МЕТОДОЛОГИЯ ОЦЕНКИ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ БИОПРЕПАРАТОВ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ

Методология оценки нефтеокисляющей способности биопрепаратов-нефтедеструкторов

Сравниваются различные методические подходы к оценке нефтеокисляющей способности микроорганизмов, проанализированы качественные и количественные характеристики различных методик оценки нефтеокисляющей активности. Предлагается способ проектирования консорциумов для биопрепаратов-нефтедеструкторов. УДК статьи 579.69

А.В. Нечаева1

Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, nechaevasasha709@gmail.com

С.В. Остах2

РГУ нефти и газа (НИУ) имени И.М. Губкина, канд. техн. наук, доцент, ostah2009@yandex.ru

1 младший научный сотрудник, Москва, Россия

2 доцент, Москва, Россия

Для цитирования: Нечаева А.В., Остах С.В. Методология оценки нефтеокисляющей способности биопрепаратов-нефтедеструкторов // Компетентность / Competency (Russia). — 2022. — № 6. DOI: 10.24412/1993-8780-2022-6-42-48

ключевые слова

биопрепарат, иерархический подход, нефтедеструктор, нефтеокисляющие микроорганизмы, проектирование консорциума

иоремедиация — актуальная технология очистки окружающей среды от токсичных загрязнений с применением живых организмов — довольно часто используется при восстановлении не-фтезагрязненной почвы [1].

Микроорганизмы, использующиеся в этом процессе для разложения углеводородов нефти, должны быть всесторонне изучены, лишь в этом случае их метаболический потенциал может быть полностью реализован [2]. При этом важно, особенно при составлении консорциумов био-препаратов-нефтедеструкторов, оценить нефтеокисляющую способность как каждого штамма, так и сообщества в целом [3].

Кроме того, нефтепродукты значительно различаются по составу и до сих пор отсутствуют универсальные критерии и необходимые основы стандартизации информационно-аналитической деятельности, с помощью которых можно было бы сравнить бактерии-деструкторы и выявить оптимальный штамм, особенно среди способных разлагать широкий спектр веществ [4].

Целью данной работы является сравнение различных методических подходов к оценке нефтеокисляющей способности микроорганизмов, а также описание способа проектирования консорциумов биопрепаратов с учетом изученных методик.

Анализ логических и методических подходов

изуальная оценка эффективности действия биопрепаратов на поверхности нефтезагрязнен-ных почв проводится по изменению цвета — от серого до темно-рыжеватого и изменению агрегатного состояния нефтепродуктов — от вязкой жидко-

сти до легко распадающихся твердых частиц [5].

Лабораторный контроль качества проб почвенного покрова осуществляется с использованием базовых аттестованных методик и стандартного перечня химических показателей, таких как водородный показатель реакции среды (рН), общее содержание азота, нитраты, фосфаты, сульфаты, хлориды, железо общее, свинец, цинк, марганец, никель, кадмий, ртуть, медь, кобальт, мышьяк, нефтепродукты, фенолы, бенз(а)пирен.

Среди различных методических подходов к оценке нефтеокисляющей способности микроорганизмов можно выделить количественные и качественные. Качественный метод заключается в визуальной оценке нефтяного загрязнения и выставлении баллов по определенным критериям, на основе которых можно сделать выводы о степени нефтеокисления. Примером такой оценки может служить «Методика определения степени нефтеокисля-ющей способности штаммов бактериальных культур» (Environmental Protection Agency, USA) [6], в которой визуальный анализ проводится по двум критериям: накоплению биомассы и однородности дисперсной системы при биодеструкции. Для оценки нефтеокисляющей активности данным методом подготавливают питательную среду с 3-процентным содержанием нефти. Затем пробирки с готовой средой инокулируют и выдерживают при оптимальной температуре и перемешивании в течение четырех суток. Нефтеокисляющую способность бактерий оценивают по 10-балльной шкале на основе таких характеристик, как переход нефти в суспензию при встряхивании, наличие нефтяного ободка

на стенках, наличие нефтяной пленки при отстаивании, изменение цвета, количество биомассы бактерий на дне, всплывание хлопьевидных включений нефти. Однако подобная оценка (хотя и быстрая) является субъективной (экспертной), поскольку зависит от мнения эксперта, который проводит анализ. Данный экспресс-метод целесообразно применять при выборе загрязненного нефтью участка для выделения аборигенных микроорганизмов, но он не является надежным, требует усовершенствования и может быть использован как предварительная оценка перед количественным анализом.

Критериями количественного анализа нефтеокисляющей активности чаще всего служат численность бактерий и остаточное содержание нефти. Остановимся подробнее на нескольких самых распространенных методах измерения этих величин.

Измерение численности проводят после культивирования микроорганизмов на среде с добавлением нефти как единственного источника углерода, от переработки которого будет зависеть развитие и размножение бактерий. Измерить количество микроорганизмов можно прямыми и косвенными методами. Для прямого подсчета часто используют чашечный метод, при котором сначала в жидкой питательной среде с добавлением нефти при определенных условиях выращивают культуру, затем проводят десятикратное разведение полученной культуры и высевают установленный объем из каждого разведения в чашки Петри с твердой питательной средой. После инкубирования в течение определенного времени подсчитывают выросшие колонии и пересчитывают это количество на число колоние-образующих единиц

Критериями количественных методов служат численность бактерий и остаточное содержание нефти

может значительно исказить результаты. Более точным прямым методом является микроскопия, позволяющая получить более достоверные данные о численности. Для подсчета клеток готовят препарат «раздавленная капля»: в случае твердой питательной среды на предметное стекло наносят каплю дистиллированной воды и размазывают в ней культуру, отобранную микробиологической петлей из чашки Петри; в случае жидкой питательной среды пипеткой отбирают небольшое количество суспензии и из этого количества наносят каплю на предметное стекло. После чего накрывают покровным стеклом и сверху капают иммерсионное масло. Полученный препарат рассматривают под иммерсионным объективом с увеличением в 1000 раз. Клетки подсчитывают в 30 полях и пересчитывают на количество клеток в 1 мл [8]. Недостатки такого подсчета — сильное напряжение зрения и возможность ошибок.

Примером косвенного метода может служить определение численности бактерий по оптической плотности. С наращиванием биомассы бактерий среда будет менять мутность по сравнению с контрольной, следовательно, будет меняться интенсивность проходящего света — величина светопо-глощения (светорассеивания). Для определения количества клеток используют калибровочные графики, индивидуальные для каждого микроорганизма, которые отражают зависимость поглощенного (рассеянного) света от численности бактерий [7]. Недостатками данного метода являются его неточность (мутность среды зависит не только от количества клеток, но и от других факторов), а также необходимость калибровочных графиков.

справка

Биоремедиация

(от био- и лат. remedio — лечить, исцелять) — комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов — растений, грибов, насекомых, червей и микроорганизмов

Инокуляция (от лат. inoculatio — прививка) — введение живых микроорганизмов, инфицированного материала, сыворотки и т.п. в ткани растений, животных, питательные среды

Лизис (от греч. Xvoiq — разделение) — растворение клеток и их систем, в том числе микроорганизмов, под влиянием различных агентов, например ферментов, бактериолизинов, бактериофагов, антибиотиков

Рис. 1. Блок-схема проведения методов оценки нефтеокисляющей активности

[Flowchart for carrying out methods for assessing oil-oxidizing activity]

Остаточное содержание нефти чаще всего определяют гравиметрическим анализом. Его можно провести несколькими способами: в хроматогра-фической колонке [9], с использованием экстрактора [10] и др. Однако в основе всех способов лежит единый принцип: определение концентрации нефти как разницы масс между образцом с нефтью и образцом, из которого экстрагировали нефть. Достоинствами метода являются его точность и простота, недостатками — длительность и трудоемкость.

При необходимости определения фракционного состава остаточной нефти используют газохроматографию, результат которой отражает хро-матограмма. Пики на хроматограмме соотносятся с определенным количеством каждого компонента и отражают время выхода каждого из них. Время как строго детерминированная величина для каждого компонента позволяет расшифровать хроматограмму [11].

Недостатками анализа являются необходимость наличия дорогого оборудования, длительность, трудоемкость, возможность определения в основном легких фракций.

Общая блок-схема проведения различных методов оценки нефтеокисля-ющей активности приведена на рис. 1.

Проектирование консорциумов биопрепаратов-нефтедеструкторов

настоящее время не существует универсального нефтедеструк-тора, способного работать при любых условиях и разрушать все нефтяные углеводороды. Поэтому для каждого загрязнения необходимо индивидуально проектировать консорциум: под конкретные температуру, кислотность, засоленность, содержание тяжелых металлов и др.

В качестве основы консорциума стоит взять несколько ключевых штаммов, обладающих высокой не-

фтеокисляющей способностью и часто использующихся при составлении биопрепаратов, например бактерии рода Pseudomonas [12]. Также в составе биопрепаратов предпочтительно наличие аборигенной микрофлоры, выделенной из загрязненной нефтью среды. Такие микроорганизмы являются уже приспособленными к токсичному загрязнителю и способны переработать его с большей скоростью [13]. Не-фтеокисляющую активность штаммов для составления биопрепарата следует оценить сначала индивидуально при создании условий, моделирующих реальные (в которых должен будет работать нефтедеструктор), а потом уже оценить нефтеокисление консорциума в целом. При выполнении этих научно-практических задач следует использовать методологии, описанные выше.

Для начала готовят необходимые стерильные инструменты, материалы, посуду, питательную среду. Среда может быть твердой или жидкой. В случае твердой питательной среды ее предварительно растапливают и разливают по чашкам Петри, добавляя нефть как единственный источник углерода и культуру. В случае жидкой среды исключается стадия растапливания, среда разливается в пробирки или колбы, остальное проводится аналогично. Культура каждого штамма сначала оценивается по способности роста и окисления в различных температурных условиях. Для этого ино-кулированные чашки Петри или колбы с добавленной нефтью культивируют в термостатах в аэробных условиях при разных температурах (5-45 °С). В конце эксперимента определяют наиболее подходящие для заданных реальных условий штаммы, которые переходят на следующий этап по оценке работы в условиях среды различной кислотности. Микроорганизмы при этом культивируют на питательных средах с различным pH (от 4 до 10) также с добавлением нефти как единственного источника углерода.

Кислотность регулируется добавлением концентрированной соляной кис-

Для каждого загрязнения необходимо индивидуально проектировать консорциум: под конкретные температуру, кислотность, засоленность, содержание тяжелых металлов и др.

лоты или ЭДТА-№. Культивирование проводится в течение определенного времени при необходимой температуре и аэрации. Выявляются наиболее подходящие штаммы.

Аналогично эксперименту по кислотности проводятся опыты по другим важным для нас факторам: засоленности (добавляют в питательную среду разные концентрации соли), содержанию тяжелых металлов (в среду добавляют соль тяжелого металла) и др. После этого отобранные штаммы исследуют на нефтеокисляющую способность при различных концентрациях нефти, добавляя в питательную среду от 5 до 20 % нефти. Культивируют в течение 14 суток при условиях, соответствующих реальным. В конце для отобранных штаммов определяют спектр действия, добавляя в среду в качестве единственного источника углерода один из субстратов (например, дизельное топливо, нафталин, фенантрен, алифатические углеводороды: гексан, октан и др.).

Во всех перечисленных опытах рост культуры и ее нефтеокисляющая способность могут определяться визуально (качественный анализ) и по численности микроорганизмов (количественный анализ): чашечный метод, микроскопия, по мутности среды.

Отобранные для консорциума штаммы необходимо исследовать на совместимость друг с другом. Для этого производят посев разных культур на твердую питательную среду перпендикулярными штрихами. Зоны пересечения, в которых будет наблюдаться задержка роста, лизиса, будут говорить о подавлении одного штамма другим. После проведенных опытов составля-

ют консорциум из отобранных микроорганизмов и исследуют его нефте-окисляющую способность аналогично индивидуальным опытам [14].

После проведения экспериментов на питательной среде следует провести модельный опыт: например, определенный объем почвы загрязнить нефтью, создать условия, отражающие реальные (температура, влажность, pH, процент загрязнения нефтью, загрязнитель и др.), и внести полученный консорциум. Оценивать нефтеокисля-ющую способность следует по остаточному содержанию нефти с помощью гравиметрического анализа, в случае если требуется установить фракционный состав остаточной нефти, применяют газохроматографию. Конечной стадией проектирования консорциума является его испытание в полевых условиях. Общая логико-информационная модель предлагаемого метода представлена на рис. 2.

Заключение

Эффективность биоремедиации напрямую зависит от нефте-окисляющей способности микроорганизмов, входящих в состав

консорциума используемого биопрепарата, поэтому успех работы также зависит и от возможности с помощью определенных методов оценить способность микроорганизмов к деградации углеводородов. Среди таких методов выделяют качественные и количественные подходы. Качественный подход заключается в визуальной оценке суспензии по накоплению биомассы, по однородности дисперсной системы и выставлении баллов по этим критериям. Такая оценка является быстрой, но субъективной и ненадежной, потому ее часто используют как предварительную перед количественным методом.

Критериями количественных методов служат численность бактерий и остаточное содержание нефти. Численность бактерий чаще всего измеряют с помощью чашечного метода, микроскопии, по мутности суспензии, остаточное содержание нефти — с помощью гравиметрического анализа или газохроматографии.

Перечисленные методы могут быть использованы при проектировании консорциумов биопрепаратов, когда оценивается нефтеокисляющая актив-

Компетентность / Competency (Russia) 6/2022 МРГ^ПСГЮОА!_НА О

DOI: 10.24412/1993-8780-2022-6-42-48 ИССЛЕДОВАНИЯ 4 7

ность штаммов при различных темпе- лит создавать нефтедеструктор с адап-

ратурах, кислотностях, засоленности, тацией под определенные условия

загрязнителях и других условиях. практического применения и тем са-

Предложенный способ составления мым управлять рисками инновацион- Статья поступила

консорциумов биопрепаратов позво- ной деятельности.  в редакцию 2.04.2022

Список литературы

1. Sharma I. Bioremediation techniques for polluted environment: concept, advantages, limitations, and prospects // Trace Metals in the Environment: New Approaches and Recent Advances. — 2020.

2. Филонов А.Е. Микробные биопрепараты для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений в условиях умеренного и холодного климата: специальность 03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии): автореф. дисс. ...

д-ра биол. наук. — Пущино, 2016.

3. Фунтикова Т.В. Разработка новых биопрепаратов, обладающих нефтеокисляющей и микотоксической активностями / Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. — М.: ИБХ РАН, 2017.

4. Мельников Д.А. Распределение признаков биодеградации углеводородов и оценка технологически важных свойств нефтеокисляющих бактерий: специальность 03.00.23 — Биотехнология: автореф. дисс. ... канд. биол. наук. — Краснодар, 2005.

5. ВРД 39-1.13-056-2002. Технология очистки различных сред и поверхностей, загрязненных углеводородами: приказ ОАО «Газпром» от 5.03.2002 № 27. — М.: Газпром, 2002.

6. Отчет по определению нефтеокисляющей активности микробных консорциумов. — М., 2018.

7. 0ФС.1.7.2.0008.15. Определение концентрации микробных клеток: утв. Фармакопейным комитетом Минздрава России 29.10.2015. — М., 2016.

8. Тыщенко Н.В. Выделение и изучение углеводородокисляющих микроорганизмов для разработки биопрепаратов: специальность 06.04.01 — Биология: магистерская дисс. — Томск, 2021.

9. ПНД Ф 16.1.41-04. Количественный химический анализ почв. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах почв гравиметрическим методом. — М.: ФГУ «Федеральный научно-методический центр анализа и мониторинга окружающей среды МПР России», 2004.

10. US Environmental Protection Agency. EPA method 3545 Pressurized Fluid Extraction (PFE); https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/manuals/Man-ASE-ASE150-0peratorsNov2020-D0C065207-04.pdf (a^.: 7.04.2021).

11. ГОСТ Р 56720-2015. Нефтепродукты и конденсат газовый стабильный. Определение фракционного состава методом газовой хроматографии. — М., 2016.

12. Рогозина Е.А., Андреева О.А., Жаркова С.И. и др. Сравнительная характеристика отечественных биопрепаратов, предлагаемых для очистки почв и грунтов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами // Нефтегазовая геология. Теория и практика. — 2010. — Т. 5. — №. 3.

13. Patowary K., Patowary R., Kalita M. C., Deka S. Development of an efficient bacterial consortium for the potential remediation of hydrocarbons from contaminated sites // Frontiers in microbiology. — 2016. — Т. 7.

14. Делеган Я.А. Термотолерантные бактерии-деструкторы углеводородов нефти: специальность 03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии): дисс. ... канд. биол. наук. — Пущино, 2016.

НОВАЯ КНИГА

Лемешева О.И., Павлов В.Е.

Подтверждение соответствия в Российской Федерации и ЕАЭС

Учебное пособие. Изд. 2-е, перераб. и доп. — М.: АСМС, 2022

Процедура декларирования претерпела кардинальные изменения в связи с вступлением в действие нового порядка регистрации деклараций о соответствии продукции и фактическим прекращением регистрации деклараций органами по сертификации. Описывается динамика развития процедур подтверждения соответствия, освещаются актуальные вопросы в сфере технического регулирования Таможенного союза и гармонизации законодательств Российской Федерации, Евразийского экономического союза и Всемирной торговой организации, подходы в области подтверждения соответствия, включая вопросы сертификации и декларирования в странах Европейского союза, а также направления сближения систем регулирования рынка.

По вопросам приобретения обращайтесь по адресу: Академия стандартизации, метрологии и сертификации (АСМС), 109443, Москва, Волгоградский пр-т, 90, корп. 1. Тел. / факс: 8 (499) 742 4643. Факс: 8 (499) 742 5241. E-mail: info@asms.ru

Kompetentnost / Competency (Russia) 6/2022 ISSN 1993-8780. DOI: 10.24412/1993-8780-2022-6-42-48

Methodology for Assessing the Oil-Oxidizing Ability of Biopreparations-Oil Destructors

A.V. Nechaeva1, S.N. Vinogradsky Institute of Microbiology of Federal Research Center Fundamentals of Biotechnology of RAS, nechaevasasha709@gmail.com

S.V. Ostakh2, I.M. Gubkin Russian State University of Oil and Gas (NRU), Assoc. Prof. PhD, ostah2009@yandex.ru

1 Junior Researcher, Moscow, Russia

2 Associate Professor, Moscow, Russia

Citation: Nechaeva A.V., Ostakh S.V. Methodology for Assessing the Oil-Oxidizing Ability of Biopreparations-Oil Destructors, Kompetentnost'/ Competency (Russia), 2022, no. 6, pp. 42-48. DOI: 10.24412/1993-8780-2022-6-42-48

key words

biological product, hierarchical approach, oil destructor, oil-oxidizing microorganisms, consortium design

A bioremediation is a technology for cleaning the environment with the help of living organisms. One of its options is the purification of oil-contaminated soil with the help of microorganisms. In order for the process of biodegradation of oil to be effective, the microorganisms involved in the process must be comprehensively studied. We believe that particular attention should be paid to the oil-oxidizing ability under different conditions of both each strain and the community as a whole. However, there are still no universal criteria for comparing strains and identifying the optimal strain, especially among those capable of oxidizing a wide range of petroleum hydrocarbons. In this regard, the purpose of this work was to compare different methodologies for assessing the oil-oxidizing ability of microorganisms, as well as to propose a way to design consortia of biological products taking into account the studied techniques. In this work, we have studied qualitative and quantitative methodological approaches for assessing oil-oxidizing activity based on such criteria of oil oxidation as biomass accumulation, homogeneity of the dispersed biodegradation system, the number of microorganisms, residual oil content. Among the methods studied are visual assessment, cup method, microscopy, gravimetric analysis, etc. Based on these methods, a method for designing consortia for biological products-oil destructors was proposed.

References

1. Sharma I. Bioremediation techniques for polluted environment: concept, advantages, limitations, and prospects, Trace Metals in the Environment: New Approaches and Recent Advances, 2020, pp. 221-236.

2. Filonov A.E. Mikrobnye biopreparaty dlya ochistki okruzhayushchey sredy ot neftyanykh zagryazneniy v usloviyakh umerennogo i kholodnogo klimata: spetsial'nost' 03.01.06 — Biotekhnologiya (v tom chisle bionanotekhnologii) [Microbial biological products for cleaning the environment from oil pollution in temperate and cold climates: specialty 03.01.06 — Biotechnology (including bionanotechnology)], Pushchino, 2016, 46 P.

3. Funtikova T.V. Razrabotka novykh biopreparatov, obladayushchikh nefteokislyayushchey i mikotoksicheskoy aktivnostyami [Development of new biopreparations with oil-oxidizing and mycotoxic activities], Perspektivnye napravleniya fiziko-khimicheskoy biologii i biotekhnologii, Moscow, 2017, 155 P.

4. Mel'nikov D.A. Raspredelenie priznakov biodegradatsii uglevodorodov i otsenka tekhnologicheski vazhnykh svoystv nefteokislyayushchikh bakteriy: spetsial'nost' 03.00.23 — Biotekhnologiya: avtoreferat dissertatsii na soiskanie uchenoy stepeni kandidata biologicheskikh nauk [Distribution of signs of hydrocarbon biodegradation and assessment of technologically important properties of oil-oxidizing bacteria: specialty 03.00.23 — Biotechnology: dissertation abstract for the degree of candidate of biological sciences], Krasnodar, 2005, 28 P.

5. WFD 39-1.13-056-2002 Technology for cleaning various media and surfaces contaminated with hydrocarbons, JSC Gazprom Order of 5.03.2002 N 27, Moscow, 2002.

6. Report on the determination of the oil-oxidizing activity of microbial consortiums, Moscow, 2018.

7. GPM.1.7.2.0008.15 Determination of the concentration of microbial cells, approved Pharmacopoeia Committee of the RF Ministry of Health of 29.10.2015, Moscow, 2016.

8. Tyshchenko N.V. Vydelenie i izuchenie uglevodorodokislyayushchikh mikroorganizmov dlya razrabotki biopreparatov: spetsial'nost' 06.04.01 — Biologiya: magisterskaya dissertatsiya [Isolation and study of hydrocarbon-oxidizing microorganisms for the development of biological products: specialty 06.04.01 — Biology: master's thesis], Tomsk, 2021, 63 P.

9. ERD F 16.1.41-04 Quantitative chemical analysis of soils. Method for measuring the mass concentration of oil products in soil samples by the gravimetric method, Moscow, 2004.

10. US Environmental Protection Agency. EPA method 3545 Pressurized Fluid Extraction (PFE); https://assets.thermofisher.com/ TFS-Assets/CMD/manuals/Man-ASE-ASE150-0peratorsNov2020-D0C065207-04.pdf (acc.: 7.04.2021).

11. GOST R 56720-2015 Petroleum products and stable gas condensate. Determination of the fractional composition by gas chromatography, Moscow, 2016.

12. Rogozina E.A., Andreeva O.A., Zharkova S.I. i dr. Sravnitel'naya kharakteristika otechestvennykh biopreparatov, predlagaemykh dlya ochistki pochv i gruntov ot zagryazneniya neft'yu i nefteproduktami [Comparative characteristics of domestic biopreparations offered for cleaning soils and soils from pollution by oil and oil products], Neftegazovaya geologiya. Teoriya i praktika, 2010, vol. 5, no. 3, 10 P.

13. Patowary K., Patowary R., Kalita M. C., Deka S. Development of an efficient bacterial consortium for the potential remediation of hydrocarbons from contaminated sites, Frontiers in microbiology, 2016, vol. 7, 1092 P.

14. Delegan Ya.A. Termotolerantnye bakterii-destruktory uglevodorodov nefti: spetsial'nost' 03.01.06 — Biotekhnologiya (v tom chisle bionanotekhnologii): dissertatsiya na soiskanie uchenoy stepeni kandidata biologicheskikh nauk [Thermotolerant bacteria-destructors of oil hydrocarbons: specialty 03.01.06 — Biotechnology (including bionanotechnology): dissertation for degree of candidate of biological sciences], Pushchino, 2016, 153 P.