ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus. musculus L - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К О-АНТИГЕНУ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 СЕРОГРУППЫ
CULTIVATED HYBRID CELL STRAIN OF Mus musculus L ANIMALS - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO O-ANTIGENE OF CHOLERA VIBRIO SEROGROUP O1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной биотехнологии, и может быть применено в здравоохранении при создании диагностических тест-систем на основе моноклональных антител для ускоренной идентификации холерных вибрионов О1 серогруппы сероваров Огава и Инаба.
В настоящее время актуальна проблема создания диагностических препаратов для серологических и иммунологических методов идентификации возбудителя холеры с использованием высокоспецифичных моноклональных антител (МКА), продуцируемых гибридомами, для повышения чувствительности и специфичности лабораторных анализов.
Известен способ иммуноферментного анализа (см. А.В.Соколенко, Л.П.Алексеева и др., «Изучение взаимодействия некультивируемых форм холерных вибрионов с моноклональными антителами к липополисахариду О1 и О139 серогрупп», журнал «Биотехнология», 2004 г., №3, стр.87-92), заключающийся в том, что используют панель моноклональных антител, полученных к О-антигену холерных вибрионов О1 серогруппы, а затем оценивают сохранность эпитопов липополисахарида (ЛПС) у холерных вибрионов О1 в процессе перехода их в некультивируемое состояние. С помощью набора МКА были выявлены различные эпитопы ЛПС, и в том числе эпитопы, которые часто встречаются у холерных вибрионов О1 в некультивируемом состоянии.
Однако известный способ получения МКА был использован для обнаружения некультивируемых форм вибрионов в микрокосмах разного состава, при этом МКА не рассматривались в качестве диагностических реагентов для создания препаратов нового поколения, которые могли быть использованы для анализа широкого набора штаммов типичных холерных вибрионов О1 серогруппы.
За прототип выбрали способ получения гибридом-продуцентов моноклональных антител к V. cholerae О1 (см. Е.А.Михеева, Н.Е.Терешкина и др., «Особенности получения гибридом-продуцентов моноклональных антител к «Vibrio cholerae О1», Материалы проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы», г.Ростов-на-Дону, 2009 г., стр.70-71), путем иммунизации мышей обеззараженных мертиолятом Na цельными клетками V. cholerae 569B (биовар классический, серотип Инаба), а затем после слияния иммунных спленоцитов и миеломы получают три вида гибридом, продуцирующие МКА, направленные к эпитопам поверхностных структур бактериальной клетки V. cholerae 569 В, МКА к О-антигену, МКА к поверхностным структурам и О-антигену.
Недостатком способа является то, что МКА этих гибридом были тестированы только с клетками штамма 569 В и с препаратом О-антигена, не приведены данные о взаимодействии с холерными вибрионами серовара Огава и с культурами близкородственных микроорганизмов, поэтому неизвестно, являются ли гибридомы видоспецифичными или серовароспецифичными.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является изыскание штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus, продуцирующего диагностически значимые моноклональные антитела к эпитопам видоспецифического антигена холерных вибрионов О1 серогруппы.
Указанный технический результат достигается получением штамма культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцента моноклональных антител, специфичных к О-антигену холерных вибрионов О1 серогруппы, депонированной под номером РККК (П) 386Д в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии (г.Санкт-Петербург).
Способ получения штамма включает несколько этапов:
8
9
4
I - получение иммунных спленоцитов. Для этого белых мышей иммунизируют внутрибрюшинно трехкратно с интервалом 10 дней бактериальной взвесью холерных вибрионов О1 серогруппы, прогретой 15 мин при температуре 100°С в дозе 10-10 м.кл. Бустерную инъекцию антигена проводят за 4 дня до гибридизации. В стерильных условиях извлекают селезенку и измельчают ее с помощью гомогенизатора. Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли, а эритроциты разрушают 0,83%-ным раствором NHCl, забуференным трис-буфером (рН 7,4). Лимфоциты дважды отмывают средой Игла-МЕМ.
II - проведение гибридизации. Для этого клетки мышиной миеломы Р3-Х63/Ag 8.653 сливают с клетками селезенки иммунных мышей с помощью 50% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 Д (Serva). Для этого дважды отмытые клетки миеломы и лимфоциты соединяют в соотношении 5:1 (клетки селезенки: миеломные клетки). Смесь клеток отмывают один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к сухому осадку добавляют 1 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля по каплям в течение 1 мин. После этого в центрифужную пробирку вносят медленно бессывороточную среду Игла-МЕМ. Взвесь клеток центрифугируют при температуре 37°С 10 мин, после этого супернатант декантируют и смесь клеток осторожно ресуспендируют в 40 мл ростовой среды (среда RPMI 1640 или ДМЕМ с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ/мл глютамина, 4 г/л глюкозы, 0,1 М пирувата натрия), содержащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/мл тимидина).
III - культивирование гибридом. Суспензию слившихся клеток в ГАТ-среде разливают по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных планшета на фидерный слой предварительно высеянных (за сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 10000 на лунку. Видимые колонии гибридных клеток мышей появляются на 7-10 день. Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ. После чего переводят на ростовую среду без селективных компонентов.
IV - скрининг гибридом. Культуральные жидкости гибридом аккуратно отбирают для тестирования в ИФА.
V - клонирование. Гибридому дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из перитонеальных макрофагов белых мышей. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МКА заданной специфичности.
Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии (г.Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 386 Д.
Заявляемый штамм гибридом обладает следующими характеристиками:
Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы. Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина. В значительной части клеток цитоплазма имеет выросты.
Культуральные признаки типичны для перевиваемых клеток мышиных плазмоцитом. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии при 37°С в пластиковой или стеклянной посуде при посевной дозе 100-150 тыс./мл в течение 3-4 дней до плотности насыщения 800-900 тыс.кл./мл клетки пассируют один раз в 3-4 дня той же дозой. Коэффициент рассева 1:4-1:5. Культивирование ведут на питательной среде RPMI 1640 или ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 8-10 мМ буфера HEPES, 50 мкг/мл гентамицина.
Культивирование штамма в организме экспериментальных животных. Индукцию асцитных опухолей у белых мышей, внутрибрюшинно праймированных пристанем в дозе 0.5 мл/мышь за 14 дней до введения гибридомы, осуществляют путем инокулирования 3-10 млн гибридных клеток на одно животное. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 12-14 дней в объеме 2-6 мл. Культуру клеток поддерживали в течение двух пассажей асцитной опухоли на мышах (срок наблюдения).
Кариологические признаки. Модальное число хромосом 87, С-маркеры родительской миеломной линии Р3-Х63/Ag 8.653.
Биотехнологическая характеристика полезного продукта. МонАТ относятся к изотипу IgG. Они выявляют О-антиген холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, не давая перекрестной активности с вибрионами не О1 группы, О139 серогруппы и представителями родов Plesiomonas, Aeromonas, штаммами Vibrio parahaemolyticus, Comamonas. Антитела тестируют в реакциях слайд-агглютинации, непрямой иммунофлуорисценции, иммуноферментном методе, развернутой агглютинации, реакции преципитации. Класс иммуноглобулинов определяют в реакции преципитации по Оухтерлони. Методом иммуноблота установили, что МонАТ гибридомы F8G12 направлены к видоспецифическим эпитопам полисахаридной части О-антигена с Mr 20-25 кДа, общим для серовара Огава и Инаба Титр монАТ в культуральной жидкости составляет 1:2000 (ИФА), 1:64 (НИФ), в асцитической - 1:100000 (ИФА), 1:6000 (НИФ).
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются. Заражение микоплазмой не выявлено.
Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 50% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% глицерина или 10% диметилсульфоксида. Замораживание проводят в программном замораживателе со снижением температуры на 1°С (до -40°С). Далее на 10°С (до -100°С). Затем клетки помещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составляет 78-92%.
Исследование специфичности монАТ. Для определения специфичности монАТ, продуцируемых гибридомой, используют набор штаммов холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба и представителей родов Plesiomonas, Aeromonas, штаммы Vibrio parahaemolyticus, Comamonas. В качестве антигенных препаратов в исследуемых серологических реакциях используют живые и убитые кипячением бактериальные клетки холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба и близкородственных микроорганизмов.
При исследовании специфичности монАТ в реакции непрямой иммунофлуоресценции и иммуноферментном анализе установлено активное взаимодействие иммуноглобулинов с детерминантами О-антигена штаммов сероваров Огава и Инаба. В реакции агглютинации на стекле со штаммами холерных вибрионов О1 серогруппы образуются хлопья агглютината с просветлением. В реакции преципитации антитела гибридомы образуют в агаре одну четкую линию преципитации с клетками холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба и не взаимодействуют с близкородственными микроорганизмами. При постановке реакции развернутой агглютинации монАТ, продуцируемые гибридомой, обладают способностью агглютинировать клетки холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба в титрах до 1:8000.
Пример 1. Использование штамма РККК (П) 386 Д.
6
6
6
Для получения моноклональных антител, продуцируемых гибридомой МКА-О1, штамм РККК (П) 386 Д выращивают in vitro до конечной концентрации 1·10-1,5·10 кл. в 1 мл среды. Клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин и вводят внутрибрюшинно мышам линии Balb/c, предварительно обработанных пристаном, по (5-10)·10 клеток в объеме 1,5-2 мл. После формирования асцитной опухоли осуществляют забор иммуноасцитической жидкости. Клетки осаждают из ИАЖ центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин и используют для последующего пассажа in vitro и in vivo.
Супернатант, содержащий МКА, используют в ИФА, слайд-агглютинации, непрямой иммунофлуоресценции для идентификации штаммов Vibrio cholerae О1 серогруппы, либо применяют в качестве полуфабриката для выделения моноклональных антител путем двукратного осаждения сульфатом аммония 50% насыщения, более пригодных для длительного хранения при температуре минус 20°С, не теряя специфичной активности в течение 2 лет (срок наблюдения), которые могут использоваться при разработке иммуноглобулиновых препаратов и тест-систем для лабораторной диагностики холеры.
Пример 2. Использование продукта штамма.
Для изучения специфичности моноклональных антител, продуцируемых гибридомой РККК (П) 386 Д, были исследованы в реакции агглютинации на стекле культуры холерных вибрионов О1 серогруппы, а также культуры близкородственных микроорганизмов (см. таблицу). При постановке реакции на стекло наносят каплю препарата МКА-О1 в рабочем разведении и каплю 0,9% раствора хлорида натрия, а затем к ним добавляют исследуемую культуру, тщательно растирая петлей или стеклянной палочкой, покачивая при этом стекло. Положительная реакция характеризуется образованием четкого крупно- или мелкозернистого агглютината в течение 30 секунд, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце холерных вибрионов О1 серогруппы. В контроле с 0,9%-ным раствором хлорида натрия микробная взвесь оставалась гомогенной. Отсутствие видимых агглютинатов расценивается как отрицательная реакция.
Таким образом, из результатов, представленных в таблице, видно, что из 62 штаммов холерных вибрионов eltor серовара Огава все агглютинировались МКА-О1, а из 35 штаммов Инаба только один штамм не агглютинировался МКА-О1. Все исследуемые штаммы классического биовара агглютинировались МКА-О1. Из этого следует, что специфичность исследуемой реакции с холерными вибрионами О1 серогруппы, представленными в таблице, составляет 99%. Отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами, представленными в таблице, также является показателем высокой специфичности МКА гибридомы РККК (П) 386 Д.
Пример 3. Подтверждение специфичности МКА-О1 при постановке непрямого варианта метода люминесцирующих антител (НИФМ).
Для проведения реакции на фиксированный мазок исследуемой культуры наносят каплю препарата МКА-О1 в рабочем разведении, инкубируют во влажной камере при 37°С 30 мин. Мазок промывают, наносят антимышиные иммуноглобулины, меченные ФИТЦ, инкубируют во влажной камере при 37°С 30 мин. Затем стекло промывают, высушивают и исследуют мазок под микроскопом в режиме люминесценции. Характерное свечение на +++ и ++++ свидетельствует о наличии холерных вибрионов О1 серогруппы. Отсутствие специфического свечения или тусклое свечение меньше чем на +++ расценивают как отрицательную реакцию. Из результатов таблицы следует, что специфичность МКА-О1 в реакции непрямой иммунофлуоресценции составляет 97%.
Таким образом, обобщая результаты проведенных исследований (см. таблицу), можно сделать вывод, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой, направлены к такому эпитопу в структуре О-антигена, который широко представлен как у холерных вибрионов серовара Огава, так и у штаммов серовара Инаба. Это нашло подтверждение в отношении исследованных штаммов V. cholerae О1 в реакциях слайд-агглютинации и непрямой иммунофлуоресценции, которые при этом относятся к ускоренным методам тестирования.
Кроме того, при изучении штаммов близкородственных микроорганизмов, а именно 7-ми RO-штаммов, 100 штаммов холерных вибрионов не О1 и не О139 серогрупп показали отрицательную реакцию, что в совокупности подтверждает высокую специфичность МКА заявленной гибридомы. Высокая специфическая активность объясняется наличием в структуре О-антигена многократно повторяющегося эпитопа, узнаваемого МКА гибридомы, что обусловливает способность холерных вибрионов О1 преципитировать, агглютинировать.
Штамм РККК (П) 386Д продуцирует моноклональные иммуноглобулины класса G специфичные к О-антигену холерных вибрионов О1 серогруппы, позволяя идентифицировать штаммы Vibrio cholerae О1 серовара Огава и Инаба.
Кроме того, МКА-О1 могут быть применены в здравоохранении в виде иммунохроматографических тест-систем (полос), которые могут эффективно использоваться в регламентированной схеме лабораторного анализа на холеру на этапе отбора подозрительных колоний и получения чистых культур для установления их принадлежности к Vibrio cholerae О1.
Таблица
№ п/п
Штаммы
Количество исследуемых штаммов
Количество штаммов, агглютинирующихся МКА-О1
Количество штаммов положительных в НПИФ с МКА О1
1
V.cholerae eltor Ogawa
62
62
61
2
V.cholerae eltor Inaba
35
34
33
3
V.cholerae cholerae Ogawa
7
7
7
4
V.cholerae cholerae Inaba
3
3
3
5
V.cholerae О139
17
6
V.cholerae RO
7
7
V.cholerae не О1/не О139 (2002-2008 г.)
100
Результаты в реакции агглютинации отрицательные
Результаты в НПИФ отрицательные
8
Plesiomonas
7
9
Aeromonas
108
10
Comamonas
30
11
Vibrio parahaemolyticus
12
12
E. coli
2
13
Brucella sp.
4
14
Salmonella sp.
4