Исследование роли протеаз нейтрофилов в развитии токсического отека легких

ТОКСИКОЛОГИЯ

© П.А. ТОРКУНОВ; 2007

Научно-исследовательский испытательный центр медико-биологической защиты государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины МО РФ; Лесопарковая ул., 4, Санкт-Петербург, 195043, Россия

Резюме

На модели токсического отека легких, вызванного фосгеном, установлена эффективность профилактического и лечебного применения ингибиторов протеиназ нейтрофилов у мышей. В исследовании использовали следующие ингибиторы ферментов: сериновых протеаз — бензилсульфохлорид; аспартильных протеаз — Ы-этилмалеинимид; фосфолипазы А2 — а-бромацетофенон и а,п-дибромацетофенон. Лечебное и в меньшей степени профилактическое применение ингибиторов протеаз позволяло уменьшать выраженность отека легких. Эффективность синтезированных ингибиторов протеаз превышала эффективность препарата сравнения контрикала. Полученные результаты позволяют говорить об участии протеаз гранулоцитов в патогенезе отека легких, вызванного фосгеном.

Исследование роли протеаз нейтрофилов в развитии токсического отека легких // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Т. 7, № 1. — С. 1448-1452.

Ключевые слова

протеазы нейтрофилов; токсический отек легких; фосген

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ПРОТЕАЗ НЕЙТРОФИЛОВ В РАЗВИТИИ ТОКСИЧЕСКОГО ОТЕКА ЛЕГКИХ

ВВЕДЕНИЕ

Протеолитические ферменты, которые содержатся в различных фракциях нейтрофильных гранулоцитов (гранулах, цитоплазме, плазматических мембранах), имеют важное значение в их функциональной активности, в значительной степени обусловливая способность к миграции, фагоцитозу, а также участие в иммунной и воспалительной реакции организма в ответ на повреждение или инфекцию. Протеазы нейтрофилов освобождаются из клеток также при их разрушении и способны, при недостаточной активности ингибиторов, повреждать нормальные ткани и различные типы клеток — эритроциты, тромбоциты, гепатоциты, кроветворные, эндотелиальные и опухолевые клетки. Одним из представителей сериновых протеаз является эластаза. Имеются данные об участии эластазы нейтрофильных гранулоцитов в патологических изменениях тканей при эмфиземе легких, гломерулонефритах, ревматоидных артритах. Установлено, что эластаза участвует в ряде процессов, связанных с воспалением поврежденных тканей. Роль фермента заключается не только в расщеплении структурных элементов соединительной ткани, но и в стимуляции процессов инфильтрации лейкоцитами мест воспаления и аккумуляции этих клеток в микрососудах. Такие функции ферментов в большей степени обусловлены наличием рецепторов эластазы на поверхности макрофагов и нейтрофилов [1, 4, 7].

В настоящее время активно исследуется участие протеаз нейтрофилов и макрофагов в патогенезе токсического отека легких. Высказываются предположения, что начальная стадия патологического процесса происходит с непосредственным участием ферментов гранулоцитов [5, 8]. Исследования последних лет дают основания предполагать, что определенное место в патогенезе токсического отека легких (ТОЛ) занимают и метаболиты арахидоновой кислоты [7]. Основными метаболитами, продуцируемыми нейтрофилами и макрофагами, являются простагландин Е2, лейкотриены В и С, а также ряд моногидроксиэйко-затетраеновых кислот. Скорость их образования ограничивается наличием неэтерифицированной формы арахидоновой кислоты. Считается, что в высвобождении арахидоновой кислоты из эфиров фосфолипидов и диацилглицеролов участвует фосфолипаза А2 [6].

Для оценки роли протеаз нейтрофилов и фосфо-липазы А2 в патогенезе ТОЛ мы исследовали эффективность использования специфических ингибиторов сериновых и аспартильных протеаз, а также фосфолипазы А2 для профилактики и лечения ТОЛ.

МЕТОДИКА

Исследование проводили на белых беспородных мышах-самцах весом 20—24 г. Животных подвергали ингаляционному воздействию фосгена в дозе 4,0 мг х мин/л, что соответствовало LCt24-100. Использовали следующие ингибиторы ферментов: сериновых протеаз — бензилсульфохлорид; аспартильных протеаз — N-этилмалеинимид; фосфолипазы А2 — а-бромацетофенон и а,п-дибромацето-фенон [1]. Животным вводили растворы исследуемых веществ за 30 мин до (профилактическое применение) или через 10 мин после отравления (лечебное применение). Исследуемые вещества вводили внут-рибрюшинно однократно в дозах, соответствующих 1/10 LD50 каждого из веществ и объеме 0,1 мл на животное. Определение острой токсичности исследуемых веществ проводили общепринятым методом [2], анализ результатов осуществляли с помощью компьютерной программы PROBIT ANALYSIS пакета прикладных программ «ТОКСИ» (РГТИЦ, Санкт-Петербург) для персонального компьютера.

Перед использованием бензилсульфохлорид суспензировали в эмульгаторе Твин-80, затем растворяли в дистиллированной воде, а-бромацетофенон, а,п-дибромацетофенон растворяли в диметилсуль-фоксиде и затем эмульгировали в соевом масле, N-этилмалеинимид растворяли в дистиллированной воде. Животным контрольной группы вводили эквивалентные объемы дистиллированной воды или соевого масла. В качестве препарата сравнения использовали контрикал (250 ЕД/кг) — поливалентный ингибитор ферментов (протеаз), используемый в практической медицине.

Оценивали выживаемость экспериментальных животных и степень отека легких. Величину отека легких определяли по величине легочного коэффициента (ЛК), который рассчитывали через 3 и 24 ч после отравления по формуле:

В работе использовались общепринятые методы параметрической и непараметрической статистической обработки данных. Выживаемости животных

Таблица 1

Острая токсичность бензилсульфохлорида, N-этилмалеинимида, а-бромацетофенона, а,п-дибромацетофенона

Соединения Величина LD50 мг/кг

Бензилсульфохлорид 525,0

N-этилмалеинимид 27,5

бромацетофенон, 27,5

ромацетофенон 27,5

ЛК =

масса легких, г масса животного, г

х 1000.

оценивали с помощью таблиц В.С. Генеса, разработанных для точного метода Фишера [3]. Легочный коэффициент представлен в виде М + т, достоверность отличий оценивали с помощью ^критерия Стьюдента [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты определения токсичности синтезированных соединений представлены в табл. 1. Из приведенных данных видно, что а-бромацетофенон, а,п-дибромацетофенон и Ы-этилмалеинимид являются токсичными соединениями с достаточно низкими значениями ЬЭ50. Для дальнейших исследований использовали дозы 1/10 от ЬЭ50, что соответствует для бензилсульфохлорида — 50 мг/кг, Ы-этилмале-инимида, а-бромацетофенона, а,п-дибромацетофе-нона — 3 мг/кг.

Результаты исследования защитного действия веществ бензилсульфохлорида, Ы-этилмалеинимида, а-бромацетофенона, а,п-дибромацетофенона при профилактическом и лечебном применении представлены в табл. 2 и 3. Установлено, что лечебное применение бензилсульфохлорида, а также профилактическое и лечебное использование Ы-этилмалеинимида приводит к замедлению нарастания ЛК, причем в группе профилактического введения Ы-этилмалеинимида положительный эффект наблюдается как на 3 ч, так и на 24 ч наблюдения. Аналогичным образом действует а,п-дибромацетофенон как при профилактическом, так и при лечебном применении, способствуя замедлению нарастания легочного отека на 24 ч наблюдения. В то же время, а-бромацетофенон оказался неэффективным ни при профилактическом, ни при лечебном применении. Справедливости ради следует заметить, что одновлеменное снижение ЛК и выживаемости животных, наблюдаемые на 24 ч при лечебном использовании препарата а,п-дибромацетофенон, наводит на

Таблица 2

Исследование эффективности бензилсульфохлорида и К-этилмалеинимида при токсическом отеке легких, вызванном отравлением фосгеном

Группа Легочный коэффициент, отн. ед Выживаемость, %

3 ч 24 ч

Контроль, соевое масло, 0,1 мл /мышь 10,6 ± 1,3 16,7 0,8 80 LCt24

Бензилсульфохлорид, в/бр, 50 мг/кг, профилактика 8,8 0,4 16,7 2,0 100

Бензилсульфохлорид, в/бр, 50 мг/кг, лечение 9,2 0,6 14,4 ± 0,7* 100

Ы-этилмалеинимид, в/бр, 3,0 мг/кг, профилактика 8,0 0,5* 13,2 ± 1,2* 100

М-этилмалеинимид, в/бр, 3,0 мг/кг, лечение 7,9 0,2* 15,1 1,2 100

Примечание: *р < 0,05 по отношению к контрольным животным. Таблица 3

Исследование эффективности а-бромацетофенона и а,п-дибромацетофенона при токсическом отеке легких, вызванном отравлением оксидами азота

Группа Легочный коэффициент, отн. ед. Выживаемость, %

3 ч 24 ч

Контроль, соевое масло, 0,1 мл /мышь 10,9 + 0,9 18,4 0,6 0

а, п-дибромацетофенон в/бр, 3,0 мг/кг, профилактика 10,3 + 0,7 15,1 + 1,2* 25

а-бромацетофенон, в/бр 3,0 мг/кг, профилактика 9,5 0,6 18,8 ± 0,6 0

Контроль, соевое масло, 0,1 мл /мышь 8,3 0,5 21,3 ± 1,9 50

а, п-дибромацетофенон в/бр, 3,0 мг/кг, лечение 7,7 0,7 16,3 + 0,9* 25

а-бромацетофенон, в/бр 3,0 мг/кг, лечение 8,8 0,5 18,7 ± 0,4 50

Примечание: *р < 0,05 по отношению к контрольным животным.

мысль о преждевременной гибели животных этой группы по сравнению с животными других экспериментальных групп. В таком случае наблюдаемое снижение ЛК следует расценивать как проявления ухудшения состо-

яния экспериментальных животных и неэффективности применения соединения. Препарат сравнения — контрикал также не оказывал положительного влияния на течение токсического отека легких (табл. 4).

Таблица 4

Исследование эффективности контрикала при токсическом отеке легких, вызванном оксидами азота

Группа Легочный коэффициент, отн. ед. Выживаемость, %

3 ч 24 ч

Контроль, физ. р-р, 0,1 мл/мышь 8,5 ± 0,5 17,9 ± 0,6 0 LCt100

Контрикал, в/бр, 250 ЕД/кг, профилактика 9,8 ± 0,7 20,2 ± 0,5 0

Контрикал, в/бр, 250 ЕД/кг, лечение 10,0 ± 0,6 18,3 ± 1,1 0

Таким образом, выполненные исследования позволили установить, что ингибиторы как сериновых (бензилсульфохлорид), так и аспартильных проте-иназ (Ы-этилмалеинимид) являются эффективными при отравлении оксидами азота, подавляя развитие отека легких и способствуя повышению выживаемости отравленных животных. Ингибиторы фосфоли-пазы А2 (а,п-дибромацетофенон, а-бромацетофе-нон) оказались практически неэффективными при данном отравлении.

Результаты исследования не полностью согласуются с литературными данными об эффективности ингибиторов сериновых протеиназ и фосфоли-пазы А2, которые были установлены на модели отека изолированных легких. Отсутствие эффективности ингибиторов фосфолипазы А2 в экспериментах на животных может быть связано с высокой токсичностью данных веществ для мышей. Возможна и другая причина. До недавнего времени считалось, что в высвобождении арахидоновой кислоты участвует фосфолипаза А2. Однако дальнейшие исследования показали, что в этом процессе такое же или даже большее значение имеет последовательное действие двух ферментов — фосфолипазы С, образующей из фосфолипидов диацилглицерол, и диацилглицероллипазы, превращающей диацилглицерол в моноацилглицерол и жирную кислоту [6].

Полученные данные показывают, что ингибиторы гранулоцитарных протеиназ являются более эффективными при токсическом отеке легких, чем препарат сравнения контрикал. По всей видимости, это может быть связано с неспецифичностью действия контрикала по отношению к различным протеина-зам. Контрикал инактивирует протеазы плазмы крови, клеточных элементов и тканей, в том числе пепсин, химотрипсин, калликреин, которые играют важную роль в развитии физиологических реак-

ций [4]. В то же время, он не является ингибитором таких гранулоцитарных протеиназ , как эластаза, коллагеназа, желатиназа и др.

Таким образом, результаты фармакологического исследования позволяют заключить, что протеи-назы играют определенную роль в развитии токсического отека легких, вызванного отравлением оксидами азота. Можно предположить также, что создание нетоксичных ингибиторов протеиназ и включение их в схему неотложной терапии отравлений поможет увеличить эффективность лечения некардиогенного отека легких. Проблема применения ингибиторов фосфолипазы А2 при терапии токсического отека легких, вероятно, может быть решена после создания менее токсичных соединений. Следует так же отметить очень плохую растворимость этих соединений, за исключением малеини-мида, что негативным образом сказывается на биологической доступности. Это само по себе может быть причиной недостаточной эффективности препаратов. Вместе с тем, положительные результаты говорят о целесообразности дальнейших исследований в этом направлении.

ВЫВОДЫ

1. Установлена эффективность профилактического и лечебного применения ингибиторов протеиназ нейтрофилов при токсическом отеке легких, вызванном фосгеном.

2. Лечебное и в меньшей степени профилактическое применение ингибиторов протеаз позволяет уменьшить выраженность отека легких у мышей, отравленных фосгеном.

3. Эффективность синтезированных ингибиторов протеаз превышает эффективность препарата сравнения контрикала.

4. Полученные результаты позволяют говорить об участии протеаз гранулоцитов в патогенезе отека легких, вызванного фосгеном.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антоняк Г.Л. Роль протеолитических ферментов в функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов // Усп. совр. биол. — 1999. — Т. 119, № 5. — С. 476-486.

2. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. — Рига: АН Латв. ССР, 1959. — 111 с.

3. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение критериев непараметрической статистики в медико-биологических исследованиях. — Л., 1965. — 59 с.

4. Зарубина И.В., Болехан А.В., Шабанов П.Д. Патогенетические механизмы и пути фармакологической коррекции пневмоний // Психофармакол. биол. наркол. — 2006. — Т. 6, № 1-2. — С. 1130-1138.

5. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Усп. совр. биол. — 1999. — Т. 119, № 5. — С. 440-450.

6. Иммунология: в 3-х т.: Пер. с англ. / Под ред. У. Пола. — М.: Мир, 1989. — Т. 3. — 360 с.

7. Мотавкин П.А., Гельцер Б.И. Клиническая и экспериментальная патофизиология легких. — М.: Наука, 1998. — 366 с.

8. Тверская М.С., Липатова В.А., Банин В.В. и др. Окислительный метаболизм нейтрофильных полиморфно-ядерных лейкоцитов при экспериментальной массивной легочной эмболии // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1994. — № 12. — С. 640-644.

Torkunov P.A. Study of the role of neutrophyle proteases in development of toxic lung oedema // Psychopharmacol. Biol. Narcol. — 2007 — Vol. 7, N 1. — P. 1448-1452.

Research and Probationary Center of Medical and Biological Defense, State Research and Probationary Institute of Military Medicine; Saint-Petersburg, Russia.

Summary: In phosgene-induced toxic lung oedema model, the preventive and curative effects of inhibitors of neutrophyl proteases in mice was established. The following inhibitors of neutrophyl proteases were used: serine proteases — benzylsulfochloride, aspartate proteases — N-ethylmaleinimid, phospholipase A2 — a-bromacetophenon and a,n-dibromace-tophenon. The curative and in the less degree preventive administration of inhibitors of neutrophyl proteases decreased the degree of the toxic lung oedema. The efficacy of inhibitors of neutrophyl proteases was higher than the one of contrical. The data obtained shows that granulocyte proteases play an important role in pathogenesis of the toxic lung oedema induced by phosgene.

Key words: neutrophyl proteases; toxic lung oedema; phosgene

электронная копия статьи — http://www.elibrary.ru, © Архив