СПОСОБ РЕГУЛИРОВАНИЯ ФОЛЛИКУЛЯРНОГО РЕЗЕРВА ЯИЧНИКА, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОТКЛОНЕНИЙ В РОСТЕ ПОКОЯЩИХСЯ ФОЛЛИКУЛОВ У ЖЕНЩИН, СРЕДСТВО СТИМУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ ФОЛЛИКУЛОВ И СРЕДСТВО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ СОЕДИНЕНИЙ НА УСКОРЕНИЕ ИЛИ ЗАМЕДЛЕНИЕ РОСТА ФОЛЛИКУЛОВ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF REGULATING FOLLICULAR RESERVE OF OVARY, METHOD OF TREATING DEVIATIONS IN GROWTH OF RESTING FOLLICLES IN WOMEN, MEDICATION OF FOLLICLE DEVELOPMENT STIMULATION AND MEANS OF DETERMINING IMPACT OF COMPOUNDS ON ACCELERATION OR RETARDATION OF FOLLICLE GROWTH IN CARRYING OUT TOXICOLOGICAL TESTS (VERSIONS)

Изобретение относится к применению соматостатина или одного из его аналогов-агонистов для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для регулирования яичникового фолликулярного резерва у женщин, у которых не наступила менопауза, или к применению аналога-антагониста соматостатина для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для ускорения начала роста покоящихся фолликулов у женщин, у которых не наступила менопауза. Изобретение также относится к применению in vitro соматостатина или одного из его аналогов-агонистов для ингибирования начала роста покоящихся фолликулов в ткани яичника или для in vitro применения аналога-антагониста соматостатина для ускорения начала роста покоящихся фолликулов в ткани яичника.
У женщин, как у всех млекопитающих, фертильность зависит от наличия в яичниках женских гамет, называемых "ооцитами". У людей запас ооцитов раз и навсегда определяется при рождении; количество ооцитов в тот момент составляет от 500000 до 1 миллиона на яичник. Данные ооциты окружены редкими гранулезными клетками; такую функциональную группу называют яичниковым фолликулом (Gougeon A., Endocrine Reviews (1996), 17, 121-155). При рождении, а также и в течение жизни вплоть до менопаузы большинство яичниковых фолликулов находится в состоянии покоя.
Medecine de la reproduction,
rd
По своей конституции запас ооцитов прогрессивно уменьшается: таким образом, в период полового созревания имеется приблизительно 200000 фолликулов на яичник, к 20 годам - приблизительно 80000, к 30 годам - приблизительно 30000, к 40 годам - приблизительно 10000, примерно в 50 лет запас фолликулов исчерпывается (см. Gougeon A. and Lefevre B. «Folliculogenese et maturation ovocytaire» in 3 edition, Ed. Flammarion, p. 49). Истощение запаса ооцитов клинически соответствует менопаузе. Покоящиеся фолликулы, присутствующие в яичнике в заданное время, составляют "яичниковый резерв".
Endocrine Reviews
В прогрессивное истощение яичникового резерва вовлечены два механизма. Приблизительно 80% фолликулов исчезают при начале апоптоза, в то время как остающееся 20% начинают расти. Последние затем начинают длинный процесс развития (приблизительно 6 месяцев), в котором меньшинство их (приблизительно 400 за всю жизнь) достигнет стадии преовуляторных фолликулов, содержащих зрелый ооцит, который пригоден для оплодотворения (Gougeon A.,(1996), 17, 121-155). Большинство растущих фолликулов уничтожаются посредством апоптоза, приводящего к их инволюции; апоптоз поражает их на любой стадии развития.
Переход от стадии покоящегося фолликула к стадии растущего фолликула - непрерывное явление, которое протекает с разной интенсивностью. В частности, оно ускоряется за 10-15 лет до менопаузы, приблизительно в возрасте 38 лет.
Williams Textbook of Endocrinology,
Факторы, стимулирующие первые стадии роста (начиная с крупного первичного фолликула), относительно хорошо известны. К ним относятся гонадотропины (ЛГ и ФСГ), но в особенности факторы роста и стероиды, такие как андрогены. Однако механизмы, управляющие инициированием роста фолликула, изучены плохо. Доказано, что данная стадия фолликулогенеза не зависит от гонадотропинов (ЛГ и ФСГ) (см., например, Bullun S. and Adashi E., Tenth Edition (2003), 587-664). Поддерживать состояние покоя фолликулов мог бы гормон, известный как фактор регрессии мюллеровых протоков, в то время в активизации роста покоящихся фолликулов мог бы участвовать как пептид, известный как Kit-лиганд (также названный SCF). Кроме того, фактор роста, известный как GDF-9, по-видимому, важен для поддержания начавшегося роста.
Cancer Res.,
Endocr. Review,
Endocr. Review,
Соматостатин (SST) представляет собой циклический пептид, присутствующей в организме в двух формах: одна форма содержит 14 аминокислот, а вторая форма содержит 28 аминокислот. Биологическая активность данных двух форм SST схожа. Форма SST-14 преобладает в центральной нервной системе. Она ингибирует секрецию гормона роста соматотропными клетками переднего гипофиза. Форма SST-28 предпочтительно экспрессируется в желудке и поджелудочной железе. Биологическая активность SST вызывается посредством ряда мембранных рецепторов, соединенных с белком G, среди которых описаны 5 подтипов, а именно подтипы с SSTR1 по SSTR5 (Reubi J.C., 47, 551-558; Resine T. et al., 16, 427-442; Lamberts SW. et al., 12,450-482).
Acta Endocrinol. (Copenh.)
Am. J. Anat.
Hum. Reprod.
Gynecol. Endocrinol.
Hum. Reprod.
Наличие SST в яичнике показано у нескольких видов, включая свиней (Mori T. et al., (1984), 106(2), 254-259), крыс (McNeill D.L. et al., (1987), 179(3), 269-76) и женщин (Holst et al., (1994), 9(8), 1448-1451). Рецепторы SST обнаружены в яичнике крысы (Lidor A. et al., (1998), 12(2), 97-101), а также в яичнике человека, в частности, подтипы 1, 2A и 5 (Strauss et al., (2003), 18, Suppl. 1, P-495).
in vivo
Histochem. J.
In vitro
Hum. Reprod.
J. Endocrinol.
Acta Endocrinol. (Copenh.)
in vitro
Fertil. Steril.
in vivo
Fertil. Steril.
Clin. Endocrinol. (Oxf.)
Gynecol. Endocrinol.
Hum. Reprod.
Вклад SST в физиологию яичника был изучен несколькими авторами. У крыс введение  SST, по-видимому, снижает число клеток гипофиза, выделяющих ЛГ и ФСГ, а также число преовуляторных фолликулов в яичнике (Nestorovic et al., (2001), 33(11-12), 695-702).  SST ингибирует ароматазу и образование прогестерона, стимулируемое ФСГ, на модели гранулезных клеток (Andreani C.L. et al., (1995), 10(8), 1968-1973). У свиней SST ингибирует увеличение количества цАМФ, вызванное ЛГ и форсколином в гранулезных клетках (Rajkumar K. et al., (1992), 134(2), 297-306), и, по-видимому, ингибируют созревание ядра у преовуляторного ооцита (Mori T. et al., (1985), 110(3), 408-412). Исследования гранулезных клеток из преовуляторных фолликулов женщин указывают на прямую роль SST в ингибировании синтеза IGF-BP1 и прогестерона (Holst N. et al., (1997), 68(3), 478-482). У женщин SST способен ослаблять секрецию ЛГ гипофизом, уменьшая продукцию андрогенов и уровень IGF-1 в сыворотке. Уровень IGF-BP3 в сыворотке SST, напротив, увеличивает (Fulghesu A.M. et al., (1995), 64(4), 703-708; Piaditis, G.P. et al., (1996), 45(5), 595-604). SST вводили совместно с ФСГ во время лечения, направленного на индукцию овуляции у пациенток, которые были бесплодными в результате синдрома поликистозных яичников. Была доказана способность SST снижать содержание в сыворотке ЛГ, гормона роста и IGF-I. Тем не менее, данный эндокринный эффект не сопровождался значимым воздействием на рост фолликулов, индуцированный введением ФСГ (Lidor A. et al., (1998), 12(2), 97-101; van der Meer M. et al., (1998), 13(6), 1465-1469). Вывод: до сих пор сообщалось о незначительном влиянии SST на секрецию ЛГ гипофизом и на образование прогестерона в гранулезных клетках преовуляторных фолликулов.
Заявители в настоящее время неожиданно обнаружили, что SST и его аналоги способны ингибировать переход фолликулов от стадии покоя к стадии роста и что данная способность делает возможными новые терапевтические применения для упомянутых соединений.
Преимущество данного изобретения прежде всего заключается в возможности применения SST или аналога-агониста SST для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для того, чтобы уменьшить или ингибировать начало роста фолликулов, находящихся в стадии покоя. Во-вторых, также возможно использование аналога-антагониста данного пептида для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для того, чтобы ускорять начало роста покоящихся фолликулов.
Существует ряд клинических ситуаций, при которых с точки зрения медицинской перспективы пациентке желательно замедлить использование яичникового резерва, чтобы отсрочить истощение последнего и тем самым сохранить функцию яичников и фертильность. Данные ситуации типично и неисключительно представляют собой пациентку, которой угрожает преждевременная менопауза. Известно, что у определенных пациенток запас фолликулов истощается преждевременно. Тогда менопауза возникает ранее 40 лет и иногда даже ранее тридцати лет. Нередко возможно предсказать преждевременную менопаузу на основе предшествующих семейных случаев или генетических аномалий, таких как синдром Тернера (полный или частичный). В данной ситуации введение SST или одного из его аналогов-агонистов является профилактической мерой, нацеленной на то, чтобы замедлить начало роста покоящихся фолликулов.
То же самое касается пациенток, которые испытывают трудности с зачатием и у которых хронологический возраст или биологический возраст их яичников соответствуют периоду ускорения активации покоящихся фолликулов: замедление такого истощения запаса фолликулов должно сделать возможным повышение эффективности лечения и шансов забеременеть.
Endocrinology
Hum. Reprod.
Hum. Reprod.
Другая клиническая ситуация, в которой можно извлечь выгоду из лечения SST или одним из его аналогов-агонистов, - трансплантат (предпочтительно аутотрансплантат) яичника или фрагментов яичника. В данном контексте возобновление функции яичников нередко временное и сопровождается преждевременным истощением количества примордиальных фолликулов (Baird D.T. et al., (1999), 140, 462-471). Фактически было показано, что во время трансплантации гранулезные клетки растущих фолликулов более подвержены апоптозу, чем гранулезные клетки примордиальных фолликулов (Liu J. et al., (2002), 17, 605-611). Кроме того, удаление ткани яичника и ее фрагментация заставляет примордиальные фолликулы быстро и массово продвигаться к стадии поздних первичных фолликулов (см. Wandji S.A., et al., (1997), 12, 1993-2001; см. также контрольную группу из примера настоящей заявки).
В контексте данного применения аналоги-агонисты соматостатина (или соматостатин) могут быть добавлены к различным средам для взятия, промывки, консервации, замораживания и размораживания ткани яичника ради трансплантатов. Изобретение, таким образом, также относится к соответствующим средам, содержащим аналог-агонист соматостатина. Оно также относится к применению аналога-агониста соматостатина в качестве вспомогательного защитного средства в средах для взятия, промывки, консервации, замораживания и размораживания ткани яичника.
in vitro
in vitro
in vivo
Кроме того, применение соматостатина или аналогов-агонистов соматостатина также может быть применимым в области токсикологических исследований и в производстве зрелых ооцитов из свежей или замороженной ткани яичника. Что касается первого, во время испытаний эффекта новых химических объектов на яичниковые фолликулы и их рост, добавление к выборке фолликулов аналога-агониста соматостатина позволяет замедлить рост фолликулов и, таким образом, с большей легкостью наблюдать любой эффект ускорения упомянутого роста, вызванного упомянутыми новыми химическими объектами. Добавление антагониста соматостатина позволяет сместить фолликулярный резерв по направлению к фазам роста и лучше оценить воздействие новых химических объектов на данное явление. Что касается образования зрелых ооцитов, добавление к выборке фолликулов аналога-агониста соматостатина делает возможным замедлить рост фолликулов в течение начальной фазы культивирования. Добавление антагониста соматостатина во вторую фазу затем делает возможным сместить фолликулярный резерв по направлению к фазам роста, что позволяет получить большее количество зрелых фолликулов и, тем самым, пригодных для оплодотворения ооцитов.
Obstet. Gynecol. Surv.
Применение аналогов-агонистов соматостатина (или соматостатина) у пациенток с поликистозными яичниками тоже благотворно. Фактически многочисленные наблюдения свидетельствуют, что в поликистозных яичниках популяция фолликулов патологически высока (см. Hughesdon, (1982), 37(2), 59-77). Чрезмерное образование андрогенов данными фолликулами в избыточном количестве могла быть причиной метаболических и эндокринных нарушений, наблюдаемых у этих пациенток. Кроме того, значительное сокращение данной популяции фолликулов путем резекции яичников, каутеризации или ультрафиолетового облучения составляет одно из самых эффективных способов лечения, потому что он позволяет приблизительно 80% пациенток овулировать и становиться беременными с кумулятивной частотой 75% за 18 месяцев. Таким образом, регулярное введение аналога-агониста соматостатина (или соматостатина) должно вызвать сокращение количества растущих фолликулов и тем самым лишних антральных фолликулов, производящих андрогены, что в результате приведет к возобновлению фертильных овуляторных циклов, временному или постоянному.
Кроме того, применение аналогов-агонистов соматостатина (или соматостатина) у пациенток, которые вскоре подвергнутся, подвергаются в настоящее время или подвергались химиотерапии или облучению (с лечебными или другими целями), уменьшает риск преждевременной менопаузы, предотвращая ускоренную активацию фолликулярного резерва, которая сделала бы его более чувствительным к химиотерапевтическим средствам или к ионизирующему излучению.
in vitro
in vivo
Могут быть предусмотрены и другие применения, особенно в ветеринарной области. Изобретение может применяться для спасения видов, применение аналогов-агонистов соматостатина (или соматостатина) позволяет сохранить яичниковый резерв самок. Подобным образом аналоги-антагонисты соматостатина могут использоваться применительно к или оплодотворению животных с высокой рыночной стоимостью. Такие животные с высокой рыночной стоимостью, в частности, могут быть лошадьми, жвачными животными, овцами или козами; они также могут быть животными трансгенного происхождения.
В дополнение к упомянутым выше патологиям систематическое замедление истощения яичникового резерва может быть предусмотрено у женщин, не страдающих от какой-либо дисфункции яичников. Непрерывное увеличение ожидаемой продолжительности жизни в промышленно развитых странах (приблизительно 83 года во Франции в настоящее время) сопровождается удлинением периода постменопаузы и связанных с ним нарушений: заболеваний сердца, остеопороза, старения кожи и т.д. Появились сомнения в долгосрочной безопасности гормональной заместительной терапии менопаузы. Следовательно, привлекательной альтернативой является отсрочка возраста, в котором возникает менопауза. Таким образом, уменьшится период постменопаузы и связанные с ним риски. Данная отсрочка, однако, не означает, что фертильность может поддерживаться до 60 лет с лишним. Многочисленные научные труды свидетельствуют, что функция яичников поддерживается до тех пор, пока сохраняется минимальное количество фолликулов резерва, и что несмотря на "нормальную" функцию яичников (слабое изменение уровней стероидов) вероятность беременности чрезвычайно низка.
"SS-подобный"
В ситуациях, в которых стремятся замедлить использование яичникового резерва, по изобретению будет применяться природный соматостатин (SST14 или SST28) или, предпочтительно, аналог-агонист соматостатина (природный или синтетический). Аналог-агонист соматостатина может представлять собой циклический или нециклический полипептид, составной или рекомбинантный белок, непептидное химическое вещество (т.е. пептидомиметик), а также пептид, такой как кортикостатин. Используемые аналоги-агонисты должны иметь высокое сродство к рецепторам SST и стимулировать их функциональную активность, такую как ингибирование секреции гормона роста соматотропными клетками гипофиза и/или ингибирование пролиферации in vitro клеток аденомы гипофиза. Предпочтительно аналог-агонист соматостатина имеет высокое сродство ко всем или по меньшей мере к 2 или 3 подтипам рецепторов SST или бóльшее сродство по меньшей мере к одному из подтипов 1, 2, 3, 4 и 5 (например, к подтипу 2).
Аналоги-агонисты соматостатина, в частности, описаны в заявке на патент PCT WO 01/00676 и WO 98/08528, а также в патентах US 6387932, US 6268342, US 6057338, US 6025372.
В соответствии с конкретным вариантом изобретения аналоги-агонисты соматостатина представляют соединения общей формулы (I)
в которой:
1
X представляет собой радикал формулы (a) или (b)
1
R, каждый, независимо представляет собой необязательно замещенный фенильный радикал, в котором необязательные заместители независимо выбраны из атома галогена и метильного, этильного, метокси- и этоксирадикалов,
2
1
2
1
2
2
1
R представляет собой Z-CH-R, -CH-CO-O-CH-R,
1
Z представляет собой O или S;
2
X представляет собой α-аминокислоту, имеющую ароматический остаток в боковой цепи Сα или аминокислотное звено, выбранное из Dab, Dpr, Dpm, His, (Bzl)HyPro, тиенил-Ala, циклогексил-Ala и t-бутил-Ala.
A представляет собой дивалентный остаток, выбранный из Pro,
3
8
9
2-6
2-6
2-6
3a
1-4
3
3b
1-4
a
5
6
b
2
1-3
3
4
3
4a
5
6
1-4
1-4
1-4
7
1-6
8
9
1-4
2-4
2
с
2
8
9
11
2
1-3
3
2
1-5
5
6
a
R представляет собой NRR-Cалкилен, гуанидин-Cалкилен или Cалкилен-COOH, R представляет собой Н, Cалкил или имеет, независимо, одно из значений, данных для R, R представляет собой Н или Cалкил, R представляет собой OH или NRR, R представляет собой -(CH)- или -CH(CH)-, R представляет собой H или CH, Rпредставляет собой бензил, необязательно замещенный по ароматическому кольцу, каждый из R и R независимо представляет собой H, Cалкил, ω-амино-Cалкилен, ω-гидрокси-Cалкилен или ацил, R представляет собой прямую связь или Cалкилен, каждый из R и R независимо представляет собой H, Cалкил, ω-гидрокси-Cалкилен, ацил или CHOH-(CHOH)-CH-, в котором с равно 0, 1, 2, 3 или 4, либо R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическую группу, которая может включать дополнительный гетероатом, и R представляет собой бензил, необязательно замещенный по ароматическому кольцу, -(СН)-OH, CH-CH(OH)- или -(CH)-NRR, и ZZ представляет собой природное или неприродное α-аминокислотное звено;
1
2
подразумевается, что X, X и Lys, каждый, имеют конфигурацию L;
или представляет собой фармацевтически приемлемые соли или защищенные формы соединения общей формулы (I).
a
a
a
2
2
3
3
a
пара-
.
ZZ может иметь конфигурацию D или L. ZZ может представлять собой, например, Thr, Ser, Ala, Val, Ile, Leu, Nle, His, Arg, Lys, Nal, Pal, Tyr, Trp, Phe, замещенные по ароматическому циклу или Nα-бензил-Gly. Если ZZ представляет собой Phe, его бензольный цикл может быть замещен, например, NH, NO, CH, OCH или атомом галогена, предпочтительно вположении Если ZZ представляет собой Phe, его бензольный цикл предпочтительно не замещен.
3
цис-
Если A состоит из остатка аминокислоты Pro, любой заместитель, присутствующий в цикле пролина, например R-NH-CO-O- и т.д., находится предпочтительно в положении 4. Такие замещенные остатки пролина могут находиться в форме, например
транс-
также как в форме. В применения по изобретению включен каждый геометрический изомер по отдельности, так же как смеси данных изомеров.
Если A представляет собой
8
9
2-6
2
2
,в котором NRR образует гетероциклическую группу, упомянутая группа может быть ароматической или насыщенной и может включать атом азота или атом азота и второй гетероатом, выбранный из азота и кислорода. Предпочтительно гетероциклическая группа представляет собой, например, пиридил или морфолин. Cалкиленовый радикал в данном остатке предпочтительно представляет собой -CH-CH-.
5
6
8
9
12
12
1-4
2-4
3-6
Ацильная группа, такая как R, R, R и R в А может, например, представлять собой RCO-группу, в которой R представляет собой H, Cалкил, Cалкенил, Cциклоалкил или бензил и метил или этил.
4a
11
a
Если R или R в A представляют собой бензил, замещенный по ароматическому циклу, бензольный цикл может быть замещен, как указано выше для ZZ.
Согласно предпочтительному варианту изобретения аналоги-агонисты соматостатина представляют собой соединения общей формулы (II)
10
11
2-6
2-6
10
11
1-4
в которой R представляет собой NRR-Cалкилен или гуанидин-Cалкилен и каждый из R и R независимо представляет собой Н или Cалкил
или представляет собой фармацевтически приемлемые соли или защищенные формы соединения общей формулы (II).
10
11
2-6
Предпочтительно R представляет собой NRR-Cалкилен. Предпочтительными соединениями общей формулы (II) являются такие, в которых R представляет собой 2-аминоэтил (и в особенности пептид SOM 230 формулы
2
2
4
цикло[{4-(NH-CH-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe], строение которого воспроизведено ниже).
Protective Groups in Organic Synthesis,
"Защищенная форма" соединения общей формулы (I) или (II) в данной заявке означает аналог соматостатина, в котором по меньшей мере одна из аминогрупп защищена и снятие защиты с которого (которое предпочтительно выполняется в физиологической среде) дает соединение общей формулы (I) или (II). Подходящие защитные группы для аминогрупп описаны, например, вT.W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981), 219-287. Примером такой защитной группы для аминогруппы является ацетильная группа.
2
2
2
2
0
Eur. J. Pharmacol.
Среди аналогов-агонистов соматостатина, которые могут использоваться по изобретению, в особенности могут быть упомянуты ланреотид, октреотид, вапреотид, SOM 230 (см. строение ниже), MK-678 (пептид строения цикло(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe)), BIM-23190 (пептид строения N-гидроксиэтилпиперазинилацетил-D-Phe-цикло[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH), BIM-23197 (пептид строения Hepes-D-Phe-цикло [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH, в котором Abu представляет аминомасляную кислоту), BIM-23268 (пептид строения цикло[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH), PTR-3173 (см. строение ниже), TT-232 (строения D-Phe-цикло[Cys-D-Trp-Lys-Cys]-Thr-NH) и их фармацевтически приемлемые соли; также может быть упомянут синтетический пептид формулы c[Tic-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Phe] и его фармацевтически приемлемые соли; наконец, может быть упомянут пептид KE 108 формулы Tyr-(цикло-D-Dab-Arg-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) описанный, в частности, Reubi et al., (2002), 456, 45-49. В особенности предпочтительно применение ланреотида, октреотида или одной из их фармацевтически приемлемых солей и, конкретнее, ланреотида или одной из его фармацевтически приемлемых солей.
mutatis mutandis.
Подобно соединениям общей формулы (I) или (II), вышеупомянутые пептиды могут также присутствовать в защищенной форме. Определение защищенной формы, данное выше для соединений общих формул (I) или (II), применимо
Согласно предпочтительному варианту изобретения пациентки, для которых предназначено лекарственное средство, основанное на упомянутом выше соматостатине или аналоге-агонисте соматостатина, представляют собой женщин с риском преждевременной менопаузы и конкретно женщин с семейным анамнезом преждевременной менопаузы. Согласно конкретному варианту изобретения пациентки, для которых предназначено лекарственное средство, основанное на упомянутом выше соматостатине или аналоге-агонисте соматостатина, представляют собой женщин с микроделецией X-хромосомы или частичным синдромом Тернера.
(in vitro)
Второе преимущество вышеупомянутого открытия заключается в возможности приготовления лекарственного средства, основанного на аналоге-антагонисте соматостатина, для того, чтобы ускорить начало роста покоящихся фолликулов. Фактически одна пара из шести из тех, кто желает забеременеть, испытывает трудности с зачатием. Хотя существует много причин, для лечения бесплодия людей возникли и обычно используются два типа лечения. Данные типы лечения, также названные «деторождением с медицинской помощью», прежде всего заключаются в индукции одновременного роста нескольких преовуляторных фолликулов. Это позволяет получить несколько зрелых ооцитов и, тем самым, несколько эмбрионов и таким образом повысить шанс зачатия. Упомянутое достигается введением одного или более лекарственных средств, стимулирующих секрецию гонадотропинов (ФСГ и ЛГ) гипофизом, таких как антиэстроген (например, кломифена цитрат или тамоксифен) или ингибитор ароматазы (например, летрозол, анастразол или эксеместан). Одновременный рост нескольких преовуляторных фолликулов также может быть индуцирован введением препарата человеческого ФСГ (экстрактивного или рекомбинантного) с сочетании с ЛГ или без такового. Когда фолликулы достигают преовуляторного размера, в зависимости от причины стерильности выбирают один из двух типов лечения. Первый заключается во внутриматочном оплодотворении (IUI), а второй - в удалении ооцитов из яичника посредством аспирации фолликулов (от 5 до 15 ооцитов) и оплодотворении в лаборатории либо с помощью простой совместной инкубации ооцитов со спермой партнера (IVF), либо микроинъекции сперматозоида непосредственно в ооцит (ICSI). Требуется обязательно получить несколько зрелых ооцитов, чтобы оптимизировать частоту удачных процедур (частоту наступления беременности) при данном лечении; однако у некоторых женщин несмотря на адекватную стимуляцию яичников количество полученных ооцитов низкое или даже равно одному. Слабая реакция на стимулирующее лечение является результатом ограниченного числа растущих фолликулов, которые присутствуют в яичниках данных пациенток. Следовательно, возможность активизировать фолликулы яичникового резерва и заставить их вступить в фазу роста является значительным лечебным преимуществом.
Другим субъектом настоящего изобретения является применение аналога-антагониста соматостатина для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для того, чтобы ускорить начало роста покоящихся фолликулов у женщин, у которых не наступила менопауза.
Введение такого лекарственного средства в течение 1-12 месяцев повышает у женщин количество фолликулов, находящихся в фазе роста, которые можно стимулировать при стандартных способах лечения, чтобы достичь стадии преовуляторных фолликулов.
in vitro
in vitro
Другое применение способности аналогов-антагонистов соматостатина индуцировать ранний рост фолликула заключается в их применении в культурах фолликулов для производства зрелых ооцитов, предназначенных для оплодотворения. Для поддержки развития фолликула используется аналог-антагонист соматостатина, добавленный к питательным средам. Следовательно, изобретение также относится к соответствующим средам, в которых содержится аналог-антагонист соматостатина. Кроме того, способность аналогов-антагонистов соматостатина индуцировать ранний рост фолликулов также может использоваться в области токсикологических исследований. В частности, во время испытаний воздействия новых химических соединений на рост фолликулов, добавление к совокупности фолликулов аналога-антагониста соматостатина позволяет ускорить рост фолликула и, таким образом, с большей легкостью наблюдать любое замедление упомянутого роста, вызванное упомянутыми новыми химическими соединениями.
"SS-подобный"
Аналог-антагонист соматостатина может представлять собой циклический или нециклический полипептид, составной или рекомбинантный белок, непептидное химическое соединение (т.е. пептидомиметик) или также пептид, такой как кортикостатин. Используемые аналоги-антагонисты должны иметь высокое сродство к рецептору SST и ингибировать функциональную активность SST14 или SST28, такую как ингибирование секреции гормона роста соматотропными клетками гипофиза и/или ингибирование in vitro пролиферации клеток аденомы гипофиза. Предпочтительно аналог-антагонист соматостатина имеет высокое сродство ко всем или по меньшей мере к 2 или 3 подтипам рецепторов SST или большее сродство по меньшей мере к одному из подтипов 1, 2, 3, 4 и 5 (например, к подтипу 2).
Аналог-антагонист соматостатина, который может использоваться для средства по изобретению, может, например, быть пептидом общей формулы
в которой:
1
A представляет собой необязательно замещенную ароматическую α-аминокислоту;
2
A представляет собой необязательно замещенную ароматическую α-аминокислоту;
3
A представляет собой Dab, Dap, Lys или Orn;
4
A представляет собой β-гидроксивалин, Ser, Hser или Thr;
5
A представляет собой необязательно замещенную ароматическую D- или L- α-аминокислоту; и
1
1
1
2
1-6
Y представляет собой OH, NH или NHR, R представляет собой (C)алкил;
2
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
9
10
9
10
каждая необязательно замещенная ароматическая α-аминокислота необязательно замещена одним и более заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из атома галогена и групп NO, OH, CN, (C)алкил, (C)алкенил, (C)алкинил, (C)алкокси, Bzl, O-Bzl и NRR, R и R, каждый, независимо представляет собой H, O или (C) алкил; и
1
каждый атом азота пептидной амидной связи и аминогруппы A необязательно замещен метильной группой; подразумевается, что в пептиде общей формулы (III) имеется по меньшей мере одна такая метильная группа;
и фармацевтически приемлемой соли пептида общей формулы (III).
Под "ароматической α-аминокислотой" подразумевается остаток аминокислоты формулы
1
2
2
3
3
3
, в которой Z представляет собой радикал, содержащий ароматический цикл, а Z представляет собой атом водорода или радикал, содержащий ароматический цикл. Примеры таких радикалов, содержащих ароматический цикл, включают, но не ограничены ими, бензольный или пиридиновый цикл и следующие структуры с одним и более заместителями X в ароматическом цикле или без таковых (X каждый раз, когда встречается, независимо представляет собой атом галогена, NO, CH, OCH, CF или ОН):
Другие примеры "ароматической α-аминокислоты" по изобретению представляют собой замещенный His, такой как MeHis, His (τ-Me) или His (π-Me).
Другие аналоги-антагонисты соматостатина, в частности, описаны в заявках на патент WO PCT 98/08528, WO 98/08529, WO 98/24807, WO 98/44921, WO 98/44922, WO 98/45285 и WO 99/22735, а также в патентах US 6387932, US 6262229, US 6063796, US 6057338, US 6025372, US 5925618, US 5846934 и US 4508711.
Среди аналогов-антагонистов соматостатина, которые могут использоваться по изобретению, и их фармацевтически приемлемых солей в особенности могут быть упомянуты:
- следующие пептиды общей формулы (III):
2
- Cpa-цикло[D-Cys-Pal-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Cys]-D-Trp-NH,
2
- Cpa-цикло[D-Cys-Tyr-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH;
2
- Cpa-цикло[D-Cys-Pal-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH;
2
- пептид, известный под кодовым названием AC-178335 (строения ацетил-D-His-D-Phe-D-Ile-D-Arg-D-Trp-D-Phe-NH);
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
- октапептид, известный под кодовым названием ODN-8 (см. фиг.1 из (2000), 97(25), 13973-13978);
- пептид, известный под кодовым названием SB-710411 (строения Cpa-цикло[D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Cpa-амид);
- пептид, известный под кодовым названием BTM-23056 (строения, представленного ниже);
- соединение, известное под кодовым названием BN-81674 (строения, представленного ниже);
- соединение, известное под кодовым названием SRA-880 (строения, представленного ниже);
и их фармацевтически приемлемые соли.
mutatis mutandis.
Подобно соединениям общей формулы (I) или (II), вышеупомянутые пептиды (включая те, которые соответствуют общей формуле (III)) тоже могут присутствовать в защищенной форме. Определение защищенной формы, данное выше для соединений общих формул (I) или (II), применимо
50
Под аналогом-агонистом соматостатина в данной заявке подразумевается соединение, для которого эффективная доза DE, определенная в описанном ниже тесте агонистического эффекта, составляет 1 мкМ или менее для по меньшей мере одного из подтипов рецепторов соматостатина.
50
Под аналогом-антагонистом соматостатина в данной заявке подразумевается соединение, для которого эффективная доза DE, определенная в описанном ниже тесте антагонистического эффекта, составляет 1 мкМ или менее для по меньшей мере одного из подтипов рецепторов соматостатина.
Int. J. Pharm.
Под фармацевтически приемлемой солью подразумеваются, в частности, в данной заявке аддитивные соли с неорганическими кислотами, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат, фосфат, дифосфат и нитрат, или с органическими кислотами, такие как ацетат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, цитрат, лактат, метансульфонат, p-толуолсульфонат, памоат и стеарат. В область техники, к которой относится изобретение, также включены, если они могут использоваться, соли, сформированные основаниями, такими как гидроксид натрия или калия. Ссылкой на другие примеры фармацевтически приемлемых солей служит "Salt selection for basic drugs", (1986), 33, 201-217.
Согласно настоящему изобретению фармацевтические препараты, содержащие соматостатин или один из его аналогов-агонистов или аналогов-антагонистов, применимых по данному изобретению, могут вводиться парентеральным путем (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или посредством имплантата), пероральным, влагалищным, ректальным, назальным, подъязычным или чрескожным путем. Влагалищный путь предпочтителен, потому что он позволяет доставлять эффективные концентрации активного компонента в яичники, минимизируя системное воздействие. Из используемого соматостатина или аналога соматостатина вместе с необходимыми наполнителями, известными специалисту в данной области техники, готовится лекарственная форма, чтобы делать возможным введение эффективным и воспроизводимым для каждого пути введения.
Доза продукта по настоящему изобретению, предназначенная для лечения вышеупомянутых болезней или расстройств, меняется в зависимости от способа введения, возраста и массы тела субъекта, которого лечат, так же как от состояния субъекта, и окончательное решение принимается лечащим врачом или ветеринаром. Такое количество, определенное лечащим врачом или ветеринаром, в данном документе называется "терапевтически эффективным количеством".
Тем не менее предусмотрены следующие типичные ситуации для применения по изобретению:
- У пациентки приблизительно 20-25 лет (например) имеется частичный синдром Тернера из-за микроделеции X-хромосомы. Внешне функция ее яичников в норме с регулярными овуляторными циклами. Уровень в сыворотке ФСГ у нее немного повышен во время перехода от лютеиновой к фолликулярной фазе (например ФСГ = приблизительно 9,2 МЕ/л). УЗИ яичников, выполненное чрезвлагалищным путем, показывает яичники нормального объема с немного сниженным количеством антральных фолликулов. Учитывая высокий риск ранней менопаузы, пациентку лечат ланреотида ацетатом в дозе 120 мг/месяц (Somatuline Autogel 120 мг, Beaufour Ipsen Pharma, Франция). Лечение прекращено через несколько лет, когда пациентка пожелала забеременеть.
-
in vitro
in vitro
Пациентка приблизительно 35-40 лет в течение нескольких лет страдает первичным бесплодием. Обследование пары позволило поставить диагноз трубного бесплодия, возникшего, вероятнее всего, вследствие перенесенного ранее перитонита. Менструальные циклы овуляторные, и уровень ФСГ в сыворотке немного повышен во время перехода от лютеиновой к фолликулярной фазе (например, ФСГ = приблизительно 11,4 МЕ/л). При УЗИ яичников, выполненным чрезвлагалищным путем, объем яичников немного уменьшен со сниженным количеством антральных фолликулов (примерно 3 на яичник). Поставлен диагноз сокращения овариального резерва. Рекомендовано оплодотворение, и пациентка подверглась индукции овуляции путем ежедневных инъекций 225 единиц рекомбинантного ФСГ. На 6-й день индукции УЗИ яичников выявило единственный растущий фолликул диаметром 14 мм в правом яичнике. Доза ФСГ была удвоена, и пациентку повторно осмотрели 2 дня спустя. Наблюдался единственный фолликул диаметром 18 мм, что подтвердило сокращение овариального резерва. Лечение прекращено. После установления спонтанного цикла начато ежедневное введение аналога-антагониста соматостатина. Во время данного лечения количество антральных фолликулов, находящихся в каждом яичнике, оценивалось по УЗИ в начале каждого менструального цикла. После 4 месяцев лечения количество антральных фолликулов в среднем составило приблизительно 6 на яичник и уровень ФСГ в сыворотке снизился. Начата стимуляция рекомбинантным ФСГ, получено развитие множества фолликулов, и выполнена стандартная процедура оплодотворения.
- У пациентки с синдромом поликистозных яичников менструации очень нерегулярные, овуляция отсутствует, имеется избыточный вес и кожные симптомы избытка андрогенов, такие как угри и гирсутизм. При УЗИ таза эндометрий гиперплазирован, объем яичников повышен, увеличено количество стромы и на срезе яичника видно более 10 антральных фолликулов. Диаметр всех фолликулов меньше 10 мм. Пациентку лечили ланреотида ацетатом в дозе 120 мг/месяц (Somatuline Autogel 120 мг, Beaufour Ipsen Pharma, Франция). Через 3 месяца лечения у пациентки появились спонтанные менструации. На 4-м месяце лечения УЗИ выявило сокращение объема яичников и количества антральных фолликулов. Наблюдался один фолликул диаметром 16 мм. На 5-м и 6-м месяцах лечения у пациентки установились регулярные менструации, а ее температурная кривая стала двухфазной, что указывает на овуляцию. В течение 8-м месяца лечения менструации у пациентки не было, тест на наличие беременности оказался положительным. Лечение ланреотида ацетатом прекращено.
Конкретные сокращения и определения, используемые в настоящей заявке:
Сокращения обыкновенных аминокислот соответствуют рекомендациям IUPAC-IUB. Кроме того, определения для некоторых из используемых в настоящей заявке сокращений следующие:
Abu = α-аминомасляная кислота;
Aib = α-аминоизомасляная кислота;
β-Ala = β-аланин;
Amp = 4-аминофенилаланин;
Ava = 5-аминовалериановая кислота;
Bzl = бензил;
Cha = циклогексилаланин;
Cpa = 3-(4-хлорфенил)аланин;
Dab = 2,4-диаминомасляная кислота;
Dap = 2,3-диаминопропионовая кислота;
Dip = 3,3'-дифенилаланин;
GABA = γ-аминомасляная кислота;
HSer = гомосерин;
1-Nal = 3-(1-нафтил)аланин;
2-Nal = 3-(2-нафтил)аланин;
Nle = норлейцин;
Nva = норвалин;
2-Pal = 3-(2-пиридил)аланин;
3-Pal = 3-(3-пиридил)аланин;
4-Pal = 3-(4-пиридил)аланин;
6
5
Phg = -HN-CH(CH)-CO-
Tfm = трифторметил;
TfmA = 4-трифторметилфенилаланин;
Tic = 1,2,3,4-тетрагидроизхинолин-3-карбоновая кислота.
Кроме того, NMeLys представляет собой N-метиллизин, в котором метилирован азот пептидной связи (а не азот боковой цепи лизина).
125
127
131
Наконец, Tyr(I) представляет собой йодированный остаток тирозина (например 3-I-Tyr, 5-I-Tyr, 3,5-I-Tyr), в котором атом йода может быть радиоактивным изотопом, например I, I или I.
Кроме того, термин "приблизительно" относится к интервалу вблизи рассматриваемого значения. Как используется в настоящей заявке, "приблизительно X" означает интервал от X, уменьшенного на 10%, до X, увеличенного на 10%, и предпочтительно интервал от X, уменьшенного на 5%, до X, увеличенного на 5%.
Получение пептидов общей формулы (I):
Упомянутые выше пептиды общих формул (I) и (II) и их синтез описаны, например, в заявках на патент PCT WO 97/01579 и WO 02/10192.
Упомянутые выше пептиды общей формулы (III) и их синтез описаны в заявке на патент PCT WO 02/072602.
Все использованные в данном документе технические и научные термины, если они не определены иначе, имеют то же самое значение, которое обычно имеется в виду лицом, обладающим обычными познаниями в области, к которой принадлежит данное изобретение. Подобным образом, все публикации, заявки на патент, все патенты и все остальные ссылки, упомянутые здесь, включены посредством ссылки.
Следующие примеры даны, чтобы проиллюстрировать вышеупомянутые процедуры, и ни в коем случае не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
ПРИМЕРЫ.
Пример 1
2
Яичники взрослых овец забирали немедленно после забоя. Яичники помещали в транспортировочную среду для органов без сыворотки (X-vivo, Bio Whittaker, Walkersville, MD, США) при 10°C и перевозили в лабораторию. Приблизительно через 1 час после удаления корковое вещество отделяли от мозгового, затем после промывки в свежей X-vivo разрезали на пластины толщиной 2 мм (1 см, средняя масса 212 мг). Фрагменты коркового вещества культивировали в термостате при содержании кислорода 5% в течение 10 дней на луночных планшетах в присутствии DMEM. Среду заменяли каждые 2 суток.
-9
-6
В контрольных фрагментах (инкубированных в отсутствие SST) примордиальные фолликулы постепенно развивались в фолликулы, находящиеся в начале роста (см. фиг.1 и 2). Добавление SST14 в концентрациях, меняющихся от 10 М до 10 М, очень значимо ингибирует начало роста примордиальных фолликулов, что доказывается сохранением в течение долгого времени числа примордиальных фолликулов (см. фиг.1) и отсутствием увеличения числа первичных фолликулов (см. фиг.2).
Пример 2
1
Использовалась та же процедура, что и в примере 1, за исключением того, что соматостатин заменили одним из его аналогов-агонистов, а именно синтетическим пептидом формулы c[Tic-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Phe] (далее пептид AG).
1
1
-9
В контрольных фрагментах (инкубированных в отсутствие пептида AG) примордиальные фолликулы постепенно развивались в фолликулы, находящиеся в начале роста (см. фиг.3). Добавление пептида AG в концентрации 10 М очень значимо ингибирует начало роста примордиальных фолликулов, что доказывается сохранением в течение долгого времени числа примордиальных фолликулов и отсутствием увеличения числа первичных фолликулов (см. фиг.4).
Пример 3
2
1
Использовалась та же процедура, что и в примере 1, за исключением того, что соматостатин заменили одним из его аналогов-антагонистов, а именно синтетическим пептидом формулы Cpa-c(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH (далее пептид ANT).
1
1
-6
В контрольных фрагментах (инкубированных в отсутствии пептида ANT) примордиальные фолликулы постепенно развивались в фолликулы, находящиеся в начале роста (см. фиг.3). Наблюдали, что добавление пептида ANT в концентрации 10 M стимулирует начало роста примордиальных фолликулов (см. фиг.5).
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена доля покоящихся фолликулов в течение 10 суток культивирования коркового вещества яичника овцы в присутствии или в отсутствие (контроль) соматостатина (SST14). Указанную долю измеряли для каждого исследуемого образца в день начала эксперимента (D0), на 4-е сутки (D4), на 7-е сутки (D7) и на 10-е сутки (D10).
На фиг.2 представлена доля первичных фолликулов в течение 10 суток культивирования коркового вещества яичника овцы в присутствии или в отсутствие (контроль) соматостатина (SST14). Указанную долю измеряли для каждого исследуемого образца в день начала эксперимента (D0), на 4-е сутки (D4), на 7-е сутки (D7) и на 10-е сутки (D10).
На фиг.3 представлена доля примордиальных, промежуточных, первичных и вторичных фолликулов в течение 10 суток культивирования коркового вещества яичника овцы в отсутствие агониста или аналога-антагониста соматостатина. Указанную долю измеряли для каждого исследуемого образца в день начала эксперимента (D0), на 4-е сутки (D4), на 7-е сутки (D7) и на 10-е сутки (D10).
1
На фиг.4 представлена доля примордиальных, промежуточных, первичных и вторичных фолликулов в течение 10 суток культивирования коркового вещества яичника овцы в присутствии или в отсутствие аналога-агониста соматостатина, синтетического пептида формулы c[Tic-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Phe] (пептида AG). Указанную долю измеряли для каждого исследуемого образца в день начала эксперимента (D0), на 4-е сутки (D4), на 7-е сутки (D7) и на 10-е сутки (D10).
2
1
На фиг.5 представлена доля примордиальных, промежуточных, первичных и вторичных фолликулов в течение 10 суток культивирования коркового вещества яичника овцы в присутствии или в отсутствие аналога-антагониста соматостатина, синтетического пептида формулы Cpa-c(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH (пептида ANT). Указанную долю измеряли для каждого исследуемого образца в день начала эксперимента (D0), на 4-е сутки (D4), на 7-е сутки (D7) и на 10-е сутки (D10).
Испытания для определения агонистического или антагонистического воздействия аналога соматостатина
Ингибирование внутриклеточного образования цАМФ
Клетки CHO-K1, экспрессирующие подтипы рецепторов человеческого соматостатина (SRIF-14), культивируются на 24-луночных планшетах в среде RPMI 1640, содержащей 10% сыворотки эмбрионов телят. Среду заменяли накануне эксперимента.
5
Клетки в количестве 10 клеток/лунка дважды промывали 0,5 мл новой среды RPMI, содержащей 0,2% BSA, дополненной 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), и инкубировали в течение приблизительно 5 минут при приблизительно 37°C. Образование циклического АТФ стимулировали добавлением 1 мМ форсколина (FSK; поставщик: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, США) в течение 15-30 минут приблизительно при 37°C.
Определение агонистического воздействия аналога соматостатина
-10
-5
Агонистическое воздействие аналога соматостатина измеряли путем одновременного добавления FSK (1 мкМ) и испытуемого аналога (от 10 М до 10 M).
Среду реакции удаляли и добавляли 200 мл 0,1 н. HCl. Количество цАМФ измеряли радиоиммунологическим анализом (Kit FlashPlate SMP001A, New England Nuclear, Boston, США).
Определение антагонистического воздействия аналога соматостатина
-10
-5
Антагонистическое воздействие аналога соматостатина измеряли путем одновременного добавления FSK (1 мкМ), SRIF-14 (от 1 до 10 нМ) (поставщик: Bachem, Torrence, CA, США) и испытуемого аналога (от 10 М до 10 M).
Среду реакции удаляли и добавляли 200 мл 0,1 н. HCl. Количество цАМФ измеряли радиоиммунологическим анализом (Kit FlashPlate SMP001A, New England Nuclear, Boston, США).