Влияние аминокислотных композиций на фонд свободных аминокислот миокарда при субхронической алкогольной интоксикации

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ КОМПОЗИЦИЙ НА ФОНД СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ МИОКАРДА ПРИ СУБХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

РАЗВОДОВСКИЙ Ю.Е., СМИРНОВ В.Ю.

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Резюме. Исследовано влияние двух аминокислотных композиций. состоящих из АРУЦ, таурина и триптофана на пул свободных аминокислот миокарда крыс при субхронической алкогольной интоксикации (СХАИ). Установлено. что СХАИ вызывает нарушение метаболизма серосодержащих аминокислот в миокарде. Введение на фоне СХАИ аминокислотных композиций приводит к нормализации уровня некоторых аминокислот. но. вместе с тем. вызывает дисбаланс аминокислотного фонда миокарда.

Ключевые слова: аминокислоты. субхроническая алкогольная

интоксикация. миокард. таурин. триптофан. АРУЦ.

Abstract. We investigated the effect of intragastrical administration of compositions of BCAA and taurine with or without tryptophan on the pool of free amino acids in the myocardium of rats undergoing sub chronic ethanol intoxication (SChAI). It was found that SChAI induced abnormality in the metabolism of sulfur containing amino acids. Administration of both amino acids compositions was found to normalize the levels of some amino acids. however it cause amino acids disbalance in the myocardium.

Keywords: amino acids. sub chronic alcohol intoxication. heart. taurine. tryptophan. BCAA.

Адрес для корреспонденции: Республика

Беларусь. 230009. г.Гродно. ул. Горького. 80.

Гродненский медицинский университет. -

Разводовский Ю.Е.

Злоупотребление алкоголем приводит к поражению практически всех органов. в том числе сердца [3. 4. 14]. При алкогольном поражении сердца «включаются» следующие механизмы: прямое токсическое действие алкоголя и его метаболитов на сердечную мышцу. дефицит нутриентов. активация аутоиммунных процессов (образование антител к миозину и аддуктам белков с ацетальдегидом). накопление эстерофицированных жирных кислот.

ингибирование окислительного фосфорилирования в митохондриях.

ингибирование взаимодействия кальций-микрофиламенты. активация

перекисного окисления липидов. нарушение структуры клеточных мембран и повреждение находящихся на них рецепторов [6. 7. 8. 9. 11. 12. 13]. Имеются основания предполагать. что аминокислотный дисбаланс. вызванный хронической алкогольной интоксикацией. являться одним из патогенетических

механизмов развития алкогольной кардиомиопатии [3]. В частности. в одном из исследований было показано. что синдром отмены этанола сопровождается выраженным аминокислотным дисбалансом. проявляющемся в снижении уровней ряда незаменимых аминокислот (треонина. изолейцина. лейцина). а также концентраций серина и аспартата [1].

Актуальной задачей современных исследований является поиск средств метаболической коррекции последствий хронической алкогольной интоксикации среди субстанций природного происхождения. Перспективными в этом смысле являются аминокислоты и их производные. поскольку они обладают минимальными побочными эффектами и высоким терапевтическим индексом [3. 5]. Из предложенных в последнее время средств метаболической коррекции последствий хронической алкогольной интоксикации перспективными являются аминокислотные композиции на основе таурина. триптофана и аминокислот с разветвленной углеводородной цепью (АРУЦ: Ь-изолейцина. Ь-валина и Ь-лейцина) [2]. В предыдущем исследовании было показано. что введение аминокислотной композиции. состоящей из АРУЦ и таурина способно полностью нормализовать нарушения аминокислотного фонда миокарда. вызванные синдромом отмены этанола [1].

Целью настоящего исследования было изучение влияния аминокислотных композиций. состоящих из АРУЦ. таурина и триптофана на аминокислотный пул миокарда при субхронической алкогольной интоксикации (СХАИ).

Методы

В эксперименте использовано 26 белых беспородных крыс-самцов массой 180-200 г. содержащихся на стандартном рационе вивария. Раствор этанола (25% об/об) вводили внутрижелудочно равными объемами в дозе 14 мл/кг два раза в сутки на протяжении 28 суток. Композицию. состоящую из лейцина. валина. изолейцина и таурина (массовое соотношении 4:1:1:2) и композицию. состоящую из лейцина. валина. изолейцина. таурина и триптофана (массовое соотношение 4:1:1:2:1.6) вводили отдельным группам животных в виде водного раствора внутрижелудочно (20 мл/кг) через 30 мин после каждого введения этанола на протяжении последних 10 дней алкоголизации. Суммарная суточная доза препаратов составляла 500 мг/кг и 600 мг/кг соответственно. для этанола -7 мл/кг массы животных. Контрольные животные получали внутрижелудочно воду в эквиобъемных количествах.

После забоя животных путем декапитации выделяли сердце. тщательно освобождали его от крови путем промокания бумажным фильтром и замораживали в жидком азоте. Затем навески ткани сердца массой 100-150 мг гомогенизировались на холоду в 0.2 М хлорной кислоте с 5-аминовалерьяновой кислотой (250 мкМ) в качестве внутреннего стандарта в соотношении 100 мг ткани на 1 мл среды. полученные гомогенаты центрифугировались при 13000 g в течение 15 мин при температуре +4 °С. после чего супернатанты немедленно отбирались в чистые пробирки. которые хранились при -78°С до анализа. После размораживания экстракты повторно центрифугировали.

Содержание свободных аминокислот и их производных определяли методом обращенно-фазной ВЭЖХ с градиентным элюированием после предколоночной дериватизации с 0.4% о-фталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой в 0.4М Na-боратном буфере. pH 9.4. Для дериватизации вторичных аминокислот (пролина и оксипролина) проба далее смешивалась с раствором флуоренилметиохлороформатом (FMOC-хлорид) в ацетонитриле (6 мг/мл) Детектирование осуществлялось по флуоресценции (231/445 нм. начиная с времени выхода пиков пролина и оксипролина и до конца хроматограммы - 260/313 нм) или по поглощению (для цистина). В методике использовались: концентрат стандартной смеси физиологических аминокислот фирмы «Calbiohem» (США). колонка Zorbax XDB C8. 3.5 мкм. 3х150 мм. Подвижная фаза А: 0.1 М Na-ацетатный буфер. pH 6.85. содержащий 20 мг/л ЭДТА; подвижная фаза В: водный раствор ацетонитрила (60% об.). Разделение проводили с градиентным элюированием от 5 до 100% В за 78 мин; температура колонки 37°С. Определение проводили с помощью хроматографа Agilent 1100. управление прибором и обработку данных - с помощью программы ChemStation A10.01. В работе использовались реактивы квалификации не ниже хч.

Статистическая обработка данных (описательная статистика. дисперсионный. корреляционный и дискриминантный анализ) реализована при помощи программы Statistica 7.0. Межгрупповые различия оценивались с применением параметрических (НЗР-тест Фишера) или ранговых (тест Ньюмана-Кеулса) методов. в зависимости от того. имеются или нет отклонения от нормальности групповых выборок (что определялось при помощи теста Шапиро-Уилка). При анализе показателей. выборочные дисперсии которых имели выраженную негомогенность (цистатионин и пролин). использовался непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллеса.

Результаты и их обсуждение

Субхроническая алкогольная интоксикация сопровождалась снижением уровней цитруллина и фосфоэтаноламина. а также повышением уровня аланина в миокарде (табл. 1). Несмотря на то. что концентрации остальных

определяемых показателей не изменялась. корреляционный анализ свидетельствует о возникновении изменений в метаболизме серосодержащих аминокислот (нарушение нормальных отрицательных корреляций таурин-цистатионин и цистеат-серин). Тем не менее. обеднения пула незаменимых аминокислот миокарда (в том числе АРУЦ) при субхронической алкогольной интоксикации не наблюдалось (табл. 2).

Таблица 1

Содержание свободных аминокислот и их производных в миокарде

крыс после введения композиций на основе АРУЦ, таурина и триптофана при субхронической алкогольной интоксикации, нмоль/г. В таблице приведены средние групповые значения ± стандартная ошибка среднего

Контроль СХАИ СХАИ + композиция АРУЦ+ таурин СХАИ + композиция АРУЦ+ таурин+ триптофан

цистеат S.27 і 0.б5 9.27 і 0.58 10.29 і 0.94 11.85 і 1.03*

аспартат 1S52 і 167.6s 1733.1 і 143.0 1891.1 і 105.4 2700.0 і 205.6*t

глутамат б925.1 і 411.3 7839.7 і 374.1 8913.4 і 581.2* 9421.4 і 268.9*

аспарагин 209.02 і 16.50 234.40 і 10.63 199.37 і 10.84 23б.б8 і 14.93

серин 573.20 і 50.27 736.34 і 51.90 745.46 і 63.87 907.16 і 87.36*t

глутамин 5003.1 і 177.4 4846.2 і 306.1 4970.7 і 276.7 5808.8 і 351.0

гистидин 249.66 і 19.13 244.75 і 23.84 238.03 і 21.33 171.08 і 11.72

глицин 70S. 15 і 41.03 677.44 і 33.37 798.86 і 44.30t 656.92 і 27.62

фенилаланин 628.97 і 25.08 559.69 і 6.29* 553.34 і 33.69* 546.26 і 17.16*

треонин 295.26 і 27.29 261.92 і 23.20 284.22 і 48.01 248.29 і 20.62

1 -метилгистидин 3.20 і 0.20 3.08 і 0.30 2.78 і 0.28 2.55 і 0.30

цитруллин 227.16 і 17.35 190.72 і 10.89* 180.32 і 14.25* 205.27 і 12.47

аргинин 222.59 і 8.99 263.52 і 13.31 222.45 і 22.31 201.45 і 1S.02t

Ь -аланин 23.24 і 1.72 22.92 і 1.76 18.57 і 0.64 17.65 і 1.23

аланин 1133.1 і 78.3 1533.8 і 102.1* 1487.0 і 117.5* 1531.4 і 79.5*

таурин 23728 і 961 24527 і 752 30047 і 1168*t 28083 і 1704*t

Ь аминобутират 13.98 і 1.07 14.47 і 1.28 16.33 і 0.85 22.97 і 0.97*t

ГАМК 8.52 і 1.75 6.40 і 0.82 4.32 і 0.79* 3.02 і 0.58*

тирозин 73.21 і 3.90 75.89 і 3.57 69.81 і 7.65 59.00 і 5.53

а-аминобутират 58.19 і 5.55 46.62 і 7.50 33.61 і 5.88* 21.93 і 5.40*t

этаноламин 49.64 і 2.60 49.95 і 3.68 40.88 і 2.59* 33.85 і 1.4S*t

валин 131.00 і 9.95 148.61 і 3.30 170.97 і 28.77 132.55 і 8.55

метионин 32.85 і 1.29 38.77 і 2.28 32.00 і 3.10 23.19 і 1.94*t

цистатионин 40.05 і 3.64 28.96 і 2.48 50.46 і 15.39 25.12 і 0.97*

триптофан 16.60 і 0.99 23.27 і 1.40 24.30 і 2.68 66.28 і 4.1S*t

фенилаланин 69.24 і 4.30 76.27 і 2.08 77.00 і 4.67 67.84 і 4.57

изолейцин 57.74 і З.Зб 72.4 і 6.28 56.9 і 5.13 43.70 і 3.29t

лейцин 108.02 і 19.29 129.80 і 11.71 249.81 і 16.03*t 228.09 і 13.94*t

оксипролин 52.87 і 4.70 45.74 і 3.13 47.76 і 5.11 68.87 і 10.57

орнитин 75.99 і 8.78 79.84 і 11.43 113.03 і 10.99 102.31 і 5.22

лизин 346.50 і 57.13 307.79 і 18.52 270.31 і 40.03 265.61 і 53.48

пролин 184.21 і 25.22 270.19 і 82.29 283.37 і 50.99 178.93 і 25.22

Примечание: * - p < 0.05 по отношению к контролю. t - p < 0.05 по

отношению к СХАИ.

Таблица 2

Параметры, характеризующие пул свободных аминокислот в миокарде крыс после введения композиций на основе АРУЦ, таурина и триптофана при субхронической алкогольной интоксикации, нмоль/г

Контроль СХАИ СХАИ + композиция АРУЦ+ таурин СХАИ + композиция АРУЦ+ таурин+ триптофан

АРУЦ/ААК 1.85 ± 0.13 1.97 ± 0.10 2.71 ± 0.17*-^ 2.10 ± 0.10

Сумма протеиногенных АК 18191 ± 764 19504 ± 720 20977 ± 1050* 22948 ± 742*f

Заменимые / незаменим. АК 13.2 ± 1.0 13.9 ± 0.5 14.0 ± 0.5 17.4 ± 0^

Фенилаланин/Т ирозин 0.95 ± 0.0559 1.01 ± 0.0350 1.16 ± 0.109 1.19 ± 0.1065

Примечание: * - р < 0.05 по отношению к контролю. f - р < 0.05 по отношению к СХАИ.

Введение композиции АРУЦ и таурина не нормализовало вызванные СХАИ изменения в пуле свободных аминокислот миокарда (табл.). Более того. отмечался рост уровней лейцина и таурина. индуцированный экзогенным введением их в составе препарата. а также рост концентрации глутамата и снижение уровней а-аминомасляной кислоты и ГАМК.

Введение композиции. состоящей из АРУЦ. таурина и триптофана на фоне СХАИ нормализовало уровень цитруллина в сердце. однако сдвиг уровней аланина и фосфоэтаноламина сохранялся (табл. 1). Кроме того. введение этой композиции вызвало существенные изменения пула свободных аминокислот и их производных миокарда. Так. происходило повышение уровней таурина. триптофана и лейцина (вероятнее всего индуцированное экзогенным поступлением их в организм в составе композиции). повышение концентрации цистеиновой кислоты и снижение уровня метионина. Как и в случае введения композиции. состоящей из АРУЦ и таурина. происходило снижение концентраций ГАМК и а- аминомасляной кислоты и повышение -глутамата. Помимо этого композиция на основе АРУЦ. таурина и триптофана вызывала снижение уровней этаноламина и лейцина. а также рост концентраций аспартата. серина и Ь- аминомасляной кислоты.

В целом. введение на фоне СХАИ композиции на основе АРУЦ. таурина и триптофана способно оказывать влияние на метаболизм серосодержащих аминокислот в миокарде. следствием чего оказывается снижение уровня метионина. Вероятной причиной этого эффекта является усиление катаболизма метионина. о чем может свидетельствовать появление положительной корреляции между уровнями серина и цистатионина. предположительно

вследствие активации цистатионин-синтазной реакции. Еще одной причиной снижения уровня метионина в миокарде может являться активация его транспорта в другие ткани. о чем косвенно может свидетельствовать снижение его уровня в плазме крови [2]. Следует отметить. что введение композиции без триптофана не в состоянии оказывать подобное действие. Триптофан. как и лейцин. относится к группе «функциональных» аминокислот. которые способны регулировать ключевые метаболические пути [15]. Это может объяснять способность экзогенного триптофана влиять на метаболизм не связанного с ним пула серосодержащих аминокислот.

По данным линейного дискриминантного анализа. наиболее значимыми (т.е. имеющие наибольшую вариабельность) соединениями являются триптофан. лейцин. таурин. фенилаланин и фосфоэтаноламин (значения Б вкл./искл. > 5). При исключении из дискриминантного анализа аминокислот. поступающих экзогенно (т.е. АРУЦ. таурина и триптофана) наиболее значимыми становятся аспартат. аланин и аргинин. что согласуется с данными о влиянии экзогенного этанола на фонд свободных аминокислот [10]. При этом расстояние на плоскости двух главных компонент между контрольной группой с одной стороны и опытными группами - с другой. становится одинаковым для всех пар групп. т.е наблюдаемый аминокислотный дисбаланс в миокарде при введении аминокислотных препаратов обусловлен главным образом повышением концентраций вводимых аминокислот и собственными эффектами СХАИ.

Таким образом. обе композиции на основе АРУЦ. таурина и триптофана при их введении на фоне субхронической алкогольной интоксикации повышают уровень таурина и лейцина в миокарде. при этом только композиция. в состав которой входит триптофан. способна снижать уровень метионина в этом органе.

Заключение

Результаты настоящего исследования указывают на то. что субхроническая алкогольная интоксикация вызывает нарушение метаболизма серосодержащих аминокислот в миокарде. В целом. изменения уровня свободных аминокислот миокарда не столь выражены. как при синдроме отмены этанола. что. очевидно. обусловлено развитием патологической адаптации к субхронической алкогольной интоксикации. Введение на фоне ХАИ композиций. состоящих из АРУЦ. таурина и триптофана приводит к нормализации уровня некоторых аминокислот. но. вместе с тем. вызывает дисбаланс аминокислотного фонда миокарда.

Литература

1. Влияние аминокислотных препаратов на пул свободных аминокислот сердца при синдроме отмены этанола. / Ю.Е. Разводовский и др. // Весщ Нацыянальнай Акадэми Навук Беларусь Серыя Медыцынсюх Навук. -2006. - №4. - С. 88-91.

2. Влияние композиции. состоящей из триптофана. АРУЦ и таурина на фонд свободных аминокислот плазмы крови при алкогольной хронической интоксикации. / Ю.Е. Разводовский. и др. // Журнал ГГМУ. - 2007 - № 1.-С.136-139.

3. Островский Ю.М. Аминокислоты в патогенезе. диагностике и лечении алкоголизма. / Ю.М. Островский. С.Ю. Островский. - Мн.: Наука и техника. 1995. - 280 с.

4. Разводовский Ю.Е. Индикаторы алкогольных проблем в Беларуси. / Ю.Е. Разводовский. - Гродно. 2008. - 68 с.

5. Средство для снижения уровня гомоцистеина при гипергомоцистеинемии: пат. Респ. Беларусь. от 2009.08.25 №12608; заявл. 07.07.2007. / А. А. Наумов. Е.М. Дорошенко. В.М. Шейбак. Ю.Е. Разводовский. А.А. Чиркин

6. Alcohol and heart muscle disease. / J. Fernandez-Sola. R. Estruch. A. Urbano-Marquez // Addiction Biology. - 1997. - N 2. - P. 9-17.

7. Evidence of apoptosis in alcoholic cardiomyopathy. / J. Fernandez-Sola

et al. // Hum Pathol. -2006. - Vol. 37. N8. - P. 1100-10.

8. Lu. C. Alcoholic cardiomyopathy: Acetaldehyde. insulin in sensitization

and ER stress. / C. Lu // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. - 2008. - Vol. 44. N6. -P.979-982.

9. Mechanisms of ethanol-induced cardiac damage. / V.R. Preedy et al. //

Br Heart J. - 1993. - Vol. 69. N3. - P. 197-200.

10. Milakofsky L.. Miller J. M.. Vogel W. H. Effects of acute ethanol administration on rat plasma amino acids and related compounds // Biochem.Pharmacol.. 1986. - Vol.35.. No.21. - P.3885-3888.

11. Piano. M.R. Alcoholic cardiomyopathy: incidence. clinical

characteristics. and pathophysiology. / M.R. Piano // Chest. - 2002. - Vol. 121. N5. -P. 1638-50.

12. Piano. M.R. Alcoholic cardiomyopathy: incidence. clinical

characteristics. and pathophysiology. / M.R. Piano // Chest. - 2002. - Vol.121. N5. -P. 1638-50.

13. Rubin. E. Alcoholic cardiomyopathy. / E. Rubin. A. Urbano-Marquez // Alcohol Clin Exp Res. - 1994. - Vol.18. N1. - P. 111-4.

14. The effects of alcohol on the heart. / V.B. Patel et al. // Adverse Drug React Toxicol Rev. - 1997. - Vol.16.N1. - P. 15-43.

15. Wu G. Amino acids: metabolism. functions. and nutrition //

Amino.Acids. 2009. - Vol.37. No.1. - P.1-17.