БАКТЕРИЯ LACTOBACILLUS RHAMNOSUS ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ, НАПРИМЕР, БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА
BACTERIUM LACTOBACILLUS RHAMNOSUS FOR THE TREATMENT OF, FOR EXAMPLE, BACTERIAL VAGINOSIS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новой молочнокислой бактерии Lactobacillus rhamnosus, пригодной для лечения, например, бактериального вагиноза.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бактериальный вагиноз (БВ) является одним из наиболее распространенных заболеваний у женщин репродуктивного возраста. Согласно данным Центров по контролю и профилактике заболеваний США (CDC), факторы риска для БВ включают спринцевание и наличие новых или множества половых партнеров.
2
2
БВ вызывается дисбалансом естественной бактериальной микрофлоры и может микробиологически характеризоваться замещением микрофлоры влагалища с преобладанием лактобактерий потенциально патогенными вагинальными бактериями. Переход от здоровой микрофлоры с преобладанием лактобактерий, продуцирующих НО и молочную кислоту, к сложной многовидовой микрофлоре может происходить относительно быстро и приводить к БВ.
Как обсуждается, например, в заявке ЕР 0257007 (поданной в 1987 г.), давно известно, что бактериальный вагиноз (БВ) сопровождается повышением рН (повышением от нормального/здорового рН, приблизительно равного 4, до рН выше 4,5) и микробным дисбактериозом, при котором микрофлора влагалища с преобладанием Lactobacillus подавляется разрастанием преимущественно анаэробных организмов.
Заявка ЕР 2509610 В1 (HSO Health Care, Vienna, поданная 13.09.2011 и опубликованная/предоставленная в 2013 году) предоставляет обобщенные результаты соответствующего предшествующего уровня техники.
Как обсуждается в ЕР 2509610 В1, в здоровом женском влагалище доминируют различные виды Lactobacillus, которые играют важную роль в защите женщин от урогенитальных инфекций. Лактобактерий обладают способностью прилипать к эпителию влагалища, подавлять адгезию и рост патогенов, поглощать питательные вещества, которые в противном случае доступны для патогенов, и модулировать иммунный ответ хозяина и микроокружение. Самое главное, лактобактерий метаболизируют гликоген, содержащийся в клетках свода влагалища, образуя молочную кислоту в качестве конечного продукта. Таким образом, в здоровом влагалище значения рН достигают уровня примерно 4,0, при котором многие патогены не могут активно развиваться.
При введении женщине в форме фармацевтической композиции (например, вагинальных капсул для введения во влагалище) защитный эффект лактобактерий против потенциальных возбудителей во влагалище осуществляется в результате метаболической активности лактобактерий. Бактерии потребляют гликоген и другие источники глюкозы и продуцируют молочную кислоту. Низкий уровень рН, создаваемый таким образом, вреден для менее желательных бактерий и грибов и, таким образом, защищает слизистую оболочку влагалища от инфекций.
Поскольку вагинальная инфекция является важным механизмом заболевания, ответственным за преждевременные роды, хранение естественного и здорового баланса микрофлоры Lactobacillus во влагалище особенно важно во время беременности. Дефицит лактобактерий может нарушить микробный баланс во влагалище, что часто приводит к синдрому бактериального вагиноза, который может быть связан с количественным и качественным переходом от присутствующих в норме лактобактерий к смешанной микрофлоре, в которой доминируют анаэробные бактерии. Согласно уровню техники, бактериальный вагиноз может характеризоваться полной потерей лактобактерий и сопутствующим увеличением грамвариабельных и грамотрицательных палочек, главными среди которых являются Gardnerella vaginalis, а также Bacteroides, Prevotella и Mobiluncus. Тем не менее, потеря вагинальных лактобактерий также делает небеременных женщин восприимчивыми к инфекции, что может привести к эндометриту или даже воспалительному заболеванию таза.
Во время менопаузы происходит инволюция женских половых путей, что отражает, возможно, встроенную биологическую продолжительность жизни, связанную с нейрогипофизарной эндокринной осью. Важнейшим общим изменением является атрофия влагалища. К частым жалобам относятся сухость, жжение, зуд и диспареуния в влагалище, а также дизурия, частое мочеиспускание и рецидивирующие инфекции. Атрофия мочеполовой системы после менопаузы связана с уменьшением секреции эстрогенов, сопровождающимся истощением лактобактерий и повышенной колонизацией патогенными микроорганизмами, связанными с бактериальным вагинозом и инфекциями мочевыводящих путей. У женщин в постклимактерическом периоде вагинальная эстриоловая терапия уменьшает колонизацию кишечной палочкой и увеличивает количество лактобактерий, в результате чего частота рецидивирующих инфекций мочевых и половых путей значительно снижается.
Было описано несколько видов Lactobacillus, в различной степени распространенных во влагалище. В течение некоторого времени считалось, что в микрофлоре здоровых женщин детородного возраста преобладают L. acidophilus и L. fermentum, за которыми следуют L. brevis, L. jensenii и L. casei. В другом исследовании, посвященном микрофлоре Lactobacillus во влагалище, авторы обнаружили, что в микрофлоре влагалища большинства участников преобладает один вид Lactobacillus, причем присутствие других видов демонстрирует широкую индивидуальную изменчивость. Наиболее часто встречающимися видами были L. crispatus, L. gasseri, L. iners и L. jensenii. В другом исследовании, наиболее часто выделяемыми штаммами Lactobacillus были L. jensenii, L. acidophilus, L. casei и L. gasseri. В недавних австрийских исследованиях преобладающие виды Lactobacillus, идентифицированные с помощью видоспецифической ПЦР, а именно L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii и L. Rhamnosus, были использованы для создания ДНК-отпечатков (DNA fingerprints). L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii и L. Rhamnosus можно считать преобладающими видами во влагалище.
Для восполнения дефицитов микрофлоры Lactobacillus (и, следовательно, защитных свойств 40 микрофлоры влагалища) наиболее распространенным способом замещения Lactobacilli является введение вагинальных суппозиториев, содержащих Lactobacilli. Некоторые авторы считают, что местное использование лактобактерий является безопасным и перспективным лечением для профилактики вагиноза и рецидирвирующих инфекций мочевыводящих путей.
Хотя вагинальные поддерживающие средства являются давней широко распространенной практикой замещения лактобактерий, пероральное введение препарата Lactobacillus представляет собой новую концепцию для восстановления нормальной микрофлоры влагалища. Сравнительно недавние результаты показывают, что пробиотические штаммы L. Rhamnosus GR-1 (АТСС 55826) и L. reuteri RC-14 (АТСС 55845) можно принимать перорально ежедневно в течение двух месяцев без каких-либо побочных эффектов. Употребление впоследствии приводило к значительному улучшению микрофлоры влагалища с точки зрения увеличения присутствия лактобактерий и снижения количества дрожжей и колиформ. В то время как одна группа авторов обсуждала полезные эффекты с точки зрения изменения иммунитета слизистой оболочки или пробиотических бактерий, поднимающихся к влагалищу от ректальной области, другая группа недавно продемонстрировала с помощью видоспецифической ПЦР-амплификации что L. Rhamnosus GR-1 и L. reuteri RC-14 могут быть доставлены в среду влагалища при пероральном введении.
В свете обсуждаемого выше предшествующего уровня техники, изобретение, описанное в ЕР 2509610 В1, относится к применению комбинации конкретных депонированных штаммов L. crispatus, L. Rhamnosus, L. jensenii и/или L. gasseri для лечения бактериального вагиноза (БВ). В таблице 11 на стр. 15 показано, что, например, депонированные L. Rhamnosus (DSM22560) обладают относительно хорошей способностью понижать рН.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в том, чтобы обеспечить новый штамм Lactobacillus rhamnosus с хорошими свойствами, в частности, в отношении лечения вагинальных и женских половых и мочеполовых инфекций и/или инфекций мочевыводящих путей, вызванных дефицитом Lactobacillus (например, бактериального вагиноза).
Как можно видеть в рабочих примерах ниже, описанный здесь новый штамм L. Rhamnosus с регистрационным номером СЕСТ 8800 (также называемый здесь BPL005) имеет ряд хороших/улучшенных свойств, в частности, в отношении лечения, например, бактериального вагиноза.
Результаты рабочего Примера 1 в настоящем документе продемонстрировали следующие соответствующие положительные характеристики выделенного штамма L. Rhamnosus СЕСТ 8800 (= BPL005):
1: Он был выделен de novo из изолятов из влагалища здоровых женщин, т.е. на первый взгляд, нет оснований полагать, что это не новый штамм как таковой;
2: Профиль, полученный методом случайной амплификации полиморфной ДНК (RAPD), показал, что штамм отличается от других, а секвенирование 16S рРНК показало, что BPL005 является уникальным штаммом L. Rhamnosus;
3: BPL005 обладал наибольшей среди выделенных штаммов влагалища способностью снижать уровень рН;
4: В анализах без контроля рН, BPL005 обеспечивал быстрое снижение рН. Быстрая продукция молочной кислоты в случае штамма BPL005 согласуется с его высокой способностью снижать рН за короткое время. Что касается продуцирования остальных кислот, штамм BPL005 был лучшим продуцентом среди исследованных штаммов;
5: Что касается резистентности к гинекологическим коммерческим продуктам, штамм BPL005 был устойчив к самой высокой из исследованных концентраций и не наблюдалось никакого ингибирования;
6: Полногеномное секвенирование штамма BPL005 показало, что он имеет уникальный контиг 3.023 Мб, то есть последовательность генома не была одной из последовательностей, описанных в предшествующем уровне техники.
Как обсуждалось выше, давно известно, что бактериальный вагиноз (БВ) сопровождается повышением рН (повышение относительно нормального/здорового рН, равного приблизительно 4, до рН выше 4,5) и микробным дисбактериозом, при котором обычная вагинальная микрофлора с преобладанием Lactobacillus подавляется разрастанием преимущественно анаэробных организмов.
Соответственно, тот факт, что описанный здесь новый штамм L. Rhamnosus СЕСТ 8800 (= BPL005) обладает очень хорошей способностью снижать рН, имеет важное значение для использования штамма в лечении, например, бактериального вагиноза.
Вкратце, не ограничиваясь теорией, на основе описанных в настоящем документе хороших свойств раскрытого в настоящем документе нового штамма L. Rhamnosus, нет оснований полагать, что этот штамм не будет полезен для лечения вагинальных и женских половых и мочеполовых инфекций и/или инфекций мочевыводящих путей, вызванных дефицитом лактобактерий (например, бактериального вагиноза).
Результаты рабочего Примера 2 в настоящем документе показали, что штамм BPL005 обеспечивает уровни снижения рН, близкие к исследованным пробиотикам рассматриваемых в настоящем документе коммерческих гинекологических пробиотических продуктов.
Результаты рабочего Примера 3 показали хорошую эффективность штамма BPL005 в процессе продукции в лабораторных условиях (объем 1 л), а данные изготовленного лиофилизированного порошка показали, что штамм BPL005 обладает хорошей стабильностью в течение 15 месяцев. Результаты рабочего Примера 4 показали хорошую эффективность штамма BPL005 в процессе продукции в промышленном масштабе (объем 1500 л), а данные изготовленного лиофилизированного порошка показали, что штамм BPL005 обладает очень хорошей стабильностью.
Очевидно, что то, что штамм Lactobacillus может быть получен надлежащим образом в промышленном масштабе, является преимуществом для возможности изготовления рассматриваемого в настоящем документе коммерческого продукта, соответственно, рабочий Пример 4 в настоящем документе демонстрирует дополнительные преимущества описанного в настоящем документе нового штамма L. Rhamnosus СЕСТ 8800 (= BPL005).
Соответственно, первый аспект изобретения относится к молочнокислой бактерии L. Rhamnosus с регистрационным номером СЕСТ 8800 (здесь также обозначается BPL005) или ее мутанту, где мутантный штамм получают с использованием выделенного штамма в качестве исходного материала, и где мутант сохраняет способность СЕСТ 8800 снижать уровни рН или обладает улучшенной способностью.
Второй аспект изобретения относится к пищевой или фармацевтической композиции, содержащей бактерии по первому аспекту и/или любому описанному в настоящем документе варианту его реализации.
Термин «пищевая» относится в соответствии с уровнем техники к питанию или регулированию питания или потребления пищи. Соответственно, пищевая композиция представляет собой композицию, которая подходит для добавления к пищевому продукту для человека или кормовому продукту для животного.
Третий аспект изобретения относится к пищевой или фармацевтической композиции по второму аспекту и/или любому описанному в настоящем описании варианту реализации для применения в лечении нарушения у женщины, где нарушение представляет собой дисбаланс естественной бактериальной микрофлоры влагалища, вагинальную инфекцию, женскую генитальную инфекцию, урогенитальную инфекцию или инфекцию мочевыводящих путей.
Четвертый аспект изобретения относится к молочному продукту, напитку, пищевому продукту для питания человека и/или пищевому продукту для кормления животных, отличающемуся тем, что продукт содержит пищевую композицию по второму аспекту и/или любому описанному в настоящем документе варианту его реализации.
Вариант реализации настоящего изобретения описан ниже исключительно в качестве примеров.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Новый штамм Lactobacillus rhamnosus
Образец нового штамма BPL005 Lactobacillus rhamnosus был депонирован в коллекции СЕСТ  de Cultivos Tipo) под регистрационным номером СЕСТ 8800 с датой депозита 15 декабря 2014 года. Депозит был сделан в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Первый аспект изобретения относится к описанному в настоящем документе новому штамму или «его мутанту».
Специалисту в данной области ясно, что, путем применения депонированного штамма в качестве исходного материала, квалифицированный читатель может с помощью обычных методов мутагенеза или повторной изоляции регулярно получать дополнительные мутанты или их производные, которые сохраняют описанные в настоящем документе соответствующие свойства и преимущества. Соответственно, термин «его мутант» по первому аспекту относится к мутантным штаммам, полученным с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала.
Говоря другими словами, изобретение относится к способу получения мутантного штамма молочнокислой бактерии. L. Rhamnosus с регистрационным номером СЕСТ 8800, включающему следующие этапы:
(i): получение мутантов молочнокислой бактерии L. Rhamnosus с регистрационным номером СЕСТ 8800;
(ii): исследование мутантов, полученных на стадии (i), и выявление мутантного штамма, который сохранил или дополнительно улучшил способность СЕСТ 8800 снижать уровень рН; а также
(iii) выделение выявленного на стадии (ii) мутантного штамма с получением, таким образом, мутантного штамма молочнокислой бактерии L. Rhamnosus с регистрационным номером СЕСТ 8800, где мутантный штамм сохранил или дополнительно улучшил способность СЕСТ 8800 снижать уровни рН.
Предпочтительно, первый аспект относится к молочнокислой бактерии L. Rhamnosus с регистрационным номером СЕСТ 8800 (здесь также обозначено BPL005).
Статья (Chenoll Е,  FM, Martinez-Blanch JF,  D,  S, Menabrito M. 2016. Complete genome sequence of Lactobacillus rhamnosus strain BPL5 (CECT 8800), a probiotic for treatment of bacterial vaginosis. Genome Announc 4(2):e00292-16. doi:10.1128/genomeA.00292-16. Copyright© 2016 Chenoll et al.) была опубликована в апреле 2016 года, то есть после даты приоритета настоящей заявки - 30 июня 2015 года ЕР 15174222.8.
В этой статье раскрыта полная последовательность генома молочнокислой бактерии L. Rhamnosus с регистрационным номером СЕСТ 8800 согласно настоящему изобретению.
Очевидно, работа по получению мутантного штамма СЕСТ 8800 была бы рутинной для специалиста даже без знания последовательности генома, а известной последовательностью это еще проще.
Пищевая или фармацевтическая композиция - второй аспект изобретения
Как обсуждалось выше, второй аспект изобретения относится к пищевой или фармацевтической композиции, содержащей бактерии по первому аспекту и/или любому описанному в настоящем документе варианту его реализации.
Пищевая композиция обычно включает пищевые или питательные приемлемые адъюванты и/или вспомогательные вещества.
Фармацевтическая композиция обычно включает фармацевтически приемлемые адъюванты и/или вспомогательные вещества.
4
14
6
14
8
14
6
13
Обычно такая композиция включает бактерии в концентрированной форме, включая замороженные, высушенные или лиофилизированные концентраты, обычно имеющие концентрацию жизнеспособных клеток, которая находится в диапазоне от 10 до 10 КОЕ (колониеобразующих единиц) на грамм композиции. Может быть предпочтительным, чтобы диапазон представлял собой диапазон от 10 до 10 КОЕ (колониеобразующих единиц) на грамм композиции или представлял собой диапазон от 10 до 10 КОЕ (колониеобразующих единиц) на грамм композиции. Соответствующий диапазон может также быть от 10 до 10 КОЕ (колониеобразующих единиц) на грамм композиции.
Может быть предпочтительным, чтобы композиция содержала сублимированные (говоря другими словами, лиофилизированные) бактерии.
Композиция может в качестве дополнительных компонентов содержать криопротекторы (например, мальтодекстрин) и/или обычные добавки, включая питательные вещества, такие как дрожжевые экстракты, сахара и витамины.
Если композиция содержит лиофилизированные бактерии, то предпочтительно содержит подходящие вещества-криопротекторы (например, мальтодекстрин).
Как понятно специалисту в данной области, пищевая или фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, будет в некоторых вариантах реализации включать множество штаммов, принадлежащих одному и тому же виду или принадлежащих разным видам. Типичным примером такой полезной комбинации молочнокислых бактерий в композиции, описанной в настоящем документе, является смесь Leuconostoc sp. и одного или нескольких подвидов Lactococcus. таких как Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris или Lc.s lactis subsp. lactis биовар. diacetylactis.
Это также может быть, например, L. crispatus, L. Rhamnosus, Lactobacillus jensenii и/или L. gasseri. Могут быть предпочтительны формы применения композиций согласно настоящему изобретению, подходящие для перорального приема или местного введения во влагалище. Например, пробиотические бактерии для применения у женщин можно вводить перорально в виде капсул, или (насыпанных в пакетики) растворенных в напитке, или в виде ферментированного молока (йогурта). При пероральном введении бактерии должны выживать прохождение через желудок и двенадцатиперстную кишку (демонстрируя определенную устойчивость к кислоте и желчи) и временно колонизировать кишечник. Оттуда небольшое количество бактерий будет подниматься во влагалище и (опять же временно) колонизировать слизистую влагалища. Пробиотические бактерии можно также использовать обычным образом в виде вагинальных капсул или суппозиториев и непосредственно применять во влагалище. Защитный эффект лактобактерий против потенциальных патогенов во влагалище возникает в результате метаболической активности лактобактерий. Бактерии потребляют гликоген и другие источники глюкозы и продуцируют молочную кислоту. Низкий рН, генерируемый таким образом, вреден для менее желательных бактерий и грибов и, таким образом, защищает слизистую оболочку влагалища от инфекций. Поэтому композицию согласно изобретению можно вводить в виде суппозиториев, вагинальных капсул для вагинального введения или в виде капсул с покрытием, таблеток, саше, пилюль, ампул, флаконов для перорального приема, а также йогурта, йогуртовых напитков, ферментированного молока, соков и других ферментированных напитков и продуктов.
Использование для лечения нарушения у женщин - третий аспект изобретения
Как обсуждалось выше, третий аспект изобретения относится к пищевой или фармацевтической композиции по второму аспекту и/или любому описанному в настоящем документе варианту его реализации для применения в лечении нарушения у женщин, где нарушение представляет собой дисбаланс естественной микрофлоры влагалища, вагинальную инфекцию, женскую половую инфекцию, урогенитальную инфекцию или инфекцию мочевыводящих путей.
Как понятно специалисту в данной области, в отношении нарушения у женщин, например, пищевая или фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, будет применяться многократно для восстановления и/или поддержания здоровой бактериальной микрофлоры влагалища.
Третий аспект может быть альтернативно описать как относящийся к способу лечения нарушения у женщин, где нарушение представляет собой дисбаланс естественной бактериальной микрофлоры влагалища, вагинальную инфекцию, женскую генитальную инфекцию, урогенитальную инфекцию или инфекцию мочевыводящих путей у женщины, включающему введение соответствующего количества пищевой или фармацевтической композиции по второму аспекту и/или любому описанному в настоящем документе варианту его реализации у женщины.
Примерами соответствующего нарушения являются вагиноз, вагинит, хронический бактериальный вагиноз, хроническая дрожжевая инфекция, хроническая инфекция мочевыводящих путей в период менопаузы, атрофический вагинит, вагиноз или бактериальный вагиноз.
В предпочтительном варианте реализации, нарушение у женщины представляет собой бактериальный вагиноз (БВ).
Дополнительно, композиции согласно изобретению особенно подходят для применения в лечении или профилактике бессимптомного и рецидивирующего бактериального вагиноза при беременности или преждевременных родах вызванных бактериальным вагинозом.
Молочный продукт, напиток, пищевой продукт и т.д. - четвертый аспект изобретения
Как обсуждалось выше, четвертый аспект изобретения относится к молочному продукту, напитку, пищевому продукту для питания человека и/или кормовому продукту для кормления животных, отличающемуся тем, что продукт содержит пищевую композицию по второму аспекту и/или любому описанному в настоящем документе варианту его реализации.
Молочные продукты согласно настоящему изобретению могут состоять из молока, йогурта, сыра, гомогенизированных продуктов (на основе молока, сыра, фруктов), ферментированного или неферментированного молока (включая сухое молоко, безлактозное молоко, молочные коктейли), содержащих пробиотики.
Лечебный сыр можно получить путем добавления подходящих пробиотических микроорганизмов в концентрированной высушенной форме на определенной фазе обработки сыра, чтобы обеспечить поставку дозы микроорганизмов, необходимых для организма. Напитки могут быть напитками быстрого приготовления или водой, содержащей композиции согласно настоящему изобретению.
Указанные интегрированные продукты (integrators), молочные продукты и пищевые продукты подходят для применения в лечении тех же нарушений у женщин, о которых говорилось выше, то есть для применения в лечении нарушений у женщин, где нарушение представляет собой дисбаланс естественной бактериальной микрофлоры влагалища, вагинальную инфекцию, генитальную инфекцию, мужскую половую инфекцию, урогенитальную инфекцию или инфекцию мочевыводящих путей.
Один из вариантов реализации изобретения относится к способу получения ферментированного пищевого продукта или ферментированного кормового продукта, включающему добавление молочнокислой бактерии Lactobacillus rhamnosus по первому аспекту к исходному материалу пищевого или кормового продукта и хранению таким образом инокулированного исходного материала в условиях, когда молочнокислая бактерия является метаболически активной.
Пригодные исходные материалы пищевых продуктов включают любой материал, который обычно подвергают стадии молочнокислой ферментации (брожения), такие как молоко, растительные материалы, мясные продукты, фруктовые соки, сусло, тесто, соя и масла.
Ферментированные продукты, которые получают указанным способом, включают в качестве типичных примеров молочные продукты, такие как ферментированное молоко, йогурт, сыр, включая свежие сырные продукты или моцареллу и пахту.
В других вариантах реализации, исходный материал представляет собой исходный материал для корма для животных, такой как силос, например, травы, зерновой материал, горох, люцерну или листья сахарной свеклы, где бактериальными культурами инокулируют кормовую культуру, предназначенную для силосования, чтобы добиться ее сохранения, или богатые белками субпродукты для животных, такие как побочные продукты переработки мяса и рыбы также с целью сохранения этих субпродуктов для целей кормления животных.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1 Выделение и характеристика штамма L. Rhamnosus BPL005 согласно изобретению
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
1. Изоляция и отбор штаммов
Чтобы получить изоляты из влагалища здоровых женщин, брали образцы из средней области влагалища у четырнадцати здоровых женщин в пременопаузе в возрасте от 18 до 45 лет. Заданными критериями исключения были беременные или кормящие женщины, менструирующие во время отбора проб, или получающие антибактериальную терапию против предыдущего вагинита.
Тампоном распределяли мазок на чашках с агаром MRS и инкубировали в анаэробных увловиях при 37°C. Грамположительные, неспорулированные палочки отбирали в качестве предположительных лактобактерий. Чистые культуры долговременно хранили (-20°C) в глицерине для дальнейшего анализа.
2. Молекулярная идентификация
Чтобы обеспечить уникальность изолятов, формировали агарозные профили случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD), и повторные изоляты отбрасывали.
Молекулярную идентификацию проводили с помощью секвенирования гена 16S рРНК, как описано у Chenoll et al. (Novel Probiotic Bifidobacterium bifidum СЕСТ 7366 strain active against the pathogenic bacterium Helicobacter pylori. 2011. Applied and Environmental Microbiology. 77(4): 1335-1343).
Вкратце, ДНК из чистых культур экстрагировали и очищали, a 16S рДНК амплифицировали с помощью технологии ПЦР. Продукты амплификации очищали и секвенировали. Идентификацию осуществляли путем сравнения последовательностей, полученных с базой данных BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
3. Выбор штамма, наилучшим образом снижающего рН.
Для изучения способности штаммов лактобактерий снижать уровни рН, стандартизированные культуры штаммов выращивали в среде MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) в течение 17 ч при 37°C. Конечный рН измеряли с помощью рН-метра.
Анализ проводили в трех повторах. После проведения экспериментов отдельно исследовали комбинацию штаммов в наибольшей степени снижающих уровень рН. Для проведения этого анализа оба штамма культивировали совместно в среде MRS в течение 17 ч при 37°С, и конечный рН измеряли с помощью рН-метра.
4. Идентификация профиля органических кислот
Для получения профиля органических кислот отобранных штаммов, каждый штамм культивировали в анаэробных условиях при 37°С в ферментерах объемом 1 л. (Biobundle, Applikon) в промышленной среде, оптимизированной в Biopolis для лактобактерий. Для каждого штамма исследовали два состояния: с контролем рН и без контроля рН. В обоих случаях осуществляли мониторинг уровней рН во время анализа. В ходе анализа брали образцы.
Для количественного анализа органических кислот 0,8 мл бесклеточного супернатанта смешивали путем встряхивания с 0,2 мл смеси, содержащей 5% метафосфорной кислоты, сульфата меди (1,56 мг/мл) и 50 мМ 4-метилвалериановой кислоты в качестве внутреннего стандарта, затем образцы фильтровали через фильтры с размером пор 0,45 мкм и разбавляли 1/2 и 1/10.
Оценку органических кислот проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Аликвоту 10 мкл обработанных образцов инъецировали в систему ВЭЖХ Альянс 2695 (Waters), снабженную колонкой Rezex (ROA Organic Acid (Н+) 8% 300×7,8 мм, 8 мкм [Премиум]) в условиях, рекомендованных производителем.
2
4
Детектирование осуществляли с помощью детектора показателя преломления (2414 Waters). Элюент дегазировали HSO 2.5 мМ при изократическом расходе 0,6 мл/мин. Во всех случаях, кривые количественной оценки строили с использованием заранее исследованных смесей.
5. Резистентность к коммерческим продуктам.
Чтобы проверить резистентность штамма BPL005 к различным гинекологическим продуктам, аликвоты непосредственно исходных растворов каждого продукта растворяли в жидкой среде до 5120 мкг/мл и фильтровали через 0,22 мкм фильтр. Исходные растворы хранили при -80°C.
Из первого разведения делали серию разведений  в диапазоне концентраций от 512 до 0,125 мкг/мл. Инокуляты получали непосредственно из 24-часовой колонии, ресуспендировали в физиологическом растворе до 0,5 MacFarland и разбавляли 1/20 в физиологическом растворе. Анализы проводили на многолуночных планшетах и инкубировали в анаэробных условиях при 37°C в течение 24 часов.
Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) определяли как минимальную концентрацию, при которой антибиотик вызывает явное ингибирование (рост отсутствует). В случае продуктов с высокой мутностью анализы включали вторую стадию, на которой 5 мкл 24-часовой культуры BPL005 в среде IST в присутствии серийно разбавленных коммерческих продуктов наносили по каплям в чашки с загаром, чтобы подтвердить рост пробиотика.
6. Геномная последовательность
Для получения полногеномной последовательности и анализа полного генома штамма BPL005, проводили секвенирование генома и биоинформационный анализ.
i) Секвенирование:
Чтобы получить последовательность полного генома отобранного штамма получали высококонцентрированный осадок из банка исходных клеток, и вручную экстрагировали ДНК высокой степени чистоты как описано у Pitcher et al. (Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. 1989. Letters in Applied Microbiology. 8 (4): 151-156). Секвенирование проводили с помощью платформы Pacific Biosciences (PacBio).
ii) Биоинформационные анализы:
Исходные последовательности, полученные в результате полногеномного секвенирования, собирали для построения скаффолдов, предназначенных для использования для аннотации генома. тРНК, рРНК и открытые рамки считывания (ОРС) будут предсказаны. Функциональность Открытых рамок Считывания (ОРС) будет аннотирована путем сравнения каждой ОРС с базой данных, содержащей все последовательности царства бактерий. После связывания функциональности гена с каждой ОРС, будут найдены и перечислены гены вирулентности и устойчивости к антибиотикам.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Изоляция и выбор штаммов
Всего, было получено 14 образцов и они были распределены на чашках с агаром MRS для получения изолятов. Четырнадцать штаммов были получены из 100 выделенных изолятов. Все они были получены из вагинальных образцов. После получения штаммы долговременно хранили (-20°C) в глицерине для дальнейшего анализа. Выделенные изолятор были классифицировали на основе окрашивания по Граму и морфологии клеток. Четырнадцать грамположительных неспорулирующих палочек определяли как предположительные лактобактерий и, соответственно, отбирали для дальнейшей идентификации.
2. Молекулярная идентификация
После выделения изолятов, получали агарозные RAPD-профили для удаления дублированных изолятов. На основе профилей RAPD четырнадцать изолятов были сгруппированы в шесть разных штаммов. Штаммы идентифицировали секвенированием 16S рРНК (Таблица 1) и штаммы Lactobacillus были отобраны для дальнейших исследований (Таблица 2). Кроме того, в исследование были включены коллекционные штаммы L. crispatus СЕСТ 4840 и L. iners DSM 13335.
3. Выбор лучшего рН-снижающего штамма
Изучена способность штаммов снижать уровень рН. В Таблице 3 приведены результаты. В анализах, проведенных только с одним штаммом, уровни рН снижались во всех случаях. Наибольшее снижение рН было получено в случае штамма L. Rhamnosus BPL005, конечное значение рН составляло 3,82.
На основании результатов снижения рН, штамм L. Rhamnosus BPL005 и L. casei BPL013 отобрали для дальнейших исследований.
4. Идентификация профиля органических кислот
Органические кислоты были описаны как ингибирующие метаболиты, а также как соединения с пробиотическим действием. В этом смысле, штаммы BPL005 и BPL013 исследовали на основе продуцирования ими органических кислот при ферментации объемом 1 л. Что касается снижения рН в анализах без контроля рН, в случае штамма BPL005, рН начал очень быстро снижаться. Через 5 часов ферментации уровень рН составлял 3,7, а через 10 часов ферментации рН достигал своего минимума (рН 3,0). В случае штамма BPL013, рН постепенно снижался, наименьшее значение рН достигалось через 30 часов после ферментации.
В Таблицах 4-5 показана продукция органических кислот. В случае ферментации с контролем рН, образцы были извлечены в конце ферментации. Во всех случаях были получены самые высокие уровни для молочной кислоты, причем самыми высокими концентрациями были 22,53 г/л для штамма BPL013, и 19,90 г/л для штамма BPL005, в ферментациях с контролируемым рН. Быстрая продукция молочной кислоты в случае штамма BPL005 согласуется с его высокой способностью снижать рН за короткое время. За образованием молочной кислоты следовало снижение рН у обоих штаммов, которое было более заметным в случае штамма BPL005.
Что касается продукции остальных кислот, штамм BPL005 был лучшим продуцентом во всех случаях. Сообщалось, что эти органические кислоты могут ингибировать болезнетворные бактерии и дрожжи ( et al. Urogenital pathogen inhibition and compatibility between vaginal Lactobacillus strains to be considered as probiotic candidates. 2011 European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 159: 399-406).
В случае молочной кислоты, полученные уровни были выше, чем другие, ранее описанные в процитированной выше статье  et al.
5. Анализы резистентности к коммерческим продуктам.
Результаты, полученные с помощью гинекологических коммерческих продуктов, суммированы в Таблице 6. Во всех случаях, штамм BPL005 был устойчив к самой высокой концентрации, и никакого ингибирования не наблюдалось даже при самых высоких концентрациях в продуктах на основе гелей и кремов.
Таблица 6. Значения MIC, полученные для продуктов на основе прогестерона.
6. Последовательность генома
Был секвенирован полный геном штамма BPL005. Провели экстракцию полного генома, подтвердили идентичность штамма и применили секвенирование. Сборка дала уникальный контиг размером 3.023 Мб. Не было последовательностей предсказанных в качестве плазмид.
Выводы
Результаты этого примера продемонстрировали приведенные ниже в настоящем документе соответствующие положительные характеристики выделенного штамма BPL005 L. Rhamnosus:
1: Штамм был выделен de novo из изолятов из влагалища здоровых женщин, т.е., нет оснований полагать, что это не новый штамм как таковой;
2: Профиль случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD) показал, что указанный штамм отличается от других, а секвенирование 16S рРНК показало, что BPL005 является уникальным штаммом L. Rhamnosus;
3: BPL005 обладал самой высокой среди выделенных штаммов влагалища способностью снижать уровень рН;
4: В анализах без контроля рН, BPL005 давал быстрое снижение рН. Быстрое продуцирование молочной кислоты в случае штамма BPL005 согласуется с его высокой способностью снижать рН за короткое время. Что касается продукции остальных кислот, штамм BPL005 был лучшим продуцентом среди исследованных штаммов;
5: Что касается резистентности к гинекологическим коммерческим продуктам, штамм BPL005 был устойчив к самой высокой концентрации и не наблюдалось никакого ингибирования;
6: Полногеномное секвенирование штамма BPL005 показало, что он имеет уникальный контиг 3.023 Мб, то есть последовательность генома не была одной из последовательностей, описанных в предшествующем уровне техники.
ПРИМЕР 2. Сравнение BPL005 с коммерческими гинекологическими пробиотиками
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Жизнеспособные клетки в продукте.
Для более глубокого изучения различных коммерческих пробиотических продуктов, доступных на рынке, исследовали коллекцию из 18 продуктов на основе пробиотиков. Сводные данные по исследованным продуктам приведены в Таблице 7. Для каждого продукта получали концентрацию жизнеспособных клеток путем подсчета на чашках с агаром MRS, и исследовали функциональность штаммов. Для изучения функциональности пробиотические штаммы выделяли, идентифицировали путем секвенирования 16S рДНК и по их способности снижать рН.
Способность снижать уровень рН
Пробиотические штаммы выделяли из коммерческих продуктов и хранили при -80°C. Идентификацию на уровне видов была подтвержади секвенированием 16S рДНК. Для каждого 10 штамма, анализы по снижению рН выполняли, как описано выше. BPL005 штамм был включен в качестве контроля.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Жизнеспособные клетки в продукте
Для более глубокого изучения различных коммерческих пробиотических продуктов, доступных на рынке, была проанализирована коллекция из 18 продуктов на основе пробиотиков. Испытанные продукты суммированы в Таблице 8. Для каждого продукта получали концентрацию жизнеспособных клеток путем подсчета на чашках с агаром MRS, и исследовали функциональность штаммов. Для изучения функциональности пробиотические штаммы выделяли, идентифицировали путем секвенирования 16S рДНК и по их способности снижать рН.
Как показано в Таблице 8, результаты были очень переменными. Некоторые из них показали более низкое по сравнению со спецификацией число жизнеспособных клеток,.
Способность снижать уровень рН
Были выделены пробиотические штаммы из коммерческих продуктов, и исследовали их способность снижать уровень рН. В таблице 9 показано сравнение между ними.
Полученные результаты показали, что штамм BPL005 имеет уровни снижения рН, близкие к уровням лучших исследлованных пробиотиков.
Выводы
Результаты этого Примера показали, что штамм BPL005 имеет уровни снижения рН аналогичные таковым у лучших протестированных пробиотиков из рассмотренных в настоящем документе соответствующих коммерческих гинекологических пробиотических продуктов.
ПРИМЕР 3: Оценка продуктивности штамма LPLB005 Lactobacillus в лабораторных условиях (объем 1 л)
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для оценки продуктивности были созданы мастер-банк клеток и рабочий банк клеток при -80°C. Продукция в лабораторных условиях осуществлялось в ферментере объемом 1 л (Biobundle, Applikon), в промышленной среде, оптимизированной для лактобактерий. Культуру получали в стандартных условиях (Таблица 10) и клетки собирали путем центрифугирования. После сбора клеток, осадок ресуспендировали в растворе носителя на основе мальтодекстрина и замораживали при -80°C и лиофилизировали.
Чтобы оценить устойчивость штамма к процессам замораживания и лиофилизации, выживаемость клеток проверяли на чашках с агаром MRS перед сбором и после лиофилизации.
Изучение стабильности лиофилизированного продукта
Лиофилизированный порошок упаковывали под вакуумом и хранили при 5°C (±3°C). Стабильность продукта проверяли путем подсчетов в чашках с агаром MRS в течение 15 месяцев.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для получения оценки эффективности штамма BPL005 осуществляли продукцию в лабораторных условиях. Полученные результаты приведены в Таблице 11. Полученные результаты показали хорошую эффективность штамма BPL005 в процессе продукции в лабораторных условиях.
Лиофилизированный порошок упаковывали под вакуумом и хранили при 5°C. Стабильность продукта проверяли путем подсчета на чашках с агаром MRS. У штамма BPL005 была хорошая стабильность в течение 15 месяцев.
Выводы
Результаты этого примера показали хорошую эффективность штамма BPL005 в процессе продукции в лабораторных условиях (объем 1 л), а данные изготовленного лиофилизированного порошка показали, что штамм BPL005 обладал хорошей стабильностью в течение 15 месяцев.
ПРИМЕР 4. Промышленное получения штамма lactobacilli BPL005 (объем 1500 л)
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Промышленное расширение получения
Промышленную продукцию проводили в ферментере объемом 1500 л. Выращивание осуществляли в промышленной среде, оптимизированной для лактобактерий. Культуру получали в стандартных условиях (в анаэробных условиях, при контроле рН и температуры), и клетки собирали путем центрифугирования в промышленной центрифуге.
Оптимизация лиофилизации
После получения осадок ресуспендировали в носителе (на основе мальтодекстрина) и лиофилизировали в промышленном лиофилизаторе. Чтобы получить устойчивость штамма к процессу лиофилизации, жизнеспособность проверяли на чашках агара MRS сразу после процесса ферментации и после промышленного процесса лиофилизации. Чистоту культуры и лиофилизированного продукта проверяли с помощью электрофоретических профилей RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) случайно отобранных колоний.
Оценка сока хранения нерасфасованного порошка.
Срок годности нерасфасованного порошка еще исследуется. Аликвоты нерасфасованного порошка хранят при 5°C и 25°C. Оценка будет проводиться периодически путем подсчета на агаре MRS.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Промышленное расширение получения
9
Промышленную продукцию проводили в ферментере на 1500 л в стандартных условиях. Культура Lactobacillus rhamnosus BPL005 составила 6.55×10 КОЕ/мл. Этот результат согласуется с результатами, полученными в объеме 1 л, и приемлемы с точки зрения эффективности процесса.
Оптимизация лиофилизации
Полученные подсчеты суммированы в Таблице 12. Полученные результаты показали хорошую эффективность штамма BPL005 в процессе получения в объеме 1500 литров.
Оценка срока хранения нерасфасованного порошка.
Стабильность, полученная при продукции в объеме 1500 л при 5°C и 25°C упакованного под вакуумом лиофилизированного штамма BPL005, показала, что продукт был очень стабильным при температуре 5°C. Результаты, полученные при 25°C, показывают приемлемое небольшое снижение в цифрах.
Выводы
Результаты этого Примера показали хорошую эффективность штамма BPL005 в процессе продукции в промышленном масштабе (объем 1500 л), и данные изготовленного лиофилизированного порошка показали, что штамм BPL005 обладал очень хорошей стабильностью.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1: ЕР 0257007(подана в 1987).
2: ЕР 2509610 В1 (HSO Health Care, Вена - подана 13.09.2011 и опубликована/предоставлена в 2013 году).
3: Chenoll Е,  FM, Martinez-Blanch JF,  D,  S, Menabrito M. 2016. Complete genome sequence of Lactobacillus rhamnosus strain BPL5 (CECT 8800), a probiotic for treatment of bacterial vaginosis. Genome Announc 4(2):e00292-16. doi:10.1128/genomeA.00292-16. © 2016 Chenoll et al. - опубликовано в апреле 2016 года.