Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и фибробласты — выбор клеточной составляющей для биологических трансплантатов

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и фибробласты — выбор клеточной составляющей для биологических трансплантатов

В.Г. Богдан 1, М.М. Зафранская 2, ЮМ. Гаин 2, Ю.Е. Демидчик 2

1 Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь

2 Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells of and fibroblast's cultures - choice of biological transplants cellular component

V.G. Bogdan 1, M.M. Zafranskaya 2, Y.M. Gain 2, YE. Demidchik 2

1 Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus

2 Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk, Belarus

С целью осуществления выбора клеточной составляющей сложных многокомпонентных биологических трансплантатов для реконструктивно-восстановительной хирургии проведена оценка пролиферативного потенциала, морфологических и фенотипических характеристик, культур клеток мезенхимального происхождения. Установлено, что первичная культура мультипотентных мезенхимных стро-мальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ.) по своему проли-феративному потенциалу превосходит культуры фибробла-стов кожи и апоневроза. Культуры МСК ЖТ, фибробластов кожи, апоневроза и линии постнатальных фибробластов Foreskin характеризовались едиными морфологическими особенностями, обладали высокой жизнеспособностью и устойчивостью к средовым факторам. Первичная культура МСК ЖТ характеризовалась гетерогенной структурой с наличием клеток с гемопоэтическими маркерами CD34, CD31, CD45. Начиная с 1 пассажа, культуры клеток ЖТ приобретали характерный для ММСК клеточный фенотип CD90+/ CD105+/CD44+/CD119+/CD34-/CD45-/CD31-, который сохранялся вплоть до 3 пассажа. Стабильно высокий уровень экспрессии маркера CCR7, не меняющийся при пассировании, возможно является одним из признаков, специфичных для фенотипа ММСК ЖТ. Высокий пролиферативный потенциал ММСК, выраженная миграционная способность, морфологическое и фенотипическое единство с культурами фибробластов, отработанный протокол выделения из жировой ткани свидетельствует о преимуществе использования ММСК ЖТ в качестве клеточной составляющей для создания биологических трансплантатов.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани, фибробласты, пролиферативный потенциал, клеточный фенотип, морфологические особенности, миграционная способность.

The estimation of proliferative potential, morphological and phenotypic characteristics of mesenchymal origin cultures for the purpose of a choice of the difficult multicomponent biological transplants cellular component for reconstructive-regenerative surgery was done. It's determined that the primary culture of adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stromal cells (adMSCs) is superior to skin fibroblasts and aponeurosis cultures in proliferative capacity. adMSCs, skin fibroblasts, the aponeurosis and the postnatal fibroblasts (Foreskin line) cultures are characterized by identical morphological features with the high viability and resistance to environmental factors. Primary cultures of adMSCs are characterized by heterogeneous structure with the presence of cells with hemopoietic CD34, CD31, CD45 markers. Cultures from the 1 till 3 passages assumed cellular phenotype as CD90+/CD105+/CD44+/CD119+/CD34/CD45-/ CD31- characteristic for MSCs. Level of CCR7 expression was high and did not change while passaging that possible could be one of the specific for adMSCs phenotype features. High proliferative potential, expressed migratory ability, morphological and phenotypic similarity with the fibroblasts cultures, the elimination from adipose tissue well-tested protocol indicates the advantages of adMSCs application as a cell-component to build biological transplants.

Key words: adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stromal cells, fibroblasts, proliferative capacity, cell phenotype, morphology, migratory ability.

Прогресс и глубокие исследования в области клеточных и молекулярных технологий в начале XXI в. не только в целом обогатили фундаментальную науку и медицину новыми знаниями и позволили достоверно обосновать понимание существующих закономерностей и ранее предложенных гипотез, но в то же время расширили перечень инновационных и актуальных областей для исследований.

Перспектива применения клеточных технологий в реконструктивно-восстановительной хирургии основывается на возможности получения культур

e-mail: bogdan-5@mail.ru

ауто- или аллогенных клеток с заданными свойствами [1—5]. Наиболее востребованными для этих целей признаются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) [6—8]. В современных условиях среди всех популяций постнатальных стволовых и прогениторных клеток значительное внимание уделено ММСК жировой ткани (ЖТ), к преимуществам использования которой можно отнести простоту и малоинвазивность способа эксплантации их тканевого источника, большой «выход» клеток при выделении [8—12].

Перспективными в настоящее время являются исследования по разработке многокомпонентых тканеинженерных конструкций для хирургического лечения пациентов с обширными дефектам мягких тканей и, в частности, с послеоперационными вентральными грыжами [2, 3, 13—15].

Одним из ключевых вопросов в решении этой задачи с применением тканеинженерных подходов является обоснованный выбор клеточной составляющей биологического трансплантата.

В современных литературных источниках достаточно много внимания уделено изучению морфологии и фенотипа ММСК, в том числе выделенных из ЖТ. Именно эти характеристики и определены Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии как специфичные для ММСК: а) адгезия к культуральному пластику и фи-бробластоподобная морфология; б) специфический иммунофенотип (экспрессия Сй73, Сй90, Сй105 и отсутствие экспрессии Сй34, Сй45, HLA-DR); в) способность дифференцироваться в трех ортодоксальных направлениях — остеогенном, адипогенном и хондрогенном [16].

Вместе с тем, отсутствие уникального маркера для ММСК побуждает к более детальному изучению фенотипа клеточных культур с определением более обширного спектра антигенов [17]. Также в доступной нам литературе отсутствуют систематизированные данные о сравнительных исследованиях пролиферативной активности, морфологических и фенотипических особенностей культур ММСК ЖТ и фибробластов, полученных из различных источников с комплексным анализом возможности применения изучаемых клеток в лечении пациентов с обширными послеоперационными дефектами.

Таким образом, исследование направлено на осуществление выбора клеточной составляющей сложных многокомпонентных биологических трансплантатов для реконструктивно-восстановительной хирургии на основании оценки пролиферативного потенциала, морфологических и фенотипических характеристик культур клеток мезенхимального происхождения.

Материал и методы

Проведение научного исследования было одобрено этическим комитетом УЗ «4-я городская клиническая больница им. Н.Е. Савченко г. Минска», с подписанием пациентами информированного согласия на предоставление биологического материала, а также использование полученной в результате исследований информации для научных отчетов, статей, докладов, диссертационных работ. В исследование были включены 5 пациентов с послеоперационными вентральными грыжами больших размеров в качестве доноров жировой ткани и фрагментов апоневроза и кожи передней брюшной стенки, использованных для выделения ММСК и фибробластов.

Получение биологического материала

Эксплантацию биологического материала у пациента с послеоперационной вентральной грыжей больших размеров выполняли инцизионным способом. Полученные фрагменты подкожной жировой клетчатки в объеме до 5 см3 участок кожи и апоневроза площадью до 2 см2, помещали в герметичный контейнер со стерильным раствором и транспорти-

ровали в течение ближайших 2 ч в лабораторию для выделения и культивирования ММСК ЖТ и фибро-бластов. Все пациенты подписывали информированное согласие.

Выделение и культивирование ММСК ЖТ Для выделения ММСК гомогенизированную ЖТ промывали стерильным раствором Хенкса и инкубировали в течение 45 мин с 0,075% раствором кол-лагеназы I типа (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при 37°С. Нейтрализацию фермента проводили равным объемом ФСБ, содержащего 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, США) (НИИ ЭиМ, РБ). Полученные в результате обработки коллагеназой клетки дважды отмывали центрифугированием, клеточный осадок ресуспендировали в культуральной среде ОМЕМ с пониженным содержанием глюкозы 1000 мг/мл (Sigma, США) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и высевали в концентрации 5*104 кл/см2 в культуральные чашки диаметром 60 мм [12].

Смену среды производили каждые четвертые сутки. По достижении культурами —75% конфлю-энтности монослоя клетки снимали с поверхности культурального пластика с помощью 0,25% раствора трипсина/ЭДТА, затем трипсин ингибировали добавлением ФСБ, содержащего 10% ЭТС; после двукратного отмывания центрифугированием клетки засевали в культуральные чашки в концентрации 1х104 кл/см2.

Выделение и культивирование фибробластов, полученных из различных источников Для выделения фибробластов человека использовали эксплантированные фрагменты кожи и апоневроза передней брюшной стенки (n = 5). Для расслоения кожи по базальной мембране и отделения дермы от эпидермиса кусочки кожи размером 1 см2 инкубировали в 0,25% диспазе (Sigma, США) в течение 24 ч при 4°С. Дерму или фрагмент апоневроза передней брюшной стенки промывали стерильным раствором Хенкса, нарезали на участки размером 0,5 см2 и инкубировали в течение 2 ч с 0,2% раствором коллагеназы I типа (Sigma, США) в ФСБ при 37°С. Нейтрализацию фермента проводили равным объемом ФСБ, содержащего 10% ЭТС. Полученные в результате обработки коллагеназой клетки дважды отмывали цетрифуги-рованием, клеточный осадок ресуспендировали в культуральной среде IMDM (Sigma, США) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и высевали в концентрации 5х104 кл/см2 в культуральные чашки диаметром 60 мм [12]. Смену среды производили каждые четвертые сутки.

Также в исследовании использовалась культура постнатальных фибробластов человека линии Foreskin (Human Foreskin Fibroblasts — HFF) [коллекция АТСС CRL 2429, ИНЦ РАН].

Микроскопия и мониторинг клеточных культур Культуры исследовали на универсальных инвертированных микроскопах Micros (Австрия) и Carl Zeiss Axiovert 200 (Германия) с применением методов светлого поля, бокового освещения, фазового и

Varel-контрастов, эпифлуоресценции (окраска акридиновым оранжевым и Хекстом 33342/пропидий йодидом).

Оценка жизнеспособности клеток Для оценки жизнеспособности культуры ММСК на разных этапах культивирования применялся метод витальной окраски клеток флуоресцентным красителем Хекстом-33342 (Sigma, Германия) в рабочей концентрации 10-5 М.

Иммунофенотипирование клеточных культур

Для изучения экспрессии поверхностных и внутриклеточных маркеров культурами клеток использовали мышиные моноклональные антитела (МАТ) к антигенам CD90-FITC, CD105-PE, CD44-FITC, CD34-APC, CD31-FITC/PE, CD45-PC7, CD119-PE, HLA-DR-PE, HLA-АВС-РЕ (Beckman Coulter, США), CCR7-PE (R&D Systems, Канада). Для внутриклеточного окрашивания клетки предварительно фиксировали и пермеабилизировали с использованием набора IntraPrep™ Permeabilization Reagent (R&D Systems, Канада). ММСК в концентрации 1х105/200 мкл переносили в пробирки для проточной цитометрии, инкубировали с моноклональными антителами в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. После окончания инкубации, клетки осаждали центрифугированием. Измерения проводили с использованием проточного цитометра FC 500 (Beckman Coulter, США).

Статистическая обработка полученных результатов

Статистическая обработка данных осуществлена с применением прикладного программного пакета «STATISTICA 6,0» (StatSoft, USA). Результаты представлены в формате Ме (25-й-75-й проценти-ли). Для сравнения динамики изменения показателя в исследуемых группах использовали критерий Вилкоксона для парных сравнений. При сравнении показателей в независимых группах применяли U-критерий Манна — Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05 [18].

Результаты и обсуждение

Проведен сравнительный анализ пролифератив-ного потенциала первичных культур ММСК ЖТ, фи-бробластов кожи и апоневроза пациентов с послеоперационными вентральными грыжами. Результаты представлены в табл. 1.

Полученные клеточные культуры отличались различной посевной концентрацией, скоростью роста, количеством клеток в первичной культуре.

Достоверное увеличение количества клеток первичной культуры более, чем в 2 раза выявлено только для ММСК ЖТ (с 1х10в (0,6х10в-1,4х10в) до 2,1 х10в (2х106-2,2х106, соответственно).

Для стандартизации полученных результатов производился пересчет увеличения клеточности культур из расчета на 1 х106 посеянных клеток. Показано, что МСК ЖТ характеризовались наибольшей скоростью пролиферации с количеством клеток в первичной культуре 2,1 х106 (2х106-2,2х106) после 2-недельно-го культивирования, в то время как фибробласты кожи отличались наименьшим показателем (р < 0,05).

Таким образом, при аналогичных сроках культивирования использование жировой ткани позволяет получить наибольший объем клеточного материала по сравнению с кожей и апоневрозом.

Сравнение на светооптическом уровне морфологической картины первичных культур клеток, выделенных из различных источников, не выявило существенных отличий. Культуры ММСК ЖТ, фибро-бластов кожи и апоневроза характеризовались сходным гомогенным клеточным составом, включающим веретеновидные, фибробластоподобные клетки с четко выраженным ядром, ядрышками и цитоплаз-матической перинуклеарной зернистостью (рис. 1).

Дальнейшее культивирование ММСК ЖТ позволило установить ряд особенностей. Благодаря высокому пролиферативному потенциалу, в течение 3—5 сут. культивирования образовывалось большое количество варьирующих по размеру колоний клеток с многочисленными межклеточными контактами (рис. 2А). К 14—20 сут. культивирования равномерный конфлюэнтный монослой «вихреобразно» растущих клеток покрывал 85-95% культурального пластика (рис. 2Б).

Таблица 1. Длительность культивирования и количество клеток первичной культуры ММСК ЖТ, фибробластов кожи и апоневроза при посеве и после снятия с пластика

Вид первичной культуры Количество клеток при посеве Сроки культивирования, сутки Количество клеток после снятия с пластика Количество клеток после снятия с пластика

ММСК ЖТ 1х106 (0,6х106-1,4х106) 15 (7-19) 2,1 х 106 (2х106-2,2х106)* 2,1 х 106 (2х106-2,2х106)**

Фибробласты кожи 1,3х106

Фибробласты апоневроза 1,7х106 (1,3х106-2х106) 20 (18-22) 2х106 (0,9х106-2,1х106) 1,2 х 106 (0,7х106-1,4х106) ***

Примечание: * — различия статистически значимы (р<0,05) при сравнении с количеством клеток при посеве; ** — различия статистически значимы (р<0,05) при сравнении с культурой фибробластов кожи и апоневроза; *** — различия статистически значимы (р<0,05) при сравнении с культурой фибробластов кожи.

С целью изучения возможных изменений морфологии клеток конфлюэнтные культуры ММСК ЖТ подвергались дальнейшему пассированию. В ходе мониторинга экспансии культур при пассировании был отмечен неравномерный рост клеток с образованием в субконфлюэнтной культуре зон гиперкон-

флюэнтности и участков с хаотично расположенными распластанными клетками (рис. 2В). Контактное торможение пролиферации в конфлюэнтных участках и низкий пролиферативный потенциал распластанных клеток приводили к увеличению сроков экспансии культуры (рис. 2 Г, Д).

Рис. 1.

Первичные клеточные культуры:

А - ММСК ЖТ, 6 сут. культивирования;

Б - ММСК ЖТ, 10 сут. культивирования;

В - фибробласты кожи, 14 сут. культивирования;

Г - фибробласты апоневроза передней брюшной стенки,

14 сут. культивирования.

Ув.: х100

На заключительных этапах культивирования проводилась оценка жизнеспособности культур с помощью методов витальной окраски клеток Хекстом 33342 (рис. 3). Жизнеспособность клеток составляла 96-98%.

В качестве положительного контроля использовалась культура постнатальных фибробластов человека 2 пассажа линии Foreskin (коллекция АТСС CRL 2429, ИНЦ РАН). Клетки характеризовались фибробластоподобной морфологией, с более мелкой и значительно выраженной цитоплазматической зернистостью по сравнению с ММСК (рис. 4).

Исследование культур фибробластов, выделенных из различных источников, не выявило существенных отличий их фенотипа от клеточного фенотипа ММСК ЖТ (табл. 2). Вместе с тем, проведенная оценка экспрессии поверхностных маркеров ММСК первичными культурами адгезивных клеток, выделенных из ЖТ, кожи, апоневроза передней брюшной стенки, а также фибробластов линии Foreskin, позволила выявить отдельные фенотипические особенности культуры ММСК ЖТ.

Нами подтверждена гетерогенная структура первичной культуры ММСК ЖТ с наличием клеток, экспрессирующих гемопоэтические маркеры CD34, CD31, CD45, с достоверным увеличением CD34 относительно других клеточных линий. Также, культуры ММСК ЖТ, в отличие от дифференцированных фибробластов, экспрессировали хемокиновый рецептор ^R7 (р < 0,05), характеризующий миграционную способность клеток.

Рис. 3. ММСК ЖТ,

2-й пассаж, 10 сут. культивирования. Витальная окраска Хекстом 33342. Ув.: х100

Рис. 4. Культура фибробластов человека линии Foreskin АТСС CRL 2429, 2-й пассаж, 10 сут. культивирования. Ув.: А х100; Б х400

Таблица 2. Иммунофенотипическая характеристика клеток

Поверхностные маркеры клеток МСК ЖТ, первичная культура, Me

CD90 95,4

CD105 97,7

CD44 93,6

CD34 19,4

CD31 3,3

CD45 2,0

CD119 94,2

CCR7 92,9

HLA-ABC 99,6

HLA-DR 0,8

Примечание: * — различия статистически значимы (р < 0,05) при сравнении с культурами фибробластов.

В таблице 3 представлены основные фенотипи-ческие маркеры первичных культур и культур 1—3 пассажей ММСК ЖТ человека. Показано, что в первичных культурах адгезивных клеток, выделенных из ЖТ, наряду с экспрессией типичных для культур мезенхимального происхождения маркеров (CD90, CD105, CD44), часть клеток имели на своей поверхности маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток CD34, CD31, CD45, экспрессия которых достоверно снижалась по мере пассирования, с сохранением стабильно высокого уровня ССR7. Таким образом, начиная с 1 пассажа, культуры клеток ЖТ приобретали характерный для ММСК клеточный фе-

Выводы

1. В первичной культуре ММСК ЖТ выявлена достоверная положительная динамика роста численности клеток и наибольшее их количество (из расчета на 1 х106 посеянных клеток), по сравнению с первичными культурами фибробластов кожи и апоневроза.

2. Культуры ММСК ЖТ, фибробластов кожи, апоневроза и линии постнатальных фибробластов Foreskin характеризуются едиными морфологическими особенностями, обладают высокой жизнеспособностью и устойчивостью к средовым факторам.

3. Подтверждена гетерогенность популяции первичной культуры стромальных клеток ЖТ с наличием клеток, экспрессирующих CD34, CD31, CD45, с достоверным преобладанием по маркеру CD34 относительно других клеточных линий.

4. Начиная с 1 пассажа культуры клеток ЖТ «очищались», приобретали характерный для ММСК клеточный фенотип CD90+/CD105+/CD44+/CD119+/

ЛИТЕРАТУРА:

1. Егиев В.Н. Современное состояние и перспективы герниоло-гии. Герниология 2006; 2(10): 5-10.

2. Егиев В.Н., Сологуб В.К., Чижов Д.В. и др. Сравнительная оценка степени фиксации фибробластов на синтетических эндопро-тезах, используемых для пластики дефектов передней брюшной стенки. Герниология 2006; 2(10): 37-41.

нотип CD90+/CD105+/CD44+/CD119+/CD34-/CD45-/ CD31-. Данные фенотипические особенности сохранялись вплоть до 3 пассажа.

Было установлено, что количество фибробластов, позитивных по ССR7 рецептору, в среднем, составило 9,5%, тогда как в случае ММСК уровень экспрессии хемокинового рецептора достигал 89,4% % (р < 0,05) (табл. 2-3).

В целом, высокий уровень ССR7 можно трактовать как выраженную миграционную способность ММСК ЖТ, по сравнению со зрелыми клетками фи-бропластического дифферона.

CD34-CD45-CD31-, который сохранялся вплоть до 3-го пассажа клеточных культур.

5. Высокий уровень экспрессии ССR7 в культурах ММСК ЖТ, по сравнению со зрелыми клетками фи-бропластического дифферона, возможно, является одним из специфических признаков, который может быть использован как дополнительный маркер ММСК ЖТ.

6. Описанный высокий пролиферативный потенциал ММСК, выраженная миграционная способность, морфологическое и фенотипическое единство с культурами фибробластов и универсальная методика выделения из жировой ткани свидетельствует о преимуществе использования ММСК ЖТ в качестве клеточной составляющей для создания сложных многокомпонентных биологических трансплантатов для реконструктивно-восстановительной хирургии.

3. Гостевской А.А., Седов В.М., Хамид А.Х. и др. Сравнительный анализ полипропиленового и биологического сетчатых имплантатов в эксперименте. Медицинский академический журнал 2007; 7(3): 135-6.

4. Карпюк В.Б., Перова М.Д., Козлов В.А. и др. Экспериментальная модель реконструкции кости путем остеогенной трансформации аутотрансплантированных свежевыделенных стромальных

Таблица 3. Экспрессия антигенных маркеров ММСК ЖТ различных пассажей

Поверхностные маркеры клеток МСК ЖТ, первичная культура, Me

CD90 95,4

CD105 97,7

CD44 93,6

CD34 19,6

CD31 3,3

CD45 2,0

CD119 94,2

CCR7 92,9

HLA-ABC 99,6

HLA-DR 0,8

клеток жировои ткани. Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии 2007; 4: 14-8.

5. Skala С.Е., Petry I.B., Gebhard S. et al. Isolation of fibroblasts for coating of meshes for reconstructive surgery: differences between mesh types. Regen. Med. 2009; 4(2): 197-204.

6. Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. J. Nippon. Med. Sch. 2009; 76(2): 56-66.

7. Locke М., Windsor J., Dunbar P.R. et al. Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery. ANZ J. Surg. 2009; 79(4): 235-44.

8. Кирик В.М., Бутенко Г.М. Стволовые клетки из жировой ткани: основные характеристики и перспективы клинического применения в регенеративной медицине. Журнал АМН УкраЫи 2010; 16(4): 576-604.

9. Fraser J., Wulur I., Alfonso Z. et al. Differences in stem and progenitor cell yield in different subcutaneous adipose tissue depots. Cytotherapy 2007; 9(5): 459-67.

10. Zhu Y., Liu T., Song K. et al. Adipose-derived stem cell: A better stem cell than BMSC. Cell Biochem. Funct. 2008; 26(6): 664-75.

11. Сергеева Н.С., Свиридова И.К., Кирсанова В.А. и др. Культивирование и характеристика негемопоэтических постнаталь-ных стволовых клеток из жировой ткани человека. Молекулярная медицина 2006; 2: 23-9.

12. Zuk Р.А., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering 2001; 7(2): 211-28.

13. Мальцева Н.В., Панченко В.А., Прокопьева Е.Г. и др. Биоматрица на основе полипропиленовой сетки и эмбриональных фибробластов. Клеточные технологии в биологии и медицине 2008; 3: 128-31.

14. Langer C., Schwartz P., Krause P. et al. In-vitro study of the cellular response of human fibroblasts cultured on alloplastic hernia meshes. Influence of mesh material and structure. Chirurg. 2005; 76(9): 876-85.

15. Богдан В.Г., Зафранская М.М., Гаин Ю.М. и др. Сравнительная характеристика композиционных биоматриц с трехмерным желатиновым матриксом и мезенхимальными стволовыми клетками жировой ткани. Доклады Национальной академии наук Беларуси 2010; 54(3): 105-09.

16. Dominici М., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315-17.

17. Егорова В. А., Пономарёва А. С., Богданова Н. Б. и др. Характеристика фенотипа мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека методом проточной цитометрии. Технологии живых систем 2009; 5: 40-6.

18. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М. 2002.

Поступила 27.04.2012

( 'НСГТЧ» J.IH lipuni.iril 114 жгтриирриир'и.II.HUP«I WjUXll

l-lhrnlH^t'lllA) Ш1

' hi'iAiiiifMii(tj'м.имП I ирг.и-1 ГЧ71 чЦйНгчгш I. (кщ|«||||чЬ ил .......М1ЬЦ|фСреИ грДнушя!» ПС^ИЯРТ», ИрЫНЯЧ'КЛИИ*

rarufci »ивы* ^йсяяюин дав!»'* (" «!• •*ia."m«ifciioii)i

J..I.I ри+ий-КИИМИ itflflll JI ли tailLl Л (1 Jn

miUU ttifflU JJIilbJW» (Ъ1ИГ|Ч1||[1Чг.г11.1»

#fc4tiilef tiheinMWWintiL и-щ'нчцуш  11 -мфери.мшы* кнл||ки|

4HOJI41L

l AqiHiMufiiTCEilM N

KTK1IQJV Пклстт|ии niw^w

JfWI41in4K РШИ1 рцпш WlUHllTIItl

лжропфн jUfwiiiiM. пицчян

InL iL'JIIh KfMLi

Г Гп L IL1111 h Kp«U

1кпВгн||чгч нрша If ШКИЦIЬ til НЩМПС 9 munfumiM iwrfui fucWWiJS 1*Гф1»ци

: pmvffllf piuu fcjLIVLIIILul h^ni.hnl

Г ICdUkVKIHIf piKU *W|Ur*VMklH

3 UCyiUCLTh XkMIC ИНГТр^И I HILT} Л ПСИН! илпшрп|т>

D Чч м I p»1 iv wh^vr MtvpviiKniiH Kf rl nainifin}

kmHHWllAl iriuniHIIHH ПЛрЯНГТр'К ll^JmiiXi H n TC4CIBW lipMK.^Pkk lipei llf14>\l-ll^lT4-ni liri^l^ril^CfhJKl flTnePipnflKJ

11(114-1 111 в ..................ил:

¡i ami« T 11 Lim L HI Ufi 11С . LU ГЧI

FH'llL'lllhKlulB Jl'MlllkllJ H ¡WJXilIMK Щ|<|Ч1Ш1|М ШЬ ШНМ-ГГ hi IKV Гк Mill lIlILM

Iif-N И1ЮШГ

Ll.lh>TKp,lTlf.l  KIICir^llKIDII ; I:LI Hint iJi-MariiLiiHH i |4ili=,^iiM

1ЫСПА 11 (dUnXhoi It* WHIMt I.VHHEI»I* ' ¡ЧЦ .Г.ГЧЧИ""1 ИЛГН-Щ nin-.тг ынршпии lipi^K-TillM

II.......I*  rtnj .Ц.ИЧ1. II I Liril l|4-,l ||lllt,-"n 1- 1Г. ~ 1 IIP-^UJUJII .................

^HlDtn

tjio&oFe.

ГНГКЧИ Ml 4i(r-ir.». nntimkii ища - SiiiM-iKlnSilt»! lir.r.n.|Fj|»>

n t>-« (i"p4iii«ji ataihim, —Уж iMUKinv'nmMiiu in-: к- iprl гйн^ониушпгскис cmx^injc клеи» in ii >'¡->1111 -1110:1 rcpiiqcpir-ktcihl 44.1л, цйпшцшч ' Т»кгц ш^тл-цлпь mi iH4loi> пиияс «[HiriijikiKNm '. \ 1.^:1.1ЫНН ПШПСРВ -L [1 ijuniWH 4*1ич1г1пссецй ^HIWIHII HVPN К ill сг щчпшфпн с miliikkm ypehif ч хм шкипсЫкюти ihk.u Lipmni>jiu

П ......... К№Ш> ЧШШКЮ* (MSMWie MC№.

№ШК111|^ЦН1 LIMMBBJ* tPCWK II II» Ol ~>lhjl>KJ h

I Ipimiira лдЛлив Sfjus осилил иj cenapaiiHN i^Lnrih^ni^uniiL-M.

IPJJW-HMMDfMJuuriVPF t.lMln-ll.-llllJ L|klH|| u. L'I4'| r^'l l'TT |l|L L' 41 IP KlimiTlW ll

...................... .................. .. n'lyrj.

( ML IL'M.I ll}IL_U« l"l I . Ill III lip№jvMI№JMkl I L-.IKnM L'hl jkUhlf МЫ Ilk h±l4FlhL>n lC14nilHl|KP^nCiVIIIIIHli W.UllinHC). I.IL 1кЧЧЛМ.1|1Ч|1 IBJtVITMPC eiipCjlDinilfW» М|М1ТОМСМГп>й K[WflH

П ( hV»"4k>n L|h-u |l bd (i ипшццЩк пдкн^ЧЩЩ . Hlpu I.||| И.^И^П klbU) I n^lwlMfcli nil ilia

:i LMinHKIITU h|4>All lhHmPjIj-'.'ClH I L ll^llpil .'Nil1 ЧМЫ11М H I ihlOhlJ -.4 [Tim tt lllliiril iM llllli HHHUp " f4iMUHn-, |in.i ip IIILII Ul J.MM. i 1

IKCK IttHkllJH IIIMIElrihHIHJLlKMl 11ННи*^МНиНМк#т 4k JIIUIkKIM ItkH^kW HI-"1||Д|^РЩИ111.|. 0 Гч •7ИЧ))Н')М:Хи: '-IJWffT < I ч bull

. .............Mill  ini.rM, III .plh t Mill ГМ. щ J ».-nib k>

9 J

ini<i4jTH нирлпл-ттш» пктгч » л.г* чрнпшя fiнп. »ппмч к ктпк к пп&тнуч imrc -HIn Irrhivf 4-1 hmmiUL-nndk СШ Л>. CiK'inii РЛ«Л1!ГЫ1Й lid обрйщии fitauw* м-ь.так

D Ня1П1 ClflinMKIIr (ЯК|Ч11Л1Я11Г011П 1^КН1ГСС]<

• Ни IKIIr* pfi.il L Ж1инли ЛМ11Э 1Ш 41Д1Ш oiifUJtlJ «ь! HpCUl 5.|HIILIIBI Ш II^OI |MUU4llH ыиурцшишш i

Fli.u.Iiuif Ш1.1 АвКПвПГЯфи«11МНЯ ПрчЧ1№ СОА^ЫаЛа fu*Vl4 -ИИ^'": • D CllfeUnCmir laipdS 41i o6o^3t*airnr

• Nc ipMjnn блаишкп uiw4i.i:iu -ihhHipa» ,ш «jpaiuiHt Г l- г , i.oaJii систем* UiaAfvhne ишаку ^^^^

Hn ill'ulC X K-ip^KHX nqwi! wwr^HHtg^ltfil dRMP1 P &TKnlBiIHK1t II ШЦНТЙ

< [1к1^чиритя1 сжгггМ! Ci-ii^j ii i: r mrvuiViinc i н»п ni firicpaiopji l. * \

• 11с11*1И111 fieaKpeCahiioju iumjbiii raoitw.i*ei ¡рапйлгпггь'шисчь ^ ийракч p сяуч« aiL№KHiu иясп*и?егм

- Ндачярц 24-Х » II AV1>1fc*l НШНГ И rtf* | J [

MlHiTilCifl..... jfitHlili *iLTW.4fnnrl4 J

Ibfiaib для лрступв 1

ID низк'р дня onupmupi, qunuJiJiJlci h Гшк данных

lliririixipnuiinuH1 iipmpiiiMBijji Ц1л«фажмя1«ель

- Мипиыи inp>c i icwiK|m>piuje иак^ипл

- OliVKIiy« »! W! p^'UHKii IffJlfrHilia чКЦмвШ !l I iipi.«J4lM4Hl!iK> » JUWf itli «.pjlicirni

Крнен^шеймпр Hi 15 Mil I

• IlucranHufl inxsecqnMcviLHlt p^iuefi чН'цм нил •

- ELx^ipiHH lipsiK« l>k*iipt>4«ili vJi UJQili j

- EU,i ikiiK+.iiiX'i ii in|||ViKjlHili4i HI 4J4liieilHt «I HttWWHIl CiHEUTfCH крстпкч йшнйнн. cnnum-sii с чслипексвич фшйс^нм

Гнстг-Ml VnpiLinrilB d6|1IUI№H

- Ilaii4l4 t-h.il! lie* III llhiK-ttKbl исн.1к1ча£1 CHIIIhTilfH . 111 > г IIl-JW-'h: ii i c" > 111-   ihijlilllri

- Ol4ff tw Wjr [ 1 L ri'piLI 'Г^Н lILI

][ццапцнгшши

Графт: Liiihipj ЖИЛ Jill 11

I'лLЛ!> I iIU Hti I L'pjlJL IfcJ Ml кЛ I hi II ПМрАНЩШШ IT I Вй'ИШЫ! к'ЛПМ' *<'||||С'нГшкн i| j rp-41111

км-ч ii.ifhT i.i CrlKilrti l.in ь^.гкпгпврмивш ilitih' h uiqiuii.n свггсчи D C"fK.ra HI'C.I Ы fc.y.lUniuri|HiHjtillfei li-AiiliiPlilMu'iKIti iu.ll'llik

NK-kinm. r-KWfut

[] CcBGro DC xu iL^iuBiiipciuiijiii агнлри шыл. Ж-ТЛОИ 1ичъ-мп1|р|пп,111ие'cpr.LM CrIIGra:

П M i. Si i П-ЛЬТНН1фЛ 11111114 fCuilinrtlTil'iCLiLM ч ПрОСЯ11iTl'pIfu%

Тнкдам

3 IK" xu J^ibiiiiHiwHfliu .mjfiutiru ч

kyu.npi ll.llUk- ЖИ11КВ ^ BrLlfp

[С..1С1Ш1и in 11:P Tcllfin I

OIH.feu liUIMBBU

JL1H inicilli-wfiiK flpfwfwnppHwi feWteh, NKHc irti?»

T>EW:IIJK н JKnupHiBUii KTICIHT

« W ^V.tllU'SlL'HHu'L'lls. TLJ