Исследование симбионтной микробиоты представителей вида Lumbricus terrestris (Linnaeus, 1758) и оценка перспектив использования их в качестве вермикультуры для биодеструкции органических отходов сельскохозяйственного производства

3. Letarov, A. Bacteriophages as a part of the human microbiome. in Bacteriophages in Health and Disease (Hyman and Abedoneds) / A. Letarov / CAB International Press . 2012. pp. 6-20.

4. Minot, S. The human gut virome: inter-individual variation and dynamic response to diet / S. Minot, R. Sinha, J. Chen, H. Li, S.A. Keilbaugh, G.D. Wu, J.D. Lewis, F.D. Bushman // Genome Res. 2011 21:1616-25

5. de Siqueira, R.S. Evaluation of the natural virucidal activity of teas for use in the phage amplification assay / de Siqueira R.S., C.E. Dodd , C.E. Rees // Int J Food Microbiol. 2006. 111:259-262.

6. Куликов, Е.Е. Биоразнообразие и динамика бактериофагов в фекалиях лошадей / А.С. Исаева А.С., Роткина, А.А. Маныкин, А.В. Летаров// Микробиология. 2007. 76, 271-278

7. Golomidova, А. The diversity of coli-phages and coliforms in horse feces reveals a complex pattern of ecological interactions / A. Golomidova Е. Kulikov, А. Isaeva, А. Manykin, А. Letarov // Appl Environ Microbiology. 2007. 73:5975-5981

8. Исаева, А.С. Новый метод высокоразрешающего геномного ПЦР-фингерпринтинга энтеробактерий / А.С. Исаева, Е.Е. Куликов, К.К. Тарасян, Летаров А.В. // Actanaturae. 2010. 2 (1), 82-87

9. Kasman, L.M. Barriers to coliphage infection of commensal intestinal flora of laboratory mice / Kasman, L.M. // Virol J. 2005 Apr 15;2:34.

10. Kasman, L.M. Overcoming the phage replication threshold: a mathematical model with implications for phage therapy / L.M. Kasman, A. Kasman, C. Westwater, J. Dolan, M.G. Schmidt, J.S. Norris // J Virol. 2002. 76:55575564

11. Kulikov, E.E. Isolation and characterization of a novel indigenous intestinal N4-re-lated coliphage vB_EcoP_G7C / E.E. Kulikov,., A.M. Kropinski, A.K. Golomidova // Virology. 2012. 426 (2012) 93-99

12. de Siqueira, R.S. Evaluation of the natural virucidal activity of teas for use in the phage amplification assay / de Siqueira R.S., ., C.E. Dodd , C.E. Rees // Int J Food Micro-biol. 2006. 111:259-262.

УДК 631.472.56

ИССЛЕДОВАНИЕ СИМБИОНТНОй МИКРОБИОТЫ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВИДА LUMBRICUS TERRESTRIS (LINNAEUS, 1758) И ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В КАЧЕСТВЕ ВЕРМИКУЛЬТУРЫ ДЛЯ БИОДЕСТРУКЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА

Романова Елена Михайловна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой «Биология, ветеринарная генетика, паразитология и экология» e-mail: vvr-emr@yandex.ru

Игнаткин Денис Сергеевич, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры «Биология, ветеринарная генетика, паразитология и экология» e-mail: ignatkin82@yandex.ru

Мухитова Минзифа Эминовна, кандидат биологических наук, ассистент кафедры «Биология, ветеринарная генетика, паразитология и экология»

Романов Василий Васильевич, кандидат технических наук, заведующий кафедрой «Информатика»

e-mail: vvr@ugsha.ru

Шленкина Татьяна Матвеевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Биология, ветеринарная генетика, паразитология и экология» e-mail: t-shlenkina@yandex.ru

ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 8(8422) 55-95-38.

ключевые слова: биотрансформация органических отходов, вермикультура, микробиоценоз, симбионтная микробиота, сапрофаги, биогумус.

Статья посвящена исследованию перспектив использования дождевых червей вида L. terrestris в биотехнологии вермикомпостирования органических отходов сельскохозяйственного производства. Охарактеризована структура и численность микробиоты, формирующей кишечный микробиоценоз представителей вида L. terrestris, обитающих в природных биогеоценозах на территории Ульяновской области. Исследована структура микробиоценоза кишечника L. Terrestris, количество симбионтной микробиоты разных функциональных групп, обеспечивающих биодеструкцию органических субстратов, проведено сравнение с микробиотой промышленной вермикультуры E. fetida andrei. Показана перспективность использования L. terrestris в качестве вермикультуры для утилизации органических отходов с высоким содержанием целлюлозы и лигнина.

введение. Широкое видовое разнообразие почвенных организмов - педобион-тов - обеспечивает их устойчивое функционирование за счет самых разнообразных ассоциаций между ними, включая все виды биотических взаимодействий, в которых доминирующая роль принадлежит симбиозу. В почвенной экосистеме дождевые черви принадлежат к мезопедобионтам. Общеизвестна их почвообразующая функция, которая является результатом деятельности их кишечной микробиоты.

На этом примере наиболее ярко проявляется тезис о биологическом равновесии, реализующемся в форме симбиоза (между макроорганизмом - хозяином и кишечной микробиотой), сформировавшегося в ходе эволюции [1]. Микробиоценоз дождевых червей формируется двумя составляющими: пристеночной микробиотой кишечника и микробиотой кишечного содержимого. По данным литературных источников, пристеночная микробиота кишечника дождевых червей представлена микроорганизмами семейств Enterobacteriaceae и Vibrionaceae, населяющими внутреннюю поверхность эпителия и кутикулы всех отделов кишечника [2].

Исследование состава и структуры микробных популяций пищеварительного тракта дождевых червей имеет важное фундаментальное значение с точки зрения генезиса почв и биосферы в целом, поскольку дождевые черви играют ключевую роль в

процессах почвообразования и повышения почвенного плодородия [3, 4]. Прикладная значимость исследований заключается в развитии биотехнологий эффективной утилизации органических отходов, в том числе и отходов сельскохозяйственного производства.

Основываясь на способности дождевых червей биотрансформировать отмершую органику в биогумус, путем селекции была создана вермикультура Eisenia fetida andrei (Bouche, 1972) для промышленного получения биогумуса. Эта вермикультура широко используется во многих странах с мягким климатом. В настоящее время ее считают эталонной вермикультурой и используют при создании новых промышленных гибридных линий, в том числе и в России. В суровых климатических условиях России круглогодичная вермикультура E.f. andrei неэффективна, поскольку требует крытых, отапливаемых помещений [5]. Поэтому поиск эффективной вермикультуры, хорошо адаптированной к Российским реалиям, актуален.

цель работы: исследовать деструктивные способности дождевых червей вида Lumbricus terrestris (Linnaeus, 1758) и оценить перспективы их промышленного использования в качестве вермикультуры для переработки органических отходов животноводства и биогумус.

В задачи исследований входило: выделение из почвенных ценозов Средне-

J-l

w

о

«

x

ц

35 30 25 -20 -15 10 5 0

Исходный субстрат

Содержимое кишечника E. andrei

Содержимое кишечника L. terrestris

Рис. 1 - Количественные показатели микробиоты

волжского региона дождевых червей L. terrestris; их размножение в лабораторных условиях на специально разработанных субстратах; наращивание биомассы, достаточной для проведения вермикультивиро-вания; исследование структуры кишечного микробиоценоза L. terrestris; характеристика функциональных групп микроорганизмов, формирующих ценоз; сравнительные исследования деструктивных способностей вермикультуры L. terrestris и промышленной линии E.f. andrei при переработке отходов животноводства в биогумус.

Материалы и методы исследований. Объектом исследования являлись дождевые черви вида L. terrestris, структура и численность их кишечного микробиоценоза. Для оценки общей численности микроорганизмов в содержимом и стенках кишечника дождевых червей вида L. terrestris мы делали посевы на МПА методом последовательных разведений. Посевы проводили обычным чашечным методом в пятикратной по-вторности. Инкубировали при температуре 370С в термостате в течение 48 часов.

Для оценки численности систематических и физиологических групп микроорганизмов проводили посевы на элективные питательные среды. Учет численности аммонифицирующих микроорганизмов проводили на МПА, нитрифицирующих микроорганизмов - на среде Виноградского, цел-люлозолитических микроорганизмов - на среде Гетчисона, актиномицетов - на крахмально аммиачном агаре, грибов - на среде

Чапека, микроорганизмов, мобилизующих органические фосфаты, - на среде Менки-ной [6].

В качестве субстрата для вермикульти-вирования использовали ферментированный навоз крупного рогатого скота.

Результаты исследований. На первом этапе работы мы оценивали общее количество микробиоты в кишечнике дождевых червей вида L. terrestris и сравнивали с количественными показателями микробиоты в субстрате для вермикультивирования и в кишечном содержимом промышленной линии E.f. andrei.

Сравнительные исследования показали, что кишечный микробиоценоз L. terrestris включал в 1,5 раза больше микроорганизмов, чем ферментированный субстрат, подлежащий переработке, но значительно уступал по количеству симбионтной микро-биоты промышленной линии E.f. andrei. Результаты сравнительной оценки количественных показателей микробиоты представлены на рис. 1.

Исследование численности целлюло-золитической микробиоты.

Дождевые черви по способу питания являются сапрофитами, играющими важную роль в биотическом круговороте. Они осуществляют минерализацию органических соединений, утилизируя разлагающуюся растительную и животную органику, детрит, экскременты и др. Биодеструкцию целлюлозы дождевые черви без симбионт-ной целлюлозолитической микробиоты ки-

О 1 1

« 0,9 -

ч 0,8 -

2 0,7 -

0,6 -

0,5 -

Исходный субстрат Содержимое кишечника Содержимое кишечника

Е.ап&вг L.terrestris

Рис. 2 - Численность целлюлозолитических бактерий

и 1 и

о

« 0,8 -

к

ц 2 0,6 -

0,4 -

0,2 -

0

Исходный субстрат

Содержимое кишечника E.andrei

Содержимое кишечника L. terrestris

Рис. 3 - Численность сапрофитных грибов

шечника осуществлять не могут [7].

Количественные исследования целлюлозолитических бактерий показали, что в содержимом кишечника I. ЬвггвзЬт их численность в 2,7 раза была выше, чем в ферментированном субстрате, и в два раза выше, чем у промышленной вермикультуры Е^ andrei. Результаты представлены на рис. 2.

Исследование численности сапрофитных грибов.

По данным литературы, в ходе вер-микомпостирования субстрата он претерпевает существенные изменения. В нем не только увеличивается общая численность грибов, но и изменяется структура сообщества микромицетов в сторону увеличения доли сапрофитных грибов (ТпсЬоввгта) за счет сокращения доли патогенных грибов [7, 8, 9, 10].

1!

га еа »1

Р и ш  !

00 и

В ходе проведенных исследований нами было установлено, что численность сапрофитных грибов в микробиоценозе кишечника I. ЬвггвзЬт в 2,8 раза больше, чем в исходном субстрате. В кишечном микробиоценозе промышленной вермикультуры Е^ andrei численность сапрофитных грибов достоверно ниже, чем у почвенных червей (рис. 3).

Оценка численности актиномицетов.

Актиномицеты - обязательный компонент кишечного микробиоценоза дождевых червей. Благодаря актиномицетам, вырабатывающим антибиотические вещества, дождевые черви ничем не болеют [11].

По результатам наших исследований, наиболее высокая численность актиномицетов в кишечном микробиоценозе I. ЬвггвзЬт. Численность актиномицетов в

u

w

О

«

X

ц

25 20 15 10 5 0

ИсходныйсубстратСодержимоекишечника Содержимоекишечника

E.andrei L.terrestris

Рис. 4 - Численность актиномицетов

И

О

«

к

ц

25 20 15 10 5 0

Исходный субстрат

Содержимое кишечника E. andrei

Содержимое кишечника L. terrestris

Рис. 5 - Численность микробиоты, мобилизующей органофосфаты

кишечном микробиоценозе промышленной линии E.f. аndrei достоверно ниже, чем у L. terrestris. В субстрате актиномицетов в 2,6 меньше, чем в кишечном микробиоценозе L. terrestris, и в 2 раза меньше, чем у промышленной линии E.f. аndrei (рис. 4.), (р<0,05).

Актиномицеты - активные деструкторы сложных субстратов, которые они преобразуют в вещество гумуса [12].

Численность микробиоты, разлагающей органофосфаты.

Органические соединения фосфора разлагаются бактериями родов Pseudomonas, Bacillus (B. megaterium, B. mes-entericus), грибами, некоторыми актиноми-цетами, дрожжами (Candida, Saccharomyces, Rhodotorula и другие) [12].

По результатам наших исследований в

кишечном микробиоценозе L. terrestris микробиоты, мобилизующей органофосфаты, достоверно меньше, чем в микробиоценозе кишечника промышленной линии E.f. andrei, однако в 1,7 раза больше, чем в субстрате, подлежащем переработке (р<0,05); Результаты приведены на рис. 5.

По данным литературных источников, фосфор находится в почве в виде нерастворимых органических и минеральных соединений, на 95% недоступных растениям [13], только благодаря эффективной работе сим-бионтной микробиоты, которая переводит их в растворимое состояние, фосфор становится доступным.

Оценка численности аммонифицирующей микробиоты.

Биодеструкцию белков в аммиачный азот осуществляют в основном микроор-

1!

£ & ES SS »1

Si

р и ш Sä ;ii H  i

са s!

ганизмы, относящиеся к родам: Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa), Proteus (P.vulgaris), Bacillus (B. mycoides, B. subtilis, B. cereus) и Closstridium (C. putrificus, C. spo-rogenes), а также актиномицеты и грибы, выделяющие протеолитические ферменты, расщепляющие белки до аминокислот, которые в клетках дезаминируются с образованием аммиака, органических кислот и других продуктов [12].

Исследование численности аммонифицирующей микробиоты показало, что в микробиоценозе L. terrestris ее содержание колеблется на уровне 9-11 млн. КОЕ/г, что достоверно меньше, чем в содержимом кишечника промышленной линии E.f. andrei, но значительно выше (в 1,7 раза), чем в субстрате, подлежащем биодеструкции. Результаты представлены на рис. 6.

Оценка численности нитрифицирую-

щей микробиоты.

Нитрифицирующая микробиота является одной из важнейших для дождевых червей групп микроорганизмов, поскольку защищает их организм от повышенных концентраций аммиака. Нитрификато-ры - это в основном бактерии семейства Nitrobactericidae, которые в два этапа осуществляют окисление аммиака до азотной кислоты [8, 12].

При оценке численности нитрифицирующей микрофлоры в кишечном микробиоценозе I. terrestris ее содержание колеблется и составляет около 3 млн. КОЕ/г, что в 1,3 раза больше, чем в субстрате, подлежащем деструкции, но значительно меньше, чем в микробиоценозе промышленной линии (р<0,05) (рис. 7).

Не все микроорганизмы, попадая в кишечный тракт дождевых червей, в нем

U 25 1

О

20 -

ч

S 15 -

10 -

5

0

Исходный субстрат

Содержимое кишечника E. andrei

Содержимое кишечника L. terrestris

Рис. 6 - Численность аммонифицирующей микробиоты

U

W

О

«

к

Ч

25 20 15 10 5 0

Исходный субстрат

Содержимое кишечника E. andrei

Содержимое кишечника L. terrestris

Рис. 7 - Численность нитрифицирующей микробиоты

и Sä

es

»1

¡с Si

Hi

и ш са 5 к Н Ü si

задерживаются и выживают, преимущество получают грамотрицательные бактерии рода Pseudomonas, актиномицеты, сапрофитные грибы, очевидно, это связано с характером биотических взаимоотношений в микробиоценозе [14,15,16].

Выводы. Подводя итог проведенным исследованиям, необходимо отметить, что дождевые черви L. terrestris Средневолжско-го региона обладают всем спектром необходимых для вермикультуры микроорганизмов, способных осуществить эффективную биотрансформацию субстрата. По ряду показателей микробиоценоз L. terrestris даже богаче микробиоценоза промышленной линии E.f. andrei. В частности, микробиоценоз почвенных червей содержит больше целлю-лозолитических бактерий, сапрофитных грибов, актиномицетов, но уступает промышленной линии по количеству микробиоты, мобилизующей органофосфаты, а также ми-кробиоты, осуществляющей нитрификацию и аммонификацию. Все полученные результаты свидетельствуют в пользу перспективности использования представителей вида L. terrestris в качестве вермикультуры для утилизации отходов животноводства, содержащих повышенные количества целлюлозы и лигнина. Для расширенного эффективного использования представителей вида L. terrestris в качестве вермикультуры для утилизации всех видов отходов животноводства недостаточно микробиоты, ответственной за процесс быстрой биотрансформации органических и минеральных форм азота и фосфатов. Для создания промышленной линии новой вермикультуры на основе генофонда L. terrestris необходимо проведение селекционной работы; прогнозы в этом направлении вполне оптимистичны.

Библиографический список

1. Ley, R. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. / R. Ley, C. Lozupone, M. Hamady, R. Knight, J. Gordon // Nature Rev Microbiol. - 2008. - V. 6. - P. 776788.

2. Третьякова, Е.Б. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными / Е.Б. Третьякова, Т.Г. Добровольская, Б.А. Бызов, Д.Г. Звягинцев // Ми-

кробиология. - №1, том 65. - 1996. - С.102-110.

3. Всеволодова-Перель, Т.С. Дождевые черви фауны России: Кадастр и определитель/ Т.С. Всеволодова-Перель. - М.: Наука, 1997. - 102 с.

4. Романова, Е.М. Общие и отличительные черты микробиоценоза промышленной вермикультуры Eisenia fetida andrei (Bouche, 1972) и ее природного аналога Eisenia fetida (Sangvini, 1826) / Е.М. Романова, М.Э. Му-хитова, Е.В. Титова // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Научно-теоретический журнал. - №4 (16). - Ульяновск, 2011. - С. 64-70.

5. Романова, Е.М. Оптимизация плотности популяции вермикультуры в условиях пониженных температур / Е.М. Романова, Д.С. Игнаткин, М.Э. Мухитова, Т.Г. Баева, Д.А. Удод, А.К. Сибгатуллова // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Научно-теоретический журнал. - №2 (22). - Ульяновск, 2013. - С. 35-39.

6. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева; под.ред. В.К. Шильнико-вой. - М.: Дрофа, 2005. - 256 с.

7. Стриганова, Б.Р. Питание почвенных сапрофагов / Б.Р. Стриганова. - М.: Наука, 1980. - 242 с.

8. Терещенко, Н.Н. Влияние различных экологических групп дождевых червей на интенсивность азотофиксации / Н.Н. Терещенко, Н.Н. Наплекова // Известия РАН сер. Биологическая. - 2002. - №6. - С.763.

9. Терещенко, Н.Н. Эколого-микробио-логические аспекты вермикультивирования / Н.Н. Терещенко. - Новосибирск: Изд-во Россельхозакадемии. Сиб. Отд-ние, 2003. -166 с.

10. Mclean, М. Field evidence of the effects of the epigeic earthworm Dendrobaena octaedra on the microfungal community in pine forest floor / M. McLean, D. Parkinson // Soil Biol. Biochem, 2000. - № 32. - Р. 351-360.

11. Зинин, Н.В. Особенности переваривания микроорганизмов почвенными беспозвоночными / Н.В. Зинин, Я.М. Рабинович, В.В. Демин, Б.А. Бызов // Проблемы почвенной зоологии: Тезисы II Всеросс. совещания. - Москва, 1999. - С. 191.

1!

SES es »1

Si

р и ш Sä ;ii H  i

са s!

12. Емцев, В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. - М.: Колос, 1993. -383с.

13. Бубина, А.Б. Использование гриба рода Trichoderma для ускорения процесса вермикультивирования методом предварительной ферментации органического субстрата / А.Б. Бубина., Н.Н. Терещенко // Мат-лы 2-й междун. науч.-практ. конф. «Дождевые черви и плодородие почв». - Владимир, 2004. - С. 162.

14. Хомяков, Н.В. Реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей / Н.В. Хомяков, С.А. Харин, Т.Ю. Нечитайло, П.Н. Голышин,

А.В. Кураков, Б.А. Бызов, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. - 2007. - № 76. - № 1. - С. 45-54.

15. Byzov, B.A. Fate of soil bacteria and fungi in the gut of earthworms / B.A. Byzov, N.V. Khomyakov, S.A. Kharin, A.V. Kurakov // European Journal of Soil Biology. - 2007. - V. 43. - P. 149-156.

16. Moody, S.A. Fate of some fungal spores associated with wheat straw decomposition on passage through the guts of Lum-bricus terrestris and Aporrectodea longa / S.A. Moody, T.G. Piearce , J. Dighton // Soil Biol. Bio-chem. 1996. V. 28. P. 533-537.

УД К 575:581.144.2:581.133.8:582.683.2

ОСОБЕННОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ ФОРМЫ КОРНЕВЫХ ВОЛОСКОВ У ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH. ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ГЕНОВ CEN1 И SAR1

Хаблак Сергей Григорьевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Почвоведение и агрохимия»

Луганский национальный аграрный университет e-mail: serhab_211981@rambler.ru

91008, Украина, г. Луганск, городокЛНАУ; тел.: е-mail:serhab_211981@rambler.ru

Ключевые слова: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., корневой волосок, клеточная стенка, ген, мутация, мутантная линия, взаимодействие генов.

Представлены результаты исследования влияния взаимодействия генов CEN1 и SAR1 на образование формы корневых волосков у Arabidopsis thaliana. Установлено, что наследование формы корневых волосков у арабидопсиса при взаимодействии генов CEN1 и SAR1 происходит по типу комплементарного действия генов.

Введение. Корень - подземный орган растения [1]. У растений кончик корня снаружи покрыт однослойной эпиблемой (кожицей). Кожица корня всасывает воду, минеральные вещества из почвы и передает их в стебель и листья. Клетки эпиблемы способны образовывать корневые волоски. Они являются настоящими выростами внешних стенок поверхностных клеток корня, которые не ограничиваются от них перегородками [2].

Несмотря на важную роль волосков эпиблемы в поглощении воды и питательных веществ из почвы, генетический контроль их развития у растений остается практически неисследованным. Очень мало известно о молекулярно-генетических механизмах, регулирующих морфогенез выростов клеток кожицы корня.

К настоящему времени генетические исследования выявили ряд генов у A. thaliana, участвующих в процессе развития

II

SEIS es »1

Si

р Ü ш SS Hi н  i

00 s!