СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УСТОЙЧИВОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ВИРУСУ ЛЕЙКОЗА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR CATTLE LEUKEMIA VIRUS TOLERANCE

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике, в частности к способам генодиагностики устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу.
Известен способ определения устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу, заключающийся в амплификации экзона 2 гена BoLA-DRB3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 п.н.) и последующем анализе рестрикционного полиморфизма этой области с помощью последовательной обработки эндонуклеазами Rsa I, Hae III, Bst YI (Van Eijk, M.J., Т.Stewart, J.A.Haynes, and H.A.Lewin. 1992. Extensive polymorphism of the BoLA-DRB3 gene distinguished by PCR-RFLP. Anim. Genet. 23:483-496).
Известен способ определения устойчивости КРС к лейкозу, заключающийся в амплификации экзона 2 гена BoLA-DRB3 и последующем анализе рестрикционного полиморфизма этой области с помощью обработки рестриктазами Rsa I, Hae III, BstYI, Bst2UI (Ковалюк, Н.В. и др. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота. / Ковалюк Н.В., Шостак В.А., Сацук В.Ф., Фоменко Д.В. // Вестник РАСХН. - 2005. - №6. - С.67-69).
Основным достоинством этих методов является возможность идентификации каждого конкретного аллеля из уже описанных и обнаружения новых аллелей.
Очевидный недостаток подобного анализа - сложность дифференцировки генотипов, поскольку фрагменты рестрикции могут отличаться друг от друга незначительно. Кроме того, данные методы требуют достаточно много времени и средств на проведение анализа.
Известен способ определения устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу, взятый в качестве прототипа, заключающийся в аллель-специфичной ПЦР с праймерами, подобранными к нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислоты Glu-Arg в позициях 70-71 аминокислотной последовательности и аминокислоты Val-Asp-Thr-Tyr в позициях 75-78 (J Immunol. 1993 Dec 15; 151(12):6977-85. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus. Xu A., van Eijk M.J., Park C., Lewin H.A.).
Данный метод быстрее и дешевле ПЦР-ПДРФ анализа, он также позволяет разделить все результаты на три группы: устойчивые, чувствительные и нейтральные аллели, не выделяя каждый конкретный аллель.
Однако данный метод анализа не позволяет выявлять гомо- или гетерозиготность особи по найденным аллелям.
При создании настоящего изобретения задача заключалась в разработке способа диагностики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза, обеспечивающего массовый скрининг поголовья с целью выявления животных-носителей аллелей, обеспечивающих их устойчивость к лейкозу.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза, включающий проведение аллель-специфичной Nested-ПЦР с праймерами, подобранными к позициям 70-71 в аминокислотной последовательности, отличающийся тем, что праймеры подбирают таким образом, что выявляют животных-носителей, только устойчивых к лейкозу аллелей, с последующим определением гомо- или гетерозиготности этих животных по данным аллелям путем пиросеквенирования.
Общим для прототипа и настоящего изобретения является использование Nested-ПЦР с аллель-специфичными праймерами.
В отличие от прототипа изобретение предполагает массовый скрининг поголовья с целью выявления с помощью аллель-специфичной ПЦР животных, несущих только желательные аллели (т.е. аллели, обуславливающие устойчивость к лейкозу), и последующее пиросеквенирование найденных образцов для установления гомо- или гетерозиготности особей по данным аллелям. При этом животных, несущих чувствительные или нейтральные аллели, не разделяют на 2 группы.
Подготовленные продукты ПЦР (ампликоны) гибридизуют с секвенирующим праймером и диагностируют нуклеотидную последовательность гена в режиме реального времени с одновременным определением 4 аминокислот (Е, R, Q, К) с применением технологии пиросеквенирования и выявлением гомо- или гетерозиготности по аллелям, обуславливающим устойчивость или чувствительность к вирусу лейкоза.
T
Пример 1. Олигонуклеотидные праймеры были подобраны исходя из последовательности гена BoLA-DRB3. Они амплифицируют фрагменты участка гена BoLA-DRB3 крупного рогатого скота длиной 284 пары оснований (п.о.), 233 п.о. и 93 п.о. (генный банк М94923, М94926, М94928, М94924, М94927, М94925) в два этапа. На первом этапе использовались праймеры Воlа30 и Воlа31 (протокол в таблице 1.1), на втором этапе - Воlа30, Bola32, E70fl и R71r (протокол в таблице 1.3);
Воlа30 - 5'-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3'
Bola31 - 5'-TTAAATTGCGCTCACCTCGCCGCT-3';
Bola32 - 5'-TCGCCGCTGCCACAGT-3';
T
E70f1 - 5'-AGAAGGAGATCCTGGAGGAAG-3';
A
R71rl - 5'-CCTGTCCACCTCGGCCCGCCTTC-3';
В праймеры E70f1 и R71r1 были введены нуклеотидные замены таким образом, чтобы отжиг происходил только на аллелях, обуславливающих устойчивость к лейкозу. Праймеры не взаимодействуют (не отжигают) с аллелями, обуславливающими повышенную чувствительность к вирусу, и нейтральными аллелями (Фиг.1).
Это дает возможность идентифицировать наличие любого из потенциально устойчивых к лейкозу аллелей (*11, *23, *28=*7А) за одну реакцию. При этом аллели, не обуславливающие устойчивость к лейкозу (чувствительные и нейтральные), не дифференцируются.
4
2
4
2
ПЦР выполняли по нижеследующим протоколам в реакционной смеси следующего состава: 1×ПЦР буфер (16.6 мМ (NH)SO, 67.7 мМ Трис-HCl, pH=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl), 200 мМ дНТФ, 10 пмоль каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы.
Проверку результативности прохождения ПЦР диагностировали методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 3% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1×ТАЕ буфере 20 мин при 100 V и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ).
Далее с образцами, показавшими на электрофорезе 3 фрагмента соответствующей длины (284, 233 и 93 п.о.), проводили еще одну ПЦР (протокол в таблице 1.2), результативность прохождения которой также проверяли в при помощи электрофореза в агарозном геле.
Оставшиеся 30 мкл амплификатов смешивали в круглодонных пластиковых 96-луночных плашках с 3 мкл сефарозы (Streptavidin Sepharose™, 17-5113-03) и 57 мкл связывающего буфера (Binding Buffer, 40-0033), инкубировали при комнатной температуре 10 мин, интенсивно перемешивая на шейкере при 1400 rpm.
С использованием вакуумной рабочей станции (Vacuum Prep Workstation (220-240 V), 60-0207) связанные с сефарозной матрицей ПЦР-продукты переносили на препарационные фильтры и последовательно промывали по 10 сек в 70% этиловом спирте, 0,2 М NaOH (для денатурации ДНК), 1× промывочном буфере (Wasching Buffer, 40-0035). После отключения вакуума пробы 5-10 сек элюировали в подготовленные тонкостенные пластиковые 96-луночные плашки (PSQ 96 Plate Low, 40-0010), содержащие в каждой лунке 45 мкл Annealing Buffer (40-0036) в смеси с 15 пикомолями секвенирующих праймеров, подобранных к местам мутаций в аминокислотах 70 и 71 гена BoLA-DRB3 крупного рогатого скота. В качестве секвенирующего нами был выбран праймер, 5'-конец которого мечен биотином, Воlа30 bio 5'-BIOATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3', и разработана схема анализа, позволяющая одновременно определять полиморфизм амплифицированного участка гена BoLA-DRB3 крупного рогатого скота в позициях 2 кодонов 70 и 71.
Подготовленные таким образом пробы помещали в термостат, инкубировали 2 мин при 90°С для гибридизации секвенирующих праймеров с одноцепочечной ДНК-матрицей, по окончании охлаждали при комнатной температуре в течении 10 мин.
Генодиагностику проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQ™ 96MA SYSTEM (Pyrosequencing AB) с использованием реагентов из набора PSQ™ 96 SNP Reagent Kit 5×96 (40-0023) в режиме реального времени. Обработку «сырых» данных пиросеквенирования изучаемых SNP проводили с использованием программного обеспечения PSQ96MA SNP software v.2.0 (Фиг.2).
Определенные таким образом для каждого животного аллели суммировали в электронной таблице Microsoft Excel. Полученная матрица генотипов служила основой для статистической обработки результатов.
Пример 2. Разработанная система была апробирована на 344 животных черно-пестрой породы (Табл.3).
В результате было выявлено, что 20,93% животных являются носителями устойчивых аллелей, при этом 4,07% являются гомозиготными по данным аллелям. При диагностике вируса лейкоза методом ПЦР среди всех носителей устойчивых аллелей было выявлено только 6,94% вирусоносителей, при этом стоит отметить, что среди гомозигот носителей вируса выявлено не было.
Среди гетерозигот было выявлено 5 животных-носителей вируса, что составляет 8,62%.
Все гомозиготы и гетерозиготы по устойчивым аллелям были РИД-отрицательны.
С использованием разработанной системы также были проанализированы пробы ДНК от 30 быков-производителей пород голштинского корня (красно-пестрой, черно-пестрой, айрширской), содержащихся на 6 племпредприятиях России (Табл.4).
Было обнаружено, что 13,33% животных являются носителями устойчивых аллелей, при этом 6,67% были гомозиготны по данным аллелям. Все животные были свободны от провируса лейкоза.
Полученная информация показывает целесообразность использования разработанной системы для характеристики генофонда племенных животных.
Изобретение позволяет сократить затраты рабочего времени, труда и денежных средств на проведение диагностики устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу за счет уменьшения числа исследуемых нуклеотидных последовательностей.
Изобретение может быть использовано для массового генотипирования животных, устойчивых к лейкозу по BoLA-DRB3, в племенных и товарных хозяйствах для отбора животных в племенное ядро.
Таблица 1
Протоколы ПЦР
Bola 1 Таблица 1.1
Bola 2 psq Таблица 1.2
Основной раствор
Компоненты
Рабочий раствор
мкл
Основной раствор
Компоненты
Рабочий раствор
мкл
H<sub>2</sub>O
10,3
H<sub>2</sub>O
27,65
10×
Буфер
1×
1,5
10×
Буфер
1×
3,5
2 мМ
дНТФ
2
1,5
2 мМ
дНТФ
2
1,75
50 пмоль/мкл
Во1а30
10 пмоль
0,2
50 пмоль/мкл
Во1а30 bio
10 пмоль
0,2
50 пмоль/мкл
Во1а31
10 пмоль
0,2
50 пмоль/мкл
Во1а32
10 пмоль
0,2
100 мМ
MgCl<sub>2</sub>
0,2
100 мМ
MgCl<sub>2</sub>
0,1
5 U/мкл
Taq
1U
0,1
5 U/мкл
Taq
1U
0,1
ДНК
1
Продукт 1-й ПЦР
1,5
Конечный объем
15
Конечный объем
35
Bola 2 al.sp. Таблица 1.3
Основной раствор
Компоненты
Рабочий раствор
мкл
H<sub>2</sub>O
22,9
10×
Буфер
1×
3,0
2 мМ
дНТФ
2
1,5
50 пмоль/мкл
Во1а30
10 пмоль
0,2
50 пмоль/мкл
Во1а32
10 пмоль
0,2
50 пмоль/мкл
E70fl
10 пмоль
0,2
50 пмоль/мкл
R71rl
10 пмоль
0,2
100 мМ
MgCl<sub>2</sub>
0,2
5 U/мкл
Taq
1U
0,1
Продукт 1-й ПЦР
1,5
Конечный объем
30
Таблица 2
Температуно-временной режим реакций амплификации
Первая реакция амплификации
Вторая реакция амплификации
Температура
Количество циклов
Время
Температура
Количество циклов
Время
95°C
1
7 мин
95°C
1
7 мин
94°C
10
1 мин
94°C
30
1 мин
60°C
2 мин
52°C
30 сек
72°C
1 мин
72°C
1 мин
72°C
1
7 мин
72°C
1
7 мин
Таблица 3
Распределение животных черно-пестрой породы в зависимости от генотипа по гену BoLA-DRB3
Генотип по гену BoLA-DRB3
Частота встречаемости генотипа ER
Диагностика провируса методом ПЦР
Результаты РИД
+
-
+
n
%
n
%
n
%
n
%
Устойчивые аллели (ER), в т.ч.
72
20,93
5
6,94
67
93,06
0
0
гомозиготы
14
4,07
0
0,00
14
100,00
0
0
гетерозиготы
58
16,86
5
8,62
53
91,38
0
0
Другие аллели
272
79,07
56
20,59
216
79,41
10
3,56
Всего по стаду
344
100,00
61
17,73
283
82,27
10
3,56
Таблица 4
Генотипы быков по гену BoLA-DRB3, содержащихся на 6 племпредприятиях России
Генотип по гену BoLA-DRB3
Частота встречаемости генотипа ER
Диагностика провируса методом ПЦР
+
-
n
%
n
%
n
%
Устойчивые аллели (ER), в т.ч.
4
13,33
0
0,00
4
100,00
гомозиготы
2
6,67
0
0,00
2
100,00
гетерозиготы
2
6,67
0
0,00
2
100,00
Другие аллели
26
86,67
0
0,00
26
100,00
Всего
30
100,00
0
0,00
30
100,00