Количественное определение соединения РУ-1205 в биологических пробах

Л. А. Смирнова, А. И. Ращенко, А. Ф. Рябуха, К. А. Кузнецов, Е. А. Сучков

Волгоградский государственный медицинский университет,

кафедра фармакологии, лаборатория фармакокинетики НИИ фармакологии ВолгГМУ

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ РУ-1205 В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБАХ

УДК 615.3:616-073

Разработан метод количественного определения нового биологически активного соединения производного бензимидазола РУ-1205 с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Были определены чувствительность метода, время удерживания вещества, максимум поглощения соединения в ультрафиолетовом спектре, а также произведен выбор экстрагента вещества из биологических проб.

Ключевые слова: ВЭЖХ, количественное определение, бензимидазол.

L. A. Smirnova, A. I. Raschenko, A. F. Riabuha, K. A. Kuznecov, E. A. Suchkov ASSAY OF COMPOUND RU-1205 IN BIOLOGICAL SAMPLES

We developed a method for chromatographic assay of a new biologically active compound, a benzimidazole derivative, RU-1205 using high performance liquid chromatography (HPLC). Sensitivity, time of substance retention, maximal absorption of the compound in the UV spectrum were determined. We also performed a selection of an extracting agent from biological samples.

Key words: HPLC, assay, benzimidazole.

Фармакокинетические показатели имеют большое значение при изучении новых высокоактивных соединений, так как они определяют тактику разработки лекарственных форм и изучение фармакоди-намики данных веществ [3]. Актуальной задачей является создание новых эффективных опиоидных анальгетиков, с отсутствующими серьезными побочными эффектами [4]. В данной области каппа-селективные агонисты представляют одну из наиболее перспективных групп соединений для создания новых отечественных препаратов [2]. Результаты предварительных исследований показывают, что производные бензимидазола могут считаться потенциальными обезболивающими средствами с каппа-опиоидной активностью [1].

В ходе настоящего исследования разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с диодноматричным детектированием для проведения фармакокинетических исследований соединения РУ-1205, позволяющий определять изучаемое вещество в биологическом материале.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработка метода количественного определения производного бензимидазола соединения РУ-1205 с использованием ВЭЖХ.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовался жидкостной хроматограф (Shimadzu, Япония). Определение соеди-

нения РУ-1205 осуществлялось при помощи ди-одноматричного ультрафиолетового детектора при длине волны 205 нм, на колонке SUPELCOSIL LC-18 (5 мкм; 100 х 4,6 мм). Мобильная фаза включала ацетонитрил (УФ210) (Россия) и буферную систему, состоящую из однозамещенного фосфата калия 50 тМоль.

В качестве модификаторов мобильной фазы рассматривались следующие соединения: гептан-сульфоновая кислота, тетрагидрофуран, триэтила-мин и додецилсульфат в различных процентных концентрациях.

Извлечение соединения РУ-1205 из биологического материала осуществлялось ацетонитрилом в соотношении 1:1.

Для количественного определения вещества применялся метод абсолютной калибровки. Зависимость площадей пиков от концентрации РУ-1205 анализировалась методом регрессионного анализа. Статистическая обработка результатов проводилась при помощи компьютерной программы Ехе1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При разработке метода использовались буферные системы с диапазоном рН от 2,5 до 7,0. При отклонении рН в кислую сторону было отмечено снижение времени удерживания вещества на хроматографической колонке. При рН = 3,0 время удерживания составило 3,5—4,0 мин. Значе-

ния рН выше 5,5—6 вызывали увеличение времени удерживания и снижение стабильности определения.

Температурный режим подбирался в диапазоне 30—75 оС. Уменьшение температуры приводило к резкому снижению чувствительности. В диапазоне 60—75 оС не выявлено значительных колебаний, соответственно окончательный выбор остановлен на значении 60 оС.

Соотношения водной и органической фаз: 30 % : 70 % v/v; 35 % : 65 % v/v; 40 % : 60 % v/v; 50 % : 50 % v/v и 55 % : 45 % v/v соответственно. Увеличение процента водной фазы приводило к значительному увеличению времени удерживания и снижению чувствительности. Увеличение доли органической фазы свыше 60 % вызывало уменьшение времени удерживания до 3—5 мин, неоправданно увеличивая риск интерференции эндогенными пиками биоматериала.

Модификаторы мобильной фазы не оказали положительного влияния на количественное определение соединения. Так, например, применение додецилсульфата приводило к резкому снижению высоты пика и увеличению его основания. При добавлении тетрагидрофурана происходило значительное снижение времени удерживания.

При разработке метода извлечения соединения РУ-1205 из биологического материала в качестве возможных экстрагентов рассматривались спирт этиловый, ацетонитрил, смесь спирт этиловый : ацетонит-рил в соотношении 1 : 1, а также спирт этиловый, подкисленный 0,1н соляной кислотой.

Образцы встряхивались в течение десяти минут в ультразвуковой ванне для преципитации белков и центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин на центрифуге Eppendorf, после чего надосадочная жидкость отбиралась и вводилась в инжектор с объемом петли 20 мкл.

В результате в качестве экстрагента был выбран ацетонитрил, обеспечивающий достаточную степень экстракции и удовлетворительную очистку пробы. Степень экстракции соединения РУ-1205 составила не менее 90 %.

Таким образом, оптимальными условиями количественного определения субстанции РУ-1205 являются следующие: буферная система, состоящая из 50 мМ однозамещенного фосфата калия, рН = 5; соотношение водной и органической фазы 50 % : 50 % v/v; температурный режим 60 оС; длина волны детекции 205 нм; скорость потока 1 мл/мин. При данных условиях время удерживания составило 8—8,5 мин (рис. 1, 2).

Количественное определение проводилось в диапазоне концентраций от 0,5 до 25 мкг/мл. В результате было установлено, что калибровочные кривые носят линейный характер, с коэффициентом регрессии (R2) равным 0,998 (рис. 3).

Были определены внутридневные процентные колебания (повторяемость метода), которые не превышали 20 % в изучаемых диапазонах концентраций. Междневные процентные колебания (воспроизводимость метода) для изучаемого соединения не превышали в основном 15 % (табл.).

При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения водных растворов соединения при комнатной температуре, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность изучаемого вещества.

Рис. 1. Хроматограмма соединения РУ-1205 в водном растворе

Рис. 2. Хроматограмма соединения РУ-1205 в биологическом материале

с, мкг/мл

Рис. 3. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации вещества РУ-1205

Чувствительность метода для изучаемого соединения составляет 1 мкг/мл. Средняя ошибка измерения не превышает 15 %.

Показатели воспроизводимости и повторяемости метода

количественного определения соединения РУ-1205 в диапазоне линейной зависимости площади хроматографического пика от концентрации растворов

Концентрация, мкг/мл Внутридневные колебания концентрации, мкг/мл Повторяемость, + А % Воспроизводимость (средняя ошибка измерения), %

день 1 день 2 день 3 день 1 день 2 день 3

0,5 0,89 ± 0,07 0,81 ± 0,08 1,06 ± 0,08 77,42 62,98 111,36 83,92

1 1,20 ± 0,06 1,18 ± 0,24 1,24 ± 0,12 20,4 18,04 24,31 20,91667

5 4,24 ± 0,51 4,25 ± 0,53 3,91 ± 0,21 -15,27 -14,99 -21,73 17,33

25 25,13 ± 6,24 21,6 ± 3,51 30,05 ± 5,10 0,54 -13,41 20,19 2,44

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований разработан хроматографический метод количественного определения соединения РУ-1205, обладающий достаточной чувствительностью и селективностью. Чувствительность метода составляет 1 мкг/мл, воспроизводимость 15 %.

Таким образом, разработанный метод количественного определения является высокоселективным и высокочувствительным, что позволяет эффективно использовать его для проведения

фармакокинетических исследований соединения РУ-1205.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гречко О. Ю, Васильев П. М., Черников М. В. и др. // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Т. 7. — С. 1666.

2. Спасов А. А., Гречко О. Ю, Васильев П. М. и др. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. — 2011. — № 8. — С. 52—57.

3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Хаб-риев Р. У. — М., 2005. - С. 217—229.

4. Kivell B., Prisinzano T. E. // Psychopharm. — 2010. — Vol. 210. — P. 109—119.

О. Ю. Гречко, Н. В. Елисеева, Д. М. Чикун, А. А. Спасов, В. А. Анисимова

Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии

ИЗУЧЕНИЕ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО БЕНЗИМИДАЗОЛА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПУТЯХ ВВЕДЕНИЯ

УДК 615.212.7:616-092.9

Выполнены экспериментальные исследования по изучению эффективности соединения под лабораторным шифром РУ-1203, проявляющего каппа-агонистическую активность, при различных путях введения. Установлено, что соединение РУ-1203 проявляет наибольшую анальгетическую эффективность при внутривенном введении, а также обладает активностью при пероральном применении в отличие от препарата сравнения буторфанола.

Ключевые слова: каппа-опиоидный рецептор, агонист, опиоидные анальгетики.

O. Y. Grechko, N. V. Eliseeva, D. M. Chikun, A. A. Spasov, V. A. Anisimova

A STUDY OF ANALGESIC ACTIVITY OF NEW BENZIMIDAZOLE DERIVATIVES WITH DIFFERENT ROUTES OF ADMINISTRATION

We studied the efficacy of RU-1203 compound exhibiting kappa-agonist activity with different routes of administration. It is established that the compound RU-1203 shows the greatest analgesic efficacy when administered intravenously; it is also active when administered orally, in contrast to butorphanol, the reference drug.

Key words: kappa-opioid receptor, agonist, opioid analgesics.

Арсенал анальгетических средств в настоящее время достаточно многообразен, среди которых максимальное обезболивание обеспечивают опиоидные анальгетики, которые по-прежнему остаются препара-

тами первого выбора при сильных болевых синдромах, связанных с травмой, хирургическими операциями, злокачественными новообразованиями и инфарктом миокарда [4, 9]. Однако выраженные побочные явления