Сочетание экспрессии маркеров CR1 и Cr2 (cd35/cd21) в диагностике В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний

иммунология

© коллектив авторов, 2015

УДК 616-006.44-078.33

Чибисова О. Н., Бурцев Д. в., Галстян К. М., Луговская Г. И.

сочетание экспрессии маркеров CR1 и CR2 (CD35/CD21) В ДиАГНоСТиКЕ b-клеточных лимфопролиферативных заболеваний

МЗРО ГАУ «Областной консультативно-диагностический центр», 344010, г. Ростов-на-Дону

Проведено исследование частоты экспрессии антигенов CD35 и CD21 в норме и при различных формах B-клеточных лимфопролиферативных заболеваний (B-ЛПЗ). Сопоставлен уровень средней интенсивности флюоресценции антигенов CD35, CD21 и CD200 для разных групп больных B-клеточными В-ЛПЗ. Выявленные закономерности экспрессии антигенов CD35 и CD21 при B-ЛПЗ позволяют рассматривать экспрессию данных маркеров как дифференциально-диагностический признак.

Ключевые слова: B-клеточные лимфопролиферативные заболевания; экспрессия антигенов CD35 и CD21; дифференциальная диагностика.

Chibisova O.N., Burtsev D.V., Galstian K.M., Lugovskaia G.I.

THE COMBINATION OF EXPRESSION OF MARKERS CR1 AND CR2 (CD35/CD21) IN DIAGNOSTIC OF B-CELL LYMPHOPROLIFERATIVE DISEASES

The oblast counseling diagnostic center, 344010 Rostov-on-Don, Russia

The study was carried out to analyze rate of expression of antigens CD35 and CD21 in norm and under different forms ofB-cell lymphoproliferative diseases. The level of average intensity of fluorescence of antigens CD35, CD21 and CD200 is compared for different groups of patients with B-cell lymphoproliferative diseases. The established patterns of expression of antigens CD35 and CD21 under B-cell lymphoproliferative diseases permit considering expression of the given markers as a characteristic of differential diagnostic.

Keywords: B-cell lymphoproliferative disease; expression; gene CD35 and CD21; differential diagnostic.

В настоящее время установлены основные иммунофе-нотипические характеристики опухолевых клеток при различных вариантах. B-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях (B-ЛПЗ). Однако нередко иммунологический фенотип опухолевых B-лимфоцитов не соответствует его классической характеристике, что затрудняет интерпретацию полученных результатов. Все это указывает на необходимость поиска новых маркеров в дифференциальной диагностике B-ЛПЗ. В последние годы появились данные об использовании антигенов CD35 и CD21 как дополнительных маркеров в дифференциально-диагностической панели типирования B-ЛПЗ [1, 2, 5].

CD35 (35-250 кД) - одноцепочечный гликопротеин клеточной поверхности, для которого известны четыре аллотипа (А, B, С, D); рецептор комплемента C3b/C4b (CR1). В норме экспрессируется эритроидными клетками, нейтрофилами, эозинофилами, базофилами, моноцитами, B-клетками и 1015% T-лимфоцитов. CD35 часто экспрессируется при остром миелоидном лейкозе, может экспрессироваться на опухолевых тучных клетках, экспрессируется при неходжкинской лимфоме, но обычно не экспрессируется опухолевыми клетками при хроническом лимфоцитарном лейкозе [5].

CD21 (145 кД) - гликопротеин клеточной поверхности; часть большого комплекса передачи сигнала, также содержащего CD19 и CD81; рецептор комплемента CR2 или C3dR,

Для корреспонденции: Чибисова Ольга Николаевна, науч. сотр. Адрес: 344010, Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 127 E-mail: chibisova.okds@gmail.ru

связывающий C3d, C3dg и iC3b; рецептор вируса Эпштейна-Барр (EBV); экспрессируется на субпопуляции нормальных B-клеток, в том числе лимфоцитах мантийной и маргинальной зоны фолликула. CD21 экспрессируется на опухолевых клетках в большинстве случаев хронического лимфоцитар-ного лейкоза и 50% случаев неходжкинской B-клеточной лимфомы, однако экспрессия при хроническом лимфоци-тарном лейкозе слабее, чем на нормальных B-клетках; слабо экспрессируется на ворсинчатых клетках [5].

Однако в связи с малочисленными исследованиями экспрессия опухолевыми клетками антигенов cD35 и cD21 при различных формах B-ЛПЗ остается недостаточно хорошо изученной.

Целью настоящего исследования стало изучение диагностического значения сочетания экспрессии антигенов cD35 и CD21 при B-ЛПЗ.

Материалы и методы. Провели иммунофенотипирова-ние лимфоцитов крови у 54 пациентов в возрасте от 40 до 82 лет с B-ЛПЗ, в том числе у 17 с B-ХЛЛ, у 8 с волосатокле-точным лейкозом (ВКЛ), у 10 лимфомой из клеток зоны мантии (ЛКЗМ). Контрольную группу составили 10 практически здоровых лиц. Опухолевые клетки пациентов с B-ХЛЛ имели классический иммунофенотип: CD19+, CD20+dim, CD22+dim, CD5+, CD23+, CD43+, CD10- с рестрикцией по легким цепям к- или Х-типа. Иммунологический фенотип опухолевых клеток ВКЛ характеризовался экспрессией CD19+, CD20++high, CD22++high, CD5-, CD103+, CD11c++, CD25+, CD43-, к- или Х-тип. Диагноз лимфомы из клеток зоны мантии подтвержден наличием экспрессии циклина D1, у 2 пациентов - наличием транслокации t (11; 14). Фенотип опухолевых клеток ЛКМЗ соответствовал CD19+, CD20+high, CD22+high, CD5+,

ИММУНОЛОГИЯ

Рис. 1. Частота (в %) экспрессии антигенов СБ35 и СБ21 в норме и у больных В-ЛПЗ.

1 - норма; 2 - В-ХЛА; 5 - ВКЛ; 4 - АМЗС; 5 - СД23-отрицательная ЛКЗМ; 6 - СД23-положительная ЛКЗМ.

Рис. 2. Зависимость МР1 антигенов СБ21 и СБ200 в контрольной группе.

Здесь и на рис. 3, 4: по оси абсцисс - число обследованных лиц; по оси ординат - уровень МБ1 (в усл. ед).

CD23+/-, CD10-, к- или Х-тип. Иммунофенотип опухолевых В-клеток ЛМЗС характеризовался CD19+, CD5-, CD20+high, CD22+high, CD43-, CD23+-, CD10-, к- или Х-тип.

Основная панель для диагностики и дифференциальной диагностики вышеперечисленных В-ЛПЗ включала следующие моноклональные антитела (МКА): Anti-CD45-PerCP (Clone 2D1;BD Pharmingen), Anti-CD5-APC (Clone L17F12; BD Pharmingen), Anti-CD43-FITC (Clone IG10; BD Pharmingen), Anti-CD22-PE (Clone S-HCL-1; BD Pharmingen), Anti-CD23-PE (Clone EBVCS-5; BD Pharmingen), Anti-CD 19-FITC (Clone SJ25C1; BD Pharmingen), Anti-CD38-PE (Clone HB7; BD Pharmingen), Anti-CD103-PE (Clone Ber-ACT8; BD Pharmingen), Anti-CD11c-APC (Clone S-HCL-3; BD Pharmingen), Anti-CD25-PE (Clone 2A3; BD Pharmingen), Anti-CD10-PE (Clone HI10a; BD Pharmingen), Anti-K-FITC/Х-PE/CD 19-PerCP (BD Pharmingen).

В качестве дополнительных маркеров в панель включили МКА: Anti-CD35-FITC (Clone E11; BD Pharmingen), Anti-CD21-PE (Clone B-1y4; BD Pharmingen), Anti-CD200-PE (Clone MCR 0X-104; BD Pharmingen).

Исследование проводили на проточном цитофлюориме-тре FACSCanto (Becton Dickinson - BD, США) с использованием программного обеспечения FACSDiva (BD). Первичное иммунофенотипирование осуществляли с применением стандартной методики пробоподготовки. Критерием пози-

Рис. 3. Зависимость MFI антигенов CD21 и CD200 у больных В-ХЛЛ.

Рис. 4. Зависимость МР1 антигенов СЭ21 и СЭ200 у больных СЭ23-позитивной ЛКЗМ.

тивности считали наличие экспрессии маркера на поверхности более чем 20% опухолевых клеток.

Результаты и обсуждение. В результате анализа установили экспрессию антигенов СБ21 и СБ35 практически на всех В-лимфоцитах у здоровых лиц контрольной группы (рис. 1).

Среди больных В-ХЛЛ экспрессию антигена СБ21 выявили у 100%, а экспрессия антигена СБ35 отсутствовала. У 100% пациентов экспрессию маркеров С035/С021 наблюдали при ЛКМЗ с типичным иммунофенотипом, при этом опухолевые клетки атипичной СВ23-позитивной лимфо-мы мантийной зоны экспрессировали антиген СБ35 слабее (80%). Наиболее низкую и гетерогенную экспрессию маркеров СБ35/СБ21 по сравнению с таковой в контрольной группе и у больных ЛКМЗ наблюдали при ЛМЗС (СБ35 экс-прессировался в 50%, а СБ21 - в 70%). У пациентов с ВКЛ экспрессия данных антигенов полностью отсутствовала.

Результаты сравнительного анализа значений средней интенсивности флюоресценции (МР1) маркеров СБ35/СБ21 при различных формах В-ЛПЗ показали, что плотность экспрессии антигена СБ21 во всех группах больных оказалась достоверно ниже, чем в контрольной группе практически здоровых лиц (р < 0,05) (см. таблицу), что согласуется с данными литературы [1, 2, 5].

При ЛКЗМ и ЛМЗС также выявляли более низкий уровень МР1 антигена СБ35 по сравнению с таковым в контрольной группе, но не достоверно (р > 0,05).

Следует отметить, что при сопоставлении уровня МР1 антигена СБ21 и антигена СБ200 (недавно описанного как ХЛЛ-рестриктированная молекула [6]) в разных группах больных В-ЛПЗ выявляли прямую корреляционную зависимость экспрессии данных антигенов у пациентов с В-ХЛЛ

Сравнительный анализ значений МП антигенов CD21, CD35 и CD200 в разных группах больных B-ЛПЗ

MFI антигенов, Контроль Больные B-ЛПЗ

усл. ед. (n = 10) B-ХЛЛ ВКЛ ЛМЗС CD23- ЛКЗМ CD23+ ЛКЗМ

CD21 13,55 ± 2,03 5,67 ± 2,52* - 5,30 ± 2,91* 6,15 ± 0,67* 8,98 ± 0,65*

CD35 4,10 ± 0,78 - - 2,37 ± 0,47 2,54 ± 0,47 2,95 ± 1,91

CD200 2,62 ± 0,93 7,97 ± 2,04* 9,45 ± 2,35* 1,92 ± 1,1 - 4,23 ± 2,02

Примечание. * p < 0,05 - по сравнению с показателями в контрольной группе.

(рис. 2-4). В контрольной группе практически здоровых лиц и у больных С023-позитивной лимфомой мантийной зоны данная зависимость отсутствовала.

Выводы. 1. Использование сочетания маркеров СБ35/ СБ21 в диагностической панели цитофлюориметрического анализа В-ЛПЗ позволяет не только получить дополнительную информацию об иммунологической характеристике опухолевых клеток, но и рассматривать экспрессию данных антигенов как дифференциально-диагностический признак.

2. Установлена прямая корреляционная зависимость плотности экспрессии антигенов СБ21 и СБ200 у больных В-ХЛЛ.

3. Более низкая частота экспрессии маркера СБ35 и наличие экспрессии антигена СБ200 при атипичной СБ23-позитивной ЛКЗМ по сравнению с таковыми у больных СБ23-отрицательной ЛКЗМ указывают на необходимость дальнейшего изучения патогенеза данной лимфомы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Асцатуров И. А. Иммунофенотипирование в диагностике хронических лимфопролиферативных заболеваний: Дис. ... канд. мед. наук. М.; 1997.

2. Волкова М. А., ред. Клиническая онкогематология: Руководство для врачей. 2-е изд. М.: ОАО «Издательство «Медицина»»; 2007.

3. Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е., Долгов В. В. Лабораторная гематология. Тверь: «Триада»; 2006.

4. Волкова М. А., ред. Редкие гематологические болезни и синдромы. М.: Практическая медицина; 2011.

5. Бэйн Б. Дж., Гупта Р. Справочник гематолога. A-Z: под ред. О. А. Рукавицына. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний; 2010.

6. Gambell P., Cargo C., Nguyen V et al. CD200 expression using flow cytometry in B-cell lymphoproliferative diseases. Int. J. Lab. Hema-tol. 2011; 33(Suppl. 1): 51-2.

REFERENCES

1. Astsaturov I. A. Immunophenotyping in the Diagnosis of Chronic Lymphoproliferative Diseases: Diss. Moscow; 1991.

2. Volkova M. A., ed. Clinical Oncohaematology: Guide for Doctors. 2-nd ed. Moscow: "Izdatel'stvo "Meditsina""; 2007.

3. Lugovskaya S. A., Morozova V. T., Pochtar' M. E., Dolgov V. V. Laboratory Hematology [Laboratornaya gematologiya]. Tver': Triada; 2006.

4. Volkova M. A., ed. Rare Hematologic Diseases and Syndromes. Moscow: prakticheskaya meditsina. 2011.

5. Beyn B. Dzh., Gupta R. Handbook of Hematologist. A-Z: ed. O. A. Rukavitsyn. Moscow: BINOM. Laboratoriya znaniy; 2010.

6. Gambell P., Cargo C., Nguyen V et al. CD200 expression using flow cytometry in B-cell lymphoproliferative diseases. Int. J. Lab. Hema-tol. 2011; 33(Suppl. 1): 51-2.

Поступила 11.08.14 Received 11.08.14

общеклинические методы

© коллектив авторов, 2015 УДК 612.616.08

Татару Д. А.1, 2, Маркова Е. В.1, Осадчук Л. В.2, Шеина Ю. И.3, Светлаков А. В.1

оптимальные условия хранения сперматозоидов для анализа фрагментации ДНК

1ООО «Красноярский центр репродуктивной медицины», Россия, 660037, г. Красноярск; 2ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия, 630090, г. Новосибирск; 3ООО «Новосибирский центр репродуктивной медицины», Россия, 630037, г. Новосибирск

Исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов методом проточной цитометрии для оценки мужской фертиль-ности все чаще начинает применяться в клинической диагностике, однако создание оптимального протокола хранения и подготовки сперматозоидов для анализа до сих пор находится на стадии экспериментальной разработки. Цель исследования - изучить влияние различных условий подготовки эякулята для адекватной оценки индекса фрагментации ДНК (ИФД) сперматозоидов методом SCSA (sperm chromatin .structure assay). У 20 пациентов Красноярского центра репродуктивной медицины оценивали ИФД методом SCSA в свежем нашивном эякуляте и после хранения сперматозоидов при различной температуре (37, 25, 4 oC) и длительности (1-2 и 1-3 сут) и условий хранения (при -20 или -70 oC) замороженных сперматозоидов (в виде нативного эякулята или в TNE-буфере), Показано, что ИФД существенно не меняется в эякуляте, хранившемся при 4 oC в течение 48 ч. При хранении эякулята при (25 или 37 oC ИФД значительно увеличивается уже после 1-х суток, а инкубация эякулята при 37 oC приводит к повышению ИФД уже после 1-го часа. Выявлены индивидуальные различия по степени увеличения ИФД под воздействием изучаемых температур инкубации эякулята. Хранение сперматозоидов при температуре 20 или 70oC в нативном эякуляте либо в TNE-буфере не влияло на ИФД при измерении в течении 1-2 ч. Таким образом, хранение и транспортировка нативного эякулята при 4oC в течение от 1 до 2 сут или в замороженном виде при температуре -20 или -70 oC могут быть рекомендованы для адекватной оценки уровня фрагментации ДНК сперматозоидов.

Ключевые слова: фрагментация ДНК сперматозоидов; мужская фертильность; хранения эякулята. Для корреспонденции:

Татару Дарья Анатольевна, биолог-генетик, аспирант Адрес: 660037, Красноярск, ул. Взлетная, 1/138 E-mail: tataru_dasha@inbox.ru