ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ, ИНГИБИРУЮЩИЕ АНГИОГЕНЕЗ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CHIMERIC PROTEINS, INHIBITING ANGIOGENESIS, AND THEIR APPLICATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к генно-инженерной технологии, в особенности к последовательностям ДНК, кодирующим рекомбинантные химерные белки, ингибирующие ангиогенез; кодируемым химерным белкам; их терапевтическому применению; лекарственной композиции, содержащей химерные белки.
Уровень техники
Ангиогенез представляет собой процесс роста новых кровеносных сосудов из существующих кровеносных сосудов. Наиболее зрелая сосудистая система находится в состоянии покоя, ангиогенез может происходить при некоторых физиологических и патологических механизмах, таких как опухоль, диабетические ретинопатии, артрит, анемические органы, эндометриальная гиперплазия и т.д. Ангиогенез играет ключевую роль в быстром росте опухолевых клеток во время развития опухолей (Hanahan and Folkman: Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell, 1996, 86:353-364). Исследования на моделях рака у животных и клинические испытания на людях уже доказали, что ингибирование опухолевого ангиогенеза могло эффективно ингибировать рост и развитие опухоли, продлевая, таким образом, жизнь пациента. Ангиогенез опосредуется и регулируется многими биологическими факторами. Основными клетками, опосредующими ангиогенез, являются эндотелиальные клетки сосудов, которые образуют внутреннюю стенку кровеносных сосудов. Различные факторы роста могут связываться с важнейшими рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток сосудов, регулировать клеточные процессы посредством передачи внутриклеточного сигнала и, таким образом, опосредовать ангиогенез.
Среди различных факторов роста наиболее важным фактором ангиогенеза является VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста) (Ferrara: VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor, Nat. Rev. Cancer, 2002, 10: 795-803; Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 sumppl): 10-14). VEGF может секретироваться многими типами клеток, но часто суперэкспрессируется в клетках опухолей. VEGF функционирует, связываясь с определенными рецепторами. Существуют два основных типа рецепторов: FLT-1 (ФМС-подобная тирозинкиназа) и KDR. В терминах молекулярных структур эти два рецептора состоят из трех функциональных участков: первый участок является внеклеточной областью, состоящей из семи иммуноглобулинподобных (Ig-подобных) доменов (d1-d7), которая обладает специфической активностью по отношению к VEGF и является ключевой областью связывания VEGF; второй участок является трансмембранной областью, содержащей гидрофобные аминокислотные остатки; третий участок является внутриклеточным доменом, который содержит функциональную группу тирозинкиназ, которая переходит в фосфорилированное состояние после того, как рецептор активируется VEGF, запуская передачу внутриклеточного сигнала, который приводит к функциональным эффектам в эндотелиальных клетках и ангиогенезу.
FLT-1 и KDR в основном распределены в эндотелиальных клетках сосудов. Таким образом, активность в отношении эндотелиальных клеток сосудов, опосредуемая через VEGF, высоко специфична. VEGF способствует дифференцировке эндотелиальных клеток, направляет передвижение эндотелиальных клеток, ингибирует апоптоз, вызывает морфологические изменения сосудов и является высоко эффективным про-ангиогенным фактором.
Уровень экспрессии VEGF в опухолевых клетках значительно выше, чем в нормальных тканях. Кроме того, быстрый рост опухолевых клеток очень часто приводит к гипоксии внутри опухоли, и гипоксия в дальнейшем индуцирует экспрессию VEGF. Таким образом, VEGF является ключевым фактором, вызывающим ангиогенез в опухоли. Многие исследования на животных показали, что ингибирование связывания VEGF с его рецепторами могло эффективно ингибировать ангиогенез в опухоли и, следовательно, ингибировать опухолевый рост. При других заболеваниях, имеющих отношение к ангиогенезу, таких как диабетические ретинопатии, артрит и т.д., VEGF также тесным образом вовлечен в развитие этих заболеваний (Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 suppl): 10-14).
Так как VEGF играет решающую роль в развитии опухолей и при других заболеваниях, белки или химические соединения, специфически ингибирующие VEGF, обладают терапевтическим потенциалом. Например, исследования показали, что нейтрализующие антитела к VEGF были способны эффективно ингибировать рост опухолей (Jain: Tumor angiogenesis and accessibility: role of vascular endothelial growth factor, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 suppl): 3-9). Поэтому разработка новых эффективных ингибиторов VEGF - важная клиническая исследовательская работа. Так как FLT-1 и KDR являются природными молекулами, связывающимися с VEGF, были проведены исследования, в которых изучали антиангиогенную роль растворимого FLT-1 (внеклеточного домена FLT-1) и растворимого KDR (внеклеточного домена KDR) (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002:2019-2023). Растворимый FLT-1 мог эффективно ингибировать рост эндотелиальных клеток сосудов in vitro, но время его полураспада в сыворотке крови было коротким, и нельзя было достичь эффективных концентраций в сыворотке. Таким же образом, растворимый KDR также обладал способностью тормозить рост эндотелиальных клеток сосудов in vitro, но его противоопухолевая активность на животных моделях была неудовлетворительной (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002:2019-2023).
Чтобы преодолеть недостатки уровня техники, настоящее изобретение обеспечивает новые химерные белки, содержащие различные фрагменты FLT-1 и KDR, предназначенные для эффективного блокирования биологической активности VEGF и ингибирования ангиогенеза.
Раскрытие изобретения
1-й аспект изобретения должен обеспечить новые рекомбинантные химерные белки, которые блокируют биологическую активность VEGF и ингибируют ангиогенез.
2-й аспект изобретения должен обеспечить последовательности ДНК, кодирующие указанные выше химерные белки.
3-й аспект изобретения должен обеспечить векторы, содержащие последовательности кодирующей ДНК химерных белков и их рекомбинантных хозяев.
4-й аспект изобретения должен обеспечить применение химерных белков при получении лекарственных средств, которые блокируют активность VEGF и ингибируют ангиогенез, и лечебную композицию, содержащую химерные белки и подходящие медицинские носители, и их лекарственную форму, а также терапевтическое применение лечебной композиции.
nd
rd
Важными пунктами изобретения являются разработка и создание серии химерных белков с различными фрагментами FLT-1 и KDR, которые предпочтительно содержат Fc человеческого иммуноглобулина (метод конструирования показан на фигуре 1); затем селекция химерного белка с высокой аффинностью к VEGF с помощью анализов, включающих анализ связывания VEGF, и, в конечном итоге, получение подходящего ингибитора VEGF. Конструирование химерного белка основано на общепринятых технологиях молекулярного клонирования. Подробную экспериментальную методологию можно найти в лабораторных справочниках, например Molecular Cloning, the 2 or the 3 edition (Joseph Sambrook).
В соответствии с настоящим изобретением химерные белки, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, содержат различные фрагменты рецепторов VEGF FLT-1 и KDR, где химерные белки выбирают из следующих групп:
а) состоящий из 1-го Ig-подобного домена KDR, 2-го Ig-подобного домена FLT-1 и 3-го Ig-подобного домена KDR, обозначенный как KDRd1-FLTd2-KDRd3;
b) состоящий из 2-го Ig-подобного домена FLT-1 и 3-го и 4-го Ig-подобных доменов KDR, обозначенный как FLTd2-KDRd3,4;
с) состоящий из 2-го Ig-подобного домена FLT-1, 3-го Ig-подобного домена KDR и 4-го Ig-подобного домена FLT-1, обозначенный как FLTd2-KDRd3-FLTd4;
d) состоящий из 2-го Ig-подобного домена FLT-1 и 3-го, 4-го и 5-го Ig-подобных доменов KDR, обозначенный как FLTd2-KDRd3,4,5
е состоящий из 2-го Ig-подобного домена FLT-1, 3-го Ig-подобного домена KDR и 4-го и 5-го Ig-подобных доменов FLT-1, обозначенный как FLTd2-KDRd3-FLTd4,5.
Аминокислотная последовательность FLTd2 показана в виде SEQ ID NO.1.
Аминокислотная последовательность FLTd4 показана в виде SEQ ID NO.2.
Аминокислотная последовательность KDRd1 показана в виде SEQ ID NO.3.
Аминокислотная последовательность KDRd3 показана в виде SEQ ID NO.4.
Аминокислотная последовательность KDRd4 показана в виде SEQ ID NO.5.
Термин FLT, используемый здесь, относится к последовательности FLT-1, KDR относится к последовательности KDR; di относится к i-му Ig-подобному домену FLT-1 или KDR.
Предпочтительно настоящее изобретение обеспечивает класс химерных белков, которые содержат Fc человеческого иммуноглобулина и которые выбирают из следующих групп:
FP2', обозначенный как KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fc;
FP3', обозначенный как FLTd2-KDRd3,4-Fc;
FP4', обозначенный как FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc;
FP5', обозначенный как FLTd2-KDRd3,4,5-Fc;
FP6', обозначенный как FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fc.
Термин «Fc», используемый здесь, относится к Fc-фрагменту человеческих иммуноглобулинов, который происходит из FC иммуноглобулинов человека, таких как иммуноглобулины классов IgG, IgM и IgA и подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Fc-участок может быть полноразмерной последовательностью Fc или фрагментом последовательности Fc из СН2, СН3 или шарнирной области.
Как показано на фигуре 1, химерный белок, известный в этой области техники (обозначенный как FP1'), состоит из 2-го Ig-подобного домена FLT-1 (FLTd2), 3-го Ig-подобного домена KDR (KDRd3) и Fc человеческого иммуноглобулина. Химерный белок FP2', обеспеченный в настоящем изобретении, имеет дополнительную аминокислотную последовательность 1-го Ig-подобного домена KDR (KDRdI) в FP1', который увеличивает количество мест связывания VEGF и повышает аффинность к VEGF. Химерные белки FP3' и FP4' имеют дополнительные последовательности 4-го Ig-подобного домена KDR (KDRd4) или 4-го Ig-подобного домена FLT-1 (FLTd4) на основе FP1', соответственно FP5' и FP6' имеют дополнительные 4-й и 5-й Ig-подобные домены KDR (KDRd4,5) и 4-й и 5-й Ig-подобные домены FLT-1 (FLT-1 d4,5) на основе FP1', соответственно. Эти дополнительные последовательности могли помочь в димеризации химерных белков, скручиванию 3-мерных структур, благоприятных для связывания VEGF и усиления аффинности к VEGF.
Более предпочтительно настоящее изобретение обеспечивает химерный белок FP3 с аминокислотной последовательностью, показанной как SEQ ID NO.7.
Химерные белки, описанные в изобретении, могут быть получены с помощью общепринятых технологий рекомбинантных ДНК. Во-первых, можно получить рекомбинантные ДНК, кодирующие последовательности указанных выше химерных белков, где последовательности кодирующих ДНК LTP-1 и KDR доступны в базе данных GenBank, NCBI (National Center for Biotechnology Information, Национальный Центр Биотехнологической Информации). Во-вторых, последовательности кодирующих ДНК указанных выше химерных белков клонируют в векторы после синтеза в ПЦР. Векторы, указанные в заявке, могли быть обычно применяемыми в молекулярной биологии плазмидами, вирусами или фрагментами ДНК. Чтобы обеспечить секрецию из клеток, в терминальную последовательность ДНК указанных выше химерных белков вставляют секреторную сигнальную последовательность. Векторная последовательность включает промоторный участок, который обеспечивает транскрипцию гена, сигналы начала и остановки трансляции белка и полиА-последовательность. Вектор содержит ген устойчивости к антибиотикам для размножения бактерий. Кроме того, вектор содержит ген селекции эукариотических клеток для селекции стабильно трансфицированных клеточных линий.
Так как у всех Ig-подобных доменов FLT-1 и KDR не существует абсолютной границы аминокислотных последовательностей, длина последовательностей этих фрагментов варьировала. Таким образом, последовательности химерных белков, описанных в настоящем изобретении, могли иметь такие же различия. Должно быть понятно, что все эти последовательности не должны рассматриваться вне объема настоящего изобретения.
После конструирования плазмид указанных выше химерных белков плазмиды можно было применять для трансфекции клеток хозяина, чтобы экспрессировать химерные белки. Существует множество экспрессионных систем для таких химерных белков, включая (но, не ограничиваясь только ими) клетки млекопитающих, бактерии, дрожжи и клетки насекомых. Среди них клетки млекопитающих и насекомых являются эукариотическими клетками, тогда как бактериальные и дрожжевые клетки являются прокариотическими клетками. Белки, экспрессированные клетками млекопитающих, гликозилируются. Так как химерные белки настоящего изобретения содержат участки гликозилирования, клетки млекопитающих являются лучшими клетками для их экспрессии. Существует множество типов клеток млекопитающих для продукции белков в широких масштабах, например клетки 293, клетки СНО, клетки SP20, клетки NS0, клетки COS, клетки ВНК, клетки PerC6 и т.д. Также для экспрессии и продукции этих белков можно применять и многие другие типы клеток, и они также составляют объем настоящего изобретения. Плазмиды, кодирующие указанные выше химерные белки, можно трансфицировать в клетки. Методы трансфекции включают, но не ограничиваются только ими, электропорацию, трансфекцию, опосредованную липосомами, преципитацию в присутствии ионов кальция и т.д.
Также для экспрессии этих химерных белков можно было применять экспрессионные системы, не являющиеся клетками млекопитающих, например бактерии, дрожжи, клетки насекомых и т.д. Все они должны рассматриваться как объем настоящего изобретения. Эти экспрессионные системы дают более высокий выход продукции белков по сравнению с клетками млекопитающих, однако они продуцируют белки без гликозилирования или с углеводными цепочками, гликозилированными не так, как это делают клетки млекопитающих.
После экспрессии химерных белков их концентрацию в культуральной клеточной среде можно измерить с помощью ELISA или других анализов. Так как химерные белки содержат иммуноглобулиновый Fc-участок, их можно очистить с помощью аффинной хроматографии на колонке с протеином А.
После того как различные химерные белки были получены из культуральной среды рекомбинантных хозяйских клеток, их анализировали в экспериментах по связыванию с VEGF для сравнения их аффинностей к VEGF. Их активности по отношению к связыванию с VEGF затем были проанализированы в экспериментах по пролиферации эндотелиальных клеток сосудов человека, индуцируемой VEGF. Результаты экспериментов показали, что все химерные белки, сконструированные в соответствии с настоящим изобретением, могут связывать VEGF с высокими аффиннбстями (фигура 2) по сравнению с FP1', прототипом, известным ранее в этой области техники. Кроме того, они могли эффективно блокировать активацию эндотелиальных клеток сосудов с помощью VEGF и ингибировать рост эндотелиальных клеток. Дальнейшие эксперименты показали, что FP3 обладает самой лучшей блокирующей VEGF активностью и является наиболее эффективным VEGF-блокирующим химерным белком настоящего изобретения.
Таким образом, химерные белки, сконструированные в настоящем изобретении, обладают наилучшими активностями по отношению к VEGF и все они обладают биологической активностью по отношению к ангиогенезу, следовательно, они могут применяться при лечении заболеваний, имеющих отношение к ангиогенезу и VEGF, включая, но не ограничиваясь только ими, различные опухоли, диабетические ретинопатии, артрит, анемию, эндометриальную гиперплазию и т.д.
Чтобы затем доказать антиангиогенный эффект химерных белков in vivo, были также проведены некоторые модельные эксперименты на животных. Результаты этих экспериментов показали, что в модели меланомы B16F10 у мышей лини BALB/C nude и в мышиной модели ксенотрансплантанта опухоли простаты человека РС-3 химерные белки настоящего изобретения были лучше, чем FP1', прототип, известный ранее в этой области техники, и эффективно ингибировали рост опухоли и делали жизнь животных более продолжительной. Таким образом, химерные белки настоящего изобретения обладают высокой противоопухолевой активностью.
Настоящее изобретение также обеспечивает лечебные композиции, включающие указанные выше химерные белки и подходящие медицинские носители. Указанные композиции могут быть составлены в любые лекарственные формы в соответствии с общепринятыми методологиями составления рецептуры, предпочтительно в лекарственной форме для инъекции и более предпочтительно в лиофилизированной форме.
Краткое описание фигур
Фигура 1 демонстрирует структуры пяти химерных белков в соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения и структуру FP1, прототипа, известного ранее в этой области техники. Они сконструированы с помощью различных фрагментов FLT-1, KDR и иммуноглобулинового Fc-участка, используя генно-инженерные технологии.
Фигура 2 демонстрирует результаты связывания VEFG пятью химерными белками предпочтительного воплощения настоящего изобретения в сравнении с их прототипом FP1, где значения оптического поглощения OD имеют отношение к сигналам связывания химерных белков с VEGF. Результаты показали, что все пять химерных белков связывали VEGF с более высокими аффинностями, чем FP1, среди них FP3 обладает самой высокой аффинностью.
Фигура 3 показывает, что химерные белки настоящего изобретения могли более эффективно по сравнению с FP1 ингибировать in vivo рост эндотелиальных клеток сосудов человека.
Фигура 4 показывает, что химерный белок FP3 мог эффективно подавлять у мышей опухолевый рост меланомы B16F10.
Фигура 5 показывает, что химерный белок FP3 мог эффективно подавлять у мышей опухолевый рост простаты человека РС-3.
Фигура 6 сравнивает активности химерного белка FP3 настоящего изобретения и его прототипа FP1, направленные против роста опухолей у мышей.
Осуществление изобретения
Следующие примеры обеспечивают детальное описание конструирования, экспериментальной методологии и применения химерных белков, описанных в изобретении. Но эти примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие объем охраны настоящего изобретения.
Воплощение 1: Клонирование последовательностей ДНК, кодирующих химерные белки, и конструирование рекомбинантных векторов
Последовательности ДНК, кодирующих различные химерные белки настоящего изобретения, не относящиеся к последовательности ДНК, кодирующей иммуноглобулиновый Fc-фрагмент, происходят из кДНК FLT-1 и KDR. Так как FLT-1 и KDR в основном экспрессируются в эндотелиальных клетках сосудов, из эндотелиальных клеток аллантоисной вены человека (HUVEC) экстрагировали суммарную РНК, используя набор RNA purification kit ("QIAGEN"); затем синтезировали из РНК с помощью набора AMV Reverse Transcriptase ("Promega") синтезировали кДНК; затем с различными праймерами амплифицировали разные фрагменты FLT-1 и KDR, в заключении последовательности FLT-1, KDR и иммуноглобулинового Fc-фрагмента человека (IgG1 Fc) сливали с помощью ПЦР вместе, чтобы получить последовательности рекомбинантных ДНК, кодирующих разные химерные белки. Структура всех шести химерных белков (включая прототип FP1) показаны на фигуре 1.
Пример 1. Конструирование последовательности, кодирующей FP3, и рекомбинантного вектора
7
Клетки HUVEC ("Clonetics") культивировали в среде EGM-2 ("Clonetics") во флаконах Т-175. Клетки в количестве 1×10 штук собирали и подвергали экстракции суммарной РНК с помощью набора RNA purification kit фирмы "QIAGEM" и затем синтезировали кДНК, используя набор Invitrogen cDNA. Продукт кДНК хранили при -80°С до использования. Для амплификации различных доменов FLT-1 и KDR из кДНК HUVEC методом ПЦР применяли следующие специфические праймеры.
Fc-фрагмент IgG1 человека амплифицировали методом ПЦР, используя следующие специфические праймеры из набора Lymph Nodes cDNA ("BD Clontech").
Праймеры:
FLT-1 d2 (прямой): 5'-cctttcgtagagatgtacagtga-3'
FLT-1 d2 (обратный): 5'-tatgattgtattggtttgtccat-3'
KDR d3-4 (прямой): 5'-gatgtggttctgagtccgtctca-3'
KDR d3-4 (обратный): 5'-cggtgggacatacacaaccaga-3'
Fc IgG1 человека (прямой): 5'-gacaaaactcacacatgcccact-3'
Fc IgG1 человека (обратный): 5'-tcatttacccggagacagggagag-3'
Ig-подобные домены Fc-фрагмента IgG1 человека были амплифицированы методом ПЦР в условиях денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 56°С в течение 45 секунд, наращивания при 72°С в течение 2 минут с общим количеством циклов 30. Продукты ПЦР затем клонировали в плазмиду pCR2.1 ("Invitrogen") с использованием набора ТА cloning kit. После трансформации в Е.coli (JM109) собирали белые колонии и культивировали их в течение ночи в среде LB. Плазмиды ДНК получали с помощью набора Qiagen kit и подвергали ферментативному перевариванию и секвенированию ДНК.
кДНК FLT-1, KDR и IgG Fc были слиты вместе с помощью «сшивающей» ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайт EcoRI. После переваривания EcoRI, фрагмент ДНК очищали с помощью набора Qiagen purification kit и клонировали в плазмиду pcDNA3.1. После трансформации в Е.coli (JM109) собирали позитивные колонии и культивировали их в течение ночи в среде LB. Плазмиды ДНК экстрагировали с помощью набора Qiagen purification kit и затем подвергали ферментативному перевариванию и секвенированию ДНК. Полученная последовательность, кодирующая FP3, показана как SEQ ID NO.6. Плазмиды подтвержденного состава использовали для трансфекции клеток 293 или клеток СНО для получения стабильных клеточных линий, экспрессирующих FP3. Аминокислотная последовательность FP3 показана как SEQ ID NO.7.
Пример 2. Конструирование гена FP1 и рекомбинантного вектора
FP1 конструировали так же, как в примере 1. Единственным различием было то, что целевая рекомбинантная ДНК была сконструирована слиянием 2-го Ig-подобного домена FLT-1, 3-го Ig-подобного домена KDR и того же IgG1 Fc человека, что и в примере 1.
Пример 3. Конструирование гена FP2 и рекомбинантного вектора
FP2 конструировали так же, как в примере 1. Единственным различием было то, что целевая рекомбинантная ДНК была сконструирована слиянием 1-го Ig-подобного домена KDR, 2-го Ig-подобного домена FLT-1, 3-го Ig-подобного домена KDR и того же IgG1 Fc человека, что и в примере 1.
Пример 4. Конструирование гена FP4 и рекомбинантного вектора
FP4 конструировали так же, как в примере 1. Единственным различием было то, что целевая рекомбинантная ДНК была сконструирована слиянием 2-го Ig-подобного домена FLT-1, 3-го Ig-подобного домена KDR, 4-го Ig-подобного домена FLT-1, и того же IgG1 Fc человека, что и в примере 1.
Пример 5. Конструирование гена FP5 и рекомбинантного вектора
FP5 конструировали так же, как в примере 1. Единственным различием было то, что целевая рекомбинантная ДНК была сконструирована слиянием 2-го Ig-подобного домена FLT-1, с 3-го по 5-ый Ig-подобного домена KDR и того же IgG1 Fc человека, что и в примере 1.
Пример 6. Конструирование гена FP6 и рекомбинантного вектора
FP6 конструировали так же, как в примере 1. Единственным различием было то, что целевая рекомбинантная ДНК была сконструирована слиянием 2-го Ig-подобного домена FLT-1, 3-го Ig-подобного домена KDR, 4-го и 5-го Ig-подобного домена FLT-1 и того же IgG1 Fc человека, что и в примере 1.
Воплощение 2: Экспрессия химерных белков в клетках
Пример 7. Экспрессия химерного белка FP3
После конструирования указанных выше рекомбинантных плазмид с помощью набора Qiagen's plasmid kit были получены плазмидные ДНК высокого качества и затем их трансфицировали в клетки 293 (АТСС) с помощью набора FUGEN6 transfection kit ("Roche"). Чтобы экепрессировать химерные белки, в зависимости от необходимого количества белков использовали два различных метода.
Первый метод был методом транзиентной трансфекции. С помощью этого метода продуцировали небольшое количество химерных белков. Вначале клетки 293 культивировали в среде DMEM, содержавшей 10%-ную FBS, в чашках для тканевых культур. При 60-80%-ной конфлюентности клеток в культуру добавляли смесь плазмидной ДНК и реагент FUGEN6. Культуральную среду на следующий день заменяли на среду DMEM, не содержавшую сыворотку, и клетки продолжали культивировать в течение еще 3 дней перед тем, как собрать среду. Эта среда содержала экспрессированные химерные белки, и концентрацию химерных белков анализировали с помощью метода ELISA.
Второй метод был методом стабильной трансфекции. Было установлено, что стабильная клеточная линия продуцирует большие количества химерных белков. Хозяйские клетки были также клетками 293 (АТСС). Стадия трансфекции рекомбинантной плазмиды была той же, что и при транзиентной трансфекции, описанной выше. Однако на 2-й день клетки культивировали в среде DMEM, содержавшей неомицин, и клонировали методом предельного разведения. Через приблизительно 21 день неомицинустойчивые клоны собирали и культивировали в более крупном масштабе. На заключительной стадии химерные белки экспрессировали во встряхиваемых флаконах. Концентрацию химерных белков анализировали методом ELISA.
FP3 очищали из культуральной среды с помощью анализов, включающих аффинную хроматографию и гельфильтрацию и т.п. Молекулярная масса FP3 составляла 140 кДа.
Пример 8. Экспрессия других химерных белков
Химерные белки FP1, FP2, FP4, FP5 и FP6 получали в соответствии с методами, описанными в примере 7.
Воплощение 3: Эксперимент по связыванию химерных белков с VEGF
Аффинность химерных белков по отношению к VEGF определяли с помощью анализа связывания VEGF настоящего изобретения. Во-первых, рекомбинантные VEGF-белки ("Chemicon") наносили на поверхность лунок 96-луночного планшета для ELISA и затем с помощью 5%-ного раствора молока блокировали неспецифические места связывания белков. Во-вторых, в каждую лунку вносили различные концентрации разных химерных белков и инкубировали в течение 2 часов при 37°С. После промывания в каждую лунку вносили кроличьи антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированным с пероксидазой хрена ("Sigma"), и в заключение в планшет добавляли колориметрические субстраты фермента. Считывание поглощения OD проводили с помощью планшетного ридера ELISA. Более высокие значения OD указывали на более прочную аффинность связывания химерных белков с VEGF.
Как показано на фигуре 2, все пять химерных белков, сконструированных и экспрессированных в воплощениях настоящего изобретения, были способны к связыванию с VEGF и обладали лучшей аффинностью по сравнению с прототипом FP1. Определяли связывание при концентрациях ниже, чем 1 мкг/мл. Предпочтительно FP3 обладал наилучшей аффинностью и был лучшим ингибитором VEGF. Его концентрация для полумаксимального связывания была примерно в 5 раз ниже, чем у FP1. FP5 обладал немного меньшей аффинностью к
VEGF по сравнению с FP3. Этот результат предполагает, что 4-й Ig-подобный домен
KDR мог значительно повысить блокирующую активность химерного белка по отношению к VEGF. Однако добавление большего количества доменов KDR, как было в случае 5-го Ig-подобного домена, не смогло дополнительно повысить ингибиторный эффект по отношению к VEGF. Три другие химерных белка демонстрировали более низкие аффинности по сравнению с FP3 и FP5, но более высокие аффинности, чем FP1.
Воплощение 4: Химерные белки эффективно ингибировали пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов человека in vitro
Это предпочтительное воплощение настоящего изобретения должно доказать, что химерные белки могли эффективно блокировать индуцируемый VEGF рост эндотелиальных клеток сосудов. В эксперименте клетки HUVEC ("Clonetics") засевали в 96-луночный планшет для тканевых культур в среду ЕВМ, содержавшую 2%-ную FBS и 15 нг/мл VEGF. В планшет вносили различные количества супернатанта клеток 293, содержавшего химерные белки. В качестве негативного контроля использовали среду нетрансфицированных клеток 293, не содержавшую химерные белки. Все клетки HUVEC культивировали при 37°С в течение 3 дней перед тем, как определяли плотность клеток с помощью клеточного счета.
Эксперимент по пролиферации HUVEC показал, что все пять химерных белков, сконструированных в соответствии с настоящим изобретением, могли ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов более эффективно, чем прототип FP1 (фигура 3). Так как в эксперименте пролиферацию клеток HUVEC индуцировали с помощью активации VEGF, поэтому предположили, что все пять химерных белков были способны ингибировать рецепторную активацию VEGF и все они обладали антиангиогенной активностью. Среди них FP3 обладал наилучшим ингибирующим эффектом нарост клеток HUVEC с IC50, составляющей около 3 нг/мл. IC50 для прототипа FP1 была равна около 12 нг/мл и IC50 для FP2, FP4, FP5 и FP6 были равны приблизительно 5-8 нг/мл.
Воплощение 5: Химерные полипептиды ингибировали опухолевый рост у мышей
Пример 9. Получение композиции для инъекций, содержащей химерные белки
Композицию для инъекций получали в соответствии с любыми общепринятыми
методологиями, в композициях для инъекций применяли 24 мг/мл FP3, 5 мМ РВ, 100 мМ NaCl и 20%-ную сахарозу.
Пример 10. Химерные белки эффективно ингибировали рост клеток меланомы B16F10 у мышей
Одним из применений химерных белков настоящего изобретения в качестве ингибиторов VEGF является их использование в противораковой терапии. Из-за своего высоко эффективного блокирующего эффекта, направленного на VEGF, FP3 был выбран для проведения противоопухолевых экспериментов на животных моделях.
5
В качестве животной модели выбирали мышей с клетками меланомы B16F10, которая является разновидностью быстро растущих опухолевых клеток. В эксперименте мышам линии BALB/C nude сначала вводили подкожно в заднюю часть 1×10 клеток B16F10 в 0,05 мл. Затем очищенный химерный белок вводили внутрибрюшинно в количестве 400 мкг на каждую мышь (средний вес мыши - 22 г) два раза в неделю. Мышам, служившим негативным контролем, вводили такое же количество очищенного иммуноглобулинового Fc-фрагмента человека. Кривые роста опухолей, приведенные на фигуре 4, указывают на то, что химерный белок FP3 эффективно ингибировал рост меланомных клеток (Р<0,01).
Пример 11. Химерные белки эффективно ингибировали рост ксенотрансплантированных раковых клеток простаты РС-3 у мышей
5
3
Ксенотрансплантантная модель роста опухолевых клеток человека у безволосых мышей является одной из животных моделей, которая наиболее приближена к опухолям человека. Безволосые мыши лишены иммунного отторжения, таким образом многие опухолевые клетки человека могли расти у безволосых мышей и образовывать опухоль. Химерный белок FP3 анализировали на ингибирование роста опухолевых клеток простаты РС-3 человека (АТСС) у мышей линии BALB/C nude. В этой модели вначале мышам вводили подкожно в заднюю часть 1×10 клеток в 0,05 мл. Затем очищенный химерный белок вводили внутрибрюшинно в количестве 400 мкг на каждую мышь два раза в неделю. Мышам, служившим негативным контролем, вводили такое же количество очищенного иммуноглобулинового Fc-фрагмента человека. Экспериментальные результаты показаны на фигуре 5. У контрольных мышей через 45 дней после имплантации опухоль выросла более чем на 1000 мм. Однако у мышей, которым вводили химерные белки, FP3 почти полностью ингибировал рост опухоли (Р<0,01), что демонстрирует значительный терапевтический противоопухолевый эффект.
Воплощение 6: Сравнительное изучение влияния химерных белка FP3 и белка FP1, известного ранее в этой области техники, на рост опухоли у мышей
5
Чтобы, кроме того, продемонстрировать чрезвычайно высокую противораковую активность FP3, сравнивали эффекты FP1 и FP3 в эксперименте по росту опухоли. Было выбрано десять здоровых мышей линии BALB/C nude и каждой мыши подкожно в заднюю часть вводили 1×10 клеток глиобластомы С6 крысы в 0,05 мл. Затем 2,5 мг/кг очищенных FP1 и FP3, соответственно, вводили внутрибрюшинно дважды в неделю вплоть до 31 дня. Мышам, служившим негативным контролем, вводили такое же количество очищенного иммуноглобулинового Fc-фрагмента человека. Экспериментальные результаты показаны на фигуре 6. Оба белка FP1 и FP3 обладали значительным терапевтическим эффектом на опухоли. На 35 день объемы опухолей у мышей, которым вводили FP1 и FP3 составляли 1167,3 и 557,6 соответственно, тогда как объем опухоли у контрольных мышей, которым вводили Fc уже достигал 1312,3 на 24 день. Следовательно, FP3 обладал более значительным эффектом (Р<0,05), чем FP1, известный из уровня техники.
Суммируя, можно заключить, что химерные белки, сконструированные в соответствии с настоящим изобретением, обладали высокой аффинностью к VEGF, были способны ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов in vitro и эффективно ингибировали опухолевый рост in vivo. Так как ангиогенез очень важен для роста всех опухолей, химерные белки настоящего изобретения могут применяться в качестве терапевтических средств против многих опухолей.