Способ получения йод-содержащих композитов арабиногалактана с антимикробными и противогрибковыми свойствами
METHOD FOR OBTAINING IODINE-CONTAINING ARABINOGALACTAN COMPOSITES WITH ANTIMICROBIAL AND ANTIFUNGAL PROPERTIES

Настоящее изобретение относится к химии, в частности к способу получения йод-содержащих нанокомпозитов арабиногалактана, обладающих антимикробными и противогрибковыми свойствами. Методика получения композитов включает механохимический способ взаимодействия арабиногалактанового сырья и элементного йода. Способ характеризуется тем, что процесс ведут при комнатной температуре 20-25 °С в шаровой мельнице, а в качестве исходного сырья используют арабиногалактан и элементный йод. Осуществление изобретения позволяет получить стабильные водорастворимые нанокомпозиты, обладающие антимикробными и противогрибковыми свойствами.
Йод является эффективным антисептиком, к которому не выявлено привыкания ни для одного вида микроорганизмов [Block, S.S. Disinfection, sterilization, and preservation. Hagerstwon, MD: Lippincott Williams & Wilkins. – 2001. –159 р.], который, однако, вызывает раздражение на месте применения, обладает токсичностью, окрашивает окружающие повреждение ткани. Некоторые из этих недостатков были преодолены путем создания и использования йода в комплексной форме, например, йодинола [Мохнач В.О. Теоретические основы биологического действия галоидных соединений. Л. – 1968. – 298 с.], который является продуктом присоединения йода к поливиниловому спирту, или повидон-йода, который представляет собой комплекс йода с поливинилпирролидоном [US2739922; InternationalJournalofSurgery. – 2017. – V. 44. – P. 260-268]. То есть концентрация свободного йода в таких структурах очень низка, что позволяет частично нивелировать описанные выше недостатки.
С другой стороны, в связи с высокой летучестью элементного йода и высокой растворимостью как в воде, так и в смешивающихся с водой органических растворителях (ацетон, спирты, дихлорметан и т.д.), введение его в состав фармакологических композиций считается не простой задачей [Tatsuo, K. Iodine Chemistry and Applications. John Wiley & Sons Limited. – 2014. – 656 p.]. Поэтому еще в середине ХХ века были разработаны механохимические способы создания препаратов на основе синтетических полимеров, обладающих фармакологическими свойствами, и элементного йода, которые эффективно способствовали приданию последнему биодоступности и пролонгированности действия.
Так, известен способ приготовления аддукта йода и поливинилпирролидона [US2900305], отличающийся уникальной стабильностью в водном растворе. Для этого элементарный йод технический или ресублимированный добавляют к твердому поливинилпирролидону, содержащий влагу (воду) от 4 до 15 мас. %, далее смесь подвергают по желанию измельчению в стеклянной или глиняной посуде и затем нагревают до температуры от 90 до 100 °С в течении более, чем 20 часов. Именно длительность проведения процесса синтеза можно отнести к недостаткам описываемого аддукта, наравне с гигроскопичностью продукта, а также изменениями препарата, вызываемыми действием света.
Известно, что для молекул природных полимеров (например, полисахаридов) в условиях окружающей среды процессы деструкции не характерны [Natural and Synthetic Biomedical Polymers. – 2014. – P. 67-89], более того, показано, что для молекулярных комплексов и/или аддуктов полисахаридов с некоторыми биологически значимыми элементами не только характерно сочетание свойств, но и синергизм свойств всех входящих в них компонентов [Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. – 2022. – V. 69. – 126904; IET Nanobiotechnology. – 2021. – V. 15. – Iss. 7. – P. 585-593], что обусловливает значительный потенциал этих структур в создании новых материалов для медицины и фармакологии. Синтез таких комплексов проводится для повышения фармакологического потенциала последних, а именно, после присоединения микроэлементов к полисахаридной матрице, возрастает их эффективность, увеличивается длительность их действия и снижается их токсичность [Polymers. – 2017. – V. 9. – 689 (1-33); IET Nanobiotechnol. – 2020. – V. 14. – I. 6. – P. 519-526]. Создание структур, содержащих помимо природных полисахаридов микроэлементы, позволяет помимо соответствующего лечебного действия реализовать такие свойства, как мембранотропность, биодеградируемость и биосовместимость [IETNanobiotechnol. – 2020. – V. 14. – I. 6. – P. 519-526; ColloidsandSurfacesB: Biointerfaces. – 2021. – V. 197. – P. 111381 (1-7).].
Например, известен способ получения композиции на основе йода и хитозана [US4275194], посредством смешения 3 мас. % раствора хитозана в уксусной кислоте с водным раствором, содержащим йод и йодид калия. Полученную смесь фильтровали, а затем промывали водой. Авторы отмечают, что данная композиция полезна в качестве дезодоранта, стерилизатора или дезинфицирующего средства. К недостаткам данного метода синтеза можно отнести плохую воспроизводимость результатов вследствие того, что количество йода в результирующем образце зависит от того, сколько раз и как его промывали водой.
Для улучшения воспроизводимости результатов некоторые авторы описали твердофазные способы получения йод-хитозановых аддуктов с разным массовым содержанием йода.
Так, был описан стабильный йод-хитозановый препарат [US5538955], содержащий до 60 мас. % йода, полученный при твердофазном взаимодействии элементного йода и хитозана в медленно вращающемся реакторе при температуре 100 °С. К недостаткам данного метода получения можно отнести сложность процедуры и высокую температуру проведения процесса синтеза (100 °С), а получаемый результирующий аддукт йода и хитозана отличается плохой растворимостью в воде, хотя авторы отмечают, что при содержании йода менее 50 % по массе образцы могут быть растворимы в водных растворах уксусной или глутаминовой кислот. Также растворимость может быть улучшена при добавлении к раствору аддукта поверхностно-активных веществ.
Известен также препарат, созданный на основе йода и хитозана [CN103113492A], который по заявлению авторов является эффективным, нетоксичным, полимерным, медицинским, дезинфицирующим стерилизующим материалом широкого спектра действия. Твердофазный синтез проводят в медленно вращающимся реакторе при постоянной температуре от 60 до 90 °С в течении 6-18 часов. К недостаткам данного препарата можно отнести сложность и длительность процедуры приготовления, а также нерастворимость результирующего йод-хитозанового препарата в воде.
Анализ имеющихся литературных источников позволяет предположить, что наиболее удобным в фармакологическом использовании и простым в изготовлении йод-содержащим препаратом можно считать комплексную структуру, обладающую следующими параметрами: (1) субстанция должна быть легко растворимой в воде или других растворителях, традиционно применяющихся в медицине, при этом результирующий композит должен удерживать йод в стабильной форме после растворения; (2) метод синтеза должен исключать применение водных растворов или растворителей легко смешивающихся с водой, так как в противном случае сложно обеспечить воспроизводимый состав результирующего композита; (3) желательно, чтобы полученная композиция после синтеза не требовала проведения дополнительных процедур, а именно, перекристаллизации, сублимации, очистки и т.д.
То есть йод должен быть рассредоточен в некой полимерной матрице, которая будет не только выполнять роль стабилизатора, но и желательно, чтобы полимерная матрица сама была носителем фармакологически активных функциональных групп. Кроме того, соединение-матрица должно быть стабильным и растворимым в воде.
Поскольку большинство известных синтетических полимеров, традиционно используемых в медицине, отличаются деструкцией кратных связей (например, С=С, С≡C, С=О, С=N, С≡N, С=S и др.), например, под действием света и/или при хранении, то логично в качестве полимерной матрицы выбрать молекулу природного полимера, для которых в условиях окружающей среды процессы деструкции не характерны [Natural and Synthetic Biomedical Polymers. – 2014. – P. 67-89]. В этом смысле особенно интересны молекулы полисахаридов, например, арабиногалактана – природного высоко разветвлённого полисахарида, состоящего из звеньев галактозы и арабинозы, водорастворимого, легко выделяемого из возобновляемого растительного сырья, главным образом, из древесины лиственниц, а значит коммерчески доступного [FoodHydrocolloids. – 2014. – V. 42. – P. 239–243; The Complex World of Polysaccharides, Ed. Karunaratn D.N., InTech. – 2012. – 634p.], обладающего значительной водорастворимостью, низкой токсичностью и высокой биологической доступностью.
Более того, известно, что для молекулярных комплексов и/или аддуктов полисахаридов, в том числе и арабиногалактана, с некоторыми биологически значимыми элементами не только характерно сочетание свойств, но и синергизм свойств всех входящих в них компонентов [Tapan,K.G., BijayaG.Polysaccharide-basednano-biocarrierindrugdelivery. – 2019. – 382 p.; Natural Polysaccharides in Drug Delivery and Biomedical Applications, Ed. Hasnain, Md.S., Nayak, A.K. – 2019. – 628 p; Polymers. – 2017. – V. 9. – 689], что обусловливает значительный потенциал этих структур в создании новых материалов для медицины и фармакологии.
Сущность заявляемого решения заключается в том, что для синтеза результирующего йод-арабиногалактанового нанокомпозита, обладающего антимикробными свойствами, предполагается использовать механохимическое взаимодействие арабиногалактанав качестве водорастворимой матрицы, а в качестве источника йода – кристаллический элементный йод.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в том, что способ позволяет получить стабильные водорастворимые нанокомпозиты, обладающие антимикробными и противогрибковыми свойствами.
Поставленная задача достигается следующим образом:
рассчитанное количество арабиногалактана (1 г.) и йода (от 0.013 до 0.3 г.) загружали в шаровую мельницу МЛ-1 (НПЭФ «Экон», Россия, материал рабочей камеры – титан) и подвергали обработке в течение 20-90 мин. Полученные таким образом порошки отличаются от соломенной до темно-желтой окраской в зависимости от содержания йода от 1.1 до 20.5 % (см. Примеры 1-4), растворимы в воде и ДМСО.
Содержание йода по массе в полученных образцах, определенное элементным анализом и рентгеновским энергодисперсионным микроанализом, варьируется в зависимости от исходного соотношения элементного йода к содержанию арабиногалактана (см. Примеры 1-4). По данным просвечивающей электронной микроскопии, размеры металлокомплексных наночастиц составляют 26 до 200 нм (Рисунок 1).
Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».
Отличительной особенностью настоящего изобретения является:
- простота (исходные вещества – это коммерчески доступные компоненты, не требующие предварительной подготовки и обработки; все манипуляции проводятся на воздухе, при комнатной температуре (20-25 °С) в одном реакционном сосуде);
- конечный продукт, а именно йод-содержащие нанокомпозиты арабиногалактана – это стабильные порошкообразные вещества, сохраняющие свои физико-химические параметры в течение длительного промежутка времени;
- полученные йод-содержащие нанокомпозиты арабиногалактана обладают антимикробными свойствами (Пример 5).
Заявителем не обнаружены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии заявленных отличительных признаков на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данного технического решения критерию «изобретательский уровень».
На рисунке 1 представлены – (а) и (б) ТЭМ микрофотографии образца йод-содержащего нанокомпозита (содержание йода 3.3 мас. %). Микрофотографии сделаны на трансмиссионном электронном микроскопе Leo 906 Ec ускоряющим напряжением 80 кв.
Пример 1.
Навеску арабиногалактана массой 1.0 г и 0.3 г элементного кристаллического йода помещали в шаровую мельницу МЛ-1 (НПЭФ «Экон», Россия) (материал рабочей камеры – титан) и подвергали обработки в течение 20 мин. После механохимической обработки выгрузили 1.12 г продукта со следующим элементным составом, мас. %: C, 32.71; H, 5.41; J, 20.5.
Пример 2.
Навеску арабиногалактана массой 1 г и 0.16 г элементного кристаллического йода помещали в шаровую мельницу МЛ-1 (НПЭФ «Экон», Россия) (материал рабочей камеры – титан) и подвергали обработки в течение 40 мин. После механохимической обработки выгрузили 1.09 г продукта со следующим элементным составом, мас. %: C, 35.08; H, 5.69; J, 13.0.
Пример 3.
Навеску арабиногалактана массой 1 г и 0.031 г элементного кристаллического йода помещали в шаровую мельницу МЛ-1 (НПЭФ «Экон», Россия) (материал рабочей камеры – титан) и подвергали обработки в течение 20 мин. После механохимической обработки выгрузили 0.94 г продукта со следующим элементным составом, мас. %: C, 37.49; H, 6.07; J, 3.30.
Пример 4.
Навеску арабиногалактана массой 1 г и 0.013 г элементного кристаллического йода помещали в шаровую мельницу МЛ-1 (НПЭФ «Экон», Россия) (материал рабочей камеры – титан) и подвергали обработки в течение 40 мин. После механохимической обработки выгрузили 0.98 г продукта со следующим элементным составом, мас. %: C, 42.06; H, 6.04; J, 1.10.
Пример 5.
-1
Для тестирования антимикробной активности полученных образцов навески нанокомпозита йода растворяли в 1 мл стерильной воды до получения образца концентрацией в пересчете на йод – 2.8 мг×мл.
5
-1
Минимальные ингибирующие и минимальные бактерицидные концентрации (МИК и МБК) синтезированного нанокомпозита исследовали в отношении контрольных тест - штаммов коллекции типовых культур Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumonia ATCC700603, Pseudomonasaeruginosa АТСС 27853, Staphylococcusaureus АТСС 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Candida albicans ATCC 90028  методом серийных двукратных разведений в жидкой питательной среде объемом 1 мл (бульон Мюллер-Хинтона, для кандиды – бульон Сабуро) с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма 5·10 КОЕ×мл. Каждый тест проводили в двух повторностях с дальнейшим культивированием при температуре 37 °С на протяжении 24 ч. Эксперимент повторяли дважды. Результаты оценивали визуально, определяя наличие или отсутствие роста в среде, содержащей различные концентрации исследуемого соединения. Последняя пробирка ряда с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствовала минимальной ингибирующей концентрации (МИК) препарата в отношении данного штамма.
Из прозрачных пробирок делали высевы на плотную питательную среду (агар Мюллер - Хинтона) для определения жизнеспособности клеток. После инкубации посевов в термостате (18-24 часа) отмечали наименьшую концентрацию препарата в пробирке, высев из которой не дал роста. Эту концентрацию принимали за минимальную бактерицидную (МБК). Изучение противогрибковой активности проводили в бульоне Сабуро, следуя тому же принципу, с последующим высевом на агар Сабуро для определения минимальной фунгицидной концентрации (МФК). Время инкубации – 48 часов.
-1
- 1
- 1
- 1
- 1
- 1
Согласно полученным результатам микробиологических исследований нанокомпозит йода обладает высокой антимикробной активностью в отношении различных штаммов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, а также грибов рода Candida (Таблица1). Бактериостатическая концентрация нанокомпозита (МИК) варьирует в диапозоне от 0.62 до 5.0 мг×мл, бактерицидная (МБК) – от 1.25 до 5.0 мг×мл(в пересчете на йод – 0.087 – 0.7 и 0.175 – 0.7 мг×млсоответственно). Наиболее эффективен нанокомпозит против штамма Escherichia coli ATCC 25922, МИК для которого составила 0.62 мг×мл, МБК – 1.25 мг×мл(по йоду – 0.087 и 0.175 мг×млсоответственно).
-1
-1
Наиболее высокие значения МИК и МБК данный нанокомпозит показал в отношении других грамотрицательных бактерий – P. aeruginosa АТСС 27853 и БЛРС – продуцирующего тест-микроорганизма K. pneumonia АТСС 700603. В данном случае МИК имеет те же значения что и МБК и составили 5 мг×мл соответственно (0.7 мг×мл по йоду).
- 1
- 1
- 1
- 1
Для референсных грамположительных штаммов S.aureus ATCC 25923 и E.faecalis АТСС 29212 МИК – 1.25 и 2.5 мг×мл соответственно (по йоду – 0.175 и 0.35мг×мл), МБК имеет одно и то же значение – 5.0 мг×мл(в пересчете на йод – 0.7 мг×мл).
Оценка ингибирующего и фунгицидного действия нанокомпозита показала его противогрибковую активность – для Candida albicans МИК, МФК – 1.25 мг/мл соответственно (в пересчете на йод – 0.175 мг/мл).
Разумеется, изобретение никоим образом не ограничивается описанными и проиллюстрированными вариантами осуществления, которые были представлены лишь в качестве примеров.
Таблица 1. – Определение спектра антимикробного действия нанокомпозита йода
Виды микроорганизмов
МИК/МБК мг∙мл<sup>- 1</sup>
Арабиногалактан -I<sub>2</sub>
По препарату
По йоду
Escherichia coliATCC 25922Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853Klebsiella pneumoniaАТСС 700603Staphylococcus aureusATCC 25923Enterococcus faecalisАТСС 29212Candida albicansАТСС 90028
0.62/1.255/55/51.25/52.5/51.25/1.25
0.087/0.1750.7/0.70.7/0.70.175/0.70.35/0.70.175/0.175