Изучение стабильности туберкулина очищенного для млекопитающих

9. Корнеев, A.A. О механизме повреждающего действия гипоксии на дыхательную цепь и способах ее фармакологической коррекции / A.A. Корнеев, И.А. Комиссарова // Эксперим. и клинич. фармакол. - 1994. - № 1. - С. 45-47.

10. Миронова, И.И. Дифференциальная диагностика анемий с помощью гематологического анализатора / И.И. Миронова // Клиническая лабораторная диагностика. -1994. - № 3. - С. 5-11.

11. Никитин, И.Н. Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий на свинокомплексах / И.Н. Никитин, Л.И. Иванов // Ветеринария. - 1990. - № 10. - С. 16-19.

УДК 619:616.98:579.873.21-07

ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ТУБЕРКУЛИНА ОЧИЩЕННОГО ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

А.Н. ПРИТЫЧЕНКО УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

Введение. Проблема туберкулеза по-прежнему имеет приоритет, как в медицине, так и ветеринарии. Несмотря на большие успехи в борьбе с туберкулезом, эта болезнь остается, с одной стороны, самой изученной, с другой - загадочной болезнью 21 века. Это подтверждает статистика. Так, по данным ВОЗ, на нашей планете каждый третий житель инфицирован возбудителем туберкулеза, ежегодно от туберкулеза умирают сотни тысяч людей [1, 2, 5].

В ветеринарной медицине особое внимание уделяется туберкулезу крупного рогатого скота, что связано с биологическими свойствами возбудителя [4].

Одним из важнейших методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является аллергическая диагностика с применением туберкулина очищенного для млекопитающих [3, 5, 6].

К концу 19 в. назрела необходимость принятия радикальных противотуберкулезных мер. В 1899 г. на VII Ветеринарном конгрессе разработаны рекомендации и поставлена одна из главных задач ветеринарной медицины - разрыв эпизоотической цепи за счет выявления и убоя больных животных, контроля туш, термической инактивации молока и мяса, охраны ферм и уничтожения резервуаров инфекции [13].

Нараставшая пандемия заставила проводить борьбу с туберкулезом крупного рогатого скота в национальных масштабах. В 1909 г. рекомендован переход от добровольности мероприятий к обязательной государственной борьбе с болезнью. Национальные программы были приняты в Голландии (1904), Австрии (1909), Германии (1912), Великобритании (1913), США (1917 г.) [8]. В них предусматривалось: выявление и убой животных с клиническими признаками болезни, компенсация убытков по убою животных, пастеризация молока от больных коров, создание национальных центров по борьбе с болезнью [12].

На начальном этапе речь шла о выявлении и убое коров с клиническими формами болезни. Позднее были разработаны более чувствительные методы диагностики. Bang (1898) предложил внутрикожное введение туберкулина, а Остертаг (1912) - клинический осмотр и бактериологическое исследование [9].

Метод Остертага оказался низкоэффективным. В Германии после 24 лет его применения клинический туберкулез был обнаружен у 1,5 % животных, а при бактериологическом исследовании - у 0,95 %, но при туберкулинодиагностике было выявлено 12-37 % реагирующих животных, т. е. как минимум в 10 раз больше [10]. Поэтому большинство национальных программ базировалось на внутрикожной туберкулиновой пробе. Например, в США программа предусматривала аккредитацию стад путем двукратной туберкулинизации с интервалом в 1 год. Если выявлялись реагирующие животные, стадо ставили на карантин и проводили туберкулинизации каждые 60 дней до получения отрицательного результата [11]. Такой подход оказался эффективным. Если в начале осуществления программы в 1917 г. пораженность стад составляла 5 %, то через 7 лет она не превышала 0,5 % [14].

В Дании в 1936 г. 40,3 % коров были поражены туберкулезом. Вследствие туберкулинодиагностики и убоя реагировавших коров в течение 19 лет уменьшилось число зараженных животных до 0,07 % [10]. Использование туберкулинизации позволило оздоровить большинство стран Западной Европы. В 2005 г. статус стран, официально свободных от туберкулеза крупного рогатого скота, имели: Австрия, Бельгия, Чехия, Дания, Финляндия, Франция, Германия, Люксембург, Нидерланды, Словакия и Швеция.

В СССР был разработан ускоренный метод оздоровления стад, который использовался и в Республике Беларусь [6, 7, 10]. Метод предусматривал проведение туберкулинизаций через 30-45 дней до получения отрицательного результата с последующей перепроверкой через 22,5 месяца [6, 9, 10]. Если по алгоритмам исследований, заложенным в национальных программах западных стран, эффект достигался через 7-20 лет, то по ускоренному методу - через 1-2 года [10].

Несмотря на успехи в оздоровлении целых регионов и стран, угроза активизации туберкулезной инфекции в них сохраняется [8, 16]. Это вызывает необходимость постоянного контроля ситуации путем проведения туберкулинизации. Так, начиная с 1959 г. в Великобритании число реагирующих на туберкулин коров неуклонно снижалось, но с 1992 г. начался рост, достигший в 2004 г. показателя 50 реагирующих коров на 10000 исследованных [16]. В 2011 г. реагирующие на туберкулин коровы были обнаружены в 9,17 % стад Северной Ирландии, в 6,87 % - Великобритании, в 5,72 % - Ирландии, 1,11 % - Испании, 0,74 % - Греции, 0,04 % - Польши и 0,01 % - Германии. В Новой Зеландии, несмотря на низкий уровень инцидентности, в 2011 г. было 80 инфицированных стад.

Осознание экономической и социальной опасности туберкулеза крупного рогатого скота привело к созданию и осуществлению национальных программ борьбы с болезнью.

Наиболее успешными оказались программы борьбы с туберкулезом, в основу которых было положено обнаружение больных и зараженных животных с помощью внутрикожной пробы с туберкулином [10, 15].

Достижение благополучия по туберкулезу зависит от алгоритма применения туберкулиновой пробы, но не исключает возможность ухудшения ситуации и требует постоянного контроля состояния с применением туберкулиновой пробы [7, 10, 15].

Потребности аллергической диагностики в нашей стране покрываются посредством выпуска туберкулина на ОАО «БелВитунифарм», кроме того, это решает проблему импортозамещения. Препарат достаточно изучен, но требует изучения в отношении стабильности в течение длительного срока.

Массовое производство туберкулина очищенного для млекопитающих на ОАО «БелВитунифарм» начато с конца 2003 г. Первоначально срок годности препарата был установлен в 12 месяцев. Производство и изучение препарата позволили в 2007 г. увеличить срок использования (хранения) туберкулина очищенного до 18 месяцев. В связи с возможностью поставок препарата на экспорт, при которых одним из требований является срок хранения 3 года, возникла необходимость изучения стабильности препарата в течение 36 месяцев.

Цель работы - изучить стабильность туберкулина очищенного (ТО) для млекопитающих в течение длительного времени.

Материал и методика исследований. Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии УО «ВГАВМ», ОАО «БелВиту-нифарм», в отделе зоонозов и разработки диагностических препаратов РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелес-ского».

В работе использовали штаммы M. bovis № 8, M. bovis Vallee, полученные в 1971 г. в ВГНКИ, депонированные в РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского», штамм M. bovis БЦЖ-1 246 пассажа Государственного научно-контрольного института им. Тарасевича (Москва), а также штаммы M. bovis БЦЖ и M. bovis СП2.

Культуральные свойства изучали путем посева на среду Гельберга и МПА с последующей инкубацией при 20, 37 и 45 °С, а также на средах Сотона и Павловского. Морфологические и тинкториальные свойства культур изучали микроскопией препаратов-мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену (Ц-Н), патогенные свойства - заражением морских свинок и кроликов в дозе 1 мг влажного веса бактериальной массы.

Кровь от 49 реагировавших коров была исследована в ИФА для определения уровня антител к антигенам M. bovis, М. tuberculosis, НТМБ и подвергнута бактериологическому исследованию с помощью

«Набора для ускоренного выявления микобактерий туберкулеза» ТУ BY 600049853.084-2007.

Для идентификации штаммов в полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяли праймеры IS1081, IS81, IS6110, ET, реакцию ставили по стандартному протоколу.

С помощью источника тока «Power pac 300» (Bio-Rad) ампликоны подвергали электрофорезу в 1,5%-ном агарозном геле с 1%-ным бромистым этидием в течение 30 мин при 10 В/см.

Для оценки результатов использовали трансиллюминатор 2000 (Bio-Rad) с длиной волны 310 нм и видеосистему для регистрации «Samsung» с программой «Се11 Ехр1огег» версия 1,0.

ДНК изолятов из туберкулинов исследовали в ПЦР в реальном времени (набор реагентов НПА «Нарвак») с зондами FAM (M. tuberculosis-M. bovis complex) и JOE (M. tuberculosis).

Исследования проводились в 2006-2011 гг. на морских свинках и крупном рогатом скоте, зараженном M. bovis BCG.

В работе использованы контрольные серии ТО, активность которых была определена относительно международного эталона:

ТО серии 20, 06.2004 г. (контрольная серия);

ТО серии 37, 03.2006 г. (контрольная серия);

ТО серии 39, 01.12.2006 г. (производственная серия);

ТО серии 50, 08.2007 г. (контрольная серия);

ТО серии 66, 08.2007 г. (контрольная серия).

Препараты хранились по действующим ТНПА и по физико-химическим свойствам соответствовали показателям качества.

Результаты исследований и их обсуждение. В июне 2006 г. была определена активность ТО серии 20 (со сроком хранения 24 месяца) относительно ТО серии 37. Десяти морским свинкам, зараженным M. bovis, вводили ТО серии 20 (1-е и 2-е разведения - 100 и 10 МЕ) и ТО с. 37 по 100 и 10 МЕ. Результаты измерения диаметра папул представлены в табл. 1. Как видно из таблицы, активность ТО серии 20 со сроком хранения 24 месяца была полностью идентичной контрольной серии ТО серии 37 со сроком хранения 3 месяца.

Таблица 1. Диаметр папул у морских свинок, зараженных M. bovis

Номер свинок Среднеарифметический диаметр папул, мм

ТО 37 ТО 20

100 МЕ 10 МЕ 1-е разведение 2-е разведение

1 16,5 13,5 16,0 13,5

2 15,5 13,0 18,5 13,5

3 14,5 12,2 20,0 12,5

4 18,5 12,5 18,5 13,5

5 18,5 14,7 19,5 13,7

6 21,5 14,5 20,5 14,0

7 23,3 16,5 19,7 16,3

8 21,5 13,5 19,3 11,5

9 18,7 11,7 17,0 12,3

10 18,2 9,7 17,5 11,5

М 18,7 13,2 18,7 13,2

В июне 2006 г. на 9 головах молодняка крупного рогатого скота, сенсибилизированного M. bovis BCG и смеью НТМБ, была определена

302

активность ТО серии 20 со сроком хранения 24 месяца относительно ТО серии 37. Как видно из табл. 2, при оценке интенсивности реакций по критерию знаков, активность ТО серии 20 со сроком хранения 24 месяца достоверно не отличалась от активности ТО контрольной серии.

В ноябре 2007 г. было проведено сравнение активности ТО серии 20 (срок хранения 40 месяцев) с контрольной серией ТО 50, изготовленного 06.08.2007 г. Морским свинкам, зараженным M. bovis, вводили разведения ТО серии 20 - 1:200, 1:1000, 1:5000 и соответствующие разведения ТО серии 50. Результаты измерения представлены в табл. 3.

Таблица 2. Утолщения кожных складок у экспериментально

зараженного крупного рогатого скота на ТО серии 20 со сроком хранения 24 месяца и ТО контрольной серии 37, мм

Номер животного | ТО серии 20 | ТО серии 37 | Оценка интенсивности реакций

Заражен M. bovis BCG

12 7 5,5 +

25 4 8 -

1 5 5 =

38 5 3 +

45 13 13,5 -

53 11 5,5 +

Заражен НТМБ

54 2 2 =

15 7 9 +

44 0 0 =

Таблица 3. Интенсивность аллергических реакций у морских свинок, зараженных M. bovis, на эквивалентные разведения ТО серий 20 и 50

Номер морских свинок Среднеарифметический диаметр папул, мм

ТО серии 20 ТО серии 50

1:200 1:1000 1:5000 1:200 1:1000 1:5000

1 16,5 12 10 17,5 13 8,5

2 12 10 5 15,5 11 5,5

3 14 9,5 8 17 12,5 7,5

4 16 10 5 16 13 7,5

5 15,5 9,5 5,5 13 9,5 5

6 15,8 14,5 10 19,5 13,5 11,5

7 14 10 5 15,5 14 6

8 17 11 6,5 18,5 13,5 6

9 16,5 11 5,5 16 11,5 5

М 16,6 12 6,9 16,1 11,1 6,5

На рис. 1 представлена зависимость эффекта (диаметра папул) от логарифма дозы при введении ТО серий 50 и 20.

Как видно, линии активности полностью накладываются друг на друга, что указывает на то, что туберкулин со сроком хранения 40 месяцев достоверно не изменил активность.

В августе 2011 г. проведены исследования активности серий туберкулина с 4-летним сроком хранения. На морских свинках, зараженных возбудителем туберкулеза, сопоставлена активность контрольной серии 74 и серии 50 со сроком хранения 4 года (табл. 4). При сравнении логарифмической зависимости доза-эффект (рис. 2) установлено, что линии активности сравниваемых серий накладываются друг на друга, что свидетельствует об их равной активности.

Рис. 1. Зависимость эффекта от логарифма дозы при введении ТО серий 50 и 20 в опыте на морских свинках, зараженныхM. bovis: по оси абсцисс - log дозы, МЕ; по оси ординат - диаметр папул, мм

Следовательно, по результатам проведенных исследований ТО производства ОАО «БелВитунифарм» сохраняет активность в течение 4 лет (48 месяцев), поэтому срок его годности может быть гарантированно продлен до 36 месяцев.

Таблица 4. Диаметр папул у морских свинок через 24 ч после введения серий туберкулина с разными сроками хранения

Номер морских свинок Среднеарифметический размер эритемы через 24 ч, мм

ТО серии 74 ТО серии 50

1:200 218 МЕ 1:1000 43,6МЕ 1:5000 8,72МЕ 1:200 1:1000 1:5000

1 16 14,8 6,8 15 15 8

2 17,8 12,8 8,3 17 15,3 7,8

3 16,5 13,5 5 15 12,3 10

4 13,8 9,8 4 15,8 8,5 5

5 15,3 12,5 7,5 16,5 13,5 8

6 13,3 11,5 7 13,3 9 5

7 14,8 13,5 6 12,5 12 5

8 11,5 10 5 12,5 10,5 5

9 10 5 4 11 5 4

10 13,8 12 6 13,5 8,8 4

М 14,28 11,5 6,0 14,2 11,0 6,13

♦ Ряд1  Ряд2

-Линейный

-Линейный

-Линейный

Рис. 2. Зависимость интенсивности реакций на ТО серий 74 и 50 с разным сроком хранения от логарифма их дозы

Заключение. Туберкулин очищенный производства ОАО «БелВи-тунифарм» при нормативных условиях хранения гарантированно сохраняет показатели качества и активности 36 месяцев.

ЛИТЕРАТУРА

1. Архипов, И.Н. Серологические, бактериологические и молекулярно-генетические маркеры туберкулезной инфекции крупного рогатого скота: автореф. дис. ... канд. вет. наук: 06.02.02 / И.Н. Архипов; Ин-т экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. - Минск, 2011. - 26 с.

2. Кузин, А.И. Вопросы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / А.И. Кузин, Л.К. Семина // Ветеринарная патология. - 2004. - № 1/2. - С. 48-49.

3. Лысенко, А.П. Антигены M. bovis и атипичных микобактерий, изучение и применение для дифференциальной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота: автореф. дис. ... д-ра вет. наук: 16.00.03 / А.П. Лысенко; БелНИИ экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. - Минск, 1994. - 35 с.

4. Найманов, А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в современных условиях / А.Х. Найманов // Ветеринарная патология. -2004. - № 1/2. - С. 18-23.

5. Притыченко, А.Н. Туберкулин очищенный для млекопитающих (оптимизация очистки, диагностические и иммунохимические свойства): автореф. дис. ... канд. вет. наук: 16.00.03 / А.Н. Притыченко; БНИИ экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. - Минск, 2002. - 17 с.

6. Туберкулез крупного рогатого скота в Беларуси (анализ эпизоотической ситуации, прогноз и проблемы ликвидации) / А.А. Холод [и др.] // Ветеринарная медицина Беларуси. - 2002. - № 4. - С. 12-13.

7. Тузова, Р.В. Туберкулез сельскохозяйственных животных и птицы / Р.В. Тузо-ва. - Минск: Ураджай, 1983. - 263 с.

8. Урбан, В.П. О природе повторных вспышек туберкулёза / В.П. Урбан // Ветеринария. - 1982. - № 10. - С. 12-14.

9. Хоменко, А.Г. Туберкулез сегодня и завтра - проблемы и пути решения / А.Г. Хоменко // Проблемы туберкулеза. - 1995. - № 1. - С. 4-8.

10. Эбер, А. Прививка туберкулина. Борьба с туберкулезом рогатого скота: научные исследования и практические опыты / А. Эбер. - СПб: Тип. училища глухонемых, 1900. - 56 с.

11. Bovine Tuberculosis Eradication: Uniform Methods and Rules / United States Depar-tament of Agriculture // Animal and Plant Health Ispection Servise. - Washington, D.C., USA, 1999. - 34 p.

12. Dubos, R. The White Plague: Tuberculosis, Man, and Society / R. Dubos, J. Dubos. - Boston: Little-Brown, 1952. - 676 p.

13. Faulder, E.T. Bovine Tuberculosis: Its Hystory, Control and Eradication / E.T. Faulder // New York State Departament of Agriculture and Marcets Bulletin. - 1928. -№ 218. - P. 23-28.

14. Mainning, E.J.B. Mycobacterial infections in domestic and wild animals / E.J.B. Mainning, M.T. Collins // Rev. sci. thech. Off. Int. Epiz. - 2001. - Vol. 20. - № 1. -P. 23-80.

15. Risk factors for bovine Tuberculosis at the national level in Great Britain / Paul R. Bes-sell [et al.] // Veterinary Research. - 2012. - Vol. 7. - P. 121-124.

16. The importance of Mycobacterium bovis as a zoonosis / C. Thoen [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2006. - Vol. 112. - № 2/4. - P. 339-345.

УДК 619:616.98:579.873.21-07

ОЦЕНКА СТАНДАРТНОСТИ СЕРИЙ ТУБЕРКУЛИНА ОЧИЩЕННОГО ПО МОЛЕКУЛЯРНОМУ СОСТАВУ

А.Н. ПРИТЫЧЕНКО УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

Введение. Туберкулез остается ключевой проблемой в инфекционной патологии человека и животных. Эпизоотическая и эпидемическая ситуация по туберкулезу в нашей стране остается сложной.

Туберкулез чаще встречается среди крупного рогатого скота. В нашей стране поддерживается благополучие по туберкулезу крупного рогатого скота посредством проведения плановых массовых мероприятий [15].

Одним из ведущих методов поддержания благополучия по туберкулезу в стране является аллергическая проба с туберкулином. Выпуск препарата в настоящее время налажен на ОАО «БелВитунифарм».

Туберкулин представляет собой сложную смесь водорастворимых антигенов микобактерий туберкулеза, выращенных на жидкой питательной среде, инактивированных высокой температурой. Существует несколько разновидностей туберкулинов: альттуберкулины, HCSM (безальбумозные) и PPD (purified protein derivative, ППД) - туберкули-ны, которые получают по разным технологиям [6, 7, 15].

В 1890 г. R. Koch (Р. Кох) получил фильтрат кипяченой взвеси туберкулезных бактерий, под названием «туберкулин». Препарат предназначался для лечения туберкулеза. В последующем Koch получал туберкулин, выращивая МБТ на мясопептонном глицериновом бульоне 8-9 недель. Возбудитель инактивировался автоклавированием (121 °С 30-60 мин), бактериальная масса отделялась фильтрованием, а