Генерация в культуре in vitro и характеристика регуляторных Т-клеток человека

Медицинская Иммунология 2008, Т. 10, № 2-3, стр. 173-180 © 2008, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

ГЕНЕРАЦИЯ в КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Курганова Е.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р.

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

Резюме. Работа посвящена оценке эффективности генерации и характеристике регуляторных Т-клеток (Treg), полученных из мононуклеарных клеток крови здоровых доноров при поликлональной активации анти-CD3-антителами и IL-2 в отсутствии (модель 1) и в присутствии (модель 2) иммуносупрессорных агентов (витамина D3 и дексаметазона). Показано, что Т-клетки, генерированные в первой модели, характеризуются сниженным пролиферативным ответом на анти-CD3 и не проявляют супрессорной активности. Т-клетки, полученные в присутствии витамина D3 и дексаметазона, находятся в состоянии анергии, которое частично нивелируется экзогенным IL-2, а также обладают супрессорной активностью, опосредуемой как через прямые межклеточные взаимодействия, так и через продукцию растворимых факторов, в частности, IL-10. Полученные данные позволяют отнести Т-клетки, генерированные во второй модели, к индуцибельным IL-10-продуцирующим регуляторным Т-клеткам (Tr1). Тем не менее, выявленное среди них увеличение FOXP3-экспрессирующих CD4+Т-клеток свидетельствует также о возможной генерации естественных регуляторных клеток.

Ключевые слова: Treg, CD4CD25, CD4FOXP3, IL-10, витамин D3, дексаметазон.

Kurganova E.V., Shevela E.Ya., Tihonova M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.

in vitbd generation and characterization of human regulatory t-cells

Abstract. The aim of present study was to evaluate efficacy of generation and characterization of regulatory T cells

Регуляторные Т-клетки (Т^) привлекают все большее внимание в связи с их важной ролью в поддержании периферической толерантности

Адрес для переписки:

Курганова Екатерина Владимировна 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская 14, НИИ клинической иммунологии СО РАМН. Тел.: (383) 228-21-01.

Факс: (383) 222-70-28.

E-mail: ct lab@mail.ru

к собственным антигенам [2, 29]. Выделяют два типа Treg — естественные, которые образуются в тимусе, и индуцибельные регуляторные клетки, представленные активированными клетками периферической крови. Естественные регуляторные Т-клетки фенотипически представлены субпопуляцией CD4+CD25+Т-лимфоцитов, не отвечают пролиферацией на митогенные воздействия и подавляют in vitro пролиферативный ответ Т-клеток посредством прямого клеточного контакта [22, 27]. Супрессорной ре-

гуляторной активностью обладает только часть CD4+ клеток с высокой экспрессией молекулы CD25 — так называемые CD4+CD25hi [16]. Ин-дуцибельные Treg также представлены CD4+ лимфоцитами, которые могут экспрессировать a-цепь рецептора к IL-2 и характеризуются функциональной ареактивностью. Ингибирующее действие индуцибельных Treg связано с продукцией иммуносупрессорных цитокинов. В зависимости от преобладающего типа продуцируемых цитокинов — IL-10 или TGFP — эти клетки обозначают соответственно как Tr1 и Tr2/(Th3) [10, 18].

Развитие аутоиммунных и аллергических заболеваний у человека ассоциировано со снижением количества и/или функциональной активности Treg [5, 6, 19, 20, 21, 26, 31]. С другой стороны, введение Treg экспериментальным животным в моделях аутоиммунной патологии приводит к реверсии или предотвращению аутоиммунного процесса, что обосновывает перспективу их использования в лечении целого ряда заболеваний [28, 30]. Поэтому актуальным является разработка воспроизводимых технологий генерации в культуре in vitro регуляторных Т-клеток с заданными функциями.

Известно, что интенсивная активация Т-клеток через Т-клеточный рецептор уже сама по себе приводит к генерации Treg [15]. Именно этим объясняется кинетика пролиферации в aнти-СD3-индуцированных культурах с пиком ответа на 3 сутки и снижением пролиферации к 6 дню. Причем после удаления CD25^-клеток ограничения пролиферации на 6 сутки не наблюдается [1]. Поэтому одним из способов генерации Treg является поликлональная активация Т-лимфоцитов с добавлением IL-2, приводящим к экспансии Treg [17, 22]. Кроме того, Treg могут индуцироваться in vitro в присутствии TGFP и IL-10 [7, 11, 14], однако внедрение таких подходов в клиническую практику ограничивается отсутствием фармакопейных форм указанных цитокинов. С другой стороны, имеются данные о возможности генерации Treg путем активации лимфоцитов периферической крови в присутствии глюко-кортикоидов, разрешенных для медицинского использования [8]. Настоящее исследование посвящено оценке эффективности генерации и характеристике Treg, полученных при поликлональной активации Т-лимфоцитов с IL-2 в отсутствии и в присутствии дексаметазона и витамина D3.

Материалы и методы

Для генерации Treg использовали моно-нуклеарные клетки (МНК) периферической

крови здоровых доноров. МНК выделяли из ге-паринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации 106/мл культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С в среде DMEM («ICN», США), дополненной

0,3 мг/мл L-глютамина, 20 ммоль HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% FCS. Для генерации регуляторных клеток использовали два подхода. В первом случае (модель 1) МНК культивировали в течение 7 дней с анти-CD3 антителами IC0-90 (анти-CD3, «Медбиоспектр», Москва;

1 мкг/мл) и рекомбинантным IL-2 (Ронколей-кин, «Биотех», Санкт-Петербург; 50 МЕ/мл). Во втором случае (модель 2) активацию МНК анти-CD3 и IL-2 проводили в присутствии витамина D3 (10-7 М, Sigma-Aldrich, Cat.N D4902) и дексаметазона (10-7 М). Контролем служили МНК, культивированные в течение 7 суток с IL-2 в дозе 50 МЕ/мл.

Полученные клетки однократно отмывали, оценивали их жизнеспособность и тестировали на пролиферативную и супрессорную активность. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию 0,2% раствором трипанового синего. Пролиферативную активность оценивали радиометрически по интенсивности ответа в 3-суточных культурах, стимулированных анти-CD3-антителами (1 мкг/мл). Супрессорную активность определяли по способности полученных клеток или их 48-часовых супернатантов (33%, v/v) подавлять анти-CD3-стимулированный пролиферативный ответ аутологичных МНК, а также в 5-суточной аллогенной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). Супрессорную активность выражали в виде индекса влияния, рассчитанного как отношение пролиферативного ответа в опыте (отвечающие клетки + генерированные Treg или их супернатанты) к уровню ответа в контроле (культуры, содержащие только отвечающие клетки).

Продукцию IL-10 в супернатантах полученных клеток определяли методом иммунофер-ментного анализа, используя соответствующие тест-системы (минимальная пороговая чувствительность 5 пг/мл), согласно инструкции фирмы-производителя («Цитокин», Санкт-Петербург).

Относительное содержание CD3+CD4+CD25hi Т-клеток и внутриклеточную экспрессию FOXP3 в сгенерированных популяциях определяли методом проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur, «Becton Dickinson», США) с помощью APC-меченных анти-CD3, FITC-меченных анти-CD25 («PharMingen», США) и PE-меченных анти-CD4 («Сорбент», Москва) моноклональных антител. Внутриклеточную экспрессию FOXP3 опреде-

ляли в популяции CD4+ клеток, используя процедуру пермеабилизации клеток и РЕ-меченные анти^ОХР3 («ВюБ^епсе», США) моноклональные антитела.

Математическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ «Statistica 6.0».

Результаты

Оценка жизнеспособности клеток показала, что к исходу 7 суток количество живых клеток в контрольных культурах с ^-2 составляло 91,7+8,3% (п = 6), в анти-CD3-стимулированных культурах — 93,5+4,3% (п = 6), а при активации МНК в присутствии витамина Dз и дексамета-зона — 91,2+5,6% (п = 6). Таким образом, выживаемость клеток в анализируемых культурах была сходной. Учитывая, что одним из характерных свойств регуляторных Т-клеток является пребывание их в состоянии анергии, далее была проведена оценка пролиферативной активности полученных клеток (рис. 1). МНК контрольных культур полностью сохраняли способность отвечать пролиферацией на стимуляцию aнти-CD3 антителами. Уровень ответа варьировал в диапазоне 6430-62910 имп/мин, составляя в среднем 31430+7220 имп/мин. По сравнению с контрольными культурами клетки, полученные в результате культивирования МНК с анти-CD3 и ^-2 (модель 1) характеризовались достоверным сни-

жением пролиферативного ответа. В этом случае средний уровень анти-CD3-стимулированной пролиферации составлял 3570+860 имп/мин (от 360 до 7820 имп/мин). Клетки, полученные во второй модели, не отвечали на стимуляцию анти-CD3 (466+235 имп/мин) и значимо отличались от клеток как в контроле, так и в первой модели. Таким образом, если в первой модели генерировались клетки со сниженной пролиферативной реактивностью, то клетки, полученные во второй модели, характеризовались полной функциональной анергией.

Известно, что дефект пролиферативного ответа Т-клеток вследствие их анергии может частично коррегироваться экзогенным ^-2 [13]. Поэтому в отдельной серии экспериментов было исследовано влияние ^-2 на уровень анти-CD3-стимулированной пролиферации полученных клеток. Усиление пролиферативного ответа в присутствии субоптимальных доз ^-2 (50 МЕ/мл) проявлялось в виде тенденции в культурах клеток первой модели (с 3570+860 до 9480+3480 имп/мин) и достоверного увеличения в культурах клеток второй модели (с 466+235 до 6340+2990 имп/мин; р = 0,04), что свидетельствовало о состоянии анергии Т-клеток, полученных в заданных культуральных условиях.

Исследование супрессорной активности генерируемых клеток показало, что МНК контрольных культур не обладали ингибирующим

35000 г-30000 25000 І 20000 :15000 10000 5000 0

31 430 1,75-,

- 1,5-

- 1,25-

— 1-

_ 0,75-

0,5-

3570** 0,25-

I I 466** ## 0

Контроль Модель 1 Модель 2

Рисунок 1. Анти^3-стимулированный пролиферативный ответ клеток, генерированных при различных условиях

Примечания. Контроль - МНК, культивированные в присутствии ^-2 (п = 9), модель 1 - МНК, культивированные в присутствии ^-2 и анти^З антител (п = 9), модель 2 - МНК, генерированные в присутствии ^-2, анти^З, витамина Dз и дексаметазона (п = 12). После генерации клетки однократно отмывали DMEM, и дополнительно культивировали в дозе 0,1 х 106 клеток/лунку при стимуляции анти^З антителами (1 мкг/мл). Уровень пролиферации оценивали через 72 часа. Результаты представлены в виде средних значений.

** и ## - ри < 0,001 - достоверность различий по сравнению

с контролем и моделью 1, соответственно

(ри - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Модель 1 Модель 2

1:1 0

1:4

1:2

1:1

Рисунок 2. Супрессорная активность клеток, генерированных с aнти-CD3 и ^-2 в отсутствии

Примечания. Генерированные МНК (МНКген) однократно отмывали, добавляли к аутологичным МНК (МНКотвеч) в различных соотношениях и стимулировали анти^З-антителами (1 мкг/мл). Уровень пролиферации оценивали через 72 часа. Индекс влияния рассчитывали как отношение пролиферативного ответа в опыте (МНКотвеч в присутствии МНКген) к уровню ответа в контроле (МНКотвеч в отсутствии генерированных клеток). По оси абсцисс - соотношение МНКген : МНКотвеч. По оси ординат - значения индекса влияния.

действием, а напротив усиливали анти-CD3-стимулированную пролиферацию аутологичных клеток. Так, при добавлении контрольных МНК к отвечающим клеткам в соотношении 1 : 2 пролиферативный ответ увеличивался в 2 раза (ИВ = 2,0±0,3; п = 8). МНК, полученные в первой модели, при добавлении к аутологичным клеткам в соотношении 1 : 2 значимо не влияли на пролиферативную активность отвечающих клеток (рис. 2). Индекс влияния в этом случае составил 1,1±0,2 (п = 8). При увеличении дозы вносимых клеток регистрировалось усиление анти-CD3-стимулированного пролиферативного ответа в среднем на 63% (ИВ = 1,63±0,3 при соотношении 1 : 1). В то же время МНК, полученные во второй модели, обладали четкой дозозависимой супрессорной активностью. Двукратное подавление ответа отмечалось при соотношении вносимых и отвечающих клеток 1 : 2. Интенсивность супрессии возрастала до 70% при равном соотношении генерированных и отвечающих клеток, и сохранялась на уровне 20% даже при минимальном содержании МНКген в культуре (при соотношении 1 : 10). Таким образом, несмотря на наличие признаков анергии Т-клеток, полученных в обеих моделях, генерация клеток с супрессорной активностью наблюдалась только в модели 2, предусматривающей активацию МНК анти-CD3-антителами с ^-2 в присутствии комбинации иммуносупрессорных агентов (дексаме-тазона и витамина D3).

Чтобы выяснить, является ли супрессорная активность клеток исключительно контакт-зависимой, или может опосредоваться через продукцию растворимых факторов, далее было исследовано влияние супернатантов полученных МНК на интенсивность пролиферативного отве-

таблица 1. супрессорная активность супернатантов генерированных клеток

Варианты генерации СНо СНанти-СО3

Контроль (п = 7) 1,08±0,09 1,59±0,37

Модель 1 (п = 4) 0,76±0,16 0,99±0,45

Модель 2 (п = 9) 0,44±0,06* 0,52±0,07*

Примечание. После генерации клетки однократно отмывали йМЕМ и дополнительно культивировали в течение 48 ч в дозе 106/мл без добавления и в присутствии анти-ОйЭ антител. Представлены индексы влияния (М±Б.Е.) супернатантов нестимулированных (СН0) и анти-Сй3-стимулированных клеток (СНанти-С03), которые рассчитывали как отношение интенсивности анти-СйЭ-стимулированной пролиферации отвечающих МНК в присутствии супернатанта (33%, у/у) к уровню пролиферации МНК в отсутствии супернатанта.* - ри < 0,05 - достоверность различий по сравнению с контролем.

та аутологичных клеток на анти-CD3 и в смешанной культуре лимфоцитов. Как видно из данных таблицы 1, супернатанты нестимулированных (СН0) и анти-CD3-стимулированных (СНанти_сю) клеток контрольных культур и модели 1 практически не обладали супрессорной активностью. Незначительная супрессорная активность факторов выявлялась лишь в СН0 клеток, полученных в первой модели (ИВ 0,76±0,16; р > 0,05). В то же время супернатанты от МНК модели 2 обладали выраженным ингибирующим действием. Так, индексы влияния СН0 и СНанти_сю варьировали в диапазонах от 0,2 до 0,69 и от 0,27 до 0,83, соответственно. Наряду с угнетением анти-CD3-стимулированный пролиферации аутологичных клеток, супернатанты МНК, полученных во второй модели, эффективно ингибировали ответ в СКЛ. В этом случае средние значения индексов влияния СН0 и СНанти_сю составили 0,44±0,05 (п = 8) и 0,46±0,1 (п = 8), соответственно. Таким образом, ингибирующее действие клеток, генерированных в присутствии витамина D3 и дек-саметазона, может отчасти опосредоваться через растворимые факторы.

Поскольку супрессорная активность инду-цибельных может опосредоваться ^-10,

далее был проведен анализ содержания ^-10 в супернатантах МНК, полученных в первой и второй моделях (рис. 3). Концентрация ^-10 в супернатантах нестимулированных и анти-CD3-активированных клеток, полученных в модели 2, составила 5,5±2,2 и 11,8±4,2 пкг/мл (п = 4), что было в 2 раза выше, чем в аналогичных супернатантах клеток первой модели (2,0±0,6 и 4,9±0,7 пкг/мл; п = 4, соответственно). Кроме того, предварительные исследования показали, что культивирование МНК в присут-

14

12

^10 Е

Л8 ° 6

4

2

0

СН„

Модель 1

ИИ СНанти-С03

Модель 2

Рисунок 3. концентрация ^-10 в нестимулированных (Сн0) и анти^3-стимулированных супернатантах (Снанти.ОТ3) генерированных клеток Примечания. Результаты представлены в виде средних значений. Модель 1 - МНК, культивированные в присутствии 1Ь-2 и анти-CD3, модель 2 - МНК, генерированные в присутствии ^-2, анти-CD3, витамина Dз и дексаметазона. * - ри < 0,05 - достоверность различий по сравнению с моделью 1.

ствии иммуносупрессорных агентов сопровождается 3-кратным увеличением доли CD4+Т-лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией 1Ь-10 (с 1,29±0,24 до 4,14±2,07%; п = 2). В целом, полученные данные указывают на то, что среди МНК, генерируемых в присутствии витамина Dз и дексаметазона, присутствуют также индуци-бельные Treg, секретирующие ^-10.

Чтобы охарактеризовать фенотип получаемых клеток, на следующем этапе было проведено сравнительное исследование относительного содержания CD4+CD25+Т-клеток, в том числе с высокой экспрессией CD25 (CD4+CD25high), и CD4+Т-клеток с внутриклеточной экспрессией FOXP3 в исследуемых культурах МНК. Из данных таблицы 2 видно, что культивирование МНК с ^-2 (контроль) сопровождалось достоверным увеличением доли CD4+CD25+ и CD4+CD25high Т-клеток по сравнению с исходным уровнем в свежевыделенных МНК периферической крови. В культурах МНК, полученных в первой и второй модели, относительное содержание CD4+CD25+ и CD4+CD25high Т-клеток увеличивалось еще в большей степени. Однако в культурах МНК, обладающих супрессорной активностью (модель 2), относительное количество этих клеток было таким же, как и в культурах МНК, лишенных супрессорной активности (модель 1). Следовательно, можно полагать, что выявленное увеличение CD4+CD25+ и CD4+CD25high Т-клеток в используемых культуральных условиях, по-видимому, отражает не столько появление Т^, сколько процессы активации Т-лимфоцитов. В то же время анализ экспрессии более специфического маркера естественных регуляторных клеток — транскрипционного фактора FOXP3 [25, 33] — выявил максимальный (2-кратный) прирост CD4+FOXP3+ клеток именно в культурах МНК, обладающих супрессорной активностью (модель 2). Количество CD4+FOXP3+ клеток в культурах МНК, полученных в модели

1, было достоверно ниже, тогда как в контрольных культурах их содержание не отличалось от исходного уровня среди свежевыделенных

МНК. Таким образом, супрессорная активность МНК, генерированных в присутствии витамина D3 и дексаметазона, ассоциируется с увеличением численности CD4+FOXP3+ Т-клеток, но не CD4+CD25+ или CD4+CD25high Т-клеток.

Обсуждение

Полученные в целом результаты свидетельствуют о том, что 7-суточная активация МНК анти-CD3-антителами с IL-2 приводит к снижению реактивности Т-клеток к последующей стимуляции через Т-клеточный рецептор. Тем не менее, эффективная генерация клеток с дозозависимой супрессорной активностью регистрируется только при активации Т-клеток в присутствии иммуносупрессорных агентов, в частности, дексаметазона и витамина D3. Генерируемые в этом случае супрессорные Т-клетки характеризуются состоянием анергии и проявляют свою активность как в условиях контактного взаимодействия, так и опосредованно через продукцию растворимых факторов. При этом супрессорная активность генерированных клеток ассоциируется с увеличением продукции IL-10, а также с повышением относительного содержания CD4+FOXP3+ клеток.

Генерация in vitro регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью представляет большой интерес в плане разработки новых технологий лечения аутоиммунных/аллергических заболеваний и контроля трансплантационных реакций. Учитывая, что IL-2 обеспечивает экспансию естественных Treg тимического происхождения, одним из методов генерации Treg является активация Т-клеток через Т-клеточный рецептор в присутствии IL-2 [9, 12]. Согласно полученным нами данным, стимуляция МНК анти-CD3 антителами с IL-2 сопровождалась индукцией анергии Т-клеток, однако полученные клетки не обладали супрессорной активностью, что может объясняться использованием низких доз IL-2 (50 МЕ/мл) и относительно коротким сроком культивирования (7 сут.). В то же время, клетки, полученные при аналогичной стимуляции, но в присутствии дексаметазона и витамина D3

ТАБлицА 2. относительное количество CD4+CD25+, CD4+CD25hi и CD4+F0XP3+Т-ЛИMФ0ЦИТ0B СРЕди свежевыделенных мнк и генерированных клеток

Группы CD4+CD25+, % CD4+CD25hi, % CD4+FOXP3+, %

МНК ПК (n = 6) 5,5±1,2 0,93±0,16 3,0±0,6

Контроль (n = 10) 9,7±1,0* 3,1±0,5 3,0±1,5

Модель 1 (n = 7) 34,1±7,6* # 1,9±0,96 4,5±1,0

Модель 2 (n = 10) 25,7±5,0* # 1,65±0,4 6,6±1,0* #

Примечание: МНК ПК - свежевыделенные МНК периферической крови, контроль - МНК, культивированные в присутствии 11_-2, модель 1 - МНК, культивированные в присутствии 11_-2 и анти-ОйЭ, модель 2 - МНК, культивированные в присутствии 11_-2, анти-ОйЭ, витамина й3 и дексаметазона. * - ри < 0,05 - достоверность различий по сравнению с МНК ПК; # - ри< 0,05 -достоверность различий по сравнению с контролем.

обладали четким дозозависимым супрессорным эффектом.

Генерация IL-ІО-продуцирующих регуляторных клеток в присутствии витамина D3 и дексаметазона из популяции наивных CD4+ Т-лимфоцитов впервые была описана Barrat с соавт. в 2002 г. [8]. Выбор такой комбинации основывался на известных фактах об ингибирующем действии витамина D3 и дексаметазона на пролиферацию Т-клеток и продукцию ими цитокинов за счет подавления активации ряда транскрипционных факторов [4, 8]. С другой стороны, известно, что генерация IL-ІО-продуцирующих Treg может индуцироваться незрелыми миелоидными дендритными клетками, а витамин D3 и дексаметазон подавляют созревание дендритных клеток [І4, 2З, 24]. Таким образом, еще одним механизмом действия этих иммуносупрессорных агентов может быть их непрямое влияние на Т-клетки, опосредованное через антигенпрезентирующие клетки [З2]. Поскольку в проведенных нами исследованиях использовались не наивные CD4+ Т-клетки, а популяции несепарированных МНК, данный механизм индукции Tr! представляется вполне возможным.

Кроме того, применение в качестве источника генерации Treg мононуклеарных клеток не исключает присутствия среди них и последующей экспансии естественных Treg тимического происхождения. Действительно, супрессорный эффект проявлялся как при добавлении супернатантов клеток, так и при прямом межклеточном контакте. Кроме того, генерация супрессорной активности ассоциировалась с увеличением численности CD4+FOXP3+ клеток. Данный факт, тем не менее, не является прямым доказательством генерации естественных Treg, поскольку в последние годы появились данные об экспрессии FOXP3 не только естественными, но и индуцированными регуляторными клетками периферической крови [З].

В заключение следует отметить еще один факт. Несмотря на увеличение относительного количества CD4+FOXP3+ клеток в процессе генерации Treg в присутствии витамина Ds и дексаметазона, содержание CD4+CD25hi клеток, с которыми обычно связывают популяцию естественных регуляторных клеток, значимо не увеличивалось по сравнению с контрольными культурами. С другой стороны, прирост CD4+CD25+ наблюдался при активации МНК как в присутствии (модель 2), так и в отсутствии иммуносупрессорных агентов (модель І) и, следовательно, не был сопряжен с генерацией супрессорной активности. По-видимому, полученные в процессе культивирования Т-лимфоциты с фенотипом CD4+CD25+ и CD4+CD25hi представлены, главным образом,

популяцией активированных Т-клеток и не связаны с Treg, обладающими супрессорной активностью.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что активация Т-клеток анти-CD3 и IL-2 в присутствии витамина D3 и дексаметазона является относительно доступным и простым методом генерации in vitro популяции Т-клеток, характеризующихся состоянием анергии и содержащих Treg с супрессорной активностью. Вопрос о том, с каким типом регуляторных клеток связана супрессорная активность — с индуцированными Treg или с индуцированными и естественными Treg, пока остается открытым и требует дальнейших исследований.

Список литературы

1. Курганова Е.В., Тихонова М.А., Стрельцова Е.И., Останин А.А., Черных Е.Р., Козлов В.А. Регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью при хирургическом сепсисе // Мед. иммунология. - 2006. - Т. 8, № 1. - С. 51-60.

2. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FOXP3 // Иммунология. - 2006. - № 3. - С. 176-188.

3. Allan S.E., Crome S.Q., Crellin N.K., Passeri-ni L., Steiner T.S., Bacchetta R., Roncarolo M.G., Levings M.K. Activation-induced FOXP3 in human T effector cells does not suppress proliferation or cytokine production // International Immunology. — 2007. - Vol. 19, N 4. - P. 345-354.

4. Alroy I., Towers T.L., Freedman L.P. Transcriptional repression of the interleukin-2 gene by vitamin D3: direct inhibition of NFATp/AP-1 complex formation by a nuclear hormone receptor // Mol. Cell. Biol. - 1995. - Vol. 15. -P. 5789-5799.

5. Baecher-Allan C., Hafler D.A. Suppressor T cells in human diseases // J. Exp. Med. - 2004. -Vol. 200, N 3. - P. 273-276.

6. Balandina A., Lecart S., Dartevelle P, Saoudi A., Berrih-Aknin S. Functional defect of regulatory CD4+CD25+ T cells in the thymus of patients with autoimmune myasthenia gravis // Blood. - 2005. -Vol. 105. - P. 735-741.

7. Baratelli F., Lin Y., Zhu L., Yang S.C., Heuze-Vourc’h N., Zeng G., Reckamp K., Dohadwala M., Sharma S., Dubinett S.M. Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in human CD4+ T cells // J. Immunol. - 2005. -Vol. 175. - P. 1483-1490.

8. Barrat FJ., Cua D.J., Boonstra A., Richards D.F., Crain C., Savelkoul H.F., de Waal-Male-fyt R., Coffman R.L., Hawrylowicz C.M., O'Garra A. In vitro generation of interleukin 10-producing regulatory CD4+ T cells is induced by immunosuppressive drugs and inhibited by T helper type 1 (Th1)- and

Th2-inducing cytokines // J. Exp. Med. — 2002. — Vol. 195, N 5. - P. 603-616.

9. Bisikirska B.C., Herold K.C. Use of anti-CD3 monoclonal antibody to induce immune regulation in type 1 diabetes // Ann. N.Y Acad. Sci. — 2004. — Vol. 1037. — P. 1-9.

10. Dieckmann D., Bruett C.H., Ploettner H., Lutz M.B., Schuler G. Human CD4+CD25+ regulatory, contact-dependent T cells induce interleukin 10-producing, contact-independent type 1-like regulatory T cells // J. Exp. Med. — 2002. — Vol. 196, N 2. — P. 247-253.

11. Fantini M.C., Becker C., Monteleone G., Pallone F., Galle P.R., Neurath M.F. TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7 // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172, N 9. — P. 5149-5153.

12. Hoffmann P., Eder R., Kunz-Schughart L.A., Andreesen R., Edinger M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4+CD25high regulatory T cells // Blood. — 2004. — Vol. 104, N 3. — P. 895-903.

13. Jonuleit H., Schmitt E., Stassen M., Tuetten-berg A., Knop J., Enk A.H. Identification and functional characterization of human CD4+CD25+ T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood // J. Exp. Med. — 2001. — Vol. 193, N 11. — P. 1285-1294.

14.Jonuleit H., Schmitt E., Schuler G., Knop J., Enk A.H. Induction of interleukin 10-producing, non-proliferating CD4+ T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells // J. Exp. Med. — 2000. — Vol. 192. — P. 1213-1222.

15. Kohm A.P., Williams J.S., Bickford A.L., McMahon J.S., Chatenoud L., Bach J.F., Bluestone J.A., Miller S.D. Treatment with nonmitogenic anti-CD3 monoclonal antibody induces CD4+ T cell unresponsiveness and functional reversal of established experimental autoimmune encephalomyelitis // J. Immunol. — 2005. — Vol. 174. — P. 4525-4534.

16.Levings M.K., Sangregorio R., Sartirana C., Moschin A.L., Battaglia M., Orban P.C., Ronca-rolo M.G. Human CD4+CD25+ T suppressor cell clones produce transforming growth factor p, but not IL-10, and are distinct from type 1 T regulatory cells // J. Exp. Med. — 2002 — Vol. 196, N 10. — P. 1335-1346.

17. Levings M.K., Sangregorio R., Roncaro-lo M.G. Human CD25+CD4+ T cells suppress naive and memory T-cell proliferation and can be expanded in vitro without loss of suppressor function // J. Exp. Med. — 2001. — Vol. 193. — P. 1295-1302.

18. Levings M.K., Roncarolo M.G. T-regulatory 1 cells: a novel subset of CD4 T cells with immunore-

gulatory properties // J. Allergy Clin. Immunol. — 2000. — Vol. 106. — P. 109-112.

19. LindleyS., DayanC.M., BishopA., Roep B.O., Peakman M., Tree T.I. Defective suppressor function in CD4+CD25+ T-cells from patients with type 1 diabetes // Diabetes. — 2005. — Vol. 54. — P. 92-99.

20. Ling E.M. Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cells suppression of allergen-driven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease // Lancet. — 2004. — Vol. 363. — P. 608-615.

21. Morgan M.E., Sutmuller R.P., Witteveen H.J., van Duivenvoorde L.M., Zanelli E., Melief C.J., Snij-ders A., Offringa R., de Vries R.R., Toes R.E. CD25+ cell depletion hastens the onset of severe disease in collagen-induced arthritis // J. Arthritis Rheum. —

2003. — Vol. 48. — P. 1452-1460.

22. Ng WF., Duggan P.J., Ponchel F., Matarese G., Lombardi G., Edwards A.D., Isaacs J.D., Lechler R.I. Human CD4+CD25+ cells: a naturally occurring population of regulatory T cells // Blood. — 2001. — Vol. 98. — P. 2736-2744.

23.Penna G., Roncari A., Amuchastegui S., Daniel K.C., Berti E., Colonna M., Adorini L. Expression of the inhibitory receptor ILT3 on dendritic cells is dispensable for induction of CD4+Foxp3+ regulatory T cells by 1,25-dihy-droxyvitamin D3 // Blood. — 2005. — Vol. 106, N 10. — P. 3490-3497.

24. Piemonti L., Monti P., Sironi M., Fraticelli P., Leone B.E., Dal Cin E., Allavena P., Di Carlo V Vitamin D3 affect differentiation, maturation, and function of human monocyte-derived dendritic cells // J. Immunol. — 2000. — Vol. 164. — P. 4443-4451.

25. Ramsdell F. Foxp3 and natural regulatory T cells: key to a cell lineage? // Immunity. — 2003. — Vol. 19. — P. 165-168.

26. Robinson D.S., Larche M., Durham S.R. Tregs and allergic disease // J. Clin. Invest. — 2004. — Vol. 114, N 10. — P. 1389-1397.

27. Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses // Annu. Rev. Immunol. — 2004. — Vol. 22. — P. 531-562.

28. Sakaguchi S. Regulatory T cells: key controllers of immunologic self-tolerance // Cell. — 2002. — Vol. 101. — P. 455-458.

29. Shevach E.M. Regulatory T cells in autoimmunity // Annu. Rev. Immunol. — 2000. — Vol. 18. — P. 423-449.

30. Suri-Payer E., Amar A.Z., Thornton A.M., Shevach E.M. CD4+CD25+ T cells inhibit both the induction and effector function of autoreactive T cells and represent a unique lineage of im-munoregulatory cells // J. Immunol. — 1998. — Vol. 160. — P. 1212-1218.

31. Viglietta V, Baecher-Allan C., Weiner H.L., Hafler D.A. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis // J. Exp. Med. — 2004. — Vol. 199, N 7. — P. 971-979.

32. Xystrakis E., Kusumakar S., Boswell S., Peek E., Urry Z., Richards D.F., Adikibi T., Prid-geon C., Dallman M., Loke T.K., Robinson D.S., Barrat F.J., O'Garra A., Lavender P., Lee T.H., Corrigan C., Hawrylowicz C.M. Reversing the defective induction of IL-10-secreting regulatory T cells in glucocorticoid-resistant asthma

patients // J. Clin. Invest. — 2006. — Vol. 116, N 1. — P. 146-155.

33.Yagi H., Nomura T, Nakamura K., Yamaza-ki S., Kitawaki T., Hori S., Maeda M., Onodera M., Uchiyama T., Fujii S., Sakaguchi S. Crucial role of FOXP3 in the development and function of human CD25+CD4+ regulatory T cells // Int. Immunol. —

2004. — Vol. 16, N 11. — P. 1643-1656.

поступила в редакцию 13.11.2007 принята к печати 27.12.2007