СПОСОБ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
METHOD OF SEWAGE WATER PURIFICATION FROM PHENOL COMPOUNDS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимической очистке сточных вод от фенольных соединений.
Известен способ очистки сточных вод от фенолов экстракцией в присутствии углеводородов [А.С. СССР 806616, заявка 2357297 от 10.05.76], однако этот метод приводит к вторичному загрязнению сточных вод и имеет высокие показатели по остаточному фенолу.
Известен способ биологической очистки сточных вод от фенольных соединений с помощью ферментных препаратов, выделенных из гомогенатов растительных тканей [А.С. СССР 939407, заявка 2966341 от 09.06.80]. Недостатком этого метода является трудоемкость процесса приготовления ферментных препаратов путем промывки гомогената растительных тканей ацетоном или растиранием в фосфатном буфере.
Известен биологический способ очистки сточных вод от фенольных соединений с помощью ферментного препарата о-дифенилоксидазы, иммобилизованного на саже [А.С. СССР 914507, заявка 2966313 от 11.06.80], но он затрагивает лишь стадию биоокисления пирокатехина, являющегося метаболитом в промежуточном окислении фенола бактериальными штаммами.
Известен способ биохимической очистки сточных вод от фенолов грибами Botrytis cinerea и Phytoptora infestans [А.С. СССР 912684, заявка 2856399 от 20.12.79].
Известен способ биохимической очистки сточных вод от фенольных соединений при pH 6-8,5 в течение 1-3 суток с помощью дереворазрушающего гриба - белой гнили Polyporus versicolor [А.С. СССР 969684, заявка 3277087 от 20.04.81].
Известен способ биохимической очистки предварительно разбавленных сточных вод от органических соединений путем культивирования микроорганизмов-дрожжей рода Candida в условиях аэрации с последующим отделением микроорганизмов [А.С. СССР 975588, заявка 3006003 от 01.08.80].
Известно применение штамма Pseudomonas aeruginosa №228, разлагающего фенол [А.С. СССР №499227, заявка №203990 от 01.07.74].
Известен способ биохимической очистки сточных вод от фенолов 3-4-суточным инокулятом лигнилитического гриба Panus (Lentinus) tigrinus ВKМ F-3613D [Патент РФ 2345957, заявка 2007123842/13 от 25.06.2007].
Известен способ очистки сточных вод от фенольных соединений с использованием штамма бактерий Mycobacterium stegmalis ВKМ В-1205 [А.С. СССР 1597384, заявка 4368424 от 23.10.87].
Известен способ биохимической очистки сточных вод от фенолсодержащих соединений с применением штамма микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa XP-25 и в присутствии пространственно-затрудненных алкилфенолов, депонированного под номером ВКПМ В-8613 [патент РФ №2270807, заявка №2004110627 от 07.04.2004].
Вышеперечисленные способы очистки длительны по времени, трудоемки и обеспечивают невысокую степень очистки сточных вод от фенольных соединений, в частности от фенольных соединений, содержащихся в сульфидно-щелочных стоках нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов, имеющих повышенное содержание сульфид-ионов. Кроме того, отдельные выделенные штаммы являются условно-патогенными и токсичными.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ биохимической очистки сточных вод от фенолсодержащих соединений с применением штамма микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa XP-25, депонированного под номером ВКПМ В-8613 [патент РФ №2270805, заявка №2004110625 от 07.04.2004]. Однако известный штамм разлагает фенол в сточных водах производства фенольных антиоксидантов или аналогичных по составу, который резко отличается от состава сульфидно-щелочных стоков нефтехимического и нефтеперерабатывающего производств.
Задачей изобретения является повышение качества очистки сточных вод, в частности сульфидно-щелочных стоков нефтехимических и нефтеперерабатывающих заводов, с повышенным содержанием сульфид-ионов, от фенольных соединений, повышение безопасности при эксплуатации штамма, расширение арсенала штаммов микроорганизмов, применяемых для очистки сточных вод.
Поставленная задача решается за счет биохимической очистки сточных вод с помощью штамма Pseudomonas putida 131, предварительно выращенного на феноле и сорбированного на нефтяном прокаленном коксе. Штамм Pseudomonas putida 131 был выделен из фенолзагрязненных почв Нефтеперерабатывающего завода ОАО «Газпром нефтехим Салават» путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде и последующего отбора наиболее активных форм и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-10894.
Культура штамма Pseudomonas putida 131 эффективно утилизирует фенольные соединения в сточных водах, в том числе в сульфидно-щелочных стоках, в аэробных условиях, используя фенольные соединения в качестве источника углерода.
Морфологические признаки. Палочковидные клетки. Грамотрицательны.
Культуральные признаки. На мясопептонном агаре (МПА) и селективном агаре для бактерий рода Pseudomonas растет обильно. МПА имеет состав, г/л:
Отвар мяса
500 г свежего мяса,
отделенного от пленок
и жира/литр воды
Агар
20
Пептон
10
NaCl
5
На МПА формирует круглые колонии с ровными краями, кремового цвета, выпуклые с возвышением в центре, однородной консистенции, диаметром до 5 мм. На селективной среде для бактерий рода Pseudomonas образует колонии кремового цвета, блестящие, выпуклые, однородной консистенции, с ровными краями и ровной поверхностью, диаметром до 10 мм. Штамм хорошо растет в минеральной среде состава, приведенного в таблице 1.
Таблица 1
Состав минеральной среды для культивирования бактерий
Вещество
Содержание, г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,16
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,55
MgSO<sub>4</sub>
0,20
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
0,50
FeSO<sub>4</sub>
0,01
CaCl<sub>2</sub>
0,01
фенол
0,5
вода дистиллированная
до 1 л
При этом образуется желтый пигмент с зеленоватым оттенком.
Физиологические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 25÷30°C, отсутствие деструкции фенольных соединений при 15°C.
Биохимические признаки. Культура оксидазоположительна, утилизирует глюкозу, сорбит, маннит, инозит, обладает каталазной и аргининдегидрогеназной активностями, дает положительную реакцию на β-галактозидазу, не утилизирует цитрат, малонат, лактозу, сахарозу, не способна к декарбоксилированию лизина и орнитина, не образует индол и сероводород, не обладает уреазной активностью. Штамм не образует поли-β оксибутират, не способен к денитрификации.
При культивировании в минеральной среде состава, указанного в таблице 1, на шейкере со скоростью 180 об/мин и температуре 26°C штамм Pseudomonas putida 131 полностью деструктурирует фенол в концентрации 500 мг/л за 12 часов.
Культура может храниться на селективной среде для бактерий рода
Pseudomonas и МПА, при pH 7,0 при 4÷8°C 3 месяца.
Культивирование в лабораторных условиях. Для деструкции фенольных соединений культуру смывают с поверхности скошенной агаризованной среды в пробирке небольшим объемом 0,5÷1,0 мл стерильной водопроводной воды или 0,9%-ного раствора хлористого натрия и вводят в 3÷5 мл стерильного мясопептонного бульона следующего состава, г/л:
Отвар мяса
500 г свежего мяса, отделенного от пленок и жира/литр воды
Пептон
10
Nad
5
Выращивают в течение 12÷18 часов при температуре 25÷30°C. Полученной культурой заражают описанную выше минеральную среду, в которой при культивировании в колбах на качалках полная деструкция фенола проходит за 12 часов.
Штамм относится к группе невирулентных, нетоксигенных и нетоксичных согласно заключению Уфимского НИИ медицины труда и экологии человека Роспотребнадзора.
Способ заключается в следующем. Очищаемые сточные воды подают в биореактор, представляющий собой емкость колонного типа, заполненную иммобилизованным на нефтяной прокаленный кокс штаммом микроорганизмов Pseudomonas putida 131 - биофильтр 1. Для исключения уноса кокса предусмотрена установка сетки в нижней и верхней частях реактора. При прохождении загрязненной фенольными соединениями сточной воды, подаваемой сверху колонны, через реактор происходит деструкция фенольных соединений штаммом микроорганизмов, равномерно распределяющимся в объеме реактора, в присутствии кислорода воздуха, подаваемого через распределитель воздуха 2. Для сохранения активности штамма микроорганизмов в биореактор вносят биогенную добавку, предварительно растворенную в сточной воде. Газы, образовавшиеся в результате жизнедеятельности бактерий, выводятся сверху.
В частном случае сточные воды, подаваемые на очистку, содержат сульфид-ионы до 64,1 мг/л. В качестве биогенной добавки может быть использована ортофосфорная кислота или соли ортофосфорной кислоты.
Клетки штамма микроорганизмов иммобилизованы на нефтяной прокаленный кокс на основе тяжелой смолы пиролиза способом нанесения в воронке, который заключается в прокачивании (с рециклом) суспензии клеток через воронку, заполненную адсорбентом-носителем. Размер фракции кокса 5÷10 мм. Для иммобилизации адсорбент и суспензия клеток использовались в соотношении 800 мл носителя на 3 л суспензии клеток. Адсорбент предварительно промывался водой и стерилизовался при 1 атм. в течение 30 мин. Наиболее оптимальным значением pH для деструкции фенола иммобилизованным штаммом является значение 7÷8, поэтому сульфидно-щелочной сток предварительно нейтрализовали кислотой.
Способ поясняется чертежом, на котором изображен биореактор, представляющий собой емкость колонного типа, внутри которой расположены биофильтр 1 и распределитель воздуха 2.
Способ иллюстрируется примерами.
2
4
Пример 1. В образец №1 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават» (состав приведен в таблице 2), предварительно нейтрализованного серной кислотой до pH 7,5, с концентрацией фенольных соединений 300 мг/л, в качестве биогенной добавки вносили соль ортофосфорной кислоты KHPO в конечной концентрации 80 мг/л. Далее образец пропускали через биореактор, изображенный на чертеже, заполненный иммобилизованным на нефтяной прокаленный кокс штаммом микроорганизмов Pseudomonas putida 131, при барботаже воздухом с расходом 2 л/ч, в течение 4 часов. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Состав образца №1 до и после очистки
Показатели
Сульфидно-щелочной сток, мг/л
Исходный
Очищенный
pH
7,5
8,9
Массовая концентрация сульфид-ионов, мг/л
28,6
8,8
Массовая концентрация сульфат-ионов, мг/л
401,4
189,1
Массовая концентрация фенольных соединений, мг/л
300
0,8
Пример 2. Образец №2 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават» с содержанием сульфид-ионов 64,1 мг/л (состав приведен в таблице 3), предварительно нейтрализованный фосфорной кислотой, с концентрацией фенольных соединений 800 мг/л, пропускали через биореактор, как показано в примере 1, в течение 15 часов. Результаты приведены в таблице 3. Таким образом, показано осуществление изобретения в интервале содержания в сточных водах сульфид-ионов до 64,1 мг/л.
Таблица 3
Состав образца №2 до и после очистки
Показатели
Сульфидно-щелочной сток, мг/л
Исходный
Очищенный
pH
7,5
8,8
Массовая концентрация сульфид-ионов, мг/л
64,1
25,6
Массовая концентрация сульфат-ионов, мг/л
1843,7
544,8
Массовая концентрация фенольных соединений, мг/л
800
50
Пример 3. Образец №3 минеральной среды (состав приведен в таблице 4), с концентрацией фенольных соединений 300 мг/л, пропускали через биореактор, как показано в предыдущих примерах. Через 4 часа концентрация фенольных соединений составляет менее 50 мг/л.
Таблица 4
Состав минеральной среды, содержащей фенольные соединения
Вещество
Содержание, мг/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
160
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
550
MgSO<sub>4</sub>
200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
500
FeSO<sub>4</sub>
010
CaCl<sub>2</sub>
010
Фенольные соединения
300
2
4
2
4
2
4
Пример 4. В образцы сульфидно-щелочного стока, предварительно нейтрализованные соляной кислотой до pH 7,5, с содержанием фенольных соединений 500 мг/л, добавляли в качестве биогенной добавки соли соляной, серной и ортофосфорной кислот NaCl, NaSO, NaHPO, KHPO. Один образец нейтрализовали ортофосфорной кислотой и соль в него не добавляли. Очистку от фенольных соединений проводили, как показано в предыдущих примерах. Результаты приведены в таблице 5.
Таблица 5
Влияние различных солей на активность деструкции фенольных соединений с помощью штамма микроорганизмов Pseudomonas putida 131
Вид и количество соли, мг/л
Содержание фенольных соединений, мг/л
Через 12 ч
Через 18 ч
Через 24 ч
NaCl - 4650
354,0
142,2
0,5
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> - 1650
385,7
324,8
0,4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> - 650
0,3
0,3
0,2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> - 650
0,3
0,2
0,1
Образец нейтрализован ортофосфорной кислотой
100,0
0,3
0,3
2
4
Пример 5. Образец №5 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават» (состав приведен в таблице 6) разбавляли в 2 раза в конической колбе нестерильной водопроводной водой до конечного объема, равного 30%-ному объему колбы. Затем добавляли соль KHPO в конечной концентрации 300 мг/л и 10% по объему культуры штамма Pseudomonas putida 131, выращенной, как описано выше, на минеральной среде с фенолом. Затем бактерии культивировали на качалке 12 ч при температуре 25°C и скорости качания 180 об/мин. Результаты приведены в таблице 6.
Таблица 6
Пример деструкции фенольных соединений в сульфидно-щелочном стоке штаммом Pseudomonas putida 131
Показатели
Сульфидно-щелочной сток
Исходный
После деструкции
pH среды
7,5
8,9
Массовая концентрация сульфид-ионов, мг/л
29,8
9,6
Массовая концентрация фенольных соединений, мг/л
204,6
Отсутствие
2
4
Пример 6. Образец №6 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават», содержащего фенольные соединения в концентрации 1200 мг/л, разбавляли в два раза водопроводной водой и доводили значение pH до 7,5 концентрированной серной кислотой. Затем вносили соль NaSO так, что конечная ее концентрация составляла 4650 мг/л (в пересчете на сульфат-ион 3143 мг/л), а общая минерализация - 5400 мг/л. Бактерии штамма Pseudomonas putida 131 культивировали на качалках, как описано в примере 5. Результаты приведены в таблице 7.
Таблица 7
Деструкция фенольных соединений бактериями Pseudomonas putida 131 в сульфидно-щелочном стоке с высоким содержанием сульфат-ионов
Вариант
Содержание фенольных соединений, мг/л, через
12 часов
18 часов
24 часа
Pseudomonas putida 131
459,0
437,8
0,6
Без бактерий
598,7
563,9
524,8
Пример 7. Для примера деструкции фенольных соединений использовалась минеральная среда состава, указанного в таблице 8. Бактерии штамма Pseudomonas putida 131 культивировали на качалках, как описано в примере 5. После 40 часов культивирования на минеральной среде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии фенольные соединения не определялись.
Таблица 8
Состав минеральной среды, содержащей фенольные соединения
Вещество
Содержание, мг/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
160
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
550
MgSO<sub>4</sub>
200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
500
FeSO<sub>4</sub>
010
CaCl<sub>2</sub>
010
Фенол
352
П-крезол
029
O-крезол
017
Вода дистиллированная
до 1 л
Эффективная деструкция фенольных соединений в различных средах говорит о возможности быстрой адаптации штамма к изменяющимся условиям среды, т.е. подтверждает высокую адаптационную способность штамма Pseudomonas putida 131.
Определение содержания фенольных соединений проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Таким образом, использование штамма Pseudomonas putida 131 обеспечивает повышение качества очистки сточных вод от фенольных соединений. Очищенные с помощью штамма сточные воды могут быть использованы для дальнейшей очистки с бытовыми сточными водами.