О выборе модели лекарственного поражения печени для изучения новых гепатопротекторов в эксперименте

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

0 выборе модели лекарственного поражения печени для изучения новых гепатопротекторов в эксперименте

Г. Н. МОЖОКИНА1, Н. А. ЕЛИСТРАТОВА', Л. П. МИХАЙЛОВА2, О. В. МАКАРОВА2

1 НИИ фтизиопульмонологии Первого московского государственного медицинского университета им. И. М. Сеченова, Москва

2 НИИ морфологии человека РАН, Москва

Experimental Simulation of the Liver Drug Injury for Investigation of New Hepatoprotectors

G. N. MOZHOKINA1, N. A. ELISTRATOVA1, L. P. MIKHAYLOVA2, O. V. MAKAROVA2

1 Research Institute of Phthiziopulmonology, I. M. Sechenov 1st Moscow State Medical University, Moscow

2 Research Institute of Human Morphology, The Russian Academy of Sciences, Moscow

Проведение эффективной химиотерапии больных туберкулёзом может осложняться развитием гепатотоксических реакций на противотуберкулёзные препараты. Частота и характер этих реакций зависит от используемых препаратов, генотипиче-ских и фенотипических особенностей их метаболизма в организме пациента, что необходимо учитывать при выборе гепатопротекторов. В эксперименте на крысах с разным фенотипом ацетилирования вызывали поражение печени противотуберкулёзными препаратами резервного ряда. Анализ клинико-биохимических и морфологических параметров показал различия в формировании модели повреждения печени: преобладание цитолитического механизма у медленных ацетилято-ров по сравнению с быстрыми ацетиляторами.

Ключевые слова: гепатопротекторы, модели поражения печени, противотуберкулёзные препараты, фенотипы ацетилирования.

Efficient chemotherapy of tuberculosis patients could be complicated by hepatoprotective responses to antituberculosis drugs. The frequency and nature of the response depend on the drug and the genotypical and phenotypical characteristics of its metabolism in the patients, that should be considered while choosing the hepatoprotector. The liver injury was induced by the reserve antituberculosis drugs in experiments on rats with various acetylation phenotypes. Analysis of the clinicobiochemical and morphological indices revealed differences in the liver injury simulation: prevalence of the cytolytic mechanism in slow acetylators vs. the rapid ones.

Key words: hepatoprotectors, liver injury simulation, antituberculosis drugs, acetylation phenotypes.

Введение

Для изучения гепатопротекторного действия новых препаратов часто используется модель экспериментального гепатита, вызванного классическим гепатотропным ядом — четыреххлористым углеродом (CCl4), которая считается эталоном поражения печени с проявлениями дисфункции органа [1]. Однако в клинической практике лекарственные поражения печени у пациентов возникают под действием различных препаратов и их комбинаций и имеют свои особенности (клинические, морфологические), обусловленные генетическими и фенотипическими факторами, влияющими на метаболизм лекарств.

© Коллектив авторов, 2016

Адрес для корреспонденции: E-mail mojokina@mail.ru

В качестве примера рассмотрим варианты использования экспериментальных моделей поражения печени, вызванных противотуберкулёзными препаратами (ПТП). Для лечения больных туберкулёзом используют ряд лекарственных режимов, основанных на наличии чувствительности или резистентности возбудителя — Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к ПТП и включающих от 3—4 до 5—7 препаратов. Однако нежелательные побочные реакции ограничивают проведение полноценной химиотерапии и являются одной из важнейших причин её недостаточной эффективности. Наиболее часто развиваются лекарственно-индуцированные поражения печени, частота их варьирует от 5,4 до 85,7% [2, 3]. В связи с этим фтизиатрам приходится не только менять режим лечения, но и отказываться от применения наиболее эффективных в отношении МБТ препаратов.

Риск развития гепатотоксических реакций связан как с генетическими, так и с приобретёнными факторами, такими как возраст, пол, рацион питания, злоупотребление алкоголем, наркотиками, беременность, сопутствующая патология печени. В связи с этим проблема профилактики и лечения лекарственных поражений печени является чрезвычайно важным компонентом терапии туберкулёза, а поиск наиболее эффективных ге-патопротекторов остается весьма актуальным.

В доклинических исследованиях для оценки гепатопротективных свойств различных лекарственных средств используются разнообразные модели поражения печени, которые индуцировали введением одного или нескольких ПТП у разных видов животных. Так, на моделях поражения печени у кроликов, вызванных изониази-дом и изониазидом в сочетании с рифампици-ном, оценивали гепатопротективные свойства аубазида, бемитила, пирацетама и метионина [4]. Ряд авторов использовали модель, предложенную Ю. И. Сливкой [5], которую воспроизводили путём подкожного введения изониазида и энтерального назначения рифампицина и пи-разинамида. При этом выбор животных, их видовые, возрастные и половые различия при моделировании специально не оговаривались. Так, эффективность галстены и Лив52 изучали на молодых крысах самках массой 220—250 г [6]; ре-максола, реамберина и S-аденозил-Ь-метиони-на (SAM) — на молодых крысах самцах [7].

Тем не менее известно, что пол и возраст крыс влияют на скорость ацетилирования изониазида, который метаболизирует, в основном, с участием цитозольного фермента N-ацетилтрансферазы 2-го типа (NAT2). Причём метаболизм изониазида у крыс происходит по тем же закономерностям, что и у человека [8]. Ген, который кодирует активность фермента NAT2, отличается выраженным полиморфизмом, что фенотипически проявляется наличием в популяции «быстрых» и «медленных» ацетиляторов. Половозрелые самки в возрасте от 1 года и старше являются быстрыми ацетиляторами; половозрелые самцы в возрасте 7—8 мес относятся к медленным ацетиляторам. Неполовозрелые животные обоего пола имеют промежуточные по отношению к взрослым самцам и самкам фенотипы. Установлены межлинейные различия в характере ацетилирования на примере тестового препарата сульфадимезина: крысы линии August по фенотипу «медленнее» крыс других линий соответствующего пола [9].

В. П. Николаев [10] показал, что у беспородных старых самок крыс, которые являются быстрыми ацетиляторами изониазида, поражения печени обусловлены преимущественно действием метаболита изониазида — моноацетилгидразина и имеют морфологическую картину жирового ге-

патоза. У самцов крыс, которые являются медленными ацетиляторами, изониазид вызывает изменения в печени смешанного характера: бел-ково-жировую дистрофию в сочетании с реакцией стромы и некрозом гепатоцитов. Такой подход к выбору модели поражения печени, с учётом особенностей метаболизма ПТП, был использован при изучении нового гепатопротектора поли-фитохола [11].

Для модели поражения печени ПТП резервного ряда, описанной Д. С. Сухановым и др. [12], использовали внутрижелудочное введение комплекса препаратов: протионамид+ циклосе-рин+ПАСК. Следует отметить, что ПАСК, как и изониазид и его производные, метаболизирует при участии фермента N-ацетилтрансферазы. Однако эффективность рунихола и SAM оценивали на данной модели, воспроизведённой у самцов мышей, а ремаксола и SAM — на модели у самцов крыс [13]. Таким образом, не учитывались видовые, генетические и фенотипические особенности метаболизма ПТП.

Цель настоящего исследования — определить особенности поражения печени, вызванного комплексом ПТП, у крыс с быстрым и медленным фенотипом ацетилирования по клинико-ла-бораторным и морфологическим показаниям.

Материал и методы

Модель поражения печени у крыс воспроизводили по методу, описанному в [12] c использованием комплекса ПТП 2-го ряда, включавшего протионамид (140 мг/кг), циклосерин (140 мг/кг) и ПАСК (1400 мг/кг). Применяли препараты: протионамид (ОАО ХФК «Акрихин», Россия), циклосерин («Коксерин», Маклеодз фармасьютикалз ЛТД, Индия) и ПАСК (ЗАО»Фарма», Россия). Препараты вводили внутриже-лудочно, ежедневно в течение 12 дней.

Для воспроизведения модели поражения печени у крыс с фенотипом быстрого ацетилирования использовали 10 старых самок в возрасте старше 12 месяцев и массой от 330 до 350 г. Для создания модели поражения печени у крыс — медленных ацетиляторов использовали 10 половозрелых самцов в возрасте 7—8 месяцев и массой от 250 до 270 г. Все крысы содержались на низкобелковой диете (хлеб, вода), что способствует более быстрому развитию дистрофического процесса [11].

Для каждой опытной группы животных при биохимических исследованиях крови имелось по контрольной группе, состоящей из 8 самцов или самок того же возраста, находящихся на той же диете.

Методы исследования

• Патофизиологический метод включал оценку физиологического состояния животных — внешний вид, поведение, поедание корма, изменение массы тела.

• Биохимический метод включал определение в сыворотке крови активности трансаминаз — АлАТ, АсАТ (Ед/л), содержания общего и прямого билирубина (мкмоль/л), щелочной фосфатазы (ЩФ, Ед/л). Кровь для исследований забирали из подъязычной вены крыс всех групп после окончания эксперимента на 15-й день. Определение биохимических показателей проводили на биохимическом анализаторе Sapfir-400 с использованием реактивов фирмы Diasys.

• Патоморфологический метод включал макроскопическую оценку печени (внешний вид, масса, весовой индекс) и гистологические исследования образцов печени (морфоме-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Биохимические показатели крови самцов крыс контрольной и опытной групп

Показатели, единицы измерения Контрольная группа

Билирубин общий, мкмоль/л 4,79+0,37 9,50+0,53**

Билирубин прямой, мкмоль/л 2,59+0,13 4,00+0,29**

АсАТ, Ед/л 92,30+3,04 208,23+16,99**

АлАТ, Ед/л 7,73±0,7 15,70+2,40*

Щелочная фосфатаза, Ед/л 499,19+35,04 549,65+17,3

Примечание. Здесь и в табл. 2: * — достоверно по сравнению с контролем (p<0,05); ** — достоверно по сравнению

с контролем (р<0,01).

Таблица 2. Биохимические показатели крови самок крыс контрольной и опытной групп

Показатели, единицы измерения Контрольная группа

Билирубин общий, мкмоль/л 3,53+0,27 8,80+0,54**

Билирубин прямой, мкмоль/л 1,94+0,05 3,31+0,07**

АсАТ, Ед/л 95,74+10,3 269,26+12,21**

АлАТ, Ед/л 19,34+1,31 19,81+2,03

Щелочная фосфатаза, Ед/л 306,11+24,35 374,10+4,03

трия). При вскрытии отмечали плотность, цвет, эластичность печени, состояние переднего края. Печень взвешивали, определяли весовой индекс, который рассчитывали по отношению массы печени к массе тела животного. Морфометрическое исследование печени проводили в гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином — суданом III на нейтральные липиды. Распространённость дистрофических изменений гепатоцитов оценивали методом точечного счёта с помощью сетки Г. Г. Автандилова [14] под световым микроскопом Leica-DM2500 (Германия) при увеличении 100: оценивали объёмную долю гепатоцитов в состоянии дистрофии. Выраженность дистрофических изменений гепатоцитов оценивали в баллах: 4 балла — крупные и мелкие вакуоли, занимающие более 70% цитоплазмы; 3 балла — вакуоли, занимающие от 70 до 50% цитоплазмы; 2 балла — от 50 до 25%; 1 балл-от 25 и менее %.

♦ Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики. Достоверность различий между средними величинами определяли по ¿-критерию Стъюдента, /-критерию Фишера [15].

Результаты исследований

К концу эксперимента отмечалось некоторое угнетение активности крыс, самцов и самок в опытных группах. Животные были вялыми, неопрятными, шерсть приобретала грязный оттенок. Различий в массе тела между контрольными и опытными группами крыс, как у самцов, так и у самок, не выявлено.

При проведении биохимических исследований крови самцов опытной группы выявлено статистически значимое повышение содержания билирубина (общего и прямого) и активности трансаминаз по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Активность щелочной фосфатазы увеличилась незначительно.

При макроскопическом исследовании у 2 из 10 самцов отмечен выраженный желтоватый оттенок печени. Средний весовой индекс печени составил 4,22±0,35.

При гистологическом исследовании отмечалось сохранение балочного и долькового строения печени. Большая часть гепатоцитов в центре

Рис. 1. Морфологические изменения печени самцов крыс опытной группы.

Окраска гематоксилином-эозином; ув. Х200. Большая часть гепатоцитов в центре и по периферии — дольки с явлениями выраженной белковой дистрофии.

и по периферии долек была с явлениями выраженной белковой и жировой дистрофии: в цитоплазме определялись вакуоли различных размеров — от мелких до крупных. При окраске суданом III на нейтральные липиды реакция положительная: в цитоплазме гепатоцитов выявлялись включения желто-оранжевого цвета. Встречались единичные двуядерные гепатоциты. При морфометрическом исследовании объёмная доля гепатоцитов с явлениями дистрофии составила 84,5±1,9%; выраженность дистрофии составила 3,4±08 балла (рис. 1).

При проведении биохимических исследований крови самок опытной группы выявлены статистически значимые повышения содержания билирубина (общего и прямого) и активности АсАТ по сравнению с контрольной группой

Самцы Щ Самки

фосфатаза

Рис. 3. Коэффициенты отклонения биохимических показателей между опытными и контрольными животными в группах самцов и самок.

Рис. 2. Морфологические изменения печени самок крыс.

Окраска гематоксилином-эозином; ув. Х200. Большая часть гепатоцитов в центре и по периферии дольки с явлениями выраженной белковой дистрофии.

(табл. 2). Активность АлАТ практически не изменилась, а щелочной фосфатазы увеличилась незначительно.

На вскрытии видимых изменений печени (цвет, консистенция, состояние края) не обнаружено. Весовой индекс печени составил 4,13±0,06.

При гистологическом исследовании печени самок отмечалось сохранение архитектоники органа. Большая часть гепатоцитов в центре и по периферии долек была с явлениями выраженной белковой и жировой дистрофии в виде разнокалиберных вакуолей и липидных включений желто-оранжевого цвета. Встречались единичные двуядерные гепатоциты (рис. 2). При морфомет-рическом исследовании объёмная доля гепатоцитов с явлениями дистрофии составила 77,4±1,7%, выраженность дистрофии составила 3,1 ±0,07 балла.

Несмотря на единообразный характер типовых дистрофических изменений в структуре печени самцов и самок, объёмная доля гепатоцитов с явлениями дистрофии у самцов была статистически большей, чем у самок (84,5± 1,9% и 77,4±1,7% соответственно, ^<0,01). Для того чтобы сравнить биохимические показатели между самцами и самками, определяли коэффициент (К) отклонения каждого показателя у животных опытной группы от такового в контрольной, рассчитывая по формуле и выражая в процентах:

К= -

контроль

Результаты представлены на рис. 3.

Как следует из рис. 3, у самцов ведущим биохимическим критерием поражения печени является значительное повышение активности АлАТ. По другим показателям резкого расхождения коэффициентов отклонения между самцами и самками не выявлено.

Таким образом, у самцов в большей степени, чем у самок, выражен цитолитический механизм поражения печени.

Заключение

На основании данных, полученных при анализе клинико-биохимических и морфологических показателей повреждения печени, вызванных ПТП резервного ряда, у крыс с разным фенотипом ацетилирования выявлено преобладание цитолитического механизма их действия у самцов (медленных ацетиляторов) по сравнению с самками (быстрые ацетиляторы). Соответственно, для оценки гепатотопротективных свойств новых и существующих препаратов, которые затем могут быть использованы для коррекции и профилактики гепатотоксических реакций у больных туберкулёзом, необходимо проводить доклинические исследования с учётом особенностей метаболизма ПТП.

Большинство ПТП метаболизирует с участием фермента К-ацетилтрансферазы. Установлено, что степень риска лекарственных поражений печени у больных туберкулёзом зависит от генотипа КАТ2 и фенотипа К-ацетилирования. В связи с этим при воспроизведении существующих моделей поражения печени ПТП необходимо предусматривать несколько групп животных, которые будут генотипически и фенотипически различаться между собой. Такой подход позволит провести индивидуализированную коррекцию гепатотоксических реакций.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ЛИТЕРАТУРА

1. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств. Ведом фармакол комитета. 1999; 1: 9—12. / Vengerovskij A.I., Markova I.V., Saratikov A.S. Doklinicheskoe izuchenie gepatozashhitnyh sredstv. Vedom farmakol komiteta. 1999; 1: 9—12. [in Russian]

2. Возненко А.А. Лекарственно-индуцированные поражения печени у больных туберкулёзом органов дыхания и пути их преодоления. Ав-тореф. дисс. канд. мед. наук. М.: 2012; 24. / Voznenko A.A. Lekarstvenno-inducirovannye porazhenija pecheni u bol'nyh tuberkule-zom organov dyhanija i puti ih preodolenija. Avtoref. diss. kand. med. nauk. M.: 2012; 24. [in Russian]

3. Меркулов С.А. Лекарственно-индуцированные поражения печени у больных туберкулёзом лёгких: оптимизация лечения и профилактики Дисс. канд. мед. наук 14.03.06. Волгоград, 2014; 195. / Merkulov S.A. Lekarstvenno-inducirovannye porazhenija pecheni u bol'nyh tuberkulezom legkih: optimizacija lechenija i profilaktiki Diss. kand. med. nauk 14.03.06. Volgograd, 2014; 195. [in Russian]

4. Литвинов А.В. Лекарственная коррекция гепатотоксичности изони-азида и сочетания его с рифампицином. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Ленинград, 1984; 23. / Litvinov A.V. Lekarstvennaja korrekcija gepatotoksichnosti izoniazida i sochetanija ego s rifampicinom. Avtoref. diss. kand. med. nauk. Leningrad, 1984; 23. [in Russian]

5. Сливка Ю.И. Сравнительная характеристика гепатотоксичности изониазида, рифампицина и пиразинамида. Фармакол токсикол 1989; 4: 82—85. / Slivka Ju.I. Sravnitel'naja harakteristika gepatotoksich-nosti izoniazida, rifampicina i pirazinamida. Farmakol toksikol 1989; 4: 82—85. [in Russian]

6. Катикова О.Ю., Костин Я.В. Эффективность галстены при повреждении печени противотуберкулёзными препаратами. Экспер клин фармакол 2002; 32: 64—66. / Katikova O.Ju, Kostin Ja.V. Jeffektivnost' galsteny pri povrezhdenii pecheni protivotuberkuleznymi preparatami. Jeksper klin farmakol 2002; 32: 64—66. [in Russian]

7. Суханов Д.С, Виноградова Т.И., Заболотных Н.В., Коваленко А.Ли др. Сравнительное изучение гепатопротективного действия ремаксола, реамберина и адеметионина при повреждении печени противотуберкулёзными препаратами (экспериментальное исследование). Антибиотики и химиотер 2011; 56: 1—2: 12—16. / Suhanov D.S, Vinogradova T.I., Zabolotnyh N.V., Kovalenko A.L i dr. Sravnitel'noe izuchenie gepatoprotektivnogo dejstvija remaksola, reamberina i ademetionina pri povrezhdenii pecheni protivotuberkuljoznymi preparatami (jeksperimental'noe issledovanie). Antibiotiki i himioter 2011; 56: 1—2: 12—16. [in Russian]

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Можокина Галина Николаевна — д.м.н., зав. отделом лабо-раторно-диагностических методов исследования во фтизиатрии НИИ фтизиопульмонологии, Москва

Елистратова Наталия Александровна — старший научный сотрудник НИИ фтизиопульмонологии, Москва

8. Гребенник Л.ЖСравнительное изучение обмена гидразида изонико-тиновой кислоты и гидразина в организме некоторых животных. Вопр мед хим 1967; 4: 359—363. / Grebennik L./.Sravnitel'noe izuche-nie obmena gidrazida izonikotinovoj kisloty i gidrazina v organizme neko-toryh zhivotnyh. Vopr med him 1967; 4: 359—363. [in Russian]

9. Ванюков М.М.Исследование изменчивости ацетиляторных фенотипов крыс. Автореф. дисс. канд.биол. наук. М.: 1984; 21. / Vanjukov M.M.Issledovanie izmenchivosti acetiljatornyh fenotipov krys. Avtoref. diss. kand.biol. nauk. M.: 1984; 21. [in Russian]

10. Николаев В.П. Поражение печени, обусловленное изониазидом, и его профилактика (клинико-экспериментальное исследование). Автореф. дисс. канд. мед. наук. М.: 1987; 19. / Nikolaev V.P. Porazhenie pecheni, obuslovlennoe izoniazidom, i ego profilaktika (kliniko-jeksperimental'noe issledovanie). Avtoref. diss. kand. med. nauk. M.: 1987; 19. [in Russian]

11. Аюшеева Л.Б. Полифитохол — новый гепатопротектор в клинике туберкулёза. Автореф. дисс. канд. мед. наук. М.: 1998; 21. / Ajusheeva L.B. Polifitohol — novyj gepatoprotektor v klinike tuberkuleza. Avtoref. diss. kand. med. nauk. M.:1998; 21. [in Russian]

12. Суханов Д.С., Виноградова Т.И., Заболотных Н.В. и др. Сравнительное влияние рунихола и экзогенного S-аденозил-L-метионина (SAM) на морфологическую картину печени при гепатотоксичес-ком воздействии противотуберкулёзных препаратов резервного ряда. Архив патол 2012; 74: 5: 51—56. / Suhanov D.S., Vinogradova T.I., Zabolotnyh N.V i dr. Sravnitel'noe vlijanie runihola i jekzogennogo S-ade-nozil-L-metionina (SAM) na morfologicheskuju kartinu pecheni pri gepatotoksicheskom vozdejstvii protivotuberkuleznyh preparatov rez-ervnogo rjada. Arhiv patol 2012; 74: 5: 51—56. [in Russian]

13. Суханов Д.С., Артюшкова Е.Б., Дудка В.Т., Оковитый С.В. Эффективность ремаксола и S-аденозил-L-метионина при сочетанном экспериментальном поражении печени противотуберкулёзными препаратами резервного ряда и алкоголем. Тубер бол лёгких 2014; 4: 59—62. / Suhanov D.S., Arjushkova E.B., Dudka V.T., Okovityj S.V. Jeffektivnost' remaksola i S-adenozil-L-metionina pri sochetannom jeksperimental'nom porazhenii pecheni protivotuberkuleznymi preparata-mi rezervnogo rjada i alkogolem. Tuber bol legkih 2014; 4: 59—62. [in Russian]

14. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию. М.: Медицина, 1980; 216. / Avtandilov G.G. Vvedenie v kolichestvennuju patologicheskuju morfologiju. M.: Medicina, 1980; 216. [in Russian]

15. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1989; 343. / Lakin G.F. Biometrija. M.: Vysshaja shkola. 1989; 343. [in Russian]

Михайлова Лилия Петровна — зав. лаб. пульмонологии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, Москва Макарова Ольга Васильевна — зав. лаб иммуноморфоло-гии воспаления ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, Москва