Кальций и биосинтез коллагена: систематический анализ молекулярных механизмов воздействия

Кальций и биосинтез коллагена: систематический анализ молекулярных механизмов воздействия

Д.м.н. О.А. Громова1, к.ф.-м.н., к.х.н. И.Ю. Торшин2, д.м.н. И.К. Томилова1, А.В. Гилельс3, к.м.н. В.И. Демидов1

1 ГБОУ ВПО «Ивановская ГМА» МЗ РФ

2 ФГАОУ ВПО «Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный Московской области

3 Медицинская корпорация RHANAÍ Москва

Введение: достаточный уровень биосинтеза коллагена является одним из важнейших показателей нормофизиологического метаболизма соединительной ткани. Из фундаментальных и клинических исследований известно, что повышение уровней внеклеточного кальция стимулирует синтез/секрецию коллагенов.

Цель: исследовать молекулярные механизмы воздействия кальция на синтез/секрецию коллагена методами системной биологии и биоинформатики.

Материал и методы: системно-биологический анализ кальций-зависимых белков протеома человека методом функциональных взаимосвязей. Результаты: наиболее релевантные молекулярные механизмы воздействия ионов кальция на биосинтез коллагена поддерживаются Са-чувстви-тельным рецептором (САЗЯ) и костным морфогенетическим белком-4 (ВМР4). Экспрессия рецептора САЗЯ в хрящевой и костной ткани непосредственно регулирует скелетный гомеостаз и метаболизм соединительной ткани. САЗЯ является физиологическим регулятором роста, диф-ференцировки и выживания фибробластов, остеобластов и остеокластов. Эти клетки производят все компоненты соединительной ткани: кол-лагеновые волокна, эластиновые волокна и протеингликаны гелеобразной среды. Стимулирование САЗЯ деления фибробластов и остеобластов неизбежно связано с повышением общего уровня активности клеток соединительной ткани, в т.ч. более активным биосинтезом коллагена. Костный морфогенетический белок 4 индуцирует образование хряща и кости, участвует в развитии зубов, формировании конечностей и заживлении переломов. Повышение уровня внеклеточного кальция стимулирует увеличение числа остеобластов и ингибирует образование остеокластов, в частности, посредством воздействия на уровни экспрессии костных морфогенетических белков. Кроме того, костный метаболизм вообще и биосинтез коллагена в частности нуждаются в поддержке определенными «остеотропными» микронутриентами. В частности, процесс биосинтеза коллагена нуждается в ионах Са2*, Мд2*, Fe2t, Мп2*, Zn2t, Си* как кофакторах соответствующих ферментов. Анализ также показал на нежелательные эффекты препаратов «блокаторы кальциевых каналов», которые ингибируют синтез коллагена-1 и его секрецию фибробластами. Выводы: проведенный анализ указывает на перспективные пути повышения эффективности препаратов кальция для нутрициальной поддержки костного метаболизма. Улучшение биосинтеза коллагена - необходимое условие для восстановления структуры кости при срастании переломов, регенерации кости при постменопаузальном, лекарственном остеопорозе, а также при других нарушениях целостности кости. Нормализация биосинтеза коллагена способствует лучшему удержанию кальция в костной ткани и, следовательно, повышению минеральной плотности кости. Ключевые слова: биосинтез коллагена, гомеостаз кальция, морфогенез кости, соединительная ткань, Кальцемин.

Для цитирования: Громова О.А., Торшин И.Ю., Томилова И.К. и др. Кальций и биосинтез коллагена: систематический анализ молекулярных механизмов воздействия //РМЖ. 2016. № 15. С. 1009-1017.

ABSTRACT

Calcium and collagen biosynthesis: systematic analysis of molecular mechanisms of action Gromova O.A.1, Torshin I.Yu.2, Tomilova I.K.1, Gilels A.V.3, Demidov V.I.1

' Ivanovo State Medical Academy

2 Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudny

3 RHANA Medical Corporation, Moscow

Introduction: Adequate level of collagen biosynthesis is one of the most important indicators of normal physiological metabolism of connective tissue. Fundamental and clinical trials revealed that increased level of extracellular calcium stimulates collagen synthesis/secretion. Objective: To investigate molecular mechanisms of calcium influence on collagen synthesis/secretion.

Material and Methods: systemic biological analysis of calcium-dependent proteins of human proteome with functional relationships method. Results: The most relevant molecular mechanisms of calcium ions influence on collagen biosynthesis are supported by Ca-sensing receptor (CASR) and bone morphogenetic protein-4 (BMP4). CASR expression in cartilage and bone tissue directly regulates skeletal homeostasis and connective tissue metabolism. CASR is a physiological regulator of growth, differentiation and survival of fibroblasts, osteoblasts and osteoclasts. These cells produce all components of connective tissue - collagen fibers, elastin fibers and proteoglycans of jelly medium. CASR promotes fibroblasts and osteoblasts segmentation, which increases activity of collagen tissue cells and collagen biosynthesis. BMP4 induces cartilage and bone production, teeth growth and fracture healing. Increased extracellular calcium stimulates an increase of osteoblasts quantity and inhibits osteoclast formation, by impact on BMP levels of expression. In addition, bone metabolism and collagen biosynthesis need the support of osteotropic micronutrients. Collagen biosynthesis requires Ca2+, Mg2+, Fe2t, Mn2+, Zn2+, Cu+ as cofactors for corresponding enzymes. The analysis also revealed adverse effects of calcium channel blockers that inhibit collagen-I synthesis and secretion by fibroblasts.

РЕЗЮМЕ

Conclusions: The analysis shows perspective ways to improve the efficacy of calcium supplementation for nutritional support of bone metabolism. Collagen biosynthesis improvement is an obligatory compound of bone structure restoration in fracture healing, bone regeneration in postmenopausal and drug-related osteoporosis and other cases of violations of bone integrity. Collagen biosynthesis normalization contributes to better calcium retention in the bone tissue and increase of bone mineral density.

Keywords: collagen biosynthesis, calcium homeostasis, bone morphogenesis, connective tissue, Calcemin.

For citation: Gromova O.A., Torshin I.Yu., Tomilova I.K. et al. Calcium and collagen biosynthesis: systematic analysis of molecular mechanisms of action // RMJ. 2016. № 15. P. 1009-1017.

Введение

Достаточный уровень биосинтеза коллагена является одним из важнейших показателей нормофизиологическо-го метаболизма соединительной ткани. Фундаментальные и клинические исследования показали, что уровни кальция во внеклеточной среде стимулируют синтез/секрецию коллагена клетками внеклеточного матрикса соединительной ткани.

В эксперименте недостаточное потребление кальция негативно сказывается на состоянии биосинтеза коллагена в костной ткани [1]. Известно, в частности, что так называемые блокаторы кальциевых каналов ингибируют синтез коллагена-! и его секрецию фибробластами, а аскорбат-

анион противодействует эффектам блокаторов кальция [2] (рис. 1). Исследования с использованием изотопных меток показали, что блокаторы кальциевых каналов снижают преимущественно биосинтез коллагена, а не биосинтез не-коллагеновых белков соединительной ткани [3].

Показано также, что использование препаратов кальция стимулирует синтез коллагена, ускоряя заживление ран и переломов. Например, альгинат кальция улучшает заживление ран в эксперименте, повышая синтез коллагена I типа и соотношение количеств фибриллярного колла-гена-1 и ретикулярного коллагена-Ш. Скорость закрытия раны при использовании альгината увеличивалась по сравнению с таковой в контрольной группе [4].

А Контроль  Иифедипин, 50 мкмоль/л Б

350 350

^ 300 1 ^300 ,

—- 250 : £ 250

5 200 * g 200

| 150 Н ™ 150

• Ь я I»; h I

25 100 400 25 100 400

Аскорбиновая кислота, мкмоль/л Аскорбиновая кислота, мкмоль/л

Рис. 1. Блокаторы кальция и синтез коллагена. Эффекты 50 мкМ нифедипина на секрецию коллагена I во внеклеточный матрикс (*р<0,02 между группами «аскорбат» и «аскорбат + нифедипин»); (Б) Данные для коллагена IV

Рис. 2. Влияние синергидной комбинации кальция (Кальцемин Адванс) на биосинтез коллагена. (А) Количественная оценка результатов иммуногистохимического окрашивания волокон коллагена I в области раны. (Б) Контроль (вода) - рыхло-волокнистая соединительная ткань с неравномерной окраской дезориентированных коллагеновых волокон в контрольной группе. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 480. (В) Кальцемин Адванс - мономорфные ориентированные коллагеновые волокна. Окраска пикрофуксином по Ван Гизону. Увеличение х 120

В проведенном нами экспериментальном исследовании были изучены эффекты синергидной комбинации кальция с цинком, медью, марганцем, бором, магнием и витамином D (препарат Кальцемин Адванс) на модели резаной раны. Введение препарата в виде водной суспензии в течение 21 сут приводило к снижению среднего времени до полного заживления раны на 6 сут по сравнению с контролем (вода, р<0,05). При этом средняя площадь раны достоверно отличалась между группами уже с 9-го дня эксперимента (значения р в интервале 0,00013-0,047) [5].

Повышенная скорость заживления раны при приеме си-нергидной комбинации кальция сопровождалась повышением содержания волокон коллагена I в области раны (рис. 2А). В контрольной группе процент окрашивания коллагена составил 62±11%, а при приеме препарата Кальцемин Адванс - 82±8% (т. е. на 20% выше по сравнению с контролем, р=0,00056) [5]. Гистоморфологический анализ подтвердил ускорение процесса созревания рубцовой ткани и указал на снижение воспалительной реакции в созревающей соединительной ткани и улучшение эпителизации раны. В контрольной группе кожный дефект замещен рыхло-волокнистой соединительной тканью. В опытной группе (Кальцемин Адванс) практически во всех наблюдениях в зоне кожной раны сформировалась зрелая соединительная (рубцовая) ткань из мономорфных ориентированных коллагеновых волокон, и лишь в одном наблюдении кожный дефект был замещен рыхло-волокнистой соединительной тканью (рис. 2Б, В) [5].

Описываемый эффект воздействия кальция на уровни коллагена был также подтвержден в клинических исследованиях. Например, дотации кальция (1200 мг/сут, 2 мес.) женщинам в постменопаузе с низким потреблением кальция снижали коллагеновые маркеры деградации: гидро-ксипролин, пиридинолин, дезоксипиридинолин [6].

Таким образом, экспериментальные и клинические исследования показывают, что препараты кальция стимулируют синтез/секрецию коллагенов. В настоящей работе представлены результаты системно-биологического анализа белков протеома человека, проведенного с целью установления наиболее вероятных молекулярных механиз-

мов осуществления данного эффекта воздействия кальция на метаболизм коллагена.

Материал и методы

В настоящей работе использован метод анализа функциональных взаимосвязей [7] - одна из информационных технологий современной биоинформатики. Соединяя данные различных уровней (данные о моногенных заболеваниях, кофакторах белков, клеточных ролях белков, симптоматику и критерии диагностики заболеваний и т. д.), данный метод позволяет систематически рассмотреть все возможные области применения препаратов кальция. В целом при использовании метода анализа функциональных взаимосвязей для каждого белка протеома человека составляется последовательная цепь описаний:

- аминокислотная последовательность белка;

- список биохимически необходимых эссенциальных кофакторов белка (в т. ч. с указанием потребности ионов кальция для активности рассматриваемого белка);

- список моногенных заболеваний, связанных с полной или частичной потерей активности этого белка;

- список клеточных функций белка (по БД Gene Ontology, GO и др.);

- список отдельных симптомов заболеваний, список диагнозов по МКБ-10 и другая информация из баз данных.

Далее в полученном списке описаний белков выделяются Са-зависимые белки, проводится последующий анализ их функций на основании статистических критериев. Для статистической обработки результатов исследования использовались методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверки статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение прогнозируемых и наблюдаемых частот встречаемости исследуемых признаков проводилось с помощью критерия Х-квадрат, T-критерия Вилкоксона - Манна - Уитни и теста Стьюдента. Для статистической обработки материала использовались прикладная программа Statistica 6.0 и электронные таблицы Microsoft Excel.

Рис. 3. Молекулярно-физиологические роли кальций-связывающих белков. Размеры сектора соответствуют числу различных типов белков, выполняющих соответствующую данному сектору функцию

Результаты

В ходе исследования была проанализирована информация о 23 500 белках протеома человека, для которых установлены биологические роли. Функции 2145 из 23 500 белков в той или иной мере зависят от уровней кальция (например, изменяются уровни экспрессии белка), а 625 из 2145 белков непосредственно связывают ион кальция как кофактор [8]. В целом ионы кальция необходимы для функционирования многочисленных мембранных белков (как правило, белков-рецепторов) и внутриядерных белков (белки транскрипции и метаболизма ДНК). Также

Результаты проведенного системно-биологического анализа кальций-зависимых белков [8] указали на диагнозы по МКБ-10, специфически ассоциированные с генетическими дефектами в кальций-зависимых белках. Наиболее кальций-специфичными группами патологий являются нарушения гемостаза и состава крови, пороки развития различных органов, нарушения функции щитовидной и па-ращитовидной желез и патологии соединительной ткани. Для целей настоящего исследования интересно отметить, что многие из этих диагнозов были ассоциированы с нарушениями структуры соединительной ткани, в т. ч. ее коллагеновых сетей (табл. 1).

В целом перечисленные в таблице 1 диагнозы, ассоциированные с нарушениями структуры соединительной ткани и коллагена, зависят от нарушений активности более 58 Са-за-висимых белков. Для уточнения молекулярных механизмов воздействия кальция на метаболизм коллагена рассмотрим молекулярные механизмы биосинтеза коллагена и затем оценим соответствие между результатами системно-биологического анализа Са-зависимых белков и этими механизмами. Молекулярные механизмы биосинтеза коллагена Коллагеновые фибриллы являются механической основой соединительной ткани всех органов и, в частности, кости. Коллаген I типа образует наиважнейший компонент колла-геновой сети - протяженные фибриллы. В костях фибриллы коллагена минерализуются гидроксиапатитом кальция и связывают ион кальция аминокислотными остатками № 1277....1285 [9]. В костной ткани фибриллы коллагена взаимодействуют с ионами кальция на поверхности кристаллов гидроксиапатита [10] (рис. 4).

Однако взаимодействия между кальцием и коллагеном вовсе не ограничены непосредственными взаимодействиями между гидроксиапатитом и коллагеновыми фибриллами в костной ткани. Например, взаимодействия между клетками, синтезирующими коллаген, и самими коллаге-новыми молекулами зависят от активности магний- и ино-зитол-зависимого фермента фосфатидилинозитол-3-ки-назы (Р13К), который участвует в регуляции уровней внутриклеточного Са + [11]. Рассмотрим и другие потенциаль-нык возможности участия препаратов кальция в процессе биосинтеза коллагена, основные стадии которого представлены на рисунке 5.

Таблица 1. Диагнозы по МКБ-10, отражающие патологии соединительной ткани и специфически ассоциированные с генетическими дефектами в кальций-зависимых белках.

В группах диагнозы расположены в порядке убывания статистической значимости (критерий 2); V-, - встречаемость диагноза (в %) в выборке Са-зависимых белков; у2 - встречаемость диагноза (в %) в выборке не-кальций-зависимых белков. Диагнозы упорядочены в соответствии со значениями Р

Диагноз МКБ-10 V, V2 V,/ V2 Р

G71.0 Мышечная дистрофия 0,98 0,14 6,77 3 10-5

Q44 Врожденные пороки развития желчного пузыря 0,40 0,05 7,05 0,006

Q21 Врожденные аномалии сердечной перегородки, Са-зависимое изменение экспрессии генов 0,40 0,05 7,05 0,006

Q78.0 Незавершенный остеогенез 0,49 0,11 4,23 0,014

E76 Нарушения обмена глюкозаминогликанов 0,65 0,23 2,82 0,029

H35.5 Наследственные ретинальные дистрофии 0,49 0,14 3,38 0,03

E76.2 Другие мукополисахаридозы (III, IV, VI, VII). Недостаточность бета-глю-куронидазы 0,40 0,11 3,52 0,04

Q80 Врожденный ихтиоз (нарушения ороговения кожи) 0,40 0,11 3,52 0,04

I42 Кардиомиопатия 0,40 0,11 3,52 0,04

Q79.6 Синдром Элерса - Данло 0,73 0,31 2,31 0,05

А

нанокристалл ,

гидроксиапатита *

Рис. 4. Взаимодействие коллагеновых фибрилл с ионами кальция кристаллов гидроксиапатита.

ионы кальция принимают значительное участие в процессах межклеточной адгезии и формирования структуры соединительной ткани, регуляции клеточного апоптоза и воспаления, синаптической трансмиссии и роста аксонов (рис. 3).

Б

Осуществляемый фибробластами или другими типами клеток соединительной ткани биосинтез коллагена включает в себя следующие стадии [12]:

• Синтез мРНК (транскрипция генов, кодирующих коллагены, 34 гена) - участвуют десятки магний- и кальций-зависимых белков.

• Синтез аминокислотной цепи пре-проколлагена на рибосоме из мРНК (трансляция) поддерживается магний-и кальций-зависимыми белками, магний-зависимыми тРНК и рибосомной РНК.

• Транспорт цепи пре-проколлагена в эндоплазматиче-ский ретикулум посредством «адреса» (сигнального пептида) на N-концевом участке аминокислотной цепи.

• Удаление сигнального пептида в последовательности пре-проколлагена посредством фермента пептидазы сигнальных пептидов SPP (нет кофакторов).

• Гидроксилирование аминокислотных остатков проли-на и лизина в пре-проколлагене с участием ферментов пролил-3-гидроксилазы, пролил-4-гидроксилазы и лизил-гидроксилаз 1, 2, 3. Все перечисленные ферменты требуют Fe2+ и аскорбат-анион в качестве кофакторов, O2 в качестве субстрата. Гиповитаминоз С и, особенно, авитаминоз С (цинга) ассоциированы с резким падением активности именно этих ферментов.

• Гликозилирование моносахаридами аминокислотных остатков лизина в пре-проколлагене посредством проколла-ген-галактозилтрансфераз, гидроксилизил-галактозилтран-сферазы (УДФ-галактозы-5-гидроксилизин-коллаген-галак-тозилтрансферазы) и галактозил-гидроксилизил-глюкозил-трансферазы (УДФ-глюкоза-5-гидроксилизин-коллаген глюкозилтрансферазы). Данные ферменты содержат ионы марганца (и, возможно, ионы Са2+) в качестве кофакторов.

• Сборка тройной спирали проколлагена из 3 аминокислотных цепей пре-проколлагена.

• Внесение необходимых конформационных изменений в проколлаген посредством изомеризации остатков ци-стеина и пролина ферментами протеиндисульфид изоме-

разы и пролил-цис-транс-изомеразы. Данные ферменты не содержат кофакторов.

• Упаковка проколлагена в транспортный везикул, перенос во внеклеточный матрикс.

• Вне клетки проколлаген-протеиназы модифицируют молекулу проколлагена с образованием тропоколлагена. Дефекты генов проколлаген-протеиназы ассоциированы с известным синдромом Элерса - Данло. Проколлаген-^про-теиназа и проколлаген-С-протеиназа нуждаются в ионах Zn2+ в качестве кофактора.

• Формирование коллагеновых фибрилл из тропокол-лагена посредством лизилоксидазы, образующей кова-лентные связки между отдельными сегментами тропокол-лагена. Кофакторами лизилоксидазы являются ионы

и тирозил-хинон.

Таким образом, процесс биосинтеза коллагена нуждается в определенных кофакторах: ионах Са2+, Mg2+, Fe2+, Мп2+, Zn2+, Си+, тирозил-хиноне и аскорбат-анионе. Следует отметить, что воздействие иона кальция собственно на биохимический процесс синтеза коллагена достаточно низкоспецифично - ведь ионы Са2+ влияют в основном на фундаментальные клеточные процессы транскрипции генов и трансляции всех видов белков. Для установления более специфичных механизмов воздействия ионов Са2+ на синтез коллагена рассмотрим результаты системно-биологического анализа Са-зависимых белков.

Системно-биологический анализ Са-зависимых

белков, которые могут воздействовать на биосинтез

коллагена

Для установления Са-зависимых белков протеома, которые могут воздействовать на синтез коллагена, был проведен поиск с использованием перечисленных в таблице 2 биологических ролей. В результате был получен список из 15 белков (табл. 3).

Для оценки вклада каждого из анализируемых 15 белков во взаимосвязь между уровнями кальция и коллагена

была разработана балльная шкала оценки релевантности биологических функций белков, содержащая следующие пункты:

• Белок влияет, прямо или косвенно, на биосинтез коллагена - 1 балл.

• Белок влияет на биодеградацию коллагена - 1 балл.

• Имеются экспериментальные данные о том, что на активность белка влияют уровни кальция, - 1 балл.

• Белок содержит хотя бы 1 Са-связывающий сайт -1 балл.

• Воздействие кальция на данный белок состоит в повышении активности коллаген-синтезирующих ферментов или в снижении активности коллаген-деградирующих ферментов - 1 балл.

• Биологические роли белка осуществляются по-

Рис. 5. Основные стадии биосинтеза коллагена

средством изменения внутриклеточных концентраций ионов Са2+ - 1 балл.

• Имеются экспериментальные данные, подтверждающие воздействие ионов кальция на биосинтез коллагена при участии данного белка, - 1 балл.

В таблице 4 приведены результаты оценки релевантности различных Са-зависимых белков по отношению к воздействию ионов Са2+ на биосинтез коллагена. Очевидно, что наиболее интересными «таргетными белками» являются Са-чувствительный рецептор (CASR) и костный морфо-генетический белок 4 (BMP4). Далее представлен более подробный анализ перечисленных в таблице 3 белков.

Са-чувствительный рецептор CASR

Са-чувствительный рецептор, или «сенсор кальция» (CASR) [13], - рецептор, взаимодействующий с различными G-белками (Ga(q), Ga(i), G(q/11), G(i/o), G(12/13) и G(s)) [14]. Рецептор CASR (рис. 6) присутствует, в частности, в клетках паращитовидной железы, секретирующих паратиреоидный гормон (ПТГ), и в клетках эндотелия почечных канальцев. Врожденные повреждения гена CASR приводят к гиперкальциемическим или гипокальциемиче-ским расстройствам: семейной гипокальциурической ги-перкальциемии, неонатальному острому первичному ги-перпаратиреозу, аутосомно-доминантной гипокальциеми-ческой гиперкальциурии [15]. Заметим, что осуществле-

Таблица 2. Функциональные категории Gene ontology, ассоциированные с процессами биосинтеза коллагена

нию биологических эффектов рецептора CASR способствует активность калиевых каналов [16].

В паращитовидной железе CASR «измеряет» концентрации ионов Са2+ в плазме крови и активирует внутриклеточные сигнальные пути, регулирующие секрецию ПТГ или фильтрацию катионов в почках. В остеоцитах CASR детектирует уровни внеклеточного кальция и активирует остео-генез. Высокие внеклеточные уровни ионов Са + (порядка 10 мМ) стимулируют экспрессию остеогенных маркеров, включая щелочную фосфатазу, костный сиалопротеин, коллагены, остеокальцин 1А1, и увеличивают минерализацию кости. Кроме того, блокада рецептора CASR ингиби-рует клеточный ответ остеоцитов на изменения внеклеточной концентрации Са2+ [17].

Рис. 6. Пространственная структура Са-чувствительного белка CASR (PDB 5 FBH). Оранжевая сфера - ион кальция в Са-чувствительном сайте структуры рецептора, зеленые сферы - ионы магния, необходимые для физиологического функционирования рецептора

Категория Биологическая функция

G0:0033343 Положительное регулирование связывания коллагена

G0:0033341 Регуляция связывания коллагена

G0:0032967 Позитивное регулирование процесса биосинтеза коллагена

G0:0032965 Регулирование процесса биосинтеза коллагена

G0:0010712 Регулирование метаболизма коллагена

G0:0032964 Биосинтез коллагена

G0:0032963 Метаболизм коллагена

G0:0004656 Активность пролил-4-гидроксилазы

Таблица 3. Са-зависимые белки, активность которых ассоциирована с биосинтезом коллагена.

Белки упорядочены в соответствии с использованной балльной оценкой релевантности белков

Ген Белок Функция Балл

CASR Са-чувствительный рецептор Измерение концентрации ионов Са2+ 6

BMP4 Костный морфогенетический белок 4 Индуцирует образование хряща и кости, заживление переломов 5

TGFB1 Преобразующий фактор роста бета-1 Контролирует деление и дифференцировку фибробластов и остеобластов 3

PDGFRB Рецептор тромбоцитарных факторов роста Регуляция деления, выживания, дифференцировки и миграции клеток 3

ITGA2 Интегрин альфа-2 Рецептор ламинина, коллагена, регулятор катаболизма коллагена 3

ITGB1 Интегрин бета-1 Катаболизм коллагена 3

CTGF Фактор роста соединительной ткани Деление и дифференцировка хондроцитов, фибробластов, биосинтез коллагена 3

ММР13 Матриксная металлопротеиназа-13 Протеолиз коллагенов I, II, III, IV, X, XIV 3

MMP1 Фибробласт коллагеназа Протеолиз коллагенов I, II, III, VII и X 3

MMP16 Матриксная металлопротеиназа-16 Протеолиз коллагена III и фибронектина 3

ММР9 Матриксная металлопротеиназа-9 Протеолиз коллагенов IV, V 3

MMP3 Матриксная металлопротеиназа-3 Протеолиз коллагенов I, III, IV, V, X, IX, фибронектина, протеогликанов 3

MMP7 Матриксная металлопротеиназа-7 Протеолиз коллагенов I, III, IV, V, казеина, фибронектина 3

MMP10 Матриксная металлопротеиназа-10 Протеолиз коллагенов I, III, IV, V, фибронектина 3

IL6 Интерлейкин-6 Индуктор провоспалительного ответа острой фазы 2

Однако рецептор CASR играет и другие важные роли, далеко простирающиеся за рамки регулирования уровней внеклеточного Са2+. Например, главная роль CASR в почках заключается в регуляции реабсорбции кальция в восходящем отделе петли Генле, причем вне зависимости от секреции ПТГ (CASR модулирует уровни белка клаудин-14, контролирующего парацеллюлярный транспорт ионов) [18].

Также CASR является физиологическим регулятором роста, дифференцировки и выживания остеобластов и остеокластов [19]. Экспрессия рецептора CASR в хрящевой и костной ткани непосредственно регулирует скелетный гомеостаз и метаболизм соединительной ткани. Ре-

цептор CASR вносит важный вклад в рост хрящевой пластинки, в т. ч. в процессы роста и дифференцировки остеобластов и остеокластов [20] (рис. 7).

В эксперименте было показано, что активируемый ионами Ca2+ рецептор стимулирует деление фибробластов и секрецию матриксных металлопротеиназ ММР-3, ММР-9 [21]. Повышение уровней внеклеточного кальция in vitro дозозависимо стимулирует деление фибробластов (рис. 8, контроль - 105 клеток, кальций - 2,2-10 клеток, p<0,05) и их активность (хемотаксис, рис. 9). Внеклеточный кальций, действуя через рецептор CASR, усиливает минерализацию кости остеобластами (рис. 10) [17].

Как известно, фибробласты являются клетками, производящими все компоненты соединительной ткани: кол-лагеновые и эластиновые волокна и протеингликаны геле-образной среды. Стимулирование CASR деления фибробластов неизбежно связано с повышением общего уровня активности фибробластов, в т. ч. более активным биосинтезом коллагена. Таким образом, активация рецептора CASR ионами Ca2+ является наиболее убедительным механизмом коллаген-продуцирующего действия кальциевых препаратов.

Костный морфогенетический белок 4

Костный морфогенетический белок 4 индуцирует образование хряща и кости, участвует в развитии зубов, формировании конечностей и заживлении переломов. Интересно, что механическая нагрузка на кость способствует синтезу внеклеточного матрикса остеобластами на фоне увеличения уровней белков BMP-2/4 [22].

Повышение уровня внеклеточного кальция стимулирует увеличение числа остеобластов и ингибирует образование остеокластов, в частности, посредством воздействия на уровни экспрессии костных морфогенетических белков. Например, добавление 0,1-0,4 мМ CaCl2 к клеткам в куль-

Рис. 7. Участие рецептора CASR в формировании и резорбции костной ткани. Остеобластогенез протекает посредством дифференциации мезенхимальных клеток -предшественников остеобластов, которые делятся и дифференцируются в преостеобласты, которые, в свою очередь, созревают в остеобласты. Зрелые остеобласты секретируют неминерализованный костный матрикс (остеоид), минерализующийся с образованием кости, в которой зрелые остеобласты становятся остеоцитами. Во время стимуляции остеобластов экспрессия активной R-формы рецептора CASR увеличивается в остеобластах, а экспрессия неактивной О-формы снижается, что повышает соотношение R:O и способствует остеокластогенезу. У молодых животных стимулируемый ионами кальция Са2+ рецептор CASR индуцирует апоптоз зрелых остеокластов и предотвращает резорбцию кости, что ведет к интенсивному росту костной ткани

Контроль Кальций

0 ч 24 ч 0 ч 24 ч

Рис. 8. CASR индуцирует деление фибробластов

Рис. 9. Повышение уровней внеклеточного кальция дозозависимо стимулирует деление и хемотаксис фибробластов in vitro.

(А) Иммунофлуоресцентное окрашивание указывает на высокую экспрессию CASR в клетках (зеленый цвет). Увеличение x 600. (Б) Деление фибробластов при различных концентрациях кальция. Реагент WST-1 был использован для оценки деления клеток. Стандартная среда содержит 1,8 мМ кальция. Среда с хелататором EGTA рассматривалась как содержащая 0 мМ Са2+. Клетки, обработанные раствором с ионами Са2+ в концентрации 10 мМ, показали наиболее высокие темпы деления

туре достоверно увеличивало уровни мРНК ВМР-2 и ВМР-4, количество синтезируемого коллагена I, оцененного по уровням карбоксиконцевого пептида проколлагена I [23]. Повышенные уровни Са2+ увеличивают экспрессию генов белков морфогенеза костей (в частности, ВМР-2) [24].

Взаимосвязи между активностью рецептора CASR и экспрессией морфогенетических белков остаются недостаточно изученными. Считается, с одной стороны, что регулируемая секреция ВМР-2 происходит в ответ на активацию рецептора CASR [25]. С другой стороны, использование кальцимиметика NPS-R568, специфического агони-ста для рецептора CASR, не увеличивало экспрессию ВМР-2. Кроме того, известно, что CASR реагирует не только на уровни Са2+, но и на ионы Mg2+, Sr2+, Gd3+. Однако только ионы Са2+, Sr2+, но не Mg2+ или Gd3+ вызывали дозо-зависимое увеличение уровней мРНК ВМР-2. Поэтому возможно, что за увеличение экспрессии костных морфогене-тических белков при высоких уровнях кальция может отвечать и другой белок - рецептор кальция, отличный от рецептора CASR [24].

О других Са-зависимых белках и их воздействии на

метаболизм коллагена

К другим Са-зависимым белкам, так или иначе влияющим на метаболизм коллагена, относятся мат-риксные металлопротеиназы (ММП) и некоторые ростовые факторы (табл. 3). ММП осуществляют протеолиз тройных спиралей коллагенов различных типов и играют роль в процессе заживления ран, ремоделировании соединительной ткани, деградации хряща, развитии и минерализации кости и заживлении переломов костей [26]. В структурах ММП содержатся Са-связывающие сайты, так что достаточные уровни кальция необходимы для деградации коллагена посредством ММП. Таким образом, ММП не могут непосредственно усиливать процессы биосинтеза коллагена.

Более вероятно, что уровни внеклеточного кальция могут способствовать повышению биологической активности ростовых факторов, активность которых связана с увеличением биосинтеза коллагена. Общеизвестно, что эффекты ростовых факторов TGFB1, PDGFRB и CTGF (табл. 3) осуществляются за счет «всплеска» внутриклеточных концентраций ионов Са2+ в момент активации рецептора. Повышение внеклеточных концентраций Са2+ (что про-

исходит при приеме кальциевых препаратов) может способствовать повышению внутриклеточных концентраций Са2+, например, за счет неспецифической диффузии через аквапорины или другие транспортные каналы. Иначе говоря, повышение концентрации внутриклеточного кальция вследствие приема кальциевых препаратов как бы имитирует активацию факторов роста ТОРБ1, РйОРЯБ и СТОГ, активность которых связана с повышением биосинтеза коллагена.

Преобразующий фактор роста бета-1 (TGF-бета1) контролирует деление и дифференцировку многих типов клеток, в т. ч. фибробластов и остеобластов. TGF-бета1 стимулирует приток ионов Са2+ в цитоплазму клетки [27] и синтез коллагена в остеобластах (р=0,001), что имеет важное значение для образования костной ткани. На остеобластах в культуре одновременное добавление к среде Са(ОН)2 и TGF-бета1 значительно увеличило синтез белка вообще и синтез коллагена в частности (р=0,048) [28].

Рецептор тромбоцитарных факторов роста PDGF-B и PDGF-D (PDGFRB) играет существенную роль в регуляции клеточного деления, выживаемости, дифференциров-ки и миграции клеток. Мутации в структуре молекулы рецептора ухудшают заживление ран и уменьшают отложение коллагена в соединительной ткани [29]. Рецептор PDGFRB активирует фосфолипазу Су 1 (PLCG1), что инициирует процессы внутриклеточной передачи сигнала с участием сигнальных молекул диацилглицерола, инози-тол-1,4,5-трифосфата, мобилизацию внутриклеточного Са2+ и активацию протеинкиназы С. Активация рецептора вызывает рост внутриклеточной концентрации Са2+, что повышает экспрессию генов коллагена и фибронектина в фибробластах [30].

Фактор роста соединительной ткани (CTGF) способствует делению и дифференцировке хондроцитов, обеспечивает клеточную адгезию фибробластов, осуществляет положительное регулирование процесса биосинтеза коллагена [31] посредством сигнальных путей Rac1/MLK3/JNK/AP-1 [32]. В частности, связывается с рецептором-2 факторов роста фибробластов (FGFR2) и стимулирует Са-зависимую внутриклеточную передачу сигнала [33].

Таким образом, первично минерализация кости начинается внутри коллагеновых фибрилл, а затем, по мере нарастания процесса, минерализация и насыщение кальцием усиливаются между фибриллами [34]. Аналогичная последовательность наблюдается при минерализации тканей дентина зубов [35]. Установлена следующая последовательность процессов формирования тканей кости во времени: остеобласты формируют неминерализованный органический ос-теоид (костную матрицу), который преимущественно состоит из коллагена I типа. Эта матрица служит своего рода «ловушкой» и основой для неорганических кристаллов гидрокси-апатита. Таким образом, в минерализации остеоида прослеживаются 2 стадии. Первичная минерализация (изначальное включение ионов кальция и фосфата в коллагеновый мат-рикс) происходит быстро - в течение

Б

10 сут.

Стандарт 10 тМСа

15 сут.

21 сут.

! (ш

о А. в

'Л - V.. V

Рис. 10. Внеклеточный кальций усиливает минерализацию кости остеобластами.

Кластеры интенсивного красного цвета указывают на активную минерализацию в клетках, культивированных с 10 мМ Са2+ в течение 7 сут.

2-3 нед. и составляет примерно 70% общего содержания минералов. Вторичная минерализация (окончательное созревание минеральных кристаллов) происходит в течение значительно более длительного времени - до 1 года и более [36].

Заключение

Миллионам женщин старше 40 лет грозит перелом из-за хрупкости костей вследствие вымывания кальция. Каждые 5 мин в России происходит перелом проксимального отдела бедренной кости [37]. В особой группе риска находятся 34 млн женщин России старше 40 лет, и 24 млн не знают об этом. Основные причины хрупкости костей - вымывание кальция и утрата коллагена. Улучшение биосинтеза коллагена - необходимое условие для восстановления структуры кости при срастании переломов, регенерации кости при постменопаузальном, лекарственном остеопо-розе, а также при других нарушениях целостности кости. Нормализация биосинтеза коллагена способствует лучшему удержанию кальция в костной ткани и, следовательно, повышению минеральной плотности кости. В отличие от других препаратов Кальцемин Адванс содержит кальций и минералы, формирующие коллагеновую сетку, что удерживает кальций в костях. Она препятствует вымыванию кальция и сохраняет прочность костной ткани.

Таким образом, Кальцемин Адванс и сохраняет прочность костной ткани: останавливает вымывание кальция, способствует синтезу коллагенового матрикса и насыщению костной ткани необходимыми микро- и макроэлементами.

Системно-биологический анализ кальций-зависимых белков протеома человека показал, что ионы кальция стимулируют биосинтез коллагена посредством действия ионов кальция на Са-чувствительный рецептор CASR и костный морфогенетический белок BMP4.

Костный метаболизм вообще и биосинтез коллагена в частности нуждается в поддержке определенными «остео-тропными» микронутриентами. В частности, процесс биосинтеза коллагена нуждается в ионах Са2+, Mg2+, Fe2+, Mn2+, Zn2+, Cu+ как кофакторах соответствующих ферментов. Поэтому препараты кальция, способствующие повышению обеспеченности организма магнием, цинком, медью, марганцем (например, препарат Кальцемин Адванс), повышают потенциал коллагенообразования в соединительной ткани.

Литература

1. Shoshan S., Plsantl S. The metabolic effect of low calcium Intake on collagen of bones and dental structures in the rat //Arch Oral Biol. 1971. Vol. 16(7). P. 791-800.

2. Ivanov V., Ivanova S., Kalinovsky T. et al. Inhibition of collagen synthesis by select calcium and sodium channel blockers can be mitigated by ascorbic acid and ascorbyl pal-mitate // Am J Cardiovasc Dis. 2016. Vol. 6(2). P. 26-35.

3. Dietrich J.W., Duffield R. Effects of the calcium antagonist verapamil on in vitro synthesis of skeletal collagen and noncollagen protein // Endocrinology. 1979. Vol. 105(5). P. 1168-1172.

4. Wang T., Gu Q., Zhao J. et al. Calcium alginate enhances wound healing by up-regulating the ratio of collagen types I/III in diabetic rats // Int J Clin Exp Pathol. 2015. Vol. 8(6). P. 6636-6645.

5. Демидов В.И., Жидоморов Н.Ю., Торшин И.Ю. и др. Эффективность заживления кожи при использовании синергидной композиции кальция на модели резаной раны// Акушерство и гинекология, 2015. № 4. С. 56-61 [Demidov V.I., Zhidomorov N.Ju., Torshin I.Ju. i dr. Jeffektivnost' zazhivlenija kozhi pri ispol'zovanii sinergidnoj kom-pozicii kal'cija na modeli rezanoj rany // Akusherstvo i ginekologija, 2015. № 4. S. 56-61 (in Russian)].

6. Kamel S., Fardellone P., Meddah B. et al. Response of several markers of bone collagen degradation to calcium supplementation in postmenopausal women with low calcium intake // Clin Chem. 1998. Vol. 44(7). P. 1437-1442.

7. Torshin I.Yu. Sensing the change from molecular genetics to personalized medicine // Nova Biomedical Books, NY, USA, 2009, In «Bioinformatics in the Post-Genomic Era» series.

8. Громова О.А., Торшин И.Ю., Гришина Т.Р., Лисица А.В. Перспективы использования препаратов на основе органических солей кальция. Молекулярные механизмы кальция // Лечащий врач. 2013. № 4. С. 42-44 [Gromova O.A., Torshin I.Ju., Grishina T.R., Lisica A.V. Perspektivy ispol'zovanija preparatov na osnove organicheskih solej kal'cija. Molekuljarnye mehanizmy kal'cija // Lechashhij vrach. 2013. № 4. S. 42-44 (in Russian)].

9. Cui F.Z., Wang Y., Caia Q., Zhang W. Conformation change of collagen during the initial stage of biomineralization of calcium phosphate // J. Mater. Chem. 2008. Vol. 18. P. 3835-3840.

10. Landis W.J., Jacquet R. Association of calcium and phosphate ions with collagen in the mineralization of vertebrate tissues // Calcif Tissue Int. 2013. Vol. 93(4). P. 329-337.

11. Ahlen K., Berg A., Stiger F. et al. Cell interactions with collagen matrices in vivo and in vitro depend on phosphatidylinositol 3-kinase and free cytoplasmic calcium // Cell Adhes Commun. 1998. Vol. 5(6). P. 461-473.

12. Alberts B., Johnson A., Lewis J. et al. Molecular Biology of the Cell, 4th edition // NY, Garland Science, 2002.

13. Zhang C., Zhang T., Zou J. et al. Structural basis for regulation of human calcium-sensing receptor by magnesium ions and an unexpected tryptophan derivative co-agonist // Sci Adv. 2016. Vol. 2(5). Р. 1600241.

14. Ray K. Calcium-Sensing Receptor: Trafficking, Endocytosis, Recycling, and Importance of Interacting Proteins // Prog Mol Biol Transl Sci. 2015. Vol. 132. Р. 127-150.

15. Zhang C., Miller C.L., Brown E.M., Yang J.J. The calcium sensing receptor: from calcium sensing to signaling // Sci China Life Sci. 2015. Vol. 58(1). P. 14-27.

16. Huang C., Miller R.T. The calcium-sensing receptor and its interacting proteins // J Cell Mol Med. 2007. Vol. 11(5). P. 923-934.

17. Gonzalez-Vazquez A., Planell J.A., Engel E. Extracellular calcium and CaSR drive osteoinduction in mesenchymal stromal cells // Acta Biomater. 2014. Vol. 10(6). P. 2824-2833.

18. Toka H.R. New functional aspects of the extracellular calcium-sensing receptor // Curr Opin Nephrol Hypertens. 2014. Vol. 23(4). Р. 352-360.

19. Caudarella R., Vescini F., Buffa A. et al. Role of calcium-sensing receptor in bone biology // J Endocrinol Invest. 2011. Vol. 34(7). Р. 13-17.

20. Goltzman D., Hendy G.N. The calcium-sensing receptor in bone--mechanistic and therapeutic insights // Nat Rev Endocrinol. 2015. Vol. 11(5). P. 298-307.

21. Zhang X., Zhang T., Wu J. et al. Calcium sensing receptor promotes cardiac fibroblast proliferation and extracellular matrix secretion // Cell Physiol Biochem. 2014. Vol. 33(3). P. 557-568.

22. Guo Y., Zhang C.Q., Zeng Q.C. et al. Mechanical strain promotes osteoblast ECM formation and improves its osteoinductive potential // Biomed Eng Online. 2012. Vol. 11. P. 80.

23. Nakade O., Takahashi K., Takuma T. et al. Effect of extracellular calcium on the gene expression of bone morphogenetic protein-2 and -4 of normal human bone cells // J Bone Miner Metab. 2001. Vol. 19(1). P. 13-19.

24. Tada H., Nemoto E., Kanaya S. et al. Elevated extracellular calcium increases expression of bone morphogenetic protein-2 gene via a calcium channel and ERK pathway in human dental pulp cells // Biochem Biophys Res Commun. 2010. Vol. 394(4). P. 1093-1097.

25. Peiris D., Pacheco I., Spencer C., MacLeod R.J. The extracellular calcium-sensing receptor reciprocally regulates the secretion of BMP-2 and the BMP antagonist Noggin in colonic myofibroblasts // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007. Vol. 292(3). Р. 753-766.

26. Lausch E., Keppler R., Hilbert K. et al. Mutations in MMP9 and MMP13 determine the mode of inheritance and the clinical spectrum of metaphyseal anadysplasia // Am J Hum Genet. 2009. Vol. 85(2). P. 168-178.

27. Alevizopoulos A., Dusserre Y., Ruegg U., Mermod N. Regulation of the transforming growth factor beta-responsive transcription factor CTF-1 by calcineurin and calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV // J Biol Chem. 1997. Vol. 272(38). P. 23597-23605.

28. Jaunberzins A., Gutmann J.L., Witherspoon D.E., Harper R.P. Effects of calcium hydroxide and transforming [correction of tumor] growth factor-beta on collagen synthesis in subcultures I and V of osteoblasts // J Endod. 2000. Vol. 26(9). P. 494-499. '

29. Vanlandewijck M., Lebouvier T., Andaloussi Mae M. et al. Functional Characterization of Germline Mutations in PDGFB and PDGFRB in Primary Familial Brain Calcification // PLoS One. 2015. Vol. 10(11). Р. 0143407.

30. Mukherjee S., Duan .F, Kolb M.R., Janssen L.J. Platelet derived growth factor-evoked Ca2+ wave and matrix gene expression through phospholipase C in human pulmonary fibroblast // Int J Biochem Cell Biol. 2013. Vol. 45(7). P. 1516-1524.

31. Oliver N., Sternlicht M., Gerritsen K., Goldschmeding R. Could aging human skin use a connective tissue growth factor boost to increase collagen content? // J Invest Dermatol. 2010. Vol. 130(2). P. 338-341.

32. Lin C.H., Yu M.C., Tung W.H. et al. Connective tissue growth factor induces collagen I expression in human lung fibroblasts through the Rac1/MLK3/JNK/AP-1 pathway // Biochim Biophys Acta. 2013. Vol. 1833(12). P. 2823-2833.

33. Aoyama E., Kubota S., Takigawa M. CCN2/CTGF binds to fibroblast growth factor receptor 2 and modulates its signaling // FEBS Lett. 2012. Vol. 586(24). P. 4270-4275.

34. Rho J.Y., Kuhn-Spearing L., Zioupos P. Mechanical properties and the hierarchical structure of bone. // Med Eng Phys. 1998. Vol. 20(2). P. 92-102.

35. Lees S., Davidson C.L. The role of collagen in the elastic properties of calcified tissues. // J Biomech. 1977. Vol. 10(8). P. 473-486.

36. Burr D.B. The complex relationship between bone remodeling and the physical and material properties of bone // Osteoporos Int. 2015. Vol. 26(3). P. 845-847.

37. Лесняк О.М., Беневоленская Л.И. Остеопороз в Российской Федерации: проблемы и перспективы // Научно-практическая ревматология. 2010. № 5. С. 14—18 [Lesnjak O.M., Benevolenskaja L.I. Osteoporoz v Rossijskoj Federacii: problemy i perspektivy // Nauchno-prakticheskaja revmatologija. 2010. № 5. S. 14—18 (in Russian)].