СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ЦИТОСТАТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИИЕМ В ОТНОШЕНИИ ЛИМФОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR PRODUCING AGENT POSSESSING CYTOSTATIC ACTION ON HUMAN LYMPHOBLASTS

Изобретение относится к медицине, клеточной биотехнологии, может быть использовано для получения средства, обеспечивающего подавление незрелых лимфоидных клеток (лимфобластов) человека, которое, в свою очередь, может найти применение для изготовления антионкологических лекарственных препаратов, используемых при лечении острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ).
ОЛЛ является самым распространенным злокачественным заболеванием в детском и юношеском возрасте (Н. Franklin Bunn, Jon С. Aster Chapter 21: Acute Leukemias // Pathophysiology of Blood Disorders. - The McGraw-Hill Companies, Inc., 2011. - С. 244-259).
Пик заболеваемости приходится на возраст от 1 года до 6 лет. Чаще болеют мальчики (Dores G.M., Devesa S.S., Curtis R.E., Linet M.S., Morton L.M. Acute leukemia incidence and patient survival among children and adults in the United States, 2001-2007 // Blood. - B. 1. - Т. 119. - С. 34-43). Заболевание протекает с поражения костного мозга, лимфатических узлов, селезенки и др. органов.
Ведущим методом лечения при ОЛЛ у детей является химиотерапия. Работы по созданию новых противоопухолевых средств направлены на получение таких препаратов, которые при максимальном ингибирующем воздействии на опухолевые клетки минимально повреждали бы нормальные клетки и ткани организма (костный мозг, слизистую оболочку пищеварительного тракта, печень, сердечную мышцу, легочную ткань и т. Д.).
Тем не менее пациенты, получающие химиотерапию, имеют высокий риск развития инфекционных осложнений, так как и опухолевый процесс, и проводимая специфическая терапия приводят к нарушению различных звеньев иммунного ответа. Известны случаи, когда у детей с ОЛЛ после проведения соответствующей химиотерапии резко снижается или полностью отсутствует протекторный уровень антител против целого ряда вирусов (Nilsson A., De MiliutoA. et al. Current chemotherapy protocols for childhood acute lymphoblastic leukemia induce loss of humoral immunity to viral vaccination antigens. Pediatrics 2002; 109(6):e91).
Значимыми факторами в ходе химиотерапии гематологических больных являются нейтропения и нарушение целостности кожных покровов и слизистых оболочек (Koh A.Y., Pizzo P.A. Fever and granulocytopenia. In S.S. Long, L.K. Pickering, C.G. Prober, eds. Principles and Practice of Pediatric Infectious Diseases, 2nd ed. Churchill Livingstone, 2003), что может оказать существенное негативное влияние на эффективность и благоприятный прогноз лечения.
Достижения онкогематологии последних лет позволяют излечить от злокачественной опухоли большинство детей. Вместе с тем, несмотря на излечение, дети и подростки, которым проводилась химиотерапия, могут иметь целый спектр медицинских проблем, включающих риск ранней смерти, возможность развития вторичных злокачественных опухолей, дисфункцию внутренних органов (Robison L.L. et al. Long-term out comes of adult survivors of childhood cancer. Cancer 2005; 104 (Suppi 11)2557-64). При этом органная токсичность непосредственно зависит не только от вида опухоли, но и проводимого лечения химиопрепаратами (С.Р. Варфоломеева и соавт. Онкология 1-2, 2008, стр. 63-69).
Работами В.А. Шестакова и соавторов была доказана возможность получения активных фракций из сыворотки крови птиц, снижающих пролиферацию различных линий опухолевых клеток человека (патент РФ №2426548).
Некоторые активные фракции, как показали наши исследования, могут оказывать стимулирующее действие на клетки костного мозга (патент РФ №2508297).
Важно отметить, что стимулирующий или ингибирующий эффекты полученных активных фракций распространяются только на раковые и стволовые клетки костного мозга и не оказывают влияния на здоровые клетки человека.
В доступной литературе нами не найдено сведений о средствах для подавления роста, миграции, пролиферации злокачественных клеток при ОЛЛ, созданных на основе сыворотки крови.
Задачей данного изобретения было получение субстанции (агента), способной разрушать злокачественные клетки (опухолевые лимфобласты) при ОЛЛ, то есть обладающего цитотоксическим действием в отношении лимфобластов, неконтролируемая пролиферация которых происходит при ОЛЛ.
Технический результат заключается в обеспечении подавления злокачественных клеток (цитостатической активности) при ОЛЛ на фоне снижения гематологической, иммунологической токсичности воздействия на организм, а также риска возникновения тяжелых осложнений, наблюдаемых при проведении противоопухолевой химиотерапии за счет использования полученного с помощью предложенного способа агента, а также в удешевлении и упрощении способа за счет использования доступного сырья.
Нами установлено, что микрофильтрация электрошоковой сыворотки крови кур через мембрану с диаметром отверстий 0,5 нм позволяет выделить из нее пептидную фракцию (ПФ), обладающую цитостатическим действием в отношении лимфобластов человека, неконтролируемая пролиферация которых наступает при ОЛЛ.
Сущность изобретения состоит в следующем.
Для получения средства (агента) из крови кур, обладающего цитостатическим действием в отношении лимфобластов человека, проводят электростимуляцию голов кур в режиме 100-120 В, 3-5 А, в течение 3-5 секунд. После чего осуществляют забор и инкубацию крови кур. Затем отделяют сыворотку. Выделяют из нее ПФ с молекулярной массой 850 - 1200 Да (от 850 до 1200 Да.). Полученную ПФ лиофилизируют и стерилизуют путем облучения в линейном ускорителе электронов (ЛУЭ) с дозой 28-32 кГр.
Способ осуществляется следующим образом.
Для получения ПФ используют кровь кур. Проводят электростимуляцию их голов в режиме 100-120 В, 3-5 А, в течение 3-5 секунд. После перерезки сонных артерий и вен кровь собирают самотеком в полиэтиленовые флаконы. Собранную кровь инкубируют при температуре 4-8°С в течение 18-24 часов, а затем отсасывают сыворотку и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 3-5 мин.
Далее полученную сыворотку подвергают микрофильтрации через мембрану с диаметром отверстий 0,5 нм для выделения ПФ с молекулярной массой 850-1200 Да.
Лиофилизацию проводят способом мягкой сушки, при котором полученную активную субстанцию замораживают, а потом помещают в вакуумную камеру, где и происходит возгонка жидкости. Далее проводят ее стерилизацию путем облучения в ЛУЭ «Электроника 10-10» с дозой 28-32 кГр.
Приводим конкретный пример получения биологически активной субстанции из крови кур для подавления злокачественных клеток при ОЛЛ.
Для получения сыворотки использовали кровь 2000 кур во время их планового забоя на птицефабрике сразу после перерезки артерий. Перед забором крови проводили электростимуляцию их голов в режиме 110 В, 4 А, в течение 4 секунд.
Кровь собирали в пластиковые емкости и затем инкубировали при низкой температуре 4-8°С в течение 24 часов, отсасывали сыворотку и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 4 мин. Далее для выделения ПФ с молекулярной массой 850-1200 Да полученную сыворотку подвергали микрофильтрации. Микрофильтрацию проводили с использованием отечественной установки «УФА» (фирмы «Эмбора») через мембрану с диаметром отверстий 0,5 нм.
Затем проводили лиофилизацию полученной ПФ способом мягкой сушки, при котором ее замораживали, а потом помещали в вакуумную камеру. Далее стерилизовали в режиме 28-32 кГр путем облучения на ЛУЭ «Электроника 10-10».
В результате получили биологически активную субстанцию с молекулярной массой 850-1200 Да. Полученную таким образом субстанцию хранили при температуре 4-8°С.
Для доказательства возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Нами были проведены следующие экспериментальные исследования.
В работе были использованы злокачественные клетки (лимфобласты), полученные у пациентов с ОЛЛ, которые в объеме 3-5 мл помещали в стерильные пластиковые пробирки («Coming»), содержащие 1 мл среды RPMI и 300 ЕД гепарина с соблюдением правил асептики. После забора образцы хранили при комнатной температуре и использовали для дальнейшего анализа в течение последующих 24 часов.
За основу метода был взят МТТ-анализ (Mosmann Т.J. Immunol. Meth., 55-63, 1965) по методике лаборатории онкогематологии и иммунологии госпиталя Свободного Университета Амстердама (Veerman AJP, 1990; Kaspers GJL, 1993), которая была модифицирована в лаборатории регуляции кроветворения ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития России (Астрелина Т.А. и соавт. Гематология и трансфузиология, Т. 47, №4, стр. 3-7, 2002).
6
Клетки ресуспендировали до концентрации 2×10/мл в полной среде. Суспензию клеток в соответствии со схемой проведения теста по 80 мкл равномерно распределяли по лункам 96-луночной планшеты, содержащим различные разведения тестируемой ПФ в объеме 20 мкл с дублированием каждого образца, а также по ряду лунок с 20 мкл среды RPMI (контроль жизнеспособности). Лунки «бланк» содержали по 20 мкл неполной среды RPMI и 80 мкл полной среды.
Использовалось 6 концентраций пептидов с 4-кратным шагом разведения. Каждый образец дублировали. В таблице 1 представлена шкала используемых концентраций ПФ.
2
Планшеты инкубировали во влажном инкубаторе с 5%-ным содержанием CO в течение 4 суток при температуре 37°С.
2
По окончании инкубации в каждую лунку планшета добавляли по 10 мкл раствора МТТ (3-[4,5-dimethilthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), разведенного 0,9% NaCl до концентрации 5 мг/мл. После встряхивания планшет на платошейкере проводили инкубацию в течение 6 часов во влажном инкубаторе с 5%-ным содержанием CO при температуре 37°С.
Кристаллы формазана, образовавшиеся по окончании инкубации, растворяли добавлением 100 мкл изопропанола с 2N HCl (Isopropyl alcohol, ICN). Содержимое каждой лунки тщательно перемешивали.
Определяли оптическую плотность опытных и контрольных образцов на ридере (Microplate Reader, model550, Bio-Rad) при длине волны 550 нм.
ОЛ
КЛ
ОЛ
КЛ
ОП - оптическая плотность опытных лунок, ОП - оптическая плотность контрольных лунок. В качестве ОП брали среднее арифметическое оптических плотностей 14 дублей, содержащих среду с опухолевыми лимфобластами и каждой концентрации полученной ПФ, а в качестве ОП - среднее арифметическое оптической плотности лунок, содержащих среду с опухолевыми лимфобластами без указанной полипептидной фракции. Затем строили график зависимости выживаемости опухолевых лимфобластов от концентрации пептидной фракции.
Статистическая обработка полученных результатов
Для оценки средних значений использовалась величина медиана, а для определения достоверности различий между группами применяли непараметрический критерий Манна-Уитни.
Статистическая компьютерная обработка полученного материала проводилась в программах Microsoft Excel, Statistica 6.0. Различия считались статистически значимыми при р<0.05.
На рис. 1 представлены данные, касающиеся первого дня исследования.
На рис. 2 представлены данные, касающиеся третьего дня исследования.
На рис. 3 представлены данные, касающиеся пятого дня исследования.
Результаты, представленные на рис. 1-3, свидетельствуют о том, что полученное с помощью предлагаемого способа средство обладает высокой эффективностью в плане подавления опухолевых лимфобластов (цитостатическое действие в отношении лимфобластов, полученных у пациента с ОЛЛ) уже 1-й день исследования и достигает своего максимума на 5-й день (р<0.01) при разведении ПФ 1 мг/мл.
В таблице 2 представлены медианы LC50 сыворотки больных ОЛЛ, тестовой средой (линия HL60) и сывороткой, содержащей лимфоциты здоровых доноров.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемая субстанция обладает высокой эффективностью в плане подавления опухолевых лимфобластов (цитостатической активностью). Так концентрация исследуемой ПФ, приводящая к гибели 50% лимфоцитов здоровых доноров, была в 10 и 20 раз выше необходимой концентрации, вызывающей 50% гибель опухолевых лимфобластов и лимфобластов линии HL60 соответственно.
Таким образом, предложенный способ позволяет получить антионкологический агент из крови кур, который обеспечивает подавление опухолевых клеток (лимфобластов) - обладает цитостатической активностью в отношении лимфобластов при ОЛЛ и не оказывает существенного влияния на здоровые клетки.
Предлагаемый способ предполагает использование доступного сырья: технология заготовки куриного мяса предполагает удаление крови, которая может быть в нем использована.