Способ адаптации неукорененных микропобегов растений разных таксономических групп к нестерильным условиям ex vitro
METHOD FOR ADAPTING NON-ROOTED MICROSHOOTS OF PLANTS OF DIFFERENT TAXONOMIC GROUPS TO NON-STERILE EX-VITRO CONDITIONS

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, и может быть использовано для получения высококачественного посадочного материала.
В настоящее время особое внимание уделяется получению высококачественного посадочного материала растений различных таксономических групп. Это связано с тем, что не для всех растений разработаны современные высокоэффективные технологии размножения. Перспективным методом размножения является клональное микроразмножение, которое уже в промышленных масштабах применяется в Нидерландах, Италии, Канаде, Польше, Эквадоре и других странах мира. В Российской Федерации исследования в этом направлении, как правило, проводятся в лабораторных условиях, и только для некоторых плодово-ягодных культур, а также для картофеля.
Для большинства растений, особенно для кустарниковых, древесных лиственных и хвойных культур, отечественные разработки показывают не эффективность применения данного метода с точки зрения коммерческого применения, за счет больших издержек на используемое оборудование, расходные материалы и химические компоненты. Кроме того, для каждого генотипа необходимо разрабатывать индивидуальные питательные среды, учитывая их физиологические и биологические особенности.
Многочисленные исследования показывают, что одним из трудоемких этапов, от которых зависит успех клонального микроразмножения, является адаптация укоренившихся микропобегов к условиям ex vitro. Перевод микроклонов в нестерильные условия нередко бывает затруднен, растения претерпевают стресс при переводе их из условий in vitro в условия ex vitro, что приводит к высокой гибели растений-регенерантов. Кроме того, в условиях in vitro микроклоны имеют слабо развитую корневую систему, не функциональный устьичный аппарат и плохо развитую кутикулу. Дополнительная гибель микроклонов ex vitro обусловлена также использованием нестерильного почвенного субстрата. В этих условиях возможно развитие бактерий, грибов, а иногда и насекомых паразитов при благоприятной температурной и влажностной среде.
Эффективность адаптации растений к условиям ex vitro в значительной степени определяется правильным выбором питательного субстрата. Процент адаптированных растений к нестерильным условиям зависит в первую очередь от контроля за потерей и поглощением воды растениями. К сожалению, корневая система растений, размноженных in vitro, не обеспечивает потребности растения в воде после пересадки их в нестерильные условия, что может приводить к гибели микроклонов. Поэтому состав субстрата необходимо подбирать для каждого вида и сорта растений.
В настоящее время известны способы укоренения микрорастений на питательной среде in vitro с последующей их адаптацией ex vitro с применением почвенных и искусственных субстратов (патенты RU №2366153, №2483530, №2659237, №2731053, №2754733). Предлагаемые способы предусматривают адаптацию микроклонов в почвенных и искусственных субстратах, состоящих из органической основы (кора хвойных пород, торф, компост, древесные опилки). Недостатком этих технологий является более длительные сроки получения адаптированных растений, высокая трудоемкость и высокие экономические затраты на получение высококачественного посадочного материала.
Известен также способ адаптации растений, полученных in vitro, в культивационных сооружениях (теплицах, пленочных тоннелях) в атмосфере искусственного тумана с частичной адаптацией растений на этапе in vitro. В качестве субстрата использовали смесь торфа с песком в соотношении 2:1, перлит, смесь торфа с перлитом (Деменко В.И., Лебедев В.А. Адаптация растений, полученных in vitro, к нестерильным условиям // Известия ТСХА. -2011. - №1. - С. 60-70). Использование крезацина, мивала, культара, структурной среды, капиллярных трубок и двойного покрытия сосудов обеспечивали частичную адаптацию in vitro, повышая жизнеспособность растений в нестерильных условиях. Недостатком данного способа является то, что предлагаемый способ сложен в исполнении и требует проведения многоступенчатой адаптации сформировавшихся растений.
Известен другой способ адаптации микрорастений к условиям in vivo, предусматривающий постепенную адаптацию к воздушно-газовому режиму. (Иванова-Ханина Л.В. Адаптация растений-регенерантов ежевики к условиям ex vitro// Ученые записки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Биология. Химия. - 2019. - Т. 5 (71).- №1. - С. 30-39). Отобранные микроклоны в течение 5 или 10 суток выдерживали с приоткрытым покрытием (ватно-марлевые пробки или ватные диски). При высадке микроклонов в субстрат после 5 суток культивирования с приоткрытой пробкой уровень приживаемости составил 38,3%, а после 10 суток - 54,2%. Приживаемость растений, высаженных после 5 суток культивирования с приоткрытым ватным диском, составила 72,0%, после 10 суток - 82,0%. Приживаемость растений, высаженных из культивационных сосудов, покрытых ватными дисками, в условиях ex vitro варьировала от 62,5 до 92,0% в зависимости от субстрата, тогда как приживаемость регенерантов из культивационных сосудов, по крытых ватно-марлевой пробкой, была значительно ниже (37,5-54,2%). Наиболее высокий уровень приживаемости микроклонов ежевики сорта «Triple Crown» отмечен при использовании трехкомпонентного субстрата (торф, перлит, почва) в соотношении 2:1:1. Недостатком данного способа является то, что предлагаемый способ разработан только для определенных сортов ежевики и не гарантирует его эффективное применение для растений разных таксономических групп.
Известен также Способ клонального микроразмножения сортов ирги ольхолистной (Amelanchier alnifolia (Nutt.) Nutt. Ex M.Roem.) (патент RU №2732450 С1, 16.09.2020), взятый в качестве прототипа. Способ включает стерилизацию апикальных и латеральных почек с последующим культивированием на питательной среде, размножение микропобегов, их укоренение и адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и последующего доращивания получают стандартные саженцы сортов ирги ольхолистной с закрытой корневой системой. Однако данный способ является довольно неудовлетворительным из-за их низкой эффективности, связанной слабым ростом растений в начальной и последующей фазах развития в нестерильных условиях.
Анализ известных технических решений показал, что технической проблемой в данной области является необходимость создания высокоэффективной технологии, адаптации микроклонов к условиям ex vitro для получения высококачественного посадочного материала растений разных таксономических групп.
Технический результат предлагаемого изобретения - обеспечение высокого коэффициента размножения растений при снижении трудоемкости процесса.
Для решения указанной проблемы и получения заявленного технического результата в способе адаптации микропобегов растений разных таксономических групп к нестерильным условиям ex vitro, включающем их размножение in vitro, последующее укоренение и адаптацию к условиям ex vitro, которые осуществляют одновременно, в условиях аэропонной системы с орошением корневой зоны раствором микроэлементов и подсветкой растений светодиодными лампами с регулируемым спектром освещения и интенсивностью до 150 μmol/ m2/с, при 16-часовом фотопериоде.
Способ позволяет быстро адаптировать неукоренившиеся микроклоны растений разных таксономических групп к условиям ex vitro, за счет их выращивания в воздушной среде без использования почвы, при котором питательные вещества доставляются к базальной части неукорененных микроклонов в виде аэрозоля (аэропоника). При этом укоренение и адаптацию микроклонов осуществляют одновременно, а не последовательно, то есть не выделяют стадию укоренения. Для адаптации используют аэропонную 2-х ярусную систему «Ферма» с фитоосвещением на 240 посадочных мест с системой орошения корневой зоны черенков раствором микроэлементов, а в качестве объектов для адаптации используют неукорененные микроклоны, полученные in vitro.
Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.
Объектом исследования были неукоренившиеся микроклоны Heuchera hybrida (L.), Syringa vulgaris (L.), Echinacea purpurea (L.), Rubus idaeus (L.), Rubus caesius (L.), Vitis vim/era (L.), Chrysanthemum indicum (L.), Mentha piperita (L.), Hedyotis salzmannii (L.), Alternanthera reineckii (L.).
Неукорененные микроклоны первоначально были получены на среде Мурасига и Скуга (МС), содержащей БАП в концентрации 1 мг/л и ИУК в концентрации 0,5 мг/л. Микроклоны культивировали в культуральных сосудах в световой комнате, где поддерживалась температура 23°С, 16-часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами, интенсивность освещения 3-3,5 тыс.лк. Полученные микроклоны вынимали из сосудов, отмывали от остатков агаризованной среды под проточной водой и помещали в неопреновые держатели, которые закрепляли в аэропонной 2-х ярусной системе «Ферма» с фитоосвещением и заполняли раствором микроэлементов.
Для укоренения и адаптации применяли гранулированное минеральное удобрение «Растворин» (Россия), в состав которого включены: калий (от 18 до 28%), азот (8-18%), фосфор (5-18%), марганец 0,1%, бор 0,01%, медь 0,01%, цинк 0,01%, молибден 0,001%. Кроме удобрения «Растворин» в систему добавляли 3 жидких комплексных минеральных удобрения марки General Hydroponics серии FloraSeries - FloraGrow, FloraBloom, FloraMicro, a также в раствор добавляли индолилмасляную кислоту (ИМК) в концентрации 2 мг/л.
0,5
max
0,5
max
2
При выращивании неукорененных микроклонов в условиях аэропоники использовали светодиодную подсветку, которая располагалась равномерно по ярусам. В качестве подсветки использовали светодиодные лампы красного (Δλ=646÷674 nm, λ=660 nm) и синего (Δλ=452÷477 nm, λ=465 nm) спектра с интенсивностью до 150 μmol/m/с и 16-часовой фотопериод.
Для оценки эффективности применения аэропоники при адаптации микроклонов с одновременным их укоренением учитывали: укореняемость микроклонов (%), приживаемость (%), интенсивность роста вегетативной и корневой части микроклонов (I), скорость роста побегов и корней (μ).
Экспериментально установлено, что для исследуемых растений разных таксономических групп установлены общие закономерности в процессах укоренения и адаптации микроклонов: 1 - можно использовать при адаптации на аэропонике неукорененные микроклоны. Формирование корневой системы наблюдается уже на 4-6 сутки с момента переноса микроклонов в неопреновые держатели, которые закрепляли в аэропонной 2-х ярусной системе «Ферма». Данный эффект не достигается при использовании почвенного субстрата. При адаптации неукорененных микроклонов в почвенном субстрате, отмечали гибель растений уже на 3-й сутки; 2 - наблюдается высокий процент приживаемости растений к нестерильным условиям. Например, гибель изучаемых растений в условиях аэропоники в среднем составила 1.8-3.5%, в то время как в контрольном варианте (почвенный субстрат) этот показатель составил 14.9-23.9%; 3 - в условиях аэропоники отмечается интенсивный рост микроклонов и заметное увеличение вегетирующей биомассы и корневой системы растений. Показано, что применение аэропоники оказало положительное влияние на индекс роста микроклонов (I) и их удельную скорость (μ). Данные показатели были в 1,5-2 раза выше по сравнению с контрольным вариантом.
Предлагаемый способ адаптации микроклонов растений разных таксономических групп к условиям ex vitro сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической работе:
1. Предлагаемый способ позволяет получать посадочный материал высокого качества, так как снижается процент гибели растений, увеличивается рост и развитие зеленной массы, а также корневой системы.
2. Предлагаемый способ позволяет проводить укоренение и адаптацию микроклонов одновременно, а не последовательно, сокращая сроки получения посадочного материала.
3. Технология предполагает проведение работ в лабораторных условиях не зависимо от сезона.
4. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогого оборудования.
Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам адаптации микроклонов разных таксономических групп.
Использование изобретения позволит снизить процент гибели растений размноженных in vitro, увеличит рост и развитие зеленной массы и корневой системы ex vitro, что дает возможность получать посадочный материал высокого качества с наименьшими трудозатратами.