Теломераза: новые возможности дифференциальной диагностики новообразований эндокринных желез и тимуса

ТЕЛОМЕРАЗА: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЭНДОКРИННЫХ ЖЕЛЕЗ И ТИМУСА

П.С. Ветшев

Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова А.И. Глухов

Кафедра биологической химии ММА им. И.М. Сеченова Л.И. Ипполитов, Д.В. Жуликов, И.И. Быков

Факультетская хирургическая клиника им. Н.Н. Бурденко ММА им. И.М. Сеченова О.В. Зимник

Лаборатория молекулярной биологии Московского НИИ медицинской экологии Департамента здравоохранения

Впервые в нашей стране проведено исследование активности теломеразы и экспрессии ее гена в опухолевой ткани различных образований эндокринных органов.

В исследование вошли 29 пациентов. Среди них было 9 пациентов с узловым зобом, 4 пациента с аденомой паращитовидной железы, 12 пациентов с новообразованием надпочечника, 4 пациента с заболеванием тимуса.

Целью работы было изучение теломеразы как онкомаркера для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей эндокринной системы и тимуса.

Всем пациентам было проведено комплексное обследование, оперативное лечение, выполнено плановое гистологическое исследование полученного в ходе оперативного вмешательства материала, который также был исследован методами TRAP (теломеразная активность, ТА) и обратной транскрипции и ПЦР (ОТ-ПЦР, экспрессия гена каталитической субъединицы теломеразы, hTERT). В результате получены данные о значительной корреляции между наличием злокачественного процесса и присутствием в ткани опухоли теломеразы. Результаты работы показывали потенциальную клиническую ценность изученных методов для диагностики опухолей щитовидной железы и надпочечников. Также предложена и опробована схема транспортировки и хранения материала, в основу которой был положен принцип - «cold chain» («холодовая цепь») - постоянное понижение температуры полученного материала при транспортировке и хранении. Схема максимально проста и не требует быстрого замораживания материала с использованием жидкого азота.

Введение

За последнее время отмечено значительное повышение интереса к проблемам заболеваний эндокринных желез и тимуса среди исследователей и практикующих врачей. Вопросы диагностики, тактики лечения и показаний к операции при различных нозологических формах поражения этих органов далеки от окончательного решения и постоянно обсуждаются в периодической печати. Увеличение числа первичных оперативных вмешательств на эндокринных железах и тимусе, обусловленное рядом объективных причин: ростом заболеваемости, улучшением диагностики, широким применением высокоэффективных диагностических технологий (УЗИ, КТ, МРТ), сохраняющейся и не всегда оправданной высокой хирургической активностью при лечении ряда заболеваний вышеуказанных органов, нередко излишней коммерциализацией медицины делает рассматриваемые вопросы еще более насущными [3-5].

Хотя к настоящему времени в диагностике и лечении новообразований эндокринных желез и тимуса достигнуты большие успехи, проблема своевременной

TELOMERASE: NEW OPPORTUNITIES FOR A DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF TUMORS OF ENDOCRINE GLANDS AND THYMUS

P.S. Vetshev, A.I. Gluhov, L.I. Ippolitov, O.V. Zimnik, D.V. Zhulikov , I.I. Bykov

Telomerase activity and expression of the telomerase gene in tumors of different endocrine glands was studied for the first time in our country. 29 patients from the Surgery Department of the Burdenko Military Hospital were enrolled into the study. Nine of them had nodular struma, 4 - adenoma of parathyroid glands, 12 - adrenocortical tumors, 4 - tumors of the thymus. The purpose of this study was to evaluate the role of telomerase as the marker for the differential diagnosis of benign and malignant tumors of endocrine glands and thymus. All patients underwent a complex diagnostic program and the surgical treatment. The histological analysis of the tumor tissue was performed. It included TRAP analysis of the telomerase activity and RT-PCR for hTERT expression. We found a significant correlation between malignant growth and telomerase activity. These methods have a significant clinical potential for differential diagnosis of tumors of endocrine glands and thymus. We have proposed and successfully applied a scheme for specimen transportation and storage based on the "cold chain" principle. The scheme is simple and does not require specimen cryoconservation with the liquid nitrogen.

диагностики и дифференциальной диагностики указанных заболеваний сохраняет свою актуальность.

Наличие результатов цитологического исследования материла, полученного при тонкоигольной аспирацион-ной биопсии (ТАБ), до оперативного вмешательства и отсутствие результатов срочного и планового гистологических исследований, получаемых лишь после оперативного вмешательства, затрудняют принятие своевременного и адекватного решения о целесообразности и объеме оперативного лечения. Получение при ТАБ клеточного, а не тканевого материала обусловливает недостаточную надежность данного метода при дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных новообразований. Все это зачастую приводит к неоправданному увеличению или уменьшению объема оперативного вмешательства, повышению риска осложнений, ухудшению отдаленных результатов и снижению качества жизни пациента.

Эти обстоятельства обусловливают поиск других методов диагностики.

К одним из таких методов, позволяющих с высокой точностью определить характер опухолевого процесса,

дополняющих результаты морфологических, лучевых методов обследования относится исследование теломеразы, путем определения структурных изменений ДНК клетки при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использовали основанный на ПЦР метод TRAP (telomeric repeat amplification protocol - протокол амплификации последовательностей теломер) - определения теломе-разной активности (ТА), а также метод совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ/ПЦР) - определение наличия мРНК гена каталитической субъединицы теломеразы hTERT (анализ экспрессии hTERT, АЭhTERT) [10, 16, 21]. Была показана ценность данных методов при диагностике новообразований различных органов (желудок, легкие, молочная железа и т.д.) [17, 19, 22, 24, 26, 27]. Существуют единичные работы, где присутствие теломеразы исследовалось вышеуказанными методами также и для новообразований отдельных эндокринных органов [14, 15, 19], однако их число крайне мало, а данные противоречивы и не всегда достоверны.

Теломеры и теломераза

Неограниченный репликативный потенциал, или иммортальность, считается одним из основных признаков, отличающих раковые клетки от нормальных [23]. В нормальных соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный постепенным и неизбежным укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления [12], что в конечном итоге приводит к запрограммированной гибели клетки (апоптозу). Раковые клетки обладают уникальной способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности. По мнению ряда исследователей [13], приобретение свойства иммортальности клетками опухолей связано с активацией фермента теломеразы (обратной транскриптазы), компенсирующей укорочение теломер. Таким образом, к настоящему времени накоплено много данных, свидетельствующих о том, что активация теломеразы может быть важным фактором в прогрессировании опухолей. С момента разработки высокочувствительных методов определения активности теломеразы (TRAP) [16] и экспрессии гена каталитической субъединицы теломеразы hTERT были исследованы тысячи образцов различных тканей человека [8, 10, 21]. Наличие активной теломеразы и экспрессии гена каталитической субъединицы теломе-разы hTERT в подавляющем большинстве злокачественных опухолей и отсутствие, как правило, нормальных соматических тканей [16, 20] дают основание считать активность теломеразы и экспрессию гена hTERT наиболее специфическими характеристиками раковых клеток. Именно поэтому данный фермент вызывает повышенный интерес исследователей, как потенциальный маркер для диагностики онкологических заболеваний.

Целью нашей работы явилось изучение клинической ценности методов определения теломеразной активности

и экспрессии ее гена в дифференциальной диагностике опухолевых заболеваний различных органов эндокринной системы и тимуса.

Материалы и методы

Всего обследовано 29 пациентов, среди которых было 9 пациентов с узловым зобом (8 женщин и 1 мужчина, средний возраст составил 44 года (31-61 год), 4 пациента с аденомой паращитовидной железы, (3 женщины и 1 мужчина, средний возраст составил 61 год (42-73 года), 12 пациентов с новообразованием надпочечника (11 женщин, 1 мужчина, средний возраст составил 53,5 года (33-67 лет), 4 пациента с заболеванием тимуса (1 с тимомой, 3 - тимома в сочетании с генерализованной формой миастении, все пациенты женщины, средний возраст 41 год (15-63 года).

Всем пациентам было проведено комплексное обследование, оперативное лечение, выполнено плановое гистологическое исследование полученного в ходе оперативного вмешательства материала, в котором определяли также ТА и АЭ^ЖХ

Затем ретроспективно проводили сравнение данных гистологического исследования с данными использованных молекулярно-генетических методов.

Нами впервые была предложена и опробована схема транспортировки и хранения материала, в основу которой был положен принцип - «cold chain» («холодовая цепь»). Данный принцип заключается в постоянном понижении температуры полученного материала при транспортировке и хранении. Схема максимально проста и не требует быстрого замораживания материала с использованием жидкого азота.

Образцы, полученные при ТАБ или интраоперацион-но, замораживаются при температуре -6-7° С (в условиях-морозильной камеры обычного бытового холодильника), и могут храниться в таком состоянии несколько дней (до 4 суток). Транспортировка материала до лаборатории осуществляется в контейнере (термосе) со льдом, замороженным при -70° C. Дальнейшее хранение материала осуществляется в специальной холодильной камере при температуре -70° С, где образцы могут находиться в течение 5-8 лет, что позволяет также создавать банки образцов, в которых в дальнейшем возможно определение других молекулярно-генетических маркеров.

Определение активности теломеразы в экстрактах тканей проводили методом TRAP [16, 25] с некоторыми модификациями [20].

Анализ экспрессии мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) проводили методом совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ/ПЦР). Выделение РНК проводили в соответствии с оригинальной методикой [18], с некоторыми изменениями [20].

Результаты

В результате исследования показана высокая ценность теломеразы для дифференциальной диагностики широко-

го спектра опухолевых заболеваний эндокринных желез, в особенности для исключения злокачественного процесса. Полученные данные представлены в (табл. 1 и 2).

При исследовании образцов ткани, полученных интра-операционно у 4 пациентов с аденомой паращитовидной железы, ТА и экспрессия hTERT не были найдены ни в одном случае, при плановом гистологическом исследовании во всех наблюдениях - картина аденомы паращитовидной железы.

При исследовании образцов ткани тимуса у 4 пациентов ТА и экспрессия hTERT присутствовали во всех наблюдениях, при плановом гистологическом исследовании

Табл. 1. Результаты исследований образцов ткани, полученных интраоперационно у пациентов с заболеваниями щитовидной железы

№ п/ п Диагноз Результаты TRAP теломеразная активность Результаты ОТ-ПЦР экспрессия гена hTERT Гистологическое исследование

1 Фолликулярная неоплазия - - Фолликулярная аденома

2 Фолликулярная неоплазия + + Фолликулярный рак

3 Узловая форма аутоиммунного Узловая форма аутоиммунного

тиреоидита тиреоидита

4 Узловой Микро-макронодулярная

коллоидный зоб аденома

Узловой коллоидный зоб Микро-макрофолликулярный

5 - - зоб, есть лимфоцитарная инфильтрация

6 Фолликулярная неоплазия + - Узловой зоб - фолликулярная аденома

7 Узловая форма аутоиммунного Узловая форма аутоиммунного

тиреоидита тиреоидита

8 Узловой коллоидный зоб + + Микро-макрофолликулярный зоб

9 Фолликулярная неоплазия + - Фолликулярная аденома

Табл. 2. Результаты исследований образцов ткани, полученных интраоперационно у пациентов с заболевания!

надпочечников

№ п/ п Диагноз Результаты TRAP теломеразная активность Результаты ОТ-ПЦР экспрессия гена hTERT Гистологическое исследование

1 Аденома коры надпочечника - - Смешанноклеточная аденома корынадпочечников

2 Аденома коры надпочечника - - Смешанноклеточная аденома коры надпочечников

3 Хромаффинома надпочечника - - Феохромоцитома - трабекулярный вариант

4 Адренокортикальный рак + + Адренокортикальный рак

5 Хромаффинома надпочечника - - Феохромоцитома

6 Хромаффинома надпочечника + + Феохромобластома

7 Хромаффинома надпочечника - - Феохромоцитома

8 Аденома коры надпочечника - - Светлоклеточная аденома коры надпочечников

9 Аденома коры надпочечника - + Светлоклеточная аденома коры надпочечников

Смешанная

10 Аденома коры надпочечника - + светло-темноклеточная аденома коры надпочечников

11 Хромаффинома надпочечника + + Феохромобластома

12 Аденома коры надпочечника - + Темноклеточная аденома коры надпочечников

- у 2 пациентов картина нормальной ткани тимуса, а у 2, соответственно, - веретеноклеточная тимома типа А без инвазии.

Практически во всех наблюдениях показано соответствие данных молекулярно-генетических методов данным гистологического исследования - показатель PV- (predictive value negative) - отрицательная предиктивная оценка

- составил около 100%, чувствительность методов также приближалась к 100%. Все это позволяет рекомендовать использованные в работе молекулярно-генетические тесты как существенное дополнение к имеющимся диагностическим методам (УЗИ, КТ, МРТ) в клинике, особенно при дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных образований щитовидной железы и хромаффинной ткани надпочечников (дифференциальная диагностика феохромоцитом и феохромобластом).

Обсуждение результатов

Впервые в нашей стране проведено исследование актив -ности теломеразы и экспрессии ее гена в опухолевой ткани различных образований эндокринных органов. В результате исследования была показана потенциальная ценность изученных методов, как важного дополнительного диагностического критерия для выбора адекватной хирургической тактики. При этом исследование образцов, полученных при ТАБ, позволит проводить дооперационную диагностику и снижать неоправданно увеличенный объем оперативного вмешательства. Вероятно, потребуется стандартизация ТАБ для проведения молекулярно-генетического анализа полученного материала, а также дополнительная обработка материала, полученного при ТАБ, перед проведением молекулярно-генетического анализа, с целью концентрации клеточной части и очистки от балластных веществ (осаждение клеток, промывание).

Согласно некоторым авторам [9], определение ТА и АЭhTERT к настоящему времени является практически един-

ственным достоверным методом дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных поражений хромаффинной ткани.

Отдельного рассмотрения заслуживают данные о наличии активной теломеразы и экспрессии гена hTERT при комбинации новообразований с аутоиммунным поражением (ЩЖ при АИТ, тимома, ткань тимуса при миастении). В этих случаях фиксируемая АТ и экспрессия hTERT, вероятно, обусловлены выраженной клеточной инфильтрацией, так как известно, что макрофаги, нейтрофи-лы и лимфоциты содержат активную теломеразу [2 ]. Другим возможным объяснением может служить тот факт, что фиксируемая АТ, возможно, связана с присутствием недетектируемых клеток, которые уже подверглись злокачественной трансформации и начали экспрессировать теломеразу. Для понимания данных результатов требуется большая подборка образцов с аутоиммунным поражением, в которых определены ТА и экспрессия hTERT.

Использование в дальнейшем полуколичественной оценки ТА и экспрессии hTERT даст возможность стандартизации формулировки конечного результата теста и проведения статистического анализа результатов исследования.

Изучение возможной связи изменения уровня ТА и экспрессии hTERT с дальнейшим прогнозом течения заболевания, несомненно, также требует применения полуколичественного представления результатов теста на ТА и экспрессию hTERT.

Выводы

1. Полученные данные являются первым отечественным исследованием по изучению диагностической ценности теломеразы, как возможного онкомаркера, для широкого спектра опухолевых заболеваний органов эндокринной системы и тимуса, что имеет важное значение для хирургии и онкологии.

2. Использованные в работе методы (в т.ч. оригинальные модификации методов TRAP и АЭhTERT) являются одними из наиболее достоверных, в отличие от многих новейших модификаций, применяемых как в отечественной практике, так и за рубежом.

3. Предложен универсальный метод транспортировки и хранения образцов для молекулярно-генетических исследований, который может быть внедрен в любом лечебно-профилактическом учреждении и не требует дополнительных затрат.

4. Показана высокая ценность определения АТ и АЭhTERT для дифференциальной диагностики широкого спектра опухолевых заболеваний щитовидной железы, хромаффинной ткани надпочечников, тимуса и выбора адекватной хирургической тактики.

5. Исследование образцов, полученных при ТАБ, является возможным перспективным методом доопера-ционной диагностики и требует дальнейшего накопления клинического материала.

6. Представляется целесообразным дальнейшее исследование диагностической роли определения ак-

тивности теломеразы и экспрессии гена hTERT при аутоиммунных процессах (и случаях лимфоцитарной инфильтрации ткани).

Литература

1. Альтшулер М.Л., Северин С.Е., Глухов А.И. Опухолевая клетка и теломера-за // Биохимия - 2003. - Т. 68, №12. - С. 1275-1283.

2. Богданов А.А. Теломеры и теломераза // Соросовский образовательный журнал - 1998. - №12. - С. 12-18.

3. Ветшев П.С., Шкроб О.С., Чилингариди К.Е., Опаленова В.А. Тонкоигольная аспирационная биопсия солитарных образований щитовидной железы // Хирургия - 1995. - №3. - С. 34-37.

4. Ветшев П.С., Мельниченко Г.А., Кузнецов Н.С., и др. Заболевания щитовидной железы // Медицинская газета - 1996. - С. 158.

5. Ветшев П.С., Шкроб О.С., Кузнецов Н.С. и др. Возможности предоперационной морфологической верификации при узловых эутиреоидных образованиях щитовидной железы // Хирургия - 1998. - №2. - С. 4-8.

6. Глухов А.И., Ветшев П.С., Зимник О.В. и др. Изучение роли теломеразы

в диагностике опухолей эндокринной системы. // «Молекулярная медицина и биобезопасность» - М. 2005. - С.110.

7. Глухов А.И., Зимник О.В., Хаитов Р.М., Северин С.Е.Теломераза - потенциальный опухолевый маркер // Российский онкологический журнал - 2003.

- №2. - С. 53-57.

8. Дымшиц Г.М. Проблема репликации концов ленейных молекул ДНК и теломераза // Соросовский образовательный журнал - 2000. - № 5. - С.8-13.

9. Alderazi Y., Yeh M.W. et al. Phaeochromocytoma - current concepts // Medical Journal of Australia - 2005. - Vol.4, No. 183. - P. 201-204.

10. Bacchetti S., Counter C.M. Telomeres and telomerase in human cancer // Int. J. Oncol. - 1995. - Vol.7. - P. 423-432.

11. Glukhov A.I., Zimnik O.V., Gordeev S.A. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides // Biochem-Biophys. research communications - 1998. - Vol. 248. - P.368-371.

12. Harley С.В., Kim N.W. // Important Advances in Oncology -1996. - P. 57-67.

13. Harley С.В., Villeponteau В. // Curr. Opin. Genet. Dev. - 1995. - Vol. 5. - P. 249-255.

14. Kammori M., Takubo K. et al. Telomerase activity and telomere length in benign and malignant human thyroid tissues // Cancer letters - 2000. - Vol. 159. - P. 175-181.

15. Karayan-Tapon L., Menet E. et al. Topoisomerase II a and telomerase expression in papillary thyroid carcinomas // The journal of cancer surgery - 2004. - Vol. 30.

- P. 73-79.

16. Ют N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R. et al. // Science - 1994. - Vol. 266. - P. 2011-2015.

17. Mori N., Oka M. et al. Detection of telomerase activity in peritoneal lavage fluid from patients with gastric cancer using immunomagnetic beads // British Journal of Cancer - 2000. - Vol. 8, No. 83. - P. 1026-1032.

18. Rolfs A., Schuller I., Finckh U., Weber-Rolfs I. PCR: Clinical diagnostics and research // Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg. - 1992.

19. Saladama S.N, Andrews L.G. et al. Analysis of telomerase activity and detection of its catalytic subunit, hTERT // Analytical Biochemistry - 2003. - No. 315. - P. 1-21.

20. Shay J.W., Wright W.E. // Curr. Opin. Oncol. - 1996. - Vol. 8. - P. 66-71.

21. Shay J.W.,Bacchetti S.A. survey of telomerase activity in human cancer // Eur. J. Cancer - 1997. - Vol.33. - P. 787-791.

22. Shay J.W., Zou Y. et al. Telomerase and cancer // Human molecular genetics

- 2001. - Vol. 10, No. 7. - P. 677-685.

23. Stamps A.C, Gusterson B.A., O'Hare M.J. // I Eur. J. Cancer - 1992. - Vol. 28A.

- P. 1495-1499.

24. Wisman G.B; Hollema H; de Jong S et al. Telomerase activity as a biomarker for (pre)neoplastic cervical disease in scrapings and frozen sections from patients with abnormal cervical smear // J Clin Oncol. - 1998. - Vol. 6, No. 16. - P. 2238-2245.

25. Wright W.E., Shay J.W., Piatyszek M.A. Modifications of a telomeric repeat amplification protocol (TRAP) result in increased reliability, linearity and sensitivity // Nucl. Acid. Res. - 1995. - Vol. 23. - P. 3794-3795.

26. Wu. A, Ichihashi M., Ueda M. Correlation of the expression of human telomerase subunits with telomerase activity in normal skin and skin tumors // Cancer - 1999.

- Vol. 86. - P. 2038-44.

27. Zhang X., Ying K., Cai X. et al. Detection of telomerase activity in bronchoscopic brushing cells of lung cancer patient // Chin. J. Cancer Res. - 1999. - Vol. 2, No. 11.

- P. 136-138.