Реакция нейромедиаторного пула аминокислот древних структур мозга на низкие температуры у гетеротермов

УДК 591.543.42

РЕАКЦИЯ НЕЙРОМЕДИАТОРНОГО ПУЛА АМИНОКИСЛОТ ДРЕВНИХ СТРУКТУР МОЗГА НА НИЗКИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ У ГЕТЕРОТЕРМОВ

© 2004 г. К. С. Бекшоков, Э.З. Эмирбеков, А.А. Эмирбекова

The content of the free and bound aminoacid neuromediators in cerebellum and hypothalamus of the hibernating gophers (Citellus pygmaeus) was studied. The changes in proportion of free/bound aminoacid were not the same in different parts of the brain and probably have been adapting character.

В последние годы внимание исследователей привлекает изучение компенсаторно-приспособительных механизмов, обеспечивающих устойчивость центральной нервной системы к повреждающим воздействиям и стрессорным состояниям. В этом плане весьма перспективным является анализ феномена природной адаптации мозга гибернантов к низким температурам. Уникальные механизмы, лежащие в основе деятельности ЦНС во время зимней спячки млекопитающих при температурах, близких к нулю, а также при переходе к нормотермии, позволяют каждый раз полностью восстанавливать функции нейронов мозга.

В нейрохимической концепции зимней спячки значительное место занимает метаболизм нейромедиаторов, как химических компонентов мозга, участвующих в пусковых механизмах, поддержания состояния гибернации и выходе из этого состояния. В ряду нейромедиаторов особое место занимают так называемые «аминокислоты глутаминовой группы»: аспарагиновая, глутаминовая и гамма-аминомасляная (ГАМК) кислоты.

Несмотря на многочисленные работы в области изучения аминокислотного обмена, в том числе и при зимней спячке, в научной литературе недостаточно изучен вопрос о содержании и функциях связанных форм аминокислот. Как показывают исследования, связанные формы свойственны почти всем аминокислотам, встречающимся в мозгу в свободной форме [1]. Связываясь с поли-пептидной цепью молекулы белка, аминокислоты участвуют в модификации макромолекулы. Хотя метаболизм изучаемых нами аминокислот глутаминовой группы весьма широк, важное место в изменении количества свободных аминокислот занимает их связывание с белковыми молекулами. По-видимому, в отличие от других тканей, мозг обладает свойством депонировать часть образовавшихся и поступивших аминокислот в виде их связанной формы, играющей существенную роль при возникновении различных функциональных состояний.

Частью этой актуальной проблемы является изучение количества свободных и связанных форм аминокислот в целом мозгу и в его отделах при разных функциональных состояниях.

В настоящей работе приведены данные о содержании свободных и связанных глутамата, аспартата и ГАМК в древних отделах мозга (мозжечке и гипоталамусе) типичного гибернанта - суслика малого в ходе зимней спячки и при искусственной гипотермии.

Исследование проведено на сусликах малых кавказских (Citellus pygmaeus Pallas.), отловленных в летние месяцы, массой 200-250 г. Животные содержались в обычных условиях вивария. Зимнюю спячку вызывали переводом зверьков в неотапливаемое помещение, с температурой воздуха, соответствующей температуре вне помещения.

Содержание свободных и связанных аминокислот в гипоталамусе и мозжечке определяли у животных при подготовке к спячке (середина октября, Ттела = 39 °С), во время кратковременной спячки (середина баута, Тте_ ла= 14 °С), при месячной спячке (середина баута, Тхела= 7 °С) и при спонтанном пробуждении (Ттела= 36 °С).

Количество свободных и связанных аминокислот определяли по методу Эллиота [1] с некоторыми изменениями, внесенными нами. После декапита-ции у животных быстро извлекали мозг и удаляли сосудистую оболочку. Исследуемые участки мозга взвешивали и переносили в стеклянные гомогенизаторы с 4 мл ледяного Рингер-фосфатного буфера (pH 7,4). Ткань гомогенизировали и суспензию центрифугировали при 15 ООО об/мин в охлажденной центрифуге в течение 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую свободные аминокислоты, переносили в пробирку с 3-кратным объемом 96° этилового спирта. Осадок промывали в 1 мл Рингер-фосфатного буфера, повторно центрифугировали и добавляли супернатант в первую пробирку. К осадку, содержащему связанные аминокислоты, добавляли Рингер-фосфатного буфера в первоначальном объеме и полученную суспензию нагревали в кипящей водяной бане в течение 15 мин, затем охлаждали, центрифугировали, надосадочную жидкость переносили в пробирки с 3-кратным объемом этанола. После часового стояния оба спиртовых раствора центрифугировали (15 мин при 10 000 об/мин), надосадочные жидкости сливали в плоскодонные стеклянные гильзы и выпаривали. Образующийся осадок растворяли в 0,2 мл дистиллированной воды и использовали для определения содержания аминокислот.

Разделение и количественное определение аминокислот производили с помощью электрофореза на бумаге в пиридин-ацетатном буфере (pH 4,0) при напряжении 600 В в течение 3 ч. Электрофореграммы проявляли 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне. Окрашенные пятна аминокислот вырезали и элюировали в 5 мл 0,005 % раствора CuS04 в 75 % этаноле. Оптическую

плотность элюатов измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 530 нм. Содержание аминокислот определяли по калибровочным кривым.

Полученные данные свидетельствуют, что содержание эндогенных свободных и связанных форм изученных аминокислот в мозжечке нормотермических сусликов, установленное нашими исследованиями, отличается от такового в коре больших полушарий по данным более ранних работ [2] (табл. 1). В мозжечке содержание связанных форм глутамата и ГАМК достоверно ниже, чем в коре, а содержание аспарагиновой кислоты одинаково. Такое различие подтверждается и другими исследованиями [3]. Возможно, эти различия связаны с более высокой активностью ферментов азотистого метаболизма в мозжечке, в частности, с большей активностью ГАМК-шунта, что обусловливает большую устойчивость этого отдела мозга к гипоксии и гипогликемии по сравнению с корой [4].

Таблица 1

Содержание свободных и связанных дикарбоновых аминокислот и ГАМК в мозжечке сусликов в динамике зимней спячки

Группа животных Глутамат Аспа ртат ГАМК

Свободные Связанные Свободные Связанные Свободные Связанные

Контрольная 4,37 ± 0,08 0,66 ±0,01 2,48 ±0,11 1,06 ± 0,08 0,8 ±0,04 0,63 ± 0,03

Входящая в спячку 6,06 ±0,53* 1,33 ±0,01* 3,10 ±0,2* 0,89 ± 0,03* 1,63 ± 0,07* 1,58 ± 0,10*

Находящаяся в кратковременной спячке 2,83 ±0,2* 2,99 ±0,02* 1,57 ±0,05* 0,84 ±0,07* 1,58 ±0,06* 0,89 ±0,12*

В 1-месячной спячке 2,38 ±0,11* 3,9 ±0,1* 1,04 ±0,02* 1,11 ±0,2 1,26 ±0,11 0,79 ± 0,06

После пробуждения 2,97 ± 0,09* 1,73 ±0,08* 1,63 ±0,3* 0,86 ± 0,06* 1,04 ±0,10* 0,45 ± 0,04*

Примечание. * - достоверность значения р < 0,05 по отношению к контролю; п - число опытов; М- среднее арифметическое; т - средняя квадратическая ошибка.

Периоды кратковременной и 1-месячной спячки характеризуются последовательным достоверным снижением свободных и увеличением связанных (за исключением ГАМК) форм всех изученных аминокислот, что отражает тенденцию их к запасанию.

При пробуяедении сусликов в мозжечке наблюдается увеличение свободных аминокислот и уменьшение связанных. Здесь также наблюдаются различия, выражающиеся в том, что изменение содержания ГАМК в коре больших

полушарий, установленное ранее [3], имеет направление, противоположное наблюдаемому в мозжечке, что отражает особенности этого отдела мозга.

Данные исследования содержания свободных и связанных аминокислот в гипоталамусе сусликов при гибернации представлены в табл. 2.

Контрольные значения содержания обеих форм аминокислот выше, чем в мозжечке, что, по-видимому, связано с большим количеством соответствующих синапсов и направлением азотистого метаболизма в этих отделах мозга.

Таблица 2

Содержание свободных и связанных дикарбоновых аминокислот и ГАМК в гипоталамусе сусликов в динамике зимней спячки

Группа животных Глутамат Аспартат ГАМК

Свободные Связанные Свободные Связанные Свободные Связанные

Контрольная 4,85 ±0,31 2,44 ±0,21 2,94 ± 0,3 3,24 ± 0,04 3,56 ±0,3 1,24 ±0,04

Входящая в спячку 3,96 ± 0,8* 0,77 ±0,31* 2,66 ±0,11* 2,09 ±0,06* 3,42 ± 0,29 2,88 ± 0,4*

Находящаяся в кратковременной спячке 3,21 ±0,04* 2,18 ±0,03 1,68 ±0,08* 2,24 ±0,10* 1,88 ±0,09* 2,30 ± 0,3*

В 1-месячной спячке 3,16 ±0,07* 0,95 ± 0,03* 2,30 ±0,12* 2,74 ±0,05* 3,16 ±0,09* 3,02 ±0,15*

После пробуждения 1,42 ±0,08* 1,94 ±0,10* 1,35 ± 0,07* 1,42 ±0,06* 1,37 ±0,07* 2,06 ±0,12*

Примечание. *- достоверность значения р < 0,05 по отношению к контролю; п - число опытов; М- среднее арифметическое; т - средняя квадратическая ошибка.

Различия обоих отделов наблюдаются и при сравнении реакции аминокислотного пула на состояние спячки. Так, в предгибернационный период, в отличие от мозжечка, происходит достоверное (кроме свободной ГАМК) снижение содержания всех форм аминокислот.

Дальнейшее углубление спячки приводит к увеличению свободных аспар-тата и ГАМК, а содержание глутамата остается на прежнем уровне, что также отличает гипоталамус от мозжечка. Для гипоталамуса характерны разнонаправленные изменения связанных форм аминокислот, в отличие от мозжечка. Так, содержание связанных аспартата и ГАМК повышается при кратковременной и 1-месячной спячке, а уровень связанного глутамата уменьшается (табл. 2).

В состоянии пробуждения изменения в содержании аминокислот снова меняют направление: содержание свободных форм падает, связанного глутамата растет (по сравнению со спячкой), а уровень связанных форм аспартата-

та и ГАМК снижается; при этом все перечисленные показатели так и не достигают контрольных значений.

Такие различия в реакции отделов мозга связаны с разной активностью прежде всего нейромедиаторных систем. Известно, что в состоянии спячки на фоне снижения активности новых отделов мозга (коры) в гипоталамусе остается довольно высокая нейрональная активность. Эго позволяет говорить о спячке как об активной форме адаптации. С другой стороны, наблюдаемое усиление процессов связывания аминокислот по мере углубления спячки может отражать участие последних в модификации белков и мембран, наблюдаемой и при других функциональных состояниях. Таким образом, наблюдаемые различия отражают связывание нейромедиаторных аминокислот как адаптивную реакцию на снижение температуры тела по мере углубления зимней спячки.

Литература

1. Бунятян ГЛ., Казарян Б.А. //Биол. журн. Армении. 1967. Т. 20. № 11. С. 29-36.

2. Эмирбеков, Э.З., Бекшоков К.С. II Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2001. №1. С. 145-147.

3. Розанов В.А., Рейтарова Т.Е. II Украинский биохим. журн. 1989. Т. 61. № 1. С. 42-48.

4. Battistin L., Dan М. II Handbook of Neurochem. N.Y; London, 1983. Vol. 10. P. 693-730.

Дагестанский государственный университет 30 марта 2004 г.