ПРИМЕНЕНИЕ 3,11b-ЦИС-ДИГИДРОТЕТРАБЕНАЗИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИМПТОМОВ БОЛЕЗНИ ГЕНТИНГТОНА
APPLICATION OF 3,11b-CIS-DIHYDROTETRABENAZINE FOR TREATMENT OF HUNTINGTON'S DISORDER SYMPTOMS

Настоящее изобретение относится к применению дигидротетрабеназина для лечения симптомов болезни Гентингтона.
Болезнь Гентингтона (БГ), ранее называемая хореей Гентингтона, представляет собой наследственное нейродегенеративное заболевание, которое в настоящее время является неизлечимым. Причиной данного заболевания является экспансия числа тринуклеотидных CAG-повторов в гене IT15, локализованном в хромосомном регионе 4р16.3, что приводит к синтезу аберрантной формы белка, называемого гентингтин. Это, в свою очередь, ведет к каскаду процессов, приводящему к гибели нейронов в полосатом теле головного мозга, возможно, за счет агрегации аберрантной формы гентингтина внутри нейронов многих типов.
Ген, ответственный за развитие болезни Гентингтона (ген HD), включает в себя сегмент ДНК, содержащий последовательность повторяющихся кодонов CAG, кодирующих аминокислоту глутамин. Было показано, что индивиды, у которых число этих повторов составляет не более тридцати, не заболевают БГ. В то же время, индивиды, у которых число CAG-повторов в этом гене составляет более сорока, с высокой вероятностью могут заболеть БГ.
Болезнь Гентингтона характеризуется аутосомно-доминантным наследованием, таким образом, каждый ребенок больного БГ с 50% вероятностью заболеет этим заболеванием. Симптомы болезни Гентингтона обычно проявляются в возрасте от 30 до 50 лет, после чего болезнь постепенно прогрессирует на протяжении последующих 10-25 лет. Отличительные черты и симптомы этого заболевания включают в себя изменения личности, депрессию, перемены настроения, неустойчивую походку, хорею, непроизвольные подергивания мышц, тремор, деменцию, невнятную речь, нарушения умственной деятельности, затруднение глотания и общий вид больного, характерный для интоксикации.
С момента проявления первых симптомов продолжительность заболевания составляет от десяти до тридцати лет. Обычно течение БГ можно приблизительно разделить на три стадии: раннюю, промежуточную и позднюю.
На ранней стадии БГ пациенты еще способны выполнять большинство обычных действий. Они по-прежнему могут работать, а также могут сохранять способность к вождению транспортных средств. На этой стадии у пациентов могут появиться незначительные неконтролируемые движения, неповоротливость и спотыкание при ходьбе, снижение концентрации внимания, кратковременное нарушение памяти, а также перемены настроения; при этом неконтролируемые движения проявляются в умеренной степени, речь является по-прежнему внятной, а деменция, если и присутствует, то в весьма умеренной степени.
На промежуточной стадии пациенты постепенно теряют способность самостоятельно выполнять привычные действия и обычно нуждаются в посторонней помощи для их выполнения. На этой стадии могут появиться падения, снижение массы тела и затруднение глотания; при этом деменция становится более заметной для постороннего наблюдателя. Также, неконтролируемые движения становятся более выраженными.
На поздней стадии состояние пациентов ухудшается до такой степени, что они становятся практически полностью зависимыми от посторонней помощи и многие из них нуждаются в постоянном уходе в лечебных учреждениях. На этой стадии пациенты более не могут ходить и говорить; хотя выраженность неконтролируемых движений может снижаться, мускулатура становится более ригидной. Пациенты на этой стадии часто не могут проглатывать пищу. Большинство пациентов теряет адекватную ориентацию в пространстве и собственной личности. Причиной смерти обычно являются различные «естественные» причины, характерные для всех сильно ослабленных/истощенных пациентов вне зависимости от основного заболевания, такие как тяжелая недостаточность питательных веществ или пневмония.
В соответствии с информацией Национального Института Неврологических Нарушений и Инсультов США (NINDS), являющегося частью Национального Института Здравоохранения США (NIH), на сегодняшний момент не существует способов вылечить или приостановить развитие болезни Гентингтона.
Nature Medicine
Был предпринят ряд попыток разработать способ лечения БГ; так, Karpuj с коллегами предложили в качестве лекарства для лечения БГ цистамин (, February 2002, vol. 8, №2, стр. 143-149). По-видимому, цистамин инактивирует фермент трансглутаминазу, которая способствует формированию агрегатов гентингтина и таким образом, предположительно, играет роль в патогенезе этого заболевания. Так или иначе, насколько известно авторам, на сегодняшний момент не существует доступных способов лечения или остановки развития болезни Гентингтона.
Cell
Am. J. Hum. Genet.
Neurol.
Am. J. Hum. Genet.
Идентификация гена, ответственного за развитие болезни Гентингтона (см. сообщение Коллаборативной Группы по Болезни Гентингтона, , vol. 72, March 26, 1993, стр. 971), позволила разработать диагностические тест-системы на присутствие соответствующей мутантной формы. Диагностические системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), при помощи которых можно определять число CAG-повторов в гене IT-15, в настоящее время широко распространены и доступны; с их помощью можно предсказать, заболеет ли обследуемый болезнью Гентингтона или нет; см., например, обзор M. Hayden с соавторами,  55: 606-617 (1994); работу S. Hersch «The Neurogenetics Genie: Testing for the Huntington's disease mutation», 1994; 44: 1369-1373; а также работу R.R. Brinkman с соавторами (1997) «The likelihood of being affected with Huntington disease by a particular age, for a specific CAG size»,  60: 1202-1210.
Am. J. Psychiatry. (
Neurology
Тетрабеназин (химическое название - 1,3,4,6,7,11b-гексагидро-9,10-диметокси-3-(2-метилпропил)-2Н-бензо(а)хинолизин-2-он) используется в качестве лекарственного препарата с конца 1950-х годов. Будучи первоначально разработанным в качестве нейролептика, в настоящее время тетрабеназин используется для симптоматического лечения различных гиперкинезов, таких как хорея Гентингтона, гемибаллизм, сенильная хорея, тик, поздняя дискинезия на фоне длительного приема нейролептиков и синдром Туретта - см., например, работы Jankovic с соавторами: 1999) Aug; 156 (8): 1279-81, а также (1997) Feb; 48 (2): 358-62.
Первичное фармакологическое действие тетрабеназина заключается в снижении транспорта моноаминов (например, допамина, серотонина и норпинефрина) в центральную нервную систему за счет блокировки изоформы 2 человеческого везикулярного моноаминового транспортера (hVMAT2). Помимо этого лекарственное средство также блокирует постсинаптические допаминовые рецепторы.
Тетрабеназин представляет собой эффективный и безопасный лекарственный препарат для лечения различных гиперкинезов, причем, в отличие от обычных нейролептиков, тетрабеназин не вызывает поздней дискинезии. Тем не менее, тетрабеназин демонстрирует ряд дозозависимых побочных эффектов, таких как депрессия, Паркинсонизм, нервозность или ощущение тревоги, бессонница и, в редких случаях, злокачественный нейролептический синдром.
Центральные эффекты тетрабеназина в значительной степени напоминают таковые для резерпина, однако, в отличие от резерпина, тетрабеназин не оказывает влияния на активность VMAT1-транспортера. Это обуславливает меньшую, нежели у резерпина, периферическую активность тетрабеназина, что, в свою очередь, обуславливает отсутствие у последнего побочных эффектов, связанных с блокировкой VMAT1, таких как гипотензия.
Химическая структура тетрабеназина соответствует формуле, приведенной на фиг.1.
Фиг.1 - структура тетрабеназина
Это соединение имеет два хиральных центра (атомы углерода 3 и 11b) и, таким образом, теоретически может существовать в виде четырех изомерных форм, приведенных на фиг.2.
Фиг.2 - возможные изомеры тетрабеназина
«Advanced Organic Chemistry»
th
На фиг.2 названия стереохимических изомеров даны в соответствии с “R”- и “S”-номенклатурой Кана-Ингольда-Прелога, см. учебник Jerry March , 4 Edition, John Wiley & Sons, New York, 1992, стр. 109-114. На фиг.2 и далее порядок указания стереоконфигурации асимметрических центров (R или S) соответствует порядку, в котором идут номера соответствующих атомов углерода. Таким образом, например, RS-изомер соответствует конфигурации 3R,11bS. Аналогично, в случае наличия в структуре соединения трех хиральных центров, как в описанном ниже дигидротетрабеназине, порядок указания стереоконфигурации асимметрических центров (R или S) также соответствует порядку, в котором идут номера соответствующих асимметрических центров - 2, 3 и 11b. Таким образом, изомер 2S,3R,11bR сокращается до SRR и т.д.
транс
транс
Коммерчески доступный тетрабеназин представляет собой рацемическую смесь RR и SS-изомеров; по-видимому, эти RR- и SS-изомеры (здесь и далее называемые (вместе и по отдельности) -тетрабеназинами, поскольку в этих изомерах атомы водорода при хиральных центрах 3 и 11b расположены в -ориентации по отношению друг к другу) являются наиболее термодинамически стабильными.
Drug Metab.Disp.
.
Тетрабеназин характеризуется плохой и варьирующейся биодоступностью. Он подвергается экстенсивному пресистемному метаболизму и практически не детектируется в моче в неизменном виде. Основным метаболитом является дигидротетрабеназин (химическое название - 2-гидрокси-3-(2-метилпропил)-1,3,4,6,7,11b-гексагидро-9,10-диметоксибензо(а)хинолизин, образующийся в ходе восстановления 2-кетогруппы тетрабеназина; считается, что именно этот метаболит в первую очередь обуславливает биологическую активность тетрабеназина (см. Mehvar с соавторами, , 15, 250-255 (1987) и J. Pharm. ScI., 76, №.6, 461-465 (1987)), а также Roberts с соавторами, Eur. J. Clin. Pharmacol, 29: 703-708 (1986).
транс
Helv. Chim. Acta.
Были идентифицированы и охарактеризованы четыре изомера дигидротетрабеназина, причем все они были получены из наиболее стабильных RR- и SS-изомеров исходного тетрабеназина; атомы водорода при хиральных центрах 3 и 11b расположены в -ориентации по отношению друг к другу во всех полученных изомерах (см. Kilbourn с соавторами, Chirality, 9: 59-62 (1997), а также Brossi с соавт., , vol. XLI, № 193, стр. 1793-1806 (1958). Полученные четыре изомера представляют собой (+)-α-дигидротетрабеназин, (-)-α-дигидротетрабеназин, (+)-β-дигидротетрабеназин, (-)-β-дигидротетрабеназин. Структуры этих известных четырех изомеров дигидротетрабеназина приведены на фиг.3.
Фиг.3 - структуры известных изомеров дигидротетрабеназина
11
11
3
11
11
in vivo
in vitro
i
i
Kilbourn с соавторами (см. Eur. J. Pharmacol, 278: 249-252 (1995), а также Med. Chem. Res., 5: 113-126 (1994)) исследовали специфичность связывания радиоактивно меченных индивидуальных изомеров дигидротетрабеназина в головном мозге бодрствующих крыс. Авторы показали, что изомер (+)-α-[C]дигидротетрабеназин (2R,3R,11bR) накапливается в участках мозга с наибольшим содержанием нейронального мембранного допаминового транспортера (DAT) и везикулярного моноаминового транспортера (VMAT2). В то же время, практически неактивный изомер (-)-α-[C]дигидротетрабеназин распределялся равномерно во всех отделах мозгах, что указывает на отсутствие специфического связывания этого изомера с DAT и VMAT2. Вышеописанные исследования кореллируют с данными, полученными , показывающими, что в опытах по конкуренции с [H]метокситетрабеназином, (+)-α-[C]дигидротетрабеназин демонстрирует значения K, более чем в 2000 раз превышающие K для изомера (-)-α-[C]дигидротетрабеназина.
цис
цис
В международной патентной заявке PCT/GB2005/000464 (номер публикации - WO 2005/077946) раскрыто получение и использование фармацевтических изомеров дигидротетрабеназина, полученных из нестабильных RS- и SR-изомеров тетрабеназина (здесь и далее называемых (вместе и по отдельности) -тетрабеназинами, поскольку в этих изомерах атомы водорода при хиральных центрах 3 и 11b расположены в -ориентации по отношению друг к другу).
цис
цис
Было показано, что описанный в предыдущей заявке авторов № PCT/GB2005/000464 -дигидротетрабеназин способен приостанавливать или замедлять развитие по меньшей мере некоторых симптомов болезни Гентингтона. В частности, было продемонстрировано, что такие симптомы, как ухудшение походки и непроизвольные движения (тремор и неконтролируемые мышечные сокращения), ассоциированные с болезнью Гентингтона, могут быть устранены, либо их развитие может быть в значительной степени замедлено путем введения -дигидротетрабеназинов согласно настоящему изобретению.
цис
В соответствии с этим, в первом аспекте, настоящее изобретение относится к 3,11b--дигидротетрабеназину, предназначенному для устранения или замедления развития одного или более симптомов болезни Гентингтона; в частности, подобные симптомы могут быть выбраны из группы симптомов, обусловленных непроизвольными движениями, таких как хорея, тремор и подергивания, а также ухудшение походки.
цис
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению 3,11b--дигидротетрабеназина для приготовления лекарственной формы, предназначенной для устранения или замедления развития одного или более симптомов болезни Гентингтона; в частности, подобные симптомы могут быть выбраны из группы симптомов, обусловленных непроизвольными движениями, таких как хорея, тремор и подергивания, а также ухудшение походки.
цис
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу устранения или замедления развития одного или более симптомов болезни Гентингтона у пациента, нуждающегося в подобном лечении, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества 3,11b--дигидротетрабеназина; в частности, вышеуказанные симптомы могут быть выбраны из группы симптомов, обусловленных непроизвольными движениями, таких как хорея, тремор и подергивания, а также ухудшение походки.
В настоящее время существуют диагностические тесты, способные определять наличие мутантного гена, ответственного за развитие болезни Гентингтона. В том случае, если индивид является носителем мутантной формы этого гена, он неизбежно заболеет болезнью Гентингтона; таким образом, предотвращение, остановка или замедление развития симптомов болезни Гентингтона в период жизни подобного индивида, когда развитие БГ наиболее вероятно, является актуальной задачей.
цис
В соответствии с вышесказанным, в еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу профилактического лечения пациента, являющегося носителем мутантного гена, ответственного за развитие болезни Гентингтона; данный способ включает в себя введение пациенту -дигидротетрабеназина (в соответствии с тем, как определено выше) в терапевтически эффективном количестве для предотвращения или замедления субклинической прогрессии болезни Гентингтона.
Под субклинической прогрессией имеется в виду досимптоматическое с клинической точки зрения развитие заболевания, когда болезнь может быть диагностирована только биохимическими и визуализационными методами, такими как компьютерная (КТ) или магнитно-резонансная (МРТ) томография.
цис
Например, -дигидротетрабеназин может быть использован для профилактического приема индивидами в возрасте от 15 до 50 лет, например в возрасте от 20 до 50 лет, или от 25 до 50 лет, или от 30 до 50 лет, являющимися носителями мутантной формы гена HD, однако еще не развившие симптомы болезни Гентингтона.
Под мутантной формой гена, ответственного за развитие болезни Гентингтона (а также под синонимичными терминами), подразумевается форма гена IT-15, в которой число CAG-повторов составляет по меньшей мере 35, в более типичных случаях - по меньшей мере 40, например по меньшей мере 45 или 50. В некоторых случаях число CAG-повторов может быть очень большим (например, 70 и более), при этом индивиды, являющиеся носителями мутантного гена IT-15 со столь большим числом CAG-повторов, часто заболевают ювенильной формой болезни Гентингтона.
цис
Таким образом, еще в одном аспекте настоящего изобретения -дигидротетрабеназин может быть использован для профилактики индивидам в возрасте менее 30 лет, например в возрасте от 10 до 29 лет, в более типичных случаях - от 15 до 29 лет или от 20 до 29 лет, которые прошли тестирование на наличие мутантной формы гена IT-15 и у которых число CAG-повторов в этом гене составляет более 60, в частности по меньшей мере 65 и предпочтительно 70 и более.
цис
цис
Используемый в контексте настоящего изобретения -дигидротетрабеназин представляет собой 3,11b--дигидротетрабеназин.
цис
В контексте настоящего изобретения 3,11b--дигидротетрабеназин может использоваться практически в стереоизомерно чистом виде, например изомерная чистота может составлять более 90%, в типичных случаях более 95%, и предпочтительно более 98%.
цис
цис
Под «изомерной чистотой» в контексте настоящего изобретения подразумевается отношение количества 3,11b--дигидротетрабеназина в изомерной смеси к общему количеству или концентрации всех остальных изомерных форм дигидротетрабеназина в смеси. Если в композиции присутствует 90% дигидротетрабеназина, являющегося 3,11b--дигидротетрабеназином, тогда изомерная чистота составляет 90%.
цис
транс
транс
3,11b--дигидротетрабеназин в контексте настоящего изобретения может быть использован в виде композиции, в которой практически не содержится 3,11b--дигидротетрабеназина; количество 3,11b--дигидротетрабеназина в подобной композиции составляет менее 5%, более предпочтительно - менее 3%, и наиболее предпочтительно - менее 1%.
цис-
цис-
В настоящем тексте термин «3,11b-» означает, что атомы водорода при асимметрических центрах в положениях 3 и 11b структуры дигидротетрабеназина находятся в ориентации по отношению друг к другу. Таким образом, изомеры, обсуждаемые в настоящей заявке, представляют собой соединения общей формулы (I) и их антиподы (зеркальные отображения).
цис
цис
цис
Всего существует четыре возможных изомера дигидротетрабеназина, имеющих 3,11b--конфигурацию, которые представляют собой изомер 2S,3S,11bR, изомер 2R,3R,11bS, изомер 2R,3S,11bR и изомер 2S,3R,11bS. Все четыре изомеры были выделены и охарактеризованы, и еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к индивидуальным изомерам 3,11b--дигидротетрабеназина. В частности, настоящее изобретение относится к следующим изомерам 3,11b--дигидротетрабеназина:
цис
(а) 2S,3S,11bR-изомер 3,11b--дигидротетрабеназина согласно формуле (Ia):
цис
(b) 2R,3R,11bS-изомер 3,11b--дигидротетрабеназина согласно формуле (Ib):
цис
(c) 2R,3S,11bR-изомер 3,11b--дигидротетрабеназина согласно формуле (Ic):
цис
(d) 2S,3R,11bS-изомер 3,11b--дигидротетрабеназина согласно формуле (Id):
Индивидуальные изомеры согласно настоящему изобретению могут быть охарактеризованы по их спектроскопическим, оптическим и хроматографическим свойствам, а также по их абсолютным стереохимическим конфигурациям, определяемым рентгеноструктурным анализом.
Предпочтительными являются правовращающие (+)-изомеры.
цис
В особенности предпочтительным является изомер (Ia), т.е. 2S,3S,11bR-изомер 3,11b--дигидротетрабеназина.
Без имплицирования каких-либо частных абсолютных конфигураций или стереохимических свойств четыре новых изомера могут быть охарактеризованы следующим образом:
Изомер А
Оптическая активность по данным дисперсии оптического вращения (метанол, 21°С): левовращающий (-).
3
1
13
Данные ИК-спектроскопии (таблетка KBr), а также спектроскопии ЯМР (CDCl) на ядрах H и С приведены в таблице 1.
Изомер B
3
1
13
Оптическая активность по данным дисперсии оптического вращения (метанол, 21°С): правовращающий (+). Данные ИК-спектроскопии (таблетка KBr), а также спектроскопии ЯМР (CDCl) на ядрах H и С приведены в таблице 1, данные рентгеноструктурного анализа приведены в примере 4.
Изомер C
Оптическая активность по данным дисперсии оптического вращения (метанол, 21°С): правовращающий (+).
3
1
13
Данные ИК-спектроскопии (таблетка KBr), а также спектроскопии ЯМР (CDCl) на ядрах H и С приведены в таблице 2.
Изомер D
Оптическая активность по данным дисперсии оптического вращения (метанол, 21°С): левовращающий (-).
3
1
13
Данные ИК-спектроскопии (таблетка KBr), а также спектроскопии ЯМР (CDCl) на ядрах H и С приведены в таблице 2.
Значения показателя дисперсии оптического вращения для каждого из изомеров приведены ниже в разделе «Примеры», однако следует отметить, что подобные значения могут в значительной степени варьироваться в зависимости от степени очистки изомера, а также других параметров, таких как флуктуации температуры, а также эффекты остаточных молекул растворителя.
Каждый из энантиомеров А, B, C и D может существовать в виде энантиомерно чистого изомера, либо в виде смеси с другими энантиомерами согласно настоящему изобретению.
цис
Термины «энантиомерно чистый» и «энантиомерная чистота» в контексте настоящего изобретения относятся к количеству данного энантиомера 3,11b--дигидротетрабеназина и общего количества или концентрации всех других энантиомерных и изомерных форм дигидротетрабеназина, присутствующих в смеси. Например, если 90% содержащегося в композиции дигидротетрабеназина составляет единственный энантиомер, энантиомерная чистота составляет 90%.
Например, в каждом из аспектов и воплощений настоящего изобретения энантиомерная чистота каждого индивидуального энантиомера, выбранного из группы, состоящей из изомера А, изомера В, изомера С и изомера D, может составлять по меньшей мере 55% (например, по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 100%).
Изомеры согласно настоящему изобретению также могут находиться в составе смесей одного или более изомеров А, В, С и D. Подобные смеси могут быть рацемическими или нерацемическими. Примерами рацемических смесей могут служить рацемическая смесь изомеров А и B, а также рацемическая смесь изомеров С и D.
Фармацевтически приемлемые соли
В объеме настоящего изобретения упоминание изомеров дигидротетрабеназина также относится к солям дигидротетрабеназина (если контекст не указывает на обратное), в частности - к кислотно-аддитивным солям.
Кислоты, при помощи которых можно получить кислотно-аддитивные соли, включают в себя кислоты со значениями pKa менее 3,5, в более типичном случае - менее 3. Например, кислотно-аддитивные соли могут быть получены путем кислот, имеющих значение pKa, находящееся в диапазоне от +3,5 до -3,5.
Предпочтительные кислотно-аддитивные соли включают в себя соли, образованные с сульфоновой кислотой, такой как метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
Одним из примеров кислоты, которая может быть использована для получения солей присоединения, является метансульфоновая кислота.
«Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use»
Кислотно-аддитивные соли могут быть получены при помощи способов, описанных в настоящей заявке, либо при помощи химических методов, описанных в книге  под редакцией P. Heinrich Stahl и Camille G. Wermuth, ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 страниц, август 2002. Обычно, подобные соли могут быть получены путем взаимодействия свободной основной формы соединения с подходящим основанием или кислотой в воде или органическом растворителе, либо в их смесях; обычно используются неводные растворители, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил.
В типичном случае, подобные соли должны быть фармацевтическим приемлемыми солями. Соли, не являющиеся фармацевтически приемлемыми, могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов для получения фармацевтически приемлемых солей. Подобные соли, не являющиеся фармацевтически приемлемыми, также входят в объем настоящего изобретения.
Способы получения изомеров дигидротетрабеназина
Дигидротетрабеназин согласно настоящему изобретению может быть получен способом, включающим взаимодействие соединения формулы (II):
с реагентом или реагентами, пригодными для гидратирования 2-3 двойной связи, и, при необходимости - с последующим разделением и выделением желаемого изомера дигидротетрабеназина.
транс
Гидратирование двойной связи между атомами углерода 2 и 3 может быть проведено путем гидроборирования боран-содержащим реагентом, таким как диборан или боран-эфир (например, боран-тетрагидрофуран (ТГФ)), с получением алкилборанового интермедиата и последующим окислением полученного аддукта и финальным гидролизом в присутствии основания. Обычно гидроборирование проводится в безводных полярных апротонных растворителях, таких как простые эфиры (например, ТГФ), без использования повышенных температур, например при комнатной температуре. Боран-алкеновые аддукты обычно окисляют окисляющим агентом, таким как пероксид водорода, в присутствии основания, служащего источником гидроксид-ионов, такого как гидроксид аммония или гидроксид щелочного металла, например гидроксид натрия или калия. Цепочка реакций гидроборирования-окисления-гидролиза согласно процессу А обычно приводит к получению изомеров дигидротетрабеназина, в которых атомы водорода в положении 2- и 3- -ориентированы по отношению друг к другу.
Helv. Chim. Acta.
Соединения общей формулы (II) могут быть получены путем восстановления тетрабеназина до дигидротетрабеназина с последующей дегидратацией дигидротетрабеназина. Восстановление тетрабеназина может быть проведено при помощи алюмогидридных реагентов, например алюмогидрида лития, либо при помощи боргидридных реагентов (таких как боргидриды натрия или калия) или их борорганических аналогов, например алкилборгидридов, таких как три(втор-бутил)боргидрид лития. При другом подходе восстановление может быть проведено при помощи каталитического гидрогенирования, например, на никеле Ренея или оксиде платины. Подходящие условия подобных реакций восстановления описаны более подробно в патенте США № 2843591 (Hoffmann-La Roche), а также в работе Brossi с соавторами, , vol. XLI, № 193, стр. 1793-1806 (1958).
транс
транс
цис
Поскольку тетрабеназин, используемый в качестве исходного вещества в реакции восстановления, в типичном случае представляет собой смесь RR- и SS-изомеров (т.е. -тетрабеназин), получаемый в ходе восстановления дигидротетрабеназин имеет ту же самую -конфигурацию атомов водорода в положениях 3 и 11b, и его структура будет соответствовать одной или более известным формам изомеров дигидротетрабеназина, приведенным на фиг.3 (см. выше). Таким образом, процесс А подразумевает дегидратацию известных изомеров дигидротетрабеназина до алкена (II) с последующей «регидратацией» последнего в условиях, обеспечивающих получение новых изомеров -дигидротетрабеназина согласно настоящему изобретению.
3
5
Дегидратация дигидротетрабеназина до алкена (II) может быть проведена при помощи многих стандартных способов дегидратации спиртов до алкенов, см., например, учебник J. March (см.выше), стр. 389-390 и ссылки. Например, такие условия включают использование фосфорсодержащих дегидратирующих агентов, таких как галогениды и оксигалогениды фосфора, например POCl и PCl. В качестве альтернативы прямой дегидратации, гидроксильная группа дигидротетрабеназина может быть модифицирована в уходящую группу L, такую как галогенидная группа (например, хлорид- или бромид-группа), с последующим элиминированием (например, в присутствии основания) соответствующего галогеноводорода H-L. Превращение гидроксильной группы в галогенидную может быть проведена с использованием одного из способов, хорошо известных опытному химику-специалисту, например взаимодействием с тетрахлорметаном или тетрабромметаном в присутствии триалкил- или триарилфосфина, такого как трифенилфосфин или трибутилфосфин.
Тетрабеназин, используемый в качестве исходного вещества для восстановления с целью получения дигидротетрабеназина, является коммерчески доступным, а также может быть синтезирован при помощи способа, описанного в патенте США № 2830993 (Hoffmann-La Roche).
Другим способом (процесс B) получения дигидротетрабеназина согласно настоящему изобретению является способ, включающий стадию раскрытия 2,3-эпоксидного цикла в соединении формулы (III), в соответствующих условиях, и при необходимости - с последующим разделением и выделением желаемого изомера дигидротетрабеназина.
цис
Раскрытие эпоксидного цикла может быть проведено в соответствии с известными способами раскрытия эпоксидных циклов. В настоящее время предпочтительным способом раскрытия эпоксидного цикла является введение эпоксида в реакцию с восстанавливающим агентом, таким как комплекс боран-ТГФ. Реакция с аддуктом боран-ТГФ может быть проведена в полярных апротонных растворителях, таких как простые эфиры (например, тетрагидрофуран), обычно при комнатной температуре, с последующим гидролизом полученного боранового комплекса кипячением в присутствии основания. Процесс B обычно приводит к получению изомеров дигидротетрабеназина, в котором атомы водорода в положении 2- и 3- находятся в -ориентации по отношению друг к другу.
мета-
Эпоксиды общей формулы (III) могут быть получены эпоксидированием алкена формулы (II) (см. выше). Эпоксидирование может быть проведено при помощи способов, известных опытному химику-специалисту, см., например, учебник J. March (см.выше), стр. 826-829 и ссылки. В типичном случае, для проведения реакции эпоксидирования могут быть использованы перкислоты, такие как хлорпербензойная кислота (MCPBA), либо смеси перкислоты и окислителя, такого как хлорная кислота.
В случае, если в качестве исходного вещества в процессах А и B используются смеси энантиомеров, то конечными продуктами обычно бывают пары энантиомеров, например рацемические смеси; также возможно присутствие диастереомерных примесей. Нежелательные диастереомеры могут быть удалены из смеси различными способами, такими как хроматография (например, ВЭЖХ), а индивидуальные энантиомеры могут быть разделены при помощи ряда способов, известных опытному химику-специалисту. Например, индивидуальные энантиомеры могут быть получены путем:
(i) хиральной хроматографии (хроматография на хиральной неподвижной фазе);
(ii) образования соли с оптически чистой хиральной кислотой, разделением солей двух диастереомеров фракционной кристаллизацией и последующим отделением дигидротетрабеназина; или
(iii) образования производного, например, сложного эфира, с оптически чистым модифицирующим агентом, например агентом эстерификации, разделения полученных эпимеров (например, путем хроматографии) с последующим превращением производного в дигидротетрабеназин.
Один в особенности эффективный способ разделения энантиомерных пар, полученных в ходе любого из процессов А и B, включает в себя этерификацию гидроксильной группы дигидротетрабеназина оптически активной кислотой Мошера, таким как нижеприведенный R(+)-изомер, либо его активной формой:
Полученную смесь сложных эфиров двух энантиомеров дигидробеназина далее можно разделить хроматографией (например, ВЭЖХ) и индивидуальные эфиры гидролизовать до индивидуальных изомеров дигидробеназина при помощи основания, такого как гидроксид щелочного металла (например, NaOH) в полярном растворителе, таком как метанол.
втор
Альтернативно, вместо использования энантиомерных смесей в качестве исходных веществ в процессах А и В с последующим разделением индивидуальных энантиомеров процессы А и В могут быть проведены с использованием индивидуальных энантиомеров в качестве исходных веществ, что приводит к получению продуктов, в которых доминирует один энантиомер. Индивидуальные энантиомеры алкена (II) могут быть получены путем стереоселективного восстановления RR/SS-тетрабеназина три(-бутил)боргидридом лития до смеси SRR- и RSS-энантиомеров дигидротетрабеназина, последующего разделения индивидуальных энантиомеров (например, фракционной кристаллизацией) и затем дегидратации нужного индивидуального энантиомера дигидротетрабеназина с получением в значительной степени либо абсолютно стереоизомерно чистого энантиомера соединения (II).
Процессы А и В проиллюстрированы более подробно на схемах 1 и 2 соответственно.
Схема 1
транс
Схема 1 иллюстрирует процесс получения индивидуальных изомеров дигидротетрабеназина с конфигурацией хиральных центров 2S,3S,11bR и 2R,3R,11bS, в которых атомы водорода при углеродных атомах в положениях 2 и 3 находятся в -конфигурации по отношению друг к другу. Эта реакционная схема включает в себя вышеописанный процесс А.
транс
Исходным веществом в цепочке реакций согласно схеме 1 является коммерчески доступный тетрабеназин (IV), представляющий собой рацемическую смесь RR- и SS-оптических изомеров тетрабеназина. В каждом из этих RR- и SS-изомеров атомы водорода в положениях 3 и 11b находятся в -конфигурации по отношению друг к другу. В качестве альтернативы использованию коммерчески доступного тетрабеназина, последний может быть синтезирован в соответствии со способом, описанным в патенте США № 2830993 (см. пример 11).
втор
Рацемическую смесь RR- и SS-изомеров тетрабеназина восстанавливают боргидридным восстанавливающим агентом три(-бутил)боргидридом лития (так называемый «L-селектрид»), в результате чего получают смесь известных 2S,3R,11bR- и 2R,3S,11bS-изомеров дигидротетрабеназина (V); для простоты на схеме 1 показан лишь 2S,3R,11bR-изомер. За счет использования более «объемного» L-селектрида вместо боргидрида натрия, в ходе реакции восстановления создается стерическое затруднение образования RRR- и SSS-изомеров, в результате чего выход этих нежелательных продуктов минимизируется или подавляется.
Изомеры дигидротетрабеназина (V) далее вводят в реакцию с дегидратирующим агентом, таким как пентахлорид фосфора, в апротонном растворителе, таком как ди- или трихлорметан (хлористый метилен или хлороформ, соответственно, предпочтительно хлористый метилен (дихлорметан)), в результате чего получают ненасыщенное соединение (II) в виде пары энантиомеров, из которых на схеме показан только R-энантиомер. Реакцию дегидратации обычно проводят при температуре ниже комнатной, например около 0-5°С.
цис
транс
Ненасыщенное соединение (II) далее подвергают стереоселективной регидратации, при этом получают дигидротетрабеназин (VI) и его энантиомер (не показано), в которых атомы водорода в положениях 3 и 11b находятся в -конфигурации по отношению друг к другу, в то время как атомы водорода в положениях 2 и 3 находятся в -конфигурации по отношению друг к другу. Стереоселективную регидратацию проводят при помощи гидроборирования комплексом боран-ТГФ в тетрагидрофуране (ТГФ), в результате чего получают промежуточный борановый комплекс (не показано), который далее окисляется пероксидом водорода в присутствии основания, такого как гидроксид натрия.
Далее может быть проведен первоначальный этап очистки (например, при помощи ВЭЖХ), в результате которого получают продукт (V) реакции регидратации в виде смеси 2S,3S,11bS- и 2R,3R,11bS-изомеров, из которых на схеме показан только 2S,3S,11bR-изомер. Для разделения изомеров смесь обрабатывают R(+)-реактивом Мошера в присутствии оксалилхлорида и диметиламинопиридина (DMAP) в дихлорметане, в результате чего получают пару диастереомерных эфиров (VII) (показан только один диастереомер из пары), которые далее могут быть разделены при помощи ВЭЖХ. Индивидуальные эфиры могут быть далее подвергнуты гидролизу в присутствии гидроксида щелочного металла, такого как гидроксид натрия, в результате чего может быть получен индивидуальный изомер (VI).
В одном из вариантов реакционной цепочки согласно схеме 1, после восстановления RR/SS-тетрабеназина, полученную смесь энантиомеров дигидротетрабеназина (V) можно разделить на индивидуальные энантиомеры. Разделение может быть выполнено путем конверсии в смесь солей хиральной кислоты, такой как (+)- или (-)-камфорсульфоновая кислота, последующего разделения полученных диастереомеров фракционной кристаллизацией с получением солей индивидуальных энантиомеров и финальной обратной конверсии из индивидуальных солей в основания индивидуальных энантиомеров дигидротетрабеназина.
цис-
Полученный индивидуальный энантиомер дигидротетрабеназина может быть далее подвергнут дегидратации с получением индивидуального энантиомера алкена (II). Последующая регидратация алкена (II) даст преимущественно или исключительно один индивидуальный энантиомер дигидротетрабеназина (VI). Преимущество этого варианта состоит в том, что он не требует получения эфиров реагента Мошера и, соответственно, последующей хроматографии, обычно используемой для разделения эфиров реагента Мошера.
цис
Схема 2 иллюстрирует процесс получения индивидуальных изомеров дигидротетрабеназина с конфигурацией хиральных центров 2R,3S,11bR и 2S,3R,11bS, в которых атомы водорода при углеродных атомах в положениях 2 и 3 находятся в -конфигурации по отношению друг к другу. Эта реакционная схема включает в себя вышеописанный процесс B.
Схема 2
5
мета
В цепочке реакций согласно схеме 2 ненасыщенный алкен (II) получают путем восстановления тетрабеназина с получением 2S,3R,11bR- и 2R,3S,11bS-изомеров дигидротетрабеназина (V) c последующей дегидратацией PCl аналогично описанному в отношении схемы 1. Однако, вместо гидроборирования соединения (II), последнее подвергается эпоксидированию по 2,3-двойной связи -хлорпербензойной кислотой (MCPBA) в присутствии хлорной кислоты. Традиционно, реакцию эпоксидирования проводят в спирте, например, в метаноле обычно при комнатной температуре.
Эпоксид (VII) далее подвергают реакции восстановительного раскрытия эпоксидного цикла с использованием комплекса боран-ТГФ в качестве электрофильного восстанавливающего агента, в результате чего получают промежуточный боратный комплекс (не показано), который далее окисляется и расщепляется под действием пероксида водорода в присутствии щелочи, такой как гидроксид натрия, с образованием смеси 2R,3S,11bR- и 2S,3R,11bS-изомеров дигидротетрабеназина (VII), из которых для простоты показан только 2R,3S,11bR-изомер. Обработка смеси изомеров (VII) R(+)-реагентом Мошера в присутствии оксалилхлорида и диметиламинопиридина (DMAP) в дихлорметане приводит к образованию двух эпимерных эфиров (IX) (из которых только один эпимер показан на схеме), которые далее могут быть хроматографически разделены и гидролизованы гидроксидом натрия в метаноле аналогично описанному выше в отношении схемы 1.
Биологические свойства и терапевтическое использование
Терапевтические эффекты тетрабеназина обусловлены ингибированием везикулярного моноаминового транспортера VMAT2 в головном мозге, а также ингибированием как пре-, так и постсинаптических допаминовых рецепторов.
Новые изомеры дигидротетрабеназина согласно настоящему изобретению также являются ингибиторами VMAT2, причем изомеры C и B демонстрируют наиболее выраженный ингибирующий эффект. Подобно тетрабеназину, соединения согласно настоящему изобретению демонстрируют низкую аффинность к изоформе VMAT1, присутствующей в периферических тканях и некоторых клетках эндокринной системы, и, таким образом, не обладают побочными эффектами, характерными для резерпина. Соединения С и В также не оказывают ингибирующего действия на катехол-О-метил-трансферазу (СОМТ), А- и В-изоформы моноаминоксидазы, а также 1d- и 1b-изоформы 5-гидрокситриптамина.
Неожиданно оказалось, что эффект изомеров С и В на активность VMAT2 значительно отличается от такового в отношении допаминовых рецепторов - хотя эти изомеры обладают сильной VMAT2-связывающей активностью, они оба демонстрируют лишь слабое связывание с допаминовыми рецепторами, либо не связывают их вообще; также, эти изомеры не связываются с допаминовым транспортером (DAT). Действительно, ни один из этих изомеров не демонстрирует сколь-нибудь значимой DAT-связывающей активности. Это указывает на то, что эти соединения могут быть лишены допаминэргических побочных эффектов, характерных для тетрабеназина. Изомеры С и В также слабо- или неактивны в качестве ингибиторов адренэргических рецепторов, что указывает на то, что эти соединения могут быть лишены адренэргических побочных эффектов, часто развивающихся при приеме тетрабеназина. Действительно, исследования локомоторной активности, проведенные на крысах, указывают на то, что тетрабеназин демонстрирует дозозависимый седативный эффект, в то время как введение изомеров дигидротетрабеназина В и С согласно настоящему изобретению не ассоциировано с возникновением седативного эффекта.

Более того, оба изомера С и В являются мощными ингибиторами серотонинового транспортера SERT. Ингибирование SERT является одним из механизмов действия антидепрессантов, таких как флуоксетин (Прозак). Таким образом, способность изомеров С и В ингибировать SERT указывает на то, что данные изомеры также могут действовать как антидепрессанты, в отличие от тетрабеназина, одним из хорошо известных побочных эффектов которого является депрессия.
цис
Изомер В был протестирован в трансгенной мышиной модели болезни Гентингтона; было показано, что это соединение приостанавливает развитие многих симптомов болезни Гентингтона, в том числе непроизвольных движений, таких как хорея, тремор, подергивания, а также ухудшения походки. На основании завершенных к настоящему моменту исследований, представляется, что-дигидротетрабеназины согласно настоящему изобретению могут быть использованы для лечения болезни Гентингтона, в частности - для приостановки или замедления прогрессии заболевания, либо в профилактических целях для предотвращения развития БГ.
Данные соединения могут быть введены индивиду, нуждающемуся в подобном лечении, например человеку или животному, предпочтительно человеку.
В типичном случае, данные соединения должны вводиться в терапевтически или профилактически эффективных количествах, не являющихся в то же время токсичными. Однако в некоторых ситуациях положительные эффекты от введения дигидротетрабеназина могут «перевешивать» негативные аспекты лечения, ассоциированные с любыми токсическими или побочными эффектами - в этом случае, может быть желательным введение дигидротетрабеназина в количестве, ассоциированном с некоторой степенью токсичности.
Обычная дневная доза соединения согласно настоящему изобретению составляет до 1000 мг в день, например от 0,01 до 10 мг на килограмм массы тела, в более типичном случае от 0,025 до 5 мг на килограмм массы тела, например до 3 мг на килограмм массы тела, и в наиболее типичном случае - от 0,15 до 5 мг на килограмм массы тела, хотя при необходимости также могут быть использованы большие или меньшие дозы.
Например, первоначальная доза может составлять 12,5 мг при введении 2 или 3 раза в день. Дозу можно увеличивать на 12,5 мг в день каждые 3-5 дней, пока лечащий врач не констатирует достижение максимальной переносимой и эффективной дозы для данного конкретного индивида. В конечном счете, количество вводимого лекарства должно соответствовать природе заболевания или физиологического состояния, для лечения/коррекции которого проводится терапия данным препаратом, а также обуславливаться терапевтическим эффектом, наличием либо отсутствием побочных эффектов, ассоциированных с данным режимом дозирования, и его выбор находится в компетенции лечащего врача.
Фармацевтические композиции
В типичном случае, дигидротетрабеназины используются в виде фармацевтических композиций.
Фармацевтические композиции могут быть изготовлены в виде любой подходящей лекарственной формы, предназначенной для перорального, парентерального, топического, интраназального, внутрибронхиального, офтальмического, внутриушного, ректального, вагинального или внутридермального введения. В том случае, если композиции предназначены для парентерального введения, они могут быть получены в виде лекарственной формы, предназначенной для внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшного или подкожного введения, а также в виде лекарственной формы для прямой доставки лекарства к органу- или ткани-мишени путем инъекции, инфузии или каким-либо другим способом.
Пригодные для перорального приема лекарственные формы включают в себя таблетки, капсулы, каплеты, драже, пастилки, сиропы, растворы, спреи, порошки, гранулы, эликсиры и суспензии, подъязычные таблетки, спреи или пластинки и трансбуккальные пластинки.
Фармацевтические композиции, содержащие дигидротетрабеназин согласно настоящему изобретению, могут использоваться в виде любой лекарственной формы в соответствии с известными технологиями, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA.
Таким образом, таблетированные композиции могут содержать однократную дозу активного компонента вместе с инертным разбавителем или носителем, таким как сахар или полиол, например лактоза, сахароза, сорбитол или маннитол; и/или другими несахарными разбавителями, такими как карбонат натрия, фосфат кальция, тальк, карбонат кальция, или целлюлоза или ее производные, например метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, либо такими как крахмал, например кукурузный крахмал. Таблетки могут также содержать стандартные ингредиенты, такие как связывающие и гранулирующие агенты, такие как поливинилпирролидон, а также дезинтегранты (например, набухающие сетчатые полимеры, такие как перекрестно-сшитая карбоксиметилцеллюлоза), лубриканты (например, стеараты), консерванты (например, парабены), антиоксиданты (например, бутилокситолуол), буферизующие агенты (например, фосфатные или цитратные буферы) и агенты, придающие лекарственной форме «шипучесть» про контакте с водой, например смесь цитрат/гидрокарбонат. Подобные вспомогательные компоненты хорошо известны, и авторы не видят необходимости обсуждать их подробно в тексте настоящей заявки.
Лекарственные формы в виде капсул могут быть получены из твердого или мягкого желатина и содержать активный компонент в твердой, полутвердой или жидкой форме. Желатиновые капсулы могут быть изготовлены из желатина или его эквивалентов животного, синтетического или растительного происхождения.
Твердые лекарственные формы (например, таблетки, капсулы и т.д.) могут быть покрыты оболочкой или же не содержать ее, однако в большинстве случаев оболочка присутствует; подобная оболочка может представлять собой, например, защитную оболочку (например, воск, лакирующие вещества), или же оболочку, обеспечивающую контролируемое высвобождение активного вещества. Оболочка (например, Eudragit™-подобный полимер) может быть сделана таким образом, чтобы высвобождать активный компонент в желаемом отделе желудочно-кишечного тракта. Оболочка может быть подобрана таким образом, чтобы растворяться при определенном значении рН в желудочно-кишечном тракте, при этом избирательно высвобождая компоненты в желудке, в подвздошной или в двенадцатиперстной кишке.
Вместо, или же в дополнение к оболочке, препарат может быть заключен в твердый матрикс, содержащий также агент, контролирующий высвобождение активного компонента, к примеру, агент, задерживающий высвобождение, адаптированный для избирательного высвобождения композиции в зависимости от изменяющихся значений pH при продвижении по желудочно-кишечному тракту. В другом случае, матрикс может представлять собой оболочку из растворимого полимера (например, полимера малеинового ангидрида), которая непрерывно и постепенно разрушается при прохождении лекарственной формы по желудочно-кишечному тракту.
Композиции, предназначенные для топического использования, включают в себя мази, кремы, спреи, пластинки, гели, жидкие капли и аппликаторы (например, интраокулярные аппликаторы). Подобные композиции могут быть получены в соответствии с известными способами.
Композиции, предназначенные для парентерального введения, обычно представлены в виде стерильных водных или масляных растворов или высокодисперсной суспензии, либо в виде высокодисперсного стерильного порошка, который перед применением смешивается со стерильной водой для инъекций.
Лекарственные формы, предназначенные для ректального или вагинального введения, включают в себя пессарии и суппозитории, которые могут быть изготовлены из формующегося или воскоподобного материала, содержащего активный компонент.
Композиции, предназначенные для ингаляционного применения, могут быть представлены в виде ингалируемых порошков, или же жидких или порошковых спреев, которые можно использовать в стандартной форме при помощи порошковых ингаляционных устройств или аэрозольных диспергирующих устройств. Подобные лекарственные формы хорошо известны. Предназначенные для ингаляционного введения порошковые композиции обычно содержат активный компонент вместе с инертным твердым порошкообразным наполнителем, таким как лактоза.
Соединения согласно настоящему изобретению в общем случае могут быть включены в состав стандартной лекарственной формы и, таким образом, в типичном случае, подобные композиции содержатся в лекарственной форме в количестве, достаточном для достижения желаемого уровня биологической активности. Например, композиция, предназначенная для перорального приема, может содержать от 2 до 200 мг активного компонента, в типичном случае - от 10 до 100 мг, например 12,5 мг, 25 мг и 50 мг.
Активное соединение согласно настоящему изобретению может быть введено пациенту (например, человеку или животному), нуждающемуся в подобном лечении, в количестве, достаточном для достижения желаемого терапевтического эффекта.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Получение 2S,3S,11bR- и 2R,3R,11bS-изомеров дигидротетрабеназина
1А. Восстановление RR/SS-тетрабеназина

1M раствор L-селектрида в тетрагидрофуране (135 мл, 135 ммоль, 2,87 экв.) медленно добавляли на протяжении 30 минут к перемешиваемому раствору RR/SS-рацемической смеси тетрабеназина (15 г, 47 ммоль) в этаноле (75 мл) и тетрагидрофуране (75 мл) при 0°С. После завершения добавления смесь перемешивали при 0°С на протяжении 30 минут, после чего давали смеси нагреться до комнатной температуры.
Смесь выливали на дробленый лед (300 г) и добавляли 100 мл воды. Раствор экстрагировали диэтиловым эфиром (2 раза по 200 мл) и объединенные эфирные фракции промывали 100 мл воды и частично высушивали над безводным карбонатом калия. Высушивание завершали над безводным сульфатом магния и после фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении (защита от света, температура бани <20°С), в результате чего получали бледно-желтый твердый продукт.
Последний смешивали с петролейным эфиром (30-40°C) и фильтровали, в результате чего получали белый порошкообразный продукт (12 г, 80%).
1B. Дегидратация восстановленного тетрабеназина
Пентахлорид фосфора (32,8 г, 157,5 ммоль, 2,5 экв.) добавляли порциями на протяжении 30 минут к раствору полученного согласно примеру 1А восстановленного тетрабеназина (20 г, 62,7 ммоль) в дихлорметане (200 мл) при 0°С. После завершения добавления смесь перемешивали при 0°С на протяжении еще 30 минут, после чего реакционную смесь медленно выливали в 2М водный раствор карбоната натрия, содержащий дробленый лед (0°C). После окончания выделения кислого газа реакционную смесь защелачивали (pH 12) сухим карбонатом натрия.
Щелочной раствор экстрагировали этилацетатом (800 мл) и объединенные органические экстракты высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении, в результате чего получали коричневое масло, которое очищали на хроматографической колонке (силикагель, этилацетат) и получали получистый алкен в виде желтого твердого продукта (10,87 г, 58%).
1С. Гидратация неочищенного алкена, полученного согласно примеру 1В
К раствору неочищенного алкена (10,87 г, 36,11 ммоль), полученного согласно примеру 1В, в безводном ТГФ (52 мл), при комнатной температуре по каплям добавляли 1М аддукт боран-ТГФ (155,6 мл, 155,6 ммоль, 4,30 экв.). Реакционную смесь перемешивали 2 часа, добавляли 20 мл воды и полученный раствор защелачивали до pH 12 30% водным раствором гидроксида натрия.
К полученному щелочному раствору добавляли 30 мл 30% водного раствора пероксида водорода, реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 1 час, после чего охлаждали. К охлажденной смеси добавляли 100 мл воды и смесь экстрагировали этилацетатом (3 раза по 250 мл). Органические экстракты объединяли и высушивали над безводным сульфатом магния; после фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении, в результате чего получали желтое масло (9 г).
Масло очищали препаративной ВЭЖХ (колонка: Lichrospher Si60, 5 мкм, 250×21,20 мм; подвижная фаза: гексан:этанол:дихлорметан 85:15:5; УФ 254 нм; скорость потока 10 мл/мин), 350 мг на инъекцию, после чего нужные фракции высушивали в вакууме. Полученное масло растворяли в эфире и снова концентрировали в вакууме, в результате чего получали рацемат дигидротетрабеназина в виде желтого пенообразного вещества (5,76 г, 50%).
1D. Получение производных реагента Мошера
и
R-(+)-α-метокси-α-трифторметилфенилуксусную кислоту (5 г, 21,35 ммоль), оксалилхлорид (2,02 мл) и DMF (0,16 мл) добавляли к 50 мл безводного дихлорметана и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут. Раствор концентрировали при пониженном давлении и остаток снова смешивали с 50 мл безводного дихлорметана. Полученный раствор охлаждали в ледяной бане, после чего последовательно добавляли диметиламинопиридин (3,83 г, 31,34 ммоль) и предварительно высушенный над 4Е-ситами раствор твердого продукта, полученного согласно примеру 1С (5 г, 15,6 ммоль), в безводном дихлорметане. Реакционную смесь перемешивали в течение 45 минут, после чего добавляли 234 мл воды и смесь экстрагировали эфиром (2 раза по 200 мл). Эфирный экстракт высушивали над безводным сульфатом магния, пропускали через слой силикагеля и элюировали эфиром.
Собранный эфирный элюат концентрировали при пониженном давлении, в результате чего получали масло, которое очищали на хроматографической колонке (силикагель, гексан:эфир 10:1). После выпаривания и последующего удаления растворителя из собранных фракций при пониженном давлении полученный продукт далее снова очищали на хроматографической колонке (силикагель, гексан:этилацетат 1:1), в результате чего получали три основных компонента, которые далее частично разделяли на ВЭЖХ на эфиры Мошера, соответствующие пику 1 и пику 2.
В результате проведения препаративной ВЭЖХ (колонка: 2×Lichrospher Si60, 5 мкм, 250 × 21,20 мм; подвижная фаза: гексан:изопропанол 97:3; УФ 254 нм; скорость потока 10 мл/мин), загрузка 300 мг, с последующим концентрированием нужных фракций в вакууме, получали чистые эфиры Мошера.
Пик 1 (3,89 г, 46,5%)
Пик 2 (2,78 г, 33%)
Фракции, соответствующие двум хроматографическим пикам, подвергали гидролизу для высвобождения индивидуальных изомеров дигидротетрабеназина, которые были идентифицированы и охарактеризованы как изомеры А и В. Авторы считают, что каждый из изомеров А и В соответствует одной из следующих структур.
Более конкретно, авторы считают, что изомер В обладает абсолютной конфигурацией 2S,3S,11bR (по данным рентгеноструктурного анализа согласно примеру 4, см. ниже).
1Е. Гидролиз эфира Мошера, соответствующего пику 1, с образованием изомера А
20% водный раствор гидроксида натрия (87,5 мл) добавляли к раствору эфира Мошера, соответствующего пику 1 (3,89 г, 7,27 ммоль) в метаноле (260 мл), смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником с течение 150 минут. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляли 200 мл воды, раствор экстрагировали 600 мл эфира, сушили над безводным сульфатом магния и после фильтрации концентрировали при пониженном давлении.
Остаток растворяли в 200 мл этилацетата, раствор промывали водой (2 раза по 50 мл), органический слой высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрации концентрировали при пониженном давлении, в результате чего получали желтое пенообразное вещество. Полученный продукт очищали на хроматографической колонке (силикагель, градиентная элюция, градиент этилацетат:гексан 1:1 - этилацетат). Нужные фракции объединяли и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в эфире, после чего растворитель снова удаляли при пониженном давлении, в результате чего получали изомер А в виде не вполне белого пенообразного вещества (1,1 г, 47%).
1
13
Изомер А, который, по мнению авторов, обладает 2R,3R,11bS-конфигурацией (абсолютную стереохимию не изучали), был охарактеризован ЯМР-спектроскопией на ядрах Н и С, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ и дисперсией оптического вращения. Данные ИК- и ЯМР-спектроскопии, а также масс-спектрометрии для изомера А приведены в таблице 1; данные хиральной ВЭЖХ и дисперсии оптического вращения приведены в таблице 3.
1F. Гидролиз эфира Мошера, соответствующего пику 2, с образованием изомера B
20% водный раствор гидроксида натрия (62,5 мл) добавляли к раствору эфира Мошера, соответствующего пику 2 (2,78 г, 5,19 ммоль) в метаноле (185 мл), смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 150 минут. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляли 142 мл воды, раствор экстрагировали 440 мл эфира, сушили над безводным сульфатом магния и после фильтрации концентрировали при пониженном давлении.
Остаток растворяли в 200 мл этилацетата, раствор промывали водой (2 раза по 50 мл), органический слой высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрации концентрировали при пониженном давлении. К остатку добавляли петролейный эфир (30-40°С) и после еще одного концентрирования раствора в вакууме получали изомер В в виде белого пенообразного вещества (1,34 г, 81%).
1
13
Изомер B, который, по мнению авторов, обладает 2S,3S,11bR-конфигурацией, был охарактеризован ЯМР-спектроскопией на ядрах Н и С, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ, дисперсией оптического вращения и рентгеноструктурным анализом. Данные ИК- и ЯМР-спектроскопии, а также масс-спектрометрии для изомера В приведены в таблице 1; данные хиральной ВЭЖХ и дисперсии оптического вращения приведены в таблице 3. Данные рентгеноструктурного анализа приведены в примере 4.
ПРИМЕР 2
Получение 2R,3S,11bR- и 2S,3R,11bS-изомеров дигидротетрабеназина
2А. Получение 2,3-дегидротетрабеназина
5
Рацемическую смесь (15 г, 47 ммоль) RR- и SS-энантиомеров тетрабеназина (раствор в тетрагидрофуране) подвергали восстановлению L-селектридом аналогично описанному в примере 1А, в результате чего получали смесь 2S,3R,11bR- и 2R,3S,11bS-энантиомеров дигидротетрабеназина в виде белого порошка (12 г, 80%). Частично очищенный дигидротетрабеназин далее дегидратировали с использованием PCl аналогично описанному в примере 1В, в результате чего получали неочищенную смесь 11bR- и 11bS-изомеров 2,3-дегидротетрабеназина (ниже приведена структура 11bR-энантиомера) в виде желтого твердого продукта (12,92 г, 68%).
2В. Эпоксидирование неочищенного алкена, полученного согласно примеру 2А
К перемешиваемому раствору полученного согласно примеру 2А неочищенного алкена (12,92 г, 42,9 ммоль) в метаноле (215 мл) добавляли раствор 70% хлорной кислоты (3,70 мл, 43 ммоль) в метаноле (215 мл). В реакционную смесь добавляли 77% раствор 3-хлорпероксибензойной кислоты (15,50 г, 65 ммоль) и полученную смесь перемешивали 18 часов при комнатной температуре, предохраняя ее от света.
Реакционную смесь выливали в 200 мл насыщенного раствора сульфита натрия, после чего добавляли 200 мл воды. В полученную эмульсию добавляли 300 мл хлороформа и смесь защелачивали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (400 мл).
Органический слой собирали, а водный слой промывали дополнительной порцией хлороформа (2 раза по 150 мл). Объединенные хлороформные экстракты высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрации и удаления растворителя получали коричневое масло (14,35 г, выход >100% - возможно, растворитель частично остается в продукте). Полученный продукт использовали без дополнительной очистки.
2С. Восстановительное раскрытие эпоксидного цикла в неочищенном соединении, полученном согласно примеру 2В
К перемешиваемому раствору полученного согласно примеру 2В неочищенного эпоксида (14,35 г, 42,9 ммоль, подразумевая 100% выход) в безводном ТГФ (80 мл) медленно добавляли 1М раствор аддукта боран-ТГФ (184,6 мл, 184,6 ммоль) на протяжении 15 минут. Реакционную смесь перемешивали на протяжении двух часов, после чего добавляли 65 мл воды и полученный раствор при перемешивании кипятили с обратным холодильником в течение 30 минут.
После охлаждения в реакционную смесь последовательно добавляли 97 мл 30% раствора гидроксида натрия и 48,6 мл 30% раствора пероксида водорода, после чего реакционную смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником еще 1 час.
Охлажденную реакционную смесь экстрагировали 500 мл этилацетата, высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрации удаляли растворитель при пониженном давлении, в результате чего получали маслообразный продукт. К полученному маслу добавляли 230 мл гексана и раствор вновь концентрировали при пониженном давлении.
Маслообразный остаток очищали на хроматографической колонке (силикагель, этилацетат). Нужные фракции объединяли и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток еще раз очищали на хроматографической колонке (силикагель, градиентная элюция, градиент гексан-эфир). Нужные фракции объединяли, растворитель упаривали при пониженном давлении, в результате чего получали светло-желтый твердый продукт (5,18 г, 38%).
D. Получение эфирных производных реагента Мошера и 2R,3S,11bR- и 2S,3R,11bS-изомеров дигидротетрабеназина
2
R-(+)-α-метокси-α-трифторметилфенилуксусную кислоту (4,68 г, 19,98 ммоль), оксалилхлорид (1,9 мл) и DMF (0,13 мл) добавляли к 46 мл безводного дихлорметана и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут. Раствор концентрировали при пониженном давлении и остаток снова смешивали с 40 мл безводного дихлорметана. Полученный раствор охлаждали в ледяной бане, после чего последовательно добавляли диметиламинопиридин (3,65 г, 29,87 ммоль) и предварительно высушенный над 4Е-ситами раствор твердого продукта, полученного согласно примеру 2С (4,68 г, 14,6 ммоль), в безводном дихлорметане (20 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 45 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 234 мл воды и смесь экстрагировали эфиром (2 раза по 200 мл). Эфирный экстракт высушивали над безводным сульфатом магния, пропускали через слой силикагеля и элюировали эфиром.
Собранный эфирный элюат концентрировали при пониженном давлении, в результате чего получали масло, которое очищали на хроматографической колонке (силикагель, гексан:эфир 1:1). После выпаривания и последующего удаления растворителя из собранных фракций при пониженном давлении получали розовый твердый продукт (6,53 г).
В результате проведения препаративной ВЭЖХ (колонка: 2×Lichrospher Si60, 5 мкм, 250 × 21,20 мм; подвижная фаза: гексан:изопропанол 97:3; УФ 254 нм; скорость потока 10 мл/мин), загрузка 100 мг, с последующим концентрированием нужных фракций в вакууме, получали твердый продукт, который смешивали с петролейным эфиром (30-40°С) и фильтровали, в результате чего получали чистые эфирные производные реагента Мошера.
Пик 1 (2,37 г, 30%)
Пик 2 (2,42 г, 30%)
Фракции, соответствующие двум хроматографическим пикам, подвергали гидролизу для высвобождения индивидуальных изомеров дигидротетрабеназина, которые были идентифицированы и охарактеризованы как изомеры C и D. Авторы считают, что каждый из изомеров С и D соответствует одной из следующих структур:
2F. Гидролиз эфира Мошера, соответствующего пику 1, с образованием изомера C
20% водный раствор гидроксида натрия (53 мл) добавляли к раствору эфира Мошера, соответствующего пику 1 (2,37 г, 4,43 ммоль) в метаноле (158 мл), смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 150 минут. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляли 88 мл воды, раствор экстрагировали 576 мл эфира. Органические экстракты сушили над безводным сульфатом магния и после фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении. К остатку добавляли 200 мл этилацетата, раствор промывали водой (2 раза по 50 мл). Органический слой высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении.
Остаток обрабатывали петролейным эфиром (30-40°С) и суспендированный продукт отделяли фильтрованием. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, после чего вторая порция суспендированного продукта также была отделена фильтрацией. Обе порции продукта были объединены и высушены при пониженном давлении. Полученный продукт представляет собой изомер С (1,0 г, 70%)
1
13
Изомер С, который, по мнению авторов, обладает 2R,3S,11bR- или 2S,3R,11bS-конфигурацией (абсолютную стереохимию не изучали), был охарактеризован ЯМР-спектроскопией на ядрах Н и С, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ и дисперсией оптического вращения. Данные ИК- и ЯМР-спектроскопии, а также масс-спектрометрии для изомера С приведены в таблице 2; данные хиральной ВЭЖХ и дисперсии оптического вращения приведены в таблице 4.
2G. Гидролиз эфира Мошера, соответствующего пику 2, с образованием изомера D
20% водный раствор гидроксида натрия (53 мл) добавляли к раствору эфира Мошера, соответствующего пику 2 (2,42 г, 4,52 ммоль) в метаноле (158 мл), смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником на протяжении 150 минут. После охлаждения к реакционной смеси добавляли 88 мл воды, раствор экстрагировали 576 мл эфира, сушили над безводным сульфатом магния и после фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток обрабатывали 200 мл этилацетата, раствор промывали водой (2 раза по 50 мл), органический слой высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении.
Остаток обрабатывали петролейным эфиром (30-40°С) и суспендированный оранжевый продукт отделяли фильтрованием. Продукт растворяли в смеси этилацетат:гексан 15:85 и очищали на хроматографической колонке (силикагель, градиент этилацетат:гексан 15:85 - этилацетат). Нужные фракции объединяли и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток смешивали с петролейным эфиром (30-40°С) и полученную суспензию фильтровали. Отфильтрованный продукт высушивали при пониженном давлении. Полученное белое вещество представляет собой изомер D (0,93 г, 64%).
1
13
Изомер D, который, по мнению авторов, обладает 2R,3S,11bR- или 2S,3R,11bS-конфигурацией (абсолютную стереохимию не изучали), был охарактеризован ЯМР-спектроскопией на ядрах Н и С, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ и дисперсией оптического вращения. Данные ИК- и ЯМР-спектроскопии, а также масс-спектрометрии для изомера D приведены в таблице 2; данные хиральной ВЭЖХ и дисперсии оптического вращения приведены в таблице 4.
1
13
+
Приведенные в таблицах 1 и 2 данные ИК-спектроскопии получены с использованием таблеток KBr. Образцы для ЯМР-спектров на ядрах Н растворяли в дейтерированном хлороформе, спектры регистрировали на ЯМР-спектрометре Varian Gemini NMR spectrometer (200 МГц). Образцы для ЯМР-спектров на ядрах Н растворяли в дейтерированном хлороформе, спектры регистрировали на ЯМР-спектрометре Varian Gemini NMR spectrometer (50 МГц). Масс-спектры регистрировали при помощи спектрометра Micromass Platform II (ES-условия). Приведенные в таблицах 3 и 4 данные по дисперсии оптического вращения были получены при 24°С при помощи прибора Optical Activity PoIAAr 2001, образцы растворяли в метаноле. Времена удерживания в опытах по ВЭЖХ регистрировали на хроматографе HP1050HPLC с системой УФ-детекции.
Таблицы 1 и 2 - спектроскопические данные
Таблица 1
Изомер дигидротетрабеназина
<sup>1</sup>Н-ЯМР спектр, СDCl<sub>3</sub>
<sup>13</sup>C-ЯМР спектр, СDCl<sub>3</sub>
ИК-спектр (таблетка KBr)
Масс-спектр (ES<sup>+</sup>)
Изомеры А и B
<img file="00000025.tif" he="29" wi="41" img-content="undefined" img-format="tif" />или
<img file="00000026.tif" he="29" wi="42" img-content="undefined" img-format="tif" />
6,67δ 1Н (с)6,57δ 1Н (с)3,84δ 6Н (с)3,55δ 1Н (уш.д)3,08δ 1Н (м)2,79δ 2Н (м)2,55δ 3Н (м)2,17δ 1Н (м)1,72δ 6Н (м)1,02δ 1Н (м)0,88δ 6Н (т)
147,7δ147,6δ130,5δ127,6δ112,1δ108,4δ70,5δ57,5δ56,5δ56,3δ54,8δ53,2δ40,4δ40,1δ36,0δ28,8δ26,2δ23,7δ22,9δ
2950 см<sup>-1</sup>2928 см<sup>-1</sup>2868 см<sup>-1</sup>2834 см<sup>-1</sup>1610 см<sup>-1</sup>1511 см<sup>-1</sup>1464 см<sup>-1</sup>1364 см<sup>-1</sup>1324 см<sup>-1</sup>1258 см<sup>-1</sup>1223 см<sup>-1</sup>1208 см<sup>-1</sup>1144 см<sup>-1</sup>1045 см<sup>-1</sup>1006 см<sup>-1</sup>870 см<sup>-1</sup>785 см<sup>-1</sup>764 см<sup>-1</sup>
МН<sup>+</sup> 320
Таблица 2
Изомер дигидротетрабеназина
<sup>1</sup>Н-ЯМР спектр, СDCl<sub>3</sub>
<sup>13</sup>C-ЯМР спектр, СDCl<sub>3</sub>
ИК-спектр (таблетка KBr)
Масс-спектр (ES<sup>+</sup>)
Изомеры С и D
<img file="00000027.tif" he="31" wi="45" img-content="undefined" img-format="tif" />или
<img file="00000028.tif" he="33" wi="45" img-content="undefined" img-format="tif" />
6,68δ 1Н (с)6,58δ 1Н (с)3,92δ 1Н (м)3,84δ 6Н (с)3,15δ 1Н (м)2,87δ 3Н (м)2,43δ 4Н (м)1,81δ 1Н (м)1,64δ 4Н (м)1,21δ 1Н (м)0,94δ 3Н (д)0,89δ 3Н (д)
147,8δ147,7δ130,4δ127,2δ112,0δ108,3δ72,4δ61,2δ58,3δ56,5δ54,3δ52,7δ38,6δ36,7δ34,4δ29,6δ26,5δ24,4δ22,5δ
3370 см<sup>-1</sup>2950 см<sup>-1</sup>2929 см<sup>-1</sup>1611 см<sup>-1</sup>1512 см<sup>-1</sup>1463 см<sup>-1</sup>1362 см<sup>-1</sup>1334 см<sup>-1</sup>1259 см<sup>-1</sup>1227 см<sup>-1</sup>1148 см<sup>-1</sup>1063 см<sup>-1</sup>1024 см<sup>-1</sup>855 см<sup>-1</sup>766 см<sup>-1</sup>
МН<sup>+</sup> 320
Таблицы 3 и 4 - данные хроматографии и дисперсии оптического вращения
Таблица 3
Изомер дигидротетрабеназина
Методы хиральной ВЭЖХ ивремя удерживания
Дисперсия оптического вращения(MeOH, 21°C)
Изомеры А и B
<img file="00000029.tif" he="31" wi="43" img-content="undefined" img-format="tif" />или
<img file="00000030.tif" he="31" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
Колонка:Chirex (S)-VAL, (R)-NEA, 250×4,6 ммПодвижная фаза:гексан:1,2-дихлорэтан:этанол 36:62:2Скорость потока: 1,0 мл/минУФ: 254 нмВремя удерживания:Изомер А - 16,6 минИзомер B - 15,3 мин
Изомер А[α<sub>D</sub>] -114,6°
Изомер B[α<sub>D</sub>] +123°
Таблица 4
Изомер дигидротетрабеназина
Методы хиральной ВЭЖХ ивремя удерживания
Дисперсия оптического вращения(MeOH, 21°C)
Изомеры C и D
<img file="00000031.tif" he="32" wi="45" img-content="undefined" img-format="tif" />или
<img file="00000032.tif" he="31" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
Колонка:Chirex (S)-VAL, (R)-NEA, 250×4,6 ммПодвижная фаза:гексан:этанол 92:8Скорость потока: 1,0 мл/минУФ: 254 нмВремя удерживания:Изомер C - 20,3 минИзомер D - 19,4 мин
Изомер С[α<sub>D</sub>] +150,9°
Изомер D[α<sub>D</sub>] -145,7°
ПРИМЕР 3
Альтернативный способ получения изомера B и получение мезилатной соли
3А. Восстановление RR/SS-тетрабеназина

1М раствор L-селектрида в тетрагидрофуране (52 мл, 52 ммоль, 1,1 экв.) на протяжении тридцати минут медленно добавляли к охлаждаемому в ледяной бане раствору рацемата тетрабеназина (15 г, 47 ммоль) в тетрагидрофуране (56 мл). После окончания добавления смеси давали нагреться до комнатной температуры, после чего реакционную смесь перемешивали еще 6 часов. На этой стадии ТСХ-анализ (силикагель, этилацетат) демонстрировал присутствие лишь минорных количеств исходного вещества.
Далее, реакционную смесь выливали в перемешиваемую смесь дробленого льда (112 г), воды (56 мл) и ледяной уксусной кислоты (12,2 г). Полученный желтый раствор промывали эфиром (2 раза по 50 мл) и защелачивали медленным добавлением твердого карбоната натрия (около 13 г). После этого в реакционную смесь при перемешивании добавляли петролейный эфир (30-40°С) (56 мл), после чего неочищенный β-DHTBZ отделяли фильтрованием.
Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане (около 150 мл), полученный раствор промывали водой, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении до приблизительно 40 мл. Образовалась густая суспензия белого твердого вещества. К продукту прибавляли петролейный эфир (30-40°С) (56 мл) и суспензию перемешивали пятнадцать минут при комнатной температуре. Продукт отделяли фильтрованием и промывали на фильтре 40-60 мл петролейного эфира (30-40°С) до тех пор, пока продукт не становился снежно-белым. Промытый продукт высушивали на воздухе при комнатной температуре. ТСХ-анализ (силикагель, этилацетат) демонстрировал присутствие только одного вещества. Выход белого твердого β-DHTBZ составил 10,1 г, 67%.
3B. Получение и фракционная кристаллизация соли рацемического β-DHTBZ и камфорсульфоновой кислоты
Продукт, полученный в примере 3А, и 1 эквивалент (S)-(+)-камфор-10-сульфоновой кислоты при нагревании растворяли в минимальном количестве метанола. Полученному раствору давали остыть до комнатной температуры, после чего в раствор медленно добавляли эфир до прекращения формирования преципитата. Полученные белые кристаллы отделяли фильтрованием, промывали эфиром и высушивали.
Соль камфорсульфоновой кислоты (10 г) растворяли в горячей смеси абсолютных этанола (170 мл) и метанола (30 мл). Полученный раствор перемешивали и охлаждали. Через два часа сформировавшийся белый кристаллический преципитат отделяли фильтрованием (2,9 г). Навеску кристаллического продукта встряхивали в делительной воронке с избытком насыщенного водного раствора карбоната натрия и дихлорметаном. Органическую фазу отделяли, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали в петролейном эфире (30-40°С) и органический раствор концентрировали еще раз. По данным хиральной ВЭЖХ (колонка: Chirex (S)-VAL, (R)-NEA, 250×4,6 мм; Подвижная фаза: гексан:этанол 98:2; Скорость потока: 1,0 мл/мин) полученной соли, выделенный β-DHTBZ обогащен одним из энантиомеров (энантиомерный избыток (ее) около 80%).
Обогащенную соль камфорсульфоновой кислоты (14 г) растворяли в горячем абсолютном этаноле (140 мл) и добавляли 420 мл пропан-2-ола. Полученный раствор перемешивали; в ходе перемешивания преципитат начинал образовываться в течение минуты. Смеси давали остыть до комнатной температуры, после чего перемешивали еще один час. Полученный осадок отделяли фильтрованием, промывали эфиром и высушивали, в результате получая белый кристаллический порошок (12 г).
Полученный продукт встряхивали в делительной воронке с избытком насыщенного водного раствора карбоната натрия и дихлорметаном. Органическую фазу отделяли, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали в петролейном эфире (30-40°С) и органический раствор концентрировали еще раз. После высушивания в вакууме получали 6,6 г, β-DHTBZ (дисперсия оптического вращения +107,8°), в котором энантиомерный избыток (+)-β-DHTBZ составил более 97%.
3С. Получение изомера B
Раствор пентахлорида фосфора (4,5 г, 21,6 ммоль, 1,05 экв.) в дихлорметане (55 мл) постепенно на протяжении 10 минут добавляли к перемешиваемому, охлаждаемому в ледяной бане раствору полученного согласно описанному в примере 3В продукта (6,6 г, 20,6 ммоль) в дихлорметане (90 мл). Когда добавление было завершено, полученный желтый раствор перемешивали еще десять минут, после чего реакционную смесь выливали в быстро перемешивающуюся смесь раствора 15 г карбоната натрия в 90 мл воды и 90 г дробленого льда. Реакционную смесь перемешивают еще 10 минут, после чего помещают в делительную воронку.
После разделения фаз коричневый органический слой отделяли, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, в результате чего получали неочищенный алкеновый интермедиат в виде коричневого масла (около 6,7 г). По данным ТСХ-анализа (силикагель, этилацетат) в неочищенном продукте не осталось (+)-β-DHTBZ.
Неочищенный алкен в атмосфере сухого азота помещали в 40 мл безводного тетрагидрофурана, после чего в течение пятнадцати минут при перемешивании добавляли 52 мл (2,5 экв.) 1М раствора борана в ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. По данным ТСХ-анализа (силикагель, этилацетат) на этой стадии в реакционной смеси не оставалось алкенового интермедиата.
После этого к перемешиваемой реакционной смеси последовательно добавляли раствор 3,7 г гидроксида натрия в 10 мл воды и около 7 мл 50% водного раствора пероксида водорода. Полученную двухфазную смесь кипятили с обратным холодильником при перемешивании в течение одного часа. По данным ТСХ-анализа (силикагель, этилацетат) на этой стадии в реакционной смеси появляется продукт со значением Rf, ожидаемым для изомера В. Также детектируется характеристический неполярный компонент.
Реакционной смеси давали остыть до комнатной температуры, остывшую смесь помещали в делительную воронку. Верхний органический слой отделяли и концентрировали при пониженном давлении для удаления большей части ТГФ. Остаток смешивали с 75 мл стабилизированного BHT эфира, промывали 40 мл воды, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, в результате чего получали бледно-желтое масло (8,1 г).
Полученное масло очищали на хроматографической колонке (силикагель, градиентная элюция, градиент этилацетат:гексан 80:20 - 100% этилацетат), нужные фракции собирали, объединяли и концентрировали при пониженном давлении, в результате чего получали бледно-желтое масло, которое смешивали с 18 мл стабилизированного эфира и концентрировали при пониженном давлении, в результате чего получали изомер В в виде бледно-желтого пенообразного твердого вещества (2,2 г).
По данным хиральной ВЭЖХ, проведенной в соответствии с протоколом, описанным в примере 3B, энантиомерный избыток изомера В в полученном продукте составил более 97%.
D
Оптическое вращение полученного продукта [α] (поляриметр Bellingham Stanley ADP220) составило +123,5°.
3D. Получение мезилатной соли изомера В
Метансульфонатную соль изомера B получали путем растворения смеси 1 эквивалента изомера В, полученного согласно примеру 3C, и 1 эквивалента метансульфоновой кислоты, в минимальном количестве этанола с последующим добавлением диэтилового эфира. Полученный преципитат отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме, в результате чего получали продукт 96% чистоты (по данным ВЭЖХ) с 85% выходом.
ПРИМЕР 4
Рентгеноструктурный анализ изомера B
Соль изомера B и (S)-(+)-камфор-10-сульфоновой кислоты была получена в виде монокристалла и подвергнута рентгеноструктурному кристаллографическому исследованию. Параметры выполнения анализа приведены ниже:
Дифрактометр: Nonius KappaCCD area detector (t/i-сканирование и OJ-сканирование для заполнения асимметричных ячеек)
J. Appl. Cryst.
Определение параметров элементарной ячейки: DirAx (Duisenberg, A.J.M.(1992).  25, 92-96)
Cбор данных: Collect (Collect: Data collection software, R. Hooft, Nonius B.V., 1998).
Methods in Enzymology
Macromolecular Crystallography,
Редактирование данных и уточнение параметров элементарной ячейки: Demo (Z. Otwinowski & W. Minor,  (1997) Vol. 276:  part A, стр. 307- 326; C. W. Carter, Jr & R. M. Sweet, Eds., Academic Press).
Коррекция поглощения: Sheldrick, G. M. SADABS - Bruker Nonius area detector scaling and absorption correction - V2.\ 0.
Acta Cryst.
Расшифровка структуры: SHELXS97 (G. M. Sheldrick, (1990) A46 467-473).
Уточнение структуры: SHELXL97 (G. M. Sheldrick (1997), University of Göttingen, Germany).
Графика: Cameron - A Molecular Graphics Package (D. M. Watkin, L. Pearce и C K. Prout, Chemical Crystallography Laboratory, University of Oxford, 1993).
Примечания: все атомы водорода были помещены в идеализированные позиции и уточнены при помощи «riding»-модели, за исключением атомов водорода в NH- и OH-группах, которые были помещены на дифференциальную карту электронной плотности и уточнены при помощи граничных условий.
Хиральность: NI=R, CI2=S, CI3=S, CI5=R, C21=S, C24=R.
Результаты исследований приведены ниже в таблицах A, B, C, D и Е.
В нижеприведенных таблицах индекс RUS0350 относится к изомеру В.
<u>Таблица А</u>
Идентификационный код
2005bdy0585(RUS0350)
Эмпирическая формула
C<sub>29</sub>H<sub>45</sub>NO<sub>7</sub>S
<img file="00000034.tif" he="43" wi="43" img-content="undefined" img-format="tif" />
Молекулярный вес
551,72
Температура
120(2)K
Длина волны
0,71073 Ǻ
Кристаллическая решетка
Орторомбическая
Пространственная группа симметрии
<i>P</i>2<sub>1</sub>2<sub>1</sub>2<sub>1</sub>
Параметры элементарной ячейки
<i>a </i>= 7,1732(9) Ǻ
<i>b </i>= 12,941(2) Ǻ
<i>c</i> = 31,025(4) Ǻ
Объем
2880,1(7) Ǻ<sup>3</sup>
Z
4
Расчетная плотность
1,272 мг/м<sup>3</sup>
Коэффициент поглощения
0,158 мм<sup>-1</sup>
F(000)
1192
Кристалл
Бесцветная пластинка
Размер кристалла
0,2×0,2×0,04 мм<sup>3</sup>
Диапазон значений θ для сбора данных
3,06-27,37°
Диапазоны индексов
-8≤<i>h</i>≤9, -16≤<i>k</i>≤16, -36≤<i>l</i>≤39
Число зарегистрированных отражений
36802
Число независимых отражений
6326[R<sub>int</sub> = 0,0863]
Полнота, θ=27,37°
97,1%
Коррекция поглощения
Полуэмпирическая, с использованием эквивалентов
Максимальное и минимальное пропускание
0,9937 и 0,9690
Метод уточнения
Полноматричный, наименьшие квадраты, F<sup>2</sup>
Данные/граничные условия/параметры
6326/1/357
Точность соответствия F<sup>2</sup>
1,042
Финальные R-индексы [F<sup>2</sup>>2σ(F<sup>2</sup>)]
<i>R1</i> = 0,0498, <i>wR2</i> = 0,0967
R-индексы (все данные)
<i>R1</i> = 0,0901, <i>wR2</i> = 0,1108
Абсолютный структурный параметр
0,04(8)
Коэффициент экстинкции
0,0059(7)
Наибольший дифф. пик и провал
0,236 и -0,336 e Ǻ<sup>3</sup>
<u>Таблица B</u><u>Атомные координаты (×10</u><sup>4</sup><u>), параметры эквивалентного изотропного смещения [A</u><sup>2</sup><u>×10</u><sup>3</sup><u>] и факторы занятости сайтов. U</u><sub>eq</sub><u> представляет собой 1/3 следа ортогонализированного тензора U</u><sup>ij</sup><u>.</u>
<img file="00000035.tif" he="47" wi="125" img-content="undefined" img-format="tif" />
<u>Таблица С</u><u>Длины связей [А] и углы между связями [</u>°<u>].</u>
<img file="00000037.tif" he="69" wi="137" img-content="undefined" img-format="tif" /><img file="00000038.tif" he="201" wi="140" img-content="undefined" img-format="tif" />
<u>Таблица D</u><u>Параметры анизотропного смещения [A</u><sup>2</sup><u>×10</u><sup>3</sup><u>]. Экспонента анизотропного фактора смещения имеет вид: 2π</u><sup>2</sup><u>[h</u><sup>2</sup><u>a·</u><sup>2</sup><u>U</u><sup>11</sup><u>+…+2hka·b·U</u><sup>12</sup><u>]</u>
Атом
<i>U</i><sup>11</sup>
<i>U</i><sup>22</sup>
<i>U</i><sup>33</sup>
<i>U</i><sup>23</sup>
<i>U</i><sup>13</sup>
<i>U</i><sup>12</sup>
<img file="00000039.tif" he="184" wi="147" img-content="undefined" img-format="tif" />
<u>Таблица Е</u><u>Координаты атомов водорода (×10</u><sup>4</sup><u>) и параметры изотропного смещения [Е</u><sup>2</sup><u>×10</u><sup>3</sup><u>].</u>
<img file="00000040.tif" he="30" wi="137" img-content="undefined" img-format="tif" /><img file="00000041.tif" he="180" wi="131" img-content="undefined" img-format="tif" />
Таблица 6Водородные связи [Е] и углы между водородными связями [°]
D-H···A
d(D-H)
d(H···A)
d(D···A)
< (DHA)
N1-H98···O6N1-H98···S1O3-H99···O4<sup>i</sup>O3-H99···S1<sup>i</sup>
0,885(10)0,885(10)0,84(4)0,84(4)
1,895(12)2,914(14)1,94(4)2,98(4)
2,773(3)3,771(2)2,766(3)3,811(2)
171(3)163(3)165(3)169(3)
Симметричные трансформации для генерирования эквивалентных атомов (i)-x+2,y+1/2,-z+1/2.
Температурные эллипсоиды, уровень вероятности 30%.
На основании вышеприведенных данных можно приписать изомеру B конфигурацию 2S,3S,11bR, что соответствует формуле (Ia).
ПРИМЕР 5
Анализ эффекта изомера В в трансгенной мышиной модели болезни Гентингтона
HD
Мыши линии B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J (R6/2) являются трансгенными по 5'-концу человеческого гена, ответственного за развитие болезни Гентингтона (), который содержит регион с экспансией тринуклеотидных повторов CAG, в котором количество последних составляет от 115 до 150. У R6/2 трансгенных мышей наблюдается прогрессирующий неврологический фенотип, который повторяет многие характеристики болезни Гентинтона, включая хорееподобные движения, непроизвольные стереотипные движения, тремор и эпилептические припадки. У них наблюдается учащенное мочеиспускание и потеря веса на протяжении течения болезни. Симптомы проявляются между 6 и 8 неделями жизни.
Исследование было проведено с целью определения эффекта изомера В в описанных трансгенных мышах - модели болезни Гентингтона, для чего с ними был проведен ряд поведенческих тестов.
Методы
Самок трансгенных мышей линии B6CBа-Tg(HDexon1)62Gpb/1J (Jackson Laboratory, США) рассаживали в клетки по 5 особей в многостимульных условиях, в световом 12/12-часовом цикле (свет с 7 часов утра до 7 часов вечера), при комнатной температуре (21±2°С) и влажности 50±15%. Мыши получали промышленный мышиный корм (для разведения мышей и крыс, № 9341 Provimi Kliba, Швейцария) и водопроводную воду.
Раствор изомера В в кукурузном масле вводили по 5 мг/кг внутрибрюшинно один раз в день в течение четырех дней мышам, достигнувшим возраста 10 недель.
В дни тестирования на животных были проведены следующие тесты по протоколам, описанным в нижеследующих разделах:
1. Упрощенный тест Ирвина
.
За два часа до обследования животных рассаживали по одному животному на клетку. Первые измерения были проведены в индивидуальных клетках. Были задокументированы (при наличии) спазмы, тремор, стереотипия и вокализация животных. Затем животных поместили на открытую площадку размером 58,5 × 68,5 см с бортиком высотой 6 см и наблюдали их поведение в течение 3 минут, в ходе чего определяли характер передвижения животных. Также фиксировали наличие или отсутствие спазмов, тремора и стереотипии. По прошествии 3 минут также записывали количество оставшихся фекальных шариков и лужиц мочи. После тестирования мышей возвращали в индивидуальные клетки.
2. Локомоторная активность
.
Мышей помещают в прозрачную пластиковую коробку с дном 30 x 30 см в комнате с малой освещенностью (не более 20 лк). Локомоторная активность оценивалась в течение 10 минут с помощью анализатора видеоизображения (Videotrack, View Point, Lyon, France). Измеряли количество, расстояние и среднюю скорость ходильных движений животных. После тестирования мышей возвращали в их домашние клетки.
3. Rotarod (Тест вращающегося стержня).
В течение двух последовательных дней перед первым введением препарата мышей тренировали на приборе Rotarod. Мышей помещали на вращающийся ускоряющийся стержень (Ugo Basile, Italy) не более чем на 450 секунд. Мыши проходили два тренировочных этапа, первый - 300 секунд со скоростью 4 оборота в минуту, второй - 150 секунд со скоростью 40 оборотов в минуту. Интервал между этапами занимал один час. В день тестирования каждая мышь проходила одну тест-тренировку согласно вышеописанному. В каждом тесте фиксировали, когда мышь упала со стержня, или же констатировали, что животное продержалось на стержне все 450 секунд. После тестирования мышей возвращали в их домашние клетки.
Результаты тестов приведены в Таблицах 5-9.
Экспериментальный протокол
Количество индивидов в исследуемых группах: 10.
Группа 1: Гемизиготные трансгенные мыши B6CBA-Tg(HDexon 1)62Gpb/1J, которым вводили кукурузное масло без тестируемого вещества (плацебо-контроль) внутрибрюшинно по одному разу в день в течение 4 дней (день 0 - день 3)
Группа 2: Гемизиготные трансгенные мыши B6CBA-Tg(HDexon 1)62Gpb/1J, которым вводили 5 мг/кг тестируемого вещества внутрибрюшинно один раз в день в течение 4 дней (день 0 - день 3)
Протокол тестирования
Мышей в возрасте 10 недель тестировали согласно нижеописанной схеме перед вводом препарата (день 0) и в каждый из последующих 3 экспериментальных дней:
День -2
- Тренировка на вращающемся стержне (Rotarod), два этапа с интервалом 1 час.
День -1
- Тренировка на вращающемся стержне (Rotarod), два этапа с интервалом 1 час.
День 0
- Упрощенный тест Ирвина.
- Тест на локомоторную активность, сразу же после упрощенного теста Ирвина.
- Тест на вращающемся стержне (Rotarod), сразу же после теста на локомоторную активность.
- Введение тестируемого вещества через 1 час после теста Rotarod.
- Упрощенный тест Ирвина через 40 минут после введения.
- Тест на локомоторную активность, сразу же после упрощенного теста Ирвина.
День 1
.
- Введение тестируемого вещества.
- Упрощенный тест Ирвина через 40 минут после введения.
- Тест на вращающемся стержне (Rotarod), сразу же после упрощенного теста Ирвина.
День 2
.
- Введение тестируемого вещества.
- Упрощенный тест Ирвина через 40 минут после введения.
- Тест на вращающемся стержне (Rotarod), сразу же после упрощенного теста Ирвина.
День 3
.
- Введение тестируемого вещества.
- Упрощенный тест Ирвина через 40 минут после введения.
- Тест на локомоторную активность, сразу же после упрощенного теста Ирвина.
Статистический анализ
.
+graphics
Результаты упрощенного теста Ирвина анализировали при помощи непараметрического U - теста Манна-Уитни. Результаты теста на локомоторную активность анализировали при помощи Т-теста Даннетта. Результаты теста на вращающемся стержне (Rotarod) анализировали при помощи непараметрического U - теста Манна-Уитни. Статистический анализ данных проводили при помощи программы Statview SE software, Brain Power.
Таблица 5Эффект изомера В в трансгенной мышиной модели болезни ГентингтонаФаза I. Эффективность в острой фазе, введение вещества в Дни 0-3 - Упрощенный тест Ирвина
Кукурузное масло, 10 мл/кг внутрибрюшинно
День 0 до введения
День 0 после введения
День 1
День 2
День 3
День 17
День 21
День 24
День 27
День 31
Домашняя клетка
Спазмы
-
-
-
0,78±0,48
0,67±0,44
Х
Х
Х
Х
Х
Тремор-подергивания
1,33±0,17
1,00±0,27
0,78±0,22
0,88±0,13
1,44±0,29
Х
Х
Х
Х
Х
Стереотипия
-
-
-
0,11±0,11
-
Х
Х
Х
Х
Х
Умывание (с)
21,00±8,49
4,00±4,00
1,33±1,33
14,22±8,18
11,67±7,72
Х
Х
Х
Х
Х
Вокализация
-
-
-
-
-
Х
Х
Х
Х
Х
Открытая площадка
n=2/8
n=2/8
n=3/7
Спазмы
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Тремор-подергивания
2,11±0,26
1,89±0,11
2,22±0,15
1,89±0,20
1,67±0,24
2,78±0,15
2,69±0,29
3,38±0,25
2,00±0,25
2,71±0,25
Стереотипия
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Умывание (сек)
18,89±10,50
40,89±15,82
26,00±13,43
45,67±16,53
44,33±9,07
24,67±8,18
20,63±8,90
29,50±8,67
30,63±12,5
21,29±9,53
Походка
1,22±0,46
0,89±0,35
0,56±0,29
1,33±0,47
2,33±0,24
2,89±0,11
2,75±0,15
2,88±0,28
2,25±0,50
3,14±0,30
Вокализация
-
-
-
-
-
0,22±0,22
0,50±0,31
0,25±0,24
0,50±0,31
1,14±0,36
Дефекация(кол-во шариков)
1,67±0,50
1,33±0,29
1,00±0,33
1,67±0,29
2,22±0,40
1,11±0,56
1,75±0,43
1,25±0,39
1,50±0,31
1,57±0,42
Мочеиспускание (кол-во лужиц)
0,44±0,24
0,22±0,15
0,33±0,24
0,22±0,15
0,11±0,11
0,22±0,15
0,50±0,18
0,13±0,12
0,00±0,00
0,00±0,00
<u>Изомер В, 5 мг/кг внутрибрюшинно</u>
День 0 до введения
День 0 после введения
День 1
День 2
День 3
День 17
День 21
День 24
День 27
День 31
Домашняя клетка
Спазмы
0,22±0,22
0,13±0,13
-
-
0,11±0,11
X
X
X
X
X
Тремор-подергивания
1,44±0,24
1,13±0,30
1,00±0,24
0,78±0,15
1,00±0,29
X
X
X
X
X
Стереотипия
-
-
-
-
-
X
X
X
X
X
Умывание (с)
10,00±7,07
7,38±6,54
-
7,78±6,13
4,22±4,22
X
X
X
X
X
Вокализация
-
-
-
-
-
X
X
X
X
X
Открытая площадка
Спазмы
-
0,67±0,67
0,11±0,11
-
-
0,67±0,67
-
-
-
Тремор-подергивания
2,11±0,11
1,89±0,26
2,33±0,17
2,00±0,24
1,78±0,36
1,44±0,24*
1,67±0,22*
2,44±0,18*
2,11±0,39
2,67±0,24
Стереотипия
-
0,11±0,11
-
-
-
-
-
-
-
-
Умывание (с)
19,44±6,92
3,11±2,45
7,78±4,34
20,56±6,94
12,67±6,71**
20,33±7,49
17,67±6,33
18,22±8,25
25,33±8,14
19,11±8,71
Походка
1,11±0,39
0,33±0,24
1,00±0,33
0,67±0,37
2,33±0,33
1,56±0,34*
1,67±0,37*
2,17±0,12<sup>a</sup>
2,56±0,24
2,33±0,29
Вокализация
0,44±0,29
0,22±0,22
0,67±0,33*
0,89±0,35
0,89±0,35*
0,22±0,22
0,44±0,29
0,44±0,29
0,00±0,00
0,22±0,22
Дефекация(кол-во шариков)
2,56±0,50
1,44±0,50
0,89±0,26
1,22±0,43
1,33±0,33
2,67±0,76
2,44±0,53
1,33±0,55
2,33±0,58
1,44±0,38
Мочеиспускание(кол-во лужиц)
0,67±0,44
0,44±0,34
0,11±0,11
0,33±0,24
0,11±0,11
0,22±0,15
0,11±0,11
0,33±0,17
0,44±0,18*
0,11±0,11
-: Никогда не наблюдали (приравнено к 0,00 ± 0,00);а:р = 0,06 в сравнении с контрольной группой (U - тест Манна-Уитни)X: наблюдения не проводили*;**: статистически значимое отличие от контрольной группы (р < 0,05; р < 0,01), U - тест Манна-Уитни
Таблица 6Эффект изомера В в трансгенной мышиной модели болезни Гентингтона.Фаза I. Эффективность в острой фазе - Тест на локомоторную активность. Средние значения результатов.День 0, до введения вещества
Неподвижность
Активное передвижение
Введенное вещество
Продолжительность (с)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Скорость (см/с)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
140±17
292±34
126±17
14,2±0,8
RUS-3505 мг/кг (внутрибрюшинно)
149±27
309±37
128±16
13,2±0,5
День 0, 40 минут после введения вещества
Неподвижность
Активное передвижение
Введенное вещество
Продолжительность (с)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Скорость (см/с)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
199±16
205±14
84±8
14,0±0,7
RUS-3505 мг/кг (внутрибрюшинно)
184±31
280±41
99±13
13,0±0,5
День 2, 40 минут после введения вещества
Неподвижность
Активное передвижение
Введенное вещество
Продолжительность (с)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Скорость (см/с)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
171±15
245±22
104±9
14,1±0,7
RUS-3505 мг/кг (внутрибрюшинно)
134±18
322±40
123±14
13,9±0,7
Таблица 7Эффект изомера В в трансгенной мышиной модели болезни Гентингтона.Фаза I. Эффективность в острой фазе - Тест на локомоторную активность. Средние значения результатов относительно результатов до введения вещества.День 0, до введения вещества
Неподвижность
Активное передвижение
Введенное вещество
Продолжительность (с)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Скорость (см/с)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
0±0
0±0
0±0
0,0±0,0
RUS-3505 мг/кг (внутрибрюшинно)
0±0
0±0
0±0
0,0±0,0
День 0, 40 минут после введения вещества
Неподвижность
Активное передвижение
Введенное вещество
Продолжительность (с)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Скорость (см/с)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
60±20
-87±24
-42±10
-0,2±0,4
RUS-3505 мг/кг (внутрибрюшинно)
36±30
-29±41
-29±15
-0,1±0,5
День 2, 40 минут после введения вещества
Неподвижность
Активное передвижение
Введенное вещество
Продолжительность (с)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Скорость (см/с)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
31±10
-47±23
-21±11
-0,1±0,7
RUS-3505 мг/кг (внутрибрюшинно)
-15±27
13±42
-6±16
0,7±0,7
Таблица 8Эффект изомера В в трансгенной мышиной модели болезни Гентингтона.Фаза I. Эффективность в острой фазе - Тест на локомоторную активность. Средние значения результатов.День 24
Неподвижность
Активное передвижение
Введенное вещество
Продолжительность (с)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Скорость (см/с)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
36±20
741±152
136±22
11,8±0,6
RUS-3505 мг/кг (внутрибрюшинно)
67±42
818±168
148±34
11,2±0,9
Таблица 9Эффект изомера В в трансгенной мышиной модели болезни Гентингтона.Фаза I. Эффективность в острой фазе, введение вещества в Дни 0-3 - тест на вращающемся стержне (Rotarod).
Время до падения с вращающегося стержня (сек) после ежедневного введения изомера В
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
Изомер В5 мг/кг (внутрибрюшинно)
День 0 до первого введения
76,9±16,6
68,4±17,7
День 1
76,2±18,3
91,4±18,1
День 3
52,9±15,7
59,4±11,2
День 9
46,0±13,1
29,0±12,1
День 17
26,0±9,2
30,0±11,0
День 21
18,5±8,6
22,1±7,3
День 24
20,9±11,1
14,8±4,3
День 27
20,1±11,9
15,8±5,2
День 31
16,1±9,8
7,8±2,4
Время до падения с вращающегося стержня (с) относительно дня 0 (до первого введения вещества)
Кукурузное масло,10 мл/кг (внутрибрюшинно)
Изомер В5 мг/кг (внутрибрюшинно)
День 1-0
-0,7±13,0
23,0±9,8
День 3-0
-24,0±10,9
-9,0±11,9
День 9-0
-32,1±9,7
-39,7±9,9
День 17-0
-51,3±15,2
-38,2±13,1
День 21-0
-64,3±13,3
-46,3±15,5
День 24-0
-61,9±12,0
-53,7±16,8
День 27-0
-62,6±13,1
-52,7±16,2
День 31-0
-72,3±16,4
-60,7±16,2
Полученные результаты показывают, что несмотря на то что и у контрольных мышей и у мышей, которым вводили изомер В, можно было наблюдать некоторый прогресс в проявлениях характерных симптомов болезни Гентингтона в течение первых трех дней после введения вещества, у мышей, которым вводили изомер В, наблюдалось значительно менее выраженное ухудшение состояния по сравнению с мышами контрольной группы в период с 17 по 24 день после введения вещества. В частности, ухудшение походки практически отсутствовало или же замедлялось в этот период времени, при этом частота непроизвольных движений, таких как хорея или тремор, у мышей, которым вводили изомер В, не увеличивалась после 21-го дня по сравнению с частотой этих же непроизвольных движений до введения изомера В. Исходя из этого можно предположить, что повторное введение изомера В через определенные интервалы времени (что не было сделано в тесте) может предотвратить или же значительно замедлить развитие симптомов болезни Гентингтона в еще большей степени.
Таким образом, полученные результаты показывают, что изомер В может эффективно предотвращать или же замедлять развитие симптомов болезни Гентингтона.
ПРИМЕР 6
Сравнение седативных свойств тетрабеназина и изомеров В и С дигидротетрабеназина
Данное исследование было проведено на крысах с целью определения седативных свойств изомеров дигидротетрабеназина согласно настоящему изобретению. Эффект данных изомеров на спонтанную локомоторную активность у крыс сравнивали с таковым для тетрабеназина и галоперидола, используя нижеследующие методы. Результаты представлены в Таблице 10.
Методы
Для исследования были использованы самцы крыс Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Saint-Germain/L'Arbresle, France) весом 200-250 г на момент начала исследования. Крысы были рассажены по 2-3 особи в клетку (клетки Makrolon тип III) в следующих условиях: температура воздуха 20±2°С, влажность воздуха не менее 45%, проветривание (> 12 циклов полной смены воздуха в час), световой цикл 12/12 часов (свет с 7 часов утра до 7 часов вечера). Крысам давали адаптироваться к экспериментальным условиям в течение не менее пяти дней перед началом исследования. Крыс без ограничения обеспечивали кормом (Dietex, Vigny, France, № 811002) и водопроводной водой в поилке.
Растворы каждого тестируемого вещества в кукурузном масле были приготовлены непосредственно в день эксперимента. Галоперидол растворяли в 0,5% растворе гидроксиэтилцеллюлозы в деионизированной воде. Плацебо-контроль (растворитель+все компоненты раствора без исследуемого вещества) или раствор тестируемого вещества вводились единой дозой (0,3, 1, 3 и 10 мг/кг, 2 мл/кг внутрибрюшинно). Контрольное вещество (галоперидол, 1 мг/кг) вводилось внутрибрюшинно, 2 мл/кг.
Животных рассаживали в плексигласовые клетки в комнате с видеокамерой, где поддерживалась слабая освещенность (не более 50 лк). Локомоторную активность крыс оценивали в течение 20 минут через 45 минут и через 3 часа после введения вещества с помощью анализатора видеоизображения (Videotrack, View Point, France). Локомоторную активность в контрольной группе (галоперидол) оценивали через 1 час после введения вещества. Измеряли количество и продолжительность передвижений, а также продолжительность пребывания крыс в неподвижном состоянии. В конце измерения локомоторной активности (45 минут и 3 часа) оценивали закрытость век и пробуждение крыс по следующей шкале:
Закрытость век:
0: (норма) веки широко открыты
1: веки слегка моргают
2: птоз, веки закрываются, не открывшись наполовину
3: веки полностью закрыты.
Пробуждение (эраузл):
1: активация сильно снижена, ступор, кома, слабая или никакой ответной реакции
2: активация снижена, некоторый ступор, вялость, наблюдаются некоторые движения головы и тела
3: активация снижена, легкий ступор, некоторые попытки осмотреться с периодами неподвижности
4: активация в норме, тревога, попытки осмотреться, некоторая заторможенность
5: активация повышена, некоторое возбуждение, напряжение, неожиданные метания с периодами неподвижности
6: активация сильно повышенная, сильная тревога, возбуждение, неожиданные передвижения или телодвижения.
Количество и продолжительность (в секундах) передвижений и продолжительность периодов неподвижности измеряли в течение двух отрезков времени продолжительностью каждый по 20 минут (через 45 минут и 3 часа после введения вещества) с помощью анализатора видеоизображения (Videotrack, ViewPoint, Ly on, France). Съемку производили видеокамерой, расположенной над плексигласовой клеткой, которая фиксировала общую локомоторную активность. Видеоизображения, снятые видеокамерой, оцифровали, а перемещения центра тяжести точек цифрового изображения записывали и анализировали следующим методом: скорость перемещения центра тяжести точки цифрового изображения измеряли, после чего устанавливали два пороговых значения для определения типа движения: пороговое значение 1 (высокая скорость передвижения) и пороговое значение 2 (низкая скорость передвижения). Когда при движении животного скорость перемещения центра тяжести точки изображения находилась выше порогового значения 1, то такое движение считалось активным передвижением. Когда животное не проявляло активности и скорость оставалась ниже порогового значения 2, то это считалось неподвижным периодом.
Результаты представлены средним значением величины ± SEM (стандартная ошибка среднего) для каждой из 12 особей. Статистический анализ проведен с помощью одностороннего теста ANOVA и Т-теста Даннетта, а также с помощью непараметрического теста Крускала-Уоллиса, после которого был применен U-тест Манна-Уитни для характеристики седативного эффекта. Отличия, характеризуемые значениями р < 0,05, считались статистически значимыми.
Протокол
Величина группы: 12.
Группа 1. Контрольная, галоперидол (1 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 2. Плацебо-контроль (вещество-носитель) (2 мл/кг внутрибрюшинно)
Группа 3. Тетрабеназин (0,3 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 4. Тетрабеназин (1 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 5. Тетрабеназин (3 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 6. Тетрабеназин (10 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 7. Изомер С (0,3 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 8. Изомер С (1 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 9. Изомер С (3 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 10. Изомер С (10 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 11. Изомер В (0,3 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 12. Изомер В (1 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 13. Изомер В (3 мг/кг внутрибрюшинно)
Группа 14. Изомер В (10 мг/кг внутрибрюшинно)
Результаты.
Таблица 10
Эффект тетрабеназина, изомера В, изомера С (0,3, 1, 3 и 10 мг/кг внутрибрюшинно) на проявления спонтанной локомоторной активности у крыс
Время наблюдения: 45 минут после введения вещества
Активное передвижение
Неподвижность
Введенное вещество
Дозировка (мг/кг)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Продолжительность (с)
Вещество-носитель
2 мл/кг
286±35
76,4±10,9
349,0±37,4
Галоперидол
1 мг/кг
58±33**
14,8±8,5**
637,2±60,1**
Тетрабеназин
0,3 мг/кг
253±32
66,8±10,7
390,4±37,4
Тетрабеназин
1 мг/кг
189±32
46,5±8,6
456,5±50,5
Тетрабеназин
3 мг/кг
38±25**
8,7±5,9**
697,8±39,7**
Тетрабеназин
10 мг/кг
1±1**
0,2±0,2**
723,1±46,5**
Изомер С
0,3 мг/кг
285±34
79,2±10,0
323,7±25,6
Изомер С
1 мг/кг
295±30
71,8±8,3
324,6±38,1
Изомер С
3 мг/кг
308±36
84,0±9,4
322,7±27,8
Изомер С
10 мг/кг
254±32
66,5±9,9
368,7±30,9
Изомер В
0,3 мг/кг
268±36
72,0±9,6
346,1±36,9
Изомер В
1 мг/кг
297±22
87,0±7,6
334,0±23,2
Изомер В
3 мг/кг
313±38
89,1±12,4
342,2±33,3
Изомер В
10 мг/кг
298±37
84,0±11,2
333,1±26,9
время наблюдения: 3 часа после введения вещества
Активное передвижение
Неподвижность
Введенное вещество
Дозировка (мг/кг)
Количество (число раз)
Продолжительность (с)
Продолжительность (с)
Вещество-носитель
2 мл/кг
101±23
24,8±6,0
540,9±37,5
Галоперидол
1 мг/кг
9±8**
2,2±2,0**
723,6±50,2**
Тетрабеназин
0,3 мг/кг
96±14
24,3±4,2
545,9±37,1
Тетрабеназин
1 мг/кг
90±16
21,5±4,0
556,9±31,1
Тетрабеназин
3 мг/кг
9±4**
1,7±0,9**
729,9±26,8**
Тетрабеназин
10 мг/кг
3±1**
0,6±0,3**
762,1±40,7**
Изомер С
0,3 мг/кг
113±19
31,4±6,0
519,3±33,7
Изомер С
1 мг/кг
128±24
30,3±6,5
510,2±44,9
Изомер С
3 мг/кг
125±22
30,2±5,5
493,6±38,5
Изомер С
10 мг/кг
164±30
42,7±8,0
465,7±49,0
Изомер В
0,3 мг/кг
101±29
28,9±9,2
566,4±44,3
Изомер В
1 мг/кг
125±18
34,5±6,2
525,8±28,6
Изомер В
3 мг/кг
113±17
31,1±6,5
530,5±38,0
Изомер В
10 мг/кг
120±26
30,9±6,4
515,0±53,0
** Статистически значимые отличия от плацебо-контроля (р<0.01), односторонний тест ANOVA с последующим тестом Даннета
По результатам эксперимента можно заключить, что тетрабеназин демонстрирует дозозависимый седативный эффект через 45 минут и 3 часа после введения, тогда как изомеры В и С не демонстрируют подобного эффекта независимо от времени, хотя изомер С демонстрирует слабый незначительный гиперлокомоторный эффект через 3 часа после введения.
ПРИМЕР 7
Фармацевтические композиции
(i) Лекарственная форма в виде таблеток I.
Композицию в виде таблеток, содержащих дигидротетрабеназин согласно настоящему изобретению, готовят путем смешивания 50 мг дигидротетрабеназина и 197 мг лактозы (ВР) в качестве разбавителя с добавлением 3 мг стеарата магния в качестве лубриканта и последующим формированием таблетки.
(ii) Лекарственная форма в виде таблеток I.
Композицию в виде таблеток, содержащих дигидротетрабеназин согласно настоящему изобретению, готовят путем смешивания основного компонента (25 мг) с оксидом железа, лактозой, стеаратом магния, белым кукурузным крахмалом и тальком с последующим формированием таблетки.
(iii) Лекарственная форма в виде капсул.
Композицию в виде капсул готовят путем смешивания 100 мг дигидротетрабеназина согласно настоящему изобретению со 100 мг лактозы, после чего смесь помещают в стандартные непрозрачные твердые желатиновые капсулы.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Легко понять, что многие модификации и изменения конкретных воплощений описанного выше изобретения могут быть реализованы без отступления от принципов, лежащих в основе настоящего изобретения. Все подобные модификации и изменения должны рассматриваться как входящие в объем настоящего изобретения.