КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ОТДЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

+
+
1. Способ идентификации CD8-клеток, способных лизировать CD4-ВИЧ-инфицированные клетки у индивидуума, где указанный способ включает:
+
получение суспензии эффекторных CD8-клеток и клеток-мишеней, взятых у индивидуума и нанесенных на сформованную пластину, содержащую по меньшей мере одну микролунку в микролуночном массиве, где указанная по меньшей мере одна микролунка в указанном микролуночном массиве имеет отдельную эффекторную клетку;
+
культивирование указанной суспензии в условиях, позволяющих осуществлять лизис указанной клетки-мишени под действием указанных CD8-клеток;
детектирование лизиса указанной клетки-мишени указанными эффекторными клетками; и
+
+
идентификацию CD8-клеток, способных лизировать CD4-ВИЧ-инфицированные клетки.
2. Способ по п.1, который также включает выделение эффекторных клеток, лизирующих указанную клетку-мишень.
3. Способ по п.2, который также включает культивирование эффекторных клеток, лизирующих указанную клетку-мишень.
4. Способ по п.1, где указанные эффекторные клетки и клетки-мишени смешивают перед их помещением в указанную микролунку.
5. Способ по п.1, где указанные эффекторные клетки и клетки-мишени смешивают после их помещения в указанную микролунку.
6. Способ по п.1, где лизис детектируют путем мониторинга изменения интенсивности флуоресценции меченных клеток.
7. Способ по п.1, где лизис детектируют путем мониторинга изменения уровней внутриклеточного кальция в указанной клетке-мишени.
8. Способ по п.7, где указанный кальций детектируют с использованием флуоресцентного красителя, чувствительного к кальцию.
9. Способ по п.8, где указанным красителем является Fura 2АМ (Invitrogen).
10. Способ по п.1, который также включает:
приведение в контакт микролуночного массива с субстратом, где указанный субстрат предварительно обрабатывают по меньшей мере одним средством, которое позволяет специфически детектировать продукт указанных эффекторных клеток; и
детектирование указанного средства.
11. Способ по п.10, где указанным средством является антитело, цитокин или растворимый медиатор лизиса.
12. Способ по п.10, где указанным средством является цитокин.
13. Способ по п.12, где указанным цитокином является TNF-α или IFN-γ.
14. Способ по п.8, где указанным средством является растворимый медиатор лизиса.
15. Способ по п.14, где указанным растворимым медиатором лизиса является гранзим В (GzB) или перфорин.
16. Способ по п.1, где указанный способ также включает, мечение эффекторных клеток антигеном CD69.
17. Способ характеристики гуморального ответа у индивидуума, где указанный способ включает:
получение суспензии В-клеток, взятых у индивидуума и нанесенных на сформованную пластину, содержащую по меньшей мере одну микролунку в микролуночном массиве, где указанный индивидуум инфицирован или, вероятно, инфицирован ВИЧ, и где по меньшей мере одна микролунка в указанном микролуночном массиве имеет отдельную клетку;
приведение в контакт указанного микролуночного массива с субстратом, где указанный субстрат предварительно обрабатывают по меньшей мере одним средством для детектирования В-клеток; и
детектирование указанного средства с последующей характеристикой указанного гуморального ответа.
18. Способ по п.17, где указанным средством для детектирования В-клеток является антитело, специфичное к эпитопу в gp120.
19. Способ по п.17, который также включает приведение в контакт указанного микролуночного массива со вторым субстратом, где указанный субстрат предварительно обрабатывают по меньшей мере одним первым средством для детектирования В-клеток.
20. Способ по п.19, где указанным первым средством для детектирования В-клеток является антитело против gp120 ВИЧ.
21. Способ по п.20, где указанное антитело направлено против С-концевого gp120 ВИЧ.
22. Способ по п.17, который также включает определение изотипа антитела, продуцируемого указанной В-клеткой в указанном микролуночном массиве.
23. Способ по п.17, который также включает выделение В-клетки, экспрессирующей антитело, реагирующее с ВИЧ.
24. Способ по п.23, который также включает амплификацию и выделение вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи указанного антитела.
25. Способ по п.17, где указанные В-клетки обрабатывают средством, стимулирующим продуцирование антител в указанной клетке.
26. Способ по п.25, где указанными средствами являются CD40L или анти-BCR антитело.
27. Способ по п.25, где указанные В-клетки обрабатывают CD40L и анти-BCR антителом.
28. Способ характеристики перекрестной реактивности В-клеток с множеством ВИЧ-изолятов, где указанный способ включает:
получение суспензии В-клеток, взятых у индивидуума и нанесенных на сформованную пластину, содержащую по меньшей мере одну микролунку в микролуночном массиве, где указанный индивидуум инфицирован или, предположительно, инфицирован ВИЧ, и где по меньшей мере одна микролунка в указанном микролуночном массиве имеет отдельную клетку;
приведение в контакт указанного микролуночного массива с первым субстратом, где указанный субстрат предварительно обрабатывают антителами, продуцируемыми указанными В-клетками по меньшей мере в одной указанной микролунке;
приведение в контакт указанного субстрата с первым меченым вирионом ВИЧ и со вторым меченным вирионом ВИЧ; и
определение наличия связывания указанного первого меченого вириона и второго меченого вириона с антителами, продуцируемыми той же самой клеткой в указанной микролунке.
29. Способ по п.28, где указанный способ дополнительно включает выделение В-клеток, продуцирующих антитела, которые специфически связываются с указанным первым меченым вирионом и вторым меченым вирионом.
30. Способ по п.29, который также включает культивирование указанных выделенных В-клеток.
31. Способ по п.17, где по меньшей мере один из указанных вирионов является меченным.
32. Способ по п.21, где указанный первый вирион и второй вирион метят различными средствами.
33. Способ создания функционального профиля для эффекторных клеток, чувствительных к ВИЧ-инфекциям у индивидуума, где указанный способ включает:
+
+
+
+
+
+
получение популяции эффекторных клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток CTL (CD8), NK-клеток (CD16), NK-T-клеток (CD1d, Vα24) или γδ-Т-клеток (Vγ9, Vδ2), где указанные эффекторные клетки получают от индивидуума и наносят на сформованную пластину, содержащую по меньшей мере одну микролунку в микролуночном массиве, где по меньшей мере одна микролунка в указанном микролуночном массиве имеет отдельную эффекторную клетку, и где указанная популяция эффекторных клеток загружена вместе с популяцией когнатных клеток-мишеней;
визуализацию указанных эффекторных клеток;
оценку цитотоксичности указанных эффекторных клеток;
приведение в контакт микролуночного массива с первым субстратом, где указанный субстрат предварительно обрабатывают средством, которое позволяет специфически детектировать один или более из IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α и IFN-γ; и
определение связывания указанных эффекторных клеток, находящихся в указанной микролунке, с одним или несколькими указанными средствами.
34. Способ по п.33, где цитотоксичность оценивают путем детектирования высвобождения кальцеина AM.
35. Способ по п.33, который также включает мечение клеток одним или несколькими поверхность-специфическими маркерными белками.
36. Способ по п.35, где указанными поверхностными маркерными белками являются CD62L, CXCR3, CCR4 или CCR7.
37. Способ по п.33, который также включает выделение эффекторной клетки из одной или нескольких микролунок.
38. Способ по п.37, где указанный способ также включает культивирование выделенных клеток до достижения клональной амплификации указанных выделенных клеток.
39. Способ по п.37, где указанный способ также включает характеристику экспрессии одного или нескольких генов в указанной выделенной клетке.
+
40. Способ по п.33, где указанными клетками являются CD8-цитотоксические Т-клетки (CTL), природные киллеры (NK), NK-T-клетки или γδ-Т-клетки.
41. Способ по п.33, где указанный индивидуум имеет инфекцию в острой стадии, проходит высокоинтенсивную антиретровирусную терапию (HAART) или является «элит-контроллером».
42. Способ оценки природного иммунного ответа у индивидуума с ВИЧ-инфекцией, где способ включает:
получение суспензии NK-клеток, взятых у индивидуума и нанесенных на сформованную пластину, содержащую по меньшей мере одну микролунку в микролуночном массиве, где указанный индивидуум инфицирован или, вероятно, инфицирован ВИЧ, и где по меньшей мере одна микролунка в указанном микролуночном массиве имеет отдельную клетку;
приведение в контакт микролуночного массива с субстратом, где субстрат предварительно обрабатывают по меньшей мере одним средством для детектирования NK-клеток;
детектирование указанного средства; и тем самым
оценку указанного природного иммунного ответа.
43. Способ по п.42, где указанные NK-клетки детектируют с использованием NKp46-Cy3, CD107a-Alexa647 и/или CD69-Alexa488.
44. Способ по п.32, где указанные клетки совместно культивируют перед их нанесением на сформованную пластину.
45. Способ по п.44, где указанные клетки совместно культивируют с IL-12 и IL-18.
46. Способ по п.45, где указанное средство для детектирования NK-клеток позволяет детектировать NK-клетки.
47. Способ оценки клонального разнообразия популяции NK-клеток, где способ включает:
получение суспензии NK-клеток и клеток-мишеней, взятых у индивидуума и нанесенных на сформованную пластину, содержащую по меньшей мере одну микролунку в микролуночном массиве, где по меньшей мере одна микролунка в указанном микролуночном массиве имеет отдельную эффекторную клетку;
культивирование указанной суспензии в условиях, позволяющих осуществлять лизис указанной клетки-мишени указанными NK-клетками;
детектирование лизиса указанных клеток-мишеней указанными эффекторными клетками; и
идентификацию указанных эффекторных клеток; и тем самым
оценку клонального разнообразия указанной популяции NK-клеток.
48. Способ по п.41, который также включает выделение эффекторных клеток, лизирующих указанную клетку-мишень.
49. Способ по п.48, который также включает культивирование указанных выделенных клеток.
50. Способ по п.47, который также включает культивирование NK-клеток, которые лизируют указанную клетку-мишень.
51. Способ по п.47, где указанные NK-клетки и клетки-мишени смешивают перед введением клеток в указанную микролунку.
52. Способ по п.47, где указанные NK-клетки и клетки-мишени смешивают после введения клеток в указанную микролунку.
53. Способ по п.47, где лизис клеток-мишеней определяют путем мониторинга изменения интенсивности флуоресценции меченой клетки.
54. Способ по п.47, который также включает приведение в контакт микролуночного массива с субстратом, где указанный субстрат предварительно обрабатывают по меньшей мере одним средством, которое позволяет специфически детектировать продукт указанных NK-клеток; и
детектирование указанного средства.
55. Способ по п.54, где указанным средством является антитело, цитокин или растворимый медиатор лизиса.
56. Способ по п.55, где указанным цитокином является TNF-α или IFN-γ.
57. Способ оценки клонального разнообразия популяции NK-клеток и В-клеток, где способ включает:
+
получение клеточной суспензии, содержащей повышенное количество ВИЧ-инфицированных CD4-T-клеток, активированных NK-клеток, В-клеток и клеток-мишеней, где указанную суспензию наносят на сформованную пластину, содержащую по меньшей мере одну микролунку в микролуночном массиве, где указанная по меньшей мере одна микролунка в указанном микролуночном массиве имеет отдельную Т-клетку;
культивирование клеток в условиях, позволяющих антителам, продуцируемым В-клетками, связываться с поверхностью Т-клеток;
идентификацию лунок, содержащих В-клетки, NK-клетки и лизированные Т-клетки, и
идентификацию В-клеток или NK-клеток.
58. Способ по п.57, где указанные NK-клетки активируют IL-2.
59. Способ по п.57, где указанные В-клетки активируют CD40L или анти-BCR антителом.
60. Способ по п.57, где В-клетки активируют CD40L и анти-BCR антителом.
61. Способ по п.57, где указанные NK-клетки активируют IL-2.
62. Способ по п.57, где указанные В-клетки активируют CD40L или анти-BCR антителом.
63. Способ по п.57, где указанный способ также включает:
выделение В-клеток или NK-клеток из указанной лунки; и
характеристику одного или нескольких свойств указанных В-клеток.
64. Способ по п.63, где указанный способ включает характеризацию генов антитела в указанных В-клетках.
65. Способ по п.64, где указанный способ включает анализ области VDJ генов, кодирующих антитела в указанных В-клетках.
66. Способ по п.57, где указанный способ включает приведение в контакт микролуночного массива с субстратом в условиях, стимулирующих связывание антител, продуцируемых В-клетками, с указанным субстратом.
67. Способ по п.57, где указанный способ включает приведение в контакт указанного субстрата с лизатами ВИЧ-инфицированных клеток, и
идентификацию лунок с В-клетками, продуцирующими антитела, которые связываются с указанным ВИЧ-лизатом, или анти-IgG3 антитело.
68. Способ по п.67, включающий идентификацию лунок с В-клетками, продуцирующими антитела, которые связываются с указанным ВИЧ-лизатом, или анти-IgG3 антитело.