ВАРИАНТ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ДЛЯ КОНТРАСКРИПЦИОННОГО КЭППИНГА

1. Вариант полимеразы рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающий РНК-полимеразу, которая содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из E350, D351, K387, N437, K441, D506, R632, D653, S628, P657, F880 и G884 относительно РНК-полимеразы, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44.
2. Вариант РНК-полимеразы по п. 1, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении E350.
3. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении D351.
4. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении K387.
5. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении N437.
6. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении K441.
7. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении D506.
8. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении R632.
9. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении D653.
10. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении S628.
11. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении P657.
12. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении F880.
13. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-полимераза содержит аминокислотную замену в положении G884.
14. Вариант РНК-полимеразы по п. 1, в котором РНК-полимераза содержит по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять аминокислотных замен в положениях, выбранных из группы, состоящей из E350, D351, K387, N437, K441, D506, R632, D653, S628, P657, F880 и G884.
15. Вариант РНК-полимеразы по п. 14, в котором РНК-полимераза включает аминокислотные замены в положениях, выбранных из группы, состоящей из: E350 и D351; E350 и K387; E350 и N437; E350 и K441; E350 и D506; E350 и R632; E350 и D653; E350 и S628; E350 и P657; E350 и F880; E350 и G884; D351 и K387, D351 и N437; D351 и K441; D351 и D506; D351 и R632; D351 и D653; D351 и S628; D351 и P657; D351 и F880; D351 и G884; K387 и N437; K387 и K441; K387 и D506; K387 и R632; K387 и D653; K387 и S628; K387 и P657; K387 и F880; и K387 и G884; N437 и K441; N437 и D506; N437 и R632; N437 и D653; N437 и S628; N437 и P657; N437 и F880; N437 и G884; K441 и D506; K441 и R632; K441 и D653; K441 и S628; K441 и P657; K441 и F880; K441 и G884; D506 и R632; D506 и D653; D506 и S628; D506 и P657; D506 и F880; D506 и G884; R632 и D653; R632 и S628; R632 и P657; R632 и F880; R632 и G884; D653 и S628; D653 и P657; D653 и F880; D653 и G884; S628 и P657; S628 и F880; S628 и G884; P657 и F880; P657 и G884; и F880, и G884.
16. Вариант РНК-полимеразы по п. 15, в котором РНК-полимераза содержит кислотные замены в положениях, выбранных из группы, состоящей из: K387, D653 и G884; E350, D351 и K387; а также D653, P657 и R632.
17. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении E350 выбрана из группы, состоящей из E350A, E350K, E350N и E350W, при этом аминокислотная замена в положении E350 необязательно представляет собой E350N.
18. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении D351 представляет собой D351V.
19. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении K387 выбрана из группы, состоящей из K387H, K387N и K387S, при этом аминокислотная замена в положении K387 необязательно представляет собой K387N.
20. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении N437 выбрана из группы, состоящей из N437F, N437I, N437T и N437Y, необязательно при этом аминокислотная замена в положении N437 представляет собой N437F.
21. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении K441 представляет собой K441R.
22. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении D506 выбрана из группы, состоящей из D506F, D506L, D506R, D506W и D506Y.
23. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении R632 представляет собой R632K или R632T.
24. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении D653 выбрана из группы, состоящей из D653A, D653F, D653G, D653H, D653I, D653K, D653L, D653M, D653N, D653P, D653Q, D653R, D653S, D653T, D653V, D653W и D653Y, при этом аминокислотная замена в положении D653 необязательно представляет собой D653W.
25. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении S628 представляет собой S628W.
26. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении P657 выбрана из группы, состоящей из P657A, P657R и P657W.
27. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении F880 представляет собой F880Y.
28. Вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотная замена в положении G884 выбрана из группы, состоящей из G884A, G884S, G884T и G884P.
29. Вариант РНК-полимеразы, включающий РНК-полимеразу, которая содержит аминокислотную замену в двух положениях, выбранных из группы, состоящей из E350, D351, K387 и D653, относительно РНК-полимеразы дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
30. Вариант РНК-полимеразы по п. 29, содержащий аминокислотные замены в положениях E350 и D351.
31. Вариант РНК-полимеразы по п. 29, содержащий аминокислотные замены в положениях E350 и K387.
32. Вариант РНК-полимеразы по п. 29, содержащий аминокислотные замены в положениях K387 и D653.
33. Вариант РНК-полимеразы по любому из пп. 29-31, в котором аминокислотная замена в положении E350 представляет собой E350W, E350A, E350K или E350N.
34. Вариант РНК-полимеразы по п. 29 или 30, в котором аминокислотная замена в положении D351 представляет собой D351V.
35. Вариант РНК-полимеразы по любому из пп. 29, 31 или 32, в котором аминокислотная замена в положении K387 представляет собой K387N, K387S или K387H.
36. Вариант РНК-полимеразы по п. 29 или 32, в котором аминокислотная замена в положении D653 представляет собой D653T или D653K.
37. Вариант РНК-полимеразы, включающий РНК-полимеразу, которая содержит аминокислотную замену в положениях E350 и K387, относительно РНК-полимеразы дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, при этом замены необязательно представляют собой E350W и K387N.
38. Вариант РНК-полимеразы, включающий РНК-полимеразу, которая содержит аминокислотную замену в положениях E350 и D351, относительно РНК-полимеразы дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, при этом замены необязательно представляют собой E350W и D351V.
39. Вариант РНК-полимеразы, включающий РНК-полимеразу, которая содержит аминокислотную замену в положениях K387 и D653, относительно РНК-полимеразы дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, при этом замены необязательно представляют собой K387N и D653T.
in vitro
40. Способ, включающий продуцирование мРНК в реакции транскрипции , которая содержит матрицу ДНК, нуклеозидтрифосфаты, вариант РНК-полимеразы по любому из предшествующих пунктов и, необязательно, аналог кэпа.
41. Способ по п. 40, в котором реакция включает аналог кэпа.
42. Способ по п. 40 или 41, в котором реакция включает концентрацию аналога кэпа, которая по меньшей мере в 5 раз ниже, чем концентрация аналога кэпа, необходимая для получения эквивалентного количества мРНК с применением РНК-полимеразы Т7, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44.
43. Способ по любому из пп. 40-42, в котором более 80% продуцируемой мРНК включает функциональный кэп, более 50% продуцируемой мРНК является гомогенной на 3'-конце, и/или реакция включает менее 5 нг дцРНК на 25 мкг продуцируемой мРНК.
44. Способ по любому из пп. 40-43, в котором аналог кэпа и нуклеозидтрифосфаты присутствуют в реакции в эквимолярных концентрациях или молярное соотношение аналога кэпа к нуклеозидтрифосфатам в реакции превышает 1:1.
45. Способ по любому из пп. 40-44, в котором аналог кэпа представляет собой динуклеотидный кэп, тринуклеотидный кэп или тетрануклеотидный кэп.
46. Способ по любому из пп. 40-45, в котором аналог кэпа представляет собой аналог тринуклеотидного кэпа, содержащий последовательность GAG.
47. Способ по п. 46, в котором аналог кэпа GAG содержит соединение, выбранное из:
<img file="00000001.jpg" he="44" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(i);
<img file="00000002.jpg" he="44" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(ii); или
<img file="00000003.jpg" he="45" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(iii).
48. Способ по любому из пп. 40-47, в котором аналог кэпа представляет собой аналог тетрануклеотидного кэпа, содержащий последовательность GGAG.
49. Способ по п. 48, в котором аналог тетрануклеотидного кэпа содержит соединение, выбранное из:
.
50. Способ по любому из пп. 40-49, в котором полинуклеотидная матрица включает остаток 2'-дезокситимидина или остаток 2'-дезоксицитидина в положении +1 матрицы.
51. Композиция, содержащая вариант РНК-полимеразы по любому из пп. 1-39 и компонент реакции IVT, необязательно выбранный из группы, состоящей из полинуклеотидной матрицы, нуклеозидтрифосфатов и аналога кэпа.
52. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант РНК-полимеразы по любому из пп. 1-39.
53. Набор, содержащий вариант РНК-полимеразы по любому из пп. 1-39 и компонент реакции IVT, необязательно выбранный из группы, состоящей из полинуклеотидной матрицы, нуклеозидтрифосфатов и аналога кэпа.