ШТАММ PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII SUBSP. SHERMANII - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА
STRAIN OF PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII SUBSP SHERMANII-PRODUCER OF FEED PROTEIN

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии, сельскому хозяйству.
Известны дрожжи Saccharomices cerevisiae расы У-1986 (Патент RU №2183666, C12F 3/10, опубл. 2002 г.) /1/.
Дрожжи данной расы используют для сбраживания зернового сусла в спиртовом производстве. Их функцией является переработка сахаров сусла в спирт. Кормовой продукт при этом не является целевым продуктом, его утилитарное назначение не определено. Он является отходом спиртового производства, загрязняющим окружающую среду. Контроль за качеством и составом данного отхода осуществлять трудно.
Известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-928К - продуцент кормового белка (Патент RU №2042713, С12Р 1/100, опубл. 20.06.2002 г.) /2/.
Недостатком данного известного штамма является использование для получения кормового белка дрожжей рода Candida, которые являются условно патогенным микроорганизмом, что требует выполнения дополнительного процесса термолиза и наличия специального оборудования, сложной системы обезвреживания стоков и воздушных выбросов при значительных объемах используемого воздуха. Санитарно-эпидемиологическими правилами СанПиН 2.3.2.1078-01 дрожжи рода Candida включены в перечень веществ, которые оказывают вредное воздействие на здоровье человека. Скорость роста клеток известного штамма невысокая, что удлиняет производственный цикл и снижает удельный выход целевого продукта на стадии биосинтеза. Кроме того, при приготовлении кормового белка с использованием данного известного штамма дрожжей требуется большой расход тепло- и энергоресурсов для высушивания биомассы и значительный расход (1,5 г/л) сульфата аммония.
Использование бактерий в качестве продуцента белкового корма является более эффективным, так как бактерии образуют до 75% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%. Использование нового штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 для приготовления белкового корма не требует расхода воздуха и энергозатрат на его подачу, так как данный штамм пропионовокислых бактерий является анаэробом. Штамм обладает широким спектром антимикробного действия, что исключает развитие посторонней микрофлоры в процессе биосинтеза и поэтому не требуется наличие специального оборудования для соблюдения условий стерильности. Возможность утилизации разнообразных отходов отраслей промышленности, использующих природное сырье, при наращивании биомассы нового штамма с целью приготовления белкового корма решает экологические проблемы предприятий.
Наиболее близким к данному изобретению является штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 - продуцент кормового белка (Патент RU №2247149 C1, C12N 1/20, С12Р 21/00 // (С12N 1/20, C12R 1/01) (опубл. 27.02.2005 г.).
Недостатком данного изобретения является недостаточно высокая концентрация биомассы, накапливаемая в присутствии 1,5% пропионовой кислоты, а следовательно, недостаточное количество белка, которое могло бы образоваться культурой.
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является исключение загрязнения окружающей среды, снижение энергозатрат при приготовлении кормового белка, упрощение аппаратурного оснащения, утилизация отходов производств, использующих природное сырье, повышение биологической ценности кормового белка за счет обеспечения возможности обогащать микрофлору кишечника животных живыми клетками пропионовокислых бактерий.
Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента кормового белка используют вновь выделенный штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27, депонированный во Всероссийской Государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, регистрационный номер - штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ВГНКИ-08.02.57.-ДЕП (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5). Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии (111033, Москва, ул. Самокатная, д.4Б).
Ниже приведены примеры реализации изобретения.
Пример 1.
Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27 был получен путем многократных (не менее 45) пересевов клеток исходного штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Ac-103 на плотную питательную среду следующего состава:
Дрожжевой экстракт
10,0 г
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
1,0 г
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
3,0 г
Лактат натрия (70% раствор)
40,0 мл
CoSO<sub>4</sub>
1,0 мг
Агар
20,0 г
Вода дистиллированная до
1000 мл
Содержание свободной пропионовой кислоты в среде постепенно повышали от 0 до 3,0%. Клетки инкубировали на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 ч. Отбор осуществляли по количеству колоний и по кислотообразующей способности, которую определяли титрованием. Отбирали те колонии, рост которых на плотной питательной среде не ингибировался в присутствии 3,0% пропионовой кислоты. После 45 пересевов штамм достиг генетической устойчивости. Результаты отбора нового штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27 путем ступенчатого селекционирования приведены в таблице 1, которая свидетельствует о том, что при содержании в среде пропионовой кислоты до 2,5%, рост клеток нового штамма пропионовокислых бактерий (в отличие от исходного штамма) не ингибируется и характеризуется достаточно большим количеством клеток. При большем содержании пропионовой кислоты (3,0%) происходит резкое снижение количества клеток и морфология клеток меняется.
Полученные результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Сравнение свойств исходного и нового штаммов Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii
Наименование штамма
Концентрация пропионовой кислоты, %
Количество клеток в 1 мл культуральной жидкости
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Ac-103 (исходный штамм)
0
3,0·10<sup>8</sup>
0,5
5,0·10<sup>6</sup>
1,0
1,0·10<sup>2</sup>
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Ac-103/27
0
3,0·10<sup>10</sup>
0,5
1,0·10<sup>10</sup>
1,0
5,0·10<sup>8</sup>
2,0
1,0·10<sup>6</sup>
3,0
2,0·10<sup>3</sup>
Для размножения штамма наиболее крупные колонии пересевали на жидкую питательную среду следующего состава:
Дрожжевой экстракт
10,0 г
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,0 г
Na<sub>2</sub> HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
3,0 г
CoSO<sub>4</sub>
1,0 мг
Лактат натрия (70% раствор)
40,0 мл
Вода дистиллированная до
1000 мл
Для длительного хранения клетки штамма лиофилизировали в сепарированном молоке и хранили в условиях отсутствия кислорода. Клетки штамма можно также хранить на 10%-ном сахарозно-желатиновом агаре или в полужидкой среде под маслом.
Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным. Он не представляет опасности по другим причинам.
В соответствии с Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams & Wilkins, USA выделенный штамм идентифицирован как Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27.
Культурально-морфологические особенности штамма: неподвижные палочки размером 0,5-1,5 мкм, иногда образующие короткие изогнутые цепочки, иногда имеют вид кокков. Грамположительные. Неспорообразующие. Аэротолерантные. Сбраживают фруктозу, лактозу, галактозу, глюкозу, маннозу. Главный продукт метаболизма - пропионовая кислота. В клеточной стенке основным компонентом является мезо-ДАН. Оптимум pH 7,0-7,2. Оптимум температуры 32°С.
Пример 2.
Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27 был оценен по способности образовывать повышенное содержание белка путем культивирования его на жидкой питательной среде состава, указанного в примере 1, по результатам измерения количества образовавшейся в культуральной жидкости биомассы и сырого протеина.
Инокулят в количестве десяти объемных процентов вносили в колбы с жидкой питательной средой объемом 750 мл и проводили культивирование в стационарных условиях при соблюдении следующих параметров: температура 37°С, pH 6,0. В качестве нейтрализующего агента использовали 20%-ный раствор гидроокиси натрия. После 48 часов культивирования определяли рост бактерий и количество образовавшейся в процессе биосинтеза биомассы и сырого протеина в культуральной жидкости.
Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Характеристика выделенного штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27
Наименование показателя
Величина показателя
Количество клеток в 1 мл культуральной жидкости
1,5·10<sup>9</sup>
Удельный выход от субстрата, мас.%
96,0
Массовая доля сырого протеина, %
49,0
2
На основании полученных результатов сделан вывод о том, что селекционированный штамм обладает высокой продуктивностью в отношении целевого продукта - накопления биомассы (исходное содержание бактериальных клеток было равно 1,0·10), высоким удельным выходом от используемого субстрата и накоплением сырого протеина до 49% против 25% у исходного штамма. Штамм может быть использован в промышленном масштабе.
Новый штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27 позволяет получать белковый корм с высоким выходом при утилизации отходов производств: послеспиртовой барды, пивной дробины, отходов мукомольного и крахмального производств, отходов переработки зернового и плодового сырья.
Пример 3.
4
В послеспиртовую барду вносят 1,1 мг/л CoSO и выращивают чистую культуру Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27.
По окончании процесса ферментации полученную массу разделяют на твердую и жидкую фазу путем фильтрования.
Твердую фазу направляют на высушивание при температуре (80-90)°С.
Кормопродукт, получаемый после высушивания твердой фазы, содержит 46,0% сырого протеина и имеет следующий состав:
массовая доля углеводов, % по с.в.
45,0
массовая доля золы, % по с.в.
2,5
общее содержание аминокислот, %
44,0
из них
лизин + гистидин
2,15
аргинин
1,25
аспарагиновая кислота
4,25
треонин
2,0
серин
2,08
глутаминовая кислота
14,84
метионин + цистин
1,3
глицин
2,6
пролин
3,14
фенилаланин + тирозин
2,65
аланин
4,4
изолейцин + лейцин
2,53
массовая доля белка по Барштейну, % по с.в.
37,1
массовая доля жира, % по с.в.
4,7
общее содержание микроэлементов, мг/кг
21800
из них
фосфор
5900
калий
3500
натрий
500
кальций
11600
магний
1000
железо
750
кобальт
4,9
содержание витаминов, мг/кг
Е (токоферол)
43,5
B<sub>1</sub> (тиамин)
3,3
В<sub>2</sub> (рибофлавин)
7,7
В<sub>3</sub> (пантотеновая кислота)
35,3
В<sub>4</sub> (холин)
700
В<sub>5</sub> (никотиновая кислота)
26,8
В<sub>6</sub> (пиридоксин)
8,2
В<sub>9</sub> (фолиевая кислота)
18,0
В<sub>12</sub> (цианкобаламин)
34,4
обменная энергия, МДж
13,4
кормовых единиц, кг
1,39
Полученная после фильтрации жидкая фаза с содержанием в г/л:
сухих веществ
10,1
массовая доля азотистых веществ
1,04
массовая доля золы
1,3
массовая доля жира
0,006
массовая доля углеводов
1,7
массовая доля аммонийного азота
0,04
общее содержание аминокислот, %
0,29
общее содержание микроэлементов
1,05
общее содержание витаминов
1,03
содержание пропионата, г/100 мл
2,5
Полученный кормовой продукт содержит живые клетки пропионовокислых бактерий, обогащающие микрофлору кишечника животных, потребляющих корм, что приводит к повышению его биологической ценности.
Пример 4.
Культуральную жидкость после ферментации с помощью Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27 по примеру 3 подвергают предварительной фильтрации. После фильтрации получается осадок влажностью 55-60%, который может использоваться в качестве готового влажного корма.
Пример 5.
2
В молочную сыворотку с содержанием сухих веществ 4-5% добавляют 1,0 мг/л CoCl, подогревают до 50°С, вносят 20 об.% клеток чистой культуры Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27. Инкубацию проводят в течение 8 ч при температуре 45°С и pH 6,0-6,5. После высушивания полученной биомассы получают белково-витаминный корм, содержащий живые клетки пропионовокислых бактерий в экспоненциальной фазе роста.
Пример 6.
4
Пивную дробину разводят водопроводной водой в соотношении 1:1, устанавливают pH на уровне 6,0-6,5, температуру 59-61°С и вносят 1,4 ед./г условного крахмала α-амилазы. Смесь выдерживают в этих условиях в течение 55 мин, а затем - 55 мин при температуре 74-76°С. После охлаждения смеси до 59-61°С вводят в нее 0,4 ед./г α-амилазы и выдерживают в этих условиях в течение 35 мин. Смесь охлаждают до 45-50°С и вносят 5,5 ед./г условного крахмала глюкоамилазы и выдерживают при pH 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 6%, после чего в приготовленный ферментолизат пивной дробины вводят 1,1 мг/л CoSO и чистую культуру Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27 в количестве 10 об.% Инкубацию ведут при периодическом перемешивании в течение 20 ч при температуре 50°С и pH 6,0-6,5.
Полученную биомассу пропионовокислых бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, высушивают и получают белково-витаминный корм.
Жизнеспособность клеток в готовом высушенном белковом корме сохранялась.
Полученный белково-витаминный продукт содержал протеина 49,9% по с.в., аминокислот 44,2% по с.в., углеводов 37,7% по с.в.
Пример 7.
Мукомольные отходы измельчают до прохода не менее 80% через сито с ячейками диаметром 1 мм. Готовят водную суспензию измельченных мукомольных отходов путем их смешивания с водой в соотношении 1:3. В приготовленную суспензию вносят 20 ед./г сухого вещества целлюлозы целлюлолитического фермента β-глюканазы и выдерживают приготовленную смесь при температуре (59-61)°С и pH 6,0 в течение 55 мин, а затем при температуре 105°С в течение 25 минут до достижения содержания редуцирующих веществ 3-5%, после чего дополнительно вносят 8 ед./г целлюлозы β-глюканазы и 5 ед./г условного крахмала глюкоамилазы. Приготовленную смесь выдерживают при температуре 45°С и pH 5,0 в течение 30 мин до достижения содержания редуцирующих веществ 7-10%.
2
После обработки в осахаренную массу вносят 0,9 мг/л CoCl и осуществляют на ней инкубацию микроорганизмов Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii 103/27 при температуре 45°С и pH 6,0-6,8. Через 24 часа образуется белково-витаминный продукт с массовой долей протеина до 49,6% по с.в., с содержанием аминокислот 44,1% по с.в., содержанием углеводов 37,7% по с.в.
Пример 8.
Крахмальные отходы обрабатывают аналогично зерновому сырью и мукомольным отходам, исключая стадию измельчения. При приготовлении смеси - крахмальные отходы - вода, количество воды регулируют так, чтобы получить суспензию концентрацией 14-16%.
На полученной среде проводят инкубацию Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27.
Получают корм, богатый биологически активными веществами и белком.
Пример 9.
Измельченное зерно, мукомольные отходы или крахмальные отходы используют для приготовления ферментолизатов путем обработки их водных суспензий амилолитическими ферментами. Для этого в водную суспензию вносят 1,4 ед./г условного крахмала α-амилазы, смесь выдерживают 55 мин при температуре 59°С и pH 5,8, затем 35 мин при 95°С, после чего смесь охлаждают до 45°С, вводят в нее 0,4 ед./г условного крахмала α-амилазы и 6,5 ед./г условного крахмала глюкоамилазы. Выдерживают приготовленную смесь 30 мин при температуре 45°С и pH 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 7% с получением ферментолизата, на котором инкубируют чистую культуру Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27 с получением полноценного белково-витаминного корма.