КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR CONTROLLING PLANT PESTS

[0001] Официальная копия перечня последовательностей подана в электронном виде через EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII с названием файла "80670-US-L-ORG-NAT-1_SeqList.txt", созданного 5 декабря 2014 г., и имеющего размер 170 килобайт, и поданного одновременно с описанием. Перечень последовательностей, содержащийся в данном документе в формате ASCII, является частью описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к пестицидным белкам и молекулам нуклеиновых кислот, которые их кодируют, а также к композициям и способам контроля вредителей растений.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Bacillus thuringiensis (Bt) является грамположительной спорообразующей почвенной бактерией, которая отличается своей способностью продуцировать кристаллические включения, которые особенно токсичны для определенных отрядов и видов вредителей растений, в том числе насекомых, но безвредны для растений и других нецелевых организмов. По этой причине композиции, содержащие штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные белки, могут применяться в качестве приемлемых с точки зрения охраны окружающей среды инсектицидов для контроля насекомых-вредителей, важных с точки зрения сельского хозяйства, или насекомых-переносчиков различных заболеваний человека или животных.
[0004] Кристаллические (Cry) белки из Bacillus thuringiensis обладают сильной инсектицидной активностью в отношении преимущественно личинок чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых. Эти белки также продемонстрировали активность в отношении вредителей из отрядов Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga и вредителей из отрядов подкласса Acari, а также других групп беспозвоночных, таких как Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarcomastigorphora (Feitelson, J. 1993. The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.). Эти белки изначально разделили на классы CryI - CryVI преимущественно на основании их инсектицидной активности. Основными классами были специфические для Lepidoptera (I), специфические для Lepidoptera и Diptera (II), специфические для Coleoptera (III), специфические для Diptera (IV) и специфические для нематод (V) и (VI). Далее белки разделили на подсемейства, белкам с более высокой степенью родства в пределах каждого семейства присвоили буквы для обозначения раздела, как, например, CryIA, CryIB, CryIC и т.д. Еще более близкородственным белкам в пределах каждого раздела присвоили названия, такие как CryIC(a), CryIC(b) и т.д. Термины "токсин Cry" и "дельта-эндотоксин" применялись взаимозаменяемо с термином "белок Cry". Современная номенклатура белков и генов Cry основана на гомологии аминокислотных последовательностей, а не на специфичности в отношении целевых насекомых (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). В этой более распространенной классификации каждому токсину присваивается уникальное название, включающее первичный ранг (арабская цифра), вторичный ранг (заглавная буква), третичный ранг (строчная буква) и четвертичный ранг (еще одна арабская цифра). В современной классификации в первичном ранге римские цифры были заменены на арабские цифры. Например, "CryIA(а)" согласно старой номенклатуре в настоящее время имеет название "Cry1Aa" согласно современной номенклатуре.
[0005] Белки Cry представляют собой глобулярные белковые молекулы, которые накапливаются в виде протоксинов в кристаллической форме в ходе стадии споруляции Bt. После поедания вредителем кристаллы, как правило, растворяются с высвобождением протоксинов, размер которых может варьировать, например, от 130-140 кДа в случае белков Cry, активных в отношении чешуекрылых, и 60-80 кДа в случае белков Cry, активных в отношении жесткокрылых. Протоксины превращаются в полноценные токсичные фрагменты (N-концевой участок размером приблизительно 60-70 кДа) под действием протеаз пищеварительного канала целевого вредителя. Многие из этих белков очень токсичны для специфических целевых насекомых, но безвредны для растений и других нецелевых организмов.
[0006] Белки Cry, как правило, имеют пять доменов с консервативной
последовательностью и три домена с консервативной структурой (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый домен с консервативной структурой, называемый домен I, как правило, состоит из семи альфа-спиралей и вовлечен во вставку в мембрану и образовании пор. Домен II, как правило, состоит из трех бета-складчатых слоев, расположенных в конфигурации типа греческий ключ, а домен III состоит из двух антипараллельных бета-складчатых слоев в виде структуры 'jelly-roll' (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III вовлечены в распознавание и связывание рецепторов, и поэтому считаются детерминантами специфичности токсина.
[0007] Многочисленные коммерчески ценные растения, в том числе широко распространенные сельскохозяйственные культуры, восприимчивы к нападению вредителей растений, в том числе насекомых-вредителей и нематод-вредителей, что приводит к существенному снижению урожайности и качества сельскохозяйственных культур. Например, вредители растений являются главным фактором потери урожая важных мировых сельскохозяйственных культур. Приблизительно 8 миллиардов долларов теряется каждый год только в Соединенных Штатах в связи с повреждениями, вызываемыми вредителями, не являющимися млекопитающими, в том числе насекомыми. В дополнение к потерям урожая полевых культур насекомые-вредители также ложатся бременем на овощеводов и плодоводов, производителей декоративных цветов, а также владельцев приусадебных хозяйств.
[0008] Насекомых-вредителей контролируют главным образом путем интенсивного применения химических пестицидов, которые действуют путем подавления роста насекомых, препятствования питанию или размножению, или вызывая гибель. Средства для биологического контроля вредителей, например, штаммы Bacillus thuringiensis, экспрессирующие пестицидные токсины, такие как белки Cry, также применялись в отношении культурных растений с удовлетворительными результатами, что является альтернативой или дополнением к химическим пестицидам. Были выделены гены, кодирующие некоторые из этих белков Cry, и было показано, что их экспрессия в гетерологичных хозяевах, таких как трансгенные растения, обеспечивает другой инструмент для контроля экономически важных насекомых-вредителей.
[0009] Таким образом, можно достичь надлежащего контроля насекомых, но определенные химические вещества иногда могут наносить вред на нецелевым полезным насекомым, и определенные биологические вещества имеют очень узкий спектр активности. Кроме того, продолжительное применение определенных способов химического и биологического контроля повышает вероятность развития у насекомых-вредителей устойчивости к таким мерам контроля. Частично это ослаблялось путем применения различных агротехнических приемов, связанных с устойчивостью, однако все еще сохраняется потребность в поиске новых и эффективных средств для контроля вредителей, которые обеспечивают экономическую пользу фермерам и которые являются приемлемыми с точки зрения охраны окружающей среды. Особенно необходимыми являются средства для контроля, целенаправленно воздействующие на более широкий спектр экономически важных насекомых-вредителей, и которые обеспечивают эффективный контроль линий насекомых, которые могут стать устойчивыми к существующим средствам для контроля насекомых или являются таковыми.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0010] Ввиду этих потребностей, целью настоящего изобретения является обеспечение новых средств для контроля вредителей путем обеспечения новых генов и пестицидных белков, которые можно применять для контроля целого ряда вредителей растений.
[0011] В настоящем изобретении предусмотрены композиции и способы придания пестицидной активности бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. В частности, предусмотрены химерные гены, содержащие новые полинуклеотиды, которые кодируют белки Cry, выделенные из Bacillus thuringiensis (Bt), и последовательности, в значительной степени идентичные им, экспрессия которых приводит к образованию белков, обладающих токсичностью в отношении экономически важных насекомых-вредителей, в частности, насекомых-вредителей, которые поражают растения. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым белкам Cry, полученным в результате экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, а также к композициям и составам, содержащим белки Cry, которые оказывают токсическое воздействие на насекомых путем подавления способности насекомых-вредителей к выживанию, росту и размножению, либо путем ограничения повреждения или гибели культурных растений, вызванных насекомыми. Белки Cry по настоящему изобретению включают нативные белки Cry и мутантные белки Cry, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций. Примеры мутантных белков Cry включают без ограничения таковые, подвергнутые мутации, чтобы обладать более широким спектром активности по сравнению с их аналогами, нативными белками Cry, или таковые, подвергнутые мутации, чтобы ввести эпитоп для выработки антител, которые избирательно распознают мутантный белок, а не нативный белок. Новые белки Cry по настоящему изобретению обладают высокой активностью в отношении насекомых-вредителей. Например, белки Cry по настоящему изобретению можно применять для контроля одного или нескольких экономически важных насекомых-вредителей, таких как совка-ипсилон (Agrotis ipsilon), кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis), совка травяная (Spodoptera frugiperda), американская кукурузная совка (Helicoverpa zea), огневка тростниковая (Diatraea saccharalis), гусеница совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевая совка (Chrysodeixis includes), огневка кукурузная юго-западная (Diatraea grandiosella), западная бобовая совка (Richia albicosta), табачная совка (Heliothis virescens), восточный кукурузный мотылек (Ostrinia furnacalis), хлопковая совка (Helicoverpa armigera), огневка желтая рисовая (Chilo suppressalis), розовая стеблевая совка (Sesamia calamistis), огневка рисовая (Cnaphalocrocis medinalis) и т.п.
[0012] В настоящем изобретении также предусмотрены синтетические полинуклеотиды, которые кодируют белки Cry по настоящему изобретению и имеют один или несколько кодонов, оптимизированных для экспрессия в трансгенных организмах, таких как бактерии и растения.
[0013] Настоящее изобретение дополнительно относится к кассетам экспрессии и рекомбинантным векторам, содержащим полинуклеотид, который кодирует белок Cry по настоящему изобретению. В настоящем изобретении также предусмотрены трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, ткани и семена, содержащие химерный ген, или кассету экспрессии, или рекомбинантный вектор, которые содержат полинуклеотид, кодирующий белок Cry по настоящему изобретению.
[0014] Настоящее изобретение также относится к способам применения полинуклеотидов, например, в ДНК-конструкциях, или химерных генах, или кассетах экспрессии, или рекомбинантных векторах для трансформация и экспрессии в организмах, в том числе микроорганизмах и растениях. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут представлять собой синтетические последовательности, которые были сконструированы для экспрессии в организме, в том числе без ограничения в микроорганизме или растении, или для получения гибридных токсинов с усиленной пестицидной активностью. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения белков Cry и к способам применения последовательностей нуклеиновых кислот, например, в микроорганизмах для контроля насекомых или в трансгенных растениях для обеспечения защиты от повреждения насекомыми, а также к способам применения белков Cry и композиций и составов, содержащих белки Cry, например, применению белков Cry, или композиций, или составов по отношению к пораженным вредителями участкам, или для профилактической обработки уязвимых для насекомых участков или растений, чтобы обеспечить защиту от повреждения насекомыми-вредителями. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут представлять собой синтетические последовательности, которые были сконструированы для экспрессии в организме, в том числе без ограничения в микроорганизме или растении.
[0015] Композиции и способы по настоящему изобретению применимы для получения организмов, которые токсичны для насекомых, в частности, для получения бактерий и растений. Такие организмы и композиции на их основе актуальны для сельскохозяйственных целей. Композиции по настоящему изобретению также применимы для получения измененных или улучшенных белков Cry, которые обладают пестицидной активностью, или для обнаружения наличия белка Cry или нуклеиновых кислот в продуктах или организмах.
[0016] Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут более понятны со ссылкой на следующее подробное описание и формулу изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0017] SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0009.
[0018] SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0012.
[0019] SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0013.
[0020] SEQ ID NO: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0023.
[0021] SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0067.
[0022] SEQ ID NO: 6 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0009.
[0023] SEQ ID NO: 7 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0012.
[0024] SEQ ID NO: 8 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0013.
[0025] SEQ ID NO: 9 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0023.
[0026] SEQ ID NO: 10 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0067.
[0027] SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0009.
[0028] SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0012.
[0029] SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0013.
[0030] SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0023.
[0031] SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0067.
[0032] SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0009.
[0033] SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0012.
[0034] SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0013.
[0035] SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0023.
[0036] SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0067.
[0037] SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0009.
[0038] SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0012.
[0039] SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0013.
[0040] SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0023.
[0041] SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0067.
[0042] SEQ ID NO: 26-31 представляют собой праймеры, применимые в настоящем изобретении.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0043] Не подразумевается, что данное описание является подробным перечнем всех различных путей, с помощью которых может быть реализовано настоящее изобретение, или всех признаков, которые можно добавить к настоящему изобретению. Например, признаки, проиллюстрированные в отношении одного варианта осуществления, могут быть включены в другие варианты осуществления, а признаки, проиллюстрированные в отношении конкретного варианта осуществления, могут быть удалены из этого варианта осуществления. Таким образом, настоящим изобретением предполагается, что в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно исключить или опустить любой признак или комбинацию признаков, изложенных в данном документе. Кроме того, многочисленные вариации и дополнения к различным вариантам осуществления, предлагаемым в данном документе, будут очевидны для специалистов в данной области в свете настоящего раскрытия, которое не отступает от сути настоящего изобретения. Следовательно, следующие описания предназначены для иллюстрации некоторых конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, а не исчерпывающего определения всех их преобразований, комбинаций и вариаций.
[0044] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Терминология, применяемая в описании настоящего изобретения в данном документе, используется только в целях описания конкретных вариантов осуществления, а не предназначена для ограничения настоящего изобретения. Следует также понимать, что терминология, применяемая в данном документе, представлена исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления, а не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения.
Определения
[0045] Применяемые в данном документе и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на "растение" является ссылкой на одно или несколько растений и включает их эквиваленты, известные специалистам в данной области, и т.д. Применяемое в данном документе слово "или" означает любой элемент из конкретного перечня, а также включает любую комбинацию элементов из такого перечня (то есть, включает также "и").
[0046] Применяемый в данном документе термин "приблизительно" означает примерно, ориентировочно, около или в районе. Если термин "приблизительно" применяется в сочетании с числовым диапазоном, он модифицирует этот диапазон, расширяя границы выше и ниже указанных численных значений. В целом, применяемый в данном документе термин "приблизительно" модифицирует численное значение выше и ниже указанного значения путем отклонения на 20 процентов, предпочтительно 10 процентов вверх или вниз (больше или меньше). Что касается температуры, термин "приблизительно" означает ±1°С, предпочтительно ±0,5°С. Если термин "приблизительно" применяется в контексте настоящего изобретения (например, в комбинациях с температурой или значениями молекулярной массы), предпочтительным является точное значение (то есть, без "приблизительно").
[0047] Под "активностью" токсичного белка Cry по настоящему изобретению подразумевается, что токсичный белок действует как активное при пероральном поступлении средство для контроля насекомых, обладает токсическим действием или способен нарушать или ограничивать питание насекомых, что может или не может вызвать гибель насекомого. Когда токсичный белок по настоящему изобретению доставляется в организм насекомого, как правило, результатом является гибель насекомого, или насекомое не питается источником, который делает токсичный белок доступным для насекомого.
[0048] Применяемый в данном документе термин "амплифицированный" означает создание множества копий молекулы нуклеиновой кислоты или множества копий, комплементарных молекуле нуклеиновой кислоты, с применением по меньшей мере одной из молекул нуклеиновых кислот в качестве матрицы. Системы амплификации включают систему на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему на основе лигазной цепной реакции (LCR), систему амплификации, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA, Cangene, Миссиссога, Онтарио), систему на основе Q-бета репликазы, систему амплификации, основанную на транскрипции (TAS), и амплификацию с замещением цепей (SDA). См., например, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, PERSING et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). Продукт амплификации называется "ампликоном".
[0049] Применяемый в данном документе термин "химерная конструкция", или "химерный ген", или "химерный полинуклеотид", или "химерная нуклеиновая кислота" (или подобные термины) относится к конструкции или молекуле, содержащей два или более полинуклеотидов разного происхождения, собранных в одну молекулу нуклеиновой кислоты. Термин "химерная конструкция", "химерный ген", "химерный полинуклеотид" или "химерная нуклеиновая кислота" относится к любой конструкции или молекуле, которая содержит без ограничения (1) полинуклеотиды (например, ДНК), в том числе регуляторные и кодирующие полинуклеотиды, которые вместе не встречаются в природе (то есть, по меньшей мере один из полинуклеотидов в конструкции является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из его других полинуклеотидов), или (2) полинуклеотиды, кодирующие части белков, не связанные в природе, или (3) части промоторов, которые не связаны в природе. Кроме того, химерная конструкция, химерный ген, химерный полинуклеотид или химерная нуклеиновая кислота могут содержать регуляторные полинуклеотиды и кодирующие полинуклеотиды, полученные из разных источников, или могут содержать регуляторные полинуклеотиды и кодирующие полинуклеотиды, полученные из одного и того же источника, но расположенные иным способом, чем встречающийся в природе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерная конструкция, химерный ген, химерный полинуклеотид или химерная нуклеиновая кислота содержат кассету экспрессии, содержащую полинуклеотид по настоящему изобретению под контролем регуляторных полинуклеотидов, в частности, под контролем регуляторных полинуклеотидов, функционирующих в растениях или бактериях.
[0050] "Кодирующая последовательность" представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в РНК, такую как mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно РНК затем транслируется в организме с продукцией белка.
[0051] Применяемое в данном документе выражение "кодон-оптимизированная" последовательность означает нуклеотидную последовательность рекомбинантного, трансгенного или синтетического полинуклеотида, в котором кодоны выбраны так, чтобы отражать склонность к определенным кодонам, которая может наблюдаться в клетке- или организме-хозяине. Как правило, это выполняется таким образом, чтобы сохранить аминокислотную последовательность полипептида, кодируемого кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК рекомбинантной ДНК-конструкции включает последовательность, которая была кодон-оптимизирована для клетки (например, клетки животного, растения или гриба), в которой данная конструкция будет экспрессироваться. Например, у конструкции, которая будет экспрессироваться в растительной клетке, может быть кодон-оптимизированной для экспрессии в растении вся последовательность или ее часть (например, первый элемент для супрессии гена или элемент для экспрессии гена). См., например, патент США №6121014, включенный в данный документ посредством ссылки.
[0052] "Контроль" насекомых означает подавление, посредством токсического действия, способности насекомых-вредителей к выживанию, росту, питанию и/или размножению, или ограничение повреждения или гибели культурных растений, вызванных насекомыми, или защиту максимального потенциального урожая сельскохозяйственной культуры при выращивании в присутствии насекомых-вредителей. "Контроль" насекомых может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя, предпочтительно, означает уничтожение насекомых.
[0053] При использовании в данном описании термины "содержит" и/или "содержащий" указывают на присутствие изложенных признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов и/или компонентов, но не исключают присутствие или добавление одного или нескольких других признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов, компонентов и/или их групп.
[0054] Применяемая в данном документе переходная фраза "состоящий главным образом из" (и ее грамматические варианты) означает, что объем пункта формулы изобретения следует интерпретировать как охватывающий указанные материалы или стадии, перечисленные в данном пункте формулы изобретения, и таковые, которые существенно не изменяют основную и новую характеристику(и) заявленного изобретения. Таким образом, термин "состоящий главным образом из", когда применяется в пункте формулы настоящего изобретения, не предназначен для интерпретации как эквивалент термину "содержащий".
[0055] В контексте настоящего изобретения "соответствующий" или "соответствует" означает, что когда аминокислотные последовательности вариантных белков Cry выравнивают друг с другом, аминокислоты, которые "соответствуют" определенным перечисленным положениям в вариантном или гомологичном белке, являются такими, которые выравниваются с этими положениями в эталонном белке, но не обязательно находятся именно в этих числовых положениях относительно конкретной эталонной аминокислотной последовательности по настоящему изобретению. Например, если SEQ ID NO: 16 является эталонной последовательностью, и ее выравнивают с SEQ ID NO: 17, Ala150 SEQ ID NO: 17 "соответствует" Ala163 SEQ ID NO: 16.
[0056] "Доставка" композиции или токсичного белка означает, что композиция или токсичный белок вступает в контакт с насекомым, что приводит к токсическому действию и контролю насекомого. Композиция или токсичный белок могут быть доставлены множеством известных путей, например, перорально при поедании насекомым или при контакте с насекомым посредством экспрессии в трансгенном растении, с помощью составленной белковой композиции(й) белков, распыляемой белковой композиции(й), матрицы приманки или любой другой известной из уровня техники системы доставки белков.
[0057] Термин "домен" относится к набору аминокислот, консервативных в определенных положениях по длине выравнивания последовательностей эволюционно родственных белков. В то время как аминокислоты в других положениях гомологов могут отличаться, аминокислоты, которые являются высококонсервативными в определенных положениях, указывают на аминокислоты, которые, вероятно, являются необходимыми для структуры, стабильности или функции белка. Идентифицированные по их высокой степени консервативности в выравненных последовательностях семейства гомологов белков, они могут применяться в качестве идентификаторов для определения того, принадлежит ли любой рассматриваемый полипептид к ранее идентифицированному семейству полипептидов.
[0058] "Эффективное для контроля насекомых количество" означает, что концентрация токсичного белка, которая обеспечивает подавление, посредством токсического действия, способности насекомых к выживанию, росту, питанию и/или размножению, или ограничение вызванных насекомыми повреждения или гибель культурного растения, или защиту максимального потенциального урожая сельскохозяйственной культуры при выращивании в присутствии насекомых-вредителей. "Эффективное для контроля насекомых количество" может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя предпочтительно оно означает уничтожение насекомых.
[0059] Применяемый в данном документе термин "кассета экспрессии" означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией по меньшей мере одного представляющего интерес полинуклеотида в соответствующей клетке-хозяине, содержащую промотор, функционально связанный с представляющим интерес полинуклеотидом, который функционально связан с сигналом терминации. "Кассета экспрессии" также, как правило, содержит дополнительные полинуклеотиды, необходимые для надлежащей трансляции представляющего интерес полинуклеотида. Кассета экспрессии также может содержать другие полинуклеотиды, которые не требуются для управления экспрессией представляющего интерес полинуклеотида, но которые присутствует из-за соответствующих сайтов рестрикции для извлечения кассеты из вектора экспрессии. Кассета экспрессии, содержащая представляющий интерес полинуклеотид(ы) может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии может также представлять собой последовательность, которая встречается в природе, но была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Тем не менее, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, то есть представляющий интерес полинуклеотид в кассете экспрессии не встречается в природе в клетке-хозяине, и его необходимо было ввести в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью процесса трансформации или процесса скрещивания. Экспрессия представляющего интерес полинуклеотида(ов) в кассете экспрессии обычно находится под контролем промотора. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфичным или предпочтительным по отношению к конкретной ткани, или органу, или стадии развития. После трансформации в растение кассета экспрессии или ее фрагмент также могут называться "вставленным полинуклеотидом" или "полинуклеотидом вставки".
[0060] "Ген" определяется в данном документе как единица наследственности, состоящая из полинуклеотида, который занимает определенное местоположение на хромосоме или плазмиде и который содержит генетическую инструкцию для определенной характеристики или признака, свойственных организму.
[0061] "Протеаза пищеварительного канала" представляет собой протеазу, которая в встречается в пищеварительном тракте насекомого в природе. Данная протеаза, как правило, участвует в переваривании поглощенных белков.
[0062] Термин "гетерологичный" при применении в отношении гена или нуклеиновой кислоты относится к гену, кодирующему фактор, который не находится в его естественном окружении (то есть, который был изменен посредством вмешательства человека). Например, гетерологичный ген может предусматривать ген организма одного вида, введенный в организм другого вида. Гетерологичный ген также может предусматривать ген, нативный по отношению к организму, но который был изменен определенным образом (например, подвергнут мутации, добавлен в виде множества копий, связан с ненативным промоторным или энхансерным полинуклеотидом и т.д.). Гетерологичные гены дополнительно могут предусматривать полинуклеотиды генов растения, которые включают кДНК-формы гена растения; кДНК могут экспрессироваться либо в смысловой (с получением мРНК), либо антисмысловой ориентации (с получением антисмыслового РНК-транскрипта, комплементарного мРНК-транскрипту). Согласно одному аспекту настоящего изобретения гетерологичные гены отличаются от эндогенных генов растения тем, что полинуклеотид гетерологичного гена, как правило, присоединен к полинуклеотидам, содержащим регуляторные элементы, такие как промоторы, которые в природе не встречаются как ассоциированные с геном для белка, кодируемого гетерологичным геном, или с полинуклеотидом гена растения в хромосоме, или ассоциированы с частями хромосомы, в которых они не встречаются в природе (например, гены экспрессируются в локусах, в которых указанный ген в обычных условиях не экспрессируется). Кроме того, "гетерологичный" полинуклеотид относится к полинуклеотиду, в природе не ассоциированному с клеткой-хозяином, в которую его вводят, в том числе к не встречающимся в природе множественным копиям полинуклеотида, встречающегося в природе.
[0063] "Гомологичная рекомбинация" представляет собой обмен ("кроссинговер") фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или хроматидами пар хромосом в участке идентичных полинуклеотидов. Будет понятно, что "событие рекомбинации" в данном документе означает мейотический кроссинговер.
[0064] Последовательность нуклеиновой кислоты является "изокодонной" по отношению к эталонной последовательности нуклеиновой кислоты в том случае, когда последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты.
[0065] Термин "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или токсин представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или токсичный белок, которые больше не находится в своей естественной среде. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или токсин по настоящему изобретению могут находиться в очищенной форме или могут находиться в рекомбинантном хозяине, таком как трансгенная бактериальная клетка или трансгенное растение.
[0066] "Молекула нуклеиновой кислоты" представляет собой одно- или двунитевую ДНК или РНК, которые могут быть выделены из любого источника. В контексте настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является сегментом ДНК.
[0067] "Функционально связанный" относится к ассоциации полинуклеотидов на одном фрагменте нуклеиновой кислоты, вследствие чего функция одного влияет на функцию другого. Например, промотор является функционально связанным с кодирующим полинуклеотидом или функциональной РНК, когда он может влиять на экспрессию такого кодирующего полинуклеотида или функциональной РНК (то есть такой кодирующий полинуклеотид или функциональная РНК находятся под контролем промотора на уровне транскрипции). Кодирующий полинуклеотид в смысловой или антисмысловой ориентации может быть функционально связан с регуляторными полинуклеотидами.
[0068] Применяемые в данном документе выражения "пестицидный," инсектицидный" и т.п. относятся к способности белка Cry по настоящему изобретению обеспечивать контроль вредного организма или к количеству белка Cry, которое может обеспечивать контроль вредного организма, как определено в данном документе. Таким образом, пестицидный белок Cry может подавлять способность вредного организма (например, насекомого-вредителя) к выживанию, росту, питанию и/или размножению или уничтожать его.
[0069] "Растение" представляет собой любое растение на любой стадии развития, в частности, семенное растение.
[0070] "Растительная клетка" представляет собой структурную и физиологическую единицу растения, содержащую протопласт и клеточную стенку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной одиночной клетки или культивируемой клетки или в качестве части более высокоорганизованной единицы, такой как, например, растительная ткань, орган растения или целое растение.
[0071] "Культура растительных клеток" означает культуры структурных единиц растения, таких как, например, протопласты, клетки в культуре клеток, клетки растительных тканей, пыльцы, пыльцевых трубок, семязачатков, зародышевых мешков, зиготы и зародышей на различных стадиях развития.
[0072] "Растительный материал" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, черенкам, клеточным или тканевым культурам, или к любым другим частям или продуктам растения.
[0073] "Орган растения" представляет собой отдельную и визуально структурированную и дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.
[0074] Выражение "растительная ткань", применяемое в данном документе, означает группу растительных клеток, организованных в структурную и функциональную единицу. Предусматривается любая ткань растения in planta или в культуре. Данный термин включает без ограничения целые растения, органы растений, семена растений, тканевую культуру и любые группы растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Применение данного термина в сочетании с любым специфическим типом растительной ткани, приведенным выше или иным образом охваченным данным определением, или без такового не предназначено для исключения любого другого типа растительной ткани.
[0075] "Полинуклеотид" относится к полимеру, состоящему из большого числа мономеров-нуклеотидов, ковалентно связанных в цепь. Такие "полинуклеотиды" включают ДНК, РНК, модифицированные олигонуклеотиды (например, олигонуклеотиды, содержащие основания, которые не являются типичными для биологической РНК или ДНК, такие как 2'-O-метилированные олигонуклеотиды) и т.п. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или полинуклеотид могут быть однонитевыми, двунитевыми, многонитевыми или представлять собой комбинацию перечисленного. Если не указано иное, конкретная нуклеиновая кислота или полинуклеотид по настоящему изобретению необязательно содержат или кодируют комплементарные полинуклеотиды, в дополнение к любому явно указанному полинуклеотиду.
[0076] "Представляющий интерес полинуклеотид" относится к любому полинуклеотиду, который при переносе в организм, например растение, придает организму требуемую характеристику, такую как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, улучшенная питательная ценность, улучшенные показатели в производственном процессе, продукция коммерчески ценных ферментов или метаболитов или измененная репродуктивная способность.
[0077] Термин "промотор" относится к полинуклеотиду, как правило, расположенному выше (5') от его кодирующего полинуклеотида, который осуществляет контроль экспрессии кодирующего полинуклеотида, обеспечивая узнавание РНК-полимеразой и другими факторами, необходимыми для правильной транскрипции.
[0078] "Протопласт" представляет собой выделенную растительную клетку без клеточной стенки или только с частичной клеточной стенкой.
[0079] Применяемый в данном документе термин "рекомбинантный" относится к форме нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), и/или белка, и/или организма, которая обычно не будет встречаться в природе и как таковая создана посредством вмешательства человека. Применяемая в данном документе "молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую комбинацию полинуклеотидов, которые в природе не встречаются вместе и являются результатом вмешательства человека, например, молекулу нуклеиновой кислоты, которая состоит из комбинации по меньшей мере двух полинуклеотидов, гетерологичных по отношению друг к другу, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, синтезированную искусственно и содержащую полинуклеотид, который отличается от полинуклеотида, который будет в норме существовать в природе, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит трансген, искусственно введенный в геномную ДНК клетки-хозяина, и ассоциированную фланкирующую ДНК генома клетки-хозяина. Примером молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты является молекула ДНК, полученная в результате вставки трансгена в геномную ДНК растения, что в конечном итоге может приводить к экспрессии молекулы рекомбинантной РНК и/или белка в данном организме. Применяемое в данном документе выражение "рекомбинантное растение" представляет собой растение, которое обычно не будет существовать в природе, и оно является результатом вмешательства человека и содержит трансген и/или гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, введенную в его геном. В результате такого изменения генома рекомбинантное растение явно отличается от родственного растения дикого типа.
[0080] "Регуляторные элементы" относятся к последовательностям, вовлеченным в контроль экспрессии нуклеотидной последовательности. Регуляторные элементы предусматривают промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, и сигналы терминации. Как правило, они охватывают также последовательности, необходимые для надлежащей трансляции нуклеотидной последовательности.
[0081] Термин "идентичный" или "в значительной степени идентичный" в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или белковых последовательностей относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые характеризуются по меньшей мере 60%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90, даже более предпочтительно 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью нуклеотидных или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как определено с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной проверки. Предпочтительно значительная степень идентичности имеет место в пределах участка последовательностей, который состоит из по меньшей мере приблизительно 50 остатков в длину, более предпочтительно в пределах участка, состоящего из по меньшей мере приблизительно 100 остатков, и наиболее предпочтительно последовательности в значительной степени идентичны в пределах по меньшей мере приблизительно 150 остатков. В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательности являются в значительной степени идентичными по всей длине кодирующих участков. Кроме того, в значительной степени идентичные последовательности нуклеиновой кислоты или белка выполняют, по сути, одинаковую функцию.
[0082] При сравнении последовательностей одна последовательность, как правило, выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты подпоследовательности, и задают программные параметры алгоритма сравнения последовательностей. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей на основе заданных программных параметров вычисляют процент идентичности последовательностей для тестируемой последовательности(ей) относительно эталонной последовательности.
[0083] Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии по Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания областей гомологии по Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с помощью способа поиска сходства по Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85: 2444 (1988), с помощью реализации данных алгоритмов в компьютерных программах (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин) или путем визуальной проверки (в целом см. Ausubel et al., ниже).
[0084] Одним примером алгоритма, который подходит для определения процента идентичности последовательности и сходства последовательности, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST является общедоступным в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Бетесда, Мэриленд 20894, США). Данный алгоритм включает первоначально идентификацию пар последовательностей с наибольшим сходством (HSP) путем идентификации коротких "слов" длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому баллу Т при выравнивании со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговым показателем соседнего "слова" (Altschul et al., 1990). Эти исходные совпадения соседних "слов" выступают в качестве затравки для начала поисков с целью обнаружения более длинных HSP, содержащих их. Совпадения "слов" затем продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может увеличиваться совокупный показатель выравнивания. Совокупные показатели рассчитывают с применением, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (балл-вознаграждение, начисляемый за пару совпадающих остатков; всегда > 0) и N (штрафной балл, начисляемый за несовпадающие остатки; всегда < 0). В случае аминокислотных последовательностей для расчета совокупного показателя применяют матрицу замен. Продление совпадений "слов" в каждом направлении прекращается, когда совокупный показатель выравнивания снижается на величину X от его максимального достигнутого значения, при этом совокупный показатель падает до нуля или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательными показателями, либо в случае достижения конца одной из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину "слова" (W), равную 11, ожидаемое значение (Е), равное 10, пороговое значение, равное 100, М=5,N=-4 и сравнение обеих нитей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию длину "слова" (W), равную 3, ожидаемое значение (Е), равное 10, и матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 10915 (1989)).
[0085] В дополнение к расчету процента идентичности последовательностей алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Одной мерой сходства, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая предусматривает показатель вероятности, согласно которому совпадения между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будут наблюдаться случайным образом. Например, тестируемая последовательность нуклеиновой кислоты считается подобной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой последовательности нуклеиновой кислоты с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты составляет менее приблизительно 0,1, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.
[0086] Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот в значительной степени идентичны, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях. Фраза "гибридизируется специфически с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях, когда такая последовательность присутствует в сложной смеси (например, общих клеточных) ДНК или РНК. "В значительной степени связывается" относится к гибридизации комплементарных последовательностей, нуклеиновой кислоты-зонда и целевой нуклеиновой кислоты, и также охватывает незначительные несовпадения, которые могут компенсироваться за счет снижения жесткости среды для гибридизации, чтобы добиться требуемого обнаружения целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
m
[0087] "Жесткие условия гибридизации" и "жесткие условия отмывки при гибридизации" в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и нозерн-гибридизация, зависят от последовательности и отличаются при разных параметрах окружающей среды. Более длинные последовательности специфично гибридизируются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. Как правило, условия гибридизации и отмывки высокой жесткости выбирают так, чтобы температура была приблизительно на 5°С ниже точки плавления (T) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Как правило, в "жестких условиях" зонд будет гибридизироваться со своей целевой подпоследовательностью, а не с другими последовательностями.
m
m
[0088] T является температурой (при определенных ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизируется с абсолютно совпадающим зондом. Для очень жестких условий выбирают температуру, равную T для конкретного зонда. Примером жестких условий гибридизации для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков на фильтре при Саузерн- или нозерн-блоттинге, является 50% формамида с 1 мг гепарина при 42°С, при этом гибридизацию проводят в течение ночи. Примером условий отмывки высокой жесткости является 0,15 М NaCl при 72°С в течение приблизительно 15 минут. Примером жестких условий отмывки является отмывка с помощью 0,2 × SSC при 65°С в течение 15 минут (описание буфера SSC см. в Sambrook ниже). Зачастую для избавления от фонового сигнала зонда отмывке в условиях высокой жесткости предшествует отмывка в условиях низкой жесткости. Примером условий отмывки средней жесткости для дуплекса, имеющего, например, более 100 нуклеотидов, является 1 × SSC при 45°С в течение 15 минут. Примером условий отмывки низкой жесткости для дуплекса, имеющего, например, более 100 нуклеотидов, является 4-6 × SSC при 40°С в течение 15 минут. Для коротких зондов (например, длиной от приблизительно 10 до 50 нуклеотидов) жесткие условия, как правило, предусматривают концентрации солей, составляющие менее чем приблизительно 1,0 М ионов Na, как правило, концентрации, составляющие приблизительно 0,01-1,0 М ионов Na (или других солей) при рН 7,0-8,3, а также температуру, как правило, составляющую по меньшей мере приблизительно 30°С. Жестких условий также можно достигать путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. В целом, соотношение сигнал-шум, в 2× (или более) раза превышающее наблюдаемое для неродственного зонда в конкретном гибридизационном анализе, указывает на выявление специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизируются друг с другом в жестких условиях, все еще являются в значительной степени идентичными, если белки, которые они кодируют, в значительной степени идентичны. Например, это происходит в том случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с применением максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.
4
4
4
4
4
[0089] Примеры комплексов условий гибридизации/отмывки, которые можно применять для клонирования гомологичных нуклеотидных последовательностей, которые в значительной степени идентичны эталонным нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению, являются следующими: эталонная нуклеотидная последовательность предпочтительно гибридизируется с эталонной нуклеотидной последовательностью в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 2 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, более желательно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 1 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, еще более желательно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,5 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,1 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, более предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,1 × SSC, 0,1% SDS при 65°С.
[0090] Еще одним показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот или белки являются в значительной степени идентичными, является то, что белок, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, характеризуется иммунологической перекрестной реактивностью с белком, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, или специфически связывается в таких реакциях. Таким образом, белок, как правило, является в значительной степени идентичным второму белку, например, если два белка отличаются только консервативными заменами.
[0091] "Синтетический" относится к нуклеотидной последовательности, содержащей основания и/или структурные признаки, отсутствующие в природной последовательности. Например, синтетической считается искусственная последовательность, кодирующая белок Cry по настоящему изобретению, которая по содержанию G+C и нормальному распределению кодонов больше похожа на гены двудольных и/или однодольных растений.
[0092] "Трансформация" представляет собой процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку- или организм-хозяин. В частности, "трансформация" означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.
[0093] "Трансформированный/трансгенньш/рекомбинантный" относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растение, в который была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекулу нуклеиновой кислоты можно стабильно интегрировать в геном хозяина, или же молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать в качестве внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может быть автореплицирующейся. Подразумевается, что трансформированные клетки, ткани или растения охватывают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и его трансгенное потомство. "Нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный" хозяин относится к организму дикого типа, например, бактерии или растению, которые не содержат гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
[0094] Нуклеотиды обозначены по их основаниям с помощью следующих стандартных сокращений: аденин (А), цитозин (С), тимин (Т) и гуанин (G). Аналогичным образом, аминокислоты обозначены с помощью следующих стандартных сокращений: аланин (Ala; А), аргинин (Arg; R), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), цистеин (Cys; С), глутамин (Gln; Q), глутаминовая кислота (Glu; Е), глицин (Gly; G), гистидин (His; Н), изолейцин (Ile; 1), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Met; М), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; Р), серии (Ser; S), треонин (Thr; Т), триптофан (Trp; W), тирозин (Tyr; Y) и валин (Val; V).
[0095] В настоящем изобретении предусмотрены композиции и способы для контроля опасных вредителей растений. В частности, настоящее изобретение относится к белкам Cry, которые токсичны для вредителей растений, и к полинуклеотидам, которые содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки Cry, а также к получению и применению полинуклеотидов и белков Cry для контроля вредителей растений.
[0096] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предусмотрен химерный ген, который содержит гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, токсичный по меньшей мере для кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), где нуклеотидная последовательность (а) характеризуется от по меньшей мере 80% (например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) до по меньшей мере 99% (99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-5; или (b) кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется от по меньшей мере 80% (например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) до по меньшей мере 99% (99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 16-20; или (с) представляет собой синтетическую последовательность на основании (а) или (b), которая имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме.
[0097] В других вариантах осуществления гетерологичный промотор представляет собой промотор, обеспечивающий экспрессию в растении. Например, без ограничения, промотор, обеспечивающий экспрессию в растении, может быть выбран из группы, состоящей из промотора убиквитина, cmp, TrpA кукурузы, 5'-UTR гена 9 бактериофага Т3, сахарозосинтетазы 1 кукурузы, алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы, светособирающего комплекса кукурузы, белка теплового шока кукурузы, малой субъединицы RuBP карбоксилазы гороха, маннопинсинтазы Ti-плазмиды, нопалинсинтазы Ti-плазмиды, халкон-изомеразы петунии, богатого глицином белка 1 бобов, пататина картофеля, лектина, 35S CaMV и малой субъединицы S-E9 RuBP карбоксилазы.
[0098] В дополнительных вариантах осуществления белок, кодируемый химерным геном, дополнительно токсичен для одного или нескольких видов насекомых, выбранных из группы, состоящей из совки-ипсилон (Agrotis ipsilon), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), огневки тростниковой (Diatraea saccharalis), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes), огневки кукурузной юго-западной (Diatraea grandiosella), западной бобовой совки (Richia albicosta), табачной совки (Heliothis virescens), восточного кукурузного мотылька (Ostrinia furnacalis), хлопковой совки (Helicoverpa armigera), огневки желтой рисовой (Chilo suppressalis), розовой стеблевой совки (Sesamia calamistis) и огневки рисовой (Cnaphalocrocis medinalis).
[0099] В дополнительных вариантах осуществления полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, или характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, или характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3, или характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, или характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5.
[00100] В других вариантах осуществления полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 16-20.
[00101] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 16.
[00102] В дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17.
[00103] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18.
[00104] В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 19.
[00105] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 20.
[00106] В некоторых вариантах осуществления химерный ген по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, содержащий синтетическую последовательность нуклеотидной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере на 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% с любой из SEQ ID NO: 6-15, где синтетическая последовательность имеет ко доны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме. В других вариантах осуществления химерный ген по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, содержащий синтетическую последовательность нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 16-25, где синтетическая последовательность имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме. В дополнительных вариантах осуществления трансгенный организм представляет собой трансгенную бактерию или трансгенное растение.
[00107] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен синтетический полинуклеотид, содержащий, состоящий главным образом или состоящий из нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, активный в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), где нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 6-15.
[00108] В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен синтетический полинуклеотид, содержащий, состоящий главным образом или состоящий из нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, активный в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), где нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательностью, которая характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 16-25.
[00109] Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрен выделенный белок, токсичный по меньшей мере для кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), при этом белок содержит, состоит главным образом или состоит из (а) аминокислотной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% идентичностью последовательности до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 16-25; или (b) аминокислотная последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая характеризуется от по меньшей мере 80% идентичностью последовательности до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 6-15.
[00110] В других вариантах осуществления выделенный белок содержит, состоит главным образом или состоит из аминокислотной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 16-20. В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 16.
[00111] В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17.
[00112] В дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18.
[00113] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 19.
[00114] В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 20.
[00115] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит, состоит главным образом или состоит из любой из SEQ ID NO: 16-25.
[00116] Антитела, вырабатываемые в ответ на иммунную стимуляцию нативными или мутантными ВТ-0009, ВТ-0012, ВТ-0013, ВТ-0023 и ВТ-0067 и подобными или родственными белками по настоящему изобретению, могут быть получены с применением стандартных иммунологических методик получения поликлональной антисыворотки и, при необходимости, иммортализации антителопродуцирующих клеток иммунизированного организма-хозяина для получения источников моноклональных антител. Методики получения антител к любому представляющему интерес веществу хорошо известны, например, как описано в Harlow и Lane (1988) и в Goding (1986). Настоящее изобретение охватывает инсектицидные белки, которые перекрестно реагируют с антителами, вырабатываемыми против одного или нескольких инсектицидных белков Cry по настоящему изобретению.
[00117] Антитела, полученные согласно настоящему изобретению, также применимы в иммунологических анализах для определение количества или наличия нативных или мутантных ВТ-0044, ВТ-0051, ВТ-0068 и ВТ-0128 или родственного белка в биологическом образце. Такие анализы также применимы в получении композиций, содержащих один или несколько токсичных белков по настоящему изобретению или родственных токсичных белков, причем такое получение проводят с обеспечением контроля качества. Кроме того, антитела можно применять для оценки эффективности рекомбинантной продукции одного или нескольких белков по настоящему изобретению или родственного белка, а также для скрининга библиотек экспрессии на наличие нуклеотидной последовательности, кодирующей один или несколько белков по настоящему изобретению или последовательностей, кодирующих родственные белки. Антитела также применимы в качестве аффинных лигандов для очистки и/или выделения любого одного или нескольких белков по настоящему изобретению и родственных белков. Белки по настоящему изобретению и белки, содержащие родственные антигенные эпитопы, могут быть получены в результате сверхэкспрессии полноразмерной или частичной последовательности, кодирующей весь белок по настоящему изобретению или родственный белок, или их часть, в предпочтительной клетке-хозяине.
[00118] Считается, что последовательности ДНК, которые кодируют нативный белок Cry по настоящему изобретению, можно изменять с помощью различных способов, и что эти изменения могут приводить к образованию последовательностей ДНК, кодирующих белки с аминокислотными последовательности, отличающимися от таковых, закодированных в нативном белке Cry по настоящему изобретению. Этот белок может быть изменен различными способами, в том числе с помощью аминокислотных замен, делеций, усечений и вставок одной или нескольких аминокислот из любой из SEQ ID NO: 13-16, включая до приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 105, приблизительно 110 приблизительно 115, приблизительно 120, приблизительно 125, приблизительно 130, приблизительно 135, приблизительно 140, приблизительно 145, приблизительно 150, приблизительно 155 или больше аминокислотных замен, делеций или вставок. Способы таких манипуляций в целом известны из уровня техники. Например, варианты аминокислотной последовательности нативного белка Cry могут быть получены посредством введения мутаций в полинуклеотид, который кодирует данный белок. Это также можно осуществлять с применением одной из нескольких форм мутагенеза и/или метода направленной эволюции. Согласно некоторым аспектам изменения, кодируемые аминокислотной последовательностью, не будут существенно влиять на функцию белка. Такие варианты будут обладать требуемой инсектицидной активностью. В одном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1-5, изменяют с введением аминокислотных замен в кодируемый белок. В некоторых вариантах осуществления полученный мутантный белок кодируется синтетическим мутантным полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 11-15. В других вариантах осуществления мутантные белки содержат, состоят главным образом или состоят из аминокислотной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 21-25.
[00119] Понятно, что способность инсектицидного белка обеспечивать инсектицидную активность может быть улучшена путем применения таких методик для композиций по настоящему изобретению. Например, можно экспрессировать белок Cry в клетках-хозяевах, которые характеризуются высоким уровнем ошибочного включения оснований в ходе репликации ДНК, например, XL-1 Red (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния). После размножения в таких штаммах можно выделять ДНК (например, путем получения плазмидной ДНК или путем амплификации с помощью ПЦР и клонирования полученного ПЦР-фрагмента в вектор), экспрессировать мутантные последовательности белка Cry в штамме, не приводящем к образованию мутаций, и идентифицировать мутированные гены с инсектицидной активностью, например, путем осуществления анализа для тестирования инсектицидной активности. Обычно белок смешивают и применяют в анализах питания. См., например Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие анализы могут включать приведение растения в контакт с одним или несколькими вредителями и определение способности растений к выживанию и/или способности вызывать гибель вредителей. Примеры мутаций, которые приводят к повышению токсичности, можно найти в Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.
[00120] В качестве альтернативы, могут быть выполнены изменения в аминокислотной последовательности по настоящему изобретению на амино- или карбокси-конце, при этом они не оказывают существенное влияние на активность. Они могут включать вставки, делеции или изменения, введенные с применением современных способов молекулярной биологии, таких как ПЦР, в том числе ПЦР-амплификаций, обеспечивающих изменение или расширение последовательности, кодирующей белок, за счет включения последовательностей, кодирующих аминокислоты, в олигонуклеотиды, используемые при ПЦР-амплификации. В качестве альтернативы добавленные последовательности, кодирующие белок, могут включать последовательности, кодирующие весь белок, такие как в большинстве случаев применяются в уровне техники для создания белков слияния. Такие белки слияния зачастую применяют для (1) повышения уровня экспрессии представляющего интерес белка, (2) для введения связывающего домена, ферментативной активности или эпитопа для облегчения одного из очистки белка, выявления белка или других применений в эксперименте, известных из уровня техники, (3) направленной секреции в субклеточную органеллу, такую как периплазматическое пространство грам-отрицательных бактерий, или трансляции в эндоплазматическом ретикулуме эукариотических клеток, в последнем случае результатом зачастую является гликозилирование белка.
[00121] Белок Cry по настоящему изобретению также может быть подвергнут мутации с введением эпитопа для получения антител, которые распознают мутантный белок. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен мутированный белок Cry, где аминокислотная замена в нативном белке Cry дает мутантный белок Cry с антигенным участком, который позволяет отличать мутантный белок Cry от нативного белка Cry в анализе выявления белков.
[00122] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения антитела, которое способно дифференцировать мутированный белок Cry и нативный белок Cry, из которого получен мутированный белок Cry, при этом метод включает стадии замены аминокислоты в антигенной петле нативного белка Cry и стимуляции выработки антител, которые специфически распознают мутированную антигенную петлю в мутированном белке Cry и не распознают нативный белок Cry. В одном варианте осуществления антигенную петлю идентифицируют в неконсервативных участках за пределами домена I нативного белка Cry. В другом варианте осуществления антигенная петля не является петлей, вовлеченной в распознавание рецепторов белков Cry в пищеварительном канале насекомого или вовлеченной в активацию белка Cry под действием протеазы.
[00123] Варианты нуклеотидных и аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению также охватывают последовательности, полученные в результате процедур мутагенеза и рекомбинации, таких как ДНК-шаффлинг. С помощью такой процедуры один или несколько различных участков, кодирующих токсичный белок, можно применять для создания нового токсичного белка, обладающего требуемыми свойствами. Следовательно, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов получают из популяции полинуклеотидов с родственными последовательностями, содержащими участки последовательности, которые характеризуются значительной степенью идентичности последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с применением данного подхода, мотивы последовательности, кодирующие представляющий интерес домен, можно подвергать шаффлингу между пестицидным геном по настоящему изобретению и другими известными пестицидными генами с получением нового гена, кодирующегоr белок с улучшенным представляющим интерес свойством, таким как повышенная инсектицидная активность. Стратегии для такого ДНК-шаффлинга известны из уровня техники. См., например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291 и патенты США №№ 5605793 и 5837458.
[00124] Обмен доменов или шаффлинг является другим механизмом для получения измененных белков Cry по настоящему изобретению. Домены можно обменивать между белками Cry, что приводит к гибридным или химерным токсичным белкам с улучшенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Способы получения рекомбинантных белков и тестирования их в отношении пестицидной активности хорошо известны из уровня техники (см., например, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).
[00125] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, молекулу нуклеиновой кислоты, кассету экспрессии или химерный ген по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления вектор дополнительно определен как плазмида, космида, фагмида, искусственная хромосома, фаг или вирусный вектор. Некоторые векторы для применения в трансформации растений и других организмов известны из уровня техники.
[00126] Таким образом, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к кассетам экспрессии, сконструированным для экспрессии полинуклеотидов и молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.
Применяемое в данном документе выражение "кассета экспрессии" означает молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере последовательность контроля, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Таким образом, например, в кассетах экспрессии для экспрессии в растении, части растения и/или растительной клетке предусмотрены промоторы растений, функционально связанные с нуклеотидными последовательностями, подлежащими экспрессии.
[00127] Кассета экспрессии, содержащая представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из ее остальных компонентов. Кассета экспрессии также может представлять собой последовательность, которая встречается в природе, но которая была получена в рекомбинантной форме, применимой для гетерологичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е. конкретная последовательность нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии не встречается в природе в клетке-хозяине, и ее необходимо было ввести в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью события трансформации.
[00128] В дополнение к промоторам, функционально связанным с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению, кассета экспрессии по настоящему изобретению также может содержать другие регуляторные последовательности. Применяемое в данном документе выражение "регуляторные последовательности" означает нуклеотидные последовательности, расположенные выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, которые влияют на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают без ограничения энхансеры, интроны, лидерные последовательности, регулирующие трансляцию, сигналы терминации и сигнальные последовательности полиаденилирования.
[00129] В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии по настоящему изобретению также может содержать нуклеотидные последовательности, которые кодируют другие требуемые признаки. Такие нуклеотидные последовательности можно "пакетировать" с любой комбинацией нуклеотидных последовательностей для создания растений, частей растений или растительных клеток с требуемым фенотипом. "Пакетированные" комбинации можно создавать с помощью любого способа, в том числе без ограничения с помощью скрещивания растений с помощью любой общепринятой методики или с помощью генетической трансформации (т.е. молекулярного стэкинга). При "пакетировании" путем генетической трансформации растений представляющие интерес нуклеотидные последовательности можно комбинировать в любой момент времени и в любом порядке. Например, трансгенное растение, содержащее один или несколько требуемых признаков, можно применять в качестве мишени для введения дополнительных признаков путем последующей трансформации. Дополнительные нуклеотидные последовательности можно вводить по протоколу котрансформации одновременно с нуклеотидной последовательностью, молекулой нуклеиновой кислоты, конструкцией нуклеиновой кислоты и/или композицией по настоящему изобретению, обеспечиваемыми любой комбинацией кассет экспрессии. Например, если будут вводить две нуклеотидные последовательности, то их можно встроить в отдельные кассеты (транс), или их можно встроить в одну кассету (цис). Экспрессия полинуклеотидов может управляться одним и тем же промотором или различными промоторами. Кроме того, известно, что полинуклеотиды можно "пакетировать" в требуемом местоположении в геноме при помощи системы сайт-специфической рекомбинации. См., например, публикации международных заявок на патенты №№ WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 и WO 99/25853.
[00130] Кассета экспрессии также может содержать кодирующую последовательность, соответствующую одному или нескольким полипептидам, обеспечивающим агрономические признаки, которые преимущественно приносят пользу семенной компании, сельхозпроизводителю или переработчику зерна. Представляющий интерес полипептид может быть любым полипептидом, кодируемым представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Неограничивающие примеры представляющих интерес полипептидов, которые подходят для продуцирования в растениях, включают таковые, обуславливающие возникновение агрономически важных признаков, таких как устойчивость к гербицидам (также иногда называемая "толерантность к гербицидам"), устойчивость к вирусам, устойчивость к патогенным бактериям, устойчивость к насекомым, устойчивость к нематодам и/или устойчивость к грибам. См., например, патенты США №№ 5569823; 5304730; 5495071; 6329504 и 6337431. Полипептид также может являться таким, который увеличивает мощность или урожайность растений (включая признаки, которые дают возможность растению произрастать при различных температурах, почвенных условиях и уровнях солнечного света и атмосферных осадков), или таким, который дает возможность идентифицировать растение, проявляющее представляющий интерес признак (например, селектируемый маркер, цвет семенной оболочки и т.д.). Разнообразные представляющие интерес полипептиды, а также способы введения этих полипептидов в растение описаны, например, в патентах США №№ 4761373; 4769061; 4810648; 4940835; 4975374; 5013659; 5162602; 5276268; 5304730; 5495071; 5554798;5561236; 5569823; 5767366; 5879903, 5928937; 6084155; 6329504 и 6337431; а также в публикации заявки на патент США №2001/0016956. См. также во всемирной сети Интернет по адресу lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/.
[00131] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также могут применяться полинуклеотиды, придающие устойчивость/толерантность к гербициду, ингибирующему конус нарастания или меристему, такому как имидазолинон или сульфонилмочевина. Иллюстративные полинуклеотиды из этой категории кодируют мутантные ферменты ALS и AHAS, как описано, например, в патентах США №№ 5767366 и 5928937. Патенты США №№ 4761373 и 5013659 относятся к растениям, устойчивым к различным имидазолиноновым или сульфонамидным гербицидам. Патент США №4975374 относится к растительным клеткам и растениям, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантную глутаминсинтетазу (GS), устойчивую к ингибированию гербицидами, которые, как известно, ингибируют GS, например, фосфинотрицин и метионинсульфоксимин. В патенте США №5162602 раскрыты растения, устойчивые к ингибированию гербицидами на основе циклогександиона и арилоксифеноксипропановой кислоты. Устойчивость придает измененная ацетил-коэнзим А-карбоксилаза (АССаза).
[00132] Полипептиды, кодируемые нуклеотидными последовательностями, придающими устойчивость к глифосату, также подходят для настоящего изобретения. См., например, патент США №4940835 и патент США №4769061. В патенте США №5554798 раскрыты трансгенные растения маиса, устойчивые к глифосату, устойчивость которым придает ген измененной 5-енолпирувил-3-фосфошикиматсинтазы (EPSP).
[00133] Также подходят полинуклеотиды, кодирующие устойчивость к фосфоновым соединениям, таким как глюфосинат аммония или фосфинотрицин, а также пиридинокси- или феноксипропионовым кислотам и циклогексанонам. См. заявку на европейский патент №0242246. См. также патенты США №№ 5879903, 5276268 и 5561236.
[00134] Другие подходящие полинуклеотиды включают таковые, кодирующие устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосинтез, таким как триазин и бензонитрил (ген нитрилазы). См. патент США №4810648. Дополнительные подходящие полинуклеотиды, кодирующие устойчивость к гербицидам, включают таковые, кодирующие устойчивость к 2,2-дихлорпропионовой кислоте, сетоксидиму, галоксифопу, имидазолиноновым гербицидам, сульфонилмочевинным гербицидам, триазолопиримидиновым гербицидам, s-триазиновым гербицидам и бромоксинилу. Также подходят полинуклеотиды, придающие устойчивость к ингибиторам фермента protox, или которые обеспечивают повышенную устойчивость к заболеваниям растений; повышенную толерантность к неблагоприятным условиям окружающей среды (видам абиотического стресса), в том числе без ограничения к засухе, чрезмерному охлаждению, чрезмерному нагреву, или чрезмерной засоленности почвы, или экстремальной кислотности или щелочности; и изменения строения или развития растений, в том числе изменения сроков развития. См., например, публикацию заявки на патент США №2001/0016956 и патент США №6084155.
[00135] Дополнительные подходящие полинуклеотиды включают таковые, кодирующие пестицидные (например, инсектицидные) полипептиды. Эти полипептиды могут быть получены в количествах, достаточных для контроля, например, насекомых-вредителей (т.е. в количествах, обеспечивающих контроль насекомых). Считается, что количество продуцируемого в растении пестицидного полипептида, необходимое для контроля насекомых или других вредителей, может варьировать в зависимости от сорта, типа вредителя, факторов окружающей среды и т.п. Полинуклеотиды, применимые для придания дополнительной устойчивости к насекомым или вредителям, включают, например, таковые, кодирующие токсины, идентифицированные в организмах Bacillus. Полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие белки Cry Bacillus thuringiensis (Bt) из нескольких подвидов, были клонированы и было обнаружено, что рекомбинантные клоны токсичны для личинок чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых насекомых. Примеры таких инсектицидных белков Bt включают белки Cry, такие как Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1Ea, Cry1Fa, Сгу3А, Cry9A, Cry9B, Cry9C, и т.п., а также вегетативные инсектицидные белки, такие как Vip1, Vip2, Vip3 и т.п. Полный перечень белков Bt можно найти во всемирной сети Интернет в базе данных номенклатуры токсинов Bacillus thuringiensis, поддерживаемой университетом Сассекса (см. также Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813).
[00136] Полипептиды, пригодные для продуцирования в растениях, дополнительно включают таковые, улучшающие превращение собранных растений и/или частей растений в коммерчески применимый продукт или иным образом содействующие ему, в том числе, например, обеспечивающие повышенное или измененное содержание и/или распределение углеводов, улучшенные свойства сбраживаемости, повышенное содержание масла, повышенное содержание белка, улучшенную усвояемость или повышенное содержание нутрицевтиков, например, повышенное содержание фитостерола, повышенное содержание токоферола, повышенное содержание станола и/или повышенное содержание витаминов. Представляющие интерес полипептиды также включают, например, таковые, обуславливающие снижение содержания нежелательного компонента в собранном урожае, например, фитиновой кислоты или ферментов, расщепляющих сахара, или способствующие этому. Под "обуславливающим" или "способствующим" подразумевается, что представляющий интерес полипептид может прямо или косвенно способствовать наличию представляющего интерес признака (например, путем увеличения расщепления целлюлозы с помощью гетерологичного фермента целлюлазы).
[00137] В одном варианте осуществления полипептид способствует улучшению усвояемости еды или корма. Ксиланазы представляют собой ферменты, расщепляющие гемицеллюлозу, которые усиливают разрушение клеточных стенок растений, что приводит к лучшему использованию питательных веществ растения животным. Это приводит к увеличению темпов роста и конверсии корма. Также можно снижать вязкость кормов, содержащих ксилан. Гетерологичное продуцирование ксиланаз в растительных клетках также может содействовать превращению лигноцеллюлозы в сбраживаемые сахара в ходе промышленной переработки.
[00138] Были идентифицированы и охарактеризованы многочисленные ксиланазы из грибковых и бактериальных микроорганизмов (см., например, патент США №5437992; Coughlin et al. (1993) "Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases" Espoo; Souminen and Reinikainen, eds. (1993) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135; публикацию заявки на патент США №2005/0208178 и публикацию согласно РСТ № WO 03/16654). В частности, три специфичные ксиланазы (XYL-I, XYL-II and XYL-III) были идентифицированы у Т. reesei (Tenkanen et al. (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:566; Torronen et al. (1992) Bio/Technology 10:1461 и Xu et al. (1998). Appl. Micribiol. Biotechnol. 49:718).
[00139] В другом варианте осуществления полипептид, применимый для настоящего изобретения, может представлять собой фермент, расщепляющий полисахариды. Растения по настоящему изобретению, вырабатывающие такой фермент, могут быть применимы для получения, например, сбраживаемого сырья для биологической переработки. В некоторых вариантах осуществления ферменты, применимые для способа сбраживания, включают альфа-амилазы, протеазы, пуллуланазы, изоамилазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, циклодекстрингликозилтрансферазы, липазы, фитазы, лакказы, оксидазы, эстеразы, кутиназы, фермент, гидролизующий гранулированный крахмал, и другие глюкоамилазы.
[00140] Ферменты, расщепляющие полисахариды, включают ферменты, расщепляющие крахмал, такие как α-амилазы (ЕС 3.2.1.1), глюкуронидазы (Е.С. 3.2.1.131); экзо-1,4-α-D-глюканазы, такие как амилоглюкозидазы и глюкоамилазы (ЕС 3.2.1.3), β-амилазы (ЕС 3.2.1.2), α-глюкозидазы (ЕС 3.2.1.20) и другие экзоамилазы; крахмал-деветвящие ферменты, такие как а) изоамилаза (ЕС 3.2.1.68), пуллуназа (ЕС 3.2.1.41) и т.п.; b) целлюлазы, такие как экзо-1,4-3-целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91), экзо-1,3-β-D-глюканаза (ЕС 3.2.1.39), β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21); с) L-арабиназы, такие как эндо-1,5-α-L-арабиназа (ЕС 3.2.1.99), α-арабинозидазы (ЕС 3.2.1.55) и т.п.; d) галактаназы, такие как эндо-1,4-β-D-галактаназа (ЕС 3.2.1.89), эндо-1,3-β-D-галактаназа (ЕС 3.2.1.90), β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22), β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23) и т.п.; е) маннаназы, такие как эндо-1,4-β-D-маннаназа (ЕС 3.2.1.78), β-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25), α-маннозидаза (ЕС 3.2.1.24) и т.п.; f) ксиланазы, такие как эндо-1,4-β-ксиланаза (ЕС 3.2.1.8), β-D-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37), 1,3-β-D-ксиланаза и т.п.; и g) другие ферменты, такие как α-L-фукозидаза (ЕС 3.2.1.51), α-L-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40), леваназа (ЕС 3.2.1.65), инулиназа (ЕС 3.2.1.7) и т.п. В одном варианте осуществления α-амилаза представляет собой синтетическую α-амилазу, Amy797E, описанную в патенте США №8093453, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[00141] Дополнительные ферменты, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, включают протеазы, такие как протеазы грибов и бактерий. Протеазы грибов включают без ограничения таковые, полученные из Aspergillus, Trichoderma, Mucor и Rhizopus, как, например, A. niger, A. awamori, А. oryzae и М. miehei. В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению могут представлять собой ферменты целлобиогидролазы (СВН) (ЕС 3.2.1.91). В одном варианте осуществления фермент целлобиогидролаза может представлять собой СВН1 или СВН2.
[00142] Другие ферменты, применимые в соответствии с настоящим изобретением, включают без ограничения гемицеллюлазы, такие как манназы и арабинофуранозидазы (ЕС 3.2.1.55); лигниназы; липазы (например, Е.С. 3.1.1.3), глюкозооксидазы, пектиназы, ксиланазы, трансглюкозидазы, альфа-1,6-глюкозидазы (например, Е.С. 3.2.1.20); эстеразы, такие как естераза феруловой кислоты (ЕС 3.1.1.73) и ацетилксиланэстеразы (ЕС 3.1.1.72); и кутиназы (например, Е.С. 3.1.1.74).
[00143] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, которая содержит полинуклеотид, молекулу нуклеиновой кислоты, химерный ген, кассету экспрессии или рекомбинантный вектор по настоящему изобретению. Трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, может включать без ограничений растительную клетку, дрожжевую клетку, бактериальную клетку или клетку насекомого. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена бактериальная клетка, выбранная из рода Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Xenorhabdus, Photorhabdus, Pasteuria, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc или Alcaligenes. Таким образом, например, в качестве средств для биологического контроля насекомых можно получать белки Cry по настоящему изобретению путем экспрессии химерного гена, кодирующего белки Cry по настоящему изобретению в бактериальной клетке. Например, в одном варианте осуществления предусмотрена клетка Bacillus thuringiensis, содержащая химерный ген по настоящему изобретению.
[00144] В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена растительная клетка, которая представляет собой клетку двудольного растения или клетку однодольного растения. В дополнительных вариантах осуществления клетка двудольного растения выбрана из группы, состоящей из клетки сои, клетки подсолнечника, клетки томата, клетки культурной разновидности капусты, клетки хлопчатника, клетки сахарной свеклы и клетки табака. В дополнительных вариантах осуществления клетка однодольного растения выбрана из группы, состоящей из клетки ячменя, клетки маиса, клетки овса, клетки риса, клетки сорго, клетки сахарного тростника и клетки пшеницы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена совокупность клеток двудольных растений или клеток однодольных растений, экспрессирующих токсичный белок по настоящему изобретению, кодируемый химерным геном по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления клетки в совокупности расположены рядом с образованием апопласта и их выращивают при естественном солнечном свете.
[00145] В другом варианте осуществления настоящего изобретения токсичный белок по настоящему изобретению экспрессируется в высшем организме, например растении. В этом случае трансгенные растения, экспрессируя эффективные количества токсичного белка, защищают себя от вредителей растений, таких как насекомые-вредители. Когда насекомое начинает питаться на таком трансгенном растении, оно также поедает экспрессируемый токсин. Это может удерживать насекомое от дальнейшего вгрызания в растительную ткань или даже может причинять вред насекомому или уничтожать его. Полинуклеотид по настоящему изобретению вставляют в кассету экспрессии, которая затем стабильно интегрируется в геном растения. В другом варианте осуществления полинуклеотид включают в непатогенный самореплицирующийся вирус. Растения, трансформированные в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой однодольные или двудольные растения, и они включают без ограничения кукурузу (маис), сою, рис, пшеницу, ячмень, рожь, овес, сорго, просо, подсолнечник, сафлор, сахарную свеклу, хлопчатник, сахарный тростник, масличный рапс, люцерну, табак, разновидности арахиса, овощные культуры, в том числе батат, фасоль, горох, цикорий, латук, кочанную капусту, цветную капусту, брокколи, репу, морковь, баклажан, огурец, редьку, шпинат, картофель, томат, спаржу, лук, чеснок, разновидности дыни, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву обыкновенную, цуккини, плодовые культуры, включая яблоню, грушу, айва, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, землянику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан и специализированные растения, такие как Arabidopsis, а также древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья. Предпочтительно растения по настоящему изобретению представляют собой культурные растения, такие как маис, сорго, пшеница, подсолнечник, томат, крестоцветные, разновидности перца, картофель, хлопчатник, рис, соя, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень, масличный рапс и т.п.
[00146] После того как требуемый полинуклеотид введен в конкретный вид растения путем трансформации, при помощи традиционных методик размножения он может передаваться в пределах данного вида или переходить в другие разновидности того же вида, в частности, включающие коммерческие разновидности.
[00147] Полинуклеотид по настоящему изобретению экспрессируется в трансгенных растениях, обусловливая тем самым биосинтез соответствующего белка Cry в трансгенных растениях. Таким способом получают трансгенные растения с улучшенной защитой урожая в присутствии нагрузки насекомых. Для экспрессии в трансгенных растениях может потребоваться модификация и оптимизация нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению. Хотя во многих случаях гены микроорганизмов могут экспрессироваться в растениях на высоких уровнях и без модификации, низкий уровень экспрессии в трансгенных растениях может быть обусловлен нуклеотидными последовательностями микроорганизмов, имеющими ко доны, которые не являются предпочтительными для растений. Как известно из уровня техники, для живых организмов характерны определенные предпочтения в отношении частоты использования кодонов, и поэтому кодоны нуклеотидных последовательностей, описанных в данном изобретении, могут быть изменены в соответствии с характерными для растений предпочтениями, при этом с сохранением аминокислот, кодируемых ими. Кроме того, высокий уровень экспрессии в растениях, например растениях кукурузы, лучше всего достигается в случае кодирующих последовательностей, которые характеризуются по меньшей мере приблизительно 35% содержанием GC, или по меньшей мере приблизительно 45%, или по меньшей мере приблизительно 50% или по меньшей мере приблизительно 60%. Нуклеотидные последовательности микроорганизмов, которые характеризуются низким содержанием GC, могут экспрессироваться в растениях на недостаточном уровне в связи с наличием мотивов АТТТА, которые могут дестабилизировать транскрипты, и мотивов ААТААА, которые могут обуславливать ненадлежащее полиаденилирование. Хотя определенные последовательности генов могут надлежащим образом экспрессироваться как в видах однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом предпочтений в отношении кодонов и предпочтений в отношении содержания GC для однодольных растений или двудольных растений, поскольку было показано, что эти предпочтения отличаются (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Кроме того, нуклеотидные последовательности подвергают скринингу на наличие неправильных сайтов сплайсинга, которые могут вызывать усечение транскрипта. Все изменения, которые требуется выполнить в пределах нуклеотидных последовательностей, такие как описанные выше, выполняют с применением хорошо известных методик сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и конструирования синтетических генов с помощью способов, описанных, например, в патентах США №№ 5625136; 5500365 и 6013523.
[00148] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены синтетические гены, полученные согласно процедуре, раскрытой в патенте США №5625136, включенном в данный документ посредством ссылки. В этой процедуре применяют предпочтительные для маиса кодоны, т.е. один кодон, который чаще всего кодирует данную аминокислоту в маисе. Предпочтительный для маиса кодон, кодирующий конкретную аминокислоту, может быть определен, например, на основании известных последовательностей генов маиса. Например, данные о частоте использования кодонов у маиса для 28 генов из растений маиса можно найти в Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки. Специально приведенные в качестве примера синтетические последовательности по настоящему изобретению, полученные с применением кодонов, оптимизированных для маиса, представлены любой из SEQ ID NO: 13-20. Подобным образом нуклеотидные последовательности могут быть оптимизированы для экспрессии в любом растении. Следует понимать, что вся нуклеотидная последовательность или любая ее часть могут быть оптимизированными или синтетическими. То есть полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая частично является нативной последовательностью и частично является синтетической оптимизированной последовательностью.
[00149] Для эффективной инициации трансляции может потребоваться модификация последовательностей, прилегающих к инициирующему метионину. Например, их можно модифицировать путем включения последовательностей, которые, как известно, являются эффективными в растениях. Joshi предложил подходящую консенсусную последовательность для растений (NAR 15:6643-6653 (1987)), а Clonetech предлагает дополнительную консенсусную последовательность, являющуюся инициатором трансляции (каталог 1993/1994, стр. 210). Эти консенсусные последовательности подходят для использования с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению. Последовательности, которые включены в конструкции, содержащие нуклеотидные последовательности, до ATG и включая ATG (оставив при этом вторую аминокислоту немодифицированной) или, в качестве альтернативы, до GTC и включая GTC вслед за ATG (с возможностью изменения второй аминокислоты трансгена).
[00150] Последовательности, кодирующие новый белок cry по настоящему изобретению, либо в виде их нативной последовательности, либо в виде синтетических последовательностей, как описано выше, могут быть функционально связаны с целым рядом промоторов для экспрессии в растениях, включая конститутивные, индуцируемые, регулируемые во времени, регулируемые в процессе развития, химически регулируемые, тканепредпочтительные и тканеспецифические промоторы, для получения молекул рекомбинантных ДНК, то есть химерных генов. Выбор промотора будет различаться в зависимости от временных и пространственных требований для экспрессии, а также в зависимости от целевого вида. Таким образом, предпочтительной является экспрессия нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению в листьях, в цветоножках или стеблях, в колосьях, в соцветиях (например, колосках, метелках, початках и т.д.), в корнях и/или проростках. Во многих случаях, однако, требуется защита от более чем одного типа насекомого-вредителя, и, следовательно, желательна экспрессия в нескольких тканях. Хотя, как было показано, многие промоторы из двудольных растений функционируют у однодольных растений и наоборот, по возможности промоторы двудольных выбирают для экспрессии у двудольных растений, а промоторы однодольных выбирают для экспрессии у однодольных растений. Однако не существует каких-либо ограничений в отношении происхождения выбранных промоторов, достаточно того, что они являются функциональными в управлении экспрессией нуклеотидных последовательностей в требуемой клетке.
[00151] Примеры конститутивных промоторов, применимых в настоящем изобретении, включают 35S и 19S промоторы CaMV (Fraley et al., патент США №5352605, включенный в данный документ посредством ссылки). Кроме того, промотор получают из любого из нескольких генов актина, экспрессируемых в большинстве типов клеток. Кассеты экспрессии с промотором, описанные в McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) можно легко модифицировать для экспрессии гена нового токсина, и они являются особенно подходящими для применения у однодольных растений-хозяев. Еще один конститутивный промотор получают из гена убиквитина, который представляет собой еще один генный продукт, который, как известно, накапливается во многих типах клеток. Убиквитиновый промотор был клонирован из нескольких видов для применения в трансгенных растениях, например, подсолнечнике (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), маисе (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632) и арабидопсисе (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21: 895-906). Убиквитиновый промотор маиса был разработан для трансгенных систем однодольных растений, и его последовательность и векторы, сконструированные для трансформации однодольных растений, раскрыты в патентной заявке ЕР 0342926. Убиквитиновый промотор подходит для экспрессии гена нового токсина в трансгенных растениях, в частности однодольных.
[00152] Тканеспецифические или тканепредпочтительные промоторы, применимые для экспрессии последовательностей, кодирующих новый белок cry по настоящему изобретению, в растениях, в частности маисе, представляют собой промоторы, которые управляют экспрессией в корне, паренхиме, листе или пыльце. Такие промоторы раскрыты в патенте США №5625136, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Другие тканеспецифические промоторы, применимые в настоящем изобретении, включают промотор гена rubisco хлопчатника, раскрытый в патенте США №6040504; промотор гена сахарозосинтазы риса, раскрытый в патенте США №5604121; и промотор вируса желтой курчавости листьев цеструма, раскрытый в патенте США №7166770, все включены посредством ссылки во всей своей полноте. Химически индуцируемые промоторы, применимые для управления экспрессией гена нового токсина в растениях, раскрыты в патенте США №5614395, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[00153] Нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению также могут экспрессироваться под контролем промоторов, которые регулируются химическим путем. Это обеспечивает возможность синтеза белков Cry по настоящему изобретению только в случае обработки культурных растений индуцирующими химическими веществами. Примеры такой технологии химической индукции экспрессии генов подробно описаны в публикации заявки ЕР 0332104 и патенте США №5614395. В одном варианте осуществления химически регулируемый промотор представляет собой промотор PR-1а табака.
[00154] Другая категория промоторов, применимых в настоящем изобретении, включает промотор, который индуцируется ранением. Были описаны многочисленные промоторы, которые экспрессируются в участках ранения, а также в участках инфицирования фитопатогеном. В идеальном случае такой промотор должен активироваться локально в участках инвазии насекомых и, таким образом, инсектицидные белки накапливаются исключительно в клетках, где необходим синтез инсектицидных белков для уничтожения нападающего насекомого-вредителя. Примеры промоторов этого типа включают таковые, описанные Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993) и Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).
[00155] Неограничивающие примеры промоторов, обуславливающих тканеспецифические паттерны экспрессии, применимые в настоящем изобретении, включают специфические для зеленой ткани, специфические для корня, специфические для стебля и/или специфические для цветка. Промоторы, подходящие для экспрессии в зеленой ткани, включают множество промоторов, которые осуществляют регуляцию генов, участвующих в фотосинтезе, и многие из них были клонированы как из однодольных растений, так и из двудольных растений. Одним из таких промоторов является промотор PEPC маиса из гена фосфоенолкарбоксилазы (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)).Другим промотором специфической для корня экспрессии является промотор, описанный de Framond (FEBS 290:103-106 (1991) или в патенте США №5466785). Другой промотор, применимый в настоящем изобретении, представляет собой специфический для стебля промотор, описанный в патенте США №5625136, который в естественных условиях управляет экспрессией гена trpA маиса.
[00156] В дополнение к выбору подходящего промотора конструкциям для экспрессии инсектицидного токсина в растениях требуется соответствующий терминатор транскрипции, который будет функционально связан ниже гетерологичной нуклеотидной последовательности. Несколько таких терминаторов доступны и известны в данной области техники (например, tml из CaMV, Е9 из rbcS). В контексте настоящего изобретения можно применять любой доступный терминатор, о котором известно, что он функционирует в растениях.
[00157] В кассеты экспрессии, описанные в настоящем изобретении, можно вводить множество других последовательностей. Они предусматривают последовательности, которые, как показано, усиливают экспрессию, как, например, интронные последовательности (например, из Adh1 и bronze1) и вирусные лидерные последовательности (например, из TMV, MCMV и AMV).
[00158] Предпочтительным может быть нацеливание экспрессии нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению в различные клеточные локализации в растении. В некоторых случаях может быть желательной локализация в цитозоле, тогда как в других случаях предпочтительной может быть локализация в определенной субклеточной органелле. Для осуществления настоящего изобретения на практике можно применять любой механизм нацеливания генных продуктов, например в растениях, и, как известно, такие механизмы существуют в растениях, и последовательности, регулирующие функционирование таких механизмов, были описаны довольно подробно. Были охарактеризованы последовательности, которые обеспечивают нацеливание генных продуктов в другие компартменты клетки. Аминоконцевые последовательности могут обусловливать нацеливание представляющего интерес белка в любой компартмент клетки, такой как вакуоль, митохондрия, пероксисома, белковые тельца, эндоплазматический ретикулум, хлоропласт, крахмальное зерно, амилопласт, апопласт или клеточная стенка растения (например, Unger et. al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989); Rogers et. al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-651; патент США №7102057; WO 2005/096704, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Необязательно, сигнальная последовательность может представлять собой N-концевую сигнальную последовательность из waxy, N-концевую сигнальную последовательность из гамма-зеина, домен, связывающий крахмал, С-концевой домен, связывающий крахмал, последовательность, нацеливающую в хлоропласт, которая обеспечивает доставку зрелого белка в хлоропласт (Comai et. al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15104-15109; van den Broeck, et. al. (1985) Nature 313: 358-363; патент США No. 5639949) или сигнальную последовательность секреции из клеток алейронового слоя (Koehler & Но, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Кроме того, аминоконцевые последовательности вместе с карбоксиконцевыми последовательностями обусловливают нацеливание генных продуктов в вакуоль (Shinshi et. al. (1990) Plant Molec. Biol. 14: 357-368). В одном варианте осуществления выбранная сигнальная последовательность включает известный сайт расщепления, и при конструировании слияния учитываются любые аминокислоты после сайта(ов) расщепления, необходимые для расщепления. В некоторых случаях это требование может быть выполнено путем добавления небольшого числа аминокислот между сайтом расщепления и ATG трансгена или, в качестве альтернативы, путем замещения некоторых аминокислот в пределах последовательности трансгена. Эти методики конструирования хорошо известны из уровня техники и одинаково применимы к любому клеточному компартменту.
[00159] Будет понятно, что описанные выше механизмы нацеливания в клетке можно использовать не только с сочетании когнатными для них промоторами, но также в сочетании с гетерологичными промоторами, так что специфическая задача нацеливания в клетке осуществляется под транскрипционным контролем промотора, характеризующегося паттерном экспрессии, отличный от такового для промотора, из которого получен нацеливающий сигнал.
Трансформация растений
[00160] Процедуры трансформации растений хорошо известны и общеприняты в данной области техники и описаны в литературе во всех отношениях. Неограничивающие примеры способов трансформации растений включают трансформацию с помощью доставки нуклеиновых кислот, опосредованной бактериями (например, с помощью Agrobacterium), доставки нуклеиновых кислот, опосредованной вирусами, доставки нуклеиновых кислот, опосредованной карбидом кремния или микроиглами с нуклеиновыми кислотами, доставки нуклеиновых кислот, опосредованной липосомами, микроинъекцию, бомбардировку микрочастицами, трансформацию, опосредованную фосфатом кальция, трансформацию, опосредованную циклодекстринами, электропорацию, трансформацию, опосредованную наночастицами, обработку ультразвуком, инфильтрацию, поглощение нуклеиновых кислот, опосредованное PEG, а также любой другой электрический, химический, физический (механический) и/или биологический механизм, который приводит к введению нуклеиновой кислоты в растительную клетку, включая любую их комбинацию. Общие руководства по разнообразным способам трансформации растений, известным в данной области техники, включают Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. и Thompson, J.E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), pages 67-88) и Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858 (2002)).
[00161] Для трансформации, опосредованной Agrobacterium, подходят бинарные векторы или векторы, несущие по меньшей мере одну граничную последовательность T-DNA, тогда как для прямого переноса генов (например, с помощью бомбардировки частицами и т.п.) подходит любой вектор, при этом можно применять линейную ДНК, содержащую только представляющую интерес конструкцию. В случае прямого переноса генов можно применять трансформацию при помощи одного вида ДНК или котрансформацию (Schocher et al., Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). В случае как прямого переноса генов, так и переноса, опосредованного Agrobacterium, трансформацию обычно (но не обязательно) выполняют с селектируемым маркером, который может представлять собой средство для позитивного отбора (фосфоманнозоизомераза), которое обеспечивает устойчивость к антибиотику (канамицину, гигромицину или метотрексату) или гербициду (глифосату или глюфосинату). Однако выбор селектируемого маркера не является критически важным для настоящего изобретения.
[00162] Трансформация, опосредованная Agrobacterium, представляет собой способ, широко применяемый для трансформации растений, в частности двудольных растений, в связи с высокой эффективностью трансформации и в связи с широкой применимостью в отношении множества различных видов. Трансформация, опосредованная Agrobacterium, как правило, предполагает перенос бинарного вектора, несущего чужеродную ДНК, представляющую интерес, в пригодный штамм Agrobacterium, что может зависеть от набора vir-генов штамма-хозяина Agrobacterium, расположенного либо в корезидентной Ti-плазмиде, либо в хромосоме (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169). Перенос рекомбинантного бинарного вектора в Agrobacterium можно выполнять с помощью процедуры трехродительского скрещивания с применением Escherichia coli, несущей рекомбинантный бинарный вектор, хелперного штамма E.coli, несущего плазмиду, которая способна мобилизовать рекомбинантный бинарный вектор в целевом штамме Agrobacterium. В качестве альтернативы, рекомбинантный бинарный вектор можно переносить в Agrobacterium путем трансформации нуклеиновой кислоты (Höfgen & Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16:9877).
[00163] Трансформация растения с помощью рекомбинантной Agrobacterium обычно включает совместное культивирование Agrobacterium с эксплантатами растения, и ее проводят в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. Трансформированную ткань регенерируют на селективной среде, содержащей маркер устойчивости к антибиотикам или гербицидам между граничными последовательностями T-DNA бинарной плазмиды.
[00164] Как обсуждалось ранее, другой способ трансформации растений, частей растений и растительных клеток включает внедрение инертных или биологически активных частиц в растительные ткани и клетки. См, например, патенты США №№ 4945050; 5036006 и 5100792. В общем случае этот способ включает внедрение в растительные клетки инертных или биологически активных частиц в условиях, эффективных для проникновения через наружную поверхность клетки и возможности включения в ее внутреннюю часть. При использовании инертных частиц вектор можно вводить в клетку путем покрытия частиц вектором, содержащим представляющую интерес нуклеиновую кислоту. В качестве альтернативы, клетка или клетки могут быть окружены вектором так, чтобы вектор переносился в клетку вслед за частицей. Биологически активные частицы (например, высушенная дрожжевая клетка, высушенная бактерия или бактериофаг, каждая(каждый) из которых содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, подлежащих введению) также можно внедрять в растительную ткань.
[00165] В другом варианте осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению можно напрямую вводить в геном пластид путем трансформации. Основное преимущество трансформации пластид состоит в том, что пластиды обычно способны экспрессировать бактериальные гены без существенной модификации, при этом пластиды способны экспрессировать несколько открытых рамок считывания под контролем одного промотора. Технология трансформации пластид подробно описана в патентах США №№ 5451513, 5545817 и 5545818, в РСТ заявке № WO 95/16783 и в McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Основная методика трансформации хлоропластов включает введение участков клонированной пластидной ДНК, фланкирующих селектируемый маркер, вместе с представляющим интерес геном в подходящую целевую ткань, например, с применением биолистики или трансформации протопластов (например, трансформации, опосредованной хлоридом кальция или PEG). Фланкирующие участки размером 1-1,5 т.о., называемые нацеливающими последовательностями, содействуют гомологичной рекомбинации с геномом пластид и, таким образом, обеспечивают замещение или модификацию специфических участков пластома. Вначале можно применять точечные мутации в 16S рРНК и генах rps12 хлоропластов, придающие устойчивость к спектиномицину и/или стрептомицину, в качестве селектируемых маркеров для трансформации (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.M., and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Наличие сайтов клонирования между этими маркерами позволяет создать вектор, нацеленный на пластиды, для введения чужеродных генов (Staub, J.М., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Существенного повышения частоты трансформации можно достичь путем замещения рецессивных генов рРНК или r-белков, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, доминантным селектируемым маркером, бактериальным геном aadA, кодирующим фермент, обезвреживающий спектиномицин, аминогликозид-3'-аденилтрансферазу (Svab, Z., and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Ранее этот маркер успешно применяли для трансформации генома пластид зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с высокой частотой (Goldschmidt-Clermont, М. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Другие селектируемые маркеры, применимые для трансформации пластид, известны из уровня техники и включены в объем настоящего изобретения. Как правило, для достижения состояния, при котором все пластиды являются одинаковыми, требуется около 15-20 циклов клеточного деления после трансформации. При экспрессии в пластидах, при которой гены вставлены с помощью гомологической рекомбинации во все несколько тысяч копий кольцевого пластидного генома, присутствующего в каждой растительной клетке, используют преимущество огромного числа копий по сравнению с генами, экспрессируемыми в ядре, что допускает уровни экспрессии, которые легко могут превышать 10% общего количества растворимых растительных белков. В одном варианте осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению может быть вставлен в вектор, нацеленный на пластиды, и введен в геном пластид требуемого растения-хозяина путем трансформации. Таким образом, можно получить растения, гомопластические в отношении геномов пластид, содержащих нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, способные экспрессировать полинуклеотид на высоком уровне.
[00166] Способы отбора трансформированных трансгенных растений, растительных клеток и/или культур растительных тканей являются общепринятыми в данной области техники и могут использоваться в способах настоящего изобретения, предусмотренных в данном документе. Например, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению также может включать кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность селектируемого маркера, который можно применять для отбора трансформированного растения, части растения и/или растительной клетки. Применяемое в данном документе выражение "селектируемый маркер" означает нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии придает отличительный фенотип растению, части растения и/или растительной клетке, экспрессирующим данный маркер, и, таким образом, позволяет отличать такие трансформированные растения, части растений и/или растительные клетки от тех, которые не имеют маркера. Такая нуклеотидная последовательность может кодировать либо селектируемый, либо подвергаемый скринингу маркер в зависимости от того, придает ли маркер признак, по которому можно провести отбор с помощью химических средств, например, с помощью селективного средства (например, антибиотика, гербицида и т.п.), или от того, является ли маркер просто признаком, который можно идентифицировать посредством наблюдения или тестирования, например, путем скрининга (например, признаком, определяемым в R-локусе). Разумеется, существует много примеров подходящих селектируемых маркеров, которые известны из уровня техники и могут применяться в кассетах экспрессии, описываемых в данном документе.
[00167] Примеры селектируемых маркеров включают без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую neo или nptII, которые придают устойчивость к канамицину, G418 и т.п. (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188); нуклеотидную последовательность, кодирующую bar, которая придает устойчивость к фосфинотрицину; нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSP), которая придает устойчивость к глифосату (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922); нуклеотидную последовательность, кодирующую нитрилазу, такую как bxn из Klebsiella ozaenae, которая придает устойчивость к бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную ацетолактатсинтазу (ALS), которая придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим химическим веществам, ингибирующим ALS (европейская патентная заявка №154204); нуклеотидную последовательность, кодирующую дигидрофолатредуктазу, устойчивую к метотрексату (DHFR) (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); нуклеотидную последовательность, кодирующую далапон-дегалогеназу, которая придает устойчивость к далапону; нуклеотидную последовательность, кодирующую маннозо-6-фосфатизомеразу (также называемую фосфоманнозоизомеразой (PMI)), которая придает способность к превращению маннозы в ходе метаболизма (патенты США №№ 5767378 и 5994629); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную антранилатсинтазу, которая придает устойчивость к 5-метилтриптофану; и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую hph, которая придает устойчивость к гигромицину. Специалист в данной области способен выбрать подходящий селектируемый маркер для применения в кассете экспрессии по настоящему изобретению.
[00168] Дополнительные селектируемые маркеры включают без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую β-глюкуронидазу или uidA (GUS), который кодирует фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты; нуклеотидную последовательность R-локуса, которая кодирует продукт, регулирующий продуцирование антоцианиновых пигментов (красного цвета) в растительных тканях (Dellaporta et al., "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac," pp. 263-282, в Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustafson & Appels eds., Plenum Press 1988)); нуклеотидную последовательность, кодирующую β-лактамазу, фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты (например, PADAC, хромогенный цефалоспорин) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741); нуклеотидную последовательность, кодирующую xylE, который кодирует катехолдиоксигеназу (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101-1105); нуклеотидную последовательность, кодирующую тирозиназу, фермент, способный окислять тирозин до DOPA и допахинона, который, в свою очередь, конденсируется с образованием меланина (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); нуклеотидную последовательность, кодирующую β-галактозидазу, фермент, для которого существуют хромогенные субстраты; нуклеотидную последовательность, кодирующую люциферазу (lux), которая позволяет производить биолюминесцентную детекцию (Ow et al. (1986) Science 234:856-859); нуклеотидную последовательность, кодирующую экворин, который можно использовать в биолюминесцентной детекции, основанной на применении кальций-чувствительных белков (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268); или нуклеотидную последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406). Специалист в данной области способен выбрать подходящий селектируемый маркер для применения в кассете экспрессии по настоящему изобретению.
[00169] Дополнительно, как хорошо известно из уровня техники, целые трансгенные растения можно регенерировать из трансформированных растительных клеток, культур растительных тканей и/или культивируемых протопластов с помощью любой из множества известных методик. Регенерация растений из растительных клеток, культур растительных тканей и/или культивируемых протопластов описана, например, в Evans et al. (Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMilan Publishing Co. New York (1983)) и Vasil I.R. (ed.) (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I (1984), and Vol. II (1986)).
[00170] Кроме того, описанные выше свойства генов, обеспеченные с помощью методов генной инженерии в трансгенных семенах и растениях, частях растения и/или растительных клетках по настоящему изобретению, могут передаваться путем полового размножения или вегетативного роста и, следовательно, могут поддерживаться и передаваться по наследству растениям-потомкам. Как правило, при поддержании и передаче по наследству применяют известные сельскохозяйственные способы, разработанные для соответствия конкретным целям, таким как уборка урожая, посев или возделывание.
[00171] Следовательно, полинуклеотид может вводиться в растение, часть растения и/или растительную клетку посредством любого количества путей, хорошо известных в данной области техники, описанных выше. Следовательно, не придерживаются какого-либо конкретного способа введения одного или нескольких полинуклеотидов в растение, а наоборот, можно применять любой способ, обеспечивающий стабильную интеграцию одного или нескольких полинуклеотидов в геном растения. Если требуется ввести более одного полинуклеотида, то соответствующие полинуклеотиды можно собрать как части одной молекулы нуклеиновой кислоты или как отдельные молекулы нуклеиновых кислот и можно расположить в пределах одной и той же или различных молекул нуклеиновых кислот. Соответственно, введение полинуклеотидов в представляющую интерес клетку можно осуществлять в ходе одного события трансформации, в ходе отдельных событий трансформации или, например, в растения, в виде части протокола скрещивания.
[00172] Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают собранные продукты, полученные из трансгенных растений и/или их частей по настоящему изобретению, а также переработанный продукт, полученный из данных собранных продуктов. Собранный продукт может представлять собой целое растение или любую часть растения, как раскрыто в данном документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления неограничивающие примеры собранного продукта включают семя, плод, цветок или его часть (например, пыльник, рыльце и т.п.), лист, стебель и т.п. В других вариантах осуществления переработанный продукт включает без ограничений муку тонкого помола, муку грубого помола, масло, крахмал, крупу и т.п., полученные из собранного семени или другой части растения по настоящему изобретению, при этом указанное семя или другая часть растения содержат молекулу нуклеиновой кислоты/полинуклеотид/нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению.
[00173] В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен экстракт из трансгенного семени и/или трансгенного растения по настоящему изобретению, при этом экстракт содержит молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид, нуклеотидную последовательность или токсичный белок по настоящему изобретению. Экстракты из растений или частей растений можно получить согласно процедурам, хорошо известным из уровня техники (см. de la Torre et al., Food Agric. Environ. 2(1):84-89 (2004); Guidet, Nucleic Acids Res. 22(9): 1772-1773 (1994); Lipton et al., Food Agric. Immun. 12:153-164 (2000)).
Инсектицидные композиции
[00174] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена инсектицидная композиция, содержащая белок Cry по настоящему изобретению в приемлемом с точки зрения сельского хозяйства носителе. Применяемое в данном документе выражение "приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель" может включать природный или синтетический, органический или неорганический материал, который объединен с активным компонентом для содействия его применения по отношению к растению или его части. Примеры приемлемых с точки зрения сельского хозяйства носителей включают без ограничения порошки, дусты, пеллеты, гранулы, аэрозоли, эмульсии, коллоиды и растворы. Приемлемые с точки зрения сельского хозяйства носители дополнительно включают без ограничения инертные компоненты, диспергирующие вещества, поверхностно-активные вещества, вспомогательные вещества, придающие липкость вещества, клейкие вещества, связующие вещества или их комбинации, которые можно применять в составах, используемых в сельском хозяйстве. Такие композиции можно применять любым способом, посредством которого пестицидные белки или другие средства для контроля вредителей приводят в контакт с вредителями. Соответственно, композиции можно наносить на поверхности растений или частей растений, в том числе на семена, листья, цветки, стебли, клубни, корни и т.п. Другим приемлемым с точки зрения сельского хозяйства носителем может быть трансгенное растение или часть растения.
[00175] В дополнительных вариантах осуществления инсектицидная композиция содержит трансгенную бактериальную клетку по настоящему изобретению, при этом бактериальная клетка содержит химерный ген по настоящему изобретению. Например, такую инсектицидную композицию можно получить путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, осаждения или концентрирования культуры клеток Bacillus thuringiensis, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. В дополнительных вариантах осуществления композиция содержит от приблизительно 1% до приблизительно 99% по весу белка Cry по настоящему изобретению.
[00176] Белки Cry по настоящему изобретению можно применять в комбинации с другими средствами для контроля вредителей для увеличения спектра целевых вредителей или для предупреждения и/или управления устойчивостью насекомых. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, обеспечивающая контроль одного или нескольких вредителей растений, при этом композиция содержит первый белок Cry по настоящему изобретению и второе средство для контроля вредителей, отличное от первого белка Cry. В других вариантах осуществления композиция представляет собой состав для местного нанесения на растение. В еще одних вариантах осуществления композиция представляет собой трансгенное растение. В дополнительных вариантах осуществления композиция представляет собой комбинацию, предусматривающую состав и трансгенное растение, на которое он наносится. В одном варианте осуществления состав содержит первый белок Cry по настоящему изобретению, если трансгенное растение содержит второе средство для контроля вредителей. В другом варианте осуществления состав содержит второе средство для контроля вредителей, если трансгенное растение содержит первый белок Cry по настоящему изобретению.
[00177] В некоторых вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей может представлять собой средство, выбранное из группы, состоящей из химического пестицида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis (Bt), инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Brevibacillus laterosporus, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, ингибиторов протеаз (как сериновых, так и цистеиновых типов), лектинов, альфа-амилазы, пероксидазы и холестериноксидазы.
[00178] В других вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей представляет собой химический пестицид, выбранный из группы, состоящей из пиретроидов, карбаматов, неоникотиноидов, блокаторов натриевых каналов нейронов, инсектицидных макроциклических лактонов, антагонистов гамма-аминомасляной кислоты (GABA), инсектицидных мочевин и миметиков ювенильного гормона. В другом варианте осуществления химический пестицид выбран из группы, состоящей из абамектина, ацефата, ацетамиприда, амидофлумета (S-1955), авермектина, азадирахтина, азинфос-метила, бифентрина, бинфеназата, бупрофезина, карбофурана, хлорфенапира, хлорфлуазурона, хлорпирифоса, хлорпирифос-метила, хромафенозида, клотианидина, цифлутрина, бета-цифлутрина, цигалотрина, лямбда-цигалотрина, циперметрина, циромазина, дельтаметрина, диафентиурона, диазинона, дифлубензурона, диметоата, диофенолана, эмамектина, эндосульфана, эсфенвалерата, этипрола, фенотикарба, феноксикарба, фенпропатрина, фенпроксимата, фенвалерата, фипронила, флоникамида, флуцитрината, тау-флювалината, флуфенерима (UR-50701), флуфеноксурона, фонофоса, галофенозида, гексафлумурона, имидаклоприда, индоксакарба, изофенфоса, луфенурона, малатиона, метальдегида, метамидофоса, метидатиона, метомила, метопрена, метоксихлора, монокротофоса, метоксифенозида, нитиазина, новалурона, новифлумурона (XDE-007), оксамила, паратиона, паратион-метила, перметрина, фората, фозалона, фосмета, фосфамидона, пиримикарба, профенофоса, пиметрозина, пиридалила, пирипроксифена, ротенона, спиносада, спиромезифена (BSN 2060), сульпрофоса, тебуфенозида, тефлубензурона, тефлутрина, тербуфоса, тетрахлорвинфоса, тиаклоприда, тиаметоксама, тиодикарба, тиосултап-натрия, тралометрина, трихлорфона и трифлумурона, алдикарба, оксамила, фенамифоса, амитраза, хинометионата, хлоробензилата, цигексатина, дикофола, диенохлора, этоксазола, феназаквина, оксида фенбутатина, фенпропатрина, фенпироксимата, гекситиазокса, пропаргита, пиридабена и тебуфенпирада. В другом варианте осуществления химический пестицид выбран из группы, состоящей из циперметрина, цигалотрина, цифлутрина и бета-цифлутрина, эсфенвалерата, фенвалерата, тралометрина, фенотикарба, метомила, оксамила, тиодикарба, клотианидина, имидаклоприда, тиаклоприда, индоксакарба, спиносада, абамектина, авермектина, эмамектина, эндосульфана, этипрола, фипронила, флуфеноксурона, трифлумурона, диофенолана, пирипроксифена, пиметрозина и амитраза.
[00179] В дополнительных вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей может представлять собой один или несколько из любого числа инсектицидных белков Bacillus thuringiensis, в том числе без ограничения белок Cry, вегетативный инсектицидный белок (VIP) и инсектицидные химерные варианты любого из перечисленных выше инсектицидных белков. В других вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей представляет собой белок Cry, выбранный из группы, состоящей из Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ad, Cry1Ae, Cry1Af, Cry1Ag, Cry1Ah, Cry1Ai, Cry1Aj, Cry1Ba, Cry1Bb, Cry1Bc, Cry1Bd, Cry1Be, Cry1Bf, Cry1Bg, Cry1Bh, Cry1Bi, Cry1Ca, Cry1Cb, Cry1Da, Cry1Db, Cry1Dc, Cry1Dd, Cry1Ea, Cry1Eb, Cry1Fa, Cry1Fb, Cry1Ga, Cry1Gb, Cry1Gc, Cry1Ha, Cry1Hb, Cry1Hc, Cry1Ia, Cry1Ib, Cry1Ic, Cry1Id, Cry1Ie, Cry1If, Cry1Ig, Cry1Ja, Cry1Jb, Cry1Jc, Cry1Jd, Cry1Ka, Cry1La, Cry1Ma, Cry1Na, Cry1Nb, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac, Cry2Ad, Cry2Ae, Cry2Af, Cry2Ag, Cry2Ah, Cry2Ai, Cry2Aj, Cry2Ak,Cry2Al, Cry2Ba, Cry3Aa, Cry3Ba, Cry3Bb, Cry3Ca, Cry4Aa, Cry4Ba, Cry4Ca, Cry4Cb, Cry4Cc, Cry5Aa, Cry5Ab, Cry5Ac, Cry5Ad, Cry5Ba, Cry5Ca, Cry5Da, Cry5Ea, Cry6Aa, Cry6Ba, Cry7Aa, Cry7Ab, Cry7Ac, Cry7Ba, Cry7Bb, Cry7Ca, Cry7Cb, Cry7Da, Cry7Ea, Cry7Fa, Cry7Fb, Cry7Ga, Cry7Gb, Cry7Gc, Cry7Gd, Cry7Ha, Cry7Ia, Cry7Ja, Cry7Ka, Cry7Kb, Cry7La, Cry8Aa, Cry8Ab, Cry8Ac, Cry8Ad, Cry8Ba, Cry8Bb, Cry8Bc, Cry8Ca, Cry8Da, Cry8Db, Cry8Ea, Cry8Fa, Cry8Ga, Cry8Ha, Cry8Ia, Cry8Ib, Cry8Ja, Cry8Ka, Cry8Kb, Cry8La, Cry8Ma, Cry8Na, Cry8Pa, Cry8Qa, Cry8Ra, Cry8Sa, Cry8Ta, Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Bb, Cry9Ca, Cry9Da, Cry9Db, Cry9Dc, Cry9Ea, Cry9Eb, Cry9Ec, Cry9Ed, Cry9Ee, Cry9Fa, Cry9Ga, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry11Ba, Cry11Bb, Cry12Aa, Cry13Aa, Cry14Aa, Cry14Ab, Cry15Aa, Cry16Aa, Cry17Aa, Cry18Aa, Cry18Ba, Cry18Ca, Cry19Aa, Cry19Ba, Cry19Ca, Cry20Aa, Cry20Ba, Cry21Aa, Cry21Ba, Cry21Ca, Cry21Da, Cry21Ea, Cry21Fa, Cry21Ga, Cry21Ha, Cry22Aa, Cry22Ab, Cry22Ba, Cry22Bb, Cry23Aa, Cry24Aa, Cry24Ba, Cry24Ca, Cry25Aa, Cry26Aa, Cry27Aa, Cry28Aa, Cry29Aa, Cry29Ba, Cry30Aa, Cry30Ba, Cry30Ca, Cry30Da, Cry30Db, Cry30Ea, Cry30Fa, Cry30Ga, Cry31Aa, Cry31Ab, Cry31Ac, Cry31Ad, Cry32Aa, Cry32Ab, Cry32Ba, Cry32Ca, Cry32Cb, Cry32Da, Cry32Ea, Cry32Eb, Cry32Fa, Cry32Ga, Cry32Ha, Cry32Hb, Cry32Ia, Cry32Ja, Cry32Ka, Cry32La, Cry32Ma, Cry32Mb, Cry32Na, Cry32Oa, Cry32Pa, Cry32Qa, Cry32Ra, Cry32Sa, Cry32Ta, Cry32Ua, Cry33Aa, Cry34Aa, Cry34Ab, Cry34Ac, Cry34Ba, Cry35Aa, Cry35Ab, Cry35Ac, Cry35Ba, Cry36Aa, Cry37Aa, Cry38Aa, Cry39Aa, Cry40Aa, Cry40Ba, Cry40Ca, Cry40Da, Cry41Aa, Cry41Ab, Cry41Ba, Cry42Aa, Cry43Aa, Cry43Ba, Cry43Ca, Cry43Cb, Cry43Cc, Cry44Aa, Cry45Aa, Cry46Aa Cry46Ab, Cry47Aa, Cry48Aa, Cry48Ab, Cry49Aa, Cry49Ab, Cry50Aa, Cry50Ba, Cry51Aa, Cry52Aa, Cry52Ba, Cry53Aa, Cry53Ab, Cry54Aa, Cry54Ab, Cry54Ba, Cry55Aa, Cry56Aa, Cry57Aa, Cry57Ab, Cry58Aa, Cry59Aa, Cry59Ba, Cry60Aa, Cry60Ba, Cry61Aa, Cry62Aa, Cry63Aa, Cry64Aa, Cry65Aa, Cry66Aa, Cry67Aa, Cry68Aa, Cry69Aa, Cry69Ab, Cry70Aa, Cry70Ba, Cry70Bb, Cry71Aa, Cry72Aa и Cry 73Аа.
[00180] В дополнительных вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей представляет собой вегетативный инсектицидный белок Vip3, выбранный из группы, состоящей из Vip3Aa1, Vip3Aa2, Vip3Aa3, Vip3Aa4, Vip3Aa5, Vip3Aa6, Vip3Aa7, Vip3Aa8, Vip3Aa9, Vip3Aa10, Vip3Aa11, Vip3Aa12, Vip3Aa13, Vip3Aa14, Vip3Aa15, Vip3Aa16, Vip3Aa17, Vip3Aa18, Vip3Aa19, Vip3Aa20, Vip3Aa21, Vip3Aa22, Vip3Aa2, Vip3Aa24, Vip3Aa25, Vip3Aa26, Vip3Aa27, Vip3Aa28, Vip3Aa29, Vip3Aa30, Vip3Aa31, Vip3Aa32, Vip3Aa33, Vip3Aa34, Vip3Aa35, Vip3Aa36, Vip3Aa37, Vip3Aa38, Vip3Aa39, Vip3Aa40, Vip3Aa41, Vip3Aa42, Vip3Aa43, Vip3Aa44, Vip3Ab1, Vip3Ab2, Vip3Ac1, Vip3Ad1, Vip3Ad2, Vip3Ae1, Vip3Af1, Vip3Af2, Vip3Af3, Vip3Ag1,Vip3Ag2,Vip3Ag3 HM117633, Vip3Ag4, Vip3Ag5, Vip3Ah1, Vip3Ba1, Vip3Ba2, Vip3Bb1, Vip3Bb2 и Vip3Bb3.
[00181] В еще одних вариантах осуществления первый белок Cry по настоящему изобретению и второе средство для контроля вредителей коэкспрессируются в трансгенном растении. Такой коэкспрессии нескольких пестицидных компонентов в одном и том же трансгенном растении можно достигнуть путем получения растения, содержащего и экспрессирующего все необходимые гены, с помощью методов генной инженерии. В качестве альтернативы растение, родитель 1, может быть получено с помощью методов генной инженерии для экспрессии белка Cry по настоящему изобретению. Второе растение, родитель 2, может быть получено с помощью методов генной инженерии для экспрессии второго средства для контроля вредителей. Путем скрещивания родителя 1 с родителем 2 получают растений-потомков, которые экспрессируют все гены, введенные в родителей 1 и 2.
[00182] В дополнительных вариантах осуществления предусмотрен способ
получения белка, токсичного по меньшей мере для кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), при этом способ включает культивирование трансгенной клетки-хозяина, отличной от клетки человека, которая содержит полинуклеотид, или химерный ген, или молекулу нуклеиновой кислоты, или рекомбинантный вектор по настоящему изобретению, в условиях, при которых хозяин продуцирует белок, токсичный по меньшей мере для кукурузного мотылька, (Ostrinia nubilalis). В некоторых вариантах осуществления трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, представляет собой растительную клетку. В одном варианте осуществления растительная клетка представляет собой клетку маиса. В других вариантах осуществления условия, при которых выращивают растительную клетку или клетку маиса, включают естественный солнечный свет. В других вариантах осуществления трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, представляет собой бактериальную клетку. В еще одних вариантах осуществления трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, представляет собой дрожжевую клетку. [00183] В других вариантах осуществления продуцируемый белок обладает инсектицидной активностью в отношении по меньшей мере одного дополнительного насекомого, при этом дополнительное насекомое выбрано из группы, состоящей из совки-ипсилон (Agrotis ipsilon), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), огневки тростниковой (Diatraea saccharalis), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes), огневки кукурузной юго-западной (Diatraea grandiosella), западной бобовой совки (Richia albicosta), табачной совки (Heliothis virescens), восточного кукурузного мотылька (Ostrinia furnacalis), хлопковой совки (Helicoverpa armigera), огневки желтой рисовой (Chilo suppressalis), розовой стеблевой совки (Sesamia calamistis) или огневки рисовой (Cnaphalocrocis medinalis) и любой их комбинации.
[00184] В других вариантах осуществления химерный ген содержит любую из SEQ ID NO: 1-5. В еще одних вариантах осуществления продуцируемый белок содержит аминокислотную последовательность под любой из SEQ ID NO: 16-20.
[00185] В некоторых вариантах осуществления химерный ген содержит нуклеотидную последовательность, кодон-оптимизированную для экспрессии в растении. В других вариантах осуществления химерный ген содержит любую из SEQ ID NO: 6-15. В дополнительных вариантах осуществления продуцируемый белок содержит аминокислотную последовательность под любой из SEQ ID NO: 16-25.
[00186] В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения устойчивого к вредителям (например, устойчивого к насекомым) трансгенного растения, включающий введение в растение полинуклеотида, химерного гена, рекомбинантного вектора, кассеты экспрессии или молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, содержащих нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок Cry по настоящему изобретению, где нуклеотидная последовательность экспрессируется в растении, за счет чего растению придается устойчивость по меньшей мере к кукурузному мотыльку, и получение устойчивого к вредителям (например, устойчивого к насекомым) трансгенного растения. В некоторых вариантах осуществления устойчивое к вредителям трансгенное растение является устойчивым к по меньшей мере совке-ипсилон (Agrotis ipsilon) в сравнении с контрольным растением, у которого отсутствует полинуклеотид, химерный ген, рекомбинантный вектор, кассета экспрессии или молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления введение достигается путем трансформации растения. В других вариантах осуществления введение достигается путем скрещивания первого растения, содержащего химерный ген, рекомбинантный вектор, кассету экспрессии или молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, с отличающимся вторым растением.
[00187] В некоторых вариантах осуществления трансгенное растение по настоящему изобретению, устойчивое по меньшей мере к кукурузному мотыльку (Ostrinia nubilalis), дополнительно является устойчивым к одному дополнительному насекомому, где дополнительное насекомое включает без ограничения совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), совку травяную (Spodoptera frugiperda), американскую кукурузную совку (Helicoverpa zea), огневку тростниковую (Diatraea saccharalis), гусеницу совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевую совку (Chrysodeixis includes), огневку кукурузную юго-западную (Diatraea grandiosella), западную бобовую совку (Richia albicosta), табачную совку (Heliothis virescens), восточного кукурузного мотылька (Ostrinia furnacalis), хлопковую совку (Helicoverpa armigera), огневку желтую рисовую (Chilo suppressalis), розовую стеблевую совку (Sesamia calamistis) или огневку рисовую (Cnaphalocrocis medinalis) и любую их комбинацию.
[00188] В дополнительных вариантах осуществления предусмотрен способ контроля по меньшей мере насекомых, представляющих собой совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), при этом способ включает доставку в насекомых эффективного количества белка Cry по настоящему изобретению. Для эффективного воздействия белок Cry вначале попадает в насекомое пероральным путем. Однако белок Cry может доставляться в насекомое с помощью многих известных способов. Способы доставки белка в насекомое пероральным путем включают без ограничения обеспечение белка (1) в трансгенном растении, при этом насекомое съедает (поглощает) одну или несколько частей трансгенного растения, поглощая тем самым полипептид, экспрессируемый в трансгенном растении; (2) в составленной белковой композиции(ях), которую можно наносить, например, на питательную среду насекомых или включать в ее состав; (3) в белковой композиции(ях), которую можно наносить на поверхность, например, путем опрыскивания поверхности части растения, и которая затем заглатывается насекомым в силу того, что насекомое съедает одну или несколько подвергнутых опрыскиванию частей растения; (4) в матрице приманки; (5) путем инъекции в насекомое; или (6) с помощью любой другой известной из уровня техники системы доставки белков. Таким образом, для доставки токсичных белков Cry по настоящему изобретению можно применять любой способ пероральной доставки в насекомое. В некоторых конкретных вариантах осуществления белок Cry по настоящему изобретению доставляют в насекомое пероральным путем, при этом насекомое поедает одну или несколько частей трансгенного растения.
[00189] В других вариантах осуществления белок Cry по настоящему изобретению доставляют в насекомое пероральным путем, при этом насекомое поедает одну или несколько частей растения, подвергнутых опрыскиванию композицией, содержащей белки Cry по настоящему изобретению. Доставку композиций по настоящему изобретению на поверхность растения можно осуществлять с помощью любого способа нанесения соединений, композиций, составов и т.п. на поверхности растений, известного специалистам в данной области техники. Некоторые неограничивающие примеры доставки на растение или его часть или приведения в контакт с ними включают опрыскивание, опыливание, посыпание, распыление, орошение туманом, мелкодисперсное разбрызгивание, разбрасывание, пропитывание, впрыскивание в почву, введение в почву, смачивание (например, обработку корней, почвы), погружение, полив, нанесение покрытия, впитывание в листья или стебли, внесение в междурядья или обработку семян и т.п. и их комбинации. Эти и другие процедуры приведения растения или его части в контакт с соединением(ями), композицией(ями) или составом(ами) хорошо известны специалистам в данной области техники.
[00190] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ предоставления фермеру средств для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, при этом способ включает поставку и продажу фермеру растительного материала, такого как семя, при этом растительный материал содержит полинуклеотид, химерный ген, кассету экспрессии или рекомбинантный вектор, способные экспрессировать белок Cry по настоящему изобретению, как описано выше.
[00191] Варианты осуществления настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на следующие примеры. Предполагается, что предыдущее и последующее описание вариантов осуществления настоящего изобретения и различные варианты осуществления не ограничивают формулу изобретения, а скорее иллюстрируют ее. Таким образом, будет понятно, что формула изобретения не ограничивается конкретными подробностями данных примеров. Специалистам в данной области будет понятно, что другие варианты осуществления настоящего изобретения могут быть осуществлены на практике без отклонения от сущности и объема данного раскрытия, объем которого определяется прилагаемой формулой изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Идентификация активных штаммов Bt
[00192] Изоляты Bacillus thuringiensis культивировали из спор, присутствующих в текущих коллекциях, и поддерживали на чашках с и Т3 + агаром с добавлением пенициллина. Каждый изолят выращивали в аэробных условиях в 24-луночных планшетах с глубокими лунками в течение приблизительно 10 дней при 28°С до споруляции, которую подтверждали с помощью окрашивания раствором кумасси синего/уксусной кислоты и визуализации с помощью микроскопа. После споруляции как растворимые, так и нерастворимые фракции тестировали, чтобы определить активность в отношении представляющих интерес видов чешуекрылых. Фракции тестировали в биологическом анализе контаминации поверхности, при котором фракциями покрывали искусственную питательную среду для культивирования множества видов. Каждый изолят подвергали скринингу в отношении по меньшей мере четырех видов чешуекрылых, в том числе Helicoverpa zea (американская кукурузная совка), Agrotis ipsilon (совка-ипсилон), Ostrinia nubilalis (кукурузный мотылек) и Spodoptera frugiperda (совка травяная), при размере выборки 12 новорожденных личинок. Продолжительность каждого анализа составляла приблизительно 7 дней при комнатной температуре; планшеты оценивали в отношении смертности, а также ингибирования роста личинок. Наблюдаемое повышение смертности на 30% по сравнению с отрицательным контролем считалось показателем активности. На основе результатов первичного тестирования на насекомых для дальнейшего анализа отобрали штаммы С0588, С0633, С0680 и М0262.
Пример 2: Выделение и секвенирование генов Bt

[00193] Конструирование фосмидной геномной библиотеки: Для некоторых штаммов Bt, идентифицированных в примере 1, гены, кодирующие предположительно активные белки, выделяли с применением способа фосмидной библиотеки, описанного в Park et al. (FEMS Microbiol. Lett. 284:28-34 (2008). Фосмидную библиотеку конструировали с применением набора для получения фосмидных библиотек CopyControl™ (Epicentre, Мэдисон, Висконсин) согласно протоколу производителя. Вкратце, очищенную ДНК из каждого штамма Bt (примерно 0,5 мкг) обрабатывали ферментами для репарации концов с образованием "тупых" концов и затем лигировали в фосмидный вектор pCC1FOS (Epicentre). После упаковки in vitro в фаги лямбда и инфицирования Escherichia coli (Е. coli) EPI1300-T1 бактериальные клетки высевали на среду Лурия-Бертани (LB), содержащую 12,5 мкг/мл хлорамфеникола. До отбора колоний планшеты инкубировали при приблизительно 37°С в течение 24 ч. Трансфицированные колонии Е. coli переносили в 96-луночные планшеты, содержащие 150 мкл LB-среды, содержащей хлорамфеникол, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч.

[00194] Скрининг колоний с помощью гибридизации: Фосмидную библиотеку высевали при плотности 300 КОЕ на 100×15 мм чашку с L-агаром и 15 мкг/мл хлорамфеникола. В общей сложности высевали 3000 бактерий с фосмидами. Гибридизации на фильтре осуществляли с применением фильтров в виде кружков Immobilon-Ny+ размером 87 мм (EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс). Перенос колоний выполняли следующим образом: фильтры помещали на чашки приблизительно на 5 мин., затем с помощью пинцета фильтры снимали с поверхности агара и помещали стороной с колониями кверху на фильтровальную бумагу Ватмана, пропитанную 0,5 М NaOH, на 5 мин. Затем фильтры с колониями помещали на фильтровальную бумагу Ватмана, пропитанную 2Х SSC, на 5 мин. ДНК иммобилизировали на мембране с применением UV Stratalinker, установленного на 2000 × 100 мкДж (Stratagene, Inc., Ла-Хойя, Калифорния). Затем фильтры сушили на воздухе на фильтровальной бумаге Ватмана. Фильтры подвергали предварительной гибридизации и гибридизации в 250 мМ NaPO4, рН 7,0, 7% SDS, 1% BSA при 65°С согласно описанию поставщика. Гибридизационные фильтры промывали в 2Х SSC, 0,5% SDS в течение 30 мин. при 65°С, затем в 0,2Х SSC, 0,2% SDS в течение 30 мин. при 65°С. Фильтры экспонировали на рентгеновскую пленку (Kodak BIOMAX XAR, Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания) в течение ночи с применением усиливающих экранов при -80°С. Положительные колонии переносили на L-агар с 15 мкг/мл хлорамфеникола.

[00195] Гибридизационные зонды: Конструировали ПЦР-праймеры для амплификации фрагмента cry9B-подобного гена размером 720 п.о. из геномной ДНК штамма Bt, обозначенного как С0633. Пара праймеров включала прямой праймер, обозначенный OAR2613a, имеющий последовательность AAACATGAACCGAAATAATCAAAATG (SEQ ID NO: 26), и обратный праймер, обозначенный OAR2615a, имеющий последовательность ATCCGTCCCTTGTGCGTGTAAA (SEQ ID NO: 27). ПЦР-реакцию проводили при следующих условиях проведения циклов: [94°С, 5 мин.], 12х [94°С, 30 с, от 57°С до 51°С, снижение на 0,5°С в каждом цикле, 30 с, 72°С, 2,5 мин.] и 35х[94°С, 30 с, 52°С, 30 с, 72°С, 2,5 мин.]. Реакционная смесь содержала 1X буфер One Taq (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс), 200 мкМ dNTP, 80 нг ДНК, 2,5 ед. ДНК-полимеразы One Taq, по 50 нг каждого праймера и стерильную дистиллированную воду, доводящую общий объем реакционной смеси до 50 мкл.
[00196] Полученный ампликон разделяли на 1% агарозном геле с ТАЕ, содержащем бромистый этидий. Ампликон визуализировали под УФ-светом и вырезали из геля. ДНК выделяли с применением набора для экстракции из геля согласно описанию поставщика (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Зонды метили с помощью EasyTide (ά-32P) dCTP, 3000 Ки/ммоль (Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс) с применением системы мечения произвольных праймеров Rediprime II (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания). Невстроившиеся нуклеотиды удаляли с применением хроматографических колонок Micro Bio-Spin 30 (Biorad, Геркулес, Калифорния). Зонды нагревали при 95°С в течение 5 мин. перед добавлением в раствор для гибридизации.
-4
[00197] Секвенирование генов Bt: Препараты ДНК для 2-4 независимых клонов готовили в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen). Реакции секвенирования с праймерами, сконструированными к двум нитям прогнозируемой представляющей интерес нуклеотидной последовательности, осуществляли с применением набора BigDye™ Terminator (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Продукты реакции подвергали электрофоретическому разделению на приборах для секвенирования ABI373 или ABI377. Все данные секвенирования анализировали с применением пакета программного обеспечения Phred/Phrap/Consed (Вашингтонский университет) с частотой ошибок, равной или меньше 10, на уровне консенсусной последовательности. Последовательность собирали с помощью программы Sequencher™ (версия 4.7, Gene Codes Corp., Энн-Арбор, Мичиган). Каждый ген секвенировали с 4Х перекрыванием.
Пример 3. Клонирование и синтез генов Bt
[00198] Конструировали пары Cry9-специфических праймеров для облегчения идентификации и клонирования генов типа cry9. Пары праймеров конструировали для гибридизации с 5'-концом гена типа cry9 с добавлением сайта рестрикции для PmeI и с 3'-концом с добавлением сайта рестрикции для AscI. Пара праймеров, применяемая для амплификации 5'-конца, включала прямой праймер, имеющий последовательность GTTTAAACATGAATCGAAATAATCAAAATG (SEQ ID NO: 28), и обратный праймер, имеющий последовательность GGCGCGCCCTACTCTTGTGTTTCAATAAA (SEQ ID NO: 29). Пара праймеров, применяемая для амплификации 3'-конца, включала прямой праймер, имеющий последовательность GTTTAAACATGAATCAAAATAAACACGGA (SEQ ID NO: 30), и обратный праймер, имеющий последовательность GGCGCGCCTTACTGTTGGGTTTCCATGAACT (SEQ ID NO: 31). Вставленные сайты рестрикции подчеркнуты в соответствующих праймерах. ПЦР-реакции осуществляли с применением следующих условий проведения циклов: [94°С, 5 мин.] и 30х [94°С, 30 с, 45°С, 30 с, 72°С, 3,5 мин.]. Реакционная смесь содержала 1X буфер OneTaq, 200 мкМ dNTP, 80 нг ДНК, 2,5 ед. ДНК-полимеразы One Taq (New England Biolabs), по 50 нг каждого праймера и стерильную дистиллированную воду, доводящую общий объем реакционной смеси до 50 мкл.
[00199] Полученный ампликон клонировали в вектор ТОРО pCR 4.0 согласно описанию поставщика (Life Technologies). Выделенную плазмидную ДНК расщепляли с применением PmeI и AscI согласно описанию поставщика (New England Biolabs).
[00200] Фрагмент PmeI/AscI клонировали в челночный вектор, обозначенный pCIB5634' сконструированный для экспрессии как в Е. coli,, так и в B. thuringiensis. Вектор pCIB5634' расщепляли с применением PmeI и AscI. Расщепленный вектор и фрагмент гена очищали путем прогона на 1% агарозном геле на основе буфера, содержащего трис-ацетат-EDTA. Фрагменты вырезали из геля и очищали с применением набора для экстракции из геля от QIAGEN согласно описанию поставщика. Фрагменты лигировали вместе с применением набора для лигирования от New England Biolabs согласно описанию поставщика. Продукты реакции лигирования трансформировали в клетки TOP10 (Life Technologies) согласно описанию поставщика и высевали их на L-агар, содержащий 100 мг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК выделяли из отдельной колонии и идентифицированный клон снова секвенировали с 2Х перекрыванием с целью подтверждения правильной последовательности.
[00201] Некоторые гены Bt, которые были отобраны для рекомбинантной продукции, но не были напрямую клонированы из геномной ДНК, были переданы сторонним подрядчикам для синтеза полного гена. Эти синтезированные гены Bt субклонировали в описанные выше челночные векторы для последующей экспрессии и дальнейшего тестирования биологической активности.
Пример 4. Сборка и анализ генома

™
™
[00202] Некоторые гены Bt по настоящему изобретению идентифицировали с применением подхода на основе секвенирования полного генома. Вкратце, ДНК Bacillus разрезали с помощью ультразвукового прибора S2 от Covaris (Covaris, Inc., Вобурн, Массачусетс) с применением программы DNA_400bp с такими установками: рабочий режим: 10%; интенсивность: 4; циклы/импульс: 200. ДНК обрабатывали с помощью модуля для репарации концов/добавления dA-хвоста NEBNext Ultra (New England Biolabs, Inc. Ипсвич, Массачусетс). Индексные адаптеры 1-57 от Biooscience (1-27 Бразилия, 28-57 США, Великобритания и Швейцария) лигировали с применением NEB Quick Ligation согласно описанию поставщика (New England Biolabs, Inc. Ипсвич, Массачусетс). Продукты лигирования очищали с применением гранул Agencourt AMPure ХР согласно описанию поставщика (Beckman Coulter, Inc., Индианаполис, Индиана).
[00203] Библиотеку разделяли на фракции по размеру следующим образом: 50 мкл образца смешивали с 45 мкл 75% смеси гранул (25% гранул AMPure и 75% раствора NaCl/PEG от TekNova, № по кат. Р4136). Смесь перемешивали и помещали на магнитную подставку. Полученный супернатант переносили в новую лунку и добавляли 45 мкл 50% смеси гранул (50% гранул AMPure и 50% раствора NaCl/PEG от TekNova, № по кат. Р4136). Данную смесь перемешивали и помещали на магнитную подставку. Полученный супернатант удаляли и гранулы промывали 80% этанолом. Добавляли 25 мкл элюирующего буфера (ЕВ) и смесь помещали на магнитную подставку. Полученный конечный супернатант удаляли и помещали в пробирку на 1,5 мл. Этот способ позволяет получать библиотеки с диапазоном размеров ДНК 525 пар оснований (п.о.) (вставка плюс адаптер).
[00204] Отсортированную по размеру ДНК-библиотеку амплифицировали с применением KAPA Biosystem HiFi Hot Start (Kapa Biosystems, Inc., Уилмингтон, Массачусетс) с применением следующих условий проведения циклов: [98°С, 45 с]; 12 х [98°С, 15 с, 60°С, 30 с, 72°С, 30 с]; [72°С, 1 мин.]. Каждая реакционная смесь содержала: 5 мкл ДНК-библиотеки, 1 мкл универсальных праймеров от Bioscience (25 мкМ), 18 мкл стерильной воды, 1 мкл индексированных праймеров от Bioscience (25 мкМ), 25 мкл 2Х полимеразы KAPA HiFi.
[00205] Библиотеки анализировали на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) с применением высокочувствительных чипов для определения диапазона размеров и среднего размера вставок в библиотеке. Все библиотеки подвергали секвенированию спаренных концов (РЕ) (100 циклов на рид; 12-24 библиотек на дорожку) в системе секвенирования HiSeq 2500 с применением стандартных протоколов секвенирования от производителя (Illumina, Inc., Сан-Диего, Калифорния).
[00206] Разрабатывали инструмент для проведения расчетов в отношении Bacillus, чтобы идентифицировать и охарактеризовать вероятные гены токсинов для расстановки приоритетов в отношении направлений дополнительных лабораторных тестов.
[00207] Сборка и анализ генома, а также анализ геномной библиотеки, описанный выше, привели к идентификации в штаммах Bacillus thuringiensis пяти Cry9-подобных генов, проявляющих токсичность в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis). Идентификационные характеристики Cry9-подобных генов и белков приведены в таблице 1.
Пример 5. Гомология BT0009, BT0012, BT0013, BT0023 и ВТ0067 с известными белками Cry Bt
[00208] Поиск по базам данных белков с применением аминокислотных последовательностей белков по настоящему изобретению показал, что они являются гомологичными известным инсектицидным белкам. Сравнение аминокислотных последовательностей белков по настоящему изобретению с неизбыточной (nr) базой данных, поддерживаемой NCBI, с применением алгоритма BLAST позволило выявить следующие белки, как характеризующиеся совокупностью аминокислот с самыми высокими значениями идентичности относительно последовательностей по настоящему изобретению (таблица 2).
Пример 6. Экспрессия белков Bt в рекомбинантных клетках-хозяевах
[00209] Экспрессия в Bacillus. Представляющие интерес гены экспрессировали в не образующем кристаллы штамме Bacillus, который не характеризовался активностью в отношении жесткокрылых или чешуекрылых, с помощью вектора экспрессии pCIB5634' описанного выше, который содержал соответствующий промотор гена белка Cry и маркер устойчивости к эритромицину. Конструкции трансформировали в штамм-хозяин посредством электропорации и проводили последующий отбор на чашках с агаром, содержащим эритромицин. Эти рекомбинантные штаммы выращивали до фазы споруляции на среде Т3 при 28°С в течение 4-5 дней. Клеточные осадки собирали и промывали несколько раз перед солюбилизацией в карбонатном буфере с высоким рН (50 мМ), содержащем 2 мМ DTT.
[00210] Экспрессия в Е. coli. Представляющие интерес гены экспрессировали в различных штаммах Е. coli с применением векторов pET28a или pET29a (EMD Millipore). Конструкции трансформировали посредством электропорации и проводили последующий отбор на чашках с агаром, содержащим канамицин. Эти рекомбинантные штаммы выращивали, а экспрессию индуцировали с применением индукции с помощью IPTG при 28°С. Клетки ресуспендировали в карбонатном буфере с высоким рН (50 мМ), содержащем 2 мМ DTT, а затем разрушали с применением гомогенизатора Microfluidics LV-1.
[00211] Анализ экспрессии. Полученные лизаты клеток (каждого хозяина) затем очищали путем центрифугирования и образцы анализировали в отношении чистоты с помощью SDS-PAGE и электрофореграммы (BioRad Experion). Концентрации общего белка определяли с помощью анализа по Брэдфорду или Thermo 660. Очищенные белки Cry затем тестировали в биологических анализах.
Пример 7. Активность белков Cry в биологических анализах
[00212] Белки, полученные в примере 6, тестировали с применением известного из уровня техники биологического анализа с использованием искусственной питательной среды в отношении одного или нескольких следующих видов насекомых-вредителей: совка травяная (FAW; Spodoptera frugiperda), американская кукурузная совка (CEW; Helicoverpa zea), кукурузный мотылек (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), совка-ипсилон (BCW; Agrotis ipsilon), огневка тростниковая (SCB; Diatraea saccharlis), гусеница совки бархатных бобов (VBC; Anticarsia gemmatalis), соевая совка (SBL; Pseudoplusia includens), огневка кукурузная юго-западная (SWCB; Diatraea grandiosella), западная бобовая совка (WBCW; Striacosta albicosta), табачная совка (TBW; Heliothis virescens), восточный кукурузный мотылек (АСВ; Ostrinia furnacalis), хлопковая совка (CBW; Helicoverpa armigera), огневка желтая рисовая (SSB; Chilo suppressalis), розовая стеблевая совка (PSB; Sesamia inferens) и огневка рисовая (RLF; Cnaphalocrocis medinails).
[00213] Равное количество белка в виде раствора наносили на поверхность искусственной питательной среды для насекомых (Bioserv, Inc., Френчтаун, Нью-Джерси) в 24-луночных планшетах. После высыхания поверхности питательной среды в каждый планшет добавляли личинок видов насекомых, подлежащих тестированию. Чашки запечатывали и выдерживали в лабораторных условиях окружающей среды с учетом температуры, освещения и относительной влажности. Группа положительного контроля состояла из личинок, подвергаемых воздействию очень активного штамма Bacillus дикого типа с широким спектром действия. Группы отрицательного контроля состояли из личинок, подвергаемых воздействию питательной среды для насекомых, обработанной только буферным раствором, и личинок на необработанной питательной среде для насекомых; то есть только на питательной среде. Смертность определяли через приблизительно 120 часов и оценивали в баллах в сравнении с контролями.
[00214] Результаты показаны в таблице 3, где "-" означает отсутствие активности в сравнении с контролем,"+/-" означает 0-10% активность в сравнении с контролем (эта категория также включала 0% смертность при сильном ингибировании роста личинок),"+" означает 10-25% активность в сравнении с контролем, "++" означает 25-75% активность в сравнении с контролем, а "+++" означает 75-100% активность в сравнении с контролем.
Пример 8. Преобразование белков Cry в анализе с использованием искусственного желудочного сока
[00215] Некоторые белки Cry уже экспрессировали в растениях, и семена таких растений ежегодно продаются фермерам для применения в контроле различных насекомых-вредителей. Такие самозащищенные пестицидные продукты рассматриваются и регистрируются различными регулирующими органами, включая, например, Агентство по охране окружающей среды США (ЕРА).
[00216] Воздействие при поступлении с пищей является основным путем, за счет которого люди могут подвергаться воздействию белков Cry, экспрессируемых трансгенными растениями. Острая пероральная токсичность для млекопитающих и переваримость белка являются конечными точками оценки риска для здоровья человека, определяемыми ЕРА. Дополнительными научными доказательствами безопасности белков Cry является то, что они, как было показано, быстро расщепляются in vitro под действием искусственного желудочного сока. Результаты семи исследований in vitro, проведенных с репрезентативными белками Cry1, Cry2 и Cry3, показали, что белки быстро расщепляются, как правило, в течение 30 секунд. Эти результаты подтверждают более широкий вывод о том, что члены этих групп белков Cry (которые обладают значительной идентичностью аминокислотных последовательностей), вероятно, быстро расщепляются после поедания человеком. Другая область рассмотрения заключается в определении того, могут ли белки Cry вызывать аллергическую реакцию. Продемонстрированное быстрое расщепление белков Cry in vitro должно сводить к минимуму возможность такого явления. Для сравнения, пищевые аллергены обычно не подвергаются распадению в in vitro модели желудочно-кишечного тракта, тогда как обычные белки пищи, для которых не показана аллергенность, быстро расщепляются в искусственном желудочном соке (Metcalfe et al., 1996).
[00217] Дополнительные понимание, касающееся потенциальной аллергенности белка, можно получить с помощью анализа переваримости белка в искусственном желудочном соке (SGF). Почти все белки Cry, экспрессируемые в трансгенных растениях, которые были протестированы на сегодняшний день, быстро переваривались и, следовательно, были определены как неаллергенные. Однако было обнаружено, что белок Cry9C, находящийся в продукте трансгенной кукурузы, известном как Starlink, является частично устойчивым к SGF. Хотя Cry9C Starlink не токсичен для животных, свойства частичной переваримости и частичной стабильности при обработке не позволили ЕРА абсолютно исключить возможность того, что белок Cry9C Starlink может действовать как пищевой аллерген, что в конечном счете привело к тому, что компания, которая разработала Starlink, отозвала продукты с рынка США.
[00218] В настоящее время не существует доказательных тестов для определения аллергенного потенциала новых белков. Таким образом, ЕРА применяет подход, основанный на совокупности доказательств, в котором рассматриваются следующие факторы: источник признака; сравнение аминокислотной последовательности с известными аллергенами и биохимические свойства белка, включая in vitro переваримость в искусственном желудочном соке (SGF) и степень гликозилирования.
[00219] С помощью анализа с использованием искусственного желудочного сока (SGF) измеряют in vitro переваримость тестируемого белка в строго контролируемых условиях, характерных для пищеварительного тракта высших млекопитающих. Вкратце, полученный в бактериях тестируемый белок Cry (в концентрации 0,5-5 мг/мл) подвергали воздействию фермента пепсина (из слизистой оболочки желудка свиньи, растворенного в 2 мг/мл NaCl, pH 1,2) в соотношении 10 единиц активности пепсина/мкг тестируемого белка в течение периода времени, составляющего один час, при 37°С. Образцы отбирали на 1, 2, 5, 10, 30 и 60 минуте и сразу же блокировали путем добавления предварительно нагретого (95°С - 2 минуты) стоп-буфера (65% 0,5 М бикарбоната натрия, рН 11, 35% трициновый загрузочный буфер) для немедленной инактивации пепсина, и снова нагревали в течение дополнительных 5 минут. После завершения анализа образцы, взятые в определенные моменты времени, и контроли (только тестируемый белок, только пепсин) исследовали с помощью SDS-PAGE в 10-20% геле с трис-глицином (при этом пептиды были визуально различимы вплоть до 1 кДа) для отслеживания кинетики и уровня переваривания, осуществляемого пепсином.
[00220] Результаты анализов с SGF продемонстрировали, что все белки Cry по настоящему изобретению расщеплялись очень быстро. Эти результаты предоставили доказательство того, что хотя белки Cry по настоящему изобретению относятся к семейству белков Cry9, они совершенно отличаются от них с точки зрения ответа в анализе с SGF при сравнении с некоторыми опубликованными результатами, например, касающимися Cry9C Starlink, что предполагает существенные структурные отличия в ключевых сайтах расщепления для пепсина в белке. Эти результаты дополнительно позволяют предположить, что аллергенный потенциал белков Cry по настоящему изобретению является минимальным.
Пример 9. Введение генов в вектор для экспрессии в растении
[00221] Перед экспрессией в растениях синтетический полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из белков Cry Bt, ВТ-0009, ВТ-0012, ВТ-0013, ВТ-0023 и ВТ-0067 (SEQ ID NO: 6-10 соответственно), и синтетический полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из мутантных белков Cry Bt, mBT-0009, mBT-0012, mBT-0013, mBT-0023 и mBT-0067 (SEQ ID NO: 21-25 соответственно), синтезировали в автоматизированной системе для синтеза генов (Genscript, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси). В этом примере получали первую кассету экспрессии, содержащую убиквитиновый промотор маиса (Ubi1), функционально связанный с последовательностью, кодирующей белок Cry, которая была функционально связана с терминатором Nos, а также получали вторую кассету экспрессии, содержащую промотор Ubil, функционально связанный с последовательностью, кодирующей фосфоманнозоизомеразу (PMI), которая была функционально связана с терминатором Nos. Экспрессия PMI позволяет осуществлять положительную селекцию трансгенных растений на маннозе. Обе кассеты экспрессии клонировали в подходящий вектор для трансформации маиса, опосредованной Agrobacterium.
Пример 11. Экспрессия белков Cry в растениях
9
[00222] Трансформацию незрелых зародышей маиса выполняли, главным образом, как описано в Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798 803. Вкратце, штамм Agrobacterium LBA4404 (pSBl), содержащий вектор, описанный в примере 12, выращивали на твердой среде YEP (дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), NaCl (5 г/л), 15 г/л агара, рН 6,8) в течение 2-4 дней при 28°С. Примерно 0,8Х 10 клеток Agrobacterium суспендировали в среде LS-inf, дополненной 100 мкМ As. Бактерий предварительно индуцировали в данной среде в течение примерно 30-60 минут.
[00223] Незрелые зародыши инбредной линии маиса вырезали из початков возрастом 8-12 дней с переносом в жидкую среду LS-inf + 100 мкМ As. Зародышей однократно ополаскивали свежей средой для инфицирования. Затем добавляли раствор Agrobacterium, и зародышей перемешивали на вихревой мешалке в течение 30 секунд и оставляли осесть с бактериями в течение 5 минут. Затем зародыши переносили стороной со щитком зародыша кверху на среду LSAs и культивировали в темноте в течение двух-трех дней. Впоследствии примерно 20-25 зародышей на чашку Петри переносили на среду LSDc, дополненную цефотаксимом (250 мг/л) и нитратом серебра (1,6 мг/л), и культивировали в темноте при примерно 28°С в течение 10 дней.
[00224] Незрелых зародышей, образующих эмбриогенный каллюс, переносили в среду LSD1M0.5S. Селекцию культур на этой среде осуществляли в течение примерно 6 недель, при этом через приблизительно 3 недели проводили стадию субкультивирования. Выжившие каллюсы переносили на среду Reg1, дополненную маннозой. После культивирования на свету (в режиме 16 часов света/8 часов темноты) зеленые ткани затем переносили на среду Reg2 без регуляторов роста и инкубировали в течение приблизительно 1-2 недель. Проростки переносили в контейнеры Magenta GA-7 (Magenta Corp, Чикаго, Иллинойс), содержащие среду Reg3, и выращивали на свету. Спустя приблизительно 2-3 недели растения тестировали с помощью ПЦР в отношении наличия генов PMI, а также гена cry Bt. Растения, показавшие положительные результаты в ПЦР-анализе, переносили в теплицу для дальнейшей оценки.
ой
[00225] Трансгенные растения оценивали в отношении числа копий (определяли с помощью анализа Taqman), уровня экспрессии белка (определяли с помощью ELISA) и эффективности в отношении представляющих интерес видов насекомых в биологических анализах с вырезанием листа. В частности, ткань листа вырезали из однокопийных объектов (на стадии V3-V4) и заражали новорожденными личинками, затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5 дней. Размер выборки для биологического анализа с листовыми дисками варьировал в зависимости от тестируемого вида насекомых (кукурузный мотылек (ЕСВ), n=10; американская кукурузная совка (CEW), n=3, совка-ипсилон (BCW), n=5). Снятие показаний для оценки повреждения ткани и смертности получали примерно в день 3 и день 5; образцы оценивали в отношении повреждения относительно отрицательного контроля с применением следующей шкалы: "+": <5% повреждение ткани, все личинки мертвые;"+/-": 5-20% повреждение ткани, все личинки мертвые; или "-": >20% повреждение ткани, некоторые личинки живые и/или развились до 2 личиночной стадии.
[00226] Результаты биологического анализа на ткани трансгенного растения подтверждают, что при экспрессии в трансгенных растениях белки Cry по настоящему изобретению токсичны для целевых насекомых. Например, mBT-0012, экспрессируемый в растении маиса, стабильно трансформированном химерным геном по настоящему изобретению, активен в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>ЗИНГЕНТА ПАРТИСИПЕЙШНС АГ
<120>Композиции и способы контроля вредителей растений
<130>  80670-WO-REG-ORG-P-1
<160>  31
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  3507
<212>ДНК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  1
atgaatcgaa ataatcaaaa tgaatatgaa gttattgatg ccccacattg tgggtgtccg       60
gcagatgatg ttgtaaaata tcctttgaca gatgatccga atgctggatt gcaaaatatg      120
aactataagg aatatttaca aacgtatggt ggagactata cagatcctct tattaatcct      180
aacttatctg ttagtggaaa agatgtaata caagttggaa ttaatattgt agggagatta      240
ctaagctttt ttggattccc cttttctagt caatgggtta ctgtatatac ctatctttta      300
aacagcttgt ggccggatga cgagaattct gtatgggacg cttttatgga gagagtagaa      360
gaacttattg atcaaaaaat ctcagaagca gtaaagggta gggcattgga tgacctaact      420
ggattacaat ataattataa tttatatgta gaagcattag atgagtggct gaatagacca      480
aatggcgcaa gggcatcctt agtttctcag cgatttaaca ttttagatag cctatttaca      540
caatttatgc caagctttgg ctctggtcct ggaagtcaaa attatgcaac tatattactt      600
ccagtatatg cacaagcagc aaaccttcat ttgttattat taaaagatgc agacatttat      660
ggagctagat gggggctgaa tcaaactcaa atagatcaat tccattctcg tcaacaaagc      720
cttactcaga cttatacaaa tcattgtgtt actgcgtata atgatggatt agcggaatta      780
agaggcacaa gcgttgcgag ttggctcaaa tatcatcaat accgtaggga aatgacagta      840
acggcaatgg atttagtggc attattccca tactataatg ttagacaata tccaaatggg      900
gcaaatccac aacttacacg tgaggtatat acagatccaa tcgtatttaa tccgcctgag      960
cgtccaagtg gcgctttctg cgaaagtttt tatactatcc gagcggctcg agaacgttta     1020
actttttcgc aacttgaaca tgcaataatt cgtccgccgc gcttgtttga aaggtttcaa     1080
gctttaggga tttatacagg cgaggcgcga ctgaatgcaa atagtgctcc aatgaactat     1140
tggattggac attttataag aaatacacgt ttaggtgact caacaacaat tactacaaat     1200
tatggaacaa ccaataatcg tttaactaac ttcagtatgc cttctgatgt ttatcaaatc     1260
aattcaacct caagtaattt agccgctatt ttaggcactt tatatggggt tactagagca     1320
caattccatt ttggatcagg aagtttttcg acgtatgtcg gacaaaatag cgttcttcca     1380
caatgtcatc aaaactataa ttcaatagaa gaattaccaa accaaagcga tgaacctaca     1440
gttagaagtt atagccatag attatctcat atcacctctt ttaatttcaa tgtacagctt     1500
aataatcctt taatttctgc gggcaatatg cctgtatatg tgtggacaca tcgcagtgtg     1560
gaccttacta acaggatttc ttcagataga attactcaaa taccagtggt aaaggcatat     1620
gagctaagta gtggtgctac tgtcgtgaaa ggtccaggat tcacaggagg agatgtaatc     1680
cgaagaacaa atactggtgg attcggagca ataagggtgt cggtcactgg accgctaaca     1740
caacgatatc gcataaggtt ccgttatgct tcgacaatag attttgattt ctttgtaaca     1800
cgtggaggaa ctactataaa taattttaga tttacacgta caatgaacag gggacaggaa     1860
tcaagatatg aatcctatcg tactgtagag tttacaactc cttttaactt tacacaaagt     1920
caagatataa ttcgaacatc tatccaggga cttagtggaa atggggaagt ataccttgat     1980
agaattgaaa tcatccctgt aaatccaaca cgagaagcgg aagaggattt agaagcggcg     2040
aagaaagcgg tggcgagctt gtttacacgc acaagggacg gattacaagt aaatgtgaaa     2100
gattatcaag tcgatcaagc ggcaaattta gtgtcatgct tatcagatga acaatatggg     2160
tatgacaaaa agatgttatt ggaagcggta cgcgcggcaa aacgcctcag ccgagaacgt     2220
aacttacttc aggacccaga ttttaataca atcaatagta cagaagaaaa tggatggaaa     2280
gcaagtaacg gcgttactat tagtgagggc ggtccattct ataaaggccg tgcacttcag     2340
ctagcaagtg cacgagaaaa ttatccaaca tacatttatc aaaaagtaga tgcatcggag     2400
ttaaaacctt atacacgata tagactagat gggttcgtga agagtagtca agatttagaa     2460
attgatctca ttcaccatca taaagtccat cttgtgaaaa atgtaccaga taatttagta     2520
tctgatactt acccagatga ttcttgtagt ggaatcaatc gatgtcagga acaacagatg     2580
gtaaatgcgc aactggaaac agagcatcat catccgatgg attgctgtga agcagctcaa     2640
acacatgagt tttcttccta tattgataca ggggatttaa attcgactgt agaccaggga     2700
atctgggtga tctttaaagt tcgaacaacc gatggttatg cgacgttagg aaatcttgaa     2760
ttggtagagg tcggaccgtt attgggtgaa cctctagaac gtgaacaaag agaaaatgcg     2820
aaatggaatg cagagttagg aagaaaacgt gcagaaacag atcgcgtgta tcaagatgcc     2880
aaacaatcca tcaatcattt atttgtggat tatcaagatc aacaattaaa tccagaaata     2940
gggatggcag atattatgga cgctcaaaat cttgtcgcat caatttcaga tgtatatagc     3000
gatgccgtac tgcaaatccc tggaattaac tatgagattt acacagagct gtccaatcgc     3060
ttacaacaag catcgtatct gtatacgtct cgaaatgcgg tgcaaaatgg ggactttaac     3120
aacgggctag atagctggaa tgcaacagcg ggtgcatcgg tacaacagga tggcaatacg     3180
catttcttag ttctttctca ttgggatgca caagtttctc aacaatttag agtgcagccg     3240
aattgtaaat atgtattacg tgtaacagca gagaaagtag gcggcggaga cggatacgtg     3300
actatccggg atgatgctca tcatacagaa acgcttacat ttaatgcatg tgattatgat     3360
ataaatggca cgtacgtgac tgataatacg tatctaacaa aagaagtggt attctattca     3420
catacagatc acatgtgggt agaggtaagt gaaacagaag gtgcatttca tatagatagt     3480
attgaattcg ttgaaacaga aaagtaa                                         3507
<210>  2
<211>  3471
<212>ДНК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  2
atgaatcaaa ataaacacgg aattattggc gcttccaatt gtggttgtgc atctgatgat       60
gttgcgaaat atcctttagc caacaatcca tattcatctg ctttaaattt aaattcttgt      120
caaaatagta gtattctcaa ctggattaac ataataggcg atgcagcaaa agaagcagta      180
tctattggga caaccatagt ctctcttatc acagcacctt ctcttactgg attaatttca      240
atagtatatg accttatagg taaagtacta ggaggtagta gtggacaatc catatcagat      300
ttgtctatat gtgacttatt atctattatt gatttacggg taagtcagag tgtcttaaat      360
gatgggattg cagattttaa tggttctgta ctcttataca ggaactattt agaggctctg      420
gatagctgga ataagaatcc taattctgct tctgctgaag aactccgtac tcgttttaga      480
atcgccgact cagaatttga tagaatttta acccgagggt ctttaacgaa tggtggctcg      540
ttagctagac aaaatgccca aatattatta ttaccttctt ttgcgagcgc tgcatttttc      600
catttattac tactaaggga tgctactaga tatggcacta attgggggct atacaatgct      660
acacctttta taaattatca atcaaaacta gtagagctta ttgaactata tactgattat      720
tgcgtacatt ggtataatcg aggtttcaac gaactaagac aacgaggcac tagtgctaca      780
gcttggttag aatttcatag atatcgtaga gagatgacat tgatggtatt agatatagta      840
gcatcatttt caagtcttga tattactaat tacccaatag aaacagattt tcagttgagt      900
agggtcattt atacagatcc aattggtttt gtacatcgta gtagtcttag gggagaaagt      960
tggtttagct ttgttaatag agctaatttc tcagatttag aaaatgcaat acctaatcct     1020
agaccgtctt ggtttttaaa taatatgatt atatctactg gttcacttac attgccggtt     1080
agcccaagta ctgatagagc gagggtatgg tatggaagtc gagatcgaat ttcccctgct     1140
aattcacaat ttattactga actaatctct ggacaacata cgactgctac acaaactatt     1200
ttagggcgaa atatatttag agtagattct caagcttgta atttaaatga taccacatat     1260
ggagtgaata gggcggtatt ttatcatgat gcgagtgaag gttctcaaag atccgtgtac     1320
gaggggtata ttcgaacaac tgggatagat aaccctagag ttcaaaatat taacacttat     1380
ttacctggag aaaattcaga tatcccaact ccagaagact atactcatat attaagcaca     1440
acaataaatt taacaggagg acttagacaa gtagcatcta atcgccgttc atctttagta     1500
atgtatggtt ggacacataa aagtctggct cgtaacaata ccattaatcc agatagaatt     1560
acacagatac cattgacgaa ggttgatacc cgaggcacag gtgtttctta tgtgaatgat     1620
ccaggattta taggaggagc tctacttcaa aggactgacc atggttcgct tggagtattg     1680
agggtccaat ttccacttca cttaagacaa caatatcgca ttagagtccg ttatgcttct     1740
acaacaaata ttcgattgag tgtgaatggc agtttcggta ctatttctca aaatctccct     1800
agtacaatga gattaggaga ggatttaaga tacggatctt ttgctataag agagtttaat     1860
acttctatta gacccactgc aagtccggac caaattcgat tgacaataga accatctttt     1920
attagacaag aggtctatgt agatagaatt gagttcattc cagttaatcc gacgcgagag     1980
gcgaaagagg atctagaagc agcaaaaaaa gcggtggcga gcttgtttac acgcacaagg     2040
gacggattac aagtaaatgt gaaagattat caagtcgatc aagcggcaaa tttagtgtca     2100
tgcttatcag atgaacaata tgggtatgac aaaaagatgt tattggaagc ggtacgtgcg     2160
gcaaaacgac ttagccgaga acgcaactta cttcaggatc cagattttaa tacaattaat     2220
agtacagaag aaaatggatg gaaagcaagt aacggcgtta ctattagtga gggcgggcca     2280
ttctataaag gccgtgcaat tcagctagca agcgcacgag aaaattatcc aacatacatt     2340
tatcaaaaag tagatgcatc ggagttaaag ccatatacac gctatagact ggatggattc     2400
gtgaagagta gtcaagattt agaaattgat ctcattcacc atcataaagt ccatcttgtg     2460
aaaaatgtac cagataattt agtacttgat acttacccag atgattcctg caacggaatt     2520
aaccgttgtg atgaacagaa gatggtaaat gcgcaactgg aaacagaaca tcatcatccg     2580
atggattgct gtgaagcggc tcaaacacat gagttttctt cctatattaa tacaggcgat     2640
ctaaatgcaa gtgtagatca aggcatttgg gttgtattga aagttcgaac aacagatggt     2700
tatgcgacgc taggaaatct tgaattggta gaggtcggac cgttatcggg tgaatctcta     2760
gaacgtgaac aaagggataa tgcgaaatgg agtgcagagc taggaagaaa gcgtgcagaa     2820
acagagagag tatattatgc tgccaaacaa tccatcaatc atttatttgt ggattatcga     2880
gatcaacaat taaatccaca aatagggatg gcagatatta tggacgctca aaatcttgtc     2940
gcatcaattt cagatgtata tagcgatgcc gtactgcaaa tccctggaat taactatgag     3000
atttacacag agctatccaa tcgcttacaa caagcatcgt atctgcatat gtctcgaaat     3060
gcgatgcaaa atggggactt taacagcggt ctagatagtt ggaatgcaac agcgggtgct     3120
acggtacaac aggatggcaa tacgcatttc ttagttcttt ctcattggga tgcacaagtt     3180
tctcaacaat ttagagtgca gccgaattgt aaatatgtat tacgtgtaac agcagagaaa     3240
gtaggcggcg gagacggata cgtgacaatc cgggatggtg ctcatcatac agaaacgctt     3300
acatttaatg catgtgatta tgatataaat ggcacgtacg tgactgataa tacgtatcta     3360
acaaaagaag tggtattcca tccggagaca caacatatgt gggtagaggt aagtgaaaca     3420
gaaggtgttt tccatataga cagtgttgag ttcatggaaa cccaacagta a              3471
<210>  3
<211>  3471
<212>ДНК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  3
atgaatcaaa ataaacacgg aattattggc gcttccaatt gtggttgtgc atctgatgat       60
gttgcgaaat atcctttagc caacaatcca tattcatctg ctttaaattt aaattcttgt      120
caaaatagta gtattctcaa ctggattaac ataataggcg atgcagcaaa agaagcagta      180
tctattggga caaccatagt ctctcttatc acagcacctt ctcttactgg attaatttca      240
atagtatatg accttatagg taaagtacta ggaggtagta gtggacaatc catatcagat      300
ttgtctatat gtgacttatt atctattatt gatttacggg taagtcagag tgtcttaaat      360
gatgggattg cagattttaa tggttctgta ctcttataca ggaactattt agaggctctg      420
gatagctgga ataagaatcc taattctgct tctgctgaag aactccgtac tcgttttaga      480
atcgccgact cagaatttga tagaatttta acccgagggt ctttaacgaa tggtggctcg      540
ttagctagac aaaatgccca aatattatta ttaccttctt ttgcgagcgc tgcatttttc      600
catttattac tactaaggga tgctactaga tatggcacta attgggggct atacaatgct      660
acacctttta taaattatca atcaaaacta gtagagctta ttgaactata tactgattat      720
tgcgtacatt ggtataatcg aggtttcaac gaactaagac aacgaggcac tagtgctaca      780
gcttggttag aatttcatag atatcgtaga gagatgacat tgatggtatt agatatagta      840
gcatcatttt caagtcttga tattactaat tacccaatag aaacagattt tcagttgagt      900
agggtcattt atacagatcc aattggtttt gtacatcgta gtagtcttag gggagaaagt      960
tggtttagct ttgttaatag agctaatttc tcagatttag aaaatgcaat acctaatcct     1020
agaccgtctt ggtttttaaa taatatgatt atatctactg gttcacttac attgccggtt     1080
agcccaagta ctgatagagc gagggtatgg tatggaagtc gagatcgaat ttcccctgct     1140
aattcacaat ttattactga actaatctct ggacaacata cgactgctac acaaactatt     1200
ttagggcgaa atatatttag agtagattct caagcttgta atttaaatga taccacatat     1260
ggagtgaata gggcggtatt ttatcatgat gcgagtgaag gttctcaaag atccgtgtac     1320
gaggggtata ttcgaacaac tgggatagat aaccctagag ttcaaaatat taacacttat     1380
ttacctggag aaaattcaga tatcccaact ccagaagact atactcatat attaagcaca     1440
acaataaatt taacaggagg acttagacaa gtagcatcta atcgccgttc atctttagta     1500
atgtatggtt ggacacataa aagtctggct cgtaacaata ccattaatcc agatagaatt     1560
acacagatac cattgacgaa ggttgatacc cgaggcacag gtgtttctta tgtgaatgat     1620
ccaggattta taggaggagc tctacttcaa aggactgacc atggttcgct tggagtattg     1680
agggtccaat ttccacttca cttaagacaa caatatcgca ttagagtccg ttatgcttct     1740
acaacaaata ttcgattgag tgtgaatggc agtttcggta ctatttctca aaatctccct     1800
agtacaatga gattaggaga ggatttaaga tacggatctt ttgctataag agagtttaat     1860
acttctatta gacccactgc aagtccggac caaattcgat tgacaataga accatctttt     1920
attagacaag aggtctatgt agatagaatt gagttcattc cagttaatcc gacgcgagag     1980
gcgaaagagg atctagaagc agcaaaaaaa gcggtggcga gcttgtttac acgcacaagg     2040
gacggattac aagtaaatgt gaaagattat caagtcgatc aagcggcaaa tttagtgtca     2100
tgcttatcag atgaacaata tgggtatgac aaaaagatgt tattggaagc ggtacgtgcg     2160
gcaaaacgac ttagccgaga acgcaactta cttcaggatc cagattttaa tacaattaat     2220
agtacagaag aaaatggatg gaaagcaagt aacggcgtta ctattagtga gggcgggcca     2280
ttctataaag gccgtgcaat tcagctagca agcgcacgag aaaattatcc aacatacatt     2340
tatcaaaaag tagatgcatc ggagttaaag ccatatacac gctatagact ggatggattc     2400
gtgaagagta gtcaagattt agaaattgat ctcattcacc atcataaagt ccatcttgtg     2460
aaaaatgtac cagataattt agtacttgat acttacccag atgattcctg caacggaatt     2520
aaccgttgtg atgaacagaa gatggtaaat gcgcaactgg aaacaggaca tcatcatccg     2580
atggattgct gtgaagcggc tcaaacacat gagttttctt cctatattaa tacaggcgat     2640
ctaaatgcaa gtgtagatca aggcatttgg gttgtattga aagttcgaac aacagatggt     2700
tatgcgacgc taggaaatct tgaattggta gaggtcggac cgttatcggg tgaatctcta     2760
gaacgtgaac aaagggataa tgcgaaatgg agtgcagagc taggaagaaa gcgtgcagaa     2820
acagagagag tatattatgc tgccaaacaa tccatcaatc atttatttgt ggattatcaa     2880
gatcaacaat taaatccaca aatagggatg gcagatatta tggacgctca aaatcttgtc     2940
gcatcaattt cagatgtata tagcgatgcc gtactgcaaa tccctggaat taactatgag     3000
atttacacag agctatccaa tcgcttacaa caagcatcgt atctgcatac gtctcgaaat     3060
gcgatgcaaa atggggactt taacagcggt ctagatagtt ggaatgcaac agcgggtgct     3120
acggtacaac aggatggcaa tacgcatttc ttagttcttt ctcattggga tgcacaagtt     3180
tctcaacaat ttagagtgca gccgaattgt aaatatgtat tacgtgtaac agcagagaaa     3240
gtaggcggcg gagacggata cgtgacaatc cgggatggtg ctcatcatac agaaacgctt     3300
acatttaatg catgtgatta tgatataaat ggcacgtacg tgactgataa tacgtatcta     3360
acaaaagaag tggtattcca tccggagaca caacatatgt gggtagaggt aagtgaaaca     3420
gaaggtgttt tccatataga cagtgttgag ttcatggaaa cccaacagta a              3471
<210>  4
<211>  3459
<212>ДНК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  4
atgaatcgaa ataatccaaa tgaatatgaa attattgatg ccccctattg tgggtgtccg       60
tcagatgatg atgtgaggta tcctttggca agtgacccaa atgcagcgtt ccaaaatatg      120
aactataaag agtatttaca aacgtatgat ggagactaca caggttctct tatcaatcct      180
aacttatcta ttaatcctag agatgtacta caaacaggta ttaatattgt gggaagaata      240
ctagggtttt taggtgttcc atttgcgggt caactagtta ctttctatac ctttctctta      300
aatcagttgt ggccaactaa tgataatgca gtatgggaag cttttatggc gcaaatagaa      360
gagctaatcg atcaaaaaat atcggcgcaa gtagtaagga atgcactcga tgacttaact      420
ggattacacg attattatga ggagtattta gcagcattag aggagtggct ggaaagaccg      480
aacggagcaa gagctaactt agttacacag aggtttgaaa acctgcatac tgcatttgta      540
actagaatgc caagctttgg tacgggtcct ggtagtcaaa gagatgcggt agcgttgttg      600
acggtatatg cacaagcagc gaatttgcat ttgttattat taaaagatgc agaaatctat      660
ggggcaagat ggggacttca acaagggcaa attaacttat attttaatgc tcaacaagaa      720
cgtactcgaa tttataccaa tcattgcgtg gaaacatata atagaggatt agaagatgta      780
agaggaacaa atacagaaag ttggttaaat taccatcgat tccgtagaga gatgacatta      840
atggcaatgg atttagtggc cttattccca tactataatg tgcgacaata tccaaatggg      900
gcaaatccac agcttacacg tgaaatatat acggacccaa tcgtatataa tccaccagct      960
aatcagggaa tttgccgacg ttgggggaat aatccgtata atacattttc tgaacttgaa     1020
aatgctttta ttcgcccgcc acatcttttt gataggttga atagattaac tatttctaga     1080
aaccgatata cagctccaac aactaatagc tacctagact attggtcagg tcatacttta     1140
caaagccagt atgcaaataa cccgacgaca tatgaaacta gttacggtca gattacctct     1200
aacacacgtt tattcaatac gactaatgga gccaatgcaa tagattcaag ggcaagaaat     1260
tttggtaact tatacgctaa tttgtatggc gttagcagct tgaacatttt cccaacaggt     1320
gtgatgagtg aaatcacctc agcccctaat acgtgttggc aagaccttac tacaactgag     1380
gaactaccac tagtgaataa taattttaat cttttatctc atgttacttt cttacgcttc     1440
aatactactc agggtggccc ccttgcaact gtagggtttg tacccacata tgtgtggaca     1500
cgtcaagatg tagattttaa taatataatt actcccaata gaattactca aataccagtg     1560
gtaaaggcat atgagctaag tagtggtgct actgtcgtga aaggtccagg attcacagga     1620
ggagatgtaa tccgaagaac aaatactggt ggattcggag caataagggt gtcggtcact     1680
ggaccgctaa cacaacgata tcgcataagg ttccgttatg cttcgacaat agattttgat     1740
ttctttgtaa cacgtggagg aactactata aataatttta gatttacacg tacaatgaac     1800
aggggacagg aatcaagata tgaatcctat cgtactgtag agtttacaac tccttttaac     1860
tttacacaaa gtcaagatat aattcgaaca tctatccagg gacttagtgg aaatggggaa     1920
gtataccttg atagaattga aatcatccct gtaaatccaa cacgagaagc ggaagaggat     1980
ttagaagcgg cgaagaaagc ggtggcgagc ttgtttacac gcacaaggga cggattacaa     2040
gtaaatgtga cagattatca agtcgatcaa gcggcaaatt tagtgtcatg cttatcagat     2100
gaacaatatg cgcatgataa aaagatgtta ttggaagcgg tacgcgcggc aaaacgcctc     2160
agccgagaac gtaacttact tcaggaccca gattttaata caatcaatag tacagaagaa     2220
aatggatgga aagcaagtaa cggcgttact attagtgagg gcggtccatt ctataaaggc     2280
cgtgcacttc agctagcaag tgcacgagaa aattacccaa catacatcta tcaaaaagta     2340
gatgcatcgg agttaaaacc ttatacacga tatagactgg atgggttcgt gaagagtagt     2400
caagatttag aaattgatct cattcaccat cataaagtcc atcttgtgaa aaatgtacta     2460
gataatttag tatctgatac ttacccagat gattcttgta gtggaatcaa tcgatgtgag     2520
gaacaacaga tggtaaatgc gcaactggaa acagaacatc atcatccgat ggattgctgt     2580
gaagcagctc aaacacatga gttttcttcc tatattgata caggggattt aaattcgact     2640
gtagaccagg gaatctgggt gatctttaaa gttcgaacaa cagatggtta tgcgacgcta     2700
ggaaatcttg aattggtaga ggtcggaccg ttattgggtg aacctctaga acgtgaacaa     2760
agagaaaatg cgaaatggaa tgcagagtta ggaagaaaac gtgcagaaac agatcgcgtg     2820
tatcaagatg ccaaacaatc catcaatcat ttatttgtgg attatcaaga tcaacaatta     2880
aatccacaaa tagggatggc agatattatg gacgctcaaa atcttgtcgc atcaatttca     2940
gatgtatata gcgatgcagt actgcaaatc cctggaatta actatgagat ttacacagag     3000
ctgtccaatc gcttacaaca agcatcgtat ctgtatacgt ctcgaaatgc ggtgcaaaat     3060
ggggacttta acaacgggct agatagctgg aatgcaacag cgggtgcatc ggtacaacag     3120
gatggcaata cgcatttctt agttctttct cattgggatg cacaagtttc ccaacaattt     3180
agagtgcagc cgaattgtaa atatgtatta cgtgtaacag cagagaaagt aggcggcgga     3240
gacggatacg tgactatccg ggatggtgct catcatacag aaacgcttac atttaatgca     3300
tgtgattatg atataaatgg cacgtacgtg actgataata cgtatctaac aaaagaagtg     3360
atattctatt cacatacaga acacatgtgg gtagaggtaa atgaaacaga aggtgcattt     3420
catatagata gtattgaatt cgttgaaaca gaaaagtaa                            3459
<210>  5
<211>  3468
<212>ДНК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  5
atgaatcgaa ataatcaaga tgaatatgaa attattgacg cttccacttg tggttgttcg       60
tcagatgatg ttgttcaata ccctttggca agagatccga atgctgtatt ccaaaatatg      120
cattataaag attatttgca aacgtatgat ggagactata caggttctct tataaatcct      180
aacttatcta ttaatcctag agatgtactg caaactggaa ttaatattgt gggaagatta      240
ctaggatttc taggtgttcc atttgctggt cagttagtta ctttctatac ctttctttta      300
aatcaactgt ggccaacaaa tgataatgca gtatgggaag cttttatggc acaaatagaa      360
gagcttatta atcaaagaat atccgaagca gtagtaggga cagcagcgga tcatttaacg      420
ggattacacg ataattatga gttatatgta gaggcattgg aggaatggct ggaaagaccg      480
aatgctgcta gaactaatct actttttaat agatttacca ccctagatag tctttttaca      540
caatttatgc caagctttgg tactggacct ggaagtcaaa actacgcagt tccattactt      600
acagtatacg cacaagcagc gaaccttcat ttgttattat taaaggatgc tgaaatatat      660
ggagcaagat ggggactgaa ccaaaatcag attaactcat tccatacgcg ccaacaagaa      720
cgtactcaat attatacaaa tcattgcgta acgacgtata ataccggttt agatagatta      780
agaggcacaa atactgaaag ttggttaaat tatcatcgtt tccgtagaga gatgacatta      840
atggcaatgg atttagtagc gctattccca tattataatg tacgacaata tccaaatgga      900
gcaaatcctc agcttacacg tgaaatatat acagatccaa ttgtatttaa tccaccagct      960
aatgtgggat tatgtagacg ttggggcaat aacccatata atagattttc tgaactagaa     1020
aacgctttta tccgcccgcc acatcttttt gatagattga ataccttaac aattagtaga     1080
aatagatttg acgttgggtc aaactttata gaaccgtggt ctggacatac gttacgccgt     1140
agttattcga ataattcgac agtatatgaa gatagttatg gccaaattac agccacaaga     1200
acaacaatta atctgccggc taatggaact ggccgagtag aatcaacagc agtagatttt     1260
cgtagcgcgc ttgtggggat atacggtgtt aatagagctt cttttattcc aggtggtgtg     1320
tttagtggca cgactcagcc ttctactgga ggatgtagag atttgtatga ttcaagtgat     1380
gaattaccac cagacgaaag tactggaagt tttgcccata gactatctca tgttaccttt     1440
ttaagtttta caactaatca ggccggttcc atagccaatt caggacgcgt ccctacttat     1500
gtctggaccc atcgcgatgt ggactttaat aatacaatta accccaatag aattactcaa     1560
ataccagtgg taaaggcata tgagctaagt agtggtgcta ctgtcgtgaa aggtccagga     1620
ttcacaggag gagatgtaat ccgaagaaca aatattggtg ggttcggagc aataagggtg     1680
tcggtcactg gaccgctaac acaacgatat cgcataaggt tccgttatgc ttcgacaata     1740
gattttgatt tctttgtaac acgtggagga actactataa ataattttag atttacacgt     1800
acaatgaaca ggggacagga atcaagatat gaatcctatc gtactgtaga gtttacaact     1860
ccttttaact ttacacaaag tcaagatata attcgaacat ctatccaggg acttagtgga     1920
aatggggaag tataccttga tagaattgaa atcatccctg taaatccaac acgagaagcg     1980
gaagaggatc tagaagcagc gaagaaagcg gtggcgagct tgtttacacg tacaagggac     2040
ggattacaag taaatgtgac agattatcaa gtcgatcaag cggcaaattt agtgtcatgc     2100
ttatcagatg aacaatatgg gcatgacaaa aagatgttat tggaagcggt aagagcggca     2160
aaacgcctca gccgagaacg caacttactt caagatccag attttaatac aatcaatagt     2220
acagaagaaa atggatggaa agcaagtaac ggcgttacta ttagcgaggg cggtccattc     2280
tataaaggcc gtgcgcttca gctagcaagc gcaagagaaa attacccaac atacatttat     2340
caaaaagtaa atgcatcaga gttaaagccg tatacacgtt atagactgga tgggttcgtg     2400
aagagtagtc aagatttaga aattgatctc attcaccatc ataaagtcca tctcgtgaaa     2460
aatgtaccag ataatttagt atccgatact tactcggatg gttcttgcag tggaatgaat     2520
cgatgtgagg aacaacagat ggtaaatgcg caactggaaa cagaacatca tcatccgatg     2580
gattgctgtg aagcggctca aacacatgag ttttcttcct atattaatac aggcgatcta     2640
aattcaagtg tagatcaagg catttgggtt gtattgaaag ttcgaacaac cgatggttat     2700
gcgacgctag gaaatcttga attggtagag gtcggaccgt tatcgggtga atctctagaa     2760
cgtgaacaaa gggataatgc gaaatggagt gcagagctag gaagaaagcg tgcagaaaca     2820
gatcgcgtgt atcaagatgc caaacaatcc atcaatcatt tatttgtgga ttatcaagat     2880
caacaattaa atccagaaat agggatggca gatattattg acgctcaaaa tcttgtcgca     2940
tcaatttcag atgtgtatag cgatgcagta ctgcaaatcc ctggaattaa ctatgagatt     3000
tacacagagc tatccaatcg cttacaacaa gcatcgtatc tgtatacgtc tcgaaatgcg     3060
gtgcaaaatg gggactttaa cagcggtcta gatagttgga atgcaacagg gggggctacg     3120
gtacaacagg atggcaatac gcatttctta gttctttctc attgggatgc acaagtttct     3180
caacaattta gagtgcagcc gaattgtaaa tatgtattac gtgtaacagc agagaaagta     3240
ggcggcggag acggatacgt gacaatccgg gatggtgctc atcatacaga aaagcttaca     3300
tttaatgcat gtgattatga tataaatggc acgtacgtga ctgataatac gtatctaaca     3360
aaagaagtgg tattctattc acatacagaa cacatgtggg tagaggtaag tgaaacagaa     3420
ggtgcatttc atatagatag tattgaattc gttgaaacag aaaagtaa                  3468
<210>  6
<211>  3471
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  6
atgaatcaga acaagcacgg catcattggg gcctcgaact gcggctgcgc ctccgacgat       60
gtggctaagt accctctcgc taacaaccct tactccagcg ccctgaacct caattcctgc      120
cagaactcgt ctatcctcaa ttggattaac atcattgggg acgccgcgaa ggaggctgtc      180
agcatcggca ccacgattgt ttcactgatc acggccccgt ccctgacagg cctcatcagc      240
attgtgtacg acctcatcgg gaaggtccta ggcgggtcat ccggccagag catttcggac      300
ctgtcgatct gcgatctcct gtctatcatt gacctcaggg tgtctcagtc agtcctgaac      360
gacgggatcg ccgatttcaa tggctcagtg ctcctgtacc gcaactacct ggaggcgctc      420
gactcctgga acaagaatcc caactccgct agcgctgagg agctgaggac caggttcagg      480
attgccgact ccgagttcga tcgcatcctc actcgcggct cactgaccaa tggcggctcc      540
ctcgcccgcc agaacgctca gatcctcctg ctccctagct tcgcgtcggc tgccttcttc      600
cacctgctcc tgctcaggga cgctacgcgc tacggaacca actggggcct ctacaatgct      660
actccgttca taaactacca gtccaagctg gtcgagctga tcgagctgta caccgactac      720
tgcgttcact ggtacaatag ggggttcaac gagctgaggc agaggggcac gagcgctaca      780
gcttggctgg agttccatcg ctaccgcagg gagatgacgc tcatggttct ggacatcgtg      840
gccagcttca gctcgctcga tattactaac taccctatcg agaccgactt ccagctgtcg      900
cgcgtgattt acaccgaccc gatcgggttc gtccaccgct cttcactgag gggcgagtct      960
tggttctcat tcgtcaatag ggcgaacttc tcggacctcg agaatgctat cccgaacccc     1020
cggccatctt ggttcctgaa caatatgatc atttccactg gcagcctgac cctccccgtt     1080
tcgccatcta cggatcgcgc gagggtgtgg tacggctcac gggaccgcat ctcaccggct     1140
aactcccagt tcattacaga gctgatctct ggccagcaca caactgctac acagactatt     1200
ctgggccgga atatcttccg cgtggacagc caggcctgca atctcaacga taccacgtac     1260
ggcgtcaaca gggctgtttt ctaccatgac gcctcggagg gctctcagcg ctcagtctac     1320
gagggataca tcaggacaac tggcatcgat aatcctcggg tgcagaatat taacacgtac     1380
ctcccgggcg agaacagcga catccctacg ccggaggatt acacacacat tctgtcgacc     1440
acaatcaacc tcaccggcgg gctgaggcag gtcgcttcta acaggcgctc cagcctcgtt     1500
atgtacggct ggactcataa gtcactggcg cgcaacaaca caatcaaccc tgataggatc     1560
actcagattc cgctcaccaa ggtggacact agggggaccg gcgtgtcgta cgtcaacgat     1620
cccggcttca tcggcggggc cctgctccag cgcaccgacc acggctccct cggggttctg     1680
cgggtgcagt tcccactgca tctccgccag cagtacagga ttcgggtccg ctacgcgtcc     1740
acaactaaca tccgcctcag cgtgaatggg tcgttcggca cgatctccca gaacctgccc     1800
agcacaatga ggctcgggga ggacctgcgc tacggctcct tcgccattcg ggagttcaac     1860
acgagcatcc gccccacagc gtcgccagat cagattaggc tcactatcga gccaagcttc     1920
atcaggcagg aggtctacgt tgaccggatc gagttcattc ctgtcaaccc gacgagggag     1980
gctaaggagg atctggaggc tgctaagaag gctgtggcta gcctcttcac caggacgagg     2040
gacggcctgc aagtgaatgt caaggactac caggttgatc aggccgcgaa cctcgtgtcc     2100
tgcctgagcg acgagcagta cggctacgat aagaagatgc tgctcgaggc ggtcagggct     2160
gctaagaggc tctccaggga gaggaacctg ctccaggacc ctgatttcaa tacgatcaac     2220
agcacagagg agaacgggtg gaaggcgtct aatggcgtga ccatttcaga gggcggccca     2280
ttctacaagg gcagggctat ccagctggct tcggctcggg agaactaccc cacgtacatc     2340
taccagaagg tcgacgcctc tgagctgaag ccatacacac gctaccgcct ggatggcttc     2400
gtgaagtcgt ctcaggacct cgagatcgat ctgattcacc atcacaaggt ccacctggtt     2460
aagaatgtgc ccgacaacct ggtcctcgac acctacccag acgattcctg caatggcatc     2520
aacaggtgcg acgagcagaa gatggtgaac gcccagctcg agaccgagca tcaccatccg     2580
atggactgct gcgaggcggc tcagacgcac gagttctcat cctacattaa cacaggggac     2640
ctgaatgcca gcgtggatca gggcatctgg gtggtcctca aagtcaggac cacggacggg     2700
tacgctacgc tgggcaacct ggagctggtt gaagtggggc cactctcggg cgagtctctg     2760
gagagggagc agagggacaa cgccaagtgg agcgctgagc tgggcaggaa gagggctgag     2820
accgagaggg tctactacgc cgcgaagcag tcgatcaatc acctcttcgt ggactacagg     2880
gatcagcagc tgaaccccca gattggcatg gctgacatca tggatgccca gaacctcgtc     2940
gcgtcaatct ccgacgtgta ctccgatgcg gtcctgcaga tcccaggcat caactacgag     3000
atctacacgg agctgagcaa ccggctgcag caggcctcgt acctccacat gtctcgcaat     3060
gcgatgcaga acggggactt caattctggc ctggattcat ggaatgcgac tgctggggcc     3120
accgttcagc aggacggcaa cacccacttc ctggtgctct cccattggga tgcccaagtt     3180
agccagcagt tccgcgtgca gccgaactgc aagtacgtcc tgagggttac tgctgagaag     3240
gtcggcgggg gcgacggcta cgttaccatc cgcgatggcg ctcaccatac agagactctc     3300
accttcaacg cctgcgacta cgatatcaat ggcacgtacg tgacagacaa cacttacctg     3360
accaaggagg ttgtgttcca cccggagacc cagcatatgt gggtcgaggt tagcgagacg     3420
gagggcgtgt tccacataga cagcgttgag ttcatggaga cccagcagta g              3471
<210>  7
<211>  3471
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  7
atgaatcaga acaagcacgg catcattggg gcctcgaact gcggctgcgc ctccgacgat       60
gtggctaagt accctctcgc taacaaccct tactccagcg ccctgaacct caattcctgc      120
cagaactcgt ctatcctcaa ttggattaac atcattgggg acgccgcgaa ggaggctgtc      180
agcatcggca ccacgattgt ttcactgatc acggccccgt ccctgacagg cctcatcagc      240
attgtgtacg acctcatcgg gaaggtccta ggcgggtcat ccggccagag catttcggac      300
ctgtcgatct gcgatctcct gtctatcatt gacctcaggg tgtctcagtc agtcctgaac      360
gacgggatcg ccgatttcaa tggctcagtg ctcctgtacc gcaactacct ggaggcgctc      420
gactcctgga acaagaatcc caactccgct agcgctgagg agctgaggac caggttcagg      480
attgccgact ccgagttcga tcgcatcctc actcgcggct cactgaccaa tggcggctcc      540
ctcgcccgcc agaacgctca gatcctcctg ctccctagct tcgcgtcggc tgccttcttc      600
cacctgctcc tgctcaggga cgctacgcgc tacggaacca actggggcct ctacaatgct      660
actccgttca taaactacca gtccaagctg gtcgagctga tcgagctgta caccgactac      720
tgcgttcact ggtacaatag ggggttcaac gagctgaggc agaggggcac gagcgctaca      780
gcttggctgg agttccatcg ctaccgcagg gagatgacgc tcatggttct ggacatcgtg      840
gccagcttca gctcgctcga tattactaac taccctatcg agaccgactt ccagctgtcg      900
cgcgtgattt acaccgaccc gatcgggttc gtccaccgct cttcactgag gggcgagtct      960
tggttctcat tcgtcaatag ggcgaacttc tcggacctcg agaatgctat cccgaacccc     1020
cggccatctt ggttcctgaa caatatgatc atttccactg gcagcctgac cctccccgtt     1080
tcgccatcta cggatcgcgc gagggtgtgg tacggctcac gggaccgcat ctcaccggct     1140
aactcccagt tcattacaga gctgatctct ggccagcaca caactgctac acagactatt     1200
ctgggccgga atatcttccg cgtggacagc caggcctgca atctcaacga taccacgtac     1260
ggcgtcaaca gggctgtttt ctaccatgac gcctcggagg gctctcagcg ctcagtctac     1320
gagggataca tcaggacaac tggcatcgat aatcctcggg tgcagaatat taacacgtac     1380
ctcccgggcg agaacagcga catccctacg ccggaggatt acacacacat tctgtcgacc     1440
acaatcaacc tcaccggcgg gctgaggcag gtcgcttcta acaggcgctc cagcctcgtt     1500
atgtacggct ggactcataa gtcactggcg cgcaacaaca caatcaaccc tgataggatc     1560
actcagattc cgctcaccaa ggtggacact agggggaccg gcgtgtcgta cgtcaacgat     1620
cccggcttca tcggcggggc cctgctccag cgcaccgacc acggctccct cggggttctg     1680
cgggtgcagt tcccactgca tctccgccag cagtacagga ttcgggtccg ctacgcgtcc     1740
acaactaaca tccgcctcag cgtgaatggg tcgttcggca cgatctccca gaacctgccc     1800
agcacaatga ggctcgggga ggacctgcgc tacggctcct tcgccattcg ggagttcaac     1860
acgagcatcc gccccacagc gtcgccagat cagattaggc tcactatcga gccaagcttc     1920
atcaggcagg aggtctacgt tgaccggatc gagttcattc ctgtcaaccc gacgagggag     1980
gctaaggagg atctggaggc tgctaagaag gctgtggcta gcctcttcac caggacgagg     2040
gacggcctgc aagtgaatgt caaggactac caggttgatc aggccgcgaa cctcgtgtcc     2100
tgcctgagcg acgagcagta cggctacgat aagaagatgc tgctcgaggc ggtcagggct     2160
gctaagaggc tctccaggga gaggaacctg ctccaggacc ctgatttcaa tacgatcaac     2220
agcacagagg agaacgggtg gaaggcgtct aatggcgtga ccatttcaga gggcggccca     2280
ttctacaagg gcagggctat ccagctggct tcggctcggg agaactaccc cacgtacatc     2340
taccagaagg tcgacgcctc tgagctgaag ccatacacac gctaccgcct ggatggcttc     2400
gtgaagtcgt ctcaggacct cgagatcgat ctgattcacc atcacaaggt ccacctggtt     2460
aagaatgtgc ccgacaacct ggtcctcgac acctacccag acgattcctg caatggcatc     2520
aacaggtgcg acgagcagaa gatggtgaac gcccagctcg agaccgagca tcaccatccg     2580
atggactgct gcgaggcggc tcagacgcac gagttctcat cctacattaa cacaggggac     2640
ctgaatgcca gcgtggatca gggcatctgg gtggtcctca aagtcaggac cacggacggg     2700
tacgctacgc tgggcaacct ggagctggtt gaagtggggc cactctcggg cgagtctctg     2760
gagagggagc agagggacaa cgccaagtgg agcgctgagc tgggcaggaa gagggctgag     2820
accgagaggg tctactacgc cgcgaagcag tcgatcaatc acctcttcgt ggactacagg     2880
gatcagcagc tgaaccccca gattggcatg gctgacatca tggatgccca gaacctcgtc     2940
gcgtcaatct ccgacgtgta ctccgatgcg gtcctgcaga tcccaggcat caactacgag     3000
atctacacgg agctgagcaa ccggctgcag caggcctcgt acctccacat gtctcgcaat     3060
gcgatgcaga acggggactt caattctggc ctggattcat ggaatgcgac tgctggggcc     3120
accgttcagc aggacggcaa cacccacttc ctggtgctct cccattggga tgcccaagtt     3180
agccagcagt tccgcgtgca gccgaactgc aagtacgtcc tgagggttac tgctgagaag     3240
gtcggcgggg gcgacggcta cgttaccatc cgcgatggcg ctcaccatac agagactctc     3300
accttcaacg cctgcgacta cgatatcaat ggcacgtacg tgacagacaa cacttacctg     3360
accaaggagg ttgtgttcca cccggagacc cagcatatgt gggtcgaggt tagcgagacg     3420
gagggcgtgt tccacataga cagcgttgag ttcatggaga cccagcagta g              3471
<210>  8
<211>  3471
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  8
atgaatcaga acaagcacgg catcattggg gcctcgaact gcggctgcgc ctccgacgat       60
gtggctaagt accctctcgc taacaaccct tactccagcg ccctgaacct caattcctgc      120
cagaactcgt ctatcctcaa ttggattaac atcattgggg acgccgcgaa ggaggctgtc      180
agcatcggca ccacgattgt ttcactgatc acggccccgt ccctgacagg cctcatcagc      240
attgtgtacg acctcatcgg gaaggtccta ggcgggtcat ccggccagag catttcggac      300
ctgtcgatct gcgatctcct gtctatcatt gacctcaggg tgtctcagtc agtcctgaac      360
gacgggatcg ccgatttcaa tggctcagtg ctcctgtacc gcaactacct ggaggcgctc      420
gactcctgga acaagaatcc caactccgct agcgctgagg agctgaggac caggttcagg      480
attgccgact ccgagttcga tcgcatcctc actcgcggct cactgaccaa tggcggctcc      540
ctcgcccgcc agaacgctca gatcctcctg ctccctagct tcgcgtcggc tgccttcttc      600
cacctgctcc tgctcaggga cgctacgcgc tacggaacca actggggcct ctacaatgct      660
actccgttca taaactacca gtccaagctg gtcgagctga tcgagctgta caccgactac      720
tgcgttcact ggtacaatag ggggttcaac gagctgaggc agaggggcac gagcgctaca      780
gcttggctgg agttccatcg ctaccgcagg gagatgacgc tcatggttct ggacatcgtg      840
gccagcttca gctcgctcga tattactaac taccctatcg agaccgactt ccagctgtcg      900
cgcgtgattt acaccgaccc gatcgggttc gtccaccgct cttcactgag gggcgagtct      960
tggttctcat tcgtcaatag ggcgaacttc tcggacctcg agaatgctat cccgaacccc     1020
cggccatctt ggttcctgaa caatatgatc atttccactg gcagcctgac cctccccgtt     1080
tcgccatcta cggatcgcgc gagggtgtgg tacggctcac gggaccgcat ctcaccggct     1140
aactcccagt tcattacaga gctgatctct ggccagcaca caactgctac acagactatt     1200
ctgggccgga atatcttccg cgtggacagc caggcctgca atctcaacga taccacgtac     1260
ggcgtcaaca gggctgtttt ctaccatgac gcctcggagg gctctcagcg ctcagtctac     1320
gagggataca tcaggacaac tggcatcgat aatcctcggg tgcagaatat taacacgtac     1380
ctcccgggcg agaacagcga catccctacg ccggaggatt acacacacat tctgtcgacc     1440
acaatcaacc tcaccggcgg gctgaggcag gtcgcttcta acaggcgctc cagcctcgtt     1500
atgtacggct ggactcataa gtcactggcg cgcaacaaca caatcaaccc tgataggatc     1560
actcagattc cgctcaccaa ggtggacact agggggaccg gcgtgtcgta cgtcaacgat     1620
cccggcttca tcggcggggc cctgctccag cgcaccgacc acggctccct cggggttctg     1680
cgggtgcagt tcccactgca tctccgccag cagtacagga ttcgggtccg ctacgcgtcc     1740
acaactaaca tccgcctcag cgtgaatggg tcgttcggca cgatctccca gaacctgccc     1800
agcacaatga ggctcgggga ggacctgcgc tacggctcct tcgccattcg ggagttcaac     1860
acgagcatcc gccccacagc gtcgccagat cagattaggc tcactatcga gccaagcttc     1920
atcaggcagg aggtctacgt tgaccggatc gagttcattc ctgtcaaccc gacgagggag     1980
gctaaggagg atctggaggc tgctaagaag gctgtggcta gcctcttcac caggacgagg     2040
gacggcctgc aagtgaatgt caaggactac caggttgatc aggccgcgaa cctcgtgtcc     2100
tgcctgagcg acgagcagta cggctacgat aagaagatgc tgctcgaggc ggtcagggct     2160
gctaagaggc tctccaggga gaggaacctg ctccaggacc ctgatttcaa tacgatcaac     2220
agcacagagg agaacgggtg gaaggcgtct aatggcgtga ccatttcaga gggcggccca     2280
ttctacaagg gcagggctat ccagctggct tcggctcggg agaactaccc cacgtacatc     2340
taccagaagg tcgacgcctc tgagctgaag ccatacacac gctaccgcct ggatggcttc     2400
gtgaagtcgt ctcaggacct cgagatcgat ctgattcacc atcacaaggt ccacctggtt     2460
aagaatgtgc ccgacaacct ggtcctcgac acctacccag acgattcctg caatggcatc     2520
aacaggtgcg acgagcagaa gatggtgaac gcccagctcg agaccggaca tcaccatccg     2580
atggactgct gcgaggcggc tcagacgcac gagttctcat cctacattaa cacaggggac     2640
ctgaatgcca gcgtggatca gggcatctgg gtggtcctca aagtcaggac cacggacggg     2700
tacgctacgc tgggcaacct ggagctggtt gaagtggggc cactctcggg cgagtctctg     2760
gagagggagc agagggacaa cgccaagtgg agcgctgagc tgggcaggaa gagggctgag     2820
accgagaggg tctactacgc cgcgaagcag tcgatcaatc acctcttcgt ggactaccaa     2880
gatcagcagc tgaaccccca gattggcatg gctgacatca tggatgccca gaacctcgtc     2940
gcgtcaatct ccgacgtgta ctccgatgcg gtcctgcaga tcccaggcat caactacgag     3000
atctacacgg agctgagcaa ccggctgcag caggcctcgt acctccacac gtctcgcaat     3060
gcgatgcaga acggggactt caattctggc ctggattcat ggaatgcgac tgctggggcc     3120
accgttcagc aggacggcaa cacccacttc ctggtgctct cccattggga tgcccaagtt     3180
agccagcagt tccgcgtgca gccgaactgc aagtacgtcc tgagggttac tgctgagaag     3240
gtcggcgggg gcgacggcta cgttaccatc cgcgatggcg ctcaccatac agagactctc     3300
accttcaacg cctgcgacta cgatatcaat ggcacgtacg tgacagacaa cacttacctg     3360
accaaggagg ttgtgttcca cccggagacc cagcatatgt gggtcgaggt tagcgagacg     3420
gagggcgtgt tccacataga cagcgttgag ttcatggaga cccagcagta g              3471
<210>  9
<211>  3459
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  9
atgaacagga acaacccaaa cgagtacgag attattgatg ctccatactg cggctgcccc       60
tccgatgacg atgtgcgcta ccccctcgcc agcgacccga acgccgcgtt ccagaatatg      120
aactacaagg agtacctgca gacctacgac ggcgattaca cggggtcact gattaatcca      180
aacctctcca tcaatcctcg cgacgtcctc cagaccggaa tcaacattgt tggccgcatc      240
ctcggcttcc tgggcgtgcc gttcgctggc cagctggtta ccttctacac gttcctcctg      300
aaccagctct ggcctacgaa tgacaacgcg gtgtgggagg ccttcatggc gcagatcgag      360
gagctgattg atcagaagat ctccgctcag gtggtcagga acgccctcga cgatctgacc      420
ggcctccacg actactacga ggagtacctg gctgctctcg aggagtggct cgagaggcca      480
aacggcgctc gcgctaatct ggtcacgcag cgcttcgaga acctccatac cgccttcgtg      540
acgaggatgc cgagcttcgg gacaggcccc gggtcgcaga gggacgcggt tgctctcctg      600
actgtgtacg cgcaggcggc taacctgcac ctcctgctcc tgaaggatgc tgagatctac      660
ggcgctcggt gggggctgca gcagggccag atcaacctct acttcaatgc ccagcaggag      720
cgcacaagga tctacactaa ccactgcgtt gagacctaca atagggggct cgaggacgtg      780
cggggcacga acacagagag ctggctgaat taccatcgct tccgcaggga gatgacgctc      840
atggcgatgg acctcgtggc gctcttcccc tactacaacg tccgccagta cccaaatggc      900
gccaaccctc agctgacaag ggagatctac actgacccga tcgtgtacaa cccaccagct      960
aatcagggga tctgcaggcg ctggggcaac aatccctaca acaccttctc tgagctggag     1020
aatgcgttca ttaggccacc tcacctcttc gaccgcctga acaggctcac catctcccgg     1080
aatcgctaca cggctccaac cacgaactcg tacctggatt actggtctgg ccataccctc     1140
cagtcacagt acgcgaacaa tcctacaact tacgagacgt cctacggcca gattacaagc     1200
aacactcgcc tcttcaatac cacgaacggc gctaatgcta tcgacagcag ggcccggaac     1260
ttcgggaatc tgtacgcgaa tctctacggc gtctccagcc tgaacatttt cccaaccggc     1320
gttatgtcag agatcacctc cgcccctaac acgtgctggc aggacctcac aactaccgag     1380
gagctgccac tggtgaacaa taacttcaat ctcctgtccc acgtcacatt cctgaggttc     1440
aacacgacac agggcggccc actcgcgact gttggcttcg tgcccaccta cgtgtggacg     1500
cggcaggacg tcgatttcaa taacatcatt acaccaaacc gcatcactca gattcctgtt     1560
gtgaaggcgt acgagctgtc gtctggcgct acagtcgtta agggcccggg gttcactggc     1620
ggggacgtca ttaggaggac taacaccggc gggttcgggg ctatcagggt gagcgtcaca     1680
ggccccctca ctcagcgcta caggattcgg ttccgctacg cgtcgaccat cgacttcgat     1740
ttcttcgtca cgcgcggcgg gactaccatc aataacttcc ggttcacgcg caccatgaac     1800
aggggccagg agagccggta cgagtcgtac cgcaccgtgg agttcacgac accgttcaac     1860
ttcacacaga gccaggacat cattcgcact tctattcagg gcctgtcagg caacggggag     1920
gtttacctcg accggatcga gatcattcca gtgaacccaa ccagggaggc tgaggaggat     1980
ctcgaggctg cgaagaaggc tgtggcctcg ctgttcacta ggacccggga cggcctccag     2040
gttaatgtga cggactacca ggtggatcag gctgccaacc tggtctcgtg cctctctgac     2100
gagcagtacg ctcacgataa gaagatgctc ctggaggccg tccgcgctgc taagaggctg     2160
tcgagggaga ggaacctcct gcaggaccca gatttcaaca ccattaattc tacggaggag     2220
aacgggtgga aggcgtcgaa tggcgtgacc atctctgagg gcgggccttt ctacaagggc     2280
cgcgctctcc agctggcttc agctagggag aactacccga catacatcta ccagaaggtc     2340
gacgcctccg agctgaagcc ctacacgcgc taccgcctcg atggcttcgt gaagtcatcc     2400
caggacctgg agatcgatct cattcaccat cacaaggtcc acctggttaa gaacgtgctg     2460
gacaatctcg tcagcgatac ctacccggac gattcttgct caggcatcaa tcgctgcgag     2520
gagcagcaga tggtgaacgc ccagctcgag accgagcatc accatccgat ggactgctgc     2580
gaggctgctc agacgcatga gttcagctcg tacatcgaca caggggatct gaactccact     2640
gtggaccagg gcatctgggt catcttcaag gtgcgcacta ccgatgggta cgcgaccctc     2700
ggcaacctcg agctggtcga ggttgggccg ctcctgggcg agccactgga gagggagcag     2760
agggagaacg ctaagtggaa tgctgagctg ggcaggaagc gggctgagac cgaccgcgtc     2820
taccaggatg ctaagcagtc catcaatcac ctgttcgtgg actaccagga tcagcagctc     2880
aacccacaga ttggcatggc tgacatcatg gatgcccaga acctggtcgc gtccatcagc     2940
gacgtctact ctgatgccgt tctccagatc cctggcatta attacgagat ctacacagag     3000
ctgtcaaacc ggctccagca ggcctcctac ctgtacacta gccgcaacgc ggtgcagaat     3060
ggggacttca ataacggcct cgattcctgg aatgctacag ctggggctag cgtccagcag     3120
gacggcaaca ctcacttcct cgttctgtct cattgggatg cccaggtttc acagcagttc     3180
agggtgcagc cgaactgcaa gtatgtgctg agggttaccg ctgagaaggt tggcgggggc     3240
gacggctacg tgacgatcag ggatggcgct caccatacgg agacactgac tttcaacgcc     3300
tgcgactacg atatcaatgg cacctacgtc acggacaaca catacctcac taaggaggtc     3360
atattctaca gccacaccga gcatatgtgg gtggaggtca acgagacgga gggcgccttc     3420
cacatagact cgattgagtt cgtggagacc gagaagtga                            3459
<210>  10
<211>  3468
<212>ДНК
<213>Искусственнаяпоследовательность
<220>
<223>Синтетическийген Cry
<400>  10
atgaatagga ataaccagga cgagtacgag atcattgacg cttcgacttg cgggtgcagc       60
tcagacgatg ttgttcagta ccccctcgct cgcgatccca atgccgtgtt ccagaacatg      120
cactacaagg actacctcca gacatacgac ggcgattaca ctgggtcgct cattaaccca      180
aatctgtcta tcaatcctcg cgacgtcctg cagacgggaa tcaacattgt tgggaggctc      240
ctgggcttcc tcggggttcc gttcgctggc cagctggtga cattctacac tttcctcctg      300
aaccagctct ggcccaccaa cgacaatgcg gtctgggagg ccttcatggc gcagatcgag      360
gagctgatta accagcgcat ctccgaggct gtggtcggca ccgctgctga tcacctcacg      420
gggctgcatg acaactacga gctttacgtg gaggctctcg aggagtggct ggagaggcca      480
aacgctgcta ggacgaacct cctgttcaat aggttcacca cgctcgactc cctgttcaca      540
cagttcatgc catcattcgg gactggcccc ggctcccaga actacgccgt ccctctcctg      600
accgtttacg cgcaggcggc taacctccac ctcctgctcc tgaaggacgc tgagatctac      660
ggcgctcgct gggggctgaa ccagaatcag atcaacagct tccacacaag gcagcaggag      720
cggacccagt actacacgaa tcattgcgtg acaacttaca acaccggcct cgataggctg      780
agggggacca atacggagtc ctggctcaac taccataggt tccgcaggga gatgaccctg      840
atggcgatgg acctcgtggc gctgttcccg tactacaacg tccggcagta cccaaacggc      900
gctaatccac agctcacccg cgagatctac acggacccaa tcgtcttcaa cccaccagct      960
aatgttggcc tgtgcaggcg ctgggggaac aatccttaca atcgcttcag cgagctggag     1020
aacgccttca tcaggccacc tcacctgttc gatcggctca atacactgac tatttcgagg     1080
aaccggttcg acgtcggcag caatttcatc gagccgtggt cgggccatac gctgaggagg     1140
tcctacagca acaattcaac agtgtacgag gattcctacg gccagattac cgctacgagg     1200
accacgatca acctccctgc caatggcaca gggcgggtgg agtctactgc tgtcgacttc     1260
cgctcagccc tggttggcat ctacggggtg aacagggcga gcttcatccc gggcggggtc     1320
ttcagcggca caactcagcc atcgaccggc gggtgcaggg acctctacga ttccagcgac     1380
gagctgccac cagacgagag cacgggctcg ttcgctcaca ggctctctca tgtcacattc     1440
ctgtcattca ccacgaacca ggctggctcg atcgccaatt ctgggagggt tccgacatac     1500
gtgtggactc accgggacgt ggatttcaac aataccatca acccaaatcg catcacgcag     1560
attcctgttg tgaaggcgta cgagctgtcc tccggcgcta ccgtcgttaa gggcccgggg     1620
ttcacgggcg gggacgtgat tcgcaggaca aacatcggcg ggttcggcgc tatcagggtc     1680
tccgttaccg gccccctgac gcagcgctac aggattcggt tccgctacgc ctccactatc     1740
gacttcgatt tcttcgtcac ccggggcggg acaactatca acaatttccg cttcacaagg     1800
actatgaaca ggggccagga gtcacggtac gagtcctacc gcaccgtgga gttcaccacg     1860
cccttcaact tcacgcagtc ccaggacatc attaggacat ccattcaggg cctcagcggc     1920
aacggggagg tttacctgga tcgcatcgag atcattccag tgaaccctac gagggaggct     1980
gaggaggacc tcgaggctgc gaagaaggct gtggctagcc tcttcaccag gacgagggat     2040
ggcctgcaag tgaatgtcac cgattaccag gtggaccagg ctgccaacct cgtctcttgc     2100
ctgtcagatg agcagtacgg ccacgacaag aagatgctcc tggaggccgt ccgcgctgct     2160
aagaggctgt ccagggagag gaacctcctg caggacccag atttcaacac aatcaatagc     2220
actgaggaga atggctggaa ggcgtccaac ggggtgacca tcagcgaggg cgggcctttc     2280
tacaagggcc gcgctctcca gctggcttcg gctagggaga attacccaac ttacatctac     2340
cagaaggtca acgcctctga gctgaagcct tacacgcgct accgcctgga tggcttcgtg     2400
aagtcatccc aggatctcga gatcgacctg attcaccatc acaaggtgca cctcgtcaag     2460
aacgttccgg acaatctggt cagcgatacg tactcggacg gctcgtgctc tgggatgaat     2520
cgctgcgagg agcagcagat ggtgaacgcg cagctcgaga cagagcatca ccatccgatg     2580
gactgctgcg aggccgcgca gactcatgag ttcagctcgt acattaatac cggcgatctg     2640
aactcttcag tcgaccaggg catctgggtg gtcctcaagg ttcgcacaac tgatggctac     2700
gccacgctgg ggaacctcga gctggttgaa gtgggcccac tctccgggga gagcctggag     2760
agggagcaga gggacaacgc gaagtggtcc gctgagctgg gcaggaagcg ggctgagacc     2820
gatagggttt accaggacgc taagcagtcc atcaatcacc tcttcgtgga ttaccaggac     2880
cagcagctga acccggagat tggcatggct gatatcattg acgcccagaa cctcgtcgcg     2940
tcaatctccg atgtctacag cgacgccgtt ctgcagatcc ccggcattaa ttacgagatc     3000
tacacggagc tgtcgaacag gctgcagcag gcctcgtacc tctacacatc tcggaacgcg     3060
gtgcagaatg gcgatttcaa ctctgggctg gactcatgga atgctaccgg cggggctacg     3120
gtgcagcagg atggcaacac ccacttcctc gtcctgtccc attgggacgc tcaggtgagc     3180
cagcagttcc gggtccagcc gaactgcaag tatgtgctga gggtcactgc tgagaaggtt     3240
ggcgggggcg atggctacgt gaccatcagg gacggggctc accatacaga gaagctcact     3300
ttcaacgcct gcgactacga tatcaatggc acctacgtca cggacaacac atacctaact     3360
aaggaggttg tgttctactc gcacactgag catatgtggg tcgaggtttc tgagaccgag     3420
ggcgccttcc acatagactc aattgagttc gtggagaccg agaagtga                  3468
<210>  11
<211>  3507
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  11
atgaatagga ataaccagaa cgagtacgag gtcattgatg ctccccattg cggctgcccg       60
gcggacgatg ttgtgaagta cccactgacc gacgatccga acgccggcct gcagaacatg      120
aattacaagg agtacctcca gacctacggc ggggactaca ccgacccgct gatcaaccct      180
aatctctcgg tttctggcaa ggacgtgatt caggtcggaa tcaacattgt ggggcgcctc      240
ctgtccttct tcgggttccc attctccagc cagtgggtga cagtctacac ttacctcctg      300
aattcactgt ggcctgacga tgagaactcc gtttgggacg ccttcatgga gcgggtggag      360
gagctgatcg atcagaagat tagcgaggct gtcaagggcc gcgcgctcga cgatctgacc      420
gggctccagt acaactacaa cctctacgtg gaggcgctgg acgagtggct caacaggcca      480
aatggcgctc gggcctctct cgtgtcacag aggttcaaca tcctggattc cctcttcacc      540
cagttcatgc catccttcgg gagcggcccc gggagccaga attacgcgac gatcctcctg      600
cctgtgtacg ctcaggccgc gaacctgcac ctcctgctcc tgaaggacgc tgatatctac      660
ggcgccaggt gggggctcaa ccagacccag attgaccagt tccactctag gcagcagtca      720
ctcacccaga cgtacacaaa ccattgcgtg acagcctaca atgacggcct ggctgagctg      780
agggggactt cggtcgcctc ttggctgaag taccaccagt accgcaggga gatgactgtc      840
accgcgatgg acctggttgc tctcttccca tactacaacg tgcgccagta cccgaacggc      900
gcgaatcccc agctcaccag ggaggtgtac acggacccaa tcgtcttcaa cccaccagag      960
aggccttctg gcgctttctg cgagtcattc tacaccatca gggctgctag ggagaggctg     1020
acgttctccc agctcgagca cgcgatcatt cgcccaccta ggctgttcga gcggttccag     1080
gctctcggca tctacacagg ggaggcccgc ctcaacgcta attccgcccc gatgaattac     1140
tggatcggcc atttcattag gaacacgagg ctgggggaca gcaccacgat cacaactaat     1200
tacggcacca cgaacaatag gctcaccaac ttctcaatgc cctccgacgt ctaccagatc     1260
aactccacgt cgtctaatct cgcggctatt ctgggcacac tctacggggt gactcgcgcc     1320
cagttccact tcggctcagg gtccttcagc acctacgtgg gccagaacag cgtcctgccg     1380
cagtgccatc agaactacaa tagcatcgag gagctgccaa accagtcgga cgagcctacc     1440
gttcgctcgt actctcacag gctgtcccat atcacgagct tcaacttcaa tgtgcagctg     1500
aacaatccgc tcatttctgc gggcaacatg cccgtttacg tgtggaccca caggtcagtc     1560
gacctgacga accggatctc atccgatcgc atcacccaga ttccggtggt caaggcttac     1620
gagctgtcct ccggcgctac agttgtgaag ggccccgggt tcactggcgg ggacgtgatc     1680
aggaggacga acacaggcgg gttcggcgcg attagggtct cggttaccgg gccgctcacg     1740
cagcgctacc gcatccgctt ccgctacgct tctaccattg acttcgattt cttcgtcacg     1800
cggggcggga caactatcaa caatttcagg ttcactcgga ccatgaacag gggccaggag     1860
tcgcggtacg agtcttaccg caccgtggag ttcaccacgc ccttcaactt cacacagtcc     1920
caggacatca ttcgcacttc aatccagggc ctgtccggca atggggaggt ctacctcgac     1980
cgcattgaga tcattccggt taaccccacg agggaggctg aggaggatct ggaggctgcg     2040
aagaaggcgg tggctagcct gttcacgagg acacgggacg gcctccaagt gaatgtcaag     2100
gactaccagg tcgatcaggc tgccaacctg gttagctgcc tctcggacga gcagtacggc     2160
tacgataaga agatgctcct ggaggccgtg cgcgctgcta agaggctctc gagggagagg     2220
aacctcctgc aggacccgga tttcaacaca atcaattcta ctgaggagaa cggctggaag     2280
gcttccaatg gggtgaccat tagcgagggc ggcccattct acaagggcag ggccctccag     2340
ctggcttcag ctcgggagaa ctacccaaca tacatctacc agaaggtcga cgccagcgag     2400
ctgaagcctt acactcgcta ccgcctcgat ggcttcgtga agtcttcaca ggacctggag     2460
atcgatctca ttcaccatca caaggttcac ctggtgaaga acgtcccgga caatctcgtc     2520
tccgatacgt accccgacga ttcatgctcc ggcatcaata ggtgccagga gcagcagatg     2580
gtgaacgccc agctggagac agagcatcac catccgatgg actgctgcga ggccgcgcag     2640
actcatgagt tctccagcta catcgacaca ggcgatctga acagcactgt ggaccagggg     2700
atctgggtca ttttcaaggt taggacaact gatggctacg cgaccctcgg gaacctcgag     2760
ctggttgaag tgggcccact cctgggggag cctctggaga gggagcagag ggagaacgcg     2820
aagtggaatg ctgagctggg caggaagcgg gctgagaccg accgcgtcta ccaggatgcc     2880
aagcagagca tcaatcacct gttcgttgac taccaggatc agcagctcaa cccagagatc     2940
ggcatggccg acattatgga tgcgcagaac ctggtcgcta gcatctcgga cgtttactcg     3000
gatgccgtgc tccagatccc tggcattaat tacgagatct acaccgagct gagcaacagg     3060
ctccagcagg cgagctacct gtacacgtcg cggaacgctg tgcagaatgg cgacttcaac     3120
aatgggctcg attcttggaa tgctaccgct ggcgcttcag tgcagcagga cgggaacacg     3180
cacttcctcg tcctgtcgca ttgggatgcc caggtttctc agcagttccg ggtgcagccg     3240
aactgcaagt atgtgctcag ggtgacagct gagaaagtgg gcgggggcga cggctacgtc     3300
actatccgcg acgatgccca ccatactgag accctgacgt tcaacgcgtg cgactacgat     3360
atcaatggca cctacgtcac ggacaacaca tacatcacta aggaggtcgt tttctactcc     3420
cacacagatc atatgtgggt cgaggttagc gagactgagg gcgccttcca catcgactcg     3480
cttgagttcg tggagaccga gaagtga                                         3507
<210>  12
<211>  3471
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  12
atgaatcaga acaagcacgg catcattggg gcctcgaact gcggctgcgc ctccgacgat       60
gtggctaagt accctctcgc taacaaccct tactccagcg ccctgaacct caattcctgc      120
cagaactcgt ctatcctcaa ttggattaac atcattgggg acgccgcgaa ggaggctgtc      180
agcatcggca ccacgattgt ttcactgatc acggccccgt ccctgacagg cctcatcagc      240
attgtgtacg acctcatcgg gaaggtcatc ggcgggtcat ccggccagag catttcggac      300
ctgtcgatct gcgatctcct gtctatcatt gacctcaggg tgtctcagtc agtcctgaac      360
gacgggatcg ccgatttcaa tggctcagtg ctcctgtacc gcaactacct ggaggcgctc      420
gactcctgga acaagaatcc caactccgct agcgctgagg agctgaggac caggttcagg      480
attgccgact ccgagttcga tcgcatcctc actcgcggct cactgaccaa tggcggctcc      540
ctcgcccgcc agaacgctca gatcctcctg ctccctagct tcgcgtcggc tgccttcttc      600
cacctgctcc tgctcaggga cgctacgcgc tacggaacca actggggcct ctacaatgct      660
actccgttca taaactacca gtccaagctg gtcgagctga tcgagctgta caccgactac      720
tgcgttcact ggtacaatag ggggttcaac gagctgaggc agaggggcac gagcgctaca      780
gcttggctgg agttccatcg ctaccgcagg gagatgacgc tcatggttct ggacatcgtg      840
gccagcttca gctcgctcga tattactaac taccctatcg agaccgactt ccagctgtcg      900
cgcgtgattt acaccgaccc gatcgggttc gtccaccgct cttcactgag gggcgagtct      960
tggttctcat tcgtcaatag ggcgaacttc tcggacctcg agaatgctat cccgaacccc     1020
cggccatctt ggttcctgaa caatatgatc atttccactg gcagcctgac cctccccgtt     1080
tcgccatcta cggatcgcgc gagggtgtgg tacggctcac gggaccgcat ctcaccggct     1140
aactcccagt tcattacaga gctgatctct ggccagcaca caactgctac acagactatt     1200
ctgggccgga atatcttccg cgtggacagc caggcctgca atctcaacga taccacgtac     1260
ggcgtcaaca gggctgtttt ctaccatgac gcctcggagg gctctcagcg ctcagtctac     1320
gagggataca tcaggacaac tggcatcgat aatcctcggg tgcagaatat taacacgtac     1380
ctcccgggcg agaacagcga catccctacg ccggaggatt acacacacat tctgtcgacc     1440
acaatcaacc tcaccggcgg gctgaggcag gtcgcttcta acaggcgctc cagcctcgtt     1500
atgtacggct ggactcataa gtcactggcg cgcaacaaca caatcaaccc tgataggatc     1560
actcagattc cgctcaccaa ggtggacact agggggaccg gcgtgtcgta cgtcaacgat     1620
cccggcttca tcggcggggc cctgctccag cgcaccgacc acggctccct cggggttctg     1680
cgggtgcagt tcccactgca tctccgccag cagtacagga ttcgggtccg ctacgcgtcc     1740
acaactaaca tccgcctcag cgtgaatggg tcgttcggca cgatctccca gaacctgccc     1800
agcacaatga ggctcgggga ggacctgcgc tacggctcct tcgccattcg ggagttcaac     1860
acgagcatcc gccccacagc gtcgccagat cagattaggc tcactatcga gccaagcttc     1920
atcaggcagg aggtctacgt tgaccggatc gagttcattc ctgtcaaccc gacgagggag     1980
gctaaggagg atctggaggc tgctaagaag gctgtggcta gcctcttcac caggacgagg     2040
gacggcctgc aagtgaatgt caaggactac caggttgatc aggccgcgaa cctcgtgtcc     2100
tgcctgagcg acgagcagta cggctacgat aagaagatgc tgctcgaggc ggtcagggct     2160
gctaagaggc tctccaggga gaggaacctg ctccaggacc ctgatttcaa tacgatcaac     2220
agcacagagg agaacgggtg gaaggcgtct aatggcgtga ccatttcaga gggcggccca     2280
ttctacaagg gcagggctat ccagctggct tcggctcggg agaactaccc cacgtacatc     2340
taccagaagg tcgacgcctc tgagctgaag ccatacacac gctaccgcct ggatggcttc     2400
gtgaagtcgt ctcaggacct cgagatcgat ctgattcacc atcacaaggt ccacctggtt     2460
aagaatgtgc ccgacaacct ggtcctcgac acctacccag acgattcctg caatggcatc     2520
aacaggtgcg acgagcagaa gatggtgaac gcccagctcg agaccgagca tcaccatccg     2580
atggactgct gcgaggcggc tcagacgcac gagttctcat cctacattaa cacaggggac     2640
ctgaatgcca gcgtggatca gggcatctgg gtggtcctca aagtcaggac cacggacggg     2700
tacgctacgc tgggcaacct ggagctggtt gaagtggggc cactctcggg cgagtctctg     2760
gagagggagc agagggacaa cgccaagtgg agcgctgagc tgggcaggaa gagggctgag     2820
accgagaggg tctactacgc cgcgaagcag tcgatcaatc acctcttcgt ggactacagg     2880
gatcagcagc tgaaccccca gattggcatg gctgacatca tggatgccca gaacctcgtc     2940
gcgtcaatct ccgacgtgta ctccgatgcg gtcctgcaga tcccaggcat caactacgag     3000
atctacacgg agctgagcaa ccggctgcag caggcctcgt acctccacat gtctcgcaat     3060
gcgatgcaga acggggactt caattctggc ctggattcat ggaatgcgac tgctggggcc     3120
accgttcagc aggacggcaa cacccacttc ctggtgctct cccattggga tgcccaagtt     3180
agccagcagt tccgcgtgca gccgaactgc aagtacgtcc tgagggttac tgctgagaag     3240
gtcggcgggg gcgacggcta cgttaccatc cgcgatggcg ctcaccatac agagactctc     3300
accttcaacg cctgcgacta cgatatcaat ggcacgtacg tgacagacaa cacttacctg     3360
accaaggagg ttgtgttcca cccggagacc cagcatatgt gggtcgaggt tagcgagacg     3420
gagggcgtgt tccacctgga cagcgttgag ttcatggaga cccagcagta g              3471
<210>  13
<211>  3471
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  13
atgaatcaga acaagcacgg catcattggg gcctcgaact gcggctgcgc ctccgacgat       60
gtggctaagt accctctcgc taacaaccct tactccagcg ccctgaacct caattcctgc      120
cagaactcgt ctatcctcaa ttggattaac atcattgggg acgccgcgaa ggaggctgtc      180
agcatcggca ccacgattgt ttcactgatc acggccccgt ccctgacagg cctcatcagc      240
attgtgtacg acctcatcgg gaaggtcatc ggcgggtcat ccggccagag catttcggac      300
ctgtcgatct gcgatctcct gtctatcatt gacctcaggg tgtctcagtc agtcctgaac      360
gacgggatcg ccgatttcaa tggctcagtg ctcctgtacc gcaactacct ggaggcgctc      420
gactcctgga acaagaatcc caactccgct agcgctgagg agctgaggac caggttcagg      480
attgccgact ccgagttcga tcgcatcctc actcgcggct cactgaccaa tggcggctcc      540
ctcgcccgcc agaacgctca gatcctcctg ctccctagct tcgcgtcggc tgccttcttc      600
cacctgctcc tgctcaggga cgctacgcgc tacggaacca actggggcct ctacaatgct      660
actccgttca taaactacca gtccaagctg gtcgagctga tcgagctgta caccgactac      720
tgcgttcact ggtacaatag ggggttcaac gagctgaggc agaggggcac gagcgctaca      780
gcttggctgg agttccatcg ctaccgcagg gagatgacgc tcatggttct ggacatcgtg      840
gccagcttca gctcgctcga tattactaac taccctatcg agaccgactt ccagctgtcg      900
cgcgtgattt acaccgaccc gatcgggttc gtccaccgct cttcactgag gggcgagtct      960
tggttctcat tcgtcaatag ggcgaacttc tcggacctcg agaatgctat cccgaacccc     1020
cggccatctt ggttcctgaa caatatgatc atttccactg gcagcctgac cctccccgtt     1080
tcgccatcta cggatcgcgc gagggtgtgg tacggctcac gggaccgcat ctcaccggct     1140
aactcccagt tcattacaga gctgatctct ggccagcaca caactgctac acagactatt     1200
ctgggccgga atatcttccg cgtggacagc caggcctgca atctcaacga taccacgtac     1260
ggcgtcaaca gggctgtttt ctaccatgac gcctcggagg gctctcagcg ctcagtctac     1320
gagggataca tcaggacaac tggcatcgat aatcctcggg tgcagaatat taacacgtac     1380
ctcccgggcg agaacagcga catccctacg ccggaggatt acacacacat tctgtcgacc     1440
acaatcaacc tcaccggcgg gctgaggcag gtcgcttcta acaggcgctc cagcctcgtt     1500
atgtacggct ggactcataa gtcactggcg cgcaacaaca caatcaaccc tgataggatc     1560
actcagattc cgctcaccaa ggtggacact agggggaccg gcgtgtcgta cgtcaacgat     1620
cccggcttca tcggcggggc cctgctccag cgcaccgacc acggctccct cggggttctg     1680
cgggtgcagt tcccactgca tctccgccag cagtacagga ttcgggtccg ctacgcgtcc     1740
acaactaaca tccgcctcag cgtgaatggg tcgttcggca cgatctccca gaacctgccc     1800
agcacaatga ggctcgggga ggacctgcgc tacggctcct tcgccattcg ggagttcaac     1860
acgagcatcc gccccacagc gtcgccagat cagattaggc tcactatcga gccaagcttc     1920
atcaggcagg aggtctacgt tgaccggatc gagttcattc ctgtcaaccc gacgagggag     1980
gctaaggagg atctggaggc tgctaagaag gctgtggcta gcctcttcac caggacgagg     2040
gacggcctgc aagtgaatgt caaggactac caggttgatc aggccgcgaa cctcgtgtcc     2100
tgcctgagcg acgagcagta cggctacgat aagaagatgc tgctcgaggc ggtcagggct     2160
gctaagaggc tctccaggga gaggaacctg ctccaggacc ctgatttcaa tacgatcaac     2220
agcacagagg agaacgggtg gaaggcgtct aatggcgtga ccatttcaga gggcggccca     2280
ttctacaagg gcagggctat ccagctggct tcggctcggg agaactaccc cacgtacatc     2340
taccagaagg tcgacgcctc tgagctgaag ccatacacac gctaccgcct ggatggcttc     2400
gtgaagtcgt ctcaggacct cgagatcgat ctgattcacc atcacaaggt ccacctggtt     2460
aagaatgtgc ccgacaacct ggtcctcgac acctacccag acgattcctg caatggcatc     2520
aacaggtgcg acgagcagaa gatggtgaac gcccagctcg agaccggaca tcaccatccg     2580
atggactgct gcgaggcggc tcagacgcac gagttctcat cctacattaa cacaggggac     2640
ctgaatgcca gcgtggatca gggcatctgg gtggtcctca aagtcaggac cacggacggg     2700
tacgctacgc tgggcaacct ggagctggtt gaagtggggc cactctcggg cgagtctctg     2760
gagagggagc agagggacaa cgccaagtgg agcgctgagc tgggcaggaa gagggctgag     2820
accgagaggg tctactacgc cgcgaagcag tcgatcaatc acctcttcgt ggactaccaa     2880
gatcagcagc tgaaccccca gattggcatg gctgacatca tggatgccca gaacctcgtc     2940
gcgtcaatct ccgacgtgta ctccgatgcg gtcctgcaga tcccaggcat caactacgag     3000
atctacacgg agctgagcaa ccggctgcag caggcctcgt acctccacac gtctcgcaat     3060
gcgatgcaga acggggactt caattctggc ctggattcat ggaatgcgac tgctggggcc     3120
accgttcagc aggacggcaa cacccacttc ctggtgctct cccattggga tgcccaagtt     3180
agccagcagt tccgcgtgca gccgaactgc aagtacgtcc tgagggttac tgctgagaag     3240
gtcggcgggg gcgacggcta cgttaccatc cgcgatggcg ctcaccatac agagactctc     3300
accttcaacg cctgcgacta cgatatcaat ggcacgtacg tgacagacaa cacttacctg     3360
accaaggagg ttgtgttcca cccggagacc cagcatatgt gggtcgaggt tagcgagacg     3420
gagggcgtgt tccacctgga cagcgttgag ttcatggaga cccagcagta g              3471
<210>  14
<211>  5919
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический ген Cry
<400>  14
atggacctgg atgggaataa gacagagaca gagaccgaga ttgtgaatgg gagcgagagc       60
agcattgacc cgagcagcgt ttcgtacgct gggaacaata gctactccag cgccctgaac      120
ctcaattcgt gccagaatag gggcatcgct cagtgggtta acacgctggg cggggctatt      180
gggcaggccg tgagcatcgg cacatctatc atttcactcc tggccgcgcc gacactcact      240
gggtctattt cactggcctt caatctcatc aggaggatgg ggaccggctc caacggctcg      300
tctatttccg acctgagcat ctgcgatctc ctgagcatca ttaacctgcg ggtttcgcag      360
gctgtgctca acgacgggat cgctgatttc aatggctccg ttgctgtgta cgacctgtac      420
ctccacgccc tgcgcagctg gaacaataac cctaacgctg ctactgctga ggagctgagg      480
acccgcttca ggatcgccga ttcggagttc gagaggattc tgacgagggg ctcgctcaca      540
catggcggct ccctcgcccg ccaggacgct caggtcctcc tgctcccgtc cttcgttaac      600
gcggcttacc tgcacctgct catcctccgc gatgcttcgc gctacggggc ctcttggggc      660
ctcttcaaca ccacgccgca tatcaattac cccgtgaggc tgcagcagct cattggcagc      720
tacacgcact actgcacaca ttggtacaac caggggctga atgagatccg gcagcgcggc      780
aacactgccg tgaattggct cgagttccac cgctaccgcc gcgacatgac gctgatggtc      840
ctcgatgtgg tctcgctgtt ctctgccctc gacacgatcc gctacccgaa cgctacagtt      900
gtgcagctca gccgcactgt ctacaccgat ccgattggct tcgttaaccg cgggtcaggc      960
aataggctgt cctggttcga ctggaggaac caggcgaatt tctctactct cgagtcagag     1020
atgccgaccc cctcatcccc actgagcctc aaccacatgt cgatcttcac tgggcctctg     1080
accctcccag tgtcccctaa cacgcatagg gcccgggtct ggtacggcaa ccagaatatg     1140
ttcacaactg ggtcacagaa ctccggccag accacgaact ctattcagaa tatctcaggc     1200
ctggagattt tccgcatcga ctctcaggcg tgcaatctca ataacaattc atacggcgtg     1260
aacagggcgg agttcttcca cggggctagc cagggctcgc agcggtctgt ctaccaggga     1320
tacatccgcc agagcggcct ggacaaccct gtcgttatga atctgcagtc tttcctccca     1380
ggcgagaact cagccacccc tacggcgcag gattacaccc acattctgtc caacccggtt     1440
aatatcaggg gcgggctcag gcagattgtg gccgacaggc gctcctccgt ggtcgtttac     1500
ggctggacgc acaagtccct gagcaggagg tcactcgtgg ctccagacca gatcacccag     1560
gtcccagccg ttaaggcgtc cccttcttca cattgcacta tcattgccgg cccaggcttc     1620
accggcgggg acctggtgtc gctccagccc aacggccagc tcgtcatccc gttccaggtt     1680
tctgcgcccg agacgaacta ccacattcgc atctgctacg tctcgacgtc tgattgcagc     1740
attaacacaa tctgcaatga cgagacgcat ctgtccacac tcccgagcac aacttccagc     1800
ctggagaacc tccagtgcaa tcacctgcat tacttcaacg tgggcacttt caagccaacc     1860
atcgactcga agctgacgct cgtcaacaca tctcctaacg ctaacatcat tatcgacaag     1920
atcgagttca tcccggtgga taccgcccag cagcagaacg aggacctcga ggccgcgaag     1980
aaggctgtcg cctccctgtt cacacgcact agggacggcc tccaggtcaa tgttaaggac     2040
taccaggtgg atcaggctgc caacctggtc tcatgcctct ccgacgagca gtacggctac     2100
gataagaaga tgctgctcga ggccgtgagg gctgctaaga ggctgagcag ggagaggaac     2160
ctgctccagg accccgattt caacacaatc aactcgaccg aggagaacgg gtggaaggcg     2220
tcaaatggcg tcaccatctc cgagggcggg ccattctaca agggcagggc tattcagctc     2280
gcgtctgctc gggagaacta ccccacatac atctaccaga aggtggatgc ctccgagctg     2340
aagccataca cccgctaccg cctcgacggc ttcgtcaagt cgtctcagga cctggagatt     2400
gatctcatcc accatcacaa ggtgcacctg gtcaagaacg ttccggacaa tctcgtgagc     2460
atgaacagga acaacccaaa cgagtacgag attattgatg ctccatactg cggctgcccc     2520
tccgatgacg atgtgcgcta ccccctcgcc agcgacccga acgccgcgtt ccagaatatg     2580
aactacaagg agtacctgca gacctacgac ggcgattaca cggggtcact gattaatcca     2640
aacctctcca tcaatcctcg cgacgtcctc cagaccggaa tcaacattgt tggccgcatc     2700
ctcggcttcc tgggcgtgcc gttcgctggc cagctggtta ccttctacac gttcctcctg     2760
aaccagctct ggcctacgaa tgacaacgcg gtgtgggagg ccttcatggc gcagatcgag     2820
gagctgattg atcagaagat ctccgctcag gtggtcagga acgccctcga cgatctgacc     2880
ggcctccacg actactacga ggagtacctg gctgctctcg aggagtggct cgagaggcca     2940
aacggcgctc gcgctaatct ggtcacgcag cgcttcgaga acctccatac cgccttcgtg     3000
acgaggatgc cgagcttcgg gacaggcccc gggtcgcaga gggacgcggt tgctctcctg     3060
actgtgtacg cgcaggcggc taacctgcac ctcctgctcc tgaaggatgc tgagatctac     3120
ggcgctcggt gggggctgca gcagggccag atcaacctct acttcaatgc ccagcaggag     3180
cgcacaagga tctacactaa ccactgcgtt gagacctaca atagggggct cgaggacgtg     3240
cggggcacga acacagagag ctggctgaat taccatcgct tccgcaggga gatgacgctc     3300
atggcgatgg acctcgtggc gctcttcccc tactacaacg tccgccagta cccaaatggc     3360
gccaaccctc agctgacaag ggagatctac actgacccga tcgtgtacaa cccaccagct     3420
aatcagggga tctgcaggcg ctggggcaac aatccctaca acaccttctc tgagctggag     3480
aatgcgttca ttaggccacc tcacctcttc gaccgcctga acaggctcac catctcccgg     3540
aatcgctaca cggctccaac cacgaactcg tacctggatt actggtctgg ccataccctc     3600
cagtcacagt acgcgaacaa tcctacaact tacgagacgt cctacggcca gattacaagc     3660
aacactcgcc tcttcaatac cacgaacggc gctaatgcta tcgacagcag ggcccggaac     3720
ttcgggaatc tgtacgcgaa tctctacggc gtctccagcc tgaacatttt cccaaccggc     3780
gttatgtcag agatcacctc cgcccctaac acgtgctggc aggacctcac aactaccgag     3840
gagctgccac tggtgaacaa taacttcaat ctcctgtccc acgtcacatt cctgaggttc     3900
aacacgacac agggcggccc actcgcgact gttggcttcg tgcccaccta cgtgtggacg     3960
cggcaggacg tcgatttcaa taacatcatt acaccaaacc gcatcactca gattcctgtt     4020
gtgaaggcgt acgagctgtc gtctggcgct acagtcgtta agggcccggg gttcactggc     4080
ggggacgtca ttaggaggac taacaccggc gggttcgggg ctatcagggt gagcgtcaca     4140
ggccccctca ctcagcgcta caggattcgg ttccgctacg cgtcgaccat cgacttcgat     4200
ttcttcgtca cgcgcggcgg gactaccatc aataacttcc ggttcacgcg caccatgaac     4260
aggggccagg agagccggta cgagtcgtac cgcaccgtgg agttcacgac accgttcaac     4320
ttcacacaga gccaggacat cattcgcact tctattcagg gcctgtcagg caacggggag     4380
gtttacctcg accggatcga gatcattcca gtgaacccaa ccagggaggc tgaggaggat     4440
ctcgaggctg cgaagaaggc tgtggcctcg ctgttcacta ggacccggga cggcctccag     4500
gttaatgtga cggactacca ggtggatcag gctgccaacc tggtctcgtg cctctctgac     4560
gagcagtacg ctcacgataa gaagatgctc ctggaggccg tccgcgctgc taagaggctg     4620
tcgagggaga ggaacctcct gcaggaccca gatttcaaca ccattaattc tacggaggag     4680
aacgggtgga aggcgtcgaa tggcgtgacc atctctgagg gcgggccttt ctacaagggc     4740
cgcgctctcc agctggcttc agctagggag aactacccga catacatcta ccagaaggtc     4800
gacgcctccg agctgaagcc ctacacgcgc taccgcctcg atggcttcgt gaagtcatcc     4860
caggacctgg agatcgatct cattcaccat cacaaggtcc acctggttaa gaacgtgctg     4920
gacaatctcg tcagcgatac ctacccggac gattcttgct caggcatcaa tcgctgcgag     4980
gagcagcaga tggtgaacgc ccagctcgag accgagcatc accatccgat ggactgctgc     5040
gaggctgctc agacgcatga gttcagctcg tacatcgaca caggggatct gaactccact     5100
gtggaccagg gcatctgggt catcttcaag gtgcgcacta ccgatgggta cgcgaccctc     5160
ggcaacctcg agctggtcga ggttgggccg ctcctgggcg agccactgga gagggagcag     5220
agggagaacg ctaagtggaa tgctgagctg ggcaggaagc gggctgagac cgaccgcgtc     5280
taccaggatg ctaagcagtc catcaatcac ctgttcgtgg actaccagga tcagcagctc     5340
aacccacaga ttggcatggc tgacatcatg gatgcccaga acctggtcgc gtccatcagc     5400
gacgtctact ctgatgccgt tctccagatc cctggcatta attacgagat ctacacagag     5460
ctgtcaaacc ggctccagca ggcctcctac ctgtacacta gccgcaacgc ggtgcagaat     5520
ggggacttca ataacggcct cgattcctgg aatgctacag ctggggctag cgtccagcag     5580
gacggcaaca ctcacttcct cgttctgtct cattgggatg cccaggtttc acagcagttc     5640
agggtgcagc cgaactgcaa gtatgtgctg agggttaccg ctgagaaggt tggcgggggc     5700
gacggctacg tgacgatcag ggatggcgct caccatacgg agacactgac tttcaacgcc     5760
tgcgactacg atatcaatgg cacctacgtc acggacaaca catacctcac taaggaggtc     5820
ctcttctaca gccacaccga gcatatgtgg gtggaggtca acgagacgga gggcgccttc     5880
cacctcgact cgattgagtt cgtggagacc gagaagtga                            5919
<210>  15
<211>  3468
<212>ДНК
<213>Искусственнаяпоследовательность
<220>
<223>Синтетическийген Cry
<400>  15
atgaatagga ataaccagga cgagtacgag atcattgacg cttcgacttg cgggtgcagc       60
tcagacgatg ttgttcagta ccccctcgct cgcgatccca atgccgtgtt ccagaacatg      120
cactacaagg actacctcca gacatacgac ggcgattaca ctgggtcgct cattaaccca      180
aatctgtcta tcaatcctcg cgacgtcctg cagacgggaa tcaacattgt tgggaggctc      240
ctgggcttcc tcggggttcc gttcgctggc cagctggtga cattctacac tttcctcctg      300
aaccagctct ggcccaccaa cgacaatgcg gtctgggagg ccttcatggc gcagatcgag      360
gagctgatta accagcgcat ctccgaggct gtggtcggca ccgctgctga tcacctcacg      420
gggctgcatg acaactacga gctttacgtg gaggctctcg aggagtggct ggagaggcca      480
aacgctgcta ggacgaacct cctgttcaat aggttcacca cgctcgactc cctgttcaca      540
cagttcatgc catcattcgg gactggcccc ggctcccaga actacgccgt ccctctcctg      600
accgtttacg cgcaggcggc taacctccac ctcctgctcc tgaaggacgc tgagatctac      660
ggcgctcgct gggggctgaa ccagaatcag atcaacagct tccacacaag gcagcaggag      720
cggacccagt actacacgaa tcattgcgtg acaacttaca acaccggcct cgataggctg      780
agggggacca atacggagtc ctggctcaac taccataggt tccgcaggga gatgaccctg      840
atggcgatgg acctcgtggc gctgttcccg tactacaacg tccggcagta cccaaacggc      900
gctaatccac agctcacccg cgagatctac acggacccaa tcgtcttcaa cccaccagct      960
aatgttggcc tgtgcaggcg ctgggggaac aatccttaca atcgcttcag cgagctggag     1020
aacgccttca tcaggccacc tcacctgttc gatcggctca atacactgac tatttcgagg     1080
aaccggttcg acgtcggcag caatttcatc gagccgtggt cgggccatac gctgaggagg     1140
tcctacagca acaattcaac agtgtacgag gattcctacg gccagattac cgctacgagg     1200
accacgatca acctccctgc caatggcaca gggcgggtgg agtctactgc tgtcgacttc     1260
cgctcagccc tggttggcat ctacggggtg aacagggcga gcttcatccc gggcggggtc     1320
ttcagcggca caactcagcc atcgaccggc gggtgcaggg acctctacga ttccagcgac     1380
gagctgccac cagacgagag cacgggctcg ttcgctcaca ggctctctca tgtcacattc     1440
ctgtcattca ccacgaacca ggctggctcg atcgccaatt ctgggagggt tccgacatac     1500
gtgtggactc accgggacgt ggatttcaac aataccatca acccaaatcg catcacgcag     1560
attcctgttg tgaaggcgta cgagctgtcc tccggcgcta ccgtcgttaa gggcccgggg     1620
ttcacgggcg gggacgtgat tcgcaggaca aacatcggcg ggttcggcgc tatcagggtc     1680
tccgttaccg gccccctgac gcagcgctac aggattcggt tccgctacgc ctccactatc     1740
gacttcgatt tcttcgtcac ccggggcggg acaactatca acaatttccg cttcacaagg     1800
actatgaaca ggggccagga gtcacggtac gagtcctacc gcaccgtgga gttcaccacg     1860
cccttcaact tcacgcagtc ccaggacatc attaggacat ccattcaggg cctcagcggc     1920
aacggggagg tttacctgga tcgcatcgag atcattccag tgaaccctac gagggaggct     1980
gaggaggacc tcgaggctgc gaagaaggct gtggctagcc tcttcaccag gacgagggat     2040
ggcctgcaag tgaatgtcac cgattaccag gtggaccagg ctgccaacct cgtctcttgc     2100
ctgtcagatg agcagtacgg ccacgacaag aagatgctcc tggaggccgt ccgcgctgct     2160
aagaggctgt ccagggagag gaacctcctg caggacccag atttcaacac aatcaatagc     2220
actgaggaga atggctggaa ggcgtccaac ggggtgacca tcagcgaggg cgggcctttc     2280
tacaagggcc gcgctctcca gctggcttcg gctagggaga attacccaac ttacatctac     2340
cagaaggtca acgcctctga gctgaagcct tacacgcgct accgcctgga tggcttcgtg     2400
aagtcatccc aggatctcga gatcgacctg attcaccatc acaaggtgca cctcgtcaag     2460
aacgttccgg acaatctggt cagcgatacg tactcggacg gctcgtgctc tgggatgaat     2520
cgctgcgagg agcagcagat ggtgaacgcg cagctcgaga cagagcatca ccatccgatg     2580
gactgctgcg aggccgcgca gactcatgag ttcagctcgt acattaatac cggcgatctg     2640
aactcttcag tcgaccaggg catctgggtg gtcctcaagg ttcgcacaac tgatggctac     2700
gccacgctgg ggaacctcga gctggttgaa gtgggcccac tctccgggga gagcctggag     2760
agggagcaga gggacaacgc gaagtggtcc gctgagctgg gcaggaagcg ggctgagacc     2820
gatagggttt accaggacgc taagcagtcc atcaatcacc tcttcgtgga ttaccaggac     2880
cagcagctga acccggagat tggcatggct gatatcattg acgcccagaa cctcgtcgcg     2940
tcaatctccg atgtctacag cgacgccgtt ctgcagatcc ccggcattaa ttacgagatc     3000
tacacggagc tgtcgaacag gctgcagcag gcctcgtacc tctacacatc tcggaacgcg     3060
gtgcagaatg gcgatttcaa ctctgggctg gactcatgga atgctaccgg cggggctacg     3120
gtgcagcagg atggcaacac ccacttcctc gtcctgtccc attgggacgc tcaggtgagc     3180
cagcagttcc gggtccagcc gaactgcaag tatgtgctga gggtcactgc tgagaaggtt     3240
ggcgggggcg atggctacgt gaccatcagg gacggggctc accatacaga gaagctcact     3300
ttcaacgcct gcgactacga tatcaatggc acctacgtca cggacaacac atacatcact     3360
aaggaggttg tgttctactc gcacactgag catatgtggg tcgaggtttc tgagaccgag     3420
ggcgccttcc acctcgactc aattgagttc gtggagaccg agaagtga                  3468
<210>  16
<211>  1168
<212>БЕЛОК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  16
Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Val Ile Asp Ala Pro His
1               5                   10                  15
Cys Gly Cys Pro Ala Asp Asp Val Val Lys Tyr Pro Leu Thr Asp Asp
20                  25                  30
Pro Asn Ala Gly Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr
35                  40                  45
Tyr Gly Gly Asp Tyr Thr Asp Pro Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Val
50                  55                  60
Ser Gly Lys Asp Val Ile Gln Val Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Leu
65                  70                  75                  80
Leu Ser Phe Phe Gly Phe Pro Phe Ser Ser Gln Trp Val Thr Val Tyr
85                  90                  95
Thr Tyr Leu Leu Asn Ser Leu Trp Pro Asp Asp Glu Asn Ser Val Trp
100                 105                 110
Asp Ala Phe Met Glu Arg Val Glu Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser
115                 120                 125
Glu Ala Val Lys Gly Arg Ala Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu Gln Tyr
130                 135                 140
Asn Tyr Asn Leu Tyr Val Glu Ala Leu Asp Glu Trp Leu Asn Arg Pro
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser Gln Arg Phe Asn Ile Leu Asp
165                 170                 175
Ser Leu Phe Thr Gln Phe Met Pro Ser Phe Gly Ser Gly Pro Gly Ser
180                 185                 190
Gln Asn Tyr Ala Thr Ile Leu Leu Pro Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn
195                 200                 205
Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Asp Ile Tyr Gly Ala Arg Trp
210                 215                 220
Gly Leu Asn Gln Thr Gln Ile Asp Gln Phe His Ser Arg Gln Gln Ser
225                 230                 235                 240
Leu Thr Gln Thr Tyr Thr Asn His Cys Val Thr Ala Tyr Asn Asp Gly
245                 250                 255
Leu Ala Glu Leu Arg Gly Thr Ser Val Ala Ser Trp Leu Lys Tyr His
260                 265                 270
Gln Tyr Arg Arg Glu Met Thr Val Thr Ala Met Asp Leu Val Ala Leu
275                 280                 285
Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln
290                 295                 300
Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Glu
305                 310                 315                 320
Arg Pro Ser Gly Ala Phe Cys Glu Ser Phe Tyr Thr Ile Arg Ala Ala
325                 330                 335
Arg Glu Arg Leu Thr Phe Ser Gln Leu Glu His Ala Ile Ile Arg Pro
340                 345                 350
Pro Arg Leu Phe Glu Arg Phe Gln Ala Leu Gly Ile Tyr Thr Gly Glu
355                 360                 365
Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ser Ala Pro Met Asn Tyr Trp Ile Gly His
370                 375                 380
Phe Ile Arg Asn Thr Arg Leu Gly Asp Ser Thr Thr Ile Thr Thr Asn
385                 390                 395                 400
Tyr Gly Thr Thr Asn Asn Arg Leu Thr Asn Phe Ser Met Pro Ser Asp
405                 410                 415
Val Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Ser Ser Asn Leu Ala Ala Ile Leu Gly
420                 425                 430
Thr Leu Tyr Gly Val Thr Arg Ala Gln Phe His Phe Gly Ser Gly Ser
435                 440                 445
Phe Ser Thr Tyr Val Gly Gln Asn Ser Val Leu Pro Gln Cys His Gln
450                 455                 460
Asn Tyr Asn Ser Ile Glu Glu Leu Pro Asn Gln Ser Asp Glu Pro Thr
465                 470                 475                 480
Val Arg Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Thr Ser Phe Asn Phe
485                 490                 495
Asn Val Gln Leu Asn Asn Pro Leu Ile Ser Ala Gly Asn Met Pro Val
500                 505                 510
Tyr Val Trp Thr His Arg Ser Val Asp Leu Thr Asn Arg Ile Ser Ser
515                 520                 525
Asp Arg Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Ser
530                 535                 540
Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Val Ile
545                 550                 555                 560
Arg Arg Thr Asn Thr Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val Ser Val Thr
565                 570                 575
Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Thr
580                 585                 590
Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr Arg Gly Gly Thr Thr Ile Asn Asn
595                 600                 605
Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Ser Arg Tyr Glu
610                 615                 620
Ser Tyr Arg Thr Val Glu Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Thr Gln Ser
625                 630                 635                 640
Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly Asn Gly Glu
645                 650                 655
Val Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro Thr Arg Glu
660                 665                 670
Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe
675                 680                 685
Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Lys Asp Tyr Gln Val
690                 695                 700
Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Gly
705                 710                 715                 720
Tyr Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu
725                 730                 735
Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn Thr Ile Asn
740                 745                 750
Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser
755                 760                 765
Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala
770                 775                 780
Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asp Ala Ser Glu
785                 790                 795                 800
Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe Val Lys Ser Ser
805                 810                 815
Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val His Leu Val
820                 825                 830
Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Pro Asp Asp Ser
835                 840                 845
Cys Ser Gly Ile Asn Arg Cys Gln Glu Gln Gln Met Val Asn Ala Gln
850                 855                 860
Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys Glu Ala Ala Gln
865                 870                 875                 880
Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asp Thr Gly Asp Leu Asn Ser Thr
885                 890                 895
Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Val Arg Thr Thr Asp Gly
900                 905                 910
Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly Pro Leu Leu
915                 920                 925
Gly Glu Pro Leu Glu Arg Glu Gln Arg Glu Asn Ala Lys Trp Asn Ala
930                 935                 940
Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Val Tyr Gln Asp Ala
945                 950                 955                 960
Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp Gln Gln Leu
965                 970                 975
Asn Pro Glu Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala Gln Asn Leu Val
980                 985                 990
Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser  Asp Ala Val Leu Gln  Ile Pro Gly
995                 1000                 1005
Ile Asn  Tyr Glu Ile Tyr Thr  Glu Leu Ser Asn Arg  Leu Gln Gln
1010                 1015                 1020
Ala Ser  Tyr Leu Tyr Thr Ser  Arg Asn Ala Val Gln  Asn Gly Asp
1025                 1030                 1035
Phe Asn  Asn Gly Leu Asp Ser  Trp Asn Ala Thr Ala  Gly Ala Ser
1040                 1045                 1050
Val Gln  Gln Asp Gly Asn Thr  His Phe Leu Val Leu  Ser His Trp
1055                 1060                 1065
Asp Ala  Gln Val Ser Gln Gln  Phe Arg Val Gln Pro  Asn Cys Lys
1070                 1075                 1080
Tyr Val  Leu Arg Val Thr Ala  Glu Lys Val Gly Gly  Gly Asp Gly
1085                 1090                 1095
Tyr Val  Thr Ile Arg Asp Asp  Ala His His Thr Glu  Thr Leu Thr
1100                 1105                 1110
Phe Asn  Ala Cys Asp Tyr Asp  Ile Asn Gly Thr Tyr  Val Thr Asp
1115                 1120                 1125
Asn Thr  Tyr Leu Thr Lys Glu  Val Val Phe Tyr Ser  His Thr Asp
1130                 1135                 1140
His Met  Trp Val Glu Val Ser  Glu Thr Glu Gly Ala  Phe His Ile
1145                 1150                 1155
Asp Ser  Ile Glu Phe Val Glu  Thr Glu Lys
1160                 1165
<210>  17
<211>  1156
<212>БЕЛОК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  17
Met Asn Gln Asn Lys His Gly Ile Ile Gly Ala Ser Asn Cys Gly Cys
1               5                   10                  15
Ala Ser Asp Asp Val Ala Lys Tyr Pro Leu Ala Asn Asn Pro Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Ala Leu Asn Leu Asn Ser Cys Gln Asn Ser Ser Ile Leu Asn Trp
35                  40                  45
Ile Asn Ile Ile Gly Asp Ala Ala Lys Glu Ala Val Ser Ile Gly Thr
50                  55                  60
Thr Ile Val Ser Leu Ile Thr Ala Pro Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ile Val Tyr Asp Leu Ile Gly Lys Val Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gln
85                  90                  95
Ser Ile Ser Asp Leu Ser Ile Cys Asp Leu Leu Ser Ile Ile Asp Leu
100                 105                 110
Arg Val Ser Gln Ser Val Leu Asn Asp Gly Ile Ala Asp Phe Asn Gly
115                 120                 125
Ser Val Leu Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Leu Asp Ser Trp Asn
130                 135                 140
Lys Asn Pro Asn Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Thr Arg Phe Arg
145                 150                 155                 160
Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asp Arg Ile Leu Thr Arg Gly Ser Leu Thr
165                 170                 175
Asn Gly Gly Ser Leu Ala Arg Gln Asn Ala Gln Ile Leu Leu Leu Pro
180                 185                 190
Ser Phe Ala Ser Ala Ala Phe Phe His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala
195                 200                 205
Thr Arg Tyr Gly Thr Asn Trp Gly Leu Tyr Asn Ala Thr Pro Phe Ile
210                 215                 220
Asn Tyr Gln Ser Lys Leu Val Glu Leu Ile Glu Leu Tyr Thr Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Val His Trp Tyr Asn Arg Gly Phe Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gly
245                 250                 255
Thr Ser Ala Thr Ala Trp Leu Glu Phe His Arg Tyr Arg Arg Glu Met
260                 265                 270
Thr Leu Met Val Leu Asp Ile Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Asp Ile
275                 280                 285
Thr Asn Tyr Pro Ile Glu Thr Asp Phe Gln Leu Ser Arg Val Ile Tyr
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ile Gly Phe Val His Arg Ser Ser Leu Arg Gly Glu Ser
305                 310                 315                 320
Trp Phe Ser Phe Val Asn Arg Ala Asn Phe Ser Asp Leu Glu Asn Ala
325                 330                 335
Ile Pro Asn Pro Arg Pro Ser Trp Phe Leu Asn Asn Met Ile Ile Ser
340                 345                 350
Thr Gly Ser Leu Thr Leu Pro Val Ser Pro Ser Thr Asp Arg Ala Arg
355                 360                 365
Val Trp Tyr Gly Ser Arg Asp Arg Ile Ser Pro Ala Asn Ser Gln Phe
370                 375                 380
Ile Thr Glu Leu Ile Ser Gly Gln His Thr Thr Ala Thr Gln Thr Ile
385                 390                 395                 400
Leu Gly Arg Asn Ile Phe Arg Val Asp Ser Gln Ala Cys Asn Leu Asn
405                 410                 415
Asp Thr Thr Tyr Gly Val Asn Arg Ala Val Phe Tyr His Asp Ala Ser
420                 425                 430
Glu Gly Ser Gln Arg Ser Val Tyr Glu Gly Tyr Ile Arg Thr Thr Gly
435                 440                 445
Ile Asp Asn Pro Arg Val Gln Asn Ile Asn Thr Tyr Leu Pro Gly Glu
450                 455                 460
Asn Ser Asp Ile Pro Thr Pro Glu Asp Tyr Thr His Ile Leu Ser Thr
465                 470                 475                 480
Thr Ile Asn Leu Thr Gly Gly Leu Arg Gln Val Ala Ser Asn Arg Arg
485                 490                 495
Ser Ser Leu Val Met Tyr Gly Trp Thr His Lys Ser Leu Ala Arg Asn
500                 505                 510
Asn Thr Ile Asn Pro Asp Arg Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Val
515                 520                 525
Asp Thr Arg Gly Thr Gly Val Ser Tyr Val Asn Asp Pro Gly Phe Ile
530                 535                 540
Gly Gly Ala Leu Leu Gln Arg Thr Asp His Gly Ser Leu Gly Val Leu
545                 550                 555                 560
Arg Val Gln Phe Pro Leu His Leu Arg Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Val
565                 570                 575
Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Ile Arg Leu Ser Val Asn Gly Ser Phe
580                 585                 590
Gly Thr Ile Ser Gln Asn Leu Pro Ser Thr Met Arg Leu Gly Glu Asp
595                 600                 605
Leu Arg Tyr Gly Ser Phe Ala Ile Arg Glu Phe Asn Thr Ser Ile Arg
610                 615                 620
Pro Thr Ala Ser Pro Asp Gln Ile Arg Leu Thr Ile Glu Pro Ser Phe
625                 630                 635                 640
Ile Arg Gln Glu Val Tyr Val Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asn
645                 650                 655
Pro Thr Arg Glu Ala Lys Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val
660                 665                 670
Ala Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Lys
675                 680                 685
Asp Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp
690                 695                 700
Glu Gln Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala
705                 710                 715                 720
Ala Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe
725                 730                 735
Asn Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly
740                 745                 750
Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Ile Gln
755                 760                 765
Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val
770                 775                 780
Asp Ala Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe
785                 790                 795                 800
Val Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys
805                 810                 815
Val His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Leu Asp Thr Tyr
820                 825                 830
Pro Asp Asp Ser Cys Asn Gly Ile Asn Arg Cys Asp Glu Gln Lys Met
835                 840                 845
Val Asn Ala Gln Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys
850                 855                 860
Glu Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp
865                 870                 875                 880
Leu Asn Ala Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg
885                 890                 895
Thr Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val
900                 905                 910
Gly Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala
915                 920                 925
Lys Trp Ser Ala Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Glu Arg Val
930                 935                 940
Tyr Tyr Ala Ala Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Arg
945                 950                 955                 960
Asp Gln Gln Leu Asn Pro Gln Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala
965                 970                 975
Gln Asn Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu
980                 985                 990
Gln Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu  Ile Tyr Thr Glu Leu  Ser Asn Arg
995                 1000                 1005
Leu Gln  Gln Ala Ser Tyr Leu  His Met Ser Arg Asn  Ala Met Gln
1010                 1015                 1020
Asn Gly  Asp Phe Asn Ser Gly  Leu Asp Ser Trp Asn  Ala Thr Ala
1025                 1030                 1035
Gly Ala  Thr Val Gln Gln Asp  Gly Asn Thr His Phe  Leu Val Leu
1040                 1045                 1050
Ser His  Trp Asp Ala Gln Val  Ser Gln Gln Phe Arg  Val Gln Pro
1055                 1060                 1065
Asn Cys  Lys Tyr Val Leu Arg  Val Thr Ala Glu Lys  Val Gly Gly
1070                 1075                 1080
Gly Asp  Gly Tyr Val Thr Ile  Arg Asp Gly Ala His  His Thr Glu
1085                 1090                 1095
Thr Leu  Thr Phe Asn Ala Cys  Asp Tyr Asp Ile Asn  Gly Thr Tyr
1100                 1105                 1110
Val Thr  Asp Asn Thr Tyr Leu  Thr Lys Glu Val Val  Phe His Pro
1115                 1120                 1125
Glu Thr  Gln His Met Trp Val  Glu Val Ser Glu Thr  Glu Gly Val
1130                 1135                 1140
Phe His  Ile Asp Ser Val Glu  Phe Met Glu Thr Gln  Gln
1145                 1150                 1155
<210>  18
<211>  1156
<212>БЕЛОК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  18
Met Asn Gln Asn Lys His Gly Ile Ile Gly Ala Ser Asn Cys Gly Cys
1               5                   10                  15
Ala Ser Asp Asp Val Ala Lys Tyr Pro Leu Ala Asn Asn Pro Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Ala Leu Asn Leu Asn Ser Cys Gln Asn Ser Ser Ile Leu Asn Trp
35                  40                  45
Ile Asn Ile Ile Gly Asp Ala Ala Lys Glu Ala Val Ser Ile Gly Thr
50                  55                  60
Thr Ile Val Ser Leu Ile Thr Ala Pro Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ile Val Tyr Asp Leu Ile Gly Lys Val Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gln
85                  90                  95
Ser Ile Ser Asp Leu Ser Ile Cys Asp Leu Leu Ser Ile Ile Asp Leu
100                 105                 110
Arg Val Ser Gln Ser Val Leu Asn Asp Gly Ile Ala Asp Phe Asn Gly
115                 120                 125
Ser Val Leu Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Leu Asp Ser Trp Asn
130                 135                 140
Lys Asn Pro Asn Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Thr Arg Phe Arg
145                 150                 155                 160
Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asp Arg Ile Leu Thr Arg Gly Ser Leu Thr
165                 170                 175
Asn Gly Gly Ser Leu Ala Arg Gln Asn Ala Gln Ile Leu Leu Leu Pro
180                 185                 190
Ser Phe Ala Ser Ala Ala Phe Phe His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala
195                 200                 205
Thr Arg Tyr Gly Thr Asn Trp Gly Leu Tyr Asn Ala Thr Pro Phe Ile
210                 215                 220
Asn Tyr Gln Ser Lys Leu Val Glu Leu Ile Glu Leu Tyr Thr Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Val His Trp Tyr Asn Arg Gly Phe Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gly
245                 250                 255
Thr Ser Ala Thr Ala Trp Leu Glu Phe His Arg Tyr Arg Arg Glu Met
260                 265                 270
Thr Leu Met Val Leu Asp Ile Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Asp Ile
275                 280                 285
Thr Asn Tyr Pro Ile Glu Thr Asp Phe Gln Leu Ser Arg Val Ile Tyr
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ile Gly Phe Val His Arg Ser Ser Leu Arg Gly Glu Ser
305                 310                 315                 320
Trp Phe Ser Phe Val Asn Arg Ala Asn Phe Ser Asp Leu Glu Asn Ala
325                 330                 335
Ile Pro Asn Pro Arg Pro Ser Trp Phe Leu Asn Asn Met Ile Ile Ser
340                 345                 350
Thr Gly Ser Leu Thr Leu Pro Val Ser Pro Ser Thr Asp Arg Ala Arg
355                 360                 365
Val Trp Tyr Gly Ser Arg Asp Arg Ile Ser Pro Ala Asn Ser Gln Phe
370                 375                 380
Ile Thr Glu Leu Ile Ser Gly Gln His Thr Thr Ala Thr Gln Thr Ile
385                 390                 395                 400
Leu Gly Arg Asn Ile Phe Arg Val Asp Ser Gln Ala Cys Asn Leu Asn
405                 410                 415
Asp Thr Thr Tyr Gly Val Asn Arg Ala Val Phe Tyr His Asp Ala Ser
420                 425                 430
Glu Gly Ser Gln Arg Ser Val Tyr Glu Gly Tyr Ile Arg Thr Thr Gly
435                 440                 445
Ile Asp Asn Pro Arg Val Gln Asn Ile Asn Thr Tyr Leu Pro Gly Glu
450                 455                 460
Asn Ser Asp Ile Pro Thr Pro Glu Asp Tyr Thr His Ile Leu Ser Thr
465                 470                 475                 480
Thr Ile Asn Leu Thr Gly Gly Leu Arg Gln Val Ala Ser Asn Arg Arg
485                 490                 495
Ser Ser Leu Val Met Tyr Gly Trp Thr His Lys Ser Leu Ala Arg Asn
500                 505                 510
Asn Thr Ile Asn Pro Asp Arg Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Val
515                 520                 525
Asp Thr Arg Gly Thr Gly Val Ser Tyr Val Asn Asp Pro Gly Phe Ile
530                 535                 540
Gly Gly Ala Leu Leu Gln Arg Thr Asp His Gly Ser Leu Gly Val Leu
545                 550                 555                 560
Arg Val Gln Phe Pro Leu His Leu Arg Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Val
565                 570                 575
Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Ile Arg Leu Ser Val Asn Gly Ser Phe
580                 585                 590
Gly Thr Ile Ser Gln Asn Leu Pro Ser Thr Met Arg Leu Gly Glu Asp
595                 600                 605
Leu Arg Tyr Gly Ser Phe Ala Ile Arg Glu Phe Asn Thr Ser Ile Arg
610                 615                 620
Pro Thr Ala Ser Pro Asp Gln Ile Arg Leu Thr Ile Glu Pro Ser Phe
625                 630                 635                 640
Ile Arg Gln Glu Val Tyr Val Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asn
645                 650                 655
Pro Thr Arg Glu Ala Lys Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val
660                 665                 670
Ala Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Lys
675                 680                 685
Asp Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp
690                 695                 700
Glu Gln Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala
705                 710                 715                 720
Ala Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe
725                 730                 735
Asn Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly
740                 745                 750
Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Ile Gln
755                 760                 765
Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val
770                 775                 780
Asp Ala Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe
785                 790                 795                 800
Val Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys
805                 810                 815
Val His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Leu Asp Thr Tyr
820                 825                 830
Pro Asp Asp Ser Cys Asn Gly Ile Asn Arg Cys Asp Glu Gln Lys Met
835                 840                 845
Val Asn Ala Gln Leu Glu Thr Gly His His His Pro Met Asp Cys Cys
850                 855                 860
Glu Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp
865                 870                 875                 880
Leu Asn Ala Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg
885                 890                 895
Thr Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val
900                 905                 910
Gly Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala
915                 920                 925
Lys Trp Ser Ala Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Glu Arg Val
930                 935                 940
Tyr Tyr Ala Ala Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln
945                 950                 955                 960
Asp Gln Gln Leu Asn Pro Gln Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala
965                 970                 975
Gln Asn Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu
980                 985                 990
Gln Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu  Ile Tyr Thr Glu Leu  Ser Asn Arg
995                 1000                 1005
Leu Gln  Gln Ala Ser Tyr Leu  His Thr Ser Arg Asn  Ala Met Gln
1010                 1015                 1020
Asn Gly  Asp Phe Asn Ser Gly  Leu Asp Ser Trp Asn  Ala Thr Ala
1025                 1030                 1035
Gly Ala  Thr Val Gln Gln Asp  Gly Asn Thr His Phe  Leu Val Leu
1040                 1045                 1050
Ser His  Trp Asp Ala Gln Val  Ser Gln Gln Phe Arg  Val Gln Pro
1055                 1060                 1065
Asn Cys  Lys Tyr Val Leu Arg  Val Thr Ala Glu Lys  Val Gly Gly
1070                 1075                 1080
Gly Asp  Gly Tyr Val Thr Ile  Arg Asp Gly Ala His  His Thr Glu
1085                 1090                 1095
Thr Leu  Thr Phe Asn Ala Cys  Asp Tyr Asp Ile Asn  Gly Thr Tyr
1100                 1105                 1110
Val Thr  Asp Asn Thr Tyr Leu  Thr Lys Glu Val Val  Phe His Pro
1115                 1120                 1125
Glu Thr  Gln His Met Trp Val  Glu Val Ser Glu Thr  Glu Gly Val
1130                 1135                 1140
Phe His  Ile Asp Ser Val Glu  Phe Met Glu Thr Gln  Gln
1145                 1150                 1155
<210>  19
<211>  1152
<212>БЕЛОК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  19
Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr
1               5                   10                  15
Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp
20                  25                  30
Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr
35                  40                  45
Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile
50                  55                  60
Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile
65                  70                  75                  80
Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp
100                 105                 110
Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser
115                 120                 125
Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp
130                 135                 140
Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His
165                 170                 175
Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser
180                 185                 190
Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn
195                 200                 205
Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp
210                 215                 220
Gly Leu Gln Gln Gly Gln Ile Asn Leu Tyr Phe Asn Ala Gln Gln Glu
225                 230                 235                 240
Arg Thr Arg Ile Tyr Thr Asn His Cys Val Glu Thr Tyr Asn Arg Gly
245                 250                 255
Leu Glu Asp Val Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His
260                 265                 270
Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu
275                 280                 285
Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln
290                 295                 300
Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala
305                 310                 315                 320
Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe
325                 330                 335
Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg
340                 345                 350
Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr
355                 360                 365
Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Gln Ser Gln Tyr
370                 375                 380
Ala Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Glu Thr Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ser
385                 390                 395                 400
Asn Thr Arg Leu Phe Asn Thr Thr Asn Gly Ala Asn Ala Ile Asp Ser
405                 410                 415
Arg Ala Arg Asn Phe Gly Asn Leu Tyr Ala Asn Leu Tyr Gly Val Ser
420                 425                 430
Ser Leu Asn Ile Phe Pro Thr Gly Val Met Ser Glu Ile Thr Ser Ala
435                 440                 445
Pro Asn Thr Cys Trp Gln Asp Leu Thr Thr Thr Glu Glu Leu Pro Leu
450                 455                 460
Val Asn Asn Asn Phe Asn Leu Leu Ser His Val Thr Phe Leu Arg Phe
465                 470                 475                 480
Asn Thr Thr Gln Gly Gly Pro Leu Ala Thr Val Gly Phe Val Pro Thr
485                 490                 495
Tyr Val Trp Thr Arg Gln Asp Val Asp Phe Asn Asn Ile Ile Thr Pro
500                 505                 510
Asn Arg Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Ser
515                 520                 525
Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Val Ile
530                 535                 540
Arg Arg Thr Asn Thr Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val Ser Val Thr
545                 550                 555                 560
Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Thr
565                 570                 575
Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr Arg Gly Gly Thr Thr Ile Asn Asn
580                 585                 590
Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Ser Arg Tyr Glu
595                 600                 605
Ser Tyr Arg Thr Val Glu Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Thr Gln Ser
610                 615                 620
Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly Asn Gly Glu
625                 630                 635                 640
Val Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro Thr Arg Glu
645                 650                 655
Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe
660                 665                 670
Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp Tyr Gln Val
675                 680                 685
Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Ala
690                 695                 700
His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu
705                 710                 715                 720
Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn Thr Ile Asn
725                 730                 735
Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser
740                 745                 750
Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala
755                 760                 765
Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asp Ala Ser Glu
770                 775                 780
Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe Val Lys Ser Ser
785                 790                 795                 800
Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val His Leu Val
805                 810                 815
Lys Asn Val Leu Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Pro Asp Asp Ser
820                 825                 830
Cys Ser Gly Ile Asn Arg Cys Glu Glu Gln Gln Met Val Asn Ala Gln
835                 840                 845
Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys Glu Ala Ala Gln
850                 855                 860
Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asp Thr Gly Asp Leu Asn Ser Thr
865                 870                 875                 880
Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Val Arg Thr Thr Asp Gly
885                 890                 895
Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly Pro Leu Leu
900                 905                 910
Gly Glu Pro Leu Glu Arg Glu Gln Arg Glu Asn Ala Lys Trp Asn Ala
915                 920                 925
Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Val Tyr Gln Asp Ala
930                 935                 940
Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp Gln Gln Leu
945                 950                 955                 960
Asn Pro Gln Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala Gln Asn Leu Val
965                 970                 975
Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu Gln Ile Pro Gly
980                 985                 990
Ile Asn Tyr Glu Ile Tyr Thr Glu  Leu Ser Asn Arg Leu  Gln Gln Ala
995                 1000                 1005
Ser Tyr  Leu Tyr Thr Ser Arg  Asn Ala Val Gln Asn  Gly Asp Phe
1010                 1015                 1020
Asn Asn  Gly Leu Asp Ser Trp  Asn Ala Thr Ala Gly  Ala Ser Val
1025                 1030                 1035
Gln Gln  Asp Gly Asn Thr His  Phe Leu Val Leu Ser  His Trp Asp
1040                 1045                 1050
Ala Gln  Val Ser Gln Gln Phe  Arg Val Gln Pro Asn  Cys Lys Tyr
1055                 1060                 1065
Val Leu  Arg Val Thr Ala Glu  Lys Val Gly Gly Gly  Asp Gly Tyr
1070                 1075                 1080
Val Thr  Ile Arg Asp Gly Ala  His His Thr Glu Thr  Leu Thr Phe
1085                 1090                 1095
Asn Ala  Cys Asp Tyr Asp Ile  Asn Gly Thr Tyr Val  Thr Asp Asn
1100                 1105                 1110
Thr Tyr  Leu Thr Lys Glu Val  Ile Phe Tyr Ser His  Thr Glu His
1115                 1120                 1125
Met Trp  Val Glu Val Asn Glu  Thr Glu Gly Ala Phe  His Ile Asp
1130                 1135                 1140
Ser Ile  Glu Phe Val Glu Thr  Glu Lys
1145                 1150
<210>  20
<211>  1155
<212>БЕЛОК
<213>  Bacillus thuringiensis
<400>  20
Met Asn Arg Asn Asn Gln Asp Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Ser Thr
1               5                   10                  15
Cys Gly Cys Ser Ser Asp Asp Val Val Gln Tyr Pro Leu Ala Arg Asp
20                  25                  30
Pro Asn Ala Val Phe Gln Asn Met His Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Thr
35                  40                  45
Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile
50                  55                  60
Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Leu
65                  70                  75                  80
Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp
100                 105                 110
Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Ser
115                 120                 125
Glu Ala Val Val Gly Thr Ala Ala Asp His Leu Thr Gly Leu His Asp
130                 135                 140
Asn Tyr Glu Leu Tyr Val Glu Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Ala Arg Thr Asn Leu Leu Phe Asn Arg Phe Thr Thr Leu Asp
165                 170                 175
Ser Leu Phe Thr Gln Phe Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser
180                 185                 190
Gln Asn Tyr Ala Val Pro Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn
195                 200                 205
Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp
210                 215                 220
Gly Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asn Ser Phe His Thr Arg Gln Gln Glu
225                 230                 235                 240
Arg Thr Gln Tyr Tyr Thr Asn His Cys Val Thr Thr Tyr Asn Thr Gly
245                 250                 255
Leu Asp Arg Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His
260                 265                 270
Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu
275                 280                 285
Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln
290                 295                 300
Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala
305                 310                 315                 320
Asn Val Gly Leu Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Arg Phe
325                 330                 335
Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg
340                 345                 350
Leu Asn Thr Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Phe Asp Val Gly Ser Asn
355                 360                 365
Phe Ile Glu Pro Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Ser Asn
370                 375                 380
Asn Ser Thr Val Tyr Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ala Thr Arg
385                 390                 395                 400
Thr Thr Ile Asn Leu Pro Ala Asn Gly Thr Gly Arg Val Glu Ser Thr
405                 410                 415
Ala Val Asp Phe Arg Ser Ala Leu Val Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg
420                 425                 430
Ala Ser Phe Ile Pro Gly Gly Val Phe Ser Gly Thr Thr Gln Pro Ser
435                 440                 445
Thr Gly Gly Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Pro
450                 455                 460
Asp Glu Ser Thr Gly Ser Phe Ala His Arg Leu Ser His Val Thr Phe
465                 470                 475                 480
Leu Ser Phe Thr Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ser Gly Arg
485                 490                 495
Val Pro Thr Tyr Val Trp Thr His Arg Asp Val Asp Phe Asn Asn Thr
500                 505                 510
Ile Asn Pro Asn Arg Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys Ala Tyr Glu
515                 520                 525
Leu Ser Ser Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly
530                 535                 540
Asp Val Ile Arg Arg Thr Asn Ile Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val
545                 550                 555                 560
Ser Val Thr Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr
565                 570                 575
Ala Ser Thr Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr Arg Gly Gly Thr Thr
580                 585                 590
Ile Asn Asn Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Ser
595                 600                 605
Arg Tyr Glu Ser Tyr Arg Thr Val Glu Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe
610                 615                 620
Thr Gln Ser Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly
625                 630                 635                 640
Asn Gly Glu Val Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro
645                 650                 655
Thr Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Ala
660                 665                 670
Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp
675                 680                 685
Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu
690                 695                 700
Gln Tyr Gly His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala
705                 710                 715                 720
Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn
725                 730                 735
Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val
740                 745                 750
Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu
755                 760                 765
Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asn
770                 775                 780
Ala Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe Val
785                 790                 795                 800
Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val
805                 810                 815
His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Ser
820                 825                 830
Asp Gly Ser Cys Ser Gly Met Asn Arg Cys Glu Glu Gln Gln Met Val
835                 840                 845
Asn Ala Gln Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys Glu
850                 855                 860
Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp Leu
865                 870                 875                 880
Asn Ser Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg Thr
885                 890                 895
Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly
900                 905                 910
Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala Lys
915                 920                 925
Trp Ser Ala Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Val Tyr
930                 935                 940
Gln Asp Ala Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp
945                 950                 955                 960
Gln Gln Leu Asn Pro Glu Ile Gly Met Ala Asp Ile Ile Asp Ala Gln
965                 970                 975
Asn Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu Gln
980                 985                 990
Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu Ile  Tyr Thr Glu Leu Ser  Asn Arg Leu
995                 1000                 1005
Gln Gln  Ala Ser Tyr Leu Tyr  Thr Ser Arg Asn Ala  Val Gln Asn
1010                 1015                 1020
Gly Asp  Phe Asn Ser Gly Leu  Asp Ser Trp Asn Ala  Thr Gly Gly
1025                 1030                 1035
Ala Thr  Val Gln Gln Asp Gly  Asn Thr His Phe Leu  Val Leu Ser
1040                 1045                 1050
His Trp  Asp Ala Gln Val Ser  Gln Gln Phe Arg Val  Gln Pro Asn
1055                 1060                 1065
Cys Lys  Tyr Val Leu Arg Val  Thr Ala Glu Lys Val  Gly Gly Gly
1070                 1075                 1080
Asp Gly  Tyr Val Thr Ile Arg  Asp Gly Ala His His  Thr Glu Lys
1085                 1090                 1095
Leu Thr  Phe Asn Ala Cys Asp  Tyr Asp Ile Asn Gly  Thr Tyr Val
1100                 1105                 1110
Thr Asp  Asn Thr Tyr Leu Thr  Lys Glu Val Val Phe  Tyr Ser His
1115                 1120                 1125
Thr Glu  His Met Trp Val Glu  Val Ser Glu Thr Glu  Gly Ala Phe
1130                 1135                 1140
His Ile  Asp Ser Ile Glu Phe  Val Glu Thr Glu Lys
1145                 1150                 1155
<210>  21
<211>  1168
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантный BT-0009
<400>  21
Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Val Ile Asp Ala Pro His
1               5                   10                  15
Cys Gly Cys Pro Ala Asp Asp Val Val Lys Tyr Pro Leu Thr Asp Asp
20                  25                  30
Pro Asn Ala Gly Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr
35                  40                  45
Tyr Gly Gly Asp Tyr Thr Asp Pro Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Val
50                  55                  60
Ser Gly Lys Asp Val Ile Gln Val Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Leu
65                  70                  75                  80
Leu Ser Phe Phe Gly Phe Pro Phe Ser Ser Gln Trp Val Thr Val Tyr
85                  90                  95
Thr Tyr Leu Leu Asn Ser Leu Trp Pro Asp Asp Glu Asn Ser Val Trp
100                 105                 110
Asp Ala Phe Met Glu Arg Val Glu Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser
115                 120                 125
Glu Ala Val Lys Gly Arg Ala Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu Gln Tyr
130                 135                 140
Asn Tyr Asn Leu Tyr Val Glu Ala Leu Asp Glu Trp Leu Asn Arg Pro
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser Gln Arg Phe Asn Ile Leu Asp
165                 170                 175
Ser Leu Phe Thr Gln Phe Met Pro Ser Phe Gly Ser Gly Pro Gly Ser
180                 185                 190
Gln Asn Tyr Ala Thr Ile Leu Leu Pro Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn
195                 200                 205
Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Asp Ile Tyr Gly Ala Arg Trp
210                 215                 220
Gly Leu Asn Gln Thr Gln Ile Asp Gln Phe His Ser Arg Gln Gln Ser
225                 230                 235                 240
Leu Thr Gln Thr Tyr Thr Asn His Cys Val Thr Ala Tyr Asn Asp Gly
245                 250                 255
Leu Ala Glu Leu Arg Gly Thr Ser Val Ala Ser Trp Leu Lys Tyr His
260                 265                 270
Gln Tyr Arg Arg Glu Met Thr Val Thr Ala Met Asp Leu Val Ala Leu
275                 280                 285
Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln
290                 295                 300
Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Glu
305                 310                 315                 320
Arg Pro Ser Gly Ala Phe Cys Glu Ser Phe Tyr Thr Ile Arg Ala Ala
325                 330                 335
Arg Glu Arg Leu Thr Phe Ser Gln Leu Glu His Ala Ile Ile Arg Pro
340                 345                 350
Pro Arg Leu Phe Glu Arg Phe Gln Ala Leu Gly Ile Tyr Thr Gly Glu
355                 360                 365
Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ser Ala Pro Met Asn Tyr Trp Ile Gly His
370                 375                 380
Phe Ile Arg Asn Thr Arg Leu Gly Asp Ser Thr Thr Ile Thr Thr Asn
385                 390                 395                 400
Tyr Gly Thr Thr Asn Asn Arg Leu Thr Asn Phe Ser Met Pro Ser Asp
405                 410                 415
Val Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Ser Ser Asn Leu Ala Ala Ile Leu Gly
420                 425                 430
Thr Leu Tyr Gly Val Thr Arg Ala Gln Phe His Phe Gly Ser Gly Ser
435                 440                 445
Phe Ser Thr Tyr Val Gly Gln Asn Ser Val Leu Pro Gln Cys His Gln
450                 455                 460
Asn Tyr Asn Ser Ile Glu Glu Leu Pro Asn Gln Ser Asp Glu Pro Thr
465                 470                 475                 480
Val Arg Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Thr Ser Phe Asn Phe
485                 490                 495
Asn Val Gln Leu Asn Asn Pro Leu Ile Ser Ala Gly Asn Met Pro Val
500                 505                 510
Tyr Val Trp Thr His Arg Ser Val Asp Leu Thr Asn Arg Ile Ser Ser
515                 520                 525
Asp Arg Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Ser
530                 535                 540
Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Val Ile
545                 550                 555                 560
Arg Arg Thr Asn Thr Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val Ser Val Thr
565                 570                 575
Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Thr
580                 585                 590
Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr Arg Gly Gly Thr Thr Ile Asn Asn
595                 600                 605
Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Ser Arg Tyr Glu
610                 615                 620
Ser Tyr Arg Thr Val Glu Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Thr Gln Ser
625                 630                 635                 640
Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly Asn Gly Glu
645                 650                 655
Val Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro Thr Arg Glu
660                 665                 670
Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe
675                 680                 685
Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Lys Asp Tyr Gln Val
690                 695                 700
Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Gly
705                 710                 715                 720
Tyr Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu
725                 730                 735
Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn Thr Ile Asn
740                 745                 750
Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser
755                 760                 765
Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala
770                 775                 780
Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asp Ala Ser Glu
785                 790                 795                 800
Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe Val Lys Ser Ser
805                 810                 815
Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val His Leu Val
820                 825                 830
Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Pro Asp Asp Ser
835                 840                 845
Cys Ser Gly Ile Asn Arg Cys Gln Glu Gln Gln Met Val Asn Ala Gln
850                 855                 860
Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys Glu Ala Ala Gln
865                 870                 875                 880
Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asp Thr Gly Asp Leu Asn Ser Thr
885                 890                 895
Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Val Arg Thr Thr Asp Gly
900                 905                 910
Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly Pro Leu Leu
915                 920                 925
Gly Glu Pro Leu Glu Arg Glu Gln Arg Glu Asn Ala Lys Trp Asn Ala
930                 935                 940
Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Val Tyr Gln Asp Ala
945                 950                 955                 960
Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp Gln Gln Leu
965                 970                 975
Asn Pro Glu Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala Gln Asn Leu Val
980                 985                 990
Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser  Asp Ala Val Leu Gln  Ile Pro Gly
995                 1000                 1005
Ile Asn  Tyr Glu Ile Tyr Thr  Glu Leu Ser Asn Arg  Leu Gln Gln
1010                 1015                 1020
Ala Ser  Tyr Leu Tyr Thr Ser  Arg Asn Ala Val Gln  Asn Gly Asp
1025                 1030                 1035
Phe Asn  Asn Gly Leu Asp Ser  Trp Asn Ala Thr Ala  Gly Ala Ser
1040                 1045                 1050
Val Gln  Gln Asp Gly Asn Thr  His Phe Leu Val Leu  Ser His Trp
1055                 1060                 1065
Asp Ala  Gln Val Ser Gln Gln  Phe Arg Val Gln Pro  Asn Cys Lys
1070                 1075                 1080
Tyr Val  Leu Arg Val Thr Ala  Glu Lys Val Gly Gly  Gly Asp Gly
1085                 1090                 1095
Tyr Val  Thr Ile Arg Asp Asp  Ala His His Thr Glu  Thr Leu Thr
1100                 1105                 1110
Phe Asn  Ala Cys Asp Tyr Asp  Ile Asn Gly Thr Tyr  Val Thr Asp
1115                 1120                 1125
Asn Thr  Tyr Ile Thr Lys Glu  Val Val Phe Tyr Ser  His Thr Asp
1130                 1135                 1140
His Met  Trp Val Glu Val Ser  Glu Thr Glu Gly Ala  Phe His Ile
1145                 1150                 1155
Asp Ser  Leu Glu Phe Val Glu  Thr Glu Lys
1160                 1165
<210>  22
<211>  1156
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантный BT-0012
<400>  22
Met Asn Gln Asn Lys His Gly Ile Ile Gly Ala Ser Asn Cys Gly Cys
1               5                   10                  15
Ala Ser Asp Asp Val Ala Lys Tyr Pro Leu Ala Asn Asn Pro Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Ala Leu Asn Leu Asn Ser Cys Gln Asn Ser Ser Ile Leu Asn Trp
35                  40                  45
Ile Asn Ile Ile Gly Asp Ala Ala Lys Glu Ala Val Ser Ile Gly Thr
50                  55                  60
Thr Ile Val Ser Leu Ile Thr Ala Pro Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ile Val Tyr Asp Leu Ile Gly Lys Val Ile Gly Gly Ser Ser Gly Gln
85                  90                  95
Ser Ile Ser Asp Leu Ser Ile Cys Asp Leu Leu Ser Ile Ile Asp Leu
100                 105                 110
Arg Val Ser Gln Ser Val Leu Asn Asp Gly Ile Ala Asp Phe Asn Gly
115                 120                 125
Ser Val Leu Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Leu Asp Ser Trp Asn
130                 135                 140
Lys Asn Pro Asn Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Thr Arg Phe Arg
145                 150                 155                 160
Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asp Arg Ile Leu Thr Arg Gly Ser Leu Thr
165                 170                 175
Asn Gly Gly Ser Leu Ala Arg Gln Asn Ala Gln Ile Leu Leu Leu Pro
180                 185                 190
Ser Phe Ala Ser Ala Ala Phe Phe His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala
195                 200                 205
Thr Arg Tyr Gly Thr Asn Trp Gly Leu Tyr Asn Ala Thr Pro Phe Ile
210                 215                 220
Asn Tyr Gln Ser Lys Leu Val Glu Leu Ile Glu Leu Tyr Thr Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Val His Trp Tyr Asn Arg Gly Phe Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gly
245                 250                 255
Thr Ser Ala Thr Ala Trp Leu Glu Phe His Arg Tyr Arg Arg Glu Met
260                 265                 270
Thr Leu Met Val Leu Asp Ile Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Asp Ile
275                 280                 285
Thr Asn Tyr Pro Ile Glu Thr Asp Phe Gln Leu Ser Arg Val Ile Tyr
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ile Gly Phe Val His Arg Ser Ser Leu Arg Gly Glu Ser
305                 310                 315                 320
Trp Phe Ser Phe Val Asn Arg Ala Asn Phe Ser Asp Leu Glu Asn Ala
325                 330                 335
Ile Pro Asn Pro Arg Pro Ser Trp Phe Leu Asn Asn Met Ile Ile Ser
340                 345                 350
Thr Gly Ser Leu Thr Leu Pro Val Ser Pro Ser Thr Asp Arg Ala Arg
355                 360                 365
Val Trp Tyr Gly Ser Arg Asp Arg Ile Ser Pro Ala Asn Ser Gln Phe
370                 375                 380
Ile Thr Glu Leu Ile Ser Gly Gln His Thr Thr Ala Thr Gln Thr Ile
385                 390                 395                 400
Leu Gly Arg Asn Ile Phe Arg Val Asp Ser Gln Ala Cys Asn Leu Asn
405                 410                 415
Asp Thr Thr Tyr Gly Val Asn Arg Ala Val Phe Tyr His Asp Ala Ser
420                 425                 430
Glu Gly Ser Gln Arg Ser Val Tyr Glu Gly Tyr Ile Arg Thr Thr Gly
435                 440                 445
Ile Asp Asn Pro Arg Val Gln Asn Ile Asn Thr Tyr Leu Pro Gly Glu
450                 455                 460
Asn Ser Asp Ile Pro Thr Pro Glu Asp Tyr Thr His Ile Leu Ser Thr
465                 470                 475                 480
Thr Ile Asn Leu Thr Gly Gly Leu Arg Gln Val Ala Ser Asn Arg Arg
485                 490                 495
Ser Ser Leu Val Met Tyr Gly Trp Thr His Lys Ser Leu Ala Arg Asn
500                 505                 510
Asn Thr Ile Asn Pro Asp Arg Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Val
515                 520                 525
Asp Thr Arg Gly Thr Gly Val Ser Tyr Val Asn Asp Pro Gly Phe Ile
530                 535                 540
Gly Gly Ala Leu Leu Gln Arg Thr Asp His Gly Ser Leu Gly Val Leu
545                 550                 555                 560
Arg Val Gln Phe Pro Leu His Leu Arg Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Val
565                 570                 575
Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Ile Arg Leu Ser Val Asn Gly Ser Phe
580                 585                 590
Gly Thr Ile Ser Gln Asn Leu Pro Ser Thr Met Arg Leu Gly Glu Asp
595                 600                 605
Leu Arg Tyr Gly Ser Phe Ala Ile Arg Glu Phe Asn Thr Ser Ile Arg
610                 615                 620
Pro Thr Ala Ser Pro Asp Gln Ile Arg Leu Thr Ile Glu Pro Ser Phe
625                 630                 635                 640
Ile Arg Gln Glu Val Tyr Val Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asn
645                 650                 655
Pro Thr Arg Glu Ala Lys Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val
660                 665                 670
Ala Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Lys
675                 680                 685
Asp Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp
690                 695                 700
Glu Gln Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala
705                 710                 715                 720
Ala Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe
725                 730                 735
Asn Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly
740                 745                 750
Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Ile Gln
755                 760                 765
Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val
770                 775                 780
Asp Ala Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe
785                 790                 795                 800
Val Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys
805                 810                 815
Val His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Leu Asp Thr Tyr
820                 825                 830
Pro Asp Asp Ser Cys Asn Gly Ile Asn Arg Cys Asp Glu Gln Lys Met
835                 840                 845
Val Asn Ala Gln Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys
850                 855                 860
Glu Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp
865                 870                 875                 880
Leu Asn Ala Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg
885                 890                 895
Thr Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val
900                 905                 910
Gly Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala
915                 920                 925
Lys Trp Ser Ala Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Glu Arg Val
930                 935                 940
Tyr Tyr Ala Ala Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Arg
945                 950                 955                 960
Asp Gln Gln Leu Asn Pro Gln Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala
965                 970                 975
Gln Asn Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu
980                 985                 990
Gln Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu  Ile Tyr Thr Glu Leu  Ser Asn Arg
995                 1000                 1005
Leu Gln  Gln Ala Ser Tyr Leu  His Met Ser Arg Asn  Ala Met Gln
1010                 1015                 1020
Asn Gly  Asp Phe Asn Ser Gly  Leu Asp Ser Trp Asn  Ala Thr Ala
1025                 1030                 1035
Gly Ala  Thr Val Gln Gln Asp  Gly Asn Thr His Phe  Leu Val Leu
1040                 1045                 1050
Ser His  Trp Asp Ala Gln Val  Ser Gln Gln Phe Arg  Val Gln Pro
1055                 1060                 1065
Asn Cys  Lys Tyr Val Leu Arg  Val Thr Ala Glu Lys  Val Gly Gly
1070                 1075                 1080
Gly Asp  Gly Tyr Val Thr Ile  Arg Asp Gly Ala His  His Thr Glu
1085                 1090                 1095
Thr Leu  Thr Phe Asn Ala Cys  Asp Tyr Asp Ile Asn  Gly Thr Tyr
1100                 1105                 1110
Val Thr  Asp Asn Thr Tyr Leu  Thr Lys Glu Val Val  Phe His Pro
1115                 1120                 1125
Glu Thr  Gln His Met Trp Val  Glu Val Ser Glu Thr  Glu Gly Val
1130                 1135                 1140
Phe His  Leu Asp Ser Val Glu  Phe Met Glu Thr Gln  Gln
1145                 1150                 1155
<210>  23
<211>  1156
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантный BT-0013
<400>  23
Met Asn Gln Asn Lys His Gly Ile Ile Gly Ala Ser Asn Cys Gly Cys
1               5                   10                  15
Ala Ser Asp Asp Val Ala Lys Tyr Pro Leu Ala Asn Asn Pro Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Ala Leu Asn Leu Asn Ser Cys Gln Asn Ser Ser Ile Leu Asn Trp
35                  40                  45
Ile Asn Ile Ile Gly Asp Ala Ala Lys Glu Ala Val Ser Ile Gly Thr
50                  55                  60
Thr Ile Val Ser Leu Ile Thr Ala Pro Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ile Val Tyr Asp Leu Ile Gly Lys Val Ile Gly Gly Ser Ser Gly Gln
85                  90                  95
Ser Ile Ser Asp Leu Ser Ile Cys Asp Leu Leu Ser Ile Ile Asp Leu
100                 105                 110
Arg Val Ser Gln Ser Val Leu Asn Asp Gly Ile Ala Asp Phe Asn Gly
115                 120                 125
Ser Val Leu Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Leu Asp Ser Trp Asn
130                 135                 140
Lys Asn Pro Asn Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Thr Arg Phe Arg
145                 150                 155                 160
Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asp Arg Ile Leu Thr Arg Gly Ser Leu Thr
165                 170                 175
Asn Gly Gly Ser Leu Ala Arg Gln Asn Ala Gln Ile Leu Leu Leu Pro
180                 185                 190
Ser Phe Ala Ser Ala Ala Phe Phe His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala
195                 200                 205
Thr Arg Tyr Gly Thr Asn Trp Gly Leu Tyr Asn Ala Thr Pro Phe Ile
210                 215                 220
Asn Tyr Gln Ser Lys Leu Val Glu Leu Ile Glu Leu Tyr Thr Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Val His Trp Tyr Asn Arg Gly Phe Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gly
245                 250                 255
Thr Ser Ala Thr Ala Trp Leu Glu Phe His Arg Tyr Arg Arg Glu Met
260                 265                 270
Thr Leu Met Val Leu Asp Ile Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Asp Ile
275                 280                 285
Thr Asn Tyr Pro Ile Glu Thr Asp Phe Gln Leu Ser Arg Val Ile Tyr
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ile Gly Phe Val His Arg Ser Ser Leu Arg Gly Glu Ser
305                 310                 315                 320
Trp Phe Ser Phe Val Asn Arg Ala Asn Phe Ser Asp Leu Glu Asn Ala
325                 330                 335
Ile Pro Asn Pro Arg Pro Ser Trp Phe Leu Asn Asn Met Ile Ile Ser
340                 345                 350
Thr Gly Ser Leu Thr Leu Pro Val Ser Pro Ser Thr Asp Arg Ala Arg
355                 360                 365
Val Trp Tyr Gly Ser Arg Asp Arg Ile Ser Pro Ala Asn Ser Gln Phe
370                 375                 380
Ile Thr Glu Leu Ile Ser Gly Gln His Thr Thr Ala Thr Gln Thr Ile
385                 390                 395                 400
Leu Gly Arg Asn Ile Phe Arg Val Asp Ser Gln Ala Cys Asn Leu Asn
405                 410                 415
Asp Thr Thr Tyr Gly Val Asn Arg Ala Val Phe Tyr His Asp Ala Ser
420                 425                 430
Glu Gly Ser Gln Arg Ser Val Tyr Glu Gly Tyr Ile Arg Thr Thr Gly
435                 440                 445
Ile Asp Asn Pro Arg Val Gln Asn Ile Asn Thr Tyr Leu Pro Gly Glu
450                 455                 460
Asn Ser Asp Ile Pro Thr Pro Glu Asp Tyr Thr His Ile Leu Ser Thr
465                 470                 475                 480
Thr Ile Asn Leu Thr Gly Gly Leu Arg Gln Val Ala Ser Asn Arg Arg
485                 490                 495
Ser Ser Leu Val Met Tyr Gly Trp Thr His Lys Ser Leu Ala Arg Asn
500                 505                 510
Asn Thr Ile Asn Pro Asp Arg Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Val
515                 520                 525
Asp Thr Arg Gly Thr Gly Val Ser Tyr Val Asn Asp Pro Gly Phe Ile
530                 535                 540
Gly Gly Ala Leu Leu Gln Arg Thr Asp His Gly Ser Leu Gly Val Leu
545                 550                 555                 560
Arg Val Gln Phe Pro Leu His Leu Arg Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Val
565                 570                 575
Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Ile Arg Leu Ser Val Asn Gly Ser Phe
580                 585                 590
Gly Thr Ile Ser Gln Asn Leu Pro Ser Thr Met Arg Leu Gly Glu Asp
595                 600                 605
Leu Arg Tyr Gly Ser Phe Ala Ile Arg Glu Phe Asn Thr Ser Ile Arg
610                 615                 620
Pro Thr Ala Ser Pro Asp Gln Ile Arg Leu Thr Ile Glu Pro Ser Phe
625                 630                 635                 640
Ile Arg Gln Glu Val Tyr Val Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asn
645                 650                 655
Pro Thr Arg Glu Ala Lys Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val
660                 665                 670
Ala Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Lys
675                 680                 685
Asp Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp
690                 695                 700
Glu Gln Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala
705                 710                 715                 720
Ala Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe
725                 730                 735
Asn Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly
740                 745                 750
Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Ile Gln
755                 760                 765
Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val
770                 775                 780
Asp Ala Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe
785                 790                 795                 800
Val Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys
805                 810                 815
Val His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Leu Asp Thr Tyr
820                 825                 830
Pro Asp Asp Ser Cys Asn Gly Ile Asn Arg Cys Asp Glu Gln Lys Met
835                 840                 845
Val Asn Ala Gln Leu Glu Thr Gly His His His Pro Met Asp Cys Cys
850                 855                 860
Glu Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp
865                 870                 875                 880
Leu Asn Ala Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg
885                 890                 895
Thr Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val
900                 905                 910
Gly Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala
915                 920                 925
Lys Trp Ser Ala Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Glu Arg Val
930                 935                 940
Tyr Tyr Ala Ala Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln
945                 950                 955                 960
Asp Gln Gln Leu Asn Pro Gln Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala
965                 970                 975
Gln Asn Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu
980                 985                 990
Gln Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu  Ile Tyr Thr Glu Leu  Ser Asn Arg
995                 1000                 1005
Leu Gln  Gln Ala Ser Tyr Leu  His Thr Ser Arg Asn  Ala Met Gln
1010                 1015                 1020
Asn Gly  Asp Phe Asn Ser Gly  Leu Asp Ser Trp Asn  Ala Thr Ala
1025                 1030                 1035
Gly Ala  Thr Val Gln Gln Asp  Gly Asn Thr His Phe  Leu Val Leu
1040                 1045                 1050
Ser His  Trp Asp Ala Gln Val  Ser Gln Gln Phe Arg  Val Gln Pro
1055                 1060                 1065
Asn Cys  Lys Tyr Val Leu Arg  Val Thr Ala Glu Lys  Val Gly Gly
1070                 1075                 1080
Gly Asp  Gly Tyr Val Thr Ile  Arg Asp Gly Ala His  His Thr Glu
1085                 1090                 1095
Thr Leu  Thr Phe Asn Ala Cys  Asp Tyr Asp Ile Asn  Gly Thr Tyr
1100                 1105                 1110
Val Thr  Asp Asn Thr Tyr Leu  Thr Lys Glu Val Val  Phe His Pro
1115                 1120                 1125
Glu Thr  Gln His Met Trp Val  Glu Val Ser Glu Thr  Glu Gly Val
1130                 1135                 1140
Phe His  Leu Asp Ser Val Glu  Phe Met Glu Thr Gln  Gln
1145                 1150                 1155
<210>  24
<211>  1152
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантный BT-0023
<400>  24
Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr
1               5                   10                  15
Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp
20                  25                  30
Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr
35                  40                  45
Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile
50                  55                  60
Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile
65                  70                  75                  80
Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp
100                 105                 110
Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser
115                 120                 125
Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp
130                 135                 140
Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His
165                 170                 175
Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser
180                 185                 190
Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn
195                 200                 205
Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp
210                 215                 220
Gly Leu Gln Gln Gly Gln Ile Asn Leu Tyr Phe Asn Ala Gln Gln Glu
225                 230                 235                 240
Arg Thr Arg Ile Tyr Thr Asn His Cys Val Glu Thr Tyr Asn Arg Gly
245                 250                 255
Leu Glu Asp Val Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His
260                 265                 270
Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu
275                 280                 285
Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln
290                 295                 300
Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala
305                 310                 315                 320
Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe
325                 330                 335
Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg
340                 345                 350
Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr
355                 360                 365
Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Gln Ser Gln Tyr
370                 375                 380
Ala Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Glu Thr Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ser
385                 390                 395                 400
Asn Thr Arg Leu Phe Asn Thr Thr Asn Gly Ala Asn Ala Ile Asp Ser
405                 410                 415
Arg Ala Arg Asn Phe Gly Asn Leu Tyr Ala Asn Leu Tyr Gly Val Ser
420                 425                 430
Ser Leu Asn Ile Phe Pro Thr Gly Val Met Ser Glu Ile Thr Ser Ala
435                 440                 445
Pro Asn Thr Cys Trp Gln Asp Leu Thr Thr Thr Glu Glu Leu Pro Leu
450                 455                 460
Val Asn Asn Asn Phe Asn Leu Leu Ser His Val Thr Phe Leu Arg Phe
465                 470                 475                 480
Asn Thr Thr Gln Gly Gly Pro Leu Ala Thr Val Gly Phe Val Pro Thr
485                 490                 495
Tyr Val Trp Thr Arg Gln Asp Val Asp Phe Asn Asn Ile Ile Thr Pro
500                 505                 510
Asn Arg Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Ser
515                 520                 525
Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Val Ile
530                 535                 540
Arg Arg Thr Asn Thr Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val Ser Val Thr
545                 550                 555                 560
Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Thr
565                 570                 575
Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr Arg Gly Gly Thr Thr Ile Asn Asn
580                 585                 590
Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Ser Arg Tyr Glu
595                 600                 605
Ser Tyr Arg Thr Val Glu Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Thr Gln Ser
610                 615                 620
Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly Asn Gly Glu
625                 630                 635                 640
Val Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro Thr Arg Glu
645                 650                 655
Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe
660                 665                 670
Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp Tyr Gln Val
675                 680                 685
Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Ala
690                 695                 700
His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu
705                 710                 715                 720
Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn Thr Ile Asn
725                 730                 735
Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser
740                 745                 750
Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala
755                 760                 765
Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asp Ala Ser Glu
770                 775                 780
Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe Val Lys Ser Ser
785                 790                 795                 800
Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val His Leu Val
805                 810                 815
Lys Asn Val Leu Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Pro Asp Asp Ser
820                 825                 830
Cys Ser Gly Ile Asn Arg Cys Glu Glu Gln Gln Met Val Asn Ala Gln
835                 840                 845
Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys Glu Ala Ala Gln
850                 855                 860
Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asp Thr Gly Asp Leu Asn Ser Thr
865                 870                 875                 880
Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Val Arg Thr Thr Asp Gly
885                 890                 895
Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly Pro Leu Leu
900                 905                 910
Gly Glu Pro Leu Glu Arg Glu Gln Arg Glu Asn Ala Lys Trp Asn Ala
915                 920                 925
Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Val Tyr Gln Asp Ala
930                 935                 940
Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp Gln Gln Leu
945                 950                 955                 960
Asn Pro Gln Ile Gly Met Ala Asp Ile Met Asp Ala Gln Asn Leu Val
965                 970                 975
Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu Gln Ile Pro Gly
980                 985                 990
Ile Asn Tyr Glu Ile Tyr Thr Glu  Leu Ser Asn Arg Leu  Gln Gln Ala
995                 1000                 1005
Ser Tyr  Leu Tyr Thr Ser Arg  Asn Ala Val Gln Asn  Gly Asp Phe
1010                 1015                 1020
Asn Asn  Gly Leu Asp Ser Trp  Asn Ala Thr Ala Gly  Ala Ser Val
1025                 1030                 1035
Gln Gln  Asp Gly Asn Thr His  Phe Leu Val Leu Ser  His Trp Asp
1040                 1045                 1050
Ala Gln  Val Ser Gln Gln Phe  Arg Val Gln Pro Asn  Cys Lys Tyr
1055                 1060                 1065
Val Leu  Arg Val Thr Ala Glu  Lys Val Gly Gly Gly  Asp Gly Tyr
1070                 1075                 1080
Val Thr  Ile Arg Asp Gly Ala  His His Thr Glu Thr  Leu Thr Phe
1085                 1090                 1095
Asn Ala  Cys Asp Tyr Asp Ile  Asn Gly Thr Tyr Val  Thr Asp Asn
1100                 1105                 1110
Thr Tyr  Leu Thr Lys Glu Val  Leu Phe Tyr Ser His  Thr Glu His
1115                 1120                 1125
Met Trp  Val Glu Val Asn Glu  Thr Glu Gly Ala Phe  His Leu Asp
1130                 1135                 1140
Ser Ile  Glu Phe Val Glu Thr  Glu Lys
1145                 1150
<210>  25
<211>  1155
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантный BT-0067
<400>  25
Met Asn Arg Asn Asn Gln Asp Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Ser Thr
1               5                   10                  15
Cys Gly Cys Ser Ser Asp Asp Val Val Gln Tyr Pro Leu Ala Arg Asp
20                  25                  30
Pro Asn Ala Val Phe Gln Asn Met His Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Thr
35                  40                  45
Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile
50                  55                  60
Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Leu
65                  70                  75                  80
Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp
100                 105                 110
Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Ser
115                 120                 125
Glu Ala Val Val Gly Thr Ala Ala Asp His Leu Thr Gly Leu His Asp
130                 135                 140
Asn Tyr Glu Leu Tyr Val Glu Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Ala Arg Thr Asn Leu Leu Phe Asn Arg Phe Thr Thr Leu Asp
165                 170                 175
Ser Leu Phe Thr Gln Phe Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser
180                 185                 190
Gln Asn Tyr Ala Val Pro Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn
195                 200                 205
Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp
210                 215                 220
Gly Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asn Ser Phe His Thr Arg Gln Gln Glu
225                 230                 235                 240
Arg Thr Gln Tyr Tyr Thr Asn His Cys Val Thr Thr Tyr Asn Thr Gly
245                 250                 255
Leu Asp Arg Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His
260                 265                 270
Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu
275                 280                 285
Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln
290                 295                 300
Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala
305                 310                 315                 320
Asn Val Gly Leu Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Arg Phe
325                 330                 335
Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg
340                 345                 350
Leu Asn Thr Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Phe Asp Val Gly Ser Asn
355                 360                 365
Phe Ile Glu Pro Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Ser Asn
370                 375                 380
Asn Ser Thr Val Tyr Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ala Thr Arg
385                 390                 395                 400
Thr Thr Ile Asn Leu Pro Ala Asn Gly Thr Gly Arg Val Glu Ser Thr
405                 410                 415
Ala Val Asp Phe Arg Ser Ala Leu Val Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg
420                 425                 430
Ala Ser Phe Ile Pro Gly Gly Val Phe Ser Gly Thr Thr Gln Pro Ser
435                 440                 445
Thr Gly Gly Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Pro
450                 455                 460
Asp Glu Ser Thr Gly Ser Phe Ala His Arg Leu Ser His Val Thr Phe
465                 470                 475                 480
Leu Ser Phe Thr Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ser Gly Arg
485                 490                 495
Val Pro Thr Tyr Val Trp Thr His Arg Asp Val Asp Phe Asn Asn Thr
500                 505                 510
Ile Asn Pro Asn Arg Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys Ala Tyr Glu
515                 520                 525
Leu Ser Ser Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly
530                 535                 540
Asp Val Ile Arg Arg Thr Asn Ile Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val
545                 550                 555                 560
Ser Val Thr Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr
565                 570                 575
Ala Ser Thr Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr Arg Gly Gly Thr Thr
580                 585                 590
Ile Asn Asn Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Ser
595                 600                 605
Arg Tyr Glu Ser Tyr Arg Thr Val Glu Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe
610                 615                 620
Thr Gln Ser Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly
625                 630                 635                 640
Asn Gly Glu Val Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro
645                 650                 655
Thr Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Ala
660                 665                 670
Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp
675                 680                 685
Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu
690                 695                 700
Gln Tyr Gly His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala
705                 710                 715                 720
Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn
725                 730                 735
Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val
740                 745                 750
Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu
755                 760                 765
Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asn
770                 775                 780
Ala Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Asp Gly Phe Val
785                 790                 795                 800
Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val
805                 810                 815
His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Ser
820                 825                 830
Asp Gly Ser Cys Ser Gly Met Asn Arg Cys Glu Glu Gln Gln Met Val
835                 840                 845
Asn Ala Gln Leu Glu Thr Glu His His His Pro Met Asp Cys Cys Glu
850                 855                 860
Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp Leu
865                 870                 875                 880
Asn Ser Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg Thr
885                 890                 895
Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly
900                 905                 910
Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala Lys
915                 920                 925
Trp Ser Ala Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Val Tyr
930                 935                 940
Gln Asp Ala Lys Gln Ser Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp
945                 950                 955                 960
Gln Gln Leu Asn Pro Glu Ile Gly Met Ala Asp Ile Ile Asp Ala Gln
965                 970                 975
Asn Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu Gln
980                 985                 990
Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu Ile  Tyr Thr Glu Leu Ser  Asn Arg Leu
995                 1000                 1005
Gln Gln  Ala Ser Tyr Leu Tyr  Thr Ser Arg Asn Ala  Val Gln Asn
1010                 1015                 1020
Gly Asp  Phe Asn Ser Gly Leu  Asp Ser Trp Asn Ala  Thr Gly Gly
1025                 1030                 1035
Ala Thr  Val Gln Gln Asp Gly  Asn Thr His Phe Leu  Val Leu Ser
1040                 1045                 1050
His Trp  Asp Ala Gln Val Ser  Gln Gln Phe Arg Val  Gln Pro Asn
1055                 1060                 1065
Cys Lys  Tyr Val Leu Arg Val  Thr Ala Glu Lys Val  Gly Gly Gly
1070                 1075                 1080
Asp Gly  Tyr Val Thr Ile Arg  Asp Gly Ala His His  Thr Glu Lys
1085                 1090                 1095
Leu Thr  Phe Asn Ala Cys Asp  Tyr Asp Ile Asn Gly  Thr Tyr Val
1100                 1105                 1110
Thr Asp  Asn Thr Tyr Ile Thr  Lys Glu Val Val Phe  Tyr Ser His
1115                 1120                 1125
Thr Glu  His Met Trp Val Glu  Val Ser Glu Thr Glu  Gly Ala Phe
1130                 1135                 1140
His Leu  Asp Ser Ile Glu Phe  Val Glu Thr Glu Lys
1145                 1150                 1155
<210>  26
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Прямой праймер OAR2613a
<400>  26
aaacatgaac cgaaataatc aaaatg                                            26
<210>  27
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Обратный праймер OAR2615a
<400>  27
atccgtccct tgtgcgtgta aa                                                22
<210>  28
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Прямой праймер OAR2611a-F
<400>  28
gtttaaacat gaatcgaaat aatcaaaatg                                        30
<210>  29
<211>  29
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Обратный праймер OAR2612a-R
<400>  29
ggcgcgccct actcttgtgt ttcaataaa                                         29
<210>  30
<211>  29
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Прямой праймер OAR2768-F
<400>  30
gtttaaacat gaatcaaaat aaacacgga                                         29
<210>  31
<211>  31
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Обратный праймер OAR2769-R
<400>  31
ggcgcgcctt actgttgggt ttccatgaac t                                      31
<---