СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ

1. Способ анализа по меньшей мере двух или более анализируемых веществ единичной клетки, который включает:
(a) обеспечение наличия множества элементов, сохраняющих связность (СЕ), где каждый СЕ включает единичную клетку;
(b) проведение лизиса единичных клеток, находящихся в СЕ, при котором анализируемые вещества, находящиеся в единичной клетке, высвобождаются в СЕ;
(c) обеспечение наличия первой репортерной группы для первого анализируемого вещества, находящегося в единичной клетке в каждом СЕ;
(d) обеспечение наличия второй репортерной группы для второго анализируемого вещества, находящегося в единичной клетке в каждом СЕ;
(e) модификацию анализируемых веществ, в результате которой по меньшей мере часть первого и второго анализируемых веществ, содержащихся в СЕ, включает первую и вторую репортерные группы, соответственно;
(f) объединение СЕ, включающего анализируемые вещества, включающие репортерные группы;
(g) компартментализацию СЕ, включающего первое и второе анализируемые вещества, включающие первую и вторую репортерные группы, соответственно, с образованием множества компартментов;
(h) обеспечение наличия третьей репортерной группы для первого анализируемого вещества, включающего первую репортерную группу, в каждом СЕ;
(i) обеспечение наличия четвертой репортерной группы для второго анализируемого вещества, включающего вторую репортерную группу, в каждом СЕ;
(j) дополнительную модификацию анализируемых веществ, в результате которой по меньшей мере часть первых анализируемых веществ включает первую и третью репортерные группы, а по меньшей мере часть вторых анализируемых веществ включает вторую и четвертую репортерные группы;
(j) анализ анализируемых веществ, включающих репортерные группы, в каждом компартменте, причем в проводимом анализе производят обнаружение анализируемых веществ единичной клетки.
2. Способ по п. 1, в котором первая и вторая репортерные группы идентифицируют источник анализируемых веществ.
3. Способ по п. 1, в котором комбинация репортерных групп идентифицирует источник анализируемых веществ.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором определение анализируемых веществ производят одновременно.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором первое анализируемое вещество представляет собой геномную ДНК, а второе анализируемое вещество представляет собой кДНК или РНК.
6. Способ по п. 5, в котором модификацию по меньшей мере части геномной ДНК, кДНК или РНК с целью включения первой и второй репортерных групп включает приведение в контакт геномной ДНК, кДНК или РНК со множеством транспосом, причем каждая транспосома включает транспозазу и последовательность транспозона, включающую первую репортерную группу или вторую репортерную группу, в таких условиях, при которых по меньшей мере часть последовательностей транспозона встраиваются в геномную ДНК, кДНК или РНК.
7. Способ по п. 6, в котором этап (g) дополнительно включает удаление транспозазы из геномной ДНК, кДНК или РНК.
8. Способ по п. 7, в котором транспозазу удаляют после проведения модификации анализируемых веществ при выполнении этапа (е).
9. Способ по п. 8, в котором удаление транспозазы включает способ, выбранный из группы, состоящей из добавления моющего средства, изменения температуры, изменения рН, добавления протеазы, добавления шаперона, изменения концентрации соли и добавления полимеразы, замещающей цепь.
10. Способ по п. 6, в котором этап (е) включает приведение в контакт целевой нуклеиновой кислоты со множеством транспосом, где каждый транспозон включает первую последовательность транспозона, включающую первую репортерную группу, вторая последовательность транспозона не составляет непрерывной последовательности с первой последовательностью транспозона, и транспозаза связана с первой последовательностью транспозона и второй последовательностью транспозона.
11. Способ по любому из пп. 6-10, в котором первая последовательность транспозона включает первый участок связывания праймера, а вторая последовательность транспозона включает второй участок связывания праймера.
12. Способ по п. 13, в котором первый участок связывания праймера дополнительно включает первый штрих-код, и второй участок связывания праймера дополнительно включает второй штрих-код.
13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором первая, вторая, третья или четвертая репортерная группа включает штрих-код.
14. Способ по п. 1, в котором одно анализируемое вещество представляет собой белок, и белок необязательно представляет собой белок, меченый репортерной группой на основе нуклеиновой кислоты, и дополнительно необязательно репортерная группа на основе нуклеиновой кислоты включает полученный комбинаторным образом набор штрих-кодов.
15. Способ по п. 14, в котором белок представляет собой белок единичной клетки.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором этапы (c)-(j) повторяют по меньшей мере еще один раз.
17. Способ по п. 16, в котором дополнительные репортерные группы в каждом из дополнительных этапов отличаются от первой, второй, третьей и четвертой репортерных групп.
18. Способ анализа анализируемых веществ, который включает:
(a) обеспечение наличия элементов, сохраняющих связность (СЕ), где каждый СЕ включает по меньшей мере одно анализируемое вещество;
(b) компартментализацию СЕ, включающего по меньшей мере одно анализируемое вещество с образованием множества первых компартментов;
(c) обеспечение наличия первого набора репортерных групп для анализируемого вещества каждого СЕ в первом компартменте, где первый набор репортерных групп идентифицирует СЕ;
(d) такую модификацию анализируемого вещества, при которой по меньшей мере часть анализируемых веществ СЕ включают первую репортерную группу;
(e) объединение СЕ, включающего анализируемое вещество, включающее первую репортерную группу;
(f) компартментализацию СЕ, включающего анализируемое вещество, включающее первую репортерную группу, с образованием множества вторых компартментов;
(g) обеспечение наличия второго набора репортерных групп для анализируемого вещества, включающего первую репортерную группу каждого СЕ;
(h) такую дополнительную модификацию анализируемого вещества, при которой по меньшей мере часть анализируемых веществ включают вторую репортерную группу;
(i) анализ анализируемого вещества, включающего первую и вторую репортерные группы, в каждом из вторых компартментов.
19. Способ по п. 18, в котором анализируемое вещество включает нуклеиновую кислоту.
20. Способ по п. 19, в котором нуклеиновая кислота включает ДНК.
21. Способ по п. 20, в котором ДНК включает геномную ДНК.
22. Способ по п. 19, в котором нуклеиновая кислота включает РНК или кДНК.
23. Способ по п. 18, в котором анализируемое вещество выбрано из группы, состоящей из среза ткани, органеллы, липида, углевода и продукта метаболизма клетки.
24. Способ по п. 19, в котором этап (d) включает приведение в контакт нуклеиновой кислоты с множеством транспосом, каждая из которых включает транспозазу и последовательность транспозона, включающую первую репортерную группу, в условиях, при которых по меньшей мере часть последовательностей транспозона встраиваются в целевую нуклеиновую кислоту.
25. Способ по п. 19, в котором этап (d) включает приведение в контакт целевой нуклеиновой кислоты с множеством транспосом, где каждый транспозон включает первую последовательность транспозона, включающую первую репортерную группу, вторая последовательность транспозона не составляет непрерывной последовательности с первой последовательностью транспозона, и транспозаза связана с первой последовательностью транспозона и второй последовательностью транспозона.
26. Способ по п. 19, в котором этап (f) включает удаление транспозазы из компартментализованных первых проиндексированных матричных нуклеиновых кислот.
27. Способ по п. 26, в котором удаление транспозазы производят после проведения этапа (d).
28. Способ по п. 26, в котором удаление транспозазы производят до проведения этапа (i).
29. Способ по п. 26, в котором удаление транспозазы включает способ, выбранный из группы, состоящей из добавления моющего средства, изменения температуры, изменения рН, добавления протеазы, добавления шаперона, изменения концентрации соли и добавления полимеразы, замещающей цепь.
30. Способ по любому из пп. 24-29, в котором первая последовательность транспозона включает первый участок связывания праймера, а вторая последовательность транспозона включает второй участок связывания праймера.
31. Способ по п. 30, в котором первый участок связывания праймера дополнительно включает первый штрих-код, а второй участок связывания праймера дополнительно включает второй штрих-код.
32. Способ по п. 18, в котором первая репортерная группа включает праймер, и в котором этап (d) включает амплификацию нуклеиновой кислоты с участием по меньшей мере одного праймера.
33. Способ по п. 18, в котором первая репортерная группа включает праймер, и в котором этап (d) включает лигирование нуклеиновой кислоты с участием по меньшей мере одного праймера.
34. Способ по любому из пп. 18-33, в котором первая репортерная группа, доставляемая к анализируемому веществу каждого из первых компартментов, отличается от других.
35. Способ по любому из пп. 18-34, в котором анализируемые вещества представляют собой компоненты единичной клетки, где каждая из первых и/или вторых репортерных групп уникальна для первой клетки, и где первая и/или вторая репортерные группы идентифицируют единичную клетку.
36. Способ по любому из пп. 18-35, в котором на этапе (с), дополнительно вводят в СЕ плазмиду, и при этом при проведении этапов (d)-(h) эту плазмиду подвергают модифицикации для включения в нее первой и/или второй репортерных групп, и плазмида включает первую или вторую репортерные группы, идентифицирующие СЕ.
37. Способ по п. 18, в котором анализируемое вещество представляет собой белок.
38. Способ по п. 37, в котором белок представляет собой белок из единичной клетки.
39. Способ по любому из пп. 18-37, в котором этапы (c)-(h) повторяют по меньшей мере еще один раз.
40. Способ по п. 39, в котором дополнительные наборы репортерных групп в каждом из дополнительных этапов отличаются от первого и второго наборов репортерных групп.
41. Способ по п. 18, в котором анализируемое вещество представляет собой мРНК или кДНК.
42. Способ по п. 41, в котором мРНК или кДНК представляет собой мРНК или кДНК единичной клетки.
43. Способ по любому из пп. 41 и 42, в котором СЕ включает твердую подложку, на которой может быть иммобилизована мРНК или кДНК.
44. Способ по п. 43, в котором твердая подложка включает олигонуклеотидные (dT) зонды, иммобилизованные на твердой подложке.
45. Способ по любому из пп. 41-44, в котором первый набор репортерных групп включает первую последовательность штрих-кода.
46. Способ по любому из пп. 41-45, в котором второй набор репортерных групп включает вторую последовательность штрих-кода.
47. Способ по любому из пп. 41-44, в котором этап (d) включает приведение в контакт нуклеиновой кислоты с множеством транспосом, каждая из которых включает транспозазу и последовательность транспозона, включающую первую репортерную группу, в условиях, при которых по меньшей мере часть последовательностей транспозона встраивается в целевую нуклеиновую кислоту.
48. Способ по любому из пп. 41-44, в котором этап (d) включает приведение в контакт целевой нуклеиновой кислоты с множеством транспосом, где каждый транспозон включает первую последовательность транспозона, включающую первую репортерную группу, вторая последовательность транспозона не составляет непрерывной последовательности с первой последовательностью транспозона, и транспозаза связана с первой последовательностью транспозона и второй последовательностью транспозона.
49. Способ по любому из пп. 47 и 48, в котором этап (f) включает удаление транспозазы из компартментализованных первых проиндексированных матричных нуклеиновых кислот.
50. Способ по п. 49, в котором удаление транспозазы производят после проведения этапа (d).
51. Способ по п. 49, в котором удаление транспозазы производят до проведения этапа (i).
52. Способ по п. 49, в котором удаление транспозазы включает способ, выбранный из группы, состоящей из добавления моющего средства, изменения температуры, изменения рН, добавления протеазы, добавления шаперона, изменения концентрации соли и добавления полимеразы, замещающей цепь.
53. Способ по любому из пп. 41-52, в котором первая и вторая репортерные группы идентифицируют источник анализируемых веществ.
54. Способ по любому из пп. 41-52, в котором комбинация репортерных групп идентифицирует источник анализируемых веществ.
55. Способ по пп. 41-54, в котором этапы (d)-(i) повторяют по меньшей мере еще один раз.
56. Способ по п. 55, в котором дополнительные наборы репортерных групп в каждом из дополнительных этапов отличаются от первого и второго наборов репортерных групп.
57. Способ по любому из пп. 1-56, в котором единичная клетка связана с заболеванием.
58. Способ по п. 57, в котором единичная клетка связана с раковым заболеванием.
59. Способ по п. 57, в котором единичная клетка связана с генетическим заболеванием.
60. Способ получения информации о последовательности из целевой нуклеиновой кислоты, содержащейся в единичной клетке, который включает:
a) введение клеточной суспензии в первый капельный манипулятор;
b) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для такого дозирования множества капель, включающих клеточную суспензию, при котором каждая капля включает единичную клетку;
c) введение буфера лизиса клеток во второй капельный манипулятор;
c) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для дозирования множества капель, включающих буфер лизиса клеток;
d) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для объединения множества капель буфера лизиса клеток и множества капель клеточной суспензии, что приводит к получению множества капель лизата клеток;
e) введение раствора реагента, включающего первую репортерную группу и ферменты, в третий капельный манипулятор, где по меньшей мере один фермент обладает способностью вводить первую репортерную группу в целевую нуклеиновую кислоту, и при этом первая репортерная группа идентифицирует единичную клетку;
f) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для дозирования множества капель, включающих раствор реагента;
g) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для объединения множества капель лизата клеток с каплями реагента, которое приводит к образованию множества капель, включающих первую репортерную группу, в котором репортерные группы введены в нуклеиновые кислоты, содержащиеся в каплях клеточного лизата;
h) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для дозирования множества капель, включающих промывной раствор;
i) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для объединения множества капель, включающих первую репортерную группу, с каплями промывного раствора, что приводит к удалению фермента, остающегося после реакции, из нуклеиновой кислоты и образованию множества капель, включающих целевую нуклеиновую кислоту, причем целевая нуклеиновая кислота включает первую репортерную группу;
(j) по меньшей мере однократное повторение этапов (e)-(i), в котором последующие растворы реагентов включают репортерные группы, отличающиеся от первой репортерной группы, что приводит к образованию множества капель, включающих целевую нуклеиновую кислоту, включающую множество репортерных групп;
(k) получение информации о последовательности из целевой нуклеиновой кислоты, включающей одну или более репортерных групп, и сопоставление информации о последовательности с единичной клеткой.
61. Способ по п. 60, дополнительно включающий:
(l) введение в капельный манипулятор раствора реагента для мечения белка, включающего метки, специфичные для белков;
(m) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для дозирования множества капель, включающих раствор реагента для мечения белка;
(n) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для объединения множества растворов реагента для мечения белка с множеством капель, включающих целевую нуклеиновую кислоту, включающую множество репортерных групп, где по меньшей мере часть белков из единичной клетки включает метку, уникальную для единичной клетки, и идентификацию по меньшей мере части белков, включающих метки.
62. Способ по п. 61, в котором способ получения информации о последовательности из целевой нуклеиновой кислоты осуществляют одновременно с идентификацией по меньшей мере части белков, включающих метки.
63. Способ по любому из пп. 60-62, в котором целевая нуклеиновая кислота представляет собой РНК.
64. Способ по любому из пп. 60-62, в котором целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
65. Способ по п. 64, в котором целевая нуклеиновая кислота представляет собой геномную ДНК.
66. Способ по любому из пп. 60-62, в котором целевая нуклеиновая кислота представляет собой и РНК, и ДНК.
67. Способ по любому из пп. 60-66, в котором первая репортерная группа введена в целевую нуклеиновую кислоту посредством лигирования.
68. Способ по любому из пп. 60-67, дополнительно включающий:
(i) введение раствора реагента, включающего репортерные группы, специфичные для продуктов метаболизма клетки, в капельный манипулятор;
(ii) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для дозирования множества капель реагента, включающего репортерные группы, специфичные для продуктов метаболизма клетки;
(iii) применение операций с каплями, проводимых посредством электродов, для объединения множества капель реагента с множеством капель, включающих целевую нуклеиновую кислоту, включающую множество репортерных групп, где по меньшей мере часть продуктов метаболизма клетки, получаемых из единичной клетки, включает репортерную группу, уникальную для единичной клетки, и идентификацию по меньшей мере части продуктов метаболизма клетки.
69. Способ получения информации о последовательности из клеточной нуклеиновой кислоты, который включает:
(a) нанесение одной или более клеток на твердую подложку, где твердая подложка включает группы, иммобилизующие клетки, и в результате такого нанесения одна или более клеток оказываются иммобилизованными на твердой подложке;
(b) проведение лизиса клеток, иммобилизованных на твердой подложке, с образованием клеточного лизата;
(c) обеспечение наличия репортерной группы для нуклеиновой кислоты, содержащейся в клеточном лизате, и модификацию нуклеиновой кислоты с образованием нуклеиновой кислоты, включающей первую репортерную группу;
(d) получение информации о последовательности из нуклеиновой кислоты, включающей первую репортерную группу.
70. Способ по п. 69, в котором нуклеиновая кислота представляет собой геномную ДНК.
71. Способ по п. 69, в котором нуклеиновая кислота представляет собой РНК.
72. Способ по п. 71, дополнительно включающий обратную транскрипцию РНК в кДНК.
73. Способ по любому из пп. 69-72, дополнительно включающий обеспечение наличия дополнительных репортерных групп для нуклеиновой кислоты этапа (с), включающей первую репортерную группу, и модификацию нуклеиновой кислоты этапа (с) с целью дополнительного включения одной или более дополнительных репортерных групп.
74. Способ по п. 73, в котором дополнительные репортерные группы отличаются от первой репортерной группы.
75. Способ по любому из пп. 69-74, в котором первая репортерная группа уникальна для каждой клетки, что позволяет идентифицировать клеточный источник нуклеиновой кислоты, включающей первый индекс.
76. Способ по любому из пп. 69-75, в котором нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту из единичной клетки.
77. Способ по любому из пп. 69-76, в котором нуклеиновая кислота представляет собой и РНК, и ДНК.
78. Способ по любому из пп. 69-77, в котором твердая подложка выбрана из группы, состоящей из проточных ячеек, гранул и микролунок.
79. Способ по любому из пп. 69-78, в котором группы, иммобилизующие клетки, представляют собой антитела, где антитела связываются с белками клеточной поверхности.
80. Способ по п. 69, в котором антитела представляют собой моноклональные антитела.
81. Способ по любому из пп. 61 и 62, в котором антитела специфично связываются с белками клеточной поверхности, специфичными для раковых клеток.
82. Способ по любому из пп. 69-81, дополнительно включающий воздействие на клеточный лизат меток, специфичных для белков, где по меньшей мере часть белка клетки включает метку, уникальную для клетки, и идентификацию по меньшей мере части белков, включающих метки.
83. Способ по п. 82, в котором идентификация по меньшей мере части белков, включающих метки, и получение информации о последовательности из клеточной нуклеиновой кислоты производят одновременно.
84. Способ по любому из пп. 69-83, в котором одна или более репортерные группы включают по меньшей мере один штрих-код.
85. Способ по любому из пп. 69-84, в котором одна или более репортерные группы включают участок связывания праймера.
86. Способ по любому из пп. 69-85, в котором модификацию нуклеиновой кислоты, включающей первую репортерную группу, производят лигированием.
87. Способ по любому из пп. 69-84, в котором модификацию нуклеиновой кислоты, включающей одну или более дополнительных репортерных групп, производят лигированием.
88. Способ по любому из пп. 69-87, в котором модифицированную нуклеиновую кислоту, включающую первую репортерную группу, подвергают амплификации до получения информации о последовательности.
89. Способ по любому из пп. 69-88, в котором модифицированную нуклеиновую кислоту, включающую две или более репортерные группы, подвергают амплификации до получения информации о последовательности.
90. Способ по любому из пп. 69-88, в котором по меньшей мере часть клеток связана с заболеванием.
91. Способ по п. 90, в котором по меньшей мере часть клеток связана с раковым заболеванием.
92. Способ анализа клеточных компонентов, включающий
(a) нанесение одной или более клеток на твердую подложку, где твердая подложка включает группы, иммобилизующие клетки, и в результате такого нанесения одна или более клеток оказываются иммобилизованными на твердой подложке;
(b) проведение лизиса клеток, иммобилизованных на твердой подложке, с образованием клеточного лизата;
(c) включение одной или более репортерных групп в клеточный лизат, в результате чего одно или более анализируемых веществ, находящихся в клеточном лизате, включают одну или более репортерных групп, и при этом одна или более репортерных групп идентифицирует клетку;
(d) анализ анализируемых веществ, включающих одну или более репортерных групп, причем такой анализ позволяет идентифицировать клетки и обнаруживать компоненты клетки.
93. Способ по п. 92, в котором единичные клетки иммобилизованы на твердой подложке.
94. Способ по любому из пп. 92 и 93, в котором в котором твердая подложка выбрана из группы, состоящей из проточных ячеек, гранул и микролунок.
95. Способ по любому из пп. 92-94, в котором группы, иммобилизующие клетки, представляют собой антитела, где антитела связываются с белками клеточной поверхности.
96. Способ по п. 95, в котором антитела представляют собой моноклональные антитела.
97. Способ по любому из пп. 95 и 96, в котором антитела специфично связываются с белками клеточной поверхности, специфичными для раковых клеток.
98. Способ по п. 90, в котором анализируемые вещества выбраны из группы, состоящей из белка, нуклеиновой кислоты, органелл, липидов, углеводов, продуктов метаболизма клетки.
99. Способ по любому из пп. 1-13, в котором первая, вторая, третья или четвертая репортерные группы включают участок связывания праймера.
100. Способ по любому из пп. 1-17, в котором первое, второе или оба анализируемых вещества представляют собой нуклеиновые кислоты.
101. Способ по п. 100, в котором перед проведением анализа нуклеиновые кислоты, включающие репортерные группы, подвергают амплификации.
102. Способ по любому из пп 100 и 101, в котором анализ нуклеиновой кислоты производят секвенированием.