Вирус миелобластоза птиц — другая «Сторона медали»

7. Collisson E.W., Li J., Sneed L.W. et al. Detection of avian infectious bronchitis using in situ hybridization and recombinant DNA. Vet Microbiol, 1990, 24, 261—271.

8. Cook J.K.H., Derbyshire J.H., Peters R.W. The use of chicken tracheal organ cultures for isolation and assay of avian bronchitis. Arch Virol, 1976, 50, 109—118.

9. Darbyshir J.H., CookJ.K.A., Peters R.W. Comparative growth kinetic studies on avian infectious bronchitis virus in different systems. J Comp Pathol, 1975, 85, 623—630.

10. De Wit J.J. Detection of infectious bronchitis virus. Avian Pathol, 2000, 29, 71—93.

11. Escorcia M., Fortoul T.I., Petrone V.M. et al. Gastric gross and microscopic lesions caused by the UNAMPublish 97 variant strain of infectious bronchitis virus after the eighth passage in specific pathogen-free chicken embryos. Poult Sci, 2002, 81, 1647—1652.

12. Kapczynski D.R., Sellers H.S., RowlG.N., Jackwood M.W. Detection of in ovo-inoculated infectious bronchitis virus by immunohistochemistry and in situ hybridization with a riboprobe in epithelial cells of the lung and cloacal bursa. Avian Dis, 2002, 46, 679—685.

13. Lee C.-W., Brown C.. Jackwood M.W. Tissue distribution of avian infectious bronchitis virus following in ovo inoculation of chicken embryos examined by in situ hybridization with antisense digoxigenin-labeled universal riboprobe. J Vet Diag Invest, 2002, 14, 377—381.

14. Liu S., Kong X. A new genotype of nephropathogenic infectious bronchitis virus circulating in vaccinated and nonvaccinated flocks in China. Avian Pathol, 2004. 33, 321—327.

15. Luppi P H., Fort P., Jouvet M. lontophoretic application of unconjugated cholera toxin В subunit (CTb) combined with immunohistochemistry of neurochemical substances: a method for transmitter identification of retrogradely labeled neurons. Brain Res, 1990, 534, 209—224.

16. McMartin D.A. Infectious bronchitis. In: McFerran J.B., McNulty M.S. (Eds). Virus Infections of Vertebrates. Virus Infections of birds. — Amsterdam: Elsevier Sci Publ, 1993, 249—275.

17. Nakamura K., CookJ.K.A., Otsuki K., Huggins M.B., FrazierJ.A. Comparative study of respiratory lesions in two chicken lines of different

ДИСКУССИОННЫЙ КЛУБ

УДК 619:578.828.3

Ключевые слова: вирус, геном, ДНК, миелобластоз птиц, обратная транскриптаза

Сокращения: ВМП — вирус миелобластоза птиц; ММ — молекулярная масса; ОТ — обратная транскриптаза; РХ — ретровирусы-хелперы

На протяжении многих десятилетий ВМП служит для молекулярных биологов основным источником ОТ. Первоначально этот фермент обнаружили у вирусов саркомы Рауса [221 и лейкемии Раушера [ 11. В последующем оказалось, что он играет ключевую роль в цикле развития ретровирусов. Обнаружение ОТ, обладающей РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, стало основой многих достижений современной биологии.

У ретровирусов ОТ обеспечивает транскрипцию одноце-почечного РНК-генома в двухцепочечную провирусную ДНК, которая встраивается в ДНК клетки хозяина. Интегрированный ировирус при определенных условиях обеспечивает формирование нового поколения вируса. Данный процесс происходит в 3 этапа, на каждом из которых ОТ выполняет роль катализатора: 1) синтез ДНК из вирусной мРНК; 2) гидролиз РНК-цепочки; 3) синтез двухцепочечной ДНК из одноцепочечной мДНК.

Хотя уже давно известно, что у ретровирусов животных достаточно высок уровень мутаций генома, этот аспект стал предметом глубокого изучения у вируса иммуно-

susceptibility infected with infectious bronchitis virus: histology, ultrastructure and immunohistochemistry. Avian Pathol, 1991, 20, 241—257.

18. Naqi S.A. A monoclonal antibody-based immunoperoxidase procedure for rapid detection of infectious bronchitis virus in infected tissues. Avian Dis, 1990, 34, 893—898.

19. Naqi S„ Gay K., Patalla P. et al. Establishment of persistent avian infectious bronchitis virus infection in antibodyfree and antibody-positive chickens. Avian Dis, 2003, 47, 594—601.

20. Oka S., BrussJ.L., Nelson R.W., Rutishauser U. Properties and developmental regulation of polysialyltransferase activity in the chicken embryo brain. J Biol Chem, 1995, 270, 19357—19363.

21. Purchase H.G., Cunningham C.H.. Burmester B.R. Genetic differences among chicken embryos in response to inoculation with an isolate of infectious bronchitis virus. Avian Dis, 1966, 10, 162—172.

22. Schat K.A., Purchase H.G. Cell culture methods. In: Swayne D.E. et al (Eds). A laboratory manual for isolation and identification of avian pathogens 4" Ed. Amer Assoc Avian Pathol, Kennett Square, PA, 1998, 223—234.

23. Winter C., Schwegmann-Webels C., Cavanagh D. et al. Sialic acid is a receptor determinant for infection of cells by avian Infectious bronchitis virus. J Gen Virol, 2006, 87, 1209—1216.

24. Winter C., HerrlerG., Neumann U. Infection of the tracheal epithelium by infectious bronchitis virus is sialic acid dependent. Microbes Infect, 2008, 10, 4. 367—373.

25. Yu L., Jiang Y., Low S. et al. Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens. Avian Dis, 2001, 45, 416—424.

A.S. Abdel-Moneim, P. Zlotowski, J. Veits, G.M. Keil, J.P. Teifke. Immunohistochemistry for detection of avian infectious bronchitis virus strain M41 in the proventriculus and nervous system of experimentally infected chicken embryos. Virol J, 2009, 6:15 (BMC OA).

дефицита человека, репликация которого in vivo сопровождается возникновением большого количества генетических вариантов [5].

Теоретически мутации могут возникать на различных этапах репликации ретровирусов — во время регулируемого ОТ синтеза минус-цепочки комплементарной ДНК на геномной мРНК и второй цепочки ДНК. а также в период транскрипции провирусного генома под контролем РНК-полимеразы II. Однако оказалось, что чаще всего они происходят на ранних этапах репликации, причем их частота на обеих стадиях, катализируемых ОТ, приблизительно одинакова [11].

В клетках, инфицированных ВМП, обнаруживают фермент, который состоит из двух структурно похожих субъединиц (а и Р), имеющих ММ 65 и 95 кД соответственно. Фермент активизируется после расщепления менее активной [3-субъединицы [7, 19). Его а-субъединица одновременно проявляет специфичную для ОТ (РНК-направленную ДНК-полимеразную) активность и гидролизует РНК. Гидролитические свойства проявляет фрагмент с ММ 24 кД, который активизируется после расщепления а-субъединицы. Полимеразная активность ОТ определяется наличием прай-мера и матрицы [12, 23].

Очищать ОТ ВМП и работать с ней значительно удобнее, чем с ОТ ретровирусов мышей, благодаря ее большей термостабильности [24]. По этой причине ОТ ВМП стала основным реагентом фундаментальных и прикладных биохимических исследований, в т. ч. широко применяемой полпме-разной цепной реакции.

Вирус миелобластоза птиц — другая «сторона медали»

Б. Пербал, University of Michigan

LTR

gag

РЕТРОВИРУС-ХЕЛПЕР ТИПА 1 (РХ-1) pol

env

LTR

672

2777 2780

5482

11111111111111111111 II 11111111111111111111111

672 689 ATG

5370

7154

ВИРУС МИЕЛОБЛАСТОЗА ПТИЦ

LTR

gag Д pol v-myb

J 672 689 gcagg :ATTCTGA..... ..................GCTATCAT actgaa

W/////////////M ШШШШШ

ATG 1

LTR

5372

7121

Вирусы

BMII — ачьфа-ретровирус, вызывающий острую миелобла-стозную лейкемию у птиц. Болезнь удается воспроизвести одновременным заражением куриных эмбрионов или вылупившихся из яиц цыплят [4] этим агентом и РХ [ 14]. Для производства биопрепаратов пользуются штаммом BAI ВМП, выделенным из плазмы крови цыпленка [8]. Инфицированную этим штаммом плазму крови на протяжении многих лет изготавливает на коммерческой основе компания Life Sciences Inc (США). Стандартная расплодка ВМП-S представляет собой смесь вирусов — штамма BAI и двух онкогенных ретровирусов, которые относятся к двум разным серогрупнам (типам 1 и 2), |17|, способны к самостоятельной репликащш и имеют геном размером 7 700 нуклеотидов. Их РНК кодирует синтез семи структурных протеинов gag (матриксного р19, капсидного р27, нуклеокапсидного р12, протеазы р15 и трех протеинов pi, р2 и р10 с неизвестными фикциями), четырех протеинов pol (субъединиц ОТ с ММ 95 и 63 кД, интегразы с 32 кД и пептида с ММ 4,1 кД, функция которого не известна) и двух структурных гликопротеинов env (поверхностного gp85 и трансмембранного gp37). Как у этих ретровирусов, так и у ВМП обнаружены уникальные З'-участки (U3) генома, принимающие участие в транскрипции. Участки U3 всех трех вирусов очень похожи и значительно отличаются от таковых других ретровирусов, хотя и5-область их генома и генома вируса саркомы Рауса различаются всего несколькими нуклеотидами.

Очищенные методом бляшек оба типа РХ способны индуцировать у птиц преимущественно остеогенную остеобла-стому и нефробластому, реже они вызывают висцеральный лимфоидный лейкоз [17). Сообщапось о проявлении слабых онкогенных свойств двумя очищенными штаммами РХ типа 2: один из них вызывал в 80 % случаев остеопетроз и в 20 % случаев остеобластому, а второй — у 80 % зараженных птиц нефробластому, а у 20 % — остеопетроз [17]. У этих штаммов выявили значительные генетические различия.

Острая трансформирующая активность ВМП, индуцированная его онкогеном v-mvb [13], служит причиной, по которой инфицированные этим агентом птицы не доживают до того времени, когда у них развиваются опухоли, вызываемые РХ.

Молекулярное клонирование провирусов РХ-1 и РХ-2 позволило лучше понять их онкогснную природу. Установили, что генетически чистые штаммы РХ-2 для проявления своего двойного патогенетического потенциала не нуждаются в присутствии других ретровирусов [9]. Замена всего лишь одной аминокислоты в трансмембранном гликопроте-ине вела к утрате этим агентом способности вызывать у цыплят остеопетроз [9]. Провирус РХ-1, выделенный из ДНК цыплят, больных миелобластозной лейкемией [16[, отнесли к N-типу; после внутривенного введения 12-дневным курам или интраперитонеачьного заражения суточных цыплят он всегда индуцировал нефробластому [20|. Столь узкая онко-генная специфичность РХ-1 позволила глубже изучить патогенез нефробластом и установить, что ключевую роль в нем играет ранее неизвестный фактор nov/сспЗ, относящийся к регуляторам клеточного роста семейства CCN [18].

Секвенирование провирусов РХ-1 и РХ-2 покачаю, что РХ-1 служит естественным хелпером ВМП [16], и подтвердило, что последний произошел от одного из РХ [2].

Провирус ВМП, выделенный из периферической крови птиц, больных миелобластозной лейкемией [21], значительно отличался от провируса РХ.

Молекулярное клонирование онкогена v-myb [15] и секвенирование провирусов ВМП и РХ показали, что включение в геном РХ онкогена v-myb происходит в результате делении гена env и З'-участка гена pol 110], кодирующего ин-тегразу (рисунок). Таким образом, вирноны РХ-1 дефектны, т. к. не имеют оболочки и интегразы (цит. по [3]).

Структура и экспрессия провирусов ВМП и РХ

А — провирусный геном РХ. Светлыми прямоугольниками изображены длинные концевые повторы (LTR), которые образуются в процессе синтеза и интеграции провирус -ной ДНК. Полипротеин-предшественник gag-pol включает в себя продукты генов gag (прямоугольник с точками) и pol (полосатый прямоугольник). Протеолитическое расщепление предшественника происходит на уровне кодонов 2777...2780. Двумя черными прямоугольниками изображены кодирующие последовательности протеина оболочки, обра-

зовавшиеся в результате сплайсинга донорного участка гена gag на уровне нуклеотида 689 и акцепторного участка гена pol в области нуклеотида 5370. Б — провирус В МП. Участок, кодирующий онкоген v-myb, состоит из части гена gag (черный прямоугольник) и последовательностей c-myb (заштрихованный прямоугольник). Стрелками показаны места рекомбинации последовательностей c-myb РХ.

РНК-геном РХ, содержащийся в инфекционных частицах, ретротранскрибируется ОТ в вирусные протеины и экспрес-сируется из провирусной двухцеиочечной копни ДНК вирусного генома, интегрированного с геномом хозяина. Структурные белки (матриксный, капсидный, нуклеокапсидный, про-теаза и р10) и ОТ (POL) образуются в результате посттрансляционного процессинга полипротеина предшественника gag-pol, который экспрессируется в бицистронной форме (672...2777, 2780...5482 нуклеотнды) из провируса. Протеин оболочки образуется в результате сплайсинга мРНК, в ходе которого присоединяются 17 терминальных аминокислотных остатков к открытому для чтения участку гена env (он у РХ начинается с нуклеотида 5370 и перекрывает З'-конец гена pol, кодирующего интегразу). Инфицированные ВМП клетки содержат вирусный РНК-геном, субгеномный предшественник gag-pol и мРНК, кодирующие синтез гликопротеина оболочки. Клеточный онкоген v-myb преобразуется ВМП. Рекомбинация c-myb комплементарной ДНК с провирусом РХ происходит в генах pol и env РХ-1 в области нуклеотидов 5372 и 7121 соответственно. Сплайсинговый акцептор env, локализующийся над 5' проксимальной точкой рекомбинации в ДНК РХ, обеспечивает прикрепление открытого для чтения участка v-myb к 17-аминотерминальному остатку протеина gag. Как следствие, интеграция v-myb в геном ВМП ведет к репликации дефектных вирусных частиц, т. к. в них отсутствуют гены gag и pol. В итоге провирус ВМП экспрессирует лишь геномную вирусную РНК и РНК v-myb. Высокая степень консервации участков гена pol, содержащихся в геноме РХ, и части гена pol генома ВМП указывает на возможность рекомбинации этих частей генома ВМП и РХ, результатом чего может служить образование ро1-протеинов обоими геномами. Однако пока подтверждений этому не получено.

Миелобласты, трансформированные очищенным ВМП в отсутствии РХ, продуцируют дефектные вирусные частицы, содержащие протеины gag, но не имеющие оболочечного гликопротеина и транскриптазы [6]. В то же время клетки, инфицированные очищенным РХ, не образуют вирусные частицы в количестве, достаточном для производства препаратов ОТ.

В клетках, одновременно зараженных РХ п ВМП, происходит транскрипция гликопротеина оболочки и интегразы, что обеспечивает: 1) формирование вирионов РХ; 2) образование вирионов РХ-1; 3) интеграцию провируса ВМП в ДНК клетки. Трансформированные v-myb миелобласты активно пролиферируют и продуцируют в очень высоком титре вири-оны ВМП и РХ, причем последних, являющихся источником активной ОТ, образуется значительно больше.

Обсуждение

Из изложенного выше ясно, что источником производимых в настоящее время коммерческих препаратов ОТ является не ВМП, а РХ. ВМП служит источником онкогена v-myb, который вызывает интенсивную пролиферацию трансформированных миелобластов, способных экспрессировать протеины РХ. На основании того, что ретровирусы склонны к рекомбинации геномов, можно предположить, что такой процесс может происходить в клетках, одновременно инфицированных ВМП и РХ, приводя к тому, что ВМП становится активным продуцентом ОТ. Однако секвешфование не выявило соответствующих изменений в геноме исследованных изолятов ВМП и РХ.

Несмотря на то что изложенные в статье факты хорошо известны, большая часть компаний продолжает утверждать,

что производит ОТ из очищенных штаммов ВМП. Данная ошибка глубоко укоренилась в научной среде и многократно повторяется в публикациях исследователей.

Существует еще немало подобных примеров, когда генам, протеинам и биохимическим реагентам присваивали названия, которые в последующем признавались необоснованными и исправлялись. Точно так же необходимо корректировать наши несоответствующие действительности представления, возникшие в период формирования ретровирусологии из-за отсутствия соответствующих знаний, и придерживаться точной научной терминологии. Поэтому научная общественность и производители биопрепаратов должны признать, что мы пользуемся ОТ, полученной из клеток, одновременно инфицированных РХ и ВМП, а не одним только ВМП.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumor viruses. Nature, 1970, 226, 1209—1211.

2. Baluda M.A., Perbal В., Rushlow K.E., Papas T.S. Avian myeloblastosis virus: a model for the generation of viral oncogenes from potentially oncogenic cellular genetic elements. Folia Biol (Praha) 1983, 29, 18—34.

3. Baluda M.A., Reddy E.P. Anatomy of an integrated avian myeloblastosis provirus: structure and function. Oncogene, 1994, 9, 2761—2774.

4. Beard J.W. Avian virus growths and their etiologic agents. Adv Cancer Res 1963, 7, 1—127.

5. Coffin J. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science 1995, 267, 483—489.

6. Duesberg P.H., Bister K., Moscovici C. Genetic structure of avian myeloblastosis virus, released from transformed myeloblasts as a defective virus particle. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77, 5120—5124.

7. Eisenman R.N., Mason W.S., Linial M. Synthesis and processing of polymerase proteins of wild-type and mutant avian retroviruses. J Virol, 1980, 36, 62—78.

8. Houts G.E., Myagi M., Ellis C., Beard D., Beard J.W. Reverse transcriptase from avian myeloblastosis virus. J Virology, 1979, 29, 517—522.

9. JoliotV., Boroughs K., Lasserre F. et al. Pathogenic potential of myeloblastosis-associated virus: implication of env proteins for osteopetrosis induction. Virology, 1993, 195, 812—819.

10. Kan N.C., Baluda M.A., Papas T.S. Sites of recombination between the transforming gene of avian myeloblastosis virus and its helper virus. Virology, 1985, 145, 323—329.

11.KimT„ Mudry R.A.Jr., Rexrode C.A. 2nd, PathakV.K. Retroviral mutation rates and A-to-G hypermutations during different stages of retroviral replication. J Virol, 1996, 70, 7594—7602.

12. Leis J., Duyk G., Johnson S. et al. Mechanism of action of the endonuclease associated with the alpha beta and beta beta forms of avian RNA tumor virus reverse transcriptase. J Virol, 1983, 45, 727—739.

13. Lipsick J.S., Wang D.M. Transformation by v-Myb. Oncogene 1999, 18, 3047—3055.

14. Moscovici C., Gazzolo L., Moscovici M.G. Focus assay and defectiveness of avian myeloblastosis virus. Virology, 1975, 68, 173—181.

15. Perbal В.. Baluda M.A. Avian myeloblastosis virus transforming gene is related to unique chicken DNA regions separated by at least one intervening sequence. J Virol, 1982, 41, 250—257.

16. Perbal В., Lipsick J.S., Svoboda J. et al. Biologically active proviral clone of myeloblastosis-associated virus type 1: implications for the genesis of avian myeloblastosis virus. J Virol, 1985, 56, 240—244.

17. Perbal B. Pathogenic potential of myeloblastosis-associated viruses. Infect Agents DIs, 1995, 4, 212—227.

18. Perbal B. Takigawa M. CCN Proteins: A New Family of Cell Growth and Differentiation Regulators. Imperial College Press, London; 2005.

19. Schiff R.D., Grandgenett D.P. Partial phosphorylation in vivo of the avian retrovirus pp32 DNA endonuclease. J Virol, 1980, 36, 889—893.

20. SoretJ., Dambrine G., Perbal B. Induction of nephroblastoma by myeloblastosis-associated virus type 1: state of proviral DNAs In tumor cells. J Virol, 1989, 63, 1803—1807.

21. Souza L.M., Baluda M.A. Identification of the avian myeloblastosis virus genome. I. Identification of restriction endonuclease fragments associated with acute myeloblasts leukemia. J Virol, 1980, 36, 317—324.

22. Temin H.M., Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature, 1970, 226 (5252), 1211—1213.

23. Verma I.M. The reverse transcriptase. Biochim Biophys Acta, 1977, 473, 1—38.

24. Yasukawa K., Nemoto D., Inouye K. Comparison of the Thermal Stabilities of Reverse Transcriptases from Avian Myeloblastosis Virus and Moloney Murine Leukemia Virus. J Biochem, 2008, 143 (2), 261—268.

B. Perbal. Avian myeoloblastosis virus