ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО: КОМПОЗИЦИЯ ИМИДАЗО[1,2-b]ТЕТРАЗИНА С ПИРАЗИНАМИДОМ
ANTITUBERCULOUS THERAPEUTIC AGENT: COMPOSITION OF IMIDAZO[1,2-b]TETRAZINE AND PYRAZINAMIDE

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, в частности к фармации, и касается фармацевтических композиций, обладающих противотуберкулезным действием и содержащих в качестве действующего вещества наряду с пиразинамидом новое соединение 6-бензилтио-3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин или известные производные имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, содержащие в тетразиновом цикле 3,5-диметилпиразолильный фрагмент и 6-фенилтио- или 6-изопропилтиогруппу в имидазольном цикле с пиразинамидом.
Уровень техники
От туберкулеза ежегодно погибает около 2-3 млн человек во всем мире. [Corbett E.L, Watt C.J., Walker N. et al. The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions with the HIV epidemic // Arch. Intern. Med. 2003. V.163. №9. P.1009-1021]. Одной из причин трудности лечения туберкулеза в настоящее время является массовое возникновение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) у возбудителя туберкулеза. К появлению МЛУ-штаммов часто приводит несвоевременно прерванное лечение или неудачно подобранный курс химиотерапии. Среди штаммов МЛУ особенно опасны штаммы с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ), устойчивые к 4-9 препаратам [Sotgiu G. et al. Epidemiology and clinical management of XDR-TB: a systematic review by TBNET. // Eur. Respir. J. 2009. Vol.33, №4. Pp.871-88111 рр.]. Смертность среди больных туберкулезом, вызываемым такими штаммами, несмотря на дорогостоящий и длительный курс лечения, составляет до 50% [Shenoi S., Friedland G. Extensively drug-resistant tuberculosis: a new face to an old pathogen. // Annu. Rev. Med. 2009. Vol.60. Pp.307-32014 pp.].
В большинстве случаев возникновение лекарственной устойчивости, в том числе к пиразинамиду, связано с возникновением точечных мутаций в определенных кодонах генов, кодирующих мишень антибиотика. Однако в последние годы все чаще отмечаются случаи устойчивости микобактерий к антибиотикам, не связанные с известными мутациями, которые не могут быть определены стандартными молекулярно-генетическими методами. Устойчивость может быть достигнута за счет перехода бактериальных клеток в латентное состояние, с образованием персистирующих форм, характеризующихся гипометаболизмом [Parrish N.M., Dick J.D., Bishai W.R. Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis // Trends in Microbiology. 1998. Vol.6, №3. Pp.107-1126 pp; Shi W., Zhang Y. Pho Y2 but not Pho Y1 is the Pho U homologue involved in persisters in Mycobacterium tuberculosis // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2010. Vol.65, №6. Pp.1237-12426 pp]. Латентное состояние, в свою очередь, предоставляет бактериям возможность выжить при неблагоприятных условиях, чтобы затем, при ослаблении иммунных систем организма, начать размножение с последующим возникновением лекарственной устойчивости. Пиразинамид является одним из препаратов, активных в отношении таких латентных форм [Shi W. et al. Pyrazinamide inhibits trans-translation in Mycobacterium tuberculosis. // Science. 2011. Vol.333, №6049. Pp.1630-16323 pp.].
Для расширения терапевтических стратегий лечения туберкулеза можно использовать синергетический эффект известных противотуберкулезных препаратов и препаратов с новым механизмом действия. Соединения, применяемые в настоящее время в фармацевтике, могут быть использованы для лечения туберкулеза, в том числе вызванного МЛУ- и ШЛ-штаммами, для которого не существует эффективных методов лечения. В настоящее время ведутся работы по поиску композиций соединений, обладающих синергическим эффектом. Их применение значительно уменьшает вероятность образования устойчивых форм, а также снижает токсический эффект каждого из соединений в отношении человеческого организма [Ramón-García S, Ng С, Anderson H, Chao JD, Zheng X, Pfeifer Т, Av-Gay Y, Roberge M, Thompson CJ. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Aug; 55(8):3861-9]. Проблема преодоления лекарственной устойчивости микобактерий осложняется плохой переносимостью данных средств больными. Поэтому создание более эффективных противотуберкулезных средств, в том числе на основе известных препаратов и новых, обладающих синергическим действием, является приоритетной задачей химии и фармации.
Решаемая проблема: Поиск противотуберкулезных средств, активных в отношении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.
i
6-Бензилтио-3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,1-b][1,2,4,5]тетразин, раскрываемое в настоящем изобретении, является новым, не описанным ранее соединением. Способ его получения описан [Толщина С.Г., Ишметова Р.И., Игнатенко Н.К., Коротина А.В., Ганебных И.Н., Ольшевская В.А., Калинин В.Н., Русинов Г.Л. Взаимодействие 1,2,4,5-тетразинов с S-нуклеофилами // Изв. АН. Сер. хим. 2011. №5. С.961-967]. 6-R-3-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразины (R=SPh, SPr) описаны ранее [Изв. АН. Сер. хим. 2011. №5. С.961-967; Патент РФ 2462466, 27.09.2012].
Известна активность производных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина в отношении протеинкиназ PknA и PknB Mycobacterium tuberculosis [Патент РФ 2462466, 27.09.2012]. Противотуберкулезная активность имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов не известна и не описана.
Применяемый в изобретении пиразинамид является широко используемым в медицинской практике препаратом. Амид пиразинкарбоновой кислоты (пиразинамид) обладает бактерицидным действием в отношении персистирующих форм микобактерий [Shi W., Zhang Y. Pho Y2 but not Pho Y1 is the Pho U homologue involved in persisters in Mycobacterium tuberculosis // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2010. Vol.65, №6. Pp.1237-12426 pp].
50
Выявлена опытным путем способность заявленных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов в сочетании с пиразинамидом многократно усиливать антибактериальное действие. Минимальные ингибирующие концентрации заявленных композиций настоящего изобретения для МЛУ-штамма МБТ MS-115 составили 1,0-2,0 мкг/мл. Минимальная ингибирующая концентрация пиразинамида для этих штаммов 200 мкг/мл. Таким образом, активность композиции в отношении микобактерий выросла до 200 раз. Полулетальные концентрации имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов и пиразинамида на мышах LD=499 мг/кг и 1680 мг/кг соответственно. Уменьшение дозы каждого из веществ в композиции приводит к снижению токсического эффекта применяемой комбинации препаратов.
Раскрытие изобретения
Задача изобретения - использование в качестве противотуберкулезных лекарственных средств композиций в составе используемого в практической медицине пиразинамида, действующего на латентные формы микобактерий и средства нового механизма действия, производного имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина формулы I, где R = бензил, а также композиций известных производных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина общей формулы I, где R = изопропил или фенил с пиразинамидом, при мольном соотношении компонентов 1:1.
Имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразины, представленные в настоящем изобретении, могут быть получены с использованием известных методов синтеза [Толщина С.Г., Ишметова Р.И., Игнатенко Н.К., Коротина А.В., Ганебных И.Н., Ольшевская В.А., Калинин В.Н., Русинов Г.Л. Взаимодействие 1,2,4,5-тетразинов с S-нуклеофилами // Изв. АН, Сер. хим. 2011. №5. С.961-967]. производных и 6-(алкилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов [Изв. АН. Сер. хим., 2011, 5].
Примеры конкретного выполнения:
Пример 1: Композиция пиразинамида с 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(фенилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразином (1р)
323 мг 3-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)-6-(фенилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина и 123 мг пиразинамида, помещают в круглодонную колбу с 5 мл хлороформа, раствор перемешивают в течение 5 минут и растворитель отгоняют при пониженном давлении на роторном испарителе.
Пример 2: Композиция пиразинамида с 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(изопропилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразином (2р)
Получают аналогично примеру 1 из 289 мг 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(изопропилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина и 123 мг пиразинамида.
Пример 3: 6-(Бензилтио)-3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин(3)
16
15
7
Выход 57%. Т.пл. 139-140°C. Найдено (%): С, 56.96; Н, 4.48; N, 29.06. CHNS.
1
3
2
Вычислено (%): С, 56.93; Н, 4.78; N, 28.82. Спектр ЯМР Н (CDCl, δ, м.д.): 2.40, 2.72 (оба с, по 3H, 2Me в пиразолиле); 4.26 (с, 2H, CH); 6.18 (с, 1H, H(4) в пиразолиле); 7.17-7.26 (м, 5H, 5CH в SPh); 8.16 (с, 1H, CH).
Пример 4: Композиция пиразинамида с 6-(бензилтио)-3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразином(3р)
Получают аналогично примеру 1 из 337 мг 6-(бензилтио)-3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина и 123 мг пиразинамида.
2
Пример 5: Активности композиций веществ в тест-системе Mycobacterium smegmatis mc155
2
Для определения активности композиций в тест-системе Mycobacterium smegmatis mc155 использовался метод бумажных дисков. Методика заключалась в определении минимальной концентрации вещества, при которой на диске появляется зона подавления роста штамма, засеянного газоном на агаризованной среде.
Минимальная ингибирующая концентрация для 1р - 2,23 мкг/диск (5 нмоль), 2р - 6,18 мкг/диск (15 нмоль), 3р - 46,1 мкг/диск (50 нмоль).
Таблица 1
Минимальная ингибирующая концентрация композиций в отношении M.smegmatis mc<sup>2</sup>
Шифр
Структура молекулярный вес
M.smegmatis mc<sup>2</sup>
МИК, нмоль/диск
1p
<img file="00000002.tif" he="34" wi="41" img-content="undefined" img-format="tif" />
5
1
<img file="00000003.tif" he="28" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
10
2р
<img file="00000004.tif" he="37" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
15
2
<img file="00000005.tif" he="28" wi="31" img-content="undefined" img-format="tif" />
10
3р
<img file="00000006.tif" he="20" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
50
3
<img file="00000007.tif" he="26" wi="34" img-content="undefined" img-format="tif" />
50
Пример 6. Активности веществ в отношении Mycobacterium tuberculosis МЛУ-штамма MS-115.
Антимикобактериальное действие тестируемых соединений изучали по динамике роста штамма MS-115 в обогащенной жидкой среде Middlebrook 7H9 в присутствии различных концентраций соединений по сравнению с ростом штамма на среде, не содержащей препаратов, и среде, содержащей контрольные препараты. Штамм МЛУ MS-115, устойчив к рифампицину (1 мкг/мл), изониазиду (0.1 мкг/мл), стрептомицину (0.1 мкг/мл), этамбутолу (5 мкг/мл), пиразинамиду (100 мкг/мл) [Matyugina E, Khandazhinskaya A, Chernousova L, Andreevskaya S, Smirnova T, Chizhov A, Karpenko I, Kochetkov S, Alexandrova L. The synthesis and antituberculosis activity of 5'-nor carbocyclic uracil derivatives. Bioorg Med Chem. 2012 Nov 15; 20(22):6680-6686].
Детекцию роста культуры микобактерий проводили с помощью автоматизированной системы учета роста культур Bactec MGIT 960 (BD, USA) каждый час с помощью программного обеспечения Epicenter (BD, USA). Время проведения эксперимента составляет 42 дня. Минимальная ингибирующая концентрация композиций указана в таблице 2.
Таблица 2
Минимальная ингибирующая концентрация композиций в отношении M.tuberculosis МЛУ-штамма MS-115.
Шифр
М.tuberculosis MS-115
МИК, мкг/мл
1p
<1
1
1
2p
2
2
1
3
1