Перспективы применения рентгенофлуоресцентной спектроскопии в фармакопейном анализе

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ РЕНТГЕНОФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ В ФАРМАКОПЕЙНОМ АНАЛИЗЕ

А.В. Пихтарь, Е.В. Кириченко, О.А. Ваганова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: Даны краткий исторический обзор и описание возможностей и преимуществ применения метода рентгенофлуоресцентной спектроскопии с полным внешним отражением первичного излучения для проведения элементного анализа лекарственных средств в сравнении с другими методами. Возможности применения метода показаны на примере качественного и количественного определения цинка в субстанциях и готовых лекарственных формах инсулина, при разработке методик определении свинца и никеля в субстанциях декстрозы и маннитола.

Ключевые слова: элементный анализ, рентгенофлуоресцентная спектроскопия с полным внешним отражением первичного излучения, фармакопейный анализ, инсулины.

PERSPECTIVES OF USING X-RAY FLUORESCENCE SPECTROSCOPY IN PHARMACOPOEIAL ANALYSIS

A.V. Pikhtar, E.V. Kirichenko, O.A. Vaganova

Abstract: The following article contains a brief historical background and a description of capabilities and advantages of using X-ray fluorescence spectroscopy with total external reflection of primary radiation for performing elemental analysis of medicines, comparing to other methods. The capabilities of the mentioned method are demonstrated as exemplified by qualitative and quantitative research of zinc in substances and finished dosage forms of insulin, when developing methods of lead and nickel identification in dextrose and mannitol substances.

Key words: elemental analysis, X-ray fluorescence spectroscopy with total external reflection of primary radiation, pharmacopoeial analysis, insulins.

Оценка качества, безопасности и эффективности лекарственных средств (ЛС) часто сопряжена с необходимостью проведения их элементного анализа. Содержание того или иного элемента может влиять на фармакологическую активность, диагностические или фармацевтические свойства ЛС. Например, присутствие ионов цинка в составе препаратов инсулина в строго определенных количествах необходимо для обеспечения их стабильности и требуемого профи -ля действия. С другой стороны, присутствие целого ряда элементов подлежит строгой регламентации по причине их токсических свойств или отрицательного влияния на фармацевтические свойства ЛС. Необходимость строгой регламентации относится к группе тяжелых металлов, к мышьяку, ртути, алюминию, а также к целому ряду других элементов, включая железо, кадмий, медь, никель, палладий и др.

В целом актуальность и значение элементного анализа для принятия решения о соответствии того или иного ЛС фармакопейным требованиям представляется очевидной.

Анализ ведущих зарубежных фармакопей, а также Государственной фармакопеи XI и XII изданий, частных фармакопейных статей и нормативных документов показал, что для определения элементов, в том числе для предельных тестов, главным образом используются методы:

1. Атомно-абсорбционной/эмиссионной спектрометрии (ААС/АЭС) с пламенной или электротермической атомизацией (ПА/ЭТА).

2. Атомно-эмиссионной спектрометрии (АЭС) и масс-спектрометрии (МС) с индуктивно-связанной плазмой (ИСП).

3. Ионообменной хроматографии в сочетании с электрохимическим или спектрофотометрическим детектированием (ИОХ).

4. Потенциометрии с использованием ион-селективных электродов (ПТМ).

5. Спектрофотометрии (СФМ).

6. Рентгенофлуоресцентной спектрометрии с волновым разрешением.

7. Химические методы (ХМ).

Элементный анализ с использованием рентгенофлуоресцентной спектрометрии (РФС ВР) основан на измерении интенсивности вторичного флуоресцентного излучения, испускаемого атомами пробы под воздействием потока первичного рентгеновского излучения. Теоретические положения, сведения об аппаратном оформлении эксперимента, основные аналитические приложения и процедуры, включая анализ источников погрешности метода, детально описаны в литературе [1,2].

В общем случае интенсивность флуоресценции элемента зависит от его содержания в пробе, а также

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

влияния основы (матрицы), в которой проводится определение. В принципе метод позволяет определять все элементы от бора ^=5) до урана ^=92). Определение следов элементов, а также концентрации примесных и основных элементов может быть выполнено из одной пробы. В зависимости от способа, которым измеряют характеристики вторичного рентгеновского излучения, различают рентгенофлуоресцентную спектрометрию с разрешением по длинам волн (РФС ВР) и с энергетическим разрешением (РФС ЭР).

Рентгенофлуоресцентная спектрометрия с энергетическим разрешением в варианте полного внешнего отражения первичного излучения (РФС ЭР ПВО) является относительно новым инструментальным методом элементного анализа [3].

Впервые явление полного внешнего отражения падающего под малым углом к поверхности образца первичного рентгеновского излучения описал А. Комптон в 1923 г. [4,5]. Началом второго этапа развития метода считается публикация в 1971 г. японских исследователей [5,6], в которой авторы рассмотрели возможность применения этого физического явления для целей рентгеноспектрального анализа. Одновременно были определены абсолютные количества около 100 нг хрома, железа, никеля и цинка. Рассчитанные пределы обнаружения оказались равными 1,9; 1,7; 1,5; 5,1 нг соответственно.

Перспективная идея не сразу обратила на себя внимание и была переоценена лишь в конце 70-х — начале 80-х годов в работах ученых из Австрии и Германии [5,7,8]. Ими были разработаны и изготовлены первые прототипы спектрометров с полным внешним отражением первичного излучения. Промышленный выпуск модуля в совокупности с разработкой приемлемых способов подготовки излучателей привели к быстрому расширению областей применения метода при определении следов элементов в геологии, биологии и контроле окружающей среды. Ежегодное число публикаций в этот период не превышало 10 [5].

Следующий, третий, период в развитии метода ознаменовался бурным расширением исследований и существенным ростом ежегодного числа публикаций до 100 [9,10]. Рядом исследователей начало этого периода относится к середине 80-х годов [5].

В 1984 г. Эйджинджер выступил на конференции в Денвере с лекцией на тему «Рентгеновская спектрометрия полного отражения», затем в 1986 г. Прэндж организовал первую конференцию по рентгеновской спектрометрии с полным внешним отражением [5].

По состоянию на настоящий момент метод не получил еще широкого распространения при определении элементов в ЛС, несмотря на то что потенциал метода в этом отношении, по-нашему мнению, значителен.

Преимущества метода при сравнении с указанными выше фармакопейными методами анализа суммированы в табл. 1.

Принцип РФС ЭР ПВО заключается в том, что при падении первичного излучения на подложку с образцом под очень маленьким, около 0,3—0,6 градусов, углом оно отражается атомами верхнего слоя излучателя под действием эффекта полного внешнего отражения (рис. 1).

Часть излучения первичного пучка поглощается атомами исследуемого образца, нанесенного в виде тонкого слоя на специальный отражатель. Характеристическое флуоресцентное излучение от образца регистрируется полупроводниковым детектором. Детектор размещается над образцом. При такой геометрии регистрируется в основном флуоресцентное излучение. Если в дополнение к этому первичное излучение монохроматизируется, например, с использованием многослойных кристаллов, то для регистрируемого спектра получается очень низкий уровень фона, что, в свою очередь, позволяет достигать очень низких пределов обнаружения (около нескольких частей на миллиард) [5]. Одновременно регистрируется спектр для всего диапазона определяемых элементов, например, от бора, натрия или алюминия до урана.

Особенностью подготовки пробы к анализу является необходимость получения тонких образцов. При этом устраняется проблема взаимных влияний элементов, а также матрицы на результаты определений.

Когда анализу подвергаются жидкие образцы или суспензии, фиксированное их количество наносят пипеткой (обычно 5—20 мкл) на держатель и высушивают. Такой способ имеет ограничения в отношении проб, для которых сушка невозможна или же при сушке происходит улетучивание части компонентов пробы. Для анализа твердых образцов их предварительно суспендируют в подходящем растворителе.

Как и в общем случае с использованием большинства других фармакопейных методов анализа для гомогенизации неоднородных проб, обычно рекомендуется их измельчение, истирание или растворение.

Технически методом РФС ЭР ПВО могут быть проанализированы также отдельные частицы. При этом частицу фиксируют на держателе с помощью вакуумной смазки.

В качестве материала держателя (отражателя) используют чистый кварц, сапфир, стеклоуглерод, акрил, кремний, германий, ниобий, тантал. Естественно, что в спектре образца будут присутствовать излучения элементов, из которых состоит отражатель.

Качественный анализ с помощью РФС ЭР ПВО прост и основан на точном измерении энергии наблюдаемых флуоресцентных (характеристических) линий. В сравнении с РФС ВР идентификация элементов может быть несколько затруднена из-за от-

Таблица 1

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДОВ ЭЛЕМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Фармакопейный метод Преимущества метода РФС ЭР ПВО

ААС/АЭС с ПА/ЭТА АЭС/МС с ИСП — возможность одновременного определения элементов от В или А1 до и; — практически отсутствует необходимость в каких-либо расходных материалах и сменных деталях; — матричные эффекты минимальны; — прямой анализ жидкостей, суспензий, твердых частиц; — без применения горючих газов; — относительно низкая стоимость одного анализа

РФС ВР — матричные эффекты минимальны

СФМ — возможность одновременного определения элементов от В или А1 до и; — практически отсутствует необходимость в каких-либо расходных материалах и сменных деталях; — матричные эффекты минимальны; — прямой анализ жидкостей, суспензий, твердых частиц; — без применения токсичных реактивов; — простая процедура пробоподготовки; — относительно низкая стоимость одного анализа

ИОХ — возможность одновременного определения элементов от В или А1 до и; — практически отсутствует необходимость в каких-либо расходных материалах и сменных деталях; — матричные эффекты минимальны; — прямой анализ жидкостей, суспензий, твердых частиц; — без применения токсичных реактивов; — простая процедура пробоподготовки; — относительно низкая стоимость одного анализа

— возможность одновременного определения элементов от В или А1 до и;

— высокая специфичность метода;

— матричные эффекты минимальны;

— прямой анализ жидкостей, суспензий, твердых частиц

— возможность одновременного определения элементов от В или А1 до и;

— высокая специфичность метода;

ХМ — матричные эффекты минимальны;

— прямой анализ жидкостей, суспензий, твердых частиц; — относительно простая процедура пробоподготовки; — без применения токсичных реактивов

носительно низкого разрешения спектральных линий. Имеющееся программное обеспечение для качественного анализа помогает спектроскописту, показывая КЬМ-маркеры на спектре. Маркеры показывают теоретическое положение К-, Ь- и М-линий элемента как вертикальные линии. Когда эти линии совпадают с наблюдаемыми максимумами пиков в спектре, элемент идентифицируют положительно.

Количественный анализ в РФС ЭР ПВО выполняют в большинстве случаев с использованием внутреннего стандарта, в качестве которого обычно выбирают элемент, не содержащийся в пробах. Внутренний стандарт позволяет уменьшить влияние неоднородности распределения материала на отражателе.

Возможность применения РФС ЭР ПВО для анализа ЛС была показана сотрудниками лаборатории биотехнологических препаратов Испытательного центра ФГБУ «НЦЭСМП» Минз-дравсоцразвития России на примере разработки унифицированной методики качественного и количественного определения цинка в субстанциях и

готовых лекарственных формах инсулина, зарегистрированных в России.

Исследования проводили на спектрометре типа Б2 РІСІГОХ (Вгикег АХБ, Германия), оснащенном острофокусной рентгеновской трубкой с анодом из молибде-

Рис 1. Принципиальная схема измерения в методе РФС ЭР ПВО

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

на (размер пятна 1*1 мм; мощность 50 Вт), многослойным плоским монохроматором (М/С), кремниевым дрейфовым детектором типа SDD ХИаБИ (активная зона 10 мм2). Содержание цинка в препарате определяли по линии Zn ка (2000 мА) с использованием кобальта в качестве внутреннего стандарта (линия Со ка (1900 мА).

Результаты валидации методики показали, что разработанная методика позволяет получать достоверные, воспроизводимые результаты, сопоставимые с результатами определения методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) в соответствии с методикой утвержденного нормативного документа (табл. 2).

Таблица 2

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИНКА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ НА ОСНОВЕ ИНСУЛИНА

Номер серии Содержание цинка, мкг/мл; %

РФС ЭД ПВО ААС (норма) Отклонение, %

Апидра, раствор для подкожного введения 100 МЕ/мл, 3 мл

0И029А 0,25 мкг/мл не определяется -

Инсуман Рапид ГТ, раствор для инъекций 100 МЕ/мл, 3 мл

0И010А 14,6 мкг/мл 14,3 мкг/мл (10,0-40,0) + 2,1

Лантус, 100 МЕ/мл, раствор для подкожного введения в картриджных системах ОптиКлик, 3 мл

0И016А 30,3 мкг/мл 30,7 мкг/мл (27,0-33,0) -1,3

Биосулин Н, суспензия для подкожного введения 100 МЕ/мл, 3 мл

360610 19 мкг/мл 17 мкг/мл (не более 40) + 11,8

Хумалог Микс 25, суспензия для подкожного введения 100 МЕ/мл, 3 мл

А6839Ш 24 мкг/мл 24 мкг/мл (14-35) 0

Инсуман Рапид ГТ, раствор для инъекций 100 МЕ/мл, 5 мл

40С429/144 13,6 мкг/мл 13,6 мкг/мл (10-40) 0

Биосулин Р, раствор для инъекций 100 МЕ/мл, 10 мл

140610/150 13 мкг/мл 14 мкг/мл (не более 40) -7,1

Хумулин МЗ, суспензия для подкожного введения 100 МЕ/мл, 10 мл

А691719А/157 25,8 мкг/мл 26,7 мкг/мл (20-40) 3,4

Хумулин НПХ, суспензия для подкожного введения 100 МЕ/мл, 10 мл

А721344Е/158 27,1 мкг/мл 25,7 мкг/мл (21-40) +5,4

Хумулин Регуляр, раствор для инъекций 100 МЕ/мл, 10 мл

А723704С/160 15,0 мкг/мл 16,0 мкг/мл (10-40) -6,2

Ринсулин Р, раствор для инъекций 100 МЕ/мл, 10 мл

030710/162 13,7 мкг/мл 13,9 мкг/мл (не более 40) -1,4

Ринсулин НПХ, суспензия для подкожного введения 100 МЕ/мл, 10 мл

020710/163 13,6 мкг/мл 14,1 мкг/мл (не более 40) -3,5

Рекомбинантный человеческий инсулин, субстанция

SIHR 9230 0,36 % - не более 1,00% -

Рис. 2. Спектр пробы образца препарата «Инсуман Рапид ГТ, раствор для инъекций 100 МЕ/мл, 3 мл (картриджи)» серии 0F010A производства «Авентис Фарма Дойчланд ГмбХ», Германия

Рис. 3. Спектр пробы образца препарата «Ринсулин НПХ, суспензия для подкожного введения 100 МЕ/мл, 10 мл (флаконы)» серии 020710 производства ОАО «Национальные биотехнологии», Россия

Рис. 4. Спектр пробы образца субстанции «Рекомбинантный человеческий инсулин» серии SШR9234 производства «Диосинт Франсе», Франция

Типичные спектры проб субстанции человеческого инсулина и различных лекарственных форм инсулина приведены на рис. 2—4.

Положительные результаты были получены также при разработке методик определении свинца и никеля в субстанциях декстрозы и маннитола.

Совокупность метрологических характеристик метода, таких как низкий предел обнаружения, достаточно высокая прецизионность, широкий диапазон определяемых элементов в сочетании с высокой специфичностью, сравнительно низкое мешающее влияние матрицы, а также простота процедур калибровки и пробоподготовки позволяют рекомендовать применение метода РФС ЭР ПВО для решения задач фармакопейного анализа в качестве альтернативного методам атомноабсорбционной спектрометрии с пламенной или электротермической атомизацией, масс-спектрометрии и атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивносвязанной плазмой.

ЛИТЕРАТУРА__________________________________

1. Handbook of Practical X-ray fluorescence analysis/ Ed. By B. Beckhoff, B. Kanngiesser, N. Landgoff, R. Wedell, H. Wolff. Berlin/Heidelberg: Springer, 2006. P. 863.

2. Lachance G., Claisse F. Quantitative X-ray fluorescence analysis: theory and Applications. Chichester: Wiley 1995.

3. Wobrauschek P Total-reflection X-ray fluorescence analysis - a review// X-Ray Spectrometry, 2007. V.36. № 5. P. 289-300.

4. Блохин М.А. Физика рентгеновских лучей /

2-е изд. М.: ГИТТЛ, 1957. 518 с.

5. Ревенко А.Г Особенности методик анализа геологических образцов с использованием рентгенофлуоресцентных спектрометров с полным внешним отражением // Аналитика и контроль. 2010. Т. 14. № 2. С. 42-64.

6. Yoneda Y, Horiuchi T. Optical flats for the use in X-ray spectrochemical microanalysis // Rev. Sci. Instruments. 1971. V. 42. P. 1069-1070.

7. Wobrauschek P, Aiginger H. Total-reflection X-ray fluorescence spectrometric determination of elements in nanogram amount // Anal. Chem. 1975. V.47. P 852-855.

8. Knoth J., Schwenke H. An X-ray fluorescence spectrometer with totally reflecting sample support for trace analysis at the ppb level // Fresenius Z. Anal. Chem. 1978. V.291. P 200-204.

9. Injuk J., Van Grieken R. Literature trends in X-ray emission spectrometry for the period 1990-2000 - a review // X-Ray Spectrometry 2003. V.32. № 1. P 35-39.

10. Von Bohlen A. Total-reflection X-ray fluorescence and grazing incidence X-ray spectrometry - Tools for micro- and surface analysis. A review// Spectrochim. Acta. Part B.

2009. V.64. №10. P 821-832.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ