Способ неинвазивной оценки нарушений структуры эндотелия синусоидов у больных хроническим гепатитом С
METHOD FOR NON-INVASIVE ASSESSMENT OF SINUSOIDAL ENDOTHELIUM STRUCTURE DISORDERS IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C

Предполагаемое изобретение относится к области медицины, а именно инфекционным болезням, и предназначено для оценки морфологических нарушений эндотелия синусоидов у больных хроническим гепатитом С (ХГС) неинвазивным методом.
Во всем мире ХГС занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии (Соболева Н.В., Карлсен А.А., Кожанова Т.В. и др. Распространенность вируса гепатита С среди условно здорового населения Российской Федерации // Журнал инфектологии. - 2017. - Т.9.М2. - С. 56-64; Lanini S., Easterbrook P.J., Zumla A., Ippolito G. Hepatitis C: global epidemiology and strategies for control // Clinical Microbiology and Infection. - 2016. - №22. - P. 833-838.). В ряде случаев это заболевание приводит к таким тяжелым последствиям, как цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярная карцинома (Пименов Н.Н., Комарова С.В., Карандашова И.В. и др. Гепатит С и его исходы в России: анализ заболеваемости, распространенности и смертности до начала программы элиминации инфекции // Инфекционные болезни. - 2018. - Т. 16, №3. - С. 37-45.).
Тяжесть течения ХГС и прогноз его исходов, в значительной мере, зависят от функционального состояния эндотелия и выраженности нарушений его структуры (Мельникова Ю.С., Макарова Т.П. Эндотелиальная дисфункция как центральное звено патогенеза хронических болезней // Казанский медицинский журнал - 2015. - Т. 96. №4. - С. 659-665; Морозова Т.С, Гришина И.Ф., Постникова Т.Н., Гурикова И.А. Характеристика структурно-функционального состояния сосудистой стенки и функции эндотелия у пациентов с хроническими гепатитами и циррозами печени, ассоциированными с HBV, HCV-инфекцией // Уральский медицинский журнал - 2013. - №8(113). - С. 93-98.).
Нарушение структуры эндотелия инициирует нарушение в системе гемостаза из-за того, что становятся открытыми участки субэндотелиального матрикса и, как следствие, происходит гиперпродукция ФВ (Петрищев Н.Н., Васина Л.В. Нарушение адгезионной активности как форма эндотелиальной дисфункции // Трансляционная медицина. - 2014. - №3. - С. 5-15). На определенном этапе эндотелиальная дисфункция сопровождается уже необратимыми изменениями в системе сосудисто-тромбоцитарного гемостаза с образованием тромбов (Зафирова В.Б. Взаимосвязь состояния микроциркуляторного русла и эндотелиальных маркеров с гистологическими изменениями печени при хронической вирусной патологии // Мед. вести. Северного Кавказа. - 2010. - №4. - С. 74-75.).
В связи с вышеизложенным, необходима разработка способов максимально раннего выявления функциональных и структурных нарушений эндотелия.
В клинической практике для оценки функционального состояния эндотелия используются различные инструментальные и биохимические методы. К первым относится метод, предложенный D.S. Celermajer с соавт.(1992), в основе которого лежит использование эндотелий-зависимой вазодилатации в условиях реактивной гиперемии плечевой или бедренной артерий (Celermajer D.S., Sorensen K.Е., Gooch V.M. et at. Noninvasive defection of endothelial dysfunction in children and adults of risk of atherosclerosis // Lancet. - 1992. - Vol. 340. - P. 1111-1115). Существенными недостатками этого метода являются погрешность измерения при определении диаметра сосуда, необходимость наличия аппаратуры экспертного класса (высокочастотный ультразвуковой датчик - 7 мГц). Кроме того, на основании указанного метода можно оценить только одну из разнообразных функций эндотелия - регуляцию сосудистого тонуса и, к сожалению, не представляется возможным судить о наличии или отсутствий нарушений структуры эндотелия.
Анализ научно-медицинской и патентной литературы позволил выявить ряд биохимических способов диагностики эндотелиальной дисфункции (ЭД), в основе которых лежит определение концентрации различных веществ, продуцируемых эндотелием. В отличие от инструментальных методов диагностики биохимические исследования позволяют получить информацию практически обо всех функциях эндотелия (Deanfield J.E., Halcox J.P., Rabelink T.J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance // Circulation. - 2007. - Vol. 115. - №10. - P. 1285-1295.). Однако, общими недостатками всех этих способов являются: невозможность их выполнения в обычных клинических лабораториях, необходимость использования дорогостоящих реактивов, сложность интерпретации полученных результатов из-за отсутствия четких количественных критериев диагностики ЭД и, что особенно важно, они совершенно неинформативны в отношении оценки нарушений морфологической структуры эндотелия.
В настоящее время единственным способом морфологической оценки эндотелия синусоидов является прижизненная биопсия печени больного с последующим морфогистологическим исследованием гепатопунктатов (Павлов Ч.С., Ивашкин В.Т. Биопсия печени: методология и практика сегодня // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2006. - Т.16, №4. - С. 65-68). К недостаткам этого способа следует отнести: инвазивность манипуляции; риск развития таких осложнений, как кровотечение, желчный перитонит и послепункционные боли; необходимость дорогостоящего оборудования для проведения электронной трансмиссии, высокие требования к квалификации клинического морфолога. Биопсия печени выбрана нами в качестве прототипа как наиболее близкого к заявляемому способу по техническому решению.
Цель предлагаемого изобретения - оценка нарушений морфологической структуры эндотелия синусоидов у больных хроническим гепатитом С без проведения пункционной биопсий печет.
Техническим результатом заявляемого способа является его простота, экономичность, а также то, что он не требует проведения морфогистологических исследований и доступен для большинства лечебно-профилактических учреждений.
Поставленная задача достигается тем, что для оценки нарушений структуры эндотелия синусоидов проводят определение в сыворотке крови активности фактора Виллебранда (ФВ). При значениях активности ФВ выше 250% констатируют наличие деструкции эндотелия синусоидов. При показателях активности ФВ в диапазоне 15*0-250% - повышенную активность эндоцитоза с наличием аутофагических вакуолей без признаков деструкции эндотелия, а при уровне ФВ ниже 150% - отсутствие изменений ультраструктуры эндотелия синусоидов. При этом, проведение биопсии печени не требуется.
Способ осуществляется следующим образом. Производится забор крови из локтевой вены в объеме 5 мл в вакуумную пробирку со стабилизатором, в качестве которого выбран цитрат натрия, затем центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин. Построение калибровочной кривой и расчет активности ФВ проводится в автоматическом режиме на агрегометре с помощью программы AGGRWB.
Заявленный способ базируется на фактическом материале, полученном нами при обследовании 61 пациента с ХГС в возрасте от 19 до 45 лет. При этом, средний возраст обследованных составил 38,7±1,1 лет. Преобладали мужчины - 67,2%. У всех пациентов был идентифицирован 16 генотип возбудителя. Мы не включали в исследование больных с наличием сердечно-сосудистой патологии, аутоиммунных заболеваний, сахарного диабета, коинфекции ВИЧ, а также лиц, страдающих алкогольной и наркотической зависимостью.
Для сравнения результативности заявляемого способа с прототипом всем больным ХГС была выполнена пункционная биопсия печени с последующим исследованием гепатоггунктатов с помощью электронной микроскопии. При анализе морфологических данных учитывались следующие признаки: отек и набухание эндотелия, активация эндоцитоза с появлением аутофагаческих вакуолей, деструкция эндотелия синусоидов различной степени выраженности - от очаговой до субтотальной, фиксация тромбоцитов к эндотелию с образованием микротромбов.
Проведенные исследования показали, что средний уровень активности ФВ у больных ХГС с наличием деструктивных изменений в эндотелии оказался достоверно более высоким, чем у пациентов с отсутствием каких-либо морфологических признаков его повреждения (соответственно 335,4±15,4% и 94,8±4,7%; р<0,001).
В ходе корреляционного анализа тми было выявлено наличие прямой корреляционной связи между показателями активности ФВ и наличием деструкции эндотелия синусоидов (r=0,83; р<0,001). Это позволило прийти к выводу о том, что уровень активности ФВ четко отражает характер морфологических нарушений в эндотелии синусоидов. Анализ полученных результатов представлен в таблице.
Таблица на фиг.1 показывает взаимосвязь морфологических нарушений эндотелия синусоидов с показателями активности ФВ у больных ХГС.
Апробация заявляемого способа иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Больная К., 29 лет обратилась в Гепатологический центр г. Ростова-на-Дону с диагнозом хронический гепатит С. При обследовании в крови была выявлена РНК HCV. Идентифицирован 1б генотип возбудителя. Уровень общего билирубина, сывороточных трансаминаз (АлАТ, АсАТ) не превышал верхнюю границу нормы. Показатель активности ФВ составил 99%. Была выполнена пункционная биопсия печени. Результаты светоптического исследования гепатопунктата подтвердили наличие у больной хронического гепатита с умеренной степенью активности (ИГА по Knodell 9 баллов) и умеренной стадией фиброза (F2 по шкале METAVIR). При электронной микроскопии полученного образца ткани печени нарушений структуры эндотелия не обнаружено. Учитывая уровень активности ФВ (<150%), такой результат морфологической оценки структуры эндотелия был вполне предсказуем.
Пример 2. Больной К., 32 г. госпитализирован в инфекционное отделение №4 МБУЗ «Городская больница №1 им. Н.А.Семашко» г. Ростова-на-Дону 30.03.2017 г. с диагнозом хронический гепатит С. Предъявлял жалобы на выраженную общую слабость, немотивированную повышенную утомляемость, ощущение дискомфорта в правом подреберье. Объективно: средней тяжести. Кожные покровы и склеры обычной окраски. Живот мягкий, слегка болезненный в правом подреберье. Печень увеличена, ее нижний край определялся на 2-3 см ниже реберной дуги, консистенция уплотнена. Селезенка не увеличена. Моча обычного цвета. РНК HCV обнаружена. Генотип HCV 1б. Биохимическое исследование крови: АлАТ - 52 Е/л, АсАТ - 47 Е/л, общий билирубин -23,1 мкмоль/л. Активность ФВ оказалась равной 304,2%, что свидетельствовало о наличии деструкции эндотелия. Позже был получен результат морфогистологического исследования гепатопунктата, выявившего F3 стадию фиброза печени и множественные участки деструкции эндотелия синусоидов. Это подтвердило предварительную оценку, согласно заявленному способу и табличным данным: при значениях активности ФВ выше 250% констатируют наличие деструкции эндотелия синусоидов.