АНТИТЕЛА К MUC16 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODIES TO MUC16 AND THEIR APPLICATION

[0001] По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 62/134,402, поданной 17 марта 2015 года, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.
[0002] Эта заявка включает по упоминанию список последовательностей, поданный с этой заявкой в виде текстового файла, озаглавленного «Sequence_Listing_13542-016-228.txt», который создан 14 марта 2016 года и имеет размер 388 Кбайт.
1. ОБЛАСТЬ
[0003] Настоящее изобретение относится к композициям, способам и применениям, в которых используют антитела, которые иммуноспецифически связываются с MUC16, связанным белком муцином, и модулируют экспрессию и/или активность MUC16 для контроляконтроля, лечения или предотвращения нарушений, таких как рак.
2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Муцины представляют собой важные биологические молекулы для клеточного гомеостаза и защиты эпителиальных поверхностей. Изменения экспрессии муцинов при раке яичников можно использовать для диагноза, прогноза и лечения (Singh AP, et al. Lancet Oncol 2008;9(11):1076-85). MUC16 представляет собой один такой муцин, который чрезмерно экспрессируется на большинстве карцином яичников и является установленным суррогатным сывороточным маркером (CA-125) для обнаружения и прогрессии рака яичников (Badgwell D, et al., Dis Markers 2007;23(5-6):397410; Bast RC, Jr, et al., Int J Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274-81; Fritsche HA, et al., Clin Chem 1998;44(7):1379-80; и Krivak TC, et al., Gynecol Oncol 2009;115(1):81-5). MUC16 представляет собой сильно гликозилированный муцин, состоящий из большого отщепляемого и высвобождаемого домена, называемого CA-125, состоящего из множества повторных последовательностей, и остающегося домена (MUC-CD), который содержит остаточный не повторяющийся внеклеточный фрагмент, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост (O'Brien TJ, et al. Tumour Biol 2001;22(6):348-66). Поскольку иначе экспрессия антигена происходит только на низком уровне в матке, эндометрии, фаллопиевых трубах, яичниках и серозной оболочке брюшной и грудной полостей, MUC16 представляет собой потенциально привлекательную мишень для иммунологической терапии.
[0005] Однако тот факт, что происходит отщепление и секреция большей части внеклеточного домена MUC16, ограничивает полезность MUC16 в качестве целевого антигена на карциномах яичников. Фактически, до настоящего времени, большинство моноклональных антител к MUC16, о которых сообщалось, связываются с эпитопами, присутствующими на большой секретированной фракции CA-125 гликопротеина, причем ничего не известно о связывании с остающейся внеклеточной фракцией (MUC-CD) антигена (Bellone S, Am J Obstet Gynecol 2009;200(1):75 el-10, Berek JS. Expert Opin Biol Ther 2004;4(7):1159-65; O'Brien TJ, et al. Int J Biol Markers 1998;13(4):188-95). Таким образом, необходимо создание новых антител к не слущиваемой области MUC16 для диагностических и терапевтических подходов.
3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
c114
[0006] Изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, а также полипептидам, содержащим такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, таким как слитые белки, конъюгаты, и/или химерные антигенные рецепторы, а также клеткам, экспрессирующим их. Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов присутствуют те, которые специфически связываются с эпитопами белка MUC16. Такие антитела обозначают в настоящем описании как «антитела к гликозилированному MUC16». Такие эпитопы обычно представляют собой эпитопы во или по существу во внеклеточной части молекулы MUC16, в целом не слущиваемой форме MUC16; в некоторых вариантах осуществления эпитоп не находится в области тандемных повторов MUC16 и/или секретируемой форме MUC16 или антитело или фрагмент не связывается с ним. В некоторых вариантах осуществления эпитоп находится в или включает остатки в MUC16, и обычно содержит один или несколько гликозилированных остатков или участки гликозилирования в нем. В некоторых вариантах осуществления эпитоп включает один или несколько участков гликозилирования, таких как участки для N-гликозилирования. В некоторых аспектах эпитоп содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1806 или Asn1800 из последовательности MUC16, приведенной в SEQ ID № 150 (и/или его гликозилированной форме(ах)); в некоторых аспектах эпитоп содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1806 из SEQ ID № 150, но не содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1800 из SEQ ID № 150; в некоторых аспектах эпитоп содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1800 из SEQ ID № 150, но не содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1806 из SEQ ID № 150. В некоторых из каких-либо из таких вариантов осуществления такие один или несколько аспарагинов гликозилированы, например, N-гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом внутри или тем, что содержит остатки внутри SEQ ID № 131; связывается с эпитопом внутри или тем, что содержит остатки внутри SEQ ID № 130, или их сочетанием; в некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент иммуноспецифически не связывается в областью MUC16, соответствующей SEQ ID № 168, или внутри остатков 2-19 из SEQ ID № 168.
18
18
[0007] В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR), соответствующих CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи последовательности антитела, такой как последовательность антитела, направленного на участок гликозилирования MUC16, которая описана в настоящем описании, например, антитела с обозначением 18C6, антитела с обозначением 10C6 и/или антитела с обозначением 19C11. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент имеет CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), имеющую последовательность, соответствующую HCDR3 одной из последовательностей тяжелой цепи, представленных в настоящем описании, например, последовательностей тяжелой цепи антитела с обозначением 18C6, антитела с обозначением 10C6, антитела с обозначением 19C11 и/или антитела с обозначением 7B12. В некоторых аспектах HCDR3 имеет последовательность, выбранную среди IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105), GTAQATDALD (SEQ ID № 111); XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которых X представляет собой T, A или S; SEQ ID № 5; SEQ ID № 25; SEQ ID № 45; SEQ ID № 65; и SEQ ID № 85; SEQ ID № 31, 51, 71 и 91; SEQ ID № 17; SEQ ID № 37; SEQ ID № 57; SEQ ID № 77; и SEQ ID № 97.
1
1
8
9
8
9
15
16
15
16
[0008] В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), имеющую последовательность, соответствующую HCDR1 одной из последовательностей тяжелой цепи, представленных в настоящем описании, например, последовательностей тяжелой цепи антитела с обозначением 18C6, антитела с обозначением 10C6, антитела с обозначением 19C11 и/или антитела с обозначением 7B12. В некоторых аспектах, HCDR1 имеет последовательность, выбранную из TXGMGVG (SEQ ID № 103), где X представляет собой L или V, последовательности GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой L или V, GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой V или L, и последовательности, приведенной в виде SEQ ID № 3; и последовательности, приведенной в виде SEQ ID № 9; и последовательности, приведенной в виде SEQ ID № 15; и последовательности, приведенной в любой из SEQ ID №№ 23, 43, 63, 83; и последовательности, приведенной в любой из SEQ ID №№ 29, 49, 69 и 89; и последовательности, приведенной в любой из SEQ ID №№ 35, 55, 75 и 95.
2
3
2
3
10
10
17
17
[0009] В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), имеющую последовательность, соответствующую HCDR2 одной из последовательностей тяжелой цепи, представленных в настоящем описании, например, последовательностей тяжелой цепи антитела с обозначением 18C6, антитела с обозначением 10C6, антитела с обозначением 19C11 и/или антитела с обозначением 7B12. В некоторых аспектах HCDR2 имеет последовательность, выбранную среди HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и X представляет собой Y или N; WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; последовательности, приведенной в виде SEQ ID № 4; последовательности, приведенной в виде SEQ ID № 10; и последовательности, приведенной в виде SEQ ID № 16; и последовательности, приведенной в любой из SEQ ID №№ 24, 44, 64, 84; и последовательности, приведенной в любой из SEQ ID №№ 30, 50, 70, 90; и последовательности, приведенной в любой из SEQ ID №№ 36, 56, 76, 96.
6
7
6
7
13
14
13
14
[0010] В некоторых вариантах осуществления, включая какие-либо из указанных выше вариантов осуществления, антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают, например, дополнительно включают, CDR3 легкой цепи (LCDR3), имеющую последовательность, соответствующую LCDR3 одной из последовательностей легкой цепи, представленных в настоящем описании, например, последовательностей легкой цепи антитела с обозначением 18C6, антитела с обозначением 10C6, антитела с обозначением 19C11 и/или антитела с обозначением 7B12. В некоторых аспектах LCDR3 имеет последовательность, выбранную среди MQXLEXPLT (SEQ ID № 108), в которой X представляет собой G или S и в которой X представляет собой H или Y; XLEXPL (SEQ ID № 114), в которой X представляет собой G или S и в которой X представляет собой H или Y; и MQSLEYPLT (SEQ ID № 120); последовательности, выбранной среди SEQ ID №№ 8, 28, 48, 68, и 88; последовательности, выбранной среди SEQ ID №№ 14, 34, 54, 74 и 94; и последовательности, выбранной среди SEQ ID №№ 20, 4, 60, 80 и 100.
4
5
11
12
11
12
19
20
19
20
[0011] В некоторых вариантах осуществления, включая какие-либо из указанных выше вариантов осуществления, антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают, например, дополнительно включают, CDR1 легкой цепи (LCDR1), имеющую последовательность, соответствующую LCDR1 одной из последовательностей легкой цепи, представленных в настоящем описании, например, последовательностей легкой цепи антитела с обозначением 18C6, антитела с обозначением 10C6, антитела с обозначением 19C11 и/или антитела с обозначением 7B12. В некоторых аспектах LCDR1 имеет последовательность, выбранную среди RSSKSLXXSNGNTYLY (SEQ ID № 106); SKSLXXSNGNTY (SEQ ID № 112), в которой X представляет собой L или R и в которой X представляет собой H или K; KSLXXSNGNTY (SEQ ID № 118), в которой X представляет собой V или L и в которой X представляет собой H или K; последовательности, выбранной среди SEQ ID №№ 6, 26, 46, 66 и 86; последовательности, выбранной среди SEQ ID №№ 12, 32, 52, 72 и 92; и последовательности, выбранной среди SEQ ID №№ 18, 38, 58, 78 и 98.
[0012] В некоторых вариантах осуществления, включая какие-либо из указанных выше вариантов осуществления, антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают, например, дополнительно включают, CDR2 легкой цепи (LCDR2), имеющую последовательность, соответствующую LCDR2 одной из последовательностей легкой цепи, представленных в настоящем описании, например, последовательностей легкой цепи антитела с обозначением 18C6, антитела с обозначением 10C6, антитела с обозначением 19C11 и/или антитела с обозначением 7B12. В некоторых аспектах LCDR2 имеет последовательность, выбранную среди YMSNLAS (SEQ ID № 107); YMS (SEQ ID № 113); и последовательности, приведенной в любой из SEQ ID №№ 7, 27, 47, 67, 87; 13, 33, 53, 73, 93, 19, 39, 59, 79, 99, 119.
1
1
2
3
2
3
[0013] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют (a) определяющую комплементарность область (CDR)1 VH, содержащую аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и X представляет собой Y или N; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105).
8
9
8
9
10
10
[0014] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют (a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой L или V; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111).
15
16
15
16
17
17
18
18
[0015] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют (a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой V или L; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S.
[0016] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 3, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 4, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 5; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 9, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 10, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 11; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 15, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 16, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 17; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 23, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 24, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 25; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 29, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 30, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 31; VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 35, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 36, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 37; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 43, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 44, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 45; VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 49, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 50, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 51; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 55, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 56, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 57; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 63, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 64, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 65; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 69, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 70, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 71; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 75, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 76, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 77; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 83, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 84, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 85; CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 89, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 90, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 91; VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 95, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 96, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 97.
4
5
4
5
6
7
6
7
[0017] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют (a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность RSSKSLXXSNGNTYLY (SEQ ID № 106), в которой X представляет собой R или L и X представляет собой K или H; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMSNLAS (SEQ ID № 107); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQXLEXPLT (SEQ ID № 108), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y.
11
12
11
12
13
14
13
14
[0018] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют (a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SKSLXXSNGNTY (SEQ ID № 112), в которой X представляет собой L или R и X представляет собой H или K; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 113); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность XLEXPL (SEQ ID № 114), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y.
19
20
19
20
[0019] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность KSLXXSNGNTY (SEQ ID № 118), в которой X представляет собой V или L и X представляет собой H или K; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 119); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQSLEYPLT (SEQ ID № 120).
[0020] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 26, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 27, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 28; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 32, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 33, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 34; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 38, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 39, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 40; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 46, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 47, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 48; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 52, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 53, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 54; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 58, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 59, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 60; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 86, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 87, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 88; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 92, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 93, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 94; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 98, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 99, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 100; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 6, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 7, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 8; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 12, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 13, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 14; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 18, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 19, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 20; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 66, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 67, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 68; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 72, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 73, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 74; или CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 78, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 79, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 80.
1
1
2
3
2
3
4
5
4
5
6
7
6
7
8
9
8
9
10
10
11
12
11
12
13
14
13
14
15
16
15
16
17
17
18
18
19
20
19
20
[0021] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют (a) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V; CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и X представляет собой Y или N; и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105); и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность RSSKSLXXSNGNTYLY (SEQ ID № 106), в которой X представляет собой R или L и X представляет собой K или H; CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMSNLAS (SEQ ID № 107); и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQXLEXPLT (SEQ ID № 108), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y; или (b) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой L или V; CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111); и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SKSLXXSNGNTY (SEQ ID № 112), в которой X представляет собой L или R и X представляет собой H или K; CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 113); и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность XLEXPL (SEQ ID № 114), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y; или (c) (i) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой V или L; CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность KSLXXSNGNTY (SEQ ID № 118), в которой X представляет собой V или L и X представляет собой H или K; CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 119); и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQSLEYPLT (SEQ ID № 120); или (d) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 23, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 24, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 25; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 26, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 27, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 28; или (e) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 29, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 30, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 31; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 32, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 33, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 34; или (f) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 35, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 36, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 37; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 38, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 39, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 40; или (g) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 43, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 44, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 45; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 46, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 47, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 48; или (h) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 49, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 50, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 51; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 52, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 53, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 54; или (i) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 55, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 56, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 57; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 58, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 59, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 60; или (j) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 83, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 84, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 85; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 86, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 87, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 88; или (k) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 89, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 90, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 91; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 92, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 93, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 94; или (l) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 95, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 96, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 97 и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 98, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 99, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 100; или (m) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 3, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 4, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 5; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 6, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 7, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 8; или (n) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 9, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 10, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 11; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 12, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 13, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 14; или (o) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 15, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 16, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 17; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 18, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 19, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 20; или (p) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 63, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 64, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 65; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 66, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 67, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 68; или (q) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 69, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 70, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 71; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 72, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 73, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 74; или (r) (i) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 75, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 76, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 77; и (ii) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 78, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 79, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 80.
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
36
37
38
39
40
41
42
43
[0022] Среди антител и антигенсвязывающих фрагментов по какому-либо из вариантов осуществления присутствуют те, которые имеют: (a) (i) VH, которая содержит аминокислотную последовательность QVXLKESGPGXLQPSQTLSLTCSFSGFSLXTXGMGVGWXRQXSGKGLEWLAH IWWDDXDKYYXPALKSRLTISXXXSKNQVFLKIXNVXTADXATYYCXRI GTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X представляет собой T или N, X представляет собой I или K, X представляет собой N или S, X представляет собой V или L, X представляет собой S или I, X представляет собой P или S, X представляет собой E или отсутствует, X представляет собой N или Y, X представляет собой K или R, X представляет собой A или D, X представляет собой T или S, X представляет собой V или A, X представляет собой G или D, X представляет собой T, I или S и X представляет собой T, S или A; и (ii) VL, которая содержит аминокислотную последовательность DIVMTQAAPSXXVTPGESVSISCRSSKSLXXSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLXISRVEAXDVGVYYCMQXLEXPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 102), в которой X представляет собой I или V, X представляет собой P или S, X представляет собой R или L, X представляет собой K или H, X представляет собой R или K, X представляет собой E или G, X представляет собой S или G и X представляет собой Y или H; или (b) (i) VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1; и (ii) VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2; или (c) (i) VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21; и (ii) VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22; или (d) (i) VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41; и (ii) VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42; или (e) (i) VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61; и (ii) VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62; или (f) (i) VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81; и (ii) VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82.
[0023] Также среди предоставленных антител или антигенсвязывающих фрагментов присутствуют те, которые имеют по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность с последовательностью(ями) VH и/или VL каких-либо таких антител и/или каких-либо антител, приведенных в таблицах 1 и 2. Также среди предоставленных антител и их фрагментов присутствуют те, которые конкурируют за связывание с MUC16 и/или его эпитопом с каким-либо из таких антител.
[0024] Изобретение также относится к слитым белкам, таким как химерные молекулы и/или конъюгаты, которые содержат какое-либо из антител, таких как химерные антигенные рецепторы (CAR), которые содержат такие антитела или фрагменты, и клетки, экспрессирующие такие молекулы. Изобретение также относится к гуманизированным версиям каких-либо таких антител.
[0025] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело (a) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (b) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (c) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16. В некоторых вариантах осуществления (i) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; (ii) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; и (iii) клетки на стадии (c) представляют собой клетки SKOV3. В конкретном варианте осуществления антитело не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139. В некоторых вариантах осуществления (i) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; (ii) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; и (iii) клетки на стадии (c) представляют собой клетки SKOV3. В некоторых вариантах осуществления (i) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; (ii) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; (iii) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; и (iv) клетки на стадии (c) представляют собой клетки SKOV3.
[0026] Также изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело (a) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (b) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (c) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16. В некоторых вариантах осуществления (i) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; (ii) клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, представляет собой клетку SKOV3; и (iii) клетки на стадии (c) представляют собой клетки SKOV3.
[0027] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связывается с эпитопом, который содержит N-гликозилированный аспарагин 1806 из SEQ ID № 150.
[0028] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связывается с аминокислотной последовательностью CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), в которой аминокислотный остаток номер 4 (N4) и аминокислотный остаток номер 10 (N10) из CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130) гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связывается с аминокислотной последовательностью CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131), в которой аминокислотный остаток номер 7 (N7) из CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131) гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование состоит из N-связанной хитобиозы.
[0029] В некоторых вариантах осуществления происходит интернализация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в клетку, которая экспрессирует первую форму MUC16, при контакте клетки с антителом или антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку SKOV3, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16.
[0030] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует рост опухоли, которая экспрессирует гликозилированную форму MUC16.
[0031] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.
1
1
2
3
2
3
[0032] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит (a) определяющую комплементарность область (CDR)1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и X представляет собой Y или N; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105).
8
9
8
9
10
10
[0033] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит (a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой L или V; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111).
15
16
15
16
17
17
18
18
[0034] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит (a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой V или L; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S.
[0035] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 3, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 4, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 5.
[0036] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 9, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 10, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 11.
[0037] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 15, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 16, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 17.
[0038] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 23, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 24, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 25.
[0039] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 29, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 30, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 31.
[0040] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 35, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 36, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 37.
[0041] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 43, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 44, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 45.
[0042] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 49, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 50, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 51.
[0043] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 55, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 56, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 57.
[0044] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 63, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 64, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 65.
[0045] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 69, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 70, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 71.
[0046] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 75, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 76, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 77.
[0047] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 83, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 84, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 85.
[0048] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 89, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 90, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 91.
[0049] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 95, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 96, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 97.
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
[0050] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность QVXLKESGPGXLQPSQTLSLTCSFSGFSLXTXGMGVGWXRQXSGKGLEWLAH IWWDDXDKYYXPALKSRLTISXXXSKNQVFLKIXNVXTADXATYYCXRI GTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X представляет собой T или N, X представляет собой I или K, X представляет собой N или S, X представляет собой V или L, X представляет собой S или I, X представляет собой P или S, X представляет собой E или отсутствует, X представляет собой N или Y, X представляет собой K или R, X представляет собой A или D, X представляет собой T или S, X представляет собой V или A, X представляет собой G или D, X представляет собой T, I или S и X представляет собой T, S или A.
[0051] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1.
[0052] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21.
[0053] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41.
[0054] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61.
[0055] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81.
4
5
4
5
6
7
6
7
[0056] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит (a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность RSSKSLXXSNGNTYLY (SEQ ID № 106), в которой X представляет собой R или L и X представляет собой K или H; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMSNLAS (SEQ ID № 107); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQXLEXPLT (SEQ ID № 108), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y.
[0057] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит
11
12
11
12
13
14
13
14
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SKSLXXSNGNTY (SEQ ID № 112), в которой X представляет собой L или R и X представляет собой H или K; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 113); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность XLEXPL (SEQ ID № 114), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y.
19
20
19
20
[0058] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит (a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность KSLXXSNGNTY (SEQ ID № 118), в которой X представляет собой V или L и X представляет собой H или K; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 119); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQSLEYPLT (SEQ ID № 120).
[0059] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 26, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 27, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 28.
[0060] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 32, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 33, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 34.
[0061] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 38, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 39, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 40.
[0062] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 46, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 47, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 48.
[0063] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 52, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 53, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 54.
[0064] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 58, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 59, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 60.
[0065] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 86, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 87, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 88.
[0066] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 92, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 93, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 94.
[0067] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 98, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 99, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 100.
[0068] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 6, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 7, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 8.
[0069] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 12, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 13, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 14.
[0070] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 18, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 19, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 20.
[0071] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 66, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 67, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 68.
[0072] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 72, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 73, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 74.
[0073] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 78, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 79, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 80.
36
37
38
39
40
41
42
43
36
37
38
39
40
41
42
43
[0074] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность DIVMTQAAPSXXVTPGESVSISCRSSKSLXXSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLXISRVEAXDVGVYYCMQXLEXPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 102), в которой X представляет собой I или V, X представляет собой P или S, X представляет собой R или L, X представляет собой K или H, X представляет собой R или K, X представляет собой E или G, X представляет собой S или G и X представляет собой Y или H.
[0075] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22.
[0076] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42.
[0077] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82.
[0078] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2.
[0079] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62.
[0080] В некоторых вариантах осуществления антитело содержит полученные у человека константные области тяжелой и легкой цепей. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи имеет изотип, выбранный из группы, состоящей из гамма1, гамма2, гамма3 и гамма4. В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи имеет изотип, выбранный из группы, состоящей из каппа и лямбда.
[0081] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированную форму антитела грызуна.
[0082] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой иммуноглобулин, который содержит две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи. В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулин представляет собой IgG.
[0083] Также в настоящем описании предоставлен конъюгат антитела, который содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предоставленный в настоящем описании, конъюгированный со средством. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой визуализирующее средство или цитотоксическое средство.
[0084] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело иммуноспецифически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело содержит иммуноглобулин, который иммуноспецифически связывает MUC16, где легкую цепь иммуноглобулина конъюгируют через пептидный линкер с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), который иммуноспецифически связывает CD3. Также в настоящем описании предоставлен конъюгат биспецифического антитела, содержащий биспецифическое антитело, предоставленное в настоящем описании, конъюгированное со средством. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой визуализирующее средство или цитотоксическое средство.
[0085] В некоторых вариантах осуществления его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). Также в настоящем описании предоставлен конъюгат scFv, который содержит scFv, предоставленный в настоящем описании, конъюгированный со средством. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой визуализирующее средство или цитотоксическое средство.
[0086] Также изобретение относится к слитым белкам, химерным молекулам и конъюгатам, которые содержат антитела и антигенсвязывающие фрагменты. Изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), которые содержат одно или несколько из каких-либо из антител или их антигенсвязывающих фрагментов по изобретению, например, CAR, который содержит какой-либо из scFv, представленных в настоящем описании, или конъюгата scFv, представленного в настоящем описании; и/или CAR, которые содержат антигенсвязывающие домены, которые конкурируют с ними за связывание с MUC16.
1
1
2
3
2
3
[0087] Также изобретение относится к тяжелой цепи антитела или ее антигенсвязывающей части. Среди антител и их антигенсвязывающих фрагментов по изобретению присутствуют те, которые имеют тяжелые цепи и/или их антигенсвязывающие части, такие как их области VH; также изобретение относится к таким тяжелым цепям и их антигенсвязывающим частям. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит (a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и X представляет собой Y или N; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105); где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
8
9
8
9
10
10
[0088] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит (a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой L или V; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111); где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
15
16
15
16
17
17
18
18
[0089] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит (a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой V или L; (b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и (c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S; где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0090] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 3, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 4, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 5, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0091] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 9, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 10, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 11, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0092] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающие части содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 15, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 16, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 17, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0093] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 23, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 24, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 25, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0094] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 29, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 30, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 31, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0095] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 35, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 36, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 37, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0096] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 43, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 44, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 45, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0097] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 49, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 50, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 51, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0098] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 55, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 56, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 57, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[0099] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 63, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 64, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 65, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00100] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 69, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 70, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 71, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00101] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 75, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 76, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 77, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00102] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 83, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 84, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 85, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00103] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 89, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 90, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 91, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00104] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 95, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 96, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 97, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
[00105] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность QVXLKESGPGXLQPSQTLSLTCSFSGFSLXTXGMGVGWXRQXSGKGLEWLAH IWWDDXDKYYXPALKSRLTISXXXSKNQVFLKIXNVXTADXATYYCXRI GTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X представляет собой T или N, X представляет собой I или K, X представляет собой N или S, X представляет собой V или L, X представляет собой S или I, X представляет собой P или S, X представляет собой E или отсутствует, X представляет собой N или Y, X представляет собой K или R, X представляет собой A или D, X представляет собой T или S, X представляет собой V или A, X представляет собой G или D, X представляет собой T, I или S и X представляет собой T, S или A, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00106] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00107] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00108] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00109] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00110] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00111] В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее антигенсвязывающая часть содержит полученную у человека константную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи имеет изотип, выбранный из группы, состоящей из гамма1, гамма2, гамма3 и гамма4. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела гуманизирована. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела представляет собой гуманизированную форму тяжелой цепи грызуна.
[00112] Также в настоящем описании предоставлен конъюгат тяжелой цепи антитела, который содержит тяжелую цепь антитела, предоставленную в настоящем описании, где указанную тяжелую цепь антитела конъюгируют со средством. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой визуализирующее средство или цитотоксическое средство.
4
5
4
5
6
7
6
7
[00113] Среди антител и их антигенсвязывающих фрагментов по изобретению присутствуют те, которые имеют легкие цепи и/или их части, такие как их области VL; также предоставлены такие легкие цепи и их антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит (a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность RSSKSLXXSNGNTYLY (SEQ ID № 106), в которой X представляет собой R или L и X представляет собой K или H; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMSNLAS (SEQ ID № 107); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQXLEXPLT (SEQ ID № 108), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
11
12
11
12
13
14
13
14
[00114] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит (a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SKSLXXSNGNTY (SEQ ID № 112), в которой X представляет собой L или R и X представляет собой H или K; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 113); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность XLEXPL (SEQ ID № 114), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
19
20
19
20
[00115] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит (a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность KSLXXSNGNTY (SEQ ID № 118), в которой X представляет собой V или L и X представляет собой H или K; (b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 119); и (c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQSLEYPLT (SEQ ID № 120), где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00116] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 6, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 7, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 8, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00117] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 12, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 13, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 14, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00118] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 18, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 19, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 20, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00119] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 26, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 27, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 28, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00120] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 32, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 33, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 34, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00121] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 38, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 39, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 40, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00122] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 46, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 47, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 48, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00123] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 52, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 53, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 54, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00124] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 58, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 59, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 60, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00125] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 66, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 67, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 68, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00126] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 72, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 73, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 74, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00127] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 78, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 79, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 80, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00128] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 86, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 87, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 88, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00129] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 92, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 93, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 94, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00130] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 98, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 99, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 100, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
36
37
38
39
40
41
42
43
36
37
38
39
40
41
42
43
[00131] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность DIVMTQAAPSXXVTPGESVSISCRSSKSLXXSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLXISRVEAXDVGVYYCMQXLEXPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 102), в которой X представляет собой I или V, X представляет собой P или S, X представляет собой R или L, X представляет собой K или H, X представляет собой R или K, X представляет собой E или G, X представляет собой S или G и X представляет собой Y или H, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00132] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00133] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00134] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00135] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00136] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее антигенсвязывающая часть содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82, где, необязательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающую часть, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16.
[00137] В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее антигенсвязывающая часть содержит полученную у человека константную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи имеет изотип, выбранный из группы, состоящей из каппа и лямбда. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела гуманизирована. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела представляет собой гуманизированную форму антитела грызуна.
[00138] Также изобретение относится к конъюгату легкой цепи антитела, который содержит легкую цепь антитела, представленную в настоящем описании, конъюгированную со средством. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой визуализирующее средство или цитотоксическое средство.
[00139] Также изобретение относится к слитому белку, содержащему легкую цепь антитела, представленного в настоящем описании, конъюгированную через пептидный линкер с scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv связывает CD3.
[00140] Также изобретение относится к клетке, такой как клетка иммунной системы, такая как T-клетка, которая рекомбинантно экспрессирует одну или несколько молекул, предоставленных в настоящем описании, таких как CAR, представленный в настоящем описании.
[00141] Также изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие scFv, представленный в настоящем описании. Также изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют scFv, или его конъюгат, представленный в настоящем описании. Также изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют CAR, представленный в настоящем описании. Также изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют тяжелую цепь антитела, или ее антигенсвязывающую часть, представленную в настоящем описании. Также изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют конъюгат тяжелой цепи антитела, представленный в настоящем описании. Также изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют легкую цепь антитела, или ее антигенсвязывающую часть, представленную в настоящем описании. Также изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют конъюгат легкой цепи антитела, представленный в настоящем описании. Также изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют слитый белок, представленный в настоящем описании. Полинуклеотид, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют (a) тяжелую цепь антитела, или ее антигенсвязывающую часть, представленную в настоящем описании, или конъюгат тяжелой цепи антитела, представленный в настоящем описании; и (b) легкую цепь антитела, или ее антигенсвязывающую часть, представленную в настоящем описании, конъюгат легкой цепи антитела, представленный в настоящем описании, или слитый белок, представленный в настоящем описании.
[00142] Также изобретение относится к вектору, который содержит полинуклеотид, представленный в настоящем описании, функционально связанный с промотором. Также изобретение относится к вектору, который содержит (a) первый полинуклеотид, представленный в настоящем описании, функционально связанный с первым промотором; и (b) второй полинуклеотид, представленный в настоящем описании, функционально связанный со вторым промотором.
[00143] Также изобретение относится к клетке ex vivo, которая содержит полинуклеотид, представленный в настоящем описании, функционально связанный с промотором. Также изобретение относится к клетке ex vivo, которая содержит полинуклеотид, представленный в настоящем описании, функционально связанный с промотором. Также изобретение относится к клетке ex vivo, которая содержит вектор, представленный в настоящем описании. Также изобретение относится к клетке ex vivo, которая содержит один или несколько полинуклеотидов, которые кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предоставленного в настоящем описании, функционально связанных с промотором.
[00144] Также изобретение относится к способу получения тяжелой цепи антитела, или ее антигенсвязывающей части, который включает культивирование клетки, представленной в настоящем описании, в таких условиях, что полинуклеотид экспрессируют с помощью клетки для того, чтобы получать тяжелую цепь антитела, или ее антигенсвязывающую часть, или конъюгат тяжелой цепи антитела, кодируемый полинуклеотидом.
[00145] Также изобретение относится к способу получения легкой цепи антитела, или ее антигенсвязывающей части, который включает культивирование клетки, представленной в настоящем описании, в таких условиях, что полинуклеотид экспрессируют с помощью клетки для того, чтобы получать легкую цепь антитела, или ее антигенсвязывающую часть, конъюгат легкой цепи антитела или слитый белок, кодируемый полинуклеотидом.
[00146] Также изобретение относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает культивирование клетки ex vivo, представленной в настоящем описании, в таких условиях, что полинуклеотид, функционально связанный с первым промотором, и полинуклеотид, функционально связанный со вторым промотором, экспрессируют с помощью клетки для того, чтобы получать (i) тяжелую цепь антитела или конъюгат тяжелой цепи антитела, кодируемые полинуклеотидом; и (ii) легкую цепь антитела, конъюгат легкой цепи антитела или слитый белок, кодируемые полинуклеотидом.
[00147] Также изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит: терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, конъюгата антитела, представленного в настоящем описании, биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, конъюгата биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, scFv, конъюгата scFv, представленного в настоящем описании, CAR, представленного в настоящем описании, тяжелой цепи антитела, или ее антигенсвязывающей части, представленной в настоящем описании, конъюгата тяжелой цепи антитела, представленного в настоящем описании, легкой цепи антитела, или ее антигенсвязывающей части, представленной в настоящем описании, конъюгата легкой цепи антитела, представленного в настоящем описании, слитого белка, представленного в настоящем описании, или T-клетки, представленной в настоящем описании; и фармацевтически приемлемый носитель.
[00148] Также изобретение относится к способу лечения раке у пациента, который включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, представленной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легкого, поджелудочной железы, молочной железы, матки, фаллопиевой трубы или первичной брюшины. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичника. В некоторых вариантах осуществления пациентом является пациент-человек. В конкретных вариантах осуществления, способ представляет собой способ комбинированного лечения, который дополнительно включает введение терапевтически эффективного количества дополнительного терапевтического средства пациенту.
[00149] В конкретном варианте осуществления способа комбинированного лечения фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество первого антитела, которое представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1806 из SEQ ID № 150, но не содержит N-гликозилированный Asn1800 из SEQ ID № 150, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1806 из SEQ ID № 150 и также содержит N-гликозилированный Asn1800 из SEQ ID № 150. В конкретном варианте осуществления первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент идентифицируют по (i) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма MUC16 гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, эта четвертая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность четвертой формы представляет собой SEQ ID № 152, и где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, относятся к одному типу клеток, и где второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент идентифицируют по (i) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; и (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует пятую форму MUC16, эта пятая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность пятой формы представляет собой SEQ ID № 172, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, относится к тому же типу клеток, что клетка, которая рекомбинантно экспрессирует пятую форму MUC16.
[00150] В частном варианте осуществления способа комбинированного лечения, фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество первого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, то есть антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем описании, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1806 из SEQ ID № 150, но не содержит N-гликозилированный Asn1800 из SEQ ID № 150, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой терапевтически эффективное количество второго антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1800 из SEQ ID № 150, но не содержит N-гликозилированный Asn1806 из SEQ ID № 150. В конкретном варианте осуществления первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент идентифицируют по (i) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма MUC16 гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, эта четвертая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность четвертой формы представляет собой SEQ ID № 152, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, относятся к одному типу клеток, и где второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент идентифицируют по (i) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма MUC16 гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, где аминокислотная последовательность четвертой формы представляет собой SEQ ID № 152; и, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, относятся к одному типу клеток.
[00151] Также изобретение относится к иммуногенному гликопептиду, который содержит один или несколько участков гликозилирования, где (i) иммуногенный гликопептид составляет от 10 до 60 аминокислотных остатков, от 10 до 30 аминокислотных остатков, от 15 до 25 аминокислотных остатков, от 15 до 20 аминокислотных остатков или от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину, и (ii) по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования связан с углеводом. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит один, два или три участка гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с углеводом. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с углеводом. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой N- или O-связанный углевод. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид или пентасахарид. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой дисахарид. В некоторых вариантах осуществления дисахарид представляет собой хитобиозу.
[00152] В некоторых вариантах осуществления N-конец иммуногенного гликопептида ацетилирован. В некоторых вариантах осуществления C-конец гликопептида присутствует в форме производного N-метилкарбоксамида. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид конъюгируют с иммуногенным белком-переносчиком. В некоторых вариантах осуществления иммуногенным белком-переносчиком является гемоцианин морского блюдца.
[00153] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с хитобиозой. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с хитобиозой.
[00154] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет 18 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные гликопептиды содержат два участка гликозилирования, каждый из которых связан с хитобиозой.
[00155] В некоторых вариантах осуществления иммуногенные гликопептиды составляют 15 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с хитобиозой.
[00156] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит по меньшей мере часть из 10 аминокислот из аминокислотной последовательности из SEQ ID № 150, где по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования находится в указанной части аминокислотной последовательности.
[00157] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 129.
[00158] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования в 30-м остатке (Asn) из SEQ ID № 129, который связан с хитобиозой.
3
2
[00159] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования в 30-м остатке (Asn) из SEQ ID № 129, который связан с фрагментом ManGlcNAc.
[00160] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 130. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные гликопептиды содержат два участка гликозилирования в 4-м остатке (Asn) и 10-м остатке (Asn) из SEQ ID № 130, каждый из которых связан с хитобиозой.
[00161] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 131. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные гликопептиды содержат участок гликозилирования в 7-м остатке (Asn) из SEQ ID № 131, который связан с хитобиозой.
3
2
[00162] Также изобретение относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают гликоль-белок, который включает иммунизацию субъекта иммуногенным гликопептидом, который содержит один или несколько участков гликозилирования, где (i) иммуногенный гликопептид составляет от 10 до 60 аминокислотных остатков, от 10 до 30 аминокислотных остатков, от 15 до 25 аминокислотных остатков, от 15 до 20 аминокислотных остатков или от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину, (ii) иммуногенный гликопептид содержит по меньшей мере часть из 10 аминокислот аминокислотной последовательности гликопротеина, (iii) по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования связан с углеводом и (iv) по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования находится в указанной части аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не имеет специфического связывания с не гликозилированной формой гликопротеина. В некоторых вариантах осуществления субъектом является коза, овца, осел, курица, морская свинка, крыса, кролик или мышь. В некоторых вариантах осуществления субъектом является крыса, кролик или мышь. В некоторых вариантах осуществления субъектом является мышь. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит один, два или три участка гликозилирования. Способ по любому из пп. 190-195, в котором иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с углеводом. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с углеводом. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой N- или O-связанный углевод. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид или пентасахарид. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой дисахарид. В некоторых вариантах осуществления дисахарид представляет собой хитобиозу. В некоторых вариантах осуществления N-конец иммуногенного гликопептида ацетилирован. В некоторых вариантах осуществления C-конец гликопептида находится в форме производного N-метилкарбоксамида. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид конъюгируют с иммуногенным белком-переносчиком. В некоторых вариантах осуществления иммуногенным белком-переносчиком является гемоцианин морского блюдца. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с хитобиозой. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с хитобиозой. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет 18 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с хитобиозой. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет 15 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с хитобиозой. В некоторых вариантах осуществления гликопротеин содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 150. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 129. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования в 30-м остатке (Asn) из SEQ ID № 129, который связан с хитобиозой. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования в 30-м остатке (Asn) из SEQ ID № 129, который связан с фрагментом ManGlcNAc. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 130. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования в 4-м остатке (Asn) и 10-м остатке (Asn) из SEQ ID № 130, каждый из которых связан с хитобиозой. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 131. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования в 7-м остатке (Asn) из SEQ ID № 131, который связан с хитобиозой.
[00163] Также изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые иммуноспецифически связываются с MUC16 и которые имеют последовательности VH, VL, CDR VH и/или CDR VL антитела, описанного в настоящем описании (например, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6), а также их конъюгаты (например, с визуализирующими или цитотоксическими средствами).
4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
c344
c344
c114
c114
c80
c80
c86
c86
c114-N123
[00164] Фиг. 1A-1I. Конструкции MUC16. Фиг. 1A: схематическая иллюстрация MUC16. Фиг. 1B: Вверху: схематическая иллюстрация MUC16. Внизу: линейное представление усеченной конструкции MUC16. Аминокислотная последовательность N-конца первого тандемного повтора представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 155. Аминокислотная последовательность C-конца первого тандемного повтора представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 156. Аминокислотная последовательность N-конца эктодомена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 157. Аминокислотная последовательность C-конца эктодомена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 158. Фиг. 1C: Вверху: схематическая иллюстрация MUC16. Внизу: линейное представление MUC16. Аминокислотная последовательность эктодомена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 161. Аминокислотная последовательность трансмембранного домена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 159. Аминокислотная последовательность для цитоплазматического хвоста представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 160. Фиг. 1D: Вверху: схематическая иллюстрация MUC16. Внизу: линейное представление MUC16. Аминокислотная последовательность эктодомена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 162. Аминокислотная последовательность трансмембранного домена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 159. Аминокислотная последовательность цитоплазматического хвоста представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 159. Фиг. 1E: Вверху: схематическая иллюстрация MUC16. Внизу: линейное представление MUC16. Аминокислотная последовательность эктодомена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 163. Аминокислотная последовательность трансмембранного домена представляет собой то, что приведено в SEQ №: 164. Аминокислотная последовательность цитоплазматического домена представляет собой SEQ ID № 165. Фиг. 1F: линейное представление MUC16. Аминокислотная последовательность 3(N→A)мутированного эктодомена 58 а. о. представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 166. Аминокислотная последовательность трансмембранного домена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 159. Аминокислотная последовательность цитоплазматического домена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 160. На фиг. 1G, фиг. 1H и фиг. 1I приведен процент клеток, обнаруживаемых с помощью 4H11 через FACS анализ, где клеточные линии экспрессируют указанные конструкции MUC16.
c114
c344
c114
c344
c114
c80
c86
[00165] Фиг. 2A-2C. Кривые роста in vitro для MUC16-трансфектантов. На фиг. 2A изображены кривы роста in vitro для MUC16 и MUC16 клеточных линий, по сравнению с контрольной клеточной линией (phrGFP), в клетках 3T3. На фиг. 2B изображены кривые роста in vitro для MUC16 и MUC16 клеточных линий, по сравнению с контрольной клеточной линией (phrGFP), в клетках A2780. На фиг. 2C изображены кривые роста in vitro для MUC16, MUC16 и MUC16 клеточных линий, по сравнению с контрольной клеточной линией (phrGFP), в клетках 3T3.
c114
c344
c114
c344
c344
c114
c114
c344
c114
c344
c114
c344
[00166] Фиг. 3A-3E. Эффект MUC16 в клетках 3T3. На фиг. 3A изображен рост на мягком агаре 3T3 трансфектантов в 60 мм чашках. После 14 суток колонии подсчитывали и наносили на график. Данные, представленные в таблице, представляют один из трех схожих экспериментов (*** p < 0,0001) по сравнению с ростом на мягком агаре клеток, экспрессирующих контрольный вектор phrGFP. На фиг. 3B представлен анализ инвазии матригеля для клеточных линий 3T3 после стабильных трансфекций с использованием или контрольного вектора phrGFP или MUC16 или MUC16 карбоксиконцевых конструкций. Каждый анализ осуществляли два или больше раз в трех повторениях и считали вручную. Обе MUC16 и MUC16 клеточные линии были значительно более инвазивными (*** p<0,0001) по сравнению с инвазией клеток, экспрессирующих контрольный вектор phrGFP, и результаты с использованием MUC16 клеточной линии значительно отличались от результатов с использованием MUC16 клеточной линии ((# p=0,0354). На фиг. 3C изображена экспрессия генов метастазов и инвазии, индуцированная экспрессией MUC16 и MUC16. Панель SuperArray из 80 транскриптов генов инвазии/метастазов исследовали на предмет клеточных линий, положительных по MUC16 конструкции и содержащих только вектор. Экспрессию выбранных транскриптов хемотаксиса, адгезии и инвазии измеряли в 3T3 MUC16 или 3T3 MUC16 клеточных линиях (каждое из трех тройных повторений исследовали в двух повторениях и сравнивали с контролями только с вектором phr посредством критерия хи-квадрат). p-значение для каждого транскрипта, скорректированное для повторных измерений, представлено в таблице. Включены все гены с изменениями при уровне p<0,05 или ниже. Фиг. 3D: трансфицированные клетки 3T3 исследовали на предмет активации путей передачи сигнала ERK/AKT по сравнению с контролями только с вектором. Фосфорилирование ERK1/2 (pT202/Y204) и AKT (S473) возрастало вслед за экспрессией конструкций MUC16 и MUC16, по сравнению с экспрессией вектора phr. Активацию обоих путей наблюдали в каждой из клеточных линий. Нормализованные по β-актину значения количественного денситометрического определения приведены на фиг. под каждым вестерн-блоттингом. На фиг. 3E показаны положительный по MUC16-конструкции опухолевый рост у бестимусных голых мышей. Два миллиона опухолевых клеток вводили в бок 15 nu/nu мышей, и наблюдали формирование опухоли у мышей. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. Различия в среднем объеме опухоли были значительно выше для мышей, несущих положительные по MUC16-конструкции опухоли (обе линии p<0,0001 по сравнению с клетками, экспрессирующими контрольный вектор phrGFP).
c114
c344
c114
c114
c344
c114
c114
c344
[00167] Фиг. 4A-4C. Онкогенные свойства фрагментов MUC16. На фиг. 4A представлен анализ инвазии матригеля для клеточных линий A2780, трансфицированных или контрольным вектором phrGFP или экспрессирующими карбоксиконец MUC16 векторами, MUC16 или MUC16. Каждый анализ осуществляли два или больше раз в трех повторениях и считали вручную. Результаты сравнивали с инвазией матригеля клетками, экспрессирующими контрольный вектор phrGFP или MUC16. MUC16 или MUC16c34 клеточные линии демонстрировали значимую инвазию матригеля относительно контрольного вектора phrGFP, и результаты с использованием MUC16 клеточной линии значительно отличались от результатов с использованием MUC16 клеточной линии (##p=0,0018). На фиг. 4B изображен эффект экспрессии MUC16, оказываемый на ERK/AKT передачу сигнала. Клетки A2780 исследовали на предмет активации путей передачи сигнала ERK/AKT. Фосфорилирование ERK1/2 (pT202/Y204) и AKT (S473) возрастало вслед за экспрессией каждой из конструкций экспрессии MUC16. Оба пути активировали в каждой из клеточных линий. Нормализованные по β-актину значения денситометрического количественного определения приведены под каждым вестерн-блоттингом на фиг. На фиг. 4C изображен положительный по MUC16-конструкции опухолевый рост у бестимусных голых мышей. Два миллиона опухолевых клеток вводили в бок 15 nu/nu мышей и наблюдали формирование опухоли у мышей. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. Различия в среднем объеме опухоли были значительно больше для мышей, несущих какую-либо из MUC16- или MUC16-положительных опухолей, в сутки 28, как показано на фиг.
c114
c114
c80
c86
c114
80
c86
c80
c114
c114
c80
c86
c114
c86
c80
[00168] Фиг. 5A-5D: эффекты усеченных вариантов MUC16. Фиг. 5A: рост на мягком агаре. 3T3 трансфектанты, экспрессирующие части внутреннего или внешнего домена MUC16, наслаивали на мягкий агар, как описано в разделе 6.1.2. Колонии подсчитывали и наносили на график. Приведенные данные представляют один из трех экспериментов. Скорости роста на мягком агаре для MUC16 и MUC16 значительно различались по сравнению со скоростью роста для MUC16 (# p =0,0111 и ## p=0,0258, соответственно), тогда как более высокий уровень значимости наблюдали для скорости роста для MUC16-трансфектанта по сравнению со скоростью роста для MUC16-трансфектанта (### p<0,0001). На фиг. 5B представлен анализ инвазии матригеля для клеточных линий 3T3, трансфицированных или контрольным вектором phrGFP или MUC16 карбоксиконцевыми конструкциями. Каждый анализ осуществляли два или больше раз в трех повторениях и считали вручную. Инвазия MUC16 клетками-трансфектантами была значимой (# p=0,0172) по сравнению с инвазией MUC16 клеточной линии. На фиг. 5C изображен эффект экспрессии MUC16, оказываемый на ERK/AKT передачу сигнала. Трансфицированные клетки 3T3 исследовали на предмет активации путей передачи сигнала ERK/AKT. Фосфорилирование в ERK1/2 (pT202/Y204) и AKT (S473) возрастало вслед за MUC16; однако сигналы были ниже в клетках, трансфицированных MUC16 или MUC16 конструкциями. Нормализованные по β-актину значения денситометрического количественного определения приведены под каждым вестерн-блоттингом на фиг. На фиг. 5D изображен положительный по MUC16-конструкции опухолевый рост у бестимусных голых мышей. Два миллиона опухолевых клеток вводили в бок 20 nu/nu мышей и наблюдали формирование опухоли у мышей. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. Различия в среднем объеме опухоли были значительно больше для мышей, несущих MUC16+ опухоли. 3T3 MUC16 и 3T3 MUC16-трансфектанты значительно различались по сравнению с MUC16-трансфектантами (### p<0,0001).
c114
c344
c86
c80
[00169] Фиг. 6A-6B. Аминокислотная последовательность для MUC16 (аминокислотные остатки с 1777 до 1890 (SEQ ID № 133), фиг. 6A) и MUC16 (аминокислотные остатки с 1547 до 1890 (SEQ ID № 132), фиг. 6B). Участки N- и O-гликозилирования выделены и трансмембранный домен (аминокислотные остатки с 1835 до 1859) подчеркнут и помечен «трансмембранный домен». Аминокислотные остатки 1857-1884 представляют делецию из 28 аминокислот во внутреннем домене, присутствующую в MUC16 конструкции (см. фиг. 1). Аминокислотные остатки 1798-1831 представляют делецию из 34 аминокислот в эктодомене, присутствующую в MUC16 конструкции (см. фиг. 1).
c114
c114-N123
c114
c114
c114-N123
c114
c114
c57-c114
117-244
c114
c114
c57-c114
117-244
c114
c114
c114-N123
c114-N123
3(N
A)c114
c114
3(N
A)c114
c114
c114
c114-N123
c57-114
c57-114
117-244
[00170] Фиг. 7A-7H. Эффект N-гликозилирования, оказываемый на MUC16 трансформацию. На фиг. 7A представлен анализ инвазии матригеля для клеточных линий 3T3, трансфицированных контрольным вектором phrGFP или MUC16 или MUC16 и MUC16 с обработкой туникамицином 0,1 мкг/мл. Результаты для MUC16 клеточной линии значительно отличались (### p<0,0001) от результатов для контрольной клеточной линии с вектором phrGFP. Результаты для MUC16 клеточной линии значительно различались (** p=0,007) по сравнению с результатами для контрольной клеточной линии с вектором phrGFP. Обработка ингибитором N-гликозилирования туникамицином значительно ингибировала инвазию матригеля по сравнению с необработанными MUC16 (p=0,004). На фиг. 7B представлен анализ инвазии матригеля для 3T3 трансфицированных клеточных линий по сравнению с контрольным вектором phrGFP. Клетки 3T3, трансфицированные MUC16, обрабатывали только средами или обрабатывали с использованием 5 мкг/мл контрольного слитого белка pFUSE hIgG1-Fc2 или с использованием 5 мкг/мл слитого белка MUC16-pFUSE hIgG1-Fc2 или с использованием 5 мкг/мл слитого белка LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2, как подробно показано на фиг. 8. MUC16 клеточная линия была значительно более инвазивной, чем контрольные клетки 3T3 (*** p<0,0001), экспрессирующие контрольный вектор phrGFP, и на это не влияла экспозиция белком только из вектора pFUSE. В отличие от этого, MUC16 клеточная линия, которую обрабатывали слитным белком MUC16-pFUSE hIgG1-Fc2 или слитным белком LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2, демонстрировала значимое ингибирование инвазии матригеля по сравнению с MUC16 контрольными клетками. На фиг. 7C изображен эффект экспрессии MUC16, оказываемый на ERK/AKT передачу сигнала. Трансфицированные клетки 3T3 также исследовали на предмет активации путей передачи сигнала ERK/AKT. Фосфорилирование ERK1/2 (pT202/Y204) и AKT (S473) возрастало в 3T3, трансфицированных с использованием MUC16; однако эффект был уменьшен в клетках 3T3, трансфицированных MUC16 вектором («MUC16» и «MUC16→» используют в настоящем описании взаимозаменяемо). Несмотря на 3 мутации аспарагина в аланин, вестерн-блоттинг с использованием антитела против MUC16 (4H11 mAb) демонстрировал более высокий сигнал, чем клетки, трансфицированные контрольным вектором phrGFP или нативным MUC16, что указывает на то, что трансфицированные клетки 3T3 экспрессируют более высокие уровни белка MUC16→. Как используют в настоящем описании, «4H11» относится к моноклональному антителу против MUC16 с обозначением 4H11 в Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72 и в публикации международной патентной заявки № WO 2011/119979. На фиг. 7D изображен положительный по MUC16-конструкции опухолевый рост у бестимусных голых мышей. Два миллиона опухолевых клеток вводили в бок 20 nu/nu мышей и наблюдали формирование опухоли у мышей. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. Различия в среднем объеме опухоли были значительно больше для мышей, несущих MUC16 опухоли (p<0,0001). Результаты для 3T3-MUC16 трансфектанта имели высокую значимость по сравнению с результатами клеточной линии с контрольным вектором phrGFP (*** p<0,0001). Однако MUC16 3T3 трансфектанты не демонстрируют какой-либо значимости относительно клеток 3T3 с контрольным вектором phrGFP, что указывает на то, что мутации N-гликозилирования значительно снижали опухолевый рост и инвазию. На фиг. 7E приведено линейное представление конструкции MUC16-pFUSE-human-IgG1-Fc2. Аминокислотная последовательность эктодомена представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 161. На фиг. 7F изображены уровни белка конструкции MUC16-pFUSE-human-IgG1-Fc2, определяемые с помощью указанных антител. На фиг. 7G приведено линейное представление конструкции LGALS3-pFUSE-human-IgG1-Fc2. Аминокислотная последовательность сахарсвязывающего домена, представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 167. На фиг. 7H изображены уровни белка конструкции 17-244LGALS3-pFUSE-human-IgG1-Fc2, определяемые с помощью указанных антител.
c57->c114
c57-c114
117-244
117-244
[00171] Фиг. 8. Последовательность для аминокислотной последовательности эктодомена-MUC16 (SEQ ID № 161; аминокислотные остатки 1777-1834 из MUC16), вставленной в вектор pFUSE-hIgG1-Fc2 для того, чтобы конструировать MUC16pFUSE в качестве ложного рецептора, и аминокислотной последовательностиLGALS3 (SEQ ID № 167), вставленной в pFUSE-hIgG1-Fc2, что дает вектор LGALS3pFUSE.
c354
c354
c354
c354
c354
c354
c354
c354
c354
c354
c354
c354
[00172] Фиг. 9A-9E. Трансгенные мыши MUC16. На фиг. 9A изображена стратегия для условной конструкции MUC16. Ранний энхансер CMV плюс промотор β-актина курицы (CAG) использовали для управления транскрипцией hrGFP между двумя loxP и последовательностью MUC16 ниже по направлению считывания. Фиг. 9B: саузерн-блоттинг показывает 12 кандидатов в MUC16 положительные основатели среди 99 животных после процедуры микроинъекции. Фиг. 9C: вестерн-блоттинг с антителом против MUC16, 4H11, использовали для того, чтобы идентифицировать основателей 9 (~50 копий) и 36 (~10 копий) для развития мышиной колонии MUC16; A5 представляет собой положительный контроль из стабильных трансфицированных SKOV3 с использованием MUC16. Фиг. 9D: гистологический анализ опухолей по двойным MUC16:p53+/-трансгенным мышам. Множественные саркомы и лимфомы идентифицировали у двойных MUC16:p53+/- трансгенных мышей. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ). Опухоль включает гистоцитарную саркому в матке (I, масштабная полоска: 100 мкм), печени (II, масштабная полоска: 50 мкм), яичнике (III, масштабная полоска: 50 мкм) и костном мозге (IV, масштабная полоска: 50 мкм), а также лимфому в яичнике (V, масштабная полоска: 50 мкм), почке (VI, масштабная полоска: 50 мкм) и легком (VII, масштабная полоска: 50 мкм) с карциномой в легком (VIII, масштабная полоска: 50 мкм). Фиг. 9E: кривые выживаемости Каплана-Мейера, специфичные для рака трансгенных мышей: MUC16 мыши не демонстрировали самопроизвольное развитие опухоли в течение первых 18 месяцев, сходно с диким типом (WT). Однако когда MUC16 мышей скрещивали с p53+/- мышами, двойные трансгенные MUC16:p53+/- мыши демонстрировали значительно более плохую общую выживаемость из-за самопроизвольного развития опухоли по сравнению с p53+/- мышами (p<0,014) или MUC16 мышами.
c354
[00173] Фиг. 10. Репрезентативная гистология тканей от самцов и самок MUC16 трансгенных мышей в возрасте 12 месяцев. Тканевые срезы окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ, масштабная полоска: 50 мкм). Гиперплазию эндометрия матки наблюдали при схожей заболеваемости и тяжести в обоих генотипах (здесь показано только у трансгенного животного). Яичник, легкое, ободочная кишка и печень трансгенных животных (Tg) были схожи с родительской линией (дикого типа, WT).
[00174] Фиг. 11A-11C. Влияние MUC16 на рак яичников человека. На фиг. 11A приведено число MUC16 транскриптов. На фиг. 11B: квинтиль пациентов с наивысшей экспрессией MUC16, в комбинации с 18 пациентами с идентифицированными мутациями MUC16, имеют значительно (p=0,02117) более плохую выживаемость по сравнению с пациентами с более низкой экспрессией MUC16 в анализе Каплана-Мейера. На фиг. 11C изображена связь генетических изменений MUC16 с мутационными событиями PI3K в раке яичников.
c114
c114
c114-N3
c114-N12
c114-N123
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
[00175] Фиг. 12A-12C. Требования к гликозилированию для MUC16 инвазии матригеля. На фиг. 12A представлен анализ инвазии матригеля для трансфицированных клеточных линий SKOV3. phrGFP относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим контрольный вектор. MUC16 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16. N3 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16. N1-2 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16. N1-2-3 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16. MUC16-shControl относится к клеткам SKOV-3, экспрессирующим MUC16 и контрольную shRNA (короткая шпилечная РНК). Популяция phrGFP shRNA MGAT #4 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим контрольный вектор и shRNA против MGAT5. Популяция phrGFP shRNA LGALS3 #15 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим контрольный вектор и shRNA против LGALS3. MUC16-shMGAT5 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16 и shRNA против MGAT5. MUC16-shLGALS3 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16 и shRNA против LGALS3. На фиг. 12B представлен анализ инвазии матригеля для клеток 3T3, экспрессирующих контрольный вектор, phrGFP, или указанных MUC16 конструкций. На фиг. 12C представлен опухолевый рост, как определяют по объему опухоли, у бестимусных голых мышей с имплантированными клетками SKOV3, экспрессирующими указанные конструкции.
c114-N12
[00176] Фиг. 13A-13D. Паттерны гликозилирования MUC16 и пептиды. На фиг. 13A изображено N-связанное профилирование клеток SKOV3, экспрессирующих MUC16. Треугольники представляют фукозу. Квадраты представляют N-ацетилглюкозамин. Серые круги представляют маннозу. Белые круги представляют галактозу. Ромбы представляют N-ацетилнейрамовую кислоту. На фиг. 13B изображен иммуногенный 55-мер (SEQ ID № 129). На фиг. 13C изображен иммуногенный 15-мер (SEQ ID № 131). На фиг. 13D изображен иммуногенный 18-мер (SEQ ID № 130).
[00177] На фиг. 14 приведен подробный ELISA анализ относительной реактивности биологически реактивных супернатантов, содержащих антитела к гликозилированному MUC16, с гликозилированным и не гликозилированными антигенами как для 15-мера, так и 18-мера, используемых в качестве иммуногенов и скрининговых антигенных мишеней.
c114
c114
[00178] Фиг. 15A-15B. Антитела к гликозилированному MUC16 ингибируют инвазию матригеля. На фиг. 15A изображена инвазия матригеля клетками SKOV3, экспрессирующими контрольный вектор phrGFP или MUC16, в присутствии или отсутствии биологически реактивных супернатантов от создания антител к гликозилированному MUC16. Линия представляет собой эталонную линию для относительного числа 200. На фиг. 15B изображена инвазия матригеля клетками SKOV3, экспрессирующими контрольный вектор phrGFP или MUC16, в присутствии или отсутствии очищенных антител к гликозилированному MUC16. Линия представляет собой эталонную линию для относительного числа 90.
c114
c344
c114
c344
c344
c344
[00179] Фиг. 16A-16E. Антитела к гликозилированному MUC16 ингибируют инвазию матригеля. На фиг. 16A изображена инвазия матригеля клетками SKOV3, экспрессирующими контрольный вектор phrGFP или указанные конструкции MUC16 в присутствии (i) контрольного антитела; (ii) 4H11; или (iii) антитела к гликозилированному MUC16 клона 10C6.E4. На фиг. 16B изображена инвазия матригеля клетками SKOV3, стабильно экспрессирующими контрольный вектор phrGFP или указанные конструкции MUC16, после третей FACs сортировки с использованием 4H11, в присутствии (i) контрольного антитела; (ii) 4H11; или (iii) антитела к гликозилированному MUC16 клона 10C6.E4. На фиг. 16C изображена инвазия матригеля клетками 3T3, экспрессирующими контрольный вектор phrGFP или указанные конструкции MUC16, в присутствии (i) контрольного антитела; (ii) 4H11; или (iii) антитела к гликозилированному MUC16 клона 10C6.E4. На фиг. 16D изображен опухолевый рост, на который указывает объем опухоли, у бестимусных голых мышей с имплантированными клетками SKOV3, экспрессирующими MUC16, которых лечили плацебо (MUC16) или лечили антителом к гликозилированному MUC16 10C6.E4(MUC16+10C6.E4). Стрелки показывают сутки, в которые вводили 100 мкг антитела к гликозилированному MUC16. На фиг. 16E изображено окрашивание образцов опухоли яичника человека с использованием указанных антител.
[00180] На фиг. 17 изображен процент клеток, в которых происходит интернализация меченного антитела к гликозилированному MUC16 при указанной температуре и в указанные моменты времени.
c114
c344
c114
c344
c344
c114
c114
c114
c344
c344
2
2
[00181] На фиг. 18A изображены кривые роста in vitro для MUC16-трансфектантов. 1000 клеток SKOV3/лунка в 96-луночных плоскодонных планшетах культивировали с контрольным вектором phrGFP, вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133), или вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 132), и инкубировали при 37°C в 5% CO в течение 5 суток. Каждые сутки планшет окрашивали аламаровым синим и инкубировали при 37°C в 5% CO в течение 4 часов. Планшеты считывали в считывателе планшетов CytoFluor Fluorescent. Между кривыми статистические различия не наблюдали. На фиг. 18B представлен анализ инвазии матригеля для клеток SKOV3 phrGFP, клеток SKOV3 MUC16-GFP или клеток SKOV3- MUC16-GFP. Каждый анализ осуществляли два или больше раз в трех повторениях и считали вручную. Результаты выражают как относительное число инвазивных клеток. c114 и c344 были статистически значимыми по сравнению с phrGFP. На фиг. 18C изображен опухолевый рост SKOV3 трансфектанта у самок бестимусных голых мышей. Два миллиона опухолевых клеток вводили в бок 10 nu/nu мышей и наблюдали формирование опухоли у мышей. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. Различия в среднем объеме опухоли были статистически значительно более высокими для мышей, несущих MUC16 опухоли (p<0,0001) и MUC16 опухоли (p=0,002) по сравнению с phrGFP опухолями. Сокращения для фиг. 18A-фиг.18C: «SKOV3 phrGFP» и «phrGFP» относятся к клеткам SKOV3, экспрессирующим контрольный вектор phrGFP; «SKOV3 MUC16-GFP» и «c114» относятся к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133); «SKOV3 MUC16-GFP» и «c344» относятся к клеткам SKOV3, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 132).
c114
c57-114
117-244
c57-114
117-244
c114
c114
c114
c344
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114-N1-N24-N30-mut
c114
c114
[00182] На фиг. 19A-19F представлен эффект экспрессии MUC16, оказываемый на клетки рака яичника SKOV3. На фиг. 19A изображен анализ инвазии матригеля для клеток SKOV3, экспрессирующих контрольный вектор phrGFP («phrGFP») или вектор phrGFP, экспрессирующий MUC16 (SEQ ID № 133; «c114»), которые обрабатывали с использованием или без использования следующего: (1) туникамицин 5 мкг/мл; (2) контрольный белок pFUSE 5 мкг/мл; (3) слитый белок MUC16-pFUSE 5 мкг/мл; или (4) слитый белок LGALS3-pFUSE 5 мкг/мл. Результаты выражают в виде числа инвазивных клеток через 48 часов после обработки. Клетки c114 были более инвазивными, чем клетки phrGFP (p<0,0001). На инвазивные свойства клеток c114 не влияла обработка с использованием белка только из вектора pFUSE. Обработка туникамицином (ингибитором N-гликозилирования) снижала инвазивные свойства клеток c114. Обработка слитным белком MUC16-pFUSE или LGALS3-pFUSE снижала инвазивные свойства клеток c114 (p<0,0001). На фиг. 19B представлен анализ инвазии матригеля для клеток SKOV3, трансфицированных контрольным вектором phrGFP («phrGFP») или вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133) («c114»), в присутствии или отсутствии контрольной shRNA lamelli, MGAT5-специфичной shRNA или LGALS3-специфичной shRNA. Клетки c114, обработанные MGAT5-специфичной shRNA или LGALS3-специфичной shRNA, имели сниженную инвазию по сравнению с клетками phrGFP, обработанными с использованием shRNA. Контрольная shRNA не оказывала влияния на инвазию клеток c114. Каждый анализ осуществляли два или больше раз в трех повторениях и считали вручную. На фиг. 19C изображена зависимость от гликозилирования для SKOV3-MUC16 инвазии матригеля. Клетки SKOV3 трансфицировали контрольным вектором phrGFP или вектором phrGFP, экспрессирующим следующие мутанты MUC16: c114 (SEQ ID № 133), N1 mut c114 (SEQ ID № 151), N24 muc c114 (SEQ ID № 152), N30 mut c114 (SEQ ID № 139), N1-N24 mut c114 (SEQ ID № 153), N1-N24-N30 mut c114 (SEQ ID № 154). c114-экспрессирующие клетки демонстрировали повышенную инвазию по сравнению с контрольными клетками phrGFP. Повышенное инвазивное свойство c114-экспрессирующих клеток зависело от N-гликозилирования аспарагинов в положениях аминокислот 24 и 30 в MUC16 (SEQ ID № 133). Хотя важны оба участка N24 и N30, положение N30 выглядело для этого эффекта более важным, чем участок N24. Каждый анализ осуществляли два или больше раз в трех повторениях и считали вручную. Результаты выражают в виде % по сравнению с контрольным вектором phrGFP. На фиг. 19D изображена зависимость от гликозилирования для SKOV3-MUC16 инвазии матригеля. Клетки SKOV3 трансфицировали контрольным вектором phrGFP или вектором phrGFP, экспрессирующим следующие мутанты MUC16: c344 (SEQ ID № 132), N24 mut c344 (SEQ ID № 173), N30 mut c344 (SEQ ID № 174) или N24-N30 mut c344 (SEQ ID № 175). c344-экспрессирующие клетки демонстрировали повышенную инвазию по сравнению с контрольными клетками phrGFP. Повышенное инвазивное свойство c344-экспрессирующих клеток зависело от N-гликозилирования аспарагинов, соответствующих положениям аминокислот 24 и 30 в MUC16 (SEQ ID № 133). Каждый анализ осуществляли два или больше раз в трех повторениях и считали вручную. На фиг. 19E изображен эффект MUC16-экспрессии, оказываемый на выбранные пути передачи сигнала. Клетки SKOV3, трансфицированные MUC16 (SEQ ID № 133), обрабатывали с использованием или без использования контрольной shRNA («shLamelli») или shRNA против MGAT5 («shMGAT5») или LGALS3 («shLGALLS3») и сравнивали с клетками SKOV3, трансфицированными контрольным вектором phrGFP («phrGFP») или вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16-N30mut (SEQ ID № 139) («N30 mut»), и клетки исследовали на предмет активации путей передачи сигнала pAKT, pERK1/2, pSRC и рецептора pEGF (pEGFR). Фосфорилирование AKT (S473) и ERK1/2 (pT202/Y204) возрастало в клетках MUC16. Каждое из нокдауна MGAT5 (shMGAT5), нокдауна галектина-3 (shLGALLS3) и мутации N30A снижало MUC16-индуцированную активацию онкогена в клеточных линиях SKOV3. На фиг. 19F изображен опухолевый рост SKOV3 трансфектанта у самок бестимусных голых мышей. Два миллиона опухолевых (описаны далее) клеток вводили в бок 10 nu/nu мышей для каждого условия и наблюдали формирование опухоли у мышей. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. Рост in vivo c114 опухолевых клеток был значительно более агрессивным (p<0,0001) по сравнению с опухолевыми клетками phrGFP. Опухолевые клетки N1-N24-N30-mut c114, c114-sh-MGAT5 и c114-sh-LGALS3 не демонстрировали усиления роста по сравнению с опухолевыми клетками phrGFP. Описание опухолевых клеток: «phrGFP» относится к клеткам SKOV3, трансфицированным контрольным вектором phrGFP; «c114» относится к клеткам SKOV3, трансфицированным вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133); «N1-N24-N30-mut c114» относится к клеткам SKOV3, трансфицированным вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 154); «c114-sh-MGAT5» относится к клеткам SKOV3, трансфицированным вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133), и обработанным shRNA против MGAT5; и «c114-sh-LGALS3» относится к клеткам SKOV3, трансфицированным вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133), и обработанным shRNA против LGALS3.
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
[00183] На фиг. 20A изображен эффект экспрессии MUC16, оказываемый на экспрессию EGFR на поверхности. SKOV3-phrGFP и SKOV3-MUC16 трансфектанты исследовали в присутствии или отсутствии обработки циклогексимидом (CHX) в течение 24 часов. Представлены геометрическое среднее флуоресценции экспрессии EGFR и MUC16 на базовом уровне и уровне после обработки CHX. EGFR в SKOV3-phrGFP образцах снижался до 58% от необработанных уровней после 24 часов обработки с использованием CHX. В этих клетках значимая экспрессия MUC16 не присутствовала. В отличие от этого, в клетках SKOV3-MUC16 имело место приблизительно 25% увеличение геометрической средней флуоресценции EGFR, которое снижалось до 83% от таковой у контроля после экспозиции CHX. Средняя флуоресценция MUC16 не значительно снижалась под действием CHX. На фиг. 20B изображена денситометрия соотношения EGFR/β-актин из вестерн-блоттинга общего клеточного EGFR и проиллюстрировано, что имеемо место устойчивое падение EGFR с течением времени в SKOV3-phrGFP клетках, обработанных с использованием CHX. В отличие от этого, общий уровень EGFR в клетках SKOV3-MUC16 сохранялся, что показывает стабилизацию EGFR по сравнению с MUC16(-) контрольной клеточной линией («phrGFP (-)»). На фиг. 20C представлен анализ инвазии матригеля для клеток SKOV3, трансфицированных контрольным вектором phrGFP («стабильный phrGFP»), SKOV3-MUC16 и SKOV3-MUC16(tet) тетрациклин-индуцибельных клеточных линий, выраженный в виде доли инвазии контрольных клеток. Тетрациклиновая индукция SKOV3-MUC16(tet) клеток вела к инвазивному фенотипу, схожему со стабильными SKOV3-MUC16 (SKOV3), тогда как не индуцированные клетки совпадали с контрольными клетками MUC16-phrGFP. Это MUC16-индуцированное увеличение инвазии матригеля полностью зависело от EGFR. Когда нокдаун шпилечной РНК EGFR (shEGFR) вводили в клетки SKOV3, тетрациклин индуцировал экспрессию MUC16 (4H11 положительный белок в вестерн-блоттинге), но не увеличивал инвазию матригеля. Каждый анализ осуществляли в трех повторениях и считали вручную. На фиг. 20D: стабильность EGFR в MUC16(+) и MUC16(-) клетках. Клеточные экстракты не индуцированных или тетрациклин-индуцированных клеточных линий SKOV3-MUC16(tet), обработанных с использованием CHX в течение 24 часов и исследованных на общий клеточный EGFR, выражают как денситометрические соотношения и нормализуют по β-актину. Наклон спада EGFR в тетрациклин-индуцированных клетках SKOV3-MUC16 воспроизводит эффект стабилизации EGFR от экспрессии MUC16 по сравнению с линией MUC16(-). Результат схож с эффектом стабильной трансфекции, показанным выше на фиг. 20B).
c114
c114
c114
c114
c114
[00184] На фиг. 21 представлена денситометрия для анализа вестерн-блоттинга клеточных экстрактов не индуцированных или тетрациклин-индуцированных клеточных линий SKOV3 («Не индуцированные MUC16» и «Tet-индуцированные MUC16», соответственно), которые обрабатывали циклогексимидом в течение 24 часов. Вестерн-блоттинг исследовали на предмет pEGFR и нормализовали уровни белка по уровням β-актина. Наклоны тетрациклин-индуцированного SKOV3 pEGFR сигнала демонстрировали стабилизированный pEGFR по сравнению с не индуцированной клеточной линией SKOV3.
c114
2
2
2
2
[00185] На фиг. 22A-22C представлена идентификация и химический синтез N-гликозилированных соединений эктодомена MUC16. Фиг. 22A: N-гликановое профилирование клеток SKOV3, трансфицированных phrGFP, экспрессирующим N1-N24 мутированный MUC16 (SEQ ID № SEQ ID № 153). Гликаны обнаруживали и определяли их характеристики с помощью полного ионного картирования в Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia. Треугольники: фукоза; квадраты: N-ацетилглюкозамин; круги, темные сплошные: манноза; круги, светлые сплошные: галактоза; ромбы: N-ацетилнейраминовая кислота. На фиг. 22B изображена схематическая структура антигенного 55-мера MUC16 с гликаном с одной хитобиозой (GlcNAc) в положении N30. Этот N-гликопептидный антиген использовали для того, чтобы иммунизировать мышей для возникновения антител. Аминокислотная последовательность представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 129. Квадраты представляют N-ацетилглюкозамин; круги представляют маннозу. На фиг. 22C изображена схематическая структура KLH-конъюгированного антигенного 15-мера MUC16, моногликозилированного хитобиозой в положении N30, и KLH-конъюгированного антигенного 18-мера MUC16, бис-гликозилированного двумя звеньями хитобиозы в положениях N24 и N30, соответственно. Эти конструкции N-гликопептид-KLH впоследствии использовали для того, чтобы иммунизировать мышей для образования моноклональных антител против GlcNAc-пептидного эпитопа в эктодомене MUC16. Также включены последовательности не гликопептидов, не родственных MUC16, и не гликозилированного пептида 2 MUC16 для образования моноклонального антитела 4H11. Аминокислотная последовательность для KLH-15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38] представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 131. Аминокислотная последовательность для KLH-18-мер(хитобиоза)[C-T22-V38] представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 130. Аминокислотная последовательность для не гликозилированного пептида 2 MUC16 представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 168. Аминокислотная последовательность для пептидного 18-мера, не родственного MUC16, и пептидного 18-мера, не родственного MUC16,+GlcNAc представляет собой то, что приведено в SEQ ID № 169. Квадраты представляют N-ацетилглюкозамин.
2
2
2
2
2
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c344
c344
c344
[00186] На фиг. 23A-23H изображено определение характеристик антитело к гликозилированному MUC16. На фиг. 23A представлена реактивность 4H11 и четырех ведущих моноклональных антител к GlcNAc-MUC16-эктодомену (антител к гликозилированному MUC16) к различным MUC16 и GlcNAc-гликозилированным пептидам согласно сэндвич-ELISA. Не наблюдали перекрестную реактивность эктодомена гликан-MUC16 с не гликозилированным пептидом 2 MUC16 (SEQ ID № 168) или любым из не родственных пептидов (SEQ ID № 169). Аналогичным образом, 4H11 по существу не имел аффинности к N-гликопептидным GlcNAc-MUC16 15-меру (SEQ ID № 131) или (GlcNAc)-18-меру (SEQ ID № 130). Квадраты представляют N-ацетилглюкозамин; треугольники представляют фукозу; круги представляют маннозу. На фиг. 23B, фиг. 23C и фиг. 23D изображен эффект антител к гликозилированному MUC16, оказываемый на MUC16-усиленную инвазию матригеля. Результаты выражают в виде % по сравнению с контролем. Матригелевый анализ клеток SKOV3, трансфицированных phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133) (фиг. 23B), клеток CAOV3 (фиг. 23C) и клеток OVCA-433 (фиг. 23D) с использованием или без использования (контроль) очищенного 4H11 или четырех антител к гликан-MUC16-эктодомену 18C6, 10C6, 19C22 или 7B12 по 5 мкг/мл. Каждое из четырех антител против гликан-MUC16-эктодомена (антител к гликозилированному MUC16) ингибировало инвазию трех различных MUC16(+) клеточных линий рака яичников (CAOV3 и OVCA-433), тогда как 4H11 оказывал меньший эффект на ингибирование инвазии клеток SKOV3-MUC16. На фиг. 23E изображено ингибирование стабилизации EGFR с помощью моноклонального антитела к гликозилированному MUC16 («MAB») 10C6. Денситометрия анализа вестерн-блоттинга клеточных экстрактов не индуцированных SKOV3-MUC16(tet), тетрациклин-индуцированных SKOV3-MUC16(tet) или обработанных моноклональным антителом к гликозилированному MUC16 10C6, тетрациклин-индуцированных SKOV3-MUC16(tet) клеточных линий, обработанных CHX и затем исследованных на общий EGFR в указанные часы (ч) после обработки циклогексамидом. Как видно на фиг. 20A, наклоны денситометрических кривых показывали, что присутствие MUC16 на клеточной поверхности стабилизировало EGFR. Антитело к гликозилированному MUC16 10C6 отменяло MUC16 стабилизацию общего белка EGFR, делая это подобно MUC16(-) не индуцированному контролю. На фиг. 23F изображены микропанели ткани яичника человека, окрашенные с использованием 4H11, OC125 (коммерческое) или моноклональных антител к гликозилированному MUC16 (10C6 и 19C11). Экспрессия MUC16 на серозном раке яичников согласовывалась и перекрывалась с OC125 и 4H11. На фиг. 23G и фиг. 23H изображен эффект антител к гликозилированному MUC16, оказываемый на опухолевый рост у самок бестимусных голых мышей. Два миллиона опухолевых клеток (клеток SKOV3, трансфицированных вектором phrGFP («phrGFP») или вектором phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 132; «c344»)) вводили в бок 20 nu/nu мышей. Десять мышей лечили внутривенно от суток 0 очищенным моноклональным антителом к гликозилированному MUC16 10C6 по 100 мкг/мышь два раза в неделю в течение 4 недель. Наблюдали формирование опухоли у всех мышей. Опухоли измеряли штангенциркулем два раза в неделю. На фиг. 23G представлен анализ инвазии матригеля теми же клетками, который выполняли в присутствии и отсутствии очищенного моноклонального антитела к гликозилированному MUC16 10C6 по 10 мкг/мл. На фиг. 23H показано, что различия в среднем объеме опухоли были значительно снижены (p=0,0004) у мышей, несущих MUC16 опухоли, которых лечили моноклональным антителом к гликозилированному MUC16 10C6, по сравнению с опухолями MUC16, которые не лечили, что указывает на защиту от эффекта MUC16, оказываемого на опухолевый рост.
c57-114
c57-114
c57-114
c57-114
c57-114
c344
c344
c114
c114
c114
c57-114
c344
c344
c114
c114
c344
c114
[00187] На фиг. 24A-фиг.24D изображены галектин-опосредованные MUC16 белок-белковые взаимодействия. На фиг. 24A изображены иммуноблот (IB) и иммунопреципитация (IP) трех гликозилированных белков (EGFR DDK-His; MUC16-pFUSE и LGALS3Myc-DDK). Гликозилированный белок MUC16-pFUSE комбинировали с белком LGALS3 (0,13 мкг) и EGFR (0,13 мкг) и затем вращали при 4°C в течение 1 часа. Предварительно блокированные гранулы Protein A/G PLUS Agarose добавляли и вращали при 4°C в течение ночи. IP осадки тщательно промывали, кипятили в загрузочном буфере и разделяли с помощью электрофореза в 10% SDS-PAGE геле, затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану исследовали с использованием антител против EGFR-v3, против 4H11-HRP или поликлональных антител против LGALS3. Как показано, связывание 4H11 демонстрировало, что MUC16-pFUSE присутствовал постоянно. LGALS3 был связан в дороже, положительной по MUC16-pFUSE, но EGFR обнаруживали только когда присутствовал как LGALS3, так и MUC16-pFUSE. Присутствие моноклонального антитела к гликозилированному MUC16 18C6 предотвращало формирование этих белковых комплексов LGALS3, EGFR и MUC16 (дорожки справа). На фиг. 24B изображена совместная локализация белков MUC16 и EGFR. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток OVCAR3 дикого типа или клеток SKOV3, трансфицированных phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 132; «SKOV3»), или phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133; «SKOV3») с использованием EGFR-A647 и 4H11-PE для MUC16 или комбинации обоих реактивов EGFR-A647 и 4H11-PE для MUC16. Микроскопические изображения (масштаб 50 мкм) показывали совместную локализацию EGFR и MUC16 во всех трех клеточных линиях (см. стрелки). На фиг. 24C изображены иммуноблот (IB) и иммунопреципитация (IP) трех гликозилированных белков (интегрин β1Myc-DDK; MUC16-pFUSE и LGALS3Myc-DDK). В целом, использовали те же способы, что и на фиг. 24A. Анализ вестерн-блоттинга иммуноблота и все иммунопреципитированных образцов выполняли на 10% SDS-PAGE геле, осуществляли перенос на нитроцеллюлозную мембрану и исследовали с использованием антител или против 4C5-DDK для интегрина β1 или против 4H11-HRP или против 4C5-DDK для LGALS3. Как и в случае EGFR, все три белка необходимы для совместной преципитации белка интегрина β1. Антитело к гликозилированному MUC16 18C6 также блокировало комбинацию MUC16, LGALS3 и интегрина β1, как показано в трех правых дорожках. На фиг. 24D изображена совместная локализация MUC16 и белка интегрина β1. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток OVCAR3 дикого типа или клеток SKOV3, трансфицированных phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 132; «SKOV3»), или phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133; «SKOV3»), с использованием интегрин β1-A647 или 4H11-PE для MUC16 или комбинации обоих реактивов интегрин β1-A647 или 4H11-PE для MUC16. Микроскопические изображения (масштаб 50 мкм) показывали совместную локализацию интегрина β1 и MUC16 в клетках OVCAR3, SKOV3 и SKOV3 (см. стрелки).
c344
c344
c114
c114
c344
c114
c344
[00188] На фиг. 25A изображено иммунофлуоресцентное окрашивание клеток OVCAR3 дикого типа или клеток SKOV3, трансфицированных phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 132; «SKOV3»), или phrGFP, экспрессирующим MUC16 (SEQ ID № 133; «SKOV3»), или клеточных линий SKOV3 или SKOV3 с использованием EGFR-A647 или 4H11-PE для MUC16 или комбинации обоих реактивов. Микроскопические изображения (масштаб 100 мкм) четко показывали совместную локализацию EGFR и MUC16 (см. стрелки). Фиг. 25B: иммунофлуоресцентное окрашивание OVCAR3 дикого типа или SKOV3 или клеточных линий с использованием интегрин β1-A647 или 4H11-PE для MUC16 или комбинации обоих реактивов. Микроскопические изображения (масштаб 100 мкм) четко показывали совместную локализацию интегрина β1 и MUC16 (см. стрелки).
c57-114
117-244
[00189] На фиг. 26A-26D изображена модель MUC16 стимулирования опухоли. На фиг. 26A приведена иллюстрация взаимоотношений EGFR-LGALS3-MUC16 и LGALS3-интегрин β1-MUC16. Сигнальная трансдукция SRC/ERK/AKT с помощью EGFR или SRC/FAK с помощью интегрина β1 зависела от MUC16 и взаимодействия сигнальных молекул с пентамерами LGALS3. На фиг. 26B изображена модель утраты гликозилирования: в shMGAT5-трансфицированных клеточных линиях N-гликозилирование в участках на MUC16, EGFR и интегрине β1 было снижено за счет утраты тетраантенных структур, что ведет к отсутствию связывания с LGALS3. На фиг. 26C изображена модель утраты галектина-3: в shLGALS3-трансфицированных клеточных линиях, хотя на MUC16 присутствовали участки N-гликозилирования, отсутствие связывания с LGALS3 вело к утрате ассоциации MUC16/EGFR или MUC16/интегрин β1 и снижению сигналов изнутри-наружу. На фиг. 26D изображена модель для потенциальных ингибиторов для взаимодействий MUC16/LGALS3. MUC16(+) клетки, на которые воздействовали антителом к гликозилированному MUC16 или «имитирующими» ложными рецепторами (против MUC16-pFUSE или LGALS3-pFUSE), не могли связываться с LGALS3 гелями и впоследствии также с EGFR или интегрином β1.
486
760
84
111
8
5+
6+
7+
[00190] На фиг. 27A изображен N-ацетилированный 55-членный пептидный амид с защитой боковой цепи (SEQ ID № 129). На фиг. 27B изображены кривые ESI-MS и UV из UPLC анализа на гликопептидный p55-мер[N1-S55]. Вычисленное для CHNOS, 9812,25 (усредненные изотопы) [M+5H] m/z 1963,45, найденное 1963,20; [M+6H] m/z 1636,38, найденное 1636,24; [M+7H] m/z 1402,75, найденное 1402,74. Колонка BEH C4, градиент: 80-99% ацетонитрил/вода в течение 6 минут при скорости потока 0,3 мл/мин.
2
2
291
463
87
97
4+
5+
6+
7+
8+
[00191] На фиг. 28A изображен несущий хитобиозу гликопептидный 55-мер: «55-мер(хитобиоза)[N1-S55]» (GlcNAc-55-мер) (SEQ ID № 129). На фиг. 28B изображены кривые ESI-MS и UV для UPLC анализа на гликопептидный «55-мер(хитобиоза) [N1-S55]» (GlcNAc-55-мер). Вычисленное для CHNOS, 6764,38 (усредненные изотопы) [M+4H] m/z 1692,10, найденное 1692,01; [M+5H] m/z 1353,88, найденное 1353,86; [M+6H] m/z 1128,40, найденное 1128,41; [M+7H] m/z 967,34, найденное 967,45; [M+8H] m/z 846,55, найденное 846,27. Колонка BEH C4, градиент: 20-40% ацетонитрил/вода в течение 6 минут при скорости потока 0,3 мл/мин.
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
309
493
87
112
4+
5+
6+
7+
[00192] На фиг. 29A изображен ManGlcNAc-несущий гликопептидный 55-мер: «55-мер(ManGlcNAc)[N1-S55]» (ManGlcNAc-55-мер) (SEQ ID № 129). На фиг. 29B изображены кривые ESI-MS и UV из аналитического ВЭЖХ анализа для гликопептида «55-мер(ManGlcNAc)[N1-S55]» (ManGlcNAc-55-мер). Вычисленное для CHNOS, 7250,80 (усредненные изотопы) [M+4H] m/z 1813,70, найденное 1813,52; [M+5H] m/z 1451,16, найденное 1451,02; [M+6H] m/z 1209,47, найденное 1209,33; [M+7H] m/z 1036,83, найденное 1036,74. Колонка Waters X-Bridge C18, градиент: 25-35% ацетонитрил/вода в течение 30 минут при скорости потока 0,2 мл/мин.
2
2
87
142
24
35
3+
2+
3+
[00193] На фиг. 30A изображен пептидный 15-мер с защитой боковой цепи (p15-мер[C-G25-V38]) (SEQ ID № 131). На фиг. 30B изображен моногликозилированный хитобиозой гликопептидный 15-мер: 15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38] (GlcNAc-15-мер) (SEQ ID № 132). На фиг. 3°C изображены кривые ESI-MS и UV из аналитического ВЭЖХ анализа для гликопептида «15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38]» (GlcNAc-15-мер). Вычисленное для CHNOS, 2116,26 (усредненные изотопы) [2M+3H] m/z 1411,84, найденное 1412,02; [M+2H] m/z 1059,13, найденное 1059,15; [M+3H] m/z 706,42, найденное 706,46. Колонка Varian Microsorb 300-5 C18, градиент: 15-30% ацетонитрил/вода в течение 30 минут при скорости потока 0,2 мл/мин.
2
2
2
2
2
2
117
193
33
50
3+
2+
3+
[00194] На фиг. 31A изображен пептидный 18-мер с защитой боковой цепи (p18-мер[C-G22-V38]) (AF-I-165) (SEQ ID № 130). На фиг. 31B изображен бис-гликозилированный хитобиозой гликопептидный 18-мер: «18-мер(хитобиоза)[C-T22-V38]» [(GlcNAc)-18-мер] (SEQ ID № 130). На фиг. 31C изображены кривые ESI-MS и UV из аналитического ВЭЖХ анализа для гликопептида «18-мер(хитобиоза)[C-T22-V38]» [(GlcNAc)-18-мер]. Вычисленное для CHNOS, 2894,04 (усредненные изотопы) [2M+3H] m/z 1930,36, найденное 1930,22; [M+2H] m/z 1448,02, найденное 1447,65; [M+3H] m/z 965,68, найденное 965,25. Колонка Varian Microsorb 300-5 C8, градиент: 15-30% ацетонитрил/вода в течение 30 минут при скорости потока 0,2 мл/мин.
2
[00195] На фиг. 32A изображен гликопептид «15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38]», конъюгированный с KLH (SEQ ID № 131). На фиг. 32B изображен гликопептид «18-мер(хитобиоза)[C-T22-V38]», конъюгированный с KLH (SEQ ID № 130).
5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
c114
[00196] Изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, и полипептидам, содержащим такие антитела или фрагменты, таким как слитые белки, конъюгаты и/или химерные антигенные рецепторы, а также клеткам, экспрессирующим их. Среди антител и фрагментов присутствуют те, которые специфично связываются с эпитопами белка MUC16. Такие антитела обозначают в настоящем описании как «антитела к гликозилированному MUC16». Такие эпитопы обычно представляют собой эпитопы внутри или по существу внутри внеклеточной части молекулы MUC16, в целом не слущиваемой формы MUC16; в некоторых вариантах осуществления эпитоп не находится внутри, или антитело или фрагмент не связывается с областью тандемных повторов MUC16 и/или секретируемой формой MUC16. В некоторых вариантах осуществления эпитоп находится внутри или содержит остатки внутри MUC16 и обычно содержит один или несколько гликозилированных остатков или участков гликозилирования в нем. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит один или несколько участков гликозилирования, таких как участки для N-гликозилирования. В некоторых аспектах эпитоп содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1806 или Asn1800 последовательности MUC16, приведенной в SEQ ID № 150 (и/или его гликозилированной формы(форм)); в некоторых аспектах эпитоп содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1806 из SEQ ID № 150, но не содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1800 из SEQ ID № 150; в некоторых аспектах эпитоп содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1800 из SEQ ID № 150, но не содержит остаток аспарагина, соответствующий Asn1806 из SEQ ID № 150. В некоторых из каких-либо из таких вариантов осуществления такой один или несколько аспарагинов гликозилированы, например, N-гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент связывается с эпитопом внутри или тем, что содержит остатки внутри SEQ ID № 131; связывается с эпитопом внутри или тем, что содержит остатки внутри SEQ ID № 130, или их сочетанием; в некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент иммуноспецифически не связывается в области MUC16, соответствующей SEQ ID № 168, или внутри остатков 2-19 из SEQ ID № 168.
[00197] В одном из аспектов, изобретение относится к антителам (например, моноклональным антителам) и их антигенсвязывающим фрагментам, которые (i) иммуноспецифически связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеют иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибируют инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16. В другом аспекте изобретение относится к антителам (например, моноклональным антителам), и их антигенсвязывающим фрагментам, которые (i) иммуноспецифически связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеют иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибируют инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16. В предпочтительном варианте осуществления антитела к гликозилированному MUC16 и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, иммуноспецифически связывают эпитоп, который содержит аминокислотный остаток 1806 (Asn1806) из SEQ ID № 150, где Asn1806 N-гликозилирован (в настоящем описании обозначают как «гликозилирование Asn1806»). Как показано в примерах в разделе 6 в настоящем описании, гликозилирование Asn1806 важно для MUC16-опосредованной инвазии и роста опухолевых клеток. Таким образом, антитела к гликозилированному MUC16 и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, способны к связывающему блокированию такой инвазии и роста опухолевых клеток.
[00198] В одном из вариантов осуществления антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающему фрагменту необходим N-гликозилированный Asn1800 в дополнение к N-гликозилированном Asn1806 для связывания с MUC16 (т. е., оба N-гликозилированных участка представляют собой часть эпитопа, распознаваемого антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом). «Asn1800» относится к аминокислотному остатку 1800 из SEQ ID № 150. Такое антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно идентифицировать по (i) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; и (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует пятую форму MUC16, эта пятая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность пятой формы представляет собой SEQ ID № 172, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, относится к тому же типу клеток, что и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует пятую форму MUC16.
[00199] В одном из вариантов осуществления антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающему фрагменту необходим N-гликозилированный Asn1806, но не необходим N-гликозилированный Asn1800, для связывания с MUC16 (т. е. N-гликозилированный Asn1806 представляет собой часть эпитопа, распознаваемого антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, но N-гликозилированный Asn1800 не представляет собой часть эпитопа, распознаваемого антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом). Такое антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно идентифицировать по (i) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, эта четвертая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность четвертой формы представляет собой SEQ ID № 152; и (iii) где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, относятся к одному типу клеток.
c114
c114
[00200] Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 133, также упоминают в настоящем описании как MUC16, и он состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16 (SEQ ID № 150 представляет собой последовательность зрелого MUC16). MUC16 способен к N-гликозилированию по аминокислотным остаткам аспарагина в положениях 1, 24 и 30 из SEQ ID № 133 (соответствующих положениям аминокислот Asn1777, Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150).
c114-N3
c114-N3
c114-N3
[00201] Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 139, также упоминают в настоящем описании как MUC16. MUC16 состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16 (SEQ ID № 150 представляет собой последовательность зрелого MUC16), за исключением того, что аспарагин в положении аминокислоты 30 (соответствующем положению аминокислоты 1806 из SEQ ID № 150) мутирован в аланин. Таким образом, MUC16 не способен к N-гликозилированию в положении аминокислоты 30 из SEQ ID № 139 (соответствующем положению аминокислоты Asn1806 из SEQ ID № 150).
c114-N2
c114-N2
c114-N2
[00202] Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 152, также упоминают в настоящем описании как MUC16. MUC16 состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16 (SEQ ID № 150 представляет собой последовательность зрелого MUC16), за исключением того, что аспарагин в положении аминокислоты 24 (соответствующем положению аминокислоты Asn1800 из SEQ ID № 150) мутирован в аланин. Таким образом, MUC16 не способен к N-гликозилированию в положении аминокислоты 24 из SEQ ID № 152 (соответствующем положению аминокислоты Asn1800 из SEQ ID № 150).
c114-N23
c114-N23
c114-N23
[00203] Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 172, также упоминают в настоящем описании как MUC16. MUC16 состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16 (SEQ ID № 150 представляет собой последовательность зрелого MUC16), за исключением того, что аспарагины в положениях аминокислот 24 и 30 (соответствующих положениям аминокислот Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150) мутированы в аланины. Таким образом, MUC16 не способен к N-гликозилированию в положениях аминокислот 24 и 30 из SEQ ID № 157 (соответствующих положениям аминокислот Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150).
[00204] Также изобретение относится к тяжелым цепям и легким цепям, где антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее указанные тяжелые и легкие цепи, (i) иммуноспецифически связывается с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеет иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибирует инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16. Также изобретение относится к полинуклеотидам (например, выделенным полинуклеотидам), содержащим последовательности нуклеиновой кислоты (например, комплементарной ДНК (кДНК)), кодирующие такие антитела, и их антигенсвязывающие фрагменты, тяжелые цепи или легкие цепи. Кроме того, изобретение относится к векторам (например, экспрессирующим векторам) и клеткам (например, выделенным клеткам или клеткам ex vivo), содержащим полинуклеотиды (например, выделенные полинуклеотиды), содержащие последовательности нуклеиновой кислоты (например, комплементарной ДНК (кДНК)), кодирующие такие антитела, и их антигенсвязывающие фрагменты, тяжелые цепи или легкие цепи. Также изобретение относится к способам получения таких антител, их антигенсвязывающих фрагментов, тяжелых цепей, легких цепей, векторов и клеток. В других аспектах, изобретение относится к способам и применениям для активности MUC16 и/или управляемого MUC16 опухолевого роста или лечения или контроляконтроля определенных состояний или нарушений, описанных в настоящем описании, например, лечения или контроля рака. Также изобретение относится к связанным композициям (например, фармацевтическим композициям), наборам и диагностическим способам.
[00205] В рамках изобретения, термин «MUC16» или «полипептид MUC16» или «пептид MUC16» относится к связанному белку муцину MUC16, как описано в Yin BW and Lloyd KO, 2001, J Biol Chem. 276(29):27371-5. Под номером доступа GenBank™ NM_024690.2 (SEQ ID № 137) предоставлена образцовая последовательность нуклеиновой кислоты MUC16 человека. Под номером доступа GenBank™ NP_078966.2 (SEQ ID № 136) представлена образцовая аминокислотная последовательность MUC16 человека. Нативный MUC16 содержит внутриклеточный домен, трансмембранный домен, эктодомен проксимально к предполагаемому сайту расщепления и большую сильно гликозилированную область из 12-20 повторов, каждый 156 аминокислот в длину (фиг. 1A). «Незрелый» MUC16 относится к SEQ ID № 136, которая содержит сигнальную последовательность MUC16 (аминокислотные остатки 1-60 из SEQ ID № 136). «Зрелый MUC16» относится к нативному MUC16, как экспрессировано на клеточной поверхности, т.е. где сигнальная последовательность удалена посредством клеточного процессинга, например, SEQ ID № 150, где удалены первые 60 аминокислотных остатков из SEQ ID № 136 (т.е. SEQ ID № 136 представляет собой «незрелую» форму MUC16).
[00206] В отношении названий антител, (i) 18C6 и 18C6.D12 используют взаимозаменяемо, (ii) 10C6 и 10C6.E4 используют взаимозаменяемо, (iii) 19C11 и 19C11.H6 используют взаимозаменяемо, и (iv) 7B12 и 7B12.B3 используют взаимозаменяемо. Субклоны антител (т.е. 18C6.D12, 10C6.E4, 19C11.H6 и 7B12.B3) использовали в экспериментах, описанных в разделе 6.
5.1 АНТИТЕЛА
[00207] Антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты могут включать, например, моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантно получаемые антитела, моноспецифические антитела, полиспецифические антитела (в том числе биспецифические антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, иммуноглобулины, синтетические антитела, тетрамерные антитела, содержащие молекулы двух тяжелых цепей и двух легких цепей, мономер легкой цепи антитела, мономер тяжелой цепи антитела, димер легкой цепи антитела, димер тяжелой цепи антитела, пару легкая цепь антитела-тяжелая цепь антитела, интраантитела, однодоменные антитела, моновалентные антитела, одноцепочечные антитела или одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), камелизованные антитела, аффитела, и Fv с дисульфидной связью (dsFv) или их фрагменты. Такие антитела можно получать способами, известными в данной области.
[00208] Полиспецифическое антитело или его фрагмент относится к антителу или его фрагменту, которые могут связываться одновременно по меньшей мере с двумя мишенями, которые имеют различную структуру, например, два различных антигена, два различных эпитопа на одном и том же антигене или гаптен и антиген или эпитоп. Одна специфичность может быть, например, для антигена или эпитопа B-клетки, T-клетки, миелоидной, плазматической или тучной клетки, такой как, например, CD3. Другая специфичность может быть к другому антигену на клетках того же или другого типа, такому как, например, MUC16. Полиспецифические поливалентные антитела представляют собой конструкции, которые имеют больше чем один сайт связывания, и сайты связывания имеют различную специфичность, например, биспецифическое диатело, где один сайт связывания вступает в реакцию с одним антигеном, а другой с другим антигеном.
[00209] Биспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может одновременно связываться с двумя мишенями, которые имеют различную структуру. Биспецифические антитела (bsAb) и фрагменты биспецифических антител (bsFab) имеют по меньшей мере одно плечо, которое иммуноспецифически связывается с первой мишенью, например, MUC16, и по меньшей мере одно другое плечо, которое иммуноспецифически связывается со второй мишенью, такой как, например, CD3. Различные биспецифические слитые белки можно получать с использованием молекулярного конструирования. В одной форме биспецифический слитый белок является двухвалентным и состоит, например, из (i) scFv с одним сайтом связывания для одного антигена и (ii) антитела или Fab фрагмента с одним сайтом связывания для второго антигена. В другой форме биспецифический слитый белок является четырехвалентным и состоит, например, из IgG с двумя сайтами связывания для одного антигена и двумя идентичными scFv для второго антигена. См., например, международную публикацию № WO 2011/1160119, которая включена по ссылке в настоящее описание в полном объеме.
[00210] Недавно разработанные способы получения биспецифических моноклональных антител включают использование сконструированных рекомбинантных моноклональных антител, которые имеют дополнительные остатки цистеина с тем, чтобы сшивать их более прочно, чем более обычные изотипы иммуноглобулинов. См., например, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225, 1997. Другой поход состоит в том, чтобы конструировать рекомбинантные слитые белки, соединяя два или больше различных одноцепочечнных сегментов антител или фрагментов антитела с требуемыми двойными специфичностями. См., например, Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997. Различные биспецифические слитые белки можно получать с использованием молекулярного конструирования.
[00211] Биспецифические слитые белки, соединяющие два или больше различных одноцепочечных антител или фрагментов антител, можно получать схожим образом. Рекомбинантные способы можно использовать для того, чтобы получать различные слитые белки. В некоторых аспектах, гибкий линкер соединяет scFv (например, scFv, направленный на CD3) с константной областью легкой цепи моноклонального антитела (например, антитела к гликозилированному MUC16, описанного в настоящем описании; см. раздел 5.1). Подходящие последовательности линкеров, необходимые для соединения тяжелой цепи Fc с scFv с сохранением рамки считывания, вводят в домены VL и Vκ через ПЦР реакции. Фрагмент ДНК, кодирующий scFv, после этого лигируют в каркасный вектор, содержащий ДНК последовательность, кодирующую домен CH1. Получаемую конструкцию вырезают и лигируют в вектор, который содержит ДНК последовательность, кодирующую область VH антитела (например, антитела к гликозилированному MUC16). Получаемый вектор можно использовать для того, чтобы трансфицировать подходящую клетку-хозяина, такую как клетка млекопитающего, для экспрессии биспецифического слитого белка.
[00212] Антитела к гликозилированному MUC16, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1), и их фрагменты в некоторых вариантах осуществления также можно использовать для того, чтобы получать функциональные биспецифические одноцепочечные антитела (bscAb), также называемые диателами, и их можно получать в клетках млекопитающих с использованием рекомбинантных способов. См., например, Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995, включенный в настоящее описание посредством ссылки. Например, bscAb можно получать посредством соединения двух одноцепочечных Fv фрагментов через линкер глицин-серин с использованием рекомбинантных способов. Домены VL и VH двух антител, представляющих интерес, выделяют с использованием стандартных способов ПЦР, известных в данной области. Биспецифические одноцепочечные антитела и биспецифические слитые белки включены в объем настоящего изобретения.
[00213] В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, относятся к scFv. scFv является термином, принятым в данной области. scFv содержит слитый белок вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей иммуноглобулина, где слитый белок сохраняет ту же антигенную специфичность, что и целый иммуноглобулин. VH сливают с VL через пептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер составляет между 5 и 25, 5 и 15, 10 и 20, 10 и 15 или 15 и 25 аминокислотными остатками в длину. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер scFv проявляет одну или несколько характеристик, подходящих для пептидного линкера, которые известны специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер scFv содержит аминокислоты, которые допускают растворимость пептидного линкера scFv, такие как, например, серин и треонин. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер scFv содержит аминокислоты, допускают гибкость пептидного линкера scFv, такие как, например, глицин. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер scFv соединяет N-конец VH с C-концом VL. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер scFv может соединять C-конец VH с N-концом VL.
[00214] В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, относятся к химерным антигенным рецепторам (CAR). CAR является термином, принятым в данной области. CAR может быть нацелен на антиген, ассоциированный с опухолью (например, MUC16). CAR, представленные в настоящем описании, обычно состоят из scFv, полученного из антитела к гликозилированному MUC16, трансмембранного домена, который в некоторых вариантах осуществления представляет собой трансмембранный домен, полученный из костимуляторной молекулы T-клетки (например, трансмембранный домен, полученный из CD28, CD8, CD38, OX-40 или 4-1BB), и первичный сигнальный домен, такой как цитоплазматический сигнальный домен дзета (ζ) цепи T-клеточного рецептора (TCR). В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит одну или несколько дополнительных областей или доменов, таких как один или несколько спейсеров или линкеров, в том числе внеклеточный спейсер, такой как тот, который получен из антитела или другой молекулы клеточной поверхности, такой как спейсер, содержащий одно или несколько из CH2, CH3 и/или шарнирных областей антитела, или спейсер, полученный из молекулы CD28 или молекулы CD8, или другой спейсер. Также в настоящем описании предоставлены клетки, такие как T-клетки, сконструированные для того, чтобы экспрессировать такие CAR, например, те, которые рекомбинантно экспрессируют такой CAR. CAR-экспрессирующая T-клетка, при распознавании MUC16-экспрессирующей опухоли, предпочтительно индуцирует активацию, пролиферацию T-клетки и/или лизис клетки такой опухоли.
[00215] Антитела к гликозилированному MUC16 могут относиться к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY), любому классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2) или любому подклассу (например, IgG2a или IgG2b) молекул иммуноглобулинов. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем описании, представляют собой антитела IgG или их класс или подкласс. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем описании, представляют собой антитела IgG1. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем описании, представляют собой антитела IgG2. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем описании, представляют собой антитела IgG2a. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем описании, представляют собой антитела IgG2b. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем описании, представляют собой смесь антител IgG2a и IgG2b. В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой гуманизированную форму моноклонального антитела грызуна.
c114
c114
[00216] В частном варианте осуществления антиген, с которым связывается антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой форму MUC16, которая гликозилирована, например, в которой аминокислотная последовательность формы MUC16 представляет собой SEQ ID № 133. Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 133, также упоминают в настоящем описании как MUC16, и он состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16. MUC16 способен к N-гликозилированию аспарагина в положениях аминокислот 1, 24 и 30 из SEQ ID № 133 (соответствующих положениям аминокислот Asn1777, Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150). Зрелый MUC16 (SEQ ID № 150) относится к полноразмерному MUC16, в котором удалена сигнальная последовательность и в котором сигнальная последовательность состоит из первых 60 аминокислотных остатков из SEQ ID № 136 (т. е. SEQ ID № 136 представляет собой «незрелую» форму MUC16).
2
[00217] Антигенсвязывающие фрагменты антител к гликозилированному MUC16 могут представлять собой Fab фрагменты, F(ab') фрагменты или часть антитела к гликозилированному MUC16, которые содержат аминокислотные остатки, которые придают антителу к гликозилированному MUC16 его специфичность к антигену (например, определяющие комплементарность области (CDR)). Антитело к гликозилированному MUC16 можно получать от животных любых видов, таких как грызуны (например, мышь, крыса или хомяк) и человек.
[00218] В рамках изобретения, термины «вариабельная область» или «вариабельный домен» используют взаимозаменяемо, и они распространены в данной области. Вариабельная область обычно относится к части антитела, в целом, части легкой или тяжелой цепи, обычно приблизительно от 110 до 120 N-концевых аминокислот в зрелой тяжелой цепи и приблизительно от 90 до 100 N-концевых аминокислот в зрелой легкой цепи, которая отличается на протяжении последовательности среди антител и которая обеспечивает связывание и специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Вариабельность в последовательности сосредоточена в тех областях, которые называют определяющими комплементарность областями (CDR), тогда как более высоко консервативные области в вариабельном домене называют каркасными областями (FR). CDR фланкированы с помощью FR. В целом, пространственная ориентация CDR и FR представляет собой следующее, в направлении от N-конца к C-концу: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Не желая ограничиваться каким-либо конкретным механизмом или теорией, полагают, что CDR легкой и тяжелой цепей в первую очередь отвечают за взаимодействие и специфичность антитела в отношении антигена. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область человека. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область содержит CDR грызуна (например, мыши или крысы) и каркасные области (FR) человека. В конкретных вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область примата (например, не являющийся человеком примата). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область содержит CDR грызуна или мыши и каркасные области (FR) примата (например, не являющегося человеком примата).
[00219] CDR определяют различными способами, известными в данной области, включая Kabat, Chothia и IMGT, а также образцовые определения. Определение Kabat основано на вариабельности последовательностей (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). В отношении системы нумерации Kabat, (i) CDR1 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 31 до 35 тяжелой цепи, которые необязательно могут включать одну или две дополнительные аминокислоты после положения аминокислоты 35 (обозначаемые в схеме нумерации Kabat как 35A и 35B); (ii) CDR2 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 50 до 65 тяжелой цепи; и (iii) CDR2 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 95 до 102 тяжелой цепи (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). В отношении системы нумерации Kabat, (i) CDR1 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 24 до 34 легкой цепи; (ii) CDR2 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 50 до 56 легкой цепи; и (iii) CDR3 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 89 до 97 легкой цепи (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). Как хорошо известно специалистам в данной области, используя систему нумерации Kabat, фактическая линейная аминокислотная последовательность вариабельного домена антитела может содержать меньше или больше аминокислот из-за укорочения или удлинения FR и/или CDR и, по существу, номер аминокислоты по Kabat не обязательно является таким же, как ее линейный номер аминокислоты.
[00220] Определение Chothia основано на местоположении областей структурных петель (Chothia et al., (1987) J Mol Biol 196: 901-917; и патент США № 7709226). Термин «CDR по Chothia» и схожие термины общепризнаны в данной области и относятся к последовательностям CDR антител, как определяют в соответствии со способом Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917, которые упоминают в настоящем описании как «CDR по Chothia» (также см., например, патент США № 7709226 и Martin, A., «Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains» в Antibody Engineering, под редакцией Kontermann и Dübel, глава 31, стр. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)). В отношении системы нумерации Chothia, используя систему нумерации Kabat для нумерации аминокислотных остатков в области VH, (i) CDR1 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 26 до 32 тяжелой цепи; (ii) CDR2 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 53 до 55 тяжелой цепи; и (iii) CDR3 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 96 до 101 тяжелой цепи. В конкретном варианте осуществления в отношении системы нумерации Chothia, используя систему нумерации Kabat для нумерации аминокислотных остатков в области VH, (i) CDR1 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 26 до 32 или 34 тяжелой цепи; (ii) CDR2 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 52 до 56 (в одном из вариантов осуществления CDR2 находится в положениях 52A-56, где 52A следует за положением 52) тяжелой цепи; и (iii) CDR3 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 95 до 102 тяжелой цепи (в одном из вариантов осуществления аминокислоты в положениях с номерами 96-100 отсутствуют). В отношении системы нумерации Chothia, используя систему нумерации Kabat для нумерации аминокислотных остатков в области VL, (i) CDR1 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 26 до 33 легкой цепи; (ii) CDR2 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 50 до 52 легкой цепи; и (iii) CDR3 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 91 до 96 легкой цепи. В конкретном варианте осуществления в отношении системы нумерации Chothia, используя систему нумерации Kabat для нумерации аминокислотных остатков в области VL, (i) CDR1 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 24 до 34 легкой цепи; (ii) CDR2 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 50 до 56 легкой цепи; и (iii) CDR3 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 89 до 97 легкой цепи (в одном из вариантов осуществления аминокислоты в положениях с номерами 96-100 отсутствуют). Эти положения CDR по Chothia могут варьировать в зависимости от антитела, и их можно определять в соответствии со способами, известными в данной области.
[00221] Определение IMGT взято из IMGT («IMGT, международной информационной системы ImMunoGeneTics, веб-сайт imgt.org, основатель и директор: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France; см., например, Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136 и Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212, оба они включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме). В отношении системы нумерации IMGT, (i) CDR1 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 25 до 35 тяжелой цепи; (ii) CDR2 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 51 до 57 тяжелой цепи; и (iii) CDR2 VH обычно присутствует в положениях аминокислот от 93 до 102 тяжелой цепи. В отношении системы нумерации IMGT, (i) CDR1 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 27 до 32 легкой цепи; (ii) CDR2 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 50 до 52 легкой цепи; и (iii) CDR3 VL обычно присутствует в положениях аминокислот от 89 до 97 легкой цепи.
5.1.1 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ И СТРУКТУРЫ
[00222] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающему фрагменту, которые содержат CDR VH какого-либо из антител к гликозилированному MUC16, представленных в настоящем описании, например, как изложено в таблицах 1, 3 и 5. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат CDR1 VH антитела к гликозилированному MUC16, как изложено в таблице 1, 3 или 5. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат CDR2 VH антитела к гликозилированному MUC16, как изложено в таблице 1, 3 или 5. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат CDR3 VH антитела к гликозилированному MUC16, как изложено в таблице 1, 3 или 5. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат одну, две или все три CDR VH антитела к гликозилированному MUC16, как изложено в таблице 1, 3 или 5 (например, CDR VL в ряду два таблицы 1, например, все CDR VH для антитела 10C6)
[00223] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающему фрагменту, которые содержат CDR VL какого-либо из антител к MUC16, представленных в настоящем описании, например, как изложено в таблицах 2, 4 и 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат CDR1 VH антитела к гликозилированному MUC16, как изложено в таблице 2, 4 или 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат CDR2 VH антитела к гликозилированному MUC16, как изложено в таблице 2, 4 или 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат CDR3 VH антитела к гликозилированному MUC16, как изложено в таблице 2, 4 или 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, содержат одну, две или все три CDR VL антитела к гликозилированному MUC16 в таблице 2, 4 или 6 (например, CDR VL в ряду два таблицы 2, например, все CDR VH для антитела 10C6)
[00224] Таблица 1. Аминокислотные последовательности VH CDR (Kabat).
Антитело
CDR1 VH (SEQ ID №)
CDR2 VH (SEQ ID №)
CDR3 VH (SEQ ID №)
10C6
TLGMGVG (SEQ ID № 3)
HIWWDDDKYYNPALKS (SEQ ID № 4)
IGTAQATDALDY (SEQ ID № 5)
7B12
TVGMGVG (SEQ ID № 23)
HIWWDDEDKYYNPALKS (SEQ ID № 24)
IGTAQATDALDY (SEQ ID № 25)
19C11
TLGMGVG (SEQ ID № 43)
HIWWDDDKYYNPALKS (SEQ ID № 44)
IGTAQATDALDY (SEQ ID № 45)
16C5
TLGMGVG (SEQ ID № 63)
HIWWDDDKYYYPALKS (SEQ ID № 64)
IGTAQATDALDY (SEQ ID № 65)
18C6
TVGMGVG (SEQ ID № 83)
HIWWDDEDKYYNPALKS (SEQ ID № 84)
IGTAQATDALDY (SEQ ID № 85)
Консенсус 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и 18C6
TX<sub>1</sub>GMGVG (SEQ ID № 103), где X<sub>1</sub> представляет собой L или V
HIWWDDX<sub>2</sub>DKYYX<sub>3</sub>PALKS (SEQ ID № 104), где X<sub>2</sub> представляет собой E или отсутствует и где X<sub>3</sub> представляет собой Y или N
IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105)
[00225] Таблица 2. Аминокислотные последовательности VL CDR (Kabat).
Антитело
CDR1 VL (SEQ ID №)
CDR2 VL (SEQ ID №)
CDR3 VL (SEQ ID №)
10C6
RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID № 6)
LVSNLES (SEQ ID № 7)
QHIRELTRS (SEQ ID № 8)
7B12
RSSKSLRKSNGNTYL (SEQ ID № 26)
YMSNLAS (SEQ ID № 27)
MQSLEYPLT (SEQ ID № 28)
19C11
RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID № 46)
YMSNLAS (SEQ ID № 47)
MQGLEHPLT (SEQ ID № 48)
16C5
LASEDIYSGIS (SEQ ID № 66)
GASNLES (SEQ ID № 67)
LGGYSYSSTLT (SEQ ID № 68)
18C6
RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID № 86)
YMSNLAS (SEQ ID № 87)
MQSLEYPLT (SEQ ID № 88)
Консенсус 7B12, 19C11 и 18C6
RSSKSLX<sub>4</sub>X<sub>5</sub>SNGNTYLY (SEQ ID № 106), где X<sub>4</sub> представляет собой R или L и где X<sub>5</sub> представляет собой K или H
YMSNLAS (SEQ ID № 107)
MQX<sub>6</sub>LEX<sub>7</sub>PLT (SEQ ID № 108), где X<sub>6</sub> представляет собой G или S и где X<sub>7</sub> представляет собой H или Y
[00226] Таблица 3. Аминокислотные последовательности VH CDR (Chothia).
Антитело
CDR1 VH (SEQ ID №)
CDR2 VH (SEQ ID №)
CDR3 VH (SEQ ID №)
10C6
GFSLNTLGM (SEQ ID № 9)
WDD (SEQ ID № 10)
GTAQATDALD (SEQ ID № 11)
7B12
GFSLSTVGM (SEQ ID № 29)
WDDE (SEQ ID № 30)
GTAQATDALD (SEQ ID № 31)
19C11
GFSLSTLGM (SEQ ID № 49)
WDD (SEQ ID № 50)
GTAQATDALD (SEQ ID № 51)
16C5
GFSLNTLGM (SEQ ID № 69)
WDD (SEQ ID № 70)
GTAQATDALD (SEQ ID № 71)
18C6
GFSLSTVGM (SEQ ID № 89)
WDDE (SEQ ID № 90)
GTAQATDALD (SEQ ID № 91)
Консенсус 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и 18C6
GFSLX<sub>8</sub>TX<sub>9</sub>GM (SEQ ID № 109), где X<sub>8</sub> представляет собой N или S и где X<sub>9</sub> представляет собой L или V
WDDX<sub>10</sub> (SEQ ID № 110), где X<sub>10</sub> представляет собой E или отсутствует
GTAQATDALD (SEQ ID № 111)
[00227] Таблица 4. Аминокислотные последовательности VL CDR (Chothia).
Антитело
CDR1 VL (SEQ ID №)
CDR2 VL (SEQ ID №)
CDR3 VL (SEQ ID №)
10C6
SKSVSTSGYSY (SEQ ID № 12)
LVS (SEQ ID № 13)
IRELTR (SEQ ID № 14)
7B12
SKSLRKSNGNTY (SEQ ID № 32)
YMS (SEQ ID № 33)
SLEYPL (SEQ ID № 34)
19C11
SKSLLHSNGNTY (SEQ ID № 52)
YMS (SEQ ID № 53)
GLEHPL (SEQ ID № 54)
16C5
SEDIYSG (SEQ ID № 72)
GAS (SEQ ID № 73)
GYSYSSTL (SEQ ID № 74)
18C6
SKSLLHSNGNTY (SEQ ID № 92)
YMS (SEQ ID № 93)
SLEYPL (SEQ ID № 94)
Консенсус 7B12, 19C11 и 18C6
SKSLX<sub>11</sub>X<sub>12</sub>SNGNTY (SEQ ID № 112), где X<sub>11</sub> представляет собой L или R и где X<sub>12</sub> представляет собой H или K
YMS (SEQ ID № 113)
X<sub>13</sub>LEX<sub>14</sub>PL (SEQ ID № 114), где X<sub>13</sub> представляет собой G или S и где X<sub>14</sub> представляет собой H или Y
[00228] Таблица 5. Аминокислотные последовательности VH CDR (IMGT).
Антитело
CDR1 VH (SEQ ID №)
CDR2 VH (SEQ ID №)
CDR3 VH (SEQ ID №)
10C6
GFSLNTLGMG (SEQ ID № 15)
IWWDDDK (SEQ ID № 16)
SRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 17)
7B12
GFSLSTVGMG (SEQ ID № 35)
IWWDDEDK (SEQ ID № 36)
TRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 37)
19C11
GFSLSTLGMG (SEQ ID № 55)
IWWDDDK (SEQ ID № 56)
ARIGTAQATDALDY (SEQ ID № 57)
16C5
GFSLNTLGMG (SEQ ID № 75)
IWWDDDK (SEQ ID № 76)
ARIGTAQATDALDY (SEQ ID № 77)
18C6
GFSLSTVGMG (SEQ ID № 95)
IWWDDEDK (SEQ ID № 96)
TRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 97)
Консенсус 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и 18C6
GFSLX<sub>15</sub>TX<sub>16</sub>GMG (SEQ ID № 115), где X<sub>15</sub> представляет собой N или S и где X<sub>16</sub> представляет собой V или L
IWWDDX<sub>17</sub>DK (SEQ ID № 116), где X<sub>17</sub> представляет собой E или отсутствует
X<sub>18</sub>RIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), где X<sub>18</sub> представляет собой T, A или S
[00229] Таблица 6. Аминокислотные последовательности VL CDR (IMGT).
Антитело
CDR1 VL (SEQ ID №)
CDR2 VL (SEQ ID №)
CDR3 VL (SEQ ID №)
10C6
KSVSTSGYSY (SEQ ID № 18)
LVS (SEQ ID № 19)
QHIRELTRS (SEQ ID № 20)
7B12
KSLRKSNGNTY (SEQ ID № 38)
YMS (SEQ ID № 39)
MQSLEYPLT (SEQ ID № 4)
19C11
KSLLHSNGNTY (SEQ ID № 58)
YMS (SEQ ID № 59)
MQGLEHPLT (SEQ ID № 60)
16C5
EDIYSG (SEQ ID № 78)
GAS (SEQ ID № 79)
LGGYSYSSTLT (SEQ ID № 80)
18C6
KSLLHSNGNTY (SEQ ID № 98)
YMS (SEQ ID № 99)
MQSLEYPLT (SEQ ID № 100)
Консенсус 7B12, 19C11 и 18C6
KSLX<sub>19</sub>X<sub>20</sub>SNGNTY (SEQ ID № 118), где X<sub>19</sub> представляет собой V или L и где X<sub>20</sub> представляет собой H или K
YMS (SEQ ID № 119)
MQSLEYPLT (SEQ ID № 120)
[00230] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит:
1
1
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V;
2
3
2
3
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и X представляет собой Y или N; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105).
[00231] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит:
8
9
8
9
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой L или V;
10
10
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111).
[00232] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит:
15
16
15
16
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и X представляет собой V или L;
17
17
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
18
18
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S.
[00233] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 3, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 4, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 5. В конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 9, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 10, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 11. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 15, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 16, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 17.
[00234] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 23, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 24, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 25. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 29, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 30, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 31. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 35, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 36, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 37.
[00235] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 43, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 44, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 45. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 49, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 50, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 51. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 55, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 56, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 57.
[00236] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 63, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 64, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 65. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 69, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 70, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 71. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 75, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 76, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 77.
[00237] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 83, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 84, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 85. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 89, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 90, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 91. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 95, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 96, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 97.
[00238] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит:
4
5
4
5
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность RSSKSLXXSNGNTYLY (SEQ ID № 106), в которой X представляет собой R или L и X представляет собой K или H;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMSNLAS (SEQ ID № 107); и
6
7
6
7
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQXLEXPLT (SEQ ID № 108), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y.
[00239] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит:
11
12
11
12
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SKSLXXSNGNTY (SEQ ID № 112), в которой X представляет собой L или R и X представляет собой H или K;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 113); и
13
14
13
14
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность XLEXPL (SEQ ID № 114), в которой X представляет собой G или S и X представляет собой H или Y.
[00240] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит:
19
20
19
20
(a) определяющую комплементарность область (CDR)1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность KSLXXSNGNTY (SEQ ID № 118), в которой X представляет собой V или L и X представляет собой H или K;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 119); и
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQSLEYPLT (SEQ ID № 120).
[00241] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 6, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 7, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 8. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 12, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 13, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 14. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 18, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 19, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 20.
[00242] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 26, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 27, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 28. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 32, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 33, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 34. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 38, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 39, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 40.
[00243] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 46, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 47, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 48. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 52, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 53, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 54. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 58, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 59, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 60.
[00244] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 66, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 67, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 68. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 72, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 73, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 74. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 78, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 79, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 80.
[00245] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 86, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 87, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 88. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 92, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 93, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 94. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 98, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 99, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 100.
[00246] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат:
(i) VH, которая содержит:
1
1
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V;
2
3
2
3
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и в которой X представляет собой Y или N; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105); и
(ii) VL, которая содержит:
4
5
4
5
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность RSSKSLXXSNGNTYLY (SEQ ID № 106), в которой X представляет собой R или L и в которой X представляет собой K или H;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMSNLAS (SEQ ID № 107); и
6
7
6
7
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQXLEXPLT (SEQ ID № 108), в которой X представляет собой G или S и в которой X представляет собой H или Y.
[00247] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат
(i) VH, которая содержит:
8
9
8
9
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой L или V;
10
10
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111); и
(ii) VL, которая содержит:
11
12
11
12
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SKSLXXSNGNTY (SEQ ID № 112), в которой X представляет собой L или R и в которой X представляет собой H или K;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 113); и
13
14
13
14
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность XLEXPL (SEQ ID № 114), в которой X представляет собой G или S и в которой X представляет собой H или Y.
[00248] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат
(i) VH, которая содержит:
15
16
15
16
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой V или L;
17
17
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
18
18
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S; и
(ii) VL, которая содержит:
19
20
19
20
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность KSLXXSNGNTY (SEQ ID № 118), в которой X представляет собой V или L и в которой X представляет собой H или K;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность YMS (SEQ ID № 119); и
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность MQSLEYPLT (SEQ ID № 120).
[00249] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат:
(i) VH, которая содержит:
1
1
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V;
2
3
2
3
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и в которой X представляет собой Y или N; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105); и
(ii) VL, которая содержит:
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 6;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 7; и
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 8.
[00250] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат
(i) VH, которая содержит:
8
9
8
9
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой L или V;
10
10
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111); и
(ii) VL, которая содержит:
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 12;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 13; и
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 14.
[00251] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит:
15
16
15
16
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой V или L;
17
17
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
18
18
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S; и
(ii) VL, которая содержит:
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 18;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 19; и
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 20.
[00252] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат
(i) VH, которая содержит:
1
1
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность TXGMGVG (SEQ ID № 103), в которой X представляет собой L или V;
2
3
2
3
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность HIWWDDXDKYYXPALKS (SEQ ID № 104), в которой X представляет собой E или отсутствует и в которой X представляет собой Y или N; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IGTAQATDALDY (SEQ ID № 105); и
(ii) VL, которая содержит:
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 26;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 27; и
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 28.
[00253] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат:
(i) VH, которая содержит:
8
9
8
9
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGM (SEQ ID № 109), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой L или V;
10
10
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность WDDX (SEQ ID № 110), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GTAQATDALD (SEQ ID № 111); и
(ii) VL, которая содержит:
(a) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 32;
(b) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 33; и
(c) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 34.
[00254] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат:
(i) VH, которая содержит:
15
16
15
16
(a) CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность GFSLXTXGMG (SEQ ID № 115), в которой X представляет собой N или S и в которой X представляет собой V или L;
17
17
(b) CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность IWWDDXDK (SEQ ID № 116), в которой X представляет собой E или отсутствует; и
18
18
(c) CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность XRIGTAQATDALDY (SEQ ID № 117), в которой X представляет собой T, A или S; и
(ii) VL, которая содержит:
(d) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 38;
(e) CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 39; и
(f) CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 40.
[00255] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 3, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 4, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 5; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 6, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 7, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 8. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 9, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 10, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 11; и (b) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 12, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 13, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 14. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 15, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 16, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 17; и (b) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 18, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 19, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 20.
[00256] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 23, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 24, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 25; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 26, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 27, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 28. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 29, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 30, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 31; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 32, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 33, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 34. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 35, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 36, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 37; и (b) CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 38, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 39, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 40.
[00257] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 43, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 44, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 45; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 46, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 47, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 48. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 49, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 50, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 51; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 52, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 53, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 54. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 55, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 56, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 57; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 58, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 59, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 60.
[00258] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 63, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 64, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 65; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 66, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 67, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 68. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 69, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 70, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 71; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 72, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 73, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 74. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 75, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 76, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 77; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 78, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 79, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 80.
[00259] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 83, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 84, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 85; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 86, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 87, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 88. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 89, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 90, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 91; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 92, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 93, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 94. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 95, CDR2 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 96, и CDR3 VH, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 97; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 98, CDR2 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 99, и CDR3 VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 100.
[00260] Таблица 7. Аминокислотные последовательности домена VH
Антитело
VH (SEQ ID №)
10C6
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTLGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPALKSRLTISKDSSKNQVFLKIANVDTADIATYYCSRIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 1)
7B12
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTVGMGVGWSRQPSGKGLEWLAHIWWDDEDKYYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADSATYYCTRIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 21)
19C11
QVNLKESGPGKLQPSQTLSLTCSFSGFSLSTLGMGVGWIRQSSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPALKSRLTISRATSKNQVFLKIVNVGTADTATYYCARIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 41)
16C5
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTLGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYYPALKSRLTISRDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCARIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 61)
18C6
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTVGMGVGWSRQPSGKGLEWLAHIWWDDEDKYYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCTRIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 81)
Консенсус VH 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и 18C6
QVX<sub>21</sub>LKESGPGX<sub>22</sub>LQPSQTLSLTCSFSGFSLX<sub>23</sub>TX<sub>24</sub>GMGVGWX<sub>25</sub>RQX<sub>26</sub>S GKGLEWLAHIWWDDX<sub>27</sub>DKYYX<sub>28</sub>PALKSRLTISX<sub>29</sub>X<sub>30</sub>X<sub>31</sub>SKNQVFLKI X<sub>32</sub>NVX<sub>33</sub>TADX<sub>34</sub>ATYYCX<sub>35</sub>RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X<sub>21</sub> представляет собой T или N, X<sub>22</sub> представляет собой I или K, X<sub>23</sub> представляет собой N или S, X<sub>24</sub> представляет собой V или L, X<sub>25</sub> представляет собой S или I, X<sub>26</sub> представляет собой P или S, X<sub>27</sub> представляет собой E или отсутствует, X<sub>28</sub> представляет собой N или Y, X<sub>29</sub> представляет собой K или R, X<sub>30</sub> представляет собой A или D, X<sub>31</sub> представляет собой T или S, X<sub>32</sub> представляет собой V или A, X<sub>33</sub> представляет собой G или D, X<sub>34</sub> представляет собой T, I или S и X<sub>35</sub> представляет собой T, S или A
[00261] Таблица 8. Аминокислотные последовательности домена VL
Антитело
VL (SEQ ID №)
10C6
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKN (SEQ ID № 2)
7B12
DIVMTQAAPSVSVTPGESVSISCRSSKSLRKSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPLTFGGGTKLKIK (SEQ ID № 22)
19C11
DIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLKISRVEAGDVGVYYCMQGLEHPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 42)
16C5
ELDMTQTPPSLSASVGETVRIRCLASEDIYSGISWYQQKPGKPPTLLIYGASNLESGVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDAATYYCLGGYSYSSTLTFGAGTNVEIK (SEQ ID № 62)
18C6
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 82)
Консенсус VH 7B12, 19C11 и 18C6
DIVMTQAAPSX<sub>36</sub>X<sub>37</sub>VTPGESVSISCRSSKSLX<sub>38</sub>X<sub>39</sub>SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX<sub>40</sub>ISRVEAX<sub>41</sub>DVGVYYCMQX<sub>42</sub>LEX<sub>43</sub>PLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 102), в которой X<sub>36</sub> представляет собой I или V, X<sub>37</sub> представляет собой P или S, X<sub>38</sub> представляет собой R или L, X<sub>39</sub> представляет собой K или H, X<sub>40</sub> представляет собой R или K, X<sub>41</sub> представляет собой E или G, X<sub>42</sub> представляет собой S или G и X<sub>43</sub> представляет собой Y или H
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
[00262] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат область VH, которая содержит QVXLKESGPGXLQPSQTLSLTCSFSGFSLXTXGMGVGWXRQXSGKGLEWLAH IWWDDXDKYYXPALKSRLTISXXXSKNQVFLKIXNVXTADXATYYCXRI GTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X представляет собой T или N, X представляет собой I или K, X представляет собой N или S, X представляет собой V или L, X представляет собой S или I, X представляет собой P или S, X представляет собой E или отсутствует, X представляет собой N или Y, X представляет собой K или R, X представляет собой A или D, X представляет собой T или S, X представляет собой V или A, X представляет собой G или D, X представляет собой T, I или S и X представляет собой T, S или A.
36
37
38
39
40
41
42
43
36
37
38
39
40
41
42
43
[00263] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат область VL, которая содержит DIVMTQAAPSXXVTPGESVSISCRSSKSLXXSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLXISRVEAXDVGVYYCMQXLEXPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 102), в которой X представляет собой I или V, X представляет собой P или S, X представляет собой R или L, X представляет собой K или H, X представляет собой R или K, X представляет собой E или G, X представляет собой S или G и X представляет собой Y или H.
[00264] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
(a) область VH, которая содержит QVXLKESGPGXLQPSQTLSLTCSFSGFSLXTXGMGVGWXRQXSGKGLEWLAH IWWDDXDKYYXPALKSRLTISXXXSKNQVFLKIXNVXTADXATYYCXRI GTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X представляет собой T или N, X представляет собой I или K, X представляет собой N или S, X представляет собой V или L, X представляет собой S или I, X представляет собой P или S, X представляет собой E или отсутствует, X представляет собой N или Y, X представляет собой K или R, X представляет собой A или D, X представляет собой T или S, X представляет собой V или A, X представляет собой G или D, X представляет собой T, I или S и X представляет собой T, S или A; и
36
37
38
39
40
41
42
43
36
37
38
39
40
41
42
43
(b) область VL, которая содержит DIVMTQAAPSXXVTPGESVSISCRSSKSLXXSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLXISRVEAXDVGVYYCMQXLEXPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID № 102), в которой X представляет собой I или V, X представляет собой P или S, X представляет собой R или L, X представляет собой K или H, X представляет собой R или K, X представляет собой E или G, X представляет собой S или G и X представляет собой Y или H.
[00265] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
(a) область VH, которая содержит QVXLKESGPGXLQPSQTLSLTCSFSGFSLXTXGMGVGWXRQXSGKGLEWLAH IWWDDXDKYYXPALKSRLTISXXXSKNQVFLKIXNVXTADXATYYCXRI GTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X представляет собой T или N, X представляет собой I или K, X представляет собой N или S, X представляет собой V или L, X представляет собой S или I, X представляет собой P или S, X представляет собой E или отсутствует, X представляет собой N или Y, X представляет собой K или R, X представляет собой A или D, X представляет собой T или S, X представляет собой V или A, X представляет собой G или D, X представляет собой T, I или S и X представляет собой T, S или A; и
(b) область VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2.
[00266] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
(a) область VH, которая содержит QVXLKESGPGXLQPSQTLSLTCSFSGFSLXTXGMGVGWXRQXSGKGLEWLAH IWWDDXDKYYXPALKSRLTISXXXSKNQVFLKIXNVXTADXATYYCXRI GTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID № 101), в которой X представляет собой T или N, X представляет собой I или K, X представляет собой N или S, X представляет собой V или L, X представляет собой S или I, X представляет собой P или S, X представляет собой E или отсутствует, X представляет собой N или Y, X представляет собой K или R, X представляет собой A или D, X представляет собой T или S, X представляет собой V или A, X представляет собой G или D, X представляет собой T, I или S и X представляет собой T, S или A; и
(b) область VL, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62.
[00267] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH, которая содержит аминокислотную последовательность как изложено в таблице 7. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1 (таблица 7) (например, VH антитела 10C6). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21 (таблица 7) (например, VH антитела 7B12). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41 (таблица 7) (например, VH антитела 19C11). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61 (таблица 7) (например, VH антитела 16C5). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81 (таблица 7) (например, VH антитела 18C6).
[00268] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VL, которая содержит аминокислотную последовательность как изложено в таблице 8. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2 (таблица 8) (например, VL антитела 10C6). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22 (таблица 8) (например, VL антитела 7B12). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42 (таблица 8) (например, VL антитела 19C11). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62 (таблица 8) (например, VL антитела 16C5). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82 (таблица 8) (например, VL антитела 18C6).
[00269] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) VH, которая содержит аминокислотную последовательность как изложено в таблице 7; и (b) VL, которая содержит аминокислотную последовательность как изложено в таблице 8. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1 (таблица 7) (например, VH антитела 10C6); и (b) последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2 (таблица 8) (например, VL антитела 10C6). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21 (таблица 7) (например, VH антитела 7B12); и (b) последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22 (таблица 8) (например, VL антитела 7B12). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41 (таблица 7) (например, VH антитела 19C11); и (b) последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42 (таблица 8) (например, VL антитела 19C11). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61 (таблица 7) (например, VH антитела 16C5); и (b) последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62 (таблица 8) (например, VL антитела 16C5). В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (a) последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81 (таблица 7) (например, VH антитела 18C6); и (b) последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82 (таблица 8) (например, VL антитела 18C6).
[00270] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат CDR VH (например, как изложено в таблице 1, 3 или 5) из VH, которая содержит аминокислотную последовательность как изложено в таблице 7, и CDR VL (например, как изложено в таблице 2, 4 или 6) из VL, которая содержит аминокислотную последовательность как изложено в таблице 8.
[00271] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, можно описывать только с помощью их домена VH, или только их домена VL, или только с помощью их трех CDR VH, или только с помощью их трех CDR VL. См., например, Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915, включенный в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме, где описана гуманизация антитела мыши против αvβ3 посредством идентификации комплементарной легкой цепи или тяжелой цепи, соответственно, в библиотеке легких цепей или тяжелых цепей человека, которая ведет к вариантам гуманизированного антитела, имеющим аффинности, которые равны или превышают аффинность исходного антитела. См. также Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628, включенный в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме, где описаны способы получения антител, которые связывают специфический антиген, с использованием специфического домена VH (или домена VL) и скрининга библиотеки на комплементарные вариабельные домены. См. также, Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, включенный в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме, где описаны способы получения антител, которые связывают специфический антиген, с использованием специфического домена VH и скрининга библиотеки (например, библиотеки VL человека) на комплементарные домены VL; выбранные домены VL, в свою очередь, можно использовать для того, чтобы направлять выбор дополнительных комплементарных доменов VH (например, человека).
[00272] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут представлять собой гуманизированное антитело, например, гуманизированную форму антитела грызуна. Гуманизированные антитела можно получать с использованием различных способов, известных в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров пересадку CDR (европейский патент № EP 239,400; международная публикация № WO 91/09967; и патенты США №№ 5225539, 5530101 и 5585089), перестановку цепей (патент США № 5565332), вениринг или изменение поверхности (европейские патенты №№ EP 592,106 и EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; и Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), и способы, раскрытые, например, в патенте США № 6407213, патенте США № 5766886, WO 9317105, Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), и Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002). Также см. публикацию патента США № US 2005/0042664 A1 (24 февраля 2005 года), каждое из которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00273] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут представлять собой составное антитело человека. Составное антитело человека можно создавать посредством, например, конструирования последовательностей вариабельных областей из фрагментов нескольких последовательностей вариабельных областей антител человека, таким образом, чтобы избегать T-клеточных эпитопов, тем самым минимизируя иммуногенность получаемого антитела (см., например, Baker et al., 2010, Self Nonself., 1(4):314-322; Bryson et al., 2010, BioDrugs, 24(1):1-8; и Jones et al., 2009, Methods Mol Biol., 525:405-23). Такие антитела могут содержать человек последовательности константной области, например, константных областей легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
[00274] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут представлять собой деиммунизированное антитело. Деиммунизированное антитело представляет собой антитело, в котором удалены T-клеточные эпитопы. Описаны способы получения деиммунизированных антител. См., например, Jones et al., Methods Mol Biol. 2009;525:405-23, xiv, и De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148-153(2006)).
[00275] В конкретных вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, представляют собой гуманизированный иммуноглобулин, который содержит 3 CDR VH и 3 CDR VL (т. е., CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL) каких-либо антител в таблице 1, таблице 2, и таблице 3, и таблице 4, таблице 5 и таблице 6, соответственно, полученные у человека каркасные области и полученные у человека константные области. Неограничивающие примеры каркасных областей человека описаны в данной области, например, см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е издание, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242). В определенном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат каркасные области (например, каркасные области домена VL и/или домена VH), которые представляют собой каркасные области человека или получены из каркасных областей человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат каркасные области (например, каркасные области домена VL и/или домена VH), которые представляют собой каркасные области примата (например, примата, не являющегося человеком) или каркасные области, происходящие от примата (например, примата, не являющегося человеком). Например, CDR из антигенспецифичных антител, не принадлежащих человеку, обычно происходящих от грызуна (например, мыши или крысы), пересаживают на гомологи человека или примата, не являющегося человеком (например, человекообразных обезьян, например, Pan troglodytes, Pan paniscus или Gorilla gorilla, Pan troglodytes, мартышковых, например, из рода Macaca, или яванского макака Macaca cynomolgus). Каркасные последовательности приматов, не являющихся человеком, описаны в публикации патентной заявки США № US 2005/0208625.
[00276] В частном варианте осуществления положение CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH в области VH и/или положение CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL в области VL антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающему фрагменту, описанным в настоящем описании, могут варьировать на 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше положений аминокислот, при условии (i) сохранения иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) сохранения отсутствия иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) сохранения ингибирования инвазии матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16 (например, по существу сохранения, например, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%). В другом варианте осуществления длина CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH в области VH и/или длина CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL в области VL антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, может варьировать (например, быть короче или длиннее) на 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше аминокислот, при условии (i) сохранения иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) сохранения отсутствия иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) сохранения ингибирования инвазии матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16 (например, по существу сохранения, например, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%). В другом варианте осуществления аминоконец и/или карбоксиконец CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, описанных в настоящем описании, может быть продлен или укорочен на 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше аминокислот по сравнению с одним или несколькими CDR, описанными в настоящем описании, при условии (i) сохранения иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) сохранения отсутствия иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) сохранения ингибирования инвазии матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16 (например, по существу сохранения, например, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%). В рамках изобретения, термины «иммуноспецифически связывает», «иммуноспецифически распознает», «специфически связывает» и «специфически распознает» представляют собой аналогичные термины в контексте антител и относятся к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с антигеном (например, эпитопом или иммунным комплексом) через участки связывания антигена, как понимает специалист в данной области, и не исключают перекрестной реактивности антитела или антигенсвязывающего фрагмента с другими антигенами. Любой известный в данной области способ можно использовать для того, чтобы устанавливать, (i) сохраняется ли иммуноспецифическое связывание с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) сохраняется ли отсутствие иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) сохраняется ли ингибирование инвазии матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16, например, анализы связывания ELISA или анализ FACs, как описано далее в разделе 6.
[00277] В конкретных аспектах изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь антитела и/или легкую цепь, например, только тяжелую цепь, только легкую цепь или как тяжелую цепь, так и легкую цепь. В отношении тяжелой цепи, в частном варианте осуществления тяжелая цепь антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанных в настоящем описании, может представлять собой альфа (α), дельта (δ), ипсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ) тяжелую цепь. В другом конкретном варианте осуществления тяжелая цепь описанного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать альфа (α), дельта (δ), ипсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ) тяжелую цепь человека.
[00278] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, которые (i) иммуноспецифически связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) не имеют иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) ингибируют инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют указанную первую форму MUC16, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, имеющие аминокислотные последовательности из SEQ ID № 103, SEQ ID № 104 и SEQ ID № 105, соответственно, SEQ ID № 109, SEQ ID № 110 и SEQ ID № 111, соответственно, или SEQ ID № 115, SEQ ID № 116 и SEQ ID № 117, соответственно, и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область альфа (α), дельта (δ), ипсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ)тяжелой цепи человека. В рамках изобретения, термин «константная область» или «константный домен» являются взаимозаменяемыми и имеют в данной области обычное значение. Константная область представляет собой часть антитела, например, C-концевую часть легкой и/или тяжелой цепи, которая непосредственно не участвует в связывании антитела с антигеном, но которая может проявлять различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с Fc-рецептором. Константная область молекулы иммуноглобулина в целом имеет более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с вариабельным доменом иммуноглобулина. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH антитела 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е., те, которые перечислены в таблице 1, таблице 3 или таблице 5) и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область альфа (α), дельта (δ), ипсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ) тяжелой цепи человека.
[00279] В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 101, и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область альфа (α), дельта (δ), ипсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ) тяжелой цепи человека. В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1, SEQ ID № 21, SEQ ID № 41, SEQ ID № 61 или SEQ ID № 81 и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область альфа (α), дельта (δ), ипсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ) тяжелой цепи человека.
[00280] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, которые имеют аминокислотные последовательности из SEQ ID № 103, SEQ ID № 104 и SEQ ID № 105, соответственно, или SEQ ID № 109, SEQ ID № 110 или SEQ ID № 111, соответственно, или SEQ ID № 115, SEQ ID № 116 или SEQ ID № 117, соответственно, и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи человека. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из любой одной из CDR VH антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 1, таблице 3 и таблице 5), и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи человека. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 101, и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи человека. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из любой одной из CDR VH антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 7), и в которой константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи человека. Неограничивающие примеры последовательностей константной области человека описаны в данной области, например, см. выше Kabat EA et al., (1991).
[00281] В отношении легкой цепи, в частном варианте осуществления легкая цепь антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанных в настоящем описании, представляет собой каппа легкую цепь. В другом конкретном варианте осуществления, легкая цепь антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, представляет собой лямбда легкую цепь. В еще одном другом конкретном варианте осуществления, легкая цепь антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, представляет собой каппа легкую цепь человека или лямбда легкую цепь человека.
[00282] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, которые имеют аминокислотные последовательности антитела SEQ ID № 106, SEQ ID № 107 и SEQ ID № 108, соответственно, или SEQ ID № 112, SEQ ID № 113 и SEQ ID № 114, соответственно, или SEQ ID № 118, SEQ ID № 119 и SEQ ID № 120, соответственно, и в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа или лямбда легкой цепи. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL антитела 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 2, таблице 4 или таблице 6) и в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа или лямбда легкой цепи.
[00283] В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 102, и в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа или лямбда легкой цепи. В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2, SEQ ID № 22, SEQ ID № 42, SEQ ID № 62 или SEQ ID № 82, и в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа или лямбда легкой цепи.
[00284] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, которые имеют аминокислотные последовательности из SEQ ID № 106, SEQ ID № 107 и SEQ ID № 108, соответственно, или SEQ ID № 112, SEQ ID № 113 и SEQ ID № 114, соответственно, или SEQ ID № 118, SEQ ID № 119 и SEQ ID № 120, соответственно, и в которой константная область легкой цепи содержит аминокислоту константной области легкой цепи человека. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, которые имеют аминокислотные последовательности из любой одной из CDR VL антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 2, таблице 4 и таблице 6), и в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи человека. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 102, и в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи человека. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, в которой аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из любой одной из CDR VL антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 8), и в которой константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи человека. Неограничивающие примеры последовательностей константной области человека описаны в данной области, например, см. Kabat EA et al., (1991) выше.
[00285] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), как описано в настоящем описании, в которых константные области относятся к тому типу, который находят в молекуле иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY или молекуле иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY человека. В другом конкретном варианте осуществления, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат VH и VL, которые содержат какие-либо аминокислотные последовательности, описанные в настоящем описании, и в которых константные области относятся к тому типу, который находят в молекуле иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY, каком-либо классе (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или каком-либо подклассе (например, IgG2a и IgG2b) молекул иммуноглобулинов. В частном варианте осуществления константные области относятся к тому типу, который находят в молекуле иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY человека, каком-либо классе (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или каком-либо подклассе (например, IgG2a и IgG2b) молекул иммуноглобулинов.
[00286] В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь и/или легкую цепь, где (i) тяжелая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, которые имеют аминокислотные последовательности из SEQ ID № 103, SEQ ID № 104 и SEQ ID № 105, соответственно, SEQ ID № 109, SEQ ID № 110 и SEQ ID № 111, соответственно, или SEQ ID № 115, SEQ ID № 116 и SEQ ID № 117, соответственно, и (b) содержит константный домен тяжелой цепи, который представляет собой константный домен тяжелой цепи IgG человека; и/или (ii) легкая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, которые имеют аминокислотные последовательности из SEQ ID № 106, SEQ ID № 107 и SEQ ID № 108, соответственно, или SEQ ID № 112, SEQ ID № 113 и SEQ ID № 114, соответственно, или SEQ ID № 118, SEQ ID № 119 и SEQ ID № 120, соответственно, и (b) константный домен легкой цепи, который представляет собой константный домен IgG человека. В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь и/или легкую цепь, где (i) тяжелая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, которые имеют аминокислотные последовательности из любой одной из CDR VH антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 1, таблице 3 и таблице 5) и (b) содержит константный домен тяжелой цепи, который представляет собой константный домен тяжелой цепи IgG человека; и/или (ii) легкая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, которые имеют аминокислотные последовательности из любой одной из CDR VL антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 2, таблице 4 и таблице 6), и (b) константный домен легкой цепи, который представляет собой константный домен IgG человека.
[00287] В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь и/или легкую цепь, где (i) тяжелая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 101, и (b) константный домен тяжелой цепи, который представляет собой константный домен IgG человека; и/или (ii) легкая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 102, и (b) константный домен легкой цепи, который представляет собой константный домен каппа легкой цепи человека. В другом конкретном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат тяжелую цепь и/или легкую цепь, где (i) тяжелая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит аминокислотную последовательность VH из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 7), и (b) константный домен тяжелой цепи, который представляет собой константный домен IgG человека; и/или (ii) легкая цепь содержит (a) вариабельную область, которая содержит аминокислотную последовательность VL из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 8), и (b) константный домен легкой цепи, который представляет собой константный домен каппа легкой цепи человека.
[00288] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, или его антигенсвязывающий фрагмент содержат аминокислотные последовательности с процентом идентичности, описанным далее, относительно какой-либо одной из SEQ ID №№ 1-100. Математические алгоритмы можно использовать для того, чтобы определять процент идентичности между двумя последовательностями (например, аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты). Предпочтительный неограничивающий пример математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, представляет собой алгоритм Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268, модифицированный как в Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877. Такой алгоритм встроен в программы NBLAST и XBLAST из Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. Нуклеотидный поиск BLAST можно осуществлять с использованием нуклеотидных параметров программы NBLAST, например, установленных на score=100, wordlength=12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты, описанным в настоящем описании. Белковый поиск BLAST можно осуществлять с использованием параметров программы XBLAST, например, установленных на score 50, wordlength=3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковой молекуле, описанной в настоящем описании. Gapped BLAST можно использовать, как описано в Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402, для получения выравниваний с пропусками для целей сравнения. Альтернативно, итеративный поиск, который обнаруживает отдаленное родство между молекулами, можно осуществлять с помощью PSI BLAST (Id.). Параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) можно использовать (см., например, National Center for Biotechnology Information (NCBI) во всемирной сети, ncbi.nlm.nih.gov) при использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI Blast. Другой предпочтительны не ограничивающий пример математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Такой алгоритм встроен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения для выравнивания последовательностей GCG. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать матрицу весов остатков PAM120, штраф за продление пропуска 12 и штраф за пропуск 4. Кроме того, процент идентичности между двумя последовательностями можно определять с использованием способов, схожих с теми, которые описаны выше, разрешая или не разрешая пропуски. Обычно только точные совпадения считают при вычислении процента идентичность.
[00289] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH, которая имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 101. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH, которая имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VH из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 1B5 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 7). В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат домен VH, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 101, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), которые идентичны CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), приведенным в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4, таблице 5 или таблице 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат домен VH, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VH из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 7), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), которые идентичны CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), приведенным в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4, таблице 5 или таблице 6.
[00290] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VL, которая имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 102. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VL, которая имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VL из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 1B5 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 8). В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат домен VL, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 102, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), которые идентичны CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), приведенным в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4, таблице 5 или таблице 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат домен VL, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VL из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 7), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), которые идентичны CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), приведенным в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4, таблице 5 или таблице 6.
[00291] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат: (i) домен VH, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 101; и (ii) домен VL, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 102. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат: (i) домен VH, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VH из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 8); и (ii) домен VL, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VL из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 7), соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат: (i) домен VH, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 101; и (ii) домен VL, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 102, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), которые идентичны CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), приведенным в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4, таблице 5 или таблице 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат: (i) домен VH, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VH из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 8); и (ii) домен VL, который имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью VL из любого одного из антител 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 18C6 (т. е. тех, которые перечислены в таблице 7), соответственно, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), которые идентичны CDR (например, CDR VH и/или CDR VL), приведенным в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4, таблице 5 или таблице 6.
[00292] В другом аспекте изобретение относится к антителам, которые связывают тот же или перекрывающийся эпитоп антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем описании (например, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и/или 16C5). В рамках изобретения, «эпитоп» является термином в данной области и может относиться к локализованной области антигена, с которой антитело может иммуноспецифически связываться. Эпитоп может представлять собой, например, прилегающие аминокислоты полипептида (линейный или непрерывный эпитоп) или эпитоп, например, может собираться вместе из двух или больше не непрерывных областей полипептида или полипептидов (конформационный, нелинейный или не непрерывный эпитоп). В некоторых вариантах осуществления эпитоп антитела можно определять посредством, например, ЯМР спектроскопии, рентгеновских дифракционных кристаллографических исследований, анализа ELISA, обмена водород/дейтерий в сочетании с масс-спектрометрией (например, MALDI масс-спектрометрией), матричного сканирующего анализа олигопептидов и/или картирования мутагенеза (например, картирования сайт-специфического мутагенеза). При рентгеновской кристаллографии кристаллизацию можно выполнять с использованием какого-либо из способов, известных в данной области (например, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Кристаллы антитело:антиген можно изучать с использованием хорошо известных способов рентгеновской дифракции и уточнение можно проводить с использованием компьютерного программного обеспечения, такого как X-PLOR (Yale University, 1992, распространитель Molecular Simulations, Inc.; см., например, Meth Enzymol (1985), тома 114 и 115, под редакцией Wyckoff HW et al.,; патентную заявку США № 2004/0014194), и BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ред. Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Исследования по картированию мутагенеза можно выполнять с использованием какого-либо способа, известного специалисту в данной области. См., например, в Champe M et al., (1995) и Cunningham BC & Wells JA (1989) описание мутагенетических способов, включая способы сканирующего аланинового мутагенеза. Кроме того, антитела, которые распознают и связываются с одним и тем же или перекрывающимися эпитопами, можно идентифицировать с использованием повседневных способов, таких как иммунологический анализ, например, демонстрируя способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном, т. е., анализ конкурентного связывания. Анализы конкурентного связывания также можно использовать для того, чтобы определять, имеют ли два антитела схожую специфичность связывания с эпитопом. Конкурентное связывание можно определять в анализе, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует иммуноспецифическое связывание эталонного антитела с общим антигеном. Известно множество типов анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммунный анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (см. Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614-9); твердофазный прямой меченый анализ, твердофазный прямой меченый сэндвич-анализ (см. Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); тврдофазный прямой меченный RIA с использованием метки I-125 (см. Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546-52); и прямой меченный RIA. (Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Обычно такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих любой из этих не меченого тестового иммуноглобулина и меченного эталонного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование можно измерять посредством определения количества метки, связанной с твердой поверхностью, или клеток в присутствии тестового иммуноглобулина. Обычно тестовый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать иммуноспецифическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% или больше. Анализ конкурентного связывания можно создавать в большом числе различных форматов с использованием или меченого антигена или меченого антитела. В обыкновенной версии этого анализа антиген иммобилизуют на 96-луночном планшете. Способность не меченых антител блокировать связывание меченых антител с антигеном после этого измеряют с использованием радиоактивных или ферментативных меток. Более подробно см., например, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 и Antibodies: A Laboratory Manual, под ред. Ed Harlow E & Lane D, выше, стр. 386-389.
[00293] В определенных аспектах анализы конкурентного связывания можно использовать для того, чтобы определять, происходит ли конкурентное блокирование антитела, например, дозозависимым образом, с помощью другого антитела, например, антитело связывает по существу тот же эпитоп или перекрывающиеся эпитопы, как эталонное антитело, когда два антитела распознают идентичные или пространственно перекрывающиеся эпитопы, в анализах конкурентного связывания, таких как конкретные ELISA анализы, которые можно выполнять во множестве различных форматов, используя или меченый антиген или меченое антитело. В частном варианте осуществления антитело можно тестировать в анализах конкурентного связывания с использованием антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании (например, IgG антитело мыши, содержащее вариабельную область из 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 16C5).
[00294] В другом аспекте изобретение относится к антителам, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, описанными в настоящем описании (например, IgG антитело мыши, содержащее вариабельную область из 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 16C5), как определяют с использованием анализов, известных специалисту в данной области или описанных в настоящем описании (например, ELISA). В другом аспекте изобретение относится к антителам, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании (например, IgG антитело мыши, содержащее вариабельную область из 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 или 16C5), с MUC16, как определяют с использованием анализов, известных специалисту в данной области или описанных в настоящем описании (например, ELISA).
[00295] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с антителом, описанным в настоящем описании для связывания, в той же степени, что и антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, конкурируют сами с собой для связывания с MUC16. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлено первое антитело, которое конкурирует с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, описанными в настоящем описании, за связывание с MUC16, у которого конкурентность проявлена в виде сниженного связывания первого антитела с эпитопом больше чем на 80% (например, 85%, 90%, 95%, или 98% или от 80% до 85%, от 80% до 90%, от 85% до 90% или от 85% до 95%).
[00296] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащими VH, которая содержит CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 1, таблице 3 или таблице 5. В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащими CDR VH из 10C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащими CDR VH из 7B12 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VH из 19C11 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VH из 16C5 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VH из 18C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5).
[00297] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат VL, которая содержит CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 2, таблице 4 или таблице 6. В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VL из 10C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VL из 7B12 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VL из 19C11 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VL из 16C5 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VL из 18C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6).
[00298] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) VH, которая содержит CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 1, таблице 3 или таблице 5; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 2, таблице 4 или таблице 6. В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) CDR VH из 10C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 10C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) CDR VH из 7B12 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 7B12 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) CDR VH из 19C11 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 19C11 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) CDR VH из 16C5 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 16C5 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) CDR VH из 18C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 18C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6).
[00299] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VH, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 7. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81.
[00300] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VL, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 8. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82.
[00301] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 7; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 8. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82.
[00302] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит VH, которая содержит CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 1, таблице 3 или таблице 5. В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VH из 10C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VH из 7B12 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за иммуноспецифическое связывание с MUC16 с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат CDR VH из 19C11 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VH из 16C5 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VH из 18C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5).
[00303] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит VL, которая содержит CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 2, таблице 4 или таблице 6. В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VL из 10C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VL из 7B12 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VL из 19C11 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VL из 16C5 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит CDR VL из 18C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6).
[00304] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) VH, которая содержит CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 1, таблице 3 или таблице 5; и (b) VL, которая содержит CDR1 VL, CDR2 VL и/или CDR3 VL, которые содержат аминокислотные последовательности, как описано в таблице 2, таблице 4 или таблице 6. В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) CDR VH из 10C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 10C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) CDR VH из 7B12 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 7B12 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) CDR VH из 19C11 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 19C11 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) CDR VH из 16C5 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 16C5 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6). В частном варианте осуществления изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) CDR VH из 18C6 (см. таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5); и (b) CDR VL из 18C6 (см. таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6).
[00305] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VH, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 7. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81.
[00306] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VL, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 8. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82.
[00307] В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 7; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность, как описано в таблице 8. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62. В конкретных аспектах, изобретение относится к антителу к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела, которое содержит (a) домен VH, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81; и (b) домен VL, который имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82.
D
A
D
[00308] Анализы, известные специалисту в данной области или описанные в настоящем описании (например, рентгеновскую кристаллографию, ELISA анализы и т. д.) можно использовать для того, чтобы определять, связываются ли два антитела с одним и тем же эпитопом. Аффинность можно измерять и/или выражать множеством путей, известных в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров равновесную константу диссоциации (K), и равновесную константу ассоциации (K). K можно определять способами, известными специалисту в данной области, такими как интерферометрия биослоя.
[00309] В некоторых вариантах осуществления эпитоп антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, используют в качестве иммуногена для того, чтобы получать антитела. См. способы получения антител, например, в разделе 5.3 и разделе 6.2.
5.1.2 ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
d
d
d
d
d
d
d
d
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-3
-4
-3
-3
-3
-4
-4
[00310] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k меньше чем 0,5×10/с, 1×10/с, 1,5×10/с, 2×10/с, 2,5×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с, 8×10/с, 9×10/с, 1×10/с, 2×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с или 8×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 0,5×10/с, 1×10/с, 1,5×10/с, 2×10/с, 2,5×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с, 8×10/с, 9×10/с, 1×10/с, 2×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с, или 8×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно от 0,5×10/с до 8×10/с. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 1×10/с. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 1,5×10/с. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 2×10/с. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 2×10/с. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 7×10/с.
a
a
a
a
a
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
4
4
4
[00311] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k по меньшей мере 2,5×10/с, 3×10/с, 3,5×10/с, 4×10/с, 4,5×10/с, 5×10/с, 5,5×10/с, 6×10/с, 6,5×10/с, 7×10/с, 7,5×10/с, 8×10/с, 9×10/с или 9×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 2,5×10/с, 3×10/с, 3,5×10/с, 4×10/с, 4,5×10/с, 5×10/с, 5,5×10/с, 6×10/с, 6,5×10/с, 7×10/с, 7,5×10/с, 8×10/с, 9×10/с или 9×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 4×10/с. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 6×10/с. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с k приблизительно 7,5×10/с.
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
[00312] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K меньше чем 1000 нМ, 500 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ или 0,05 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно 1000 нМ, 500 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ или 0,05 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно от 500 нМ до 1000 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно от 5 нМ до 75 нМ. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно 7 нМ. В другом конкретном варианте осуществления, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно 10 пМ. В другом конкретном варианте осуществления, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно 15 пМ. В другом конкретном варианте осуществления, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно 20 пМ. В другом конкретном варианте осуществления, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно 25 пМ. В другом конкретном варианте осуществления, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с MUC16 с K приблизительно 65 пМ. В рамках изобретения, термин «приблизительно», когда используют для того, чтобы модифицировать числовое значение или числовой диапазон, указывает на то, что отклонения от 5% до 10% выше и от 5% до 10% ниже значения или диапазона остаются в пределах предполагаемого смысла указанного значения или диапазона.
[00313] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке (например, клетку раке яичника, клетку раке легкого, клетку раке поджелудочной железы, клетку раке молочной железы, клетку раке фаллопиевой трубы, клетку раке матки (например, эндометрия) или клетку раке первичной брюшины). В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке яичника. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке легкого. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке молочной железы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке матки (например, эндометрия). В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке фаллопиевой трубы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку раке первичной брюшины. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку SKOV3. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133, по меньшей мере в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500 или 1000 раз сильнее, чем изотипическое контрольное антитело, которое связывается с клетками. Изотипическое контрольное антитело является термином, принятым в данной области. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133, приблизительно в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500 или 1000 раз сильнее, чем изотипическое контрольное антитело связывается с клеткой. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133, между 10 и 50, 50 и 100, 100 и 250, 250 и 500 или 500 и 1000 раз сильнее, чем изотипическое контрольное антитело связывается с клеткой.
c114
c114
[00314] Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 133, также упоминают в настоящем описании как MUC16, и он состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16 (SEQ ID № 150 представляет собой последовательность зрелого MUC16). MUC16 способен к N-гликозилированию по аминокислоте аспарагин в положениях 1, 24 и 30 из SEQ ID № 133 (соответствующих положениям аминокислот Asn1777, Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150).
[00315] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, не имеют иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки раке яичника. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки раке легкого. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки раке поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки раке молочной железы. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки раке матки (например, эндометрия). В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки раке фаллопиевых труб. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки раке первичной брюшины. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки SKOV3. В некоторых вариантах осуществления вторую форму MUC16 сливают с поддающимся обнаружению белком, таким как, например, зеленый флуоресцентный белок или красный флуоресцентный белок. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139, самое большее в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз сильнее, чем изотипическое контрольное антитело связывается с клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139, приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз сильнее, чем изотипическое контрольное антитело связывается с клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139, между 0 и 1,1, 1,1 и 1,5, 1,5 и 3, или 3 и 5 раз сильнее, чем изотипическое контрольное антитело связывается с клетками.
c114-N3
c114-N3
c114-N3
[00316] Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 139, также упоминают в настоящем описании как MUC16. MUC16 состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16 (SEQ ID № 150 представляет собой последовательность зрелого MUC16), за исключением того, что аспарагин в положении аминокислоты 30 (соответствующем положению аминокислоты 1806 из SEQ ID № 150) мутирован в аланин. Таким образом, MUC16 не способен к N-гликозилированию в положении аминокислоты 30 из SEQ ID № 139 (соответствующем положению аминокислоты Asn1806 из SEQ ID № 150).
[00317] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139, по меньшей мере в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30 или 40 раз слабее, чем 4H11 связывается с клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139, приблизительно в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30 или 40 раз слабее, чем 4H11 связывается с клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует вторую форму MUC16, эта вторая форма не гликозилирована, и где аминокислотная последовательность второй формы представляет собой SEQ ID № 139, между 3 и 5, 5 и 10, 10 и 20, или 20 и 40 раз слабее, чем 4H11 связывается с клеткой.
[00318] Анализы для того, чтобы определять связывание антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанные в настоящем описании, с клеткой, например, такие как FACs, известны специалисту в данной области. См., например, способы, описанные в разделе 6.2.
[00319] В рамках изобретения, «4H11» относится к моноклональному антителу против MUC16 с обозначением 4H11 в Rao et al., Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72 и в публикации международной патентной заявки № WO 2011/119979.
[00320] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, связываются с пептидом, который содержит аминокислотную последовательность CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), в которой аминокислотный остаток номер 4 (N4) и аминокислотный остаток номер 10 (N10) из CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130) гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления пептид состоит из аминокислотной последовательности CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), в которой аминокислотный остаток номер 4 (N4) и аминокислотный остаток номер 10 (N10) из CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130) гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование состоит из N-связанной хитобиозы. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с пептидом, который содержит аминокислотную последовательность CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131), где аминокислотный остаток номер 7 (N7) из CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131) гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления пептид состоит из аминокислотной последовательности CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131), где аминокислотный остаток номер 7 (N7) из CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131) гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование состоит из N-связанной хитобиозы. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается со смесью пептидов, где смесь пептидов содержит (a) первый пептид, который содержит аминокислотную последовательность CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), где аминокислотный остаток номер 4 (N4) и аминокислотный остаток номер 10 (N10) из CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130) гликозилированы, и (b) второй пептид, который содержит аминокислотную последовательность CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131), где аминокислотный остаток номер 7 (N7) из CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131) гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления первый пептид состоит из аминокислотной последовательности CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), где аминокислотный остаток номер 4 (N4) и аминокислотный остаток номер 10 (N10) из CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130) гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления второй пептид состоит из аминокислотной последовательности CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131), где аминокислотный остаток номер 7 (N7) из CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131) гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование состоит из N-связанной хитобиозы.
[00321] Анализы для того, чтобы определять связывание антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, с клеткой, например, такие как ELISA, известны специалисту в данной области. См., например, способы, описанные в разделе 6.2. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 30 раз сильнее, чем связывание моноклонального антитела против MUC16 4H11 с пептидом. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) приблизительно в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 30 раз сильнее, чем связывание моноклонального антитела против MUC16 4H11 с пептидом.
d
d
d
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-4
-3
-4
[00322] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с k меньше чем 0,5×10/с, 1×10/с, 1,5×10/с, 2×10/с, 2,5×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с, 8×10/с, 9×10/с, 1×10/с, 2×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с или 8×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с k приблизительно 0,5×10/с, 1×10/с, 1,5×10/с, 2×10/с, 2,5×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с, 8×10/с, 9×10/с, 1×10/с, 2×10/с, 3×10/с, 4×10/с, 5×10/с, 6×10/с, 7×10/с или 8×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с k приблизительно от 0,5×10/с до 8×10/с.
a
a
a
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
4
5
[00323] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с k по меньшей мере 2,5×10/с, 3×10/с, 3,5×10/с, 4×10/с, 4,5×10/с, 5×10/с, 5,5×10/с, 6×10/с, 6,5×10/с, 7×10/с, 7,5×10/с, 8×10/с, 9×10/с или 9×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с k приблизительно 2,5×10/с, 3×10/с, 3,5×10/с, 4×10/с, 4,5×10/с, 5×10/с, 5,5×10/с, 6×10/с, 6,5×10/с, 7×10/с, 7,5×10/с, 8×10/с, 9×10/с или 9×10/с. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с k приблизительно от 2,5×10/с до 9×10/с.
D
D
D
[00324] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с K меньше чем 1000 нМ, 500 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ или 0,05 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) with a K приблизительно 1000 нМ, 500 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ или 0,05 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, связываются с пептидом(ами) с K приблизительно от 500 нМ до 1000 нМ.
[00325] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или антигенсвязывающий фрагмент не имеют иммуноспецифического связывания с аминокислотной последовательностью CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), где аминокислотный остаток номер 4 (N4) и аминокислотный остаток номер 10 (N10) из CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130) не гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент не имеют иммуноспецифического связывания с аминокислотной последовательностью CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131), где аминокислотный остаток номер 7 (N7) из CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131) гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, не имеют иммуноспецифического связывания со смесью пептидов, где смесь пептидов содержит (a) первый пептид, который состоит из аминокислотной последовательности CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), где аминокислотный остаток номер 4 (N4) и аминокислотный остаток номер 10 (N10) из CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130) гликозилированы, и (b) второй пептид, который состоит из аминокислотной последовательности CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131), где аминокислотный остаток номер 7 (N7) из CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131) гликозилирован.
c114
c114
c114
c114
c114
c114
[00326] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, ингибируют инвазию матригеля in vitro клетками, которые рекомбинантно экспрессируют определенную форму MUC16, которая гликозилирована, и где аминокислотная последовательность определенной формы MUC16 представляет собой SEQ ID № 133 (MUC16). В некоторых вариантах осуществления клетки, которые рекомбинантно экспрессируют гликозилированный MUC16, представляют собой клетки SKOV3. В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной. В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной по аминокислотному остатку Asn30 (соответствующему Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной по аминокислотным остаткам Asn 24 и Asn30 (соответствующим Asn1800 и Asn1806, соответственно, зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной по аминокислотным остаткам Asn1, Asn24 и Asn30 (соответствующим Asn1777, Asn1800 и Asn1806, соответственно, зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). В некоторых вариантах осуществления гликозилирование содержит N-связанную хитобиозу. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование состоит из N-связанной хитобиозы. В некоторых вариантах осуществления инвазию матригеля ингибируют по меньшей мере в 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению с инвазией матригеля in vitro клетками, где клетки обрабатывают контрольным антителом (например, антителом, которое не нацелено на MUC16) или с использованием 4H11. В некоторых вариантах осуществления инвазию матригеля ингибируют приблизительно в 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению с инвазией матригеля in vitro клетками, где клетки обрабатывают контрольным антителом (например, антителом, которое не нацелено на MUC16) или с использованием 4H11.
2
2
[00327] Анализы для того, чтобы определять ингибирование инвазии матригеля, опосредованное антителом к гликозилированному MUC16 или антигенсвязывающим фрагментом, известны специалисту в данной области. См., например, способы, описанные в разделе 6.2. Например, BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Inserts or Chambers (№ по каталогу 354480 в 24-луночном планшете) и Control Inserts (№ по каталогу 354578 в 24-луночном планшете) можно приобретать в BD Biosciences, MA. Анализ инвазии матригеля можно осуществлять в соответствии с протоколом производителя. В кратком изложении, матригелевые камеры в 24-луночных планшетах (которые хранят при -20°C) и контрольные вставки (которые хранят при 4°C) оставляют, чтобы они доходили до комнатной температуры. Обе вставки регидратируют с использованием 0,5 мл бессывороточной среды во вставке, а также во внешней лунке 24-луночного планшета, в течение 2 ч при 37°C 5% CO во влажном инкубаторе. Культивируемые клетки SKOV3 трипсинизируют и промывают средой для культивирования. Миллион клеток отделяют в другую пробирку для центрифуги и промывают 3 раза бессывороточной средой. Эти клетки позднее корректируют, чтобы получить 5000 клеток в 0,5 мл бессывороточной среды. Среду в регидратированных вставках удаляют и вставки переносят в новый 24-луночный планшет, содержащий 0,75 мл среды для культивирования, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), в лунке, которая служит в качестве хемоаттрактанта. Незамедлительно во вставку добавляют 0,5 мл клеток (5000 клеток) в бессывороточной среде. Надлежащее внимание уделяют проверки, чтобы воздушные пузырьки не застревали во вставке внешней лунке. 24-луночный планшет инкубируют при 37°C 5% CO во влажном инкубаторе в течение 48 ч. После инкубации не проникающие клетки удаляют с верхней поверхности мембраны «отскребанием», вставляя тампон с хлопком на конце в матригель или контрольную вставку и аккуратно прикладывая давление, при этом перемещая кончик тампона по поверхности мембраны. Отскребание повторяют с использованием второго тампона, увлажненного в среде. Затем вставки окрашивают в новом 24-луночном планшете, содержащем 0,5 мл 0,5% красителя кристаллического фиолетового в дистиллированной воде в течение 30 минут. После окрашивания вставки споласкивают в 3 стаканах дистиллированной воды для того, чтобы удалять избыточный краситель. Вставки сушат на воздухе в новом 24-луночном планшете. Проникшие клетки считают вручную под инвертированным микроскопом на увеличении 200×. Несколько полей мембран в трех повторениях подсчитывали и регистрировали на фиг.
c114
[00328] В некоторых вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, способны ингибировать или снижать метастазирование, ингибировать опухолевый рост или индуцировать регресс опухоли в исследованиях в модели на мышах. Например, линии опухолевых клеток можно вводить бестимусным голым мышам, и бестимусным мышам можно вводить антитела к гликозилированному MUC16, описанные в настоящем описании, один или несколько раз, и можно осуществлять мониторинг прогрессирования опухоли из инъецированных опухолевых клеток в течение периода в недели и/или месяцы. В некоторых случаях, введение антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов бестимусным голым мышам может происходить перед введением линий опухолевых клеток. В определенном варианте осуществления клетки SKOV3, экспрессирующие MUC16, используют для моделей ксенотрансплантата на мышах, описанных в настоящем описании. См., например, раздел 6.2 и раздел 6.3.
[00329] В конкретных вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, ингибируют опухолевый рост или индуцируют регресс опухоли в модели на мышах по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100%, как оценивают способами, описанными в настоящем описании или известными специалисту в данной области, по сравнению с мышами, которые получали имитацию лечения. В конкретных вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, ингибируют опухолевый рост или индуцируют регресс опухоли в модели на мышах по меньшей мере приблизительно на 25% или 35%, необязательно приблизительно до 75%, как оценивают способами, описанными в настоящем описании или известными специалисту в данной области, по сравнению с мышами, которые получали имитацию лечения. В конкретных вариантах осуществления, антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, ингибируют опухолевый рост или индуцируют регресс опухоли в модели на мышах посредством по меньшей мере приблизительно в 1 раз, 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, как оценивают способами, описанными в настоящем описании или известными специалисту в данной области, по сравнению с мышами, которые получали имитацию лечения. Мышей, которые получали имитацию лечения, например, можно лечить фосфатно-солевым буфером или контролем (например, антителом против IgG).
[00330] Определение ингибирования роста опухоли или регресса опухоли можно оценивать, например, посредством мониторинга размера опухоли за период времени, например, посредством физического измерения пальпируемых опухолей или других визуальных способов обнаружения. Например, можно создавать линии опухолевых клеток для того, чтобы рекомбинантно экспрессировать визуализирующее средство, такое как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или люцифераза, затем визуализацию GFP in vivo можно осуществлять посредством микроскопии, а визуализацию люциферазы in vivo можно осуществлять посредством вконтроля субстрата люциферазы мышам с ксенотрансплантатами и обнаружения люминесценции из-за того, что фермент люцифераза преобразует субстрат люциферазы. Степень или уровень обнаружения GFP или люциферазы коррелирует с размером опухоли у мышей с ксенотрансплантатами.
[00331] В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, могут повышать выживаемость животных в моделях ксенотрансплантата опухоли по сравнению с мышами, которые получали имитацию лечения. В конкретных вариантах осуществления, антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, повышают выживаемость мышей в моделях ксенотрансплантата опухоли по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, как оценивают способами, описанными в настоящем описании или известными специалисту в данной области, по сравнению с мышами, которые получали имитацию лечения. В конкретных вариантах осуществления, антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, повышают выживаемость мышей в моделях ксенотрансплантата опухоли по меньшей мере приблизительно на 25% или 35%, необязательно приблизительно до 75%, как оценивают способами, описанными в настоящем описании или известными специалисту в данной области, по сравнению с мышами, которые получали имитацию лечения, в моделях ксенотрансплантата опухоли. В конкретных вариантах осуществления, антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, повышают выживаемость мышей в моделях ксенотрансплантата опухоли по меньшей мере приблизительно в 1 раз, 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, как оценивают способами, описанными в настоящем описании или известными специалисту в данной области, по сравнению с мышами, которые получали имитацию лечения, в моделях ксенотрансплантата опухоли. Выживаемость, например, можно определять посредством построения кривой выживаемости для числа выживших мышей в зависимости от времени (например, сутки или недели) после инъекции линии опухолевых клеток. Мышей, которые получали имитацию лечения, например, можно лечить фосфатно-солевым буфером или контролем (например, антителом против IgG).
c114
c114
c114
c114
c114
c114
[00332] В некоторых вариантах осуществления происходит интернализация антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, в клетку, которая экспрессирует определенную форму MUC16, которая гликозилирована, и где аминокислотная последовательность определенной формы MUC16 представляет собой SEQ ID № 133 (MUC16), при контакте клетки с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом. «Интернализированный» или «интернализация», по отношению к молекуле, которую интернализирует клетка, относится к прохождению молекулы, которая находится в контакте с внеклеточной поверхностью клеточной мембраны, через клеточную мембрану на внутриклеточную поверхность клеточной мембраны и/или в цитоплазму клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки, которые рекомбинантно экспрессируют гликозилированный MUC16, представляют собой клетки SKOV3. В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной. В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной по аминокислотному остатку Asn30 (соответствующему Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной по аминокислотным остаткам Asn 24 и Asn30 (соответствующим Asn1800 и Asn1806, соответственно, зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). В некоторых вариантах осуществления гликозилированная форма MUC16 является N-гликозилированной по аминокислотным остаткам Asn1, Asn24 и Asn30 (соответствующим Asn1777, Asn1800 и Asn1806, соответственно, зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). В некоторых вариантах осуществления гликозилирование содержит N-связанную хитобиозу. В некоторых вариантах осуществления гликозилирование состоит из N-связанной хитобиозы.
89
c114
5
2
[00333] Анализы для того, чтобы определять интернализацию антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, в клетку, такие как, например, с использованием радиомеченных антител, известны специалисту в данной области. См., например, способы, описанные в разделе 6.2. Например, интернализацию меченного Zr антитела можно исследовать на клетках SKOV3, экспрессирующих MUC16. В кратком изложении, приблизительно 1×10 клеток высевают в 12-луночный планшет и инкубируют в течение ночи при 37°C 5% CO в инкубаторе. Определенный объем радиоактивно меченного белка добавляют в каждую лунку и планшеты инкубируют при 37°C и 4°C в течение 1, 5, 12 и 24 часов. После каждого периода инкубации собирают среду и споласкивают клетки с использованием 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Активность, связанную с поверхностью, собирают посредством промывания клеток в 1 мл 100 мМ уксусной кислоты с использованием 100 мМ глицина (1:1, pH 3,5) при 4°C. Затем прилипшие клетки лизируют с использованием 1 мл 1 M NaOH. Каждый смыв собирают и подсчитывают активность. Соотношение активности в конечном смыве к общей активности всех смывов используют для того, чтобы определять % интернализованных. В некоторых вариантах осуществления анализ осуществляют при 37°C. В некоторых вариантах осуществления интернализация антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента происходит по меньшей мере в 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 процентах клеток, инкубированных с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления интернализация антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента происходит приблизительно в 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 процентах клеток, которые инкубировали с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления интернализация антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента происходит в пределах 1, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20 или 24 часов контакта клеток с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом.
5.2 КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА
[00334] В предпочтительных вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент (см. раздел 5.1), представленные в настоящем описании, не конъюгируют с какой-либо другой молекулой, такой как органический фрагмент, поддающаяся обнаружению метка или изотоп. В альтернативных вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент (см. раздел 5.1), представленные в настоящем описании, конъюгируют с одним или несколькими органическими фрагментами. В альтернативных вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, конъюгируют с одной или несколькими поддающимися обнаружению метками. В альтернативных вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, конъюгируют с одним или несколькими изотопами.
5.2.1 ПОДДАЮЩИЕСЯ ОБНАРУЖЕНИЮ МЕТКИ И ИЗОТОПЫ
[00335] В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлены конъюгаты антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов (см. раздел 5.1), где указанное антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгируют с одним или несколькими средствами, например, визуализирующим средством или цитотоксическим средством. Также в настоящем описании предоставлены конъюгаты биспецифических антител, в которых указанное биспецифическое антитело конъюгируют с одним или несколькими средствами, например, визуализирующим средством или цитотоксическим средством. Также в настоящем описании предоставлены конъюгаты тяжелых цепей антител, в котором указанную тяжелую цепь антитела конъюгируют с одним или несколькими средствами, например, визуализирующим средством или цитотоксическим средством. Также в настоящем описании предоставлены конъюгаты легких цепей антител, в которых указанную легкую цепь антитела конъюгируют с одним или несколькими средствами, например, визуализирующим средством или цитотоксическим средством. Также в настоящем описании предоставлены конъюгаты слитых белков, в которых указанный слитый белок конъюгируют со средством, например, визуализирующим средством или цитотоксическим средством. В некоторых вариантах осуществления средство конъюгируют ковалентно или не ковалентно.
[00336] В некоторых вариантах осуществления визуализирующее средство представляет собой поддающуюся обнаружению метку, такую как хромогенная, ферментативная, радиоизотопная, изотопная, флуоресцентная, токсическая, хемилюминесцентная метка, контрастное средство для ядерного магнитного резонанса или другая метка.
[00337] Неограничивающие примеры подходящих хромогенных меток включают диаминобензидин и 4-гидроксиазо-бензол-2-карбоновую кислоту.
[00338] Неограничивающие примеры подходящих ферментативных меток включают малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, дрожжевую дегидрогеназу спирта, альфа-глицеринфосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, β-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.
3
111
125
131
32
35
14
51
57
58
59
75
152
90
67
217
211
212
47
223
223
89
177
109
111
125
131
111
111
[00339] Неограничивающие примеры подходящих радиоизотопных меток включают H, In, I, I, P, S, C, Cr, To, Co, Fe, Se, Eu, Y, Cu, Ci, At, Pb, Sc, Ra, Ra, Zr, Lu и Pd. В некоторых вариантах осуществления In является предпочтительным изотопом для визуализации in vivo, поскольку он позволяет избежать проблемы дегалогенирования I- или I-меченных антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов в печени. Кроме того, In имеет более благоприятную энергию гамма-излучения для визуализации (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo et al,, J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)). Например, показано, что происходит небольшой захват In, сопряженного с моноклональными антителами с использованием 1-(п-изотиоцианатобензил)-ДПТК, в не опухолевых тканях, в частности, печени и, следовательно, происходит усиление специфичности определения местоположения опухоли (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).
157
55
162
52
56
[00340] Неограничивающие примеры подходящих не радиоактивных изотопных меток включают Gd, Mn, Dy, Tr и Fe.
152
[00341] Неограничивающие примеры подходящих флуоресцентных меток включают метку Eu, флуоресцеиновую метку, изотиоцианатную метку, родаминовую метку, фикоэритриновую метку, фикоцианиновую метку, аллофикоцианиновую метку, метку зеленый флуоресцентный белок (GFP), метку о-фталевый альдегид и флуорескаминовую метку.
[00342] Неограничивающие примеры хемилюминесцентных меток включают люминоловую метку, изолюминоловую метку, метку сложный ароматический эфир акридиния, имидазоловую метку, метку соль акридиния, метку сложный эфир оксалата, люцифериновую метку, люциферазную метку и эквориновую метку.
[00343] Неограничивающие примеры контрастных средств для ядерного магнитного резонанса включают ядра тяжелых металлов, таких как Gd, Mn и железо.
[00344] Способы, известные специалисту в данной области для конъюгации описанных выше меток с указанными антителами к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающими фрагментами, биспецифическими антителами, тяжелыми цепями антител, легкими цепями антител и слитными белками, описаны, например, в Kennedy et at., Clin. CMm. Acta 70:1-31 (1976), и Schurs et al., Clin. CMm. Acta 81:1-40 (1977). Способы связывания, отмеченные в последнем, представляют собой способ с глутаральдегидом, способ с перйодатом, способ с дималеимидом, способ со сложным эфиром м-малеимидобензил-N-гидроксисукцинимида, все эти способы включены посредством ссылки в настоящее описание.
[00345] Неограничивающие примеры цитотоксических средств включают цитостатические или цитоцидные средства, радиоактивные ионы металлов, например, альфа-излучатели, и токсины, например, экзотоксин Pseudomonas, абрин, токсин холеры, рицин A и дифтерийный токсин.
223
[00346] В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой диагностическое средство. Диагностическое средство представляет собой средство, которое можно использовать при диагностировании или обнаружении заболевания посредством определения местоположения клеток, содержащих антиген. Пригодные диагностические средства включают, но не ограничиваясь этим, радиоизотопы, красители (например, с биотин-стрептавидиновым комплексом), контрастные средства, флуоресцентные соединения или молекулы и усиливающие средства (например, парамагнитные ионы) для магнитно-резонансной визуализации (MRI). Способ MRI и получение антител, конъюгированных с MRI усиливающим средством, описаны в патенте США № 6331175, который включен в полном объеме посредством ссылки. Предпочтительно, диагностические средства выбирают из группы, состоящей из радиоизотопов, усиливающих средств для использования в магнитно-резонансной визуализации и флуоресцентных соединений. Для того чтобы нагружать антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент радиоактивными металлами или парамагнитными ионами, можно быть необходимо проводить реакцию с реактивом, имеющим длинный хвост, к которому прикрепляют множество хелатирующих групп для связывания ионов. Такой хвост может представлять собой полимер, такой как полилизин, полисахарид или другая цепь, дериватизированная или допускающая дериватизацию, которая имеет боковые группы, с которыми можно связывать хелатирующие группы, такие как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), порфирины, полиамины, краун-эфиры, био-тиосемикарбазоны, полиоксимы и схожие группы, которые, как известно, можно использовать с этой целью. Хелаты связывают с антителами с использованием стандартных химических реакций. Хелат обычно связывают с антителом с помощью группы, которая допускает формирование связи с молекулой при минимальной потере иммунологической реактивности и минимальном агрегировании и/или внутреннем сшивании другие, более нестандартные, способы и реактивы для конъюгации хелатов с антителами раскрыты в патенте США № 4824659 на Hawthorne, озаглавленном «Antibody Conjugates», который выдан 25 апреля 1989 года, раскрытие которого включено в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки. В частности, полезные комбинации металл-хелат включают 2-бензил-диэтилентриаминпентауксусную кислоту и ее монометиловый и циклогексиловый аналоги, используемые с диагностическими изотопами для радиологической визуализации. Те же хелаты, в комплексе с не радиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, можно использовать для MRI, когда используют наряду с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, предоставленными в настоящем описании. Макроциклические хелаты, такие как NOTA, DOTA и TETA, можно использовать с различными металлами и радиометаллами, наиболее конкретно с радионуклидами галлия, иттрия и меди, соответственно. Такие металл-хелатные комплексы можно делать очень стабильными посредством адаптации размера кольца к металлу, представляющему интерес. Другие хелаты кольцевого типа, такие как макроциклические простые полиэфиры, которые представляют интерес, для стабильного связывания нуклидов, таких как Ra для RAIT, включены в настоящее описание.
5000
20000
[00347] В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой органическое средство. Такие органические средства позволяют получать конъюгат с усовершенствованными фармакокинетическими свойствами (например, повышенным временем полужизни в сыворотке in vivo). Органический фрагмент может представлять собой гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или сложноэфирную группу жирной кислоты. В рамках изобретения, термин «жирная кислота» охватывает монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. В рамках изобретения, «гидрофильная полимерная группа» относится к органическому полимеру, который более растворим в воде, чем в октане, например, полилизин. Гидрофильные полимеры, подходящие для модификации антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставленных в настоящем описании, могут быть линейными или разветвленными и включают, например, полиалкангликоли (например, полиэтиленгликоль (PEG), монометоксиполиэтиленгликоль и полипропиленгликоль), углеводы (например, декстран, целлюлозу, олигосахариды и полисахариды), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин и полиаспартат), полиалканоксиды (например, полиэтиленоксид и полипропиленоксид) и поливинилпирролидон. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный полимер, который модифицирует антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическое антитело, тяжелую цепь антитела, легкую цепь антитела или слитый белок, представленные в настоящем описании, имеет молекулярную массу приблизительно от 800 приблизительно до 150000 Да в виде отдельной молекулярной частицы. Например, можно использовать PEG и PEG, в которых нижней индекс представляет собой усредненную молекулярную массу полимера в Да. Гидрофильную полимерную группу можно заменять на от одной приблизительно до шести алкильных групп, групп жирных кислот или сложных эфиров жирных кислот. Гидрофильные полимеры, которые замещают группами жирных кислот или сложных эфиров жирных кислот, можно получать с использованием подходящих способов. Например, полимер, содержащий аминогруппу, можно соединять с карбоксилатом жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты, и активированный карбоксилат (например, активированный N,N-карбонилдиимидазолом) на жирной кислоте или сложном эфире жирной кислоты можно соединять с гидроксильной группой на полимере.
[00348] Жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот, подходящие для модификации антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифического антитела, тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела или слитого белка, предоставленных в настоящем описании, могут быть насыщенными или могут содержать одно или несколько не насыщенных звеньев. Жирные кислоты, которые подходят для модификации антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифического антитела, тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела или слитого белка, предоставленных в настоящем описании, включают, например, н-додеканоат, н-тетрадеканоат, н-октадеканоат, н-эйкозаноат, н-докозаноат, н-триаконтаноат, н-тетраконтаноат, цис-дельта-9-октадеканоат, все цис-дельта-5,8,11,14-эйкозатетраеноат, октандикарбоновую кислоту, тетрадекандикарбоновую кислоту, октадекандикарбоновую кислоту, докозандикарбоновую кислоту и т.п. Подходящие сложные эфиры жирных кислот включают сложные моноэфиры дикарбоновых кислот, которые содержат линейную или разветвленную низшую алкильную группу. Низшая алкильная группа может содержать от одного приблизительно до двенадцати, предпочтительно от одного приблизительно до шести, атомов углерода.
1
12
2
3
[00349] Конъюгаты, представленные в настоящем описании, можно получать с использованием подходящих способов, например, посредством реакции с одним или несколькими модифицирующими средствами. В рамках изобретения, «активирующая группа» представляет собой химический фрагмент или функциональную группу, которая может, при подходящих условиях, вступать в реакцию со второй химической группой, тем самым формируя ковалентную связь между модифицирующим средством и второй химической группой. Например, аминореакционноспособные активирующие группы включают электрофильные группы, такие как, например, тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), сложные N-гидроксисукцинимидиловые эфиры (NHS) и т.п. Активирующие группы, которые могут вступать в реакцию с тиолами, включают, например, малеимид, йодацетил, акрилолил, пиридилдисульфиды, тиол 5-тиол-2-нитробензойной кислоты (ТНБ-тиол) и т.п. Альдегидную функциональную группу можно соединять с амин- или гидразидсодержащими молекулами, и азидная группа может вступать в реакцию с группой трехвалентного фосфора для того, чтобы формировать фосфорамидатные или фосфоримидные связи. Подходящие способы контроля активирующих групп в молекулы известны в данной области (см., например, Hernanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)). Активирующую группу можно связывать непосредственно с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, сложным эфиром жирной кислоты), или через линкерный фрагмент, например, двухвалентную C-C группу, в которой один или несколько атомов углерода можно заменять на гетероатом, такой как кислород, азот или сера. Подходящие линкерные фрагменты включают, например, тетраэтиленгликоль, (CH) и NH. Модифицирующие средства, которые содержат линкерный фрагмент, можно получать, например, посредством реакции моно-Boc-алкилдиамина (например, моно-Boc-этилендиамина или моно-Boc-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) для того, чтобы формировать амидную связь между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Защитную группу Boc можно удалять с продукта посредством обработки трифторуксусной кислотой (TFA) для того, чтобы обнажать первичный амин, который можно связывать с другим карбоксилатом, как описано, или он может вступать в реакцию с малеиновым ангидридом, а получаемый продукт циклизовать для того, чтобы получать активированное малеимидное производное жирной кислоты. (См., например, Thompson, et al., WO 92/16221, все положения которого включены в настоящее описание посредством ссылки.)
[00350] «Модифицирующее средство» может относиться к подходящей органической группе (например, гидрофильному полимеру, жирной кислоте и сложному эфиру жирной кислоты), которая содержит активирующую группу. Например, органические фрагменты можно связывать с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом не сайт-специфичным образом с использованием аминореакционноспособного модифицирующего средства, например, сложного эфира N-гидроксисукцинимида и полиэтиленгликоля. Модифицированное антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент также можно получать посредством восстановления дисульфидных связей (например, дисульфидных связей внутри цепей) антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифического антитела, тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела или слитого белка. Затем восстановленное антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическое антитело, тяжелая цепь антитела, легкая цепь антитела или слитый белок может вступать в реакцию с тиолреакционноспособным модифицирующим средством для того, чтобы получать конъюгаты, представленные в настоящем описании. Конъюгаты, которые содержат органический фрагмент, который связан с конкретными участками антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставленных в настоящем описании, можно получать с использованием подходящих способов, таких как обратный протеолиз (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), и способов, описанных в Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996).
5.3 ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ
5.3.1 ПОЛУЧЕНИЕ И СКРИНИНГ АНТИТЕЛ
[00351] В другом аспекте изобретение относится к способам получения антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов (см. раздел 5.1 и раздел 5.2).
[00352] Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, можно получать каким-либо известным в данной области способом для синтеза антител, например, посредством химического синтеза или способами рекомбинантной экспрессии. В способах, описанных в настоящем описании, используют, если не указано иное, общепринятые способы в молекулярной биологии, микробиологии, генетическом анализе, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПЦР, олигонуклеотидного синтеза и модификации, гибридизации нуклеиновых кислот и связанных областях в рамках компетенции в данной области техники. Эти способы описаны, например, в источниках, цитируемых в настоящем описании, и полностью объяснены литературе. См., например, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные обновления); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные обновления) Gait (ред.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ред.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (ред.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[00353] В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, представляют собой антитело (например, рекомбинантное антитело), полученное, экспрессированное, созданное или выделенное с помощью какого-либо средства, которое включает создание, например, через синтез, генетическую инженерию последовательностей ДНК. В некоторых вариантах осуществления такое антитело содержит последовательности, которые кодируют последовательности ДНК, которые в природе не существуют в репертуаре зародышевой линии антител животного или млекопитающего (например, человека) in vivo. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, создают способом, который включает использование гликозилированной формы из SEQ ID № 129, SEQ ID № 130 и/или SEQ ID № 131. В частном варианте осуществления гликозилированная форма из SEQ ID № 129, SEQ ID № 130 и/или SEQ ID № 131 гликозилирована одной или несколькими хитобиозами. Подробное описание получения антител, описанных в настоящем описании, см., например, в разделе 6.2, разделе 6.3 и разделе 6.4.
[00354] В определенном аспекте, в настоящем описании предоставлен иммуногенный гликопептид, который содержит один или несколько участков гликозилирования, где (i) иммуногенный гликопептид составляет от 10 до 60 аминокислотных остатков, от 10 до 30 аминокислотных остатков, от 15 до 25 аминокислотных остатков, от 15 до 20 аминокислотных остатков или от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину и (ii) по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования связан с углеводом.
[00355] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит один, два или три участка гликозилирования. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид содержит один участок гликозилирования. В другом конкретном варианте осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования.
[00356] В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит один участок гликозилирования, который связан с углеводом. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с углеводом.
[00357] Углевод, связанный с одним или несколькими участками гликозилирования иммуногенного гликопептида, может представлять собой N-связанный углевод, O-связанный углевод или C-связанный углевод. N-связанный углевод прикрепляют к остатку аспарагина, и это представляет собой наиболее распространенную форму, встречающуюся в природе. Большинство N-связанных углеводов связаны с пептидом в форме GlcNAc-β-Asn. O-связанный углевод прикрепляют к гидроксильной боковой цепи аминокислоты (обычно, в серине или треонине). Большинство O-связанных углеводов связаны с пептидами в форме GlcNAc-β-Ser/Thr или GlcNAc-α-Ser/Thr. C-связанный углевод относится к маннозе, прикрепленной к остатку триптофана, и представляет собой наименее обыкновенную форму, встречающуюся в природе. В одном из вариантов осуществления углевод в иммуногенном гликопептиде представляет собой N- или O-связанный углевод. В частном варианте осуществления углевод в иммуногенном гликопептиде представляет собой N-связанный углевод.
3
2
[00358] Углевод, связанный с одним или несколькими участками гликозилирования иммуногенного гликопептида, может представлять собой моносахарид, дисахарид, олигосахарид (например, трисахарид, тетрасахарид или пентасахарид) или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид или пентасахарид. В частном варианте осуществления углевод представляет собой дисахарид. В частном варианте осуществления дисахарид представляет собой хитобиозу. В другом конкретном варианте осуществления, углевод представляет собой ManGlcNAc. В конкретных вариантах осуществления N-конец иммуногенного гликопептида ацетилирован. В конкретных вариантах осуществления C-конец иммуногенного гликопептида находится в форме производного N-метилкарбоксамида.
[00359] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид конъюгируют с иммуногенным белком-переносчиком. В большинстве случаев небольшие антигены (например, короткие пептиды или небольшие гаптены) не достаточно сложны для того, чтобы вызывать образование антител. Иммуногенные белки-переносчики, по причине их большого размера и сложной структуры, могут придавать иммуногенность конъюгированным небольшим антигенам, что ведет к образованию антител к эпитопам на небольших антигенах и иммуногенных белках-переносчиках. Следовательно, небольшие антигены всегда химически конъюгированы с иммуногенными белками-переносчиками для того, чтобы интенсифицировать иммунный ответ для успешного образования антител. Широко используемые иммуногенные белки-переносчики включают, но не ограничиваясь этим, гемоцианин морского блюдца (KLH), гемоцианин Concholepas concholepas (CCH), бычий сывороточный альбумин (BSA), и овальбумин (OVA). В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид конъюгируют с KLH. KLH представляет собой медьсодержащий полипептид, который относится к группе негемовых белков, называемых гемоцианинами, которые встречаются у членистоногих и моллюсков. KLH выделяют у фиссурелловых (Megathura crenulata). В силу его эволюционной удаленности от млекопитающих, высокой молекулярной массы, сложной структуры и большой поверхности, содержащей несколько сотен групп лизина, которые предоставляют первичные амины в качестве мишеней для конъюгации, KLH является чрезвычайно иммуногенным и эффективным белком-переносчиком у млекопитающих.
[00360] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет от 10 до 60 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет от 10 до 30 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 25 аминокислотных остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 20 аминокислотных остатков в длину. В конкретных вариантах осуществления, иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину. В конкретном аспекте таких конкретных вариантов осуществления, в которых иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину, иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с хитобиозой. В другом конкретном аспекте таких конкретных вариантов осуществления, в которых иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину, иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с хитобиозой. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид составляет 55 аминокислотных остатков в длину. В конкретном аспекте такого конкретного варианта осуществления, в котором иммуногенный гликопептид составляет 55 аминокислотных остатков в длину, иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с хитобиозой. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид составляет 18 аминокислотных остатков в длину. В конкретном аспекте такого конкретного варианта осуществления, в котором иммуногенный гликопептид составляет 18 аминокислотных остатков в длину, иммуногенный гликопептид содержит два участка гликозилирования, каждый из которых связан с хитобиозой. В другом конкретном варианте осуществления иммуногенный гликопептид составляет 15 аминокислотных остатков в длину. В конкретном аспекте такого конкретного варианта осуществления, в котором иммуногенный гликопептид составляет 15 аминокислотных остатков в длину, иммуногенный гликопептид содержит участок гликозилирования, который связан с хитобиозой.
3
2
[00361] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит по меньшей мере часть из 10 аминокислот аминокислотной последовательности из SEQ ID № 150, и по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования иммуногенного гликопептида находится в указанной части аминокислотной последовательности. В определенных других вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит часть по меньшей мере в 15, 20, 25 или 30 аминокислот из аминокислотной последовательности из SEQ ID № 150, и по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования иммуногенного гликопептида находится в указанной части аминокислотной последовательности. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет от 15 до 18 аминокислотных остатков в длину. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет 55 аминокислотных остатков в длину. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 129. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид составляет 55 аминокислотных остатков в длину и содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 129. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид, который содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 129, содержит участок гликозилирования в 30-м остатке (Asn), который связан с хитобиозой. В другом конкретном варианте осуществления иммуногенный гликопептид, который содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 129, содержит участок гликозилирования в 30-м остатке (Asn) из SEQ ID № 129, который связан с фрагментом ManGlcNAc. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет 18 аминокислотных остатков в длину. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 130. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид составляет 18 аминокислотных остатков в длину и содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 130. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид, который содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 130, содержит два участка гликозилирования в 4-м остатке (Asn) и 10-м остатке (Asn), каждый из которых связан с хитобиозой. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид составляет 15 аминокислотных остатков в длину. В конкретных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 131. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид составляет 15 аминокислотных остатков в длину и содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 131. В частном варианте осуществления иммуногенный гликопептид, который содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 131, содержит участок гликозилирования в 7-м остатке (Asn), который связан с хитобиозой.
[00362] В другом аспекте изобретение относится к способу создания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с гликопротеином, который включает иммунизацию субъекта иммуногенным гликопептидом, который содержит один или несколько участков гликозилирования, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит по меньшей мере часть из 10 аминокислот аминокислотной последовательности гликопротеина, и по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования иммуногенного гликопептида находится в указанной части аминокислотной последовательности. В других определенных вариантах осуществления иммуногенный гликопептид содержит часть по меньшей мере из 15, 20, 25 или 30 аминокислот аминокислотной последовательности гликопротеина, и по меньшей мере один из одного или нескольких участков гликозилирования иммуногенного гликопептида присутствует в указанной части аминокислотной последовательности. В частном варианте осуществления гликопротеин содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 150. В частном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не имеют специфического связывания с не гликозилированной формой гликопротеина. Субъект, иммунизируемый в соответствии со способами, описанными в настоящем описании, может представлять собой, но не ограничиваясь этим, козу, овцу, осла, курицу, морскую свинку, крысу, кролика или мышь. В некоторых вариантах осуществления субъект, иммунизируемый в соответствии со способами, описанными в настоящем описании, представляет собой крысу, кролика или мышь. В частном варианте осуществления субъект, иммунизируемый в соответствии со способами, описанными в настоящем описании, представляет собой мышь. Иммунизацию субъекта можно осуществлять каким-либо известным в данной области способом, например, посредством вконтроля иммуногенного гликопептида и адъюванта субъекту, как описано в примере 2 и примере 3 (см. раздел 6.2 и раздел 6.3).
[00363] В другом аспекте также изобретение относится к способу получения иммуногенного гликопептида, описанного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления способ получения иммуногенного гликопептида включает связывание одного или нескольких участков гликозилирования иммуногенного гликопептида, описанных в настоящем описании, с углеводом (например, хитобиозой). В некоторых вариантах осуществления способ получения иммуногенного гликопептида также включает синтез фрагмента пептида. Фрагмент пептида иммуногенного гликопептида можно синтезировать каким-либо известным в данной области способом, например, посредством Fmoc твердофазного синтеза пептидов, как описано в примере 2 (см. раздел 6.2). В некоторых вариантах осуществления аминокислоту (например, аспарагин) в одном или нескольких участках гликозилирования защищают защитной группой во время синтеза иммуногенного гликопептида. В частном варианте осуществления только один остаток аспарагина фрагмента пептида связан с углеводом (например, хитобиозой), и защитная группа на аспарагине представляет собой аллиловую группу. В другом конкретном варианте осуществления каждый из больше чем одного (например, двух) остатков аспарагина фрагмента пептида связан с углеводом (например, хитобиозой), и защитная группа на остатках аспарагина представляет собой сложный эфир O-2-фенилизопропила (O-2-Phi Pr, OPp). Стадию связывания можно осуществлять каким-либо известным в данной области способом. В предпочтительном варианте осуществления молекулу углевода связывают с фрагментом пептида с использованием процедуры аспартилирования/снятия защитных групп в одной колбе, как описано в примере 2 (см. раздел 6.2.2.1).
[00364] Способы получения антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, известны специалисту в данной области, например, посредством химического синтеза, посредством очистки из биологических источников или посредством способов рекомбинантной экспрессии, в том числе, например, из клетки млекопитающего или трансгенных препаратов. В способах, описанных в настоящем описании, если не указано иное, используют общепринятые способы в молекулярной биологии, микробиологии, генетическом анализе, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПЦР, олигонуклеотидном синтезе и модификации, гибридизации нуклеиновых кислот и связанных областях в рамках компетенции в данной области техники. Эти способы описаны, например, в источниках, цитируемых в настоящем описании, и полностью объяснены в литературе. См., например, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные обновления); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные обновления) Gait (ред.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ред.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (ред.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[00365] В данной области существуют различные способы получения антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2). Например, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно создавать посредством способов рекомбинантной ДНК, таких как те, которые описаны в патенте США № 4816567. Одна или несколько ДНК, кодирующих антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, можно легко выделять и секвенировать с использованием стандартных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфично с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител или такие цепи у человека, гуманизированные, или из других источников). После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют клетки-хозяева, такие как клетки NS0, клетки COS обезьян, клетки яичника китайского хомяка (CHO), дрожжевые клетки, клетки водорослей, яйцеклетки или миеломные клетки, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы добиваться синтеза антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также можно модифицировать, например, посредством подстановки кодирующей последовательности желаемого вида для константных доменов тяжелых и легких цепей человека вместо гомологичных последовательностей человека (патент США № 4816567; Morrison et al., выше) или посредством ковалентного соединения с кодирующей последовательностью иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности для не иммуноглобулинового полипептида. Такой не иммуноглобулиновый полипептид можно использовать вместо константных доменов антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления ДНК представляет собой то, что описано в разделе 5.3.2.
[00366] Антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, также можно получать с использованием по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, чтобы предоставлять трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы и т.п., которые продуцируют такие антитела в своем молоке. Таких животных можно предоставлять с применением известных способов. См., например, но не ограничиваясь этим, патенты США №№ 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616, 5565362; 5304489 и т.п., каждый из которых полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
[00367] В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагменты, представленные в настоящем описании, дополнительно можно получать с использованием по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, который предоставлен в настоящем описании, чтобы предоставлять трансгенные растения и культивируемые клетки растения (например, но не ограничиваясь этим, табака и маиса), которые продуцируют такие антитела, конкретные части или варианты в частях растений или в культивируемых клетках из них. В качестве неограничивающего примера, листья трансгенного табака, экспрессирующие рекомбинантные белки, успешно использовали для предоставления больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием индуцибельного промотора. См., например, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) и цитируемые в нем ссылки. Также трансгенный маис использовали для того, чтобы экспрессировать белки млекопитающих на уровнях коммерческого получения, с биологическими активностями, эквивалентными тем, что получают в других рекомбинантных системах или выделяют из природных источников. См., например, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) и цитируемые в нем ссылки. Также из семян трансгенных растений получали в больших количествах антитела, в том числе фрагменты антител, такие как scFv, включая семена табака и клубни картофеля. См., например, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) и цитируемые в нем ссылки. Таким образом, антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты также можно получать с использованием трансгенных растений, в соответствии с известными способами. См. также, например, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (октябрь 1999 года), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem Soc. Trans. 22:940-944 (1994); и цитируемые в них ссылки. Каждый из вышеупомянутых источников полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
[00368] В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, можно получать с использованием по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленного в настоящем описании, чтобы предоставлять бактерии, которые продуцируют такие антитела к гликозилированному MUC16 или антигенсвязывающие фрагменты. В качестве неограничивающего примера, E. coli, экспрессирующие рекомбинантные белки, успешно использовали для предоставления больших количеств рекомбинантных белков. См., например, Verma et al., 1998, 216(1-2): 165-181 и цитируемые в нем ссылки.
[00369] Описаны способы получения полиспецифических (например, биспецифических антител), см., например, патенты США №№ 7951917; 7183076; 8227577; 5837242; 5989830; 5869620; 6132992 и 8586713.
[00370] В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, (см. раздел 5.1 и раздел 5.2) используют при создании биспецифических антител. Биспецифические антитела можно создавать посредством слияния двух гибридом для того, чтобы создавать гибридные молекулы иммуноглобулина с двумя сайтами связывания. Биспецифические антитела не только приковывают опухоли к T-клеткам; они сшивают CD3 на T-клетках и инициируют каскад активации. Таким образом, цитотоксичность, основанную на T-клеточных рецепторах, перенаправляют на желаемые опухолевые мишени, обходя ограничения MHC. Вооружение поликлонально активированных T-клеток (ATC) биспецифической связывающей молекулой против CD3 и против MUC16 объединяет направленную специфичность антитела к гликозилированному MUC16 с опосредованной перфорином/гранзимом цитотоксичностью T-клеток, которая не ограничена MHC. Биспецифические связывающие молекулы BsAb или BiTE могут вооружать размноженные ex vivo активированные T-клетки перед инфузией пациенту. Эта стратегия превращает каждую ATC в специфический CTL (Thakur and Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340-349; Grabert et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 569-576).
[00371] Биспецифические связывающие молекулы могут состоять из антитела к гликозилированному MUC16, где антитело к гликозилированному MUC16 представляет собой иммуноглобулин, где каждая легкая цепь иммуноглобулина представляет собой слитый белок, где слитый белок представляет собой легкую цепь иммуноглобулина, связанную через пептидный линкер с scFv, нацеленный на CD3. Мутация N297A в домене CH2 ведет к aгликозилированию, которое ведет к отсутствию связывания с FcR или C1q.
4
3
[00372] A антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно использовать для того, чтобы создавать CAR. CAR наиболее часто состоят из антитела длины одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), такого как тот, который происходит от моноклонального антитела, нацеленного на данный опухолеассоциированный антиген и/или его вариант, трансмембранного домена (например, трансмембранного домена, происходящего от молекулы поверхности T-клетки, такой как костимулирующая молекула, такая как CD8, CD28, OX-40 и 4-1BB), сигнальной части TCR комплекса, такой как внутриклеточный домен, и/или дополнительной части(и) дзета (ζ) цепи TCR, такой как ее цитоплазматический сигнальный домен. В частном варианте осуществления вариабельные области тяжелых и легких цепей моноклонального антитела к гликозилированному MUC16, описанных в настоящем описании, выделяют из гибридомной клеточной линии, которая создает моноклональное антитело к гликозилированному MUC16. Например, из гибридомной клеточной линии экстрагируют РНК и создают кДНК из РНК посредством ПЦР с обратной транскрипцией. Вариабельные области цепей VH и VL клонируют посредством стандартной ПЦР с использованием праймеров, специфичных к таким вариабельным областям. Получаемые фрагменты VH и VL субклонируют в челночный вектор, например, такой как клонирующий вектор TopoTA PCR 2.1 (Invitrogen), и секвенируют. Впоследствии фрагменты VH и VL лигируют к спейсерному домену (GlySer), создавая scFv антитела к гликозилированному MUC16, и сливают с лидерным пептидом CD8 человека (CD8L) (CD8L-scFv антитела к гликозилированному MUC16) посредством перекрывающейся ПЦР (см., например, Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.; и Gong MC et al., Neoplasia 1999;1(2):123-7). Кодирующую область CD8L-scFv антитела к гликозилированному MUC16 сливают с шарнирным и трансмембранным доменами CD8 человека или альтернативно с трансмембранным и цитоплазматическим сигнальным доменами CD28, слитыми с CD3-ζ сигнальным доменом T-клеточного рецептора (см., например, Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.; Brentjens RJ, et al. Nat Med 2003;9(3):279-86; и Brentjens RJ, et al., Clin Cancer Res 2007;13(18 Pt 1):5426-35).
[00373] Также в настоящем описании предоставлена T-клетка, которая экспрессирует CAR, описанный в настоящем описании. Способы создания T-клетки, экспрессирующей CAR, известны в данной области. Например, конструкцию CAR можно субклонировать в модифицированный MMLV ретровирусный вектор SFG (см., например, Riviere I, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(15):6733-7) или другие подходящие ретровирусные векторы. В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, например, вектор на основе HIV. VSV-G псевдотипированные ретровирусные супернатанты, происходящие от трансдуцировнных gpg29 фибробластов, можно использовать для того, чтобы конструировать стабильные клеточные линии PG13, продуцирующие вирус лейкоза гиббонов (GaLV) с псевдотипированной ретровирусной оболочкой (см., например, Gong MC, et al. Neoplasia 1999;1(2):123-7). Выделенные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) здорового донора можно активировать с использованием фитогемагглютинина (PHA) по 2 мкг/мл (Sigma. St. Louis, MO) и трансдуцировать ретровирусом на покрытых ретронектином не тканевых культуральных планшетах (Quintas-Cardama A, et al., Hum Gene Ther 2007;18(12):1253-60) для того, чтобы создавать T-клетку, рекомбинантно экспрессирующую CAR. Перенос генов CAR в T-клетку можно оценивать с помощью FACS.
[00374] Однодоменные антитела, например, антитела, не содержащие легких цепей, можно получать способами, хорошо известными в данной области. См. Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; патент США № 6005079; и международные публикации №№ WO 94/04678, WO 94/25591 и WO 01/44301.
[00375] В конкретных вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, которые связываются с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом, что и антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, представляют собой антитело человека к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент. В конкретных вариантах осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, которые конкурентно блокируют (например, дозозависимым образом) связывание с MUC16 какого-либо одного из антител, описанных в настоящем описании, представляют собой антитело человека к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела человека можно получать с использованием какого-либо способа, известного в данной области. Например, можно использовать трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулинов человека. В частности, комплексы генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека можно вводить случайно или посредством гомологичной рекомбинации в эмбриональные стволовые клетки мышей. Альтернативно, вариабельную область человека, константную область и область разнообразия можно вводить в эмбриональные стволовые клетки мыши в дополнение к генам тяжелых и легких цепей человека. Гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов мыши можно делать не функциональным отдельно или одновременно со введением локусов иммуноглобулинов человека посредством гомологичной рекомбинации. В частности, гомозиготная делеция области JH предотвращает продуцирование эндогенных антител. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки размножают и вводят микроинъекциями в бластоцисты для того, чтобы получать химерных мышей. Затем химерных мышей скрещивают для того, чтобы получать гомозиготного потомка, который экспрессирует антитела человека. Трансгенных мышей иммунизируют нормальным образом с использованием выбранного антигена, например, всего антигена или его части. Моноклональные антитела, направленные против антигена, можно получать от иммунизированных, трансгенных мышей с использованием стандартной гибридомной технологии. Трансгены иммуноглобулинов человека, которые несут трансгенные мыши, перестраиваются во время дифференцировки B-клеток и впоследствии проходят переключение класса и соматические мутации. Таким образом, используя такой способ, возможно получать терапевтически эффективные антитела IgG, IgA, IgM и IgE. Обзор этой технологии получения антитела человека см., например, в Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93. Подробное обсуждение этой технологии получения антител человека и моноклональных антител человека и протоколов для получения таких антител см., например, в международных публикациях №№ WO 98/24893, WO 96/34096 и WO 96/33735; и патентах США №№ 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318 и 5939598. Примеры мышей, способных продуцировать антитела человека, включают Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; патенты США №№ 6075181 и 6150184), HuAb-Mouse™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; патенты США №№ 5545806 и 5569825), Trans Chromo Mouse™ (Kirin) и KM Mouse™ (Medarex/Kirin).
[00376] Антитела человека, которые иммуноспецифически связываются с MUC16, можно создавать различными способами, известными в данной области, включая описанные выше способы фагового дисплея, используя библиотеки антител, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов человека. Также см. патенты США №№ 4444887, 4716111 и 5885793; и международные публикации №№ WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741.
[00377] В некоторых вариантах осуществления антитела человека можно получать с использованием гибридом мышь-человек. Например, лимфоциты периферической крови человека, трансформированные вирусом Эпштейна-Барр (EBV), можно сливать с миеломными клетками мыши для того, чтобы получать гибридомы мышь-человек, секретирующие моноклональные антитела человека, и можно осуществлять скрининг этих гибридом мышь-человек для того, чтобы определять те, которые секретируют моноклональные антитела человека, которые иммуноспецифически связываются с целевым антигеном. Такие способы известны и описаны в данной области, см., например, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.
[00378] В конкретных вариантах осуществления способы получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связываются с MUC16, представляют собой то, что описано далее в разделе 6.2.
[00379] В конкретных вариантах осуществления способы скрининга и отбора антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связываются с MUC16, представляют собой то, что описано далее в разделе 6.2.
[00380] Когда антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, получены, их можно очищать каким-либо известным в данной области способом очистки молекул иммуноглобулина, например, посредством хроматографии (например, ионообменной, аффинной, в частности, с помощью аффинности к специфическому антигену после белка A, и колоночной хроматографии на молекулярных ситах), центрифугирования, дифференциальной растворимости или каким-либо другим стандартным способом очистки белков. Кроме того, антитела, описанные в настоящем описании, можно сливать с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в настоящем описании или иначе известными в данной области, чтобы содействовать очистке.
[00381] В конкретных вариантах осуществления, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, выделяют или очищают. В целом, выделенное антитело представляет собой то, которое по существу не содержит других антител с другими антигенными специфичностями, нежели выделенное антитело. Например, в частном варианте осуществления препарат антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, по существу не содержит клеточного материала и/или химических предшественников. Фраза «по существу не содержит клеточный материал» включает препараты антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело отделено от клеточных компонентов клеток, из которых его выделяют или рекомбинантно получают. Таким образом, антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, который по существу не содержит клеточный материал, включает препараты антитела, которые содержат приблизительно меньше 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% (по сухому весу) гетерологичного белка (также обозначаемого в настоящем описании как «контаминирующий белок») и/или вариантов антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, например, форм антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента с отличной посттрансляционной модификацией или других отличных версий антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающему фрагменту (таких как фрагменты антител). Когда антитело получают рекомбинантно, оно также в целом по существу не содержит среды для культивирования, т.е. среда для культивирования составляет приблизительно меньше 20%, 10%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% объема препарата белка. Когда антитело получают химическим синтезом, в целом, оно по существу не содержит химических предшественников или других химических соединений, т.е. его отделяют от химических предшественников или других химических соединений, которые участвуют в синтезе белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат приблизительно меньше 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) химических предшественников или соединений, отличных от антитела, представляющего интерес. В частном варианте осуществления антитела, описанные в настоящем описании, выделяют или очищают.
5.3.2 ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ
[00382] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полинуклеотидам, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент (см. раздел 5.1 и раздел 5.2). Также в настоящем описании предоставлены векторы, содержащие такие полинуклеотиды (см. раздел 5.3.3). Также изобретение относится к полинуклеотидам, которые кодируют антигены антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2). Также изобретение относится к полинуклеотидам, которые гибридизуются при строгих условиях гибридизации или условиях гибридизации более низкой степени строгости с полинуклеотидами, которые кодируют антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании.
[00383] Фраза «очищенный» включает препараты полинуклеотида или молекул нуклеиновой кислоты, которые содержат приблизительно меньше 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% (в частности, приблизительно меньше 10%) другого материала, например, клеточного материала, среды для культивирования, других молекул нуклеиновой кислоты, химических предшественников и/или других химических соединений. В частном варианте осуществления молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, (см. раздел 5.1 и раздел 5.2) выделяют или очищают.
[00384] Молекулы нуклеиновой кислоты, представленные в настоящем описании, могут быть в форме РНК, такой как мРНК, гетерогенной ядерной РНК, тРНК или какой-либо другой форме, или в форме ДНК, включая в качестве неограничивающих примеров кДНК и геномную ДНК, полученную клонированием или полученную синтетически, или какие-либо их сочетания. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной или одноцепочечной или представлять собой какое-либо их сочетание. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может представлять собой кодирующую цепь, также известную как смысловая цепь, или она может представлять собой некодирующую цепь, также обозначаемую как антисмысловая цепь.
[00385] В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлен полинуклеотид, который содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2).
[00386] В конкретных аспектах также изобретение относится к полинуклеотидам, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), которые иммуноспецифически связываются с MUC16 и содержат аминокислотную последовательность, как описано в настоящем описании, а также антитела, которые конкурируют с таким антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом за связывание с MUC16 или которые связываются с тем же эпитопом, что и такие антитела.
[00387] Полинуклеотиды, представленные в настоящем описании, можно получать каким-либо известным в данной области способом. Например, если известна нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), описанные в настоящем описании, полинуклеотид, кодирующий антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, можно собирать из химически синтезированных олигонуклеотидов (например, как описано в Kutmeier et al., BioMethods 17:242 (1994)), что, в кратком изложении, включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитело, ренатурацию и лигирование этих олигонуклеотидов, а затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов посредством ПЦР.
[00388] Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), можно создавать из нуклеиновой кислоты из подходящего источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретное антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, не доступен, но известна последовательность антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, можно химически синтезировать или получать из подходящего источника (например, библиотеки кДНК антител или библиотеки кДНК, созданной из, или нуклеиновой кислоты, предпочтительно полиA+РНК, выделенной из, какой-либо ткани или клеток, экспрессирующих антитело, таких как гибридомные клетки, отобранные для того, чтобы экспрессировать антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании) посредством ПЦР амплификации с использованием синтетических праймеров, которые гибридизуются с 3'- и 5'-концами последовательности, или посредством клонирования с использованием олигонуклеотидного зонда, специфического для последовательности конкретного гена, чтобы идентифицировать, например, клон кДНК из библиотеки кДНК, который кодирует антитело. Затем амплифицированные нуклеиновые кислоты, создаваемые посредством ПЦР, можно клонировать в реплицируемые клонирующие векторы с использованием какого-либо способа, хорошо известного в данной области (см., например, раздел 5.3.3).
[00389] В таких вариантах осуществления полинуклеотидом, кодирующим такое антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, можно манипулировать с помощью способов, хорошо известных в данной области для манипуляций нуклеотидными последовательностями, например, способов рекомбинантной ДНК, сайт-специфического мутагенеза, ПЦР и т.д. (см., например, способы, описанные в Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. и Ausubel et al., ред., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., оба они включены посредством ссылки в настоящее описание в полном объеме), чтобы создавать антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, имеющие другую аминокислотную последовательность, например, чтобы создавать замены, делеции и/или инсерции аминокислот. Например, такие манипуляции можно осуществлять для того, чтобы делать кодируемую аминокислоту агликозилированной или уничтожать способность антитела связываться с C1q, Fc-рецептором или активировать систему комплемента.
[00390] Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, представленные в настоящем описании, могут включать молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие открытую рамку считывания (ORF), необязательно с одним или несколькими интронами, например, но не ограничиваясь этим, по меньшей мере одну точно определенную часть по меньшей мере одной определяющей комплементарность области (CDR), в качестве CDR1, CDR2 и/или CDR3 по меньшей мере одной тяжелой цепи или легкой цепы; молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность для антитела к гликозилированному MUC16 или вариабельной области; и молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат нуклеотидную последовательность, по существу отличную от тех, которые описаны выше, но которые, из-за вырожденности генетического кода, все еще кодируют по меньшей мере одно антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем описании.
[00391] Также в настоящем описании предоставлены выделенные нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при селективных условиях гибридизации с полинуклеотидом, описанным в настоящем описании. Таким образом, полинуклеотиды по этому варианту осуществления можно использовать для выделения, обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды, представленные в настоящем описании, можно использовать для того, чтобы идентифицировать, выделать или амплифицировать частичные или полноразмерные клоны в депонированной библиотеке. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представляют собой геномные или кДНК последовательности, выделенные из, или иначе комплементарные, кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.
[00392] Нуклеиновые кислоты могут в целях удобства содержать последовательности в дополнение к полинуклеотиду, предоставленном в настоящем описании. Например, сайт множественного клонирования, содержащий один или несколько участков рестрикции эндонуклеаз, можно вставлять в нуклеиновую кислоту, чтобы содействовать выделению полинуклеотида. Кроме того, транслируемые последовательности можно вставлять для того, чтобы содействовать выделению транслированного полинуклеотида, представленного в настоящем описании. Например, последовательность гексагистидинового маркера предоставляет удобное средство для того, чтобы очищать полипептиды, представленные в настоящем описании. Нуклеиновая кислота, предоставленная в настоящем описании, за исключением кодирующей последовательности, необязательно представляет собой вектор, адаптер или линкер для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида, представленного в настоящем описании.
[00393] Дополнительные последовательности также можно добавлять к таким последовательностям для клонирования и/или экспрессии, чтобы оптимизировать их функцию при клонировании и/или экспрессии, чтобы содействовать выделению полинуклеотида или усовершенствовать введение полинуклеотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессирующих векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно в данной области (см., например, Ausubel, выше; или Sambrook, выше).
[00394] В частном варианте осуществления, используя повседневные способы рекомбинантной ДНК, одну или несколько из CDR антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, можно вставлять в известные каркасные области. Каркасные области могут быть встречающимся в природе или представлять собой консенсусные каркасные области и, предпочтительно, каркасные области человека (см., например, в Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) список каркасных областей человека). Предпочтительно, полинуклеотид, создаваемый посредством комбинации каркасных областей и CDR, кодирует антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, который иммуноспецифически связывает MUC16. Одну или несколько замен аминокислот можно создавать в каркасных областях и, предпочтительно, замены аминокислот улучшают связывание антитела с его антигеном. Дополнительно такие способы можно использовать, чтобы создавать замены или делеции аминокислот в одном или нескольких остатках цистеина вариабельной области, участвующих в межцепной дисульфидной связи для того, чтобы создавать молекулы антител, не имеющие одной или нескольких межцепных дисульфидных связей. Другие изменения в полинуклеотиде предусмотрены в настоящем описании и входят в компетенцию в данной области техники.
[00395] В некоторых вариантах осуществления выделенная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты или ее фрагмент, при соединении с другой молекулой нуклеиновой кислоты, может кодировать слитый белок. Создание слитых белков входит в обычные навыки в данной области и может включать использование рестрикционного фермента или способов рекомбинантного клонирования (см., например, Gateway.TM. (Invitrogen)). Также см. патент США № 5314995.
[00396] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид в настоящем описании предоставлен в форме вектора (например, экспрессирующего вектора), как описано в разделе 5.3.3.
[00397] В определенных аспектах изобретение относится к полинуклеотидам, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, или его антигенсвязывающий фрагмент (например, вариабельная область легкой цепи и/или вариабельная область тяжелой цепи), которые иммуноспецифически связываются с MUC16, и векторы, например, векторы, содержащие такие полинуклеотиды для их эффективной экспрессии в клетках-хозяевах (например, E. coli и клетки млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид выделяют или очищают.
[00398] В рамках изобретения, «выделенный» полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты представляет собой то, что отделяют от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в природном источнике (например, у мыши или человека) молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, «выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может по существу не содержать другой клеточный материал или среду для культивирования, когда ее получают рекомбинантными способами, или по существу не содержать химические предшественники или другие химические соединения при химическом синтезе. Например, фраза «по существу не содержит» включает препараты полинуклеотида или молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат приблизительно меньше 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% другого материала, например, клеточного материала, среды для культивирования, других молекул нуклеиновой кислоты, химических предшественников и/или других химических соединений.
[00399] В конкретных аспектах изобретение относится к полинуклеотидам, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты, и содержат аминокислотную последовательность, как описано в настоящем описании, а также антитела, которые конкурируют с такими антителами за связывание с MUC16 (например, дозозависимым образом) или которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом, что и такие антитела.
[00400] В определенных аспектах изобретение относится к полинуклеотидам, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании. Полинуклеотиды могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь, содержащую CDR VH, описанные в настоящем описании (см., например, таблицу 1, таблицу 3 и таблицу 5). Полинуклеотиды могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую цепь, содержащую CDR VL, описанные в настоящем описании (см., например, таблицу 2, таблицу 4 и таблицу 6).
[00401] В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к полинуклеотидам, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, содержащее три CDR VH, например, содержащее CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, как описано в таблице 1, таблице 3 или таблице 5. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из консенсусных CDR VH 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и 18C6 (т. е., SEQ ID № 103, SEQ ID № 104 и SEQ ID № 105, соответственно, или SEQ ID № 109, SEQ ID № 110 и SEQ ID № 111, соответственно, или SEQ ID № 115, SEQ ID № 116 и SEQ ID № 117). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 10C6 (т. е., SEQ ID № 3, SEQ ID № 4 и SEQ ID № 5, соответственно, или SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 и SEQ ID № 11, соответственно, или SEQ ID № 15, SEQ ID № 16 и SEQ ID № 17, соответственно). В конкретных вариантах осуществления, полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 7B12 (т. е., SEQ ID № 23, SEQ ID № 24 и SEQ ID № 25, соответственно, или SEQ ID № 29, SEQ ID № 30 и SEQ ID № 31, соответственно, или SEQ ID № 35, SEQ ID № 36 и SEQ ID № 37, соответственно). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 19C11 (т. е., SEQ ID № 43, SEQ ID № 44 и SEQ ID № 45, соответственно, или SEQ ID № 49, SEQ ID № 50 и SEQ ID № 51, соответственно, или SEQ ID № 55, SEQ ID № 56 и SEQ ID № 57, соответственно). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 16C5 (т. е., SEQ ID № 63, SEQ ID № 64 и SEQ ID № 65, соответственно, или SEQ ID № 69, SEQ ID № 70 и SEQ ID № 71, соответственно, или SEQ ID № 75, SEQ ID № 76 и SEQ ID № 77, соответственно). В конкретных вариантах осуществления, полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 18C6 (т. е., SEQ ID № 83, SEQ ID № 84 и SEQ ID № 85, соответственно, или SEQ ID № 89, SEQ ID № 90 и SEQ ID № 91, соответственно, или SEQ ID № 95, SEQ ID № 96 и SEQ ID № 97, соответственно).
[00402] В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к полинуклеотидам, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, содержащее (a) три CDR VH, например, содержащее CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, как описано в таблице 1, таблице 3 или таблице 5, и (b) три CDR цепи VL, например, содержащее CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как описано в таблице 2, таблице 4 или таблице 6. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует (a) CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из консенсусных CDR VH 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и 18C6 (т. е., SEQ ID № 103, SEQ ID № 104 и SEQ ID № 105, соответственно, или SEQ ID № 109, SEQ ID № 110 и SEQ ID № 111, соответственно, или SEQ ID № 115, SEQ ID № 116 и SEQ ID № 117), и (b) CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из консенсусных CDR VL 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 и 18C6 (т. е., SEQ ID № 106, SEQ ID № 107 и SEQ ID № 108, соответственно, или SEQ ID № 112, SEQ ID № 113 и SEQ ID № 114, соответственно, или SEQ ID № 118, SEQ ID № 119 и SEQ ID № 120). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует (a) CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 10C6 (т. е., SEQ ID № 3, SEQ ID № 4 и SEQ ID № 5, соответственно, или SEQ ID № 9, SEQ ID № 10 и SEQ ID № 11, соответственно, или SEQ ID № 15, SEQ ID № 16 и SEQ ID № 17, соответственно), и (b) CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из 10C6 (т. е., SEQ ID № 6, SEQ ID № 7 и SEQ ID № 8, соответственно, или SEQ ID № 12, SEQ ID № 13 и SEQ ID № 14, соответственно, или SEQ ID № 18, SEQ ID № 19 и SEQ ID № 20, соответственно). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует (a) CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 7B12 (т. е., SEQ ID № 23, SEQ ID № 24 и SEQ ID № 25, соответственно, или SEQ ID № 29, SEQ ID № 30 и SEQ ID № 31, соответственно, или SEQ ID № 35, SEQ ID № 36 и SEQ ID № 37, соответственно), и (b) CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из 7B12 (т. е., SEQ ID № 26, SEQ ID № 27 и SEQ ID № 28, соответственно, или SEQ ID № 32, SEQ ID № 33 и SEQ ID № 34, соответственно, или SEQ ID № 38, SEQ ID № 39 и SEQ ID № 40, соответственно). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует (a) CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 19C11 (т. е., SEQ ID № 43, SEQ ID № 44 и SEQ ID № 45, соответственно, или SEQ ID № 49, SEQ ID № 50 и SEQ ID № 51, соответственно, или SEQ ID № 55, SEQ ID № 56 и SEQ ID № 57, соответственно), и (b) CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из 19C11 (т. е., SEQ ID № 46, SEQ ID № 47 и SEQ ID № 48, соответственно, или SEQ ID № 52, SEQ ID № 53 и SEQ ID № 54, соответственно, или SEQ ID № 58, SEQ ID № 59 и SEQ ID № 60, соответственно). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует (a) CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 16C5 (т. е., SEQ ID № 63, SEQ ID № 64 и SEQ ID № 65, соответственно, или SEQ ID № 69, SEQ ID № 70 и SEQ ID № 71, соответственно, или SEQ ID № 75, SEQ ID № 76 и SEQ ID № 77, соответственно), и (b) CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из 16C5 (т. е., SEQ ID № 66, SEQ ID № 67 и SEQ ID № 68, соответственно, или SEQ ID № 72, SEQ ID № 73 и SEQ ID № 74, соответственно, или SEQ ID № 78, SEQ ID № 79 и SEQ ID № 80, соответственно). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует (a) CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из 18C6 (т. е., SEQ ID № 83, SEQ ID № 84 и SEQ ID № 85, соответственно, или SEQ ID № 89, SEQ ID № 90 и SEQ ID № 91, соответственно, или SEQ ID № 95, SEQ ID № 96 и SEQ ID № 97, соответственно), и (b) CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из 18C6 (т. е., SEQ ID № 86, SEQ ID № 87 и SEQ ID № 88, соответственно, или SEQ ID № 92, SEQ ID № 93 и SEQ ID № 94, соответственно, или SEQ ID № 98, SEQ ID № 99 и SEQ ID № 100, соответственно).
[00403] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании (например, SEQ ID № 1, SEQ ID № 21, SEQ ID № 41, SEQ ID № 61, SEQ ID № 81 или SEQ ID № 101), где антитело иммуноспецифически связывается с MUC16.
[00404] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании (например, SEQ ID № 2, SEQ ID № 22, SEQ ID № 42, SEQ ID № 62, SEQ ID № 82 или SEQ ID № 102), где антитело иммуноспецифически связывается с MUC16.
[00405] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 101, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 102. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 101, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 101, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 21, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 22. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 41, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 42. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 61, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 62. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16, описанное в настоящем описании, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 81, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID № 82.
[00406] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует VH, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 140, SEQ ID № 142, SEQ ID № 144, SEQ ID № 146 или SEQ ID № 148. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует VL, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 141, SEQ ID № 143, SEQ ID № 145, SEQ ID № 147 или SEQ ID № 149. В частном варианте осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует VH, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 140, и VL, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 141 (например, 10C6). В частном варианте осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует VH, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 142, и VL, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 143 (например, 7B12). В частном варианте осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует VH, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 144, и VL, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 145 (например, 19C11). В частном варианте осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует VH, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 146, и VL, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 147 (например, 16C5). В частном варианте осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, кодирует VH, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 148, и VL, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID № 149 (например, 18C6).
[00407] В конкретных аспектах, в настоящем описании предоставлен полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие легкую цепь и тяжелую цепь, например, отдельную легкую цепь и тяжелую цепь. В отношении тяжелой цепи, в частном варианте осуществления полинуклеотид, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гамма (например, гамма1, гамма2, гамма3 или гамма4) тяжелую цепь. В частном варианте осуществления полинуклеотид, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, где антитело содержит тяжелую цепь и где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может содержать какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID № 1, SEQ ID № 21, SEQ ID № 41, SEQ ID № 61, SEQ ID № 81 или SEQ ID № 101, и где константная область тяжелой цепи представляет собой константную область гамма тяжелой цепи человека.
[00408] В отношении легкой цепи, в частном варианте осуществления полинуклеотид, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую каппа легкую цепь. В другом конкретном варианте осуществления полинуклеотид, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую лямбда легкую цепь. В еще одном другом конкретном варианте осуществления, полинуклеотид, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, которые содержат каппа легкую цепь человека или лямбда легкую цепь человека. В частном варианте осуществления полинуклеотид, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, где антитело содержит легкую цепь и где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может содержать какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2, SEQ ID № 22, SEQ ID № 42, SEQ ID № 62, SEQ ID № 82 или SEQ ID № 102, и где константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа легкой цепи человека. В другом конкретном варианте осуществления полинуклеотид, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат легкую цепь, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи могут содержать какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID № 2, SEQ ID № 22, SEQ ID № 42, SEQ ID № 62, SEQ ID № 82 или SEQ ID № 102, и где константная область легкой цепи представляет собой константную область лямбда легкой цепи человека.
[00409] Подробный пример создания антител к гликозилированному MUC16, описанных в настоящем описании, см. в разделе 6.2 и разделе 6.3.
5.3.3 КЛЕТКИ И ВЕКТОРЫ
[00410] В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлены клетки (например, клетки ex vivo), экспрессирующие (например, рекомбинантно) одно или несколько антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов (см. раздел 5.1 и раздел 5.2). Также в настоящем описании предоставлены векторы (например, экспрессирующие векторы), содержащие нуклеотидные последовательности (см., например, раздел 5.3.2), кодирующие антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, предпочтительно в клетках млекопитающих. Также в настоящем описании предоставлены клетки (например, клетки ex vivo), содержащие такие векторы или нуклеотидные последовательности, для рекомбинантной экспрессии антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных здесь. Также изобретение относится к способам получения антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, который включает экспрессию такого антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки (например, клетки ex vivo). В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой клетку ex vivo.
[00411] Вектор (например, экспрессирующий вектор) представляет собой молекулу ДНК, содержащую ген, который экспрессируют в клетке (например, клетке ex vivo). Обычно, экспрессию гена помещают под управление определенных регуляторных элементов, в том числе конститутивных или индуцибельных промоторов, тканеспецифических регуляторных элементов и энхансеров. Такой ген называют «функционально связанным с» регуляторными элементами, например, промотором. Рекомбинантный организм-хозяин может представлять собой какую-либо прокариотическую или эукариотическую клетку, которая содержит или клонирующий вектор или экспрессирующий вектор. Этот термин также включает те прокариотические или эукариотические клетки, а также трансгенное животное, которые генетически сконструированы так, чтобы содержать клонированный ген(ы) в хромосоме или геноме клетки-хозяина или клеток-хозяев из клеток-хозяев (например, клеток ex vivo). В одном из вариантов осуществления промотор представляет собой CMV промотор.
[00412] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к вектору, который содержит один или несколько полинуклеотидов, как описано в разделе 5.3.2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, как описано в разделе 5.3.2, можно клонировать в подходящий вектор и можно использовать для того, чтобы трансформировать или трансфицировать любой подходящий организм-хозяин. Векторы и способы для того, чтобы конструировать такие векторы, известны специалисту в данной области и описаны в основных технических руководствах (см., в целом, «Recombinant DNA Part D», Methods in Enzymology, том 153, Wu and Grossman, ред., Academic Press (1987)). В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторные последовательности, такие как инициирующие и терминирующие транскрипцию и трансляцию кодоны, которые специфичны для организма-хозяина определенного типа (например, бактерии, гриба, растения, насекомого или млекопитающего), введению которому подлежит вектор, в зависимости от ситуации и учитывая то, представляет вектор собой ДНК или РНК. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторные последовательности, которые специфичны для рода организма-хозяина. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторные последовательности, которые специфичны для биологического вида организма-хозяина.
[00413] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или несколько маркерных генов, которые делают возможным отбор трансформированных или трансфицированных организмов-хозяев. Неограничивающие примеры маркерных генов включают устойчивость к биоцидам, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т. д., комплементацию у ауксотрофного организма-хозяина для того, чтобы обеспечивать прототрофность, и т. п. В предпочтительном варианте осуществления вектор содержит ампициллиновые и гигромициновые селективные маркеры.
[00414] В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор может содержать нативный или нормативный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, как описано в разделе 5.3.2. Выбор промоторов, например, сильных, слабых, индуцибельных, тканеспецифических и специфичных для развития, известен специалистам в данной области. Аналогичным образом, объединение молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагмента, как описано выше, с промотором также известно специалистам в данной области.
[00415] Неограничивающие примеры подходящих векторов включают те, которые разработаны для размножения и заселения или для экспрессии или для того и другого. Например, клонирующий вектор можно выбирать из группы, состоящей из серии pUC, серии pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), серии pET (Novagen, Madison, Wis.), серии pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и серии pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). Бактериофаговые векторы, такие как lamda-GT10, lamda-GT11, lamda-ZapII (Stratagene), lamda-EMBL4 и lamda-NM1149, также можно использовать. Неограничивающие примеры растительных экспрессирующих векторов включают pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). Неограничивающие примеры животных экспрессирующих векторов включают pEUK-C1, pMAM и pMAMneo (Clontech). Систему клонирования TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) также можно использовать в соответствии с рекомендациями производителя.
[00416] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления вектор млекопитающего содержит по меньшей мере один промоторный элемент, который опосредует инициацию транскрипции мРНК, кодирующую последовательность антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента и сигналы, необходимые для терминации транскрипции и полиаденилирования транскрипта. В некоторых вариантах осуществления вектор млекопитающего содержит дополнительные элементы, такие как, например, энхансеры, последовательности Козака и промежуточные последовательности, фланкированные донорными и акцепторными сайтами для сплайсинга РНК. В некоторых вариантах осуществления высокоэффективной транскрипции можно достичь с использованием, например, ранних и поздних промоторов из SV40, длинных концевых повторов (LTR) из ретровирусов, например, RSV, HTLVI, HIVI и раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Однако также можно использовать клеточные элементы (например, промотор актина человека). Неограничивающие примеры экспрессирующих векторов млекопитающих включают векторы, такие как pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN или pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, Calif.), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) или pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL и PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) и pBC12MI (ATCC 67109). Неограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающих, которые можно использовать в комбинации с такими векторами млекопитающих, включают клетки Hela 293, H9 и Jurkat человека, клетки NIH3T3 и C127 мыши, клетки Cos 1, Cos 7 и CV 1, quail QC1-3, клетки L мыши и клетки яичника китайского хомяка (CHO).
[00417] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, например, ретровирусные векторы, векторы на основе парвовирусов, например, векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), AAV-аденовирусные химерные векторы и векторы на основе аденовирусов, и лентивирусные векторы, такие как векторы на основе Herpes simplex (HSV). В некоторых вариантах осуществления вирусным вектором манипулируют для того, чтобы делать репликацию вируса дефектной. В некоторых вариантах осуществления вирусным вектором манипулируют для того, чтобы устранять токсичность для организма-хозяина. Эти вирусные векторы можно получать с использованием стандартных способов рекомбинантной ДНК, которые описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2-е издание, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)).
[00418] В некоторых вариантах осуществления вектор или полинуклеотид, описанный в настоящем описании, можно переносить в клетку (например, клетку ex vivo) общепринятыми способами, и получаемую клетку можно культивировать общепринятыми способами для того, чтобы получать антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании. Соответственно, в настоящем описании предоставлены клетки, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, его тяжелую или легкую цепь, или слитый полипептид с его легкой цепью, функционально связанные с промотором для экспрессии таких последовательностей в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий тяжелую цепь, функционально связанную с промотором, и вектор, кодирующий легкую цепь, функционально связанную с промотором, можно совместно экспрессировать в клетке для экспрессии всего антитела к гликозилированному MUC16. В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий тяжелую цепь, функционально связанную с промотором, и вектор, кодирующий слитый полипептид легкой цепи, функционально связанный с промотором, можно совместно экспрессировать в клетке для экспрессии всей биспецифической связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид как тяжелой цепи, так и легкой цепи антитела к гликозилированному MUC16, описанного в настоящем описании, который функционально связан с промотором. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид как тяжелой цепи, так и легкой цепи биспецифической связывающей молекулы, описанной в настоящем описании, который функционально связан с промотором. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит два различных вектора, первый вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, который функционально связан с промотором, и второй вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид легкой цепи, который функционально связан с промотором. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит два различных вектора, первый вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, функционально связанный с промотором, и второй вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид легкой цепи, функционально связанный с промотором. В некоторых вариантах осуществления первая клетка содержит первый вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела к гликозилированному MUC16, описанного в настоящем описании, и вторая клетка содержит второй вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид легкой цепи антитела к гликозилированному MUC16, описанного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлена смесь клеток, содержащая такую первую клетку и такую вторую клетку. В некоторых вариантах осуществления первая клетка содержит первый вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь биспецифической связывающей молекулы, описанной в настоящем описании, и вторая клетка содержит второй вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид легкой цепи биспецифической связывающей молекулы, описанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлена смесь клеток, содержащая такую первую клетку и такую вторую клетку. В предпочтительном варианте осуществления клетка экспрессирует вектор или векторы так, что посредством клетки эффективно происходит как транскрипция, так и трансляция олигонуклеотида.
[00419] В варианте осуществления клетка экспрессирует вектор так, что посредством клетки эффективно как транскрипция, так и трансляция олигонуклеотида или его фрагмента.
[00420] В некоторых вариантах осуществления клетка присутствует в организме-хозяине, который может представлять собой животное, такое как млекопитающее. Примеры клеток включают, но не ограничиваясь этим, клетку человека, клеточную линию человека, E. coli (например, E. coli TB-1, TG-2, DH5a, XL-Blue MRF' (Stratagene), SA2821 и Y1090), B. subtilis, P. aerugenosa, S. cerevisiae, N. crassa, клетки насекомого (например, Sf9, Ea4) и другие, изложенные в настоящем описании далее. В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой клетку CHO. В особенно предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой клетку CHO-S.
[00421] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании, можно экспрессировать в стабильной клеточной линии, которая содержит полинуклеотид, встроенный в хромосому посредством контроля полинуклеотида в клетку. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид вводят в клетку, например, посредством электропорации. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид вводят в клетку, например, посредством трансфекции вектора, который содержит полинуклеотид, в клетку. В некоторых вариантах осуществления вектор совместно трансфицируют с селективным маркером, таким как DHFR, GPT, неомицин или гигромицин, для того, чтобы сделать возможным идентификацию и выделение трансфицированных клеток. В некоторых вариантах осуществления трансфицированный полинуклеотид также можно амплифицировать для того, чтобы экспрессировать большие количества кодируемого антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, маркер DHFR (дигидрофолатредуктаза) можно использовать для того, чтобы развивать клеточные линии, которые несут несколько сотен или даже несколько тысяч копий полинуклеотида, представляющего интерес. Другим примером селективного маркера является фермент глутаминсинтаза (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Используя эти маркеры, клетки выращивают в селективной среде и отбирают клетки с наивысшей устойчивостью. Эти клеточные линии содержат амплифицированный ген(ы), встроенный в хромосому. Клетки яичника китайского хомячка (CHO) и NSO часто используют для получения антител.
[00422] В одном из вариантов осуществления вектор содержит (i) первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь иммуноглобулина, который связывается с MUC16, которая функционально связана с первым промотором, и (ii) второй полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь иммуноглобулина, который связывается с MUC16, который функционально связан со вторым промотором. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор.
[00423] В одном из вариантов осуществления вектор содержит (i) первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую слитый полипептид легкой цепи, который содержит легкую цепь иммуноглобулина, слитую с scFv, через пептидный линкер, где легкая цепь связывается с MUC16 и где scFv связывается с CD3, функционально связанную с первым промотором, и (ii) второй полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь иммуноглобулина, который связывается с MUC16, который функционально связан со вторым промотором. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор.
5.4 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
[00424] В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлены композиции (например, фармацевтические композиции) и наборы, содержащие фармацевтически эффективное количество одного или нескольких антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов (см. раздел 5.1 и раздел 5.2). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат клетки иммунной системы, например, T-клетки, рекомбинантно экспрессирующие антитело, его антигенсвязывающий фрагмент и/или CAR, описанные в настоящем описании. Композиции можно использовать при получении индивидуальных разовых стандартных дозированных форм. Композиции, представленные в настоящем описании, можно формулировать для парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, интраабдоминального, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, интрацилиального, интрацеребеллярного, интрацеребровентрикулярного, внутрь резервуара Оммайя, внутриглазного, интравитреального, внутриободочного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, интраперитонеального, интраплеврального, внутрипростатного, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного, интравезикального, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального, интратекального, внутрижелудочкового в головной мозг, внутрипаренхимального в головной мозг или трансдермального контроля. В предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют для парентерального вконтроля. В особенно предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют для внутривенного контроля. В предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют для интраперитонеального контроля. В частном варианте осуществления композицию формулируют для интраперитонеального вконтроля, чтобы лечить перитонеальные метастазы. В предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют для интратекального вконтроля. В частном варианте осуществления композицию формулируют для интратекального вконтроля, чтобы лечить метастазы головного мозга. См., например, Kramer et al., 2010, 97: 409-418. В предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют для внутрижелудочкового контроля в головной мозг. В частном варианте осуществления композицию формулируют для внутрижелудочкового контроля, чтобы лечить метастазы головного мозга. См., например, Kramer et al., 2010, 97: 409-418. В предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют для внутрипаренхимального контроля в головной мозг. В частном варианте осуществления композицию формулируют для внутрипаренхимального контроля, чтобы лечить опухоль головного мозга или метастазы опухоли головного мозга. См., например, Luther et al., 2014, Neuro Oncol, 16: 800-806, и Clinical Trial ID № NCT01502917.
[00425] В частном варианте осуществления композицию формулируют для интраперитонеального вконтроля для перитонеальных метастазов.
[00426] В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлена композиция, которая содержит один или несколько полинуклеотидов, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлена композиция, которая содержит клетку, где клетка содержит один или несколько полинуклеотидов, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлена композиция, которая содержит вектор, этот вектор содержит один или несколько полинуклеотидов, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предоставлена композиция, которая содержит клетку, эта клетка содержит вектор, где вектор содержит один или несколько полинуклеотидов, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании.
[00427] В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная в настоящем описании, представляет собой стабильный или консервированный состав. В некоторых вариантах осуществления стабильный состав содержит фосфатный буфер с физиологическим раствором или выбранной солью. В некоторых вариантах осуществления описанная композиция представляет собой консервированный состав множественного использования, подходящий для фармацевтического или ветеринарного использования. В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная в настоящем описании, содержит консервант. Консерванты известны специалисту в данной области. Неограничивающие примеры консервантов включают фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, нитрит фенилртути, феноксиэтанол, формальдегид, хлорбутанол, хлорид магния (например, гексагидрат), алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и т.п.), хлорид бензалкония, хлорид бензетония и дегидроацетат натрия и тимеросал, или их смеси в водном разбавителе. Любую подходящую концентрацию или смесь можно использовать, как известно в данной области, такую как 0,001-5% или какой-либо диапазон или значение между, такое как, но не ограничиваясь этим, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или какой-либо диапазон или значение между. Неограничивающие примеры включают отсутствие консерванта, 0,1-2% м-крезол (например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% бензиловый спирт (например, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% тимеросал (например, 0,005, 0,01), 0,001-2,0% фенол (например, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабен(ы) (например, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) и т.п.
[00428] Иногда может быть желательно доставлять композиции, представленные в настоящем описании, субъекту в течение длительных периодов времени, например, в течение периодов от одной недели до одного года или больше от одного вконтроля. Можно использовать различные медленно высвобождаемые, депо или имплантированные дозированные формы. Например, дозированная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединений, которая имеет низкую степень растворимости в текучих веществах организма, например, (a) кислотно-аддитивную соль многоосновной кислоты, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталин моно- или дисульфоновые кислоты, полигалактуроновая кислота и т. п.; (b) соль поливалентного катиона металла, такого как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и т.п., или органического катиона, сформированного, например, из N,N'-дибензилэтилендиамина или этилендиамина; или (c) комбинации (a) и (b), например, соль таннат цинка. Дополнительно, композицию, предоставленную в настоящем описании, предпочтительно, относительно нерастворимую соль, такую как те, которые описаны выше, можно формулировать в геле, например, геле моностеарата алюминия, например, с сезамовым маслом, подходящим для инъекции. Особенно предпочтительные соли представляют собой соли цинка, соли танната цинка, соли памоата и т.п. Другой тип медленно высвобождаемого депо-состава для инъекции будет содержать соединение или соль, диспергированные для инкапсуляции в медленно распадающемся, нетоксичном, неантигенном полимере, таком как полимер полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты, например, как описано в патенте США № 3773919. Соединения или, предпочтительно, относительно нерастворимые соли, такие как те, которые описаны выше, также можно формулировать в силастиковых пеллетах с холестериновой матрицей, в частности для использования у животных. Дополнительные медленно высвобождаемые, депо или имплантированные композиции, например, газовые или жидкие липосомы, известны в литературе (патент США № 5770222 и «Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems», ред. J. R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).
[00429] Диапазон композиции по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, предоставленных в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), включает количества, получаемые при восстановлении, если во влажной/сухой системе, концентрации приблизительно от 1,0 мкг/мл приблизительно до 1000 мг/мл, несмотря на то, что более низкие и более высокие концентрации подходят и зависят от планируемого наполнителя для доставки, например, растворенные составы будут отличаться от трансдермального пластыря, пульмональных, чреcслизистых или осмотических или микронасосных способов.
[00430] В некоторых вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержат по меньшей мере одно из любого подходящего вспомогательного средства, такого как, но не ограничиваясь этим, разбавитель, связывающее средство, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант или тому подобное. В некоторых вариантах осуществления предпочтительны фармацевтически приемлемые вспомогательные средства. Неограничивающие примеры и способы получения таких стерильных растворов хорошо известны в данной области, например, но не ограничиваясь этим, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990. Обычным образом можно выбирать фармацевтически приемлемые носители, которые подходят для способа вконтроля, растворимости и/или стабильности антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании.
[00431] В некоторых вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержат один или несколько фармацевтических эксципиентов и/или добавок. Неограничивающими примерами фармацевтических эксципиентов и добавок являются белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, включая моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; производные сахаров, такие как альдиты, альдоновые кислоты, этерифицированные сахара и т.п.; и полисахариды или полимеры сахаров), которые могут присутствовать по отдельности или в комбинации, содержащей отдельно или в комбинации 1-99,99% по массе или объему. Неограничивающие примеры белковых эксципиентов включают сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека (HSA), рекомбинантный альбумин человека (rHA), желатин, казеин и т. п. Неограничивающие примеры аминокислотных/антительных компонентов, которые также могут принимать участие в буферной емкости, включают аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т.п. В некоторых вариантах осуществления аминокислотой является глицин. Неограничивающие примеры углеводных эксципиентов включают моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелицитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит сорбит (глюцит), миоинозитол и т.п. В некоторых вариантах осуществления углеводным эксципиентом является маннит, трегалоза, или раффиноза.
[00432] В некоторых вариантах осуществления композиция, предоставленная в настоящем описании, содержит одно или несколько буферных или корректирующих pH средств; обычно, буфер представляет собой соль, полученную из органической кислоты или основания. Неограничивающие примеры буферов включают соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; Tris, гидрохлорид трометамина или фосфатные буферы. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой соли органической кислоты, такие как цитрат. Другие эксципиенты, например, изотонические средства, буферы, антиоксиданты, усилители консервантов, можно необязательно и предпочтительно добавлять в разбавитель. Изотоническое средство, такое как глицерин, широко используют в известных концентрациях. Физиологически переносимый буфер предпочтительно добавляют для обеспечения усовершенствованного управления pH. Композиции могут покрывать широкий диапазон pH, такой как приблизительно от pH 4 приблизительно до pH 10, и предпочтительные диапазоны приблизительно от pH 5 приблизительно до pH 9, и наиболее предпочтительный диапазон приблизительно 6,0 приблизительно до 8,0. Предпочтительно, композиции, представленные в настоящем описании, имеют pH между приблизительно 6,8 и приблизительно 7,8. Предпочтительные буферы включают фосфатные буферы, наиболее предпочтительно фосфат натрия, в частности фосфатно-солевой буфер (PBS).
[00433] В некоторых вариантах осуществления композиция, предоставленная в настоящем описании, содержит один или несколько полимерных эксципиентов/добавок, таких как, например, поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, ароматизаторы, противомикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатические средства, поверхностно-активные средства (например, полисорбаты, такие как «TWEEN 20» и «TWEEN 80»), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и/или хелатирующие средства (например, EDTA).
[00434] Другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизаторы, такие как Tween 20 (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат), Tween 40 (полиоксиэтилен (20) сорбитан монопальмитат), Tween 80 (полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат), Pluronic F68 (блок-сополимеры полиоксиэтиленов и полиоксипропиленов) и PEG (полиэтиленгликоль), или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 или полоксамер 184 или 188, Pluronic.RTM. polyls, другие блок-сополимеры и хелаторы, такие как EDTA и EGTA, можно необязательно добавлять в композиции для того, чтобы снижать агрегирование. Эти добавки, в частности, можно использовать, если насос или пластмассовый контейнер используют для вконтроля композиции. Присутствие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного средства смягчает предрасположенность белка к агрегации.
[00435] Дополнительные фармацевтические эксципиенты и/или добавки, пригодные для использования в композиции, представленной в настоящем описании, известны специалисту в данной области и упомянуты, например, в «Remington: The Science & Practice of Pharmacy», 19-е изд., Williams & Williams, (1995) и в «Physician's Desk Reference», 52-е изд., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. В определенных предпочтительных вариантах осуществления материалы носителей или эксципиентов представляют собой углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитрат) или полимерные средства.
[00436] Предпочтительно, водный разбавитель необязательно дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. Предпочтительные консерванты включают те, которые выбраны из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и т. п.), хлорида бензалкония, хлорида бензетония, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в композиции, представляет собой концентрацию, достаточную для того, чтобы получать противомикробный эффект. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и уже определены специалистом в данной области.
[00437] Композиции, представленные в настоящем описании, можно получать с помощью процесса, который включает смешивание по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), и консерванта, выбранного из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и т. п.), хлорида бензалкония, хлорида бензетония, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, и консерванта в водном разбавителе осуществляют с использованием стандартных процедур растворения и смешивания. Для того чтобы получать подходящую композицию, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, в буферном растворе объединяют с желаемым консервантом в буферном растворе в количествах, достаточных для предоставления антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, и консерванта в желаемых концентрациях. Композиции, представленные в настоящем описании, можно получать с помощью процесса, который включает смешивание по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, и выбранного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, содержащего физиологический раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, и буфера в водном разбавителе осуществляют с использованием стандартных процедур растворения и смешивания. Для того чтобы получать подходящую композицию, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, в воде или буфере объединяют с желаемым буферным средством в воде в количествах, достаточных для предоставления белка и буфера в желаемых концентрациях. Вариации этих процессов будут известны специалисту в данной области. Например, порядок добавления компонентов, используют ли дополнительные добавки, температура и pH, при которых получают композицию, все эти факторы можно оптимизировать для используемых концентрации и средств вконтроля.
5.4.1 ПАРЕНТЕРАЛЬНЫЕ СОСТАВЫ
[00438] В некоторых вариантах осуществления композицию, предоставленную в настоящем описании, формулируют для парентерального инъекционного вконтроля. В рамках изобретения, термин «парентеральный» включает внутривенный, внутрисосудистый, внутримышечный, внутрикожный, подкожный и внутриглазной. Для парентерального вконтроля композицию можно формулировать в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка, совместно или отдельно предоставленных с фармацевтически приемлемым парентеральным наполнителем. Неограничивающие примеры таких наполнителей представляют собой воду, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, глицерин, этанол и 1-10% сывороточный альбумин человека. Липосомы и неводные наполнители, такие как жирные масла, также можно использовать. Наполнитель или лиофилизированный порошок может содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Состав стерилизуют с помощью известных или подходящих способов.
[00439] Подходящие фармацевтические носители описаны в самом последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, стандартом справочном тексте в этой области.
[00440] Составы для парентерального вконтроля могут содержать в качестве обыкновенных эксципиентов стерильную воду или физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и т. п. Водные или масляные суспензии для инъекции можно получать с использованием подходящего эмульсификатора или увлажнителя и суспендирующего средства, в соответствии с известными способами. Средства для инъекции могут представлять собой нетоксичное, перорально не вводимое разбавляющее средство, такое как водный раствор или стерильный инъецируемый раствор или суспензия в растворителе. В качестве подходящего наполнителя или растворителя допустимы вода, раствор Рингера, изотонический физиологический раствор и т.д.; в качестве обычного растворителя или суспендирующего растворителя можно использовать стерильное нелетучее масло. Для этих целей можно использовать нелетучее масло и жирную кислоту какого-либо типа, включая природные или синтетические или полусинтетические жирные масла или жирные кислоты; природные или синтетические или полусинтетические моно- или ди- или триглицериды. Парентеральное введение известно в данной области и включает, но не ограничиваясь этим, стандартные средства инъекции, безыгольное устройство для инъекции давлением газа, как описано в патенте США № 5851198, и лазерное перфорационное устройство, как описано в патенте США № 5839446, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
5.4.2 ЛЕГОЧНЫЕ СОСТАВЫ
[00441] В некоторых вариантах осуществления композицию, которая содержит антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), формулируют для легочного вконтроля. Для легочного вконтроля композицию доставляют при размере частицы, эффективном для достижения нижних дыхательных путей легких или синусов. Композиции для легочного вконтроля можно доставлять посредством какого-либо множества ингаляционных или назальных устройств, известных в данной области для вконтроля терапевтического средства посредством ингаляции. Эти устройства, способные осаждать аэрозольные составы в полости синуса или альвеолах пациента, включают ингаляторы отмеренных доз, небулайзеры, генераторы сухого порошка, распылители и т. п. Другие устройства, подходящие для того, чтобы направлять легочное или назальное введение антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, также известны в данной области. Во всех таких устройствах используют составы, подходящие для вконтроля, для дозирования антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, в аэрозоле. Такие аэрозоли могут состоять или из растворов (как водных, так и неводных) или из твердых частиц. В ингаляторах отмеренных доз, таких как ингалятор отмеренных доз Ventolin, обычно используют газообразный пропеллент и необходимо приведение в действие во время вдоха (см., например, WO 94/16970, WO 98/35888). В ингаляторах сухого порошка, таких как Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler (Glaxo), Diskus (Glaxo), устройствах, поставляемых на рынок Inhale Therapeutics, среди прочего, используют приведение смешанного порошка в движение дыханием (патент США № 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, Патент США № 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Небулайзеры, такие как небулайзер Ultravent (Mallinckrodt) и небулайзер Acorn II (Marquest Medical Products) (патент США № 5404871 Aradigm, WO 97/22376), приведенные выше источники полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, создают аэрозоли из растворов, тогда как ингаляторы отмеренных доз, ингаляторы сухого порошка и т.д. создают аэрозоли из мелких частиц. Такие примеры коммерчески доступных ингаляционных устройств представляют собой неограничивающие примеры, не предназначенные для ограничения объема.
[00442] В некоторых вариантах осуществления спрей, содержащий антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), можно получать, проталкивая суспензию или раствор по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, через сопло под давлением. Размер и конфигурацию сопла, прикладываемое давление и скорость подачи жидкости можно выбирать для того, чтобы достигать желаемой выдачи и размера частиц. Электрораспыление можно получать, например, с помощью электрического поля совместно с капиллярной подачей или подачей через сопло. Благоприятно, частицы композиции, которая содержит по меньшей мере одно антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, доставляемые с помощью распылителя, имеют размер частицы приблизительно меньше 10 мкм, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 1 мкм приблизительно до 5 мкм и наиболее предпочтительно приблизительно от 2 мкм приблизительно до 3 мкм.
[00443] Составы композиции, которая содержит по меньшей мере одно антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), пригодные для использования с распылителем, обычно содержат по меньшей мере одно антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, в водном растворе в концентрации приблизительно от 0,1 мг приблизительно до 100 мг на мл раствора или мг/г, или каком-либо диапазоне или значении между, например, но не ограничиваясь этим, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/мл или мг/г. Состав может содержать средства, такие как эксципиент, буфер, изотоническое средство, консервант, поверхностно-активное средство и, предпочтительно, цинк. Состав также может содержать эксципиент или средство для стабилизации композиции антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, такое как буфер, восстанавливающее средство, белок-наполнитель или углевод. Белки-наполнители, которые можно использовать при формулировании такой композиции, включают альбумин, протамин или тому подобное. Типичные углеводы, которые можно использовать при формулировании белков композиции антитела, включают сахарозу, маннит, лактозу, трегалозу, глюкозу или тому подобное. Композиция также может содержать поверхностно-активное средство, которое может снижать или предотвращать вызванное поверхностью агрегирование композиции, обусловленное атомизацей раствора при формировании аэрозоля. Можно использовать различные стандартные поверхностно-активные средства, такие как сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот и спирты, а также сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирных кислот. Количества в целом находятся в диапазоне между 0,001 и 14% по массе состава. Предпочтительные поверхностно-активные средства представляют собой полиоксиэтиленсорбитан моноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 или тому подобное.
[00444] В некоторых вариантах осуществления композицию вводят через небулайзер, такой как струйный небулайзер или ультразвуковой небулайзер. Обычно, в струйном небулайзере источник сжатого воздуха используют для того, чтобы создавать струю воздуха высокой скорости через отверстие. По мере расширения газа за пределами сопла возникает область низкого давления, которая увлекает раствор белка композиции антитела через капиллярную трубку, соединенную с резервуаром жидкости. Поток жидкости из капиллярной трубки рассекается на нестабильные нити и капли по мере выхода из трубки, создавая аэрозоль. Можно использовать спектр конфигураций, скоростей потока и типов перегородок, чтобы достигать желаемых характеристик эффективности данного струйного небулайзера. В ультразвуковом небулайзере высокочастотную электрическую энергию используют для того, чтобы создавать вибрационную механическую энергию, обычно с использованием пьезоэлектрического преобразователя. Эту энергию передают на состав белка композиции антитела или непосредственно или через соединяющее текучее вещество, создавая аэрозоль, содержащий белок композиции антитела. Благоприятно, частицы белка композиции антитела, доставляемые посредством небулайзера, имеют размер частицы приблизительно меньше 10 мкм, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 1 мкм приблизительно до 5 мкм и наиболее предпочтительно приблизительно от 2 мкм приблизительно до 3 мкм.
[00445] В некоторых вариантах осуществления композицию вводят через ингалятор отмеренных доз (MDI), в котором пропеллент, по меньшей мере одно антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), и какие-либо эксципиенты или другие добавки содержатся в емкости в виде смеси, содержащей сжиженный сжатый газ. Приведением дозирующего клапана в действие высвобождают смесь фильеры в виде аэрозоля, предпочтительно содержащего частицы в диапазоне размеров приблизительно меньше 10 мкм, предпочтительно приблизительно от 1 мкм приблизительно до 5 мкм и наиболее предпочтительно приблизительно от 2 мкм приблизительно до 3 мкм. Желаемый размер частиц аэрозоля можно получать с использованием состава белка композиции антитела, получаемого различными способами, известными специалистам в данной области, включая размол на струйной мельнице, распылительную сушку, конденсацию в критической точке или тому подобное. Предпочтительные ингаляторы отмеренных доз включают те, что производят 3M или Glaxo и в которых используют пропеллент гидрофторуглерод.
[00446] Составы антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), для использования с устройством ингалятора отмеренных доз, в целом включают мелкодисперсный порошок, содержащий по меньшей мере одно антитело против IL-6, в виде суспензии в неводной среде, например, суспендированный в пропелленте с помощью поверхностно-активного средства. пропеллент может представлять собой какой-либо стандартный материал, используемый с этой целью, такой как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод, или углеводород, в том числе трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, HFA-134a (гидрофторалкан-134a), HFA-227 (гидрофторалкан-227) или тому подобное. Предпочтительно пропеллентом является гидрофторуглерод. Поверхностно-активное средство можно выбирать для того, чтобы стабилизировать по меньшей мере одно антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, в виде суспензии в пропелленте, чтобы защищать активное средство от химического разрушения, и т.п. Подходящие поверхностно-активные средства включают сорбитантриолеат, лецитин сои, олеиновую кислоту или тому подобное. В некоторых случаях аэрозольные растворы предпочтительны при использовании таких растворителей, как этанол. В состав также можно включать дополнительные средства, известные в данной области для белковых составов.
5.4.3 ОРАЛЬНЫЕ СОСТАВЫ
[00447] В некоторых вариантах осуществления композицию, предоставленную в настоящем описании, формулируют для перорального вконтроля. В некоторых вариантах осуществления для перорального вконтроля композиции и способы вконтроля по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, основаны на совместном введении адъювантов, например, таких как резорцины, и неионных поверхностно-активных средств, таких как простой полиоксиэтиленолеиловый эфир и простой н-гексадецилполиэтиленовый эфир, чтобы искусственно повышать проницаемость стенок кишечника, а также совместном введении ингибиторов ферментов, например, таких как ингибиторы панкреатического трипсина, диизопропилфторфосфат (DFF) и трасилол, для того, чтобы ингибировать ферментативное разрушение. Активное соединение, входящее в состав твердой дозированной формы для перорального вконтроля можно, смешивать по меньшей мере с одной добавкой, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу, раффинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакантовую камедь, аравийскую камедь, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Эти дозированные формы также могут содержать добавки другого типа(ов), такие как, например, неактивное разбавляющее средство, смазывающее средство, такое как стеарат магния, парабен, консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, α-токоферол, антиоксидант, такой как цистеин, дезинтегрирующее средство, связывающее средство, загуститель, буферное средство, подсластитель, ароматизатор, отдушку и т.д.
[00448] В некоторых вариантах осуществления таблетки и пилюли для перорального вконтроля, кроме того, можно превращать в препараты с кишечным покрытием. В некоторых вариантах осуществления жидкие препараты для перорального вконтроля включают, например, препараты эмульсии, сиропа, крепкого настоя, суспензии и раствора, допустимые для медицинского использования. Эти препараты могут содержать неактивные разбавляющие средства, как правило, используемые в указанной области, например, воду. Липосомные препараты можно использовать для перорально вводимых препаратов, например, как описано для инсулина и гепарина (патент США № 4239754). Дополнительно, микросферы из искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеиноидов) можно использовать при пероральном введении фармацевтических средств, например, как описано в патенте США № 4925673. Кроме того, при пероральном введении биологически активных средств используют соединения-носители, такие как те, которые описаны в патенте США № 5879681 и патенте США № 5871753,.
5.4.4 СОСТАВЫ ДЛЯ СЛИЗИСТЫХ
[00449] В некоторых вариантах осуществления композицию, предоставленную в настоящем описании, формулируют для абсорбции через поверхности слизистых. В некоторых вариантах осуществления для абсорбции через поверхности слизистых композиции и способы вконтроля по меньшей мере одного антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), включают эмульсию, содержащую множество субмикронных частиц, мукоадгезивную макромолекулу, биоактивный пептид и непрерывную водную фазу, которая способствует абсорбции через поверхности слизистых посредством достижения мукоадгезии частиц эмульсии (патент США № 5514670). Поверхности слизистых, подходящие для нанесения эмульсий, предоставленных в настоящем описании, могут включать, например, роговичный, конъюнктивальный, буккальный, сублингвальный, назальный, вагинальный, легочный, желудочный, кишечный и ректальный пути вконтроля. Составы для вагинального или ректального вконтроля, например, суппозитории, могут содержать в качестве эксципиентов, например, полиалкиленгликоли, вазелин, кокосовое масло и т.п. Составы для интраназального вконтроля могут быть твердыми и содержать в качестве эксципиентов, например, лактозу, или могут представлять собой водные или масляные растворы капель для носа. Для буккального вконтроля эксципиенты включают, например, сахара, стеарат кальция, стеарат магния, прежелатинизированный крахмал и т.п. (патент США № 5849695).
5.4.5 ТРАНСДЕРМАЛЬНЫЕ СОСТАВЫ
[00450] В некоторых вариантах осуществления композицию, предоставленную в настоящем описании, формулируют для трансдермального вконтроля. В некоторых вариантах осуществления для трансдермального вконтроля композиция содержит по меньшей мере одно антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), инкапсулированные в устройстве для доставки, например, таком как липосома или полимерные наночастицы, микрочастицы, микрокапсулы или микросферы (собирательно называемые микрочастицами, если не указано иное). Известно множество подходящих устройств для трансдермального вконтроля, включая микрочастицы, выполненные из синтетических полимеров, таких как полиоксикислоты, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры, сложные полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены и природные полимеры, такие как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды, а также их сочетания (патент США № 5814599).
5.4.6 НАБОРЫ
[00451] Также в настоящем описании предоставлены наборы, содержащие одно или несколько антител, описанных в настоящем описании, или их антигенсвязывающих фрагментов или их конъюгатов. В частном варианте осуществления в настоящем описании предоставлен фармацевтический пакет или набор, содержащий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании, такими как одно или несколько антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат фармацевтическую композицию, описанную в настоящем описании, и профилактическое или терапевтическое средство.
[00452] Необязательно связанным с таким контейнером(ами) может быть уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, использование или продажу фармацевтических или биологических продуктов, дозированная форма и/или инструкции для ее использования. В некоторых вариантах осуществления инструкции, включенные в набор, предоставляют руководство в отношении количеств доз и/или схем дозирования для вконтроля фармацевтической композиции(й).
[00453] Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваясь этим, блистерные упаковки, бутылки, пакеты, саше, пробирки, ингаляторы, наносы, мешки, флаконы, контейнеры, шприцы и какой-либо упаковочный материал, подходящий для выбранной фармацевтической композиции и предполагаемого способа вконтроля и лечения.
[00454] Наборы, представленные в настоящем описании, дополнительно могут содержать устройства, которые используют для того, чтобы вводить активные ингредиенты. Примеры таких устройств включают, но не ограничиваясь этим, шприцы, безыгольные инъекторы, капельные мешки, пластыри и ингаляторы.
[00455] Наборы, представленные в настоящем описании, дополнительно могут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, которые можно использовать для того, чтобы вводить ингредиенты. Например, если ингредиент предоставляют в твердой форме, которую нужно восстанавливать для парентерального вконтроля, набор может содержать закупоренный контейнер подходящего наполнителя, в котором ингредиент можно растворять для того, чтобы формировать стерильный раствор без частиц, который подходит для парентерального вконтроля, или можно восстанавливать в виде суспензии для перорального вконтроля. Примеры фармацевтически приемлемых наполнителей включают, но не ограничиваясь этим: водные наполнители, включая в качестве неограничивающих примеров воду для инъекций USP, хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, декстрозу для инъекций, декстрозу и хлорид натрия для инъекций и лактированный раствор Рингера для инъекций; наполнители, смешиваемые с водой, включая в качестве неограничивающих примеров, этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль; и неводные наполнители, включая в качестве неограничивающих примеров кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, сезамовое масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.
5.5 ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И СПОСОБЫ
5.5.1 ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И СПОСОБЫ
[00456] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения раке у субъекта, в частности, MUC16-положительной раке у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента (см. раздел 5.1 и раздел 5.2). В частном варианте осуществления субъект представляет собой субъект, как описано в разделе 5.5.5. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе, как описано в разделе 5.5.3. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в соответствии со способом, как описано в разделе 5.5. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными фармацевтически активными средствами, как описано в разделе 5.5.4.
[00457] Для использования антитела к гликозилированному MUC16 или его фрагмента у субъекта конкретного биологического вида, используют антитело к гликозилированному MUC16 или его фрагмент, которые связываются с MUC16 этого конкретного биологического вида. Например, для лечения человека используют антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с MUC16 человека. В частном варианте осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой иммуноглобулин.
[00458] Кроме того, для использования антитела к гликозилированному MUC16 или его фрагмента у субъекта конкретного биологического вида, антитело к гликозилированному MUC16, предпочтительно, константную область антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент получают у этого конкретного биологического вида. Например, для лечения человека антитело к гликозилированному MUC16 или его фрагмент может содержать антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое представляет собой иммуноглобулин, где иммуноглобулин содержит константную область человека. В частном варианте осуществления субъектом является человек.
[00459] В частном варианте осуществления MUC16-положительная рак представляет собой рак яичников, рак легких, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак фаллопиевой трубы, рак матки (например, эндометрия), рак первичной брюшины или рак какой-либо другой ткани, которая экспрессирует рецептор MUC16.
[00460] В конкретных вариантах осуществления лечение может быть направлено на достижение полезных или желаемых клинических результатов, включая, в качестве неограничивающих примеров, облегчение симптома, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) стадии заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или облегчение стадии заболевания и ремиссию (частичную или полную), которые поддаются обнаружению или не поддаются обнаружению. В частном варианте осуществления «лечение» также может быть направлено на продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если не получать лечение. В конкретных вариантах осуществления введение антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, субъекту со злокачественной опухолью (например, злокачественной опухолью яичников, злокачественной опухолью легких, злокачественной опухолью поджелудочной железы, злокачественной опухолью молочной железы, злокачественной опухолью фаллопиевой трубы, злокачественной опухолью матки (например, эндометрия) или злокачественной опухолью первичной брюшины или злокачественной опухолью какой-либо другой ткани, которая экспрессирует рецептор MUC16) достигает по меньшей мере одного, двух, трех, четырей или более из следующих эффектов: (i) снижение или уменьшение интенсивности тяжести одного или нескольких симптомов раке; (ii) уменьшение длительности одного или нескольких симптомов, связанных со злокачественной опухолью; (iii) предотвращение рецидива симптома, связанного со злокачественной опухолью; (iv) снижение госпитализации субъекта; (v) уменьшение длительности госпитализации; (vi) увеличение выживаемости субъекта; (vii) усиление или усовершенствование терапевтического эффекта другой терапии; (viii) ингибирование развития или начала одного или нескольких симптомов, связанных со злокачественной опухолью; (ix) уменьшение числа симптомов, связанных со злокачественной опухолью; (x) усовершенствование качества жизни, как оценивают способами, хорошо известными в данной области; (x) ингибирование рецидива опухоли; (xi) регрессия опухолей и/или одного или нескольких симптомов, связанных с ними; (xii) ингибирование прогрессирования опухолей и/или одного или нескольких симптомов, связанных с ними; (xiii) уменьшение роста опухоли; (xiv) уменьшение размера опухоли (например, объема или диаметра); (xv) уменьшение формирования вновь сформированной опухоли; (xvi) предотвращение, эрадикация, устранение или контроль первичных, регионарных и/или метастатических опухолей; (xvii) уменьшение числа или размера метастазов; (xviii) уменьшение смертности; (xix) увеличение безрецидивной выживаемости; (xx) размер опухоли сохраняется и не увеличивается или увеличивается меньше, чем увеличение опухоли после вконтроля стандартной терапии, как измеряют стандартными способами, доступными специалисту в данной области, такими как магнитно-резонансная визуализация (MRI), динамическая MRI с контрастированием (DCE-MRI), рентген и компьютерное томографическое (CT) сканирование или позитронно-эмиссионное томографическое (PET) сканирование; и/или (xxi) увеличение длительности ремиссии у пациентов. Лечение может быть направлено на достижение одного или нескольких из приведенных выше.
5.5.2 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
[00461] В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), описанные в настоящем описании, можно использовать для диагностических целей, чтобы обнаруживать, диагностировать или осуществлять мониторинг состояния, описанного в настоящем описании (например, состояния, включающего MUC16-положительные клетки раке). В некоторых вариантах осуществления антитела к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающие фрагменты для использования в диагностических целях метят, как описано в разделе 5.2.
[00462] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам обнаружения состояния, описанного в настоящем описании, которые включают (a) анализ экспрессии MUC16 или его фрагмента в клетках или образце ткани субъекта с использованием одного или нескольких антител к гликозилированному MUC16 или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании; и (b) сравнение уровня экспрессии MUC16 или его фрагмента с контрольным уровнем, например, уровнями в образцах нормальных тканей (например, от субъекта, не имеющего состояния, описанного в настоящем описании, или от того же пациента до начала состояния), в соответствии с чем увеличение или уменьшение анализируемого уровня экспрессии MUC16 или его фрагмента по сравнению с контрольным уровнем экспрессии MUC16 или его фрагмента отражает состояние, описанное в настоящем описании.
125
121
14
35
3
121
99
[00463] Антитела, описанные в настоящем описании, можно использовать для анализа уровней MUC16 или его фрагмента в биологическом образце с использованием классических иммуногистологических способов, как описано в настоящем описании или как известно специалистам в данной области (например, см. Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; и Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Другие способы на основе антител, которые можно использовать для обнаружения экспрессии гена белка, включают иммунологические анализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммунологический анализ (RIA). Подходящие метки для анализа антител известны в данной области и включают ферментативные метки, такие как глюкозооксидаза; радиоизотопы, такие как йод (I, I), углерод (C), сера (S), тритий (H), индий (In) и технеций (Tc); люминесцентные метки, такие как люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин, и биотин.
[00464] В некоторых вариантах осуществления мониторинг состояния, описанного в настоящем описании (например, MUC16-положительной раке), осуществляют посредством повторения способа диагностирования в течение определенного периода времени после начального диагноза.
[00465] Присутствие меченой молекулы можно обнаруживать у субъекта с использованием известных в данной области способов для сканирования in vivo. Специалисты в данной области смогут определять подходящий способ обнаружения конкретной метки. Способы и устройства, которые можно использовать в диагностических способах по изобретению, включают, но не ограничиваясь этим, компьютерную томографию (CT), сканирование всего организма, такое как позитронно-эмиссионная томография (PET), магнитно-резонансная визуализация (MRI) и сонография.
5.5.3 ДОЗЫ И СХЕМЫ
[00466] Антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент (см. раздел 5.1 и раздел 5.2) или композицию (см. раздел 5.4) или клетки, экспрессирующие антитела, или его антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, можно доставлять субъекту с помощью различных путей. Они включают, но не ограничиваясь этим, парентеральный, интраназальный, интратрахеальный, пероральный, внутрикожный, топический, внутримышечный, интраперитонеальный, трансдермальный, внутривенный, внутриопухолевый, конъюнктивальный и подкожный пути. Легочное введение также можно использовать, например, с использованием ингалятора или небулайзера и состава с аэрозольным средством для применения в качестве спрея. В одном из вариантов осуществления антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент или композицию, описанную в настоящем описании, вводят парентерально субъекту (например, субъекту, как описано в разделе 5.5.5). В частном варианте осуществления указанное парентеральное введение является внутривенным, внутримышечным или подкожным.
[00467] Количество антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции, которое будет эффективно при лечении и/или предотвращении состояния, зависит от свойств заболевания, и его можно определять стандартными клиническими способами.
[00468] Точная доза, подлежащая использованию в композиции, также зависит от пути вконтроля и типа раке, и решение о ней следует принимать в соответствии с суждением практикующего врача и всех обстоятельств субъекта. Например, эффективные дозы также могут варьировать в зависимости от средства вконтроля, целевого места, физиологического состояния пациента (включая возраст, массу тела и состояние здоровья), является ли пациент человеком или животным, других вводимых лекарств, или является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Дозы лечения оптимально титруют для того, чтобы оптимизировать безопасность и эффект.
[00469] В некоторых вариантах осуществления анализ in vitro используют для того, чтобы помогать идентифицировать оптимальные диапазоны доз. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых доза-эффект, полученных на тестовых системах in vitro или животных моделях.
[00470] Для антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента доза может находиться в диапазоне приблизительно от 0,0001 до 100 мг/кг и более обычно от 0,01 до 15 мг/кг массы тела пациента. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела, 10 мг/кг массы тела или в диапазоне 1-10 мг/кг или другими словами 70 мг или 700 мг или в диапазоне 70-700 мг, соответственно, для пациента 70 кг. В целом, антитела человека имеют более длительное время полужизни внутри организма человека, чем антитела от других биологических видов из-за иммунного ответа на инородные полипептиды. Таким образом, часто возможны более низкие дозы антител человека и менее частое введение.
9
5
6
5
5
5
6
6
6
6
4
9
5
7
[00471] В некоторых вариантах осуществления, таких как при введении сконструированных клеток, экспрессирующих антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, или CAR, субъект вводят субъекту в диапазоне приблизительно от одного миллиона приблизительно до 100 миллиард клеток, таком как, например, от 1 миллиона приблизительно до 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток или диапазон, определяемый какими-либо двумя из приведенных выше значений), таком как приблизительно от 10 миллионов приблизительно до 100 миллиардов клеток (например, приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 30 миллионов клеток, приблизительно 40 миллионов клеток, приблизительно 60 миллионов клеток, приблизительно 70 миллионов клеток, приблизительно 80 миллионов клеток, приблизительно 90 миллионов клеток, приблизительно 10 миллиардов клеток, приблизительно 25 миллиардов клеток, приблизительно 50 миллиард клеток, приблизительно 75 миллиардов клеток, приблизительно 90 миллиардов клеток или диапазон, определяемый какими-либо двумя из приведенных выше значений), и в некоторых случаях приблизительно от 100 миллионов клеток приблизительно до 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 120 миллионов клеток, приблизительно 250 миллионов клеток, приблизительно 350 миллионов клеток, приблизительно 450 миллионов клеток, приблизительно 650 миллионов клеток, приблизительно 800 миллионов клеток, приблизительно 900 миллионов клеток, приблизительно 3 миллиарда клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 45 миллиардов клеток) или какое-либо значение между этими диапазонами. В некоторых вариантах осуществления доза всех клеток и/или доза индивидуальных субпопуляций клеток находится в диапазоне между по или приблизительно 104 и по или приблизительно 10 клеток/кг (кг) массы тела, например, между 10 и 10 клеток/кг массы тела, например, по или приблизительно 1×10 клеток/кг, 1,5×10 клеток/кг, 2×10 клеток/кг или 1×10 клеток/кг, 2×10 клеток/кг, 5×10 клеток/кг или 10×10 клеток/кг массы тела. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки вводят по, или в определенном диапазоне ошибки, между по или приблизительно 10 и по или приблизительно 10 T-клеток/кг (кг) массы тела, например, между 10 и 10 T-клеток/кг массы тела.
[00472] Антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить во многих случаях. Интервалы между разовыми дозами может составлять 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 1 год или 2 года.
5.5.4 СПОСОБЫ КОМБИНИРОВАННОГО ЛЕЧЕНИЯ
[00473] В частном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании для лечения раке (например, раке яичников, раке поджелудочной железы, раке легких, раке молочной железы, раке фаллопиевой трубы, раке матки (например, эндометрия) или раке первичной брюшины) у субъекта, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), дополнительно включают введение субъекту одного или нескольких дополнительных терапевтических средств. В частном варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство предназначено для лечения раке у субъекта (например, раке яичников, раке поджелудочной железы, раке легких, раке молочной железы, раке фаллопиевой трубы, раке матки (например, эндометрия) и раке первичной брюшины). В частном варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство предназначено для лечения каких-либо побочных эффектов лечения антителом к гликозилированному MUC16 или антигенсвязывающим фрагментом, описанными в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2).
c114-N23
c114-N23
c114-N23
[00474] В одном из вариантов осуществления вводят первое антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые распознают эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1806, но не содержит N-гликозилированный Asn1800 (т.е. им нужен N-гликозилированный Asn1806, но не N-гликозилированный Asn1800, для связывания с MUC16) в комбинации со вторым антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, которые распознают эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1806 и также содержит N-гликозилированный Asn1800 (т.е. оба N-гликозилированных участка представляют собой часть эпитопа, распознаваемого антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом). Такое первое антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно идентифицировать по (i) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма MUC16 гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, эта четвертая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность четвертой формы представляет собой SEQ ID № 152, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, относятся к одному типу клеток. Такое второе антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно идентифицировать по (i) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; и (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует пятую форму MUC16, эта пятая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность пятой формы представляет собой SEQ ID № 172, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16 относится к тому же типу клеток, что и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует пятую форму MUC16. Белок, кодируемый аминокислотной последовательностью из SEQ ID № 172, также упоминают в настоящем описании как MUC16. MUC16 состоит из C-концевых 114 аминокислотных остатков зрелого MUC16 (SEQ ID № 150 представляет собой последовательность зрелого MUC16), за исключением того, что аспарагины в положениях аминокислот 24 и 30 (соответствующих положениям аминокислот Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150), мутированы в аланины. Таким образом, MUC16 не способен к N-гликозилированию в положениях аминокислот 24 и 30 из SEQ ID № 172 (соответствующих положениям аминокислот Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150).
[00475] В одном из вариантов осуществления вводят первое антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые распознают эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1806, но не содержит N-гликозилированный Asn1800 (т.е. им нужен N-гликозилированный Asn1806, но не N-гликозилированный Asn1800, для связывания с MUC16) в комбинации со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые распознают эпитоп в MUC16, который содержит N-гликозилированный Asn1800, но не содержит N-гликозилированный Asn1806 (т.е. им нужен N-гликозилированный Asn1800, но не N-гликозилированный Asn1806, для связывания с MUC16). Такое первое антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент можно идентифицировать по (i) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма MUC16 гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) его способности иммуноспецифически связывать клетку, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, эта четвертая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность четвертой формы представляет собой SEQ ID № 152, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, относятся к одному типу клеток. Такое второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно идентифицировать по (i) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, эта первая форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность первой формы представляет собой SEQ ID № 133; (ii) его способности иммуноспецифически связываться с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, эта третья форма гликозилирована, и где аминокислотная последовательность третьей формы представляет собой SEQ ID № 139; и (iii) отсутствию у него иммуноспецифического связывания с клеткой, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, эта четвертая форма гликозилирована, где аминокислотная последовательность четвертой формы представляет собой SEQ ID № 152, где клетка, которая рекомбинантно экспрессирует первую форму MUC16, клетка, которая рекомбинантно экспрессирует третью форму MUC16, и клетка, которая рекомбинантно экспрессирует четвертую форму MUC16, относятся к одному типу клеток.
[00476] В конкретных вариантах осуществления дополнительным средством является средство, используемое для лечения раке яичников. В конкретных вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой средство, используемое для лечения раке поджелудочной железы. В конкретных вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой средство, используемое для лечения раке легких. В конкретных вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой средство, используемое для лечения раке молочной железы. В конкретных вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой средство, используемое для лечения раке фаллопиевой трубы. В конкретных вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой средство, используемое для лечения раке матки (например, эндометрия). В конкретных вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой средство, используемое для лечения раке первичной брюшины.
[00477] Антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), можно вводить с дополнительным терапевтическим средством параллельно или последовательно (до и/или после). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в той же или различных композициях, и с помощью того же или различных путей вконтроля. Первую терапию (которая представляет собой антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), или дополнительное терапевтическое средство) можно вводить прежде (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель до), параллельно с или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель после) вконтроля второй терапии (антитела к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), или дополнительного терапевтического средства) субъекту со злокачественной опухолью (например, злокачественной опухолью яичников, злокачественной опухолью поджелудочной железы, злокачественной опухолью легких, злокачественной опухолью молочной железы, злокачественной опухолью фаллопиевой трубы, злокачественной опухолью матки (например, эндометрия) и злокачественной опухолью первичной брюшины). В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство, вводимое субъекту в комбинации с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, описанными в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), вводят в той же композиции (фармацевтической композиции). В других вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство, вводимое в комбинации с антителом к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающим фрагментом, описанным в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2), вводят субъекту в другой композиции, нежели антитело к гликозилированному MUC16 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании (см. раздел 5.1 и раздел 5.2) (например, используют две или больше фармацевтических композиций).
5.5.5 ПОПУЛЯЦИЯ ПАЦИЕНТОВ
[00478] Субъект, которого лечат в соответствии со способами, предоставленными в настоящем описании, может представлять собой какое-либо млекопитающее, такое как грызун, кошка, собака, лошадь, корова, свинья, мартышка, примат или человек и т.д. В предпочтительном варианте осуществления субъектом является человек. В другом предпочтительном варианте осуществления субъектом является собака. В рамках изобретения, термины «субъект» и «пациент» используют взаимозаменяемо.
[00479] В некоторых вариантах осуществления у субъекта, которого лечат в соответствии со способами, предоставленными в настоящем описании, диагностирована MUC16-положительная рак, включая в качестве неограничивающих примеров рак яичника, легкого, поджелудочной железы, молочной железы, матки, фаллопиевой трубы или первичной брюшины или рак какой-либо другой ткани, которая экспрессирует MUC16.
[00480] Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации и не ограничения.
6. ПРИМЕРЫ
6.1 ПРИМЕР 1: ЭКСПРЕССИЯ КАРБОКСИКОНЦЕВОЙ ЧАСТИ MUC16/CA125 ИНДУЦИРУЕТ ТРАНСФОРМАЦИЮ И ИНВАЗИЮ ОПУХОЛИ
6.1.1 ВВЕДЕНИЕ
c114
c114
[00481] Сывороточный антиген CA125, антигенный фрагмент MUC16, был главной опорой при оценке и ведении раке яичников с начала 1980-х годов, но его биология и вклад в манифестацию раке яичников плохо поняты (см. источники 1-3, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Клонирование CA125, которого добились в 2001, сначала идентифицировало MUC16 как связанный муцин с небольшим внутриклеточным доменом, трансмембранным доменом, эктодоменом проксимально к предполагаемому сайту расщепления, и большой сильно гликозилированной областью из 12-20 тандемных повторов, каждый по 156 аминокислот в длину (фиг. 1A) (см. источники 4-6, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Серьезные злокачественные опухоли яичника, фаллопиевой трубы и матки часто экспрессируют большие количества MUC16, а аберрантную экспрессию MUC16 можно найти в нескольких других злокачественных новообразованиях, в том числе злокачественных опухолях легкого, поджелудочной железы и молочной железы. Экспрессия других связанных муцинов является обыкновенным признаком эпителиальных органов, и они часто чрезмерно экспрессированы в злокачественном новообразовании. Два значимых примера представляют собой MUC1, который чрезмерно экспрессирован во многих злокачественных опухолях молочных желез и яичников, и MUC4, который характерно избыточен в злокачественных опухолях поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта (см. источник 7, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Оба этих муцина идентифицированы как обладающие трансформирующими свойствами (см. источники 8 и 9, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Механизмы трансформации различают и поняты не полностью. MUC1 имеет область гомологии с β-катенином, для которой показана транслокация в ядро и действие в качестве фактора транскрипции (см. источники 10 и 11, как приведено в разделе 6.1.5, далее). В отличие от этого, MUC4 имеет HER-связывающие домены в его трансмембранной области и действует, по меньшей мере отчасти, через киназы семейства HER (см. источники 12 и 13, как приведено в разделе 6.1.5, далее). MUC16 не содержит областей гомологии с любым из этих доменов и, похоже, развивался независимо (см. источник 12, как приведено в разделе 6.1.5, далее). По сравнению как с MUC1, так и с MUC4, экспрессия MUC16 более ограничена, и он экспрессирован обычно, почти исключительно, в мюллеровом тракте и глазном эпителии (см. источники 14-16, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Области тандемных повторов молекулы MUC16, похоже, выполняет функцию ключевых взаимодействующих белков с мезотелином и другими белками стромы (см. источник 17, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Эти взаимодействия, вероятно, отвечают за классические паттерны серозного распространения рака яичников. В клинических условиях высокие уровни циркулирующих элементов из MUC16, которые кодируют антиген CA125, связаны с нежелательным клиническим исходом, независимо от стадии, степени дифференцировки и других традиционных клинических факторов (см. источник 18, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Другие идентифицировали C-конец MUC16 в качестве важного при инвазии и роста, но конкретные области проксимальной последовательности MUC16, отвечающие за трансформацию, не определены (см., например, Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-443 и Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91-98). Амплификацию геномных областей, кодирующих MUC16 в ДНК раке яичников, и сверхэкспрессию мРНК MUC16 наблюдали в проекте по раке яичников The Cancer Genome Atlas (TCGA) и связали с худшим исходом (см. источник 19, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Утрата MUC16 у мышей не связана с отчетливым фенотипом, но эффект персистирующей или аберрантной экспрессии MUC16 не известен (см. источник 20, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Данные в этом примере показывают, что экспрессия 114 C-концевых аминокислотных остатков MUC16 (MUC16, SEQ ID № 133) и, в частности, гликозилирование остатка Asn30 в MUC16 (соответствующего Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)) связано с конкретными изменениями сигнальной трансдукции, экспрессии гена и агрессивным биологическим поведением.
6.1.2 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
c114
c344
6.1.2.1 Синтез ДНК конструкций карбоксиконца MUC16 (MUC16) и домена MUC16-CA125 (MUC16) и гликозилированного слитого белка
c344
c114
c80
c86
c114
c80
c86
c344
c344
c114
c80
c86
c57-114
117-244
c57-114
[00482] Создавали ДНК конструкции, кодирующие усеченные формы MUC16 (обозначаемые MUC16, MUC16, MUC16 и MUC16; фиг. 1B и фиг. 1C). Сайты множественного клонирования EcoRV и NotI вектора phrGFP II-C (phrGFP) (Stratagene, LaJolla, CA) использовали для встраивания ДНК MUC16, MUC16, MUC16 и MUC16, чтобы создавать GFP слитые конструкции получали с белком GFP, присутствующем на карбоксиконце усеченного слитого белка MUC16. ПЦР продукты для фрагментов MUC16 (MUC16, MUC16, MUC16 и MUC16) создавали с использованием ДНК pBK-CMV-MUC16-B53 в качестве матрицы (Yin BWT, et al., International Journal of Cancer, 2002, 98(5):737-740), и очищали продукты ПЦР в 1% агарозном геле, секвенировали и вставляли в сайты множественного клонирования EcoRV и NotI вектора phrGFP II-C (phrGFP). Вектор pFUSE-hIgG1-Fc2 приобретали в InvivoGen (San Diego, CA). Праймеры полимеразной цепной реакции (ПЦР) разрабатывали для эктодомена MUC16 (от положения 1777 до 1834 из SEQ ID № 150) или сахарсвязывающего домена из LGALS3 ДНК последовательности синтезировали (Sigma-Genosys, The Woodlands, TX) с использованием сайта рестрикционного фермента EcoRV в качестве прямого праймера и сайта рестрикционного фермента NcoI в качестве обратного праймера. Продукты ПЦР для фрагмента MUC16 создавали с использованием pBK-CMV-MUC16-B53 ДНК в качестве матрицы и клона кДНК LGALS3 (MGC:2058 IMAGE:3050135 GenBank: AAH01120.1; DBSource accession BC001120.2), который получали из ATCC (Manassas, VA), использовали в качестве ДНК матрицы для того, чтобы синтезировать сахарсвязывающий домен продукта ПЦР LGALS3. Продукты ПЦР очищали в 1% агарозном геле, секвенировали и вставляли в вектор pFUSE-hIgG1-Fc2.
6.1.2.2 Праймеры и ПЦР
c114
c344
c114
c80
c86
c57-114
117-244
[00483] Прямой и обратный праймеры для MUC16-цитоплазматического домена (MUC16, карбоксиконец 114 а. о.) (5'-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGAACTTCTCGCCACTGGCT-3' и 5'-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3', SEQ ID № 121 и SEQ ID № 122, соответственно). MUC16 (один тандемный повтор, который имеет только одну цистеиновую петлю, 344 а. о.) (5'-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGACAGGCCCTGGGCTGGACAGA-3' и 5'-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3', SEQ ID № 123 и SEQ ID № 124, соответственно) с EcoRV и KOZAK в прямом праймере и NotI в обратном праймере. ДНК конструкцию MUC16-GFP использовали для того, чтобы создавать конструкции MUC16 и MUC16 с помощью праймеров QuikChange. Прямой и обратный праймеры для вектора pFUSE-hIgG1-Fc2 MUC16 (5'-CCATGCGATATCAAACTTCTCGCCACTGGCT-3' и 5'-AGATCTAACCATGGGAAGGTCAGAATTCCCAGT-3', SEQ ID № 125 и SEQ ID № 126, соответственно) и прямой и обратный праймеры для сахарсвязывающего домена LGALS3 для вектора pFUSE-hIgG1-Fc2 (5'-CATGCGATATCACCTTATAACCTGCCTTTG-3' и 5'-AGATCTAACCATGGTATATGAAGCACTGGT-3', SEQ ID № 127 и SEQ ID № 128, соответственно) с EcoRV в прямом праймере и NcoI в обратном праймере. Все вышеприведенные праймеры синтезировали в Sigma Genosys, The Woodlands, TX.
[00484] Условий ПЦР достигали посредством следующих процессов: ДНК плавили при 95°C в течение 5 минут для того, чтобы достигать денатурации. Проводили тридцать повторных циклов нагрева при 97°C в течение 30 секунд, отжиг при 60°C в течение 1 минуты и удлинение при 72°C в течение 1 минуты. После этого следовало удлинение созданной цепи продукта ПЦР при 72°C в течение 5 минут и затем охлаждение при 4°C в течение ночи.
c114
c80
c86
c344
c678
c57-114
117-244
c114
c344
c678
c57-114
117-244
c57-114
117-244
c57-114
117-244
[00485] ДНК вектора phrGFP II-C, очищенную на геле ДНК MUC16, MUC16, MUC16, MUC16 и MUC16 индивидуально расщепляли в течение ночи при 37°C на водяной бане с использованием рестрикционных ферментов EcoRV и NotI (New England Biolabs, Beverly, MA). ДНК вектора pFUSE-hIgG1-Fc2, очищенную на геле ДНК MUC16 и LGALS3 индивидуально расщепляли в течение ночи при 37°C на водяной бане с использованием рестрикционных ферментов EcoRV и NcoI (New England Biolabs, Beverly, MA). Расщепленную рестриктазами ДНК MUC16 и phrGFP; MUC16 и phrGFP; или MUC16 и phrGFP очищали на геле и лигировали в течение ночи с использованием T4 лигазы (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). Аналогичным образом, расщепленную рестриктазами ДНК MUC16 и pFUSE-hIgG1-Fc2; LGALS3 и pFUSE-hIgG1-Fc2 очищали на геле и лигировали в течение ночи с использованием T4 лигазы (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). Лигированную ДНК трансформировали в суперкомпетентные клетки XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA), следуя протоколу производителя, и высевали их на чашки с агаром со средой LB, содержащей канамицин (50 мкг/мл, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) для векторов phrGFP или на чашки с агаром со средой LB, содержащей зеоцин 25 мкг/мл (Invitrogen, CA). Клоны отбирали на следующие сутки и Miniprep ДНК экстрагировали с использованием системы очистки Wizard Plus Miniprep DNA (Promega Corporation, Madison, WI). ДНК отобранных клонов секвенировали в центре коллективного использования по секвенированию ДНК MSKCC с использованием прямых и обратных праймеров MUC16 и phrGFP для того, чтобы подтверждать присутствие MUC16 и phrGFP в последовательностях в виде слитых конструкций или MUC16 и pFUSE-hIgG1-Fc2 или LGALS3 и pFUSE-hIgG1-Fc2. Megaprep ДНК из таких клонов делали с использованием системы очистки Wizard Plus Megaprep DNA (Promega Corporation, Madison, WI), в которой также подтверждали присутствие MUC16 и phrGFP или MUC16 и pFUSE-hIgG1-Fc2 или LGALS3 и pFUSE-hIgG1-Fc2 в ее последовательностях в виде слитых конструкций.
6.1.2.3 Сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS)
6
[00486] Трансфицированные клетки трипсинизировали, промывали и считали с помощью гемоцитометра. Клетки распределяли в несколько пробирок Eppendorf по меньшей мере по 0,5-1×10/пробирка. Клетки промывали PBS, содержащим 1% FCS и 0,025% азида натрия (FACS буфер). Для поверхностного FACS окрашивания клетки инкубировали или без (для контроля вторым антителом) или с 1 мкг/пробирка биологически реактивных супернатантов MUC16-карбоксиконцевых МАт (4H11.2.5), Ат мыши против OC125 человека (M3519) (DakoCytomation, Dako North America Inc., Carpinteria, CA) в течение 30 минут на льду. Поверхности клеток в пробирках Eppendorf также окрашивали с использованием 1 мкг/пробирка неспецифических контрольных антител мыши совпадающего изотипа (13C4 для IgG1 и 4E11 для IgG2b МАт, полученных из моноклонального центра коллективного использования MSKCC)(данные не приведены) и инкубировали на льду в течение 30 минут. Все клетки промывали 3 раза в FACS буфере. Клетки инкубировали с 1 мкг/пробирка второго антитела козы против IgG1-PE или IgG2b-PE мыши в течение 30 минут на льду и затем промывали 3 раза в FACS буфере. Клетки анализировали с помощью FACS Calibur.
6.1.2.4 Клеточные культуры
c344
c114
c80
c86
c114
c344
[00487] Клетки NIH/3T3 (3T3) (фибробласты) получали через American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), и клетки A2780 представляют собой клеточную линию карциномы яичника человека (см. источник 28, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Обе клеточные линии содержали в соответствии с опубликованными условиями. Стабильные MUC16-положительные клеточные линии создавали посредством трансфекции MUC16 экспрессирующих векторов (phrGFP-MUC16, phrGFP-MUC16, phrGFP-MUC16 и phrGFP-MUC16) и отбирали с использованием генетицина (G418, Invitrogen, Grand Island, NY) в соответствующей им среде для культивирования и выделяли на основании экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP). MUC16 трансфектанты имеют на клеточной поверхности экспрессию белка MUC16 от предполагаемого сайта расщепления до карбоксиконца (аминокислоты с 1777 до 1890 из SEQ ID № 150) (см. источник 5, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Клеточные линии с более длинными фрагментами MUC16 получали схожим образом, включая линии с экспрессией вектора MUC16-GFP, которые на клеточной поверхности имеют экспрессию белка MUC16 в виде фрагмента из 344 аминокислот, идущего до карбоксиконца MUC16 (аминокислоты с 1547 до 1890) (см. источник 5, как приведено в разделе 6.1.5, далее).
6.1.2.5 Трансфекция
[00488] Все конструкции вводили в клетки NIH/3T3 (3T3) и A2780 с использованием DOTAP (Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN), следуя протоколу производителя. Стабильные трансфектанты отбирали с использованием 400 мкг/мл G418 для клеток 3T3 и A2780 в соответствующих им средах для культивирования. Клетки сортировали два раза по экспрессии GFP в центр коллективного использования проточной цитометрии MSKCC (FCCF), и отобранные клетки выращивали в виде линий вплоть до 15 переносов. Обычный мониторинг посредством FACS анализа выполняли для того, чтобы подтверждать GFP-положительность этих линий. Белковые экстракты этих линий анализировали посредством вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител против hrGFP (Stratagene, La Jolla, CA) и против MUC16-карбоксиконца (см. источники 5 и 14, как приведено в разделе 6.1.5, далее).
6.1.2.6 Кривые роста
2
2
[00489] Одну тысячу стабильно трансфицированных клеток/лунка высевали в 200 мкл сред для культивирования/лунка в несколько 96-луночных плоскодонных планшетов и инкубировали при 37°C и 5% CO в течение 5 суток. Каждые сутки в трех повторениях культивируемые планшеты проявляли с использованием 25 мкл/лунка аламарового синего (ABD Serotec Co. UK) и инкубировали при 37°C и 5% CO в течение 4 часов. Планшеты считывали на флуоресцентном считывателе планшетов PerSeptive Biosystems CytoFluor Multiwell модель № 4000 с возбуждением на 530 нМ и испусканием на 620 нМ. Регистрировали кривые роста в течение 4 суток и, соответственно, строили график по средним значениям из планшетов в трех повторениях.
6.1.2.7 Анализ на мягком агаре
2
[00490] Стабильно трансфицированные клетки помещали в агарозную суспензию и высевали на тонкий слой агарозы и анализировали по их способности формировать безъякорные колонии. На чашку высевали от одного до пяти миллионов клеток в 10 мл суспензии среды-агарозы и инкубировали при 37°C и 5% CO. Осуществляли мониторинг чашек на формирование колоний. Дополнительные среды для культивирования помещали сверху каждые 4-5 суток. После 11-14 суток культивирования колонии нумеровали и получали изображения колоний.
6.1.2.8 Трансфекция в эукариотических экспрессирующих векторах
c57-114
117-244
c57-114
[00491] Конструкции MUC16-pFUSE-hIgG1-Fc2 и LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 отдельно трансфицировали в эмбриональные клетки почки человека (HEK) FreeStyle 293F (Invitrogen, CA), которые экспрессируют и секретируют слитые белки в бессывороточные среды. В три 10% SDS-PAGE геля вносили 5 мкг/дорожка супернатантов со слитными белками от временно трансфицированных клеток HEK 293F с контрольным пустым вектором pFUSE-hIgG1-Fc2, вектором MUC16-pFUSE-hIgG1-Fc2 и вектором LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2. Один гель непосредственно окрашивали реактивом Gelcode, в соответствии с протоколом производителя. Белки из двух гелей переносили на две нитроцеллюлозные мембраны, которые блокировали фосфатно-солевым буфером с 5% обезжиренным молоком, который содержал 0,1% Tween-20 (PBST), в течение 1 часа при комнатной температуре на встряхивателе. Мембраны исследовали с использованием антитела против IgG1 человека-Fc-HRP (со специфичностью к γ1 цепи) (Southern Biotech Inc., CA) в разведении 1:5000 в PBST с 5% обезжиренным молоком; mAb 4H11-HRP в разведении 1:2000 (см. источник 14, как приведено в разделе 6.1.5, далее) в PBST с 5% обезжиренным молоком и mAb против GAL3 человека (Santa Cruz Biotechnology, CA) в разведении 1:200 в PBST с 5% обезжиренным молоком в течение ночи при 4°C на встряхивателе. GAL3-мембрану промывали три раза в PBST и метили вторым антителом против IgG мыши-HRP в разведении 1:3000 в PBST с 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа при комнатной температуре на встряхивателе. Мембраны промывали три раза в PBST и затем их обрабатывали реактивом хемилюминесцентного субстрата ECL (Perkin Elmer, NY) в течение 5 минут, и излучаемые сигналы регистрировали на рентгеновских пленках.
6.1.2.9 Инвазия
c57-c114
117-244
[00492] Инвазию базальной мембраны определяли в камерах инвазии матригеля (BD Biosciences, Bedford, MA). Миграцию в матригеле измеряли в 48 часов в лунках в трех повторениях и сравнивали с контрольным вектором phrGFP и выражали в виде % phrGFP контрольной инвазии матригеля. Миграцию стабильных клеточных линий, обработанных 0,1 мкг/мл туникамицина (Sigma-Aldrich, St. Louis MO № по каталогу T7765) или слитным белком 5 мкг/мл MUC16-pFUSE-hIgG1-Fc2 или 5 мкг/мл LGALS3 pFUSE-hIgG1-Fc2, в матригеле после 48 часов измеряли и выражали в виде % phrGFP контрольной инвазии матригеля.
2
2
[00493] BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Inserts или Chambers (№ по каталогу 354480 в 24-луночном планшете) и Control Inserts (№ по каталогу 354578 в 24-луночном планшете) приобретали в BD Biosciences, MA. Анализ инвазии матригеля осуществляли в соответствии с протоколом производителя. В кратком изложении, матригелевые камеры в 24-луночных планшетах (хранили при -20°C) и контрольные вставки (хранили при 4°C) оставляли доходить до комнатной температуры. Обе вставки регидратировали в 0,5 мл бессывороточной среды во вставке, также как и во внешней лунке 24-луночного планшета, в течение 2 ч при 37°C 5% CO во влажном инкубаторе. Культивируемые клетки 3T3 или A2780 трипсинизировали и промывали средой для культивирования. Миллион клеток отделяли в другую пробирку для центрифуги и промывали 3 раза бессывороточной средой. Позже эти клетки корректировали, чтобы получить 10000 клеток в 0,5 мл бессывороточной среды. Среду в регидратированных вставках удаляли и вставку переносили в новый 24-луночный планшет, содержащий 0,75 мл среда для культивирования, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), в лунке, которая служит в качестве хемоаттрактанта. Незамедлительно 0,5 мл клеток (10000 клеток) в бессывороточной среде добавляли во вставку. Надлежащее внимание уделяли, чтобы видеть, что воздушные пузырьки не застревали во вставке и внешней лунке. 24-луночный планшет инкубировали при 37°C 5% CO во влажном инкубаторе в течение 48 ч. После инкубации не проникающие клетки удаляли с верхней поверхности мембраны посредством «отскребания», вставляя тампон с хлопком на конце в матригель или контрольную вставку и аккуратно прикладывая давление, при этом перемещая кончик тампона по поверхности мембраны. Отскребание повторяли с использованием второго тампона, увлажненного в среде. Затем вставки окрашивали в новом 24-луночном планшете, содержащем 0,5 мл 0,5% красителя кристаллического фиолетового в дистиллированной воде в течение 30 минут. После окрашивания вставки споласкивали в 3 стаканах дистиллированной воды для того, чтобы удалять избыточный краситель. Вставки сушили на воздухе в новом 24-луночном планшете. Проникшие клетки считали вручную под инвертированным микроскопом при 200× увеличении. Несколько полей мембран в трех повторениях подсчитывали и регистрировали на фиг.
6.1.2.10 Полимеразная цепная реакция в реальном времени
[00494] Выделенную РНК получали, следуя протоколу RiboPure Kit (Ambion, Austin, TX). RT ПЦР для панели генов белков метастазов и внеклеточного матрикса осуществляли с использованием системы RT2 Profiler PCR Array (Super Array, Frederick, MD), как описано ранее (см. источник 29, как приведено в разделе 6.1.5, далее).
6.1.2.11 Опухолевый рост у бестимусных голых мышей
3
[00495] Трансфицированные клеточные линии и подходящие контрольные клеточные линии вводили в бок или перитонеальную полость бестимусных голых мышей и обычный уход за животными обеспечивали с помощью центра коллективного использования противоопухолевой оценки MSKCC. Для экспериментов по оценке опухолевого роста 2 миллиона клеток из каждой опухолевой линии имплантировали каждой из 5-15 бестимусных голых мышей. Измерения опухоли выполняли два раза в неделю и регистрировали опухолевый рост до максимального размера 1500 мм по руководствам MSKCC RARC.
6.1.2.12 Анализ вестерн-блоттинга
2
3
4
[00496] Стабильные клеточные линии культивировали в 10 см чашках в соответствующих им средах для культивирования и инкубировали при 37°C и 5% CO в течение 3 суток. Затем их промывали два раза в ледяном PBS и соскребали с использованием 1-2 мл ледяного PBS и центрифугировали. Осажденные клетки лизировали с использованием 0,2 мл модифицированного лизирующего буфера Ripa (20 мМ Tris-HCL, pH 7,4; 150 мМ NaCl; 1% NP-40; 1 мМ NaVO; 1 мМ PMSF; 1 мМ DTT; с коктейлями ингибиторов протеаз и фосфатаз (№ по каталогу 11836170001 в Roche Diagnostics, IN)) в течение 30 мин на льду и центрифугировали при 4°C в течение 10 мин. Концентрацию белка в супернатанте измеряли с использованием Bio-Rad Protein Assay (BioRaD Laboratories, Hercules, CA). Равные количества белка разделяли посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и переносили PVDF мембрану с использованием аппарата для переноса BioRad при 4°C. Мембраны блокировали с использованием 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) или 5% обезжиренного молока в PBS с 0,1% Tween-20 (PBST) при 4°C в течение ночи. Мембраны проявляли с использованием различных первичных антител (Cell Signaling, MA: Akt № по каталогу 9272; Phospho-Akt (Ser473)(193H12) № по каталогу 4058; p44/43 MAPK (Erk1/2) № по каталогу 9102; Phospho-p44/43 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) № по каталогу 9101); (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO: β-Actin № по каталогу A5441); (Southern BioTech, Birmingham, AL: Anti-human-Fc-IgG1-HRP № по каталогу 9054-05 и Abgent, San Diego, CA: Polyclonal LGALS3 antibody № по каталогу AP11938b) при 4°C в течение ночи. Мембраны промывали три раза в PBST и проявляли с использованием HRP-конъюгированного антитела против мыши или против кролика (GE Healthcare, UK) (разведение 1:5000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мембраны промывали три раза в PBS-T и проявляли с использованием реактива Western Lightning Chemiluminescence (ECL, Perkin Elmer) в течение 1-5 минут при комнатной температуре, и сигналы проявляли на пленке HyBlot CL (Denville Scientific Inc. Metuchen, NJ).
6.1.2.13 Анализ экспрессии MUC16 в TCGA
[00497] Исчерпывающие геномные данные доступны для 316 образцов серозных рака яичников как часть проекта TCGA (tcga.cancer.gov). На генном уровне вызовы числа копий ДНК получали из CBS-сегментированных данных микрочипа Agilent 1M с использованием GISTIC. Экспрессию мРНК MUC16 измеряли с использованием трех различных платформ (Agilent 244K Whole Genome Expression Array, чипы Affymetrix HT-HG-U133A, and Affymetrix Exon 1.0), и значения экспрессии гена получали, как описано ранее (см. источник 30, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Соматические мутации в MUC16 идентифицировали во всем экзоме, после чего следовало секвенирование следующего поколения (SOLiD или Illumina). Все данные TCGA загружали с cBio Cancer Genomics Portal (www.cbioportal.org). Затем значения экспрессии мРНК коррелировали с соответствующими категориями числа копий ДНК (гомозиготная делеция, гемизиготная делеция, диплоид, приобретение, амплификация на высоком уровне) и соматические мутации накладывали на все образцы и строили в виде коробчатой диаграммы с использованием статистической интергированной среды R (www.R-project.org), как описано ранее (см. источник 31, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Клинические данные получали с портала данных TCGA (tcga-data.nci.nih.gov/tcga/).
c354
6.1.2.14 MUC16 трансгенные мыши
c354
c354
c354
c354
[00498] Условную трансгенную конструкцию с карбоксиконцевыми 354 аминокислотами (MUC16) создавали, используя вектор phrGFP II-C (Stratagene, La Jolla, CA), и промотор CMV заменяли на промотор CAG из вектора pCAG-CreERT2 (Addgene, Cambridge, MA). Фрагмент MUC16 амплифицировали посредством ПЦР из конструкции B53, которую создавали Yin BW et al (см. источники 5 и 6, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Условная конструкция MUC16 содержит следующие блоки: pCAG, 5' loxP, hrGFP, BGHpA, 3' loxP, MUC16, HA и SV40pA.
c354
c354
c354
c354
[00499] Используя приведенную выше условную трансгенную конструкцию MUC16, центр коллективного использования мышиной генетики MSKCC выполнял процедуру микроинъекции мышам B6CBAF1/J. Из 99 мышей идентифицировали двенадцать условных трансгенных MUC16 мышей посредством саузерн-блоттинга. Все 12 основателей скрещивали с мышами B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI) для того, чтобы удалять hrGFP, который располагался между двумя loxP. Рассекали MUC16 ПЦР положительных самок мышей для каждого основателя. Органы (головной мозг, ободочную кишку, сердце, почку, печень, легкое, яичник и селезенку) этих рассеченных мышей крошили и гомогенизировали. Образцы белков анализировали посредством вестерн-блоттинга для того, чтобы идентифицировать основателей с высокой экспрессией MUC16. Получаемых трансгенных мышей содержали на смешанном субстрате.
c354
c354
[00500] Двух основателей трансгенных MUC16 мышей скрещивали с p53 гетерозиготными мышами (B6.129S2- Trp53TM1Tyj/J) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI) для того, чтобы создавать двойных трансгенных MUC16:p53+/-. Получаемых трансгенных мышей содержали на смешанном субстрате. Генотипы всех мышей определяли посредством ПЦР с использованием экстрагированной ДНК пальца задней ноги или хвоста. Всех экспериментальных животных содержали в соответствии с руководствами, одобренными MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee and Research Animal Resource Center, и NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
6.1.2.15 Гистологический анализ
[00501] Мышей в возрасте 12 месяцев умерщвляли и вскрывали. После макроскопического исследования, иссеченные образцы тканей фиксировали в течение 24 часов в 10% нейтральном буферном формалине, затем обрабатывали в спирте и ксилоле, заливали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ). Ткани исследовал ветеринарный патолог (SM), и неопластические и не неопластические повреждения диагностировали в соответствии с опубликованными руководствами по номенклатуре патологий грызунов.
6.1.2.16 Статистический анализ
3
3
[00502] Двусторонний парный критерий Стьюдента использовали для того, чтобы сравнивать группы для исследований роста in vitro, инвазии и потенциала роста на мягком агаре. Критерий хи-квадрат использовали для того, чтобы анализировать данные RT-ПЦР на значимость, в соответствии с предоставленным программным обеспечением (SuperArray). Сравнения объемов опухоли выполняли, используя оценку площади под кривой для всего объема опухоли с течением времени у каждого животного. Оценку объема опухоли выполняли на основании последних суток, в которые все животные были живы в обеих группах. Непараметрический критерий для рангов (критерий Вилкоксона на основе двойной выборки) использовали для того, чтобы тестировать различия в распределениях среди групп. В исследованиях выживаемости животных осуществляли анализ времени до наступления события, где событие определяли как время до превышения объема опухоли 1500 мм или образования язв. Животных с объемом опухоли меньше чем 1500 мм прослеживали вплоть до 60 суток и затем цензурировали. Способ Каплана-Мейера использовали для того, чтобы оценивать распределение выживаемости (см. источник 32, как приведено в разделе 6.1.5, далее).
6.1.3 РЕЗУЛЬТАТЫ
c114
c344
c114
c344
c114
c344
c344
c114
c114
[00503] Полагают, что после очевидного отщепления и высвобождения области тандемных повторов белка MUC16, приблизительно 114 аминокислот карбоксиконца (c114) белка остаются на клеточной поверхности, и потенциальные функции этой части молекулы не известны. Анализировали роль этой самой проксимальной части белка MUC16 в злокачественной трансформации и поведении в клеточных линиях фибробластов 3T3 и раке яичников. Для того чтобы тестировать эффект элемента из остаточных c114 аминокислот, проксимального к сайту расщепления, конструировали два вектора: (1) вектор MUC16-GFP и (2) усеченный вектор MUC16-GFP (фиг. 1), и эти векторы и контрольный вектор phrGFP, независимо трансфицировали в клетки фибробластов 3T3. MUC16- и MUC16-экспрессирующие клеточные линии отбирали и содержали с использованием G418, и стабильную экспрессию MUC16 и MUC16 подтверждали посредством FACS анализа, используя моноклональные антитела, которые распознают уникальные аминокислотные последовательности карбоксиконца MUC16 (см. источник 14, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Клеточные линии, которые экспрессируют 344 аминокислот из белка MUC16 (SEQ ID № 132) (линии MUC16-GFP), несут классический эпитоп CA125, который распознает антитело OC125 на клеточной поверхности при FACS анализе, и CA125 высвобождается в супернатант клеточной культуры. OC125 не распознает MUC16-GFP клетки. Однако все трансфицированные линии имели клеточные поверхности, положительные по внеклеточным последовательностям MUC16 (SEQ ID № 133), проксимальным к предполагаемому сайту расщепления, и их распознавало антитело 4H11, специфичное к эктодомену MUC16 (см. источник 14, как приведено в разделе 6.1.5, далее; фиг. 1).
6.1.3.1 Клетки 3T3
c114
c344
c114
c344
[00504] Чтобы исследовать трансформирующие свойства, которые придают остаточные элементы MUC16 после расщепления, анализировали характеристики клеточных линий 3T3 MUC16-GFP и 3T3 MUC16-GFP и эффекты этих двух минимальных элементов MUC16 сравнивали с векторными контролями. Экспрессия или самых проксимальных 114 аминокислот (MUC16) или проксимальных 344 аминокислот (MUC16) последовательности MUC16 не оказывала достоверного эффекта на скорости роста in vitro для какой-либо из трансфицированных клеточных линий по сравнению с таковой у родительской линии фиг. 2A. Однако экспрессия тех же элементов белка MUC16 по существу изменяла якорный рост 3T3 при клонировании на мягком агаре. Как минимальный c114 фрагмент, так и c344 фрагмент значительно увеличивали число колоний на мягком агаре по сравнению с контролями только с вектором (фиг. 3A). Проксимальные части экспрессии белка MUC16 также усиливали миграцию (p<0,0001) MUC16+ клеток 3T3 в классическом анализе инвазии матригеля по сравнению с клетками 3T3, трансфицированными контрольными векторами phrGFP (фиг. 3B). Когда клетки 3T3, экспрессирующие различные фрагменты белка MUC16, исследовали на экспрессию выбранных транскриптов генов метастазов и инвазии, имела место повышающая регуляция нескольких генов инвазии, включая хемокиновый лиганд 12 (CXCL12), кадгерин 11 (CDH11) и матриксные металлопротеиназы MMP2 и MMP9 (фиг. 3C). Другие транскрипты, включая фибронектин (FN1) и нейрофибромин (NF2), постоянно снижены. MUC16 может действовать через канонические пути передачи сигнала сходно с эффектами MUC1 и MUC4, поскольку MUC16 изменяет опухолевый рост in vivo и увеличивает инвазивные свойства клеток, несущих белок MUC16. Взаимодействующие пути ERK и AKT ранее идентифицированы в качестве важных сигнальных механизмов в раке яичников и регуляторов инвазии опухолевых клеток (см. источники 21 и 22, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Как показано на фиг. 3D, имела место активация обоих путей, о чем свидетельствовало увеличение в pAKT(S473) и pERK (T202/Y204).
c114
c344
c114
c344
c114
c344
[00505] Наиболее однозначным признаком онкогенной трансформации является способность ускорять рост у иммунодефицитных мышей. Для того чтобы измерять эффекты MUC16, оказываемые на скорость роста опухоли, модель опухоли в боку использовали для того, чтобы облегчать регулярные измерения опухоли. Как показано на фиг. 3E, когда MUC16 экспрессирующие клеточные линии 3T3 (вектор phrGFP, MUC16-GFP и MUC16-GFP) имплантировали в бока бестимусных голых мышей, как MUC16-GFP, так и MUC16-GFP формировали более крупные опухоли по сравнению с контролями только с вектором через 4 недели. Отсутствовали статистические различия между клеточной линией, экспрессирующей белки MUC16-GFP и MUC16-GFP (фиг. 3E), что подсказывает, что онкогенные эффекты экспрессии MUC16 связаны с самыми проксимальными частями молекулы. Это увеличение скорости роста опухоли наблюдали на всем протяжении периода опухолевого роста, и оно находится в соответствии с клинической связью между высокими уровнями экспрессии MUC16 (в виде сывороточного CA125) и низкой выживаемостью (см. источник 18, как приведено в разделе 6.1.5, далее).
6.1.3.2 Клетки рака яичника человека A2780
c114
c344
c344
c114
c114
c344
c114
c344
c114
c344
c114
c344
[00506] Хотя экспрессия белка MUC16 в клетках 3T3 четко связана с признаками трансформации, некоторые полностью трансформированные клеточные линии раке яичников не имеют экспрессии MUC16 при культивировании. Для того чтобы исследовать вклад MUC16 в поведение клеток рака яичника человека, клетки A2780 (клеточная линия карциномы яичника человека, которая не экспрессирует MUC16) трансфицировали MUC16-GFP или MUC16-GFP. MUC16-экспрессирующие клетки отбирали с помощью G418 и подвергали FACS по экспрессии MUC16 и GFP. Поскольку эти клетки хорошо растут в мягком агаре в отсутствие экспрессии MUC16, анализировали эффект MUC16 и MUC16, оказываемый на инвазию матригеля. Как показано на фиг. 4A, экспрессия MUC16 и MUC16 в клетках A2780 четко способствовала инвазии матригеля. Аналогичным образом, эффект MUC16 и MUC16, оказываемый на активацию путей ERK и AKT, схож с таковым, наблюдаемым в клетках 3T3, увеличивая базовые уровни как pAKT(S473), так и pERK (T202/Y204) (фиг. 4B). Таким образом, даже в озлокачествленных клеточных линиях яичника повышенная экспрессия карбоксиконцевых элементов MUC16 связана с повышенной инвазией и активацией онкогена. Кроме того, анализировали опухолевый рост MUC16- и MUC16-трансфицированных линий A2780 in vivo (фиг. 4C). В обеих ситуациях MUC16 клеточная линия и MUC16 клеточная линия росла более быстро, чем контроли только с вектором. В этой модели раке человека векторные контроли не растут с достаточной скоростью, чтобы в конечном итоге убивать животных.
6.1.3.3 Исследования гликозилирования
c114
c80
c114
c86
c114
c80
c86
c80
c86
c86
c80
c80
c86
c114
c344
c80
c86
c114
[00507] Для того чтобы определять конкретную часть MUC16, отвечающую за трансформацию, конструировали два дополнительных фрагмента MUC16: (1) MUC16, в котором удаляли 34-аминокислотную последовательность из эктодомена MUC16 (от положения 1798 до 1831, как пронумеровано в исходной публикации) (фиг. 1D; SEQ ID № 135) (см. источник 5, как приведено в разделе 6.1.5, далее); и (2) MUC16, в которой конструкция MUC16 сохраняла весь эктодомен MUC16, но не содержала 28-аминокислотную последовательность из предполагаемого домена эзрина цитоплазматического домена, потенциальные участки фосфорилирования тирозина и SH2 домен (от положения 1857 до 1884) (фиг. 1D; SEQ ID № 134). Эти конструкции вводили в клетки 3T3 и отбирали с помощью FACS по экспрессии на клеточной поверхности остающихся последовательностей MUC16 и MUC. Эти две дополнительные популяции клеток затем исследовали на MUC16- и MUC-зависимые изменения. Конструкция MUC16 (конструкция с интактным эктодоменом) сохраняла значительно более высокую способность к формированию колоний на мягком агаре, чем конструкция MUC16 (конструкция с интактным цитоплазматическим доменом (фиг. 5A)). Также это справедливо для способности к инвазии матригеля (фиг. 5B). MUC16 экспрессирующие клетки 3T3 имели скорость инвазии, которая не была статистически отлична от той, что у контрольного вектора phrGFP. В отличие от этого, MUC16 экспрессирующие клетки 3T3 сохраняли более инвазивный фенотип, схожий с интактными MUC16 и MUC16 клетками. Когда исследовали активацию путей AKT и ERK, результаты были в соответствии с исследованием колоний на мягком агаре и инвазии матригеля (фиг. 5C). Экспрессия MUC16 фрагмента (без полного интактного эктодомена) не активирует ERK и AKT и схожа с контрольным вектором phrGFP, в отличие от этого MUC16 (с интактным эктодоменом) экспрессирующие клетки 3T3 схожи с экспрессирующими полный MUC16 клетками 3T3 в активации ERK и AKT. Наконец, значимость интактного эктодомена подтверждали в моделях ксенотрансплантированной опухоли.
c80
c114
c114
c86
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114-N123
c114-N123
c114
c114
c114
c57-c114
c114
c114
c114
117-244
c114
c114-N123
c114-N123
[00508] Утрата интактного эктодомена MUC16 (3T3 MUC16) вела к утрате MUC16-зависимого усиления роста 3T3 по сравнению с MUC16 контролем, тогда как MUC16-экспрессирующие клетки 3T3 имели умеренную задержку роста, но имели общий эффект, схожий с MUC16 экспрессирующими клетками 3T3 (фиг. 5D). Таким образом, внеклеточная часть MUC16 фрагмента отвечала за трансформирующие эффекты MUC16 в клетках 3T3. Чтобы дополнительно исследовать роль внеклеточного фрагмента MUC16, осуществляли исследования копреципитации с MUC16-экспрессирующими клетками 3T3, используя панель MUC16-нацеленных антител (см. источник 14, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Не идентифицировали отдельных полос копреципитации с помощью окрашивания серебром, и специфический вестерн-блоттинг для EGFR, интегринов и HER3 был отрицательным. Однако анализ последовательности MUC16 подсказывал, что три потенциальных участка N-гликозилирования (Asn1777, Asn1800 и Asn1806 (фиг. 6, SEQ ID № 132 и SEQ ID № 133)) в эктодомене могли играть роль. Анализировали роль этих участков N-гликозилирования. Используя сайт-специфические точечные мутации, все три аспарагина заменяли на аланины. Эту модифицированную MUC16 конструкцию, обозначенную MUC16, вводили в клетки 3T3, и MUC16-экспрессирующие клетки выделяли посредством FACS и антител 4H11 к эктодомену. Как показано на фиг. 7A, эти мутации аспарагина в аланин полностью устраняли MUC16-индуцированное усиление инвазии матригеля, которое наблюдали с использованием экспрессирующего родительский MUC16 вектора в клетках 3T3. Для того чтобы подтверждать роль N-гликозилирования, клетки 3T3 обрабатывали ингибитором гликозилирования туникамицином (0,1 мкг/мл) и отмечали значимое снижение инвазии матригеля. Два синтетических белковых ингибитора также тестировали для того, чтобы дополнительно исследовать роль внеклеточной последовательности MUC16. Внешнюю последовательность MUC16 (от положения 1777 до 1834, как пронумеровано в источнике 5, как приведено в разделе 6.1.5, далее) прикрепляли к pFUSE с Fc остовом человек (MUC16 pFUSE), чтобы предоставить «имитирующий» рецептор. Эту конструкцию сравнивали как с MUC16 инвазией, так и с контролем вектором pFUSE. Как показано на фиг. 7B, конструкция «имитирующего» рецептора уменьшала общий эффект MUC16 экспрессирующего вектора, оказываемый на инвазию матригеля (фиг. 7). Исходя из того, что лектины связаны с эффектом гликозилированного белка MUC16, конструировали второй ингибитор из сахарсвязывающего домена LGALS3 (аминокислоты с 117 до 244; фиг. 7 и фиг. 8) (см. источник 23, как приведено в разделе 6.1.5, далее), прикрепленный к тому же остову pFUSE (LGALS3pFUSE). Подобно туникамицину, оба этих белковых ингибитора мешали взаимодействию MUC16 с другими белками клеточной поверхности, тогда как отдельно вектор pFUSE не оказывал эффекта (фиг. 7B). Как и в случае с другими вмешательствами, эффект, оказываемый на экспрессию pAKT и pERK, уменьшался параллельно с утратой инвазии матригеля, когда удаляли участки N-гликозилирования, как показано на фиг. 7C. Однако конструкция MUC16 имела высокие уровни экспрессии белка MUC16, как продемонстрировано с помощью связывания 4H11 (со специфичностью к эктодомену MUC16). Влияние утраты N-гликозилирования аналогичным образом подтверждали при снижении роста в трансфицированных клетках 3T3 у nu/nu мышей, как показано на фиг. 7D.
6.1.3.4 Трансгенные мыши
c354
c354
[00509] Исследовали эффект экспрессии карбоксиконцевых элементов MUC16 у трансгенных мышей и скорость формирования самопроизвольных опухолей. Создавали условных трансгенных мышей, экспрессирующих MUC16 (полная последовательность c114 и наиболее проксимальный тандемный повтор, несущий CA125). Ранний энхансер CMV плюс промотор β-актина курицы (CAG) использовали для усиления существенной экспрессии MUC16 во всех тканях мышей. Эту стратегию выбирали, поскольку физиология яичника человека сильно отличается от репродуктивной системы мышей, и слабые тканеспецифические промоторы яичников относительно сложно использовать в трансгенных системах. Стратегия для этих мышей представлена на фиг. 9A.
c354
c354
c354
c354
c354
[00510] Условных трансгенных животных отбирали с помощью саузерн-блоттинга, как показано на фиг. 9B, и скрещивали с мышами EIIa-Cre для того, чтобы получать MUC16 трансгенных основателей. Как показано на фиг. 9C, отбирали два основателя и создавали колонию MUC16 трансгенных мышей. Два основателя сильно экспрессируют MUC16 во многих органах, например, головном мозге, ободочной кишке, сердце, почке, печени, легком, яичнике и селезенке. Эти мыши не имели эффекта повсеместной эктопической экспрессии MUC16, при нормальных соотношениях самцы:самки в потомстве, нормальных уровнях фертильности и, по-видимому, нормальном времени жизни, превышающем 2 года. Вскрытие двух практически здоровых животных (одного самца и одной самки) из контрольной популяции и MUC16 трансгенных мышей с 3-месячными интервалами вплоть до 1 года примечательно только слабой/умеренной гиперплазией эндометрия матки у более старых самок мышей, но заболеваемость и тяжесть значительно не отличались от таковых у контролей дикого типа. Выбранные ткани представлены на фиг. 10. Только одну самопроизвольную опухоль мягких тканей (саркому) наблюдали в колонии из больше чем 100 животных, которых наблюдали в течение 2 лет или больше.
c354
c354
c354
c354
c354
[00511] На основании этого результата предложена гипотеза о том, что потенциально необходим «второй удар». Примечательно, что мышиные модели с мутацией BRCA1 также требуют второго удара, и утрата p53 значительно повышает частоту опухолей. MUC16 мышей скрещивали с p53+/- мышами из The Jackson Laboratory. Имел место ограниченный ранний эффект. Однако после приблизительно 6 месяцев MUC16 мыши с p53+/- начинали развивать самопроизвольные саркоматозные опухоли мягких тканей и лимфому с частотой, превышающей таковую у нормальных контрольных животных. Выбранные опухоли представлены на врезках на фиг. 9D. Выживаемость Каплана-Мейера для этих мышей представлена на фиг. 9E. MUC16:p53+/- мыши демонстрировали значительно более низкую общую выживаемость из-за самопроизвольного развития опухолей (p<0,014). Общее число опухолей, которые наблюдали в каждой группе, составляет: p53 +/- мыши, 20/107 мышей; MUC16 и p53 +/- мыши, 34/91 мышей; MUC16 мыши, 1/72 мышей; мыши дикого типа, 0/91 мышей. Когда 8 собранных опухолей исследовали в геномном секвенировании p53, все самопроизвольные опухоли имели утрату нормального аллеля p53, что указывает на то, что MUC16 зависимое развитие опухоли также требует утраты функции нормального p53.
6.1.3.5 TCGA для яичников
[00512] На основании фрагментов MUC16 на трансформацию и агрессивности опухолей в экспериментальных моделях исследовали связь между генетическими изменениями в MUC16 и исходами при злокачественных опухолях яичников. Проект по злокачественным опухолям яичников TCGA представляет собой хорошо изученную коллекцию, которая содержит 316 серозных рака яичников с полными данными, включая данные о клиническом исходе. Поскольку экспрессия белка MUC16 является важным драйвером поконтроля раке, анализировали влияние числа копий MUC16 на экспрессию мРНК MUC16. Экспрессия транскрипта MUC16 в целом связана с числом копий гена MUC16, несмотря на то, что имели место широкие вариации в экспрессии транскрипта MUC16 во всех исследованных группах (конечно, за исключением редких гомозиготных делеций MUC16). В большинстве случаев, экспрессия мРНК MUC16 кластеризованы у более высоких чисел транскриптов, чем нормальные образцы фаллопиевых труб, включенные в качестве контролей. Число копий гена представляет собой одну из нескольких переменных, которые потенциально изменяют экспрессию белка MUC16, но ясно, что экспрессия мРНК MUC16 (и белка MUC16, конечно) часто увеличена в серозной раке яичников. Также исследовали комбинированное влияние сверхэкспрессии или мутации MUC16 на клинические исходы в наборе данных TCGA. Когда набор данных TCGA делят на квинтили по экспрессии MUC16, 20% пациентов с наивысшей экспрессией MUC16 имели значительно более низкую выживаемость, чем пациенты с более низкой экспрессией MUC16 (p=0,02969). Эта зависимость дополнительно усиливалась, когда 18 пациентов с мутациями MUC16 включали в группу высокой экспрессии MUC16 (p=0,02117), как показано на фиг. 11A. В совокупности, этот анализ демонстрирует, что экспрессия MUC16 оказывает нежелательное влияние на выживаемость пациентов со злокачественной опухолью яичников и подтверждает негативные биологические эффекты экспрессии MUC16, идентифицированные в доклинических моделях авторов изобретения.
[00513] Злокачественные опухоли яичников часто демонстрируют активацию пути PI3K. Эта активация происходит в первую очередь через амплификацию и сверхэкспрессию вместо событий точечных мутаций, поскольку рак яичников в целом характеризуется изменениями числа копий. На основании активации пути PI3K/AKT в моделях авторов изобретения на клеточных линиях, исследовали зависимость между MUC16 и другими активирующими генетическими изменениями в пути PI3K. Как показано на фиг. 11B, сверхэкспрессия и мутационные события, связанные с MUC16, в целом комплементарны с событиями в другом пути, такими как утрата PTEN, амплификация AKT1, AKT2 или PI3KCA. Механизм это MUC16-движимой активации AKT остается неизвестен. Кроме того, исследовали роль активации ERK, но не идентифицировали связь между экспрессией MUC16 и мутациями ERK пути.
6.1.4 ОБСУЖДЕНИЕ
[00514] MUC16, кодирующий антиген CA125, циркулирует в плазме многих пациентов со злокачественной опухолью яичников (см. источник 1, как приведено в разделе 6.1.5, далее). MUC16 является уникальным среди связанных муцинов благодаря его ограниченной экспрессии за пределами мюллеровых тканей (см. источники 2 и 14, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Хотя все более рассматривают в качестве нежелательного прогностического фактора, независимого от массы опухоли, биологический механизм его негативного влияния не вполне понятен (см. источник 18, как приведено в разделе 6.1.5, далее). NH2-часть молекулы содержит несколько тандемных повторов, которые кодируют антиген CA125, и, по-видимому, служит в качестве важных партнеров адгезии к мезотелину и некоторым галектинам (фиг. 1A) (см. источники 5, 17, и 24-26, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Хотя предполагают, что эти адгезионные функции критичны для MUC16-связанного неблагоприятного исхода, эти исследования не объясняют все наблюдаемые изменения в поведении клеток раке яичника. Клонирование гликопротеина MUC16 предоставило базовую структурную информацию о продукте гена MUC16 (см. источники 4 и 5, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Данные, представленные в этом примере, являются первыми данными, показывающими, что MUC16 может опосредовать передачу сигналов от среды в клетку раке, в частности, данные, представленные в этом примере, идентифицируют гликозилированный эктодомен MUC16 как критичный для MUC16 изменений в поведении клетки раке.
c114
c114
[00515] Этот пример демонстрирует, что 114 аминокислот с карбоксиконца MUC16 достаточно для того, чтобы трансформировать клетки NIH/3T3 (3T3), поддерживая как увеличенный рост на мягком агаре, так и увеличенную способность к инвазии матригеля. Хотя другие идентифицировали большинство мембранной проксимальной C-концевой части MUC16 в качестве критических элементов в MUC16-индуцированном поведении, авторы изобретения связывают это поведение с участками N-гликозилирования в сохраненном эктодомене MUC16. Эти изменения связанны с измененным профилем экспрессии генов и увеличенной экспрессией критических генов инвазии, таких как MMP2, MMP9, CXCL12 и CDH11. Хотя более длинные элементы могут индуцировать более опасное поведение, даже остаточные 114 аминокислот, проксимальные к предполагаемому сайту расщепления, являются достаточными, чтобы в клетках 3T3 индуцировать те же изменения экспрессии генов инвазии. Кроме того, гликозилирование Asn30 в MUC16 (соответствующего Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150) необходимо для онкогенных свойств MUC16. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, эти находки более всего согласуются с сигнальной трансдукцией «снаружи-внутрь» посредством самых проксимальных частей белка, включая остаточный внеклеточный домен, наряду с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом. В отличие от результатов Theriault (Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-443) и Giannakouros (Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91-98), утрата внутриклеточного цитоплазматического домена оказала меньше влияние, чем утрата гликозилированного эктодомена. Эти различия могут отражать конкретные выбранные мутации и способ снижения экспрессии. Похоже, сигнал «изнутри-наружу» активирует транскрипцию генетической программы, которая содействует имплантации и росту MUC16 экспрессирующих клеток в мягком агаре и у голых мышей. Когда трансфицированные клетки исследовали на предмет активации обыкновенных онкогенных путей, оба пути AKT и ERK выглядели активированными конститутивной экспрессией MUC16. Механизм, посредством которого MUC16 повышает фосфорилирование AKT/ERK, не ясен и требует дополнительных исследований. Отсутствие копреципитирующих рецепторов подсказывает, что также могут быть вовлечены другие механизмы. Несмотря на то, что последовательности MUC16 очень различны, показано, что другие связанные муцины, включая как MUC1, так и MUC4, действуют в качестве онкогенов, генерирующих сигналы, в клетках 3T3 и фибробластах крысы (см. источники 8 и 9, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Вероятно, что муцины на клеточных поверхностях рака играют важные роли через механизмы, которые все еще устанавливают.
[00516] На основании находок в клетках 3T3, результаты эксперимента с MUC16 трансгенными мышами являются очень подходящими. Сама по себе, та же MUC16 проксимальная 354 последовательность может быть легко экспрессирована почти во всех мышиных тканях без нежелательного эффекта у трансгенной мыши. Скорость формирования самопроизвольных опухолей очень низка у этих мышей, а репродуктивная функция выглядит незатронутой. Однако подобно другим моделям рака яичников мышей, утрата функции p53, похоже, играет сильную разрешительную роль при MUC16-зависимом формировании опухоли (см. источник 27, как приведено в разделе 6.1.5, далее). Эти результаты определенно соответствуют равномерной инактивации p53, которая характеризует рак яичников в наборе данных TCGA.
[00517] Эти находки описывают MUC16-связанные изменения в клеточном поведении и транскрипции генов. Модели in vitro и in vivo находятся в соответствии с нежелательными эффектами уровней экспрессии MUC16 в серозной раке яичников и помогают пониманию MUC16 в качестве патогенного фактора, вносящего вклад в поведение раке яичников. Нежелательное влияние возрастающей экспрессии CA125 находится в соответствии с увеличенным опухолевым ростом in vivo и летальностью MUC16 (+) 3T3 трансфектантов (см. источник 18, как приведено в разделе 6.1.5, далее).
6.1.5 ИСТОЧНИКИ, ЦИТИРУЕМЫЕ В ПРИМЕРЕ 1
[00518] 1. Bast RC Jr, Klug TL, St John E, Jenison E, Niloff JM, et al. (1983) A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer. N Engl J Med 309: 883-887.
[00519] 2. Kabawat SE, Bast RC Jr, Bhan AK, Welch WR, Knapp RC, et al. (1983) Tissue distribution of a coelomic-epithelium-related antigen recognized by the monoclonal antibody OC125. Int J Gynecol Pathol 2: 275-285.
[00520] 3. Bast RC Jr, Badgwell D, Lu Z, Marquez R, Rosen D, et al. (2005) New tumor markers: CA125 and beyond. Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3: 274-281.
[00521] 4. O'Brien TJ, Beard JB, Underwood LJ, Dennis RA, Santin AD, et al. (2001) The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumour Biol 22: 348-366.
[00522] 5. Yin BW, Lloyd KO (2001) Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem 276: 27371-27375.
[00523] 6. Yin BW, Dnistrian A, Lloyd KO (2002) Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int J Cancer 98: 737-740.
[00524] 7. Hollingsworth MA, Swanson BJ (2004) Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat Rev Cancer 4: 45-60.
[00525] 8. Li Y, Liu D, Chen D, Kharbanda S, Kufe D (2003) Human DF3/MUC1 carcinoma-associated protein functions as an oncogene. Oncogene 22: 6107-6110.
[00526] 9. Bafna S, Singh AP, Moniaux N, Eudy JD, Meza JL, et al. (2008) MUC4, a multifunctional transmembrane glycoprotein, induces oncogenic transformation of NIH3T3 mouse fibroblast cells. Cancer Res 68: 9231-9238.
[00527] 10. Huang L, Chen D, Liu D, Yin L, Kharbanda S, et al. (2005) MUC1 oncoprotein blocks glycogen synthase kinase 3beta-mediated phosphorylation and degradation of beta-catenin. Cancer Res 65: 10413-10422.
[00528] 11. Li Q, Ren J, Kufe D (2004) Interaction of human MUC1 and beta-catenin is regulated by Lck and ZAP-70 in activated Jurkat T cells. Biochem Biophys Res Commun 315: 471-476.
[00529] 12. Duraisamy S, Ramasamy S, Kharbanda S, Kufe D (2006) Distinct evolution of the human carcinoma-associated transmembrane mucins, MUC1, MUC4 AND MUC16. Gene 373: 28-34.
[00530] 13. Ramsauer VP, Carraway CA, Salas PJ, Carraway KL (2003) Muc4/sialomucin complex, the intramembrane ErbB2 ligand, translocates ErbB2 to the apical surface in polarized epithelial cells. J Biol Chem 278: 30142-30147.
[00531] 14. Dharma Rao T, Park KJ, Smith-Jones P, Iasonos A, Linkov I, et al. (2010) Novel Monoclonal Antibodies Against the Proximal (Carboxy-Terminal) Portions of MUC16. Appl Immunohistochem Mol Morphol 18: 462-72.
[00532] 15. Corrales RM, Galarreta D, Herreras JM, Saez V, Arranz I, et al. (2009) Conjunctival mucin mRNA expression in contact lens wear. Optom Vis Sci 86: 1051-1058.
[00533] 16. Govindarajan B, Gipson IK (2010) Membrane-tethered mucins have multiple functions on the ocular surface. Exp Eye Res 90: 655-663.
[00534] 17. Kaneko O, Gong L, Zhang J, Hansen JK, Hassan R, et al. (2009) A binding domain on mesothelin for CA125/MUC16. J Biol Chem 284: 3739-3749.
[00535] 18. Zorn KK, Tian C, McGuire WP, Hoskins WJ, Markman M, et al. (2009) The prognostic value of pretreatment CA 125 in patients with advanced ovarian carcinoma: a Gynecologic Oncology Group study. Cancer 115: 1028-1035.
[00536] 19. The Cancer Genome Atlas. Available from: http://cancergenome.nih.gov/.
[00537] 20. Cheon DJ, Wang Y, Deng JM, Lu Z, Xiao L, et al. (2009) CA125/MUC16 is dispensable for mouse development and reproduction. PLoS One 4: e4675.
[00538] 21. Mazzoletti M, Broggini M (2010) PI3K/AKT/mTOR Inhibitors In Ovarian Cancer. Curr Med Chem 17: 4433-4447.
[00539] 22. Ventura AP, Radhakrishnan S, Green A, Rajaram SK, Allen AN, et al. (2010) Activation of the MEK-S6 pathway in high-grade ovarian cancers. Appl Immunohistochem Mol Morphol 18: 499-508.
[00540] 23. Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, Derge JG, Klausner RD, et al. (2002) Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 99: 16899-16903.
[00541] 24. Seelenmeyer C, Wegehingel S, Lechner J, Nickel W (2003) The cancer antigen CA125 represents a novel counter receptor for galectin-1. J Cell Sci. 116(Pt 7): 1305-1318.
[00542] 25. Lloyd KO, Yin BW (2001) Synthesis and secretion of the ovarian cancer antigen CA 125 by the human cancer cell line NIH:OVCAR-3. Tumour Biol 22: 77-82.
[00543] 26. Liu J, Yang G, Thompson-Lanza JA, Glassman A, Hayes K, et al. (2004) A genetically defined model for human ovarian cancer. Cancer Res 64: 1655-1663.
[00544] 27. Xing D, Orsulic S (2006) A mouse model for the molecular characterization of brca1-associated ovarian carcinoma. Cancer Res 66: 8949-8953.
[00545] 28. Rao TD, Rosales N, Spriggs DR (2011) Dual-fluorescence isogenic high-content screening for MUC16/CA125 selective agents. Mol Cancer Ther 10: 1939-1948.
[00546] 29. Shinoda Y, Ogata N, Higashikawa A, Manabe I, Shindo T, et al. (2008) Kruppel-like factor 5 causes cartilage degradation through transactivation of matrix metalloproteinase 9. J Biol Chem 283: 24682-24689.
[00547] 30. TCGA (2008) Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature 455: 1061-1068.
[00548] 31. Taylor BS, Schultz N, Hieronymus H, Gopalan A, Xiao Y, et al. (2010) Integrative genomic profiling of human prostate cancer. Cancer Cell 18: 11-22.
[00549] 32. Heller G, Vendatraman E (1996) Resampling procedures to compare two survival distributions in the presence of right censored data. Biometrics 52: 1204-1213.
6.2 ПРИМЕР 2: АНТИТЕЛА К ГЛИКОЗИЛИРОВАННОМУ MUC16
6.2.1 ВВЕДЕНИЕ
[00550] Антиген CA125, распознаваемый антителом OC125 (см. источник 1, как приведено в разделе 6.2.5, далее), представляет собой сильно гликозилированный антиген, экспрессируемый в доменах тандемных повторов во внеклеточной части гликопротеина MUC16 (см. источники 2 и 3, как приведено в разделе 6.2.5, далее). Этот циркулирующий антиген преимущественно извлекают из доброкачественных или злокачественных мюллеровых тканей, и он одобрен FDA в качестве опухолевого маркера для раке яичников человека, но его функция и роль в канцерогенезе не известны (см. источники 4-6, как приведено в разделе 6.2.5, далее). MUC16 относится к семейству сложных связанных муцинов и состоит из большого сильно гликозилированного внеклеточного домена, небольшого эктодомена между мембраной и предполагаемым сайтом расщепления, гидрофобной трансмембранной области и короткого внутриклеточного хвоста (фиг. 1) (см. источники 7 и 8, как приведено в разделе 6.2.5, далее). Основная часть белка MUC16 высвобождается в окружающее пространство после отщепления, а эктодомен остается на клеточной поверхности. OC125 и большинство других MUC16-реактивных моноклональных антител (mAb) реагируют с антигенами в области тандемных повторов, присутствующих исключительно в отщепляемой части молекулы. Поскольку эти эпитопы вероятно встречаются в циркуляции, существующие mAb нельзя использовать для отслеживания судьбы остального фрагмента белка MUC16, и они могут не точно отражать истинное распределение экспрессии MUC16 (см. источник 9, как приведено в разделе 6.2.5, далее). Другие показали, что гликозилированные поверхностные белки могут регулировать клеточную пролиферацию и дифференцировку через основанные на галектине-3 взаимодействия с участками N-гликозилирования тирозинкиназных рецепторов, например, EGFR, PDGFR и другие (KS Lau Cell 129:123, 2007). Как продемонстрировано в примере 1 (см. раздел 6.1), проксимальные части MUC16 (всего лишь в 114 аминокислот) могут трансформировать иммортализованные клетки 3T3, и этот эффект, по-видимому, устраняется туникамицином.
c114
[00551] Этот пример демонстрирует точные участки гликозилирования, которые опосредуют эти эффекты и обязательную роль галектина 3 в MUC16-зависимой трансформации. Таким образом, разрабатывали антитела, способные связываться с проксимальной пептидной последовательностью (например, MUC16) специфично к гликозилированию, чтобы ингибировать ключевые MUC16-опосредованные злокачественные функции, такие как адгезия и инвазия. Моноклональные антитела, направленные на ключевой участок N-гликозилирования в эктодомене MUC16 создавали с использованием определенных синтетических N-гликопептидных антигенов в качестве ключевых имитаторов эпитопов. Эти антитела ингибировали онкогенную биологию MUC16 посредством снижения MUC16-движимой инвазии матригеля, активации онкогена и опухолевого роста, в отличие от других mAb, направленных на не гликозилированный белок, которые не оказывали эффекта. Эти антитела демонстрировали механизм муциновой трансформации и предоставляют эффективный инструмент для диагностического и терапевтического использования в MUC16-положительных опухолях.
6.2.2 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
6.2.2.1 СИНТЕЗ ГЛИКОПЕПТИДОВ
c55
c55
c55
c55
2
2
3
4
3
2
2
2
[00552] Антитела со специфичностью к третьему участку гликозилирования (Asn30, аналогичен Asn1806 в MUC16) 55-аминокислотной последовательности MUC16 (MUC16: NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNS (SEQ ID № 129) создавали с использованием синтетических гликопептидов в качестве ключевых имитаторов эпитопов, содержащих четко определенную хитобиозу (GlcNAc) на Asn30 в MUC16 (SEQ ID № 129, фиг. 13). Синтез гомогенного N-гликопептида был очень конвергентным и включал образование связи между частично защищенным полноразмерным пептидом (MUC16; SEQ ID № 129) и амином хитобиозы в условиях аспартилирования Лансбери (см. источник 11, как приведено в разделе 6.2.5, далее). MUC16 (SEQ ID № 129) получали посредством микроволнового Fmoc твердофазного синтеза пептидов (SPPS), после чего следовало N-ацетилирование на смоле (AcO, DIEA), деаллирование Asp30 (Pd(PPh), PhSiH) и последующее отщепление смолы (1-2% TFA/CHCl). Используя процедуру аспартилирования/снятия защитных групп в одной колбе (как описано в источнике 12, как приведено в разделе 6.2.5, далее), свободную боковую цепь карбоновой кислоты в положении Asn30 связывали с амином хитобиозы (см. источник 13, как приведено в разделе 6.2.5, далее), после чего следовала обработка TFA (коктейль R: 90% TFA, 5% тиоанизол, 3% этандитиол, 2% анизол), чтобы предоставлять гликопептид GlcNAc-55-мер. Присутствие псевдопролиновых мотивов служило для смягчения нежелательного формирования аспартимида во время аспартилирования.
3
2
[00553] Кроме того, ManGlcNAc-содержащий пептид получали в схожей последовательности в одной колбе.
c55
[00554] Получали более короткие гликопептиды, содержащие Asn30 и Asn24 (аналогичные Asn1800 и Asn1806, соответственно, в MUC16) из MUC16 (SEQ ID № 129), (1) 18-мер: CTRNGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 130), и (2) 15-мер: CGTQLQNFTLDRSSV (SEQ ID № 131). Гликопептидные 18-мер и 15-мер конъюгировали с гемоцианином морского блюдца (KLH). 15-мер (SEQ ID № 131) содержал хитобиозу в Asn7 (аналогичном Asn1806 в MUC16). Гликопептидные 15-меры синтезировали образом, аналогичным синтезу гликопептидных 55-меров.
2
2
[00555] 18-мер (SEQ ID № 130) содержал хитобиозу в Asn4 и Asn10 (аналогичных Asn1800 и Asn1806, соответственно, в MUC16). Аллил-защита в Asn4 и Asn10 в 18-мере (аналогичных Asn1800 и Asn1806, соответственно, в MUC16) вела к значимому формированию аспартимида. Таким образом, пространственно более затрудненный сложный O-2-фенилизопропиловый эфир (O-2-PhiPr, OPp) использовали в SPPS для того, чтобы предоставлять после N-ацетилирования и одновременного отщепления смолы/удаления OPp (1-2% TFA/CHCl) частично защищенный пептид со свободными боковыми цепями Asn4 и Asn10 в 18-мере (аналогичных Asn1800 и Asn1806, соответственно, в MUC16). Осуществляли высоко конвергентную установку двух звеньев хитобиозы через двойное аспартилирование Лансбери, после чего следовало глобальное кислотное снятие защитных групп для того, чтобы создавать бис-гликозилированный пептидный 18-мер (27% после ВЭЖХ очистки).
[00556] Финальное связывание N-концевых остатков цистеина гликопептидных 18-мера и 15-мера с малеимидным производным белка-переносчика предоставляло KLH-конъюгированные конструкции для вакцинации мышей.
6.2.2.2 Протокол иммунизации мышей
2
[00557] Пять мышей BALB/c и пять мышей Swiss Webster иммунизировали с использованием гликопептиднного 55-мера (см. раздел 6.2.2.1) три раза каждые три недели в присутствии 25 мкл адъюванта Titermax для того, чтобы иммунизировать мышей. Тремя неделями позже мышей иммунизировали смесью KLH-конъюгированных конструкций моногликозилированного 15-мера (SEQ ID № 131) и бис-гликозилированного 18-мера (SEQ ID № 130). Сыворотки анализировали на реактивность к GlcNAc-гликозилированному 55-меру и более коротким гликопептидам, не конъюгированным с KLH. Не гликозилированные пептидные 55-мер, 15-мер и 18-мер вместе с двумя не родственными MUC16 пептидами, содержащими хитобиозу, использовали в качестве отрицательных контролей для скрининга. Мышей дополнительно иммунизировали KLH-конъюгатами 15-мера и 18-мера еще два раза каждые три недели и ответы анализировали с помощью ELISA после каждой иммунизации.
6.2.2.3 Инвазия
2
2
[00558] См. раздел 6.1.2.9. Для экспериментов с shRNA, BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Inserts или Chambers (№ по каталогу 354480 в 24-луночном планшете) и Control Inserts (№ по каталогу 354578 в 24-луночном планшете) приобретали в BD Biosciences, MA. Анализ инвазии матригеля осуществляли в соответствии с протоколом производителя. В кратком изложении, матригелевые камеры в 24-луночных планшетах (хранили при -20°C) и контрольные вставки (хранили при 4°C) оставляли доходить до комнатной температуры. Обе вставки регидратировали в 0,5 мл бессывороточной среды во вставке, а также во внешней лунке 24-луночного планшета, в течение 2 ч при 37°C 5% CO во влажном инкубаторе. Культивируемые клетки SKOV3 трипсинизировали и промывали средой для культивирования. Миллион клеток отделяли в другую пробирку для центрифуги и промывали 3 раза бессывороточной средой. Эти клетки затем корректировали, чтобы получить 5000 клеток в 0,5 мл бессывороточной среды. Среду в регидратированных вставках удаляли и вставку переносили в новый 24-луночный планшет, содержащий 0,75 мл среды для культивирования, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), в лунке, которая служит в качестве хемоаттрактанта. Незамедлительно во вставку добавляли 0,5 мл клеток (5000 клеток) в бессывороточной среде. Надлежащее внимание уделяли, чтобы видеть, что воздушные пузырьки не застревали во вставке и внешней лунке. 24-луночный планшет инкубировали при 37°C 5% CO во влажном инкубаторе в течение 48 ч. После инкубации не проникающие клетки удаляли с верхней поверхности мембраны посредством «отскребания», вставляя тампон с хлопком на конце в матригель или контрольную вставку и аккуратно прикладывая давление, при этом перемещая кончик тампона по поверхности мембраны. Отскребание повторяли с использованием второго тампона, увлажненного в среде. Затем вставки окрашивали в новом 24-луночном планшете, содержащем 0,5 мл 0,5% красителя кристаллического фиолетового в дистиллированной воде в течение 30 минут. После окрашивания вставки споласкивали в 3 стаканах дистиллированной воды для того, чтобы удалять избыточный краситель. Вставки сушили на воздухе в новом 24-луночном планшете. Проникшие клетки считали вручную под инвертированным микроскопом при 200× увеличении. Несколько полей мембран в трех повторениях подсчитывали и регистрировали на фиг.
6.2.2.4 Опухолевый рост у бестимусных голых мышей
[00559] См. раздел 6.1.2.11.
6.2.2.5 Анализ связывания биотинилированных гликопептидов
[00560] Аффинность связывания определяли с использованием ForeBio Octet QK. 5 мкг/мл гликопептидного 18-мера, конъюгированного с биотинилированной хитобиозой, загружали на стрептавидиновый биосенсор. После смывания избыточного антигена, антитела мыши тестировали по 10 мкг/мл для стадий ассоциации и диссоциации, соответственно. Параметры связывания вычисляли с использованием модели сайта связывания 1:1, частичная подгонка.
6.2.2.6 Иммуногистохимия тканевой микропанели
[00561] Толстоигольные биопсии уже существующей погруженной в парафин ткани получали из так называемых донорских блоков и затем перемещали в реципиентский парафинизированный «мастер-блок», используя способы Kononen et al. (см., Kononen J, et al. Nat Med 1998;4(7):8447) и впоследствии модифицированные Hedvat et al (см., Hedvat CV et al. Hum Pathol 2002;33(10):968-74). Управляемый вручную Tissue Arrayer MTA-1 из Beecher Instruments Inc. (Sun Prairie, WI) использовали для того, чтобы получать круглые участки (сердцевины) образцов, которые составляли от 0,6 до 1,0 мм в диаметре. Сердцевины располагали на 0,3-0,4 мм друг от друга. Слой контрольных тканей стратегически накладывали около текущих тканевых микропанелей во избежание краевых эффектов. Конкретный состав каждой тканевой микропанели изложен далее. Препараты тканевых микропанелей для раке яичников или контрольной ткани получали, нарезая 4 мкм срезы фиксированной формалином ткани, погруженной в парафин.
[00562] Иммуногистохимию осуществляли на тканевых микропанелях, используя стандартное OC125 (Ventana, Tuscon, AZ), 4H11 (см. Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72) и 19C11 моноклональное антитело. Срезы тканевых микропанелей резали по 4 мкм, помещали на предметные стекла Superfrost/Plus (марки Fisher) и нагревали в 60° печи в течение по меньшей мере 60 минут. Затем препараты депарафинизировали и гидратировали в дистиллированной воде, вымачивали в цитратном буфере при pH 6,00 в течение 30 минут при 97°C, промывали в проточной воде в течение 2-5 минут, инкубировали в течение 5 минут в 3% пероксиде водорода, разбавленном в дистиллированной воде. Препараты промывали в дистиллированной воде в течение 1 минуты, переносили в ванну с фосфатно-солевым буфером (PBS), pH 7,2, две смены по 5 минут каждая, и помещали в 0,05% BSA, разбавленный в PBS минимум на 1 минуту. После сушки вокруг тканевых срезов нормальную сыворотку применяли в разведении 1:20 в 2% BSA/PBS и инкубировали в течение минимум 10 минут при комнатной температуре во влажной камере. Затем сыворотку отсасывали, не позволяя срезам сохнуть, и приблизительно 150 лямбда нового антитела в разведении 1:1000 помещали на ткань. Препарат инкубировали в течение ночи (приблизительно 15-18 часов) при 4°C во влажной камере. Первичное антитело смывали, используя три смены PBS, в течение 10 минут каждая. Вторичное антитело, биотинилированное α-мышиное из Vector Laboratories (Burlingame, Ca) применяли в разведении 1:500 в 1% BSA/PBS и инкубировали в течение 45-60 минут при комнатной температуре во влажной камере. Антитело смывали, снова используя три смены PBS, как выше. Затем препараты переносили в ванну диаминобензидина (DAB), разведенного в PBS, на 5-15 минут. Затем препараты промывали в водопроводной воде в течение 1 минуты, контрастно окрашивали с использованием модифицированного гематоксилина Харриса (Fisher), обесцвечивали с использованием 1% кислого спирта и синили в аммиачной воде, дегидратировали с использованием 3 смен, каждая из 95% этанола, 100% этанола и ксилола в течение 2 минут каждая и закрывали покровным стеклом с перманентной заливочной средой.
6.2.2.7 Анализ интернализации
89
c114
5
2
[00563] Интернализацию Zr-19C11 изучали на клетках SKOV3, экспрессирующих MUC16. Приблизительно 1×10 клеток высевали в 12-луночный планшет и инкубировали в течение ночи при 37°C 5% CO в инкубаторе. Определенный объем радиоактивно меченного белка добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали при 37°C и 4°C в течение 1, 5, 12 и 24 часов. После каждого периода инкубации собирали среду и промывали клетки в 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Активность, связанную с поверхностью, собирали посредством промывания клеток в 1 мл 100 мМ уксусной кислоты с 100 мМ глицина (1:1, pH 3,5) при 4°C. Затем прилипшие клетки лизировали с использованием 1 мл 1 M NaOH. Каждый смыв собирали и подсчитывали активность. Соотношение активности финального смыва и общей активности всех смывов использовали для того, чтобы определять % интернализации.
6.2.3 РЕЗУЛЬТАТЫ
6.2.3.1 Патобиология MUC16 зависит от N-гликозилирования C-концевого эктодомена MUC16.
c114
c114
c114
c114
c114
c114-N123
c114-N3
c114-N12
c114-N123
c114
c114
[00564] В примере 1 (см. раздел 6.1) показано, что экспрессия MUC16 вела к более агрессивному поведению in vitro/in vivo у фибробластов 3T3 мыши, ведущему к значимому увеличению MUC16-движимой инвазии матригеля и более быстрому опухолевому росту in vivo. Таким образом, клеточную линию SKOV-3 (клеточную линия яичника человека, которая не имеет экспрессии MUC16), исследовали на эффект MUC16-зависимых свойств. Экспрессия MUC16 вела к экспрессии на клеточной поверхности и почти 3-кратному увеличению инвазии матригеля (сравните дорожки 1 и 2 на фиг. 12A). Это увеличение инвазии зависело от N-гликозилирования аспарагина в положениях аминокислот 1 (Asn1), 24 (Asn24) и 30 (Asn 30) в MUC16 (соответствующих Asn1777, Asn1800 и Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150), соответственно; MUC16), поскольку мутация Asn30 в аланин (MUC16, фиг. 12A, дорожка 3), мутация Asn1 и Asn24 в аланин (MUC16, фиг. 12A, дорожка 4) и мутация Asn1, Asn24 и Asn30 в аланин (MUC16, фиг. 12A, дорожка 4), устраняли инвазию матригеля. Также см. фиг. 12B. Кроме того, MUC16-индуцированная повышенная инвазия матригеля зависела от MGAT5 (первого фермента, участвующего в реакции N-гликозилирования) и/или LGALS3 (фермента, амплифицированного во многих серозных злокачественных опухолях с низкой степенью дифференцировки), поскольку эксперименты с нокдауном shRNA, которые снижали экспрессию MGAT5 или LGALS3, оказывали эффект, схожий с MUC16 мутацией в участках N-гликозилирования, и снижали инвазию почти до базовых уровней (фиг. 12A, дорожки 6-10).
c114
c114-N123
c114
c114
c114
c114
c114
[00565] Наиболее однозначным признаком онкогенной трансформации является способность ускорять рост у иммунодефицитных мышей. Для того чтобы измерять эффекты N-гликозилирования MUC16, MGAT5 и LGALS2, оказываемые на скорость роста опухоли, модель опухоли в боку использовали для того, чтобы облегчать регулярные измерения опухоли. Как показано на фиг. 12C, когда клеточные линии 3T3, экспрессирующие вектор (phrGFP), MUC16, MUC16, MUC16 и shRNA против MGAT5 (MUC16-shMGAT5) или MUC16 и shRNA против LGALS3 (MUC16-shLGALS3), имплантировали в бока бестимусных голых мышей, только MUC16 клетки 3T3 формировали более крупные опухоли по сравнению с контролями только с вектором на 24 сутки. Эти данные подтверждают анализы in vitro, которые показывают, что для опухолевого роста необходимы N-гликозилирование MUC16, MGAT5 и LGALS3.
6.2.3.2 Синтез гомогенных N-гликопептидов в качестве ключевых имитаторов эпитопов для разработки mAb
c114
c114-N3
c114-N12
c114-N12
2
[00566] Поскольку определяли, что N-гликозилирование в участке Asn30 в MUC16 (соответствующем Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150); MUC16) представляет собой центральное требование для онкогенного действия MUC16, осуществляли гликановое профилирование MUC16, экспрессированного в клетках SKOV3, поскольку MUC16 сохраняет способность к N-гликозилированию в Asn30 (соответствующем Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). Анализ гликома демонстрировал очень разнообразный паттерн N-гликозилирования для этого C-концевого фрагмента MUC16, с критическим стеблем хитобиозы (GlcNAc) в качестве минимального повторяющегося звена, к которому прикрепляют различные маннозные фрагменты (фиг. 13A).
c114
c55
[00567] Таким образом, создавали mAb, направленные на гликозилирование, с целью ингибирования зависящих от гликозилирования эффектов MUC16, оказываемых на метастазы и инвазию. Эти антитела разрабатывали для нацеленного воздействия на эпитопы N-гликопептида, содержащие ключевой третий участок гликозилирования (Asn30 в MUC16) на более короткой 55-аминокислотной последовательности в эктодомене MUC16 (MUC16; SEQ ID № 129). Описание синтеза гликопептидов, используемых в качестве иммуногенов, см. в разделе 6.2.2.1 и на фиг. 13B, фиг. 13C и фиг. 13D. Описание процесса иммунизации см в разделе 6.2.2.2.
c114
[00568] Антитела создавали через иммунизацию короткими гликопептидами MUC16 (55-мер, 18-мер, и 15-мер), содержащими хитобиозу на аминокислотных остатках, соответствующих Asn24 и/или Asn30 в MUC16 (соответствующих Asn1800 и Asn1806, соответственно, зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)). В дополнение к тому, что хитобиоза является самым маленьким мотивом, общим для более крупных N-гликанов, она также делает возможной более хорошую экспозицию подлежащего пептида, происходящего из MUC16, для индукции антител, которые не только демонстрируют зависимость от гликана, но также пептидную специфичность. Это гипогликозилирование является частым, отличительным признаком у муциновых гликопротеинов на поверхности опухолевых клеток в сравнении с нормальными клетками.
6.2.3.3 Вакцинация мышей синтетическими гликопептидами/гликоконъюгатами и серологический анализ
2
2
2
2
2
3
2
[00569] Вакцинацию мышей и сбор сыворотки осуществляли в соответствии с протоколом, описанным в разделе 6.2.2.2. После трех иммунизаций с использованием GlcNAc-55-мера (фиг. 13B), мышей дополнительно иммунизировали смесью KLH-конъюгированных конструкций (моногликозилированный 15-мер (SEQ ID № 131; фиг. 13C) и бис-гликозилированный 18-мер (SEQ ID № 130; фиг. 13D)), две из десяти мышей демонстрировали положительные ELISA сигналы для обоих 55-меров (с и без GlcNAc), но ответ был в целом слабым, что подсказывает, что мыши не полностью сенсибилизировались при иммунизациях 55-мером. Две дополнительные иммунизации с использованием KLH конъюгатов (GlcNAc-15-мер (фиг. 13C) и (GlcNAc)-18-мер (фиг. 13D)) вели к усиленным IgG иммунным ответам на более короткие гликопептидные 15-мер и 18-мер, в частности, у двух мышей (мышь 7 и мышь 8). Однако эти антитела не демонстрируют какой-либо поддающейся обнаружению реактивности посредством ELISA при использовании гликопептидных 55-меров, что подсказывает, что в этом конкретном анализе эпитоп в этом большом фрагменте или недоступен или конформационно отличен. Мышь 5, которая отвечала на оба 55-мера (содержащий хитобиозу и/или не гликозилированный пептид) была отрицательной к ManGlcNAc-производному 55-мера. Не удивительно, что mAb 4H11 (Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72), которое направлено на не гликозилированный пептидный остов, не демонстрировало связывания с не конъюгированными гликопептидными 15/18-мерами, что указывает на то, что могут иметь место некоторые различия в доступных эпитопах. См. фиг. 14.
6.2.3.4 Разработка зависящего от гликозилирования моноклонального антитела и биологические анализы in vitro - MUC16-движимая инвазия матригеля
c114
c114
[00570] Отбирали одну из десяти мышей (мышь 7), сыворотка которой демонстрировала наивысшее соотношение реактивностей для коротких гликопептидов против не гликозилированных и, следовательно, демонстрировала некоторое предпочтение к присутствию сахара. Получали селезенку мыши 7 и стандартной технологией гибридомных культур предоставляли IgG-продуцирующие гибридомные клеточные линии. Спленоциты сливали с гибридомным партнером слияния, что давало чрезвычайно высокую эффективность слияния (>5,5 колонии/лунка в среднем, при > 30000 гибридом). Отбирали супернатанты и осуществляли их скрининг по реактивности с помощью ELISA против индивидуальных гликопептидов. Предварительный ELISA анализ для тестового планшета слияния против пептида 15-мер-хитобиоза и пептида 18-мер-хитобиоза (объединенных в одной и той же лунке) показывал некоторые положительные сигналы, что указывает на присутствие антител против пептидов, хотя их зависимость от гликозилирования не может быть полностью оценена в этой точке. См. фиг. 14. Тем не менее более высокую долю антител с благоприятной положительностью и, следовательно, более специфичных к гликозилированным хитобиозой антигенам, наблюдали в сравнении с не гликозилированными антигенами. При разбавлении культуры получали по одному клону, растущему в каждой лунке (соотношение 1:1 выше), и первичный скрининг выявлял, что антитела, продуцируемые этими гибридомами, не распознают эпитоп 4H11, который лежит близко к не гликозилированному 15-/18-меру. См. фиг. 14. После завершения скрининга моноклональных антител в более высоком разведении получали антитела, демонстрирующие предпочтение к гликопептидному эпитопу. Таким образом, этот процесс давал 36 первичных mAb, зависящих от хитобиозы, которые тестировали на реактивность к MUC16. Из них 15 mAb оценивали (параллельно с 4H11) по их эффекту, оказываемому на инвазию посредством матригелевого анализа с SKOV3-MUC16 трансфектантом (фиг. 15A). Антитела к гликозилированному MUC16 1B5, 10C6, 13A7, 18C6, 19C11, 16C5, 6H10, 21F8, 7B12 демонстрировали ингибирование инвазии матригеля, тогда как 4H11 не оказывало эффекта на это свойство, что указывает на то, что антитела, направленные на Asn30 в MUC16 (соответствующий Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)) ингибируют биологию MUC16. Впоследствии антитела к гликозилированному MUC16 субклонировали и очищали. Определяли параметры связывания для определенных антител к гликозилированному MUC16 (см. таблицу 9).
[00571] Таблица 9. Параметры связывания антител к гликозилированному MUC16
Антитело
k<sub>d</sub> (1/с)
Ошибка в k<sub>d</sub> (1/с)
k<sub>a</sub> (1/с)
K<sub>D</sub> (нМ)
10C6.E4
*
--
**
>1000
19C11.H6
2,42×10<sup>-3</sup>
2,35×10<sup>-4</sup>
3,80×10<sup>4</sup>
63,7
13A7.C8
*
--
**
>1000
16C5.C1
1,72×10<sup>-3</sup>
1,20×10<sup>-4</sup>
6,68×10<sup>4</sup>
25,7
7B12.B3
1,04×10<sup>-3</sup>
1,09×10<sup>-4</sup>
7,50×10<sup>4</sup>
13,8
18C6.D12
6,78×10<sup>-4</sup>
1,83×10<sup>-4</sup>
6,14×10<sup>4</sup>
11,1
1B5.A7
1,49×10<sup>-3</sup>
1,12×10<sup>-4</sup>
7,35×10<sup>4</sup>
20,2
4H11
--
--
--
--
*= низкая достоверность вычисления; без подгонки для скорости диссоциации;
a
**= k слишком низка для определения скорости ассоциации.
[00572] Наконец, иммуногистохимия образцов тканей яичника человека, которую проводили с использованием антитела к гликозилированному MUC16 10C6, показывала усовершенствованное обнаружение MUC16 по сравнению с иммуногистохимией, которую проводили с использованием 4H11 или OC125 (фиг. 16E).
6.2.3.5 Антитела к гликозилированному MUC16 специфичны для гликозилирования MUC16.
c114
c114
c114-N1
c114-N1
c114-N3
c114-N3
c114-N123
c114-N123
c114
c114
c114-N1
c114
c114
c114-N123
c114
[00573] Чтобы исследовать специфичность антител к гликозилированному MUC16, анализ FACs осуществляли на (i) клетках, экспрессирующих нативный (зрелый) MUC16 (клетки OVCA-433), (ii) клетках SKOV3, у которых отсутствует экспрессия MUC16, которые экспрессируют контрольный вектор (клетки SKOV3 phrGFP), (iii) клетках SKOV3, экспрессирующих MUC16 (SKOV3 MUC16), (iv) клетках SKOV3, экспрессирующих MUC16 (SKOV3 MUC16), (v) клетках SKOV3, экспрессирующих MUC16 SKOV3 MUC16), или (vi) клетках SKOV3, экспрессирующих SKOV3 MUC16 (SKOV3 MUC16), в присутствии или отсутствии антитела к гликозилированному MUC16 (18C6, 19C11, 10C6, 1B5 или 13A7) или моноклонального антитела против MUC16, 4H11 (таблица 10). Антитела 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5 и 13A7 демонстрировали связывание с клетками OVCA-433 (таблица 10; сравните ID №№ 3-8 с отрицательными контролями, ID №№ 1 и 2). В отличие от этого, как ожидали, исходя из постановки исследований и создания антител, ни одно из антител 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5 и 13A7 не связывало клетки SKOV3 phrGFP (таблица 10, ID №№ 11-16 в сравнении с отрицательными контролями, ID №№ 9 и 10). Антитела 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5 и 13A7 связывали SKOV3 MUC16 (таблица 10, ID №№ 19-24 в сравнении с отрицательными контролями, ID №№ 17 и 18). Мутация Asn1 в MUC16 (соответствующем Asn1777 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)) не ингибировала связывание антитела с клетками SKOV3 MUC16 (таблица 10, ID №№ 27-32 в сравнении с отрицательными контролями, ID №№ 25 и 26). Однако, мутация Asn30 в MUC16 (соответствующем Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)) устраняла связывание антител к гликозилированному MUC16 18C6, 19C11, 10C6, 1B5 и 13A7 (таблица 10, ID №№ 36-40, в сравнении с отрицательными контролями, ID №№ 33 и 34). Кроме того, мутация Asn30 в MUC16 (соответствующем Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)) не устраняла связывание антитела 4H11, которое не является антителом к гликозилированному MUC16 (таблица 10, ID № 35, в сравнении с отрицательными контролями, ID №№ 33 и 34). Кроме того, мутации аспарагина в аланин в Asn1, Asn24 и Asn30 (соответствующих Asn1777, Asn1800 и Asn1806, соответственно, зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)) устраняли связывание антител к гликозилированному MUC16 18C6, 19C11, 10C6 и 1B5 (таблица 10, ID №№ 44-47, в сравнении с отрицательными контролями, ID №№ 41 и 42), но при этом не устраняли связывание 4H11. Следует отметить, что 13A7 сохраняло связывание с клетками SKOV3 MUC16. Эти данные демонстрируют, что антитела к гликозилированному MUC16 связываются с MUC16 зависимым от гликозилирования образом.
[00574] Таблица 10. FACs анализ антител к гликозилированному MUC16 с клетками OVCA-433 или клетками-трансфектантами SKOV3.
ID №
Антитела к гликозилированному MUC16
Средн. % PE
1
Клетки OVCA-433
0,12*
2
OVCA-433+G против M IgG PE
5,01*
3
OVCA-433+4H11+G против M IgG PE
82,4
4
OVCA-433+18C6+G против M IgG PE
91,4
5
OVCA-433+19C11+G против M IgG PE
93,7
6
OVCA-433+10C6+G против M IgG PE
84,5
7
OVCA-433+1B5+G против M IgG PE
94,6
8
OVCA-433+13A7+G против M IgG PE
92,8
9
Клетки SKOV3 phrGFP
1,01*
10
SKOV3 phrGFP+G против M IgG PE
1,2*
11
SKOV3 phrGFP+4H11+G против M IgG PE
3,39*
12
SKOV3 phrGFP+18C6+G против M IgG PE
2,09*
13
SKOV3 phrGFP+19C11+G против M IgG PE
1,69*
14
SKOV3 phrGFP+10C6+G против M IgG PE
1,84*
15
SKOV3 phrGFP+1B5+G против M IgG PE
1,5*
16
SKOV3 phrGFP+13A7+G против M IgG PE
2,66*
17
Клетки SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>
0,218*
18
SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>+G против M IgG PE
2,42*
19
SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>+4H11+G против M IgG PE
85,7
20
SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>+18C6+G против M IgG PE
73,1
21
SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>+19C11+G против M IgG PE
69,3
22
SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>+10C6+G против M IgG PE
72,9
23
SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>+1B5+G против M IgG PE
73,2
24
SKOV3 MUC16<sup>c114</sup>+13A7+G против M IgG PE
68,4
25
Клетки SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>
0,139*
26
SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>+G против M IgG PE
2,84*
27
SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>+4H11+G против M IgG PE
91,5
28
SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>+18C6+G против M IgG PE
83
29
SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>+19C11+G против M IgG PE
81,7
30
SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>+10C6+G против M IgG PE
83
31
SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>+1B5+G против M IgG PE
85,4
32
SKOV3 MUC16<sup>c114-N1</sup>+13A7+G против M IgG PE
84,5
33
Клетки SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>
0,0202*
34
SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>+G против M IgG PE
0,856*
35
SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>+4H11+G против M IgG PE
15,6
36
SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>+18C6+G против M IgG PE
1,48*
37
SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>+19C11+G против M IgG PE
1,25*
38
SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>+10C6+G против M IgG PE
1,4*
39
SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>+1B5+G против M IgG PE
1,06*
40
SKOV3 MUC16<sup>c114-N3</sup>+13A7+G против M IgG PE
2,39*
41
Клетки SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>
0,274*
42
SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>+G против M IgG PE
7,02*
43
SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>+4H11+G против M IgG PE
32,3
44
SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>+18C6+G против M IgG PE
11,6*
45
SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>+19C11+G против M IgG PE
5,25*
46
SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>+10C6+G против M IgG PE
5,84*
47
SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>+1B5+G против M IgG PE
7,39*
48
SKOV3 MUC16<sup>c114-N123</sup>+13A7+G против M IgG PE
28,7
* Показывает, что связывание считали не наблюдаемым.
6.2.3.6 Антитела к гликозилированному MUC16 ингибируют инвазию матригеля.
c114
c114
c114
c114
[00575] Учитывая специфичность к гликозилированию у антител к гликозилированному MUC16 (таблица 9), оценивали способность биологически реактивных супернатантов антител к гликозилированному MUC16 ингибировать инвазию матригеля специфично к гликозилированию. Таким образом, анализ инвазии матригеля осуществляли с использованием стабильных клеточных линий раке яичников SKOV3, которые экспрессируют phrGFP (фиг. 15A, дорожка 1) или phr-GFP-MUC16 (MUC16; фиг. 15A, дорожки 2-18) в присутствии (фиг. 15A, дорожки 3-18) или отсутствии (фиг. 15A, дорожки 1 и 2) биологически реактивных супернатантов антител к гликозилированному MUC16. Моноклональное антитело к MUC16 4H11 (фиг. 15A, дорожка 3) использовали в качестве контроля для биологически реактивных супернатантов антител к гликозилированному MUC16 (фиг. 15A, дорожки 4-18), чтобы оценивать зависимость от гликозилирования при инвазии матригеля. Экспрессия MUC16, или отдельно в присутствии 4H11 (фиг. 15A, дорожки 2 и 3, соответственно), вела к увеличению активности инвазии матригеля. В отличие от этого, инкубация с антителами к гликозилированному MUC16 (фиг. 15A, дорожки 4-18) снижала инвазию матригеля MUC16-экспрессирующими клетками раке яичника.
c114
c114
c114
[00576] Затем оценивали способность очищенных антител к гликозилированному MUC16 ингибировать инвазию матригеля. С этой целью клетки SKOV3, экспрессирующие MUC16, инкубировали в присутствии и отсутствии антитела к MUC16 4H11 или очищенных антител к гликозилированному MUC16 (фиг. 15B). Антитела к гликозилированному MUC16 7B12, 19C11, 18C6 и 10C6 ингибировали MUC16-индуцированную инвазию матригеля (фиг. 15B, сравните дорожки 3-6 с отрицательным контролем, дорожка 2). В отличие от этого, моноклональное антитело против MUC16 4H11 не ингибировало MUC16-индуцированную инвазию матригеля (фиг. 15B, сравните дорожку 2 с отрицательным контролем, дорожкой 1). Эти данные демонстрируют, что, в отличие от моноклонального антитела 4H11, антитела к гликозилированному MUC16 (например, 7B12, 19C11, 18C6 и 10C6) блокируют инвазию матригеля.
c114
c114
c114-N1
c114-N2
c114-N3
c114
c114-N3
c114
c114
c114
c114-N1
c114-N2
c344
[00577] Способность антител к гликозилированному MUC16 ингибировать инвазию матригеля анализировали в контексте мутантов N-гликозилирования MUC16 (фиг. 16A). С этой целью анализ инвазии матригеля осуществляли на клетках SKOV3 phrGFP, клетках SKOV3 MUC16, клетках SKOV3 MUC16, клетках SKOV3 MUC16 или клетках SKOV3 MUC16 (фиг. 16A, дорожки 1-5, соответственно), в присутствии (i) контрольного антитела; (ii) антитела 4H11; или (iii) антитела к гликозилированному MUC16 10C6. MUC16-индуцированную инвазию матригеля ингибировали в клетках SKOV3 MUC16, поскольку Asn30 в MUC16 необходим для MUC16 инвазии матригеля. Кроме того, инвазию матригеля индуцировали в клетках SKOV3 MUC16, клетках SKOV3 MUC16 и клетках SKOV3 MUC16 в присутствии и отсутствии моноклонального антитела к MUC16 4H11. В отличие от этого, инкубация этих клеток с антителом к гликозилированному MUC16 10C6 устраняла инвазию матригеля (фиг. 16A). Эти данные также подтверждали на фиг. 16B и в клетках 3T3, экспрессирующих мутантов MUC16 (фиг. 16C).
[00578] В совокупности, эти данные показывают, что антитела к гликозилированному MUC16, в отличие от моноклонального антитела против MUC16 4H11, способны ингибировать инвазию матригеля зависимым от гликозилирования образом.
6.2.3.7 Интернализация антитела к гликозилированному MUC16 19C11.
c114
c114
89
c114
[00579] Наконец, оценивали способность антитела к гликозилированному MUC16, направленного на Asn30 в MUC16, к интернализации. Клетки SKOV3, экспрессирующие MUC16, инкубировали с Zr-DFO-меченным антителом 19C11 и определяли интернализацию через радиоактивную метку (фиг. 17). Эти данные демонстрируют, что интернализация меченого антитела 19C11 происходила, когда его инкубировали с MUC16-экспрессирующими клетками SKOV3 при 37°C, уже через 1 час после обработки антителом. Клеточное поглощение меченого антитела снижалось при 4°C.
6.2.4 ОБСУЖДЕНИЕ
C114
[00580] MUC16/антиген CA125, элемент семейства муцинов с существенной гомологией с MUC1, долго связывали с гинекологическими злокачественными новообразованиями (см. источник 4, как приведено в разделе 6.2.5, далее). Несмотря на то, что оно не является достаточно чувствительным или специфичным в качестве основного инструмента скрининга, измерение CA125 регулярно используют для того, чтобы осуществлять мониторинг пациентов со злокачественными опухолями яичников через способы обнаружения на основе антител. Подавляющее большинство MUC16-реактивных антител, таких как OC125, направлено против зависящих от гликозилирования эпитопов, встречающихся в отщепляемой фракции молекулы, и их нельзя использовать в качестве инструментов скрининга для того, чтобы обнаруживать проксимальную часть MUC16 после отщепления. Как следствие, биологические исследования остающегося фрагмента белка MUC16 недостаточны. Данные в примере 1 (раздел 6.1) демонстрировали, что 114 аминокислотная последовательность проксимальной области MUC16 (MUC16) является достаточной для того, чтобы увеличивать инвазию и опухолевый рост в нескольких клеточных линиях рака яичников. В настоящем описании разительное открытие, что N-гликозилирование этого C-концевого эктодомена, в частности в третьем участке Asn (Asn30, соответствующем Asn1806 зрелого MUC16 (SEQ ID № 150)), является ключевым для онкогенных эффектов MUC16, указывает на новые роли MUC16, который после этого можно рассматривать не только как пассивный маркер заболевания, но также как патогенную молекулу. На основании этого предположения разработка моноклональных антител против этих сохраняемых частей MUC16 выглядит как мощный инструмент для исследования патобиологии этого муцина и создания терапевтических средств, нацеленных на MUC16.
[00581] В предыдущих исследованиях идентифицировали mAb против не отщепляемой C-концевой области MUC16, хотя, в отличие от предшествующих антител, они направлены на не гликозилированный пептидный остов вместо сложных гликопротеиновых эпитопов. В частности, 4H11 демонстрировало высокоаффинное связывание с эктодоменом MUC16 и интернализацию клетками раке яичника более эффективно, чем OC125, по причине близкого местоположения эпитопа. Эта находка подсказывает, что проксимальная область гликопротеина обладает биологией, не зависящей от слущиваемой части MUC16, дистальной относительно предполагаемого сайта расщепления. Однако, поскольку 4H11 не распознает ключевые участки гликозилирования в эктодомене, которые необходимы для патогенного действия MUC16, его потенциал в будущих исследованиях нацеленной терапии ограничен.
c114
[00582] Разработана панель зависящих от гликозилирования моноклональных антител, направленных на ключевые гликопептидные эпитопы в эктодомене MUC16, с использованием KLH-конъюгированных, синтетических гликопептидных имитаторов в комбинации с гибридомной технологией. Этот способ предпочтительнее создания поликлональных антител, поскольку на поликлональном этапе гликопептидная специфичность не являлась полной и также обнаруживали некоторое связывание с пептидными фрагментами не гликозилированного MUC16. Для получения антител к гликозилированному MUC16, первичный отбор генерации моноклональных антител проходил по более высокой доле зависимости от гликозилирования в поликлональной культуре, что связывали с некоторой степенью предпочтения к присутствию сахара. Силу новых моноклональных антител и их более высокую специфичность к гликопептидному эпитопу демонстрировали посредством изучения их эффекта, оказываемого на MUC16-движимую инвазию матригеля. Эти антитела к гликозилированному MUC16 способны ингибировать инвазию в матригелевом анализе, тогда как 4H11, не направленное на гликозилирование, не способно. На основании находки, что N-гликозилирование в Asn30 важно для действия MUC16, эти результаты подтверждают, что вновь созданные антитела специфически направлены на ключевой гликопептидный эпитоп эктодомена MUC16, результатом чего является ингибирование патобиологии MUC16. Важно, что антитело к гликозилированному MUC16 10C6 значительно задерживало MUC16-положительный опухолевый рост в модели на бестимусных голых мышах, которым имплантировали MUC16-экспрессирующие клетки раке яичника, что демонстрирует потенциал этих моноклональных антител стать перспективным инструментом для их терапевтического использования в оптимизированных клинических применениях.
6.2.5 ЦИТИРУЕМЫЕ ИСТОЧНИКИ
[00583] 1. Bast, R. C. Jr. et al. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J. Clin. Invest. 68, 1331-1337 (1981).
[00584] 2. Yin, B. W. & Lloyd, K. O. Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J. Biol. Chem. 276, 27371-27375 (2001).
[00585] 3. O'Brien, T. J. et al. The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumor Biol. 22, 348-366 (2001).
[00586] 4. Bast, R. C. Jr., et al. CA125: the past and the future. Int. J. Biol. Markers 13, 179-187 (1998).
[00587] 5. Rustin, G. J. S. Use of CA-125 in clinical trial evaluation of new therapeutic drugs for ovarian cancer. Clin. Cancer Res. 10, 3919-3926 (2004).
[00588] 6. Scholler, N. & Urban, N. CA125 in ovarian cancer. Biomark. Med. 1, 513-523 (2007).
[00589] 7. Yin, B. W., Dnistrian, A. & Lloyd, K. O. Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int. J. Cancer 2002, 98, 737-740.
[00590] 8. O'Brien, T. J., Beard, J. B., Underwood, L. J. & Shigemasa, K. The CA 125 gene: a newly discovered extension of the glycosylated N-terminal domain doubles the size of this extracellular superstructure. Tumor Biol. 23, 154-169 (2002).
[00591] 9. Nap, M. et al. Immunohistochemical characterization of 22 monoclonal antibodies against the CA125 antigen: 2nd report from the ISOBM TD-1 workshop. Tumor Biol. 17, 325-331 (1996).
[00592] 10. Rao, T. D. et al. Novel monoclonal antibodies against the proximal (carboxy-terminal) portions of MUC16. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 18, 462-472 (2010).
[00593] 11. Cohen-Anisfeld, S. T., Lansbury, P. T. A practical, convergent method for glycopeptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. 115, 10531-10537 (1993).
[00594] 12. Wang, P., Aussedat, B., Vohra, Y. & Danishefsky, S. J. An advance in the chemical synthesis of homogeneous N-linked glycopolypeptides by convergent aspartylation. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11571-11575 (2012).
[00595] 13. Likhosherstov, L. M., Novikova, O. S., Derevitskaja, V. & Kochetkov, N. K. A new simple synthesis of amino sugar β-d-glycosylamines. Carbohydr. Res. 146, C1-C5 (1986).
[00596] 14. Nakada, H. et al. Epitopic structure of Tn glycophorin A for an anti-Tn antibody (MLS 128). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2495-2499 (1993).
[00597] 15. Osinaga, E. et al. Analysis of the fine specificity of Tn-binding proteins using synthetic glycopeptide epitopes and a biosensor based on surface plasmon resonance spectroscopy. FEBS Lett. 469, 24-28 (2000).
[00598] 16. Mazal, D. et al. Monoclonal antibodies toward different Tn-amino acid backbones display distinct recognition patterns on human cancer cells. Implications for effective immuno-targeting of cancer. Cancer Immunol. Immunother. 62, 1107-1122 (2013).
[00599] 17. Rosen, D.G. et al. Potential markers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 99, 267-277 (2005).
[00600] 18. Moore, R.G., Maclaughlan, S. & Bast, R.C. Jr. Current state of biomarker development for clinical application in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 116, 240-245 (2010).
6.3 ПРИМЕР 3: СПОСОБСТВУЮЩИЕ ОПУХОЛИ ЭФФЕКТЫ MUC16 ТРЕБУЮТ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ГАЛЕКТИНОМ-3 И РЕЦЕПТОРАМИ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ
[00601] В этом примере предоставлены (a) более подробное описание определенных экспериментов, описанных в примере 2 (раздел 6.2); и (b) дополнительные эксперименты по сравнению с примером 2 (раздел 6.2).
6.3.1 ВВЕДЕНИЕ
c114
[00602] Сверхэкспрессия MUC16/CA125 обычна при серозной раке яичников и повышенные уровни CA125 в сыворотке ассоциированы со сниженной выживаемостью. Антиген CA125, распознаваемый антитело OC125, представляет собой сильно гликозилированный антиген, экспрессируемый в доменах тандемных повторов из внеклеточной части гликопротеина MUC16 (см. источники 3 и 22 в разделе 6.3.13, далее). Этот антиген преимущественно экспрессируют доброкачественные или озлокачествленные мюллеровы ткани, но его функция и роль в канцерогенезе в настоящее время не полностью поняты (см. источник 4 в разделе 6.3.13, далее). MUC16 представляет собой очень сложный связанный муцин, который содержит большой, гетерогенно гликозилированный внеклеточный домен, 58-аминокислотный эктодомен между клеточной мембраной и предполагаемым сайтом расщепления, гидрофобную трансмембранную область и короткий внутриклеточный хвост (см. источник 21 в разделе 6.3.13, далее). OC125 и большинство других MUC16-реактивных моноклональных антител (mAb) распознают иммуногенную 156-аминокислотную область тандемных повторов, присутствующую в отщепляемой части молекулы. Более новые специфичные к эктодомену антитела (например, 4H11 и 4A5) распознают пептидный эпитоп в сохраняемой после расщепления части MUC16 (см. источник 6 в разделе 6.3.13, далее). Продемонстрировано, что C-концевая часть MUC16 (MUC16) трансформирует иммортализованные клетки 3T3, как измеряют по увеличенному безъякорному росту, активации путей AKT и ERK, повышенной инвазии матригеля и усиленному росту в ксенотрансплантатах голых мышей (см. раздел 6.1 и источник 19 в разделе 6.3.13, далее). Эти эффекты зависели от эктодомена MUC16, тогда как утрата 31-аминокислотного цитоплазматического хвоста оказывала небольшой эффект на эти свойства. Механизмы, посредством которых эктодомен способствует онкогенному поведению, не полностью поняты (см. источник 19 в разделе 6.3.13, далее). Хотя отсутствуют консенсусные белоксвязывающие домены, 58-аминокислотная последовательность эктодомена MUC16 содержит три участка N-гликозилирования, которые представляют потенциальные участки взаимодействия/регуляторные участки для MUC16 с другими молекулами клеточной поверхности.
[00603] Участки N-гликозилирования тирозинкиназных рецепторов, таких как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) и другие, похоже, взаимодействуют с клеточными лектинами, такими как галектин-3, чтобы регулировать пребывание на поверхности, интенсивность передачи сигналов и клеточное поведение (см. источник 12 в разделе 6.3.13, далее). Эффекты N-гликозилирования зависят от числа участков N-гликозилирования на усиливающих рост рецепторах и аффинности галектина-3 к сложным N-гликозилированным соединениям. На компенсирующих ингибирующих сигналах молекул клеточной поверхности, таких как рецепторы трансформирующего фактора роста β (TGF-β), меньше участков N-гликозилирования. Эти рецепторы чувствительны к сильными потоками питательных веществ, связанным с факторами роста, и обеспечивают функцию демпферирования в нормальных условиях. Однако механизмы ассоциированных со злокачественными опухолями гликопротеиновых взаимодействий с классическими рецепторными тирозинкиназами не известны. MUC1, MUC4 и MUC16 представляют собой сильно гликозилированные связанные гликопротеины, которые отличаются присутствием трансмембранных доменов и сверхэкспрессией в эпителиальных злокачественных опухолях (см. источник 10 в разделе 6.3.13, далее).
[00604] В этом примере (раздел 6.3) показано, что гликозилирование MUC16 играет ключевую роль в трансформации, связанной с муцином, опосредуя сложные взаимодействия на клеточной поверхности.
[00605] C-концевая часть MUC16 способствовала активации онкогена, инвазии матригеля и опухолевому росту. Эти эффекты зависели от MGAT5-зависимого гликозилирования двую проксимальных участков N-гликозилирования в остающемся 58-аминокислотном эктодомене MUC16. Ни N-, ни O-участки гликозилирования в более дистальной области тандемных повторов MUC16 не могут функционально заменить эти два участка. Паттерны гликозилирования MUC16 разнообразны, но стебель хитобиозы характеризовал основание всех частиц в N-гликозилировании. Антитела к проксимальным гликопептидам MUC16, содержащим хитобиозу, блокировали опосредованное галектином-3 связывание с сигнальными рецепторами клеточной поверхности и ингибировали способствующие опухоли эффекты MUC16.
[00606] Систематические изменения в гликопептидах MUC16 использовали для непосредственного детального исследования зависимости между структурой гликана и способствующим опухоли эффектам, оказываемым посредством экспрессии MUC16. Эти эффекты, включая совместную локализацию, активацию онкогена, инвазию матригеля и рост опухолевого ксенотрансплантата, проявлялись посредством опосредованного галектином-3 связывания между N-гликозилированной последовательностью на остающейся не циркулирующей части MUC16 и молекулами клеточной поверхности, такими как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и интегрин β1. Внеклеточное движимое муцином стимулирование опухоли является механизмом, подтверждаемым находками и данными, представленными в настоящем описании, на который можно успешно нацеленно воздействовать с помощью антител, направленных на участок N-гликозилирования.
[00607] Как показано в этом примере: (1) состояние внеклеточного гликозилирования MUC16 управляет поведением серозной раке яичника; (2) инвазия и рост MUC16+ ксенотрансплантата зависели от конкретных участков N-гликозилирования MUC16; (3) MUC16 формировал гетеротримерные комплексы с галектином-3 и EGFR или интегрином β1; и (4) антитела против участков гликозилирования блокировали внеклеточное MUC16 стимулирование опухоли.
6.3.2 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
c114
c344
6.3.2.1 Синтез ДНК конструкций карбоксиконца MUC16 (MUC16), домена MUC16-CA125 (MUC16) и гликозилированного слитого белка
c57-114
117-244
[00608] См. в разделах 6.1.2 и 6.2.2 и источнике 19 в разделе 6.3.13, далее, описание C-концевых конструкций MUC16. Вектор pFUSE-human IgG1-Fc2 (pFUSE) приобретали в InvivoGen (San Diego, CA), и конструкции химерных белков MUC16-pFUSE и LGALS3-pFUSE также описаны в разделах 6.1.2 и 6.2.2 и источнике 19 в разделе 6.3.13, далее.
6.3.2.2 Клеточная культура, трансфекция и определение характеристик клеточной линии
[00609] Клеточные линии SKOV3, CAOV3 и OVCAR3 получали и поддерживали, как описано в разделах 6.1.2 и 6.2.2 и источнике 19 в разделе 6.3.13, далее. Подробности см. в разделе 6.3.6.
6.3.2.3 Синтез гликопептидов
[00610] Описание подробного синтеза гликопептидов MUC16 см. в разделе 6.4.
6.3.2.4 Инвазия матригеля
c57-c114
117-244
c114
[00611] Инвазия базальной мембраны определяли в камерах инвазии матригеля (BD Biosciences, Bedford, MA). Стабильные клеточные линии обрабатывали туникамицином 5 мкг/мл (Sigma-Aldrich, St. Louis MO № по каталогу T7765) или слитным белком MUC16-pFUSE 5 мкг/мл или LGALS3-pFUSE 5 мкг/мл; затем миграцию в матригеле измеряли после 48 часов трижды в лунках и по сравнению с трансфектантами контрольным вектором phrGFP и MUC16. Также см. разделы 6.1.2 и 6.2.2 и источник 19 в разделе 6.3.13, далее.
6.3.2.5 Опухолевый рост у бестимусных голых мышей
3
[00612] Трансфицированные клеточные линии и подходящие контрольные клеточные линии вводили в бок самкам бестимусных голых мышей и животным предоставляли стандартный уход в Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitumor Assessment Core Facility. Измерения опухолей выполняли два раза в неделю, и опухолевй рост регистрировали до максимального размера 1500 мм по руководствам Memorial Sloan Kettering Cancer Center Research Animal Resource Center. Также см. разделы 6.1.2 и 6.2.2 и источник 19 в разделе 6.3.13, далее.
6.3.2.6 Получение моноклональных антител; протокол иммунизации мышей
2
2
2
2
2
[00613] Протокол иммунизации начинали с содержащего хитобиозу гликопептидного 55-мера MUC16 (GlcNAc-55-мер; SEQ ID № 129), который вводили пяти мышам BALB/c и пяти мышам Swiss Webster три раза каждые 3 недели в присутствии адъюванта. Четвертую иммунизацию осуществляли с использованием смеси MUC16 конструкций KLH-конъюгированного моногликозилированного 15-мера (GlcNAc-15-мер-KLH; SEQ ID № 131) и бис-гликозилированного 18-мера ([GlcNAc]-18-мер-KLH; SEQ ID № 130). Сыворотки анализировали на реактивность против гликопептидных GlcNAc-55-мера (SEQ ID № 129) и не конъюгированного несущего хитобиозу 15/18-мера (SEQ ID № 131 и SEQ ID № 130, соответственно). Кроме того, не гликозилированные пептидные 55-мер (SEQ ID № 129), 15-мер (SEQ ID № 131) и 18-мер (SEQ ID № 130) вместе с двумя не родственными MUC16, содержащими хитобиозу пептидами использовали в качестве отрицательных контролей для скрининга (SEQ ID №№ 168 и 169). Мышей дополнительно иммунизировали более короткими KLH-конъюгатами (SEQ ID № 130 и SEQ ID № 131) еще два раза каждые 3 недели и ответы анализировали с помощью ELISA после каждой иммунизации. Также см. раздел 6.2.2.
6.3.2.7 ELISA
[00614] Сэндвич-ELISA осуществляли для того, чтобы оценивать положительность антител к индивидуальным (гликоль)пептидам, придерживаясь стандартного протокола центр коллективного использования для ELISA анализа. Также см. раздел 6.2.2.
6.3.2.8 Анализ вестерн-блоттинга
[00615] Равные количества белка разделяли посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и переносили на поливинилидендифторидные (PVDF) или нитроцеллюлозные мембраны с использованием аппарата для переноса BioRad при 4°C. Мембраны блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) или 5% обезжиренным молоком в PBS с 0,1% Tween-20 (PBST) в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны проявляли с использованием различных первичных антител [Cell Signaling, MA: Akt № по каталогу9272; Phospho-Akt (Ser473)(193H12) № по каталогу 4058; p44/43 MAPK (Erk1/2) № по каталогу 9102; Phospho-p44/43 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) № по каталогу 9101; Src № по каталогу 2109S; Phospho-Src № по каталогу 2101L; EGFR № по каталогу 2237L; Phospho-EGFR (Y1068)(D7A5) XP(R) № по каталогу 3777S]; (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO: beta-actin № по каталогу A5441); (Southern BioTech, Birmingham, AL: anti-human-Fc-IgG1-HRP № по каталогу 9054-05); (Abgent, San Diego, CA: polyclonal LGALS3 antibody № по каталогу AP11938b); и (Origene, Rockville, MD: mouse monoclonal anti-EGFR v3 clone OTI3H2 № по каталогу TA506224; mouse monoclonal anti-DDK clone 4C5 № по каталогу TA50011-100) при 4°C в течение ночи. Мембраны промывали три раза в PBS-T и проявляли с использованием HRP-конъюгированного антитела против мыши или против кролика (GE Healthcare, UK) (разведение 1:5000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мембраны промывали три раза в PBS-T и проявляли реактивом Western Lightning Chemiluminescence (ECL, Perkin Elmer) в течение 1-5 минут при комнатной температуре, и сигналы проявляли на пленке HyBlot CL (Denville Scientific Inc. Metuchen, NJ).
[00616] Описания протоколов анализа вестерн-блоттинга также см. разделы 6.1.2 и 6.2.2 и источник 6 в разделе 6.3.13, далее.
6.3.3 ИММУНОГИСТОХИМИЯ ТКАНЕВОЙ МИКРОПАНЕЛИ (TMA)
[00617] Иммуногистохимию скрининга TMA человека осуществляли, как описано ранее (см. источник 6 в разделе 6.3.13, далее).
C344
C114
6.3.4 ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ОКРАШИВАНИЕ OVCAR3, SKOV3-MUC16 И SKOV3-MUC16
2
[00618] 50000 клеток отдельно высевали в чашки Delta TPG 0,17 мм и культивировали в соответствующих им средах при 37°C в 5% CO в течение ночи. Прилипшие клетки промывали два раза в PBS, содержащем 1% эмбриональную телячью сыворотку (FCS) и 0,025% азида натрия (FACS буфер). Клетки окрашивали в разведении 1:50 с использованием или EGFR(R-1)-Alexa Fluor 647 нм (Santa Cruz Biotechnology, CA, № по каталогу sc-101 AF647) и 4H11 или Integrin β1(4B7R)-Alexa Fluor 647 нм (Santa Cruz Biotechnology, CA, № по каталогу sc-9970 AF647) и 4H11 в течение 30 минут при 4°C. Клетки промывали в FACS буфере три раза и затем метили IgG2b-PE козы против мыши (Santa Cruz Biotechnology, CA, № по каталогу sc-3766-PE) в течение 30 минут при 4°C. Клетки промывали в FACS буфере три раза и получали изображения на Zeiss Axio Observer Z1 с использованием 20×/0,8NA воздушного и 63×/1,4NA масляного объектива и регистрирующего программного обеспечения ZEN2.
6.3.5 СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
[00619] Для того чтобы сравнивать группы, оцениваемые в исследованиях роста и инвазии in vitro и in vivo, данные анализировали на статистическую значимость с использованием двустороннего критерия Стьюдента и программного обеспечения GraphPad Prism (San Diego, CA).
6.3.6 КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА, ТРАНСФЕКЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ
c114
c114
c114
c344
[00620] См. источник 3 в разделе 6.3.13 в отношении клеточной линии OVCA-433. Тетрациклин-индуцибельную систему pLenti приобретали в Invitrogen, CA (№ по каталогу K4925-00) и использовали для того, чтобы создавать pLenti-SKOV3. Нокаут шпилечной shRNA для EGFR-экспрессирующих вирусных плазмид получали с помощью Memorial Sloan Kettering Cancer Center High Throughput Screening (HTS) Core Facility; трансфицировали клетки HEK293 и собирали вирусные супернатанты с клеток HEK293 для того, чтобы инфицировать клеточные линии pLenti-SKOV3-shEGFR. MUC16 трансфектанты имели на клеточной поверхности экспрессию белка MUC16 от предполагаемого сайта расщепления до карбоксиконца (аминокислоты с 1777 до 1890 из SEQ ID № 150) (см. источник 21 в разделе 6.3.13, далее). Клеточные линии с более длинными фрагментами MUC16 получали схожим образом, включая линии с экспрессией вектора MUC16-GFP, которые имеют на клеточной поверхности экспрессию белка MUC16 в виде 344-аминокислотного фрагмента, идущего до карбоксиконца MUC16 (аминокислоты с 1547 до 1890 из SEQ ID № 150) (см. источники 19 и 22 в разделе 6.3.13, далее).
6.3.7 ТРАНСФЕКЦИЯ
c57-114
117-244
[00621] ДНК конструкции вводили в клетки SKOV3 с использованием DOTAP (Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN), следуя протоколу производителя. Стабильные трансфектанты отбирали с использованием 800 мкг/мл G418 для клеток SKOV3 в их средах для культивирования. Они проходили сортировку клеток по экспрессии GFP два раза, и отобранные клетки выращивали в виде линий вплоть до 15 переносов. Стандартный мониторинг FACS анализа осуществляли для того, чтобы подтверждать GFP положительность этих линий. Белковые экстракты этих линий анализировали посредством вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител против hrGFP (Stratagene, La Jolla, CA) и против карбоксиконца MUC16 (см. источник 19 в разделе 6.3.13, далее). Как описано в разделе 6.1, конструкции MUC16-pFUSE-hIgG1-Fc2 и LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 were трансфицировали в эмбриональные клетки почки человека (HEK) FreeStyle 293F (Invitrogen, CA), которые экспрессируют и секретируют слитые белки в бессывороточные среды, в соответствии с протоколом производителя (см. раздел 6.1 и источник 19 в разделе 6.3.13, далее). Секретируемые слитые белки очищали и определяли их характеристики посредством анализа вестерн-блоттинга с использованием антитела против IgG1 человека-Fc-HRP (со специфичностью к γ1 цепи) (Southern Biotech Inc., Birmingham, AL) или 4H11-HRP или поликлонального антитела против LGALS3 человека (Abgent, San Diego, CA). Очищенные белки EGFRDDK-HIS (№ по каталогу TP700043), LGALS3Myc-DDK (№ по каталогу TP308785) и Integrin-β1Myc-DDK (№ по каталогу TP303818), экспрессируемые клетками HEK293, приобретали в Origene, Rockville, MD.
6.3.8 ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ОКРАШИВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ FACS АНАЛИЗА
[00622] FACS анализ экспрессии MUC16 осуществляли, как описано в разделе 6.1 и источнике 6 в разделе 6.3.13, далее.
6.3.9 КРИВЫЕ РОСТА
[00623] Кривые роста получали, как описано в разделах 6.1 и 6.2 и источниках 18 и 19 в разделе 6.3.13, далее.
6.3.10 НОМЕНКЛАТУРА
[00624] Как используют в примере 3 (раздел 6.3), «N1» относится к аспарагину в положении 1777 из SEQ ID № 150, также обозначаемому как «Asn1777». Как используют в примере 3 (раздел 6.3), «N24» относится к аспарагину в положении 1800 из SEQ ID № 150, также обозначаемому как «Asn1800». Как используют в примере 3 (раздел 6.3), «N30» относится к аспарагину в положении 1806 из SEQ ID № 150, также обозначаемому как «Asn1806».
6.3.11 РЕЗУЛЬТАТЫ
6.3.11.1 Патобиология MUC16 зависит от N-гликозилирования C-концевого эктодомена MUC16
c114
c114
c114
,
[00625] Экспрессия самых проксимальных 114 аминокислот C-концевого эктодомена MUC16 (MUC16) вела к более агрессивному поведению фибробластов 3T3 мыши in vitro/in vivo, включая значимое увеличение MUC16-движимой инвазии матригеля и более быстрый опухолевый рост in vivo (см. раздел 6.1 и источник 19 в разделе 6.3.13, далее). Чтобы исследовать роль эффектов MUC16 и его гликозилирования, оказываемых на клетки яичника человека, MUC16-отрицательную клеточную линия яичника человека SKOV3 исследовали на влияние экспрессии MUC16 (фиг. 18A-18C). Трансфекция клеток SKOV3 стабильным экспрессирующим MUC16 вектором вела к высоким уровням экспрессии MUC16 на клеточной поверхности и больше чем двукратному увеличению инвазии матригеля, как показано на фиг. 19A. 24-часовое воздействие ингибитором N-гликозилирования туникамицином на клетки сильно снижало инвазивные свойства клеток SKOV3-MUC16, но оказывало небольшой эффект на инвазию матригеля клеткамитрансфицированными только вектором SKOV3-phrGFP (фиг. 19A).
117-244
117-244
c114
c57-114
117-244
c57-114
c114
c114
[00626] Ранее лектины были вовлечены в опосредование эффектов гликозилирования (см. источник 17 в разделе 6.3.13, далее), и поскольку галектин-3 часто сверхэкспрессирован в злокачественных опухолях яичников человека, лектин-блокирующую конструкцию создавали посредством объединения сахарсвязывающего домена галектина-3 (LGALS3) с усеченной последовательностью pFUSE-human IgG1-Fc2 (pFUSE), не содержащей вариабельный связывающий домен («LGALS3-pFUSE») (см. источник 1 в разделе 6.3.13, далее). Эта химерная молекула связывает лиганды галектина-3, но не обладает способностью формировать пентамеры галектина-3. Как показано на фиг. 19A, когда эту галектин-блокирующую конструкцию вводили в клетки, она оказывала небольшой эффект на инвазию матригеля контрольными клетками SKOV3-phrGFP, но значительно снижала SKOV3-MUC16 инвазию. Контрольный вектор pFUSE, не имеющий сахарсвязывающего домена галектина-3, не имел эффекта. Также создавали растворимый MUC16 эктодомен, сконструированный путем связывания того же вектора pFUSE с 58 аминокислотами из эктодомена MUC16 («MUC16-pFUSE»). Как и в случае галектин-3-pFUSE(LGALS3-pFUSE)-блокирующей конструкции, MUC16-pFUSE конструкция также значительно снижала инвазию для клеток SKOV3-MUC16, но не для клеток SKOV3-phrGFP. MGAT5 представляет собой фермент гликозилирования, который катализирует формирование тетраантенных N-гликанов с наивысшей аффинностью к связыванию галектином-3 (см. источник 9 в разделе 6.3.13, далее). Мыши с нокаутом MGAT5 устойчивы к опухолевому росту (см. источник 8 в разделе 6.3.13, далее). Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предложена гипотеза о том, что эффекты MUC16 зависят от экспрессии как галектина-3, так и MGAT5. Как показано на фиг. 19B, shRNA, которые снижают MGAT5 или галектин-3 (LGALS3), заметно снижали SKOV3-MUC16 инвазию, тогда как shRNA отрицательного контроля, обеспечивающая нокдаун Lamelli, не оказывала эффекта.
c114
c344
c344
c344
c114
[00627] Введение мутаций в участки N-гликозилирования эктодомена MUC16 (остатки аспарагина в положениях N1, N24 и N30 эктодомена MUC16) снижало наблюдаемые изменения, зависящие от гликозилирования MUC16. Как показано на фиг. 19C, мутация аспарагина в аланин в наиболее дистальном аспарагине (N1), смежно с сайтом расщепления, не оказывала негативного эффекта на инвазию. В отличие от этого, мутации аспарагина в аланин в любом из более проксимальных аспарагинов (N24 или N30) отрицательно влияли на инвазию. В частности, сохранение аспарагина, ближайшего к поверхности мембраны (N30), было наиболее критичным для усиления инвазии, и этот эффект существенно не увеличивался за счет дополнительных мутаций аспарагина в аланин в других остатках аспарагина. Также исследовали более крупную конструкцию MUC16 с 344 аминокислотами из C-конца MUC16 (MUC16). Когда экспрессирующие векторы, несущие мутации MUC16 в N30 из MUC16 или N24 и N30 из MUC16, трансфицировали в клеточную линию SKOV3, происходило значительное снижение инвазии матригеля (фиг. 19D). Несмотря на то, что эта более крупная конструкция имеет семь дополнительных участков N-гликозилирования дистально от сайта расщепления, мутации в ключевых проксимальных участках N24 и N30 все еще снижали инвазию матригеля, как показано на фиг. 19D, так же, как те мутации, которые изменяли инвазию при использовании SKOV3-MUC16.
c114
c114
c114
c114
[00628] Продемонстрирована активация ниже по каскаду в обоих путях ERK и PI3K/AKT при MUC16 трансформации клеток 3T3 (см. раздел 6.1 и источник 19 в разделе 6.3.13, далее). На фиг. 19E можно видеть, что трансфекция клеток SKOV3 с использованием MUC16 активировала различные онкогены, включая pERK1/2, pSRC, и фосфорилирование EGFR. Фиг. 19E демонстрирует, что каждое из следующих условий ослабляет MUC16-индуцированную активацию онкогена: нокдаун MGAT5 (shMGAT5), нокдаун галектина-3 (shLGALS3) и мутация аспарагина в аланин в N30. Эти данные находятся в соответствии со снижениями, наблюдаемыми при инвазии матригеля, связанной с экспрессией MUC16.
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
c114
[00629] Эффекты нокдауна MGAT5 или LGALS3 или мутаций участков N-гликозилирования эктодомена MUC16 исследовали на опухолевом росте ксенотрансплантата у голых мышей. Как показано на фиг. 19F, имело место полное устранение MUC16-индуцированного опухолевого роста при использовании какого-либо из этих вмешательств, направленных на N-гликозилирование. Также исследовали эффект MUC16, оказываемый на стабильность рецепторов. Присутствие как N-гликозилирования, так и связи с галектиновым каркасом ассоциировали со стабилизацией EGFR на клеточной поверхности (см. источник 11 в разделе 6.3.13, далее). Без ограничения какой-либо конкретной теорией, полагали, что увеличенное присутствие MUC16 стабилизирует галектиновый каркас клеточной поверхности, тем самым стабилизируя EGFR на клеточной поверхности. Как показано на фиг. 20A, присутствие EGFR на клеточной поверхности клеток SKOV3 возрастало, когда стабильные SKOV3-MUC16 трансфектанты сравнивали с контролями, содержащими только вектор, используя FACS анализ. Кроме того, экспрессия MUC16 почти удваивала EGFR на клеточной поверхности после обработки циклогексимидом (CHX), чтобы ингибировать синтез новых EGFR, по сравнению с контрольным вектором phrGFP. Стабильность эктодомена MUC16 (4H11 положительного) не менялась под действием CHX. Общий EGFR с течением времени сравнивали в стабильных клетках SKOV3-MUC16 и SKOV3-phrGFP, которые обрабатывали CHX в течение 24 часов, посредством вестерн-блоттинг, и EGFR сравнивали с β-актином. Денситометрические кривые (фиг. 20B) показывали, что присутствие MUC16 на клеточной поверхности стабилизировало EGFR в сравнении с контрольным вектором phrGFP. Для того чтобы исключать возможность того, что этот эффект связан с выбором SKOV3-стабильных MUC16 клонов, использовали тетрациклин-индуцибельную MUC16 систему. Как показано на фиг. 20C, воздействие тетрациклина в течение 24 часов не оказывало эффекта на инвазию матригеля или контрольными клетками SKOV3, трансфицированными пустым вектором phrGFP, или стабильным MUC16 экспрессирующим вектором с под управлением CMV. В MUC16 тетрациклин-индуцибельной системе воздействие тетрациклина индуцировало MUC16-зависимую инвазию матригеля, схожую со стабильными трансфектантами, как контрольными, так и MUC16. Требование к EGFR исследовали через стабильную экспрессию конструкции shRNA (shEGFR), вводимой в клетки SKOV3, которая снижала экспрессию EGFR. Оба клона отдельных клеток для shEGFR-трансфицированных клеток демонстрировали заметно сниженную инвазию матригеля. Тетрациклин-индуцированная экспрессия MUC16 в этих двую shEGFR клеточных линиях оказывала минимальный эффект на инвазию матригеля по сравнению с SKOV3-MUC16 клеточными линиями, подтверждая, что SKOV3-MUC16-индуцированная инвазия матригеля была созависимой от экспрессии EGFR. Стабильность EGFR в тетрациклин-индуцированном SKOV3-MUC16, обработанном CHX, исследовали посредством вестерн-блоттинга и сравнивали с β-актином. Как показано на фиг. 20D, воздействие CHX в течение 24 часов вело к устойчивому спаду общего белка EGFR в не индуцированных MUC16(-) клетках SKOV3. Когда тот же эксперимент осуществляли после тетрациклиновой индукции SKOV3-MUC16(tet) клеток, CHX-индуцированный уровень утраты EGFR был снижен. MUC16 не только стабилизировал содержание EGFR в клетках, он также стабилизировал уровни экспрессии pEGFR в тетрациклин-индуцированных SKOV3-MUC16(tet) клетках по сравнению с не индуцированными SKOV3-MUC16(tet) клетками (фиг. 21).
6.3.11.2 Синтез гомогенных N-гликопептидов в качестве имитаторов эпитопов для разработки моноклональных антител (mAb)
c114
c114
c114
2
[00630] Идентифицировав N-гликозилирование в участках N24 и N30 в MUC16 в качестве центрального требования для действия MUC16, анализировали гликановый профиль мутированного гликопептида MUC16, содержащего мутации аланина в аспарагин в N1 и N24, который очищали от клеточной линии SKOV3-MUC16 (фиг. 22). Этот очищенный гликопептид, таким образом, содержал один остаток аспарагина (N30) для N-гликозилирования. Анализ гликома очищенного гликопептида представлен на фиг. 22A. Его характеристики определяли с помощью паттерна разнообразного N-гликозилирования, содержащего главным образом усеченные гликозилированные соединения, которые имели общий проксимальный дисахарид хитобиозу (GlcNAc) в качестве минимального повторяющегося звена, к которому прикрепляют фукозные и различные маннозные остатки (фиг. 22A).
[00631] Предложена гипотеза о том, что антитела, нацеленные на эпитоп MUC-16-эктодомена, содержащий ключевой участок гликозилирования N30, могут ингибировать взаимодействие MUC16 с галектиновым каркасом, снижая нежелательные эффекты экспрессии MUC16, включая опухолевый рост и инвазию. Таким образом, конструировали синтетические пептидные антигены различной длины (т. е., 55, 18 и 15 аминокислоты в длину; SEQ ID №№ 129, 131 и 130, соответственно) в эктодомене MUC16, гликозилированные хитобиозой по этому участку N30. Помимо того, что она представляет собой минимальный мотив, общий для более крупных, более сложных N-гликанов, дисахарид хитобиоза также должен быть способен к улучненной экспозиции подлежащего пептида для того, индуцировать антитела, направленные на гликан, которые сохраняют пептидную специфичность.
2
3
2
[00632] Синтез N-гликопептидного 55-мера MUC16-эктодомена (GlcNAc-55-мер; SEQ ID № 129) был очень конвергентным и включал соединение между полноразмерным пептидом (55-мером), защищенным в целях удобства, и амином хитобиозы, после чего следовало кислое глобальное снятие защитных групп с использованием процедуры аспартилирования/снятия защитных групп авторов изобретения в одной колбе (см. разделы 6.2 и 6.4 и источники 7 и 20 в разделе 6.3.13, далее). Придерживаясь схожего подхода, с помощью конвергентного аспартилирования, также получали более сложный ManGlcNAc-гликопептидный 55-мер, несущий концевой гликан триманнозу.
[00633] Для того чтобы фокусировать иммунный ответ против эпитопа меньшего размера около релевантного участка гликозилирования, также синтезировали более короткие гликопептидные 15-мер и 18-мер, несущие один (N30) и два хитобиозных гликана (N24 и N30), соответственно (фиг. 22C; SEQ ID №№ 131 и 130, соответственно), последний по аналогии с кластерным представлением антигена Tn (GalNAc-α-O-Ser/Thr), который, как показано, необходим для связывания с некоторыми mAb (см. разделы 6.2 и 6.4 и источники 14-16 в разделе 6.3.13, далее). Эти гликопептиды затем конъюгировали с белком-переносчиком KLH через N-концевой цистеин для того, чтобы генерировать соответствующие иммуногены для вакцинации мышей.
6.3.11.3 Вакцинация мышей синтетическими гликопептидами/гликоконъюгатами и серологический анализ
2
2
2
2
2
[00634] Вакцинацию мышей и сбор сывороток осуществляли в соответствии с протоколом, описанным в разделах 6.2 и 6.4. После 3 иммунизаций GlcNAc-гликопептидным 55-мером (SEQ ID № 129, фиг. 22B), за которыми следовала иммунизация равной смесью несущих хитобиозу, KLH-конъюгированных конструкций (моногликозилированный 15-мер (SEQ ID № 131) и бис-гликозилированный 18-мер (SEQ ID № 130)), только 2 из 10 мышей демонстрировали слабые положительные ELISA сигналы к обоим 55-мерам (с и без GlcNAc (SEQ ID № 129)), что подсказывает, что мыши имели ограниченный иммунный ответ на иммунизации 55-мерами. Две дополнительные реиммунизации с использованием обоих KLH-конъюгатов (GlcNAc-15-мер (SEQ ID № 131) и (GlcNAc)-18-мер (SEQ ID № 130)) вели к усиленным иммунным ответам (типа IgG) на более короткие гликопептиды, в частности, у двух мышей (мышь 7 и мышь 8). mAb 4H11, направленное на другую, не гликозилированную часть пептидного остова MUC16, не демонстрировало связывание с гликопептидными 15-мером/18-мером, что указывает на определенный распознаваемый эпитоп отдельно от положительности сывороток мышей.
c114
c114
[00635] Характеристики поликлональной сыворотки от мыши 7 дополнительно определяли с помощью ELISA, и с помощью FACS проводили скрининг нескольких клеточных линий с экспрессией MUC16 и без нее. Эти исследования по сортировке клеток подтверждали положительные сигналы как для клеток SKOV3-MUC16, так и для клеток OVCAR3, подобно контрольному антителу 4H11 против MUC16 (см. источник 6 в разделе 6.3.13, далее). Контрольные клетки SKOV3-phrGFP, не имеющие MUC16, были отрицательными по связыванию с сывороткой мыши 7.
6.3.11.4 Отбор mAb, направленных на гликозилирование
2
2
2
[00636] Получали селезенку мыши 7 и спленоциты сливали с гибридомным партнером слияния с высокой эффективностью слияния. Супернатанты отбирали и осуществляли их скрининг по реактивности с помощью ELISA против индивидуальных гликопептидов (фиг. 22C). Несмотря на то, что несколько супернатантов реактивны к гликопептидным GlcNAc-15-меру и (GlcNAc)-18-меру, ни один из гибридомных супернатантов, скрининг которых осуществляли, не демонстрировал высокую степень избирательности к гликозилированным относительно не гликозилированных пептидов в ELISA скрининге. Сохранялась специфичность к MUC16 и ни один из положительных супернатантов не был реактивен к нерелевантным пептидам, гликозилированным хитобиозой. Не наблюдали перекрытия с пептидной последовательностью, распознаваемой mAb 4H11.
[00637] После серийного субклонирования, процесс давал несколько первичных mAb, направленных на хитобиозу, которые реактивны с MUC16-гликозилированными эпитопами и гомологичными не гликозилированными последовательностями, но не несущими хитобиозу нерелевантными пептидами, служащими в качестве отрицательного контроля. Из этого пула отбирали четыре антитела с высокой аффинностью, и дополнительно очищали их для определения характеристик.
6.3.11.5 Определение характеристик mAb, нацеленных/направленных против N30-гликозилированного MUC16
3
2
2
[00638] Результаты подтверждающих исследований по определению характеристик для четырех репрезентативных антител представлены с помощью ELISA на фиг. 23A. Связывание кандидатных антител с различными синтетическими пептидами оценивали и сравнивали со связыванием антитела 4H11, которое распознает пептидный остов MUC16-эктодомена. Не родственные пептиды, связанные с хитобиозой, не демонстрировали значимого связывания каким-либо из выбранных антител против гликан-MUC16. Все кандидатные антитела демонстрировали схожие аффинности связывания с обоими 15-мерами, происходящими из MUC16 (т. е. не гликозилированным пептидом и соответствующим хитобиозным гликопептидом). Дополнительные синтетические гликопептиды, несущие фрагменты альтернативных сахаров, в том числе один GlcNAc, концевую триманнозу-хитобиозу (ManGlcNAc) и фукозилированную хитобиозу (GlcNAcFuc), по существу не изменяли реактивность антител к пептидам MUC16, связанным с хитобиозой, которые использовали для иммунизации.
c114
c344
c114
N24c114
N30c114
N1-N24-N30c114
c114
N24c114
N30c114
N1-N24-N30c114
[00639] Каждое антитело также тестировали на специфичности к гликан-MUC16 и гликан-MUC16 на расширенной панели клеточных линий, экспрессирующий по-разному гликозилированные пептиды MUC16 (таблица 11). В этих исследованиях SKOV3-phrGFP трансфектанты сравнивали с SKOV3-MUC16 (полное N-гликозилирование), мутантами SKOV3-MUC16 (без участка гликозилирования N24), SKOV3-MUC16 (без участка гликозилирования N30) и SKOV3-MUC16 (без участков гликозилирования N1, N24 или N30). SKOV3-MUC16 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим усеченную форму MUC16, который способен к N-гликозилированию по N1, N24 и N30. SKOV3-MUC16 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим усеченную мутантную форму MUC16, в которой положение аминокислоты, соответствующей Asn1800 из SEQ ID № 150, содержит мутацию аспарагина в аланин, и, таким образом, не способной к N-гликозилированию в этом положении. SKOV3-MUC16 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим усеченную мутантную форму MUC16, в которой положение аминокислоты, соответствующее Asn1806 из SEQ ID № 150, содержит мутацию аспарагина в аланин, и, таким образом, не способной к N-гликозилированию в этом положении. SKOV3-MUC16 относится к клеткам SKOV3, экспрессирующим усеченную мутантную форму MUC16, в которой положения аминокислот, соответствующие Asn1777, Asn1800 и Asn1806 из SEQ ID № 150, содержат мутации аспарагина в аланин, и, таким образом, не способную к N-гликозилированию в этих положениях. Как и в случае данных ELISA, результаты показывали, что имела место MUC16-специфичная нацеленность.
c114
c344
[00640] Однако, в отличие от данных ELISA, утрата обоих участков гликозилирования N24 и N30 в эктодомене MUC16 снижала реактивность антител, нацеленных на гликозилирование, тогда как реактивность антитела 4H11 сохранялась, тем самым подтверждая присутствие SKOV3-MUC16 на клеточной поверхности. Клетки, несущие C-концевую цепь MUC16, продленную до 344 аминокислот (например SKOV3-MUC16), также имели схожее требование к гликозилированию N24 или N30 (таблица 11). Кроме того, реактивность антител против эктодомена гликан-MUC16 не уменьшалась за счет понижающей регуляции MGAT5 (таблица 11), что подтверждает, что хитобиоза в участках N24/N30 вносит вклад в связывание антитела с целыми клетками, независимо от более сложного ветвления.
2
2
c114
c344
[00641] Таблица 11. В таблице 11 приведено геометрическое среднее флуоресценции фикоэритрина (PE) из 4H11 и четырех моноклональных антител к эктодомену GlcNAc-MUC16 при SKOV3-MUC16 трансфекции с модификациями участков N-гликозилирования. 4H11 сохраняет связывание со всеми клеточными линиями (за исключением линии SKOV3-phrGFP, которая не экспрессирует MUC16), независимо от модификации гликозилирования, таким образом подтверждая белок MUC16 на клеточной поверхности. При утрате обоих участков гликозилирования N24 и N30 имело место снижение связывания антител к гликан-MUC16 для обоих MUC16 и MUC16 трансфектантов. Ограниченная утрата реактивности к клеточной линии с MGAT5 нокдауном подтверждала, что хитобиоза важна для каждого антитела к эктодомену GlcNAc-MUC16, тогда как более обширное ветвление имело ограниченный эффект.
Антитела против эктодомена гликозилированного MUC16
Только клетки
G против M IgG2a-PE
G против M IgG2b-PE
4H11+G против M IgG2b-PE
18C6+G против M IgG2b-PE
10C6+G против M IgG2a-PE
19C11+G против M IgG2a-PE
7B12+G против M IgG2a-PE
SKOV3-phrGFP
46
50
57
77
56
70
77
80
SKOV3-c114
56
74
104
1124
2054
571
617
492
SKOV3-N24 mutc114
43
62
78
2654
1830
435
486
471
SKOV3-N30 mutc114
49
65
90
696
1696
645
536
444
SKOV3-N24N30 mutc114
125
142
155
655
461
264
236
185
SKOV3-N1-N24-N30mutc114
37
50
71
514
34
74
61
82
SKOV3-shMGAT5-c114
108
133
145
2384
855
645
525
289
SKOV3-c344
53
66
68
559
1652
792
578
422
SKOV3-N24mutc344
89
102
64
574
1569
991
661
512
SKOV3-N30mutc344
93
104
47
661
1064
687
454
440
SKOV3-N24-N30mutc344
80
161
140
765
277
231
195
220
«G против M» относится к антителу козы против мыши. «PE» относится к фикоэритрину.
c114
c114
c114
c114
c114
c344
c114
c344
c344
[00642] Четыре репрезентативных антитела к гликозилированному MUC16 (18C6, 10C6, 19C11, 7B12), характеристики которых определяли, оценивали вместе с 4H11 на аффинность связывания (таблица 12) и их эффект, оказываемый на инвазию посредством матригелевого анализа с SKOV3-MUC16 трансфектантами. Как показано на фиг. 23B-23D, новые разработанные антитела демонстрировали обширное ингибирование инвазии матригеля, тогда как 4H11 отличался своей неспособностью блокировать опосредованную SKOV3-MUC16 инвазию, что указывает на то, что эти антитела, нацеленный на эпитопы гликозилированного пептида в эктодомене MUC16, ингибировали некоторые из ключевых биологических свойств MUC16 лучше, чем антитела, нацеленные на близко смежные эпитопы. Все антитела к гликозилированному MUC16 были ингибирующими в клетках раке яичника, экспрессирующих нативный полноразмерный MUC16, таких как клетки CAOV3 и OVCA-433. Это подсказывает, что участки гликозилирования N24/N30 критичны для усиленных инвазивных свойств MUC16, тогда как присутствие других участков N- и O-гликозилирования MUC16 было недостаточным для преодоления блокирования антителом к гликозилированному MUC16 этого критичного эпитопа. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, можно предсказать, что ингибирование антителом N24/30 связывания галектина-3 с MUC16 также будет ослаблять стабилизацию EGFR на клеточной поверхности. На фиг. 23B-23D показано, что когда одно из этих антител (10C6) вводили в клеточную культуру, преодолевали эффект стабилизации EGFR от тетрациклин-индуцированного SKOV3-MUC16(tet), и степень утраты EGFR в обработанных CHX клетках схож с таковым у не индуцированных SKOV3-MUC16(tet) клеточных линий без экспрессии MUC16. Иммуногистохимическое окрашивание антителами также исследовали в тканевых микропанелях раке яичников. Как показано на фиг. 23E, каждое из антител, направленных на гликан, к эктодомену MUC16 связывалось с клетками серозной раке яичника в фиксированной парафином ткани с ограниченным взаимодействием с другой стромальной тканью, подобно поведению 4H11. Наконец, у мышей с ослабленным иммунитетом тестировали эффект антитела 10C6, оказываемый на рост SKOV3-MUC16344. Клетки SKOV3-MUC16 использовали вместо клеток SKOV3-MUC16 в качестве более строгого теста эффекта антитела в MUC16-положительных опухолевых клетках с несколькими участками N- и O-гликозилирования. Антитело 10C6 снижало инвазию матригеля MUC16 клетками (фиг. 23F) и значительно снижало рост опухолевых клеток SKOV3-MUC16 в боку мыши при введении мышам-опухоленосителям два раза в неделю (фиг. 23G).
[00643] Таблица 12.
Антитело
k<sub>d</sub> [1/с]
Ошибка в k<sub>d</sub> [1/с]
k<sub>a</sub> [1/с]
kD [нМ]
10C6.E4
*
--
**
>1000
19C11.H6
2,42×10<sup>-3</sup>
2,35×10<sup>-3</sup>
3,80×10<sup>-4</sup>
63,7
7B12.B3
1,04×10<sup>-3</sup>
1,09×10<sup>-4</sup>
7,50×10<sup>-4</sup>
13,8
18C6.D12
6,78×10<sup>-4</sup>
1,83×10<sup>-4</sup>
6,14×10<sup>-4</sup>
11,1
4H11
--
--
--
--
* низкая достоверность вычисления, без подгонки для скорости диссоциации;
a
** k слишком низка для определения скорости ассоциации.
6.3.11.6 Галектин-зависимая совместная локализация MUC16 и других белков клеточной поверхности
c57-114
c57-114
c57-114
c344
c114
c57-114
c114
[00644] MUC16-стабилизированный EGFR, по-видимому, является важным драйвером инвазии клеток раке яичника, и это взаимодействие зависит от EGFR, надлежащим образом N-гликозилированного эктодомена белка MUC16 и присутствия галектина-3. Это взаимодействие оценивали с использованием очищенных белков для того, чтобы устанавливать необходимое/достаточное трехстороннее взаимодействие между этими тремя белками. С этой целью, использовали очищенный белок MUC16-pFUSE (полученный в эмбриональных клетках почки человека [HEK] FreeStyle 293F) (в качестве MUC16 стороны взаимодействия), очищенный белок EGFR (полученный с помощью клеток HEK293) и очищенный галектин-3 (LGALS3; полученный с помощью клеток HEK293). Поскольку эти белки получали в клетках человека, ожидали, что они несут типичные нативные гликозилированные соединения. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предложена гипотеза о том, что три белка будут формировать гетеромеры, которые можно идентифицировать посредством иммунокопреципитации. На фиг. 24A проиллюстрированы результаты этой иммунокопреципитации, в которой каждый из трех обнаруженных белков показан в прямом иммуноблоте на трех левых дорожках. Используя гранулы Agarose Protein A/G PLUS, можно видеть, что белок MUC16-pFUSE связывался с Protein A/G PLUS-конъюгированными гранулами и присутствовал в элюате при разделении на SDS-PAGE геле. EGFR присутствовал только в объединенном элюате с MUC16-pFUSE, когда галектин-3 (LGALS3) также присутствовал. Антитело 18C6 устраняло взаимодействие EGFR-MUC16 посредством блокирования N-гликозилированного сайта связывания галектина-3 (см. фиг. 24A). Прямую молекулярную двойную иммунофлуоресцентную визуализацию также использовали для того, чтобы подтверждать совместную локализацию EGFR и MUC16 в живых клетках. Как показано на фиг. 24B и фиг. 25A, EGFR и MUC16 тесно совместно локализованы в клеткахOVCAR3, SKOV3-MUC16 и SKOV3-MUC16 (см. стрелки на фиг. 24B и 25A). Эти исследования убедительно подтверждали, что MUC16 объединяется с галектином-3 для ассоциации с EGFR на поверхности MUC16-положительных клеток раке яичника. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, поскольку многие усиливающие рост рецепторы гликозилированы, пришли к выводу, что лектин-зависимые эффекты MUC16 клеточной поверхности могут включать другие N-гликозилированные белки и не ограничиваться EGFR. Белки интегрины часто изменены в злокачественных опухолях и участвуют в передаче сигналов «снаружи-внутрь», которые инициированы стромально-эпителиальными взаимодействиями, запускающими SRC фосфорилирование и другие эффекты ниже по каскаду. На фиг. 24C изображены взаимодействия MUC16 с интегрином β1, компонент интегрина часто связан с развитием и прогрессированием раке. Как в случае EGFR, очищенный MUC16-pFUSE связывался с интегрином β1 галектин-3-зависимым образом, и это гетеротримерное взаимодействие требовало всех 3 белков. Как и в случае EGFR, взаимодействие полностью блокировалось блокирующим антителом 18C6 против участка гликозилирования MUC16. Совместную локализацию MUC16 и интегрина β1 также подтверждали посредством двойной иммунофлуоресценции в нескольких клеточных линиях рака яичников (фиг. 24D и фиг. 25B). Таким образом, N-гликозилирование в ключевых участках на пептидных эпитопах эктодомена MUC16 опосредовало взаимодействие с белковыми рецепторами клеточной поверхности лектин-специфичным образом для того, чтобы создавать характеристики озлокачествленного поконтроля, включая инвазию матригеля, активацию путей PI3K/ERK и SRC, а также усиленный MUC16-положительный опухолевый рост у мышей с ослабленным иммунитетом.
[00645] Без ограничения каким-либо конкретным механизмом, механистическая модель для муцина, связанного со злокачественной опухолью, MUC16, и его эффекта, оказываемого на поведение клеток раке яичника, представлена на фиг. 26. На фиг. 26A MUC16 связывается с EGFR и интегрином β1 через галектин-3 для того, чтобы усиливать стабильность и сигналы «изнутри-наружу», которые содействуют росту и инвазии. Когда мутированы участки N-гликозилирования эктодомена MUC16 или супрессирована активность MGAT5 (фиг. 26B), связывание предотвращено и сигналы EGFR/интегрин ослаблены. Аналогичным образом, если сурпессирована экспрессия белка галектина-3 (фиг. 26C), молекулярная ассоциация утрачена, а сигналы и инвазия ослаблены. Наконец, когда химерные антитела к эктодомену MUC16 или химерные «TRAP» LGALS3 молекулы препятствуют молекулярному взаимодействию, клетка раке испытывает недостаток каких-либо из наблюдаемых свойств MUC16, способствующих опухоли (фиг. 26D).
6.3.12 ОБСУЖДЕНИЕ
[00646] MUC16 и другие связанные муцины, такие как MUC1 и MUC4, могут трансформировать клетки 3T3 и связаны с нежелательными исходами. Механизмы аберрантно экспрессируемых муцинов в раке сложны и разнообразны. Точно описано, что паттерны N-гликозилирования играют важные роли в росте клеток в ответ на локальное окружение. На разнообразие гликопротеиновых паттернов влияет зависящий от окружения поток гексозаминов через гликозилирование, основанное на аппарате Гольджи. Обычные рецепторы факторов роста, такие как EGFR, рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF1R) и PDGFR, предпочтительно сначала подвергаются гликозилированию зависимым от питательных веществ образом, и эти сильно гликозилированные рецепторы предпочтительно доставляются на клеточную поверхность. В отличие от этого, ингибирующие рецепторы, такие как TGF-β, имеют меньше участков N-гликозилирования, и их представление на клеточной поверхности происходит позже, с последующим ингибированием программы роста (см. источник 12 в разделе 6.3.13, далее). В раке яичников экспрессия EGFR связана с инвазивным поведением и передача сигналов EGFR зависит от состояния гликозилирования рецепторов и аффинности N-гликозилированных соединений к лектинам (см. источник 2 в разделе 6.3.13, далее). Фермент MGAT5, по-видимому, является ключевым для синтеза тетраантенных разветвленных N-гликанов, которые обладают наивысшей аффинностью к галектину-3, важному лектину, сверхэкспрессированному в клетках раке (см. источник 17 в разделе 6.3.13, далее).
c114
c114
[00647] В этом примере приведено доказательство того, что поведение, связанное с экспрессией MUC16, опосредовано через эти процессы на конкретных участках N-гликозилирования на наиболее проксимальной области эктодомена MUC16 относительно клеточной поверхности. MGAT5-зависимые паттерны N-гликозилирования необходимы для высокоаффинного взаимодействия с галектином-3 и белками клеточной поверхности, чтобы способствовать инвазии, активации онкогена и повышенному опухолевому росту у мышей с ослабленным иммунитетом. В частности, N-гликозилирование в самых проксимальных участках на остающемся эктодомене MUC16 после отщепления критически важно для этого взаимодействия. Все вмешательства, которые удаляли эти участки N-гликозилирования, блокировали участки с использованием имитационных рецепторов или препятствовали их полному N-гликозилированию, ослабляли трансформирующие эффекты MUC16. Эти трансформирующие эффекты, похоже, зависят не только от одного MUC16, но также от взаимодействия N-гликозилированного MUC16 с галектином-3 и другими белками клеточной поверхности в проксимальных участках N-гликозилирования. Показано, что экспрессия эктодомена MUC16 стабилизировала EGFR, медиатор роста и инвазии, и продлевала его присутствие на поверхностях SKOV3-MUC16 клеток, по сравнению с исходными клетками SKOV3phrGFP. Даже в упрощенной модели гликопептида MUC16, сохраняющей только один участок N-гликозилирования, стохастический характер гликозилирования вел к присутствию различных N-гликанов, все из который связаны с белковым остовом MUC16 через общий стебель хитобиозы. Таким образом, получали антитела против связанного с хитобиозой эпитопа гликан-пептида MUC16 (в участках N24/N30) эктодомена MUC16. Эти новые антитела (антитела к гликозилированному MUC16) блокировали усиленную MUC16 инвазию, активацию онкогена и опухолевый рост in vivo. Что важно, эти антитела к гликозилированному MUC16 ингибировали связанные с MUC16 свойства в клетках с полноразмерной экспрессией MUC16, а также тестовых усеченных конструкций с экспрессией более короткого C-конца MUC16. Антитела к гликозилированному MUC16 препятствовали стабилизации EGFR клеточной поверхности раке яичников в присутствии CHX и ослабляли рост трансплантата у голых мышей. Кроме того, эффект антител к гликозилированному MUC16 также предотвращал взаимодействие очищенного MUC16 с очищенным EGFR или интегрином β1 в присутствии рекомбинантного галектина-3.
[00648] В этом примере раскрыты идеи о роли сверхэкспрессии муцина в раке. Через формирование лектин-опосредованных низкоаффинных мультимолекулярных комплексов, MUC16 способен усиливать сигнальную трансдукцию «снаружи-внутрь» зависимым от гликозилирования образом. Конкретные участки N-гликозилирования, отвечающие за максимальный эффект, уникальны и близки к клеточной поверхности, тогда как другие, более дистальные участки N-гликозилирования могли быть менее важными. Ингибиторы галектина-3 проходят клинические испытания, но конструкция имитационного рецептора «галектин-3-TRAP» или усеченные «MUC16-TRAP» молекулы имели схожий эффект в моделях in vitro из этого примера. Антитела к гликозилированному MUC16, идентифицированные в этом примере, ингибировали трансформирующие эффекты MUC16.
6.3.13 ИСТОЧНИКИ
[00649] 1. Ahmad, N., Gabius, H. J., Andre, S., Kaltner, H., Sabesan, S., Roy, R., Liu, B., Macaluso, F., and Brewer, C. F. (2004). Galectin-3 precipitates as a pentamer with synthetic multivalent carbohydrates and forms heterogeneous cross-linked complexes. J Biol Chem 279, 10841-10847.
[00650] 2. Alper, O., Bergmann-Leitner, E. S., Bennett, T. A., Hacker, N. F., Stromberg, K., and Stetler-Stevenson, W. G. (2001). Epidermal growth factor receptor signaling and the invasive phenotype of ovarian carcinoma cells. J Natl Cancer Inst 93, 1375-1384.
[00651] 3. Bast, R. C., Jr., Feeney, M., Lazarus, H., Nadler, L. M., Colvin, R. B., and Knapp, R. C. (1981). Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. The Journal of clinical investigation 68, 1331-1337.
[00652] 4. Burton, D. R., and Mascola, J. R. (2015). Antibody responses to envelope glycoproteins in HIV-1 infection. Nat Immunol 16, 571-576.
[00653] 5. Dharma Rao, T., Park, K. J., Smith-Jones, P., Iasonos, A., Linkov, I., Soslow, R. A., and Spriggs, D. R. (2010). Novel monoclonal antibodies against the proximal (carboxy-terminal) portions of MUC16. Appl Immunohistochem Mol Morphol 18, 462-472.
[00654] 6. Fernandez-Tejada, A., Vadola, P. A., and Danishefsky, S. J. (2014). Chemical synthesis of the β-subunit of human luteinizing (hLH) and chorionic gonadotropin (hCG) glycoprotein hormones. J Am Chem Soc 136, 8450-8458.
[00655] 7. Granovsky, M., Fata, J., Pawling, J., Muller, W. J., Khokha, R., and Dennis, J. W. (2000). Suppression of tumor growth and metastasis in Mgat5-deficient mice. Nat Med 6, 306-312.
[00656] 8. Hirabayashi, J., Hashidate, T., Arata, Y., Nishi, N., Nakamura, T., Hirashima, M., Urashima, T., Oka, T., Futai, M., Muller, W. E., et al. (2002). Oligosaccharide specificity of galectins: a search by frontal affinity chromatography. Biochim Biophys Acta 1572, 232-254.
[00657] 9. Hollingsworth, M. A., and Swanson, B. J. (2004). Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat Rev Cancer 4, 45-60.
[00658] 10. Lajoie, P., Partridge, E. A., Guay, G., Goetz, J. G., Pawling, J., Lagana, A., Joshi, B., Dennis, J. W., and Nabi, I. R. (2007). Plasma membrane domain organization regulates EGFR signaling in tumor cells. J Cell Biol 179, 341-356.
[00659] 11. Lau, K. S., Partridge, E. A., Grigorian, A., Silvescu, C. I., Reinhold, V. N., Demetriou, M., and Dennis, J. W. (2007). Complex N-glycan number and degree of branching cooperate to regulate cell proliferation and differentiation. Cell 129, 123-134.
[00660] 12. Mascola, J. R., and Haynes, B. F. (2013). HIV-1 neutralizing antibodies: understanding nature's pathways.Immunol Rev 254, 225-244.
[00661] 13. Mazal, D., Lo-Man, R., Bay, S., Pritsch, O., Deriaud, E., Ganneau, C., Medeiros, A., Ubillos, L., Obal, G., Berois, N., et al. (2013). Monoclonal antibodies toward different Tn-amino acid backbones display distinct recognition patterns on human cancer cells. Implications for effective immuno-targeting of cancer. Cancer Immunol Immunother 62, 1107-1122.
[00662] 14. Nakada, H., Inoue, M., Numata, Y., Tanaka, N., Funakoshi, I., Fukui, S., Mellors, A., and Yamashina, I. (1993). Epitopic structure of Tn glycophorin-a for an anti-Tn antibody (Mls-128). Proc Natl Acad Sci USA 90, 2495-2499.
[00663] 15. Osinaga, E., Bay, S., Tello, D., Babino, A., Pritsch, O., Assemat, K., Cantacuzene, D., Nakada, H., and Alzari, P. (2000). Analysis of the fine specificity of Tn-binding proteins using synthetic glycopeptide epitopes and a biosensor based on surface plasmon resonance spectroscopy. FEBS Lett 469, 24-28.
[00664] 16. Partridge, E. A., Le Roy, C., Di Guglielmo, G. M., Pawling, J., Cheung, P., Granovsky, M., Nabi, I. R., Wrana, J. L., and Dennis, J. W. (2004). Regulation of cytokine receptors by Golgi N-glycan processing and endocytosis. Science 306, 120-124.
[00665] 17. Rao, T. D., Rosales, N., and Spriggs, D. R. (2011). Dual-fluorescence isogenic high-content screening for MUC16/CA125 selective agents. Mol Cancer Ther 10, 1939-1948.
[00666] 18. Rao, T. D., Tian, H., Ma, X., Yan, X., Thapi, S., Schultz, N., Rosales, N., Monette, S., Wang, A., Hyman, D. M., et al. (2015). Expression of CARboxy-terminal portion of MUC16/CA125 induces transformation and tumor invasion. PLoS One 10, e0126633.
[00667] 19. Strausberg, R. L., Feingold, E. A., Grouse, L. H., Derge, J. G., Klausner, R. D., Collins, F. S., Wagner, L., Shenmen, C. M., Schuler, G. D., Altschul, S. F., et al. (2002). Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 99, 16899-16903.
[00668] 20. Wang, P., Aussedat, B., Vohra, Y., and Danishefsky, S. J. (2012). An advance in the chemical synthesis of homogeneous N-linked glycopolypeptides by convergent aspartylation. Angew Chem Int Edit 51, 11571-11575.
[00669] 21. Yin, B. W., Dnistrian, A., and Lloyd, K. O. (2002). Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int J Cancer 98, 737-740.
[00670] 22. Yin, B. W., and Lloyd, K. O. (2001). Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem 276, 27371-27375.
6.4 ПРИМЕР 4: ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ХИМИЧЕСКАЯ ИНФОРМАЦИЯ
[00671] В этом примере предоставлены (a) более подробное описание определенных используемых способов и экспериментов, описанных в примерах 2 и 3 (разделы 6.2 и 6.3); и (b) дополнительная информация по сравнению с примерами 2 и 3 (разделы 6.2 и 6.3).
6.4.1 ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
[00672] Все коммерчески доступные материалы (Aldrich, Fluka, Novabiochem) использовали без дополнительной очистки. Аминокислоты с N-α-Fmoc защитой, псевдопролиновые дипептиды, Oxyma Pure и смолу NovaSyn TG Sieber приобретали в Novabiochem. 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазолo[4,5-b]пиридиний 3-оксид гексафторфосфат (HATU) приобретали в Genscript. (7-азабензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфоний гексафторфосфат (PyAOP) приобретали в Oakwood Products, Inc. Октаацетат хитобиозы приобретали в Carbosynth Limited. Раствор TCEP (0,5 M, нейтральный pH) и гетеробифункциональныйлинкер sulfo-GMBS приобретали в Pierce, ThermoScientific. Все другие реактивы, включая гемоцианин морского блюдца (KLH) приобретали в Aldrich. Все растворители имели степень чистоты реактива или ВЭЖХ (Fisher Scientific). Безводный тетрагидрофуран, диэтиловый эфир, дихлорметан, толуол и бензол получали из системы для сухих растворителей (пропускали через колонку нейтрального оксида алюминия в атмосфере аргона) и использовали без дополнительной сушки.
1
13
[00673] Реакции осуществляли в атмосфере предварительно очищенного сухого аргона. Жидкости и растворы, чувствительные к воздуху и влаге, переносили через шприц. Подходящие углеводные реактивы сушили через азеотропное удаление воды с использованием толуола. Молекулярные сита активировали при 350°C и дробили непосредственно перед использованием, затем сушили в пламени под вакуумом. Органические растворы концентрировали при пониженном давлении посредством роторного испарения ниже 30°C. ЯМР спектры (H и C) регистрировали на спектрометре Bruker Advance DRX-600 MHz, и привязывали к TMS или остаточному растворителю. Масс-спектрометрический анализ низкого разрешения осуществляли с использованием масс-спектрометра JOEL JMS-DX-303-HF или масс-спектрометра Waters Micromass ZQ. Аналитическую TLC осуществляли на пластинках E. Merck silica gel 60 F254 и визуализировали под УФ светом (254 нм) или посредством окрашивания молибденатом церия аммония (CAM) или 5% серной кислотой в метаноле. Колоночную флэш-хроматографию на диоксиде кремния осуществляли on E. Merck 230-400 mesh silica gel 60.
6.4.1.1 UPLC/LC-MS анализ и очистка ВЭЖХ с обращенной фазой.
[00674] Все хроматографические разделения с обращенной фазой содержали подвижную фазу, состоящую из 0,05% трифторуксусной кислоты (TFA) (об./об.) в воде и 0,04% TFA в ацетонитриле. Мониторинг прогресса реакции осуществляли посредством UPLC-MS анализа на системе Waters Acquitytm Ultra Preformance Liquid Chromatography с фотодиодным детектором и одноквадрупольным детектором массы, оборудованной колонками Acquity UPLC BEH C18/C8/C4 (1,7 мкм, 2,1×100 мм), при скорости потока 0,3 мл/мин. Аналитические LC-MS анализы осуществляли на Waters 2695 Separations Module, оборудованном Waters 2996 Photodiode Array Detector, используя колонку Varian Microsorb C18 (150×2,0 мм), колонку Varian Microsorb C8/C4 (250×2,0 мм) или колонку Waters X-Bridge C18 (150×2,1 мм), при скорости потока 0,2 мл/мин. Препаративную ВЭЖХ очистку осуществляли на системе доставки растворителей Ranin HPLC, оборудованной детектором Rainin UV-1, используя колонку Agilent Dynamax Reverse Phase HPLC Microsorb C18/C8/C4 (250×21,4 мм) или колонку Waters X-Bridge C18 (150×19,0 мм), при скорости потока 16,0 мл/мин.
6.4.2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
6.4.2.1 Твердофазный синтез пептидов на основе Fmoc (SPPS)
[00675] Автоматизированный синтез пептидов осуществляли на CEM Liberty Microwave Peptide Synthesizer. Пептиды синтезировали по стандартным Fmoc протоколам на смоле NovaSyn TG Sieber. Деблокирующая смесь состояла из раствора Oxyma Pure (0,1 M) в 20% пиперидине/DMF. Использовали следующие Fmoc аминокислоты из Novabiochem: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Dmcp)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Asp(OPp)-OH, Fmoc-Asp(OAllyl)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Dmcp)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH. Использовали сдедующие Dmb (2,4-диметоксибензил) и псевдопролиновые дипептиды (Novabiochem): Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH, Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH, Fmoc-Phe-Thr(ψMe,MePro)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,MePro)-OH.
6.4.2.2 N-концевое ацетилирование пептид-смолы
2
2
[00676] По завершению автоматизированного синтеза в масштабе 0,1 ммоль, пептид-смолу смывали с использованием DMF (2 мл) в сосуд для синтеза пептидов и обрабатывали уксусным ангидридом (188 мкл, 2 ммоль) и DIEA (384 мкл, 2,2 ммоль) в DMF (2 мл). Смесь встряхивали посредством мягкого барботирования азота в течение 1 часа и затем промывали с использованием DMF и CHCl, прежде чем подвергнуть деаллилированию.
6.4.2.3 Деаллилирование боковой цепи аспарагиновой кислоты, Asp(OAllyl), на смоле
3
4
2
2
3
4
2
2
[00677] N-ацетилированный связанный со смолой пептид (0,1 моль) обрабатывали с использованием Pd(PPh) (7,5 мг, 6,5 мкмоль) и фенилсилана (75 мкл, 0,6 ммоль) в DMF/CHCl (4 мл, 1:1). После 20 минут мягкого барботирования азота обработку Pd(PPh)/фенилсиланом повторяли два раза. Затем пептид-смолу промывали с использованием DMF, CHCl и метанола и сушили под вакуумом.
6.4.2.4 Отщепление от смолы [и одновременное снятие защитных групп боковой цепи Asp(O-2-PhiPr), где применимо]
2
2
2
2
2
2
2
[00678] После сушки, на пептид-смолу воздействовали отщепляющим коктейлем (1% TFA/CHCl, 4 мл) 5 циклов×5 мин, и этот процесс process повторяли четыре раза. Дополнительные последовательности отщепления включали обработку с использованием 1,5% TFA/CHCl (4 мл 5 циклов×5 мин) и 2% TFA/CHCl (4 мл 5 циклов×5 мин). Соответствующие части отщепленного раствора индивидуально собирали в ледяном EtO и концентрировали. Соответствующие маслянистые остатки ресуспендировали в минимальном количестве трифторэтанола и преципитировали водой. Получаемые смеси незамедлительно лиофилизировали, чтобы получать неочищенные защищенные пептиды, несущие C-концевой амид.
6.4.2.5 Сочетание частично защищенного полноразмерного пептида (55-мера) с амином гликана через аспартилирование Лансбери, за которым следовало удаление неустойчивых к кислотам защитных групп с использованием коктейля R
3
2
3
[00679] Частично защищенный полноразмерный пептид (1,0 экв.) и амин гликана (хитобиоза: 4,0 экв.; ManGlcNAc 1,6 экв.) комбинировали и растворяли в безводном DMSO. В эту смесь добавляли свежий приготовленный раствор PyAOP (4,0 экв.) в DMSO, после чего следовал DIEA (6,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов и гасили добавлением 1 мл ледяной воды (0,05% TFA). Образованный осадок выделяли посредством центрифугирования, ресуспендировали в воде/CHCN (1:1, 0,05% TFA) и незамедлительно лиофилизировали.
2
3
[00680] Затем защищенный гликопептид подвергали глобальному кислотному снятию защитных групп посредством обработки коктейлем R (90% TFA, 5% тиоанизол, 3% этандитиол, 2% анизол) (1 мл) в течение 2 часов. Остаток осаждали ледяным EtO (12 мл) и получаемую суспензию центрифугировали для получения белого осадка. Супернатант декантировали и осадок растирали в порошок с ледяным диэтиловым эфиром (12 мл). Этот процесс повторяли всего три раза, и получаемый преципитат растворяли в воде/CHCN (1:1, 0,05% TFA) и лиофилизировали. Соответствующий неочищенный гликопептид очищали посредством ВЭЖХ с обращенной фазой.
6.4.2.6 Сочетание частично защищенных пептидов малых размеров (15- и 18-меров) с амином хитобиозы через аспартилирование Лансбери/двойное аспартилирование Лансбери, после чего следовало удаление неустойчивых к кислотам защитных групп
3
[00681] Частично защищенный пептид (1,0 экв.) и амин хитобиозы (3,0 экв./7,0 экв. для двойного аспартилирования Лансбери) объединяли и растворяли в безводном DMSO. В эту смесь добавляли свежий приготовленный раствор PyAOP (4 экв./6 экв. в последнем случае) в DMSO, после чего следовал DIEA (6 экв./8 экв., соответственно). Реакционную смесь перемешивали в течение 2,5 часа и гасили добавлением 1 мл ледяной воды (0,05% TFA). Образованный осадок выделяли центрифугированием, ресуспендировали в воде/CHCN (1:1, 0,05% TFA) и незамедлительно лиофилизировали.
2
2
3
[00682] Затем защищенный гликопептид подвергали глобальному кислотному снятию защитных групп посредством обработки TFA коктейлем (94% TFA, 2,5% HO, 2,5% EDT, 1% TIPSH) (1 мл) в течение 2 часов. Остаток преципитировали ледяным EtO (12 мл) и суспензию центрифугировали, чтобы получать осадок белого цвета. Супернатант декантировали и осадок растирали в порошок с ледяным диэтиловым эфиром (12 мл). Этот процесс повторяли всего три раза и получаемый преципитат растворяли в воде/CHCN (1:1, 0,05% TFA) и лиофилизировали. Соответствующий неочищенный гликопептид очищали посредством ВЭЖХ с обращенной фазой.
6.4.2.7 KLH-конъюгация с гликопептидными 15/18-мерами
[00683] KLH сначала инкубировали с гетеробифункциональным сшивателем sulfo-GMBS) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) pH 7 в течение 2 часов. Не конъюгированный сшиватель удаляли посредством эксклюзионной хроматографии (прохождение через тонкодисперсную колонку Bio-Gel P-10, соответственно) и затем получали активированный малеимидом KLH. Свежие (глико)пептиды со снятыми защитными группами, несущими, концевую тиоловую функциональность, смешивали с малеимид-содержащим KLH в PBS pH 7 и инкубировали при комнатной температуре в течение 6 часов. По истечении этого времени не вступивший в реакцию (глико)пептид удаляли с использованием центробежного фильтра Amicon Ultra-4 (порог молекулярной массы 50000). Наконец, соответствующие конъюгаты KLH получали в виде раствора в PBS.
6.4.3 СИНТЕЗ ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ ГЛИКОПЕПТИДОВ MUC16 (55-МЕРОВ)
6.4.3.1 Синтез полноразмерного гликопептида, несущего хитобиозу
2
2
[00684] По завершении автоматизированного синтеза в соответствии со способами в разделе 6.4.2.1, пептид-смолу подвергали N-ацетилированию и деаллилированию (см. раздел 6.4.2.2 и раздел 6.4.2.3, соответственно), чтобы предоставлять после отщепления от смолы (см. раздел 6.4.2.4) частично защищенный пептидный p55-мер[N1-S55], несущий свободную карбоновую кислоту на боковой цепи Asp30. Фракцию этого неочищенного пептида очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле, осуществляя элюирование с использованием 5→12% MeOH/CHCl, чтобы получать пептидный p55-мер[N1-S55] (70 мг) в виде твердого вещества белого цвета после лиофилизации. На фиг. 27A изображен амид N-ацетилированного пептидного 55-мера с защитой боковой цепи. На фиг. 27B изображены кривые ESI-MS и UV из UPLC анализа для гликопептидного p55-мера[N1-S55].
2
[00685] В соответствии с разделом 6.4.2.6, пептидный p55-мер[N1-S55] (20 мг, 2,0 мкмоль) и аномерный амин хитобиозы (GlcNAc) (3,5 мг, 8,1 мкмоль) объединяли и растворяли в безводном DMSO (100 мкл). Затем добавляли раствор PyAOP (4,3 мг, 8,1 мкмоль) в DMSO (30 мкл), после чего следовал DIEA (2,0 мкл, 12,2 мкмоль). Смесь золотисто-желтого цвета перемешивали в течение 3 часов, гасили посредством добавления 1 мл ледяной воды (0,05% TFA), замораживали и лиофилизировали.
2
2
2
[00686] Затем на защищенный гликопептид воздействовали коктейлем R (1,0 мл) в течение 2 часов, осаждали ледяным EtO, центрифугировали, ресуспендировали и лиофилизировали, как описано в разделе 6.4.2.6. Неочищенный пептид растворяли в 25% ацетонитриле/воде (0,05% TFA) (2 мл) и очищали посредством ВЭЖХ на колонке X-Bridge C18, используя линейный градиент 25-35% ацетонитрила в воде (0,05% TFA) в течение 30 минут. Фракции, содержащие желаемый продукт, который элюировали через 20 минут, собирали и лиофилизировали, чтобы предоставлять гликопептидный «55-мер(хитобиоза)[N1-S55]» (GlcNAc-55-мер) (3,0 мг, 22% выход) в виде твердого вещества белого цвета (фиг. 28A). На фиг. 28B предоставлены кривые ESI-MS и UV из UPLC анализа для гликопептидного «55-мер(хитобиоза)[N1-S55]» (GlcNAc-55-мер).
6.4.3.2 Синтез полноразмерного гликопептида, несущего пентасахарид
3
2
[00687] В соответствии с разделом 6.4.2.6, пептидный p55-мер[N1-S55] (10 мг, 1,0 мкмоль) и аномерный амин пентасахарида ManGlcNAc (1,5 мг, 1,6 мкмоль) объединяли и растворяли в безводном DMSO (30 мкл). Затем добавляли раствор PyAOP (2,1 мг, 4,1 мкмоль) в DMSO (5 мкл), после чего следовал DIEA (1,0 мкл, 6,1 мкмоль). Смесь золотисто-желтого цвета перемешивали в течение 3 часов, гасили добавлением 1 мл ледяной воды (0,05% TFA), замораживали и лиофилизировали.
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
[00688] Затем на защищенный гликопептид воздействовали коктейлем R (1,0 мл) в течение 2 часов, осаждали ледяным EtO, центрифугировали, ресуспендировали и лиофилизировали как описано в разделе 6.4.2.6. Неочищенный пептид растворяли в 25% ацетонитриле/воде (0,05% TFA) (2 мл) и очищали посредством ВЭЖХ на колонке X-Bridge C18, используя линейный градиент 25-35% ацетонитрила в воде (0,05% TFA) в течение 30 минут. Фракции, содержащие желаемый продукт, который элюировали через 18 минут, собирали и лиофилизировали, чтобы предоставлять гликопептидный «55-мер(ManGlcNAc)[N1-S55]» (ManGlcNAc-55-мер) (1,5 мг, 20% выход) в виде твердого вещества белого цвета. На фиг. 29A изображен ManGlcNAc-несущий гликопептидный 55-мер: «55-мер(ManGlcNAc)[N1-S55]» (ManGlcNAc-55-мер). На фиг. 29B изображены кривые ESI-MS и UV из аналитического ВЭЖХ анализа для гликопептида «55-мер(ManGlcNAc)[N1-S55]» (ManGlcNAc-55-мер).
6.4.4 СИНТЕЗ ГЛИКОПЕПТИДОВ МЕНЬШИХ РАЗМЕРОВ (15-МЕРА И 18-МЕРА)
6.4.4.1 Синтез моногликозилированного хитобиозой 15-мера
[00689] После завершения автоматизированного синтеза в соответствии с разделом 6.4.2.1, пептид-смолу подвергали N-ацетилированию и деаллилированию (см. раздел 6.4.2.2 и раздел 6.4.2.3, соответственно), чтобы предоставлять после отщепления от смолы (см. раздел 6.4.2.4) частично защищенный пептид p15-мер[C-G25-V38], несущий свободную карбоновую кислоту на боковой цепи Asp30 (соответствующем Asn1806 из SEQ ID № 150). Фиг. 30A. Этот пептид использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
2
2
2
2
[00690] Пептидный p15-мер[C-G25-V38] (10 мг, 3,8 мкмоль) и аномерный амин хитобиозы (GlcNAc) (4,8 мг, 11,3 мкмоль) объединяли и растворяли в безводном DMSO (80 мкл). Добавляли раствор PyAOP (5,9 мг, 11,3 мкмоль) в DMSO (20 мкл), после чего следовал DIEA (2,6 мкл, 15 мкмоль), и смесь золотисто-желтого цвета перемешивали в течение 2,5 часа, замораживали и лиофилизировали. Затем на защищенный гликопептид воздействовали TFA коктейлем (1 мл) в течение 2 часов, осаждали ледяным диэтиловым эфиром, центрифугировали, ресуспендировали и лиофилизировали в соответствии с разделом 6.4.2.6. Неочищенный пептид растворяли в 15% ацетонитриле/воде (0,05% TFA) (2 мл) и очищали посредством ВЭЖХ на колонке C18, используя линейный градиент 15-35% ацетонитрила в воде (0,05% TFA) в течение 30 минут. Фракции, содержащие желаемый продукт, который элюировали через 17 минут, собирали и лиофилизировали для того, чтобы предоставлять гликопептидный «15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38]» (GlcNAc-15-мер) (2,0 мг, 25% выход) в виде твердого вещества белого цвета. См. На фиг. 30B моногликозилированный хитобиозой гликопептидный 15-мер: 15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38] (GlcNAc-15-мер). На фиг. 3°C изображены кривые ESI-MS и UV из аналитического ВЭЖХ анализа для гликопептидного «15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38]» (GlcNAc-15-мер).
6.4.4.2 Синтез бис-гликозилированного хитобиозой 18-мера
[00691] После завершения автоматизированного синтеза в соответствии с разделом 6.4.2.1, пептид-смолу подвергали N-ацетилированию (см. 6.4.2.2). Затем отщепление от смолы и сопутствующее удаление защитных групп OPp осуществляли, следуя способам, изложенным в разделе 6.4.2.4, чтобы получать частично защищенный пептидный p18-мер[C-T22-V38], несущий свободную карбоновую кислоту на обеих боковых цепях Asp24 и Asp30 (соответствующих Asn1800 и Asn1806, соответственно, из SEQ ID № 150). Этот пептид использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. См. фиг. 32A.
2
2
2
2
2
2
2
[00692] Пептидный p18-мер[C-T22-V38] (30 мг, 9,1 мкмоль) и аномерный амин хитобиозы (GlcNAc) (27 мг, 63,4 мкмоль) объединяли и растворяли в безводном DMSO (150 мкл). Затем добавляли PyAOP (28,5 мг, 54,6 мкмоль) в DMSO (50 мкл), после чего следовал DIEA (2,6 мкл, 15 мкмоль), и смесь золотисто-желтого цвета перемешивали в течение 2,5 часа, замораживали и лиофилизировали. Затем на защищенный гликопептид воздействовали TFA коктейлем (1 мл) в течение 2 часов, осаждали ледяным диэтиловым эфиром, центрифугировали, ресуспендировали и лиофилизировали в соответствии с разделом 6.4.2.6. Неочищенный пептид растворяли в 15% ацетонитриле/воде (0,05% TFA) (6 мл) и очищали посредством ВЭЖХ на колонке C8, используя линейный градиент 15-27% ацетонитрила в воде (0,05% TFA) в течение 30 минут. Фракции, содержащие желаемый продукт, который элюировали через 15 минут, собирали и лиофилизировали для того, чтобы предоставлять гликопептидный «18-мер(хитобиоза)[C-T22-V38]» [(GlcNAc)-18-мер] (6,5 мг, 25% выход) в виде твердого вещества белого цвета. См. фиг. 32B. На фиг. 32C изображены кривые ESI-MS и UV из аналитического ВЭЖХ анализа для гликопептидного «18-мер(хитобиоза)[C-T22-V38]» [(GlcNAc)-18-мер].
6.5 KLH-КОНЪЮГАЦИЯ ГЛИКОПЕПТИДНЫХ 15-МЕРА И 18-МЕРА MUC16
2
2
2
2
[00693] Гликопептидные «15-мер(хитобиоза)[C-G25-V38]» и «18-мер(хитобиоза)[C-T22-V38]» конъюгировали с KLH, придерживаясь процедуры, изложенной в разделе 6.4.2.7, чтобы получать соответствующие конъюгаты KLH, GlcNAc-15-мер-KLH и (GlcNAc)-18-мер-KLH, соответственно. См. фиг. 33A и фиг. 33B.
7. ТАБЛИЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[00694] Таблица 13. Таблица последовательностей.
SEQ ID №
Название
Последовательность
1
10C6 VH
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTLGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPALKSRLTISKDSSKNQVFLKIANVDTADIATYYCSRIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS
2
10C6 VL
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKN
3
10C6 HCDR1 (KABAT)
TLGMGVG
4
10C6 HCDR2 (KABAT)
HIWWDDDKYYNPALKS
5
10C6 HCDR3 (KABAT)
IGTAQATDALDY
6
10C6 LCDR1 (KABAT)
RASKSVSTSGYSYMH
7
10C6 LCDR2 (KABAT)
LVSNLES
8
10C6 LCDR3 (KABAT)
QHIRELTRS
9
10C6 HCDR1 (CHOTHIA)
GFSLNTLGM
10
10C6 HCDR2 (CHOTHIA)
WDD
11
10C6 HCDR3 (CHOTHIA)
GTAQATDALD
12
10C6 LCDR1 (CHOTHIA)
SKSVSTSGYSY
13
10C6 LCDR2 (CHOTHIA)
LVS
14
10C6 LCDR3 (CHOTHIA)
IRELTR
15
10C6 HCDR1 (IMGT)
GFSLNTLGMG
16
10C6 HCDR2 (IMGT)
IWWDDDK
17
10C6 HCDR3 (IMGT)
SRIGTAQATDALDY
18
10C6 LCDR1 (IMGT)
KSVSTSGYSY
19
10C6 LCDR2 (IMGT)
LVS
20
10C6 LCDR3 (IMGT)
QHIRELTRS
21
7B12 VH
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTVGMGVGWSRQPSGKGLEWLAHIWWDDEDKYYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADSATYYCTRIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS
22
7B12 VL
DIVMTQAAPSVSVTPGESVSISCRSSKSLRKSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPLTFGGGTKLKIK
23
7B12 HCDR1 (KABAT)
TVGMGVG
24
7B12 HCDR2 (KABAT)
HIWWDDEDKYYNPALKS
25
7B12 HCDR3 (KABAT)
IGTAQATDALDY
26
7B12 LCDR1 (KABAT)
RSSKSLRKSNGNTYL Y
27
7B12 LCDR2 (KABAT)
YMSNLAS
28
7B12 LCDR3 (KABAT)
MQSLEYPLT
29
7B12 HCDR1 (CHOTHIA)
GFSLSTVGM
30
7B12 HCDR2 (CHOTHIA)
WDDE
31
7B12 HCDR3 (CHOTHIA)
GTAQATDALD
32
7B12 LCDR1 (CHOTHIA)
SKSLRKSNGNTY
33
7B12 LCDR2 (CHOTHIA)
YMS
34
7B12 LCDR3 (CHOTHIA)
SLEYPL
35
7B12 HCDR1 (IMGT)
GFSLSTVGMG
36
7B12 HCDR2 (IMGT)
IWWDDEDK
37
7B12 HCDR3 (IMGT)
TRIGTAQATDALDY
38
7B12 LCDR1 (IMGT)
KSLRKSNGNTY
39
7B12 LCDR2 (IMGT)
YMS
40
7B12 LCDR3 (IMGT)
MQSLEYPLT
41
19C11 VH
QVNLKESGPGKLQPSQTLSLTCSFSGFSLSTLGMGVGWIRQSSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPALKSRLTISRATSKNQVFLKIVNVGTADTATYYCARIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS
42
19C11 VL
DIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLKISRVEAGDVGVYYCMQGLEHPLTFGGGTKLEIK
43
19C11 HCDR1 (KABAT)
TLGMGVG
44
19C11 HCDR2 (KABAT)
HIWWDDDKYYNPALKS
45
19C11 HCDR3 (KABAT)
IGTAQATDALDY
46
19C11 LCDR1 (KABAT)
RSSKSLLHSNGNTYLY
47
19C11 LCDR2 (KABAT)
YMSNLAS
48
19C11 LCDR3 (KABAT)
MQGLEHPLT
49
19C11 HCDR1 (CHOTHIA)
GFSLSTLGM
50
19C11 HCDR2 (CHOTHIA)
WDD
51
19C11 HCDR3 (CHOTHIA)
GTAQATDALD
52
19C11 LCDR1 (CHOTHIA)
SKSLLHSNGNTY
53
19C11 LCDR2 (CHOTHIA)
YMS
54
19C11 LCDR3 (CHOTHIA)
GLEHPL
55
19C11 HCDR1 (IMGT)
GFSLSTLGMG
56
19C11 HCDR2 (IMGT)
IWWDDDK
57
19C11 HCDR3 (IMGT)
ARIGTAQATDALDY
58
19C11 LCDR1 (IMGT)
KSLLHSNGNTY
59
19C11 LCDR2 (IMGT)
YMS
60
19C11 LCDR3 (IMGT)
MQGLEHPLT
61
16C5 VH
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTLGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYYPALKSRLTISRDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCARIGTAQATDALDYWGQGTSVTV SS
62
16C5 VL
ELDMTQTPPSLSASVGETVRIRCLASEDIYSGISWYQQKPGKPPTLLIYGASNLESGVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDAATYYCLGGYSYSSTLTFGAGTNVEIK
63
16C5 HCDR1 (KABAT)
TLGMGVG
64
16C5 HCDR2 (KABAT)
HIWWDDDKYYYPALKS
65
16C5 HCDR3 (KABAT)
IGTAQATDALDY
66
16C5 LCDR1 (KABAT)
LASEDIYSGIS
67
16C5 LCDR2 (KABAT)
GASNLES
68
16C5 LCDR3 (KABAT)
LGGYSYSSTLT
69
16C5 HCDR1 (CHOTHIA)
GFSLNTLGM
70
16C5 HCDR2 (CHOTHIA)
WDD
71
16C5 HCDR3 (CHOTHIA)
GTAQATDALD
72
16C5 LCDR1 (CHOTHIA)
SEDIYSG
73
16C5 LCDR2 (CHOTHIA)
GAS
74
16C5 LCDR3 (CHOTHIA)
GYSYSSTL
75
16C5 HCDR1 (IMGT)
GFSLNTLGMG
76
16C5 HCDR2 (IMGT)
IWWDDDK
77
16C5 HCDR3 (IMGT)
ARIGTAQATDALDY
78
16C5 LCDR1 (IMGT)
EDIYSG
79
16C5 LCDR2 (IMGT)
GAS
80
16C5 LCDR3 (IMGT)
LGGYSYSSTLT
81
18C6 VH
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTVGMGVGWSRQPSGKGLEWLAHIWWDDEDKYYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCTRIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS
82
18C6 VL
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPLTFGGGTKLEIK
83
18C6 HCDR1 (KABAT)
TVGMGVG
84
18C6 HCDR2 (KABAT)
HIWWDDEDKYYNPALKS
85
18C6 HCDR3 (KABAT)
IGTAQATDALDY
86
18C6 LCDR1 (KABAT)
RSSKSLLHSNGNTYLY
87
18C6 LCDR2 (KABAT)
YMSNLAS
88
18C6 LCDR3 (KABAT)
MQSLEYPLT
89
18C6 HCDR1 (CHOTHIA)
GFSLSTVGM
90
18C6 HCDR2 (CHOTHIA)
WDDE
91
18C6 HCDR3 (CHOTHIA)
GTAQATDALD
92
18C6 LCDR1 (CHOTHIA)
SKSLLHSNGNTY
93
18C6 LCDR2 (CHOTHIA)
YMS
94
18C6 LCDR3 (CHOTHIA)
SLEYPL
95
18C6 HCDR1 (IMGT)
GFSLSTVGMG
96
18C6 HCDR2 (IMGT)
IWWDDEDK
97
18C6 HCDR3 (IMGT)
TRIGTAQATDALDY
98
18C6 LCDR1 (IMGT)
KSLLHSNGNTY
99
18C6 LCDR2 (IMGT)
YMS
100
18C6 LCDR3 (IMGT)
MQSLEYPLT
101
VH консенсус 10C6-18C6
QVX<sub>21</sub>LKESGPGX<sub>22</sub>LQPSQTLSLTCSFSGFSLX<sub>23</sub>TX<sub>24</sub>GM GVGWX<sub>25</sub>RQX<sub>26</sub>SGKGLEWLAHIWWDDX<sub>27</sub>DKYYX<sub>28</sub>PA LKSRLTISX<sub>29</sub>X<sub>30</sub>X<sub>31</sub>SKNQVFLKIX<sub>32</sub>NVX<sub>33</sub>TADX<sub>34</sub>ATY YCX<sub>35</sub>RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSSгде X<sub>21</sub> представляет собой T или N, X<sub>22</sub> представляет собой I или K, X<sub>23</sub> представляет собой N или S, X<sub>24</sub> представляет собой V или L, X<sub>25</sub> представляет собой S или I, X<sub>26</sub> представляет собой P или S, X<sub>27</sub> представляет собой E или отсутствует, X<sub>28</sub> представляет собой N или Y, X<sub>29</sub> представляет собой K или R, X<sub>30</sub> представляет собой A или D, X<sub>31</sub> представляет собой T или S, X<sub>32</sub> представляет собой V или A, X<sub>33</sub> представляет собой G или D, X<sub>34</sub> представляет собой T, I или S и X<sub>35</sub> представляет собой T, S или A
102
VL консенсус 7B12, 19C11, 18C6
DIVMTQAAPSX<sub>36</sub>X<sub>37</sub>VTPGESVSISCRSSKSLX<sub>38</sub>X<sub>39</sub>SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX<sub>40</sub>ISRVEAX<sub>41</sub>DVGVYYCMQX<sub>42</sub>LEX<sub>43</sub>PLTFGGGTKLEIKгде X<sub>36</sub> представляет собой I или V, X<sub>37</sub> представляет собой P или S, X<sub>38</sub> представляет собой R или L, X<sub>39</sub> представляет собой K или H, X<sub>40</sub> представляет собой R или K, X<sub>41</sub> представляет собой E или G, X<sub>42</sub> представляет собой S или G и X<sub>43</sub> представляет собой Y или H
103
КОНСЕНСУС HCDR1 KABAT
TX<sub>1</sub>GMGVGгде X<sub>1</sub> представляет собой L или V
104
КОНСЕНСУС HCDR2 KABAT
HIWWDDX<sub>2</sub>DKYYX<sub>3</sub>PALKSгде X<sub>2</sub> представляет собой E или отсутствует и X<sub>3</sub> представляет собой Y или N
105
КОНСЕНСУС HCDR3 KABAT
IGTAQATDALDY
106
КОНСЕНСУС LCDR1 7B12, 19C11, 18C6KABAT
RSSKSLX<sub>4</sub>X<sub>5</sub>SNGNTYLYгде X<sub>4</sub> представляет собой R или L и X<sub>5</sub> представляет собой K или H
107
КОНСЕНСУС LCDR2 7B12, 19C11, 18C6KABAT
YMSNLAS
108
КОНСЕНСУС LCDR3 7B12, 19C11, 18C6KABAT
MQX<sub>6</sub>LEX<sub>7</sub>PLTгде X<sub>6</sub> представляет собой G или S и X<sub>7</sub> представляет собой H или Y
109
КОНСЕНСУС HCDR1 10C6-18C6CHOTHIA
GFSLX<sub>8</sub>TX<sub>9</sub>GMгде X<sub>8</sub> представляет собой N или S и X<sub>9</sub> представляет собой L или V
110
КОНСЕНСУС HCDR2 10C6-18C6CHOTHIA
WDDX<sub>10</sub>где X<sub>10</sub> представляет собой E или отсутствует
111
КОНСЕНСУС HCDR3 10C6-18C6CHOTHIA
GTAQATDALD
112
КОНСЕНСУС LCDR1 7B12, 19C11, 18C6CHOTHIA
SKSLX<sub>11</sub>X<sub>12</sub>SNGNTYгде X<sub>11</sub> представляет собой L или R и X<sub>12</sub> представляет собой H или K
113
КОНСЕНСУС LCDR2 7B12, 19C11, 18C6CHOTHIA
YMS
114
КОНСЕНСУС LCDR3 7B12, 19C11, 18C6CHOTHIA
X<sub>13</sub>LEX<sub>14</sub>PLгде X<sub>13</sub> представляет собой G или S и X<sub>14</sub> представляет собой H или Y
115
КОНСЕНСУС HCDR1 10C6-18C6IMGT
GFSLX<sub>15</sub>TX<sub>16</sub>GMGгде X<sub>15</sub> представляет собой N или S и X<sub>16</sub> представляет собой V или L
116
КОНСЕНСУС HCDR2 10C6-18C6IMGT
IWWDDX<sub>17</sub>DKгде X<sub>17</sub> представляет собой E или отсутствует
117
КОНСЕНСУС HCDR3 10C6-18C6IMGT
X<sub>18</sub>RIGTAQATDALDYгде X<sub>18</sub> представляет собой T, A или S
118
КОНСЕНСУС LCDR1 7B12, 19C11, 18C6IMGT
KSLX<sub>19</sub>X<sub>20</sub>SNGNTYгде X<sub>19</sub> представляет собой V или L и X<sub>20</sub> представляет собой H или K
119
КОНСЕНСУС LCDR2 7B12, 19C11, 18C6IMGT
YMS
120
КОНСЕНСУС LCDR3 7B12, 19C11, 18C6IMGT
MQSLEYPLT
121
Прямой праймер MUC16<sup>c114</sup>
CCATGCGATATCGCCACCATGGTGAACTTCTCGCCACTGGCT
122
Обратный праймер MUC16<sup>c114</sup>
TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG
123
Прямой праймер MUC16<sup>c344</sup>
CCATGCGATATCGCCACCATGGTGACAGGCCCTGGGCTGGACAGA
124
Обратный праймер MUC16<sup>c344</sup>
TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG
125
Прямой праймер MUC16<sup>c57-114</sup>
CCATGCGATATCAAACTTCTCGCCACTGGCT
126
Обратный праймер MUC16<sup>c57-114</sup>
AGATCTAACCATGGGAAGGTCAGAATTCCCAGT
127
Прямой праймер <sup>117-244</sup>LGALS3
CCATGCGATATCACCTTATAACCTGCCTTTG
128
Обратный праймер <sup>117-244</sup>LGALS3
AGATCTAACCATGGTATATGAAGCACTGGT
129
Иммунизирующий пептидный 55-мер
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNS
130
Иммунизирующий пептидный 18-мер
CTRNGTQLQNFTLDRSSV
131
Иммунизирующий пептидный 15-мер
CGTQLQNFTLDRSSV
132
MUC16<sup>c344</sup>
WELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNQNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHQLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
133
MUC16<sup>c114</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
134
MUC16<sup>c86</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
135
MUC16<sup>c80</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGDLEDLQ
136
Аминокислотная последовательность незрелого MUC16 человека (NP_078966.2)
MLKPSGLPGSSSPTRSLMTGSRSTKATPEMDSGLTGATLSPKTSTGAIVVTEHTLPFTSPDKTLASPTSSVVGRTTQSLGVMSSALPESTSRGMTHSEQRTSPSLSPQVNGTPSRNYPATSMVSGLSSPRTRTSSTEGNFTKEASTYTLTVETTSGPVTEKYTVPTETSTTEGDSTETPWDTRYIPVKITSPMKTFADSTASKENAPVSMTPAETTVTDSHTPGRTNPSFGTLYSSFLDLSPKGTPNSRGETSLELILSTTGYPFSSPEPGSAGHSRISTSAPLSSSASVLDNKISETSIFSGQSLTSPLSPGVPEARASTMPNSAIPFSMTLSNAETSAERVRSTISSLGTPSISTKQTAETILTFHAFAETMDIPSTHIAKTLASEWLGSPGTLGGTSTSALTTTSPSTTLVSEETNTHHSTSGKETEGTLNTSMTPLETSAPGEESEMTATLVPTLGFTTLDSKIRSPSQVSSSHPTRELRTTGSTSGRQSSSTAAHGSSDILRATTSSTSKASSWTSESTAQQFSEPQHTQWVETSPSMKTERPPASTSVAAPITTSVPSVVSGFTTLKTSSTKGIWLEETSADTLIGESTAGPTTHQFAVPTGISMTGGSSTRGSQGTTHLLTRATASSETSADLTLATNGVPVSVSPAVSKTAAGSSPPGGTKPSYTMVSSVIPETSSLQSSAFREGTSLGLTPLNTRHPFSSPEPDSAGHTKISTSIPLLSSASVLEDKVSATSTFSHHKATSSITTGTPEISTKTKPSSAVLSSMTLSNAATSPERVRNATSPLTHPSPSGEETAGSVLTLSTSAETTDSPNIHPTGTLTSESSESPSTLSLPSVSGVKTTFSSSTPSTHLFTSGEETEETSNPSVSQPETSVSRVRTTLASTSVPTPVFPTMDTWPTRSAQFSSSHLVSELRATSSTSVTNSTGSALPKISHLTGTATMSQTNRDTFNDSAAPQSTTWPETSPRFKTGLPSATTTVSTSATSLSATVMVSKFTSPATSSMEATSIREPSTTILTTETTNGPGSMAVASTNIPIGKGYITEGRLDTSHLPIGTTASSETSMDFTMAKESVSMSVSPSQSMDAAGSSTPGRTSQFVDTFSDDVYHLTSREITIPRDGTSSALTPQMTATHPPSPDPGSARSTWLGILSSSPSSPTPKVTMSSTFSTQRVTTSMIMDTVETSRWNMPNLPSTTSLTPSNIPTSGAIGKSTLVPLDTPSPATSLEASEGGLPTLSTYPESTNTPSIHLGAHASSESPSTIKLTMASVVKPGSYTPLTFPSIETHIHVSTARMAYSSGSSPEMTAPGETNTGSTWDPTTYITTTDPKDTSSAQVSTPHSVRTLRTTENHPKTESATPAAYSGSPKISSSPNLTSPATKAWTITDTTEHSTQLHYTKLAEKSSGFETQSAPGPVSVVIPTSPTIGSSTLELTSDVPGEPLVLAPSEQTTITLPMATWLSTSLTEEMASTDLDISSPSSPMSTFAIFPPMSTPSHELSKSEADTSAIRNTDSTTLDQHLGIRSLGRTGDLTTVPITPLTTTWTSVIEHSTQAQDTLSATMSPTHVTQSLKDQTSIPASASPSHLTEVYPELGTQGRSSSEATTFWKPSTDTLSREIETGPTNIQSTPPMDNTTTGSSSSGVTLGIAHLPIGTSSPAETSTNMALERRSSTATVSMAGTMGLLVTSAPGRSISQSLGRVSSVLSESTTEGVTDSSKGSSPRLNTQGNTALSSSLEPSYAEGSQMSTSIPLTSSPTTPDVEFIGGSTFWTKEVTTVMTSDISKSSARTESSSATLMSTALGSTENTGKEKLRTASMDLPSPTPSMEVTPWISLTLSNAPNTTDSLDLSHGVHTSSAGTLATDRSLNTGVTRASRLENGSDTSSKSLSMGNSTHTSMTYTEKSEVSSSIHPRPETSAPGAETTLTSTPGNRAISLTLPFSSIPVEEVISTGITSGPDINSAPMTHSPITPPTIVWTSTGTIEQSTQPLHAVSSEKVSVQTQSTPYVNSVAVSASPTHENSVSSGSSTSSPYSSASLESLDSTISRRNAITSWLWDLTTSLPTTTWPSTSLSEALSSGHSGVSNPSSTTTEFPLFSAASTSAAKQRNPETETHGPQNTAASTLNTDASSVTGLSETPVGASISSEVPLPMAITSRSDVSGLTSESTANPSLGTASSAGTKLTRTISLPTSESLVSFRMNKDPWTVSIPLGSHPTTNTETSIPVNSAGPPGLSTVASDVIDTPSDGAESIPTVSFSPSPDTEVTTISHFPEKTTHSFRTISSLTHELTSRVTPIPGDWMSSAMSTKPTGASPSITLGERRTITSAAPTTSPIVLTASFTETSTVSLDNETTVKTSDILDARKTNELPSDSSSSSDLINTSIASSTMDVTKTASISPTSISGMTASSSPSLFSSDRPQVPTSTTETNTATSPSVSSNTYSLDGGSNVGGTPSTLPPFTITHPVETSSALLAWSRPVRTFSTMVSTDTASGENPTSSNSVVTSVPAPGTWTSVGSTTDLPAMGFLKTSPAGEAHSLLASTIEPATAFTPHLSAAVVTGSSATSEASLLTTSESKAIHSSPQTPTTPTSGANWETSATPESLLVVTETSDTTLTSKILVTDTILFSTVSTPPSKFPSTGTLSGASFPTLLPDTPAIPLTATEPTSSLATSFDSTPLVTIASDSLGTVPETTLTMSETSNGDALVLKTVSNPDRSIPGITIQGVTESPLHPSSTSPSKIVAPRNTTYEGSITVALSTLPAGTTGSLVFSQSSENSETTALVDSSAGLERASVMPLTTGSQGMASSGGIRSGSTHSTGTKTFSSLPLTMNPGEVTAMSEITTNRLTATQSTAPKGIPVKPTSAESGLLTPVSASSSPSKAFASLTTAPPTWGIPQSTLTFEFSEVPSLDTKSASLPTPGQSLNTIPDSDASTASSSLSKSPEKNPRARMMTSTKAISASSFQSTGFTETPEGSASPSMAGHEPRVPTSGTGDPRYASESMSYPDPSKASSAMTSTSLASKLTTLFSTGQAARSGSSSSPISLSTEKETSFLSPTASTSRKTSLFLGPSMARQPNILVHLQTSALTLSPTSTLNMSQEEPPELTSSQTIAEEEGTTAETQTLTFTPSETPTSLLPVSSPTEPTARRKSSPETWASSISVPAKTSLVETTDGTLVTTIKMSSQAAQGNSTWPAPAEETGSSPAGTSPGSPEMSTTLKIMSSKEPSISPEIRSTVRNSPWKTPETTVPMETTVEPVTLQSTALGSGSTSISHLPTGTTSPTKSPTENMLATERVSLSPSPPEAWTNLYSGTPGGTRQSLATMSSVSLESPTARSITGTGQQSSPELVSKTTGMEFSMWHGSTGGTTGDTHVSLSTSSNILEDPVTSPNSVSSLTDKSKHKTETWVSTTAIPSTVLNNKIMAAEQQTSRSVDEAYSSTSSWSDQTSGSDITLGASPDVTNTLYITSTAQTTSLVSLPSGDQGITSLTNPSGGKTSSASSVTSPSIGLETLRANVSAVKSDIAPTAGHLSQTSSPAEVSILDVTTAPTPGISTTITTMGTNSISTTTPNPEVGMSTMDSTPATERRTTSTEHPSTWSSTAASDSWTVTDMTSNLKVARSPGTISTMHTTSFLASSTELDSMSTPHGRITVIGTSLVTPSSDASAVKTETSTSERTLSPSDTTASTPISTFSRVQRMSISVPDILSTSWTPSSTEAEDVPVSMVSTDHASTKTDPNTPLSTFLFDSLSTLDWDTGRSLSSATATTSAPQGATTPQELTLETMISPATSQLPFSIGHITSAVTPAAMARSSGVTFSRPDPTSKKAEQTSTQLPTTTSAHPGQVPRSAATTLDVIPHTAKTPDATFQRQGQTALTTEARATSDSWNEKEKSTPSAPWITEMMNSVSEDTIKEVTSSSSVLRTLNTLDINLESGTTSSPSWKSSPYERIAPSESTTDKEAIHPSTNTVETTGWVTSSEHASHSTIPAHSASSKLTSPVVTTSTREQAIVSMSTTTWPESTRARTEPNSFLTIELRDVSPYMDTSSTTQTSIISSPGSTAITKGPRTEITSSKRISSSFLAQSMRSSDSPSEAITRLSNFPAMTESGGMILAMQTSPPGATSLSAPTLDTSATASWTGTPLATTQRFTYSEKTTLFSKGPEDTSQPSPPSVEETSSSSSLVPIHATTSPSNILLTSQGHSPSSTPPVTSVFLSETSGLGKTTDMSRISLEPGTSLPPNLSSTAGEALSTYEASRDTKAIHHSADTAVTNMEATSSEYSPIPGHTKPSKATSPLVTSHIMGDITSSTSVFGSSETTEIETVSSVNQGLQERSTSQVASSATETSTVITHVSSGDATTHVTKTQATFSSGTSISSPHQFITSTNTFTDVSTNPSTSLIMTESSGVTITTQTGPTGAATQGPYLLDTSTMPYLTETPLAVTPDFMQSEKTTLISKGPKDVSWTSPPSVAETSYPSSLTPFLVTTIPPATSTLQGQHTSSPVSATSVLTSGLVKTTDMLNTSMEPVTNSPQNLNNPSNEILATLAATTDIETIHPSINKAVTNMGTASSAHVLHSTLPVSSEPSTATSPMVPASSMGDALASISIPGSETTDIEGEPTSSLTAGRKENSTLQEMNSTTESNIILSNVSVGAITEATKMEVPSFDATFIPTPAQSTKFPDIFSVASSRLSNSPPMTISTHMTTTQTGSSGATSKIPLALDTSTLETSAGTPSVVTEGFAHSKITTAMNNDVKDVSQTNPPFQDEASSPSSQAPVLVTTLPSSVAFTPQWHSTSSPVSMSSVLTSSLVKTAGKVDTSLETVTSSPQSMSNTLDDISVTSAATTDIETTHPSINTVVTNVGTTGSAFESHSTVSAYPEPSKVTSPNVTTSTMEDTTISRSIPKSSKTTRTETETTSSLTPKLRETSISQEITSSTETSTVPYKELTGATTEVSRTDVTSSSSTSFPGPDQSTVSLDISTETNTRLSTSPIMTESAEITITTQTGPHGATSQDTFTMDPSNTTPQAGIHSAMTHGFSQLDVTTLMSRIPQDVSWTSPPSVDKTSSPSSFLSSPAMTTPSLISSTLPEDKLSSPMTSLLTSGLVKITDILRTRLEPVTSSLPNFSSTSDKILATSKDSKDTKEIFPSINTEETNVKANNSGHESHSPALADSETPKATTQMVITTTVGDPAPSTSMPVHGSSETTNIKREPTYFLTPRLRETSTSQESSFPTDTSFLLSKVPTGTITEVSSTGVNSSSKISTPDHDKSTVPPDTFTGEIPRVFTSSIKTKSAEMTITTQASPPESASHSTLPLDTSTTLSQGGTHSTVTQGFPYSEVTTLMGMGPGNVSWMTTPPVEETSSVSSLMSSPAMTSPSPVSSTSPQSIPSSPLPVTALPTSVLVTTTDVLGTTSPESVTSSPPNLSSITHERPATYKDTAHTEAAMHHSTNTAVTNVGTSGSGHKSQSSVLADSETSKATPLMSTTSTLGDTSVSTSTPNISQTNQIQTEPTASLSPRLRESSTSEKTSSTTETNTAFSYVPTGAITQASRTEISSSRTSISDLDRPTIAPDISTGMITRLFTSPIMTKSAEMTVTTQTTTPGATSQGILPWDTSTTLFQGGTHSTVSQGFPHSEITTLRSRTPGDVSWMTTPPVEETSSGFSLMSPSMTSPSPVSSTSPESIPSSPLPVTALLTSVLVTTTNVLGTTSPEPVTSSPPNLSSPTQERLTTYKDTAHTEAMHASMHTNTAVANVGTSISGHESQSSVPADSHTSKATSPMGITFAMGDTSVSTSTPAFFETRIQTESTSSLIPGLRDTRTSEEINTVTETSTVLSEVPTTTTTEVSRTEVITSSRTTISGPDHSKMSPYISTETITRLSTFPFVTGSTEMAITNQTGPIGTISQATLTLDTSSTASWEGTHSPVTQRFPHSEETTTMSRSTKGVSWQSPPSVEETSSPSSPVPLPAITSHSSLYSAVSGSSPTSALPVTSLLTSGRRKTIDMLDTHSELVTSSLPSASSFSGEILTSEASTNTETIHFSENTAETNMGTTNSMHKLHSSVSIHSQPSGHTPPKVTGSMMEDAIVSTSTPGSPETKNVDRDSTSPLTPELKEDSTALVMNSTTESNTVFSSVSLDAATEVSRAEVTYYDPTFMPASAQSTKSPDISPEASSSHSNSPPLTISTHKTIATQTGPSGVTSLGQLTLDTSTIATSAGTPSARTQDFVDSETTSVMNNDLNDVLKTSPFSAEEANSLSSQAPLLVTTSPSPVTSTLQEHSTSSLVSVTSVPTPTLAKITDMDTNLEPVTRSPQNLRNTLATSEATTDTHTMHPSINTAVANVGTTSSPNEFYFTVSPDSDPYKATSAVVITSTSGDSIVSTSMPRSSAMKKIESETTFSLIFRLRETSTSQKIGSSSDTSTVFDKAFTAATTEVSRTELTSSSRTSIQGTEKPTMSPDTSTRSVTMLSTFAGLTKSEERTIATQTGPHRATSQGTLTWDTSITTSQAGTHSAMTHGFSQLDLSTLTSRVPEYISGTSPPSVEKTSSSSSLLSLPAITSPSPVPTTLPESRPSSPVHLTSLPTSGLVKTTDMLASVASLPPNLGSTSHKIPTTSEDIKDTEKMYPSTNIAVTNVGTTTSEKESYSSVPAYSEPPKVTSPMVTSFNIRDTIVSTSMPGSSEITRIEMESTFSLAHGLKGTSTSQDPIVSTEKSAVLHKLTTGATETSRTEVASSRRTSIPGPDHSTESPDISTEVIPSLPISLGITESSNMTIITRTGPPLGSTSQGTFTLDTPTTSSRAGTHSMATQEFPHSEMTTVMNKDPEILSWTIPPSIEKTSFSSSLMPSPAMTSPPVSSTLPKTIHTTPSPMTSLLTPSLVMTTDTLGTSPEPTTSSPPNLSSTSHEILTTDEDTTAIEAMHPSTSTAATNVETTSSGHGSQSSVLADSEKTKATAPMDTTSTMGHTTVSTSMSVSSETTKIKRESTYSLTPGLRETSISQNASFSTDTSIVLSEVPTGTTAEVSRTEVTSSGRTSIPGPSQSTVLPEISTRTMTRLFASPTMTESAEMTIPTQTGPSGSTSQDTLTLDTSTTKSQAKTHSTLTQRFPHSEMTTLMSRGPGDMSWQSSPSLENPSSLPSLLSLPATTSPPPISSTLPVTISSSPLPVTSLLTSSPVTTTDMLHTSPELVTSSPPKLSHTSDERLTTGKDTTNTEAVHPSTNTAASNVEIPSSGHESPSSALADSETSKATSPMFITSTQEDTTVAISTPHFLETSRIQKESISSLSPKLRETGSSVETSSAIETSAVLSEVSIGATTEISRTEVTSSSRTSISGSAESTMLPEISTTRKIIKFPTSPILAESSEMTIKTQTSPPGSTSESTFTLDTSTTPSLVITHSTMTQRLPHSEITTLVSRGAGDVPRPSSLPVEETSPPSSQLSLSAMISPSPVSSTLPASSHSSSASVTSLLTPGQVKTTEVLDASAEPETSSPPSLSSTSVEILATSEVTTDTEKIHPFSNTAVTKVGTSSSGHESPSSVLPDSETTKATSAMGTISIMGDTSVSTLTPALSNTRKIQSEPASSLTTRLRETSTSEETSLATEANTVLSKVSTGATTEVSRTEAISFSRTSMSGPEQSTMSQDISIGTIPRISASSVLTESAKMTITTQTGPSESTLESTLNLNTATTPSWVETHSIVIQGFPHPEMTTSMGRGPGGVSWPSPPFVKETSPPSSPLSLPAVTSPHPVSTTFLAHIPPSPLPVTSLLTSGPATTTDILGTSTEPGTSSSSSLSTTSHERLTTYKDTAHTEAVHPSTNTGGTNVATTSSGYKSQSSVLADSSPMCTTSTMGDTSVLTSTPAFLETRRIQTELASSLTPGLRESSGSEGTSSGTKMSTVLSKVPTGATTEISKEDVTSIPGPAQSTISPDISTRTVSWFSTSPVMTESAEITMNTHTSPLGATTQGTSTLDTSSTTSLTMTHSTISQGFSHSQMSTLMRRGPEDVSWMSPPLLEKTRPSFSLMSSPATTSPSPVSSTLPESISSSPLPVTSLLTSGLAKTTDMLHKSSEPVTNSPANLSSTSVEILATSEVTTDTEKTHPSSNRTVTDVGTSSSGHESTSFVLADSQTSKVTSPMVITSTMEDTSVSTSTPGFFETSRIQTEPTSSLTLGLRKTSSSEGTSLATEMSTVLSGVPTGATAEVSRTEVTSSSRTSISGFAQLTVSPETSTETITRLPTSSIMTESAEMMIKTQTDPPGSTPESTHTVDISTTPNWVETHSTVTQRFSHSEMTTLVSRSPGDMLWPSQSSVEETSSASSLLSLPATTSPSPVSSTLVEDFPSASLPVTSLLNPGLVITTDRMGISREPGTSSTSNLSSTSHERLTTLEDTVDTEDMQPSTHTAVTNVRTSISGHESQSSVLSDSETPKATSPMGTTYTMGETSVSISTSDFFETSRIQIEPTSSLTSGLRETSSSERISSATEGSTVLSEVPSGATTEVSRTEVISSRGTSMSGPDQFTISPDISTEAITRLSTSPIMTESAESAITIETGSPGATSEGTLTLDTSTTTFWSGTHSTASPGFSHSEMTTLMSRTPGDVPWPSLPSVEEASSVSSSLSSPAMTSTSFFSTLPESISSSPHPVTALLTLGPVKTTDMLRTSSEPETSSPPNLSSTSAEILATSEVTKDREKIHPSSNTPVVNVGTVIYKHLSPSSVLADLVTTKPTSPMATTSTLGNTSVSTSTPAFPETMMTQPTSSLTSGLREISTSQETSSATERSASLSGMPTGATTKVSRTEALSLGRTSTPGPAQSTISPEISTETITRISTPLTTTGSAEMTITPKTGHSGASSQGTFTLDTSSRASWPGTHSAATHRSPHSGMTTPMSRGPEDVSWPSRPSVEKTSPPSSLVSLSAVTSPSPLYSTPSESSHSSPLRVTSLFTPVMMKTTDMLDTSLEPVTTSPPSMNITSDESLATSKATMETEAIQLSENTAVTQMGTISARQEFYSSYPGLPEPSKVTSPVVTSSTIKDIVSTTIPASSEITRIEMESTSTLTPTPRETSTSQEIHSATKPSTVPYKALTSATIEDSMTQVMSSSRGPSPDQSTMSQDISTEVITRLSTSPIKTESTEMTITTQTGSPGATSRGTLTLDTSTTFMSGTHSTASQGFSHSQMTALMSRTPGDVPWLSHPSVEEASSASFSLSSPVMTSSSPVSSTLPDSIHSSSLPVTSLLTSGLVKTTELLGTSSEPETSSPPNLSSTSAEILAITEVTTDTEKLEMTNVVTSGYTHESPSSVLADSVTTKATSSMGITYPTGDTNVLTSTPAFSDTSRIQTKSKLSLTPGLMETSISEETSSATEKSTVLSSVPTGATTEVSRTEAISSSRTSIPGPAQSTMSSDTSMETITRISTPLTRKESTDMAITPKTGPSGATSQGTFTLDSSSTASWPGTHSATTQRFPQSVVTTPMSRGPEDVSWPSPLSVEKNSPPSSLVSSSSVTSPSPLYSTPSGSSHSSPVPVTSLFTSIMMKATDMLDASLEPETTSAPNMNITSDESLAASKATTETEAIHVFENTAASHVETTSATEELYSSSPGFSEPTKVISPVVTSSSIRDNMVSTTMPGSSGITRIEIESMSSLTPGLRETRTSQDITSSTETSTVLYKMPSGATPEVSRTEVMPSSRTSIPGPAQSTMSLDISDEVVTRLSTSPIMTESAEITITTQTGYSLATSQVTLPLGTSMTFLSGTHSTMSQGLSHSEMTNLMSRGPESLSWTSPRFVETTRSSSSLTSLPLTTSLSPVSSTLLDSSPSSPLPVTSLILPGLVKTTEVLDTSSEPKTSSSPNLSSTSVEIPATSEIMTDTEKIHPSSNTAVAKVRTSSSVHESHSSVLADSETTITIPSMGITSAVDDTTVFTSNPAFSETRRIPTEPTFSLTPGFRETSTSEETTSITETSAVLYGVPTSATTEVSMTEIMSSNRIHIPDSDQSTMSPDIITEVITRLSSSSMMSESTQMTITTQKSSPGATAQSTLTLATTTAPLARTHSTVPPRFLHSEMTTLMSRSPENPSWKSSLFVEKTSSSSSLLSLPVTTSPSVSSTLPQSIPSSSFSVTSLLTPGMVKTTDTSTEPGTSLSPNLSGTSVEILAASEVTTDTEKIHPSSSMAVTNVGTTSSGHELYSSVSIHSEPSKATYPVGTPSSMAETSISTSMPANFETTGFEAEPFSHLTSGFRKTNMSLDTSSVTPTNTPSSPGSTHLLQSSKTDFTSSAKTSSPDWPPASQYTEIPVDIITPFNASPSITESTGITSFPESRFTMSVTESTHHLSTDLLPSAETISTGTVMPSLSEAMTSFATTGVPRAISGSGSPFSRTESGPGDATLSTIAESLPSSTPVPFSSSTFTTTDSSTIPALHEITSSSATPYRVDTSLGTESSTTEGRLVMVSTLDTSSQPGRTSSSPILDTRMTESVELGTVTSAYQVPSLSTRLTRTDGIMEHITKIPNEAAHRGTIRPVKGPQTSTSPASPKGLHTGGTKRMETTTTALKTTTTALKTTSRATLTTSVYTPTLGTLTPLNASMQMASTIPTEMMITTPYVFPDVPETTSSLATSLGAETSTALPRTTPSVFNRESETTASLVSRSGAERSPVIQTLDVSSSEPDTTASWVIHPAETIPTVSKTTPNFFHSELDTVSSTATSHGADVSSAIPTNISPSELDALTPLVTISGTDTSTTFPTLTKSPHETETRTTWLTHPAETSSTIPRTIPNFSHHESDATPSIATSPGAETSSAIPIMTVSPGAEDLVTSQVTSSGTDRNMTIPTLTLSPGEPKTIASLVTHPEAQTSSAIPTSTISPAVSRLVTSMVTSLAAKTSTTNRALTNSPGEPATTVSLVTHPAQTSPTVPWTTSIFFHSKSDTTPSMTTSHGAESSSAVPTPTVSTEVPGVVTPLVTSSRAVISTTIPILTLSPGEPETTPSMATSHGEEASSAIPTPTVSPGVPGVVTSLVTSSRAVTSTTIPILTFSLGEPETTPSMATSHGTEAGSAVPTVLPEVPGMVTSLVASSRAVTSTTLPTLTLSPGEPETTPSMATSHGAEASSTVPTVSPEVPGVVTSLVTSSSGVNSTSIPTLILSPGELETTPSMATSHGAEASSAVPTPTVSPGVSGVVTPLVTSSRAVTSTTIPILTLSSSEPETTPSMATSHGVEASSAVLTVSPEVPGMVTSLVTSSRAVTSTTIPTLTISSDEPETTTSLVTHSEAKMISAIPTLAVSPTVQGLVTSLVTSSGSETSAFSNLTVASSQPETIDSWVAHPGTEASSVVPTLTVSTGEPFTNISLVTHPAESSSTLPRTTSRFSHSELDTMPSTVTSPEAESSSAISTTISPGIPGVLTSLVTSSGRDISATFPTVPESPHESEATASWVTHPAVTSTTVPRTTPNYSHSEPDTTPSIATSPGAEATSDFPTITVSPDVPDMVTSQVTSSGTDTSITIPTLTLSSGEPETTTSFITYSETHTSSAIPTLPVSPGASKMLTSLVISSGTDSTTTFPTLTETPYEPETTAIQLIHPAETNTMVPRTTPKFSHSKSDTTLPVAITSPGPEASSAVSTTTISPDMSDLVTSLVPSSGTDTSTTFPTLSETPYEPETTATWLTHPAETSTTVSGTIPNFSHRGSDTAPSMVTSPGVDTRSGVPTTTIPPSIPGVVTSQVTSSATDTSTAIPTLTPSPGEPETTASSATHPGTQTGFTVPIRTVPSSEPDTMASWVTHPPQTSTPVSRTTSSFSHSSPDATPVMATSPRTEASSAVLTTISPGAPEMVTSQITSSGAATSTTVPTLTHSPGMPETTALLSTHPRTETSKTFPASTVFPQVSETTASLTIRPGAETSTALPTQTTSSLFTLLVTGTSRVDLSPTASPGVSAKTAPLSTHPGTETSTMIPTSTLSLGLLETTGLLATSSSAETSTSTLTLTVSPAVSGLSSASITTDKPQTVTSWNTETSPSVTSVGPPEFSRTVTGTTMTLIPSEMPTPPKTSHGEGVSPTTILRTTMVEATNLATTGSSPTVAKTTTTFNTLAGSLFTPLTTPGMSTLASESVTSRTSYNHRSWISTTSSYNRRYWTPATSTPVTSTFSPGISTSSIPSSTAATVPFMVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNATERELQGLLKPLFRNSSLEYLYSGCRLASLRPEKDSSATAVDAICTHRPDPEDLGLDRERLYWELSNLTNGIQELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSMPTTSTPGTSTVDVGTSGTPSSSPSPTTAGPLLMPFTLNFTITNLQYEEDMRRTGSRKFNTMESVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNDIEELGPYTLDRNSLYVNGFTHQSSVSTTSTPGTSTVDLRTSGTPSSLSSPTIMAAGPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMGHPGSRKFNTTERVLQGLLGPIFKNTSVGPLYSGCRLTSLRSEKDGAATGVDAICIHHLDPKSPGLNRERLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTSSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPATAGPLLVLFTLNFTITNLKYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQTLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHWIPVPTSSTPGTSTVDLGSGTPSSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLKYEEDMHCPGSRKFNTTERVLQSLLGPMFKNTSVGPLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHQTSAPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTSAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRPEKNGAATGMDAICSHRLDPKSPGLNREQLYWELSQLTHGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVAPTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTTAVPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLGPLFKNSSVGPLYSGCRLISLRSEKDGAATGVDAICTHHLNPQSPGLDREQLYWQLSQMTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSGLTTSTPWTSTVDLGTSGTPSPVPSPTTTGPLLVPFTLNFTITNLQYEENMGHPGSRKFNITESVLQGLLKPLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGVATRVDAICTHRPDPKIPGLDRQQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSTPGTFTVQPETSETPSSLPGPTATGPVLLPFTLNFTITNLQYEEDMRRPGSRKFNTTERVLQGLLMPLFKNTSVSSLYSGCRLTLLRPEKDGAATRVDAVCTHRPDPKSPGLDRERLYWKLSQLTHGITELGPYTLDRHSLYVNGFTHQSSMTTTRTPDTSTMHLATSRTPASLSGPMTASPLLVLFTINFTITNLRYEENMHHPGSRKFNTTERVLQGLLRPVFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPKKDGAATKVDAICTYRPDPKSPGLDREQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSIPGTPTVDLGTSGTPVSKPGPSAASPLLVLFTLNFTITNLRYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLRSLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGTATGVDAICTHHPDPKSPRLDREQLYWELSQLTHNITELGPYALDNDSLFVNGFTHRSSVSTTSTPGTPTVYLGASKTPASIFGPSAASHLLILFTLNFTITNLRYEENMWPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGEATGVDAICTHRPDPTGPGLDREQLYLELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSTGVVSEEPFTLNFTINNLRYMADMGQPGSLKFNITDNVMQHLLSPLFQRSSLGARYTGCRVIALRSVKNGAETRVDLLCTYLQPLSGPGLPIKQVFHELSQQTHGITRLGPYSLDKDSLYLNGYNEPGPDEPPTTPKPATTFLPPLSEATTAMGYHLKTLTLNFTISNLQYSPDMGKGSATFNSTEGVLQHLLRPLFQKSSMGPFYLGCQLISLRPEKDGAATGVDTTCTYHPDPVGPGLDIQQLYWELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNWNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGVITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
137
Последовательность нуклеиновой кислоты незрелого MUC16 человека (NM_024690.2)
AGCGTTGCACAATTCCCCCAACCTCCATACATACGGCAGCTCTTCTAGACACAGGTTTTCCCAGGTCAAATGCGGGGACCCCAGCCATATCTCCCACCCTGAGAAATTTTGGAGTTTCAGGGAGCTCAGAAGCTCTGCAGAGGCCACCCTCTCTGAGGGGATTCTTCTTAGACCTCCATCCAGAGGCAAATGTTGACCTGTCCATGCTGAAACCCTCAGGCCTTCCTGGGTCATCTTCTCCCACCCGCTCCTTGATGACAGGGAGCAGGAGCACTAAAGCCACACCAGAAATGGATTCAGGACTGACAGGAGCCACCTTGTCACCTAAGACATCTACAGGTGCAATCGTGGTGACAGAACATACTCTGCCCTTTACTTCCCCAGATAAGACCTTGGCCAGTCCTACATCTTCGGTTGTGGGAAGAACCACCCAGTCTTTGGGGGTGATGTCCTCTGCTCTCCCTGAGTCAACCTCTAGAGGAATGACACACTCCGAGCAAAGAACCAGCCCATCGCTGAGTCCCCAGGTCAATGGAACTCCCTCTAGGAACTACCCTGCTACAAGCATGGTTTCAGGATTGAGTTCCCCAAGGACCAGGACCAGTTCCACAGAAGGAAATTTTACCAAAGAAGCATCTACATACACACTCACTGTAGAGACCACAAGTGGCCCAGTCACTGAGAAGTACACAGTCCCCACTGAGACCTCAACAACTGAAGGTGACAGCACAGAGACCCCCTGGGACACAAGATATATTCCTGTAAAAATCACATCTCCAATGAAAACATTTGCAGATTCAACTGCATCCAAGGAAAATGCCCCAGTGTCTATGACTCCAGCTGAGACCACAGTTACTGACTCACATACTCCAGGAAGGACAAACCCATCATTTGGGACACTTTATTCTTCCTTCCTTGACCTATCACCTAAAGGGACCCCAAATTCCAGAGGTGAAACAAGCCTGGAACTGATTCTATCAACCACTGGATATCCCTTCTCCTCTCCTGAACCTGGCTCTGCAGGACACAGCAGAATAAGTACCAGTGCGCCTTTGTCATCATCTGCTTCAGTTCTCGATAATAAAATATCAGAGACCAGCATATTCTCAGGCCAGAGTCTCACCTCCCCTCTGTCTCCTGGGGTGCCCGAGGCCAGAGCCAGCACAATGCCCAACTCAGCTATCCCTTTTTCCATGACACTAAGCAATGCAGAAACAAGTGCCGAAAGGGTCAGAAGCACAATTTCCTCTCTGGGGACTCCATCAATATCCACAAAGCAGACAGCAGAGACTATCCTTACCTTCCATGCCTTCGCTGAGACCATGGATATACCCAGCACCCACATAGCCAAGACTTTGGCTTCAGAATGGTTGGGAAGTCCAGGTACCCTTGGTGGCACCAGCACTTCAGCGCTGACAACCACATCTCCATCTACCACTTTAGTCTCAGAGGAGACCAACACCCATCACTCCACGAGTGGAAAGGAAACAGAAGGAACTTTGAATACATCTATGACTCCACTTGAGACCTCTGCTCCTGGAGAAGAGTCCGAAATGACTGCCACCTTGGTCCCCACTCTAGGTTTTACAACTCTTGACAGCAAGATCAGAAGTCCATCTCAGGTCTCTTCATCCCACCCAACAAGAGAGCTCAGAACCACAGGCAGCACCTCTGGGAGGCAGAGTTCCAGCACAGCTGCCCACGGGAGCTCTGACATCCTGAGGGCAACCACTTCCAGCACCTCAAAAGCATCATCATGGACCAGTGAAAGCACAGCTCAGCAATTTAGTGAACCCCAGCACACACAGTGGGTGGAGACAAGTCCTAGCATGAAAACAGAGAGACCCCCAGCATCAACCAGTGTGGCAGCCCCTATCACCACTTCTGTTCCCTCAGTGGTCTCTGGCTTCACCACCCTGAAGACCAGCTCCACAAAAGGGATTTGGCTTGAAGAAACATCTGCAGACACACTCATCGGAGAATCCACAGCTGGCCCAACCACCCATCAGTTTGCTGTTCCCACTGGGATTTCAATGACAGGAGGCAGCAGCACCAGGGGAAGCCAGGGCACAACCCACCTACTCACCAGAGCCACAGCATCATCTGAGACATCCGCAGATTTGACTCTGGCCACGAACGGTGTCCCAGTCTCCGTGTCTCCAGCAGTGAGCAAGACGGCTGCTGGCTCAAGTCCTCCAGGAGGGACAAAGCCATCATATACAATGGTTTCTTCTGTCATCCCTGAGACATCATCTCTACAGTCCTCAGCTTTCAGGGAAGGAACCAGCCTGGGACTGACTCCATTAAACACTAGACATCCCTTCTCTTCCCCTGAACCAGACTCTGCAGGACACACCAAGATAAGCACCAGCATTCCTCTGTTGTCATCTGCTTCAGTTCTTGAGGATAAAGTGTCAGCGACCAGCACATTCTCACACCACAAAGCCACCTCATCTATTACCACAGGGACTCCTGAAATCTCAACAAAGACAAAGCCCAGCTCAGCCGTTCTTTCCTCCATGACCCTAAGCAATGCAGCAACAAGTCCTGAAAGAGTCAGAAATGCAACTTCCCCTCTGACTCATCCATCTCCATCAGGGGAAGAGACAGCAGGGAGTGTCCTCACTCTCAGCACCTCTGCTGAGACTACAGACTCACCTAACATCCACCCAACTGGGACACTGACTTCAGAATCGTCAGAGAGTCCTAGCACTCTCAGCCTCCCAAGTGTCTCTGGAGTCAAAACCACATTTTCTTCATCTACTCCTTCCACTCATCTATTTACTAGTGGAGAAGAAACAGAGGAAACTTCGAATCCATCTGTGTCTCAACCTGAGACTTCTGTTTCCAGAGTAAGGACCACCTTGGCCAGCACCTCTGTCCCTACCCCAGTATTCCCCACCATGGACACCTGGCCTACACGTTCAGCTCAGTTCTCTTCATCCCACCTAGTGAGTGAGCTCAGAGCTACGAGCAGTACCTCAGTTACAAACTCAACTGGTTCAGCTCTTCCTAAAATATCTCACCTCACTGGGACGGCAACAATGTCACAGACCAATAGAGACACGTTTAATGACTCTGCTGCACCCCAAAGCACAACTTGGCCAGAGACTAGTCCCAGATTCAAGACAGGGTTACCTTCAGCAACAACCACTGTTTCAACCTCTGCCACTTCTCTCTCTGCTACTGTAATGGTCTCTAAATTCACTTCTCCAGCAACTAGTTCCATGGAAGCAACTTCTATCAGGGAACCATCAACAACCATCCTCACAACAGAGACCACGAATGGCCCAGGCTCTATGGCTGTGGCTTCTACCAACATCCCAATTGGAAAGGGCTACATTACTGAAGGAAGATTGGACACAAGCCATCTGCCCATTGGAACCACAGCTTCCTCTGAGACATCTATGGATTTTACCATGGCCAAAGAAAGTGTCTCAATGTCAGTATCTCCATCTCAGTCCATGGATGCTGCTGGCTCAAGCACTCCAGGAAGGACAAGCCAATTCGTTGACACATTTTCTGATGATGTCTATCATTTAACATCCAGAGAAATTACAATACCTAGAGATGGAACAAGCTCAGCTCTGACTCCACAAATGACTGCAACTCACCCTCCATCTCCTGATCCTGGCTCTGCTAGAAGCACCTGGCTTGGCATCTTGTCCTCATCTCCTTCTTCTCCTACTCCCAAAGTCACAATGAGCTCCACATTTTCAACTCAGAGAGTCACCACAAGCATGATAATGGACACAGTTGAAACTAGTCGGTGGAACATGCCCAACTTACCTTCCACGACTTCCTTGACACCAAGTAATATTCCAACAAGTGGTGCCATAGGAAAAAGCACCCTGGTTCCCTTGGACACTCCATCTCCAGCCACATCATTGGAGGCATCAGAAGGGGGACTTCCAACCCTCAGCACCTACCCTGAATCAACAAACACACCCAGCATCCACCTCGGAGCACACGCTAGTTCAGAAAGTCCAAGCACCATCAAACTTACCATGGCTTCAGTAGTAAAACCTGGCTCTTACACACCTCTCACCTTCCCCTCAATAGAGACCCACATTCATGTATCAACAGCCAGAATGGCTTACTCTTCTGGGTCTTCACCTGAGATGACAGCTCCTGGAGAGACTAACACTGGTAGTACCTGGGACCCCACCACCTACATCACCACTACGGATCCTAAGGATACAAGTTCAGCTCAGGTCTCTACACCCCACTCAGTGAGGACACTCAGAACCACAGAAAACCATCCAAAGACAGAGTCCGCCACCCCAGCTGCTTACTCTGGAAGTCCTAAAATCTCAAGTTCACCCAATCTCACCAGTCCGGCCACAAAAGCATGGACCATCACAGACACAACTGAACACTCCACTCAATTACATTACACAAAATTGGCAGAAAAATCATCTGGATTTGAGACACAGTCAGCTCCAGGACCTGTCTCTGTAGTAATCCCTACCTCCCCTACCATTGGAAGCAGCACATTGGAACTAACTTCTGATGTCCCAGGGGAACCCCTGGTCCTTGCTCCCAGTGAGCAGACCACAATCACTCTCCCCATGGCAACATGGCTGAGTACCAGTTTGACAGAGGAAATGGCTTCAACAGACCTTGATATTTCAAGTCCAAGTTCACCCATGAGTACATTTGCTATTTTTCCACCTATGTCCACACCTTCTCATGAACTTTCAAAGTCAGAGGCAGATACCAGTGCCATTAGAAATACAGATTCAACAACGTTGGATCAGCACCTAGGAATCAGGAGTTTGGGCAGAACTGGGGACTTAACAACTGTTCCTATCACCCCACTGACAACCACGTGGACCAGTGTGATTGAACACTCAACACAAGCACAGGACACCCTTTCTGCAACGATGAGTCCTACTCACGTGACACAGTCACTCAAAGATCAAACATCTATACCAGCCTCAGCATCCCCTTCCCATCTTACTGAAGTCTACCCTGAGCTCGGGACACAAGGGAGAAGCTCCTCTGAGGCAACCACTTTTTGGAAACCATCTACAGACACACTGTCCAGAGAGATTGAGACTGGCCCAACAAACATTCAATCCACTCCACCCATGGACAACACAACAACAGGGAGCAGTAGTAGTGGAGTCACCCTGGGCATAGCCCACCTTCCCATAGGAACATCCTCCCCAGCTGAGACATCCACAAACATGGCACTGGAAAGAAGAAGTTCTACAGCCACTGTCTCTATGGCTGGGACAATGGGACTCCTTGTTACTAGTGCTCCAGGAAGAAGCATCAGCCAGTCATTAGGAAGAGTTTCCTCTGTCCTTTCTGAGTCAACTACTGAAGGAGTCACAGATTCTAGTAAGGGAAGCAGCCCAAGGCTGAACACACAGGGAAATACAGCTCTCTCCTCCTCTCTTGAACCCAGCTATGCTGAAGGAAGCCAGATGAGCACAAGCATCCCTCTAACCTCATCTCCTACAACTCCTGATGTGGAATTCATAGGGGGCAGCACATTTTGGACCAAGGAGGTCACCACAGTTATGACCTCAGACATCTCCAAGTCTTCAGCAAGGACAGAGTCCAGCTCAGCTACCCTTATGTCCACAGCTTTGGGAAGCACTGAAAATACAGGAAAAGAAAAACTCAGAACTGCCTCTATGGATCTTCCATCTCCAACTCCATCAATGGAGGTGACACCATGGATTTCTCTCACTCTCAGTAATGCCCCCAATACCACAGATTCACTTGACCTCAGCCATGGGGTGCACACCAGCTCTGCAGGGACTTTGGCCACTGACAGGTCATTGAATACTGGTGTCACTAGAGCCTCCAGATTGGAAAACGGCTCTGATACCTCTTCTAAGTCCCTGTCTATGGGAAACAGCACTCACACTTCCATGACTTACACAGAGAAGAGTGAAGTGTCTTCTTCAATCCATCCCCGACCTGAGACCTCAGCTCCTGGAGCAGAGACCACTTTGACTTCCACTCCTGGAAACAGGGCCATAAGCTTAACATTGCCTTTTTCATCCATTCCAGTGGAAGAAGTCATTTCTACAGGCATAACCTCAGGACCAGACATCAACTCAGCACCCATGACACATTCTCCCATCACCCCACCAACAATTGTATGGACCAGTACAGGCACAATTGAACAGTCCACTCAACCACTACATGCAGTTTCTTCAGAAAAAGTTTCTGTGCAGACACAGTCAACTCCATATGTCAACTCTGTGGCAGTGTCTGCTTCCCCTACCCATGAGAATTCAGTCTCTTCTGGAAGCAGCACATCCTCTCCATATTCCTCAGCCTCACTTGAATCCTTGGATTCCACAATCAGTAGGAGGAATGCAATCACTTCCTGGCTATGGGACCTCACTACATCTCTCCCCACTACAACTTGGCCAAGTACTAGTTTATCTGAGGCACTGTCCTCAGGCCATTCTGGGGTTTCAAACCCAAGTTCAACTACGACTGAATTTCCACTCTTTTCAGCTGCATCCACATCTGCTGCTAAGCAAAGAAATCCAGAAACAGAGACCCATGGTCCCCAGAATACAGCCGCGAGTACTTTGAACACTGATGCATCCTCGGTCACAGGTCTTTCTGAGACTCCTGTGGGGGCAAGTATCAGCTCTGAAGTCCCTCTTCCAATGGCCATAACTTCTAGATCAGATGTTTCTGGCCTTACATCTGAGAGTACTGCTAACCCGAGTTTAGGCACAGCCTCTTCAGCAGGGACCAAATTAACTAGGACAATATCCCTGCCCACTTCAGAGTCTTTGGTTTCCTTTAGAATGAACAAGGATCCATGGACAGTGTCAATCCCTTTGGGGTCCCATCCAACTACTAATACAGAAACAAGCATCCCAGTAAACAGCGCAGGTCCACCTGGCTTGTCCACAGTAGCATCAGATGTAATTGACACACCTTCAGATGGGGCTGAGAGTATTCCCACTGTCTCCTTTTCCCCCTCCCCTGATACTGAAGTGACAACTATCTCACATTTCCCAGAAAAGACAACTCATTCATTTAGAACCATTTCATCTCTCACTCATGAGTTGACTTCAAGAGTGACACCTATTCCTGGGGATTGGATGAGTTCAGCTATGTCTACAAAGCCCACAGGAGCCAGTCCCTCCATTACACTGGGAGAGAGAAGGACAATCACCTCTGCTGCTCCAACCACTTCCCCCATAGTTCTCACTGCTAGTTTCACAGAGACCAGCACAGTTTCACTGGATAATGAAACTACAGTAAAAACCTCAGATATCCTTGACGCACGGAAAACAAATGAGCTCCCCTCAGATAGCAGTTCTTCTTCTGATCTGATCAACACCTCCATAGCTTCTTCAACTATGGATGTCACTAAAACAGCCTCCATCAGTCCCACTAGCATCTCAGGAATGACAGCAAGTTCCTCCCCATCTCTCTTCTCTTCAGATAGACCCCAGGTTCCCACATCTACAACAGAGACAAATACAGCCACCTCTCCATCTGTTTCCAGTAACACCTATTCTCTTGATGGGGGCTCCAATGTGGGTGGCACTCCATCCACTTTACCACCCTTTACAATCACCCACCCTGTCGAGACAAGCTCGGCCCTATTAGCCTGGTCTAGACCAGTAAGAACTTTCAGCACCATGGTCAGCACTGACACTGCCTCCGGAGAAAATCCTACCTCTAGCAATTCTGTGGTGACTTCTGTTCCAGCACCAGGTACATGGACCAGTGTAGGCAGTACTACTGACTTACCTGCCATGGGCTTTCTCAAGACAAGTCCTGCAGGAGAGGCACACTCACTTCTAGCATCAACTATTGAACCAGCCACTGCCTTCACTCCCCATCTCTCAGCAGCAGTGGTCACTGGATCCAGTGCTACATCAGAAGCCAGTCTTCTCACTACGAGTGAAAGCAAAGCCATTCATTCTTCACCACAGACCCCAACTACACCCACCTCTGGAGCAAACTGGGAAACTTCAGCTACTCCTGAGAGCCTTTTGGTAGTCACTGAGACTTCAGACACAACACTTACCTCAAAGATTTTGGTCACAGATACCATCTTGTTTTCAACTGTGTCCACGCCACCTTCTAAATTTCCAAGTACGGGGACTCTGTCTGGAGCTTCCTTCCCTACTTTACTCCCGGACACTCCAGCCATCCCTCTCACTGCCACTGAGCCAACAAGTTCATTAGCTACATCCTTTGATTCCACCCCACTGGTGACTATAGCTTCGGATAGTCTTGGCACAGTCCCAGAGACTACCCTGACCATGTCAGAGACCTCAAATGGTGATGCACTGGTTCTTAAGACAGTAAGTAACCCAGATAGGAGCATCCCTGGAATCACTATCCAAGGAGTAACAGAAAGTCCACTCCATCCTTCTTCCACTTCCCCCTCTAAGATTGTTGCTCCACGGAATACAACCTATGAAGGTTCGATCACAGTGGCACTTTCTACTTTGCCTGCGGGAACTACTGGTTCCCTTGTATTCAGTCAGAGTTCTGAAAACTCAGAGACAACGGCTTTGGTAGACTCATCAGCTGGGCTTGAGAGGGCATCTGTGATGCCACTAACCACAGGAAGCCAGGGTATGGCTAGCTCTGGAGGAATCAGAAGTGGGTCCACTCACTCAACTGGAACCAAAACATTTTCTTCTCTCCCTCTGACCATGAACCCAGGTGAGGTTACAGCCATGTCTGAAATCACCACGAACAGACTGACAGCTACTCAATCAACAGCACCCAAAGGGATACCTGTGAAGCCCACCAGTGCTGAGTCAGGCCTCCTAACACCTGTCTCTGCCTCCTCAAGCCCATCAAAGGCCTTTGCCTCACTGACTACAGCTCCCCCAACTTGGGGGATCCCACAGTCTACCTTGACATTTGAGTTTTCTGAGGTCCCAAGTTTGGATACTAAGTCCGCTTCTTTACCAACTCCTGGACAGTCCCTGAACACCATTCCAGACTCAGATGCAAGCACAGCATCTTCCTCACTGTCCAAGTCTCCAGAAAAAAACCCAAGGGCAAGGATGATGACTTCCACAAAGGCCATAAGTGCAAGCTCATTTCAATCAACAGGTTTTACTGAAACCCCTGAGGGATCTGCCTCCCCTTCTATGGCAGGGCATGAACCCAGAGTCCCCACTTCAGGAACAGGGGACCCTAGATATGCCTCAGAGAGCATGTCTTATCCAGACCCAAGCAAGGCATCATCAGCTATGACATCGACCTCTCTTGCATCAAAACTCACAACTCTCTTCAGCACAGGTCAAGCAGCAAGGTCTGGTTCTAGTTCCTCTCCCATAAGCCTATCCACTGAGAAAGAAACAAGCTTCCTTTCCCCCACTGCATCCACCTCCAGAAAGACTTCACTATTTCTTGGGCCTTCCATGGCAAGGCAGCCCAACATATTGGTGCATCTTCAGACTTCAGCTCTGACACTTTCTCCAACATCCACTCTAAATATGTCCCAGGAGGAGCCTCCTGAGTTAACCTCAAGCCAGACCATTGCAGAAGAAGAGGGAACAACAGCTGAAACACAGACGTTAACCTTCACACCATCTGAGACCCCAACATCCTTGTTACCTGTCTCTTCTCCCACAGAACCCACAGCCAGAAGAAAGAGTTCTCCAGAAACATGGGCAAGCTCTATTTCAGTTCCTGCCAAGACCTCCTTGGTTGAAACAACTGATGGAACGCTAGTGACCACCATAAAGATGTCAAGCCAGGCAGCACAAGGAAATTCCACGTGGCCTGCCCCAGCAGAGGAGACGGGGAGCAGTCCAGCAGGCACATCCCCAGGAAGCCCAGAAATGTCTACCACTCTCAAAATCATGAGCTCCAAGGAACCCAGCATCAGCCCAGAGATCAGGTCCACTGTGAGAAATTCTCCTTGGAAGACTCCAGAAACAACTGTTCCCATGGAGACCACAGTGGAACCAGTCACCCTTCAGTCCACAGCCCTAGGAAGTGGCAGCACCAGCATCTCTCACCTGCCCACAGGAACCACATCACCAACCAAGTCACCAACAGAAAATATGTTGGCTACAGAAAGGGTCTCCCTCTCCCCATCCCCACCTGAGGCTTGGACCAACCTTTATTCTGGAACTCCAGGAGGGACCAGGCAGTCACTGGCCACAATGTCCTCTGTCTCCCTAGAGTCACCAACTGCTAGAAGCATCACAGGGACTGGTCAGCAAAGCAGTCCAGAACTGGTTTCAAAGACAACTGGAATGGAATTCTCTATGTGGCATGGCTCTACTGGAGGGACCACAGGGGACACACATGTCTCTCTGAGCACATCTTCCAATATCCTTGAAGACCCTGTAACCAGCCCAAACTCTGTGAGCTCATTGACAGATAAATCCAAACATAAAACCGAGACATGGGTAAGCACCACAGCCATTCCCTCCACTGTCCTGAATAATAAGATAATGGCAGCTGAACAACAGACAAGTCGATCTGTGGATGAGGCTTATTCATCAACTAGTTCTTGGTCAGATCAGACATCTGGGAGTGACATCACCCTTGGTGCATCTCCTGATGTCACAAACACATTATACATCACCTCCACAGCACAAACCACCTCACTAGTGTCTCTGCCCTCTGGAGACCAAGGCATTACAAGCCTCACCAATCCCTCAGGAGGAAAAACAAGCTCTGCGTCATCTGTCACATCTCCTTCAATAGGGCTTGAGACTCTGAGGGCCAATGTAAGTGCAGTGAAAAGTGACATTGCCCCTACTGCTGGGCATCTATCTCAGACTTCATCTCCTGCGGAAGTGAGCATCCTGGACGTAACCACAGCTCCTACTCCAGGTATCTCCACCACCATCACCACCATGGGAACCAACTCAATCTCAACTACCACACCCAACCCAGAAGTGGGTATGAGTACCATGGACAGCACCCCGGCCACAGAGAGGCGCACAACTTCTACAGAACACCCTTCCACCTGGTCTTCCACAGCTGCATCAGATTCCTGGACTGTCACAGACATGACTTCAAACTTGAAAGTTGCAAGATCTCCTGGAACAATTTCCACAATGCATACAACTTCATTCTTAGCCTCAAGCACTGAATTAGACTCCATGTCTACTCCCCATGGCCGTATAACTGTCATTGGAACCAGCCTGGTCACTCCATCCTCTGATGCTTCAGCTGTAAAGACAGAGACCAGTACAAGTGAAAGAACATTGAGTCCTTCAGACACAACTGCATCTACTCCCATCTCAACTTTTTCTCGTGTCCAGAGGATGAGCATCTCAGTTCCTGACATTTTAAGTACAAGTTGGACTCCCAGTAGTACAGAAGCAGAAGATGTGCCTGTTTCAATGGTTTCTACAGATCATGCTAGTACAAAGACTGACCCAAATACGCCCCTGTCCACTTTTCTGTTTGATTCTCTGTCCACTCTTGACTGGGACACTGGGAGATCTCTGTCATCAGCCACAGCCACTACCTCAGCTCCTCAGGGGGCCACAACTCCCCAGGAACTCACTTTGGAAACCATGATCAGCCCAGCTACCTCACAGTTGCCCTTCTCTATAGGGCACATTACAAGTGCAGTCACACCAGCTGCAATGGCAAGGAGCTCTGGAGTTACTTTTTCAAGACCAGATCCCACAAGCAAAAAGGCAGAGCAGACTTCCACTCAGCTTCCCACCACCACTTCTGCACATCCAGGGCAGGTGCCCAGATCAGCAGCAACAACTCTGGATGTGATCCCACACACAGCAAAAACTCCAGATGCAACTTTTCAGAGACAAGGGCAGACAGCTCTTACAACAGAGGCAAGAGCTACATCTGACTCCTGGAATGAGAAAGAAAAATCAACCCCAAGTGCACCTTGGATCACTGAGATGATGAATTCTGTCTCAGAAGATACCATCAAGGAGGTTACCAGCTCCTCCAGTGTATTAAGGACCCTGAATACGCTGGACATAAACTTGGAATCTGGGACGACTTCATCCCCAAGTTGGAAAAGCAGCCCATATGAGAGAATTGCCCCTTCTGAGTCCACCACAGACAAAGAGGCAATTCACCCTTCTACAAACACAGTAGAGACCACAGGCTGGGTCACAAGTTCCGAACATGCTTCTCATTCCACTATCCCAGCCCACTCAGCGTCATCCAAACTCACATCTCCAGTGGTTACAACCTCCACCAGGGAACAAGCAATAGTTTCTATGTCAACAACCACATGGCCAGAGTCTACAAGGGCTAGAACAGAGCCTAATTCCTTCTTGACTATTGAACTGAGGGACGTCAGCCCTTACATGGACACCAGCTCAACCACACAAACAAGTATTATCTCTTCCCCAGGTTCCACTGCGATCACCAAGGGGCCTAGAACAGAAATTACCTCCTCTAAGAGAATATCCAGCTCATTCCTTGCCCAGTCTATGAGGTCGTCAGACAGCCCCTCAGAAGCCATCACCAGGCTGTCTAACTTTCCTGCCATGACAGAATCTGGAGGAATGATCCTTGCTATGCAAACAAGTCCACCTGGCGCTACATCACTAAGTGCACCTACTTTGGATACATCAGCCACAGCCTCCTGGACAGGGACTCCACTGGCTACGACTCAGAGATTTACATACTCAGAGAAGACCACTCTCTTTAGCAAAGGTCCTGAGGATACATCACAGCCAAGCCCTCCCTCTGTGGAAGAAACCAGCTCTTCCTCTTCCCTGGTACCTATCCATGCTACAACCTCGCCTTCCAATATTTTGTTGACATCACAAGGGCACAGTCCCTCCTCTACTCCACCTGTGACCTCAGTTTTCTTGTCTGAGACCTCTGGCCTGGGGAAGACCACAGACATGTCGAGGATAAGCTTGGAACCTGGCACAAGTTTACCTCCCAATTTGAGCAGTACAGCAGGTGAGGCGTTATCCACTTATGAAGCCTCCAGAGATACAAAGGCAATTCATCATTCTGCAGACACAGCAGTGACGAATATGGAGGCAACCAGTTCTGAATATTCTCCTATCCCAGGCCATACAAAGCCATCCAAAGCCACATCTCCATTGGTTACCTCCCACATCATGGGGGACATCACTTCTTCCACATCAGTATTTGGCTCCTCCGAGACCACAGAGATTGAGACAGTGTCCTCTGTGAACCAGGGACTTCAGGAGAGAAGCACATCCCAGGTGGCCAGCTCTGCTACAGAGACAAGCACTGTCATTACCCATGTGTCTAGTGGTGATGCTACTACTCATGTCACCAAGACACAAGCCACTTTCTCTAGCGGAACATCCATCTCAAGCCCTCATCAGTTTATAACTTCTACCAACACATTTACAGATGTGAGCACCAACCCCTCCACCTCTCTGATAATGACAGAATCTTCAGGAGTGACCATCACCACCCAAACAGGTCCTACTGGAGCTGCAACACAGGGTCCATATCTCTTGGACACATCAACCATGCCTTACTTGACAGAGACTCCATTAGCTGTGACTCCAGATTTTATGCAATCAGAGAAGACCACTCTCATAAGCAAAGGTCCCAAGGATGTGTCCTGGACAAGCCCTCCCTCTGTGGCAGAAACCAGCTATCCCTCTTCCCTGACACCTTTCTTGGTCACAACCATACCTCCTGCCACTTCCACGTTACAAGGGCAACATACATCCTCTCCTGTTTCTGCGACTTCAGTTCTTACCTCTGGACTGGTGAAGACCACAGATATGTTGAACACAAGCATGGAACCTGTGACCAATTCACCTCAAAATTTGAACAATCCATCAAATGAGATACTGGCCACTTTGGCAGCCACCACAGATATAGAGACTATTCATCCTTCCATAAACAAAGCAGTGACCAATATGGGGACTGCCAGTTCAGCACATGTACTGCATTCCACTCTCCCAGTCAGCTCAGAACCATCTACAGCCACATCTCCAATGGTTCCTGCCTCCAGCATGGGGGACGCTCTTGCTTCTATATCAATACCTGGTTCTGAGACCACAGACATTGAGGGAGAGCCAACATCCTCCCTGACTGCTGGACGAAAAGAGAACAGCACCCTCCAGGAGATGAACTCAACTACAGAGTCAAACATCATCCTCTCCAATGTGTCTGTGGGGGCTATTACTGAAGCCACAAAAATGGAAGTCCCCTCTTTTGATGCAACATTCATACCAACTCCTGCTCAGTCAACAAAGTTCCCAGATATTTTCTCAGTAGCCAGCAGTAGACTTTCAAACTCTCCTCCCATGACAATATCTACCCACATGACCACCACCCAGACAGGGTCTTCTGGAGCTACATCAAAGATTCCACTTGCCTTAGACACATCAACCTTGGAAACCTCAGCAGGGACTCCATCAGTGGTGACTGAGGGGTTTGCCCACTCAAAAATAACCACTGCAATGAACAATGATGTCAAGGACGTGTCACAGACAAACCCTCCCTTTCAGGATGAAGCCAGCTCTCCCTCTTCTCAAGCACCTGTCCTTGTCACAACCTTACCTTCTTCTGTTGCTTTCACACCGCAATGGCACAGTACCTCCTCTCCTGTTTCTATGTCCTCAGTTCTTACTTCTTCACTGGTAAAGACCGCAGGCAAGGTGGATACAAGCTTAGAAACAGTGACCAGTTCACCTCAAAGTATGAGCAACACTTTGGATGACATATCGGTCACTTCAGCAGCCACCACAGATATAGAGACAACGCATCCTTCCATAAACACAGTAGTTACCAATGTGGGGACCACCGGTTCAGCATTTGAATCACATTCTACTGTCTCAGCTTACCCAGAGCCATCTAAAGTCACATCTCCAAATGTTACCACCTCCACCATGGAAGACACCACAATTTCCAGATCAATACCTAAATCCTCTAAGACTACAAGAACTGAGACTGAGACAACTTCCTCCCTGACTCCTAAACTGAGGGAGACCAGCATCTCCCAGGAGATCACCTCGTCCACAGAGACAAGCACTGTTCCTTACAAAGAGCTCACTGGTGCCACTACCGAGGTATCCAGGACAGATGTCACTTCCTCTAGCAGTACATCCTTCCCTGGCCCTGATCAGTCCACAGTGTCACTAGACATCTCCACAGAAACCAACACCAGGCTGTCTACCTCCCCAATAATGACAGAATCTGCAGAAATAACCATCACCACCCAAACAGGTCCTCATGGGGCTACATCACAGGATACTTTTACCATGGACCCATCAAATACAACCCCCCAGGCAGGGATCCACTCAGCTATGACTCATGGATTTTCACAATTGGATGTGACCACTCTTATGAGCAGAATTCCACAGGATGTATCATGGACAAGTCCTCCCTCTGTGGATAAAACCAGCTCCCCCTCTTCCTTTCTGTCCTCACCTGCAATGACCACACCTTCCCTGATTTCTTCTACCTTACCAGAGGATAAGCTCTCCTCTCCTATGACTTCACTTCTCACCTCTGGCCTAGTGAAGATTACAGACATATTACGTACACGCTTGGAACCTGTGACCAGCTCACTTCCAAATTTCAGCAGCACCTCAGATAAGATACTGGCCACTTCTAAAGACAGTAAAGACACAAAGGAAATTTTTCCTTCTATAAACACAGAAGAGACCAATGTGAAAGCCAACAACTCTGGACATGAATCCCATTCCCCTGCACTGGCTGACTCAGAGACACCCAAAGCCACAACTCAAATGGTTATCACCACCACTGTGGGAGATCCAGCTCCTTCCACATCAATGCCAGTGCATGGTTCCTCTGAGACTACAAACATTAAGAGAGAGCCAACATATTTCTTGACTCCTAGACTGAGAGAGACCAGTACCTCTCAGGAGTCCAGCTTTCCCACGGACACAAGTTTTCTACTTTCCAAAGTCCCCACTGGTACTATTACTGAGGTCTCCAGTACAGGGGTCAACTCTTCTAGCAAAATTTCCACCCCAGACCATGATAAGTCCACAGTGCCACCTGACACCTTCACAGGAGAGATCCCCAGGGTCTTCACCTCCTCTATTAAGACAAAATCTGCAGAAATGACGATCACCACCCAAGCAAGTCCTCCTGAGTCTGCATCGCACAGTACCCTTCCCTTGGACACATCAACCACACTTTCCCAGGGAGGGACTCATTCAACTGTGACTCAGGGATTCCCATACTCAGAGGTGACCACTCTCATGGGCATGGGTCCTGGGAATGTGTCATGGATGACAACTCCCCCTGTGGAAGAAACCAGCTCTGTGTCTTCCCTGATGTCTTCACCTGCCATGACATCCCCTTCTCCTGTTTCCTCCACATCACCACAGAGCATCCCCTCCTCTCCTCTTCCTGTGACTGCACTTCCTACTTCTGTTCTGGTGACAACCACAGATGTGTTGGGCACAACAAGCCCAGAGTCTGTAACCAGTTCACCTCCAAATTTGAGCAGCATCACTCATGAGAGACCGGCCACTTACAAAGACACTGCACACACAGAAGCCGCCATGCATCATTCCACAAACACCGCAGTGACCAATGTAGGGACTTCCGGGTCTGGACATAAATCACAATCCTCTGTCCTAGCTGACTCAGAGACATCGAAAGCCACACCTCTGATGAGTACCACCTCCACCCTGGGGGACACAAGTGTTTCCACATCAACTCCTAATATCTCTCAGACTAACCAAATTCAAACAGAGCCAACAGCATCCCTGAGCCCTAGACTGAGGGAGAGCAGCACGTCTGAGAAGACCAGCTCAACAACAGAGACAAATACTGCCTTTTCTTATGTGCCCACAGGTGCTATTACTCAGGCCTCCAGAACAGAAATCTCCTCTAGCAGAACATCCATCTCAGACCTTGATCGGCCCACAATAGCACCCGACATCTCCACAGGAATGATCACCAGGCTCTTCACCTCCCCCATCATGACAAAATCTGCAGAAATGACCGTCACCACTCAAACAACTACTCCTGGGGCTACATCACAGGGTATCCTTCCCTGGGACACATCAACCACACTTTTCCAGGGAGGGACTCATTCAACCGTGTCTCAGGGATTCCCACACTCAGAGATAACCACTCTTCGGAGCAGAACCCCTGGAGATGTGTCATGGATGACAACTCCCCCTGTGGAAGAAACCAGCTCTGGGTTTTCCCTGATGTCACCTTCCATGACATCCCCTTCTCCTGTTTCCTCCACATCACCAGAGAGCATCCCCTCCTCTCCTCTCCCTGTGACTGCACTTCTTACTTCTGTTCTGGTGACAACCACAAATGTATTGGGCACAACAAGCCCAGAGCCCGTAACGAGTTCACCTCCAAATTTAAGCAGCCCCACACAGGAGAGACTGACCACTTACAAAGACACTGCGCACACAGAAGCCATGCATGCTTCCATGCATACAAACACTGCAGTGGCCAACGTGGGGACCTCCATTTCTGGACATGAATCACAATCTTCTGTCCCAGCTGATTCACACACATCCAAAGCCACATCTCCAATGGGTATCACCTTCGCCATGGGGGATACAAGTGTTTCTACATCAACTCCTGCCTTCTTTGAGACTAGAATTCAGACTGAATCAACATCCTCTTTGATTCCTGGATTAAGGGACACCAGGACGTCTGAGGAGATCAACACTGTGACAGAGACCAGCACTGTCCTTTCAGAAGTGCCCACTACTACTACTACTGAGGTCTCCAGGACAGAAGTTATCACTTCCAGCAGAACAACCATCTCAGGGCCTGATCATTCCAAAATGTCACCCTACATCTCCACAGAAACCATCACCAGGCTCTCCACTTTTCCTTTTGTAACAGGATCCACAGAAATGGCCATCACCAACCAAACAGGTCCTATAGGGACTATCTCACAGGCTACCCTTACCCTGGACACATCAAGCACAGCTTCCTGGGAAGGGACTCACTCACCTGTGACTCAGAGATTTCCACACTCAGAGGAGACCACTACTATGAGCAGAAGTACTAAGGGCGTGTCATGGCAAAGCCCTCCCTCTGTGGAAGAAACCAGTTCTCCTTCTTCCCCAGTGCCTTTACCTGCAATAACCTCACATTCATCTCTTTATTCCGCAGTATCAGGAAGTAGCCCCACTTCTGCTCTCCCTGTGACTTCCCTTCTCACCTCTGGCAGGAGGAAGACCATAGACATGTTGGACACACACTCAGAACTTGTGACCAGCTCCTTACCAAGTGCAAGTAGCTTCTCAGGTGAGATACTCACTTCTGAAGCCTCCACAAATACAGAGACAATTCACTTTTCAGAGAACACAGCAGAAACCAATATGGGGACCACCAATTCTATGCATAAACTACATTCCTCTGTCTCAATCCACTCCCAGCCATCCGGACACACACCTCCAAAGGTTACTGGATCTATGATGGAGGACGCTATTGTTTCCACATCAACACCTGGTTCTCCTGAGACTAAAAATGTTGACAGAGACTCAACATCCCCTCTGACTCCTGAACTGAAAGAGGACAGCACCGCCCTGGTGATGAACTCAACTACAGAGTCAAACACTGTTTTCTCCAGTGTGTCCCTGGATGCTGCTACTGAGGTCTCCAGGGCAGAAGTCACCTACTATGATCCTACATTCATGCCAGCTTCTGCTCAGTCAACAAAGTCCCCAGACATTTCACCTGAAGCCAGCAGCAGTCATTCTAACTCTCCTCCCTTGACAATATCTACACACAAGACCATCGCCACACAAACAGGTCCTTCTGGGGTGACATCTCTTGGCCAACTGACCCTGGACACATCAACCATAGCCACCTCAGCAGGAACTCCATCAGCCAGAACTCAGGATTTTGTAGATTCAGAAACAACCAGTGTCATGAACAATGATCTCAATGATGTGTTGAAGACAAGCCCTTTCTCTGCAGAAGAAGCCAACTCTCTCTCTTCTCAGGCACCTCTCCTTGTGACAACCTCACCTTCTCCTGTAACTTCCACATTGCAAGAGCACAGTACCTCCTCTCTTGTTTCTGTGACCTCAGTACCCACCCCTACACTGGCGAAGATCACAGACATGGACACAAACTTAGAACCTGTGACTCGTTCACCTCAAAATTTAAGGAACACCTTGGCCACTTCAGAAGCCACCACAGATACACACACAATGCATCCTTCTATAAACACAGCAGTGGCCAATGTGGGGACCACCAGTTCACCAAATGAATTCTATTTTACTGTCTCACCTGACTCAGACCCATATAAAGCCACATCCGCAGTAGTTATCACTTCCACCTCGGGGGACTCAATAGTTTCCACATCAATGCCTAGATCCTCTGCGATGAAAAAGATTGAGTCTGAGACAACTTTCTCCCTGATATTTAGACTGAGGGAGACTAGCACCTCCCAGAAAATTGGCTCATCCTCAGACACAAGCACGGTCTTTGACAAAGCATTCACTGCTGCTACTACTGAGGTCTCCAGAACAGAACTCACCTCCTCTAGCAGAACATCCATCCAAGGCACTGAAAAGCCCACAATGTCACCGGACACCTCCACAAGATCTGTCACCATGCTTTCTACTTTTGCTGGCCTGACAAAATCCGAAGAAAGGACCATTGCCACCCAAACAGGTCCTCATAGGGCGACATCACAGGGTACCCTTACCTGGGACACATCAATCACAACCTCACAGGCAGGGACCCACTCAGCTATGACTCATGGATTTTCACAATTAGATTTGTCCACTCTTACGAGTAGAGTTCCTGAGTACATATCAGGGACAAGCCCACCCTCTGTGGAAAAAACCAGCTCTTCCTCTTCCCTTCTGTCTTTACCAGCAATAACCTCACCGTCCCCTGTACCTACTACATTACCAGAAAGTAGGCCGTCTTCTCCTGTTCATCTGACTTCACTCCCCACCTCTGGCCTAGTGAAGACCACAGATATGCTGGCATCTGTGGCCAGTTTACCTCCAAACTTGGGCAGCACCTCACATAAGATACCGACTACTTCAGAAGACATTAAAGATACAGAGAAAATGTATCCTTCCACAAACATAGCAGTAACCAATGTGGGGACCACCACTTCTGAAAAGGAATCTTATTCGTCTGTCCCAGCCTACTCAGAACCACCCAAAGTCACCTCTCCAATGGTTACCTCTTTCAACATAAGGGACACCATTGTTTCCACATCCATGCCTGGCTCCTCTGAGATTACAAGGATTGAGATGGAGTCAACATTCTCCCTGGCTCATGGGCTGAAGGGAACCAGCACCTCCCAGGACCCCATCGTATCCACAGAGAAAAGTGCTGTCCTTCACAAGTTGACCACTGGTGCTACTGAGACCTCTAGGACAGAAGTTGCCTCTTCTAGAAGAACATCCATTCCAGGCCCTGATCATTCCACAGAGTCACCAGACATCTCCACTGAAGTGATCCCCAGCCTGCCTATCTCCCTTGGCATTACAGAATCTTCAAATATGACCATCATCACTCGAACAGGTCCTCCTCTTGGCTCTACATCACAGGGCACATTTACCTTGGACACACCAACTACATCCTCCAGGGCAGGAACACACTCGATGGCGACTCAGGAATTTCCACACTCAGAAATGACCACTGTCATGAACAAGGACCCTGAGATTCTATCATGGACAATCCCTCCTTCTATAGAGAAAACCAGCTTCTCCTCTTCCCTGATGCCTTCACCAGCCATGACTTCACCTCCTGTTTCCTCAACATTACCAAAGACCATTCACACCACTCCTTCTCCTATGACCTCACTGCTCACCCCTAGCCTAGTGATGACCACAGACACATTGGGCACAAGCCCAGAACCTACAACCAGTTCACCTCCAAATTTGAGCAGTACCTCACATGAGATACTGACAACAGATGAAGACACCACAGCTATAGAAGCCATGCATCCTTCCACAAGCACAGCAGCGACTAATGTGGAAACCACCAGTTCTGGACATGGGTCACAATCCTCTGTCCTAGCTGACTCAGAAAAAACCAAGGCCACAGCTCCAATGGATACCACCTCCACCATGGGGCATACAACTGTTTCCACATCAATGTCTGTTTCCTCTGAGACTACAAAAATTAAGAGAGAGTCAACATATTCCTTGACTCCTGGACTGAGAGAGACCAGCATTTCCCAAAATGCCAGCTTTTCCACTGACACAAGTATTGTTCTTTCAGAAGTCCCCACTGGTACTACTGCTGAGGTCTCCAGGACAGAAGTCACCTCCTCTGGTAGAACATCCATCCCTGGCCCTTCTCAGTCCACAGTTTTGCCAGAAATATCCACAAGAACAATGACAAGGCTCTTTGCCTCGCCCACCATGACAGAATCAGCAGAAATGACCATCCCCACTCAAACAGGTCCTTCTGGGTCTACCTCACAGGATACCCTTACCTTGGACACATCCACCACAAAGTCCCAGGCAAAGACTCATTCAACTTTGACTCAGAGATTTCCACACTCAGAGATGACCACTCTCATGAGCAGAGGTCCTGGAGATATGTCATGGCAAAGCTCTCCCTCTCTGGAAAATCCCAGCTCTCTCCCTTCCCTGCTGTCTTTACCTGCCACAACCTCACCTCCTCCCATTTCCTCCACATTACCAGTGACTATCTCCTCCTCTCCTCTTCCTGTGACTTCACTTCTCACCTCTAGCCCGGTAACGACCACAGACATGTTACACACAAGCCCAGAACTTGTAACCAGTTCACCTCCAAAGCTGAGCCACACTTCAGATGAGAGACTGACCACTGGCAAGGACACCACAAATACAGAAGCTGTGCATCCTTCCACAAACACAGCAGCGTCCAATGTGGAGATTCCCAGCTCTGGACATGAATCCCCTTCCTCTGCCTTAGCTGACTCAGAGACATCCAAAGCCACATCACCAATGTTTATTACCTCCACCCAGGAGGATACAACTGTTGCCATATCAACCCCTCACTTCTTGGAGACTAGCAGAATTCAGAAAGAGTCAATTTCCTCCCTGAGCCCTAAATTGAGGGAGACAGGCAGTTCTGTGGAGACAAGCTCAGCCATAGAGACAAGTGCTGTCCTTTCTGAAGTGTCCATTGGTGCTACTACTGAGATCTCCAGGACAGAAGTCACCTCCTCTAGCAGAACATCCATCTCTGGTTCTGCTGAGTCCACAATGTTGCCAGAAATATCCACCACAAGAAAAATCATTAAGTTCCCTACTTCCCCCATCCTGGCAGAATCATCAGAAATGACCATCAAGACCCAAACAAGTCCTCCTGGGTCTACATCAGAGAGTACCTTTACATTAGACACATCAACCACTCCCTCCTTGGTAATAACCCATTCGACTATGACTCAGAGATTGCCACACTCAGAGATAACCACTCTTGTGAGTAGAGGTGCTGGGGATGTGCCACGGCCCAGCTCTCTCCCTGTGGAAGAAACAAGCCCTCCATCTTCCCAGCTGTCTTTATCTGCCATGATCTCACCTTCTCCTGTTTCTTCCACATTACCAGCAAGTAGCCACTCCTCTTCTGCTTCTGTGACTTCACTTCTCACACCAGGCCAAGTGAAGACTACTGAGGTGTTGGACGCAAGTGCAGAACCTGAAACCAGTTCACCTCCAAGTTTGAGCAGCACCTCAGTTGAAATACTGGCCACCTCTGAAGTCACCACAGATACGGAGAAAATTCATCCTTTCTCAAACACGGCAGTAACCAAAGTTGGAACTTCCAGTTCTGGACATGAATCCCCTTCCTCTGTCCTACCTGACTCAGAGACAACCAAAGCCACATCGGCAATGGGTACCATCTCCATTATGGGGGATACAAGTGTTTCTACATTAACTCCTGCCTTATCTAACACTAGGAAAATTCAGTCAGAGCCAGCTTCCTCACTGACCACCAGATTGAGGGAGACCAGCACCTCTGAAGAGACCAGCTTAGCCACAGAAGCAAACACTGTTCTTTCTAAAGTGTCCACTGGTGCTACTACTGAGGTCTCCAGGACAGAAGCCATCTCCTTTAGCAGAACATCCATGTCAGGCCCTGAGCAGTCCACAATGTCACAAGACATCTCCATAGGAACCATCCCCAGGATTTCTGCCTCCTCTGTCCTGACAGAATCTGCAAAAATGACCATCACAACCCAAACAGGTCCTTCGGAGTCTACACTAGAAAGTACCCTTAATTTGAACACAGCAACCACACCCTCTTGGGTGGAAACCCACTCTATAGTAATTCAGGGATTTCCACACCCAGAGATGACCACTTCCATGGGCAGAGGTCCTGGAGGTGTGTCATGGCCTAGCCCTCCCTTTGTGAAAGAAACCAGCCCTCCATCCTCCCCGCTGTCTTTACCTGCCGTGACCTCACCTCATCCTGTTTCCACCACATTCCTAGCACATATCCCCCCCTCTCCCCTTCCTGTGACTTCACTTCTCACCTCTGGCCCGGCGACAACCACAGATATCTTGGGTACAAGCACAGAACCTGGAACCAGTTCATCTTCAAGTTTGAGCACCACCTCCCATGAGAGACTGACCACTTACAAAGACACTGCACATACAGAAGCCGTGCATCCTTCCACAAACACAGGAGGGACCAATGTGGCAACCACCAGCTCTGGATATAAATCACAGTCCTCTGTCCTAGCTGACTCATCTCCAATGTGTACCACCTCCACCATGGGGGATACAAGTGTTCTCACATCAACTCCTGCCTTCCTTGAGACTAGGAGGATTCAGACAGAGCTAGCTTCCTCCCTGACCCCTGGATTGAGGGAGTCCAGCGGCTCTGAAGGGACCAGCTCAGGCACCAAGATGAGCACTGTCCTCTCTAAAGTGCCCACTGGTGCTACTACTGAGATCTCCAAGGAAGACGTCACCTCCATCCCAGGTCCCGCTCAATCCACAATATCACCAGACATCTCCACAAGAACCGTCAGCTGGTTCTCTACATCCCCTGTCATGACAGAATCAGCAGAAATAACCATGAACACCCATACAAGTCCTTTAGGGGCCACAACACAAGGCACCAGTACTTTGGACACGTCAAGCACAACCTCTTTGACAATGACACACTCAACTATATCTCAAGGATTTTCACACTCACAGATGAGCACTCTTATGAGGAGGGGTCCTGAGGATGTATCATGGATGAGCCCTCCCCTTCTGGAAAAAACTAGACCTTCCTTTTCTCTGATGTCTTCACCAGCCACAACTTCACCTTCTCCTGTTTCCTCCACATTACCAGAGAGCATCTCTTCCTCTCCTCTTCCTGTGACTTCACTCCTCACGTCTGGCTTGGCAAAAACTACAGATATGTTGCACAAAAGCTCAGAACCTGTAACCAACTCACCTGCAAATTTGAGCAGCACCTCAGTTGAAATACTGGCCACCTCTGAAGTCACCACAGATACAGAGAAAACTCATCCTTCTTCAAACAGAACAGTGACCGATGTGGGGACCTCCAGTTCTGGACATGAATCCACTTCCTTTGTCCTAGCTGACTCACAGACATCCAAAGTCACATCTCCAATGGTTATTACCTCCACCATGGAGGATACGAGTGTCTCCACATCAACTCCTGGCTTTTTTGAGACTAGCAGAATTCAGACAGAACCAACATCCTCCCTGACCCTTGGACTGAGAAAGACCAGCAGCTCTGAGGGGACCAGCTTAGCCACAGAGATGAGCACTGTCCTTTCTGGAGTGCCCACTGGTGCCACTGCTGAAGTCTCCAGGACAGAAGTCACCTCCTCTAGCAGAACATCCATCTCAGGCTTTGCTCAGCTCACAGTGTCACCAGAGACTTCCACAGAAACCATCACCAGACTCCCTACCTCCAGCATAATGACAGAATCAGCAGAAATGATGATCAAGACACAAACAGATCCTCCTGGGTCTACACCAGAGAGTACTCATACTGTGGACATATCAACAACACCCAACTGGGTAGAAACCCACTCGACTGTGACTCAGAGATTTTCACACTCAGAGATGACCACTCTTGTGAGCAGAAGCCCTGGTGATATGTTATGGCCTAGTCAATCCTCTGTGGAAGAAACCAGCTCTGCCTCTTCCCTGCTGTCTCTGCCTGCCACGACCTCACCTTCTCCTGTTTCCTCTACATTAGTAGAGGATTTCCCTTCCGCTTCTCTTCCTGTGACTTCTCTTCTCAACCCTGGCCTGGTGATAACCACAGACAGGATGGGCATAAGCAGAGAACCTGGAACCAGTTCCACTTCAAATTTGAGCAGCACCTCCCATGAGAGACTGACCACTTTGGAAGACACTGTAGATACAGAAGACATGCAGCCTTCCACACACACAGCAGTGACCAACGTGAGGACCTCCATTTCTGGACATGAATCACAATCTTCTGTCCTATCTGACTCAGAGACACCCAAAGCCACATCTCCAATGGGTACCACCTACACCATGGGGGAAACGAGTGTTTCCATATCCACTTCTGACTTCTTTGAGACCAGCAGAATTCAGATAGAACCAACATCCTCCCTGACTTCTGGATTGAGGGAGACCAGCAGCTCTGAGAGGATCAGCTCAGCCACAGAGGGAAGCACTGTCCTTTCTGAAGTGCCCAGTGGTGCTACCACTGAGGTCTCCAGGACAGAAGTGATATCCTCTAGGGGAACATCCATGTCAGGGCCTGATCAGTTCACCATATCACCAGACATCTCTACTGAAGCGATCACCAGGCTTTCTACTTCCCCCATTATGACAGAATCAGCAGAAAGTGCCATCACTATTGAGACAGGTTCTCCTGGGGCTACATCAGAGGGTACCCTCACCTTGGACACCTCAACAACAACCTTTTGGTCAGGGACCCACTCAACTGCATCTCCAGGATTTTCACACTCAGAGATGACCACTCTTATGAGTAGAACTCCTGGAGATGTGCCATGGCCGAGCCTTCCCTCTGTGGAAGAAGCCAGCTCTGTCTCTTCCTCACTGTCTTCACCTGCCATGACCTCAACTTCTTTTTTCTCCACATTACCAGAGAGCATCTCCTCCTCTCCTCATCCTGTGACTGCACTTCTCACCCTTGGCCCAGTGAAGACCACAGACATGTTGCGCACAAGCTCAGAACCTGAAACCAGTTCACCTCCAAATTTGAGCAGCACCTCAGCTGAAATATTAGCCACGTCTGAAGTCACCAAAGATAGAGAGAAAATTCATCCCTCCTCAAACACACCTGTAGTCAATGTAGGGACTGTGATTTATAAACATCTATCCCCTTCCTCTGTTTTGGCTGACTTAGTGACAACAAAACCCACATCTCCAATGGCTACCACCTCCACTCTGGGGAATACAAGTGTTTCCACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAAACTATGATGACACAGCCAACTTCCTCCCTGACTTCTGGATTAAGGGAGATCAGTACCTCTCAAGAGACCAGCTCAGCAACAGAGAGAAGTGCTTCTCTTTCTGGAATGCCCACTGGTGCTACTACTAAGGTCTCCAGAACAGAAGCCCTCTCCTTAGGCAGAACATCCACCCCAGGTCCTGCTCAATCCACAATATCACCAGAAATCTCCACGGAAACCATCACTAGAATTTCTACTCCCCTCACCACGACAGGATCAGCAGAAATGACCATCACCCCCAAAACAGGTCATTCTGGGGCATCCTCACAAGGTACCTTTACCTTGGACACATCAAGCAGAGCCTCCTGGCCAGGAACTCACTCAGCTGCAACTCACAGATCTCCACACTCAGGGATGACCACTCCTATGAGCAGAGGTCCTGAGGATGTGTCATGGCCAAGCCGCCCATCAGTGGAAAAAACTAGCCCTCCATCTTCCCTGGTGTCTTTATCTGCAGTAACCTCACCTTCGCCACTTTATTCCACACCATCTGAGAGTAGCCACTCATCTCCTCTCCGGGTGACTTCTCTTTTCACCCCTGTCATGATGAAGACCACAGACATGTTGGACACAAGCTTGGAACCTGTGACCACTTCACCTCCCAGTATGAATATCACCTCAGATGAGAGTCTGGCCACTTCTAAAGCCACCATGGAGACAGAGGCAATTCAGCTTTCAGAAAACACAGCTGTGACTCAGATGGGCACCATCAGCGCTAGACAAGAATTCTATTCCTCTTATCCAGGCCTCCCAGAGCCATCCAAAGTGACATCTCCAGTGGTCACCTCTTCCACCATAAAAGACATTGTTTCTACAACCATACCTGCTTCCTCTGAGATAACAAGAATTGAGATGGAGTCAACATCCACCCTGACCCCCACACCAAGGGAGACCAGCACCTCCCAGGAGATCCACTCAGCCACAAAGCCAAGCACTGTTCCTTACAAGGCACTCACTAGTGCCACGATTGAGGACTCCATGACACAAGTCATGTCCTCTAGCAGAGGACCTAGCCCTGATCAGTCCACAATGTCACAAGACATATCCACTGAAGTGATCACCAGGCTCTCTACCTCCCCCATCAAGACAGAATCTACAGAAATGACCATTACCACCCAAACAGGTTCTCCTGGGGCTACATCAAGGGGTACCCTTACCTTGGACACTTCAACAACTTTTATGTCAGGGACCCACTCAACTGCATCTCAAGGATTTTCACACTCACAGATGACCGCTCTTATGAGTAGAACTCCTGGAGATGTGCCATGGCTAAGCCATCCCTCTGTGGAAGAAGCCAGCTCTGCCTCTTTCTCACTGTCTTCACCTGTCATGACCTCATCTTCTCCCGTTTCTTCCACATTACCAGACAGCATCCACTCTTCTTCGCTTCCTGTGACATCACTTCTCACCTCAGGGCTGGTGAAGACCACAGAGCTGTTGGGCACAAGCTCAGAACCTGAAACCAGTTCACCCCCAAATTTGAGCAGCACCTCAGCTGAAATACTGGCCATCACTGAAGTCACTACAGATACAGAGAAACTGGAGATGACCAATGTGGTAACCTCAGGTTATACACATGAATCTCCTTCCTCTGTCCTAGCTGACTCAGTGACAACAAAGGCCACATCTTCAATGGGTATCACCTACCCCACAGGAGATACAAATGTTCTCACATCAACCCCTGCCTTCTCTGACACCAGTAGGATTCAAACAAAGTCAAAGCTCTCACTGACTCCTGGGTTGATGGAGACCAGCATCTCTGAAGAGACCAGCTCTGCCACAGAAAAAAGCACTGTCCTTTCTAGTGTGCCCACTGGTGCTACTACTGAGGTCTCCAGGACAGAAGCCATCTCTTCTAGCAGAACATCCATCCCAGGCCCTGCTCAATCCACAATGTCATCAGACACCTCCATGGAAACCATCACTAGAATTTCTACCCCCCTCACAAGGAAAGAATCAACAGACATGGCCATCACCCCCAAAACAGGTCCTTCTGGGGCTACCTCGCAGGGTACCTTTACCTTGGACTCATCAAGCACAGCCTCCTGGCCAGGAACTCACTCAGCTACAACTCAGAGATTTCCACAGTCAGTGGTGACAACTCCTATGAGCAGAGGTCCTGAGGATGTGTCATGGCCAAGCCCGCTGTCTGTGGAAAAAAACAGCCCTCCATCTTCCCTGGTATCTTCATCTTCAGTAACCTCACCTTCGCCACTTTATTCCACACCATCTGGGAGTAGCCACTCCTCTCCTGTCCCTGTCACTTCTCTTTTCACCTCTATCATGATGAAGGCCACAGACATGTTGGATGCAAGTTTGGAACCTGAGACCACTTCAGCTCCCAATATGAATATCACCTCAGATGAGAGTCTGGCCGCTTCTAAAGCCACCACGGAGACAGAGGCAATTCACGTTTTTGAAAATACAGCAGCGTCCCATGTGGAAACCACCAGTGCTACAGAGGAACTCTATTCCTCTTCCCCAGGCTTCTCAGAGCCAACAAAAGTGATATCTCCAGTGGTCACCTCTTCCTCTATAAGAGACAACATGGTTTCCACAACAATGCCTGGCTCCTCTGGCATTACAAGGATTGAGATAGAGTCAATGTCATCTCTGACCCCTGGACTGAGGGAGACCAGAACCTCCCAGGACATCACCTCATCCACAGAGACAAGCACTGTCCTTTACAAGATGCCCTCTGGTGCCACTCCTGAGGTCTCCAGGACAGAAGTTATGCCCTCTAGCAGAACATCCATTCCTGGCCCTGCTCAGTCCACAATGTCACTAGACATCTCCGATGAAGTTGTCACCAGGCTGTCTACCTCTCCCATCATGACAGAATCTGCAGAAATAACCATCACCACCCAAACAGGTTATTCTCTGGCTACATCCCAGGTTACCCTTCCCTTGGGCACCTCAATGACCTTTTTGTCAGGGACCCACTCAACTATGTCTCAAGGACTTTCACACTCAGAGATGACCAATCTTATGAGCAGGGGTCCTGAAAGTCTGTCATGGACGAGCCCTCGCTTTGTGGAAACAACTAGATCTTCCTCTTCTCTGACATCATTACCTCTCACGACCTCACTTTCTCCTGTGTCCTCCACATTACTAGACAGTAGCCCCTCCTCTCCTCTTCCTGTGACTTCACTTATCCTCCCAGGCCTGGTGAAGACTACAGAAGTGTTGGATACAAGCTCAGAGCCTAAAACCAGTTCATCTCCAAATTTGAGCAGCACCTCAGTTGAAATACCGGCCACCTCTGAAATCATGACAGATACAGAGAAAATTCATCCTTCCTCAAACACAGCGGTGGCCAAAGTGAGGACCTCCAGTTCTGTTCATGAATCTCATTCCTCTGTCCTAGCTGACTCAGAAACAACCATAACCATACCTTCAATGGGTATCACCTCCGCTGTGGACGATACCACTGTTTTCACATCAAATCCTGCCTTCTCTGAGACTAGGAGGATTCCGACAGAGCCAACATTCTCATTGACTCCTGGATTCAGGGAGACTAGCACCTCTGAAGAGACCACCTCAATCACAGAAACAAGTGCAGTCCTTTATGGAGTGCCCACTAGTGCTACTACTGAAGTCTCCATGACAGAAATCATGTCCTCTAATAGAATACACATCCCTGACTCTGATCAGTCCACGATGTCTCCAGACATCATCACTGAAGTGATCACCAGGCTCTCTTCCTCATCCATGATGTCAGAATCAACACAAATGACCATCACCACCCAAAAAAGTTCTCCTGGGGCTACAGCACAGAGTACTCTTACCTTGGCCACAACAACAGCCCCCTTGGCAAGGACCCACTCAACTGTTCCTCCTAGATTTTTACACTCAGAGATGACAACTCTTATGAGTAGGAGTCCTGAAAATCCATCATGGAAGAGCTCTCTCTTTGTGGAAAAAACTAGCTCTTCATCTTCTCTGTTGTCCTTACCTGTCACGACCTCACCTTCTGTTTCTTCCACATTACCGCAGAGTATCCCTTCCTCCTCTTTTTCTGTGACTTCACTCCTCACCCCAGGCATGGTGAAGACTACAGACACAAGCACAGAACCTGGAACCAGTTTATCTCCAAATCTGAGTGGCACCTCAGTTGAAATACTGGCTGCCTCTGAAGTCACCACAGATACAGAGAAAATTCATCCTTCTTCAAGCATGGCAGTGACCAATGTGGGAACCACCAGTTCTGGACATGAACTATATTCCTCTGTTTCAATCCACTCGGAGCCATCCAAGGCTACATACCCAGTGGGTACTCCCTCTTCCATGGCTGAAACCTCTATTTCCACATCAATGCCTGCTAATTTTGAGACCACAGGATTTGAGGCTGAGCCATTTTCTCATTTGACTTCTGGATTTAGGAAGACAAACATGTCCCTGGACACCAGCTCAGTCACACCAACAAATACACCTTCTTCTCCTGGGTCCACTCACCTTTTACAGAGTTCCAAGACTGATTTCACCTCTTCTGCAAAAACATCATCCCCAGACTGGCCTCCAGCCTCACAGTATACTGAAATTCCAGTGGACATAATCACCCCCTTTAATGCTTCTCCATCTATTACGGAGTCCACTGGGATAACCTCCTTCCCAGAATCCAGGTTTACTATGTCTGTAACAGAAAGTACTCATCATCTGAGTACAGATTTGCTGCCTTCAGCTGAGACTATTTCCACTGGCACAGTGATGCCTTCTCTATCAGAGGCCATGACTTCATTTGCCACCACTGGAGTTCCACGAGCCATCTCAGGTTCAGGTAGTCCATTCTCTAGGACAGAGTCAGGCCCTGGGGATGCTACTCTGTCCACCATTGCAGAGAGCCTGCCTTCATCCACTCCTGTGCCATTCTCCTCTTCAACCTTCACTACCACTGATTCTTCAACCATCCCAGCCCTCCATGAGATAACTTCCTCTTCAGCTACCCCATATAGAGTGGACACCAGTCTTGGGACAGAGAGCAGCACTACTGAAGGACGCTTGGTTATGGTCAGTACTTTGGACACTTCAAGCCAACCAGGCAGGACATCTTCATCACCCATTTTGGATACCAGAATGACAGAGAGCGTTGAGCTGGGAACAGTGACAAGTGCTTATCAAGTTCCTTCACTCTCAACACGGTTGACAAGAACTGATGGCATTATGGAACACATCACAAAAATACCCAATGAAGCAGCACACAGAGGTACCATAAGACCAGTCAAAGGCCCTCAGACATCCACTTCGCCTGCCAGTCCTAAAGGACTACACACAGGAGGGACAAAAAGAATGGAGACCACCACCACAGCTCTGAAGACCACCACCACAGCTCTGAAGACCACTTCCAGAGCCACCTTGACCACCAGTGTCTATACTCCCACTTTGGGAACACTGACTCCCCTCAATGCATCAATGCAAATGGCCAGCACAATCCCCACAGAAATGATGATCACAACCCCATATGTTTTCCCTGATGTTCCAGAAACGACATCCTCATTGGCTACCAGCCTGGGAGCAGAAACCAGCACAGCTCTTCCCAGGACAACCCCATCTGTTTTCAATAGAGAATCAGAGACCACAGCCTCACTGGTCTCTCGTTCTGGGGCAGAGAGAAGTCCGGTTATTCAAACTCTAGATGTTTCTTCTAGTGAGCCAGATACAACAGCTTCATGGGTTATCCATCCTGCAGAGACCATCCCAACTGTTTCCAAGACAACCCCCAATTTTTTCCACAGTGAATTAGACACTGTATCTTCCACAGCCACCAGTCATGGGGCAGACGTCAGCTCAGCCATTCCAACAAATATCTCACCTAGTGAACTAGATGCACTGACCCCACTGGTCACTATTTCGGGGACAGATACTAGTACAACATTCCCAACACTGACTAAGTCCCCACATGAAACAGAGACAAGAACCACATGGCTCACTCATCCTGCAGAGACCAGCTCAACTATTCCCAGAACAATCCCCAATTTTTCTCATCATGAATCAGATGCCACACCTTCAATAGCCACCAGTCCTGGGGCAGAAACCAGTTCAGCTATTCCAATTATGACTGTCTCACCTGGTGCAGAAGATCTGGTGACCTCACAGGTCACTAGTTCTGGGACAGACAGAAATATGACTATTCCAACTTTGACTCTTTCTCCTGGTGAACCAAAGACGATAGCCTCATTAGTCACCCATCCTGAAGCACAGACAAGTTCGGCCATTCCAACTTCAACTATCTCGCCTGCTGTATCACGGTTGGTGACCTCAATGGTCACCAGTTTGGCGGCAAAGACAAGTACAACTAATCGAGCTCTGACAAACTCCCCTGGTGAACCAGCTACAACAGTTTCATTGGTCACGCATCCTGCACAGACCAGCCCAACAGTTCCCTGGACAACTTCCATTTTTTTCCATAGTAAATCAGACACCACACCTTCAATGACCACCAGTCATGGGGCAGAATCCAGTTCAGCTGTTCCAACTCCAACTGTTTCAACTGAGGTACCAGGAGTAGTGACCCCTTTGGTCACCAGTTCTAGGGCAGTGATCAGTACAACTATTCCAATTCTGACTCTTTCTCCTGGTGAACCAGAGACCACACCTTCAATGGCCACCAGTCATGGGGAAGAAGCCAGTTCTGCTATTCCAACTCCAACTGTTTCACCTGGGGTACCAGGAGTGGTGACCTCTCTGGTCACTAGTTCTAGGGCAGTGACTAGTACAACTATTCCAATTCTGACTTTTTCTCTTGGTGAACCAGAGACCACACCTTCAATGGCCACCAGTCATGGGACAGAAGCTGGCTCAGCTGTTCCAACTGTTTTACCTGAGGTACCAGGAATGGTGACCTCTCTGGTTGCTAGTTCTAGGGCAGTAACCAGTACAACTCTTCCAACTCTGACTCTTTCTCCTGGTGAACCAGAGACCACACCTTCAATGGCCACCAGTCATGGGGCAGAAGCCAGCTCAACTGTTCCAACTGTTTCACCTGAGGTACCAGGAGTGGTGACCTCTCTGGTCACTAGTTCTAGTGGAGTAAACAGTACAAGTATTCCAACTCTGATTCTTTCTCCTGGTGAACTAGAAACCACACCTTCAATGGCCACCAGTCATGGGGCAGAAGCCAGCTCAGCTGTTCCAACTCCAACTGTTTCACCTGGGGTATCAGGAGTGGTGACCCCTCTGGTCACTAGTTCCAGGGCAGTGACCAGTACAACTATTCCAATTCTAACTCTTTCTTCTAGTGAGCCAGAGACCACACCTTCAATGGCCACCAGTCATGGGGTAGAAGCCAGCTCAGCTGTTCTAACTGTTTCACCTGAGGTACCAGGAATGGTGACCTCTCTGGTCACTAGTTCTAGAGCAGTAACCAGTACAACTATTCCAACTCTGACTATTTCTTCTGATGAACCAGAGACCACAACTTCATTGGTCACCCATTCTGAGGCAAAGATGATTTCAGCCATTCCAACTTTAGCTGTCTCCCCTACTGTACAAGGGCTGGTGACTTCACTGGTCACTAGTTCTGGGTCAGAGACCAGTGCGTTTTCAAATCTAACTGTTGCCTCAAGTCAACCAGAGACCATAGACTCATGGGTCGCTCATCCTGGGACAGAAGCAAGTTCTGTTGTTCCAACTTTGACTGTCTCCACTGGTGAGCCGTTTACAAATATCTCATTGGTCACCCATCCTGCAGAGAGTAGCTCAACTCTTCCCAGGACAACCTCAAGGTTTTCCCACAGTGAATTAGACACTATGCCTTCTACAGTCACCAGTCCTGAGGCAGAATCCAGCTCAGCCATTTCAACAACTATTTCACCTGGTATACCAGGTGTGCTGACATCACTGGTCACTAGCTCTGGGAGAGACATCAGTGCAACTTTTCCAACAGTGCCTGAGTCCCCACATGAATCAGAGGCAACAGCCTCATGGGTTACTCATCCTGCAGTCACCAGCACAACAGTTCCCAGGACAACCCCTAATTATTCTCATAGTGAACCAGACACCACACCATCAATAGCCACCAGTCCTGGGGCAGAAGCCACTTCAGATTTTCCAACAATAACTGTCTCACCTGATGTACCAGATATGGTAACCTCACAGGTCACTAGTTCTGGGACAGACACCAGTATAACTATTCCAACTCTGACTCTTTCTTCTGGTGAGCCAGAGACCACAACCTCATTTATCACCTATTCTGAGACACACACAAGTTCAGCCATTCCAACTCTCCCTGTCTCCCCTGGTGCATCAAAGATGCTGACCTCACTGGTCATCAGTTCTGGGACAGACAGCACTACAACTTTCCCAACACTGACGGAGACCCCATATGAACCAGAGACAACAGCCATACAGCTCATTCATCCTGCAGAGACCAACACAATGGTTCCCAGGACAACTCCCAAGTTTTCCCATAGTAAGTCAGACACCACACTCCCAGTAGCCATCACCAGTCCTGGGCCAGAAGCCAGTTCAGCTGTTTCAACGACAACTATCTCACCTGATATGTCAGATCTGGTGACCTCACTGGTCCCTAGTTCTGGGACAGACACCAGTACAACCTTCCCAACATTGAGTGAGACCCCATATGAACCAGAGACTACAGCCACGTGGCTCACTCATCCTGCAGAAACCAGCACAACGGTTTCTGGGACAATTCCCAACTTTTCCCATAGGGGATCAGACACTGCACCCTCAATGGTCACCAGTCCTGGAGTAGACACGAGGTCAGGTGTTCCAACTACAACCATCCCACCCAGTATACCAGGGGTAGTGACCTCACAGGTCACTAGTTCTGCAACAGACACTAGTACAGCTATTCCAACTTTGACTCCTTCTCCTGGTGAACCAGAGACCACAGCCTCATCAGCTACCCATCCTGGGACACAGACTGGCTTCACTGTTCCAATTCGGACTGTTCCCTCTAGTGAGCCAGATACAATGGCTTCCTGGGTCACTCATCCTCCACAGACCAGCACACCTGTTTCCAGAACAACCTCCAGTTTTTCCCATAGTAGTCCAGATGCCACACCTGTAATGGCCACCAGTCCTAGGACAGAAGCCAGTTCAGCTGTACTGACAACAATCTCACCTGGTGCACCAGAGATGGTGACTTCACAGATCACTAGTTCTGGGGCAGCAACCAGTACAACTGTTCCAACTTTGACTCATTCTCCTGGTATGCCAGAGACCACAGCCTTATTGAGCACCCATCCCAGAACAGAGACAAGTAAAACATTTCCTGCTTCAACTGTGTTTCCTCAAGTATCAGAGACCACAGCCTCACTCACCATTAGACCTGGTGCAGAGACTAGCACAGCTCTCCCAACTCAGACAACATCCTCTCTCTTCACCCTACTTGTAACTGGAACCAGCAGAGTTGATCTAAGTCCAACTGCTTCACCTGGTGTTTCTGCAAAAACAGCCCCACTTTCCACCCATCCAGGGACAGAAACCAGCACAATGATTCCAACTTCAACTCTTTCCCTTGGTTTACTAGAGACTACAGGCTTACTGGCCACCAGCTCTTCAGCAGAGACCAGCACGAGTACTCTAACTCTGACTGTTTCCCCTGCTGTCTCTGGGCTTTCCAGTGCCTCTATAACAACTGATAAGCCCCAAACTGTGACCTCCTGGAACACAGAAACCTCACCATCTGTAACTTCAGTTGGACCCCCAGAATTTTCCAGGACTGTCACAGGCACCACTATGACCTTGATACCATCAGAGATGCCAACACCACCTAAAACCAGTCATGGAGAAGGAGTGAGTCCAACCACTATCTTGAGAACTACAATGGTTGAAGCCACTAATTTAGCTACCACAGGTTCCAGTCCCACTGTGGCCAAGACAACAACCACCTTCAATACACTGGCTGGAAGCCTCTTTACTCCTCTGACCACACCTGGGATGTCCACCTTGGCCTCTGAGAGTGTGACCTCAAGAACAAGTTATAACCATCGGTCCTGGATCTCCACCACCAGCAGTTATAACCGTCGGTACTGGACCCCTGCCACCAGCACTCCAGTGACTTCTACATTCTCCCCAGGGATTTCCACATCCTCCATCCCCAGCTCCACAGCAGCCACAGTCCCATTCATGGTGCCATTCACCCTCAACTTCACCATCACCAACCTGCAGTACGAGGAGGACATGCGGCACCCTGGTTCCAGGAAGTTCAACGCCACAGAGAGAGAACTGCAGGGTCTGCTCAAACCCTTGTTCAGGAATAGCAGTCTGGAATACCTCTATTCAGGCTGCAGACTAGCCTCACTCAGGCCAGAGAAGGATAGCTCAGCCACGGCAGTGGATGCCATCTGCACACATCGCCCTGACCCTGAAGACCTCGGACTGGACAGAGAGCGACTGTACTGGGAGCTGAGCAATCTGACAAATGGCATCCAGGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACCGGAACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCGAAGCTCTATGCCCACCACCAGCACTCCTGGGACCTCCACAGTGGATGTGGGAACCTCAGGGACTCCATCCTCCAGCCCCAGCCCCACGACTGCTGGCCCTCTCCTGATGCCGTTCACCCTCAACTTCACCATCACCAACCTGCAGTACGAGGAGGACATGCGTCGCACTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCATGGAGAGTGTCCTGCAGGGTCTGCTCAAGCCCTTGTTCAAGAACACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGATTGACCTTGCTCAGGCCCGAGAAAGATGGGGCAGCCACTGGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCGCCTTGACCCCAAAAGCCCTGGACTCAACAGGGAGCAGCTGTACTGGGAGCTAAGCAAACTGACCAATGACATTGAAGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACAGGAACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCAGAGCTCTGTGTCCACCACCAGCACTCCTGGGACCTCCACAGTGGATCTCAGAACCTCAGGGACTCCATCCTCCCTCTCCAGCCCCACAATTATGGCTGCTGGCCCTCTCCTGGTACCATTCACCCTCAACTTCACCATCACCAACCTGCAGTATGGGGAGGACATGGGTCACCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACAGAGAGGGTCCTGCAGGGTCTGCTTGGTCCCATATTCAAGAACACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGACCTCTCTCAGGTCTGAGAAGGATGGAGCAGCCACTGGAGTGGATGCCATCTGCATCCATCATCTTGACCCCAAAAGCCCTGGACTCAACAGAGAGCGGCTGTACTGGGAGCTGAGCCAACTGACCAATGGCATCAAAGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACAGGAACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCGGACCTCTGTGCCCACCAGCAGCACTCCTGGGACCTCCACAGTGGACCTTGGAACCTCAGGGACTCCATTCTCCCTCCCAAGCCCCGCAACTGCTGGCCCTCTCCTGGTGCTGTTCACCCTCAACTTCACCATCACCAACCTGAAGTATGAGGAGGACATGCATCGCCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACTGAGAGGGTCCTGCAGACTCTGCTTGGTCCTATGTTCAAGAACACCAGTGTTGGCCTTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGACCTTGCTCAGGTCCGAGAAGGATGGAGCAGCCACTGGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCGTCTTGACCCCAAAAGCCCTGGAGTGGACAGGGAGCAGCTATACTGGGAGCTGAGCCAGCTGACCAATGGCATCAAAGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACAGGAACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATTGGATCCCTGTGCCCACCAGCAGCACTCCTGGGACCTCCACAGTGGACCTTGGGTCAGGGACTCCATCCTCCCTCCCCAGCCCCACAACTGCTGGCCCTCTCCTGGTGCCGTTCACCCTCAACTTCACCATCACCAACCTGAAGTACGAGGAGGACATGCATTGCCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACAGAGAGAGTCCTGCAGAGTCTGCTTGGTCCCATGTTCAAGAACACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGACCTTGCTCAGGTCCGAGAAGGATGGAGCAGCCACTGGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCGTCTTGACCCCAAAAGCCCTGGAGTGGACAGGGAGCAGCTATACTGGGAGCTGAGCCAGCTGACCAATGGCATCAAAGAGCTGGGTCCCTACACCCTGGACAGAAACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCAGACCTCTGCGCCCAACACCAGCACTCCTGGGACCTCCACAGTGGACCTTGGGACCTCAGGGACTCCATCCTCCCTCCCCAGCCCTACATCTGCTGGCCCTCTCCTGGTGCCATTCACCCTCAACTTCACCATCACCAACCTGCAGTACGAGGAGGACATGCATCACCCAGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACGGAGCGGGTCCTGCAGGGTCTGCTTGGTCCCATGTTCAAGAACACCAGTGTCGGCCTTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGACCTTGCTCAGGCCTGAGAAGAATGGGGCAGCCACTGGAATGGATGCCATCTGCAGCCACCGTCTTGACCCCAAAAGCCCTGGACTCAACAGAGAGCAGCTGTACTGGGAGCTGAGCCAGCTGACCCATGGCATCAAAGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACAGGAACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCGGAGCTCTGTGGCCCCCACCAGCACTCCTGGGACCTCCACAGTGGACCTTGGGACCTCAGGGACTCCATCCTCCCTCCCCAGCCCCACAACAGCTGTTCCTCTCCTGGTGCCGTTCACCCTCAACTTTACCATCACCAATCTGCAGTATGGGGAGGACATGCGTCACCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACAGAGAGGGTCCTGCAGGGTCTGCTTGGTCCCTTGTTCAAGAACTCCAGTGTCGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGATCTCTCTCAGGTCTGAGAAGGATGGGGCAGCCACTGGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCACCTTAACCCTCAAAGCCCTGGACTGGACAGGGAGCAGCTGTACTGGCAGCTGAGCCAGATGACCAATGGCATCAAAGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACCGGAACAGTCTCTACGTCAATGGTTTCACCCATCGGAGCTCTGGGCTCACCACCAGCACTCCTTGGACTTCCACAGTTGACCTTGGAACCTCAGGGACTCCATCCCCCGTCCCCAGCCCCACAACCACCGGCCCTCTCCTGGTGCCATTCACACTCAACTTCACCATCACTAACCTACAGTATGAGGAGAACATGGGTCACCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACATCACGGAGAGTGTTCTGCAGGGTCTGCTCAAGCCCTTGTTCAAGAGCACCAGTGTTGGCCCTCTGTATTCTGGCTGCAGACTGACCTTGCTCAGGCCTGAGAAGGATGGAGTAGCCACCAGAGTGGACGCCATCTGCACCCACCGCCCTGACCCCAAAATCCCTGGGCTAGACAGACAGCAGCTATACTGGGAGCTGAGCCAGCTGACCCACAGCATCACTGAGCTGGGACCCTACACCCTGGATAGGGACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCAGCGGAGCTCTGTGCCCACCACCAGCACTCCTGGGACTTTCACAGTACAGCCGGAAACCTCTGAGACTCCATCATCCCTCCCTGGCCCCACAGCCACTGGCCCTGTCCTGCTGCCATTCACCCTCAATTTTACCATCACTAACCTGCAGTATGAGGAGGACATGCGTCGCCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACGGAGAGGGTCCTTCAGGGTCTGCTTATGCCCTTGTTCAAGAACACCAGTGTCAGCTCTCTGTACTCTGGTTGCAGACTGACCTTGCTCAGGCCTGAGAAGGATGGGGCAGCCACCAGAGTGGATGCTGTCTGCACCCATCGTCCTGACCCCAAAAGCCCTGGACTGGACAGAGAGCGGCTGTACTGGAAGCTGAGCCAGCTGACCCACGGCATCACTGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACAGGCACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCAGAGCTCTATGACGACCACCAGAACTCCTGATACCTCCACAATGCACCTGGCAACCTCGAGAACTCCAGCCTCCCTGTCTGGACCCATGACCGCCAGCCCTCTCCTGGTGCTATTCACAATTAACTTCACCATCACTAACCTGCGGTATGAGGAGAACATGCATCACCCTGGCTCTAGAAAGTTTAACACCACGGAGAGAGTCCTTCAGGGTCTGCTCAGGCCTGTGTTCAAGAACACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGACCTTGCTCAGGCCCAAGAAGGATGGGGCAGCCACCAAAGTGGATGCCATCTGCACCTACCGCCCTGATCCCAAAAGCCCTGGACTGGACAGAGAGCAGCTATACTGGGAGCTGAGCCAGCTGACCCACAGCATCACTGAGCTGGGCCCCTACACCCTGGACAGGGACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACACAGCGGAGCTCTGTGCCCACCACTAGCATTCCTGGGACCCCCACAGTGGACCTGGGAACATCTGGGACTCCAGTTTCTAAACCTGGTCCCTCGGCTGCCAGCCCTCTCCTGGTGCTATTCACTCTCAACTTCACCATCACCAACCTGCGGTATGAGGAGAACATGCAGCACCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACCACGGAGAGGGTCCTTCAGGGCCTGCTCAGGTCCCTGTTCAAGAGCACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGACTGACTTTGCTCAGGCCTGAAAAGGATGGGACAGCCACTGGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCACCCTGACCCCAAAAGCCCTAGGCTGGACAGAGAGCAGCTGTATTGGGAGCTGAGCCAGCTGACCCACAATATCACTGAGCTGGGCCCCTATGCCCTGGACAACGACAGCCTCTTTGTCAATGGTTTCACTCATCGGAGCTCTGTGTCCACCACCAGCACTCCTGGGACCCCCACAGTGTATCTGGGAGCATCTAAGACTCCAGCCTCGATATTTGGCCCTTCAGCTGCCAGCCATCTCCTGATACTATTCACCCTCAACTTCACCATCACTAACCTGCGGTATGAGGAGAACATGTGGCCTGGCTCCAGGAAGTTCAACACTACAGAGAGGGTCCTTCAGGGCCTGCTAAGGCCCTTGTTCAAGAACACCAGTGTTGGCCCTCTGTACTCTGGCTGCAGGCTGACCTTGCTCAGGCCAGAGAAAGATGGGGAAGCCACCGGAGTGGATGCCATCTGCACCCACCGCCCTGACCCCACAGGCCCTGGGCTGGACAGAGAGCAGCTGTATTTGGAGCTGAGCCAGCTGACCCACAGCATCACTGAGCTGGGCCCCTACACACTGGACAGGGACAGTCTCTATGTCAATGGTTTCACCCATCGGAGCTCTGTACCCACCACCAGCACCGGGGTGGTCAGCGAGGAGCCATTCACACTGAACTTCACCATCAACAACCTGCGCTACATGGCGGACATGGGCCAACCCGGCTCCCTCAAGTTCAACATCACAGACAACGTCATGCAGCACCTGCTCAGTCCTTTGTTCCAGAGGAGCAGCCTGGGTGCACGGTACACAGGCTGCAGGGTCATCGCACTAAGGTCTGTGAAGAACGGTGCTGAGACACGGGTGGACCTCCTCTGCACCTACCTGCAGCCCCTCAGCGGCCCAGGTCTGCCTATCAAGCAGGTGTTCCATGAGCTGAGCCAGCAGACCCATGGCATCACCCGGCTGGGCCCCTACTCTCTGGACAAAGACAGCCTCTACCTTAACGGTTACAATGAACCTGGTCCAGATGAGCCTCCTACAACTCCCAAGCCAGCCACCACATTCCTGCCTCCTCTGTCAGAAGCCACAACAGCCATGGGGTACCACCTGAAGACCCTCACACTCAACTTCACCATCTCCAATCTCCAGTATTCACCAGATATGGGCAAGGGCTCAGCTACATTCAACTCCACCGAGGGGGTCCTTCAGCACCTGCTCAGACCCTTGTTCCAGAAGAGCAGCATGGGCCCCTTCTACTTGGGTTGCCAACTGATCTCCCTCAGGCCTGAGAAGGATGGGGCAGCCACTGGTGTGGACACCACCTGCACCTACCACCCTGACCCTGTGGGCCCCGGGCTGGACATACAGCAGCTTTACTGGGAGCTGAGTCAGCTGACCCATGGTGTCACCCAACTGGGCTTCTATGTCCTGGACAGGGATAGCCTCTTCATCAATGGCTATGCACCCCAGAATTTATCAATCCGGGGCGAGTACCAGATAAATTTCCACATTGTCAACTGGAACCTCAGTAATCCAGACCCCACATCCTCAGAGTACATCACCCTGCTGAGGGACATCCAGGACAAGGTCACCACACTCTACAAAGGCAGTCAACTACATGACACATTCCGCTTCTGCCTGGTCACCAACTTGACGATGGACTCCGTGTTGGTCACTGTCAAGGCATTGTTCTCCTCCAATTTGGACCCCAGCCTGGTGGAGCAAGTCTTTCTAGATAAGACCCTGAATGCCTCATTCCATTGGCTGGGCTCCACCTACCAGTTGGTGGACATCCATGTGACAGAAATGGAGTCATCAGTTTATCAACCAACAAGCAGCTCCAGCACCCAGCACTTCTACCTGAATTTCACCATCACCAACCTACCATATTCCCAGGACAAAGCCCAGCCAGGCACCACCAATTACCAGAGGAACAAAAGGAATATTGAGGATGCGCTCAACCAACTCTTCCGAAACAGCAGCATCAAGAGTTATTTTTCTGACTGTCAAGTTTCAACATTCAGGTCTGTCCCCAACAGGCACCACACCGGGGTGGACTCCCTGTGTAACTTCTCGCCACTGGCTCGGAGAGTAGACAGAGTTGCCATCTATGAGGAATTTCTGCGGATGACCCGGAATGGTACCCAGCTGCAGAACTTCACCCTGGACAGGAGCAGTGTCCTTGTGGATGGGTATTCTCCCAACAGAAATGAGCCCTTAACTGGGAATTCTGACCTTCCCTTCTGGGCTGTCATCCTCATCGGCTTGGCAGGACTCCTGGGAGTCATCACATGCCTGATCTGCGGTGTCCTGGTGACCACCCGCCGGCGGAAGAAGGAAGGAGAATACAACGTCCAGCAACAGTGCCCAGGCTACTACCAGTCACACCTAGACCTGGAGGATCTGCAATGACTGGAACTTGCCGGTGCCTGGGGTGCCTTTCCCCCAGCCAGGGTCCAAAGAAGCTTGGCTGGGGCAGAAATAAACCATATTGGTCGGA
138
Биспецифическое
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLQITR
139
MUC16<sup>c114-N3</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
140
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VH 10C6
CAGGTAACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAACACTCTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGGCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATAACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATCTCCAAGGATTCCTCCAAAAACCAGGTTTTCCTCAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGATATTGCCACATACTACTGTTCTCGAATCGGGACAGCTCAGGCTACGGATGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
141
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VL 10C6
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAC
142
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VH 7B12
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTGTTGGTATGGGTGTAGGCTGGAGTCGTCAGCCCTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATCTGGTGGGATGATGAAGATAAGTATTATAATCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAAAAACCAGGTCTTCCTCAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGATAGTGCCACATACTACTGTACTCGAATCGGGACAGCTCAGGCTACGGATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
143
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VL 7B12
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTATCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCGGAAAAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCGCCTGATATATTATATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAAAGTCTAGAATATCCTCTCACGTTCGGAGGGGGGACTAAGCTAAAAATAAAA
144
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VH 19C11
CAGGTTAATCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGAAATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTCTTGGTATGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGTCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATAACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATCTCCAGGGCTACCTCCAAAAACCAGGTTTTCCTCAAGATCGTCAATGTGGGCACTGCAGATACTGCCACATATTACTGTGCTCGAATCGGGACAGCTCAGGCTACGGATGCTTTGGACTATTGGGGTCAGGGAACCTCAGTCACCGTTTCCTCA
145
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VL 19C11
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTATCCCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCTGCATAGTAATGGCAACACTTATTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCGCCTGATATATTATATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGGGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAGGGTCTAGAGCATCCTCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
146
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VH 16C5
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAACACTCTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATTACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATCTCCAGGGATACCTCCAAAAACCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAATCGGGACAGCTCAGGCTACGGATGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
147
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VL 16C5
GAGCTCGATATGACCCAGACTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCAGGATTAGGTGCCTGGCCAGTGAGGACATTTATAGTGGTATATCCTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAAACCTCCTACACTCCTGATCTATGGTGCATCCAATTTAGAATCTGGGGTCCCACCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACCCTCACCATTGGCGGCGTGCAGGCTGAAGATGCTGCCACCTACTACTGTCTAGGCGGTTATAGTTATAGTAGTACCTTGACTTTTGGAGCTGGCACCAATGTGGAAATCAAA
148
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VH 18C6
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTGTTGGTATGGGTGTAGGCTGGAGTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGAGGATAAGTATTATAACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAAAAACCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTACTCGAATCGGGACAGCTCAGGCTACGGATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
149
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА VL 18C6
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCGCCTGATATATTATATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAAAGTCTAGAATATCCTCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
150
Аминокислотная последовательность зрелого MUC16 человека
DKTLASPTSSVVGRTTQSLGVMSSALPESTSRGMTHSEQRTSPSLSPQVNGTPSRNYPATSMVSGLSSPRTRTSSTEGNFTKEASTYTLTVETTSGPVTEKYTVPTETSTTEGDSTETPWDTRYIPVKITSPMKTFADSTASKENAPVSMTPAETTVTDSHTPGRTNPSFGTLYSSFLDLSPKGTPNSRGETSLELILSTTGYPFSSPEPGSAGHSRISTSAPLSSSASVLDNKISETSIFSGQSLTSPLSPGVPEARASTMPNSAIPFSMTLSNAETSAERVRSTISSLGTPSISTKQTAETILTFHAFAETMDIPSTHIAKTLASEWLGSPGTLGGTSTSALTTTSPSTTLVSEETNTHHSTSGKETEGTLNTSMTPLETSAPGEESEMTATLVPTLGFTTLDSKIRSPSQVSSSHPTRELRTTGSTSGRQSSSTAAHGSSDILRATTSSTSKASSWTSESTAQQFSEPQHTQWVETSPSMKTERPPASTSVAAPITTSVPSVVSGFTTLKTSSTKGIWLEETSADTLIGESTAGPTTHQFAVPTGISMTGGSSTRGSQGTTHLLTRATASSETSADLTLATNGVPVSVSPAVSKTAAGSSPPGGTKPSYTMVSSVIPETSSLQSSAFREGTSLGLTPLNTRHPFSSPEPDSAGHTKISTSIPLLSSASVLEDKVSATSTFSHHKATSSITTGTPEISTKTKPSSAVLSSMTLSNAATSPERVRNATSPLTHPSPSGEETAGSVLTLSTSAETTDSPNIHPTGTLTSESSESPSTLSLPSVSGVKTTFSSSTPSTHLFTSGEETEETSNPSVSQPETSVSRVRTTLASTSVPTPVFPTMDTWPTRSAQFSSSHLVSELRATSSTSVTNSTGSALPKISHLTGTATMSQTNRDTFNDSAAPQSTTWPETSPRFKTGLPSATTTVSTSATSLSATVMVSKFTSPATSSMEATSIREPSTTILTTETTNGPGSMAVASTNIPIGKGYITEGRLDTSHLPIGTTASSETSMDFTMAKESVSMSVSPSQSMDAAGSSTPGRTSQFVDTFSDDVYHLTSREITIPRDGTSSALTPQMTATHPPSPDPGSARSTWLGILSSSPSSPTPKVTMSSTFSTQRVTTSMIMDTVETSRWNMPNLPSTTSLTPSNIPTSGAIGKSTLVPLDTPSPATSLEASEGGLPTLSTYPESTNTPSIHLGAHASSESPSTIKLTMASVVKPGSYTPLTFPSIETHIHVSTARMAYSSGSSPEMTAPGETNTGSTWDPTTYITTTDPKDTSSAQVSTPHSVRTLRTTENHPKTESATPAAYSGSPKISSSPNLTSPATKAWTITDTTEHSTQLHYTKLAEKSSGFETQSAPGPVSVVIPTSPTIGSSTLELTSDVPGEPLVLAPSEQTTITLPMATWLSTSLTEEMASTDLDISSPSSPMSTFAIFPPMSTPSHELSKSEADTSAIRNTDSTTLDQHLGIRSLGRTGDLTTVPITPLTTTWTSVIEHSTQAQDTLSATMSPTHVTQSLKDQTSIPASASPSHLTEVYPELGTQGRSSSEATTFWKPSTDTLSREIETGPTNIQSTPPMDNTTTGSSSSGVTLGIAHLPIGTSSPAETSTNMALERRSSTATVSMAGTMGLLVTSAPGRSISQSLGRVSSVLSESTTEGVTDSSKGSSPRLNTQGNTALSSSLEPSYAEGSQMSTSIPLTSSPTTPDVEFIGGSTFWTKEVTTVMTSDISKSSARTESSSATLMSTALGSTENTGKEKLRTASMDLPSPTPSMEVTPWISLTLSNAPNTTDSLDLSHGVHTSSAGTLATDRSLNTGVTRASRLENGSDTSSKSLSMGNSTHTSMTYTEKSEVSSSIHPRPETSAPGAETTLTSTPGNRAISLTLPFSSIPVEEVISTGITSGPDINSAPMTHSPITPPTIVWTSTGTIEQSTQPLHAVSSEKVSVQTQSTPYVNSVAVSASPTHENSVSSGSSTSSPYSSASLESLDSTISRRNAITSWLWDLTTSLPTTTWPSTSLSEALSSGHSGVSNPSSTTTEFPLFSAASTSAAKQRNPETETHGPQNTAASTLNTDASSVTGLSETPVGASISSEVPLPMAITSRSDVSGLTSESTANPSLGTASSAGTKLTRTISLPTSESLVSFRMNKDPWTVSIPLGSHPTTNTETSIPVNSAGPPGLSTVASDVIDTPSDGAESIPTVSFSPSPDTEVTTISHFPEKTTHSFRTISSLTHELTSRVTPIPGDWMSSAMSTKPTGASPSITLGERRTITSAAPTTSPIVLTASFTETSTVSLDNETTVKTSDILDARKTNELPSDSSSSSDLINTSIASSTMDVTKTASISPTSISGMTASSSPSLFSSDRPQVPTSTTETNTATSPSVSSNTYSLDGGSNVGGTPSTLPPFTITHPVETSSALLAWSRPVRTFSTMVSTDTASGENPTSSNSVVTSVPAPGTWTSVGSTTDLPAMGFLKTSPAGEAHSLLASTIEPATAFTPHLSAAVVTGSSATSEASLLTTSESKAIHSSPQTPTTPTSGANWETSATPESLLVVTETSDTTLTSKILVTDTILFSTVSTPPSKFPSTGTLSGASFPTLLPDTPAIPLTATEPTSSLATSFDSTPLVTIASDSLGTVPETTLTMSETSNGDALVLKTVSNPDRSIPGITIQGVTESPLHPSSTSPSKIVAPRNTTYEGSITVALSTLPAGTTGSLVFSQSSENSETTALVDSSAGLERASVMPLTTGSQGMASSGGIRSGSTHSTGTKTFSSLPLTMNPGEVTAMSEITTNRLTATQSTAPKGIPVKPTSAESGLLTPVSASSSPSKAFASLTTAPPTWGIPQSTLTFEFSEVPSLDTKSASLPTPGQSLNTIPDSDASTASSSLSKSPEKNPRARMMTSTKAISASSFQSTGFTETPEGSASPSMAGHEPRVPTSGTGDPRYASESMSYPDPSKASSAMTSTSLASKLTTLFSTGQAARSGSSSSPISLSTEKETSFLSPTASTSRKTSLFLGPSMARQPNILVHLQTSALTLSPTSTLNMSQEEPPELTSSQTIAEEEGTTAETQTLTFTPSETPTSLLPVSSPTEPTARRKSSPETWASSISVPAKTSLVETTDGTLVTTIKMSSQAAQGNSTWPAPAEETGSSPAGTSPGSPEMSTTLKIMSSKEPSISPEIRSTVRNSPWKTPETTVPMETTVEPVTLQSTALGSGSTSISHLPTGTTSPTKSPTENMLATERVSLSPSPPEAWTNLYSGTPGGTRQSLATMSSVSLESPTARSITGTGQQSSPELVSKTTGMEFSMWHGSTGGTTGDTHVSLSTSSNILEDPVTSPNSVSSLTDKSKHKTETWVSTTAIPSTVLNNKIMAAEQQTSRSVDEAYSSTSSWSDQTSGSDITLGASPDVTNTLYITSTAQTTSLVSLPSGDQGITSLTNPSGGKTSSASSVTSPSIGLETLRANVSAVKSDIAPTAGHLSQTSSPAEVSILDVTTAPTPGISTTITTMGTNSISTTTPNPEVGMSTMDSTPATERRTTSTEHPSTWSSTAASDSWTVTDMTSNLKVARSPGTISTMHTTSFLASSTELDSMSTPHGRITVIGTSLVTPSSDASAVKTETSTSERTLSPSDTTASTPISTFSRVQRMSISVPDILSTSWTPSSTEAEDVPVSMVSTDHASTKTDPNTPLSTFLFDSLSTLDWDTGRSLSSATATTSAPQGATTPQELTLETMISPATSQLPFSIGHITSAVTPAAMARSSGVTFSRPDPTSKKAEQTSTQLPTTTSAHPGQVPRSAATTLDVIPHTAKTPDATFQRQGQTALTTEARATSDSWNEKEKSTPSAPWITEMMNSVSEDTIKEVTSSSSVLRTLNTLDINLESGTTSSPSWKSSPYERIAPSESTTDKEAIHPSTNTVETTGWVTSSEHASHSTIPAHSASSKLTSPVVTTSTREQAIVSMSTTTWPESTRARTEPNSFLTIELRDVSPYMDTSSTTQTSIISSPGSTAITKGPRTEITSSKRISSSFLAQSMRSSDSPSEAITRLSNFPAMTESGGMILAMQTSPPGATSLSAPTLDTSATASWTGTPLATTQRFTYSEKTTLFSKGPEDTSQPSPPSVEETSSSSSLVPIHATTSPSNILLTSQGHSPSSTPPVTSVFLSETSGLGKTTDMSRISLEPGTSLPPNLSSTAGEALSTYEASRDTKAIHHSADTAVTNMEATSSEYSPIPGHTKPSKATSPLVTSHIMGDITSSTSVFGSSETTEIETVSSVNQGLQERSTSQVASSATETSTVITHVSSGDATTHVTKTQATFSSGTSISSPHQFITSTNTFTDVSTNPSTSLIMTESSGVTITTQTGPTGAATQGPYLLDTSTMPYLTETPLAVTPDFMQSEKTTLISKGPKDVSWTSPPSVAETSYPSSLTPFLVTTIPPATSTLQGQHTSSPVSATSVLTSGLVKTTDMLNTSMEPVTNSPQNLNNPSNEILATLAATTDIETIHPSINKAVTNMGTASSAHVLHSTLPVSSEPSTATSPMVPASSMGDALASISIPGSETTDIEGEPTSSLTAGRKENSTLQEMNSTTESNIILSNVSVGAITEATKMEVPSFDATFIPTPAQSTKFPDIFSVASSRLSNSPPMTISTHMTTTQTGSSGATSKIPLALDTSTLETSAGTPSVVTEGFAHSKITTAMNNDVKDVSQTNPPFQDEASSPSSQAPVLVTTLPSSVAFTPQWHSTSSPVSMSSVLTSSLVKTAGKVDTSLETVTSSPQSMSNTLDDISVTSAATTDIETTHPSINTVVTNVGTTGSAFESHSTVSAYPEPSKVTSPNVTTSTMEDTTISRSIPKSSKTTRTETETTSSLTPKLRETSISQEITSSTETSTVPYKELTGATTEVSRTDVTSSSSTSFPGPDQSTVSLDISTETNTRLSTSPIMTESAEITITTQTGPHGATSQDTFTMDPSNTTPQAGIHSAMTHGFSQLDVTTLMSRIPQDVSWTSPPSVDKTSSPSSFLSSPAMTTPSLISSTLPEDKLSSPMTSLLTSGLVKITDILRTRLEPVTSSLPNFSSTSDKILATSKDSKDTKEIFPSINTEETNVKANNSGHESHSPALADSETPKATTQMVITTTVGDPAPSTSMPVHGSSETTNIKREPTYFLTPRLRETSTSQESSFPTDTSFLLSKVPTGTITEVSSTGVNSSSKISTPDHDKSTVPPDTFTGEIPRVFTSSIKTKSAEMTITTQASPPESASHSTLPLDTSTTLSQGGTHSTVTQGFPYSEVTTLMGMGPGNVSWMTTPPVEETSSVSSLMSSPAMTSPSPVSSTSPQSIPSSPLPVTALPTSVLVTTTDVLGTTSPESVTSSPPNLSSITHERPATYKDTAHTEAAMHHSTNTAVTNVGTSGSGHKSQSSVLADSETSKATPLMSTTSTLGDTSVSTSTPNISQTNQIQTEPTASLSPRLRESSTSEKTSSTTETNTAFSYVPTGAITQASRTEISSSRTSISDLDRPTIAPDISTGMITRLFTSPIMTKSAEMTVTTQTTTPGATSQGILPWDTSTTLFQGGTHSTVSQGFPHSEITTLRSRTPGDVSWMTTPPVEETSSGFSLMSPSMTSPSPVSSTSPESIPSSPLPVTALLTSVLVTTTNVLGTTSPEPVTSSPPNLSSPTQERLTTYKDTAHTEAMHASMHTNTAVANVGTSISGHESQSSVPADSHTSKATSPMGITFAMGDTSVSTSTPAFFETRIQTESTSSLIPGLRDTRTSEEINTVTETSTVLSEVPTTTTTEVSRTEVITSSRTTISGPDHSKMSPYISTETITRLSTFPFVTGSTEMAITNQTGPIGTISQATLTLDTSSTASWEGTHSPVTQRFPHSEETTTMSRSTKGVSWQSPPSVEETSSPSSPVPLPAITSHSSLYSAVSGSSPTSALPVTSLLTSGRRKTIDMLDTHSELVTSSLPSASSFSGEILTSEASTNTETIHFSENTAETNMGTTNSMHKLHSSVSIHSQPSGHTPPKVTGSMMEDAIVSTSTPGSPETKNVDRDSTSPLTPELKEDSTALVMNSTTESNTVFSSVSLDAATEVSRAEVTYYDPTFMPASAQSTKSPDISPEASSSHSNSPPLTISTHKTIATQTGPSGVTSLGQLTLDTSTIATSAGTPSARTQDFVDSETTSVMNNDLNDVLKTSPFSAEEANSLSSQAPLLVTTSPSPVTSTLQEHSTSSLVSVTSVPTPTLAKITDMDTNLEPVTRSPQNLRNTLATSEATTDTHTMHPSINTAVANVGTTSSPNEFYFTVSPDSDPYKATSAVVITSTSGDSIVSTSMPRSSAMKKIESETTFSLIFRLRETSTSQKIGSSSDTSTVFDKAFTAATTEVSRTELTSSSRTSIQGTEKPTMSPDTSTRSVTMLSTFAGLTKSEERTIATQTGPHRATSQGTLTWDTSITTSQAGTHSAMTHGFSQLDLSTLTSRVPEYISGTSPPSVEKTSSSSSLLSLPAITSPSPVPTTLPESRPSSPVHLTSLPTSGLVKTTDMLASVASLPPNLGSTSHKIPTTSEDIKDTEKMYPSTNIAVTNVGTTTSEKESYSSVPAYSEPPKVTSPMVTSFNIRDTIVSTSMPGSSEITRIEMESTFSLAHGLKGTSTSQDPIVSTEKSAVLHKLTTGATETSRTEVASSRRTSIPGPDHSTESPDISTEVIPSLPISLGITESSNMTIITRTGPPLGSTSQGTFTLDTPTTSSRAGTHSMATQEFPHSEMTTVMNKDPEILSWTIPPSIEKTSFSSSLMPSPAMTSPPVSSTLPKTIHTTPSPMTSLLTPSLVMTTDTLGTSPEPTTSSPPNLSSTSHEILTTDEDTTAIEAMHPSTSTAATNVETTSSGHGSQSSVLADSEKTKATAPMDTTSTMGHTTVSTSMSVSSETTKIKRESTYSLTPGLRETSISQNASFSTDTSIVLSEVPTGTTAEVSRTEVTSSGRTSIPGPSQSTVLPEISTRTMTRLFASPTMTESAEMTIPTQTGPSGSTSQDTLTLDTSTTKSQAKTHSTLTQRFPHSEMTTLMSRGPGDMSWQSSPSLENPSSLPSLLSLPATTSPPPISSTLPVTISSSPLPVTSLLTSSPVTTTDMLHTSPELVTSSPPKLSHTSDERLTTGKDTTNTEAVHPSTNTAASNVEIPSSGHESPSSALADSETSKATSPMFITSTQEDTTVAISTPHFLETSRIQKESISSLSPKLRETGSSVETSSAIETSAVLSEVSIGATTEISRTEVTSSSRTSISGSAESTMLPEISTTRKIIKFPTSPILAESSEMTIKTQTSPPGSTSESTFTLDTSTTPSLVITHSTMTQRLPHSEITTLVSRGAGDVPRPSSLPVEETSPPSSQLSLSAMISPSPVSSTLPASSHSSSASVTSLLTPGQVKTTEVLDASAEPETSSPPSLSSTSVEILATSEVTTDTEKIHPFSNTAVTKVGTSSSGHESPSSVLPDSETTKATSAMGTISIMGDTSVSTLTPALSNTRKIQSEPASSLTTRLRETSTSEETSLATEANTVLSKVSTGATTEVSRTEAISFSRTSMSGPEQSTMSQDISIGTIPRISASSVLTESAKMTITTQTGPSESTLESTLNLNTATTPSWVETHSIVIQGFPHPEMTTSMGRGPGGVSWPSPPFVKETSPPSSPLSLPAVTSPHPVSTTFLAHIPPSPLPVTSLLTSGPATTTDILGTSTEPGTSSSSSLSTTSHERLTTYKDTAHTEAVHPSTNTGGTNVATTSSGYKSQSSVLADSSPMCTTSTMGDTSVLTSTPAFLETRRIQTELASSLTPGLRESSGSEGTSSGTKMSTVLSKVPTGATTEISKEDVTSIPGPAQSTISPDISTRTVSWFSTSPVMTESAEITMNTHTSPLGATTQGTSTLDTSSTTSLTMTHSTISQGFSHSQMSTLMRRGPEDVSWMSPPLLEKTRPSFSLMSSPATTSPSPVSSTLPESISSSPLPVTSLLTSGLAKTTDMLHKSSEPVTNSPANLSSTSVEILATSEVTTDTEKTHPSSNRTVTDVGTSSSGHESTSFVLADSQTSKVTSPMVITSTMEDTSVSTSTPGFFETSRIQTEPTSSLTLGLRKTSSSEGTSLATEMSTVLSGVPTGATAEVSRTEVTSSSRTSISGFAQLTVSPETSTETITRLPTSSIMTESAEMMIKTQTDPPGSTPESTHTVDISTTPNWVETHSTVTQRFSHSEMTTLVSRSPGDMLWPSQSSVEETSSASSLLSLPATTSPSPVSSTLVEDFPSASLPVTSLLNPGLVITTDRMGISREPGTSSTSNLSSTSHERLTTLEDTVDTEDMQPSTHTAVTNVRTSISGHESQSSVLSDSETPKATSPMGTTYTMGETSVSISTSDFFETSRIQIEPTSSLTSGLRETSSSERISSATEGSTVLSEVPSGATTEVSRTEVISSRGTSMSGPDQFTISPDISTEAITRLSTSPIMTESAESAITIETGSPGATSEGTLTLDTSTTTFWSGTHSTASPGFSHSEMTTLMSRTPGDVPWPSLPSVEEASSVSSSLSSPAMTSTSFFSTLPESISSSPHPVTALLTLGPVKTTDMLRTSSEPETSSPPNLSSTSAEILATSEVTKDREKIHPSSNTPVVNVGTVIYKHLSPSSVLADLVTTKPTSPMATTSTLGNTSVSTSTPAFPETMMTQPTSSLTSGLREISTSQETSSATERSASLSGMPTGATTKVSRTEALSLGRTSTPGPAQSTISPEISTETITRISTPLTTTGSAEMTITPKTGHSGASSQGTFTLDTSSRASWPGTHSAATHRSPHSGMTTPMSRGPEDVSWPSRPSVEKTSPPSSLVSLSAVTSPSPLYSTPSESSHSSPLRVTSLFTPVMMKTTDMLDTSLEPVTTSPPSMNITSDESLATSKATMETEAIQLSENTAVTQMGTISARQEFYSSYPGLPEPSKVTSPVVTSSTIKDIVSTTIPASSEITRIEMESTSTLTPTPRETSTSQEIHSATKPSTVPYKALTSATIEDSMTQVMSSSRGPSPDQSTMSQDISTEVITRLSTSPIKTESTEMTITTQTGSPGATSRGTLTLDTSTTFMSGTHSTASQGFSHSQMTALMSRTPGDVPWLSHPSVEEASSASFSLSSPVMTSSSPVSSTLPDSIHSSSLPVTSLLTSGLVKTTELLGTSSEPETSSPPNLSSTSAEILAITEVTTDTEKLEMTNVVTSGYTHESPSSVLADSVTTKATSSMGITYPTGDTNVLTSTPAFSDTSRIQTKSKLSLTPGLMETSISEETSSATEKSTVLSSVPTGATTEVSRTEAISSSRTSIPGPAQSTMSSDTSMETITRISTPLTRKESTDMAITPKTGPSGATSQGTFTLDSSSTASWPGTHSATTQRFPQSVVTTPMSRGPEDVSWPSPLSVEKNSPPSSLVSSSSVTSPSPLYSTPSGSSHSSPVPVTSLFTSIMMKATDMLDASLEPETTSAPNMNITSDESLAASKATTETEAIHVFENTAASHVETTSATEELYSSSPGFSEPTKVISPVVTSSSIRDNMVSTTMPGSSGITRIEIESMSSLTPGLRETRTSQDITSSTETSTVLYKMPSGATPEVSRTEVMPSSRTSIPGPAQSTMSLDISDEVVTRLSTSPIMTESAEITITTQTGYSLATSQVTLPLGTSMTFLSGTHSTMSQGLSHSEMTNLMSRGPESLSWTSPRFVETTRSSSSLTSLPLTTSLSPVSSTLLDSSPSSPLPVTSLILPGLVKTTEVLDTSSEPKTSSSPNLSSTSVEIPATSEIMTDTEKIHPSSNTAVAKVRTSSSVHESHSSVLADSETTITIPSMGITSAVDDTTVFTSNPAFSETRRIPTEPTFSLTPGFRETSTSEETTSITETSAVLYGVPTSATTEVSMTEIMSSNRIHIPDSDQSTMSPDIITEVITRLSSSSMMSESTQMTITTQKSSPGATAQSTLTLATTTAPLARTHSTVPPRFLHSEMTTLMSRSPENPSWKSSLFVEKTSSSSSLLSLPVTTSPSVSSTLPQSIPSSSFSVTSLLTPGMVKTTDTSTEPGTSLSPNLSGTSVEILAASEVTTDTEKIHPSSSMAVTNVGTTSSGHELYSSVSIHSEPSKATYPVGTPSSMAETSISTSMPANFETTGFEAEPFSHLTSGFRKTNMSLDTSSVTPTNTPSSPGSTHLLQSSKTDFTSSAKTSSPDWPPASQYTEIPVDIITPFNASPSITESTGITSFPESRFTMSVTESTHHLSTDLLPSAETISTGTVMPSLSEAMTSFATTGVPRAISGSGSPFSRTESGPGDATLSTIAESLPSSTPVPFSSSTFTTTDSSTIPALHEITSSSATPYRVDTSLGTESSTTEGRLVMVSTLDTSSQPGRTSSSPILDTRMTESVELGTVTSAYQVPSLSTRLTRTDGIMEHITKIPNEAAHRGTIRPVKGPQTSTSPASPKGLHTGGTKRMETTTTALKTTTTALKTTSRATLTTSVYTPTLGTLTPLNASMQMASTIPTEMMITTPYVFPDVPETTSSLATSLGAETSTALPRTTPSVFNRESETTASLVSRSGAERSPVIQTLDVSSSEPDTTASWVIHPAETIPTVSKTTPNFFHSELDTVSSTATSHGADVSSAIPTNISPSELDALTPLVTISGTDTSTTFPTLTKSPHETETRTTWLTHPAETSSTIPRTIPNFSHHESDATPSIATSPGAETSSAIPIMTVSPGAEDLVTSQVTSSGTDRNMTIPTLTLSPGEPKTIASLVTHPEAQTSSAIPTSTISPAVSRLVTSMVTSLAAKTSTTNRALTNSPGEPATTVSLVTHPAQTSPTVPWTTSIFFHSKSDTTPSMTTSHGAESSSAVPTPTVSTEVPGVVTPLVTSSRAVISTTIPILTLSPGEPETTPSMATSHGEEASSAIPTPTVSPGVPGVVTSLVTSSRAVTSTTIPILTFSLGEPETTPSMATSHGTEAGSAVPTVLPEVPGMVTSLVASSRAVTSTTLPTLTLSPGEPETTPSMATSHGAEASSTVPTVSPEVPGVVTSLVTSSSGVNSTSIPTLILSPGELETTPSMATSHGAEASSAVPTPTVSPGVSGVVTPLVTSSRAVTSTTIPILTLSSSEPETTPSMATSHGVEASSAVLTVSPEVPGMVTSLVTSSRAVTSTTIPTLTISSDEPETTTSLVTHSEAKMISAIPTLAVSPTVQGLVTSLVTSSGSETSAFSNLTVASSQPETIDSWVAHPGTEASSVVPTLTVSTGEPFTNISLVTHPAESSSTLPRTTSRFSHSELDTMPSTVTSPEAESSSAISTTISPGIPGVLTSLVTSSGRDISATFPTVPESPHESEATASWVTHPAVTSTTVPRTTPNYSHSEPDTTPSIATSPGAEATSDFPTITVSPDVPDMVTSQVTSSGTDTSITIPTLTLSSGEPETTTSFITYSETHTSSAIPTLPVSPGASKMLTSLVISSGTDSTTTFPTLTETPYEPETTAIQLIHPAETNTMVPRTTPKFSHSKSDTTLPVAITSPGPEASSAVSTTTISPDMSDLVTSLVPSSGTDTSTTFPTLSETPYEPETTATWLTHPAETSTTVSGTIPNFSHRGSDTAPSMVTSPGVDTRSGVPTTTIPPSIPGVVTSQVTSSATDTSTAIPTLTPSPGEPETTASSATHPGTQTGFTVPIRTVPSSEPDTMASWVTHPPQTSTPVSRTTSSFSHSSPDATPVMATSPRTEASSAVLTTISPGAPEMVTSQITSSGAATSTTVPTLTHSPGMPETTALLSTHPRTETSKTFPASTVFPQVSETTASLTIRPGAETSTALPTQTTSSLFTLLVTGTSRVDLSPTASPGVSAKTAPLSTHPGTETSTMIPTSTLSLGLLETTGLLATSSSAETSTSTLTLTVSPAVSGLSSASITTDKPQTVTSWNTETSPSVTSVGPPEFSRTVTGTTMTLIPSEMPTPPKTSHGEGVSPTTILRTTMVEATNLATTGSSPTVAKTTTTFNTLAGSLFTPLTTPGMSTLASESVTSRTSYNHRSWISTTSSYNRRYWTPATSTPVTSTFSPGISTSSIPSSTAATVPFMVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNATERELQGLLKPLFRNSSLEYLYSGCRLASLRPEKDSSATAVDAICTHRPDPEDLGLDRERLYWELSNLTNGIQELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSMPTTSTPGTSTVDVGTSGTPSSSPSPTTAGPLLMPFTLNFTITNLQYEEDMRRTGSRKFNTMESVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNDIEELGPYTLDRNSLYVNGFTHQSSVSTTSTPGTSTVDLRTSGTPSSLSSPTIMAAGPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMGHPGSRKFNTTERVLQGLLGPIFKNTSVGPLYSGCRLTSLRSEKDGAATGVDAICIHHLDPKSPGLNRERLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTSSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPATAGPLLVLFTLNFTITNLKYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQTLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHWIPVPTSSTPGTSTVDLGSGTPSSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLKYEEDMHCPGSRKFNTTERVLQSLLGPMFKNTSVGPLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHQTSAPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTSAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRPEKNGAATGMDAICSHRLDPKSPGLNREQLYWELSQLTHGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVAPTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTTAVPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLGPLFKNSSVGPLYSGCRLISLRSEKDGAATGVDAICTHHLNPQSPGLDREQLYWQLSQMTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSGLTTSTPWTSTVDLGTSGTPSPVPSPTTTGPLLVPFTLNFTITNLQYEENMGHPGSRKFNITESVLQGLLKPLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGVATRVDAICTHRPDPKIPGLDRQQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSTPGTFTVQPETSETPSSLPGPTATGPVLLPFTLNFTITNLQYEEDMRRPGSRKFNTTERVLQGLLMPLFKNTSVSSLYSGCRLTLLRPEKDGAATRVDAVCTHRPDPKSPGLDRERLYWKLSQLTHGITELGPYTLDRHSLYVNGFTHQSSMTTTRTPDTSTMHLATSRTPASLSGPMTASPLLVLFTINFTITNLRYEENMHHPGSRKFNTTERVLQGLLRPVFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPKKDGAATKVDAICTYRPDPKSPGLDREQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSIPGTPTVDLGTSGTPVSKPGPSAASPLLVLFTLNFTITNLRYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLRSLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGTATGVDAICTHHPDPKSPRLDREQLYWELSQLTHNITELGPYALDNDSLFVNGFTHRSSVSTTSTPGTPTVYLGASKTPASIFGPSAASHLLILFTLNFTITNLRYEENMWPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGEATGVDAICTHRPDPTGPGLDREQLYLELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSTGVVSEEPFTLNFTINNLRYMADMGQPGSLKFNITDNVMQHLLSPLFQRSSLGARYTGCRVIALRSVKNGAETRVDLLCTYLQPLSGPGLPIKQVFHELSQQTHGITRLGPYSLDKDSLYLNGYNEPGPDEPPTTPKPATTFLPPLSEATTAMGYHLKTLTLNFTISNLQYSPDMGKGSATFNSTEGVLQHLLRPLFQKSSMGPFYLGCQLISLRPEKDGAATGVDTTCTYHPDPVGPGLDIQQLYWELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNWNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGVITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
151
MUC16<sup>c114-N1</sup>
AFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
152
MUC16<sup>c114-N2</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
153
MUC16<sup>c114-N12</sup>
AFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
154
MUC16<sup>c114-N123</sup>
AFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
155
N-конец первого тандемного повтора MUC16<sup>c344</sup>
WELSQL
156
C-конец первого тандемного повтора MUC16<sup>c344</sup>
TGVDSLC
157
N-конец эктодомена MUC16<sup>c344</sup>
NFSPLAR
158
C-конец эктодомена MUC16<sup>c344</sup>
TGNSDLP
159
Трансмембранный
FWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLV
160
Цитоплазматический хвост
TTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
161
Эктодомен MUC16<sup>c114</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP
162
Эктодомен MUC16<sup>c80</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMDLP
163
Эктодомен MUC16<sup>c86</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP
164
Трансмембранный MUC16<sup>c86</sup>
FWAVILIGLAGLLGLITCLICG
165
Цитоплазматический MUC16<sup>c86</sup>
DLEDLQ
166
Эктодомен MUC16 3(N в A)c114
AFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP
167
Домен LGALS3, связывающий сахар
PYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTS
168
Не гликозилированный пептид 2 MUC16
CTLDRSSVLVDGYSPNRNE
169
Неродственный MUC16 пептидный 18-мер
GAVPRSATINVSRIATGP
170
18-мер (без C)
TRNGTQLQNFTLDRSSV
171
15-мер (без C)
GTQLQNFTLDRSSV
172
MUC16<sup>c114-N23</sup>
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
173
N24 mut c344
WELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNQNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHQLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
174
N30 mut c344
WELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNQNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHQLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
175
N24-N30 mut c344
WELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNQNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHQLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
8. ЭКВИВАЛЕНТЫ
[00695] Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в этом описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая индивидуальная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана в качестве включенной посредством ссылки. Несмотря на то, что приведенное выше изобретение описано в некоторых подробностях в качестве иллюстрации и примера для целей прозрачности понимания, специалистам в данной области будет легко видно в свете положений данного изобретения, что в нем можно выполнять определенные изменения и модификации, не отступая от сущности и объема приложенной формулы изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER
<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ MUC16 И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
<130> 13542-016-228
<150> 62/134,402
<151> 2015-03-17
<160> 175
<170> FastSEQ для Windows версии 4.0
<210> 1
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 VH
<400> 1
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ser Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 2
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 VL
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85                  90                  95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Asn
100                 105
<210> 3
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (KABAT)
<400> 3
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1               5
<210> 4
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (KABAT)
<400> 4
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1               5                  10                  15
<210> 5
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (KABAT)
<400> 5
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 6
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (KABAT)
<400> 6
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1               5                  10                  15
<210> 7
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (KABAT)
<400> 7
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1               5
<210> 8
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (KABAT)
<400> 8
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser
1               5
<210> 9
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 9
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met
1               5
<210> 10
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 10
Trp Asp Asp
1
<210> 11
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 11
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
<210> 12
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 12
Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1               5                  10
<210> 13
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 13
Leu Val Ser
1
<210> 14
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 14
Ile Arg Glu Leu Thr Arg
1               5
<210> 15
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (IMGT)
<400> 15
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met Gly
1               5                  10
<210> 16
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (IMGT)
<400> 16
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210> 17
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (IMGT)
<400> 17
Ser Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 18
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (IMGT)
<400> 18
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1               5                  10
<210> 19
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (IMGT)
<400> 19
Leu Val Ser
1
<210> 20
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (IMGT)
<400> 20
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser
1               5
<210> 21
<211> 123
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 VH
<400> 21
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Val Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 22
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 VL
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Lys Ile Lys
100                 105                 110
<210> 23
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (KABAT)
<400> 23
Thr Val Gly Met Gly Val Gly
1               5
<210> 24
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (KABAT)
<400> 24
His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
1               5                  10                  15
Ser
<210> 25
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (KABAT)
<400> 25
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 26
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (KABAT)
<400> 26
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1               5                  10                  15
<210> 27
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (KABAT)
<400> 27
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210> 28
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (KABAT)
<400> 28
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 29
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 29
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met
1               5
<210> 30
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 30
Trp Asp Asp Glu
1
<210> 31
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 31
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
<210> 32
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 32
Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 33
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 33
Tyr Met Ser
1
<210> 34
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 34
Ser Leu Glu Tyr Pro Leu
1               5
<210> 35
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (IMGT)
<400> 35
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met Gly
1               5                  10
<210> 36
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (IMGT)
<400> 36
Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys
1               5
<210> 37
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (IMGT)
<400> 37
Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 38
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (IMGT)
<400> 38
Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 39
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (IMGT)
<400> 39
Tyr Met Ser
1
<210> 40
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (IMGT)
<400> 40
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 41
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 VH
<400> 41
Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Lys Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Ala Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Val Asn Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 42
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 VL
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85                  90                  95
Leu Glu His Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 43
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (KABAT)
<400> 43
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1               5
<210> 44
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (KABAT)
<400> 44
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1               5                  10                  15
<210> 45
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (KABAT)
<400> 45
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 46
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (KABAT)
<400> 46
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1               5                  10                  15
<210> 47
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (KABAT)
<400> 47
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210> 48
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (KABAT)
<400> 48
Met Gln Gly Leu Glu His Pro Leu Thr
1               5
<210> 49
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 49
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu Gly Met
1               5
<210> 50
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 50
Trp Asp Asp
1
<210> 51
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 51
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
<210> 52
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 52
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 53
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 53
Tyr Met Ser
1
<210> 54
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 54
Gly Leu Glu His Pro Leu
1               5
<210> 55
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (IMGT)
<400> 55
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu Gly Met Gly
1               5                  10
<210> 56
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (IMGT)
<400> 56
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210> 57
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (IMGT)
<400> 57
Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 58
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (IMGT)
<400> 58
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 59
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (IMGT)
<400> 59
Tyr Met Ser
1
<210> 60
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (IMGT)
<400> 60
Met Gln Gly Leu Glu His Pro Leu Thr
1               5
<210> 61
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 VH
<400> 61
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 62
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 VL
<400> 62
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20                  25                  30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser
85                  90                  95
Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 63
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (KABAT)
<400> 63
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1               5
<210> 64
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (KABAT)
<400> 64
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ala Leu Lys Ser
1               5                  10                  15
<210> 65
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (KABAT)
<400> 65
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 66
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (KABAT)
<400> 66
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Ile Ser
1               5                  10
<210> 67
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (KABAT)
<400> 67
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1               5
<210> 68
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (KABAT)
<400> 68
Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Thr
1               5                  10
<210> 69
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 69
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met
1               5
<210> 70
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 70
Trp Asp Asp
1
<210> 71
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 71
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
<210> 72
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 72
Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
1               5
<210> 73
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 73
Gly Ala Ser
1
<210> 74
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 74
Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu
1               5
<210> 75
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (IMGT)
<400> 75
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met Gly
1               5                  10
<210> 76
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (IMGT)
<400> 76
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210> 77
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (IMGT)
<400> 77
Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 78
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (IMGT)
<400> 78
Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
1               5
<210> 79
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (IMGT)
<400> 79
Gly Ala Ser
1
<210> 80
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (IMGT)
<400> 80
Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Thr
1               5                  10
<210> 81
<211> 123
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 VH
<400> 81
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Val Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 82
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 VL
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 83
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (KABAT)
<400> 83
Thr Val Gly Met Gly Val Gly
1               5
<210> 84
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (KABAT)
<400> 84
His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
1               5                  10                  15
Ser
<210> 85
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (KABAT)
<400> 85
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 86
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (KABAT)
<400> 86
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1               5                  10                  15
<210> 87
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (KABAT)
<400> 87
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210> 88
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (KABAT)
<400> 88
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 89
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 89
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met
1               5
<210> 90
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 90
Trp Asp Asp Glu
1
<210> 91
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 91
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
<210> 92
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 92
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 93
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 93
Tyr Met Ser
1
<210> 94
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 94
Ser Leu Glu Tyr Pro Leu
1               5
<210> 95
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (IMGT)
<400> 95
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met Gly
1               5                  10
<210> 96
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (IMGT)
<400> 96
Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys
1               5
<210> 97
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (IMGT)
<400> 97
Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 98
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (IMGT)
<400> 98
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 99
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (IMGT)
<400> 99
Tyr Met Ser
1
<210> 100
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (IMGT)
<400> 100
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 101
<211> 123
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6-18C6 VH консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> Xaa = Thr или Asn
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 11
<223> Xaa = Ile или Lys
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 30
<223> Xaa = Asn или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 32
<223> Xaa = Val или Leu
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 39
<223> Xaa = Ser или Ile
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 42
<223> Xaa = Pro или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 58
<223> Xaa = Glu или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 63
<223> Xaa = Asn или Tyr
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 74
<223> Xaa = Lys или Arg
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 75
<223> Xaa = Ala или Asp
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 76
<223> Xaa = Thr или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 86
<223> Xaa = Val или Ala
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 89
<223> Xaa = Gly или Asp
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 93
<223> Xaa = Thr, Ile или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 99
<223> Xaa = Thr, Ser или Ala
<400> 101
Gln Val Xaa Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Xaa Arg Gln Xaa Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys Tyr Tyr Xaa Pro
50                  55                  60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Xaa Xaa Xaa Ser Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Val Phe Leu Lys Ile Xaa Asn Val Xaa Thr Ala Asp Xaa Ala Thr Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Xaa Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 102
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 VL консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 11
<223> Xaa = Ile или Val
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 12
<223> Xaa = Pro или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 30
<223> Xaa = Arg или Leu
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 31
<223> Xaa = Lys или His
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 79
<223> Xaa = Arg или Lys
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 86
<223> Xaa = Glu или Gly
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 96
<223> Xaa = Ser или Gly
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 99
<223> Xaa = Tyr или His
<400> 102
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Xaa Xaa Val Thr Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Xaa Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Xaa
85                  90                  95
Leu Glu Xaa Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 103
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HCDR1 KABAT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 2
<223> Xaa = Lue или Val
<400> 103
Thr Xaa Gly Met Gly Val Gly
1               5
<210> 104
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HCDR2 KABAT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 7
<223> Xaa = Glu или Отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 12
<223> Xaa = Tyr или Asn
<400> 104
His Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys Tyr Tyr Xaa Pro Ala Leu Lys
1               5                  10                  15
Ser
<210> 105
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HCDR3 KABAT КОНСЕНСУС
<400> 105
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 106
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 KABAT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 7
<223> Xaa = Arg или Leu
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 8
<223> Xaa = Lys или His
<400> 106
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1               5                  10                  15
<210> 107
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 KABAT КОНСЕНСУС
<400> 107
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210> 108
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 KABAT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> Xaa = Gly или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa = His или Tyr
<400> 108
Met Gln Xaa Leu Glu Xaa Pro Leu Thr
1               5
<210> 109
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR1 CHOTHIA КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa = Asn или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 7
<223> Xaa = Leu или Val
<400> 109
Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa Gly Met
1               5
<210> 110
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR2 CHOTHIA КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> Xaa = Glu или Отсутствует
<400> 110
Trp Asp Asp Xaa
1
<210> 111
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR3 CHOTHIA КОНСЕНСУС
<400> 111
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
<210> 112
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR1 CHOTHIA КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa = Leu или Arg
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa = His или Lys
<400> 112
Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 113
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 CHOTHIA КОНСЕНСУС
<400> 113
Tyr Met Ser
1
<210> 114
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 CHOTHIA КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 1
<223> Xaa = Gly или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> Xaa = His или Tyr
<400> 114
Xaa Leu Glu Xaa Pro Leu
1               5
<210> 115
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR1 IMGT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa = Asn или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 7
<223> Xaa = Val или Leu
<400> 115
Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa Gly Met Gly
1               5                  10
<210> 116
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR2 IMGT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa = Glu или Отсутствует
<400> 116
Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys
1               5
<210> 117
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR3 IMGT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 1
<223> Xaa = Thr, Ala или Ser
<400> 117
Xaa Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1               5                  10
<210> 118
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR1 IMGT КОНСЕНСУС
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> Xaa = Val или Leu
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa = His или Lys
<400> 118
Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                  10
<210> 119
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 IMGT КОНСЕНСУС
<400> 119
Tyr Met Ser
1
<210> 120
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 IMGT КОНСЕНСУС
<400> 120
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 121
<211> 42
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер MUC16c114
<400> 121
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala
1               5                  10                  15
Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Cys
20                  25                  30
Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr
35                  40
<210> 122
<211> 34
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер MUC16c114
<400> 122
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys
1               5                  10                  15
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala
20                  25                  30
Gly Gly
<210> 123
<211> 45
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер MUC16c344
<400> 123
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala
1               5                  10                  15
Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys
20                  25                  30
Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala
35                  40                  45
<210> 124
<211> 34
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер MUC16c344
<400> 124
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys
1               5                  10                  15
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala
20                  25                  30
Gly Gly
<210> 125
<211> 31
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер MUC16c57-114
<400> 125
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys
1               5                  10                  15
Thr Thr Cys Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr
20                  25                  30
<210> 126
<211> 33
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер MUC16c57-114
<400> 126
Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala
1               5                  10                  15
Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly
20                  25                  30
Thr
<210> 127
<211> 31
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер 117-244LGALS3
<400> 127
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr
1               5                  10                  15
Thr Ala Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Thr Thr Gly
20                  25                  30
<210> 128
<211> 30
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер 117-244LGALS3
<400> 128
Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Ala
1               5                  10                  15
Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr
20                  25                  30
<210> 129
<211> 55
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> иммунизирующий пептидный 55-мер
<400> 129
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
50                  55
<210> 130
<211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> иммунизирующий пептидный 18-мер
<400> 130
Cys Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser
1               5                  10                  15
Ser Val
<210> 131
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> иммунизирующий пептидный 15-мер
<400> 131
Cys Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val
1               5                  10                  15
<210> 132
<211> 344
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c344
<400> 132
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1               5                  10                  15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20                  25                  30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35                  40                  45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50                  55                  60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65                  70                  75                  80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85                  90                  95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100                 105                 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115                 120                 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130                 135                 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165                 170                 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180                 185                 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195                 200                 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210                 215                 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225                 230                 235                 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr
245                 250                 255
Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260                 265                 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275                 280                 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290                 295                 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305                 310                 315                 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325                 330                 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 133
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c114
<400> 133
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85                  90                  95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100                 105                 110
Leu Gln
<210> 134
<211> 80
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c86
<400> 134
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly
20                  25                  30
Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu
35                  40                  45
Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln
50                  55                  60
Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
65                  70                  75                  80
<210> 135
<211> 86
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c80
<400> 135
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Asp Leu Glu Asp Leu Gln
85
<210> 136
<211> 14507
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Аминокислотная последовательность незрелого MUC16 человека
(NP_078966.2)
<400>  136
Met Leu Lys Pro Ser Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ser Pro Thr Arg Ser
1               5                   10                  15
Leu Met Thr Gly Ser Arg Ser Thr Lys Ala Thr Pro Glu Met Asp Ser
20                  25                  30
Gly Leu Thr Gly Ala Thr Leu Ser Pro Lys Thr Ser Thr Gly Ala Ile
35                  40                  45
Val Val Thr Glu His Thr Leu Pro Phe Thr Ser Pro Asp Lys Thr Leu
50                  55                  60
Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr Gln Ser Leu Gly
65                  70                  75                  80
Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg Gly Met Thr His
85                  90                  95
Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln Val Asn Gly Thr
100                 105                 110
Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser Gly Leu Ser Ser
115                 120                 125
Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe Thr Lys Glu Ala
130                 135                 140
Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly Pro Val Thr Glu
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu Gly Asp Ser Thr
165                 170                 175
Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys Ile Thr Ser Pro
180                 185                 190
Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu Asn Ala Pro Val
195                 200                 205
Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser His Thr Pro Gly
210                 215                 220
Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Leu
225                 230                 235                 240
Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr Ser Leu Glu Leu
245                 250                 255
Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Gly Ser
260                 265                 270
Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Ser Ala
275                 280                 285
Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile Phe Ser Gly Gln
290                 295                 300
Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu Ala Arg Ala Ser
305                 310                 315                 320
Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala
325                 330                 335
Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Thr
340                 345                 350
Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile Leu Thr Phe His
355                 360                 365
Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His Ile Ala Lys Thr
370                 375                 380
Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu Gly Gly Thr Ser
385                 390                 395                 400
Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr Leu Val Ser Glu
405                 410                 415
Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu Thr Glu Gly Thr
420                 425                 430
Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala Pro Gly Glu Glu
435                 440                 445
Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly Phe Thr Thr Leu
450                 455                 460
Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser Ser His Pro Thr
465                 470                 475                 480
Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ser Ser Ser
485                 490                 495
Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala Thr Thr Ser Ser
500                 505                 510
Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr Ala Gln Gln Phe
515                 520                 525
Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser Pro Ser Met Lys
530                 535                 540
Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala Pro Ile Thr Thr
545                 550                 555                 560
Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu Lys Thr Ser Ser
565                 570                 575
Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp Thr Leu Ile Gly
580                 585                 590
Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala Val Pro Thr Gly
595                 600                 605
Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser Gln Gly Thr Thr
610                 615                 620
His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser Ala Asp Leu
625                 630                 635                 640
Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser Pro Ala Val Ser
645                 650                 655
Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr Lys Pro Ser Tyr
660                 665                 670
Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ser Ser
675                 680                 685
Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Leu Asn Thr Arg
690                 695                 700
His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly His Thr Lys Ile
705                 710                 715                 720
Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val Leu Glu Asp Lys
725                 730                 735
Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala Thr Ser Ser Ile
740                 745                 750
Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys Pro Ser Ser Ala
755                 760                 765
Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr Ser Pro Glu Arg
770                 775                 780
Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser Pro Ser Gly Glu
785                 790                 795                 800
Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ala Glu Thr Thr
805                 810                 815
Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr Ser Glu Ser Ser
820                 825                 830
Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser Gly Val Lys Thr
835                 840                 845
Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe Thr Ser Gly Glu
850                 855                 860
Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln Pro Glu Thr Ser
865                 870                 875                 880
Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Val Pro Thr Pro
885                 890                 895
Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser Ala Gln Phe Ser
900                 905                 910
Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser Ser Thr Ser Val
915                 920                 925
Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser His Leu Thr Gly
930                 935                 940
Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe Asn Asp Ser Ala
945                 950                 955                 960
Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro Arg Phe Lys Thr
965                 970                 975
Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ala Thr Ser Leu
980                 985                 990
Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys  Phe Thr Ser Pro Ala  Thr Ser Ser
995                 1000                 1005
Met Glu  Ala Thr Ser Ile Arg  Glu Pro Ser Thr Thr  Ile Leu Thr
1010                 1015                 1020
Thr Glu  Thr Thr Asn Gly Pro  Gly Ser Met Ala Val  Ala Ser Thr
1025                 1030                 1035
Asn Ile  Pro Ile Gly Lys Gly  Tyr Ile Thr Glu Gly  Arg Leu Asp
1040                 1045                 1050
Thr Ser  His Leu Pro Ile Gly  Thr Thr Ala Ser Ser  Glu Thr Ser
1055                 1060                 1065
Met Asp  Phe Thr Met Ala Lys  Glu Ser Val Ser Met  Ser Val Ser
1070                 1075                 1080
Pro Ser  Gln Ser Met Asp Ala  Ala Gly Ser Ser Thr  Pro Gly Arg
1085                 1090                 1095
Thr Ser  Gln Phe Val Asp Thr  Phe Ser Asp Asp Val  Tyr His Leu
1100                 1105                 1110
Thr Ser  Arg Glu Ile Thr Ile  Pro Arg Asp Gly Thr  Ser Ser Ala
1115                 1120                 1125
Leu Thr  Pro Gln Met Thr Ala  Thr His Pro Pro Ser  Pro Asp Pro
1130                 1135                 1140
Gly Ser  Ala Arg Ser Thr Trp  Leu Gly Ile Leu Ser  Ser Ser Pro
1145                 1150                 1155
Ser Ser  Pro Thr Pro Lys Val  Thr Met Ser Ser Thr  Phe Ser Thr
1160                 1165                 1170
Gln Arg  Val Thr Thr Ser Met  Ile Met Asp Thr Val  Glu Thr Ser
1175                 1180                 1185
Arg Trp  Asn Met Pro Asn Leu  Pro Ser Thr Thr Ser  Leu Thr Pro
1190                 1195                 1200
Ser Asn  Ile Pro Thr Ser Gly  Ala Ile Gly Lys Ser  Thr Leu Val
1205                 1210                 1215
Pro Leu  Asp Thr Pro Ser Pro  Ala Thr Ser Leu Glu  Ala Ser Glu
1220                 1225                 1230
Gly Gly  Leu Pro Thr Leu Ser  Thr Tyr Pro Glu Ser  Thr Asn Thr
1235                 1240                 1245
Pro Ser  Ile His Leu Gly Ala  His Ala Ser Ser Glu  Ser Pro Ser
1250                 1255                 1260
Thr Ile  Lys Leu Thr Met Ala  Ser Val Val Lys Pro  Gly Ser Tyr
1265                 1270                 1275
Thr Pro  Leu Thr Phe Pro Ser  Ile Glu Thr His Ile  His Val Ser
1280                 1285                 1290
Thr Ala  Arg Met Ala Tyr Ser  Ser Gly Ser Ser Pro  Glu Met Thr
1295                 1300                 1305
Ala Pro  Gly Glu Thr Asn Thr  Gly Ser Thr Trp Asp  Pro Thr Thr
1310                 1315                 1320
Tyr Ile  Thr Thr Thr Asp Pro  Lys Asp Thr Ser Ser  Ala Gln Val
1325                 1330                 1335
Ser Thr  Pro His Ser Val Arg  Thr Leu Arg Thr Thr  Glu Asn His
1340                 1345                 1350
Pro Lys  Thr Glu Ser Ala Thr  Pro Ala Ala Tyr Ser  Gly Ser Pro
1355                 1360                 1365
Lys Ile  Ser Ser Ser Pro Asn  Leu Thr Ser Pro Ala  Thr Lys Ala
1370                 1375                 1380
Trp Thr  Ile Thr Asp Thr Thr  Glu His Ser Thr Gln  Leu His Tyr
1385                 1390                 1395
Thr Lys  Leu Ala Glu Lys Ser  Ser Gly Phe Glu Thr  Gln Ser Ala
1400                 1405                 1410
Pro Gly  Pro Val Ser Val Val  Ile Pro Thr Ser Pro  Thr Ile Gly
1415                 1420                 1425
Ser Ser  Thr Leu Glu Leu Thr  Ser Asp Val Pro Gly  Glu Pro Leu
1430                 1435                 1440
Val Leu  Ala Pro Ser Glu Gln  Thr Thr Ile Thr Leu  Pro Met Ala
1445                 1450                 1455
Thr Trp  Leu Ser Thr Ser Leu  Thr Glu Glu Met Ala  Ser Thr Asp
1460                 1465                 1470
Leu Asp  Ile Ser Ser Pro Ser  Ser Pro Met Ser Thr  Phe Ala Ile
1475                 1480                 1485
Phe Pro  Pro Met Ser Thr Pro  Ser His Glu Leu Ser  Lys Ser Glu
1490                 1495                 1500
Ala Asp  Thr Ser Ala Ile Arg  Asn Thr Asp Ser Thr  Thr Leu Asp
1505                 1510                 1515
Gln His  Leu Gly Ile Arg Ser  Leu Gly Arg Thr Gly  Asp Leu Thr
1520                 1525                 1530
Thr Val  Pro Ile Thr Pro Leu  Thr Thr Thr Trp Thr  Ser Val Ile
1535                 1540                 1545
Glu His  Ser Thr Gln Ala Gln  Asp Thr Leu Ser Ala  Thr Met Ser
1550                 1555                 1560
Pro Thr  His Val Thr Gln Ser  Leu Lys Asp Gln Thr  Ser Ile Pro
1565                 1570                 1575
Ala Ser  Ala Ser Pro Ser His  Leu Thr Glu Val Tyr  Pro Glu Leu
1580                 1585                 1590
Gly Thr  Gln Gly Arg Ser Ser  Ser Glu Ala Thr Thr  Phe Trp Lys
1595                 1600                 1605
Pro Ser  Thr Asp Thr Leu Ser  Arg Glu Ile Glu Thr  Gly Pro Thr
1610                 1615                 1620
Asn Ile  Gln Ser Thr Pro Pro  Met Asp Asn Thr Thr  Thr Gly Ser
1625                 1630                 1635
Ser Ser  Ser Gly Val Thr Leu  Gly Ile Ala His Leu  Pro Ile Gly
1640                 1645                 1650
Thr Ser  Ser Pro Ala Glu Thr  Ser Thr Asn Met Ala  Leu Glu Arg
1655                 1660                 1665
Arg Ser  Ser Thr Ala Thr Val  Ser Met Ala Gly Thr  Met Gly Leu
1670                 1675                 1680
Leu Val  Thr Ser Ala Pro Gly  Arg Ser Ile Ser Gln  Ser Leu Gly
1685                 1690                 1695
Arg Val  Ser Ser Val Leu Ser  Glu Ser Thr Thr Glu  Gly Val Thr
1700                 1705                 1710
Asp Ser  Ser Lys Gly Ser Ser  Pro Arg Leu Asn Thr  Gln Gly Asn
1715                 1720                 1725
Thr Ala  Leu Ser Ser Ser Leu  Glu Pro Ser Tyr Ala  Glu Gly Ser
1730                 1735                 1740
Gln Met  Ser Thr Ser Ile Pro  Leu Thr Ser Ser Pro  Thr Thr Pro
1745                 1750                 1755
Asp Val  Glu Phe Ile Gly Gly  Ser Thr Phe Trp Thr  Lys Glu Val
1760                 1765                 1770
Thr Thr  Val Met Thr Ser Asp  Ile Ser Lys Ser Ser  Ala Arg Thr
1775                 1780                 1785
Glu Ser  Ser Ser Ala Thr Leu  Met Ser Thr Ala Leu  Gly Ser Thr
1790                 1795                 1800
Glu Asn  Thr Gly Lys Glu Lys  Leu Arg Thr Ala Ser  Met Asp Leu
1805                 1810                 1815
Pro Ser  Pro Thr Pro Ser Met  Glu Val Thr Pro Trp  Ile Ser Leu
1820                 1825                 1830
Thr Leu  Ser Asn Ala Pro Asn  Thr Thr Asp Ser Leu  Asp Leu Ser
1835                 1840                 1845
His Gly  Val His Thr Ser Ser  Ala Gly Thr Leu Ala  Thr Asp Arg
1850                 1855                 1860
Ser Leu  Asn Thr Gly Val Thr  Arg Ala Ser Arg Leu  Glu Asn Gly
1865                 1870                 1875
Ser Asp  Thr Ser Ser Lys Ser  Leu Ser Met Gly Asn  Ser Thr His
1880                 1885                 1890
Thr Ser  Met Thr Tyr Thr Glu  Lys Ser Glu Val Ser  Ser Ser Ile
1895                 1900                 1905
His Pro  Arg Pro Glu Thr Ser  Ala Pro Gly Ala Glu  Thr Thr Leu
1910                 1915                 1920
Thr Ser  Thr Pro Gly Asn Arg  Ala Ile Ser Leu Thr  Leu Pro Phe
1925                 1930                 1935
Ser Ser  Ile Pro Val Glu Glu  Val Ile Ser Thr Gly  Ile Thr Ser
1940                 1945                 1950
Gly Pro  Asp Ile Asn Ser Ala  Pro Met Thr His Ser  Pro Ile Thr
1955                 1960                 1965
Pro Pro  Thr Ile Val Trp Thr  Ser Thr Gly Thr Ile  Glu Gln Ser
1970                 1975                 1980
Thr Gln  Pro Leu His Ala Val  Ser Ser Glu Lys Val  Ser Val Gln
1985                 1990                 1995
Thr Gln  Ser Thr Pro Tyr Val  Asn Ser Val Ala Val  Ser Ala Ser
2000                 2005                 2010
Pro Thr  His Glu Asn Ser Val  Ser Ser Gly Ser Ser  Thr Ser Ser
2015                 2020                 2025
Pro Tyr  Ser Ser Ala Ser Leu  Glu Ser Leu Asp Ser  Thr Ile Ser
2030                 2035                 2040
Arg Arg  Asn Ala Ile Thr Ser  Trp Leu Trp Asp Leu  Thr Thr Ser
2045                 2050                 2055
Leu Pro  Thr Thr Thr Trp Pro  Ser Thr Ser Leu Ser  Glu Ala Leu
2060                 2065                 2070
Ser Ser  Gly His Ser Gly Val  Ser Asn Pro Ser Ser  Thr Thr Thr
2075                 2080                 2085
Glu Phe  Pro Leu Phe Ser Ala  Ala Ser Thr Ser Ala  Ala Lys Gln
2090                 2095                 2100
Arg Asn  Pro Glu Thr Glu Thr  His Gly Pro Gln Asn  Thr Ala Ala
2105                 2110                 2115
Ser Thr  Leu Asn Thr Asp Ala  Ser Ser Val Thr Gly  Leu Ser Glu
2120                 2125                 2130
Thr Pro  Val Gly Ala Ser Ile  Ser Ser Glu Val Pro  Leu Pro Met
2135                 2140                 2145
Ala Ile  Thr Ser Arg Ser Asp  Val Ser Gly Leu Thr  Ser Glu Ser
2150                 2155                 2160
Thr Ala  Asn Pro Ser Leu Gly  Thr Ala Ser Ser Ala  Gly Thr Lys
2165                 2170                 2175
Leu Thr  Arg Thr Ile Ser Leu  Pro Thr Ser Glu Ser  Leu Val Ser
2180                 2185                 2190
Phe Arg  Met Asn Lys Asp Pro  Trp Thr Val Ser Ile  Pro Leu Gly
2195                 2200                 2205
Ser His  Pro Thr Thr Asn Thr  Glu Thr Ser Ile Pro  Val Asn Ser
2210                 2215                 2220
Ala Gly  Pro Pro Gly Leu Ser  Thr Val Ala Ser Asp  Val Ile Asp
2225                 2230                 2235
Thr Pro  Ser Asp Gly Ala Glu  Ser Ile Pro Thr Val  Ser Phe Ser
2240                 2245                 2250
Pro Ser  Pro Asp Thr Glu Val  Thr Thr Ile Ser His  Phe Pro Glu
2255                 2260                 2265
Lys Thr  Thr His Ser Phe Arg  Thr Ile Ser Ser Leu  Thr His Glu
2270                 2275                 2280
Leu Thr  Ser Arg Val Thr Pro  Ile Pro Gly Asp Trp  Met Ser Ser
2285                 2290                 2295
Ala Met  Ser Thr Lys Pro Thr  Gly Ala Ser Pro Ser  Ile Thr Leu
2300                 2305                 2310
Gly Glu  Arg Arg Thr Ile Thr  Ser Ala Ala Pro Thr  Thr Ser Pro
2315                 2320                 2325
Ile Val  Leu Thr Ala Ser Phe  Thr Glu Thr Ser Thr  Val Ser Leu
2330                 2335                 2340
Asp Asn  Glu Thr Thr Val Lys  Thr Ser Asp Ile Leu  Asp Ala Arg
2345                 2350                 2355
Lys Thr  Asn Glu Leu Pro Ser  Asp Ser Ser Ser Ser  Ser Asp Leu
2360                 2365                 2370
Ile Asn  Thr Ser Ile Ala Ser  Ser Thr Met Asp Val  Thr Lys Thr
2375                 2380                 2385
Ala Ser  Ile Ser Pro Thr Ser  Ile Ser Gly Met Thr  Ala Ser Ser
2390                 2395                 2400
Ser Pro  Ser Leu Phe Ser Ser  Asp Arg Pro Gln Val  Pro Thr Ser
2405                 2410                 2415
Thr Thr  Glu Thr Asn Thr Ala  Thr Ser Pro Ser Val  Ser Ser Asn
2420                 2425                 2430
Thr Tyr  Ser Leu Asp Gly Gly  Ser Asn Val Gly Gly  Thr Pro Ser
2435                 2440                 2445
Thr Leu  Pro Pro Phe Thr Ile  Thr His Pro Val Glu  Thr Ser Ser
2450                 2455                 2460
Ala Leu  Leu Ala Trp Ser Arg  Pro Val Arg Thr Phe  Ser Thr Met
2465                 2470                 2475
Val Ser  Thr Asp Thr Ala Ser  Gly Glu Asn Pro Thr  Ser Ser Asn
2480                 2485                 2490
Ser Val  Val Thr Ser Val Pro  Ala Pro Gly Thr Trp  Thr Ser Val
2495                 2500                 2505
Gly Ser  Thr Thr Asp Leu Pro  Ala Met Gly Phe Leu  Lys Thr Ser
2510                 2515                 2520
Pro Ala  Gly Glu Ala His Ser  Leu Leu Ala Ser Thr  Ile Glu Pro
2525                 2530                 2535
Ala Thr  Ala Phe Thr Pro His  Leu Ser Ala Ala Val  Val Thr Gly
2540                 2545                 2550
Ser Ser  Ala Thr Ser Glu Ala  Ser Leu Leu Thr Thr  Ser Glu Ser
2555                 2560                 2565
Lys Ala  Ile His Ser Ser Pro  Gln Thr Pro Thr Thr  Pro Thr Ser
2570                 2575                 2580
Gly Ala  Asn Trp Glu Thr Ser  Ala Thr Pro Glu Ser  Leu Leu Val
2585                 2590                 2595
Val Thr  Glu Thr Ser Asp Thr  Thr Leu Thr Ser Lys  Ile Leu Val
2600                 2605                 2610
Thr Asp  Thr Ile Leu Phe Ser  Thr Val Ser Thr Pro  Pro Ser Lys
2615                 2620                 2625
Phe Pro  Ser Thr Gly Thr Leu  Ser Gly Ala Ser Phe  Pro Thr Leu
2630                 2635                 2640
Leu Pro  Asp Thr Pro Ala Ile  Pro Leu Thr Ala Thr  Glu Pro Thr
2645                 2650                 2655
Ser Ser  Leu Ala Thr Ser Phe  Asp Ser Thr Pro Leu  Val Thr Ile
2660                 2665                 2670
Ala Ser  Asp Ser Leu Gly Thr  Val Pro Glu Thr Thr  Leu Thr Met
2675                 2680                 2685
Ser Glu  Thr Ser Asn Gly Asp  Ala Leu Val Leu Lys  Thr Val Ser
2690                 2695                 2700
Asn Pro  Asp Arg Ser Ile Pro  Gly Ile Thr Ile Gln  Gly Val Thr
2705                 2710                 2715
Glu Ser  Pro Leu His Pro Ser  Ser Thr Ser Pro Ser  Lys Ile Val
2720                 2725                 2730
Ala Pro  Arg Asn Thr Thr Tyr  Glu Gly Ser Ile Thr  Val Ala Leu
2735                 2740                 2745
Ser Thr  Leu Pro Ala Gly Thr  Thr Gly Ser Leu Val  Phe Ser Gln
2750                 2755                 2760
Ser Ser  Glu Asn Ser Glu Thr  Thr Ala Leu Val Asp  Ser Ser Ala
2765                 2770                 2775
Gly Leu  Glu Arg Ala Ser Val  Met Pro Leu Thr Thr  Gly Ser Gln
2780                 2785                 2790
Gly Met  Ala Ser Ser Gly Gly  Ile Arg Ser Gly Ser  Thr His Ser
2795                 2800                 2805
Thr Gly  Thr Lys Thr Phe Ser  Ser Leu Pro Leu Thr  Met Asn Pro
2810                 2815                 2820
Gly Glu  Val Thr Ala Met Ser  Glu Ile Thr Thr Asn  Arg Leu Thr
2825                 2830                 2835
Ala Thr  Gln Ser Thr Ala Pro  Lys Gly Ile Pro Val  Lys Pro Thr
2840                 2845                 2850
Ser Ala  Glu Ser Gly Leu Leu  Thr Pro Val Ser Ala  Ser Ser Ser
2855                 2860                 2865
Pro Ser  Lys Ala Phe Ala Ser  Leu Thr Thr Ala Pro  Pro Thr Trp
2870                 2875                 2880
Gly Ile  Pro Gln Ser Thr Leu  Thr Phe Glu Phe Ser  Glu Val Pro
2885                 2890                 2895
Ser Leu  Asp Thr Lys Ser Ala  Ser Leu Pro Thr Pro  Gly Gln Ser
2900                 2905                 2910
Leu Asn  Thr Ile Pro Asp Ser  Asp Ala Ser Thr Ala  Ser Ser Ser
2915                 2920                 2925
Leu Ser  Lys Ser Pro Glu Lys  Asn Pro Arg Ala Arg  Met Met Thr
2930                 2935                 2940
Ser Thr  Lys Ala Ile Ser Ala  Ser Ser Phe Gln Ser  Thr Gly Phe
2945                 2950                 2955
Thr Glu  Thr Pro Glu Gly Ser  Ala Ser Pro Ser Met  Ala Gly His
2960                 2965                 2970
Glu Pro  Arg Val Pro Thr Ser  Gly Thr Gly Asp Pro  Arg Tyr Ala
2975                 2980                 2985
Ser Glu  Ser Met Ser Tyr Pro  Asp Pro Ser Lys Ala  Ser Ser Ala
2990                 2995                 3000
Met Thr  Ser Thr Ser Leu Ala  Ser Lys Leu Thr Thr  Leu Phe Ser
3005                 3010                 3015
Thr Gly  Gln Ala Ala Arg Ser  Gly Ser Ser Ser Ser  Pro Ile Ser
3020                 3025                 3030
Leu Ser  Thr Glu Lys Glu Thr  Ser Phe Leu Ser Pro  Thr Ala Ser
3035                 3040                 3045
Thr Ser  Arg Lys Thr Ser Leu  Phe Leu Gly Pro Ser  Met Ala Arg
3050                 3055                 3060
Gln Pro  Asn Ile Leu Val His  Leu Gln Thr Ser Ala  Leu Thr Leu
3065                 3070                 3075
Ser Pro  Thr Ser Thr Leu Asn  Met Ser Gln Glu Glu  Pro Pro Glu
3080                 3085                 3090
Leu Thr  Ser Ser Gln Thr Ile  Ala Glu Glu Glu Gly  Thr Thr Ala
3095                 3100                 3105
Glu Thr  Gln Thr Leu Thr Phe  Thr Pro Ser Glu Thr  Pro Thr Ser
3110                 3115                 3120
Leu Leu  Pro Val Ser Ser Pro  Thr Glu Pro Thr Ala  Arg Arg Lys
3125                 3130                 3135
Ser Ser  Pro Glu Thr Trp Ala  Ser Ser Ile Ser Val  Pro Ala Lys
3140                 3145                 3150
Thr Ser  Leu Val Glu Thr Thr  Asp Gly Thr Leu Val  Thr Thr Ile
3155                 3160                 3165
Lys Met  Ser Ser Gln Ala Ala  Gln Gly Asn Ser Thr  Trp Pro Ala
3170                 3175                 3180
Pro Ala  Glu Glu Thr Gly Ser  Ser Pro Ala Gly Thr  Ser Pro Gly
3185                 3190                 3195
Ser Pro  Glu Met Ser Thr Thr  Leu Lys Ile Met Ser  Ser Lys Glu
3200                 3205                 3210
Pro Ser  Ile Ser Pro Glu Ile  Arg Ser Thr Val Arg  Asn Ser Pro
3215                 3220                 3225
Trp Lys  Thr Pro Glu Thr Thr  Val Pro Met Glu Thr  Thr Val Glu
3230                 3235                 3240
Pro Val  Thr Leu Gln Ser Thr  Ala Leu Gly Ser Gly  Ser Thr Ser
3245                 3250                 3255
Ile Ser  His Leu Pro Thr Gly  Thr Thr Ser Pro Thr  Lys Ser Pro
3260                 3265                 3270
Thr Glu  Asn Met Leu Ala Thr  Glu Arg Val Ser Leu  Ser Pro Ser
3275                 3280                 3285
Pro Pro  Glu Ala Trp Thr Asn  Leu Tyr Ser Gly Thr  Pro Gly Gly
3290                 3295                 3300
Thr Arg  Gln Ser Leu Ala Thr  Met Ser Ser Val Ser  Leu Glu Ser
3305                 3310                 3315
Pro Thr  Ala Arg Ser Ile Thr  Gly Thr Gly Gln Gln  Ser Ser Pro
3320                 3325                 3330
Glu Leu  Val Ser Lys Thr Thr  Gly Met Glu Phe Ser  Met Trp His
3335                 3340                 3345
Gly Ser  Thr Gly Gly Thr Thr  Gly Asp Thr His Val  Ser Leu Ser
3350                 3355                 3360
Thr Ser  Ser Asn Ile Leu Glu  Asp Pro Val Thr Ser  Pro Asn Ser
3365                 3370                 3375
Val Ser  Ser Leu Thr Asp Lys  Ser Lys His Lys Thr  Glu Thr Trp
3380                 3385                 3390
Val Ser  Thr Thr Ala Ile Pro  Ser Thr Val Leu Asn  Asn Lys Ile
3395                 3400                 3405
Met Ala  Ala Glu Gln Gln Thr  Ser Arg Ser Val Asp  Glu Ala Tyr
3410                 3415                 3420
Ser Ser  Thr Ser Ser Trp Ser  Asp Gln Thr Ser Gly  Ser Asp Ile
3425                 3430                 3435
Thr Leu  Gly Ala Ser Pro Asp  Val Thr Asn Thr Leu  Tyr Ile Thr
3440                 3445                 3450
Ser Thr  Ala Gln Thr Thr Ser  Leu Val Ser Leu Pro  Ser Gly Asp
3455                 3460                 3465
Gln Gly  Ile Thr Ser Leu Thr  Asn Pro Ser Gly Gly  Lys Thr Ser
3470                 3475                 3480
Ser Ala  Ser Ser Val Thr Ser  Pro Ser Ile Gly Leu  Glu Thr Leu
3485                 3490                 3495
Arg Ala  Asn Val Ser Ala Val  Lys Ser Asp Ile Ala  Pro Thr Ala
3500                 3505                 3510
Gly His  Leu Ser Gln Thr Ser  Ser Pro Ala Glu Val  Ser Ile Leu
3515                 3520                 3525
Asp Val  Thr Thr Ala Pro Thr  Pro Gly Ile Ser Thr  Thr Ile Thr
3530                 3535                 3540
Thr Met  Gly Thr Asn Ser Ile  Ser Thr Thr Thr Pro  Asn Pro Glu
3545                 3550                 3555
Val Gly  Met Ser Thr Met Asp  Ser Thr Pro Ala Thr  Glu Arg Arg
3560                 3565                 3570
Thr Thr  Ser Thr Glu His Pro  Ser Thr Trp Ser Ser  Thr Ala Ala
3575                 3580                 3585
Ser Asp  Ser Trp Thr Val Thr  Asp Met Thr Ser Asn  Leu Lys Val
3590                 3595                 3600
Ala Arg  Ser Pro Gly Thr Ile  Ser Thr Met His Thr  Thr Ser Phe
3605                 3610                 3615
Leu Ala  Ser Ser Thr Glu Leu  Asp Ser Met Ser Thr  Pro His Gly
3620                 3625                 3630
Arg Ile  Thr Val Ile Gly Thr  Ser Leu Val Thr Pro  Ser Ser Asp
3635                 3640                 3645
Ala Ser  Ala Val Lys Thr Glu  Thr Ser Thr Ser Glu  Arg Thr Leu
3650                 3655                 3660
Ser Pro  Ser Asp Thr Thr Ala  Ser Thr Pro Ile Ser  Thr Phe Ser
3665                 3670                 3675
Arg Val  Gln Arg Met Ser Ile  Ser Val Pro Asp Ile  Leu Ser Thr
3680                 3685                 3690
Ser Trp  Thr Pro Ser Ser Thr  Glu Ala Glu Asp Val  Pro Val Ser
3695                 3700                 3705
Met Val  Ser Thr Asp His Ala  Ser Thr Lys Thr Asp  Pro Asn Thr
3710                 3715                 3720
Pro Leu  Ser Thr Phe Leu Phe  Asp Ser Leu Ser Thr  Leu Asp Trp
3725                 3730                 3735
Asp Thr  Gly Arg Ser Leu Ser  Ser Ala Thr Ala Thr  Thr Ser Ala
3740                 3745                 3750
Pro Gln  Gly Ala Thr Thr Pro  Gln Glu Leu Thr Leu  Glu Thr Met
3755                 3760                 3765
Ile Ser  Pro Ala Thr Ser Gln  Leu Pro Phe Ser Ile  Gly His Ile
3770                 3775                 3780
Thr Ser  Ala Val Thr Pro Ala  Ala Met Ala Arg Ser  Ser Gly Val
3785                 3790                 3795
Thr Phe  Ser Arg Pro Asp Pro  Thr Ser Lys Lys Ala  Glu Gln Thr
3800                 3805                 3810
Ser Thr  Gln Leu Pro Thr Thr  Thr Ser Ala His Pro  Gly Gln Val
3815                 3820                 3825
Pro Arg  Ser Ala Ala Thr Thr  Leu Asp Val Ile Pro  His Thr Ala
3830                 3835                 3840
Lys Thr  Pro Asp Ala Thr Phe  Gln Arg Gln Gly Gln  Thr Ala Leu
3845                 3850                 3855
Thr Thr  Glu Ala Arg Ala Thr  Ser Asp Ser Trp Asn  Glu Lys Glu
3860                 3865                 3870
Lys Ser  Thr Pro Ser Ala Pro  Trp Ile Thr Glu Met  Met Asn Ser
3875                 3880                 3885
Val Ser  Glu Asp Thr Ile Lys  Glu Val Thr Ser Ser  Ser Ser Val
3890                 3895                 3900
Leu Arg  Thr Leu Asn Thr Leu  Asp Ile Asn Leu Glu  Ser Gly Thr
3905                 3910                 3915
Thr Ser  Ser Pro Ser Trp Lys  Ser Ser Pro Tyr Glu  Arg Ile Ala
3920                 3925                 3930
Pro Ser  Glu Ser Thr Thr Asp  Lys Glu Ala Ile His  Pro Ser Thr
3935                 3940                 3945
Asn Thr  Val Glu Thr Thr Gly  Trp Val Thr Ser Ser  Glu His Ala
3950                 3955                 3960
Ser His  Ser Thr Ile Pro Ala  His Ser Ala Ser Ser  Lys Leu Thr
3965                 3970                 3975
Ser Pro  Val Val Thr Thr Ser  Thr Arg Glu Gln Ala  Ile Val Ser
3980                 3985                 3990
Met Ser  Thr Thr Thr Trp Pro  Glu Ser Thr Arg Ala  Arg Thr Glu
3995                 4000                 4005
Pro Asn  Ser Phe Leu Thr Ile  Glu Leu Arg Asp Val  Ser Pro Tyr
4010                 4015                 4020
Met Asp  Thr Ser Ser Thr Thr  Gln Thr Ser Ile Ile  Ser Ser Pro
4025                 4030                 4035
Gly Ser  Thr Ala Ile Thr Lys  Gly Pro Arg Thr Glu  Ile Thr Ser
4040                 4045                 4050
Ser Lys  Arg Ile Ser Ser Ser  Phe Leu Ala Gln Ser  Met Arg Ser
4055                 4060                 4065
Ser Asp  Ser Pro Ser Glu Ala  Ile Thr Arg Leu Ser  Asn Phe Pro
4070                 4075                 4080
Ala Met  Thr Glu Ser Gly Gly  Met Ile Leu Ala Met  Gln Thr Ser
4085                 4090                 4095
Pro Pro  Gly Ala Thr Ser Leu  Ser Ala Pro Thr Leu  Asp Thr Ser
4100                 4105                 4110
Ala Thr  Ala Ser Trp Thr Gly  Thr Pro Leu Ala Thr  Thr Gln Arg
4115                 4120                 4125
Phe Thr  Tyr Ser Glu Lys Thr  Thr Leu Phe Ser Lys  Gly Pro Glu
4130                 4135                 4140
Asp Thr  Ser Gln Pro Ser Pro  Pro Ser Val Glu Glu  Thr Ser Ser
4145                 4150                 4155
Ser Ser  Ser Leu Val Pro Ile  His Ala Thr Thr Ser  Pro Ser Asn
4160                 4165                 4170
Ile Leu  Leu Thr Ser Gln Gly  His Ser Pro Ser Ser  Thr Pro Pro
4175                 4180                 4185
Val Thr  Ser Val Phe Leu Ser  Glu Thr Ser Gly Leu  Gly Lys Thr
4190                 4195                 4200
Thr Asp  Met Ser Arg Ile Ser  Leu Glu Pro Gly Thr  Ser Leu Pro
4205                 4210                 4215
Pro Asn  Leu Ser Ser Thr Ala  Gly Glu Ala Leu Ser  Thr Tyr Glu
4220                 4225                 4230
Ala Ser  Arg Asp Thr Lys Ala  Ile His His Ser Ala  Asp Thr Ala
4235                 4240                 4245
Val Thr  Asn Met Glu Ala Thr  Ser Ser Glu Tyr Ser  Pro Ile Pro
4250                 4255                 4260
Gly His  Thr Lys Pro Ser Lys  Ala Thr Ser Pro Leu  Val Thr Ser
4265                 4270                 4275
His Ile  Met Gly Asp Ile Thr  Ser Ser Thr Ser Val  Phe Gly Ser
4280                 4285                 4290
Ser Glu  Thr Thr Glu Ile Glu  Thr Val Ser Ser Val  Asn Gln Gly
4295                 4300                 4305
Leu Gln  Glu Arg Ser Thr Ser  Gln Val Ala Ser Ser  Ala Thr Glu
4310                 4315                 4320
Thr Ser  Thr Val Ile Thr His  Val Ser Ser Gly Asp  Ala Thr Thr
4325                 4330                 4335
His Val  Thr Lys Thr Gln Ala  Thr Phe Ser Ser Gly  Thr Ser Ile
4340                 4345                 4350
Ser Ser  Pro His Gln Phe Ile  Thr Ser Thr Asn Thr  Phe Thr Asp
4355                 4360                 4365
Val Ser  Thr Asn Pro Ser Thr  Ser Leu Ile Met Thr  Glu Ser Ser
4370                 4375                 4380
Gly Val  Thr Ile Thr Thr Gln  Thr Gly Pro Thr Gly  Ala Ala Thr
4385                 4390                 4395
Gln Gly  Pro Tyr Leu Leu Asp  Thr Ser Thr Met Pro  Tyr Leu Thr
4400                 4405                 4410
Glu Thr  Pro Leu Ala Val Thr  Pro Asp Phe Met Gln  Ser Glu Lys
4415                 4420                 4425
Thr Thr  Leu Ile Ser Lys Gly  Pro Lys Asp Val Ser  Trp Thr Ser
4430                 4435                 4440
Pro Pro  Ser Val Ala Glu Thr  Ser Tyr Pro Ser Ser  Leu Thr Pro
4445                 4450                 4455
Phe Leu  Val Thr Thr Ile Pro  Pro Ala Thr Ser Thr  Leu Gln Gly
4460                 4465                 4470
Gln His  Thr Ser Ser Pro Val  Ser Ala Thr Ser Val  Leu Thr Ser
4475                 4480                 4485
Gly Leu  Val Lys Thr Thr Asp  Met Leu Asn Thr Ser  Met Glu Pro
4490                 4495                 4500
Val Thr  Asn Ser Pro Gln Asn  Leu Asn Asn Pro Ser  Asn Glu Ile
4505                 4510                 4515
Leu Ala  Thr Leu Ala Ala Thr  Thr Asp Ile Glu Thr  Ile His Pro
4520                 4525                 4530
Ser Ile  Asn Lys Ala Val Thr  Asn Met Gly Thr Ala  Ser Ser Ala
4535                 4540                 4545
His Val  Leu His Ser Thr Leu  Pro Val Ser Ser Glu  Pro Ser Thr
4550                 4555                 4560
Ala Thr  Ser Pro Met Val Pro  Ala Ser Ser Met Gly  Asp Ala Leu
4565                 4570                 4575
Ala Ser  Ile Ser Ile Pro Gly  Ser Glu Thr Thr Asp  Ile Glu Gly
4580                 4585                 4590
Glu Pro  Thr Ser Ser Leu Thr  Ala Gly Arg Lys Glu  Asn Ser Thr
4595                 4600                 4605
Leu Gln  Glu Met Asn Ser Thr  Thr Glu Ser Asn Ile  Ile Leu Ser
4610                 4615                 4620
Asn Val  Ser Val Gly Ala Ile  Thr Glu Ala Thr Lys  Met Glu Val
4625                 4630                 4635
Pro Ser  Phe Asp Ala Thr Phe  Ile Pro Thr Pro Ala  Gln Ser Thr
4640                 4645                 4650
Lys Phe  Pro Asp Ile Phe Ser  Val Ala Ser Ser Arg  Leu Ser Asn
4655                 4660                 4665
Ser Pro  Pro Met Thr Ile Ser  Thr His Met Thr Thr  Thr Gln Thr
4670                 4675                 4680
Gly Ser  Ser Gly Ala Thr Ser  Lys Ile Pro Leu Ala  Leu Asp Thr
4685                 4690                 4695
Ser Thr  Leu Glu Thr Ser Ala  Gly Thr Pro Ser Val  Val Thr Glu
4700                 4705                 4710
Gly Phe  Ala His Ser Lys Ile  Thr Thr Ala Met Asn  Asn Asp Val
4715                 4720                 4725
Lys Asp  Val Ser Gln Thr Asn  Pro Pro Phe Gln Asp  Glu Ala Ser
4730                 4735                 4740
Ser Pro  Ser Ser Gln Ala Pro  Val Leu Val Thr Thr  Leu Pro Ser
4745                 4750                 4755
Ser Val  Ala Phe Thr Pro Gln  Trp His Ser Thr Ser  Ser Pro Val
4760                 4765                 4770
Ser Met  Ser Ser Val Leu Thr  Ser Ser Leu Val Lys  Thr Ala Gly
4775                 4780                 4785
Lys Val  Asp Thr Ser Leu Glu  Thr Val Thr Ser Ser  Pro Gln Ser
4790                 4795                 4800
Met Ser  Asn Thr Leu Asp Asp  Ile Ser Val Thr Ser  Ala Ala Thr
4805                 4810                 4815
Thr Asp  Ile Glu Thr Thr His  Pro Ser Ile Asn Thr  Val Val Thr
4820                 4825                 4830
Asn Val  Gly Thr Thr Gly Ser  Ala Phe Glu Ser His  Ser Thr Val
4835                 4840                 4845
Ser Ala  Tyr Pro Glu Pro Ser  Lys Val Thr Ser Pro  Asn Val Thr
4850                 4855                 4860
Thr Ser  Thr Met Glu Asp Thr  Thr Ile Ser Arg Ser  Ile Pro Lys
4865                 4870                 4875
Ser Ser  Lys Thr Thr Arg Thr  Glu Thr Glu Thr Thr  Ser Ser Leu
4880                 4885                 4890
Thr Pro  Lys Leu Arg Glu Thr  Ser Ile Ser Gln Glu  Ile Thr Ser
4895                 4900                 4905
Ser Thr  Glu Thr Ser Thr Val  Pro Tyr Lys Glu Leu  Thr Gly Ala
4910                 4915                 4920
Thr Thr  Glu Val Ser Arg Thr  Asp Val Thr Ser Ser  Ser Ser Thr
4925                 4930                 4935
Ser Phe  Pro Gly Pro Asp Gln  Ser Thr Val Ser Leu  Asp Ile Ser
4940                 4945                 4950
Thr Glu  Thr Asn Thr Arg Leu  Ser Thr Ser Pro Ile  Met Thr Glu
4955                 4960                 4965
Ser Ala  Glu Ile Thr Ile Thr  Thr Gln Thr Gly Pro  His Gly Ala
4970                 4975                 4980
Thr Ser  Gln Asp Thr Phe Thr  Met Asp Pro Ser Asn  Thr Thr Pro
4985                 4990                 4995
Gln Ala  Gly Ile His Ser Ala  Met Thr His Gly Phe  Ser Gln Leu
5000                 5005                 5010
Asp Val  Thr Thr Leu Met Ser  Arg Ile Pro Gln Asp  Val Ser Trp
5015                 5020                 5025
Thr Ser  Pro Pro Ser Val Asp  Lys Thr Ser Ser Pro  Ser Ser Phe
5030                 5035                 5040
Leu Ser  Ser Pro Ala Met Thr  Thr Pro Ser Leu Ile  Ser Ser Thr
5045                 5050                 5055
Leu Pro  Glu Asp Lys Leu Ser  Ser Pro Met Thr Ser  Leu Leu Thr
5060                 5065                 5070
Ser Gly  Leu Val Lys Ile Thr  Asp Ile Leu Arg Thr  Arg Leu Glu
5075                 5080                 5085
Pro Val  Thr Ser Ser Leu Pro  Asn Phe Ser Ser Thr  Ser Asp Lys
5090                 5095                 5100
Ile Leu  Ala Thr Ser Lys Asp  Ser Lys Asp Thr Lys  Glu Ile Phe
5105                 5110                 5115
Pro Ser  Ile Asn Thr Glu Glu  Thr Asn Val Lys Ala  Asn Asn Ser
5120                 5125                 5130
Gly His  Glu Ser His Ser Pro  Ala Leu Ala Asp Ser  Glu Thr Pro
5135                 5140                 5145
Lys Ala  Thr Thr Gln Met Val  Ile Thr Thr Thr Val  Gly Asp Pro
5150                 5155                 5160
Ala Pro  Ser Thr Ser Met Pro  Val His Gly Ser Ser  Glu Thr Thr
5165                 5170                 5175
Asn Ile  Lys Arg Glu Pro Thr  Tyr Phe Leu Thr Pro  Arg Leu Arg
5180                 5185                 5190
Glu Thr  Ser Thr Ser Gln Glu  Ser Ser Phe Pro Thr  Asp Thr Ser
5195                 5200                 5205
Phe Leu  Leu Ser Lys Val Pro  Thr Gly Thr Ile Thr  Glu Val Ser
5210                 5215                 5220
Ser Thr  Gly Val Asn Ser Ser  Ser Lys Ile Ser Thr  Pro Asp His
5225                 5230                 5235
Asp Lys  Ser Thr Val Pro Pro  Asp Thr Phe Thr Gly  Glu Ile Pro
5240                 5245                 5250
Arg Val  Phe Thr Ser Ser Ile  Lys Thr Lys Ser Ala  Glu Met Thr
5255                 5260                 5265
Ile Thr  Thr Gln Ala Ser Pro  Pro Glu Ser Ala Ser  His Ser Thr
5270                 5275                 5280
Leu Pro  Leu Asp Thr Ser Thr  Thr Leu Ser Gln Gly  Gly Thr His
5285                 5290                 5295
Ser Thr  Val Thr Gln Gly Phe  Pro Tyr Ser Glu Val  Thr Thr Leu
5300                 5305                 5310
Met Gly  Met Gly Pro Gly Asn  Val Ser Trp Met Thr  Thr Pro Pro
5315                 5320                 5325
Val Glu  Glu Thr Ser Ser Val  Ser Ser Leu Met Ser  Ser Pro Ala
5330                 5335                 5340
Met Thr  Ser Pro Ser Pro Val  Ser Ser Thr Ser Pro  Gln Ser Ile
5345                 5350                 5355
Pro Ser  Ser Pro Leu Pro Val  Thr Ala Leu Pro Thr  Ser Val Leu
5360                 5365                 5370
Val Thr  Thr Thr Asp Val Leu  Gly Thr Thr Ser Pro  Glu Ser Val
5375                 5380                 5385
Thr Ser  Ser Pro Pro Asn Leu  Ser Ser Ile Thr His  Glu Arg Pro
5390                 5395                 5400
Ala Thr  Tyr Lys Asp Thr Ala  His Thr Glu Ala Ala  Met His His
5405                 5410                 5415
Ser Thr  Asn Thr Ala Val Thr  Asn Val Gly Thr Ser  Gly Ser Gly
5420                 5425                 5430
His Lys  Ser Gln Ser Ser Val  Leu Ala Asp Ser Glu  Thr Ser Lys
5435                 5440                 5445
Ala Thr  Pro Leu Met Ser Thr  Thr Ser Thr Leu Gly  Asp Thr Ser
5450                 5455                 5460
Val Ser  Thr Ser Thr Pro Asn  Ile Ser Gln Thr Asn  Gln Ile Gln
5465                 5470                 5475
Thr Glu  Pro Thr Ala Ser Leu  Ser Pro Arg Leu Arg  Glu Ser Ser
5480                 5485                 5490
Thr Ser  Glu Lys Thr Ser Ser  Thr Thr Glu Thr Asn  Thr Ala Phe
5495                 5500                 5505
Ser Tyr  Val Pro Thr Gly Ala  Ile Thr Gln Ala Ser  Arg Thr Glu
5510                 5515                 5520
Ile Ser  Ser Ser Arg Thr Ser  Ile Ser Asp Leu Asp  Arg Pro Thr
5525                 5530                 5535
Ile Ala  Pro Asp Ile Ser Thr  Gly Met Ile Thr Arg  Leu Phe Thr
5540                 5545                 5550
Ser Pro  Ile Met Thr Lys Ser  Ala Glu Met Thr Val  Thr Thr Gln
5555                 5560                 5565
Thr Thr  Thr Pro Gly Ala Thr  Ser Gln Gly Ile Leu  Pro Trp Asp
5570                 5575                 5580
Thr Ser  Thr Thr Leu Phe Gln  Gly Gly Thr His Ser  Thr Val Ser
5585                 5590                 5595
Gln Gly  Phe Pro His Ser Glu  Ile Thr Thr Leu Arg  Ser Arg Thr
5600                 5605                 5610
Pro Gly  Asp Val Ser Trp Met  Thr Thr Pro Pro Val  Glu Glu Thr
5615                 5620                 5625
Ser Ser  Gly Phe Ser Leu Met  Ser Pro Ser Met Thr  Ser Pro Ser
5630                 5635                 5640
Pro Val  Ser Ser Thr Ser Pro  Glu Ser Ile Pro Ser  Ser Pro Leu
5645                 5650                 5655
Pro Val  Thr Ala Leu Leu Thr  Ser Val Leu Val Thr  Thr Thr Asn
5660                 5665                 5670
Val Leu  Gly Thr Thr Ser Pro  Glu Pro Val Thr Ser  Ser Pro Pro
5675                 5680                 5685
Asn Leu  Ser Ser Pro Thr Gln  Glu Arg Leu Thr Thr  Tyr Lys Asp
5690                 5695                 5700
Thr Ala  His Thr Glu Ala Met  His Ala Ser Met His  Thr Asn Thr
5705                 5710                 5715
Ala Val  Ala Asn Val Gly Thr  Ser Ile Ser Gly His  Glu Ser Gln
5720                 5725                 5730
Ser Ser  Val Pro Ala Asp Ser  His Thr Ser Lys Ala  Thr Ser Pro
5735                 5740                 5745
Met Gly  Ile Thr Phe Ala Met  Gly Asp Thr Ser Val  Ser Thr Ser
5750                 5755                 5760
Thr Pro  Ala Phe Phe Glu Thr  Arg Ile Gln Thr Glu  Ser Thr Ser
5765                 5770                 5775
Ser Leu  Ile Pro Gly Leu Arg  Asp Thr Arg Thr Ser  Glu Glu Ile
5780                 5785                 5790
Asn Thr  Val Thr Glu Thr Ser  Thr Val Leu Ser Glu  Val Pro Thr
5795                 5800                 5805
Thr Thr  Thr Thr Glu Val Ser  Arg Thr Glu Val Ile  Thr Ser Ser
5810                 5815                 5820
Arg Thr  Thr Ile Ser Gly Pro  Asp His Ser Lys Met  Ser Pro Tyr
5825                 5830                 5835
Ile Ser  Thr Glu Thr Ile Thr  Arg Leu Ser Thr Phe  Pro Phe Val
5840                 5845                 5850
Thr Gly  Ser Thr Glu Met Ala  Ile Thr Asn Gln Thr  Gly Pro Ile
5855                 5860                 5865
Gly Thr  Ile Ser Gln Ala Thr  Leu Thr Leu Asp Thr  Ser Ser Thr
5870                 5875                 5880
Ala Ser  Trp Glu Gly Thr His  Ser Pro Val Thr Gln  Arg Phe Pro
5885                 5890                 5895
His Ser  Glu Glu Thr Thr Thr  Met Ser Arg Ser Thr  Lys Gly Val
5900                 5905                 5910
Ser Trp  Gln Ser Pro Pro Ser  Val Glu Glu Thr Ser  Ser Pro Ser
5915                 5920                 5925
Ser Pro  Val Pro Leu Pro Ala  Ile Thr Ser His Ser  Ser Leu Tyr
5930                 5935                 5940
Ser Ala  Val Ser Gly Ser Ser  Pro Thr Ser Ala Leu  Pro Val Thr
5945                 5950                 5955
Ser Leu  Leu Thr Ser Gly Arg  Arg Lys Thr Ile Asp  Met Leu Asp
5960                 5965                 5970
Thr His  Ser Glu Leu Val Thr  Ser Ser Leu Pro Ser  Ala Ser Ser
5975                 5980                 5985
Phe Ser  Gly Glu Ile Leu Thr  Ser Glu Ala Ser Thr  Asn Thr Glu
5990                 5995                 6000
Thr Ile  His Phe Ser Glu Asn  Thr Ala Glu Thr Asn  Met Gly Thr
6005                 6010                 6015
Thr Asn  Ser Met His Lys Leu  His Ser Ser Val Ser  Ile His Ser
6020                 6025                 6030
Gln Pro  Ser Gly His Thr Pro  Pro Lys Val Thr Gly  Ser Met Met
6035                 6040                 6045
Glu Asp  Ala Ile Val Ser Thr  Ser Thr Pro Gly Ser  Pro Glu Thr
6050                 6055                 6060
Lys Asn  Val Asp Arg Asp Ser  Thr Ser Pro Leu Thr  Pro Glu Leu
6065                 6070                 6075
Lys Glu  Asp Ser Thr Ala Leu  Val Met Asn Ser Thr  Thr Glu Ser
6080                 6085                 6090
Asn Thr  Val Phe Ser Ser Val  Ser Leu Asp Ala Ala  Thr Glu Val
6095                 6100                 6105
Ser Arg  Ala Glu Val Thr Tyr  Tyr Asp Pro Thr Phe  Met Pro Ala
6110                 6115                 6120
Ser Ala  Gln Ser Thr Lys Ser  Pro Asp Ile Ser Pro  Glu Ala Ser
6125                 6130                 6135
Ser Ser  His Ser Asn Ser Pro  Pro Leu Thr Ile Ser  Thr His Lys
6140                 6145                 6150
Thr Ile  Ala Thr Gln Thr Gly  Pro Ser Gly Val Thr  Ser Leu Gly
6155                 6160                 6165
Gln Leu  Thr Leu Asp Thr Ser  Thr Ile Ala Thr Ser  Ala Gly Thr
6170                 6175                 6180
Pro Ser  Ala Arg Thr Gln Asp  Phe Val Asp Ser Glu  Thr Thr Ser
6185                 6190                 6195
Val Met  Asn Asn Asp Leu Asn  Asp Val Leu Lys Thr  Ser Pro Phe
6200                 6205                 6210
Ser Ala  Glu Glu Ala Asn Ser  Leu Ser Ser Gln Ala  Pro Leu Leu
6215                 6220                 6225
Val Thr  Thr Ser Pro Ser Pro  Val Thr Ser Thr Leu  Gln Glu His
6230                 6235                 6240
Ser Thr  Ser Ser Leu Val Ser  Val Thr Ser Val Pro  Thr Pro Thr
6245                 6250                 6255
Leu Ala  Lys Ile Thr Asp Met  Asp Thr Asn Leu Glu  Pro Val Thr
6260                 6265                 6270
Arg Ser  Pro Gln Asn Leu Arg  Asn Thr Leu Ala Thr  Ser Glu Ala
6275                 6280                 6285
Thr Thr  Asp Thr His Thr Met  His Pro Ser Ile Asn  Thr Ala Val
6290                 6295                 6300
Ala Asn  Val Gly Thr Thr Ser  Ser Pro Asn Glu Phe  Tyr Phe Thr
6305                 6310                 6315
Val Ser  Pro Asp Ser Asp Pro  Tyr Lys Ala Thr Ser  Ala Val Val
6320                 6325                 6330
Ile Thr  Ser Thr Ser Gly Asp  Ser Ile Val Ser Thr  Ser Met Pro
6335                 6340                 6345
Arg Ser  Ser Ala Met Lys Lys  Ile Glu Ser Glu Thr  Thr Phe Ser
6350                 6355                 6360
Leu Ile  Phe Arg Leu Arg Glu  Thr Ser Thr Ser Gln  Lys Ile Gly
6365                 6370                 6375
Ser Ser  Ser Asp Thr Ser Thr  Val Phe Asp Lys Ala  Phe Thr Ala
6380                 6385                 6390
Ala Thr  Thr Glu Val Ser Arg  Thr Glu Leu Thr Ser  Ser Ser Arg
6395                 6400                 6405
Thr Ser  Ile Gln Gly Thr Glu  Lys Pro Thr Met Ser  Pro Asp Thr
6410                 6415                 6420
Ser Thr  Arg Ser Val Thr Met  Leu Ser Thr Phe Ala  Gly Leu Thr
6425                 6430                 6435
Lys Ser  Glu Glu Arg Thr Ile  Ala Thr Gln Thr Gly  Pro His Arg
6440                 6445                 6450
Ala Thr  Ser Gln Gly Thr Leu  Thr Trp Asp Thr Ser  Ile Thr Thr
6455                 6460                 6465
Ser Gln  Ala Gly Thr His Ser  Ala Met Thr His Gly  Phe Ser Gln
6470                 6475                 6480
Leu Asp  Leu Ser Thr Leu Thr  Ser Arg Val Pro Glu  Tyr Ile Ser
6485                 6490                 6495
Gly Thr  Ser Pro Pro Ser Val  Glu Lys Thr Ser Ser  Ser Ser Ser
6500                 6505                 6510
Leu Leu  Ser Leu Pro Ala Ile  Thr Ser Pro Ser Pro  Val Pro Thr
6515                 6520                 6525
Thr Leu  Pro Glu Ser Arg Pro  Ser Ser Pro Val His  Leu Thr Ser
6530                 6535                 6540
Leu Pro  Thr Ser Gly Leu Val  Lys Thr Thr Asp Met  Leu Ala Ser
6545                 6550                 6555
Val Ala  Ser Leu Pro Pro Asn  Leu Gly Ser Thr Ser  His Lys Ile
6560                 6565                 6570
Pro Thr  Thr Ser Glu Asp Ile  Lys Asp Thr Glu Lys  Met Tyr Pro
6575                 6580                 6585
Ser Thr  Asn Ile Ala Val Thr  Asn Val Gly Thr Thr  Thr Ser Glu
6590                 6595                 6600
Lys Glu  Ser Tyr Ser Ser Val  Pro Ala Tyr Ser Glu  Pro Pro Lys
6605                 6610                 6615
Val Thr  Ser Pro Met Val Thr  Ser Phe Asn Ile Arg  Asp Thr Ile
6620                 6625                 6630
Val Ser  Thr Ser Met Pro Gly  Ser Ser Glu Ile Thr  Arg Ile Glu
6635                 6640                 6645
Met Glu  Ser Thr Phe Ser Leu  Ala His Gly Leu Lys  Gly Thr Ser
6650                 6655                 6660
Thr Ser  Gln Asp Pro Ile Val  Ser Thr Glu Lys Ser  Ala Val Leu
6665                 6670                 6675
His Lys  Leu Thr Thr Gly Ala  Thr Glu Thr Ser Arg  Thr Glu Val
6680                 6685                 6690
Ala Ser  Ser Arg Arg Thr Ser  Ile Pro Gly Pro Asp  His Ser Thr
6695                 6700                 6705
Glu Ser  Pro Asp Ile Ser Thr  Glu Val Ile Pro Ser  Leu Pro Ile
6710                 6715                 6720
Ser Leu  Gly Ile Thr Glu Ser  Ser Asn Met Thr Ile  Ile Thr Arg
6725                 6730                 6735
Thr Gly  Pro Pro Leu Gly Ser  Thr Ser Gln Gly Thr  Phe Thr Leu
6740                 6745                 6750
Asp Thr  Pro Thr Thr Ser Ser  Arg Ala Gly Thr His  Ser Met Ala
6755                 6760                 6765
Thr Gln  Glu Phe Pro His Ser  Glu Met Thr Thr Val  Met Asn Lys
6770                 6775                 6780
Asp Pro  Glu Ile Leu Ser Trp  Thr Ile Pro Pro Ser  Ile Glu Lys
6785                 6790                 6795
Thr Ser  Phe Ser Ser Ser Leu  Met Pro Ser Pro Ala  Met Thr Ser
6800                 6805                 6810
Pro Pro  Val Ser Ser Thr Leu  Pro Lys Thr Ile His  Thr Thr Pro
6815                 6820                 6825
Ser Pro  Met Thr Ser Leu Leu  Thr Pro Ser Leu Val  Met Thr Thr
6830                 6835                 6840
Asp Thr  Leu Gly Thr Ser Pro  Glu Pro Thr Thr Ser  Ser Pro Pro
6845                 6850                 6855
Asn Leu  Ser Ser Thr Ser His  Glu Ile Leu Thr Thr  Asp Glu Asp
6860                 6865                 6870
Thr Thr  Ala Ile Glu Ala Met  His Pro Ser Thr Ser  Thr Ala Ala
6875                 6880                 6885
Thr Asn  Val Glu Thr Thr Ser  Ser Gly His Gly Ser  Gln Ser Ser
6890                 6895                 6900
Val Leu  Ala Asp Ser Glu Lys  Thr Lys Ala Thr Ala  Pro Met Asp
6905                 6910                 6915
Thr Thr  Ser Thr Met Gly His  Thr Thr Val Ser Thr  Ser Met Ser
6920                 6925                 6930
Val Ser  Ser Glu Thr Thr Lys  Ile Lys Arg Glu Ser  Thr Tyr Ser
6935                 6940                 6945
Leu Thr  Pro Gly Leu Arg Glu  Thr Ser Ile Ser Gln  Asn Ala Ser
6950                 6955                 6960
Phe Ser  Thr Asp Thr Ser Ile  Val Leu Ser Glu Val  Pro Thr Gly
6965                 6970                 6975
Thr Thr  Ala Glu Val Ser Arg  Thr Glu Val Thr Ser  Ser Gly Arg
6980                 6985                 6990
Thr Ser  Ile Pro Gly Pro Ser  Gln Ser Thr Val Leu  Pro Glu Ile
6995                 7000                 7005
Ser Thr  Arg Thr Met Thr Arg  Leu Phe Ala Ser Pro  Thr Met Thr
7010                 7015                 7020
Glu Ser  Ala Glu Met Thr Ile  Pro Thr Gln Thr Gly  Pro Ser Gly
7025                 7030                 7035
Ser Thr  Ser Gln Asp Thr Leu  Thr Leu Asp Thr Ser  Thr Thr Lys
7040                 7045                 7050
Ser Gln  Ala Lys Thr His Ser  Thr Leu Thr Gln Arg  Phe Pro His
7055                 7060                 7065
Ser Glu  Met Thr Thr Leu Met  Ser Arg Gly Pro Gly  Asp Met Ser
7070                 7075                 7080
Trp Gln  Ser Ser Pro Ser Leu  Glu Asn Pro Ser Ser  Leu Pro Ser
7085                 7090                 7095
Leu Leu  Ser Leu Pro Ala Thr  Thr Ser Pro Pro Pro  Ile Ser Ser
7100                 7105                 7110
Thr Leu  Pro Val Thr Ile Ser  Ser Ser Pro Leu Pro  Val Thr Ser
7115                 7120                 7125
Leu Leu  Thr Ser Ser Pro Val  Thr Thr Thr Asp Met  Leu His Thr
7130                 7135                 7140
Ser Pro  Glu Leu Val Thr Ser  Ser Pro Pro Lys Leu  Ser His Thr
7145                 7150                 7155
Ser Asp  Glu Arg Leu Thr Thr  Gly Lys Asp Thr Thr  Asn Thr Glu
7160                 7165                 7170
Ala Val  His Pro Ser Thr Asn  Thr Ala Ala Ser Asn  Val Glu Ile
7175                 7180                 7185
Pro Ser  Ser Gly His Glu Ser  Pro Ser Ser Ala Leu  Ala Asp Ser
7190                 7195                 7200
Glu Thr  Ser Lys Ala Thr Ser  Pro Met Phe Ile Thr  Ser Thr Gln
7205                 7210                 7215
Glu Asp  Thr Thr Val Ala Ile  Ser Thr Pro His Phe  Leu Glu Thr
7220                 7225                 7230
Ser Arg  Ile Gln Lys Glu Ser  Ile Ser Ser Leu Ser  Pro Lys Leu
7235                 7240                 7245
Arg Glu  Thr Gly Ser Ser Val  Glu Thr Ser Ser Ala  Ile Glu Thr
7250                 7255                 7260
Ser Ala  Val Leu Ser Glu Val  Ser Ile Gly Ala Thr  Thr Glu Ile
7265                 7270                 7275
Ser Arg  Thr Glu Val Thr Ser  Ser Ser Arg Thr Ser  Ile Ser Gly
7280                 7285                 7290
Ser Ala  Glu Ser Thr Met Leu  Pro Glu Ile Ser Thr  Thr Arg Lys
7295                 7300                 7305
Ile Ile  Lys Phe Pro Thr Ser  Pro Ile Leu Ala Glu  Ser Ser Glu
7310                 7315                 7320
Met Thr  Ile Lys Thr Gln Thr  Ser Pro Pro Gly Ser  Thr Ser Glu
7325                 7330                 7335
Ser Thr  Phe Thr Leu Asp Thr  Ser Thr Thr Pro Ser  Leu Val Ile
7340                 7345                 7350
Thr His  Ser Thr Met Thr Gln  Arg Leu Pro His Ser  Glu Ile Thr
7355                 7360                 7365
Thr Leu  Val Ser Arg Gly Ala  Gly Asp Val Pro Arg  Pro Ser Ser
7370                 7375                 7380
Leu Pro  Val Glu Glu Thr Ser  Pro Pro Ser Ser Gln  Leu Ser Leu
7385                 7390                 7395
Ser Ala  Met Ile Ser Pro Ser  Pro Val Ser Ser Thr  Leu Pro Ala
7400                 7405                 7410
Ser Ser  His Ser Ser Ser Ala  Ser Val Thr Ser Leu  Leu Thr Pro
7415                 7420                 7425
Gly Gln  Val Lys Thr Thr Glu  Val Leu Asp Ala Ser  Ala Glu Pro
7430                 7435                 7440
Glu Thr  Ser Ser Pro Pro Ser  Leu Ser Ser Thr Ser  Val Glu Ile
7445                 7450                 7455
Leu Ala  Thr Ser Glu Val Thr  Thr Asp Thr Glu Lys  Ile His Pro
7460                 7465                 7470
Phe Ser  Asn Thr Ala Val Thr  Lys Val Gly Thr Ser  Ser Ser Gly
7475                 7480                 7485
His Glu  Ser Pro Ser Ser Val  Leu Pro Asp Ser Glu  Thr Thr Lys
7490                 7495                 7500
Ala Thr  Ser Ala Met Gly Thr  Ile Ser Ile Met Gly  Asp Thr Ser
7505                 7510                 7515
Val Ser  Thr Leu Thr Pro Ala  Leu Ser Asn Thr Arg  Lys Ile Gln
7520                 7525                 7530
Ser Glu  Pro Ala Ser Ser Leu  Thr Thr Arg Leu Arg  Glu Thr Ser
7535                 7540                 7545
Thr Ser  Glu Glu Thr Ser Leu  Ala Thr Glu Ala Asn  Thr Val Leu
7550                 7555                 7560
Ser Lys  Val Ser Thr Gly Ala  Thr Thr Glu Val Ser  Arg Thr Glu
7565                 7570                 7575
Ala Ile  Ser Phe Ser Arg Thr  Ser Met Ser Gly Pro  Glu Gln Ser
7580                 7585                 7590
Thr Met  Ser Gln Asp Ile Ser  Ile Gly Thr Ile Pro  Arg Ile Ser
7595                 7600                 7605
Ala Ser  Ser Val Leu Thr Glu  Ser Ala Lys Met Thr  Ile Thr Thr
7610                 7615                 7620
Gln Thr  Gly Pro Ser Glu Ser  Thr Leu Glu Ser Thr  Leu Asn Leu
7625                 7630                 7635
Asn Thr  Ala Thr Thr Pro Ser  Trp Val Glu Thr His  Ser Ile Val
7640                 7645                 7650
Ile Gln  Gly Phe Pro His Pro  Glu Met Thr Thr Ser  Met Gly Arg
7655                 7660                 7665
Gly Pro  Gly Gly Val Ser Trp  Pro Ser Pro Pro Phe  Val Lys Glu
7670                 7675                 7680
Thr Ser  Pro Pro Ser Ser Pro  Leu Ser Leu Pro Ala  Val Thr Ser
7685                 7690                 7695
Pro His  Pro Val Ser Thr Thr  Phe Leu Ala His Ile  Pro Pro Ser
7700                 7705                 7710
Pro Leu  Pro Val Thr Ser Leu  Leu Thr Ser Gly Pro  Ala Thr Thr
7715                 7720                 7725
Thr Asp  Ile Leu Gly Thr Ser  Thr Glu Pro Gly Thr  Ser Ser Ser
7730                 7735                 7740
Ser Ser  Leu Ser Thr Thr Ser  His Glu Arg Leu Thr  Thr Tyr Lys
7745                 7750                 7755
Asp Thr  Ala His Thr Glu Ala  Val His Pro Ser Thr  Asn Thr Gly
7760                 7765                 7770
Gly Thr  Asn Val Ala Thr Thr  Ser Ser Gly Tyr Lys  Ser Gln Ser
7775                 7780                 7785
Ser Val  Leu Ala Asp Ser Ser  Pro Met Cys Thr Thr  Ser Thr Met
7790                 7795                 7800
Gly Asp  Thr Ser Val Leu Thr  Ser Thr Pro Ala Phe  Leu Glu Thr
7805                 7810                 7815
Arg Arg  Ile Gln Thr Glu Leu  Ala Ser Ser Leu Thr  Pro Gly Leu
7820                 7825                 7830
Arg Glu  Ser Ser Gly Ser Glu  Gly Thr Ser Ser Gly  Thr Lys Met
7835                 7840                 7845
Ser Thr  Val Leu Ser Lys Val  Pro Thr Gly Ala Thr  Thr Glu Ile
7850                 7855                 7860
Ser Lys  Glu Asp Val Thr Ser  Ile Pro Gly Pro Ala  Gln Ser Thr
7865                 7870                 7875
Ile Ser  Pro Asp Ile Ser Thr  Arg Thr Val Ser Trp  Phe Ser Thr
7880                 7885                 7890
Ser Pro  Val Met Thr Glu Ser  Ala Glu Ile Thr Met  Asn Thr His
7895                 7900                 7905
Thr Ser  Pro Leu Gly Ala Thr  Thr Gln Gly Thr Ser  Thr Leu Asp
7910                 7915                 7920
Thr Ser  Ser Thr Thr Ser Leu  Thr Met Thr His Ser  Thr Ile Ser
7925                 7930                 7935
Gln Gly  Phe Ser His Ser Gln  Met Ser Thr Leu Met  Arg Arg Gly
7940                 7945                 7950
Pro Glu  Asp Val Ser Trp Met  Ser Pro Pro Leu Leu  Glu Lys Thr
7955                 7960                 7965
Arg Pro  Ser Phe Ser Leu Met  Ser Ser Pro Ala Thr  Thr Ser Pro
7970                 7975                 7980
Ser Pro  Val Ser Ser Thr Leu  Pro Glu Ser Ile Ser  Ser Ser Pro
7985                 7990                 7995
Leu Pro  Val Thr Ser Leu Leu  Thr Ser Gly Leu Ala  Lys Thr Thr
8000                 8005                 8010
Asp Met  Leu His Lys Ser Ser  Glu Pro Val Thr Asn  Ser Pro Ala
8015                 8020                 8025
Asn Leu  Ser Ser Thr Ser Val  Glu Ile Leu Ala Thr  Ser Glu Val
8030                 8035                 8040
Thr Thr  Asp Thr Glu Lys Thr  His Pro Ser Ser Asn  Arg Thr Val
8045                 8050                 8055
Thr Asp  Val Gly Thr Ser Ser  Ser Gly His Glu Ser  Thr Ser Phe
8060                 8065                 8070
Val Leu  Ala Asp Ser Gln Thr  Ser Lys Val Thr Ser  Pro Met Val
8075                 8080                 8085
Ile Thr  Ser Thr Met Glu Asp  Thr Ser Val Ser Thr  Ser Thr Pro
8090                 8095                 8100
Gly Phe  Phe Glu Thr Ser Arg  Ile Gln Thr Glu Pro  Thr Ser Ser
8105                 8110                 8115
Leu Thr  Leu Gly Leu Arg Lys  Thr Ser Ser Ser Glu  Gly Thr Ser
8120                 8125                 8130
Leu Ala  Thr Glu Met Ser Thr  Val Leu Ser Gly Val  Pro Thr Gly
8135                 8140                 8145
Ala Thr  Ala Glu Val Ser Arg  Thr Glu Val Thr Ser  Ser Ser Arg
8150                 8155                 8160
Thr Ser  Ile Ser Gly Phe Ala  Gln Leu Thr Val Ser  Pro Glu Thr
8165                 8170                 8175
Ser Thr  Glu Thr Ile Thr Arg  Leu Pro Thr Ser Ser  Ile Met Thr
8180                 8185                 8190
Glu Ser  Ala Glu Met Met Ile  Lys Thr Gln Thr Asp  Pro Pro Gly
8195                 8200                 8205
Ser Thr  Pro Glu Ser Thr His  Thr Val Asp Ile Ser  Thr Thr Pro
8210                 8215                 8220
Asn Trp  Val Glu Thr His Ser  Thr Val Thr Gln Arg  Phe Ser His
8225                 8230                 8235
Ser Glu  Met Thr Thr Leu Val  Ser Arg Ser Pro Gly  Asp Met Leu
8240                 8245                 8250
Trp Pro  Ser Gln Ser Ser Val  Glu Glu Thr Ser Ser  Ala Ser Ser
8255                 8260                 8265
Leu Leu  Ser Leu Pro Ala Thr  Thr Ser Pro Ser Pro  Val Ser Ser
8270                 8275                 8280
Thr Leu  Val Glu Asp Phe Pro  Ser Ala Ser Leu Pro  Val Thr Ser
8285                 8290                 8295
Leu Leu  Asn Pro Gly Leu Val  Ile Thr Thr Asp Arg  Met Gly Ile
8300                 8305                 8310
Ser Arg  Glu Pro Gly Thr Ser  Ser Thr Ser Asn Leu  Ser Ser Thr
8315                 8320                 8325
Ser His  Glu Arg Leu Thr Thr  Leu Glu Asp Thr Val  Asp Thr Glu
8330                 8335                 8340
Asp Met  Gln Pro Ser Thr His  Thr Ala Val Thr Asn  Val Arg Thr
8345                 8350                 8355
Ser Ile  Ser Gly His Glu Ser  Gln Ser Ser Val Leu  Ser Asp Ser
8360                 8365                 8370
Glu Thr  Pro Lys Ala Thr Ser  Pro Met Gly Thr Thr  Tyr Thr Met
8375                 8380                 8385
Gly Glu  Thr Ser Val Ser Ile  Ser Thr Ser Asp Phe  Phe Glu Thr
8390                 8395                 8400
Ser Arg  Ile Gln Ile Glu Pro  Thr Ser Ser Leu Thr  Ser Gly Leu
8405                 8410                 8415
Arg Glu  Thr Ser Ser Ser Glu  Arg Ile Ser Ser Ala  Thr Glu Gly
8420                 8425                 8430
Ser Thr  Val Leu Ser Glu Val  Pro Ser Gly Ala Thr  Thr Glu Val
8435                 8440                 8445
Ser Arg  Thr Glu Val Ile Ser  Ser Arg Gly Thr Ser  Met Ser Gly
8450                 8455                 8460
Pro Asp  Gln Phe Thr Ile Ser  Pro Asp Ile Ser Thr  Glu Ala Ile
8465                 8470                 8475
Thr Arg  Leu Ser Thr Ser Pro  Ile Met Thr Glu Ser  Ala Glu Ser
8480                 8485                 8490
Ala Ile  Thr Ile Glu Thr Gly  Ser Pro Gly Ala Thr  Ser Glu Gly
8495                 8500                 8505
Thr Leu  Thr Leu Asp Thr Ser  Thr Thr Thr Phe Trp  Ser Gly Thr
8510                 8515                 8520
His Ser  Thr Ala Ser Pro Gly  Phe Ser His Ser Glu  Met Thr Thr
8525                 8530                 8535
Leu Met  Ser Arg Thr Pro Gly  Asp Val Pro Trp Pro  Ser Leu Pro
8540                 8545                 8550
Ser Val  Glu Glu Ala Ser Ser  Val Ser Ser Ser Leu  Ser Ser Pro
8555                 8560                 8565
Ala Met  Thr Ser Thr Ser Phe  Phe Ser Thr Leu Pro  Glu Ser Ile
8570                 8575                 8580
Ser Ser  Ser Pro His Pro Val  Thr Ala Leu Leu Thr  Leu Gly Pro
8585                 8590                 8595
Val Lys  Thr Thr Asp Met Leu  Arg Thr Ser Ser Glu  Pro Glu Thr
8600                 8605                 8610
Ser Ser  Pro Pro Asn Leu Ser  Ser Thr Ser Ala Glu  Ile Leu Ala
8615                 8620                 8625
Thr Ser  Glu Val Thr Lys Asp  Arg Glu Lys Ile His  Pro Ser Ser
8630                 8635                 8640
Asn Thr  Pro Val Val Asn Val  Gly Thr Val Ile Tyr  Lys His Leu
8645                 8650                 8655
Ser Pro  Ser Ser Val Leu Ala  Asp Leu Val Thr Thr  Lys Pro Thr
8660                 8665                 8670
Ser Pro  Met Ala Thr Thr Ser  Thr Leu Gly Asn Thr  Ser Val Ser
8675                 8680                 8685
Thr Ser  Thr Pro Ala Phe Pro  Glu Thr Met Met Thr  Gln Pro Thr
8690                 8695                 8700
Ser Ser  Leu Thr Ser Gly Leu  Arg Glu Ile Ser Thr  Ser Gln Glu
8705                 8710                 8715
Thr Ser  Ser Ala Thr Glu Arg  Ser Ala Ser Leu Ser  Gly Met Pro
8720                 8725                 8730
Thr Gly  Ala Thr Thr Lys Val  Ser Arg Thr Glu Ala  Leu Ser Leu
8735                 8740                 8745
Gly Arg  Thr Ser Thr Pro Gly  Pro Ala Gln Ser Thr  Ile Ser Pro
8750                 8755                 8760
Glu Ile  Ser Thr Glu Thr Ile  Thr Arg Ile Ser Thr  Pro Leu Thr
8765                 8770                 8775
Thr Thr  Gly Ser Ala Glu Met  Thr Ile Thr Pro Lys  Thr Gly His
8780                 8785                 8790
Ser Gly  Ala Ser Ser Gln Gly  Thr Phe Thr Leu Asp  Thr Ser Ser
8795                 8800                 8805
Arg Ala  Ser Trp Pro Gly Thr  His Ser Ala Ala Thr  His Arg Ser
8810                 8815                 8820
Pro His  Ser Gly Met Thr Thr  Pro Met Ser Arg Gly  Pro Glu Asp
8825                 8830                 8835
Val Ser  Trp Pro Ser Arg Pro  Ser Val Glu Lys Thr  Ser Pro Pro
8840                 8845                 8850
Ser Ser  Leu Val Ser Leu Ser  Ala Val Thr Ser Pro  Ser Pro Leu
8855                 8860                 8865
Tyr Ser  Thr Pro Ser Glu Ser  Ser His Ser Ser Pro  Leu Arg Val
8870                 8875                 8880
Thr Ser  Leu Phe Thr Pro Val  Met Met Lys Thr Thr  Asp Met Leu
8885                 8890                 8895
Asp Thr  Ser Leu Glu Pro Val  Thr Thr Ser Pro Pro  Ser Met Asn
8900                 8905                 8910
Ile Thr  Ser Asp Glu Ser Leu  Ala Thr Ser Lys Ala  Thr Met Glu
8915                 8920                 8925
Thr Glu  Ala Ile Gln Leu Ser  Glu Asn Thr Ala Val  Thr Gln Met
8930                 8935                 8940
Gly Thr  Ile Ser Ala Arg Gln  Glu Phe Tyr Ser Ser  Tyr Pro Gly
8945                 8950                 8955
Leu Pro  Glu Pro Ser Lys Val  Thr Ser Pro Val Val  Thr Ser Ser
8960                 8965                 8970
Thr Ile  Lys Asp Ile Val Ser  Thr Thr Ile Pro Ala  Ser Ser Glu
8975                 8980                 8985
Ile Thr  Arg Ile Glu Met Glu  Ser Thr Ser Thr Leu  Thr Pro Thr
8990                 8995                 9000
Pro Arg  Glu Thr Ser Thr Ser  Gln Glu Ile His Ser  Ala Thr Lys
9005                 9010                 9015
Pro Ser  Thr Val Pro Tyr Lys  Ala Leu Thr Ser Ala  Thr Ile Glu
9020                 9025                 9030
Asp Ser  Met Thr Gln Val Met  Ser Ser Ser Arg Gly  Pro Ser Pro
9035                 9040                 9045
Asp Gln  Ser Thr Met Ser Gln  Asp Ile Ser Thr Glu  Val Ile Thr
9050                 9055                 9060
Arg Leu  Ser Thr Ser Pro Ile  Lys Thr Glu Ser Thr  Glu Met Thr
9065                 9070                 9075
Ile Thr  Thr Gln Thr Gly Ser  Pro Gly Ala Thr Ser  Arg Gly Thr
9080                 9085                 9090
Leu Thr  Leu Asp Thr Ser Thr  Thr Phe Met Ser Gly  Thr His Ser
9095                 9100                 9105
Thr Ala  Ser Gln Gly Phe Ser  His Ser Gln Met Thr  Ala Leu Met
9110                 9115                 9120
Ser Arg  Thr Pro Gly Asp Val  Pro Trp Leu Ser His  Pro Ser Val
9125                 9130                 9135
Glu Glu  Ala Ser Ser Ala Ser  Phe Ser Leu Ser Ser  Pro Val Met
9140                 9145                 9150
Thr Ser  Ser Ser Pro Val Ser  Ser Thr Leu Pro Asp  Ser Ile His
9155                 9160                 9165
Ser Ser  Ser Leu Pro Val Thr  Ser Leu Leu Thr Ser  Gly Leu Val
9170                 9175                 9180
Lys Thr  Thr Glu Leu Leu Gly  Thr Ser Ser Glu Pro  Glu Thr Ser
9185                 9190                 9195
Ser Pro  Pro Asn Leu Ser Ser  Thr Ser Ala Glu Ile  Leu Ala Ile
9200                 9205                 9210
Thr Glu  Val Thr Thr Asp Thr  Glu Lys Leu Glu Met  Thr Asn Val
9215                 9220                 9225
Val Thr  Ser Gly Tyr Thr His  Glu Ser Pro Ser Ser  Val Leu Ala
9230                 9235                 9240
Asp Ser  Val Thr Thr Lys Ala  Thr Ser Ser Met Gly  Ile Thr Tyr
9245                 9250                 9255
Pro Thr  Gly Asp Thr Asn Val  Leu Thr Ser Thr Pro  Ala Phe Ser
9260                 9265                 9270
Asp Thr  Ser Arg Ile Gln Thr  Lys Ser Lys Leu Ser  Leu Thr Pro
9275                 9280                 9285
Gly Leu  Met Glu Thr Ser Ile  Ser Glu Glu Thr Ser  Ser Ala Thr
9290                 9295                 9300
Glu Lys  Ser Thr Val Leu Ser  Ser Val Pro Thr Gly  Ala Thr Thr
9305                 9310                 9315
Glu Val  Ser Arg Thr Glu Ala  Ile Ser Ser Ser Arg  Thr Ser Ile
9320                 9325                 9330
Pro Gly  Pro Ala Gln Ser Thr  Met Ser Ser Asp Thr  Ser Met Glu
9335                 9340                 9345
Thr Ile  Thr Arg Ile Ser Thr  Pro Leu Thr Arg Lys  Glu Ser Thr
9350                 9355                 9360
Asp Met  Ala Ile Thr Pro Lys  Thr Gly Pro Ser Gly  Ala Thr Ser
9365                 9370                 9375
Gln Gly  Thr Phe Thr Leu Asp  Ser Ser Ser Thr Ala  Ser Trp Pro
9380                 9385                 9390
Gly Thr  His Ser Ala Thr Thr  Gln Arg Phe Pro Gln  Ser Val Val
9395                 9400                 9405
Thr Thr  Pro Met Ser Arg Gly  Pro Glu Asp Val Ser  Trp Pro Ser
9410                 9415                 9420
Pro Leu  Ser Val Glu Lys Asn  Ser Pro Pro Ser Ser  Leu Val Ser
9425                 9430                 9435
Ser Ser  Ser Val Thr Ser Pro  Ser Pro Leu Tyr Ser  Thr Pro Ser
9440                 9445                 9450
Gly Ser  Ser His Ser Ser Pro  Val Pro Val Thr Ser  Leu Phe Thr
9455                 9460                 9465
Ser Ile  Met Met Lys Ala Thr  Asp Met Leu Asp Ala  Ser Leu Glu
9470                 9475                 9480
Pro Glu  Thr Thr Ser Ala Pro  Asn Met Asn Ile Thr  Ser Asp Glu
9485                 9490                 9495
Ser Leu  Ala Ala Ser Lys Ala  Thr Thr Glu Thr Glu  Ala Ile His
9500                 9505                 9510
Val Phe  Glu Asn Thr Ala Ala  Ser His Val Glu Thr  Thr Ser Ala
9515                 9520                 9525
Thr Glu  Glu Leu Tyr Ser Ser  Ser Pro Gly Phe Ser  Glu Pro Thr
9530                 9535                 9540
Lys Val  Ile Ser Pro Val Val  Thr Ser Ser Ser Ile  Arg Asp Asn
9545                 9550                 9555
Met Val  Ser Thr Thr Met Pro  Gly Ser Ser Gly Ile  Thr Arg Ile
9560                 9565                 9570
Glu Ile  Glu Ser Met Ser Ser  Leu Thr Pro Gly Leu  Arg Glu Thr
9575                 9580                 9585
Arg Thr  Ser Gln Asp Ile Thr  Ser Ser Thr Glu Thr  Ser Thr Val
9590                 9595                 9600
Leu Tyr  Lys Met Pro Ser Gly  Ala Thr Pro Glu Val  Ser Arg Thr
9605                 9610                 9615
Glu Val  Met Pro Ser Ser Arg  Thr Ser Ile Pro Gly  Pro Ala Gln
9620                 9625                 9630
Ser Thr  Met Ser Leu Asp Ile  Ser Asp Glu Val Val  Thr Arg Leu
9635                 9640                 9645
Ser Thr  Ser Pro Ile Met Thr  Glu Ser Ala Glu Ile  Thr Ile Thr
9650                 9655                 9660
Thr Gln  Thr Gly Tyr Ser Leu  Ala Thr Ser Gln Val  Thr Leu Pro
9665                 9670                 9675
Leu Gly  Thr Ser Met Thr Phe  Leu Ser Gly Thr His  Ser Thr Met
9680                 9685                 9690
Ser Gln  Gly Leu Ser His Ser  Glu Met Thr Asn Leu  Met Ser Arg
9695                 9700                 9705
Gly Pro  Glu Ser Leu Ser Trp  Thr Ser Pro Arg Phe  Val Glu Thr
9710                 9715                 9720
Thr Arg  Ser Ser Ser Ser Leu  Thr Ser Leu Pro Leu  Thr Thr Ser
9725                 9730                 9735
Leu Ser  Pro Val Ser Ser Thr  Leu Leu Asp Ser Ser  Pro Ser Ser
9740                 9745                 9750
Pro Leu  Pro Val Thr Ser Leu  Ile Leu Pro Gly Leu  Val Lys Thr
9755                 9760                 9765
Thr Glu  Val Leu Asp Thr Ser  Ser Glu Pro Lys Thr  Ser Ser Ser
9770                 9775                 9780
Pro Asn  Leu Ser Ser Thr Ser  Val Glu Ile Pro Ala  Thr Ser Glu
9785                 9790                 9795
Ile Met  Thr Asp Thr Glu Lys  Ile His Pro Ser Ser  Asn Thr Ala
9800                 9805                 9810
Val Ala  Lys Val Arg Thr Ser  Ser Ser Val His Glu  Ser His Ser
9815                 9820                 9825
Ser Val  Leu Ala Asp Ser Glu  Thr Thr Ile Thr Ile  Pro Ser Met
9830                 9835                 9840
Gly Ile  Thr Ser Ala Val Asp  Asp Thr Thr Val Phe  Thr Ser Asn
9845                 9850                 9855
Pro Ala  Phe Ser Glu Thr Arg  Arg Ile Pro Thr Glu  Pro Thr Phe
9860                 9865                 9870
Ser Leu  Thr Pro Gly Phe Arg  Glu Thr Ser Thr Ser  Glu Glu Thr
9875                 9880                 9885
Thr Ser  Ile Thr Glu Thr Ser  Ala Val Leu Tyr Gly  Val Pro Thr
9890                 9895                 9900
Ser Ala  Thr Thr Glu Val Ser  Met Thr Glu Ile Met  Ser Ser Asn
9905                 9910                 9915
Arg Ile  His Ile Pro Asp Ser  Asp Gln Ser Thr Met  Ser Pro Asp
9920                 9925                 9930
Ile Ile  Thr Glu Val Ile Thr  Arg Leu Ser Ser Ser  Ser Met Met
9935                 9940                 9945
Ser Glu  Ser Thr Gln Met Thr  Ile Thr Thr Gln Lys  Ser Ser Pro
9950                 9955                 9960
Gly Ala  Thr Ala Gln Ser Thr  Leu Thr Leu Ala Thr  Thr Thr Ala
9965                 9970                 9975
Pro Leu  Ala Arg Thr His Ser  Thr Val Pro Pro Arg  Phe Leu His
9980                 9985                 9990
Ser Glu  Met Thr Thr Leu Met   Ser Arg Ser Pro Glu   Asn Pro Ser
9995                 10000                 10005
Trp Lys   Ser Ser Leu Phe Val   Glu Lys Thr Ser Ser   Ser Ser Ser
10010                 10015                 10020
Leu Leu   Ser Leu Pro Val Thr   Thr Ser Pro Ser Val   Ser Ser Thr
10025                 10030                 10035
Leu Pro   Gln Ser Ile Pro Ser   Ser Ser Phe Ser Val   Thr Ser Leu
10040                 10045                 10050
Leu Thr   Pro Gly Met Val Lys   Thr Thr Asp Thr Ser   Thr Glu Pro
10055                 10060                 10065
Gly Thr   Ser Leu Ser Pro Asn   Leu Ser Gly Thr Ser   Val Glu Ile
10070                 10075                 10080
Leu Ala   Ala Ser Glu Val Thr   Thr Asp Thr Glu Lys   Ile His Pro
10085                 10090                 10095
Ser Ser   Ser Met Ala Val Thr   Asn Val Gly Thr Thr   Ser Ser Gly
10100                 10105                 10110
His Glu   Leu Tyr Ser Ser Val   Ser Ile His Ser Glu   Pro Ser Lys
10115                 10120                 10125
Ala Thr   Tyr Pro Val Gly Thr   Pro Ser Ser Met Ala   Glu Thr Ser
10130                 10135                 10140
Ile Ser   Thr Ser Met Pro Ala   Asn Phe Glu Thr Thr   Gly Phe Glu
10145                 10150                 10155
Ala Glu   Pro Phe Ser His Leu   Thr Ser Gly Phe Arg   Lys Thr Asn
10160                 10165                 10170
Met Ser   Leu Asp Thr Ser Ser   Val Thr Pro Thr Asn   Thr Pro Ser
10175                 10180                 10185
Ser Pro   Gly Ser Thr His Leu   Leu Gln Ser Ser Lys   Thr Asp Phe
10190                 10195                 10200
Thr Ser   Ser Ala Lys Thr Ser   Ser Pro Asp Trp Pro   Pro Ala Ser
10205                 10210                 10215
Gln Tyr   Thr Glu Ile Pro Val   Asp Ile Ile Thr Pro   Phe Asn Ala
10220                 10225                 10230
Ser Pro   Ser Ile Thr Glu Ser   Thr Gly Ile Thr Ser   Phe Pro Glu
10235                 10240                 10245
Ser Arg   Phe Thr Met Ser Val   Thr Glu Ser Thr His   His Leu Ser
10250                 10255                 10260
Thr Asp   Leu Leu Pro Ser Ala   Glu Thr Ile Ser Thr   Gly Thr Val
10265                 10270                 10275
Met Pro   Ser Leu Ser Glu Ala   Met Thr Ser Phe Ala   Thr Thr Gly
10280                 10285                 10290
Val Pro   Arg Ala Ile Ser Gly   Ser Gly Ser Pro Phe   Ser Arg Thr
10295                 10300                 10305
Glu Ser   Gly Pro Gly Asp Ala   Thr Leu Ser Thr Ile   Ala Glu Ser
10310                 10315                 10320
Leu Pro   Ser Ser Thr Pro Val   Pro Phe Ser Ser Ser   Thr Phe Thr
10325                 10330                 10335
Thr Thr   Asp Ser Ser Thr Ile   Pro Ala Leu His Glu   Ile Thr Ser
10340                 10345                 10350
Ser Ser   Ala Thr Pro Tyr Arg   Val Asp Thr Ser Leu   Gly Thr Glu
10355                 10360                 10365
Ser Ser   Thr Thr Glu Gly Arg   Leu Val Met Val Ser   Thr Leu Asp
10370                 10375                 10380
Thr Ser   Ser Gln Pro Gly Arg   Thr Ser Ser Ser Pro   Ile Leu Asp
10385                 10390                 10395
Thr Arg   Met Thr Glu Ser Val   Glu Leu Gly Thr Val   Thr Ser Ala
10400                 10405                 10410
Tyr Gln   Val Pro Ser Leu Ser   Thr Arg Leu Thr Arg   Thr Asp Gly
10415                 10420                 10425
Ile Met   Glu His Ile Thr Lys   Ile Pro Asn Glu Ala   Ala His Arg
10430                 10435                 10440
Gly Thr   Ile Arg Pro Val Lys   Gly Pro Gln Thr Ser   Thr Ser Pro
10445                 10450                 10455
Ala Ser   Pro Lys Gly Leu His   Thr Gly Gly Thr Lys   Arg Met Glu
10460                 10465                 10470
Thr Thr   Thr Thr Ala Leu Lys   Thr Thr Thr Thr Ala   Leu Lys Thr
10475                 10480                 10485
Thr Ser   Arg Ala Thr Leu Thr   Thr Ser Val Tyr Thr   Pro Thr Leu
10490                 10495                 10500
Gly Thr   Leu Thr Pro Leu Asn   Ala Ser Met Gln Met   Ala Ser Thr
10505                 10510                 10515
Ile Pro   Thr Glu Met Met Ile   Thr Thr Pro Tyr Val   Phe Pro Asp
10520                 10525                 10530
Val Pro   Glu Thr Thr Ser Ser   Leu Ala Thr Ser Leu   Gly Ala Glu
10535                 10540                 10545
Thr Ser   Thr Ala Leu Pro Arg   Thr Thr Pro Ser Val   Phe Asn Arg
10550                 10555                 10560
Glu Ser   Glu Thr Thr Ala Ser   Leu Val Ser Arg Ser   Gly Ala Glu
10565                 10570                 10575
Arg Ser   Pro Val Ile Gln Thr   Leu Asp Val Ser Ser   Ser Glu Pro
10580                 10585                 10590
Asp Thr   Thr Ala Ser Trp Val   Ile His Pro Ala Glu   Thr Ile Pro
10595                 10600                 10605
Thr Val   Ser Lys Thr Thr Pro   Asn Phe Phe His Ser   Glu Leu Asp
10610                 10615                 10620
Thr Val   Ser Ser Thr Ala Thr   Ser His Gly Ala Asp   Val Ser Ser
10625                 10630                 10635
Ala Ile   Pro Thr Asn Ile Ser   Pro Ser Glu Leu Asp   Ala Leu Thr
10640                 10645                 10650
Pro Leu   Val Thr Ile Ser Gly   Thr Asp Thr Ser Thr   Thr Phe Pro
10655                 10660                 10665
Thr Leu   Thr Lys Ser Pro His   Glu Thr Glu Thr Arg   Thr Thr Trp
10670                 10675                 10680
Leu Thr   His Pro Ala Glu Thr   Ser Ser Thr Ile Pro   Arg Thr Ile
10685                 10690                 10695
Pro Asn   Phe Ser His His Glu   Ser Asp Ala Thr Pro   Ser Ile Ala
10700                 10705                 10710
Thr Ser   Pro Gly Ala Glu Thr   Ser Ser Ala Ile Pro   Ile Met Thr
10715                 10720                 10725
Val Ser   Pro Gly Ala Glu Asp   Leu Val Thr Ser Gln   Val Thr Ser
10730                 10735                 10740
Ser Gly   Thr Asp Arg Asn Met   Thr Ile Pro Thr Leu   Thr Leu Ser
10745                 10750                 10755
Pro Gly   Glu Pro Lys Thr Ile   Ala Ser Leu Val Thr   His Pro Glu
10760                 10765                 10770
Ala Gln   Thr Ser Ser Ala Ile   Pro Thr Ser Thr Ile   Ser Pro Ala
10775                 10780                 10785
Val Ser   Arg Leu Val Thr Ser   Met Val Thr Ser Leu   Ala Ala Lys
10790                 10795                 10800
Thr Ser   Thr Thr Asn Arg Ala   Leu Thr Asn Ser Pro   Gly Glu Pro
10805                 10810                 10815
Ala Thr   Thr Val Ser Leu Val   Thr His Pro Ala Gln   Thr Ser Pro
10820                 10825                 10830
Thr Val   Pro Trp Thr Thr Ser   Ile Phe Phe His Ser   Lys Ser Asp
10835                 10840                 10845
Thr Thr   Pro Ser Met Thr Thr   Ser His Gly Ala Glu   Ser Ser Ser
10850                 10855                 10860
Ala Val   Pro Thr Pro Thr Val   Ser Thr Glu Val Pro   Gly Val Val
10865                 10870                 10875
Thr Pro   Leu Val Thr Ser Ser   Arg Ala Val Ile Ser   Thr Thr Ile
10880                 10885                 10890
Pro Ile   Leu Thr Leu Ser Pro   Gly Glu Pro Glu Thr   Thr Pro Ser
10895                 10900                 10905
Met Ala   Thr Ser His Gly Glu   Glu Ala Ser Ser Ala   Ile Pro Thr
10910                 10915                 10920
Pro Thr   Val Ser Pro Gly Val   Pro Gly Val Val Thr   Ser Leu Val
10925                 10930                 10935
Thr Ser   Ser Arg Ala Val Thr   Ser Thr Thr Ile Pro   Ile Leu Thr
10940                 10945                 10950
Phe Ser   Leu Gly Glu Pro Glu   Thr Thr Pro Ser Met   Ala Thr Ser
10955                 10960                 10965
His Gly   Thr Glu Ala Gly Ser   Ala Val Pro Thr Val   Leu Pro Glu
10970                 10975                 10980
Val Pro   Gly Met Val Thr Ser   Leu Val Ala Ser Ser   Arg Ala Val
10985                 10990                 10995
Thr Ser   Thr Thr Leu Pro Thr   Leu Thr Leu Ser Pro   Gly Glu Pro
11000                 11005                 11010
Glu Thr   Thr Pro Ser Met Ala   Thr Ser His Gly Ala   Glu Ala Ser
11015                 11020                 11025
Ser Thr   Val Pro Thr Val Ser   Pro Glu Val Pro Gly   Val Val Thr
11030                 11035                 11040
Ser Leu   Val Thr Ser Ser Ser   Gly Val Asn Ser Thr   Ser Ile Pro
11045                 11050                 11055
Thr Leu   Ile Leu Ser Pro Gly   Glu Leu Glu Thr Thr   Pro Ser Met
11060                 11065                 11070
Ala Thr   Ser His Gly Ala Glu   Ala Ser Ser Ala Val   Pro Thr Pro
11075                 11080                 11085
Thr Val   Ser Pro Gly Val Ser   Gly Val Val Thr Pro   Leu Val Thr
11090                 11095                 11100
Ser Ser   Arg Ala Val Thr Ser   Thr Thr Ile Pro Ile   Leu Thr Leu
11105                 11110                 11115
Ser Ser   Ser Glu Pro Glu Thr   Thr Pro Ser Met Ala   Thr Ser His
11120                 11125                 11130
Gly Val   Glu Ala Ser Ser Ala   Val Leu Thr Val Ser   Pro Glu Val
11135                 11140                 11145
Pro Gly   Met Val Thr Ser Leu   Val Thr Ser Ser Arg   Ala Val Thr
11150                 11155                 11160
Ser Thr   Thr Ile Pro Thr Leu   Thr Ile Ser Ser Asp   Glu Pro Glu
11165                 11170                 11175
Thr Thr   Thr Ser Leu Val Thr   His Ser Glu Ala Lys   Met Ile Ser
11180                 11185                 11190
Ala Ile   Pro Thr Leu Ala Val   Ser Pro Thr Val Gln   Gly Leu Val
11195                 11200                 11205
Thr Ser   Leu Val Thr Ser Ser   Gly Ser Glu Thr Ser   Ala Phe Ser
11210                 11215                 11220
Asn Leu   Thr Val Ala Ser Ser   Gln Pro Glu Thr Ile   Asp Ser Trp
11225                 11230                 11235
Val Ala   His Pro Gly Thr Glu   Ala Ser Ser Val Val   Pro Thr Leu
11240                 11245                 11250
Thr Val   Ser Thr Gly Glu Pro   Phe Thr Asn Ile Ser   Leu Val Thr
11255                 11260                 11265
His Pro   Ala Glu Ser Ser Ser   Thr Leu Pro Arg Thr   Thr Ser Arg
11270                 11275                 11280
Phe Ser   His Ser Glu Leu Asp   Thr Met Pro Ser Thr   Val Thr Ser
11285                 11290                 11295
Pro Glu   Ala Glu Ser Ser Ser   Ala Ile Ser Thr Thr   Ile Ser Pro
11300                 11305                 11310
Gly Ile   Pro Gly Val Leu Thr   Ser Leu Val Thr Ser   Ser Gly Arg
11315                 11320                 11325
Asp Ile   Ser Ala Thr Phe Pro   Thr Val Pro Glu Ser   Pro His Glu
11330                 11335                 11340
Ser Glu   Ala Thr Ala Ser Trp   Val Thr His Pro Ala   Val Thr Ser
11345                 11350                 11355
Thr Thr   Val Pro Arg Thr Thr   Pro Asn Tyr Ser His   Ser Glu Pro
11360                 11365                 11370
Asp Thr   Thr Pro Ser Ile Ala   Thr Ser Pro Gly Ala   Glu Ala Thr
11375                 11380                 11385
Ser Asp   Phe Pro Thr Ile Thr   Val Ser Pro Asp Val   Pro Asp Met
11390                 11395                 11400
Val Thr   Ser Gln Val Thr Ser   Ser Gly Thr Asp Thr   Ser Ile Thr
11405                 11410                 11415
Ile Pro   Thr Leu Thr Leu Ser   Ser Gly Glu Pro Glu   Thr Thr Thr
11420                 11425                 11430
Ser Phe   Ile Thr Tyr Ser Glu   Thr His Thr Ser Ser   Ala Ile Pro
11435                 11440                 11445
Thr Leu   Pro Val Ser Pro Gly   Ala Ser Lys Met Leu   Thr Ser Leu
11450                 11455                 11460
Val Ile   Ser Ser Gly Thr Asp   Ser Thr Thr Thr Phe   Pro Thr Leu
11465                 11470                 11475
Thr Glu   Thr Pro Tyr Glu Pro   Glu Thr Thr Ala Ile   Gln Leu Ile
11480                 11485                 11490
His Pro   Ala Glu Thr Asn Thr   Met Val Pro Arg Thr   Thr Pro Lys
11495                 11500                 11505
Phe Ser   His Ser Lys Ser Asp   Thr Thr Leu Pro Val   Ala Ile Thr
11510                 11515                 11520
Ser Pro   Gly Pro Glu Ala Ser   Ser Ala Val Ser Thr   Thr Thr Ile
11525                 11530                 11535
Ser Pro   Asp Met Ser Asp Leu   Val Thr Ser Leu Val   Pro Ser Ser
11540                 11545                 11550
Gly Thr   Asp Thr Ser Thr Thr   Phe Pro Thr Leu Ser   Glu Thr Pro
11555                 11560                 11565
Tyr Glu   Pro Glu Thr Thr Ala   Thr Trp Leu Thr His   Pro Ala Glu
11570                 11575                 11580
Thr Ser   Thr Thr Val Ser Gly   Thr Ile Pro Asn Phe   Ser His Arg
11585                 11590                 11595
Gly Ser   Asp Thr Ala Pro Ser   Met Val Thr Ser Pro   Gly Val Asp
11600                 11605                 11610
Thr Arg   Ser Gly Val Pro Thr   Thr Thr Ile Pro Pro   Ser Ile Pro
11615                 11620                 11625
Gly Val   Val Thr Ser Gln Val   Thr Ser Ser Ala Thr   Asp Thr Ser
11630                 11635                 11640
Thr Ala   Ile Pro Thr Leu Thr   Pro Ser Pro Gly Glu   Pro Glu Thr
11645                 11650                 11655
Thr Ala   Ser Ser Ala Thr His   Pro Gly Thr Gln Thr   Gly Phe Thr
11660                 11665                 11670
Val Pro   Ile Arg Thr Val Pro   Ser Ser Glu Pro Asp   Thr Met Ala
11675                 11680                 11685
Ser Trp   Val Thr His Pro Pro   Gln Thr Ser Thr Pro   Val Ser Arg
11690                 11695                 11700
Thr Thr   Ser Ser Phe Ser His   Ser Ser Pro Asp Ala   Thr Pro Val
11705                 11710                 11715
Met Ala   Thr Ser Pro Arg Thr   Glu Ala Ser Ser Ala   Val Leu Thr
11720                 11725                 11730
Thr Ile   Ser Pro Gly Ala Pro   Glu Met Val Thr Ser   Gln Ile Thr
11735                 11740                 11745
Ser Ser   Gly Ala Ala Thr Ser   Thr Thr Val Pro Thr   Leu Thr His
11750                 11755                 11760
Ser Pro   Gly Met Pro Glu Thr   Thr Ala Leu Leu Ser   Thr His Pro
11765                 11770                 11775
Arg Thr   Glu Thr Ser Lys Thr   Phe Pro Ala Ser Thr   Val Phe Pro
11780                 11785                 11790
Gln Val   Ser Glu Thr Thr Ala   Ser Leu Thr Ile Arg   Pro Gly Ala
11795                 11800                 11805
Glu Thr   Ser Thr Ala Leu Pro   Thr Gln Thr Thr Ser   Ser Leu Phe
11810                 11815                 11820
Thr Leu   Leu Val Thr Gly Thr   Ser Arg Val Asp Leu   Ser Pro Thr
11825                 11830                 11835
Ala Ser   Pro Gly Val Ser Ala   Lys Thr Ala Pro Leu   Ser Thr His
11840                 11845                 11850
Pro Gly   Thr Glu Thr Ser Thr   Met Ile Pro Thr Ser   Thr Leu Ser
11855                 11860                 11865
Leu Gly   Leu Leu Glu Thr Thr   Gly Leu Leu Ala Thr   Ser Ser Ser
11870                 11875                 11880
Ala Glu   Thr Ser Thr Ser Thr   Leu Thr Leu Thr Val   Ser Pro Ala
11885                 11890                 11895
Val Ser   Gly Leu Ser Ser Ala   Ser Ile Thr Thr Asp   Lys Pro Gln
11900                 11905                 11910
Thr Val   Thr Ser Trp Asn Thr   Glu Thr Ser Pro Ser   Val Thr Ser
11915                 11920                 11925
Val Gly   Pro Pro Glu Phe Ser   Arg Thr Val Thr Gly   Thr Thr Met
11930                 11935                 11940
Thr Leu   Ile Pro Ser Glu Met   Pro Thr Pro Pro Lys   Thr Ser His
11945                 11950                 11955
Gly Glu   Gly Val Ser Pro Thr   Thr Ile Leu Arg Thr   Thr Met Val
11960                 11965                 11970
Glu Ala   Thr Asn Leu Ala Thr   Thr Gly Ser Ser Pro   Thr Val Ala
11975                 11980                 11985
Lys Thr   Thr Thr Thr Phe Asn   Thr Leu Ala Gly Ser   Leu Phe Thr
11990                 11995                 12000
Pro Leu   Thr Thr Pro Gly Met   Ser Thr Leu Ala Ser   Glu Ser Val
12005                 12010                 12015
Thr Ser   Arg Thr Ser Tyr Asn   His Arg Ser Trp Ile   Ser Thr Thr
12020                 12025                 12030
Ser Ser   Tyr Asn Arg Arg Tyr   Trp Thr Pro Ala Thr   Ser Thr Pro
12035                 12040                 12045
Val Thr   Ser Thr Phe Ser Pro   Gly Ile Ser Thr Ser   Ser Ile Pro
12050                 12055                 12060
Ser Ser   Thr Ala Ala Thr Val   Pro Phe Met Val Pro   Phe Thr Leu
12065                 12070                 12075
Asn Phe   Thr Ile Thr Asn Leu   Gln Tyr Glu Glu Asp   Met Arg His
12080                 12085                 12090
Pro Gly   Ser Arg Lys Phe Asn   Ala Thr Glu Arg Glu   Leu Gln Gly
12095                 12100                 12105
Leu Leu   Lys Pro Leu Phe Arg   Asn Ser Ser Leu Glu   Tyr Leu Tyr
12110                 12115                 12120
Ser Gly   Cys Arg Leu Ala Ser   Leu Arg Pro Glu Lys   Asp Ser Ser
12125                 12130                 12135
Ala Thr   Ala Val Asp Ala Ile   Cys Thr His Arg Pro   Asp Pro Glu
12140                 12145                 12150
Asp Leu   Gly Leu Asp Arg Glu   Arg Leu Tyr Trp Glu   Leu Ser Asn
12155                 12160                 12165
Leu Thr   Asn Gly Ile Gln Glu   Leu Gly Pro Tyr Thr   Leu Asp Arg
12170                 12175                 12180
Asn Ser   Leu Tyr Val Asn Gly   Phe Thr His Arg Ser   Ser Met Pro
12185                 12190                 12195
Thr Thr   Ser Thr Pro Gly Thr   Ser Thr Val Asp Val   Gly Thr Ser
12200                 12205                 12210
Gly Thr   Pro Ser Ser Ser Pro   Ser Pro Thr Thr Ala   Gly Pro Leu
12215                 12220                 12225
Leu Met   Pro Phe Thr Leu Asn   Phe Thr Ile Thr Asn   Leu Gln Tyr
12230                 12235                 12240
Glu Glu   Asp Met Arg Arg Thr   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Met
12245                 12250                 12255
Glu Ser   Val Leu Gln Gly Leu   Leu Lys Pro Leu Phe   Lys Asn Thr
12260                 12265                 12270
Ser Val   Gly Pro Leu Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg
12275                 12280                 12285
Pro Glu   Lys Asp Gly Ala Ala   Thr Gly Val Asp Ala   Ile Cys Thr
12290                 12295                 12300
His Arg   Leu Asp Pro Lys Ser   Pro Gly Leu Asn Arg   Glu Gln Leu
12305                 12310                 12315
Tyr Trp   Glu Leu Ser Lys Leu   Thr Asn Asp Ile Glu   Glu Leu Gly
12320                 12325                 12330
Pro Tyr   Thr Leu Asp Arg Asn   Ser Leu Tyr Val Asn   Gly Phe Thr
12335                 12340                 12345
His Gln   Ser Ser Val Ser Thr   Thr Ser Thr Pro Gly   Thr Ser Thr
12350                 12355                 12360
Val Asp   Leu Arg Thr Ser Gly   Thr Pro Ser Ser Leu   Ser Ser Pro
12365                 12370                 12375
Thr Ile   Met Ala Ala Gly Pro   Leu Leu Val Pro Phe   Thr Leu Asn
12380                 12385                 12390
Phe Thr   Ile Thr Asn Leu Gln   Tyr Gly Glu Asp Met   Gly His Pro
12395                 12400                 12405
Gly Ser   Arg Lys Phe Asn Thr   Thr Glu Arg Val Leu   Gln Gly Leu
12410                 12415                 12420
Leu Gly   Pro Ile Phe Lys Asn   Thr Ser Val Gly Pro   Leu Tyr Ser
12425                 12430                 12435
Gly Cys   Arg Leu Thr Ser Leu   Arg Ser Glu Lys Asp   Gly Ala Ala
12440                 12445                 12450
Thr Gly   Val Asp Ala Ile Cys   Ile His His Leu Asp   Pro Lys Ser
12455                 12460                 12465
Pro Gly   Leu Asn Arg Glu Arg   Leu Tyr Trp Glu Leu   Ser Gln Leu
12470                 12475                 12480
Thr Asn   Gly Ile Lys Glu Leu   Gly Pro Tyr Thr Leu   Asp Arg Asn
12485                 12490                 12495
Ser Leu   Tyr Val Asn Gly Phe   Thr His Arg Thr Ser   Val Pro Thr
12500                 12505                 12510
Ser Ser   Thr Pro Gly Thr Ser   Thr Val Asp Leu Gly   Thr Ser Gly
12515                 12520                 12525
Thr Pro   Phe Ser Leu Pro Ser   Pro Ala Thr Ala Gly   Pro Leu Leu
12530                 12535                 12540
Val Leu   Phe Thr Leu Asn Phe   Thr Ile Thr Asn Leu   Lys Tyr Glu
12545                 12550                 12555
Glu Asp   Met His Arg Pro Gly   Ser Arg Lys Phe Asn   Thr Thr Glu
12560                 12565                 12570
Arg Val   Leu Gln Thr Leu Leu   Gly Pro Met Phe Lys   Asn Thr Ser
12575                 12580                 12585
Val Gly   Leu Leu Tyr Ser Gly   Cys Arg Leu Thr Leu   Leu Arg Ser
12590                 12595                 12600
Glu Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Gly Val Asp Ala Ile   Cys Thr His
12605                 12610                 12615
Arg Leu   Asp Pro Lys Ser Pro   Gly Val Asp Arg Glu   Gln Leu Tyr
12620                 12625                 12630
Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   Asn Gly Ile Lys Glu   Leu Gly Pro
12635                 12640                 12645
Tyr Thr   Leu Asp Arg Asn Ser   Leu Tyr Val Asn Gly   Phe Thr His
12650                 12655                 12660
Trp Ile   Pro Val Pro Thr Ser   Ser Thr Pro Gly Thr   Ser Thr Val
12665                 12670                 12675
Asp Leu   Gly Ser Gly Thr Pro   Ser Ser Leu Pro Ser   Pro Thr Thr
12680                 12685                 12690
Ala Gly   Pro Leu Leu Val Pro   Phe Thr Leu Asn Phe   Thr Ile Thr
12695                 12700                 12705
Asn Leu   Lys Tyr Glu Glu Asp   Met His Cys Pro Gly   Ser Arg Lys
12710                 12715                 12720
Phe Asn   Thr Thr Glu Arg Val   Leu Gln Ser Leu Leu   Gly Pro Met
12725                 12730                 12735
Phe Lys   Asn Thr Ser Val Gly   Pro Leu Tyr Ser Gly   Cys Arg Leu
12740                 12745                 12750
Thr Leu   Leu Arg Ser Glu Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Gly Val Asp
12755                 12760                 12765
Ala Ile   Cys Thr His Arg Leu   Asp Pro Lys Ser Pro   Gly Val Asp
12770                 12775                 12780
Arg Glu   Gln Leu Tyr Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   Asn Gly Ile
12785                 12790                 12795
Lys Glu   Leu Gly Pro Tyr Thr   Leu Asp Arg Asn Ser   Leu Tyr Val
12800                 12805                 12810
Asn Gly   Phe Thr His Gln Thr   Ser Ala Pro Asn Thr   Ser Thr Pro
12815                 12820                 12825
Gly Thr   Ser Thr Val Asp Leu   Gly Thr Ser Gly Thr   Pro Ser Ser
12830                 12835                 12840
Leu Pro   Ser Pro Thr Ser Ala   Gly Pro Leu Leu Val   Pro Phe Thr
12845                 12850                 12855
Leu Asn   Phe Thr Ile Thr Asn   Leu Gln Tyr Glu Glu   Asp Met His
12860                 12865                 12870
His Pro   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Thr Glu Arg   Val Leu Gln
12875                 12880                 12885
Gly Leu   Leu Gly Pro Met Phe   Lys Asn Thr Ser Val   Gly Leu Leu
12890                 12895                 12900
Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg Pro Glu   Lys Asn Gly
12905                 12910                 12915
Ala Ala   Thr Gly Met Asp Ala   Ile Cys Ser His Arg   Leu Asp Pro
12920                 12925                 12930
Lys Ser   Pro Gly Leu Asn Arg   Glu Gln Leu Tyr Trp   Glu Leu Ser
12935                 12940                 12945
Gln Leu   Thr His Gly Ile Lys   Glu Leu Gly Pro Tyr   Thr Leu Asp
12950                 12955                 12960
Arg Asn   Ser Leu Tyr Val Asn   Gly Phe Thr His Arg   Ser Ser Val
12965                 12970                 12975
Ala Pro   Thr Ser Thr Pro Gly   Thr Ser Thr Val Asp   Leu Gly Thr
12980                 12985                 12990
Ser Gly   Thr Pro Ser Ser Leu   Pro Ser Pro Thr Thr   Ala Val Pro
12995                 13000                 13005
Leu Leu   Val Pro Phe Thr Leu   Asn Phe Thr Ile Thr   Asn Leu Gln
13010                 13015                 13020
Tyr Gly   Glu Asp Met Arg His   Pro Gly Ser Arg Lys   Phe Asn Thr
13025                 13030                 13035
Thr Glu   Arg Val Leu Gln Gly   Leu Leu Gly Pro Leu   Phe Lys Asn
13040                 13045                 13050
Ser Ser   Val Gly Pro Leu Tyr   Ser Gly Cys Arg Leu   Ile Ser Leu
13055                 13060                 13065
Arg Ser   Glu Lys Asp Gly Ala   Ala Thr Gly Val Asp   Ala Ile Cys
13070                 13075                 13080
Thr His   His Leu Asn Pro Gln   Ser Pro Gly Leu Asp   Arg Glu Gln
13085                 13090                 13095
Leu Tyr   Trp Gln Leu Ser Gln   Met Thr Asn Gly Ile   Lys Glu Leu
13100                 13105                 13110
Gly Pro   Tyr Thr Leu Asp Arg   Asn Ser Leu Tyr Val   Asn Gly Phe
13115                 13120                 13125
Thr His   Arg Ser Ser Gly Leu   Thr Thr Ser Thr Pro   Trp Thr Ser
13130                 13135                 13140
Thr Val   Asp Leu Gly Thr Ser   Gly Thr Pro Ser Pro   Val Pro Ser
13145                 13150                 13155
Pro Thr   Thr Thr Gly Pro Leu   Leu Val Pro Phe Thr   Leu Asn Phe
13160                 13165                 13170
Thr Ile   Thr Asn Leu Gln Tyr   Glu Glu Asn Met Gly   His Pro Gly
13175                 13180                 13185
Ser Arg   Lys Phe Asn Ile Thr   Glu Ser Val Leu Gln   Gly Leu Leu
13190                 13195                 13200
Lys Pro   Leu Phe Lys Ser Thr   Ser Val Gly Pro Leu   Tyr Ser Gly
13205                 13210                 13215
Cys Arg   Leu Thr Leu Leu Arg   Pro Glu Lys Asp Gly   Val Ala Thr
13220                 13225                 13230
Arg Val   Asp Ala Ile Cys Thr   His Arg Pro Asp Pro   Lys Ile Pro
13235                 13240                 13245
Gly Leu   Asp Arg Gln Gln Leu   Tyr Trp Glu Leu Ser   Gln Leu Thr
13250                 13255                 13260
His Ser   Ile Thr Glu Leu Gly   Pro Tyr Thr Leu Asp   Arg Asp Ser
13265                 13270                 13275
Leu Tyr   Val Asn Gly Phe Thr   Gln Arg Ser Ser Val   Pro Thr Thr
13280                 13285                 13290
Ser Thr   Pro Gly Thr Phe Thr   Val Gln Pro Glu Thr   Ser Glu Thr
13295                 13300                 13305
Pro Ser   Ser Leu Pro Gly Pro   Thr Ala Thr Gly Pro   Val Leu Leu
13310                 13315                 13320
Pro Phe   Thr Leu Asn Phe Thr   Ile Thr Asn Leu Gln   Tyr Glu Glu
13325                 13330                 13335
Asp Met   Arg Arg Pro Gly Ser   Arg Lys Phe Asn Thr   Thr Glu Arg
13340                 13345                 13350
Val Leu   Gln Gly Leu Leu Met   Pro Leu Phe Lys Asn   Thr Ser Val
13355                 13360                 13365
Ser Ser   Leu Tyr Ser Gly Cys   Arg Leu Thr Leu Leu   Arg Pro Glu
13370                 13375                 13380
Lys Asp   Gly Ala Ala Thr Arg   Val Asp Ala Val Cys   Thr His Arg
13385                 13390                 13395
Pro Asp   Pro Lys Ser Pro Gly   Leu Asp Arg Glu Arg   Leu Tyr Trp
13400                 13405                 13410
Lys Leu   Ser Gln Leu Thr His   Gly Ile Thr Glu Leu   Gly Pro Tyr
13415                 13420                 13425
Thr Leu   Asp Arg His Ser Leu   Tyr Val Asn Gly Phe   Thr His Gln
13430                 13435                 13440
Ser Ser   Met Thr Thr Thr Arg   Thr Pro Asp Thr Ser   Thr Met His
13445                 13450                 13455
Leu Ala   Thr Ser Arg Thr Pro   Ala Ser Leu Ser Gly   Pro Met Thr
13460                 13465                 13470
Ala Ser   Pro Leu Leu Val Leu   Phe Thr Ile Asn Phe   Thr Ile Thr
13475                 13480                 13485
Asn Leu   Arg Tyr Glu Glu Asn   Met His His Pro Gly   Ser Arg Lys
13490                 13495                 13500
Phe Asn   Thr Thr Glu Arg Val   Leu Gln Gly Leu Leu   Arg Pro Val
13505                 13510                 13515
Phe Lys   Asn Thr Ser Val Gly   Pro Leu Tyr Ser Gly   Cys Arg Leu
13520                 13525                 13530
Thr Leu   Leu Arg Pro Lys Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Lys Val Asp
13535                 13540                 13545
Ala Ile   Cys Thr Tyr Arg Pro   Asp Pro Lys Ser Pro   Gly Leu Asp
13550                 13555                 13560
Arg Glu   Gln Leu Tyr Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   His Ser Ile
13565                 13570                 13575
Thr Glu   Leu Gly Pro Tyr Thr   Leu Asp Arg Asp Ser   Leu Tyr Val
13580                 13585                 13590
Asn Gly   Phe Thr Gln Arg Ser   Ser Val Pro Thr Thr   Ser Ile Pro
13595                 13600                 13605
Gly Thr   Pro Thr Val Asp Leu   Gly Thr Ser Gly Thr   Pro Val Ser
13610                 13615                 13620
Lys Pro   Gly Pro Ser Ala Ala   Ser Pro Leu Leu Val   Leu Phe Thr
13625                 13630                 13635
Leu Asn   Phe Thr Ile Thr Asn   Leu Arg Tyr Glu Glu   Asn Met Gln
13640                 13645                 13650
His Pro   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Thr Glu Arg   Val Leu Gln
13655                 13660                 13665
Gly Leu   Leu Arg Ser Leu Phe   Lys Ser Thr Ser Val   Gly Pro Leu
13670                 13675                 13680
Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg Pro Glu   Lys Asp Gly
13685                 13690                 13695
Thr Ala   Thr Gly Val Asp Ala   Ile Cys Thr His His   Pro Asp Pro
13700                 13705                 13710
Lys Ser   Pro Arg Leu Asp Arg   Glu Gln Leu Tyr Trp   Glu Leu Ser
13715                 13720                 13725
Gln Leu   Thr His Asn Ile Thr   Glu Leu Gly Pro Tyr   Ala Leu Asp
13730                 13735                 13740
Asn Asp   Ser Leu Phe Val Asn   Gly Phe Thr His Arg   Ser Ser Val
13745                 13750                 13755
Ser Thr   Thr Ser Thr Pro Gly   Thr Pro Thr Val Tyr   Leu Gly Ala
13760                 13765                 13770
Ser Lys   Thr Pro Ala Ser Ile   Phe Gly Pro Ser Ala   Ala Ser His
13775                 13780                 13785
Leu Leu   Ile Leu Phe Thr Leu   Asn Phe Thr Ile Thr   Asn Leu Arg
13790                 13795                 13800
Tyr Glu   Glu Asn Met Trp Pro   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Thr
13805                 13810                 13815
Glu Arg   Val Leu Gln Gly Leu   Leu Arg Pro Leu Phe   Lys Asn Thr
13820                 13825                 13830
Ser Val   Gly Pro Leu Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg
13835                 13840                 13845
Pro Glu   Lys Asp Gly Glu Ala   Thr Gly Val Asp Ala   Ile Cys Thr
13850                 13855                 13860
His Arg   Pro Asp Pro Thr Gly   Pro Gly Leu Asp Arg   Glu Gln Leu
13865                 13870                 13875
Tyr Leu   Glu Leu Ser Gln Leu   Thr His Ser Ile Thr   Glu Leu Gly
13880                 13885                 13890
Pro Tyr   Thr Leu Asp Arg Asp   Ser Leu Tyr Val Asn   Gly Phe Thr
13895                 13900                 13905
His Arg   Ser Ser Val Pro Thr   Thr Ser Thr Gly Val   Val Ser Glu
13910                 13915                 13920
Glu Pro   Phe Thr Leu Asn Phe   Thr Ile Asn Asn Leu   Arg Tyr Met
13925                 13930                 13935
Ala Asp   Met Gly Gln Pro Gly   Ser Leu Lys Phe Asn   Ile Thr Asp
13940                 13945                 13950
Asn Val   Met Gln His Leu Leu   Ser Pro Leu Phe Gln   Arg Ser Ser
13955                 13960                 13965
Leu Gly   Ala Arg Tyr Thr Gly   Cys Arg Val Ile Ala   Leu Arg Ser
13970                 13975                 13980
Val Lys   Asn Gly Ala Glu Thr   Arg Val Asp Leu Leu   Cys Thr Tyr
13985                 13990                 13995
Leu Gln   Pro Leu Ser Gly Pro   Gly Leu Pro Ile Lys   Gln Val Phe
14000                 14005                 14010
His Glu   Leu Ser Gln Gln Thr   His Gly Ile Thr Arg   Leu Gly Pro
14015                 14020                 14025
Tyr Ser   Leu Asp Lys Asp Ser   Leu Tyr Leu Asn Gly   Tyr Asn Glu
14030                 14035                 14040
Pro Gly   Pro Asp Glu Pro Pro   Thr Thr Pro Lys Pro   Ala Thr Thr
14045                 14050                 14055
Phe Leu   Pro Pro Leu Ser Glu   Ala Thr Thr Ala Met   Gly Tyr His
14060                 14065                 14070
Leu Lys   Thr Leu Thr Leu Asn   Phe Thr Ile Ser Asn   Leu Gln Tyr
14075                 14080                 14085
Ser Pro   Asp Met Gly Lys Gly   Ser Ala Thr Phe Asn   Ser Thr Glu
14090                 14095                 14100
Gly Val   Leu Gln His Leu Leu   Arg Pro Leu Phe Gln   Lys Ser Ser
14105                 14110                 14115
Met Gly   Pro Phe Tyr Leu Gly   Cys Gln Leu Ile Ser   Leu Arg Pro
14120                 14125                 14130
Glu Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Gly Val Asp Thr Thr   Cys Thr Tyr
14135                 14140                 14145
His Pro   Asp Pro Val Gly Pro   Gly Leu Asp Ile Gln   Gln Leu Tyr
14150                 14155                 14160
Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   His Gly Val Thr Gln   Leu Gly Phe
14165                 14170                 14175
Tyr Val   Leu Asp Arg Asp Ser   Leu Phe Ile Asn Gly   Tyr Ala Pro
14180                 14185                 14190
Gln Asn   Leu Ser Ile Arg Gly   Glu Tyr Gln Ile Asn   Phe His Ile
14195                 14200                 14205
Val Asn   Trp Asn Leu Ser Asn   Pro Asp Pro Thr Ser   Ser Glu Tyr
14210                 14215                 14220
Ile Thr   Leu Leu Arg Asp Ile   Gln Asp Lys Val Thr   Thr Leu Tyr
14225                 14230                 14235
Lys Gly   Ser Gln Leu His Asp   Thr Phe Arg Phe Cys   Leu Val Thr
14240                 14245                 14250
Asn Leu   Thr Met Asp Ser Val   Leu Val Thr Val Lys   Ala Leu Phe
14255                 14260                 14265
Ser Ser   Asn Leu Asp Pro Ser   Leu Val Glu Gln Val   Phe Leu Asp
14270                 14275                 14280
Lys Thr   Leu Asn Ala Ser Phe   His Trp Leu Gly Ser   Thr Tyr Gln
14285                 14290                 14295
Leu Val   Asp Ile His Val Thr   Glu Met Glu Ser Ser   Val Tyr Gln
14300                 14305                 14310
Pro Thr   Ser Ser Ser Ser Thr   Gln His Phe Tyr Leu   Asn Phe Thr
14315                 14320                 14325
Ile Thr   Asn Leu Pro Tyr Ser   Gln Asp Lys Ala Gln   Pro Gly Thr
14330                 14335                 14340
Thr Asn   Tyr Gln Arg Asn Lys   Arg Asn Ile Glu Asp   Ala Leu Asn
14345                 14350                 14355
Gln Leu   Phe Arg Asn Ser Ser   Ile Lys Ser Tyr Phe   Ser Asp Cys
14360                 14365                 14370
Gln Val   Ser Thr Phe Arg Ser   Val Pro Asn Arg His   His Thr Gly
14375                 14380                 14385
Val Asp   Ser Leu Cys Asn Phe   Ser Pro Leu Ala Arg   Arg Val Asp
14390                 14395                 14400
Arg Val   Ala Ile Tyr Glu Glu   Phe Leu Arg Met Thr   Arg Asn Gly
14405                 14410                 14415
Thr Gln   Leu Gln Asn Phe Thr   Leu Asp Arg Ser Ser   Val Leu Val
14420                 14425                 14430
Asp Gly   Tyr Ser Pro Asn Arg   Asn Glu Pro Leu Thr   Gly Asn Ser
14435                 14440                 14445
Asp Leu   Pro Phe Trp Ala Val   Ile Leu Ile Gly Leu   Ala Gly Leu
14450                 14455                 14460
Leu Gly   Val Ile Thr Cys Leu   Ile Cys Gly Val Leu   Val Thr Thr
14465                 14470                 14475
Arg Arg   Arg Lys Lys Glu Gly   Glu Tyr Asn Val Gln   Gln Gln Cys
14480                 14485                 14490
Pro Gly   Tyr Tyr Gln Ser His   Leu Asp Leu Glu Asp   Leu Gln
14495                 14500                 14505
<210> 137
<211> 43815
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты незрелого MUC16 человека
(NM_024690.2)
<400> 137
agcgttgcac aattccccca acctccatac atacggcagc tcttctagac acaggttttc 60
ccaggtcaaa tgcggggacc ccagccatat ctcccaccct gagaaatttt ggagtttcag 120
ggagctcaga agctctgcag aggccaccct ctctgagggg attcttctta gacctccatc 180
cagaggcaaa tgttgacctg tccatgctga aaccctcagg ccttcctggg tcatcttctc 240
ccacccgctc cttgatgaca gggagcagga gcactaaagc cacaccagaa atggattcag 300
gactgacagg agccaccttg tcacctaaga catctacagg tgcaatcgtg gtgacagaac 360
atactctgcc ctttacttcc ccagataaga ccttggccag tcctacatct tcggttgtgg 420
gaagaaccac ccagtctttg ggggtgatgt cctctgctct ccctgagtca acctctagag 480
gaatgacaca ctccgagcaa agaaccagcc catcgctgag tccccaggtc aatggaactc 540
cctctaggaa ctaccctgct acaagcatgg tttcaggatt gagttcccca aggaccagga 600
ccagttccac agaaggaaat tttaccaaag aagcatctac atacacactc actgtagaga 660
ccacaagtgg cccagtcact gagaagtaca cagtccccac tgagacctca acaactgaag 720
gtgacagcac agagaccccc tgggacacaa gatatattcc tgtaaaaatc acatctccaa 780
tgaaaacatt tgcagattca actgcatcca aggaaaatgc cccagtgtct atgactccag 840
ctgagaccac agttactgac tcacatactc caggaaggac aaacccatca tttgggacac 900
tttattcttc cttccttgac ctatcaccta aagggacccc aaattccaga ggtgaaacaa 960
gcctggaact gattctatca accactggat atcccttctc ctctcctgaa cctggctctg 1020
caggacacag cagaataagt accagtgcgc ctttgtcatc atctgcttca gttctcgata 1080
ataaaatatc agagaccagc atattctcag gccagagtct cacctcccct ctgtctcctg 1140
gggtgcccga ggccagagcc agcacaatgc ccaactcagc tatccctttt tccatgacac 1200
taagcaatgc agaaacaagt gccgaaaggg tcagaagcac aatttcctct ctggggactc 1260
catcaatatc cacaaagcag acagcagaga ctatccttac cttccatgcc ttcgctgaga 1320
ccatggatat acccagcacc cacatagcca agactttggc ttcagaatgg ttgggaagtc 1380
caggtaccct tggtggcacc agcacttcag cgctgacaac cacatctcca tctaccactt 1440
tagtctcaga ggagaccaac acccatcact ccacgagtgg aaaggaaaca gaaggaactt 1500
tgaatacatc tatgactcca cttgagacct ctgctcctgg agaagagtcc gaaatgactg 1560
ccaccttggt ccccactcta ggttttacaa ctcttgacag caagatcaga agtccatctc 1620
aggtctcttc atcccaccca acaagagagc tcagaaccac aggcagcacc tctgggaggc 1680
agagttccag cacagctgcc cacgggagct ctgacatcct gagggcaacc acttccagca 1740
cctcaaaagc atcatcatgg accagtgaaa gcacagctca gcaatttagt gaaccccagc 1800
acacacagtg ggtggagaca agtcctagca tgaaaacaga gagaccccca gcatcaacca 1860
gtgtggcagc ccctatcacc acttctgttc cctcagtggt ctctggcttc accaccctga 1920
agaccagctc cacaaaaggg atttggcttg aagaaacatc tgcagacaca ctcatcggag 1980
aatccacagc tggcccaacc acccatcagt ttgctgttcc cactgggatt tcaatgacag 2040
gaggcagcag caccagggga agccagggca caacccacct actcaccaga gccacagcat 2100
catctgagac atccgcagat ttgactctgg ccacgaacgg tgtcccagtc tccgtgtctc 2160
cagcagtgag caagacggct gctggctcaa gtcctccagg agggacaaag ccatcatata 2220
caatggtttc ttctgtcatc cctgagacat catctctaca gtcctcagct ttcagggaag 2280
gaaccagcct gggactgact ccattaaaca ctagacatcc cttctcttcc cctgaaccag 2340
actctgcagg acacaccaag ataagcacca gcattcctct gttgtcatct gcttcagttc 2400
ttgaggataa agtgtcagcg accagcacat tctcacacca caaagccacc tcatctatta 2460
ccacagggac tcctgaaatc tcaacaaaga caaagcccag ctcagccgtt ctttcctcca 2520
tgaccctaag caatgcagca acaagtcctg aaagagtcag aaatgcaact tcccctctga 2580
ctcatccatc tccatcaggg gaagagacag cagggagtgt cctcactctc agcacctctg 2640
ctgagactac agactcacct aacatccacc caactgggac actgacttca gaatcgtcag 2700
agagtcctag cactctcagc ctcccaagtg tctctggagt caaaaccaca ttttcttcat 2760
ctactccttc cactcatcta tttactagtg gagaagaaac agaggaaact tcgaatccat 2820
ctgtgtctca acctgagact tctgtttcca gagtaaggac caccttggcc agcacctctg 2880
tccctacccc agtattcccc accatggaca cctggcctac acgttcagct cagttctctt 2940
catcccacct agtgagtgag ctcagagcta cgagcagtac ctcagttaca aactcaactg 3000
gttcagctct tcctaaaata tctcacctca ctgggacggc aacaatgtca cagaccaata 3060
gagacacgtt taatgactct gctgcacccc aaagcacaac ttggccagag actagtccca 3120
gattcaagac agggttacct tcagcaacaa ccactgtttc aacctctgcc acttctctct 3180
ctgctactgt aatggtctct aaattcactt ctccagcaac tagttccatg gaagcaactt 3240
ctatcaggga accatcaaca accatcctca caacagagac cacgaatggc ccaggctcta 3300
tggctgtggc ttctaccaac atcccaattg gaaagggcta cattactgaa ggaagattgg 3360
acacaagcca tctgcccatt ggaaccacag cttcctctga gacatctatg gattttacca 3420
tggccaaaga aagtgtctca atgtcagtat ctccatctca gtccatggat gctgctggct 3480
caagcactcc aggaaggaca agccaattcg ttgacacatt ttctgatgat gtctatcatt 3540
taacatccag agaaattaca atacctagag atggaacaag ctcagctctg actccacaaa 3600
tgactgcaac tcaccctcca tctcctgatc ctggctctgc tagaagcacc tggcttggca 3660
tcttgtcctc atctccttct tctcctactc ccaaagtcac aatgagctcc acattttcaa 3720
ctcagagagt caccacaagc atgataatgg acacagttga aactagtcgg tggaacatgc 3780
ccaacttacc ttccacgact tccttgacac caagtaatat tccaacaagt ggtgccatag 3840
gaaaaagcac cctggttccc ttggacactc catctccagc cacatcattg gaggcatcag 3900
aagggggact tccaaccctc agcacctacc ctgaatcaac aaacacaccc agcatccacc 3960
tcggagcaca cgctagttca gaaagtccaa gcaccatcaa acttaccatg gcttcagtag 4020
taaaacctgg ctcttacaca cctctcacct tcccctcaat agagacccac attcatgtat 4080
caacagccag aatggcttac tcttctgggt cttcacctga gatgacagct cctggagaga 4140
ctaacactgg tagtacctgg gaccccacca cctacatcac cactacggat cctaaggata 4200
caagttcagc tcaggtctct acaccccact cagtgaggac actcagaacc acagaaaacc 4260
atccaaagac agagtccgcc accccagctg cttactctgg aagtcctaaa atctcaagtt 4320
cacccaatct caccagtccg gccacaaaag catggaccat cacagacaca actgaacact 4380
ccactcaatt acattacaca aaattggcag aaaaatcatc tggatttgag acacagtcag 4440
ctccaggacc tgtctctgta gtaatcccta cctcccctac cattggaagc agcacattgg 4500
aactaacttc tgatgtccca ggggaacccc tggtccttgc tcccagtgag cagaccacaa 4560
tcactctccc catggcaaca tggctgagta ccagtttgac agaggaaatg gcttcaacag 4620
accttgatat ttcaagtcca agttcaccca tgagtacatt tgctattttt ccacctatgt 4680
ccacaccttc tcatgaactt tcaaagtcag aggcagatac cagtgccatt agaaatacag 4740
attcaacaac gttggatcag cacctaggaa tcaggagttt gggcagaact ggggacttaa 4800
caactgttcc tatcacccca ctgacaacca cgtggaccag tgtgattgaa cactcaacac 4860
aagcacagga caccctttct gcaacgatga gtcctactca cgtgacacag tcactcaaag 4920
atcaaacatc tataccagcc tcagcatccc cttcccatct tactgaagtc taccctgagc 4980
tcgggacaca agggagaagc tcctctgagg caaccacttt ttggaaacca tctacagaca 5040
cactgtccag agagattgag actggcccaa caaacattca atccactcca cccatggaca 5100
acacaacaac agggagcagt agtagtggag tcaccctggg catagcccac cttcccatag 5160
gaacatcctc cccagctgag acatccacaa acatggcact ggaaagaaga agttctacag 5220
ccactgtctc tatggctggg acaatgggac tccttgttac tagtgctcca ggaagaagca 5280
tcagccagtc attaggaaga gtttcctctg tcctttctga gtcaactact gaaggagtca 5340
cagattctag taagggaagc agcccaaggc tgaacacaca gggaaataca gctctctcct 5400
cctctcttga acccagctat gctgaaggaa gccagatgag cacaagcatc cctctaacct 5460
catctcctac aactcctgat gtggaattca tagggggcag cacattttgg accaaggagg 5520
tcaccacagt tatgacctca gacatctcca agtcttcagc aaggacagag tccagctcag 5580
ctacccttat gtccacagct ttgggaagca ctgaaaatac aggaaaagaa aaactcagaa 5640
ctgcctctat ggatcttcca tctccaactc catcaatgga ggtgacacca tggatttctc 5700
tcactctcag taatgccccc aataccacag attcacttga cctcagccat ggggtgcaca 5760
ccagctctgc agggactttg gccactgaca ggtcattgaa tactggtgtc actagagcct 5820
ccagattgga aaacggctct gatacctctt ctaagtccct gtctatggga aacagcactc 5880
acacttccat gacttacaca gagaagagtg aagtgtcttc ttcaatccat ccccgacctg 5940
agacctcagc tcctggagca gagaccactt tgacttccac tcctggaaac agggccataa 6000
gcttaacatt gcctttttca tccattccag tggaagaagt catttctaca ggcataacct 6060
caggaccaga catcaactca gcacccatga cacattctcc catcacccca ccaacaattg 6120
tatggaccag tacaggcaca attgaacagt ccactcaacc actacatgca gtttcttcag 6180
aaaaagtttc tgtgcagaca cagtcaactc catatgtcaa ctctgtggca gtgtctgctt 6240
cccctaccca tgagaattca gtctcttctg gaagcagcac atcctctcca tattcctcag 6300
cctcacttga atccttggat tccacaatca gtaggaggaa tgcaatcact tcctggctat 6360
gggacctcac tacatctctc cccactacaa cttggccaag tactagttta tctgaggcac 6420
tgtcctcagg ccattctggg gtttcaaacc caagttcaac tacgactgaa tttccactct 6480
tttcagctgc atccacatct gctgctaagc aaagaaatcc agaaacagag acccatggtc 6540
cccagaatac agccgcgagt actttgaaca ctgatgcatc ctcggtcaca ggtctttctg 6600
agactcctgt gggggcaagt atcagctctg aagtccctct tccaatggcc ataacttcta 6660
gatcagatgt ttctggcctt acatctgaga gtactgctaa cccgagttta ggcacagcct 6720
cttcagcagg gaccaaatta actaggacaa tatccctgcc cacttcagag tctttggttt 6780
cctttagaat gaacaaggat ccatggacag tgtcaatccc tttggggtcc catccaacta 6840
ctaatacaga aacaagcatc ccagtaaaca gcgcaggtcc acctggcttg tccacagtag 6900
catcagatgt aattgacaca ccttcagatg gggctgagag tattcccact gtctcctttt 6960
ccccctcccc tgatactgaa gtgacaacta tctcacattt cccagaaaag acaactcatt 7020
catttagaac catttcatct ctcactcatg agttgacttc aagagtgaca cctattcctg 7080
gggattggat gagttcagct atgtctacaa agcccacagg agccagtccc tccattacac 7140
tgggagagag aaggacaatc acctctgctg ctccaaccac ttcccccata gttctcactg 7200
ctagtttcac agagaccagc acagtttcac tggataatga aactacagta aaaacctcag 7260
atatccttga cgcacggaaa acaaatgagc tcccctcaga tagcagttct tcttctgatc 7320
tgatcaacac ctccatagct tcttcaacta tggatgtcac taaaacagcc tccatcagtc 7380
ccactagcat ctcaggaatg acagcaagtt cctccccatc tctcttctct tcagatagac 7440
cccaggttcc cacatctaca acagagacaa atacagccac ctctccatct gtttccagta 7500
acacctattc tcttgatggg ggctccaatg tgggtggcac tccatccact ttaccaccct 7560
ttacaatcac ccaccctgtc gagacaagct cggccctatt agcctggtct agaccagtaa 7620
gaactttcag caccatggtc agcactgaca ctgcctccgg agaaaatcct acctctagca 7680
attctgtggt gacttctgtt ccagcaccag gtacatggac cagtgtaggc agtactactg 7740
acttacctgc catgggcttt ctcaagacaa gtcctgcagg agaggcacac tcacttctag 7800
catcaactat tgaaccagcc actgccttca ctccccatct ctcagcagca gtggtcactg 7860
gatccagtgc tacatcagaa gccagtcttc tcactacgag tgaaagcaaa gccattcatt 7920
cttcaccaca gaccccaact acacccacct ctggagcaaa ctgggaaact tcagctactc 7980
ctgagagcct tttggtagtc actgagactt cagacacaac acttacctca aagattttgg 8040
tcacagatac catcttgttt tcaactgtgt ccacgccacc ttctaaattt ccaagtacgg 8100
ggactctgtc tggagcttcc ttccctactt tactcccgga cactccagcc atccctctca 8160
ctgccactga gccaacaagt tcattagcta catcctttga ttccacccca ctggtgacta 8220
tagcttcgga tagtcttggc acagtcccag agactaccct gaccatgtca gagacctcaa 8280
atggtgatgc actggttctt aagacagtaa gtaacccaga taggagcatc cctggaatca 8340
ctatccaagg agtaacagaa agtccactcc atccttcttc cacttccccc tctaagattg 8400
ttgctccacg gaatacaacc tatgaaggtt cgatcacagt ggcactttct actttgcctg 8460
cgggaactac tggttccctt gtattcagtc agagttctga aaactcagag acaacggctt 8520
tggtagactc atcagctggg cttgagaggg catctgtgat gccactaacc acaggaagcc 8580
agggtatggc tagctctgga ggaatcagaa gtgggtccac tcactcaact ggaaccaaaa 8640
cattttcttc tctccctctg accatgaacc caggtgaggt tacagccatg tctgaaatca 8700
ccacgaacag actgacagct actcaatcaa cagcacccaa agggatacct gtgaagccca 8760
ccagtgctga gtcaggcctc ctaacacctg tctctgcctc ctcaagccca tcaaaggcct 8820
ttgcctcact gactacagct cccccaactt gggggatccc acagtctacc ttgacatttg 8880
agttttctga ggtcccaagt ttggatacta agtccgcttc tttaccaact cctggacagt 8940
ccctgaacac cattccagac tcagatgcaa gcacagcatc ttcctcactg tccaagtctc 9000
cagaaaaaaa cccaagggca aggatgatga cttccacaaa ggccataagt gcaagctcat 9060
ttcaatcaac aggttttact gaaacccctg agggatctgc ctccccttct atggcagggc 9120
atgaacccag agtccccact tcaggaacag gggaccctag atatgcctca gagagcatgt 9180
cttatccaga cccaagcaag gcatcatcag ctatgacatc gacctctctt gcatcaaaac 9240
tcacaactct cttcagcaca ggtcaagcag caaggtctgg ttctagttcc tctcccataa 9300
gcctatccac tgagaaagaa acaagcttcc tttcccccac tgcatccacc tccagaaaga 9360
cttcactatt tcttgggcct tccatggcaa ggcagcccaa catattggtg catcttcaga 9420
cttcagctct gacactttct ccaacatcca ctctaaatat gtcccaggag gagcctcctg 9480
agttaacctc aagccagacc attgcagaag aagagggaac aacagctgaa acacagacgt 9540
taaccttcac accatctgag accccaacat ccttgttacc tgtctcttct cccacagaac 9600
ccacagccag aagaaagagt tctccagaaa catgggcaag ctctatttca gttcctgcca 9660
agacctcctt ggttgaaaca actgatggaa cgctagtgac caccataaag atgtcaagcc 9720
aggcagcaca aggaaattcc acgtggcctg ccccagcaga ggagacgggg agcagtccag 9780
caggcacatc cccaggaagc ccagaaatgt ctaccactct caaaatcatg agctccaagg 9840
aacccagcat cagcccagag atcaggtcca ctgtgagaaa ttctccttgg aagactccag 9900
aaacaactgt tcccatggag accacagtgg aaccagtcac ccttcagtcc acagccctag 9960
gaagtggcag caccagcatc tctcacctgc ccacaggaac cacatcacca accaagtcac 10020
caacagaaaa tatgttggct acagaaaggg tctccctctc cccatcccca cctgaggctt 10080
ggaccaacct ttattctgga actccaggag ggaccaggca gtcactggcc acaatgtcct 10140
ctgtctccct agagtcacca actgctagaa gcatcacagg gactggtcag caaagcagtc 10200
cagaactggt ttcaaagaca actggaatgg aattctctat gtggcatggc tctactggag 10260
ggaccacagg ggacacacat gtctctctga gcacatcttc caatatcctt gaagaccctg 10320
taaccagccc aaactctgtg agctcattga cagataaatc caaacataaa accgagacat 10380
gggtaagcac cacagccatt ccctccactg tcctgaataa taagataatg gcagctgaac 10440
aacagacaag tcgatctgtg gatgaggctt attcatcaac tagttcttgg tcagatcaga 10500
catctgggag tgacatcacc cttggtgcat ctcctgatgt cacaaacaca ttatacatca 10560
cctccacagc acaaaccacc tcactagtgt ctctgccctc tggagaccaa ggcattacaa 10620
gcctcaccaa tccctcagga ggaaaaacaa gctctgcgtc atctgtcaca tctccttcaa 10680
tagggcttga gactctgagg gccaatgtaa gtgcagtgaa aagtgacatt gcccctactg 10740
ctgggcatct atctcagact tcatctcctg cggaagtgag catcctggac gtaaccacag 10800
ctcctactcc aggtatctcc accaccatca ccaccatggg aaccaactca atctcaacta 10860
ccacacccaa cccagaagtg ggtatgagta ccatggacag caccccggcc acagagaggc 10920
gcacaacttc tacagaacac ccttccacct ggtcttccac agctgcatca gattcctgga 10980
ctgtcacaga catgacttca aacttgaaag ttgcaagatc tcctggaaca atttccacaa 11040
tgcatacaac ttcattctta gcctcaagca ctgaattaga ctccatgtct actccccatg 11100
gccgtataac tgtcattgga accagcctgg tcactccatc ctctgatgct tcagctgtaa 11160
agacagagac cagtacaagt gaaagaacat tgagtccttc agacacaact gcatctactc 11220
ccatctcaac tttttctcgt gtccagagga tgagcatctc agttcctgac attttaagta 11280
caagttggac tcccagtagt acagaagcag aagatgtgcc tgtttcaatg gtttctacag 11340
atcatgctag tacaaagact gacccaaata cgcccctgtc cacttttctg tttgattctc 11400
tgtccactct tgactgggac actgggagat ctctgtcatc agccacagcc actacctcag 11460
ctcctcaggg ggccacaact ccccaggaac tcactttgga aaccatgatc agcccagcta 11520
cctcacagtt gcccttctct atagggcaca ttacaagtgc agtcacacca gctgcaatgg 11580
caaggagctc tggagttact ttttcaagac cagatcccac aagcaaaaag gcagagcaga 11640
cttccactca gcttcccacc accacttctg cacatccagg gcaggtgccc agatcagcag 11700
caacaactct ggatgtgatc ccacacacag caaaaactcc agatgcaact tttcagagac 11760
aagggcagac agctcttaca acagaggcaa gagctacatc tgactcctgg aatgagaaag 11820
aaaaatcaac cccaagtgca ccttggatca ctgagatgat gaattctgtc tcagaagata 11880
ccatcaagga ggttaccagc tcctccagtg tattaaggac cctgaatacg ctggacataa 11940
acttggaatc tgggacgact tcatccccaa gttggaaaag cagcccatat gagagaattg 12000
ccccttctga gtccaccaca gacaaagagg caattcaccc ttctacaaac acagtagaga 12060
ccacaggctg ggtcacaagt tccgaacatg cttctcattc cactatccca gcccactcag 12120
cgtcatccaa actcacatct ccagtggtta caacctccac cagggaacaa gcaatagttt 12180
ctatgtcaac aaccacatgg ccagagtcta caagggctag aacagagcct aattccttct 12240
tgactattga actgagggac gtcagccctt acatggacac cagctcaacc acacaaacaa 12300
gtattatctc ttccccaggt tccactgcga tcaccaaggg gcctagaaca gaaattacct 12360
cctctaagag aatatccagc tcattccttg cccagtctat gaggtcgtca gacagcccct 12420
cagaagccat caccaggctg tctaactttc ctgccatgac agaatctgga ggaatgatcc 12480
ttgctatgca aacaagtcca cctggcgcta catcactaag tgcacctact ttggatacat 12540
cagccacagc ctcctggaca gggactccac tggctacgac tcagagattt acatactcag 12600
agaagaccac tctctttagc aaaggtcctg aggatacatc acagccaagc cctccctctg 12660
tggaagaaac cagctcttcc tcttccctgg tacctatcca tgctacaacc tcgccttcca 12720
atattttgtt gacatcacaa gggcacagtc cctcctctac tccacctgtg acctcagttt 12780
tcttgtctga gacctctggc ctggggaaga ccacagacat gtcgaggata agcttggaac 12840
ctggcacaag tttacctccc aatttgagca gtacagcagg tgaggcgtta tccacttatg 12900
aagcctccag agatacaaag gcaattcatc attctgcaga cacagcagtg acgaatatgg 12960
aggcaaccag ttctgaatat tctcctatcc caggccatac aaagccatcc aaagccacat 13020
ctccattggt tacctcccac atcatggggg acatcacttc ttccacatca gtatttggct 13080
cctccgagac cacagagatt gagacagtgt cctctgtgaa ccagggactt caggagagaa 13140
gcacatccca ggtggccagc tctgctacag agacaagcac tgtcattacc catgtgtcta 13200
gtggtgatgc tactactcat gtcaccaaga cacaagccac tttctctagc ggaacatcca 13260
tctcaagccc tcatcagttt ataacttcta ccaacacatt tacagatgtg agcaccaacc 13320
cctccacctc tctgataatg acagaatctt caggagtgac catcaccacc caaacaggtc 13380
ctactggagc tgcaacacag ggtccatatc tcttggacac atcaaccatg ccttacttga 13440
cagagactcc attagctgtg actccagatt ttatgcaatc agagaagacc actctcataa 13500
gcaaaggtcc caaggatgtg tcctggacaa gccctccctc tgtggcagaa accagctatc 13560
cctcttccct gacacctttc ttggtcacaa ccatacctcc tgccacttcc acgttacaag 13620
ggcaacatac atcctctcct gtttctgcga cttcagttct tacctctgga ctggtgaaga 13680
ccacagatat gttgaacaca agcatggaac ctgtgaccaa ttcacctcaa aatttgaaca 13740
atccatcaaa tgagatactg gccactttgg cagccaccac agatatagag actattcatc 13800
cttccataaa caaagcagtg accaatatgg ggactgccag ttcagcacat gtactgcatt 13860
ccactctccc agtcagctca gaaccatcta cagccacatc tccaatggtt cctgcctcca 13920
gcatggggga cgctcttgct tctatatcaa tacctggttc tgagaccaca gacattgagg 13980
gagagccaac atcctccctg actgctggac gaaaagagaa cagcaccctc caggagatga 14040
actcaactac agagtcaaac atcatcctct ccaatgtgtc tgtgggggct attactgaag 14100
ccacaaaaat ggaagtcccc tcttttgatg caacattcat accaactcct gctcagtcaa 14160
caaagttccc agatattttc tcagtagcca gcagtagact ttcaaactct cctcccatga 14220
caatatctac ccacatgacc accacccaga cagggtcttc tggagctaca tcaaagattc 14280
cacttgcctt agacacatca accttggaaa cctcagcagg gactccatca gtggtgactg 14340
aggggtttgc ccactcaaaa ataaccactg caatgaacaa tgatgtcaag gacgtgtcac 14400
agacaaaccc tccctttcag gatgaagcca gctctccctc ttctcaagca cctgtccttg 14460
tcacaacctt accttcttct gttgctttca caccgcaatg gcacagtacc tcctctcctg 14520
tttctatgtc ctcagttctt acttcttcac tggtaaagac cgcaggcaag gtggatacaa 14580
gcttagaaac agtgaccagt tcacctcaaa gtatgagcaa cactttggat gacatatcgg 14640
tcacttcagc agccaccaca gatatagaga caacgcatcc ttccataaac acagtagtta 14700
ccaatgtggg gaccaccggt tcagcatttg aatcacattc tactgtctca gcttacccag 14760
agccatctaa agtcacatct ccaaatgtta ccacctccac catggaagac accacaattt 14820
ccagatcaat acctaaatcc tctaagacta caagaactga gactgagaca acttcctccc 14880
tgactcctaa actgagggag accagcatct cccaggagat cacctcgtcc acagagacaa 14940
gcactgttcc ttacaaagag ctcactggtg ccactaccga ggtatccagg acagatgtca 15000
cttcctctag cagtacatcc ttccctggcc ctgatcagtc cacagtgtca ctagacatct 15060
ccacagaaac caacaccagg ctgtctacct ccccaataat gacagaatct gcagaaataa 15120
ccatcaccac ccaaacaggt cctcatgggg ctacatcaca ggatactttt accatggacc 15180
catcaaatac aaccccccag gcagggatcc actcagctat gactcatgga ttttcacaat 15240
tggatgtgac cactcttatg agcagaattc cacaggatgt atcatggaca agtcctccct 15300
ctgtggataa aaccagctcc ccctcttcct ttctgtcctc acctgcaatg accacacctt 15360
ccctgatttc ttctacctta ccagaggata agctctcctc tcctatgact tcacttctca 15420
cctctggcct agtgaagatt acagacatat tacgtacacg cttggaacct gtgaccagct 15480
cacttccaaa tttcagcagc acctcagata agatactggc cacttctaaa gacagtaaag 15540
acacaaagga aatttttcct tctataaaca cagaagagac caatgtgaaa gccaacaact 15600
ctggacatga atcccattcc cctgcactgg ctgactcaga gacacccaaa gccacaactc 15660
aaatggttat caccaccact gtgggagatc cagctccttc cacatcaatg ccagtgcatg 15720
gttcctctga gactacaaac attaagagag agccaacata tttcttgact cctagactga 15780
gagagaccag tacctctcag gagtccagct ttcccacgga cacaagtttt ctactttcca 15840
aagtccccac tggtactatt actgaggtct ccagtacagg ggtcaactct tctagcaaaa 15900
tttccacccc agaccatgat aagtccacag tgccacctga caccttcaca ggagagatcc 15960
ccagggtctt cacctcctct attaagacaa aatctgcaga aatgacgatc accacccaag 16020
caagtcctcc tgagtctgca tcgcacagta cccttccctt ggacacatca accacacttt 16080
cccagggagg gactcattca actgtgactc agggattccc atactcagag gtgaccactc 16140
tcatgggcat gggtcctggg aatgtgtcat ggatgacaac tccccctgtg gaagaaacca 16200
gctctgtgtc ttccctgatg tcttcacctg ccatgacatc cccttctcct gtttcctcca 16260
catcaccaca gagcatcccc tcctctcctc ttcctgtgac tgcacttcct acttctgttc 16320
tggtgacaac cacagatgtg ttgggcacaa caagcccaga gtctgtaacc agttcacctc 16380
caaatttgag cagcatcact catgagagac cggccactta caaagacact gcacacacag 16440
aagccgccat gcatcattcc acaaacaccg cagtgaccaa tgtagggact tccgggtctg 16500
gacataaatc acaatcctct gtcctagctg actcagagac atcgaaagcc acacctctga 16560
tgagtaccac ctccaccctg ggggacacaa gtgtttccac atcaactcct aatatctctc 16620
agactaacca aattcaaaca gagccaacag catccctgag ccctagactg agggagagca 16680
gcacgtctga gaagaccagc tcaacaacag agacaaatac tgccttttct tatgtgccca 16740
caggtgctat tactcaggcc tccagaacag aaatctcctc tagcagaaca tccatctcag 16800
accttgatcg gcccacaata gcacccgaca tctccacagg aatgatcacc aggctcttca 16860
cctcccccat catgacaaaa tctgcagaaa tgaccgtcac cactcaaaca actactcctg 16920
gggctacatc acagggtatc cttccctggg acacatcaac cacacttttc cagggaggga 16980
ctcattcaac cgtgtctcag ggattcccac actcagagat aaccactctt cggagcagaa 17040
cccctggaga tgtgtcatgg atgacaactc cccctgtgga agaaaccagc tctgggtttt 17100
ccctgatgtc accttccatg acatcccctt ctcctgtttc ctccacatca ccagagagca 17160
tcccctcctc tcctctccct gtgactgcac ttcttacttc tgttctggtg acaaccacaa 17220
atgtattggg cacaacaagc ccagagcccg taacgagttc acctccaaat ttaagcagcc 17280
ccacacagga gagactgacc acttacaaag acactgcgca cacagaagcc atgcatgctt 17340
ccatgcatac aaacactgca gtggccaacg tggggacctc catttctgga catgaatcac 17400
aatcttctgt cccagctgat tcacacacat ccaaagccac atctccaatg ggtatcacct 17460
tcgccatggg ggatacaagt gtttctacat caactcctgc cttctttgag actagaattc 17520
agactgaatc aacatcctct ttgattcctg gattaaggga caccaggacg tctgaggaga 17580
tcaacactgt gacagagacc agcactgtcc tttcagaagt gcccactact actactactg 17640
aggtctccag gacagaagtt atcacttcca gcagaacaac catctcaggg cctgatcatt 17700
ccaaaatgtc accctacatc tccacagaaa ccatcaccag gctctccact tttccttttg 17760
taacaggatc cacagaaatg gccatcacca accaaacagg tcctataggg actatctcac 17820
aggctaccct taccctggac acatcaagca cagcttcctg ggaagggact cactcacctg 17880
tgactcagag atttccacac tcagaggaga ccactactat gagcagaagt actaagggcg 17940
tgtcatggca aagccctccc tctgtggaag aaaccagttc tccttcttcc ccagtgcctt 18000
tacctgcaat aacctcacat tcatctcttt attccgcagt atcaggaagt agccccactt 18060
ctgctctccc tgtgacttcc cttctcacct ctggcaggag gaagaccata gacatgttgg 18120
acacacactc agaacttgtg accagctcct taccaagtgc aagtagcttc tcaggtgaga 18180
tactcacttc tgaagcctcc acaaatacag agacaattca cttttcagag aacacagcag 18240
aaaccaatat ggggaccacc aattctatgc ataaactaca ttcctctgtc tcaatccact 18300
cccagccatc cggacacaca cctccaaagg ttactggatc tatgatggag gacgctattg 18360
tttccacatc aacacctggt tctcctgaga ctaaaaatgt tgacagagac tcaacatccc 18420
ctctgactcc tgaactgaaa gaggacagca ccgccctggt gatgaactca actacagagt 18480
caaacactgt tttctccagt gtgtccctgg atgctgctac tgaggtctcc agggcagaag 18540
tcacctacta tgatcctaca ttcatgccag cttctgctca gtcaacaaag tccccagaca 18600
tttcacctga agccagcagc agtcattcta actctcctcc cttgacaata tctacacaca 18660
agaccatcgc cacacaaaca ggtccttctg gggtgacatc tcttggccaa ctgaccctgg 18720
acacatcaac catagccacc tcagcaggaa ctccatcagc cagaactcag gattttgtag 18780
attcagaaac aaccagtgtc atgaacaatg atctcaatga tgtgttgaag acaagccctt 18840
tctctgcaga agaagccaac tctctctctt ctcaggcacc tctccttgtg acaacctcac 18900
cttctcctgt aacttccaca ttgcaagagc acagtacctc ctctcttgtt tctgtgacct 18960
cagtacccac ccctacactg gcgaagatca cagacatgga cacaaactta gaacctgtga 19020
ctcgttcacc tcaaaattta aggaacacct tggccacttc agaagccacc acagatacac 19080
acacaatgca tccttctata aacacagcag tggccaatgt ggggaccacc agttcaccaa 19140
atgaattcta ttttactgtc tcacctgact cagacccata taaagccaca tccgcagtag 19200
ttatcacttc cacctcgggg gactcaatag tttccacatc aatgcctaga tcctctgcga 19260
tgaaaaagat tgagtctgag acaactttct ccctgatatt tagactgagg gagactagca 19320
cctcccagaa aattggctca tcctcagaca caagcacggt ctttgacaaa gcattcactg 19380
ctgctactac tgaggtctcc agaacagaac tcacctcctc tagcagaaca tccatccaag 19440
gcactgaaaa gcccacaatg tcaccggaca cctccacaag atctgtcacc atgctttcta 19500
cttttgctgg cctgacaaaa tccgaagaaa ggaccattgc cacccaaaca ggtcctcata 19560
gggcgacatc acagggtacc cttacctggg acacatcaat cacaacctca caggcaggga 19620
cccactcagc tatgactcat ggattttcac aattagattt gtccactctt acgagtagag 19680
ttcctgagta catatcaggg acaagcccac cctctgtgga aaaaaccagc tcttcctctt 19740
cccttctgtc tttaccagca ataacctcac cgtcccctgt acctactaca ttaccagaaa 19800
gtaggccgtc ttctcctgtt catctgactt cactccccac ctctggccta gtgaagacca 19860
cagatatgct ggcatctgtg gccagtttac ctccaaactt gggcagcacc tcacataaga 19920
taccgactac ttcagaagac attaaagata cagagaaaat gtatccttcc acaaacatag 19980
cagtaaccaa tgtggggacc accacttctg aaaaggaatc ttattcgtct gtcccagcct 20040
actcagaacc acccaaagtc acctctccaa tggttacctc tttcaacata agggacacca 20100
ttgtttccac atccatgcct ggctcctctg agattacaag gattgagatg gagtcaacat 20160
tctccctggc tcatgggctg aagggaacca gcacctccca ggaccccatc gtatccacag 20220
agaaaagtgc tgtccttcac aagttgacca ctggtgctac tgagacctct aggacagaag 20280
ttgcctcttc tagaagaaca tccattccag gccctgatca ttccacagag tcaccagaca 20340
tctccactga agtgatcccc agcctgccta tctcccttgg cattacagaa tcttcaaata 20400
tgaccatcat cactcgaaca ggtcctcctc ttggctctac atcacagggc acatttacct 20460
tggacacacc aactacatcc tccagggcag gaacacactc gatggcgact caggaatttc 20520
cacactcaga aatgaccact gtcatgaaca aggaccctga gattctatca tggacaatcc 20580
ctccttctat agagaaaacc agcttctcct cttccctgat gccttcacca gccatgactt 20640
cacctcctgt ttcctcaaca ttaccaaaga ccattcacac cactccttct cctatgacct 20700
cactgctcac ccctagccta gtgatgacca cagacacatt gggcacaagc ccagaaccta 20760
caaccagttc acctccaaat ttgagcagta cctcacatga gatactgaca acagatgaag 20820
acaccacagc tatagaagcc atgcatcctt ccacaagcac agcagcgact aatgtggaaa 20880
ccaccagttc tggacatggg tcacaatcct ctgtcctagc tgactcagaa aaaaccaagg 20940
ccacagctcc aatggatacc acctccacca tggggcatac aactgtttcc acatcaatgt 21000
ctgtttcctc tgagactaca aaaattaaga gagagtcaac atattccttg actcctggac 21060
tgagagagac cagcatttcc caaaatgcca gcttttccac tgacacaagt attgttcttt 21120
cagaagtccc cactggtact actgctgagg tctccaggac agaagtcacc tcctctggta 21180
gaacatccat ccctggccct tctcagtcca cagttttgcc agaaatatcc acaagaacaa 21240
tgacaaggct ctttgcctcg cccaccatga cagaatcagc agaaatgacc atccccactc 21300
aaacaggtcc ttctgggtct acctcacagg atacccttac cttggacaca tccaccacaa 21360
agtcccaggc aaagactcat tcaactttga ctcagagatt tccacactca gagatgacca 21420
ctctcatgag cagaggtcct ggagatatgt catggcaaag ctctccctct ctggaaaatc 21480
ccagctctct cccttccctg ctgtctttac ctgccacaac ctcacctcct cccatttcct 21540
ccacattacc agtgactatc tcctcctctc ctcttcctgt gacttcactt ctcacctcta 21600
gcccggtaac gaccacagac atgttacaca caagcccaga acttgtaacc agttcacctc 21660
caaagctgag ccacacttca gatgagagac tgaccactgg caaggacacc acaaatacag 21720
aagctgtgca tccttccaca aacacagcag cgtccaatgt ggagattccc agctctggac 21780
atgaatcccc ttcctctgcc ttagctgact cagagacatc caaagccaca tcaccaatgt 21840
ttattacctc cacccaggag gatacaactg ttgccatatc aacccctcac ttcttggaga 21900
ctagcagaat tcagaaagag tcaatttcct ccctgagccc taaattgagg gagacaggca 21960
gttctgtgga gacaagctca gccatagaga caagtgctgt cctttctgaa gtgtccattg 22020
gtgctactac tgagatctcc aggacagaag tcacctcctc tagcagaaca tccatctctg 22080
gttctgctga gtccacaatg ttgccagaaa tatccaccac aagaaaaatc attaagttcc 22140
ctacttcccc catcctggca gaatcatcag aaatgaccat caagacccaa acaagtcctc 22200
ctgggtctac atcagagagt acctttacat tagacacatc aaccactccc tccttggtaa 22260
taacccattc gactatgact cagagattgc cacactcaga gataaccact cttgtgagta 22320
gaggtgctgg ggatgtgcca cggcccagct ctctccctgt ggaagaaaca agccctccat 22380
cttcccagct gtctttatct gccatgatct caccttctcc tgtttcttcc acattaccag 22440
caagtagcca ctcctcttct gcttctgtga cttcacttct cacaccaggc caagtgaaga 22500
ctactgaggt gttggacgca agtgcagaac ctgaaaccag ttcacctcca agtttgagca 22560
gcacctcagt tgaaatactg gccacctctg aagtcaccac agatacggag aaaattcatc 22620
ctttctcaaa cacggcagta accaaagttg gaacttccag ttctggacat gaatcccctt 22680
cctctgtcct acctgactca gagacaacca aagccacatc ggcaatgggt accatctcca 22740
ttatggggga tacaagtgtt tctacattaa ctcctgcctt atctaacact aggaaaattc 22800
agtcagagcc agcttcctca ctgaccacca gattgaggga gaccagcacc tctgaagaga 22860
ccagcttagc cacagaagca aacactgttc tttctaaagt gtccactggt gctactactg 22920
aggtctccag gacagaagcc atctccttta gcagaacatc catgtcaggc cctgagcagt 22980
ccacaatgtc acaagacatc tccataggaa ccatccccag gatttctgcc tcctctgtcc 23040
tgacagaatc tgcaaaaatg accatcacaa cccaaacagg tccttcggag tctacactag 23100
aaagtaccct taatttgaac acagcaacca caccctcttg ggtggaaacc cactctatag 23160
taattcaggg atttccacac ccagagatga ccacttccat gggcagaggt cctggaggtg 23220
tgtcatggcc tagccctccc tttgtgaaag aaaccagccc tccatcctcc ccgctgtctt 23280
tacctgccgt gacctcacct catcctgttt ccaccacatt cctagcacat atccccccct 23340
ctccccttcc tgtgacttca cttctcacct ctggcccggc gacaaccaca gatatcttgg 23400
gtacaagcac agaacctgga accagttcat cttcaagttt gagcaccacc tcccatgaga 23460
gactgaccac ttacaaagac actgcacata cagaagccgt gcatccttcc acaaacacag 23520
gagggaccaa tgtggcaacc accagctctg gatataaatc acagtcctct gtcctagctg 23580
actcatctcc aatgtgtacc acctccacca tgggggatac aagtgttctc acatcaactc 23640
ctgccttcct tgagactagg aggattcaga cagagctagc ttcctccctg acccctggat 23700
tgagggagtc cagcggctct gaagggacca gctcaggcac caagatgagc actgtcctct 23760
ctaaagtgcc cactggtgct actactgaga tctccaagga agacgtcacc tccatcccag 23820
gtcccgctca atccacaata tcaccagaca tctccacaag aaccgtcagc tggttctcta 23880
catcccctgt catgacagaa tcagcagaaa taaccatgaa cacccataca agtcctttag 23940
gggccacaac acaaggcacc agtactttgg acacgtcaag cacaacctct ttgacaatga 24000
cacactcaac tatatctcaa ggattttcac actcacagat gagcactctt atgaggaggg 24060
gtcctgagga tgtatcatgg atgagccctc cccttctgga aaaaactaga ccttcctttt 24120
ctctgatgtc ttcaccagcc acaacttcac cttctcctgt ttcctccaca ttaccagaga 24180
gcatctcttc ctctcctctt cctgtgactt cactcctcac gtctggcttg gcaaaaacta 24240
cagatatgtt gcacaaaagc tcagaacctg taaccaactc acctgcaaat ttgagcagca 24300
cctcagttga aatactggcc acctctgaag tcaccacaga tacagagaaa actcatcctt 24360
cttcaaacag aacagtgacc gatgtgggga cctccagttc tggacatgaa tccacttcct 24420
ttgtcctagc tgactcacag acatccaaag tcacatctcc aatggttatt acctccacca 24480
tggaggatac gagtgtctcc acatcaactc ctggcttttt tgagactagc agaattcaga 24540
cagaaccaac atcctccctg acccttggac tgagaaagac cagcagctct gaggggacca 24600
gcttagccac agagatgagc actgtccttt ctggagtgcc cactggtgcc actgctgaag 24660
tctccaggac agaagtcacc tcctctagca gaacatccat ctcaggcttt gctcagctca 24720
cagtgtcacc agagacttcc acagaaacca tcaccagact ccctacctcc agcataatga 24780
cagaatcagc agaaatgatg atcaagacac aaacagatcc tcctgggtct acaccagaga 24840
gtactcatac tgtggacata tcaacaacac ccaactgggt agaaacccac tcgactgtga 24900
ctcagagatt ttcacactca gagatgacca ctcttgtgag cagaagccct ggtgatatgt 24960
tatggcctag tcaatcctct gtggaagaaa ccagctctgc ctcttccctg ctgtctctgc 25020
ctgccacgac ctcaccttct cctgtttcct ctacattagt agaggatttc ccttccgctt 25080
ctcttcctgt gacttctctt ctcaaccctg gcctggtgat aaccacagac aggatgggca 25140
taagcagaga acctggaacc agttccactt caaatttgag cagcacctcc catgagagac 25200
tgaccacttt ggaagacact gtagatacag aagacatgca gccttccaca cacacagcag 25260
tgaccaacgt gaggacctcc atttctggac atgaatcaca atcttctgtc ctatctgact 25320
cagagacacc caaagccaca tctccaatgg gtaccaccta caccatgggg gaaacgagtg 25380
tttccatatc cacttctgac ttctttgaga ccagcagaat tcagatagaa ccaacatcct 25440
ccctgacttc tggattgagg gagaccagca gctctgagag gatcagctca gccacagagg 25500
gaagcactgt cctttctgaa gtgcccagtg gtgctaccac tgaggtctcc aggacagaag 25560
tgatatcctc taggggaaca tccatgtcag ggcctgatca gttcaccata tcaccagaca 25620
tctctactga agcgatcacc aggctttcta cttcccccat tatgacagaa tcagcagaaa 25680
gtgccatcac tattgagaca ggttctcctg gggctacatc agagggtacc ctcaccttgg 25740
acacctcaac aacaaccttt tggtcaggga cccactcaac tgcatctcca ggattttcac 25800
actcagagat gaccactctt atgagtagaa ctcctggaga tgtgccatgg ccgagccttc 25860
cctctgtgga agaagccagc tctgtctctt cctcactgtc ttcacctgcc atgacctcaa 25920
cttctttttt ctccacatta ccagagagca tctcctcctc tcctcatcct gtgactgcac 25980
ttctcaccct tggcccagtg aagaccacag acatgttgcg cacaagctca gaacctgaaa 26040
ccagttcacc tccaaatttg agcagcacct cagctgaaat attagccacg tctgaagtca 26100
ccaaagatag agagaaaatt catccctcct caaacacacc tgtagtcaat gtagggactg 26160
tgatttataa acatctatcc ccttcctctg ttttggctga cttagtgaca acaaaaccca 26220
catctccaat ggctaccacc tccactctgg ggaatacaag tgtttccaca tcaactcctg 26280
ccttcccaga aactatgatg acacagccaa cttcctccct gacttctgga ttaagggaga 26340
tcagtacctc tcaagagacc agctcagcaa cagagagaag tgcttctctt tctggaatgc 26400
ccactggtgc tactactaag gtctccagaa cagaagccct ctccttaggc agaacatcca 26460
ccccaggtcc tgctcaatcc acaatatcac cagaaatctc cacggaaacc atcactagaa 26520
tttctactcc cctcaccacg acaggatcag cagaaatgac catcaccccc aaaacaggtc 26580
attctggggc atcctcacaa ggtaccttta ccttggacac atcaagcaga gcctcctggc 26640
caggaactca ctcagctgca actcacagat ctccacactc agggatgacc actcctatga 26700
gcagaggtcc tgaggatgtg tcatggccaa gccgcccatc agtggaaaaa actagccctc 26760
catcttccct ggtgtcttta tctgcagtaa cctcaccttc gccactttat tccacaccat 26820
ctgagagtag ccactcatct cctctccggg tgacttctct tttcacccct gtcatgatga 26880
agaccacaga catgttggac acaagcttgg aacctgtgac cacttcacct cccagtatga 26940
atatcacctc agatgagagt ctggccactt ctaaagccac catggagaca gaggcaattc 27000
agctttcaga aaacacagct gtgactcaga tgggcaccat cagcgctaga caagaattct 27060
attcctctta tccaggcctc ccagagccat ccaaagtgac atctccagtg gtcacctctt 27120
ccaccataaa agacattgtt tctacaacca tacctgcttc ctctgagata acaagaattg 27180
agatggagtc aacatccacc ctgaccccca caccaaggga gaccagcacc tcccaggaga 27240
tccactcagc cacaaagcca agcactgttc cttacaaggc actcactagt gccacgattg 27300
aggactccat gacacaagtc atgtcctcta gcagaggacc tagccctgat cagtccacaa 27360
tgtcacaaga catatccact gaagtgatca ccaggctctc tacctccccc atcaagacag 27420
aatctacaga aatgaccatt accacccaaa caggttctcc tggggctaca tcaaggggta 27480
cccttacctt ggacacttca acaactttta tgtcagggac ccactcaact gcatctcaag 27540
gattttcaca ctcacagatg accgctctta tgagtagaac tcctggagat gtgccatggc 27600
taagccatcc ctctgtggaa gaagccagct ctgcctcttt ctcactgtct tcacctgtca 27660
tgacctcatc ttctcccgtt tcttccacat taccagacag catccactct tcttcgcttc 27720
ctgtgacatc acttctcacc tcagggctgg tgaagaccac agagctgttg ggcacaagct 27780
cagaacctga aaccagttca cccccaaatt tgagcagcac ctcagctgaa atactggcca 27840
tcactgaagt cactacagat acagagaaac tggagatgac caatgtggta acctcaggtt 27900
atacacatga atctccttcc tctgtcctag ctgactcagt gacaacaaag gccacatctt 27960
caatgggtat cacctacccc acaggagata caaatgttct cacatcaacc cctgccttct 28020
ctgacaccag taggattcaa acaaagtcaa agctctcact gactcctggg ttgatggaga 28080
ccagcatctc tgaagagacc agctctgcca cagaaaaaag cactgtcctt tctagtgtgc 28140
ccactggtgc tactactgag gtctccagga cagaagccat ctcttctagc agaacatcca 28200
tcccaggccc tgctcaatcc acaatgtcat cagacacctc catggaaacc atcactagaa 28260
tttctacccc cctcacaagg aaagaatcaa cagacatggc catcaccccc aaaacaggtc 28320
cttctggggc tacctcgcag ggtaccttta ccttggactc atcaagcaca gcctcctggc 28380
caggaactca ctcagctaca actcagagat ttccacagtc agtggtgaca actcctatga 28440
gcagaggtcc tgaggatgtg tcatggccaa gcccgctgtc tgtggaaaaa aacagccctc 28500
catcttccct ggtatcttca tcttcagtaa cctcaccttc gccactttat tccacaccat 28560
ctgggagtag ccactcctct cctgtccctg tcacttctct tttcacctct atcatgatga 28620
aggccacaga catgttggat gcaagtttgg aacctgagac cacttcagct cccaatatga 28680
atatcacctc agatgagagt ctggccgctt ctaaagccac cacggagaca gaggcaattc 28740
acgtttttga aaatacagca gcgtcccatg tggaaaccac cagtgctaca gaggaactct 28800
attcctcttc cccaggcttc tcagagccaa caaaagtgat atctccagtg gtcacctctt 28860
cctctataag agacaacatg gtttccacaa caatgcctgg ctcctctggc attacaagga 28920
ttgagataga gtcaatgtca tctctgaccc ctggactgag ggagaccaga acctcccagg 28980
acatcacctc atccacagag acaagcactg tcctttacaa gatgccctct ggtgccactc 29040
ctgaggtctc caggacagaa gttatgccct ctagcagaac atccattcct ggccctgctc 29100
agtccacaat gtcactagac atctccgatg aagttgtcac caggctgtct acctctccca 29160
tcatgacaga atctgcagaa ataaccatca ccacccaaac aggttattct ctggctacat 29220
cccaggttac ccttcccttg ggcacctcaa tgaccttttt gtcagggacc cactcaacta 29280
tgtctcaagg actttcacac tcagagatga ccaatcttat gagcaggggt cctgaaagtc 29340
tgtcatggac gagccctcgc tttgtggaaa caactagatc ttcctcttct ctgacatcat 29400
tacctctcac gacctcactt tctcctgtgt cctccacatt actagacagt agcccctcct 29460
ctcctcttcc tgtgacttca cttatcctcc caggcctggt gaagactaca gaagtgttgg 29520
atacaagctc agagcctaaa accagttcat ctccaaattt gagcagcacc tcagttgaaa 29580
taccggccac ctctgaaatc atgacagata cagagaaaat tcatccttcc tcaaacacag 29640
cggtggccaa agtgaggacc tccagttctg ttcatgaatc tcattcctct gtcctagctg 29700
actcagaaac aaccataacc ataccttcaa tgggtatcac ctccgctgtg gacgatacca 29760
ctgttttcac atcaaatcct gccttctctg agactaggag gattccgaca gagccaacat 29820
tctcattgac tcctggattc agggagacta gcacctctga agagaccacc tcaatcacag 29880
aaacaagtgc agtcctttat ggagtgccca ctagtgctac tactgaagtc tccatgacag 29940
aaatcatgtc ctctaataga atacacatcc ctgactctga tcagtccacg atgtctccag 30000
acatcatcac tgaagtgatc accaggctct cttcctcatc catgatgtca gaatcaacac 30060
aaatgaccat caccacccaa aaaagttctc ctggggctac agcacagagt actcttacct 30120
tggccacaac aacagccccc ttggcaagga cccactcaac tgttcctcct agatttttac 30180
actcagagat gacaactctt atgagtagga gtcctgaaaa tccatcatgg aagagctctc 30240
tctttgtgga aaaaactagc tcttcatctt ctctgttgtc cttacctgtc acgacctcac 30300
cttctgtttc ttccacatta ccgcagagta tcccttcctc ctctttttct gtgacttcac 30360
tcctcacccc aggcatggtg aagactacag acacaagcac agaacctgga accagtttat 30420
ctccaaatct gagtggcacc tcagttgaaa tactggctgc ctctgaagtc accacagata 30480
cagagaaaat tcatccttct tcaagcatgg cagtgaccaa tgtgggaacc accagttctg 30540
gacatgaact atattcctct gtttcaatcc actcggagcc atccaaggct acatacccag 30600
tgggtactcc ctcttccatg gctgaaacct ctatttccac atcaatgcct gctaattttg 30660
agaccacagg atttgaggct gagccatttt ctcatttgac ttctggattt aggaagacaa 30720
acatgtccct ggacaccagc tcagtcacac caacaaatac accttcttct cctgggtcca 30780
ctcacctttt acagagttcc aagactgatt tcacctcttc tgcaaaaaca tcatccccag 30840
actggcctcc agcctcacag tatactgaaa ttccagtgga cataatcacc ccctttaatg 30900
cttctccatc tattacggag tccactggga taacctcctt cccagaatcc aggtttacta 30960
tgtctgtaac agaaagtact catcatctga gtacagattt gctgccttca gctgagacta 31020
tttccactgg cacagtgatg ccttctctat cagaggccat gacttcattt gccaccactg 31080
gagttccacg agccatctca ggttcaggta gtccattctc taggacagag tcaggccctg 31140
gggatgctac tctgtccacc attgcagaga gcctgccttc atccactcct gtgccattct 31200
cctcttcaac cttcactacc actgattctt caaccatccc agccctccat gagataactt 31260
cctcttcagc taccccatat agagtggaca ccagtcttgg gacagagagc agcactactg 31320
aaggacgctt ggttatggtc agtactttgg acacttcaag ccaaccaggc aggacatctt 31380
catcacccat tttggatacc agaatgacag agagcgttga gctgggaaca gtgacaagtg 31440
cttatcaagt tccttcactc tcaacacggt tgacaagaac tgatggcatt atggaacaca 31500
tcacaaaaat acccaatgaa gcagcacaca gaggtaccat aagaccagtc aaaggccctc 31560
agacatccac ttcgcctgcc agtcctaaag gactacacac aggagggaca aaaagaatgg 31620
agaccaccac cacagctctg aagaccacca ccacagctct gaagaccact tccagagcca 31680
ccttgaccac cagtgtctat actcccactt tgggaacact gactcccctc aatgcatcaa 31740
tgcaaatggc cagcacaatc cccacagaaa tgatgatcac aaccccatat gttttccctg 31800
atgttccaga aacgacatcc tcattggcta ccagcctggg agcagaaacc agcacagctc 31860
ttcccaggac aaccccatct gttttcaata gagaatcaga gaccacagcc tcactggtct 31920
ctcgttctgg ggcagagaga agtccggtta ttcaaactct agatgtttct tctagtgagc 31980
cagatacaac agcttcatgg gttatccatc ctgcagagac catcccaact gtttccaaga 32040
caacccccaa ttttttccac agtgaattag acactgtatc ttccacagcc accagtcatg 32100
gggcagacgt cagctcagcc attccaacaa atatctcacc tagtgaacta gatgcactga 32160
ccccactggt cactatttcg gggacagata ctagtacaac attcccaaca ctgactaagt 32220
ccccacatga aacagagaca agaaccacat ggctcactca tcctgcagag accagctcaa 32280
ctattcccag aacaatcccc aatttttctc atcatgaatc agatgccaca ccttcaatag 32340
ccaccagtcc tggggcagaa accagttcag ctattccaat tatgactgtc tcacctggtg 32400
cagaagatct ggtgacctca caggtcacta gttctgggac agacagaaat atgactattc 32460
caactttgac tctttctcct ggtgaaccaa agacgatagc ctcattagtc acccatcctg 32520
aagcacagac aagttcggcc attccaactt caactatctc gcctgctgta tcacggttgg 32580
tgacctcaat ggtcaccagt ttggcggcaa agacaagtac aactaatcga gctctgacaa 32640
actcccctgg tgaaccagct acaacagttt cattggtcac gcatcctgca cagaccagcc 32700
caacagttcc ctggacaact tccatttttt tccatagtaa atcagacacc acaccttcaa 32760
tgaccaccag tcatggggca gaatccagtt cagctgttcc aactccaact gtttcaactg 32820
aggtaccagg agtagtgacc cctttggtca ccagttctag ggcagtgatc agtacaacta 32880
ttccaattct gactctttct cctggtgaac cagagaccac accttcaatg gccaccagtc 32940
atggggaaga agccagttct gctattccaa ctccaactgt ttcacctggg gtaccaggag 33000
tggtgacctc tctggtcact agttctaggg cagtgactag tacaactatt ccaattctga 33060
ctttttctct tggtgaacca gagaccacac cttcaatggc caccagtcat gggacagaag 33120
ctggctcagc tgttccaact gttttacctg aggtaccagg aatggtgacc tctctggttg 33180
ctagttctag ggcagtaacc agtacaactc ttccaactct gactctttct cctggtgaac 33240
cagagaccac accttcaatg gccaccagtc atggggcaga agccagctca actgttccaa 33300
ctgtttcacc tgaggtacca ggagtggtga cctctctggt cactagttct agtggagtaa 33360
acagtacaag tattccaact ctgattcttt ctcctggtga actagaaacc acaccttcaa 33420
tggccaccag tcatggggca gaagccagct cagctgttcc aactccaact gtttcacctg 33480
gggtatcagg agtggtgacc cctctggtca ctagttccag ggcagtgacc agtacaacta 33540
ttccaattct aactctttct tctagtgagc cagagaccac accttcaatg gccaccagtc 33600
atggggtaga agccagctca gctgttctaa ctgtttcacc tgaggtacca ggaatggtga 33660
cctctctggt cactagttct agagcagtaa ccagtacaac tattccaact ctgactattt 33720
cttctgatga accagagacc acaacttcat tggtcaccca ttctgaggca aagatgattt 33780
cagccattcc aactttagct gtctccccta ctgtacaagg gctggtgact tcactggtca 33840
ctagttctgg gtcagagacc agtgcgtttt caaatctaac tgttgcctca agtcaaccag 33900
agaccataga ctcatgggtc gctcatcctg ggacagaagc aagttctgtt gttccaactt 33960
tgactgtctc cactggtgag ccgtttacaa atatctcatt ggtcacccat cctgcagaga 34020
gtagctcaac tcttcccagg acaacctcaa ggttttccca cagtgaatta gacactatgc 34080
cttctacagt caccagtcct gaggcagaat ccagctcagc catttcaaca actatttcac 34140
ctggtatacc aggtgtgctg acatcactgg tcactagctc tgggagagac atcagtgcaa 34200
cttttccaac agtgcctgag tccccacatg aatcagaggc aacagcctca tgggttactc 34260
atcctgcagt caccagcaca acagttccca ggacaacccc taattattct catagtgaac 34320
cagacaccac accatcaata gccaccagtc ctggggcaga agccacttca gattttccaa 34380
caataactgt ctcacctgat gtaccagata tggtaacctc acaggtcact agttctggga 34440
cagacaccag tataactatt ccaactctga ctctttcttc tggtgagcca gagaccacaa 34500
cctcatttat cacctattct gagacacaca caagttcagc cattccaact ctccctgtct 34560
cccctggtgc atcaaagatg ctgacctcac tggtcatcag ttctgggaca gacagcacta 34620
caactttccc aacactgacg gagaccccat atgaaccaga gacaacagcc atacagctca 34680
ttcatcctgc agagaccaac acaatggttc ccaggacaac tcccaagttt tcccatagta 34740
agtcagacac cacactccca gtagccatca ccagtcctgg gccagaagcc agttcagctg 34800
tttcaacgac aactatctca cctgatatgt cagatctggt gacctcactg gtccctagtt 34860
ctgggacaga caccagtaca accttcccaa cattgagtga gaccccatat gaaccagaga 34920
ctacagccac gtggctcact catcctgcag aaaccagcac aacggtttct gggacaattc 34980
ccaacttttc ccatagggga tcagacactg caccctcaat ggtcaccagt cctggagtag 35040
acacgaggtc aggtgttcca actacaacca tcccacccag tataccaggg gtagtgacct 35100
cacaggtcac tagttctgca acagacacta gtacagctat tccaactttg actccttctc 35160
ctggtgaacc agagaccaca gcctcatcag ctacccatcc tgggacacag actggcttca 35220
ctgttccaat tcggactgtt ccctctagtg agccagatac aatggcttcc tgggtcactc 35280
atcctccaca gaccagcaca cctgtttcca gaacaacctc cagtttttcc catagtagtc 35340
cagatgccac acctgtaatg gccaccagtc ctaggacaga agccagttca gctgtactga 35400
caacaatctc acctggtgca ccagagatgg tgacttcaca gatcactagt tctggggcag 35460
caaccagtac aactgttcca actttgactc attctcctgg tatgccagag accacagcct 35520
tattgagcac ccatcccaga acagagacaa gtaaaacatt tcctgcttca actgtgtttc 35580
ctcaagtatc agagaccaca gcctcactca ccattagacc tggtgcagag actagcacag 35640
ctctcccaac tcagacaaca tcctctctct tcaccctact tgtaactgga accagcagag 35700
ttgatctaag tccaactgct tcacctggtg tttctgcaaa aacagcccca ctttccaccc 35760
atccagggac agaaaccagc acaatgattc caacttcaac tctttccctt ggtttactag 35820
agactacagg cttactggcc accagctctt cagcagagac cagcacgagt actctaactc 35880
tgactgtttc ccctgctgtc tctgggcttt ccagtgcctc tataacaact gataagcccc 35940
aaactgtgac ctcctggaac acagaaacct caccatctgt aacttcagtt ggacccccag 36000
aattttccag gactgtcaca ggcaccacta tgaccttgat accatcagag atgccaacac 36060
cacctaaaac cagtcatgga gaaggagtga gtccaaccac tatcttgaga actacaatgg 36120
ttgaagccac taatttagct accacaggtt ccagtcccac tgtggccaag acaacaacca 36180
ccttcaatac actggctgga agcctcttta ctcctctgac cacacctggg atgtccacct 36240
tggcctctga gagtgtgacc tcaagaacaa gttataacca tcggtcctgg atctccacca 36300
ccagcagtta taaccgtcgg tactggaccc ctgccaccag cactccagtg acttctacat 36360
tctccccagg gatttccaca tcctccatcc ccagctccac agcagccaca gtcccattca 36420
tggtgccatt caccctcaac ttcaccatca ccaacctgca gtacgaggag gacatgcggc 36480
accctggttc caggaagttc aacgccacag agagagaact gcagggtctg ctcaaaccct 36540
tgttcaggaa tagcagtctg gaatacctct attcaggctg cagactagcc tcactcaggc 36600
cagagaagga tagctcagcc acggcagtgg atgccatctg cacacatcgc cctgaccctg 36660
aagacctcgg actggacaga gagcgactgt actgggagct gagcaatctg acaaatggca 36720
tccaggagct gggcccctac accctggacc ggaacagtct ctatgtcaat ggtttcaccc 36780
atcgaagctc tatgcccacc accagcactc ctgggacctc cacagtggat gtgggaacct 36840
cagggactcc atcctccagc cccagcccca cgactgctgg ccctctcctg atgccgttca 36900
ccctcaactt caccatcacc aacctgcagt acgaggagga catgcgtcgc actggctcca 36960
ggaagttcaa caccatggag agtgtcctgc agggtctgct caagcccttg ttcaagaaca 37020
ccagtgttgg ccctctgtac tctggctgca gattgacctt gctcaggccc gagaaagatg 37080
gggcagccac tggagtggat gccatctgca cccaccgcct tgaccccaaa agccctggac 37140
tcaacaggga gcagctgtac tgggagctaa gcaaactgac caatgacatt gaagagctgg 37200
gcccctacac cctggacagg aacagtctct atgtcaatgg tttcacccat cagagctctg 37260
tgtccaccac cagcactcct gggacctcca cagtggatct cagaacctca gggactccat 37320
cctccctctc cagccccaca attatggctg ctggccctct cctggtacca ttcaccctca 37380
acttcaccat caccaacctg cagtatgggg aggacatggg tcaccctggc tccaggaagt 37440
tcaacaccac agagagggtc ctgcagggtc tgcttggtcc catattcaag aacaccagtg 37500
ttggccctct gtactctggc tgcagactga cctctctcag gtctgagaag gatggagcag 37560
ccactggagt ggatgccatc tgcatccatc atcttgaccc caaaagccct ggactcaaca 37620
gagagcggct gtactgggag ctgagccaac tgaccaatgg catcaaagag ctgggcccct 37680
acaccctgga caggaacagt ctctatgtca atggtttcac ccatcggacc tctgtgccca 37740
ccagcagcac tcctgggacc tccacagtgg accttggaac ctcagggact ccattctccc 37800
tcccaagccc cgcaactgct ggccctctcc tggtgctgtt caccctcaac ttcaccatca 37860
ccaacctgaa gtatgaggag gacatgcatc gccctggctc caggaagttc aacaccactg 37920
agagggtcct gcagactctg cttggtccta tgttcaagaa caccagtgtt ggccttctgt 37980
actctggctg cagactgacc ttgctcaggt ccgagaagga tggagcagcc actggagtgg 38040
atgccatctg cacccaccgt cttgacccca aaagccctgg agtggacagg gagcagctat 38100
actgggagct gagccagctg accaatggca tcaaagagct gggcccctac accctggaca 38160
ggaacagtct ctatgtcaat ggtttcaccc attggatccc tgtgcccacc agcagcactc 38220
ctgggacctc cacagtggac cttgggtcag ggactccatc ctccctcccc agccccacaa 38280
ctgctggccc tctcctggtg ccgttcaccc tcaacttcac catcaccaac ctgaagtacg 38340
aggaggacat gcattgccct ggctccagga agttcaacac cacagagaga gtcctgcaga 38400
gtctgcttgg tcccatgttc aagaacacca gtgttggccc tctgtactct ggctgcagac 38460
tgaccttgct caggtccgag aaggatggag cagccactgg agtggatgcc atctgcaccc 38520
accgtcttga ccccaaaagc cctggagtgg acagggagca gctatactgg gagctgagcc 38580
agctgaccaa tggcatcaaa gagctgggtc cctacaccct ggacagaaac agtctctatg 38640
tcaatggttt cacccatcag acctctgcgc ccaacaccag cactcctggg acctccacag 38700
tggaccttgg gacctcaggg actccatcct ccctccccag ccctacatct gctggccctc 38760
tcctggtgcc attcaccctc aacttcacca tcaccaacct gcagtacgag gaggacatgc 38820
atcacccagg ctccaggaag ttcaacacca cggagcgggt cctgcagggt ctgcttggtc 38880
ccatgttcaa gaacaccagt gtcggccttc tgtactctgg ctgcagactg accttgctca 38940
ggcctgagaa gaatggggca gccactggaa tggatgccat ctgcagccac cgtcttgacc 39000
ccaaaagccc tggactcaac agagagcagc tgtactggga gctgagccag ctgacccatg 39060
gcatcaaaga gctgggcccc tacaccctgg acaggaacag tctctatgtc aatggtttca 39120
cccatcggag ctctgtggcc cccaccagca ctcctgggac ctccacagtg gaccttggga 39180
cctcagggac tccatcctcc ctccccagcc ccacaacagc tgttcctctc ctggtgccgt 39240
tcaccctcaa ctttaccatc accaatctgc agtatgggga ggacatgcgt caccctggct 39300
ccaggaagtt caacaccaca gagagggtcc tgcagggtct gcttggtccc ttgttcaaga 39360
actccagtgt cggccctctg tactctggct gcagactgat ctctctcagg tctgagaagg 39420
atggggcagc cactggagtg gatgccatct gcacccacca ccttaaccct caaagccctg 39480
gactggacag ggagcagctg tactggcagc tgagccagat gaccaatggc atcaaagagc 39540
tgggccccta caccctggac cggaacagtc tctacgtcaa tggtttcacc catcggagct 39600
ctgggctcac caccagcact ccttggactt ccacagttga ccttggaacc tcagggactc 39660
catcccccgt ccccagcccc acaaccaccg gccctctcct ggtgccattc acactcaact 39720
tcaccatcac taacctacag tatgaggaga acatgggtca ccctggctcc aggaagttca 39780
acatcacgga gagtgttctg cagggtctgc tcaagccctt gttcaagagc accagtgttg 39840
gccctctgta ttctggctgc agactgacct tgctcaggcc tgagaaggat ggagtagcca 39900
ccagagtgga cgccatctgc acccaccgcc ctgaccccaa aatccctggg ctagacagac 39960
agcagctata ctgggagctg agccagctga cccacagcat cactgagctg ggaccctaca 40020
ccctggatag ggacagtctc tatgtcaatg gtttcaccca gcggagctct gtgcccacca 40080
ccagcactcc tgggactttc acagtacagc cggaaacctc tgagactcca tcatccctcc 40140
ctggccccac agccactggc cctgtcctgc tgccattcac cctcaatttt accatcacta 40200
acctgcagta tgaggaggac atgcgtcgcc ctggctccag gaagttcaac accacggaga 40260
gggtccttca gggtctgctt atgcccttgt tcaagaacac cagtgtcagc tctctgtact 40320
ctggttgcag actgaccttg ctcaggcctg agaaggatgg ggcagccacc agagtggatg 40380
ctgtctgcac ccatcgtcct gaccccaaaa gccctggact ggacagagag cggctgtact 40440
ggaagctgag ccagctgacc cacggcatca ctgagctggg cccctacacc ctggacaggc 40500
acagtctcta tgtcaatggt ttcacccatc agagctctat gacgaccacc agaactcctg 40560
atacctccac aatgcacctg gcaacctcga gaactccagc ctccctgtct ggacccatga 40620
ccgccagccc tctcctggtg ctattcacaa ttaacttcac catcactaac ctgcggtatg 40680
aggagaacat gcatcaccct ggctctagaa agtttaacac cacggagaga gtccttcagg 40740
gtctgctcag gcctgtgttc aagaacacca gtgttggccc tctgtactct ggctgcagac 40800
tgaccttgct caggcccaag aaggatgggg cagccaccaa agtggatgcc atctgcacct 40860
accgccctga tcccaaaagc cctggactgg acagagagca gctatactgg gagctgagcc 40920
agctgaccca cagcatcact gagctgggcc cctacaccct ggacagggac agtctctatg 40980
tcaatggttt cacacagcgg agctctgtgc ccaccactag cattcctggg acccccacag 41040
tggacctggg aacatctggg actccagttt ctaaacctgg tccctcggct gccagccctc 41100
tcctggtgct attcactctc aacttcacca tcaccaacct gcggtatgag gagaacatgc 41160
agcaccctgg ctccaggaag ttcaacacca cggagagggt ccttcagggc ctgctcaggt 41220
ccctgttcaa gagcaccagt gttggccctc tgtactctgg ctgcagactg actttgctca 41280
ggcctgaaaa ggatgggaca gccactggag tggatgccat ctgcacccac caccctgacc 41340
ccaaaagccc taggctggac agagagcagc tgtattggga gctgagccag ctgacccaca 41400
atatcactga gctgggcccc tatgccctgg acaacgacag cctctttgtc aatggtttca 41460
ctcatcggag ctctgtgtcc accaccagca ctcctgggac ccccacagtg tatctgggag 41520
catctaagac tccagcctcg atatttggcc cttcagctgc cagccatctc ctgatactat 41580
tcaccctcaa cttcaccatc actaacctgc ggtatgagga gaacatgtgg cctggctcca 41640
ggaagttcaa cactacagag agggtccttc agggcctgct aaggcccttg ttcaagaaca 41700
ccagtgttgg ccctctgtac tctggctgca ggctgacctt gctcaggcca gagaaagatg 41760
gggaagccac cggagtggat gccatctgca cccaccgccc tgaccccaca ggccctgggc 41820
tggacagaga gcagctgtat ttggagctga gccagctgac ccacagcatc actgagctgg 41880
gcccctacac actggacagg gacagtctct atgtcaatgg tttcacccat cggagctctg 41940
tacccaccac cagcaccggg gtggtcagcg aggagccatt cacactgaac ttcaccatca 42000
acaacctgcg ctacatggcg gacatgggcc aacccggctc cctcaagttc aacatcacag 42060
acaacgtcat gcagcacctg ctcagtcctt tgttccagag gagcagcctg ggtgcacggt 42120
acacaggctg cagggtcatc gcactaaggt ctgtgaagaa cggtgctgag acacgggtgg 42180
acctcctctg cacctacctg cagcccctca gcggcccagg tctgcctatc aagcaggtgt 42240
tccatgagct gagccagcag acccatggca tcacccggct gggcccctac tctctggaca 42300
aagacagcct ctaccttaac ggttacaatg aacctggtcc agatgagcct cctacaactc 42360
ccaagccagc caccacattc ctgcctcctc tgtcagaagc cacaacagcc atggggtacc 42420
acctgaagac cctcacactc aacttcacca tctccaatct ccagtattca ccagatatgg 42480
gcaagggctc agctacattc aactccaccg agggggtcct tcagcacctg ctcagaccct 42540
tgttccagaa gagcagcatg ggccccttct acttgggttg ccaactgatc tccctcaggc 42600
ctgagaagga tggggcagcc actggtgtgg acaccacctg cacctaccac cctgaccctg 42660
tgggccccgg gctggacata cagcagcttt actgggagct gagtcagctg acccatggtg 42720
tcacccaact gggcttctat gtcctggaca gggatagcct cttcatcaat ggctatgcac 42780
cccagaattt atcaatccgg ggcgagtacc agataaattt ccacattgtc aactggaacc 42840
tcagtaatcc agaccccaca tcctcagagt acatcaccct gctgagggac atccaggaca 42900
aggtcaccac actctacaaa ggcagtcaac tacatgacac attccgcttc tgcctggtca 42960
ccaacttgac gatggactcc gtgttggtca ctgtcaaggc attgttctcc tccaatttgg 43020
accccagcct ggtggagcaa gtctttctag ataagaccct gaatgcctca ttccattggc 43080
tgggctccac ctaccagttg gtggacatcc atgtgacaga aatggagtca tcagtttatc 43140
aaccaacaag cagctccagc acccagcact tctacctgaa tttcaccatc accaacctac 43200
catattccca ggacaaagcc cagccaggca ccaccaatta ccagaggaac aaaaggaata 43260
ttgaggatgc gctcaaccaa ctcttccgaa acagcagcat caagagttat ttttctgact 43320
gtcaagtttc aacattcagg tctgtcccca acaggcacca caccggggtg gactccctgt 43380
gtaacttctc gccactggct cggagagtag acagagttgc catctatgag gaatttctgc 43440
ggatgacccg gaatggtacc cagctgcaga acttcaccct ggacaggagc agtgtccttg 43500
tggatgggta ttctcccaac agaaatgagc ccttaactgg gaattctgac cttcccttct 43560
gggctgtcat cctcatcggc ttggcaggac tcctgggagt catcacatgc ctgatctgcg 43620
gtgtcctggt gaccacccgc cggcggaaga aggaaggaga atacaacgtc cagcaacagt 43680
gcccaggcta ctaccagtca cacctagacc tggaggatct gcaatgactg gaacttgccg 43740
gtgcctgggg tgcctttccc ccagccaggg tccaaagaag cttggctggg gcagaaataa 43800
accatattgg tcgga                                                  43815
<210> 138
<211> 518
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Биспецифическ.
<400> 138
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85                  90                  95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100                 105                 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115                 120                 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130                 135                 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145                 150                 155                 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165                 170                 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180                 185                 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195                 200                 205
Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
210                 215                 220
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
225                 230                 235                 240
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
245                 250                 255
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
260                 265                 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
275                 280                 285
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
290                 295                 300
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
305                 310                 315                 320
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
325                 330                 335
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
340                 345                 350
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
355                 360                 365
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
370                 375                 380
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
385                 390                 395                 400
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
405                 410                 415
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
420                 425                 430
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
435                 440                 445
Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu
450                 455                 460
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
485                 490                 495
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr
500                 505                 510
Lys Leu Gln Ile Thr Arg
515
<210> 139
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c114-N3
<400> 139
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85                  90                  95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100                 105                 110
Leu Gln
<210> 140
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 10C6 VH
<400> 140
caggtaactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac actcttggta tgggtgtagg ctggattcgg 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tataacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaagg attcctccaa aaaccaggtt 240
ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatattgcca catactactg ttctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctctggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca                                                            366
<210> 141
<211> 330
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 10C6 VL
<400> 141
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac                                  330
<210> 142
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 7B12 VH
<400> 142
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actgttggta tgggtgtagg ctggagtcgt 120
cagccctcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacatct ggtgggatga tgaagataag 180
tattataatc cagccctgaa gagtcggctc acaatctcca aggatacctc caaaaaccag 240
gtcttcctca agatcgccaa tgtggacact gcagatagtg ccacatacta ctgtactcga 300
atcgggacag ctcaggctac ggatgctttg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca                                                         369
<210> 143
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 7B12 VL
<400> 143
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtatctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttcgg aaaagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgaaga tgtgggtgtt tattactgta tgcaaagtct agaatatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac taagctaaaa ataaaa                           336
<210> 144
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 19C11 VH
<400> 144
caggttaatc tgaaagagtc tggccctggg aaattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actcttggta tgggtgtagg ttggattcgt 120
cagtcttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tataacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaggg ctacctccaa aaaccaggtt 240
ttcctcaaga tcgtcaatgt gggcactgca gatactgcca catattactg tgctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctttggac tattggggtc agggaacctc agtcaccgtt 360
tcctca                                                            366
<210> 145
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 19C11 VL
<400> 145
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct atccctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttctg catagtaatg gcaacactta tttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgaaaatc 240
agtagagtgg aggctgggga tgtgggtgtt tattactgta tgcagggtct agagcatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa                           336
<210> 146
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 16C5 VH
<400> 146
caggttactc tgaaagagtc tggccctgga atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac actcttggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tattacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaggg atacctccaa aaaccaggta 240
ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctctggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca                                                            366
<210> 147
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 16C5 VL
<400> 147
gagctcgata tgacccagac tccaccctcc ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcagg 60
attaggtgcc tggccagtga ggacatttat agtggtatat cctggtatca acagaagcca 120
gggaaacctc ctacactcct gatctatggt gcatccaatt tagaatctgg ggtcccacca 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tacaccctca ccattggcgg cgtgcaggct 240
gaagatgctg ccacctacta ctgtctaggc ggttatagtt atagtagtac cttgactttt 300
ggagctggca ccaatgtgga aatcaaa                                     327
<210> 148
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 18C6 VH
<400> 148
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actgttggta tgggtgtagg ctggagtcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgaggataag 180
tattataacc cagccctgaa gagtcggctc acaatctcca aggatacctc caaaaaccag 240
gtattcctca agatcgccaa tgtggacact gcagatactg ccacatacta ctgtactcga 300
atcgggacag ctcaggctac ggatgctttg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca                                                         369
<210> 149
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА 18C6 VL
<400> 149
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaaagtct agaatatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa                           336
<210> 150
<211> 14447
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Аминокислотная последовательность зрелого MUC16 человека
<400>  150
Asp Lys Thr Leu Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr
1               5                   10                  15
Gln Ser Leu Gly Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg
20                  25                  30
Gly Met Thr His Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln
35                  40                  45
Val Asn Gly Thr Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser
50                  55                  60
Gly Leu Ser Ser Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe
65                  70                  75                  80
Thr Lys Glu Ala Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly
85                  90                  95
Pro Val Thr Glu Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu
100                 105                 110
Gly Asp Ser Thr Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys
115                 120                 125
Ile Thr Ser Pro Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu
130                 135                 140
Asn Ala Pro Val Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser
145                 150                 155                 160
His Thr Pro Gly Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser
165                 170                 175
Phe Leu Asp Leu Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr
180                 185                 190
Ser Leu Glu Leu Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro
195                 200                 205
Glu Pro Gly Ser Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu
210                 215                 220
Ser Ser Ser Ala Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile
225                 230                 235                 240
Phe Ser Gly Gln Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu
245                 250                 255
Ala Arg Ala Ser Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr
260                 265                 270
Leu Ser Asn Ala Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser
275                 280                 285
Ser Leu Gly Thr Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile
290                 295                 300
Leu Thr Phe His Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His
305                 310                 315                 320
Ile Ala Lys Thr Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu
325                 330                 335
Gly Gly Thr Ser Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr
340                 345                 350
Leu Val Ser Glu Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu
355                 360                 365
Thr Glu Gly Thr Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala
370                 375                 380
Pro Gly Glu Glu Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly
385                 390                 395                 400
Phe Thr Thr Leu Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser
405                 410                 415
Ser His Pro Thr Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg
420                 425                 430
Gln Ser Ser Ser Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala
435                 440                 445
Thr Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr
450                 455                 460
Ala Gln Gln Phe Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser
465                 470                 475                 480
Pro Ser Met Lys Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala
485                 490                 495
Pro Ile Thr Thr Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu
500                 505                 510
Lys Thr Ser Ser Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp
515                 520                 525
Thr Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala
530                 535                 540
Val Pro Thr Gly Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser
545                 550                 555                 560
Gln Gly Thr Thr His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr
565                 570                 575
Ser Ala Asp Leu Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser
580                 585                 590
Pro Ala Val Ser Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr
595                 600                 605
Lys Pro Ser Tyr Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser
610                 615                 620
Leu Gln Ser Ser Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro
625                 630                 635                 640
Leu Asn Thr Arg His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly
645                 650                 655
His Thr Lys Ile Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val
660                 665                 670
Leu Glu Asp Lys Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala
675                 680                 685
Thr Ser Ser Ile Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys
690                 695                 700
Pro Ser Ser Ala Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr
705                 710                 715                 720
Ser Pro Glu Arg Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser
725                 730                 735
Pro Ser Gly Glu Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser
740                 745                 750
Ala Glu Thr Thr Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr
755                 760                 765
Ser Glu Ser Ser Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser
770                 775                 780
Gly Val Lys Thr Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe
785                 790                 795                 800
Thr Ser Gly Glu Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln
805                 810                 815
Pro Glu Thr Ser Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser
820                 825                 830
Val Pro Thr Pro Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser
835                 840                 845
Ala Gln Phe Ser Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser
850                 855                 860
Ser Thr Ser Val Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser
865                 870                 875                 880
His Leu Thr Gly Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe
885                 890                 895
Asn Asp Ser Ala Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro
900                 905                 910
Arg Phe Lys Thr Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser
915                 920                 925
Ala Thr Ser Leu Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro
930                 935                 940
Ala Thr Ser Ser Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr
945                 950                 955                 960
Ile Leu Thr Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala
965                 970                 975
Ser Thr Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu
980                 985                 990
Asp Thr Ser His Leu Pro Ile Gly  Thr Thr Ala Ser Ser  Glu Thr Ser
995                 1000                 1005
Met Asp  Phe Thr Met Ala Lys  Glu Ser Val Ser Met  Ser Val Ser
1010                 1015                 1020
Pro Ser  Gln Ser Met Asp Ala  Ala Gly Ser Ser Thr  Pro Gly Arg
1025                 1030                 1035
Thr Ser  Gln Phe Val Asp Thr  Phe Ser Asp Asp Val  Tyr His Leu
1040                 1045                 1050
Thr Ser  Arg Glu Ile Thr Ile  Pro Arg Asp Gly Thr  Ser Ser Ala
1055                 1060                 1065
Leu Thr  Pro Gln Met Thr Ala  Thr His Pro Pro Ser  Pro Asp Pro
1070                 1075                 1080
Gly Ser  Ala Arg Ser Thr Trp  Leu Gly Ile Leu Ser  Ser Ser Pro
1085                 1090                 1095
Ser Ser  Pro Thr Pro Lys Val  Thr Met Ser Ser Thr  Phe Ser Thr
1100                 1105                 1110
Gln Arg  Val Thr Thr Ser Met  Ile Met Asp Thr Val  Glu Thr Ser
1115                 1120                 1125
Arg Trp  Asn Met Pro Asn Leu  Pro Ser Thr Thr Ser  Leu Thr Pro
1130                 1135                 1140
Ser Asn  Ile Pro Thr Ser Gly  Ala Ile Gly Lys Ser  Thr Leu Val
1145                 1150                 1155
Pro Leu  Asp Thr Pro Ser Pro  Ala Thr Ser Leu Glu  Ala Ser Glu
1160                 1165                 1170
Gly Gly  Leu Pro Thr Leu Ser  Thr Tyr Pro Glu Ser  Thr Asn Thr
1175                 1180                 1185
Pro Ser  Ile His Leu Gly Ala  His Ala Ser Ser Glu  Ser Pro Ser
1190                 1195                 1200
Thr Ile  Lys Leu Thr Met Ala  Ser Val Val Lys Pro  Gly Ser Tyr
1205                 1210                 1215
Thr Pro  Leu Thr Phe Pro Ser  Ile Glu Thr His Ile  His Val Ser
1220                 1225                 1230
Thr Ala  Arg Met Ala Tyr Ser  Ser Gly Ser Ser Pro  Glu Met Thr
1235                 1240                 1245
Ala Pro  Gly Glu Thr Asn Thr  Gly Ser Thr Trp Asp  Pro Thr Thr
1250                 1255                 1260
Tyr Ile  Thr Thr Thr Asp Pro  Lys Asp Thr Ser Ser  Ala Gln Val
1265                 1270                 1275
Ser Thr  Pro His Ser Val Arg  Thr Leu Arg Thr Thr  Glu Asn His
1280                 1285                 1290
Pro Lys  Thr Glu Ser Ala Thr  Pro Ala Ala Tyr Ser  Gly Ser Pro
1295                 1300                 1305
Lys Ile  Ser Ser Ser Pro Asn  Leu Thr Ser Pro Ala  Thr Lys Ala
1310                 1315                 1320
Trp Thr  Ile Thr Asp Thr Thr  Glu His Ser Thr Gln  Leu His Tyr
1325                 1330                 1335
Thr Lys  Leu Ala Glu Lys Ser  Ser Gly Phe Glu Thr  Gln Ser Ala
1340                 1345                 1350
Pro Gly  Pro Val Ser Val Val  Ile Pro Thr Ser Pro  Thr Ile Gly
1355                 1360                 1365
Ser Ser  Thr Leu Glu Leu Thr  Ser Asp Val Pro Gly  Glu Pro Leu
1370                 1375                 1380
Val Leu  Ala Pro Ser Glu Gln  Thr Thr Ile Thr Leu  Pro Met Ala
1385                 1390                 1395
Thr Trp  Leu Ser Thr Ser Leu  Thr Glu Glu Met Ala  Ser Thr Asp
1400                 1405                 1410
Leu Asp  Ile Ser Ser Pro Ser  Ser Pro Met Ser Thr  Phe Ala Ile
1415                 1420                 1425
Phe Pro  Pro Met Ser Thr Pro  Ser His Glu Leu Ser  Lys Ser Glu
1430                 1435                 1440
Ala Asp  Thr Ser Ala Ile Arg  Asn Thr Asp Ser Thr  Thr Leu Asp
1445                 1450                 1455
Gln His  Leu Gly Ile Arg Ser  Leu Gly Arg Thr Gly  Asp Leu Thr
1460                 1465                 1470
Thr Val  Pro Ile Thr Pro Leu  Thr Thr Thr Trp Thr  Ser Val Ile
1475                 1480                 1485
Glu His  Ser Thr Gln Ala Gln  Asp Thr Leu Ser Ala  Thr Met Ser
1490                 1495                 1500
Pro Thr  His Val Thr Gln Ser  Leu Lys Asp Gln Thr  Ser Ile Pro
1505                 1510                 1515
Ala Ser  Ala Ser Pro Ser His  Leu Thr Glu Val Tyr  Pro Glu Leu
1520                 1525                 1530
Gly Thr  Gln Gly Arg Ser Ser  Ser Glu Ala Thr Thr  Phe Trp Lys
1535                 1540                 1545
Pro Ser  Thr Asp Thr Leu Ser  Arg Glu Ile Glu Thr  Gly Pro Thr
1550                 1555                 1560
Asn Ile  Gln Ser Thr Pro Pro  Met Asp Asn Thr Thr  Thr Gly Ser
1565                 1570                 1575
Ser Ser  Ser Gly Val Thr Leu  Gly Ile Ala His Leu  Pro Ile Gly
1580                 1585                 1590
Thr Ser  Ser Pro Ala Glu Thr  Ser Thr Asn Met Ala  Leu Glu Arg
1595                 1600                 1605
Arg Ser  Ser Thr Ala Thr Val  Ser Met Ala Gly Thr  Met Gly Leu
1610                 1615                 1620
Leu Val  Thr Ser Ala Pro Gly  Arg Ser Ile Ser Gln  Ser Leu Gly
1625                 1630                 1635
Arg Val  Ser Ser Val Leu Ser  Glu Ser Thr Thr Glu  Gly Val Thr
1640                 1645                 1650
Asp Ser  Ser Lys Gly Ser Ser  Pro Arg Leu Asn Thr  Gln Gly Asn
1655                 1660                 1665
Thr Ala  Leu Ser Ser Ser Leu  Glu Pro Ser Tyr Ala  Glu Gly Ser
1670                 1675                 1680
Gln Met  Ser Thr Ser Ile Pro  Leu Thr Ser Ser Pro  Thr Thr Pro
1685                 1690                 1695
Asp Val  Glu Phe Ile Gly Gly  Ser Thr Phe Trp Thr  Lys Glu Val
1700                 1705                 1710
Thr Thr  Val Met Thr Ser Asp  Ile Ser Lys Ser Ser  Ala Arg Thr
1715                 1720                 1725
Glu Ser  Ser Ser Ala Thr Leu  Met Ser Thr Ala Leu  Gly Ser Thr
1730                 1735                 1740
Glu Asn  Thr Gly Lys Glu Lys  Leu Arg Thr Ala Ser  Met Asp Leu
1745                 1750                 1755
Pro Ser  Pro Thr Pro Ser Met  Glu Val Thr Pro Trp  Ile Ser Leu
1760                 1765                 1770
Thr Leu  Ser Asn Ala Pro Asn  Thr Thr Asp Ser Leu  Asp Leu Ser
1775                 1780                 1785
His Gly  Val His Thr Ser Ser  Ala Gly Thr Leu Ala  Thr Asp Arg
1790                 1795                 1800
Ser Leu  Asn Thr Gly Val Thr  Arg Ala Ser Arg Leu  Glu Asn Gly
1805                 1810                 1815
Ser Asp  Thr Ser Ser Lys Ser  Leu Ser Met Gly Asn  Ser Thr His
1820                 1825                 1830
Thr Ser  Met Thr Tyr Thr Glu  Lys Ser Glu Val Ser  Ser Ser Ile
1835                 1840                 1845
His Pro  Arg Pro Glu Thr Ser  Ala Pro Gly Ala Glu  Thr Thr Leu
1850                 1855                 1860
Thr Ser  Thr Pro Gly Asn Arg  Ala Ile Ser Leu Thr  Leu Pro Phe
1865                 1870                 1875
Ser Ser  Ile Pro Val Glu Glu  Val Ile Ser Thr Gly  Ile Thr Ser
1880                 1885                 1890
Gly Pro  Asp Ile Asn Ser Ala  Pro Met Thr His Ser  Pro Ile Thr
1895                 1900                 1905
Pro Pro  Thr Ile Val Trp Thr  Ser Thr Gly Thr Ile  Glu Gln Ser
1910                 1915                 1920
Thr Gln  Pro Leu His Ala Val  Ser Ser Glu Lys Val  Ser Val Gln
1925                 1930                 1935
Thr Gln  Ser Thr Pro Tyr Val  Asn Ser Val Ala Val  Ser Ala Ser
1940                 1945                 1950
Pro Thr  His Glu Asn Ser Val  Ser Ser Gly Ser Ser  Thr Ser Ser
1955                 1960                 1965
Pro Tyr  Ser Ser Ala Ser Leu  Glu Ser Leu Asp Ser  Thr Ile Ser
1970                 1975                 1980
Arg Arg  Asn Ala Ile Thr Ser  Trp Leu Trp Asp Leu  Thr Thr Ser
1985                 1990                 1995
Leu Pro  Thr Thr Thr Trp Pro  Ser Thr Ser Leu Ser  Glu Ala Leu
2000                 2005                 2010
Ser Ser  Gly His Ser Gly Val  Ser Asn Pro Ser Ser  Thr Thr Thr
2015                 2020                 2025
Glu Phe  Pro Leu Phe Ser Ala  Ala Ser Thr Ser Ala  Ala Lys Gln
2030                 2035                 2040
Arg Asn  Pro Glu Thr Glu Thr  His Gly Pro Gln Asn  Thr Ala Ala
2045                 2050                 2055
Ser Thr  Leu Asn Thr Asp Ala  Ser Ser Val Thr Gly  Leu Ser Glu
2060                 2065                 2070
Thr Pro  Val Gly Ala Ser Ile  Ser Ser Glu Val Pro  Leu Pro Met
2075                 2080                 2085
Ala Ile  Thr Ser Arg Ser Asp  Val Ser Gly Leu Thr  Ser Glu Ser
2090                 2095                 2100
Thr Ala  Asn Pro Ser Leu Gly  Thr Ala Ser Ser Ala  Gly Thr Lys
2105                 2110                 2115
Leu Thr  Arg Thr Ile Ser Leu  Pro Thr Ser Glu Ser  Leu Val Ser
2120                 2125                 2130
Phe Arg  Met Asn Lys Asp Pro  Trp Thr Val Ser Ile  Pro Leu Gly
2135                 2140                 2145
Ser His  Pro Thr Thr Asn Thr  Glu Thr Ser Ile Pro  Val Asn Ser
2150                 2155                 2160
Ala Gly  Pro Pro Gly Leu Ser  Thr Val Ala Ser Asp  Val Ile Asp
2165                 2170                 2175
Thr Pro  Ser Asp Gly Ala Glu  Ser Ile Pro Thr Val  Ser Phe Ser
2180                 2185                 2190
Pro Ser  Pro Asp Thr Glu Val  Thr Thr Ile Ser His  Phe Pro Glu
2195                 2200                 2205
Lys Thr  Thr His Ser Phe Arg  Thr Ile Ser Ser Leu  Thr His Glu
2210                 2215                 2220
Leu Thr  Ser Arg Val Thr Pro  Ile Pro Gly Asp Trp  Met Ser Ser
2225                 2230                 2235
Ala Met  Ser Thr Lys Pro Thr  Gly Ala Ser Pro Ser  Ile Thr Leu
2240                 2245                 2250
Gly Glu  Arg Arg Thr Ile Thr  Ser Ala Ala Pro Thr  Thr Ser Pro
2255                 2260                 2265
Ile Val  Leu Thr Ala Ser Phe  Thr Glu Thr Ser Thr  Val Ser Leu
2270                 2275                 2280
Asp Asn  Glu Thr Thr Val Lys  Thr Ser Asp Ile Leu  Asp Ala Arg
2285                 2290                 2295
Lys Thr  Asn Glu Leu Pro Ser  Asp Ser Ser Ser Ser  Ser Asp Leu
2300                 2305                 2310
Ile Asn  Thr Ser Ile Ala Ser  Ser Thr Met Asp Val  Thr Lys Thr
2315                 2320                 2325
Ala Ser  Ile Ser Pro Thr Ser  Ile Ser Gly Met Thr  Ala Ser Ser
2330                 2335                 2340
Ser Pro  Ser Leu Phe Ser Ser  Asp Arg Pro Gln Val  Pro Thr Ser
2345                 2350                 2355
Thr Thr  Glu Thr Asn Thr Ala  Thr Ser Pro Ser Val  Ser Ser Asn
2360                 2365                 2370
Thr Tyr  Ser Leu Asp Gly Gly  Ser Asn Val Gly Gly  Thr Pro Ser
2375                 2380                 2385
Thr Leu  Pro Pro Phe Thr Ile  Thr His Pro Val Glu  Thr Ser Ser
2390                 2395                 2400
Ala Leu  Leu Ala Trp Ser Arg  Pro Val Arg Thr Phe  Ser Thr Met
2405                 2410                 2415
Val Ser  Thr Asp Thr Ala Ser  Gly Glu Asn Pro Thr  Ser Ser Asn
2420                 2425                 2430
Ser Val  Val Thr Ser Val Pro  Ala Pro Gly Thr Trp  Thr Ser Val
2435                 2440                 2445
Gly Ser  Thr Thr Asp Leu Pro  Ala Met Gly Phe Leu  Lys Thr Ser
2450                 2455                 2460
Pro Ala  Gly Glu Ala His Ser  Leu Leu Ala Ser Thr  Ile Glu Pro
2465                 2470                 2475
Ala Thr  Ala Phe Thr Pro His  Leu Ser Ala Ala Val  Val Thr Gly
2480                 2485                 2490
Ser Ser  Ala Thr Ser Glu Ala  Ser Leu Leu Thr Thr  Ser Glu Ser
2495                 2500                 2505
Lys Ala  Ile His Ser Ser Pro  Gln Thr Pro Thr Thr  Pro Thr Ser
2510                 2515                 2520
Gly Ala  Asn Trp Glu Thr Ser  Ala Thr Pro Glu Ser  Leu Leu Val
2525                 2530                 2535
Val Thr  Glu Thr Ser Asp Thr  Thr Leu Thr Ser Lys  Ile Leu Val
2540                 2545                 2550
Thr Asp  Thr Ile Leu Phe Ser  Thr Val Ser Thr Pro  Pro Ser Lys
2555                 2560                 2565
Phe Pro  Ser Thr Gly Thr Leu  Ser Gly Ala Ser Phe  Pro Thr Leu
2570                 2575                 2580
Leu Pro  Asp Thr Pro Ala Ile  Pro Leu Thr Ala Thr  Glu Pro Thr
2585                 2590                 2595
Ser Ser  Leu Ala Thr Ser Phe  Asp Ser Thr Pro Leu  Val Thr Ile
2600                 2605                 2610
Ala Ser  Asp Ser Leu Gly Thr  Val Pro Glu Thr Thr  Leu Thr Met
2615                 2620                 2625
Ser Glu  Thr Ser Asn Gly Asp  Ala Leu Val Leu Lys  Thr Val Ser
2630                 2635                 2640
Asn Pro  Asp Arg Ser Ile Pro  Gly Ile Thr Ile Gln  Gly Val Thr
2645                 2650                 2655
Glu Ser  Pro Leu His Pro Ser  Ser Thr Ser Pro Ser  Lys Ile Val
2660                 2665                 2670
Ala Pro  Arg Asn Thr Thr Tyr  Glu Gly Ser Ile Thr  Val Ala Leu
2675                 2680                 2685
Ser Thr  Leu Pro Ala Gly Thr  Thr Gly Ser Leu Val  Phe Ser Gln
2690                 2695                 2700
Ser Ser  Glu Asn Ser Glu Thr  Thr Ala Leu Val Asp  Ser Ser Ala
2705                 2710                 2715
Gly Leu  Glu Arg Ala Ser Val  Met Pro Leu Thr Thr  Gly Ser Gln
2720                 2725                 2730
Gly Met  Ala Ser Ser Gly Gly  Ile Arg Ser Gly Ser  Thr His Ser
2735                 2740                 2745
Thr Gly  Thr Lys Thr Phe Ser  Ser Leu Pro Leu Thr  Met Asn Pro
2750                 2755                 2760
Gly Glu  Val Thr Ala Met Ser  Glu Ile Thr Thr Asn  Arg Leu Thr
2765                 2770                 2775
Ala Thr  Gln Ser Thr Ala Pro  Lys Gly Ile Pro Val  Lys Pro Thr
2780                 2785                 2790
Ser Ala  Glu Ser Gly Leu Leu  Thr Pro Val Ser Ala  Ser Ser Ser
2795                 2800                 2805
Pro Ser  Lys Ala Phe Ala Ser  Leu Thr Thr Ala Pro  Pro Thr Trp
2810                 2815                 2820
Gly Ile  Pro Gln Ser Thr Leu  Thr Phe Glu Phe Ser  Glu Val Pro
2825                 2830                 2835
Ser Leu  Asp Thr Lys Ser Ala  Ser Leu Pro Thr Pro  Gly Gln Ser
2840                 2845                 2850
Leu Asn  Thr Ile Pro Asp Ser  Asp Ala Ser Thr Ala  Ser Ser Ser
2855                 2860                 2865
Leu Ser  Lys Ser Pro Glu Lys  Asn Pro Arg Ala Arg  Met Met Thr
2870                 2875                 2880
Ser Thr  Lys Ala Ile Ser Ala  Ser Ser Phe Gln Ser  Thr Gly Phe
2885                 2890                 2895
Thr Glu  Thr Pro Glu Gly Ser  Ala Ser Pro Ser Met  Ala Gly His
2900                 2905                 2910
Glu Pro  Arg Val Pro Thr Ser  Gly Thr Gly Asp Pro  Arg Tyr Ala
2915                 2920                 2925
Ser Glu  Ser Met Ser Tyr Pro  Asp Pro Ser Lys Ala  Ser Ser Ala
2930                 2935                 2940
Met Thr  Ser Thr Ser Leu Ala  Ser Lys Leu Thr Thr  Leu Phe Ser
2945                 2950                 2955
Thr Gly  Gln Ala Ala Arg Ser  Gly Ser Ser Ser Ser  Pro Ile Ser
2960                 2965                 2970
Leu Ser  Thr Glu Lys Glu Thr  Ser Phe Leu Ser Pro  Thr Ala Ser
2975                 2980                 2985
Thr Ser  Arg Lys Thr Ser Leu  Phe Leu Gly Pro Ser  Met Ala Arg
2990                 2995                 3000
Gln Pro  Asn Ile Leu Val His  Leu Gln Thr Ser Ala  Leu Thr Leu
3005                 3010                 3015
Ser Pro  Thr Ser Thr Leu Asn  Met Ser Gln Glu Glu  Pro Pro Glu
3020                 3025                 3030
Leu Thr  Ser Ser Gln Thr Ile  Ala Glu Glu Glu Gly  Thr Thr Ala
3035                 3040                 3045
Glu Thr  Gln Thr Leu Thr Phe  Thr Pro Ser Glu Thr  Pro Thr Ser
3050                 3055                 3060
Leu Leu  Pro Val Ser Ser Pro  Thr Glu Pro Thr Ala  Arg Arg Lys
3065                 3070                 3075
Ser Ser  Pro Glu Thr Trp Ala  Ser Ser Ile Ser Val  Pro Ala Lys
3080                 3085                 3090
Thr Ser  Leu Val Glu Thr Thr  Asp Gly Thr Leu Val  Thr Thr Ile
3095                 3100                 3105
Lys Met  Ser Ser Gln Ala Ala  Gln Gly Asn Ser Thr  Trp Pro Ala
3110                 3115                 3120
Pro Ala  Glu Glu Thr Gly Ser  Ser Pro Ala Gly Thr  Ser Pro Gly
3125                 3130                 3135
Ser Pro  Glu Met Ser Thr Thr  Leu Lys Ile Met Ser  Ser Lys Glu
3140                 3145                 3150
Pro Ser  Ile Ser Pro Glu Ile  Arg Ser Thr Val Arg  Asn Ser Pro
3155                 3160                 3165
Trp Lys  Thr Pro Glu Thr Thr  Val Pro Met Glu Thr  Thr Val Glu
3170                 3175                 3180
Pro Val  Thr Leu Gln Ser Thr  Ala Leu Gly Ser Gly  Ser Thr Ser
3185                 3190                 3195
Ile Ser  His Leu Pro Thr Gly  Thr Thr Ser Pro Thr  Lys Ser Pro
3200                 3205                 3210
Thr Glu  Asn Met Leu Ala Thr  Glu Arg Val Ser Leu  Ser Pro Ser
3215                 3220                 3225
Pro Pro  Glu Ala Trp Thr Asn  Leu Tyr Ser Gly Thr  Pro Gly Gly
3230                 3235                 3240
Thr Arg  Gln Ser Leu Ala Thr  Met Ser Ser Val Ser  Leu Glu Ser
3245                 3250                 3255
Pro Thr  Ala Arg Ser Ile Thr  Gly Thr Gly Gln Gln  Ser Ser Pro
3260                 3265                 3270
Glu Leu  Val Ser Lys Thr Thr  Gly Met Glu Phe Ser  Met Trp His
3275                 3280                 3285
Gly Ser  Thr Gly Gly Thr Thr  Gly Asp Thr His Val  Ser Leu Ser
3290                 3295                 3300
Thr Ser  Ser Asn Ile Leu Glu  Asp Pro Val Thr Ser  Pro Asn Ser
3305                 3310                 3315
Val Ser  Ser Leu Thr Asp Lys  Ser Lys His Lys Thr  Glu Thr Trp
3320                 3325                 3330
Val Ser  Thr Thr Ala Ile Pro  Ser Thr Val Leu Asn  Asn Lys Ile
3335                 3340                 3345
Met Ala  Ala Glu Gln Gln Thr  Ser Arg Ser Val Asp  Glu Ala Tyr
3350                 3355                 3360
Ser Ser  Thr Ser Ser Trp Ser  Asp Gln Thr Ser Gly  Ser Asp Ile
3365                 3370                 3375
Thr Leu  Gly Ala Ser Pro Asp  Val Thr Asn Thr Leu  Tyr Ile Thr
3380                 3385                 3390
Ser Thr  Ala Gln Thr Thr Ser  Leu Val Ser Leu Pro  Ser Gly Asp
3395                 3400                 3405
Gln Gly  Ile Thr Ser Leu Thr  Asn Pro Ser Gly Gly  Lys Thr Ser
3410                 3415                 3420
Ser Ala  Ser Ser Val Thr Ser  Pro Ser Ile Gly Leu  Glu Thr Leu
3425                 3430                 3435
Arg Ala  Asn Val Ser Ala Val  Lys Ser Asp Ile Ala  Pro Thr Ala
3440                 3445                 3450
Gly His  Leu Ser Gln Thr Ser  Ser Pro Ala Glu Val  Ser Ile Leu
3455                 3460                 3465
Asp Val  Thr Thr Ala Pro Thr  Pro Gly Ile Ser Thr  Thr Ile Thr
3470                 3475                 3480
Thr Met  Gly Thr Asn Ser Ile  Ser Thr Thr Thr Pro  Asn Pro Glu
3485                 3490                 3495
Val Gly  Met Ser Thr Met Asp  Ser Thr Pro Ala Thr  Glu Arg Arg
3500                 3505                 3510
Thr Thr  Ser Thr Glu His Pro  Ser Thr Trp Ser Ser  Thr Ala Ala
3515                 3520                 3525
Ser Asp  Ser Trp Thr Val Thr  Asp Met Thr Ser Asn  Leu Lys Val
3530                 3535                 3540
Ala Arg  Ser Pro Gly Thr Ile  Ser Thr Met His Thr  Thr Ser Phe
3545                 3550                 3555
Leu Ala  Ser Ser Thr Glu Leu  Asp Ser Met Ser Thr  Pro His Gly
3560                 3565                 3570
Arg Ile  Thr Val Ile Gly Thr  Ser Leu Val Thr Pro  Ser Ser Asp
3575                 3580                 3585
Ala Ser  Ala Val Lys Thr Glu  Thr Ser Thr Ser Glu  Arg Thr Leu
3590                 3595                 3600
Ser Pro  Ser Asp Thr Thr Ala  Ser Thr Pro Ile Ser  Thr Phe Ser
3605                 3610                 3615
Arg Val  Gln Arg Met Ser Ile  Ser Val Pro Asp Ile  Leu Ser Thr
3620                 3625                 3630
Ser Trp  Thr Pro Ser Ser Thr  Glu Ala Glu Asp Val  Pro Val Ser
3635                 3640                 3645
Met Val  Ser Thr Asp His Ala  Ser Thr Lys Thr Asp  Pro Asn Thr
3650                 3655                 3660
Pro Leu  Ser Thr Phe Leu Phe  Asp Ser Leu Ser Thr  Leu Asp Trp
3665                 3670                 3675
Asp Thr  Gly Arg Ser Leu Ser  Ser Ala Thr Ala Thr  Thr Ser Ala
3680                 3685                 3690
Pro Gln  Gly Ala Thr Thr Pro  Gln Glu Leu Thr Leu  Glu Thr Met
3695                 3700                 3705
Ile Ser  Pro Ala Thr Ser Gln  Leu Pro Phe Ser Ile  Gly His Ile
3710                 3715                 3720
Thr Ser  Ala Val Thr Pro Ala  Ala Met Ala Arg Ser  Ser Gly Val
3725                 3730                 3735
Thr Phe  Ser Arg Pro Asp Pro  Thr Ser Lys Lys Ala  Glu Gln Thr
3740                 3745                 3750
Ser Thr  Gln Leu Pro Thr Thr  Thr Ser Ala His Pro  Gly Gln Val
3755                 3760                 3765
Pro Arg  Ser Ala Ala Thr Thr  Leu Asp Val Ile Pro  His Thr Ala
3770                 3775                 3780
Lys Thr  Pro Asp Ala Thr Phe  Gln Arg Gln Gly Gln  Thr Ala Leu
3785                 3790                 3795
Thr Thr  Glu Ala Arg Ala Thr  Ser Asp Ser Trp Asn  Glu Lys Glu
3800                 3805                 3810
Lys Ser  Thr Pro Ser Ala Pro  Trp Ile Thr Glu Met  Met Asn Ser
3815                 3820                 3825
Val Ser  Glu Asp Thr Ile Lys  Glu Val Thr Ser Ser  Ser Ser Val
3830                 3835                 3840
Leu Arg  Thr Leu Asn Thr Leu  Asp Ile Asn Leu Glu  Ser Gly Thr
3845                 3850                 3855
Thr Ser  Ser Pro Ser Trp Lys  Ser Ser Pro Tyr Glu  Arg Ile Ala
3860                 3865                 3870
Pro Ser  Glu Ser Thr Thr Asp  Lys Glu Ala Ile His  Pro Ser Thr
3875                 3880                 3885
Asn Thr  Val Glu Thr Thr Gly  Trp Val Thr Ser Ser  Glu His Ala
3890                 3895                 3900
Ser His  Ser Thr Ile Pro Ala  His Ser Ala Ser Ser  Lys Leu Thr
3905                 3910                 3915
Ser Pro  Val Val Thr Thr Ser  Thr Arg Glu Gln Ala  Ile Val Ser
3920                 3925                 3930
Met Ser  Thr Thr Thr Trp Pro  Glu Ser Thr Arg Ala  Arg Thr Glu
3935                 3940                 3945
Pro Asn  Ser Phe Leu Thr Ile  Glu Leu Arg Asp Val  Ser Pro Tyr
3950                 3955                 3960
Met Asp  Thr Ser Ser Thr Thr  Gln Thr Ser Ile Ile  Ser Ser Pro
3965                 3970                 3975
Gly Ser  Thr Ala Ile Thr Lys  Gly Pro Arg Thr Glu  Ile Thr Ser
3980                 3985                 3990
Ser Lys  Arg Ile Ser Ser Ser  Phe Leu Ala Gln Ser  Met Arg Ser
3995                 4000                 4005
Ser Asp  Ser Pro Ser Glu Ala  Ile Thr Arg Leu Ser  Asn Phe Pro
4010                 4015                 4020
Ala Met  Thr Glu Ser Gly Gly  Met Ile Leu Ala Met  Gln Thr Ser
4025                 4030                 4035
Pro Pro  Gly Ala Thr Ser Leu  Ser Ala Pro Thr Leu  Asp Thr Ser
4040                 4045                 4050
Ala Thr  Ala Ser Trp Thr Gly  Thr Pro Leu Ala Thr  Thr Gln Arg
4055                 4060                 4065
Phe Thr  Tyr Ser Glu Lys Thr  Thr Leu Phe Ser Lys  Gly Pro Glu
4070                 4075                 4080
Asp Thr  Ser Gln Pro Ser Pro  Pro Ser Val Glu Glu  Thr Ser Ser
4085                 4090                 4095
Ser Ser  Ser Leu Val Pro Ile  His Ala Thr Thr Ser  Pro Ser Asn
4100                 4105                 4110
Ile Leu  Leu Thr Ser Gln Gly  His Ser Pro Ser Ser  Thr Pro Pro
4115                 4120                 4125
Val Thr  Ser Val Phe Leu Ser  Glu Thr Ser Gly Leu  Gly Lys Thr
4130                 4135                 4140
Thr Asp  Met Ser Arg Ile Ser  Leu Glu Pro Gly Thr  Ser Leu Pro
4145                 4150                 4155
Pro Asn  Leu Ser Ser Thr Ala  Gly Glu Ala Leu Ser  Thr Tyr Glu
4160                 4165                 4170
Ala Ser  Arg Asp Thr Lys Ala  Ile His His Ser Ala  Asp Thr Ala
4175                 4180                 4185
Val Thr  Asn Met Glu Ala Thr  Ser Ser Glu Tyr Ser  Pro Ile Pro
4190                 4195                 4200
Gly His  Thr Lys Pro Ser Lys  Ala Thr Ser Pro Leu  Val Thr Ser
4205                 4210                 4215
His Ile  Met Gly Asp Ile Thr  Ser Ser Thr Ser Val  Phe Gly Ser
4220                 4225                 4230
Ser Glu  Thr Thr Glu Ile Glu  Thr Val Ser Ser Val  Asn Gln Gly
4235                 4240                 4245
Leu Gln  Glu Arg Ser Thr Ser  Gln Val Ala Ser Ser  Ala Thr Glu
4250                 4255                 4260
Thr Ser  Thr Val Ile Thr His  Val Ser Ser Gly Asp  Ala Thr Thr
4265                 4270                 4275
His Val  Thr Lys Thr Gln Ala  Thr Phe Ser Ser Gly  Thr Ser Ile
4280                 4285                 4290
Ser Ser  Pro His Gln Phe Ile  Thr Ser Thr Asn Thr  Phe Thr Asp
4295                 4300                 4305
Val Ser  Thr Asn Pro Ser Thr  Ser Leu Ile Met Thr  Glu Ser Ser
4310                 4315                 4320
Gly Val  Thr Ile Thr Thr Gln  Thr Gly Pro Thr Gly  Ala Ala Thr
4325                 4330                 4335
Gln Gly  Pro Tyr Leu Leu Asp  Thr Ser Thr Met Pro  Tyr Leu Thr
4340                 4345                 4350
Glu Thr  Pro Leu Ala Val Thr  Pro Asp Phe Met Gln  Ser Glu Lys
4355                 4360                 4365
Thr Thr  Leu Ile Ser Lys Gly  Pro Lys Asp Val Ser  Trp Thr Ser
4370                 4375                 4380
Pro Pro  Ser Val Ala Glu Thr  Ser Tyr Pro Ser Ser  Leu Thr Pro
4385                 4390                 4395
Phe Leu  Val Thr Thr Ile Pro  Pro Ala Thr Ser Thr  Leu Gln Gly
4400                 4405                 4410
Gln His  Thr Ser Ser Pro Val  Ser Ala Thr Ser Val  Leu Thr Ser
4415                 4420                 4425
Gly Leu  Val Lys Thr Thr Asp  Met Leu Asn Thr Ser  Met Glu Pro
4430                 4435                 4440
Val Thr  Asn Ser Pro Gln Asn  Leu Asn Asn Pro Ser  Asn Glu Ile
4445                 4450                 4455
Leu Ala  Thr Leu Ala Ala Thr  Thr Asp Ile Glu Thr  Ile His Pro
4460                 4465                 4470
Ser Ile  Asn Lys Ala Val Thr  Asn Met Gly Thr Ala  Ser Ser Ala
4475                 4480                 4485
His Val  Leu His Ser Thr Leu  Pro Val Ser Ser Glu  Pro Ser Thr
4490                 4495                 4500
Ala Thr  Ser Pro Met Val Pro  Ala Ser Ser Met Gly  Asp Ala Leu
4505                 4510                 4515
Ala Ser  Ile Ser Ile Pro Gly  Ser Glu Thr Thr Asp  Ile Glu Gly
4520                 4525                 4530
Glu Pro  Thr Ser Ser Leu Thr  Ala Gly Arg Lys Glu  Asn Ser Thr
4535                 4540                 4545
Leu Gln  Glu Met Asn Ser Thr  Thr Glu Ser Asn Ile  Ile Leu Ser
4550                 4555                 4560
Asn Val  Ser Val Gly Ala Ile  Thr Glu Ala Thr Lys  Met Glu Val
4565                 4570                 4575
Pro Ser  Phe Asp Ala Thr Phe  Ile Pro Thr Pro Ala  Gln Ser Thr
4580                 4585                 4590
Lys Phe  Pro Asp Ile Phe Ser  Val Ala Ser Ser Arg  Leu Ser Asn
4595                 4600                 4605
Ser Pro  Pro Met Thr Ile Ser  Thr His Met Thr Thr  Thr Gln Thr
4610                 4615                 4620
Gly Ser  Ser Gly Ala Thr Ser  Lys Ile Pro Leu Ala  Leu Asp Thr
4625                 4630                 4635
Ser Thr  Leu Glu Thr Ser Ala  Gly Thr Pro Ser Val  Val Thr Glu
4640                 4645                 4650
Gly Phe  Ala His Ser Lys Ile  Thr Thr Ala Met Asn  Asn Asp Val
4655                 4660                 4665
Lys Asp  Val Ser Gln Thr Asn  Pro Pro Phe Gln Asp  Glu Ala Ser
4670                 4675                 4680
Ser Pro  Ser Ser Gln Ala Pro  Val Leu Val Thr Thr  Leu Pro Ser
4685                 4690                 4695
Ser Val  Ala Phe Thr Pro Gln  Trp His Ser Thr Ser  Ser Pro Val
4700                 4705                 4710
Ser Met  Ser Ser Val Leu Thr  Ser Ser Leu Val Lys  Thr Ala Gly
4715                 4720                 4725
Lys Val  Asp Thr Ser Leu Glu  Thr Val Thr Ser Ser  Pro Gln Ser
4730                 4735                 4740
Met Ser  Asn Thr Leu Asp Asp  Ile Ser Val Thr Ser  Ala Ala Thr
4745                 4750                 4755
Thr Asp  Ile Glu Thr Thr His  Pro Ser Ile Asn Thr  Val Val Thr
4760                 4765                 4770
Asn Val  Gly Thr Thr Gly Ser  Ala Phe Glu Ser His  Ser Thr Val
4775                 4780                 4785
Ser Ala  Tyr Pro Glu Pro Ser  Lys Val Thr Ser Pro  Asn Val Thr
4790                 4795                 4800
Thr Ser  Thr Met Glu Asp Thr  Thr Ile Ser Arg Ser  Ile Pro Lys
4805                 4810                 4815
Ser Ser  Lys Thr Thr Arg Thr  Glu Thr Glu Thr Thr  Ser Ser Leu
4820                 4825                 4830
Thr Pro  Lys Leu Arg Glu Thr  Ser Ile Ser Gln Glu  Ile Thr Ser
4835                 4840                 4845
Ser Thr  Glu Thr Ser Thr Val  Pro Tyr Lys Glu Leu  Thr Gly Ala
4850                 4855                 4860
Thr Thr  Glu Val Ser Arg Thr  Asp Val Thr Ser Ser  Ser Ser Thr
4865                 4870                 4875
Ser Phe  Pro Gly Pro Asp Gln  Ser Thr Val Ser Leu  Asp Ile Ser
4880                 4885                 4890
Thr Glu  Thr Asn Thr Arg Leu  Ser Thr Ser Pro Ile  Met Thr Glu
4895                 4900                 4905
Ser Ala  Glu Ile Thr Ile Thr  Thr Gln Thr Gly Pro  His Gly Ala
4910                 4915                 4920
Thr Ser  Gln Asp Thr Phe Thr  Met Asp Pro Ser Asn  Thr Thr Pro
4925                 4930                 4935
Gln Ala  Gly Ile His Ser Ala  Met Thr His Gly Phe  Ser Gln Leu
4940                 4945                 4950
Asp Val  Thr Thr Leu Met Ser  Arg Ile Pro Gln Asp  Val Ser Trp
4955                 4960                 4965
Thr Ser  Pro Pro Ser Val Asp  Lys Thr Ser Ser Pro  Ser Ser Phe
4970                 4975                 4980
Leu Ser  Ser Pro Ala Met Thr  Thr Pro Ser Leu Ile  Ser Ser Thr
4985                 4990                 4995
Leu Pro  Glu Asp Lys Leu Ser  Ser Pro Met Thr Ser  Leu Leu Thr
5000                 5005                 5010
Ser Gly  Leu Val Lys Ile Thr  Asp Ile Leu Arg Thr  Arg Leu Glu
5015                 5020                 5025
Pro Val  Thr Ser Ser Leu Pro  Asn Phe Ser Ser Thr  Ser Asp Lys
5030                 5035                 5040
Ile Leu  Ala Thr Ser Lys Asp  Ser Lys Asp Thr Lys  Glu Ile Phe
5045                 5050                 5055
Pro Ser  Ile Asn Thr Glu Glu  Thr Asn Val Lys Ala  Asn Asn Ser
5060                 5065                 5070
Gly His  Glu Ser His Ser Pro  Ala Leu Ala Asp Ser  Glu Thr Pro
5075                 5080                 5085
Lys Ala  Thr Thr Gln Met Val  Ile Thr Thr Thr Val  Gly Asp Pro
5090                 5095                 5100
Ala Pro  Ser Thr Ser Met Pro  Val His Gly Ser Ser  Glu Thr Thr
5105                 5110                 5115
Asn Ile  Lys Arg Glu Pro Thr  Tyr Phe Leu Thr Pro  Arg Leu Arg
5120                 5125                 5130
Glu Thr  Ser Thr Ser Gln Glu  Ser Ser Phe Pro Thr  Asp Thr Ser
5135                 5140                 5145
Phe Leu  Leu Ser Lys Val Pro  Thr Gly Thr Ile Thr  Glu Val Ser
5150                 5155                 5160
Ser Thr  Gly Val Asn Ser Ser  Ser Lys Ile Ser Thr  Pro Asp His
5165                 5170                 5175
Asp Lys  Ser Thr Val Pro Pro  Asp Thr Phe Thr Gly  Glu Ile Pro
5180                 5185                 5190
Arg Val  Phe Thr Ser Ser Ile  Lys Thr Lys Ser Ala  Glu Met Thr
5195                 5200                 5205
Ile Thr  Thr Gln Ala Ser Pro  Pro Glu Ser Ala Ser  His Ser Thr
5210                 5215                 5220
Leu Pro  Leu Asp Thr Ser Thr  Thr Leu Ser Gln Gly  Gly Thr His
5225                 5230                 5235
Ser Thr  Val Thr Gln Gly Phe  Pro Tyr Ser Glu Val  Thr Thr Leu
5240                 5245                 5250
Met Gly  Met Gly Pro Gly Asn  Val Ser Trp Met Thr  Thr Pro Pro
5255                 5260                 5265
Val Glu  Glu Thr Ser Ser Val  Ser Ser Leu Met Ser  Ser Pro Ala
5270                 5275                 5280
Met Thr  Ser Pro Ser Pro Val  Ser Ser Thr Ser Pro  Gln Ser Ile
5285                 5290                 5295
Pro Ser  Ser Pro Leu Pro Val  Thr Ala Leu Pro Thr  Ser Val Leu
5300                 5305                 5310
Val Thr  Thr Thr Asp Val Leu  Gly Thr Thr Ser Pro  Glu Ser Val
5315                 5320                 5325
Thr Ser  Ser Pro Pro Asn Leu  Ser Ser Ile Thr His  Glu Arg Pro
5330                 5335                 5340
Ala Thr  Tyr Lys Asp Thr Ala  His Thr Glu Ala Ala  Met His His
5345                 5350                 5355
Ser Thr  Asn Thr Ala Val Thr  Asn Val Gly Thr Ser  Gly Ser Gly
5360                 5365                 5370
His Lys  Ser Gln Ser Ser Val  Leu Ala Asp Ser Glu  Thr Ser Lys
5375                 5380                 5385
Ala Thr  Pro Leu Met Ser Thr  Thr Ser Thr Leu Gly  Asp Thr Ser
5390                 5395                 5400
Val Ser  Thr Ser Thr Pro Asn  Ile Ser Gln Thr Asn  Gln Ile Gln
5405                 5410                 5415
Thr Glu  Pro Thr Ala Ser Leu  Ser Pro Arg Leu Arg  Glu Ser Ser
5420                 5425                 5430
Thr Ser  Glu Lys Thr Ser Ser  Thr Thr Glu Thr Asn  Thr Ala Phe
5435                 5440                 5445
Ser Tyr  Val Pro Thr Gly Ala  Ile Thr Gln Ala Ser  Arg Thr Glu
5450                 5455                 5460
Ile Ser  Ser Ser Arg Thr Ser  Ile Ser Asp Leu Asp  Arg Pro Thr
5465                 5470                 5475
Ile Ala  Pro Asp Ile Ser Thr  Gly Met Ile Thr Arg  Leu Phe Thr
5480                 5485                 5490
Ser Pro  Ile Met Thr Lys Ser  Ala Glu Met Thr Val  Thr Thr Gln
5495                 5500                 5505
Thr Thr  Thr Pro Gly Ala Thr  Ser Gln Gly Ile Leu  Pro Trp Asp
5510                 5515                 5520
Thr Ser  Thr Thr Leu Phe Gln  Gly Gly Thr His Ser  Thr Val Ser
5525                 5530                 5535
Gln Gly  Phe Pro His Ser Glu  Ile Thr Thr Leu Arg  Ser Arg Thr
5540                 5545                 5550
Pro Gly  Asp Val Ser Trp Met  Thr Thr Pro Pro Val  Glu Glu Thr
5555                 5560                 5565
Ser Ser  Gly Phe Ser Leu Met  Ser Pro Ser Met Thr  Ser Pro Ser
5570                 5575                 5580
Pro Val  Ser Ser Thr Ser Pro  Glu Ser Ile Pro Ser  Ser Pro Leu
5585                 5590                 5595
Pro Val  Thr Ala Leu Leu Thr  Ser Val Leu Val Thr  Thr Thr Asn
5600                 5605                 5610
Val Leu  Gly Thr Thr Ser Pro  Glu Pro Val Thr Ser  Ser Pro Pro
5615                 5620                 5625
Asn Leu  Ser Ser Pro Thr Gln  Glu Arg Leu Thr Thr  Tyr Lys Asp
5630                 5635                 5640
Thr Ala  His Thr Glu Ala Met  His Ala Ser Met His  Thr Asn Thr
5645                 5650                 5655
Ala Val  Ala Asn Val Gly Thr  Ser Ile Ser Gly His  Glu Ser Gln
5660                 5665                 5670
Ser Ser  Val Pro Ala Asp Ser  His Thr Ser Lys Ala  Thr Ser Pro
5675                 5680                 5685
Met Gly  Ile Thr Phe Ala Met  Gly Asp Thr Ser Val  Ser Thr Ser
5690                 5695                 5700
Thr Pro  Ala Phe Phe Glu Thr  Arg Ile Gln Thr Glu  Ser Thr Ser
5705                 5710                 5715
Ser Leu  Ile Pro Gly Leu Arg  Asp Thr Arg Thr Ser  Glu Glu Ile
5720                 5725                 5730
Asn Thr  Val Thr Glu Thr Ser  Thr Val Leu Ser Glu  Val Pro Thr
5735                 5740                 5745
Thr Thr  Thr Thr Glu Val Ser  Arg Thr Glu Val Ile  Thr Ser Ser
5750                 5755                 5760
Arg Thr  Thr Ile Ser Gly Pro  Asp His Ser Lys Met  Ser Pro Tyr
5765                 5770                 5775
Ile Ser  Thr Glu Thr Ile Thr  Arg Leu Ser Thr Phe  Pro Phe Val
5780                 5785                 5790
Thr Gly  Ser Thr Glu Met Ala  Ile Thr Asn Gln Thr  Gly Pro Ile
5795                 5800                 5805
Gly Thr  Ile Ser Gln Ala Thr  Leu Thr Leu Asp Thr  Ser Ser Thr
5810                 5815                 5820
Ala Ser  Trp Glu Gly Thr His  Ser Pro Val Thr Gln  Arg Phe Pro
5825                 5830                 5835
His Ser  Glu Glu Thr Thr Thr  Met Ser Arg Ser Thr  Lys Gly Val
5840                 5845                 5850
Ser Trp  Gln Ser Pro Pro Ser  Val Glu Glu Thr Ser  Ser Pro Ser
5855                 5860                 5865
Ser Pro  Val Pro Leu Pro Ala  Ile Thr Ser His Ser  Ser Leu Tyr
5870                 5875                 5880
Ser Ala  Val Ser Gly Ser Ser  Pro Thr Ser Ala Leu  Pro Val Thr
5885                 5890                 5895
Ser Leu  Leu Thr Ser Gly Arg  Arg Lys Thr Ile Asp  Met Leu Asp
5900                 5905                 5910
Thr His  Ser Glu Leu Val Thr  Ser Ser Leu Pro Ser  Ala Ser Ser
5915                 5920                 5925
Phe Ser  Gly Glu Ile Leu Thr  Ser Glu Ala Ser Thr  Asn Thr Glu
5930                 5935                 5940
Thr Ile  His Phe Ser Glu Asn  Thr Ala Glu Thr Asn  Met Gly Thr
5945                 5950                 5955
Thr Asn  Ser Met His Lys Leu  His Ser Ser Val Ser  Ile His Ser
5960                 5965                 5970
Gln Pro  Ser Gly His Thr Pro  Pro Lys Val Thr Gly  Ser Met Met
5975                 5980                 5985
Glu Asp  Ala Ile Val Ser Thr  Ser Thr Pro Gly Ser  Pro Glu Thr
5990                 5995                 6000
Lys Asn  Val Asp Arg Asp Ser  Thr Ser Pro Leu Thr  Pro Glu Leu
6005                 6010                 6015
Lys Glu  Asp Ser Thr Ala Leu  Val Met Asn Ser Thr  Thr Glu Ser
6020                 6025                 6030
Asn Thr  Val Phe Ser Ser Val  Ser Leu Asp Ala Ala  Thr Glu Val
6035                 6040                 6045
Ser Arg  Ala Glu Val Thr Tyr  Tyr Asp Pro Thr Phe  Met Pro Ala
6050                 6055                 6060
Ser Ala  Gln Ser Thr Lys Ser  Pro Asp Ile Ser Pro  Glu Ala Ser
6065                 6070                 6075
Ser Ser  His Ser Asn Ser Pro  Pro Leu Thr Ile Ser  Thr His Lys
6080                 6085                 6090
Thr Ile  Ala Thr Gln Thr Gly  Pro Ser Gly Val Thr  Ser Leu Gly
6095                 6100                 6105
Gln Leu  Thr Leu Asp Thr Ser  Thr Ile Ala Thr Ser  Ala Gly Thr
6110                 6115                 6120
Pro Ser  Ala Arg Thr Gln Asp  Phe Val Asp Ser Glu  Thr Thr Ser
6125                 6130                 6135
Val Met  Asn Asn Asp Leu Asn  Asp Val Leu Lys Thr  Ser Pro Phe
6140                 6145                 6150
Ser Ala  Glu Glu Ala Asn Ser  Leu Ser Ser Gln Ala  Pro Leu Leu
6155                 6160                 6165
Val Thr  Thr Ser Pro Ser Pro  Val Thr Ser Thr Leu  Gln Glu His
6170                 6175                 6180
Ser Thr  Ser Ser Leu Val Ser  Val Thr Ser Val Pro  Thr Pro Thr
6185                 6190                 6195
Leu Ala  Lys Ile Thr Asp Met  Asp Thr Asn Leu Glu  Pro Val Thr
6200                 6205                 6210
Arg Ser  Pro Gln Asn Leu Arg  Asn Thr Leu Ala Thr  Ser Glu Ala
6215                 6220                 6225
Thr Thr  Asp Thr His Thr Met  His Pro Ser Ile Asn  Thr Ala Val
6230                 6235                 6240
Ala Asn  Val Gly Thr Thr Ser  Ser Pro Asn Glu Phe  Tyr Phe Thr
6245                 6250                 6255
Val Ser  Pro Asp Ser Asp Pro  Tyr Lys Ala Thr Ser  Ala Val Val
6260                 6265                 6270
Ile Thr  Ser Thr Ser Gly Asp  Ser Ile Val Ser Thr  Ser Met Pro
6275                 6280                 6285
Arg Ser  Ser Ala Met Lys Lys  Ile Glu Ser Glu Thr  Thr Phe Ser
6290                 6295                 6300
Leu Ile  Phe Arg Leu Arg Glu  Thr Ser Thr Ser Gln  Lys Ile Gly
6305                 6310                 6315
Ser Ser  Ser Asp Thr Ser Thr  Val Phe Asp Lys Ala  Phe Thr Ala
6320                 6325                 6330
Ala Thr  Thr Glu Val Ser Arg  Thr Glu Leu Thr Ser  Ser Ser Arg
6335                 6340                 6345
Thr Ser  Ile Gln Gly Thr Glu  Lys Pro Thr Met Ser  Pro Asp Thr
6350                 6355                 6360
Ser Thr  Arg Ser Val Thr Met  Leu Ser Thr Phe Ala  Gly Leu Thr
6365                 6370                 6375
Lys Ser  Glu Glu Arg Thr Ile  Ala Thr Gln Thr Gly  Pro His Arg
6380                 6385                 6390
Ala Thr  Ser Gln Gly Thr Leu  Thr Trp Asp Thr Ser  Ile Thr Thr
6395                 6400                 6405
Ser Gln  Ala Gly Thr His Ser  Ala Met Thr His Gly  Phe Ser Gln
6410                 6415                 6420
Leu Asp  Leu Ser Thr Leu Thr  Ser Arg Val Pro Glu  Tyr Ile Ser
6425                 6430                 6435
Gly Thr  Ser Pro Pro Ser Val  Glu Lys Thr Ser Ser  Ser Ser Ser
6440                 6445                 6450
Leu Leu  Ser Leu Pro Ala Ile  Thr Ser Pro Ser Pro  Val Pro Thr
6455                 6460                 6465
Thr Leu  Pro Glu Ser Arg Pro  Ser Ser Pro Val His  Leu Thr Ser
6470                 6475                 6480
Leu Pro  Thr Ser Gly Leu Val  Lys Thr Thr Asp Met  Leu Ala Ser
6485                 6490                 6495
Val Ala  Ser Leu Pro Pro Asn  Leu Gly Ser Thr Ser  His Lys Ile
6500                 6505                 6510
Pro Thr  Thr Ser Glu Asp Ile  Lys Asp Thr Glu Lys  Met Tyr Pro
6515                 6520                 6525
Ser Thr  Asn Ile Ala Val Thr  Asn Val Gly Thr Thr  Thr Ser Glu
6530                 6535                 6540
Lys Glu  Ser Tyr Ser Ser Val  Pro Ala Tyr Ser Glu  Pro Pro Lys
6545                 6550                 6555
Val Thr  Ser Pro Met Val Thr  Ser Phe Asn Ile Arg  Asp Thr Ile
6560                 6565                 6570
Val Ser  Thr Ser Met Pro Gly  Ser Ser Glu Ile Thr  Arg Ile Glu
6575                 6580                 6585
Met Glu  Ser Thr Phe Ser Leu  Ala His Gly Leu Lys  Gly Thr Ser
6590                 6595                 6600
Thr Ser  Gln Asp Pro Ile Val  Ser Thr Glu Lys Ser  Ala Val Leu
6605                 6610                 6615
His Lys  Leu Thr Thr Gly Ala  Thr Glu Thr Ser Arg  Thr Glu Val
6620                 6625                 6630
Ala Ser  Ser Arg Arg Thr Ser  Ile Pro Gly Pro Asp  His Ser Thr
6635                 6640                 6645
Glu Ser  Pro Asp Ile Ser Thr  Glu Val Ile Pro Ser  Leu Pro Ile
6650                 6655                 6660
Ser Leu  Gly Ile Thr Glu Ser  Ser Asn Met Thr Ile  Ile Thr Arg
6665                 6670                 6675
Thr Gly  Pro Pro Leu Gly Ser  Thr Ser Gln Gly Thr  Phe Thr Leu
6680                 6685                 6690
Asp Thr  Pro Thr Thr Ser Ser  Arg Ala Gly Thr His  Ser Met Ala
6695                 6700                 6705
Thr Gln  Glu Phe Pro His Ser  Glu Met Thr Thr Val  Met Asn Lys
6710                 6715                 6720
Asp Pro  Glu Ile Leu Ser Trp  Thr Ile Pro Pro Ser  Ile Glu Lys
6725                 6730                 6735
Thr Ser  Phe Ser Ser Ser Leu  Met Pro Ser Pro Ala  Met Thr Ser
6740                 6745                 6750
Pro Pro  Val Ser Ser Thr Leu  Pro Lys Thr Ile His  Thr Thr Pro
6755                 6760                 6765
Ser Pro  Met Thr Ser Leu Leu  Thr Pro Ser Leu Val  Met Thr Thr
6770                 6775                 6780
Asp Thr  Leu Gly Thr Ser Pro  Glu Pro Thr Thr Ser  Ser Pro Pro
6785                 6790                 6795
Asn Leu  Ser Ser Thr Ser His  Glu Ile Leu Thr Thr  Asp Glu Asp
6800                 6805                 6810
Thr Thr  Ala Ile Glu Ala Met  His Pro Ser Thr Ser  Thr Ala Ala
6815                 6820                 6825
Thr Asn  Val Glu Thr Thr Ser  Ser Gly His Gly Ser  Gln Ser Ser
6830                 6835                 6840
Val Leu  Ala Asp Ser Glu Lys  Thr Lys Ala Thr Ala  Pro Met Asp
6845                 6850                 6855
Thr Thr  Ser Thr Met Gly His  Thr Thr Val Ser Thr  Ser Met Ser
6860                 6865                 6870
Val Ser  Ser Glu Thr Thr Lys  Ile Lys Arg Glu Ser  Thr Tyr Ser
6875                 6880                 6885
Leu Thr  Pro Gly Leu Arg Glu  Thr Ser Ile Ser Gln  Asn Ala Ser
6890                 6895                 6900
Phe Ser  Thr Asp Thr Ser Ile  Val Leu Ser Glu Val  Pro Thr Gly
6905                 6910                 6915
Thr Thr  Ala Glu Val Ser Arg  Thr Glu Val Thr Ser  Ser Gly Arg
6920                 6925                 6930
Thr Ser  Ile Pro Gly Pro Ser  Gln Ser Thr Val Leu  Pro Glu Ile
6935                 6940                 6945
Ser Thr  Arg Thr Met Thr Arg  Leu Phe Ala Ser Pro  Thr Met Thr
6950                 6955                 6960
Glu Ser  Ala Glu Met Thr Ile  Pro Thr Gln Thr Gly  Pro Ser Gly
6965                 6970                 6975
Ser Thr  Ser Gln Asp Thr Leu  Thr Leu Asp Thr Ser  Thr Thr Lys
6980                 6985                 6990
Ser Gln  Ala Lys Thr His Ser  Thr Leu Thr Gln Arg  Phe Pro His
6995                 7000                 7005
Ser Glu  Met Thr Thr Leu Met  Ser Arg Gly Pro Gly  Asp Met Ser
7010                 7015                 7020
Trp Gln  Ser Ser Pro Ser Leu  Glu Asn Pro Ser Ser  Leu Pro Ser
7025                 7030                 7035
Leu Leu  Ser Leu Pro Ala Thr  Thr Ser Pro Pro Pro  Ile Ser Ser
7040                 7045                 7050
Thr Leu  Pro Val Thr Ile Ser  Ser Ser Pro Leu Pro  Val Thr Ser
7055                 7060                 7065
Leu Leu  Thr Ser Ser Pro Val  Thr Thr Thr Asp Met  Leu His Thr
7070                 7075                 7080
Ser Pro  Glu Leu Val Thr Ser  Ser Pro Pro Lys Leu  Ser His Thr
7085                 7090                 7095
Ser Asp  Glu Arg Leu Thr Thr  Gly Lys Asp Thr Thr  Asn Thr Glu
7100                 7105                 7110
Ala Val  His Pro Ser Thr Asn  Thr Ala Ala Ser Asn  Val Glu Ile
7115                 7120                 7125
Pro Ser  Ser Gly His Glu Ser  Pro Ser Ser Ala Leu  Ala Asp Ser
7130                 7135                 7140
Glu Thr  Ser Lys Ala Thr Ser  Pro Met Phe Ile Thr  Ser Thr Gln
7145                 7150                 7155
Glu Asp  Thr Thr Val Ala Ile  Ser Thr Pro His Phe  Leu Glu Thr
7160                 7165                 7170
Ser Arg  Ile Gln Lys Glu Ser  Ile Ser Ser Leu Ser  Pro Lys Leu
7175                 7180                 7185
Arg Glu  Thr Gly Ser Ser Val  Glu Thr Ser Ser Ala  Ile Glu Thr
7190                 7195                 7200
Ser Ala  Val Leu Ser Glu Val  Ser Ile Gly Ala Thr  Thr Glu Ile
7205                 7210                 7215
Ser Arg  Thr Glu Val Thr Ser  Ser Ser Arg Thr Ser  Ile Ser Gly
7220                 7225                 7230
Ser Ala  Glu Ser Thr Met Leu  Pro Glu Ile Ser Thr  Thr Arg Lys
7235                 7240                 7245
Ile Ile  Lys Phe Pro Thr Ser  Pro Ile Leu Ala Glu  Ser Ser Glu
7250                 7255                 7260
Met Thr  Ile Lys Thr Gln Thr  Ser Pro Pro Gly Ser  Thr Ser Glu
7265                 7270                 7275
Ser Thr  Phe Thr Leu Asp Thr  Ser Thr Thr Pro Ser  Leu Val Ile
7280                 7285                 7290
Thr His  Ser Thr Met Thr Gln  Arg Leu Pro His Ser  Glu Ile Thr
7295                 7300                 7305
Thr Leu  Val Ser Arg Gly Ala  Gly Asp Val Pro Arg  Pro Ser Ser
7310                 7315                 7320
Leu Pro  Val Glu Glu Thr Ser  Pro Pro Ser Ser Gln  Leu Ser Leu
7325                 7330                 7335
Ser Ala  Met Ile Ser Pro Ser  Pro Val Ser Ser Thr  Leu Pro Ala
7340                 7345                 7350
Ser Ser  His Ser Ser Ser Ala  Ser Val Thr Ser Leu  Leu Thr Pro
7355                 7360                 7365
Gly Gln  Val Lys Thr Thr Glu  Val Leu Asp Ala Ser  Ala Glu Pro
7370                 7375                 7380
Glu Thr  Ser Ser Pro Pro Ser  Leu Ser Ser Thr Ser  Val Glu Ile
7385                 7390                 7395
Leu Ala  Thr Ser Glu Val Thr  Thr Asp Thr Glu Lys  Ile His Pro
7400                 7405                 7410
Phe Ser  Asn Thr Ala Val Thr  Lys Val Gly Thr Ser  Ser Ser Gly
7415                 7420                 7425
His Glu  Ser Pro Ser Ser Val  Leu Pro Asp Ser Glu  Thr Thr Lys
7430                 7435                 7440
Ala Thr  Ser Ala Met Gly Thr  Ile Ser Ile Met Gly  Asp Thr Ser
7445                 7450                 7455
Val Ser  Thr Leu Thr Pro Ala  Leu Ser Asn Thr Arg  Lys Ile Gln
7460                 7465                 7470
Ser Glu  Pro Ala Ser Ser Leu  Thr Thr Arg Leu Arg  Glu Thr Ser
7475                 7480                 7485
Thr Ser  Glu Glu Thr Ser Leu  Ala Thr Glu Ala Asn  Thr Val Leu
7490                 7495                 7500
Ser Lys  Val Ser Thr Gly Ala  Thr Thr Glu Val Ser  Arg Thr Glu
7505                 7510                 7515
Ala Ile  Ser Phe Ser Arg Thr  Ser Met Ser Gly Pro  Glu Gln Ser
7520                 7525                 7530
Thr Met  Ser Gln Asp Ile Ser  Ile Gly Thr Ile Pro  Arg Ile Ser
7535                 7540                 7545
Ala Ser  Ser Val Leu Thr Glu  Ser Ala Lys Met Thr  Ile Thr Thr
7550                 7555                 7560
Gln Thr  Gly Pro Ser Glu Ser  Thr Leu Glu Ser Thr  Leu Asn Leu
7565                 7570                 7575
Asn Thr  Ala Thr Thr Pro Ser  Trp Val Glu Thr His  Ser Ile Val
7580                 7585                 7590
Ile Gln  Gly Phe Pro His Pro  Glu Met Thr Thr Ser  Met Gly Arg
7595                 7600                 7605
Gly Pro  Gly Gly Val Ser Trp  Pro Ser Pro Pro Phe  Val Lys Glu
7610                 7615                 7620
Thr Ser  Pro Pro Ser Ser Pro  Leu Ser Leu Pro Ala  Val Thr Ser
7625                 7630                 7635
Pro His  Pro Val Ser Thr Thr  Phe Leu Ala His Ile  Pro Pro Ser
7640                 7645                 7650
Pro Leu  Pro Val Thr Ser Leu  Leu Thr Ser Gly Pro  Ala Thr Thr
7655                 7660                 7665
Thr Asp  Ile Leu Gly Thr Ser  Thr Glu Pro Gly Thr  Ser Ser Ser
7670                 7675                 7680
Ser Ser  Leu Ser Thr Thr Ser  His Glu Arg Leu Thr  Thr Tyr Lys
7685                 7690                 7695
Asp Thr  Ala His Thr Glu Ala  Val His Pro Ser Thr  Asn Thr Gly
7700                 7705                 7710
Gly Thr  Asn Val Ala Thr Thr  Ser Ser Gly Tyr Lys  Ser Gln Ser
7715                 7720                 7725
Ser Val  Leu Ala Asp Ser Ser  Pro Met Cys Thr Thr  Ser Thr Met
7730                 7735                 7740
Gly Asp  Thr Ser Val Leu Thr  Ser Thr Pro Ala Phe  Leu Glu Thr
7745                 7750                 7755
Arg Arg  Ile Gln Thr Glu Leu  Ala Ser Ser Leu Thr  Pro Gly Leu
7760                 7765                 7770
Arg Glu  Ser Ser Gly Ser Glu  Gly Thr Ser Ser Gly  Thr Lys Met
7775                 7780                 7785
Ser Thr  Val Leu Ser Lys Val  Pro Thr Gly Ala Thr  Thr Glu Ile
7790                 7795                 7800
Ser Lys  Glu Asp Val Thr Ser  Ile Pro Gly Pro Ala  Gln Ser Thr
7805                 7810                 7815
Ile Ser  Pro Asp Ile Ser Thr  Arg Thr Val Ser Trp  Phe Ser Thr
7820                 7825                 7830
Ser Pro  Val Met Thr Glu Ser  Ala Glu Ile Thr Met  Asn Thr His
7835                 7840                 7845
Thr Ser  Pro Leu Gly Ala Thr  Thr Gln Gly Thr Ser  Thr Leu Asp
7850                 7855                 7860
Thr Ser  Ser Thr Thr Ser Leu  Thr Met Thr His Ser  Thr Ile Ser
7865                 7870                 7875
Gln Gly  Phe Ser His Ser Gln  Met Ser Thr Leu Met  Arg Arg Gly
7880                 7885                 7890
Pro Glu  Asp Val Ser Trp Met  Ser Pro Pro Leu Leu  Glu Lys Thr
7895                 7900                 7905
Arg Pro  Ser Phe Ser Leu Met  Ser Ser Pro Ala Thr  Thr Ser Pro
7910                 7915                 7920
Ser Pro  Val Ser Ser Thr Leu  Pro Glu Ser Ile Ser  Ser Ser Pro
7925                 7930                 7935
Leu Pro  Val Thr Ser Leu Leu  Thr Ser Gly Leu Ala  Lys Thr Thr
7940                 7945                 7950
Asp Met  Leu His Lys Ser Ser  Glu Pro Val Thr Asn  Ser Pro Ala
7955                 7960                 7965
Asn Leu  Ser Ser Thr Ser Val  Glu Ile Leu Ala Thr  Ser Glu Val
7970                 7975                 7980
Thr Thr  Asp Thr Glu Lys Thr  His Pro Ser Ser Asn  Arg Thr Val
7985                 7990                 7995
Thr Asp  Val Gly Thr Ser Ser  Ser Gly His Glu Ser  Thr Ser Phe
8000                 8005                 8010
Val Leu  Ala Asp Ser Gln Thr  Ser Lys Val Thr Ser  Pro Met Val
8015                 8020                 8025
Ile Thr  Ser Thr Met Glu Asp  Thr Ser Val Ser Thr  Ser Thr Pro
8030                 8035                 8040
Gly Phe  Phe Glu Thr Ser Arg  Ile Gln Thr Glu Pro  Thr Ser Ser
8045                 8050                 8055
Leu Thr  Leu Gly Leu Arg Lys  Thr Ser Ser Ser Glu  Gly Thr Ser
8060                 8065                 8070
Leu Ala  Thr Glu Met Ser Thr  Val Leu Ser Gly Val  Pro Thr Gly
8075                 8080                 8085
Ala Thr  Ala Glu Val Ser Arg  Thr Glu Val Thr Ser  Ser Ser Arg
8090                 8095                 8100
Thr Ser  Ile Ser Gly Phe Ala  Gln Leu Thr Val Ser  Pro Glu Thr
8105                 8110                 8115
Ser Thr  Glu Thr Ile Thr Arg  Leu Pro Thr Ser Ser  Ile Met Thr
8120                 8125                 8130
Glu Ser  Ala Glu Met Met Ile  Lys Thr Gln Thr Asp  Pro Pro Gly
8135                 8140                 8145
Ser Thr  Pro Glu Ser Thr His  Thr Val Asp Ile Ser  Thr Thr Pro
8150                 8155                 8160
Asn Trp  Val Glu Thr His Ser  Thr Val Thr Gln Arg  Phe Ser His
8165                 8170                 8175
Ser Glu  Met Thr Thr Leu Val  Ser Arg Ser Pro Gly  Asp Met Leu
8180                 8185                 8190
Trp Pro  Ser Gln Ser Ser Val  Glu Glu Thr Ser Ser  Ala Ser Ser
8195                 8200                 8205
Leu Leu  Ser Leu Pro Ala Thr  Thr Ser Pro Ser Pro  Val Ser Ser
8210                 8215                 8220
Thr Leu  Val Glu Asp Phe Pro  Ser Ala Ser Leu Pro  Val Thr Ser
8225                 8230                 8235
Leu Leu  Asn Pro Gly Leu Val  Ile Thr Thr Asp Arg  Met Gly Ile
8240                 8245                 8250
Ser Arg  Glu Pro Gly Thr Ser  Ser Thr Ser Asn Leu  Ser Ser Thr
8255                 8260                 8265
Ser His  Glu Arg Leu Thr Thr  Leu Glu Asp Thr Val  Asp Thr Glu
8270                 8275                 8280
Asp Met  Gln Pro Ser Thr His  Thr Ala Val Thr Asn  Val Arg Thr
8285                 8290                 8295
Ser Ile  Ser Gly His Glu Ser  Gln Ser Ser Val Leu  Ser Asp Ser
8300                 8305                 8310
Glu Thr  Pro Lys Ala Thr Ser  Pro Met Gly Thr Thr  Tyr Thr Met
8315                 8320                 8325
Gly Glu  Thr Ser Val Ser Ile  Ser Thr Ser Asp Phe  Phe Glu Thr
8330                 8335                 8340
Ser Arg  Ile Gln Ile Glu Pro  Thr Ser Ser Leu Thr  Ser Gly Leu
8345                 8350                 8355
Arg Glu  Thr Ser Ser Ser Glu  Arg Ile Ser Ser Ala  Thr Glu Gly
8360                 8365                 8370
Ser Thr  Val Leu Ser Glu Val  Pro Ser Gly Ala Thr  Thr Glu Val
8375                 8380                 8385
Ser Arg  Thr Glu Val Ile Ser  Ser Arg Gly Thr Ser  Met Ser Gly
8390                 8395                 8400
Pro Asp  Gln Phe Thr Ile Ser  Pro Asp Ile Ser Thr  Glu Ala Ile
8405                 8410                 8415
Thr Arg  Leu Ser Thr Ser Pro  Ile Met Thr Glu Ser  Ala Glu Ser
8420                 8425                 8430
Ala Ile  Thr Ile Glu Thr Gly  Ser Pro Gly Ala Thr  Ser Glu Gly
8435                 8440                 8445
Thr Leu  Thr Leu Asp Thr Ser  Thr Thr Thr Phe Trp  Ser Gly Thr
8450                 8455                 8460
His Ser  Thr Ala Ser Pro Gly  Phe Ser His Ser Glu  Met Thr Thr
8465                 8470                 8475
Leu Met  Ser Arg Thr Pro Gly  Asp Val Pro Trp Pro  Ser Leu Pro
8480                 8485                 8490
Ser Val  Glu Glu Ala Ser Ser  Val Ser Ser Ser Leu  Ser Ser Pro
8495                 8500                 8505
Ala Met  Thr Ser Thr Ser Phe  Phe Ser Thr Leu Pro  Glu Ser Ile
8510                 8515                 8520
Ser Ser  Ser Pro His Pro Val  Thr Ala Leu Leu Thr  Leu Gly Pro
8525                 8530                 8535
Val Lys  Thr Thr Asp Met Leu  Arg Thr Ser Ser Glu  Pro Glu Thr
8540                 8545                 8550
Ser Ser  Pro Pro Asn Leu Ser  Ser Thr Ser Ala Glu  Ile Leu Ala
8555                 8560                 8565
Thr Ser  Glu Val Thr Lys Asp  Arg Glu Lys Ile His  Pro Ser Ser
8570                 8575                 8580
Asn Thr  Pro Val Val Asn Val  Gly Thr Val Ile Tyr  Lys His Leu
8585                 8590                 8595
Ser Pro  Ser Ser Val Leu Ala  Asp Leu Val Thr Thr  Lys Pro Thr
8600                 8605                 8610
Ser Pro  Met Ala Thr Thr Ser  Thr Leu Gly Asn Thr  Ser Val Ser
8615                 8620                 8625
Thr Ser  Thr Pro Ala Phe Pro  Glu Thr Met Met Thr  Gln Pro Thr
8630                 8635                 8640
Ser Ser  Leu Thr Ser Gly Leu  Arg Glu Ile Ser Thr  Ser Gln Glu
8645                 8650                 8655
Thr Ser  Ser Ala Thr Glu Arg  Ser Ala Ser Leu Ser  Gly Met Pro
8660                 8665                 8670
Thr Gly  Ala Thr Thr Lys Val  Ser Arg Thr Glu Ala  Leu Ser Leu
8675                 8680                 8685
Gly Arg  Thr Ser Thr Pro Gly  Pro Ala Gln Ser Thr  Ile Ser Pro
8690                 8695                 8700
Glu Ile  Ser Thr Glu Thr Ile  Thr Arg Ile Ser Thr  Pro Leu Thr
8705                 8710                 8715
Thr Thr  Gly Ser Ala Glu Met  Thr Ile Thr Pro Lys  Thr Gly His
8720                 8725                 8730
Ser Gly  Ala Ser Ser Gln Gly  Thr Phe Thr Leu Asp  Thr Ser Ser
8735                 8740                 8745
Arg Ala  Ser Trp Pro Gly Thr  His Ser Ala Ala Thr  His Arg Ser
8750                 8755                 8760
Pro His  Ser Gly Met Thr Thr  Pro Met Ser Arg Gly  Pro Glu Asp
8765                 8770                 8775
Val Ser  Trp Pro Ser Arg Pro  Ser Val Glu Lys Thr  Ser Pro Pro
8780                 8785                 8790
Ser Ser  Leu Val Ser Leu Ser  Ala Val Thr Ser Pro  Ser Pro Leu
8795                 8800                 8805
Tyr Ser  Thr Pro Ser Glu Ser  Ser His Ser Ser Pro  Leu Arg Val
8810                 8815                 8820
Thr Ser  Leu Phe Thr Pro Val  Met Met Lys Thr Thr  Asp Met Leu
8825                 8830                 8835
Asp Thr  Ser Leu Glu Pro Val  Thr Thr Ser Pro Pro  Ser Met Asn
8840                 8845                 8850
Ile Thr  Ser Asp Glu Ser Leu  Ala Thr Ser Lys Ala  Thr Met Glu
8855                 8860                 8865
Thr Glu  Ala Ile Gln Leu Ser  Glu Asn Thr Ala Val  Thr Gln Met
8870                 8875                 8880
Gly Thr  Ile Ser Ala Arg Gln  Glu Phe Tyr Ser Ser  Tyr Pro Gly
8885                 8890                 8895
Leu Pro  Glu Pro Ser Lys Val  Thr Ser Pro Val Val  Thr Ser Ser
8900                 8905                 8910
Thr Ile  Lys Asp Ile Val Ser  Thr Thr Ile Pro Ala  Ser Ser Glu
8915                 8920                 8925
Ile Thr  Arg Ile Glu Met Glu  Ser Thr Ser Thr Leu  Thr Pro Thr
8930                 8935                 8940
Pro Arg  Glu Thr Ser Thr Ser  Gln Glu Ile His Ser  Ala Thr Lys
8945                 8950                 8955
Pro Ser  Thr Val Pro Tyr Lys  Ala Leu Thr Ser Ala  Thr Ile Glu
8960                 8965                 8970
Asp Ser  Met Thr Gln Val Met  Ser Ser Ser Arg Gly  Pro Ser Pro
8975                 8980                 8985
Asp Gln  Ser Thr Met Ser Gln  Asp Ile Ser Thr Glu  Val Ile Thr
8990                 8995                 9000
Arg Leu  Ser Thr Ser Pro Ile  Lys Thr Glu Ser Thr  Glu Met Thr
9005                 9010                 9015
Ile Thr  Thr Gln Thr Gly Ser  Pro Gly Ala Thr Ser  Arg Gly Thr
9020                 9025                 9030
Leu Thr  Leu Asp Thr Ser Thr  Thr Phe Met Ser Gly  Thr His Ser
9035                 9040                 9045
Thr Ala  Ser Gln Gly Phe Ser  His Ser Gln Met Thr  Ala Leu Met
9050                 9055                 9060
Ser Arg  Thr Pro Gly Asp Val  Pro Trp Leu Ser His  Pro Ser Val
9065                 9070                 9075
Glu Glu  Ala Ser Ser Ala Ser  Phe Ser Leu Ser Ser  Pro Val Met
9080                 9085                 9090
Thr Ser  Ser Ser Pro Val Ser  Ser Thr Leu Pro Asp  Ser Ile His
9095                 9100                 9105
Ser Ser  Ser Leu Pro Val Thr  Ser Leu Leu Thr Ser  Gly Leu Val
9110                 9115                 9120
Lys Thr  Thr Glu Leu Leu Gly  Thr Ser Ser Glu Pro  Glu Thr Ser
9125                 9130                 9135
Ser Pro  Pro Asn Leu Ser Ser  Thr Ser Ala Glu Ile  Leu Ala Ile
9140                 9145                 9150
Thr Glu  Val Thr Thr Asp Thr  Glu Lys Leu Glu Met  Thr Asn Val
9155                 9160                 9165
Val Thr  Ser Gly Tyr Thr His  Glu Ser Pro Ser Ser  Val Leu Ala
9170                 9175                 9180
Asp Ser  Val Thr Thr Lys Ala  Thr Ser Ser Met Gly  Ile Thr Tyr
9185                 9190                 9195
Pro Thr  Gly Asp Thr Asn Val  Leu Thr Ser Thr Pro  Ala Phe Ser
9200                 9205                 9210
Asp Thr  Ser Arg Ile Gln Thr  Lys Ser Lys Leu Ser  Leu Thr Pro
9215                 9220                 9225
Gly Leu  Met Glu Thr Ser Ile  Ser Glu Glu Thr Ser  Ser Ala Thr
9230                 9235                 9240
Glu Lys  Ser Thr Val Leu Ser  Ser Val Pro Thr Gly  Ala Thr Thr
9245                 9250                 9255
Glu Val  Ser Arg Thr Glu Ala  Ile Ser Ser Ser Arg  Thr Ser Ile
9260                 9265                 9270
Pro Gly  Pro Ala Gln Ser Thr  Met Ser Ser Asp Thr  Ser Met Glu
9275                 9280                 9285
Thr Ile  Thr Arg Ile Ser Thr  Pro Leu Thr Arg Lys  Glu Ser Thr
9290                 9295                 9300
Asp Met  Ala Ile Thr Pro Lys  Thr Gly Pro Ser Gly  Ala Thr Ser
9305                 9310                 9315
Gln Gly  Thr Phe Thr Leu Asp  Ser Ser Ser Thr Ala  Ser Trp Pro
9320                 9325                 9330
Gly Thr  His Ser Ala Thr Thr  Gln Arg Phe Pro Gln  Ser Val Val
9335                 9340                 9345
Thr Thr  Pro Met Ser Arg Gly  Pro Glu Asp Val Ser  Trp Pro Ser
9350                 9355                 9360
Pro Leu  Ser Val Glu Lys Asn  Ser Pro Pro Ser Ser  Leu Val Ser
9365                 9370                 9375
Ser Ser  Ser Val Thr Ser Pro  Ser Pro Leu Tyr Ser  Thr Pro Ser
9380                 9385                 9390
Gly Ser  Ser His Ser Ser Pro  Val Pro Val Thr Ser  Leu Phe Thr
9395                 9400                 9405
Ser Ile  Met Met Lys Ala Thr  Asp Met Leu Asp Ala  Ser Leu Glu
9410                 9415                 9420
Pro Glu  Thr Thr Ser Ala Pro  Asn Met Asn Ile Thr  Ser Asp Glu
9425                 9430                 9435
Ser Leu  Ala Ala Ser Lys Ala  Thr Thr Glu Thr Glu  Ala Ile His
9440                 9445                 9450
Val Phe  Glu Asn Thr Ala Ala  Ser His Val Glu Thr  Thr Ser Ala
9455                 9460                 9465
Thr Glu  Glu Leu Tyr Ser Ser  Ser Pro Gly Phe Ser  Glu Pro Thr
9470                 9475                 9480
Lys Val  Ile Ser Pro Val Val  Thr Ser Ser Ser Ile  Arg Asp Asn
9485                 9490                 9495
Met Val  Ser Thr Thr Met Pro  Gly Ser Ser Gly Ile  Thr Arg Ile
9500                 9505                 9510
Glu Ile  Glu Ser Met Ser Ser  Leu Thr Pro Gly Leu  Arg Glu Thr
9515                 9520                 9525
Arg Thr  Ser Gln Asp Ile Thr  Ser Ser Thr Glu Thr  Ser Thr Val
9530                 9535                 9540
Leu Tyr  Lys Met Pro Ser Gly  Ala Thr Pro Glu Val  Ser Arg Thr
9545                 9550                 9555
Glu Val  Met Pro Ser Ser Arg  Thr Ser Ile Pro Gly  Pro Ala Gln
9560                 9565                 9570
Ser Thr  Met Ser Leu Asp Ile  Ser Asp Glu Val Val  Thr Arg Leu
9575                 9580                 9585
Ser Thr  Ser Pro Ile Met Thr  Glu Ser Ala Glu Ile  Thr Ile Thr
9590                 9595                 9600
Thr Gln  Thr Gly Tyr Ser Leu  Ala Thr Ser Gln Val  Thr Leu Pro
9605                 9610                 9615
Leu Gly  Thr Ser Met Thr Phe  Leu Ser Gly Thr His  Ser Thr Met
9620                 9625                 9630
Ser Gln  Gly Leu Ser His Ser  Glu Met Thr Asn Leu  Met Ser Arg
9635                 9640                 9645
Gly Pro  Glu Ser Leu Ser Trp  Thr Ser Pro Arg Phe  Val Glu Thr
9650                 9655                 9660
Thr Arg  Ser Ser Ser Ser Leu  Thr Ser Leu Pro Leu  Thr Thr Ser
9665                 9670                 9675
Leu Ser  Pro Val Ser Ser Thr  Leu Leu Asp Ser Ser  Pro Ser Ser
9680                 9685                 9690
Pro Leu  Pro Val Thr Ser Leu  Ile Leu Pro Gly Leu  Val Lys Thr
9695                 9700                 9705
Thr Glu  Val Leu Asp Thr Ser  Ser Glu Pro Lys Thr  Ser Ser Ser
9710                 9715                 9720
Pro Asn  Leu Ser Ser Thr Ser  Val Glu Ile Pro Ala  Thr Ser Glu
9725                 9730                 9735
Ile Met  Thr Asp Thr Glu Lys  Ile His Pro Ser Ser  Asn Thr Ala
9740                 9745                 9750
Val Ala  Lys Val Arg Thr Ser  Ser Ser Val His Glu  Ser His Ser
9755                 9760                 9765
Ser Val  Leu Ala Asp Ser Glu  Thr Thr Ile Thr Ile  Pro Ser Met
9770                 9775                 9780
Gly Ile  Thr Ser Ala Val Asp  Asp Thr Thr Val Phe  Thr Ser Asn
9785                 9790                 9795
Pro Ala  Phe Ser Glu Thr Arg  Arg Ile Pro Thr Glu  Pro Thr Phe
9800                 9805                 9810
Ser Leu  Thr Pro Gly Phe Arg  Glu Thr Ser Thr Ser  Glu Glu Thr
9815                 9820                 9825
Thr Ser  Ile Thr Glu Thr Ser  Ala Val Leu Tyr Gly  Val Pro Thr
9830                 9835                 9840
Ser Ala  Thr Thr Glu Val Ser  Met Thr Glu Ile Met  Ser Ser Asn
9845                 9850                 9855
Arg Ile  His Ile Pro Asp Ser  Asp Gln Ser Thr Met  Ser Pro Asp
9860                 9865                 9870
Ile Ile  Thr Glu Val Ile Thr  Arg Leu Ser Ser Ser  Ser Met Met
9875                 9880                 9885
Ser Glu  Ser Thr Gln Met Thr  Ile Thr Thr Gln Lys  Ser Ser Pro
9890                 9895                 9900
Gly Ala  Thr Ala Gln Ser Thr  Leu Thr Leu Ala Thr  Thr Thr Ala
9905                 9910                 9915
Pro Leu  Ala Arg Thr His Ser  Thr Val Pro Pro Arg  Phe Leu His
9920                 9925                 9930
Ser Glu  Met Thr Thr Leu Met  Ser Arg Ser Pro Glu  Asn Pro Ser
9935                 9940                 9945
Trp Lys  Ser Ser Leu Phe Val  Glu Lys Thr Ser Ser  Ser Ser Ser
9950                 9955                 9960
Leu Leu  Ser Leu Pro Val Thr  Thr Ser Pro Ser Val  Ser Ser Thr
9965                 9970                 9975
Leu Pro  Gln Ser Ile Pro Ser  Ser Ser Phe Ser Val  Thr Ser Leu
9980                 9985                 9990
Leu Thr  Pro Gly Met Val Lys   Thr Thr Asp Thr Ser   Thr Glu Pro
9995                 10000                 10005
Gly Thr   Ser Leu Ser Pro Asn   Leu Ser Gly Thr Ser   Val Glu Ile
10010                 10015                 10020
Leu Ala   Ala Ser Glu Val Thr   Thr Asp Thr Glu Lys   Ile His Pro
10025                 10030                 10035
Ser Ser   Ser Met Ala Val Thr   Asn Val Gly Thr Thr   Ser Ser Gly
10040                 10045                 10050
His Glu   Leu Tyr Ser Ser Val   Ser Ile His Ser Glu   Pro Ser Lys
10055                 10060                 10065
Ala Thr   Tyr Pro Val Gly Thr   Pro Ser Ser Met Ala   Glu Thr Ser
10070                 10075                 10080
Ile Ser   Thr Ser Met Pro Ala   Asn Phe Glu Thr Thr   Gly Phe Glu
10085                 10090                 10095
Ala Glu   Pro Phe Ser His Leu   Thr Ser Gly Phe Arg   Lys Thr Asn
10100                 10105                 10110
Met Ser   Leu Asp Thr Ser Ser   Val Thr Pro Thr Asn   Thr Pro Ser
10115                 10120                 10125
Ser Pro   Gly Ser Thr His Leu   Leu Gln Ser Ser Lys   Thr Asp Phe
10130                 10135                 10140
Thr Ser   Ser Ala Lys Thr Ser   Ser Pro Asp Trp Pro   Pro Ala Ser
10145                 10150                 10155
Gln Tyr   Thr Glu Ile Pro Val   Asp Ile Ile Thr Pro   Phe Asn Ala
10160                 10165                 10170
Ser Pro   Ser Ile Thr Glu Ser   Thr Gly Ile Thr Ser   Phe Pro Glu
10175                 10180                 10185
Ser Arg   Phe Thr Met Ser Val   Thr Glu Ser Thr His   His Leu Ser
10190                 10195                 10200
Thr Asp   Leu Leu Pro Ser Ala   Glu Thr Ile Ser Thr   Gly Thr Val
10205                 10210                 10215
Met Pro   Ser Leu Ser Glu Ala   Met Thr Ser Phe Ala   Thr Thr Gly
10220                 10225                 10230
Val Pro   Arg Ala Ile Ser Gly   Ser Gly Ser Pro Phe   Ser Arg Thr
10235                 10240                 10245
Glu Ser   Gly Pro Gly Asp Ala   Thr Leu Ser Thr Ile   Ala Glu Ser
10250                 10255                 10260
Leu Pro   Ser Ser Thr Pro Val   Pro Phe Ser Ser Ser   Thr Phe Thr
10265                 10270                 10275
Thr Thr   Asp Ser Ser Thr Ile   Pro Ala Leu His Glu   Ile Thr Ser
10280                 10285                 10290
Ser Ser   Ala Thr Pro Tyr Arg   Val Asp Thr Ser Leu   Gly Thr Glu
10295                 10300                 10305
Ser Ser   Thr Thr Glu Gly Arg   Leu Val Met Val Ser   Thr Leu Asp
10310                 10315                 10320
Thr Ser   Ser Gln Pro Gly Arg   Thr Ser Ser Ser Pro   Ile Leu Asp
10325                 10330                 10335
Thr Arg   Met Thr Glu Ser Val   Glu Leu Gly Thr Val   Thr Ser Ala
10340                 10345                 10350
Tyr Gln   Val Pro Ser Leu Ser   Thr Arg Leu Thr Arg   Thr Asp Gly
10355                 10360                 10365
Ile Met   Glu His Ile Thr Lys   Ile Pro Asn Glu Ala   Ala His Arg
10370                 10375                 10380
Gly Thr   Ile Arg Pro Val Lys   Gly Pro Gln Thr Ser   Thr Ser Pro
10385                 10390                 10395
Ala Ser   Pro Lys Gly Leu His   Thr Gly Gly Thr Lys   Arg Met Glu
10400                 10405                 10410
Thr Thr   Thr Thr Ala Leu Lys   Thr Thr Thr Thr Ala   Leu Lys Thr
10415                 10420                 10425
Thr Ser   Arg Ala Thr Leu Thr   Thr Ser Val Tyr Thr   Pro Thr Leu
10430                 10435                 10440
Gly Thr   Leu Thr Pro Leu Asn   Ala Ser Met Gln Met   Ala Ser Thr
10445                 10450                 10455
Ile Pro   Thr Glu Met Met Ile   Thr Thr Pro Tyr Val   Phe Pro Asp
10460                 10465                 10470
Val Pro   Glu Thr Thr Ser Ser   Leu Ala Thr Ser Leu   Gly Ala Glu
10475                 10480                 10485
Thr Ser   Thr Ala Leu Pro Arg   Thr Thr Pro Ser Val   Phe Asn Arg
10490                 10495                 10500
Glu Ser   Glu Thr Thr Ala Ser   Leu Val Ser Arg Ser   Gly Ala Glu
10505                 10510                 10515
Arg Ser   Pro Val Ile Gln Thr   Leu Asp Val Ser Ser   Ser Glu Pro
10520                 10525                 10530
Asp Thr   Thr Ala Ser Trp Val   Ile His Pro Ala Glu   Thr Ile Pro
10535                 10540                 10545
Thr Val   Ser Lys Thr Thr Pro   Asn Phe Phe His Ser   Glu Leu Asp
10550                 10555                 10560
Thr Val   Ser Ser Thr Ala Thr   Ser His Gly Ala Asp   Val Ser Ser
10565                 10570                 10575
Ala Ile   Pro Thr Asn Ile Ser   Pro Ser Glu Leu Asp   Ala Leu Thr
10580                 10585                 10590
Pro Leu   Val Thr Ile Ser Gly   Thr Asp Thr Ser Thr   Thr Phe Pro
10595                 10600                 10605
Thr Leu   Thr Lys Ser Pro His   Glu Thr Glu Thr Arg   Thr Thr Trp
10610                 10615                 10620
Leu Thr   His Pro Ala Glu Thr   Ser Ser Thr Ile Pro   Arg Thr Ile
10625                 10630                 10635
Pro Asn   Phe Ser His His Glu   Ser Asp Ala Thr Pro   Ser Ile Ala
10640                 10645                 10650
Thr Ser   Pro Gly Ala Glu Thr   Ser Ser Ala Ile Pro   Ile Met Thr
10655                 10660                 10665
Val Ser   Pro Gly Ala Glu Asp   Leu Val Thr Ser Gln   Val Thr Ser
10670                 10675                 10680
Ser Gly   Thr Asp Arg Asn Met   Thr Ile Pro Thr Leu   Thr Leu Ser
10685                 10690                 10695
Pro Gly   Glu Pro Lys Thr Ile   Ala Ser Leu Val Thr   His Pro Glu
10700                 10705                 10710
Ala Gln   Thr Ser Ser Ala Ile   Pro Thr Ser Thr Ile   Ser Pro Ala
10715                 10720                 10725
Val Ser   Arg Leu Val Thr Ser   Met Val Thr Ser Leu   Ala Ala Lys
10730                 10735                 10740
Thr Ser   Thr Thr Asn Arg Ala   Leu Thr Asn Ser Pro   Gly Glu Pro
10745                 10750                 10755
Ala Thr   Thr Val Ser Leu Val   Thr His Pro Ala Gln   Thr Ser Pro
10760                 10765                 10770
Thr Val   Pro Trp Thr Thr Ser   Ile Phe Phe His Ser   Lys Ser Asp
10775                 10780                 10785
Thr Thr   Pro Ser Met Thr Thr   Ser His Gly Ala Glu   Ser Ser Ser
10790                 10795                 10800
Ala Val   Pro Thr Pro Thr Val   Ser Thr Glu Val Pro   Gly Val Val
10805                 10810                 10815
Thr Pro   Leu Val Thr Ser Ser   Arg Ala Val Ile Ser   Thr Thr Ile
10820                 10825                 10830
Pro Ile   Leu Thr Leu Ser Pro   Gly Glu Pro Glu Thr   Thr Pro Ser
10835                 10840                 10845
Met Ala   Thr Ser His Gly Glu   Glu Ala Ser Ser Ala   Ile Pro Thr
10850                 10855                 10860
Pro Thr   Val Ser Pro Gly Val   Pro Gly Val Val Thr   Ser Leu Val
10865                 10870                 10875
Thr Ser   Ser Arg Ala Val Thr   Ser Thr Thr Ile Pro   Ile Leu Thr
10880                 10885                 10890
Phe Ser   Leu Gly Glu Pro Glu   Thr Thr Pro Ser Met   Ala Thr Ser
10895                 10900                 10905
His Gly   Thr Glu Ala Gly Ser   Ala Val Pro Thr Val   Leu Pro Glu
10910                 10915                 10920
Val Pro   Gly Met Val Thr Ser   Leu Val Ala Ser Ser   Arg Ala Val
10925                 10930                 10935
Thr Ser   Thr Thr Leu Pro Thr   Leu Thr Leu Ser Pro   Gly Glu Pro
10940                 10945                 10950
Glu Thr   Thr Pro Ser Met Ala   Thr Ser His Gly Ala   Glu Ala Ser
10955                 10960                 10965
Ser Thr   Val Pro Thr Val Ser   Pro Glu Val Pro Gly   Val Val Thr
10970                 10975                 10980
Ser Leu   Val Thr Ser Ser Ser   Gly Val Asn Ser Thr   Ser Ile Pro
10985                 10990                 10995
Thr Leu   Ile Leu Ser Pro Gly   Glu Leu Glu Thr Thr   Pro Ser Met
11000                 11005                 11010
Ala Thr   Ser His Gly Ala Glu   Ala Ser Ser Ala Val   Pro Thr Pro
11015                 11020                 11025
Thr Val   Ser Pro Gly Val Ser   Gly Val Val Thr Pro   Leu Val Thr
11030                 11035                 11040
Ser Ser   Arg Ala Val Thr Ser   Thr Thr Ile Pro Ile   Leu Thr Leu
11045                 11050                 11055
Ser Ser   Ser Glu Pro Glu Thr   Thr Pro Ser Met Ala   Thr Ser His
11060                 11065                 11070
Gly Val   Glu Ala Ser Ser Ala   Val Leu Thr Val Ser   Pro Glu Val
11075                 11080                 11085
Pro Gly   Met Val Thr Ser Leu   Val Thr Ser Ser Arg   Ala Val Thr
11090                 11095                 11100
Ser Thr   Thr Ile Pro Thr Leu   Thr Ile Ser Ser Asp   Glu Pro Glu
11105                 11110                 11115
Thr Thr   Thr Ser Leu Val Thr   His Ser Glu Ala Lys   Met Ile Ser
11120                 11125                 11130
Ala Ile   Pro Thr Leu Ala Val   Ser Pro Thr Val Gln   Gly Leu Val
11135                 11140                 11145
Thr Ser   Leu Val Thr Ser Ser   Gly Ser Glu Thr Ser   Ala Phe Ser
11150                 11155                 11160
Asn Leu   Thr Val Ala Ser Ser   Gln Pro Glu Thr Ile   Asp Ser Trp
11165                 11170                 11175
Val Ala   His Pro Gly Thr Glu   Ala Ser Ser Val Val   Pro Thr Leu
11180                 11185                 11190
Thr Val   Ser Thr Gly Glu Pro   Phe Thr Asn Ile Ser   Leu Val Thr
11195                 11200                 11205
His Pro   Ala Glu Ser Ser Ser   Thr Leu Pro Arg Thr   Thr Ser Arg
11210                 11215                 11220
Phe Ser   His Ser Glu Leu Asp   Thr Met Pro Ser Thr   Val Thr Ser
11225                 11230                 11235
Pro Glu   Ala Glu Ser Ser Ser   Ala Ile Ser Thr Thr   Ile Ser Pro
11240                 11245                 11250
Gly Ile   Pro Gly Val Leu Thr   Ser Leu Val Thr Ser   Ser Gly Arg
11255                 11260                 11265
Asp Ile   Ser Ala Thr Phe Pro   Thr Val Pro Glu Ser   Pro His Glu
11270                 11275                 11280
Ser Glu   Ala Thr Ala Ser Trp   Val Thr His Pro Ala   Val Thr Ser
11285                 11290                 11295
Thr Thr   Val Pro Arg Thr Thr   Pro Asn Tyr Ser His   Ser Glu Pro
11300                 11305                 11310
Asp Thr   Thr Pro Ser Ile Ala   Thr Ser Pro Gly Ala   Glu Ala Thr
11315                 11320                 11325
Ser Asp   Phe Pro Thr Ile Thr   Val Ser Pro Asp Val   Pro Asp Met
11330                 11335                 11340
Val Thr   Ser Gln Val Thr Ser   Ser Gly Thr Asp Thr   Ser Ile Thr
11345                 11350                 11355
Ile Pro   Thr Leu Thr Leu Ser   Ser Gly Glu Pro Glu   Thr Thr Thr
11360                 11365                 11370
Ser Phe   Ile Thr Tyr Ser Glu   Thr His Thr Ser Ser   Ala Ile Pro
11375                 11380                 11385
Thr Leu   Pro Val Ser Pro Gly   Ala Ser Lys Met Leu   Thr Ser Leu
11390                 11395                 11400
Val Ile   Ser Ser Gly Thr Asp   Ser Thr Thr Thr Phe   Pro Thr Leu
11405                 11410                 11415
Thr Glu   Thr Pro Tyr Glu Pro   Glu Thr Thr Ala Ile   Gln Leu Ile
11420                 11425                 11430
His Pro   Ala Glu Thr Asn Thr   Met Val Pro Arg Thr   Thr Pro Lys
11435                 11440                 11445
Phe Ser   His Ser Lys Ser Asp   Thr Thr Leu Pro Val   Ala Ile Thr
11450                 11455                 11460
Ser Pro   Gly Pro Glu Ala Ser   Ser Ala Val Ser Thr   Thr Thr Ile
11465                 11470                 11475
Ser Pro   Asp Met Ser Asp Leu   Val Thr Ser Leu Val   Pro Ser Ser
11480                 11485                 11490
Gly Thr   Asp Thr Ser Thr Thr   Phe Pro Thr Leu Ser   Glu Thr Pro
11495                 11500                 11505
Tyr Glu   Pro Glu Thr Thr Ala   Thr Trp Leu Thr His   Pro Ala Glu
11510                 11515                 11520
Thr Ser   Thr Thr Val Ser Gly   Thr Ile Pro Asn Phe   Ser His Arg
11525                 11530                 11535
Gly Ser   Asp Thr Ala Pro Ser   Met Val Thr Ser Pro   Gly Val Asp
11540                 11545                 11550
Thr Arg   Ser Gly Val Pro Thr   Thr Thr Ile Pro Pro   Ser Ile Pro
11555                 11560                 11565
Gly Val   Val Thr Ser Gln Val   Thr Ser Ser Ala Thr   Asp Thr Ser
11570                 11575                 11580
Thr Ala   Ile Pro Thr Leu Thr   Pro Ser Pro Gly Glu   Pro Glu Thr
11585                 11590                 11595
Thr Ala   Ser Ser Ala Thr His   Pro Gly Thr Gln Thr   Gly Phe Thr
11600                 11605                 11610
Val Pro   Ile Arg Thr Val Pro   Ser Ser Glu Pro Asp   Thr Met Ala
11615                 11620                 11625
Ser Trp   Val Thr His Pro Pro   Gln Thr Ser Thr Pro   Val Ser Arg
11630                 11635                 11640
Thr Thr   Ser Ser Phe Ser His   Ser Ser Pro Asp Ala   Thr Pro Val
11645                 11650                 11655
Met Ala   Thr Ser Pro Arg Thr   Glu Ala Ser Ser Ala   Val Leu Thr
11660                 11665                 11670
Thr Ile   Ser Pro Gly Ala Pro   Glu Met Val Thr Ser   Gln Ile Thr
11675                 11680                 11685
Ser Ser   Gly Ala Ala Thr Ser   Thr Thr Val Pro Thr   Leu Thr His
11690                 11695                 11700
Ser Pro   Gly Met Pro Glu Thr   Thr Ala Leu Leu Ser   Thr His Pro
11705                 11710                 11715
Arg Thr   Glu Thr Ser Lys Thr   Phe Pro Ala Ser Thr   Val Phe Pro
11720                 11725                 11730
Gln Val   Ser Glu Thr Thr Ala   Ser Leu Thr Ile Arg   Pro Gly Ala
11735                 11740                 11745
Glu Thr   Ser Thr Ala Leu Pro   Thr Gln Thr Thr Ser   Ser Leu Phe
11750                 11755                 11760
Thr Leu   Leu Val Thr Gly Thr   Ser Arg Val Asp Leu   Ser Pro Thr
11765                 11770                 11775
Ala Ser   Pro Gly Val Ser Ala   Lys Thr Ala Pro Leu   Ser Thr His
11780                 11785                 11790
Pro Gly   Thr Glu Thr Ser Thr   Met Ile Pro Thr Ser   Thr Leu Ser
11795                 11800                 11805
Leu Gly   Leu Leu Glu Thr Thr   Gly Leu Leu Ala Thr   Ser Ser Ser
11810                 11815                 11820
Ala Glu   Thr Ser Thr Ser Thr   Leu Thr Leu Thr Val   Ser Pro Ala
11825                 11830                 11835
Val Ser   Gly Leu Ser Ser Ala   Ser Ile Thr Thr Asp   Lys Pro Gln
11840                 11845                 11850
Thr Val   Thr Ser Trp Asn Thr   Glu Thr Ser Pro Ser   Val Thr Ser
11855                 11860                 11865
Val Gly   Pro Pro Glu Phe Ser   Arg Thr Val Thr Gly   Thr Thr Met
11870                 11875                 11880
Thr Leu   Ile Pro Ser Glu Met   Pro Thr Pro Pro Lys   Thr Ser His
11885                 11890                 11895
Gly Glu   Gly Val Ser Pro Thr   Thr Ile Leu Arg Thr   Thr Met Val
11900                 11905                 11910
Glu Ala   Thr Asn Leu Ala Thr   Thr Gly Ser Ser Pro   Thr Val Ala
11915                 11920                 11925
Lys Thr   Thr Thr Thr Phe Asn   Thr Leu Ala Gly Ser   Leu Phe Thr
11930                 11935                 11940
Pro Leu   Thr Thr Pro Gly Met   Ser Thr Leu Ala Ser   Glu Ser Val
11945                 11950                 11955
Thr Ser   Arg Thr Ser Tyr Asn   His Arg Ser Trp Ile   Ser Thr Thr
11960                 11965                 11970
Ser Ser   Tyr Asn Arg Arg Tyr   Trp Thr Pro Ala Thr   Ser Thr Pro
11975                 11980                 11985
Val Thr   Ser Thr Phe Ser Pro   Gly Ile Ser Thr Ser   Ser Ile Pro
11990                 11995                 12000
Ser Ser   Thr Ala Ala Thr Val   Pro Phe Met Val Pro   Phe Thr Leu
12005                 12010                 12015
Asn Phe   Thr Ile Thr Asn Leu   Gln Tyr Glu Glu Asp   Met Arg His
12020                 12025                 12030
Pro Gly   Ser Arg Lys Phe Asn   Ala Thr Glu Arg Glu   Leu Gln Gly
12035                 12040                 12045
Leu Leu   Lys Pro Leu Phe Arg   Asn Ser Ser Leu Glu   Tyr Leu Tyr
12050                 12055                 12060
Ser Gly   Cys Arg Leu Ala Ser   Leu Arg Pro Glu Lys   Asp Ser Ser
12065                 12070                 12075
Ala Thr   Ala Val Asp Ala Ile   Cys Thr His Arg Pro   Asp Pro Glu
12080                 12085                 12090
Asp Leu   Gly Leu Asp Arg Glu   Arg Leu Tyr Trp Glu   Leu Ser Asn
12095                 12100                 12105
Leu Thr   Asn Gly Ile Gln Glu   Leu Gly Pro Tyr Thr   Leu Asp Arg
12110                 12115                 12120
Asn Ser   Leu Tyr Val Asn Gly   Phe Thr His Arg Ser   Ser Met Pro
12125                 12130                 12135
Thr Thr   Ser Thr Pro Gly Thr   Ser Thr Val Asp Val   Gly Thr Ser
12140                 12145                 12150
Gly Thr   Pro Ser Ser Ser Pro   Ser Pro Thr Thr Ala   Gly Pro Leu
12155                 12160                 12165
Leu Met   Pro Phe Thr Leu Asn   Phe Thr Ile Thr Asn   Leu Gln Tyr
12170                 12175                 12180
Glu Glu   Asp Met Arg Arg Thr   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Met
12185                 12190                 12195
Glu Ser   Val Leu Gln Gly Leu   Leu Lys Pro Leu Phe   Lys Asn Thr
12200                 12205                 12210
Ser Val   Gly Pro Leu Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg
12215                 12220                 12225
Pro Glu   Lys Asp Gly Ala Ala   Thr Gly Val Asp Ala   Ile Cys Thr
12230                 12235                 12240
His Arg   Leu Asp Pro Lys Ser   Pro Gly Leu Asn Arg   Glu Gln Leu
12245                 12250                 12255
Tyr Trp   Glu Leu Ser Lys Leu   Thr Asn Asp Ile Glu   Glu Leu Gly
12260                 12265                 12270
Pro Tyr   Thr Leu Asp Arg Asn   Ser Leu Tyr Val Asn   Gly Phe Thr
12275                 12280                 12285
His Gln   Ser Ser Val Ser Thr   Thr Ser Thr Pro Gly   Thr Ser Thr
12290                 12295                 12300
Val Asp   Leu Arg Thr Ser Gly   Thr Pro Ser Ser Leu   Ser Ser Pro
12305                 12310                 12315
Thr Ile   Met Ala Ala Gly Pro   Leu Leu Val Pro Phe   Thr Leu Asn
12320                 12325                 12330
Phe Thr   Ile Thr Asn Leu Gln   Tyr Gly Glu Asp Met   Gly His Pro
12335                 12340                 12345
Gly Ser   Arg Lys Phe Asn Thr   Thr Glu Arg Val Leu   Gln Gly Leu
12350                 12355                 12360
Leu Gly   Pro Ile Phe Lys Asn   Thr Ser Val Gly Pro   Leu Tyr Ser
12365                 12370                 12375
Gly Cys   Arg Leu Thr Ser Leu   Arg Ser Glu Lys Asp   Gly Ala Ala
12380                 12385                 12390
Thr Gly   Val Asp Ala Ile Cys   Ile His His Leu Asp   Pro Lys Ser
12395                 12400                 12405
Pro Gly   Leu Asn Arg Glu Arg   Leu Tyr Trp Glu Leu   Ser Gln Leu
12410                 12415                 12420
Thr Asn   Gly Ile Lys Glu Leu   Gly Pro Tyr Thr Leu   Asp Arg Asn
12425                 12430                 12435
Ser Leu   Tyr Val Asn Gly Phe   Thr His Arg Thr Ser   Val Pro Thr
12440                 12445                 12450
Ser Ser   Thr Pro Gly Thr Ser   Thr Val Asp Leu Gly   Thr Ser Gly
12455                 12460                 12465
Thr Pro   Phe Ser Leu Pro Ser   Pro Ala Thr Ala Gly   Pro Leu Leu
12470                 12475                 12480
Val Leu   Phe Thr Leu Asn Phe   Thr Ile Thr Asn Leu   Lys Tyr Glu
12485                 12490                 12495
Glu Asp   Met His Arg Pro Gly   Ser Arg Lys Phe Asn   Thr Thr Glu
12500                 12505                 12510
Arg Val   Leu Gln Thr Leu Leu   Gly Pro Met Phe Lys   Asn Thr Ser
12515                 12520                 12525
Val Gly   Leu Leu Tyr Ser Gly   Cys Arg Leu Thr Leu   Leu Arg Ser
12530                 12535                 12540
Glu Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Gly Val Asp Ala Ile   Cys Thr His
12545                 12550                 12555
Arg Leu   Asp Pro Lys Ser Pro   Gly Val Asp Arg Glu   Gln Leu Tyr
12560                 12565                 12570
Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   Asn Gly Ile Lys Glu   Leu Gly Pro
12575                 12580                 12585
Tyr Thr   Leu Asp Arg Asn Ser   Leu Tyr Val Asn Gly   Phe Thr His
12590                 12595                 12600
Trp Ile   Pro Val Pro Thr Ser   Ser Thr Pro Gly Thr   Ser Thr Val
12605                 12610                 12615
Asp Leu   Gly Ser Gly Thr Pro   Ser Ser Leu Pro Ser   Pro Thr Thr
12620                 12625                 12630
Ala Gly   Pro Leu Leu Val Pro   Phe Thr Leu Asn Phe   Thr Ile Thr
12635                 12640                 12645
Asn Leu   Lys Tyr Glu Glu Asp   Met His Cys Pro Gly   Ser Arg Lys
12650                 12655                 12660
Phe Asn   Thr Thr Glu Arg Val   Leu Gln Ser Leu Leu   Gly Pro Met
12665                 12670                 12675
Phe Lys   Asn Thr Ser Val Gly   Pro Leu Tyr Ser Gly   Cys Arg Leu
12680                 12685                 12690
Thr Leu   Leu Arg Ser Glu Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Gly Val Asp
12695                 12700                 12705
Ala Ile   Cys Thr His Arg Leu   Asp Pro Lys Ser Pro   Gly Val Asp
12710                 12715                 12720
Arg Glu   Gln Leu Tyr Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   Asn Gly Ile
12725                 12730                 12735
Lys Glu   Leu Gly Pro Tyr Thr   Leu Asp Arg Asn Ser   Leu Tyr Val
12740                 12745                 12750
Asn Gly   Phe Thr His Gln Thr   Ser Ala Pro Asn Thr   Ser Thr Pro
12755                 12760                 12765
Gly Thr   Ser Thr Val Asp Leu   Gly Thr Ser Gly Thr   Pro Ser Ser
12770                 12775                 12780
Leu Pro   Ser Pro Thr Ser Ala   Gly Pro Leu Leu Val   Pro Phe Thr
12785                 12790                 12795
Leu Asn   Phe Thr Ile Thr Asn   Leu Gln Tyr Glu Glu   Asp Met His
12800                 12805                 12810
His Pro   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Thr Glu Arg   Val Leu Gln
12815                 12820                 12825
Gly Leu   Leu Gly Pro Met Phe   Lys Asn Thr Ser Val   Gly Leu Leu
12830                 12835                 12840
Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg Pro Glu   Lys Asn Gly
12845                 12850                 12855
Ala Ala   Thr Gly Met Asp Ala   Ile Cys Ser His Arg   Leu Asp Pro
12860                 12865                 12870
Lys Ser   Pro Gly Leu Asn Arg   Glu Gln Leu Tyr Trp   Glu Leu Ser
12875                 12880                 12885
Gln Leu   Thr His Gly Ile Lys   Glu Leu Gly Pro Tyr   Thr Leu Asp
12890                 12895                 12900
Arg Asn   Ser Leu Tyr Val Asn   Gly Phe Thr His Arg   Ser Ser Val
12905                 12910                 12915
Ala Pro   Thr Ser Thr Pro Gly   Thr Ser Thr Val Asp   Leu Gly Thr
12920                 12925                 12930
Ser Gly   Thr Pro Ser Ser Leu   Pro Ser Pro Thr Thr   Ala Val Pro
12935                 12940                 12945
Leu Leu   Val Pro Phe Thr Leu   Asn Phe Thr Ile Thr   Asn Leu Gln
12950                 12955                 12960
Tyr Gly   Glu Asp Met Arg His   Pro Gly Ser Arg Lys   Phe Asn Thr
12965                 12970                 12975
Thr Glu   Arg Val Leu Gln Gly   Leu Leu Gly Pro Leu   Phe Lys Asn
12980                 12985                 12990
Ser Ser   Val Gly Pro Leu Tyr   Ser Gly Cys Arg Leu   Ile Ser Leu
12995                 13000                 13005
Arg Ser   Glu Lys Asp Gly Ala   Ala Thr Gly Val Asp   Ala Ile Cys
13010                 13015                 13020
Thr His   His Leu Asn Pro Gln   Ser Pro Gly Leu Asp   Arg Glu Gln
13025                 13030                 13035
Leu Tyr   Trp Gln Leu Ser Gln   Met Thr Asn Gly Ile   Lys Glu Leu
13040                 13045                 13050
Gly Pro   Tyr Thr Leu Asp Arg   Asn Ser Leu Tyr Val   Asn Gly Phe
13055                 13060                 13065
Thr His   Arg Ser Ser Gly Leu   Thr Thr Ser Thr Pro   Trp Thr Ser
13070                 13075                 13080
Thr Val   Asp Leu Gly Thr Ser   Gly Thr Pro Ser Pro   Val Pro Ser
13085                 13090                 13095
Pro Thr   Thr Thr Gly Pro Leu   Leu Val Pro Phe Thr   Leu Asn Phe
13100                 13105                 13110
Thr Ile   Thr Asn Leu Gln Tyr   Glu Glu Asn Met Gly   His Pro Gly
13115                 13120                 13125
Ser Arg   Lys Phe Asn Ile Thr   Glu Ser Val Leu Gln   Gly Leu Leu
13130                 13135                 13140
Lys Pro   Leu Phe Lys Ser Thr   Ser Val Gly Pro Leu   Tyr Ser Gly
13145                 13150                 13155
Cys Arg   Leu Thr Leu Leu Arg   Pro Glu Lys Asp Gly   Val Ala Thr
13160                 13165                 13170
Arg Val   Asp Ala Ile Cys Thr   His Arg Pro Asp Pro   Lys Ile Pro
13175                 13180                 13185
Gly Leu   Asp Arg Gln Gln Leu   Tyr Trp Glu Leu Ser   Gln Leu Thr
13190                 13195                 13200
His Ser   Ile Thr Glu Leu Gly   Pro Tyr Thr Leu Asp   Arg Asp Ser
13205                 13210                 13215
Leu Tyr   Val Asn Gly Phe Thr   Gln Arg Ser Ser Val   Pro Thr Thr
13220                 13225                 13230
Ser Thr   Pro Gly Thr Phe Thr   Val Gln Pro Glu Thr   Ser Glu Thr
13235                 13240                 13245
Pro Ser   Ser Leu Pro Gly Pro   Thr Ala Thr Gly Pro   Val Leu Leu
13250                 13255                 13260
Pro Phe   Thr Leu Asn Phe Thr   Ile Thr Asn Leu Gln   Tyr Glu Glu
13265                 13270                 13275
Asp Met   Arg Arg Pro Gly Ser   Arg Lys Phe Asn Thr   Thr Glu Arg
13280                 13285                 13290
Val Leu   Gln Gly Leu Leu Met   Pro Leu Phe Lys Asn   Thr Ser Val
13295                 13300                 13305
Ser Ser   Leu Tyr Ser Gly Cys   Arg Leu Thr Leu Leu   Arg Pro Glu
13310                 13315                 13320
Lys Asp   Gly Ala Ala Thr Arg   Val Asp Ala Val Cys   Thr His Arg
13325                 13330                 13335
Pro Asp   Pro Lys Ser Pro Gly   Leu Asp Arg Glu Arg   Leu Tyr Trp
13340                 13345                 13350
Lys Leu   Ser Gln Leu Thr His   Gly Ile Thr Glu Leu   Gly Pro Tyr
13355                 13360                 13365
Thr Leu   Asp Arg His Ser Leu   Tyr Val Asn Gly Phe   Thr His Gln
13370                 13375                 13380
Ser Ser   Met Thr Thr Thr Arg   Thr Pro Asp Thr Ser   Thr Met His
13385                 13390                 13395
Leu Ala   Thr Ser Arg Thr Pro   Ala Ser Leu Ser Gly   Pro Met Thr
13400                 13405                 13410
Ala Ser   Pro Leu Leu Val Leu   Phe Thr Ile Asn Phe   Thr Ile Thr
13415                 13420                 13425
Asn Leu   Arg Tyr Glu Glu Asn   Met His His Pro Gly   Ser Arg Lys
13430                 13435                 13440
Phe Asn   Thr Thr Glu Arg Val   Leu Gln Gly Leu Leu   Arg Pro Val
13445                 13450                 13455
Phe Lys   Asn Thr Ser Val Gly   Pro Leu Tyr Ser Gly   Cys Arg Leu
13460                 13465                 13470
Thr Leu   Leu Arg Pro Lys Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Lys Val Asp
13475                 13480                 13485
Ala Ile   Cys Thr Tyr Arg Pro   Asp Pro Lys Ser Pro   Gly Leu Asp
13490                 13495                 13500
Arg Glu   Gln Leu Tyr Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   His Ser Ile
13505                 13510                 13515
Thr Glu   Leu Gly Pro Tyr Thr   Leu Asp Arg Asp Ser   Leu Tyr Val
13520                 13525                 13530
Asn Gly   Phe Thr Gln Arg Ser   Ser Val Pro Thr Thr   Ser Ile Pro
13535                 13540                 13545
Gly Thr   Pro Thr Val Asp Leu   Gly Thr Ser Gly Thr   Pro Val Ser
13550                 13555                 13560
Lys Pro   Gly Pro Ser Ala Ala   Ser Pro Leu Leu Val   Leu Phe Thr
13565                 13570                 13575
Leu Asn   Phe Thr Ile Thr Asn   Leu Arg Tyr Glu Glu   Asn Met Gln
13580                 13585                 13590
His Pro   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Thr Glu Arg   Val Leu Gln
13595                 13600                 13605
Gly Leu   Leu Arg Ser Leu Phe   Lys Ser Thr Ser Val   Gly Pro Leu
13610                 13615                 13620
Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg Pro Glu   Lys Asp Gly
13625                 13630                 13635
Thr Ala   Thr Gly Val Asp Ala   Ile Cys Thr His His   Pro Asp Pro
13640                 13645                 13650
Lys Ser   Pro Arg Leu Asp Arg   Glu Gln Leu Tyr Trp   Glu Leu Ser
13655                 13660                 13665
Gln Leu   Thr His Asn Ile Thr   Glu Leu Gly Pro Tyr   Ala Leu Asp
13670                 13675                 13680
Asn Asp   Ser Leu Phe Val Asn   Gly Phe Thr His Arg   Ser Ser Val
13685                 13690                 13695
Ser Thr   Thr Ser Thr Pro Gly   Thr Pro Thr Val Tyr   Leu Gly Ala
13700                 13705                 13710
Ser Lys   Thr Pro Ala Ser Ile   Phe Gly Pro Ser Ala   Ala Ser His
13715                 13720                 13725
Leu Leu   Ile Leu Phe Thr Leu   Asn Phe Thr Ile Thr   Asn Leu Arg
13730                 13735                 13740
Tyr Glu   Glu Asn Met Trp Pro   Gly Ser Arg Lys Phe   Asn Thr Thr
13745                 13750                 13755
Glu Arg   Val Leu Gln Gly Leu   Leu Arg Pro Leu Phe   Lys Asn Thr
13760                 13765                 13770
Ser Val   Gly Pro Leu Tyr Ser   Gly Cys Arg Leu Thr   Leu Leu Arg
13775                 13780                 13785
Pro Glu   Lys Asp Gly Glu Ala   Thr Gly Val Asp Ala   Ile Cys Thr
13790                 13795                 13800
His Arg   Pro Asp Pro Thr Gly   Pro Gly Leu Asp Arg   Glu Gln Leu
13805                 13810                 13815
Tyr Leu   Glu Leu Ser Gln Leu   Thr His Ser Ile Thr   Glu Leu Gly
13820                 13825                 13830
Pro Tyr   Thr Leu Asp Arg Asp   Ser Leu Tyr Val Asn   Gly Phe Thr
13835                 13840                 13845
His Arg   Ser Ser Val Pro Thr   Thr Ser Thr Gly Val   Val Ser Glu
13850                 13855                 13860
Glu Pro   Phe Thr Leu Asn Phe   Thr Ile Asn Asn Leu   Arg Tyr Met
13865                 13870                 13875
Ala Asp   Met Gly Gln Pro Gly   Ser Leu Lys Phe Asn   Ile Thr Asp
13880                 13885                 13890
Asn Val   Met Gln His Leu Leu   Ser Pro Leu Phe Gln   Arg Ser Ser
13895                 13900                 13905
Leu Gly   Ala Arg Tyr Thr Gly   Cys Arg Val Ile Ala   Leu Arg Ser
13910                 13915                 13920
Val Lys   Asn Gly Ala Glu Thr   Arg Val Asp Leu Leu   Cys Thr Tyr
13925                 13930                 13935
Leu Gln   Pro Leu Ser Gly Pro   Gly Leu Pro Ile Lys   Gln Val Phe
13940                 13945                 13950
His Glu   Leu Ser Gln Gln Thr   His Gly Ile Thr Arg   Leu Gly Pro
13955                 13960                 13965
Tyr Ser   Leu Asp Lys Asp Ser   Leu Tyr Leu Asn Gly   Tyr Asn Glu
13970                 13975                 13980
Pro Gly   Pro Asp Glu Pro Pro   Thr Thr Pro Lys Pro   Ala Thr Thr
13985                 13990                 13995
Phe Leu   Pro Pro Leu Ser Glu   Ala Thr Thr Ala Met   Gly Tyr His
14000                 14005                 14010
Leu Lys   Thr Leu Thr Leu Asn   Phe Thr Ile Ser Asn   Leu Gln Tyr
14015                 14020                 14025
Ser Pro   Asp Met Gly Lys Gly   Ser Ala Thr Phe Asn   Ser Thr Glu
14030                 14035                 14040
Gly Val   Leu Gln His Leu Leu   Arg Pro Leu Phe Gln   Lys Ser Ser
14045                 14050                 14055
Met Gly   Pro Phe Tyr Leu Gly   Cys Gln Leu Ile Ser   Leu Arg Pro
14060                 14065                 14070
Glu Lys   Asp Gly Ala Ala Thr   Gly Val Asp Thr Thr   Cys Thr Tyr
14075                 14080                 14085
His Pro   Asp Pro Val Gly Pro   Gly Leu Asp Ile Gln   Gln Leu Tyr
14090                 14095                 14100
Trp Glu   Leu Ser Gln Leu Thr   His Gly Val Thr Gln   Leu Gly Phe
14105                 14110                 14115
Tyr Val   Leu Asp Arg Asp Ser   Leu Phe Ile Asn Gly   Tyr Ala Pro
14120                 14125                 14130
Gln Asn   Leu Ser Ile Arg Gly   Glu Tyr Gln Ile Asn   Phe His Ile
14135                 14140                 14145
Val Asn   Trp Asn Leu Ser Asn   Pro Asp Pro Thr Ser   Ser Glu Tyr
14150                 14155                 14160
Ile Thr   Leu Leu Arg Asp Ile   Gln Asp Lys Val Thr   Thr Leu Tyr
14165                 14170                 14175
Lys Gly   Ser Gln Leu His Asp   Thr Phe Arg Phe Cys   Leu Val Thr
14180                 14185                 14190
Asn Leu   Thr Met Asp Ser Val   Leu Val Thr Val Lys   Ala Leu Phe
14195                 14200                 14205
Ser Ser   Asn Leu Asp Pro Ser   Leu Val Glu Gln Val   Phe Leu Asp
14210                 14215                 14220
Lys Thr   Leu Asn Ala Ser Phe   His Trp Leu Gly Ser   Thr Tyr Gln
14225                 14230                 14235
Leu Val   Asp Ile His Val Thr   Glu Met Glu Ser Ser   Val Tyr Gln
14240                 14245                 14250
Pro Thr   Ser Ser Ser Ser Thr   Gln His Phe Tyr Leu   Asn Phe Thr
14255                 14260                 14265
Ile Thr   Asn Leu Pro Tyr Ser   Gln Asp Lys Ala Gln   Pro Gly Thr
14270                 14275                 14280
Thr Asn   Tyr Gln Arg Asn Lys   Arg Asn Ile Glu Asp   Ala Leu Asn
14285                 14290                 14295
Gln Leu   Phe Arg Asn Ser Ser   Ile Lys Ser Tyr Phe   Ser Asp Cys
14300                 14305                 14310
Gln Val   Ser Thr Phe Arg Ser   Val Pro Asn Arg His   His Thr Gly
14315                 14320                 14325
Val Asp   Ser Leu Cys Asn Phe   Ser Pro Leu Ala Arg   Arg Val Asp
14330                 14335                 14340
Arg Val   Ala Ile Tyr Glu Glu   Phe Leu Arg Met Thr   Arg Asn Gly
14345                 14350                 14355
Thr Gln   Leu Gln Asn Phe Thr   Leu Asp Arg Ser Ser   Val Leu Val
14360                 14365                 14370
Asp Gly   Tyr Ser Pro Asn Arg   Asn Glu Pro Leu Thr   Gly Asn Ser
14375                 14380                 14385
Asp Leu   Pro Phe Trp Ala Val   Ile Leu Ile Gly Leu   Ala Gly Leu
14390                 14395                 14400
Leu Gly   Val Ile Thr Cys Leu   Ile Cys Gly Val Leu   Val Thr Thr
14405                 14410                 14415
Arg Arg   Arg Lys Lys Glu Gly   Glu Tyr Asn Val Gln   Gln Gln Cys
14420                 14425                 14430
Pro Gly   Tyr Tyr Gln Ser His   Leu Asp Leu Glu Asp   Leu Gln
14435                 14440                 14445
<210> 151
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c114-N1
<400> 151
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85                  90                  95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100                 105                 110
Leu Gln
<210> 152
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c114-N2
<400> 152
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85                  90                  95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100                 105                 110
Leu Gln
<210> 153
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c114-N12
<400> 153
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85                  90                  95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100                 105                 110
Leu Gln
<210> 154
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c114-N123
<400> 154
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85                  90                  95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100                 105                 110
Leu Gln
<210> 155
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-конец первого тандемного повтора MUC16c344
<400> 155
Trp Glu Leu Ser Gln Leu
1               5
<210> 156
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> C-конец первого тандемного повтора MUC16c344
<400> 156
Thr Gly Val Asp Ser Leu Cys
1               5
<210> 157
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-конец эктодомена MUC16c344
<400> 157
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg
1               5
<210> 158
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> C-конец эктодомена MUC16c344
<400> 158
Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
1               5
<210> 159
<211> 25
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Трансмембранн.
<400> 159
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
1               5                  10                  15
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val
20                  25
<210> 160
<211> 31
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цитоплазматический хвост
<400> 160
Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln
1               5                  10                  15
Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
20                  25                  30
<210> 161
<211> 58
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен MUC16c114
<400> 161
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50                  55
<210> 162
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен MUC16c80
<400> 162
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Asp Leu Pro
20
<210> 163
<211> 58
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен MUC16c86
<400> 163
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50                  55
<210> 164
<211> 22
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранн. MUC16c86
<400> 164
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
1               5                  10                  15
Thr Cys Leu Ile Cys Gly
20
<210> 165
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> цитоплазматическ. MUC16c86
<400> 165
Asp Leu Glu Asp Leu Gln
1               5
<210> 166
<211> 58
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эктодомен MUC16 3(N в A)c114
<400> 166
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50                  55
<210> 167
<211> 128
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сахарсвязывающий домен LGALS3
<400> 167
Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile
1               5                  10                  15
Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp
20                  25                  30
Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn
35                  40                  45
Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn
50                  55                  60
Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys
65                  70                  75                  80
Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala
85                  90                  95
Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu
100                 105                 110
Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser
115                 120                 125
<210> 168
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> не гликозилированный пептид 2 MUC16
<400> 168
Cys Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn
1               5                  10                  15
Arg Asn Glu
<210> 169
<211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> не родственный MUC16 пептидный 18-мер
<400> 169
Gly Ala Val Pro Arg Ser Ala Thr Ile Asn Val Ser Arg Ile Ala Thr
1               5                  10                  15
Gly Pro
<210> 170
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 18-мер (no C)
<400> 170
Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser
1               5                  10                  15
Val
<210> 171
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 15-мер (без C)
<400> 171
Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val
1               5                  10
<210> 172
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC16c114-N23
<400> 172
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1               5                  10                  15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35                  40                  45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50                  55                  60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65                  70                  75                  80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85                  90                  95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100                 105                 110
Leu Gln
<210> 173
<211> 344
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N24 mut c344
<400> 173
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1               5                  10                  15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20                  25                  30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35                  40                  45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50                  55                  60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65                  70                  75                  80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85                  90                  95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100                 105                 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115                 120                 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130                 135                 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165                 170                 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180                 185                 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195                 200                 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210                 215                 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225                 230                 235                 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr
245                 250                 255
Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260                 265                 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275                 280                 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290                 295                 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305                 310                 315                 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325                 330                 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 174
<211> 344
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N30 mut c344
<400> 174
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1               5                  10                  15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20                  25                  30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35                  40                  45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50                  55                  60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65                  70                  75                  80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85                  90                  95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100                 105                 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115                 120                 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130                 135                 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165                 170                 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180                 185                 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195                 200                 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210                 215                 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225                 230                 235                 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr
245                 250                 255
Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260                 265                 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275                 280                 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290                 295                 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305                 310                 315                 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325                 330                 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 175
<211> 344
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N24-N30 mut c344
<400> 175
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1               5                  10                  15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20                  25                  30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35                  40                  45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50                  55                  60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65                  70                  75                  80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85                  90                  95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100                 105                 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115                 120                 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130                 135                 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165                 170                 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180                 185                 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195                 200                 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210                 215                 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225                 230                 235                 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr
245                 250                 255
Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260                 265                 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275                 280                 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290                 295                 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305                 310                 315                 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325                 330                 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<---