ГЕКСОКИНАЗНЫЙ СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРА В КРОВИ. ГЕКСОКИНАЗНЫЙ СПОСОБ КАЛИБРОВКИ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРА В КРОВИ
HEXOKINASE METHOD FOR NON-INVASIVE BLOOD SUGAR MEASUREMENT; HEXOKINASE METHOD FOR CALIBRATION OF AGENTS FOR NON-INVASIVE BLOOD SUGAR MEASUREMENT

Изобретение относится к области медицины и предназначено для использования при экспресс-анализах в клиниках, больницах или в условиях поликлиник, а также может применяться в индивидуальном порядке, в домашних условиях.
Как известно, диабет - это хроническое заболевание, и если отсутствует контроль, со временем это заболевание приводит к нарушениям многих систем организма. Это состояние кровеносных сосудов, органов зрения, почек и сердца, а также нервной системы.
Важным элементом проверки наличия диабета является регулярный контроль как со стороны органов медицины, так и самоконтроль, как правило, в домашних условиях. Для существующих способов текущего контроля и самоконтроля характерен болезненный характер забора крови через кожу перед проведением анализа.
Известен способ определения общего содержания глюкозы в цельной крови и композиции для его осуществления (патент РФ №2050546. G01N 33/48, 1990). Способ включает в себя контактирование пробы цельной крови в микрокювете с сухим реагентом, содержащим также гемолизирующее вещество, и последующее спектрофотометрическое измерение содержания продукта реакции. К недостаткам данного способа следует отнести использование цельной неразбавленной крови, сложность и раздельность компонентов как в способе, так и в композиции для количественного определения общего содержания глюкозы.
Известен также способ определения содержания гемоглобина в крови, реактив-комплексообразователь и раствор-калибратор (Патент РФ №2044319. G01N 33/48, 1992). Недостаток известного решения состоит в том, что при определении используется проба крови, обрабатываемая реактивами, причем реактивы специфичны и в основном направлены на очистку крови.
В известном способе измерения концентрации сахара и сахариметра для его реализации (патент РФ №2224240. G01N 21/21, 2002) описан принцип поляриметрических измерений. Конструкция сахариметра включает в себя два канала измерения, при этом в одном из каналов установлена кювета с измеряемым раствором. Для измерения используется микропроцессор. Описанная конструкция сахариметра сложна и обязательно требует забора крови пациента.
В настоящее время получили развитие медицинские приборы, обеспечивающие неинвазивное определение сахара в крови.
Так, известно устройство неинвазивного определения химических компонентов крови (патент РФ №2478197. G01N 21/31, 2008), в котором имеется энергетический источник (батарейка), с подключенным к нему источником света, генерирующим множество световых пучков, имеющих различный диапазон длин волн от 800 нм до 1600 нм, входную и выходную апертуры оптического прибора, между которыми помещают объект контроля - человеческий палец. Далее расположена оптическая линза и детекторный блок, выход которого подключен к процессору.
Использование для неинвазивного определения такого органа пациента, как палец, не требует забора крови. В результате обеспечивается ряд преимуществ, достигаемых в процессе измерения: это исключение заражения крови и неприятных ассоциаций у детей и даже у взрослых.
Недостатки известного решения. В процессе контроля при прохождении света через такой биологический образец, как человеческий палец, свет поглощается и рассеивается компонентами пальца, такими как кожа, жир, кость, внутритканевая жидкость и кровь, что вносит погрешность в процесс определения, существенно искажая конечный результат. Следует отметить, что эти компоненты не идентичны у контролируемых пациентов. Кроме того, размеры апертуры не универсальны - для детей они должны быть уменьшены, при этом уменьшается и количество инфракрасных излучающих диодов, равно как и детекторов, число которых для точной информации должно быть не менее двадцати-тридцати.
В настоящее время получили распространение приборы, используемые преимущественно, в домашних условиях - глюкометры (Глюкометр One Touch Select. www.lifescan.ru).
Этот глюкометр компактен, имеет малый вес, обеспечивает контроль сахара в крови.
К недостаткам глюкометра можно отнести такие проблемы. Как следует из инструкции, анализ крови может проводиться из предплечья, ладони или из пальца. При этом анализ в первых двух случаях отличается от анализа для третьего случая, главным образом, с учетом жизненно важных ситуаций. После включения прибора нужен прокол пальца с помощью специальной ручки. Необходимо получить определенную форму капли - круглую. При невыполнении этого условия необходим дополнительный прокол пальца в другом месте. Также возможна и необходима настройка глубины прокола с помощью специальной ручки с контролем по шкале глубины прокола, для получения достаточного количества крови для анализа. Далее используется тест-полоска. На нее должна быть нанесена капля крови. При этом возможна ситуация, при которой на экране прибора не отображается окно: НАНЕСИТЕ КРОВЬ, тогда необходимо вынуть неиспользованную тест-полоску и начать процедуру заново. Из приведенных материалов следует, что, кроме определенных сложностей при работе с глюкометром, его основной недостаток состоит в необходимости взятия крови у пациента.
Задача, на решение которой направлен заявляемый гексокиназный способ неинвазивного определения сахара в крови, заключается в исключении указанных недостатков.
Технический результат состоит в упрощении способа, в повышении его надежности, за счет исключения из контроля такого органа человека, как его палец, а вместе с ним и все негативные эффекты указанные выше.
Указанный технический результат в гексокиназном способе неинвазивного определения сахара в крови, заключается в том, что осуществляют подготовку рабочего прибора для определения сахара в крови, в котором используют пробу и реагент, при этом в качестве пробы применяют дозу слюны пациента, а для реагента употребляют первичный конгломерат монореактива, в качестве которого применяют монореактив, например Глюкоза-УФ-Ново, где гексокиназа дополнительно содержит диафоразу, помещаемых в кювету для их перемешивания с получением раствора, содержащего окончательный конгломерат монореактива с сахаром в слюне, и устанавливаемую в рабочий прибор для определения сахара в крови, включают источник светового излучения, в котором используют, например, лазерный диод с диапазоном длин световых волн 290-340 нм, а также фильтр-селектор для формирования пучка света с длиной волны 310 нм, направляемого на кювету с упомянутым раствором, причем осуществляют контроль многосекционным фотоприемником его оптической плотности по направлениям, что возникает за счет эффекта упругого рассеивания, то есть разного преломления по разным направлениям, и определяют искомое значение сахара в крови посредством обработки данных процессором.
Кювета изготовлена из оптического прозрачного материала, например кварца, на котором имеются выемки в виде рисок с целью более глубокого и упругого рассеяния светового излучения и создания благоприятных условий для эффекта упругого рассеивания в растворе, причем риски расположены на стороне, обращенной к источнику излучения.
Гексокиназный способ неинвазивного определения сахара в крови реализуется с помощью средств, изображенных на Фиг. 1 и Фиг. 2.
На Фиг. 1 показана реализация способа на основе блок-схемы.
Фиг. 2 поясняет приготовление раствора с пробой и реагентом в кювете, устанавливаемой в прибор (Фиг. 1) для определения сахара в крови.
Для реализации указанного способа осуществляют подготовку рабочего прибора, обеспечивающего определение сахара в крови по слюне. Прибор, на основе которого реализуется заявленный способ, содержит лазерный диод 1, фильтр-селектор 2, кювету 3, многосекционный фотоприемник 4 и процессор 5, снабженный жидкокристаллическим индикатором 6. Питание прибора осуществляется от источника 7.
Основа способа заключается в процессе приготовления раствора, желательно, при комнатной температуре от 18-25°С. Первоначально производят установку нуля на рабочем приборе при помощи кюветы с дистиллированной водой. Процессор 8 прибора запоминает это значение и хранит его в памяти.
Раствор состоит из двух составляющих - дозы слюны пациента и первичного конгломерата монореактива. Для этого с целью упрощения приготовления используют вспомогательные кюветы 8 и 9. Во вспомогательную кювету 8 помещают дозу 10 слюны пациента, а во вспомогательную кювету 9 - первичный конгломерат монореактива 11 (Фиг. 2а), в качестве которого применяют монореактив Глюкоза-УФ-Ново.
Содержимое вспомогательных кювет 8 и 9 помещают в рабочую кювету 3 (Фиг. 2б) и перемешивают.
Гексокиназный (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназный) метод определения концентрации глюкозы основан на двух последовательно протекающих реакциях: а) катализируемый гексокиназой процесс образования из глюкозы эквимолярных количеств глюкозо-6-фосфата и б) последующее превращение глюкозо-6-фосфата под воздействием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в 6-фосфоглюконат. В течение реакции происходит также восстановление NAD (никатинамидадениндинуклеотид) в NADH-восстановленная форма NAD (тест Варбурга), изменение скорости и образования которого регистрируется при 190 нм и 340 нм, так как приводит к значительному изменению спектра поглощения раствора, именно в этом диапазоне длин волн. В этом растворе образуются конгломераты, что изменяют его оптическую плотность по разным направлениям, и это происходит пропорционально концентрации глюкозы в слюне в анализируемом образце, находящемся в рабочей кювете 3 (Фиг. 2б). Если менять соотношение активностей гексокиназы и диафоразы, то скорость образования NAD в NADH или обратно будет также пропорциональна концентрации глюкозы, что исключает воздействие других соединений, находящихся в слюне, на результат.
Также для лучшего взаимодействия светового излучения с раствором на кварцевой кювете 3 имеются риски 22, что приводит к изменению его оптической плотности по разным направлениям, что возникает за счет эффекта упругого рассеивания, то есть разного преломления по этим направлениям, что приводит к большему взаимодействию светового излучения и раствора, и эти результаты считываются и фиксируются процессором 5.
В результате в рабочей кювете 3 образуется раствор 12, содержащий окончательный конгломерат монореактива, готовый для дальнейшего исследования. Эту кювету помещают в рабочий прибор. Включают источник питания 7. При работе лазерного диода 1 и фильтра-селектора 2 обеспечивается прохождение пучков света с упомянутыми выше длинами световых волн, а на выходе многосекционного фотоприемника 4 регистрируется оптическая плотность полученного раствора процессором.
Искомое значение сахара в крови определяется посредством обработки результатов процессором 5. Это значение выводится на жидкокристаллический индикатор 6.
При выполнении операций данного способа не требуется забор крови пациента. Это особенно важно, если пациент - ребенок. Кроме того, обеспечено получение достоверных данных за минимальный временной срок.
В этом изобретении также описан новый гексокиназный способ калибровки реагентов при неинвазивном определении сахара в крови.
Калибровка реагентов необходима для получения стандарта с целью дальнейшей установки индивидуального коэффициента, позволяющего стандартизировать индивидуальный прибор под данные пациента.
Технический результат состоит в установлении значения полученной концентрации раствора, поверяемой на рабочем и стационарном приборах, при которой осуществляется калибровка рабочего прибора.
Указанный технический результат в гексокиназном способе калибровки реагентов для неинвазивного определения сахара в крови достигается тем, что осуществляют подготовку рабочего прибора для определения сахара в крови с применением в нем проб и реагента, при этом в качестве проб используют несколько доз слюны пациента одинакового объема и соответствующее количество частей первичного конгломерата монореактива, например Глюкоза-УФ-Ново, где гексокиназа дополнительно содержит диафоразу, причем части первичного конгломерата монореактива используют в концентрации, состоящей, например, из трех, четырех или пяти частей по отношению к одной части соответствующей дозы слюны пациента, которую после добавления также в соответствующую кювету перемешивают последовательно с одной из указанных пропорций монореактива с получением растворов, содержащих каждый окончательный конгломерат с сахаром в слюне, устанавливают последовательно кюветы в рабочий прибор, в котором для каждой кюветы включают источник светового излучения, например лазерный диод с диапазоном длин световых волн 170-360 нм, а с помощью фильтра-селектора обеспечивают выделение пучка света с длиной волны 190 нм и 340 нм, направляемого на соответствующую кювету с упомянутым раствором и, кроме того, используют данные многосекционного фотоприемника, оценивающие степень его оптической плотности по направлениям, что возникает за счет эффекта упругого рассеивания, то есть разного преломления по разным направлениям, создавая при этом юстированные растворы, с последующим использованием процессора, и применяя стационарный прибор для определения сахара в крови, проводят сверку результатов, используя обозначенные выше концентрации, причем концентрация, показывающая на обоих приборах одинаковые результаты, является калибровочной или основой для калибровки.
Кроме того:
- при изменении соотношения гексокиназы и диафоразы, например, путем разбавления раствора дистиллированной водой меняется линейность реакции или ее можно сдвигать, или изменять направление, что позволяет получать более точные результаты при калибровке;
- кювета изготовлена из оптического прозрачного материала, например кварца, на котором имеются выемки в виде рисок, обеспечивающих более глубокое упругое рассеяние светового излучения, причем риски расположены на стороне, обращенной к источнику излучения;
Как отмечено, для проб используют дозы слюны пациента, а для реагента употребляют первичный конгломерат монореактива, в качестве которого применяют, например, монореактив Глюкоза-УФ-Ново, в котором гексокиназа дополнительно содержит диафоразу.
Калибровка выполняется в поликлиниках или больницах, оборудованных стационарными приборами, обеспечивающими такой процесс.
Согласно этому способу осуществляют подготовку рабочего прибора для определения сахара в крови по слюне пациента (Фиг. 1). Для этого предварительно осуществляют подготовку проб и реагента, которые в дальнейшем подвергают взаимодействию (Фиг. 3).
В качестве проб используют несколько доз 15 слюны пациента одинакового объема. Объем каждой дозы 1-5 мл. Эти дозы 15 располагают во вспомогательных кюветах 13-1 - 13-3. Для первичного конгломерата указанного выше монореактива Глюкоза-УФ-Ново, употребляют его соответствующее количество частей. Для проведения калибровки используют три части 16, четыре части 17, или пять частей 18 первичного конгломерата монореактива по отношению к дозе слюны. Их располагают во вспомогательных кюветах 14-1 - 14-3 (Фиг. 3а).
Выбор трех, четырех или пяти частей разбавлений, обуславливается тем, что при подобных концентрациях раствора образуются такие конгломераты (окончательные), степень поглощения или оптическая плотность, то есть эффект упругого рассеивания которых становится выше на указанных длинах световой волны, а именно 190 нм 340 нм, то есть повышается спектральная чувствительность раствора, но если это не происходит по какой либо причине, то рекомендуется увеличить количество частей монореактива или изменить соотношение диафоразы относительно гексодиназы.
Все подготовленные компоненты перемешивают в соответствующих рабочих кюветах 3-1 - 3-3 с получением растворов 19, 20 и 21, содержащих каждый окончательный конгломерат взаимодействия с сахаром в слюне (Фиг. 3б).
Кюветы 3-1 - 3-3 изготовлены с рисками 22, с целью более глубокого и упругого рассеяния светового излучения и создания благоприятных условий для эффекта указанного рассеивания в растворе, причем риски 22 расположены на стороне, обращенной к источнику излучения.
После этого устанавливают кювету, например 3-1, в рабочий прибор (Фиг. 1), в котором включают источник светового излучения. Это лазерный диод 1 с диапазоном длин световых волн 170-360 нм. С помощью фильтра-селектора 2 обеспечивается поочередное выделение пучков света с длиной волны 190 нм и 340 нм, направляемых на кювету 3-1 с глубокой степенью упругого рассеивания с упомянутым раствором.
Эти цифровые значения длин световых волн обеспечивают максимальное взаимодействие окончательного конгломерата со световым излучением за счет повышения спектральной чувствительности образуемого раствора благодаря эффекту упругого рассеивания его оптической плотности по направлениям, что возникает за счет эффекта упругого рассеивания, то есть разного преломления по разным направлениям.
Используют данные многосекционного фотоприемника 4, с помощью которых оценивается его оптическая плотность посредством эффекта упругого рассеивания. Аналогичные операции повторяют с рабочими кюветами 3-2 и 3-3. При этом формируются юстированные растворы, и для их анализа используется процессор 5, на выходе которого установлен жидкокристаллический индикатор 6.
В процессе применения стационарного прибора для определения сахара в крови (на чертежах прибор не изображен), проводят сверку результатов, используя обозначенные выше концентрации - три части, четыре части или пять частей первичного конгломерата монореактива.
При выявлении концентрации, показывающей на обоих приборах - рабочем и стационарном - одинаковые результаты, ее считают калибровочной или основой для дальнейшей работы прибора.
Таким образом, рабочий прибор считается откалиброванным под конкретного пациента, у которого была взята доза слюны при выявленной для него концентрации.
Преимущества данного изобретения и реализуемого в нем способа неинвазивного определения сахара в крови, а также способа калибровки реагентов для неинвазивного определения сахара в крови, состоят в том, что первый способ прост, не требует забора крови, применим не только для взрослых, но главным образом для детей, так как исключает травматизацию тканей. Дети не участвуют в прямом процессе определения сахара в крови, в результате не наносятся психологические травмы, характерные при заборе крови.
В отношении второго способа необходимо отметить следующее.
Этот способ позволяет обеспечивать стандартизацию процесса и выявлять калибровочную функцию установочного коэффициента.
Источники информации
1. Патент РФ №2050546. G01N 33/48, 1990. Способ определения общего содержания глюкозы в цельной крови и композиция для его осуществления.
2. Патент РФ №2044319. G01N 33/48, 1992. Способ определения содержания гемоглобина в крови. Реактив-комплексообразователь. Раствор-калибратор.
3. Патент РФ №2224240. G01N 21/21, 2002. Способ измерения концентрации сахара и сахариметр для его реализации.
4. Патент РФ №2478197. G01N 21/31, 2008. Устройство для неинвазивного определения химических компонентов крови (варианты).
5. Компания «ВЕКТОР БЕСТ». Название набора реагентов: «Глюкоза-УФ-Ново». Адрес компании: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1.
6. Глюкометр One Touch Select. www. lifescan. ru