СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
METHOD FOR OBTAINING PHARMACEUTICAL AGENT FOR INHIBITING PROLIFERATIVE ACTIVITY OF TUMOR CELLS

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для торможения пролиферативной активности опухолевых клеток.
Известен способ получения противоопухолевой композиции [RU 2686679 С2, МПК (2006.01) A61K 33/30, A61K 47/12, A61K 47/36, А61Р 35/00, опубл. 30.04.2019], заключающийся в том, что готовят водный раствор ацилированного производного гиалуроновой кислоты, затем добавляют суперпарамагнитные наночастицы, диспергированные в органическом галогенидном растворителе и стабилизированные олеиновой кислотой. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком до образования гомогенной смеси, а затем свободные суперпарамагнитные наночастицы отделяют от суперпарамагнитных наночастиц, загруженных в наномицеллы, центрифугированием и последующей фильтрацией. Фильтрат затем лиофилизируют и стерилизуют автоклавированием в окончательной упаковке. Лиофилизат может быть растворен в водном растворе, а затем подвергнут стерилизации автоклавированием в окончательной упаковке. Суперпарамагнитные наночастицы, имеющие размер от 5 до 20 нм, представляют собой наночастицы на основе оксидов железа. Количество железа в композиции составляет от 0,3 до 3 мас. %.
Полученная композиция может содержать лекарственное вещество и является селективно цитотоксической как в отношении суспензионных, так и адгезивных клеточных опухолевых линий, особенно в отношении опухолевых клеточных линий колоректальной карциномы и аденокарциномы, карциномы легкого, гепатоцеллюлярной карциномы и аденокарциномы молочной железы.
Известен способ получения фармацевтического средства для угнетения пролиферативной активности опухолевых клеток [пример 2 из RU 2560432 С2, МПК (2006.01) B01J 20/06, В82В 3/00, A61K 33/08246, опубл. 20.08.2015], принятый за прототип, включающий получение биметаллических наночастиц Fe-Al с размером частиц около 100 им параллельным электрическим взрывом железной и алюминиевой проволоки в атмосфере азота при соотношении Fe:Al=50:50% масс. 20 г полученного порошка заливают 2000 мл дистиллированной воды и нагревают при постоянном перемешивании до 60°С, контролируя и поддерживая рН реагирующей смеси на уровне 9,0 раствором аммиака. Реакцию проводят в течение 60 мин. Затем суспензию отфильтровывают, промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и сушат при температуре 90°С в течение 4 часов.
Полученное фармацевтическое средство в виде порошка суспендируют в ростовом средстве и добавляют смесь трипсин:версена (в соотношении 1:3) и используют для подавления пролиферативной активности раковых клеток, которую оценивают путем определения индекса пролиферации (отношение числа выросших клеток к числу посеянных) через 48 и 72 часа.
Техническим результатом предложенного изобретения является расширение арсенала средств для торможения пролиферативной активности опухолевых клеток.
Способ получения фармацевтического средства для торможения пролиферативной активности клеток рака также как в прототипе включает использование металлического порошка, полученного электрическим взрывом металлической проволоки в атмосфере газа.
-2
5
Согласно изобретению ведут электрический взрыв проволоки из низкоуглеродистой стали при удельной энергии 7-18 кДж/г и длительности импульса 1,2-2 мкс в реакторе, предварительно вакуумированном до остаточного давления 10 Па, а затем заполненном монооксидом углерода до давления 10 Па при скорости циркуляции газового потока в реакторе 10 м/с. Осажденные в ловушку продукты взрыва пассивируют в атмосфере воздуха в течение не менее 48 часов. Полученный порошок извлекают и смешивают с питательным раствором, рН которого составляет 7,2, в пропорции Т:Ж от 1:10 до 2,7:10, затем центрифугируют до разделения фаз, жидкую фазу сливают и используют в качестве фармацевтического средства.
В качестве питательного раствора используют среду RPMI-1640 с L-глутамином.
В предложенном способе при получении металлического порошка происходит взаимодействие наночастиц металлического железа с монооксидом углерода по реакции:
5
Fe+5СО=Fe(CO)
Так как продукты взрыва потоком газа переносятся в ловушку, то эта реакция не доходит до конца. Образующийся продукт накапливается в адсорбционном слое и остается на поверхности твердых наночастиц.
5
Для отделения Fe(CO) от непрореагировавших металлических частиц в качестве растворителя использован питательный раствор.
Использование предложенного фармацевтического средства позволяет тормозить пролиферативную активность опухолевых клеток с индексом пролиферации менее 1,0 отн. ед. через 5-10 часов.
На фиг. 1 представлена схема установки для получения металлического порошка.
На фиг. 2 представлены фотографии частиц порошка, полученного в примере 1.
На фиг. 3 и 4 показано распределение частиц полученного в примере 1 порошка по размерам.
На фиг. 5 представлена рентгенограмма полученного в примере 1 порошка.
На фиг. 6 проиллюстрировано изменение клеточного индекса в клетках HeLa после добавления фармацевтического средства.
На фиг. 7 и 8 представлены фотографии частиц порошка, полученного в примере 2.
На фиг. 9 показано распределение частиц полученного в примере 2 порошка по размерам.
На фиг. 10 и 11 представлены фотографии частиц порошка, полученного в примере 3.
На фиг. 12 показано распределение частиц по размерам полученного в примере 3 порошка.
Установка для получения металлического порошка содержит горизонтально установленный реактор 1, внутри которого расположены высоковольтный 2 и заземленный 3 электроды, а также механизм подачи 4 заготовки проволоки. Электрод 2 подключен к источнику питания 5 (ИП). Снизу реактор 1 соединен трубопроводом с входом в циклон 6 цилиндрического типа, нижняя часть которого снабжена бункером 7 для сбора порошка. Выход циклона 6 соединен с верхней частью реактора 1 трубопроводом, в котором размещен вентилятор 8. Циклон 6 через соответствующие трубопроводы, оснащенные вентилями, соединен с баллоном 9 (БГ), содержащим монооксид углерода, с форвакуумным насосом 10 (ВН) и с вентилем сброса рабочего газа.
Пример 1.
-2
5
Катушку стальной низкоуглеродистой проволоки сплава марки СВ-08 разместили в механизме подачи 4 проволоки в реакторе 1. Диаметр проволоки составлял 0,3 мм, а длина межэлектродного промежутка 80 мм. С помощью форвакуумного насоса 10 (ВН) вакуумировали объем установки до остаточного давления 10. Затем из баллона 9 (БГ) заполнили рабочий объем установки монооксидом углерода до давления 10 Па. Включив вентилятор 8 по трубопроводу, соединяющему его с реактором 1, осуществляли непрерывную циркуляцию монооксида углерода со скоростью 10 м/с. Включив механизм подачи 4 обеспечили непрерывную подачу проволоки в направлении от заземленного 3 электрода к высоковольтному 2. Расстояние межэлектродного промежутка составляло 80 мм. На высоковольтный 2 электрод от источника питания 5 (ИП) подавали высокое напряжение длительностью 1,5 мкс. При касании проволоки, подаваемой в реактор 1, высоковольтного электрода 2 происходил ее взрыв, затраченная удельная энергия составляла 14 кДж/г. Продукты взрыва проволоки газовым потоком выносились из реактора 1 в циклон 6, где происходило их отделение от монооксида углерода и осаждение в бункере 7. Очищенный газ из циклона 6 возвращался на вход вентилятора 8 и вновь поступал в реактор 1. После заполнения бункера 7 наработанными продуктами взрыва проволоки, отключили источник питания 5 (ИП), механизм подачи 4 проволоки, вентилятор 8 и отсоединили бункер 7 от циклона 6. Бункер 7 накрыли крышкой с отверстием диаметром 1 мм и выдержали в таком состоянии в течение 48 часов для приведения полученного продукта в равновесное состояние. После этого полученный металлический порошок извлекли из бункера 7 и поместили в емкость для хранения.
Полученный металлический порошок представляет собой смесь наночастиц размером от 20 до 300 нм (фиг. 2, 3) с максимумом распределения в 80 нм и микрочастиц с размером до 2 мкм и максимумом распределения около 0,8 мкм. При этом количество частиц размером более 500 нм составляет не более 1% (фиг. 4).
2
Рентгенофазовый анализ показал, что полученный металлический порошок состоит из частиц чистого железа в виде фазы α-Fe и соединения аустенита в виде Fe-C (фиг. 5). Площадь его удельной поверхности составила 9,3 м/г.
В стерильных условиях из полученного металлического порошка взяли навеску массой 270 мкг и прилили к нему 1000 мкл питательного раствора RPMI-1640 с L-глутамином с рН 7,2. Полученную смесь перемешали ультразвуком в течение 10 минут в ультразвуковой ванне «WiseClean» с рабочей частотой 300 кГц. Затем полученную суспензию центрифугировали 10 минут на центрифуге «Allegra 64R» (USA) при 3000 об/мин для разделения жидкой и твердой фаз. Жидкую фазу, которая является готовым фармацевтическим средством, слили в емкость.
Полученное фармацевтическое средство использовали для проведения тестирования в клетках HeLa в режиме in vitro.
2
2
Использовали клеточную линию рака шейки матки HeLa, полученную из яичника китайского хомячка СНО-K1. Клетки содержались в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотики (50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина), при 37°С, при 5% содержании СО, во влажной среде(в СО инкубаторе).
Действие полученного фармацевтического средства на эпителиоидную карциному рака шейки матки человека He-La клеток рака осуществляли с помощью планшета. Клетки высаживали в каждую лунку 8-ми луночного планшета от системы iCelligence (ACEA Bioscience, США) из расчета 70 тысяч клеток на лунку.
Через 4 часа после посева клеток в одни лунки прилили 200 мкл полученного фармацевтического средства, а в другие - 200 мкл питательного раствора RPMI-1640.
Для определения уровня пролиферативной активности использовали систему оценки в режиме реального времени iCelligence (ACEA Bioscience, США). Снятие показаний осуществляли в автоматическом режиме с интервалом в 1 час. Система iCelligence производила автоматический пересчет снимаемых значений в клеточный индекс, свидетельствующий об уровне пролиферативной активности клеток, а так же подсчет стандартного отклонения. Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica.
Кривая малинового цвета (270 мкг/мл) на фиг.6 показывает торможение пролиферативной активности опухолевых клеток HeLa относительно контроля (кривая красного цвета). Торможение пролиферативной активности опухолевых клеток начинается практически сразу после добавления фармацевтического средства. Клеточный индекс составляет 0,5 отн. ед., а в контроле 3,25 отн. ед. за 120 час наблюдения.
Пример 2.
В условиях аналогичных примеру 1 осуществляли электрический взрыв заготовки диаметром 0,3 мм и длиной 80 мм из стальной низкоуглеродистой проволоки сплава марки СВ08, подавая энергию 7 кДж/г в течение 2 мкс.
Характерные изображения частиц полученного порошка приведены на фиг. 7 и 8.
2
Порошок представляет собой смесь микронных частиц с размером до 6 мкм и максимумом распределения в 2 мкм и нанометровых частиц размером от 20 до 300 нм с максимумом распределения 80 нм. Количество частиц размером более 500 нм составляет более 2% (фиг. 9). Фазовый состав полученного порошка такой же, как в примере 1 (фиг. 5). Площадь удельной поверхности этого порошка оставила 4 м/г.
В стерильных условиях из полученного металлического порошка взяли навеску массой 100 мкг и прилили к нему 1000 мкл питательного раствора RPMI-1640 с L-глутамином с рН 7,2. При таких же условиях, как в примере 1, приготовили фармацевтическое средство.
Внесли в одни лунки полученное фармацевтическое средство из расчета 100 мкг/мл, а в контрольные - питательный раствор. Результаты наблюдения представлены голубой кривой на фиг. 6 (100 мкг/мл). Торможение пролиферативной активности опухолевых клеток HeLa относительно контрольной кривой красного цвета, начинается практически сразу после добавления фармацевтического средства. Клеточный индекс составляет 0,75 отн. ед., а в контроле 3,25 отн. ед. за 120 час наблюдения.
Пример 3.
В условиях аналогичных примеру 1 осуществляли электрический взрыв заготовки диаметром 0,3 мм и длиной 80 мм из стальной низкоуглеродистой проволоки сплава марки СВ08, подавая энергию 18 кДж/г в течение 1,2 мкс.
Характерные изображения частиц полученного порошка приведены на фиг. 10, 11.
2
Полученный порошок представляет собой смесь микронных частиц размером до 2 мкм и максимумом распределения в 500 нм и частично спекшихся нанометровых частиц размером от 20 до 300 нм с максимумом распределения 80 нм. Количество частиц размером более 500 нм составляет не более 0,5% (фиг. 12).Фазовый состав порошка такой же, как в примере 1 (фиг. 5). Площадь удельной поверхности этого порошка составила 11 м/г.
Из полученного порошка взяли навеску массой 170 мкг и прилили к нему 1000 мкл питательного раствора RPMI-1640 L-глутамином с рН 7,2. При таких же условиях, как в примере 1, приготовили фармацевтическое средство. Внесли в одни лунки полученное фармацевтическое средство из расчета 170 мкг/мл, а в контрольные - питательный раствор. Результаты наблюдения представлены кривой зеленого цвета на фиг. 6 (170 мкг/мл). Торможение пролиферативной активности опухолевых клеток HeLa относительно контрольной кривой красного цвета начинается практически сразу после добавления фармацевтического средства. Клеточный индекс составляет 0,75 отн. ед., а в контроле 3,25 отн. ед. за 120 час наблюдения.