ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА-ТРИС-(2-ГИДРОКСИЭТИЛ)АМИНА С БИС-(2-МЕТИЛФЕНОКСИАЦЕТАТОМ) ЦИНКА (ЦИНКАТРАНА) ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ МАТРИЧНОЙ РНК ТРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ
USING ZINC COMPLEX-TRIS-(2-HYDROXYETHYL)AMINE WITH BIS-(2-METHYLPHENOXYACETATE) (ZINCATRANE) FOR STIMULATING EXPRESSION OF MATRIX RNA OF TRYPTOPHANYL-tRNA-SYNTHETASE

Изобретение относится к биохимии, фармакологии, биологии, медицине и может быть использовано, например, для контроля ангиогенеза при создании лекарственных препаратов противосклеротического действия.
Последние данные по молекулярному механизму атерогенеза через развитие местного воспалительного процесса и экспрессии цитокинов и белковых факторов в атеросклеротических бляшках свидетельствуют, что существует определенный баланс между провоспалительными и антивоспалительными цитокинами и этот баланс критичен для развития повреждения. В этом плане особое внимание привлекают белковые и ферментные системы, действующие по механизму стимуляции и торможения атерогенеза. Это, в частности, аминоацил-тРНК-синтетазы (АРСазы). Установлено мощное про- и антиангиогенное действие пары: тирозил-тРНК-синтетаза и триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРСазы) (Wakasugi К., Slike B.M., Hood J., Otani A., Ewalt K.L., Friedlander M., Cheresh D.A., Schimmel P. A human ami-noacyl-tRNA synthetase as a regulator of angiogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, v.99(1), p.173-177). Причем важной представляется роль ТРСазы не только в связи с ее антиангиогенной и антиатерогенной активностью (через прорастание «сосудов в сосудах») и способностью подавлять так называемый «shia stress» повреждения в местах разветвления сосудов (Tzima E., Reader J.S., Irani-Tehrani M., Ewalt K.L., Schwartz M.A. Schimmel P. Biologically active fragment of a human tRNA synthetase inhibits fluid shear stress-activated responses of endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003, v.100(25), p.14903-14907), но и в связи с участием в синтезе регуляторов функций сердечно-сосудистой системы (ССС) - диаденозинполифосфатов (Kisselev L.L., Justesenc J., Wolfson A.V., Frolova L. Yu. Diadenosine oligo-phosphates (ApnA), a novel class of signalling molecules? // FEBS Letters, 1998, v.427, N2, p.157-163).
Известно, что стимулирующее воздействие на экспрессию гена триптофанил-тРНК-синтетазы человека могут оказывать форболовые эфиры (Биохимия, 2003, т.68, №4, с.592-597) и эритропоэтин (Smith K.J., Bleyer A.J., Little W.C., Sane D.C. The cardiovascular effects of erythropoietin.// Cardio-vasc Res. 2003, v.59(3), p.538-548).
Однако эти активирующие воздействия имеют свою специфику. В первом случае - узкоспецифический эффект по стимуляции возможных защитных реакций организма на воздействия онкостимулирующего препарата - форболовых эфиров (для создания моделей животных с опухолями), во втором - общий пролиферативный анаболический эффект.
Наиболее близким по воздействию и выбранный нами за прототип является трекрезан, который воздействует на экспрессию аминоацил-тРНК-синтетаз и может быть использовано с лечебными или диагностическими целями (Патент RU №2429836, МПК A61K 31/205 от 27.09.2011). Ввиду того, что перечень такого рода препаратов единичен, возникает необходимость поиска новых, более эффективных средств аналогичного назначения.
Задача настоящего исследования состоит в использовании известного вещества, обладающего свойством стимулировать экспрессию аминоацил-тРНК-синтетаз, для повышения эффективности средств для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов.
2
2
3
2
6
4
3
2
Для решения этой задачи нами предлагается использовать биологически активное соединение: комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [цинкатран или цитримин] формулы (HOCHCH)N·Zn(OOCCHOCHCH-2) синтезированный ранее (Воронков М.Г., Адамович С.Н., Мирсков Р.Г., Мирскова А.Н. Синтез новых биологически активных O-гидрометаллоатранов (ЖОХ, 2009, т.79, №1, С.162-163).
Известна возможность применения цинкатрана в качестве антидота при отравлении алкоголем (Патент RU №2418580, МПК А61К 31/133 от 20.05.2011).
Заявляемая биологическая активность цинкатрана в качестве средства, обладающего свойством стимулировать экспрессию аминоацил-тРНК-синтетаз, не была известна и в литературе не описана.
3
6
4
2
2
2
3
-
+
В качестве ближайшего аналога выбран трекрезан, имеющий формулу: [2-CHCHOCHCOO][NH(CHCHOH)] (Патент RU №2429836 МПК A61K 31/205 от 27.09.2011).
Приведенные формулы указывают как на сходство трекрезана и цинкатрана, что позволяет отнести их к одной группе - протатранов, так и на различие их, которое определяется наличием катиона цинка в молекуле цинкатрана.
Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующим примером.
Пример 1
Эксперименты проводят «in vitro» для установления стимулирующего эффекта цинкатрана на экспрессию аминоацил-тРНК-синтетаз.
Эффекты цинкатрана изучают на культуре мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека.
Схема опыта включает следующие этапы:
1) получение МНПК;
2) культивирование МНПК в присутствии цинкатрана в различных концентрациях;
3) экспресс-выделение через определенные промежутки времени препаратов суммарной РНК;
4) синтез на матрице РНК кДНК;
5) количественное определение специфической мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы методом РТ-ПЦР.
1. Получение мононуклеарных клеток. Периферическую кровь из локтевой вены в объеме 10 мл берут в стерильных условиях в пробирку, содержащую гепарин, в конечной концентрации 25 ед в 1 мл крови. Затем кровь стерильно переносят в пластиковую пробирку объемом около 50 мл. Туда же добавляют 10 мл стерильного PBS буфера. Разбавленную кровь аккуратно наслаивают на 3-5 мл градиента фиколл-уротраст в центрифужной пробирке. Соотношение объемов градиент - плазмы выдерживают в пределах 1:2-1:4.
6
Пробирки центрифугируют в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорением 200 g (1500-1800 об/мин) при температуре 20°С. В процессе центрифугирования эритроциты и гранулоциты "проваливаются" в градиент и оседают на дно пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее из мононуклеарных клеток. Супернатант представлен плазмой. Последовательность фракций крови в градиенте: плазма - тромбоциты - мононуклеарные клетки - фиколл - эритроциты (на дне). Плазму удаляют. Остаток фиколла с эритроцитами удаляют. Осторожно собирают клетки интерфазы (слой между плазмой - вверху и собственно фиколлом и осадком - внизу) пипеткой в пробирку с небольшим объемом среды, ресуспендируют. Заполняют пробирку PBS, центрифугируют при 800 или 1000 об/мин в течение 8-10 мин. Отсасывают и удаляют надосадок, ресуспендируют осадок в среде или PBS, заполняют пробирку PBS, повторно центрифугируют 800 (1000) об/мин в течение 8-10 мин. Удаляют надосадок, осадок ресуспендируют в среде и приступают к подсчету клеток. После подсчета готовят рабочую концентрацию мононуклеарных клеток, содержащую 2×10 клеток в 1 мл.
2. Культивирование клеток. Культивирование проводят в полной культуральной среде: RPMI-1640, 0,01 М HEPES, 10% фетальной бычьей сывороткой (Sigma) 200 мМ L-глутамина, 100 мг/мл гентамицина. Раствор цинкатрана фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкМ и вносят в культуру мононуклеаров в конечной концентрации 5 мкг/мл (оптимальную дозу определяют предварительно).
Контрольные пробы инкубируют с полной культуральной средой без цинкатрана. Оптимальное время подбирают экспериментально, отбирая для анализа из отдельных лунок планшеты аликвоты клеток через 1, 2, 3, 4, 6, 12 и 24 часа. Основные этапы выделения и культивирования МНПК проводят, как описано в работах [Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л. Ранняя активация лимфоцитов и моноцитов периферической крови человека компонентами проеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens // Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, №3, С.45-48; Nair M.P., Mahajan S., Reynolds J.L., et al. The Flavonoid Quercetin Inhibits Proinflammatory Cytokine (Tumor Necrosis Factor Alpha) Gene Expression in Normal Peripheral Blood Mononuclear Cells via Modulation of the NF-β System // Clinical and Vaccine Immunology, 2006, Vol.13, No.3, p.319-328].
Концентрацию цинкатрана в культуральной среде и время инкубации подбирают в отдельной серии опытов.
6
3. Экспресс выделение суммарных препаратов РНК. Для выделения суммарных препаратов РНК из аликвот культуры МНПК используют набор фирмы «Силекс-М» «YellowSolve» и процедуру выделения осуществляют по рекомендуемому протоколу фирмы с учетом специфики экспериментов и поставленных задач. Для выделения суммарной РНК отбирают приблизительно 10 клеток из 12-луночной культуральной планшеты. Суспензию клеток (1-10 млн) гомогенизируют в 1 мл лизирующего раствора Yellow Solve до полного исчезновения комочков клеточного материала. Объем пробы не превышает 10% от объема лизирующего раствора YellowSolve (т.е. не более 0,1 мл пробы на 1 мл YellowSolve). Для удаления возможных примесей внеклеточного материала, полисахаридов и т.д., лизат центрифугируют при 10-15 тысяч об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант отбирают в стерильную пробирку. Добавляют к супернатанту 0,1 мл хлороформа, энергично перемешивают смесь на вортексе и оставляют на столе на 20 минут, встряхивая пробирку примерно каждые 5 минут. При стоянии содержимое пробирки расслаивается на две фазы. Если расслоения не произошло, добавляют еще 0,1 мл хлороформа и повторяют процедуру. Пробирку центрифугируют при 10-15 тысяч об/мин в течение 5 мин. По окончании центрифугирования в пробирке образуются два слоя жидкости. Переносят верхний, содержащий РНК слой жидкости в чистую пробирку, стараясь не захватить белую белковую интерфазу, если таковая присутствует. Нижний слой жидкости, содержащий фенол, удаляют. К отобранному верхнему слою добавляют равный объем депротеинизирующего раствора GreenClean и энергично встряхивают смесь на вортексе 2-3 минуты, после чего центрифугируют, как описано выше. Отбирают верхний, содержащий РНК, слой жидкости в чистую пробирку, замеряют его объем, добавляют к нему 2 объема 96%-ного этанола, хорошо перемешивают содержимое пробирки и помещают на 20-30 мин в морозильную камеру при минус 20°C для формирования осадка РНК. РНК осаждают центрифугированием при 10-15 тысяч об/мин в течение 10-20 мин. Спиртсодержащий супернатант удаляют. К осадку РНК осторожно, по стенке пробирки, добавляют 0,5 мл 80%-ного этанола и центрифугируют при 10-15 тысяч об/мин в течение 15 минут. Следят, чтобы в процессе промывки осадок РНК не был смыт со дна пробирки и утерян. После удаления этанола еще раз центрифугируют (30 секунд при 10-15 тысяч об/мин) пробирку с осадком РНК для полного удаления остатков спирта со стенок пробирки. Растворяют осадок РНК в воде при 4°C, концентрацию и нативность полученного препарата РНК определяют спектрофотометрически с последующим электрофорезом в 1,2-1,5%-ной агарозе, приготовленной на однократном трис-боратном буфере (ТБЕ) и содержащем 0.3 мкг/мл бромистого этидия. Хранят препарат РНК при минус 20°C или ниже, либо в виде спиртового осадка при минус 20°C.
4. Синтез на матрице РНК кДНК. Для синтеза кДНК с использованием полученных препаратов суммарной РНК применяют реактивы фирмы Силекс М и прилагающиеся протоколы. Для синтеза кДНК в пробирке, помещенной в лед, смешивают следующие компоненты:
+
а) РНК матрица - 2 мкл (тотальная РНК от 0,1 до 5 мкг) (поли(А)РНК от 0,1 до 0,5 нанограммов или специфическая РНК - 0,01 пикограммов и менее)
б) праймер - 1 мкл (специфический 15-20 пикомолей, случайный гексапраймер 0,5 нанограммов),
аз
в) вода, свободная от pH - до 18 мкл.
1. Перемешивают, осаждают капли кратковременным центрифугированием. Смесь инкубируют 5 мин при 70°C, переносят пробирку в лед и собирают капли кратковременным центрифугированием.
2. Помещают пробирку в лед и добавляют следующие компоненты:
- 10-кратный ОТ буфер (фирма «Силекс-М») - 2,5 мкл;
- 1,5 миллимоль смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) - 4 мкл;
- обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей Молони - M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) - 0,5 мкл.
3. Смесь инкубируют в течение 60 мин при 37°С (при использовании случайных гексапраймеров перед инкубацией при 37°С смесь инкубируют в течение 10 мин при 25°С). Реакцию останавливают прогреванием смеси в течение 10 мин при 70°С.
4. Смесь переносят в лед. Полученную кДНК используют либо сразу же для проведения РТ ПНР, либо для синтеза второй цепи и последующего клонирования. Хранят полученную кДНК при минус 20°С либо при минус 70°С.
5. Количественный анализ специфической мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы. Количественный анализ специфической экспрессии гена ТРСазы проводят через оценку уровня специфической мРНК. При этом критерием оценки уровня мРНК служит количественный анализ суммарной кДНК, проводимый методом РТ-ПЦР. Реакцию РТ-ПЦР проводят с использованием наборов реактивов фирмы «Синтол» (Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I Кат. номер R-402). Количественное определение уровня специфических кДНК для ТРСазы проводят на РТ-ПЦР приборе. Условия амплификации: денатурация при 95°С в течение 15 с, прокаливание при 60°С - 15 с, и полимеризация при 72°С в течение 15 с (сбор данных осуществляют на стадии полимеризации). Затравки конструют с использованием программы «Праймер Экспресс Версия 2.0», с применением дополнительной приставки к РТ-ПЦР прибору ABI Prism 7900HT для β-актина:
- прямая = 5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′
- обратная = 5′-CGGCCACATTGTGAACTTTG-3′;
для кДНК копии мРНК ТРСазы:
- прямая = 5′-GAAAGGCATTTTCGGCTTCA-3′
- обратная = 5′-CAGCCTGGATGGCAGGAA-3′′.
Все реакции проводят в сериях по 3 раза. Анализ полученных данных проводят с тем же пакетом программ (SDS2.1), прилагающихся к прибору ABI Prism 7900HT. Уровень отклонений рассчитывают по программе с учетом оптимизации. Стандарты получают путем амплификации контрольных образцов в ПЦР реакции с теми же затравками, реактивами и условиями, оптимизированными для РТ-ПЦР. Измерения проводят относительно стандартных значений, при этом делают 4-кратные последовательные разбавления.
Результаты представлены в виде соотношения между изучаемым геном мишенью и мРНК β-актина (табл.1). Как следует из представленных данных, при введении цинкатрана значительно увеличивается экспрессия мРНК ТРСазы. Установлено, что цинкатран максимально повышает экспрессию ТРСазы в дозе 5 мкг/мл вещества почти на 70% по отношению к прототипу и почти в 5 раз по отношению к контролю (табл.1). В отличие от этого трекрезан (прототип), увеличивает экспрессию ТРСазы максимум на 220% по сравнению с контролем, в дозе, в 4 раза большей (20 мкг/мл препарата), чем цинкатран. Следовательно, стимулирующие экспрессию ТРСазы свойства цинкатрана существенно выше, чем у трекрезана, что, скорее всего, обусловлено наличием в молекуле цинкатрана катиона цинка.
Таким образом, применение химического соединения - комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [цинкатрана] достоверно увеличивает экспрессию матричной РНК триптофанил-тРНК-синтетазы.
Изобретение позволит создать на его основе новые фармакологические препараты для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов.
Таблица 1
Экспрессия мРНК ТРСазы в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)
Время после культивирования(час)
Относительные единицы активности мРНК ТРСазы/мРНК бета-актина
Контроль (без цинкатрана)
Трекрезан в дозе 20 мкг/мл (прототип)
Цинкатран в дозе 5 мкг/мл
1
0,4±0,06
0,45±0,08
0,67±0,1*
3
0,41±0,07
0,6±0,1
0,89±0,1*
6
0,3 8±0,06
0,9±0,11
1,35±0,14*
12
0,37±0,05
1,05±0,12
1,6±0,15*
24
0,35±0,05
0,92±0,11
1,33±0,14*
Примечание * - достоверно при p<0,05 по отношению к прототипу (при n=12)