СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ ШТАММОВ Bac. subtilis И Bac. licheniformis
METHOD TO PRODUCE PROBIOTIC PREPARATION BASED ON SPOROGENOUS STRAINS Bac subtillis AND Bac licheniformis

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам производства пробиотических препаратов на основе штаммов бактерий Bac.subtilis и Bac.licheniformis. Подобные препараты могут использоваться как кормовая добавка для составления кормовых рационов, предназначенная для повышения усвояемости кормов сельскохозяйственных животных и птицы.
Известен способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммов энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus falcium ВГНКИ-27 в течение 12-15 ч, затем нативную культуральную охлаждают до температуры 15-20°C и концентрируют в 10-15 раз, полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°C. При этом концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах, или микрофильтрацией на плоских мембранах, или сепарированием в полупериодическом режиме работы (см. патент РФ №2065305, опубл. 08.20.1996).
Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, необходимость использования гидролизата казеина значительно удорожает препарат. Во-вторых, использование в качестве метода концентрирования ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрации на плоских мембранах делает данный метод дорогостоящим и требующим больших капиталовложений и высокой подготовки персонала. Также использование криогенной техники обезвоживания значительно усложняет технологический процесс. Кроме того, использование в качестве смешанной пробиотической культуры только двух видов бактерий делает эту смешанную популяцию неустойчивой, что снижает эффективность ее применения.
Известен способ получения сухого пробиотического препарата, который включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus acidophilus и Rhuminococcus albus до заданного достижения титра каждого микроорганизма, смешивание полученной маточной культуры с подсолнечниковым шротом в заданном соотношении, причем в качестве микроорганизмов дополнительно используют Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, из Lactobacillus acidophilus используют Lactobacillus acidophilus Suav. ВКПМ B-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus KR, при этом выращенные маточные культуры смешивают в соотношении 1:1, засеивают ею автоклавированный подсолнечниковый шрот при следующем соотношении компонентов, масс.%:
автоклавированный подсолнечниковый шрот
45-55
маточная культура Lactobacillus
acidophilus Suav.
ВКПМ 4625,
Rhuminococcus albus Kr
20-30
маточная культура Bacillus subtilis ВКПМ B-8130
20-30
8
инкубируют полученную смесь при 30-45°C в течение 4-8 дней с получением в полувлажном препарате не менее 1×10 клеток/г препарата, причем смешивают полученный препарат с подсолнечниковым шротом в соотношении 1:10-1:12 с получением препарата с остаточной влажностью 8-10%.
Наиболее близким способом производства пробиотической добавки является смешивание биомассы бактерий Bacillus subtilis В-2250 и/или Bacillus licheniformis В-2252 и вспомогательных веществ носителя-сорбента и влагоемкого наполнителя. В качестве носителя-сорбента она содержит аэросил гидрофильной марки A и гидрофобной марки AM, влагоемкого наполнителя - смолы-катиониты ионообменные марок КБ-4П-2 и КУ-2-8чс в заданном соотношении компонентов по массе сухого вещества. Сухую микрокапсулированную форму пробиотической добавки получают методом капиллярно-сорбционного высушивания смеси компонентов до содержания влаги в готовом продукте 8-25%. В результате получают микрокапсулированную форму пробиотической добавки, содержащую пробиотик, удобную в применении и употреблении, способную обеспечивать стабильностью свойств на всех этапах приготовления (RU 2252956 С2, 2005).
Однако полученный вышеуказанным способом пробиотический препарат хотя и обладает стабильными физико-химическими свойствами, недостаточно эффективен в связи с невысоким содержанием пробиотических микроорганизмов. Кроме того, его производство энергозатратно и сложно.
По этой причине сохраняется потребность в высокоэффективных пробиотических препаратах, используемых в качестве кормовых добавок для повышения привесов с/х животных и птицы.
Техническим результатом данного изобретения является повышение эффективности пробиотической составляющей получаемого продукта, что обеспечивает повышенную усвояемость кормов и увеличение привесов животных.
12
Этот результат может быть реализован при использовании описываемого способа производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, предназначенного для использования в качестве кормовой добавки к рационам с/х животных и птицы, направленной для повышения усвояемости кормов, включающий культивирование штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее стерильное обезвоживание, причем используют штамм Bac. subtilis ВКПМ В-10172 и штамм Bac. licheniformis ВКПМ В-10135, биомассы штаммов смешивают в соотношении 1:1, в качестве протектора микробных клеток используют желатиносахарозную защитную среду в количестве, обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 2×10 КОЕ/г.
В способе производства используются новые штаммы бактерий Bac. subtilis и Bac. licheniformis. Штаммы депонированы к коллекции ГНИИГенетика под регистрационными номерами: Bac. subtilis ВКПМ В-10172 и Bac. licheniformis ВКПМ В-10135. Штаммы выделены из природного сообщества в Кировской области. Далее приведены свойства каждого штамма.
Bac. subtilis ВКПМ В-10172
Культурально-морфологические признаки
Клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Граму - грамположительны. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре, а также на этих средах с добавлением 10 мг/мл канамицина, образуя блестящие складчатые колонии кремоватого цвете с неровными краями. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) культура образует равномерную муть.
Физиолого-биохимические признаки
Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной активностью не обладает. Обладает липазной активностью.
Культуру поддерживают на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и картофельном агаре с добавлением 50 мкг/мл канамицина.
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: пептон 5 г/л, дрожжевой экстракт 3 г/л, NaCl 5 г/л, вода водопроводная - до 1 л.
2
4
2
2
4
4
2
4
3
6
5
7
2
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: KHPO×3HO - 18,3 г/л; KHPO - 6,0 г/л; (NH)SO - 2,0 г/л; NACHO×5,5HO - 1,2 г/л.
Bac. licheniformis ВКПМ В-10135
Культурально-морфологические признаки
Клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Граму - грамположительны. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре, а также на этих средах с добавлением 10 мг/мл канамицина, образуя блестящие складчатые колонии кремоватого цвета с неровными краями. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) культура образует равномерную муть.
Физиолого-биохимические признаки
Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной активностью не обладает. Обладает липазной активностью.
Культуру поддерживают на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и картофельном агаре с добавлением 50 мкг/мл канамицина.
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: пептон 5 г/л, дрожжевой экстракт 3 г/л, NaCl 5 г/л, вода водопроводная - до 1 л.
2
4
2
2
4
4
2
4
3
6
5
7
2
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: KHPO×3HO - 18,3 г/л; KHPO - 6,0 г/л; (NH)SO - 2,0 г/л; NACHO×5,5HO - 1,2 г/л.
3
Способ осуществляют следующим образом. Биомассу B.subtilis и B.licheniformis получают выращиванием в стерильных условиях, отделяют биомассу на центрифуге, пасту смешивают с защитной средой (желатинно-сахарозной), разливают и сушат в лиофильной сушилке. Биомассу B.subtilis и B.licheniformis получают путем культивирования в качалочных колбах объемом 750 мл или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м на среде с глюкозой, пептоном, кукурузным экстрактом. Полученную в процессе ферментации культуральную жидкость центрифугируют. Биомассу бактерий и спор (в виде концентрированной суспензии) смешивают с защитной средой, содержащей сахарозу и желатин, разливают в пенициллиновые флаконы по 3 мл и сушат в лиофильной сушилке.
Пример
Получение инокулята Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis.
Культуру бактерий B.subtilis и B.licheniformis хранят на скошенной плотной среде МПА или ГРМ №1 в пробирках, закрытых ватными пробками. Оптимальная температура хранения 4-6°C. Для поддержания культуры в жизнеспособном состоянии один раз в 3 месяца производят пересев на свежую питательную среду МПА или ГРМ и выращивают при t=37°C до спорообразования 16-24 час.
Для получения посевного материала для засева 100 колб с ферментационной питательной средой готовят от 1 до 5 колб инокулята. Для получения инокулята используют 2 варианта:
2
- в качалочную колбу объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100 мл вносят кусочек размером 1×1 см исходной культуры со скошенного плотного агара МПА;
- в качалочную колбу объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100 мл вносят 0,5-1 мл споровой взвеси, смытой с двух биологических пробирок с исходной культурой 20 мл физиологического раствора.
3
Выращивание проводят в термостатируемой качалке при N=180-200 об/мин или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м, при t=37°C в течение 16-24 часов для культуры Bacillus subtilis и в течение 40-48 часов для Bacillus licheniformis. Чистоту культуры проверяют путем высева на чашки Петри с агаризованной средой МПА с последующим термостатированием при t=37°C. Отсутствие роста посторонней микрофлоры определяют визуально по виду колоний. Кроме этого, чистоту культуры определяют микроскопически. При отсутствии посторонней микрофлоры инокулят используют для засева колб с ферментационной средой.
Приготовление сред.
Приготовление жидкой питательной среды для инокулята.
Состав питательной среды:
Пептон - 10 г/л
Глюкоза - 20 г/л
NaCl - 1 г/л
2
CaCl - 0,05 г/л
4
MgSO - 0,25 г/л
4
MnSO - 0,3 г/л
4
FeSO - 0,01 г/л
Кукурузный экстракт - 30 г/л
pH среды 7,5±0,1 доводят 20% раствором NaOH.
Разливают в качалочные колбы с отбойниками по 100-150 мл.
Стерилизуют в паровом стерилизаторе ВК-75 при t=121±1°C в течение 25 мин.
ТП-2-2 Приготовление жидкой питательной среды для ферментации.
Состав питательной среды:
Пептон - 10 г/л
Глюкоза - 20 г/л
NaCl - 1 г/л
2
CaCl - 0,05 г/л
4
MgSO - 0,25 г/л
4
MnSO- 0,3 г/л
4
FeSO - 0,01 г/л
Кукурузный экстракт - 30 г/л
pH среды 7,5±0,1 доводят 20% раствором NaOH.
Разливают в качалочные колбы с отбойниками по 100-150 мл.
Стерилизуют в паровом стерилизаторе ВК-75 при t=121±1°C в течение 25 мин.
Приготовление желатино-сахарозной защитной среды для лиофилизации продукта.
Состав питательной среды:
Желатин - 10 г/л
Сахар - 100 г/л
Среду тщательно перемешивают, разливают во флаконы по 100-150 мл и стерилизуют в паровом стерилизаторе ВК-75 при t=121±1°C в течение 25 мин.
Культивирование Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis.
3
В качалочные колбы с отбойниками объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100-150 мл засевают инокулят в количестве 0,5-1 мл. Выращивание проводят в термостатируемой качалке N=200-220 об/мин или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м при N=250-270 об/мин с расходом воздуха 1:1, при t=37°C в течение 16-24 часов для культуры Bacillus subtilis и в течение 40-48 часов для Bacillus licheniformis.
3
Окончание культивирования определяют по достижению pH 7,2-7,6 для Bacillus subtilis и pH 8,0-8,5 для Bacillus licheniformis по полному потреблению глюкозы и обильному спорообразованию. Количество бактерий определяют методом десятикратных разведений с высевом на чашки Петри. В 1 см культуральной жидкости должно быть не менее 1010 клеток.
Обработка полученной культуральной суспензии.
Полученные культуральные жидкости B.subtilis и B.licheniformis смешивают по титру в соотношении 1:1. С целью концентрирования культуральной жидкости проводят центрифугирование. Центрифугирование проводят на центрифуге при N=6000-8000 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкость собирают в реактор-нейтрализатор, обеззараживают при температуре 100°C в течение двух часов, после чего сливают в канализацию. Центрифугу после сбора пасты обрабатывают 4% раствором хлорамина, затем промывают водой.
12
Полученную биомассу клеток B.subtilis и B.licheniformis с влажностью 60-80% (паста бактерий) (≈2 г со 100 мл культуральной жидкости) выгружают в эмалированные или пластиковые емкости, смешивают с протектором (желатино-сахарозной смесью) таким образом, чтобы титр сухого продукта после сушки составил КОЕ/г 2×10. Перемешивание до полной гомогенизации проводят на мешалке при N=1000 об/мин, в течение 20-25 мин. Перед розливом суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли и разливают по 3 мл во флакон.
Сушка
Флаконы устанавливают на полки сублимационной сушилки.
Режим сушки состоит из трех сегментов.
1 сегмент: замораживание от комнатной температуры до t=-40°C со скоростью 0,3, выдержка в течение 4-5 часов при этой температуре.
2 сегмент: сушка под вакуумом при температуре от t=-40°C до t=-20°C. Выдержка при t=-20°C в течение 4-5 часов.
3 сегмент: сушка под вакуумом при температуре от t=-20°C до t=+30°C. Выдержка при t=+30°C в течение 0,5 часа.
После окончания 3 сегмента сбрасывают вакуум, достают флаконы и передают в бокс для укупорки.
Остаточная влажность таблетки препарата не более 4%.
Упаковка готового продукта.
Флаконы с лиофильно высушенным продуктом укупоривают резиновыми пробками и фиксируют алюминиевыми колпачками. На флаконы с препаратом наклеивают этикетки, укладывают в картонные коробки. Картонные коробки укладывают в ящики из гофрированного картона. Этикетку с названием препарата и датой изготовления вкладывают в коробку.
Сухая биомасса B.subtilis и B.licheniformis применяется для приготовления кормовой добавки, которая используется для повышения усвояемости кормов вследствие улучшения пищеварения сельскохозяйственных животных, птиц и рыб в условиях их промышленного воспроизводства.
Примеры.
12
- выпаивание (0,5×10 КОЕ/фл)
11
- добавка в премикс (3,3×10 КОЕ/г)
9
- добавка в комбикорм (3,3×10 КОЕ/г)
Возраст
Норма здоровой птице
Восстановление после антибиотиков
Снятие стресса при вакцинации
Оздоровление при инфекции
до 5 дней
1 флакон в день на 2500 голов, выпаивание 3 -5 дней
1 флакон в день на 1250 голов, выпаивание 3-5 дней
1 флакон в день на 1000 голов, выпаивание 3-5 дней
1 флакон в день на 825 голов, выпаивание 3-5 дней с 10%-ным  раствором глюкозы
5-10 дней
300 г на 1 тонну премикса
500 г на 1 тонну премикса
500 г на 1 тонну премикса
750 г на 1 тонну корма
1000 г на 1 тонну корма А
1000 г на 1 тонну корма
10-20 дней
175 г на 1 тонну премикса
225 г на 1 тонну премикса
200 г на 1 тонну премикса
500 г на 1 тонну премикса
350 г на 1 тонну корма
450 г на 1 тонну корма
400 г на 1 тонну корма
20-30 дней
100 г на 1 тонну премикса
200 г на 1 тонну премикса
175 г на 1 тонну премикса
1000 г на 1 тонну корма 3-5 дней
200 г на 1 тонну корма
400 г на 1 тонну корма
350 г на 1 тонну корма
Нормы ввода (г/т) (3,3×10<sup>9</sup> КОЕ/г) в корм и (3,3×10<sup>11</sup> КОЕ/г) в премикс
Вид
Комбикорм
Премикс
Цыплята
500 г/тонна
250 г/тонна
Бройлеры
1000 г/тонна
500 г/тонна
Пушные звери
300 г/тонна
150 г/тонна
Поросята сосуны
400 г/тонна
200 г/тонна
Поросята на откорме
300 г/тонна
150 г/тонна
Свиноматки
500 г/тонна
250 г/тонна
Индейки
400 г/тонна
200 г/тонна
Телята, жеребята
500 г/тонна
250 г/тонна
Норма суточного выпаивания 1 флакона (0,5×10<sup>12</sup> КОЕ)
Вид молодняка
Норма
Цыплята суточные
2500 голов
Поросята сосуны
10 голов
Кролики
10 голов
Щенки пушных зверей
15 голов
Козлята, барашки
10 кг массы
Телята
40 кг массы
Споры пробиотика вместе с кормом попадают в пищевод, затем преодолевают жизнеспособными кислую среду желудка и, попадая в щелочную среду тонкого кишечника, прорастают в вегетативные клетки, выделяя при этом большое количество пищеварительных ферментов, чем способствуют более полному расщеплению и перевариванию корма.
Одновременно проросшие споры вступают в конкуренцию за питательные субстраты с патогенной микрофлорой и вытесняют ее из кишечника, повышая тем самым иммунный статус животного и его защитный барьер от инфекций. В прямой кишке не завершившие метаболизм вегетативные клетки спорулируют и выходят с калом с последующим санирующим эффектом навоза.
Эффективность пробиотика усиливается тем, что в составе добавки присутствуют аэробная В.subtilis и анаэробная В.licheniformis бактерии, при этом на поверхности корма или слизистой в присутствии кислорода работает аэробная бактерия, по объему корма и внутри слизистой без доступа кислорода - анаэробная. Однако, в отличие от похожих по составу добавок, эти бактерии находятся в составе препарата в реальном соотношении 1:1, что как раз и гарантирует заявленый мощный синергический эффект.
Шесть качеств спорогенного пробиотика, делающих его пробиотическим стимулятором роста:
- Продуцент пищеварительных ферментов (амилаз, липаз, протеаз).
- Антагонист патогенов (конкуренция за питательные субстраты).
- Сапротроф (антитоксическое действие, лизис продуктов гниения).
- Иммуномодулятор (активация макрофагов, индукция эндогенного интерферона).
- Толерантность (дополняет и/или заменяет кормовые антибиотики, нейтрален в кормовых смесях и премиксах).
- Стабильность (выдерживает высокие температуры и давления гранулирования на комбикормовых заводах, неприхотлив в хранении.