СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНЫХ ДИСПЕРСИЙ НАНОЧАСТИЦ ИЗ СМЕСИ ПРИРОДНЫХ ТРИТЕРПЕНОИДОВ
METHOD FOR PREPARING AQUEOUS DISPERSIONS OF NANOPARTICLES OF NATURAL TRITERPENOID MIXTURE

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения дисперсий наночастиц природных биологически активных соединений. Данные дисперсий могут найти широкое применение в фармацевтической промышленности, как адъюванты или средства доставки лекарственных препаратов.
Природные тритерпеноиды обладают широким спектром терапевтической активности, однако их использование осложнено плохой растворимостью в воде [YingMeei Tan, Rong Yu, Pezzuto J.M. Betulinic acid - induced programmed cell death in human melanoma cells involves mitogen-activated protein kinase activation. // Clin. Cancer Research. 2003. V.9. P.2866-2875]. Решением проблемы растворимости может быть создание нанодисперсных структур, в частности сферических аморфных наночастиц, но в большинстве случаев нанодисперсии недостаточно стабильны, в них проходят необратимые процессы агрегации и кристаллизации [Yajun С., Jie L., Xiangliang Y., Xiaoling Z. and Huibi X. Oleanolic acid nanosuspensions: preparation, in-vitro characterization and enhanced hepatoprotective effect. J. of Pharmacy and Pharmacology 2005, 57/259-264].
Известен способ солюбилизации тритерпеноидов, основанный на включении в состав наночастиц яичного фосфатидилхолиа [А.Н. Бастрич и др. Солюбилизация тритерпеноидов лупаного ряда, выделенных из бересты. Биотехнология, 2008, 6, С.51-59]. Однако полученные по данному методу дисперсии содержат не только сферические наночастиц, но и значительные количества липосом и кристаллов. Морфологическая неоднородность ограничивает практическое применение таких нанодисперсии.
Наиболее близким техническим решением к предложенному изобретению является способ получения нанодисперсии из композиции биологически активных веществ (природных тритерпеноидов), включающая введение раствора композиции тритерпеноидов в контакт с водой или водными растворами растворителей, перемешивание полученной смеси, удаление растворителя и основной части воды [патент РФ №2322091].
Однако дисперсии, полученные таким способом, отличаются высокой морфологической неоднородностью частиц. Помимо сферических наночастиц, оптимальных для использования, такие дисперсии могут содержать и кристаллы, в т.ч. и выходящие по размерам за рамки, допустимые для дисперсий, применение которых подразумевает внутрисосудистое введение.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение высококачественных водных дисперсий наночастиц для использования в качестве адъювантов и объединение экстрактивного удаления избытка неполярных компонентов (бетулина и лупеола) и растворителя в одну технологическую стадию.
Технический результат достигается способом получения водных дисперсий наночастиц из смеси природных тритерпеноидов, включающий растворение смеси тритерпеноидов в органическом растворителе, введение раствора тритерпеноидов в контакт с водой или водным раствором растворителей, перемешивание полученной смеси, обработку гексаном (жидкостной экстракцией) для одностадийного удаления избытка неполярных компонентов (бетулина и лупеола) и растворителя, с последующим отделением гексановой фазы от дисперсии наночастиц, удаление растворителя и основной части воды с образованием водной дисперсии наночастиц из смеси природных тритерпеноидов с увеличенной монодисперсностью и морфологической однородностью.
За счет удаления неполярных компонентов (бетулина и лупеола) происходит повышение доли полярного компонента (кофеата бетулина) в наночастицах дисперсии, что приводит к повышению качества получаемой дисперсии: увеличению монодисперсности и морфологической однородности сферических аморфных наночастиц, образующих дисперсную фазу, за счет предотвращения их непроизвольной кристаллизации.
Пример 1.
В качестве смеси природных тритерпеноидов использовали сухой экстракт бересты (БЭС). В шести колбах путем перешивания раствора БЭС в тетрагидрофуране с водой готовили нанодисперсии БЭС с разными соотношениями тетрагидрофуран-вода, затем к этим дисперсиям приливали разные количества гексана. Данные по соотношению жидких компонентов приведены в таблице 1. Затем дисперсию отделяли с помощью делительной воронки от неполярной фазы и удаляли растворитель и основную часть воды упариванием на роторном испарителе до объема 10 мл.
Таблица 1
Номер образца
Объем жидких компонентов, мл
Тетрагидрофуран
Вода
Гексан
1
1
25
25
2
1
5
25
3
1
5
5
4
1
10
20
Образцы дисперсии исследовали с помощью электронной микроскопии, в результате чего установили, что дисперсия №1 состоит исключительно из сферических наночастиц, в дисперсиях №2 и №3 также преобладают сферические наночастиц (фиг.1).
Для исследования образца №4 использовали электронный микроскоп с большей разрешающей способностью. Результаты микрофотографии представленные на фиг.2 подтверждают, что дисперсия состоит из частиц, форма которых близка к сферической, а диаметр близок к 100 нм. Ни кристаллов, ни крупных агрегатов, ни деформированных частиц на снимках не видно.
Фазовое состояние вещества в наночастицах определяли по рентгеновской дифрактограмме, представленной на фиг.3. Дифрактограмма имеет вид, характерный для аморфных веществ без примесей кристаллов, что подтверждает аморфность наночастиц и отсутствие кристаллов бетулина в составе дисперсии.
Пример 2.
По методике, аналогичной примеру 1, были приготовлены два образца с соотношением тетрагидрофуран-вода-гексан 1:25:25
Дисперсию №5 окончательно упарили спустя неделю после приготовления и экстракции, №6 - сразу после экстракции. Обе дисперсии оказались устойчивыми. Результаты измерения размера наночастиц и объемное распределение частиц по размеру представлены на фиг.4: а) для дисперсии №5 (средний размер частиц - 112 нм); б) для дисперсии №6 (средний размер частиц - 111 нм).
В случае дисперсии №5 (упаренной через неделю) средний размер частиц составил 112 нм, а дзета-потенциал - 5,66 мВ, для дисперсии №6 (упаренной сразу) эти показатели составили соответственно 111 нм и - 21,22 мВ.
Пример 3.
По методике, аналогичной примеру 1, были приготовлены два образца с соотношением тетрагидрофуран-вода 1:25.
Образец №7 не обрабатывался гексаном и не упаривался.
Образец №8 был обработан 25 мл гексана и не упаривался.
Пробы образцов №7 и №8 анализировали на жидкостном хроматографе, используя нормально-фазовый вариант ВЭЖХ (колонка 4.6×120 мм LiChrosorb RP-18, элюент метанол-вода 4:6 (объемные доли), скорость подачи элюента 0.70 мл/мин, объем вводимой пробы 20 мкл). Регистрацию хроматографической информации и обработку результатов осуществляли с помощью программы «МультиХром для Windows» (Ampersand Ltd., Россия).
Таблица 2
Массовая концентрация тетрагидрофурана в пробах
Номер образца
Площадь сигнала на хроматограмме, отн. ед.
Массовая концентрация, %
7
20862.67
2.0
8
203.75
0.0195
После обработки гексаном массовая концентрация тетрагидрофурана уменьшилась с 2% до 0.0195%, что говорит о практически полном удалении растворителя из дисперсии.
Пробы гексановой и водной фаз образца №8 исследовали с помощью тонкослойной хроматографии. Анализ проводили на пластинках с силикагелем в системе хлороформ:этилацетат 80:20.
Результаты исследования показали, что в гексановой фазе отсутствует компонент, оставшийся на старте (Rf=0) на треке водной фазы (кофеат бетулина). Два верхних пятна бетулин (Rf=0.62) и лупеол (Rf=0.74), присутствуют в обеих пробах. Таким образом, данные, полученные с помощью тонкослойной хроматографии, подтверждают частичную экстракцию бетулина и лупеола в гексановую фазу.
Добавление гексана положительно сказывается на морфологической однородности частиц и позволяет получить дисперсии, состоящие из очень близких по размеру сферических аморфных наночастиц. За счет обработки гексаном происходит удаление из дисперсии основной массы растворителя, при этом отпадает необходимость безотлагательного упаривания дисперсии, что увеличивает гибкость технологии получения дисперсии.
Данное изобретение позволит сократить число технологических стадий при промышленном получении нанодисперсий из смеси природных тритерпеноидов и использовать полученные дисперсии наночастиц без предварительного обогащения его кофеатом бетулина.