ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS

Данная заявка претендует на привилегии, предоставляемые в связи с подачей предварительной заявки на патент США № 61/289671, поданной 23 декабря 2009 г., которая в полном объеме включается в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении описываются способы содействия дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование дефинитивной эндодермы. Клетки дефинитивной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3 beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировке дефинитивной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX1. При отсутствии PDX1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировке панкреатической эндодермы.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в публикации Lumelsky et al. (Science 292: 1389, 2001) сообщается о дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. Soria и соавторы (Diabetes 49: 157, 2000) сообщают, что инсулин-секретирующие клетки, полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток, нормализовали гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.
В одном примере, в публикации Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002), описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
В другом примере, в публикации Blyszczuk et al. (PNAS 100: 998, 2003), сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать PDX1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54: 301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Они также отметили, что ретиноевая кислота не влияла на уровень экспрессии инсулина и Pdx1 мРНК; однако, лечение с использованием 3 нМ FGF7 привело к повышению уровня транскрипта для Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в PDX1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).
Gordon и соавторы продемонстрировали индукцию брахиурия-[положительных]/HNF3-бета-[положительных] клеток эндодермы из мышиных эмбриональных стволовых клеток в отсутствие сыворотки и в присутствии активина с ингибитором сигнализации Wnt (US 2006/0003446A1).
В публикации Gordon et al. (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались одновременно сигнальные пути Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например у человека.
Thomson и соавторы выделяли эмбриональные стволовые клетки из человеческих бластоцист (Science 282: 114, 1998). Параллельно Gearhart и соавторы получили клеточные линии человеческих эмбриональных зародышевых клеток (чЭЗ, hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцировке которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека должны культивироваться в очень специфических условиях (US № 6200806, WO 99/20741, WO 01/51616).
D’Amour и соавторы описывают производство обогащенных культур дефинитивной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology, 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцировке в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки дефинитивной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшей дифференцировке в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
in vivo
В публикации D’Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали процесс дифференцировки, преобразующий эмбриональные клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы , проводя клетки через стадии, напоминающие образование дефинитивной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».
В другом примере Fisk et al. сообщают о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из человеческих эмбриональных стволовых клеток (US 2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцировки был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировались с антагонистами TGF-β, такими как ноггин, в сочетании с EGF или бетацеллюлином с получением PDX1-положительных клеток. Окончательная дифференцировка запускалась никотинамидом.
in vivo
В одном из примеров Benvenistry et al. сообщают: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия PDX1 увеличивала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только » (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24: 1923-1930).
В другом примере Grapin-Botton et al. сообщают: «Ранняя активация Ngn3 почти во всех случаях индуцировала клетки глюкагон+, разрушая при этом прогениторные клетки поджелудочной железы. Как и в случае E11.5, прогениторные клетки PDX-1 могут дифференцироваться в инсулин-[положительные] и PP-[положительные] клетки» (Johansson KA et al., Developmental Cell, 12, 457-465, March 2007).
Например, Diez et al. сообщают: «После 9 и 10 недель большинство глюкагон-положительных клеток соэкспрессировали инсулин, хотя на этих стадиях явно обнаруживались и отдельные клетки, экспрессирующие только инсулин. Клетки, соэкспрессирующие инсулин и глюкагон, наблюдались в течение всего периода исследования (от 9 до 21 недели), но представляли лишь небольшую часть от общего количества экспрессирующих инсулин и глюкагон клеток» (J. Histochem. Cytochem. 2009 Sep; 57(9): 811-24. 2009 Apr 13.)
В одном из примеров Chen и соавторы сообщают: «(-)-индолактам V [(ILV)] активирует сигнализацию протеинкиназы С и направляет поджелудочную спецификацию hESC, которые уже были зафиксированы в линии эндодермы… ILV и ретиноевая кислота воздействуют через соответствующий механизм… ILV демонстрирует более сильную индукцию экспрессирующих PDX-1 клеток (процент клеток, экспрессирующих PDX-1), чем ретиноевая кислота». (Nature Chemical Biology 5, 195-196 (April 2009) doi:10.1038/nchembio0409-195).
Lyttle и соавторы сообщают: «NKX6-1 солокализованы только с клетками инсулина, что указывает на то, что NKX6-1 участвует только в развитии бета-клеток человека». (Diabetologia 2008 Jul: 51(7): 1169-80, 2008).
in vitro
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке  способов создания функциональных инсулиноэкспрессирующих клеток, более схожих с β-клетками. Данное изобретение представляет альтернативный подход к повышению эффективности дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в экспрессирующие инсулин клетки путем генерирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте настоящее изобретение обеспечивает популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.
В одном варианте настоящее изобретение обеспечивает способ дифференцировки популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона, включающий следующие стадии:
a. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток,
b. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы,
c. Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцировки в клетки панкреатической эндодермы, и
d. Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринной поджелудочной железы, соэкспрессирующие NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, обогащенной активатором протеинкиназы С.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1 показан эффект от обработки TPB на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках согласно данному изобретению. На панелях a и b показана экспрессия инсулина и глюкагона, соответственно, в клетках, обработанных TPB. Контрольные популяции клеток показаны на панелях c и d.
На фиг.2 показано влияние различных концентраций TPB на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панелях с a по d показана экспрессия инсулина и глюкагона в популяциях клеток, обработанных TPB в указанных дозах.
На фиг.3 показано влияние различных концентраций ингибитора протеинкиназы C на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панели a изображена экспрессия инсулина и глюкагона в клетках, обработанных TPB, а на панели c изображено соответствующее маркирование посредством DAPI). На панели b изображена экспрессия инсулина и глюкагона в клетках, обработанных TPB и GÖ 6976, а на панели d изображено соответствующее маркирование посредством DAPI).
На фиг.4 показано влияние различных концентраций активаторов протеинкиназы C на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панели a показана экспрессия инсулина в клетках, обработанных TPB. На панели b показана экспрессия инсулина в клетках, обработанных ILV. На панели c показана экспрессия инсулина в клетках, обработанных PMA.
На фиг.5 показана экспрессия маркеров, характерных для эндокринной линии поджелудочной железы в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панелях изображена экспрессия инсулина и NKX6.1 (панель a), инсулина и PDX1 (панель b), инсулина и NEUROD1 (панель c), инсулина и соматостатина (панель d), а также инсулина и грелина (панель e).
На фиг.6 показана экспрессия инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панелях с a по c показана экспрессия инсулина (панель a), экспрессия глюкагона (панель b) и окрашивание DAPI (панель c) в клетках, обрабатывавшихся DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина + 20 нг/мл активина A + ингибитор киназы p38 (раскрывается в US 6214830 при 2,5 мкМ) в течение четырех дней (стадия 3, обработка 8, пример 2). На панелях с d по f показана экспрессия инсулина (панель d), экспрессия глюкагона (панель e) и окрашивание DAPI (панель f) в клетках, обрабатывавшихся глюкозой с высоким уровнем DMEM + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина в течение четырех дней (стадия 3, обработка 9, пример 2).
На фиг.7 показано обнаружение человеческого С-пептида в (SCID) - бежевые (Bg) мыши, через четыре, восемь и двенадцать недель после получения клеток согласно настоящему изобретению, после сахарной нагрузки.
На фиг.8 показан процент клеток, соэкспрессирующих PDX1 и NKX6.1, полученных после обработки различными ингибиторами протеинкиназы C в указанных концентрациях.
На фиг.9 показана экспрессия NGN3, PDX1, NKX6.1 и PTF1-альфа в клетках, обработанных способами, описанными в примере 6.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
in vitro
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться  в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцировки из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть, способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть, способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть, способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК, HSC) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть, способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть, способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, такой как, например, нервная или мышечная клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированной дифференцировкой представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клетки или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцировкой называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцировки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцировки.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы», «клетки 1-й стадии» или «стадия 1» относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки дефинитивной эндодермы.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 или PROX1. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
«Панкреатической эндокринной клеткой», или «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы», или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
in vitro
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или несколько стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток  приводит к утрате экспрессирования SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к увеличению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализу их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но необязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).
В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в следующих публикациях Thomson et al. (US № 5843780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. Альтернативно, плюрипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
Например, в работах Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science 6 November 1998: Vol. 282. № 5391, рр. 1145-1147) описано культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов.
Richards и соавторы (Stem Cells 21: 546-556, 2003) анализировали набор из одиннадцати слоев питающих клеток, полученных от взрослых, новорожденных и эмбрионов людей, по их способности осуществлять поддержку культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Richards и соавторы сообщают: «линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемые на питающих слоях из фибробластов кожи взрослых людей, сохраняют морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток, и остаются плюрипотентными».
В US 20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку плюрипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В US 20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.
В другом примере Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанной дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В еще одном примере Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают получение питающих клеток из человеческой плаценты.
Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.
В другом примере Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих фибробластов постнатальной крайней плоти.
В US 6642048 описывают среду, поддерживающую рост плюрипотентных стволовых клеток приматов (пПС, pPS) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В US 6642048 говорится: «Данное изобретение включает мезенхимо- и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способы получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды”.
В другом примере, WO 2005014799, описывают кондиционированную среду для поддержания, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В WO 2005014799 говорится: «Питательная среда, подготовленная в соответствии с настоящим изобретением, обусловлена секрецией мышиных клеток; в частности, дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов под названием MMH (гепатоциты мышей Met)».
В другом примере Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.
В другом примере, US 20070010011, описывают культуральную среду определенного химического состава для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).
В другом примере, US 20050148070, описан способ культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в среде с определенным составом, не содержащей сыворотки и не содержащей питающих клеток - фибробластов. Данный способ заключается в культивировании стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заместитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, причем упомянутая культуральная среда существенно свободна от эмбриональной сыворотки млекопитающих и содержит по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, где упомянутый фактор роста поступает из источника, отличного от просто питающего слоя фибробластов; данная среда поддерживает пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии в отсутствие питающих клеток или кондиционированной среды.
В другом примере, US 20050233446, описывают среду с определенным составом, которая может использоваться при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе среда по существу является изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество каждого из bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенной дифференцировки.
В другом примере, US 6800480, говорится: “В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания клеток зародышевых стволовых клеток приматов, в значительной степени в недифференцированном состоянии, включающая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, включающей питающие клетки и экстраклеточный матрикс, полученный из питающих клеток. Среда также содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, содержащей нуклеозиды и соль пируват”.
В другом примере, US 20050244962, говорится: «В одном примере в изобретении предлагается способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, в основном не содержащей эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно также в основном не содержащей эмбриональной сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, иного, чем просто питающие клетки-фибробласты. В предпочтительной форме слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов».
В другом примере, WO 2005065354, описана существенно свободная от питающих клеток и сыворотки изотоническая питательная среда с определенным составом, которая включает a. основную среду; b. инсулин в количестве bFGF, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; c. инсулин в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d. аскорбиновую кислоту в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.
В другом примере, WO 2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является MATRIGEL (Becton Dickenson). MATRIGEL представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco №10829-018, основная среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток из плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте настоящее изобретение обеспечивает способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные линии поджелудочной эндодермы из плюрипотентных стволовых клеток, включающий следующие стадии:
a. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток,
b. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы,
c. Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцировки в клетки панкреатической эндодермы, и
d. Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дифференцировки в клетки панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки.
В одном варианте настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессируют NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Количество плюрипотентных стволовых клеток обычно минимально для таких маркеров. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, способами, описанными в публикации Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой, а затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример использования данного способа приведен в публикации D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2005.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и лиганд Wnt в отсутствие сыворотки, затем удаления лиганда Wnt и культивирования клеток с активином A и сывороткой. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США сер. № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США сер. № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США сер. № 60/990529.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США сер. № 61/076889.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США сер. № 61/076900.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США сер. № 61/076908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США сер. № 61/076915.
Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или с использованием способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы с использованием способов, описанных в публикации D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006.
В одном варианте клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, соэкспрессируют PDX1, NKX6.1 при минимальном количестве CDX2 и NGN3.
В одном варианте клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, соэкспрессирующие PDX1, NKX6.1 при минимальном количестве CDX2 и NGN3, путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в первой среде, обогащенной FGF7, с последующим культивированием клеток во второй среде, обогащенной FGF7, фактором, способным ингибировать BMP, агонистом рецептора TGFβ, ретиноевой кислоты и ингибитором сигнального пути белка хеджехог.
В одном варианте FGF7 может использоваться в концентрации от около 50 пг/мл до около 50 мкг/мл. В одном варианте FGF7 используется в концентрации 50 нг/мл.
В одном варианте фактором, способным ингибировать BMP, является ноггин. Ноггин может использоваться в концентрациях от около 500 нг/мл до около 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления ноггин используется в концентрации 100 нг/мл.
В одном из вариантов агонист рецептора TGFβ выбирается из группы, содержащей активин А, активин B, TGFβ-I, TGFβ-II, GDF-8 и GDF-11.
Активин А может использоваться в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном варианте активин А используется в концентрации 20 нг/мл. В альтернативном варианте активин А используется в концентрации 50 нг/мл.
Активин B может использоваться в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном варианте активин B используется в концентрации 20 нг/мл. В альтернативном варианте активин B используется в концентрации 50 нг/мл.
TGFβ-I может использоваться в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном варианте TGFβ-I используется в концентрации 20 нг/мл. В альтернативном варианте TGFβ-I используется в концентрации 50 нг/мл.
TGFβ-II может использоваться в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном варианте TGFβ-II используется в концентрации 20 нг/мл. В альтернативном варианте TGFβ-II используется в концентрации 50 нг/мл.
GDF-8 может использоваться в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном варианте GDF-8 используется в концентрации 20 нг/мл. В альтернативном варианте GDF−8 используется в концентрации 50 нг/мл.
GDF-11 может использоваться в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном варианте GDF-11 используется в концентрации 20 нг/мл. В альтернативном варианте GDF-11 используется в концентрации 50 нг/мл.
Ретиноевая кислота может использоваться в концентрациях от около 1 нМ до около 1 мМ. В одном из вариантов осуществления ретиноевая кислота используется в концентрации 1 мкМ.
В одном из вариантов в качестве ингибитора сигнального пути белка хеджехог используется циклопамин-KAAD. Циклопамин-KAAD может использоваться в концентрации от около 0,025 мкМ до около 2,5 мкМ. В одном из вариантов циклопамин-KAAD используется в концентрации 0,25 мкМ.
Эффективность дифференцировки может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.
in situ
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация  (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - метод проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для дефинитивной линии эндодермы, выбираются из группы, содержащей SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая как минимум один из маркеров, характерных для линии дефинитивной эндодермы. В одном из вариантов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В альтернативном варианте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В альтернативном варианте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой клетку дефинитивной эндодермы.
Маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, выбираются из группы, содержащей PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая как минимум один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из вариантов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы в клетки, экспрессирующие маркеры эндокринной линии поджелудочной железы
В одном варианте клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном варианте клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, соэкспрессируют PDX1, NKX6.1 при минимальном количестве CDX2 и NGN3.
В одном варианте клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессируют NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.
В одном варианте клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующие NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона, путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, в среде, обогащенной фактором, способным ингибировать BMP, ингибитором сигнализации рецептора TGFβ и активатором протеинкиназы С.
В одном варианте осуществления фактором, способным ингибировать BMP, является ноггин. Ноггин может использоваться в концентрациях от около 500 нг/мл до около 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления ноггин используется в концентрации 100 нг/мл.
В одном из вариантов ингибитором сигнализации рецептора TGFβ является ингибитор ALK5. В одном из вариантов ингибитором ALK5 является ингибитор ALK5 II. Ингибитор ALK5 II может использоваться в концентрации от 0,1 мкМ до приблизительно 10 мкМ. В одном варианте ингибитор ALK5 II используется в концентрации 1 мкМ.
В одном варианте активатор протеинкиназы С выбирают из группы, содержащей (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламин)бензолактам, индолактам V и форбол-12-миристат-13-ацетат. В одном из вариантов активатором протеинкиназы С является (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламин)бензолактам. (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламин)бензолактам может использоваться в концентрации от приблизительно 20 нМ до приблизительно 500 нМ. (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламин)бензолактам, индолактам V и форбол-12-миристат-13-ацетат в настоящем документе называются «TPB».
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, PAX4 и PAX6. В одном варианте клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессируют NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.
Методы лечения
in vitro
В одном из вариантов настоящего изобретения предлагается способ лечения пациентов, страдающих от диабета 1 типа или подвергающихся риску развития этого заболевания. В одном варианте способ предполагает выращивание плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток  в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, и имплантацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, пациенту.
in vitro
В другом варианте настоящего изобретения предлагается способ лечения пациентов, страдающих от диабета 2 типа или подвергающихся риску развития этого заболевания. В одном варианте способ предполагает выращивание плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток  в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, и имплантацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы пациенту.
При необходимости пациент далее может получать лечение фармацевтическими средствами или биологически активными веществами, улучшающими выживаемость и функционирование трансплантированных клеток. К этим агентам могут относиться, например, помимо прочего, инсулин, члены семейства TGF-β, включая TGF-β1, 2 и 3, костные морфогенетические белки (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 и -13), факторы роста фибробластов-1 и -2, тромбоцитарный фактор роста -AA и -BB, плазма, богатая тромбоцитами, инсулин-подобный фактор роста (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), фактор роста из клеток эндотелия сосудов (VEGF), плейотропин, эндотелин. К другим фармакологическим веществам могут относиться, например, никотинамид, глюкагон-подобный пептид-I (GLP-1) и II, миметические антитела GLP-1 и 2, экзендин-4, ретиноевая кислота, паратиреоидный гормон, ингибиторы MAPK, такие, например, как описаны в опубликованной патентной заявке США 2004/0209901 и опубликованной патентной заявке США 2004/0132729.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в инсулин-продуцирующие клетки перед трансплантацией реципиенту. В специфической реализации плюрипотентные стволовые клетки являются полностью дифференцированными в β-клетки до трансплантации реципиенту. В качестве альтернативы плюрипотентные стволовые клетки могут быть трансплантированы реципиенту в недифференцированном или частично дифференцированном состоянии. Дальнейшая дифференцировка может происходить в организме реципиента.
Клетки дефинитивной эндодермы или, альтернативно, клетки панкреатической эндодермы или, альтернативно, β-клетки, могут имплантироваться в форме дисперсных клеток или клеток, образовавших кластеры, которые методом инфузии могут вводиться в воротную вену печени. В качестве альтернативы клетки могут вводиться в биологически совместимых разрушающихся полимерных вспомогательных материалах, в пористых неразрушающихся приспособлениях или в инкапсулированном виде для защиты от иммунного ответа организма-хозяина. Клетки могут имплантироваться в подходящее место организма реципиента. К таким местам для имплантации относятся, например, печень, естественная поджелудочная железа, пространство под почечной капсулой, сальник, брюшная полость, субсерозное пространство, кишечник, желудок или подкожный карман.
in vivo
in situ
Для стимуляции дальнейшей дифференцировки, выживания или активности имплантированных клеток предварительно, одновременно или после имплантации клеток могут вводиться дополнительные факторы, такие как факторы роста, антиоксиданты или противовоспалительные агенты. В некоторых вариантах осуществления факторы роста применяются для дифференцировки введенных клеток . Такие факторы могут секретироваться эндогенными клетками и воздействовать на введенные клетки . Дифференцировку имплантированных клеток можно индуцировать любым сочетанием эндогенных и введенных экзогенно факторов роста, известных специалистам в данной области.
Число клеток, используемое при имплантации, зависит от ряда различных факторов, в том числе от состояния пациента и его реакции на лечение, и может быть определено специалистом в данной области.
in vitro
in vitro
in vitro
В одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ лечения пациентов, страдающих от диабета или подвергающихся риску развития этого заболевания. Данный способ включает культивирование плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку культивированных стволовых клеток  в линию β-клеток и заключение клеток в опорный материал с трехмерной структурой. Клетки могут поддерживаться  на этом опорном материале до имплантации пациенту. В альтернативном варианте опорный материал, содержащий клетки, может напрямую имплантироваться в организм пациента без дополнительного культивирования . В опорный материал может быть заключен по меньшей мере один фармакологический агент, повышающий выживание и функционирование трансплантированных клеток.
in vitro
in vivo
К опорным материалам, соответствующим целям настоящего изобретения, относятся тканевые шаблоны, каналы, перегородки и резервуары, применяемые для восстановления тканей. В частности, для практического применения способов настоящего изобретения подходят синтетические и природные материалы в форме пеноматериалов, губок, гелей, гидрогелей, тканых и нетканых структур, применяемых  и  для реконструкции и регенерации биологической ткани, а также для доставки хемотаксических агентов, индуцирующих рост ткани. См., например, материалы, содержащиеся в U.S. Patent 5,770,417, U.S. Patent 6,022,743, U.S. Patent 5,567,612, U.S. Patent 5,759,830, U.S. Patent 6,626,950, U.S. Patent 6,534,084, U.S. Patent 6,306,424, U.S. Patent 6,365,149, U.S. Patent 6,599,323, U.S. Patent 6,656,488, U.S. Published Application 2004/0062753 A1, U.S. Patent 4,557,264 и U.S. Patent 6,333,029.
Для того чтобы создать опорный материал с включенным фармацевтическим средством, такое средство можно смешать с раствором полимера до изготовления опорной структуры. В качестве альтернативы фармацевтическое средство можно нанести на изготовленную опорную структуру, предпочтительно в присутствии фармацевтического носителя. Фармацевтическое средство может быть в виде жидкости, мелкодисперсного твердого вещества или иметь любую другую подходящую физическую форму. В качестве альтернативы в опорный материал могут быть добавлены инертные наполнители для изменения скорости высвобождения фармацевтического средства. В альтернативном варианте осуществления в опорный материал включается как минимум одно фармацевтическое соединение, являющееся противовоспалительным средством, как например, описанные в патенте США 6509369.
В опорный материал может включаться по меньшей мере одно фармацевтическое средство, являющееся антиапоптозным средством, такое как, например, средства, описанные в патенте США 6793945.
В опорный материал также может включаться по меньшей мере одно фармацевтическое средство, являющееся ингибитором фиброза, таким как, например, средства, описанные в патенте США 6331298.
В опорный материал также может включаться по меньшей мере одно фармацевтическое средство, являющееся стимулятором ангиогенеза, такое как, например, средства, описанные в U.S. Published Application 2004/0220393 и U.S. Published Application 2004/0209901.
В опорный материал также может включаться по меньшей мере одно фармацевтическое средство, являющееся иммуносупрессором, такое как, например, средства, описанные в U.S. Published Application 2004/0171623.
В опорный материал также может включаться как минимум одно фармацевтическое средство, представляющее собой фактор роста, такое как, например, члены семейства TGF-β, включая TGF-β1, 2 и 3, костные морфогенетические белки (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 и -13), факторы роста фибробластов-1 и -2, тромбоцитарный фактор роста -AA и -BB, плазма, богатая тромбоцитами, инсулин-подобный фактор роста (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -8, -10, -15), фактор роста из клеток эндотелия сосудов (VEGF), плейотропин, эндотелин и другие. Другие фармацевтические средства могут включать, например, никотинамид, индуцированный гипоксией фактор 1-alpha, глюкагон-подобный пептид-I (GLP-1), миметические антитела GLP-1 и GLP-2, и II, экзендин-4, Nodal, Noggin, NGF, ретиноевую кислоту, паратиреоидный гормон, тенасцин-C, тропоэластин, пептиды тромбинового происхождения, кателицидины, дефензины, ламинин, биологические пептиды, содержащие связывающие клетки и гепарин домены протеинов адгезивного внеклеточного матрикса, такие как фибронектин и витронектин, ингибиторы MAPK, такие как средства, описанные в U.S. Published Application 2004/0209901 и U.S. Published Application 2004/0132729.
Включение клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, в опорный каркас может осуществляться путем простого нанесения клеток на опорный каркас. Клетки могут входить внутрь каркаса путем простой диффузии (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). Было разработано несколько других подходов для повышения эффективности посева клеток. Например, для посева хондроцитов на каркасы из полигликолевой кислоты используются центрифужные пробирки (Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)). Другой подход к посеву клеток представляет собой использование центрифугирования, создающего минимальный стресс для высеиваемых клеток и повышающий эффективность посева. Например, в публикации Yang et al. разработан способ посева клеток (J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)), названный центрифужной иммобилизацией клеток (CCI).
Настоящее изобретение далее иллюстрируется, но без ограничения, следующими примерами.
Примеры
Пример 1
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих инсулин, NKX6.1 и минимальное количество глюкагона

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в блюдцах, покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) (BD Biosciences; № по каталогу 356231) со средой RPMI (Invitrogen, № по каталогу 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по каталогу 120-14) + 20 нг/мл WNT-3а (R&D Systems; № по каталогу 1324-WN/CF) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A еще на два дня (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 (Invitrogen; № по каталогу 11330-032) + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 (PeproTech; № по каталогу 100-19) в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen; № по каталогу 10569) + 1% В27 + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD (Calbiochem; № по каталогу 239804) + 100 нг/мл ноггина (R&D Systems; № по каталогу 3344-NG) в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% В27 (Invitrogen; № по каталогу 0791) + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II (Axxora; № по каталогу ALX-270-445) + 500 нм ТВР ((2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламин)бензолактам) (Calbiochem; № по каталогу 565740) в течение шести дней (стадия 4).
В качестве контроля отдельные популяции клеток обрабатывали DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% В27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II в течение шести дней (стадия 4, группа контроля).
Как показано на фиг. 1, обработка ТВР на 4-й стадии приводила к увеличению количества экспрессирующих инсулин клеток (фиг. 1, панель а). Было отмечено, что около 60% экспрессирующих инсулин клеток являются клетками, экспрессирующими один эндокринный гормон, при этом клетки экспрессировали инсулин и не экспрессировали глюкагон соматостатин и грелин (фиг. 1, панели а и b; фиг. 5, панели d и е). Экспрессирующие глюкагон клетки были также отмечены в обработанной ТВР культуре. Большинство экспрессирующих глюкагон клеток также соэкспрессировали инсулин(фиг.1, панели а и b). В контрольной группе большинство клеток соэкспрессировали инсулин и глюкагон (фиг.1, панели c и d.).

В отдельном эксперименте клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) блюдцах со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина + 20 нг/мл WNT-3а, в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. Обработка 1: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нм TBP в течение шести дней (стадия 4, обработка 1), или
d. Обработка 2: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 100 нм TBP в течение шести дней (стадия 4, обработка 2), или
e. Обработка 3: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нм TBP в течение шести дней (стадия 4, обработка 3), или
f. Обработка 4: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II в течение шести дней (стадия 4, обработка 4).
in vitro
Для оценки влияния различных концентраций TPB на формирование клеток в рамках настоящего изобретения применялся иммуноцитохимический анализ. Значительное увеличение количества клеток, экспрессирующих только инсулин, наблюдалось в обеих группах TPB: 500 нм и 100 нм (фиг. 2, панели a и b). Анализ FACS подтвердил, что при обоих уровнях обработки  формировалось 12% клеток, экспрессирующих только инсулин, а 15% этой популяции также экспрессировали NKX6.1 (Таблица 1 - NKX6.1/INS экспрессирующие клетки составили 2,4% от общей популяции). При 20 нм TPB, как и в контрольной группе, большинство клеток соэкспрессировали инсулин и глюкагон (фиг.2, панели c и d).
Таблица 1
<b>Экспрессия маркеров, характерных для эндокринной линии поджелудочной железы, показанных как процент от общей популяции клеток</b>
Синаптофизин
INS
NKX6.1
NKX6.1/INS
TPB(500 нм)
38,3%
9,4%
45,7%
2,4%
TPB(100 нм)
47,6%
14,4%
34,8%
3,1%

Чтобы дополнительно подтвердить, что воздействие на формирование экспрессирующих эндокринный гормон клеток было опосредовано активацией протеинкиназы С, отдельные популяции клеток линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) блюдцах со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A + 20 нг/мл WNT-3а, в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. Обработка 5: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нМ TBP в течение шести дней (стадия 4, обработка 5), или
d. Обработка 6: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нМ TPB + 5 мкМ GÖ 6976 в течение шести дней (стадия 4, обработка 6), или
e. Обработка 7: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II (стадия 4, обработка 7), затем
f. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 в течение четырех дней (стадия 5).
2+
Известно, что GÖ 6976 избирательно ингибирует Ca-зависимые изоформы протеинкиназы С. Значительное снижение количества клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, в культурах, получавших только TPB (фиг.3, панель a) и TPB и GÖ 6976 (фиг.3, панель b). Анализ FACS подтвердил, что обработка TPB (обработка 6) позволила получить 30,6% клеток, экспрессирующих синаптофизин, 12% - только инсулин и 4,6% - глюкагон. С другой стороны, обработка TPB и GÖ 6976 (обработка 7) позволила получить 10,6% клеток, экспрессирующих синаптофизин, при отсутствии заметного уровня клеток, экспрессирующих только инсулин (таблица 2). Разницы в общем количестве клеток между обработками 6 и 7 не было. (См. фиг.3, панели c и d, где показано окрашивание DAPI, отражающее общее количество клеток при обработках 6 и 7). Эти результаты показывают, что сигнализация протеинкиназы С может играть важную роль при формировании клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы.
Проверялись также и другие активаторы протеинкиназы С. К ним относились индолактам V (ILV) (Axxora; № по каталогу ALX-420-011-C300) и форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) (Calbiochem; № по каталогу 524400). Тем не менее, только TPB продемонстрировал формирование клеток, экспрессирующих только инсулин (фиг.4, панель a). Как ILV (фиг.4, панель b), так и PMA (фиг.4, панель c) при 500 нм после шести дней обработки приводили к образованию клеток, соэкспрессирующих инсулин и глюкагон. Анализ FACS подтвердил, что обработка TPB привела к формированию 12% клеток, экспрессирующих только инсулин, 4,6% клеток, экспрессирующих глюкагон, и 7,1% клеток, соэкспрессирующих инсулин и глюкагон. С другой стороны, обработка ILV привела к формированию 3% клеток, экспрессирующих только инсулин, 12% клеток, экспрессирующих глюкагон, и 12% клеток, соэкспрессирующих инсулин и глюкагон (таблица 2). Иммуноцитохимический анализ показал, что в культурах, обработанных TPB, 20% клеток, экспрессирующих инсулин, соэкспрессировали NKX6.1 (фиг.5, панель a) и PDX1 (фиг.5, панель b). Большинство клеток, экспрессирующих инсулин, соэкспрессировали NEUROD, производитель эндокрина (фиг.5, панель с). Очень небольшое количество экспрессирующих инсулин клеток соэкспрессировали соматостатин или грелин (GHRL) (фиг.5, панели d и e).
Таблица 2
<b>Экспрессия маркеров, характерных для эндокринной линии поджелудочной железы, показанных как процент от общей популяции клеток</b>
TPB
ILV
TPB+Go6976
Синаптофизин
30,6%
56,8%
10,6%
INS
12%
3%
-
GCG
4,6%
12,6%
3,1%
INS/GCG
7,1%
12,9%
4%
Пример 2
Альтернативный способ формирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона

В отдельном эксперименте клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) блюдцах со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина А + 20 нг/мл WNT-3, в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. Обработка 8: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина + 20 нг/мл активина A + ингибитор киназы p38 (раскрывается в US 6214830 при 2,5 мкМ) в течение четырех дней (стадия 3, обработка 8), или
c. Обработка 9: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ, циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина в течение четырех дней (стадия 3, обработка 9); затем
d. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нМ TPB в течение шести дней (стадия 4).
Стадия 3, обработка 8 позволила получить популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, соэкспрессирующих PDX1 и NKX6.1, но не экспрессирующих CDX2 и NGN3. С другой стороны, стадия 3, обработка 9 позволила получить популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, соэкспрессирующих PDX1, NKX6.1 и NGN3. Было изучено воздействие на эти клеточные популяции обработки активатором протеинкиназы С (стадия 4 выше).
Был проведен анализ FACS, чтобы установить процент клеток, экспрессирующих только инсулин, клеток, экспрессирующих только глюкагон, клеток, соэкспрессирующих инсулин и глюкагон, клеток, экспрессирующих NKX6.1, клеток, экспрессирующих инсулин и NKX6.1, и клеток, экспрессирующих синаптофизин (панэндокринный маркер).
Как показано в таблице 3, популяция клеток, сформированная в результате обработки 8, позволила получить больший процент эндокринных клеток, отраженный в экспрессии синаптофизина: 49,7% от общей популяции клеток экспрессировали синаптофизин. 27,8% от общей популяции составляли клетки, экспрессирующие только инсулин.
С другой стороны, в популяции клеток, образовавшейся после обработки 9, содержалось 25,7% экспрессирующих синаптофизин клеток. 7,6% от общей популяции клеток экспрессировали только инсулин. Существенной разницы в количестве экспрессирующих только глюкагон клеток между группами обработки не наблюдалось, а процент экспрессирующих глюкагон клеток был значительно ниже, чем клеток, экспрессирующих инсулин.
Значительное количество клеток, экспрессирующих инсулин, также соэкспрессировали NKX6.1. В популяциях клеток, прошедших обработку 8, 11% от общей популяции экспрессировали инсулин и NKX6.1. В популяциях клеток, прошедших обработку 9, 2% от общей популяции экспрессировали инсулин и NKX6.1.
Иммунофлуоресцентный анализ подтвердили вышеприведенные данные (фиг.6). Обработка 8 привела к увеличению количества экспрессирующих инсулин клеток по сравнению с обработкой 9 (фиг.6, панели a и d). Большинство экспрессирующих глюкагон клеток были полигормональными (фиг.6, панели a, b, d и e). Эти результаты показывают, что популяцию клеток, полученных в результате обработки 8 (клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, соэкспрессирующих PDX1 и NKX6.1, но не экспрессирующих CDX2 и NGN3), с большей эффективностью можно довести до дифференцировки в функциональные экспрессирующие инсулин клетки посредством способов, описанных в данном изобретении.
Таблица 3
<b>Экспрессия маркеров, характерных для эндокринной линии поджелудочной железы, показанных как процент от общей популяции клеток</b>
Синаптофизин
Инсулин
Глюкагон
Инсулин/глюкагон
NKX6.1
NKX6.1/инсулин
T8
49,7%
27,8%
2,0%
16,4%
44,2%
11,0%
T9
25,7%
7,6%
2,5%
4,9%
61,7%
2,0%
Пример 3
Альтернативный способ формирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона

В другом эксперименте клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) блюдцах со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A + 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина + 20 нг/мл активина A + ингибитор киназы p38 (JNJ3026582 при 2,5 мкМ) в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. Обработка 10: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нм TPB в течение шести дней (стадия 4, обработка 10), или
d. Обработка 11: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нм TPB в течение девяти дней (стадия 4, обработка 11), или
e. Обработка 12: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нм TPB в течение двенадцати дней (стадия 4, обработка 12).
Как показано в таблице 4, при продлении обработки активатором протеинкиназы С до девяти (обработка 11) или двенадцати дней (обработка 12) не было установлено дополнительных преимуществ. Клетки, экспрессирующие только инсулин, составили 27,8% от общей популяции после шести дней обработки 10. С другой стороны, количество клеток, экспрессирующих инсулин, снизилось до 10% после девяти дней обработки (обработка 11), а затем и до 4% после двенадцати дней обработки (обработка 12). Кроме того, общий процент клеток, соэкспрессирующих инсулин и NKX6.1 в популяции, также значительно снизился после продления обработки. Эти результаты показали, что шестидневная обработка ноггином, ингибитором Alk5 II и активатором протеинкиназы С достаточна для формирования клеток, описываемых в данном изобретении.
Таблица 4
<b>Экспрессия маркеров, характерных для эндокринной линии поджелудочной железы, показанных как процент от общей популяции клеток</b>
Синаптофизин
Инсулин
Глюкагон
Инсулин/глюкагон
NKX6.1
NKX6.1/инсулин
6 дней
49,7%
27,8%
2,0%
16,4%
44,2%
11,0%
9 дней
43,5%
10,0%
6,6%
7,8%
33,5%
1,0%
12 дней
37,6%
4,4%
4%
6,3%
32,5%
1,0%
Пример 4
Имплантация клеток согласно данному изобретению мышам с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД, SCID)

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) блюдцах со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A + 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 100 нг/мл ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 500 нм TBP в течение шести дней (стадия 4).
В конце четвертой стадии клетки механически собирались стеклянной пипеткой на 1 мл и далее переносились на не допускающие прикрепления планшеты и культивировались в течение ночи. Получившиеся агрегаты клеток были собраны. Агрегаты, содержащие 5 миллионов клеток, были трансплантированы в почечную капсулу мышей с иммунодефицитом (ТКИД/Bg, животные № 47, 48, 49, 50 и 51). См. фиг.7.
После четырех недель функциональность производящих инсулин клеток в этих образцах ткани была проверена путем введения животным глюкозы с целью вызвать секрецию инсулина. Животным не давали есть 15-20 часов, после чего проводили ретроорбитальный отбор образца крови (до введения глюкозы). Далее каждому животному интраперитонеально вводили глюкозу в дозе около 3 г/кг в 30% растворе декстрозы и приблизительно через 60 минут после введения глюкозы отбирали образец крови. Циркуляционный человеческий С-пептид обнаруживали с применением в сыворотке мышей сверхчувствительных пластин для твердофазного иммуноферментного анализа, предназначенных особо для выявления С-пептида человека (№ по каталогу 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, NH). Определение человеческого C-пептида показывает, что трансплантированные клетки секретируют инсулин.
Человеческий C-пептид определялся в крови животных уже через 4 недели после трансплантации, и его содержание со временем увеличивалось. Данные трансплантации представлены на фиг.7. По итогам месяца человеческий С-пептид (менее 0,2 нг/мл) в ответ на ввод глюкозы удалось обнаружить у 60% животных в группе исследования. Стимулируемый глюкозой уровень человеческого С-пептида в сыворотке крови увеличился в 5-10 раз у трех из четырех мышей после четырех недель. Через двенадцать недель после имплантации средний уровень стимулированного глюкозой уровня человеческого С-пептида в сыворотке крови у мышей с пересаженными клетками превысил 1 мг/мл (n=4).
Пример 5
Альтернативный способ формирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, соэкспрессирующих PDX1 и NKX6.1
Вкратце, клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) блюдцах со средой RPMI, обогащенной 0,2% FBS, 100 нг/мл активина A и 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, обогащенной 0,5% FBS и 100 нг/мл активина A, в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нм PMA, или 100 нм TPB, или 20 нм форбол-12,13-дибутирата (PDBu) (Calbiochem, № по каталогу 524390) в течение шести дней (этап 4)
В качестве контроля отдельные популяции клеток обрабатывали DMEM с высоким содержанием глюкозы, обогащенным 1% B27, 100 нг/мл ноггина и 1 мкМ ингибитора ALK5 II в течение шести дней (стадия 4).
На стадии 4, в день 6 отбирали два экземпляра культур, изображения которых получали с помощью аппарата IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания для каждой лунки снимали по 100 проекций. Измерения общего количества клеток, общего количества клеток, экспрессирующих PDX1, и общего количества клеток, экспрессирующих NKX6.1, были получены для каждой лунки с использованием программного обеспечения IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общее количество клеток, экспрессирующих белки PDX1 и NKX6.1, было представлено в процентах от общей популяции клеток. Как показано на фиг.8, в группах, подвергавшихся обработке активатором протеинкиназы С, резкое увеличение популяции клеток, экспрессирующих NKX6.1/PDX1, произошло при более низкой эффективной концентрации (около 20 нм) по сравнению с образцами, полученными после контрольной обработки. В 6-й день этапа 4 в популяции клеток, обрабатывавшейся активатором протеинкиназы С, или в контрольной популяции 92%±4% популяции экспрессировали PDX1. В группе, обрабатывавшейся активатором протеинкиназы С, 75%±5% клеток, экспрессирующих PDX1, экспрессировали и NKX6.1. При этом в популяциях, обработанных только ноггином и ингибитором бета-рецептора TGF (контроль), только 58%±5% клеток, экспрессирующих PDX1, экспрессировали NKX6.1. В присутствии активатора протеинкиназы С 20% клеток, экспрессирующих NKX6.1, соэкспрессировали маркер пролиферации, EdU (Click-iT EdU Imaging Kit, Invitrogen, Cat#C10337).
Этот пример показывает, что активатор протеинкиназы С можно использовать в сочетании с ноггином и ингибитором бета-рецептора TGF при относительно низкой эффективной концентрации (~20 нМ) в целях содействия повышению экспрессии Nkx6.1, а также увеличению процента клеток, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1.
Пример 6
Обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, активаторами протеинкиназы С
Вкратце, клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировали в покрытых MATRIGEL (раствор 1:30) блюдцах со средой RPMI, обогащенной 0,2% FBS, 100 нг/мл активина A и 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, обогащенной 0,5% FBS и 100 нг/мл активина A, в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. T1: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина + 50 нг/мл FGF10 в течение четырех дней (стадия 3, T1), или
T2: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Noggin + 50 нг/мл FGF10 + 100 нМ ТРВ в течение четырех дней (стадия 3, T2), затем
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II в течение шести дней (стадия 4)
Как показано на фиг.9, в клетках, обработанных TPB (T2), наблюдалось значительное сокращение маркеров эндодермы поджелудочной железы PDX1, NKX6.1 и PTF1 alpha по сравнению с контрольной группой (T1). При помощи иммуногистохимии NKX6.1 обнаружить не удалось. Эти данные позволяют предположить, что обработка активатором протеинкиназы на стадии 3 не способствует формированию клеток, соэкспрессирующих PDX1/NKX6.1.
Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включаются в настоящий документ. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.