Опыт использования технологии CRISPR-Cas9 для нокаута генов, кодирующих внутриклеточные белки с низкой экспрессией (на примере nod1 и nod2)

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

МЕТОДЫ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 612.014.1.083

Дагиль Ю.А., Пащенков М.В.

ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТЕХНОЛОГИИ CRISPR-CAS9 ДЛЯ НОКАУТА ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ С НИЗКОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва

Технология CRISPR-Cas9 позволяет в сжатые сроки нокаутировать гены в клетках эукариот. Одной из основных проблем при использовании CRISPR-Cas9 является отбор жизнеспособных клеток, несущих функционально значимые мутации нокаутируемого гена. Эта проблема наиболее остра в тех случаях, когда белковый продукт целевого гена экспрессируется внутриклеточно, а низкий уровень экспрессии не позволяет детектировать этот белок обычными средствами. В этом случае критерием отбора нокаутных клеток может быть отсутствие функции целевого белка, при условии, что эта функция известна и может быть измерена. Экспериментальная методика в таких ситуациях состоит из следующих этапов: 1) введение в клетки репортерной конструкции, позволяющей измерять функцию целевого гена; 2) нокаутирование гена с помощью Cas9-никазы; 3) получение клеточных клонов и их скрининг с помощью введенной ранее репортерной конструкции; 4) отбор неотвечающих клонов; 5) повторное тестирование отобранных клонов на предмет утраты функции целевого гена и отсутствия значимых нецелевых эффектов; 6) подтверждение нокаута целевого гена путем генетического анализа. Успешное применение данной методики описано на примере нокаутирования генов NOD1 и NOD2, кодирующих рецепторы к фрагментам пепти-догликана, в клетках HEK293T.

Ключевые слова: CRISPR-Cas9; генетический нокаут; NOD1; NOD2; репортерный ген; NF-kappaB. Для цитирования: Дагиль Ю.А., Пащенков М.В. Опыт использования технологии CRISPR-Cas9 для нокаута генов, кодирующих внутриклеточные белки с низкой экспрессией (на примере NOD1 и NOD2). Иммунология. 2018; 39(4): 214-220. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-214-220

Dagil Yu.A., Pashenkov M.V.

THE USE OF CRISPR-CAS9 TECHNOLOGY TO KNOCK OUT GENES ENCODING INTRACELLULAR PROTEINS WITH LOW EXPRESSION

National Research Center «Institute of Immunology» of the Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115478 Moscow, Russia

The CRISPR-Cas9 technology allows to rapidly knock out genes in eukaryotic cells. One of the main problems with the use of CRISPR-Cas9 is the selection of viable cells carrying functionally significant mutations of the target gene. This problem is especially evident when the protein encoded by the target gene is expressed intracellularly at a low level that cannot be detected by routine techniques. In these cases, the criterion for the selection of knock-out cells could be lack of function of the target protein, provided that this function is known and can be measured. In such situations, the experimental technique consists of following steps: (1) the cells are transfected with a reporter construct that allows to measure function of the target gene; 2) the target gene is knocked-out using Cas9 nickase; (3) single-cell clones are obtained and screened for target gene function using the reporter construct introduced earlier; (4) non-responding clones are selected; (5) the selected clones are tested again for the function of target gene and absence of significant off-target effects; (6) knock-out of the target gene is verified by genetic analysis. The successful use of this technique is illustrated by knocking out NOD1 and NOD2 genes, which code receptors to peptidoglycan fragments, in HEK293T cells.

Keywords: CRISPR-Cas9; gene knock-out; NOD1; NOD2; reporter gene; NF-kappaB.

For citation: Dagil Yu.A., Pashenkov M.V. The use of CRISPR-Cas9 technology to knock out genes encoding intracellular proteins with low expression (exemplified by NOD1 and NOD2). Immunologiya. 2018; 39(4): 214-220. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-3-214-220

For correspondence: Pashenkov Mikhail Vladimirovich, Dr. Med. Sci.,115478, Moscow, E-mail: mvpashenkov@yandex.ru

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The work is executed at support of RFBR grant No. 13-04-00753.

Received 31.01.18 Accepted 16.03.18

Для корреспонденции: Пащенков Михаил Владимирович, д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник, E-mail: mvpashenkov@ yandex.ru

введение

Система CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) является «адаптивной иммунной системой» бактерий. В основе её работы лежит повреждение чужерод-

ной ДНК с помощью РНК-направляемых эндонуклеаз [1]. В 2012 г этот базовый принцип CRISPR был впервые применён для редактирования генома [2]. В настоящее время технология CRISPR - точнее, её вариант CRISPR-Cas9 - стала одним из основных инструментов молекулярной биологии.

CRISPR-Cas9 применяется в первую очередь для нокаутирования генов, позволяя в разумные сроки и при сравнительно небольших затратах получить нокауты практически любых генов в различных типах эукариотических клеток [2, 3]. Согласно технологии CRISPR-Cas9, в клетках коэкспрес-сируется РНК-направляемая эндонуклеаза Cas9 и так называемая единая гидовая РНК (single guiding RNA или sgRNA), которая направляет Cas9 в нужный участок генома [4]. Так, sgRNA - это короткие одноцепочечные РНК, состоящие из двух сегментов: 1) вариабельного сегмента, обычно из 20 оснований, который специфически гибридизуется с требуемым участком геномной ДНК; 2) константного сегмента, служащего для связывания Cas9. Целевые участки генов для гибридизации с sgRNA подбираются в соответствии с известными правилами [4]. Фермент Cas9 разрезает обе цепи геномной ДНК в месте гибридизации sgRNA. Образующийся двунитевой разрыв ДНК является пусковым сигналом для процесса репарации, который у млекопитающих обычно идет по пути негомологичного соединения концов (NHEJ). При этом возникают вставки или делеции, приводящие к утрате важных сегментов гена и/или сдвигу рамки считывания, в результате чего белковый продукт данного гена утрачивает функцию или вообще не синтезируется.

Для повышения специфичности метода и уменьшения нецелевых эффектов (off-target effects), обусловленных гибридизацией sgRNA с нецелевыми участками генома, применяют так называемую Cas9-никазу (Cas9n или мутант Cas9-D10A) [4]. Cas9n разрезает только одну цепь ДНК - противоположную той, с которой гибридизовалась sgRNA. Чтобы получить двунитевой разрыв ДНК с помощью Cas9n, необходимы две sgRNA, которые гибридизуются с противоположными цепями ДНК на расстоянии не более 20 пар оснований друг от друга, что резко повышает специфичность метода [4].

Эффективность нокаутирования генов зависит от многих факторов, в первую очередь от эффективности трансфекции, которая обычно существенно ниже 100 %. Кроме того, возникающие при репарации геномной ДНК делеции и вставки могут иметь небольшой размер и не приводить к сдвигу рамки считывания, что не будет влиять на функцию белка. Далее необходимо получить функционально значимый нокаут обоих аллелей данного гена, что дополнительно усложняет задачу. Поэтому на первый план выходит проблема отбора жизнеспособных клеток с биаллельным функционально значимым нокаутом. Если целевой белок экспрессируется на поверхности клеток, то задача обычно решается путём мечения клеток антителами к данному белку и выделения непометив-шихся клеток с помощью флюоресцентной или магнитной сортировки [5]. Если целевой белок является внутриклеточным, то его мечение с помощью антител невозможно без утраты жизнеспособности клеток. В этом случае прибегают к более трудоёмкой технологии: трансфицированные клетки клонируют, и часть клеток из каждого клона используют для анализа уровня целевого белка с помощью внутриклеточного иммунофлюоресцентного окрашивания или Вестерн-блоттинга. Но если целевой белок экспрессируется на низком уровне, который не может быть выявлен с помощью стандартных методик, то данный способ скрининга значительно усложняется. Тем не менее, функция данного белка может быть легко определима даже при его низкой экспрессии. В этом случае наиболее разумным подходом является скрининг на базе функционального теста, где оценивается не экспрессия, а именно функция данного белка, которая фактически и является конечной целью применения CRISPR-Cas9. В клонах, отобранных на основе утраты функции, подтверждает-

ORIGINAL ARTICLE

ся повреждение целевого участка генома и по возможности утрата экспрессии целевого белка.

Примерами внутриклеточных белков с низкой экспрессией являются NOD1 и NOD2 [6-8]. Оба являются рецепторами к мурамилпептидам - фрагментам бактериального пептидогликана [9, 10]. NOD1 избирательно распознаёт мура-милпептиды грамотрицательных бактерий, содержащие остаток мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАП) [9]. NOD2 распознает мурамилдипептид (МДП), являющийся структурным элементом пептидогликана всех бактерий [10]. Одна из функций NOD1 и NOD2 состоит в активации фактора транскрипции NF-kB при стимуляции соответствующими агониста-ми [9-11]. Активация NF-KB может быть легко измерена с помощью репортерных генетических конструкций. Этот подход был применён нами для получения и отбора человеческих клеток, нокаутных по NOD1 и NOD2. В качестве модели были выбраны клетки HEK293T в связи с их хорошей трансфицируемостью и наличием эндогенной экспрессии NOD1 и NOD2.

Материал и методы

Плазмиды и реактивы

Плазмида pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro], кодирующая репортёрный ген люциферазы (luc2P) под NF-кВ-зависимым промотором, была приобретена у Promega (США). Плазмиды pUNO1-hNOD1 и pUNO-hNOD2a, кодирующие соответственно NOD1 и NOD2 человека под конституциональным промотором, были куплены у Invivogen (San Diego, США, Калифорния), контрольная плазмида pcDNA3.1 - у Life Technologies (Paisley, Великобритания). Плазмида pcDNA3.3-Cas9n, кодирующая Cas9n, была получена из плазмиды pcDNA3.3-Cas9 (Addgene #41815) [3] путём введения мутации D(10)A в кодирующую последовательность Cas9. Вектор pKS-gRNA-BB, сконструированный для экспрессии sgRNA, был получен, как описано ранее [12], и любезно предоставлен Д.В. Мазуровым (ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России). pKS-gRNA-BB содержит, в частности: 1) промотор для РНК-полимеразы III типа, необходимый для транскрипции sgRNA; 2) два сайта рестрикции BbsI для встраивания синтетических двухцепочечных олигодезоксинуклеотидов (дцОДН), кодирующих геноспецифическую часть sgRNA; 3) последовательность, кодирующую константную часть sgRNA [12].

D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота (iE-DAP) и №ацетилмурамил-Ь-аланил^-изоглутамин (МДП) были куплены у Invivogen, Липофектамин 2000 и рекомби-нантный фактор некроза опухолей (ФНО) человека - у Life Technologies.

Дизайн и получение sgRNA

Целевые сайты для связывания sgRNA, расположенные в 5'-регионах кодирующих последовательностей генов NOD1 и NOD2, были выбраны в соответствии с известными критериями [4] с помощью онлайн-сервиса http://crispr.mit.edu/. Так как использовали Cas9n, то каждый ген таргетировался двумя sgRNA (табл. 1). Фрагменты ДНК, кодирующие гено-специфические участки sgRNA, синтезировали искусственно и встраивали в вектор pKS-gRNA-BB.

Получение клеток 293Luc и нокаутов

Клеточную линию HEK293T вели в среде DMEM (Панэ-ко, Москва) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) и 10% инактивированной фетальной телячьей сыворотки (PAA, Австрия).

Для получения клеточной линии, в которой ген luc2P под NF-KB-зависимым промотором был бы стабильно интегрирован в геном, клетки HEK293T трансфицировали плазмидой pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] в присутствии липофекта-мина 2000 и культивировали 1 мес с 200 мкг/мл гигромици-на B (Life Technologies). Полученную таким образом линию 293Luc вели в присутствии гигромицина B и регулярно тестировали на присутствие трансгена путём оценки активности luc2P при индукции ФНО.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Чтобы получить клетки с одинарным нокаутом NOD1 или NOD2, клетки 293Luc высевали в 24-луночный планшет и трансфицировали одновременно тремя плазмидными конструкциями: двумя конструкциями (по 250 нг каждая), кодирующими sgRNA против данного гена, и 500 нг pcDNA3.3-Cas9n. Клетки с двойным нокаутом NOD1/NOD2 получали таким же способом, но в качестве исходной популяции брали клеточный клон с одинарным нокаутом NOD1. Через 48 ч клетки пересевали в 96-луночный плоскодонный планшет в средней плотности 1 клетка на лунку. Через 2-3 нед отмечали лунки, содержащие по одной колонии (клону) клеток. Такие лунки трипсинизировали, после чего половину клеток переносили в лунку 24-луночного планшета для подращивания, а оставшуюся половину высевали в равных частях в 2 или 3 лунки 96-луночного плоскодонного планшета для скрининга.

Скрининг клонов

При первичном скрининге одну из лунок оставляли без стимуляции, а во вторую вносили специфический агонист нокаутируемого NOD-рецептора (iE-DAP в концентрации 300 мкМ в случае NOD1, МДП в концентрации 1 мкМ в случае NOD2 [11]). Через 24 ч в лунки добавляли субстрат Bright-Glo (Promega) и измеряли хемилюминесценцию на приборе Lucy II (Anthos, Австрия). Результаты выражали в относительных световых единицах (ОСЕ). Нокаут NOD1 или NOD2 в данном клоне считали вероятным в том случае, если не наблюдалось индукции люциферазной активности при стимуляции специфическим агонистом нокаутируемого рецептора (индекс стимуляции менее 2).

Клоны с вероятным нокаутом, отобранные при скрининге, подвергали повторному тестированию для подтверждения результатов скрининга и исключения нецелевых эффектов. Клоны и материнские клетки (референс-образец) высевали в 96-луночные планшеты в количестве 104 клеток на 100 мкл на лунку. Спустя 48 ч, когда монослой достигал конфлюэнтности 70—80 %, добавляли iE-DAP (300 мкМ) и МДП (1 мкМ). В лунки положительного контроля добавляли ФНО (100 нг/мл), в лунки отрицательного контроля - эквивалентный объем DMEM. Все стимуляции делали в дублях или триплетах. Через 24 ч измеряли хемилюминесценцию, как описано выше. Об отсутствии нецелевых эффектов судили по следующим признакам: 1) отсутствие значительных изменений ответа на агонист «нецелевого» NOD-рецептора (МДП при нокауте NOD1 и iE-DAP при нокауте NOD2); 2) отсутствие значительных изменений ответа на ФНО; 3) отсутствие значительных изменений скорости роста по сравнению с материнской линией 293Luc.

Секвенирование целевых геномных локусов

Из отобранных в результате скрининга клонов и референс-образцов выделяли геномную ДНК. Целевые участки генов NOD1 и NOD2 подвергали ПЦР-амплификации с применением высокоточной ДНК-полимеразы Phu-sion (Fermentas, Литва). Использовали праймеры, фланкирующие сайты связывания sgRNA: NOD1 прямой 5'-GAGAGGACACACGCAGCTGAAG-3'; NOD1 обратный 5'-ACTGTGCAACCTGCTAACCC-3'; NOD2 прямой 5'-TGGAAGGCTTCGAGAGTGTC-3'; NOD2 обратный 5'-TAGGGGAAATCCCATGGACC-3'. ПЦР-продукты подвергали электрофорезу в 1,5 % агарозном геле для визуализации крупных делеций и вставок. Кроме того, ПЦР-продукты из каждой реакции клонировали в вектор pJet1.2/blunt (Fermentas) и полученными плазмидами трансформировали компетентные клетки E. coli. Из полученных бактериальных колоний (по 6-8 колоний на один ПЦР-продукт) выделяли плазмидную ДНК, вставки секвенировали по Сэнгеру.

Определение мРНК NOD1 и NOD2 с помощью ПЦР в реальном времени

Общую РНК из монослоев клеток 293Luc и их производных выделяли с помощью TRI-реагента (Sigma), согласно инструкции производителя, 0,5 мкг РНК подвергали обратной

транскрипции с использованием набора RevertAid (Fermentas). При амплификации кДНК использовали наборы прайме-ров/зондов производства Applied Biosystems (США), номера наборов: NOD1 - Hs00l96075_ml; NOD2 - Hs00223394_ml; ACTB - 4333762F). Сайты гибридизации праймеров к NOD1 и NOD2 располагались ниже сайтов гибридизации sgRNA. Амплификацию выполняли в дублях на приборе 7300 RealTime PCR System (Applied Biosystems), используя стандартный протокол Taqman. Относительную экспрессию NOD1 и NOD2 вычисляли методом 2-ACt, используя ACTB (ß-актин) в качестве нормировочного гена.

Определение NOD1 и NOD2 с помощью проточной цито-метрии

Для приготовления положительных контролей клетки 293Luc транс фицировали плазмидами pUNOl-hNODl или pU-NO-hNOD2a (2,5 мкг плазмид на 5 мкл Липофектамина 2000 в 6-луночном планшете) за 24 ч до основного эксперимента. Трансфицированные и нетрансфицированные клетки 293Luc трипсинизировали, фиксировали 4 % парафальмальдегидом (Sigma) в течение 20 мин при + 4 °C, отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и пермеабилизировали отмывочным буфером, который представлял собой ФСБ с 0,1 % сапонином (Sigma) и 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Далее клетки ресуспендировали в отмывочном буфере и инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к NOD1 человека или с моноклональными мышиными антителами к NOD2 человека (клон 2D9) в течение 30 мин при комнатной температуре. Оба антитела были производства Santa Cruz Biotechnologies (США). После двух отмывок клетки окрашивали вторичными ослиными антителами к IgG кролика с меткой NorthernLights 493 (R&D Systems, США) или козьими антителами к IgG мыши с меткой Alexa Fluor 488 (Thermo Fischer Scientific, США), тоже в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали l раз отмывочным буфером и l раз отмывочным буфером без сапонина. Клетки анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 с помощью программного обеспечения CXP (Beckman Coulter, США).

Определение NOD1 и NOD2 с помощью Вестерн-блоттинга

Положительные контроли готовили так же, как для проточной цитометрии. Mонослои клеток лизировали в Трис-буфере с 1 % Тритоном X-100 (pH 8.0) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (MSSAFE, Sigma). Электрофорез белков проводили в готовых гелях TGX Any kD (Bio-Rad, США). Перенос белков с гелей на мембраны из поливинили-дендифлюорида (Millipore, Франция) осуществляли полусухим методом. Mембраны блокировали 5 % БСА на ФСБ с 0,05 % Твином-20. NOD1 и NOD2 определяли с помощью тех же антител, что и для проточной цитометрии, с использованием соответствующих вторичных антител, меченных пероксида-зой. Контролем загрузки служила окраска на альфа-тубулин, который определяли с помощью мышиных моноклональных антител, клон DM1A (Millipore). Окраску проявляли с помощью субстратного раствора Immobilon Western (Millipore) с хемилюминесцентной детекцией на приборе Amersham Im-ager 600 (Amersham, Великобритания).

результаты

Клетки HEK293T были стабильно трансфицированы плазмидной конструкцией, кодирующей ген люциферазы (luc2P) под контролем индуцибельного NF-кБ-зависимого промотера. Полученная клеточная линия 293Luc стабильно отвечала высокой экспрессией люциферазы при стимуляции рекомбинантным ФНО (рис. l, а). По результатам 58 опытов, поставленных на протяжении более чем 3 лет, фоновое свечение составило 7,6 ± 5,1 ОСЕ, при стимуляции ФНО - 12960 ± 4268 ОСЕ, индекс стимуляции 2175 ± 1216 (M ± а).

Индукция люциферазы отмечалась также при стимуляции клеток 293Luc специфическими агонистами NOD1 (iE-

Таблица 1. сайты гибридизации sgRNA в генах NOD1 и NOD2*

Целевой Сайты гибри- Целевые сайты Длина кодирую-

ген дизации sgRNA Cas9n щей последова-

(включительно) тельности гена**

NOD1 105-124, 144-163 107/108, 160/161 2859

NOD2 377-396, 407-426 379/380, 423/424 3120

Примечание. * - Нумерация оснований дана по отношению к кодирующим последовательностям NOD1 и NOD2; ** - без стоп-кодона.

DAP) и NOD2 (МДП) (рис. 1, б), что говорит о естественной экспрессии функционирующих белков NOD1 и NOD2 в клетках 293Luc. В исследуемых клетках определялась мРНК NOD1 и NOD2 (рис. 1, в). Однако сами белки NOD1 и NOD2 не удалось убедительно определить ни с помощью Вестерн-блоттинга (рис. 1, г), ни с помощью проточной цитометрии (рис. 1, д). При этом и NOD1, и NOD2 легко выявлялись теми же антителами при искусственной гиперэкспрессии в клетках 293Luc (см. рис. 1, г, д). Таким образом, естественная экспрессия белков NOD1 и NOD2 в клетках 293Luc не поддается определению стандартными методами, что согласуется с литературными данными [6-8]. В связи с этим для скрининга на наличие нокаутов NOD1 и NOD2 использовали функциональный тест: индукция люциферазы под действием специфических агонистов NOD1 и NOD2.

При нокаутировании NOD1 первичный скрининг клонов проводили стимуляцией iE-DAP. Было проверено 42 клона (рис. 2, а). У 8 из них (19 %) ответ на iE-DAP отсутствовал. Из этих 8 были отобраны клоны 1G5 и 1F8 (соответственно № 12 и № 25 см. на рис. 2, а), которые по скорости роста наиболее близки к материнской линии 293Luc (данные не показаны). Результаты их повторного функционального тестирования представлены на рис. 2, б. Подтверждено отсутствие ответа на iE-DAP при сохранности ответа на МДП и ФНО, что в сочетании с нормальной скоростью роста говорит о специфическом нокауте NOD1 и отсутствии значительных нецелевых эффектов в этих двух клонах.

При нокаутировании NOD2 на стадии скрининга использовали стимуляцию как МДП, так и ФНО. Как видно на рис. 2, в, у 4 (13,8 %) из 29 клонов был резко снижен ответ на ФНО (более чем в 100 раз по сравнению материнскими клетками 293 Luc). Низкий ответ на ФНО в клонах может быть обусловлен двумя причинами: 1) гетерогенностью экспрессии репортерной конструкции в материнских клетках; 2) нецелевыми эффектами. Все такие клоны отбраковывали независимо от их ответа на МДП. Также было выявлено 7 (24,1 %) клонов, не отвечающих на МДП при сохранном ответе

ORIGINAL ARTICLE

на ФНО, что указывало на специфический нокаут NOD2 (см. рис. 2, в). На рис. 2, г представлены результаты проверочного тестирования одного из таких клонов: подтверждено отсутствие ответа на МДП при полной сохранности ответа на iE-DAP и ФНО.

Нокаутирование гена NOD2 выполняли также в клоне 1G5 с целью получения клеток с двойным нокаутом NOD1/ NOD2. Резкое снижение ответа на ФНО при скрининге выявлено у 12 (54,5 %) из 22 субклонов (рис. 2, д). Поскольку ответ на ФНО у исходного клона 1G5 был высоким, то снижение/отсутствие ответа у субклонов, вероятно, было обусловлено нецелевыми эффектами. Лишь у 4 (18,2 %) из 22 клонов отсутствовал ответ на МДП при нормальном ответе на ФНО. Только 2 из этих 4 клонов по скорости роста были сопоставимы с клетками 293Luc и 1G5 (данные не показаны). Эти два клона подвергли повторному функциональному тестированию, которое подтвердило отсутствие ответа на агонисты обоих NOD-рецепторов (iE-DAP и МДП) при наличии нормального ответа на ФНО (рис. 2, е).

Для генетического анализа были отобраны 2 клона с вероятным нокаутом NOD1 (1G5 и 1F8), 1 клон с вероятным нокаутом NOD2 (3H9) и 1 клон с вероятным двойным нокаутом (4B11). При ПЦР-амплификации геномной ДНК с использованием праймеров, фланкирующих сайт связывания sgRNA в гене NOD1 (рис. 3, а), в клонах 1G5, 1F8 и 4B11 выявлены ампликоны, более короткие или более длинные по сравнению с ожидаемыми, тогда как в клоне 3H9 - ампликон ожидаемой длины. При этом картина в клоне 1G5 и в его дочернем клоне 4B11 была идентичной (см. рис. 3. а). В свою очередь, при амплификации целевого сайта в гене NOD2 более короткие ампликоны образовывались в клонах 3H9 и 4B11, а амплико-ны ожидаемой длины - в клонах 1G5 и 1F8 (рис. 3, б).

При секвенировании аномальных ПЦР-продуктов в соответствующих клонах были подтверждены делеции в генах NOD1 и NOD2, а в клоне 1G5 - также вставка в одном из аллелей гена NOD1 (табл. 2). Размеры делеций и вставок соответствуют ПЦР-картине (см. рис. 3), а их локализация хорошо согласуется с расчётными сайтами разрезов геномной ДНК ферментом Cas9n (см. табл. 2). Во многих случаях делеции и вставки приводили к сдвигам рамки считывания с возникновением ранних стоп-кодонов (т.е. к значительному изменению аминокислотной последовательности и резкому сокращению длины белкового продукта). В остальных случаях происходила утрата существенного количества аминокислотных остатков и замены отдельных аминокислот. Интересно, что в клоне 4B11 выявлено 3 мутантных аллеля NOD2 (см. табл. 2), что может объясняться вариабельной гипотриплоидностью исходных клеток HEK293T.

Т а б л и ц а 2 .

результаты секвенирования целевых участков генов NOD1 и NOD2 в нокаутных клонах*

Ген, клон Целевые сайты Cas9n Генетические аберрации** Результат на уровне белка

NOD1, 1F8 (№25) 107/108, 160/161 Аллель 1: делеция 119 осн. (107-225) Аллель 2: делеция 18 осн. (96-113) + 54 осн. (118-171) Аллель 1: сдвиг рамки, ранний стоп-кодон Аллель 2: замены Tyr32Met и His33Cys, утрата еще 24 а.к.

NOD1, 1G5 (№12) 107/108, 160/161 Аллель 1: вставка 90 осн. между осн. 107-108, вставка 7 осн. между осн. 159-160 Аллель 2: делеция 34 осн. (126-159) Оба аллеля: сдвиг рамки, ранние стоп-кодоны

NOD2, 3H9 (№63) 379/380, 423/424 Аллель 1: делеция 21 осн. (381-401) Аллель 2: делеция 51 осн. (381-431) Аллель 1: утрата 7 а.к. Аллель 2: утрата 17 а.к.

NOD2, 4B11 (№74) 379/380, 423/424 Аллель 1: делеция 33 осн. (379-411) Аллель 2: делеция 22 осн. (380-401) Аллель 3: делеция 29 осн. (402-430) Аллель 1: утрата 11 а.к. Аллели 2 и 3: сдвиг рамки, ранние стоп-кодоны

Примечание. * - Нумерация оснований дана по отношению к кодирующим последовательностям NOD1 и NOD2; ** - при делециях номера утраченных оснований указаны включительно.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 № опыта

Спонт . iE-DAP МДП

10

О

15

20

s

25

>s

-û m о 30

i_

о Ci о 35

IZ

40

• 293Luc кДНК о Огр. к-ль

NOD1

альфа -тубулин

NOD2

альфа -тубулин

NOD1 NOD2 ACTB

a

B1 32

d 293Luc

NOD1

B3 34

Ш 0.27%

= 31 B2 293Luc

33 M B4' 0.49%

10'- B1 293Luc + NOD1

ip B3 m B4  6.9%

.......11,1.......jo=.....;;

2° Ab NL493

NOD1 NL493

NOD1 NL493

NOD2

= 31 92 293Luc

-^iÉÉ B4 : 0.25%

= 31 92 293Luc

ш -  - '/1Ш1 B4 g- 1.2%

31 92 293Luc + NOD2

ÉMË Ш B4 k. 2 2%

2° Ab AF488

NOD2 AF488

NOD2 AF488

Рис. 1. Характеризация репортерных клеток 293Luc.

а - люциферазная активность клеток 293Luc без стимуляции и после 24-часовой стимуляции ФНО (100 нг/мл). Показаны средние дублей или триплетов по 58 экспериментам, поставленным на протяжении 3 лет; б - ответ клеток 293Luc на стимуляцию специфическим агонистом NOD1 (iE-DAP, 300 мкМ) и NOD2 (МДП, 1 мкМ). M ± о триплетов в репрезентативном опыте; в - экспрессия мРНК NOD1, NOD2 и ACTB (бета-актина) по данным ПЦР-РВ. NOD1 и ACTB - 3 независимых опыта, NOD2 - 2 опыта. Результаты выражены в пороговых циклах (Ct). Отрицательный контроль - вода вместо кДНК; г - экспрессия белков NOD1 и NOD2 в клетках 293Luc в базальных условиях и после трансфекции указанными плазмидами (Вестерн-блоттинг); д - экспрессия NOD1 и NOD2 в клетках 293Luc в базальных условиях и после трансфекции указанными плазмидами (проточная цитоме-трия). Указаны проценты положительно окрашенных клеток. NL493 и AF488 - флюорохромы Northern Lights 493 и Alexa Fluor 488.

ORIGINAL ARTICLE

J

К

>

100000 i 10000 1000 100

о о CD x

10 1

0,1

100000 10000 1000 100 10 1

0,1

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 293 1G5

№ клона Luc

1F8

293Luc

100000

10000

J

К

>

о о CD X

1000 100 10 1 0,1

100000

J

к

>

о о CD X

43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 293

Luc

№ клона

10000

1000 100 10 1 0,1

MDP  TNF

i

CI

IM

1

J

100000 10000 1000 100 10 1

0,1

100000 10000 1000 100 10 1

0,1

3H9

4B11

72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 293

Luc

№ клона

293Luc

4F6

iE-DAP

MDP

TNF

1G5

Рис. 2. Скрининг и проверка клонов при получении нокаутов NOD1 и NOD2.

а и б - нокаутирование NOD1, в и г - нокаутирование NOD2, д и е - нокаутирование NOD2 в NODt-нокаутном клоне (1G5 или №12). а, в и д -скрининг. В зависимости от нокаутируемого гена, клоны стимулировали специфическим агонистом NOD1 (iE-DAP) или NOD2 (МДП), а также контрольным стимулом - ФНО. На графиках а, в и д стрелками обозначены клоны с вероятными нокаутами целевых генов, треугольниками - клоны с вероятными нецелевыми эффектами; б, г и е - проверка функциональных свойств некоторых клонов-кандидатов. В качестве положительного контроля во всех случаях использовали материнскую линию 293Luc. Пунктирная черта на всех графиках соответствует пороговому индексу стимуляции (ИС = 2), который служил критерием отбора клонов-кандидатов.

Обсуждение

Таким образом, в работе была успешно применена селекция нокаутных клеток по признаку отсутствия функции целевого гена. Данный метод селекции технически прост, поскольку требует лишь добавления соответствующих агони-стов в культуральную среду с анализом хемилюминесценции через 24 ч. Отобранные клоны-кандидаты далее подвергаются более трудоёмким методам анализа, включающим секве-

нирование целевого локуса, с целью подтверждения нокаута на генном уровне. Схожая последовательность действий описана в ряде недавних работ при нокаутировании некоторых других генов, участвующих во врождённом иммунном ответе [13-15]. Частота нокаутных клонов в нашем случае составляла 18—24 %, что позволило отобрать избыточное количество клонов-кандидатов при скрининге сравнительно небольшого общего числа клонов. В результате нашей ра-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Рис. 3. ПЦР геномной ДНК указанных клонов и материнской линии 293Luc с помощью праймеров, фланкирующих сайты связывания sgRNA в гене NOD1 (а) и NOD2 (б).

Указаны расчётные длины ампликонов (426 п.о. для NOD1 и 510 п.о. для NOD2).

боты получена панель клеточных линий и клонов, которые могут применяться для оценки биологической активности и рецепторной специфичности агонистов NOD1 и NOD2 [16], а также для изучения сигнальных путей этих рецепторов.

Как показано на примере NOD2, данный метод селекции может применяться и для отбраковывания клеток с нецелевыми эффектами, которые выявляются по снижению ответа на другие индукторы NF-kB, например ФНО. Частота клонов с низким/отсутствующим ответом на ФНО при нокаутировании NOD2 в клетках 293Luc была сравнительно невелика (13,8%), но возрастала в 4 раза при нокаутировании NOD2 в клоне 1G5 с уже имеющимся нокаутом NOD1, что указывает на пределы применимости технологии CRISPR-Cas9 для получения множественных генных нокаутов. В случае нокаутирования NOD1 и NOD2 дополнительным удобством является тот факт, что сигнальные пути от этих двух рецепторов практически идентичны [17]. Поэтому, если в клетках с функционально и генетически подтвержденным нокаутом NOD1 сохранена функция NOD2, то можно быть уверенным, что отсутствие функции NOD1 обусловлено именно нокаутом NOD1, а не неучтёнными нецелевыми эффектами, затрагивающими сигнальный путь. То же касается и нокаута NOD2.

Необходимо отметить, что применение данного метода селекции ограничено теми генами, функция которых может быть измерена с помощью репортёрных конструкций. Кроме того, данный подход по-прежнему основан на получении клеточных клонов, что занимает 2-3 нед, а в случае медленно растущих клеткок - и дольше. В перспективе желательно полное устранение этапа клонирования, например путём введения репортёрных флюоресцентных конструкций непосредственно в участок двунитевого разрыва ДНК, что позволило бы отбирать нокаутные клетки уже в первые несколько суток после трансфекции.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13-04-00753.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

литература

1. Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F. Development and applications of CRIS-PR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014; 157 (6): 1262-78.

2. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012; 337 (6096): 816-21.

3. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville

J.E., Church G.M. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013; 339 (6121): 823-6.

4. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8 (11): 2281-308.

5. Zotova A., Lopatukhina E., Filatov A., Khaitov M., Mazurov D. Gene Editing in Human Lymphoid Cells: Role for Donor DNA, Type of Genomic Nuclease and Cell Selection Method. Viruses. 2017; 9 (11): E325.

6. Legrand-Poels S., Kustermans G., Bex F., Kremmer E., Kufer T.A., Pi-ette J. Modulation of Nod2-dependent NF-kappaB signaling by the actin cytoskeleton. J. Cell. Sci. 2007; 120 (Pt 7): 1299-310.

7. Weichart D., Gobom J., Klopfleisch S., Hasler R., Gustavsson N., Billmann S., Lehrach H., Seegert D., Schreiber S., Rosenstiel P. Analysis of NOD2-mediated proteome response to muramyl dipeptide in HEK293 cells. J. Biol. Chem. 2006; 281 (4): 2380-9.

8. Kufer T.A., Kremmer E., Adam A.C., Philpott D.J., Sansonetti P.J. The pattern-recognition molecule Nod1 is localized at the plasma membrane at sites of bacterial interaction. Cell. Microbiol. 2008; 10 (2): 477-86.

9. Girardin S.E., Boneca I.G., Carneiro L.A., Antignac A., Jehanno M., Viala J., Tedin K., Taha M.K., Labigne A., Zahringer U., Coyle A.J., DiS-tefano P.S., Bertin J., Sansonetti P. J., Philpott D.J. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan. Science. 2003; 300 (5625): 1584-7.

10. Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J., Chamaillard M., Labigne A., Thomas G., Philpott D.J., Sansonetti P.J. Nod2 is a general sensor of peptidogly-can through muramyl dipeptide (MDP) detection. J. Biol. Chem. 2003; 278 (11): 8869-72.

11. Girardin S.E., Travassos L.H., Herve M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J., Sansonetti P.J., Mengin-Lecreulx D. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41702-8.

12. Tarasevich A., Filatov A., Pichugin A., Mazurov D. Monoclonal antibody profiling of cell surface proteins associated with the viral biofilms on HTLV-1 transformed cells. Acta Virol. 2015; 59 (3): 247-56.

13. Ren Q., Li C., Yuan P., Cai C., Zhang L., Luo G.G., Wei W. A Dualreporter system for real-time monitoring and high-throughput CRISPR/ Cas9 library screening of the hepatitis C virus. Sci. Rep. 2015; 5: 8865.

14. Covarrubias S., Robinson E.K., Shapleigh B., Vollmers A., Katzman S., Hanley N., Fong N., McManus M.T., Carpenter S. CRISPR/Cas-based screening of long non-coding RNAs (lncRNAs) in macrophages with an NF-kappaB reporter. J. Biol. Chem. 2017; 292 (51): 20911-20.

15. Sato R., Shibata T., Tanaka Y., Kato C., Yamaguchi K., Furukawa Y., Shi-mizu E., Yamaguchi R., Imoto S., Miyano S., Miyake K. Requirement of glycosylation machinery in TLR responses revealed by CRISPR/Cas9 screening. Int. Immunol. 2017; 29 (8): 347-55.

16. Dagil Y.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., L'Vov V L., Mazurov D.V., Pashenkov M.V. The Dual NOD1/NOD2 Agonism of Muropeptides Containing a Meso-Diaminopimelic Acid Residue. PLoS One. 2016; 11 (8): e0160784.

17. Boyle J.P., Parkhouse R., Monie T.P. Insights into the molecular basis of the NOD2 signalling pathway. Open Biol. 2014; 4 (12): 140178.

Поступила 31.01.18 Принята в печать 16.03.18