СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ДЛЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ НУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

1. Способ определения присутствия экзогенного донорского полинуклеотида ДНК, вставленного в целевой геномный локус, включающий:
a. амплификацию в первой реакции амплификации образца геномной ДНК, содержащей целевой геномный локус, с использованием первого набора олигонуклеотидов, которые связываются в условиях гибридизации в непосредственной близости от целевого геномного локуса, для получения таким образом первого ампликона, содержащего целевой геномный локус; и
b. обнаружение наличия или отсутствия первого ампликона, при этом отсутствие первого ампликона указывает на присутствие донорского полинуклеотида ДНК в целевом геномном локусе.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий:
a. амплификацию во второй реакции амплификации образца геномной ДНК с использованием второго набора олигонуклеотидов, которые связываются в условиях гибридизации в непосредственной близости от целевого геномного локуса и в пределах донорского полинуклеотида ДНК, для получения таким образом второго ампликона, содержащего по меньшей мере часть целевого геномного локуса и по меньшей мере часть донорского полинуклеотида ДНК; и
b. обнаружение наличия или отсутствия второго ампликона, при этом наличие второго ампликона указывает на присутствие донорского полинуклеотида ДНК в целевом геномном локусе.
3. Способ по п. 2, дополнительно включающий:
a. количественное определение результатов первой реакции амплификации;
b. количественное определение результатов второй реакции амплификации;
c. сравнение результатов первой и второй реакций амплификации и
d. определение присутствия или отсутствия донорского полинуклеотида ДНК в целевом геномном локусе, при этом подтверждением вставки донорского полинуклеотида ДНК в целевой геномный локус является отсутствие первого ампликона и наличие второго ампликона,
необязательно, дополнительно включающий мультиплексную реакцию, когда первую и вторую реакции амплификации проводят в одной пробирке или лунке,
где количественное определение результатов первой и второй реакций амплификации включает получение сигнатурного профиля для одной или обеих из первой и второй реакций амплификации,
где сигнатурный профиль выбран из группы, состоящей из сигнатурного профиля кривой температуры плавления и сигнатурного профиля флуоресценции, или
где сигнатурный профиль получают от интеркалирующего красителя ДНК,
где интеркалирующий краситель ДНК включает цианиновый краситель,
где цианиновый краситель используют в реакции амплификации в концентрации менее 4 мкМ или
где цианиновый краситель используют в реакции амплификации в концентрации менее 2,7 мкМ, или
где сигнатурный профиль получают от флуоресцентного красителя.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий:
a. выбор трансгенного объекта, содержащего донорский полинуклеотид ДНК в целевом геномном локусе.
5. Растение, представляющее собой трансгенный объект, выбранный способом по п. 4.
6. Растение по п. 5, представляющее собой
двудольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения сои, растения канолы и растения хлопка, или
однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения кукурузы, растения риса и растения пшеницы.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что геномный локус расщепляют сайт-специфической нуклеазой, где нуклеаза включает нуклеазу с «цинковыми пальцами», нуклеазу TALEN или CRISPR.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что амплификация включает амплификацию в полимеразной цепной реакции.
9. Способ по п. 2, отличающийся тем, что второй ампликон содержит 5’-область соединения донорского полинуклеотида ДНК и целевого геномного локуса,
где второй ампликон содержит 3’-область соединения донорского полинуклеотида ДНК и целевого геномного локуса.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что донорский полинуклеотид ДНК содержит по меньшей мере одну генную экспрессионную кассету.
11. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что первый или второй набор олигонуклеотидов или оба содержат флуоресцентный краситель
где флуоресцентный краситель выбирают из группы, состоящей из флуоресцентного красителя HEX, флуоресцентного красителя FAM, флуоресцентного красителя JOE, флуоресцентного красителя TET, флуоресцентного красителя Cy 3, флуоресцентного красителя Cy 3,5, флуоресцентного красителя Cy 5, флуоресцентного красителя Cy 5,5, флуоресцентного красителя Cy 7 и флуоресцентного красителя ROX.
12. Способ определения нарушения геномного локуса, включающий:
a. амплификацию в первой реакции амплификации образца геномной ДНК, содержащей нарушенный геномный локус, с использованием набора олигонуклеотидов, которые связываются в условиях гибридизации в непосредственной близости от нарушенного геномного локуса, для получения таким образом первого ампликона, содержащего нарушенный геномный локус; и
b. обнаружение наличия или отсутствия первого ампликона, при этом отсутствие ампликона указывает на нарушение геномного локуса.
13. Способ по п. 11, дополнительно включающий:
a. определение наличия донорской вставки в нарушенном геномном локусе и
b. выбор трансгенного объекта, содержащего донорскую вставку в нарушенном геномном локусе.
14. Растение, представляющее собой трансгенный объект по п. 13.
15. Растение по п. 14, представляющее собой двудольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения сои, растения канолы и растения хлопка, или
однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения кукурузы, растения риса и растения пшеницы.
16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что геномный локус расщепляют сайт-специфической нуклеазой,
где нуклеаза включает нуклеазу с «цинковыми пальцами», нуклеазу TALEN или CRISPR,
где амплификация включает амплификацию в полимеразной цепной реакции,
где донорский полинуклеотид ДНК содержит по меньшей мере одну генную экспрессионную кассету,
где первый или второй набор олигонуклеотидов или оба содержат флуоресцентный краситель,
где флуоресцентный краситель выбирают из группы, состоящей из флуоресцентного красителя HEX, флуоресцентного красителя FAM, флуоресцентного красителя JOE, флуоресцентного красителя TET, флуоресцентного красителя Cy 3, флуоресцентного красителя Cy 3,5, флуоресцентного красителя Cy 5, флуоресцентного красителя Cy 5,5, флуоресцентного красителя Cy 7 и флуоресцентного красителя ROX.
17. Способ определения нарушения геномного локуса среди множества растительных клеток, включающий:
a. амплификацию в первой реакции амплификации образца геномной ДНК, содержащей нарушенный геномный локус, с использованием набора олигонуклеотидов, которые связываются в условиях гибридизации в непосредственной близости от нарушенного геномного локуса, для получения таким образом первого ампликона, содержащего нарушенный геномный локус;
b. количественное определение результатов первой реакции амплификации;
c. амплификацию во второй реакции амплификации образца геномной ДНК, содержащей нарушенный геномный локус, с использованием набора олигонуклеотидов, которые связываются в условиях гибридизации в непосредственной близости от нарушенного геномного локуса, для получения таким образом второго ампликона, содержащего нарушенный геномный локус;
d. количественное определение результатов второй реакции амплификации; и
e. сравнение количественных результатов первой и второй реакций амплификации, при этом количественный результат первой реакции амплификации соответствует меньшему количеству амплифицированного продукта по сравнению со второй реакцией амплификации, что свидетельствует о нарушении геномного локуса в образцах первого ампликона.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что количественное определение результатов первой и второй реакций амплификации включает получение сигнатурного профиля для одной или обеих из первой и второй реакций амплификации,
где сигнатурный профиль выбран из группы, состоящей из сигнатурного профиля кривой температуры плавления и сигнатурного профиля флуоресценции,
где сигнатурный профиль получают от интеркалирующего красителя ДНК,
где интеркалирующий краситель ДНК включает цианиновый краситель,
где цианиновый краситель используют в реакции амплификации в концентрации менее 4 мкМ, или
цианиновый краситель используют в реакции амплификации в концентрации менее 2,7 мкМ, или
где сигнатурный профиль получают от флуоресцентного красителя.
19. Способ по п. 17, дополнительно включающий:
a. определение наличия донорской вставки в целевом геномном локусе и
b. выбор трансгенного объекта, содержащего донорскую вставку в целевом геномном локусе.
20. Растение, представляющее собой трансгенный объект по п. 19.
21. Растение по п. 20, представляющее собой
двудольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения сои, растения канолы и растения хлопка, или однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения кукурузы, растения риса и растения пшеницы.
22. Способ по п. 17, отличающийся тем, что геномный локус расщепляют сайт-специфической нуклеазой,
где нуклеаза включает нуклеазу с «цинковыми пальцами», нуклеазу TALEN или CRISPR.
23. Способ по п. 17, отличающийся тем, что амплификация включает амплификацию в полимеразной цепной реакции,
где донорский полинуклеотид ДНК содержит по меньшей мере одну генную экспрессионную кассету или
где наборы олигонуклеотидов включают флуоресцентный краситель,
где флуоресцентный краситель выбирают из группы, состоящей из флуоресцентного красителя HEX, флуоресцентного красителя FAM, флуоресцентного красителя JOE, флуоресцентного красителя TET, флуоресцентного красителя Cy 3, флуоресцентного красителя Cy 3,5, флуоресцентного красителя Cy 5, флуоресцентного красителя Cy 5,5, флуоресцентного красителя Cy 7 и флуоресцентного красителя ROX.