СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ
DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR BRONCHIAL ASTHMA

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, аллергологии, внутренним болезням, и может быть использовано для дифференциальной диагностики бронхиальной астмы (БА).
Согласно современным представлениям эпителий бронхов является одним из ключевых регуляторов воспаления при БА.
Известен способ дифференциальной диагностики БА, заключающийся в проведении иммуногистохимического исследования для определения уровня экспрессии гена-регулятора апоптоза (Вах) в бронхиальных эпителиальных клетках, полученных путем биопсии в ходе фибробронхоскопии у больных аллергической бронхиальной астмой (АБА) и неаллергической бронхиальной астмой (НАБА) [Минеев В.Н., Нестерович И.И., Трофимов В.И., Кашинцева Т.В., Рыбакова М.Г., Грозов Р.В. Оценка активности генов - регуляторов апоптоза по экспрессии Bcl-2, Вах, активности каспазы-3 в бронхиальных эпителиальных клетках у больных бронхиальной астмой // Архив патологии. - 2011. - Том 73, №1. - С.11-14.]. Способ основан на статистически значимом повышении уровня экспрессии индуктора апоптоза - Вах в эпителиальных клетках бронхов у больных НАБА по сравнению с больными АБА. Этот способ принят авторами за прототип.
Высокая инвазивность и травматичность способа, включая возможные смертельные исходы, связанные с проведением фибробронхоскопии и биопсии, резко ограничивают его использование даже в специализированных пульмонологических стационарах и пульмонологических отделениях, а в целом ряде случаев даже исключают применение способа для указанной цели. Следует также учитывать, что в ряде случаев БА является относительным противопоказанием к проведению фибробронхоскопии. Трудоемкость, неэкономичность, необходимость специального оборудования - также ограничивают возможное использование данного способа для дифференциальной диагностики БА.
Техническим результатом изобретения является разработка менее опасного, более простого и достаточно информативного способа дифференциальной диагностики БА.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики БА, включающем определение уровня активности индуктора апоптоза биологических клеток, согласно изобретению определяют уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови и при уровне активности эффекторной каспазы-3 не более 0,98% диагностируют АБА, а при уровне активности эффекторной каспазы-3 не менее 1,00% диагностируют НАБА.
В настоящее время не вызывает сомнений ведущая роль протеаз в запуске и развитии процесса апоптоза. После активации эффекторной каспазы-3 процесс апоптоза становится необратимым. В проведенных исследованиях в качестве маркера клетки, подвергшейся апоптозу, использовали эффекторную каспазу-3.
В табл. представлены результаты исследования уровня активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови.
Таблица
Уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах венозной крови у больных БА, процент клеток (М±0) по изобретению
Индуктор апоптоза
Диагноз
Достоверность различий
АБА n=23
НАБА n=23
Каспаза-3
0,68±0,30
1,91±0,91
p=0,0001
Из табл. следует, что у больных НАБА выявлено статистически значимое повышение уровня активности индуктора апоптоза - эффекторной каспазы-3 по сравнению с больными АБА, что позволяет проводить дифференциальную диагностику между вариантами БА.
Было обследовано две группы больных, страдающих БА, общим количеством 46 человек. В первую группу из 23 человек вошли больные с клинически подтвержденным диагнозом НАБА, во вторую группу - больные с клинически подтвержденным диагнозом - АБА. Распределение больных по группам осуществлялось на основании алергологического обследования, клинического анализа крови, анамнестических данных.
Полученные результаты сравнивались с результатами по исследованию уровня экспрессии Вах в эпителии бронхов при БА, используемых для дифференциальной диагностике по способу-прототипу.
При проведении корреляционного анализа были выявлены достоверные положительные корреляционные связи (p<0,05) между уровнем экспрессии Вах в бронхиальных эпителиальных клетках органа - мишени и уровнем активности эффекторной каспазы-3 (r=0,343) в лимфоцитах периферической венозной крови больных БА, что свидетельствует о достаточной информативности заявляемого способа.
Статистическая обработка материала выполнялась на ПЭВМ с использованием стандартного пакета прикладного статистического анализа SPSS для Windows (от англ.: Statistical Package for the Social Science) (версия 16.0).
Таким образом, технический результат (безопасность, простота, информативность) достигнут за счет определения уровня эффекторной каспазы-3 при исследовании лимфоцитов периферической венозной крови больных БА.
Способ выполняют следующим образом.
3
6
Для исследования используют лимфоциты периферической венозной крови больных БА. Выделение мононуклеаров проводят не позднее чем через 2 часа после получения крови методом центрифугирования в градиенте плотности "Limpholite" (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/см. Гепаринизированную кровь разводят в два раза раствором хлорида натрия (9 г/л, pH=7,2), наслаивают на 3 мл градиента плотности и центрифугируют 30 минут при 400 g. Образовавшееся в интерфазе "кольцо" мононуклеаров отбирают пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывают раствором хлорида натрия (9 г/л, pH=7,2) и доводят концентрацию до 2×10 клеток/мл. Жизнеспособность клеток, которую определяли по связыванию трипанового синего, составляет 95-100%.
TM
6
TM
6
TM
TM
TM
Для определения уровня активности каспазы-3 в лимфоцитах периферической крови полученную взвесь мононуклеаров отмывают дважды в холодном фосфатно-солевом буфере (PBS), затем с целью пермеабилизации мембраны взвесь клеток ресуспендируют в растворе Cytofix/Cytoperm в концентрации 1×10 клеток/0,5 мл. Далее клетки инкубируют в течение 20 минут на льду, центрифугируют 10 минут при 1,500 об/мин, удаляют надосадочную жидкость, после чего дважды отмывают в растворе буфера Perm/Wash в соотношении 0,5 мл буфера/1×10клеток при комнатной температуре. Затем удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 100 мкл Perm/Wash буфера и 20 мкл антител. Клетки ресуспендируют и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После этого пробы отмывают в 1 мл раствора Perm/Wash буфера, затем ресуспендируют в 0,5 мл раствора Perm/Wash буфера и анализируют на проточном цитометре. Для измерения интенсивности флуоресценции фикоэритрина (РЕ) используют узкополостной фильтр 585/42 нм (FL2).
Цитометрический анализ лимфоцитов проводят на проточном цитофлуориметре PARTEC PAS (Германия). Накопление производят до 5000 событий в лимфоцитарной области. Сбор данных и компьютерную обработку проводят с использованием программы FloMax.
При уровне активности эффекторной каспазы-3 менее или равном 0,98% диагностируют АБА, а при уровне эффекторной каспазы-3 более или равном 1,0% диагностируют НАБА.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Больной Т., 18 лет. Клинический диагноз: АБА (бытовая сенсибилизация), легкое течение, фаза обострения. Аллергический ринит, постоянная форма. Страдает БА с 8-летнего возраста. Впервые приступ удушья возник при контакте с домашней пылью. Наследственность отягощена по БА астме: отец и брат страдают БА.
Аллергологическим обследованием подтверждено наличие бытовой сенсибилизации.
При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 0,39%, что характерно для больных АБА.
Рекомендованный курс специфической иммунотерапии (СИТ) с аллергеном домашней пыли обеспечил положительный эффект. Применение интала привело к стойкой ремиссии.
Пример 2. Больная И., 20 лет. Клинический диагноз: АБА (бытовая, эпидермальная сенсибилизация), легкое течение, ремиссия. Аллергический ринит, постоянная форма. Страдает БА в течение 2-х лет. Впервые приступ удушья возник при контакте с домашней пылью. Наследственность отягощена по БА: мать страдает БА.
Аллергологическим обследованием подтверждено наличие бытовой и эпидермальной сенсибилизации.
При обследовании выявлена эозинофилия в клиническом анализе крови (5,2%), мокроты (18%). По результатам ФВД: выявлены умеренные обструктивные нарушения, частично обратимая обструкция, выраженный бронхоспазм.
При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 0,98%, что подтверждает наличие АБА.
После назначения интала достигнут положительный эффект.
Пример 3. Больная Л., 54 года. Клинический диагноз: НАБА (инфекционно-зависимая, нервно-психическая), средней степени тяжести, фаза затихающего обострения. Страдает БА в течение 1,5 лет. Дебют заболевания после перенесенного бронхита. Отмечает связь приступов удушья с резкими запахами, переохлаждением. Настоящее ухудшение в течение 2-х недель после перенесенного ОРВИ. Наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям не отмечает.
9
В клиническом анализе крови - лейкоцитоз: лейкоциты - 15,4*10/л, СОЭ - 40 мм в час. При цитологическом исследовании мокроты выявлен выраженный воспалительный процесс (нейтрофилы 70%), небольшая эозинофилия.
При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 1,00%, что подтверждает наличие НАБА.
Применение антибактериальной терапии (цефтриаксона) имело положительный эффект.
Пример 4. Больная К., 55 лет. Клинический диагноз: НАБА (инфекционно-зависимая), средней степени тяжести, фаза обострения. Страдает БА в течение 7 лет, дебют заболевания на фоне обострения хронического бронхита. Наследственность по БА не отягощена. Имеет профессиональные вредности.
9
В клиническом анализе крови - лейкоцитоз: лейкоциты - 12,3*10/л, СОЭ - 33 мм в час. При цитологическом исследовании мокроты выявлен воспалительный процесс (нейтрофилы 44%), небольшая эозинофилия.
При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 2,40%, что подтверждает наличие НАБА.
К терапии БА добавлен антибактериальный препарат. На фоне антибактериальной терапии обострение заболевания купировано.
Заявляемый способ обладает простотой, безопасностью и достаточной информативностью при дифференциальной диагностике вариантов БА.