СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТЕРОГЕННОСТИ КРОВИ (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR INSTANT DETERMINATION OF BLOOD ATHEROGENICITY (VERSIONS)

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для определения атерогенности крови для ранней диагностики атеросклероза.
Атерогенность крови характеризуется накоплением модифицированных липопротеинов, обладающих иммуногенными свойствами и способствующих гиперагрегации тромбоцитов, и в конечном итоге приводит к возникновению атеросклеротических заболеваний.
Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [1]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность, длительность проведения исследования (более 2 суток).
Задачей изобретения является разработка способа, устраняющего вышеуказанные недостатки, расширение арсенала способов для ранней диагностики атеросклероза для клинико-диагностических лабораторий за счет упрощения технологии и визуальной оценки результатов теста, сокращения времени проведения процедуры (до 10 мин), а также его многократное удешевление.
Эта задача решается тем, что определение атерогенности плазмы крови человека проводят путем обработки ее 10% раствором поливинилпирролидона (ПВП) 12600±2700 при объемном соотношении плазма:среда (1:8), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, и при наличии помутнения в опытной пробе визуально констатируют атерогенность крови.
Среду для определения атерогенности крови готовят растворением 10 г ПВП (относительная молекулярная масса 12600±2700) в 100 мл 0,01М Трис-HCl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Среду добавляют к плазме крови, тщательно перемешивают, инкубируют и определяют помутнение в опытной пробе.
Пример 1. Определение оптимальной концентрации ПВП для выявления атерогенности плазмы крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. К 50 мкл пулированной плазмы крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) добавляют 100-800 мкл 10% раствора ПВП в 0,01М Трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Степень помутнение раствора определяют визуально по сравнению с контрольной пробой и оценивают как слабое помутнение - (+) и сильное - (++++). В качестве контроля используют пробы плазмы крови с соответствующим количеством буфера, не содержащего ПВП, и оценивают как - (-). Полученные результаты приведены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, с увеличением концентрации ПВП в инкубационной системе с 7,1% до 8,9% наблюдается помутнение, обусловленное агрегацией ммЛП, с максимальным помутнением при 8,9% ПВП, т.е. при объемном соотношении плазма:среда (1:8). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 8,9% наблюдается снижение степени агрегации, которое характеризуется уменьшением мутности.
Для подтверждения агрегации ммЛП плазмы крови больных ИБС в 8,9% растворе ПВП нами была исследована пулированная плазма 10 здоровых доноров при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Добавление к пулированной плазме крови здоровых доноров возрастающих концентраций 10% ПВП не приводит к агрегации нормальных липопротеинов низкой и очень низкой плотности.
Пример 2. Определение содержания холестерина, триацилглицерола (ТАГ) и общих белков в ПВП-преципитатах. Для подтверждения наличия ммЛП в ПВП-преципитатах из плазмы крови были проведены следующие эксперименты. Из 0,5 мл пулированной плазмы больных ИБС и контрольных здоровых доноров были приготовлены ПВП-преципитаты в условиях 8,9% ПВП. Преципитат был осажден путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин при 23°С. Супернатант тщательно декантировали, ПВП-преципитат 2 раза отмывали 8,9% раствором ПВП и ресуспендировали в 0,5 мл 0,01М Трис-НС1-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. В полученных ПВП-преципитатах определяли содержание холестерина, ТАГ и общих белков с использованием реактивов фирмы «Диакон» (Россия). Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, в ПВП-преципитате пулированной плазмы больных ИБС содержание холестерина в 12 раз, а ТАГ - в 16 раз больше, чем в ПВП-преципитате из плазмы здоровых доноров. Содержание общего белка в 1,3 раза выше в ПВП-преципитате больных.
Таким образом, наличие холестерина, ТАГ и общего белка в ПВП-преципитатах, приготовленных из пулированной плазмы крови, свидетельствует о липопротеиновой природе агрегатов, образующихся в присутствии 8,9% ПВП. Повышенный уровень ПВП-преципитата, содержащего ммЛП у больных с ИБС, является специфическим маркером атеросклеротического процесса.
Пример 3. Подбор оптимального времени инкубации смеси цельной плазмы крови с ПВП для агрегации ммЛП. К 50 мкл пулированной плазмы крови больных ИБС и здоровых доноров добавляют 400 мкл 10% раствора ПВП в 0,01 М трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10, 20, 30 и 60 мин в прозрачных пробирках. Степень помутнения определяют визуально. В качестве бланка используют пробы плазмы крови с соответствующим количеством 0,01 М Трис-НСl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Полученные результаты приведены в таблице 4.
Как видно из данных, представленных в таблице 4, в пулированной плазме крови больных ИБС агрегация ммЛП протекает в течение 10 минут. В пулированной плазме крови визуально не определяется помутнение в течение 60 мин инкубации.
Таким образом, для выявления повышенного уровня [ммЛП] 10 минутная инкубация является оптимальной для рутинных исследований атерогенности крови экспресс-методом.
2+
2+
405
Пример 4. Определение связывания комплемента морской свинки преципитатами ммЛП из плазмы крови в зависимости от концентрации. К 10-160 мкл раствора ПВП-преципитата (4,3 мг/мл по белку), приготовленного из пулированной плазмы крови больных ИБС и разбавленного в соотношении 1:99 буфером VBS, добавляли 20 мкл раствора, разбавленного 1:19 комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS и инкубировали 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и инкубировали 30 мин при 37°С. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину А супернатанта. Контрольная проба не содержала ПВП-преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:
У (%)=[(X-R)/(H-R)×100],
412
где Н, R и X-величины оптической плотности A в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле:
ССК (%)=100-У
Данные о степени связывания комплемента при разных концентрациях ПВП-преципитата приведены в таблице 5.
Как видно из данных, представленных в таблице 5, ммЛП, преципитированные в растворе 8,9% ПВП, обладают комплемент-связывающей способностью, причем эффект является дозо-зависимым.
Таким образом, определение комплемент-связывающей способности ПВП-преципитата свидетельствует о наличии ммЛП и о специфическом взаимодействии ммЛП с комплементом морской свинки. Определение холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитате при концентрации 8,9%, а также максимальная комплемент-связывающая способность подтверждает оптимальную концентрацию ПВП (8,9%) для специфической агрегации ммЛП из плазмы крови больных с атеросклеротической болезнью.
Пример 5. Влияние ммЛП на агрегацию тромбоцитов. ммЛП были приготовлены в условиях 8,9% ПВП, как описано в примере 2. Для исследования агрегации тромбоцитов получали кровь из краевой вены уха кролика в 3,8% раствор цитрата натрия (9:1 по объему). Центрифугировали кровь при 150 g в течение 10 мин. Супернатант, представляющий собой богатую тромбоцитами плазму (БТП) крови, использовали для анализа агрегации тромбоцитов. Исследования агрегации тромбоцитов проводили по методу Born [2] в модификации O'Brien [3, 4] с графической регистрацией на агрегометре фирмы Crono-Log Co. (США). Принцип метода основан на изменении оптической плотности БТП при добавлении индукторов агрегации. При агрегации суспензия тромбоцитов становится более прозрачной, и за счет падения оптической плотности светопропускание растет. Графически это отображается отклонением кривой от нулевой линии (0% агрегации) до 100% агрегации.
оп
к
оп
к
Ход определения: 0,25 мл ТБП помещали в кювету агрегометра, прогревали до 37°С в течение 1 мин при постоянном перемешивании и выставляли 0% агрегации. В опытную пробу вносили препарат ммЛП, дополнительно инкубировали в течение 4 мин и проводили агрегацию тромбоцитов введением индуктора АДФ (конечная концентрация 1,25 мкМ). Регистрировали агрегацию в течение 5 мин. За 100% агрегации принимали светопропускание пробы, содержащей 0,25 мл плазмы, обедненной тромбоцитами. В качестве параметров агрегации использовали максимальный процент снижения оптической плотности - В (%). Степень агрегации тромбоцитов при действии ммЛП характеризовали величиной В/В, где В и В - изменение светопропускания соответственно богатой тромбоцитами плазмы, содержащей ммЛП, и контрольного образца. Результаты представлены в таблице 5.
Как видно из данных, представленных в таблице 6, предварительное введение ммЛП при конечной концентрации 0,4 мкг/мл вызывает усиление агрегации, в то время как ПВП-преципитат из плазмы крови контрольной группы здоровых доноров практически не оказывает влияния на функцию тромбоцитов.
Таким образом, ПВП-преципитат, приготовленный из плазмы больных ИБС, вызывает гиперагрегацию тромбоцитов кролика.
Пример 6. Определение атерогенности крови у больных ИБС и здоровых доноров. Проведены исследования атерогенности плазмы крови предлагаемым экспресс-способом у 64 больных ИБС и 60 здоровых доноров (контрольная группа). К 50 мкл исследуемой плазме крови добавляли 400 мкл 10% ПВП в 0,01 М трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в прозрачных пробирках. Степень помутнения (атерогенность) определяли визуально по сравнению с контрольной пробой. В качестве контроля использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01 М Трис-НСl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Полученные результаты приведены в таблице 7.
В контрольной группе доноров атерогенность не выявлена ни у одного испытуемого. В то время как у больных ИБС атерогенность выявлена в 53 случаях, что составляет 79% обследованных больных ИБС.
Таким образом, из приведенных выше примеров следует, что:
1. 10 мин инкубация плазмы крови в 8,9% растворе ПВП обеспечивает полную преципитацию ммЛП;
2. В присутствии 8,9% ПВП из плазмы крови больных с ИБС преципитируют ммЛП, в то время как у здоровых доноров не наблюдается преципитация нативных ЛП;
3. Атерогенность ммЛП подтверждается двумя независимыми тестами (ммЛП способны связывать и активировать систему комплемента и вызывать гиперагрегацию тромбоцитов кролика);
Предлагаемый способ отличается простотой, включает всего 2 операции: смешивание плазмы крови с раствором ПВП и визуальную регистрацию мутности. Для приготовления среды необходимы широко распространенные реактивы: ПВП, NaCl и трис-HCl. Способ позволяет регистрировать наличие ммЛП непосредственно в плазме без предварительного ее фракционирования. Использование простого и быстрого в осуществлении способа определения атерогенности крови позволяет проводить скрининг и выявлять людей с предрасположенностью к атеросклерозу на доклинических стадиях заболевания. Дальнейшие углубленные исследования таких пациентов позволят установить индивидуальную причину атерогенности крови и проводить этиотропную терапию на доклинической стадии атеросклероза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann. Med. - 1989. - V.21(6). - P.455-459.
2. Born G.V. Aggregation of bkood platelets by ADP and its reversal // Nature. - 1962. - V.194. - P.927-929.
3. O'Brien J.R. Platelet aggregation: Part I Some effect of the adenosine phosphates, thrombin, and cocaine upon platelet adehesiveness // J.Clin. Path. - 1962. - V.15, №5. - P.446-452.
4. O'Brien J.R. Platelet aggregation: Part II Some resalts from a new method of study // J. Clin. Path. - 1962. - V.15, №5. - P.452-455.
Таблица 1
Влияние ПВП на агрегацию множественно модифицированных липопротеинов (ммЛП) в пулированной плазме крови больных ИБС
№
Серии экспер.
Сыв., мкл
ПВП, 10%, мкл
0,9% NaCl
% ПВП в системе
Помутнение Раствора (Атерогенность)
1
Опыт
50
100
-
6,7%
(-)
Бланк
50
-
100
0%
(-)
2
Опыт
50
125
-
7,1%
(+)
Бланк
50
-
125
0%
(-)
3
Опыт
50
150
-
7,5%
(++)
Бланк
50
-
150
0%
(-)
4
Опыт
50
175
-
8,0%
(++)
Бланк
50
-
175
0%
(-)
5
Опыт
50
200
-
8,6%
(+++)
Бланк
50
-
200
0%
(-)
6
Опыт
50
400
-
8,9%
(++++)
Бланк
50
-
400
0%
(-)
7
Опыт
50
800
-
9,4%
(++)
Бланк
50
-
800
0%
(-)
Таблица 2
Влияние ПВП на агрегацию нативных липопротеинов в пулированной плазме крови здоровых доноров
№
Серии экспер.
Сыв., мкл
ПВП, 10%, мкл
0,9% NaCl
%ПВП в системе
Помутнение раствора (Атерогенность)
1
Опыт
50
100
-
6,7%
(-)
Бланк
50
-
100
0%
(-)
2
Опыт
50
125
-
7,1%
(-)
Бланк
50
-
125
0%
(-)
3
Опыт
50
150
-
7,5%
(-)
Бланк
50
-
150
0%
(-)
4
Опыт
50
175
-
8,0%
(-)
Бланк
50
-
175
0%
(-)
5
Опыт
50
200
-
8,6%
(-)
Бланк
50
-
200
0%
(-)
6
Опыт
50
400
-
8,9%
(-)
Бланк
50
-
400
0%
(-)
7
Опыт
50
800
-
9,4%
(-)
Бланк
50
-
800
0%
(-)
Таблица 3
Содержание холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитатах приготовленных из плазмы крови больных ИБС и здоровых доноров
Холестерин, мг/дл
ТАГ, мкМ/л
Белок, мг/мл
ПВП-преципитат из сыворотки больных ИБС
4,6
117
4,3
5,1
117
4,5
5,2
116
4,2
М±m
4,97±0,32
116,7±0,6
4,3±0,2
ПВП-преципитат из сыворотки доноров
0,5
7
3,4
0,3
10
2,9
0,4
5
3,2
М±m
0,4±0,1
7,3±2,5
3,2±0,3
Таблица 4
Влияние времени инкубации сыворотки с 8,9% ПВП на агрегацию ммЛП в пулированной плазме крови больных ИБС
Время инкубации, мин
10
20
30
60
[ммЛП] в пулированной плазме крови больных ИБС
(+++)
(+++)
(+++)
(+++)
[ммЛП] в пулированной плазме крови доноров
(-)
(-)
(-)
(-)
Таблица 5
Степень связывания комплемента ммЛП в ПВП-преципитате в зависимости от концентрации
[ммЛП], мкл
0
10
20
40
80
160
ССК, %
0
27
57
83
97
100
Таблица 6
Влияние ммЛП на агрегацию тромбоцитов (индуктор АДФ, 1,25 мкМ/л)
Пробы
В, %
B<sub>оп</sub>/B<sub>контр</sub>
Контроль
22
1,0
Опыт (0,4 мкг/мл ммЛП, ПВП-прец. из пул. сыворотки больных ИБС)
36
1,64
Опыт (0,4 мкг/мл ПВП-прец. из пул. сыворотки контрольных доноров)
21
0,95
Таблица 7
Атерогенность (ммЛП) крови больных ИБС и здоровых доноров по результатам экспресс-анализа
Количество обследованных, n
ммЛП
ммЛП
(+++)
(-)
n (%)
n (%)
Плазма крови больных ИБС
64
53 (79%)
11 (21%)
Плазма контрольной группы доноров
60
0
60 (100%)