ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОТОРАЯ ОБЕСПЕЧИВАЕТ ПОДДЕРЖАНИЕ ЭПИСОМАЛЬНОЙ РЕПЛИКАЦИИ В КЛЕТКЕ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, И ВЕКТОР ЕЕ ВКЛЮЧАЮЩИЙ
NUCLEIC ACID SEQUENCE THAT PROVIDES MAINTENANCE OF EPISOMAL REPLICATION IN MAMMALIAN CELL AND VECTOR COMPRISING THEREOF

Известный уровень техники
Вирус Эпштейна-Барра (EBV) представл ет собой вирус герпеса человека с латентной фазой, характеризуемой стабильным эписомальным размножением замкнутой в кольцо формы вирусной ДНК. Дл  латентной фазы репликации необходимы два дискретных элемента ДНК: наход щеес  в цис-положении начало репликации, OriP, и  дерный антиген 1 Эпштейна-Барра (EBNA1) - единственный кодируемый вирусом белок, необходимый дл  репликации (Yates et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3806-10, 1984; Yates et al. Nature 313: 812-5, 1985). Большинство векторов EBV очень велики, пор дка 10 т.п.о. или больше (без вставки), из-за большого размера сегментов EBNA1 и OriP. Размер существующих сегментов EBNA1 и OriP служит помехой в разработке экспрессионных векторов с улучшенными свойствами и в создании компактных экспрессирующих ген и стабильных кассет, которые могут быть введены в состав других средств доставки, таких как ретровирусы или аденовирусы.
Краткое изложение существа изобретени
В целом отличительной особенностью изобретени  служит последовательность нуклеиновой кислоты, котора  обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего. Эта нуклеотидна  последовательность включает (а) последовательность OriP с делецией и (b) последовательность EBNA1 с делецией, функционально св занную с промотором, и эта нуклеотидна  последовательность имеет длину менее 3 т.п.о., предпочтительно менее 2 т.п.о. и наиболее предпочтительно менее 1,8 т.п.о.
В предпочтительных вариантах последовательность OriP включает приблизительно 1-495 остатки SEQ ID NO:1 последовательность EBNA1 включает приблизительно 627-1718 остатки SEQ ID NO:1; последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно включает консенсусную последовательность полиаденилировани  (например, близкую к последовательности SEQ ID NO: 2); а промотор представл ет собой вирусный промотор.
В сходных вариантах в изобретении характеризуютс  также векторы и клетки (например, клетки млекопитающих и предпочтительно клетки человека), которые включают такие последовательности нуклеиновых кислот.
Подробное описание
Фиг.1 представл ет собой последовательность укороченной EBV OriP и EBNA-1 кассеты.
Фиг.2 представл ет собой последовательность компактного синтетического работающего в обоих направлени х сайта полиаденилировани , котора  может быть применена совместно с компактным репликоном EBV.
После большой делеции и мутагенеза оказалось возможным вставить во фрагмент длиной менее 2 т.п.о. цис- и трансдействующие функции, необходимые дл  эписомальной репликации EBV. В частности, примером  вл етс  представленный на фиг.1 фрагмент из 1748 пар оснований (SEQ ID NO: 1), который действует как компактный репликон EBV. Этот фрагмент содержит все последовательности, необходимые дл  эффективной экспрессии белка EBNA-1, за исключением консенсусной последовательности полиаденилировани . Фрагмент  вл етс  сегментом от сайта Вg12 до сайта BamHl, который содержит OriP элемент между остатками 1 и 495, модифицированный промотор гена тими-динкиназы вируса 1 Неrpes simplex между остатками с 496 до 616 и кодирующую последовательность дл  укороченного и модифицированного гена EBNA1 между остатками 627 и 1718. Плазмидные векторы, основанные на этой последовательности, реплицируют как эписомы в  дре трансфецированных клеток, происход щих не от грызунов (Yates et al., 1985, смотри выше).
Дл  сведени  к минимуму суммарной длины последовательности указанный выше фрагмент конструировали как вставку вышеработающего в обоих направлени х сайта полиаденилировани  в соответствующем векторе. Пример компактного синтетического работающего в обоих направлени х сайта полиаденилировани  представлен на фиг.2 (SEQ ID NO: 2).
Компактные репликоны EBV наход т применение в векторах дл  генной терапии, например, в средствах доставки генов, таких как экспрессионные векторы.
Другие осуществлени  представлены в формуле изобретени .