СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ БОДЯКА ПОЛЕВОГО
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE AMOUNT OF FLAVONOIDS IN THE HERB OF THE WILD THISTLE

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве бодяка полевого (Cirsium arvense L.).
Существующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ [Современные подходы к вопросу стандартизации лекарственного растительного сырья / А.Н. Миронов, И.В. Сакаева, Е.И. Саканян и [др.] // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. - 2013, №2. - С. 52-55.].
Бодяк полевой (Cirsium arvense L.) является одним из видов растений, не включенных в Государственную Фармакопею Российской Федерации XIV издания, но широко используемый в народной медицине [Государственная фармакопея Российской Федерации XIV изд. [Электронный ресурс] // Федеральная электронная медицинская библиотека, 2018. - Режим доступа: http://www.femb.ru., Кароматов, И.Д. Использование сорного растения Осот огородный в лечебных целях / И.Д. Кароматов, А.Т. Абдувохидов // Биология и интегративная медицина. 2017. №5. С. 57-62]. В литературе описано его применение в народной медицине при лечении различных заболеваний как противовоспалительное, противоязвенное, антиоксидантное, антибактериальное, противоопухолевое, тонизирующее, потогонное средство, его используют при лечении подагры, ревматизма, неврозах, эпилепсии, болезнях пищеварительной системы, наружно при кожных заболеваниях [Губанов, И.А. Иллюстрированный определитель растений Средней России. Т. 2. Покрытосеменные. / И.А. Губанов, К.В. Киселева, B.C. Новиков, В.Н. Тихомиров // - М.: Изд-во КМК, Институт технологических исследований, 2003. - 672 с, илл., Жирова, О.С. Род Cirsium Hill - Бодяк // Флора Сибири: Asteraceae. - Новосибирск: Наука, 1997. - Т. 13. - С. 213-222, Кароматов, И.Д. Использование сорного растения Осот огородный в лечебных целях / И.Д. Кароматов, А.Т. Абдувохидов // Биология и интегративная медицина. 2017. №5. С. 57-62]. Недостаточные сведения о химическом составе, отсутствие нормативной документации на сырье бодяка полевого ограничивают его применение в официнальной медицине. Нерешенным остается вопрос стандартизации данного вида сырья.
Наиболее близким аналогом изобретения является метод количественного определения флавоноида линарина в сырье бодяка полевого спектро фотометрическим методом после длительной экстракции (48 час) в аппарате Сокслета спиртом этиловым 70%, затем упариванием спиртового экстракта досуха, растворением его в диметилформамиде (2 час), хроматографированием этого извлечения в системе метанол-этилацетат-вода (5:2:1), элюированием линарина с хроматограммы смесью диоксан-вода (1:1) (12 час) и определением оптической плотности раствора при длине волны 334 нм [Рендюк, Т. Д. Изучение растений рода бодяк, как источников получения линарина и акацетина: Дис.канд. фармац. наук - М., 1978. - 113 л.: илл, табл. л. 91-103]. Однако, на наш взгляд, затруднение в количественном определении линарина заключается не только в плохой растворимости самого гликозида, но и в том, что методика достаточно сложная и трудно воспроизводимая.
Задачей изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в траве бодяка полевого, обладающего высокой специфичностью, точностью и воспроизводимостью.
Техническим результатом при использовании изобретения является повышение точности и упрощение способа.
Предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в траве бодяка полевого осуществляется следующим образом. Предварительно получают водно-спиртовое извлечение из растительного сырья путем экстракции 1 г точной навески измельченного до размера частиц 2 мм травы бодяка полевого 40%-ным спиртом этиловым, при соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30, трехкратно по 30 минут. Затем к водно-спиртовому извлечению добавляют 2% спиртовой раствор алюминия хлорида в количестве 1 мл для комплексовбразования, взаимодействие проводят в течение 45 минут. Количественное определение флавоноидов проводят методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием стандартного образца апигенина с алюминия хлоридом при длине волны 389 нм в пересчете на апигенин и абсолютно сухое сырье по формуле:
где:
X - содержание суммы флавоноидов в траве бодяка полевого в пересчете на апигенин и абсолютно сухое сырье, %;
А - оптическая плотность анализируемого раствора;
0
А - оптическая плотность комплекса стандартного образца апигенина с алюминия хлоридом;
а - навеска сырья, г;
0
а - навеска стандартного образца апигенина, г;
W - потеря в массе сырья при высушивании, %.
max
max
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно апигенин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения в траве бодяка полевого. Было установлено, что спектр поглощения травы бодяка полевого имеет близкий максимум к спектру апигенина (λ=389 нм), поэтому этот флавоноид был выбран в качестве основного в сумме, на который в дальнейшем предлагается вести пересчет. На фигуре 1 представлены дифференциальные спектры поглощения, где кривая 1 - стандартное вещество апигенин, кривая 2 -извлечения из травы бодяка полевого с добавлением раствора алюминия хлорида (λ=389 нм).
Данный факт позволяет проводить количественное определение суммы флавоноидов в траве бодяка полевого методом дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 389 нм.
Также нами были изучены условия экстракции флавоноидов, обеспечивающих максимальный их выход из сырья бодяка полевого, а именно: концентрация экстрагента, измельченность сырья, так как размер частиц сырья влияет на полноту и скорость перехода в раствор исследуемых веществ, соотношение сырья и экстрагента, время и кратность экстракции.
При сравнительной оценке влияния экстрагента на выход флавоноидов был использован спирт этиловый различной концентрации. В таблице 1 представлена зависимость выхода суммы флавоноидов травы бодяка полевого от концентрации экстрагента. В ходе проведения эксперимента установлено, что оптимальным экстрагентом, при использовании которого наблюдались более высокие показатели содержания флавоноидов, является спирт этиловый 40%, который и был выбран для дальнейших исследований.
В таблице 2 представлены результаты исследований по выбору степени измельченности сырья, времени экстракции, соотношения сырья и экстрагента, кратности экстракции. Нами установлено, что оптимальной является измельченность сырья до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, время экстракции, при котором происходит максимальное извлечение флавоноидов, - 30 минут, соотношение сырья и экстрагента - 1:30 и трехкратная экстракция обеспечивают наиболее полное извлечение флавоноидов из сырья бодяка полевого.
Также нами определены оптимальные параметры влияния комплексообразователя на концентрацию флавоноидов, были изучены концентрация спиртового раствора алюминия хлорида и его количество, добавляемое к извлечению. Результаты исследований представлены в таблице 3. Установлено, что наиболее оптимальным является использование 2% раствора алюминия хлорида в количестве 1 мл, реакция комплексообразования развивается в течение 45 минут и комплекс остается стабильным в течение часа.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Около 1 г (точная навеска) сырья помещают в колбу термостойкого стекла со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 30 мл 40% спирта этилового, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем полученное извлечение осторожно фильтруют через вату в мерную колбу на 100 мл, избегая попадания частиц сырья в воронку. К оставшемуся в колбе сырью прибавляют 30 мл 40% спирта этилового и вату, через которую фильтровали, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане еще 30 минут. Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу с первой порцией извлечения через вату. Процесс повторяют еще один раз по вышеизложенной схеме. Полученное извлечение доводят в мерной колбе до 100 мл этим же растворителем (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют 1 мл 2% спиртового раствора хлорида алюминия и доводят раствор до метки 95% этиловым спиртом (раствор В). Через 45 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 389 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А, 1 мл 3% кислоты уксусной, доведенный 95% этиловым спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность комплекса раствора стандартного образца апигенина с раствором алюминия хлорида: к 1 мл 0,05%) раствора апигенина прибавляют 1 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят раствор этиловым спиртом 95% до 25 мл в мерной колбе. Измерения проводят аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов (X) в пересчете на апигенин и абсолютно сухое сырье (в %) вычисляют по формуле:
где:
X - содержание суммы флавоноидов в траве бодяка полевого в пересчете на апигенин и абсолютно сухое сырье, %;
А - оптическая плотность анализируемого раствора (раствор В);
0
А - оптическая плотность комплекса стандартного образца апигенина с алюминия хлоридом;
а - навеска сырья, г;
0
а - навеска стандартного образца апигенина, г;
W - потеря в массе сырья при высушивании, %>.
Предлагаемый способ поясняется следующим примером.
Аналитическую пробу сырья бодяка полевого (заготовленного в Республике Башкортостан, 2019 г.) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Около 0,9990 г (точная навеска) сырья помещают в колбу термостойкого стекла со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 30 мл 40% спирта этилового, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем полученное извлечение осторожно фильтруют через вату в мерную колбу на 100 мл, избегая попадания частиц сырья в воронку. К оставшемуся в колбе сырью прибавляют 30 мл 40% спирта этилового и вату, через которую фильтровали, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане еще 30 минут. Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу с первой порцией извлечения через вату. Процесс повторяют еще один раз по вышеизложенной схеме. Полученное извлечение доводят в мерной колбе до 100 мл этим же растворителем (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют 1 мл 2% спиртового раствора хлорида алюминия и доводят раствор до метки 95% этиловым спиртом (раствор В). Через 45 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 389 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А, 1 мл 3% кислоты уксусной, доведенный 95% этиловым спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность комплекса раствора стандартного образца апигенина с раствором алюминия хлорида: к 1 мл 0,05%) раствора апигенина прибавляют 1 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят раствор этиловым спиртом 95% до 25 мл в мерной колбе. Измерения проводят аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы флавоноидов (X) в пересчете на апигенин и абсолютно сухое сырье (в %) вычисляют по формуле:
где:
0,415 - оптическая плотность анализируемого раствора (раствор В);
0,799 - оптическая плотность комплекса стандартного образца апигенина с алюминия хлоридом;
0,9990 - навеска сырья в граммах;
0,05 - навеска стандартного образца апигенина в граммах;
7,6 - потеря в массе сырья при высушивании, %.
Х=2,88%.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±3,13%, что не превышает предельно допустимых значений.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в траве бодяка полевого методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием стандартного образца апигенина разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья трехкратно 40% этиловым спиртом, позволяющим исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для травы бодяка полевого вещество - апигенин, определяющее характер кривой поглощения в УФ - спектре испытуемого раствора (длина волны 389 нм).
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±3,13%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.
4. Разработанный способ позволяет исключить пробоподготовку, заключающуюся в обработке экстракта токсическими растворителями.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа травы бодяка полевого (Cirsium arvense L.).