Секвенирование «Нового поколения» (NGS): применение для молекулярно-генетических исследований в онкологии

Секвенирование «нового поколения» (NGS): применение для молекулярно-генетических исследований в онкологии. Next-Generation Sequencing (NGS): application in molecular genetic studies in oncology.

Новикова Е.И., д.б.н. Снигирева Г.П. Novikova E.I., Dr. Snigiryova G.P.

ФГБУ "Российский Научный Центр Рентгенорадиологии" Минздрава РФ Москва, ул. Профсоюзная, д.86, 117997

FBSI "Russian Scientific Center of Roentgenology&Radiology" Ministry of Health Moscow, Profsouznaya 86, 117997

Секвенирование «нового поколения» в качестве комплексного высокопроизводительного диагностического и прогностического молекулярно-генетического метода активно внедряется в практическую медицину. В настоящее время доступны как полногеномные и полноэкзомные исследования, так и различные таргетные панели для NGS. В обзоре рассмотрены основные принципы и технологии высокопроизводительного секвенирования для использующихся в настоящее время коммерческих платформ (подготовка библиотек, секвенирование и обработка полученных данных), а также применение данного метода в клинической онкологии для выявления герминальных и соматических мутаций в таргетных генах и поиска новых генетических вариантов, ассоциированных с онкологическими заболеваниями.

Next-generation sequencing as a complex high-throughput diagnosis and prognosis molecular genetic method is actively implemented in practical medicine. Whole-genome sequencing, whole-exome sequencing and different targeted region panels for NGS are available now. In this review fundamental principles and technologies of high-throughput sequencing for the currently used commercial platforms (library preparation, sequencing and obtained data processing) are considered, as well as the application of this method in clinical oncology to

identify germline and somatic mutations in the targeted genes and search for new cancer associated genetic variants.

теквенирование «нового поколения» (NGS), диагностический и прогностический молекулярно-генетический метод, терминальные мутации, соматические мутации персонализированная медицина

next-generation sequencing (NGS), diagnosis and prognosis molecular genetic method, germline mutations, somatic mutations, personalized medicine

Оглавление

1. Введение

2. Технологии NGS

3. Применение NGS в клинической онкологии

• Идентификация новых мутаций

• Тестирование терминальных мутаций

• Персонализированное лечение онкологических заболеваний

• Исследование циркулирующей опухолевой ДНК

4. Заключение

5. Список литературы

1. Введение

Молекулярная диагностика в настоящее время играет важную роль в медицине и, в частности, в онкологии, так как возникновение онкопатологии напрямую связано с накоплением мутаций в молекуле ДНК. В настоящее время для анализа нуклеотидной последовательности ДНК широко используются традиционные подходы, включая методы секвенирования по Сэнгеру, пиросеквенирования и аллель-специфической ПЦР. Однако, из-за низкой призводительности, данные методы ориентированы исключительно на тестирование наиболее распространенных мутаций в целевых генах.

В последние годы бурное развитие получили технологии массового параллельного секвенирования, которые позволяют за несколько дней проанализировать весь человеческий геном или большое количество генов (сотни и тысячи) в одном тесте. Благодаря своей высокой производительности, технологии NGS находят применение в практической медицине. Появляются мультигенные панели для анализа наследственных мутаций в генах, ассоциированных с высоким риском возникновения онкопатологии, а также соматических мутаций, влияющих на выбор таргетных препаратов. В настоящее время происходит внедрение широкого спектра разрешенных к использованию в

медицинской практике методов диагностики, основанных на секвенировании «нового поколения».

Использование молекулярно-генетической диагностики в онкологии имеет особую актуальность, так как появилась возможность выбирать оптимальные схемы лечения пациентов в зависимости от молекулярного профиля опухоли, применяя персонализированный подход, а также выявлять наследственную предрасположенность к онкологическим заболеваниям для их своевременного предупреждения.

2. Технологии NGS

Новые технологии секвенирования позволили усовершенствовать открытый более 30 лет назад основанный на электрофорезе метод Сэнгера, недостатками которого являются низкая пропускная способность и относительно высокая стоимость (Sanger et al., 1977). Технологии NGS позволяют секвенировать одновременно тысячи молекул ДНК, тем самым повышая скорость исследования и увеличивая объем получаемых данных, при этом снижая себестоимость анализа.

Принцип NGS основан на массовом параллельном секвенировании специальным образом подготовленных однонитевых библиотек фрагментированной ДНК исследуемых образцов. В настоящее время для высокопроизводительного секвенирования доступны несколько коммерческих платформ: HiSeq, MiSeq и NextSeq 500 (Illumina), Roche 454 GS, Ion torrent (Thermo Fisher Scientific) и SOLiD (Applied Biosystems) (Cronin, Ross, 2011; Meldrum et al., 2011; Ross, Cronin, 2011; Desai, Jere, 2012; Ku et al., 2012; Rizzo, Buck, 2012).

Большинство технологий высокопроизводительного секвенирования включают в себя следующие этапы: подготовку библиотек, непосредственно секвенирование и анализ полученных данных.

Подготовка библиотек включает в себя фрагментирование ДНК до 300-500 нуклеотидных пар, лигирование (присоединение) секвенсовых адаптеров (синтезированные

олигонуклеотиды с известной последовательностью) с концами фрагментов и амплификацию полученных библиотек. Метод амплификации может отличаться для различных платформ. Например, платформа Ion torrent от Thermo Fisher Scientific использует метод эмульсионной ПЦР для амплификации одноцепочечных фрагментов на микросферах, в то время как технология фирмы Illumina основана на амплификации фрагментов методом мостиковой ПЦР и формировании кластеров на проточной ячейке (Berglund et al., 2011; Quail et al., 2012).

Секвенирование производится путем синтеза новых фрагментов ДНК на одноцепочечных ДНК-библиотеках, которые выполняют роль матрицы. Нуклеотиды встраиваются в новую цепь в определенном порядке, соответствующем матричной цепи, который записывается в цифровом виде. После включения в цепь каждого последующего нуклеотида прибор регистрирует сигнал. Разные платформы для NGS используют различные механизмы детекции встроенных в новую цепь нуклеотидов: детекцию флуоресцентного сигнала после включения в цепь комплементарного матрице нуклеотида (Illumina, SOLiD Applied Biosystems), изменение рН раствора в микрореакторе, связанное с выделением в среду ионов водорода в ходе синтеза ДНК ферментом (Ion torrent Thermo Fisher Scientific), или регистрацию светового сигнала после выделения пирофосфата, активирующего каскад химических реакций (Roche) (Quail et al., 2012).

После секвенирования полученные данные могут быть обработаны либо с помощью биоинформатика, либо - специального программного обеспечения, установленного на приборе или сервере. Данные проходят несколько этапов обработки: исключение ридов с низким качеством прочтения, выравнивание данных относительно референсной последовательности или сборку последовательности de novo и анализ результатов секвенирования, позволяющий определять тип генетических вариантов, включая их наследственный характер, оценить уровень экспрессии генов, идентифицировать новые гены и регуляторные элементы.

Для анализа полученных генетических вариантов на персональном компьютере, включая информацию об их клиническом значении, возможно использование предоставляемого компаниями программного обеспечения (Variant Studio, Illumina; Ion Reporter, Thermo Fisher Scientific), разработанного для простоты и удобства идентификации и классификации генетических нарушений.

3. Применение NGS в клинической онкологии

В зависимости от поставленной задачи, технологии NGS позволяют секвенировать как весь геном или экзом, так и использовать панели, включающие только необходимые таргетные гены, изменения в которых характерны для каждой локализации опухоли, тем самым снижая себестоимость анализа, увеличивая его производительность и упрощая обработку и интерпретацию полученных данных. Такие генетические тесты являются диагностическими и прогностическими факторами в клинической онкологии и играют важную роль при выборе тактики лечения для каждого пациента. Идентификация новых мутаций

Технологии NGS являются эффективным методом поиска новых и редких соматических мутаций. Полногеномное, полноэкзомное и даже таргетное секвенирование могут быть использованы для поиска новых генетических аберраций и связанных с ними потенциальных терапевтических мишеней для различных локализаций опухоли. Полногеномное секвенирование с помощью NGS у пациентов с редкой формой острого промиелоцитарного лейкоза позволило идентифицировать новую генетическую рекомбинацию PML-RARA, которую не удалось обнаружить стандартными цитогенетическими методами (Welch et al., 2011).

Gui и его коллеги (Gui et al., 2011) в своем исследовании отсеквенировали экзомы 9 образцов переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря для поиска соматических мутаций, ассоциированных с данной онкопатологией, и затем протестировали образцы 88 пациентов с данным заболеванием на наличие выявленных генетических вариантов, в

результате чего были обнаружены 55 мутаций, 49 из которых впервые найдены у больных раком мочевого пузыря.

Используя таргетное секвенирование с применением NGS, Keller и его коллеги (Keller et al., 2011) протестировали образцы 4 пациентов с диагнозом глиобластома и выявили более 1300 однонуклеотидных замен в 132 целевых генах, ассоциированных с данной локализацией опухоли, 34-64% (в зависимости от образца) из которых аннотированы в базе данных SNP. Этот факт свидетельствует о возможности эффективного применения целевого ресеквенирования в персонализированной медицине для оценки соответствующего генотипа и риска возникновения онкопатологии.

При обследовании группы пациентов (25 человек) с диагнозом немелкоклеточный рак легкого с использованием таргетной панели нами (Иванов и др., 2015) была обнаружена ранее не описанная в базах данных мутация в гене EGFR.

Успешное использование высокопроизводительного секвенирования было также продемонстрировано для идентификации новых генетических вариантов при почечно-клеточной карциноме (Guo et al., 2011), мелкоклеточном раке легкого (Pleasance et al.,

2010), раке предстательной железы (Berger et al., 2011), остром миелобластном лейкозе (Ley et al., 2008; Mardis et al., 2009) и хроническом лимфоцитарном лейкозе (Puente et al.,

2011).

Тестирование терминальных мутаций

Около 5-10% всех онкологических заболеваний носят наследственный характер. Повреждение молекулы ДНК в определенных, характерных для каждой локализации опухоли генах является определяющим фактором в развитии онкопатологии. Определение наследственного характера онкологического заболевания является важным условием для назначения адекватного лечения пациентов, а выявление мутаций в данных генах у здоровых людей позволяет оценить риск возникновения заболевания в течение жизни и проводить профилактические мероприятия с целью его ранней диагностики.

Определение терминальных мутаций в высокопенетрантных генах BRCA1 и BRCA2, играющих ключевую роль в поддержании целостности генома, в частности, в процессах репарации ДНК (Narod, Foulkes, 2004; Gudmundsdottir, Ashworth, 2006;) при раке молочной железы, а также в других высокопенетрантных и среднепенетрантных генах, ассоциированных с данной онкопатологией, имеет огромное значение для выбора индивидуальной схемы лечения пациентов, включающей профилактические операции, использование цитостатиков и PARP-ингибиторов (Helleday et al., 2008). В настоящее время для анализа генов, ассоциированных с наследственными онкологическими заболеваниями, широко используется метод генетического тестирования по Сэнгеру, который считается «золотым» стандартом для выявления генетических нарушений. Однако данный метод удобен только для поиска известных, наиболее распространенных мутаций и не подходит для секвенирования генов целиком из-за своей низкой производительности и высокой стоимости данного исследования (Walsh et al., 2010). Секвенирование «нового поколения» позволяет обнаружить редкие генетические варианты и протестировать одновременно большое число генов предрасположенности на наличие в них клинически значимых мутаций в короткие сроки, в отличие от традиционных молекулярно-генетических методов.

Так, с помощью NGS, были обнаружены герминальные мутации у пациентов с клиническими признаками наследственного заболевания, не найденные рутинными методами молекулярной диагностики. При обследовании 300 семей с высоким риском развития рака молочной железы Walsh и его коллегам удалось обнаружить ранее не выявленные клинически значимые генетические варианты у 52 человек (Walsh et al., 2006).

При обследовании 108 больных раком молочной железы с клиническими признаками наследственного заболевания и отсутствием часто встречающихся мутаций в генах BRCA1/2, проходивших лечение в РНЦРР, у 31% пациентов нами

были найдены патогенные варианты в генах предрасположенности BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBS1, ATM, PALB2.

В исследовании М.В.Немцовой и ее коллег (Немцова и др., 2015) с использованием таргетной панели среди 10 пациентов с диагнозом рак желудка без семейной истории заболевания у 3 были обнаружены герминальные мутации в генах APC, MET, CDKN2B, ATM, RB1, непосредственно не ассоциированных с данной онкопатологией, но, вероятно, имеющих отношение к развитию рака желудка и повышающих риск возникновения рецидива.

Ozcelik и соавторы (Ozcelik et al., 2012) в своей работе также продемонстрировали преимущества, экономичность и удобство использования NGS для BRCA -тестирования, обследовав 12 больных наследственным раком молочной железы и подтвердив результаты, полученные методом Сэнгера.

Таким образом, использование NGS для генетического тестирования наследственных онкологических заболеваний является первым шагом на пути внедрения данного метода в клиническую практику.

Персонализированное лечение онкологических заболеваний

Совершенствование рациональной индивидуализированной медицины и, в частности, персонализированного лечения онкологических заболеваний является на сегодняшний день одной из важных задач, для решения которой многие исследователи используют технологии высокопроизводительного секвенирования. Клиническая значимость такого исследования для выбора тактики лечения и назначения соответствующих таргетных препаратов была успешно продемонстрирована на примере использования NGS для молекулярно-генетического обследования больных раком поджелудочной железы (Mardis, 2012) и немелкоклеточным раком легкого (Marchetti et al., 2012).

Ярким примером внедрения молекулярной диагностики в персонализированную медицину в последние годы является идентификация соматических мутаций в генах EGFR

и BRAF, позволяющая предсказывать клинический ответ на лечение и выживаемость и являющаяся основанием для выбора кандидатов для терапии гефитинибом и вемурафенибом соответственно (Mok et al., 2009; Chapman et al., 2011). Roychowdhury и его коллеги впервые провели исследование, включающее одновременно секвенирование генома, экзома и транскриптома, в котором приняли участие 2 онкологических пациента, не реагирующих на терапевтическое лечение. У больного колоректальным раком были найдены изменения в генах CDK8 и NRAS, являющиеся потенциальными мишенями для будущих клинических испытаний. У пациента с диагнозом меланома обнаружены структурные перестройки в генах CDKN2C и HRAS, что стало основанием для назначения комбинированного лечения с ингибиторами PI3K и MEK (Roychowdhury et al., 2011).

Удачным примером применения NGS в клинической практике стало исследование полного генома и транскриптома опухолевых клеток, проведенное учеными Вашингтонского университета для их коллеги с диагнозом острый лимфобластный лейкоз, у которого дважды за 10 лет с момента постановки диагноза возникали рецидивы. В результате ученым удалось выявить повышенную экспрессию гена FLT3, после чего было назначено лечение препаратом сунитиниб, подавляющим экспрессию данного гена (Lev-Ari, 2012).

Вышеупомянутые исследования свидетельствуют о необходимости комплексного молекулярного-генетического обследования пациентов и разработки персонализированных схем лечения с учетом полученных результатов. Исследование циркулирующей опухолевой ДНК

Чувствительность метода NGS позволяет использовать его для поиска специфических мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК в плазме крови (Diaz, Bardelli, 2014). С помощью высокопроизводительного секвенирования Forshew (Forshew et al., 2012) удалось идентифицировать соматические мутации в генах KRAS, TP53 и EGFR в плазме

крови онкологических больных даже с низкой частотой мутантного аллеля - около 2%. По литературным данным уровень циркулирующей опухолевой ДНК увеличивается с прогрессированием заболевания и снижается после успешного терапевтического и хирургического лечения, что позволяет применять данный неинвазивный метод для мониторинга опухолевого ответа на терапию (Brennan et al., 2014).

Секвенирование «нового поколения» может быть использовано также для обнаружения новых мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК, возникающих с течением времени в процессе терапии, и вызывающих терапевтическую резистентность опухоли (Leary et al., 2012; Diaz et al., 2013; Murtaza et al., 2013).

Для выявления мутаций, возникающих во время терапии, Murtaza и его коллеги (Murtaza et al., 2013) проводили полноэкзомное исследование образцов плазмы метастатических больных раком молочной железы, яичников и легкого в течение 1-2 лет для отслеживания ответа на терапевтическое лечение. В процессе мониторинга были обнаружены новые генетические варианты, резистентные к терапии: мутации в генах PIK3CA, RB1, MED1, GAS6 и EGFR после лечения паклитакселом, цисплатином, тамоксифеном и трастузумабом, лапатинибом и гефитинибом соответственно. Таким образом, данное тестирование позволяет отслеживать динамику ответа на проводимое лечение, при необходимости модифицировать его, а также выявлять признаки возможного рецидива при невозможности получения биопсийного материала.

4. Заключение

Секвенирование «нового поколения» может применяться в клинической онкологии в качестве удобного инструмента, используемого в диагностических и прогностических целях. Благодаря своей высокой производительности, чувствительности и относительно низкой себестоимости, технологии NGS составляют достойную конкуренцию рутинным методам, активно использующимся сегодня в клинической практике. Активное внедрение

метода секвенирования «нового поколения» в клиническую практику делает нас на шаг ближе к персонализированной медицине.

5. Список литературы

1. Иванов М.В., Новикова Е.И., Баранова А.В. и др. Опыт использования высокопроизводительного секвенирования (NGS) для подбора таргетной терапии при немелкоклеточном раке легкого: преимущества и ограничения. // Международный ежеквартальный научно-практический журнал по онкологии "Злокачественные опухоли". Москва. 2015. №4. С.310-311.

2. Немцова М.В., Танас А.С., Алексеева Е.А. и др. Соматические и герминальные мутации при раке желудка. // Молекулярная медицина. 2015. №4. С.28-34.

3. Снигирева Г.П., Агаджанян А.В., Новицкая Н.Н. и др. Роль молекулярно-генетического исследования при раке молочной железы. // Международный ежеквартальный научно-практический журнал по онкологии "Злокачественные опухоли". Москва. 2014. №3. С.213.

4. Berger MF., Lawrence M S., Demichelis F. et al. The genomic complexity of primary human prostate cancer. // Nature. 2011. V. 470. N. 7333. P. 214-220.

5. Berglund E C., Kiialainen A., Syva nen, A C. Next-generation sequencing technologies and applications for human genetic history and forensics. // Investig. Genet., 2011. V. 2. P. 23.

6. Brennan C W., Verhaak R G., McKenna A. et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. // Cell. 2014. V. 157. N. 3. P. 753.

7. Chapman P B., Hauschild A., Robert C. et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. // N. Engl. J. Med. 2011. V. 364. N. 26. P. 2507-2516.

8. Cronin M., Ross J S. Comprehensive next-generation cancer genome sequencing in the era of targeted therapy and personalized oncology. // Biomark Med. 2011. V. 5. N. 3. P. 293-305.

9. Desai A N., Jere A. Next-generation sequencing: ready for the clinics? // Clin Genet. 2012. V. 81. N. 6. P. 503-510.

10. Diaz L A. Jr., SausenM., Fisher G A. et al. Insights into therapeutic resistance from whole-genome analyses of circulating tumor DNA. // Oncotarget. 2013. V. 4. N. 10. P. 1856-1857.

11. Diaz, L A. Jr., Bardelli A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. // J. Clin. Oncol. 2014. V. 32. N. 6. P. 579-586.

12. Forshew T., Murtaza M., Parkinson C. et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. // Sci Transl Med. 2012. V. 4.

N. 136:136ra68.

13. Gudmundsdottir K., Ashworth A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. // Oncogene. 2006. V. 25. N. 43. P. 5864-5874.

14. Gui Y., Guo G., Huang Y. et al. Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cell carcinoma of the bladder. // Nat Genet. 2011. V. 43. N. 9. P. 875-878.

15. Guo G., Gui Y., Gao S. et al. Frequent mutations of genes encoding ubiquitin-mediated proteolysis pathway components in clear cell renal cell carcinoma. // Nat Genet. 2011. V. 44.

N. 1. P. 17-19.

16. Helleday T., Petermann E., Lundin C. et al. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. // Nature Reviews Cancer. 2008. V. 8. N. 3. P. 193-204.

17. Keller A., Harz C., Matzas M. et al. Identification of novel SNPs in glioblastoma using targeted resequencing. // PLoS One. 2011. V. 6. N. 6 : e18158.

18. Ku C S., Wu M., Cooper D N. et al. Technological advances in DNA sequence enrichment and sequencing for germline genetic diagnosis. // Expert Rev Mol Diagn. 2012. V. 12. N. 2.

P. 159-173.

19. Leary R J., Sausen M., Kinde I. et al. (2012) Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing. // Sci. Transl. Med. 2012. V. 4. N. 162 : 162ra154.

20. Lev-Ari A. Sunitinib brings Adult acute lymphoblastic leukemia (ALL) to Remission-RNA Sequencing-FLT3 Receptor Blockade. 2012.

21. Ley T J., Mardis E R., Ding L. et al. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. // Nature. 2008. V. 456. N. 7218. P. 66-72.

22. Marchetti A., Del G M., Filice G. et al. Complex mutations & subpopulations of deletions at exon 19 of EGFR in NSCLC revealed by next generation sequencing: potential clinical implications. // PLoS One. 2012. V. 7: e42164.

23. Mardis E R., Ding L., Dooling D J. et al. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome. // N Engl J Med. 2009. V. 361. N. 11. P. 1058-1066.

24. Mardis E R. Applying next-generation sequencing to pancreatic cancer treatment. // Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012. V. 9. N. 8. P. 477-486.

25. Meldrum C., Doyle M A., Tothill R W. Next-generation sequencing for cancer diagnostics: a practical perspective. // Clin Biochem Rev. 2011. V. 32. N. 4. P. 177-195.

26. Mok TS., Wu YL., Thongprasert S. et al. Gefitinib or carboplatin-

paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. // N. Engl. J. Med. 2009. V. 361. P. 947-957.

27. Murtaza M., Dawson S J., Tsui D W. et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. // Nature. 2013. V. 497. N. 7447. P. 108-112.

28. Narod S A., Foulkes W D. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond. // Nat Rev Cancer. 2004. V. 4. N. 9. P. 665-676.

29. Ozcelik H., Shi X., Chang M C. et al. Long-range PCR and next-generation sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. // J Mol Diagn. 2012. V. 14. N. 5. P. 467-475.

30. Pleasance E D., Cheetham K., Stephens P J. et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. // Nature. 2010. V. 463. N. 7278. P. 191-196.

31. Puente X S., Pinyol M., Quesada V. et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia. // Nature. 2011. V. 475. N. 7354. P. 101-105.

32. Quail M A., Smith M., Coupland P. et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. // BMC Genomics. 2012. V. 13. P. 341.

33. Rizzo J M., Buck M J. Key principles and clinical applications of "next-generation" DNA sequencing. // Cancer Prev Res (Phila). 2012. V. 5. N. 7. P. 887-900.

34. Ross J S., Cronin M. Whole cancer genome sequencing by next-generation methods. // Am J Clin Pathol. 2011. V. 136. N. 4. P. 527-539.

35. Roychowdhury S., Iyer MK., Robinson D R. et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. // Sci Transl Med. 2011. V. 3. N. 111: 111ra121.

36. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1977. V. 74. N. 12. P. 5463-5467.

37. Walsh T., Casadei S., Coats KH. et al. Spectrum of mutations in BRCA1, BRCA2, CHEK2, and TP53 in families at high risk of breast cancer. // JAMA. 2006. V. 295. N. 12. P. 1379-1388.

38. Walsh T., Lee MK., Casadei S. et al. Detection of inherited mutations for breast and ovarian cancer using genomic capture and massively parallel sequencing. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. V. 107. N. 28. P. 12629-12633.

39. Welch J S., Westervelt P., Ding L. et al. Use of whole-genome sequencing to diagnose a cryptic fusion oncogene. // JAMA. 2011. V. 305. N. 15. P. 1577-1584.