СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОБЩЕЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ
METHOD FOR PREDICTION OF OVERALL SURVIVAL IN PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHATIC LEUKAEMIA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом.
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - опухолевое заболевание лимфатической ткани, в основе развития которого лежит моноклоновая пролиферация патологических лимфоидных элементов. Болезнь проявляется лимфатическим лейкоцитозом, диффузной лимфоцитарной пролиферацией в костном мозге, увеличением лимфатических узлов, селезенки и печени [1]. Среди всех лейкозов хронический лимфолейкоз занимает особое место. Хронический лимфолейкоз - наиболее распространенный вид лейкоза в странах Европы. На его долю приходится около 30% среди всех лейкозов. Ежегодная заболеваемость ХЛЛ составляет 3-3.5 на 100000 населения, а среди лиц старше 65 лет - до 20 на 100000 [2]. В России ХЛЛ заболевают около 4500 человек в год и 2300 умирают от этой болезни. Не менее 40-50% пациентов имеют короткую выживаемость, свободную от лечения, и требуют неотложного назначения лечебных мероприятий. В данной группе больных болезнь быстро прогрессирует и проходит всего 2-4 года с момента установления диагноза до смерти больного, несмотря на интенсивную терапию. У других больных болезнь характеризуется вялотекущим течением, необходимость в терапии возникает в ближайшие 3-5 лет от момента постановки диагноза [3]. Таким образом, разработка способа прогнозирования общей выживаемости больных ХЛЛ является актуальной для гематологии.
Анализ литературных данных по патогенезу хронического лимфолейкоза позволяет заключить, что до настоящего времени имеются разные взгляды на природу этого заболевания и в основе развития хронического лимфолейкоза лежат сложные многоэтапные иммунопатологические механизмы. Одним из ключевых звеньев в реализации каскада этих механизмов являются процессы взаимодействия цитокинов [4]. При этом центральное место в данных взаимодействиях занимают интерлейкины, в частности, интерлейкин 4 и интерлейкин 6 [5, 6].
Согласно данным литературы, интерлейкин-4 или IL-4 - полипептид, продуцируемый Т-хелперами 2-го класса (Th2), а также тучными клетками. Основными клетками мишенями IL-4 служат В-лимфоциты. IL-4 усиливает пролиферацию В-лимфоцитов и, действуя в синергизме с IL-6, является самым сильным ростовым и дифференцировочным фактором для этих клеток. Ген IL-4 картирован в 5-й хромосоме (5q31.1). Функционально значимым полиморфным вариантом гена IL-4 является полиморфизм 590С/Т в промоторной области, который представляет собой замену С на Т в 590-м положении [7]. Согласно некоторым исследованиям полиморфизм -590С/Т гена IL-4 ассоциирован с повышенной промоторной активностью гена и повышенным уровнем общего IgE в сыворотке крови. Также показана роль полиморфизма -590С/Т гена IL-4 в патогенезе бронхиальной астмы, герпетической инфекции, рака молочной железы и др. [8].
Интерлейкин 6 или IL-6 - полипептид, состоящий из 212 аминокислотных остатков с молекулярной массой 19-34 kDa, который является фактором дифференцировки В-клеток, способствуя созреванию В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки. Ген IL-6 локализован на коротком плече 7-й хромосомы и состоит из 5 экзонов и 4 интронов Распространенный G/C полиморфизм в нуклеотидной позиции -174 промотора гена интерлейкина-6 влияет на уровень экспрессии данного гена, определяя таким образом склонность к развитию ряда заболеваний, включая опухолеобразование [9].
При изучении уровня техники и проведении патентного исследования по направлению «Способ прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом» аналогов не найдено.
Задачей настоящего технического решения является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом по данным о генетических полиморфизмах -590С/Т гена интерлейкина 4, -174G/C гена интерлейкина 6 и наличия цитопенических осложнений в течении заболевания.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки выживаемости больных хроническим лимфолейкозом.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов -590С/Т гена интерлейкина 4 и -174G/C гена интерлейкина 6;
- выявление наличия цитопенических осложнений;
- прогнозирование снижения общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом в случае выявления аллеля -590Т гена интерлейкина 4, аллеля -174G гена интерлейкина 6 и наличия цитопенических осложнений в течении заболевания.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом по наличию аллеля -590Т гена интерлейкина 4, аллеля -174G гена интерлейкина 6 и цитопенических осложнений в течении заболевания. Способ осуществляют следующим образом:
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим лимфолейкозом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (рН=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).
Изучение полиморфных локусов интерлейкина 4 (-590С/Т IL-4) и интерлейкина 6 (-174G/C IL-6) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (таблица 1) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей.
Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (рН=8,8), 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 95°С) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин. при 59°С; денатурация - 15 сек при 95°С.
Изобретение характеризуется на фиг.1. и фиг.2.
На фиг.1 представлена дискриминация аллелей по локусу -590С/Т IL-4 (где • - гомозиготы по аллелю -590С,  - гомозиготы по аллелю -590Т,  - гетерозиготы -590СТ,  - отрицательный контроль), которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю Т, зонд с красителем FAM - аллелю С.
На фиг.2 представлена дискриминация аллелей по локусу -174G/C IL-6 (где • - гомозиготы по аллелю -174С,  - гомозиготы по аллелю -174G,  - гетерозиготы -174GC,  - отрицательный контроль), которая также осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю С.
На фиг.1 и 2 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси х) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (-590СТ IL-4, -174GC IL-6, соответственно).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю -590Т IL-4 и аллелю -174GIL-6, соответственно (RFU для данных аллелей отложены по оси у).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю -590С IL-4 и аллелю -174С IL-6, соответственно (RFU для данных аллелей отложены по оси х).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Влияние генетических и паратипических факторов на общую выживаемость больных хроническим лимфолейкозом изучали с применением регрессионной модели Кокса [11].
Возможность использования предложенного способа для оценки риска снижения общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом подтверждает анализ результатов наблюдений 206 больных хроническим лимфолейкозом и 307 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.
В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.
С помощью монофакторного анализа общей выживаемости пациентов с хроническим лимфолейкозом (регрессионная модель Кокса) были выделены факторы, имеющие неблагоприятное прогностическое значение. Установлено, что наличие аллеля -590Т гена IL-4, аллеля -174G гена IL-6 и развитие цитопенических осложнений в течении хронического лимфолейкоза ухудшают общую выживаемость (табл.2).
Предполагая, что возможна взаимосвязь факторов, влияющих на общую выживаемость пациентов с хроническим лимфолейкозом, был проведен многофакторный регрессионный анализ, который показал аналогичные данным монофакторного анализа результаты: неблагоприятными прогностическими факторами являются носительство аллелей -590Т IL-4, -174G IL-6 и наличие цитопенических осложнений в течении ХЛЛ (р=0,05).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о взаимосвязи двух полиморфизмов генов -590С/Т IL-4 и -174G/C IL-6 с общей выживаемостью больных хроническим лимфолейкозом. С помощью регрессионного анализа выделены факторы, снижающие общую выживаемость: факторами риска являются носительство аллеля -590Т гена IL-4 и аллеля -174G гена IL-6, а также наличие цитопенических осложнений в течении хронического лимфолейкоза.
Применение данного способа позволит спрогнозировать выживаемость пациентов с хроническим лимфолейкозом и подобрать индивидуальную тактику ведения больного хроническим лимфолейкозом.
Таблица 2
Монофакторный анализ влияния генетических и паратипических факторов на общую выживаемость у больных хроническим лимфолейкозом
Факторы, снижающие общую выживаемость пациентов
Уровень значимости фактора, р
Наличие мужского пола
0,10
Наличие септических осложнений в дебюте заболевания
0,34
Наличие симптомов интоксикации в дебюте заболевания
0,34
Наличие цитопенических осложнений в дебюте заболевания
0,41
Наличие септических осложнений на момент обследования
0,33
Наличие симптомов интоксикации на момент обследования
0,42
Наличие цитопенических осложнений на момент обследования
0,04
Наличие аллеля -889С L-1A
0,45
Наличие аллеля -511С IL-1B
0,42
Наличие аллеля -590Т IL-4
0,05
Наличие аллеля -703 С IL-5
0,31
Наличие аллеля -174G IL-6
0,05
Наличие аллеля -251A IL-8
0,67
Наличие аллеля 113Т IL-9
0,15
Наличие аллеля -592C IL-10
0,33
Литература.
1. Клиническая онкогематология. / Под ред. М.А. Волковой. - М.: Медицина, 2001 - С.376-394.
2. Воробьев А.И., Кременецкая А.М., Харазишвили Д.В. Опухоли лимфатической системы. // Гематол. и трансфузиология. - 2000. - №3. - С.3-14.
3. Волкова М.А. Биологические особенности хронического лимфолейкоза и современные подходы к его терапии. // Материалы V Российской онкологической конференции, Москва - 2001. - 240 с.
4. Геном человека и гены «предрасположенности»: введ. в предиктив. медицину / В.С. Баранов, Е.В. Баранова, Т.Э. Иващенко [и др.]. - СПб.: Интермедика, 2000. - 271 с.
5. Chronic lymphocytic leukemia cell CD38 expression and inducible nitric oxide synthase expression are associated with serum IL-4 levels / M. C. Levesque, Y. Chen, В. E. Beasley [et al.] // Leuk. Res. - 2006. - Vol.30, №1. - P.24-28.
6. Калимуллина, Д. X. Полиморфизм промоторной области (-174 G/C) гена IL-6 и выживаемость при множественной миеломе / Д.X. Калимуллина, А.Б. Бакиров, Т.В. Викторова // Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т.3, №3. - С.32-36.
7. Популяционные особенности полиморфизма генов цитокинов (IL-4, IL-10) у коренных жителей республики Хакасия, больных аллергической бронхиальной астмой / Е.А. Андрейчикова, Ю.А. Сенникова, А.А. Пискунов [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т.8, №4. - С.37-40.
8. Полиморфизм промоторного региона генов IL-4, IL-6 и IL-10 у пациенток с раком молочной железы / А.В. Шевченко, О.В. Голованова, М.Ю. Коломейчук [и др.] // Медицинская иммунология. - 2009. - Т.11, №1. - С.21-28.
9. Ассоциация полиморфных маркеров генов цитокинов (IL1B, IL1RN, TNFA, LTA, IL6, IL8, IL10) с развитием хронической обструктивной болезни легких / К.В. Данилко, Г.Ф. Корытина, Л.З. Ахмадишина [и др.] // Молекулярная биология. - 2007. - Т.41, №1. - С.26-36.
10. Analysis of inflammation- and atherosclerosis-related gene polymorphisms in branch retinal vein occlusion / I. Steinbrugger, A. Haas, R. Maier [et al] // Mol. Vis. - 2009. - Vol.15. - P.609-618.
11. Боровиков, В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов).