СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ РЕЦИДИВА ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING RECURRENT INFLAMMATORY INTESTINAL DISEASES

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, гастроэнтерологии и может быть применено для прогнозирования развития рецидива неспецифического язвенного колита или болезни Крона по результатам иммуноферментного определения в крови и образцах кала антимикробных пептидов.
В описании изобретения к патенту «Полипептиды с противомикробной активностью и кодирующие их полинуклеотиды» (патент РФ №2393224, опубл. 27.06.2010) дана характеристика различных классов дефензинов, их способности вызывать гибель или ингибировать рост микробных клеток. В патенте указано, что полипептиды с противомикробной активностью обладают способностью снижать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) и Bacillus subtilis (АТСС 6633) до 1/100 через 8 часов, ингибировать рост Escherichia coli (DSM 1576) и Bacillus subtilis (АТСС 6633) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для микробного роста, что может быть использовано в качестве лечебного или профилактического средства для больного с инфекционной патологией.
В исследованиях других авторов (Вахрамеева Т.Н., Бедарева Т.Ю. «Дефензины как маркер системной активации нейтрофилов при клещевых нейроинфекциях» // Медицина в Кузбассе. -2008. - №3. - С.15-19) было доказано, что в динамике инфекционного заболевания уровень дефензинов соответствовал клинической выраженности общеинфекционного синдрома: в остром периоде уровень дефензинов повышался, при микст-инфекциях отмечалось более высокое содержание дефензинов в сравнении с моноинфекциями. При этом, развивающиеся воспалительные изменения в ликворе коррелировали с ростом уровня дефензинов. В период регресса общеинфекционных проявлений количество дефензинов при менингеальной форме клещевого энцефалита значительно снижалось, достигая практически нормальных показателей. Таким образом, авторы делают вывод о возможности определения концентрации дефензинов в крови как биоцидных продуктов нейтрофилов для объективизации тяжести течения инфекции.
Известен способ определения в кале кальпротектина (связанный с кальцием протеин, содержащийся в нейтрофильных гранулоцитах) как маркера воспаления слизистой оболочки толстой кишки («Fecal sample test device and methods of use», US, 7780915, 24.08.2010). В описании изобретения к патенту указано, что содержание кальпротектина ниже 50 мкг/г свидетельствует об отсутствии воспаления слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Однако, автор не указывает возможностей для оценки активности воспалительного процесса и его ремиссии.
В исследовании других авторов представлено, что фекальный кальпротектин отражает активность воспалительного процесса у детей с воспалительными заболеваниями кишечника (Татьянина О.Ф., Потапов А.С., Намазова-Баранова Л.С., Цимбалова Е.Г., Кучеренко А.Г. Возможности кальпротектина в диагностике воспалительных заболеваний кишечника у детей // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2009. - №1. - С.42-48). При ремиссии неспецифического язвенного колита содержание фекального кальпротектина составило 94,43±13,23 мкг/г, при низкой и высокой клинической активности заболевания, соответственно, 193,14±24,02 мкг/г и 253,17±26,85 мкг/г. Однако, содержание кальпротектина в стуле у детей имеет отличительные особенности по сравнению со взрослыми пациентами, что требует изучения проблемы в различные возрастные периоды.
Известен также способ определения степени активности неспецифического язвенного колита у детей (патент РФ №2391669, опубликован 10.06.2010). Способ включает определение степени активности неспецифического язвенного колита у детей по содержанию коллагена IV типа в крови. При значении последнего в пределах от 53 до 104 мкг/л в сыворотке крови определяют 1 степень, от 104 до 201 мкг/л - 2 степень, от 201 мкг/л и выше - 3 степень активности колита.
Известен также способ определения показаний к иммунологической коррекции болезни Крона и неспецифического язвенного колита (патент РФ №2258223, опубл. 10.08.2005), согласно которому уточняют содержание сывороточных фактора некроза опухоли-α, интерлейкина-6, интерлейкина-12 до и после введения препарата ремикейда в дозе 4-6 мг/кг и при снижении содержания сывороточного фактора некроза опухоли-α вдвое и интерлейкина-6 на 37% и более и при повышении уровня интерлейкина-12 на 230-250%, считают иммунологическую коррекцию болезни Крона и неспецифического язвенного колита доказанной. Таким образом, по содержанию в крови иммунологических факторов судят о степени активности заболевания и наступлении ремиссии.
Общим недостатком приведенных способов является то, что определение маркеров воспаления в крови, в частности, у взрослых пациентов с возможной коморбидной воспалительной патологией, характеризует общую характеристику заболевания, а не локальный статус активности воспаления. Определение факторов, отражающих степень активности воспалительного процесса в биоптате слизистой толстой кишки при эндоскопическом исследовании травматично и инвазивно, не может использоваться часто, а при измерении концентрации маркеров воспаления в кале следует учитывать протеолитическую активность фекальных ферментов. Быстрое разрушение интерлейкинов, фактора некроза опухоли-α, коллагена IV протеолитическими ферментами, содержащимися в кале, препятствует их широкому использованию в клинической практике.
Выходом из сложившейся ситуации является определение антимикробных пептидов в кале с одновременным определением их в крови, так как они не подвержены воздействию протеолитических ферментов, сохраняются в образцах стула в течение 7 дней при комнатной температуре, а для исследования методом иммуноферментного анализа (ИФА) требуется небольшое количество образца до 50 мг.
Задачей заявляемого изобретения является оценка вероятности развития рецидива у больных с воспалительными заболеваниями кишечника по результатам анализа содержания в крови и кале комплекса антимикробных пептидов.
Указанная задача достигается тем, что у больных с воспалительными заболеваниями кишечника с помощью ИФА в крови определяют уровень α-дефензина, а в кале - содержание β-дефензина и кальпротектина. Полученные значения подставляют в математическую формулу линейной множественной регрессии и рассчитывают прогнозируемую величину вероятности развития рецидива язвенного колита в %. Если вероятность равна 50% и более, то у пациента риск развития рецидива высокий и необходима модификация лечения. Если вероятность развития рецидива менее 50%, то состояние больного классифицируется как ремиссия, что не требует дополнительного обследования больного и изменения лечения.
Новизна изобретения состоит в том, что одновременная оценка сразу трех антимикробных пептидов как в крови, так и в кале, позволяет повысить чувствительность прогноза диагностики обострения воспалительных заболеваний кишечника, более точно отражает изменение активности заболевания.
Изобретение имеет изобретательский уровень, так как для специалиста-гастроэнтеролога явным образом не следует из уровня медицины в данной области клинической практики.
В доступных источниках информации России и зарубежных не обнаружено аналогичного предлагаемому способа прогнозирования обострения у больных с воспалительными заболеваниями кишечника.
Заявляемое изобретение является промышленно применимым, так как может быть многократно повторено и использовано при оценке вероятности развития рецидива у больных с воспалительными заболеваниями кишечника, и воспроизведено в различных лечебно-профилактических и научных медицинских учреждениях, особенно гастроэнтерологического и терапевтического профиля.
Способ прогнозирования рецидива у больных с воспалительными заболеваниями кишечника, осуществляется следующим образом.
У больных с установленным диагнозом неспецифического язвенного колита или болезнью Крона забирают образцы венозной крови и кала. Содержание осдефензина в плазме крови определяют с помощью иммунофер-ментного анализа (ELISA) и стандартных диагностических наборов в нг/мл. Контролем служит HNP-1 (human neutropil peptide-1). Плазму получают путем центрифугирования при 3000 об/мин крови, взятой с консервантом (3,8% цитрат натрия) в соотношении 9:1.
Образец кала собирают в чистую пробирку. С помощью специального устройства для экстракции экстрагируют 50-100 мг исходного образца кала для определения кальпротектина. Возможно хранение при температуре 2-8°C в течение 6 дней. Количественное определение содержания кальпротектина в образцах стула проводят иммуноферментным анализом (ELISA) с помощью стандартных наборов. Преаналитический этап заключается в предварительной процедуре экстракции образцов. В пустую полипропиленовую пробирку помещают 50-100 мг образца кала и 2,5-5,0 мл буферного раствора для экстракции (1 объем кала к 49 объемам буферного раствора). Смесь в течение 30 мин энергично встряхивают на вортексе, затем 1,5 мл гомогената переносят в чистую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 g. Полученный супернатант помещают в чистую пробирку и хранят при 20°C до проведения ИФА (экстракты стабильны в течение 4 мес.). Дальнейшее тестирование проводят с помощью ИФА, результаты регистрируют на микропланшетном фотометре при длине волны 450 нм. Расчет концентрации кальпротектина производят с помощью калибровочной кривой. Концентрацию ФК выражают в мкг кальпротектина на 1 г фекалий.
Уровень β-дефензина в кале также определяют с помощью иммуноферментной тест-системы для количественного определения анализируемого вещества в кале в нг/г.
Найденные величины содержания пептидов в биологических средах подставляют в формулу линейной множественной регрессии, полученную методом множественной регрессии, и рассчитывают вероятность развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника в %:
р=(0,0014·βД+0,0005·αД+0,002·ФК-0,4)·100%,
где р - вероятность развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника в %;
βД - содержание β-дефензина в кале в нг/г;
αД - содержание α-дефензина в крови в нг/мл;
ФК - содержание кальпротектина в кале в мкг/г.
Если вероятность развития рецидива равна 50% и более, то у пациента риск развития рецидива высокий и необходима оптимизация лечения. Если вероятность развития рецидива менее 50%, то состояние больного расценивается как состояние ремиссии, что не требует дополнительного обследования и продолжения лечения.
При проведении ROC-анализа были определены диагностические точки разделения для уровней β-дефензина, α-дефензина и кальпротектина с целью дифференцирования состояний рецидива болезни и ремиссии. У больных с воспалительными заболеваниями кишечника рецидив развивался при превышении содержания β-дефензина в кале более 213 нг/г (диагностическая чувствительность - 78%, диагностическая специфичность - 85%), α-дефензина в крови - более 312 нг/мл (диагностическая чувствительность - 71%, диагностическая специфичность - 88%), кальпротектина в кале - более 232 мкг/г (диагностическая чувствительность - 82%, диагностическая специфичность - 89%). Вероятность развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника при достижении указанных диагностических точек разделения трех антимикробных пептидов равна 50%.
При превышении уровней сразу трех антимикробных пептидов в биологических жидкостях диагностическая чувствительность возрастала до 87%, а диагностическая специфичность составила 92%.
Практическое применение заявляемого способа иллюстрируется примерами из клинической практики.
ПРИМЕРЫ:
Пример 1. Больная С., 32 лет. Находилась на обследовании и лечении в отделении гастроэнтерологии. Диагноз: язвенный колит, левосторонняя форма, рецидивирующие течение, средней тяжести, высокой степени активности, стадия обострения.
Жалобы на частый жидкий стул (до 9 раз в сутки) с примесью крови и слизи, субфебрильную лихорадку, тенезмы, переодические боли схвадкообразного характера в левом фланке живота, потерю веса 6 кг за последние 1,5 месяца, общую слабость. Болеет 10 лет. Обострения 2-3 раза в год. Получала препараты 5-АСК, микроклизмы с гидрокортизоном. Последние месяцы принимала 5 мг преднизолона (отменен около 3 недель назад).
Объективно. Удовлетворительного питания, кожные покровы и видимые слизистые бледные. Язык густо обложен белым налетом. Сердце, легкие без отклонений от нормы. Живот болезненный при пальпации по ходу нисходящего отдела толстой кишки. Печень, селезенка пальпаторно не увеличены.
12
9
9
Общий анализ крови: эритроциты 2,94×10/л, Hb 87 г/л, лейкоциты 8,2×10/л, тромбоциты 230×10/л, эозинофилы 2%, сегментоядерные нейтрофилы 69%, палочкоядерные 4%, лимфоциты 22%, моноциты 3%. СОЭ 20 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. Общий белок 78 г/л. Билирубин общий 10,78 мкмоль/л, СРБ (+), сиаловые кислоты 200 ед., фибриноген 6,95 г/л, глюкоза крови 4,7 ммоль/л, АлАТ 11 Ед/л, АсАТ 15 Ед/л, сывороточное железо 11,9 мкмоль/л, кальций сыворотки 2,3 ммоль/л, калий - 4,9 ммоль/л. Простейшие в кале не обнаружены, выявлен дисбактериоз кишечника 2 степени.
Ирригоскопия: кишка несколько укорочена, левая половина лишена гаустр. Контур кишки деформирован, складки сглажены. Колоноскопия: в нисходящем отделе ободочной кишки визуализируются единичные воспалительные полипы 0,3-0,6 см в Д с ярко красной верхушкой и наложением фибрина, подслизистые геморрагии и эрозии. Слизистая рыхлая, легко кровоточит. Сосудистый рисунок отсутствует. Гистологически: обильная лимфоцитарно-нейтрофильная инфильтрация собственной пластинки с очагами деструкции. Снижение количества бокаловидных клеток, нарушение архитектоники железистого эпителия.
Результаты изучения содержания антимикробных пептидов при обострении: β-дефензин в кале 278 нг/г, α-дефензин в крови 485 нг/мл, кальпротектин в кале 312 мкг/г. Вероятность рецидива - 85,5% (более 50%).
Больной был назначен салофальк в дозе 4 г/сут (3 г внутрь и 1 грамм ректально в виде свечей). Клинические симптомы исчезли через 3 недели. Поддерживающая терапия составляла 3 г салофалька в сутки. Через каждые 2 мес.мониторировали содержание антимикробных пептидов в крови и кале. Через 2 мес. β-дефензин в кале 175 нг/г, α-дефензин в крови 289 нг/мл, кальпротектин в кале 86 мкг/г.Вероятность рецидива - 16,1% (менее 50%).
На 4 мес. β-дефензин в кале 238 нг/г, α-дефензин в крови 406 нг/мл, кальпротектин в кале 244 мкг/г. Вероятность рецидива - 62%. Поскольку вероятность рецидива возросла более 50%, то это потребовало увеличения суточной дозы салофалька до 4 г/сутки. Дальнейший мониторинг за больной в течение 8 месяцев наблюдения констатировал наступление ремиссии Ж.
Пример 2. Больной Б., 31 года. Статус через 6 мес. после выписки из гастроэнтерологического отделения. Диагноз: язвенный колит, левосторонняя форма, рецидивирующие течение, средней тяжести, низкой степени активности, ремиссия. Болеет в течение 9 лет. Находится на поддерживающей терапии салофальком 2,5 г в сутки.
Жалоб не предъявляет.
Объективно: удовлетворительного питания. Кожа и видимые слизистые розовые. Язык умеренно обложен белым налетом у корня. Тоны сердца звучные, пульс 76 в 1 минуту, ритмичный, АД 110/70 мм рт.ст. В легких дыхание везикулярное. Живот мягкий, безболезненный. Печень, селезенка не увеличены.
12
9
9
Общий анализ крови: эритроциты 4,1×10/л, Hb 147 г/л, лейкоциты 6,9×10/л, тромбоциты 280×10 /л, эозинофилы -0, сегментоядерные нейтрофилы 65%, палочкоядерные - 1%, лимфоциты 29%, моноциты 4%. СОЭ 12 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. СРВ (-), церулоплазмин 2,0 ммоль/л, сиаловые кислоты 100 ед, фибриноген 3,87 г/л. Общий белок 82 г/л. Билирубин общий 16,7 мкмоль/л, глюкоза крови 4,6 ммоль/л, АлАТ 11 Ед/л, АсАТ 14 Ед/л, сывороточное железо 11,9 мкмоль/л. Микроэлементы плазмы: Ca, Na, K, Mg в норме. Простейшие в кале не обнаружены, выявлен дисбактериоз кишечника 2-й степени.
Результаты изучения содержания антимикробных пептидов: (3-дефензин в кале 164 нг/г, β-дефензин в крови 189 нг/мл, кальпротектин в кале 112 мкг/г. Вероятность рецидива - 14,8%). Поскольку вероятность рецидива низкая (менее 50%), то поддерживающая терапия оставалась прежней. Рецидива в последующие 6 мес.наблюдения не возникало.
Технико-экономическая эффективность заявляемого способа заключается в том, что высокая прогностическая вероятность развития рецидива у больных воспалительными заболеваниями кишечника позволяет провести своевременную профилактику и лечение патологии, что способствует снижению риска инвалидизации пациента и потери им своего социального и трудового потенциала. Исследование безопасно, инвазивные вмешательства (забор крови из вены и кала) минимальны, доступно для профильных учреждений здравоохранения, нетрудоемкое, затраты на оборудование и обучение персонала минимальные.