Устройство сверхбыстрого охлаждения биологических образцов до криогенных температур
DEVICE FOR SUPER-QUICK COOLING OF BIOLOGICAL SAMPLES UP TO CRYOGENIC TEMPERATURES

Изобретение относится к консервации клеток биологических образцов при помощи криогенного охлаждения, а именно, к устройствам и способам, обеспечивающим криогенную консервацию путем витрификации.
Криоконсервацию клеток можно осуществить при помощи быстрого охлаждения, при котором отверждение биологического образца происходит без образования как внутри-, так и внеклеточного льда. При этом происходит витрификация образца - образование аморфного стеклоподобного тела.
Известен способ быстрого охлаждения, при котором образец помещается в контейнер, выполненный в виде тонкой трубочки, с последующим опусканием ее в жидкий азот [1]. Однако скорость охлаждения в этом способе недостаточно высока для обеспечения витрификации многих типов клеток. Это связано с тем, что из-за значительной разности температур на поверхности образца жидкий азот переходит в пар, образуя газовую (паровую) пленку с относительно низким коэффициентом теплопроводности.
Известен способ быстрого охлаждения клеток образца, при котором твердая металлическая поверхность контейнера предварительно охлаждается криогенной жидкостью, после чего капельку образца непосредственно направляют на эту поверхность [2]. Однако при этом возникают трудности в обращении с образцом в таких контейнерах, существует риск утраты, загрязнения образца при непосредственном контакте с жидким азотом, или повреждения при столкновении с твердой поверхностью контейнера.
Известен способ быстрого охлаждения клеток образца, основанный на использовании прямоточных трубок-соломинок (OPS) [3]. В этом способе изготовленную из поливинилхлорида трубочку с малым объемом, например 0,25-мл, размягчают под действием тепла и вытягивают в трубку с внутренним диаметром 0,800 мм и толщиной стенки 0,075 мм. После этого заполненную образцом трубочку OPS помещают в жидкий азот. Хотя толщина стенок трубки OPS мала, существуют ограничения по скорости охлаждения в жидком азоте, связанные с теплоизоляционным материалом и толщиной стенки. Кроме того, малый диаметр трубочки OPS обуславливает трудности при использовании ряда биологических образцов. Многие биологические образцы удобно хранить в плоском контейнере или в трубке с относительно большим диаметром.
Известен способ быстрого охлаждения клеток образца, находящегося в контейнере, при котором используется криоконсервант (cryoprotective agents SPA), обеспечивающий витрификацию [4]. При этом охлаждение образца осуществляют путем выдерживания контейнера в струе паров жидкого азота в течение 10-15 мин, после чего его погружают в жидкий азот.
Однако скорость охлаждения образца при этом недостаточно высока поскольку коэффициент теплоотдачи газообразного азота ниже, чем у жидкого азота. Кроме того, введение криоконсерванта негативно для клеток многих образцов.
Известно устройство быстрого охлаждения клеток образца, в котором используется сверхтонкая (диаметр около 0,1 мм) трубочка-соломинка [5]. Биологический образец, например клеточную суспензию, помещается в эту трубочку, которую в свою очередь помещается в центр пульсационной трубки. Сильный пульсирующий поток под большим давлением в этой трубке и тонкая пленка пара на поверхности вызваны пульсирующим характером движения жидких пробок и пузырьков пара в охлаждающем пространстве. Тонкопленочное испарение происходит на поверхности трубки-соломинки, что обеспечивает высокий коэффициент теплоотдачи.
Однако в данном устройстве охлаждения длина трубки (около 5 см) намного больше ее диаметра. Поэтому параметры пульсирующего потока на входе и выходе трубки различаются. Охлаждение образца начинается от входного участка с последующим перемещением вдоль трубки. Таким образом, помимо радиального градиента температур, направленного к центру, возникает более сильный осевой градиент температур в биологическом объекте. Кроме того, конструкция контейнера сложна и ограничивает применение для многих биологических объектов.
Известно устройство охлаждения биологического образца, в котором используется ряд линейно расположенных с зазорами медных блоков с прямым треком, проходящих через них [6]. Каждый блок оснащен охладителем на одной стороне и нагревателем на другой стороне. Биологический образец помещается внутрь трубочек-соломинок, которые перемещают вдоль трека с заданными скоростями. Блоки могут быть смонтированы в горловине сосуда Дьюара с жидким азотом так, что вход трека находится вверху горловины, а выход трека - внутри горловины. В таком варианте трубочки-соломинки при достижении выхода падают в жидкий азот.
Данное устройство удобно в эксплуатации, однако в нем сложно обеспечить высокие скорости охлаждения биологического объекта, необходимые для витрификации.
Известно устройство быстрого охлаждения биологического образца, расположенного в трубопроводе, в котором реализуется контактное взаимодействие образца с жидким азотом повышенного давления в трубопроводе [7]. Жидкий азот выходит из герметизированного сосуда Дьюара под напором, который создается путем образования области повышенного давления газообразного азота над поверхностью жидкости при помощи источника теплоты. За счет повышенного напора жидкого азота увеличивается эффективность теплоотвода от биологического образца, что приводит к увеличению скорости охлаждения.
Однако теплообмен между жидким азотом и биологическим образцом в трубопроводе происходит «последовательно» для различных участков, т.е. вначале охлаждаются участки, на которые попала жидкость. После этого жидкость переходит в пар, который воздействует на последующие по ходу движения участки образца. Таким образом, последующие участки образца охлаждаются менее интенсивно паром, чем предыдущие. Но даже если продавливается жидкость, то парожидкостная смесь может сепарироваться по сечению трубопровода: на границе с образцом продолжительное время существует паровая пленка, а жидкая фаза не имеет прямого контакта с образцом и омывает паровую рубашку.
Кроме того, у жидкого азота, находящегося в трубопроводе под повышенным давлением, возрастает температура кипения. В данном устройстве можно использовать только специально подготовленные и помещаемые в тонкие трубки биологические образцы, имеющие малый объем и особую консистенцию. Такие образцы затруднительны для последующего исследования и использования. Устройство не технологично и имеет одноразовый цикл охлаждения из-за того, что проблематично добавлять жидкий азот в сосуд Дьюара с повышенным давление пара.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является устройство сверхбыстрого охлаждения и нагревания образцов с использованием криогенного хладагента, включающее: расположенный в зоне с температурой окружающей среды линейный шаговый привод ударного действия, обеспечивающий при помощи направляющего штыря ступенчатое прерываемое паузами высокоскоростное перемещение плоского контейнера с биологическим образцом; смежно расположенные между собой патрубок охлаждающего сосуда с распылителем на конце, обеспечивающий направленный поток жидкого криогенного хладагента, струи которого воздействуют на поверхность плоского контейнера, и сосуд хранения с жидким криогенным хладагентом; смежно расположенные между собой сосуд хранения с жидким криогенным хладагентом и активная зона нагревательного устройства; герметизируемый сосуд с жидким криогенным хладагентом, в верхней части которого расположены нагреватель, вентиль, стравливающий избыточное давление, и соединенный с охлаждающим сосудом при помощи теплоизолированного патрубка с запорным вентилем [8].
Линейный шаговый привод ударного действия выполнен в виде коаксиального линейного импульсного электродвигателя индукционного типа, содержащего неподвижный индуктор и электропроводящий якорь. Контейнер выполнен в виде плоского короба, нижняя стенка которого выполнена тонкостенной из теплопроводящего материала, а верхняя крышка выполнена из оптически прозрачного материала. Охлаждающий сосуд и сосуд хранения выполнены из теплоизоляционного материала.
В устройстве-прототипе обеспечивается эффективное охлаждение биологического образца за счет того, что контейнер с высокой скоростью переходит из области с комнатной температурой в охлаждающий сосуд под поток струй криогенного хладагента. При этом практически устраняется паровая пленка, и контейнер эффективно охлаждается криогенной жидкостью.
Однако линейный электропривод не достаточно надежен, что связано с наличием пружины и упругих упоров на направляющем штыре, и не достаточно эффективен, поскольку магнитное поле индуктора проходит по воздушной среде. Вследствие этого электродинамические силы, действующие на электропроводящий якорь недостаточно велики. Кроме того возникают большие магнитные поля рассеяния, что неблагоприятно для близко находящегося обслуживающего персонала, оборудования и биологического образца.
Выполнения сосуда хранения и охлаждающего сосуда в виде единого блока не всегда целесообразно, поскольку сосуд хранения может находиться в ином месте и обладать отличными от охлаждающего сосуда параметрами, например, габаритами, объемом криогенной жидкости и др.
Расположение нагревательного устройства сзади сосуда хранения и их соединение усложняет конструкцию устройства. Нагревательное устройство может использоваться только при необходимости нагрева биологического образца, и необязательно сразу же после криогенного охлаждения.
Наличие нагревателя в герметизируемом сосуде обуславливает инерционность процесса повышения давления в нем и вызывает повышенный расход криогенной жидкости.
Выполнение контейнера в виде плоского короба не позволяет эффективно охлаждать находящийся внутри него биологический образец, т.к. в объеме биологического образца возникают значительные градиенты температур. Кроме того, ухудшению охлаждения биологического образца способствует выполнение верхней крышки контейнера из оптически прозрачного материала, обладающего низкой теплопроводностью.
Невозможность оперативного отделения охлажденного контейнера от направляющего штыря усложняет выполнение ряда манипуляций, например, выниманием контейнера из сосуда.
Выброс газообразного хладагента из сосудов в окружающую среду ухудшает экологическую обстановку, что важно при использовании устройства в закрытом помещении, и приводит к безвозвратным потерям хладагента.
Задачей изобретения является повышение эффективности устройства сверхбыстрого охлаждения биологических образцов до криогенных температур с использованием линейного электропривода за счет повышения скорости охлаждения биологического образца и совершенствования конструкции устройства.
Поставленная задача решается за счет того, что в известном устройстве сверхбыстрого охлаждения и нагревания образцов с использованием криогенного хладагента, содержащем расположенный в зоне с температурой окружающей среды линейный электропривод, содержащий коаксиально расположенные неподвижный индуктор и подвижный якорь, обеспечивающий при помощи направляющего штыря прерываемое паузами перемещение контейнера с биологическим образцом, выполненный из теплоизоляционного материала охлаждающий сосуд, на передней стенке которого выполнено проходное отверстие для контейнера, а внутри расположен патрубок с распылителем на конце, обеспечивающий направленный поток жидкого криогенного хладагента, струи которого воздействуют на контейнер с биологическим образцом, нагревательное устройство, смежно расположенное с охлаждающим сосудом, и герметизируемый сосуд с жидким криогенным хладагентом, в верхней части которого расположены вентиль, стравливающий избыточное давление, и соединенный с охлаждающим сосудом при помощи теплоизолированного патрубка, в соответствии с предлагаемым изобретением, линейный электропривод возвратно-поступательного движения содержит два расположенных на одной оси индуктора, во внутренних отверстиях которых установлен цилиндрический якорь, соединенный с направляющим штырем, выполненным из теплоизоляционного материала и обеспечивающим перемещение контейнера с биологическим образцом, при этом каждый из индукторов представляет собой многовитковую катушку, охваченную снаружи ферромагнитным сердечником и соединенную с электронным блоком питания с импульсным источником, цилиндрический якорь содержит два электропроводящих кольца, разделенных ферромагнитным цилиндром, и ограничительные фиксаторы, установленные на концах, во внутренних отверстиях цилиндрического якоря и направляющего штыря размещен тонкий провод, на одном конце которого закреплен цанговый зажим, фиксирующий посредством держателя контейнер, а на другом конце - подпружиненная кнопка, нагревательное устройство выполняется переносным и устанавливается перед передней стенкой охлаждающего сосуда, герметизируемый сосуд соединен с баллоном газообразного хладагента, выходные патрубки охлаждающего сосуда и герметизированного сосуда соединены с входным патрубком газгольдера, выходной патрубок которого соединен с входом компрессора, обеспечивающего повышенное давление газообразного хладагента в баллоне, контейнер выполнен в виде двух соединяемых между собой нижней и верхней рамок, между которыми зафиксированы упорядоченно расположенные элементы с биологическим образцом таким образом, что в охлаждающем сосуде на них воздействует направленный поток жидкого криогенного хладагента, при этом нижняя рамка присоединена к направляющему штырю, а верхняя рамка выполнена с возможностью поворота вокруг оси относительно нижней рамки.
Кроме того, элементы с биологическим образцом выполнены в виде параллельно расположенных трубочек, которые концами зафиксированы между рамками.
Кроме того, элементы с биологическим образцом выполнены в виде лунок в многолуночном планшете, при этом нижняя рамка контейнера содержит горизонтальные и вертикальные наружные стенки, причем между вертикальной наружной стенкой нижней рамки и планшетом, а также между горизонтальной стенкой верхней рамки и планшетом расположены плоские пружины.
Кроме того, концевые участки трубочек с биологическим образцом размещаются в цилиндрических втулках, выполненных в виде стакана, к днищу которого присоединена ножка, фиксируемая между рамками.
Кроме того, концевые участки трубочек размещаются в цилиндрических втулках свободно с возможностью вращения струями жидкого криогенного хладагента, выходящими из отверстий распылителя, расположенных в упорядоченные линии, параллельные трубочкам напротив каждого второго бокового зазора между трубочками.
Кроме того, над контейнером установлен плоский отражатель струй потока жидкого хладагента от расположенного снизу контейнера распылителя струй потока жидкого хладагента, соединенный с верхней рамкой, причем поверхность отражателя расположена параллельно поверхности распылителя и выполнена с закругленными углублениями, в которых с зазором  расположены трубочки.
Кроме того, участки рамок, обращенные к ножкам втулок, выполнены с закругленными углублениями, форма которых соответствует форме ножки.
Кроме того, отверстия распылителя струй потока жидкого хладагента, установленного сверху контейнера, и отверстия распылителя струй потока жидкого хладагента, установленного снизу контейнера, расположены между трубочками так, что смежные боковые зазоры между трубочками расположены поочередно напротив отверстий распылителей.
Линейный электропривод обеспечивает возвратно-поступательное перемещение контейнера с биологическим образцом на заданное расстояние и с высокой скоростью. Указанный электропривод надежен в работе и имеет простую конструкцию. Наличие двух индукторов в линейном электроприводе и цилиндрического якоря, содержащего два электропроводящих кольца, разделенных ферромагнитным цилиндром, позволяет обеспечивать быстрое перемещение контейнера на заданное расстояние в противоположных направлениях вдоль одной оси. При этом на якорь со стороны индукторов действуют одновременно электродинамические силы отталкивания медных колец и электромагнитные силы притяжения ферромагнитного цилиндра, которые направлены в одну сторону.
Наличие ферромагнитных сердечников, охватывающих катушки индукторов, экранирует магнитные поля рассеяния в окружающее пространство, и увеличивает магнитные поля в якоре, что повышает эффективность линейного электропривода. Ограничительные фиксаторы ограничивают нежелательные перемещения якоря и позволяют легко управлять подпружиненной кнопкой цангового зажима, который обеспечивает легкое отделение контейнера, в том числе в охлажденном состоянии, от направляющего штыря.
Выполнение нагревательного устройства переносным и установленным перед передней стенкой охлаждающего сосуда обеспечивает компактность установки. Это позволяет легко удалять нагревательное устройство при необходимости и упрощает конструкцию устройства.
Баллон газообразного хладагента позволяет оперативно и на заданную величину повышать давление в герметизируемом сосуде.
Наличие газгольдера, компрессора и соответствующих патрубков позволяет устранить выброс газообразного хладагента из сосудов в окружающее пространство, поскольку весь использованный хладагент возвращается в баллон повышенного давления. Это сохраняет хладагент для последующей работы.
Выполнение контейнера в виде двух соединяемых между собой рамок, между которыми зафиксированы упорядоченно расположенные элементы с биологическим образцом, обеспечивает эффективное охлаждение образца в охлаждающем сосуде, поскольку на них непосредственно воздействует направленный поток жидкого криогенного хладагента.
Присоединение нижней рамки контейнера к направляющему штырю и выполнение верхней рамки с возможностью поворота вокруг оси относительно нижней рамки, позволяет легко устанавливать и вынимать элементы с биологическим образцом из контейнера.
Выполнение элементов с биологическим образцом в виде параллельно расположенных трубочек, которые концами зафиксированы между рамками, позволяет увеличить площадь, а значит и скорость охлаждения образцов.
При расположении биологического образца в лунках многолуночного планшета, который широко используется в криобиологии, рамочная конструкция контейнера с плоскими пружинами позволяет его надежно зафиксировать при эффективном охлаждении образцов.
Если концевые участки трубочек с биологическим образцом размещаются в цилиндрических втулках, выполненных в виде стакана, к днищу которого присоединена ножка, фиксируемая между рамками, то сами трубочки не деформируются и легко монтируются в контейнере. Этой же цели способствует выполнение участков рамок, обращенных к ножкам втулок, с закругленными углублениями, форма которых соответствует форме ножки.
Если концевые участки трубочек размещаются в цилиндрических втулках свободно с возможностью вращения струями жидкого криогенного хладагента, выходящими из отверстий распылителя, то эффективность охлаждения повышается. Этой же цели способствует установка над контейнером плоского отражателя струй потока жидкого хладагента.
Если отверстия распылителя струй потока жидкого хладагента, установленного сверху, и отверстия распылителя, установленного снизу контейнера, расположены между трубочками так, что смежные боковые зазоры между расположены поочередно напротив отверстий распылителей, то обеспечивается вращение трубочек под воздействием потока криогенного хладагента и повышается скорость охлаждения биологического образца.
На фиг. 1 показана схема устройства сверхбыстрого охлаждения биологических образцов с односторонним охлаждением и нагреванием контейнера в исходном состоянии;
на фиг. 2 - схема устройства сверхбыстрого охлаждения биологических образцов с двусторонним охлаждением и нагреванием контейнера в исходном состоянии;
на фиг. 3 - схема устройства на фиг. 1 при расположении контейнера над распылителем струй азота;
на фиг. 4 - схема устройства на фиг. 2 при расположении контейнера над распылителем струй азота;
на фиг. 5 - схема устройства на фиг. 1 при расположении контейнера над подвижной емкостью;
на фиг. 6 - схема устройства на фиг. 1 при расположении контейнера в подвижной емкости;
на фиг. 7 - якорь электропривода с фиксированным контейнером на фиг. 5;
на фиг. 8 - якорь электропривода с не фиксированным контейнером;
на фиг. 9 - контейнер рамочного типа, прижимающий трубочки, которые охлаждаются с нижней стороны (вид сбоку);
на фиг. 10 - контейнер рамочного типа, прижимающий трубочки, которые охлаждаются с двух противоположных сторон (вид сбоку);
на фиг. 11 - контейнер рамочного типа в разъединенном состоянии с уложенными трубочками (вид сбоку);
на фиг. 12 - вид А на фиг. 9;
на фиг. 13 - контейнер рамочного типа, прижимающий ножки втулок, в которых расположены концы трубочек, охлаждаемые с одной стороны (вид сбоку);
на фиг. 14 - контейнер рамочного типа, прижимающий ножки втулок, в которых расположены концы трубочек, охлаждаемые с двух противоположных сторон (вид сбоку);
на фиг. 15 - вид В на фиг. 13;
на фиг. 16 - контейнер рамочного типа с отражателем, прикрепленным к верхней рамке, который прижимает ножки втулок (вид сбоку);
на фиг. 17 - контейнер в виде рамки, прижимающей ножки втулок, в которых расположены концы трубочки с возможностью вращения, охлаждаемые с двух противоположных сторон (вид сбоку);
на фиг. 18 - вид Е на фиг. 15;
на фиг. 19 - вид D на фиг. 18;
на фиг. 20 - вид С на фиг. 17;
на фиг. 21 - вид сбоку многолуночного планшета (multi-well plate);
на фиг. 22 - вид F на фиг. 21;
на фиг. 23 - контейнер рамочного типа для многолуночного планшета в разъединенном состоянии (вид сбоку);
на фиг. 24 - вид G на фиг. 23;
на фиг. 25 - вид Н на фиг. 23;
на фиг. 26 - контейнер рамочного типа без многолуночного планшета в собранном состоянии (вид сбоку);
на фиг. 27 - контейнер рамочного типа с многолуночным планшетом в разъединенном состоянии (вид сбоку);
на фиг. 28 - вид I на фиг. 27;
на фиг. 29 - контейнер рамочного типа с многолуночным планшетом, который охлаждается с нижней стороны (вид сбоку);
на фиг. 30 - контейнер рамочного типа с многолуночным планшетом, который охлаждается с двух противоположных сторон (вид сбоку).
Устройство сверхбыстрого охлаждения образцов до криогенных температур с использованием линейного электропривода состоит из линейного электропривода 1 возвратно-поступательного движения, расположенного в зоне 2 с температурой окружающей среды, контейнера 3 с биологическим образцом 4, который соединен с приводом 1 при помощи направляющего штыря 5, выполненного из теплоизоляционного материала. Вдоль направления перемещения контейнера 3 последовательно расположено переносное нагревательное устройство 6 и охлаждающий сосуд 7, который выполнен из теплоизоляционного материала, например из плотного пенопласта.
В охлаждающем сосуде 7 установлен патрубок 8, на входном конце которого расположен распылитель 9, обеспечивающий направленный поток струй 10 жидкого криогенного хладагента 11, например, жидкого азота. Выходной конец 12 патрубка 8 расположен внутри герметизируемого сосуда 13 с жидким азотом 11 у его днища. Охлаждающий сосуд 7 снабжен патрубком 14 для выхода газообразного азота.
Переносное нагревательное устройство 6, расположенное в зоне 2 с температурой окружающей среды, содержит один (фиг. 1) или два (фиг. 2) нагревательные элементы 15, соединенные с источником нагрева 16. Нагревательное устройство 6 устанавливается перед передней стенкой 7а охлаждающего сосуда 7. В качестве источника нагрева 16 может выступать находящийся под давлением горячий воздух, газ, жидкость или высокочастотное электромагнитное поле.
Герметизируемый сосуд 13 выполнен в виде криостата, выдерживающего повышенное внутреннее давление. Через патрубок 17 сосуд 13 соединен с баллоном 18 газообразного хладагента, например, азота повышенного давления. Герметизируемый сосуд 13 снабжен патрубком 19 для выхода газообразного азота. Патрубки 8, 17 и 19 снабжены запорными вентилями, соответственно, 20, 21 и 22.
На передней стенке 7а охлаждающего сосуда 7, обращенной к линейному электроприводу 1, выполнено проходное отверстие 23 для контейнера 3. В сосуде 7 расположена подвижная емкость 24 для транспортировки охлажденного контейнера 3, например, в места длительного хранения или исследования. Для перемещения емкости 24 используется рукоятка 25, выполненная из теплоизоляционного материала и установленная в крышке 7b сосуда 7.
Линейный электропривод 1 содержит два неподвижных индуктора 26 и 27, которые установлены на одной оси. Каждый из индукторов и представляет собой многовитковую катушку, охваченную снаружи ферромагнитным сердечником. Катушки индукторов соединены с электронным блоком питания 28, содержащим импульсные источники возбуждения, например, емкостные накопители энергии (на фиг. не показаны). Электронный блок питания 28 электрически соединен с каждым из индукторов 26 и 27.
Во внутренних отверстиях индукторов 26 и 27 установлен цилиндрический якорь 29 электропривода 1, соединенный с направляющим штырем 5. Цилиндрический якорь 29 содержит два электропроводящих, например, медных кольца 30a и 30b, разделенных ферромагнитным цилиндром 31. На концах якоря 29 установлены ограничительные фиксаторы 32.
На патрубке 8 может быть установлен один распылитель 9, обеспечивающий однонаправленный поток струй 10 жидкого азота 11 (фиг. 1), или два установленных с зазором для контейнера распылителя 9a и 9b, обеспечивающих встречные потоки струй жидкого азота (фиг. 2).
Нагревательное устройство 6 может содержать один нагревательный элемент 15, обеспечивающий нагрев контейнера 3 с биологическим образцом 4 с одной стороны (фиг. 1), или два установленных с зазором для контейнера нагревательных элемента 15a и 15b, обеспечивающих нагрев контейнера 3 с биологическим образцом 4 с двух сторон (фиг. 2).
Во внутренних отверстиях цилиндрического якоря 29 и направляющего штыря 5 размещен тонкий провод 33, на одном конце которого закреплен цанговый зажим 34, а на другом конце - подпружиненная кнопка 35. При нажатии на кнопку 35 через тонкий провод 33 цанговый зажим 34 раскрывается (фиг. 8). При отпускании кнопки 35 через тонкий провод 33 цанговый зажим 34 закрывается, что позволяет фиксировать контейнер 3 относительно направляющего штыря 5 (фиг. 7). Для этого на боковой стенке контейнера 3 выполнен держатель 3а, охватываемый цанговым зажимом 34.
Устройство содержит газгольдер 36 с входным патрубком 37, соединенным с патрубками 14 и 19, и с выходным патрубком 38, подсоединенным к входу компрессора 39. К выходу компрессора 39 присоединен патрубок 40, соединяющий его с баллоном 18 газообразного хладагента. На патрубке 40 установлен вентиль 41. Нижняя часть охлаждающего сосуда 7 соединена с верхней частью герметизируемого сосуда 13 при помощи патрубка 42 с вентилем 43.
Патрубки 8 и 42 выполнены теплоизолированными.
Контейнер 3 рамочного типа выполнен в виде нижней 3b и верхней 3c рамок (фиг. 9 - фиг. 19). Нижняя рамка 3b присоединена к направляющему штырю 5 (фиг. 12), а верхняя рамка 3c выполнена с возможностью поворота вокруг оси 3d относительно нижней рамки 3b (фиг. 11).
Биологический образец 4 находится внутри трубочек 44, которые упорядочено, например, параллельно друг другу, расположены в контейнере 3. Концы трубочек 44 зажаты между нижней 3b и верхней 3c рамками так, что их средняя часть при охлаждении расположена напротив струй жидкого азота 10, выходящих из распылителя 9 (фиг. 9, фиг. 12). Оси трубочек 44 параллельны оси направляющего штыря 5 (фиг. 12).
Для обеспечения равномерности расположения трубочек 44 в контейнере 3 на нижней рамке 3b выполнены выступы 45 (фиг. 9 - фиг. 11).
Рамки 3b и 3c фиксируются друг относительно друга при помощи фиксатора 46, расположенного сбоку рамок, и зажима 47, расположенного с противоположного боку рамок.
Фиксатор 46 содержит ось 3d, позволяющей верхней рамке 3c поворачиваться относительно нижней рамки 3b. Зажим 47 позволяет фиксировать и разъединять рамки между собой, например, при помощи выступа 47a на рамке 3b и упругого зацепа 47b на рамке 3c (фиг. 11).
Для того чтобы приблизить трубочки 44 к распылителю 9 патрубка 8 и предотвратить зажимание и деформирование их концевых участков рамками 3b и 3c, концевые участки трубочек 44 размещаются в цилиндрических втулках 48, выполненных в виде стакана, к днищу которого присоединена ножка 49 (фиг. 15, фиг. 18, фиг. 19). В данном варианте рамки 3b и 3c зажимают тонкие ножки 49 втулок 48, обеспечивая фиксацию установленных в них трубочек 44 без деформирования.
На фиг. 16 и фиг. 17 представлены конструкции контейнера 3, позволяющего вращение трубочек 44 струями жидкого азота 10, что обеспечивает их охлаждение со всех сторон. Для этого рамки 3b и 3c зажимают ножки 49 втулок 48, а концы каждой трубочки 44 свободно устанавливаются во внутренних полостях втулки 48.
На фиг. 16 имеется один распылитель 9 патрубка 8, расположенный под контейнером 3. А сверху над контейнером установлен плоский отражатель 50 струй потока жидкого азота 10. Указанный отражатель 50 соединен с подвижной верхней рамкой 3c. Участки рамок 3b и 3c, обращенные к ножкам 49 втулок 48 выполнены с закругленными углублениями 50a, форма которых соответствует форме ножки 49 (фиг. 19). Поверхность отражателя 50 струй потока жидкого азота 10 расположена параллельно поверхности распылителя 9 патрубка 8 и выполнена с закругленными углублениями 50b, в которых с зазором 51 расположены трубочки 44 (фиг. 16).
Отверстия 9c распылителя 9 расположены в упорядоченные линии, которые параллельны трубочкам 44 (фиг. 20). На фиг. 16 между закругленными углублениями 50b отражателя 50 выполнены выступы 9d. Линии отверстий 9c расположены напротив каждого второго выступа 9d и бокового зазора 52 между трубочками 44 (фиг. 16, фиг. 20).
На фиг. 17 отверстия 9c распылителя 9a, находящегося сверху, и отверстия 9c распылителя 9b, находящегося снизу контейнера 3, расположены между трубочками 44. Причем смежные боковые зазоры 52 между трубочками 44 расположены поочередно напротив отверстий 9c распылителей 9a и 9b.
На фиг. 21 и фиг. 22 показан многолуночный планшет (multi-well plate) 53, состоящий из корпуса 53a и крышки 53b, которая закрывает его сверху. Внутри корпуса установлены упорядочено расположенные цилиндры 53с, которые наполняются биологическим образцом 4.
Контейнер 3, предназначенный для многолуночного планшета, выполнен в виде нижней 3b и верхней 3c рамок. Нижняя рамка 3b этого контейнера выполнена в форме уголка, т.е. содержит горизонтальную стенку 3e, параллельную плоскости контейнера, и вертикальную наружную стенку 3f, которая перпендикулярна плоскости контейнера (фиг. 23). К четырем вертикальным наружным стенкам 3f внутри контейнера 3 для многолуночного планшета присоединены плоские пружины 54. К двум горизонтальным стенкам 3g верхней рамки 3c, которые параллельны направляющему штырю 5 и обращены во внутрь контейнера 3, присоединены плоские пружины 55.
Устройство сверхбыстрого охлаждения образцов до криогенных температур с использованием линейного электропривода работает следующим образом.
Трубочки 44 заполняют биологическим образцом 4, после чего их параллельно друг другу укладывают в контейнер 3 рамочного типа. Контейнер с трубочками 44 фиксируется при помощи выступа 47a на рамке 3b и упругого зацепа 47b на рамке 3c (фиг. 11). Равномерность укладки трубочек 44 в контейнере 3 обеспечивается либо при помощи выступов 45 (фиг. 9 - фиг. 11), либо при помощи закругленных углублений 50a в рамках 3b и 3c, охватывающих ножки 49 цилиндрических втулок 48 (фиг. 19).
При использовании многолуночного планшета 53 во внутрь цилиндров 53с, установленных в корпусе 53a, помещают биологический образец 4. После этого корпус 53a сверху закрывают крышкой 53b (фиг. 21). В нижнюю рамку 3b контейнера 3 на ее горизонтальные стенки 3e устанавливают многолуночный планшет. При этом плоские пружины 54, прикрепленные к вертикальным наружным стенкам 3f, сжимаются и надежно фиксируют многолуночный планшет 53 внутри нижней рамки 3b контейнера 3 в горизонтальной плоскости (фиг. 27).
После этого рамки 3b и 3c фиксируются друг относительно друга при помощи фиксатора 46, расположенного сбоку рамок, и зажима 47, расположенного с противоположного боку рамок. При этом плоские пружины 55, прикрепленные к горизонтальным стенкам 3g верхней рамки 3c, сжимаются. Это обеспечивает надежное соединение корпуса 53a с верхней крышкой 53b и фиксацию многолуночного планшета 53 внутри контейнера 3 от вертикальных перемещений.
В исходном состоянии контейнер 3 с биологическим образцом 4 располагается в зоне 2 с температурой окружающей среды напротив передней стенки сосуда 7 с проходным отверстием 23 (фиг. 1, фиг. 2). Контейнер 3 при помощи направляющего штыря 5 фиксируется к якорю 29 линейного электропривода 1. Якорь 29 располагается во внутреннем отверстии индукторов 27 и 28 так, что медное кольцо 30b охвачено примерно половиной индуктора 27, обращенной к сосуду 7.
Нагревательное устройство 6 выключено. Подвижная емкость 24 при помощи рукоятки 25 располагается у днища сосуда 7.
Вентили 20, 22, 41 и 43 закрыты, а вентиль 21 открыт. При подаче газообразного азота из баллона 18 в герметизируемом сосуде 13 возрастает давление. После этого открывается вентиль 20 и жидкий азот 11 под действием повышенного давления газообразного азота через патрубок 8 из сосуда 13 поступает в охлаждающий сосуд 7. Выходя из распылителя 9, жидкий азот 11 формируется в виде направленного потока 10, направленного либо в одну сторону (фиг. 1), либо во встречно направленные стороны (фиг. 2). При этом газообразный азот через патрубок 14 выходит из охлаждающего сосуда 7 и поступает в газгольдер 36, где и накапливается.
После этого включают линейный электропривод 1 возвратно-поступательного движения. От электронного блока питания 28 на индуктор 27 подается импульс тока. Индуктор 27 возбуждает импульсное магнитное поле, которое в медном кольце 30b якоря 29 возбуждает вихревые токи. Вследствие взаимодействия вихревых токов в кольце 30b с магнитным полем индуктора 27 на указанное кольцо 30b действует электродинамическая сила отталкивания. На ферромагнитный цилиндр 31 якоря 29 со стороны индуктора 27 действует электромагнитная сила притяжения. После подачи импульса тока линейный электропривод 1 отключается.
Поскольку электродинамическая сила отталкивания и электромагнитная сила притяжения направлены в сторону охлаждающего сосуда 7, то якорь 29 стремительно перемещает контейнер с биологическим образцом через проходное отверстие 23 в сосуд 7. При этом контейнер 3 устанавливается или над распылителем 9, направляющего струи потока 10 жидкого азота вверх (фиг. 3), или между распылителями 9a и 9b, направляющих струи потока 10 жидкого азота, соответственно вниз и вверх (фиг. 4). При этом медное кольцо 30a охватывается примерно половиной индуктора 27, обращенной в сторону противоположную сосуду 7 (фиг. 3, фиг. 4).
При попадании непосредственно под струи потока 10 жидкого азота трубочки 44 интенсивно охлаждаются либо с одной стороны (фиг. 9, фиг. 13) либо с двух сторон (фиг. 10, фиг. 14). При этом струи потока 10 «продавливают» образующуюся при этом паровую пленку, устраняя эффект Лейденфроста, что способствую повышению скорости охлаждения биологического образца 4.
Охлаждение многолуночного планшета может осуществляться либо с одной, например нижней стороны (фиг. 29), либо с двух противоположных сторон (фиг. 30).
Концы трубочек 44 могут быть установлены во втулках 48 не плотно, а с возможностью вращения (фиг. 18). При этом ножки 49 втулок 48 могут быть зафиксированы рамками 3b и 3c контейнера 3. На фиг. 16 и фиг. 17 показаны два варианта обеспечения вращения трубочек 44.
В первом варианте (рис. 16) показана конструкция контейнера 3, у которого к подвижной верхней рамке 3c присоединен плоский отражатель 50 струй потока 10 жидкого азота. Распылитель 9 расположен под охлаждаемым контейнером 3. Струи потока 10 жидкого азота, выходящие из отверстий 9c распылителя вверх, проходят через боковые зазоры 52 между трубочками 44. Далее струи потока 10 проходят через зазор 51 между закругленными углублениями отражателя 50 и трубочками 44 и направляются вниз через боковые зазоры 52. Поскольку струи потока 10 вокруг каждой трубочки имеют одно направление протекания, то образуется вращающий момент, приводящий трубочки во вращение (фиг. 16).
Во втором варианте (рис. 17) струи потока 10 жидкого азота с верхнего распылителя 9a проходят через одни зазоры 52 между трубочками 44, а струи потока 10 с нижнего распылителя 9b проходят через смежные зазоры 52. В результате эти потоки 10, воздействуя на противоположные стороны трубочек, образуют вращающий момент, приводя их во вращение.
Вращение трубочек 44 под струями потока 10 жидкого азота способствует интенсификации процесса охлаждения биологического образца.
После охлаждения биологического образца в трубочках 44 включается линейный электропривод 1. Для этого от электронного блока питания 28 подается ток на индуктор 27. Магнитное поле этого индуктора наводит вихревые токи в медном кольце 30a якоря 29, что приводит к образованию электродинамической силы отталкивания, направленной в сторону, противоположную сосуду 7. На ферромагнитный цилиндр 31 якоря 29 со стороны индуктора 27 действует электромагнитная сила притяжения. Поскольку силы отталкивания и притяжения направлены в сторону от сосуда 7, то якорь 29 перемещается внутри сосуда 7 к его передней стенке с отверстием 23 (фиг. 5). При этом медное кольцо 30a охватывается примерно половиной индуктора 26, обращенной в сторону противоположную сосуду 7.
Для перемещения биологического образца 4 из сосуда 7 закрывают вентиль 20, и прекращают в него подачу жидкого азота 11 из сосуда 13. Нажимают кнопку 35, которая через тонкий провод 33 открывает цанговый зажим 34, отпуская держатель 3а контейнера 3 (фиг. 6). При этом контейнер 3 с биологическим образцом 4 опускается в емкость 24, наполненную жидким азотом 11. Рукояткой 25 поднимают емкость 24. После чего снимают крышку 7b, емкость 24 вынимают из сосуда 7 и перемещают в место хранения или исследования биологического образца 4.
Для быстрого нагревания биологического образца 4 цанговым зажимом 34 фиксируют контейнер 3 и включают линейный электропривод 1. Для этого от электронного блока питания 28 подается ток на индуктор 26 (см. фиг. 5). Магнитное поле этого индуктора наводит вихревые токи в медном кольце 30a якоря 29, что приводит к образованию электродинамической силы отталкивания, направленной в сторону от сосуда 7. На ферромагнитный цилиндр 31 якоря 29 со стороны индуктора 26 действует электромагнитная сила притяжения. Поскольку силы отталкивания и притяжения направлены в сторону от сосуда 7, то якорь 29 перемещается из сосуда 7, устанавливаясь напротив нагревательного элемента 15 (фиг. 1). В это время источник нагрева 16 осуществляет быстрый нагрев биологического образца 4 в контейнере 3 до необходимой температуры.
После окончания рабочего процесса вентиль 21 закрывается, вентиль 22 открывается и происходит сброс повышенного давления в сосуде 13. Газообразный хладагент 11 через патрубок 19 поступает в газгольдер 36. В это же время вентиль 41 открывается, включается компрессор 39, который по патрубкам 38 и 40 перекачивает газообразный хладагент из газгольдера 36 в баллон 18, обеспечивая в нем повышенное давление. После сброса давления газа в сосуде 13 открывается вентиль 43 и жидкий хладагент 11 из сосуда 7 сливается в сосуд 13. Таким образом, газообразный криогенный хладагент практически не попадает в зону окружающей среды 2, что делает установку экологически безопасной.
При необходимости описанный выше рабочий цикл может быть выполнен повторно без потери хладагента.
Указанное устройство обеспечивает высокую скорость охлаждения биологического образца до криогенной температуры с последующим быстрым нагреванием. Устройство компактное, полностью автоматизированное и включает хорошо апробированные устройства, например, линейный электропривод возвратно-поступательного движения.
Источники информации
1. W.F. Raul, G.M. Faby. Ice-free cryopreservation of embryos at - 196 degrees C by vitrification, Nature 313 (1985) P. 573-575.
2. I. Begin, B. Bhatia, H. Baldassarre, A. Dinnyes, C.L. Keefer, Cryopreservation of goat oocytes and in vivo derived 2- to 4-cell embryos using the cryoloop (CLV) and solid-surface vitrification (SSV) methods, Theriogenology 59 (2003) 1839-1850.
3. M. Kuwayama, G. Vajta, O. Kato, S.P. Leibo, Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes, Reprod. Biomed. Online 11 (2005) 300-308.
4. Пат. РФ № 2257710. МПК A01N 1/02. Способ криоконсервации спермы человека. Заявка № 2003131647/15, подана 28.10.2003. Опубл. 10.08.2005. - Одинцов А.А., Кучков И.Н., Черкашина И.В.
5. Anjun Jiao, Xu Han, John K. Critser, Hongbin Ma. Numerical investigations of transient heat transfer characteristics and vitrification tendencies in ultra-fast cell cooling processes // Cryobiology 52 (2006) 386-392.
6. PAT. US 5873254, F25D 13/06. Device and methods for multigradient directional cooling and warming of biological specimens. 23.02.1999.
7. PAT. US 2009/0186405А1, C12M 1/00, F17C 13/00. Rapid chilling device for vitrification. 23.07.2009.
8. US Patent Application Publication № US 2014/0069119 A1. - Int. Cl. F25D 3/10. Method and scalable devices for hyper-fast cooling and warming. - Pub. Date 13.03.2014. - Provisional application № 61/741,778, filed on Sep. 12, 2012 (прототип).