Изучение влияния этилметилгидроксипиридин гемисукцината на гемостаз

УДК 612.1

Н. И. Микуляк, Ю. А. Кинзирская, А. И. Микуляк, Л. В. Ионичева

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭТИЛМЕТИЛГИДРОКСИПИРИДИН ГЕМИСУКЦИНАТА НА ГЕМОСТАЗ

Изучено влияние нового антиоксиданта, производного 3-оксипиридина, близкого по химической структуре к мексидолу, - этилметилгидроксипиридин гемисукцината на гемостаз животных. Показано, что исследуемый препарат как и мексидол, оказывает сходное влияние на гемостаз, но с менее выраженным цитопротекторным действием.

Работы по созданию новых противоопухолевых средств направлены на получение таких препаратов, которые при максимально ингибирующем воздействии на опухолевые клетки минимально повреждали бы нормальные клетки и ткани организма. Несмотря на успехи молекулярной биологии, генетики, биохимии и вирусологии опухолей, до настоящего времени отсутствуют сведения об особенностях биологии опухолевой клетки, позволяющие четко сформулировать предпосылки создания противоопухолевых препаратов [1-3].

В настоящее время считается доказанным, что в патогенезе возникновения злокачественных новообразований заложены механизмы активации окислительных процессов [4-9], сопровождающиеся угнетением антиокси-дантной защиты [10]. Из этого следует, что одним из путей предотвращения возникновения заболеваний, сопряженных с окислительным стрессом, является усиление антиокислительных возможностей организма за счет экзогенного введения антиоксидантов [11, 12]. Актуальность проблемы определяет повышенный интерес к созданию новых эффективных лекарственных средств. Свободно-радикальная концепция канцерогенеза обосновывает потребность в препаратах, способных нормализовать активность антиоксидантной защиты и тем самым повышать резистентность неповрежденных тканей к токсическому воздействию химиопрепаратов [13].

Одним из перспективных путей снижения токсичности лекарственных препаратов является использование переносчиков естественных биологически активных веществ-регуляторов кроветворения, в частности гемопоэтиче-ских ростковых факторов [14-18]. Изучается влияние рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, активно используются иммуномодуляторы - интерферон, лейкинферон [19-23]. Между тем при выборе методов коррекции основных побочных эффектов противоопухолевых средств - явлений тошноты, рвоты, угнетения костномозгового кроветворения, алопеции, кардиотоксичности и гепатотоксичности - следует учитывать тот факт, что в основе токсического действия препаратов лежит их мембранодеструктивное действие [24-27].

Целью настоящего исследования явилось изучение возможности фармакологической коррекции побочных эффектов при проведении химиотерапевтического лечения. Установление роли ПОЛ в канцерогенезе и повреждении гомеостатических структур определило место антиоксидантов в профилактике как опухолевых заболеваний, так и осложнений цитостатической терапии. Появление нового типа водорастворимых антиоксидантов, производных 3-оксипиридина, обладающих широким спектром действия при различ-

ных патологических состояниях, явилось основанием для применения с целью коррекции побочного действия цитостатических лекарственных средств.

Нами изучалось влияние аналога производного 3-оксипиридина - мек-сидола, синтезированного этилметилгидроксипиридина гемисукцината на систему гемостаза.

Эксперименты были проведены на кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2,5-З,0 кг. В опытах использовали животных, не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из десяти животных в каждой. Все исследования проводили в одно и то же время суток, с 8 до 12 часов, с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, Франция, 1986).

Выполнено две серии опытов, в которых изучалась реакция системы крови на фоне фармакологической коррекции этилметилгидроксипиридин гемисукцинатом, а также группа животных, которая служила контролем. Этилметилгидроксипиридин гемисукцинат вводили по 5 мг/кг внутривенно через день в течение 29 суток.

Во всех сериях венозную кровь забирали на 8-е, 15-е, 22-е и 29-е сутки опыта из краевой вены уха кроликов. Исследовали абсолютное число тромбоцитов в 1 мкл крови по унифицированной методике в камере Горяева. Костный мозг брали при помощи асептической аспирации иглой Кассирского и шприцом (обезвоженными) из подвздошной кости под местным обезболиванием 2,5 мл 2 % раствором новокаина. Исследовали абсолютное количество мегакариоцитов, абсолютное и относительное количество кроветворных клеток в состоянии митотического деления. Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами (по В. В. Меньшикову, 1987). Систему гемостаза изучали по унифицированным методикам:

- определение времени свертывания цельной крови;

- определение активированного парциального (частичного) тромбопла-стинового времени (АЧТВ) по J. Caen et al. (1968);

- аутокоагуляционный тест (АКТ) по Brekarda et al. (1965), разработанный и модифицированный Л. З. Баркаганом (1972);

- определение протромбинового времени по A. J. Qwick (1935);

- определение фибриногена по М. В. Рамплинг и П. Гаффней;

- определение тромбинового времени по R. M. Biggs, R. G. Macfarlane (1962);

- орто-фенантролиновый тест по В. А. Елыкомову, А. П. Момоту (1987);

- определение активности антитромбина III по V. Abildgaard et al. (1970) в модификации К. М. Бишевского (1983);

- Хагеман-зависимый фибринолиз по Г. Ф. Еремину, А. Г. Архипову (1982);

- естественный лизис фибринового сгустка по М. А. Котовщиковой и Б. И. Кузнику (1962);

- агрегация тромбоцитов под влиянием АДФ;

- агрегация тромбоцитов с универсальным индуктором агрегации (УИА);

- агрегация тромбоцитов с ристомицином по А. С. Шитиковой (1980). Все указанные методы исследования гемостаза изложены в [28-31].

Статистическую обработку результатов экспериментальных исследований проводили с помощью г-критерия Стьюдента (В. Я. Гельман, 2002) на персональном компьютере IBM PC/Pentium с использованием программы Microsoft Excel и применением поправки Бонферрони. Проверка нормальности распределения ввиду относительно малого количества данных производилась визуально по графикам на вероятностной бумаге, и наблюдавшаяся близость экспериментальных точек к прямой линии позволила не отвергать гипотезу о нормальности распределения. Вычисляли среднюю арифметическую выборочную (М), ошибку средней арифметической (m) и коэффициент достоверности (г). Степень достоверности различий показателей определяли в каждой серии во все периоды исследования через 8 суток воздействия, через 15 суток, через 22 дня и 29 суток относительно контроля (р) (таблица 1). Явление считали достоверным прир < 0,05 (0,01; 0,001).

Изучение гемостаза при введении этилметилгидроксипиридина геми-сукцината показало, что время свертывания крови на 8-е, 15-е сутки укорачивалось на 13,5 и 17 %, на 22-е сутки удлинялось на 20,5 %, к концу эксперимента, на 29-е сутки, снижалось и определялось ниже значений контроля. О первой фазе гемостаза - протромбинообразовании - судили по определению каолин-кефалинового времени и аутокоагуляционному тесту. Определение активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени показало стойко стабилизированное АЧТВ в течение всего эксперимента, которое не выходило за пределы контрольного АЧТВ. Для оценки максимальной тромбопластин-тромбиновой активности крови был использован аутокоагуляционный тест с определением времени достижения максимальной свертывающей активности. Время достижения максимальной активности свертывания удлинялось на 22,9 % через неделю после введения антиоксиданта, на 47,37 и 52,4 % на 15-е и 22-е сутки. К концу эксперимента отмечалось резкое укорочение АКТ в четыре раза относительно 22-х суток и в

1,5 раза относительно контроля. О второй фазе - тромбинообразовании - судили по протромбиновому времени, что характеризует внешнее свертывание. Протромбиновый индекс удлинялся во все периоды исследования с максимальным увеличением на 22-е сутки на 16,2 % (р < 0,001), что коррелирует с количественным изменением фибриногена. О третьей фазе - фибринообразо-вании - судили по количеству фибриногена и определению тромбинового времени. Количество фибриногена при введении этилметилгидроксипиридина гемисукцината стабильно повышалось в течение исследуемого периода: на 14,4 % (р < 0,05) при первом исследовании, на 30,7% (р < 0,001) при втором, на 60,7 % (р < 0,001) при третьем и на 52 % (р < 0,001) в конце эксперимента. Имело тенденцию к удлинению тромбиновое время на 12,7 % (р < 0,05) через неделю, на 19,2 % (р < 0,001) на второй неделе, с приближением к норме на третьей и четвертой неделе, что коррелирует с увеличением уровня фибриногена в эти периоды. О посткоагуляционном гемостазе судили по определению эуглобулинового и Хагеман-зависимого фибринолиза. Время лизиса замедлялось на второй неделе эксперимента на 16,6 % при определении эугло-булиновым методом и на 5,3 % Хагеман-зависимым фибринолизом относительно контроля.

Таблица 1

Изучение влияния этилметилгидроксипиридина гемисукцината на гемостаз крови кроликов в динамике

Коагулограмма Контроль 8-е сутки 15-е сутки 22-е сутки 29-е сутки

Время свертывания, мин 4,92 ± 0,07 4,17 ±0,03 р < 0,001 4,01 ±0,09 /7 < 0,001 5,93 ±0,13 р < 0,001 4,4 ±0,1 /7 < 0,001

Каолин-кефалиновое время, с 29,65 ± 0,43 30,75 ± 0,83 30,09 ± 0,8 31,4 ± 1,76 29,4 ± 1,54

Аутокоагулограмма, с 12,2 ±0,26 15 ± 1,13 р < 0,05 18,03 ±0,65 р< 0,001 18,6 ±0.16 р < 0,001 8,3 ±0,14 р < 0,001

Протромбиновое время, % 100,2±2,17 108,25± 1,24 р < 0,05 105,6±1,1 р < 0,05 116,25±1,16 /7 < 0,001 108,8±0,69 р < 0,05

Фибриноген, г/л 3,67 ±0,13 4,2 ±0,12 р < 0,05 4,8 ± 0,25 /7 < 0,001 5,9 ±0,53 р < 0,001 5,58 ±0,36 < 0,001

Тромбиновое время, с 12,58 ±0,17 14,18 ±0,47 р < 0,05 15 ± 0,36 /7 < 0,001 12,74 ±0,83 11,57 ±0,26 р < 0,05

Эуглобулиновый фибринолиз, мин 206 ± 4,9 194,4 ± 2,27 240 ± 8,98 р < 0,05 191,1 ±9,35 160 ± 13,03 р < 0,05

Хагеман-зависимый фибринолиз, мин 10,78 ± 0,74 7,7 ±0,39 р < 0,05 11,36 ±0,53 6,98 ± 1,14 р < 0,05 5.31 ±0,99 р < 0,001

О-фенантролиновый тест, х 10 2/ л 5,8 ±0,3 5,3 ±0,16 8.42 ± 0,73 р < 0,05 6,5 ± 0,22 6 ±0,11

Антитромбин III, % 102,7 ±3,19 90,74 ± 2,27 р < 0,05 115 ±2,51 р < 0,05 126 ±0,83 р < 0,001 107 ±5,02

Агрегационная активность тромбоцитов с АДФ, с 12 ±0,3 15,2 ±0,4 р < 0,001 17,3 ±0,34 р <0,001 16 ±0,24 р < 0,001 27 ± 0,59 р < 0,001

УИА, % 106 ± 1,42 85,87 ± 1,9 Р< 0,001 94,78 ± 1,68 р < 0,001 94 ± 1,4 /7 < 0,001 33,3 ± 3,23 р < 0,001

Агрегация с ристомицином, с 11 ± 0,07 12,6 ±0,01 14,3 ±0,03 /7 < 0.001 11,6 ±0,01 13,3 ±0,07 /7 < 0.001

Тромбоциты,л 286.89 ±8,41 211,1 ±2,6 р < 0,05 201,1 ±2,61 р < 0,05 220 ± 7,64 < 0,001 211 ±2.61 р < 0,05

Мегакариоциты, л 138,59 ±8,14 37,5 ± 1,61 р < 0,001 236,88 ± 57,63 р < 0,05 3028 ±351,53 р < 0,05 61,88 ±7,98 р < 0,05

Примечание, р - относительно контроля.

№ 1, 2008 Медицинские науки. Теоретическая и экспериментальная медицина

К третьей неделе фибринолиз приходил в пределы нормы с последующей активацией к концу эксперимента на 32,3 % (р < 0,05) при определении эуглобулинов и на 56,4% (р < 0,001) Хагеман-зависимый фибринолиз. С целью выявления растворимых фибрин-мономерных комплексов, являющихся индикатором ДВС-синдрома, использовали орто-фенантролиновый тест. Повышение уровня РФМК было характерно только на 15-е сутки. В течение всего остального периода исследования РФМК соответствовали контрольным цифрам. Антикоагуляционную активность плазмы исследовали по определению гепарин-кофакторной активности антитромбина III. При введении этил-метилгидроксипиридина гемисукцината активность АТ III увеличивалась на

11,9 % (р < 0,05) на 15-е сутки и на 22,6 % (р < 0,001) на 22-е сутки относительно уровня контроля. Для исследования нарушений тромбоцитарного гемостаза изучали агрегационную активность тромбоцитов с АДФ и проводили экспресс-оценку с универсальным индуктором агрегации (УИА). В течение всего экспериментального периода отмечалось замедленное образование агрегатов с УИА, что предполагает более низкую активность тромбоцитов. Время агрегационной активности тромбоцитов с АДФ было также выше нормы (удлинялось) в течение всего периода наблюдения. При введении этилметилгидроксипиридина гемисукцината имело место снижения количества тромбоцитов в периферической крови и мегакариоцитов в костном мозге. Курс вливаний этилметилгидроксипиридина гемисукцината вызывал умеренное уменьшение количества тромбоцитов в венозной крови - от 286,89 ± 8,41х103/мкл до 211,11 ± 2,61х103/мкл (р < 0,05). Количество мегакариоцитов на 8-е сутки резко снижалось, содержание мегакариоцитов в пунктате уменьшилось от 138,59 ± 8,14/мкл до 37,50 ± 1,61/мкл (р < 0,001), но в дальнейшем уровень их возрастал, на 15-й и 22-й день показатель достоверно поднялся соответственно до 236,88 ± 57,63/мкл и 3028,00 ± 351,53/мкл, на 29-е сутки 1 мкл пунктата содержал не более 61,88 ± 7,98 мегакариоцитов.

Выводы

Таким образом, этилметилгидроксипиридин гемисукцината стабилизирует процесс гемокоагуляции как по внешнему, так и по внутреннему механизму образования протромбиназы, повышает уровень фибриногена, замедляет все фазы свертывания крови, активирует фибринолиз, повышает анти-коагуляционную активность плазмы. При введении этилметилгидроксипири-дина гемисукцината имет место снижение количества тромбоцитов в периферической крови и мегакариоцитов в костном мозге, а также угнеталась аг-регационная активность тромбоцитов. Антиоксидант нового поколения можно рекомендовать при патологических процессах, сопровождающихся повышенной активностью гемокоагуляционного потенциала.

Список литературы

1. Богуш, Т. А. Снижение токсичности и повышение эффективности противоопухолевой химиотерапии путем коррекции активности монооксигеназ печени: от эксперимента - в клинику / Т. А. Богуш, Е. А. Богуш, Л. А. Дурнов [и др.] // Вестник РАМН. - 2002. - № 1. - С. 37-41.

2. Переводчикова, Н. И. Место химиотерапии в системе лечения онкологических больных и выбор терапевтической тактики / Н. И. Переводчикова // Современная онкология. - 2001. - Т. 3. - № 2.

3. Переводчикова, Н. И. Противоопухолевая химиотерапия / Н. И. Переводчикова. - М., 1993. - С. 4-208.

4. Киреев, Г. В. Зависимость перекисного окисления липидов при раке желудка от размеров опухоли / Г. В. Киреев, О. Ю. Баленков, Ф. К. Шарипов [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - № 12. - С. 20-34.

5. Корман, Д. Б. Рак молочной железы и ненасыщенность липидов крови / Д. Б. Корман, С. Л. Потапов // Вопросы онкологии. - 1997. - Т. 43. - № 2. -С.165-170.

6. Горожанская, Э. Г. Некоторые особенности механизма антиоксидантной защиты в доброкачественных и злокачественных опухолях печени и яичников /

Э. Г. Горожанская, Н. Е. Кушлинский, Е. Н. Королева [и др.] // I съезд онкологов стран СНГ : тез. докл. - М., 1996. - С. 81-82.

7. Рудой, С. В. Эффективность сочетанного применения непрямой электрохимической детоксикации крови гипохлоридом натрия при паллиативной химиолуче-вой терапии онкологическим больным / С. В. Рудой // Паллиативная медицина и реабилитация. - 1997. - № 2. - С. 13-16.

8. Ларионова, В. Б. Современные возможности улучшения непосредственных результатов хирургического лечения онкологических больных / В. Б. Ларионова, Н. Е. Кушпинский, Э. Г. Горожанская [и др.] // I съезд онкологов стран СНГ : тез. докл. - М., 1996. - С. 564-565.

9. Даманский, В. Ю. Функциональное состояние и фосфолипидный состав эритроцитов у больных раком молочной железы / В. Ю. Даманский, В. И. Мисы-чева, Г. И. Сергеева [и др.] // Вопр. онкол. - 1992. - № 11. - С. 1155-1163.

10. Донскова, Ю. С. Состояние антиоксидантной и иммунной систем у онкологических больных на этапах хирургического лечения с интраоперационной радиотерапией / Ю. С. Донскова, Н. А. Осипова, Р. И. Якубовская [и др.] // Анестезиология и реаниматология. - 2004. - № 3. - С. 67-70.

11. Горенкова, Н . А . Коррекция постреанимационных нарушений поведенческих реакций мексидолом и киоторфином / Н. А. Горенкова, И. В. Назаренко, И. В. Са-морукова // Анестезиология и реаниматология. - 2002. - № 6. - С. 63-66.

12. Orton, C. G. Uses of Therapeutic X - Rays in Medicine / C. G. Orton // Health Physics. - 1995. - Vol. 69. - № 5. - P. 662-676.

13. Степанов, В. А. Снижение кардиотоксичности адриамицина в присутствии экзогенного фосфокреатинина / В. А. Степанов, М. А. Вититнова, С. А. Крыжа-новский // VI Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 1999. - С. 69.

14. Скороход, А. А. Повреждающее воздействие рубомицина и доксорубицина на эритроциты человека in vitro / А. А. Скороход, В. М. Витвицкий, Р. А. Кульман [и др.] // Вопросы онкологии. - 1999. - Т. 45. - № 4. - С. 374-379.

15. Михайлова, А. О. Миелопептиды и перспективы их использования для иммунореабилитации больных с онкологическими заболеваниями / А. О. Михайлова, Л. О. Стрелков // International Jonnal on Immunorehabilitation. - 1998. - № 10. -С. 49-54.

16. Кузнецов, В. П. Лейкинферон-механизмы терапевтического действия и тактика иммунокоррекции / В. П. Кузнецов, А. В. Караулов // International Jоurnal on Immunorheabilitation. - 1998. - № 10. - Р. 66-67.

17. Лебедев, В. В. Иммунофармакологическая и клиническая эффективность применения регуляторного пептида имунофорана у инфекционных и онкологических больных / В. В. Лебедев, В. И. Покровский // International Jоurnal on Immunorhe-abilitation. - 1998. - № 8. - Р. 11.

18. Rowinsky, E. K. High-dose topotecan with granulocite-colone stimulating factor in fluoropyrimidine-refractory colorectal cancer: A phase II and pharmacodynamic study / E. K. Rowinsky, S. D. Baker, K. Burks [et al.] // International JоurnaI on Immunorhe-abilitation. - 1998. - Vol. 9. - P. 173-180.

19. Стрелков, Л. А. Миелопептиды отменяют супрессию Т-лимфоцитов, вызванную лейкозными клетками человека / Л. А. Стрелков, А. О. Михайлова // Иммунология. - 1980. - № 6. - С. 32-35.

20. Ингель, Ф. И. Геноинженерый у-интерферон как модификатор генетической активности циклофосфамида / Ф. И. Ингель, Ю. А. Ревазова // IV Рос. нац. конг. «Человек и лекарство» . - 1997. - С. 53.

21. Лаврентьева, Г. И. Опыт применения интерферона у больных хроническим миелолейкозом / Г. И. Лаврентьева, И. А. Урванцева, Т. А. Сеитова // International Jоurnal on Immunorheabilitation. - 1998. - № 8. - Р. 87.

22. Глушков, Н. В. Иммуномодулирующее влияние неовира у больных с операбельными опухолями желудочно-кишечного тракта / Н. В. Глушков, Н. В. Шаба-шова, Е. В. Фролова [и др.] // International Journal on Immunorehabilitation. - 1998. -November. - Р. 90.

23. Woll, P. J. Can cytotoxic dose-intensity be increased by using granocyte colony-stimulating factor? A randomixed controlled trial of lenograstin in small cell lung cancer / P. J. Woll, J. Hodgettes, L. Lomax [et al.] // J. Clin. Oncol. - 1995. - Vol. 13. -P. 652-659.

24. Russell, K. Photon versus fast neutron extrenal beam radiotherapy in the treatment of locally advanced prostate cancer: results of a randomized prospective trial / K. Russell, R. Caplan, G. Laramore [et al.] // Int. Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 1994. - Vol. 28. -P. 47-54.

25. Pharmacokinetics of Doxorubicin in patients with lymphoproliferative disorders after infusion of Doxorubicin - Loaded Erythrocytes / F. I. Ataullakhanov, V. G. Isaw, A. V. Kohno [et al.] // Erythrocytes as Drug Carriers in Medicine. - New York ; London : Plenum press, 1997.

26. Monohydroxyethylrutoside as protector against chromis doxorubicin - induced cardio-toxicity / S. A. B. Vanacker, K. Kramer, J. A. Grimbergen [et al.] // Br. J. Pharmacol. -1995. - Vol. 115. - P. 1260-1264.

27. Pharmacokinetics of Doxorubicin in patients with lymphoproliferative disorders after infusion of Doxorubicin - Loaded Erythrocytes / F. I. Ataullakhanov, V. G. Isaw, A. V. Kohno [et al.] // Erythrocytes as Drug Carriers in Medicine. - New York ; London : Plenum press, 1997.

28. Лабораторные методы исследования систем гемостаза / под ред. В. П. Балуда [и др.]. - Томск, 1980.

29. Лычев, В. Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови / В. Г. Лычев. - Н. Новгород, 1998.

30. Лабораторные методы исследования в клинике / под ред В. В. Меньшиков.- М., 1987.

31. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний : учебное пособие / под ред. Н. Н. Петрищева, П. П. Паяна. - СПб., 1999.