УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНОГО ИНДЕКСА В ВОДНЫХ СРЕДАХ

3
Устройство для определения фенольного индекса в водных средах относится к области экологического мониторинга окружающей среды и может быть использовано для оценки состояния поверхностных вод и контроля процессов очистки сточной воды от летучих фенолов, составляющих фенольный индекс - количество летучих фенолов (в мкг/дм). Продолжительность стандартного метода составляет 6 часов [ПНДФ 14.1:2.105-97. Методика выполнения измерений массовой концентрации летучих фенолов в природных и очищенных сточных водах фотометрическим методом после отгонки с водяным паром. - М.: 1997. - 19 с.], поэтому растет потребность в разработке экспресс-анализаторов.
3
3
Известно устройство для экспресс-определения летучих фенолов, которое представляет собой биосенсорную систему на основе физико-химического преобразователя и иммобилизованного биоматериала, зафиксированного на поверхности кислородного электрода с помощью нейлоновой сетки. [Кувичкина Т.Н. и др. Окисление фенола и катехола иммобилизованными клетками актинобактерий Rhodococcus gordoniae Leto // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2019. - №4. - С. 28-38.]. Устройство содержит физико-химический преобразователь на основе кислородного электрода Кларка и иммобилизованный биоматериал - бактерии Rhodococcus gordoniae Leto, иммобилизованные на хроматографической стеклобумаге, нейлоновую сетку. Устройство позволяет определять фенольные соединения в диапазоне концентраций от 4,7 до 47 мг/дм, срок эксплуатации составил 9 суток, время анализа от 15 до 20 минут и помимо фенола устройство регистрирует окисление 9 субстратов. Существенным недостатком устройства является высокая нижняя граница определяемых концентрация (4,7 мг/дм), не позволяющая проводить анализ проб с содержанием фенола на уровне предельно-допустимых концентраций [СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества].
T
3
-3
3
Наиболее близким по своим признакам, принятое за прототип, является устройство для экспресс-мониторинга фенольного индекса [Лаврова Т.В. и др. Адаптация бактериальных штаммов Pseudomonas putida BS394 (pBS216) и Pseudomonas veronii DSM 11331 как основа формирования биосенсора для определения фенольного индекса // экотоксикология-2021. - 2021. - с. 122-124.]. Устройство содержит пластмассовый корпус, в его полости располагается платиновый проводник, погруженный в угольную пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, рабочая поверхность покрыта редокс-слоем - модифицированной угольной пасты на основе ферроцена, далее нанесен слой иммобилизованных адаптированных к фенолу бактерий Pseoudomonas putida BS394 (pBS216), которые зафиксированы диализной мембраной с помощью пластикового кольца. Бактерии Pseudomonas putida BS394 являются носителем нафталиновой плазмиды (pBS216), которая обеспечивает процесс биодеградации нафталина, оказывая детерминирующие окисление этого соединения до метаболитов цикла Кребса, и оказывает положительное влияние на процесс окисления ароматических соединений. Устройство позволяет определять фенол в концентрациях от 0,5 мг/дм, время анализа одной пробы составляет 15 минут, долговременная стабильность - 8 суток, коэффициент чувствительности, составляет 4,9±0,3⋅10 мкА⋅дм/мг, число регистрируемых субстратов 16, включая легкоокисляемые субстраты, не входящие в фенольный индекс, долговременная стабильность составила 8 суток. Замена физико-химического преобразователя с кислородного электрода на модифицированный угольно-пастовый электрод позволяет работать при более низких потенциалах, определяемых свойствами электроактивных частиц редокс-слоя - ферроцена. Использование иммобилизованных адаптированных к фенолу бактерий Pseudomonas putida BS394 (pBS216) позволяет определять более низкие значения фенольного индекса.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является улучшение технических характеристик устройства для определения фенольного индекса в водных средах, в частности снижение нижней границы определяемых значений фенольного индекса.
Данная задача решается за счет того, что заявленное устройство для определения фенольного индекса в водных средах содержит пластмассовый корпус, платиновый проводник, погруженный в угольную пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, рабочая поверхность покрыта редокс-слоем, на поверхность электрода нанесен слой иммобилизованных адаптированных к фенолу бактерий Pseoudomonas putida BS394 (pBS216), которые зафиксированы диализной мембраной с помощью пластикового кольца, причем в качестве редокс-слоя используют композитный материал на основе углеродных нанотрубок и модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина.
На фигуре показано устройство для определения фенольного индекса в водных средах. В табл. представлены характеристики прототипа и заявляемого устройства для определения фенольного индекса в водных средах.
3
3
-3
3
-3
3
Технический результат заявляемого устройства заключается в улучшении технических характеристик, за счет увеличения долговременной стабильности с 8 суток (прототип) до 11 суток (заявляемое техническое решение), сужение спектра окисляемых субстратов с 16 веществ (прототип) до 5 (заявляемое техническое решение), снижения нижней границы 0,5 мг/дм (прототип) до 0,001 мг/дм, время анализа с 15 минут (прототип) до 10 минут (заявляемое техническое решение), увеличение коэффициента чувствительности с (4,9±0,3)⋅10 мкА⋅дм/мг (прототип) до (5,8±0,2)⋅10 мкА⋅дм/мг (заявляемое техническое решение).
Увеличение чувствительности (снижение нижней границы определяемых концентраций и увеличение коэффициента чувствительности) с одной стороны связано с улучшением электронной проводимости за счет введение в состав редокс-слоя углеродных нанотрубок, регистрируемый аналитический сигнал приобретает более высокие значения, и, таким образом, повышается чувствительность определения фенольного индекса. С другой стороны, за счет введения в состав редокс-слоя модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина повышается эффективность электронного переноса: ковалентносвязанный ферроцен непосредственно на более близком расстоянии может встраиваться в полиферментативную систему бактерий и, таким образом, ускоряет перенос электронов, образующихся в результате протекания ферментативных реакций.
Увеличение долговременной стабильности обусловлено использованием в составе редокс-слоя модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина. Ковалентное связывание медиатора предотвращает вымывание редокс-частиц ферроцена. Изменение числа окисляемых субстратов заявляемым техническим решением связано с изменением природы медиатора электронного транспорта в редокс-слое. Повышение экспрессности анализа обусловлено использованием в составе редокс-слоя углеродных нанотрубок и модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина: углеродные нанотрубки повышают константу скорости гетерогенного переноса электронов с молекулы ковалентносвязанного ферроцена на электрод, благодаря чему перенос электронов происходит на порядок быстрее, чем в редокс-слое на основе чистого ферроцена.
Заявляемое устройство состоит из следующих элементов: пластмассового корпуса 1, платинового проводника 2, угольной пасты 3 содержащей минеральное масло и графитовую пудру, редокс-слоя 4 композитного материала на основе углеродных нанотрубок и модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина, иммобилизованных адаптированных к фенолу бактерий Pseoudomonas putida В S394 (pBS216) 5, диализной мембраны 6 и пластикового кольца 7.
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является улучшение характеристик устройства: сужение субстратной специфичности, увеличение чувствительности (снижение нижней границы и увеличение коэффициента чувствительности) и долговременной стабильности, что связано с использованием редокс-слоя композитного материала на основе углеродных нанотрубок и модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина.
3
Устройство для определения фенольного индекса в водных средах собирают следующим образом: готовят угольную пасту 3 следующего состава: ферроцен - 10 мг, растворенный в 500 мкл ацетона, графитовая пудра - 90 мг, минеральное масло - 40 мкл. Угольной пастой заполняют пластмассовый корпус 1. Платиновый проводник 2 погружают в графитовую пасту. Затем на поверхность электрода модифицируют редокс-слоем 4, для этого поверхность покрывают 10 мкл суспензии углеродных нанотрубок 250 мг/мл. Модифицированный ферроценкарбоксальдегидом бычий сывороточный альбумин массой 0,0035 г растворяют в 50 мкл фосфатного буфера (рН=6,8) и добавляют 7,5 мкл глутарового альдегида и через 10 секунд в количестве 10 мкл добавляют к нанесенному слою углеродных нанотрубок. Редокс-слой 4 в виде композитного материала на основе углеродных нанотрубок и модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина высушивают при комнатной температуре. Поверх редокс-слоя наносят суспензию бактерий Pseudomonas putida BS394 (pBS216) объемом суспензии с общим титром 330 мг/см, 10 мкл 5, высушивают и закрепляют на электроде диализной мембраной 6 с помощью пластикового кольца 7.
Для определения фенольного индекса в водных средах используют измерительную кювету объемом 5 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буферный раствор (рН=6,8). В измерительную кювету погружают хлорсеребряный электрод и пластмассовый корпус 1 устройства, таким образом, чтобы калий-натрий фосфатный буферный раствор контактировал с иммобилизованными адаптированными бактериями Pseoudomonas putida BS394 (pBS216) 5, которые расположены на поверхности редокс-слоя 4 представляющего собой композитный материал на основе углеродных нанотрубок и модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина устройства, и зафиксированы диализной мембраной 6 с помощью пластикового кольца 7. Устройство посредством платинового проводника 2 подключают к потенциостату, регистрирующего зависимость силы тока от времени - IPC Micro. К потенциостату подключают хлорсеребряный электрод. Измерения проводят при постоянном потенциале +350 мВ и непрерывном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки (300 об/мин) при комнатной температуре.
После установления стабильного уровня тока в измерительную кювету микропипеткой вводят необходимое количество раствора анализируемого вещества. После каждого измерения производят промывку измерительной кюветы калий-натрий-фосфатным буферным раствором. Скорость окисления фенола и его гомологов рассчитывают по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) и определяют значение фенольного индекса по предварительно построенной с помощью стандартного раствора фенола калибровочной кривой.
3
Таким образом, заявляемое устройство для определения фенольного индекса в водных средах не требует привлечения высококвалифицированного персонала и позволяет определять индекс биохимического потребления кислорода за время не более 10 минут, при этом нижняя граница определяемых значений составляет 0,001 мг/дм.