2альфа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНА Ф ИЗ ВОДОРОСЛИ Gracilaria verrucoza
2α
METHOD FOR PRODUCING F PROSTAGLANDIN OF Gracilaria verrucosa ALGAE

2α
2α
Изобретение относится к способам получения простагландинов из морских культивируемых агароносных красных водорослей, в частности простагландина Ф (ПГФ) из Gracilaria verrucoza, и может быть использовано для получения фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов, предназначенных для применения в комплексной терапии социально-значимых заболеваний.
2α
2α
Известные способы получения ПГФ, описанные в патентных документах России, позволяют получать рацемический ПГФ и его аналоги (п. РФ №331439, C07C 405/00, опубл. 21.03.72; а.с. СССР №1291587, C07C 177/00, опубл. 23.02.87).
2α
2α
Однако указанные методы относятся к химическому синтезу и позволяют получать только синтетический ПГФ, который по своим биологическим свойствам значительно уступает природному. Кроме того, в результате синтезов образуется не чистый ПГФ, а смесь трудно разделяемых рацематов (изомеров).
1
2
3
2α
2α
2α
1
2
3
2α
2
Наиболее близким способом по количеству существенных признаков и достигаемому техническому результату является способ получения смеси простагландинов (ПГЕ, ПГЕ, ПГЕ и ПГФ) из водоросли Gracilaria verrucoza. В составе данной смеси получают, в том числе и ПГФ. Из смеси простагландинов ПГФ выделяется известным методом жидкостной хроматографии. Согласно данному способу водоросль измельчают на кусочки или клетки физическими или химическими методами, в частности с использованием лиофильной сушки и гомогенизации, вымораживания, разрезания на кусочки, разрушения клеток ультразвуком. Измельченную водоросль или ее порошок смешивают с дистиллированной водой или водоорганическим растворителем и выдерживают смесь при 5-40°С при pH 3-12 в течение ночи для превращения ненасыщенных жирных кислот под воздействием ферментов, присутствующих в водорослях, в простагландины и перехода их в дистиллированную воду или водоорганический растворитель. В случае использования для извлечения простагландинов воды их затем переводят в органическую фазу, используя в качестве органического растворителя, в частности тетрагидрофуран, этилацетат, этиловый эфир, петролейный эфир, н-гексан, хлороформ, четыреххлористый углерод, метиленхлорид или бензин. Полученный раствор пропускают через неполярную синтетическую пористую смолу, имеющую специфическую поверхность не менее 350 м/г, с объемом пор не менее 0,8 мл/г, при этом простагландины сорбируются на этой смоле, с которой они элюируются органическим или водоорганическим растворителем. Полученная смесь простагландинов (ПГЕ, ПГЕ, ПГЕ и ПГФ) разделяется на индивидуальные простагландины известными методами жидкостной хроматографии (EP №0424915, C07C 405/00, C07C 67/00, C07C 401/00, 02.05.91 г.).
К недостаткам известного способа следует отнести следующее:
2α
2α
- невысокий выход ПГФ, выход по данным, приведенным в патенте, составляет от 0 до 4,2 мкг/г сырой водоросли, что делает нецелесообразным применение данного способа для получения индивидуального ПГФ;
- предварительная обработка сырья физическими или химическими методами приводит к частичному разрушению ферментных систем, присутствующих в водоросли, и, как следствие, снижению выхода простагландинов;
- необходимость измельчения исходного сырья приводит к усложнению самого способа;
- длительность процесса получения простагландинов. Так, процесс превращения ненасыщенных жирных кислот проходит в течение ночи, т.е. не менее 8-10 часов, при этом в течение этого периода необходимо постоянно поддерживать определенную температуру (5-40°С) и pH в интервале 3-12, что значительно усложняет технологический процесс;
- длительное выдерживание в воде приводит к повышенному выделению полисахаридов, которые за счет образования эмульсий затрудняют процесс последующей экстракции простагландинов органическими растворителями;
- необходимость экстракции простагландинов органическими растворителями. Эта стадия является трудоемкой и не обеспечивает достаточной степени перехода простагландинов из водной фазы в органическую фазу;
- недостаточная емкость неполярной синтетической пористой смолы, используемой для извлечения простагландинов из раствора, что требует использования значительного количества сорбента и соответственно больших количеств органических растворителей для элюирования.
2α
Задача, поставленная перед изобретением, - повышение выхода и обеспечение возможности получения индивидуального простагландина Ф и упрощение способа его получения.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе получения простагландинов из водоросли Gracilaria verrucoza, включающем инкубацию водоросли в дистиллированной воде для превращения ненасыщенных жирных кислот под воздействием ферментов, присутствующих в этой водоросли, в простагландины, переход простагландинов в воду, извлечение простагландинов из водного раствора сорбцией на сорбенте с последующим элюированием водоорганическими растворителями, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют свежесобранную водоросль, перед инкубацией в дистиллированную воду вводят 0,5-5 мМ адреналина, инкубацию ведут в течение 1-2 час при освещении и температуре не более 4°С. Перед извлечением простагландинов сорбцией на сорбенте полученный водный раствор подкисляют до pH 2,5-3,0.
2α
2
2α
2
Введение в инкубационную среду (дистиллированная вода) адреналина обеспечивает образование практически одного вида простагландина, а именно ПГФ, и, в конечном результате, позволяет отказаться от сложных, затратных стадий очистки. При снижении концентрации адреналина менее 0,5 мМ снижается общий выход простагландинов и изменяется соотношение ПГА/ПГФ в сторону ПГА. При увеличении концентрации адреналина выше 5 мМ происходит общее снижение синтеза простагландинов и выход целевого продукта снижается.
2α
Использование в качестве сырья свежесобранной водоросли не только приводит к упрощению способа, поскольку отсутствует необходимость замораживания и измельчения сырья, но и способствует увеличению выхода простагландина Ф.
2α
2
2
2
Проведение инкубации свежесобранных морских водорослей при освещении также значительно повышает выход простагландинов, в том числе ПГФ. При этом целесообразно освещать водоросли светом интенсивностью 100-300 мкЕ/мс. При использовании света интенсивностью менее 100 мкЕ/мс увеличение выхода простагландинов не наблюдается, а при использовании света интенсивностью более 300 мкЕ/мс происходит подавление ферментативной активности, что отрицательно сказывается на выходе целевого продукта.
Установлено, что процесс превращения ненасыщенных жирных кислот, в частности арахидоновой кислоты, в простагландины под воздействием ферментов наилучшим образом проходит при температуре среды не более 4°С, обеспечивая, в конечном результате, повышение выхода простагландинов. Повышение температуры более 4°С приводит к снижению выхода простагландинов.
Инкубация морской водоросли в дистиллированной (пресной) воде менее 1 час не обеспечивает в полной мере переход ненасыщенных жирных кислот в простагландины. Увеличение времени инкубации более 2 час приводит к нежелательным последствиям. Так, при этом начинается интенсивный переход в раствор полисахаридов, присутствующих в водорослях. Полисахариды образуют эмульсию, что, в последующем, затрудняет выделение простагландинов на сорбенте, т.е. осложняется процесс очистки, и, как следствие, уменьшает выход простагландинов. Кроме того, при инкубации более 2 час существенно снижалась скорость фильтрации из-за образования на поверхности фильтра студенистого осадка полисахаридов. Осаждение на поверхности сорбента полисахаридов является также причиной того, что поверхностный слой сорбента быстро теряет свою фильтрационную способность.
2
2
2α
2
Подкисление водного раствора, содержащего простагландины до pH среды 2,5-3,0, обеспечивает перевод простагландинов, находящихся в воде в виде солей, в форму свободных ионизированных кислот. Это способствует наилучшему удержанию простагландинов на силикагеле и, в конечном результате, повышает выход простагландинов. При повышении кислотности среды, pH ниже 2,5, наблюдается нежелательный переход биологически активной формы простагландина ПГЕ в неактивную форму ПГА, и, как следствие, не только снижается выход ПГФ, но и требуется дополнительная его очистка от неактивной формы ПГА.
8
18
В качестве сорбента целесообразно использовать полярный модифицированный силикагель с привитыми углеводородами с размером зерен до 100 мкм. В качестве привитых могут быть углеводороды с длиной цепи от С до С. Эти сорбенты обладают по сравнению с ионообменными смолами, используемыми в прототипе, емкостью выше на 2-3 порядка, что позволяет перерабатывать значительные объемы раствора, обеспечивает быстрое и качественное извлечение простагландинов и позволяет отказаться от стадии предварительного концентрирования простагландинов в органических растворителях перед их разделением на сорбенте.
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1.
2
18
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 458 мг адреналина, при этом получается 0,5 мМ раствор адреналина. Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 100 мкЕ/мс в течение 2 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С, содержащий 9-12% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 51 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 538 мкг/г сырой водоросли. Структура полученных веществ подтверждалась методами газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Пример 2.
2
18
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 4580 мг адреналина (5 мМ раствор адреналина). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 мкЕ/мс в течение 1,5 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 2,5 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С, содержащий 16-18% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 16 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 265 мкг/г сырой водоросли.
Пример 3.
2
18
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 916 мг адреналина (1 мМ раствор адреналина). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 мкЕ/мс в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С, содержащий 22-24% углерода) с размером зерен 50 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 67 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 545 мкг/г сырой водоросли.
Пример 4.
2
18
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 916 мг адреналина (1 мМ раствор адреналина). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 мкЕ/мс в течение 1 часа. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С, содержащий 22-24% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 71 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 557 мкг/г сырой водоросли.
Пример 5.
2
8
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 916 мг адреналина (1 мМ раствор адреналина). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 мкЕ/мс в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 3,0 и пропускают через колонку с окта силикагелем (С, 9 содержащий 15-18% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 15 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 187 мкг/г сырой водоросли.
Пример 6.
2
12
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 1 мМ 916 мг адреналина (1 мМ раствор адреналина). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 мкЕ/мс в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 3,0 и пропускают через колонку с силикагелем (С, содержащий 22-24% углерода) с размером зерен 50 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл изопропилового спирта. В изопропиловый спирт элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата изопропиловый спирт удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 55 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 512 мкг/г сырой водоросли.
Пример 7.
2
12
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 1 мМ (183,2 мг) адреналина. Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 мкЕ/мс в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 3,0 и пропускают через колонку с силикагелем (C, содержащий 22-24% углерода) с размером зерен 50 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл метилового спирта. В метиловый спирт элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата метиловый спирт удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 60 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 511 мкг/г сырой водоросли.
Пример 8.
2
18
2α
2
2
2α
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 1000 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (5 л). Предварительно в воде растворяют 916 мг адреналина (1 мМ раствор адреналина). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 300 мкЕ/мс в течение 1 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 3,0 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С, содержащий 22-24% углерода) с размером зерен 50 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин). Получено ПГЕ - 49 мкг/г сырой водоросли и ПГФ - 485 мкг/г сырой водоросли.
Пример 9.
2
18
2α
2
Свежесобранные водоросли Gracilaria verrucosa отжимают от морской воды, берут 500 г водоросли и помещают в ванну с дистиллированной водой (2,5 л). Предварительно в воде растворяют 2290 мг адреналина (5 мМ раствор адреналина). Ванну термостатируют при 4°С и освещают ксеноновой лампой с интенсивностью 175 мкЕ/мс в течение 1,5 час. По окончании инкубации воду отделяют, подкисляют 2н. соляной кислотой до pH 2,5 и пропускают через колонку с октадецил силикагелем (С, содержащий 16-18% углерода) с размером зерен 100 мкм. Затем сорбент промывают сначала 500 мл воды для удаления примесей нелипидной природы, затем 500 мл этанола. В этанол элюируются простагландины и другие неполярные вещества. После чего из элюата этанол удаляют упариванием, остаток суспендируют в 50 мл насыщенного раствора диазаметана в диэтиловом эфире. Через 30 минут реакционную смесь упаривают и остаток разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ выполняют на колонке Zorbax ODS (22 мм × 250 мм), мобильная фаза ацетонитрил-вода, 80:20 (по объему) со скоростью 20 мл/мин, детектирование с помощью УФ-детектора при 200 нм. Собирают пики, соответствующие по времени удерживания стандартам метиловых эфиров ПГФ (4,75 мин) и ПГЕ (5,28 мин).
2α
2α
2α
2
Как видно из представленных примеров, заявляемый способ позволяет повысить выход ПГФ по сравнению с прототипом более чем на два порядка, получить практически чистый ПГФ и не требует дополнительно длительной и затратной процедуры очистки ПГФ от других видов простагландинов, поскольку доля ПГЕ после инкубации в растворе незначительна.
Кроме того, предложенный метод позволяет существенно упростить процедуру выделения простагландинов из инкубационной среды (разделения на индивидуальные простагландины) и отказаться от использования значительного количества органических растворителей.