СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-ПДРФ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И К ГЕНА DGAT1
METHOD OF CARRYING OUT PCR-RFLP FOR GENOTYPING CATTLE ON ALLELES A AND K OF GENE DGAT1

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена DGAT1 (дкацилглицерол O-ацилтрансфераза 1) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.
Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.
/
/
/
/
Так, в способе, предложенном J. Komisarek (2008) [1], используются праймеры F: 5-TGCCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCC-3 и R: 5-ACCTGGAGCTGGGTGAGGAACAGC-3, инициирующие амплификацию локуса DGAT1-гена длиной 378 bp, с последующим его эндонуклеазным расщеплением рестриктазой BglI для генерации и интерпретации образующихся генотип-специфичных фрагментов (генотип AA=254/96/28 bp, генотип KK=282/96 bp и генотип AK=282/254/96/28 bp).
Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену DGAT1 на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.
Нами разработан способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:
а на этапе ПДРФ применяется эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип AA=82/18 bp, генотип KK=100 bp и генотип AK=100/82/18 bp (фиг.1 и 2).
Условия проведения реакции
Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб Б», ЦНИИЭМ, Россия).
ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколу, представленному в табл.1.
Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере ТВЕ (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).
Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.
В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.
Заключение
По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (AA, KK, AK) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-специфичных фрагментов (AA=82/18 bp, KK=100 bp и AK=100/82/18 bp), где ПЦР-ПДРФ-фрагменты с длинами 100 bp и 82 bp являются идентификационными, а минорный ПДРФ-фрагмент длиной 18 bp - неинформативным, из-за его малого размера, что существенно не снижает точность ДНК-анализа.
Источники информации
1. Komisarek, J.A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle / J. Komisarek, A, Michalak // Animal Science Papers and Reports. - 2008. - V.26. - N.2. - P.89-95.
Таблица 1
Протокол ПЦР-ПДРФ для генотипирования кр.рог.ск. по аллелям A и K гена DGAT1
Протокол ПЦР
Реагенты
Исходная кон центрация
Рабочая концентрация
1 проба (мкл)
10 проб (мкл)
dH<sub>2</sub>O
13.4
134
ДМСО
100%
5%
1
10
dNTP
2,5 мМ
0,25 мМ
2
20
Буфер
10×
1×
2
20
Таq ДНК Полимераза
5 ед
1 ед
0,2
2
SEQ ID NO: 1
50 мкМ
0,25 мкМ
0,1
1
SEQ ID NO: 2
50 мкМ
0,25 мкМ
0,1
1
SEQ ID NO: 3
50 мкМ
0,5 мкМ
0,2
2
Проба ДНК
1
ВСЕГО
20
Праймеры:
Режим амплификации
×1:94°C - 4 мин
×40:94°C - 10 сек, 72°C - 10 сек
×1:72°C - 5 мин
ХРАНЕНИЕ +10°C
ПЦР-продукт = 100 bp
Протокол ПДРФ
Реагенты
Исходная концентрация
Рабочая концентрация
1 проба
10 проб
dH<sub>2</sub>O
1,25
12,5
BSA
10 мг/мл
0,1 мг/мл
0,25
2,5
SE-буфер Y
10×
1×
2,5
25
TaqI
20 U
20 U
1
10
ПЦР-проба
20
ВСЕГО
25
Инкубация при 65°C в течение ночи
ПЦР-ПДФР-фрагменты:
Генотип AA=82/18 bp
Генотип KK=100 bp
Генотип AK=100/82/18 bp
Электрофорез в 3% агарозе
Краткое описание графических материалов
Пояснение к фиг.1 - Фланкируемые участки праймеров, используемые для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1 предложенным способом проведения ПЦР-ПДРФ.
Пояснение к фиг.2 - Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.
Обозначения:
M) ДНК-маркеры 100 bp+50 bp (СибЭнзим).
1-4, 6, 8-11, 13, 15, 17-18) генотип АК гена DGAT1 кр.рог.ск.
5, 16) генотип AA гена DGAT1 кр.рог.ск.
7, 12. 14) генотип КК гена DGAT1 кр.рог.ск.