Лечебный эффект системной трансплантации культивируемых аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных с резистентными формами туберкулеза легких

IIIIII1 -ф-

Клинический опыт

КЛИНИЧЕСКИЙ опыт

ЕЕ^ЕШ

Лечебный эффект системной трансплантации культивируемых аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных с резистентными формами туберкулеза легких

И А. Васильева1, АГ. Коноплянников*2, В.В. Ерохин1, А.Ф. Цыб 2, Т.Р. Багдасарян1 ,АА. Цаниленко 2, ПА. Лепехина 2, С.Ш. Кальсина 2, И.В. Семенкова 2, Е.В. Агаева 2 Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, Москва 2Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск

Therapeutic effects of systemic transplantation of cultured autologous mesenchymal stem cells derived from bone marrow in patients with resistant pulmonary tuberculosis

I A. Vasiljeva1, A.G. Konoplyannikov2, V.V. Erokhin1, A.F. Tsyb 2, Tfl, Bagdasaryan1, AA. Danilenko 2,

LA. Lepekhina 2, S,Sh, Kalsina 2,1.V, Semenkova 2, EA, Agaeva 2 1Centrai Tuberculosis Research Institute, RAMS, Moscow 2Medical Radiological Research Center, RAMS, Obninsk

Известно, что системная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток [МСК) может способствовать развитию репаративных процессов в различных поврежденных тканях, в том числе и в ткани легкого. Это послужило основанием для нашего исследования, в котором изучали эффект системной трансплантации [внутривенного введения) аутогенных МСК при проведении комплексной терапии больных с резистентными формами туберкулеза легких. В нашем исследовании, начатом три года назад, под наблюдением находится 27 больных с туберкулезом легких, из которых 15 пациентов относились к категории MDR [multidrug resistance), а 12 пациентов - к категории X-DR [X-drug resistance). Все больные являлись бактериовыделителями с распространенными кавернозными процессами в легочной ткани, у 17 пациентов до включения в схему терапии системной трансплантации 150-200 млн размноженных в клеточной культуре МСК из аутогенного костного мозга был хронический туберкулез [продолжительность заболевания -от 13 месяцев до 5 лет), а у остальных 10 пациентов диагноз заболевания был поставлен за Б-12 месяцев до включения в схему лечения клеточной терапии. У всех пациентов предыдущее достаточно длительное специфическое противотуберкулезное лечение было безуспешным или недостаточно эффективным [среди них был 1 пациент с одним оперативно удаленным легким). После системной трансплантации аутогенных МСК пациентам продолжали проводить ранее начатую медикаментозную терапию. 16 пациентов наблюдаются после системной трансплантации МСК в течение 1,5-2 лет и более, а остальные 11 пациентов - не менее 6 месяцев. После введения МСК во всех 27 случаях наблюдался положительный клинический эффект; больные отмечали улучшение общего состояния, уменьшение одышки, значительное уменьшение или исчезновение слабости и недомогания, 24 пациента прибавили в весе. У 20 пациентов через 3-4 месяца после трансплантации аутогенных МСК отмечено стойкое прекращение бактериовыделения, а у

11 больных в дальнейшем наступило заживление длительно существующих каверн легочной ткани. В настоящий период у 9 из 16 больных, которым трансплантировали МСК 1,5-2 года назад, можно констатировать стойкую ремиссию туберкулезного процесса. У 6 пациентов этой группы наблюдается существенная положительная бактериологическая и морфологическая динамика, только в 1 случае из 1Б эффект трансплантации МСК ограничился непродолжительным клиническим улучшением. Таким образом, включение в курс противотуберкулезной терапии трансплантации размноженных в культуре аутогенных МСК может явиться перспективным способом повышения эффективности проводимой терапии у пациентов с резистентными формами туберкулеза легких.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, системная трансплантация, туберкулез легких, множественная резистентность к препаратам

Systemic transplantation of mesenchymal stem cells [MSC] is known to promote reparative process in a number of tissue damage as well as lung tissue one. It provided the basis for our study which was aimed to the effect of systemic transplantation of autologous MSC [intravenous transfusion) in complex therapy of patients with resistant pulmonary tuberculosis. Started three years ago, 27 tuberculous patients are being under our observation now; 15 patients were classified as having multidrug resistance, 12 cases - as being X-drug resistant. Bacterioexcretion and substantial pulmonary cavitation were observed in every patient, most of them [n=17) having chronic tuberculosis of 13 months to 5 years duration, the rest 10 patients diagnosed 6 to 12 months before including them to the study. All these patients had previously been undertreated or unsuccessfully treated, with one patient having one lung removed. Undergone systemic transplantation of 150-200 million of cultured MSCs derived from autlogous bone marrow the patients continued conservative therapy started before. 16 patients have been under observation for 1.5 -2 years and longer after transplantation, the rest 11 patients observed not less than 6 months. MSC- introduction gave positive clinical effects in all 27 cases: somatic status improvement, dyspnoea reduction, relieving of weakness and indisposition, putting on weight [24 cases). 3-4 months after transplantation bacterioexcretion was noticed to stop in 20 patients, in 11 patients long-termed cavities healed later. At present 9 of 16 patients who had MSC transplantation 1.5-2 years ago can be stated to have stable remission of tuberculosis, 6 patients of this group demonstrate significant positive bacteriological and morphological dynamics. Only in one of 16 cases MSC transplantation resulted in short clinical improvement. Thus, MSC transplantation as a part of antitubercular therapy can be perspective in enhancing treatment of patients with drug-resistant tuberculosis.

Key words: mesenchymal stem cells, systemic transplantation, pulmonary tuberculosis, multidrug resistance.

* Адрес для корреспонденции:

249036, Обнинск, ул. Королева, 4

Тел.: (48439)9 32 90; факс: (495)956 14 40;

эл. почта: konopl@mrrc.obninsk.ru и konopl@obninsk.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007

Клинический опыт

Введение

Системное (внутривенное) введение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в организм в настоящее время рас сматривается как один из перспективных методов активиза ции репаративных процессов в поврежденных органах и тка нях [1,2]. Для легких оседание МСК в тканях документировано в ряде исследований [3, 4], однако проявления биологическо го эффекта клеточной терапии поврежденных легких с исполь зованием МСК неоднозначны, а возможный терапевтический эффект практически не изучен [5 7]. Необходимость исполь зования дополнительного воздействия на способность по врежденной легочной ткани к репарации в некоторых ситуа циях весьма остра. К ним, несомненно, относятся ситуации лечения больных с резистентными формами туберкулеза. Мы уже сообщали о нашем первом опыте такой терапии [8], а в данной работе предпринята попытка обобщить некоторые из полученных результатов работы, которая ведется силами двух наших научных учреждений в течение последних 3 лет.

Материал и методы

Под наблюдением в нашем исследовании, начатом три года назад, находятся 27 больных с туберкулезом легких, из которых 15 пациентов относятся к категории MDR (multidrug resistance), а 12 пациентов - к категории X DR (X drug resistance). Лечение подобных больных представляет слож ную терапевтическую задачу, обусловленную устойчивостью возбудителя заболевания к большинству противотуберку лезных препаратов, в т. ч. к наиболее активным. По сути дела, MDR и, особенно, X DR туберкулез сродни туберкулезу доантибактериальной эпохи, против которого нет эффектив ных средств этиотропной терапии.

Информация о поле, возрасте пациентов и продолжитель ности заболевания представлена в табл. 1. Распространенность патологического процесса в легких представлена в табл. 2.

Все пациенты после выявления заболевания подверга лись специфическому лечению стандартными режимами химиотерапии, а после выявления лекарственной устойчи вости возбудителя использовали схемы на основе резерв ных химиопрепаратов в соответствии с данными тестов на

чувствительность микобактерий туберкулеза (МБТ). Дли тельная комбинированная противотуберкулезная терапия у данной группы пациентов не оказала желаемого эффекта, больные перешли в категорию хронических с постоянным выделением мультирезистентных форм микобактерий и прогрессирующими воспалительно деструктивными изме нениями в легочной ткани. При этом, у 17 (63,0%) больных наблюдались фиброзные полости распада, которые, как пра вило, не поддаются терапевтическому лечению даже в случае сохранения чувствительности МБТ к химиопрепаратам.

В этой ситуации возникла необходимость дополнения проводимого лечения процедурой системной транспланта ции аутогенных МСК, проводимой в рамках разработанного кли нического протокола, утвержденного Учеными Советами двух учреждений и одобренного Этическим Комитетом ЦНИИТ РАМН, а также на основе информированного согласия каж дого пациента. Исследование проводилось в рамках отрасле вой программы «Новые клеточные технологии - медицине», утвержденной Президиумом РАМН 29 мая 2002 г.

Метод получения и размножения аутогенных МСК в не обходимом для системной трансплантации количестве (по рядка 150 200 млн клеток) в настоящее время разрешен Федеральной службой по надзору в сфере здравоохране ния и социального развития МЗиСР РФ (лицензия ФС 2006/206). Описание этого метода уже представлено в публикации [3] и коротко сводится к следующему.

Клетки костного мозга (0,5 1 мл) получали путем пунк ции грудины или подвздошной кости пациента под местной анестезией в строго стерильных условиях, которые соблю дали в процессе всей дальнейшей работы с клетками в куль туральном боксе. После отстаивания эритроцитов в тече ние 1 2 часов при комнатой температуре супернатант из суспензии костномозговых клеток отсасывали пастеровс кой пипеткой, выделенные клетки переносили в среду 199 (здесь и далее указанные среды и посуда закупались в фир мах, уполномоченных на поставку МЗиСР РФ). Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин для получения осадка, который ресуспен дировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды

Таблица 1, Сведения о распределении пациентов по полу, возрасту и продолжительности выявленного заболевания туберкулезом легких

Число больных Пол Возраст Длительность заболевания после его выявления

муж. жен. сч н -е 1^ ц СП со н -е О ц со 40-49 лет S0-S9 лет м6- 13-24 мес. 2-3 года 5т -е СО ц

Абс. 27 17 1O 17 S 4 I 1O 4 II 2

% 1OO бЗ^ З7^ бЗ^ 18,5 14,8 З,7 З7^ 14,8 4O,7 7,4

Таблица 2, Распространенность туберкулезного процесса в легочной ткани у хронических больных мультирезистентным туберкулезом

Распространенность туберкулезного

Число процесса

больных 1-2 сегмента 1-2 доли 3 и более долей

Абс. 27 З 11 1З

% 1OO 11,1 4O,7 48,2

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

Клинический опыт

+

использовали среду RPMI 1640, содержащаую пеницил лин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L глютамин (2 мМ) и 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Культиви рование проводили в пластиковых флаконах Карреля с пло щадью дна 25 смг, в которые вносили 5x106-107 клеток ко стного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещали в термостат на 37°С. Продувание фла конов такой газовой смесью проводили каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культураль ные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина в новые флаконы, вначале с той же площадью дна (25 смг), а впоследствии при нарастании клеточной массы с площадью дна 175 смг. Такой метод культивирования позволял к концу 5 6 й недели добиться получения популяции аутогенных МСК пациента в количе x

в организм донора исходного костного мозга. Дополнитель но проведенными исследованиями было показано, что по лученные в условиях примененного в нашей работе способа культивирования клетки человека во всех исследованных слу чаях имели фенотип CD10lo“/CD34/CD45/CD105vc kit, что характерно для клеток, относимых в настоящее время к МСК. Как мы уже сообщали ранее [3], в выполненных на ла бораторных животных опытах была показана безопасность применения полученных таким способом культур МСК в от ношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эф фектов.

Перед внутривенным введением пациентам клеток из полученных выращиванием в культуре популяций делался посев для контроля возможного бактериального загрязне ния (его не было выявлено ни в одном случае). Для осуществ ления системной трансплантации 150 200 млн аутогенных МСК, размноженных в культуре, клетки взвешивались в 200 мл стерильного физиологического раствора, содержа щего гепарин в концентрации 10 ед/мл, и путем постановки капельницы вводились пациенту в течение 40 60 минут. Примерно у 20% пациентов трансплантация МСК приводила к развитию слабой трансфузионной реакции (повышение в первые сутки температуры до 37,2 37,4°С, ломота, разби тость), которая не требовала дополнительного пособия и исчезала на следующие сутки.

После системной трансплантации аутогенных МСК па циенты продолжали получать ранее назначенное медика ментозное лечение. Контроль за результатами лечения вели по динамике клинических проявлений заболевания, бактери овыделения и специфических изменений в легких по данным рентгено томографического и КТ исследований.

Результаты и их обсуждение

После системной трансплантации МСК из 27 пациентов 16 наблюдаются в течение 1,5 2 лет и более, а остальные

11 пациентов не менее 6 месяцев. Спустя от 1 до 5 меся цев после введения МСК у всех 27 больных наблюдался по ложительный клинический эффект: улучшение общего состо яния, уменьшение одышки, значительное уменьшение или исчезновение слабости и недомогания, 24 пациента значи тельно прибавили в весе и отмечали «прилив сил и энергии».

У всех больных на момент введения МСК отмечались вое палительные изменения в клиническом анализе крови: лей коцитоз с увеличением палочкоядерной фракции, моноцитоз и /или лимфопения, ускорение СОЭ до 27-65 мм/ч. Через 1 2 месяца после трансплантации стволовых клеток показа тели периферической крови улучшались: нормализовалось количество лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов, СОЭ сни жалась до нормальных и субнормальных цифр (219 мм/ч).

Одним из наиболее важных критериев активности спе цифического процесса является бактериовыделение. У 20 (74,1%) больных, длительное время выделявших микобакте рии туберкулеза, через 3 4 месяца после трансплантации аутогенных МСК отмечено стойкое прекращение бактери овыделения, подтвержденное микробиологическими И МО лекулярно генетическими методами.

Наиболее полную информацию о течении, характере и распространенности туберкулеза дают рентгено томографи ческие методы исследования. Так, у 11 (40,7%) больных в дальнейшем наступило заживление длительно существую щих каверн в легочной ткани, в т. ч. числе фиброзных в 7 наблюдениях. У 15 пациентов отмечалось выраженное рас сасывание воспалительных изменений, частичное закрытие полостей распада и/или уменьшение их размеров при мно жественных деструкциях. В качестве примера заживления существующих более 2 х лет каверн в обоих легких приво дятся рентгенограммы больной Б. до введения МСК и спустя 6 и 17 месяцев после него (рис.).

+

Рентгенограммы легких у пациентки Б. до проведения системной трансплантации аутогенных МСК [А], а также через В (В) и 17 (С) месяцев после трансплантации:

А - в верхних долях обоих легких определяются сформированные каверны с неравномерно широкими стенками, перикавитарной инфильтрацией и очагами отсева по всем полям легких;

В — слева на месте каверны - фиброзная трансформация легочной ткани, справа каверны значительно уменьшились в размерах, отмечается рассасывание перикавитарной инфильтрации и очагов отсева;

С — заживление каверн в обоих легких с развитием рубцовой ткани

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007

Клинический опыт

В настоящий период у 9 (56,3%) из 16 пациентов, которым трансплантировали МСК 1,5 2 года назад, можно констати ровать стойкую ремиссию туберкулезного процесса с расса сыванием воспалительных и исчезновением деструктивных изменений в легких, у 6 (37,5%) существенную положи тельную бактериологическую и морфологическую динамику. Лишь в одном случае из 16 эффект трансплантации МСК ограничился непродолжительным клиническим улучшени ем. Остальные 11 больных продолжают начатое ранее лече ние, об эффективности которого можно будет судить спустя

12 15 месяцев.

Заключение

Таким образом, полученный в данном пилотном исследо вании материал позволяет надеяться на то, что использова ние системной трансплантации аутогенных МСК открывает новые перспективы при лечении пациентов с резистентны ми формами легочного туберкулеза. Природа наблюдаемых эффектов пока остается недостаточно понятной, можно только констатировать усиление регенеративных процессов

в поврежденных участках легких. Вызваны ли они длитель ным существованием в тканях трансплантированных МСК с их необычными иммунологическими свойствами (способ ностью ослаблять продукцию активных форм кислорода клетками, принимающими участие в развитии воспалитель ных процессов (9)) или эффекты опосредуются в основном через паракринные механизмы [10], или еще какими то дру гими возможными механизмами, например, нормализацией кроветворения с уменьшением доли клеток продуцентов фактора некроза опухолей, что существенно для развития патологических процессов в поврежденных тканях легкого при туберкулезе, можно будет выяснить только на основе продолжения экспериментально клинических работ в дан ном направлении. Одновременно можно отметить, что полу ченные результаты указывают на перспективность использо вания аутогенных МСК при лечении резистентных форм легочного туберкулеза не только путем проведения клеточной терапии, но и генной терапии, основанной на использова ния МСК для доставки ряда генов в поврежденные ткани легкого (например, гена у интерферона).

ЛИТЕРАТУРА

1. Battler A., Leor J. Stem cell and gene based therapy. Frontiers in regenerative medicine. L., Springer Verlag, 2006.

2. Gnecchi М., He H., Nicolas Noiseux N. et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt modified mesenchymal stem cell mediated cardiac protection and functional improvement. The FASEB J. 2006; 20: 661 9.

3. Цыб А.Ф., Коногшянников А.Г., Колесникова А.И., и др. Получение и использование в медицине клеточных культур из мезенхимальных

стволовых клеток костного мозга человека. Вестник Российской Академии медицинских наук. 2004; 59(9): 71 6.

4. Broker V., Florian Linger F., Tariq G. et al. Fibroblasts of recipient origin contribute to bronchiolitis obliterans in human lung transplants. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2006;173(11): 1276 82.

5. Weiss D.J, Berberich M.A, Borok Z. et al. Adult stem cells, lung biology,

and lung disease. NHLBI/Cystic Fibrosis Foundation Workshop. Proc Am. Thorac Soc. 2006; 3(3): 193 207.

6. Kotton D. N., Fabian A. J., Mulligan R. C. Failure of bone marrow to reconstitute lung epithelium. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 33(4): 328 34.

7. MacPherson H., Keir P., S. Webb S. et al. Bone marrow derived SP cells can contribute to the respiratory tract of mice in vivo. J. Cell Sci. 2005; 118[Pt 11): 2441 50.

8. Ерохин В.В., Цыб А.Ф., Чуканов В.И. и др. Клеточные технологии в терапии хронического мультирезистентного туберкулеза легких. Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2006; (8): 3 5.

9. Ryan J.M., Barry F.P., Murphy J.M., Mahon B.P. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J. Inflammation, 2005; 2(8): 111.

10. Thum T., Bauersachs J., Barry F.P. et al. The dying stem cell hypothesis. J. Amer. Coll. of Cardiology. 2005; 46(10): 1799 802.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

А