Размножение in vitro ремонтантных сортов малины

УДК 58.085, 581.143.6

Д.С. Кульханова, Т.В. Плаксина, И.Д. Бородулина Размножение in vitro ремонтантных сортов малины

D.S. Kulkhanova, T.V. Plaksina, I.D. Borodulina Remontant Raspberry Varieties' Propagation in Vitro

Изучались особенности клонального микроразмножения ремонтантных сортов малины. В результате проведенных исследований определены оптимальные концентрации и сочетания гормонов роста, обеспечивающие интенсивную пролиферацию адвентивных побегов и развитие морфологических признаков. Ключевые слова: ремонтантная малина, размножение in vitro, регенеранты, культура тканей.

We study the characteristics of clone micro-propagation of remontant raspberry varieties. As a result the optimal concentrations and combinations of growth regulators providing intensive proliferation of adventitious shoots and development of morphological features are determined.

Key words: remontant raspberries, propagation in vitro, regenerant, tissue culture.

Малина - одна из наиболее ценных ягодных культур. Ее плоды пользуются большим спросом у населения, так как обладают уникальными питательными и лечебными свойствами.

Перспективным направлением является создание сортов малины ремонтантного типа, формирующих основной урожай на побегах текущего года во второй половине лета - начале осени, генетический потенциал и необычный способ возделывания которых обеспечивают максимальную механизацию по уходу за насаждениями, включая уборку урожая. Выращивание ремонтантных сортов малины, в дополнение к сортам обычного типа (неремонтантным), позволяет продлить период потребления свежих ягод на 1,5-2 месяца. При подборе сортов разного срока созревания можно создать непрерывный конвейер поступления свежих ягод малины с конца июня до октября [1, с. 13; 2, с. 49].

Однако ремонтантные формы малины сложного межвидового происхождения отличаются низкими коэффициентами размножения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли [3, с. 2]. Данная биологическая особенность ремонтантной малины увеличивает период полевого размножения и, следовательно, значительно удлиняет процесс перехода элитных форм к сортоиспытанию. Поэтому для ускорения селекционного процесса актуально использование метода клонального микроразмножения растений.

По сравнению с традиционными способами размножения, применение биотехнологических приемов позволяет в короткие сроки получить в большом количестве оздоровленный посадочный материал, генетически идентичный материнскому растению, работать в лабораторных условиях круглый год и планировать выпуск растений к определенному сроку,

длительно сохранять растительный материал в условиях in vitro, ускорять селекционный процесс [4, с. 21; 5, с. 66; 6, с. 50].

Цель исследования - изучение морфогенетическо-го потенциала ремонтантных сортов малины в культуре in vitro.

Объекты и методы исследования. Объектом для исследования служили сорта ремонтантной малины Атлант и Шапка Мономаха. Данные сорта были выбраны вследствие их высокой урожайности, круп-ноплодности, а также возможности использования в приусадебном хозяйстве.

Растения-регенеранты помещали на агаризирован-ную питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга с увеличенной вдвое концентрацией хелата железа, дополненной различными регуляторами роста. Для индукции морфогенеза использовали цитокинины: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентениладе-нин (2-ip), тидиазурон (TDZ); ауксины: индолил-3-масляная кислота (ИМК), индолил-3-уксусная кислота (ИУК), 1-нафтилуксусная кислота (НУК); гибберел-лины: гибберелловая кислота (ГК).

Культивирование проводили при 24±1 °С, в условиях фотопериода 16/8 часов. Длительность пассажа составляла 25-30 дней. Фиксировали следующие показания: количество побегов, шт./экспл.; высота побега, мм; количество листьев на побеге, шт./экспл.; наличие каллуса +\-. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2007.

Исследования выполнены в 2010-2012 гг. в лаборатории биотехнологии и цитологии ГНУ НИИ садоводства Сибири им. М.А. Лисавенко Россельхозакадемии.

Результаты исследований и их обсуждение. Опытным путем нами было установлено, что для культивирования растений различных сортов может

подходить несколько питательных сред с разным содержанием фитогормонов.

В результате проведенных экспериментов отобраны варианты сред, на которых наблюдалось активное побегообразование. Существенным моментом, обеспечивающим активную пролиферацию микропобегов in vitro, является правильный выбор цитокинина и его концентрации [7, с. 641]. Из регуляторов роста

цитокининового ряда наиболее эффективными оказались среды с 6-БАП и TDZ как для сорта Атланта, так и для сорта Шапка Мономаха.

Изучая влияние 6-БАП на побегообразование ремонтантной малины, было отмечено, что наибольший коэффициент размножения (2,3±0,2 шт./экспл.) для сорта Атлант обеспечивала среда МС с 1,0 мкМ этого цитокинина (рис. 1).

3,5

2

3

4

5

Варианты сред  " Атлант И Шапка Мономаха

1 И

1 а.

В—и

й m

7

8

Рис. 1. Влияние различных цитокининов на количество побегов ремонтантной малины

Условные обозначения: 1 - 6-БАП 1,0 мкМ; 2 - 6-БАП 2,0 мкМ; 3 - 6-БАП 5,0 мкМ; 4 - 6-БАП 10,0 мкМ; 5 - 2^р 2,0 мкМ; 6 - 2^р 5,0 мкМ; 7 - TDZ 0,5 мкМ; 8 - TDZ 1,0 мкМ.

3

6

При этом высота побега составляла 14,0±0,7 мм; количество листьев на побеге - 8,0±0,4 шт./экспл. Для сорта Шапка Мономаха оптимальна среда МС с 5,0 мкМ 6-БАП. На этой среде растения имели максимальную высоту (18,8±3,2 мм) и количество листьев (13,0±1,3 шт./

30

25

Варианты сред Атлант Шапка Мономаха

Рис. 2. Влияние различных цитокининов на высоту побега ремонтантной малины

Условные обозначения: 1 - 6-БАП 1,0 мкМ; 2 - 6-БАП 2,0 мкМ; 3 - 6-БАП 5,0 мкМ; 4 - 6-БАП 10,0 мкМ; 5 - 2-1р 2,0 мкМ; 6 - 2^р 5,0 мкМ; 7 - TDZ 0,5 мкМ; 8 - TDZ 1,0 мкМ.

экспл.), но при этом невысокий коэффициент размножения - 1,8±0,5 шт./экспл. Учет высоты побега в дальнейшем дает возможность использовать при размножении микрочеренки, что влияет на успешность адаптации рас-тений-регенерантов к нестерильным условиям (рис. 2).

При использовании в качестве цитокини-на TDZ наблюдались практически такие же коэффициенты размножения, как и при использовании 6-БАП: 2,4±0,8 побега на эксплант для сорта Атлант и 1,7±0,2 шт./экспл. - для сорта Шапка Мономаха. Однако при этом отмечалось каллусообразование у основания побега, что нежелательно при микроразмножении, так как затрудняется поступление питательных веществ в растение.

Внесение в питательную среду 2^р в качестве активатора побегообразования сопровождалось низким коэффициентом размножения для обоих сортов ремонтантной малины.

Изучение совместного влияния разных регуляторов роста (цитокининов, ауксинов и гибберелли-нов) на морфогенез ремонтантной малины показало,

что наибольший эффект для сорта Атлант обеспечивали комбинации 1,0 мкМ 6-БАП + 0,1 мкМ НУК, а также среда с 5,0 мкМ 6-БАП + 0,25 мкМ ИМК (рис. 3). При этом на обеих средах микрорастения имели оптимальную высоту (13,7±1,0 и 15,3±0,5 мм соответственно) и достаточное количество листьев (11,6±0,7 и 9,0±1,4 шт./экспл. соответственно), но на первой среде каллус образовывался, а на второй отсутствовал. Для сорта Шапка Мономаха наилучших результатов удалось достичь в варианте с 1,0 мкМ 2^р + 0,1 мкМ НУК. Регенеранты были достаточно высокими (17,0±0,8 мм) и хорошо облиственными (12,2±0,8 шт./экспл.). Внесение в питательную среду МС цитокининов, ауксинов и гиббереллинов в различных концентрациях несколько снижало коэффициенты размножения изучаемых сортов малины.

2,5

3

4

Варианты сред Атлант  Шапка Мономаха

Рис. 3. Влияние регуляторов роста на количество побегов ремонтантной малины

Условные обозначения: 1 - 6-БАП 1,0 мкМ + НУК 0,1 мкМ; 2 - 6-БАП 5,0 мкМ + НУК 0,25 мкМ; 3 - 6-БАП 5,0 мкМ + ИМК 2,5 мкМ; 4 - 6-БАП 5,0мкМ + ИМК 0,5 мкМ + ГК 1,5 мкМ; 5 - 6-БАП 5,0 мкМ + ИМК 0,25 мкМ; 6 - 2^р 1,0 мкМ + НУК 0,1 мкМ; 7 - 2^р 5,0 мкМ + ИМК 2,5 мкМ.

1

2

5

6

7-

Экспериментально установлено, что предпочтительнее использовать 6-БАП, так как этот цитокинин обеспечивает более высокий коэффициент размножения, хороший рост и развитие микрорастений, а также отсутствие каллуса (рис. 4)..

Рис. 4. Растение-регенерант ремонтантной малины сорта Атлант на питательной среде, содержащей 1,0 мкМ 6-БАП

Следует добавить, что при снижении концентрации 6-БАП (с 10,0 до 5,0 мкМ) увеличивается количество побегов длиной более 10,0 мм. При этом отмечено, что высокие концентрации 6-БАП (10,0 мкМ) негативно влияют на коэффициент размножения.

Сравнительный анализ сортов показал, что более высоким морфогенетическим потенциалом обладает сорт Атлант, по сравнению с Шапкой Мономаха. Этот сорт легче размножался в условиях in vitro: у него более высокий коэффициент размножения, высота и об-лиственность побегов.

Таким образом, изучены особенности клонально-го микроразмножения ремонтантных сортов малины и установлено, что на этапе собственно размножение целесообразно использовать невысокие концентрации ци-токининов: для сорта Атлант - 1,0 мкМ 6-БАП (коэффициент размножения 2,3±0,2 шт./экспл.), для сорта Шапка Мономаха - 5,0 мкМ 6-БАП (коэффициент размножения 1,8±0,5 шт./экспл.). При культивировании малины на данных средах растения-регенеранты имели развитый листовой аппарат и достаточную высоту побега.

Библиографический список

1. Евдокименко С.Н. Ремонтантная малина - перспективное направление в селекции // Агро XXI. - 2009. -№10-12.

2. Казаков И.В., Евдокименко С.Н. Достижения в селекции ремонтантной малины на основе межвидовой гибридизации // Вестник Южно-Уральского государственного университета. - 2009. - №1.

3. Озеровский А.В. Микроклональное размножение селекционных форм ремонтантной малины с использованием новых регуляторов роста: автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. - Брянск, 2007.

4. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. - М., 1999.

5. Ветчинкина Е.М., Малаева Е.В., Мамаева Н.А., Зини-на Ю.М., Коновалова Л.Н., Коротков О.И., Молканова О.И. Использование биотехнологических методов для сохранения генофонда редких и ценных видов растений // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тез. докл. IX Меж-дунар. конф. (8-12 сентября 2008 г., Звенигород). - М., 2008.

6. Sedlak J., Paprstein F., Bilavcik A., Zamenik J. Long term storage of vegetetively propagated fruit species // Vyzkumny a slechtitelskyustavovocnarsky. - Holovousy, 2005. - №19.

7. Шорников Д.Г., Брюхина С.А., Муратова С.А., Янковская М.Б., Папихин Р.В. Оптимизация условий культивирования in vitro ягодных и декоративных культур // Вестник ТГУ - 2010. - Т. 15, вып. 2.