Применение метода кругового дихроизма для изучения хиральности лекарственных препаратов

Є

СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Применение метода кругового дихроизма для изучения хиральности лекарственных препаратов

Г. Н. ГИЛЬДЕЕВА, И. Г. СМИРНОВА

Первый московский государственый медицинский университет им. И. М. Сеченова, Москва Московский государственный университет, химический факультет, Москва

Circular Dichroism in Study of Drug Chirality

G. N. GILDEEVA, I. G. SMIRNOVA

I. M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow

Методом кругового дихроизма (КД) изучены субстанции верапамила и препараты верапамила фармацевтических фирм. Показано, что метод КД является быстрым и высокоэффективным методом определения оптических изомеров и может быть рекомендован, как метод контроля качества лекарственных средств.

Ключевые слова: круговой дихроизм, УФ-спектроскопия, хиральность, оптическая изомерия.

Verapamyl substance and market verapamyl were investigated with circular dichroism. It was shown that circular dichroism provided rapid and highly efficient determination of the optic isomers and could be recommended as a method for control of drug quality.

Key words: circular dichroism, UV spectroscopy, chirality, optical isomerism.

В основе всех биологических процессов, их взаимообусловленности, высокой эффективности и строгой избирательности лежит тонкое структурное соответствие взаимодействующих молекул, определяемое, прежде всего, спецификой пространственной организации молекул.

Стереоспецифичность свойственна большинству биомолекул — это характерная особенность молекулярной логики живыгх клеток.

Конформация органических биомолекул играет исключительно важную роль во многих биохимических процессах, в частности при взаимодействии каталитических центров ферментов с субстратами. Для обеспечения нормальных биологических функций молекулы фермента и субстрата должны быть комплементарны, то есть их структуры должны стерически точно соответствовать друг другу. Строгая комплементарность необходима и для связывания молекулы гормона с его рецептором на поверхности клетки, и для репликации ДНК, и многих других процессов протекающих в клетке [1]. У большинства лекарственных препаратов также существует тесная взаимосвязь между пространственной структурой и фармакологической активностью, то есть стереоспецифичность действия [2, 3].

© Г. Н. Гильдеева, И. Г. Смирнова, 2011

Адрес для корреспонденции: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2. Московский государственый медицинский университет им. И. М. Сеченова

Многие синтетические лекарственные препараты существуют в виде двух или нескольких пространственных изомеров. Фармакологическая активность рацемических лекарственных препаратов обычно связана с действием лишь одного энантиомера [4]. Второй или обладает менее выраженной активностью, или совсем не активен, или проявляет другие фармакологические эффекты. Известны примеры использования в терапевтической практике рацемических препаратов, когда один из стереоизомеров обладал сильным токсическим эффектом, что приводило к трагическим случаям. Например, левовращающий изомер препарата талидомида является мощным транквилизатором, а присутствующий в смеси в равных количествах правовращающий изомер обладает тератогенным действием, то есть приводит к появлению уродств у новорождённых. В некоторых случаях количественные различия в биологической активности двух энантиомеров одного и того же соединения выражены очень сильно. Например, Б-изомер изопротеренола — лекарственного препарата, применяемого при лёгких приступах астмы, действует как бронхорасширяющее средство в 50—70 раз активнее, чем Ь-изомер [1]. Распознавание стереоизомеров вводимого в организм вещества может осуществляться на разных стадиях: при связывании с ферментами и рецепторами, при транспортировке

О

e

через мембраны, в процессах поглощения в клетках и распределения между тканями. Все эти процессы изучает фармакокинетика [4].

Выявление фармакокинетических особенностей отдельных изомеров открывает перспективное направление совершенствования уже известных лекарственных средств. Лишь 15% синтетических препаратов, находящихся на европейских рынках, производится в виде отдельных стереоизомеров, остальные 85% представляют собой смеси изомеров [5]. В то же время современные методы позволяют получать в чистом виде отдельные изомеры и выбирать из них те, которые обладают наиболее выраженными эффектами и (или) наименьшей токсичностью [3, 6].

В настоящее время для изучения веществ, обладающих хиральностью, широко используются методы спектрополяриметрии: дисперсия оптического вращения (ДОВ) и круговой дихроизм (КД) [7]. С помощью этих методов измеряют в зависимости от длины волны способность оптически активного хромофора вращать плоскополяри-зованный свет (ДОВ) и по-разному поглощать поляризованный по кругу вправо и влево свет (КД). В основе ДОВ и КД лежат одни и те же физические законы, и фактически оба эти метода представляют собой просто два разных способа изучения одного и того же явления: взаимодействия поляризованного света с оптически активными молекулами [8].

С помощью метода кругового дихроизма (КД) можно дифференцировать вклады в суммарную оптическую активность отдельных полос поглощения изучаемых изомеров. Экспериментальные спектры КД визуально сравнивают с реперными спектрами КД, полученными для гипотетических структур ЬиБ конфигураций. Таким образом, получают качественную и количественную картину состава изучаемой субстанции. Большим преимуществом метода КД является его высокая чувствительность. Для анализа в отдельных случаях можно ограничиться сотыми долями миллиграмма субстанции.

Материал и методы

Приготовление проб. Необходимым условием получения качественных спектров КД является индивидуальность и высокая чистота препарата, поэтому перед приготовлением рабочих растворов, вещества должны быть тщательно очищены и охарактеризованы (Тпл, бумажная и тонкослойная хроматография).

Концентрация растворов должна быть такой, чтобы оптическая плотность (А) при длине волны максимума поглощения в кварцевой кювете составляла 1,2±0,2. Если величина КД будет в некоторых участках спектра очень мала, можно повысить концентрацию, следя, однако, за тем, чтобы величина пропускания (Т) не принимала значения меньше, чем 20% (2-1§ Т= А). Растворы должны быть прозрачными. При наличии осадка, пылинок, волосков хроматографической бумаги растворы требуется отфильтровать через мелкопористый фильтр или отцентрифугировать.

Измерение КД. Кривые КД регистрировали на автоматическом дихрографе фирмы Yobin Yvon Mark (Франция), модернизированном во ВНИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Ввод данных и обработку спектров осуществляли с использованием программы RDA. Программа позволяет работать в режиме накопления. Дихрограф управляется компьютером. Интервал длин волн от 210 до 320 нм., шкала чувствительности 1х10-5 (это соответствует 10-5 единицам оптической плотности КД в 1 мм), развертка спектра 10 мм/см или 5 мм/см, постоянная времени 2 или 4. Используют 1 см кварцевую кювету, специально предназначенную для измерения КД. Кювету тщательно промывают водой, перегнанным этиловым спиртом (или ацетоном спектральной чистоты) и высушивают, поместив в горлышко кюветы полиэтиленовый капилляр, подсоединённый к вакууму (нельзя сушить током воздуха!). Оптических поверхностей кюветы нельзя касаться, их промывают спиртом и аккуратно протирают тканью для линз. При различных измерениях положение кюветы в кюветном отделении должно быть всегда одинаковым. Температура измерений — комнатная. В начале работы в кювету помещают растворитель и прописывают нулевую линию. Затем снимают кривые КД приготовленных препаратов.

Представление результатов измерения КД. На экспериментальных кривых КД отмечают линию фона по растворителю и через каждые 5 нм (в районе экстремумов через 2 нм) рассчитывают циркулярно-дихроичное поглощение (А£ = £j — £r = ДА х C х 1, где:

ДА — оптическая плотность кругового дихроизма (показания прибора с учётом чувствительности);

С — молекулярная концентрация раствора;

1 — длина оптического пути, см.

Затем строят кривые КД. Кривые КД можно представить в виде зависимости эллиптичности ([0] ) от длины волны, учитывая, что [0] = 3300 х Д£.

Рекомендуется дать таблицу, в которой будут указаны длины волн, отвечающие положительным и отрицательным максимумам КД, и величины этих максимумов, а также длины волн, отвечающие точкам нулевого перехода. При представлении результатов обязательно указывается растворитель, концентрация вещества и максимум его поглощения в УФ, длина оптического пути, температура и чувствительность измерений.

Далее сравнивают визуально экспериментальный спектр КД с реперными спектрами КД, полученными для гипотетических структур L и D конфигурации, и рассчитывают содержание этих структур в исследуемом образце.

Исходные вещества. В работе использовали субстанции № 1 (серия № 331204904 В); № 2 (серия № 067210816 А); № 3 (серия № 0400092), полученные из института клинической фармакологии НЦ ЭСМП МЗРФ, образцы препаратов вера-памил (Республика Македония, 1 драже содержит 80 мг верапамила хлоргидрата), верапамил (Химико-фармацевтический комбинат «Акрихин»), верапамил (Щелковский витаминный завод), приобретённых в аптеках.

Из всех изученных образцов были приготовлены растворы одинаковой концентрации для дальнейшего исследования их методами УФ-спектроскопии и кругового дихроизма. Концентрация растворов подбиралась таким образом, что оптическая плотность при длине волны 275 нм (максимум поглощения молекулы верапамила) составила ~ 1,0±0,2.

УФ-спектры (рис. 1) снимали на автоматическом спектрофотометре фирмы «Hitachi» (Япония) в интервале длин волн 200—400 нм. Для измерения использовали 1 см кварцевые кюветы. КД спектры (рис. 2) снимали на автоматическом дихрографе фирмы Yobin Yvon Mark (Франция) интервал длин волн 220—400 нм, шкала чувствительности 1х10-5. Для измерений использовали кварцевые кюветы, специально предназначенные для измерения КД.

Є

СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Рис. 1. Уф-спектры: 1, 2, 3 — субстанции верапамила; 4, 5 — препараты верапамила фармацевтических фирм.

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма.

Результаты и обсуждение

Анализ полученных данных УФ-спектроско-пии и кругового дихроизма (рис. 1, 2) показал, что на кривых кругового дихроизма всех исследуемых субстанций и образцов верапамила отсутствуют эффекты Коттона в области поглощения хромофора верапамила при длине волны 275 нм. Таким образом, все исследованные образцы оптически не активны т. е. представляют собой рацематы.

Для наглядности приведены спектры кругового дихроизма оптически активной R+ формы верапамила, на которых четко виден эффект Коттона (максимум на кривой) при длине волны 275 нм.

ЛИТЕРАТУРА

1. Lehninger A., Cox N. Principles of Biochemistry, World Publishers, New York, 1993; 58—67.

2. Голиков С. H., Кузнецов С. Г., Зацепин Э. П. Стереоспифичность действия лекарственных веществ. Л.: 1973.

3. Williams K., Lee E. Importance of drug enantiomers in clinical pharmacology. Drugs 1985; 30: 333—354.

4. Алексеев В. В. Оптическая изомерия и фармакологическая активность лекарственных препаратов. Соросовский образовательный жури 1998; 1: 49—55.

Заключение

1. Показано, что метод кругового дихроизма является быстрым и высокоэффективным методом определения оптических изомеров биологически активных веществ (на примере верапамила).

2. Метод кругового дихроизма может быть рекомендован как метод контроля качества воспроизводимых препаратов на всех этапах их обращения, включая текущий контроль терапевтической активности.

5. Яницкий П. К., Реверский В., Гумулка В. Новости фармации мед 1991; 4/5: 98—104.

6. Дунина В. В., Белецкая И. П. Гомогенный катализ оптически активными комплексами переходных металлов и его применение в синтезе биологически активных молекул. Жури орган хим 1992; 28: 1929—2000.

7. Adler A. I., Greenfield N. I., Fasman G. D. Circular dichroism and optical rotatory dispersion of proteins and polypeptides. Methods in Enzymology, vol. 27D / edited С H. W. Hirs, S. N. Timasheff. 1973; 675—735.

8. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия, М.: 1984; 2: 63—77.

9. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. М.: 1980.

-Є

---- R + верапамил

0 0 0 Верапамил 6 • • • Верапамил 5

---- Верапамил 4

---- Верапамил3

---- Верапамил2

Верапамил 1  S-верапамил