Синтез молочной кислоты грибом Rhizopus oryzae на питательных средах из гидролизатов клетчатки

УДК 663.15

Л. А. Мингазова, Е. В. Крякунова, А. В. Канарский СИНТЕЗ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ RHIZOPUS ORYZAE НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

ИЗ ГИДРОЛИЗАТОВ КЛЕТЧАТКИ

Ключевые слова: сульфитный щелок, Rhizopus oryzae, гидролизат клетчатки, молочная кислота.

Показана целесообразность использования отъемно-доливного метода для синтеза молочной кислоты грибом Rhizopus oryzae F-1030 при культивировании на питательной среде из гидролизатов клетчатки. Проведен анализ выхода молочной кислоты при отъемно-доливном и периодическом способах. Установлено, что общее содержание молочной кислоты в культуральной жидкости при отъемно-доливном методе выше, чем при периодическом методе почти в 1,5раза.

Key words: sulphite lye, Rhizopus oryzae, cellulose hydrolyzate, lactic acid.

It was shown the expediency of the detachable-topping method using for the lactic acid synthesis by the fungus Rhizopus oryzae F-1030 when it is cultivated on a nutrient medium from cellulose hydrolyzates. The analysis of the lactic acid yield using detachable-topping and periodic methods was performed. It was found that the total content of lactic acid in the culture liquid at a detachable-topping method is almost 1.5 times higher in comparison with a periodic method of cultivation.

Введение

Молочная (2-гидроксипропановая) кислота -высокорастворимая, трёхуглеродная хиральная гидроксикарбоновая кислота, встречающаяся в природе преимущественно в L-форме.

Впервые молочную кислоту обнаружили в простокваше в 1780 году и ошибочно приняли за компонент молока. В 1857 году Пастер обнаружил, что это вещество является продуктом жизнедеятельности микроорганизмов (Вепт^а, 1990) [1].

Молочная кислота широко используется в пищевой, фармацевтической и косметической отраслях промышленности [2]. Эта кислота также используется для производства таких химических веществ, как эфиры лактатов, пропиленгликоль, 2,3-пентандион, пропионовая кислота, акриловая кислота, ацетальдегид и лактид, которые находят различные применения в пищевой,

фармацевтической, полимерной, текстильной промышленности [3,4]. В последние десятилетия молочная кислота находит широкое применение в качестве мономера для получения биоразлагаемых полимеров, полимолочной кислоты [5]. Спрос на молочную кислоту постоянно растет при темпах роста на рынке на уровне 8 % годовых. Но ее широкое использование ограничивается высокой стоимостью чистой L-молочной кислоты [6]. Молочную кислоту вырабатывают из различных углеводов, в том числе крахмалистых и лигноцеллюлозных масс, в зависимости от наличия сырья в стране-изготовителе [7]. Стоимость сырья, предварительная обработка и осахаривание сырья методами физико-химической и ферментативной обработок являются одним из процессов, препятствующих рентабельному производству молочной кислоты [8,9]. В связи с этим актуальной является разработка дешевых источников сырья для получения молочной кислоты из различных отходов перерабатывающей промышленности.

Древесина - один из основных видов мирового сырья. Мировое производство древесины составляет примерно 1300 млн. тонн в год. Большая ее часть перерабатывается химическими способами с целью производства целлюлозы и бумаги. При этом образуется большое количество отходов, в частности различных видов щелоков, которые содержат много питательных веществ и являются ценным сырьем для промышленного производства микробиального белка [11].

Экономически эффективным является использование отходов, получаемых при кислых сульфитовых способах обработки (варки) древесины, когда образуются сульфитные щелока. При других способах варки древесной массы (сульфатный способ, щелочно-кислородный способ и т. д.) получаемые щелока либо непригодны для микробиосинтеза, либо технология их использования до сих пор не разработана.

Состав сульфитного щелока зависит от породы дерева, его возраста, места произрастания, различных экологических условиях и способа варки [11].

Отделяемый после варки от волокна сульфитный щелок содержит 90-100 кг/м3 органических веществ, около половины, которых составляют лигносульфоновые кислоты, 25-35 % приходится на редуцирующие вещества (РВ). В составе РВ примерно 80-85 % различных сахаров, образовавшихся при варке вследствие гидролиза гемицеллюлоз и части целлюлозы. Активная кислотность щелока (рН) составляет 1-1,5. В щелоке содержится растворенный сернистый ангидрид, а также соли сернистой кислоты (моносульфит и бисульфит), небольшое количество уксусной кислоты, фурфурола и других соединений [12,13].

Целью настоящей работы является обоснование возможности культивирования гриба Rhizopus oryzae периодическим и отъемно-доливным методом на питательной среде, приготовленной из гидролизатов клетчатки.

Методическая часть

В экспериментах для синтеза молочной кислоты использовали штамм Rhizopus oryzae F-1030, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Питательную среду готовили из гидролизатов клетчатки, которые входят в состав сульфитного щелока, полученного из Выборгского ЦБК. Сульфитный щелок содержит 50-70 г/л редуцирующих веществ при рН 4,5-6. Культивирование Rhizopus oryzae проводили в колбах вместимостью 250 мл при температуре 28±1 °С без перемешивания. Общий объем питательной среды составил 150 мл. Стерилизацию питательной среды проводили при 115 °С в течение 30 мин, затем среду охлаждали до температуры 28±1 °С и вносили чистую культуру Rhizopus oryzae F-1030.

Культивирование проводили отъемно-доливным и периодическим способом. При отъемно-доливном способе каждые 3-4 сутки в течение 24 суток культивирования отбирали 100 мл и доливали такой же объем стерильной и охлажденной до 28±1 0С питательной среды. В отобранной культуральной жидкости определяли количество редуцирующих веществ, рН, концентрацию молочной кислоты. В питательной среде контролировали количество редуцирующих веществ, рН, температуру.

При периодическом способе культивирования каждые 3-4 сутки в культуральной жидкости определяли количество редуцирующих веществ и рН, содержание молочной кислоты. Для продолжения Осаждение молочной кислоты проводили гашеной известью, из-за чего рН в культуральной жидкости повышалось с 5,5 до 7,5. Повышение рН с 5, 5 до 7,5 вероятно нейтрализует только часть молочной кислоты образуя лактат кальция, так как остальная часть молочной кислоты остается в культуральной жидкости. Восстановление редуцирующих веществ в культуральной жидкости проводили добавлением упаренного сульфитного щелока с содержанием редуцирующих веществ 317 г/л.

Содержание молочной кислоты в культуральной жидкости определяли титрованием 1н раствором №ОН. Значения рН определяли рН-метром рН-150МИ.

Для выделения молочной кислоты культуральную жидкость обрабатывали гашеной известью, доводя значение рН до 10. Образовавшийся лактат кальция отделяли центрифугированием. Надосадочную жидкость выпаривали, охлаждали и проводили повторное выделение лактата кальция. Указанную обработку надосадочной жидкости проводили 4 раза.

Затем отделенный центрифугированием осадок лактата кальция диспергировали дистиллированной водой и доводили рН концентрированной H2SO4 до 2±0,5. По истечению суток выпавшую гипсовую смесь отделяли центрифугированием. Далее надосадочную жидкость, содержащую молочную кислоту, дополнительно очищали от гипса фильтрованием [14].

Результаты и обсуждение

Как видно из результатов, представленных в таблице 1, по окончанию культивирования содержание молочной кислоты в культуральной жидкости при отъемно-доливном методе по сравнении с периодическим методом выше более чем в 1,5 раза. Расход РВ в процессе культивирования составил в среднем 55±5 г/л для обоих методов. Однако было показано, что при отъемно-доливном методе РВ используются в меньшей степени, чем при периодическом. Более того, при периодическом методе культивирования необходим точный контроль количества вносимых РВ для создания оптимальных условий роста гриба Rhizopus oryzae, а при отъемно-доливном методе количество РВ в питательной среде оставалось постоянным.

Таблица 1 - Продукция молочной кислоты грибом Rhizopus огутде на различных стадиях культивирования периодическим и отъемно-доливным методами

Способ культивирования

отъемно-доливной периодический

о метод метод

1 и 1ч в 1ч

и о & и & й о о к й в н о « о £ Объем, мл Концентрация молочной кислот! культуральной жидкости, % Количество молочной кислоты, Объем, мл Концентрация молочной кислот культуральной жидкости % Количество молочной кислоты,

9 113 0,9 1,017 150 0,9 1,35

14 106 0,9 0,954 151 0,63 0,95

17 100 1,7 1,7 166 0,55 0,88

21 118 1,7 2,006 181 0,36 0,65

24 129 1,7 2,193 181 0,5 0,91

Итого 7,87 4,74

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в процессе культивирования гриба Rhizopus oryzae происходит снижение рН культуральной жидкости, связанное с синтезом молочной кислоты. При периодическом методе культивирования для нейтрализации молочной кислоты использовали гашеную известь, что увеличивало рН до 7,5, тогда как при отъемно-доливном методе поддерживалось постоянное значение рН в пределах 5-5,5 (оптимальное значение рН для роста гриба Rhizopus oryzae 4,5-6,0). При периодическом методе культивирования внесение в культуральную жидкость гашеной извести для нейтрализации молочной кислоты не позволяло довести рН до оптимального значения Снижение значений рН, связанное с выделением молочной кислоты, при

отъемно-доливном методе на каждом анализируемом временном интервале было гораздо менее заметным, чем в аналогичные контрольные точки при периодическом методе культивирования.

Таблица 2 - Изменение рН при культивировании гриба Rhizopus огугае периодическим и отъемно-доливным методами

Продолжительность культивирования, сутки Способ культивирования

отъемно-доливной метод периодический метод

pH начальное pH конечное pH начальное pH конечное

9 5,46 4,73 5,46* 4,75

14 5,46 5,27 7,5 5,51

17 5,54 5,5 6,25 5,36

21 5,54 5,25 6,9 5,87

24 5,54 5,36 7,24 5,31

Примечание: для периодического метода культивирования начальные значения рН даны после добавления гашеной извести

* Значение представлено до добавления гашеной извести Выводы

Показана целесообразность использования отьемно-доливного метода по сравнению с периодическим культивированием гриба Rhizopus oryzae для получения молочной кислоты из гидролизатов клетчатки

Литература

1. Young-Jung Wee, Jin-Nam Kim and Hwa-Won Ryu, Food Technol. Biotechnol. 44

2. Michal Rosenberg, Martin Rebros, Ludmila Kristofikova & Katarina Malatova, Biotechnology Letters, 27, 1943-1947

3. Pyung Cheon Lee, Woo Gi Lee, Sang Yup Lee, Ho Nam Chang, Yong Keun Chang, Biotechnol progress Engineering^, 379-381,(2000).

4. Christina Akerberg, Guido Zacchi, Bioresource Technology, 7, pp. 119-121.

5. Datta R, Henry M; J; "Lactic acid: recent advances in products, processes and technologies - A- review". Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 81, pp. 11191129. (2006).

6. Global Industry Analysis, Inc. "Lactic Acid-Global Strategic Business Report", 2012 .http://www.researchandmarkets.com/reports/354880/ lactic_acid_global_ strategic_business_ report, accessed 6.12.

7. Litchfield, J. H. et al. "Microbiological production of lactic acid". Advances in Applied Microbiology, 42, pp. 4595.

8. Abdel-Rahman, Y. Tashiro, K. Sonomoto, "Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: overview and limits", Journal of Biotechnology, 156, pp. 286-301, (2011).

9. Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Еремец В.И., Шинкарев С.М., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Лермонтов С.А., Зимагулова Л.А., Галиева А.Р. Вестник Казанского технологического университета - 2017. - Т - 20 №. 1- С. 162 - 166.

10. Ковернинский И. Н. Основы технологии химической переработки древесины.-- М.: Лесная промышленность, 1984.-- 184 с.

11. Переработка сульфатного и сульфитного щелоков / Б.Д. Богомолов, С.А. Сапотницкий, О.М. Соколов и др.-М.: Лесн. пром-сть, 1989. - 360 с.

12. Бондарева Т.А, Бобров А.И., Мутовина М.Г. Изменение содержания редуцирующих веществ в варочном щелоке при бисульфитной варке древесины лиственницы //Химия древесины. 1974. - № 2. - с. 39-43.

13. Буевской А.В., Сапотницкий С. А. Зависимость качества сульфитного щелока от условий и режима варки целлюлозы // Гидролизная и лесохим. пром-сть. 1954. - № 2. - с. 9-10.

14. Зимагулова Л.А., Гематдинова В.М., Канарский А.В., Вестник технологического университета, 19, 112 -114.

© Л. А. Мингазова - аспирант кафедры Пищевая инженерия малых предприятий КНИТУ, zleisan1 @таД.ги; Е. В. Крякунова - к.б.н., доцент кафедры Пищевая инженерия малых предприятий КНИТУ, oscillatoria@rambler.ru; А. В. Канарский - проф., д.т.н., каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, alb46@mail.ru.

© L. A. Mingazova - Ph.D. Student, Department of food engineering in small enterprises, Kazan National Research Technological University, zleisan1@mail.ru; E. V. Kryakounova - candidate of biological science, the assistant professor of the department of food engineering at small enterprises at Kazan National Research Technological University, oscillatoria@rambler.ru; A. V. Kanarskiy - Dr. Sci. (Tech.), Prof., Department of Food Biotechnology, KNRTU, alb46@mail.ru.