Способ выделения фибробластов из стромы роговицы
METHOD FOR ISOLATING FIBROBLASTS FROM THE CORNEAL STROMA

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, конкретнее к технологии получения клеток из роговицы глаза.
Клетки, выращенные in vitro, способны при культивировании в соответствующих условиях сохранять свои физиологические функции и могут использоваться при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей (в том числе стромальной ткани роговицы) или в косметических целях для омоложения или улучшения состояния кожи.
Строение стромы роговицы уникально, лишь на 3-5% она имеет клеточный состав и строгую пространственную ориентированность коллагеновых ламеллей. Это позволяет роговице поддерживать прозрачность, выполнять светопроводящую, светопреломляющую и защитно-опорную функции. Именно поэтому возрастает интерес к тканевой инженерии в офтальмологии, поскольку актуальными являются дефицит донорского материала и возможные осложнения, связанные с трансплантацией аллогенного клеточного заместителя, либо кератопротезов.
В патогенезе многих патологических изменений роговицы, таких как постожоговые, посттравматические, дистрофические и эктатические состояния (в том числе, кератоконус), особая роль отводится потере кератоцитов (снижение плотности клеток на единицу площади).
Кератоцит является митотически покоящейся мезенхимальной клеткой нервного гребня. Роль кератоцитов заключается в поддержании внеклеточного матрикса и постоянства окружающей среды, осуществлении фагоцитоза коллагеновых фибрилл, синтеза коллагена, гликозаминогликанов, коллагеназы, ростовых факторов и цитокинов, ингибиторов металлопротеиназ. При культивировании клеток стромы роговицы в присутствии сыворотки кератоциты приобретают фенотип фибробластов, что является физиологическим обратимым переходом для активации митотического цикла и возможности осуществления активного терапевтического эффекта.
Перспективной задачей клеточной терапии роговицы является получение «здоровой» однородной популяции клеток с целью восполнения утраченной толщины, продуцировании нового коллагена, создании «здорового клеточного микроокружения» в строме эктатической и поврежденной роговицы.
Известен способ выделения фибробластов для заместительной терапии, заключающийся в том, что фибробласты выделяют из биоптатов кожи человека путем ферментативной обработки раствором 0,2% диспазы/ 0,1 мг/мл коллагеназы I в среде DMEM с добавлением 5% ЭБС (эмбриональной телячьей сыворотки) при температуре 37°С в течение 1,5 ч в стерильных условиях, полученную суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в среде DMEM с добавлением 10% ЭБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона и высевают на чашки, затем фибробласты переводят на длительное культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента: DMEM/10% ССКП, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона или в терапевтической среде AIM-V, перед введением пациентам клетки несколько раз отмывают в буфере Krebs-Ring, обрабатывают раствором 0,25%) трипсина/0,02%) ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляют 1 мл Krebs-Ringer, центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, клетки ресуспендируют в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам. При этом, культивированные фибробласты дополнительно обрабатывают добавлением rhTGF-β1 в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования (патент RU 2320720 С2, опубл. 27.03.2008).
Недостатками способа являются длительность и высокая стоимость целевого продукта из-за использования дорогостоящих импортных реактивов.
6
Известен способ получения трансплантата для лечения лимбальной недостаточности, включающий механическую очистку аллогенной склеры, ее замачивание в 6% растворе перекиси водорода и выдерживание 4 часа, затем промывание стерильной дистиллированной водой и замораживание при температуре -20°С в течение 2 часа. Затем после дефростации замачивают в водном растворе гидроксида аммония 10% на 2 часа при температуре 40°С. Далее отмывают стерильным физиологическим раствором, замачивают в 6% растворе перекиси водорода и выдерживают 6 часов. Далее промывают стерильным физиологическим раствором, разделяют на фрагменты шириной 2 мм и длиной 4 мм и вымачивают в физиологическом растворе в течение 20 минут. Фрагменты помещают в культуральные планшеты с 10 мл питательной среды DMEM/F12 с добавлением 15% эмбриональной сыворотки и добавляют 1 мл концентрированной клеточной суспензии ММСК и прогениторных клеток эпителия роговицы (0,5-0,6×10 клеток /мл) и инкубируют в течение 5 суток (патент RU 2720470 С1, опубл. 30.04.2020).
Недостатками способа являются длительность и трудоемкость.
В настоящее время существует несколько способов выделения фибробластов роговицы, которые включают в себя механическую и длительную ферментативную дезагрегацию роговицы. Обычно для выделения клеток используют кадаверные и/или не пригодные для трансплантации роговицы человека.
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ выделения клеток из роговицы, заключающийся в следующем. Из роговицы вырезают центральную часть, инкубируют в 0,2% трипсине в смеси 1:1 с DMEM/F-12, содержащий антибиотики (пенициллин, 100 единиц/мл; стрептомицин, 100 мг/мл; гентамицин, 50 мг/мл; амфотерицин В, 2,5 мг/мл) в течение 16 часов при 4°С, затем 30 минут при 37°С. На следующем этапе работы удаляют эпителиальные и эндотелиальные клетки роговицы соскабливанием пластиковым шпателем в холодном физиологическом растворе. Ткань промывают, измельчают бритвенным лезвием на кусочки размером 2-3 мм и встряхивают при 37°С, 70 об/мин в течение 2-3 часов в объеме 1 мл/стромы роговицы с 1% (мас./об.) раствором коллагеназы I типа в DMEM/F-12 с антибиотиками до полного разрушения ткани. Полученную суспензию клеток пропускают через нейлоновый сетчатый фильтр диаметром 70 мм, дважды промывают центрифугированием в среде DMEM/F-12 и высевают в матрасы для культивирования клеток в ростовой среде DMEM/F-12, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FCS) и культивируют до достижения необходимого пассажа клеток [Chad J. Long, et al. Fibroblast Growth Factor-2 Promotes Keratan Sulfate Proteoglycan Expression by Keratocytes in Vitro. The J. of Biological Chemistry 2000,Vol. 275, No. 18, pp. 13918-13923].
Недостатками известного способа являются трудоемкость и недостаточная чистота целевого продукта, поскольку в результате получают смесь из клеток, содержащую неоднородную популяцию фибробластов из передних, средних и задних отделов стромы, а также примесь эпителиальных и эндотелиальных клеток соответствующих слоев роговицы.
Задачей изобретения является упрощение способа, а также получение «чистой» клеточной популяции передне-среднего отдела стромы роговицы in vitro.
Технический результат: упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счет исключения побочных примесей клеток.
Поставленная задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.
2
Фибробласты роговицы выделяют ферментативным методом из стромальных лентикул, полученных при лазерной коррекции зрения методом ReLEx SMILe. Лентикулы промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ЗФР), измельчают на кусочки размером 2-3 мм. Кусочки лентикул обрабатывают 0,05-0,1% раствором коллагеназы I типа, с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS) при 37°С в течение 18-20 ч. Затем из клеточной взвеси осаждают дебрис центрифугированием при 1500 об/мин, в течение 30 сек. Собирают надосадок и осаждают из него клетки центрифугированием при 1500 об/мин, в течение 5-7 мин. Клетки отмывают два раза ЗФР, центрифугируя 10 мин при 1500 об/мин. Затем осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды DMEM/F12 и подсчитывали количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева. Количество выделенных клеток из двух лентикул составило 30930±9854 клетки, жизнеспособность 98%-100%. После подсчета, клетки высаживали в 24-луночный планшет в культуральной среде DMEM/F12 с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина. Далее клетки культивируют при 37°С и 5% CO. до достижения необходимого пассажа клеток, обновляя культуральную среду каждые 3-4 дня. При пересеве клетки снимали с использованием смеси 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-го раствора ЭДТА.
Аутологичный стромальный материал лентикул роговиц позволяет получить «чистую» клеточную популяцию для трансплантирования с регенеративной целью при патологических состояниях стромы роговицы без последующей иммунной реакции «хозяин против трансплантата».
Предлагаемый способ позволяет упростить процесс выделения клеток фибробластов за счет сокращения сроков ферментативной обработки и исключения этапа механической обработки роговицы (удаление эпителиального и эндотелиального слоев роговицы), а также обеспечить качество целевого продукта за счет исключения побочных примесей клеток.
Определяющими отличиями предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1) Фибробласты роговицы выделяют из стромальных лентикул in vitro, полученных при лазерной коррекции зрения, что позволяет получить однородную клеточную популяцию. В известных способах фибробласты выделяют из цельной роговицы, поэтому полученная культура клеток на начальных этапах культивирования может содержать примесь эпителиальных и эндотелиальных клеток. Кроме этого, лентикулы являются более доступным биологическим материалом, по сравнению с кадаверными роговицами.
2) Лентикулы обрабатывают 0,05-0,1% раствором коллагеназы типа I, с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS) при 37°С в течение 18-20 часов, что позволяет сократить длительность способа, за счет сокращения сроков ферментативной обработки лентикул, которые намного тоньше цельной нативной роговицы.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1
2
Фибробласты роговицы выделяли из лентикул роговицы, полученных на заданной глубине роговицы - 120 микрон, при лазерной коррекции зрения методом ReLEx SMILe. Для этого, лентикулы, в количестве 2 штуки от каждого пациента, диаметром 6-6,5 мм, толщиной -120 мкм сразу после извлечения из глаза помещали в 2 мл ростовой среды DMEM/F12 и транспортировали в лабораторию на холоду. В лаборатории лентикулы промывали ЗФР (содержащим хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия), измельчали ножницами на кусочки размером 2-3 мм. Кусочки лентикул обрабатывали 0,05%-м раствором коллагеназы {Clostridium histolyticum, тип I, «Sigma-Aldrich», США) с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS, HyClone, «Thermo FisherScientific», США) при 37°С в течение 18 ч. Затем из клеточной взвеси цетрифугированием осаждали дебрис при 1500 об/мин, 30 сек. Собирали надосадок и осаждали из него клетки центрифугированием при 1500 об/мин, 5-7 мин. Клетки отмывали два раза ЗФР (1500 об/мин, 10 мин), ресуспендировали в 1 мл среды DMEM/F12 и подсчитывали количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева. Количество выделенных клеток из двух лентикул составило 10263 клетки, жизнеспособность - 98%. После подсчета клетки высаживали в 24-луночный планшет в культуральной среде DMEM/F12 (Dullbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F12 Ham, Gibco, «ThermoFisher Scientific)), США) с добавлением 10% FCS (HyClone, США), 2 мМ L-глютамина («Биолот», Санкт-Петербург), 40 мкг/мл гентамицина («Дальхимфарм», Хабаровск). Клетки культивировали при 37°С и 5% СО. Первые сутки культура представляла собой адгезированные к поверхности пластика клетки, округлой формы, одинакового размера. К 3 дню культивирования клетки приобретали морфологию фибробластоподобных клеток, имели вид вытянутых, веретеновидных клеток, адгезированных к поверхности культурального пластика, пролиферирующих с образованием колоний. Прилипающую фракцию культивировали до получения конфлюэнтного слоя в полной ростовой среде, которую обновляли каждые 3-4 дня. При пересеве клетки снимали с использованием смеси 0,25% -го раствора трипсина и 0,02%-го раствора ЭДТА («Биолот», Санкт-Петербург). Пассаж клеток №3, который использовали для морфофункциональной характеристики клеток, был получен через 21 день от момента выделения клеток из лентикул.
Пример 2
Фибробласты роговицы выделяли из лентикул роговицы, полученных при лазерной коррекции зрения методом ReLEx SMILe аналогично примеру 1, за исключением того, что ферментативную обработку кусочков лентикул осуществляли 0,1% раствором коллагеназы типа I, с добавлением 2% FCS при 37°С в течение 20 часов. Количество выделенных клеток из двух лентикул составило 38125 клетки, жизнеспособность - 100%. Первые сутки культура представляла собой адгезированные к поверхности пластика клетки, округлой формы, одинакового размера. К 4 дню культивирования клетки приобретали морфологию фибробластоподобных клеток, имели вид вытянутых, веретеновидных клеток, адгезированных к поверхности культурального пластика, пролиферирующих с образованием колоний. По достижению конфлюентности клетки закрывали поверхность пластика на 90% монослоем. Пассаж клеток № 3, который использовали для морфофункциональной характеристики, был получен через 18 дней от момента выделения клеток из лентикул.
Предлагаемый способ позволяет получать однородную клеточную популяцию фибробластов для трансплантации с регенеративной целью при патологических состояниях стромы роговицы без последующей иммунной реакции «хозяин против трансплантата».