СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СВЯЗАННЫХ С ИНФЕКЦИЕЙ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫХ РОДОВ
METHOD FOR DIAGNOSING INFECTION-RELATED PRETERM BIRTH

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Данное изобретение относится к способам и наборам для диагностики беременностей с риском преждевременных родов (ПВР) вследствие восходящей внутриутробной инфекции.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Несмотря на десятилетия исследований и значительный прогресс в понимании этиологии, ПВР остаются основной проблемой в области акушерства национального и мирового значения. ПВР являются единственной основной причиной смерти и инвалидности у детей в возрасте до пяти лет в развитых странах мира и основной единственной причиной перинатальной смертности и заболеваемости; во всем мире преждевременно рождаются около 15 миллионов детей. В то время как многие дети, рожденные слишком рано, продолжают вести нормальную и здоровую жизнь, значительная часть детей не выживает или страдает от пожизненной инвалидности; влияние на отдельных индивидуумов, семьи и общество является значительным, равно как и расходы на здравоохранение, связанные с перинатальным уходом и пожизненной инвалидностью.
[0003] Около 20 % случаев спонтанных ПВР (сПВР) связаны с внутриутробной инфекцией, которая в большинстве случаев возникает в результате проникновения бактерий из слизистой влагалища в беременную матку, вызывая хориоамнионит, фунитоз и преждевременные схватки и роды. Хотя было обнаружено, что многочисленные бактерии вызывают ПВР, выявление подверженных риску женщин на ранних сроках беременности для получения соответствующего профилактического лечения было проблематичным. Традиционные микробиологические способы являются неточными, не обладают высоким прогностическим потенциалом и требуют квалифицированной интерпретации (что является медленным процессом, а число специалистов по интерпретации с соответствующей квалификацией невелико, поэтому они не используются широко).
[0004] Исследования по профилактике сПВР с использованием профилактического введения антибиотиков имели неоднозначный успех. Для достижения максимальной пользы с точки зрения снижения ПВР, противомикробное лечение следует применять избирательно к женщинам из группы риска на основании микробного статуса влагалища, избегая при этом ненужного лечения женщин с низким микробным риском. Как правило, женщин привлекают к участию в исследовании на основании диагноза бактериального вагиноза (БВ) или других связанных с ним вагинальных микробных факторов риска. Это связано с тем, что наличие БВ было единственным средством выявления женщин с риском сПВР на основании микробиологического исследования влагалища.
[0005] Большое количество микроорганизмов были вовлечены в этиологию сПВР. Некоторые из бактерий, которые регулярно вызывают сПВР, вызываемые инфекцией, являются распространенными бактериями, часто обнаруживаемыми в репродуктивном тракте беременных женщин, тогда как другие встречаются только у женщин с аномальной микробиотой влагалища (например, БВ) и/или связаны с инфекциями репродуктивного тракта. Не более чем в половине случаев связанных с инфекцией сПВР в амниотической полости присутствуют множество бактерий. Микроорганизм, наиболее часто связанный с сПВР, представляет собой Ureaplasma, род внутриклеточных бактерий, которые присутствуют в репродуктивном тракте приблизительно у половины беременных женщин, независимо от других маркеров дисбактериоза влагалища. Исследования показали, что присутствие Ureaplasma (обычно не определяемой на уровне видов) является слабым фактором риска возникновения сПВР.
2
2
[0006] Далеко не просто идентифицировать женщин с риском преждевременных родов, связанных с инфекцией, и такая идентификация до сих пор основана на неточной диагностике таких патологических состояний, как БВ. БВ характеризуется нарушением нормальной микробиоты влагалища, потерей продуцирующей HO Lactobacillus spp., повышением рН влагалища и увеличением грамм-вариабельных коккобацилл, анаэробных организмов и генитальных микоплазм. Важно, что известно, что вагинальная микробиота, связанная с БВ, варьируется в зависимости от расы. Было показано, что БВ является прогностическим фактором повышенного риска сПВР в популяциях африканского происхождения, но является относительно слабым прогностическим фактором риска в популяциях европеоидов (OR < 2) с низкой частотой распространенности (<10 %). Аэробный вагинит (АВ) также является фактором риска возникновения сПВР, с таким же профилем риска, как БВ, хотя и с различными характеристиками микроорганизмов.
[0007] Идентификация женщин из группы риска и тех, кто будет отвечать на лечение, является критическим фактором при разработке успешной терапии для предотвращения сПВР, связанных с инфекцией. Следовательно, существует потребность в альтернативных способах диагностики сПВР или по меньшей мере в обеспечении новых диагностических способов для дополнения ранее известных способов.
[0008] На сегодняшний день идентификация женщин с риском сПВР на основе их уреаплазматического статуса не представляется возможным, несмотря на тот факт, что именно этот микроорганизм чаще всего обнаруживается при преждевременных родах у инфицированных женщин и легко поддается лечению. Это является основным недостатком современных методов прогнозирования сПВР.
[0009] Данное изобретение направлено на создание улучшенного или альтернативного способа диагностики беременностей с риском сПВР, вызванных инфекцией, на основе микробиологического профиля, включающего оценку статуса колонизации уреаплазмой, с тем чтобы, можно было применять соответствующее профилактическое лечение для женщин из группы риска.
[0010] Предыдущее обсуждение уровня техники предназначено только для облегчения понимания данного изобретения. Обсуждение не является подтверждением или признанием того, что любой из упомянутых материалов являются или были частью общедоступных сведений на дату приоритета заявки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Данное изобретение обеспечивает способ определения подверженности беременной женщины риску спонтанных преждевременных родов, связанных с инфекцией (сПВР), причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
при этом присутствие бактерий указывает на то, что субъект подвергжен риску сПВР.
[0012] Необязательно, способ тестирования дополнительно проверяет присутствие Fusobacterium nucleatum, и при этом наличие любого из:
- Fusobacterium nucleatum в отсутствие Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6; или
- Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners
указывает на то, что субъект находится в группе риска сПВР.
[0013] Предпочтительно, способ тестирования представляет собой количественную ПЦР (кПЦР).
[0014] Тестированию необязательно может предшествовать тестирование на присутствие высоких уровней видов Lactobacillus, отличных от L. iners, предпочтительно Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus и/или Lactobacillus jensenii. В случае выявления высоких уровней этих видов Lactobacillus, тогда риск спонтанных преждевременных родов (сПВР), связанных с инфекцией, является низким, а этап (а) выполнять не нужно.
[0015] Изобретение дополнительно обеспечивает способ определения того, будет ли беременной женщине полезно лечение для предотвращения сПВР, связанных с инфекцией, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
при этом присутствие бактерий указывает на то, что субъект подвергжен риску сПВР и, следовательно, получит пользу от лечения с целью предотвращения сПВР.
[0016] Изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения беременной женщины с риском сПВР, связанных с инфекцией, включающий этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
b) если бактерии присутствуют, назначения беременной женщине антибиотикотерапии для устранения бактерий.
[0017] Изобретение дополнительно обеспечивает способ снижения риска сПВР, связанных с инфекцией, у беременной женщины, включающий этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
b) если бактерии присутствуют, назначения беременной женщине антибиотикотерапии для устранения бактерии и, следовательно, снижения риска сПВР.
[0018] Антибиотикотерапия может необязательно сопровождаться или проводиться одновременно с терапией пробиотиками для снижения вероятности повторного заражения.
[0019] Данное изобретение обеспечивает набор для определения подверженности беременной женщины риску сПВР, содержащий:
a) средства для тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
b) Инструкции по применению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0020] Дополнительные признаки данного изобретения более полно описаны в следующем описании нескольких неограничивающих вариантов его осуществления. Это описание включено исключительно в целях иллюстрации данного изобретения. Его не следует понимать как ограничение общей сущности, раскрытия или описания изобретения, как изложено выше. Описание будет сделано со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
На Фиг. 1 представлена диаграмма Венна, демонстрирующая различия между частотой выявления сПВР, основанных на молекулярном диагнозе БВ по сравнению с диагнозом, поставленным с использованием ПЦР-анализа на GLU (Gardnerella vaginalis; Lactobacillus iners; Ureaplasma parvum генотипа SV3 или SV6; Fusobacterium nucleatum) согласно данному изобретению. БВ определяется как положительный в отношении G. vaginalis и двух или более дополнительных связанных с БВ бактерий.
На Фиг. 2 представлен график прогнозирования ПВР, демонстрирующий различия между частотой выявления сПВР, поделенных на гестационный возраст при родах, на основании молекулярного диагноза БВ в сравнении с диагнозом с использованием теста на GLU согласно данному изобретению.
На Фиг. 3 представлен график стабильности распространенности Ureaplasma, Candida и Mycoplasma spp. в вагинальных мазках у 134 женщин, от которых в течение беременности были получено по три образца. Сплошной черный, образец момента времени 1; темно-серый, образец момента времени 2; светло-серый, образец момента времени 3.
На Фиг. 4 представлена блок-схема по времени для Примера 3: Клиническое исследование программы «скрининг - лечение» («screen and treat»).
ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Подробное описание сущности изобретения
Способы выявления
[0021] Существует глобальная потребность в надежных, быстрых, недорогих, простых и эффективных способах диагностики женщин, подвергающихся риску спонтанных преждевременных родов (сПВР), связанных с инфекцией, на ранних/средних сроках беременности и установления того, какие группы беременных женщин получат наибольшую пользу от антибиотикотерапии, чтобы уменьшить этот риск. Данное изобретение может быть использовано для идентификации значительной доли женщин, подверженных риску сПВР, связанных с инфекцией, в первой половине беременности, так что можно применять целевую противомикробную терапию и терапию пробиотиками для устранения бактерий и снижения частоты сПВР.
[0022] Следовательно, данное изобретение обеспечивает способ определения подверженности беременной женщины риску сПВР, связанных с инфекцией, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
при этом присутствие бактерий указывает на то, что субъект подвержен риску сПВР.
[0023] Изобретение дополнительно обеспечивает способ определения того, будет ли беременной женщине полезно лечение для предотвращения сПВР, связанных с инфекцией, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
при этом присутствие бактерий указывает на то, что субъект подвержен риску сПВР и, следовательно, получит пользу от лечения с целью предотвращения сПВР.
[0024] Антибиотикотерапия может необязательно сопровождаться или проводиться одновременно с терапией пробиотиками для снижения вероятности повторного заражения.
[0025] Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет преждевременные роды как рождение детей живыми до наступления 37 недели беременности. Существуют подкатегории ПВР, основанные на гестационном возрасте, которые являются:
• очень ранними преждевременными (<28 недель)
• ранними преждевременными (от 28 до <34 недель)
• от умеренных до поздних преждевременных (35 недель +).
[0026] В данном изобретении установлено, что частота возникновения сПВР выше у беременных женщин, которые имеют положительный результат теста в отношении бактериального профиля, указанного выше. Не придерживаясь какой-либо теории, мы полагаем, что беременные женщины, у которых положительный результат теста в отношении вышеупомянутой бактериальной сигнатуры, с большей вероятностью получат пользу от противомикробной терапии для снижения риска сПВР.
[0027] Присутствие трех или более бактерий из перечня может быть четырьмя бактериями из перечня.
[0028] Ureaplasma связана с большинством случаев сПВР, но большинство женщин с Ureaplasma не подвержены риску сПВР. До данного изобретения не существовало способа идентифицировать тех беременных женщин, которые находятся или не находятся в группе риска. Предыдущие тесты, включающие диагностику БВ, игнорировали уреаплазматический статус, так как Ureaplasma является несвязанным с БВ организмом. Кроме того, до настоящего времени выявление, как правило, ограничивалось идентификацией до уровня рода для видов Ureaplasma человека и не дифференцировало два известных вида и связанные серовары. Предпочтительно сПВР, связанные с инфекцией, ассоциируются с восходящей внутриутробной инфекцией; переносом через плаценту в кровь матери; инфекцией, вызванной инвазивными процедурами, такими как амниоцентез, и колонизацией небеременной матки бактериями. Наиболее предпочтительно сПВР, связанные с инфекцией, ассоциируется с восходящей внутриутробной инфекцией.
[0029] Необязательно, данное изобретение обеспечивает способ определения подверженности беременной женщины риску сПВР, связанных с инфекцией, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Fusobacterium nucleatum;
ii) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
iii) Gardnerella vaginalis; и
iv) Lactobacillus iners
причем присутствие или:
- Fusobacterium nucleatum в отсутствие Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6; или
- Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners
указывает на то, что субъект находится в группе риска сПВР.
[0030] Необязательно, данное изобретение обеспечивает способ определения того, будет ли беременной женщине полезно лечение для предотвращения сПВР, связанных с инфекцией, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Fusobacterium nucleatum;
ii) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
iii) Gardnerella vaginalis; и
iv) Lactobacillus iners
причем присутствие или:
- Fusobacterium nucleatum в отсутствие Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6; или
- Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners
указывает на то, что субъект находится в группе риска сПВР.
[0031] Необязательно, протестированная Gardnerella vaginalis представляет собой кладу 4.
[0032] Не придерживаясь какой-либо теории, считается, что присутствие Fusobacterium nucleatum само по себе может повысить риск сПВР, связанных с инфекцией. Поскольку риск сПВР уже высок у женщин с Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6, дополнительная прогностическая сила, добавленная присутствием F. nucleatum, является значимой только у женщин, отрицательных в отношении U. parvum SV3/SV6.
[0033] Поэтому риски разделяются следующим образом:
Присутствие бактерий
Риск сПВР, связанных с инфекцией
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: положительный
Высокий
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: положительный
Низкий
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: положительный
Низкий
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: положительный
Низкий
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: положительный
Высокий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: положительный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: положительный
Высокий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: положительный
Высокий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: отрицательный
Высокий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: отрицательный
Высокий
Fusobacterium nucleatum: отрицательныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: положительный
Высокий
Fusobacterium nucleatum: отрицательныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: положительный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: отрицательныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: отрицательныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: отрицательныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: положительный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: отрицательныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: положительный
Низкий
Fusobacterium nucleatum: положительныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: положительныйLactobacillus iners: отрицательный
Высокий
Fusobacterium nucleatum: отрицательныйUreaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательныйGardnerella vaginalis: отрицательныйLactobacillus iners: отрицательный
Низкий
[0034] Таким образом, беременная женщина с положительным тестом на следующие комбинации видов бактерий имеет высокий риск сПВР, связанных с инфекцией:
• Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительный; Gardnerella vaginalis: положительный; Lactobacillus iners: положительный
• Fusobacterium nucleatum: положительный; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительный; Gardnerella vaginalis: положительный; Lactobacillus iners: положительный
• Fusobacterium nucleatum: положительный; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательный; Gardnerella vaginalis: положительный; Lactobacillus iners: положительный
• Fusobacterium nucleatum: положительный; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательный; Gardnerella vaginalis: отрицательный; Lactobacillus iners: положительный
• Fusobacterium nucleatum: положительный; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательный; Gardnerella vaginalis: положительный; Lactobacillus iners: отрицательный
• Fusobacterium nucleatum: положительный; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательный; Gardnerella vaginalis: отрицательный; Lactobacillus iners: отрицательный
• Fusobacterium nucleatum: отрицательный; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: положительный; Gardnerella vaginalis: положительный; Lactobacillus iners: положительный
• Fusobacterium nucleatum: положительный; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или SV6: отрицательный; Gardnerella vaginalis: положительный; Lactobacillus iners: отрицательный
, а другие комбинации означают низкий риск.
[0035] Необязательно, протестированная Gardnerella vaginalis представляет собой кладу 4.
[0036] Необязательно, тестированию может предшествовать тестирование на присутствие во влагалищном отделяемом высоких уровней видов Lactobacillus, отличных от Lactobacillus iners. В случае выявления высоких уровней видов Lactobacillus, отличных от Lactobacillus iners, риск спонтанных преждевременных родов (сПВР) является низким, а этап (а) выполнять не нужно. Виды Lactobacillus, отличные от Lactobacillus iners, предпочтительно выбраны из перечня, включающего Lactobacillus gasseri, L. crispatus и L. jensenii. Под «высокими уровнями» подразумевается, что имеется более чем около 10 000 копий, 15 000 копий или предпочтительно более чем около 20 000 копий гена 16S рРНК видов Lactobacillus. Альтернативно, присутствие высоких уровней видов Lactobacillus, отличных от Lactobacillus iners, можно протестировать путем определения количества копий гена фактора элонгации Tu (tuf). Другие гены, которые можно использовать для количественной оценки присутствия высоких уровней видов Lactobacillus, отличных от Lactobacillus iners, также могут быть использованы.
[0037] Не придерживаясь какой-либо теории, считается, что высокие уровни видов Lactobacillus, отличных от Lactobacillus iners, обеспечивают беременной женщине снижение риска связанных с инфекцией сПВР, связанных с Fusobacterium nucleatum; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6; Gardnerella vaginalis; и Lactobacillus iners. Следовательно, в случае выявления высоких уровней видов Lactobacillus, отличных от Lactobacillus iners, риск связанных с инфекцией сПВР, связанный с Fusobacterium nucleatum; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6; Gardnerella vaginalis; и Lactobacillus iners, является низким, а этап (а) вышеуказанного способа выполнять не нужно.
[0038] Предпочтительно способ тестирования представляет собой количественную ПЦР (кПЦР), также известную как ПЦР в реальном времени. Альтернативно, тестирование может проводиться при помощи ПЦР по конечной точке и последующего секвенирования ДНК, цифровой ПЦР, флуоресцентной гибридизации in situ, бактериальной культуры или иммунологического тестирования. В случае культивирования может быть проведен второй раунд тестирования, такой как тестирование методом кПЦР, на образцах, определенных первым способом на содержание Ureaplasma (для идентификации вида и конкретного генотипа U. parvum) и/или Gardnerella vaginalis (для того, чтобы идентифицировать кладу).
[0039] Предпочтительно тестирование проводят в период между 10-й и 24-й неделями беременности, между 16-й и 24-й неделями беременности, более предпочтительно между 18-й и 22-й неделями беременности, наиболее предпочтительно между 18-й и 20-й неделями беременности или до 22-й недели беременности.
[0040] Предпочтительно жидкость, собираемая в ходе отбора образцов, представляет собой влагалищное отделяемое, также известное как цервико-вагинальное отделяемое. Альтернативно, собранная жидкость может представлять собой цервикальную жидкость, цервикальную слизь и/или материал из цервикальной слизистой пробки.
[0041] Предпочтительно образец представляет собой самостоятельно собранное влагалищное отделяемое. Например, образец может быть собран самостоятельно с использованием вагинального зонда-тампона. Альтернативно, влагалищное отделяемое может быть собрано в хирургических, стационарных или клинических условиях. Например, влагалищное отделяемое, цервикальная слизь и/или материал из цервикальной слизистой пробки могут быть собраны медицинским работником при помощи вагинального зонда-тампона при помощи зеркала или без него. Образец может дополнительно представлять собой образец жидкости в результате вагинального душа, собранной после спринцевания влагалища.
[0042] Вагинальные зонды-тампоны могут представлять собой сухие зонды-тампоны. Предпочтительно сухие зонды-тампоны немедленно помещают в жидкие среды.
[0043] Для целей сравнения с данным изобретением БВ определяется в данном изобретении как обнаружение при помощи кПЦР в цервикально-вагинальном образце ДНК G. vaginalis, а также одной или более дополнительных связанных с БВ бактерий (или F. nucleatum, L. amnionii, S. sanguinegens, M. hominis, Peptostreptococcus spp.).
[0044] Тест может оказаться положительным на следующие комбинации бактерий:
• Ureaplasma parvum генотипа SV3, Ureaplasma parvum генотипа SV6, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners;
• Ureaplasma parvum генотипа SV6, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners;
• Ureaplasma parvum генотипа SV3, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners;
• Fusobacterium nucleatum; Ureaplasma parvum генотипа SV3 и SV6; Gardnerella vaginalis; Lactobacillus iners;
• Fusobacterium nucleatum;
• Fusobacterium nucleatum; Gardnerella vaginalis; Lactobacillus iners;
• Fusobacterium nucleatum; Lactobacillus iners;
• Fusobacterium nucleatum; Gardnerella vaginalis;
• Fusobacterium nucleatum; Ureaplasma parvum генотипа SV3; Gardnerella vaginalis; Lactobacillus iners;
• Fusobacterium nucleatum; Ureaplasma parvum генотипа SV6; Gardnerella vaginalis; Lactobacillus iners.
Способ лечения
[0045] Изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения беременной женщины с риском сПВР, связанных с инфекцией, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
b) если бактерии присутствуют, назначения беременной женщине антибиотикотерапии для устранения бактерий.
[0046] Изобретение дополнительно обеспечивает способ снижения риска сПВР у беременной женщины, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
b) если бактерии присутствуют, назначения беременной женщине антибиотикотерапии для устранения бактерии и, следовательно, снижения риска сПВР.
[0047] Изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения беременной женщины с риском сПВР, связанных с инфекцией, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Fusobacterium nucleatum;
ii) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
iii) Gardnerella vaginalis; и
iv) Lactobacillus iners
b) если
- или Fusobacterium nucleatum; или
- Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners
присутствуют, назначения беременной женщине антибиотикотерапии для устранения бактерий.
[0048] Изобретение дополнительно обеспечивает способ снижения риска сПВР, связанных с инфекцией, у беременной женщины, причем способ включает этапы:
a) тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Fusobacterium nucleatum;
ii) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
iii) Gardnerella vaginalis; и
iv) Lactobacillus iners
b) если
- Fusobacterium nucleatum в отсутствие Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6; или
- Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6, Gardnerella vaginalis и Lactobacillus iners
присутствуют, назначения беременной женщине антибиотикотерапии для устранения бактерий.
[0049] Антибиотикотерапия может необязательно сопровождаться или проводиться одновременно с терапией пробиотиками для снижения вероятности повторного заражения.
[0050] Предпочтительно, способ тестирования представляет собой количественную ПЦР (кПЦР).
[0051] Необязательно, протестированная Gardnerella vaginalis представляет собой кладу 4.
[0052] Необязательно, тестированию предшествует тестирование на присутствие во влагалищном отделяемом высоких уровней видов Lactobacillus, отличных от Lactobacillus iners, предпочтительно Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus и/или Lactobacillus jensenii. В случае выявления высоких уровней этих видов Lactobacillus, тогда риск спонтанных преждевременных родов (сПВР), связанных с инфекцией, является низким, а этап (а) выполнять не нужно.
[0053] Предпочтительно тестирование проводят в период между 10-й и 24-й неделями беременности, между 16-й и 24-й неделями беременности, более предпочтительно между 18-й и 22-й неделями беременности, наиболее предпочтительно между 18-й и 20-й неделями беременности или до 22-й недели беременности.
[0054] Предпочтительно антибиотикотерапию проводят в период между 10-й и 24-й неделями беременности, между 16-й и 24-й неделями беременности, более предпочтительно между 18-й и 22-й неделями беременности, наиболее предпочтительно между 18-й и 20-й неделями беременности или до 22-й недели беременности.
[0055] Предпочтительно терапию пробиотиками проводят в период между 10-й и 24-й неделями беременности, между 16-й и 24-й неделями беременности, более предпочтительно между 18-й и 22-й неделями беременности, наиболее предпочтительно между 18-й и 20-й неделями беременности или до 22-й недели беременности.
Наборы
[0056] Данное изобретение обеспечивает набор для определения подверженности беременной женщины риску сПВР, содержащий:
a) средства для тестирования образца влагалищного отделяемого на присутствие следующих бактерий:
i) Ureaplasma parvum генотипа SV3 и/или Ureaplasma parvum генотипа SV6;
ii) Gardnerella vaginalis; и
iii) Lactobacillus iners
b) Инструкции по применению.
[0057] Набор может дополнительно содержать тест на Fusobacterium nucleatum.
[0058] Набор может дополнительно содержать тест на виды Lactobacillus, отличные от Lactobacillus iners. Предпочтительные виды Lactobacillus, отличные от Lactobacillus iners, которые тестируют, представляют собой Lactobacillus gasseri, L. crispatus и L. jensenii.
[0059] Набор согласно данному изобретению может также содержать инструкции, разработанные для облегчения соблюдения пользователем требований. В контексте данного документа инструкции относятся к любой этикетке, вкладышу и т. д. и могут располагаться на одной или более поверхностях упаковочного материала, или инструкции могут предоставляться на отдельном листе или в любой их комбинации. Например, в варианте осуществления набор согласно данному изобретению содержит инструкции по тестированию на связанные с сПВР бактерии согласно данному изобретению. В одном варианте осуществления в инструкции указано, что способ согласно данному изобретению подходит для прогнозирования сПВР и для женщин, которым было бы полезно лечение для предотвращения сПВР.
Общие положения
[0060] Специалистам в данной области техники будет понятно, что изобретение, описанное в данном документе, подвержено изменениям и модификациям, отличным от тех, которые конкретно описаны. Изобретение включает все такие варианты и модификации. Изобретение также включает все этапы, признаки, составы и соединения, упомянутые или указанные в описании, по отдельности или совместно, а также любые и все комбинации или любые две или более из этапов или признаков.
[0061] Каждый документ, ссылка, заявка на патент или патент, процитированные в этом тексте, прямо включены в данный документ во всей полноте посредством ссылки, что означает, что они должны быть прочитаны и рассмотрены читателем как часть этого текста. Тот факт, что документ, ссылка, заявка на патент или патент, упомянутые в данном тексте, не повторяются в данном тексте, объясняется исключительно соображениями краткости.
[0062] Любые инструкции производителя, описания, характеристики продукта и информация о продуктах для любых продуктов, упомянутых в данном документе или в любом документе, включенном в данный документ посредством ссылки, настоящим включены в данный документ посредством ссылки и могут использоваться при практическом применении изобретения.
[0063] Данное изобретение не должно быть ограничено в объеме каким-либо конкретным вариантом осуществления, описанным в данном документе. Эти варианты осуществления предназначены только для иллюстративных целей. Функционально эквивалентные продукты, составы и способы явно находятся в пределах объема изобретения, как описано в данном документе.
[0064] Изобретение, описанное в данном документе, может включать одно или более значений (например, концентрацию, сигнал, обнаружение, усиление, последовательность и т. д.). Под диапазоном значений следует понимать все значения в этом диапазоне, включая значения, определяющие диапазон, и значения, смежные с диапазоном, которые приводят к тому же или по существу тому же результату, что и значения, непосредственно примыкающие к тому значению, которое определяет границу диапазона. Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, изложенные в описании и формуле изобретения, являются приблизительными значениями, которые могут варьироваться в зависимости от желаемых свойств, которые должны быть получены при помощи данного изобретения. Следовательно, «около 80 %» означает «около 80 %», а также «80 %». По меньшей мере, каждый числовой параметр должен быть истолкован в свете количества значащих цифр и способов обычного округления.
[0065] Во всем этом описании, если контекст не требует иного, будет подразумеваться, что слово «содержит» или варианты, такие как «содержать» или «содержащий», подразумевает включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение какого-либо другого целого числа или группы целых чисел. Также отмечено, что в этом описании и, в частности, в формуле изобретения и/или абзацах такие термины, как «содержит», «содержать», «содержащий» и тому подобное, могут иметь значение, приписываемое ему в Патентном законе США; например, они могут означать «включает», «включен», «включает» и тому подобное; и что такие термины, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из», имеют значение, приписанное им в Патентном законе США, например, они допускают элементы, которые не указаны явно, но исключают элементы, обнаруженные в предшествующем уровне техники или влияющие на основную или новую характеристику изобретения.
[0066] Другие определения для выбранных терминов, используемых в данном документе, могут быть найдены в подробном описании изобретения и применяются повсеместно. Если не указано иное, все другие научные и технические термины, используемые в данном документе, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области техники, к которой относится изобретение. Термин «активный агент» может означать один активный агент или может включать два или более активных агента.
[0067] Следующие примеры служат для более полного описания способа применения вышеописанного изобретения, а также для определения наилучших способов, предполагаемых для осуществления различных аспектов изобретения. Понятно, что эти способы никоим образом не служат для ограничения фактического объема данного изобретения, а скорее представлены для иллюстративных целей.
ПРИМЕРЫ
[0068] Дополнительные признаки данного изобретения более полно описаны в следующих неограничивающих примерах. Это описание включено исключительно в целях иллюстрации данного изобретения. Его не следует понимать как ограничение общего описания изобретения, как изложено выше.
Пример 1
Исследование UPCAN - проспективное исследование вагинальной колонизации Ureaplasma, Mycoplasma и Candida sp. у бессимптомных беременных с низким уровнем риска, и связи со спонтанными преждевременными родами.
Субъекты
[0069] В исследовании приняли участие 206 беременных женщин с низким уровнем риска, набранных из Мемориальной больницы имени короля Эдварда (KEMH), Перт, Западная Австралия. Пятнадцать женщин было исключено из исследования или потеряно для последующего наблюдения, таким образом в исследовании оставалось 191 женщина. Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований с участием людей Департамента здравоохранения штата Западная Австралия, отделение охраны здоровья матери и ребенка Западной Австралии (2056/EW).
Критерии включения и невключения
[0070] Женщины с одноплодной беременностью соответствовали критериям включения, если они были в возрасте 18-40 лет, могли говорить и читать по-английски и были на первом или втором триместре беременности.
[0071] Женщин не включали в исследование, если считалось, что они подвержены высокому риску возникновения ПВР (одни или более предыдущих ПВР) и/или другим осложнениям при беременности, таким как преэклампсия. К другим критериям невключения относились продолжающееся применение противогрибковых, тетрациклиновых и/или макролидных антибиотиков, текущий диагноз инфекции мочевыводящих путей и рецидивирующий вагинальный кандидоз в анамнезе.
Опросники
[0072] После включения в исследование и на каждом последующем этапе отбора образцов женщинам предлагалось заполнить деидентифицированный медицинский опросник/опросник по образу жизни в частной обстановке. В опроснике сначала был задан вопрос о применяемых в настоящее время лекарственных препаратах (антибиотиках/препаратах природного происхождения/пробиотиках) и о диагностированных в прошлом инфекциях мочевыводящих путей/вагинального кандидоза. Информацию о курении и/или употреблении алкоголя в настоящее время и в прошлом запрашивали в виде ответа на вопрос «да» или «нет», после чего следовали вопросы для определения количества выкуриваемых сигарет/стандартных доз алкоголя, потребляемых каждый день в зависимости от ситуации. Регистрировали среднее количество половых контактов в неделю во время беременности.
Данные об исходе беременности
[0073] Данные об исходах беременности из электронных медицинских карт больницы были доступны опытным акушерам-исследователям и закодированы после завершения беременности.
Сбор образцов
[0074] Письменное информированное согласие было получено акушером, ведущим беременность, до включения в исследование. Оно включало согласие на публикацию любых данных, полученных в ходе исследования. Участники предоставили два самостоятельно собранных вагинальных мазка (Copan Diagnostics, Murrieta, Калифорния, США) на этапе набора в исследование (в среднем 21 неделя, диапазон 13-26 недель гестационного возраста [ГВ]), на ~ 28-й неделе ГВ (медиана 29, диапазон 24-38 недель) и на ~ 36-й неделе ГВ (медиана 36, диапазон 32-40 недель). Первый мазок был использован для обнаружения Ureaplasma и Mycoplasma spp,. а второй для обнаружения Candida spp. В попытке стандартизировать процесс взятия мазков всем женщинам были предоставлены подробные устные, письменные и наглядные инструкции. Вкратце, участники в перчатках вставляли тампон на 5 см во влагалище и осторожно вращали его в течение 20 с, обеспечивая контакт стенок влагалища с зондом-тампоном. Затем зонды-тампоны сразу же помещали в пробирку для сбора образцов, содержащую или 1 мл среды UTM (Ureaplasma и Mycoplasma spp.) (Copan Diagnostics), или 2 мл среды CAT (Candida spp.) (Copan Diagnostics), защелкиваемой в средней части оси зонда-тампона, закрывали и хранили при 4 °C. Все образцы были доставлены в лабораторию на льду для культивирования в течение 24 часов после сбора.
Обнаружение Ureaplasma spp.
Культура
2
2
[0075] Пробирки с UTM встряхивали в течение 10 с для высвобождения всех клеток из зондов-тампонов. Затем зонды-тампоны прижимали к стенке пробирки, чтобы высвободить всю свободную жидкость, а затем утилизировали. 200 мкл образца добавляли к 1,8 мл бульонной питательной среды 10B (Melbourne University Media Preparation Unit) и инкубировали в течение 48 ч при 37 °C, 5 % CO, 2 % O. Оставшийся объем образца переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и замораживали при -80°С до выделения ДНК.
[0076] Положительные культуры, на которые указывает изменение цвета, связанное с рН (желтый > розовый), немедленно переносили в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл и замораживали при -80°С.
Выделение ДНК
[0077] ДНК экстрагировали из 250 мкл элюата из зонда-тампона с UTM с использованием набора для подготовки образцов Siemens Sample Preparation Kit 1.0 (Siemens, Мюнхен, Германия) на автоматизированной платформе для экстракции Kingfisher Duo (Thermo Fisher Scientific Inc. Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя. Все экстракты элюировали в конечном объеме 100 мкл буфера для элюирования (Siemens). Положительный контроль экстракции, состоящий из приблизительно 250 цветоизменяющих единиц (ЦИЕ), каждого из U. parvum и U. urealyticum, был включен во все прогоны.
ПЦР в реальном времени
[0078] В дополнение к культуре, с использованием ПЦР в реальном времени в вагинальных мазках проводили обнаружение ДНК Ureaplasma spp. ДНК вагинального мазка подвергали скринингу с использованием анализа, нацеленного на ген уреазы U. parvum и U. urealyticum как описано Yi et al. (1), адаптированного для использования в системе ПЦР в реальном времени ViiA7 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Реакционные смеси (конечная концентрация) состояли из 1X Taqman FAST Advanced Master Mix (Life Technologies), 0,9 мкМ праймеров UU1613F и UU1524R (Life Technologies), 0,25 мкМ зондов UU-parvo (FAM) и UU-T960 (VIC) (Life Technologies), 5 мкл матричной ДНК и воды без нуклеазной активности (Ambion, Life Technologies) до конечного объема 20 мкл. Условия циклирования ПЦР состояли из начальной денатурации/активации Taq при 95°С в течение 20 с, после чего следовали 40 циклов количественного определения при 95°С в течение 1 с и 60°С в течение 20 с (сбор данных). Положительные стандарты были включены в каждый прогон.
ПЦР с высокоразрешающим плавлением
2
[0079] Образцы, которые были положительными в отношении ДНК U. parvum, были генотипированы и классифицированы как серовар (SV) один, SV3, SV6 или SV14 с использованием ранее описанного нами анализа методом ПЦР с высокоразрешающим плавлением (HRM - англ.: high resolution melt), нацеленного на ген mba (многокомпонентный антиген) (2) в cистеме для ПЦР в реальном времени ViiA7 (Life Technologies). Реакционные смеси (конечная концентрация) состояли из 1X буфера Amplitaq Gold 360 (Life Technologies), 1,5 мМ MgCl (Life Technologies), 200 мкМ каждого dNTP (Life Technologies), 0,3 мкМ праймеров UPHRM-F и UPHRM-R (Life Technologies), 1X красителя MeltDoctor HRM (Life Technologies), ДНК-полимеразы Amplitaq Gold 360 (0,1 ед./мкл) (Life Technologies), 10 мкл матричной ДНК и воды без нуклеазной активности (Ambion, Life Technologies) до конечного объема 20 мкл. Условия циклирования ПЦР состояли из начальной денатурации/активации Taq при 95°С в течение 10 минут, а затем 40 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 минуты (сбор данных). Чтобы получить данные о статусе серовара U. parvum, ампликоны затем подвергали стадии HRM, где температуру повышали до 95°С в течение 10 с, а затем понижали до 60°С в течение 1 мин. Затем температуру повышали до 95°С со скоростью 0,025°С/с (непрерывный сбор данных), выдерживали при 95°С в течение 15 с, а затем понижали до 60°С в течение 15 с. Профили HRM анализировали с использованием программного обеспечения ViiA7 для ПЦР в реальном времени, версия 1.2.1 (Life Technologies). Все образцы были проанализированы в двух экземплярах, и положительные стандарты U. parvum SV1, SV3, SV6 и SV14 были включены в каждый прогон.
Секвенирование
2
[0080] После анализа HRM образцы, которые давали нестандартные кривые плавления, подвергались секвенированию ДНК. Ампликоны ПЦР получали с использованием того же набора праймеров HRM на термоциклере Veriti PCR (Life Technologies). Реакционные смеси (конечная концентрация) состояли из 1X буфера Amplitaq Gold 360 (Life Technologies), 2,0 мМ MgCl (Life Technologies), 200 мкМ каждого dNTP (Life Technologies), 0,5 мкМ праймеров UPHRM-F и UPHRM-R (Life Technologies), ДНК-полимеразы Amplitaq Gold 360 (1,25 Ед.) (Life Technologies), 5 мкл матричной ДНК и воды без нуклеазной активности (Ambion, Life Technologies) до конечного объема 50 мкл. Условия циклирования ПЦР состояли из начальной денатурации/активации Taq при 95°С в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 с, 56°С в течение 30 с, и 72°С в течение 45 с. Также был включен последний этап элонгации при 72°С в течение 7 мин.
[0081] Ампликоны ПЦР проверяли в отношении размера (305 п.н.) на 1,5 % агарозном геле, окрашенном Gel Red (Biotium), и затем очищали с использованием набора для ПЦР-очистки QIAquick (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные фрагменты ДНК секвенировали с использованием набора реактивов Big Dye версии 3.1 (Applied Biosystems) и подвергали последующей очистке с использованием SPRI. Фрагменты разделяли на анализаторе ДНК 3730xI с использованием 96-капиллярного блока (Applied Biosystems) в Австралийском центре исследований генома (Перт, Западная Австралия).
Обнаружение Mycoplasma spp.
Выделение ДНК
[0082] ДНК экстрагировали из 250 мкл элюата из зонда-тампона с UTM, как описано выше.
ПЦР в реальном времени
Mycoplasma hominis
[0083] При помощи ПЦР в реальном времени в вагинальных мазках проводили обнаружение ДНК M. hominis. Образцы ДНК подвергали скринингу с использованием анализа, нацеленного на ген yidC M. hominis, как описано Ferandon et al. (3), адаптированного для использования в системе для ПЦР в реальном времени ViiA7 (Life Technologies). Реакционные смеси (конечная концентрация) состояли из 1X Taqman FAST Advanced Master Mix (Life Technologies), 0,9 мкМ праймеров MHyidCfwd и MHyidCrev (Life Technologies), 0,25 мкМ зонда MHyidC (FAM) (Life Technologies), 5 мкл матричной ДНК и воды без нуклеазной активности (Ambion, Life Technologies) до конечного объема 20 мкл. Условия циклирования ПЦР были такими, как описано для Ureaplasma spp. Положительный стандарт был включен в каждый прогон.
Mycoplasma genitalium
[0084] Обнаружение ДНК M. genitalium проводили в вагинальных мазках при помощи ПЦР в реальном времени. Образцы ДНК подвергали скринингу с использованием анализа, нацеленного на ген MgPa M. genitalium, как описано Jensen et al. (4), адаптированного для использования в системе для ПЦР в реальном времени ViiA7 (Life Technologies). Реакционные смеси (конечная концентрация) состояли из 1X Taqman FAST Advanced Master Mix (Life Technologies), 0,9 мкМ праймеров MgPa-355F и MgPa-432R (Life Technologies), 0,25 мкМ зонда MgPa-380 (VIC) (Life Technologies), 7,9 мкл матричной ДНК и воды без нуклеазной активности (Ambion, Life Technologies) до конечного объема 20 мкл. Условия циклирования ПЦР состояли из начальной денатурации/активации Taq при 95°С в течение 20 с, после чего следовали 50 циклов количественного определения при 95°С в течение 1 с и 60°С в течение 20 с (сбор данных). Положительные стандарты были включены в каждый прогон.
Обнаружение Candida spp.
Культура
[0085] Пробирки с CAT встряхивали в течение 10 с для высвобождения всех клеток из зондов-тампонов. Затем зонды-тампоны прижимали к стенке пробирки, чтобы высвободить всю свободную жидкость, а затем утилизировали. 1 мл образца переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и замораживали при -80°С до выделения ДНК. Оставшийся образец (приблизительно 900 мкл) инкубировали при 37°С в течение 24 часов для обогащения при низких титрах клеток Candida spp. После инкубации две 10 мкл петли образца высевали на агар Candida Brilliance (Oxoid, Thebarton, Южная Австралия, Австралия) и инкубировали при 37°C в течение 72 часов.
[0086] Положительные культуры на агаре Candida Brilliance (Oxoid) классифицировали следующим образом: зеленые колонии = C. albicans;; розовые/желтые/бежевые/коричневые колонии = Candida spp., отличные от C. albicans. Все положительные культуры повторно высевали на чистоту и после инкубации чистые культуры ресуспендировали в 2 мл бульона Сабуро с декстрозой (Oxoid) и замораживали при -80°С.
Выделение ДНК
[0087] ДНК выделяли из 250 мкл чистого ресуспендированного в бульоне изолята Candida sp., как описано выше.
ПЦР в реальном времени
[0088] Для подтверждения идентификации Candida spp., отличных от albicans, выделенный с использованием агара Candida Brilliance, мультиплексного ПЦР-анализа в реальном времени, нацеленного на ген рибонуклеазы Р (RPR) Candida sp. и C. glabrata. Конструкты праймеров и зондов были сходны с таковыми у Innings et al. (5), но были оптимизированы для использования в системе для ПЦР в реальном времени ViiA7 (Life Technologies). Реакционные смеси (конечная концентрация) состояли из 1X Taqman FAST Advanced Master Mix (Life Technologies), 0,9 мкМ праймеров CAND-CR1F (5’ CGGGTGGGAAATTCGGT 3’), CAND-CR5R (5’ CAATGATCGGTATCGGGT 3’), GLA-F (5’ TGGCTCACACACTTTGTCACTTT 3’) and GLAR (5’ ACCTCGCCTCACACCAATG 3’) (Life Technologies), 0,25 мкМ зондов ALLCAN (NED-TTCGCATATTGCACTMAAYAGC-MGB) и GLA (VIC-AACCTGCCATTTCCGCTCCCTTAAGA-TAMRA) (Life Technologies), 5 мкМ матричной ДНК и воды без нуклеазной активности (Ambion, Life Technologies) до конечного объема 20 мкл. Условия циклирования ПЦР были такими, как описано выше для Ureaplasma spp.
Статистический анализ
[0089] Данные были обобщены с использованием частотных распределений для категориальных данных и медианы, межквартильного диапазона и диапазона для непрерывных данных. Категориальные результаты сравнивали с использованием точных критериев Хи-квадрат и Фишера, а непрерывные результаты сравнивали с использованием критериев Манна - Уитни. Все анализы проводили на обнаружение микроорганизмов при наборе в исследование, из-за относительно стабильных уровней колонизации на протяжении всей беременности. Для анализа данных использовали статистическое программное обеспечение SPSS версии 20.0 (Армонк, Нью-Йорк: IBM Corp). P-значения <0,05 считались статистически значимыми.
Результаты
[0090] Всего в исследование было включено 206 женщин. Из них 15 человек исключены или утрачены для последующего наблюдения. Демографические характеристики/характеристики, связанные с родами и образом жизни 191 женщины, которые сформировали окончательную когорту исследования, представлены ниже (таблица 1). Общая частота ПВР (<37 нед. ГВ) составила 9 %, что включало 13 спонтанных родов и четыре рождения, которые требовали индукции родовой деятельности или кесарева сечения по показаниям в отношении матери или плода. Эти четыре рождения были исключены при сравнении микроорганизмов между преждевременными и срочными родами. Было шесть родов (пять спонтанных) <34 недели ГВ (3 %) и двое с массой при рождении <1500 г (1 %).
Таблица 1: Демографические характеристики, характеристики, связанные с родами и образом жизни женщин в исследовании
Демографические и связанные с родами
n= 191
Материнский возраст (л)
30 (26-3 3;18-43)
Европеоиды
119(62 %)
ГВ при родах
39 (38-40; 26-42)
ГВ <37 недель
17(9 %)
Масса при рождении (г)
3435 (3080-3733,690-4794)
Мужской пол
92 (48 %)
Образ жизни и лекарственные препараты
n = 189
Текущий прием антибиотиков, противогрибковых илипробиотических препаратов
8(4 %)
УГИ когда-либо в анамнезе
75 (40 %)
Молочница когда-либо в анамнезе
91 (48 %)
Молочница > 2 раз
12(13 %)
Курят в настоящее время
21 (11 %)
Сигареты >10/сутки
5(3 %)
Курили ранее
50 (27 %)
Сигарет >10-20/сутки
13(7 %)
Сигареты >20/сутки
5(3 %)
Употребляют алкоголь в настоящее время
4(2 %)
> 5 доз алкоголя/нед.
1 (0,5 %)
Употребляли алкоголь раньше
108 (57 %)
> 1 доза алкоголя/нед.
17(9 %)
> 1-4 дозы алкоголя/нед.
64 (34 %)
> 5 доз алкоголя в неделю
18(9 %)
Половые контакты в настоящее время
< 1 нед.
42 (23 %)
1-2 раза/нед.
96 (52 %)
> 3 раз/нед.
48 (26 %)
л-лет, ГВ-гестационный возраст, нед.-недели, г-граммы
а
Данные представляют медиану (межквартильный диапазон; диапазон) или N (%), в зависимости от ситуации
Обнаружение вагинальных Ureaplasma, Mycoplasma и Candida spp. во время беременности
[0091] Частоты обнаружения Ureaplasma spp., Mycoplasma spp. и Candida spp. во влагалище значительно варьировались как на уровне рода, так и на уровне вида (таблица 2). Ureaplasma spp. были наиболее распространенными среди трех обнаруженных организмов, которые присутствуют у 44-48 % женщин в трех точках отбора образцов. В этом роде наиболее часто обнаруживаем видом был U. parvum, в 3-4 раза более распространенным, чем U. urealyticum (таблица 2).
[0092] Candida spp. был вторым наиболее часто обнаруживаемым организмом, который присутствовал у 34-38 % женщин. В этом роде C. albicans был наиболее часто обнаруживаем видом, в 6-25 и 10-24 раза более распространенным, чем C. glabrata и Candida spp., отличных от albicans/glabrata, соответственно (Таблица 2).
[0093] Частоты обнаружения M. hominis и M. genitalium были значительно ниже, чем Ureaplasma spp. и Candida spp. Частоты обнаружения M. hominis варьировались от 8 до 11 % по трем точкам отбора образцов, тогда как для M. genitalium частоты варьировались от 2 до 3 % (таблица 2).
Таблица 2: Частоты обнаружения вагинальных Ureaplasma, Mycoplasma и Candida spp. во время беременности
Организмы
Временная точка 1 (n = 191)
Временная точка 2(n = 154)
Временная точка 3 (n = 152)
Гестация при сборе образцов (нед.)
21 (13-26)
29 (24-38)
36 (32-40)
Ureaplasma spp.
91 (48 %)
74 (48 %)
67 (44 %)
U. parvum
74 (39 %)
63 (41 %)
53 (35 %)
SV1
11 (5,8 %)
10 (6,5 %)
10(6,6 %)
SV3
27 (14,1 %)
20(13 %)
19(12,5 %)
SV6
31 (16,2 %)
24 (15,6 %)
18(11,8 %)
SV6.1
1 (0,5 %)
1 (0,6 %)
1 (0,7 %)
SV14
0(0 %)
0(0 %)
0(0 %)
Смешанные
2 (1 %)
2(1,3 %)
3 ( 2%)
Слишком слабый, чтобы определить
0(0 %)
3(1,9 %)
0(0 %)
Отсутствие амплификации
2 (1 %)
2 (1,3 %)
2 (13 %)
U. urealyticum
25 (13 %)
15 (10 %)
16(11 %)
Candida spp.
73 (38 %)
53 (34 %)
52 (34 %)
C. albicans
63 (33 %)
50 (33 %)
48 (32 %)
C. glabrata
10(5 %)
2(1 %)
3 (2 %)
Отличные от albicans/glabrataCandida spp.
5 (3 %)
5(3 %)
2 (1 %)
M. hominis
21 (11 %)
12 (8 %)
16(11 %)
M. genitalium
6(3 %)
3(2 %)
4 (3 %)
a
Из-за различий в соответствии выборки, очевидное уменьшение или увеличение генотипов в течение трех временных точек не свидетельствует о стабильности генотипа
b
Представляет медиану, диапазон
c
Те же участники исследования
Сравнение культуры и ПЦР в реальном времени для обнаружения Ureaplasma spp.
o
2
2
Частоты обнаружения Ureaplasma spp. при помощи культивирования в бульоне 10B при 37 C (5% CO, 95% N) были практически идентичны частотам обнаружения при помощи ПЦР в реальном времени. Соответствие между этими двумя методами составило 99, 100 и 100 % в трех временных точках, соответственно.
Генотипирование U. parvum методом ПЦР с высокоразрешающим плавлением
[0095] HRM-ПЦР была способна различить единичные генотипы U. parvum в 91% колонизированных клинических образцов. U. parvum генотипа SV6 был наиболее часто обнаруживаемым, за ним следуют SV3, SV1 и SV6.1, соответственно. Ни в одном из случаев не был обнаружен генотип SV14 (таблица 2). Еще 3 % случаев различали до уровня «смешанного» генотипа, что свидетельствует о присутствии двух или более генотипов U. parvum в одном и том же образце. Также было небольшое количество случаев, когда или амплификация была слишком слабой, чтобы получить кривую плавления, достаточную для установление различий по генотипу (1%), или амплификация вообще не происходила (3%). Кроме того, для одного участника исследования все три образца дали слегка отличающиеся кривые HRM, которые при секвенировании ДНК показали четыре уникальных нуклеотидных полиморфизма в пределах целевой области гена mba, что не указывает ни на один из четырех охарактеризованных генотипов U. parvum. Последовательность наиболее близко соответствовала генотипу SV6, и в результате ее отнесли к генотипу SV6.1.
Динамика вагинальной колонизации
[0096] Из 191 участника исследования 134 предоставили образцы во всех трех временных точках. У этих женщин частоты обнаружения всех организмов показали минимальную дисперсию на протяжении всего исследования (Фиг. 1). У M. genitalium (1,5 % во всех трех точках) наблюдали самую низкую дисперсию среди всех обнаруженных организмов, за которым следовали U. parvum (36,6-37,3 %), U. urealyticum (9,7-11,2 %) и Candida spp., отличных от albicans/glabrata (0,7-2,2 %), C. albicans (32,1-34,3%) и M. hominis (9-11,2 %) и, наконец, C. glabrata (1,5-5,2 %). Эти результаты включают один случай, когда U. parvum/U. urealyticum были обнаружены при отборе образцов во время набора в исследование, после чего в последующих образцах U. urealyticum повторно не обнаруживали.
[0097] Аналогично, в любой из трех временных точек было очень мало различий в определении генотипа U. parvum. Почти во всех случаях генотип, обнаруженный при наборе в исследование, сохранялся во второй и третьей временных точках. Единичные исключения были в одном случае, когда участник, колонизированный U. parvum генотипа SV6 при наборе в исследование, демонстрировал смешанный генотипический профиль в более поздние временные точки, и в другом случае, когда смешанные генотипические профили были обнаружены во всех трех временных точках. Поэтому невозможно утверждать, что в каждом случае присутствовала одна и та же комбинация генотипов из-за ограничений HRM-анализа. Также были еще два случая, когда при помощи HRM-анализа не удалось достичь достаточной амплификации для второго образца, чтобы обеспечить точное разделение по генотипу. Однако в обоих этих случаях идентификаторы генотипа первого и третьего образцов были сходны.
Связь между фармацевтическими факторами и факторами образа жизни и обнаружением организмов при наборе в исследование
[0098] На основании ответов, предоставленных 189 участниками исследования при наборе в исследование (таблица 3), Ureaplasma spp. и Mycoplasma spp. чаще выявлялись у женщин, которые ранее курили (Ureaplasma spp.- у 37 % присутствовали и у 17 % отсутствовали, р = 0,002; и Mycoplasma spp. - у 44 % присутствовали и у 24 % отсутствовали, р = 0,036) и у женщин, которые имели половые сношения ≥ 3 раза в неделю во время беременности (Ureaplasma spp. - у 35 % отсутствовали и у 18 % отсутствовали, р = 0,018; и Mycoplasma spp. - у 56 % присутствовали и 21% отсутствовали, р = 0,001).
[0099] Candida spp. чаще выявлялись у женщин, которые продолжали курить во время беременности (Candida spp. - у 18 % присутствовали и у 7 % отсутствовали, р = 0,020).
Таблица 3: Связь между фармацевтическими характеристиками/характеристиками, связанными с образом жизни, и обнаружением Ureaplasma, Mycoplasma and Candida spp. при наборе в исследование (n = 189)
Связь между микробной колонизацией влагалища и спонтанными преждевременными родами
Спонтанные преждевременные роды на <37 нед. ГВ
6
5
[00100] Общие характеристики для микроорганизмов из вагинальных образцов, полученных во время исследования, представлены в таблице 4.При наборе в исследование Ureaplasma spp. были обнаружены чаще [85% (95% ДИ: 62-100%) против 45% (37-52%), р = 0,006] в образцах от женщин, родивших преждевременно, по сравнению с теми, кто родил в срок (таблица 4). На уровне видов присутствие U. parvum было значительно увеличено среди пациентов с ПВР [77% (50-100%) против 36% (29-43%), р = 0,004]. Была небольшая, но значимая связь между титром U. parvum и ПВР, со средним титром U. parvum 10 ЦИЕ в случаях ПВР против 10 ЦИЕ для случаев срочных родов. Генотипы SV3 и SV6 U. parvum были одинаково представлены среди доношенных беременностей; однако у женщин, имевших преждевременные роды, генотип SV6, который был значительно более распространенным, был обнаружен в 54% (22-85%) случаев преждевременных родов по сравнению с 15% (10-20%) случаями срочных родов (р = 0,002). При обнаружении по отдельности присутствие Candida spp. не было связано с ПВР на уровне рода или вида. Однако, когда C. albicans был обнаружен вместе с U. parvum, наблюдали значительную положительную связь с ПВР [46% (15-78%) против 13% (8-18%), р = 0,005]. Эта связь усиливалась, когда присутствовал U. parvum генотипа SV6 [39% (8-69%) против 7% (3-11%), р = 0,003].
[00101] Не было очевидной связи между присутствием Mycoplasma spp. и ПВР; тем не менее, M. genitalium чаще встречался в образцах, полученных при наборе в исследование, от женщин, родивших преждевременно или срочно (15 против 2%, соответственно), и этот результат имел тенденцию к повышению значимости (p = 0,057). Аналогично, Candida spp. были также более распространены в образцах, полученных при наборе в исследование, от женщин, которые родили преждевременно или срочно (54 против 36%, соответственно); однако это различие не было статистически значимым (р = 0,241).
[00102] Не было обнаружено связи между ПВР и присутствием или U. urealyticum, C. albicans, C. glabrata, Candida spp., отличные от albicans/glabrata, или M. hominis.
Таблица 4: Частота вагинальной колонизации Ureaplasma, Mycoplasma и Candida spp. при наборе в исследование у женщин, родивших спонтанно преждевременно или срочно
Спонтанные преждевременные роды на <34 неделе ГВ и масса при рождении <1500 г
[00103] Пятеро детей родились на <34 неделе ГВ, в том числе двое массой <1500 г (таблица 5). U. parvum была обнаружена при наборе в исследование во всех случаях, и в 80% (4/5) из них определяли генотип SV6. При четырех самых ранних преждевременных родах (25,9-31,4 нед. ГВ) при наборе в исследование были обнаружены как U. parvum, так и C. albicans (таблица 5). К сожалению, из-за недостаточного количества данных в отношении риска ПВР на <34 неделе ГВ не были выполнены статистические анализы.
Пример 2
Исследование Predict1000 - Микробные биомаркеры для предотвращения преждевременных родов
Будут проведены два исследования: большое когортное исследование женщин, обращающихся за дородовым наблюдением, и меньшее подисследование новых микробных биомаркеров.
Когортное исследование
[00104] Это исследование расширит данные о распространенности U. parvum, U. urealyticum и M. hominis во влагалище во время беременности и расширит их еще больше, определив распространенность ключевых организмов, связанных с БВ, в этой когорте.
[00105] Кроме того, в исследовании будут документировать рН влагалищного отделяемого и уровни сиалидазы во время беременности, и это предоставит достаточную возможность выявления связей между всеми этими факторами, а также первичными и вторичными исходами. К участию будут приглашены как нерожавшие, так и повторнородящие женщины, посещающие дородовые женские консультации в KEMH до 20 недели беременности в течение 12 месяцев. Набор в исследование будет продолжаться за счет предпочтительного отбора женщин с предшествующими ПВР. Женщины будут считаться не соответствующими критериям участия, если они принимают антибиотики или противогрибковые препараты, имеют многоплодную беременность, имеют цервикальный шов или используют вагинальный прогестерон.
Первичные и вторичные конечные точки
[00106] Основная конечная точка представляет собой ПВР до 37-й недели беременности
[00107] Среди вторичных конечных точек: ПВР до 34-й недели беременности; угроза преждевременных родов в любом гестационном возрасте; ПРПО (преждевременный разрыв плодных оболочек); низкая масса при рождении; очень низкая масса при рождении; сепсис новорожденных или другие заболевания; клинический и/или гистологический хориоамнионит.
[00108] Участие будет включать:
i) Заполнение опросника с вопросами по образу жизни, рациону питания, сексуальной активности, инфекциям (текущим/предыдущим) и любом применении антибиотиков/пробиотиков в течение предыдущих 12 месяцев.
ii) Мазок заднего свода влагалища, собранный акушеркой-исследователем с помощью медицинского зеркала для анализа микробной ДНК (кПЦР) и измерения уровня сиалидазы (анализ расщепления флуоресцентного субстрата).
iii) Второй мазок для микробной культуры (Ureaplasma spp. и M. hominis).
iv)Оценка рН влагалищного отделяемого.
v) Сбор плаценты после всех родов на <34 неделе беременности в соответствии с процедурой, утвержденной в больнице.
Подисследование новых микробных биомаркеров
[00109] Это подисследование будет включать метагеномный анализ влагалищных мазков, взятых у всех женщин в когортном исследовании, которые родили до 34-й недели беременности после спонтанных ПВС или ПРПО, сопоставимого с аналогичным числом женщин, родивших в срок путем кесаревого сечения без осложнений. По нашим оценкам, 50 случаев противопоставляют 50 контрольным. Это подисследование обеспечит данные по родам и видам, касающиеся состава микробных сообществ влагалища во время беременности. Оно также будет сравнивать вагинальные микробные сообщества недоношенных и доношенных беременностей, выявляя микробные роды и виды, связанные с риском развития ПВР, и значительно повышая диагностическую чувствительность системы оценивания рисков.
[00110] Сбор плаценты после всех родов со сроком гестации, не превышающем 34 недели, будут проводить для гистологического исследования и культивирования микроорганизмов в соответствии с рутинной клинической практикой. Кроме того, субамниотические мазки будут взяты из четырех мест на плацентарной ячейке для отбора образцов любой микробиоты, связанной с интраамниотической инфекцией (без загрязнения влагалища матери). Вагинальные и плацентарные мазки будут ретроспективно проанализированы с использованием метагеномного анализ генов 16S рРНК, чтобы подтвердить, что влагалище является источником внутриамниотической инфекции путем сравнения микробных сообществ.
Сбор образцов и необходимость лечения
[00111] Все беременные женщины, которые посещают KEMH, обычно проходят скрининг на Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae путем анализа мочи и получают соответствующее лечение. Кроме того, любые симптомы, свидетельствующие о вагинальной инфекции, такой как кандидоз, вызванной Candida spp., купируют путем взятия соответствующих образцов и назначения лечения. Вагинальные мазки, собранные во время исследования, будут культивировать при помощи используемых в настоящее время наших протоколов культивирования Ureaplasma spp. и M. hominis.
[00112] Связанная с культурой часть этого исследования будет в основном использоваться для каталогизации изолятов для будущих штамм-специфических анализов. В дополнение к культуре оба этих организма, наряду со связанных с БВ организмами, G. vaginalis, A. vaginae, Megasphaera spp. и ассоциированными с бактериальным вагинозом бактериями-2 (BVAB-2), будут определять и полуколичественно анализировать при помощи ПЦР в реальном времени. Candida spp. будут определять с использованием ПЦР-анализа в реального времени, как ранее описано CIC Payne (P011679345).
[00113] pH влагалищного отделяемого и уровни сиалидазы также будут измерять с помощью тест-перчаток для измерения pH и анализа расщепления флуоресцентного субстрата, соответственно.
Сбор и анализ образцов
Вагинальные мазки
[00114] Во время исследования будут использоваться два набора для взятия мазков. Первым из них является клинически подтвержденный набор с универсальной транспортной средой (UTM), специфической для Ureaplasma/Mycoplasma (Copan Diagnostics). Наборы с UTM содержат ворсистый зонд-тампон и флакон с UTM, предназначенные для поддержки роста видов Ureaplasma/Mycoplasma spp. В дополнение к этому, для сбора всех образцов для молекулярного анализа будет использоваться высокоплотный ворсистый зонд-тампон (Copan Diagnostics).
Анализ культуры
[00115] После сбора зонды-тампоны немедленно поместят акушеркой в UTM, закроют крышкой и будут хранить при температуре 4 °С не более 24 часов до обработки. 200 мкл образца будут добавлены к 1,8 мл среды 10B, содержащей мочевину (Ureaplasma spp.) и среды 10B, содержащей аргинин (M. hominis), и инкубированы при 37°C/48-120 часов. Положительные культуры будут очищены с использованием способа микроразведения бульона, и 1 мл культуры будет заморожен при -80°C для будущих генотипических анализов.
ПЦР-анализ
[00116] Ворсистые вагинальные зонды-тампоны будут помещены обратно в пробирку для сбора и немедленно сохранены при 4 °С в течение <24 ч до обработки. Мазки будут тщательно ресуспендированы в 2 мл ФСБ; 100 мкл аликвоты будет удалено для измерения уровней вагинальной сиалидазы, а оставшийся объем элюата будет центрифугирован при 20000 × g, 4 °C в течение 20 минут, а супернатант удален. Гранулы будут ресуспендированы в 250 мкл ФСБ и ДНК, выделенных из всего объема с использованием универсального набора Stratec InviMag Universal Bacteria (ThermoFisher) на платформе для экстракции Kingfisher.
[00117] Полуколичественные ПЦР-анализы в реальном времени будут использоваться для выявления U. parvum и U. urealyticum (1), M. hominis (2), положительных и отрицательных по сиалидазе G. vaginalis (3), A. vaginae, Megasphaera spp. и BVAB-2 (4) в системе для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems ViiA7. Все положительные по U. parvum мазки будут дополнительно проанализированы с использованием генотипирования методом ПЦР с высокоразрешающим плавлением (5) для фиксации случаев одиночной и смешанной колонизации сероваром.
Метагеномика
[00118] Выделение ДНК из вагинальных и плацентарных мазков будет проводиться, как описано выше. Для всех экстрактов после подтверждения присутствия бактериальной ДНК с помощью ПЦР весь ген 16S рРНК будет амплифицирован с использованием набора праймеров 8F/1492R (6) (полный размер 1,5 кб) и положительных ампликонов, очищенных с помощью набора для ПЦР-очистки QIAGEN PCR. Очищенные ампликоны ПЦР из отдельных образцов будут иметь прикрепленные адаптеры и баркоды для секвенирования и подвергаться секвенированию на платформе PacBio Sequel для секвенирования нового поколения. Данные последовательности будут обрабатываться с использованием программного пакета Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (7). Для филогенетической информации, гомологии последовательностей 97% и 99% будут использоваться для идентификации рода и вида, соответственно.
Гистопатология плаценты и микробиологический анализ
[00119] Плаценты всех пациенток с ПВР на ≤34-й неделе беременности будут доставлены в гистопатологическое отделение для гистопатологического и микробиологического исследования в рамках ведения пациенток в рутинной клинической практике. Мы ожидаем, что будет около 50 случаев родов на <34-й неделе беременности. В качестве контроля будет использоваться равное количество плацент от срочного родоразрешения путем кесарева сечения.
[00120] Гистопатологическое исследование будет выполнено опытным перинатальным патоморфологом, ослепленным по отношению к клиническим результатам. Полуколичественное гистологическое оценивание экстрацентральных мембран, пуповины, хориона и плаценты будет проводиться с использованием нашей стандартной системы оценивания.
[00121] Все собранные плаценты будут культивировать, как описано ранее. Субамниотический мазок культивируют в отношении аэробных организмов в дополнение к Haemophilus influenzae.
[00122] Часть этого образца будет доставлена в исследовательские лаборатории для выделения микробной ДНК для метагеномного анализа для сравнения с соответствующим вагинальным образцом.
Сбор данных, связанных с образом жизни и клиническими исследованиями
[00123] Материнские опросники будут вопросы о таких симптомах, как вагинальные выделения или раздражения, дизурии, недавние/прошлые инфекции мочевыводящих путей или вагинальные инфекции, о практике курения, частоте/характере половых контактов и использовании антибиотиков/пробиотиков. Данные по акушерскому и неонатальному исходу для всех женщин в исследовании будут получены из больничных баз данных.
Статистическая мощность
2
[00124] Общая частота ПВР в KEMH составляет 25%, а распространенность по всему штату составляет 8,8%; мы ожидаем, что набор пациентов в наши клиники с обогащением в отношении пациентов с высоким риском приведет к частоте ПВР не менее 15%. Размер выборки из 1000 женщин, используемой в логистическом регрессионном анализе, в котором мы будем моделировать риск ПВР, достигнет мощности не менее 90% для выявления последствий микробной колонизации, превышающей двукратное увеличение риска ПВР (эквивалент отношения шансов ≥2,50), когда частота ПВР составляет не менее 12,0% (то есть от 12,0 до 25,4% или от 15,0 до 30,6%), одновременно корректируя другие соответствующие микробиологические данные и клинические факторы риска с частичным r = 0,1
Статистический анализ
[00125] Распространенность колонизации генитальными микоплазмами, различными сероварами U. parvum и микрофлорой, связанной с БВ, будет оценена с использованием биномиального распределения. Первичный статистический анализ позволит получить прогностические оценки для ПВР, связанных с бактериальной инфекцией, для выявления женщин с высоким риском, используя микробный профиль только на ранних сроках беременности и микробный профиль, скорректированный с учетом других соответствующих материнских и акушерских характеристик. Для определения баллов микробного риска и скорректированных баллов микробного риска по всем первичным и вторичным клиническим конечным точкам будет использоваться однофакторный и многофакторный логистический регрессионный анализ. Логистический регрессионный анализ для получения этих микробных прогностических оценок риска ПВР будет дополнен моделями рекурсивного секционирования, такими как бинарные, регрессионные деревья и деревья выживаемости, предназначенные для изучения нелинейных отношений внутри микробных профилей и с другими факторами риска в акушерстве перед выполнением логистического регрессионного анализа. Вторичную оценку величины влияния микробных профилей на гестационный возраст при родах и гестационный возраст, когда возникают вторичные клинические конечные точки, будут проводить с использованием пропорциональной регрессии Кокса. Сравнения между вагинальным и плацентарным микробными профилями при недоношенных и доношенных беременностях будут проводить с использованием анализ главных компонентов.
[00126] Некоторые данные были получены из исследования Predict1000. В таблице 6 приведено присутствие/отсутствие всех бактерий в отношении которых в данном исследовании был проведен скрининг, в связи сПВР, нсПВР и срочных родов.
Таблица 6: Присутствие/отсутствие видов бактерий в исследовании Predict1000.
Недели ГВ при родах
сПВР
нсПВР
Срочные
N
(%)
N
(%)
N
(%)
UP3 и/или UP6
Нет
31
55,4 %
34
54,8 %
510
62,3 %
Да
25
44,6 %
28
45,2 %
308
37,7 %
c_GassCrispJens_or01
Нет
48
85,7 %
40
66,7 %
563
68,8 %
Да
8
14,3 %
20
33,3 %
255
31,2 %
c_LIners
Нет
26
46,4 %
27
44,3 %
402
49,1 %
Да
30
53,6 %
34
55,7 %
416
50,9 %
c_Gvag
Нет
26
46,4 %
27
43,5 %
380
46,5 %
Да
30
53,6 %
35
56,5 %
438
53,5 %
c_Fnucl
Нет
41
73,2 %
45
72,6 %
656
80,2 %
Да
15
26,8 %
17
27,4 %
162
19,8 %
c_Pepto
Нет
41
73,2 %
35
56,5 %
599
73,2 %
Да
15
26,8 %
27
43,5 %
219
26,8 %
c_CAlb
Нет
49
87,5 %
52
83,9 %
686
83,9 %
Да
7
12,5 %
10
16,1 %
132
16,1 %
c_AVag
Нет
19
33,9 %
15
24,2 %
202
24,7 %
Да
37
66,1 %
47
75,8 %
616
75,3 %
c_Sialid
Нет
37
66,1 %
36
58,1 %
512
62,6 %
Да
19
33,9 %
26
41,9 %
306
37,4 %
c_Lamni
Нет
50
89,3 %
55
88,7 %
736
90,0 %
Да
6
10,7 %
7
11,3 %
82
10,0 %
c_Ssang
Нет
54
96,4 %
57
91,9 %
770
94,1 %
Да
2
3,6 %
5
8,1 %
48
5,9 %
c_Mindo
Нет
55
98,2 %
60
96,8 %
806
98,5 %
Да
1
1,8 %
2
3,2 %
12
1,5 %
c_Mhomi
Нет
54
96,4 %
55
88,7 %
798
97,6 %
Да
2
3,6 %
7
11,3 %
20
2,4 %
c_Mgenit
Нет
56
100,0 %
61
98,4 %
816
99,8 %
Да
0
.0 %
1
1,6 %
2
.2 %
c_Prevo
Нет
56
100,0 %
62
100,0 %
818
100,0 %
c_Mobil
Нет
56
100,0 %
62
100,0 %
818
100,0 %
Пример 3
Клиническое исследование программы «скрининг - лечение»
Дизайн исследования
[00127] Проспективное открытое рандомизированное клиническое исследование новой микробиологической программы «скрининг - лечение» для профилактики преждевременных родов.
[00128] Выявление в середине беременности невыбранных женщин с одноплодными беременностями и микробными профилями влагалища, связанными с повышенным риском ПВР, с последующим целевым противомикробным лечением, снизит частоту спонтанных преждевременных родов на по меньшей мере 30%.
Критерии включения и невключения
[00129] Женщины будут соответствовать критериям включения, если у них будет одноплодная беременность, ≥16 лет и подтвержденный ультразвуком ГВ.
[00130] Женщины не будут соответствовать критериям включения, если у них многоплодная беременность, симптомы вагинальных инфекций, вагинальное кровотечение, разрыв плодных оболочек, активные схватки, противомикробная терапия ≤14 суток до набора в исследование.
Первичные и вторичные конечные точки
[00131] Основной конечной точкой является ≥ 30% снижение сПВР на ≤ 37 неделе в группе вмешательства по сравнению с контрольной группой.
[00132] Среди вторичных конечных точек - основные критерии эффективности, включая сПВР ≤ 34 и 28 недель, выкидыш, масса при рождении ≤ 2500 г и ≤ 1500 г, ятрогенные ПВР, сПВР у положительных по GLU женщин; ПРПО, преэклампсия, ответ на терапию, материнская смертность и сепсис, неонатальная смертность, сложная неонатальная заболеваемость, госпитализация/длительность пребывания в ОРИТН, неонатальный сепсис (поздний или ранний), задержка внутриутробного развития и гистологический хориоамнионит.
Набор пациентов в исследование
[00133] Будут набираться женщины, посещающие дородовые женские консультации на 18-20 недели беременности в трех родильных домах Западной Австралии (KEMH, Osborne Park Hospital и SJOG-Midland Hospital). После получения информированного согласия и присвоения идентификационного номера в исследовании будут собраны исходные демографические данные. Женщины будут самостоятельно собирать предварительно помеченный вагинальный Eswab COPAN (содержащий стабилизирующую жидкость, которая сохраняет целостность микроорганизмов в течение 24 часов при комнатной температуре), который будет помещен в коробку для ежедневного сбора и транспортировки в централизованную лабораторию для хранения при температуре -80°C и последующего извлечения и анализа.
Рандомизация и ослепление
[00134] Рандомизацию или в группу вмешательства, или в контрольную группу будут выполнять с помощью специализированной программы рандомизации, которая будет случайным образом распределять в группу лечения при стратификации по неспособности к деторождению, ПВР в анамнезе и исследовательскому центру (соотношение распределения 1:1). Распределение по группам будут проводить в офисе координации исследований Фонда исследований женщин и младенцев (WIRF). Ошибки при распределении в группы можно избежать путем рандомизации участников, ослепленных в отношении процедуры тестирования на GLU. Все зонды-тампоны будут обработаны и подвергнуты скринингу в соответствии с одним и тем же протоколом; обработка образцов и уведомление о результатах будут произведены в течение 4 рабочих суток после сбора образцов.
[00135] Для участников контрольной группы результат скринингового теста не будет раскрыт участникам до окончания исследования, и им будут продолжать ведение нормальной беременности (включая лечение, если появляются симптомы вагинальной инфекции). Они не будут уведомлены о своем распределении до тех пор, пока не завершится стадия набора в исследование и родов в исследовании. Плацебо не будет использоваться, поскольку а) плацебо может само по себе влиять на вагинальную микробиоту и дисбактериоз; b) знание статуса колонизации может изменить поведение участников; и c) это будет отходить от нормальной акушерской помощи, которая является основным компаратором в этом исследовании.
[00136] Женщины в группе вмешательства будут уведомлены об их распределении в группу и статусе скрининга (положительном или отрицательном) примерно через неделю после набора в исследование. Для тех, у кого положительный результат, результаты теста будут отправлены акушерке, которая набирает их в исследование; затем акушерки свяжутся с ними, предоставив эту информацию и рекомендованный план лечения (см. ниже). Затем участникам будет выслан пакет с лекарственными средствами с учетом результатов скринингового теста. Женщины в группе вмешательства не будут ослеплены по отношению к распределению, так как их нужно будет информировать об их статусе, чтобы они могли получить лечение.
[00137] Данные о результатах родов будут получены из медицинских и частных медицинских карт.
Скрининговый тест
[00138] Мазки будут проанализированы при помощи мультиплексного ПЦР-анализа на GLU. Выделение ДНК и анализ будут проводить в лаборатории молекулярной микробиологии с использованием автоматизированных технологий для достижения оптимальной эффективности, точности и длительности циклов обработки. ДНК также будет храниться для углубленного анализа микробиома в последующих исследованиях для изучения улучшений в прогнозировании риска и ответа на лечение.
Вмешательство
[00139] Женщины, которые являются положительными в отношении GLU, получат азитромицин для перорального приема (250 мг в течение 7 суток) и вагинальный крем с клиндамицином (2%) в течение 7 суток. Это стандартные схемы приема антибиотиков, которые широко используются при беременности. Сразу после противомикробного лечения женщины начнут вагинальную терапию пробиотиком Canesflor (Bayer). Лечение состоит из одной вагинальной капсулы каждую ночь в течение шести последовательных суток, за которой следует одна капсула в неделю в течение четырех недель.
[00140] Через несколько суток после того, как лекарственные средства будут отправлены по почте, акушерки-исследователи с участниками будут связываться по телефону/при помощи почты исследования, чтобы убедиться, что участники получили свой рецепт и проверяют на понимание инструкций и комплаентность. Женщин из группы вмешательства попросят повторно взять мазки через 26-28 недель (после завершения 5-недельного курса пробиотиков) и отправить их по почте в день сбора, используя почтовый конверт с предварительно напечатанным адресом получателя в лабораторию на повторное тестирование. Результаты будут затем переданы им через акушерок-исследователей. В это же время будет также возвращен опросник по соблюдению пациентом инструкций по приему лекарственным средствам и обратной связи. Исходя из опубликованных данных об эффективности противомикробного лечения БВ с терапией пробиотиком, мы ожидаем, что успех лечения превысит 90%.
Статистическая мощность
[00141] Исходя из частоты ПВР для одноплодных беременностей в Западной Австралии в 2015 году, равной 6,9%, при условии, что 70% из них являются сПВР (9) (4,83% от всех родов), при наборе в исследование 3087 женщин на группу (6174 в целом) будет достигнута 80% мощность для выявления 30% снижения частоты сПВР в группе вмешательства - с 4,83% до 3,38% - при использовании двустороннего z-критерия для пропорции при р = 0,05; ожидается, что примерно 494 женщины в группе будут иметь положительный результат. Этот размер выборки также позволяет выполнять единый промежуточный анализ с помощью затратной альфа-функции О'Брайена-Флеминга, используемой для определения пределов теста (программное обеспечение для анализа мощности и оценка объема выборки PASS, 2015). Так как из медицинских карт всех женщин в электронном виде будет извлечен ГВ при родах, никаких корректировок для учета выпавших из-под последующего наблюдения внесено не было.
Статистический анализ
[00142] Статистический анализ будет проводить по принципу анализа в зависимости от назначенного лечения, с вторичной оценкой полученного лечения, основанного на мазках, собранных в течение 26-28 недель ГВ. Исходы ПВР между группами будут проанализированы с использованием z-критерия для пропорций. Дополнительный логистический регрессионный анализ будут проводить для оценки групповых различий в частотах сПВР и категориальных вторичных исходах, с учетом корректировок в отношении факторов стратификации и путаницы из-за характеристик, связанных с беременной женщиной и/или беременностью. Бинарные и номинальные логистические регрессии будут выполнять для оценки влияния факторов микробного риска, используемых в качестве скрининговых критериев в исследовании (PASS 2014). Эти регрессии также будут учитывать дополнительные микробиологические и иммунологические данные, отдельно и вместе с характеристиками, связанными с беременной женщиной и беременностью, чтобы уточнить факторы риска для сПВР и вывести уравнения риска для будущей реализации. Все проверки гипотез будут двусторонними при р = 0,05.
Ссылки
(1) vanʼt Hooft J, Duffy JM, Daly M, Williamson PR, Meher S, Thom E, Saade GR, Alfirevic Z, Mol BW, Khan KS; Global Obstetrics Network (GONet). (2016) A Core Outcome Set for Evaluation of Interventions to Prevent Preterm Birth. Obstet Gynecol. 127(1):49-58.
(2) Payne MS, Ireland DJ, Watts R, Nathan EA, Furfaro LL, Kemp MW, Keelan JA, Newnham JP. (2016) Ureaplasma parvum genotype, combined vaginal colonisation with Candida albicans, and spontaneous preterm birth in an Australian cohort of pregnant women. BMC Pregnancy Childbirth. 16:312.
(3) Lamont RF. (2015) Advances in the prevention of infection-related preterm birth. Front Inflammation. 6:566.
(4) Kiss H, Petricevic L, Husslein P. (2004) Prospective randomised controlled trial of an infection screening programme to reduce the rate of preterm delivery. BMJ. 329:371.
(5) Kiss H, Petricevic L, Martina S, Husslein P. (2010) Reducing the rate of preterm birth through a simple antenatal screen-and-treat programme: A retrospective cohort study. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 153:38-42.
(6) Griffin C. (2015) Probiotics in obstetrics and gynaecology. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 55:201-9.
(7) Parma M, Stella Vanni V, Bertini M, Candiani M. (2014) Probiotics in the prevention of recurrences of bacterial vaginosis. Alternative Therap Health Med. 20 Suppl. 1:52-7.
(8) Newnham JP, White SW, Meharry S, Lee HS, Pedretti MK, Arrese CA, Keelan JA, Kemp MW, Dickinson JE, Doherty DA. (2017) Reducing preterm birth by a statewide multifaceted program: an implementation study. Am J Obstet Gynecol. 216(5):434-442.
(9) Romero R, Dey SK, Fisher SJ. (2014) Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345(6198):760-5.
(10) Bahat Dinur A, Koren G, Matok I, Wiznitzer A, Uziel E, Gorodischer R, Levy A. Fetal safety of macrolides. Antimicrob Agents Chemother. 2013. 57(7):3307-11.
(11) Yi J, Yoon BH, Kim EC. (2005) Detection and biovar discrimination of Ureaplasma urealyticum by real-time PCR. Mol Cell Probes. 19(4):255-260.
(12) Ferandon C, Peuchant O, Janis C, Benard A, Renaudin H, Pereyre S, Bebear C. (2011) Development of a real-time PCR targeting the yidC gene for the detection of Mycoplasma hominis and comparison with quantitative culture. Clin Microbiol Infect. 17(2):155-9.
(13) Santiago GL, Deschaght P, El Aila N, Kiama TN, Verstraelen H, Jefferson KK, Temmerman M, Vaneechoutte M. (2011) Gardnerella vaginalis comprises three distinct genotypes of which only two produce sialidase. Am J Obstet Gynecol. 204(5):450.
(14) Cartwright CP, Lembke BD, Ramachandran K, Body BA, Nye MB, Rivers CA, Schwebke JR. (2012) Development and validation of a semiquantitative, multitarget PCR assay for diagnosis of bacterial vaginosis. J Clin Microbiol. 50(7):2321-9.
(15) Payne, MS, Tabone T, Kemp MW, Keelan JA, Spiller OB, Newnham JP. (2013) High-resolution melt PCR analysis for the genotyping of Ureaplasma parvum directly from clinical samples. J Clin Microbiol. 52(2):599-606.
(16) Klindworth A, Pruesse E, Schweer T, Peplies J, Quast C, Horn M,  (2011) Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41(1).
(17) Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, Fierer N,  Goodrich JK, Gordon JI, Huttley GA, Kelley ST, Knights D, Koenig JE, Ley RE, Lozupone CA, McDonald D, Muegge BD, Pirrung M, Reeder J, Sevinsky JR, Turnbaugh PJ, Walters WA, Widmann J, Yatsunenko T, Zaneveld J, Knight R. (2010) QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. (5):335-6.
(18) Jensen JS, Bjornelius E, Dohn B, Lidbrink P. (2004) Use of TaqMan 5′ nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol. 42(2):683-92.
(19) Innings A, Ullberg M, Johansson A, Rubin CJ, Noreus N, Isaksson M, Herrmann B. (2007) Multiplex real-time PCR targeting the RNase P RNA gene for detection and identification of Candida species in blood. J Clin Microbiol. 45(3):874-80.