СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БРОМЕЛАЙНА, ОБЛАДАЮЩЕГО РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ
METHOD FOR OBTAINING HETEROGENEOUS PREPARATION BASED ON BROMELAIN WITH THE WOUND-HEALING PROPERTIES

Изобретение относится к биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано при изготовлении лекарственных средств, обладающих регенерирующим и ранозаживляющим действием.
Процесс ранозаживления сложен и многостадиен, поэтому актуальной задачей современной медицины является проблема лечения ран. Лекарственные препараты, применяемые для лечения и профилактики кожных повреждений, воздействуют на разные этапы заживления ткани и действуют по различным механизмам. Включение ферментов в процесс ранозаживления способствует энзиматическому очищению ран от сгустков крови, а также лизису некротических образований. При использовании ферментов в свободном состоянии не наблюдается высокого лечебного эффекта, регистрируется их быстрая инактивация и не обеспечивается длительного контакта с раневой поверхностью. Наиболее эффективными композициями являются гели, мази, повязки. Известны марлевые перевязочные материалы на основе натуральных волокон, предназначенных защищать рану от механического воздействия и впитывать экссудаты. Недостатком таких материалов является низкая эффективность курса лечения, его длительность, поэтому необходимо такие повязки сочетать с применением других лекарственных средств, в частности с ферментными препаратами. В медицинской практике широко распространены такие материалы как «Легиус». Однако их недостатком является одноразовое использование и при таком способе лечения не происходит удаления токсичных веществ [Патент RU 2093190, МПК A61L 15/22, A61L 15/44, опубл. 20.10.1997; Патент RU 2066199, МПК A61L 15/16, опубл. 10.09.1996].
Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический растительный фермент, получаемый из ананаса, относится к группе цистеиновых протеиназ. Бромелайн является основным белком с изоэлектрической точкой при рН 9.55. Температурный оптимум составляет 62°С, рН оптимум - около 7 единиц. Бромелайн используется для улучшения пищеварения, облегчения воспалительных процессов при травмах, снятия отека мягких тканей, а также для ускорения их восстановления после повреждений. Показаны его противораковые свойства и способность предотвращать образование тромбов. Бромелайн обладает иммуномодулирующим действием, ускоряет процессы репарации тканей в результате деполимеризации межклеточных структур и модификации проницаемости сосудов [Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. - М.: Наука, 1971. - 404 с.].
Все большее применение в химико-фармацевтической промышленности находят иммобилизованные ферменты, т.е. искусственно связанные с нерастворимым носителем посредством физических или химических взаимодействий и сохраняющие частично или полностью каталитические свойства.
На сегодняшний день использование лекарственных средств под перевязочным материалом является главенствующим благодаря его доступности и простоте применения.
Задачей предлагаемого изобретения является расширение базы ранозаживляющих материалов на основе иммобилизованных ферментов. Целью изобретения является создание высокоэффективного лекарственного средства, которое будет позволять лечить гнойные и длительно незаживающие раны без образования рубца в более короткой срок, обладать противовоспалительным, регенераторным действием, не вызывая аллергических реакций, значительно сокращать расход ранозаживляющего материала.
Поставленная задача решается применением в качестве действующего вещества протеолитического фермента бромелайна (КФ 3.4.22.32), иммобилизованного на матрицах волокон ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1. Технология по производству ионообменных материалов, а также тканных и нетканых прошивных полотен из него, давно известна и легко осуществима на заводах, которые синтезируют полиакрилонитрильные волокна [Патент RU 2102544, МПК D01F 11/04, C08J 5/20, опубл. 20.01.1998]. Сочетание недорогих компонентов позволит сделать доступным этот технологичный метод для отечественных лабораторий.
В медицинской практике уже применяются лекарственные средства, включающие в свой состав бромелайн, в частности для ферментотерапии с использованием полиэнзимного препарата «Wobenzym» в виде драже в кишечнорастворимой оболочке, для лечения хронических воспалительных дерматозов у детей, при инфекционных заболеваниях органов дыхания, для фармакологического лечения аутоиммунного мужского бесплодия [Патент RU 2149021, МПК A61K 38/43, A61P 15/08, опубл. 20.05.2000; Патент RU 2175244, МПК A61K 38/43, A61P 17/00, опубл. 27.10.2001; Патент RU 2450812, МПК A61K 31/194, A61K 36/03, A61K 36/185, A61P 11/00, опубл. 20.05.2012].
В качестве прототипа служил СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН (SU 1814764, МПК A61K 31/557, A61K 47/48, опубл. 20.03.1995), включающий иммобилизацию ферментного препарата, с целью повышения лечебного эффекта средства, иммобилизацию проводили путем обработки 2%-ного геля хитозана 2%-ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере при рН 7.5, взятых в соотношении 1:1, выдерживания его при температуре 18-20°С в течение 30 мин, после чего пропускали через гель экстракт гепатопанкреаса камчатского краба, содержащего комплекс ферментов.
Технический результат заключается в разработке способа получения нового ранозаживляющего материала на основе бромелайна, который позволит сократить расход ранозаживляющего средства благодаря высокой стабильности препарата при температурах выше физиологических и его пролонгированному действию.
Действующим веществом предлагаемого нами средства является бромелайн, который обладает противовоспалительным действием, ускоряет процессы репарации тканей в результате деполимеризации межклеточных структур и модификации проницаемости сосудов. Противовоспалительный и антиагрегантный эффекты фермента обусловлены его способностью изменять метаболизм арахидоновой кислоты. Температурный оптимум функционирования бромелайна составляет порядка 60°С [H.J. Suh [et al.] Purification and characterization of bromelain isolated from pineapple // J. Han'guk Nonghwa Hakhoechi - 1992. - Vol. 35. - P. 300-307], иммобилизация фермента на матрице нерастворимого полимера дает эффект дополнительной стабилизации препарата [R. Mahmood [et al.] Additional stabilization of stem bromelain coupled to a thermosensitive polymer by uniform orientation and using polyclonal antibodies // Biochemistry. - 2007. - Vol. 72. - P. 307-312]. Кроме того, в качестве носителя для иммобилизации бромелайна (основы повязки) нами были выбраны ионообменные волокна ВИОН - ранозаживляющие материалы, характеризующиеся высокой степенью сорбции, очищающие и дезинфицирующие рану [Патент RU 2229311, МПК A61L 15/00, A61L 15/16, A61L 15/22, опубл. 27.05.2004].
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами, включающем иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе, инкубирование и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию бромелайна проводят на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 или ВИОН АН-1 в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 т волокон; в качестве буферного раствора для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0.05 М глициновый буфер (рН 9.0-10.5) или 0.05 М боратный буфер без добавления KCl (рН 8.0), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0.2 М ацетатный (рН 5.0) буфер; инкубация проводится в течение 24 часов при комнатной температуре; образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Фиг. 1. Структура элементарного звена волокон (а) ВИОН КН-1 и (б) ВИОН АН-1. Фиг. 2 и 5 приведены диаграммы содержания белка в препаратах бромелайна, иммобилизованных на ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 соответственно. Фиг. 3 и 6 приведены диаграммы общей активности препаратов бромелайна, иммобилизованных на ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 соответственно. Фиг. 4 и 7 приведены диаграммы удельной активности препаратов бромелайна, иммобилизованных на ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 соответственно.
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы «Sigma-Aldrich», носителем для иммобилизации -ионообменные волокна ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 (фиг. 1). Содержание белка в препаратах определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall RJ. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
На первом этапе экспериментов для получения гетерогенных биокатализаторов на основе бромелайна, иммобилизованного на матрице ионообменных волокон ВИОН КН-1, в качестве иммобилизационной среды мы использовали следующие растворы: 0.1 М карбонатный (рН 9.0-10.5), 0.05 М глициновый (рН 8.6-10.5), 0.1 М боратный буфер без добавления KCL (рН 8.0-10.0), 0.2 М ацетатный (рН 4.0-5.8), 0.05 М трис-HCL буфер (рН 7.0-9.0).
Установлено, что наибольшее содержание белка (в мг на г носителя) в препаратах бромелайна, адсорбированного на матрице ионообменного волокна ВИОН КН-1, наблюдается при иммобилизации в следующих растворах: 0.2 М ацетатный (рН 4.0-5.8), 0.05 М трис-HCL (рН 7.0-9.0) буферы (фиг. 2).
Высокую общую активность (в ед на мл раствора) показали препараты бромелайна, приготовленные с помощью боратного буфера (рН 8.0-10.0), трис-HCL (рН 7.0-9.0) и глицинового (рН 9.0, 10.0 и 10.5) буферов (фиг. 3).
Максимальная удельная активность (в ед на мг белка) гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, сорбированного на матрице ионообменного волокна ВИОН КН-1, регистрируется при использовании боратного буфера без добавления KCL (рН 8.0) и глицинового буфера (рН 9.0 и 10.5) (фиг. 4).
На втором этапе эксперимента для получения гетерогенного биокатализатора на основе протеолитического фермента бромелайна, иммобилизованного на матрице ионообменного волокна ВИОН АН-1, в качестве иммобилизационной среды мы использовали следующие растворы: 0.2 М ацетатный (рН 4.0-5.8), 0.1 М карбонатный (рН 9.0-10.5), 0.05 М глициновый (рН 8.6-10.5) буферы.
Установлено, что наибольшее содержание белка (в мг на г носителя) в препаратах бромелайна наблюдается при иммобилизации в глициновом (рН 9.0 и 10.5) и карбонатном (рН 10.0) буферных растворах (фиг. 5).
Высокую общую активность (в ед на мг белка) показали препараты бромелайна, приготовленные с помощью ацетатного (рН 5.0 и 5.8), карбонатного (рН 10.0 и 10.5) и глицинового (рН 9.0, 10.0 и 10.5) буферов (фиг. 6).
Максимальная удельная активность (в ед на мг белка) гетерогенного препарата, приготовленного на основе бромелайна, сорбированного на матрице ВИОН АН-1, зарегистрирована при использовании ацетатного буфера (рН 5.0) (фиг. 7).
Из вышеизложенного материала следует, что оптимальными для создания гетерогенных препаратов на основе бромелайна являются следующие два варианта:
Пример 1. К 1 г катионообменных волокон ВИОН КН-1 добавляли 20 мл раствора бромелайна в концентрации 2 мг/мл в 0.05 М глициновом буфере (рН 9.0) или 0.05 М боратном буфере без добавления KCl (рН 8.0), инкубировали в течение 24 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали буфером до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Пример 2. К 1 г анионообменных волокон ВИОН АН-1 добавляли 20 мл раствора бромелайна в концентрации 2 мг/мл в 0.2 М ацетатном (рН 5.0) буфере, инкубировали в течение 24 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали буфером до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Таким образом, нами была разработана методика получения ранозаживляющего гетерогенного препарата медицинского назначения на основе бромелайна и ионообменных волокон ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1. Подобраны оптимальные условия для иммобилизации бромелайна на матрицах ионообменных волокон ВИОН. Предлагаемый нами продукт может быть использован в медицинской практике, обладает пролонгированным действием благодаря стабилизации фермента, что позволит сократить расход перевязочного материала.