Исследование эффективности ИЛ-2 при неполном удалении спонтанного рака молочных желез мышей

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИЛ-2 ПРИ НЕПОЛНОМ УДАЛЕНИИ СПОНТАННОГО РАКА МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ

МЫШЕЙ

Ю.О. Носкова, А.В. Чаадаева

Эффективность однократной терапии интерлейкином-2 для снижения темпов роста остаточных опухолевых масс при неполном удалении рака молочных желез была изучена на мышиной модели. Данный вид иммунотерапии существенно продлил выживание самок с медленно растущими опухолями с выраженным латентным периодом, особенно с предсуществующими патоморфологическими признаками спонтанного отторжения.

Введение

Несмотря на значительные успехи в лечении и изучении причин и особенностей рака молочной железы (РМЖ) и даже некоторое снижение частоты этого заболевания в ряде стран, смертность от РМЖ продолжает увеличиваться [1]. Это обусловливает актуальность разработки новых и совершенствования существующих методов лечения РМЖ, в том числе и иммунотерапевтических подходов. Иммунотерапия интерлейки-ном-2 (ИЛ-2) широко применяется в клинической практике для лечения меланомы и рака почки, тогда как эффективность этого вида иммунотерапии при РМЖ изучена явно недостаточно, результаты исследований по данному вопросу неоднозначны и противоречат друг другу [2]. В связи с этим возникает необходимость поиска возможных прогностических факторов с целью предварительного отбора пациентов для применения иммунотерапии ИЛ-2 [3] с использованием адекватных мышиных моделей человеческого РМЖ.

В результате исследований противоопухолевого эффекта однократной локальной инъекции ИЛ-2 на перевитых [4] и спонтанных мышиных моделях РМЖ человека [5] было показано, что опухоли, проявляющиеся быстрее как видимые узелки, более чувствительны к действию данного цитокина. Кроме того, было замечено, что при хирургическом удалении первичных возникающие у мышей вторичные опухоли молочной железы более агрессивны и растут быстрее, чем первичные, особенно при неполном удалении первичной опухоли (Моисеева, неопубликованные данные). Известно, что в некоторых клинических случаях РМЖ по тем или иным причинам невозможно полное удаление опухолевой массы (особенно в ветеринарной практике [6]), что является причиной рецидивов и исключает возможность излечения пациента. В связи с этим исследование эффективности иммунотерапии РМЖ при неполном удалении опухоли является актуальным. В нашей лаборатории проводится изучение противоопухолевой активности различных препаратов на модели спонтанного РМЖ самок мышей родственных линий БЬКВ-КЬ(8.17)11еш и БУКВ-КЬ(8.17)11еш, которая по патоморфологическим характеристикам адекватно отражает клиническую картину фамильного РМЖ человека [5]. Мы предположили, что однократная локальная инъекция ИЛ-2 при неполном иссечении опухолевой массы поможет снизить интенсивность роста остаточной опухоли, предупредить появление вторичных опухолей и увеличить продолжительность жизни реципиентов. Таким образом, целью исследования было проверить данную гипотезу и выявить возможные прогностические факторы, определяющие исход иммунотерапии, как связанные с самим реципиентом, так и с патоморфологическими особенностями частично удаленной опухоли.

Постановка задачи

В связи с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. разработать модель неполного удаления РМЖ;

2. исследовать эффект однократной локальной инъекции ИЛ-2 во время частичной мастэктомии (ЧМЭ) спонтанного РМЖ мышей на выживание реципиентов;

3. оценить возможное влияние факторов, связанных с реципиентом (статус разведения и возраст возникновения первой опухоли) и особенностями роста опухоли (наличие/отсутствие латентного периода, динамика роста опухоли до и после операции) на выживание самок;

4. методом гистопатологического анализа охарактеризовать как удаленную опухоль, так и локализацию, количество и, по возможности, состав лейкоцитарных инфильтратов.

Материалы и методы

Линии мышей. В работе использовали самок мышей двух оригинальных родственных линий BLRB-Rb(8.17)1Iem и BYRB-Rb(8.17)1Iem, далее называемых BLRB и BYRB, соответственно. Обе линии характеризуются высокой частотой возникновения спонтанного РМЖ с возможным участием экзогенного MMTV-ретровируса, обнаруженного у них в лейкоцитарной фракции [5]. Частота возникновения опухолей молочных желез близка к 100% для много рожавших самок данных линий мышей. Средний возраст самок к моменту обнаружения первой опухоли около 9,5 и 11 месяцев для много рожавших самок линий BYRB и BLRB, соответственно [5]. Мыши содержались в тщательно контролируемых условиях в отделении Биомоделей лаборатории биотехнологии Института биоорганической химии. Мыши находились в условиях обычного светового режима, получали полнорационный гранулированный комбикорм, стандартные добавки (каша на молоке, растительное масло, витамины А,Е,Б,Б) и воду без ограничений.

За каждой самкой наблюдали индивидуально в течение всей ее жизни: помету при отсадке от родителей и регистрации в племенном журнале присваивали ушную метку («фамилия», одинаковая для самок одного помета, рис. 1, б). Индивидуальные метки по пальцам задних лап («имя») самки получали при рассадке по парам с самцами (рожавшие) или в группы стареющих самок (девственные). Сведения о статусе разведения (девственная/рожавшая), физическом состоянии самки, появлении и росте опухолей еженедельно заносили в специальные протоколы. Базу данных хранили в программе Excel.

Выявление подкожных опухолей. Подкожные опухоли выявляли у стареющих самок после выведения их из разведения, а также по достижении девственными самками возраста ожидаемого появления опухоли (более 6 месяцев). Еженедельно оценивали физическое состояние самок и выявляли появляющиеся опухоли визуально и путем пальпации. Подкожные опухоли, которые определялись только на ощупь (меньше

4 мм), по крайней мере, две недели или дольше (т.е. имели латентный период), называли «постепенно проявляющимися», или лаг-положительными (лаг+). Опухоли, видимые глазом уже при первом обнаружении (средний размер 4-5 мм), называли «внезапно появившимися» или лаг-отрицательными (лаг-). Под латентным периодом (лаг-периодом) понимали - период от момента обнаружения опухоли методом пальпации до ее видимого проявления, продолжающийся две и более недели. Локализацию опухоли регистрировали латинскими буквами и номером в зависимости от близости к одному из

5 пар сосков (рис. 1).

Рис. 1. Различная локализация опухолей: а - схема 5 пар сосков самки мыши (Biology of laboratory mouse, 1949); б - операбельная опухоль R2 самки BLRB; в - неоперабельная опухоль L1 самки BYRB

Определение размеров опухолей. Методика измерения размера опухолей как среднего диаметра по трем взаимно перпендикулярным параметрам была разработана Е.В. Моисеевой с соавторами [7]. Индивидуальный рост визуально определяемой ОМЖ выражали с помощью динамики роста среднего диаметра опухоли (СДО), вычисляемого по формуле (a+b+h)/3; где a -максимальная длина, b - максимальная ширина, а h -средняя высота более или менее симметричной опухоли (этот подход используется для визуализации фазы линейного роста опухоли [8]). Для несимметричных опухолей или нескольких локализаций подсчет СДО имел свои особенности. Сначала измеряли объемы более мелких сферических опухолей по формуле V = 1/6п abh (Schreck, 1936) и суммировали их. Далее рассчитывали диаметр результирующей сферы, который и принимали за средний диаметр опухоли.

Частичная мастэктомия. Прооперировали 5 самок с целью разработки методики, затем были прооперированы еще 15 самок мышей с операбельными спонтанными опухолями. Перед операцией шерсть с операционного поля удаляли с помощью депиляци-онного крема. Мышей наркотизировали внутримышечной инъекцией Zoletil50:Vetrankvil:PBS (1:1:9) из расчета 0,01 мл на 10 г веса. Инъекцию делали в мышцы бедра задней лапы, предпочтительно противоположной локализации опухоли. При проведении частичной мастэктомии иссекали 50-80% опухолевой массы. Операционную рану с остатком опухоли закрывали непрерывным кожным швом. Использовали шовный материал - атравматическую нить Ethilon № 6.0. Во время операции производили локальную терапию ИЛ-2. Ежедневно проверяли физическое состояние прооперированных самок, еженедельно измеряли размер опухолей.

Локальная терапия ИЛ-2. ИЛ-2 был любезно предоставлен профессором В. Ден Оттером (Нидерланды). Из 20 прооперированных самок 10 были пролечены ИЛ-2, 10 самок лечения не получали и составили контрольную группу. После иссечения опухолевой массы в остаток опухоли опытным мышам вводили однократно 0,2 мл стерильного раствора, содержащего 1*106 МЕ ИЛ-2 с частичками туши для дальнейшей визуализации места инъекции при анализе гистологического образца. Контрольным мышам (n=5) - соответствующее количество физиологического раствора с частичками туши. Следует отметить, что в связи с особенностями опухолевой структуры полную дозу ИЛ-2 удалось ввести только в солидные опухоли, а в кистозные - примерно половину дозы, остальная часть из остаточной опухолевой массы выливалась в поле операции. Операционную рану с остатком опухоли закрывали непрерывным кожным швом. Одной самке не удалось ввести ИЛ-2, у одной с локализацией опухоли около левого уха цитологически была диагносцирована лимфома (впоследствии подтвержденная гистологически и фенотипически как Т-лимфолейкоз). Эти 2 самки были выведены из дальнейшего рассмотрения. Эффективность лечения оценивали по темпам роста остаточной первичной и появившихся вторичных опухолей и улучшению выживания мышей в экспериментальной группе по сравнению с контролем.

Некропсия и патоморфологический анализ. С целью предотвращения естественной гибели опухоленосителей всех животных с опухолями более 15 мм и потерей

веса более 10% подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. Некропсия включала патанатомический анализ состояния молочной железы, регионарных лимфатических узлов, головного мозга, органов грудной и брюшной полости. Отмечали наличие и характер видимых метастатических узелков в легких.

Операционный и изъятый в ходе вскрытия материал фиксировали в 4% растворе нейтрального формалина (РН=7.2); гистологические срезы готовили по стандартной методике. Окраску гематоксилином-эозином по Майеру по стандартной методике применяли для классификации опухолей, а также для визуализации геморрагических участков опухоли и выявления эозинофильных гранулоцитов (Эо) в лейкоцитарном инфильтрате опухоли (ЛИО). Для визуализации секреторной активности клеток и выявления макрофагов (Мф), в том числе эпителиоидных (эпМф), в инфильтрате опухоли использовали РЛБ-окрашивание (Шифф-реакцию) по стандартной методике [9].

Полученные препараты анализировали по методике, предложенной Е.В. Моисеевой с соавторами [4]. Опухоли молочных желез классифицировали по схеме, разработанной Е.В. Моисеевой и А.В. Чаадаевой [4, 10].

Статистический анализ. Статистическую значимость различий в значениях параметров двух групп определяли с помощью Ц-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [11].

Результаты и их обсуждение

Разработка методики частичной мастэктомии ЧМЭ. Методика частичной мас-тэктомии (ЧМЭ) была разработана с целью, удалить около 80% опухолевой массы. Последовательность операций представлена на рис. 2 на примере самки БУКВ (МС75, Ь4=11,3 мм; выживание после ЧМЭ 4 нед.). Эта группа самок мышей (п=5) была прооперирована без введения частиц туши.

Рис. 2. Этапы частичной мастэтомии: а - план операции, общий вид; б - 1_4 сосок будет оставлен после ЧМЭ; в - удаленная кистозная часть составляет 80% опухолевой массы; г - оставшаяся часть опухоли с соском 1_4; д - конец операции, общий вид;

е - остаток опухоли с соском

Выживание мышей в зависимости от полученной дозы ИЛ-2. По средней продолжительности жизни, леченные ИЛ-2 реципиенты получили незначительное прему-щество (7.1 ± 0.8 нед. при 5.9 ± 0.5 нед. в контроле). Динамика выживания опытной и контрольной групп различалась только после достижения 50%-го выживания (рис. 3, а). Реципиенты были представлены коротко (менее 6 нед., 50% мышей) и долгоживущей (более 6 нед., 50% мышей) подгруппами как в контроле, так и в эксперименте (рис. 3, б, таблица).

Рис. 3. Выживание мышей после частичной мастэктомии и лечения ИЛ-2: а - динамика выживания; б - индивидуальное выживание, 4 мыши (заштрихованные столбики) получили полную дозу ИЛ-2 в опухоль

При этом леченные ИЛ-2 коротко выжившие самки демонстрировали слабую тенденцию к ухудшению выживания по сравнению с выживанием нелеченных коротко выживших самок, тогда как динамика выживания леченных долго выживших реципиентов была лучше контрольной. Необходимо отметить, что в связи с особенностями структуры опухоли не всегда удавалось ввести полную дозу ИЛ-2 в остаток опухолевой массы (рис. 3, б, рис. 4). Введение полной и неполной доз ИЛ-2 внутрь опухоли зависело от морфологической структуры образования (показано на рис. 4).

Таким образом, в солидные опухоли была введена полная доза ИЛ-2, в кистозные - примерно половина дозы в опухоль, остальное содержимое инъекции выливалось в поле операции перитуморально. Однако, как следует из рис. 3, б, видимо, это не являлось причиной неэффективности ИЛ-2 у коротко выживших самок, так как среди мышей экспериментальной группы, как с полной, так и с неполной инъекцией ИЛ-2 в опухоль есть мыши, коротко и долго выжившие.

Влияние факторов реципиента и опухоли на выживание. Популяции леченных и контрольных самок до проведения ЧМЭ в среднем не различались ни по одному из учитываемых параметров: соотношению девственных и рожавших самок, возрасту на момент появления опухоли и операции, размеру опухоли на момент операции (таблица). Однако наблюдалась явная тенденция к преобладанию более старых самок в пролеченной группе (возникновение опухоли в возрасте более года, т.е. более 52 нед.). Не вызывает удивления тот факт, что 3 из 3 пролеченных самок с коротким выживанием оказались старыми (на 10 недель старее самок аналогичной подгруппы контрольной группы). Вероятно, отбор более молодых самок для проведения иммунотерапии мог бы оказать положительное влияние на выживание. Другие параметры реципиента также способствовали более продолжительному выживанию. Например, девственный статус самки явно являлся положительным прогностификатором в целом по полученным данным, девственные самки преобладали в долгоживущих подгруппах как леченной, так и контрольной групп.

Параметры роста и проявления опухоли тоже оказали заметное влияние на исход лечения. Так, самки с лаг+ опухолями, в основном, оказались в долго прожившей подгруппе, тогда как в контрольной они приблизительно поровну попали и в коротко, и в долго выжившие подгруппы. Заметно меньший размер опухолей в коротко выжившей

опытной подгруппе наводит на мысль о том, что они, вероятно, были прооперированы и пролечены слишком рано. По крайней мере, на уровне тенденции, прослеживается системное действие ИЛ-2, так как только у 1/3 пролеченных самок возникли вторичные опухоли (в контроле - у половины). Более того, одна из самок контрольной группы (выживание 5 нед.) и опытной группы (выживание 7 нед.) имели по 2 опухоли разных локализаций на момент операции, представляя, таким образом, не модельную, а реальную ситуацию, близкую к наблюдаемой в ветеринарной практике. У этих самок удаляли полностью одну опухоль, а ИЛ-2 вводили локально во вторую, не удаляемую. Пролеченная ИЛ-2 самка выжила лучше контрольной.

Контроль п=10 Опыт п=8 Контроль Опыт

Параметры Коротко 5 / 10 Долго 5 / 10 Коротко 4 / 8 Долго 4 / 8

Реципиента

Статус: 4 / 6 4 /4 1 / 4 3 / 2 1 / 3 3 / 1

дев. / рож.

Возраст с ОМЖ, 50.4 54.8 49.0 51.1 58.3 51.3

нед.

Возраст на момент 53.1 60.1 52.6 53.4 62.8 59.9

ЧМЭ, нед.

Старые / молодые 6 / 4 6 / 2 3 / 2 3 / 2 3 / 0 3 / 2

Время с ОМЖ до 2.7 5.8 2.5 3.9 3.3 8.6

ЧМЭ, нед.

ПЖ после ЧМЭ, 5.9 7.1 4.4 7.8 4.2 10.8

нед.

Полная ПЖ, нед. 59.6 67.8 56.8 61.3 65.3 69.9

Опухоли

Лаг-период: 4 / 6 4 / 4 2 / 3 2 / 3 1 / 3 3 / 1

лаг+ / лаг-

Диаметр на момент 8.0 6.4 7.8 8.3 6.0 6.8

ЧМЭ, мм

Больше одной 5 / 5 2 / 6 2 / 3 3 / 2 1 / 3 1 / 3

ОМЖ / 1 ОМЖ

Прирост после 21 21 27 16 27 16

ЧМЭ, %/нед

Прирост после 106 127 112 101 111 143

ЧМЭ, %

Макс. диаметр, мм 15.5 14.3 15.0 15.9 12.4 16.4

Таблица. Факторы реципиента в зависимости от короткого и долгого выживания

реципиентов

Темпы роста остаточной опухолевой массы не различались в опыте и контроле (прирост в неделю в процентах от размера на момент операции). У самок с коротким выживанием опухоли прирастали в среднем на 27% и в опыте, и контроле и на 16% - у самок с долгим выживанием. Как в опыте, так и в контроле опухолевая масса приросла на 100 %, т.е. увеличившись в среднем в 2 раза (по сравнению с изначальным размером на момоент проведения ЧМЭ); опухоли достигли прмерно одинаковых размеров перед гибелью животных.

Таким образом, проведенный анализ выявил ряд важных прогностических факторов и показал, что гормональный статус девстенных самок мог благоприятно сказаться на выживании как пролеченных ИЛ-2, так и контрольных животных. Наличие у опухоли таких особенностей, как медленного проявления и роста, также было связано с более долгой продолжительностью жизни после операции. Ряд моментов обозначил перспективы применения данного вида иммунотерапии в дальнейшем: следует применять его при неполном удалении неоперабельных солидных медленно проявляющихся опухолей при размере более 5-6 мм более молодых самок.

Отрицательные результаты иммунотерапии у рожавших и старых самок в применяемой модельной системе имеют важные последствия. Полученные данные приводят к выводу о том, что, используя при тестировании новых противооопухолевых подходов только опухоли, перевиваемые девственным и молодым животным, легко получить положительные результаты, никоим образом не воспроизводящие реальный, естественно возникающий РМЖ не только человека, но и ветеринарных пациентов. Это подчеркивает необходимость обязательного тестирования противооопухолевых препаратов на адекватных модельных системах.

Рис. 4. Зависимость выживания леченых ИЛ-2 самок от морфологической структуры ОМЖ: а - план ЧМЭ, б - особенности строения ОМЖ на момент операции 1, 2в - общий вид ОМЖ две нед. после ЧМЭ; 3в - остаток опухоли МС91 после введения ИЛ-2

с тушью

Зависимость выживания леченых ИЛ-2 самок БУКВ от морфологической структуры ОМЖ и способа введения ИЛ-2 (интра- или перитуморально в поле операции) продемонстрирована на рис. 4 на примере трех самок с коротким (4 нед., МС94, рис. 4, 1), долгим (9 нед., МС90, рис. 4, 2) и самым долгим выживанием (19 нед.).

В итоге способ введения ИЛ-2 различался для солидных опухолей, где полная доза ИЛ-2 была введена интратуморально, и кистозных - примерно половина дозы в опухоль (интратуморально), остальное содержимое инъекции выливалось в поле операции

и действовало, таким образом, перитуморально. Однако, как следует из рис. 3, б, видимо, это не являлось причиной неэффективности ИЛ-2 у коротко выживших самок, так как среди мышей экспериментальной группы, как с полной, так и с неполной инъекцией ИЛ-2 в опухоль, есть мыши коротко и долго выжившие.

Полученные данные приводят к выводу о том, что выживание вряд ли зависело от дозы ИЛ-2, введенной внутрь остаточной опухолевой массы. Однако можно предположить, что обработка ИЛ-2 во время проведения ЧМЭ только солидных опухолей, вероятно, может оказаться в дальнейшем более эффективной. Кроме того, вероятно, более целесообразно вводить ИЛ-2 в район статочной опухоли после закратия раны швом. Может быть, следует проводить повторную локальную инъекцию.

Зависимость выживания от прогрессии опухоли. Неоднозначность влияния количества ЛИО на выживание. Предпринимая попытку оценить, как количество/композиция ЛИО повлияет на прогноз после ЧМЭ, следует иметь в виду, что при сходных количествах и композиции расположение и происхождение (эту информацию о ЛИО мы должны почерпнуть из патоморфологического анализа), и, естественно, функция данного инфильтрата в опухоли может быть различной.

1а 1б 1 в

Рис. 5. Стадии прогрессии кистозно-папилломатозной первичной опухоли от солидной формы (МС76, 1, а-в) до крайней степени выраженности кистного строения (МС77, 2, а-в): 1а - общий вид твердой на ощупь ОМЖ 1_4=11мм до операции;

1б - солидная карцинома с выраженной стромой и начальными признаками кистозности; 1в - выраженные ЛИО в строме: Эо, лимфоциты и Мф, в том числе эпМф; 2а - кистозное строение мягкой на ощупь ОМЖ Р3 во время удаления;

2б - солидные и 2в - кистозные области этой карциномы со слабо выраженной стро-

мой

И, далее, степень выраженности ЛИО может зависеть от степени прогрессии опухоли, наличия областей с кистозным и геморрагическим строением. Для иллюстрации высказанного тезиса предлагается рассмотреть две карциномы, прооперированные в один и тот же день, явно представляющие начальную (МС76, Ь4=11 мм, самка БЬЯБ, выживание 7 нед., рис. 3, 1, а-в) и крайнюю степень выраженности кистозного строения (МС77, Я3= 15 мм, самка БУКВ, выживание 5 нед., рис. 3, 2, а-в) ОМЖ сходного типа. В интактной опухоли ЛИО инфильтрировали строму по всей толще опухоли (истинные ЛИО).

В более поздней опухоли МС77 подобного типа с кистозными структурами, наполненными кровью, было обнаружено на порядок больше лейкоцитов в ЛИО, что, однако, явно не свидетельствует о благоприятном прогнозе. Поэтому у самки с более кис-

тозной ОМЖ, было обнаружено в ЛИО на порядок больше лейкоцитов, что, однако, явно не свидетельствует о благоприятном прогнозе (самка прожила всего 5 нед. после ЧМЭ). Действительно, в интактной опухоли эти лейкоцитарные массы (сходные по композиции с ЛИО опухоли М76, не показаны на рис. 3) располагались по преимуществу в геморрагических областях, так как явно были принесены извне в толщу опухоли с кровью.

Такие и сходные инфильтраты принято считать ассоциированными с опухолью (ЛАО); они не являются благоприятным фактором прогноза. Случай МС77 дополнительно нтересен тем, что самка имела на момент операции 2 ОМЖ разных локализаций, из которых только одна, подробно рассмотренная выше, была удалена.

Патологоморфологический анализ образцов РМЖ самок с самым долгим выживанием. Гистологический анализ ОМЖ двух долгоживущих (одна - в контроле и одна - в опыте с самым долгим выживанием, рис. 4, 3, а-в) выявил наличие признаков спонтанного отторжения опухоли в образцах удаленных опухолей. Следовательно, ИЛ-2 оказался наиболее эффективным только при наличии предсуществующего иммунного ответа организма на опухоль.

Рис. 6. Папиллярный РМЖ пролеченной ИЛ-2 самки МС91 с самым долгим выживанием со значительными инфильтрациями и признаками некроза, окраска по Шиффу: а - малое увеличение, общий вид; б - масляная иммерсия, некроз с признаками кариорексиса и кальцифицированными тельцами; в - истинный ЛИО, Шифф-реакция выявляет

плазматические клетки и макрофаги

Заключение

Влияние иммунотерапии путем однократной инъекции интерлейкина-2 внутрь опухоли при неполном удалении спонтанного РМЖ было неоднозначным. Леченные ИЛ-2 коротко выжившие самки демонстрировали тенденцию к ухудшению выживания по сравнению с выживанием нелеченных коротко выживших самок, тогда как динамика выживания леченных долго выживших реципиентов была лучше контрольной. Кроме того, проведенный анализ выявил ряд важных прогностических факторов. Было показано, что дольше прожили более молодые девственные самки, несущие медленно растущие опухоли с выраженным латентным периодом, особенно с предсуществующими пато-морфологическими признаками спонтанного отторжения опухоли. Эти характеристики животных в дальнейшем смогут послужить аргументами в пользу выбора данного вида иммунотерапии при проведении неполной мастэктомии (при удалении труднодоступных опухолей в клинике). Гормональный статус рожавшей самки и кистозная морфология ее опухоли могут расцениваться как отрицательные прогностификаторы.

Литература

1. Breast Cancer Facts & Figures. 2007 - 2008 Режим доступа: http://www.cancer.org/downloads/STT/BCFF-Final.pdf

2. Hadden J.W. The immunology and immunotherapy of breast cancer: an update // Int J Immunopharmacol. - 1999. - V.21. - P.79-101.

3. Kedar E., Klein E. Cancer immunotherapy: are the results discouraging? Can they be improved? // Adv Cancer Res. - 1992. - V.59. - P. 245-322.

4. Moiseeva E.V, Merkulova I.B, Bijleveld C., Koten J.W., Miroshnikov A.I. Den Otter W.:Therapeutic effect of a single peritumoural dose of IL-2 on transplanted murine breast cancer // Cancer Immunol Immunother. - 2003. - V.8. - P.487-496.

5. Moiseeva E. Original approaches to test anti-breast cancer drugs in a novel set of mouse models. Pathobiology, Utrecht University, The Netherlands 191 pp. Режим доступа: http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/20051130-200033/index.htm, 2005.

6. Misdorp W. Incomplete surgery, local immunostimulation, and recurrence of some tumour types in dogs and cats. Vet Q. -1987. - V.9. - P. 279-286.

7. Moiseeva E.V., Farber S.M., Lomova L.V., Nikonenko B.V., Klepikov N.N. Some biological characteristics of BLRB and CBRB mice. Lab Animals (Balt Lab Anim Sci) 1991 - V.1. - P.24 - 27.

8. Vodovozova E.L., Moiseeva E.V., Grechko G.K., Gayenko G.P., Nifant'ev N.E., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Antitumour activity of cytotoxic liposomes, equipped with se-lectin ligand SiaLeX, in mouse mammary adenocarcinoma // Eur J Cancer. - 2000. -V.36. - P.942-949.

9. Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. Гистологическая и микроскопическая техника: Руководство. - 2000.

10. Moiseeva E.V., Rapoport E.M., Bovin N.V., Miroshnikov A.I., Chaadaeva A.V., Kra-silshchikova M.S., Bojenko V.K., Bijleveld C., van Dijk J.E., Den Otter W. Galectins as markers of aggressiveness of mouse mammary carcinoma: towards a lectin target therapy of human breast cancer // Breast Cancer Res Treat. - 2005. - V.91. - P.227-241.

11. Гублер Е.В., Генкин А. А. Критерий U Вилкоксона-Манна-Уитни. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологичеких исследованиях -1973. - С.72 -75.