СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАЛИЧИЯ МУТАЦИИ ГЕНА COL4A5 У ПАЦИЕНТОВ С ПРЕДПОЛАГАЕМЫМ ДИАГНОЗОМ "СИНДРОМ АЛЬПОРТА"
METHOD FOR PREDICTING EXISTENCE OF COL4A5 GENE MUTATION IN PATIENTS PRESUMPTIVELY DIAGNOSED WITH ALPORT SYNDROME

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, и может найти применение в диагностике синдрома Альпорта (СА).
СА (согласно Международной классификации болезней 10-го пересмотра МКБ-10: другие уточненные синдромы врожденных аномалий, не классифицированные в других рубриках: Q87.8), также в литературе называемый наследственным нефритом, имеет в нашей стране распространенность около 1 случая на 6 тысяч жителей [Тареева И.Е. Нефрология: руководство для врачей. // Москва: Медицина. - 2000. - 688 с]. Развивается вследствие нарушения структуры базальной мембраны клубочков (БМК), связанного с дефектом сборки или отсутствием протомеров альфа-цепей коллагена IV типа. Данное нарушение приводит к изменению проницаемости гломерулярного фильтра, вследствие чего развивается гематурия, протеинурия и другие симптомы, характерные для наследственного нефрита [Abrahamson D.R. Steps on the Alport path to proteinuria // Kidney Int. - 2016. - №2 (90). - C. 242-244; Kashtan C. Alport syndrome: facts and opinions // F1000 Research. - 2017. - №6. - C. 50.].
Согласно современным диагностическим рекомендациям [Savige J. и др. Expert guidelines for the management of Alport syndrome and thin basement membrane nephropathy // J. Am. Soc. Nephrol. JASN. - 2013. - №3 (24). - C. 364-375.], диагноз СА высоковероятен при наличии стойкой гломерулярной гематурии в сочетании с двусторонней нейросенсорной тугоухостью, характерными нарушениями зрения (помутнение роговицы, передний лентиконус, катаракта, центральная перимакулярная и периферическая ретинопатии, сопровождающиеся пятнами, истончение сетчатки с височной стороны; редко - задняя полиморфная дистрофия роговицы, макулярное отверстие или макулопатия) или семейным анамнезом. Наличие у пациента стойкой гломерулярной гематурии с раннего возраста при отсутствии других диагностических критериев СА не позволяет исключить данное заболевание и требует наблюдения за пациентом с определением динамики СКФ и протеинурии. В случае снижения СКФ и/или нарастания протеинурии у пациента, вероятно наличие СА. Подтверждение диагноза может быть проведено при помощи электронной микроскопии нефробиоптата, однако данный метод является инвазивным и имеет ограниченную чувствительность, особенно в детском возрасте. В связи с развитием в последние годы и активным внедрением в диагностическую практику методов высокопроизводительного секвенирования, стал доступен другой способ подтверждения СА - генетический, являющийся малоинвазивным и обеспечивающий возможность верификации диагноза в любом возрасте [Savige J. и др. Expert guidelines for the management of Alport syndrome and thin basement membrane nephropathy // J. Am. Soc. Nephrol. JASN. - 2013. - №3 (24). - C. 364-375.]. Метод может быть основан на секвенировании экзома пациента, либо на секвенировании панели генов [Shagam L.I., Polyakova A.V., Shentseva D.V. et al. Targeted sequencing of COL4A3, COL4A4 and COL4A5 coding exons as a direct approach to Alport syndrome diagnostics // European Journal of Human genetics. - 2014. - 22 supplement 1].
При этом полное генетическое исследование, а именно секвенирование генов COL4A3, COL4A4 и COL4A5, требует значительных трудозатрат и финансовых ресурсов. Мы выявили в российской популяции частую мутацию гена COL4A5 с. 1871G>А, p. (Gly624Asp) (нумерация нуклеотидов соответствует транскриптам NM_000495.4 и NM_033380.2), также характерную для некоторых других популяций Европы [Demosthenous Р. и др. X-linked Alport syndrome in Hellenic families: phenotypic heterogeneity and mutations near interruptions of the collagen domain in COL4A5 // Clin. Genet. - 2012. - №3 (81). - C. 240-248;  G. и др. Efficient Targeted Next Generation Sequencing-Based Workflow for Differential Diagnosis of Alport-Related Disorders // PLOS ONE / ed. Brusgaard K. - 2016. - №3 (11). - C. e0149241; Slajpah M. и др. Sixteen novel mutations identified in COL4A3, COL4A4, and COL4A5 genes in Slovenian families with Alport syndrome and benign familial hematuria // Kidney Int. - 2007. - №12 (71). - C. 1287-1295]. Данная мутация может быть выявлена методом, требующим значительно меньше финансовых и временных затрат, таким, как ПЦР в реальном времени, ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ), секвенирование по Сэнгеру двадцать пятого экзона гена COL4A5, мультиплексная лигазозависимая амплификация (MLPA) и другие [патент США PCT/US1991/004051 «Способ и зонды для выявления синдрома Альпорта»; Martin Р. и др. High mutation detection rate in the COL4A5 collagen gene in suspected Alport syndrome using PCR and direct DNA sequencing // J. Am. Soc. Nephrol. JASN. - 1998. - №12 (9). - C. 2291-2301].
Прототипом исследования является методика [Slajpah М. и др. Sixteen novel mutations identified in COL4A3, COL4A4, and COL4A5 genes in Slovenian families with Alport syndrome and benign familial hematuria // Kidney Int. - 2007. - №12 (71). - C. 1287-1295], где авторы описывают способ генетического подтверждения СА с использованием метода ПЦР и анализа однонитевого конформационного полиморфизма (англ. SSCP), и выявление данной мутации в 6 семьях, пяти из которых авторы, в связи с легкостью течения заболевания, поставили диагноз «доброкачественная семейная гематурия», а не СА. Из таблицы 1а, приведенной в работе, ясно, что у пациентов в 5 семьях из 6 не было выявлено протеинурии.
Недостатком данного способа выявления мутаций при СА является его низкая эффективность и чувствительность в сравнении с секвенированием. Недостатком данного способа прогнозирования наличия частой мутации является отсутствие выявления достоверной связи наличия данной мутации с возрастом манифестации гематурии, а также отсутствие описания возможности прогнозирования ее наличия исходя из клинико-лабораторных признаков (включая наличие протеинурии). Кроме того, были проанализированы в основном взрослые пациенты (возраст пациентов 14-47 лет, средний 26 лет), в статье не говорится о наличии у них протеинурии в детском и подростковом возрасте.
Известен также «Способ и зонды для выявления синдрома Альпорта» (патент США PCT/US1991/004051), полученный в 1991 году был как первый патент на генетическую диагностику СА методом детекции мутаций в гене COL4A5.
Недостатком данного способа являются высокие финансовые и временные затраты на проведение теста. Данный метод не позволяет прогнозировать наличие частой в российской популяции мутации исходя из клинико-лабораторных признаков.
Известен также аналог патента - способ анализа в российской популяции ранее описанных в литературе мутаций, связанных с Х-сцепленным синдромом Альпорта [Тверская СМ. Молекулярно-генетическое исследование синдрома Альпорта: дисс. канд. мед. наук, Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, 1995].
Недостатком данного способа является то, что среди проверяемых мутаций не было частой мутации COL4A5 с. 1871G>А, p. (Gly624Asp). Кроме того, автор не нашел в российской популяции ни одной из выбранных им мутаций, описанных в литературе на тот момент, для которых был разработан метод ПЦР-ПДРФ.
Известен также аналог патента - способ секвенирования экзонов и промоторной области гена COL4A5 [Martin Р. и др. High mutation detection rate in the COL4A5 collagen gene in suspected Alport syndrome using PCR and direct DNA sequencing // J. Am. Soc. Nephrol. JASN. - 1998. - №12 (9). - C. 2291-2301] методом Сэнгера. Авторами данного способа вариант нуклеотидной последовательности COL4A5 c. 1871G>A, p. (Gly624Asp) был впервые описан в выборке пациентов из Дании, Германии, Исландии, Швеции и США.
Недостатком данного способа является то, что в данной работе не приведено описание клинической картины заболевания у его носителя, в связи с чем скрининговое определение частой мутации невозможно. Кроме того, недостатком данного способа является высокая стоимость и времязатратность.
Известен также аналог патента - способ прогнозирования наличия частой мутации на основе позднего возраста развития терминальной стадии хронической почечной недостаточности (тХПН) у мужчин и в целом более мягкого течения заболевания. [Demosthenous Р. и др. X-linked Alport syndrome in Hellenic families: phenotypic heterogeneity and mutations near interruptions of the collagen domain in COL4A5 // Clin. Genet. - 2012. - №3 (81). - C. 240-248].
Недостатком данного способа является то, что представлены данные только по 2 семьям из Греции и Кипра. Авторы не изучали отличия возраста манифестации гематурии, а также наличия протеинурии у носителей частой мутации в сравнении с носителями прочих вариантов нуклеотидной последовательности. Кроме того, прогнозирование наличия мутации по возрасту развития тХПН возможно только в позднем возрасте, тогда как диагностика СА наиболее актуальна в детском и подростковом возрасте.
Задачей изобретения является прогнозирование наличия патогенного варианта нуклеотидной последовательности COL4A5 c. 1871G>A, p. (Gly624Asp) исходя из клинико-лабораторных признаков до проведения генетического исследования с целью рекомендовать определенной группе пациентов, выявляемой в процессе скрининга, проведение исследование на данную точечную мутацию.
Предлагаемый способ прогнозирования наличия частой мутации может быть использован для пациентов из российской популяции с вероятным или высоковероятным диагнозом СА (см. выше) со следующими клиническими признаками СА: наличием стойкой гломерулярной гематурии в сочетании с семейным анамнезом СА, либо семейным анамнезом гематурии, не связанной с иным выявленным заболеванием. При этом паттерн наследования в семье должен соответствовать Х-сцепленному: у мужчин заболевание протекает тяжелее, чем у женщин; нет передачи от отца к сыну.
Предлагаемый способ прогнозирования наличия частой мутации основан на следующих клинико-лабораторных признаках: возраст манифестации гематурии и наличие протеинурии (а именно, количества белка в моче более 100 мг/сут).
На выборке из 44 пациентов возраста 1-17 лет (средний 12 лет±3,7) с генетически подтвержденным диагнозом СА Х-сцепленного типа наследования, мутация COL4A5 c. 1871G>A, p. (Gly624Asp) была выявлена у 7 человек (16%). Мутация выявлена у пациентов из различных регионов европейской части России: Московская (3 чел), Нижегородская, Калужская и Липецкая области, а также республика Мордовия. При этом среди 5 пациентов с возрастом манифестации гематурии не ранее 49 месяцев и без протеинурии у всех (100%, 95% ДИ 48-100%) была выявлена данная мутация, среди 3 пациентов с возрастом манифестации гематурии не ранее 49 месяцев с протеинурией данная мутация была выявлена только у 1 пациента, при этом она сочеталась с другим вероятно патогенным вариантом нуклеотидной последовательности COL4A3 c. 3247G>C, p. (Gly1083Arg) (вероятность наличия мутации 33%, 95% ДИ 9-71%). Среди 11 пациентов с возрастом манифестации гематурии до 48 месяцев и без протеинурии мутация COL4A5 c. 1871G>A, p. (Gly624Asp) была выявлена у 1 человека (вероятность наличия мутации 9%, 95% ДИ 2-28%). Среди 23 пациентов с возрастом манифестации гематурии до 48 месяцев и с протеинурией мутация COL4A5 c. 1871G>A, p. (Gly624Asp) не была выявлена ни у одного испытуемого (0%; 95% ДИ 0-15%). При этом для двух пациентов возраст манифестации гематурии известен не был, носителей частой мутации среди них нет.
На основании полученных результатов, мы рекомендуем пациентам с возрастом выявления гематурии от 49 месяцев и без протеинурии (либо с возрастом выявления протеинурии не ранее 18 лет) для генетического подтверждения СА в качестве первого теста проводить анализ частой мутации COL4A5 c. 1871G>A, p. (Gly624Asp).
Пациентам с возрастом манифестации гематурии не позднее 48 месяцев с протеинурией (возраст манифестации до 18 лет) не рекомендуем проведение теста на частую мутацию.
Пациентам с возрастом манифестации гематурии не позднее 48 месяцев без протеинурии (либо с возрастом выявления протеинурии не ранее 18 лет), а также пациентам с возрастом выявления гематурии от 49 месяцев с протеинурией (возраст манифестации до 18 лет) также рекомендуем по возможности пройти тест на частую мутацию, исходя из того, что ее наличие не исключается.