Экспериментальная онкология

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

А.А.Бабаев, В.В.Новиков СТРУКТУРА ПУЛА

РАСТВОРИМЫХ МОЛЕКУЛ АДГЕЗИИ ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород

Растворимые молекулы адгезии входят в состав пула растворимых форм дифференцировочных молекул лейкоцитов и выполняют функции, направленные на регуляцию иммунного ответа и межклеточных взаимодействий. К растворимым молекулам адгезии относят белки крови, принадлежащие нескольким семействам, в том числе растворимые молекулы 1САМ-1, 1САМ-3 (СБ54, СБ50), ЬБА-1 (СБ11а/СБ18), Мас-1 (СБ11а/СБ18). Эффекторное действие растворимых дифференцировочных молекул зависит от особенностей их наноструктурной организации, то есть от того, находятся ли они в мономерной или олигомерной форме, образуют ли ассоциаты с лигандами или формируют более сложные растворимые наноструктуры, находящиеся в межклеточном пространстве, в том числе - в плазме (сыворотке) крови. В предыдущих исследованиях нами показано что растворимые молекулы адгезии СБ18, СБ50, СБ54 входят в состав таких растворимых гетеромерных ассоциатов дифференцировочных молекул, как СБ18-СБ54 и СБ18-СБ50. В исследованиях ряда зарубежных авторов обнаружено существование олигомерных форм растворимых молекул СБ54. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о наличии в крови гомоолигомерных белковых наноструктур, построенных из растворимых молекул СБ18 или СБ50. Кроме того, с применением различных вариантов имму-ноферментного анализа показано существование растворимых молекул СБ11Ъ, представляющих собой а-цепь гетеродимера Мас-1.

Изучено сывороточное содержание обнаруженных наноструктурных форм растворимых молекул адгезии. Показан различный характер изменений сывороточного уровня олигомерных форм растворимых молекул СБ18 и СБ50 при раке легкого, раке эндометрия, хроническом миелолейкозе, раке молочной железы. Сывороточный уровень тестированных олигомерных наноструктур находится в сложной взаимосвязи с содержанием суммарных фракций данных молекул адгезии, а также с изменениями в содержании растворимых ассоциатов СБ18-СБ54 и СБ18-СБ50. Получены данные о связи сывороточного содержания разных наноструктурных форм растворимых молекул адгезии с особенностями опухолевых процессов разного генеза, а также о возможной мониторинговой значимости определения пула растворимых молекул адгезии при онкологических заболеваниях.

Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Т.В. Белова, Е.С. Плеханова, Д.В. Новиков,

О. С. Янченко, В.В. Новиков мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АГ У БОЛЬНЫХ КРР АССОЦИИРОВАНА Р КЛЕТКАМИ, ЦИРКУЛИРУЮЩИМИ В КРОВИ ННГУ им. Н.И. Лобачевского, НГМА, Н. Новгород

Задачи исследования. Ранее проведенные исследования показали, что матричная РНК раковотестикулярных антигенов выявляется в крови онкологических больных с помощью ОТ-ПЦР (Новиков Д.В. и др., 2008). Однако, вопрос о том, каков источник мРНК, неясен. Обнаруживаемые в крови мРНК различных раково-тестикулярных антигенов могут принадлежать на-

ходящимся в кровотоке метастазирующим опухолевым клеткам, могут быть продуктом деградации опухолевых клеток и циркулировать в свободном виде или могут быть связаны с поверхностью клеток крови. Исходя из этого, задача работы состояла в определении источника обнаруживаемой в периферической крови больных КРР мРНК раково-тестикулярных АГ.

Материалы и методы. В работе использована периферическая кровь 16 больных КРР, проходивших лечение в ГУЗ ОКБ им. Семашко. Свежую кровь разделяли центрифугированием на клеточную фракцию и надо-садок. Внеклеточные мРНК, ассоциированные с поверхностью клеток, смывали с помощью ЭДТА и кратковременной обработки клеток трипсином. Матричную РНК раково-тестикулярных антигенов определяли с помощью метода гнездовой ПЦР.

Результаты и выводы. Показано, что у больных КРР на первой и второй стадиях заболевания мРНК GAGE, PAGE, XAGE, MAGE-C, SSX и NY-ESO-1 выявляется только в клеточной фракции, свободной от мРНК, ассоциированной с поверхностью клеток. Это указывает на циркуляцию метастазирующих опухолевых клеток в кровяном русле уже на первой и второй стадиях КРР. На третьей стадии мРНК исследуемых антигенов была также выявлена в составе метастази-рующих клеток. Кроме того, она детектировалась в элюате, полученном после обработки клеток трипсином, что свидетельствует о наличии мРНК раковотестикулярных антигенов на поверхности клеток. На четвертой стадии колоректального рака мРНК раковотестикулярных антигенов выявлялась в клетках, а также смывах с клеток, полученных с помощью ЭДТА и смывах с клеток, полученных с помощью трипсина. В плазме крови, свободной от клеточного материала, мРНК раково-тестикулярных антигенов не обнаруживалась. Таким образом, мРНК раково-тестикулярных антигенов принадлежит метастазирующим опухолевым клеткам, присутствующим в кровотоке онкологических больных уже на первых стадиях, или связана с поверхностью циркулирующих клеток.

Исследование поддержано грантом РФФИ № 0904-9 7081-р-поволжье-а.

Т.А. Богуш, М.В. Тихомиров, Е.А. Дудко,

Е.А. Богуш, Р.Ю., Раманаускайте,

К.К. Лактионов, Э.Э. Джураев, Б.Е. Полоцкий ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРА МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ PGP В КЛЕТКАХ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА И ОКРУЖАЮЩЕЙ НОРМАЛЬНОЙ ТКАНИ ЛЕГКОГО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Цель исследования. Существует точка зрения, что врожденная множественная лекарственная резистентность опухолей, обусловленная выбросом противоопухолевых препаратов из клеток, предопределена гипер-экспресией АТФ-зависимых транспортных белков (MDR-транспортеров) в соответствующей нормальной ткани. Представление базируется на сравнении средних показателей частоты их экспрессии в опухолевой и нормальной ткани разных больных, что, по нашему мнению, неадекватно поставленной задаче. Целью настоящего исследования является сопоставление экспрессии MDR-маркера Pgp в клетках НМРЛ и окружающей нормальной ткани легкого у каждого из обследованных больных.

Материалы и методы. Клетки НМРЛ и окружающей нормальной ткани получены из хирургических образцов тканей 27 пациентов. Экспрессия Pgp исследована методом проточной цитофлуориметрии с использованием FITC конъюгированных моноклональных и соответствующих изотипических антител. Специфическую флуоресценцию клеток анализировали с помощью программы WinMDI, количество специфически окрашенных клеток определяли методом Колмогорова-Смирнова. Проведено сопоставление экспрессии Pgp в опухолевых и нормальных клетках по средним показателям в группе обследованных больных и у каждого из обследованных пациентов.

Результаты.

1. В группе обследованных больных не выявлено различий между средними показателями экспрессии Pgp в клетках НМРЛ и окружающей нормальной ткани: количество специфически окрашенных клеток составило 24,8 и 20,1%, а отношение специфической к изотипической флуоресценции клеток - 1,7 и 1,5 соответственно.

2. При сравнении показателей экспрессии Pgp в нормальной и опухолевой ткани легкого индивидуально у каждого больного выявлены значительные различия. Совпадение отношения специфической флуоресценции клеток к изотипической и количества специфически окрашенных клеток в нормальной и опухолевой ткани отмечено в 60 и 55% случаев соответственно. Среди остальных пациентов эти показатели в клетках нормальной ткани легкого были ниже (в 45 и 73% случаев), или выше (в 55 и 27% случаев), чем в НМРЛ.

Выводы. На примере НМРЛ и одного из основных маркеров множественной лекарственной резистентности - Pgp - показано, что врожденная множественная лекарственная резистентность опухоли не предопределена экспрессией MDR-фенотипа в соответствующей нормальной ткани и является независимой патогенетической характеристикой опухоли.

Поддержано Грантом РФФИ № 09-04-13560.

А.А. Вартанян

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ВАСКУЛОГЕННОЙ МИМИКРИИ ПРИ МЕЛАНОМЕ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Актуальность проблемы. Термин «васкулогенная мимикрия» (ВМ) был введен в 1999 г. группой американских ученых для описания уникальной особенности высоко агрессивных опухолевых клеток формировать сосудистую сеть, имитирующую васкуляризацию эмбриона. Тот факт, что наличие компонента ВМ описывается при многих высоко агрессивных, метастатических опухолях говорит о том, что мы имеем дело с новой характеристикой злокачественной опухоли. В настоящем докладе будет вынесен на дискуссию материал, аккумулированный за последние 5 лет по проблеме становления ВМ при злокачественных новообразованиях.

Методы. В работе были использованы клетки меланомы, выведенные в клеточную линию из операционного материала больных диссеминированной меланомой, а также срезы из опухолевого материала больных. Мы оперировали методами формирования СПС в 3D-культуре, иммуногистохимии, иммуноцитохимии, проточной цитофлуриометрии, электрофореза белков, им-муноблотинга, определяли инвазивный потенциал и миграцию клеток, а также подтверждали полученные результаты в in vivo экспериментальной модели меланомы

Результаты. СПС формируют высоко инвазивные клетки, низко инвазивные клетки подобных структур

не дают. Основные геометрические параметры рисунка васкулогенной мимикрии формируются на самой начальной стадии процесса. Для формирования СПС необходима не репрессированная апоптическая машина. Движущей силой формирования СПС является высокий уровень Я08 в клетке. Формирование сосудисто-подобных структур находится под контролем УБвБ. В отличие от образования ангиогенных сосудов, васкулогенная мимикрия опухоли запускается УБвРЯ!. Выявление компонента ВМ в опухолевых срезах коррелирует с частотой метастазирования.

Заключение. В последние годы стало ясно, что

1. Не все опухоли отвечают на антиангиогенную терапию.

2. Более того, через несколько курсов терапии наступает резистентность.

Единственно разумное объяснение этому является существование других механизмов (кроме УБОР/УБОРР2), регулирующих ангиогенез опухоли, и возможно, существования дополнительной системы кровотока в опухоли. ВМ при злокачественных заболеваниях может быть одной из таких систем.

Н.В. Голубцова, Н.Б. Преснякова, В.В.Новиков,

К.А. Барышников, И.Н.Михайлова, А.Ю. Барышников СОДЕРЖАНИЕ СЫВОРОТОЧНОГО УРОВНЯ РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ МОЛЕКУЛ ИЬА I КЛАССА У БОЛЬНЫХ С ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ КОЖИ ПРИ ДЕНДРИТНОКЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНОТЕРАПИИ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород

Задачи исследования. Исследовать содержание сывороточного уровня растворимой формы молекул ИЬА I класса у больных диссеминированной меланомой кожи в процессе вакцинотерапии дендритными клетками.

Материалы и методы. Материалом для исследования явились образцы сывороток периферической крови 55 больных, которые после хирургического удаления опухоли получали дендритную вакцину (6-27 вакцинаций) с интервалом в 1 мес. Образцы сывороток готовили до введения вакцины и перед каждой последующей вакцинацией. В качестве контроля использовали сыворотки 32 здоровых доноров. Определение сывороточного уровня проводили иммуноферментным методом с использованием МКА серии ИКО и поликлональных антител, специфичных к мембранным протеинам мононукле-арных клеток крови человека. Результаты выражали в условных единицах (и/т1).

Результаты и выводы. Среднее значение концентрации сывороточного уровня растворимой формы молекул ИЬА I класса у здоровых доноров составило 1012±36 и/т1, при этом уровень колебался 800-1200 и/т1. Для унификации анализа высчитывали процент угнетения или стимуляции уровня по сравнению с контролем. У здоровых доноров колебания уровня, по сравнению со средним его значением, составили 20%. В зависимости от изменения содержания уровня в образцах сыворотки крови пациентов больные были разделены на 3 группы. В процессе вакцинотерапии у пациентов 1 группы (10 человек) наблюдали линейное повышение уровня 70-250 %. Во 2 группе (13 пациентов) с пониженным начальным содержанием сывороточного уровня растворимой формы молекул ИЬА I класса наблюдалось снижение уровня, а в 3 группе (32 пациента) в течение первых 5 вакцинаций наблюдалось умеренное снижение до нижних границ нормы, а затем - повышение до контрольного уровня. Изучается корреляция полученных показателей содержания сывороточного уровня растворимой формы молекул ИЬА I класса с клиническими характеристиками данных больных.

Г.А. Гордина, А.В. Киселев, И.Ю. Кубасова.,

С.А. Зорина, О.И. Тарасова ПАТЕНТЫ

В РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН В 2009 ГОДУ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

На 1 января 2009 года в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН имелось 40 патентов. Объектами патентных прав поддерживаемых патентов являлись: способы диагностики и лечения различных форм злокачественных опухолей; способы криоконсервирования пуповинной крови; способ получения противоопухолевых препаратов; противоопухолевые средства; клеточные линии, используемые для скрининга противоопухолевых препаратов и получения противоопухолевых вакцин; устройства медицинского назначения.

В создании интеллектуальной собственности РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН следует отметить наибольшую активность научных сотрудников НИИ ЭДиТО и НИИ КО. Из 25 поддерживаемых в силе патентов авторами 18 изобретений являлись сотрудники НИИ ЭДиТО; 13 - сотрудники НИИ КО. Восемь изобретений созданы при совместном участии институтов.

В результате научного сотрудничества с другими НИИ (ФГУП “ГНЦ НИОПИК”, ИОФ им. А.М. Прохорова РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова и др.) получены 8 патентов на изобретения.

Пять изобретений из числа поддерживаемых в силе патентов включены Федеральным институтом промышленной собственности в базу «Перспективные изобретения», два изобретения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН награждены Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломом в номинации «100 лучших изобретений России».

В связи с невозможностью коммерческого использования и необходимостью экономии средств поддержание в силе 15 патентов было прекращено до истечения правового срока. Таким образом, к концу 2009 г. поддерживались в силе 25 патентов, которые потенциально могут быть использованы с коммерческой целью.

И.Н.Григорьева, Е.В. Степанова, Н.Н. Семенов,

Н.В.Доброва, А.Ю.Барышников ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ ХИМИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ В ТКАНИ ПЕРВИЧНОЙ ОПУХОЛИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА И ОТВЕТ НА ПЕРВУЮ ЛИНИЮ ХИМИОТЕРАПИИ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Введение. Анализ экспрессии маркеров химиорезистентности в ткани первичной опухоли КРР может предсказать эффективность химиотерапевтического лечения. Целью настоящего исследования является определение корреляции между экспрессией маркеров химиорезистентности в ткани КРР и ответом на первую линию ХТ.

Материалы и методы. 100 больных КРР получали фторпиримидины и/или Оксалиплатин в качестве первой линии ХТ. Иммуногистохимическое исследование 6 молекулярно-биологических маркеров было проведено на срезах с парафиновых блоков первичной опухоли с использованием антител к тимидин фосфо-рилазе (ТФ) (1:100, РОвБ 44С, СаІЬіосИет), тимиди-лат синтетазе (ТС) (1:50, Т8106, СИетісоп), Топоизо-меразе I (1:100, АЬ-1, АЬсат), Топоизомеразе II альфа (1:200, КіБ1, БАКО), Кі-67 (1:50, М1В1, БАКО) и ХЯСС-1 (1:500, АЬ-3(144), №оМагкеге).

Результаты. Эффективность ХТ колоректального рака не коррелирует с такими клинико-морфологически-

ми характеристиками как размер опухоли, локализация опухоли и стадия заболевания. Высокая эффективность Оксалиплатина в первой линии химиотерапии коррелирует с низким уровнем экспрессии Топоизомеразы I и XRCC1 в ткани первичной опухоли. В опухолях, отрицательных по Топоизомеразе I, выживаемость без прогрессии составляет 8,2 мес., а в опухолях, положительных по маркеру, - 1,7 мес. (p=0,034). В опухолях, отрицательных по XRCC-1, выживаемость без прогрессии составляет 6,6 мес., а в опухолях, положительных по маркеру, - 1,6 мес. (р=0,051). Уровень экспрессии TC и ТФ в ткани первичной опухоли может предсказать эффективность фторпиримидинов в качестве первой линии химиотерапии. Низкий уровень экспрессии ТФ в ткани первичной опухоли коррелирует с низкой, а низкий уровень экспрессии ТС - с высокой эффективностью лечения метастатической болезни фторипримидинами.

Выводы. Определение экспрессии Топоизомеразы

I, XRCC-1, ТФ и ТС в опухоли является перспективным маркером предсказания эффективности лечения больных метастатическим колоректальным раком режимами с использованием фторпиримидинов и/или оксалиплатина.

Работа осуществлялась при финансовой поддержке Московского Правительства.

H. Гуррам, Д.В. Новиков, К.В. Березин, Т.В. Белова,

А.В. Калугин, А.В. Алясова, В.В. Новиков

мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АГ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород НГМА , Н. Новгород

Задачи. Среди опухоле ассоциированных антигенов выделяют группу раково-тестикулярных антигенов, которые обнаруживаются в опухолевых клетках различного происхождения в различных комбинациях и имеют прогностический потенциал. Обнаружено, что мРНК, кодирующая раково-тестикулярные антигены, встречается не только в опухолевом очаге, но и в периферической крови онкологических больных. Матричная РНК MAGE-A1-6 антигенов обнаружена на всех стадиях опухолевого процесса в крови больных раком молочной железы, раком легкого и раком эндометрия (Новиков Д.В. и др., 2009). Задачей настоящего исследования явилось исследование встречаемости матричной РНК раковотестикулярных XAGE, GAGE, SSX и MAGE-C антигенов в крови и опухолевых очагах больных раком почки.

Материалы и методы. В ходе работы были исследованы образцы периферической крови и опухолевых очагов, полученные от 34 больных раком почки, проходивших лечение в Приволжском медицинском центре (Н. Новгород). мРНК раково-тестикулярных АГ XAGE-1, GAGE1-9, SSX-1,2,4 и MAGE-C определяли методом гнездовой ОТ-ПЦР с применением разработанных авторами праймеров. Результаты реакции учитывали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

Результаты и выводы. В образцах опухолевых очагов больных раком почки мРНК XAGE-1; GAGE1-9 и SSX-1,2,4 антигенов выявлялись в 44; 33 и 67 % случаев, соответственно. В периферической крови больных раком почки матричные РНК XAGE-1, GAGE1-9 и SSX-

I,2,4 АГ выявлялись в 40, 78 и 84 % случаев соответственно. Ни в одном образце периферической крови и опухолевых очагов не обнаружена мРНК АГ MAGE-C. Таким образом, при раке почки как в опухолевых клетках, так и периферической крови обнаруживается мРНК различных раково'-тестикулярных АГ.

Исследование поддержано ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, ГК №П802.

Гурцевич В.Э., Смирнова К.В., Дидук С.В.,

Сенюта Н.Б., Щербак Л.Н., Гончарова Е.В.,

Степина В.Н., Ковригина А.М.,

Никулин М.П., Яковлева Л.С.

РАК ЖЕЛУДКА И ВИРУС ЭПШТЕЙНА-БАРР: ЛИТЕРАТУРНЫЕ ДАННЫЕ И СОБСТВЕННЫЕ НАБЛЮДЕНИЯ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

По данным МАИР в структуре онкологической заболеваемости населения земного шара рак желудка занимает четвертое место после рака легкого, молочной железы и толстой кишки. В России заболеваемость РЖ занимает второе место среди злокачественных опухолей всех локализаций. Ежегодно число случаев этого заболевания в нашей стране увеличивается на 48,8 тыс. и около 45 тыс. умирает от этой патологии. К числу известных факторов риска, влияющих на уровень заболеваемости РЖ, следует отнести инфекцию Helicobacter pylori, высокое потребление соли, низкое потребление свежих овощей и фруктов, курение, ожирение и ряд других. Среди инфекционных агентов кроме Helicobacter pylori к факторам риска относят также и вирус Эпштейна-Барр (EBV).

Впервые ассоциация EBV с РЖ была продемонстрирована в конце 1990-х гг. для редко встречающегося лимфоэпителиома подобного (ЛЭП) варианта опухоли. Вскоре EBV-инфекцию в виде малой РНК вируса (EBER) стали обнаруживать методом ISH в опухолевых клетках типичных, гистологически часто встречающихся случаев заболевания. При этом число EBV+-вариантов РЖ в этой группе опухолей колебалось от 1,8 до 16%, в зависимости от географического региона, в то время как среди ЛЭП-подобных опухолей этот показатель достигал 80%.

В наших более ранних работах при изучении методом ISH образцов опухоли от 430 больных РЖ EBER+^лучаи были выявлены у 49 пациентов, что составляет 11,4% и соответствует среднестатистическому мировому показателю (10%) для этой EBV-ассоциированной патологии. При этом вирусную РНК, обнаруживали практически в 80-100% эпителиальных опухолевых клеток, но не в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах. Однако позитивные сигналы EBER у больных РЖ в ряде исследований были обнаружены и в лимфоцитах, инфильтрирующих слизистую оболочку желудка, не подверженную неопластическому процессу или в лимфоцитах реактивных лимфатических узлов. Эти данные, а также идентификация LMP1 в высоком проценте реактивных лимфоцитов в опухолях, не ассоциированных с вирусом (РЖ™^), поднимает вопрос о роли EBV в патогенезе EBV- форм этого заболевания.

Для внесения ясности в данную проблему нам представлялось важным на первом этапе исследований выяснить наличие генетических различий между вариантами EBV, персистирующими в опухолевой ткани больных РЖш^и в организме этих же больных, ранее первично инфицированных этим вирусом. С этой целью нами был проведен сиквенсный анализ одного из онкогенов EBV, LMP1, амплифицированно-го из опухолевой ткани указанных больных и клеток ротоглоточных смывов этих же больных. Проведенные исследования показали, что в некоторых случаях сиквенсы образцов LMP1 из изучаемых биологических материалов были идентичными, в других - существенно разнились. Выявленные различия, по-видимому, могут быть объяснены результатом репликации исходно инфицирующего варианта ВЭБ в двух типах клеток - лимфоидных (в опухоли) и эпителиальных (в ротоглотке).

Нельзя исключить, однако, и возможности вторичного инфицирования больного дополнительным отличающимся штаммом вируса. Полученные данные являются начальным этапом в изучении роли ВЭБ в патогенезе РЖШУ- и нуждаются в продолжении исследований на репрезентативном клиническом материале с использованием дополнительных методов и современных технологий.

‘Деженкова Л.Г., гТевяшова А.Н., 1Збарский В.Б., Олсуфьева Е.Н., 2Штиль А.А,1 Преображенская М.Н. ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ РОЛЬ О-АЦИЛЬНЫХ ЗАМЕСТИТЕЛЕЙ В УГЛЕВОДНЫХ ФРАГМЕНТАХ ОЛИВОМИЦИНА А В ЦИТОТОКСИЧНОСТИ И ИНГИБИРОВАНИИ ТОПОИЗОМЕРАЗЫ I 1НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Цели. Исследование роли О-ацильных заместителей в проявлении цитотоксического эффекта оливоми-цина А, его природных и полусинтетических производных. Выяснение механизма цитотоксического действия антибиотиков группы ауреоловой кислоты.

Методы. Природные антибиотики (1; 2; 3) выделены из смеси оливомицинов, получаемой при ферментации штамма-продуцента. Деацилированные

производные (4; 5) получены путем селективного щелочного гидролиза О-ацильных групп в ди- и трисаха-ридном остатке. Цитотоксичность определяли в МТТ-тесте при действии соединений на клетки линии НСТ116. Мишень-направленное действие на ДНК-зависимый фермент топоизомеразу I изучали в реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК (в диапазоне концентраций 0,1-10 мкМ).

Результаты. Оливомицин А и производные 2 и 3 вызывали гибель клеток и ингибировали топоизоме-разу I в субмикромолярных концентрациях. Производные оливомицина А, содержащие лишь ацетильную группу в дисахаридном остатке (5) или не содержащие ацильных групп в дисахаридной и трисахарид-ной ветвях (4), оказались не цитотоксичны и не влияли на активность топоизомеразы I.

Таблица

Выводы. При изучении серии природных противоопухолевых антибиотиков - оливомицинов и их полусинтетических производных выявлена определяющая роль О-ацильных заместителей в углеводных остатках в антипролиферативной активности и ингибировании ключевого фермента - топоизомеразы I. Удаление О-ацильных остатков в углеводных фрагментах значительно сильнее снижает цитотоксичность, чем О-метилирование, О-ацетилирование агли-кона или модификация боковой цепи антибиотика.

Соединение R1 R2 IC50, цМ (HCT116)* Ингибирование топо I **

1 Ac (CH3)2CHC(O) < 0,025 +++

2 H (CH3)2CHC(O) 0,28±0,05 +

3 Ac Ac 0,064±0,006 ++

4 H H > 50 нет эффекта

5 Ac H > 50 нет эффекта

*данные 3 экспериментов; **полуколичественная оценка.

OMe OH

ROW

~ I-П

OH OH о

HO. CH3 HO CH

1 - 5

А.В. Калугин, Т.В. Белова, Е.С. Плеханова,

Д.В. Новиков, К.А. Коровушкина,

Е.Ю. Конторщикова, В.В. Новиков СРАВНЕНИЕ ВСТРЕЧАЕМОСТИ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АГ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ МИОМОЙ МАТКИ И РАКОМ ЭНДОМЕТРИЯ НИИ МБРЭ ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород НГМА

Задачи исследования. Сравнить частоту обнаружения матричных РНК NY-ESO-1, SSX-1,2,4, MAGE-C, XAGE-1, GAGE1-S и PAGE-1 АГ в периферической крови больных миомой матки и раком эндометрия.

Материалы и методы. 32 образца периферической крови больных миомой матки и 20 образцов периферической крови больных раком эндометрия исследовали на присутствие мРНК NY-ESO-1, SSX-1,2,4, MAGE-C, XAGE-1, GAGE1-S и PAGE-1 методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров.

Результаты. Суммарная частота выявления мРНК тестированных антигенов при раке эндометрия составила 40 %, а при миоме матки - 31,3 %. В образцах периферической крови больных раком эндометрия мРНК NY-ESO-l обнаружена в 30 % случаев, мРНК PAGE-l

- в 20 % случаев, мРНК XAGE-1 - в 1S % случаев, мРНК SSX-1,2,4 - в 12 % случаев, а мРНК GAGE1-S - в

l0 % случаев. При этом в образцах крови 5 больных раком эндометрия была обнаружена мРНК одного из исследуемых антигенов, а в 3 образцах крови - мРНК двух АГ. Ни один образец периферической крови больных раком эндометрия не содержал матричные РНК более чем двух АГ. В образцах периферической крови больных миомой матки чаще выявлялись мРНК SSX-

1,2,4 (19 %), мРНК PAGE-1 (1S %), мРНК NY-ESO-1 (12 %) и мРНК XAGE-1 (11 %). Реже экспрессировалась мРНК GAGE1-S (4 %).

При этом мРНК хотя бы одного АГ была обнаружена в образцах крови l0 больных миомой матки, мРНК двух АГ - в крови 2 пациентов и мРНК 3 АГ - в крови l пациента (ХAGE-1, PAGE-1 и SSX-1,2,4). Ни в одном из исследованных образцов периферической крови больных раком эндометрия и миомы матки мРНК MAGE-C обнаружена не была.

Выводы. Матричная РНК NY-ESO-1, SSX-1,2,4, MAGE-C, XAGE-1, GAGE1-S и PAGE-1 встречается как при раке эндометрия, так и при миоме матки.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Д.И. Князев, Т.А. Сахарнова, Д.В. Новиков,

А. В. Алясова, В. В. Новиков

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ И ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ICAM-1 ПРИ РАКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ

НИИ МБРЭ ННГУ им. Н.И. Лобачевского Н. Новгород

Задачи исследования. Согласно опубликованным данным, повышенная экспрессия ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) при раке может как подавлять развитие опухоли, так и способствовать агрессивному опухолевому росту и усилению метастатического потенциала. В настоящей работе проведено исследование образцов опухолей ТК на наличие матричных РНК, кодирующих мембранную и растворимую формы ICAM-1; выполнено сравнение уровня растворимого ICAM-1 в сыворотке крови между пациентами и условно здоровыми донорами; проведено генотипирование больных по однонуклеотидному полиморфизму (SNP, single nucleotide polymorphism) rs549S - замене аденина на гуанин, приводящего к аминокислотной замене лизин-глутамин в составе трансмембранного домена ICAM-1.

Материалы и методы. В исследование было включено 49 больных КРР в возрасте от 45 до 84 лет с хирургически извлеченной первичной опухолью на разных стадиях патологии. Детекцию мРНК мембранной и растворимой форм 1САМ-1 в образцах опухолей проводили методом ОТ-ПЦР.

Генотипирование по 8КР ге5498 выполняли методами ПЦР и секвенирования. Определение уровня растворимого 1САМ-1 в сыворотке крови выполняли двухсайтовым иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител ИКО-184, специфичных к 1САМ-1, и поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека.

Результаты и выводы. мРНК мембранной формы 1САМ-1 наблюдалась в 84% случаев, из них в 34% случаев обнаруживалась мРНК растворимой формы. Случаев экспрессии мРНК только растворимой формы в опухолевых очагах не наблюдалось. У больных без метастазов мРНК растворимой формы выявлялась в 35% случаев, тогда как у больных с регионарными и отдаленными метастазами - в 13% случаев.

Таким образом, можно предположить, что наличие растворимой формы мРНК 1САМ-1 ассоциировано с пониженным риском возникновения метастазов. Уровень растворимого 1САМ-1 в сыворотке крови больных был вдвое выше, чем у доноров, независимо от присутствия мРНК 1САМ-1 в клетках опухолевых очагов. Распределение генотипов по ге5498 было следующим: АА-33%, Ав-49%, вв-18%, частота аллеля А составила 57%, в - 43%.

Полученные данные соответствуют ранее опубликованным результатам исследователей из Германии.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Короленкова Л.И., Степанова Е.В., Ермилова В.Д., Барышников А.Ю., Брюзгин В.В. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВНУТРИЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ ШЕЙКИ МАТКИ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Цель исследования. Определение уровня экспрессии молекулярно-биологических маркеров (Ш-67, ТФ, РТЕ" при внутриэпителиальных гиперплазиях шейки матки и их значении для определения степени дисплазии.

Было исследовано образцы от 52 больных с СШ" шейки матки: из них 12 Сш 1; 16 СШ 2 и 24 СШ 3. В качестве контрольных исследованы 10 образцов нормальной ткани шейки матки. Было проведено иммуно-гистохимическое исследование экспрессии Кт-67, ТФ, РТЕ" в фиксированных в формалине, заключенных в парафин блоках тканей шейки матки, взятых при выполнении петлевых эксцизий и конусовидных ампутаций. Для каждого маркера оценивались процент положительных клеток и интенсивность окрашивания.

В нормальной эпителиальной ткани шейки матки обнаружен низкий уровень экспрессии К1-67. Экспрессия К1-67 локализуется в базальных слоях эпителия, средний индекс Кь67-положительных клеток не превышает 7+4%.

При увеличении степени СШ происходит увеличение количества К1-67 положительных клеток до 18+6% при СЕЧ 1, 57+12% при СЕЧ 2 и 87+9% при СШ 3. При СШ2 К1-67^клетки присутствуют только в слоях, соответствующих 1/2 толщины эпителия, тогда как при СШ" 3 они выявляются по всей толщине эпителия. Экспрессия ТФ также значительно увеличивается с увеличением стадии СГЫ".

Чем выше стадия CIN, тем больше ТФ+-клеток наблюдается в слоях, соответствующих базальному и парабазальному слоям эпителия. Также показано, что при CIN 3 в 15% случаях наблюдается снижение экспрессии PTEN в эпителиальных клетках.

Таким образом показано, что индекс Ki-67 и экспрессия TP в эпителии прямо коррелируют со степенью дисплазии. Они могут играть важную роль в канцерогенезе предраковых поражениях шейки матки и могут быть использованы как молекулярные маркеры прогрессии CIN и являться объектами таргетной терапии.

А.В. Лихтенштейн

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ СОСТАВЛЯЮЩИЕ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

С давних пор противостояли друг другу две идеи: «рак - болезнь генов» и «рак - болезнь регуляции генов». Первая полагала первопричиной рака генные мутации, вторая - изменения структур, управляющих генной активностью. Сегодня они взаимно дополняют друг друга: в канцерогенезе, как оказалось, есть две составляющие: мутагенез (точковые мутации, делеции, инсер-ции, хромосомные аберрации) и эпигенез (метилирование промоторов генов-супрессоров, глобальное деметилирование генома, модификации гистонов, микроРНК-регуляция). В рамках канцерогенеза, таким образом, уживаются несовместимые, казалось бы, начала: хаотическое (мутагенез) и высоко упорядоченное (эпигенез). Мутации редки, случайны, возникают в одиночных клетках (моноклональны). Эпигенетические события, напротив, упорядочены - охватывая геном, они координируют ряд сложных подсистем, формируются в эмбриогенезе и разворачиваются на протяжении последующей жизни. Ведущие к раку эпигенетические им-принты наследуемы, возникают рано (часто на стадии доклинических изменений), одновременно во многих клетках (поликлональны), имеют детерминистический характер. Эти данные свидетельствуют в пользу эпигенетической модели возникновения рака (epigenetic progenitor model of cancer, Feinberg et al., 2006), предполагающей существование особой популяции клеток-предшественников, мутации которых порождают раковые стволовые клетки. Последние, в свою очередь, дают начало злокачественной опухоли.

И.Н. Михайлова1 , Е.С. Панкратова2, Д.А. Добрынин2, И.В. Самойленко , В.В. Решетникова1, В.М. Шелепова1, Л.В. Демидов1, А.Ю. Барышников1, В.К. Финн2 О ПРИМЕНЕНИИ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ КОМПЬЮТЕРНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛИНИЧЕСКИХ ДАННЫХ БОЛЬНЫХ

1МЕЛАНОМОЙ

1РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ВИНИТИ РАН, Москва

Прогноз у больных локализованными формами меланомы кожи зависит от исходной стадии заболевания (TNM) и многих других факторов, значение которых остается малоизученным. Мы решили применить компьютерную интеллектуальную систему для выяснения ее возможности порождать прогноз больных меланомой кожи. Также мы решили оценить прогностическое значение уровня S100 - широко изучаемого биохимического маркера прогрессирования меланомы кожи - при помощи этой новой компьютерной системы.

Цель. Создание компьютерной интеллектуальной системы прогнозирования продолжительности жизни больных меланомой в зависимости от экспрессии протеина S100.

Материалы и методы. Для анализа клинических данных больных с меланомой кожи был применен ДСМ-метод автоматического порождения гипотез, который является новым средством доказательной медицины. Для этой системы была создана база данных (БД), атрибутами которой являются сведения о больных, представленные в медицинских картах (всего 50 атрибутов, включая демографические данные, гистологические характеристики, лабораторные показатели). Для каждого больного определено значение протеина S100 и общая продолжительность жизни. Созданная интеллектуальная система устанавливает сходство фактов в БД посредством процедуры индукции; найденное сходство используется для порождения гипотез о причинно-следственных зависимостях; система использует эти гипотезы для предсказания посредством аналогии наличие (или отсутствие) изучаемых эффектов (продолжительности жизни в данном исследовании); далее система осуществляет процедуру проверки того, что в начальном состоянии БД позитивные факты содержат позитивную причину, а негативные факты - негативную причину (условие отсутствия изучаемого эффекта); процедура объяснения дает возможность пополнить БД новыми фактами, если порожденных гипотез недостаточно.

Результаты. В результате проведенных экспериментов было выявлено следующее: все порожденные положительные гипотезы-причины (продолжительности жизни больше 5 лет), помимо прочих атрибутов, включают значение S100 меньше 0,120 нг/мл (лабораторная норма РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН), а все отрицательные (продолжительность жизни меньше 5 лет) - значение S100 больше 0,120 нг/мл. Для проверки работы системы применялась следующая стратегия: последовательно каждый пример из БД считался неизвестным и доопределялся средствами системы.

Выводы. Предлагаемая компьютерная интеллектуальная система является инструментом поддержки медицинских исследований со сложно структурированными данными и множеством фактов, необозримых без использования компьютерных технологий. Результаты применения ДСМ-метода как средства анализа онкологических данных демонстрируют полезность этого метода, являющегося новым инструментом доказательной медицины.

Т.В. Михайлова, М.А. Барышникова, Л.Ф. Морозова,

О. С. Бурова, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников ЭКСПРЕССИЯ HSP70 НА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Задачи исследования. Оценить уровень экспрессии hsp70 на клеточных линиях меланомы человека и отобрать линии с высокой экспрессией как потенциально иммуногенные.

Материалы и методы. Готовили лизаты клеток меланомы человека линий mel P, mel Kor, mel Mtp, mel

Il, mel Is, mel Si, mel Me, mel Gus, mel Z, mel Gi, mel Ibr, mel R, mel Rac, mel Ch, Mel Cher, полученных из опухолевого материала больных диссеминированной меланомой и выведенных в клеточную линию в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Методом иммуноблоттинга определяли уровень экспрессии hsp70 в лизатах. Сравнивали лизаты, приготовленные из клеток, культивированных по стандартной методике, а также прогретых при температуре 42 °С на водяной бане в течение 10 мин и после заморозки при температуре -80 °С.

Результаты. Во всех 15 анализируемых клеточных линиях меланомы был обнаружен белок с молекулярной массой 70 кДа, соответствующий полноразмерному hsp70, но его количество варьировало как в различных клеточных линиях, так и в зависимости от предварительной обработки клеток.

Самое низкое содержание hsp70 обнаружено на линиях Mel Si (5,29%), Mel Kor (5,13%), Mel Ibr (5,13%), Mel Ch (5,46%). Высокое содержание hsp70 зафиксировано на линиях Mel Me (20,04%), Mel Is (15,17%), Mel Z (13,81%). Высокий уровень экспрессии hsp70 в клетках после прогревания наблюдали на клеточных линиях Mel Me (24,76%), Mel Si (11,98%).

Наибольшее количество hsp70 в клетках, подвергну -тых заморозке, обнаружили на линиях Mel Si (16,47%), Mel Mtp (19,73%), Mel Is (11,12%), Mel Gi (12,38%), Mel Me (16,56%), Mel Z (14,58%).

Практически не изменялся уровень экспрессии в клетках после прогревания по сравнению с непрогретыми клетками на клеточных линиях Mel R, Mel Kor, Mel Ibr, Mel Cher, Mel P, Mel Gus, Mel Rac. Эти результаты могут указывать на то, что клетки этих линий слабо реагируют на прогревание.

Выводы. Исследованные клеточные линии меланомы различаются по уровню экспрессии hsp70, причем интенсивность ее меняется в зависимости от типа и времени воздействия на клетки. Наиболее высокий уровень экспрессии hsp70 имеют клетки после предварительной заморозки.

Предположительно, потенциально более иммуно-генными являются клетки линий Mel Si, Mel Mtp, Mel Is, Mel Z после предварительной заморозки.

В.В. Новиков

ОСОБЕННОСТИ ТРАНСКРИПТОМА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

НГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород

Результаты постгеномных проектов, направленных на изучение генома и транскриптома опухолевых клеток, свидетельствуют о наличии множества мутаций, обусловливающих злокачественную трансформацию клеток и прогрессирование опухолевого процесса.

В геномах раковых клеток в зависимости от гистологического типа обнаруживается от 50 до нескольких сотен значимых для развития опухоли мутаций в белок-кодирующих регионах генов. Более того, обнаруживается значительная гетерогенность геномных альтераций в опухолевых клетках одного и того же типа.

Однако картина значительно упрощается, если рассматриваются молекулярно-биологические пути и процессы, в которых участвуют мутантные гены. Сложность и многообразие изменений сводится к нарушению относительно небольшого количества путей реализации биологической информации. При этом особенности нарушений могут варьировать от опухоли к опухоли.

Геномные изменения отражаются на состоянии транс-криптома опухолевых клеток. Профилирование экспрессии генов показало, что в зависимости от опухоли насчитывается от нескольких сотен до нескольких тысяч генов с измененной экспрессией или генов, не характерных для данного типа клеток в норме (от 0,6 до 20 % генов).

Дисрегуляция и, как следствие, изменение уровня экспрессии зарегистрировано для генов, участвующих в передаче внутриклеточных и межклеточных сигналов, молекулярных механизмах прохождения по клеточному циклу, в апоптотических процессах, механизмах инвазии клеток, репликации и репарации ДНК.

В опухолевых клетках обнаруживается матричная РНК, кодирующая белки, характерные для эмбрионального периода онтогенеза, достаточно часто и в больших

количествах присутствует матричная РНК большой группы раково-тестикулярных антигенов, в норме принимающих участие в сперматогенезе. Многие из этих антигенов высоко иммуногены и рассматриваются как потенциальные высокоэффективные средства для вакцинотерапии опухолей.

В раковых клетках включается экспрессия генов, отвечающих за иммунологические процессы.

Так, в опухолевых клетках обнаруживается матричная РНК, кодирующая молекулы адгезии, в частности ICAM-1, a-цепь рецептора ИЛ-2, участвующего в активации и пролиферации клеток, а также меняется спектр экспрессии альтернативных вариантов матричной РНК молекулы Fas, опосредующей апоптоз как раковых клеток, так и клеток иммунной системы.

Д.В. Новиков, Т.В. Белова, А.В., Д.И. Князев,

Т. В. Наседкина ВЫЯВЛЕНИЕ

мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АГ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕЛЕВОГО БИОЧИПА

НГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород

Задачи исследования. Среди генов, экспрессия которых обнаруживается в опухолевых клетках, известна обширная группа раково-тестикулярных генов (cancer/testis).

Их экспрессия в соматических клетках взрослого организма подавлена эпигенетически. Ограниченная экспрессия раково-тестикулярных генов позволяет использовать их в качестве маркера неопластических процессов.

Материалы и методы. Исследовали образцы опухолевых очагов и периферической крови 25 больных раком легкого и 48 больных РТК.

В качестве отрицательного контроля использовали образцы периферической крови 30 здоровых волонтеров. Матричную РНК выявляли методом ОТ-ПЦР. Результаты реакции регистрировали методом ЭФ в агарозном геле или гибридизацией на разработанном авторами ДНК-чипе.

Результаты и выводы. Подобраны праймеры и зонды для специфичного выявления мРНК 24 раковотестикулярных генов, относящихся к семействам BAGE, CAGE, GAGE, MAGE-A, MAGE-C, NY-ESO-I, SSX, и XAGE. При анализе частоты выявления мРНК в образцах опухолевых очагов рака легкого наиболее часто обнаруживались мРНК MAGE-A, MAGE-C, NY-ESO-I и XAGE (95, 70, 65 и 45% случаев соответственно).

В образцах опухолевых очагов РТК чаще других выявлялись мРНК MAGE-A, MAGE-C, и XAGE (68; 52 и 68% случаев соответственно).

Частота обнаружения мРНК остальных антигенов варьировала от 0 до 36 %.

Суммарная частота выявления мРНК раково-тестикулярных АГ в образцах опухолевых очагов как рака легкого, так и РТКсоставила 100 %. Причем в каждом образце была выявлена мРНК как минимум двух раково-тестикулярных АГ.

В образцах периферической крови больных раком легкого и РТК мРНК хотя бы одного из исследуемых раково-тестикулярных АГ выявлена в 70 и 62% случаев соответственно.

Так же как и в опухолевых очагах, в образцах периферической крови чаще других выявлялись мРНК MAGE-A, MAGE-C, NY-ESO-I и XAGE.

В образцах периферической крови от здоровых волонтеров мРНК раково-тестикулярных АГ обнаружено не было.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

С.В. Новикова, Н.А. Сахарнов, Д.В. Новиков, А.В. Алясова АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА а-ЦЕПИ РЕЦЕПТОРА ИЛ-2

В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГОВ БОЛЬНЫХ КРР

НГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород

Задачи исследования. Известно, что в опухолевой клетке происходит существенный сдвиг спектра экспрессии многих генов, сопровождающийся синтезом продуктов, не свойственных данному типу ткани в норме. Так, опухолевый процесс может обусловливать появление на поверхности неопластической клетки белков, характерных для клеток иммунной системы. Одним из белков клеток иммунной системы является а-цепь рецептора интерлейкина-2 (СБ25-антиген). СБ25-антиген участвует в механизмах активации иммунной системы в целом и в процессах пролиферации отдельных лимфоцитов. Целью работы явилась оценка частоты встречаемости матричной РНК СБ25 антигена в клетках опухолевых очагов больных КРР.

Материалы и методы. Исследовали 51 образец клеток опухолевых очагов больных КРР. Характер экспрессии гена а-цепи рецептора ИЛ-2 определяли методом ОТ-ПЦР с использованием разработанных авторами праймеров, специфичных к местам соединения экзонов мРНК. Нуклеотидную последовательность кДНК определяли с использованием дидезокси-нуклеотидного метода.

Результаты и выводы. В тестированных образцах были обнаружены полноразмерная и альтернативная формы мРНк СБ25-антигена. Анализ первичной структуры альтернативной формы мРНК СБ25 показал делецию 4 экзона. Обе формы мРНК СБ25-антигена в клетках опухолевых очагов больных КРР были обнаружены в 92% случаев (47 из 51). В двух исследованных образцах была выявлена только полноразмерная форма мРНК СБ25 АГ. В двух образцах не обнаружена ни одна форма мРНК СБ25-АГ. В доступной литературе данных об экспрессии гена а-цепи рецептора ИЛ-2 в клетках опухолевых очагов больных КРР авторами не обнаружено. Появление в пуле мРНК малигнизирован-ной клетки транскриптов данного гена может являться одним из механизмов неограниченного размножения клеток опухоли.

Кроме того, продукты посттрансляционной модификации транскриптов гена а-цепи рецептора ИЛ-2 могут принимать участие в уходе опухоли из-под надзора иммунной системы и развитии иммуносупрессии.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Ж.С. Нурмаганбетов1, А.Ж. Турмухамбетов1, З.Т.

Шульгау1, М.В. Огородникова2, С.М.Адекенов1, А.Ю.

Барышников2

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ

НА АПОПТОЗ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

ГИДРОХЛОРИДА ГАРМИНА

1МНПХ «Фитохимия», Караганда, Казахстан

2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Семейство каспазы - это цистеиновые протеазы, которые играют важную роль в процессе апоптоза. В каспазном каскаде каспаза-3 играет основную роль в дезагрегации ядра во время апоптоза, вызывает фрагментацию ДНК и конденсацию хроматина, активирует фактор фрагментации ДНК путем его расщепления, тем самым индуцирует образование лестницы ДНК. Таким образом, активная каспаза-3 является маркером ранней стадии апоптоза.

Цель исследования. изучить влияние гидрохлорида гармина (ГГ) на апоптоз в отношении клеточных линий Jurkat, Raji, U937 с применением современного метода регистрации апоптоза.

Материалы и методы. В работе использовали следующие клеточные линии: Jurkat, Raji, U937. Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации опухолевых клеток с ГГ в течение 72 часов с использованием набора FITS-Conjugated monoclonal active cas-pase-3 antibody apoptosis Kit I (BD Pharmingen, США).

Результаты. После инкубации клеток линии Jurkat с ГГ в дозе 1х 10-5 М количество апоптотических клеток составило 13%. С увеличением концентрации ГГ до 1^10-4 М популяция клеток положительных по каспа-зе-3 увеличилась и составила 65,3 %.

После инкубации клеток линии Raji с ГГ в дозе 1^10-5 М количество апоптотических клеток составило 12,3%. С увеличением концентрации ГГ до 1*10-4 М популяция апоптотических клеток составила 56,2 %.

После инкубации клеток линии U937 с ГГ в дозе 1*10-5 М количество апоптотических клеток составило 9,1%. С увеличением концентрации ГГ до 1*10-4 М популяция апоптотических клеток составила 90 %.

Выводы. Гидрохлорид гармина обладает высокой экспрессией активной каспазы-3 в отношении опухолевых клеток линий Jurkat, Raji, U937. Данный факт свидетельствует о том, что гидрохлорид гармина вызывает гибель опухолевых клеток линий Jurkat, Raji, U937 по типу апоптоза.

А.Г. Орлова1, А.В. Масленникова1,2, Г.Ю. Голубятников1, Т.И. Пряникова3, В.И. Плеханов1, Л.Б. Снопова2,

А.А. Бабаев3, И.П. Иванова2, В.А. Каменский1,

Н.М. Шахова1, И.В. Турчин1 НЕИНВАЗИВНАЯ ОЦЕНКА ДИНАМИКИ КИСЛОРОДНОГО СТАТУСА ОПУХОЛЕВЫХ МОДЕЛЕЙ МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ В ПРОЦЕССЕ ЕСТЕСТВЕННОГО РОСТА И НА ФОНЕ ПРОВЕДЕНИЯ ХТ Учреждение РАН ИПФ, Н. Новгород 2НГМА

3НГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород

Кислородный статус опухоли является одним из ключевых факторов, определяющих прогноз заболевания и эффективность лечебных воздействий. Многие терапевтические агенты изменяют данный параметр, и его определение в зоне патологии может иметь существенное значение при оценке ответа опухоли на действие терапии. ОДС позволяет неинвазивно определять содержание основных тканевых хромофоров - окисленного и восстановленного гемоглобина - и, соответственно, оценивать степень насыщения крови кислородом (StO2) - параметр, косвенным образом отражающий кислородный статус опухоли.

Цель настоящего исследования - оценка возможностей ОДС для исследования динамики кислородного статуса экспериментальной опухоли в ходе химиотерапевтического воздействия.

Материалы и методы. Эксперименты проводились с использованием двух опухолевых моделей: ЛСП и РМЖ крыс (РМК-1), существенно различающихся по морфофункциональным характеристикам. В работе использовалась установка для ОДС, разработанная в ИПФ РАН (Н. Новгород).

Серию ОДС-исследований с интервалом 2-3 дня проводили после однократного введения циклофос-фана. Для верификации результатов проводилось ИГХ с маркером гипоксии пимонидазолом.

ТЕЗИСЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ 57

Результаты. Для модели ЛСП методом ОДС выявлено снижение уровня 8Ю2 по сравнению с окружающими нормальными тканями; ИГХ подтверждено состояние гипоксии опухоли. Модель РМК-1 характеризовалась сопоставимым с нормой уровнем 8Ю2 и достаточной степенью оксигенации. Продемонстрировано, что данные различия вызваны главным образом разницей в содержании дезоксигемоглобина исследуемых моделей: повышенном у ЛСП и сниженным у РМК-1. Под воздействием циклофосфана наблюдалось торможение роста опухоли, на фоне которого отмечалось постепенное повышение уровня 8Ю2 за счет снижения концентрации дезоксигемоглобина по сравнению с контрольной группой.

Выводы. Таким образом, метод ОДС позволяет наблюдать в динамике изменения оксигенации ткани опухоли в ходе ее роста и при лекарственном воздействии.

Л.А. Островская1, Л.В. Снегур2, Н.В. Блюхтерова1, М.М. Фомина1, В.А. Рыкова , А.А. Сименел2,

С. И. Зыкова2, Ю.С. Некрасов2 ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ ФЕРРОЦЕНСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ ;ИБФ им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2ИЭС им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва

Задачи исследования. Уникальные свойства ферро-ценовой системы, а именно, окислительно-восстановительная активность, хорошая проницаемость через липидные мембраны, низкая токсичность, а также легкость химических модификаций, являются определяющими факторами для поиска различных видов биологической активности среди соединений ферроценового ряда. Нами разработаны препаративные подходы к синтезу ферроцен содержащих биомолекул и синтезированы с высокими выходами ферроценовые производные азолов (ЛС-8), пуриновых и пиримидиновых оснований (ЛС-4), тио-пиримидинов (ЛС-17), аминокислот, а также энантио-мерно обогащенные ферроценовые соединения. Задача данной работы состояла в оценке противоопухолевой активности ферроценсодержащих соединений различной структуры.

Материалы и методы. Исследована токсичность и противоопухолевая эффективность ряда ферроценсодержащих производных, имеющих представленные ниже структуры. Противоопухолевый эффект препаратов изучен в кинетике на моделях солидных опухолей - ЬЬС, карцинома 755, меланома В-16 (мыши ББР1). Показателем ростингибирующей активности соединений служил коэффициент ТРО%.

ЛС-3

ЛС-8

ЛС-17

Результаты. Установлено, что среди изученных соединений наибольшую противоопухолевую активность проявляют препараты ферроценилметил тимин (ЛС-4) и ферроценил(этил)-2-тиопиримидин (ЛС-17), вызывающие ингибирование роста указанных солидных опухолей на 70% по сравнению с контролем.

Выводы. Обнаружены ферроценсодержащие соединения, обладающие значительной противоопухолевой активностью (ЛС-4, ЛС-17), намечены пути рационального синтеза новых производных, показана целесообразность дальнейшего углубленного изучения препаратов данной группы в онкологическом эксперименте.

Т.И. Пряникова3, А.Г. Орлова1, А.В. Масленникова1'2, Г.Ю. Голубятников1, В.И. Плеханов1, Л.Б. Снопова, И.П. Иванова, В.А. Каменский1, И.В. Турчин1,

Н.М. Шахова1.

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПЕНТОКСИФИЛЛИНА НА УРОВЕНЬ ОКСИГЕНАЦИИ ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ИПФ РАН, Н. Новгород 2НГМУ

3НГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород

Состояние гипоксии является характерной особенностью большинства солидных опухолей.

С целью преодоления резистентности гипоксичных опухолей в отношении лечебных воздействий используются препараты, искусственно повышающие кислородный статус тканей.

Разработка таких препаратов требует создание новых методов, позволяющих проводить неивазивную прижизненную оценку динамики степени оксигенации тканей. В данной работе для оценки оксигенации опухоли предлагается метод ОДС.

Этот метод позволяет определять концентрацию окисленного и восстановленного гемоглобина в тканях и, соответственно, оценивать степень насыщения крови. Целью работы было исследование возможностей метода ОДС для оценки изменений оксигенации экспериментальной опухоли.

Работа проводилась с использованием опухолевой модели лимфосаркомы Плисса. В работе применялась установка для ОДС, разработанная в ИПФ РАН. По ОДС-данным рассчитывали двумерное распределение концентраций основных тканевых хромофоров в зоне опухоли и уровень оксигенации крови.

Для искусственной модификации кислородного статуса опухоли использовали пентоксифиллин, повышающий микроциркуляторную перфузию. Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг.

Сканирование осуществляли до и через 60 мин. после введения препарата. Для верификации степени окси-генации тканей осуществляли гистологическое исследование и иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей с использованием пимонидазола.

Пентоксифиллин вызывал снижение концентрации дезоксигемоглобина и повышение содержания окисленной формы соединения.

Такие изменения привели к существенному росту уровня насыщения крови кислородом в проекции опухолевого узла и, соответственно, кислородного статуса опухоли.

Таким образом, метод ОДТ позволяет наблюдать изменения оксигенации опухоли при действии препарата, повышающего перфузию тканей, и может быть использован для разработки новых агентов, предназначенных для повышения кислородного статуса.

Н.А. Сахарнов, Д.В Новиков, А.В. Алясова,

С.В. Новикова, О.В. Уткин, В.В. Новиков АНАЛИЗ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ТРАНСКРИПТОВ ГЕНА APT-1 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ РТК НГУ им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород НГМА , Н. Новгород

Задачи исследования: Fas-зависимый апоптоз является одним из способов гибели опухолевых клеток. Система Fas-Fas-лиганд имеет множественные пути регуляции, в том числе с участием растворимых форм Fas (CD95) АГ. Растворимые формы образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК первичного транскрипта. В настоящее время обнаружено более 10 различных вариантов мРНК Fas-АГ, встречающихся в клетках в разных сочетаниях. Целью настоящей работы явилась характеристика экспрессии гена APT-J(FAS) в опухолевых клетках на разных стадиях РТК.

Материалы и методы. Материалом для исследования явились 48 образцов клеток опухолевых очагов, полученных из НООД при резекции опухолей у больных РТК. мРНК Fas-АГ детектировали методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к местам соединения экзонов пре-мРНК Fas-АГ.

Результаты и выводы: В клетках опухолевых очагов больных РТК обнаружено 7 различных вариантов мРНК Fas-АГ. Матричная РНК мембранной формы Fas-АГ детектировалась в 100% случаев. Матричная РНК доминирующей растворимой формы Fas-АГ с делецией б экзона обнаруживалась в 9б% случаев, матричные РНК пяти минорных форм с делециями 3; 4; 5 и б экзонов в различных комбинациях встречались с частотой от 25 до 90% случаев. При этом мРНК Fas с делецией 5 экзона отсутствовала во всех исследованных образцах на 3 стадии заболевания, а мРНК с делецией 4 экзона - во всех образцах опухолевых клеток больных с 4 стадией заболевания. Всего было выявлено 15 различных спектров мРНК, отличающихся как по числу, так и составу форм мРНК Fas-АГ. Общей особенностью больных явилась высокая гетерогенность спектров форм мРНК Fas-АГ.

Л.В. Скоторенко, О.В. Короткова, Т.Н. Заботина,

А.А. Борунова, Н.Ю. Очеева ИММУНОФЕНОТИП ЛИМФОЦИТОВ ПЕРВИЧНО ОПЕРАБЕЛЬНЫХ БОЛЬНЫХ РМЖ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Задачи исследования. Изучить линейные маркеры клеточного звена иммунитета и оценить субпо-пуляционную структуру лимфоцитов периферической крови первично операбельных больных РМЖ.

Материалы и методы. В исследование включены 25 первично операбельных больных РМЖ. Средний возраст пациенток составил 55,2 года. В качестве контрольных образцов использовали ПК 11 практически здоровых женщин в возрасте 25-58 лет. Многопараметровый анализ иммунофенотипа лимфоцитов ПК проводили до и через 2 нед. после хирургического лечения с использованием коммерческих наборов МКА методом проточной цитометрии (BD Biosciences, Bekman Coulter).

Результаты. В результате исследования было выявлено нарушение линейной структуры лимфоцитов ПК больных раком молочной железы по сравнению с донорской группой. Проведенное хирургическое лечение не оказало влияния на динамику распределения основных популяций лимфоцитов при анализе общей группы больных. Индивидуальный анализ иммунограмм в зависимости от исходного уровня CD3 показал, что у 3б% больных содержится исходно сниженное количество CD3+ лимфоцитов (группа 1), у 32 % пациенток исходно нор-

мальное число CD3+-лимфоцитов (группа 2), исходно повышенное - у 32% (группа 3). Количество CD19+ В-лимфоцитов соответствовало норме во всех 3 группах. У всех больных 1 группы было исходно повышено кол-во NK-клеток с фенотипом CD3-CDi6+CD56+ (29,3 2,1), в то время как в остальных группах количество NK-клеток соответствовало нормальным показателям. Особо следует отметить, что у больных 1 и 2 групп было значительно повышено число CD8+- лимфоцитов, и как следствие этого снижен иммунорегуляторный индекс, который составил 0,8 и 0,б8 соответственно. Таким образом, у 88% больных первично операбельным РМЖ имеется дисбаланс в структуре Т-лимфоцитов.

Выводы. Необходимо проводить индивидуальный мониторинг состояния иммунной системы больных РМЖ с целью дальнейшей коррекции субпопуляцион-ной структуры Т-клеточного звена иммунитета и обеспечения возможности проведения адъювантной химио-и ЛТ в полном объеме.

Д.В. Соколова, Е.В. Степанова, Е.М. Трещалина,

А.Ю. Барышников

ОЦЕНКА УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ОСНОВНЫХ ФАКТОРОВ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТАХ ЛИМФОМЫ БЕРКИТТА ЧЕЛОВЕКА

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Перспективным средством селективного воздействия на опухолевые клетки являются иммунолипосомальные формы. Для доклинического изучения эффективности им-мунолипосом адекватной моделью являются п/к ксено-графты опухолей человека с подтвержденной специфичностью. Получение информации о состоянии неоангиогенеза доклинической модели, предназначенной для системного лечения, в том числе, с использованием иммунолипосом, позволяет использовать ее в терапевтическом эксперименте.

Цель исследования. Определение состояния нео-ангиогенеза в подкожных ксенографтах лимфомы Беркитта человека штамм ЛБР-2.

Материалы и методы. Использованы мыши-самки Balb/c nude 8-10 нед 18-20 г собственного разведения и штамм ЛБР-2 из Коллекции опухолевых штаммов РОНЦ. Гистологические срезы готовили из п/к узлов опухоли, находящейся в средней точке экспоненциальной фазы роста (23 сутки после трансплантации). Состояние неоан-гиогенеза определяли по количеству микрососудов и экспрессии основных маркеров VEGF, CD31 и HIF-la с помощью метода ИГХ с системой визуализации DAB+ [DAKO]. Оценку результатов окрашивания проводили на световом микроскопе «Nikon», увеличение х40. Количество положительных клеток оценивали в зонах максимального скопления. Опухоль считали VEGF+ или HIF-la+, если окрашивание наблюдали в >25 % клеток.

Результаты. Исследование показало, что на 23 сутки п/к ксенографты ЛБР-2, достигшие среднего объема 1734[1312+215б]мм3, имеют полноценную сосудистую сеть и активность АГ факторов. ИГХ окрашивание выявило в ткани опухоли б0-80% VEGF+ клеток. В поле зрения найдено б±3 CD31+ микрососудов. В 80-100 % клеток отмечено накопление HIFl-a Интенсивность ИГХ-окрашивания выше в центре опухоли.

Заключение. Лимфома Беркитта штамм ЛБР-2 в виде п/к ксенографтов в наиболее благоприятный для лечения период роста характеризуется полноценной сосудистой сетью и способностью к неоангиогенезу, о чем свидетельствуют достаточная плотность микрососудов и высокая экспрессия факторов неоангиогенеза. Указанные характеристики свидетельствуют о пригодности данной модели для проведения системной терапии в том числе, адресными агентами.

Степанова Е.В.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ РМЖ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

РМЖ занимает первое место по частоте возникновения среди женщин и является основной причиной смертности женщин 35-55 лет. 5-летняя ОВ больных составляет в среднем 65%, выживаемость зависит от стадии заболевания. Возможность выбора химиотерапевтических препаратов из нескольких одинаково эффективных требует от онколога рационального подхода к назначению режима лечения каждому конкретному пациенту. Клинические и морфологические характеристики болезни являются недостаточно точными для предсказания прогноза течения болезни и эффекта ХТ. Широко проводятся исследования по молекулярнобиологической характеристике РМЖ для выбора тактики рационального лечения.

В настоящее время разработана новая классификация РМЖ на основе происхождения опухоли (базальный или люминальный тип РМЖ), приведены подходы к рациональному назначению лекарственной терапии.

В РОНЦ им. Н.Н. Блохина проводятся широкие исследования по молекулярно-биологической характеристике РМЖ различного происхождения. Исследованы более 14 различных маркеров, включая Ki-67, HER-2/neu, EGFR, pAkt, PTEN, p53, Bcl-2, Bax, рецепторы эстрогенов и прогестерона, цитокератин 5/6, VEGF, CD31, HIF-1 alpha и другие. Иммуногистохи-мический анализ является наиболее удобным методом для тестирования, позволяющий проводить исследования большого количества маркеров. Получены результаты об экспрессии молекулярно-биологических маркеров в 4 основных молекулярно-биологических типах РМЖ. Показано, что наиболее высокая экспрессия биологически неблагоприятных маркеров (EGFR, p53, VEGF и других) наблюдается при базальном типе РМЖ (HER2-, ЭР-, ПР-, СК5/16+).

Отсутствие экспрессии PTEN в опухолевых клетках, высокая экспрессия pAkt и EGFR являются неблагоприятными факторами эффективности комбинаций химиотерапии с Г ерцептином для больных РМЖ, получающих лечение адъювантно или по поводу метастатической болезни (р<0,05). Высокая экспрессия тимидилат синте-тазы в ткани опухоли коррелирует с высокой частотой появления метастазов после удаления первичной опухоли вне зависимости от получаемого лечения (р<0,05). Разработан метод прогноза эффективности ХТ и биотерапии у больных РМЖ на основе определения молекулярно-биологических маркеров в опухоли.

Метод прогноза эффективности лечения ХТ и биотерапией может быть использован в онкологических клиниках РФ для назначения рационального лечения больных РМЖ.

Работа поддержана Федеральным агентством по науке и инновациям (Государственный контракт № 02.512.12.2009 от С25Пиюня 2008 г.) и Советом по грантам Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых  докторов наук.

Н.М. СураеваП В.В. Мартиросян2, А.З. Кесян2,

А.В. Самойлов , А.Ю. Барышников

ТРАНСФЕКЦИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПТИЦЫ 'РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва 2НИИ пушного звероводства кролиководства им. В. А. Афанасьева, МО, пос. Раменки

Современные технологии получения рекомбинантных белков открывают новые эффективные пути

производства любых белковых структур, в том числе

- фармацевтических препаратов. В этой связи разработка методов введения чужеродных генов в половые клетки птицы и получение трансгенных продуцентов представляется весьма актуальной задачей, т.к. создается широкая перспектива производства белков терапевтического назначения.

Задачи исследования. Отработка метода трансфекции экзогенным геном ИНК кур.

Материалы и методы. Были проведены инъекции донорских трансфецированных ИИК в зону зародыше-го серпа эмбриона реципиента. ИИК были выделены из гонад 5,5-суточных эмбрионов. Трансфекцию клеток проводили плазмидным комплексом, содержащим целевой ген Г-КСФ человека, с помощью липосом Ы-ро!ес1атт2000 (1пу1й^еп). С целью получения трансгенных половых химер проводили стерилизацию реципиентов перед инъекцией донорских ИИК при помощи УФО по разработанной нами схеме, которая, как предполагалось, могла бы способствовать уменьшению эндогенных НИК. Инъецированные эмбрионы инкубировали в течение 7 сут. Интеграцию гена определяли методом НЦР, путем анализа гомогената всех тканей эмбрионов (кроме гонад) и отдельно гонад.

Результаты. Суспензией трансфецированных НИК было проинъецированно 23 эмбриона, после 7 дней инкубации продолжили развитие 14 эмбрионов. Но результатам НЦР анализа у 3 эмбрионов был зафиксирован ген человеческого Г-КСФ, а у одного эмбриона трансгенная вставка присутствовала и в клетках гонад, при этом этот эмбрион был получен от реципиента без стерилизации (1 из 6).

Выводы. В результате разработанного метода трансфекции экзогенным геном ННК кур получена трансгенная химерная птица с присутствием экзогенного гена в половых органах. Различий в эффективности встраивания экзогенного гена в клетки половых органов в случае инъекции трансфецированных ННК реципиентам, подвергнутым стерилизации при помощи ультрафиолета, контролем обнаружить не удалось.

Степанова Е.В, Лавренов С.Н., Штиль А.А., Преображенская М.Н., Соломко Э.Ш., Иншаков А.Н., Абрамов М.Е., Личиницер М.Р.

НОВЫЙ КЛАСС

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ РИИНДОЛИЛМЕТАНОВ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва

Соединения, содержащие фрагмент трииндолилме-тана, представляют класс перспективных соединений с потенциально высокой противоопухолевой активностью. Целью исследования являлся направленный синтез производных гетероциклических триарилметанов и отбор соединений, обладающих выраженным специфическим противоопухолевым действием в отношении клеточных линий РМЖ, толстой кишки, меланомы и лейкоза человека. Среди производных трииндолилме-танов наибольший интерес в качестве потенциального противоопухолевого препарата представляют соли М-алкилтрииндолилметилиев. Разработаны эффективные методы их синтеза, что позволило получить соли трииндолилметилиев с высокими выходами, получено около 40 новых производных, имеющих различные заместители - как при атоме азота индольного ядра, так и в индольном цикле, изучена их реакционная способность и физико-химические свойства.

Разработана методология проведения биологических исследований на противоопухолевую активность с учетом современных представлений о механизмах роста и прогрессии злокачественных опухолей.

Методика скрининга включает не только традиционный метод - оценку цитотоксического действия препаратов, но и определение антиангиогенного, антиинвазивно-го, апоптотического действия синтезированных веществ. В скрининговых исследованиях in vitro было показано, что данный класс соединений обладает цитотоксическим действием, вызывая гибель различных клеточных линий опухолей человека РМЖ (SK-BR-3, MCF-7), яичников (SKOV-3), меланомы (Mel Kor), лейкоза (Jurkat)) путем индукции апоптоза. Особенно выраженной цитотоксичностью обладает данный класс соединений в отношении меланомы. Одним из возможных механизмов противоопухолевого эффекта может быть блокирование активности белка NFkB, которое было показано в нецитотоксиче-ских дозах. Использование полного спектра методов определения противоопухолевой активности позволило эффективно оценить противоопухолевый эффект синтезированных веществ. Показана зависимость активности структуры препарата, проводится изучение механизма действия наиболее активных веществ.

Наиболее перспективными для дальнейшего изучения признаны ЛСТА-1319 (IC50 для клеточной линии меланомы кожи Mel Kor составила 0,236+0,067 цМ), ЛСТА 1574 (IC50 - 0,073+0,013цМ) и ЛСТА 1578 (IC50 - 0,052+0,003 цМ).

Разрабатываемый новый класс противоопухолевых агентов на основе производных трииндолилметана в потенциале может обеспечить создание высокоэффективных противоопухолевых препаратов с различными механизмами действия для самостоятельного использования или в комбинации с традиционными лекарствами.

Работа поддержана Федеральным агентством по науке и инновациям (государственный контракт № 02.512.12.2035 от «12»мая 2009 г).

Н.М. Сууаееа', В .В. Мартиросян2, А А.В. Сса^с^ойл^^, А.Ю. Бараиинитв1 ПОЛЬСЕНИЕТРИИСГЕНННК КУР И ГЕОТМ ГРАШЛОЦИТАРНОГП КЕЛОНИЕ-СТИМУЛИРУЮЩЕГО ФМРТОРА ЧЕЛОВЕКА 'РОНИ пу- КН-Блохриа РдстЕ^, к^с^с^ква 2НИИ аншого зверсващства ьфРликDвoхcавa им. В.А.Афанасьева, МО, пос. Раменки

Траглгенез с использованием сперматозоидов не требует больших финансовых затрат, однако предполагает использование невирусных конструкций генов. Поэтому разработка технологии введения чужеродного гена путем переноса со спермой открывает широкие возможности по использованию яйца кур для продукции фармацевтических белков.

Цель исследования - отработка метода трансфекции экзогенным геном спермы петухов и получение тратсгенных цыплят после искусственного осеменения кур тратсфецированной спермой.

Материалы и методы. Трансфекцию сперматозоидов проводили плазмидным комплексом, содержащим целевой ген Г-КСФ человека, с помощью липосом «Li-pofectine» и Lipofectamin2000 (Invitrogen). После искусственного осеменения кур трагсфецировагной спермой проводили сбор яиц, инкубировали их 7 суток, извлекали эмбрионы и анализировали методом ПЦР. А также инкубировали собранные яйца в течении 21 дня и получали цыплят. Методом ПЦР анализировали эмбрионы и кровь полученных цыплят на присутствие экзогенной дУк.

Результаты. Проведено 7 осеменений куриц трагсфецвровагной спермой с применением «Li-pofectine». Было собрано 51 яйцо, из которых было получено 29 эмбрионов, один из которых оказался трагсгенгым. Далее было проведено 3 осеменения куриц трансфецированной спермой с помощью «Lipofec-

1ашт 2000». Собрано 20 яиц, из них получено 9 эмбрионов, 3 из которых оказались трансгенными. Трансфецированной спермой с этим же липофектантом было осеменено еще 3 курицы, собрано 20 яиц, из которых вылупились 6 цыплят. У 2 была зафиксирована экзогенная ДНК. В возрасте 3-4 мес.в в крови трансгенных кур была обнаружена экспрессия гена Г-КСФ человека на уровне 20-70 пг/мл.

Выводы. В результате разработанного метода трансфекции спермы петухов были получены трансгенные цыплята, зафиксирована экспрессия гена Г-КСФ человека и показано, что эффективность встраивания экзогенного гена значительно увеличивается при использовании липосом Ыро1ес1атт2000 (1пу1й^еп).

Н.С. Торгушина С. С. Кузнецов О ВОЗМОЖНОСТЯХ И НЕОБХОДИМОСТИ ОЦЕНКИ БЛИЖАЙШИХ РЕЗУЛЬТАТОВ (ПАТОМОРФОЗА) ХТ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ НГМА , Н. Новгород

Химиотерапевтический патоморфоз имеет гамму специфических особенностей, выделяющих его из известных ныне видов патоморфоза, игнорирование которых не позволяет четко оценить итог проведенного лечения и сформулировать прогноз в отношении конкретного пациента. В литературных источниках нет ясности о ценности различных морфологических характеристик незрелых опухолей в прогнозе результатов лечения, поэтому при определении уровня лечебного патоморфоза повсеместно пользуются схемой, разработанной ещё в семидесятых годах прошлого столетия Г. А. Лавниковой, используемой для оценки лучевого патоморфоза, не внося в неё коррективов, которые дают современные методы. На наш взгляд первоочередной задачей является определение прогностической значимости возникающих изменений в опухолях и составление алгоритма оценки результатов химиотерапевтического воздействия на основе морфологических и морфометрических методик, используя как традиционные способы исследования, так и инновационные.

Располагая солидным опытом изучения лучевого, термолучевого и спонтанного патоморфоза злокачественных опухолей, мы считаем, что протокол исследования должен включать не только качественную, но и количественную морфологическую оценку состояния паренхимы, экстрацеллюлярного матрикса с учетом структурных особенностей новообразований и выделением спектра достоверно прогностически значимых критериев. В качестве примера предлагаем результаты изучения термолучевого патоморфоза карцином молочной железы. Переводя полученные результаты в практическую плоскость, были разработаны карты определения пато-морфоза с учетом критериальных параметров прогноза. Так, при определении степени патоморфоза в инфильтрирующих протоковых карциномах молочной железы при использования предоперационной терморадиотерапии с включением в схему лечения интерстициальной локальной ВЧ-гипертермии, целесообразно учитывать следующие критерии: общее количество раковых клеток с экспрессией р53, количество клеток с умеренной экспрессией р53, количество клеток со слабой, умеренной и высокой экспрессией Ьс12, общее число раковых клеток с экспрессией антигена РСМА, число раковых элементов со слабой и умеренной экспрессией РСМА. Учитывая роль гемодинамических и гемореологических расстройств как одного из узловых звеньев морфогенеза патоморфоза инфильтрирующих протоковых карцином молочной железы в условиях терморадиотерапии, на наш взгляд, введение этого показателя в комплекс пара-

Итак, количественные критерии степеней термолучевого патоморфоза инфильтрирующих протоковых карцином молочной железы следующие (см. таблицу): Таким образом, переходя в плоскость оценки эффективности химиопрепаратов, из приведенного примера следует, что данные, получаемые в итоге определения прогностической значимости возникающих изменений в опухолях в сочетании с алгоритмизацией

оценки результатов химиотерапевтического воздействия на основе морфологических и морфометрических методик предоставят возможность осуществления индивидуального прогнозирования и оценки эффекта терапии на основе ближайших результатов лечения, что позволит оптимизировать моделирование дальнейшей тактики терапии больных и, следовательно, повысить эффективность лечения.

Критерии Степени патоморфоза

I II III IV

Общее количество раковых клеток, экспрессирующих р53 (%) 38-48 49-56 57-68 69 и выше

п раковых клеток с умеренной экспрессией р53 (%) 6,1-10 11-17 18-24 25 и выше

п раковых клеток со слабой экспрессией Ьс12 (%) 9-12 13-16 17-19 20 и выше

п раковых клеток с умеренной экспрессией Ьс12 (%) 27-23 22-20 19-17 16 и ниже

п раковых клеток с высокой экспрессией Ьс12 (%) 59-45 44-37 36-24 23 и ниже

общее п раковых клеток, экспрессирующих РСМА (%) 63-53 52-40 39-26 25 и ниже

п раковых клеток со слабой экспрессией РСМА (%) 7,2-15 16-21 22-28 29 и ниже

п раковых клеток с умеренной экспрессией РСМА (%) 29,3-22 21-14 13-8 7 и ниже

8 зон гемодинамических и гемореологических расстройств (%Б ракового узла) 5-15 16-20 21-25 26 и выше

Е. Н. Филатова, В. В. Новиков, И. М. Солопаева ВЛИЯНИЕ ХГ

НА СОСТОЯНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЖИВОТНЫХ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ

НГМУ им. Н. И. Лобачевского, Н. Новгород

Цель исследования. Изучить влияние хорионического гонадотропина на популяционный состав мононуклеарных клеток периферической крови крыс-носителей ЛСП.

Материалы и методы. Эксперимент поставлен на 50 самцах белых беспородных крыс массой 180-200 гр., которым подкожно вводили клетки опухолевого штамма ЛСП.

Популяционный состав мононуклеарных клеток периферической крови крыс оценивали методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью МКА ИКО-101 против Сб4-АГ крыс и ИКО-109 против антигенов II класса главного комплекса системы гистосовместимости крыс.

Результаты.

1. На десятые сутки развития ЛСП в периферической крови крыс, не получавших ХГ, наблюдалось достоверное снижение относительного количества СБ4+ мононуклеарных клеток (в 3,6 раза на десятые сутки развития опухоли) и достоверное повышение по сравнению с нормой относительного содержания мононуклеарных клеток крови, несущих на поверхности антигены гистосовместимости

II класса (ЯТ-1а+ клеток) ( в 2,0 раза на десятые сутки развития ЛСП).

2. У животных-опухоленосителей, получавших по 75; 150 или 1000 ЕД ХГ, на третьи сутки наблюдалась тенденция к нормализации содержания тестированных клеток, а на десятые сутки относительное количество СБ4+ и КТ-[а+ клеток в периферической крови нормализовалось.

Выводы. Показана способность ХГч в определенных дозах - 1000; 150 и 75 ЕД - нормализовы-вать сниженное под воздействием выраженного онкоиммунодефицита относительное содержание СБ4+ клеток периферической крови крыс, а также способность ХГч нормализовать повышенное в результате развития новообразования относительное содержание ЯТ-!а+ клеток в периферической крови крыс с ЛСП.

А. А. Филъченков1, М. П. Завелевич1, В. В. Семенов2, М. Н. Семенова3, Д. Ю. Блохин4 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АПОПТОЗ-ИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ТУБУЛИНА ДЛЯ КЛЕТОК тяклт И ИХ РЕЗИСТЕНТНОГО КЛОНА 1иИКЛТ/А4 :ИЭПОР им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев 2ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва 3ИБР им. Н.К. Кольцова РАН, Москва 4РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Известно, что ингибиторы полимеризации тубулина обладают противоопухолевой активностью. Несмотря на то, что дестабилизаторы тубулина уже широко используются в онкологической практике, поиск новых оригинальных препаратов этого класса остается актуальным направлением экспериментальной ХТ. Интересным является и вопрос о том, в какой степени опухолевые клетки могут быть резистентными к таким соединениям.

Цель исследования. Сравнительный анализ чувствительности к синтетическим ингибиторам полимеризации тубулина злокачественных лимфоидных клеток Лгка и клональной линии ЛгШ/А4, обладающей множественной лекарственной резистентностью.

Материалы и методы. Производные 6-нитроиндолов (БК-112 и БК-113) и азааналог подофиллотоксина ММЯ/19217524 были синтезированы в ИОХ РАН.

БК-112 I. БК-113

КМЯ/19217524

По данным :Н-ЯМР (500 Мгц) их чистота составляет не менее 98%. Клональная линия Jurkat/A4 была получена в РОНЦ РАМН (патент РФ №2267532), а клетки Jurkat - из банка клеточных линий ИЭПОР НАНУ. Уровень апоптоза и распределение клеток по фазам клеточного цикла определяли с помощью ци-тофлуориметра FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Активность препаратов сравнивали с таковой подофиллотоксина (Aldrich, США).

Результаты. Ранее было показано, что производные 6-нитроиндолов и аналог подофиллотоксина блокируют деление клеток эмбрионов морского ежа за счет дестабилизации тубулина.

В настоящих исследованиях эффективность торможения роста клеток Jurkat этими соединениями существенно различается.

Так, производные 6-нитроиндолов в концентрациях вплоть до 5 мкмоль/л практически не изменяют кинетики роста клеток, при повышении концентрации замедляют пролиферацию, и только в концентрациях 40 мкмоль/л и выше проявляют токсические эффекты.

В то же время цитотоксичность азааналога подо-филлотоксина для клеток Jurkat оказалась не ниже, чем у подофиллотоксина. Препарат обладает выраженной токсичностью в концентрациях от 50 нмоль/л, индуцируя при этом апоптоз в 15-20% клеточной популяции и полную гибель клеток на 2-3 сутки, в зависимости от концентрации.

При сопоставимой величине апоптотического индекса при действии подофиллотоксина или его аналога в резистентных клетках Мгка/А4, тем не менее, отмечается лишь прекращение пролиферации и гибель части клеточной популяции, причем с повышением концентрации препарата дозозависимости гибели клеток не наблюдается. В дозах, вызывающих гибель клеток Лгка1 и индукцию апоптоза в части клеточной популяции, как производные 6-нитро-индолов, так и аналог подофиллотоксина снижают содержание клеток в фазе 8 при увеличении содержания клеток в фазах во/в! и в2/М. В то же время в клетках Лгка1/А4 действие подофиллотоксина или его азааналога приводит к практически полному блоку цикла (свыше 80%) в фазе в2/М.

Выводы. Синтетические ингибиторы полимеризации тубулина являются индукторами апоптоза как в клетках Лгка1, так и в клональной линии Лгка1/А4, обладающей множественной лекарственной резистентностью. Тем не менее, клетки МгкаШ4 обнаруживают резистентность и в отношении соединений этого класса. Цитотоксичность и апоптоз-индуцирующая активность производных 6-нитроиндолов на несколько порядков ниже, чем у подофиллотоксина и его аналога. Представляется перспективным сравнительное изучение соединений разной химической структуры, обладающих активностью дестабилизаторов тубулина, как для поиска новых противоопухолевых веществ, так и для выяснения механизмов перекрестной лекарственной резистентности.

Издание 2-е, переработанное и дополненное

ЭНЦИКЛОПЕДИЯ

КЛИНИЧЕСКОЙ

ОНКОЛОГИИ

Готовится к печати Издательская группа РОНЦ