НОВЫЙ КИЛЛЕРНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
A NEW KILLER YEAST STRAIN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Saccharomyces cerevisiae,
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и касается нового киллерного штамма  используемого в промышленности в качестве источника двуспиральных РНК.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Природные двуспиральные РНК (дсРНК) являются одними из важнейших медиаторов, обеспечивающих индукцию интерферона (IFN) (Isaque João da Silva de Faria, et al., dsRNA Sensing During Viral Infection: Lessons from Plants, Worms, Insects, and Mammals //Journal of Interferon & Cytokine Research. - 2013. - 33:5, 239-253), при этом дсРНК вызывают индукцию всех типов интерферона, включая интерферон-дельта, обладают противовирусным действием в отношении различных видов вирусов. Таким образом, с точки зрения терапевтического потенциала дсРНК являются перспективным объектом для создания на их основе противовирусных, антибактериальных, противоопухолевых препаратов, а также средств для повышения неспецифической защитной реакции и снижения восприимчивости организма к действию патогенных агентов различной природы (Yoneyama M, Fujita T. Recognition of viral nucleic acids in innate immunity. Rev Med Virol. - 2010 Jan. - 20(1). - 4-22).
Двуспиральные РНК перспективны с точки зрения их терапевтического потенциала, поскольку могут быть использованы в качестве индукторов интерферонов при лечении и/или профилактике инфекционных заболеваний (Ершов Ф.И., и др., Использование индукторов интерферона при вирусных инфекциях // Вопросы вирусологии. - 2015. - №2.- С. 5-10).
Escherichia coli
Источниками природных дсРНК, помимо РНК-содержащих вирусов, вызывающих заболевания человека и животных, могут быть вирусы насекомых, растений и микроорганизмов, а также некоторые грибы. Известно несколько штаммов микроорганизмов, которые являются источниками дсРНК. Например,  продуцирует репликативную форму дсРНК бактериофага f2 (Логинова С.Я., и др. Изучение эффективности Ларифана при экспериментальной форме тяжёлого острого респираторного синдрома. Антибиотики и Химиотерапия. - 2019. - 64(5-6):13-17).
Pseudomonas phaseolicola
Также известен штамм, который используется для получения дсРНК бактериофага ϕ6 -  (Ермолаев В.В., Клименко В.П., Гогина Я.С., Лебедев Л.Р. Особенности культивирования бактериофага ϕ6 - продуцента двуспиральной РНК // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2016. - №6-1).
Saccharomyces cerevisiae
Totiviridae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
В качестве еще одного источника двуспиральных РНК могут быть использованы киллерные штаммы дрожжей . Для данных штаммов характерно содержание в цитоплазме вирусоподобных частиц, которые в свою очередь содержат дсРНК. Вирусы, обеспечивающие фенотип «киллер», принадлежат семейству миковирусов . Один из этих вирусов - вирус-помощник, другой - вирус-сателлит (Е.В. Самбук и др., Киллер-токсины дрожжей : синтез, механизмы действия и практическое использование // Экологическая генетика. - 2019. - Т. 17. - № 3. - С. 59-73). Дрожжи  могут содержать одновременно несколько типов вирусов, которые относятся к семейству миковирусов (J. C. Ribas  L-BC Double-Stranded RNA Virus Replicase Recognizes the L-A Positive-Strand RNA 39 End // JOURNAL OF VIROLOGY, Jan.- 1996. - p. 292-297).
Saccharomyces cerevisiae
Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является киллерный штамм  ВКПМ Y-448 (RU2558256, опубл. 27.07.2015).
Saccharomyces cerevisiae
Цель настоящего изобретения - получение нового штамма дрожжей , превосходящего известные штаммы по уровню содержания вирусоподобных частиц, которые в свою очередь содержат дсРНК.
Saccharomyces cerevisiae
Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма , сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции дсРНК, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Saccharomyces cerevisiae
В процессе индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора из родительского штамма  ВКПМ Y-448 был получен новый штамм RAD-02, источник дсРНК.
Saccharomyces cerevisiae
Родительский штамм  ВКПМ Y-448 подвергался процессу индуцированного мутагенеза путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах.
Saccharomyces cerevisiae
Полученный новый штамм депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Y-5058. Новый киллерный штамм  VKPM Y-5058 может применяться для промышленного производства различных форм двуспиральных рибонуклеиновых кислот.
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является новый киллерный штамм  VKPM Y-5058, который может быть использован для получения двуспиральной РНК. Одним из вариантов осуществления изобретения является применение штамма для  VKPM Y-5058 для получения двуспиральных РНК. Другим вариантом настоящего изобретения является способ получения двуспиральной РНК, включающий культивирование штамма  VKPM Y-5058, разрушение клеток и очистку дсРНК (Фиг. 3).
ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
Термин «вирусоподобные частицы» в контексте настоящего изобретения являются естественными компонентами киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые репродуцируются в процессе роста и деления клеток. Каждая вирусоподобная частица содержит двуспиральную рибонуклеиновую кислоту (дсРНК).
Термин «двуспиральная РНК» или «дсРНК» в контексте настоящего изобретения характеризует молекулу РНК, состоящую из двух комплементарных цепей. В контексте настоящего изобретения дсРНК может находиться в виде соли, например, натриевой, калиевой и тд.
Термин «фармацевтически приемлемые соли» по настоящему изобретению относится к нетоксичным солям, которые могут быть использованы в терапии млекопитающих.
Saccharomyces cerevisiae
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток киллерного штамма дрожжей , отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
Термин «сухая биомасса» в контексте настоящего изобретения характеризует биомассу с содержанием воды не более 10 мас. %.
Термин культуральная жидкость в контексте настоящего изобретения означает двухфазную газожидкостную питательную (или ферментационную) среду с микроорганизмами.
Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces cerevisiae,
Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству дсРНК, содержащейся в вирусоподобных частицах киллерного штамма дрожжей рассчитанному на единицу сухой биомассы киллерного штамма дрожжей отделенной в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, выраженному в милиграммах дсРНК на кг сухой биомассы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1- Фиг. 3.
На Фиг. 1 изображены клетки Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, окрашенные метиленовым синим (увеличение ×1000).
Saccharomyces cerevisiae
На Фиг. 2 изображены клетки  VKPM Y-5058 посредством световой микроскопии (прижизненно, увеличение × 400).
На Фиг. 3 изображены основные этапы получения дсРНК из культуры киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058.
Saccharomyces cerevisiae
На Фиг. 4 изображена электрофореграмма образцов дсРНК, полученных из клеток дрожжей киллерных штаммов :
М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);
Saccharomyces cerevisiae
* - образец, полученный из клеток дрожжей киллерного штамма ВКПМ Y-448;
Saccharomyces cerevisiae
** - образец, полученный из клеток дрожжей киллерного штамма VKPM Y-5058.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Saccharomyces cerevisiae
Согласно настоящему изобретению предложен новый киллерный штамм дрожжей , являющийся источником дсРНК - депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Y-5058.
Культурально-морфологические
признаки штамма:
аэроб; при поверхностном культивировании на агаризованной среде колонии от светло-бежевого до бежевого цвета, выпуклые, округлой ровной формы, не врастающие в агар; поверхность колонии гладкая, ослизлая. Клетки имеют шаровидную или эллипсоидную форму (Фиг. 1, 2).
Физико-биохимические признаки:
хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, арабинозу, инозит, галактозу, манит, глюкозу.
Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: декстрозы моногидрат - 10,0-18,0; пептон мясной - 10,0-35,0; агар бактериологический - 10,0-40,0; дрожжевой экстракт - 1,0-15,0; калий хлористый - 0,8-3,0; pH до стерилизации - 4,5-6,3.
Условия поверхностного культивирования для выделения единичных колоний: 4-8 суток, при температуре 27-35°С.
ПРИМЕРЫ
Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.
Пример 1.
Saccharomyces cerevisiae
Получение нового штамма .
Saccharomyces cerevisiae
Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского штамма ВКПМ Y-448 был получен новый киллерный штамм, являющийся источником дсРНК.
Saccharomyces cerevisiae
7
Для этого клетки  ВКПМ Y-448 ресуспендировали в стерильном 0,9 % растворе натрия хлорида в концентрации примерно 10кл/мл, воздействовали УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) при 0°С и затем рассевали на агаризованную питательную среду. Инкубировали при температуре 27-35°С до появления видимых единичных колоний. Проводили селективные отборы и тесты в рамках процесса ферментации в биореакторах.
Полученному штамму был присвоен внутренний номер RAD-02, после чего штамм был депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекцию промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Y-5058.
Пример 2.
Методика культивирования.
Saccharomyces cerevisiae
Проводили подготовку посевного материала киллерного штамма  VKPM Y-5058 путем посева культуры в чашках Петри для этого агаризованную среду засевали суспензией исходной посевной культуры, и выдерживали в термостате от 4 до 8 суток, при температуре 27-35°С.
Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 27-35°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.
Далее осуществляли культивирование посевной культуры в ферментере объемом 15/100 л - для этого проводили засев ферментера путем инокуляции посевной культурой в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при постоянном перемешивании в течении 24-96 часов.
Пример 3.
Saccharomyces cerevisiae
Получение вирусоподобных частиц из клеток киллерных штаммов .
Для выделения вирусоподобных частиц биомассу дрожжей киллерных штаммов Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 гомогенизировали в трис-солянокислом буфере с добавлением ферментного препарата, полученного из культуральной жидкости Arthrobacter luteus, из расчета 40 ед. активности (100 мкл) на 1 г клеток.
Полученную суспензию при перемешивании инкубировали при температуре 36° в течение 1,5 ч. После этого проводили замораживание (до - 17-19°С, 30-40 мин) и оттаивание (до 28-32°С, 30-40 мин) препарата. Далее проводили центрифугирование с последующей фильтрацией. После чего, вирусоподобные частицы осаждали 10-12 % раствором полиэтиленгликоля. Осадок растворяли в изотоническом растворе и проводили очистку и концентрирование вирусоподобных частиц методом гель - фильтрации. Состав образцов вирусоподобных частиц исследовали электрофоретическим методом.
При анализе с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях было установлено, что в составе препаратов, полученных из клеток киллерных штаммов Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, преимущественно присутствуют белки с молекулярной массой 70,0 ± 10,0 кДа, что соответствует молекулярной массе капсидного белка и РНК-полимеразы в вирусоподобных частицах. При этом высокая степень интенсивности окрашивания Coumassi данных участков, соответствующих вирусоподобным частицам, на электрофореграммах препаратов вирусоподобных частиц клеток киллерного штамма Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058, в отличие от электрофореграмм препаратов вирусоподобных частиц клеток киллерного штамма Saccharomyces cerevisia  ВКПМ Y-448 (где интенсивность окрашивания соответствующих участков на электрофореграммах была значительно меньше), говорит о высоком содержании вирусоподобных частиц в клетках киллерного штамма Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058, в отличие от клеток киллерного штамма Saccharomyces cerevisia  ВКПМ Y-448.
Пример 4.
Saccharomyces cerevisiae
Технологический процесс получения дсРНК из клеток киллерных штаммов .
Saccharomyces cerevisiae
За счет увеличенного количества вирусоподобных частиц в клетках нового киллерного штамма дрожжей VKPM Y-5058 по настоящему изобретению, увеличивается и количество дсРНК, что показано в настоящем примере.
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisia
Клетки дрожжей киллерных штаммов VKPM Y-5058 и  ВКПМ Y-448 подвергали разрушению, центрифугировали, отделяли надосадочную жидкость и прецепитировали суммарную РНК. Полученный осадок отделяли и при перемешивании добавляли воду и хлорид натрия. Образовавшуюся суспензию отстаивали и центрифугировали. В полученный супернатант добавляли этиловый спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубировали и центрифугировали.
После чего к осадку при перемешивании добавляли буферный раствор и фракционировали раствором лития хлорида в две последовательные стадии.
В приготовленный раствор дсРНК приливали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 2 М. Полученную суспензию перемешивали в течение 15 мин, охлаждали до 4±1°С и отстаивали при установленной температуре 12 часов. Полученную суспензию центрифугировали при 8000 об/мин для отделения супернатанта.
К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, загружали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 4 М. Полученный раствор перемешивали до получения однородной суспензии в течение 15 минут, охлаждали до 4±1°С и отстаивали при установленной температуре в течение 12 часов. Далее суспензию центрифугировали при 8000 об/мин для отделения осадка. Супернатант утилизировали.
Полученный осадок отправляли на повторные стадии фракционирования 2 М и 4 М хлоридом лития.
После полученную суспензию центрифугировали и ресуспендировали в буферном растворе и далее дважды проводили депротеинизацию хлороформом в соотношении целевой раствор: хлороформ от 1:5 по объему. Полученную суспензию отстаивали.
Далее проводили осаждение дсРНК из суспензии раствором этилового спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %. Полученную суспензию центрифугировали, полученный осадок промывали 96 % раствором этилового спирта и растворяли в воде инъекционной до полного растворения осадка.
Полученный водный раствор дсРНК с предыдущей стадии подвергали фильтрации с целью удаления взвешенных частиц и мутности, и лиофильно высушивали.
Идентификацию дсРНК проводили методами электрофореза в агарозном геле (Фиг. 4). На электрофореграммах фиксировались полосы с четко очерченными границами. Высокая контрастность полос была обусловлена высокой степенью взаимодействия дсРНК с интеркалирующим агентом - бромистым этидием. Высокая степень интеркалирования прямо свидетельствует о двуспиральной структуре молекулы.
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Для проведения описанных экспериментов, использовали сухую биомассу киллерных дрожжей ВКПМ Y-448 и VKPM Y-5058. Для оценки сходимости результатов эксперименты проводили по 3 раза. Все целевые продукты, полученные по завершении экспериментов, лиофилизировали при одинаковых условиях. Количественное содержание и чистоту дсРНК в лиофилизатах оценивали методом эксклюзионной ВЭЖХ в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат.
Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Продуктивность киллерных штаммов <i>Saccharomyces cerevisiae</i>.
Штамм
Продуктивность штаммов (дсРНК мг/кг сухой биомассы)
в ферментере объемом 15 литров
в ферментере объемом 100 литров
Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058
1500±45
1470°35
Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448
870±17
940±25
Saccharomyces cerevisiae
Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что новый штамм  VKPM Y-5058 обладает высоким биотехнологическим потенциалом и может применяться для промышленного производства дсРНК.