ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ КОСТНЫХ МЕТАСТАЗОВ ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОЙ ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОЙ КАРЦИНОМЕ
SELECTIVE DETECTION OF BONE METASTASES IN CLEAR CELL RENAL CELL ADENOCARCINOMA

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к выявлению костных метастазов при почечно-клеточной карциноме (RCC) и к подходящим для этого реагентам.
Уровень техники
Почечно-клеточная карцинома (RCC) является наиболее распространенным типом рака почек, составляя от 80% до 90% всех случаев. Встречаемость почечно-клеточной карциномы неуклонно возрастает. По оценкам, в 2009 г. в США возникло примерно 57760 новых случаев почечно-клеточной карциномы (RCC) при ожидаемой смертности в 12980 (СА Cancer J. Clin. 2009, 59:225-249).
Первоначальная диагностика RCC обычно проводится с помощью ультразвука, СТ или MRI. Большинство случаев (50-70%) обнаруживается в виде случайных почечных масс при единовременной процедуре интраскопии, проводящейся в других целях. В настоящее время признанным лучшим лечением в такой ситуации является хирургическое удаление почечной опухоли. При обследовании почти 20% почечных масс находятся на стадии IV, а еще 20% считаются "локально прогрессирующими" по современным критериям интраскопии.
Почечная масса с подозрением на RCC в конечном счете оказывается доброкачественной примерно в 20% случаев. Из злокачественных опухолей почек примерно 15-20% всех случаев представляют вялотекущие или менее агрессивные формы, чаще всего с несветлоклеточной гистологией типа хромофобных или сосковидных клеток, тогда как 75-85% случаев представляют светлоклеточную форму почечно-клеточной карциномы (ccRCC). Светлоклеточная почечно-клеточная карцинома является агрессивным фенотипом и обычно ассоциируется с худшим клиническим прогнозом, чем другие формы RCC. Около 90% пациентов, у которых обнаруживаются или позднее развиваются метастазы от рака почек, имеют светлоклеточную карциному.
Прогноз и лечение при метастазирующей RCC значительно хуже (примерно 12-24 мес.), чем при локализованном заболевании, поддающемся полному хирургическому удалению. Поэтому важно как можно раньше установить распространение отдаленных метастазов, чтобы обеспечить оптимальное лечение для этой стадии RCC.
Моноклональное антитело G250, как было показано в исследованиях на животных и человеке, связывается со светлоклеточной почечно-клеточной карциномой. Антигенной мишенью для G250 является эпитоп карбоангидразы IX. Методами иммуногистологии карбоангидраза (CA-IX) IX обнаруживается у более чем 94% светлоклеточных карцином почек. Была создана химерная форма антитела (обозначенная cG250), которая менее иммуногенна и применима для клинического применения при диагностике и терапии на людях. Интригующей чертой этого антитела является его исключительная авидность к почечно-клеточным карциномам, причем исследования на основе биопсии показали, что накопление его в опухолях достигает 0-1%/г, а это наибольшая авидность, зарегистрированная для любых солидных опухолей. G250 в его мышиной и химерной форме широко применялось в качестве потенциального терапевтического средства, само по себе или конъюгированное с радиоактивным изотопом.
Таргетирование и сродство G250 к светлоклеточной карциноме почек пробудило интерес к его разработке в качестве диагностического маркера для предсказания a priori этого обычно агрессивного фенотипа.
124
124
I24
Недавно появилось сообщение о проведении РЕТ-томографии с использованием I-меченного cG250. Исследовали в общей сложности 26 пациентов с почечными массами методом РЕТ/СТ-томографии с помощью I-cG250 до операции. Чувствительность I-cG250-PET в отношении светлоклеточной карциномы почек в данном испытании составляла 94%; отрицательная прогностическая достоверность составляла 90%; а специфичность и положительная прогностическая достоверность составляли 100%. Не сообщалось ни о каких связанных с препаратом ранних или отдаленных неблагоприятных эффектах в данном испытании (Divgi et al., Lancet Oncol. 8 (2007) 304-310). Кроме того, в исследовании описана визуализация метастаза в легких и метастаза в лимфатическом узле у двух пациентов. Метастазы в костях не отмечены.
Однако выявление костных метастаз имеет большое значение, так как большое число больных RCC уже имеют метастазы, когда заболевание у них только отмечено и/или диагностировано (прибл. 30%), из которых примерно 22-32% представляют костные метастазы.
В настоящее время так называемое ядерное сканирование костей применяется для диагностики или при диагностике целого ряда заболеваний, связанных с костями. Сканирование костей представляет собой метод ядерного сканирования, при котором пациенту вводится небольшое количество радиоактивного материала, такого, к примеру, как технеций-99m, а затем его сканируют при помощи устройства, чувствительного к радиации, испускаемой введенным материалом. Чем более активен метаболизм в костях, тем больше радиоактивности локализуется в костях. Некоторые опухоли или метастазы проявляются как участки с усиленным захватом вследствие роста или разрушения костей. Однако не все опухоли можно легко увидеть при сканировании костей. К тому же доброкачественные заболевания, как-то старые переломы или другие повреждения костей, артриты и инфекции могут проявляться как "положительные" при сканировании костей и требуют дальнейшего исследования, чтобы отличить их от истинно злокачественных раковых клеток почек. Таким образом, специфичность этого метода выявления костных метастазов является субоптимальной. Излишне говорить, что этот метод представляет дополнительное воздействие радиации, затраты и тревоги для пациента.
Раннее и специфическое выявление костных метастазов позволяет принимать соответствующие терапевтические контрмеры, такие как хирургическое удаление, фокальная радиотерапия или системное медицинское лечение. Более того, подтверждение вовлечения костей может полностью изменить терапевтическую стратегию, делая хирургическое вмешательство ненужным или неуместным.
Таким образом, имеется большая потребность в обеспечении чувствительного и надежного способа выявления костных метастазов при RCC.
Раскрытие изобретения
124
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что I-меченные антитела являются полезным и очень специфическим реагентом для выявления костных метастаз.
124
Так, один аспект настоящего изобретения касается способа выявления костных метастазов при почечно-клеточной карциноме (RCC), особенно при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме (ccRCC), который включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества I-меченного антитела против CA-IX или его антигенсвязывающего фрагмента и определение радиации у данного субъекта, напр., методом РЕТ-томографии данного субъекта.
124
Другой аспект настоящего изобретения касается применения I-меченных антител или их антигенсвязывающих фрагментов против карбоангидразы IX для выявления костных метастаз при почечно-клеточной карциноме (RCC), в частности при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме (ccRCC).
124
Согласно настоящему изобретению применяются I-меченные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Эти антитела или фрагменты антител направлены против CA-IX, в частности против CA-IX человека. Антитела против карбоангидразы IX и получение таких антител описано, к примеру, в WO 93/18152, содержание которого включено в описание путем ссылки.
В особенно предпочтительном воплощении антителом является моноклональное антитело G250, в частности химерное антитело G250 или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело G250, его антигенсвязывающие участки и клетки гибридомы, способные вырабатывать это антитело, описаны в WO 02/062972, содержание которого включено в описание путем ссылки. Клетки гибридомы, способные вырабатывать антитело G250, в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов были депонированы 11 сентября 2001 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Германия) под номером доступа DSM ACC 2526.
Согласно изобретению термин "антитело G250" охватывает любые антитела, включая мультиспецифичные антитела (напр., биспецифичные антитела) и фрагменты антител, если только они проявляют нужную активность, а именно содержат, по меньшей мере, один антигенсвязывающий участок G250. Антитело может представлять собой IgM, IgG (напр., IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgD, IgA или IgE, в особенности антитело IgG, рекомбинантное антитело или фрагмент антитела, полученный протеолитическими методами или методами рекомбинантной ДНК.
Термин "моноклональное антитело" в настоящем изобретении обозначает антитело, полученное из популяции практически однородных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций природного происхождения, которые могут присутствовать в небольших количествах.
Термин "антитело" в настоящем изобретении обозначает любые полипептиды, содержащие, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт G250, т.е., по меньшей мере, один участок CDR3 в тяжелой цепи G250 и/или участок CDR3 в легкой цепи G250 или вариант участка CDR3 G250, идентичный, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90% исходному участку CDR3 G250 на аминокислотном уровне, при условии, что вариант участка CDR3 обладает эквивалентными характеристиками связывания антигена, в частности сродством и специфичностью, по сравнению с исходным участком CDR3. Участки CDR3 G250 раскрыты в WO 02/062972.
Предпочтительно термин "антитело" охватывает химерные антитела, гуманизированные и полностью гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела, напр., sFv-фрагменты антител, фрагменты типа диател, протеолитические или рекомбинантные фрагменты антител, как-то Fv-, Fab-, Fab'- или F(аb')2-фрагменты или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител. Антитело также может быть слитым или конъюгированным с другими молекулами.
Антитела специфически включают химерные антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи, включая антигенсвязывающий сайт, идентична или гомологична соответствующим последовательностям, полученным из первоначальной линии клеток гибридомы G250, тогда как остальные части цепей идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям, происходящим из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если только они проявляют нужную биологическую активность. Более предпочтительно химерные антитела содержат вариабельные участки, напр., участки, определяющие комплементарность (CDR), и каркасные участки из тяжелой цепи и легкой цепи исходного моноклонального антитела G250 и константные последовательности человека, в частности константные последовательности легкой каппа-цепи человека и тяжелой гамма-цепи. Получение химерных антител описано, напр., в Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851-6855), включенном в описание путем ссылки.
Далее, антитела специфически включают гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела. Гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты, которые содержат минимальную последовательность из иммуноглобулина не человека. В частности, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из CDR данного антитела человека заменены остатками из CDR G250, в частности участка CDR1, 2 и/или 3 тяжелой и/или легкой цепи. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе человека, ни в импортированных последовательностях CDR G250. Эти модификации делаются для дальнейшего улучшения и оптимизации характеристик антитела. В общем, гуманизированное или полностью человеческое антитело должно содержать почти все из, по меньшей мере, 1 и обычно 2 вариабельных доменов, в которых все или почти все участки CDR соответствуют таковым у исходного иммуноглобулина G250 и все или почти все каркасные участки и константные области соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Получение гуманизированных антител описано, напр., в Jones et al. (Nature 321 (1986), 522-525); Riechmann et al. (Nature 332 (1988), 323-329); и Presta (Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 332-339), включенных в описание путем ссылки.
H
L
H
L
Далее, антитела специфически включают одноцепочечные антитела типа одноцепочечных Fv-фрагментов антител, содержащих домены V и V антител, причем эти домены присутствуют в одиночной полипептидной цепи. В общем, Fv-полипептиды дополнительно содержат полипептидный линкер между доменами V и V, который способствует образованию требуемой для связывания антигена структуры sFv. Получение sFv-антител описано, напр., Pliickthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore, Eds., Springer Verlag, NY, pp.269-315 (1994); Barbas III (Methods: Companion Methods Enzymol. 2 (1991), 119); и Hoogenboom et al. (Immunol. Rev. 130 (1992), 41-68), которые включены в описание путем ссылки.
Далее, антитела специфически включают диатела, т.е. небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи в одной и той же полипептидной цепи. При использовании линкера, слишком короткого для спаривания между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Получение диател описано, напр., Hollinger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6444-6448), включенном в описание путем ссылки.
124
В соответствии с настоящим изобретением антитела подвергаются конъюгированию, напр., путем ковалентного присоединения радиоактивного изотопа I. Этот изотоп является излучателем позитронов и может быть присоединен к антителам, напр., как описано Larsson et al. (J. Nucl. Med. 33 (1992), 2020-2023) или в US 5,185,142, содержание которых включено в описание путем ссылки.
Предпочтительно радиомечение антител осуществляется путем ковалентного йодирования, в особенности с помощью реагента lodogen Reagent (1,3,4,6-тетрахлоро-3α,6α-дифенилгликолурил). Мечение реагентом lodogen представляет собой метод окисления в твердой фазе, сходный с методом Chloramine-T, но в общем оно считается более мягким, так как реакция происходит на поверхности окислителя, минимизируя экспозицию субстрата (Salacinzki P.R.P. et al., Anal.Biochem. 117:136 (1981)).
124
I-меченные антитела особенно применимы в медицине для человека, т.е. для введения больным людям, напр. пациентам, страдающим от почечных масс, в частности RCC, особенно ccRCC.
В одном воплощении настоящего изобретения пациентом является предоперационный пациент с почечными массами, напр. предоперационный пациент, которому поставлен диагноз RCC или ccRCC и который назначен на хирургическую операцию. В этом воплощении у пациента особенно высокий риск появления метастаз, в частности костных метастаз, и ему предпочтительно поставлен диагноз ccRCC.
124
Более предпочтительно пациентом является предоперационный пациент с почечными массами, которому назначена РЕТ-томография с I-меченным cG250 для определения типа рака почек перед операцией, напр. ccRCC или не ccRCC. Эти пациенты имеют дополнительное преимущество в том, что они должны пройти только одну диагностическую процедуру и получить информацию и о типе рака, и о наличии костных метастаз.
Следующим предпочтительным пациентом является предоперационный пациент с почечными массами, которому поставлен диагноз ccRCC любым другим методом, напр. по биопсии и гистологическому анализу образца.
В другом воплощении настоящего изобретения пациентом является пациент с диагнозом почечных масс, который подвергался хирургической операции, в частности послеоперационный пациент с RCC или более предпочтительно ccRCC, более предпочтительно пациент с высоким риском рецидива. Патологоанатомическое определение стадии при операции может выявить пациентов с особенно высоким риском возникновения рецидива RCC.
124
Следующими предпочтительными пациентами являются больные с удалением опухолей в почках, у которых выявлено повреждение костей. В этом воплощении применение I-меченных антител по изобретению предпочтительно дает надежную информацию о том, является ли это повреждение костей следствием ccRCC.
В медицине человека антитела обычно вводятся в дозе от 1 мг до 50 мг, предпочтительно в дозе от 5 мг до 20 мг, более предпочтительно в дозе около 10 мг. Удельная активность радиомеченного антитела предпочтительно составляет от 15 до 20 МБк/мг, более предпочтительно от 18 до 19 МБк/мг.
Антитела обычно вводятся в виде фармацевтической композиции с фармацевтически приемлемым носителем, напр. физиологическим раствором, необязательно содержащим стабилизатор белка типа сывороточного альбумина человека (HSA). Антитела предпочтительно вводятся посредством инфузии (вливания).
124
В предпочтительном воплощении пациента, которому назначено введение I-антител, подвергают тиреоидной блокаде введением соли йода, напр. йодида калия. Для этой цели можно использовать таблетки йодида калия, напр. IOSAT™, и/или можно принимать йодид калия в жидкой форме, напр. в виде капель типа SSKI.
124
124
124
Измерение I включает позитронно-эмиссионную томографию (PET) или РЕТ/СТ. Пациента сканируют в нескольких положениях лежа для получения снимка всего тела. Для получения оптимальных результатов РЕТ-интраскопия предпочтительно проводится в пределах 7±2 дней от введения I-антител, в частности в течение 5±2 дней после введения I-антител.
Далее настоящее изобретение будет изложено более подробно на следующих примерах.
124
Пример 1. Введение I-меченных химерных антител G250 для выявления метастазов при RCC
1. Получение и введение антител
124
Радиомеченное антитело (5 мКи/10 мг I-cG250) в объеме 10 мл 15% HSA помещалось в стерильном флаконе вместе со стерильным физраствором. Перед внутривенным вливанием радиомеченное антитело (10 мл) разводили в 20 мл стерильного физраствора, получая 30 мл раствора для внутривенной инфузии.
Метка на продукте включала код пациента и дату и время калибровки (т.е. дату и время, когда там было 5 мКи радиоактивности). Продукт использовали в пределах 24 ч после времени калибровки.
Для непрерывного вливания использовали инфузионный шприц-насос (Graseby 3400 или эквивалентный) на 30 мл со скоростью 2 мл/мин на протяжении 15 минут в день вливания. Линия для внутривенного введения, содержащая 3-сторонний клапан, включала встроенный фильтр на 0,22 микрона. Инфузию проводили после обеспечения адекватного доступа в вену (предпочтительно в локтевую вену), используя 5% раствор сывороточного альбумина человека (HSA). По окончании инфузии шприц и линию для внутривенного введения промывали, по меньшей мере, 10 мл 5% HSA.
124
124
Количество радиоактивности, введенной пациенту, рассчитывали ретроспективно, исходя из даты/времени калибровки по сравнению с датой/временем введения, используя известное время распада I. Регистрировали точное время (день/час/минута) введения I-cG250 пациенту. Данные относительно введенной дозы радиоактивности, полученные методом расчета, анализировали на предмет воспроизводимости и вариабельности.
Кроме того, измеряли введенную дозу для каждого пациента с помощью соответствующего устройства и заносили результаты в форму для передачи данных, которую заполняли для каждого снимка.
2. Вспомогательная терапия: тиреоидная блокада
124
Все пациенты получали ежедневно пероральную дозу йодида калия (SSKI, Upsher-Smith) для блокирования захвата свободного йода в щитовидную железу. В первый день за 24 часа до введения I-cG250 давали 600 мг, а затем давали по 600 мг в день в течение 2 недель после вливания или до дня операции, что бы ни случилось первым.
124
3. РЕТ/СТ-интраскопия с помощью I-cG250
124
124
I-РЕТ/СТ-интраскопию всего тела проводили через 5±2 дня после введения I-cG250. Регистрировали РЕТ/СТ-снимки с поправкой на ослабление.
4. Результаты
Классификацию опухолей проводили согласно Рекомендациям Международного союза против рака (UICC) (TNM Classification of Malignant Tumors, Edited by L.H. Sobin and Ch. Wittekind, Sixth Edition, John Wiley & Sons, New York, NY. 2002)
На фигурах представлены РЕТ-снимки 3 пациентов. У пациентов наблюдались хорошо выраженные костные метастазы. Костные метастазы указаны стрелками.
На фиг.1-5 представлены результаты 48-летней пациентки. Первоначальным симптомом у нее были боли в нижней части спины. Способом изобретения обнаружена метастазирующая ccRCC с костным метастазом в крестцовой кости.
На фиг.1 представлен исходный СТ-снимок живота с низкой контрастностью, на котором виден неспецифический костный дефект в правом крестце (обведен кружком).
99
На фиг.2 представлен снимок кости с помощью Тc, указывающий на литический костный метастаз в крестцовой кости (указан стрелкой).
На фиг.3 представлен СТ-снимок, на котором виднеется большая почечная масса в левой почке.
124
На фиг.4 и 5 представлены локальные СТ-снимки, I-cG250-PET-cнимки и соответствующие комбинированные РЕТ/СТ-снимки (в рамке). Стрелками указаны метастазы в крестце и первичная опухоль в почке.
На фиг.6-10 представлены результаты 55-летнего пациента. Способом изобретения обнаружена метастазирующая ccRCC с костными метастазами в ребрах, ключице и лопатке.
На фиг.6 представлен исходный СТ-снимок грудной клетки, на котором видны костные дефекты в заднем ребре и ключице (обведены кружками).
На фиг.7 представлены СТ-снимки, на которых выявляется почечная масса, почти замещающая левую почку.
124
На фиг.8-10 представлены СТ-снимки, I-cG250-PET-cнимки и соответствующие комбинированные РЕТ/СТ-снимки (в рамке). Стрелками указаны метастазы в ребрах, в ключице и лопатке и первичная опухоль почки.
На фиг.11-15 представлены результаты 68-летнего пациента. Способом изобретения обнаружено метастазирующее заболевание ccRCC с костными метастазами в позвоночнике и подвздошном крыле.
На фиг.11 представлен исходный СТ-снимок живота, на котором видна почечная масса в правой почке (обведена кружком).
На фиг.12 представлен СТ-снимок, на котором видна слабовыраженная литическая аномалия в позвоночнике и подвздошном крыле (обведены кружками).
124
На фиг.13-15 представлены СТ-снимки, I-cG250-PET-cнимки и соответствующие комбинированные РЕТ/СТ-снимки (в рамке). Стрелками указаны метастазы в позвоночнике и подвздошном крыле и первичная опухоль в почке.