Способ ферментации стеблей растений семейства POACEAE
METHOD OF FERMENTATION OF STEMS OF PLANTS OF POACEAE FAMILY

ДАННЫЕ О ПРИОРИТЕТЕ
[0001] Настоящая международная заявка на патент заявляет приоритет по заявке на патент США №15/424843, поданной 4 февраля 2017 г., и заявке на патент США №62/349674, поданной 14 июня 2016 г., каждая из которых настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Изобретение относится к способам ферментации для синтеза желаемого химического соединения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению кислородсодержащих органических соединений с помощью нескольких типов микроорганизмов.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Наиболее широко культивируемыми сельскохозяйственными культурами семейства Роасеае являются сахарный тростник (Saccharum officinarum), сорго (Sorghum bicolor) и маис (Zea mays). Слово Роасеае происходит от древнегреческого , что означает "фураж". Стебли сельскохозяйственных культур семейства Роасеае применяли в качестве фуража для животных на протяжении тысячелетий. Эти стебли едят жвачные животные, в том числе крупный рогатый скот, овцы и козы, потому что жвачные животные могут переваривать целлюлозу и гемицеллюлозу. Также эти стебли содержат сахара в клетках запасающей паренхимы и иногда содержат меньшее количество гранул крахмала в клетках запасающей паренхимы.
[0004] Сахара из этих стеблей уже давно применяют для производства столового сахара и мелассы и уже давно ферментируют до этанола для получения питьевого этанола (например, рома) и топливного этанола. Также эти стебли часто силосуют путем опрыскивания их молочнокислыми бактериями, и данный способ позволяет сохранять стебли в течение периода до года в качестве корма для животных и делает стебли более легко перевариваемыми для жвачных животных.
[0005] Силосование практикуют в течение приблизительно 200 лет с тех пор, как было обнаружено (в Германии), что при нарезании трав и прессовании нарезанных трав с вытеснением воздуха нарезанные (засилосованные) травы не "портятся" (т.е. не пахнут уксусом). Даже сегодня силосование трав и других сельскохозяйственных культур семейства Роасеае включает вначале нарезание стеблей на мелкие кусочки длиной приблизительно 12-25 мм, затем опрыскивание микроорганизмами (в основном молочнокислыми бактериями), а затем прессование нарезанных стеблей для вытеснения воздуха.
[0006] Это является действенным только потому, что сахара могут диффундировать к поверхностям среза нарезанных стеблей, так что молочнокислые бактерии могут потреблять сахара. Большинство дрожжей и большинство молочнокислых бактерий не являются подвижными (они не могут двигаться сами по себе), поэтому сахар должен диффундировать к ним (эти микроорганизмы не могут плыть туда, где находятся сахара). Поскольку они не являются подвижными, и поскольку микроорганизмы не без труда проникают в стебли растений семейства Роасеае, стебли следует либо нарезать, либо раздробить, чтобы сахара могли диффундировать к микроорганизмам.
[0007] При опрыскивании микроорганизмами и ферментами нарезанных или раздробленных стеблей происходит только осаждение микроорганизмов и ферментов на внешних поверхностях стеблей. Трещины, которые образуются при нарезании или дроблении стеблей, содержат пузырьки воздуха, которые остаются зафиксированными в трещинах, предотвращая осаждение микроорганизмов и ферментов в трещинах при опрыскивании стеблей. Поскольку дрожжи и молочнокислые бактерии не являются подвижными, и поскольку диффузия ферментов и микроорганизмов является чрезвычайно медленной, то проникновение дрожжей, молочнокислых бактерий и ферментов в стебли является слабым.
[0008] В данной области техники существует потребность в решении этой проблемы неполного проникновения дрожжей, молочнокислых бактерий и особенно ферментов в стебли.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] Изобретение в некоторых вариациях предусматривает способ ферментации стеблей растений семейства Роасеае, при этом способ включает стадии:
[0010] (а) получения стеблей растений семейства Роасеае, где стебли имеют среднюю длину более 100 мм, и где стебли имеют среднее исходное содержание влаги от 25% до 80%;
[0011] (b) прессования стеблей между роликами, при этом стебли погружены в водный раствор реагентов, где с помощью роликов стебли спрессовывают на от 20% до 90% от их среднего диаметра, и где водный раствор реагентов содержит один или несколько ферментирующих организмов, выбранных из группы, состоящей из дрожжей, молочнокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и их комбинаций;
[0012] (с) удаления стеблей из водного раствора реагентов, где в стеблях сохраняется по меньшей мере часть одного или нескольких ферментирующих организмов; и
[0013] (d) ферментации стеблей в течение периода ферментации с получением продуктов ферментации в стеблях.
[0014] В предпочтительных вариантах осуществления стебли выбраны из группы, состоящей из стеблей сахарного тростника, стеблей сорго и стеблей маиса.
[0015] В некоторых вариантах осуществления стебли имеют листья, прикрепленные к стеблям.
[0016] В некоторых вариантах осуществления стебли представлены в виде целого растения.
[0017] В предпочтительных вариантах осуществления ролики имеют тангенциальную скорость от 0,1 м/с до 10 м/с.
[0018] В предпочтительных вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит ферменты, выбранные из группы, состоящей из пектинлиазы, амилазы, целлюлазы, глюкозооксидазы, гексозооксидазы, ксиланазы и их комбинаций.
[0019] В некоторых вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит кислоты, выбранные из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты и их комбинаций.
[0020] В некоторых вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит ионы железа, перекись водорода или их комбинацию.
[0021] В предпочтительных вариантах осуществления период ферментации составляет от 1 дня до 7 дней.
[0022] В предпочтительных вариантах осуществления дрожжи представляют собой штамм Saccharomyces cerevisiae.
[0023] В некоторых вариантах осуществления стебли дегидратируют в ходе латентной фазы ферментации на стадии (d).
[0024] В некоторых вариантах осуществления молочнокислые бактерии выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Propionibacterium freudenreichii и их комбинаций.
[0025] В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает перемешивание водного раствора реагентов с применением энергии турбулентности от 0,15 Вт/кг до 5 Вт/кг.
[0026] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поддержание стеблей в анаэробной среде в течение периода силосования после завершения периода ферментации.
[0027] В некоторых вариантах осуществления период силосования составляет от одного дня до одного года.
[0028] В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает извлечение продуктов ферментации путем дробления стеблей.
[0029] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает извлечение продуктов ферментации путем выпаривания продуктов ферментации из стеблей.
[0030] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает скармливание стеблей жвачным животным после стадии (d).
[0031] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает применение стеблей в анаэробном сбраживании для получения метана после стадии (d).
[0032] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает применение стеблей в ферментативном гидролизе для получения этанола из целлюлозы после стадии (d).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0033] Фиг. 1 представляет собой схематический чертеж экспериментального устройства, применяемого в вариантах осуществления и примерах настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0034] Способы, процессы и системы по настоящему изобретению будут подробно описаны посредством ссылки на различные неограничивающие варианты осуществления и фиг. 1.
[0035] Данное описание позволит специалисту в данной области производить и применять настоящее изобретение, и в нем описано несколько вариантов осуществления, адаптации, вариаций, альтернатив и путей применения настоящего изобретения. Эти и другие варианты осуществления, особенности и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными для специалистов в данной области при ссылке на следующее подробное описание настоящего изобретения в сочетании с прилагаемыми графическими материалами.
[0036] Применяемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, какое обычно понимает специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
[0037] Если не указано иное, все числа, выражающие параметры, условия, результаты и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "приблизительно". Соответственно, если не указано обратное, числа, изложенные в нижеследующем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными и могут варьировать в зависимости от конкретных алгоритмов и расчетов.
[0038] Термин "включающий", который является синонимом "включающего в себя", "содержащего" или "характеризуемого", является включающим или открытым и не исключает дополнительных, не упомянутых элементов или стадий способа. "Включающий" является термином из уровня техники, применяемым в стиле формулы изобретения, который означает, что названные элементы пункта формулы изобретения являются существенными, но могут быть добавлены другие элементы пункта формулы изобретения, которые по-прежнему образуют конструкцию в пределах объема пункта формулы изобретения.
[0039] Используемая в данном документе фраза "состоящий из" исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы изобретения. Если фраза "состоит из" (или ее вариации) появляется в основной части пункта формулы изобретения, а не сразу после ограничительной части, она ограничивает только элемент, изложенный в этой части; другие элементы не исключаются из пункта формулы изобретения в целом. Используемая в данном документе фраза "состоящий главным образом из" ограничивает объем пункта формулы изобретения определенными элементами или стадиями способа, а также таковыми, которые существенно не влияют на основную(основные) и новую(новые) характеристику(характеристики) заявленного объекта изобретения.
[0040] Что касается терминов "включающий", "состоящий из" и "состоящий главным образом из", если в данном документе используется один из этих трех терминов, то раскрытый в данном документе и заявленный объект изобретения может предусматривать использование любого из двух других терминов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, не упомянутых в явном виде в иных случаях, любой пример термина "содержащий" может быть заменен на "состоящий из" или, альтернативно, на "состоящий главным образом из".
[0041] Никакие варианты осуществления, описанные в данном документе, не должны ограничиваться какой-либо теорией или предположениями относительно механизмов реакции, механизмов массообмена или описаниями исходного сырья или продуктов.
[0042] Настоящее изобретение основано на техническом решении проблемы, заключающейся в том, что получение продуктов ферментации из богатой сахаром растительной паренхиматозной ткани является дорогостоящим ввиду большого количества энергии и капитала, необходимых для эффективного дробления стеблей растений семейства Роасеае для экстракции сахаров. Настоящее изобретение также основано на техническом решении проблемы разложения стеблей растений семейства Роасеае после сбора урожая и перед переработкой или потреблением.
[0043] Используемые в данном документе выражения "прессовать", "спрессованный", "осуществление прессования" и "прессование" означают, что средний диаметр стеблей уменьшают на 20%-90%. Используемые в данном документе выражения "дробить", "раздробленный" и "дробление" означают, что средний диаметр стеблей уменьшают более чем на 90%.
[0044] В настоящем изобретении применяют технический подход прессования стеблей на от 20% до 90% от их среднего диаметра, при этом стебли погружены в раствор реагентов, содержащий один или несколько ферментирующих организмов. При таком прессовании стебли разламываются без существенной потери сахаров, и раствор реагентов втягивается в образующиеся трещины в паренхиматозной ткани. Сахара диффундируют из клеток паренхимы, вступают в контакт с ферментирующими организмами, находящимися в трещинах, и в стеблях образуется этанол и/или молочная кислота. Этанол и/или молочная кислота консервируют стебли для последующей экстракции этанола и/или потребления жвачными животными в качестве фуража. В некоторых вариантах ферменты в растворе реагентов разлагают и отделяют стенки клеток паренхимы для низкоэнергетического дробления с экстракцией этанола или сахаров.
[0045] Принципы настоящего изобретения демонстрируются в примерах в данном документе.
[0046] Низкий уровень рН в результате ферментации сахаров в сельскохозяйственных культурах молочнокислыми бактериями предотвращает рост других организмов, вызывающих порчу. Хранение сельскохозяйственных культур в анаэробных условиях предотвращает потребление этанола уксуснокислыми бактериями и выработку уксусной кислоты (уксуса). Поскольку уксуснокислые бактерии обладают высокой подвижностью, они могут потреблять весь этанол в засилосованных стеблях, если среду не поддерживать в анаэробных условиях (без кислорода).
[0047] В настоящее время считается, что низкий уровень рН, обусловленный деятельностью молочнокислых бактерий, также вызывает некоторый тип слабокислотного гидролиза гемицеллюлозы в стеблях, который улучшает перевариваемость стеблей. Обычно слабокислотный гидролиз проходит в течение нескольких часов при рН 2,0 или ниже, но при рН 4,0 в силосе этот слабокислотный гидролиз проходит в течение нескольких недель или месяцев. Данные, подтверждающие слабокислотный гидролиз в силосе, описаны в Henk, Linda L., and James С.Linden, "Solid-state production of ethanol from sorghum". Applied biochemistry and biotechnology 57.1 (1996): 489-501, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Henk отмечает (на стр. 491, внутренние цитаты опущены): "Наши данные показывают, что силосование представляет собой форму слабокислотного гидролиза. Силосование улучшало реакционную способность лигноцеллюлозных волокон к ферментативному гидролизу".
[0048] Специалисты в данной области поймут, что для силосования сельскохозяйственных культур обычно применяют многие микроорганизмы и ферменты, в том числе дрожжи, молочнокислые бактерии, гемицеллюлазу, целлюлазу и глюкозооксидазу. Это описано в Kung, L, "Silage fermentation and additives", Proceedings of Alltech's Seventeenth Annual Symposium. 2001, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.Также это описано в Charley, Robert С., РСТ-заявка на патент № РСТ/СА 2010/001729, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
[0049] Специалисты в данной области и те, кто хорошо знаком со свежесобранным сахарным тростником, сорго и маисом, признают, что свежесобранные стебли этих сельскохозяйственных культур являются довольно хрупкими. Если обычный человек наступает пяткой на стебель, лежащий на земле, он почувствует его треск, и, глядя на спрессованный стебель, он увидит большую трещину, несколько меньших трещин и большое количество еще более мелких трещин, все из каковых трещин проходят в осевом направлении. Он также увидит, что после простого наступания на стебель пяткой из стебля выжимается немного сока. Он также признает, что согнутый стебель внезапно сломается с щелчком (хрупким разрушением) - как при известном дефекте "обламывания стеблей" в сельскохозяйственных культурах кукурузы. В настоящем изобретении используется преимущество хрупкой природы свежесобранных стеблей для распространения трещин в стеблях при очень малой энергии.
[0050] Клетки запасающей паренхимы в стеблях растений семейства Роасеае представляют собой тонкостенные полиэдральные клетки размером примерно 360 микронов в длину и 60 микронов в диаметре с толщиной стенки приблизительно 2 микрона. Это описано более подробно в Dong, "A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems (a new role for the apoplast)", Plant Physiology 105.4 (1994): 1139-1147, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
[0051] В частности, Dong демонстрирует на фиг. 2, изображениях С и G, что клетки паренхимы сахарного тростника выровнены в осевом направлении, но не выровнены в радиальном направлении. Именно поэтому вода течет по апопласту в осевом направлении (ограниченном длиной междоузлия), но не течет по апопласту в радиальном или в боковом направлениях. Аналогично выровнены клетки паренхимы стеблей других растений семейства Роасеае. Стебли сахарного тростника и других растений семейства Роасеае легко разламываются в осевом направлении, потому что стенки клеток паренхимы образуют плоскости разлома в осевом направлении. Стебли растений семейства Роасеае трудно разрезать в радиальном направлении, потому что клеточные стенки не выровнены в радиальном направлении, что вынуждает проводить разрезание через клеточные стенки. Напротив, стебли растений семейства Роасеае не требуют большого количества энергии для разделения или раскалывания в осевом направлении.
[0052] Стебли растений семейства Роасеае легко раскалываются при прессовании в радиальном направлении. Результаты раскалывания стеблей сахарного тростника, а также конечно-элементная модель раскалывания содержатся в Skantz, J., and S.A. Domanti, "Experiments into the constitutive behaviour of sugarcane billets". PROCEEDINGS-AUSTRALIAN SOCIETY OF SUGAR CANE TECHNOLOGISTS. WATSON FERGUSON AND COMPANY, 1998, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что начальное радиальное прессование приводит к образованию одной большой трещины, последующее прессование приводит к образованию двух меньших трещин, последующее прессование дает четыре еще более мелкие трещины и т.д.
[0053] Стебли растений семейства Роасеае, которые раскалываются при прессовании, быстро возвращаются к округлой форме при устранении усилия в отношении стебля. Волокна стеблей обладают высокой прочностью на растяжение и служат для восстановления округлой формы стебля при устранении усилия в отношении стебля, хоть и с трещинами в паренхиматозной ткани стебля.
[0054] Сок в клетках паренхимы стеблей растений семейства Роасеае обычно содержит от 2% до 20% гексозных сахаров, состоящих в основном из сахарозы, глюкозы и фруктозы. Паренхиматозная ткань также часто содержит гранулы крахмала. Сухое вещество этих стеблей после выжимания сока часто называют багассой. Багасса обычно содержит примерно 35% целлюлозы, 25% гемицеллюлозы и 22% лигнина. Гемицеллюлоза обычно состоит из приблизительно 85% ксилозы, 13% глюкозы и 2% арабинозы. Целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин часто прочно связаны друг с другом, что предотвращает доступ ферментов для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы. Силосование (превращение свободных сахаров в молочную кислоту) представляет собой форму слабокислотного гидролиза, при котором гемицеллюлоза подвергается гидролизу, что делает целлюлозу более доступной для ферментов при переваривании жвачным животным, анаэробном сбраживании или ферментативном гидролизе.
[0055] Содержание крахмала в стеблях сахарного сорго описано в Zhao, Ya Li et al. "Changes in stem composition and harvested produce of sweet sorghum during the period from maturity to a sequence of delayed harvest dates", Biomass and Bioenergy 39 (2012): 261-273, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Zhao демонстрирует в таблице 2, что приблизительно 10,1% от веса стеблей составляют сахара и 3,6% от их веса - крахмал. Если бы крахмал выдавливался в соке, то приблизительно 4,3% от веса сока составлял бы крахмал, но исследования демонстрируют, что крахмал составляет только приблизительно 0,1% от веса сока (1000 мг/л). Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что при выжимании сока большая часть крахмала остается в стеблях вследствие фильтрации гранул крахмала, происходящей, когда стебли находятся под сверхвысоким давлением.
[0056] Содержание крахмала в соке сахарного тростника и сахарного сорго описано в Alves, Fernanda Viginotti et al. "Structural and physicochemical characteristics of starch from sugar cane and sweet sorghum stalks", Carbohydrate polymers 111 (2014): 592-597, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Alves демонстрирует, что сок сахарного тростника содержит приблизительно 356 мг/л крахмала, а сок сахарного сорго содержит приблизительно 1147 мг/л крахмала. Это означает, что стебли сахарного тростника содержат приблизительно одну треть от количества крахмала, содержащегося в стеблях сахарного сорго, и поэтому приблизительно 1% от веса стебля сахарного тростника составляет крахмал.
[0057] Содержание сахара в тропических гибридах маиса описано в White, Wendy G. et al. "The sugar, biomass and biofuel potential of temperate by tropical maize hybrids", GCB Bioenergy 4.5 (2012): 496-508, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. White демонстрирует, что из среднеширотных и тропических гибридов маиса (Zea mays) получают как зерно, так и ферментируемые сахара стеблей.
[0058] Многие ферментирующие организмы могут напрямую превращать глюкозу, фруктозу, мальтозу (димер глюкозы) и сахарозу (димер глюкозы и фруктозы) в этанол и молочную кислоту. В данном документе мономеры и димеры глюкозы и фруктозы будут называться сахарами, ферментирующие организмы, которые превращают сахара в этанол, будут называться дрожжами, а ферментирующие организмы, которые превращают сахара в молочную кислоту, будут называться молочнокислыми бактериями. Ферментирующие организмы, которые превращают сахара в этанол, могут быть эукариотическими, одноклеточными организмами или могут быть бактериями. Ферментирующие организмы, которые превращают сахара в молочную кислоту, могут быть эукариотическими, одноклеточными организмами или могут быть бактериями.
[0059] Многие ферментирующие организмы превращают сахара в этанол. Наиболее широко применяемыми ферментирующими организмами, вырабатывающими этанол, являются штаммы пивоваренных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Этанол имеет значительную экономическую ценность в напитках, транспортном топливе и в качестве предшественника для других органических соединений.
[0060] Другие ферментирующие организмы превращают сахара в молочную кислоту. Они известны как молочнокислые бактерии, и наиболее распространенным штаммом является Lactobacillus plantarum. Молочная кислота снижает рН ферментируемого материала до приблизительно 4,2, при котором ингибируется рост большинства других бактерий и грибов. Это обычно применяют, чтобы сохранить продукты, такие как йогурт и квашеная капуста. Также это обычно применяют для сохранения сельскохозяйственных культур для последующего применения в качестве корма для животных (фуража), что известно как "силосование".
[0061] Некоторые организмы превращают этанол в уксусную кислоту (уксус) в присутствии кислорода (в аэробной среде). Наиболее распространенным штаммом является Acetobacter aceti.
[0062] 0,5% раствор муравьиной кислоты является селективным ингибитором молочнокислых бактерий, а также других загрязняющих бактерий, но не ингибирует дрожжи. Это описано в Schmidt, J. et al. "Preservation of sugar content in ensiled sweet sorghum", Bioresource Technology 60.1 (1997): 9-13, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Значительную процентную долю муравьиной кислоты, производимой во всем мире, применяют для силосования корма для животных.
[0063] Ингибирование Saccharomyces cerevisiae молочной кислотой и уксусной кислотой описано в Narendranath, N.V., К.С. Thomas, and W.М. Ingledew, "Effects of acetic acid and lactic acid on the growth of Saccharomyces cerevisiae in a minimal medium". Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 26.3 (2001): 171-177, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Narendranath отмечает: "В тех случаях, когда в среде присутствовала молочная кислота в концентрации 0,5% вес/объем, присутствие уксусной кислоты (которая не вызывала значительного изменения скорости роста дрожжей в случаях, когда она присутствовала в отдельности) в концентрации даже 0,04% вес/объем вызывало значительное снижение скорости роста S. cerevisiae".
[0064] Точка кипения этанола составляет 78°С, точка кипения молочной кислоты составляет 122°С, и точка кипения уксусной кислоты составляет 118°С. Это делает возможным недорогостоящее отделение этанола от растворов, содержащих молочную кислоту и уксусную кислоту, путем применения перегонного куба (иногда называемого аламбиком). Однако точка кипения муравьиной кислоты составляет 100,8°С, что затрудняет разделение смеси этанола и муравьиной кислоты с применением перегонного куба. Также с помощью ферментирующих организмов и некоторых ферментов в ограниченных количествах получают метанол, и он имеет точку кипения 65°С. Так как он кипит при более низкой температуре, чем этанол, его можно удалить с применением перегонного куба, слив первоначальные несколько процентов дистиллята (называемые головной фракцией). Как муравьиная кислота, так и метанол являются токсичными для человека, поэтому, если спирт для алкогольных напитков получают из ферментированных стеблей, муравьиную кислоту не следует применять для силосования стеблей.
[0065] Существуют хорошо известные методики ферментации сахаров в стеблях растений семейства Роасеае до этанола. Стебли обычно дробят между рядом роликов для экстракции сока в результате разрыва клеток паренхимы, а затем сок отделяют от остаточных твердых веществ и ферментируют. Поскольку клетки паренхимы довольно малы, требуется много энергии, чтобы их раздробить. Почти 35% капитальных и эксплуатационных расходов в производстве сахара из стеблей обусловлены расходами на дробление. Экономическая составляющая дробления сахарного тростника описана более подробно в Gbaboa, "Comparative study on cane cutter/juice expeller and roller model Sugarcane juice extraction systems", INT J CURR SCI 2013, 7: E 55-60, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
[0066] Иногда применяют твердофазную ферментацию для ферментации стеблей растений семейства Роасеае, разрезая стебли на мелкие кусочки (или измельчая стебли), опрыскивая их дрожжами и оставляя их для ферментации. Дрожжи прилипают к свежеобнаженной паренхиматозной ткани, а сахара изнутри нарезанных кусочков (или измельченных стеблей) диффундируют к дрожжам, которые ферментируют сахара до этанола. В этом случае механизм такой же, как и при силосовании, но вместо молочнокислых бактерий применяют дрожжи. Недостаток этого типа твердофазной ферментации заключается в том, что для пастеризации стеблей перед ферментацией требуется много энергии. Другим недостатком этой методики является большое количество энергии, необходимой для разрезания или измельчения стеблей. Другим недостатком этой методики является то, что он не позволяет осуществлять реакцию содержимого внутренней части стеблей с ферментами вследствие очень медленной диффузии ферментов. Другим недостатком является то, что нарезанные или измельченные стебли имеют значительно меньшую объемную плотность, чем целые стебли или заготовки.
[0067] Одним из примеров этого является способ EX-FERM, описанный в патенте США №4560659, выданном Asturias 24 декабря 1985 г., который настоящим включен посредством ссылки в данный документ. Способ EX-FERM предусматривает нарезание сахарного тростника на кусочки со средним размером частиц в диаметре от 0,25 см до 4,0 см, смешивание с дрожжами и водой и ферментацию. Ферментированный раствор затем повторно применяют в последующих процессах ферментации для увеличения концентрации этанола перед дистилляцией.
[0068] Другой тип твердофазной ферментации описан в Bryan, William L., "Solid-state fermentation of sugars in sweet sorghum", Enzyme and Microbial Technology 12.6 (1990): 437-442, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.В этой методике стебли разрезают до длины 0,6 см или измельчают стебли. Почти 80% сахара в стеблях ферментируют до этанола. Однако получают большие количества молочной кислоты и уксусной кислоты, поскольку стебли перед ферментацией не пастеризовали.
[0069] Аналогичный тип твердофазной ферментации описан в Henk, Linda L., and James С. Linden, "Solid-state production of ethanol from sorghum", Applied biochemistry and biotechnology 57.1 (1996): 489-501, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. В этой методике применяют косилку-измельчитель для нарезания как стеблей, так и листьев в поле, опрыскивают нарезанные кормовые растения дрожжами и ферментами, а затем оставляют для ферментации. Недостатком является то, что для экстракции этанола необходима противоточная экстракция, которая является более капиталоемким способом, чем дробление стеблей. Henk отмечает (на стр. 500): "Этанолсодержащий сорговый силос стабилен в течение периода по меньшей мере 230 дней, что потенциально позволяет получать недорогостоящее исходное сырье для непрерывного получения этанола на годовой основе".
[0070] Другая методика ферментации сахаров в стеблях растений семейства Роасеае до этанола описана в патенте США №9499839, выданном Hamrick 22 ноября 2016 г., который настоящим включен посредством ссылки в данный документ и который имеет того же заявителя, что и настоящая заявка. В этой методике применяют вакуум для введения дрожжей и ферментов в апопласт богатых углеводами сельскохозяйственных культур, в том числе сахарного тростника и сахарного сорго; отведение жидкости от сельскохозяйственных культур со всех сторон, а затем ферментацию в апопласте.
[0071] Стебли растений семейства Роасеае могут перевариваться жвачными животными после силосования. Henk утверждает, что эта улучшенная перевариваемость обусловлена слабокислотным гидролизом гемицеллюлозы. Перевариваемость сахарного сорго описана в Di Marco, О.N. et al. "Digestibility of forage silages from grain, sweet and bmr sorghum types: Comparison of in vivo, in situ and in vitro data", Animal Feed Science and Technology 153.3 (2009): 161-168, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.Перевариваемость сахарного тростника описана в Kawashima, Т. et al. "Feeding value of sugarcane stalk for cattle", ASIAN AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES 15.1 (2002): 55-60, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
Перевариваемость стеблей кукурузной соломы описана в Tolera, Adugna, and Frik Sundst∅l, "Morphological fractions of maize stover harvested at different stages of grain maturity and nutritive value of different fractions of the stover", Animal Feed Science and Technology 81.1 (1999): 1-16, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
[0072] Перевариваемость и питательная ценность засилосованных трав описаны в Jaakkola, Seija, Pekka Huhtanen, and К. Hissa, "The effect of cell wall degrading enzymes or formic acid on fermentation quality and on digestion of grass silage by cattle", Grass and Forage Science 46.1 (1991): 75-87, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Jaakkola делает вывод, что в случае, если тимофеевка луговая (Phleum pretense, растение семейства Роасеае) содержит недостаточно сахаров для силосования с помощью молочнокислых бактерий, то силосование с помощью муравьиной кислоты является более действенным, чем силосование с помощью ферментов целлюлазы и гемицеллюлазы.
6
12
6
2
2
2
[0073] Большинство ферментирующих организмов окисляют сахара до диоксида углерода и воды в аэробной среде (в присутствии кислорода). Один моль глюкозы или фруктозы (СНО) (или 0,5 моля сахарозы или мальтозы) и шесть молей кислорода (О) окисляются до шести молей диоксида углерода (СО) и шести молей воды (НО). Этот механизм обеспечивает быстрое удаление кислорода из среды при ферментации.
[0074] Дрожжи ферментируют сахара до этанола в анаэробной среде (без кислорода). Один моль глюкозы или фруктозы (или 0,5 моля сахарозы или мальтозы) ферментируется до 2 молей этанола и 2 молей диоксида углерода с выделением 118 кДж тепла. Это означает, что ферментация 18% раствора сахара приведет к повышению температуры до 34°С, что означает необходимость охлаждения ферментационной среды. При ферментации 1 литра 18% раствора сахара (1 моль глюкозы) также будут получать 2 моля диоксида углерода, который имеет объем приблизительно 48 литров при 20°С и атмосферном давлении. Типичные дрожжи осуществляют ферментацию наиболее эффективно при от 20°С до 40°С, однако обладают значительной ферментативной активностью вплоть до 5°С (белое вино ферментируется при от 7°С до 15°С). Дрожжевые клетки постепенно погибают при температурах выше 42°С. Saccharomyces cerevisiae относительно нечувствителен к рН и будет осуществлять ферментацию в диапазоне рН от 2,9 до 7,2. Это описано более подробно в , "Effects of temperature, рН and sugar concentration on the growth parameters of Saccharomyces cerevisiae, S. kudriavzevii and their interspecific hybrid", International journal offood microbiology 131.2 (2009): 120-127, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
6
12
6
3
6
3
6
12
6
3
6
3
2
6
2
2
2
[0075] Молочнокислые бактерии ферментируют сахара до молочной кислоты как в аэробной, так и в анаэробной среде в зависимости от типа молочнокислых бактерий. При гомоферментативной молочнокислой ферментации один моль глюкозы или фруктозы (СНО) (или 0,5 моля сахарозы или мальтозы) ферментируется до двух молей молочной кислоты (СНО). При гетероферментативной молочнокислой ферментации один моль глюкозы или фруктозы (СНО) (или 0,5 моль сахарозы или мальтозы) ферментируется до одного моля молочной кислоты (СНО), одного моля этанола (СНО) и одного моля диоксида углерода (СО). Lactobacillus plantarum растет при от 15°С до 40°С как в аэробных, так и в анаэробных средах. В аэробных средах Lactobacillus plantarum использует в процессе дыхания кислород, и этот потребляемый кислород приводит к образованию перекиси водорода (НО), которая ингибирует рост других организмов.

[0076] Большинство штаммов Saccharomyces cerevisiae имеют диаметр примерно 10 микронов. Штамм Saccharomyces cerevisiae с размером клетки примерно 5 микронов представляет собой Thermosacc Dry, доступный от Lallemand Biofuels & Distilled Spirits, Дулут, Джорджия, США. Он вырабатывает этанол в концентрациях до 20% по объему (16% по весу), поэтому богатые сахаром сельскохозяйственные культуры с содержанием сахара до 32% по весу можно ферментировать с помощью этих дрожжей. Это означает, что сельскохозяйственная культура или экстрагированный сок можно дегидратировать перед ферментацией, чтобы в результате получить более высокую концентрацию этанола. Дрожжевая ферментация может занимать от 1 часа до 8 часов до получения значительного количества этанола и диоксида углерода. Этот период обычно называют латентной фазой ферментации. Путем дегидратации в ходе латентной фазы ферментации можно увеличить конечную концентрацию этанола.

[0077] Большинство штаммов Lactobacillus plantarum являются палочковидными с диаметром приблизительно 0,5-1,2 микрона и длиной 1-10 микронов. Одним из источников Lactobacillus plantarum является инокулянт для силоса BIOTAL II, доступный от Lallemand Animal Nutrition, Милуоки, Висконсин, США. Lactobacillus plantarum часто применяют с другими бактериями и ферментами для обработки силоса. Это описано в патенте США №5433074, выданном Evans et al. 11 июля 1995 г., который настоящим включен посредством ссылки в данный документ. Доступные в настоящее время составы для силосования от Lallemand Animal Nutrition содержат смеси Lactobacillus plantarum с Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici и Propionibacterium freudenreichii.
-9
2
-10
2
-11
2
[0078] Ферментирующие организмы являются настолько крупными, что они не перемещаются путем диффузии в течение своей жизни. Однако, газы и сахара диффундируют легко и легко диффундируют через стенки клеток паренхимы, а ферменты диффундируют через жидкости снаружи клеток паренхимы. Коэффициент диффузии диоксида углерода составляет 2,5×10 м/с, что означает, что он диффундирует на 1 мм приблизительно за 7 минут и на 10 мм приблизительно за 11 часов. Коэффициент диффузии сахарозы составляет 7,1×10 м/с, что означает, что она диффундирует на 1 мм приблизительно за 17 минут и на 10 мм приблизительно за 39 часов. Коэффициент диффузии пектинлиазы составляет 8,0×10 м/с, что означает, что она диффундирует на 1 мм приблизительно за 3,5 часа и на 10 мм приблизительно за 14 дней.
[0079] Дрожжевые клетки прилипают к поверхностям (таким как клетки паренхимы) в присутствии сахаров. Это описано в Verstrepen and Klis, "Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts", Molecular microbiology 60.1 (2006): 5-15, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Аналогично, молочнокислые бактерии также прилипают к поверхностям, таким как клетки паренхимы.
[0080] Как дрожжи, так и молочнокислые бактерии продают в лиофилизированной форме, и они просты в обращении. И те и другие классифицируются как GRAS (общепризнанные как безопасные) и обычно потребляются в среднем рационе, например, хлеб производят с помощью дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а йогурт производят с помощью Lactobacillus plantarum (который также присутствует в слюне) и Lactobacillus acidophilus. Аналогично, ферменты пектинлиаза, амилаза, целлюлаза, глюкозооксидаза, гексозооксидаза и ксиланаза доступны в пищевой форме.
[0081] Крахмал представляет собой полимер глюкозы. Прежде чем крахмал может быть превращен дрожжами в этанол или молочнокислыми бактериями в молочную кислоту, его сначала нужно превратить в глюкозу с помощью ферментов амилаз. Крахмал нерастворим в воде в температурном диапазоне, в котором активны дрожжи или молочнокислые бактерии.

[0082] Существуют доступные амилазы, которые эффективно превращают крахмал в глюкозу в температурном диапазоне, в котором эффективно функционируют дрожжи. Одним из примеров является ферментный состав STARGEN 002 от DuPont Industrial Biosciences, США. Он содержит альфа-амилазу Aspergillus kawachi, экспрессируемую в Trichoderma reesei, и глюкоамилазу Trichoderma reesei, которые действуют синергически, гидролизуя гранулированный крахмальный субстрат до глюкозы. Эндогенно активная альфа-амилаза и экзогенно активная глюкоамилаза катализируют полный гидролиз гранулированного крахмала в различных условиях ферментации этанола. STARGEN 002 обладает значительной активностью при от 20°С до 40°С и при рН от 3,5 до 4,5, поэтому он подходит для рН и температуры, необходимых для дрожжей.
[0083] Паренхиматозную ткань можно мацерировать (отделить клетки друг от друга) с помощью ферментов. При мацерации паренхиматозной ткани также нарушается целостность клеточной мембраны, как в результате механического действия, так и благодаря ферментам, высвобождающимся из клеточной стенки. Это приводит к тому, что содержимое вакуолей просачивается из клеток паренхимы и обуславливает облегчение диффузии ферментов в вакуоли. Также это обеспечивает вымачивающее действие, при котором жидкость в клетках паренхимы можно легче удалить путем выжимания или выпаривания. Пектинлиаза и ксиланаза мацерируют клетки паренхимы в стеблях растений Роасеае. Это описано в Ishii, "Enzymes for the isolation of protoplasts", Plant Protoplasts and Genetic Engineering I. Springer Berlin Heidelberg, 1989, 23-33, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Также Ishii демонстрирует, что целлюлаза также обуславливает разложение клеточной стенки.

[0084] Пектинлиаза разлагает пектин без образования метанола в качестве побочного продукта. Это делает ферментированный сок более полезным в качестве более ценного этанолсодержащего продукта по настоящему изобретению. Существуют доступные пектинлиазы, которые функционируют в том же диапазоне рН и температуры, что и дрожжи, в частности, пектинлиаза Aspergillus niger с оптимальным значением рН 5,5 и оптимальной температурой 35°С. Однако пектинлиаза необычна тем, что обладает значительной активностью при столь низких температурах, как 5°С. Пектинлиаза описана в Yadav et al. "Pectin lyase: a review", Process Biochemistry 44.1 (2009): 1-10, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Двумя примерами пектинлиазы, которая функционирует в том же диапазоне рН и температуры, что и дрожжи, являются "Pectinex XXL" (Novozymes A/S, Дания) и "Rohapect 10L" (AB Enzymes GmbH, Германия).
[0085] Также Ishii демонстрирует, что ксиланаза мацерирует клетки паренхимы стеблей в стеблях растений Роасеае, а целлюлаза разрывает клеточные стенки клеток паренхимы в этих стеблях. Примером коммерчески доступной ксиланазы является НТес3 (Novozymes A/S, Дания), которая представляет собой смесь эндоксиланазы и целлюлазы. НТес3 обладает приблизительно 90% активностью при температурах ниже 30°С и приблизительно 70% активностью при рН 4,0 и поэтому подходит для рН и температуры, необходимых для дрожжей.
2
[0086] Глюкозооксидаза превращает глюкозу и О в глюконовую кислоту и перекись водорода. Было продемонстрировано, что комбинация глюкозооксидазы и целлюлазы предотвращает разложение травяного силоса в аэробных условиях. Это описано в Rauramaa, A.L., J.J. Setaia, and А.Е.А. Tommila, "The effect of glucose oxidase on the preservation of grass silage", Grass and Forage Science 46.4 (1991): 359-364, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Глюкозооксидаза активна в широком диапазоне рН и температур, что описано в Biyela, В.N.Е. et al. "The production of reduced-alcohol wines using Gluzyme Mono 10.000 BG-treated grape juice", S. Afr. J. Enol. Vitic, Vol. 30, No. 2, (2009): 124-132, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что целлюлаза высвобождает глюкозу из трудногидролизуемой целлюлозы, и это медленное высвобождение глюкозы приводит к медленной выработке глюконовой кислоты и перекиси водорода, где комбинированный эффект более низкого рН вследствие присутствия глюконовой кислоты и токсичности перекиси водорода предотвращает выработку молочной кислоты и уксусной кислоты большинством загрязняющих организмов.
2
2
2

[0087] При ферментации дрожжи вырабатывают большое количество диоксида углерода (СО). При растворении СО в воде образуется угольная кислота. При ферментации парциальное давление СО составляет МО кПа (1 атм), и рН этого раствора составляет около 3,92. Дрожжи хорошо осуществляют ферментацию при этом рН, ферменты пектинлиазы Aspergillus niger (такие как Pectinex XXL и Rohapect 10L) обладают значительной активностью при этом рН, и ферменты, гидролизующие гранулированный крахмал (такие как STARGEN), обладают значительной активностью при этом рН. Аналогично, все эти ферменты обладают значительной активностью в температурном диапазоне, необходимом для дрожжей (от 25°С до 40°С).
[0088] Температура во время сбора урожая сахарного тростника, сорго и маиса может быть ниже 20°С. Однако тепло, выделяемое при ферментации сахаров, диффундирующих из паренхиматозной ткани, быстро повысит температуру этой ткани до температурного диапазона, в котором ферменты обладают значительной активностью.
3
3
3
[0089] Объемная плотность сахарного тростника и сорго в виде целых стеблей составляет от 300 до 400 кг/м. Объемная плотность заготовок (вырезанных частей) сахарного тростника, сорго и маиса (т.е. стеблей) составляет от 180 до 240 кг/м. Объемная плотность стеблей, нарезанных до длины от 10 мм до 25 мм, составляет приблизительно 60 кг/м. Как правило, объемная плотность обратно пропорциональна длине нарезанных стеблей.
3
[0090] Если целые стебли, заготовки или нарезанные стебли ферментируют в водном растворе, сок в стеблях разбавляют с коэффициентом от 2,5× до 10×. Поскольку расходы на отделение этанола из разбавленных растворов являются непомерно высокими, это не применимо на практике. Например, если объемная плотность стеблей составляет 200 кг/м, то каждые 0,5 л сока из стеблей окружают 5 л водного раствора. Если 1 л сока из стеблей содержит 10% сахара, то после ферментации он будет содержать примерно 5% этанола. Если стебли ферментируют в водном растворе, то получаемый раствор будет содержать 0,5% этанола после ферментации, что не является коммерчески целесообразным для его экстракции. Это можно решить путем ферментации целых стеблей и заготовок в 5% растворе этанола, но это имеет другие проблемы, связанные с накоплением загрязнений с течением времени.
[0091] Поскольку транспортные расходы зависят главным образом от объема (а не от веса), и поскольку урожай сельскохозяйственных культур часто собирают на значительных расстояниях от места их переработки, транспортировка сахаров при таких низких объемных плотностях является довольно дорогостоящей, поскольку только от 2% до 5% объема грузовика занимает сахар. В данной области техники существует необходимость в уменьшении расходов на производство этанола из богатых сахаром сельскохозяйственных культур путем производства этанола на месте сбора урожая этих сельскохозяйственных культур (или близко к нему) с уменьшением транспортных расходов.
[0092] Клетки паренхимы стеблей представляют собой живую ткань и поэтому осуществляют дыхание (газообмен) после сбора урожая. Дыхание включает превращение кислорода и сахара в клетках паренхимы в диоксид углерода и энергию для поддержания клетки. Сахарный тростник, сорго и маис при хранении теряют значительное количество сахара на дыхание. В данной области техники существует необходимость в уменьшении потери сахара на дыхание за счет более быстрого по сравнению с существующими способами превращения сахаров в этанол. После превращения сахаров сельскохозяйственных культур в этанол их можно хранить в течение длительных периодов, что позволяет непрерывно удалять этанол круглый год. Желательно более эффективно использовать капитал, вложенный в экстракцию с помощью роликов, отгонку и дистилляцию этанола, применяя это оборудование круглый год, а не только во время сезона сбора урожая.
[0093] Если стебли сахарного тростника, сорго и маиса хранят в анаэробных условиях (без кислорода), микроорганизмы на внешней стороне стеблей колонизируют стебли и через 21 день полностью ферментируют весь сахар в стеблях, в основном в молочную кислоту и уксусную кислоту. Поскольку внешний слой стеблей часто подвергается истиранию и повреждению при сборе урожая, микроорганизмы могут легче проникать через внешние слои стеблей, что приводит к потерям сахара из-за ферментации в молочную кислоту и уксусную кислоту. Опрыскивание стеблей дрожжами или молочнокислыми бактериями без предварительного нарезания или измельчения стеблей является неэффективной методикой силосования.
[0094] Дрожжи вырабатывают большое количество диоксида углерода при ферментации, а при введении дрожжей в расколотые стебли на внешней стороне стеблей во время ферментации образуется пена, и из стеблей вытесняется жидкость под действием пузырьков газа, образующихся внутри ткани. На удивление, дрожжи не вытесняются этими пузырьками, и дрожжи могут продолжать ферментацию до тех пор, пока все сахара не будут ферментированы.
[0095] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что прилипание дрожжевых клеток к клеткам паренхимы в присутствии сахаров является более сильным, чем усилия пузырьков диоксида углерода, действующие на вытеснение дрожжей из паренхиматозной ткани.
[0096] Настоящее изобретение также основано на том факте, что скорость диффузии сахаров через клеточную мембрану в клетках паренхимы стеблей растений семейства Роасеае является достаточной для того, чтобы ферментирующие организмы в трещинах могли ферментировать сахара в клетках паренхимы с высокой скоростью. Затем этанол диффундирует в клетки паренхимы. В некоторых вариациях пектинлиаза мацерирует паренхиматозную ткань, уменьшая расход энергии, необходимой для дробления стеблей для извлечения этанола или неферментированных сахаров.
[0097] Настоящее изобретение предусматривает способ ферментации стеблей растений семейства Роасеае, при этом способ включает стадии:
[0098] (а) получения стеблей растений семейства Роасеае, где стебли имеют среднюю длину более 100 мм, и где стебли имеют среднее исходное содержание влаги от 25% до 80% (по весу), такое как 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75%;
[0099] (b) прессования стеблей между роликами, при этом стебли погружены в водный раствор реагентов, где с помощью роликов стебли спрессовывают на от 20% до 90% от их среднего диаметра, и где водный раствор реагентов содержит один или несколько ферментирующих организмов, выбранных из группы, состоящей из дрожжей, молочнокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и их комбинаций;
[00100] (с) удаления стеблей из водного раствора реагентов, где в стеблях сохраняется по меньшей мере часть одного или нескольких ферментирующих организмов; и
[00101] (d) ферментации стеблей в течение периода ферментации с получением продуктов ферментации в стеблях.
[00102] Стебли растений семейства Роасеае являются хрупкими, если содержание влаги в них составляет от 25% до 80%, поэтому их прессование между роликами приводит к образованию тонкой сети трещин в осевом направлении. Дрожжи дикого типа и молочнокислые бактерии на наружной части стеблей не вводят в значительном количестве в тонкую сеть трещин в стеблях во время стадии (b), поскольку концентрация ферментирующих организмов в водном растворе реагентов намного выше, чем концентрация этих ферментирующих организмов дикого типа на наружной части стеблей. Ни дрожжи, ни молочнокислые бактерии не являются подвижными, поэтому ферментирующие организмы с наружной части стеблей не колонизируют внутреннюю часть стеблей, а сахара, диффундирующие из внутренней части стеблей, потребляются внутри стеблей ферментирующими организмами, введенными с водным раствором реагентов. Поэтому очень мало сахара из стеблей потребляется дрожжами дикого типа и молочнокислыми бактериями на наружной части стеблей.
[00103] Стебли должны быть достаточно длинными, чтобы их можно было втянуть из загрузочного желоба, продвинуть через ролики (два ролика либо три ролика в предпочтительных вариантах осуществления) и вытолкнуть через выходной желоб. Выходной желоб должен иметь постоянный (или увеличивающийся) диаметр для предотвращения засорения на выходе. Тесты продемонстрировали, что стебли длиной 100 мм и более могут взаимодействовать с роликами. Специалисты в данной области увидят, что стебли можно прессовать между роликами по одному либо между роликами можно подавать несколько стеблей.
[00104] Ключевой элементарной операцией в этом способе является прессование стеблей, погруженных в водный раствор реагентов, ровно настолько, чтобы сформировать сеть микроскопических трещин, и не настолько сильно, чтобы выдавить значительное количество сока. На удивление, стебли можно прессовать погруженными с высокой скоростью движения стеблей, и водный раствор реагентов втягивается в сеть микроскопических трещин с этой высокой скоростью. Тесты при скорости движения тростника 1 м/с демонстрируют, что при глубине погружения приблизительно 200 мм для проникновения ферментов и ферментирующих организмов в стебель необходимо время погружения, составляющее приблизительно 200 мс. Данные примеры показывают, что это время является достаточным для полного проникновения в стебель.
[00105] Стебли различных растений семейства Роасеае (или различных гибридов) требуют различных величин давления между роликами. При различных диаметрах роликов, различных сопротивлениях пружины, различных высотах лопастей, различных количествах роликов и различных тангенциальных скоростях к различным типам стеблей будут прилагаться различные усилия распространения трещин. Однако, для определения требуемого усилия между роликами не требуется проведение излишних экспериментов, поскольку существуют простые процедуры для определения требуемого оптимального сопротивления пружины.
[00106] Простейший калибровочный тест включает прогонку стеблей между роликами с производственной скоростью (от 0,1 до 10 м/с) без жидкости в устройстве, замену пружин с различными константами пружины до тех пор, пока не будет достигнута потеря менее 1% сока. Эти тесты потери сока можно провести в течение нескольких часов. Тесты продемонстрировали, что при достаточном давлении между роликами для осуществления полного введения происходит потеря только 0,5% сока.
[00107] Специалистам в данной области будет понятно, что следующий проверочный тест представляет собой измерение числа Брикса сока в стебле перед введением, введение стеблей в водный раствор реагентов и измерение результата ферментации после 3 дней ферментации. По измерению содержания этанола и размягчению паренхиматозной ткани будет легко подтверждена эффективность выбранного давления между роликами.
[00108] Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является прессование целых стеблей между роликами, поскольку это можно делать на недорогом оборудовании, приводимом в действие вручную, небольшими внутренними двигателями для прессования или небольшими электродвигателями. Энергия, необходимая для прессования, в основном применяется для распространения трещин, что является особенно энергоэффективным. Специалисты в данной области могут увидеть, как создавать другие варианты осуществления с роликами с возможностью введения в промышленных масштабах (более 10 метрических тонн в час).
[00109] Когда стебли спрессованы, водный раствор реагентов затекает в сеть микроскопических трещин, распределяя ферментирующие организмы и ферменты из водного раствора реагентов по всей паренхиматозной ткани стеблей.
[00110] Стебли растений семейства Роасеае имеют приблизительно в два раза больший диаметр в нижней 1/3, чем диаметр в верхней 1/3, и давление прессования в нижней 1/3 примерно в два раза больше, чем в верхней 1/3. Этот профиль диаметра (диаметр в зависимости от расстояния от одного конца стебля) уменьшают с помощью роликов, спрессовывающих стебли на от 20% до 90% от диаметра в каждой точке стебля, включая 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% и 90%, причем в каждой точке стебля наиболее предпочтительный диапазон составляет от 40% до 60% диаметра.
[00111] Для роликов в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения необходимо усилие в зазоре между роликами, пропорциональное расстоянию между роликами. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяются пружины, сталкивающие или сдвигающие ролики. Пружины имеют характерную особенность, заключающуюся в том, что усилие, создаваемое пружиной, линейно пропорционально смещению пружины (закон Гука).
[00112] Стебли сгибаются не без труда перед тем, как они пройдут через ролики, и легко сгибаются после их прессования при прохождении через ролики. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ролики расположены так, что загрузочный желоб, проходящий от уровня выше водного раствора реагентов до уровня ниже водного раствора реагентов, осуществляет подачу непосредственно на ролики. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения желоб, выходящий из водного раствора реагентов, обуславливает сгибание стебля в восходящем направлении после прохождения через ролики. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют два ролика, но специалисты в данной области поймут, что три ролика также являются целесообразным вариантом осуществления.
[00113] Ролики должны захватывать стебли для их подачи через ролики. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ролики имеют выступающие горизонтальные лопасти, способствующие протягиванию стеблей через ролики.
[00114] В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения резервуар содержит водный раствор реагентов и имеет клапан подачи, который поддерживает постоянный уровень водного раствора реагентов. Стебли, проходящие через водный раствор реагентов, уносят часть водного раствора реагентов, и тесты продемонстрировали, что стебли путем впитывания уносят воду в количестве приблизительно 15% от массы стебля, что требует пополнения из резервуара, содержащего водный раствор реагентов. Это означает, что одна тонна стеблей впитывает приблизительно 150 литров водного раствора реагентов. Вариант осуществления настоящего изобретения имеет пару роликов для прессования стеблей в перпендикулярном направлении к роликам 107 и 108 на фиг. 1, прежде чем стебли попадут в выпускной патрубок 113, чтобы выжать ненужный водный раствор реагентов, впитанный стеблями.
[00115] Дрожжи представляют собой организм, вырабатывающий этанол из сахаров в паренхиматозной ткани и из глюкозы, высвобождаемой в результате ферментативного гидролиза и слабокислотного гидролиза. Это применяют для богатых сахаром стеблей, где целью ферментации является извлечение этанола. Молочнокислые бактерии применяют для снижения рН внутренней части стеблей до приблизительно 4,2, что предотвращает колонизацию стеблей другими организмами. Это применяют при силосовании стеблей для последующего потребления жвачными животными. Совместные культуры дрожжей и уксуснокислых бактерий применяют для превращения сахаров в уксусную кислоту в случае, когда стебли подлежат последующему применению для анаэробного сбраживания после силосования. Совместные культуры преимущественно дрожжей с меньшим количеством молочнокислых бактерий применяют как для ферментации сахаров до этанола, так и для сохранения стеблей для последующего потребления жвачными животными.
[00116] В предпочтительных вариантах осуществления стебли выбраны из группы, состоящей из стеблей сахарного тростника, стеблей сорго и стеблей маиса.
[00117] Это стебли наиболее широко культивируемых растений семейства Роасеае.
[00118] В некоторых вариантах осуществления стебли имеют листья, прикрепленные к стеблям.
[00119] При получении силоса листья часто легче перевариваются, чем стебли, и содержат ценные питательные вещества для жвачных животных. Целое растение с прикрепленными листьями можно раздробить между роликами для введения водного раствора реагентов в стебли с одновременной обработкой листьев тем же водным раствором реагентов. При прессовании с прикрепленными листьями предпочтительно подавать стебель на ролики от нижней части стебля (толстого конца) к верхней части стебля (тонкому концу), чтобы листья складывались к стеблю.
[00120] В некоторых вариантах осуществления стебли представлены в виде целого растения.
[00121] При получении силоса иногда полезно силосовать целое растение, включая листья и любые зерна, прикрепленные к целому растению. При прессовании также будет разрушаться оболочка, окружающая зерна, что делает зерна более доступными для дрожжей и ферментов и делает зерна более легко перевариваемыми.
[00122] В предпочтительных вариантах осуществления ролики имеют тангенциальную скорость от 0,1 м/с до 10 м/с.
[00123] Тесты продемонстрировали, что тангенциальная скорость 1 м/с позволяет вводить приблизительно 1 метрическую тонну стеблей сахарного сорго в час, в результате чего более 90% сахаров в стеблях подвергается ферментации. Меньшие или большие тангенциальные скорости также могут обеспечить полное введение. Кроме того, при больших тангенциальных скоростях создается более тонкая сеть трещин, как описано у Skantz.
[00124] В предпочтительных вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит ферменты, выбранные из группы, состоящей из пектинлиазы, амилазы, целлюлазы, глюкозооксидазы, ксиланазы и их комбинаций.
[00125] Тесты продемонстрировали, что пектинлиаза применима для мацерации клеточной ткани паренхимы в стеблях растений семейства Роасеае, что делает более эффективным экстракцию из нее сока путем дробления.
[00126] Амилазу применяют в сочетании с пектинлиазой для гидролиза гранул крахмала в клетках паренхимы до глюкозы. Пектинлиаза и/или ксиланаза мацерируют клетки паренхимы, а целлюлаза разрывает клетки паренхимы, что обеспечивает диффузию амилазы к гранулам крахмала.
2
[00127] Целлюлазу применяют для гидролиза целлюлозы в стеблях до глюкозы, что является путем медленного высвобождения глюкозы. Глюкозу, в свою очередь, можно ферментировать до этанола или молочной кислоты, а глюкозооксидазу можно применять для превращения глюкозы и О в глюконовую кислоту и перекись водорода.
[00128] В некоторых вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит кислоты, выбранные из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты и их комбинаций.
[00129] Исследования продемонстрировали, что муравьиная кислота эффективна при силосовании стеблей растений семейства Роасеае. Уксусная кислота и молочная кислота применимы в качестве рН-буфера, и они обе предотвращают рост нежелательных микроорганизмов.
[00130] В некоторых вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит ионы железа, перекись водорода или их комбинацию.
[00131] Ионы железа применяют с перекисью водорода в реакции Фентона. Соли железа растворимы в воде и могут безопасно скармливаться жвачным животным в концентрациях, необходимых для реакции Фентона. Некоторые молочнокислые бактерии вырабатывают перекись водорода, гексозооксидазы обеспечивают выработку перекиси водорода из глюкозы, маннозы и галактозы, и эта перекись водорода вместе с ионами железа катализирует распад лигноцеллюлозного матрикса, делая его более легко перевариваемым и доступным для ферментов. Saccharomyces cerevisiae может переносить до 2 мМ перекиси водорода, но молочнокислые бактерии и уксуснокислые бактерии не могут переносить эту концентрацию перекиси водорода. Это описано в Jamieson, DEREK J., "Saccharomyces cerevisiae has distinct adaptive responses to both hydrogen peroxide and menadione", Journal of bacteriology 174.20 (1992): 6678-6681, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
[00132] В предпочтительных вариантах осуществления период ферментации составляет от 1 дня до 7 дней.
[00133] Тесты продемонстрировали, что полная ферментация занимает от 1 дня до 7 дней в зависимости от температуры и концентрации ферментирующих организмов.
[00134] Эксперименты продемонстрировали, что концентрация дрожжей приблизительно 2 клетки на клетку паренхимы дает в результате период ферментации от приблизительно 48 часов до 96 часов, но при более низких концентрациях дрожжей или молочнокислых бактерий может требоваться больше времени. Более низкие концентрации приводят к замедлению ферментации, что приводит к меньшему повышению температуры, что снижает потребность в дорогостоящих охлаждающих механизмах.
[00135] В предпочтительных вариантах осуществления дрожжи представляют собой штамм Saccharomyces cerevisiae.
[00136] Saccharomyces cerevisiae является наиболее широко применяемыми дрожжами для ферментации сахаров до этанола. Этот организм обладает наиболее высокой переносимостью этанола среди всех ферментирующих организмов, и доступно много его гибридов.
[00137] В некоторых вариантах осуществления стебли дегидратируют в ходе латентной фазы ферментации на стадии (d).
[00138] При дегидратации стеблей в ходе латентной фазы ферментации на стадии (d) выпаривают воду из стеблей, уменьшая количество воды в стеблях в конце ферментации на стадии (d). Если продуктом ферментации является этанол, этот вариант обуславливает более высокую концентрацию этанола в соке из стеблей, что более ценно, чем более низкая концентрация этанола. Если продуктом ферментации является молочная кислота, этот вариант обуславливает более высокую концентрацию молочной кислоты, что обуславливает снижение рН и улучшение силосования. Увеличение площади обнаженной внутренней поверхности стеблей в результате образования сети мелких трещин приводит к увеличению скорости дегидратации, поскольку скорость дегидратации пропорциональна площади обнаженной поверхности.
[00139] Латентную фазу ферментации можно удлинить путем уменьшения концентрации ферментирующих организмов в водном растворе реагентов, увеличивая таким образом общее количество воды, удаляемой в ходе латентной фазы ферментации. Нагретый воздух, нагревание излучением, кондуктивный нагрев и их комбинации передают тепловую энергию стеблям в ходе дегидратации, при этом горячий воздух, нагретый солнцем, является предпочтительным вариантом осуществления. Специалистам в данной области будет понятно, что существует множество способов поддержания температуры в стеблях ниже 38°С в ходе дегидратации, в частности, путем контроля скорости циркуляции горячего воздуха через стебли. В некоторых простых вариантах осуществления стебли можно просто оставить высушиваться на солнце в ходе латентной фазы ферментации и позднее хранить в анаэробной среде в течение большей части периода ферментации. Успех этого простого варианта осуществления зависит от температуры стеблей, которая не должна подниматься выше 38°С во время стадии (d), иначе ферментирующие организмы, введенные в тонкую сеть трещин в стеблях, будут убиты.
[00140] В ходе латентной фазы ферментации образуется мало этанола и преимущественно удаляется вода из стеблей путем дегидратации. Оптимальным объемом дегидратации является такой, при котором концентрация сахара в стеблях является максимально возможной для ферментации ферментирующими организмами, как, например, приблизительно 32% сахара по весу для некоторых штаммов Saccharomyces cerevisiae. В некоторых вариантах осуществления молочнокислые бактерии выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Propionibacterium freudenreichii и их комбинаций.
[00141] Эти молочнокислые бактерии применяют в коммерчески доступных составах для силосования.
[00142] В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает перемешивание водного раствора реагентов с применением энергии турбулентности от 0,15 Вт/кг до 5 Вт/кг.
-6
2
[00143] Применяют достаточную турбулентную энергию, чтобы колмогоровский масштаб длины имел меньший порядок, чем свободная длина апопласта (например, приблизительно 20 микронов). При применении колмогоровского масштаба длины и с учетом того, что кинематическая вязкость воды при 20°С составляет приблизительно 10 м/с, энергия, необходимая для смешивания реагентов и технологической воды в 20-микронном масштабе, составляет приблизительно 5 Вт/кг, а для смешивания в 50-микронном масштабе необходимо приблизительно 0,15 Вт/кг. Эти масштабы таковы, что диффузия сахаров в этом масштабе занимает несколько секунд, а диффузия ферментов в этом масштабе занимает несколько минут.
[00144] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поддержание стеблей в анаэробной среде в течение периода силосования после завершения периода ферментации.
[00145] Если среда является анаэробной и в стеблях нет сахаров и/или рН ниже 4,0, грибы и бактерии не могут расти на пектине или этаноле в стеблях.
[00146] В некоторых вариантах осуществления период силосования составляет от одного дня до одного года.
[00147] Во время сбора урожая мало свободного времени для переработки сельскохозяйственных культур с целью удаления сахаров или этанола, а силосование представляет собой способ, при котором времязатратную переработку урожая распределяют на целый год. Кроме того, если сельскохозяйственные культуры подлежат применению в качестве корма для животных, их необходимо силосовать в течение всего периода до сбора следующего урожая сельскохозяйственной культуры, чтобы их можно было скармливать жвачным животным.
[00148] В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает извлечение продуктов ферментации путем дробления стеблей.
[00149] Пектинлиаза мацерирует паренхиматозную ткань стеблей растений семейства Роасеае. Это обеспечивает вымачивающее действие, при котором жидкость в клетках паренхимы можно легче удалить путем дробления, чем при традиционном дроблении необработанных стеблей.
[00150] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает извлечение продуктов ферментации путем выпаривания продуктов ферментации из стеблей.
[00151] Скорость выпаривания пропорциональна площади обнаженной поверхности жидкости, а микроскопическая сеть трещин в стеблях по настоящему изобретению обнажает очень большую площадь поверхности на единицу объема, что делает выпаривание этанола эффективным. Кроме того, концентрация этанола в выпаренном паре выше, чем концентрация внутри стеблей. Это делает применимым на практике прямое получение алкогольного напитка из выпаренного пара из стеблей.
[00152] Пример дистиллятора на солнечной энергии, который будет выпаривать этанол из ферментированных стеблей, описан в патенте США №4966655, выданном Wilkerson 30 октября 1990 г., который настоящим включен посредством ссылки в данный документ. Солнце нагревает стебли путем освещения светом через пластиковое укрытие, а холодный воздух ночью вызывает конденсацию выпаренного пара этанола. Этот дистиллятор на солнечной энергии является герметичным и будет поддерживать анаэробную среду, поскольку в процессе ферментации будут продолжать вырабатываться низкие уровни диоксида углерода, поддерживая внутреннее положительное давление.
[00153] Этот вид тип дистиллятора на солнечной энергии требует очень небольших капиталовложений для конструирования, и только лист пластикового укрытия необходимо заменять каждые несколько лет из-за ультрафиолетового излучения, разрушающего пластик.
[00154] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает скармливание стеблей жвачным животным после стадии (d).
[00155] Подвергнутые механическому дроблению и ферментативному разложению стебли являются для жвачных животных более легкими для переваривания, чем нераздробленные стебли. Кроме того, дрожжи в стеблях увеличивают содержание белка. Более того, эффект слабокислотного гидролиза во время силосования делает гемицеллюлозу и целлюлозу более легко перевариваемыми.
[00156] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает применение стеблей в анаэробном сбраживании для получения метана после стадии (d).
[00157] Подвергнутые механическому дроблению и ферментативному разложению стебли более эффективно применяются в анаэробном сбраживании, чем нераздробленные стебли. Кроме того, эффект слабокислотного гидролиза во время силосования делает гемицеллюлозу и целлюлозу более подверженными анаэробному сбраживанию.
[00158] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает применение стеблей в ферментативном гидролизе для получения этанола из целлюлозы после стадии (d).
[00159] Из подвергнутых механическому дроблению и ферментативному разложению стеблей высвобождается больше глюкозы в ходе ферментативного гидролиза, чем из нераздробленных стеблей. Кроме того, эффект слабокислотного гидролиза во время силосования делает гемицеллюлозу и целлюлозу более подверженными ферментативному гидролизу.
[00160] Средний специалист в данной области признает, что температуру во время ферментации можно ограничить до приблизительно 38°С с помощью различных недорогостоящих методик, особенно если ферментация происходит в течение 3 дней, и что столь низкая исходная температура, как 5°С, является достаточной для начала ферментации. В ходе этой низкотемпературной ферментации температура стеблей быстро повысится до уровня выше 38°С.
[00161] Средний специалист в данной области признает, что можно применять известные устройства для процессов, систем и способов, раскрытых в данном документе. Процессы в данном документе могут быть периодическими, непрерывными, полунепрерывными или псевдонепрерывными. Любая ссылка на "сосуд" или "реактор" в данном документе должна толковаться как означающая одно или несколько таких устройств (как, например, расположенных последовательно или параллельно). Могут быть желательными или наблюдаемыми различные схемы потоков. С учетом того, что химические реакции и одновременные процессы массообмена включают несколько фаз, динамика жидкостей может быть довольно сложной. В зависимости от конкретной конструкции схемы потоков могут быть близкими к пробковому потоку или хорошо перемешиваемому потоку.
[00162] Пропускная способность или производительность процесса могут широко варьировать от небольших установок лабораторного масштаба до полномасштабных промышленных заводов по переработке биомассы, включая любой пробный, демонстрационный или полупромышленный масштаб. В различных вариантах осуществления производительность процесса составляет по меньшей мере приблизительно 1 кг/день, 10 кг/день, 100 кг/день, 1 тонна/день (все тонны являются метрическими тоннами), 10 тонн/день, 100 тонн/день, 500 тонн/день, 1000 тонн/день, 2000 тонн/день или более.
[00163] Общая система может находиться в фиксированном месте или может быть сделана переносной. Система может быть сконструирована с применением модулей, которые могут быть просто продублированы для практического масштабирования.
[00164] Различные датчики могут обеспечивать точное управление процессом и его контроль на различных этапах процесса, вплоть до всех этапов процесса и, возможно, охватывая их все. Ожидается, что точный контроль процесса приведет к улучшению урожайности и эффективности как в динамическом режиме, так и в течение периода времени, когда операционная история может быть применена для корректировки условий процесса (включая программы циклического изменения давления). В некоторых вариантах осуществления реакционный датчик расположен в рабочем сообщении с производственной зоной. Такой реакционный датчик может быть применимым для экстракции жидких образцов и их анализа с целью определения степени гидролиза или профиля сахаров и т.д. Корректировки процесса могут быть основаны на измерениях, если это представляется необходимым или желательным, с применением хорошо известных принципов контроля процесса (обратной связи, упреждающего управления, пропорционально-интегрально-дифференциального алгоритма и т.д.).
[00165] Потоки твердых веществ, жидкостей и газов, созданные или существующие в процессе, можно независимо использовать повторно, пропускать на последующие стадии или удалять/отводить из процесса в любой момент.
ПРИМЕРЫ
[00166] Следующие примеры демонстрируют принципы настоящего изобретения. Экспериментальные данные продемонстрировали, что введение дрожжей и ферментов путем прессования с погружением, как описано выше, является применимым для ферментации стеблей растений семейства Роасеае.
[00167] Экспериментальное устройство на фиг. 1 предназначено для воспроизведения функциональных возможностей промышленного процесса в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в отношении температуры, давления и контроля потока в промышленной установке. Его применяли при сборе урожая сахарного сорго на ферме сахарного сорго Delta BioRenewables в Мемфисе, Теннесси, США в ноябре 2016 г., чтобы протестировать прессование свежесобранных стеблей. Некоторые стебли затем замораживали и транспортировали в Миннеаполис, Миннесота, США и там размораживали с последующим прессованием, применяя это экспериментальное устройство, как описано в примерах 2, 3 и 4 ниже. Потеря массы, вызванная прессованием, описана в примере 2, а ферментация и эффективность ферментов описаны в примерах 3 и 4.
[00168] На фиг. 1 проиллюстрировано применяемое устройство. Нарезанные стебли длиной более 100 мм без ограничения максимальной длины подают через загрузочный патрубок 103. Сосуд 101 содержит водный раствор реагентов. Стебель, подаваемый в устройство, сначала погружают в раствор, а затем приводят в контакт с роликами 108 и 107. Ролик 108 свободно вращается вокруг вала 109, который, в свою очередь, может перемещаться вертикально благодаря пружине 111. Сжатие пружины и количество движения ролика можно регулировать с помощью натяжного устройства 112, таким образом позволяя проводить оптимальную обработку стеблей различного диаметра и обеспечивая ограничение прессования стеблей величинами 20%-90%. Вал 114 ролика 107 не может двигаться вертикально, и он приводится в движение внешним источником вращения. Этим внешним источником вращения чаще всего является электродвигатель, но также может быть ручной рычаг, велосипедный шатун или двигатель внутреннего сгорания. Ролик 107 обеспечивает повышенное трение и прессование стеблей. Металлические лопасти 120 способствуют продвижению стеблей через ролик 107 и ролик 108. Ролик 107 приводит в движение стебли между двумя роликами, и после завершения их прохождения через систему стебли вытесняются через выпускной патрубок 113. Как только стебель покидает пространство между роликами и, следовательно, больше не приводится в движение ими, он вытесняется системой путем подталкивания следующими стеблями, спрессовываемыми между роликами. Сосуд 101 функционирует, наполненный водным раствором реагентов, и предусмотрены меры для поддержания заполнения сосуда посредством заливной пробки 122 и слива посредством сливной пробки 121.
[00169] В экспериментальном устройстве применялись диаметр ролика 107, составляющий примерно 90 мм, диаметр ролика 108, составляющий примерно 100 мм, толщина и высота металлических лопастей 120, составляющая примерно 6 мм, минимальное расстояние между роликом 107 и роликом 108, составляющее 9,5 мм, тангенциальная скорость ролика 107, составляющая примерно 1 м/с, диаметр загрузочного патрубка 103 и выпускного патрубка 113, составляющий 100 мм, и длина загрузочного патрубка 103 и выпускного патрубка 113, составляющая 2 м.
[00170] В следующих примерах применяют сахарное сорго с фермы сахарного сорго Delta BioRenewables в Мемфисе, Теннесси, США. Сок из стеблей сахарного сорго выдавливали путем выжимания, и содержание сахара в градусах Брикса измеряли цифровым рефрактометром. Применяемые стебли сахарного сорго имели содержание влаги 70%.
[00171] Следует обратить внимание, что измеренное число Брикса сока сахарного сорго было скорректировано путем умножения числа Брикса на 0,8, чтобы получить процентное содержание общего сахара по весу. Это объясняется тем, что сок сахарного сорго содержит больше глюкозы и фруктозы, чем сок сахарной свеклы или сахарного тростника, и показатель преломления глюкозы и фруктозы отличается от показателя преломления сахарозы. Это описано в Liu, Ronghou, Jinxia Li, and Fei Shen, "Refining bioethanol from stalk juice of sweet sorghum by immobilized yeast fermentation", Renewable Energy 33.5 (2008): 1130-1135, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
[00172] Ниже показаны четыре примера настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
[00173] В примере 1 показано различие в прессовании между одним кусочком стебля сахарного сорго между губками тисков, погруженным в водный раствор реагентов, и другим кусочком, не погруженным. Прессование с погружением приводит к увеличению ферментации на 30% по сравнению с прессованием без погружения с последующим погружением.
[00174] Сахарное сорго ферментировали в обоих случаях, спрессовывая на 50% с погружением в водный раствор реагентов и спрессовывая на воздухе с погружением в водный раствор реагентов на 30 минут.
[00175] Применяли стебель сахарного сорго, который собирали на ферме сахарного сорго Delta BioRenewables в Мемфисе, Теннесси, США в октябре 2015 года, транспортировали в сухом льду и хранили в морозильнике до тестирования в июне 2016 года. Из морозильника отбирали стебель сахарного сорго длиной 200 мм и диаметром 10 мм. Его размораживали в холодильнике в течение двух дней. Стебель разрезали на две части длиной 100 мм, при этом левый образец весил 7,1 г, а правый образец весил 9,4 г. Выдавливали небольшое количество сока, и измеренное число Брикса составляло 13%.
[00176] Один литр водного раствора реагентов получали путем нагревания 1 литра воды до 38°С с последующим добавлением 1 г дрожжей Thermosacc от Lallemand Biofuels & Distilled Spirits и 1 г питательных веществ для дрожжей Fermax от BSG Corporation. Этот водный раствор реагентов перемешивали магнитной мешалкой в течение 30 минут для регидратации лиофилизированных дрожжей, при этом температуру водного раствора реагентов поддерживали при 38°С.
[00177] Левый образец помещали в пластиковый пакет, заполненный водным раствором реагентов, сжимали до диаметра 5 мм, а затем сразу же вынимали и оставляли сушиться. Масса левого образца увеличилась с 7,1 г до 7,5 г, что составляло приблизительно 5,6% увеличение.
[00178] Правый образец сжимали до диаметра 5 мм под воздействием воздуха, затем взвешивали. Масса правого образца уменьшилась с 9,4 г до 8,7 г, что составляло приблизительно 7,4% уменьшение. Затем правый образец погружали в водный раствор реагентов на 30 минут. Выделение пузырьков газа со стебля наблюдали в течение 10 минут. Через 30 минут масса правого образца увеличилась с 8,7 г до 9,3 г, что составляло приблизительно 6,9% увеличение.
[00179] Левый и правый образцы затем помещали в две герметичные PVC-трубки, каждая из которых имела длину приблизительно 100 мм и внутренний диаметр 20,9 мм. Затем эти PVC-трубки погружали в водяную баню, поддерживаемую при 38°С, и подсоединяли к газовому счетчику.
2
[00180] Ход ферментации оценивали по газу, вырабатываемому в каждой PVC-трубке, применяя два счетчика MilliGascounter типа MGC-1 от Dr.-Ing. Ritter Apparatebau GmbH & Co. KG, Бохум, Германия. Количество образующегося газа измеряли с миллилитровым разрешением в течение периода ферментации. При ферментации 3,35 г сахара (обычно сахарозы) образуется 1 л газа (СО), поэтому количество ферментированного сахара, скорость ферментации и общее количество ферментированного сахара можно определить по графику выработки газа с течением времени.
[00181] В левом образце выработалось 0,0753 л газа за 897 минут (14,95 часа). В правом образце выработалось 0,0767 л газа за 942 минуты (15,7 часа).
[00182] После завершения ферментации из каждого образца выжимали сок, и число Брикса для левого образца составляло 2,6, а число Брикса для правого образца составляло 4,2. рН левого образца составлял 3,98, а рН правого образца составлял 3,61.
[00183] Чтобы вычислить содержание сахара в соке сахарного сорго по измеренному числу Брикса, число Брикса 13% умножали на 0,8, в результате чего получали содержание сахара в соке, составляющее приблизительно 10,4%. Это объясняется тем, что сок сахарного сорго содержит больше глюкозы и фруктозы, чем сок сахарного тростника, и показатель преломления глюкозы и фруктозы отличается от показателя преломления сахарозы. Это описано в Liu et al. "Refining bioethanol from stalk juice of sweet sorghum by immobilized yeast fermentation", Renewable Energy 33.5 (2008): 1130-1135, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.
[00184] Для вычисления содержания сахара в каждом стебле исходили из того, что содержание влаги составляет приблизительно 70%, и в результате получали оценочное значение 8,3% сахара от массы стебля. С учетом того, что левый образец имел массу 7,1 г до прессования, и исходя из того, что потеря сахаров вследствие прессования составляла 7%, в результате получали оценочное значение 0,55 г сахара в левом образце. Аналогично, правый образец имел массу 9,4 г до прессования, и в результате получали оценочное значение 0,73 г сахара в правом образце.
[00185] В левом образце вырабатывалось 0,55 г/0,0753 л = 7,3 г/л (эффективность 49%), тогда как в правом образце вырабатывалось 0,73 г/0,0767 л = 9,5 г/л (эффективность 35%). Это демонстрирует, что эффективность настоящего изобретения значительно выше, чем в альтернативном подходе разламывания сахарного сорго с последующим его погружением. Кроме того, это демонстрирует, что в настоящем изобретении введение водного раствора реагентов в стебель происходит по меньшей мере в 100 раз быстрее, чем в альтернативном подходе (за несколько секунд вместо 10 минут), что является критически важным из-за необходимости быстрого введения в сельскохозяйственные культуры по мере сбора их урожая.
ПРИМЕР 2
[00186] В примере 2 показана потеря массы при прессовании стеблей сахарного сорго с применением устройства, изображенного на фиг. 1, при скорости 1 м/с между роликами без погружения. В этом прессовании применяли высокую нагрузку пружины (натяжное устройство 112 поворачивали для сжатия пружины 111 на 5 мм выше нулевой силы давления пружины покоя) и низкую нагрузку пружины (натяжное устройство 112 поворачивали для сжатия пружины 111 до нулевой силы давления пружины покоя). Данную низкую нагрузку пружины применяли в примере 3, и данную высокую нагрузку пружины применяли в примере 4.
[00187] Процедура эксперимента была следующей:
[00188] (1) нарезать восемь частей сахарного сорго размером 600 мм;
[00189] (2) зафиксировать массу и средний диаметр;
[00190] (3) установить натяжное устройство 112 на 5 мм выше нулевой силы давления пружины покоя;
[00191] (4) подать 4 части сорго и зафиксировать массу;
[00192] (5) установить натяжное устройство 112 на нулевую силу давления пружины покоя;
[00193] (6) подать 4 части сорго и зафиксировать массу.
[00194] Пружины, применяемые в этих экспериментах, имели константу пружины, подчиняющейся закону Гука, равную 17,4 кН/м, измеренную путем добавления веса к пружинам с шагом в 2 кг и измерения смещения пружины. Кривая была довольно линейной, при этом 24 кг веса (235,36 Н) сжимали пружину с 52,2 мм до 38,7 мм (сжатие 13,5 мм).
[00195] Измеренное уменьшение диаметра и расчетное усилие дробления для стебля на 20 мм показаны в таблице 1. Это демонстрирует, что при высокой нагрузке пружины (сжатие пружины 5 мм) стебель на 20 мм спрессовывался на 75% между лопастями 120 и роликом 108 и спрессовывался на 45% между роликом 107 и роликом 108.
[00196] В таблице 2 показано, что при высокой нагрузке пружины (сжатие пружины 5 мм) потеря массы составляла в среднем 0,35%, а при низкой нагрузке пружины (сжатие пружины 0 мм) потеря массы составляла в среднем 0,24%. Данную низкую нагрузку пружины применяют в примере 3, и данную высокую нагрузку пружины применяют в примере 4. Следует обратить внимание, что в примере 2 потеря сока составляла 7% при спрессовывании стебля на 50%. Этот пример демонстрирует, что прессование между роликами при 1 м/с приводит к значительно меньшим потерям сока, чем при простом статическом прессовании стебля.
ПРИМЕР 3
[00197] В примере 3 показан результат ферментации после прессования между роликами при низкой нагрузке пружины с четырьмя различными комбинациями ферментов (отсутствие, НТес3, Pectinex XXL, а также НТес3 и Pectinex XXL). Это демонстрирует, что ферментация успешна при низкой нагрузке пружины, но данное ферментативное действие неэффективно. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что при низкой нагрузке пружины создавалась менее разветвленная сеть трещин в стеблях, чем при высокой нагрузке пружины, и среднее расстояние диффузии для ферментов в период ферментации было большим, но при этом значительно более высокая скорость диффузии сахаров обуславливала полную диффузию сахаров к дрожжевым клеткам, хотя и на более длинных расстояниях.
[00198] В таблице 3 показан дрожжевой и ферментный состав образцов 1-4 в примере 3 и примере 4.
[00199] В таблице 4 показаны результаты ферментации стеблей при низкой нагрузке пружины. Ни в одном из этих образцов после завершения ферментации не наблюдали видимого размягчения паренхиматозной ткани.
ПРИМЕР 4
[00200] В таблице 5 показаны результаты ферментации стеблей при высокой нагрузке пружины. После ферментации паренхиматозная ткань образца 1 не размягчилась, в образце 2 произошло умеренное размягчение, и паренхиматозная ткань образцов 3 и 4 полностью растворилась. Это демонстрирует, что как ферментация, так и ферментативное действие эффективны при высокой нагрузке пружины. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что показатели эффективности выше 100% была обусловлены ферментативным гидролизом целлюлозы в стеблях под действием целлюлазы в НТес3.
[00201] Сок из этих четырех образцов выдавливали коммерческой прессовой соковыжималкой для сахарного тростника и отправляли для анализа содержания метанола с помощью процедуры GC-100H в Galbraith Laboratories, Inc. в Ноксвилле, Теннесси, США. Образец 1 содержал 42 ppm, образец 2 содержал 35 ppm, образец 3 содержал 64 ppm и образец 4 содержал 70 ppm метанола в выдавленном соке. Это демонстрирует, что выработка метанола во время ферментации в стебле очень ограничена и что Pectinex XXL обеспечивает выработку очень незначительных количеств метанола.
[00202] В данном подробном описании были сделаны ссылки на несколько вариантов осуществления и на сопровождающие графические материалы, на которых продемонстрированы в качестве примеров конкретные иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения. Эти варианты осуществления описаны для того, чтобы сделать возможным практическое осуществление настоящего изобретения специалистами в данной области, и следует понимать, что специалистом в данной области могут быть выполнены модификации различных раскрытых вариантов осуществления.
[00203] Если способы и стадии, описанные выше, указывают на определенные события, происходящие в определенном порядке, специалисты в данной области поймут, что порядок определенных стадий можно модифицировать, и что такие модификации соответствуют вариациям настоящего изобретения. Кроме того, определенные этапы можно выполнять одновременно в параллельном процессе, если это возможно, а также выполнять последовательно.
[00204] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, как если бы каждая публикация, патент или патентная заявка были конкретно и индивидуально изложены в данном документе.
[00205] Варианты осуществления, вариации и фигуры, описанные выше, должны давать представление о полезности и универсальности настоящего изобретения. Другие варианты осуществления, в которых не представлены все особенности и преимущества, изложенные в данном документе, также можно использовать без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Такие модификации и вариации считаются находящимися в пределах объема настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. В случае противоречий в определениях между настоящим раскрытием и словарем или другим литературным источником настоящее раскрытие будет иметь преимущественную силу.