НУФЛЕИН БИСАНГИДРОХЛОРИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ОПУХОЛЕВЫМ КЛЕТКАМ ЧЕЛОВЕКА
NUFLEIN BISANHYDROCHLORIDE, WITH CYTOTOXIC ACTIVITY RELATED TO HUMAN TUMOUR CELLS

Изобретение относится к области создания высокоэффективных противоопухолевых препаратов растительного происхождения, а именно к нуфлеину бисангидродихлорида, обладающему избирательной, цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека. Изобретение может найти применение в медицине для лечения злокачественных опухолей женской половой сферы.
Одной из стратегий лечения злокачественных новообразований является медикаментозная терапия с использованием различных цитостатических средств, в том числе растительного происхождения.
Достаточно хорошо изученным алкалоидом является Лютенурин, полученный из кубышки желтой (лат. - ) [Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. Фармакогнозия, 2002, стр. 413]. Кубышка желтая распространена по всей России, за исключением горных районов и Арктики, растет зарослями в прудах, озерах, по берегам речек с тихим течением. Препарат «Лютенурин» впервые был разработан во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений, представляет собой сумму гидрохлоридов димерных серосодержащих фуранохинолизидиновых алкалоидов из корневищ кубышки желтой (Nuphar luteae (L.) Smith syn. Nuphar luteum. L.) семейства кувшинковых. Антимикробная активность препарата обусловлена основным компонентом суммы алкалоидов - бисангидродихлоридом нуфлеина. [М.Е. Перельсон, Т.Н. Ильинская, О.Н. Толкачев. Структура нуфлеина - алкалоида Nuphar Luteum // Химия природных соединений, 1975, №6, стр. 768-770]
Препарат Лютенурин представляет собой смесь гидрохлоридов, преимущественно димерных серусодержащих хинолизидиновых алкалоидов: тиобинуфаридина, неотиобинуфаридина, нуфлеина. Действующим началом препарата является алкалоид нуфлеин (дигидрокси-тиобинуфаридин) (Т.Н. Ильинская, А.Д. Кузовков, Т.Г. Монахова. Химическое изучение алкалоидов кубышки желтой, в кн.: "Лекарственные растения. Химия", Том 15, ВИЛАР, под ред. А.И.Баньковского, "Колос", Москва, 1969, с. 322-333). Известный препарат Лютенурин (авт. свид. СССР №145858, ФС 42-948-75) обладает высокой антибактериальной активностью и применяется для лечения трихомонадных урогенитальных заболеваний и в качестве контрацептивного средства.
Известны различные способы получения препарата Лютенурина, разработанные в ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР).
Так, например, способ получения препарата Лютенурин заключается в том, что сухой экстракт суммы алкалоидов корневища кубышки желтой растворяют в этаноле, добавляют 20%-ный раствор метилен-бис-салициловой кислоты или растворяют в 10%-ной соляной кислоте, отфильтровывают от смолистых примесей, добавляют 10%-ный раствор перхлората натрия и полученный лютенурин - основание (или перхлорат лютенурина) обрабатывают известными приемами (авт. свид. СССР №145184).
Также известен способ получения лютенурина из корневищ кубышки желтой (Nuphar Lutea (L.), заключающийся в экстракции сырья, извлечении алкалоидов и получении гидрохлоридов насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом, отличающийся тем, что экстракцию сырья на головной стадии осуществляют 20-60%-ным водным алифатическим спиртом, предпочтительно этиловым или изопропиловым, подкисленным 5%-ной фосфорной кислотой, фильтруют, удаляют органический растворитель, водный кубовый остаток после отгонки спирта обрабатывают бутанолом, который затем отделяют, водно-кислотную фазу после нейтрализации до рН 8 обрабатывают карбонатом кальция для удаления фосфат-ионов, выпавший осадок фильтруют, промывают ацетоном и фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в разбавленной серной кислоте, подщелачивают до рН 8, экстрагируют основания алкалоидов толуолом, упаривают экстрагент и получают гидрохлориды (пат. РФ №2292218).
Известен способ получения лютенурина, который заключается в следующем: высушенные и измельченные корневища кубышки желтой, содержащие 0,4% суммы алкалоидов, обрабатывают гидратом окиси аммония, экстрагируют дихлорэтаном, затем реэкстрагируют серной кислотой, подщелачивают водную фазу гидратом окиси аммония, извлекают алкалоиды эфиром, после сушки экстракта поташом его концентрируют, осаждают примеси петролейным эфиром, а затем получают гидрохлориды насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом, целевой продукт отделяют, промывают петролейным эфиром, сушат и просеивают через сито ("Лекарственные вещества из растений и способы их производства", Ташкент, ФАН Уз ССР, 1980, с. 10-12).
Действующим началом препарата Лютенурин является алкалоид нуфлеин (дигидрокси-тиобинуфаридин) формулы 1 (Т.Н. Ильинская, А.Д. Кузовков, Т.Г. Монахова. Химическое изучение алкалоидов кубышки желтой, в кн.: "Лекарственные растения. Химия", Том 15, ВИЛАР, под ред. А.И. Баньковского, "Колос", Москва, 1969, с. 322-333).
Формула 1. Нуфлеина бисангидродигидрохлорид
В результате проведенных авторами исследований была обнаружена высокая цитотоксическая активность нуфлеина бисангидродихлорида формулы 1, являющегося предметом настоящего исследования.
Основной задачей данного изобретения является создание нового препарата на основе растительного сырья, обладающего цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека, высокой избирательной активностью по отношению к опухолевым клеткам и наименьшее цитотоксическое действие по отношению здоровым клеткам.
Такими свойствами могут обладать алкалоиды, полученные из лекарственных растений.
Поставленная цель достигается за счет использования соединение нуфлеина бисангидродигидрохлорида формулы I
C30H40N2C12 Мм 563,6
обладающего избирательной, цитотоксической активностью на клетки рака шейки матки человека.
Нуфлеина бисангидродигидрохлорид формулы 1 по эффективности в 100 раз превосходящей зарубежный цисплатин, используемый для тех же целей. Механизм цитотоксической активности нуфлеина бисангидродигидрохлорида связан с разобщением окислительного фосфорилирования в митохондриях, индукцией митохондриального пути апоптоза.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение Нуфлеина бисангидродигидрохлорида
Нуфлеин получают известным способом, заключающимся в экстракции сырья, извлечении алкалоидов и получении гидрохлоридов насыщением раствора алкалоидов хлористым водородом. Полученный препарат «Лютенурин» растворяют в растворе хлороформа, который обрабатывают предпочтительно 10% раствором хлористоводородной кислоты. Образовавшиеся хлоргидраты алкалоидов распределяются по растворимости между хлороформом и водно-кислыми солями, в результате до 45% хлоргидратов побочных алкалоидов остаются в хлороформе, а нуфлеин с сопутствующими алкалоидами целиком переходит в кислые растворы, которые после подщелачивания экстрагируют хлороформом. Остаток после упаривания в вакууме хроматографируют на колонке с силикагелем (в качестве элюента используют хлороформ), отбирают нуфлеинсодержащие фракции, упаривают их, растворяют в диэтиловом эфире, из которого целевой продукт извлекают 5% раствором хлористоводородной кислоты. Кислые растворы обрабатывают раствором перхлората натрия, получают перхлорат нуфлеина, кристаллизуют и проверяют его чистоту, затем получают бисангидродихлорид нуфлеина.
Чистота полученной субстанции нуфлеина бисангидродихлорида подтверждается отсутствием в спектре 1Н ЯМР сигналов от других веществ (см. Рис. 1).
Пояснение к Рис. 1
1
2
В H ЯМР-спектре (Рис. 1) раствора нуфлеина в смеси растворителей бензол : хлороформ : трифторуксусная кислота (2:1:3) химические сдвиги сигналов имеют следующие значения (в м.д.): 0,69 и 0,67 дублеты 3Н (1,1' метальные группы), 2,47 и 2,62 (дублеты J=15,2 Гц) - протоны метиленовой группы в пятичленном кольце в β-положении к атому серы, 2,76 и 3,11 (дублеты J=12,3 Гц) - протоны метиленовой группы в α-положении к атому серы; 3,44 (2Н) мультиплеты с уширенными компонентами - протоны в положениях 1 и 1', уширенные синглеты 4,11, 4,17, 4,75 и 4,80 относятся к протонам 10,10' и 4, 4' соответственно. В фурановых кольцах сигналы 6,26 и 6,36 м.д. (β-протоны фурановых колец), 7,30 (2Н), 7,38, 7,52 и 7,58 м.д. (α-протоны фурановых колец), 7,58 и 7,83 м.д. (протоны иммониевого фрагмента).
Пример 2. Определение цитотоксической активности нуфлеина
2
-7
-4
Цитотоксическую активность нуфлеина бисангидродихлорида оценивали на культурах опухолевых клеток и нормальных клеток. В качестве модели опухолевых клеток использовали клетки рака шейки матки человека HeLa, чувствительные к цитостатикам. Данная клеточная культура является стандартным объектом оценки цитотоксического действия противоопухолевых соединений (Федеральное руководство по доклиническому испытанию лекарственных средств, 2014). В качестве нормальных клеток использовали быстроделящиеся фибробласты кожи крыс. Влияние нуфлеина бисангидродихлорида на параметры энергообеспечения клетки исследовали на изолированных митохондриях, полученных из печени крыс. Цитотоксическую активность нуфлеина бисангидродихлорида и препарата сравнения цисплатина определяли спектрофотометрическим методом МТТ. Клетки HeLa инкубировали при 37°С, в условиях 5% СО в стандартной культуральной среде DMEM и 10% эмбриональной телячьей с исследуемыми веществами в диапазоне концентрации 10-10 M в течение 48 ч, после чего в культуральную среду на 3 ч вносился 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Затем жидкость из лунок удаляли и вносили по 150 мкл диметилсульфоксида на 30 мин. МТТ восстанавливается за счет действия дегидрогеназ живых клеток до водонерастворимых кристаллов формазана. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) и характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках и может быть использовано в качестве критерия цитотоксического действия изучаемых соединений. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны 530 нм на анализаторе иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 (Россия). Оптическую плотность контрольных образцов принимали за 100% выживаемость клеток.
50
-6
-8
Показано, что нуфлеина бисангидродихлорид обладает цитотоксическим действием, в 100 раз превышающим цитотоксический эффект Цисплатина. Так, IC - концентрация, вызывающая 50% гибель клеток, - для цисплатина составила 6,2*10 М, а для нуфлеина - 2,89*10 M (см. Рис. 2). На Рис. 2 представлено влияние нуфлеина бисангидродихлорида на жизнеспособность опухолевых клеток линии HeLa, инкубация 48 ч.
На нормальные, трансформированные фибробласты кожи крыс нуфлеина бисангидродихлорид оказывал почти в 100 раз менее выраженное цитотоксическое действие, чем на опухолевые клетки (см. Рис. 3. Влияние нуфлеина бисангидродихлорида на жизнеспособность фибробластов кожи крыс).
Механизмы цитотоксического действия нуфлеина бисангидродихлорида связаны с действием на митохондрии - ключевые клеточные органеллы, участвующие как в процессах энергообеспечения клетки, так и в процессах апоптоза.
Митохондрии получали из печени взрослых крыс-самцов линии Wistar стандартным методом дифференциального центрифугирования [Fedotcheva N.I., Teplova V.V., Fedotcheva Т.А., Rzheznikov V.M., Shimanovskii N.L. Effect of progesterone and its synthetic analogues on the activity of mitochondrial permeability transition pore in isolated rat liver mitochondria // Biochemical Pharmacology. 2009. V. 78. No 8. P. 1060-1068]. Печень гомогенизировали в ледяном 10 мМ HEPES-Tris (рН 7.4) буфере, содержащем 220 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ ЭГТА. Гомогенат центрифугировали при 600 g в течение 7 мин и 4°С, затем супернатант центрифугировали при 9,000 g в течение 10 мин для получения осадка с митохондриями. Митохондрии дважды промывали вышеуказанным буфером без ЭГТА. Конечный митохондриальный осадок суспендировали в промывочном буфере до получения 60-80 мг белка/мл. Митохондрии инкубировали в среде, содержащей 120 мМ KCl, 1.5 мМ KH2PO4, 10 мМ HEPES (рН 7.25). Контрольные пробы с растворителем проводились в каждой серии экспериментов.
Влияние нуфлеина бисангидродихлорида на индукцию митохондриальной поры ионами кальция определяли с помощью селективных электродов для измерения мембранного потенциала и кальциевой емкости митохондрий. Определение кальциевой емкости основано на измерении концентрации Са2+, требуемой для необратимого снижения мембранного потенциала и выхода ионов кальция из митохондрий при последовательных добавках Са2+ в концентрациях 20-50 мкМ. Митохондрии инкубировали в среде, содержащей 120 мМ KCl, 1.5 мМ KH2PO4, 10 мМ HEPES (рН 7.25). Концентрация ТРР+ в кювете составляла 1 мкМ. Все измерения проводили при постоянном перемешивании в термостатируемой кювете объемом 1 мл при 26°С.
На изолированных митохондриях печени крыс показано, что нуфлеина бисангидродихлорид (20-50 мкМ) вызывает разобщение окислительного фосфорилирования - митохондрии поглощают кислород, но при этом синтез АТФ не происходит. Кроме того, нуфлеина бисангидродихлорид индуцирует открытие митохондриальной поры, что в дальнейшем сопровождается выходом цитохрома С из митохондрий и индукцией апоптоза. В концентрациях 20-50 мкМ нуфлеина бисангидродихлорид ингибирует дыхание митохондрий.
Заявляемое соединение - нуфлеина бисангидродихлорид - обладает высокой цитостатической активностью в отношении клеток рака шейки матки человека, превосходящей активность цисплатина. В отношении нормальных клеток нуфлеин проявляет умеренное (в 1000 раз меньшее) цитотоксическое действие, что очень ценно для повышения избирательности химиотерапии опухолей. В механизме цитотоксического действия нуфлеина присутствует апоптотический компонент и ингибирование дыхания митохондрий. В настоящее время проходят клинические испытания нуфлеина.