Способ культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer. f. globosa V. Andr. IIPAS C-2024 в природных условиях с использованием воды из пруда
METHOD FOR CULTIVATING MICROALGAE CHLORELLA VULGARIS BEIJER. f. GLOBOSA V. ANDR IPPAS C-2024 IN NATURE USING POND WATER

Изобретение относится к защите окружающей среды и предназначено для получения в мобильных, стрессовых, природных условиях биотехнологического препарата - деструктора нефтепродуктов.
В настоящее время оценен вклад микроводорослей как эффективных деструкторов углеводородов. Поиск решений на получение необходимого объема биомассы микроводорослей для решения задач экологической биотехнологии при минимальной себестоимости состава и процесса приготовления, сокращении сроков роста и повышении выхода биомассы становится особо актуальным в настоящее время, когда загрязнения, в том числе, нефтепродуктами приводят к экологическим катастрофам.
Важным является решение задачи наработки микроводорослей Chlorella vulgaris в условиях не стационарных, прямо на полигонах, где произошла экологическая катастрофа - разлив нефтепродуктов с учетом климатического стресса Крайнего севера и Арктики.
Известны синтетические питательные среды Тамия, Болда, наиболее применимые для наработки биомассы микроводорослей. Недостатками их является большое количество макро- и микроэлементов в их составе, обязательная стерилизация и культивирование в условиях комнатных температур.
Известен способ культивирования микроводорослей на основе штамма Chlorella vulgaris ИФР №с-111 (Патент РФ №2176667). Способ предусматривает розлив питательной среды в емкости, инокуляцию суспензии штаммом, освещение культуральной жидкости в процессе роста микроводорослей и поддержание необходимой температуры суспензии. Емкости представляют собой сосуды из прозрачного материала, и для освещения используют источник искусственного света.
Известен способ культивирования микроводорослей Chlorella (Патент РФ №2668162). Способ включает культивирование суспензии микроводоросли в фотобиореакторе, в котором суспензию микроводоросли перемешивают в течение 13-17 минут с частотой вращения 500 об./мин. через каждые 120 минут. При этом культивирование осуществляют, также при непрерывной продувке воздухом с помощью барботирующего устройства с расходом 1,2-1,8 л/мин. при температуре 26-30°С, непрерывном воздействии инфракрасного излучения 10900-11300 Лк и при поверхностной освещенности 2200-2800 Лк с фотопериодом 12 часов.
Известен способ (Патент РФ №2508398), когда культивирование штамма микроводорослей Chlorella vulgaris Al 123 проводят в лабораторных условиях при температуре 25°С на среде ВВМ рН 6.8 в лимитированных по азоту условиях в течение 7 дней, в объеме среды 200 мл в колбах на 500 мл, при непрерывном барботировании суспензии стерильным воздухом со скоростью 200 мл/мин, при освещенности 120 Вт/м с фотопериодом 16 часов.
Известен способ культивирования хлореллы на питательной среде, содержащей марганцовокислый калий, хлористый кобальт и зерно-картофельную барду, которая образуется при производстве спирта (Патент РФ №2685955). Готовую питательную среду стерилизуют в течение 30 минут. В период светового выращивания водорослей культуру перемешивают воздухом.
Известен способ (Патент РФ №2643256). Культивирование выполняют в различных режимах с использованием отдельных планктонных штаммов: Chlorella vulgaris ИФР С-111, Chlorella vulgaris BIN, Chlorella kessleri ВКПМ Al-12. В способе выращивают штаммы хлореллы с использованием источника света, оптимальной питательной среды и температурных условий. Достижение оптимального освещения в начальный период культивирования осуществляют путем включения вертикально расположенных ламп, находящихся между аквариумами. В процессе роста клеток и увеличения оптической плотности культуры подключают горизонтальные лампы, расположенные над центральным аквариумом.
Известен способ искусственного культивирования микроводорослей и установка для его осуществления (Патент РФ №2175013). Культивирование микроводорослей осуществляется путем фотосинтеза при воздействии на них радиолюминесцентного излучения и тепла, возбуждаемого проникающими ядерными излучениями, при этом спектр радиолюминесцентного излучения может быть выбран резонансно совпадающим со спектром действия фотосинтеза. Искусственным источником энергии служит источник проникающих ядерных излучений, источником люминесцентного оптического излучения - радиолюминофор, тепло генерируется в среде источника ядерных излучений. В качестве источника ядерных излучений используется ядерный реактор, в том числе, реактор-размножитель с уран-ториевым циклом, в том числе, в виде решетки из ядерных радиолюминесцентных ламп, которые со всех сторон окружены светоприемными кюветами с суспензией культивируемых микроводорослей.
Недостатками этих способов является трудоемкость, высокие энергозатраты, культивирование не в природных условиях на полигонах.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа культивирования суспензии микроводорослей Chlorella vulgaris в природных условиях с использованием воды из пруда.
ср
Технический результат достигается тем, что способ культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris включает в себя штамм микроводорослей Chlorella vulgaris, воду, взятую из пруда, компоненты питательной среды Люка, режим культивирования: аэрация с помощью компрессоров AQUAEL OXYBOOST 300 plus, климатические условия окружающей среды (t=13°С).
Описание штамма микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer. f. globosa V. Andr. UPAS C-2024 из коллекции Института биологии Коми НЦ УрО РАН ФИЦ.
Вид Chlorella vulgaris относится к роду Chlorella. Зеленые одноклеточные водоросли имеют сферическую форму, размером от 2 до 4 мкм, без жгутиков. Хлоропласт широкопоясковидный незамкнутый зеленого цвета, содержащий хлорофилл-а и хлорофилл-б. Клетки делятся на 2-8, редко на 16 автоспор.
3
3
3
2
4
2
4
2
Маточную культуру Chlorella vulgaris нарабатывали на среде Тамия в ферментере Biostat А МО UniVessel Glass ВВ-8822000 2L 230V 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации при 350 об./мин, температуре 25-27°С, рН 5,5-6,5, освещении фитолампой 175-250 В 50 Гц до достижения титра клеток в суспензии 8,34 млн. кл./мл. Среда Тамия (на 1 дм деионизированной воды) следующего состава: KNO - 5 г, KHPO × 3НО - 1,25 г, MgSO×7HO - 2,5 г, растворы микроэлементов - по 1 см. В исходном штамме содержалось 8,34 млн. кл./мл.
0,84
0,47
0,40
4
10
2
Согласно патента РФ №2556126 «Питательная среда Люка для культивирования микроводорослей» экономически выгодной является экологичная органо-минеральная питательная среда Люка. Состав питательной среды Люка: вода - 99,75%; минеральный ионит «Ionsorb™» - 0,2%. Минеральный ионит включает в себя следующий состав компонентов - ((K, Са, Na)(AlFe0, 66Mg)(SiAl)O(OH)); стабилизированный гашенной известью и минеральным ионитом «Ionsorb™» куриный помет - 0,005%.
Для оценки режима культивирования провели наработку суспензии микроводорослей в разных условиях.
Пример 1.
сp
В емкости 18 л вносили воду из пруда, добавляли состав среды Люка, перемешивали и вносили маточную культуру микроводорослей. Аэрацию осуществляли с помощью компрессоров AQUAEL OXYBOOST 300 plus. Культивирование суспензии микроводорослей проводилось на улице в климатических условиях окружающей среды (t=13°С) (уличные условия). Эксперимент был поставлен на 10 суток в 2-х повторностях (образец 1 и образец 2). Производился ежедневный отбор проб для определения общего количества клеток микроводорослей в суспензии и определения оптической плотности суспензии (Таблица 1).
Подсчет количества клеток Chlorella vulgaris проводили с помощью камеры Горяева. Расчет числа клеток на 1 мл осуществлялся, исходя из разведения среды и числа больших квадратов (100), по формуле: X=(а×250) / 100, где X - число клеток хлореллы в 1 мл среды; а - число клеток хлореллы, посчитанных в 100 больших квадратах камеры Горяева.
Определения оптической плотности суспензии микроводорослей Chlorella vulgaris микроводорослей Chlorella vulgaris проводили на спектрофотометре ПЭ-5400УФ, толщина кюветы 10 мм.
Пример 2.
cp
В емкости 18 л вносили воду из пруда, добавляли состав среды Люка, перемешивали и вносили маточную культуру микроводоросли. Аэрацию осуществляли с помощью компрессоров AQUAEL OXYBOOST 300 plus. Культивирование суспензии микроводорослей проводилось в теплице (t=24°С) (тепличные условия). Эксперимент был поставлен на 10 суток в 2-х повторностях (образец 3 и образец 4). Производился ежедневный отбор проб для определения общего количества клеток микроводорослей в суспензии и определения оптической плотности суспензии (Таблица 2).
Подсчет количества клеток Chlorella vulgaris проводили с помощью камеры Горяева. Расчет числа клеток на 1 мл осуществлялся, исходя из разведения среды и числа больших квадратов (100), по формуле: X=(а×250) / 100, где X - число клеток хлореллы в 1 мл среды; а - число клеток хлореллы, посчитанных в 100 больших квадратах камеры Горяева.
Определения оптической плотности суспензии микроводорослей Chlorella vulgaris микроводорослей Chlorella vulgaris проводили на спектрофотометре ПЭ-5400УФ, толщина кюветы 10 мм.
При сравнении двух режимов культивирования (уличного и тепличного) было выявлено, что для накопления максимального количества клеток микроводорослей Chlorella vulgaris на питательной среде Люка достаточно уличных условий в температурном режиме от 9°С до 19°С за 11 суток.