Биосовместимые гелеобразные полимерные формы лекарственных средств на основе растворов хитозана в присутствии спиртов

УДК 544.777

М. В. Базунова, И. Р. Аллаяров, Л. А. Шарафутдинова, Е. И. Кулиш, Г. Е. Заиков

БИОСОВМЕСТИМЫЕ ГЕЛЕОБРАЗНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ ФОРМЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ РАСТВОРОВ ХИТОЗАНА В ПРИСУТСТВИИ СПИРТОВ

Ключевые слова: хитозан, гель, спирты, лекарственные вещества.

Исследован подход к созданию упруго-вязких систем на основе хитозана в отсутствии сшивающих агентов, заключающийся в формировании дополнительной сетки физических связей за счёт введения низкомолекулярного модификатора - этанола или глицерина. Установлено, что структурообразование хитозана в растворе сопровождается формированием дополнительной сетки физических связей, узлами которой служат агрегаты макромолекул хитозана, сформированные в смешанном растворителе уксусная кислота-вода-глицерин или уксусная кислота-вода-этанол, и способствует более раннему формированию упруго-вязких свойств, что в итоге приводит к гелеобразованию при более низких концентрациях полимера, чем в случае растворов хитоза-на без добавок спирта. Полученные гелеобразные системы обладают хорошей биосовместимостью, поэтому могут использоваться в качестве полимерных форм лекарственных средств.

Keywords: chitosan, gel, alcohols, drugs.

We investigated approach to making viscoelastic chitosan-based systems in the absence of crosslinking agents. It is the formation of an additional network ofphysical links by introducing low molecular weight modifier - ethanol or glycerol. It is found that the gelation of chitosan in the solution is accompanied by the formation of additional meshes physical links, nodes which are aggregates of chitosan macromolecules formed in a mixed solvent of acetic acid-water-glycerol or acetic acid-water-ethanol. This promotes earlier formation of viscoelastic properties, which eventually leads to gelation at lower polymer concentrations than in the case of chitosan solutions without alcohol additives. The resulting gelled system have good biocompatibility, and therefore can be used as polymeric forms of drugs.

Введение

В последнее время полимерные гидрогели (трехмерные сшитые системы на основе полимеров) нашли широкое применение в качестве поддерживающих и разделяющих средств для электрофореза, в гель-проникающей хроматографии, в качестве носителей иммобилизованных биологически активных соединений (БАС), материалов для изготовления эн-допротезов и т.д. [1]. Причиной столь широкого и разнообразного применения гидрогелей является их уникальная пористая структура, обеспечивающая набухание гидрогелей в воде, высокую проницаемость для низко- и высокомолекулярных соединений.

Весьма актуальной является проблема создания гидрогелей медицинского назначения с заданным комплексом свойств на основе полимеров природного происхождения, например, хитозана (ХТЗ) и его производных, обладающих биосовместимостью и отсутствием токсичности. Гидрогели на их основе могут быть использованы в качестве транспортных форм лекарственных препаратов, ранозаживляющих покрытий, имплантируемых протезов [2-4]. Так, преимуществами гидрогелей в качестве ранозажив-ляющих покрытий, в отличие от обычных сорбци-онных перевязочных средств (марлевых, ватно-марлевых, нетканых материалов, полимерных губок), у которых устанавливается динамическое равновесие концентрации микрофлоры на границе "повязка-рана", являются: пластифицирующее воздействие на ткани раны, размягчение некротическихоб-разований, облегчение механического удаления нежизнеспособных тканей, предотвращение развитие инфекции на поверхности раны под струпом. Они создают на ране влажную среду, оптимальную для нормального течения процессов регенерации. За

счет охлаждающего действия гелевых повязок и, соответственно, понижения местной температуры подлежащих тканей создаются условия, препятствующие развитию гноеродной инфекции в ране. Гидрогель способствует элиминации экссудата, подавлению микрофлоры [5].

В ряду показателей и количественных параметров, характеризующих технологические процессы, связанные с получением и применением полимерных гелей важное место занимают упруго-пластические (реологические) свойства: вязкость, предел текучести, модуль вязкости, модуль упругости, тиксотропность. В случае разработки полимерных лекарственных форм реологические параметры оказывают влияние на такие показатели, как удобство применения и дозирования.

Хитозан, в принципе, является ассоциирующим полиэлектролитом, т.е. его макромолекулы состоят из заряженных участков цепи (гидрофильных блоков) и распределенных вдоль цепи гидрофобных групп - стикеров, способных агрегировать друг с другом и образовывать термообратимые связи. Такие полиэлектролиты могут образовывать кластеры конечного размера и, в принципе, формировать физический гель[6]. Однако, изхитозана, очевидно в силу его полиэлектролитной природы, путем растворения в наиболее часто употребляемом растворителе - уксусной кислоте, не удается получить упруго-вязкие системы.

Самым распространенным способом получения упруго-вязких систем на основе ХТЗ и его производных, является сшивание их макромолекул бифункциональными соединениями, например, глута-ровым альдегидом [7]. Однако, продуктами взаимодействия глутарового альдегида с амино-

группами ХТЗ являются основания Шиффа, являющиеся достаточно токсичными.

Нами выбран подход к созданию упруго-вязких систем на основе ХТЗ в отсутствии сшивающих агентов, заключающийся в формировании дополнительной сетки физических связей за счёт введения низкомолекулярного модификатора - этанола или глицерина..

Выбор данных модификаторов для регулирования процессов гелеобразования растворов ХТЗ обусловлен тем, что глицерин способен образовывать межмолекулярные водородные связи с макромолекулами полисахаридов, а введение этанола вызывает ухудшение термодинамического качества растворителя по отношению к полимеру, что должно приводить к возрастанию степени ассоциации макромолекул в растворе, так как контакты полимер-полимер становятся более вероятными, чем контакты полимер-растворитель.

Такие образом, целью данной работы стало определение реологических характеристик растворов ХТЗ в смесях уксусная кислота-глицерин различного объёмного соотношения и растворов ХТЗ в вод-но-этанольных смесях различного объёмного соотношения.

Экспериментальная часть

В работе использовали ХТЗ с М.м. = 340 кДа (ТУ 9284-027-11734126-08)) производства ЗАО «Биопрогресс» (г. Щелково).

В качестве растворителя ХТЗ использовали 0,1%-ную уксусную кислоту,смеси 0,1%-ной уксусной кислоты с глицерином в объёмном соотношении 90:10, 80:20 и 70:30 об. %или смеси0,1 %-ной уксусной кислоты с этанолом в объёмном соотношении 90:10, 80:20 и 70:30 об. %..

Реологические измерения растворов ХТЗ проводили на модульном динамическом реометре HaakeMars III при 25°Св двух режимах - непрерывного сдвигового деформирования в диапазоне скоростей сдвига от 0.1 до 100 с-1 и в осцилляционном режиме. Кривые течения и кривые вязкости получены в режиме непрерывного сдвигового деформирования в диапазоне скоростей сдвига от 0,1 до 100 с-1. За наибольшую ньютоновскую вязкость принимали вязкость, определенную при скорости сдвига равной 0,1 с-1, за наименьшую - при скорости сдвига 100 с-1.

Поскольку испытания в осцилляционном режиме должны выполняться в области линейной вязкоуп-ругости, первоначально, на основе зависимостей модулей накопления и потерь от амплитуды напряжений, полученных при постоянной частоте осцилляции, определяли оптимальные значения амплитуды, соответствующие неизменным значениям модулей (область линейной вязкоупругости). В случае растворов ХТЗ в интервале концентраций от 0.2 до 7 % мас. в диапазоне амплитуд от 0.1 до 10 Па и частот осцилляции от 0.1 до 10 Гц растворы соответствуют области линейной вязкоупругости, так как значения модулей не зависят от амплитуды напряжения.

Для оценки биосовместимостиполимерных гелей invivo и формирования целостной картины возникшего биологического ответа проведена серия экспе-

риментов по имплантации систем ХТЗ-глицерин-0,1 %-ная уксусная кислота и ХТЗ-этанол-0,1 %-ная уксусная кислотас последующим анализом клинических показателей крови в динамике.

Для исследований использовали беспородных крыс линии Wistar (п=24) массой 200-250 г с соблюдением требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей (Страсбург, 1986) и Федеральным законом Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997. Всех животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. Было сформировано 4 группы животных, по 6 в каждой группе. Животным каждой группы были подкожно вшиты полимерные гели на основе систем ХТЗ-глицерин.

Стерильные матрицы размером 5 х 5 мм были в асептических условиях подкожно вшиты в области холки крысам самцам линии Wistar, наркотизированным эфир-тиопенталовым наркозом. Операционное поле после механической депиляции обрабатывалось кожным антисептиком «Астрадез - ОП». После ориентации исследуемых образцов подкожно-жировую клетчатку ушивали внутренними швами кетгутовыми нитями, на кожу накладывали кожные швы шелковой нитью. Послеоперационное ведение заключалось в обработке раневой поверхности «Ас-традез - ОП» до третьего дня и снятии кожных швов на пятый день эксперимента. При послеоперационном ведении животных общих реакций на имплан-таты вы явлено не было, термометрические показатели оставались в пределах нормы, масса тела у всех животных была стабильной. На 1, 3, 7, 14 и 30 день эксперимента из кончика хвоста была взята кровь для анализа гематологических показателей [8].

Обсуждение результатов

В данной работе в качестве подхода к регулированию гелеобразования в растворах ХТЗ предложено введение в раствор низкомолекулярного модификатора - трёхатомного спирта глицерина, способного образовывать межмолекулярные водородные связи с макромолекулами ХТЗ или одноатомного спирта этанола, ухудшающего термодинамическое качество растворителя по отношению к полимеру, что должно приводить к возрастанию степени ассоциации макромолекул в растворе, так как контакты полимер-полимер становятся более вероятными, чем контакты полимер-растворитель [9, 10].

Следовательно, от растворов ХТЗ в водной уксусной кислоте и в смесях уксусная кислота-вода-глицерин или уксусная кислота-вода-этанол можно ожидать различную структурную организацию и вид флуктуационной сетки зацеплений макромолекул полимера, что не может ни сказаться на гелеоб-разующих свойств формируемых систем.

При изучении реологического поведения растворов ХТЗ в смесях уксусная кислота-вода-глицерин различного объёмного соотношения было установлено следующее. Добавление глицерина в систему ХТЗ-вода-уксусная кислота сопровождается значительным увеличением динамической вязкости прак-

тически во всём диапазоне изученных концентраций полимера. Формирование сетки зацеплений в присутствии глицерина начинается значительно при более низких концентрациях ХТЗ, чем в случае водно-уксуснокислых растворов полимера (рис. 1). Например, при содержании глицерина 20 об. % существенный прирост динамической вязкостипо сравнению с вязкостью водных растворов полимера наблюдается при концентрации ХТЗ 0,8 и более мас. %, а при содержании глицерина 30 об. % - при концентрации ХТЗ более 0,2 мас. %. Более того, можно отметить (рис. 2), что чем больше содержание глицерина в системе, тем больше прирост динамической вязкости.

Рис. 1 - Зависимость прироста динамической вязкости растворов ХТЗ в смесях уксусная кислота-вода-глицерин по сравнению с растворами ХТЗ в уксусной кислоте от концентрации полимера, концентрация уксусной кислоты 1%: 1 -соотношение уксусная кислота-вода-глицерин: 1:89:10 об. %; 2 - соотношение уксусная кислота-вода-глицерин: 1:79:20 об. %; 3 - соотношение уксусная кислота-вода-глицерин: 1:69:10 об. %

Рис. 2 - Зависимость динамической вязкости растворов ХТЗ различных концентраций в смесях уксусная кислота-вода-глицерин от содержания глицерина; концентрация уксусной кислоты 1%: 1 -концентрация ХТЗ 0.2%; 2 - концентрация ХТЗ 0.4%; 3 - концентрация ХТЗ 0.6%; 4 - концентрация ХТЗ 0.8%; 5 - концентрация ХТЗ 1.0%

При концентрациях ХТЗ 0,8 % мас. при соотношениях 0,1 % уксусная кислота-глицерин 70:30 и 80:20 об. %.модуль накоплений изучаемых систем становится больше модуля потерь, системы становятся упруго-вязкими (табл. 1).

Таблица 1 - Модуль накоплений и модуль по-терьрастворов ХТЗ концентрацией 1 % мас. в смесях 0,1 %-наяуксусная кислота-глицерин при частоте осциллирующего напряжения 1 Гц. Амплитуда напряжения - 1 Па

Модуль накоплений, Па Модуль потерь, Па

Раствор ХТЗ в смеси 0,1 %-наяуксусная кислота-глицерин 90:10 % об. 2,5 2,8

Раствор ХТЗ в смеси 0,1 %-наяуксусная кислота-глицерин 80:20 % об. 8 4

Раствор ХТЗ в смеси 0,1 %-наяуксусная кислота-глицерин 70:30 % об. 13 9

При концентрациях полимера 2 и более мас. % системы ХТЗ - глицерин-1 %-ная уксусная кислота представляют собой термообратимый гель.

Изучение реологического поведения растворов ХТЗ в смесях этанол-0,1 %-наяуксусная кислота различного объёмного соотношения показало следующее. Во-первых, при превышении концентрации ХТЗ в растворе более 2 % происходит образование гелевых систем, характеризующихся потерей текучести, что свидетельствует о формировании прочной сетки физических межмолекулярных связей. При этом модуль упругости превышает модуль вязкости (табл.2).

Таблица 2 - Модуль накоплений и модуль по-терьрастворов ХТЗ концентрацией 3 % мас. в смесях 0,1 %-наяуксусная кислота-этанол при частоте осциллирующего напряжения 1 Гц. Амплитуда напряжения - 1 Па

Модуль накоплений, Па Модуль потерь, Па

Раствор ХТЗ в смеси 0,1 %-наяуксусная кислота-этанол 90:10 % об. 4,3 2,1

Раствор ХТЗ в смеси 0,1 %-наяуксусная кислота-этанол 80:20 % об. 2,0 0,4

Раствор ХТЗ в смеси 0,1 %-наяуксусная кислота-этанол 70:30 % об. 11 9

Во-вторых, добавление этанола в систему ХТЗ-0,1 %-наяуксусная кислота сопровождается значительным увеличением динамической вязкости во всём диапазоне концентраций полимера (рис. 3). Причём, как и в случае добавления глицерина, чем больше содержание спирта в системе, тем больше вклад упругой составляющей в общий прирост вязкости.

n.nat

а, 5-1

0,0 0.5 1.0 1,5 2,0 25 3,0 3,5 ХТЗ, %

Рис. 3 - Зависимость динамической вязкости растворов ХТЗ в смесях уксусная кислота-вода-этанол по сравнению с растворами ХТЗ в уксусной кислоте от концентрации полимера, концентрация уксусной кислоты 1%: 1 - соотношение уксусная кислота-вода-глицерин: 1:89:10 об. %;2 - соотношение уксусная кислота-вода-глицерин: 1:79:20 об. %;3 - соотношение уксусная кислота-вода-глицерин: 1:69:10 об. %

Результаты исследований биосоместимости по гематологическим показателям показали, что в присутствии изученных систем ХТЗ - глицерин-1 %-ная уксусная кислота все суммарные показатели красной крови в группах экспериментальных животных за весь постоперационный период в целом варьировали в пределах физиологической нормы и имели сходную динамикой. После незначительного снижения в течение первой недели в период с 14-и по 30-е сутки базовые показатели красной крови постепенно восстанавливались до исходных значений или даже

превышали их уровень. Все вышесказанное, на наш взгляд, позволяет допустить, что системы ХТЗ-глицерин не только не вызывают угнетение эритро-поэза, но и оказывает незначительное эритропоэти-ческое влияние.

Таким образом, структурообразование ХТЗ в растворе сопровождается формированием дополнительной сетки физических связей, узлами которой служат агрегаты макромолекул ХТЗ, сформированные в смешанном растворителе уксусная кислота-вода-глицерин или уксусная кислота-вода-этанол, и способствует более раннему формированию упруго-вязких свойств, что в итоге приводит к гелеобразо-ванию при более низких концентрациях полимера, чем в случае растворов ХТЗ без добавок спирта. Полученные гелеобразные системы обладают хорошей биосовместимостью, поэтому могут использоваться в качестве полимерных форм лекарственных средств.

Литература

1. Каплунов И.А., Пахомов П.М. // Нанотехнология. Экология. Производство. 2012. № 6 (19), С. 24-25.

2. А.Е. Мочалова, Л.В. Никищенкова, Н.Н. Смирнова, Л.А. Смирнова. // Высокомолекулярные соединения, Серия Б. 2007. Т. 49. № 2. С. 371-376.

3. Mochalova A.E., Smimova L.A., SemchikovYu.D. et al. // Polymer Science. Series A. 2005. V. 47. № 6. P. 614.

4. Григорьева М.В. // Биотехнология. 2011. Т. 4. № 2. С. 9 - 23.

5. Медицинский полимерный гелевый материал и лечебные средства на его основе. Патент RU 2198685.

6. Philippova O.E., Korchagina E.V. // Polymer Science. SeriesA. 2012. V. 54. № 7. P. 552.

7. Перминов П.А., Н.Р. Кильдеев, Тимофеева Л.М и др. // Химия и химическая технология. 2007. Т. 50. Вып. 3. С. 53.

8. Справочник по функциональной диагностике / под ред. акад. АМН СССР проф. И.А. Кассирского. М.: Медицина; Высшая школа. 1972. 344 с.

9. Базунова М.В., Валиев Д.Р., Тухватуллин Р.Ф., Кулиш Е.И. //Научно-технический вестник Поволжья. 2015. №2. С. 30-32

10. Базунова М.В.1, Аллаяров И.Р., Валиев Д.Р. // Сборник трудов Международной научно- практической конференции «Современное общество, образование и наука». ООО «Консалтинговая компания Юком» (Тамбов). 2015. С. 14-15.

© М. В. Базунова, к.х.н., доц. каф. высокомолекулярных соединений и общей химической технологии, Башкирский государственный университет, mbazunova@mail.ru; И. Р. Аллаяров, магистр той же кафедры; Л. А. Шарафутдинова, к.б.н., доц. каф. физиологии человека и зоологии того же вуза, sharafla@yandex.ru; Е. И. Кулиш, Башкирский государственный университет, д.х.н., проф. каф высокомолекулярных соединений и общейхимической технологии того же вуза, onlyalena@mail.ru; Г. Е. Заиков — д-р хим. наук, проф. каф. технологии пластических масс КНИТУ chembio@sky.chph.ras.ru.

© M. V. Bazunov, Bashkir State University, Ph.D., Associate Professor, Department of Macromolecular Compounds and General Chemical Technology, mbazunova@mail.ru; I. R. Allayarov, Bashkir State University, Master of 1 year, the Department of High-Molecular Compounds and General Chemical Technology; L. А. Sharafutdinova, Bashkir State University, PhD, assistant professor, Department of human physiology and zoology Faculty of Biology, sharafla@yandex.ru; Н. I. Kulish, , Bashkir State University, Doctor of Chemistry, Professor, Department of Macromolecular Compounds and General Chemical Technology, onlyalena@mail.ru; G. E. Zaikov - Doctor of Chemical Sciences, professor of department "Technology of plastic masses" of KNRTU, chembio@sky.chph.ras.ru.