СПОСОБ СОЗДАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА У ЖИВОТНОГО
METHOD FOR DEVELOPING EXPERIMENTAL MODEL OF ACUTE PANCREATITIS IN ANIMAL

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии, патофизиологии, и касается острого панкреатита.
Запросы практической медицины не могут быть удовлетворены только на основании клинических наблюдений. Неизмеримо возросшие возможности клинических дисциплин, прежде всего в хирургии, для повышения эффективности лечения требуют решения фундаментальных проблем патологии, теоретического осмысления новых и усовершенствования известных способов оперативных вмешательств. В большинстве случаев решить эти задачи можно только в опытах на животных, в том числе путем создания моделей заболевания.
Моделирование острого панкреатита можно объединить в три известных группы моделей: 1 - каналикулярно-гипертензионные, 2 - сосудисто-аллергические, 3 - травматические и токсико-инфекционные (Шалимов С.А., Радзиховский А.П., Кейсевич Л.В. Руководство по экспериментальной хирургии. Москва, Изд. «Медицина», 1989 г., с. 190-205) - [1].
Перельман А.Д. (Перельман А.Д. Способ моделирования острого панкреатита. Авторское свидетельство №1105191, МПК А61В 10/00, Бюл. №28, 1984) - [2] моделировал панкреатит путем перевязки главного выводного протока с введением непосредственно в проток и ткань железы 0,05-0,1% раствора пилокарпина из расчета 0,22-0,29 мг/кг массы тела, добиваясь при этом не резко выраженного панкреатита с дальнейшим фиброзом экзокринной ткани поджелудочной железы. Недостатком данного способа является наличие не резко выраженного панкреатита, проявления которого далее быстро проходили.
Моделирование по гипертензионному типу требует введения не менее 4-5 мл объема жидкости с давлением, превышающим 50 см вод. ст. для изотонического раствора хлорида натрия, для желчи - 30 см вод. ст. Чем выше давление, объем и длительнее застой, тем более выражен панкреатит [1, стр. 192]. Создание гипертензии в протоках позволяет создать лишь модель геморрагического панкреатита. Регулировка давления подачи жидкости достаточно кропотлива.
Введение одновременно в проток стафилококкового α-токсина, антитоксической сыворотки и фермента лецитовителлазы вызывает лишь очаговый некроз, использование скипидара, кислот, солей, масла, хлорэтила, термокоагуляции вызывает склероз паренхимы (Трояшкин А.А. Геморрагический панкреонекроз у морских свинок, вызванный стафилококком // Стафилококковая инфекция - Л., 1972 - С. 43-44) - [3].
Модели чисто сосудистого генеза относительно сложны для воспроизведения, так как окклюзия экстраорганных и магистральных артерий или вен не приводит к развитию острого панкреатита - [1, стр. 197].
Аллергическая модель острого панкреатита, воспроизводимая путем сенсибилизации гемологичного антигена поджелудочной железы в дозе 2-5 мг белка/кг приводит к развитию только геморрагического панкреатита на 2 день, а на 3-5 день собака погибает - [1, стр. 198].
Существует способ создания острого панкреатита - [1, стр. 192-193], где после выделения основного ствола выводного протока поджелудочной железы специальной тонкой иглой (27G-30G) пунктируют двенадцатиперстную кишку, вводят ее в отверстие выводного протока, фиксируют иглу в протоке лигатурой и заполняют систему протоков 2-4 мл 1% раствора перманганата калия, стараясь не повредить протоки. Затем снимают лигатуру, удаляют иглу и герметизируют стенку кишки. Через 10-20 минут возникает отек поджелудочной железы с последующим развитием острого панкреатита.
При введении большего количества раствора эпителий и стенка протоков повреждаются, что ведет к геморрагическому некрозу и деструктивному панкреатиту. Если же количество введенного раствора будет минимальным (2-3 мл), возникает склерозирование поджелудочной железы, развивающееся без клинически выраженной фазы острого и деструктивного панкреатита.
Наиболее близким способом к предлагаемому, взятым за прототип, является способ создания острого панкреатита путем инфузии 5% раствора хенодезоксихолевой кислоты в проток поджелудочной железы, с последующим лигированием поджелудочной железы. (SUN W et al. Beneficial effects of hydrocortisone in induced acute pancreatitis of rats. Chin Med J (Engl). 2007 Oct 20; 120(20):1757-61, реф.; OSMAN MO Beneficial effects of hydrocortisone in a model of experimental acute pancreatitis Dig Surg. 1999; 16(3):214-21, реф.) - [4].
Технический результат, на достижении которого направлено заявляемое изобретение, заключается в повышении эффективности создания экспериментального острого панкреатита - создание модели острого жирового, геморрагического или смешанного панкреатита для усовершенствования известных способов консервативных и оперативных методов лечения.
Технический результат достигается тем, что по способу создания экспериментальной модели острого панкреатита у животного, включающему лигирование основного ствола выводного протока поджелудочной железы, введение в систему протоков поджелудочной железы агрессивного раствора для проявления панкреатита, удаление лигатуры и определение морфологических изменений в тканях поджелудочной железы, новым является то, что в качестве агрессивного раствора для проявления панкреатита используют 1% раствор хенодеоксихолевой кислоты с 5% раствором натрия гидрокарбоната в объеме 0,3-0,5 мл из расчета 10-15 мг/кг массы тела животного, при этом 1% раствор хенодеоксихолевой кислоты с 5% раствором натрия гидрокарбоната вводят в равных соотношениях.
Способ осуществляют следующим образом.
После вводного наркоза: кетамин 0,5 мг/кг внутримышечно, проведения лапаротомии у крыс 200-220 грамм обоего пола выделяют основной ствол выводного протока поджелудочной железы. Во избежание попадания раствора хенодеоксихолевой кислоты в проксимальные отделы протоков проводят лигирование основного ствола выводного протока. Специальной тонкой иглой (27G-30G) пунктируют выводной проток, увеличенный в диаметре после лигирования, у стенки двенадцатиперстной кишки, фиксируют иглу в протоке и заполняют систему протоков 0,3-0,5 мл 1% раствора хенодеоксихолевой кислоты с 5% раствором натрия гидрокарбоната в равных соотношениях из расчета 10-15 мг/кг массы тела животного. Процентное содержание растворов вычислено экспериментальным путем. Затем снимают лигатуру, удаляют иглу. Лапаротомная рана ушивается наглухо. Через 10-20 минут возникает отек поджелудочной железы с последующим развитием морфологических изменений в железе через 1-1,5 и более часов в виде острого жирового, геморрагического или смешанного панкреатита.
Предлагаемое изобретение позволяет создать острый геморрагический, жировой или смешанный панкреатит путем введения 0,3-0,5 мл. 1% раствора хенодеоксихолевой кислоты с 5% раствором натрия гидрокарбоната в равных соотношениях из расчета 10-15 мг/кг массы тела животного в перевязанный проток с последующим снятием лигатуры, при этом дает возможность для динамического изучения течения геморрагического, жирового или смешанного панкреатита при осмотре тканей поджелудочной железы в различных промежутках времени.
На базе вивария Казанской ветеринарной академии проводились следующие лабораторные и морфологические исследования, представленные на чертежах (фото) 1-15, где показано следующее.
Фиг. 1 - перевязка общего желчного протока для блокирования поступления хенодезоксехолевой кислоты в печеночные протоки.
Фиг. 2 - введение в ампулу БДС для попадания в ткань поджелудочной железы.
Фиг. 3 - поджелудочная железа после введения препарата.
Фиг. 4 - поджелудочная железа после введения препарата через 15 мин.
Фиг. 5 - поджелудочная железа через 30 минут.
Фиг. 6 - геморрагический некроз в тканях поджелудочной железы.
х
Фиг. 7 - ткань поджелудочной железы через 40 мин. после воспроизведения экспериментального острого панкреатита. Гематоксилин-эозин, увел. 120.
х
Фиг. 8 - ткань поджелудочной железы через 1 час после воспроизведения острого экспериментального панкреатита. Гематоксилин-эозин. Увеличение 120.
х
Фиг. 9, 10 - ткань поджелудочной железы через 1-1,5 часа после воспроизведения острого экспериментального панкреатита. Гематоксилин-эозин. Увеличение 120.
х
Фиг. 11 - ткань поджелудочной железы через 3 часа после воспроизведения острого экспериментального панкреатита. Окраска Ван-Гизон. Увеличение 120.
х
Фиг. 12 - ткань поджелудочной железы через 6 часов после воспроизведения острого экспериментального панкреатита. Гематоксилин-эозин. Увеличение 120.
х
Фиг. 13 - ткань поджелудочной железы через 24 часов после воспроизведения острого экспериментального панкреатита. Окраска Ван-Гизон. Увеличение 120.
х
Фиг. 14 - ткань поджелудочной железы через 12 суток после воспроизведения экспериментального острого панкреатита. Гематоксилин-эозин. Увеличение 120.
х
Фиг. 15 - ткань поджелудочной железы через 12 суток после воспроизведения острого экспериментального панкреатита. Окраска Ван-Гизон. Увеличение 120.
Лабораторные исследования.
1. Производим расчет хенодеоксихолевой кислоты сухого вещества для создания 1% раствора. (Учебник «Фармакология», 2006, Харкевич Д.А.) - [4]. Хенодеоксихолевой кислоты сухого вещества (в капсуле Хеносан, Хенофалк, Хенофальк, Хенохол) содержится 250 мг. Для создания 1% раствора необходимо перевести миллиграммы сухого вещества в граммы сухого вещества, известно что1 гр = 1000 мг, т.о. 250 гр:1000 мг=0,25 гр. Далее 0,25 гр. сухого вещества растворяем в 100 мл (NaCl 0,9% или дистиллированной воды)=0,25% хенодеоксихолевой кислоты. 250 гр сухого вещества хенодеоксихолевой кислоты растворяем в 250 мл (NaCl 0,9% или дистиллированной воды) = 1% раствор хенодеоксихолевой кислоты.
Далее вычисляем количество объема вводимого раствора, для чего необходимо рассчитать количество сухого вещества 1% хенодеоксихолевой кислоты в мг на 1 кг массы тела животного. Берем 1000 мг 1% хенодеоксихолевой кислоты, растворяем в 100 мл (NaCl 0,9% или дистиллированной воды) 1000:100=10 мг хенодеоксихолевой кислоты 1%. Далее, 1% хенодехоксехолевую кислоту, 10 мг, взятую на 1 кг массы тела животного, переводим в мл.
100 мл × 10 мг:1000 мг=1 мл, т.е. 10 мг=1 мл.
Животное 200 мг (Доза препарата в гр?) сухого вещества.
10 мг - 1000 г
X - 200 г
X=2 мг (на животное 200 гр)
Количество 1% (хенодезоксехолевой кислоты в мл?) в жидком виде.
1000 мг - 100 мл
2 мг - X
X=0,2 мл (на животное 200 гр).
2. Смешиваем в равных соотношениях 1% раствора хенодеоксихолевой кислоты с 5% раствором натрия гидрокарбоната из расчета 10-15 мг/кг массы тела животного.
3. Полученный раствор вводят в проток поджелудочной железы, заполняя систему протоков.
Данные морфологических исследований.
Через 20 мин после воспроизведения экспериментального острого панкреатита определяется выраженный интерстициальный отек, сосуды паретически расширены. Определяются стаз в капиллярах. Ацинарные клетки сохранены. Эпителий выводных протоков сохранен (фиг. 7).
Через 1 час после экспериментального острого панкреатита определяется выраженный межуточный отек, очаговые некрозы жировой ткани, очаговая лейкоцитарная инфильтрация паренхимы, дистрофические изменения панкреацитов, паретическое расширение сосудов, стазы в капиллярах (фиг. 8).
Через 1,5-3 часа от начала воспроизведения экспериментального острого панкреатита определяется дискомплексация и дистрофия панкреоцитов вплоть до некроза групп клеток, очаговая лейкоцитарная инфильтрация паренхимы, некроз жировой ткани с диффузной лейкоцитарной инфильтрацией, паретическое расширение сосудов, стазы в капиллярах (фиг. 9). Также на этих сроках определяется выраженный межуточный отек, диффузная лейкоцитарная инфильтрация, некроз жировой ткани междолькового пространства, дистрофия ацинарных клеток вплоть до некроза отдельных групп клеток. Эпителий выводных протоков сохранен (фиг. 10). Вокруг кровеносных сосудов и выводных протоков выявляется соединительная ткань, (фиг. 11). Через 6 часов после воспроизведения определяется в основном жировая ткань с очаговой лейкоцитарной инфильтрацией. Среди некротизированной жировой ткани участки поджелудочной железы с очаговой лейкоцитарной инфильтрацией, дистрофическими изменениями ацинарных клеток (фиг. 12). Явления смешанного панкреатита. Соединительная ткань через 24 часа после воспроизведения острого экспериментального панкреатита не выявляется (фиг. 13). На 12 сутках развития экспериментального острого панкреатита определяются очаги некротизированной жировой ткани с наличием гигантских многоядерных клеток (липофаги), окруженные разрастаниями грануляционной ткани местами с наличием бурого пигмента гемосидерина (фиг. 14). На этих же сроках определяется выводной проток с метаплазией эпителия с образованием многослойных структур. Соединительная ткань окрашивается в красный цвет вокруг очагов жирового некроза (фиг. 15).
При создании модели экспериментального острого панкреатита в сравнении с аналогом позволяет поэтапно воспроизводить патологические изменения в поджелудочной железе. Разработанная модель экспериментального острого панкреатита отражает основные морфофункциональные нарушения, происходящие при данной патологии. В ранние сроки экспериментального острого панкреатита при отсутствии лечебного воздействия стадия компенсации переходит в субкомпенсацию, а при прогрессировании течения заболевания переходит в стадию декомпенсации.
Таким образом, предложенный способ решает задачу воссоздания за короткое время после начала проведения способа острого геморрагического, жирового или смешанного панкреатита, экономичен, прост в техническом исполнении, применим в условиях любой экспериментальной лаборатории.