Димерный дипептидный миметик 1-й петли фактора роста нервов ГК-6, активирующий PI3K/Akt и МЕК/mapk/erk, вызывает дифференцировку клеток РС12 по нейрональному типу

Димерный дипептидный миметик 1-й петли фактора роста нервов ГК-6, активирующий PI3K/AKT и MEK/MAPK/ERK, вызывает дифференцировку клеток РС12 по нейрональному типу

Антипова Т.А.1, Николаев С.В.1, Ревищин А.В.2, Савченко Е.А.2, Павлова Г. В.2, Гудашева Т.А.1

1 - ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва 2 - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена

Российской академии наук, г. Москва

Резюме. Димерный дипептидный миметик 1-й петли NGF ГК-6 (10-6М), активирующий как фосфатидилинозитол-З/АИ-киназный, так и митоген-активируемый протеинкиназный (MEK/MAPK/ERK) сигнальные каскады, вызывает дифференцировку клеток РС12 по нейрональному типу. В то же время димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF ГК-2 (10-6М), активирующий только фос-фатидилинозитол-3/Akt- киназный путь, не обладает дифференцирующим действием.

Ключевые слова: NGF, димерные дипептидные миметики, ГК-2, ГК-6, дифференцировка, РС12, бета-тубулин 3

Dimeric dipeptide mimetic the 1st loop of nerve growth factor of GK-6, which activates PI3K/AKT and MEK/MAPK/ERK, causes a neuronal type differentiation of PC12 cells

Antipova T.A.1, NikoLaev S.V.1, Revishchin A.V.2, Savchenko E.A.2, Pavlova G.V.2, Gudasheva T.A.1 1 - FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow 2 - Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow

Resume. Dimeric dipeptide mimetic 1st Loop of NGF GK-6 (10-6M) activating as phosphatidylinozitol 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase MEK/MAPK/ERK) signaling cascades causes PC12 cell differentiation into neuron-like cells. At the same time dimeric dipeptide mimetic the 4th loop of NGF GK-2 (10-6M), which activates only phosphatidylinozitol 3-kinase/Akt, does not possess the differentiating effect.

Keywords: NGF, dimeric dipeptide mimetics of NGF, differenciation, PC12, beta-tubulin III

Автор, ответственный за переписку:

Антипова Татьяна Алексеевна - заведующая лабораторией фармакологии нейропротекции, ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; тел. +7 (495) 601-22-43; e-mail: zenina_tatyana@mail.ru

Введение

Развивающиеся нейроны для своего выживания и дифференцировки нуждаются в нейротрофинах, наиболее изученным из которых является фактор роста нервов (NGF). Известно, что эффекты этого нейро-трофина на выживаемость и рост отростков нейронов обусловлены взаимодействием с ТгкА рецептором. Связывание с NGF ведёт к димеризации и активации ТгкА путём аутофосфорилирования внутриклеточных тирозиновых остатков [13]. Это инициирует запуск сигнального трансдукционного каскада, включающего фосфатидилинозитол-3 киназный (Р13К/АКТ) и митоген-активируемый протеинкиназный (МЕК/ MAPK/ERK) пути. Активация Р13К/АКТ способствует выживанию нейронов. МЕК/МАРК/Егк-киназный путь контролирует в основном деление и дифференцировку клеток [10, 12].

В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова была сформулирована гипотеза, что разные функции NGF контролируются взаимодействием разных петель с

одним и тем же ТгкА-рецептором [7]. В рамках этой гипотезы были получены ГК-2 (гексаметилендиа-мид бис-(^моносукцинил-Х-глутамил-Х-лизина)), димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF, и ГК-6 (гексаметилендиамид бис-(^аминокапроил-глицил-Х-лизина)), миметик 1-й петли NGF. Оба миметика активировали ТгкА-рецептор, Р13К/АКТ, и обладали нейропротекторным эффектом [2]. ГК-6, кроме того, активировал ещё и МЕК/МАРК/Егк-киназный путь [1].

Цель исследования

Целью настоящего исследования было показать, что миметик 1-й петли ГК-6, но не миметик 4-й петли NGF ГК-2, обладает дифференцирующей активностью.

Материалы и методы

Все манипуляции с клетками выполнялись в строго стерильных условиях. Клетки культивировали при

31

ФШКОШЕТШ И ФШЩШМШ

температуре 37 °С, 5 % СО2 в среде ДМЕМ (Dulbecco's modified Eagle's medium, HyClone, США), содержащей 5 % FBS (фетальной бычьей сыворотки, Gibco, США) для клеток линий НТ-22 и РС12 и 10 % FBS для нейро-бластомы человека линии SH-SY5Y, 2мМ Х-глутамина (ICN Pharmaceuticals, США). Смену культуральной среды производили через 24 ч после рассева и каждые последующие 3 дня. Рассев на культуральные флаконы общей площадью 75 см2 (Corning-Costar, США) осуществляли каждую неделю.

Недифференцированые клетки РС12 рассеивали с плотностью 3,5 тыс на лунку в среде ДМЕМ с 1 % сывороткой FBS. В момент посева в среду культивирования добавляли NGF в качестве положительного контроля в конечной концентрации 100 нг/мл (BD Bioscience, Великобритания), пептиды ГК-2 и ГК-6 в конечных концентрациях 10-5—10-8М. Концентрация NGF («10-9 М) используется в экспериментах по выявлению нейропротекторной и дифференцирующей активности на клетках РС12 [6] и не является токсичной для клеток [16].

В дальнейшем исследуемые пептиды и NGF вносили в среду каждые 48 ч в течение 6 сут. О степени дифференцировки клеток судили по форме и размерам клеток, количеству и длине отростков. Дифференцированными считались клетки, имевшие отростки размером более, чем величина диаметра тела клетки.

Для окраски клеток РС12 на нейрональный маркер бета-тубулин 3 (Abcam, Великобритания) пептиды вносили по той же схеме. После этого клеточную среду отбирали, клетки промывали 2 раза холодным PBS и фиксировали 4 % формальдегидом в PBS. Окрашивание клеток антителами на бета-тубулин 3 в разведении 1:100 проводили в течение ночи при 4 °С в PBS, содержащем 1 % BSA и 0,1 % Tween. В качестве вторичных использовали антитела козы против иммуноглобулина кролика конъюгированные флуоресцентным красителем DyLight 488 (Abcam, США) в разведении 1:250 в течение 1 ч. Фотографирование клеток проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TS100-F (Япония) при увеличении 100.

Результаты и обсуждение

Для определения дифференцирующей активности пептидных миметиков фактора роста нервов использовали клетки феохромоцитомы крысы линии РС12. Известно, что эти клетки содержат ТгкА рецепторы и при добавлении NGF дифференцируются по ней-рональному типу [5].

Дипептидный миметик ГК-2 в отличие от NGF не вызывал дифференцировку клеток линии РС12 ни в одной из исследуемых концентраций от 10-5 до 10-8 М. Внешний вид клеток РС12 после обработки ГК-2 не отличался от контроля, образование отростков не наблюдалось (рис. 1).

В то же время на 6-й день после внесения в среду культивирования ГК-6 в конечной концентрации 10-6 М недифференцированные клетки РС12 образовывали цитоплазматические отростки, величина которых превышала диаметр клетки (см. рис. 1).

Для подтверждения дифференцировки клеток РС12 по нейрональному типу было использовано окрашивание на нейрональный маркер бета-тубулин III, поскольку последний экспрессируется в дендритах, аксонах и окончаниях аксонов нейронов исключительно при дифференцировке клеток по нейрональному типу [4, 11]. Как видно на рис. 2, в терминалях дифференцированных клеток РС12 как под действием ГК-6 (10-6 М), так и NGF («10-9 М) действительно обнаруживается бета-тубулин III.

Таким образом, дипептидный миметик 1-й петли фактора роста нервов ГК-6 вызывает дифференцировку клеток РС-12 по нейрональному типу.

Полученные нами данные об отсутствии дифференцирующего действия у ГК-2, который активирует Akt-путь и не активирует Erk и наличия дифференцирующей активности у ГК-6, который активирует оба сигнальных пути, согласуются с данными литературы [3, 8] о необходимости активации MEK/MAPK/Erk-киназного пути для дифференцировки клеток по нейрональному типу.

Таким образом, выявленная нами способность у исследованных пептидов вызывать дифференцировку (ГК-6) либо отсутствие таковой (ГК-2) свидетельствует в пользу того, что разные петли NGF могут быть ответственны за разные функции этого белка.

При изучении активации TrkA рецептора после внесения ГК-2 и ГК-6 нами были использованы антитела на TrkA, содержащий фосфорилированный тирозин Y490. Было показано, что оба этих дипептида вызывали фосфорилирование TrkA рецептора по этому тирозину. При этом ГК-2 и ГК-6 имели разный паттерн активации пострецепторных сигнальных киназ. Можно предположить, что фосфорилирование других тирозиновых последовательностей вовлечено в активацию разных пострецепторных сигнальных путей под действием димерных миметиков разных петель фактора роста нервов и, в конечном итоге, в дивергенцию функций NGF. Согласно данным литературы, существует несколько тирозиновых остатков, фосфорилирование которых приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей. Три из них, Y670, Y674 и Y675, представлены в активирующей петле киназного домена и регулируют киназную активность рецептора. Фосфорилирование этих остатков необходимо для конформационных изменений, обеспечивающих взаимодействие каталитического центра и С-концевых последовательностей тирозина. Фосфорилирование Y785 связано с активацией фосфолипазы PL^y, ответственной за процесс клеточной дифференцировки и активацию Erk1/2 [8]. Мутация хотя бы одного из трёх остатков Y670, Y674 и Y675 активирующей петли

32

ФШШШШ И ФШЩШМШ

Контроль

NGF 10-9М

ГК-2 10-6М ГК-6 10-6М

Рис. 1. Дифференцировка клеток РС-12 после внесения NGF, ГК-2 и ГК-6. Фазовый контраст. Увеличение х 200

33

ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩШМШ

I

1р

\J

ГК-2 10-6М ГК-6 10-6М

Рис. 2. Обнаружение нейронального маркера ß-тубулина III после внесения NGF, ГК-2 и ГК-6 в культуру клеток феохромацитомы крысы PC-12. Увеличение х 200. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к ß-тубулину III

34

ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФАРМАКОДИНАМИКА

полностью предотвращают фосфорилирование Y785 и последующую активацию Erk1/2 и PLC-y. Фосфорилирование Y499 приводит к активации адапторного белка Shc, фосфорилирование Y760 — к активации PI3 киназы, Y794 — к активации PLC-y [15]. Отдельные мутации этих трёх остатков тирозина ингибируют рост нейритов в культуре клеток РС12 [9].

Кроме того, существует также независимый от фосфорилирования остатка 490 путь, приводящий к дифференцировке и повышению выживаемости клеток через другие адаптеры. Например, имеются два дополнительных адаптера, rAPS и SH2-B, фосфори-лирующиеся при активации Trk-рецептора. Они могут образовывать гомо- и гетеродимеры и образовывать комплекс с адаптерным белком Grb2, обеспечивающий проведение сигнала через белок SOS к Ras/MAPK/ERk и через комплекс белков Ras/Gab к фосфоинозитол-3-киназе. Показано, что использование антител к SH2-B препятствует NGF-зависимой выживаемости, активации Erk и аксональному росту симпатических нейронов [14].

Arevalo J. et al. указывают на наличие ещё одного сигнального комплекса, ответственного за селектив-

Литература

1. Антипова Т.А., Логвинов И.О., Николаев С.В., Круглое С.В., Тара-сюк А.В., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. Сравнительный анализ активации пострецепторных сигнальных путей димерными дипептидны-ми миметиками разных петель NGF. Фармакокинетика и фармакоди-намика. 2016; 2: 14-17.

2. Гудашева Т.А., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Новые низкомолекулярные миметики фактора роста нервов. ДАН. 2010; 434:4: 549-552.

3. Arvalo J.C., PereiraD.B., YanoH, TengK.K., ChaoM.V. Identification of a switch in neurotrophin signaling by selective tyrosine phosphorylation. J Biol Chem. 2006; 281:2:1001-1007.

4. C ceres A., Banker G.A., Binder L. Immunocytochemical localization of tubulin and microtubule-associated protein 2 during the development of hippocampal neurons in culture. J Neurosci. 1986; 6:3 : 714-722.

5. Chang J.H., Mellon E., Schanen N.C., Twiss J.L. Persistent TrkA activity is necessary to maintain transcription in neuronally differentiated PC12 cells. J. Biol. Chem. 2003; 278:44: 42877- 42885.

6. Gong Y, Wu J., QiangH, Liu B., Chi Z, Chen T, Yin B., PengX., Yuan J. BRI3 associates with SCG10 and attenuates NGF-induced neurite outgrowth in PC12 cells. BMB Rep. 2008; 41:4:287-293.

7. Gudasheva T.A., P.Yu. Povarnina, T.A. Antipova, Yu.N. Firsova, M.A. Konstantinopolsky, S.B. Seredenin. Dimeric dipeptide mimetics of the nerve growth factor Loop 4 and Loop 1 activate TRKA with different patterns of intracellular signal transduction. Journal of Biomedical Science (2015) 22:106. DOI 10.1186/s12929-015-0198-z.

ную активацию Erk-киназ [3]. Этот комплекс образуется после взаимодействия трансмембранных доменов TrkA и ARMS. Тирозин Y1096 ARMS фосфорилируется после связывания нейротрофинов с рецепторами и обеспечивает образование докинг сайтов для CrkL, приводящее к Rap1-зависимой долговременной активации Erk-киназ. Нарушения взаимодействия Trk с ARMS или ARMS с CrkL (белком, содержащим домен SH2 и два домена SH3 (src-гомологичные домены)) с помощью мутаций тирозина Y1096 ARMS существенно снижает пролонгированный нейротрофиновый сигна-линг Erk, но не влияет на Ras или Akt активацию [3].

Таким образом, конечный ответ клетки на разные сигналы бывает различным, в зависимости от первого участника проведения сигнала от TrkA-рецептора. Активация под действием ГК-2 или ГК-6 одного или двух сигнальных каскадов, а также наличие или отсутствие дифференцирующего действия может быть связано, в частности, с фосфорилированием тирози-новых остатков, отличных от Y490 и далее различных вариантов образующихся комплексов адаптерных белков, участвующих в трансдукции сигнала, что требует дальнейшего изучения.

8. Huang E.J., Reichardt L.F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annu Rev Biochem. 2003; 72: 609-642.

9. InagakiN., Thoenen H., Lindholm D. TrkA tyrosine residues involved in NGF-induced neurite outgrowth of PC12 cells. Eur J Neurosci. 1995; 7: 6:1125-1133.

10. Kaplan D.R., Miller F.D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr. Opin. Neurobiol. 2000; 10: 3: 381-391.

11. Lee M., Tuttle J., Rebhun L., Cleveland D., Frankfurter A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motil. Cytoskeleton. 1990; 17: 118-132.

12. Obata K., Noguchi K. MAPK activation in nociceptive neurons and pain hypersensitivity. Life Sci. 2004; 74: 21: 2643-5263.

13. Pollack S.J., Harper S.J. Small molecule Trk receptor agonists and other neurotrophic factor mimetics. Cur. Drug Targets-CNS and Neurol. Disorders. 2002; 1:1: 59-80.

14. Qian X., Riccio A., Zhang Y., Ginty D.D. Identification and characterization of novel substrates of Trk receptors in developing neurons. Neuron. 1998; 21:5:1017-1029.

15. Rozakis-Adcock M., McGlade J., Mbamalu G., Pelicci G. et al. Association of the Shc and Grb2/Sem5 SH2-containing proteins is implicated in activation of the Ras pathway by tyrosine kinases. Nature. 1992; 360: 6405: 689-692.

16. Senger D.L., CampenotR.B. Rapid retrograde tyrosine phosphorilation of trkA and other proteins in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Cell Biol. 1997; 138: 2: 411-412.

35

ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩИШИКА