СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗАТОРА
METHOD FOR ENZYME CATALYST REGENERATION

Настоящее изобретение относится к способу регенерации ферментативного катализатора путем отделения/прикрепления фермента к носителю, при этом вышеуказанный фермент применяют прикрепленным к своему носителю в каталитической реакции.
В настоящее время все больше процессов применяют ферментативный катализ. В подавляющем большинстве случаев эти процессы требуют закрепления фермента на корпускулярном твердом носителе, или для серийных реакций или для реакций с неподвижным слоем катализатора. Однако время жизни фермента ограничено, и регенерация катализаторов, содержащих ферменты, является сложной по сравнению с регенерацией обычных катализаторов. Регенерация катализатора состоит из отделения использованного фермента и затем прикрепления активного фермента к носителю. Эту операцию часто усложняют, в частности в промышленном масштабе, где применяют большие количества ферментов, а их стоимость прямо отражается на цене готовых изделий. В действительности, до сих пор регенерация катализатора на основе фермента требовала выгрузки указанных катализаторов из реактора, обработки носителя вышеуказанного катализатора для удаления использованного фермента, например, с помощью химической обработки и/или прокаливания, затем загрузки носителя обратно в реактор и, в конце концов, прикрепления на последний свежего активного фермента для восстановления активного катализатора. Такой способ является трудоемким и дорогим, так как он значительно увеличивает время простоя реактора.
Настоящее изобретение направлено на преодоление этих недостатков путем предложения способа, при котором не требуется ни выделения катализатора для замены фермента, ни освобождения содержащего его реактора, что сокращает время простоя реактора.
Поэтому, настоящее изобретение относится к способу регенерации ферментативного катализатора, расположенного в реакторе, включающего минеральный носитель на основе по меньшей мере одного оксида металла и по меньшей мере один фермент, отличающемуся тем, что он включает по меньшей мере одну стадию отделения ферментов от носителя сольватацией путем вымывания катализатора, применяя по меньшей мере одно ионное поверхностно-активное вещество до тех пор, пока использованные ферменты не будут удалены, и по меньшей мере одну стадию повторного прикрепления активных ферментов путем промывки вышеуказанного очищенного носителя по меньшей мере одним раствором активных ферментов, причем эти две стадии выполняют in situ внутри реактора.
Этот способ не только предоставляет экономию времени относительно операций выгрузки-загрузки и обработки носителя, но также финансовую выгоду, получающуюся в результате улучшенной оптимизации использования ферментативных катализаторов. Он обеспечивает дополнительное преимущество, давая возможность применения ко всем типам ферментов на носителе и всем прикладным задачам, применяющим ферменты на носителях в реакциях ферментативного катализа.
Под словом ”фермент” подразумевается молекула, позволяющая снизить энергию активации реакции и ускорить химические реакции, происходящие в среде, без изменения равновесия, которое было установлено. Они также предоставляют преимущество тем, что их можно применять при температуре окружающей среды.
Стадия отделения ферментов включает вымывание катализатора жидким раствором так называемого амфифильного ионного поверхностно-активного вещества, причем это поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из солей алкилсульфонатов, солей алкилсульфатов, солей алкилсульфосукцинатов, солей ал кил фосфатных эфиров, солей алкилбензолсульфонатов и четвертичных аммонийных солей, используемых в одиночку или в смеси.
1
2
3
4
1
2
3
4
+
Аммонийные соли обычно выбирают из солей формулы N RRRR, где R, R, R и R представляют собой алкильную, арильную, аралкильную или циклоалкильную группы, содержащие от 1 до 30 атомов углерода. Среди последних предпочтительными являются соли тетраметиламмония, тетраэтиламмония, тетрапропиламмония, тетрабутиламмония, тетрапентиламмония, тетрагексиламмония, бензилтриметиламмония, бензилтриэтиламмония и гексаметония. Соли фосфония во всех отношениях структурно соответствуют вышеуказанным аммонийным солям.
В течение стадии отделения ферментов количество ферментов захваченных эффлюентом, покидающим реактор, оценивают путем измерения, непрерывно или дискретно, его поглощения при длине волны, характерной искомому ферменту с помощью УФ-спектрометрии. Обычно длины волн, соответствующие ферментам, варьируют от 280 нм (нанометров) до 420 нм. В случае, когда используемым ферментом является гемоглобин, характерная длина волны составляет 404 нм. Количество ферментов уменьшается в уходящем эффлюенте по мере протекания стадии отделения. Концентрация использованных ферментов, измеренная путем оценки поглощения при длине волны, характерной ферменту в УФ-спектрометрии, уменьшается в уходящем эффлюенте в течение вышеуказанного вымывания. Конец этой стадии будет достигнут тогда, когда дифференциальное измерение УФ поглощательной способности между уходящим эффлюентом и потоком, поступающим в реактор, станет равным нулю.
Среди ионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) предпочтительными являются соли алкилсульфаты щелочных металлов и щелочно-земельных металлов. Их выбирают из солей алкилсульфатов, в которых каждая алкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода в линейной или разветвленной парафиновой цепи, причем вышеуказанная цепь предпочтительно содержит от 10 до 16 атомов углерода.
Предпочтительно алкилсульфатная соль представляет собой соль лаурилсульфата натрия, также называемую додецилсульфатом натрия (ДСН). Ионное ПАВ или ПАВы вводят в реактор смешанными с водой в концентрации предпочтительно в интервале от 1 до 50 г/л, более предпочтительно от 1 до 20 г/л.
Способ по данному изобретению позволяет отделить ферменты, составляющие часть группы, состоящей из шести классов ферментов, т.е. гидролазы, трансферазы, оксидоредуктазы, изомеразы, лиазы или декарбоксилазы и лигазы.
Среди этих ферментов способ, в частности, подходит для отделения оксидоредуктаз, в частности гемопротеинов и конкретнее гемоглобина.
2
2
Носители, позволяющие отсоединять и прикреплять ферменты, согласно способу по изобретению предпочтительно представляют собой аморфные или кристаллические минеральные носители на основе оксидов металлов, выбранных из группы кристаллических, аморфных или композитных материалов, содержащих оксид алюминия, диоксид кремния, диоксид циркония, диоксид титана или любой композитный материал, содержащий по меньшей мере один из этих материалов с удельной площадью поверхности в интервале от 200 до 1000 м/г, предпочтительно из диоксида кремния и/или оксида алюминия с удельной площадью поверхности в интервале от 200 до 600 м/г.
Согласно способу по данному изобретению, повторное прикрепление ферментов после процесса отделения, описанного выше, осуществляют с помощью промывания очищенного носителя раствором фермента до тех пор, пока концентрация фермента, т.е. его поглощение, измеренное при длине волны, характерной для требуемого фермента, с помощью УФ-спектрометрии, не увеличится в уходящем эффлюенте и не достигнет такого же поглощения, как и во входящем потоке. Стадию повторного прикрепления выполняют или немедленно или позже, с таким же типом фермента или другим типом фермента.
Стадию повторного прикрепления ферментов останавливают, когда дифференциальное измерение концентрации ферментов, выраженной их поглощением, измеренным во входящем потоке и в эффлюенте, покидающем реактор, становится равным нулю. Фактически, концентрация раствора ферментов на выходе идентична концентрации раствора, поступающего в реактор, т.е. они имеют идентичное поглощение.
Если бы на носитель помещали несколько ферментов различной природы, но совместимых друг с другом, причем вышеуказанные ферменты наносили вместе или последовательно, это было в пределах объема изобретения.
В предпочтительном воплощении изобретения между стадией отделения использованных ферментов и стадией прикрепления активных ферментов способ включает стадию промывки носителя в реакторе водой для удаления использованных ферментов и особенно оставшегося поверхностно-активного вещества.
В течение этой стадии промывки поглощение измеряют с помощью УФ-спектрометрии при длине волны SDS (додецил сульфат натрия) (260-280 нм), потому что предпочтительно удалить весь SDS, используемый для отделения, перед повторным прикреплением ферментов. Дифференциальное измерение поглощения между уходящим эффлюентом и входящим потоком будет оставаться высоким, пока поверхностно-активное вещество одно или в смеси с использованным ферментом будут выявлять в растворе для промывки, покидающем вышеуказанный реактор. Таким образом, стадия помывки подойдет к концу, когда дифференциальное измерение поглощения между двумя потоками станет равным нулю, связано ли это с поглощением УФ SDS или поглощением ферментов, которые отделяют.
Согласно одному воплощению, конец промывки достигается, когда поглощение при длине волны, характерной для фермента в уходящем из реактора эффлюенте, становится равным нулю.
После стадии повторного прикрепления, если желательно применять восстановленный ферментативный катализатор в органической среде, может быть полезным циркулирование в реакторе смеси вода/растворитель, имеющей постепенно меняющуюся концентрацию воды от 100 до 0%, органического растворителя от 0 до 100% между началом и окончанием сушки, причем сушка соответствует полному удалению воды из носителя, и необязательно удалению избытка неприкрепленных ферментов. Этот растворитель обычно будет соответствовать растворителям, выбранным в качестве реакционной смеси, например, кетонам, сложным эфирам и простым эфирам.
Вторым объектом по данному изобретению является применение способа по изобретению ко всем ферментативным катализаторам, в которых ферменты прикреплены к носителю низкоэнергетическими связями, такими как связи Ван-дер-Ваальса, электростатические связи или водородные связи.
Третьим объектом по изобретению является применение в ферментативном катализе катализаторов, регенерированных согласно способу, описанному выше.
Примеры и графические материалы, приведенные ниже, направлены на описание изобретения в некоторых из его конкретных воплощениях, но не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.
Пример 1
2
В этом примере готовят свежий ферментативный катализатор. Реактор наполняют 8,4 г DavicatSI 1700 диоксида кремния (Merk) с удельной площадью поверхности 320 м/г, затем раствором немодифицированного гемоглобина (поставляемого Vapran) 10 г/л в буферном растворе при рН, равном 5. ВЭЖХ насос настраивают на поток 1 мл/мин для того, чтобы ввести раствор гемоглобина в реактор, и отсчет времени начинают в момент, когда первая капля гемоглобина поступает в реактор.
Пробы потоков, входящих в реактор и покидающих его, отбирают регулярно для измерения концентрации гемоглобина, для определения путем дифференциального измерения между входящим потоком и уходящим эффлюентом, количества гемоглобина, адсорбированного диоксидом кремния. Таким образом, поглощение входящего потока и уходящего эффлюента измеряют с помощью УФ-спектрометрии, используя UV UVIKON XS спектрометр, поставляемый Socoman, при 404 нм, длине волны, соответствующей длине волны гемоглобина. Разница в поглощении между двумя потоками, таким образом, отслеживается как функция времени введения.
Конечно, вышеуказанный УФ-спектрометр был заранее откалиброван, используя разные стандартные растворы гемоглобина в воде с разными концентрациями. Калибровочная кривая показывает измерение УФ-поглощения как функции концентрации гемоглобина в растворе гемоглобина, используемом, например, для прикрепления (смотри Фиг.1, калибровочная кривая УФ поглощения при 404 нм как функции концентрации раствора гемоглобина).
Путем подсчета количества гемоглобина, введенного в реактор перед тем, как дифференциальное измерение поглощения между входом и выходом станет равным нулю, можно определить максимальное количество гемоглобина, прикрепленного к диоксиду кремния. Фиг.2 показывает варьирование количества гемоглобина, который прикреплен к диоксиду кремния, относительно массы диоксида кремния, введенного в реактор. Насыщение диоксида кремния гемоглобином в этом случае 100 мг/г диоксида кремния.
Поскольку гемоглобин растворим в воде вплоть до концентрации 100 г/л, можно повторять этот эксперимент при более высоких концентрациях (например, 30 или 50 г/л) для того, чтобы уменьшить время, затрачиваемое на прикрепление гемоглобина к диоксиду кремния.
Пример 2
Этот пример описывает влияние скорости входящего потока раствора гемоглобина на скорость прикрепления последнего к носителю из диоксида кремния для оценки адсорбционной эффективности носителя для свежего ферментативного катализатора.
Как в Примере 1, входящий поток представляет собой раствор гемоглобина с концентрацией 10 г/л в воде, который проходит через реактор, заранее заполненный 8,4 г DavicatSI 1700 диоксида кремния. Нагнетание ВЭЖХ насоса устанавливают с варьированием от 0,2 до 1 мл/мин, в зависимости от экспериментов (на Фиг.3; 0,2 мл/мин; 0,5 мл/мин; 1 мл/мин), и для каждого из них отсчет времени начинают в момент, когда первая капля раствора гемоглобина поступает в реактор.
Образцы эффлюента на выходе реактора регулярно отбирают для того, чтобы отследить изменение в концентрации гемоглобина и, следовательно, количестве гемоглобина, которое осталось прикрепленным к носителю из диоксида кремния относительно количества гемоглобина в потоке, поступающем в реактор. По-прежнему, количество гемоглобина, адсорбированного на диоксиде кремния, определяют путем дифференциального измерения между поглощениями входящего потока, которые всегда постоянны, и поглощениями уходящих эффлюентов как функцию скорости введения раствора гемоглобина.
Фиг.3 показывает изменение в количестве гемоглобина, прикрепленного на грамм диоксида кремния, как функция скорости потока подающего насоса для раствора гемоглобина. Видно, что скорость адсорбции гемоглобина на диоксиде кремния увеличивается с увеличением скорости потока, поступающего в реактор. Увеличение скорости потока позволяет уменьшить время насыщения диоксида кремния гемоглобином.
Пример 3
Настоящий пример описывает влияние количества додецилсульфата натрия (SDS), используемого на стадии отделения гемоглобина от носителя, как приготовлено в Примере 1, на поглощение, измеренное в растворе гемоглобина как на входе реактора, так и на выходе реактора.
Для того, чтобы учесть влияние присутствия SDS на измерения поглощения раствора гемоглобина, измерения поглощения проводили с помощью УФ-спектрометрометра между 350-550 нм на растворах гемоглобина с варьирующими содержаниями SDS для калибровки прибора.
Эти измерения повторяли для двух концентраций гемоглобина 0,25 г/л и 50 г/л.
Фиг.4 показывает, несмотря на концентрацию гемоглобина в воде во входящем потоке, уменьшение УФ поглощения, характерного для гемоглобина при 404 нм в присутствии SDS, значительно. Однако это изменение стабильно на протяжении времени.
Фактически, концентрация SDS имеет только очень незначительное влияние на поглощение гемоглобина при 404 нм, и, более того, линейность хорошо соблюдается, несмотря на концентрацию SDS.
Пример 4
Настоящий пример описывает стадию отделения гемоглобина, прикрепленного к диоксиду кремния, в случае катализатора, приготовленного в Примере 2. Таким образом, берут ферментативный катализатор, содержащий 93 мг/г гемоглобина, адсорбированного на диоксиде кремния.
В ходе стадии отделения жидкий раствор SDS с концентрацией 10 г/л подают в реактор со скоростью потока 1 мл/мин ВЭЖХ насосом, описанным выше.
Количество гемоглобина, отделенного от диоксида кремния, измеряют путем сравнения значений поглощения во входящем потоке, содержащем только SDS в растворе, и в уходящем эффлюенте, все еще содержащем SDS, но также гемоглобин.
Калибровку УФ-спектрометра проводили, как описано в Примере 1, с разными стандартными растворами гемоглобина в присутствии ДСН. Калибровочные кривые показывают измерение спектральной поглощательной способности, соответствующей концентрации гемоглобина стандартного раствора (смотри Фиг.4).
Пробы уходящего эффлюента отбирают в 10 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин, 240 мин и 480 мин для того, чтобы оценить их поглощение при 404 нм и, следовательно, их концентрацию гемоглобина на выходе реактора. На Фиг.6 показан профиль десорбции гемоглобина в течение фазы отделения, основанный на этих измеренных величинах.
В конце этой стадии отделения 88 мг гемоглобина/г диоксида кремния отделяли и регенерировали на выходе реактора, т.е. 95% количества гемоглобина, изначально адсорбированного на диоксиде кремния.
Пример 5
Настоящий пример описывает стадию повторного прикрепления гемоглобина к носителю, от которого гемоглобин только что отделили согласно Примеру 4, после стадии промывки или ополаскивания реактора водой до тех пор, пока SDS больше не будет обнаруживаться в уходящем из реактора эффлюенте.
В конце этой стадии раствор гемоглобина с концентрацией 10 г/л заново непрерывно вводят, как описано в Примере 2, до тех пор, пока УФ поглощение потока, поступающего в реактор, и эффлюента на выходе реактора, не станут идентичными, причем содержание гемоглобина на входе и на выходе является равным.
Изменение в количестве связанного гемоглобина представлено на Фиг.5, показывающей два цикла прикрепления. Цикл 1 соответствует прикреплению, как описано в Примере 2, а цикл 2 соответствует повторному прикреплению, выполняемому после стадий отделения и промывки реактора, описанных в настоящем примере и Примере 4.
Видно, что соответствующие профили иммобилизации первого цикла прикрепления для приготовления свежего катализатора и второго цикла после отделения фермента совмещены. Обработка SDS для отделения гемоглобина от диоксида кремния, следовательно, не приводит к уменьшению потенциала адсорбции гемоглобина на диоксиде кремния с целью его иммобилизации.