Получение растений-регенерантов ириса из изолированных зародышей в условиях in vitro

При сравнении наших данных с литературными, полученными в середине прошлого века, было выявлено, что в структуре фитопланктона обследованных рек значительно возросло видовое богатство (р. Омь) и обилие фитопланктона (реки Тара, Уй, Шиш), во всех реках в структуре фитопланктона отмечено преобладание цианобактерий и мелкоклеточных хлорококковых водорослей [4, 5]. Видовое богатство фитопланктона всех обследованных притоков возросло за счет вхождения в его состав криптофитовых, ди-нофитовых и желто-зеленых водорослей. В фитопланктоне р. Оми отмечено массовое развитие индикаторов антропогенного эвтрофирования (5. hantzschii, М. pulverea), в других притоках — их постоянное присутствие. В составе фитопланктона р. Оми произошло увеличение числа а- и Р-мезосапробов и появились виды-индикаторы полисапробной зоны. В других реках возросло число видов-индикаторов Р-мезосапробной зоны, появились а-мезосапробы и полисапробы.

Выводы

Установленные изменения структуры, таксономического состава и обилия фитопланктона указывают на то, что в настоящее время правобережные притоки Иртыша подвержены эвтрофированию и загрязнению легко окисляющимися органическими веществами. Согласно концепции

экологических модификаций В.А. Абакумова экосистема р. Оми находится в состоянии экологического напряжения, что вызывает опасения в связи с высокой возможностью её сдвига в сторону негативных изменений [6].

Библиографический список

1. Федоров В.Д. О методах изучения фитопланктона и его активности / В.Д. Федоров. — М.: МГУ, 1979. — 168 с.

2. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений. — Л.: Гидрометеоиз-дат, 1983. — С. 44-46.

3. Шитиков В.К. Количественная гидроэкология: методы системной идентификации / В.К. Шитиков, Г.С. Розенберг, Т.Д. Зинченко. — Тольятти: ИЭВБ РАН, 2003. — 463 с.

4. Бобкова Г.И. Альгофлора низовьев реки Оми и ее сезонные изменения / Г.И. Бобкова / / Тр. Омского мед. ин-та. — Омск, 1963. — № 37. — С. 165-177.

5. Скабичевский А.П. Фитопланктон некоторых правых притоков Иртыша /

A.П. Скабичевский // Тр. Омского мед. ин-та. — Омск, 1965. — № 61. — С. 14-24.

6. Абакумов В.А. Экологические модификации и развитие биоценозов /

B.А. Абакумов / / Экологические модификации и критерии экологического нормирования: тр. Междунар. симпозиума. — Л.: Гидрометеоиздат, 1991. — С. 18-40.

+ + +

УДК 575:635.92

Л.И. Тихомирова

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИРИСА ИЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Ключевые слова: культура in vitro, зародыш, ирис, микроклональное размножение, эмбриокультура, питательные среды, растения-регенеранты, регуляторы роста, гибриды, стерилизация.

Введение

Название «iris» дал Гиппократ, что в переводе с древнегреческого означает «радуга». Разнообразие и богатство окрасок

цветков этих растений по праву сравнивается с красивейшим явлением природы. Римляне дали одному из городов название Флоренция (цветущая) лишь потому, что окрестности его были усыпаны ирисами. Ирисы почитались в Аравии и Древнем Египте, где их разводили еще в КУ^У вв. до н.э.; в Японии из ирисов и померанцев для мальчиков делали магические амулеты, охраняющие от болезней и вселяю-

щие отвагу. В культуре ирисы возделы-ваются более двух тысячелетий; их ценят не только за красоту и аромат цветов, но также и за аромат корня (вытяжки из него используются в парфюмерной промышленности, при изготовлении винно-водочных и кондитерских изделий).

У традиционных приемов создания новых форм декоративных многолетников и производства посадочного материала есть существенный недостаток — низкая эффективность, несовместимая с потребностями современного рынка. Многолетники имеют продолжительный жизненный цикл, что усложняет и затягивает процесс селекции, а на создание гибридов с ценными признаками, стабильно передающимися по наследству, может понадобиться более десяти лет. Длительность прорастания и невысокая всхожесть семян, довольно долгий виргильный период развития растений затягивают срок получения селекционного посадочного материала. Поэтому для размножения многих культур успешно используют способ регенерации растений из изолированных зиготических зародышей. При этом зародыш изолируют из семени или семязачатка, помещают в искусственные условия, замещающие эндосперм. Применение такого способа позволяет быстро получить массовое количество селекционного материала и значительно сократить срок оценки гибридизации [1, 2]. Наиболее изучен в данном аспекте I. ensataThunb. В Японии ирис мечевидный культивируется более 500 лет. Это одна из популярных и любимых культур в стране. По данным Японского Общества Iris, впервые в Японии из незрелых зародышей отдаленных гибридов I. ensata успешно регенерированы растения в результате индукции соматического эмбриогенеза в каллусной культуре [3-5]. Разработан способ размножения in vitro гибридов I. hybrida hort., который позволяет получить через несколько месяцев после гибридизации из одного семени до 6-8 генетически однородных растений и значительно сократить сроки получения селекционного материала [6].

Цель работы — разработать метод эм-бриокультуры in vitro для 3 видов ириса (I. hybrida, I. ensata, I. sibirica L.) с целью ускорения селекционного процесса.

Объекты, методы и условия исследований

Объектами исследования являлись зародыши семян гибридных форм ириса:

для I. sibirica гибрид 36-38-01 х св. опыление, для I. hybrida гибрид Лилэс Лайн х св. опыление, для I. ensata гибрид 21 х св. опыление из коллекции НИИСС им. Лиса-венко.

Из стерилизующих средств использовали растворы этилового спирта 96 и 0,1%, сульфохлорантина.

Питательные среды готовили по прописи Мурасиге и Скуга, с дабавлением 30 г/л сахарозы. Из регуляторов роста на этапе введения ирисов в культуру изучено действие 3-5 мкМ нафтилуксусной кислоты (НУК), 0,5-1 мкМ индолилмасляной кислота (ИМК), 1-20 мкМ 6-бензилами-нопурина (БАП), 100 мг/л L-глутамина и 100 мг/л аденинсульфата. Работу в асептических условиях, приготовление и стерилизацию питательных сред проводили по общепринятым методикам [7].

Растения выращивали в лабораторных условиях при искусственном освещении (2000-4000 лк) в условиях фотопериода: 16/8 ч свет/темнота и температуре 24-260С.

В опыте использовано по 20 зародышей для каждого вида в три срока введения в культуру; всего в трех повторностях — 90 растений-регенерантов.

Учетными элементами явились: число побегов на эксплант, средняя длина побега, число корней в первых четырёх пассажах. Продолжительность пассажа на одной среде составляла 25-30 суток.

Результаты и их обсуждение

Стерилизацию материала проводили в условиях ламинар-бокса в два этапа. На первом этапе бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигали в пламени спиртовки. Следующий этап обеззараживания проводили в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в течение 20 минут. Подобный способ обеспечивал на 90% стерильность материала и 100% жизнеспособность.

Для успешного введения в культуру зародышей трёх видов ириса определён оптимальный возраст эксплантов, отработана техника вычленения зародышей из семян. Для ириса характерно замедленное развитие и дифференциация зародыша [8]. Даже на 30-е сутки после опыления зародыши ириса плохо просматривались. В связи с этим попытки вычленения их из семени не дали положительных результатов. Выявлено, что оптимальным сроком изоляции зародышей является с 50-х по 80-е сутки после опыления, когда у ос-

новнои массы семян их размер достигал 2-3 мм. После 80 суток развития эндосперм становится очень плотным, что также затрудняет вычленение зародыша.

Согласно классификации рода Ирис, предложенной Г.И. Родионенко, виды I. ensata и I. sibirica относятся к подроду Лимнирис, а I. hybrida — к подроду Ирис. Между ними нет близкого родства. Это подтверждается их нескрещиваемостью [8]. Учитывая это, для каждого вида ириса были использованы различные по содержанию фитогормонов питательные среды.

Введение в культуру in vitro зародышей I. sibirica. Зародыши размером 2-3 мм от свободного опыления гибрида 36-38-01 в возрасте 50-60 дней. Размеры плода и семени в этот период составляли 35х20 и 7х 4 мм соответственно. После поверхностной стерилизации плодов зародыши вычленяли из семени и помещали на поверхность искусственной питательной среды MS с различным сочетанием гормональных и не гормональных стимуляторов роста. Всего пять вариантов сред. Лучшей питательной средой для введения зародышей явился вариант пять (табл. 1).

Влияние питательной среды I. sibirica гибрида 36-38-01 х св.

Полученные регенеранты субкультиви-ровали на среде с 5 мкМ БАП в течение двух пассажей, а далее чередовали среды, содержащие 5 и 1 мкМ БАП, до получения необходимого количества расте-ний-регенерантов. После чего регенеранты переносили на среду, не содержащую гормональные добавки для укоренения. Таким способом за 4 месяца культивирования от одного зародыша можно получить 35 растений-регенерантов с длиной листьев 37-45 мм, пригодных для дальнейшего укоренения и адаптации к нестерильным условиям.

Введение в культуру in vitro зародышей ириса I. hybrida. Зародыши ириса I. hybrida изолировали в возрасте 60-80 сут. Размеры плода и семени в этот период составляли 45 х 18 и 9 х 8 мм соответственно. Было испытано четыре варианта питательных сред. Полученные ре-генеранты субкультивировали на средах с 1 мкМ БАП, а далее — чередуя среды, содержащие 2,5 и 1 мкМ БАП до получения необходимого количества растений-регенерантов. Лучшими питательными средами для введения зародышей явились варианты один и четыре (табл. 2).

Таблица 1

на развитие зародышей опыление в культуре in vitro

мкМ 0-й пассаж 1-й пассаж 5 мкМ БАП 2-й пассаж 5 мкМ БАП 3-й пассаж 1 мкМ БАП

ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к.

1. 1 БАП + 1 ИМК 1 5 1 1 10 0 1 20 0 3 15 0

2. 2,5 БАП 1 7 0 1 11 0 4 18 0 10 13 0

3. 2,5БАП + 0,5 ИМК 1 25 0 1 60 0 1 80 0 3 40 0

4. 5 БАП + 0,5 ИМК 1 8 1 1 15 0 2 20 0 7 20 0

5. 6 БАП +5 НУК + l-г + а.с. 100 мг/л 1 + Ад.п. 12 1 5 15 0 10 20 0 35 37 0

Примечание. Ч.п. — число побегов на один эксплант; д.р. — средняя длина растения; ч.к. — среднее число корней; 1-г — L-глутамин; а.с. — аденинсульфат; Ад.п. — адвентивные побеги.

Рис. 1. Регенерация побегов из ткани зародыша I. в1Ь1г1са гибрида 36-38-01 х св. опыление в культуре ¡п vitro па питательной среде с 6 БАП + 5 НУК + 1-г + а.с. 100 мг/л

Рис. 2. Регенерация побегов из ткани зародыша I. hybrida гибрида Лил эс Лайн х св. опыление в культуре in vitro на питательной среде с 6 БАП + 5 НУК + l-г + а.с. 100 мг/л

Размноженные регенеранты переносили на среду, не содержащую гормональные добавки для укоренения. Таким образом, за 4 месяца культивирования от одного зародыша можно получить 37 расте-ний-регенерантов с длиной листьев 50 мм, пригодных для дальнейшего укоренения и адаптации к нестерильным условиям.

Введение в культуру in vitro зародышей ириса I. ensata. Зародыши ириса I. ensata изолировали в возрасте 50 суток. Размеры плода и семени в этот период составляли 30 х 20 и 8 х 4мм соответственно. В этот период развития эндосперм мягкий, иногда гелеобразный, зародыш хорошо оформлен, легко вычленяется. Было испытано четыре варианта питательных сред. На всех средах жизнеспособность зародышей была достаточно высокой и составляла 50-100%. Полученные регенеранты субкультивировали на средах с 20 мкМ БАП и 1 ИМК, а далее снижали содержание БАП до 1 мкМ в течение следующих двух пассажей до получения необходимого количества растений-реге-нерантов. Лучшими питательными средами для введения зародышей явились варианты 2, 3 и 4 (табл. 3).

Размноженные регенеранты переносили на среду, не содержащую гормональные добавки для укоренения. Таким образом, за 4 месяца культивирования от одного зародыша можно получить 13 расте-ний-регенерантов с длиной листьев 43 мм, пригодных для дальнейшего укоренения и адаптации к нестерильным условиям.

Таблица 2

Влияние питательной среды на развитие зародышей I. hybrida гибрида Лилэс Лайн х св. опыление в культуре ¡п vitro

мкМ 0-й пассаж 1-й пассаж 1 мкМ БАП 2-й пассаж 2,5 мкМ БАП 3-й пассаж 1 мкМ БАП

ч.п. д-р-, мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к.

1. 1 БАП 1 10 0 5 14 0 11 31 3 24 25 0

2. 1 БАП + 1 ИМК 1 10 1 1 45 0 1 60 0 1 112 0

3. 5 БАП + 0,5 ИМК 1 40 0 1 80 0 1 80 0 2 40 0

4. 6 БАП +5 НУК + l-г + а.с. 100 мг/л 1 + Ад.п. 5 0 9 1 0 16 20 0 37 50 0

Примечание. Ч.п. — число побегов на один эксплант; д.р. — средняя длина растения; ч.к. — среднее число корней; 1-г — L-глутамин; а.с. — аденинсульфат; Ад.п. — адвентивные побеги.

Влияние питательной среды на развитие зародышей I. ensata гибрида 21 х св. опыление в культуре in vitro

Таблица 3

мкМ 0-й пассаж 1-й пассаж 20 мкМ БАП + 1 ИМК 2-й пассаж 5 мкМ БАП 3-й пассаж 1 мкМ БАП

ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к. ч.п. д.р., мм ч.к.

1. 1 БАП + 1 ИМК 1 20 1 1 35 1 1 80 0 1 115 0

2. 5 БАП 1 10 1 2 15 0 6 9 0 11 40 0

3. 6 БАП + 5 НУК + l-г + а.с. 100 мг/л 1 19 1 1 25 0 10 12 0 13 43 0

4. 20 БАП + 1 ИМК 1 15 1 1 10 0 6 11 0 8 45 0

Примечание. Ч.п. — число побегов на один эксплант; д.р. — средняя длина растения; ч.к. — среднее число корней; 1-г — L-глутамин; а.с. — аденинсульфат.

Довольно часто при переносе зародыша на искусственную питательную среду из одного зародыша развивается только одно растение. Однако на определённых питательных средах у зародыша можно индуцировать образование пазушных меристем прямым путём, это увеличивает коэффициент размножения в несколько раз и ускоряет сам процесс размножения гибридного растения. Главную роль в этом процессе играют компоненты питательной среды на этапе введения в культуру. Влияние этих компонентов прослеживается до 4 месяцев культивирования зародышей. На всех испытанных питательных средах регенеранты зародышей трёх видов ириса имели хорошо развитые листья, а иногда и корни. На среде с 6 мкМ БАП + 5 мкМ НУК, дополненной L-глута-мином и аденинсульфатом в количестве 100 мг/л, из зародышей I. hybrida, I. sibirica наряду с основным формировались адвентивные побеги в нулевом пассаже. У I.ensata на этой среде в нулевом пассаже развивался один побег, но в последующих наблюдалась тенденция к размножению с наибольшим коэффициентом.

Выводы

1. Определён срок введения в культуру in vitro для зародышей ириса I. hybrida, I. ensata, I. sibirica — 50-80 суток.

2. Отработан способ стерилизации растительного материала, который обеспечивал на 90% стерильность зародышей и 100% их жизнеспособность.

3. На всех испытанных питательных средах регенеранты зародышей трёх видов ириса имели хорошо развитые листья, а иногда и корни. На среде с 6 мкМ БАП + 5 мк МНУК, дополненной L-глутамином и аденинсульфатом в количестве 100 мг/л, из зародышей I. hybrida, I. sibirica формировались адвентивные побеги, у

I.ensata в последующих пассажах увеличивался коэффициент размножения.

Библиографический список

1. Ишмуратова М.М. Использование культуры in vitro для размножения гибридов Iris L. / М.М. Ишмуратова, Ф.Ф. Рахимова / / Растительные ресурсы. — 1999. — Вып 4. — С. 74-78.

2. Бибикова А.В. Растения как объект биотехнологии / А.В. Бибикова, Т.Ю. Горпенченко, Ю.Н. Журавлёв // Комаровские чтения. — 2007. — Вып. IV. — С. 184-211.

3. Kawase K. Shoot formation on floral organs of Japanese iris in vitro / K. Kawase, H. Mizutani, M. Yoshioka, S. Fukuda // Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 64. — 1995. — Р. 143-8.

4. Yabuva T. Embryo Growth and Cultural and Conditions in Iris-Ensata / T. Yabuva, H. Yamagata // Japanese Journal of Breeding 31. — 1981. — Р. 377-82.

5. Yabuva T. Amphidiploids between Iris-Laeviegata and Iris-Ensata Induced through in-Vitro Culture of Embryos treated with Colchicine / T. Yabuva // Japanese Journal of Breeding 35. — 1985. — Р. 136-44.

6. Ветчинкина Е.М. Некоторые аспекты использования культуры семян и зародышей in vitro для изучения и сохранения биоразнообразия рода Iris L. / Е.М. Вет-чинкина, Н.А. Мамаева // Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем: сб. ст. 3-го Молодежного научного семинара (г. Екатеринбург, 25-28 окт. 2004 г.). — Екатеринбург, 2005. — С. 21-25.

7. Калинин Ф.А. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.А. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Поли-щук. — Киев, 1980. — 488 с.

8. Родионенко Г.И. Ирис / Г.И. Родио-ненко. — М.: Минкомхоз РСФСР, 1961. — 60 с.

+ + +