Изменение морфологических, иммунологических и генетических характеристик клеток меланомной линии (Mel Ibr) при культивировании в ростовой среде с низкой концентрацией эмбриональной телячьей сыворотки

ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КЛЕТОК МЕЛАНОМНОЙ ЛИНИИ (MEL IBR) ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В РОСТОВОЙ СРЕДЕ С НИЗКОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТЕЛЯЧЬЕЙ СЫВОРОТКИ

Цель исследования — изучение изменения фенотипических и генетических характеристик клеток меланомы Mel Ibr при культивировании в ростовой среде со сниженной концентрацией эмбриональной телячьей сыворотки до 5 %. Материалы и методы. Клетки линии Ме1 Ibr для селекции колоний веретеновидных клеток предварительно культивировали в среде RPMI-1640 с 5 % эмбриональной телячьей сыворотки в течение 3 пассажей, а затем рассеивали на чашки в дубликатах диаметром 60 мм в количестве 200—400 клеток на чашку Петри и оставляли в инкубаторе на 14 дней до образования колоний. Каждую из сформировавшихся колоний, состоящих из клеток веретеновидной формы, продолжали культивировать в тех же условиях на протяжении более 30 пассажей. Для исследования морфологии растущих клеток их окрашивали по методу Лейшмана. Экспрессию антигенов на клетках определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции. Результаты. При культивировании клеток меланомной линии человека Mel Ibr в ростовой среде со сниженным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки до 5 % получен субклон, клетки которого сравнивали по морфологическим, иммунологическим и цитогенетическим характеристикам с клетками родительской линии. Клетки субклона отличались веретеновид-ной формой, значительно меньшим размером, большим ядром, занимающим практически весь объем цитоплазмы, и образованием в процессе роста колоний сфероидного типа, а также резким уменьшением HLA-DR+ клеток, уменьшением процентного содержания CD-54+ клеток, увеличением CD-63+ клеток и появлением CD-133+ клеток. Кариотип клеток субклона значительно отличался от кариотипа родительской популяции.

Выводы. В результате проведенных исследований выявлено, что клетки полученного субклона обладают признаками стволовых клеток и могут быть использованы в качестве модели для изучения опухолевой прогрессии.

Ключевые слова: сыворотка, клеточная линия меланомы, опухолевая стволовая клетка, субклон

CHANGES IN THE MORPHOLOGICAL, IMMUNOLOGICAL AND GENETIC CHARACTERISTICS OF MEL IBR MELANOMA CELLS IN RESPONSE TO LOW CONCENTRATION OF EMBRYO CALF SERUM

L.F. Morozova1, N.M. Suraeva1, O.S. Burova1, E.S. Voronina2, M.A. Baryshnikova1

'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoye shosse, Moscow, ''5478, Russia; 2Research Center for Medical Genetics; ' Moskvorech'e St., Moscow, ''5478, Russia

Objective: the purpo.se of the study is research of the changes in phenotypic and genetic characteristics of melanoma cells Mel Ibr cultured in growth medium with low concentration (5 %) of embryo calf serum.

Materials and methods. Cell line Меl Ibr was pre-cultured in RPMI-1640 medium with 5 % FBS for 3passages, and then 200—400 cells were replaced on the Petri dish with a diameter of 60 mm and left in the incubator for 14 days to form colonies. Colonies of spindle form cells were cultivated in the same conditions for more than 30 passages. Cells were stained according to the method of Leishman to investigate the morphology. The expression of antigens was determined in the reaction of indirect immunofluorescence. Results. Exposure of Mel Ibr human melanoma cells to low concentration of embryo calf serum resulted in the appearance of a subclone with morphological, immunological and cytogenetical characteristics differed to those of parental cells. The subclone cells distinguished

Л.Ф. Морозова1, Н.М. Сураева1, О.С. Бурова1, Е.С. Воронина2, М.А. Барышникова1

ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; 2ФГБНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1

Контакты: Сураева Наталья Михайловна nsuraeva@yandex.ru

DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-2-19-23

20 Оригинальные статьи

with spindle form, more small size, large nucleus which broadcasted on whole cytoplasm, formation spheroid and sharply reduced percentage of HLA-DR (+) and CD54 (+) cells, a significantly elevated percentage of CD63 (+) cells, and appearance of CD133 (+). The subclone karyotype differed to those of parental cells. Conclusoin. The subclone cells were characterized by the same features as stem tumor cells and could be use as tumor progression model. Key words: serum, melanoma cell line, tumor stem cell, subclone Введение ческих характеристик родительских меланомных Злокачественная опухоль представляет собой клеток при культивировании в норме и в ростовой гетерогенную популяцию клеток на различных ста- среде со сниженной концентрацией ТЭС в ростовой диях дифференцировки. Принято считать, что такая среде до 5 %. гетерогенность обусловлена генетическими и эпигенетическими отклонениями от нормы в популяциях Материалы и методы опухолевых клеток [1]. Исследования по идентифи - В работе использовалась стабильно перевиваемая кации и изучению характеристик этих клеток позво- клеточная линия меланомы человека Mel Ibr (патент лили выдвинуть гипотезу существования стволовых на изобретение Российской Федерации № 2287576 опухолевых клеток, дающих начало опухолевому от 20.11.06 г.), полученная из опухолевого образца росту. Комплекс многообразных нарушений, проис- метастатического узла пациентки с диагнозом «дис-ходящих в клетке в процессе опухолевой прогрессии, семинированная меланома кожи» [2]. Клетки из потребует создания адекватной модели для исследова- севного банка культивировали с 10 % ТЭС с добав-ния стадий онкогенеза. В настоящее время проводит- лением 2 ммоль L-глутамина, 0,04 мг/мл гентамицина ся анализ фенотипических и генетических свойств при температуре 37 °С в атмосфере 5 %-ного СО2. стволовых опухолевых клеток с использование раз- Клетки линии Mel Ibr для селекции колоний ве-личных методов. Широко применяется скрининг ретеновидных клеток предварительно культивирова-поверхностных маркеров на разных этапах прогрессии ли в среде RPMI-1640 с 5 % ТЭС в течение 3 пассажей, с последующей оценкой эффективности пролифера- а затем рассеивали на чашки в дубликатах диаметром ции опухолевых клеток после имплантации животным. 60 мм в количестве 200—400 клеток на чашку и остав-Изучается воздействие цитокинов и других биологи- ляли в инкубаторе на 14 дней до образования коло-чески активных препаратов в культурах in vitro и экс- ний. Каждую из сформировавшихся колоний, состо-периментах in vivo на опухолевый рост и прогрессию. ящих из клеток веретеновидной формы, снимали Используются трансгенные нокаутные животные. Раз- раствором Версена, переносили в другие чашки и прорабатываются различные клеточные модели и другие должали культивировать в тех же условиях на протя-технологии. И несмотря на весь этот спектр приемов, жении более 30 пассажей. Смену среды на свежую по-прежнему остается открытым вопрос об адекват- проводили 1 раз в 3 дня. ности той или иной модели. Для исследования морфологии растущих клеток Нами также была предпринята попытка создать их окрашивали по методу Лейшмана. Окрашенные модель опухолевой стволовой клетки на основе куль- клетки оценивали под световым микроскопом при туры меланомных клеток человека после снижения увеличении х 100. концентрации телячьей эмбриональной сыворотки Экспрессию антигенов на клетках определяли (ТЭС) в культуре до 5 % и с дальнейшей обработкой в реакции непрямой иммунофлуоресценции с исполь-куриным эмбриональным экстрактом (КЭЭ) [2, 3]. зованием моноклональных антител серии ICO [4] В этих экспериментах показано, что после обработки и Serotec. Тестировали экспрессию антигенов главно-экстрактом единичные выжившие клетки отличались го комплекса гистосовместимости I (HLA-ABC) от эпителиоподобных родительских своей веретено- и II (HLA-DR), меланоцитов (CD63), клеточной адге-видной формой, более интенсивным ростом и об- зии (CD54), стволовых опухолевых клеток (CD44, ладали сходством со стволовыми эмбриональными CD117, CD133), стволовой гемопоэтической клетки и опухолевыми клетками по морфологическим, рос- (CD34), рецептора эндотелиальных клеток (CD105), товым и иммунологическим параметрам. нелинейного антигена (CD-24), антигена эмбриональ- В процессе проведения указанных экспериментов ных стволовых клеток (Oct-4A, RnDSystem). Реакцию мы обратили внимание на то, что снижение концент- учитывали на проточном цитофлюориметре. рации ТЭС при культивировании родительской ли- Для кариологического исследования цитогене-нии также способствует образованию колоний верете- тические препараты готовили по стандартной мето-новидных клеток. С целью изучения данного феномена дике [5]. Для каждой культуры анализировали не менее мы провели исследование фенотипических и генети- 15 метафаз. Анализ препаратов проводили согласно

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY 2 2016 том 15 | vol.15

Рис. 1. Фиксированная и окрашенная по методу Лейшмана культура Mel Ibr, у 100

Рис. 2. Фиксированные и окрашенные по методу Лейшмана колонии 1-го типа веретено-видных (слева) и 2-го типа эпителиоподобных клеток линии Mel Ibr, х 100

Рис. 3. Фиксированная и окрашенная по методу Лейшмана культура субклона Mel Ibr, 5 у 100

Международной цитогенетической номенклатуре хромосом человека (ISCN, 2005). Препараты анализировали под световым микроскопом при увеличении у 1000.

Результаты и обсуждение

Клетки линии Mel Ibr, растущие в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % ТЭС, образовывали адгезионный монослой. Он был представлен преимущественно клетками эпителиоподобного вида с признаками низкой дифференцировки. Клетки в основной массе были неправильной округлой (эпителиоподобной) формы с полиморфными ядрами и обильно вакуоли-зированной, без четких контуров цитоплазмой. Среди них встречались отдельные клетки (0,5—1 %) вытянутой формы (рис. 1). При культивировании в среде RPMI-1640 с добавлением 5 % ТЭС в чашках диаметром 60 мм наблюдали незначительную гибель клеток. Выросшие в этих чашках колонии состояли из 3 типов клеток, различающихся своей морфологией. Первый тип был представлен веретеновидными клетками, второй — эпителиоподобными, а третий — клетками обоих типов (эпителиоподобными и вере-теновидными) примерно в равной степени (рис. 2).

Мы обратили внимание на тот факт, что морфологически клетки 1-го типа были очень похожи на ве-ретеновидные клетки ранее полученного нами субклона после воздействия КЭЭ на клетки меланомной линии человека Mel Ibr [2]. Поэтому для дальнейшего изучения и получения субклона под микроскопом были отобраны колонии 1-го типа. После 30 пассажей клетки оставались мономорфными и сохраняли свой иммунологический фенотип. Полученная субпопуляция клеток была обозначена нами как субклон Mel Ibr 5C (рис. 3). Действительно, клетки Mel Ibr 5C субклона так же, как и ранее полученный субклон с выявленными характеристиками стволовых опухолевых клеток [2], отличались от родительских значительно меньшим размером, большим ядром, занимающим практически весь объем цитоплазмы, длинными

вытянутыми отростками, более интенсивным ростом. Эти клетки росли плотным монослоем и обладали способностью формировать на поверхности монослоя выпуклые образования в виде сфероидов.

С целью дальнейшей характеристики полученного субклона Mel Ibr 5C было проведено исследование его иммунологического фенотипа и маркеров стволовых опухолевых клеток. Как видно из табл. 1, указанный фенотип субклона действительно отличался от исходных клеток Mel Ibr. В клетках субклона Mel Ibr 5C уменьшился процент HLA-DR+ клеток, CD95 и CD54+, на их поверхности появились антигены стволовых клеток CD133 (24,9 %), но не эмбриональный антиген

Таблица 1. Иммунологический фенотип клеток линии Mel Ibr и ее субклона Mel Ibr 5C

Маркеры Количество положительных клеток по маркеру от общего числа клеток, %

Исходная линия Mel Ibr, 48-й пассаж Субклон Mel Ibr 5C, 30-й пассаж

HLA-ABC 97,6 ± 2,0 99,6 ± 0,4

HLA-DR 87,9 ± 2,0 10,2 ± 2,0

CD24 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,1

CD34 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1

CD44 99,2 ± 0,5 99,9 ± 0,5

CD133 1,6 ± 1,0 24,9 ± 1,0

CD117 0,2 ± 0,1 1,0 ± 0,5

CD105 95,4 ± 2,0 92,4 ± 10,0

CD63 20,0 ± 3,0 92,4 ± 10,0

CD54 93,1 ± 5,0 24,9 ± 1,0

CD 95 70,0 ± 5,0 10,0 ± 2,0

CD117 0,2 ± 0,1 1,0 ± 0,1

Oct-4A 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1

22

Оригинальные статьи

Таблица 2. Кариотип клеток исходной линии Mel Ibr и субклона Mel Ibr 5C

Клетки

Кариотип

Mel Ibr — линия Mel Ibr C — субклон

71 87 < 4n->,XX,add(X)(q28),del(1)(q12),+7,+7,+7,i(21)(q10), inc. 92 100<4n+>,XXX,-X,del(6)(p21),?der(6)del(6)(12)dup(6)(q?q?),der(9)t(1;9)(q12;p21), inc.

I

I

Oct-4A, повысился процент CD63+ клеток и не изменилось число клеток, экспрессиющих антигены HLA-ABC и CD24, СD34, CD44, CD117 и CD105. Похожие отличия по сравнению с родительской линией, за исключением Oct-4A маркера, наблюдались и у ранее полученного субклона [2].

Цитогенетическое исследование показало, что клетки субклона Mel Ibr 5C отличаются по кариотипу от популяции клеток исходной линии Mel Ibr. Данные представлены в табл. 2.

При анализе 15 метафаз клеток линии Mel Ibr выявлено, что число хромосом колеблется от 71 до 87. Модальное число хромосом соответствует гипертетра-плоидному набору (4n). Популяция клеток культуры характеризуется увеличенным количеством хромосом 7, их число в клетках колеблется от 4 до 7. Кариотип не соответствует стандартному набору не только по числу хромосом, но и по их структуре. Во всех клетках обнаружен дополнительный хромосомный материал неизвестного происхождения на длинном плече Х-хромосомы. Наблюдаются две различные делегированные хромосомы 1, в одном случае имеет место де-леция практически всего плеча (p21-pter), а в другом — (q12-qter). Присутствует изохромосома, образованная двумя длинными плечами хромосомы 21.

Определение кариотипа клеток субклона Mel Ibr 5C строилось на анализе 25 метафаз. Установлено, что число хромосом колеблется от 92 до 100. Модальное число хромосом соответствует гипертетраплоид-ному набору (4n+). Обнаружены структурные перестройки: дериватная хромосома 9, образованная транслокацией хромосом 1 и 9; делеция короткого плеча хромосомы 6 (p21-pter), а также, возможно, дериватная хромосома 6, образовавшаяся в результате терминальнальной делеции короткого плеча (p21-pter) и дубликацией части длинного плеча хромосомы 6. Имели место и другие перестройки, которые возможно было идентифицировать с помощью мо-лекулярно цитогенетических методов.

В исходной культуре Mel Ibr наблюдается одно из характерных для меланомы нарушений: увеличе-

ние числа хромосом 7. На коротком плече хромосомы 7 в районе 7p12.3-p12.1 расположен ген рецептора эпидермального фактора роста, который может вызывать или усиливать злокачественную транфор-мацию клеток при меланоме. Кроме того, экспрессия этого гена повышена в метастазах.

В клетках субклона Mel Ibr 5C общее количество хромосом больше (гипертетраплоидный набор), однако относительное количество хромосом 7 нормальное. В этой культуре наблюдается другое характерное хромосомное нарушение: перестройка, затрагивающая локус p21 хромосомы 9, в котором расположен ген-супрессор опухоли CDKN2A (p16), играющий важную роль при многих злокачественных новообразованиях (он кодирует белок, участвующий в регуляции клеточного цикла и клеточного старения).

Таким образом, выявленные хромосомные нарушения в популяции клеточной линии Mel Ibr и клетках субклона Mel Ibr 5C полностью различны.

Выводы

На основании полученных данных можно предположить, что в исходной популяции линии Mel Ibr присутствует небольшое число клеток с веретеновид-ной морфологией, утративших антигены гистосовме-стимости II класса (HLA-DR) и имеющих антиген стволовых клеток-CD133 (но не Oct-4A). В условиях роста клеток Mel Ibr в среде со сниженной концентрацией ТЭС до 5 % и в результате отбора колоний из клеток веретеновидной формы и дальнейшего их культивирования на протяжении длительного времени произошла селекция форм с признаками стволовых клеток. Потомки этих клеток имеют про-лиферативное преимущество по сравнению с клетками родительской линии и могут, возможно, представлять собой метастазирующий клон. Дальнейшее изучение полученного субклона Mel Ibr 5C как модели меланомных клеток с характеристиками стволовых клеток позволит определить их роль в опухолевой прогрессии.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Геращенко Т.С., Денисов Е.В., Литвяков Н.В. и др. Внутриопухолевая гетерогенность: природа и биологическое значение. Биохимия 2013;78(11):1531—49.

2. Сураева Н.М., Морозова Л.Ф., Самойлов А. В. и др. Изменение морфологических и иммунологических характеристик клеток меланомной линии (MEL IBR) в результате

воздействия куриного эмбрионального экстракта. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2015;159(4):521-4. 3. Сураева Н.М., Самойлов А. В. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 2009;20(4):19-25.

4. Барышников А.Ю. Моноклональные антитела серии ИКО к дифференциро-вочным антигенам лимфоцитов человека. Гематология и трансфузиология 1990;8:4-7.

5. Short protocols in human genetics: a compendium of methods from current protocols in human genetics. N.C. Dracopoli et al. (eds.). New York: Willey, 2004.