АНТИТЕЛА ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ИМИГЛЮЦЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
ANTIBODIES FOR BINDING OF IMIGLUCERASE AND USE THEREOF IN AFFINITY CHROMATOGRAPHY

Изобретение относится к промышленной медицинской биотехнологии и может найти применение при хроматографической очистке имиглюцеразы из культуральных жидкостей клона-продуцента. Изобретение относится также к последовательностям к одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) антитела, к их моновалентным и двухвалентным (ди-антитело) формам, которые являются специфичными в отношении имиглюцеразы человека. Полноразмерные антитела, полученные с использованием данных фрагментов, также обладают способностью с высокой эффективностью связывать имиглюцеразу. Антитела или их фрагменты образуют комплексы с имиглюцеразой, способные диссоциировать в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля. На основе антител/фрагментов создан иммуносорбент для выделения и очистки имиглюцеразы из культуральных жидкостей, применение которого позволяет получить препарат активной имиглюцеразы из культуральной жидкости за одну стадию, не содержащий детектируемых с помощью электрофореза в полиакриламидном геле загрязнений. Представленное техническое решение относится также к созданию усовершенствованного способа очистки имиглюцеразы с применением иммунохроматографии на высокоаффинном сорбенте. Изобретение относится также к последовательностям выделенных пептидов, имеющих высокую степень аффинности к имиглюцеразе.
Рекомбинантная бета-глюкоцереброзидаза является аналогом лизосомальной бета-глюкоцереброзидазы человека (синонимы: имиглюцераза, бета-глюкоцереброзидаза, кислая бета-глюкозидаза, алглюцераза, глюкозилцерамидаза). Очищенная имиглюцераза представляет собой мономерный гликопротеин, в состав которого входят 497 аминокислотных остатков и олигосахаридный компонент. Имиглюцераза компенсирует функциональную недостаточность ферментативной активности бета-глюкоцереброзидазы. Имиглюцераза катализирует гидролиз гликолипида глюкоцереброзида до глюкозы и церамида и предупреждает накопление глюкоцереброзида в макрофагах, т.е. препятствует образованию клеток Гоше. Болезнь Гоше является самой распространенной из лизосомных болезней накопления. Развивается в результате недостаточности фермента глюкоцереброзидазы, которая приводит к накоплению глюкоцереброзида во многих тканях, включая селезенку, печень, почки, легкие, мозг и костный мозг. В настоящее время, для лечения этой болезни применяются препараты генноинженерной глюкоцереброзидазы, самым распространенным из которых является церезим (Cerezyme; Genzyme) (Patrick В Deegan and Timothy M Cox (2012) Imiglucerase in the treatment of Gaucher disease: a history and perspective. Drug Des Devel Ther. 2012; 6: 81-106). Отмечаются высокие расходы на производство этого препарата, что обуславливает его значительную стоимость. В связи с этим имеется необходимость в разработке новых эффективных подходов для очистки глюкоцереброзидазы, позволяющих за минимальное число стадий получить высокочистый и активный препарат.
Иммуноаффинная хроматография является широко распространенным подходом при очистке белков, дающим возможность получить высокочистые и концентрированные препараты даже из сложного стартового материала (Jack, G.W. & Beer, D.J. (1996) Immunoaffinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59,187-196). Лиганд может быть как моно-, так и поликлональным антителом или же фрагментом антитела. Моноклональные антитела имеют ряд существенных преимуществ, так, их моноспецифичность дает большую воспроизводимость хроматоргафического процесса, а лиганд может быть наработан заново (Scopes, R.K. (1994) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edn. Springer-Verlag New York Inc., New York).
В настоящее время известен способ получения активной имиглюцеразы с помощью мышиных моноклональных антител (Aerts, J.M., Donker-Koopman, W.E., Murray, G.J., Barranger, J.A., Tager, J.M., Schram, A.W. (1986) A procedure for the rapid purification in high yield of human glucocerebrosidase using irnmunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies. Anal. Biochem. 1; 154(2):655-63). Так же, разработано значительное число коммерческих моноклональных антител к имиглюцеразе, например, антитела производства Acris Antibodies и Aviva Systems Biology, но область применения данных антител ограничивается иммуногистохимией и аналитической биохимией, применение их в промышленной медицинской биотехнологии производителем не рассматривается.
Однако, хотя моноклональные антитела производятся для большого количества мишеней и могут потенциально рассматриваться как основной источник аффинных лигандов (Cutler, Р. (1996) Affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59, 157-168), ряд проблем, связанных с происхождением и природой этих антител, должны учитываться при обсуждении их использования в GMP производстве. Очищенные с их помощью мишени, предполагаемые для терапевтического использования, должны проходить процедуры вирусной инактивации для минимизации рисков вирусной контаминации продукта (Barrowcliffe, T.W. (1993) Viral inactivation vs. biological activity. Dev. Biol. Stand. 81, 125-135, Burton, S.J. (1996) Affinity chromatography: production and regulatory considerations. Am. Biotechnol. Lab. 14, 64-66). В дополнение, моноклональные антитела могут быть относительно чувствительны к процедурам стерилизации колонки, что приводит к укорачиванию жизни колонки и загрязнению продукта фрагментами антител. Из-за потенциальной иммуногенности этих фрагментов, представляющих чужеродный мышиный белок, необходимы значительные усилия на стадии валидации процесса для подтверждения чистоты продукта. Также сама методика получения продуцентов моноклональных антител в большинстве случаев делает невозможным целенаправленное получение лигандов с желательными условиями элюции. Таким образом, логичным представляется поиск потенциальных аффинных лигандов с помощью фагового дисплея, при котором отбор кандидатов ведется в заранее обозначенных условиях (рН, ионная сила, не денатурирующие целевой белок условия элюции).
Полученные аффинные лиганды, представляющие собой антитела и фрагменты антител, могут эффективно воспроизводиться в больших количествах. Так, современные методики ферментирования предполагают выход одноцепочечных фрагментов антител (scFv) до 1,2 г с литра (экспрессия в Е. coli), и полноразмерных антител до 5-12 г/л (экспрессия в ооцитах китайского хомячка) ( Frenzel, Michael Hust, and Thomas Schirrmann (2013) Expression of Recombinant Antibodies. Front Immunol. 2013; 4: 217).
Задачей данного изобретения являлась разработка антител или фрагментов антител, пригодных для создания высокоэффективного иммуносорбента для промышленного выделения имиглюцеразы. Разработанные молекулы являются человеческими IgG1, или же их фрагментами, что выгодно отличает их от мышиных моноклональных антител. В частности, отсутствует иммунная реакция на потенциально загрязняющие препарат фрагменты антител, а в случае использования одноцепочных фрагментов, продуцируемых в Е. coli, отсутствует теоретическая возможность вирусной контаминации. Элюция с сорбента, созданного с применением данных антител (фрагментов антител), происходит в мягких условиях, в присутствии от 30 до 60 процентов этиленгликоля. Данные условия известны как не оказывающие заметного денатурирующего влияния на имиглюцеразу (Murray G.J., Youle R.J., Gandy S.E., Zirzow G.C., Barranger J.A. (1985) Purification of beta-glucocerebrosidase by preparative-scale high-performance liquid chromatography: the use of ethylene glycol-containing buffers for chromatography of hydrophobic glycoprotein enzymes. Anal Biochem. 1985 Jun; 147(2):301-10). Антитела не теряют своей связывающей способности при как минимум 50 актах сорбции/элюции, что делает возможным многократное использование сорбента. За одну стадию применение данного сорбента позволяет получить препарат активной, высокочистой имиглюцеразы из культуральной жидкости. Существенным признаком scFv и антител по изобретению, обусловленным их первичной структурой, является их способность специфично и в то же время обратимо связывать имиглюцеразу таким образом, что комплекс диссоциирует в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля. Данное свойство непосредственно определяет получение технического результата изобретения - высокоэффективную очистку имиглюцеразы из культуральной жидкости в один этап, а также позволяет использовать предложеннные scFv и антитела в широком спектре биотехнологических применений, в том числе в различных диагностических целях.
Антитело или фрагмент антитела для связывания имиглюцеразы по изобретению содержит вариабельный фрагмент тяжелой цепи, имеющий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, где аминокислотная последовательностью CDRH1 выбрана из группы SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, аминокислотная последовательностью CDRH2 выбрана из группы SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38; аминокислотная последовательность CDRH3 выбрана из группы SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39. Данное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный фрагмент легкой цепи каппа или лямбда, имеющий аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2, CDRL3, где аминокислотная последовательность CDRL1 выбрана из группы SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40; где аминокислотная последовательность CDRL2 выбрана из группы SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41;где аминокислотная последовательность CDRL3 выбрана из группы SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42. Антитело или его фрагмент по изобретению способны образовывать комплекс с имиглюцеразой, диссоцирующий в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля, что обеспечивает получение ряда технических результатов - возможность получения специфического комплекса с имиглюцеразой в присутствии большого количества загрязнений в неочищенном лизате, устранение возможности неспецифических взаимодействий, и, соответственно, возможность очистки имиглюцеразы из клеточного лизата за одну стадию хроматографической очистки. Представленные в настоящем изобретении фрагменты антител имеют установленную аминокислотную последовательность, на основании которой можно составить Fv, scFv, Fab, F(ab') фрагменты, диабоди, линейные антитела которые могут быть скомбинированы с другими аминокислотными последовательностями, для ориентированной посадки на сорбент, например, с полилизиновым тагом, различные комбинации фрагментов, их димеры, тримеры (диатела, триатела, тетратела, Bis-scFv, минитела, Fab2, Fab3) и так далее. Эти фрагменты антиген-связывающего участка любого антитела определяют специфичность его связывания с антигеном. Моновалентные F(ab) фрагменты имеют один антиген-связывающий сайт, тогда как двухвалентные F(ab')2 -фрагменты имеют две антигенсвязывающие области, которые связаны дисульфидными связями. Уменьшение F(ab')2 фрагментов дает 2 моновалентных Fab' фрагмента, которые имеют свободную сульфгидрильную группу, которая используется для конъюгации с другими молекулами. Fv фрагмент - это наименьший фрагмент, получаемый в результате ферментативного расщепления антител класса IgG и IgM. Fv фрагмент имеет антиген-связывающий сайт, состоящий из областей VH и ВК, но отсутствуют СН1 и CL области. Цепи VH и VL удерживаются вместе в Fv фрагменте нековалентными взаимодействиями.
Методы генной инженерии позволяют получать вариабельные одноцепочечные фрагменты (scFv), которые представляют собой фрагменты типа Fv и включают домены VH и VL, соединенные гибким пептидом. Когда линкер имеет длину по меньшей мере 12 остатков, фрагменты ScFv в основном мономерные. Манипуляция ориентации V-доменов и длины линкера создает различные формы молекул Fv. Линкеры, которые в длину 3-11 остатков, дают ScFv молекулы, которые не могут фолдировать в функциональный домен Fv. Эти молекулы связываются со второй молекулой ScFv, создавая двухвалентное диатело - димер фрагмента антитела формата scFv, "diabody". Диатело может быть и биспецифическое (Бис-scFv), а может и моноспецифическое дивалентное. Если длина линкера составляет менее трех остатков, молекулы scFv объединяться в тритела или тетратела. Мультивалентные scFv обладают большей функциональной аффинностью связывания со своими антигенами-мишенями, чем их аналоги одновалентные из-за связывания с двумя антигенами-мишенями, что уменьшает скорость диссоциации фрагмента антитела. Минитела представляют собой scFv-СН3 слитые белки, которые собираются в двухвалентные димеры. Миниатюрные фрагменты scFv могут быть сгенерированы с содержанием двух различных вариабельных доменов, что позволяет этим Бис-scFv молекулам одновременно связываться с двумя различными эпитопами. Генетические методы также используются для создания биспецифических (Fab-димеров) и Fab2 триспецифических Fab тримеров (Fab3). Эти фрагменты антител способны связываться с 2 (Fab2) или 3 (Fab3) различными антигенами сразу. В дополнение, на основании данных о включении данных фрагментов в состав антитела, могут быть созданы камелидные антитела (нанотела, nanobody), которые содержат набор специфических Heavy Chain Antibodies (hcAb), исключительно состоящих из гомодимера тяжелых цепей и не имеют легких цепей. Fab часть этих антител называется VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела), является наименьшей антиген-связывающей областью, найденной в природе. Нанотела представляют собой рекомбинантные домены из VHH, способные связывать антигены. Они очень стабильны и могут быть получены в огромном количестве с помощью традиционных систем, таких как бактерии и, таким образом, представляет собой перспективный инструмент для диагностических и терапевтических целей. Нанотела также могут быть экспрессированы непосредственно in vivo.
Фрагменты имеют преимущества по сравнению с полноразмерными антителами для некоторых целей - например, они достаточно малы, чтобы проникать в ткани, в которые полноразмерные антитела не могут проникать. Это преимущество используется в терапевтических и иммуногистохимических процедурах. Фрагменты антител, как правило, не имеют гликозилирования, что позволяет их производить в прокариотических системах экспрессии. Отсутствие домена Fc является существенным преимуществом для первичных антител, используемых в иммуногистохимических и других целях, так как они значительно уменьшают неспецифическое связывание с рецептором Fc. Фрагменты антител не имеющие Fc-области, имеют редуцированное неспецифическое связывание. Нанотела могут быть использованы также для коиммунопреципитации или в сочетании с флуоресцентными белками для отслеживания в реальном времени внутриклеточных мишеней в живых клетках.
По своей способности к распознаванию имиглюцеразы человека in vitro и in vivo полноразменое антитело, включающее в свой состав раскрытые в настоящем изобретении фрагменты, равно как и фрагменты scFv моновалентного антитела и их комбинации, аналогичны. При этом фрагменты scFv моновалентного антитела и их комбинации, не имеющие Fc-доменов, за счет меньшего размера молекулы лучше проникают в ткани in vivo и оказывают меньшее иммуногенное действие при введении человеку в диагностических целях.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Сенсограммы накопления комплексов AT1(mAb 2D4)-Аг (А) или AT2(mAb 2L18)-Аг (В), полученные методом BLI на Octet QKe. Аг серийно разводился от 900 нМ с шагом 2 при постоянном количестве иммобилизованного AT. Панель (С) представляет схему нековалентной ориентированной иммобилизации AT на поверхность сенсора. На панели (D) представлены вычисленные константы скоростей ассоциаций (ka), диссоциаций (kd), значения KD, их погрешности (KD error), вычисленные значения максимально возможного количества образованных комплексов (Rmax) и статистический параметр коэффициента детерминации (R2).
Фиг. 2. Сенсограммы накопления комплексов AT1(mAb 2D4)-Аг (А) или AT2(mAb 2L18)-Аг (В), полученные методом BLI на Octet QKe, многократные циклы адсорбции-регенерации.
Фиг. 3. Хроматограмма препарата очищенной имиглюцеразы на 2L18 Sepharose.
Фиг. 4. Препарат имиглюцеразы до и после сорбции на колонках с 2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose.
Фиг. 5. Хроматограмма получения церезима из бессывороточной КЖ на аффинном сорбенте 2L18Sepharose.
Фиг. 6. Иммуноаффинная очистка имиглюцеразы на колонках с 2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose из безсывороточной среды.
Фиг. 7. Иммуноаффинная очистка имиглюцеразы на колонках с 2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose из среды с 4% FBS.
Все использованные штаммы бактерий, плазмиды, праймеры полимеразной цепной реакции (ПЦР), рекомбинантные белки, а также клеточная линия, продуцирующая антитела, коммерчески доступны.
9
В настоящем исследовании использовалась нативная scFv библиотека сделанная на основе фагмиды pSEX81 с разнообразием примерно 10; штаммы Е. coli XL10-Gold и XL1-Blue и TG1; праймеры полимеразной цепной реакции (Евроген), клеточная линия СНО-k. Препарат имиглюцеразы был предоставлен АО ГЕНЕРИУМ.
Все последовательности, включение которых в состав антитела обеспечивало его связывание с имиглюцеразой, были найдены методом фагового дисплея.
Пример 1. Фаговый дисплей.
12
Селекции проводились в Maxisorb Immunotubes (Nunc, Wiebaden, Germany) с адсорбированной на поверхности имиглюцеразой и заблокированных раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS (50 mM аммония ацетата, рН 6.0, 800 mM NaCl и 0,1% Tween 80). Для каждой селекции, приблизительно 10 фаговых частиц заблокированных в буфере AAcTS с 2% обезжиренного молока, добавлялись в иммунотьюбы и инкубировались при постоянном вращении в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем, раствор удалялся и иммунотьюбы промывались 10 раз в AAcTS. Связавшиеся фаги элюировались 2 мл буфера AAcSE (50 mM аммония ацетата, рН 6.0, 800 mM NaCl, 50% этиленгликоля (Applichem)). Элюат использовался для инфицирования 40 ml Escherichia coli XL 1-blue находившихся в экспоненциальной фазе роста в среде 2YT (12.5 μg/ml tetracycline) при 37°С. Для продукции фаговых частиц, эти клетки после рассева на чашки дополнительно заражались хелперным фагом M13KO7 (Thermo Fisher Scientific) и инкубировались 10-12 часов при 30°С.
Обогащение библиотек определялось по увеличению числа клонов, выросших на чашках после заражения элюированными фаговыми частицами и по увеличению сигнала в ИФА, где сорбировавшиеся на иммобилизованной имиглюцеразе фаговые частицы прокрашивались анти-М13 антителами мечеными пероксидазой хрена (HRP) (Sigma).
Пример 2. Скрининг клонов.
Препарат фагмид из обогащенной библиотеки выделялся с помощью центрифужных микроколонок по стандартной методике (Qiagen). Последовательности, кодирующие scFv, вырезались из фагмид по сайтам NcoI/NotI и лигировались в экспрессионный вектор pHOG по тем же сайтам. Лигазной смесью трансформировались клетки Escherichia coli TGI, после чего отдельные клоны наращивались для экспрессии scFv в 96 и 384-луночных плашках. Имиглюцераза (3 (μg/ml) сорбировалась на поверхность MAXISORP ИФА планшетов (Nunc). Планшеты блокировались раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS. Культуральные жидкости, содержащие scFv, смешивались 1:1 с раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS и вносились в лунки планшетов в 2 повторах. После инкубации с культуральной жидкостью планшет 1 промывался 30 мин с буфером AAcSE, планшет 2-с AAcTS для выявления специфических байндеры, элюирующихся в 50% этиленгликоле. Детекция осуществлялась с использованием 9Е10 anti-c myc mAb и HRP-коньюгированными anti-mouse антителами козы (Abcam).
Для дальнейшей оценки разнообразия определялись нуклеотидные последовательности позитивных клонов.
Пример 3. Получение одноцепочечных фрагментов, связывающих имиглюцеразу.
В результате секвенирования клонов были определены нуклеотидные последовательности 7-ми одноцепочных фрагментов антител scFv (2D4, 2С11, 2L18, 2Е8, 2F9, 2D11, 3B12).
Клон 2D4 встречался наиболее часто (около 50% всех клонов). Клоны 2F9 и 2D11 имели идентичную аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (но отличающуюся нуклеотидную) и разные легкие цепи. 2L18 и 3В12 имели идентичный CDRH3. Остальные клоны были уникальны и не имели гомологии по CDR (Табл. 1).
Специалистам известны различные способы экспрессии антител и фрагментов антител как в прокариотических клетках, таких как E.coli, (Pluckthun A. Bio/Technology 9:545-551, 1991; Gavilondo J, Larrick J.W. Biotechniques 29:128-132, 134-136, 2000), так и в культурах клеток высших эукариот (Reff М.Е. Curr Opinion Biotech. 4:573-576, 1993; Trill J.J. et al., Curr. Opinion Biotech 6:553-560, 1995). В данном случае, для получения аффинных лигандов была выбрана экспрессия в культуре эукариотических клеток. Для этого последовательности scFv были переформатированы в легкие и тяжелые цепи полноразмерных человеческих IgG1, которые были затем клонированы в экспрессионный вектор, экспрессия с которого осуществлялась под контролем CMV промотора. Полученными векторами были трансфецированы клетки СНО (клеточная линия СНО-k; продуктивность стабильных клонов составила около 0,7 грамма с литра культуры. Антитела из культуральной жидкости были выделены с помощью аффинной хроматографии на сорбенте MabSelect SuRe; способ получения антител и фрагментов детально описан в инструкциях к колонкам (https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1353507340364/litdoc28940348_20161014190936.pdf). Так же, антитела могут быть выделены любым известным в настоящее время способом. То же самое относится к способу получения сорбента для связывания имиглюцеразы, несущего антитела определенной структуры. Он может быть сделан по классической методике, известной с 1979 года (J.Biochem. 1979 Apr;85(4):1091-8. Activation of Sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand for affinity adsorbent. Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N.), но так же возможно использование любых альтернативных методик ковалентной пришивки белков к сорбенту. Приведенные ниже примеры подтверждают высокую эффективность связывания с имиглюцеразой антител, полученных согласно изобретению.
Обладая знаниями о последовательностях CDR, обеспечивающих высокую аффинность к имиглюцеразе антител, несущих их в своем составе, и общего знания современного уровня техники квалифицированный специалист может сконструировать антитело любого известного к настоящему времени формата, включающее любую из раскрытых аминокислотных последовательностей, любым удобным способом наработать его в прокариотах или эукариотах, почистить, пришить на сорбент и провести хроматографическую очистку имиглюцеразы в указанных условиях. Так как моновалентные и двухвалентные фрагменты scFv и их эквивалентные варианты согласно изобретению могут быть получены посредством экспрессии кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует любую из полипептидных молекул, описанных выше, является частью настоящего изобретения, также как и способ экспрессии такой нуклеиновой кислоты. Для рекомбинантной экспрессии моновалентного и двухвалентного scFv и его эквивалентных вариантов могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие адекватные регуляторные последовательности, включая промотор, терминатор, энхансер, последовательность полиаденилирования, маркерные гены и другие подходящие последовательности. Такими векторами могут быть плазмиды. Многие известные протоколы и методы модификации нуклеиновых кислот, например получение конструкций нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция, мутагенез, секвенирование, введение ДНК в клетки, экспрессия генов, анализ белка и т.п., подробно описаны в нескольких руководствах, таких, например, как, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, или Short Protocols in Molecular Biology, Second edition, Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 1992 или Erlich HA PCR Technology, Stockton Press, 1989.
После их продуцирования моновалентные и двухвалентные фрагменты scFv и их эквивалентные варианты могут быть использованы в любом способе, требующем применения пептидного реагента, обладающего способностью с высокой аффинностью обратимо связывать имиглюцеразу. Помимо способа аффинной хроматографии они могут быть использованы, например, для создания диагностического продукта, включенного в набор реагентов, который, помимо специфически связывающегося агента, включает в себя один или несколько реагентов для определения уровня связывания указанного агента с клетками или с имиглюцеразой, не связанной с клетками, как обсуждалось выше.
Другие аспекты настоящего изобретения и способы их осуществления очевидны каждому специалисту. Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение его притязаний и объема.
Пример 4. Аффинная хроматография имигюцеразы.
В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. При иммобилизации одного из компонентов комплекса получается специфический сорбент (так называемая "неподвижная фаза" для второго его компонента, если соблюдаются все условия, необходимые для образования этого комплекса. Хроматография может быть проведена с использованием различных приборов и приспособлений и даже без них, путем простой сорбции макромолекулы, выделяемой из подвижной фазы, на специфическом сорбенте (который часто бывает даже одноразового употребления).
Очищенные полноразмерные антитела по изобретению или scFv пришивали на сефарозу (Sepharose 6В, GE Healthcare), активированную эпихлоргидрином. На 1 мл сефарозы в среднем можно пришить около 10 мг белка (количество оценивалось по разнице концентрации антител в растворе до и после пришивки).
В работе использовались следующие буферные растворы: PBS, рН 7.4 (Буфер А), 20 mM NaP, 1М NaCl, рН 7.4 (Буфер В), 20 mM NaP, 1М NaCl, 60% этиленгликоль рН 6.0 (Буфер С).
Пример 5. Получение полноразмерных антител на основе одноцепочечных фрагментов.
На основе одноцепочечных фрагментов 2D4 и 2L18 были созданы человеческие антитела класса IgG1, пригодные для промышленного производства и сохранившие способность специфично формировать комплекс с имиглюцеразой, диссоциирующий в присутствии 30 и более процентов этиленгликоля:
Пример 6. Измерение аффинности антител.
Определение констант связывания разработанных антител проводили, используя метод биослойной интерферометрии на приборе Octet QKe согласно рекомендациям производителя. Биосенсоры protA (PALL corp) с иммобилизованным белком А согласно рекомендациям производителя. Стандартным буфером для SPR являлся PBSTB (10 мМ Na-фосфат, 150 мМ NaCl, 0.005%-ный твин-20, 0,01%-ный BSA, рН 7,4). Далее в стандартном буфере иммобилизовали на экспериментальные сенсоры исследуемое антитело до величины накопления слоя 1 нм. для чего в течение 300 сек при 1000 об/мин проводилась параллельная ассоциация серии из 7 концентраций имиглюцеразы. Далее после 600 секунд диссоциации сенсоры регенерировали 0,1 М GlyHCl, рН 2,0. Таким образом, с сенсоров удалялись как имиглюцераза, так и исследуемое антитело, после чего цикл повторялся. Анализ сенсограмм проводили, используя программу ForteBio Data Analysis.
Измерения аффинности анти-имиглюцеразных антител показали специфическое связывание с имиглюцеразой. Оба антитела, 2D4 и 2L18, показали сходные константы диссоциации, 41.3 нМ и 12 нМ соответственно (Фиг. 1).
Пример 7. Оценка стабильности полноразмерных антител по изобретению.
Оценка стабильности антител проводилась на приборе Octet QKe аналогично процедуре, описанной ниже (Пример 8), с тем отличием, что отсутствовала стадия диссоциации, а регенерация проводилась в буфере AAcSE, при этом с сенсоров удалялась только имиглюцераза, но не антитела.
50-кратное повторение циклов адсорбции-регенерации не выявило заметного снижения антиген-связывающей способности антител (Фиг. 2).
Таким образом, антитела демонстрируют высокую стабильность в используемых условиях, что делает возможным многократное использование сорбента на их основе.
Пример 8. Очистка имиглюцеразы аффинной хроматографией.
Индивидуальные связывающие имиглюцеразу антитела, полученные в результате селекций в фаговом дисплее, были присоединены к хроматографической матрице, и их связывающая емкость, сохранение активности, чистота и условия элюции были изучены. Данный пример иллюстрирует результат очистки имиглюцеразы раскрытым в изобретении способом.
Колонки с полученным по настоящему изобретению сорбентом были присоединены к хроматографическим системам ™ purifier 10 или ™ pure 25 и уравновешивались 10CV буфера А, скорость протока 0,3 мл/мин. Образцы наносились на колонку с полученными аффинными сорбентами при скорости протока 0.2 мл/мин. Колонки были промыты (10CV буфера A, 20CV буфера В, скорость протока 0,3 мл/мин) и адсорбированный белок элюировался буфером С при скорости протока 0,2 мл/мин.
Образцы, наносившиеся на аффинные колонки: имиглюцераза (АО «ГЕНЕРИУМ») с удельной активностью 40 ед/мг, концентрация белка 0.24 мг/мл в PBS с 2% этиленгликолем; бессывороточная среда с экспрессирующей имиглюцеразу культуры клеток (1,2 ед/мл активности); содержащая 4% FBS среда с экспрессирующей имиглюцеразу культуры клеток (1,6 ед/мл активности).
Исходные образцы и образцы, полученные в результате хроматографии белковых фракций, анализировались с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях.
Специфическая активность в препаратах имиглюцеразы определялась с помощью хромогенного теста с использованием 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида (Sigma) в качестве субстрата.
Содержание остаточных белков FBS (BSA, иммуноглобулины) оценивалось с помощью иммуноферментных наборов Cygnus (Bovine Serum Albumin (BSA) Assay и Bovine IgG Assay).
Результат: Имиглюцераза как на 2D4 Sepharose, так и на 2L18 сходит одним четко выраженным пиком при элюции буфером С (Фиг. 3).
Содержание остаточных белков FBS незначительно, около или менее 1% от общего белка в элюате (Табл. 3). Эксперименты с сорбцией на колонки препарата очищенной имиглюцеразы показали сорбционную емкость колонок около 1.8-2.7 мг имиглюцеразы на мл сорбента (основной пик, элюция буфером С). После 10 циклов сорбции-десорбции емкость колонки осталась прежней; активность имиглюцеразы в элюате полностью сохраняется (Табл.2).
Протеолитическая деградация имиглюцеразы так же отсутствует, все фракции демонстрируют единственную широкую полосу, соответствующую гликозилированной имиглюцеразе (Фиг. 4) Наработка имиглюцеразы культурой эукариотических клеток может происходить как в безсывороточной среде, так и в среде, содержащей FBS, каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки. В элюате, полученном из сред с экспрессионных культур (Фиг. 5), видимые белковые примеси также отсутствуют (Фиг. 6, Фиг. 7).