УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В КОЖНЫЕ ПОКРОВЫ ИЛИ ЧЕРЕЗ КОЖУ И ПРОЧИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ БАРЬЕРЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ СВЕТОПОГЛОЩАЮЩИХ ТОНКИХ ПЛЕНОК
DEVICE FOR EFFECTIVE DRUG DELIVERY TO SKIN OR THROUGH SKIN OR OTHER BIOLOGICAL BARRIERS WITH USING LIGHT-ABSORBING THIN FILMS

Предпосылки к созданию изобретения
2
Данное изобретение относится к устройству, способному быстро и эффективно преобразовывать энергию импульсов лазерного излучения в высокоимпульсные волны давления, и данное устройство применяет такие волны для создания временной проницаемости биологических мембран, в том числе внешних слоев кожи, без повреждений или дискомфорта для пациента. Настоящее изобретение описано в соответствии с физическими законами эффективной генерации лазером волн давления и свойствами поглощающих материалов, увеличивающих амплитуду волны давления и минимизирующих время нарастания импульса волны, а также с точки зрения практической доставки лекарственных препаратов и биологически активных соединений в кожные покровы или через кожу и прочие биологические барьеры. Приведенные примеры наглядно иллюстрируют использование устройства и возможности его применения. Отличительной чертой устройства является использование тонких пленок (толщиной <200 мкм), эффективно поглощающих свет импульсных лазеров, а также использование доступных (недорогих) импульсных лазеров, таких как низкоэнергетические лазеры (с энергией лазерного излучения <500 мДж), при этом указанное устройство способно генерировать высокоимпульсные акустические волны с коротким временем нарастания импульса (время нарастания импульса <50 нс) при низкой мощности оптического излучения (<40 мВт/см на импульс).
Кожный покров является очень эффективным защитным средством от проникновения инородных материалов, например химических веществ и микроорганизмов. Самый крайний слой кожи, называемый stratum corneum (роговой слой, далее - SC), имеет толщину всего от 10 до 20 мкм, но он является основным источником непроницаемости кожи. SC состоит из десятка плотно уложенных слоев неживых корнеоцитовых клеток, с внедренными в их состав липидами с высокой пространственной организацией. Большинство молекул проникают в кожу при помощи диффузии через межклеточные липиды, извилистый путь обхода корнеоцитов, который крайне ограничен по причине структуры и способности к растворимости. Ниже слоя SC находится живой эпидермис, толщина которого составляет от 50 до 100 мкм, и сосудистый слой. Еще ниже расположен слой дермы (собственно кожа), толщиной 1-2 мм, в котором в большом количестве содержатся капилляры, способные удалять большинство проникающих веществ в течение нескольких минут.
ow
ow
Идея доставки лекарственных препаратов в организм человека через кожный покров имеет многолетнюю историю. Попытки достичь этой цели можно подразделить на две группы: пассивная и активная доставка лекарственных препаратов в организм. К первой категории относятся рецептурные транспортирующие средства, призванные повысить диффузию определенного лекарственного препарата через кожный покров, включая различные мази, кремы или гели, которые могут иметь в своем составе вещества, усиливающие химическую проницаемость. Действительно, большое разнообразие химических веществ имеет свойство повышать проницаемость кожи, это такие вещества, как диметилсульфоксид, лаурокапрам (Азон), 2-n-нонил-1,3- диоксолан (SEPA), жирные кислоты и эфиры жирных кислот, поверхностно-активные вещества и другие вещества, хорошо известные специалистам. Однако получаемая повышенная проницаемость, даже для малых молекул, обычно взаимосвязана с повышенным раздражением кожи. Пассивные методы эффективны только для трансдермальной доставки небольших молекул (с молекулярным весом <500 Да) с соответствующей липофильностью (n-октанол коэффициент распределения воды K, в пределах 1 < (лаг K) < 3) и с менее чем 3 группами водородного связывания. Более того, рецептурный состав транспортирующего средства является специфическим для каждого лекарственного препарата. Активные методы доставки лекарственных препаратов используют соответствующие физические методы, такие как средства электрического содействия процессу доставки препаратов (ионтофорез, электропорация), механические процессы (микроиглы, послойное удаление, иссечение, перфорация, микропроекции) или ультразвук (сонофорез). Другой метод активной доставки лекарственного препарата состоит в генерации фотомеханических волн с помощью интенсивного импульсно-лазерного облучения объекта. Волны напряжений, сформированные в результате оптического разрыва, иссечения или термоэластичного расширения, продемонстрировали способность к временной проницаемости SC и облегчению процесса передачи макромолекул в живой эпидермис.
2
2
Промышленное применение волн напряжения при доставке лекарственных средств через слой эпителиальных клеток уже был описан в научных трудах. Например, Коллиас (Kollias) и другие авторы описали в патенте US 6251099 В1 доставку лекарственных средств с помощью кратковременных одиночных импульсов (транзиентов), генерируемых лазерами с потоком энергии лазерного излучения между 1 и 7 Дж/см и продолжительностью импульса 20-30 нс, что соответствует плотности энергии оптического излучения в пределах между 40 и 300 мВт/см. Эти интенсивные и кратковременные импульсы лазерного излучения были направлены на объект толщиной от 0,8 мм (для металлов) до 3 мм (для пластмасс). При таких плотностях энергии оптического излучения доминантным механизмом взаимодействия между лазерным импульсом и целью является иссечение (удаление кожного покрова) облучаемого материала, что обычно сопровождается плазмообразованием. При этом процессе образуется выброс вещества с поверхности объекта, облучаемого лазерным импульсом, а сопутствующий импульс отдачи распространяется в большей части объекта облучения, этот импульс достигает противоположной поверхности объекта в виде акустической (звуковой) волны. Способность данной акустической волны временно увеличивать проницаемость кожного покрова относится к указанному импульсу. Для внутрикожной доставки высокомолекулярных лекарственных средств без разрушения кожного покрова требуется использование импульсов в диапазоне от 2 до 50 бар/нс. Генерация волн давления с такими высокочастотными импульсами в обусловленной области объекта облучения требует использования лазеров с высокой плотностью энергии, что, по общему признанию, является очень сложным и затратным процессом, при этом поиск альтернативных решений ведется уже давно.
2
Устройства, способствующие доставке лекарственных препаратов с помощью энергетической плотности оптического излучения ниже 10 мДж/см, также были описаны. Например, Визури (Visuri) и другие авторы описали в патенте US 6484052 В1, как такие низкоэнергетические плотности оптического излучения при частоте лазерных импульсов между 100 Гц и 1 МГц могут использоваться с оптическим волокном и вводиться в участок тела человека для генерации поля звукового облучения в данном участке тела. Авторы также описали подключение оптико-энергетического механического преобразователя к удаленному концу указанного волновода, но не смогли определить характеристики данного преобразователя. Несмотря на то что преобразователь имеет очень специфические физические и фотохимические свойства и особые свойства материалов, он не в состоянии произвести волну давления, способную обеспечить временную проницаемость сквозь биологические барьеры. Использование высокочастотных лазерных импульсов вместо одиночного импульса или небольшого количества лазерных импульсов не изменяет свойства волн давления. Таким образом, не было выявлено оптико-энергетических механических преобразователей, которые могли бы производить акустические волны, способные проникать через биологические барьеры.
В другой области деятельности, касающейся исследований спектральной характеристики биологической ткани, Биаджи (Biagi) и другие авторы описали в патенте US 6519376 В2 оптико-звуковой генератор для генерации звуковых или ультразвуковых волн, получаемых из источника импульсного лазерного излучения. Поглощение лазерных импульсов графитсодержащим слоем применялось для конечной точки оптоволоконного кабеля, соединенного с источником импульсного лазерного излучения, что показало свою эффективность при генерации широкополосных звуковых импульсов. Чистые графитовые пленки могут производиться со сверхтонкой толщиной, но они будут иметь достаточную механическую прочность для разделения ее на части по 2,5 см в диаметре. Более того, при толщине в 50 нм явно выраженное светопоглощение (абсорбция) таких пленок доводит значение до 400 нм. Отдельно располагающиеся графитовые пленки с очень короткой стадией состояния возбуждения  могут соответствующим образом приготавливаться с помощью пиролиза полиакрилонитрила. Однако звуковые импульсы, сгенерированные таким способом использования графитсодержащих слоев, никогда не рассматривались с точки зрения доставки лекарственных препаратов в организм, так как область определения характеристик ткани использует лазерные импульсы с энергией в несколько микроджоулей, а этого недостаточно для доставки требуемого количества лекарственных средств с точки зрения терапевтического эффекта. В настоящее время терапевтический эффект не является желательным при спектральном исследовании биологических тканей или при их диагностике.
При наличии множества систем трансдермальной доставки лекарственных препаратов все эти системы остаются незначительной альтернативой по отношению к пероральному приему лекарств или их доставке с помощью подкожных инъекций. Простой и экономичный метод трансдермальной доставки, позволяющий транспортировать большое множество лекарственных препаратов через кожу, не вызывая болевых реакций и дискомфорта для пациентов (что позволяет коже восстанавливать свои защитные функции через несколько минут после процедуры), должен быть сопоставим с трансдермальной доставкой препаратов, осуществляемой перорально, или с помощью подкожных инъекций.
Описание изобретения
2
В настоящем изобретении описано устройство для доставки молекул, макромолекул или даже более крупных биологических материалов через биологические барьеры, включая кожу, мягкие ткани или клеточные мембраны, что соответствует идеальным характеристикам способа доставки биологических препаратов, описанного выше. Способ доставки лекарственных препаратов и активных биологических соединений при помощи данного устройства основан на быстрой и эффективной генерации временной широкополосной, высокочастотной и высокоимпульсной волны при светоабсорбции кратковременных лазерных импульсов тонкими пленками, а также эффективном акустическом контакте с биологическими барьерами, включая кожные покровы или слизистую оболочку. В последующем используется термин тонкая пленка для описания слоя материала с толщиной менее 200 мкм и большей толщины молекулярного слоя (обычно более 1 нм), нанесенного на материал с большей толщиной и жесткостью (с высоким акустическим сопротивлением). Это и есть основной объект настоящего изобретения - описание молекулярных свойств тонкой пленки, которая способствуют быстрой и эффективной генерации волны давления, включая требования к тому, что такая пленка содержит хромофоры, которые поглощают большинство падающего потока лазерного излучения, и требования к тому, чтобы данные хромофоры высвобождали энергию, поглощаемую неизлучающими процессами, с периодом продолжительности, сопоставимым или более коротким, чем длительность лазерного импульса. Эффективность данного способа была наглядно продемонстрирована при доставке крупных молекул и протеинов в кожный покров и при трансфекции генов в живые клетки при плотности оптической энергии в 10 мВт/см на импульс или меньше.
А. Определения
В целях описания применения данного устройства будут использоваться следующие определения.
2
Плотность энергии лазерного излучения - энергия лазерного излучения на единицу площади обрабатываемого материала, выраженная в Дж/см.
L
Длительность лазерного импульса τ - рабочая ширина при 1/е уровне лазерного импульса, для удобства она выражена в наносекундах, нс.
2
2
Оптическая плотность энергии - плотность энергии пучка лазерного излучения, где плотностью энергии является мощность лазерного излучения на единицу зоны облучения, выраженная в Вт/см или для большего удобства в МВт/см.
Иссечение (абляция) - удаление материала (кожного покрова) в результате действия падающего луча. В полимерных веществах такое удаление может быть вызвано светочувствительными изменениями, что включает в себя химическое растворение полимера.
Акустический одиночный кратковременный импульс (транзиент) используется для описания как сверхзвуковой ударной волны, так и звуковой волны.
Импульс акустического транзиента определяется как скорость повышения давления за единицу времени, выраженную в бар/с или для большего удобства в бар/нс.
Время нарастания акустического транзиента определяется как время максимального (пикового) давления от 10% до 90%.
Широкополосный частотный диапазон, перекрывающий постоянный спектр частот - термин обозначает оценку волны давления, предназначенной для акустической эмиссии со значительными частотными составляющими в десятки МГц.
Оптико-акустический опорный материал - материал, поглощающий излучаемую энергию лазерного импульса и быстро преобразующий энергию в тепло с помощью неизлучающего процесса, возвращаясь при этом в свое основное электронное и/или колебательное состояние. Как известно науке, опорный материал РАС генерирует оптико-акустическую волну максимально возможной интенсивности с помощью поглощения лазерного импульса, производимого данной энергией, и в данной конфигурации при отсутствии чистых химических реакций - в течение всей длительности лазерного импульса.
Глубина оптического проникновения δ - глубина, при которой интенсивность излучения внутри материала падает до 1/е, для удобства она выражена в см.
а
-1
Линейный десятеричный коэффициент поглощения µ, или линейный коэффициент поглощения - степень поглощения, разделенная на оптическую длину пути при проходе через образец, она выражена в см.
В. Физические принципы
В литературе описаны различные способы, на основании которых волна давления генерируется в результате взаимодействия кратковременного лазерного импульса с данным материалом. Тремя наиболее важными механизмами взаимодействия являются диэлектрический пробой, выпаривание или иссечение материала, а также термоэластичные процессы. Требуется высокая плотность потоков лазерного излучения, чтобы сгенерировать оптический пробой с последующим образованием плазмы и с последующим образованием интенсивной ударной волны. Промежуточные потоки лазерного излучения взаимодействуют с поглощающей жидкостью или с прозрачными жидкостями, находящимися вблизи поглощающей границы твердого тела, для образования быстрого термического расширения и скачкообразного испарения, или в отношении некоторых материалов для иссечения (абляции). Низкие потоки лазерного излучения, падающие на поглощающие материалы, образуют термоэластичное расширение материалов. Образование плазмы благодаря диэлектрическому пробою приводит к возникновению волн высокого давления, но необходимая высокая энергия и ее разрушительная сила не могут быть использованы на практике для создания временной проницаемости кожи. Волна давления, образованная в результате скачкообразного испарения или иссечения материала, может иметь форму ударной волны как при образовании плазмы, так и при выбросе материала с поверхности, на которую пришелся удар, когда лазерный импульс образует импульс отдачи. В основном ударная волна распространяется по всему материалу и достигает противоположной поверхности объекта в качестве акустической волны, так как ударная волна быстро рассеивается и продолжает существовать уже как акустическая волна, которая затем очень медленно затухает при последующем распространении. Пространственная протяженность ударной волны ограничена десятыми долями миллиметров. С другой стороны, временное термоэластичное расширение генерирует акустическую волну. Акустические волны, полученные в результате иссечения или термоэластичного расширения были названы кратковременными импульсами (транзиентами) и использовались для временного проникновения через слои эпителиальный клеток.
2
L
Образование оптико-акустических волн при термоэластичном расширении ограниченной поглощающей среды может быть достигнуто при использовании низкой плотности энергии лазерного излучения (ниже порога удаления ткани, это зависит от материала, но обычно это значение выше 50 мДж/см), этот процесс может происходить при длительном лазерном импульсе (τ), и он не оказывает разрушающего воздействия. Полагается, что термоэластичное расширение является неэффективным методом образования волны давления из лазерного импульса, и обычная эффективность термоэластичного расширения ниже 0,1% признается неконкурентной по сравнению с 30% эффективностью, которая может быть достигнута во время механизмов иссечения и образования плазмы. Такое общепринятое мнение служило причиной использования энергии потоков лазерного излучения, стоящей выше порогов удаления ткани, для генерации одиночных импульсов, способных создавать временную проницаемость рогового слоя кожи.
max
Однако максимальная амплитуда давления p, которая может быть сгенерирована термоэластичным расширением, следующим за поглощением лазерного импульса материалом, ограничена строгими границами:
p
s
0
s
p
0
L
-5
-1
2
2
где α - коэффициент термического расширения, C - удельная теплоемкость при постоянном давлении, c - звуковая скорость среды (материала) и I - максимальный плотность энергии лазерного излучения. Например, ограниченная целевая область из полистирола (c=2320 м/с, C=2 Дж/(г К) и α=7×10 К), поглощающая лазерный импульс в 5 нс с 50 мДж в 1 см (I=10 мВт/см), должна быть способна производить максимальное давление в 80 бар. Этот порядок величины меньший, чем обычное максимальное давление для трансдермальной доставки лекарственного препарата с помощью волны давления, но если время нарастания оптико-акустической волны сопровождается лазерным импульсом продолжительностью τ=5 нс, ее максимальный импульс достигнет 15 бар/нс. Такого импульса более чем достаточно для проникновения через роговой слой кожи. Следовательно, эффективная конверсия энергии лазерного импульса в термоэластичное расширение, использующая быстрые неизлучающие переходы от начального наполненного возбужденного состояния до основного состояния хромофор, жестко ограниченных в сжатом участке, как, например, в соответствии с оптико-акустической методикой (РАС), должна быть способна производить акустическую волну с импульсом, способным проникнуть через роговой слой кожи.
Амплитуда оптико-акустической волны, образованной в оптической тонкой передней части РАС клетки, представлена в виде формулы
th
p
где А - облучаемый участок, h толщина РАС-клетки и H количество высвобождаемой термической энергии. , коэффициент изотермической сжимаемости (β), C и плотность (ρ) относятся к поглощающей среде внутри клетки. Термоэластичные свойства твердой поглощающей среды удобно характеризуются безразмерным коэффициентом Грюнейзена (Grϋneisen)
p
где C - удельная теплоемкость образца. Физические свойства тонкопленочных образцов также применяется для случаев, когда коэффициент поглощения образца приблизительно равен 1, если нижнее значение границы в целом является отражающим и свет дважды проходит (пересекает) поглощающую среду. Зависимость между амплитудой оптико-акустической волной и толщиной светопоглощающего материала наблюдалась также, когда эффективно поглощающие пленки использовались в качестве целевых областей для импульсов лазера. Оказалось, что максимальное давление, образуемое термоэластичным процессом, призванное увеличивать толщину поглощающей пленки, снижается, и его свойства были использованы при конструировании более эффективных оптико-акустических генераторов ультразвуковых волн.
2
Важная составляющая толщины поглощающего материала была пересмотрена в предыдущих попытках использования лазерных импульсах для образования транзиентных импульсов, которые обеспечивали проницаемость кожного покрова. Ориентированность на выбор материалов по показателям их опалесцентности (светонепроницаемости) и жесткости, что является необходимыми, но не достаточными условиями для оптимальной работы устройства, приводит к неточному выбору металлических целевых областей толщиной больше чем 0,8 мм или целевых областей из пластмасс более чем 1 мм, какими являются поглощающие материалы. На Фиг. 1 сравниваются акустические транзиенты, образуемые когда одинаковая энергия лазерных импульсов поглощается на поверхности в 1 см слоя в 1 мм черного пластика или пленки толщиной 10-30 микрометров при мощном поглощении длины волн возмущения, причем оба образца сжаты стеклянной крышкой и поглощают более 80% лазерного излучения. При снижении толщины целевой области, амплитуда волн давления увеличивается, как показано на Фиг. 2. Данный факт меняет парадигму образования временных импульсов высокого давления с помощью источника импульсного лазерного излучения, так как он делает возможным существенное снижение энергии источника импульсного лазерного излучения с помощью оптимизации устройства, которое конвертирует энергию импульсов лазерного излучения в оптико-акустическую волну.
Повышение эффективности конверсии лазерного излучения в акустический транзиент через термоэластичный процесс требует соответствующего выбора материалов, конвертирующих энергию импульсов лазерного излучения в выделяемое тепло с длительностью лазерного импульса, тонкую пленку (меньшее значение h) с коэффициентом поглощения выше, чем у объекта, и материалами, имеющими больший коэффициент Грюнейзена. Следовательно, устройство, нацеленное на быстрое и эффективное преобразование энергии лазерного импульса в оптико-акустическую волну, должно объединять в очень тонкий слой соединение, усиленно поглощающее излучение и длину волны лазерного импульса, что преобразует в тепловой эффект всю энергию, поглощаемую во время излучения такого лазерного импульса. Опорные материалы РАС соответствуют таким требованиям. В дальнейшем интенсивность оптико-акустической волны может быть увеличена, если сверхбыстрые изменения структурного объема будут сопровождаться неизлучающим убыванием импульса, которое происходит при длительности лазерного импульса.
Тот факт, что свойства поглощающих материалов являются решающими при определении формы и амплитуды переходного давления, не был должным образом оценен в предыдущих случаях использования временных импульсов высокого давления для трансдермальной доставки лекарственный препаратов и соединений. На Фиг. 3 показаны имитации для одного транзиента с различными периодами затухания импульса и фракциями высвобождаемой лазерной энергии. При измерении с помощью датчика-преобразователя на 2,25 МГц амплитуда акустических одиночных импульсов увеличивается в 2 раза, если период существования электронного состояние одиночного импульса увеличивается с 10 до 100 нс, даже если вся энергия лазерного излучения превращается в тепло. Время нарастания акустического одиночного импульса также заменяется более длительными промежутками времени, как и ожидалось. Если присутствуют два одиночных импульса и один из них имеет более долгий период существования, чем лазерный импульс, на выходе всегда будет получаться наименьший акустический одиночный импульс, чем тот, который можно получить при использовании опорного материала РАС. Это будет происходить до тех пор, пока продукты имеют больший объем, чем реагенты или стандартное теплосодержание продуктов будет меньше, чем у реагентов, или если реакция является экзотермической.
L
L
L
2
2
Экзотермические реакции могут производить больше тепла и, следовательно, более интенсивные одиночные акустические импульсы, чем опорные материалы РАС. Амплитуда таких одиночных акустических импульсов в дальнейшем возрастает, если экзотермические реакции сопровождаются увеличением структурного объема благодаря ферментации материала, как обычно происходит при лазерно-индуцированной абляции. Однако импульсы таких акустических транзиентов остаются кратковременными. Происходит давление транзиентов, генерируемых термоэластичным расширением под воздействием сверхнизких потоков лазерного излучения τ, если опорные материалы РАС используются как хромофоры, потому что, по определению, их периоды существования короче, чем τ, и имеют биполярную характеристику с компонентами сжатия и растяжения. Известно, что когда плотность энергии лазерного излучения превышает границы иссечения ткани, наблюдается дополнительная волна сжатия на поздних этапах времени по причине отдачи абляции. Время нарастания абляционной отдачи снижается, как только поток лазерного излучения возрастает, и не зависит от τ. Механизм образования давления лазерной абляцией порождает рост пузырьков, время нарастания которых составляет приблизительно 100 нс, располагается на нижней границе ширины импульсов давления. Для потоков лазерного излучения, более высокого, чем порог удаления (иссечения) ткани, высокая интенсивность акустических одиночных импульсов компенсируется и относительно продолжительным временем нарастания, поэтому могут быть созданы длительные импульсные транзиенты. Хотя это хорошо известно науке, это не соответствует требованиям к простому и доступному источнику импульсного лазерного излучения для активной трансдермальной доставке широкого ряда лекарственных средств, или плазмидной трансфекции через клетки мембран. Тонкопленочные материалы с низкими границами наносекундного иссечения, предпочтительно менее чем 50 мДж/см, могут преодолеть данное ограничение. Границы лазерной импульсной абляции ниже 50 мДж/см были найдены для некоторых полимерных пленок с большим коэффициентом линейного поглощения при соответствующей длине возбужденных волн.
Очень высокий коэффициент линейного поглощения также важен, так как спектральная полоса оптико-акустического одиночного импульса определяется спектральной полосой лазерного импульса, если
L
L
s
а
а
L
L
-1
где τ длительность лазерного импульса. Таким образом, будет получена совокупность параметров импульсного акустического профиля при τ=10 нс лазерного импульса в обычных полимерах (c=2500 м/с), где µ>>400 см. Если достаточные количества опорных соединений РАС внедрены в соответствующие вспомогательные материалы, то оптическая глубина проницаемости (δ=1/(2.3 µ) меньше чем 10 мкм, длительность лазерного импульса в наносекундах, а его максимальная мощность определяет ширину полосы волны и интенсивность акустического одиночного импульса (транзиента). Амплитуда акустических транзиентов снижается, когда показатель τ значительно больше, чем степень оптической глубины проникновения по отношению к скорости волн сжатия-расширения, и наблюдается снижение амплитуды акустических транзиентов с увеличением показателя τ, что становится наиболее очевидно при высоких частотах. Быстрое и эффективное преобразование энергии лазерного импульса образует широкополосные акустические одиночные импульсы с шириной полосы в десятки или сотни МГц в зависимости от ширины импульса лазера. Для достаточно кратковременных импульсов лазера средняя частота генерируемого ультразвука располагается на более высоких частотах, при которых глубина оптической проницаемости поглощающего материала снижается. Например, для лазерного возбуждения с помощью лазера Nd:YAG при 1064 нм углеродосодержащие материалы имеют глубину оптической проницаемости от 10 до 50 микрон, причем глубина оптической проницаемости алюминия составляет 10 нм, и это смещает среднюю частоту генерируемого ультразвука с 2,1 до 12 МГц. Акустические транзиенты, рассчитанные в соответствии с быстрым преобразованием Фурье, имеют это свойство, как показано на Фиг. 4. Данный эксперимент задействует измерительный преобразователь в 225 МГц, потому что высокочастотные составляющие ширины полосы пропускания лучше всего измеряются с помощью высокочастотных измерительных преобразователей.
Для временной проницаемости кожных покровов и слизистой оболочки желательно, чтобы ширина полосы пропускания акустического транзиента распространялась до границы высоких частот (частот, превышающих 20 МГц), поскольку при высоких частотах пределы полости (кавитации) располагаются позади значений высоких энергетических потоков, хотя высокие частоты более сильно поглощаются биологической тканью. Необходимо избегать образования временных кавитационных пузырьков, поскольку они могут служить причиной разрушения биологической ткани, так как они расширяются для миллиметровых размеров и затем лопаются. Вероятность того, что воздействие акустическим транзиентам образовывает инерционную (или временную) полость, измеряется с помощью механического индекса (MI)
rmax
L
где p - давление максимального разрежения (растяжения), a f - средняя (номинальная) частота акустического одиночного импульса (транзиента). Высокое значение MI указывает на более высокую вероятность образования полостей и, следовательно, вышеуказанное уравнение означает, что амплитуда минимального давления, которая соответствует границам полости, увеличивается при частоте ультразвука. С другой стороны, ослабление акустической частоты в 10 МГц на 3 см при проходе воды составляет только 7%, но она увеличивается до 85% при 50 МГц давлении компонента. Сверхвысокие частоты присутствуют в акустических транзиентах, в то время как кратковременны лазерные импульсы (τ<20 нс) поглощаются опорным соединениями РАС, заключенные в очень тонкие слои (толщиной менее 10 микрон). Опорные соединения РАС должны иметь очень высокий коэффициент поглощения при длине волны лазерного импульса, чтобы поглощать большинство потока лазерного импульса в пределах толщины пленки, в которую эти соединения собраны. Ввиду вышеуказанного ослабления акустической волны желательно также, чтобы источник волны РАС располагался как можно ближе к кожному покрову.
Конструкция устройства с очень тонкими поглощающими слоями, заключенными в тонкие элементы креплений, также должна учитывать границы, на которые можно будет генерировать плоскую акустическую волну. Критерием является то, что радиус пучка лазерного излучения должен соответствовать следующим условиям
s
L
s
L
2
2
где c скорость звука в образце, τ длительность лазерного импульса и z расстояние между поверхностью поглощающего слоя и детектором. Опора конструкции с z=1 мм, со значениями c=2500 м/с и τ=10 нс, требует r>>0,2 мм. Следовательно, существует возможность сфокусировать лазерный пучок в радиусе 1 мм и таким образом сгенерировать плоскую акустическую волну. Отличительным преимуществом устройства с такой конфигурацией является то, что плотность энергии в 10 мДж/см на импульс на площадь поверхности в 0,03 см соответствует лазерному импульсу в 0,3 мДж. Энергия такой величины для длительного лазерного импульса в несколько наносекунд всегда присутствует в импульсных волоконных лазерах, лазерах с накачкой светодиодами и других лазерах на твердотельных элементах, которые также могут достигать частот в сотни кГц. Эти лазеры являются переносными, компактными, износостойкими, доступными по цене, простыми в обращении и не требующими особого обслуживания.
2
Конструкция эффективного оптико-акустического преобразователя лазерных импульсов должна также учитывать то, что генерация волны давления в условиях работы в жестких границах ведет к повышенному давлению, нежели при работе в свободных границах. Акустическое ограничение оптико-акустического преобразователя с помощью кварцевых пластин было призвано улучшить амплитуду двадцати мегагерцовых (20 МГц) оптико-акустических волн приблизительно в 100 раз. Более того, в случае когда акустический транзиент образовывался в результате термоэластичного расширения, наличие жестких границ трансформирует воздействие кратковременного одиночного импульса (транзиента), состоящего из сжатия, следующего за разрежением, в однонаправленный сжимающий импульс. Эффективное преобразование энергии лазерного импульса делает возможным использовать энергию потоков лазерного излучения ниже 100 мДж/см для генерации интенсивных и по большей части сокращающихся акустических транзиентов.
Оптимизация термоэластических свойств опорного материала также способствует увеличению амплитуды акустических транзиентов, генерируемых термоэластичным расширением обжатой тонкой пленки, включающей в себя опорный материал РАС. Органические жидкости обладают термоэластичными свойствами, которые также могут быть описаны через высокие коэффициенты Грюнейзена, образуют прекрасные акустические границы с твердыми поверхностями. При фиксации тонкой пленки между оконным элементом и тонким слоем органической жидкости с высоким коэффициентом Грюнейзена (Г), это впоследствии будет способствовать увеличению эффективности преобразования энергии лазерного импульса в оптико-акустическую волну. Различные жидкости, такие как тетрахлорид углерода, бромбензол, ацетон или ацетонитрил, имеют термоэластичные свойства, которые приводят к образованию высокоамплитудных оптико-акустических волн. Такие эластомеры, как каучук, неопрен (синтетический каучук), вайтон или полиуретан, известны как материалы, у которых очень большой коэффициент термического расширения, но это иногда компенсируется другими свойствами материалов.
В науке известно, что при проходе акустической волны через одну среду (среда 1) происходит столкновение на границе второй среды (среда 2), так образуются отраженные и передаваемые (или преломляемые) волны. Коэффициент передачи выражен в следующей формуле
2
1
1
2
1
2
кожи
воды
алюминий
сталь
тефлон
полииэтелен
полистирол
парафин
глицерин
графит
целлюлоза
кожа
6
2
где А и А являются начальной амплитудой в среде 1 и конечной амплитудой в среде 2, a Z и Z являются акустическим импедансом (волновым сопротивлением) в обеих средах. Полная звукопередача между двумя средами требует, чтобы Z=Z. Присутствие пустот в устройстве является главной причиной неэффективности работы устройства. Пустоты обычно заполнены воздухом, и волновое сопротивление очень сильно отличается от других материалов, входящих в состав устройства. Это служит причиной очень плохой звуконепроницаемости и потере устройством эффективности. Следовательно, необходимо обеспечить надежный акустический контакт между тонкой пленкой устройства в том месте, где генерируется оптико-акустическая волна, и всеми частями устройства, которые оптико-акустическая волна должна пересекать для того, чтобы достичь кожного покрова. Также необходимо иметь хороший акустический контакт между устройством и кожей или слизистой оболочкой. Волновое сопротивление кожи составляет Z=1/54 MRayl (MRayl - акустическое полное сопротивление) [1 MRayl=1×10 кг/(м с)], аналогично воде (Z=1,48 MRayl), но сильно отличается от металлов (Z=17 MRayl, Z=46 MRayl), хотя и относительно близко к некоторым пластмассам (Z=2,97 MRayl, Z=1,76 MRayl, Z=2,42 MRayl). Материалами, вызывающими интерес для обеспечения надежного акустического контакта с кожными покровами, являются парафин (Z=1,8 MRayl), глицерин (Z=2,3 MRayl), графит (Z=2,7 MRayl), ацетатцеллюлоза (Z=3,2 MRayl) или акустическая эхопроводящая паста. Эффективная доставка акустических волн в кожные покровы требует выбора материалов с показателем волнового сопротивления, близким к Z. Проблема несоответствия волнового сопротивления может также быть решена с помощью использования многочисленных подходящих слоев, соединенных последовательно, причем оптимальное волновое сопротивление для каждого слоя будет равно среднему пропорциональному значению волнового сопротивления слоев на каждой стороне материала.
С. Материаловедение
Целевые материалы с сильным поглощающим эффектом и большой степенью жесткости являются широкодоступными. Однако рассмотрение вопроса, детально описанного выше, предусматривает также использование материалов со свойствами опорных материалов РАС с высоким коэффициентом линейного поглощения, внедренным в тонкий поглощающий слой с высокими коэффициентами Грюнейзена, надежным акустическим контактом между светопоглощающим слоем и всеми материалами, через которые акустический транзиент распространяется в направлении кожного покрова, при условии хорошего акустического контакта с кожей и предпочтительно с механизмом отражения проходящего света позади устройства, чтобы обеспечить второй проход волны через поглощающий слой. Как альтернативный вариант, вместо использования тонких пленок с включенными материалами, обладающими свойствами опорных материалов РАС, может быть изготовлена светопоглощающая пленка с полимерами, обладающая низкими границами порога удаления ткани при низком наносекундном лазерном импульсе. Это и является основными принципами того, как изготовить устройства, которые смогут эффективно преобразовывать энергию лазерного импульса в высокоинтенсивные, кратковременные и широкомасштабные акустические транзиенты. На Фиг. 5 отображена рабочая диаграмма предпочтительного варианта устройства в соответствии с данными основными принципами. Примеры, приведенные в тексте, представлены для того, чтобы наглядно продемонстрировать различные методы получения материала, необходимого для быстрого и эффективного преобразования энергии лазерного импульса в акустический одиночный кратковременный импульс (транзиент), но выбор материалов ограничен только вышеуказанными основными принципами.
III
Некоторые, но не ограниченные только указанными образцами опорных материалов РАС, которые могут быть объединены в тонкие слои, являются орто-гидроксибензофенон и аналогичные молекулы, подвергающиеся воздействию сверхбыстрых фотоинициированных внутримолекулярных протонов или переносу атомов водорода, который быстро возвращается в естественное основное состояние, Mn комплексы мезо-тетрафенилпорфирин (MnTPP) и другие парамагнитные комплексы со сверхбыстрыми металл - лиганд и/или лиганд - метал ионообменными релаксациями, комплексы с ионообменными связями, которые возвращаются в основное состояние под воздействием сверхбыстрой рекомбинации зарядов, β- каротин и другие системы, которые быстро распадаются до естественного основного состояния при коническом взаимопересечении, графит и другие материалы, способные на сверхбыструю передачу их электронной энергии в фононные моды, происходящие при охлаждении в субнаносекундный масштаб времени, полупроводниковые материалы с кратковременным переходным состоянием, или другие материалы, или смеси материалов со сверхбыстрыми безызлучательными релаксациями. Такие процессы безызлучательных релаксаций могут включать, в дополнение к термической релаксации, структурные изменения объема, который быстрей образуется в промежуточных материалах с большими молекулярными объемами, чем у реагентов. Опорные соединения РАС в тонком слое могут также быть колебательно возбуждены при помощи инфракрасных лазерных импульсов, обеспечивая то, что колебательные режимы, возбужденные с помощью инфракрасного излучения, очень быстро возвратятся в основное колебательное состояние, как это видно, например, в оптико-акустических спектрах воды и других материалах.
III
Тонкие полимерные пленки могут быть недорого изготовлены с помощью нескольких различных технологий. Например, стандартное покрытие, полученное методом центрифугирования, производит пленки с толщиной между 1 и 10 микрометров. Красители, которые квалифицируются как опорные материалы РАС, должны быть внедрены в больших количествах в пределах самого полимера, а устройство должно быть сконструировано, чтобы обеспечить плотность и жесткость пленки, необходимые для эффективной работы. Внедрение больших количеств красителей в полимер облегчается внедрением длинных цепочек алкила, таких как мезо-тетраундецилпорфиринов. Свойства опорных материалов РАС также присутствуют в тех соединениях, в которых они объединены с парамагнитными ионами, такими как Mn в присутствии противоионов, таких как галогениды, карбоксилаты, и т.д. Данные опорные материалы РАС обозначаются в настоящем документе как MnTAP и предполагают наличие противоионов. Чтобы проиллюстрировать использование и производительность тонких полимерных пленок, мы предоставляем в качестве Примера 1 способ изготовления устройства для трансдермальной доставки лекарственных препаратов с помощью тонкой полимерной пленки с большим количеством внедренных материалов MnTAP. Другим классом соединений со свойствами, необходимыми для внедрения в данную полимерную пленку, являются поглощающие красители ближней области спектра инфракрасного диапазона, разработанные, например, для блокирования ближней области спектра инфракрасного излучения. Пример 2 описывает изготовление устройства с одним таким красителем, который имеет преимущество, так как использует лазерные импульсы ближней области инфракрасного диапазона для производства оптико-акустических волн. Лазеры ближнего инфракрасного диапазона могут поставлять данные потоки лазерного излучения по более низкой стоимости, чем лазеры видимого диапазона или лазеры ультрафиолетового диапазона.
2
2
2
3
Изготовление фотоэлементов с сенсибилизированным красителем в настоящее время применяется в небольшом количестве микронных слоев нанокристаллического титана TiO, отлагаемого на тонком слое стекла. Таким образом, наиболее тонкие слои предлагают большую площадь поверхности, которая может быть использована для поглощения красителей. Пример 3 иллюстрирует изготовление устройств с очень тонкими слоями из TiO с поглощающим мезо-тетрафенилпорфирин сульфонатом марганца (MnTTPS), который в данных условиях проявляет себя как хороший пример оптико-акустического опорного материала. Этот же пример также предусматривает использование полупроводниковых материалов, которые хорошо поглощают длину возбужденных волн, таких как: гематит - в нанокристаллической форме, пленки из мезопора α-FeO - с быстрым электронно-дырочным геминальным воссоединением.
2
5
5
-1
5
-1
2
a
a
Тонкие пленки материалов с порогом удаления ткани при лазерных импульсах с показателями ниже 50 мДж/см также соответствуют вышеуказанным принципам для быстрого и эффективного преобразования энергии лазерных импульсов в акустический транзиент. Это действительно так, например, для поли(этилен)терефталата (PET), полиимида и триазеновых полимеров. В дополнение необходимо отметить, что такие полимеры имеют сильное поглощение ультрафиолетового излучения (UV) с линейными десятеричными коэффициентами поглощения µ=1,6×10 и 2,5×10 см при 248 нм для PET и полиимида, соответственно, и µ≈10 см при 308 нм для триазеновых полимеров. Имея такие высокие коэффициенты поглощения, можно получать пленки толщиной 200 нм, которые поглощают более 99% падающего лазерного импульса соответствующей длины волны и переносят иссечение вместе с образованием высокоамплитудных акустических транзиентов при потоке лазерного излучения ниже 100 мДж/см.
2
На Фиг. 1 сравниваются акустические транзиенты, производимые различными устройствами при тех же самым потоках лазерного излучения, которые можно регистрировать с помощью датчика-преобразователя Panametrics 2.25 МГц (модель A106S) и осциллоскопа с цифровым запоминающим устройством (Tektronix DSA 601,1 Gs/s, двухканальный). Было использовано возбуждение третьей гармоники спектр-физического квантового излучающего лазера (Spectra-Physics Quanta Ray) GCR 130 Nd:YAG (с длительностью импульса 5-6 нс) с энергией, равной приблизительно 10 мДж/см на импульс при 355 нм. Относительные амплитуды таких акустических транзиентов зависят от чувствительности датчика-преобразователя по отношению к различным акустическим частотам, присутствующим в проходящей акустической волне. Следовательно, амплитуда акустических транзиентов, измеряемая датчиком-преобразователем, является только показательной для оценки эффективности оптико-акустического преобразования, достигаемого устройствами. Тем не менее, амплитуды акустических транзиентов, производимые устройствами, сконструированными в соответствии с вышеуказанными основными принципами, гораздо выше, чем те, которые образованы волной давления при использовании полистирольной целевой области черного цвета с толщиной 1 мм.
Пример 4 показывает влияние коэффициента линейного поглощения на длину волны акустической проходящей волны. С помощью датчика-преобразователя Panametrics 225 МГц (модель V2113) становится очевидным, что акустические транзиенты в соответствии быстрым преобразованием Фурье (fast Fourrier transform), сгенерированные пленкой с более высокими коэффициентами линейного поглощения, имеют ультразвуковые частоты, которые распространяются до 200 МГц, Фиг. 4. Данные высокие частоты показывают, что образование акустических транзиентов сопровождается длительным лазерным импульсом (приблизительно 6 нс).
D. Биологическая оценка
2
Определение производительности оптико-акустических волн, генерируемых данными устройствами для содействия трансдермальной доставки крупных молекул лекарственных препаратов и биологических материалов, лучше всего оценивать на животных образцах, имеющих сходную структуру кожных покровов с человеческой кожей. Лучшим животным образцом для тестирования проницаемости кожи является минипиг (карликовая домашняя свинья) ввиду большого сходства характеристик кожи минипига и человека и их схожей проницаемости для различных лекарственных препаратов. Подтверждение принципов эффективности устройств, о которых рассказывается в настоящем документе, представлено в Примерах 58, с учетом использования двух клинически соответствующих элементов: порфирина и протеина. Порфирины и порфириновые производные в настоящее время используются в качестве оптических сенсибилизаторов при фотодинамической терапии рака. Их использование при лечении рака кожи и воспалений кожи, таких как актинический кератоз (ороговение кожи), эпидермоидный плоскоклеточный рак, болезнь Боуэна (внутриэпителиальный эпидермоидный рак) или базально-клеточная карцинома, ограничено низкой диффузией таких крупных молекул через кожный покров. Трансдермальная доставка 5,10,15,20-тетракис-(2,6-фторо-3-N-метилсульфамоилфенил) порфирина (FTPPMet, молекулярный вес 1131 Да) через кожу минипига с помощью описываемых устройств показано в Примерах 5 и 7. Протеины в настоящее время доставляются в организм с помощью игл для подкожных инъекций для лечения различных заболевания и нарушений. Почти аналогичным примером является подкожные инъекции инсулина (молекулярный вес 6 кДа) для лечения диабетов. Примеры 6 и 8 описывают эффективное внутрикожное введение зеленого флуоресцентного белка (GFP, молекулярный вес 27 кДа) с помощью устройств, описанных в данном документе.
2
Тестирование in vivo и in vitro проводилось на четырех минипигах, полученных из IMIDRA (Instituto Madrile о de Investigaci n у Desarrollo Rural, Agrario у Alimentario Мадридский института исследований и развития сельских районов, сельского хозяйства и продуктов питания) муниципалитет Аранхуэс (Мадрид). Все минипиги были самками, в возрасте 6-8 месяцев, белые с коричневыми пятнами, средний вес 56,8 кг (66,2, 57,1, 43,5, 60,6 кг). Они были переданы на Национальную зоотехническую станцию (Esta о Zoot cnica Nacional), Вале-де-Сантарен (Португалия), где были размещены в отдельных боксах площадью 1,5 м, питались они по стандартной для свиней диете, вода предоставлялась без ограничений, период акклиматизации перед исследованиями составил три недели. Исследования осуществлялись в соответствии с Этическими принципами Португалии в соответствии с лицензией, выданной Управлением здравоохранения и защиты животных (Direc о de Servi os de Sa de e Protec о Animal), номер 0420/000/000/2007. Доступ к пище был приостановлен за 24 часа до начала исследования. Спинки животных были побриты за 24 часа до применения дерматологических композиций in vivo (на живом организме). Составы композиций были такие же как для пассивной, так и для активной трансдермальной доставки препаратов с помощью оптико-акустических волн. Устройства оптико-акустического преобразования и лазеры, используемые во время данных исследований, были описаны выше. Все процедуры были выполнены с использованием анестезии. Средства, применяемые для обработки за 30 минут перед началом тестирования, были следующие: азаперон (Stresnil - Veterinaria ESTEVE Испания), 2 мг/кг внутримышечная инъекция + сульфат атропина, 50 мг SC. Введение было осуществлено с помощью кетамина (Clorketam - V toquinol, Франция), 20 мг/кг, внутримышечная инъекция. Анестезия поддерживалась с помощью внутритрахейной интубации, используя спонтанную вентиляцию со смесью 2-3 л/мин кислорода + 3% изофлурана (Isoflo - Veterin ria ESTEVE, Испания). Образцы были собраны у трех минипигов под анестезией, описанной выше. Аликвотные пробы кожи с размерами 20×20×10 (длина, сторона, глубина) были получены с помощью удаления хирургическим путем. После сбора образцов кожи животные были умерщвлены постпредством передозировки тиопенталом натрия (25 мг/кг) + 20 мл 7,5% хлорида калия. Четвертый минипиг содержался еще в течение 3 недель в условиях стандартной диеты для свиней и неограниченной подачи воды.
Кожные фрагменты были вырезаны из спинок минипигов, после того как они были умерщвлены. Кожные фрагменты были заморожены и хранились при 18°C до момента использования для исследований in vitro (в лабораторных условиях). Перед каждым исследованием in vitro требуемое количество кожи минипига медленно доводилось до комнатной температуры. Все исследования были проведены при комнатной температуре.
Образцы кожи, собранные после экспериментов, были проанализированы с помощью микроскопии для выявления глубины проникновения требуемых препаратов или с последующей процедурой выведения препаратов для оценки их содержания под кожным покровом. Оценка глубины проникновения с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной микроскопии требует фиксации ткани. Первым этапом фиксации было погружение образца в параформальдегид (4% водный раствор) на не менее чем 24 часа. Затем образцы были перемещены в 25% раствор сахарозы на не менее чем 48 часов. После такой обработки образцы кожи стали плотней, чем раствор сахарозы. Аликвотная проба была выделена с помощью дерматома (инструмента для иссечения участка кожи), заморожена в сухом льду, а затем закреплена в держателе с составом Tissue-Тек О.С.Т. (производитель Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Нидерланды) и разрезана на тонкие срезы выбранной контролируемой толщины от 25 и 100 мм методом криостатного среза. Кожные срезы были собраны на предметных стеклах микроскопа и хранились замороженными перед их исследованием с помощью флуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии. В качестве альтернативы вместо использования параформальдегида в качестве фиксаторного раствора образцы кожи были непосредственно заморожены в сухом льду.
2
2
2
2
2
2
Для того чтобы оценить количество FTPPMet, доставленного под кожу, был разработан специальный метод. Из 1 см площади экспериментального кожного покрова был взят материал из пробитого отверстия в 4 мм и он был полностью секционирован на мельчайшие возможные срезы с помощью скальпеля. Эти срезы были помещены в стеклянную чашку вместе с определенным количеством метиленхлорида для полного разрушения в шредере (измельчителе), модель YSTRAL Micro Shaft 6G. После этого оставшаяся измельченная кожа прошла процедуру выделения в течение 6 часов при использовании соответствующего растворителя. В отношении FTPPMet, метиленхлорид представил данные правильного выбора, принимая во внимание липофильность кожного покрова и порфирина. Флуоресцентные градуировочные кривые фармакологического вспомогательного вещества, доставленного в кожный покров, были получены при обработке в растворе-экстракторе, чтобы подтвердить использованную методику. В конце массовая доля вещества, доставленная в кожный покров, определяется для каждой пробы с помощью замещения ее флуоресценции в градуировочной кривой. Флуоресцентный сигнал флуоресцентных изображений также был выражен количественно с помощью анализа спектральной световой эффективности FTPPMet, доставленного под кожу после обрисовки контура зон, где наблюдалась флуоресценция. Процедура извлечения вещества при пассивной в отличие от активной трансдермальной доставки FTPPMet подтвердила данные, полученные флуоресцентной микроскопией, а именно увеличение количества FTPPMet, доставленного в кожу при использовании высокоимпульсной широкополосной волны давления. Это еще один факт в пользу активной трансдермальной доставки как оптимального способа доставки лекарственного препарата.
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) имеет молекулярный вес 27 кДа, что намного больше, чем протеины, имеющие терапевтический эффект, такие как инсулин (5,8 кДа). С другой стороны, GFP имеет сильное и характерное поглощение света и излучение света, которое облегчает его анализ с использованием флуоресцентных методов исследования, а именно с помощью конфокальной микроскопии. В данном случае была использована модель для интрадермальной доставки белков. В дополнение необходимо отметить, что плазмиды, в которые был внедрен GFP, являются доступными для приобретения, особенно те из них, которые основаны на gWIZ векторах. Уровень выделения GFP после трансфекции, проведенной с помощью gWizGFP плазмидов, можно отслеживать с помощью флуоресценции, с параметрами возбуждения 470-480 нм и испускания при 510 нм. Пример 9 in vitro представляет доказательство используемого принципа плазмидной трансфекции с помощью gWizGFP.
Описание рисунков
2
На Фиг. 1 сравниваются оптико-акустические волны, образуемые различными устройствами при одинаковом потоке лазерного излучения (10 мДж/см) и определяемого датчиком-преобразователем Panametrics 2.25 МГц (модель A106S), а также осциллоскопом с цифровым запоминающим устройством (Tektronix DSA 601,1 Gs/s, двухканальный). Возбуждение использовало третью гармонику лазера Spectra-Physics Quanta Ray GCR 130 Nd:YAG (длительность импульса 5-6 нс).
2
На Фиг. 2 показано, что амплитуды акустических снижаются, когда толщина поглощающей пленки увеличивается, в данном случае с помощью поглощающих последующих слоев наночастиц TiO на стеклянной пластинке. Когда второй слой является поглощающим, а толщина увеличена в два раза, амплитуда акустического транзиента, сгенерированная тетрафенилпорфирин сульфонатом марганца (MnTTPS), поглощенного наночастицами TiO, снижается наполовину.
На Фиг. 3 показано моделирование оптико-акустических волн, как показано датчиком-преобразователем на 2,25 МГц, которые образуются с помощью неизлучающего ослабления одного кратковременного импульса (транзиента) в течение времени затухания в 10 нс или при затухании одного транзиента в течение 100 нс, а также оптико-акустическую волну, производимую в период затухания двух последующих импульсов с продолжительностью жизни от 10 до 100 нс, каждая с 50% энергии лазерного излучения. Амплитуда оптико-акустических волн снижается в два раза, если продолжительностью жизни электронного состояния транзиента увеличивается с 10 до 100 нс и их время нарастания становится больше, таким образом снижая импульс акустической проходящей волны.
На Фиг. 4 показано, что оптико-акустические волны по быстрому преобразованию Фурье, измеренные контактным датчиком-преобразователем Panametrics 225 МГц, получаемые вследствие возбуждения импульсного лазера или с применением промышленного черного полистирольного диска толщиной 634 мкм, или с применением полистирольной пленки толщиной 38 мкм, с внедренным MnTAP в конструкцию устройства, имеют поглощение более чем 99,9% лазерного излучения при 484 нм. Возбуждение использовалось устройством EKSPLA ОРО, модель PG-122 с излучением импульсов лазером EKSPLA NL301G Nd:YAG, генерирующим лазерные импульсы длительностью 4-6 нс.
Фиг. 5 является схематическим поперечным сечением, не в масштабе, конструктивного исполнения устройства для доставки соединений/препаратов в соответствующем фармакологической форме (А) через биологические барьеры (В), где ближний конец оптического волновода (световода) (7) соединен с источником импульсного лазерного излучения, а дальний конец направлен в тонких поглощающий слой (4) пленки, состоящей из опорного материала РАС. Оптический волновод обеспечивает направленность, с контактом или без физического контакта, между источником импульсного лазерного излучения и поглощающим слоем, содержащим опорный материал РАС. Один лазерный импульс (1) может быть направлен и/или сфокусирован на части пленки (4), а последующие лазерные импульсы могут быть направлены в это же или другие части пленки (4). Жесткий закрепленный оконный элемент (3) прозрачен для длины волны лазерного импульса (1), которая выборочно поглощается опорным материалом РАС, внедренным в тонкую пленку (4). Свет, передаваемый через пленку (4), по выбору отражается лицевым отражающим опорным элементом (5) и осуществляет второй проход волны через пленку (4) с еще большей степенью поглощения. Оптико-акустическая волна, образуемая в пленке (4), по выбору передается через опорный элемент (5) на биологический барьер (В), как, например, кожный покров, с помощью акустического контакта при содействии специального дерматологического состава (А), содержащего лекарственный препарат, который необходимо доставить в кожный покров (В). Близкий контакт между оконным элементом (3), тонкой пленкой (4) и опорным элементом (5) обеспечивается конструктивным элементом (6). Этот конструктивный элемент может включать в себя устройство/аппаратуру для ориентации лазерного импульса (1) и распространять последовательные лазерные импульсы в различные части пленки (4).
2
2
На Фиг. 6 сравниваются данные флуоресцентной микроскопии (А) пассивной и (В) активной трансдермальной доставки порфирина с молекулярным весом приблизительно 1 кДа через кожный покров минипига, с данными при использовании устройства в Примере 1 и 12 с лазерными импульсами при 355 нм и потоком лазерного излучения 10 мДж/см, сфокусированным на площадь поверхностью 1 см, и временем инкубации 20 минут.
2
На Фиг. 7 отображены данные конфокальной микроскопии при трансдермальной доставке порфирина с молекулярным весом приблизительно 1 кДа через кожный покров минипига с данными при использовании устройства в Примере 3 и 6 с лазерными импульсами при длине волны 355 нм, энергией потока лазерного излучения 10 мДж/см и временем инкубации 20 минут. Режим конфокальной микроскопии: детектор-преобразователь @1150 В, микроотверстие = 111,44 мкм и лазерное возбуждение @ 514 нм.
2
На Фиг. 8 отображены данные флуоресцентной микроскопии (А) и конфокальной микроскопии (В) при активной трансдермальной доставке GFP (с молекулярным весом 27 кДа) через кожный покров ех-vivo минипига с помощью устройства, указанного в Примере 1, используя 6 лазерных импульсов 355 нм, с энергией потока лазерного излучения 50 мДж/см и временем инкубации 20 минут. Режим конфокальной микроскопии: детектор-преобразователь @1150 В, микроотверстие = 111,44 мкм и лазерное возбуждение @ 488 нм.
2
На Фиг. 9 отображены данные флуоресцентной микроскопии при активной трансдермальной доставке порфирина с молекулярным весом приблизительно 1 кДа через кожный покров in-vivo минипига с помощью устройства, указанного в Примере 1, используя 12 лазерных импульсов 355 нм с энергией потока лазерного излучения 10 мДж/см и временем инкубации 20 минут.
2
На Фиг. 10 отображены данные флуоресцентной микроскопии при активной трансдермальной доставке GFP через кожный покров in-vivo минипига с помощью устройства, указанного в Примере 1, используя 12 лазерных импульсов 355 нм и с энергией потока лазерного излучения 10 мДж/см и временем инкубации 20 минут.
2
На Фиг. 11 отображены отображает данные флуоресцентной микроскопии о GFP, произведенном после in vitro доставки плазмида gWizGFP в клетки COS-7 с помощью устройства, указанного в Примере 1, используя лазерные импульсы 532 нм и с энергией потока лазерного излучения 55 мДж/см. Через двадцать четыре часа после облучения выделение GFP в клетках было исследовано с помощью флуоресцентного микроскопа (DMIRE200 Leica). Образцы клеток были облучены при лазерном импульсе 488 нм.
Подробное описание изобретения
Пример 1
Генерация акустических транзиентов устройством с внедренными в них полимерными пленками микрометровой толщины
кожа
2
Мезо-тетраундецилпорфирин марганца (MnTAP) является соответствующим опорным материалом РАС, к тому же он внедрен в большое количество полистирольных пленок. Пленка была изготовлена методом покрытия тонкой стеклянной пластины. Стекло функционирует в качестве оконного элемента, а пленка закреплена на другой стороне с помощью отражающего пластикового покрытия. Жесткое устройство поглощает более 90% света при 355 нм, поглощающий материал соответствует критериям соответствующего опорного материала РАС, поглощающий слой имеет толщину приблизительно 30 мкм, а материал, контактирующий с кожей, имеет волновое сопротивление близкое к значению Z. Волновое сопротивление между всеми слоями может быть улучшено с помощью соответствующей связующей среды, такой как акустическая эхопроводящая паста, парафин или глицерин. Работа данного устройства при возбуждении лазерного импульса в 355 нм по третьей гармонике лазера Nd:YAG с плотностью энергии излучения 10 мДж/см, измеренной датчиком-преобразователем 2,25 МГц, сравнивается на Фиг. 1 с данными, полученными при использовании стандартной полистирольной пластмассы толщиной 1 мм с аналогичным стеклянным оконным элементом.
Данный пример наглядно показывает увеличение эффективности оптико-акустического преобразования, достигаемого устройством, сконструированным в соответствии с основными принципами, раскрытыми в данном изобретении, по сравнению с эффективностью использования простой черной пластиковой пленки, известной в данной области науки.
Пример 2
Генерация акустических транзиентов устройствами с внедренными в них поглощающими (в инфракрасной области) красителями микрометровой толщины
Поглощающие излучения в инфракрасной области красители, используемые для изготовления средств для защиты глаз от лазерного излучения, также могут демонстрировать свойства, схожие со свойствами рассматриваемых опорных материалов РАС. Пленка с внедренным промышленным порошковым красителем EPOLIGHT 1178 от компании Epolin с устойчивым поглощением при 1064 и 355 нм была подготовлена в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1. Оптико-акустические волны, образуемые пленкой с внедренным EPOLIGHT 1178, были сравнены с такими же волнами, образованными аналогичной пленкой с внедренным MnTAP, имеющим такой же коэффициент поглощения, плотность энергии лазерного излучения при 355 нм и другие лабораторные условия. Пленки вырабатывали одинаковые оптико-акустические волны, продемонстрировав то, что краситель EPOLIGHT 1178 имеет свойства опорного материала РАС. Фиг. 1 сравнивает измеренные оптико-акустические волны устройства с внедренным красителем EPOLIGHT 1178 с измеренными волнами аналогичных устройств, в которые был внедрен MnTAP, для одинаковой плотности энергии лазерного излучения.
Данный пример показывает, что широкий диапазон длины волн лазерного излучения может быть использован для эффективного преобразования лазерных импульсов в оптико-акустические волны, при условии что основные принципы, изложенные в настоящем изобретении, будут соблюдены.
Пример 3
2
Генерация акустических транзиентов устройствами с внедренными в них на но структурными слоями TiO нано- или микрометровой толщины
2
2
Способы производства тонких слоев наноструктурированного TiO, нанесенного поверх стеклянных поверхностей, хорошо известны в области изготовления фотоэлементов с использованием сенсибилизированного красителя. В отличие от данных применений устройства для трансдермальной доставки лекарственных препаратов не требуют использования процесса спекания для обеспечения хорошей электрической проводимости между наночастицами TiO. Напортив, спекание снижает площадь контакта.
2
2
Как только мезо-тетрафенилпорфирин сульфоната (MnTTPS) поглощается в достаточном количестве, чтобы поглощать более 90% излучения при 355 нм, тонкая пластина высушивается и добавляется тонкий слой глицерина перед помещением сверху отражающей металлическая пластины. Устройство подвергается облучению с тыльной стороны, то есть пучок лазера сталкивается со стеклянной тонкой пластиной, проходит ее и поглощается светопоглощающим красителем в нанокристаллическом блоке TiO. Любое излучение, которое не было поглощено красителем, далее либо поглощается, либо отражается металлической поверхностью, которая блокирует все излучение, которое проходит через устройство. Слой частиц TiO с крупными размерами, например 100-200 нм, может также быть внедрен для усиления эффекта светорассеивания и, соответственно, этот слой увеличивает путь оптического луча и возможность поглощения света поглощающим красителем. Фиг. 1 сравнивает оптико-акустические волны, измеренные на данном устройстве, и возбуждение волн при 355 нм с такими же волнами, измеренными на устройствах, описанных в предыдущих примерах, с применением одинакового потока лазерного излучения.
Пример 4
Генерация акустических транзиентов устройствами с высокими линейными коэффициентами поглощения
а
1
MnTAP может быть внедрен в большое количество тонких полистирольных пленок. Была изготовлена пленка толщиной 38 мкм с коэффициентом поглощения 1,8 при 647 нм, что соответствует большей поглощающей способности, чем у пленки с коэффициентом поглощения 5 при 484 нм. Данная тонкая пленка имеет µ>>1300 см и полоса спектра оптико-акустического транзиента, которую она может образовывать, должна определяться полосой спектра лазерного импульса, поглощаемого тонкой пленкой. Пленка была зафиксирована между кварцевым оконным элементом и поверхностью датчика-преобразователя Panametrics 225 МГц и была приведена в возбужденное состояние устройством EKSPLA OPO, модель PG-122, приводимым в действие лазером EKSPLA NL301G Nd:YAG, передающим импульсы длительностью 4-6 нс при 484 нм. Оптико-акустический транзиент в соответствии с быстрым преобразованием Фурье приводит к распределению энергии излучения по длинам волн, как показано на Фиг. 4. В этом сигнале представлены все важные частотные компоненты до 200 МГц. Этот же рисунок также отображает сигнал в соответствии с быстрым преобразованием Фурье, полученный при использовании промышленного черного полистирольного диска с коэффициентом поглощения больше 5 при 484 нм и измеренного в аналогичных условиях. Сигнал, сгенерированный данным устройством, не содержит значимых частотных компонентов выше 50 МГц.
Пример 5
Исследование in-vitro трансдермальной доставки порфирина с молекулярным весом приблизительно 1 кДа
2
Дерматологический рецептурный состав с FTPPMet был получен при растворении 5 мг порфирина в 0,556 мл абсолютного этанола, затем было добавлено 1,737 мл пропиленгликоля, а затем 0,22 мл азона и 0,3 мл воды. Данная смесь была тщательно перемешена в приборе для встряхивания и перемешивания и диспергирована с помощью ультразвука для облегчения растворимости, а затем было добавлено гелевое основание, состоящее из воды (76,65%), 96% этанола (15%), глицерина (6%), триэтаноламин (1,35%), карбопола 940 (1%). Смесь была тщательно перемешена до полной гомогенизации. В данном рецептурном составе конечная концентрация порфирина составляет 0,1%, а азона (Azone) - 4%.
2
Данный состав был применен в отношении ориентировочного прямоугольного образца кожи минипига, 2×2 см, устройство, описанное в Примере 1, было плавно прижато к составу и кожному покрову, и 12 лазерных импульсов второй гармоники было сгенерировано лазером Nd:YAG (532 нм) с энергией 50 мДж на импульс. Облучаемая площадь составляла приблизительной 1 см. Устройство было отведено сразу после процедуры облучения, обработанный участок кожи был покрыт 1 мм слоем дерматологического состава и сохранен под герметичной повязкой в течение 20 минут. По истечении этого времени состав был удален с помощью медицинского шпателя и промыт с помощью медицинской ваты, смоченной в этаноле, пока никаких следов присутствия порфирина не осталось на медицинской вате. Ткани были закреплены в соответствии с процедурами, описанными выше, и проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии, Фиг. 6. Фиг. 6 также показывает данные флуоресцентной микроскопии, полученные из образца только с пассивной трансдермальной доставкой с использованием аналогичного дерматологического состава и при таком же времени контакта этого состава с кожей, находящейся под герметической повязкой. Фиг. 7 отображает результаты аналогичных экспериментов, но с использованием устройства, описанного в Примере 3, анализы образцов кожи были произведены с помощью конфокальной микроскопии.
Пример 6
Исследование in-vitro трансдермальной доставки протеина с молекулярным весом приблизительно 27 кДа
2
Дерматологический рецептурный состав, содержащий Зеленый флуоресцентный протеин (GFP), был приготовлен так же, как описано в предыдущем примере, только GFP заменил в составе препарата FTPPMet.
Данный состав был применен на образцах кожи минипига при помощи устройства, описанного в Примере 1, и в соответствии с протоколом, указанным в Примере 5, а именно как состав, способствующий трансдермальной доставке GFP с помощью 12 лазерных импульсов, каждый импульс по 50 мДж, и после двадцати (20) минут контакта состава с кожей под герметической повязкой. Данные флуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии образцов кожных срезов представлены на Фиг. 8. Пассивная трансдермальная доставка этого же дерматологического состава при одинаковых условиях контакта состава с кожей под герметической повязкой не привели к выявлению измеряемого состава GFP в кожных покровах.
Пример 7
Исследование in-vivo трансдермальной доставки порфирина с молекулярным весом приблизительно 1 кДа
Исследования пассивной и активной трансдермальной доставки in vivo были проведены на спинной части минипигов. В каждом опыте был использован рецептурный состав, содержащий порфирин, состав был нанесен, под герметической повязкой, на предварительно определенный участок кожи на необходимое количество времени. По истечении времени состав был удален с помощью медицинского шпателя и смоченной в этаноле медицинской ваты, удаление происходило до тех пор, пока на вате не осталось видно никаких следов состава. Образцы кожи были хирургически изъяты, а животные были умерщвлены.
2
Был использован дерматологический рецептурный состав, описанный в Примере 5. Содержание животных было описано выше. При успокоении животных с помощью анестезии состав был нанесен вручную с использованием хирургических перчаток. Состав наносился на круговую площадь диаметром около 3 см, толщина геля составила несколько миллиметров. Места применения состава для исследования пассивной доставки были закрыты герметической повязкой. Места применения состава для исследования активной доставки были покрыты устройством, описанным в Примере 1 и подвергались излучению 12 лазерных импульсов при 355 нм с энергией лазерного излучения 10 мДж на импульс и фокусировкой луча на площади приблизительно 1 см. Затем устройство было удалено, был добавлен тонкий слой геля, а место применения состава было покрыто герметической повязкой. Повязка была снята через 20 минут после применения, и спинная часть животных была очищена от состава. Образцы кожи были отобраны у тех минипигов способом, описанным выше. Каждый образец был приблизительно прямоугольной формы, стороны по 2 см, толщина 1 см. Четвертый минипиг оставался жить еще 10 дней для дальнейших исследований. Ни у одного из животных, особенно у того, которое оставалось живым, не было выявлено никаких побочных эффектов, вызванных применением состава с использованием или без использования лазерной обработки
После закрепляющей обработки каждый образец был разрезан на тонкие слои (срезы) для их оценки с помощью флуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии. Фиг. 9 отображает репрезентативные примеры изображений, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии. Через 20 минут, порфирин распространился на весь эпидермис, в то время как роговой слой кожи остался нетронутым.
Пример 8
Исследование in-vivo трансдермальной доставки протеина с молекулярным весом приблизительно 27 кДа
Был использован дерматологический рецептурный состав, описанный в Примере 6. Используемое устройство было описано в Примере 1. Протокол (последовательность действий) был описан в Примере 7. Инкубационный период после применения составило 20 минут. После фиксирующей обработки исследования с помощью флуоресцентной микроскопии выявили наличие GFP в значительной части эпидермиса, в то время как роговой слой кожи остался нетронутым, Фиг. 10.
Пример 9
Исследование in-vitro доставки генов
2
2
Для подтверждения функциональности исследования in-vitro о доставке генов в клетки клетки COS-7 были выращены в среде Дульбекко (Dulbecco′s Modified Eagle Medium - далее DMEM) с помощью бычьей сыворотки и антибиотиков (пенициллин/стрептомицин), в инкубаторе клеточных культур при температуре 37°C в атмосфере с содержанием 5% CO в воздухе. По достижении смыкания 90% монослоя клетки были собраны, а затем посеяны в чашки для культивирования и помещены в инкубатор при температуре 37°C на 24 часа. Перед применением волны давления в отношении этих клеток был добавлен водный раствор плазмида ДНК с закодированным GFP в культурной среде (gWizGFP, Aldevron, Фарго, Нидерланды), чтобы достичь в среде концентрации 100 мкг/мл. Устройство, описанное в Примере 1, было прижато к днищу резервуара с культурой, и при этом испускался лазерный импульс второй гармоники с помощью лазера Nd:YAG (532 нм, 10 Гц, 31 мДж/импульс) в течение 3 минут. Площадь облучения составила приблизительно 0,57 см. Через двадцать четыре часа после облучения лазером наблюдалось выделение GFP в клетках с помощью флуоресцентного микроскопа (DMIRE200 Leica). Клетки также были визуально обследованы с помощью светлого поля. Фиг. 12 представляет результаты флуоресцентной микроскопии выделенного GFP в клетках COS-7.
Другие конструктивные исполнения устройств
Лица, связанные с данной областью науки, прекрасно понимают, что существует много других путей для применения данного изобретения с использованием наносекундных и пикосекундных лазерных импульсов и тонких слоев сверх поглощающих материалов с одинаковыми или более кратковременными периодами существования, чем продолжительность лазерного импульса, иными, чем в некоторых примерах, описанных выше. Рецептурные составы, которые должны быть доставлены в кожу или через кожный покров, могут применяться в виде фармакологически допустимых рецептов перед или после воздействия одиночных кратковременных импульсов (транзиентов), генерируемых в тонком поглощающем слое путем поглощения лазерного импульса. Составление и организация контакта тонких поглощающих слоев с кожей может являться связующим промежуточным звеном в конструкции благодаря большому разнообразию материалов с одинаковым волновым сопротивлением, при условии что толщина является достаточной, чтобы обеспечить необходимую жесткость устройства и достаточную толщину планарной акустической волны. Лазерные импульсы в ультрафиолетовом, видимом и инфракрасном спектрах, могут использоваться для электронного, электронно-колебательного или колебательного возбуждения.
Таким образом, указанные выше примеры не являются окончательными по отношению к материалам, которые также могут использоваться в целях данного изобретения, они являются всего лишь иллюстрацией принципов работы устройства. Соответственно, читатель должен сам определить перечень материалов, которые можно применять в данном изобретении, основываясь на прилагаемых пунктах изобретения и их легальных эквивалентов, а не на основании приведенных примеров.