Динамика активности некоторых компонентов комплемента при лечении атопического дерматита у детей

Вопросы диагностики

Динамика активности некоторых компонентов комплемента при лечении атопического дерматита у детей

С. С. Андина1, А. М. Бичучер1, Н. В. Гора1, Л. В. Козлов1, О. В. Логунов1, О. А. Башкина2, О. В. Рубальский2, В. А. Алешкин1

Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского1, Астраханская государственная медицинская академия2

Разработаны иммуноферментные методы определения функциональной активности компонентов С3, С9 и С1 ингибитора системы комплемента для решения диагностических и прогностических задач при лечении больных. Исследованы активности этих компонентов, а также активности и количества С1 ингибитора в сыворотках крови детей в возрасте от 6 месяцев до 1 8 лет, больных атопическим дерматитом, до и после лечения для выяснения участия системы комплемента в патогенезе этого заболевания. Разработанные методы иммуноферментного анализа для определения функциональной компонентов системы комплемента показали высокую чувствительность и надежность. У детей с атопическим дерматитом активность компонента С9, участвующего в мембранной атаке комплемента была существенно ниже нормы, что указывает на участие компонентов мембрано-атакующего комплекса в осуществлении некротических процессов в области кожных поражений. Снижена была также активность компонента С3 ключевого компонента каскада активации, участвующего в процессах воспаления. До и в ходе лечения больных удельная активность С1 ингибитора была повышена, что свидетельствовало о повышенном биосинтезе этого белка, являющегося белком острой фазы. Прослеживаются позитивные сдвиги в сторону нормализации статуса комплемента после лечения. Полученные в работе данные указывают на участие системы комплемента в патологическом процессе при ато-пическом дерматите у детей.

Ключевые слова: система комплемента, компонент С3, компонент С9, С1 ингибитор, атопический дерматит

Dynamics of Activity of Some Components of Complement in Treatment of Atopic Dermatitis in Children

S. S. Andina1, A. M. Bichucher1, N. V. Gora1, L. V. Kozlov1, O. V. Logunov1, O. A. Bashkina2, O. V Rubalsky2 , V A. Aleshkin1

Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky1 Astrahan State Medical Academy2

The article describes immunoassay methods of determining the functional activity of the components C3 and C9 and C1 inhibitor for diagnostic and prognostic purposes in the treatment of patients. The activity of these components, as well as the activity and the amount of C1 inhibitor in the blood serum of children aged 6 months to 1 8 years suffering from atopic dermatitis have been analyzed before and after treatment to determine the involvement of the complement system in the pathogenesis of this disease. The developed methods of enzyme immunoassay for determination of the functional components of the complement system have shown high sensitivity and reliability. The activity of C9 component involved in the membrane attack of the complement was significantly below normal in children with atopic dermatitis. That indicates the involvement of membrane attack complex components in the skin necrotic processes. Component C3 activity is also reduced. C3 is the key component of the activation cascade involved in the inflammatory processes. Specific activity of C1 inhibitor increased before and during the treatment, indicating an increased biosynthesis of this acute phase protein. Positive tendency towards the normalization of the status of complement after treatment has been observed. Data obtained in this study indicate the involvement of complement system in the pathological process of atopic dermatitis in children. Key words: system of complement, component C3, component C9, C1 inhibitor, atopic dermatitis

Контактная информация: Козлов Леонид Васильевич — главный научный сотрудник ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского, профессор, доктор биологических наук; 1252 1 2, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10; 452-38-01, lvkozlov@mail.ru.

УДК 616.5-08

Два важных патогномоничных фактора атопического дерматита: воспаление и кожные проявления не могут не отражаться на состоянии системы комплемента, а динамика изменения статуса комплемента может характеризовать этапы выздоровления больного в ходе терапии. Однако имеющиеся на сегодняшний день данные о количественных изменениях компонентов комплемента в сыворотках крови больных атопическим дерматитом часто противоречивы и, кроме того, относятся в большинстве случаев лишь к количественной характеристике, но не к определению изменений функциональной активности компонентов комплемента.

Исходя из этого были разработаны новые иммуноферментные методы определения функциональной активности компонентов С3, С9 и С1 ингибитора. Такой выбор обусловлен тем, что активность компонента С3 и его потребление в ходе патологического процесса характеризует реакцию воспаления, что хорошо известно; удельная активность С1 ингибитора, как нами было показано ранее [1], является маркером острофазного состояния больного, а компонент С9 является ключевым белком мембра-ноатакующего комплекса и обязан участвовать в процессах некроза и апоптоза.

В литературе имеются противоречивые сведения о содержании компонента С3 и С1 ингибитора в сы-

воротке крови больных атопическим дерматитом. Было обнаружено значительное повышение содержания этих белков [2, 3]. Снижение активности С3 показано в работах [4, 5]. Никаких изменений активности С1 ингибитора не было обнаружено в работе [6]. Что касается компонента С9, то его количество у больных с аллергическими заболеваниями кожи часто имело повышенный уровень [7].

Материалы и методы исследования

Мы использовали 96-луночные плоскодонные микропанели с повышенной сорбционной емкостью (Биомедикал, Россия), Твин-20 (Sigma, США), пероксидазу хрена (Диаэм, Россия), 3,3',5,5'-тетра-метил-бензидин (Medac, Германия), козьи поликло-нальные IgG антитела к компоненту C3 человека (Sigma, США), козьи поликлональные IgG антитела к компоненту C9 человека (Sigma, США), аптечный препарат тромбина, аптечный препарат дерината, набор для определения С1 ингибитора (ООО Цито-кин, Санкт-Петербург).

Объектом исследования являлись дети в возрасте с 6 месяцев до 18 лет, больные атопическим дерматитом, проходившие обследование в отделении аллергологии ГУЗ «Областная детская клиническая больница им. Н. Н. Силищевой» г. Астрахани. Было проведено полное клинико-лабораторное обследование соответственно стандартам диагностики ато-пического дерматита с неосложненным течением заболевания и при наличии вторичного инфицирования у 98 детей в возрасте от 6 мес. до 7 лет. Лечение среднетяжелого атопического дерматита, как при наличии, так и при отсутствии вторичной инфекции, проводилось соответственно стандарту [8] с использованием антибиотиков: линкомицина, сума-меда, рулида, мази тридерм и антигистаминного препарата тавегила, согласно инструкциям по применению и в соответствии с возрастом больного.

Определение количества С1 ингибитора проводили с помощью набора (ООО Цитокин, Санкт-Петербург).

Определение функциональной активности С1 ингибитора. Растворяют препарат тромбина в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, с конечной концентрацией 15—50 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М №С1, 0,15 мМ Са2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS2+), по 200 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 1 00 мкл

VBS2+. В лунки планшета каждого ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый С1 ингибитор в VBS2+, в виде прогрессивных двукратных разведений. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М МаС1 и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С1-ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фос-фатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15—30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество компонента О ингибитора рассчитывают по стандартной кривой.

Определение функциональной активности компонента C3. Растворяют аптечный препарат дерина-та в вероналовом буферном растворе, рН 7,4, содержащем 0,15 М №С1, 0,15 мМ Са2+ и 0,5 мМ Mg2+, в концентрациях 10—150 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Содержимое лунок выливают, отмывают планшет тем же буфером, затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBS2+, содержащего 10 мкл реагента R3 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С3), и анализируемую пробу, содержащую компонент С3 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М №С1 и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т) и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента СЗ человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5—10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектро-

Таблица 1. Активность компонентов С3 и С9 в сыворотках 67 детей с атопическим дерматитом до и после лечения

C3, мг/мл, до лечения 0,80 ± 044 Норма 1,20

C3, мг/мл, после лечения 0,87 ± 0,39

C9, мкг/мл, до лечения 24,0 ± 11,5 Норма 61,1

C9, мкг/мл, после лечения 25,0 ± 15,5

фотометра с вертикальным лучом измерением све-топоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С2 рассчитывают по стандартной кривой.

Определение функциональной активности компонента С9. Растворяют аптечный препарат дерина-та в вероналовом буферном растворе, рН 7,4, содержащим 0,15 М №С1, 0,15 мМ Са2+ и 0,5 мМ Мд2+, в концентрациях 10—100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Содержимое лунок выливают, трижды отмывают планшет тем же буфером, затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора VBS2+, содержащего препарат морской свинки в количествах, соответствующих 0,05 мкл сыворотки морской свинки, и анализируемую пробу, содержащую компонент С9 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М №С1 и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 1 00 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С9 человека в том же бу-

Удельная активность, отн. ед.

1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1

этапы лечения

до во время после

Рисунок 1. Изменение удельной активности С1 ингибитора

фере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбен-зидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5—10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением све-топоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С9 рассчитывают по стандартной кривой.

Результаты и их обсуждение

В настоящее время доступны лишь методы определения количественного содержания отдельных компонентов системы комплемента человека. Для определения активности компонентов остается пользоваться лишь гемолитическими методами, имеющими много недостатков и неудобств применения. Между тем определение лишь количественного содержания компонентов малоинформативно. Основная задача, ставившаяся при разработке методов определения функциональной активности, была — использовать доступные реагенты для инициации процесса иммуноформентного определения. Так, для связывания активного С1 ингибитора вместо труднодоступного субкомпонента С1 s применили аптечный препарат тромбина, а в качестве активатора классического пути при определении С3 и С9 вместо иммуноглобулинов использовали аптечный препарат деринат.

Определение активности компонентов С3, С9 и С1 инг в сыворотках крови детей, больных атопиче-ским дерматитом до лечения и у тех же детей в ходе и после лечения, дало следующие результаты.

В отличие от литературных данных, приведенных выше, для С1 инг, мы наблюдали пониженные уровни количества и повышенные уровни активности, что отражалось на уровнях удельной активности этого белка и объяснялось более высокой скоростью оборота ингибитора, обусловленного повышенным биосинтезом в состоянии острой фазы больного. Динамика этих изменений, показанная на рис. 1, свидетельствует о снижении острофазности и нормализации состояния к концу лечения.

Проведены определения активностей компонентов С3 и С9 в сыворотках крови 67 больных детей. Содержание активного С3 в норме принято за 1,2 мг/мл в соответствии с литературными данными [9]. Для получения значений нормальной активности С9 было проведено ее определение в сыворотках крови

Количество больных

12 10 8 6 4 2

0,5

До лечения

1,5 2 С3, мг/мл

— После лечения

Рисунок 2. Гистограмма распределения активности компонента С3 в сыворотках больных

12 10 8 6 4 2

Количество больных

ч/\ „ А

V

20 40

До лечения

С9, мкг/мл

60 80 После лечения

Рисунок 3. Гистограмма распределения активности компонента С9 в сыворотках больных (67 детей) до и после лечения

0

0

0

0

15 здоровых взрослых людей. Получено значение 61,1 ± 21,5 мкг/мл, что выше значений количественного содержания 44,5 ± 10,6 мкг/мл (29 человек) в работе [7].

Согласно полученным результатам активность обоих компонентов и до и после лечения была ниже нормы, что свидетельствовало о потреблении этих компонентов в ходе патологического процесса. Снижение активности компонента С3 характерно для процесса воспаления. Существенное снижение активности С9 может быть обусловлено участием в процессах некроза и апоптоза.

По данным таблицы 1, небольшое повышение активностей этих компонентов комплемента после лечения статистически не достоверно, однако характер гистограмм (рис. 2, 3) распределения активностей в сыворотках крови позволяет говорить о положительной динамике активностей.

Выводы

Разработаны новые удобные иммунофермент-ные методы определения функциональной активности компонентов С3, С9 и С1 ингибитора системы комплемента с использованием доступных аптечных препаратов тромбина для связывания С1 ингибитора и дерината для активации классического пути комплемента. Методы применены для характеристики состояния ключевых компонентов системы в сыворотках крови детей в возрасте от 6 месяцев до 18 лет, больных атопическим дерматитом, до и после лечения.

Показано, что у детей с атопическим дерматитом активность компонента С9 была существенно ниже нормы, что может свидетельствовать об участии компонентов мембраноатакующего комплекса в осуществлении некротических процессов в области кожных поражений. Снижена была также активность компонента С3, участвующего в процессах воспаления. До и в ходе лечения больных удельная активность С1 ингибитора была повыше-

на, что свидетельствовало об усилении биосинтеза этого белка острой фазы. Прослеживаются позитивные сдвиги в сторону нормализации статуса комплемента после лечения. Полученные в работе данные указывают на участие системы комплемента в патологическом процессе при атопическом дерматите у детей.

Литература:

1. Активность комплемента при коклюше / О.Н. Кулешина и др. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 201 3. — Т. 69. — № 2. — С. 46—51.

2. A. Kapp. Involvement of complement in psoriasis and atopic dermatitis — measurement of C3a and C5a, C3, C4 and C1 inactivator / A. Kapp, H. Wokalek, E. Schöpf / / Arch. Dermatol. Res. — 1985. — V. 277. — № 5. — P. 359—361.

3. L. Lugovic. Values of complement, T- and B-lymphocytes and immune complexes in patients with skin allergies / L. Lugovic, J. Lipozencic // Acta Med. Croatica. — 1998. — V. 52. — № 4—5. — P. 203—208.

4. J. Ring. Plasma complement and histamine changes in atopic dermatitis. / J. Ring, T. Senter, R.C. Cornell, C.M. Arroyave, E.M. Tan // Br. J. Dermatol. — 1 979. — V. 1 00. — № 5. — P. 521—530.

5. Ю.В. Сергеев. Атопический дерматит. 2. Состояние комплементарных блоков и патогенетическая роль анафила-токсинов С4а, СЗа и С5а / Ю.В. Сергеев, Ю.П. Резников, Е.В. Лобанова, Н.С. Пименова // Вестн. дерматол. — 1989. — № 4. — С. 4—7.

6. K. Obtutowicz. Immunoglobulin E and complement in patients with contact allergy to nickel suffering from atopic and contact eczema / K. Obtutowicz, M. Kapusta, G. Antoszc-zyk, A. Obtutowicz // Przegl. Lek. — 2002. — V. 59. — № 6. — P. 427—429.

7. S. Kawachi-Takahashi. Determination of serum C9 level by immunodiffusion. Elevation in patients with infectious or allergic skin diseases / S. Kawachi-Takahashi, K. Tanaka, M. Takahashi, T. Kawashima, K. Shimada // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. — 1975. — V. 48. — № 2. — P. 161 — 170.

8. Стандарт медицинской помощи больным атопическим дерматитом. Приказ № 432 от 30.05.2006 Минздрав-соцразвития.

9. A.F. Hallett. Complement activation in Staphylococcus aureus bacteraemia / A.F. Hallett, R. Cooper / / Clin. exp. Immunol. — 1980. — V. 40. — P. 306—311.