ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α1-ТИМОЗИН-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-α-ТИМОЗИН-α1, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА - "НЕОТИМ-НС", СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Гибридный белок α1-тимозин-фактор некроза опухолей-α-тимозин-α1, обладающий активностью, содержащий рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие синтез гибридного белка, отличающийся тем, что сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pThy325 с молекулярной массой 2,2 МДа (3,33 т.п.н.), содержит ген, кодирующий синтез гибридного белка αl-тимозин-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 (Т-ФНО-Т) с молекулярной массой 23,78 КДа посредством:
- KpnI-Eco91I - фрагмента ДНК размером 0,5 т.п.н. плазмиды pThy230, содержащего участок связывания рибосом, часть гена гибридного белка, имеющего последовательность для α1-тимозина, промежуточной последовательности аспарагиновая кислота-пролин и N-концевой части фактора некроза опухолей;
- KpnI-Eco91I-фрагмента ДНК размером 2,8 т.п.н. плазмиды pThy315, содержащего тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7, часть гена гибридного белка, имеющего последовательность С-концевой части фактора некроза опухолей и тимозина-α1, между которыми расположен метиониновый остаток, терминатор транскрипции фага λ;
- генетического маркера селекции, гена β-лактамазы, придающего устойчивость к антибиотику ампициллину клеткам Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy325;
- уникальных сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенных на расстоянии в т.п.н.: EcoRI - 0 и 0,11, Bg1II - 0,32 и 0,88, BamHI - 0,36, ClaI - 0,27 и 0,83, Eco47III - 0,76, Eco91I - 0,75, KpnI - 0,25, PstI - 2,58, XbaI - 0,93 и 1,03, при этом кодирующий его ген состоит из аминокислотной последовательности (тимозин-α1)-Asp-Pro-(фактор некроза опухолей-α)-Ile-Asp-Met-(тимозин-α1), имеет молекулярную массу мономера 23,78 КДа и изоэлектрическую точку 4,5.
2. Способ получения гибридного белка αl-тимозин-фактор некроза опухолей-тимозин-αl, заключающийся в культивировании штамма Escherichia coli SG20050 с плазмидой pThy325 в жидкой питательной среде с 10 граммами триптона, дрожжевого экстракта и NaCl с рН 7,2-7,4, с последующим выделением и очисткой гибридного белка хроматографией на гидрофобных носителях (фенил-), анионообменниках (ДЕ-, ДЕАЕ-), отличающийся тем, что для трансформации используют плазмиду pThy325, культивируют свежеполученные трансформанты без их предварительной селекции при температуре 30-32°C, которые хранят при температуре от -20° до -40°C в бульоне с 40% глицерином, надосадочную жидкость, получившуюся после лизиса клеток, наносят на гидрофобный носитель при рН 5,8-6,0 в присутствии 33% насыщения сульфата аммония, носитель промывают буфером без сульфата аммония при рН 5,8-6,0 и элюируют гибридный белок указанным буфером, содержащим дополнительно 6 М мочевины, фракции с гибридным белком наносят на анионообменный носитель при рН 5,6-5,8 в буфере с 7 М мочевиной, элюируют гибридный белок указанным буфером с добавлением до 250 мМ NaCl, затем фракции с гибридным белком наносят на матрицу с иммобилизованным красителем, которую уравновешивают буфером с 7 М мочевиной при рН 5,5-5,8, белок элюируют буфером с градиентом рН 6,0-7,8 в присутствии 7 М мочевины и 0,4 М NaCl, с последующим диализом против раствора, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфата, при рН 7,2-7,4.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культивируют трансформанты, отобранные на начальной фазе экспоненциального роста.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культивирование проводят при 37°C до поздней фазы экспоненциального роста, а затем до стационарной фазы при 41°C, для очистки гибридного белка используют осадок, получившийся после лизиса клеток, который отмывают и растворяют в буфере, содержащем 6 М мочевины, а хроматографию на гидрофобных носителях не используют.
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что для культивирования штамма Escherichia coli SG20050 с плазмидой pThy325 используют жидкую питательную среду следующего состава: 1-1,2% пептона, 1-1,2% дрожжевого экстракта, 1-1,2% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что используют 1-1,4% триптона.
7. Лекарственный препарат гибридного белка, содержащий активное действующее вещество, стабилизирующую добавку в виде Полиглюкина (60), физиологический раствор, отличающееся тем, что в качестве активного действующего вещества использован гибридный белок α1-тимозин-α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 (Т-ФНО-Т), имеющий тимозин-α1 на N- и С-концах молекулы, в качестве вспомогательных веществ использован полиглюкин и натрий хлористый, при следующем соотношении компонентов на одну дозу (соотношение компонентов указывается в одних единицах измерения: либо в мкг, либо в мг):
Состав на 1 флакон препарата НЕОТИМ-НС:
Активные вещества, мкг:
α1-тимозин-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 рекомбинантный 60000 ЕД
50
Вспомогательные вещества, мг:
Полиглюкин (60)
12
Натрия хлорид
8,8
Натрия фосфат однозамещенный 2-водный
0,3
Натрия фосфат двузамещенный 12-водный
2,9
8. Способ получения лекарственного препарата по п. 7, включает смешивание компонентов, лиофилизацию и досушивание, отличающийся тем, что смешивают раствор очищенного гибридного белка α1-тимозин-α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 (Т-ФНО-Т), имеющего тимозин-α1 на N- и С-концах молекулы со стабилизирующей добавкой и физиологическим раствором, содержащим вспомогательные вещества: хлористый натрий и полиглюкин в расчете на одну дозу, затем полученный раствор разливают во флаконы для инъекций по 1 мл и замораживают при температуре - 40°C, после чего осуществляют лиофилизацию путем высушивания в течение 2 часов при температуре -40°C, далее при постепенном повышении температуры со скоростью 2,5°C в час осуществляют досушивание при 30°C в течение 6-8 ч до достижения остаточной влажности в 2-5% и получают сухой лекарственный препарат, который представляет собой во флаконе таблетку белого цвета, постоянное хранение препарата осуществляют при температуре 4-10°C.
9. Способ применения лекарственного препарата полученного по п. 9, включающее растворение и парентеральное введение, отличающийся тем, что содержимое флакона растворяют в 1-2 мл стерильной воды для инъекций в течение менее чем 1 мин до образования прозрачного, бесцветного раствора, набирают в стерильный шприц и вводят один раз в сутки, при этом полученный раствор хранят не более суток в холодильнике без замораживания.