом тесте в группе крыс, получающих комбинацию флупиртина и циклобензаприна, показатели боли, сопряженной со злокачественным процессом, были значительно ниже, чем во всех группах моновведения и группе плацебо. Более того, в эксперименте был показан синергический эффект действия комбинации флупиртина и циклобензаприна.
Пример 6. Оценка эффективности комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения дисменореи и альгоменореи.
Эффективность комбинации флупиртина и циклобензаприна для лечения дисменореи и альгоменореи оценивали на модели маточного спазма, индуцированного внутрибрюшинным введением окситоцина самкам мышей после 6-дневного предварительного введения эстрадиола бензоата [Wang C., et al. “Pirt contributes to uterine contraction-induced pain in mice” // Molecular Pain. 2015, 11: 57].
Мыши: в исследовании участвовало 77 здоровых самок мышей линии c57bl/6, имеющих массу тела 15-20 граммов. Животных содержали по 4 в клетке, в помещении с контролируемой температурой (20-24°С) и влажностью (46-65%), при этом соблюдался 12-часовой цикл дня/ночи и был обеспечен свободный доступ к воде и пищи.
Формирование групп исследования: мышей случайным образом распределяли на 11 равных по составу групп (по 7 особей в каждой), отличающихся типом вводимого препарата и его дозировкой.
Вводимые препараты и дозы: исследование проводилось для 3 препаратов (флупиртин, циклобензаприн и диклофенак), которые вводили перорально за 2 часа до введения окситоцина в указанных дозах и комбинациях: флупиртин, 25 мг/сутки (группа №1); флупиртин, 300 мг/сутки (группа №2); флупиртин, 600 мг/сутки (группа №3); циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №4); циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №5); циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №6); флупиртин, 25 мг/сутки + циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №7); флупиртин, 300 мг/сутки + циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №8); флупиртин, 600 мг/сутки + циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №9); и диклофенак, 50 мг/сутки (группа №10). Контролем служила группа мышей, получающих только носитель (группа плацебо). Все дозы приведены в пересчете на человека.
Методика: на протяжении 6 последовательных дней утром (в 9 часов) самкам мышей вводили эстрадиола бензоат (Sigma, США) путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,01 г/кг/день. На 7 день (через день после окончания введения эстрадиола бензоата) утром (в 9 часов) самкам мышей перорально вводили исследуемые препараты в указанных выше дозах. Через 4 часа после этого у животных вызывали маточный спазм путем внутрибрюшинной инъекции окситоцина в дозе 0,01 л/кг. Животных оставляли в покое на 10 минут, после чего наблюдали в поведенческом тесте.
Поведенческий тест: в течение 80 минут после введения окситоцина поведение животных регистрировали на цифровую видеокамеру (HDR-PJ820E, Sony, Япония). Проявлением боли в данной модели являются эпизоды корчей – характерных движений животных, включающих сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягивание задних конечностей и прогибание спины. Исследователями подсчитывалось количество корчей в каждой группе на протяжении всего времени записи.
Статистический анализ: для каждой группы исследования (n=7) рассчитывали среднее значение количества корчей и стандартную ошибку среднего. Полученные средние значения далее сравнивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (при уровне значимости p<0,05) для выявления статистических различий между группами.
Результаты: приведены в таблице 6 ниже.
Таблица 6. Влияние флупиртина и циклобензаприна, применяемых по-отдельности или в комбинации, на поведение у мышей после индукции у них маточного спазма.
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
Количество корчей (среднее по группе ± стандартная ошибка среднего)
носитель
-
плацебо
15 ± 0,5
флупиртин
25
1
7,9 ± 0,8
300
2
7,7 ± 0,7
600
3
7,2 ± 0,5
циклобензаприн
1,25
4
8,4 ± 1,6
15
5
8,3 ± 1,1
30
6
8,0 ± 0,4
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7 *
4,1 ± 0,9
300 + 15
8 *
3,6 ± 0,3
600 + 30
9 *
3,1 ± 0,4
диклофенак
50
10
6,3 ± 0,9
* достоверное отличие от ожидаемого (расчётного) аддитивного эффекта комбинации флупиртин + циклобензаприн (уровень значимости р<0,05).
Вывод: Число корчей в течение 80-минутного периода после введения окситоцина в группе мышей, получающих комбинацию флупиртина и циклобензаприна, было значительно ниже, чем в группе плацебо, а также значительно ниже, чем во всех группах моновведения, что свидетельствует об эффективности применения данной комбинации для лечения дисменореи и альгоменореи. Но помимо этого также был показан синергический эффект действия комбинации флупиртина и циклобензаприна.
Пример 7. Тест на токсичность комбинации флупиртина и циклобензаприна.
Известно, что при многократном введении флупиртина у пациентов наблюдаются следующие наиболее частые побочные эффекты: головокружение, общая усталость/слабость, изжога, тошнота, рвота, сухость во рту, головная боль, тремор [Harish S., et al. “Flupirtine: Clinical pharmacology” // J Anaesthesiol Clin Pharmacol. 2012, 28(2): 172-177]. Аналогичные побочные эффекты показаны при длительном приеме циклобензаприна [Browning R., Jackson J.L., O’Malley P.G. "Cyclobenzaprine and back pain: a meta-analysis" // Archives of Internal Medicine. 2001, 161(13): 1613-1620.]. Целью данного исследования было установить, не приводит ли совместное применение флупиртина и циклобензаприна к усилению этих побочных эффектов.
Крысы: в экспериментах использовали 100 крыс (50 самцов и 50 самок) линии Спрег-Доули в возрасте 8-9 недель, имеющих массу тела 150-200 граммов на начало исследования. Крысы содержались по пять особей в терморегулируемых боксах (с температурой в среднем 21°С) при 12-часовом цикле дня и ночи и с достаточным количеством воды и пищи.
Формирование групп исследования: крыс случайным образом распределяли на 10 равных по составу групп (по 5 самцов и 5 самок в каждой группе), отличающихся типом вводимого препарата и его дозировкой.
Дизайн тестирования: тестируемые вещества вводили самцам и самкам крыс перорально ежедневно в течение 28 дней в дозах, указанных ниже. В течение всего исследования у животных регистрировали клинические признаки интоксикации, изменение поведения и вес тела.
Вводимые препараты и дозы: исследование проводилось для 2 препаратов (флупиртин и циклобензаприн), которые вводили перорально ежедневно в течение 28 дней в указанных дозах и комбинациях: флупиртин, 25 мг/сутки (группа №1); флупиртин, 300 мг/сутки (группа №2); флупиртин, 600 мг/сутки (группа №3); циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №4); циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №5); циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №6); флупиртин, 25 мг/сутки + циклобензаприн, 1,25 мг/сутки (группа №7); флупиртин, 300 мг/сутки + циклобензаприн, 15 мг/сутки (группа №8); флупиртин, 600 мг/сутки + циклобензаприн, 30 мг/сутки (группа №9). Контролем служила группа крыс, получающих только носитель (группа плацебо). Все дозы приведены в пересчете на человека.
Определение веса тела: всех животных взвешивали не реже 1 раза в неделю. По результатам каждого измерения рассчитывали средний вес животных в группе (отдельно для самцов, отдельно для самок).
Потребление пищи: регистрировали ежедневно в среднем для каждой группы животных.
Поведенческие тесты: прием препаратов может сказываться на количестве и качестве двигательной активности животного. Для оценки данной активности использовали методику «открытое поле». «Открытое поле» представляет собой хорошо освещенную круглую арену диаметром 1,2 м и высотой 45 см, пол которой размечен радиальными и круговыми линиями. Крысу выпускали в центральный сектор поля и в течение 3 мин регистрировали суммарное число горизонтальных и вертикальных перемещений.
Горизонтальная двигательная активность включает пробежки по разным траекториям, вплоть до кружения вокруг одного места. Основным критерием для идентификации данной формы поведения является участие в перемещении животного между секторами всех четырех лап. Вертикальную двигательная активность определяли и обсчитывали по количеству стоек без разделения на «стойка с упором» (задние лапы животного остаются на полу арены, а передние упираются в стенку поля) и «без упора» (передние лапы остаются на весу). Эксперимент проводили на 28 день исследования, через 90 минут после введения препарата. Эффекты препаратов оценивали по степени изменения олигокинезии в данном тесте.
Для оценки моторного дефицита и нарушений координации движений животных помещали на горизонтальный стержень диаметром 3 см, который вращали с постоянной скоростью 10 оборотов в минуту или с нарастающей скоростью – каждые 7 секунд на 1 оборот, где: начальная скорость – 5, конечная – 30 оборотов в минуту. Регистрировали время удерживания животного на вращающемся стержне (максимально в течение 200 с). Предварительно проводили однократное обучение удержанию крыс на стержне при минимальной скорости вращения. Тестирование в условиях вращающегося стержня проводили на 28 день исследования, через 90 минут после введения препарата.
Появление признаков клинической интоксикации: фиксировались любые другие отклонения от нормального состояния животных, например, рвота, отказ от приема пищи, тремор и т.п.
Статистический анализ: все данные представлены в виде среднего значения для группы ± стандартная ошибка среднего. Различия между группами оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (при уровне значимости p<0,05).
Результаты: представлены в таблицах 7 и 8 ниже. В поведенческих тестах не отмечено достоверных различий между группами моновведения и группами, получающими комбинацию исследуемых препаратов. Различия в весе тела в группах крыс также не были достоверными. Клинических признаков интоксикации не было отмечено ни в одной из групп животных, длительно получающих флупиртин и циклобензаприн, в комбинации или по отдельности в указанных дозах.
Таблица 7. Вес тела животных
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
Вес тела, граммов(среднее по группе ± стандартная ошибка среднего)
14 день
28 день
самцы
самки
самцы
самки
носитель
-
плацебо
262±2,7
210±1,8
312±3,7
250±2,8
флупиртин
25
1
257±2,0
223±2,9
297±4,1
244±3,1
300
2
249±2,5
195±2,6
306±2,9
259±2,6
600
3
260±1,9
201±2,4
290±3,4
247±2,7
циклобензаприн
1,25
4
263±2,8
215±2,1
323±4,6
243±2,3
15
5
256±2,3
189±2,9
309±3,3
253±3,0
30
6
251±2,5
296±2,6
289±3,9
239±2,9
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7
276±1,8
206±1,7
299±2,8
245±3,2
300 + 15
8
253±2,1
198±2,0
310±4,2
251±2,4
600 + 30
9
261±2,8
208±2,3
304±3,6
261±2,9
Таблица 8. Влияние препаратов на двигательную активность и координацию животных
Препарат
Доза, мг/сутки
Группа №
Число вертикальных и горизонтальных перемещений
Время удержания на вращающемся стержне, секунд
среднее по группе ± стандартная ошибка среднего
носитель
-
плацебо
78,07±2,11
167,8±8,6
флупиртин
25
1
73,21±1,19
144,2±9,3
300
2
70,23±3,01
142,4±7,2
600
3
64,90±2,41
139,1±4,3
циклобензаприн
1,25
4
65,45±2,30
143,3±4,9
15
5
60,98±2,55
139,6±9,2
30
6
56,46±1,98
136,2±7,3
флупиртин +циклобензаприн
25 + 1,25
7 *
76,46±2,34
166,5±4,8
300 + 15
8 *
74,69±2,85
164,4±8,7
600 + 30
9 *
70,44±2,06
162,5±5,6
* достоверное отличие от ожидаемого (расчётного) аддитивного эффекта комбинации флупиртин + циклобензаприн (уровень значимости р<0,05).
Вывод: применение комбинации флупиртина и циклобензаприна по настоящему изобретению приводит к статистически значимому уменьшению побочных эффектов, связанных с нарушением координации.
Пример 8. Получение лекарственного средства в форме таблеток. Смешивают 1600 мг крахмала, 1600 мг измельченной лактозы, 400 мг талька, 952,4 мг флупиртина малеата и 47,6 мг циклобензаприна гидрохлорида и спрессовывают в брусок. Полученный брусок измельчают в гранулы и просеивают через сита, собирая гранулы размером 14-16 меш. Полученные гранулы таблетируют в подходящую форму таблетки весом 560 мг каждая.
Пример 9. Получение лекарственного средства в форме капсул. Тщательно смешивают флупиртин, или его фармацевтически приемлемую соль, с циклобензаприном, или его фармацевтически приемлемой солью, в соотношении 20 : 1. Полученную комбинацию смешивают с порошком лактозы в соотношении 2 : 1. Полученную порошкообразную смесь упаковывают по 300 мг в желатиновые капсулы подходящего размера.
Пример 10. Получение лекарственного средства в форме инъекционных композиций для внутримышечных, внутрибрюшинных или подкожных инъекций. Смешивают 952,4 мг флупиртина малеата и 47,6 мг циклобензаприна гидрохлорида, с 600 мг хлорбутанола, 4 мл пропиленгликоля и 200 мл инъекционной воды. Полученный раствор фильтруют и помещают по 1 мл в ампулы, которые запаивают.
Изобретение может быть использовано в медицине, фармакологии.