СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ
METHOD FOR CRYOPRESERVATION OF HAEMOPOIETIC UMBILICAL STEM CELLS

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам консервирования гемопоэтических стволовых клеток человека.
Наиболее близким к предлагаемому является способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови [Патент РФ №2416197, МПК A01N 1/02, A61K 35/14, A61K 35/44, 2011], включающий введение ограждающего раствора криопротектора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) в криопакете, механическое перемешивание, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет, программное многоэтапное замораживание, после чего образец помещается в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию, по истечении карантинного срока хранения образец переносится на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°C, в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.
Известной причиной, препятствующей достижению технического результата, обеспечиваемого предлагаемым изобретением, является защита образца от внешних воздействий не на всех этапах способа, длительность процесса подготовки ГСК к криоконсервации, сравнительно невысокая жизнеспособности ГСК после размораживания.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является снижение вероятности заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией, сокращение продолжительности подготовки к длительному хранению криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и сохранение жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
При осуществлении изобретения поставленная задача решается за счет достижения технического результата, который заключается в улучшении условий стерильности, уменьшении времени программного многоэтапного замораживания и повышении количества жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после периода хранения.
Указанный технический результат достигается способом криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, включающим в себя вскрытие флакона криопротектора в ламинарном боксе, заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса, введение с помощью шприцевого насоса ограждающего раствора криопротектора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C со скоростью 0,8 мл/мин во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками в криопакет с одновременным механическим перемешиванием в аппарате для перемешивания при +4°C, прекращение механического перемешивания сразу после поступления требуемого количества криопротектора в криопакет с концентратом, перенос системы вместе с флаконом криопротектора в ламинарный бокс, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет, программное многоэтапное замораживание, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре  +4°C, на втором этапе охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждают образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, после замораживания образец помещается в карантинный дьюар с жидким азотом, до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию, по истечению карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносится на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°C в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.
Вскрытие флакона криопротектора и заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса осуществляют в ламинарном боксе для того, чтобы обеспечить стерильность процесса. Это позволяет снизить вероятность заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией.
Введение с помощью шприцевого насоса ограждающего раствора криопротектора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C со скоростью 0,8 мл/мин во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками с одновременным механическим перемешиванием позволяет равномерно распределить криопротектор по объему лейкоцитарной клеточной фракции. Благодаря этому, раствор криопротектора проникает практически во все клетки, содержащиеся в данной фракции, и увеличивается количество жизнеспособных ГСК после размораживания. Скорость введения криопротектора 0,8 мл/мин является оптимальной для данного способа и выбрана исходя из скорости диффузии раствора криопротектора через клеточную мембрану. Механическое перемешивание при +4°C в аппарате для перемешивания прекращают сразу после поступления требуемого количества криопротектора в криопакет с концентратом. Если перемешивание будет длиться дольше по времени, то есть вероятность образования гемолиза.
После механического перемешивания систему вместе с флаконом криопротектора переносят в ламинарный бокс, выпускают воздух из криопакета и часть взвеси, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет. Проведение этих операций в ламинарном боксе позволяет снизить вероятность заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией.
На третьем этапе программного многоэтапного замораживания образец охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C. За счет увеличения скорости охлаждения достигается равномерное охлаждение образца во всем объеме до нужной температуры.
На четвертом этапе программного многоэтапного замораживания нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C. Благодаря более медленному повышению температуры происходит плавный процесс оттаивания за счет выброса латентного тепла, что дает возможность обойти точку перекристаллизации и погасить термоудар.
Таким образом, более быстрое охлаждение на третьем этапе и более медленный нагрев на четвертом этапе, по сравнению с прототипом, позволяют избежать резкого скачка температуры, тем самым сохраняя жизнеспособность клеток в образце.
Примеры осуществления предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови приведены ниже.
В ламинарном боксе «Тепло Scientific» Hera Safe KS 12 (Heraeus, США) вскрывали флакон криопротектора CryoSur-DEX 40, содержащий раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, и заправляли в специальный шприц 20 мл для шприцевого насоса Pilot (Fresenius Vial, Франция).
Криопакет с концентратом лейкоцитов помещали в аппарат предподготовки CoolMix AS-210 (Biosafe, Швейцария), с помощью системы полимерных магистралей присоединяли к шприцевому насосу. На шприцевом насосе Pilot выставляли скорость введения раствора криопротектора, равную 0,8 мл/мин. Когда 5 мл криопротектора поступили в криопакет с концентратом, насос Pilot давал сигнал, сразу прекращали перемешивание и переносили систему вместе с флаконом в ламинарный бокс.
Выпускали воздух из криопакета, выдавливали небольшое количество крови из пакета, чтобы она заполнила трубку на расстоянии 5 см от пакета; отпаивали трубку на этом расстоянии и делали перепайки на расстоянии 1 см друг от друга. Перепаивали участки, ведущие к пробирке-спутнику.
Криопакет концентрата упаковывали в термоусадочный пакет, удаляли воздух из пакета и запаивали с помощью аппарата Shop Sealer FS-315 (Fuji Impulse Co. Ltd, EC) для запаивания термоусадочного пакета «CryoFlex», помещали на хладагент и передавали для программного замораживания.
Упакованный в термоусадочный пакет концентрат помещали в кассету для программного замораживания; устанавливали в камеру на штатив.
Контрольный датчик температуры Sample программного замораживателя Planer Kryo 560-16 (Planer pis, Великобритания) размещали в непосредственной близости к образцу. Контроль температуры в камере осуществляли дополнительным датчиком Chamber программного замораживателя Planer Cryo 560/16 (Planer pis, Великобритания). При составлении криопротокола заданный график выстраивали по уставке температуры камеры.
Также использовали дополнительный выносной датчик системы мониторинга Master Scada, для контроля температуры и своевременной калибровки камеры.
Замораживание концентрата осуществляли в программном замораживателе Planer Cryo 560/16 по следующим этапам: на первом этапе смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания выдерживали 10 мин при температуре +4°C, на втором этапе охлаждали со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждали со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревали образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждали образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждали со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C.Данные по процедуре замораживания регистрировали в протоколе программного замораживания концентрата стволовых клеток, который представлен на фиг.1. Протокол программного замораживания концентрата стволовых клеток по прототипу представлен на фиг.2.
Протокол криоконсервации ГСК по предлагаемому способу по длительности выполнения составляет 86 мин (+1…3 мин), а в прототипе 114 мин (+1…2 мин). Следовательно, сокращается продолжительности подготовки к длительному хранению криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови по предлагаемому способу.
Результаты всех исследований, характеризующие образец пуповинной крови и полученный концентрат стволовых клеток пуповинной крови, вносили в базу данных ООО НПО «Тюменькриобанк» под единым идентификационным номером образца.
Концентрат стволовых клеток пуповинной крови хранили в карантинном дьюаре до тех пор, пока не известны результаты тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию (согласно приказу Минздрава РФ №325 от 25 июля 2003 г.). По истечении карантинного срока хранения концентрат лейкоцитов пуповинной крови переносили на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°C, в дьюар с жидким азотом при отрицательных результатах тестирования (Анти-fflV-l и -2, HIV-lAg, Анти-HTLV-I и -II, Анти-HbcorAg, HBs-Ag, Анти-HCV). Данные по изъятию образца заносили в протокол изъятия образца концентрата стволовых клеток, информацию по изменению локализации образца регистрировали в протоколе переноса концентрата стволовых клеток, а также в базе данных ООО НПО «Тюменькриобанк» и в «Журнале учета и регистрации замороженных образцов стволовых клеток пуповинной крови».
Размораживание криоконсервированного образца и отмывку концентрата стволовых клеток пуповинной крови от криопротектора проводили по общепринятой методике следующим образом.
Сперва подготавливали помещение, в котором производили процедуру размораживания и отмывки образца пуповинной крови: включали УФ-лампы на 15 мин.
Включали водяную баню в сеть, устанавливали 37°C. Подогревали физиологический раствор в термостате при 37°C в течение 15 мин. В ламинарном боксе приготавливали отмывочный буфер: физиологический раствор, содержащий 2,5% альбумина человеческого рекомбинантного. Отобирали из пакета для конечного продукта весь антикоагулянт.
Изымали образец из криохранилища, регистрировали надлежащим образом. Размораживание криоконсервированного образца проводили на программном замораживателе Planer Kryo 560-16 следующим образом: выдерживали 5 мин при температуре -160°C, нагревали образец со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, выдерживали образец 5 мин при температуре -100°C, нагревали образец со скоростью 1°C/мин до температуры -60°C, нагревали образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, нагревали образец со скоростью 3°C/мин до температуры -4°C, выдерживали образец 5 мин при температуре -4°C, нагревали образец со скоростью 1°C/мин до температуры 0°C, выдерживали образец 5 мин при температуре 0°C. Последующее оттаивание проводили на водяной бане - термостат медицинский TW-2.02.
После того как кровь становилась жидкой, в воздушном потоке ламинарного бокса салфеткой, смоченной 70%-ным раствором этилового спирта, тщательно обрабатывали пакет с кровью, после чего через оба порта пакета отбирали шприцами (объемом 10 мл) весь концентрат клеток. Распределяли концентрат поровну в две конические центрифужные пробирки (объемом 50 мл) и заливали равным объемом отмывочного буфера. Проводили центрифугирование 400 g 10 мин при комнатной температуре.
В ламинарном боксе удаляли супернатант и резуспендировали осадок с клетками в промывочном буфере. Помещали конечный продукт в пустой пакет, в который через стерильный порт добавляли шприцом необходимое количество гепарина для предотвращения свертывания крови.
Из пакета с конечным продуктом отбирали 0,5 мл концентрата для анализа на жизнеспособность и количество клеток методом проточной цитофлюориметрии.
Жизнеспособность клеток определяли с помощью витального красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, США), анализируя на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Идентификацию клеток выполняли путем регистрации двух параметров: объема и светорассеяния в боковом направлении (SS) и интенсивность флуоресценции (7-AAD).
На фиг.3 представлена гистограмма количества жизнеспособных клеток в размороженном образце в результате предлагаемого способа.
На фиг.4 представлена гистограмма количества жизнеспособных клеток в размороженном образце в результате способа-прототипа.
На гистограммах слева от вертикальной линии (у значения 10°) зарегистрированы живые клетки крови, а справа - мертвые. Полученные данные показали, что в результате применения предлагаемого способа количество жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после периода хранения в рассмотренном образце составило 87,24%, а по способу-прототипу 79,01%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить вероятность заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией, сократить продолжительность подготовки к длительному хранению криоконсервированных ГСК пуповинной крови и повысить количество жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после периода хранения.