СПОСОБ АКТИВАЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ МИЕЛОИДНОЙ ТКАНИ СТАРЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR ACTIVATING MYELOID TISSUE REGENERATION IN OLD LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к области клеточной биологии и может найти применение в медицине для восстановления гемопоэза у лиц пожилого и старческого возраста.
В настоящее время в современной биомедицине формируется новый раздел - клеточная терапия, которая позволяет с помощью трансплантации клеток восполнить недостаточную функциональную активность тканей и регенерировать поврежденные органы. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют стволовые клетки, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. В связи с этим применение стволовых клеток является наиболее перспективным направлением клеточной терапии (Grossman Т. Latest advances in antiaging medicine. Keio J Med. 2005; 54(2):85-94).
В течение процесса старения стволовые клетки претерпевают как количественные, так и качественные изменения, которые влияют как на скорость старения, так и на продолжительность жизни организма. С возрастом, вследствие угнетения выработки факторов роста, развивается распространенный G1/S блок клеточного цикла, что приводит к прогрессивной убыли стволовых клеток и снижает регенерационные возможности различных тканей и органов. Исследования на человеке и различных животных показали, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) стареют, показывая существенное снижение функциональной способности с увеличением возраста. Поддержание нормальной функции ГСК является критически важным для коагуляции крови, транспорта кислорода, а также в повышении специфической и неспецифической резистентности организма.
Преодоление генерализованного G1/S блока клеточного цикла с целью активации регенерации миелоидной ткани при старении обеспечивается применением заместительной гормональной терапии: стимуляцией оси СТГ-инсулиноподобные факторы роста (ИПФР). Повышение уровня ИПФР приводит к преодолению блока для процессов дифференциации и пролиферации клеток и последующему самообновлению тканей (А.А. Кишкун. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции»: Руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008, - 976).
В то же время, проведенные исследования по восстановлению регенерации тканей в возрастном аспекте с использованием факторов роста зачастую противоречат друг другу. Так было установлено, что пожилые люди с высоким уровнем гормона ИПФР-1 живут дольше и уровень регенерации тканей у них выше, чем у пожилых людей с низким уровнем ИФР-1 (Brugts et al. Low Circulating IGF-I Bioactivity in Elderly Men is Associated with Increased Mortality. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2008; DOI: 10.1210/jc.2007-1633).
Однако исследования на лабораторных мышах установили, что гипофизэктомия (Bartke A., Brown-Borg H., Mattison J. et al. Prolonged longevity of hypopitui-tary mice// Exp. Gerontol. 2001. Vol.36. P.21-28.), a также генетические модификации (Coschigano et al., Endocrinology. 2000, 141(7):2608-2613), направленные на снижение чувствительности рецептора к соматотропному гормону (СТГ) приводят к увеличению продолжительности жизни мышей. На сегодняшний день доказана возможность инсулина и ИПФР-1 существенно снижать устойчивость клеток организма к стрессу через угнетение работы транскрипционных факторов FOXO и SKN-1 вследствие снижения образования агентов периферической стресс-лимитирующей системы (Direct Inhibition of the Longevity-Promoting Factor SKN-1 by Insulin-like Signaling in C. elegans Tullet JMA, Hertweck MT, Ai. JH, Baker J, Hwang JY, Liu S, Oliveira RP, Baumeister R, and Blackwell TK Cell, Vol 132, 1025-1038, 21 March 2008).
Следующим направлением в активации регенерации миелоидной ткани при старении является коррекция антиоксидантного статуса с использованием антиоксидантов (витамин Е, витамин С). Однако все антиоксиданты обладают очень ограниченной «емкостью» для поглощения активных форм кислорода и инактивации продуктов свободнорадикального окисления (А.А. Кишкун. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции»: Руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008, - 976).
6
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ восстановления миелоидной ткани старых лабораторных животных (лабораторные крысы возраст 3 года, масса 300 г) в физиологических условиях (без воздействия ионизирующего излучения), путем внутривенной трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты, в количестве 2 млн клеток на 1 животное (или 6·10 клеток/кг) (Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на регенерацию миелоидной ткани старых животных в условиях воздействия ионизирующего излучения / А.П. Ястребов, И.Ю. Маклакова, Д.Ю. Гребнев, С.Е. Емельянова // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2008. - №4. - С.93-97.) - прототип.
Данный способ обеспечивает активацию регенераторного потенциала тканей, ингибированного при старении. Однако использование трансплантации ММСК оказывает недостаточное действие на активацию регенерации миелоидной ткани у старых лабораторных животных.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к активации регенерации миелоидной ткани при старении.
Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в снижении количества цитогенетически измененных клеток.
Технический результат достигается тем, что в способе активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных путем внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты в количестве 6 млн клеток/кг, дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из пуповинной крови в количестве 300 тыс. клеток/кг.
Сущность изобретения состоит в сочетанной трансплантации лабораторным животным ММСК и ГСК.
Свойство ММСК вырабатывать хемоаттрактант для ГСК (SDF-1) обеспечит увеличение пула ГСК в костном мозге за счет трансплантированных (аллогенных) ГСК, что в свою очередь будет способствовать восстановлению гемопоэза (Журнал Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. Том II, №3, 2007. Страница 21-22. «Регуляция хоуминга клеток-предшественников в область инфаркта миокарда методом пролонгированной секреции фактора SDF-1»).
Доза трансплантируемых ГСК (300 тыс. клеток/кг) подобрана экспериментальным путем.
Плюрипотентность ММСК, специфическая миграция в область повреждения и адгезионные свойства - все это обуславливает восстановительную функцию ММСК. ММСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и формировать микроокружение для ГСК. ММСК способствуют направленной миграции ГСК: вырабатывая SDF-1 (определяет миграцию ГСК через рецепторы CXCR4 на поверхности ГСК). ММСК способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции ряда цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15, макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор роста стволовой клетки. Постоянным продуктом секреции ММСК является простагландин Е2 (иммуносупрессивный фактор), способный снижать экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 на поверхности периферических лимфоцитов, что препятствует их активации.
Из анализа научно-технической и патентной литературы сочетанной внутривенной трансплантации ММСК и ГСК, приводящей к снижению количества цитогенетически измененных клеток, оказывающих цитопротективное действие на миелоидную ткань, а следовательно, к повышению активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных, нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на 36 белых лабораторных мышах-самцах возраста 3 года, массой 50 г. Эксперименты по получению культуры ММСК и ГСК выполнены на 18 лабораторных животных мышах-самках возраста 3-4 месяца, массой 30 г, срок гестации 18 дней. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария, предусмотренных «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г. и Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения». Манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с положениями Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии.
Количество экспериментальных животных и распределение их по сериям экспериментов представлены в таблице 1.
Животным опытной группы внутривенно однократно вводилась суспензия ММСК и ГСК соответственно в дозе 6 млн кл./кг и 300 тыс. кл./кг, животным контрольной группы внутривенно однократно вводили 0,9% раствор NaCl - 0,2 мл внутривенно (см. Таблицу 1). Кроме того, животным по прототипу вводили ММСК в количестве 6 млн клеток/кг (см. Таблицу 2). Забой животных осуществлялся на 1 и 7 сутки после трансплантации клеток.
Таблица 1
Распределение животных по сериям экспериментов
Животные
Путь введения
Препарат
Время проведения аутопсии органов
24 часа
7 сутки
Старые
в/в
ММСК 6 млн кл./кг и ГСК 300 тыс. кл./кг в 0,2 мл физраствора
9 шт.
9 шт.
в/в
0,9% р-р NaCl 0,2 мл
9 шт.
9 шт.
Таблица 2
Распределение животных по сериям экспериментов
Животные
Путь введения
Препарат
Время проведения аутопсии органов
24 часа
7 сутки
Старые
в/в
ММСК 6 млн кл./кг 0,5 мл физраствора
9 шт.
9 шт.
в/в
0,9% р-р NaCl 0,5 мл
9 шт.
9 шт.
Приготовление, окраску, микроскопию и подсчет микроядер в полихроматофильных нормобластах костного мозга крыс осуществляли следующим образом.
0
На обезжиренное оптическое стеклышко наносили сыворотку AB (IV) группы крови человека. Далее стеклянной палочкой, круговыми движениями готовили суспензию клеток костного мозга (она должна быть определенной плотности - иметь беловатую опалесцирующую окраску). Затем каплю этой суспензии наносили на край обезжиренного предметного стекла. Распределение материала по стеклу осуществляли перемещением позади шлифованного стекла под углом 45°. Оптимальная длина мазка - 2-3 см.
Мазок высушивался на воздухе в течение суток.
Окрашивание мазков по Паппенгейму производили на следующий день с последующей фиксацией в метаноле в течение 1 минуты. (Краситель - Май-Грюнвальд (спиртовой раствор) смешивался с фосфатным буфером 1:1. Время покраски - 1,5 мин.)
Затем сливаем краску и без промывания заливаем раствором красителя Романовского-Гимзы. Время покраски - 10 минут.
Раствор Романовского-Гимзы готовили на водопроводной воде 1:6 (10 мл Романовского + 60 мл воды). Краску готовили непосредственно перед окрашиванием.
Затем промывали в гистологичеких стаканчиках под струей воды (струя не на стекла).
Цитологические препараты костного мозга анализировались с помощью микроскопа Micros МС-50(Австрия) при увеличении 100*15.
Микроядерный тест (МЯТ) рассчитывали как отношение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами к 1000 подсчитанных полихроматофильных эритроцитов, выраженное в промилях (Методические рекомендации по оценке мутагенной активности химических веществ микроядерным тестом, подготовлены Всесоюзным научно-исследовательским институтом дезинфекции и стерилизации Министерства здравоохранения СССР, Москва 1984).
<mrow><mi>М</mi><mi>Я</mi><mi>Т</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>Ч</mi><mi>и</mi><mi>с</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>и</mi><mi>х</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>т</mi><mi>о</mi><mi>ф</mi><mi>и</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>ы</mi><mi>х</mi><mtext> </mtext><mi>э</mi><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>ц</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mtext> </mtext><mi>с</mi><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>и</mi><mi>к</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>я</mi><mi>д</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>м</mi><mi>и</mi></mrow><mrow><mn>1000</mn><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>и</mi><mi>х</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>т</mi><mi>о</mi><mi>ф</mi><mi>и</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>ы</mi><mi>х</mi><mtext> </mtext><mi>э</mi><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>ц</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>о</mi><mi>в</mi></mrow></mfrac><mo>*</mo><mn>1000</mn><mi>%</mi></mrow>
Получение культуры ММСК
2+
2+
Производилось выделение плаценты (срок гестации 18 дней), образец ткани массой 1 г трижды промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS) при pH 7.2, без ионов Ca и Mg, дополненным антибиотиками (пенициллин 50 ед./мл, стрептомицин 50 мкг/мл), после чего осуществлялось механическое измельчение ткани и энзиматическая обработка (0,25% трипсин - ЭДТА 15 мин. при 37°C). Полученная суспензия клеток была дважды профильтрована через 100 мкм нейлоновую мембрану для очистки от крупных не измельченных кусочков ткани. Суспензию разбавляли средой α-МЕМ, содержащей антибиотики, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1000 g.
2
Полученный клеточный осадок суспендировали в среде α-MEM (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Sigma, США) и однократным раствором антибиотиков (Chemicon). Суспензию клеток высевали в концентрации 150000-160000 кл./см на чашки Петри 60 мм (Nunc, Дания).
1.1. Условия культивирования ММСК
2
Культивирование производилось при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% СO.
1.2. Подсчет клеток
Подсчет клеток производили в гемоцитометре. Расчет количества клеток в 1 мл суспензии производили по формуле: X=а*10000, где X - число клеток в 1 мл суспензии; а - сумма клеток в малых квадратах.
1.3. Субкультивирование ММСК
2
Субкультивирование клеток осуществляли по достижении ими 80% монослоя. Клетки промывали смесью 0,25% трипсин - ЭДТА в соотношении 1:1, в которой клетки инкубировали около 5 мин при 37°C. Трипсин инактивировали добавлением ростовой среды с СЭК (10%), и центрифугировали суспензию при 200 g в течение 5 мин. Удалив супернатант, клетки суспендировали, производили подсчет и высевали в нужной концентрации (10000 кл./ см).
1.4. Характеристику культуры проводили с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated).
Выделение ГСК
Для выделения ГСК использовали набор Mouse Hematopoietic Progenitor (Stem) Cell Enrichment Set-DM. (StemCell Technologies, Канада).
Методы статистической обработки полученных результатов
Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий между подгруппами оценивали с помощью t - критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при p<0,05.
Анализируя данные микроядерного теста старых лабораторных животных, мутагенного действия ММСК не выявлено, т.к. количество ядер соответствует спонтанному уровню мутагенеза (таблица 3).
Таблица 3
Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 1 сутки после введения, М±m (n=9)
Параметры
Значение
Заявляемый способ
Прототип
Микроядерный тест, %
3,37±0,30
8,83±1,83
Как видно из таблицы, по заявляемому способу микроядерный тест в 2,3-2,9 раза ниже по сравнению с прототипом.
Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 7 сутки по заявляемому способу и способу по прототипу показаны в таблице 4.
Таблица 4
Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 7 сутки после введения, М±m (n=9)
Параметры
Значение
Старые
Прототип
Микроядерный тест, %
1,50±0,30
5,60±1,27
Как видно из таблицы, на 7 сутки по заявляемому способу микроядерный тест в 3,6-3,8 раза ниже по сравнению с прототипом, что приводит к снижению спонтанного уровня мутагенеза у старых лабораторных животных. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в физиологических условиях у старых лабораторных животных сочетанная трансплантация ММСК и ГСК на 7 сутки приводит к уменьшению содержания цитогенетически измененных клеток. Сравнивая данные по активации регенерации у старых лабораторных животных после трансплантации ММСК и сочетанной трансплантации ММСК и ГСК, следует отметить существенно большую эффективность сочетанной трансплантации. Так, после сочетанной трансплантации ММСК и ГСК на 7 сутки в физиологических условиях установлено, что содержание цитогенетически измененных клеток уменьшалось после введения ММСК и сочетанной трансплантации соответственно на 41,0% и 57,1%.
Выводы
У старых лабораторных животных в физиологических условиях ММСК и ГСК оказывает цитопротективное действие на миелоидную ткань за счет уменьшения цитогенетически измененных клеток.