ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA TYPHIMURIUM, УСТОЙЧИВЫЙ К СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИНАМ И ТРИАЗОЛПИРИМИДИНАМ, ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ МУТАГЕННОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В ТЕСТЕ ЭЙМСА
SALMONELLA TYPHIMURIUM BACTERIA STRAIN RESISTANT TO SULPHONYLUREAS AND TRIAZOLPYRIMIDINES FOR DETECTION OF POTENTIAL MUTAGENICITY OF CHEMICALS IN THE AIMS TEST

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и генетической токсикологии, конкретно к клеткам живых культур, и касается создания нового мутантного штамма бактерий Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099, обладающего устойчивостью к высоким концентрациям сульфонилмочевин и триазолпиримидинов, который может быть использован в качестве тест-штамма для выявления потенциальной мутагенности химических веществ методом оценки обратных мутаций на бактериях (тест Эймса).
Уровень техники
Для оценки мутагенного потенциала химических соединений, применяемых в производстве товаров массового потребления, лекарственных препаратов, а также химических соединений, применяемых в сельском хозяйстве (как в открытом, так и в закрытом грунте), таких как пестициды и пр., используют тест Эймса. Тест Эймса - тест на мутагенность, в котором в качестве объекта тестирования применяют штаммы бактерий рода Salmonella - Salmonella typhimurium - ауксотрофы по гистидину.
Известно применение в тесте Эймса штаммов бактерий S. typhimurium ТА97, ТА98, ТА100 и ТА102 для биологической оценки мундштучной бумаги для сигарет [CN 102095842, 2011], а также штаммов бактерий S. typhimurium ТА98 и ТА100 для выявления мутагенности конденсата сигаретного дыма. Известно применение в тесте Эймса штаммов бактерий S. typhimurium ТА98 для оценки мутагенности красителей, применяемых в производстве товаров массового потребления [JPH 11124510, 1999]. Также известно применение в тесте Эймса индикаторных культур (тест-штаммов) S. typhimurium для оценки мутагенной активности лекарственных препаратов, например, противоопухолевого препарата глицифон [Г.В. Черепнев, И.В. Шалашова, А.А. Муслинкин, Б.М. Куриненко. Ученые записки Казанского государственного университета. Серия: Естественные науки. 2008, том 150, кн.2, с. 251-257].
Кроме того, бактерии S. typhimurium используют в качестве тест-микроорганизмов для оценки бактерицидной активности дезинфицирующих средств [ГОСТ Р 56990-2016]. Также известно применение штаммов бактерий S. typhimurium (ТА1535; ТА1537 или ТА97, или ТА97а; ТА98; ТА100; ТА102) для оценки мутагенности пестицидов [МУ 1.2.3364-16 «Оценка мутагенной активности пестицидов»].
Производные сульфонилмочевин (СФМ) и триазолпиримидинов (ТАЛ) используются в сельском хозяйстве в качестве пестицидов (гербицидов). Кроме того, производные СФМ применяются в фармацевтической промышленности в производстве лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета 2 типа, таких как глибенкламид, гликвидон, гликлазид, глимепирид, глипизид, хлорпропамид [Регистр лекарственных средств России, https://www.rlsnet.ru/fg_index_id_292.htm; Недосугова Л.В. Препараты сульфонилмочевины в современной стратегии лечения сахарного диабета 2 типа. Сахарный диабет.2011:14(2):99-109. https://doi.org/10.14341/2072-0351-5645].
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является получение резистентного индикаторного штамма бактерий Salmonella typhimurium, обладающего устойчивостью к высоким концентрациям химических веществ из классов СФМ и ТАП; расширение номенклатуры микроорганизмов, которые могут быть использованы в тесте Эймса для оценки мутагенности химических веществ из классов СФМ и ТАП, а также для подтверждения эквивалентности технических продуктов пестицидов указанных химических классов оригинальным действующим веществам по критерию «мутагенность».
Раскрытие изобретения
Поставленная задача решалась путем создания резистентного индикаторного штамма Salmonella typhimurium, устойчивого к высоким концентрациям СФМ и ТАП.
Для получения резистентного индикаторного штамма в качестве исходной родительской культуры использован штамм из коллекции Национального Биоресурсного Центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) Salmonella typhimurium ТА100 под регистрационным номером ВКПМ В-5300 (hisG46, rfa del, uvrB-bio, pKm101 Ap-r), применяемый в тесте Эймса для оценки мутагенности химических веществ.
Использован метод селекции, основанный на ступенчатом культивировании исходного микроорганизма в присутствии возрастающих концентраций антибактериального агента как селективного фактора. В качестве селективного фактора -цитотоксичного агента - применен тифенсульфуронметил (ТФСМ).
Путем ступенчатого отбора индуцированных мутантов получен новый, оригинальный, устойчивый (резистентный) к СФМ и ТАП штамм Salmonella typhimurium ТА100 SFmut_plsmd+. Штамм депонирован в НБЦ ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ В-14099 и характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические особенности заявляемого штамма Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+).
Морфология колоний штамма на среде LB через 24 часа роста: колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка бежевые, диаметром 2-3 мм, непрозрачные с однородной структурой, поверхность гладкая, блестящая, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.
Морфология колоний штамма на среде ГРМ через 24 часа роста: колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка бежевые, диаметром 3-4 мм, непрозрачные с однородной структурой, поверхность гладкая, блестящая, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.
Морфология колоний штамма на среде ГМФ через 24 часа роста: колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка сероватые, диаметром 3-4 мм, поверхность гладкая, блестящая, непрозрачные с однородной структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.
Морфология колоний штамма на среде Эндо через 24 часа роста: колонии округлые, выпуклые с ровным краем, темно-пурпурного цвета, диаметром 2-3 мм, поверхность гладкая, блестящая, непрозрачные с однородной структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.
Морфология колоний штамма на висмут-сульфит агаре через 48 часов роста: колонии округлые с приподнятым центром и валиком по краям, темно-зеленые, диаметром 1-3 мм, поверхность гладкая, без металлического блеска, непрозрачные с однородной структурой и ровным краем, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, среда под колонией слегка прокрашена.
Морфология колоний штамма на SS-arape (сальмонелла-шигелла агар) через 48 часов роста: колонии округлые, выпуклые с приподнятым центром и радиальной складчатостью края, бежевые, по краям более светлые, диаметром 4-5 мм, непрозрачные с зернистой структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, среда под колонией слегка прокрашена.
Морфология колоний штамма на среде Плоскирева через 48 часов роста: колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка бежевые, диаметром 3-4 мм, поверхность гладкая, блестящая, непрозрачные с однородной структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.
4
6
5
7
3
2
2
4
2
2
4
4
2
4
Морфология колоний штамма на среде GM через 48 часов роста: колонии округлые с приподнятым центром и валиком по краям, бесцветные с бежевым оттенком, диаметром 2-3 мм, непрозрачные с однородной структурой, поверхность гладкая, блестящая, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют. Среда Gm: 2% водный агар (750 мл), солевой концентрат (рН 7,2-7,4) (40 мл), 20% раствор глюкозы (20 мл), 1% раствор MgSO (12 мл), 0,2% биотин (2 мл), 0,5% гистидин (8 мл). Солевой концентрат: CHONa×НО - 10 г/л; KHPO×3НО - 210 г/л; KHPO - 90 г/л; аммоний сернокислый (NH)SO - 20 г/л; дистиллированная вода.
Физиолого-биохимические признаки микроорганизма
Аэроб/факультативный анаэроб, оптимальная температура для размножения 35-37°С. Оптимальный диапазон рН 7,2-7,4.
Способность штамма утилизировать различные субстраты оценена с помощью биохимического анализатора bioMerieux VITEK2 (Франция) и коммерческих дифференцирующих карт. Ферментирует D-глюкозу, кумарат, D-мальтозу, D-маннозу, D-тагатозу, D-трегалозу, D-маннит, D-сорбит, цитрат натрия. Микроорганизм подщелачивает сукцинат, L-лактат, не ассимилирует L-малат, L-лактат, L-гистидин, L-арабит, адонитол; неустойчив к вибриостатическому агенту O/129; не образует сероводород, сбраживает глюкозу. Имеет место отсутствие ферментативной активности в тестах на утилизацию малоната, 5-кето-D-глюконата, палатинозы, D-целлобиозы, сахарозы. Тест Эллмана отрицательный. Отрицательная реакция на идентификационный субстрат (отсутствие ферментативной реакции) Ala-Phe-Pro-ариламидазы; L-пролинариламидазы; глицинар ил амидазы; Glu- Gly- Arg-ариламидазы; L-пирролидон-ариламидазы; глютамилариламидазы pNA; бета-аланинариламидазы pNA; альфаглюкозидазы; бета-глюкозидазы; бета-N-ацетил-глюкозаминидазы; бета-N-ацетилгалактозаминидазы; липазы; гамма-глютамил-трансферазы; бета-ксилозидазы; бета-глюкуронидазы; альфа-галактозидазы; бета-галактоз идазы; уреазы. Наличие позитивной активности орнитидин-декарбоксилазы; лизиндекарбоксилазы; фосфотазы. Неустойчивая активность тирозинариламидазы.
Техническим результатом является создание нового мутантного штамма бактерий Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+), обладающего устойчивостью к высоким концентрациям СФМ и ТАП, который может быть использован в тесте Эймса для выявления потенциальной мутагенности химических веществ.
Новый штамм S. typhimurium ВКПМ В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+) по настоящему изобретению обладает целевыми свойствами (учет мутационных событий), но при этом имеет очевидные преимущества в сравнении с родительским штаммом S.typhimurium ВКПМ В-5300 (ТА100).
Так, исходный штамм S. typhimurium ВКПМ В-5300 (ТА100) чувствителен к действию цитотоксичных технических продуктов пестицидов класса СФМ (например, римсульфурон, тифенсульфурон-метил, метсульфурон-метил, триасульфурон, хлорсульфурон) и класса ТАП (например, пеноксулам, флорасулам), максимальные нецитотоксичные концентрации которых не превышают 0,05-0,125 мг/чашка, что не позволяет оценить потенциальную мутагенность пестицида за счет примесей, присутствующих в небольших количествах. Напротив, применение нового мутантного резистентного штамма S. typhimurium ВКПМ В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+) при оценке химических соединений классов СФМ и ТАП позволяет проводить тестирование в диапазоне доз вплоть до максимальной - 5 мг/чашка, рекомендованной руководством ОЭСР №471 [https://www.oecd.org/chemicalsafety/risk-assessment/1948418.pdf]. Следует отметить, что эта особенность нового резистентного штамма может иметь большое значение в фармацевтической промышленности для выявления мутагенности примесей в субстанциях лекарственных препаратов, в частности, производных СФМ.
Получение и использование штамма Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+) проиллюстрировано следующими примерами.
Культура S. typhimurium В-5300 (ТА100 (hisG46, rfa del, uvrB-bio, pKm101 Ap-r)) получена из НБЦ ВКПМ в лиофилизированном виде. Выделение, хранение и проверку генотипа культуры осуществляли согласно методике, описанной в [Mortelmans К., Zeiger Е. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2000; 455 (1-2): 29-60].
В работе использованы следующие готовые коммерческие среды: ГМФ-агар (производитель ЗАО НИЦФ, Санкт-Петербург); ГРМ-агар, Эндо-ГРМ, Висмут-сульфит агар, среда Плоскириева, SS-arap, (производитель ФБУН ГНЦ МПБ, Оболенск).
При приготовлении питательных сред для культивирования родительского штамма в качестве селективного фактора использован технический продукт ТФСМ с содержанием основного вещества 97,4%, который растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО).
При генетическом анализе в состав агаризованной среды LB (15 г/л агара) включали ампициллин в концентрации 50 мкг/мл.
В таблицах 1-4 приведены некоторые примеры оценки мутагенной активности цитотоксичных соединений классов СФМ и ТАП лишь для иллюстрации технического результата применимости нового мутантного штамма по настоящему изобретению и его преимуществ по сравнению с родительской культурой.
Пример 1. Получение мутантного штамма Salmonella typhimurium В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+), устойчивого к действию СФМ.
Исходный штамм Salmonella typhimurium В-5300 (ТА100) из замороженной рабочей культуры засевали на жидкую LB-среду (1,25%, об/об) следующего состава (г/л): пептон -10; дрожжевой экстракт 5; NaCl 10; дистиллированная вода. Инкубировали при 37°С без встряхивания в течение 16 час. Полученный инокулят вносили (5%, об./об) в жидкую LB-среду, содержащую 0,5 мг/мл ТФСМ, и культивировали при 37°С и встряхивании при 140 об/мин в течение 3 час до плотности приблизительно 2,0 ОпЕд.
Культуральную жидкость (КЖ) высевали на агаризованную среду ГМФ (ЗАО «НИЦФ»), содержащую ТФСМ (0,05-5,0 мг/чашка). Штамм (100 мкл) вносили на плотную ростовую среду в верхнем агаре без гистидина и биотина (1,5 мл), содержащем 0,2 М калий фосфатный буфер (500 мкл) и 50-100 мкл раствора ТФСМ в концентрациях 0,5; 1,25; 2,5 или 5,0 мг/чашка. В качестве контроля вносили 100 мкл ДМСО. После инкубации в течение 21 час при 37°С оценивали визуально рост культуры на чашках. Для последующей селекции использовали вариант с максимальной нагрузкой ТФСМ: 0,5 мг/чашка в плотной среде + 5,0 мг/чашка в составе верхнего агара.
Оценка спонтанного фона мутирования штамма S. typhimurium В-5300 (ТА100), выращенного в присутствии ТФСМ, показала, что число спонтанных ревертантов (91±2) укладывается в диапазон колебаний исторического контроля для родительского штамма. Но колонии по сравнению с родительским штаммом были мельче, скорость роста культуры на селективном агаре - медленнее.
Последующая селекция включала несколько этапов пассирования культуры на богатых и голодных питательных средах, содержащих возрастающие концентрации ТФСМ, с инкубацией при 37°С. Отбирали колонии с лучшими фенотипическими признаками (размер колонии, ее форма).
Клетки микроорганизма после ресуспендирования в стерильной дистиллированной воде (0,7 ОпЕд), засевали на твердую ГРМ среду, содержащую ТФСМ (25 мг/чашка), и инкубировали в течение 16,5 час. Полученную культуру петлей переносили в жидкую LB-среду с 1,0 мг/мл ТФСМ (инкубация 15 час при перемешивании 130 об/мин до плотности 3,5 ОпЕд) с последующим разведением КЖ 1:50 и высевом на Gm-среду [Mortelmans К. and Zeiger Е. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research 455 (2000) 29-60], содержащую 13 - 113 мг ТФСМ на чашку. Для последующей селекции использовали культуру, выращенную на твердой голодной среде, содержащей ТФСМ (35 мг /чашка). После хранения в течение 2 мес.при 4-6°С мутантный штамм повторно пассировали штрихом на Gm среду с ТФСМ (35 мг/чашка), культивировали в течение 4 суток при 37°С. Полученную культуру мутантного штамма обозначили как S. typhimurium ТА100 SFmutj»lsmd+.
Пример 2. Оценка мутантного штамма S. typhimurium ТА100 SFmut_plsmd+на соответствие генетическим характеристикам и устойчивости к высоким концентрациям ТФСМ в тесте Эймса.
Оценка фенотипа мутантного штамма S. typhimurium ТА100 SFmut_plsmd+включала проверку ауксотрофности по гистидину, наличие/отсутствие плазмид R-фактора, присутствие специфических мутаций rfa и uvrB, анализ спонтанного фона реверсии и получение доказательств выраженной дозозависимой активности соединений с доказанной мутагенностью в условиях метаболической активации и без нее.
Аликвоты КЖ после культивирования на среде LB хранили при минус 80°С с использованием 1% ДМСО в качестве крио протектор а и использовали в дальнейшем для получения рабочих культур.
Пример 3. Сравнительная оценка мутагенной активности химических соединений родительским штаммом Salmonella typhimurium В-5300 (ТА100) и штаммом Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+).
При оценке мутагенной активности химических соединений использовали стандартный чашечный тест Эймса без метаболической активации и в присутствии микросомной активирующей смеси с содержанием постмитохондриальной фракции (S9) 20-30% (15-22 мг/мл белка) [Egorova O.V., Ilyushina N.A., Rakitskii V.N. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicology in Vitro. 2020. T. 69. C. 105006].
Тестировали технические продукты действующих веществ пестицидов: тифенсульфуронметил (97,4%), метсульфуронметил (96,2%), триасульфуронметил (98,0%), хлорсульфурон (95,0%), каптан (95,1%), тирам (95,2%), диметоат (98,7%), дикват (40,8%), флорасулам (98,1%), цимоксанил (98,5%), римсульфурон (98,3%), пеноксулам (98,5%).
3
В качестве отрицательного контроля использовали варианты с растворителем (ДМСО). Положительными контролями служили 2-аминоантрацен (2АА) и азид натрия (NaN).
Соединение рассматривали, как цитотоксичное, если имело место 40% снижение фона спонтанного мутирования [A. Hamel, M.Roy, R. Proudlock. The bacterial reverse mutation test. Chapter 4. In Genetic Toxicology Testing. A Laboratory Manual. 2016]. Вещество считали мутагенным согласно критериям, описанным в [Egorova O.V., Ilyushina N.A., Rakitskii V.N. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicology in Vitro. 2020. T. 69. C. 105006].
Статистическую обработку проводили с помощью программы SPSS Statistics v.22.0 (Корпорация IBM, Нью-Йорк, США). Для оценки результатов, полученных в тесте Эймса, использовали t-тест для независимых выборок (для сравнения двух групп), тест Даннетта (для трех и более групп). Различия между группами считали статистически значимыми при р≤0,05.
Результаты сравнительной оценки мутагенной активности некоторых цитотоксичных действующих веществ пестицидов классов СФМ ии ТАП родительским штаммом Salmonella typhimurium В-5300 (ТА100) и штаммом Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+) по настоящему изобретению представлены в таблицах 1-4.