Биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций in vivo
BIOREACTOR FOR GROWING TISSUE ENGINEERING STRUCTURES IN VIVO

Известно устройство - биореактор для создания тканеинженерного эквивалента трахеи. Биореактор представляет собой прямоугольной формы емкость, заполненную на 1/2 или 1/3 культуральной питательной средой. Вдоль емкости вставлена вращающаяся трубка, на которую надевалась биоматрица трахеи или любого другого органа трубчатого строения и сопоставимых размеров. На медленно вращающийся отрезок трахеи равномерно наносят суспензию клеток с помощью шприца - как на внешнюю, так и на внутреннюю его поверхность. Затем трансплантат наполовину погружался в среду культивирования и на протяжении всего времени пребывания в биореакторе постоянно вращался, чтобы клетки попеременно контактировали со средой и воздухом. Такой биореактор позволяет применить разные среды культивирования для хондроцитов и эпителиоцитов (Macchiarini P., Jungebluth P., Go Т. et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet 2008; 372 (9655): 2023-30). В биореакторе трансплантат находился 96 часов. Известное устройство не позволяет выращивать части биоискусственных органов более сложной формы, и предназначено только для выполнения экспериментов «в пробирке» (in vitrum) - вне взаимодействия с живым организмом.
Прототипом изобретения выбран Биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций, в котором биоматрица помещается внутрь емкости биореактора, через пневмоакустические форсунки подается воздушно-водяная смесь с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и поддерживается постоянная температуры этой смеси, соответствующая внутренней температуре тела. Питательная культуральная среда представляет жидкостную фазу смеси и равномерно осаждается на все стенки тканеинженерной конструкции, при таком распылении питательная среда обладает способностью проникать в тончайшие складки, щели, подниматься по микропорам биоматрицы - "капиллярный эффект" (что называется "течет вверх"), что обеспечивает адекватное поступление питательных веществ к пролиферирующим клеткам конструкции. Угол раскрытия факела в 180° позволяет обойтись меньшим количеством форсунок в устройстве с сохранением направления распыления культуральной среды. Расположение форсунок над и под биоматрицей обеспечивает равномерное поступление питательной среды во все части тканеинженерной конструкции и позволяет увеличить толщину этой конструкции. 5% содержание углекислого газа в воздушной смеси, в совокупности с питательной средой и температурой, обеспечивают оптимальные условия для культивирования клеток и наращивания их количества. Это устройство хоть и повышает эффективность и создает возможность формировать биоискусственные органы и их части более сложной формы, но в тех же условиях in vitrum - вне живого организма (Пат. 2482180 Российская Федерация, МПК C12N 5/00 С12М 3/00. Биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций [Текст] / Ковалев А.В.; заявитель и патентообладатель Ковалев А.В. - №2011129288/10; заявл. 14.07.2011; опубл. 20.05.2013, Бюл. №14 -4 с.).
Известное устройство не позволяет проводить выращивание биоискусственных органов и тканей в эксперименте на живом организме, а также не позволяет отказаться от необходимости проведения дополнительного необходимого последующего этапа тканевой инженерии крупных графтов - префабрикации, на котором происходит гибель существенного количества культивированных клеток и значительное разрушение матрицы графта, что существенно затрудняет достижение желаемой полноты восстановления утраченных биологических структур.
Цель изобретения - повысить эффективность выращивания и интеграции тканеинженерных конструкций в организм реципиента, а также предоставить возможность сформировать биоискусственные ткани непосредственно на раневой поверхности, а также достроить с помощью биотехнологий и управления регенерацией утраченные части органов сложной формы в условиях in vivo (в эксперименте на живом организме).
Предложен биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций in vivo, включающий емкость с прозрачными стенками, клапан сброса избыточного давления, трубку сброса культуральной питательной среды, пневмоакустические форсунки, выполненные с возможностью мелкодисперсного распыления в емкость стерильной воздушно-водяной смеси, в состав которой входит культуральная питательная среда, с повышенным содержанием до 5% углекислого газа и заданной температурой смеси, в стенке емкости расположено отверстие с элементом крепления в виде съемной манжеты на неподвижном резьбовом соединении для вхождения и удержания сегмента конечности или части хвоста живого индивида с закрепленной тканеинженерной конструкцией, в стенках емкости расположены в верхней и нижней точках штуцеры для подачи и извлечения культуральной питательной среды, а в верхней стенки отверстие с герметичной крышкой, через которую осуществляются манипуляции, в том числе клеточная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток, при этом пневмоакустические форсунки для мелкодисперсного распыления стерильной воздушно-водяной смеси, в состав которой входит культуральная питательная среда, выполнены съемными с изменяющимся углом раскрытия факела, размещены на стенках емкости над и под сегментом конечности или части хвоста живого индивида, снаружи на емкости установлен съемный теплоизолирующий чехол.
Технический результат достигается тем, что поврежденный сегмент конечности или хвоста с закрепленной на раневой поверхности
тканеинженерной конструкцией помещается внутрь емкости биореактора через входной отверстие и фиксируется манжетой, через пневмоакустические форсунки подается стерильная воздушно-водяная смесь, в состав которой входит культуральная питательная среда, с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и поддерживается постоянная температуры этой смеси, соответствующая внутренней температуре тела, заключается в повышении эффективности выращивания и интеграции тканеинженерных конструкций в условиях эксперимента на живом организме, совмещении по времени построения тканеинженерной конструкции с регенерацией тканей реципиента от дна раны по каркасу (по этой же тканеинженерной конструкции), а именно: молодой соединительной ткани, нервов и сосудов. В устройстве происходит пневмоакустического распыления питательной культуральной среды в составе контролируемой стерильной воздушно-водяной смеси. Тонко распыленная культуральная питательная среда обладает очень большой проникающей способностью, а мелкодисперсное распыление среды происходит без разрушения структуры составляющих ее веществ и физико-химических свойств, а также без повреждения живых тканей и тканеинженерных конструкций. Такой способ подачи питательной среды при 100% влажности внутри емкости устройства позволяет обеспечить газообмен и оптимальные парциальные давления кислорода и углекислого газа в микрослое культуральной питательной среды, что обеспечивает адекватное клеточное дыхание и питание клеточной биомассы на больших матрицах. Разборность конструкции облегчает поддержание асептики на весь период эксперимента. Устройство легко снимается и внутри стерильного ламинара меняется на стерильное, одновременно осуществляется необходимая обработка интактной кожи и манипуляции с тканеинженерной конструкцией.
Сущность предлагаемого технического решения поясняется чертежом, на котором представлено продольное сечение Биореактора для выращивания тканеинженерных конструкций in vivo (фиг. 1).
Устройство состоит из емкости биореактора с герметично соединенными прозрачными стенками 1,2,3, отверстия 4, герметично закрывающееся крышкой 5, крепящей манжеты 6, клапана сброса избыточного давления 7, штуцера сброса питательной среды 8, пневмоакустических форсунок 9, тканеинженерной конструкции 10, теплоизолирующего чехла 11.
Устройство работает следующим образом: в емкость биореактора помещается поврежденная часть конечности или хвоста, с закрепленной тканеинженерной конструкцией. С помощью шприца или иных устройств на и в конструкцию вносится суспензия клеток, закрывается крышка и создается специальное контролируемое микроокружение: тканеинженерная конструкция обильно смачивается распыляемой через форсунки подогреваемой стерильной воздушно-водяной смесью, в состав которой входит культуральная питательная среда. Избыток жидкости удаляется через трубки сброса. Снаружи на емкость устанавливается съемный теплоизолирующий чехол.
Работоспособность предлагаемого устройства подтверждается следующим экспериментальным примером: внутрь емкости биореактора помещается сегмент конечности или часть хвоста с кожной раной. Биоматрица кожного покрова с живыми клетками из питательной среды переносится в биореактор и подшивается к раневой поверхности. Закрывается крышка и через форсунки периодически подается стерильная воздушно-водяная смесь, в состав которой входит культуральная питательная среда. Факелы расположены над матрицей. Тканеинженерная конструкция может длительно строиться в биореакторе такого типа до восстановления желаемой формы и объема тканей.