КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОЙ ПЛЕНКИ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОСЕНСОРНЫХ АНАЛИЗАТОРАХ
COMPOSITION FOR PRODUCING POLYMER FILM FOR MICROORGANISM IMMOBILISATION IN BIOSENSOR ANALYSERS

Техническое решение относится к биотехнологии, а именно к системам на основе микроорганизмов, иммобилизованных в матрицу синтетического носителя.
Известна полимерная композиция для иммобилизации микроорганизмов на основе криогеля поливинилового спирта (ПВС). Криогели ПВС образуются при замораживании 10-20% водных растворов при -20 - -30°С в течение 10-24 часов и последующем оттаивании при 4-20°С. [Пат. РФ 2253677. Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора]. Иммобилизованные в данной композиции микроорганизмы мало пригодны для применения в качестве рецепторных элементов биосенсорных анализаторов, так как в виде тонких пленок криогель ПВС обладает очень низкой механической прочностью.
Известно, что микроорганизмы иммобилизуют в гель ПВС, выливая 20% водный раствор ПВС, содержащий живые клетки, при перемешивании в раствор борной кислоты и выдерживая в течение 1 часа для формирования сферических гранул. [J.Wang, Y.Zhang, Y.Wang, R.Xu, Z.Sun, Z.Jie. An innovative reactor-type biosensor for BOD rapid measurement // Biosensors and Bioelectronics. 2010. V.25 (7). p.1705-1709]. Недостатком этого метода является губительное действие борной кислоты на многие микроорганизмы.
4
3
6
Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является полимерная композиция для иммобилизации ферментов, основанная на сополимере ПВС и N-винилпиридина [В.Li, L.Niu, W.Kou, Q.Deng, G.Cheng, S.Dong. Synthesis of a self-gelatinizable grafting copolymer of poly(vinyl alcohol) for construction of an amperometric peroxidase electrode // Analytical biochemistry. 1998. 256. p.130-132]. Для приготовления сополимера поливинилового спирта с N-винилпиридином к 20 мл 5%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 5 мл 1 моль/л раствора азотной кислоты, 0,2 мл церия аммония-нитрата [(NH)Се(NO)] (Т=0,1 г/мл) и небольшое количество 4-винилпиридина. Смешивание проводят при 40°С в атмосфере азота в течение 3-х часов. Полученную смесь осаждают метанолом и собирают фильтрацией. Гомополимер отмывают от непрореагировавшего ПВС извлечением при помощи метанола в аппарате Сокслета. Для приготовления рецепторного элемента биосенсора 2 мг пероксидазы хрена растворяют в 500 мкл 5% водного раствора сополимера ПВС и N-винилпиридина. Полученный рецепторный элемент выдерживают 24 часа при температуре 4°С.
Процедура приготовления рецепторных элементов на основе описанной полимерной композиции является трудоемкой и требует больших временных затрат, кроме того, приготовленные данным способом рецепторные элементы обладают невысокой долговременной стабильностью и чувствительностью.
Задачей технического решения является повышение основных характеристик биосенсора путем получения полимерной композиции на основе ПВС для иммобилизации микроорганизмов, обеспечивающей отсутствие токсичного действия на биоматериал.
Технический результат, который может быть получен при использовании заявляемой композиции для получения полимерной пленки, заключается в том, что полученные тонкие, эластичные, не растворимые в воде пленки могут быть использованы для иммобилизации микроорганизмов при создании рецепторных элементов биосенсорных анализаторов.
Сущность технического решения заключается в том, что композиция для получения полимерной пленки для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах состоит из поливинилового спирта и сополимера, в качестве сополимера содержит N-винилпирролидон, при этом исходные компоненты взяты в мольном соотношении ПВС:N-ВП 239:(9,0-56,2).
На фиг.1 представлен механизм сополимеризации, приводящий к образованию сетчатой структуры композиции для получения полимерной пленки.
В таблице 1 приведены характеристики биосенсора на основе иммобилизованных в представленной композиции для получения полимерной пленки бактерий Gluconobacter oxydans при анализе глюкозы.
Композицию для получения полимерной пленки получают из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном. Модификацию проводят в токе азота в присутствии нитрата церия-аммония в качестве катализатора при мольном соотношении реагентов ПВС:N-ВП:катализатор - 239:(9,0-56,2):(0,7-6,0). Для приготовления рецепторных элементов биосенсора полученный раствор композиции для получения полимерной пленки смешивают с бактериальными клетками и высушивают в течение 2 ч при 20°С.
При приготовлении рецепторных элементов биосенсоров с иммобилизованными микроорганизмами с использованием описанной композиции для получения полимерной пленки не требуется длительное замораживание, что позволяет упростить процедуру иммобилизации и избежать потери чувствительности биорецепторных элементов, вследствие губительного действия низкой температуры на микроорганизмы. Полученные с использованием описанной композиции для получения полимерной пленки тонкие пленки с иммобилизованными микроорганизмами используют в работе в качестве рецептора на кислородном электроде.
Пример.
4
2
3
6
Для приготовления ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном, к 20 мл 5% водного раствора ПВС (молярная масса 70000-100000) прибавляли 0,2-0,8 мл водного раствора нитрата церия-аммония (NH)Се(NO) (Т=0,1 г/мл) и 0,3-0,1 мл N-винилпирролидона при постоянном перемешивании. Перемешивание проводили при 40°С в атмосфере азота в течение 3-х часов.
Для иммобилизации бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius BKM В-1280 раствор поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, охлаждали до комнатной температуры, отбирали необходимое количество микропипеткой и добавляли в него бактериальные клетки Gluconobacter oxydans (30 мг биомассы на 250 мкл полученного раствора полимера), смесь переносили на предметное стекло и высушивали в течение 2 часов при 20°С. Из полученной пленки толщиной 0,2-0,5 мм вырезали рецепторные элементы размером 3×3 мм, которые хранили в холодильнике (+4°С) в сухом виде или в фосфатно-цитратном буферном растворе (рН=6,0).
Кислородный электрод с размещенным на нем биорецептором погружали в измерительную ячейку объемом 3 мл, содержащую 30 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.5), и регистрировали силу тока при добавлении разных концентраций определяемых веществ.
Таким образом, разработанная композиция для получения полимерной пленки для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах обеспечивает высокую чувствительность биосенсора при стабильной работе до 40 суток.