ПРОИЗВОДНЫЕ ДОКОЗАГЕКСАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
DOCOSAHEXAENOIC ACID DERIVATIVES AND THEIR APPLICATION AS DRUGS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к соединениям общей формулы (I):
и их использованию в качестве лекарственных средств, в особенности для лечения сахарного диабета 2-го типа и преддиабетических состояний. Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединения формулы (I), и к композиции жирных кислот, включающей соединения формулы (I).
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Повышение частоты заболеваемости сахарным диабетом 2-го типа во всем мире является огромной медицинской проблемой и ставит необходимость внедрения успешных профилактических и лечебных мер. Повышение частоты случаев ожирения и избыточной массы тела, которые сильно коррелируют с диабетом 2-го типа, негативным образом сказывается на лечении диабета и повышает вероятность заболеваний, связанных с гипертонией, дислипидемией и атеросклерозом.
Патофизиологическое состояние, предшествующее развитию диабета 2-го типа, связано с пониженным влиянием инсулина на периферические ткани, это явление называется резистентностью к инсулину. Этими тканями являются главным образом мышечные, жировые ткани и ткани печени. При диабете 2-го типа резистентность к инсулину наиболее характерна для мышечной ткани. Синдром, при котором наблюдаются резистентность к инсулину, повышенное кровяное давление, дислипидемия и провоспалительное состояние, называется метаболическим синдромом. Распространенность метаболического синдрома во взрослой популяции в развитых странах составляет 22-39% (Meighs 2003).
В настоящее время наиболее обещающим способом уменьшения метаболического синдрома является изменение стиля жизни, заключающееся в снижении веса, снижении потребления насыщенного жира, увеличении физической активности в комбинации с соответствующей фармакотерапией. При здоровых диетах, которые позволяют избегать излишнего потребления энергии, насыщенные жиры заменяются на моно- и полиненасыщенные жирные кислоты. В предупреждении диабета 2-го типа особенно свою эффективность доказали омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты, которые содержатся в жирной рыбе, эйкозапентаеновая кислота (ЕРА) и докозагексаеновая кислота (DHA).
ЕРА и DHA оказывают влияние на различные физиологические процессы, такие как регуляция уровня липидов в плазме, сердечно-сосудистая и иммунная функции, действие инсулина, развитие нервной системы и зрительная функция. Существуют доказательства роли этих кислот в предупреждении и коррекции ишемической болезни сердца, дислипидемии, диабета 2-го типа, инсулиновой резистентности и гипертонии (Simonopoulos 1999; Geleijnse 2002; Storlien 1998). Недавние исследования показали, что омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты являются важными медиаторами генной экспрессии, действуя через ядерные рецепторы, такие как рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом (PPARs), контролируя экспрессию генов, имеющих отношение к углеводному и липидному обмену и липогенезу (Jump 2002). Рецепторы PPARs являются ядерными рецепторами, которые играют важную роль в развитии связанных с ожирением нарушений обмена веществ, таких как гиперлипидемия, резистентность к инсулину и ишемическая болезнь.
Три подтипа рецепторов, α, γ и δ, имеют различный характер экспрессии и распознают компоненты различных липопротеинов, и регулируют липидный гомеостаз на основании потребностей специфических тканей. PPARα усиливает катаболизм жирных кислот в печени и является молекулярной мишенью фибратов, понижающих уровень липидов. PPARγ играет роль в дифференциации адипоцитов и опосредует активность инсулин-сенсибилизаторов - тиазолидиндионов (глитазоны), механизмы этого опосредования мало изучены (Chih-Нао 2003; Yki-Jarvinen 2004).
Недавно лекарственные средства, действующие как лиганды PPARγ рецептора, стали использоваться в лечении диабета 2-го типа (Yki-Jarvinen 2004). Эти соединения, называемые тиазолидиндионами или глитазонами, являются лекарственными средствами, которые реверсируют резистентность к инсулину, которая является патофизиологической базой для развития метаболического синдрома и диабета 2-го типа. Эти соединения, из которых розиглитазон и пиоглитазон выпускаются как лекарственные средства, понижают концентрацию глюкозы натощак и постпрандиальную концентрацию глюкозы (как было показано с помощью теста толерантности к глюкозе), уровень инсулина в плазме, а также концентрацию свободных жирных кислот. В этом отношении глитазоны действуют как инсулин-сенсибилизаторы.
Однако эти улучшения обычно сопровождаются прибавлением в весе и повышением массы подкожной жировой ткани (Adams 1997). Применение тиазолидиндионов не только связано с прибавлением в весе, но у части пациентов также наблюдается задержка жидкости и увеличение объема плазмы, что приводит к периферическим отекам. Увеличение массы тела и отеки могут приводить к нарушениям сердечной деятельности, это послужило причиной того, что Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) включило предостережение в информацию о розиглитазоне (Avandia) и пиоглитазоне (Takeda). Эти неблагоприятные эффекты ограничивают применение глитазонов особенно у пациентов с ишемической болезнью сердца. Очевидно, что существует необходимость в разработке новых лекарственных средств, которые оказывают положительное влияние на резистентность к инсулину, но снижают вес тела и не способствуют задержке воды в организме.
Эффект полиненасыщенных жирных кислот (PUFAs) на рецепторы PPARs является не только результатом структуры жирных кислот и сродства к рецептору. Также важны факторы, влияющие на концентрацию неэстерифицированных жирных кислот (NEFA). На пул NEFA влияет концентрация экзогенных жирных кислот, поступающих в клетку, и количество эндогенных синтезированных жирных кислот, их удаление через включение в липиды, а также их пути окисления (Pawar 2003).
Хотя омега-3 жирные кислоты являются слабыми агонистами PPARs по сравнению с такими фармакологическими агонистами как тиоглитазоны, эти жирные кислоты показали улучшение усвоения глюкозы и повышение чувствительности к инсулину (Storlien 1987). Было сделано сообщение о том, что адипоциты были более чувствительны к инсулину и транспортировали больше глюкозы, когда в диете было повышено отношение полиненасыщенных жирных кислот к насыщенным жирным кислотам (Field 1990). Вместе эти данные указывают на то, что С20 и С22 жирные кислоты, называемые ЕРА и DHA, могут играть определенную роль в предупреждении развития резистентности к инсулину.
Из-за их ограниченной стабильности in vivo и отсутствия биологической специфичности PUFAs не являются действительно широко используемыми терапевтическими агентами. Несколькими исследовательскими группами были выполнены химические модификации п-3 полиненасыщенных жирных кислот с целью изменить или повысить их метаболические эффекты.
Например, гиполипидемический эффект ЕРА был усилен путем введения метильной или этильной в α- или β-положение ЕРА (Vaagenes 1999). Эти соединения также снижают уровень свободных жирных кислот в плазме, тогда как этиловый эфир ЕРА не оказывает такого эффекта.
В недавней работе, опубликованной L. Larsen (Larsen 2005), авторы показывают, что α-метил производные ЕРА и DHA повышают активацию ядерного рецептора PPARα и таким образом экспрессию L-FABP по сравнению с EPA/DHA. ЕРА с этильной группой в α-положении активирует PPARα с такой же силой, как α-метил-ЕРА. Авторы полагают, что замедленный катаболизм этих α-метил жирных кислот может способствовать их повышенным эффектам из-за уменьшенного β-окисления в митохондриях, ведущего к пероксисомальному окислению.
Было показано, что альфа-метил-ЕРА является более сильным ингибитором агрегации тромбоцитов, чем ЕРА, как in vitro (Larsen 1998), так и in vivo (Willumsen 1998). В реферате патента Японии, номер публикации 05-00974, сообщается о DHA, замещенной в альфа-положении ОН-группой, однако только в качестве промежуточного продукта. Об исследованиях возможных фармацевтических эффектов этого соединения не сообщается.
Компания Laxdale Limited также описала применение альфа-замещенных производных ЕРА в лечении психиатрических расстройств и нарушений со стороны центральной нервной системы (US 6689812).
Ни одна из этих модифицированных жирных кислот не имела, однако, удовлетворительной фармацевтической активности и ни одна из них не вышла на фармацевтический рынок.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является получение новых производных DHA, имеющих терапевтический эффект.
На основании настоящего изобретения представлен ряд аспектов в прилагаемых пунктах формулы изобретения. Некоторыми из этих аспектов являются следующие аспекты:
1. Новые соединения, т.е. некоторые α-замещенные производные полиненасыщенной жирной кислоты.
2. Новые соединения для применения в качестве лекарственных средств и для применения в терапии.
3. Композиция жирных кислот или фармацевтическая композиция, включающая новые соединения.
4. Композиция жирных кислот, включающая новые соединения для применения в качестве лекарственного средства и для применения в терапии.
5. Применение новых соединений для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения диабета у человека или у животных.
6. Применение новых соединений для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики ожирения или избыточной массы тела.
7. Применение новых соединений для получения лекарственного средства для контроля снижения массы тела и/или для профилактики прибавления в весе.
8. Применение новых соединений для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с амилоидозом.
9. Применение новых соединений для получения лекарственного средства для лечения или профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний.
10. Применение новых соединений для получения лекарственного средства для профилактики нарушения мозгового кровообращения, церебральных или транзиторных ишемических атак, связанных с атеросклерозом некоторых артерий.
11. Способ специфического лечения диабетического заболевания, предпочтительно диабета 2-го типа.
12. Способ контролирования снижения массы тела, профилактики прибавления в весе и/или лечения и/или профилактики ожирения или избыточной массы тела.
13. Способ лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с амилоидозом
14. Способ лечения или профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний.
15. Способ профилактики нарушения мозгового кровообращения, церебральных или транзиторных ишемических атак, связанных с атеросклерозом некоторых артерий.
16. Способы получения новых аналогов жирных кислот, соответствующих настоящему изобретению
Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I):
1
2
где - R и R являются одинаковыми или различными и могут быть выбраны из группы, состоящей из атома водорода, гидроксильной группы, алкильной группы, атома галогена, алкоксигруппы, ацилоксигруппы, ацильной группы, алкенильной группы, алкинильной группы, арильной группы, алкилтиогруппы, алкоксикарбонильной группы, алкилсульфинильной группы, алкилсульфонильной группы, аминогруппы, алкиламиногруппы; и
- Х означает карбоксильную группу, карбоксилатную группу или карбоксамидную группу или любую фармацевтически приемлемую соль, сольват, их комплекс или пролекарство при условии, что:
- соединение формулы (I) не является (полностью-Z)-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислотой (DHA), альфа-метил-DHA, метиловым эфиром альфа-метил-DHA, этиловьм эфиром альфа-метил-DHA или этиловым эфиром альфа-гидрокси-DHA.
Условия относятся к следующим случаям:
1
2
- когда R является атомом водорода, R не является атомом водорода;
2
1
- когда R является атомом водорода, R не является атомом водорода;
1
2
- когда R является метильной группой, R не является атомом водорода и Х не является карбоксильной группой, метилкарбоксилатом или этилкарбоксилатом;
2
1
- когда R является метильной группой, R не является атомом водорода, и Х не является карбоксильной группой, метилкарбоксилатом или этилкарбоксилатом;
1
2
- когда R является гидроксильной группой, R не является атомом водорода и Х не является этилкарбоксилатом; и
2
1
- когда R является гидроксильной группой, R не является атомом водорода и Х не является этилкарбоксилатом.
2
3
2
2
3
В соединении, соответствующем настоящему изобретению, указанная алкильная группа может быть выбрана из группы, состоящей из метильной, этильной, н-пропильной, изопропильной, н-бутильной, втор-бутильной, n-гексильной и бензильной групп; указанный галогеновый атом может быть выбран из группы, состоящей из фтора, хлора, брома и йода; указанная алкоксигруппа может быть выбрана из группы, состоящей из метокси-, этокси-, пропокси-, изопропокси-, втор-бутокси-, фенокси-, бензилокси-, ОСНСF и ОСНСНОСН групп; указанная ацилоксигруппа может быть выбрана из ацетокси-, пропионокси- и бутироксигрупп; указанная алкенильная группа может быть выбрана из группы, состоящей из аллильной, 2-бутенилыюй и 3-гексенильной групп; указанная алкинильная группа может быть выбрана из группы, состоящей из пропаргильной, 2-бутинильной и 3-гексенильной групп; указанная арильная группа является фенильной группой; указанная алкилтиогруппа может быть выбрана из группы, состоящей из метилтио-, этилтио-, изопропилтио- и фенилтиогрупп; указанная алкоксикарбонильная группа может быть выбрана из группы, состоящей из метоксикарбонильной, этоксикарбонильной, пропоксикарбонильной и бутоксикарбонильной групп; указанная алкилсульфинильная группа может быть выбрана из группы, состоящей из метансульфинильной, этансульфинильной и изопропансульфинильной групп; указанная алкилсульфонильная группа может быть выбрана из группы, состоящей из метансульфонильной, этансульфонильной и изопропансульфонильной групп; указанная алкиламиногруппа может быть выбрана из группы, состоящей из метиламино-, диметиламино-, этиламино- и диэтиламино групп; указанная карбоксилатная группа может быть выбрана из группы, состоящей из этилкарбоксилата, метилкарбоксилата, н-пропилкарбоксилата, изопропилкарбоксилата, н-бутилкарбоксилата, втор-бутилкарбоксилата и н-гексилкарбоксилата; указанная карбоксамидная группа может быть выбрана из группы, состоящей из первичной карбоксамидной, N-метилкарбоксамидной, N,N-диметилкарбоксамидной, N-этилкарбоксамидной и N,N-диэтилкарбоксамидной групп.
1
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения R и R выбраны из группы, состоящей из атома водорода, гидроксигруппы, алкильной группы, атома галогена, алкоксигруппы, алкилтиогруппы, алкилсульфинильной группы, алкилсульфонильной группы, аминогруппы и алкиламиногруппы.
1
2
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
В другом варианте осуществления настоящего изобретения R и R выбраны из группы, состоящей из атома водорода, гидроксигруппы, C-Cалкильной группы, атома галогена, C-Cалкоксигруппы, C-Cалкилтиогруппы, C-C алкилсульфинильной группы, C-C алкилсульфонильной группы, аминогруппы и C-Cалкиламиногруппы. Указанная C-C алкильная группа может быть метильной, этильной или бензильной группой; указанный атом галогена может быть фтором или йодом: указанная C-C алкоксигруппа может быть метокси- или этоксигруппой; указанная C-Cалкилтиогруппа может быть метилтио-, этилтио- или фенилтиогруппой; указанная C-C алкилсульфинильная группа может быть этансульфинильной группой; указанная C-C алкилсульфонильная группа может быть этансульфонильной группой; указанная C-Cалкиламиногруппа может быть этиламино- или диэтиламиногруппой; и Х может означать этилкарбоксилатную или карбоксамидную группу.
1
2
2
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
В другом варианте осуществления настоящего изобретения R и R выбраны из группы, состоящей из атома водорода, С-С алкильной группы, атома галогена, C-Cалкоксигруппы, C-Cалкилтиогруппы, C-Cалкилсульфинильной группы, C-C алкилсульфонильной группы, аминогруппы и C-Cалкиламиногруппы; и Х означает карбоксилат. Указанная С-С алкильная группа может быть этильной или бензильной группой; указанный атом галогена может быть фтором или йодом; указанная C-Cалкоксигруппа может быть метокси- или этоксигруппой; указанная C-Cалкилтиогруппа может быть метилтио-, этилтио- или фенилтиогруппой; указанная C-C алкилсульфинильная группа может быть этансульфинильной группой; указанная C-C алкилсульфонильная группа может быть этансульфонильной группой; указанная C-Cалкиламиногруппа может быть этиламино- или диэтиламиногруппой; и Х может означать этилкарбоксилат.
1
2
В соединении, соответствующем формуле (I) настоящего изобретения, R и R могут быть одинаковыми или разными. Когда они разные, соединения формулы (I) способны существовать в стереоизомерных формах. Это понимается таким образом, что настоящее изобретение включает все оптические изомеры соединений формулы (I) и их смеси, включая рацематы.
1
2
1
2
Следовательно, где R отличается от R, настоящее изобретение включает соединения формулы (I), которые являются рацемическими или энантиомерно чистыми, или как (S) или (R) энантиомер. Следовательно, где R отличается от R, настоящее изобретение включает соединения формулы (I), которые являются рацемическими или энантиомерно чистыми, или как (S) или (R) стереоизомер.
В пределах настоящего изобретения находятся энантиомеры соединений формулы (I), как определено выше. Кроме того, энантиомеры производных DHA, соответствующих настоящему изобретению, могут находиться в форме карбоновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли, любого эфира, ангидрида или амида (первичного, вторичного, третичного). Производное кислоты может быть в форме фосфолипида или три-, ди- или моноглицерида.
1
2
2
7
В одном варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, один из R и R означает С-С алкильную группу, например, этил или бензил, и другой означает атом водорода. Предпочтительно, алкильная группа является этилом.
1
2
В другом варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, один из R и R означает алкоксигруппу, например, этокси- или метоксигруппу, и другой означает атом водорода.
1
2
В другом варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, один из R и R означает атом галогена, например, фтор или йод, и другой означает атом водорода.
1
2
В другом варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, один из R и R означает алкилтиогруппу, например этилтио-, метилтил- или фенилтиогруппу, и другой означает атом водорода. Предпочтительно алкилтиогруппа является этилтиогруппой.
1
2
В другом варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, один из R и R означает алкилсульфонильную группу, например этилсульфонильную, и другой означает атом водорода.
1
2
В другом варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, один из R и R означает аминогруппу, и другой означает атом водорода.
1
2
В другом варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, один из R и R означает алкиламиногруппу, например, этиламино- или диэтиламиногруппу, и другой означает атом водорода.
1
2
1
7
В дальнейшем варианте осуществления соединения формулы (I), соответствующем настоящему изобретению, R и R являются одинаковыми и означают C-C - алкильные группы, предпочтительно метильные или этильные группы.
В предпочтительных вариантах осуществления соединения формулы (I), X означает карбоксилат, например, этилкарбоксилат.
Соединение, соответствующее настоящему изобретению, может существовать в форме фосфолипида, три-, ди- или моноглицерида или в форме свободной кислоты.
Альфа-замещенные производные DHA, соответствующие настоящему изобретению, фармацевтически были очень активны. В частности, производные жирной кислоты, соответствующие настоящему изобретению, обладают огромным потенциалом для использования в лечении и/или профилактике диабета и преддиабетических состояний.
Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы (I) для применения в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение также относится к способу получения соединения формулы (I). К примеру, соединение формулы (I) может быть получено из (полностью-Z)-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислоты (DHA). DHA может быть растительного, микробного и/или животного происхождения (к примеру, жир морской рыбы). Другим важным преимуществом с соединениями формула (I) является то, что аналоги жирной кислоты могут быть получены непосредственно на основе (полностью-Z)-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислоты (DHA).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аналоги жирной кислоты формулы (I) получены на основе DHA, где указанная DHA получена по меньшей мере из одного источника растительного, микробного и животного происхождения или их комбинации. Настоящее изобретение включает, следовательно, производные, полученные из жира микробного происхождения, содержащего DHA. Указанная DHA получена из морского жира, такого как рыбий жир.
Другой аспект настоящего изобретения связан с фармацевтической композицией, включающей соединение формулы (I) в качестве активного ингредиента. Фармацевтическая композиция может включать фармацевтически активный носитель. Соответственно фармацевтическая композиция, соответствующая настоящему изобретению, создана для перорального введения, например, в форме капсулы или саше-порошка. Соответствующая дневная дозировка соединения формулы (I), соответствующего настоящему изобретению, составляет от 10 мг до 10 г, в частности, от 100 мг до 1 г указанного соединения.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции жирных кислот, включающей соединение формулы (I). По меньшей мере 60% или по меньшей мере 90% веса композиции жирных кислот может составлять указанное соединение. Композиция жирных кислот может дополнительно включать (полностью-Z)-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), (полностью-2)-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновую кислоту (DHA), (полностью-Z)-6,9,12,15,18-генэйказапентаеновую кислоту (НРА), и/или (полностью-Z)-7,10,13,16,19-докозапентаеновую кислоту (DPA). Жирные кислоты могут присутствовать в форме производных. Композиция жирных кислот, соответствующая настоящему изобретению, может дополнительно включать фармацевтически приемлемый антиоксидант, например токоферол. В пределах настоящего изобретения находится также композиция жирных кислот, описанная выше, для применения в качестве лекарственного средства.
В добавочном аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего формуле (I), для производства лекарственного средства для контроля снижения массы тела и/или предупреждения прибавления в весе; для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики ожирения или избыточной массы тела; для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения диабета у животных, особенно диабета 2-го типа; для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с амилоидозом; для производства лекарственного средства для лечения или профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, особенно для лечения повышенного уровня липидов в крови, для производства лекарственного средства профилактики нарушения мозгового кровообращения, церебральных или транзиторных ишемических атак, связанных с атеросклерозом некоторых артерий.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу контроля снижения массы тела и/или предупреждения прибавления в весе; способу лечения и/или профилактики ожирения или избыточной массы тела; способу профилактики и/или лечения диабета, особенно диабета 2-го типа; способу лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с амилоидозом; способу лечения или профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний; способу профилактики нарушения мозгового кровообращения, церебральных или транзиторных ишемических атак, связанных с атеросклерозом некоторых артерий, где фармацевтически эффективное количество соединения формулы (I) вводится человеку или животному. Соответственно соединение формулы (I) применяется перорально у человека или животных.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 является схематическим описанием теории пула свободных жирных кислот.
На фигуре 2 представлено описание моделей и способов, использовавшихся в настоящем изобретении для демонстрации эффектов на метаболический синдром и диабет 2-го типа.
На фигуре 3 отображены концентрации свободных жирных кислот различных соединений, соответствующих настоящему изобретению, в ткани печени животных, получавших эти соединения в концентрации 1,5% от общего содержания жира.
На фигуре 4 отображены внутриклеточные концентрации DHA в ткани печени животных, получивших различные соединения, соответствующие настоящему изобретению, в концентрации 1,5% от общего содержания жира.
На фигуре 5 отображено сродство связывания для рецептора PPARγ различных соединений, соответствующих настоящему изобретению.
На фигуре 6 отображено сродство связывания для рецептора PPARα различных соединений, соответствующих настоящему изобретению.
На фигуре 7 отображено сродство связывания для рецептора RXRα различных соединений, соответствующих настоящему изобретению.
На фигуре 8 отображено высвобождение люциферазы из трансфецированных клеток, обработанных различными соединениями, соответствующими настоящему изобретению,
На фигуре 9 показан план эксперимента блока 4.
На фигуре 10 показано изменение массы тела в течение 2 недель экспериментальной диеты после 8 недель диеты с высоким содержанием жиров.
На фигуре 11 показаны результаты люциферазной активности, т.е. эндогенной активности PPARγ.
На фигуре 12 показана эндогенная люциферазная активность при различных соединениях, соответствующих настоящему изобретению, по сравнению с DHA.
На фигуре 13 показана типичная кривая снижения в крови уровня глюкозы до и после того, как животным с резистентностью к инсулину было дано соединение, уменьшающее резистентность к инсулину.
На фигурах 14, 15 и 16 показаны различные эффекты производных DHA, соответствующих настоящему изобретению, на метаболический синдром и резистентность к инсулину.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В исследовательской работе, приведшей к настоящему изобретению, были получены новые производные DHA, показавшие высокую фармацевтическую активность.
Жирные кислоты проникают в клетку пассивно или посредством Г-белок сопряженных транспортных систем, таких как транспортные белки жирных кислот. Внутри клеток они временно связываются связывающими белками (белки, связывающие жирные кислоты, FABP), которые играют важную роль в направлении жирных кислот к различным местам клетки для метаболизма и генной экспрессии (Pawar & Jump 2003). (Фигура 1 клетка печени).
Эстерификация жирных кислот в триглицериды, полярные липиды, холестериновые эфиры и их бета-окисление (митохондриальное и пероксисомальное) требует преобразования жирных кислот в ацил СоА тиоэфиры. Другие пути метаболизма, как микросомальное NADPH-зависимое моноокисление и синтез эйкозаноидов используют неэстерифицированные жирные кислоты в качестве субстратов. Все эти реакции, по всей видимости, влияют на концентрацию в клетке свободных жирных кислот (неэстерифицированных) и, таким образом, на количество и тип жирных кислот, которые могут быть использованы в качестве лигандов к ядерным рецепторам. Поскольку известно, что рецепторы PPARs связываются с неэстерифицированными жирными кислотами, представляется справедливым предположение, что состав пула жирных кислот является важным фактором в активности PPAR.
На состав пула свободных жирных кислот влияет концентрация экзогенных жирных кислот, поступающих в клетки, и скорость их удаления посредством путей метаболизма, перечисленных выше. Поскольку жирные кислоты с короткими и средними цепями требуются для этих путей метаболизма, практически только полиненасыщенные жирные кислоты с длинными цепями будут свободны для связывания с ядерными рецепторами. Кроме того, важным фактором может также являться структура жирной кислоты. Даже если серии моно- и полиненасыщенных жирных кислот показали сродство к рецептору PPARα, ЕРА и DHA показали наивысшую способность связывания в экспериментах с клетками печени крысы (Pawar & Jump 2003).
Поиск кандидатов жирных кислот, доступных для генетической модификации белков путем взаимодействия с ядерными рецепторами, подобными PPARs, важен для того, чтобы подтвердить, что соответствующие жирные кислоты обогатят пул свободных жирных кислот.
DHA, которая входит в клетки, быстро преобразуется в ацил-СоА тиоэфиры и включается в фосфолипиды, вследствие чего внутриклеточная концентрация DHA относительно низка. Эти DHA-СоА являются также субстратом для β-окисления первоначально в пероксисомах, что приводит к ретроконверсии DHA ЕРА, см. фигуру 1. Из-за быстрого включения в нейтральные липиды и окисления DHA не задержится долгое время в пуле свободных жирных кислот. Вследствие этого влияние DHA на генную экспрессию, возможно, ограничено.
Настоящее изобретение имеет целью скорее накопление производных жирных кислот в пуле свободных жирных кислот, чем включение в фосфолипиды. Изобретатели с удивлением обнаружили, что введение по меньшей мере одного заместителя в α-положение DHA дает в результате более низкую скорость окисления и меньшее включение в нейтральные липиды. Это приводит к повышенному влиянию на генную экспрессию, так как производные DHA будут накапливаться в тканях печени, мышечной ткани, жировых клетках и стимулировать активность ядерных рецепторов в большей степени, чем DHA.
Различные заместители, соответствующие настоящему изобретению, дадут различную степень сродства производных к рецепторам. Также возможно, что изменения в сродстве к белкам, связывающим жирные кислоты, ведут к изменениям биологической активности этих α-замещенных производных DHA формулы (I). В целом эти изменения приводят к повышению терапевтического эффекта производных DHA, соответствующих настоящему изобретению, по сравнению с DHA.
ЕРА (полностью-Z)-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота) ранее была алкилирована в α- и β-положении с целью ингибирования митохондриального β-положения. DHA не окисляется в митохондриях, а включается в фосфолипиды. В пероксисомах некоторое количество DHA реконвертируется в ЕРА. Заместитель в α-положении ЕРА и DHA будет влиять на различные метаболические пути. Ранее было показано, что α-метил-ЕРА и β-метил-ЕРА включаются в фосфолипиды и триглицериды, а α-этил-ЕРА нет (Larsen 1998). В этом исследовании производные были испытаны, как субстраты и/или ингибиторы ферментов, играющих роль в каскаде эйказаноидов. Поскольку большинство субстратов для этих ферментов является жирными кислотами, освобожденными из фосфолипидов, было желаемым, чтобы производные были включены в фосфолипиды. В противоположность этому, как упоминалось выше, мы хотели, чтобы производные не были включены в липиды, а накапливались в пуле NEFA.
В этом описании аббревиатура "PRB-x", где x является целым числом, будет использоваться при описании специфических соединений, соответствующих настоящему изобретению. Ниже приводятся структурные формулы и обычные названия этих соединений.
PRB-1 этиловый эфир α-метилдокозагексаеновой кислоты
PRB-2 этиловый эфир α-этилдокозагексаеновой кислоты
PRB-3 этиловый эфир α-этоксидокозагексаеновой кислоты
PRB-4 этиловый эфир α-фтородокозагексаеновой кислоты
PRB-5 этиловый эфир α,α-диметилдокозагексаеновой кислоты
PRB-6 этиловый эфир α-тиометилдокозагексаеновой кислоты
PRB-7 этиловый эфир α-тиоэтилдокозагексаеновой кислоты
PRB-8 этиловый эфир α,α-диэтилдокозагексаеновой кислоты
PRB-9 этиловый эфир α-бензилдокозагексаеновой кислоты
PRB-10 этиловый эфир α-этансульфенилдокозагексаеновой кислоты
PRB-11 этиловый эфир α-тиофенилдокозагексаеновой кислоты
PRB-12 этиловый эфир α-гидроксидокозагексаеновой кислоты
PRB-13 амид α-метилдокозагексаеновой кислоты
PRB-14 этиловый эфир α-метоксидокозагексаеновой кислоты
PRB-15 этиловый эфир α-йододокозагексаеновой кислоты
PRB-17 этиловый эфир α-аминодокозагексаеновой кислоты
PRB-18 (4R,5S)-3-докозагексаеноил-4-метил-5-фенил-оксазолидин-2-он
PRB-19 (4R,5S)-3-[(S)-α-этилдокозагексаеноил]-4-метил-5-фенил-оксазолидин-2-он
PRB-20 этиловый эфир (S)-(+)-α-этилдокозагексаеновой кислоты
PRB-21 (4S,5R)-3-докозагексаеноил-4-метил-5-фенил-оксазолидин-2-он
PRB-22 (4S,5R)-3-[(R)-α-этилдокозагексаеноил]-4-метил-5-фенил-оксазолидин-2-он
PRB-23 этиловый эфир (R)-(-)-α-этилдокозагексаеновой кислоты
PRB-24 этиловый эфир 2-(1,3-Диоксо-1,3-дигидро-изоиндол-2-ил)-докозагексаеновой кислоты
PRB-25 этиловый эфир α-этиламинодокозагексаеновой кислоты
PRB-26 этиловый эфир α-диэтиламинодокозагексаеновой кислоты
1
2
PRB-1 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает метил и второй означает водород, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-2 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает этил и второй означает водород, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-3 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает этоксигруппу и второй означает водород, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-4 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает фтор, и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-5 соответствует соединению формулы (I), где R и R означает метил, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-6 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает метилтиогруппу, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-7 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает этилтиогруппу и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-8 соответствует соединению формулы (I), где R и R означает этил и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-9 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает бензил и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-10 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает этансульфинил и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-11 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает фенилтиогруппу и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-12 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает гидроксигруппу и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-13 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает метил и другой является водородом, и Х означает первичный карбоксамид.
1
2
PRB-14 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает метоксигруппу и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-15 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает йод и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-17 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает аминогруппу и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-20 соответствует (S) стереоизомеру соединения формулы (I), где R или R означает этил и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-23 соответствует (R) стереоизомеру соединения формулы (I), где R или R означает этил и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-24 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает N-фталимид и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
1
2
PRB-25 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает этиламиногруппу и другой является водородом, и Х означает первичный карбоксамид.
1
2
PRB-26 соответствует соединению формулы (I), где R или R означает диэтиламиногруппу и другой является водородом, и Х означает этилкарбоксилат.
PRB-2 является наиболее предпочтительным соединением, соответствующим настоящему изобретению. Другими предпочтительными соединениями, соответствующими настоящему изобретению, являются PRB-5, PRB-7 и PRB-8.
Должно быть понятным, что настоящее изобретение включает любые возможные фармацевтически приемлемые соли, сольваты, комплексы или пролекарства соединений формулы (I).
«Пролекарства» являются веществами, которые могут или не могут обладать фармакологической активностью, как таковые, но могут вводиться в тело (например, перорально или парентерально), где будут подвержены биоактивации (к примеру, метаболизированы), в результате чего будет получен агент настоящего изобретения, который является фармакологически активным.
Где Х является карбоновой кислотой, настоящее изобретение также включает соли карбоновой кислоты. Соответствующие фармакологически приемлемые соли карбоксигрупп включают соли металлов, таких как, например, алюминия, соли щелочных металлов, таких как лития, натрия или калия, соли щелочноземельных металлов, таких как кальция, магния и соли аммония и замещенные аммониевые соли.
"Терапевтически эффективное количество" обозначает количество терапевтического агента, при котором достигается ожидаемый результат. Так как индивидуальные потребности пациента могут варьировать, определение оптимальных количеств каждого аддукта оксида нитрита находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Как правило, схема применения для лечения заболеваний и нарушений соединениями и/или композициями настоящего изобретения выбирается в соответствии с разнообразными факторами, включающими возраст, вес, пол, диету и общее состояние пациента.
Под "лекарственным средством" понимается соединение, соответствующее формуле (I), в любой форме, пригодной для применения для медицинских целей, например, в форме лекарственного продукта, фармацевтического препарата или продукта, диетического продукта, продукта питания или пищевой добавки.
В контексте настоящей спецификации, термин "терапия" также включает "профилактику", если не существует специфических указаний к обратному. Подобным образом применяются и термины "терапевтический" и "терапевтически".
Лечение включает любое терапевтическое применение, которое может быть полезно для человека или животного. Лечение млекопитающих предпочтительно. Как лечение человека, так и лечение животных находится в пределах настоящего изобретения. Лечение может быть лечением существующего патологического состояния или оно может быть профилактическим. Лечение может осуществляться в отношении взрослых субъектов, ювенильных субъектов, детей, плодов, или частей (например, орган, ткань, клетка или молекула нуклеиновой кислоты). Под "хроническим лечением" понимается лечение, которое продолжается в течение недель или лет.
Термин "терапевтически или фармацевтически активное количество" обозначает то количество, которое в результате дает желаемые фармакологические и/или терапевтические эффекты. Соединение, соответствующее настоящему изобретению, может, к примеру, быть включено в продукт питания, пищевую добавку, питательную добавку или диетический продукт. Альфа-замещенные производные DHA и ЕРА (или DHA в этом отношении) могут быть связаны вместе или объединены в триглицеридной форме посредством эстерификации между смесью альфа-производных, ЕРА и глицерином, катализируемой с помощью Novozym 435 (коммерчески доступная липаза из Candida antarctica в иммобилизованной форме).
Соединения формулы (I) обладают активностью, как фармацевтические продукты, в частности, как триггеры активности ядерных рецепторов. Таким образом, настоящее изобретение также относится к соединениям формулы (I), фармацевтически приемлемым солям, сольватам, комплексам или их пролекарствам, как определено выше, для применения в качестве лекарственных средств и/или для применения в терапии. Предпочтительно новые соединения или фармацевтически приемлемые соли, сольваты, комплексы или их пролекарства настоящего изобретения могут использоваться:
- для профилактики и/или лечения сахарного диабета у человека и животных; для контроля снижения массы тела и/или предупреждения прибавления в весе;
- для профилактики и/или лечения ожирения или избыточной массы тела у человека или у животных;
- для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с амилоидозом;
- для лечения или профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний;
- для профилактики нарушения мозгового кровообращения, церебральных или транзиторных ишемических атак, связанных с атеросклерозом некоторых артерий.
- для лечения туберкулеза или ВИЧ.
Существует две формы сахарного диабета. Одна форма является диабетом 1-го типа, который известен, как инсулин-зависимый сахарный диабет (IDDM), и другая форма является диабетом 2-го типа, который известен, как инсулин-независимый сахарный диабет (NDDDM). Диабет 2-го типа связан с ожирением/излишней массой тела и отсутствием упражнений, начало его часто постепенное, обычно диабет 2-го типа возникает у взрослых и вызывается сниженной чувствительностью к инсулину. Это ведет к компенсаторному повышению продукции инсулина. Эта стадия до развития самого диабета 2-го типа называется метаболическим синдромом и характеризуется гиперинсулинемией, резистентностью к инсулину, ожирением, нарушением толерантности к глюкозе, повышенным уровнем липидов в крови, гиперкоагулопатией, дислипидемией и воспалением, часто приводящим к атеросклерозу артерий. Позже, когда нарушается секреция инсулина, развивается сахарный диабет 2-го типа.
В предпочтительном варианте осуществления соединения, соответствующие формуле (I), могут использоваться для лечения диабета 2-го типа. Соединения, соответствующие формуле (I), могут также использоваться для лечения других типов диабетов, выбранных из группы, включающей метаболический синдром, вторичные диабеты, таких как панкреатический, экстрапанкреатический/эндокринный или диабеты, вызванные действием лекарственных препаратов, или особые формы диабетов, таких как липоатрофический, миатонический или заболевание, вызванное нарушением инсулиновых рецепторов. Настоящее изобретение также включает лечение диабета 2-го типа. Соответственно соединения формулы (I), как определено выше, могут активировать ядерные рецепторы, предпочтительно PPAR (рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом) α и/или γ.
Соединения формулы (I) также могут использоваться для лечения и/или профилактики ожирения. Ожирение обычно связано с повышенной резистентностью к инсулину, и страдающие ожирением люди подвержены высокому риску развития диабета 2-го типа, который является большим фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Ожирение является хроническим заболеванием, которым страдает все большее количество людей в западных странах, ожирение связано не только с моральными страданиями, но также со снижением продолжительности жизни и множеством проблем, например, сахарным диабетом, резистентностью к инсулину и повышенным кровяным давлением. Таким образом, настоящее изобретение отвечает давно ощущаемой необходимости в создании лекарственного средства, которое будет снижать общий вес тела или количество жировой ткани у людей, страдающих ожирением, снижать вес до их идеального веса тела и без значительных нежелательных побочных эффектов.
Соединения, соответствующие формуле (I), могут также использоваться для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с амилоидозом. Связанные с амилоидозом патологические состояния или заболевания связаны с отложением амилоида, предпочтительно как следствие образования бляшек, включают болезнь Альцгеймера или деменцию, болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз, спонгиформные энцефалопатии, Крецфельда-Якоба, кистозный фиброз, первичный и вторичный почечный амилоидоз, IgA нефропатию, отложение амилоида в артериях, миокарде и нервной ткани. Эти заболевания могут быть спорадическими, наследственными или даже связанными с инфекциями, такими как туберкулез или ВИЧ и часто проявляются только на позднем этапе жизни, даже если ненаследственные формы могут появляться гораздо раньше. Каждое заболевание связано с особенным белком или совокупностью этих белков, которые, как полагают, являются причиной патологических состояний, связанных с заболеванием. Лечение связанных с амилоидозом заболеваний может быть как кратковременным (острым), так и длительным (хроническим).
Соединения формулы (I) могут быть также использованы для лечения, направленного на уменьшение амилоидных скоплений, предупреждения неправильного сворачивания белка, которое может привести к образованию так называемых бляшек, лечения, направленного на снижение продукции белка-предшественника, такого как Аβ-белок (бета-амилоидный белок), и предупреждения и/или лечения, направленного на ингибирование или замедление образования скоплений белка или бляшек. Предупреждение нейрофибриллярных клубков путем применения соединений формулы (I), как определено выше, также включено в настоящее изобретение. В одном варианте осуществления новые соединения, фармацевтически приемлемые соли, сольваты, комплексы или их пролекарства, как определено выше, используются для лечения туберкулеза или ВИЧ (вирус иммунодефицита человека).
Далее соединения формулы (I) могут применяться у пациентов с симптомами атеросклероза артерий, питающих головной мозг, например с нарушением мозгового кровообращения или транзиторными ишемическими атаками с целью уменьшения риска будущей, возможно фатальной атаки.
Соединения формулы (I) могут также использоваться для лечения повышенного уровня липидов в крови.
Кроме того, соединения формулы (I), как определено выше, могут использоваться для лечения и профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, таких как повышенное кровяное давление, гипертриглицеридемия и высокая коагуляционная активность фактора VII. Предпочтительно соединения формулы (I) используются для лечения повышенного уровня липидов в крови у человека.
Соединения формулы (I) и фармацевтически приемлемые соли, сольваты пролекарства или их комплексы могут применяться сами по себе, но обычно будут вводиться в форме фармацевтической композиции, в которой соединения формулы (I) (активный ингредиент) связаны с фармацевтически приемлемыми наполнителем, растворителем или носителем.
Настоящее изобретение, таким образом, также относится к фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель (включая их комбинации).
Это фармацевтическая композиция, которая включает или состоит из терапевтически эффективного количества фармацевтически активного агента. Фармацевтическая композиция предпочтительно включает фармацевтически приемлемые носитель, растворитель или наполнитель (включая их комбинации). Приемлемые носители или растворители для терапевтического использования хорошо известны в фармацевтической области. Выбор фармацевтического носителя, вспомогательного вещества или растворителя зависит от предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции могут включать как (или кроме того) носитель, наполнитель или растворитель, любое подходящее связующее вещество(-ва), смазывающее вещество(-ва), суспендирующее вещество(-ва), покровное вещество(-ва), солюбилизирующее вещество(-ва).
Фармацевтические композиции в пределах настоящего изобретения могут включать одно или более из следующих веществ: консерванты, солюбилизирующие вещества, стабилизирующие вещества, увлажняющие вещества, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизирующие вещества, одоранты (соединения солей настоящего изобретения могут сами находиться в форме фармацевтически приемлемой соли), буферы, покровные вещества, антиоксиданты, суспендирующие вещества, адъюванты, наполнители и растворители.
Фармацевтическая композиция, соответствующая настоящему изобретению, предпочтительно составлена для перорального применения для людей и для животных. Фармацевтическая композиция может быть также составлена и для любого другого пути введения, при котором активные ингредиенты могут быть эффективно абсорбированы и использованы, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интраназально, ректально, вагинально или местно.
В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть в форме капсулы, или в форме микрокапсул, образующих порошок, или в форме саше-порошка. Капсула может быть ароматизирована. Этот вариант осуществления также включает капсулу, где и капсула, и инкапсулированная композиция жирных кислот, соответствующая настоящему изобретению, ароматизированы. Ароматизированная капсула более привлекательна для потребителя. Для вышеперечисленных терапевтических применений дозировка будет, конечно, варьировать в зависимости от использующегося соединения, способа введения, желаемого лечения и степени нарушений организма.
Фармацевтическая композиция может быть составлена таким образом, что суточная дозировка будет составлять от 10 мг до 10 г. Предпочтительно фармацевтическая композиция составлена таким образом, что суточная дозировка вышеупомянутой композиции составляет от 5 мг до 5 г. Более предпочтительно фармацевтическая композиция составлена таким образом, что суточная дозировка вышеупомянутой композиции составляет от 100 мг до 1 г. Под суточной дозировкой понимается дозировка в течение 24 часов. Дозировка будет, конечно, варьировать в зависимости от использующегося соединения, способа введения, желаемого лечения и степени нарушений организма. Обычно врач определяет дозировку, которая наиболее подойдет данному субъекту. Доза и частота приема для каждого отдельного пациента может варьировать и будет зависеть от множества факторов, включая активность используемого соединения, метаболическую стабильность и продолжительность действия соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья пациента, пол, диету, способ и время введения, скорость выведения, комбинацию препаратов, тяжесть патологического состояния и индивидуальную терапию. Вещество и/или фармацевтическая композиция настоящего изобретения могут быть введены в организм от 1 до 10 раз в день, например 1 или 2 раза в день. При пероральном и парентеральном применении суточная доза вещества может вводиться однократно или может быть разделена на несколько доз.
Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к композиции жирных кислот, включающей соединения формулы (I). Композиция жирных кислот, включающая соединения формулы (I), повышает естественные биологические эффекты DHA, которые являются результатом регуляции генной экспрессии, и производные, соответствующие настоящему изобретению, будут накапливаться в пуле свободных жирных кислот.
Композиция жирных кислот может включать от 60 до 100% по весу соединения формулы (I), все процентные отношения по весу основываются на общем весе композиции жирных кислот. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 80% по весу композиции жирных кислот составляют соединения формулы (I). Более предпочтительно соединения формулы (I) составляют по меньшей мере 90% по весу композиции жирных кислот. Более предпочтительно соединения формулы (I) составляют более чем 95% по весу композиции жирных кислот. Композиция жирных кислот может включать по меньшей мере одну из жирных кислот: (полностью-Z)-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота (ЕРА), (полностью-Z)-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота (DHA), (полностью-Z)-6,9,12,15,18-хенейкозапентаеновая кислота (НРА) и (полностью-Z)-7,10,13,16,19-докозапентаеновая кислота (DPAn-3), (полностью-Z)-8,11,14,17-эйкозатетраеновая кислота (ЕТАn-3) или их комбинации. Кроме того, композиция жирных кислот может включать (полностью-Z)-4,7,10,13,16-докозапентаеновую кислоту (DPAn-6) и/или (полностью-Z)-5,8,11,14-эйкозатетраеновую кислоту (ARA) или их производные. Композиция жирных кислот может также включать эти жирные кислоты или их комбинации в форме производных. Производные замещены так же, как производные DHA формулы (I), как определено выше.
Композиция жирных кислот, соответствующая настоящему изобретению, может включать (полностью-Z омега-3)-6,9,12,15,18- хенейкозапентаеновую кислоту (НРА) или их производные в количестве по меньшей мере 1% по весу или в количестве от 1 до 4% по весу.
Кроме того, композиция жирных кислот, соответствующая настоящему изобретению, может включать омега-3 жирные кислоты, не ЕРА и не DHA, которые имеют 20, 21 или 22 атома углерода, или их производные в количестве по меньшей мере 1,5% по весу или в количестве по меньшей мере 3% по весу.
В специфических вариантах осуществления настоящего изобретения композиция жирных кислот является фармацевтической композицией, пищевой композицией или диетической композицией. Композиция жирных кислот может, кроме того, включать эффективное количество фармацевтически приемлемого антиоксиданта. Предпочтительно антиоксидантом является токоферол или смесь токоферолов. В предпочтительном варианте осуществления композиция жирных кислот, кроме того, содержит токоферол или смесь токоферолов в количестве до 4 мг на 1 г общего веса композиции жирных кислот. Предпочтительно композиция жирных кислот включает количество токоферолов от 0.2 до 0.4 мг на 1 г композиции.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции жирных кислот, любым фармацевтически приемлемым соли, сольвату, пролекарству или их комплексу, которые включают соединения формулы (I), как определено выше, для использования в качестве лекарственного средства и/или в терапии. Такая композиция жирных кислот может использоваться для предупреждения и/или лечения таких же патологических состояний, при которых применяются соединения формулы (I), как было описано выше.
Когда композиция жирных кислот используется в качестве лекарственного средства, она будет введена в организм терапевтически или фармацевтически активном количестве.
В предпочтительном варианте осуществления, композиция жирных кислот у человека или животных применяется перорально.
Настоящее изобретение относится также к применению соединения формулы (I), или фармацевтически приемлемых соли, сольвата, их пролекарства или комплекса, как определено выше, для производства лекарственного средства для контроля снижения массы тела и/или предупреждения прибавления в весе; для производства лекарственного средства лечения и/или профилактики ожирения или избыточной массы тела; для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения диабета у человека или животных; для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с амилоидозом; для производства лекарственного средства для лечения или профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, таких как повышенное кровяное давление, гипертриглицеридемия и высокая коагуляционная активность фактора VII; для производства лекарственного средства для лечения туберкулеза или ВИЧ; для производства лекарственного средства для профилактики нарушения мозгового кровообращения, церебральных или транзиторных ишемических атак, связанных с атеросклерозом некоторых артерий; для производства лекарственного средства для понижения уровня триглицеридов в крови млекопитающих и/или повышения уровня липопротеинов высокой плотности у пациентов; или для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики метаболического синдрома. Все эти варианты осуществления также включают применение композиции жирных кислот, как определено выше, включающей компоненты формулы (I) для производства лекарственных средств, как было указано выше. Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению альфа-гидрокси-DHA для производства лекарственных средств, как было указано выше.
Настоящее изобретение также относится к способу контроля снижения массы тела и/или предупреждения прибавления в весе, где композиция жирных кислот, включающая по меньшей мере соединение формулы (I), как определено выше, вводится человеку или животному.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики ожирения или избыточной массы тела, где композиция жирных кислот, включающая по меньшей мере соединение формулы (I), как определено выше, вводится человеку или животному.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения сахарного диабета, где композиция жирных кислот, включающая по меньшей мере соединение формулы (I), как определено выше, вводится человеку или животному. Предпочтительно сахарный диабет является диабетом 2-го типа.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к:
- способу лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с амилоидозом;
- способу лечения или профилактики множественных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний;
- способу профилактики нарушения мозгового кровообращения, церебральных или транзиторных ишемических атак, связанных с атеросклерозом некоторых артерий;
где композиция жирных кислот, включающая по меньшей мере соединение формулы (I), как определено выше, вводится человеку или животному.
Производные жирных кислот формулы (I) могут быть получены наиболее эффективно на основе DHA. Если начальный материал не является чистой DHA (т.е. не является 100% DHA), конечная композиция жирных кислот будет содержать смесь производных DHA, как определено выше, и некоторое количество других жирных кислот, не DHA, где эти жирные кислоты замещены таким же образом, как новые аналоги жирных кислот формулы (I). Такие варианты осуществления также включены в настоящее изобретение.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединения формулы (I) получены на основе (полностью-Z)-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислоты (DHA), где указанная DHA получена из источника растительного происхождения, источника микробного и/или животного происхождения или их комбинаций. Предпочтительно указанная DHA получена из рыбьего жира.
Жирные кислоты в композиции могут быть также получены из источника растительного, микробного или животного происхождения или их комбинации. Таким образом, настоящее изобретение также включает композицию жирных кислот, приготовленную из микробного жира.
Настоящее изобретение относится к способу приготовления новых аналогов жирных кислот формулы (I), как определено выше.
DHA получают из биологических источников: жира морской рыбы, микробного жира, растительного жира. Все возможные сырьевые материалы являются смесями жирных кислот в триглицеридной форме, где DHA составляет только фракцию жирных кислот. Обычно концентрация DHA составляет 40% в микробном жире и 10-25% в жире морской рыбы. Содержащие DHA растительные жиры находятся в разработке, и в будущем ожидается получение жиров с высокой концентрацией DHA.
Первой ступенью процесса всегда будет преобразование триглицеридов в свободные жирные кислоты или моноэфиры. Предпочтительными сложными эфирами являются сложный этиловый или сложный метиловый эфир. Таким образом, жирные кислоты, связанные в триглицериде, отделяются одна от другой, и разделение делается возможным. Существует несколько способов отделения DHA от других жирных кислот, наиболее часто используются способ молекулярной перегонки, при котором жирные кислоты разделяются испарением, и способ разделения путем осаждения с мочевиной, при котором жирные кислоты разделяются по степени ненасыщенности. Разделение жирных кислот также производится с помощью следующих способов: способ с применением нитрата серебра, при котором жирные кислоты разделяются по степени ненасыщенности, реакции эстерификации, катализированные липазами, в комбинации с молекулярной перегонкой и противоточной экстракцией с диоксидом углерода в сверхкритическом состоянии.
Наиболее важной задачей, связанной с получением чистой DHA. является отделение этой жирной кислоты от других высоконенасыщенных жирных кислот, содержащих 20-22 атома углерода, присутствующих во всех источниках. Эти жирные кислоты имеют свойства, настолько схожие с DHA, что ни один из методов, перечисленных выше, не обеспечивает достаточную степень разделения. Для некоторых микробных жиров, содержащих большое количество DHA и очень низкий уровень высоконенасыщенных жирных кислот, содержащих 20-22 атома углерода, применение способа молекулярной перегонки в отдельности или в комбинации с другими способами может обеспечить более чем 90% чистоту.
Жиры, содержащие большое количество DHA, также содержат значительные количества высоконенасыщенных жирных кислот, содержащих 20-22 атома углерода, например ЕРА (20:5n-3), n-3DPA (22:5n-3), HPA (21:5n-3) и другие. Единственным существующим способом отделения DHA от таких жирных кислот является высокоэффективная жидкостная хроматография, в качестве стационарной фазы используют силикагель или силикагель, импрегнированный нитратом серебра, в качестве подвижной фазы используют выбранные органические сольвенты или диоксид углерода в сверхкритическом состоянии. С помощью этого способа получают DHA с более чем 97% чистотой. Однако нужно отметить, что технологическая себестоимость сильно повышается с возрастанием концентрации, к примеру, технологическая себестоимость 97% DHA более чем в пять раз превышает технологическую себестоимость 90% DHA.
DHA, имеющая чистоту 90, 95 или 97%, содержит очень небольшие количества других жирных кислот. К примеру, DHA, имеющая чистоту 97%, содержит n-3DPA (22:5n-3), но также длинноцепочечные жирные кислоты, например ЕРА (20:5n-3), HPA (21:5n-3) и другие. Однако другие жирные кислоты будут реагировать так же, как DHA и будут получены альфа-замещенные производные.
С помощью органического синтеза возможен метод очищения, так как DHA и n-6DPA (и 22:5n-6, которая присутствует обычно в очень низких концентрациях) являются единственными известными жирными кислотами, на основе которых можно получить гамма-лактоны путем циклизации с первой двойной связью. Может быть применен следующий путь: лактонизация, затем очистка и гидролиз, но этот способ более дорогостоящий, чем ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография).
1
2
1
2
1
7
В одном варианте осуществления соединения формулы (I), где R (или R) является водородом, получены с помощью следующих способов (Схема 1). Соответствующим образом адаптированные, эти способы могут быть использованы для получения соединений, представленных общей формулой (I), где и R и R являются, например, С-С алкильной группой, бензилом, галогеном, бензилом, алкенилом или алкинилом.
1
2
1
7
Соединения, представленные общей формулой (I), где R является водородом и R обозначает С-С алкильную группу, бензил, галоген, бензил, алкенил, алкинил, полученные путем реагирования эфира DHA с сильным ненуклеофильным основанием, т.е. с такими веществами, как лития диизопропиламин или гемаметилдизилазидеан калия/натрия в таком сольвенте, как тетрагидрофуран, диэтилэфир при температурах от -60 до -78°С, для получения енолята эфира (способ 1/1 st process).
(Схема 1)
Енолят эфира реагирует с электрофильным реагентом, подобным алкилгалоиду, примерами которого являются йодистый этил, бензилхлорид, ацилгалоиду, примерами которого являются бромистый бензоил, карбоксильному ангидриду, примером которого является уксусный ангидрид, или электрофильному реагенту галогенизации, примером которого является N-фторбензол сульфонимид (NFSI), и т.д. для получения монозамещенного производного (способ 2/2 nd process). Сложный эфир далее гидролизуется в сольвенте, таком как этанол или метанол до производного карбоновой кислоты путем добавления основания, такого как гидроксид лития/натрия в воде при температурах от 15 до 40°С.
Конденсация Клайзена этилового эфира DHA происходит во время обработки этилового эфира DHA сильным основанием. Этот продукт конденсации может обладать интересной биологической активностью. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения описываются конденсация (промежуточная) продукта, упомянутого выше, и применение этого продукта для лечения и/или предупреждения заболеваний, соответствующих настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления соединения, представленные общей формулой (I), синтезируются с помощью следующих способов (Схема 2).
(Схема 2)
1
2
Соединения, представленные общей формулой (I), где R является водородом и R обозначает гидрокси, алкоксигруппу, ацилокси, получены путем реагирования эфира DHA с сильным ненуклеофильным основанием, т.е. с такими веществами, как лития диизопропиламин или гемаметилдизилазидеан калия/натрия в таком сольвенте, как тетрагидрофуран, диэтилэфир при температурах от -60 до -78°С, для получения енолята эфира (способ 4/process 4). Этот енолят эфира реагирует с таким источником кислорода, как диметилдиоксиран, 2-(фенилсульфонил)-3-фенилоксазиридин, молекулярным кислородом с различными добавками, как триметилфосфит или различные катализаторы, подобные Ni(II) комплексу для получения эфира альфа-гидрокси-DHA ester (способ 5/process 5). Реакция вторичного спирта с основанием, подобным гидриду натрия в сольвенте, подобному THF или DMF, дает алкоксид, который реагирует с различными электрофильными реагентами, такими как йодистый алкил, к примеру; йодистый метил, йодистый этил, бромистый бензил или ацилгалоид, к примеру; ацетилхлорид, бромистый бензоил (способ 6/process 6). Сложный эфир далее гидролизуется в сольвенте, таком как этанол или метанол до производного карбоновой кислоты путем добавления основания, такого как гидроксид лития/натрия в воде при температурах от 15 до 40°С (способ 7/process 7).
Эфир гидрокси-DHA является удобным промежуточным соединением для введения других функциональных групп в α-положение, соответствующее настоящему изобретению. Гироксильная группа может быть активирована путем конверсии в галид или тозилат до реакции с различными нуклеофильными соединениями, такими как аммиак, амины, тиолы и т.д. Для конверсии гидроксильной группы в другие функциональные группы можно также применять реакцию Митцунобу (Mitsunobu, О, Synthesis, 1981, 1).
Соединения, представленные общей формулой (I), как определено выше, могут быть также синтезированы путем комбинаций различных описанных способов. Настоящее изобретение включает упомянутые выше способы.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения фармацевтической композиции настоящего изобретения, которая включает по меньшей мере соединение формулы (I) или фармацевтически приемлемые соль, сольват, комплекс или их пролекарство, как определено выше, с фармацевтически приемлемыми вспомогательным веществом, растворителем или носителем.
Чистые энатиомерные соединения могут быть получены путем расщепления рацемических соединений формулы (I), как определено выше. Расщепление соединения формулы (I) может быть выполнено при использовании известных процедур, к примеру, путем реагирования соединения формулы (I) будет получена смесь диастереоизомеров, которая может быть разделена с помощью хроматографии. После этого два энантиомера соединения (I) могут быть получены из разделенных диастереоизомеров путем, например, гидролиза.
Также можно применять стехиометрические хиральные соединения для осуществления асимметричного введения заместителей в α-положении DHA. Наиболее эффективной методикой оказалось использование хирального оксазолин-2-она. Еноляты, полученные из хиральных N-ацилоксазолидинов, могут быть блокированы различными электрофилами в высоко стереорегулируемой манере (Ager, Prakash, Schaad 1996).
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью следующих примеров, которые не следует рассматривать в качестве единственно возможных в настоящем изобретении. В примерах структуры были проверены с помощью масс-спектрометрии (МС). Нужно отметить, что производные жирных кислот могут быть также получены из исходного материала, содержащего низкие и средние количества DHA (т.е. приблизительно 40-60% по весу DHA).
Протоколы синтеза
Получение этилового эфира α-метил-DНА (PRB-1)
2
2
4
Бутиллитий (228 мл, 0,37 моль, 1,6 М в гексане) был добавлен каплями к перемешанному раствору диизопропиламина (59,5 мл, 0,42 моль) в сухом THF (800 мл) в атмосфере N при 0°С. Полученный раствор перемешивали при 0°С в течение 30 минут, охлаждали до -78°С и затем перемешивали в течение дополнительных 30 минут до добавления по каплям этилового эфира DHA (100 г, 0,28 моль) в сухом THF (500 мл) в течение 2 часов. Темно-зеленый раствор перемешивали при -78°С в течение 30 минут до добавления МеI (28 мл, 0,45 моль). Раствор был оставлен на 1,5 часа до достижения им температуры -20°С, затем влит в воду (1,5 л) и экстрагирован с помощью гептана (2×800 мл). Объединенные органические фазы были отмыты 1 М НСl (1 л), высушены (NaSO), отфильтрованы и выпарены в вакууме. Продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс (99:1), и было получено 50 г (48%) названного соединения в виде светло-желтого масла;
1
3
H-ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 1,02 (t, J 7,5 Гц, 3Н), 1,20 (d, J 6,8 Гц, 3H), 1,29 (t, J 7,1 Гц, 3H), 2,0-2,6 (m, 5H), 2,8-3,0 (m, 10H), 4,17 (t, J 7,1 Гц, 2H), 5,3-5,5 (m, 12H);
MC (ионизация электрораспылением); 393 [M+Na].
Получение этилового эфира α-этил-DHA (PRB-2)
2
2
4
Бутиллитий (440 мл, 0.67 моль, 1,6 М в гексане) был добавлен каплями к перемешанному раствору диизопропиламина (111 мл, 0,78 моль) в сухом THF (750 мл) в атмосфере N при 0°С. Полученный раствор перемешивали при -78°С в течение 45 минут до добавления по каплям этилового эфира DHA (200 г, 0,56 моль) в сухом THF (1,6 л). Добавление сложного эфира было завершено через 4 часа. Темно-зеленый раствор перемешивали при -78°С в течение 30 минут до добавления EtI (65 мл, 0,81 моль). Раствор был оставлен до достижения - 40°С до добавления дополнительного количества EtI (5 мл, 0,06 моль), и затем раствор был оставлен до достижения им - 15°С (в течение 3 часов с -78°С), после этого смесь была влита в воду и экстрагирована с помощью гексана (2х). Объединенные органические фазы были отмыты 1 М НСl, водой, высушены (NaSO), отфильтрованы и выпарены в вакууме. Продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс (99:1, затем 50:1), и было получено 52,2 г (20%) названного соединения в виде желтого масла.
1
3
Н-ЯМР (200 MГц; CDCl) δ 0,8-1,0 (m, 6H), 1,2-1,4 (m, 4H), 1,5-1,7 (m, 2H), 2,12 (m, 2H), 2,3-2,5 (m, 2H), 2,8-3,0 (m, 10Н), 4,18 (t, J=7,1 Гц, 2H), 5,3-5,6 (m, 12H);
MC (ионизация электрораспылением); 407 [M+Na].
Получение этилового эфира α-этокси-DНА (PRB-3)
2
4
2
4
К суспензии 60% NaH (84,1 мг, 2,1 ммоль) в THF, 5 мл, при -78°С в атмосфере N был добавлен каплями раствор этилового эфира α-гидрокси-DHA (PRB-12) (372 мг, 1,00 ммоль) в THF, 5 мл, полученную смесь перемешивали при -78°С в течение 20 минут до добавления каплями йодистого этила (0,24 мл, 3,01 ммоль). Реакционная смесь постепенно была доведена до комнатной температуры в течение ночи. Был добавлен насыщенный водный раствор NHCl, 15 мл, и смесь была экстрагирована с помощью диэтилового эфира, 25 мл × 2, органическая фаза была отмыта соляным раствором, 25 мл, высушена (NaSO), отфильтрована и выпарена в вакууме, затем проводилась флеш-хроматография на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс (95:5), и было получено 68 мг (17%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,94 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,16-1,29 (m, 6H), 2,05 (квинтет, J=7,2 Гц, 2H), 2,50 (m, 2H), 2,76-2,84 (m, 10Н), 3,33-3,48 (m, 1H), 3,53-3,71 (m, 1H), 3,83 (дд, J=6,8 Гц, J=6,2 Гц, 1H), 4,18 (q, J=7,1 Гц, 2H), 5,31-5,45 (m, 12H)
13
3
С ЯМР (50 MГц, СDСl) δ 14,2, 15,1, 20,5, 25,5, 25,6, 25,7, 31,0, 60,8, 66,0, 78,7, 124,1, 127,0, 127,8, 127,9, 128,0 (2 сигнала), 128,2 (2 сигнала), 128,5, 130,7, 132,0, 172,5 (3 скрытых сигнала)
+
MC (ионизация электрораспылением); 423 [M+Na]
Получение этилового эфира α-фторо-DHA (PRB-4)
2
2
4
К LDA (2,1 мл, 4,2 моль 2 M в THF/гептане/этилбензоле) в сухом THF (10 мл) в атмосфере N при -78°С добавлялся каплями в течение 15 минут этиловый эфир DHA (1 г, 2,8 ммоль) в сухом THF (30 мл). Затем был добавлен NFSi (1,06 г, 3,4 ммоль). Раствор был оставлен до достижения им комнатной температуры и затем перемешивался в течение 70 часов. Смесь была влита в воду и экстрагирована с помощью гексана (2х). Объединенные органические фазы были отмыты 1 M HCl, водой, высушены (NaSO), отфильтрованы и выпарены в вакууме; МС (ионизация электрораспылением); 397 [M+Na].
Получение этилового эфира α,α-диметил DHA (PRB-5)
2
2
4
Бутиллитий (100 мл, 0,17 моль, 1,6 М в гексане) был добавлен каплями к перемешанному раствору диизопропиламина (28 мл, 0,20 моль) в сухом THF (100 мл) в атмосфере N при 0°С. Полученный раствор перемешивали при 0°С в течение 30 минут, охлаждали до -78°С и каплями был добавлен раствор этилового эфира DHA (50 г, 0,14 моль) в сухом THF (200 мл). Полученный темно-зеленый раствор перемешивался при -78°С в течение 30 минут до добавления МеI (17 мл, 0,28 моль). Раствор был оставлен до достижения им температуры -10°С, затем влит в воду и экстрагирован с помощью гептана (2х). Объединенные органические фазы были отмыты 1 М НСl (1 л), высушены (NaSO), отфильтрованы и выпарены в вакууме.
Процедура была повторена, но неочищенный продукт этилового эфира α-метил-DHA использовался вместо этилового эфира DHA. Продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, гептан/ЕtOАс (99:1, затем 98:2), и было получено 31.6 г (59%) названного соединения в виде светло-желтого масла;
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 1,01 (t, J 7,5 Гц, 3H), 1,21 (s, 6H), 1,28 (t, J 7,1 Гц, 3H), 2,08 (m, 2H), 2,34 (d, J 6,8 Гц, 2H), 2,8-3,0 (m, 10H), 4,15 (q, J 7,5 Гц, 2H), 5,3-5,6 (m, 12H);
13
3
С-ЯМР (50 MГц, CDCl) δ 14,7, 21,0, 25,3, 26,0, 26,1, 38,3, 42,8, 60,7, 125,8, 127,4, 128,3, 128,5, 128,6, 128,7, 129,0, 130,7, 132,4, 177,9;
МС (ионизация электрораспылением); 385 [М+Н].
Получение этилового эфира α-тиометил-DНА (PRB-6)
2
2
4
Этиловый эфир α-йодо-DHA (0,5 г, 1,04 ммоль) был растворен в 20 мл THF в атмосфере N при 0°С. Был добавлен MeSNa (80 мг, 1,14 ммоль) и смесь перемешивали в течение нескольких минут до того, как ее разбавили гептаном. Органическая фаза была отмыта водой (2х), высушена (NaSO) и выпарена в вакууме. Желаемый продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс (30:1), был получен этиловый эфир α-тиометил-DHA в виде бледно-желтого масла. Этиловый эфир α-тиометил-DHA был растворен в 10 мл EtOH и 10 мл ТНF. К раствору был добавлен LiOH (0,39 г, 9,2 ммоль), растворенный в 5 мл воды. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, затем смесь была разведена водой и гептаном.
2
4
Органическая фаза была экстрагирована с 1 М LiOH (2x) и объединенные водные фазы были подкислены 5 М НСl и экстрагированы с помощью диэтилового эфира (2x). Объединенные органические фазы были отмыты соляным раствором, водой, высушены (NaSO) и выпарены в вакууме, в результате было получено 183 мг (47%) названного соединения в виде бледно-желтого масла;
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,98 (t, J 6,6 Гц, 3H), 1,95-2,65 (m, 7H), 2,72-3,05 (m, 10Н), 3,12-3,43 (m, 1H), 5,20-5,70 (m, 12H), 10,65 (br s, 1H);
13
3
Н-ЯМР (50 MГц, СDСl) δ 14,7, 21,0, 25,9, 26,0, 26,2, 28,8, 125,4, 127,4, 128,1, 128,3, 128,4, 128,7, 128,9, 129,0, 131,6, 132,4, 177,0.
Получение этилового эфира α-тиоэтил-DHA (PRB-7)
2
Этиловый эфир α-йодо-DHA (11 г, 23 ммоль) был растворен в 100 мл THF в атмосфере N при 0°С.
2
4
Был добавлен EtSNa (2,1 г, 25 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°С. Реакция была остановлена с помощью 1 М НСl и разбавление осуществлялось с помощью гептана. Органическая фаза была отмыта водой (2x), высушена (NaSO) и выпарена в вакууме. Желаемый продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии, гептан/ЕtOАс (30:1), и было получено 7,3 г (76%) названного соединения в виде бледно-желтого масла;
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 1,1-1,3 (m, 9H), 2,05 (m, 2H), 2,3-2,7 (m, 4H), 2,7-2,9 (m, 10H), 3,25 (m, 1H), 4,17 (q, J 7,1 Гц, 2H), 5,3-5,5 (m, 12H);
МС (ионизация электрораспылением): 439 [M+Na].
Получение этилового эфира α,α-диэтил-DНА (PRB-8):
2
2
4
Бутиллитий (38,6 мл, 0,62 моль, 1,6 М в гексане) был добавлен каплями к перемешанному раствору диизопропиламина (9,1 мл, 0,65 моль) в сухом THF (200 мл) в атмосфере N при 0°С. Полученный раствор перемешивали при 0°С в течение 30 минут, охлаждали до -78°С и каплями был добавлен раствор этилового эфира DHA (20,0 г, 0,56 моль) в сухом THF (100 мл). Полученный темно-зеленый раствор перемешивался при -78°С в течение 30 минут до добавления EtI (6,8 мл, 0,84 моль). Раствор был оставлен до достижения им температуры -10°С, затем влит в воду и экстрагирован с помощью гексана (2x). Объединенные органические фазы были отмыты 1 М НСl, высушены (NaSO), отфильтрованы и выпарены в вакууме.
Процедура была повторена, но неочищенный продукт этилового эфира α-этил-DHA использовался вместо этилового эфира DHA. Реакционная смесь после добавления EtI была оставлена до достижения комнатной температуры и перемешивалась в течение ночи. Продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс (99:1, затем 98:2), и было получено 10.0 г (43%) названного соединения в виде светло-желтого масла;
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,83 (t, J 7,4 Гц, 6H), 0,94 (t, J 5,8 Гц, 3Н), 1,28 (t, J 7,1 Гц, 3Н), 1,63 (q, 77,4 Гц, 4H), 2,10 (m, 2H), 2,34 (d, J 6,9 Гц, 2H), 2,8-3,0 (m, 10H), 4,15 (q, J 7,5 Гц, 2H), 5,3-5,6 (m, 12H);
13
3
С-ЯМР (50 MГц, CDCl) δ 8,9, 14,7, 21,0, 23,1, 25,9, 26,0, 26,2, 27,4, 31.2, 50,1, 60,6, 125,5, 127,4, 128,3, 128,6, 128,9, 130,5, 132,4, 177,1;
МС (ионизация электрораспылением); 413.3 [М+Н], 435.3 [M+Na].
Получение этилового эфира α-бензил-DНА (PRB-9)
2
4
К перемешанному раствору диизопропиламина (0,91 мл, 6,46 ммоль) в сухом THF (20 мл) в инертной атмосфере при 0°С был добавлен каплями n-BuLi (1,6 M в гексане, 3,86 мл, 6,18 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут, доводили до -78°С и далее перемешивали при этой температуре в течение 5 минут. Этиловый эфир DHA (2,0 г, 5,62 ммоль) в сухом THF (10 мл) был добавлен по каплям и смесь перемешивалась при -78°С в течение 20 минут, затем был добавлен бромистый бензил (0,80 мл, 6,74 ммоль). Полученный раствор выдерживали в течение 3 ч, пока его температура не становилась равной 0°С, затем его подвергали распределению между водой (100 мл) и гептаном (100 мл). Водный слой был экстрагирован с помощью гептана и объединенные органические слои были промыты 1 М НСl и высушены (NaSO). Проводилась концентрация под уменьшенным давлением и очищение с помощью флеш-хроматографии (Гептан: ЕtOАс 99:1), в результате было получено 1,05 г (42%) названного соединения в виде бесцветного масла;
1
3
H-ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,99 (t, 3Н), 1,18 (t, 3Н), 2,08-2,16 (m, 2H), 2,35-2,42 (m, 2H), 2,74-2,98 (m, 13H), 4,09 (q, 4H), 5,38-5,50 (m, 10Н), 7,19-7,36 (m, 5H);
13
3
С-ЯМР (50 MГц, CDCl): δ 14,61, 14,71, 20,99, 25,98, 26,07, 30,07, 38,32, 48,02, 60,88, 126,75, 126,83, 127,46, 128,31, 128,45, 128,53, 128,58, 128,86, 128,77, 129,01, 129,35, 130,55, 132,46, 138,89, 175,39.
МС (ионизация электрораспылением): 447.3 [М+Н], 469.3 [M+Na].
Получение этилового эфира α-этансульфенил-DНА (PRB-10)
3
2
3
3
3
2
4
К раствору этилового эфира α-тиоэтил-DHA (0,5 г, 1,3 ммоль) в 15 мл СНСl в атмосфере N при -20°С был добавлен раствор МСРВА (0,22 г, 1.3 ммоль) в 10 мл СНСl. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при этой температуре, затем смесь была отфильтрована и промыта насыщенным водным раствором NаНСО. Водная фаза была экстрагирована дважды с помощью СHCl и объединенная органическая фаза была промыта водой и соляным раствором, высушена над NaSO, отфильтрована и сконцентрирована. Продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии при использовании гексана: ЕtOАс 8:2, в результате было получено 0,35 г (70%) названного соединения.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,99 (t, 3H), 1,27-1,45 (m, 6H), 2,09 (m, 2H), 2,79-2,94 (m, 14H), 3,55 (m, 1H), 4,25 (q, 2H), 5,37-5,59 (m, 12H).
13
3
С-ЯМР (50 MГц, CDCl): δ 7,97, 14,58, 14,68, 20,95, 23,68, 25,17, 25.93, 26,04, 44,20, 45,15, 62,30, 64,08, 123,91, 124,47, 127,41, 127,86, 128,26, 128,40, 128,44, 128,72, 128,72, 128,96, 129,12, 132,42, 132,47, 174,55.
МС (ионизация электрораспылением): 455.3 [M+Na].
Получение этилового эфира α-тиофенил-DНА (PRB-11)
К раствору этилового эфира α-йодо-DHA (PRB-15) (3,40 г, 7.05 ммоль) в ацетоне (20 мл) был добавлен каплями раствор натрия фенилсульфида (1,039 г, 7,86 ммоль) в ацетоне (110 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение получаса, смесь была выпарена в вакууме, затем проводилась флеш-хроматография на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс 200:1-95:5, и в результате было получено 2,35 г (72%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,97 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,18 (t, J=7,1 Гц, 3H), 2,09 (квинтет, J=7,l Гц, 2H), 2,54-2,66 (m, 2H), 2,83-2,86 (м, 10 Н), 3,67 (dd, J=6,8 Гц, J=8,3 Гц, 1Н), 4,12 (квинтет, J=7,1 Гц, 2H), 5,24-5,49 (m, 12Н), 7,28-7,33 (m, 3H), 7,46-7,50 (m, 2H)
13
3
С ЯМР (50 MГц, СDСl): δ 14,0, 14,2, 20,5, 25,5, 25,6. 25,7, 29,4, 50,6, 61,1, 125,1, 127,0, 127,7, 127,9, 128,0, 128,3, 128,42, 128,45, 128,9, 131,2, 132,0, 133,0, 133,2, 174,1 (5 скрытых сигналов)
+
+
МС (ионизация электрораспылением); 465 [М+Н], 487 [M+Na]
30
40
2
Масс-спектроскопия высокого разрешения (HRMS) (EI (ионизация электронным ударом)) рассчитано для CHOS: 464.2749, найдено: 464.2741
Получение этилового эфира α-гидрокси-DНА (PRB-12)
2
2
3
2
4
К раствору диизопропиламина (19,76 мл, 140 ммоль) в сухом THF, 40 мл, в атмосфере N при -78°С был добавлен каплями 1.6 М BuLi в гексане (87,5 мл, 140 ммоль). Полученную смесь перемешивали при -78°С в течение 15 минут перед тем, как каплями был добавлен раствор этилового эфира DHA (24,99 г, 70,1 ммоль) в THF (80 мл). Полученную реакционную смесь темно-зеленого цвета перемешивали в течение 1 часа при -78°С до того, как был добавлен каплями триэтилфосфит (12,2 мл, 70,1 ммоль) и затем O пропускали через реакционную смесь в течение ночи, реакционная смесь выдерживалась при -78°С в течение 5 часов и затем медленно согревалась до комнатной температуры. Был добавлен насыщенный водный раствор NaHCO (100 мл), и смесь была экстрагирована диэтиловым эфиром, 200 мл × 2. Органическая фаза была высушена (NaSO), отфильтрована и выпарена в вакууме, затем проводилась флеш-хроматография на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс 99:1-95:5, и в результате было получено 4.52 г (17%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,92 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,24 (t, J=7,1 Гц, 3Н), 2,02 (квинтет, J=7,1 Гц, 2H), 2,44-2,54 (m, 2H), 2,74-2,87 (m, 10 H), 4,13-4,24 (m, 3H), 5,25-5,94 (m, 12H)
13
3
С-ЯМР (50 MГц, CDCl): δ 14,0, 14,1, 20,4, 25,4, 25,5, 25,6, 32,0, 61,5, 69,9, 123,3, 126,9, 127,7, 127,9, 128,08, 128,1, 128,2, 128,4, 131,3, 131,8, 174,4 (4 скрытых сигнала)
+
МС (ионизация электрораспылением); 395 [MH-Na]
24
36
3
HRMS (ES) рассчитано для CHONa: 395.2556, найдено: 395.2543
Получение амида α-метил-DНА (PRB-13)
2
3
4
2
4
2
2
3
К раствору α-метил-DHA (PRB-1 FA) (3,13 г, 9,1 ммоль) и оксалилхлорида (8,0 мл, 94,5 ммоль) в толуоле (90 мл) был добавлен DMF (0,1 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере N в течение 15 ½ часов. Смесь затем была выпарена в вакууме и осадок был растворен в THF, 100 мл, раствор охлажден до 0°С, затем каплями был добавлен водный NH (20 мл). Ванна со льдом была удалена и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, затем было добавлено 50 мл воды, и водная фаза была экстрагирована диэтиловым эфиром, 2×100 мл. Органическая фаза была промыта насыщенным водным раствором NHCl, 50 мл, высушена (NaSO), отфильтрована и выпарена в вакууме, затем проводилась флеш-хроматография на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью СНСl/2М NH в МеОН 97.5:2.5, и в результате было получено 2,51 г (80%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,91 (t, J=7,5 Гц, 3Н), 1,10 (d, J=9,8 Гц, 3H), 1,94-2,11 (m, 3Н), 2,19-2,35 (m, 2H), 2,76-2,77 (m, 10 H), 5,18-5,45 (m, 12 H), 6,03 (s, 1H), 6,72 (s, 1H)
13
3
C ЯМР (50 MГц, CDCl) δ 14,6, 17,6, 20,8, 25,8, 25,9, 32,0, 41,0, 127,3, 128,1, 128,4, 128,6, 128,8, 130,1, 132,2, 179,6 (8 скрытых сигналов)
+
+
МС (ионизация электрораспылением); 342 [M+H], 364 [M+Na]
23
35
HRMS (EI) рассчитано для CHNO: 341.2719, найдено: 341.2707
Получение этилового эфира α-метокси-DHA (PRB-14)
2
4
2
4
К суспензии 60% NaH (61,1 мг, 1,53 ммоль) в THF (5 мл) в атмосфере N при -78°С был добавлен каплями раствор этилового эфира α-гидрокси-DHA (PRB-12) (373 мг, 1,00 ммоль) в THF (5 мл), полученную смесь перемешивали при -78°С в течение 20 минут перед тем, как каплями был добавлен йодистый метил (0,13 мл, 2,09 ммоль). Реакционная смесь постепенно была доведена до комнатной температуры в течение 5 часов. Был добавлен насыщенный водный раствор NHCl, 15 мл, и смесь была экстрагирована с помощью диэтилового эфира (25 мл × 2), органическая фаза была отмыта соляным раствором (25 мл), высушена (NaSO), отфильтрована и выпарена в вакууме, затем проводилась флеш-хроматография на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана/ЕtOАс (99:1-4:1), и было получено 136 мг (35%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,92 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,24 (t, J=7,1 Гц, 3H), 2,03 (квинтет, J=7,3 Гц, 2H), 2,48 (t, J=5,7 Гц, 2H), 2,73-2,82 (m, 10 H), 3,34 (s, 3H), 3,74 (t, J=6,2 Гц, IH), 4,17 (q, J=7,1 Гц, 2 H), 5,24-5,43 (m, 12H)
13
3
C ЯМР (50 MГц, CDCl) δ 14,1, 20,4, 25,4, 25,5, 25,7, 30,6, 57,9, 60,9, 80,8, 123,7, 126,9, 127,71, 127,73, 127,92, 127,94, 128,07, 128,1, 128,2, 128,4, 130,7, 131,8, 171,9 (3 скрытых сигнала)
+
МС (ионизация электрораспылением); 409 [M+Na]
25
38
3
HRMS (ES) рассчитано для CHONa: 409.2713, найдено: 409.2711
Получение этилового эфира α-йодо-DHA (PRB-15)
2
2
2
2
2
3
2
4
Диизопропиламин (20 мл, 140 ммоль) был растворен в 150 мл THF в атмосфере N при -20°С. BuLi (88 мл, 140 ммоль, 1,6 M) был каплями добавлен к смеси перед тем, как раствор был охлажден до -78°С. Этиловый эфир DHA (50 г, 140 ммоль) в 250 мл THF каплями был добавлен к раствору и реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученная смесь была добавлена каплями к раствору I (42,8 г, 169 ммоль) в 400 мл THF в атмосфере N при -70°С. Реакция была остановлена с помощью 1 М НСl и разбавление осуществлялось с помощью гептана. Органическая фаза была промыта 10% NaSO (2x), высушена (NaSO), отфильтрована и выпарена в вакууме. Желаемый продукт был очищен с помощью флеш-хроматографии, в качестве элюента использовались Гептан/ЕtOАс (100:1), и было получено 11.0 г (16%) названного соединения в виде бледно-желтого масла;
МС (Ионизация электрораспылением): 505 [M+Na].
Получение этилового эфира α-йодо-DНА (PRB-15)
2
2
2
4
К раствору диизопропиламина (42 мл, 298 ммоль) в сухом THF (150 мл) в атмосфере N при -78°С каплями был добавлен 1.6 М BuLi в гексане (158 мл, 253 ммоль). Полученную смесь перемешивали при -78°С в течение 35 минут, затем был добавлен каплями раствор этилового эфира DHA (75,05 г, 210 ммоль) в THF (300 мл). Полученная темно-зеленая реакционная смесь перемешивалась в течение 30 минут при -78°С перед добавлением каплями раствора I (91,06 г, 359 ммоль) в THF (200 мл). Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 20 минут, затем реакция была остановлена с помощью воды (200 мл), экстрагирование осуществлялось с помощью гептана (300 мл). Органическая фаза была промыта 1 М НСl (150 мл) и водой (200 мл), высушена (NaSO), отфильтрована и выпарена в вакууме. Неочищенный продукт был очищен по методу флеш-хроматографии на силикагеле, в качестве элюента использовались гептан/ЕtOАс (100:1), и было получено 26,14 г (26%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,94 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,24 (t, J=7,1 Гц, 3Н), 2,04 (квинтет, J=7,1 Гц, 2H), 2,69-2,84 (m, 12 H), 4,17 (q, J=7,l Гц, 2H), 4,22 (t, J=7,9 Гц, 1H), 5,24-5,49 (m, 12 H)
13
3
С ЯМР (50 MГц, CDCl) δ 13,7, 14,2, 25,5, 26,0 (2 сигнала), 25,8, 34,0, 61,7, 126,1, 127,0, 127,4, 127,8, 127,9, 128,0, 128,2, 128,5, 128,5, 131,6, 131,9, 170,9 (4 скрытых сигнала)
+
МС (ионизация электрораспылением); 505 [M+Na]
Получение этилового эфира α-амино-DНА (PRB-17)
2
2
2
3
К раствору этилового эфира α-фталимид-DHA (313,5 мг, 0,62 ммоль) в этаноле (5 мл) был добавлен гидрат гидразина (46 мкл, 0,95 ммоль) и полученную смесь дефлегмировали в атмосфере N в течение 15 ½ часов, затем следовало выпаривание в вакууме, очистка проводилась с помощью метода флеш-хроматографии на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью СНСl:7М NH в метаноле (99:1-95:1), в результате было получено 149 мг (64%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯMR (200 MГц, CDCl) δ 0,91 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,22 (t, J=7,1 Гц, 3H), 1,72 (bs, 2H), 2,02 (квинтет, J=7,2 Гц, 2H), 2,39-2,46 (m, 2H), 2,73-2,82 (m, 10 H), 3,47 (bs, 1H), 4,13 (q, 2H), 5,23-5,56 (m, 12 H)
13
3
С ЯМР (50 MГц, CDCl) δ 14,1, 20,4, 25,4, 25,5, 25,6, 54,1, 60,8, 124,4, 126,9, 127,7 (2 сигнала), 127,9, 128,2, 128,3, 128,4, 131,4, 131,9, 189,3 (6 скрытых сигналов)
+
МС (ионизация электрораспылением); 372 [М+Н]
Получение этилового эфира (S)-(+)-α-этил DHA (PRB-20)
Синтез промежуточного соединения PRB-18:
2
2
DHA (3,00 г, 18,3 ммоль) была растворена в сухом СНСl (120 мл) при 0°С в инертной атмосфере и были добавлены DMAP (2,45 г, 20,1 ммоль) и DCC (3,96 г, 19,2 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 20 минут, затем был добавлен (4R,5S)-(+)-4-метил-5-фенил-2-оксазолидинон (3,24 г, 18,3 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Продукт был профильтрован и очистка по методу флеш-хроматографии (гептан: этилацетат 6:1) дала выход 3,00 г (34%) промежуточного соединения PRB-18 в виде бесцветного масла.
1
3
H-ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,93-1,05 (t+d, 6H), 2,11 (m, 2H), 2,51 (m, 2H), 2,80-3,00 (m, 10Н), 3,05 (m, 2H), 4,77 (m, 1H), 5,34-5,68 (m, 12H), 5,70 (d, 1H), 7,28-7,32 (m,2H), 131-1 Al (m, 3H).
Синтез промежуточного соединения PRB-19
4
2
4
Соединение PRB-18 (1,80 г, 3,70 ммоль) в сухом THF (10 мл) было добавлено каплями к раствору LiHMDS (1M в THF, 4,00 мл, 4,00 ммоль) в сухом THF (15 мл) при -78°С в инертной атмосфере. Смесь перемешивали при -78°С в течение 30 минут, был добавлен EtI (0,89 мл, 11,1 ммоль), и смесь в течение часа медленно доводили до 0°С. Затем смесь перемешивали при 0°С в течение 18 часов и подвергали распределению между насыщенным NHC1 (50 мл) и диэтиловым эфиром (50 мл). Водный слой был экстрагирован диэтиловым эфиром (50 мл), объединенный органический слой был промыт 0.1 М HCl (50 мл) и соляным раствором (50 мл). Высушивание осуществлялось над NaSO, очистка по методу флеш-хроматографии (гептан: этилацетат 95:5) дала выход 0,52 г (27%) промежуточного соединения PRB-19 в виде бесцветного масла.
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,88-1,01 (m, 9H), 1,64-1,78 (m, 2H), 2,08 (m. 2H), 2,31 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 2,87 (m, 10H), 3,87 (m, 1H), 4,75 (m, 1H), 5,32 (m, 12H), 5,63 (d,.77,1 Гц, 1H), 7,32 (m, 2H), 7,42 (m, 3H).
13
3
С-ЯМР (50 MГц, CDCl): δ 7,26, 11,75, 14,67, 14,98, 20,95, 25,57, 25,93, 26,04, 29,93, 44,59, 55,31, 79,10, 125,21, 126,01, 127,17, 127,42, 128,27, 128,50, 128,55, 128,67, 128,95, 129,09, 130,35, 132,42, 133,80, 153,18, 176,25.
+
МС (ионизация электрораспылением): 538.2 [M+Na]
Соединение PRB-19 (0,25 г, 0,485 ммоль) было растворено в абсолютном этаноле (5 мл) и температура доведена до 0°С в инертной атмосфере. Был добавлен NaOEt (1 M в этаноле, 0,54 мл, 0,54 ммоль) и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут и подвергали распределению между водой и гептаном. Водный слой был экстрагирован с помощью гептана и объединенный органический слой был промыт 0.1 М HCl и высушен. Очистка по методу флеш-хроматографии дала выход 0.025 г (13%) названного соединения PRB-20 в виде бесцветного масла.
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,8-1,0 (m, 6H), 1,2-1,4 (m, 4H), 1,5-1,7 (m, 2H), 2,12 (m, 2H), 2,3-2,5 (m, 2H), 2,8-3,0 (m, 10Н), 4,18 (t, 2H), 5,3-5,6 (m, 12H).
МС (ионизация электрораспылением); 407 [M+Na].
[α]D+1,7°(с=1,5, этанол).
Получение этилового эфира (R)-(-)-α-этил-DНА (PRB-21):
Синтез промежуточного соединения PRB-21:
2
2
DHA (1,00 г, 3,05 ммоль) была растворена в сухом СНСl (20 мл) при 0°С в инертной атмосфере и были добавлены DMAP (0,41 г, 3,35 ммоль) и DCC (0,66 г, 3,20 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 20 минут, был добавлен(4S,5R)-(-)-4-метил-5-фенил-2-оксазолидинон (0,54 г, 3,05 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Фильтрация и очистка по методу флеш-хроматографии (гептан: этилацетат 6:1) дали выход 1,08 г (73%) промежуточного соединения PRB-21 в виде бесцветного масла.
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,93-1,05 (t+d, 6H), 2,11 (m, 2H), 2,51 (m, 2H), 2,80-3.00 (m, 10Н), 3,05 (m, 2H), 4,77 (m, 1H), 5,34-5,68 (m,12H), 5,70 (d, 1H), 7,28.7,32 (m, 2H), 7,37-7,47 (m, 3H).
Синтез промежуточного соединения PRB-22:
4
2
4
Соединение PRB-21 (3,25 г, 6,67 ммоль) в сухом THF (15 мл) было добавлено каплями к раствору LiHMDS (1M в THF, 7,34 мл, 7,34 ммоль) в сухом THF (35 мл) при -78°С в инертной атмосфере. Смесь перемешивали при -78°С в течение 30 минут, был добавлен EtI (1.6 мл, 20.0 ммоль) и смесь в течение часа медленно доводили до 0°С. Затем смесь перемешивали при 0°С в течение 18 часов и подвергали распределению между насыщенным NHCl (50 мл) и диэтиловым эфиром (50 мл). Водный слой был экстрагирован диэтиловым эфиром (50 мл), объединенный органический слой был промыт 0,1 M HCl (50 мл) и соляным раствором (50 мл). Высушивание осуществлялось над NaSO, очистка по методу флеш-хроматографии (гептан: этилацетат 95:5) дала выход 1,50 г (44%) промежуточного PRB-22 в виде бесцветного масла.
1
3
Н-ЯМР (200 MГц, CDCl): δ 0,88-1,01 (m, 9H), 1,64-1,78 (m, 2H), 2,08 (m, 2H), 2,31 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 2,87 (m, 10H), 3,87 (m, 1H), 4,75 (m, 1H), 5,32 (m, 12H), 5,63 (d, J7,l Гц, 1H), 7,32 (m, 2H), 7,42 (m, 3H).
13
3
С-ЯМР (50 MГц, CDCl): δ 7,26, 11,75, 14,67, 14,98, 20,95, 25,57, 25,93, 26,04, 29,93, 44,59, 55,31, 79,10, 125,21, 126,01, 127,17, 127,42, 128,27, 128,50, 128,55, 128,67, 128,95, 129,09, 130,35, 132,42, 133,80, 153,18,176,25.
МС (ионизация электрораспылением): 538.2 [M+Na]
Соединение PRB-22 (0,25 г, 0,485 ммоль) было растворено в абсолютном EtOH (5 мл) и температура доведена до 0°С в инертной атмосфере. Был добавлен NaOEt (1М в этаноле, 0,54 мл, 0,54 ммоль) и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут и смесь подвергали распределению между водой и гептаном. Водный слой был экстрагирован с помощью гептана и объединенный органический слой был промыт 0,1 M HCl и высушен. Очистка по методу флеш-хроматографии дала выход (13%) названного соединения PRB-23 в виде бесцветного масла.
1
3
Н-ЯМР (200 MГц; CDCl) δ 0,8-1,0 (m, 6H), 1,2-1,4 (m, 4H), 1,5-1,7 (m, 2H), 2,12 (m, 2H), 2,3-2,5 (m, 2H), 2,8-3,0 (m, 10Н), 4,18 (t, 2H), 5,3-5,6 (m, 12H);
МС (ионизация электрораспылением); 407 [M+Na].
[α]D-1.3° (с=1,00, этанол).
Получение этилового эфира α-фталимид-DНА (PRB-24)
2
Смесь этилового эфира α-гидрокси-DHA (PRB-12) (373,5 мг, 1,00 ммоль), фталимида (178 мг, 1,21 ммоль) и трифенилфосфина (313,9 мг, 1,20 ммоль) в THF (10 мл), была охлаждена до 0°С в атмосфере N, затем каплями был добавлен диизопропилазодикарбоксилат (0,24 мл, 1,24 ммоль). Ванна со льдом была удалена, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов, после чего было осуществлено выпаривание в вакууме и проведена очистка по методу флеш-хроматографии на силикагеле при использовании в качестве элюента смеси гептан/этилацетат (99:1-95:1), в результате было получено 323 мг (64%) продукта в виде желтой жидкости.
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,95 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,22 (t, J=7,1 Гц, 3H), 2,05 (m, 2H), 2,72-2,84 (m, 11 H), 3,02-3,22 (1Н), 4,20 (q, 7=7,1 Гц, 2H), 4,87 (dd, J=11 Гц, J=4,9 Гц, 1Н), 5,17-5,40 (m, 12H), 7,68-7,75 (m, 2H), 7,79-7,85 (m, 2H)
13
3
С ЯМР (50 MГц, CDCl) δ 14,0, 14,1, 20,4, 25,4, 25,4, 25,5, 27,0, 51,8, 61,7, 123,8, 124,3, 126,9, 127,5, 127,7, 127,9, 127,9, 128,1, 128,1, 128,3, 128,4, 131,6, 131,8, 131,8, 134,0, 167,3, 168,7 (2 скрытых сигнала)
+
+
МС (ионизация электрораспылением); 502 [М+Н], 524 [M+Na]
Получение этилового эфира α-этиламино-DНА (PRB-25) и этилового эфира α-диэтиламино-DНА (PRB-26)
2
2
4
2
2
3
К смеси этилового эфира α-амино-DHA (PRB-17) (746,5 мг, 2,01 ммоль), LiOH·HO (171,6 мг, 4,09 ммоль) и molsieve 4A (599 мг) в DMF (4 мл) был добавлен этилбромид (3,0 мл, 40,2 ммоль), полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 71 часа. Смесь была разведена диэтиловым эфиром (100 мл) и отфильтрована. Органическая фаза была промыта 1 M NaOH (20 мл) и соляным растовором (20 мл), высушена (NaSO), отфильтрована и выпарена в вакууме, очистка проводилась по методу флеш-хроматографии на силикагеле, элюирование осуществлялось с помощью гептана: этилацетата (95:5) - СНСl:2М NH в метаноле (99:1), в результате было получено 458 мг (53%) PRB-26 в виде желтой жидкости и 152 мг (19%) PRB-25 в виде желтой жидкости.
PRB-26:
1
3
Н ЯМР (200 MГц, CDCl) δ 0,89 (t, J=7,5 Гц, 3H), 1,03 (t, 3H), 1,24 (t, J=7,1 Гц, 6H), 2,05 (квинтет, J=7,1 Гц, 2H), 2,52 (m, 4H), 2,76-2,85 (m, 12 H), 3,35 (t, 1Н), 4,13 (q, J=7,1 Гц, 2 H), 5,28-5,44 (m, 12 H)
13
3
С ЯМР (75 MГц, CDCl) δ 14,1, 14,3, 14,4, 20,5, 22,6, 25,5, 25,6, 25,7, 31,9, 44,4, 60,1, 62,9, 127,0, 127,8, 128,05, 128,13, 128,17, 128,22, 128,5, 132,0, 173,3 (5 скрытых сигналов)
Примеры
Модели и методы, использовавшиеся в настоящем изобретении для демонстрации эффектов на метаболический синдром и диабет 2-го типа, представлены на фигуре 2: Пять блоков экспериментов было выполнено с целью выяснения, уменьшают ли производные DHA резистентность к инсулину и/или смягчают признаки метаболического синдрома. Настоящее изобретение не ограничивается представленными вариантами осуществления и примерами.
Пример 1. Анализ внутриклеточных свободных жирных кислот (неэстерифицированные жирные кислоты) в клетках печени (блок 1 на фигуре 2)
Предпосылки
В первом блоке экспериментов (см. фиг.2) ткани печени от животных, получавших PRB-1, 2, 5 и 7, были проанализированы на предмет содержания свободных неэстерифицированных жирных кислот. Животные были набраны из пятнадцатого блока экспериментов (фармакодинамические эффекты производных DHA на животной модели метаболического синдрома). Животные получали DHA (15% жирового содержания диеты) или производные DHA (1,5% жирового содержания диеты) в течение 8 недель и предполагалось, что внутриклеточные концентрации DHA и производные DHA стабильны. Ткань печени была выбрана по той причине, что в печени скорость метаболизма очень высока.
Способ
Образцы печени были гомогенизированы в холодном растворе фосфатного буфера (PBS) и немедленно экстрагированы хлороформом: метанол (2:1), содержащий бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), 0,2 мМ, при использовании цис-10-гептадеценовой кислоты в качестве внутреннего стандарта. Органические фазы были высушены над азотом, вновь растворены в ацетонитриле с 0.1% уксусной кислотой и 10 мкМ ВНТ для анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (RP-HPLC МС/МС). Общее содержание белка было измерено с помощью методики Bio-Rad после гомогенизации.
Система Agilent 1100 использовалась для колонки обратной фазы (колонка Supelco Ascentis C1S, 25 см × 4.6 мм, внутренний диаметр 5 мкм) отделения DHA и ее производных PRB в течение 22 минут. Подвижная фаза - ацетонитрил-вода (87+13), содержащая 0,1% уксусную кислоту. Температура колонки составляла 35°С. Для качественного и количественного анализа элюата использовали масс-спектрометрический детектор "ABI Qtrap-400" с трехстадийным квадрупольным масс-фильтром (ионной ловушкой) в режиме мониторинга множественных ионов. Ионные пары были следующими: 327,3/327,3 (DHA), 341,3/341,3 (PRB-1), 355,3/355,3 (PRB-2 и PRB-5), 387,3/387,3 (PRB-7), 267,2/267,2 (I.S. FA 17:1) соответственно под единичной резолюцией. Время выдержки составляло 100 мсек, за исключением FA 17:1, где время выдержки составляло 200 мсек. Точная верификация изомерных соединений PRB была получена путем комбинации времени удержания и отношения масса/заряд. Стандартная кривая квадратичной регрессии использовалась для количественного анализа после определения с помощью внутреннего стандарта.
Результаты
Концентрация различных производных DHA и концентрации DHA были представлены как мкг на г общего количества белка в клетках печени. На фиг.3 показаны концентрации различных PRBs от животных, получивших PRB-1, 2, 5 и 7 в концентрации 1,5% от общего жирового содержания в диете с высоким содержанием жиров.
Наивысшая внутриклеточная концентрация была получена в случае с PRB-2. Также высокое внутриклеточное содержание наблюдалось в случае с PRB-5, хотя и не до такой степени, как в случае с PRB-2. Этот результат является неожиданным.
На фиг.4 показаны внутриклеточные концентрации DHA в тканях печени от животных, которые получили различные PRBs. Содержание DHA достигало гораздо более высокого уровня у животных, которые получили PRB-7 по сравнению с тремя другими производными DHA. У животных, которые получили PRB-2, отмечалась наиболее низкая концентрация DHA. По-видимому, PRB-7 до некоторой степени преобразовывается обратно в DHA. Наивысшая внутриклеточная концентрация наблюдалась в случае PRB-2. Это означает, что соединение PRB-2 будет более доступно в качестве лиганда для ядерных рецепторов, таким образом, будет наблюдаться терапевтический эффект, выражающийся в контроле уровня глюкозы в крови и уровня липидов в крови.
Пример 2
Компьютерное тестирование сродства (блок 2 на фигуре 2)
Предпосылки
Ядерные рецепторы были секвенированы и известна аминокислотная последовательность для PPARs и других рецепторов, которые играют роль в генетическом контроле уровня глюкозы и жиров. Можно использовать рентгенокристаллографию и ЯМР-спектроскопию рецепторов PPAR и для оценки кинетики связывания может быть использовано компьютеризированное тестирование сродства жирных кислот к рецепторам. Геометрические формы связывания, часто называемые способами или положениями связывания, включают как положение лиганда относительно рецептора, так и конформационное положение лиганда и рецептора. Таким образом, может быть проанализирован эффективный докинг лиганда.
Сродство лиганда по отношению к рецептору определяется с помощью двух различных параметров: докинг лиганда (производного DНА) в связывающий сайт рецептора и электростатическое связывание между некоторыми аминокислотами рецептора и карбоксильной группой или боковыми цепями «головы» жирной кислоты (Krumrine).
Как известно, рецептор PPARα является более «неразборчивым» по сравнению с PPARγ, то есть PPARα будет принимать больше жирных кислот в качестве лигандов по сравнению с PPARγ. Однако, поскольку пациенты с метаболическим синдромом или диабетом 2-го типа обычно страдают ожирением или имеют излишнюю массу тела и имеют повышенный уровень липидов в крови, главным образом, повышенный уровень триглицеридов и низкий уровень холестерина липопротеинов высокой плотности, является важной активация рецептора PPARα. Идеальное лекарственное средство для лечения метаболического синдрома будет действовать, как лиганд к обоим этим рецепторам, предпочтительно с более высоким сродством к рецептору PPARγ.
Способ
Классификация различных производных DHA соответственно их сродству связывания была подсчитана и представлена, как наиболее низкое сродство связывания (LBA) и среднее сродство связывания (ABE).
Все 15 производных DHA (PRB-1-PRB-15) были протестированы с помощью компьютеризированной методики докинга. Некоторые из производных, такие как PRB-1, PRB-2, PRB-7, PRB-9, PRB-10, PRB-11, PRB-12, PRB-13, PRB-14 и PRB-15 представлены как г и s энантиомеры и в этом случае оба были протестированы. Лиганды PPARγ розиглитазон и пиоглитазон, оба в r и s форме, были протестированы для сравнения. Эти соединения являются зарегистрированными фармацевтическими средствами для лечения диабета.
Результаты
Результаты показаны в таблице 1, в которой представлены параметры низкой энергии связывания одиночной конфирмации (LBE), средней энергии связывания (ABE) правильно ориентированной ICM 20 наименьшей конфирмации энергии (найдено) протестированных соединений. Так же было исследовано сродство к RXRα. Рецептор RXRα взаимодействует с PPAR рецептором, образуя гетеродимер при связывании жирной кислоты.
На фиг.5 отображено сродство связывания для рецептора PPARγ, который, главным образом, играет роль в транскрипции белков, задействованных в контроле уровня глюкозы в крови. Несомненно, PRB-2, как в r, так и s стереоизомерной форме обладает сильным сродством к рецептору PPARγ. PRB-5 обладает меньшим сродством, а PRB-8 обладает наивысшей ABE. Эти данные являются в высокой степени неожиданными и могут выражаться в более эффективной транскрипции активированного гена PPARγ, ответственного за контроль уровня глюкозы в крови.
На фиг.6 отображено сродство к ядерному рецептору PPARα, который, главным образом, ответственен за метаболизацию жиров, липидов в крови, биологию жировой ткани и контроль веса. Несколько производных DHA имеют высокое сродство связывания, но наивысшее сродство связывания наблюдается в случае с PRB8. Также это в высшей степени неожиданный результат.
На фиг.7 отображено сродство к ядерному рецептору RXRα. Физиологический результат связывания с рецептором RXRα точно установлен не был. Известно, что RXR связывается с рецепторами PPAR, таким образом, образуя гетеродимер, который позднее инициирует транскрипцию описанного гена.
ND=отсутствие докинга, с=двойные связи в полностью-цис форме. r=R энантиоизомер, s=S энантиоизомер. ROSI=Розиглитазон, РIO=Пиоглитазон
Некоторые PRBs имеют высокие LBE и ABE для рецепторов PPARα и PPARγ даже по сравнению с исходным соединением DHA, но также и по сравнению с лигандами PPARγ розиглитазоном и пиоглитазоном, как в r, так и в s форме. Это интересное наблюдение указывает на то, что некоторые PRBs могут быть конкурентами хорошо известным антидиабетическим лекарственным средствам розиглитазону и пиоглитазону.
Этильные производные в альфа-положении этих же жирных кислот, как в r, так и в s форме, не повышали степень сродства. Это было особенно подтверждено для рецептора PPARγ. Как уже было упомянуто, рецептор PPARα является более «неразборчивым» (связываться могут очень многие жирные кислоты). В заключение: многие испытанные производные DНА показали высокое сродство к рецепторам PPARα и PPARγ, при этом сродство связывания выше, чем в случае с розиглитазоном и пиоглитазоном.
Пример 3
Исследование сродства в трансфецированных клетках (блок 3 на фигуре 2)
Предпосылки
Высвобождение люциферазы коррелирует с транскрипцией генов. Связывание лиганда с ядерным рецептором, таким как PPARγ, индуцирует транскрипцию соответствующего гена, таким образом, происходит высвобождение люциферазы. Эта техника, следовательно, обеспечивает измерение сродства лиганда к рецептору, а также активацию ответственного гена.
Способ
Транзиентная трансфекция клеток COS-I была выполнена в 6-луночных планшетах, как было описано Graham и van der Eb (Graham). Для полных исследований по трансфекции в каждую лунку вносили 5 мкг репортерного конструкта, 2.5 мкг pSV-β-галактозидазы в качестве внутреннего контроля, 0,4 мкг рSG5-РРАRγ2. Клетки были собраны через 72 часа, люциферазная активность была измерена соответственно протоколу (Promega). Значения люциферазной активности были нормализованы к значениям β-галактозидазной активности. Адипоциты были трансфецированы при D11 дифференциации при использовании 16 мкл реагента LipofectaminPlus, 4 мкл Lipofectamine (Life Technologies Inc.), 0,2 мкл pSG5-PPARγ и 100 нг рТК Renilla luciferase в качестве контроля эффективности трансфекции. После трансфекции клетки инкубировали в течение трех часов в сыворотке, содержащей среду, и затем инкубировали в течение 48 часов в той же среде, содержащей соответствующие агенты. Люциферазная активность измерялась в соответствии с рекомендациями производителя (Dual Luciferase assay, Promega). Все трансфекции были проведены три раза.
Жирные кислоты (BRL или DHA) и соединения PRBs (исходные растворы) были растоворены в DMSO до конечной концентрации 0.1 М. Затем проводилось растворение до 10 мМ в DMSO, хранение осуществлялось в 1,5 мл пробирках (гомополимерные, пластиковые пробирки), которые наполняли аргоном и хранили при - 20°С. 10 мкМ соединений PRBs или жирных кислот и DMSO (контроль) было добавлено к среде через 5 часов после трансфекции. Трансфецированные клетки поддерживались в среде в течение 24 часов до лизиса репортерным лизирующим буфером. Связывание PRBs или жирных кислот с LBD PPAR активирует связывание GAL4 с UAS, который в свою очередь стимулирует промотер tk к запуску экспрессии люциферазы. Люциферазная активность измерялась при использовании люминометра (TD-20/20 luminometer; Turner Designs, Sunnycvale, CA) и значения были нормализованы к содержанию белка.
Результаты
На фигуре 8 представлено высвобождение люциферазы из трансфецированных клеток, обработанных различными PRBs. Результаты указывают на то, что PRB-1, 2, 6, 7 и 14 оказывают больший эффект на высвобождение люциферазы по сравнению с РRВ-3, 5, 9, 10, 11, 12 и 16.
Пример 4
Исследование сродства к связыванию PRBs и DHA у склонных к ожирению животных с метаболическим синдромом (блок 4 на фигуре 2)
Предпосылки
Для исследования сродства PRB-2, 5 и 8 к PPARγ в сравнении с 97% DHA и антидиабетического соединения розиглитазона использовалась животная модель метаболического синдрома (склонные к ожирению мыши, штамм C57BL/6J), исследование сродства осуществлялось путем измерения высвобождения люциферазы из жировых клеток, взятых от этих животных. Животные (n=8 в каждой группе) в течение 8 недель получали диету с высоким содержанием жиров (жиры составляют 60% от общего количества калорий, такая же диета использовалась в блоке 5). После этого животные получали PRBs в дозе 1,5% от общего содержания жиров в диете в течение последующих двух недель. Группа мышей, получавших розиглитазон, получила 100 мг/кг корма. Контрольные группы продолжали получать либо диету с высоким содержанием жиров, либо стандартную диету. На фиг.9 показан план исследования.
Способ
После забоя животных жировая ткань (эпидидимальная или подкожная) была очищена от других структур и разрезана на миллиметровые кусочки. Жировая ткань была отмыта в 0,9% NaCl и обработана в 5 мл раствора Krebs-Ringer, содержащего хепес, свободный от жирных кислот бычий сывороточный альбумин, 200 нМ аденозина, 2 нМ глюкозы и 260 Ед/мл коллагеназы, в течение 1,5 часов при 37°С на встряхивающей водяной бане. После разрушения с помощью коллагеназы адипоциты были отделены от дебриса путем фильтрации. Клетки затем были отмыты в растворе Кребс-Рингера, содержащего хепес, бычий сывороточный альбумин, свободный от жирных кислот, 200 нМ аденозина, 2 нМ глюкозы, после чего клетки держали на встряхивающей водяной бане при 37°С в течение максимум 30 минут до электропорации.
Изолированные первичные адипоциты были трансфецированы путем электропорации с целью измерения активности специфических регулирующих пролиферацию элементов в структуре пероксисом (PPRE). В этом случае мы вставили плазмиду, которая кодирует кДНК-ген люциферазы светлячка под контролем PPRE из гена ацил-СоА-оксидазы. Кроме того, клетки были трансфецированы плазмидой, содержащей кДНК люциферазы коралла Renilla под контролем конститутивно активного промотера. Индуцируемая PPRE активность люциферазы светлячка была нормализована соответственно люциферазе Renilla luciferase, таким образом, были скорректированы потенциальные различия в количестве трансфецированных клеток. Для измерения люциферазного сигнала мы использовали Dual-Luciferase(R) Reporter assay System (Promega, USA).
Жировой ткани было достаточно для того, чтобы выделить адипоциты для дупликатов. Животные каждой из групп были забиты с 2-дневным интервалом и для каждой диетической группы были получены 4 независимые трансфекции.
Результаты
В течение первых 8 недель у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров (HF diet) (33,7% жиров, w/w), наблюдалось постепенное повышение веса тела по сравнению с мышами в контроле, которые получали обычную диету (4,5% w/w). В течение последующих двух недель животные, получавшие диету с высоким содержанием жиров, и животные, получавшие диету с высоким содержанием жиров в комбинации с розиглитазоном, продолжали набирать вес приблизительно с той же скоростью, что и раньше. В случае получения диеты с высоким содержанием жиров с добавлением PRB-8 и PRB-5 скорость прибавления в весе снижалась. Однако в случае получения PRB-2 и DHA (5% w/w) прибавление в весе полностью останавливалось, и вес тела даже снижался (фиг.10). Потребление пищи контролировалось время от времени (4х). В этом аспекте различий между группами, получавшими диету с высоким содержанием жиров, и группами, получавшими соединения PRB, отмечено не было.
В случае получения диеты с высоким содержанием жиров в комбинации с розиглитазоном эндогенная активность рецепторова PPARγ была приблизительно в 2 раза выше, чем во всех остальных группах, получавших специфическую диету (фиг.11). Кроме того, эти жировые клетки стали более чувствительны к дополнительной стимуляции in vitro 5 uM розиглитазона (стимуляция в 5, 12 раз) по сравнению с самой диетой с высоким содержанием жиров (стимуляция в 1,5 раз). Этот розиглитазон-сенсибилизирующий эффект отмечался также в группах, получавших PRB-2 и PRB-5 (стимуляция в 2,6 раз).
Данные, полученные в этом исследовании, наглядным образом показали активность в отношении ядерных рецепторов PPAR, в особенности это касается влияния на вес тела, наиболее заметные результаты были получены с группами, получавшими соединение PRB-2. Даже животные, получавшие соединения PRB-5 и PRB-8, не так быстро набирали вес, как животные в группе, получавшей только диету с высоким содержанием жиров. Интересно, что у животных, получавших розиглитазон, вес тела повышался до такой же степени, как у животных, получавших только диету с высоким содержанием жиров. Это ясно демонстрирует отрицательные эффекты применения только лигандов PPARγ, таких как глитазоны, так как присутствует риск повышения веса тела, даже если резистентность к инсулину снижена. Однако, когда дело касается активации PPARγ, в этом эксперименте измеренной как люциферазная активность, эффект розиглитазона выражен больше, чем эффект любого из соединений PRBs. Соединения PRB-2 и PRB-5 были более эффективны, чем PRB-8 и DHA (фиг.12).
Пример 5
Фармакодинамические эффекты производных DHA у животной модели метаболического синдрома (блок 5 на фигуре 2)
Предпосылки
Животная модель метаболического синдрома (мыши, склонные к ожирению, штамма C57BL/6J) использовалась для демонстрации эффектов на типичные лабораторные и патологические анатомические особенности, характерные для метаболического синдрома. При получении диеты с высоким содержанием жиров (60% жиров) у животных развивалось ожирение, значительно повышался уровень инсулина в плазме, нарушалась толерантность к глюкозе, в сыворотке крови повышался уровень триглицеридов и неэстерифицированных жирных кислот, наблюдалось ожирение печени.
Пример 5а
Эффекты производных DHA у мышей, склонных к ожирению в течение 4-месячной экспериментальной диеты.
Способ
Все эксперименты были выполнены на самцах мышей штамма C57BL/6, подштамма C57BL/N (поставщик: Charles River, Германия, n=160, эксперименты А-С, см. ниже) или подштамма C57BL/6J (поставщик: the Jackson laboratory, Bar Harbor, ME, США, n=32, эксперимент D). Общее количество использованных животных было выше из-за выбраковки (n=170 и 36 соответственно). В последнем случае животные разводились для нескольких поколений (<20) в Институте физиологии. В начале эксперимента животным было 14 недель и их вес составлял 23.6-27.1 г. За неделю перед началом исследования животные были рассортированы на 8 подгрупп в зависимости от их веса тела. Было отбраковано около 5-10% животных с наименьшим и наибольшим весом соответственно. Животные, исключенные из исследования, на этой стадии были умерщвлены методом цервикальной дислокации. Полная проверка состояния здоровья мышей была выполнена компанией-поставщиком Charles River и в начале исследований серологические тесты были выполнены лабораторией ANLAB (Прага, Чешская Республика). Кроме того, регулярные проверки здоровья были выполнены в специальных помещениях для животных с 3-месячными интервалами при использовании индикаторных животных, проводились серологические исследования (ANLAB). Как показали исследования, животные были свободны от инфекций.
Диеты
Животные получали три типа экспериментальных диет:
(i) Смешанная диета (ssniffRM-H из SSNIFF Spezialdieten Gmbh, Soest, Germany; см. также http://ssniff.de), в которой белки, жиры и углеводы составляли соответственно 33, 9 и 58% энергии.
(ii) Диета с высоким содержанием жиров (cHF diet), приготовленная в лабораторных условиях, в которой белки, жиры и углеводы составляли соответственно 15, 59 и 26% энергии, в эту диету была добавлена хорошо охарактеризованная композиция жирных кислот (большинство липидов было выделено из кукурузного масла; см. Ruzickova 2004).
(iii) Диеты с высоким содержанием жиров, приготовленные в лабораторных условиях, в которых 0,15, 0,5 и 1,5% жиров (компонент кукурузного масла) были заменены различными соединениями PRB (PRB1, PRB2, PRB5, PRB7 и PRB8) или DHA. Все эти соединения находились в форме этиловых эфиров, полученных от Pronova Biocare в герметичных контейнерах. Химический состав соединений PRB был неизвестен для работников лаборатории, проводящих эксперименты (Институт физиологии. Пражская Академия Наук, Чешская Республика).
После получения соединения PRB хранили в холодильнике в исходных контейнерах. Контейнеры открывали непосредственно перед приготовлением экспериментальных диет. Диеты сохранялись в пластиковых пакетах, заполненных азотом, и хранились при -70°С небольшими порциями, которых хватало на кормление животных в течение недели. Свежие нормы давались с 2-дневным интервалом или ежедневно.
План исследования
В исследование входило 4 эксперимента. В каждом эксперименте различные соединения PRB (или DHA) смешивали с диетой с высоким содержанием жиров в трех разных концентрациях (0,15, 0,5 и 1,5% от общего содержания жира). В каждом эксперименте была включена подгруппа мышей, служивших в качестве контроля. Мыши были посажены в клетки по 4 и получали смешанную диету до 3-месячного возраста, затем животные (n=8-13) были случайным образом разбиты на группы, которые получали разные экспериментальные диеты. После двух месяцев получения специфической диеты (в 5-месячном возрасте), животных оставили без пищи в течение ночи и утром и был проведен тест толерантности к глюкозе (внутрибрюшинная инъекция). Животные были забиты в 7-месячном возрасте после 4 месяцев экспериментальной диеты.
Параметры исследования
Параметры в исследовании были следующими: прибавление в весе (граммы), площадь под кривой (AUC) в тестах толерантности к глюкозе (ммоль × 180 мин), уровень инсулина в плазме (нг/мл), уровень триглицеридов в сыворотке (TAGs ммоль/1) и неэстерифицированные жирные кислоты (NEFA ммоль/1).
На фиг.13 показана типичная кривая клиренса глюкозы из крови перед и после дачи животным соединения, уменьшающего резистентность к инсулину. Уменьшение площади под кривой обозначает, что уровень глюкозы в крови быстрее снижается из-за уменьшенной резистентности к инсулину.
Результаты
Результаты представлены в таблицах 2, 3 и 4. (*=значимые различия по сравнению с диетами с высоким содержанием жиров (Р<0.05).)
В таблице 2 показаны эффекты у животных, получивших тестируемые соединения PRB в концентрации 1,5% по сравнению с животными, которые получили диету с высоким содержанием жиров или 97% DHA. Скорость прибавления в весе была значительно снижена у животных, получавших PRB-2, по сравнению с животными, получившими диету с высоким содержанием жиров (cHF). В этой группе было несколько снижено потребление пищи. Наиболее выраженное уменьшение площади под кривой в тесте толерантности к глюкозе наблюдалось в этой же группе и даже у животных, получавших PRB-1. Уровень инсулина в плазме был значительно ниже в группе, получавшей PRB-2, по сравнению с контролями cHF, даже если у животных, получавших PRB-1 и PRB-5, также наблюдался некоторый эффект на этот параметр. В группе, получавшей PRB-2, наблюдалось наибольшее снижение уровня триглицеридов (TAGs) и неэстерифицированных жирных кислот (NEFA).
В таблице 3 показаны эффекты у животных, получивших наименьшую концентрацию, 0,5%, тестируемых соединений по сравнению с животными, получавшими стандартную диету, диету с высоким содержанием жиров (cHF) или 97% DHA. Прибавление в весе было несколько ниже у животных, получавших PRB-2 и PRB-5. AUC в тесте толерантности к глюкозе, а также уровень инсулина в плазме, были, однако, существенно ниже только в группе, получавшей PRB-2.
В таблице 4 представлены результаты диеты с наименьшей концентрацией PRB, 0,15%. В этом случае различия были очень небольшими. Прибавление в весе было несколько ниже в группах, получавших PRB-1 и РRВ-2, тогда как AUC была значительно ниже только в группе, получавшей PRB-2. Уровень инсулина в плазме был ниже в группах, получавших PRB-1, 2 и 7.
Таблица 2
Эффект производных PRB после 4-месячной диеты, содержащей 1,5% PRB
Параметр
STD
сНF
PRB-1
PRB-2
PRB-5
PRB-7
DHA
Вес тела (граммы)
32,4±0,7
49,6±0,6
44,0±1,5*
30,1±1,1*
46,3±1,6
45,9±1,1*
47,1±0,7*
Прибавление в весе (граммы)
7,8±,0,4
25,2±0,5
20,2±1,3*
6,4±0,8*
22,4+1,4
21,7±0,9*
23,0±0,8*
Потребление пищи (граммы/мышь/день)
3,64±0,04
2,70±0,02
2,64±0,03
2,38±0,05*
2,62±0,02
2,68±0,03
2,63±0,02
AUC глюкозы (мМ × 180мин)
1124±57
1625±151
913±68*
982±89*
1264±192
1122±73
2132±288*
Глюкоза натощак (мг/дл)
77±3
145±7
130±14
95±6*
136±12
120±9
138±7
Инсулин (нг/мл)
1,03±0,09
5,35±0,36
2,73±0,33
0,60±0,18*
2,47±0,19*
4,42±0,87
6,55±0,31
Триглицериды (ммоль/л)
1,41±0,09
1,45±0,07
1,58±0,08
0,71+0,01*
1,19±,0,07
1,15±0,08
1,91±0,26*
Неэстерифицированные жирные кислоты (нмоль/л)
0,57±0,05
0,61±0,04
0,63±0,03*
0,54±0,03*
0,72±0,05
0,82±0,06
0,98±0,07
Таблица 3
Эффект производных PRB после 4-месячной диеты, содержащей 0,5% PRB
Параметр
STD
cHF
PRB-1
PRB-2
PRB-5
PRB-7
DHA
Вес тела (граммы)
32,4±0,7
49,6±0,6
47,4±0,6
45,8±1,7
45,7±1,5
48,8±0,9
46,9±0,7*
Прибавление в весе (граммы)
7,8±0,4
25,2±0,5
23,8±0,5
21,9±0,6
22,0±1,4
24,8±0,8
22,9±0,7*
Потребление пищи (граммы/мышь/день)
3,64±0,04
2,70±0,02
2,67±0,04
2,69±0,04
2,63±0,02
2,69±0,03
2,70±0,03
AUC глюкозы (мМ х 180 мин)
1124+57
1625±151
1596+205
1224±72*
1581±231
1674±203
1816±182
Глюкоза натощак (мг/дл)
77±3
145±7
131±7
136±7
130±7
152±6
136±8
Инсулин (нг/мл)
1,03±0,08
5,35±0,36
3,93±0,59
2,75±0,21*
5,12±0,93
4,10±0,57*
5,82±0,47
Триглицериды (ммоль/л)
1,41±0,09
1,45±0,07
2,03±0,22
1,29±0,08
1,4б±0,17
1,42±0,08
1,78±0,08*
Неэстерифицированные жирные кислоты (нмоль/л)
0,57±0,05
0,61±0,04
0,73±0,04*
0,75±0,04
0,77±0,03*
0,87±0,04
0,89±0,03
Таблица 4
Эффект производных PRB после 4-месячной диеты, содержащей 0,15% PRB
Параметр
STD
cHF
PRB-1
PRB-2
PRB-5
PRB-7
DHA
Вес тела (граммы)
32,4±0,7
49,6±0,6
47,2±1,3
46,7±1,1
48,0±0,8
47,4±0,8*
48,3±0,6
Прибавление в весе (граммы)
7,8±0,4
25,2±0,5
22,9±1,1
22,8±0,9
24,2±0,5
23,2±0,7*
24,3±0,8
Потребление пищи (граммы/мышь/день)
3,64±0,04
2,70±0,02
2,63±0,04
2,57±0,03*
2,66±0,02
2,59±0,02
2,79±0,03
AUC глюкозы (мМ × 180 мин)
1124±57
1625±151
1291±172
1071±148*
1443±70
1425±97
1477±214
Глюкоза натощак (мг/дл)
77+3
145±7
126±15
132±5
151+5
141±9
141±10
Инсулин (нг/мл)
1,03±0,08
5,35±0,36
3,50±0,29
4,00±0,64
6,21±0,45
3,76±0,72*
4,31±0,39*
Триглицериды (ммоль/л)
1,41±0,09
1,45±0,07
1,75±0,08
1,42±0,07
1,б4±0,28
1,41±0,11
1,50±0,13
Неэстерифицированные жирные кислоты (нмоль/л)
0,57±0,05
0,61±0,04
0,62±0,04*
0,78±0,04*
0,71±0,09
0,85±0,06
0,96±0,07
В заключение: исследование применения PRB-1, 2, 5 и 7 в течение 4 месяцев у склонных к ожирению животных с резистентностью к инсулину и метаболическим синдромом показало очевидный и неожиданный эффект протестированных соединений PBRs и в особенности производного DHA соединения PRB-2 на резистентность к инсулину и симптомы метаболического синдрома, наблюдалось снижение веса, уменьшение AUC во внутрибрюшинном тесте толерантности к глюкозе, а также снижение уровня триглицеридов и неэстерифицированных жирных кислот. Эффекты наблюдались в группе, получавшей дозу PRB 1,5%, и группе, получавшей дозу 0,5%. Некоторые эффекты были отмечены даже в группе, получавшей наименьшую концентрацию 0,15%.
Испытание соединения PRB-8 началось позднее, поэтому в трех группах, получавших диету с концентрацией этого соединения 1,5%, 0,5% и 0,15%, были получены данные только 2-месячных исследований. В группе, получившей 1,5%, вес тела (BW) составлял 28.0±0.7 г по сравнению с контролем 29.6±0.9, AUC составляла 1031±104 по сравнению с контролем 1074±91. Эти различия небольшие, но тенденция интересна. Для этих параметров отсутствовали различия между экспериментальными диетами, в которых животные получали наименьшие дозы 0,5% и 0,15%, и контрольными группами. Данные, полученные с PRB-8 (применение в течение 2 месяцев), показали, что существует тенденция к снижению веса и AUC.
Пример 5b
Эффект производных DHA на метаболический синдром и резистентность к инсулину
Способ
В другом эксперименте PRB-2, PRB-5 и PRB-7 испытывались на животных той же породы. В этом эксперименте животные вначале получали диету с высоким содержанием жиров (так же как в предыдущем эксперименте 5а) в течение 8 недель, у животных развивались резистентность к инсулину и метаболический синдром и затем они получали соединения PRBs. Начальная доза PRBs составляла 15% содержания жира, но животные не переносили эту дозу. Через 2-недельный период животные получали 1,5% PRB-2, 5% и 1,5% PRB-5 и 1,5% и 0,5% PRB-7.
Результаты
Снижение веса было очень выражено у животных, получавших PRB-2. Даже у животных, получавших PRB-5, наблюдалось некоторое снижение веса, но в более высокой дозе - 5%. Уровень триглицеридов снижался при применении всех испытанных производных по сравнению с контрольными животными, получавшими диету с высоким содержанием жиров (cHF diet). Снижение уровня неэстерифицированных жирных кислот было более выражено при применении PRB-2 и PRB-5, однако в различных доза (см. фиг.14).
Уровень холестерина в крови были снижен у животных, получавших PRB-2 и PRB-5. Уровень глюкозы в крови изменен не был из-за того, что эти животные находятся в преддиабетическом состоянии с нормальным уровнем глюкозы из-за высокого уровня секреции продукции инсулина. Однако наиболее важным является тот факт, что уровень инсулина в плазме был значительно снижен в группе животных, получавших PRB-2 в гораздо меньшей концентрации по сравнению со вторым очень эффективным DHA производным PRB-5. Даже в случае применения PRB-7 наблюдались эффекты на концентрацию инсулина (см. фиг.15).
При применении PRB-2 наблюдалось статистически значимое уменьшение AUC глюкозы в крови во все моменты времени по сравнению с исходными величинами. Это означает, что уровень глюкозы в крови снижался после применения PRB-2 в концентрации 1,5%. При применении PRB-5 и PRB-7 некоторый эффект наблюдался, но в меньшей степени, чем в случае с PRB-2 (см. фиг.16).
Эти результаты очень неожиданны и говорят о положительном эффекте этих соединений при метаболическом синдроме и диабете 2-го типа. Практически все эти пациенты страдают ожирением или имеют избыточную массу тела и результаты показали, что лекарственное средство является многообещающим в плане снижения веса. Наиболее применяемыми средствами для лечения диабета 2-го типа на сегодняшний день являются тиазолидиноны, которые являются сильными лигандами PPARγ, таким образом, уменьшая резистентность к инсулину, что часто приводит к повышению веса тела, что очень нежелательно для этих пациентов (Yki-Jarvinen 2004).
Снижение уровня триглицеридов в сыворотке крови является другим очень важным эффектом, который был показан в этих экспериментах. У пациентов с метаболическим синдромом и диабетом 2-го типа часто повышен уровень триглицеридов. Эффекты производных DHA по снижению уровня триглицеридов являются очень положительным результатом и опять соединение PRB-2 показало наибольший эффект при наименьших дозах. Очень положительные эффекты на уровень инсулина в плазме и тест толерантности к глюкозе являются весьма перспективными и очень неожиданными. Взятые вместе все результаты, полученные с производными DHA, особенно с PRB-2, являются весьма обнадеживающими для формирования хорошей базы для разработки антидиабетического лекарственного средства.
Пример 5с
Применение производных DHA при жировом перерождении печени
Способ
В экспериментах с производными DHA были отобраны образцы тканей, было проведено гистологическое исследование. После парафинирования образцы тканей печени, жировой ткани, скелетной мускулатуры, поджелудочной железы, почек были окрашены эозином-гематоксилином.
Результаты
Патологических изменений в тканях за исключением ткани печени обнаружено не было. У животных в контроле, которые получали диету с высоким содержанием жиров, наблюдалось жировое перерождение печени (стеатоз печени). Жировые капли в печени легко были отличимы от нормальных клеток печени. У животных, получавших соединения PRB-1, 5 и 7, отмечалась низкая степень жирового перерождения печени. Однако у животных, получавших PRB-2 в концентрации 1,5%, не наблюдалось никаких признаков жирового перерождения печени. Это наблюдение является чрезвычайно важным и имеет большое значение для лечения пациентов с резистентностью к инсулину, ожирением и диабетом 2-го типа. Жировое перерождение печени является очень частым явлением у этих пациентов, которое связано избытком жирных кислот и триглицеридов, биологических маркеров в развитии резистентности к инсулину и метаболического синдрома. Производные DHA уменьшают жировое перерождение печени, наиболее выраженный эффект показало соединение PRB-2.
ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей заявке рассматривается новая группа соединений, которые активируют ядерные рецепторы, особенно PPARγ и PPARα, таким образом, оказывая ряд терапевтических эффектов при лечении резистентности к инсулину, метаболического синдрома, диабета 2-го типа, сердечно-сосудистых заболеваний и других заболеваний, связанных с атеросклерозом.
Членами этой группы являются производные DHA с различными боковыми цепями в альфа-положении молекул. Большое количество альфа-замещенных производных DHA были протестированы и сравнены с контролями, а также с чистыми DHA и ЕРА. Некоторые испытанные соединения показали интересные биологические эффекты, имеющие значение для создания антидиабетического лекарственного средства на их основе.
Интересным и пока непонятным является тот факт, что этиловый эфир альфа-этил-DHA (PRB-2) был значительно эффективнее в ряде тестов, использовавшихся для демонстрации эффектов, связанных с резистентностью к инсулину и вследствие этого с заболеваниями, которые и вызваны этим патофизиологическим состоянием, этими заболеваниями являются метаболический синдром, диабет 2-го типа, сердечно-сосудистые заболевания и другие заболевания, связанные с атеросклерозом. Ткань печени животных, получивших различные производные DHA (блок 1), была насыщена этиловым эфиром альфа-этил-DHA, это указывает на то, что это соединение не использовалось для синтеза триглицеридов, эйкозаноидов или других промежуточных веществ метаболизма. Косвенным образом это обозначает то, что альфа-этил-DHA будет доступна для связывания с ядерными рецепторами, такими как PPARs.
Тестирование сродства к PPARγ и PPARα при использовании докинг-технологии показало, что большое количество производных DHA обладают сродством к обоим рецепторам и не в последнюю очередь к PPARγ, который, возможно, является наиболее важным ядерным рецептором, участвующим в активации генов, ответственных за метаболизацию глюкозы в крови. Особенно альфа-этил-DHA (PRB-2) и альфа-диэтил-DHA (PRB-8) обладали сильным сродством к этим ядерным рецепторам. По сравнению с альфа-диэтил-DHA альфа-этил-DHA имеет два стереоизомера, r и s формы. При использовании докинг-технологии было показано, что оба стереоизомера обладают одинаковым сродством к PPARγ и PPARα, это означает, что ни r, ни s форма не обладают преимуществами по сравнению с рацемической формой. Более того, рацемическая форма может иметь преимущества перед каждым из изомеров.
Когда сродство было исследовано в трансфецированных клетках, несущих ядерный рецептор и элемент ответа ДНК, было показано, что некоторые соединения PRBs обладают сильным сродством, измеренным как высвобождение люциферазы. Наилучшие результаты наблюдались в случае с альфа-этил-DHA (PRB-2) и PRB-6, 7 и 14.
Пять производных DHA было испытано на мышах штамма C57BL/6, у которых развивались резистентность к инсулину и метаболический синдром при получении диеты с высоким содержанием жиров. Соединение альфа-этил-DHA (PRB-2) было испытано в трех отдельных экспериментах, тогда как PRB-1, 5 и 7 были испытаны в двух экспериментах и соединение альфа-диэтил-DHA (PRB-8) было испытано в одном эксперименте. Все производные показали значительные биологические эффекты. Однако в случае с альфа-этил-DHA (PRB-2) наблюдались наиболее обещающие эффекты: снижение веса тела, AUC во внутрибрюшинном тесте толерантности к глюкозе, уровня инсулина в плазме, а также снижение концентрации триглицеридов и неэстерифицированных жирных кислот в сыворотке крови. Эти результаты были получены при дозах 1,5% и 0,5%. При наименьшей дозе 0,15% эффекты не были четко выражены. Соединение альфа-этил-DHA (PRB-2) в дозе 1,5% также было эффективно в предупреждении жирового перерождения печени, которое часто развивается у людей и животных с резистентностью к инсулину и метаболическим синдромом.
Соединение альфа-этил-DHA (PRB-2) действует в 10-30 раз сильнее, чем чистая DHA. Результаты сравнения производных DHA с исходной молекулой DHA по силе действия оказались в высшей степени неожиданными.
Так как альфа-этил-DHA (PRB-2) по всей видимости работает посредством связывания с ядерными рецепторами PPARγ и PPARα, соединение не только обладает интересными терапевтическими эффектами на обмен углеводов и жиров не в последнюю очередь у пациентов с резистентностью к инсулину, метаболическим синдромом и диабетов 2-го типа, но также снижает вес и оказывает общее противовоспалительное действие. Напрямую или через влияние на фактры риска соединение альфа-этил-DHA (PRB-2) может предупреждать развитие сердечно-сосудистых заболеваний, таких как инфаркт миокарда и нарушение мозгового кровообращения, а также это соединение может снизить смертность от сердечно-сосудистых заболеваний.
Фармацевтические средства, действующие как лиганды PPARγ, уже присутствуют на фармацевтическом рынке, но даже если эти соединения оказывают положительное влияние на углеводный обмен, им присущи побочные эффекты, такие как повышенный уровень триглицеридов, повышение веса тела и отеки. Представленные в настоящей заявке альфа-замещенные производные DHA оказывают комбинированный эффект на рецепторы PPARγ и PPARα, что, возможно, имеет преимущество для пациентов с резистентностью к инсулину, метаболическим синдромом и диабетом 2-го типа. Кроме того, это комбинированное воздействие влияет на уровень липидов в крови, явления воспаления, атеросклероз и, следовательно, на сердечно-сосудистые заболевания.
Настоящее изобретение не ограничивается показанными вариантами осуществления и примерами.
Источники информации
Simonopoulos АР. Essential fatty in health and chronic disease. Am J ClinNutr 1999; 70 (Suppl):560S-569S.
Geleijnse JM, Giltay EJ, Grobbee DE, et al. Blood pressure response to fish oil supplementation: metaregression analysis of randomized trials. J Hypertension 2002; 20:1493-1499.
Storlien LH, Hulbert AJ, and Else PL. Polyunsaturated fatty acids, membrane function and metabolic diseases such as diabetes and obesity. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 1998; 1 - 559-563.
Jump DB. The biochemistry of n-3 polyunsaturated fatty acids, J Biol Chem 2002; 277 - 8755-8758.
Pawar A and Jump D. Unsaturated fatty acid regulation ofperoxisomes proliferator-activated receptor alfa activity in rat primary hepatocytes. J Biol Chem 2003; 278:35931-35939.
Meigs JB, Wilson PWF, Nathan DM, et al. Prevalence and characteristics of the metabolic syndrome in the San Antonio Heart and Framingham offspring studies. Diabetes 2003; 52:2160-2167.
Storlien LH, KraegenWE, Chisholm DJ, et al. Fish oil prevents insulin resistance induced by high fat feeding in rats. Science 1987; 237:885-888.
Field CJ, Ryan EA, Thomson ABR, et al. Diet fat composition alters membrane phospholipid composition, insulin binding and glucose metabolism in adipocytes from control and diabetic animals. J Biol Chemistry 1990; 265:11143-11150.
Yki-Jarvinen, H. Thiazolidinediones. NEJM 2004; 351:1106-1118. Adams M, Montague CT5 Prins JB, et al. Activators of peroxisomes proliferator- activated receptor gamma have depot-specific effects on human preadipocyte differentiation. J Clin Invest 1997, 100:3149-3153.
Ruzickovaj, Rossmeisl M, Prazak T, et al. Omega-3 PUFA of marine origin limit diet-induced obesity in mice by reducing cellularity of adipose tissue, Lipids 2004; 39: 1177-1185.
Vaagenes H, Madsen L, Dyroy E, et al. The hypolipidaemic effect of EPA is potentiated by 2- and 3-methylation. Biochim Pharmacol 1999; 58:1133-1143.
Larsen L, Granslund L, Holmeide AK, et al. Sulfur-substituted and [alpha]-methylated fatty acids as peroxisome proliferator-activated receptor activators. Lipids 2005, 40:49-57.
Larsen L, Horvik K, Sorensen HIN, et al. Polyunsaturated thia- and oxa-fatty acids: incorporation into cell-lipids and their effects on arachidonic acid- and eikosanoids synthesis. Biochim et Biophys Acta 1997, 1348:346-354.
Larsen, et.al. Biochemical Pharmacology 1998; 55, 405.
Chih-Hao L, Olson P, and Evans RM. Lipid metabolism, metabolic diseases, and peroxisome proliferator-activated receptors. Endocrinology 2003; 144:2201-2207.
Willumsen N, Waagenes H, Holmsen H, et al. On the effect of 2-deuterium- and 2-methyl-eicosapentaenoic acid derivatives on triglycerides, peroxisomal beta-oxidation and platelet aggregation in rats. Biochim Biophys Acta 1998; 1369:193-203.
Mitsunobu O, Synthesis 1981;1.
Ager DJ, Prakash I, and Schaad DR. 1,2-amino alcohols and their heterocyclic derivatives as chiral auxiliaries in asymmetric synthesis Chem Rev 1996; 96:835-876.