СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ВЕЩЕСТВ
METHOD FOR SUBSTANCES CYTOTOXICITY DETERMINATION

Изобретение относится к биомедицине и касается способа определения цитотоксичности различных веществ, например, лекарственных препаратов и наночастиц, которые могут быть использованы в качестве контрастного агента для магнитно-резонансной томографии, магнитной сепарации, адресной доставки лекарств, и т.д.
Известен способ определения цитотоксичности веществ путем обработки культуры клеток веществом с последующим определением количества живых клеток [Tim Mosmann, «Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays» // Journal of Immunological Methods, 1983, V. 65, p. 55-63]. В данном способе количество живых клеток определяют путем добавления красителя желтого тетразола к клеткам в присутствии растворяющего компонента (диметилсульфоксида) для перевода нерастворимого пурпурного формазана в цветной раствор. По степени поглощения красителя в клетках методом спектрофотомерии определяют количество живых клеток. Известный способ имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как обработка культуры клеток веществом с последующим определением его токсичности.
Недостатками данного способа являются его длительность и сложность, обусловленные использованием дополнительных реагентов, а также то, что данный способ позволяет определять только высокую степень токсичности, приводящую к потерям живых клеток. Указанные недостатки обусловлены особенностями способа.
Известен способ определения цитотоксичности магнитных наночастиц путем обработки культуры клеток магнитными наночастицами с последующим определением количества погибших клеток [Saba Naqvi, Mohammad Samim, MZ Abdin, Farhan Jalees Ahmed, AN Maitra, CK Prashant, Amit К Dinda, «Concentration-dependent toxicity of iron oxide nanoparticles mediated by increased oxidative stress» // International Journal of Nanomedicine, 2010, V. 5, p. 983-989]. В данном способе количество погибших клеток определяют путем добавления апоптического маркера красителя Hoechst - 33342 (Roche). По степени яркости свечения клеток с помощью флуоресцентного микроскопа определяют количество погибших клеток. Известный способ имеет такие существенные признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как обработка культуры клеток веществом с последующим определением его токсичности.
Недостатками данного способа являются его длительность и сложность, обусловленные использованием дополнительных реагентов, а также то, что данный способ позволяет определять только высокую степень токсичности, приводящую к потерям живых клеток. Указанные недостатки обусловлены особенностями способа.
Из научно-технической литературы известно, что одним из первых признаков токсического воздействия на клетку или группу клеток является повышение в клетках уровня активных форм кислорода (АФК) [Peter P. Fu, Qingsu Xia, Huey-Min Hwang, Paresh C. Ray, Hongtao Yu, «Mechanisms of nanotoxicity: Generation of reactive oxygen specie» // Journal of food and drug analysis, 2014, V. - 22, p. 64-75], что может быть использовано в способах определения токсичности различных веществ.
Наиболее близким к заявляемому является известный способ определения цитотоксичности веществ путем обработки по крайней мере одной клетки веществом с последующим определением токсичности вещества по изменению уровня внутриклеточных АФК [Igor Pujalty, Isabelle Passagne, Brigitte Brouillaud, Mona Treguer, Etienne Durand, Celine Ohayon-Courtes, Beatrice L'Azou 1, Cytotoxicity and oxidative stress induced by different metallic nanoparticles on human kidney cells» // Particle and Fibre Toxicology 2011, 8:10, http://www.particleandfibretoxicology.com/content/8/1/10] - прототип. В данном способе изменение внутриклеточного уровня АФК определяют по свечению флуоресцентного красителя DCFH-DA, способного проникать внутрь клеток, а также излучать свет при связывании с АФК. По изменению интенсивности свечения судят о токсичности тестируемого вещества.
Известный способ имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как обработка по крайней мере одной клетки веществом с последующим определением токсичности вещества по изменению уровня внутриклеточных АФК.
Недостатками известного способа является его относительно низкая чувствительность, что осложняет выявление ранних признаков токсичности, и сложность данного способа, обусловленная использованием дополнительных реагентов, а также отсутствие возможности проведения количественной оценки уровня АФК. Указанные недостатки определяются техническими особенностями прототипа.
Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа определения цитотоксичности веществ, лишенного вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом изобретения является упрощение способа определения цитотоксичности веществ и повышение его чувствительности.
Предварительно были проведены эксперименты с различными способами определения токсичности веществ по изменению уровня внутриклеточных АФК, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе определения цитотоксичности веществ путем обработки клетки веществом с последующим определением токсичности вещества по изменению уровня внутриклеточных АФК, определение уровня внутриклеточных АФК проводят путем ввода внутрь клетки заполненного углеродом кварцевого нанокапилляра, содержащего платину в полости острия нанокапилляра, имеющего форму усеченного конуса, с последующим определением изменения сигнала, вызванного электрохимической реакцией на острие капилляра с участием АФК.
Предлагаемый способ является новым и не описан в научно-технической литературе. Используемый в предлагаемом техническом решении нанокапилляр также является новым и не описан в научно-технической литературе. Предлагаемые оптимальные форма и устройство нанокапилляра, выполняющего функцию электрода, были установлены экспериментально.
Используемый капилляр может быть получен по следующей методике. Протокол производства вышеописанного нанокапилляра с необходимыми размерами состоит из следующих шагов: 1) вытяжка кварцевого нанокапилляра при помощи лазерного пуллера; 2) заполнение полученного нанокапилляра пиролитическим углеродом при помощи термической декомпозиции смеси бутана и пропана. Радиус наноэлектрода можно надежно контролировать при помощи изменения параметров вытягивания во время производства нанокапилляров. Таким образом получают нанокапилляр с острием в форме усеченного конуса, заполненный углеродом. Полость у острия нанокапилляра получают электрохимическим травлением в присутствии NaOH, например, путем прикладывания напряжения с циклической линейной разверткой потенциала, с последующей промывкой полученного нанокапилляра дистиллированной водой. Объем полости зависит от количества циклов, величины напряжения, продолжительности линейной развертки и т.д. Заполнение полости металлической платиной осуществляют общепринятым методом электрохимического осаждения платины из водного раствора платинохлористоводородной кислоты.
В данном техническом решении могут быть использованы капилляры с острием (наноострием) на конце, внутренний диаметр которого может составлять, например, 1-500 нанометров (нм). Внешний диаметр такого острия капилляра должен не превышать размер клеток, и также может варьироваться в широких пределах, например, 10-1000 нм. Типичная длина острия нанокапилляра обычно не превышает 10 микрометров (мкм) и может варьироваться в зависимости от решаемой задачи. Следует отметить, что используемый нанокапиляр должен быть изготовлен из кварца. Данный материал обладает высокой температурой плавления и не меняет свой формы в процессе заполнения его углеродом методом пирролитического осаждения. У используемого капилляра по крайней мере острие должно иметь форму усеченного конуса, что облегчает введение нанокапилляра в клетку и затрудняет десорбцию платины от углерода в полости капилляра. При этом размеры полости в острие капилляра могут быть различными. Такая полость может быть заполнена платиной полностью или частично. Количество вводимой платины можно контролировать по электрохимическому сигналу в процессе осаждения металла для предотвращения превращения наноэлектрода в микроэлектрод в результате микрообразований на конце капилляра.
Выбор платины в качестве наносимого в полость нанокапилляра металла обусловлена химической стойкостью металлической платины, ее инертностью к биологическим объектам и ее каталитической активностью.
Следует отметить, что известно использование кварцевого нанокапилляра, заполненного углеродом, и содержащего тонкий слой платины только на острие капилляра [P. Actis, S. Tokar, J. Clausmeyer, В. Babakinejad, S. Mikhaleva, R. Cornut, Ya. Takahashi, A.L. Cordoba, P. Novak, A.I. Shevchuck, J.A. Dougan, S.G. Kazarian, P. Gorelkin, A.S. Erofeev, I. Yaminsky, P.R. Unwin, W. Schuhmann, D. Klenerman, D.A. Rusakov, E.V. Sviderskaya, Yu.E. Korchev, «Electrochemical Nanoprobes for Single-Cell Analysis» // ACS Nano, 2014, 8 (1), 875-884]. Однако данный капилляр был использован для определения уровня АФК у здоровых и раковых клеток меланоцитов, но не использовался для определения токсичности веществ. У данного капилляра нет полости, заполненной платиной, металлическая платина нанесена тонким слоем в качестве покрытия только на плоский торец нанокапилляра, заполненного углеродом, и может легко удаляться в процессе использования капилляра при механическом воздействии, что снижает срок службы капилляра в качестве электрода и может приводить к получению недостоверных и невоспроизводимых результатов.
Известно, что внутри любой клетки имеются те или иные АФК. Поэтому при реализации предлагаемого способа необходимо предварительно осуществить калибровку вводимого в клетку измерительного нанокапилляра, выполняющего функцию электрода, по одному из видов АФК, например по перекиси водорода. Это позволяет построить градуировочную кривую, где на одной оси приведена концентрация перекиси водорода, а по другой - величина силы тока, что позволят осуществлять количественную оценку уровня АФК.
Следует отметить, что временной интервал между обработкой клеток тестируемым веществом и началом определения АФК может быть различным и зависит от токсичности наночастиц и природы клеток.
Предлагаемый способ определения цитотоксичности веществ может быть применен для клеток различной природы. Он может быть использован для определения цитотоксичности веществ как по отношению к одной клетке, так и группы клеток, например, культуры клеток. В предлагаемом способе клетки обязательно должны быть предварительно обработаны исследуемыми веществом. В противном случае предлагаемый способ утрачивает работоспособность. При этом клетки можно обрабатывать как непосредственно веществом, так и суспензией или эмульсией тестируемого вещества в жидкости или газе.
В предлагаемом изобретении определение уровня АФК целесообразно проводить на клетках, расположенных на твердой подложке. Для улучшения адгезии клеток можно проводить дополнительную химическую модификацию поверхности подложки либо использовать закрепление клеток на подложке физическими методами, например путем создания гидродинамического потока.
Процесс введения нанокапилляра в клетку можно осуществлять механически «в ручном режиме» под контролем соответствующих оптических систем. Также возможно проводить ввод нанокапилляра в клетку с помощью автоматизированных инструментальных средств. Например, с помощью системы сканирующего ионного микроскопа можно определять положение исследуемого объекта, а затем с помощью системы трехмерного позиционирования проводить контролируемый ввод нанокапилляра в клетку. Глубина введения нанокапилляра в исследуемую клетку может быть различной. Под введением в клетку подразумевается прохождение острия нанокапилляра через цитоплазматическую мембрану. Следует отметить, что если использованный в предлагаемом техническом решении нанокапилляр не вводить в клетку, а, например, только касаться ее стенок, то способ утрачивает свою работоспособность.
В предлагаемом техническом решении изменение силы тока или напряжения может выступать в качестве изменения сигнала, вызванного электрохимической реакцией на острие капилляра с участием АФК. Изменение силы тока и напряжения (разности потенциалов) определяется между острием нанокапилляра, содержащего платину и выполняющего функцию электрода, и электродом сравнения, который предпочтительно должен быть погружен в проводящую жидкость, окружающую исследуемые клетки. В данном изобретении измерять изменение электрического потенциала и/или силы тока между электродами можно с использованием приборов, традиционно используемых для снятия вольтамперных характеристик в аналогичных системах. Данные приборы могут быть различных типов и моделей. Величины устанавливаемых силы тока и/или напряжения определяются в зависимости от выбора электрода сравнения. При этом до введения нанокапилляра в клетку величина потенциала и/или силы тока может быть как равной нулю, так и иметь какое-либо конкретное экспериментально определяемое значение. Поэтому в предлагаемом способе целесообразно фиксировать именно изменение этих параметров в ходе эксперимента.
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1 (качественное определение токсичности вещества)
Используемый в данном примере нанокапилляр получают путем вытяжки кварцевого капилляра с внешним диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,8 мм при помощи лазерного пуллера с последующим заполнением конца нанокапилляра пиролитическим углеродом при помощи термической декомпозиции смеси бутана и пропана. Получают кварцевый капилляр, содержащий на одном из своих концов заполненный углеродом нанокапилляр длиной 10 мкм, имеющий форму усеченного конуса. После этого в незаполненный углеродом конец капилляра вводят проволочный электрод, подсоединенный к усилителю тока, приводят его в соприкосновение с заполняющим нанокапилляр углеродом. Далее нанокапилляр и хлорсеребряный электрод сравнения погружают в водный раствор NaOH с концентрацией 0,1 моль/литр (М), содержащий KCl в концентрации 10 М. Затем на нанокапилляр подают напряжение 20 циклов линейной развертки от 0 до плюс 2 В. Получают заполненный углеродом нанокапилляр, содержащий на конце незаполненную углеродом полость. Затем полученный нанокапилляр промывают в дистиллированной воде. После чего нанокапилляр и хлорсеребряный электрод сравнения погружают в водный раствор платинохлористоводородной кислоты с концентрацией 2 мМ. Затем на нанокапилляр подают 10 циклов линейной развертки потенциала от минус 0,8 В до 0 В со скоростью 1 B/мин. Получают заполненный углеродом нанокапилляр, содержащий на конце острия полость, полностью заполненную металлической платиной. Степень заполнения полости платиной определяют с помощью сканирующей электронной микроскопии с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией.
2
Полученный нанокапилляр используют для определения степени токсичности дихлорацетата. Для этого тестируемую культуру клеток печени человека линии LO помещают в чашку Петри с физиологическим раствором. Далее нанокапилляр и хлорсеребряный электрод сравнения, подключенные к усилителю тока, погружают в физиологический раствор, содержащий культуру клеток. На нанокапилляр прикладывается напряжение плюс 0,8 В относительно электрода сравнения. Затем полученный нанокапилляр последовательно вводят в пять различных клеток с помощью микроманипулятора под контролем оптического микроскопа. После введения нанокапилляра в клетку определяют изменение силы тока с последующим определением усредненного значения силы тока, равного 1 пикоампер (пА), соответствующего уровню АФК в необработанных тестируемым веществом клетках.
После чего клетки обрабатывают в течение 3 ч раствором тестируемого вещества дихлорацетата с концентрацией 15 мМ в физиологическом растворе. Затем проводят аналогичное измерение силы тока у 5 различных клеток с последующим определением усредненного значения силы тока, равного 2 пА. Двухкратное увеличение силы тока после обработки их дихлорацетатом свидетельствует о его токсичности.
Пример 2 (полуколичественное определение АФК)
Опыт проводят с использованием нанокапилляра, описанного в примере 1, однако в место 20 циклов травления углерода в нанокапилляре в водном растворе NaOH используют 30 аналогичных циклов, а также для осаждения платины в полсти нанокапилляра вместо 10 циклов используют 7 циклов. Получают заполненный углеродом нанокапилляр, содержащий на конце острия полость, не полностью заполненную металлической платиной. Степень заполнения полости платиной подтверждают с помощью сканирующей электронной микроскопии с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией.
-7
-3
Перед экспериментом по определению АФК в клеках проводят калибровку полученного нанокапилляра в зависимости от концентрации модельного соединения пероксида водорода. Нанокапилляр и хлорсеребряный электрод сравнения, подключенные к усилителю тока, погружают в натрий-фосфатный буферный раствор. На нанокапилляр прикладывается напряжение плюс 0,8 В относительно хлорсеребряного электрода сравнения, после чего в буферный раствор последовательно добавляют разные концентрации пероксида водорода, начиная с наименьшей, с последующим определением изменения силы тока. Проводят измерение изменения силы тока в диапазоне концентраций пероксида водорода от 10 до 10 моль/литр. На основе полученных значений строят градуировочный график зависимости силы тока от концентрации пероксида водорода в растворе.
Откалиброванный капилляр используют для определения токсичности наночастиц ZnO размером 75 нм на клетках почки человека IP15. Эксперимент проводят аналогично примеру 1, однако обрабатывают клетки в течение 5 ч водной суспензией наночастиц с концентрацией 50 микрограмм/мл. Получают изменение силы тока в результате повышения уровня АФК после обработки наночастицами, которое соответствует повышению уровня пероксида водорода в клетках с 1 мкМ до 5 мкМ.
Пример 3
2
2
Опыт по определению токсичности проводят аналогично примеру 1, однако определяют токсичность FeCl на культуре клеток рака предстательной железы человека LNCaP. При этом клетки предварительно обрабатывают в течение 24 ч натрий-фосфатным буферным раствором FeCl с концентрацией 0,1 мМ.
Измерения изменения силы тока проводят путем снятия циклических вольтамперных характеристик с линейной разверткой потенциала от минус 1 В до 1 В. При этом измеряют изменение среднего значения силы тока в области положительных потенциалов в диапазоне от 400 до 800 мВ. В результате эксперимента было установлено, что среднее значение силы тока до и после обработки солью хлорида железа повысилось на 3 пА, что свидетельствует о цитотоксичности тестируемого соединения.
Пример 4 (прототип)
Для определения токсичности наночастиц ZnO размером 75 нм на клетках почки человека IP15 используют метод с применением флуоресцентного красителя DCFH-DA. Эксперимент проводят аналогично примеру 2, однако для определения изменения внутриклеточного АФК используют флуоресцентный метод. Перед обработкой клеток наночастицами их инкубируют в течение 15 мин в натрий-фосфатном буферном растворе, содержащим флуоресцентный краситель DCFH-DA с концентрацией 20 мкМ. Далее определяют интенсивность свечения стандартным методом с помощью флуориметра. Минимальная концентрация частиц, при которой возможна детекция изменения интенсивности в результате обработки частицами, составила 100 мкг/мл.
Таким образом из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ действительно существенно проще известного способа, выбранного в качестве прототипа, и имеет более высокую чувствительность, о чем можно судить по двукратному снижению порога определения концентраций тестируемого вещества.