Определение в моче основных метаболитов каннабимиметиков PB-22 и PB-22F методом ГХ-МС

Рис. 4. Результаты иммунохроматографического исследования на ПСА

тографического исследования по обнаружению ПСА с регистрацией его количества можно дать обоснование такой ситуации. В Европе доказано, что при величине ПСА 4,0 нг/мл есть смысл назначать генетическое исследование. При проведении более 50 совместных с генетиками экспертиз нами установлено, что при имеющемся на данный момент в нашем распоряжении генетическом оборудовании эта величина равна 15,0 и более. Эффективность использования метода:

1. Возможность практического применения иммунохроматографического метода с объективной его оценкой, с использованием прибора « SeraQuant», позволяющего одномоментно устанавливать наличие и вид крови, значительно сокращая технологический процесс исследования и сохраняя большую часть объекта для дальнейшего исследования.

2. Полученные данные позволяют рекомендовать применение в экспертной практике иммунохроматогра-фического метода с использованием прибора « SeraQuant» для обнаружения спермы, даже при отсутствии в ней сперматозоидов. Ввиду простоты его использования, экономичности во времени и высокой доказательности этот метод может рассматриваться, как метод экспресс-диагностики и может быть применен в учреждениях судебно-медицинской экспертизы.

Литература:

1. БарсегянцЛ.О. Судебно-медицинскоеисследованиевещественныхдоказателъств./ М.:Медицина, 2005. -447 с.

2. Гладких A.C. Перспективные направления судебно-медицинских исследований волос и следов спермы. // Судебно-медицинская экспертиза, 1983. —N4.— 27-29 с.

3. Гуртовая C.B. // Сборник работ врачей судебно-медицинских экспертов биологов / подготовлен С. В. Гуртовой; РЦСМЭ МЗ РФ - М„ 2005. - 38 с.

4. http://www.seratec.com/

Рис. 3. Результаты иммунохроматографического исследования на гемоглобин человека

• предварительная интерполяция базисной кривой, полученной при съёмке пустой (белой) тест-кассеты.

• автоматический контроль помех (т.н. Dust-Factor): при превышении уровня загрязнения тест будет «забракован».

Результаты:

• Результат отображается в количестве параметра в ng/ml, если результат отрицательный, то величина будет указана как знак < 0,4 для ПСА и <4,0 для Hb (Рис. 3).

• дополнительно указывается интервал погрешности, величина которого зависит от самого результата.

Исследовать вытяжки можно непосредственно внося их в углубление кассеты и через 10 минут будет готов результат при исследовании на гемоглобин, а через 15 минут при исследовании на ПСА (Рис. 4). Также можно исследовать тест-кассеты, в лунки которых была внесена вытяжка более чем 10 минут назад, и тогда количественный результат будет зарегистрирован через 10 секунд. Для этого при проведении исследования в приборе выбирается соответствующая калибровка для так называемого «свежего» исследования или отсроченного.

Важно отметить, что выполняя генетические экспертизы, эксперты сталкиваются с ситуацией, когда биологи обнаружили единичные сперматозоиды, а ДНК не выделяется и не типируется. При проведении иммунохрома-

© С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, О.Н. Дворская, 2013 УДК 340.67:54.061:615.074

С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, О.Н. Дворская ОПРЕДЕЛЕНИЕ В МОЧЕ ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ КАННАБИМИМЕТИКОВ PB-22 и PB-22F МЕТОДОМ ГХ-МС

ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (начальник - к.м.н. В.Н. Коротун); ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»

определенные трудности выявления злоупотребления данной группой веществ. При этом основной проблемой

В практике российских и зарубежных аналитических служб в последние годы все чаще встречаются новые синтетические каннабимиметики, что вызывает серьезные трудности их идентификации в связи с постоянным изменением и расширением их ассортимента на рынке потребителей психоактивных средств [6, 7, 9, 10].

Большое разнообразие синтетических каннабимиме-тиков и специфичность их поведения в организме создает

является вопрос идентификации метаболитов, которые в дальнейшем могут использоваться для целей химико-токсикологического и судебно-химического анализа [3, 4, 5, 8].

В данной работе нами приведены методы выявления основных метаболитов РВ-22 и РВ-22Б в моче с применением рутинных методов, включающих жидкость-жид-

костную экстракцию (ЖЖЭ) и газовую хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС).

Материалы и методы

Оборудование. Газовый хроматограф Agilent 7820, масс-селективный детектор Agilent 5975 (Agilent, США), колонка капиллярная HP-5MS, внутренний диаметр 0,25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0,25 мкм. Термоблок ПЭ-4030, одноканальный испаритель ПЭ-2300, микровс-тряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия). Полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4-40, 40-200 мкл и 0,2-1, 1-5 мл. В качестве источника микроволнового излучения применяли бытовую микроволновую печь Rolsen MS1770SA («Россия»).

Материалы. Все используемые растворители и реактивы градации «х.ч.». Пробы мочи до исследования хранились при - 18°С.

Скрининг наркотических и лекарственных веществ в моче. К пробе мочи объемом 2 мл прибавляли по 50 мкл спиртовых растворов внутренних стандартов: этил-морфина гидрохлорида (0,02 мг/мл), N-этилбензиламина (0,01 мг/мл). Затем прибавляли 0,4 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, флакон укупоривали и выдерживали при 100°С в течение 15 минут. Гидролизат охлаждали, прибавляли 0,6 мл 25% водного раствора аммиака. Контролировали рН (9-10) и дважды экстрагировали смесью хлороформ - бутанол-1 (6:1) порциями по 2 мл. Органические фазы отделяли, объединяли и фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Перед выпариванием экстракта во флакон вносили 20 мкл ледяной уксусной кислоты. Экстракт выпаривали до сухого остатка в токе азота (40°С).

К сухому остатку прибавляли 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида (замывая стенки виалы), виалу плотно укупоривали и обрабатывали микроволновым излучением в СВЧ - печи с мощностью 560 Вт в течение 5 минут. После охлаждения виалу вскрывали и выпаривали избыток реагентов в токе азота (не выше 40°С). Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель ХМС.

Режим работы газового хроматографа с масс-селек-тивным детектором. Скорость потока газа-носителя (ге-

лий) через колонку 1,5 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 15:1, с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задавалась 250 и 280°С. Температура колонки: начальная 70°С в течение 2 мин и прогрев до 280°С со скоростью программирования 20 град/мин, выдержка при конечной температуре 8 мин. Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали равной величине автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров для ацетильных и метильных производных в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42-450 а.е.

Обработку хроматограмм с целью идентификации компонентов проб проводили с использ ованием пр ограмм ChemStation G1701 DA и AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST).

Результаты и их обсуждение

Новый тип синтетических каннабимиметиков PB-22 и PB-22F был выявлен в Перми и Пермском крае во второй половине 2012 года. Ранее нами была описана идентификация основных метаболитов каннабимиметиков PB-22 и PB-22F: 1-пентил-1Н-индол-3-карбоновой кислоты (маркер PB-22), 1-(5-фторпентил)-1Н-индол-3-карбоно-вой кислоты (маркер PB-22F) и 8-оксихинолина в моче потребителей методами твердофазной экстракции (ТФЭ) и ГХ-МС [9].

Одной из проблем определения каннабимиметиков является отсутствие быстрых и недорогих методов предварительного анализа. Использование ранее предложенного нами метода [9] с применением ферментативного гидролиза эффективно для целей определения маркеров каннабимиметиков PB-22 и PB-22F, но не всегда доступно в рутинном анализе по причине использования ферментных препаратов ф-глюкуронидаза) и оборудования для ТФЭ.

Установлено, что применение метода скрининга мочи на лекарственные и наркотические вещества также позволяет установить в моче наличие 8-оксихинолина (Рис. 1). 8-Оксихинолин может быть идентифицирован с

тгкв

кислота

8-ТГК кислота

ТГК кислота

Маркеры PB-22 и PB-22F

Рис. 2. Фрагмент ионных профилей, полученных при исследовании мочи лица, употреблявшего марихуану.

Рис. 1. Фрагмент ионного профиля для характеристических ионов ацетилированного 8-оксихинолина - А. Масс-спектры пика со временем удерживания 8,72 и библиотечного спектра сравнения ацетилированного 8-оксихинолина - Б.

тгкв

кислота

4 4 .7 О , 0 2 4 5 .7 О О О 7 6 О .D 8-ТГК

] кислота

1 и..

12 7О , 0 3 1 3 7 О> ОО76° D ТГК

I кислота

Маркеры

PB-22 и PB-22F

77 А9 11

Рис. 3. Фрагмент ионных профилей, полученных при исследовании мочи лица, употреблявшего каннабимиметики РВ-22 и РВ-22Е

. . .11.-1 2 3. 2 9. .'.ее. .1.1 151. . 16 «I 7 4 i в з i 9 о

О 1 1 О 1 2 О 130 1 4 О 1 5 О 1 6 0 170 1 8 О

использованием коммерческих библиотек масс-спектров: NIST, Designer Drugs 2011. Обнаружение 8-оксихинолина в результате проведения скрининга мочи позволяет предположить употребление синтетических каннабимиметиков PB-22 и/или PB-22F.

Для определения маркеров PB-22 и PB-22F может быть использована модифицированная методика определения основного метаболита ТГК в моче [2].

Модификация метода заключалась во введении дополнительных регистрируемых групп характеристических ионов для маркеров PB-22 и PB-22F. Общие данные для модифицированного метода ГХ-МС приведены в таблице 1.

На Рис. 2 и Рис. 3 представлены фрагменты ионных профилей, полученных при исследовании мочи лиц, употреблявших марихуану и каннабимиметики PB-22 и PB-22F.

Как показала практика применения модифицированного метода, в ряде случаев при подтверждении предварительных положительных результатов иммуно-анализа на наличие марихуаны (каннабиноидов), помимо тетрагидроканнабиноловой кислоты, в виде метиловых эфиров выявлялись и маркеры каннабимиметиков PB-22 и/или PB-22F (метиловые эфиры 1-пентил-1Н-индол-3-карбоновой и/или 1-(5-фторпентил)-1Н-индол-3-карбо-новой кислоты), что свидетельствует о комбинированном приеме синтетических каннабимиметиков и растительных каннабиноидов.

Оба рассматриваемых метода имеют стадию гидролиза, позволяющую разрушить конъюгаты целевых аналитов, этап ЖЖЭ с применением доступных и широко применяемых в судебно-химических исследованиях и хи-

Таблица 1

Интервалы регистрации ионов, характеристические ионы, интенсивности ионов и времена удерживания аналитов для модифицированного метода ГХ-МС

Соединение Интервал регистрации, мин m/z и интенсивности регистрируемых ионов Время удерживания, мин Индекс удерживания

PB-22 маркер, метил- 7,8 - 8,4 188 245 (72) 214 (36) 7,99 2211

PB-22F маркер, метил- 8,4 - 10,0 188 263 (56) 232 (37) 8,51 2261

ТГКВ кислота*, диметил- 10,0 -11,20 285 329 (74) 344 (49) 10,62 2573

Дельта-8-ТГК кислота**, диме-тил- 11,2- 13,0 316 245 (152) 12,36 2763

ТГК кислота, ди-метил- 313 357 (80) 372 (49) 12,44 2779

* 11-нор-дельта-9-тетрагидроканнабиварин-9-карбоновая кислота; ** 11-нор-дельта-8-тетрагидроканнабинол-9-карбоновая кислота - внутренний стандарт.

мико-токсикологическом анализе растворителей, а также стадию дериватизации извлечения для последующего ГХ-МС исследования.

Выводы:

Предложен вариант определения основных метаболитов каннабимиметиков РВ-22 и РВ-22Б: 8-оксихинолина, 1-пентил-1Н-индол-3-карбоновой и 1-(5-фторпентил)-1Н-индол-3-карбоновой кислот с применением скрининга мочи на наркотические и лекарственные вещества и модифицированного метода определения каннабиноидов в моче. Сочетание обоих методов может быть использовано для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Литература:

1. Катаев С.С., Зеленина Н.Б., Дворская О.Н. Идентификация маркеров каннабимиметиков РВ-22 и PB-22F в моче методом ГХ-МС//Бутлеровские сообщения, 2013. - Т. 34. -№4.-С. 116-122.

2. Катаев С.С., Зеленина Н.Б., Мелентьев А.Б., Залесова В.А., Курдина Л.Н. Обнаружение каннабиноидов в моче // Суд.-мед. экспертиза, 2005. -№2.-С. 35-38.

3. Grigoryev A., Kavanagh P., MelnikA. The detection of the urinary metabolites of 3-[(adamantan-l-yl)carbonyl]-l-pentylindole (AB-001), a novel cannabimimetic, by gas chromatography-mass spectrometry // Drug Test Analysis, 2012. - Vol. 4.-№6.-P. 519-524.

4. Grigoryev A., Melnik A., Savchuk S., Simonov A., Rozhanets V. Gas and liquid chromatography-mass spectrometry studies on the metabolism of the synthetic phenylacetylindole cannabimimetic JWH-250, the psychoactive component of smoking mixtures // J. Chromatogr. BAnalyt. Technol. Biomed.LifeSci., 2011. - Vol. 879. -№25. - P. 2519-2526.

5. Kavanagh P., Grigoryev A., Melnik A., Simonov A. The identification of the urinary metabolites of 3-(4-methoxybenzoyl)-l-pentylindole (RCS-4), anovelcannabimimetic, bygaschromatography-massspectrometry//J. Analyt. Toxicol., 2012. - Vol. 36. —№5.—P. 303-311.

6. Moosmann В., Kneisel S., Girreser U., Brecht V., Westphal F., Auwarter V. Separation and structural characterization of the synthetic cannabinoids JWH-412 and l-[(5-fluoropentyl)-lH-indol-3yl]-(4-methylnaphthalen-l-yl)methanone using GC-MS, NMR analysis and a flashchromatographysystem/ZForensicSciencelnternational, 2012. - Vol. 220. -№1-3. - P. 17-22.

7. Shevyrin V., Melkozerov V., Nevero A., Eltsov O., Morzherin Y., Shafran Y. Identification and analytical properties of new synthetic cannabimimetics bearing 2,2,3,3-tetramethylcyclopropanecarbonyl moiety // Forensic Science International, 2013. - Vol. 226. - № 1-3. -P. 62-73.

8. Sobolevsky T., Prasolov I., Rodchenkov G. Detection of JWH-018 metabolites in smoking mixture post-administration urine // Forensic Science International, 2010. - Vol. 200. -№1-3. -P.141-147.

9. Uchiyama N., Kawamura M., Kikura-Hanajiri R., Goda Y. URB-754: a new class of designer drug and 12 synthetic cannabinoids detected in illegalproducts/ZForensicSciencelnternational, 2013. - Vol. 227. -№ 1-3. -P.21-32.

10. Zuba D., Byrska B. Analysis of the prevalence and coexistence of synthetic cannabinoids in "herbal high "products in Poland // Forensic Toxicol., 2013. - Vol. 31. -№ 1. -P.21-30.

© Д.С. Сопин, Н.В. Захарченко, 2013 УДК 340.67.615.273.2: 543.42.062

Д.С. Сопин, Н.В. Захарченко ВАРИАНТ ОБНАРУЖЕНИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ ПРЕПАРАТА «СОРБИФЕР ДУРУЛЕС»

Северо-Казахстанский Филиал Республиканского Государственного Казенного Предприятия «Центр Судебно-медицинской экспертизы» МЗ Республики Казахстан

Содержание ионов железа в органах, тканях и моче «Сорбифер Дурулес» - антианемический препарат,

человека в "норме", мг/100г сырой массы: печень 10,1-31,0; содержащий в 1 таблетке 320 мг железа сульфата (II) и 60 мг

почки 4,8-19,0; сердце 4,0-17,0; легкие 13,9-33,5; селезенка аскорбиновой кислоты [1]. Минимальная летальная доза

12,8-61,0; вещество головного мозга 3,7-6,1; кровь 23,2- сульфата железа (II) для взрослых составляет примерно 30

60,0; моча 1,0-30,0 [6]. г, но для ребенка опасность может представлять и 1 г. [11].