Исследование содержания свободного пролина в растениях кукурузы, трансформированных in planta с использованием LBA4404, несущего pBi2E с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы

УДК 579.254.2

ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА В РАСТЕНИЯХ КУКУРУЗЫ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ IN PLANTA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ LBA4404, НЕСУЩЕГО pBi2E С ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫМ РНК-СУПРЕССОРОМ ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ

©2013 С.И. Михальская1, А.Ю. Матвеева1, Л.Е. Сергеева1, A.B. Кочетов2, E.H. Тищенко1

Институт физиологии растений и генетики HAH Украины, г. Киев, 2Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Поступила 23.05.2013

Получены трансгенные Т1-растения кукурузы (Zea mays L.), содержащие двухцепочечный РНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы. Проанализирован уровень свободного L-пролина в побегах и корнях проростков в условиях сульфатно-хлоридного засоления. Показано, что стресс-устойчивость сопровождается повышением содержания этого осмолита.

Ключевые слова: Zea mays L, солеустойчивостъ, супрессор гена пролиндегидрогеназы, трансгенез.

Метаболическая инженерия предоставила новые возможности для решения проблемы устойчивости культурных растений к осмотическим стрессам. Одно из перспективных её направлений связано с генами, контролирующими метаболизм L-пролина (Pro). Генетические и физиолого-биохимические исследования показали, что L-пролин - полифункциональная аминокислота, которая может принимать участие в сложных интегральных процессах адаптации растений. Развивается также представление о Pro как о сигнальной/регуляторной молекуле в ходе роста, дифференцировки клеток и их программированной гибели [1-6]. Повышение уровня свободного L-пролина - физиологическая реакция многих видов растений в ответ на разные типы абиотических стрессов. Вместе с тем, роль Pro и его участие в процессах адаптации/устойчивости не всегда очевидна, о чём свидетельствуют результаты исследований уровня толерантности трансгенных растений и диких видов растений [2, 7-9].

Эндогенный уровень L-пролина растений в норме и при стрессе координировано регулируется его синтезом, катаболизмом и транспортом [10, 1, 2]. Гены, контролирующие метаболизм Pro, кодируются ядерным геномом, и наиболее детально исследованы у арабидопсиса и табака. Проанализированные на сегодняшний день гены синтеза - P5CS (энзим \'-пиррол ин-5-карбоксилатсинтстаза.

ЕС.2.7.2.11.1.2.1.41) и катаболизма - ProDH (энзим пролиндегидрогеназа, ЕС.1.5.99.8.) ряда растений находятся в центре внимания при разработке молекулярных биотехнологий, направленных на повышение уровня стрессоустойчивости культурных

Михальская Светпана Ивановна, к.б.н., научный сотрудник, e-mail: svetlana_mykhalska(a!mail.ru; Матвеева Апександра Юрьевна, к.б.н., младший научный сотрудник, e-mail: mgi-rais(a!mail.ru; Сергеева Лариса Евгеньевна, к.б.н., старший научный сотрудник; Кочетов Апексей Владимирович, к.б.н., заведущий лабораторией, e-mail: aK(a!bionet.nsc.ru; Тищенко Елена Николаевна, д.б.н., заведующая отделом, e-mail: olty-ко(й! gmail.com

растений. Они представлены единичными копиями с высоким уровнем гомологии, каждая из которых может выполнять различные функции, связанные с ответной реакцией на стресс и/или с пролиферацией, дифференцировкой клеток растений [11, 1, 2]. В связи с чем целесообразен предварительный анализ эффективности их применения для получения биотехнологических продуктов.

Что касается ProDH, то для повышения уровня свободного пролина исследуются возможности частичной супрессии генов, контролирующих катаболизм L-пролина, с использованием векторных конструкций, создаваемых на основе чужеродных генов пролиндегидрогеназы, расположенных в антисмысловой ориентации или в форме обращённо-го повтора. При этом есть основания полагать, что применение siRNA -технологий является более эффективным [5,6, 12, 13].

Целью данной работы был анализ содержания L-пролина в проростках кукурузы, трансформированной in planta с использованием обезоруженного агробактериального штамма ZÄ44404, содержащего плазмиду с двухцепочечным (дц)РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы, в условиях стресса, вызванного сульфатно-хлоридным засолением.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служила инбредная линия кукурузы 250 (селекции Института физиологии растений и генетики HAH Украины), трансформированная in planta с использованием обезоруженного агробактериального штамма ZÄ44404, несущего бинарный вектор pBi2E с дцРНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы, полученным на основе гена арабидопсиса ProDH 1 (рис. 1).

Присутствие трансгена в геноме кукурузы анализировали ПЦР-методом так, как описано ранее [14].

1662

RB

LB

NOSpro nptll NOSterm 35Spro ProDH-exl intl ProDH-exl NOSterm

Рис. 1. Блок-схема Т-ДНК области pBi2E. NOSpro и 35Spro - соответственно промоторы гена нопалинсинтазы и 35S вируса мозаики цветной капусты; ProDH-exl и intl - фрагменты первого экзона и интрона гена ProDHl арабидопсиса, соответственно; NOSterm - сигнал полиаденилирования гена нопалинсинтазы; nptll - ген неоми-цинфосфотрансферазы Е. coli, RB, LB - повторы, ограничивающие Т-область

Уровень свободного L-пролина (Рго) определяли методом Чинарда с модификациями [15]. Для сравнительного анализа использовали 14-, 18- и 21-суточные проростки. Пробы отбирали и фиксировали в одно и то же время суток. Стрессовые условия создавали добавлением в среду культивирования летальные дозы солей морской воды (2,0% и 2,5%). Стрессовому воздействию подвергали 7-суточные проростки, выращенные в нормальных условиях (1 вариант), и зерновки, проращиваемые и культивируемые в стрессовых условиях в течение 28 дней (2 вариант). Содержания Рго определяли в корнях и побегах 18-суточных трансгенных проростков, полученных при проращивании зерновок (по 8 штук), взятых из 6-ти разных початков. Контролем служили побеги или корни нетрансгенных вариантов в нормальных/стрессовых условиях. При статистической обработке использовали критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для углубления представления о роли генов ProDH в процессах адаптации и жизнедеятельности кукурузы исследовали содержание свободного L-пролина в проростках кукурузы, трансформированной in planta с применением LBA4404, несущего

плазмиду с дцРНК-супрессором гена пролиндегид-рогеназы, в условиях засоления, приводившего к гибели контрольных (нетрансгенных) вариантов. Параллельно, такой подход позволяет проанализировать эффективность частичной супрессии генов ProDH кукурузы с использованием siRNA-технологий.

На рис. 2 представлены результаты содержания свободного Pro в побегах проростков, адаптированных к засолению (общий возраст проростков 14 суток, вариант 1). Видно, что уровень этой аминокислоты у ряда индивидуальных трансгенных вариантов варьировал, однако по абсолютной величине, за исключением трёх случаев, существенно превышал содержание Pro в проростках контрольных побегов. По-видимому, в вариантах V, VI и XI трансген был нефункциональным или уровень его транскрипции был незначительным. Полученные данные дают основание предполагать, что эта аминокислота выступает в качестве протектора при адаптации к ионному стрессу. Отметим, что повышение уровня свободного пролина у трансгенных растений кукурузы, содержащих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, на фоне хло-ридного засоления ранее показано Моисеевой Е.М. исоавт. [15].

600

500

400

i

ü 300

1—

S 200

s

о

'ь. О. 100

о

I

7 14 дм дн Контроль

Варианты

Рис. 2. Содержание свободного Ь-пролина в побегах адаптировавшихся к сульфатно-хлоридному засолению (2,0% солей морской воды) 14-суточных проростков кукурузы (1 - XI). Контроль: 7 сут в нормальных условиях и через 7 сут в условиях стресса

Зерновки трансгенных растений кукурузы характеризовались также способностью к прорастанию в условиях постоянного действия стрессового фактора (вариант 2). Их проращивали сначала на фоне 2,0% засоления (летальная доза стрессора), затем 7-суточные проростки переносили в более жёсткие условия стресса (2,5% солей морской во-

ды) и культивировали ещё 2 недели. Рис. 3 отображает содержание свободного пролина в 21-суточных проростках. Видно, что в условиях стресса уровень Pro существенно превышал показатель контроля. Это свидетельствует в пользу того, что этот осмолит является одним из факторов, принимающих участие в поддержании жизнедеятельно-

1663

Рис. 3. Содержание свободного Ь-пролина в побегах 21-суточных проростков, культивируемых в условиях возрастающего сульфатно-хлоридного засоления

Рис. 4. Содержание свободного Ь-пролина в корнях и побегах 18-суточных трансгенных проростков, которые культивировались в условиях постоянного действия сульфатно-хлоридного засоления (2,5% солей морской воды). К - побеги трансгенных проростков в отсутствие стресса

сти кукурузы в стрессовых условиях. Очевидно, что уровень свободного пролина является результатом координированного функционирования системы синтеза - катаболизма.

Сравнительное изучение содержания свободного Pro в побегах и в корнях 18-суточных трансгенных проростков показало, что уровень его накопления в корнях превышал этот показатель в побегах, как в норме, так и в условиях стресса (рис. 4). Наблюдаемые различия в нормальных условиях культивирования трансгенных проростков свидетельствуют о тканеспецифичности аккумуляции этой аминокислоты. Следует отметить, что в контрольных вариантах (дикий тип) уже на 14-й день опыта содержание пролина составляло в побегах (138,66 ± 30,41 мг%/г с.м.), корнях (146,63 ± 19,86 мг%/г с.м.) и достоверно не различалось. Далее продолжалась прогрессирующая гибель контроля. Высокие показатели уровня пролина в данном случае, очевидно, являлись отражением деградации пролин-содержащих компартментов клеток. Эти результаты согласуются с литературными данными [16, 17]. При летальных дозах сульфатно-хлоридного засоления у трансформантов по сравнению с контролем (трансгенные проростки) про-

исходило существенное увеличение содержания свободного пролина. Больший уровень аккумуляции этой аминокислоты в корнях, возможно, являлся отражением депонирования токсичных ионов.

Таким образом, солеустойчивость трансформантов, содержащих двухцепочечный РНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы кукурузы, сопровождался аккумуляцией свободного L-пролина.

Работа поддержана грантом совместных научных проектов НАН Украины

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kavi Kishor Р.В., Sangani S., Amnitha R.N. et al. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implication in plant growth and abiotic stress tolerance // Current Sci. 2005. V. 88. N 3. P. 424438.

2. Szabados L, Savoare A. Proline: a multifunctional amino acid // Trends in plant science. 2009. V.15. N2. P. 89- 97.

3. MaggioA, Miyazaki S., Veronese P. et al. Does proline accumulation play an active role in stress-induced growth reduction? // The Plant Journal. 2002. V. 3. N 16. P. 699-712.

4. Cecchini NM, Monteoliva MI, Alvarez ME. Proline dehydrogenase is a positive regulator of cell death in different kingdoms // Plant Signal Behav. 2011. V. 6. N 8. P. 11951197.

1664

5. Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С. и др. Повышение содержания пролина и осмотического давле- ния клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т. 40. № 2. С. 282-285.

6. Ибрагимова С.С., Колодяжная Я.С., Герасимова С.В., Кочетов А.В. Частичная супрессия гена пролиндегидрогеназы увеличивает устойчивость растений к различным видам абиотических стрессов // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 99-107.

7. Mani S., Van de Cotte В, Van Montagu M, Verbniggen N. Altered levels of proline dehydrogenase cause hypersensitivity to proline and its analogs in Arabidopsis // Plant Physiology. 2002. V. 128. P. 73-83.

8. Kaplan F, Kopka J, Sung DY et al. Transcript and metabolite profiling during cold acclimation of Arabidopsis reveals an intricate relationship of cold-regulated gene expression with modifications in metabolite content // Plant J. 2007. V. 50. P. 967-981.

9. Sharnta S. Villamor J. G., P. E. Verslues. Essential role of tissue-specific proline synthesis and catabolism in growth and redox balance at low water potential // Plant Physiology. 2011. V. 157. P. 292-304.

10. Peng Z., Lu O., Verna D.P. Reciprocal regulation of delta 1-pirroline-5-carboxylate syntetase and proline dehydrogenase genes controls proline levels during and after osmotic stress in plants//Mol. Gen. Genet. 1996. N3. P. 334-341.

11. Miller G., Stein H., Honig A. et al. Responsive modes of Medicago sativa proline dehydrogenase genes dining salt stress and recovery dictate proline accumulation // Planta. 2005. V. 222/N1. P. 70-79.

12. Титов C.E. Изучение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирую-

щих антисмысловой супрессор гена пролинденидроге-назы: Автореф. дисс. ...канд. биол. наук. Новосибирск, 2008. 16 с.

13. Tateishi Г., Nakagama Т., Esaka М. Osmotolerance and growth stimulation of transgenic tobacco cells accumulating free proline by dehydrogenase expression with double-stranded RNA interference technique // Physiologia Planta-rum. 2005. 125. P.1399-3054.

14. Михальская СЛ., Адаменко H.IL, Моргун Б.В. и др. Компетентность к Agrobacterium-ouocpejspBamiovL трансформации сегментов побега элитных инбредных линий кукурузы //Бютехнолопя. 2012. Т. 5. № 3. С. 98-103.

15. Сергеева Л.Е., КомисаренкоА.Г.,Бронникова Л.II. и др. Содержание свободного пролина в тканях подсолнечника при реализации морфогенетического потенциала in vitro II Бютехнолопя. 2013. Т. 6. № 1. С. 113-118.

16. Моисеева Е.М., Агапонов Д.А., Вешков В.А. и др. Повышение содержания пролина в растениях кукурузы, эксп-рессирующих фрагмент гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации // Физиология растений. 2012. Т. 59. №3. С. 457-460.

17. Михальская СЛ., Адаменко ПЛ., Моргун Б.В. и др. Компетентность к Agrobacterium - опосредованной трансформации сегментов побега элитных инбредных линий кукурузы // Бютехнолопя. 2012. Т. 5. № 3. С. 98103.

18. Battaglia М, Solorzanlo R.M., Hernandez P. et al. Proline-rich cell wall proteins accumulate in growing regions and phloem tissue in response to water deficit in common bean seedlings//Planta. 2007. V. 225. P. 1121-1133.

19. Goo J.N., ParkAR., Park W.J., Park O.K. Selection of Arabidopsis genes encoding and secreted plasma membrane proteins//Plant Mol. Biol. 1999. V. 41. P. 415-423.

INVESTIGATION OF THE FREE PROLINE CONTENTS IN CORN PLANTS TRANSFOR-MATED IN PLANTA USING ¿/¿44404, HARBORING pBi2E WITH DOUBLE-STRANDED RNA-SUPPRESSOR PROLINE DEHYDROGENASE

©2013 S.I. Mykhalska1, A.Y. Matveeva1, L.E. Sergeeva1, A.V. Kochetov2, E.N. Tishchenko1

1 Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv 2 Institute of Cytology and Genetics, Russian Academy of Science, Novosibirsk

The transgenic com Tl-plants (Zea mays L.) with double-stranded RNA-suppressor proline dehydrogenase were obtained. The levels of free L-proline in shoots and roots under sulfate-chloride salinity were estimated. There was shown that com salt tolerance was conferred by elevated level of this osmolyte.

Key words: Zea mays L, salt tolerance, proline dehydrogenase gene suppression, transgene plant.

Svetlana Mykhalska, Candidate of Biology, researcher, e-mail: svetlana_mykhalska(S!mail.ru; Aleksandra Matveeva, Candidate of Biology, junior researcher, e-mail: mgirais(S)mail.ru; Larisa Setgeeva, Candidate of Biology, senior researcher; Alexey Kochetov, Candidate of Biology, associate professor, laboratory chief, e-mail: aK(S)bionet.nsc.ru; Elena Tishchenko, Doctor of Biology, department chief, e-mail: oltyko(S)gmail.com

1665