СПОСОБЫ И АППАРАТЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
METHODS AND DEVICES FOR PREPARING CELL POPULATIONS FOR CELL THERAPY

[0001] Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/183273, поданной 23 июня 2015 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Уровень техники
Область техники
[0002] Варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам и аппарату для подготовки клеточных популяций для улучшения их характеристик для применения в качестве терапевтических агентов. В частности, варианты реализации настоящего изобретения относятся к аппарату и способу для подготовки стволовых клеток путем приложения к стволовым клеткам регулируемого напряжения сдвига вдоль границы проточной камеры, в которой находятся стволовые клетки.
Предшествующий уровень техники
[0003] Специфические в отношении линии дифференцированные клеточные популяции рассматриваются с точки зрения их применения в клеточной заместительной терапии для пациентов с заболеваниями или расстройствами. Клеточные популяции, которые сохраняют способность дифференцироваться в специализированные типы клеток (стволовые клетки) и/или секретировать определенные факторы, рассматривали с точки зрения их применения в клеточной терапии для пациентов с различными заболеваниями или расстройствами.
[0004] Считается, что исследовательские и технологические наработки, связанные с направленной дифференцировкой стволовых клеток могут обеспечить лечение многих заболеваний и расстройств. Однако все еще остается потребность в возможности получать достаточные донорные популяции клеток, которые являются надежно подготовленными так, чтобы их терапевтическая активность была прогнозируема Представленные способы и аппарат обеспечивают решение этих проблем и, таким образом, облегчают применение клеток в качестве клеточных терапевтических средств или в качестве источника растворимых факторов.
[0005] Биореактор представляет собой устройство, в котором компоненты биологического материала, такие как содержащие стволовые клетки жидкости, могут быть подготовлены путем управления факторами, которые оказывают влияние на эти материалы. На состояние содержащей стволовые клетки жидкости влияют многие факторы, включая рН, содержание отходов, содержание питательных веществ и тип и концентрацию растворенных газов, таких как, например, кислород. Эти факторы вцелом можно называть химическими факторами, которые влияют на состояние стволовых клеток в содержащей стволовые клетки жидкости.
[0006] Биореактор может обеспечивать возможность управления состоянием содержащих стволовые клетки жидкостей путем контролирования нехимических факторов. Традиционные аппараты и способы подготовки клеточных популяций для традиционной клеточной терапии не могут обеспечить точный контроль механического воздействия (?) на клетки, предназначенные для кондиционирования. Следовательно, необходимы аппараты и способы для контролируемого приложения напряжения сдвига к клеткам, предназначенным для подготовки, в проточной камере биореактора с возможностью осуществления производства клеток в больших объемах.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Варианты реализации настоящего изобретения включают аппарат, который обеспечивает возможность контроля по меньшей мере одного механического фактора, который влияет на состояние содержащих стволовые клетки жидкостей. В частности, варианты реализации настоящего изобретения включают аппарат, который обеспечивает возможность контроля уровня напряжения сдвига, прикладываемого к стволовым клетками в содержащей стволовые клетки жидкости. Варианты реализации настоящего изобретения можно применять для пропускания жидкой среды через одну или более проточных камер, сформированных так, чтобы обеспечивать очень высокое соотношение между периметром граничного слоя потока и площадью поперечного сечения потока, чтобы таким образом сделать максимальным действие механических сил (сдвига) на стволовые клетки, прикрепившиесяе к камерам.
2=
[0008] Очень высокое значение периметра граничного слоя потока для соответствующей площади поперечного сечения потока рассчитывают для заданного проточного канала, деля периметр проточной камеры на площадь поперечного сечения потока. Например, круговой канал обеспечивает минимальный достижимый периметр граничного слоя потока для соответствующей площади поперечного сечения потока, который рассчитывается как: 2πr ÷ πr2/r. Следовательно, канал, характеризующийся минимальным соотношением между периметром и площадью поперечного сечения потока, в общем случае обеспечивает минимальное напряжение сдвига, сообщаемое жидкости, когда она протекает через канал, то же самое относится ко всем остальным факторам (режиму турбулентного или ламинарного потока, шероховатости поверхности и т. д.).
[0009] Максимальное значение периметра граничного слоя потока для соответствующей площади поперечного сечения потока обеспечивается, например, бесконечно широким и бесконечно тонким каналом, для которого достижимое значение периметра граничного слоя потока для соответствующей площади поперечного сечения потока теоретически приближается к ∞. Конечно, бесконечно широкий и бесконечно узкий канал является непрактичным, так как он будет оказывать бесконечное сопротивление потоку, но очень высокое значение периметра граничного слоя потока для соответствующей площади поперечного сечения потока достигают, обеспечивая широкие, но тонкие каналы для стимуляции приложения сдвига вдоль периметра граничного слоя потока к переместившейся туда содержащей стволовые клетки жидкости.
[0010] В одном варианте реализации аппарата согласно настоящему изобретению предложен аппарат, содержащий первую крышку, имеющую первый конец, второй конец, стенку между ними, соединитель для впуска жидкости со стороны первого конца, вертикальный канал со стороны первого конца и питающий канал, идущий от соединителя для впуска жидкости к вертикальному каналу для обеспечения жидкостного сообщения между вертикальным каналом и соединителем для впуска жидкости, вторую крышку, имеющую первый конец, второй конец, стенку между ними, соединитель для выпуска жидкости со стороны второго конца, вертикальный канал со стороны второго конца и сливной канал, идущий от вертикального канала к соединителю для выпуска жидкости для обеспечения жидкостного сообщения между вертикальным каналом и соединителем для впуска жидкости, и по меньшей мере один промежуточный модуль, расположенный между стенкой первой крышки и стенкой второй крышки и находящийся в герметичном соединении с каждой из первой крышки и второй крышки после сборки аппарата, при этом каждый промежуточный модуль включает в себя рамку, имеющую первый конец, второй конец, барьер между ними с первой стороной, обращенной к стенке первой крышки, и второй стороной, обращенной к стенке второй крышки, причем барьер расположен в середине рамки и между первым концом и вторым концом с образованием первой проточной камеры между стенкой первой крышки и барьером промежуточного модуля после герметичного соединения уплотнительной поверхности первой крышки с уплотнительной поверхностью первой стороны промежуточного модуля и также с образованием второй проточной камеры между стенкой второй крышки и барьером промежуточного модуля после герметичного соединения уплотнительной поверхности второй крышки с уплотнительной поверхностью второй стороны промежуточного модуля с уплотнительной поверхностью второй крышки с промежуточным модулем, модульный питающий канал в рамке со стороны первого конца промежуточного модуля для герметичного соединения вертикального канала первой крышки после сборки аппарата, распределительный канал в рамке со стороны первого конца промежуточного модуля и находящийся в жидкостном сообщении с модульным питающим каналом для распределения потока жидкости, поступающей в распределительный канал из модульного питающего канала, несколько впускных отверстий проточной камеры, расположенных со стороны первого конца промежуточного модуля и находящихся в жидкостном сообщении с распределительным каналом для введения потока жидкости, поступающей в первую и вторую проточные камеры, несколько сливных отверстий проточной камеры, расположенных со стороны второго конца промежуточного модуля и находящихся в жидкостном сообщении с первой и второй проточными камерами, собирающий канал, расположенный вдоль второго конца промежуточного модуля и находящийся в жидкостном сообщении с первой и второй проточными камерами посредством сливных отверстий проточных камер, модульный сливной канал со стороны второго конца промежуточного модуля и находящийся в жидкостном сообщении с собирающим каналом и предназначенный для герметичного соединения вертикального канала второй крышки после сборки аппарата, причем после сборки аппарата с одним или более промежуточными модулями, расположенными между первой крышкой и второй крышкой для герметичного соединения первой стороны уплотнительной поверхности на одном или более промежуточных модулях с уплотнительной поверхностью на первой крышке и также для герметичного соединения второй стороны уплотнительной поверхности на одном или более промежуточных модулях с уплотнительной поверхностью на второй крышке, обеспечивается герметичное соединение соединителя для впуска жидкости первой крышки с соединителем для выпуска жидкости на второй крышке для обеспечения раздвоенного пути жидкости, который включает первую проточную камеру, расположенную между по меньшей мере некоторыми из нескольких питающих отверстий проточной камеры и по меньшей мере некоторыми из нескольких сливных отверстий проточной камеры и между по меньшей мере одной первой стороной промежуточного модуля и первой крышкой, и вторую проточную камеру, расположенную между по меньшей мере некоторыми из нескольких питающих отверстий проточной камеры и по меньшей мере некоторыми из нескольких сливных отверстий проточной камеры и между по меньшей мере одной второй стороной промежуточного модуля и второй крышкой, при этом несколько питающих отверстий проточной камеры, распределенных вдоль распределительного канала, и несколько сливных отверстий проточной камеры, распределенных вдоль собирающего канала промежуточного модуля, обеспечивают более равномерную локализованную скорость жидкости в пределах проточных камер после обеспечения градиента давления жидкости на соединителе для впуска жидкости и соединителе для выпуска жидкости аппарата, причем соотношение между периметром первой проточной камеры и площадью поперечного сечения первой проточной камеры превышает.
[0011] Определенные варианты реализации изобретения касаются способа получения подготовленной композиции. В контексте данного документа выражение подготовленная композиция относится к композиции, которая была подвергнута подготовительному воздействию механических сил. Например, механической силой может быть приложение контролируемого напряжения сдвига с силой, достаточной для получения подготовленной композиции. В некоторых аспектах подготовленная композиция содержит популяцию подготовленных плюрипотентных клеток (например, МСК). Таким образом, некоторые аспекты касаются выделения популяции подготовленных плюрипотентных клеток. В дополнительных аспектах подготовленная композиция представляет собой среду (например, бесклеточную среду), содержащую секретируемые факторы из плюрипотентных клеток, которые были подвергнуты воздействию контролируемого напряжения сдвига.
[0012] Аспекты вариантов реализации изобретения включают культивирование стволовых клеток на субстрате для обеспечения адгезии клеток. В некоторых случаях субстратом является поверхность, которая поддерживает рост стволовых клеток в монослое. Например, в некоторых аспектах поверхность представляет собой пластиковую или стеклянную поверхность, такую как поверхность, покрытая материалами внеклеточного матрикса (например, коллагеном IV, фибронектином, ламинином и/или витронектином). В дополнительных аспектах субстрат можно модифицировать так, чтобы он включал поверхность (или поверхностное покрытие) с повышенной или пониженной поверхностной энергией. Примеры низкоэнергетических материалов, которые можно применять в качестве поверхности или поверхностного покрытия, включают, без ограничения, углеводородные полимеры, такие как полиэтилен или полипропилен и нитриды. Например, поверхность или поверхностное покрытие может содержать полигексафторпропилен, политетрафторэтилен, поли(винилиденфторид), поли(хлортрифторэтилен), полиэтилен, полипропилен, поли(метилметакрилат) -ПММА, полистирол, полиамид, нейлон-6,6, поли(винилхлорид), поли(винилиденхлорид), поли(этилентерефталат), эпоксидные соединения (например, упрочненный или отвержденный аминами каучук), фенол-резорциновую смолу, карбамидоформальдегидную смолу, бутадиен-стирольный каучук, бутадиен-акрилонитрильный каучук и/или армированный углеродным волокном пластик. Примеры высокоэнергетических материалов, которые можно применять в качестве поверхности или поверхностного покрытия, включают, без ограничения, металлы и оксиды. Например, поверхность или поверхностное покрытие может содержать оксид алюминия, оксид бериллия, медь, графит, оксид железа (Fe 2O 3), свинец, ртуть, слюду, никель, платину, диоксид кремния - кремнезем - и/или серебро.
[0013] Дополнительные аспекты вариантов реализации изобретения касаются приложения контролируемого напряжения сдвига с силой, достаточной для получения подготовленной композиции. В определенных аспектах напряжение сдвига прикладывают в форме жидкостного ламинарного напряжения сдвига. Например, сила напряжения сдвига составляет по меньшей мере около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дин на квадратный сантиметр. В определенных случаях сила напряжения сдвига составляет по меньшей мере 5, 10 или 15 дин на квадратный сантиметр, например, в промежутке около 5-20; 5-15; 10-20 или 10-15 дин на квадратный сантиметр. В некоторых аспектах контролируемое напряжение сдвига прикладывают в течение периода от около 1 минуты до двух дней. Например, контролируемое напряжение сдвига можно прикладывать в течение периода от 5 минут до 24 часов; от 10 минут до 24 часов; от 0,5 часа до 24 часов или от 1 часа до 8 часов. В дополнительных аспектах клетки согласно вариантам реализации изобретения подвергают воздействию повышенного давления.
[0014] В дополнительных аспектах клетки или среду из культуры согласно вариантам реализации изобретения периодически исследуют, чтобы определить уровень подготовки. Например, образец, содержащий клетки или среду, можно отбирать из культуры приблизительно каждые 10 минут, 15 минут, 30 минут или каждый час. Такие образцы можно исследовать, например, чтобы определить уровень экспрессии противовоспалительных факторов, таких как транскрипционные факторы или цитокины. В конкретных аспектах клетки или среду можно отбирать из отверстия для отбора образцов, расположенного в месте более низкого давления жидкости, включая, например, участок вблизи впуска насоса, выполненного с возможностью направлять жидкость через аппарат.
[0015] В определенных аспектах получают исходную популяцию стволовых клеток. Например, исходная популяция стволовых клеток может содержать индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки или мезенхимальные стволовые клетки (МСК). В некоторых аспектах МСК выделены из ткани. Например, в некоторых аспектах ткань включает костный мозг, пуповинную кровь, периферическую кровь, фаллопиеву трубу, эмбриональную печень, легкое, зубную пульпу, плаценту, адипозную ткань или амниотическую жидкость. В дополнительных аспектах клетки являются клетками человека. Например, клетки могут быть аутологичными стволовыми клетками. В некоторых аспектах стволовые клетки являются трансгенными клетками.
[0016] В дополнительных аспектах вариантов реализации изобретения способ получения подготовленной композиции включает пропускание жидкости через стволовые клетки для приложения контролируемого напряжения сдвига. Например, жидкость, пропускаемая через стволовые клетки, может представлять собой клеточную среду для роста. В дополнительных аспектах среда для роста содержит по меньшей мере первый экзогенный цитокин, фактор роста, агонист TLR или стимулятор воспаления. Например, среда для роста может содержать IL1B, TNF-α, IFNγ, поли(I:C), липополисахарид (ЛПС), форболмиристатацетат (ФМА) и/или простагландин. В определенных конкретных аспектах простагландин представляет собой 16,16'-диметилпростагландин E2 (dmPGE2).
[0017] В определенных аспектах подготовленные стволовые клетки согласно вариантам реализации изобретения характеризуются по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 6 раз большей экспрессией противовоспалительного гена по сравнению с исходной популяцией стволовых клеток. Например, противовоспалительный ген может представлять собой TSG-6, PGE-2, COX-2, IL1Ra, HMOX-1, LIF и/или KLF2.
[0018] В дополнительных вариантах реализации изобретения подготовленная композиция содержит композицию подготовленной среды. Таким образом, определенные аспекты касаются выделения подготовленной среды после приложения напряжения сдвига. В некоторых случаях подготовленная среда практически не содержит клеток.
[0019] Дополнительные аспекты вариантов реализации изобретения касаются приложения напряжения сдвига в биореакторе (например, таком как биореактор, подробно описанный в данном документе). В определенных аспектах биореакторная система содержит питающую пластину для впуска жидкости, базовую пластину и несколько промежуточных пластин, расположенных между питающей пластиной для впуска жидкости и базовой пластиной. Например, промежуточная пластина содержит первый конец, второй конец, первую сторону и вторую сторону; распределительный канал со стороны первого конца; и собирающий канал со стороны второго конца. В дополнительных аспектах распределительный канал находится между первой стороной и второй стороной промежуточной пластины. В определенных аспектах собирающий канал находится между первой стороной и второй стороной промежуточной пластины. В некоторых случаях биореакторная система дополнительно содержит резервуар, первую трубку и вторую трубку. В определенных аспектах питающая пластина для впуска жидкости содержит первый впуск для жидкости, первый выпуск для жидкости, второй впуск для жидкости и второй выпуск для жидкости. Например, резервуар соединен с первым впуском для жидкости посредством первой трубки и соединен со вторым выпуском для жидкости посредством второй трубки.
[0020] В дополнительных аспектах вариантов реализации изобретения биореакторная система содержит насос, соединенный с первым выпуском для жидкости и со вторым впуском для жидкости питающей пластины для впуска жидкости. В определенных аспектах насос выполнен с возможностью выкачивать жидкость из резервуара через первый впуск для жидкости и первый выпуск для жидкости и направлять жидкость через второй впуск для жидкости, через несколько промежуточных пластин, из второго выпуска и назад в резервуар. В некоторых аспектах скорость жидкости через второй впуск для жидкости контролируется скоростью вращения ролика насоса. В определенных аспектах биореакторная система обеспечивает высокое соотношение между периметром граничного слоя потока и площадью поперечного сечения потока. В некоторых аспектах биореакторная система может обеспечивать производство клеток в больших объемах. Например, способ получения подготовленной композиции автоматизирован.
[0021] В определенных аспектах вариантов реализации изобретения предложена композиция терапевтически эффективного количества подготовленых стволовых клеток. В некоторых аспектах предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества подготовленных стволовых клеток. Например, клетки могут содержать подготовленную композицию (например, клеточную композицию или подготовленную среду), полученную способом в соответствии с вариантами реализации изобретения. Как продемонстрировано в данном документе, такие подготовленные композиции могут, в некоторых аспектах, обеспечивать повышенную приживаемость стволовых клеток в организме субъекта. Например, в некоторых аспектах субъект имеет хроническое или острое воспаление, болезнь «трансплантат-против-хозяина», неврологическое повреждение (например, ишемическое повреждение, такое как инсульт, или травматическое повреждение головного мозга), скелетно-мышечную травму или аутоиммунное расстройство. В некоторых аспектах подготовленные стволовые клетки вводят в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими агентами.
+
[0022] В дополнительном варианте реализации изобретения предложен способ повышения числа клеток CD105 в костном мозге пациента, включающий введение пациенту эффективного количества стволовых клеток (например, мезенхимальных стволовых клеток). Например, клетки могут содержать подготовленную композицию (например, клеточную композицию или подготовленную среду), полученную способом в соответствии с вариантами реализации изобретения. В некоторых аспектах пациент имеет неврологическое повреждение, такое как ишемическое повреждение (например, от инсульта) или травматическое повреждение головного мозга. В определенных аспектах пациент имел неврологическое повреждение менее чем за 24, 18, 12 или 6 часов до введения клеток.
[0023] В определенных аспектах варианты реализации изобретения касаются введения клеток и/или подготовленых композиций. В некоторых аспектах введение может быть местным, например, в больные или поврежденные ткани или вблизи них. В дополнительных аспектах введение является системным. Например, введение можно осуществлять путем инъекции композиции, такой как внутривенная инъекция.
[0024] Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут понятны из нижеприведенного подробного описания. При этом следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя указывают определенные варианты реализации изобретения, приведены исключительно в качестве иллюстрации, так как после изучения данного подробного описания специалистам в данной области техники станут очевидны различные изменения и модификации, находящиеся в пределах сути и объема данного изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0025] Цели и преимущества представленных способов, системы и аппарата, станут более понятны и более очевидны при рассмотрении в сочетании с нижеприведенным подробным описанием и прилагающимися графическими материалами, которые иллюстрируют, в качестве примера, предпочтительные варианты реализации этой системы и способов.
[0026] На ФИГ. 1 представлена горизонтальная проекция питающей крышки варианта биореактора в соответствии с настоящим изобретением.
[0027] На ФИГ. 2 представлена вертикальная боковая проекция питающей крышки на ФИГ. 1.
[0028] На ФИГ. 3 представлено сечение вертикальной проекции питающей крышки на ФИГ. 1 и 2, взятое по вертикальному каналу.
[0029] На ФИГ. 4 представлен вид с торца питающей крышки на ФИГ. 1-3.
[0030] На ФИГ. 5 представлена горизонтальная проекция промежуточного модуля варианта биореактора в соответствии с настоящим изобретением.
[0031] На ФИГ. 6 представлена вертикальная боковая проекция промежуточного модуля на ФИГ. 5.
[0032] На ФИГ. 7 представлен вид в увеличенном масштабе каналов для жидкости во втором конце вертикальной боковой проекции промежуточного модуля на ФИГ. 6.
[0033] На ФИГ. 8 представлен вид с торца второго конца промежуточного модуля на ФИГ. 5-7.
[0034] На ФИГ. 9 представлена горизонтальная проекция сливной крышки варианта биореактора согласно настоящему изобретению.
[0035] На ФИГ. 10 представлена вертикальная боковая проекция сливной крышки на ФИГ. 10.
[0036] На ФИГ. 11 представлено сечение вертикальной проекции сливной крышки на ФИГ. 10 и 11, взятое по вертикальному каналу.
[0037] На ФИГ. 12 представлен вид с торца сливной крышки на ФИГ. 10-12.
[0038] На ФИГ. 13 представлено сечение вертикальной проекции собранного варианта биореактора согласно настоящему изобретению с раздвоенным путем жидкости, соединяемого с емкостью (не показана), содержащей жидкость, предназначенную для подготовки с применением биореактора, и соединяемого с коллекторной емкостью (не показана) для получения жидкости из биореактора.
[0039] На ФИГ. 14 представлено сечение вертикальной проекции варианта биореактора на ФИГ. 13.
[0040] На ФИГ. 15 представлен вид в перспективе варианта биореактора на ФИГ. 13.
[0041] На ФИГ. 16 представлено изображение в разобранном виде одного варианта реализации системы для приготовления клеток в соответствии с настоящим изобретением.
[0042] На ФИГ. 17 представлен вид в перспективе на собранную систему для приготовления клеток на ФИГ. 16.
[0043] На ФИГ. 18 представлен первый вид в перспективе на систему для приготовления клеток, содержащую несколько модульных аппаратов для приготовления клеток.
[0044] На ФИГ. 19 представлен второй вид в перспективе на систему для приготовления клеток на ФИГ. 18.
[0045] На ФИГ. 20 графики демонстрируют, что индукция транскрипции является сильной для COX2, TSG6, HMOX1 и IL1RN в человеческих МСК, подвергнутых воздействию жидкостного напряжения сдвига. чКМ МСК, человеческие МСК из костного мозга (первые четыре столбца на каждом графике); чАЖ МСК, человеческие МСК из амниотической жидкости (от второго до последнего столбца на каждом графике); чАТ МСК, МСК, полученные из адипозной ткани (последний столбец на каждом графике). Р-значения рассчитаны по парному t-критерию, равные дисперсии.
[0046] На ФИГ. 21 изображены типовые результаты вестерн-блоттинга, показывающие повышенные уровни внутриклеточного белка COX2, которые снижаются антагонистом NF-kB BAY11-7085 (10 мкM).
2
[0047] На ФИГ. 22 изображен анализ супрессии цитокинов TNF-α, который подчеркивает функциональное усиление иммуномодуляции МСК. Человеческие МСК, которые предварительно подвергают воздействию механической силы (напряжения сдвига 15 дин/см а течение 3 ч), помещают в статическую совместную культуру с активированными липополисахаридом (ЛПС) или фитогемагглютинином (ФГА) спленоцитами, включающими макрофаги, нейтрофилы, NK-, B- и T-клетки. Результаты анализа показывают, что секреция TNF-α спленоцитами снижена на 10-50%, когда МСК временно подвергают воздействию указанным напряжением сдвига. Более низкие значения соответствуют большей противовоспалительной эффективности. чКМ МСК, человеческие МСК из костного мозга; чАЖ МСК, человеческие МСК из амниотической жидкости (обозначены «*» на графике); чАТ МСК, МСК, полученные из адипозной ткани (обозначены «^» на графике). Р-значения рассчитаны по парному t-критерию, равные дисперсии.
[0048] На ФИГ. 23 показано, что ингибирование COX2 (индометацин, 10 мкM; NS-398, 10 мкM) и NF-kB (BAY11-7085, 10 мкM) элиминирует положительное действие напряжения сдвига, тогда как эктопический dmPGE2 (10 мкM) имитирует супрессию МСК. Звездочками обозначены значения p<0,001 по сравнению со статическим базовым раствором. n=6 означает шесть разных донорных линий МСК, включенных в приведенные данные.
[0049] На ФИГ. 24 показано, что примирующие агенты дополняют индуцированную сдвигом противовоспалительную сигнализацию. Затемненные столбцы представляют комбинации обработки, которые приводят к значительной индукции этого пути посредством напряжения сдвига и цитокинов (IFN-γ, 20 нг/мл; TNF-α, 50 нг/мл). В этой низкопроизводительной человеческой амниотической линии МСК TSG6 индуцировался только посредством напряжения сдвига. IDO индуцировался только IFN-γ. чАЖ МСК, человеческие МСК из амниотической жидкости.
+
+
+
[0050] На ФИГ. 25A-D показано, что разрушение клеточной композиции костного мозга вследствие травматического повреждения головного мозга у крыс устранимо путем внутривенного введения предварительно обработанных НСС человеческих МСК. (A) Иммунодетекция эндогенных крысиных МСК в костном мозге через 24 часа после травматического повреждения головного мозга ККП выявило истощение популяции CD105 (контрокрашивание получено с помощью ядерного прочного красного). (B) Меньшее количество МСК CD105 присутствует в костном мозге после ККП. (C) CD105 выявляется через 72 часа после повреждения (контрокрашивание гематоксилином). (D) Количественная оценка частоты МСК CD105 через 72 часа после ККП демонстрирует защиту клеточной композиции костного мозга вследствие терапии МСК при внутривенном введении через 24 часа после ККП. Защитное действие на популяцию МСК CD105 усиливается предварительной обработкой НСС применяемых для терапии МСК (однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, ***p<0,001).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0051] При работе с мультипотентными стволовыми клетками, такими как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), контроль результата дифференцировки является важным этапом в разработке клеточной терапии. Получение согласующихся результатов требует точного контроля за окружающей средой клетки, которая включает большое число параметров. Они включают химические факторы, такие как питательные вещества, отходы, рН и растворенные газы. Было разработано и создано большое количество биореакторов, соответствующих уровню техники, для того, чтобы контролировать и отслеживать эти химические параметры.
[0052] Однако механическое окружение также играет существенную роль в результате, касающемся получения стволовых клеток. Механическое окружение зависит от двух основных элементов: подложки и динамического состояния окружающей среды. Жесткость подложки можно контролировать путем тщательной подборки обработки или покрытия поверхности, что может влиять как на адгезию клеток к подложке, так и на результат дифференцировки.
[0053] После прикрепления популяции клеток к подложке их подвергают воздействию механических сил, прикладываемых со стороны среды, в которую погружены клетки. В традиционной клеточной культуре эти силы практически нулевые вследствие отсутствия объемного потока среды. Существующие системы биореакторов имеют постоянный или переменный поток жидкости (среды), но в них отсутствует разработанный контроль профиля потока (ламинарный, в одном или двух направлениях, или турбулентный) или степени сдвигающих сил, которые взаимодействуют с клетками. Движущаяся жидкость создает напряжение сдвига в отношении клеток, которое пропорционально скорости и вязкости жидкости. Большинство исследований механотрансдукции проводили в режиме ламинарного потока, для которого поведение при напряжении сдвига хорошо известно и описывается простыми уравнениями. Ламинарный поток характеризуется неоднородным профилем скорости через поперечное сечение проточного канала. Скорость жидкости на границах (например, у стенок) можно считать нулевой, что известно под названием «условия отсутствия скольжения» или «граничного условия». Простое уравнение, описывающее напряжение сдвига (Ʈ) для Ньютоновских жидкостей в ламинарном потоке, имеет вид Ʈ=-μ (du/dy), где μ - вязкость, а u - скорость жидкости на конкретной глубине в канале. Зная вязкость среды и скорость жидкости, модно рассчитать прикладываемое напряжение сдвига.
[0054] Клеточные популяции, которые сохраняют способность дифференцировать в разные типы клеток (например, стволовые клетки), доказали свою пользу для разработки большого числа специфических в отношении линии дифференцированных клеточных популяций. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются одним из таких типов стволовых клеток и, как известно, являются мультипотентными и самообновляющимися. Таким образом МСК стали кандидатными клеточными терапевтическими средствами и потенциально могут обеспечивать долговременный источник биоактивных иммуномодулирующих молекул. Однако, на данный момент одним из препятствий, ограничивающих клиническую эффективность применения МСК, является то, что индукция функции МСК сильно зависит от наличия цитокинов и сигналов, вырабатываемых активированными иммунными клетками, которые, в свою очередь, инициируют иммуномодулирующую активность МСК. До представленных способов, например, эта вариабельность превращалась в непредсказуемую терапевтическую активность композиций стволовых клеток.
[0055] В некоторых аспектах описанная в данном документе биореакторная система обеспечивает повышенное число стволовых клеток (например, МСК), которые к тому же были прогнозируемо и надежно кондиционированы in vitro в отношении иммуномодулирующей функции. Полученные таким образом стволовые клетки обеспечивают терапевтически эффективные количества МСК, которые являются надежно и соответствующим образом кондиционированными в отношении иммуномодулирующей функции. В других вариантах реализации изобретения указанная система обеспечивает источник секретируемых факторов, которые можно выделять и очищать для применения в качестве терапевтических средств.
[0056] В некоторых вариантах реализации изобретения такие способы могут обеспечивать кондиционированные клетки, такие как МСК, для применения в терапии и, например, при подавлении хронического или острого воспаления, связанного с повреждением (например, неврологическим повреждением), болезнью «трансплант-против-хозяина» и аутоиммунностью. В данном документе было продемонстрировано, что такая кондиционированная композиция обеспечивает повышенную эффективность приживления клеток после введения, что может существенно повысить эффективность терапевтических способов.
[0057] Определенные варианты реализации изобретения включают систему для производства повышенных количеств терапевтически прогнозируемых кондиционированных клеток, таких как, без ограничений, МСК, для применения в клеточной терапии. В некоторых вариантах реализации изобретения описанную систему можно применять, помимо прочего, например для кондиционирования МСК для того, чтобы они проявляли противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства для лечения многих типов скелетно-мышечных травм и воспалительных состояний, когда, например, такие кондиционированные клетки или вырабатываемые ими факторы инъецируют в месте повреждения.
В некоторых вариантах реализации изобретения эта система включает модульную биореакторную систему, которая объединяет контроль гидродинамического окружения и прямое механическое кондиционирование клеток, таких как, без ограничений, МСК.
[0058] Один вариант биореактора применяют для кондиционирования клеток в потоке жидкой среды в соответствии с настоящим изобретением (например, среду пропускают через адгезивные клетки, чтобы обеспечить приложение сдвигающей силы). Один вариант реализации биореактора изображен на прилагаемых фигурах, которые обсуждаются ниже.
[0059] На ФИГ. 1 представлена горизонтальная проекция питающей крышки 12 варианта реализации биореактора. Питающая крышка 12 содержит первый конец 15 и второй конец 18, и стенку 13 между ними. Питающая крышка 12 дополнительно содержит питающий канал 16 (изображено пунктирной линией) со стороны первого конца 15, начинающийся с соединителя для впуска жидкости 11 и заканчивающийся вертикальным каналом 17, проходящим от питающего канала 16 в направлении смотрящего на ФИГ. 1. Короткая часть 19 питающего канала 16 в варианте реализации питающей крышки 12 по ФИГ. 1 повернута перпендикулярно к питающему каналу 16 для подсоединения к вертикальному каналу 17. Питающая крышка 12 включает в себя уплотнительную поверхность 14, окружающую стенку 13. Следует отметить, что на питающей крышке 12 в месте 50 отсутствует второй вертикальный канал. Причина, по которой было отмечено это отсутствие, станет понятна после рассмотрения нижеприведенного описания.
[0060] На ФИГ. 2 представлена вертикальная боковая проекция питающей крышки 12 на ФИГ. 1, на которой видно уплотнитель 16 внутри соединителя для впуска жидкости 11 для герметичного соединения жидкостной трубки (не показана), соединенной с находящимся под давлением источником жидкости. Стрелкой указано место вертикального канала 17 со стороны первого конца 15 питающей крышки 12. Стенка 13 питающей крышки 12 изображена на ФИГ. 2 и 3 на верхней стороне питающей крышки 12 в противоположность внешней части 20 питающей крышки 12, изображенной на нижней стороне питающей крышки 12. Следует понимать, что крышки и модули из вариантов реализации аппарата согласно настоящему изобретению могут быть ориентированы другим образом без потери функциональности.
[0061] На ФИГ. 3 представлено сечение вертикальной проекции питающей крышки 12 на ФИГ. 1 и 2, взятой по вертикальному каналу 17 со стороны первого конца 15 питающей крышки 12. Вертикальный канал 17 получает жидкость из питающего канала 16 и доставляет поток жидкости к одному или более промежуточным модулям (не показанным на ФИГ. 3), по меньшей мере один из которых герметично соединен с уплотнительной поверхностью 14.
[0062] На ФИГ. 4 представлен вид с торца питающей крышки 12 на ФИГ. 1-3. На ФИГ. 4 изображено размещение соединителя для впуска жидкости 11 со стороны первого конца 15 питающей крышки 12, при этом питающий канал 16 проходит от соединителя для впуска жидкости 11 к вертикальному каналу 17. Следует отметить, что соединитель для впуска жидкости 11, питающий канал 16 и вертикальный канал 17 питающей крышки 12 расположены о стороны первого конца 15 питающей крышки 12, и что со стороны второго конца 18 питающей крышки 12 не расположено соответствующих каналов для жидкости.
[0063] На ФИГ. 5 представлена горизонтальная проекция промежуточного модуля 30 варианта биореактора согласно настоящему изобретению, адаптированного для герметичного и функционального соединения питающей крышки 12. Промежуточный модуль 30 содержит первую сторону 31 и вторую сторону 32 (не показано на ФИГ. 5), каждая из которых имеет уплотнительную поверхность 44 для соединения с уплотнительной поверхностью 14 питающей крышки 12. Промежуточный модуль 30 дополнительно включает в себя первый модульный канал 34 через промежуточный модуль 30, находящийся со стороны первого конца 47 промежуточного модуля 30. Модульный канал 34 размещен так, чтобы стыковаться и совпадать с вертикальным каналом 17 питающей крышки 12 на ФИГ. 1-4 после герметичного соединения между уплотнительной поверхностью 44 на первой стороне 31 промежуточного модуля 30 и соответствующей уплотнительной поверхностью 14 питающей крышки 12. Промежуточный модуль 30 дополнительно включает в себя второй модульный канал 134, находящийся со стороны второго конца 48 промежуточного модуля 30 и в позиции, обеспечивающей возможность совпадения и соединения со второй питающей крышкой 12 (вторая питающая крышка 12 может быть идентичной первой питающей крышке 12, но повернута на 180 градусов вокруг оси 60 на ФИГ. 1. Следует понимать, что вторая питающая крышка 12 будет соединять уплотнительную поверхность 44 на второй стороне 32 промежуточного модуля 30, а первая питающая крышка 12 будет соединять уплотнительную поверхность 44 первой стороны 31 промежуточного модуля 30. Следует понимать, что отсутствие второго вертикального канала 17 со стороны второго конца 18 питающей крышки 12 обеспечивает герметизацию уплотнительной поверхностью 14 питающей крышки 12 второго модульного канала 134 промежуточного модуля 30 со стороны второго конца 48 промежуточного модуля 30. Питающая крышка 12 может, в одном варианте реализации аппарата согласно настоящему изобретению, в первом режиме, в котором питающая крышка 12 соединяет первую сторону 31 промежуточного модуля 30 для получения потока жидкости и доставки потока к первому концу 47 промежуточного модуля 30 и, в обратном втором режиме, в котором вторая питающая крышка 112 соединяет вторую сторону 32 промежуточного модуля 30 для получения потока жидкости из нескольких камер для жидкости, включая по меньшей мере первую камеру для жидкости 38A, образуемую между стенкой 13 первой питающей крышки 12 и барьером 39 промежуточного модуля 30 после соединения уплотнительной поверхности 14 первой питающей крышки 12 с уплотнительной поверхностью 44 зеркально расположенной второй питающей крышки 112, и камеру для жидкости 38B, образуемую между стенкой 113 зеркально расположенной второй питающей крышки 112 и барьером 38 промежуточного модуля 30 после соединения уплотнительной поверхности 14 второй питающей крышки 112 с уплотнительной поверхностью 114 зеркально расположенной второй питающей крышки 112. Структура второй питающей крышки 112 дополнительно обсуждается в связи с ФИГ. 9-12.
[0064] Промежуточный модуль 30 на ФИГ. 5 дополнительно включает в себя диффузионный питающий канал 35 со стороны первого конца 47 промежуточного модуля 30, начинающийся от модульного канала 34 и заканчивающийся у распределительного канала 36. Диффузионный питающий канал 35 в общем случае проходит вдалеке от первого модульного канала 34 со стороны первого конца 47 промежуточного модуля 30 до распределительного канала 36. Распределительный канал 36 промежуточного модуля 30 получает поток жидкости из диффузионного питающего канала 35 и проходит от диффузионного канала 35 к первому краю 57 промежуточного модуля 30 и также от диффузионного канала 35 ко второму краю 58 промежуточного модуля 30. Аналогично, промежуточный модуль 30 на ФИГ. 5 дополнительно включает в себя инфузионный сливной канал 135 со стороны второго конца 48 промежуточного модуля 30, начинающийся от инфузионных устройств 133 и заканчивающийся у собирающего канала 136. Инфузионный сливной канал 135 в общем случае проходит вблизи второго модульного канала 134 со стороны второго конца 48 промежуточного модуля 30 к собирающему каналу 136. Собирающий канал 136 промежуточного модуля 30 получает поток жидкости от инфузионных устройств 133 и направляет поток жидкости ко второму модульному каналу 134 через инфузионный сливной канал 135.
[0065] На ФИГ. 6 представлена вертикальная боковая проекция промежуточного модуля 30 на ФИГ. 5, показывающая размещение нескольких жидкостных диффузионных устройств 33, расположенных внутри первой камеры для жидкости 38A, нескольких жидкостных диффузионных устройств 33, расположенных внутри второй камеры для жидкости 38B, нескольких жидкостных инфузионных устройств 133 расположенных внутри первой камеры для жидкости 38A, и нескольких жидкостных инфузионных устройств 133, расположенных внутри второй камеры для жидкости 38B, при этом несколько жидкостных диффузионных устройств 33 находятся со стороны первого конца 47 промежуточного модуля 30, а несколько жидкостных инфузионных устройств 133 находятся со стороны второго конца 48 промежуточного модуля 30. Следует понимать, что в контексте данного документа термин «диффузионное устройство» означает устройство для снижения скорости и повышения статического давления жидкости. Следует понимать, что в контексте данного документа термин «инфузионное устройство» означает устройство для получения потока с низкой скоростью и высоким давлением и преобразования его в поток с большей скоростью и меньшим давлением.
[0066] На ФИГ. 7 представлен вид в увеличенном масштабе нескольких соединенных каналов для жидкости и инфузионных устройств 133 во втором конце 48 вертикальной боковой проекции промежуточного модуля 30 на ФИГ. 6. Следует понимать, что расположение каналов для жидкости в варианте реализации аппарата согласно настоящему изобретению, изображенному на прилагаемых фигурах, может быть реализовано разными путями без материального изменения их функции. На ФИГ. 7 показан промежуточный модуль 30, имеющий проходящий через него второй модульный канал 34. Второй модульный канал 134 находится в жидкостном сообщении с собирающим каналом 136 посредством инфузионного сливного канала 135. Собирающий канал 136 входит в страницу и выходит из страницы с точки зрения смотрящего на ФИГ. 7 для обеспечения жидкостного сообщения между несколькими диффузионными устройствами 133 посредством соответствующих нескольких впускных каналов 137. Жидкость попадает в первую камеру для жидкости 38A и во вторую камеру для жидкости 38B, которые разделены барьером 39, в инфузионные устройства 133, во впускные каналы 137, в собирающий канал 136, в инфузионный сливной канал 135, во второй модульный канал 134. Следует отметить, что на ФИГ. 7 показана часть 40 из нескольких впускных каналов 137, проходящих в первую и вторую камеры для жидкости 38A и 38B.
[0067] На ФИГ. 8 представлен вид с торца промежуточного модуля на ФИГ. 5-7, показывающий расположение инфузионных устройств 133, которые получают поток из первой проточной камеры 38A и второй проточной камеры 38B. Следует понимать, что ФИГ. 8 можно также рассматривать как вид с торца промежуточного модуля 30, показывающий расположение диффузионных устройств 33, которые вносят поток в первую проточную камеру 38A и вторую проточную камеру 38B. На ФИГ. 8 показано пространственное расположение инфузионных устройств 133 (во втором конце 48 промежуточного модуля 30) и диффузионных устройств 33 (в первом конце 47 промежуточного модуля 30).
[0068] На ФИГ. 9 представлена горизонтальная проекция сливной крышки 112 варианта реализации биореактора согласно настоящему изобретению. Сливная крышка 112 содержит первый конец 115 и второй конец 118, и стенку между ними 113. Сливная крышка 112 дополнительно содержит сливной канал 116 (изображен пунктирной линией) со стороны первого конца 115, начинающийся от вертикального канала 117 и заканчивающийся у соединителя для выпуска жидкости 111. Вертикальный канал 117 проходит от сливного канала 116 в направлении смотрящего на ФИГ. 9. Короткая часть 119 сливного канала 116 в варианте реализации сливной крышки 112 на ФИГ. 9 повернута перпендикулярно к сливному каналу 116 для подсоединения к вертикальному каналу 117. Сливная крышка 112 включает в себя уплотнительную поверхность 114, окружающую стенку 113.
[0069] На ФИГ. 10 представлена вертикальная боковая проекция сливной крышки 112 на ФИГ. 9, показывающая уплотнение 116 внутри соединителя для выпуска жидкости 111 для герметичного соединения трубки для жидкости (не показана), соединенной с коллектором, для получения кондиционированной жидкости из биореактора 10. Стрелкой указано расположение вертикального канала 117. Показано, что стенка 113 сливной крышки 112 находится на верхней стороне сливной крышки 112 в противоположность внешней части 120 сливной крышки 112, находящейся на нижней стороне сливной крышки 112. Следует понимать, что крышки и модули из вариантов реализации аппарата согласно настоящему изобретению могут быть ориентированы другим образом без потери функциональности.
[0070] На ФИГ. 11 представлено сечение вертикальной проекции сливной крышки 112 на ФИГ. 9 и 10, взятое по вертикальному каналу 117. Вертикальный канал 117 получает жидкость из первой камеры для жидкости 38A и второй камеры для жидкости 38B посредством второго модульного канала 134 промежуточного модуля 30 (смотрите ФИГ. 5-8) и доставляет поток к сливной крышке 112, имеющей уплотнительную поверхность 114, герметично соединенную с уплотнительной поверхностью 44 первой стороны 31 промежуточного модуля 30.
[0071] На ФИГ. 12 представлен вид с торца сливной крышки 112 на ФИГ. 9-11. На ФИГ. 12 показано расположение соединителя для выпуска жидкости 111 со стороны первого конца 115 сливной крышки 112 и сливного канала 116, идущего от соединителя для выпуска жидкости 111 до вертикального канала 117. Следует отметить, что соединитель для выпуска жидкости 111, сливной канал 116 и вертикальный канал 117 сливной крышки 112 расположены со стороны первого конца 115 сливной крышки 112, и что со стороны второго конца 118 не расположено соответствующих каналов для жидкости.
[0072] На ФИГ. 13 представлен вид в перспективе собранного варианта биореактора 10 согласно настоящему изобретению со соединителем для впуска жидкости 11 и соединителем для выпуска жидкости 111 питающей крышки 12 и сливной крышки 112 соответственно, не указанными на ФИГ. 13, для того, чтобы лучше показать размещение вертикального канала 17 питающей крышки 12, вертикального канала 117 сливной крышки 112, первого модульного канала, соединяемого с емкостью (не показана), содержащей жидкость, предназначенную для применения в кондиционировании стволовых клеток, находящуюся внутри проточных камер 38A и 38B биореактора 10, и соединителя для выпуска жидкости 111 (не показан), соединяемого с емкостью для получения кондиционированной жидкости из биореактора.
[0073] Следует понимать, что собранный вариант биореактора 10, показанный на ФИГ. 13 содержит питающую крышку 12, сливную крышку 112 и промежуточный модуль 30 между ними. Также следует понимать, что скорость и направление потока жидкости через вариант биореактора 10 зависит от разницы в давлении (разницы между давлением во соединителе для впуска жидкости 11 и давлением в соединителе для выпуска жидкости 111), сопротивления потоку жидкости в объеме биореактора 10, вязкости жидкости и других факторов. Питающая крышка 12, промежуточный модуль 30 и сливная крышка 112 могут быть защищены в собранной конфигурации варианта биореактора 10 на ФИГ. 13 различными способами, включая применение зажимов, ремней, лент и т. д.
[0074] В альтернативном варианте питающая крышка 12, промежуточный модуль 30 и сливная крышка 112 могут быть защищены в собранной конфигурации варианта биореактора 10 на ФИГ. 13 посредством обеспечения питающей крышки 12, сливной крышки 112 и промежуточного модуля 30, имеющих встроенные или подсоединенные магнитные элементы, ориентированные для взаимного притяжения. На ФИГ. 14 и 15 показан вариант реализации биореактора 10, имеющего несколько редкоземельных магнитов 49, встроенных в нескольких позициях вдоль периметра питающей крышки 12, а соответствующие несколько редкоземельных магнитов могут быть встроены в упорядоченных позициях вдоль периметра сливной крышки 112.
[0075] Согласно ФИГ. 16 и 17 другой вариант реализации биореактора 200 показан в перспективном и в разобранном виде соответственно. В целях ясности не все элементы на каждой фигуре обозначены цифрами. Вариант биореактора 200 содержит питающую пластину для впуска жидкости 212, несколько промежуточных модульных пластин 232 и базовую модульную пластину 234. Каждая промежуточная модульная пластина 232 содержит первый конец 233, второй конец 235, первую сторону 273 и вторую сторону 275. Кроме того, промежуточные модульные пластины 232 установлены вертикально одна за другой между питающей пластиной для впуска жидкости 212 и базовой модульной пластиной 234.
[0076] Как показано на ФИГ. 18 и 19, вариант биореактора 200 может быть собран как компонент модульного аппарата для подготовки клеток 300. В варианте реализации, показанном на ФИГ. 18 и 19, несколько модульных аппаратов для подготовки клеток 300 собраны как компоненты в системе для подготовки клеток 400. Система для подготовки клеток 400 содержит базу 450, выполненную с возможностью поддерживать несколько модульных аппаратов для подготовки клеток 300. В показанном варианте реализации каждая система для подготовки клеток содержит вариант биореактора 200, резервуар 220, первый корпус 271, второй корпус 272 и насос 250. Резервуар 220 находится в жидкостном сообщении с вариантом биореактора 200 посредством подающей трубки 215 и обратной трубки 225.
[0077] Согласно ФИГ. 16 и 17 вариант биореактора 200 содержит питающую пластину для впуска жидкости 212 с центральным каналом 217, имеющим первый впуск для жидкости 211 и первый выпуск для жидкости 221. Питающая пластина для впуска 212 также содержит второй впуск для жидкости 231 и второй выпуск для жидкости 241. Как показано на ФИГ. 18 и 19, первый впуск для жидкости 211 и второй выпуск для жидкости 241 могут быть соединены с резервуаром 220, тогда как первый выпуск для жидкости 221 и второй впуск для жидкости 231 могут быть соединены с насосом 250. В определенных вариантах реализации изобретения насос 250 может быть выполнен в виде роллерного (например, перистальтического) насоса. Насос 250 содержит ролик 252 и сжимаемую трубку 254. Во время работы ролик 252 вращается электродвигателем 260. Жидкость из резервуара 220 перекачивается через трубку 215 в первый впуск для жидкости 211, через центральный канал 217 и первый выпуск для жидкости 221 в сжимаемую трубку 254. Затем жидкость направляется во второй впуск для жидкости 231 и к распределительному отверстию 238, находящемуся в жидкостном сообщении с промежуточными модульными пластинами 232.
[0078] Каждая из промежуточных модульных пластин 232 содержит впускное отверстие 237, находящееся в жидкостном сообщении с распределительным отверстием 238. Каждая промежуточная модульная пластина 232 дополнительно содержит распределительный канал 253, находящийся в жидкостном сообщении с впускным отверстием 237. Каждый распределительный канал 253 и впускное отверстие 237 находятся со стороны первого конца 233 промежуточной модульной пластины 232. Каждый распределительный канал 253 проходит через культуральную пластину 239 и распределяет жидкость по культуральной пластине 239. После протекания через культуральную пластину 239 жидкость собирается собирающим каналом 263, который находится в жидкостном сообщении с возвратным отверстием 261 в каждой промежуточной модульной пластине 232. Собирающий канал 263 и возвратное отверстие 261 находятся со стороны второго конца 235 промежуточной модульной пластины 232. Соответственно, жидкость должна протекать через культуральную пластину 239, чтобы попасть в собирающий канал 263. Возвратные отверстия 261 также находятся в жидкостном сообщении со вторым выпуском для жидкости 241, который находится в жидкостном сообщении с резервуаром 220 посредством обратной трубки 225.
[0079] Поток жидкости через культуральные пластины 239 из распределительных каналов 253 к собирающим каналам 263 подвергает клетки на культуральных пластинах 239 воздействию напряжения сдвига. Возможность повторной циркуляции жидкости из резервуара 220 и через вариант биореактора 200 (включая некоторое количество промежуточных модульных пластин 232 и культуральных пластин 239) с помощью насоса 250 обеспечивает возможность приложения напряжения сдвига в течение длительных (теоретически неограниченных) периодов времени.
[0080] В типовых вариантах реализации изобретения желательно контролировать величину напряжения сдвига, прикладываемого к клеткам на культуральных пластинах 239, на равномерном уровне и свести к минимуму разницу в прикладываемом напряжении сдвига в разных местах культуральных пластин 239. Одним из факторов при поддержании равномерно прикладываемого к клеткам напряжения сдвига является скорость жидкой среды относительно клеток и культуральной пластины 239. Снижение вариаций в скорости жидкости может помочь поддерживать более равномерно прикладываемое напряжение сдвига. Как показано на ФИГ. 16, распределительные каналы 253 и собирающие каналы 263 идут практически через всю ширину W поверхности промежуточной модульной пластины 232 (например, расстояние между первой стороной 273 и второй стороной 275 промежуточной модульной пластины 232). В определенных вариантах реализации изобретения длина L распределительных каналов 253 и собирающих каналов 263 (например, расстояние между каждым концом каналов, измеренное параллельно W промежуточной модульной пластины 232) проходит через большую часть ширины W промежуточной модульной пластины 232. В конкретных вариантах реализации изобретения длина L составляет по меньшей мере 70 процентов, 75 процентов, 80 процентов, 85 процентов, 90 процентов или 95 процентов ширины W. Эта конфигурация может обеспечить более равномерную скорость жидкой среды через культуральные пластины 239 по сравнению, например, с впускными и выпускными отверстиями, которые не проходят через большую часть культуральных пластин 239. Клетки, прикрепленные к культуральным пластинам 239, в свою очередь будут подвергаться воздействию более равномерного напряжения сдвига.
[0081] Уровень напряжения сдвига, прикладываемого к клеткам, также можно контролировать путем подбора различных рабочих параметров. Например, давление, прикладываемое к жидкости с помощью насоса 250, можно менять, подбирая степень, до которой ролик 252 сжимает сжимаемую трубку 254. Объем и скорость жидкости, протекающей через культуральные пластины 239, также можно подбирать, меняя скорость электродвигателя 260, который в свою очередь меняет скорость вращения ролика 252. Дополнительный контроль можно осуществлять, выбирая конкретные размеры и геометрию компонентов, включая, но не ограничиваясь этим, обработку поверхности (например, шероховатость), длину и ширину культуральных пластин 239, а также расстояние между промежуточными модульными пластинами 232.
[0082] Кроме того, применение нескольких промежуточных модульных пластин 232 с культуральными пластинами 239 в вертикальном расположении одна за другой позволяет подвергать воздействию напряжения сдвига большее число клеток. Кроме того, применение нескольких аппаратов для подготовки клеток 300, работающих параллельно в системе для подготовки клеток 400, может дополнительно увеличить число подвергаемых воздействию напряжения сдвига клеток в препарате для дополнительной обработки или анализа.
[0083] В определенных вариантах реализации изобретения модульный аппарат для подготовки клеток 300 (работающий индивидуально или как компонент системы для подготовки клеток 400) может работать так, чтобы осуществлять контроль гидродинамического микроокружения для управления механотрансдукционным кондиционированием клеток, таких как, без ограничений, МСК, контролируемым образом. В качестве примера, приведенные в данном документе исследования демонстрируют, что описанные способы и аппарат кондиционируют клеточные популяции, включая, например, МСК, подвергая их однородному и контролируемому напряжению сдвига, что необходимо для кондиционирования таких клеток, чтобы они проявляли конкретный тип активности, включая, но не ограничиваясь этим, индукцию и высвобождение иммуномодулирующих факторов.
[0084] Приведенные ниже в примерах исследования демонстрируют способы, в которых культуры человеческих клеток, например, МСК, подвергают воздействию напряжения сдвига такого типа, который схож с обеспечиваемым представленным аппаратом, однако применяя менее гибкую систему, применяя устройство, которое является намного более ограниченным и менее препаративным в отношении масштаба возможностей приложения напряжения сдвига. Однако эти исследования показывают, что напряжение сдвига можно использовать для кондиционирования клеток, чтобы они проявляли конкретный тип активности, такой как, без ограничений, индукция и высвобождение иммуномодулирующих факторов.
[0085] Представленные в данном документе результаты демонстрируют, что функциональные МСК можно напрямую кондиционировать, чтобы они экспрессировали и вырабатывали противовоспалительные и иммуномодулирующие факторы. В контексте клеточной терапии эта техника обещает обеспечить облегчение пациентам, пораженным или подверженным риску воспаления, связанного с повреждением или заболеванием. Это свидетельствует о том, что кондиционирование МСК с применением напряжения сдвига такого типа, который обеспечивает представленная система, существенно повышает их способность ингибировать воспалительные клетки в предсуществующем воспалительном окружении и может помочь в предотвращении и решении проблемы воспаления.
[0086] Кроме того, при применении описанной в данном документе системы кондиционирование может быть завершено быстрее, равномернее и надежнее, чем при применении альтернативных доступных способов индукции клеточной иммуномодулирующей активности МСК, включая, например, выработку противовоспалительных молекул. Описанная система для кондиционирования клеток может иметь исключительное преимущество, когда в качестве терапевтического средства предполагается использовать собственные (аутологичные) клетки субъекта и требуется способ для размножения и кондиционирования клеток.
[0087] В отсутствие кондиционирования наивные МСК экспрессируют небольшое количество или не экспрессируют ключевые медиаторы иммуносупрессии, такие как многофункциональные противовоспалительные белки, стимулируемый TNF-α белок 6 (TSG-6), простагландин E2 (PGE2) и антагонист рецепторов интерлейкина (IL)-1 (IL1RN). Как подробно описано ниже в примерах, было обнаружено, что МСК, полученные из трех источников человеческой ткани, костного мозга, адипозной ткани и амниотической жидкости, чувствительны к этой системе кондиционирования на основании напряжения сдвига так, что активация иммуномодулирующей сигнализации была в разной степени выявляемой. В частности, оценка показала, что кондиционирование человеческих МСК из костного мозга с применением напряжения сдвига такого типа, который обеспечивает представленная система, стимулировало заметную повышающую регуляцию генной экспрессии с 6-120-кратным увеличением в транскрипции генов МСК, кодирующих TSG-6, COX-2, IL1Ra, HMOX-1, LIF и KLF2.
[0088] Типовые варианты реализации изобретения включают способы обеспечения популяции кондиционированных клеток, включающие: получение популяции клеток и применение к клеткам контролируемого напряжения сдвига. Определенные варианты реализации изобретения включают способы обеспечения популяции кондиционированных клеток, включающие: получение популяции клеток; культивирование указанных клеток в клеточной среде; и применение к клеткам контролируемого напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки изначально получают от млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки изначально получают от животного-компаньона. В предпочтительных вариантах реализации изобретения клетки изначально получают от человека. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки изначально получают из костного мозга. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки изначально получают из амниотической жидкости, тогда как в других вариантах реализации изобретения. Тогда как в некоторых вариантах реализации изобретения клетки изначально получают из адипозной ткани. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки, подвергаемые воздействию контролируемого напряжения сдвига, представляют собой МСК.
[0089] В дополнительных вариантах реализации изобретения представлены способы получения терапевтически эффективного количества кондиционированных клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены способы получения терапевтически эффективного количества клеток, кондиционированных с применением описанных в данном документе аппарата и способов. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены способы получения терапевтически эффективного количества клеток, кондиционированных с применением способа, включающего: получение популяции клеток; приложение контролируемого напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования таких клеток, чтобы они действовали желаемым образом. В некоторых других вариантах реализации изобретения представлены способы получения терапевтически эффективного количества клеток, кондиционированных с применением способа, включающего: получение популяции клеток; приложение контролируемого напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования таких клеток, чтобы они действовали желаемым образом. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены способы получения терапевтически эффективного количества клеток, кондиционированных с применением способа, включающего: получение популяции клеток; культивирование клеток на первой культуральной поверхности в клеточной среде таким образом, чтобы клетки прикреплялись к первой культуральной поверхности; и приложение контролируемого напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования таких клеток, чтобы они действовали желаемым образом. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены способы получения терапевтически эффективного количества клеток, кондиционированных с применением способа, включающего: получение популяции клеток; культивирование клеток на культуральной поверхности в клеточной среде таким образом, чтобы клетки прикреплялись к барьеру; и приложение контролируемого напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования таких клеток, чтобы они действовали желаемым образом.
[0090] В сходных вариантах реализации изобретения представлены способы обеспечения популяции кондиционированных клеток, включающие: получение популяции клеток; культивирование клеток в культуральной системе в клеточной среде таким образом, чтобы клетки прикреплялись к барьеру; пропускание клеточной среды через указанные клетки для обеспечения контролируемого жидкостного ламинарного напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования указанных клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения кондиционированные клетки проявляют противовоспалительную активность. В некоторых вариантах реализации изобретения противовоспалительная активность включает повышенную экспрессию генов, выбранных из группы, содержащей гены, кодирующие TSG-6, COX-2, IL1RN, HMOX-1, LIF или KLF2. В некоторых вариантах реализации изобретения активность включает повышенную экспрессию бека COX2 кондиционированными клетками.
[0091] Дополнительные варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие клетки, которые были кондиционированы с применением контролируемого напряжения сдвига в аппарате, описанном в пунктах 1-10. Некоторые варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие клетки, которые были кондиционированы с применением способа, включающего: получение популяции клеток; культивирование указанных клеток в культуральной системе в клеточной среде таким образом, чтобы клетки прикреплялись к барьеру; и приложение жидкостного ламинарного напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования указанных клеток. В сходных вариантах реализации изобретения представлены композиции, содержащие клетки, которые были кондиционированы с применением способа обеспечения популяции кондиционированных клеток, включающего: получение популяции клеток; культивирование клеток в культуральной системе в клеточной среде таким образом, чтобы клетки прикреплялись к барьеру; пропускание клеточной среды через указанные клетки для обеспечения жидкостного ламинарного напряжения сдвига достаточной силы для кондиционирования указанных клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат кондиционированные клетки, которые проявляют противовоспалительную активность. В некоторых вариантах реализации изобретения противовоспалительная активность включает повышенную экспрессию генов, выбранных из группы, содержащей гены, кодирующие TSG-6, COX-2, IL1RN, HMOX-1, LIF или KLF2. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат кондиционированные клетки, которые экспрессируют повышенные уровни белка COX2. В дополнительных вариантах реализации изобретения описанные устройство и способы можно применять для стимуляции экспрессии и высвобождения противовоспалительных факторов, которые можно выделять из среды и применять в качестве терапевтических средств.
[0092] В дополнительных вариантах реализации изобретения представлены способы лечения нуждающегося в таком лечении субъекта клетками, кондиционированными описанными способами. В дополнительных вариантах реализации изобретения представлены способы лечения нуждающегося в таком лечении субъекта, которые могут включать применение факторов, высвобождаемых клетками, кондиционированными описанными способами.
2
3
4
5
6
[0093] В некоторых вариантах реализации изобретения способы лечения субъекта включают, но не ограничиваются этим, получение популяции кондиционированных клеток, полученных в соответствии с описанной системой, и введение клеток нуждающемуся в лечении субъекту. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект нуждается в противовоспалительной терапии, а популяция клеток представляет собой человеческие МСК, чья противовоспалительная активность была индуцирована с помощью описанной системы. В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтическая доза таких клеток может содержать по меньшей мере 1×10, 1×10, 1×10, 1×10 или 1×10 клеток, которые вводят нуждающемуся в терапии субъекту. В некоторых вариантах реализации изобретения противовоспалительную активность популяции кондиционированных клеток можно использовать для лечения острых расстройств, таких как, без ограничений, скелетно-мышечные повреждения, такие как ортопедическое повреждение, повреждение спинного мозга или травматическое повреждение головного мозга.
[0094] Системы для кондиционирования клеточных культур описаны в данном документе в различных вариантах реализации, и следует понимать, что наряду с представленными вариантами реализации можно применять дополнительные способы культивирования и поддержания клеток, как известно специалисту. В определенных вариантах реализации изобретения в отношении культивирования можно использовать различные матричные компоненты для культивирования, поддержания или дифференцировки человеческих стволовых клеток. Кроме тех, что описаны ниже в примерах, для покрытия и культивирования поверхности можно использовать, например, коллаген IV, фибронектин, ламинин и витронектин в комбинации в качестве средств обеспечения твердой подложки для роста плюрипотентных клеток. Также для обеспечения субстрата для культуры клеток и поддержания человеческих плюрипотентных стволовых клеток можно использовать Матригель™. Матригель™ представляет собой желатинообразную белковую смесь, секретируемую мышиными опухолевыми клетками, и доступен на коммерческой основе от BD Biosciences (New Jersey, USA). Смесь напоминает сложную внеклеточную среду, обнаруживаемую во многих тканях, и используется клеточными биологами в качестве субстрата для клеточных культур.
[0095] В некоторых вариантах реализации культивирования клеток после заполнения культурального контейнера (например, до конфлюэнтности) колонию разделяют на агрегированные клетки или даже одиночные клетки любым способом, подходящим для диссоциации, а затем эти клетки помещают в новые культуральные контейнеры для пассирования. Пассирование или разделение клеток представляет собой способ, который обеспечивает возможность выживания и роста клеток в культуральных условиях в течение длительных периодов времени. Как правило, клетки пассируют до достижения около 70%-100% конфлюэнтности.
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
2
3
4
5
6
7
8
[0096] В определенных аспектах исходные клетки для представленной системы кондиционирования могут содержать по меньшей мере или около 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 клеток или любой получаемый из этих значений диапазон. Исходная клеточная популяция может иметь плотность посева, составляющую по меньшей мере или около 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 клеток/мл или любой получаемый из этих значений диапазон.
[0097] В качестве базальной среды, кроме тех, что описаны в примерах ниже, доступен ряд сред, включая определенную среду, такую как базальная среда Игла (BME), BGJb, CMRL 1066, MEM Глазго, улучшенная MEM Zinc Option, среда Дульбекко в модификации Искова (IMDM), среда 199, MEM Игла, αMEM, DMEM, среда Хэма, RPMI 1640 и среда Фишера. Дополнительные примеры сред, которые можно использовать в соответствии с вариантами реализации изобретения, включают, без ограничений, среду Lonza Therapeak (химически определенную), Irvine Scientific Prime-XV (SFM или XSFM), среду для роста МСК PromoCell (DXF), StemCell Technologies Mesencult (ACF) или среду, обогащенную тромбоцитами или лизатами тромбоцитов человека.
[0098] В дополнительных вариантах реализации изобретения среда также может содержать добавки, такие как добавка B-27, инсулин, трансферрин и селеновая добавка (ITS), L-глутамин, ЗАК (заменимые аминокислоты), П/С (пенициллин/стрептомицин), добавка N2 (5 мкг/мл инсулина, 100 мкг/мл трансферрина, 20 нМ прогестерона, 30 нМ селена, 100 мкМ путресцина и β-меркаптоэтанола (β-ME). Подразумевается, что можно добавлять или не добавлять дополнительные факторы, включая, но не ограничиваясь этим, фибронектин, ламинин, гепарин, гепаринсульфат, ретиноевую кислоту.
[0099] Дополнительные факторы можно добавлять в среду для применения в сочетании с напряжением сдвига для создания кондиционированной композиции, такой как популяция кондиционированных клеток. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения до, во время или после биомеханической стимуляции можно применять по меньшей мере один химический модулятор гемопоэза. Примеры дополнительных компонентов, которые можно добавлять в среду, включают, без ограничений, атенолол, дигоксин, доксазозин, доксициклин, фендилин, гидралазин, 13-гидроксиоктадекадиеновую кислоту (13(s)-HODE), ланатозид C, NG-монометил- L-аргинин (L-NMMA), метопролол, нерифолин, никардипин, нифедипин, оксид азота (NO) или агонистов сигнальных путей NO, lH-[1,2,4]оксадиазоло-[4,3-a]хиноксалин-l-он (ODQ), перувозид, пиндолол, пронеталол, синаптосомальный белок (SNAP), нитропруссид натрия, строфантидин, тодралазин, 1,5-пентаметилентетразол, простагландин E 2 (PGE2), сложный метиловый эфир PGE2, сериноламид PGE2, 11-дезокси-16,16-диметил PGE2, 15(R)-15-метил PGE2, 15(S)-15-метил PGE2, 6,16-диметил PGE2, 16,16-диметил PGE2 п-(п-ацетамидобензамидо) сложный фенилэфир, 16-фенилтетранор PGE2, 19(R)-гидрокси PGE2, простагландин B2, простациклин (PGI2, эпопростенол), 4-аминопиридин, 8-бром-cAMP, 9-дезокси-9-метилен PGE2, 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил PGE2, агониста рецептора PGE2, Bapta-AM, бенфотиамин, бикукуллин, (2'Z,3'E)-6-броминдирубин-3'-оксим (BIO), брадикинин, бутапрост, CaylO397, хлортрианизен, хлорпропамид, диазоксид, эйкозатриеновую кислоту, эпоксиэйкозатриеновую кислоту, флурандренолид, форсколин, габоксадол, галламин, инданилоксиуксусную кислоту 94 (IAA 94), имипрамин, кинуреновую кислоту, L-аргинин, линолевую кислоту, LY171883, мидовую кислоту, мебеверин, 12 метоксидодеценовую кислоту, N-формил-Met-Leu-Phe, селективного агониста ЕР2 рецептора простагландина E2 (ONO-AEl -259), перувозид, пимозид, пиндолол, нитропруссид натрия, ванадат натрия, строфантидин, сульпростон, тиабендазол, везамикол, 1,2-дидеканоил-глицерин (10:0), 11,12 эпоксиэйкозатриеновую кислоту, l-гексадецил-2-арахидоноил-глицерин, 5-гидроксидеканоат, 6-формилиндоло [3,2-B] карбазол, анандамид (20:3, n-6), карбациклин, карбамильный фактор активации тромбоцитов (C-PAF) или сложный метиловый эфир S-фарнезил-L-цистеина.
[00100] В дополнительных аспектах среда может содержать один или более факторов роста, таких как представители семейства эпидермальных факторов роста, например, EGF, представители семейства факторов роста фибробластов (FGF), включая FGF2 и/или FGF8, представители семейства тромбоцитарных факторов роста (PDGF), антагонисты семейства трансформирующего фактора роста (TGF)/костного морфогенетического белка (BMP)/фактора роста и дифференцировки (GDF), включая, но не ограничиваясь этим, ноггин, фоллистатин, хордин, гремлин, белки семейства cerberus/DAN, ventropin amnionless, а антагонисты TGF, BMP и GDF также можно добавлять в форме химерных молекул рецептор TGF, BMP и GDF-Fc. Другие факторы, которые можно добавлять или не добавлять, включают молекулы, которые могут активировать или инактивировать сигнализацию посредством семейства рецепторов Notch, включая, но не ограничиваясь этим, белки Delta-подобного и Jagged семейств, а также ингибиторы гамма-секретазы и другие ингибиторы процессинга или расщепления Notch, такие как DAPT. Дополнительные факторы роста могут включать семейство инсулин-подобных факторов роста (IGF), семейство родственных wingless факторов (WNT) и семейство факторов hedgehog.
[00101] В дополнительных аспектах среда может содержать один или более примирующих агентов, таких как воспалительный цитокин, ЛПС, ФГА, поли(I:C) и/или ConA. Дополнительные примирующие агенты, которые можно применять в соответствии с вариантами реализации изобретения, включают подробно описанные в Wagner et al., 2009, которая включена в данный документ посредством ссылки. Дополнительные факторы, которые можно добавлять непосредственно в дополнительную среду для дифференцировки, чтобы стимулировать пролиферацию и выживаемость предшественников клеток, а также самообновление и дифференцировку, включают, но не ограничиваются этим, диметилпростагландин Е2, илопрост и другие аналогичные продукты метаболизма арахидоновой кислоты.
[00102] Среда может содержать сыворотку или не содержать сыворотку. Бессывороточная среда может относиться к среде, не содержащей непроцессированную или неочищенную сыворотку и, соответственно, может включать среды с очищенными компонентами, полученными из крови, или компонентами, полученными из организма животного (такими как факторы роста). С точки зрения предотвращения загрязнения гетерогенными компонентами животного происхождения сыворотка может быть получена от того же животного, что и клетка(и).
[00103] Среда может содержать или не содержать любые альтернативы сыворотке. Альтернативы сыворотке могут включать материалы, которые, соответственно, содержат альбумин (такой как богатый липидами альбумин, заместители альбумина, такие как рекомбинантный альбумин, растительный крахмал, декстраны и гидролизаты белков), трансферрин (или другие переносчики железа), жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, следовые элементы, 2-меркаптоэтанол, 3'-тиоглицерин или их эквиваленты. Альтернативы сыворотке можно получить способом, раскрытым, например, в международной публикации № WO98/30679. В альтернативном варианте для большего удобства можно использовать любые коммерчески доступные материалы. Коммерчески доступные материалы включают нокаутный заменитель сыворотки (KSR), химически определенный липидный концентрат (Gibco) и глутамакс (Gibco).
[00104] Среда также может содержать жирные кислоты или липиды, аминокислоты (такие как заменимые аминокислоты), витамин(ы), факторы роста, цитокины, антиоксиданты, 2-меркаптоэтанол, пировиноградную кислоту, буферные агенты и неорганические соли. Концентрация 2-меркаптоэтанола может составлять, например, от около 0,05 до 1,0 мM, и, в частности, от около 0,1 до 0,5 или 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,8, 1, 1,5, 2, 2,5, 5, 7,5, 10 мM, или любые промежуточные значения, но концентрация не ограничена конкретно ими до тех пор, пока она подходит для культивирования стволовых клеток.
[00105] Клетки можно культивировать в объеме, составляющем по меньшей мере или около 0,005, 0,010, 0,015, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 800, 1000, 1500 мл или любой получаемый из этих значений диапазон, в зависимости от потребностей культуры. Биореактор может иметь объем, составляющий по меньшей мере или около 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 литров, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 кубических метров или любой получаемый из этих значений диапазон.
TM
[00106] Культуральная поверхность и камера, образуемые между стенкой 13 питающей крышки 12 и барьером 39 промежуточного модуля 30, когда аппарат находится в собранном виде, могут быть получены с возможностью клеточной адгезии или не зависеть от цели. Культуральная емкость с возможностью клеточной адгезии может быть покрыта подходящим субстратом для адгезии клеток (например, внеклеточным матриксом [ВКМ]) для улучшения адгезивности поверхности емкости и клеток. Субстратом, применяемым для адгезии клеток, может быть любой материал, предназначенный для присоединения стволовых клеток или питающих клеток (в случае их применения). Неограничивающие субстраты для адгезии клеток включают коллаген, желатин, поли-L-лизин, поли-D-лизин, поли-D-орнитин, ламинин, витронектин и фибронектин и их смеси, например, белковые смеси из клеток саркомы мышей Энгельбрета-Хольма-Сварма (такие как Матригель или Гельтрекс) и лизированные препараты клеточных мембран. В конкретных вариантах реализации изобретения культуры содержат матрицу, содержащую поли-L-лизин (или поли-D-лизин) и ламинин.
2
[00107] Другие условия культивирования могут быть соответствующим образом определены. Например, температура культивирования может составлять от около 30 до 40°C, например, по меньшей мере или около 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C, не не ограничивается конкретно этими значениями. Концентрация CO может составлять от около 1 до 10%, например, от около 2 до 7%, или любой получаемый из этих значений диапазон. Давление кислорода может составлять по меньшей мере или около 1, 5, 8, 10, 20% или любой получаемый из этих значений диапазон.
[00108] Выражение практически не содержащий «добавленных извне» компонентов относится к среде, которая не содержит или практически не содержит конкретный компонент из источника, отличного от клеток в среде. Выражение «практически не содержащий» добавленных извне факторов роста или полипептидов, таких как FGF или EGF и т. д., может означать минимальное количество или неопределяемое количество добавленных извне компонентов. Например, среда, практически не содержащая полипептиды FGF или EGF, может содержать менее 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001 нг/мл или любой получаемый из этих значений диапазон.
[00109] В некоторых вариантах реализации изобретения клетки, кондиционированные с помощью описанной системы, имеют множество терапевтических применений. В частности, если клетки являются человеческими МСК, заболевания или расстройства, в отношении которых такие кондиционированные клетки можно применять терапевтически, или, в альтернативном варианте, заболевания или расстройства, в отношении которых применима терапия факторами, выработанными и выделенными из культивируемых клеток, включая, но не ограничиваясь этим, МСК, подвергнутые кондиционированию с помощью описанной системы, включают, но не ограничиваются этим, аутоиммунные расстройства (включая, но не ограничиваясь этим, ревматоидный артрит (РА), системную красную волчанку (СКВ))), болезнь «трансплантат-против-хозяина», болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, нейродегенеративные расстройства, нейрональные дисфункции, расстройства головного мозга, расстройства центральной нервной системы, расстройства периферической нервной системы, неврологические патологические состояния, расстройства памяти и обучения, сердечную аритмию, болезнь Паркинсона, расстройства глаз, повреждение спинного мозга, расстройства, требующие лечения и регенерации нервов, множественный склероз (МС), амиотрофический боковой склероз (АБС), болезнь Паркинсона, инсульт, хроническое или острое повреждение, регенерацию костей, травматическое повреждение головного мозга, ортопедические и спинномозговые патологические состояния, хрящевые, скелетные или мышечные нарушения, остеоартрит, остеонекроз, сердечно-сосудистые заболевания, повреждение кровеносных сосудов, связанное с сердечными припадками или заболеваниями, такими как критическая ишемия конечностей, заболевание периферических артерий, атеросклероз, и заболевания, для которых полезна неоваскуляризация, раны, ожоги и язвы.
[00110] В определенных вариантах реализации изобретения описанную в настоящем документе систему можно применять для кондиционирования клеток и улучшения их иммунных регуляторных свойств. В определенных вариантах реализации изобретения такие композиции можно вводить в комбинации с одним или более дополнительными соединениями или агентами («дополнительными активными агентами») для лечения, ведения и/или предотвращения, помимо прочего, аутоиммунных заболеваний и расстройств. Такие терапевтические средства можно вводить пациенту в терапевтически эффективных дозах для лечения или облегчения, помимо прочего, иммунорегуляторных заболеваний и расстройств.
50
50
50
50
[00111] Токсичность и терапевтическую эффективность таких композиций кондиционированных клеток или факторов можно определить стандартными фармацевтическими способами, используя, например, клеточные культуры или экспериментальных животных, например, для определения LD (дозы, летальной для 50% популяции) и ED (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение между дозами токсического и терапевтического действий называется терапевтическим индексом, выражаемым как соотношение LD/ED. Предпочтительными являются композиции, демонстрирующие высокие терапевтические индексы. Соединения, которые демонстрируют токсические побочные эффекты, можно применять в определенных вариантах реализации изобретения, однако следует позаботиться о том, чтобы разработать системы доставки, которые направляют такие композиции преимущественно в участок пораженной ткани, чтобы свести к минимуму потенциальный вред, наносимый непораженным клеткам, тем самым снижая побочные эффекты.
50
50
[00112] Данные, полученные из анализа клеточных культур и исследований на животных, можно применять для составления ряда дозировок для применения на людях. Дозировки таких композиций предпочтительно лежат в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED со слабой или отсутствующей токсичностью. Дозировка может варьироваться в пределах этого диапазона в зависимости от применяемых дозированной формы и пути введения. Для любой композиции терапевтически эффективную дозу можно изначально оценить по результатам анализа клеточных культур. Доза может быть составлена с применением животных моделей для получения диапазона циркулирующей плазменной концентрации, который включает IC (т. е. концентрацию исследуемой композиции, при которой достигается полумаксимальное ингибирование симптомов) согласно определению в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать, чтобы более точно определить применимые к людям дозы. Плазменные уровни можно измерять, например, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
[00113] Когда предусматривается терапевтическое лечение, помимо прочего, аутоиммунных расстройств, соответствующую дозировку также можно определить, проводя исследования на животных для определения максимальной переносимой дозы или МПД биоактивного агента на килограмм массы исследуемого субъекта. В общем случае, по меньшей мере одним из исследуемых видов животных является млекопитающее. Специалисты в данной области техники регулярно экстраполируют дозы для того, чтобы достичь эффективности и избежать токсичности, на другие виды, включая человека. Перед тем, как проводить исследования эффективности на людях, клинические исследования фазы I помогут установить безопасные дозы.
[00114] Кроме того, биоактивный агент может быть сопряжен или комплексирован с различными хорошо известными композициями или структурами, которые, например, повышают стабильность биоактивного агента или каким-либо другим образом повышают его фармакологические свойства (например, повышают in vivo время полужизни, снижают токсичность и т. д.).
[00115] Клетки, кондиционированные с помощью представленных систем, или факторы, высвобождаемые из таких клеток, и другие подобные терапевтические агенты можно вводить любыми способами, известными специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, введение клеток во время хирургического вмешательства, внутривенную (В.В.), внутрибрюшинную (В.Б.), внутримышечную (В.М.) или интратекальную инъекцию, ингаляцию, подкожное введение (П.К.) или местное применение (трансдермальное применение, мази, кремы, бальзамы, глазные капли и тому подобное).
[00116] В нижеприведенном разделе примеров приведены дополнительные подробности, касающиеся примеров различных вариантов реализации изобретения. Специалистам в данной области техники следует понимать, что ниже представлены способы и/или композиции, открытые авторами изобретения для надлежащего функционирования. Однако в свете настоящего изобретения специалистам в данной области техники следует понимать, что в конкретные раскрытые варианты реализации можно вносить большое количество изменений и получать при этом аналогичные или сходные результаты, не отступая от сути и объема изобретения. Эти примеры являются иллюстрациями раскрытых в данном документе способов и систем и не предназначены для ограничения объема изобретения. Неограничивающие примеры включают, но не ограничиваются этим, представленные ниже.
[00117] В контексте данного документа и если не указано иное, термины «лечить», «лечение» и «терапия» подразумевают действие, происходящее во время, когда пациент страдает от заболевания или расстройства, которое снижает тяжесть одного или более симптомов или действия такого заболевания или расстройства. Так, где это позволяет контекст, термины «лечить» и «лечение» также относятся к действиям, предпринимаемым, чтобы гарантировать, что индивиды, подвергнутые повышенному риску появления заболевания или расстройства, могли получить соответствующее хирургическое и/или другое медицинское вмешательство до появления заболевания или расстройства. В контексте данного документа и если не указано иное, термины «предотвращать» и «предотвращение» подразумевают действие, происходящее до того, как пациент начинает страдать от заболевания или расстройства, которое замедляет появление и/или ингибирует или снижает тяжесть заболевания или расстройства.
[00118] В контексте данного документа и если не указано иное, термины «вести» и «ведение» включают предотвращение, замедление или снижение тяжести повторного появления заболевания или расстройства у пациента, который уже страдал от такого заболевания, расстройства или патологического состояния. Эти термины включают модуляцию порога, развития и/или длительности заболевания или расстройства или изменение ответа пациента на заболевание или расстройство.
[00119] В контексте данного документа и если не указано иное, «терапевтически эффективное количество» клеток, факторов или соединений представляет собой количество, достаточное для обеспечения любой терапевтической пользы при лечении или ведении заболевания или расстройства или для замедления одного или более симптомов, связанных с заболеванием или расстройством. Терапевтически эффективное количество означает количество клеток, факторов или соединений, одних или в комбинации с одним или более другими видами терапии и/или терапевтическими агентами, которое обеспечивает любую терапевтическую пользу при лечении или ведении заболевания или расстройства. Термин «терапевтически эффективное количество» может включать количество, которое снижает интенсивность заболевания или расстройства, улучшает или уменьшает степень заболевания или расстройства, улучшает общую терапию или повышает терапевтическую эффективность другого терапевтического агента.
[00120] В контексте данного документа и если не указано иное, «профилактически эффективное количество» клеток, факторов или соединений представляет собой количество, достаточное для предотвращения или замедления появления заболевания или расстройства или одного или более симптомов, связанных с заболеванием или расстройством, или предотвращает или замедляет их повторное появление. Профилактически эффективное количество клеток, факторов или соединений означает количество клеток, факторов или соединений, одних или в комбинации с одним или более другими лечебными и/или профилактическими агентами, которое обеспечивает профилактическую пользу в отношении предотвращения заболевания или расстройства. Термин «профилактически эффективное количество» может включать количество клеток, факторов или соединений, которое предотвращает заболевание или расстройство, улучшает общую профилактику или повышает профилактическую эффективность другого профилактического агента. «Профилактически эффективное количество» может предписано, например, до появления заболевания или расстройства.
[00121] В контексте данного документа термин «пациент» или «субъект» включает млекопитающих, которые могут страдать от описанного в данном документе заболевания или расстройства, таких как люди и отличные от человека млекопитающие, например, без ограничений, грызуны, мыши, крысы, обезьяны, животные-компаньоны, такие как собаки или кошки, а также сельскохозяйственные животные, например, овцы, коровы, лошади и т. д.
[00122] В контексте данного документа «МСК» -это мезенхимальные стволовые клетки, которые также называются мезенхимальными стромальными клетками.
[00123] В контексте данного документа выражение «контролируемое напряжение сдвига» относится к способности устанавливать величину напряжения сдвига, прикладываемого к клеткам, путем подбора скорости потока среды через поверхность. Напряжение прикладывается равномерно по всей площади поверхности пластины.
[00124] В контексте данного документа термин «кондиционированные клетки» относится к клеткам, которые проявляют дополнительную функциональность в результате воздействия на них напряжения сдвига.
[00125] Подразумевается, что соответствующие структуры, материалы, действия и эквиваленты всех средств или этапов плюс функциональные элементы в нижеприведенной формуле изобретения включают любую структуру, материал или действие для осуществления функции в комбинации с другими заявляемыми элементами, заявленными прямым образом. Описание настоящего изобретения было представлено в целях иллюстрации и описания, но не претендует на то, чтобы быть исчерпывающим или ограничительным в отношении изобретения в раскрытой форме. Для специалистов в данной области техники очевидно существование большого количества модификаций и вариаций, осуществляемых без отступления от объема и сути изобретения. Один из вариантов реализации был выбран и описан, чтобы наилучшим образом объяснить принципы изобретения и практическое применение и чтобы другие специалисты в данной области техники могли понять изобретение в отношении различных вариантов реализации с различными модификациями, которые подходят для конкретного подразумеваемого применения.
[00126] Без дополнительной подготовки считается, что специалист в данной области техники может, используя приведенное в данном документе описание, в полной степени применять представленные способы. Описанные в данном документе варианты реализации изобретения следует воспринимать как иллюстративные, но не как ограничивающие оставшуюся часть изобретения каким-либо образом. Несмотря на то, что были показаны и описаны предпочтительные варианты реализации изобретения, специалистом в данной области техники может быть осуществлено большое количество их вариаций и модификаций без отступления от сути и принципов представленных в настоящем документе способов.
[00127] Соответственно, объем правовой охраны не ограничен приведенным выше описанием, а ограничен исключительно формулой изобретения, включая все эквиваленты заявленного предмета. Описание всех патентов, патентных заявок и публикаций, цитируемых в данном документе, включено в данный документ посредством ссылки в той степени, в которой они соответствуют настоящему изобретению, определенному в данном документе.
ПРИМЕРЫ
[00128] Следующие примеры включены, чтобы продемонстрировать предпочтительные варианты реализации изобретения. Специалистам в данной области техники следует понимать, что способы, раскрытые в нижеприведенных примерах, представляют способы, открытые авторами изобретения для надлежащего функционирования при практической реализации изобретения, и, следовательно, могут считаться предпочтительными способами его практической реализации. Однако в свете настоящего изобретения специалистам в данной области техники следует понимать, что в конкретные раскрытые варианты реализации можно вносить большое количество изменений и получать при этом аналогичные или сходные результаты, не отступая от сути и объема изобретения.
Пример 1

[00129] Проводили пилотное исследование для получения подтверждения, что напряжение сдвига в жидкости можно использовать для кондиционирования стволовых клеток, изменения генной экспрессии и повышения функциональной активности. Чтобы проиллюстрировать кондиционирующую активность напряжения сдвига того типа, который обеспечивает представленная система, но в намного меньшем аналитическом масштабе, прикладывали силу (напряжение сдвига) с помощью специально изготовленных слайдов или мелкомасштабных микрофлюидных канальных слайдов IBIDI, получаемых от IBIDI, LLC. (Verona, WI, USA). Человеческие образцы получали из костного мозга (КМ), амниотической жидкости (АЖ) или адипозной ткани (АТ), обрабатывали для выделения и размножения чМСК и хранили в замороженном виде. Замороженные чМСК размораживали и высевали в колбы для клеточного культивирования T225 с 50 мл минимальной поддерживающей среды (MEM-α) (20% ФБС, 5% пенициллина/стрептомицина, 5% глутамина). Среду меняли каждые 3-4 дня. чМСК поддерживали в культуре до достижения практически 100% конфлюэнтности. Клетки имели фенотип фибробластов. Перед посевом клеток в устройство (микрофлюидный канальный слайд IBIDI или специально изготовленный слайд) для обеспечения жидкостного ламинарного напряжения сдвига, но в намного меньшем масштабе, чем тот, который обеспечивает представленная система, культуральные поверхности предварительно покрывали 100 мкд/мл фибронектина в ФСБ в течение 30-45 мин при 37°C и промывали 2X ФСБ перед посевом клеток и оставляли в инкубаторе в течение 30-45 минут, пока клетки готовили к посеву. Культивируемые чМСК готовили путем удаления среды из колбы T225 с помощью вакуума и стеклянной пипетки Пастера, клетки промывали 1Х ФСБ комнатной температуры, который удаляли путем отсасывания. Добавляли 3 мл 0,25% раствора трипсина и инкубировали колбу при 37°C в течение 5 мин. После инкубации колбу забирали из инкубатора и интенсивно постукивали, чтобы сместить клетки. Колбу исследовали с помощью препаровального микроскопа, чтобы гарантировать, что все клетки отделились и свободно плавают. В этот момент в колбу добавляли 9 мл MEM-α, а весь объем (12 мл) удаляли и помещали в 15 мл коническую пробирку. Пробирку помещали в центрифугу и центрифугировали при 300 RCF (относительная сила центрифугирования) в течение 5 минут при комнатной температуре. Супернатант отсасывали, оставляя небольшое количество среды выше клеточного осадка, добавляли 3 мл MEM-α и ресуспендировали клеточный осадок в этой среде. Число присутствующих живых клеток определяли методом вытеснения трипанового синего. Число живых клеток определяли на гемоцитометре, а клетки ресуспендировали для получения желаемой концентрации для каждого анализа (смотрите Таблицу 1). Каналы IBIDI использовали для обеспечения жидкостного ламинарного напряжения сдвига, аналогичного, но не настолько хорошо контролируемого, чем тип, обеспечиваемый представленной системой. Клетки оставляли на 30-45 минут перед тем, как заполнить лунки 60 мкл среды на лунку (если проходит слишком много времени, среда начнет испарятся из каналов). Клетки оставляли инкубироваться в течении 12-18 часов. Затем трубку подсоединяли к слайду IBIDIв ламинарном боксе с чистым трехходовым запорным краном (все элементы предварительно автоклавировали или стерилизовали EtO, трехходовой запорный кран, необходимый для применения с перистальтическим насосом, можно стерилизовать с помощью EtO или УФ), а затем переносили в инкубатор. В экспериментах с каналом IBIDI происходила рециркуляция общего объема 6 мл, а в экспериментах с более крупным изготовленным слайдом происходила рециркуляция общего объема 50 мл. Перистальтический или Гарвардский шприцевой насос программировали так, чтобы он проталкивал среду через культуральную поверхность при 15 дин/см2. Жидкостное напряжение сдвига прикладывали в течение 3, 6 или 8 часов.
ТАБЛИЦА 1:
Анализ
Концентрация клеток (клеток/мл)
Культуральная платформа
Общий объем в канале
Время воздействия сдвига
кОФ ПЦР
3×10^6
IBIDI
30 мкл
3, 6, 8 часов
Вестерн-блоттинг
3×10^6
IBIDI
30 мкл
8 часов
Анализ связывания NF-kB
2×10^6
Специальный
10 мл
8 часов
In Vivo эксперименты на крысах
2×10^6
Специальный
10 мл
8 часов
Анализ ELISA
2×10^5
IBIDI
30 мкл
3, 8 часов
ИФ-окрашивание
2×10^5
IBIDI
30 мкл
3 часов
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВСЛЕДСТВИЕ ЖИДКОСТНОГО ЛАМИНАРНОГО НАПРЯЖЕНИЯ СДВИГА
2
[00130] Наивные МСК не экспрессируют ключевые медиаторы иммуносупрессии, такие как многофункциональные противовоспалительные белки, такие как стимулируемый TNF-α белок 6 (TSG-6), простагландин E2 (PGE2) и антагонист рецептора интерлейкина (IL)-1 (IL1RN). Было обнаружено, что МСК, полученные из трех источников человеческой ткани, костного мозга, адипозной ткани и амниотической жидкости, в разной степени восприимчивы к напряжению сдвига. Например, напряжение сдвига, прикладываемое с силой 15 дин/см, активировало иммуномодулирующую сигнализацию в МСК, полученных из многих человеческих тканей. Оценка МСК из костного мозга показала, что ламинарное напряжение сдвига стимулировало заметную повышающую регуляцию с 6-120-кратным увеличением в транскрипции генов МСК, кодирующих TSG-6, COX-2, IL1RN, HMOX-1, LIF и KLF2. Смотрите, например (ФИГ. 20).
[00131] Аналогично, с помощью коммерчески доступного анализа ELISA было определено, что среда из культур человеческих МСК, подвергнутых воздействию жидкостного напряжения сдвига, также содержала иммуномодулирующие белки, такие как простагландин E2. Кроме того, вестерн-блот-анализ подтвердил наличие повышенных белковых уровней (трансляции) COX2, TSG6 и IL1RN. В качестве контроля для базовой белковой экспрессии использовали уровни экспрессии белка актина, которые являются постоянными. В этом исследовании было определено, что после воздействия на человеческие МСК (полученные из чКМ, человеческого костного мозга, МСК; чАЖ МСК, МСК из амниотической жидкости; чАТ МСК, МСК, полученные из адипозной ткани) жидкостного напряжения сдвига в течение 8 часов наблюдалось значительное повышение экспрессии белка СОХ2 по сравнению со средой, полученной от МСК, которые не подвергались воздействию жидкостного напряжения сдвига. Также было определено, что индукцию можно элиминировать путем добавления 10 мкМ антагониста NF-каппа В BAY11-7085 (ФИГ. 21). Кроме того, с помощью коммерчески доступного анализа ELISA было определено, что среда из культур человеческих МСК, которые подвергались воздействию жидкостного напряжения сдвига в течение всего лишь 3 часов, обладала иммуносупрессивной активностью, о чем свидетельствует 10-50% снижение в TNF-α в случае совместного культивирования обработанных чМСК с активированными иммунными клетками из селезенки (ФИГ. 22). Также с помощью анализа супрессии цитокинов было определено, что применение ингибиторов COX или NF-kB элиминирует способность обработанных напряжением сдвига МСК подавлять выработку TNF-α; тогда как добавление стабилизированной синтетической формы PGE2 (dmPGE2) снижало TNF-α до уровней, вырабатываемых в присутствии обработанных напряжением сдвига МСК (ФИГ. 23). Дополнительные свидетельства позволяют предположить, что обработанные напряжением сдвига МСК могут быть более восприимчивы к другим примирующим агентами, чем МСК, которые не подвергались воздействию жидкостного напряжения сдвига, так как при добавлении IFN-γ наблюдалась большая индукция COX2 и HMOX1 (ФИГ. 24). Таким образов, это свидетельствует о том, что человеческие МСК, подвергнутые воздействию жидкостного напряжения сдвига, могут действовать синергетически с цитокинами, например, в случае комбинированной терапии.
[00132] Дополнительно было определено, что наивные МСК, подвергнутые воздействию напряжения сдвига, в отсутствие предварительного кондиционирования воспалительными цитокинами, были способны блокировать секрецию TNF-α активированными липополисахаридами (ЛПС) мышиными спленоцитами (начиная от полного ингибирования, до 2-кратного снижения ниже уровня МСК, культивируемых в статических условиях, в зависимости от донора МСК и вариабельности источника).
НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЕ СПОСОБНОСТИ:
[00133] Проводили исследования, чтобы установить, что клетки, такие как МСК, подвергнутые воздействию контролируемого напряжения сдвига, могут обеспечивать нейропротекцию после, например, травматического повреждения головного мозга (ТПГМ). Для осуществления этого использовали крысиную модель, чтобы оценить функциональные результаты. Контролируемое кортикальное воздействие (ККВ) у крыс представляет морфологические и цереброваскулярные ответы на повреждение, которое напоминает травму головы у человека. Таким образом, получение характеристик клеточных и молекулярных изменений, которые усиливают неврологическое повреждение и воспаление, обеспечивает эффективный инструмент для определения потенциальной клинической эффективности предварительного кондиционирования МСК.
6
6
[00134] Теоретически, необходимо было по двенадцать (12) крыс на патологическое состояние для достижения 80% эффективности при уровне ошибки первого рода 0,05 (прогнозно-аналитическое программное обеспечение SAS). Клетками, предназначенными для введения для клеточной терапии, были полученные из костного мозга МСК. МСК находились в статических условиях или подвергались воздействию напряжения сдвига в течение 3 часов с интенсивностью 15 дин/см2, при этом такая скорость потока жидкости и длительность продемонстрировали сильную индукцию COX2, TSG6, IL1RN и HMOX1 и подавление выработки цитокинов в активированных иммунных клетках. Непосредственно после применения силы со стороны системы для создания бокового потока большой емкости 10×10 клеток/кг МСК переносили крысам-реципиентам путем инъекции в хвостовую вену (приблизительная доза составляла 2,5×10 МСК на крысу).
[00135] Проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) определяли стандартными способами для исследования пропотевания жидкости через сосуды (с применением декстрановых гранул в суспензии, как описано в данном документе). Повреждение правой париетальной ассоциативной зоны коры осуществляли у самцов крыс (225-250 грамм) с помощью устройства для ККВ (Leica Impactor 1). Параллельно контрольных крыс обрабатывали только ККВ или просто анестезировали (плацебо-контроль). Через сорок восемь (48) часов после повреждения вводили МСК. Через двадцать четыре (24) часа после инъекции МСК через хвостовую вену осуществляли доставку флуоресцентно конъюгированных с Alexa 680 декстрановых гранул (10 кДа, 0,5 мл 1 мг/мл). Через тридцать (30) минут после инъекции этого красителя животных умерщвляли и перфузировали 4% параформальдегидом. Получали корональные среды зафиксированного головного мозга толщиной 1 мм. Пропотевание жидкости через сосуды определяли по интенсивности флуоресценции срезов головного мозга в инфракрасном лазерном сканере LI-COR Odyssey CLx, используя каналы для 700 и 800 нм (сигнал на 800 нм использовали для вычитания фона). Гистологический анализ частоты появления определенных иммунных и нервных типов клеток, которые, как известно, быстро меняются в ответ на нейровоспаление и являются важными индикаторами прогноза. В будущих исследованиях в независимой группе крыс
[00136] будут анализировать срезы головного мозга от 8 до 50 мкм в отношении воспалительных фенотипов в ЦНС методом иммуногистохимии с применением антител для выявления микроглии (Iba1, ED1 или CD63), инфильтрирующих нейтрофилов (RP-3), астроглии (GFAP) и нейронов (NeuN), а также индикатора гибели клеток (расщепляемая каспаза 3). Окрашивание срезов головного мозга будут проводить с применением стандартного протокола окрашивания свободно плавающих срезов или нанесенных на слайды криосрезов.
[00137] Когнитивное восстановление обработанных и контрольных крыс можно оценивать с помощью гиппокамп-зависимого пространственного обучения, водного лабиринта Морриса, в котором крысы обнаруживают подводную платформу на основании дополнительных подсказок лабиринта. Для этих исследований через две (2) недели после повреждения обучение исследуют по скорости, времени, проведенном в каждом квадранте, и расстоянию пути до нахождения платформы. Тех же самых животных будут исследовать через 4 недели после повреждения в отношении функции памяти с помощью таких же исследований в лабиринте. Предполагаемыми результатами является то, что доставка подвергнутых сдвигу МСК снизит проницаемость ГЭБ и воспалительные клеточные фенотипы в головном мозге по сравнению с наивными, культивируемым в статических условиях, МСК и также приведет к улучшению когнитивного восстановления.
Пример 2 - Повреждение изменяет частоту появления МСК в костном мозге
2
[00138] Хроническое воспаление при травматическом повреждении головного мозга запоминается моноцитами и лимфоцитами врожденной и адаптивной иммунных систем. Сообщалось, что МСК перемещаются из костного мозга в участки повреждения и воспаления, однако подробный анализ перемещений МСК из костного мозга в этом контексте отсутствует. Чтобы следить за изменениями в частоте появления МСК вследствие повреждения, использовали крысиную модель травматического повреждения головного мозга, которая представляет морфологические и цереброваскулярные ответы на повреждение, которое напоминает травму головы у человека. Вкратце, осуществляли контролируемое кортикальное воздействие (ККВ) в отношении открытой правой париетальной ассоциативной зоны коры вблизи срединной структуры. Параллельно анестезировали плацебо-контрольных животных и делали надрезы без повреждения. Частоту появления CD105+ МСК исследовали в костном мозге и обнаружили, что абсолютное число CD105+ МСК значительно снизилось через 24 часа после повреждения (ФИГ. 25A и 25B). Эти данные позволяют предположить, что МСК отвечают на повреждение, покидая костный мозг аналогично тому, что могло наблюдаться с гемопоэтическими стволовыми клетками или клетками-предшественниками, таким образом, повышая вероятность непосредственного воздействия на МСК гемодинамических сил в кровеносном потоке и на сосудистой стенке. Что важно, внутривенное введение человеческих МСК, которые предварительно кондиционировали в течение 3 часов при 15 дин/см НСС, значительно повышало частоту появления CD105+ МСК в костном мозге крыс с повреждением при введении через 24 часа после ККВ (ФИГ. 25C и 25D). Через 72 часа после ККВ частота появления клеток CD105+ была значительно выше при введении статически культивированных или подвергнутых воздействию НСС МСК, а защитное действие в отношении костного мозга было значительно большим в случае, когда МСК предварительно кондиционировали посредством НСС.
Материалы и способы
5
6
5
2
[00139] Клеточная культура - МСК костного мозга были получены из цельного костного мозга от независимых доноров-людей (AllCells). Вкратце, мононуклеарные клетки обогащали в лейкоцитарном слое цельного костного мозга путем фазовой сепарации в Ficoll-Paque. Клетки криоконсервировали или ресуспендировали для незамедлительного размножения в полной культуральной среде, состоящей из MEM-α (Thermo Scientific), 20% фетальной бычьей сыворотки (Atlanta Biologicals), 100 единиц/мл пенициллина (Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco) и 2 мM L-глутамина (Gibco). Неадгезивные клетки удаляли через 2 дня. Адгезивные колонии дополнительно размножали и замораживали как пассаж 1. Размороженные МСК высевали при 1×10 клеток/мл, а среду меняли каждые три дня. При 80% конфлюэнтности клетки пассировали в каналы IBIDI (μ-Slide VI 0.4) при плотности 3×10 клеток/мл для кОФ ПЦР, иммуноблоттинга и экспериментов с ККВ крыс и при 5×10 клеток/мл для экспериментов ELISA и иммунофлуоресцентных исследований. После присоединения к культуральной поверхности использовали шприцевые насосы (программируемый PhD ULTRA, Harvard Apparatus) или перистальтические насосы (аналог REGLO MS4/12, Ismatec) для создания ламинарного напряжения сдвига 15 дин/см.
2
6
[00140] Контролируемое кортикальное воздействие (ККВ) -Устройство для ККВ (Leica IMPACT ONE™) использовали для осуществления одного воздействия, заключающегося в 3,1 мм сжатии при 6 м/с правой париетальной ассоциативной зоны коры (вблизи срединной структуры между брегмой и лямбдой) с применением 6 мм ударного наконечника к открытому головному мозгу самцов крыс (225-250 грамм). Параллельно контрольных крыс обрабатывали только ККВ или просто анестезировали (плацебо-контроль). В экспериментах по клеточной терапии кратковременно пассированные (P2-5) МСК культивировали в статических условиях или с напряжением сдвига 15 дин/смв течение 3 часов. Крысы-реципиенты получали МСК (10×10 клеток/кг) через хвостовую вену в течение 2 ч с момента сдвигового воздействия. Во время умерщвления крыс перфузировали 4% параформальдегидом, а ткани дополнительно фиксировали после получения. Все эксперименты проводили в соответствии с руководством от Институционального комитета по уходу за животными и их использованию научного центра здоровья Техасского университета.
[00141] Гистологическая обработка крысиных тканей - Вырезали большеберцовые кости крыс и тщательно удаляли окружающие мышцы. Кости дополнительно фиксировали в 4% параформальдегиде и декальцифицировали с помощью 10% ЭДТА. После декальцификации кости переносили в гистологический центр медицинской школы Техасского университета для макроскопического изучения, заливки в парафин и получения срезов.
2
2
[00142] Иммуноокрашивание костного мозга - Залитые в парафин срезы разогревали при 60˚C в течение 20 мин и серийно регидратировали в ксилене и этаноле разной степени разведения. Термическую демаскировку антигена проводили, используя раствор для демаскировки целевого антигена DAKO (pH 6,1). Эндогенную пероксидазу блокировали 0,3% HO. Слайды блокировали 2,5% БСА в течение 1 ч и инкубировали в течение ночи с анти-CD105 антителом (1:200, SN6, Ab11414) в 2,5% БСА. Обнаружение иммунопероксидазы проводили, используя набор Vector ABC и набор DAKO DAB (набор VECTASTAIN Elite ABC; PK-6102, набор Dako DAB; K3468) в соответствии с инструкциями производителя и проводили контрокрашивание ядерным прочным красным или гематоксилином CAT (Vector Labs; H-3403, Biocare Medical; 012215). Чтобы гарантировать оптимальную клеточную контрастность, вместе с гематоксилином использовали подсиняющий реагент (Statlab, SL203). Слайды высушивали на воздухе и заключали под покровное стекло с помощью Biocare Ecomount (EM897L).
[00143] Получение и анализ изображений - Иммуногистохимические микрофотографии получали с помощью поляризационного микроскопа Olympus BX51P (цветная камера DP71) и программного обеспечения DP Controller (Olympus, версия 3.3.1.292). Количественный анализ изображений проводили с помощью Image J (NIH). Подсчет CD105+ МСК проводил исследователь, работающий с обезличенными данными по группам обработки и идентификации образцов. Для отбора 8 случайных групп изображений, для которых потом проводили статистический анализ, использовали генератор случайных чисел.
[00144] Статистический анализ - Все данные проанализированы с помощью программного обеспечения SIGMAPLOT 12.5 в отношении статистической значимости и представлены в виде среднего±СПС. Для оценки разницы в гистологических измерениях использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA и метод Хольма-Сидака. Уровни значимости с P < 0,001 обозначены на графиках тройными звездочками ***. Показаны репрезентативные результаты по меньшей мере по трем независимым биологическим репликами, если не указано иное. (Смотрите ФИГ. 25B и 25D)
* * *
[00145] Все раскрытые и заявленные в данном документе способы могут быть реализованы и осуществлены без проведения необязательных экспериментов с учетом настоящего описания. Хотя композиции и способы согласно этому изобретению были описаны в терминах предпочтительных вариантов реализации изобретения, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что возможно применение вариаций к способам и на этапах или на последовательности этапов описанного в данном документе способа без отступления от концепции, сути и объема изобретения. В частности, будет очевидно, что некоторые агенты, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут замещать описанные в данном документе агенты с достижением аналогичных или сходных результатов. Считается, что все такие сходные замещения и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, соответствуют сути, объему и концепции изобретения, определяемым прилагаемой формулой изобретения.
[00146] Применяемые в данном документе заголовки разделов используются в целях упорядочения и не должны восприниматься как ограничивающие описанный предмет изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в этой заявке, включая, но не ограничиваясь этим, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, явным образом включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме и в любых целях. В случае, если в одном или более из включенных литературных источников и сходных материалов дается определение термина, которое противоречит определению этого термина в данной заявке, преимущество имеет данная заявка.
Ссылки
Следующие ссылки, в той степени, в которой они обеспечивают описание типовых процедур или других подробностей, дополняющих приведенные в данном документе, явным образом включены в данный документ посредством ссылки.
Международная публикация № WO98/30679
Wagner et al., Optimizing mesenchymal stem cell-based therapeutics. Curr Opin Biotechnol 20(5): 531-536, 2009.