ИНГИБИТОРЫ КИНАЗЫ, ИХ ПРОЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПИИ
KINASE INHIBITORS, PRODRUG FORMS THEREOF AND USE THEREOF IN THERAPY

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к ингибиторам киназы, к ингибиторам киназы в форме пролекарства, к содержащим их композициям и лекарственным средствам, и к способам получения и применения таких ингибиторов, композиций и лекарственных средств.
Уровень техники
Киназы представляют большое семейство ферментов, которые катализируют фосфорилирование белков, липидов и метаболитов и играют центральную роль в регуляции широкого ряда клеточных процессов. Аномальную киназную активность связывают с широким рядом расстройств, включая рак. Это привело к разработке ингибиторов киназы в качестве терапевтических средств.
Настоящее изобретение в целом относится к соединениям, обладающим активностью в качестве ингибиторов киназы, включая формы их пролекарств, а также к применению таких соединений в терапии.
Сущность изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает ингибитор киназы формулы I:
где либо:
1
(1) R представляет собой H, и
2
3
(a) R представляет собой (3-хлорбензил)окси-, и R представляет собой хлор;
2
3
(b) R и R, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют 1-(3-фторбензил)-1Н-пиразол;
2
3
(c) R представляет собой 2-пиридинилметокси, и R представляет собой хлор;
2
3
(d) R и R оба представляют собой хлор;
2
3
(e) R представляет собой хлор, и R представляет собой бром;
2
3
(f) R и R оба представляют собой бром;
2
3
(g) R представляет собой фтор, и R представляет собой этинил;
2
3
(h) R представляет собой хлор, и R представляет собой этинил;
2
3
(i) R представляет собой бром, и R представляет собой этинил;
2
3
2
3
(j) за исключением тех случаев, когда R находится в 3-положении в сочетании с R в 4-положении, R представляет собой бром и R представляет собой фтор;
2
3
(k) R представляет собой 2-пиридинилметокси и R представляет собой фтор; или
2
3
(l) R представляет собой 2-пиридинилметокси и R представляет собой бром; либо
1
2
3
1
2
3
2
4
1
2
3
1
2
3
(2) по меньшей мере один из R, R и R выбран из бензилокси, 3-хлорбензилокси и 2-пиридинилметокси, и когда по меньшей мере один из R, R и R не является бензилокси, 3-хлорбензилокси или 2-пиридинилметокси, каждый из остальных независимо выбран из H, галогена и C-C алкинила, при условии, что когда один из R, R и R представляет собой бензилокси или 2-пиридинилметокси, другие два из R, R и R не могут представлять собой H; либо
1
2
3
2-
4
(3) два из R, R и R, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют 1-(3-фторбензил)-1H-пиразол, а оставшийся выбран из H, галогена и CC алкинила;
или его фармацевтически приемлемую соль или сольват.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ингибиторы киназы формулы IA
1
где R представляет собой H, и либо
2
3
(a) R представляет собой (3-хлорбензил)окси-, и R представляет собой хлор;
2
3
(b) R и R, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют 1-(3-фторбензил)-1H-пиразол;
2
3
(c) R представляет собой 2-пиридинилметокси, и R представляет собой хлор;
2
3
(d) R и R оба представляют собой хлор;
2
3
(e) R представляет собой хлор, и R представляет собой бром;
2
3
(f) R представляет собой бром, и R представляет собой хлор;
2
3
(g) R и R оба представляют собой бром;
2
3
(h) R представляет собой фтор, и R представляет собой этинил;
2
3
(i) R представляет собой хлор, и R представляет собой этинил;
2
3
(j) R представляет собой бром, и R представляет собой этинил;
2
3
(k) R представляет собой бром, и R представляет собой фтор;
2
3
(l) R представляет собой 2-пиридинилметокси, и R представляет собой фтор; либо
2
3
(m) R представляет собой 2-пиридинилметокси, и R представляет собой бром;
и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты.
Предпочтительно, ингибитор киназы выбран из следующих:
(2E)-N-(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)-4-(диметиламино)-2-бутенамид (1),
(2E)-4-(диметиламино)-N-(4-{[1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)-2-бутенамид (2),
(2E)-N-{4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}-4-(диметиламино)-2-бутенамид (3),
(2E)-N-[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (4),
(2E)-N-[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (5),
(2E)-N-[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (6),
(2Е)-N-[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (7),
(2Е)-4-(диметиламино)-N-[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-2-бутенамид (8),
(2E)-N-[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (9),
(2E)-N-[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (10),
(2Е)-N-[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (11),
(2E)-4-(диметиламино)-N-{4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}-2-бутенамид (89) и
(2E)-N-{4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}-4-(диметиламино)-2-бутенамид (90);
и их фармацевтически приемлемых солей и гидратов.
Структуры перечисленных выше соединений представлены ниже:
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение ингибитора киназы формулы I, определенного выше, или его соли или сольвата для получения лекарственного средства.
В одном предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство представляет собой пролекарство, и соединение формулы I или его соль или сольват связаны с восстановительным пусковым механизмом (триггером).
В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает восстановительное пролекарство, включающее ингибитор киназы формулы I, определенный выше, или его соль или сольват и восстановительный триггер, связанный непосредственно или опосредованно с азотом ингибитора киназы.
В некоторых вариантах осуществления восстановительный триггер имеет формулу II:
5
1
6
4
2
где * представляет собой точку присоединения к атому азота указанного ингибитора киназы, и где в Формуле II R выбран из C-C алкила, и R выбран из H, метила, этила, трифторметила, -CN, -CONH и пропин-1-ила.
В некоторых вариантах осуществления восстановительный триггер выбран из группы, включающей формулы IIa-IIg:
5
В некоторых вариантах осуществления R выбран из метила, этила и пропила, предпочтительным является метил.
5
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления восстановительный триггер имеет формулу IIa, где R выбран из метила, этила и пропила.
5
Наиболее предпочтительно, восстановительный триггер имеет формулу IIa, где R выбран из метила.
В одном варианте осуществления пролекарство представляет собой соединение формулы III:
1
2
3
4
2
5
1
6
где X представляет собой любой отрицательно заряженный противоион, R, R и R имеют значения, определенные для формулы I, R выбран из H, метила, этила, трифторметила, -CN, -CONH и пропин-1-ила, и R представляет собой C-C алкил.
В некоторых вариантах осуществления пролекарство представляет собой соединение формулы IIIA
1
2
3
4
2
где X представляет собой любой отрицательно заряженный противоион, R, R и R имеют значения, определенные для формулы I, и R выбран из H, метила, этила, трифторметила, -CN, -CONH и пропин-1-ила.
Еще в одном варианте осуществления пролекарство представляет собой соединение формулы IIIB
1
2
3
4
2
где X представляет собой любой отрицательно заряженный противоион, R, R и R имеют значения, определенные для формулы IA, и R выбран из H, метила, этила, трифторметила, -CN, -CONH и пропин-1-ила.
В предпочтительных вариантах осуществления X выбран из галогенида (фторида, хлорида, бромида, иодида), метансульфоната, трифторметансульфоната, ацетата, трифторацетата, тозилата, лактата, цитрата и формиата.
Более предпочтительно, X представляет собой галогенид, при этом наиболее предпочтительным является бромид.
Предпочтительно, соединение формулы III выбрано из следующих:
(2E)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (12),
(2E)-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1H-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (13),
(2E)-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1H-имидазол-5-ил)метил]-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1Н-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (14),
(2E)-4-({4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (15),
(2E)-4-{[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1H-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (16),
(2E)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (17),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (18),
(2Е)-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (19),
(2Е)-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (20),
(2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (21),
(2Е)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (22),
(2Е)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (23),
(2Е)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (24),
(2Е)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (25),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (26),
(2Е)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (27),
(2Е)-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1Н-имидазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (28),
(2E)-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1H-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (29),
(2E)-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1Н-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (30),
(2E)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-5-ил]метил}-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (31),
(2E)-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1H-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (32),
(2Е)-4-({4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (33),
(2Е)-4-({4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (34),
(2Е)-4-({4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (35),
(2Е)-4-({4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (36),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-5-ил]метил}-4-({4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (37),
(2Е)-4-({4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (38),
(2Е)-4-({4-[3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (39),
(2Е)-4-({4-[3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (40),
(2Е)-4-{[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (41),
(2Е)-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-5-ил)метил]-4-{[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (42),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (43),
(2Е)-4-{[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (44),
(2Е)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (45),
(2Е)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (46),
(2Е)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (47),
(2Е)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (48),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (49),
(2Е)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (50),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (51),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (52),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (53),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (54),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (55),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (56),
(2Е)-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (57),
(2Е)-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (58),
(2Е)-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (59),
(2Е)-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (60),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (61),
(2Е)-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (62),
(2Е)-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (63),
(2Е)-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (64),
(2Е)-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (65),
(2Е)-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (66),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (67),
(2Е)-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (68),
(2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (69),
(2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (70),
(2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (71),
(2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (72),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (73),
(2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (74),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (75),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (76),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (77),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (78),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (79),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (80),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (81),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (82),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (83),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (84),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (85),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (86),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-{[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (87),
(2Е)-4-{[4-(4-бром-3-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (88),
(2Е)-4-({4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (91),
(2Е)-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-({4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]-пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (92),
(2Е)-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-({4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]-пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (93),
(2Е)-4-({4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (94),
(2Е)-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-({4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]-пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (95),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-({4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (96),
(2Е)-4-({4-[3-фтор-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (97),
(2Е)-4-({4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (98),
(2Е)-4-({4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (99),
(2Е)-4-({4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N-[(2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (100),
(2Е)-4-({4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(трифторметил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (101),
(2Е)-4-({4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N-[(2-циано-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (102),
(2Е)-N-{[2-(аминокарбонил)-1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-({4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (103) и
(2Е)-4-({4-[3-бром-4-(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-{[1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазол-5-ил]метил}-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (104).
Структуры перечисленных выше соединений в форме пролекарств представлены ниже:
В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение формулы I или его соль или сольват, определенные выше, восстановительное пролекарство, определенное выше, или соединение формулы III или его соль или сольват, определенные выше, для применения в терапии.
В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие соединение формулы I или его соль или сольват, определенные выше, восстановительное пролекарство, определенное выше, или соединение формулы III или его соль или сольват, определенные выше, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами или разбавителями.
В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения, который включает стадию введения терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его соли или сольвата, определенных выше, восстановительного пролекарства, определенного выше, или соединения формулы III или его соли или сольвата, определенных выше, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Предпочтительно, способ лечения представляет собой лечение рака.
В следующем аспекте изобретение обеспечивает способ ингибирования киназной активности у субъекта, который включает стадию введения указанному субъекту ингибирующего количества соединения формулы I или его соли или сольвата, определенных выше, восстановительного пролекарства, определенного выше, или соединения формулы III или его соли или сольвата, определенных выше.
Предпочтительно, указанное ингибирование киназной активности осуществляют для терапевтических целей, включая противораковое назначение.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения противоракового эффекта у теплокровного животного, такого как человек, при этом способ включает введение животному эффективного количества соединения формулы I или его соли или сольвата, определенных выше, восстановительного пролекарства, определенного выше, или соединения формулы III или его соли или сольвата, определенных выше.
В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения противоракового эффекта в клетке, при этом способ включает контактирование клетки с эффективным количеством соединения формулы I или его соли или сольвата, определенных выше, восстановительного пролекарства, определенного выше, или соединения формулы III или его соли или сольвата, определенных выше.
В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака у теплокровного животного, такого как человек, который включает введение животному эффективного количества соединения формулы I или его соли или сольвата, определенных выше, восстановительного пролекарства, определенного выше, или соединения формулы III или его соли или сольвата, определенных выше.
Несмотря на то, что настоящее изобретение в широком смысле определено выше, оно не ограничивается этим и также включает варианты осуществления, примеры которых описаны ниже.
Краткое описание фигур
Настоящее изобретение далее описано более подробно со ссылкой на прилагаемые фигуры, представляющие следующее:
Фиг. 1 представляет средний рост H1975 опухоли после q3dx4 лечения ингибиторами киназы 1, 2, 3 (n=3);
Фиг. 2 представляет средний рост H1975 опухоли после q3dx4 лечения ингибиторами киназы 4, 5 (n=3);
Фиг. 3 представляет средний рост H1975 опухоли после q3dx4 лечения ингибиторами киназы 7, 8 (n=3-4);
Фиг. 4 представляет средний рост A431 опухоли после q3dx4 лечения ингибиторами киназы 5, 6, 9 (n=3);
Фиг. 5 представляет средний рост H1975 опухоли после q3dx4 лечения пролекарствами 12, 13, 15 (n=3);
Фиг. 6 представляет средний рост H1975 опухоли после q3dx4 лечения пролекарствами 16, 17 (n=3);
Фиг. 7 представляет средний рост H1975 опухоли после q3dx4 лечения пролекарствами 19, 20 (n=3-4);
Фиг. 8 представляет средний рост A431 опухоли после q3dx4 лечения пролекарствами 17, 18, 21 (n=3);
Фиг. 9 представляет средний рост H1975 опухоли после q3dx4 лечения пролекарством 15 и родственным ему ингибитором киназы 3 (n=3);
Фиг. 10 представляет средний рост (A) и средний рост (B) H1975 опухоли после q3dx4 лечения пролекарством 17 и родственным ему ингибитором киназы 5 (n=3);
Фиг. 11 представляет средний рост H1975 опухоли после лечения пролекарством 17 при q3dx4, q5dx4 и q7dx4 схемах введения (n=3);
Фиг. 12 демонстрирует ингибирование автофосфорилирования erbB1 (EGFR) и фосфорилирования p44/42 MAPK(Erk 1/2) в интактных A431 клетках после 1-часовой обработки различными концентрациями соединения 3;
Фиг. 13 демонстрирует ингибирование автофосфорилирования erbB1 (EGFR) и фосфорилирования p44/42 MAPK(Erk 1/2) в интактных A431 клетках после 1-часовой обработки различными концентрациями соединения 5;
Фиг. 14 демонстрирует ингибирование автофосфорилирования erbB1 (EGFR) и фосфорилирования p44/42 MAPK(Erk 1/2) в интактных A431 клетках после 1-часовой обработки различными концентрациями соединения 6; и
Фиг. 15 демонстрирует ингибирование автофосфорилирования erbB1 (EGFR) и фосфорилирования p44/42 MAPK(Erk 1/2) в интактных A431 клетках после 1-часовой обработки различными концентрациями пролекарства 15;
Фиг. 16 представляет график результатов зонного денситометрического анализа соответствующего (β-актин скорректированного) ингибирования автофосфорилирования erbB1 (EGFR) в интактных A431 клетках после 1-часовой обработки различными концентрациями пролекарства 15 и соединения 3.
Описание изобретения
Определения
1
6
2
2
1-
6
1-
6
2
2
1-
6
2
2
2
1-
6
Как это используется в настоящей заявке, термины "алкил" и "алкинил", если не указано иное, включают группы как с линейной, так и с разветвленной цепью, и незамещенные и замещенные группы. Необязательные заместители могут включать, без ограничения, галоген, С-С алкокси, CN, OH, NH, NO, NH(CC алкил), N(CC алкил), CONH, CO(CC алкил), SONH и SO(CC алкил).
"Противораковые эффекты" включают, но не ограничиваются этим, противоопухолевые эффекты, скорость ответа, время до прогрессирования заболевания и коэффициент выживаемости. "Противоопухолевые" эффекты включают, но не ограничиваются этим, ингибирование роста опухоли, задержку роста опухоли, регрессию опухоли, сокращение опухоли, увеличение времени до возобновления роста опухоли при остановке лечения и замедление прогрессирования заболевания.
"Эффективное количество" означает количество соединения, которое при введении субъекту для лечения рака является достаточным для обеспечения эффекта такого лечения рака. "Эффективное количество" может варьировать в зависимости от рака, подлежащего лечению, соединения, которое вводят, тяжести рака, который лечат, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, пути и формы введения, от того, является ли применяемое лечение монотерапией или комбинированной терапией, от суждения лечащего врача и других факторов.
"Фармацевтически приемлемый" означает полезный для получения фармацевтической композиции, которая в целом является безопасной, нетоксичной и не является ни биологически, ни каким-либо иным образом нежелательной, и включает вещество, которое является приемлемым для ветеринарии, а также в фармацевтике для человека.
"Фармацевтически приемлемые соли" соединения означает соли, которые являются фармацевтически приемлемыми, как определено в настоящей заявке, и которые обладают желаемой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают:
кислотноаддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и подобные; или образованные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, метансульфоновая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота и подобные; или
соли, образованные, когда кислотный протон, присутствующий в исходном соединении, либо замещают ионом металла, например, ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла или ионом алюминия; или координирует с органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают этаноламин, диэтаноламин, N-метилглюкамин, триэтаноламин и подобные. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид алюминия, гидроксид кальция, гидроксид калия, карбонат натрия и гидроксид натрия.
"Теплокровное животное" означает любой член класса млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, человека, отличных от человека приматов, таких как шимпанзе и другие виды человекообразных обезьян и обезьян, сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы и свиньи; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и т.п.
Соединения по настоящему изобретению
Как определено выше, в широком смысле, настоящее изобретение относится к соединениям, полезным в качестве ингибиторов киназы. Такие соединения применяют в терапии.
В одном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению представляют собой 4-анилинопиридо[3,4-d]пиримидиновые необратимые ингибиторы erbB1, 2, 4 киназы формулы I.
В другом варианте осуществления соединения включают ингибитор киназы формулы I и восстановительный триггер. Восстановительный триггер фрагментируется при восстановлении. Предпочтительно фрагментация триггера происходит на уровне восстановления одного электрона и эффективно подавляется присутствием кислорода, обеспечивая, таким образом, селективную активацию в гипоксических условиях. Эта супрессия кислородом может осуществляться через повторное окисление содержащего один электрон радикала кислородом, или путем окисления восстановительных промежуточных продуктов, необходимых для восстановления пролекарства. Последнее должно включать, например, активность кислорода как акцептора радиационно-индуцированных восстановительных радикалов, таких как гидратированный электрон, или окисление восстановительных промежуточных продуктов в каталитическом цикле редуктаз. Восстановительные эквиваленты, необходимые для восстановления триггера, могут обеспечиваться ферментами, радиационно-индуцированными радикалами или химическими восстановителями.
В предпочтительных формах триггер представляет собой восстановительно-активированный ароматический нитрогетероцикл или ароматический нитрокарбоциклический триггер, и является непосредственно связанным с кватернизируемым атомом азота соединения формулы I, таким образом, образуется четвертичный азот. Однако особенно предпочтительно, когда триггер имеет структуру формулы II, представленную выше.
В таких вариантах осуществления соединения действуют как пролекарства, с восстановлением триггера, высвобождающего ингибитор киназы. В настоящем изобретении наиболее предпочтительно, когда пролекарственные формы соединений по настоящему изобретению имеют формулу III, определенную выше.
Терапевтические применения соединений по настоящему изобретению
Соединения по настоящему изобретению находят применение в любом терапевтическом подходе, где ингибирование активности киназы является желательным. Настоящее изобретение поэтому относится к способам лечения и профилактики заболеваний, например, гиперпролиферативных, воспалительных расстройств и ангиогенеза, а также остеопороза у млекопитающих путем введения соединения по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, включающей одно или несколько соединений по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение, в частности, относится к способу лечения или профилактики рака и других гиперпролиферативных расстройств путем введения соединения по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, включающей одно или несколько соединений по настоящему изобретению, либо отдельно в виде монотерапии, либо в сочетании со вторым антипролиферативным средством.
ом
Необязательные антипролиферативные средства, которые также можно вводить, включают, но не ограничиваются этим, соединения, перечисленные в схемах химиотерапевтического лечения рака в 14 издании Merck Index (2006), который включен в настоящую заявку посредством ссылки, такие как аспарагиназа, блеомицин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, коласпаза, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин (адриамицин), эпирубицин, этопозид, 5-фторурацил, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, ифосфамид, иринотекан, лейковорин, ломустин, мехлорэтамин, 6-меркаптопурин, месна, метотрексат, митомицин C, митоксантрон, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, стрептозоцин, тамоксифен, тиогуанин, топотекан, винбластин, винкристин и виндезин.
Дополнительные антипролиферативные средства включают другие средства против молекулярных мишеней, которые модулируют параллельные пути, такие как ингибиторы MEK 1/2, ингибиторы AKT и ингибиторы mTOR, моноклональные антитела, оксалиплатин, гемцитабин, гефинитиб, таксотер, ara A, ara C, герцептин, BCNU, CCNU, DTIC и актиномицин D. Другие дополнительные антипролиферативные средства включают, но не ограничиваются этим, те соединения, которые признаны как подходящие для использования в лечении неопластических заболеваний в Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Eleventh Edition), editor Molinoff et al., publ. by McGraw-Hill, pages 1225-1287 (2006), который включен в настоящую заявку посредством ссылки, такие как аминоглутетимид, L-аспарагиназа, азатиоприн, 5-азацитидин кладрибин, бусульфан, диэтилстилбестрол, 2',2'-дифтордезоксицитидин, доцетаксел, эритрогидроксинониладенин, этинил эстрадиол, 5-фтордезоксиуридин, 5-фтордезоксиуридин монофосфат, флударабин фосфат, флуоксиместерон, флутамид, гидроксипрогестерон капроат, идарубицин, интерферон, медроксипрогестерон ацетат, мегестрол ацетат, мелфалан, митотан, паклитаксел, пентостатин, N-фосфоноацетил-L-аспартат (PALA), пликамицин, семустин, тенипозид, тестостерон пропионат, тиотепа, триметилмеламин, уридин и винорелбин.
Рак и гиперпролиферативные расстройства, как это используется в настоящей заявке, включают, но не ограничиваются этим, солидные опухоли, такие как рак молочной железы, дыхательных путей, головного мозга, репродуктивных органов, пищеварительного тракта, мочевых путей, глаза, печени, кожи, головы и шеи, щитовидной железы, паращитовидной железы и их отдаленные метастазы. Такие расстройства также включают лимфомы, саркомы и лейкозы.
in situ
in situ
Примеры рака молочной железы включают, но не ограничиваются этим, инвазивную дуктальную карциному, инвазивную лобулярную карциному, дуктальную карциному  и лобулярную карциному .
Примеры рака дыхательных путей включают, но не ограничиваются этим, мелкоклеточную и немелкоклеточную карциному легкого, а также бронхиальную аденому и плевропульмонарную бластому.
Примеры рака головного мозга включают, но не ограничиваются этим, глиому ствола головного мозга и гипоталамуса, церебеллярную и церебральную астроцитому, медуллобластому, эпендимому, а также нейроэктодермальную и пинеальную опухоль.
Опухоли мужских репродуктивных органов включают, но не ограничиваются этим, рак предстательной железы и тестикулярный рак.
Опухоли женских репродуктивных органов включают, но не ограничиваются этим, эндометриальный, цервикальный, овариальный, вагинальный рак и рак наружных половых органов, а также саркому матки.
Опухоли пищеварительного тракта включают, но не ограничиваются этим, анальный рак, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак пищевода, желчного пузыря, желудка, поджелудочной железы, прямой кишки, тонкого кишечника и слюнной железы.
Опухоли мочевых путей включают, но не ограничиваются этим, рак мочевого пузыря, полового члена, почки, почечных лоханок, мочеточника и уретры.
Раковые заболевания глаз включают, но не ограничиваются этим, внутриглазную меланому и ретинобластому.
Примеры рака печени включают, но не ограничиваются этим, гепатоцеллюлярную карциному (гепатоклеточные карциномы с или без фиброламеллярного варианта), холангиокарциному (карциному внутрипеченочных желчных протоков) и гепатоцеллюлярную холангиокарциному смешанного типа.
Раковые заболевания кожи включают, но не ограничиваются этим, сквамозноклеточную карциному, саркому Капоши, злокачественную меланому, рак кожи с участием клеток Меркеля и немеланомный рак кожи.
Раковые заболевания головы и шеи включают, но не ограничиваются этим, ларингеальный/гипофарингеальный/
назофарингеальный/орофарингеальный рак, а также рак губы и ротовой полости.
Лимфомы включают, но не ограничиваются этим, связанную со СПИД лимфому, неходжскинскую лимфому, кожную Т-клеточную лимфому, болезнь Ходжкина и лимфому центральной нервной системы.
Саркомы включают, но не ограничиваются этим, саркому мягкой ткани, остеосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, лимфосаркому и рабдомиосаркому. Лейкозы включают, но не ограничиваются этим, острый миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и волосистоклеточный лейкоз.
Эти расстройства были подробно охарактеризованы как расстройства человека, но также существуют с подобной этиологией у других теплокровных животных, и их можно лечить при помощи фармацевтических композиций по настоящему изобретению.
Состояния человека или другого теплокровного животного, которое можно лечить путем введения соединения по настоящему изобретению, включают рост опухоли, ретинопатию, включая диабетическую ретинопатию, ишемическую окклюзию ретинальной вены, ретролетальную фиброплазию и возрастную дегенерацию желтого пятна; псориаз или буллезное расстройство, связанное с образованием субэпидермальных волдырей, включая буллезный пемфигоид, мультиформную эритему, или герпетический дерматит, ревматоидный артрит, остеоартрит, септический артрит, опухолевые метастазы, заболевание периодонта, корнеальные язвы, протеинурию, коронарный тромбоз, вызванный атеросклеротическими бляшками, аневризму аорты, дистрофобный врожденный буллезный эпидермолиз, дегенерацию хряща после травматического поражения сустава, остеопении, опосредованные активностью MMP, заболевание височных-нижнечелюстных суставов или демиелинизирующее заболевание нервной системы.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что в каждом конкретном способе лечения используют выбранный путь введения, который, в свою очередь, зависит от различных факторов, которые учитываются должным образом при введении терапевтических средств. Специалистам в данной области также должно быть понятно, что оптимальный курс лечения, т.е. режим лечения и суточное количество доз соединения по настоящему изобретению, вводимого в течение определеного количества дней, определяет специалист в данной области с использованием традиционных испытаний.
Терапевтические дозы должны быть, насколько это возможно, в пределах от 1 мг до 3000 мг в день. Конкретный уровень доз, выбираемый для каждого конкреного пациента, зависит от различных факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, режим питания, время введения, путь введения и скорость выведения из организма, сочетание лекарственных средств и тяжесть состояния, подлежащего лечению.
Фармацевтические композиции соединений по настоящему изобретению
Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции, включающие соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Соединения можно вводить пероральным, местным, парентеральным путем, при помощи ингаляции или спрея или ректальным путем с использованием препаратов, включающих единицы дозирования. Термин 'введение путем инъекции' включает внутривенную, внутримышечную, подкожную и парентеральную инъекции, а также введение при помощи инфузии. Одно или несколько соединений могут присутствовать в сочетании с одним или несколькими нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями и, если это желательно, другими активными ингредиентами.
Композиции, предназначенные для перорального применения, можно получить в соответствии с любым подходящим способом, известным в области получения фармацевтических композиций. Такие композиции могут содержать одно или несколько веществ, выбранных из группы, включающей разбавители, подсластители, отдушки, красители и консерванты, чтобы обеспечить приятные на вид и вкус препараты. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые являются подходящими для получения таблеток. Эти эксципиенты могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие вещества и разрыхлители, например, кукурузный крахмал или альгиновую кислоту; и связующие, например, стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Таблетки могут быть без покрытия, или они могут иметь покрытие, нанесенное известными способами для замедления разложения и адсорбции в желудочно-кишечном тракте и обеспечения, таким образом, замедленного действия в течение более длительного времени. Например, можно использовать вещество, задерживающее время высвобождения, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Эти соединения также можно получить в твердой форме быстрого высвобождения.
Композиции для перорального применения также могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, при этом активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, при этом активный ингредиент смешан с водной или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.
Водные суспензии содержат активные вещества в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водных суспензий. Такие эксципиенты включают суспендирующие вещества, например, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие вещества могут включать природный фосфатид, например, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, образованными из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, образованными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, полиэтиленсорбитанмоноолеат. Водные суспензии также могут содержать один или несколько консервантов, например, этил или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, одну или несколько отдушек и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии при добавлении воды, обеспечивают активный ингредиент в смеси с диспергирующим или смачивающим веществом, суспендирующим веществом и одним или несколькими консервантами. Примеры подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ представлены выше. Также могут присутствовать дополнительные эксципиенты, например, подсластители, отдушки и красители.
Соединения также могут быть в форме неводной жидкой композиции, например, масляных суспензий, которые можно сформулировать путем суспендирования активных ингредиентов в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или масле земляного ореха, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Можно добавить подсластители, такие как указанные выше, и отдушки для обеспечения приятных на вкус пероральных препаратов. Эти композиции можно сохранить при добавлении антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут быть в форме эмульсий масло-в-воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, например, оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например, жидкий парафин, или смесь таких веществ. Подходящие эмульгаторы могут представлять собой природные смолы, например, аравийскую камедь или трагакантовую камедь, природные фосфатиды, например, соевые бобы, лецитин и сложные эфиры или неполные эфиры, образованные из жирных кислот и ангидридов гексита, например, сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсии также могут содержать подсластители и отдушки.
Сиропы и эликсиры могут быть сформулированы с подсластителями, например, глицерином, пропиленгликолем, сорбитом или сахарозой. Такие композиции также могут содержать уменьшающее раздражение средство, консервант и отдушку и красители.
Соединения также можно вводить в форме суппозиториев для ректального введения лекарственного средства. Такие композиции можно получить путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре, и поэтому будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие вещества включают масло какао и полиэтиленгликоли.
Получение пролекарств по настоящему изобретению в форме соли четвертичного азота
Пролекарственные соединения по настоящему изобретению включают эффекторную часть, связанную с восстановительным триггером, который предпочтительно представляет собой нитрогетероциклический восстановительный триггер формулы II, более предпочтительно формулы IIa, определенной выше.
Эффекторная часть представляет собой 4-анилинопиридо[3,4-d]пиримидиновый необратимый ингибитор киназы erbB1, 2, 4 формулы I.
4-анилинопиридо[3,4-d]пиримидиновые необратимые ингибиторы киназы erbB1, 2, 4 формулы I содержат амидный акцептор Михаэля в 6-положении, при этом акцептор Михаэля обладает такой отличительной особенностью, как двойная связь, которая замещена по бета-углероду метиленовой группой, которая заканчивается группой третичного диметиламина, как показано ниже.
Должно быть понятно, что та остальная часть из эффекторной части, которая не показана в формуле Iva, содержит бициклическую ароматическую кольцевую структуру, определенную в формуле I.
Предпочтительные пролекарственные соединения представляет собой соединения формулы III, определенные выше. Как правило, предпочтительные пролекарственные соединения формулы III можно получить путем кватернизации алифатической содержащей третичный диметиламин эффекторной части при помощи части, представляющей собой нитрогетероциклический восстановительный триггер. Такие способы описаны более подробно ниже.
Получение 4-анилинопиридо[3,4-d]пиримидиновых необратимых ингибиторов киназы erbB1, 2, 4
Эффекторные соединения, родственные соединениям формулы I, представленной выше, где центральная структура ингибитора представляет собой 4-анилинопиридо[3,4-d]пиримидин и 6-положение замещено амидным акцептором Михаэля, можно получить в соответствии со способами, описаными в предшествующем уровне техники, когда амидный акцептор Михаэля, например, является незамещенным (Smaill et al. J Med Chem, 1999, 42, 1803-1815), замещен в N-положении, альфа-положении или бета-положении рядом групп (Smaill et al. J Med Chem, 2001, 44, 429-440) за исключением диметиламинометилена, описанного выше, и когда акцептор Михаэля содержит тройную связь, замещенную в бета-положении (Klutchko et al. J Med Chem, 2006, 49, 1475-1485; U.S. Pat. No. 6,602,863). Соединения формулы I по настоящему изобретению можно получить с использованием аналогичных способов.
Схема 1 ниже иллюстрирует получение 4-анилинопиридо[3,4-d]пиримидиновых эффекторных соединений по настоящему изобретению из известного промежуточного соединения 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидинона (200) (Rewcastle et al, J Chem Soc, Perkins Trans 1, 1996, 2221-2226) с использованием способов, описанных в Rewcastle et al, J Chem Soc, Perkins Trans 1, 1996, 2221-2226, и Soyka et al, US 2005/0085495 A1.
Схема 1
Схема 2 ниже иллюстрирует получение специфических эффекторных соединений по настоящему изобретению.
in situ
Тионилхлорид-опосредованное преобразование 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидинона (200) в 4-хлор-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин, с последующим взаимодействием с подходящим анилином давали 4-анилино-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидины (201-209). Замещение фтора 4-метоксибензиламином затем давало бензиламины (210-218), которые подвергали взаимодействию с трифторуксусной кислотой (TFA) с получением аминов (219-227). CDI-промотируемое амидное связывание с 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислотой давало фосфонаты (228-236). Реакция Хорнера-Ватсворда-Эммонса связывания этих соединений с альдегидом, образованным в результате  гидролиза 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина затем давала иллюстративные эффекторные соединения 1-9.
Схема 2
Получение пролекарств
Пролекарственные соединения по настоящему изобретению, как правило, можно получить путем взаимодействия содержащего алифатический третичный амин ингибитора киназы формулы I с подходящим нитрогетероциклическим или нитрокарбоциклическим α-метилгалогенидом/мезилатом/тозилатом в подходящем растворителе и в течение подходящего периода времени (например, в N-метил-2-пирролидиноне в течение около 15 часов), с получением содержащей четвертичный азот соли, включающей нитрогетероциклическую или нитрокарбоциклическую часть, которая является восстановительным триггером, связанную непосредственно или опосредованно с азотом ингибитора киназы.
Предпочтительные восстановительные триггерные части, подходящие для применения в пролекарствах по настоящему изобретению, имеют формулу II, представленную ниже:
4
5
где R и R имеют значения, определенные выше.
Особенно предпочтительные части, которые являются восстановительными триггерами, имеют формулы IIa-IIg, представленные ниже:
α -метилгалогениды формулы IIa можно получить, как описано ранее (бромид; Stribbling et al, Международная патентная публикация РСТ WO 2008/039087) (хлорид; Tercel et al, J Med Chem, 2001, 44, 3511-3522).
Схема 3 ниже иллюстрирует два альтернативных способа получения α-метилбромида 239 из коммерчески доступных исходных веществ.
Схема 3
Схема 4 ниже иллюстрирует путь к α-метилбромиду 244, исходя из коммерчески доступных исходных веществ.
Схема 4
Схема 5 ниже иллюстрирует путь к α-метилбромиду 250, исходя из 1,5-диметил-4-нитро-1H-имидазола (238) (схема 3).
Схема 5
Схема 6 ниже иллюстрирует путь к α-метилбромиду 261, исходя из коммерчески доступного оксазола (251).
Схема 6
Схема 7 ниже иллюстрирует два альтернативных пути к α-метилбромиду 264, исходя из α-метилбромида 246 (схема 5) и 2-бром-1,5-диметил-4-нитро-1H-имидазола (245) (схема 5), соответственно. Схема 7 ниже также иллюстрирует путь к α-метилбромиду 266, исходя из α-метилбромида 264.
Схема 7
Схема 8 ниже иллюстрирует путь к α-метилбромиду 270, исходя (2-бром-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-5-ил)метилацетата (247) (схема 5).
Схема 8
Схема 9 ниже иллюстрирует путь к соединениям формулы III в форме содержащей четвертичный азот соли путем взаимодействия содержащего алифатический третичный амин ингибитора киназы формулы I с подходящим нитрогетероциклическим α-метилгалогенидом/мезилатом/тозилатом (формулы VIII), в подходящем растворителе и в течение подходящего периода времени (например, в N-метил-2-пирролидиноне в течение около 15 часов).
Схема 9
Схема 10 ниже иллюстрирует получение ряда пролекарственных соединений формулы III в соответствии с настоящим изобретением. 4-анилинопиридо[3,4-d]пиримидиновые эффекторные соединения 1-9 (схема 2) подвергали взаимодействию с α-метилбромидом 239 (схема 3) в N-метил-2-пирролидиноне (NMP) при комнатной температуре в течение приблизительно 15 часов, перед добавлением ацетонитрила, с получением четвертичной аммониевой соли (12, 13, 15-21) в виде тонкодисперсного осадка, который собирали фильтрованием и промывали ацетонитрилом, этилацетатом и гексаном.
Схема 10
Схема 11 ниже иллюстрирует получение пролекарственного соединения в соответствии с настоящим изобретением.
Схема 11
5
1
6
Схемы 12-14 ниже иллюстрируют получение содержащих алкильный триггер бромидов, в которых R представляет собой С-C алкил.
Схема 14
Без дополнительных усложнений, считается, что специалист в данной области, при помощи представленного выше описания, сможет использовать настоящее изобретение в самом полном объеме. Следующие далее примеры, поэтому, следует рассматривать как просто иллюстративные и не ограничивающие остальное раскрытие каким-либо образом.
Экспеиментальная часть
1. Синтез
1.1 Химический синтез
1
4
Анализы продуктов сгорания осуществлялись микрохимической лабораторией Университета Отаго, Данедин, Новая Зеландия. Температуры плавления определяли с использованием устройства Electrothermal Model 9200 и представляли в том виде, как их считывали. Спектры Н ЯМР измеряли на спектрометре Bruker Avance-400 и соотносили с MeSi. Масс-спектры высокого разрешения записывали на спектрометре Varian VG-70SE при номинальном 5000 разрешении. Масс-спектрометрию осуществляли на квадрупольном масс-спектрометре ThermoFinnigan MSQ. Детекцию массы осуществляли с использованием APCI источника, с одновременным сбором положительных и отрицательных ионов. Если не указано иное, соединения очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле 60 (Scharlau, 230-400 меш ASTM), с использованием указанных элюентов.
1.1.1 Синтез эффекторов ингибиторов киназы
1.1.1.1 Получение (2Е)-N-(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)-4-(диметиламино)-2-бутенамида (1) (схема 2)
4
3
2
20
13
2
4
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3Н)-она (200) (1,0 г, 6,06 ммоль), тионилхлорида (20 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 40 минут с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 40°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли смесь 3-хлор-4-(3-хлорбензилокси)анилина (1,79 г, 6,67 ммоль) и безводного DMA (10 мл). Остаток 3-хлор-4-(3-хлорбензилокси)анилина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа 30 минут. Смесь распределяли между этилацетатом (400 мл) и водой (400 мл). Этилацетатный слой отделяли и снова промывали водой (2×200 мл), сушили (MgSO) и упаривали с получением неочищенного продукта N-(3-хлор-4-(3-хлорбензилокси)фенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (201). Хроматография на силикагеле (дихлорметан/MeOH=25:1) давала чистое соединение 201 (2,52 г, 100%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 196-198°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,03 (с, 1H), 8,94 (с, 1H), 8,69 (с, 1H), 8,21 (с, 1H), 8,07 (д, J=2,5 Гц, 1H), 7,75 (дд, J=9,0, 2,5 Гц, 1H), 7,57-7,54 (м, 1H), 7,49-7,39 (м, 3H), 7,31 (д, J=9,0 Гц, 1H). Анал. Рассчитано для CHClFNO: C, 57,85; H, 3,16; N, 13,49, Найдено C, 57,60; H, 3,45; N, 13,32.
4
3
2
28
23
2
5
2
4
6
Смесь соединения 201 (2,60 г, 6,27 ммоль) и 4-метоксибензиламина (8,24 мл, 62,7 ммоль) в безводном DMSO (15 мл) перемешивали в атмосфере азота при 71-72°C (температура бани) в течение 91 часа. Смесь распределяли между этилацетатом (500 мл) и водой (300 мл). Этилацетатный слой отделяли и снова промывали водой (3×300 мл); сушили (MgSO) и упаривали с получением неочищенного продукта N-(3-хлор-4-(3-хлорбензилокси)фенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (210). Хроматография на силикагеле (этилацетат/петролейный эфир=1:1) давала чистое соединение 210 (2,02 г, 61%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 120-122°C; 1H ЯМР δ [(CD)SO] 9,59 (с, 1H), 8,72 (с, 1H), 8,33 (с, 1H), 7,99 (д, J=2,4 Гц, 1H), 7,57-7,53 (м, 1H), 7,48-7,38 (м, 3H), 7,36-7,19 (м, 4H), 7,15 (шир.с, 1H), 6,91-6,85 (м, 2H), 5,25 (с, 1H), 4,48 (д, J=6,3 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHClNO: С, 63,16; H, 4,35; N, 13,15, Найдено С, 62,96; H, 4,63; N, 13,12.
3
3
2
20
15
2
5
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 210 (1,46 г, 2,74 ммоль) и безводного DCM (27 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (2,1 мл, 27,4 ммоль) с последующим добавлением анизола (0,60 мл, 5,48 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 91 часа. Смесь выливали в петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 30 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл). Полученный после этого остаток растворяли в смеси растворителей ацетон-вода=1:1 (примерно 100 мл) и перемешивали с 5M NH (100 мл) при комнатной температуре в течение 1 часа. Твердое вещество фильтровали и промывали последовательно смесью ацетон-вода=1:4 (5×20 мл), смесью петролейный эфир-этилацетат=3:1 (5×20 мл) и сушили с получением N-(3-хлор-4-(3-хлорбензилокси)фенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (219) (1,10 г, 97%), т.пл. 251-254°C (разл.); H ЯМР δ [(CD)SO] 9,70 (с, 1H), 8,68 (с, 1H), 8,34 (с, 1H), 8,04 (шир.с, 1H), 7,73 (шир.д, J=8,0 Гц, 1H), 7,57-7,53 (м, 1H), 7,48-7,39 (м, 3H), 7,26 (д, J=9,0 Гц, 1H), 7,12 (шир.с, 1H), 7,65 (шир.с, 2H), 5,24 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHClNO: C, 58,27; H, 3,67; N, 16,99, Найдено C, 58,33; H, 3,57; N, 17,2.
1
3
3
2
26
26
2
5
5
2
К перемешиваемой смеси GDI (0,53 г, 3,25 ммоль) и безводного ТГФ (2 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (0,64 г, 3,25 ммоль) в ТГФ (1 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли раствор соединения 219 (1,03 г, 2,50 ммоль) в смеси растворителей безводного ТГФ (2,5 мл) и DMA (2,5 мл) и продолжали перемешивать при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=20:1), и было обнаружено, что произошло только примерно 60% осуществление реакции по прошествии 50 минут. Таким образом, еще одну партию реагента получали из CDI [0,53 г, 3,25 ммоль; безводный ТГФ (2 мл)] и 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты [0,64 г, 3,25 ммоль); ТГФ (1 мл)] и добавляли к реакционной смеси. Смесь продолжали перемешивать в течение 3 часов при 40°C. Реакционную смесь выливали в воду (300 мл) и перемешивали с петролейным эфиром (400 мл) при комнатной температуре в течение 12 часов. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×20 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(3-хлор-4-(3-хлорбензилокси)фениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (228) (1,37 г, 93%); т.пл. 106-109°C; H ЯМР δ (CDCl) 9,41 (с, 1H), 9,02 (с, 1H), 8,70 (с, 1H), 8,54 (с, 1H), 7,91 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,66 (с, 1H), 7,54 (дд,J=8,8, 2,6 Гц, 1H), 7,48 (с, 1H), 7,40-7,29 (м, 3H), 6,99 (д, J=8,9 Гц, 1H), 5,15 (с, 2H), 4,30-4,18 (м, 4H), 3,15 (д, J=21,1 Гц, 2H), 1,39 (т, J=7,0 Гц, 6H), δ [(CD)SO]: 10,82 (с, 1H), 10,25 (с, 1H), 8,99 (плохо разрешаемый д, J=0,6 Гц, 1H), 8,41 (с, 1H), 8,58 (с, 1H), 7,95 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,71 (дд, J=9,0, 2,6 Гц, 1H), 7,56 (шир.с, 1H), 7,50-7,38 (м, 3H), 7,27 (д, J=9,0 Гц, 1H), 5,26 (с, 2H), 4,15-4,04 (м, 4H), 3,34 (д, частично скрытый пиком воды, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHC1NOP·0,5HO: C, 52,10; H, 4,54; N, 11,68%, Найдено C, 52,09; H, 4,60; N, 11,70%.
1
3
2
26
24
2
6
2
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (1,16 г, 7,20 ммоль) и воды (1,2 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли водный раствор 37% HC1 (1,21 мл, 14,4 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 40°C (температура бани) в течение 24 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (1,03 г, 18,4 ммоль) растворяли в воде (5,5 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 228 (1,70 г, 2,88 ммоль) и ТГФ (5,5 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (3 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (122 мг, 2,88 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Добавляли охлажденный раствор B и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=20:1). Через 25 минут добавляли снова KOH (раствор) (0,34 г, 6,13 ммоль) и продолжали перемешивать при 0°C еще в течение 35 минут. Смесь выливали в воду (200 мл). Добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (4×20 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением (2Е)-N-(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)-4-(диметиламино)-2-бутенамида (1) (1,28 г, 85%) в виде бледно-желтого твердого вещества, т.пл. 195-198; ВЭЖХ: чистота 96,8%; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,88 (с, 1H), 10,19 (с, 1H), 8,99 (с, 1H), 8,97 (с, 1H), 8,58 (с, 1H), 7,99 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,73 (дд, J=9,0, 2,6 Гц, 1H), 7,56 (шир.с, 1H), 7,49-7,38 (м, 3H), 7,27 (д, J=9,0 Гц, 1H), 6,87 (дт, J=15,4, 6,0 Гц, 1H), 6,51 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 5,26 (с, 2H), 3,09 (шир.д, J=6,0 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHClNO·0,3HO: C, 59,05; H, 4,69; N, 15,89, Найдено С, 58,96; H, 4,62; N, 15,73.
1.1.1.2 Получение (2E)-4-(диметиламино)-N-(4-{[1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)-2-бутенамида (2) (схема 2)
2
3
3
2
21
14
2
6
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3H)-она (200) (1,65 г, 10,0 ммоль), тионилхлорида (30 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 5 часов с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 45°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-амина (международная заявка РСТ, 2005058245, 30 июня 2005 года) (2,65 г, 11,0 ммоль) в безводном DMA (15 мл). Остаток 1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-амина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 65 часов. Смесь выливали в воду (200 мл). pH доводили до примерно 9 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (200 мл). Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (5×25 мл). Смесь суспендировали в ацетоне (80 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавляли воду (160 мл) и продолжали перемешивание в течение 1,5 часов. Твердое вещество фильтровали, сушили и окончательно очищали на колонке с диоксидом кремния (MeOH/дихлорметан: градиент 0-10%) с получением 6-фтор-N-(1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (202) (3,11 г, 80%) в виде бледно-коричневого твердого вещества, т.пл. 218-221°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,15 (с, 1H), 8,92 (с, 1H), 8,64 (с, 1H), 8,30 (д, J=1,3 Гц, 1H), 8,28 (шир.с, 1H), 8,19 (плохо разрешаемый д, J=0,7 Гц, 1Н), 7,77 (д, J=9,0 Гц, 1Н), 7,72 (дд, J=9,0, 1,8 Гц, 1H), 7,42-7,32 (м, 1H), 7,15-7,01 (м, 3Н), 5,71 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHFN: C, 64,94; H, 3,63; N, 21,64, Найдено C, 65,21; H, 3,71; N, 21,63.
4
3
2
29
24
7
2
4
6
1
Смесь соединения 202 (3,00 г, 7,73 ммоль) и 4-метоксибензиламина (10,2 мл, 77,3 ммоль) в безводном DMSO (18 мл) перемешивали в атмосфере азота при 68-70°C (температура бани) в течение 165 часов. Раствор затем охлаждали и добавляли петролейный эфир (200 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (200 мл). Добавляли воду (200 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут. Происходило осаждение масляного осадка. Таким образом, продукт экстрагировали в этилацетат; сушили (MgSO) и растворитель удаляли с получением коричневого масла. Смесь очищали на колонке с диоксидом кремния (EtOAc/петролейный эфир: градиент от 30% до чистого EtOAc) с получением чистого N-(1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (211) (2,38 г, 61%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 196-198°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,75 (с, 1H), 8,72 (с, 1H), 8,29 (с, 1H), 8,22 (плохо разрешаемый д, J=1,3 Гц, 1H), 8,15 (д, J=0,7 Гц, 1H), 7,73 (шир.д, J=9,0 Гц, 1H), 7,68 (дд, J=9,0, 1,8 Гц, 1H), 7,40-7,31 (м, 3H), 7,24-7,17 (м, 2H), 7,13-7,01 (м, 3H), 6,92-6,84 (м, 2H), 5,70 (с, 2H), 4,49 (д, J=6,3 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHFNO·1,5HO: C, 65,40; H, 5,11; N, 18,41%, Найдено C, 65,45; H, 5,07; N, 18,58%.
3
3
2
21
16
7
2
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 211 (2,27 г, 4,48 ммоль) и DCM (45 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (3,45 мл, 44,8 ммоль) с последующим добавлением анизола (0,99 мл, 8,96 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 5 дней. Смесь выливали в петролейный эфир (500 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 20 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл). К оставшемуся твердому веществу добавляли 5M NH (80 мл) при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Твердое вещество собирали и промывали последовательно водой (6×10 мл), смесью петролейный эфир-этилацетат=3:1 (3×20 мл) и сушили с получением N-(1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (220) (1,68 г, 97%), т.пл. 241-244°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,72 (с, 1H), 8,67 (с, 1H), 8,30 (с, 1H), 8,27 (шир.с, 1H), 8,15 (с, 1H), 7,75-7,68 (м, 2H), 7,41-7,33 (м, 1H), 7,18 (с, 1H), 7,14-7,01 (м, 3Н), 6,20 (с, 2Н), 5,69 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHFN·1,5HO: C, 61,16; H, 4,64; N, 23,77, Найдено С, 61,23; H, 4,71; N, 23,87.
1
3
2
27
27
7
4
2
К перемешиваемой смеси CDI (1,41 г, 8,73 ммоль) и безводного ТГФ (6 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (1,56 г, 7,94 ммоль) в ТГФ (4 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли раствор соединения 220 (1,53 г, 3,97 ммоль) в смеси растворителей безводного ТГФ (4 мл) и DMA (5 мл) и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=15:1). После перемешивания в течение ночи (16 часов), было обнаружено завершение реакции только ~70%. Таким образом, еще одну партию реагента получали из CDI [0,42 г, 2,62 ммоль; DCM (3 мл)] и 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты [0,47 г, 2,38 ммоль); DCM (2 мл)] и добавляли к реакционной смеси. Смесь продолжали перемешивать в течение 4 часов при 40°C. Реакционную смесь выливали в воду (200 мл) и перемешивали с петролейным эфиром (400 мл) при комнатной температуре в течение 20 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (200 мл). Липкое твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×30 мл). Смесь растворяли в ацетоне (50 мл) и перемешивали с водой (100 мл) и петролейным эфиром (200 мл) при комнатной температуре в течение 68 часов. Твердое вещество собирали, промывали смесью ацетон/вода=1:10 (5×30 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-иламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (229) (1,95 г, 87%); т.пл. 111-114°C; H ЯМР δ [(CD)SO]: 10,81 (с, 1H), 10,36 (с, 1H), 8,98 (с, 1H), 8,88 (с, 1H), 8,52 (с, 1H), 8,16 (д, J=0,7 Гц, 1H), 8,13 (д, J=1,3 Гц, 1H), 7,73 (д, J=9,0 Гц, 1H), 7,68 (дд, J=9,0, 1,8 Гц, 1H), 7,42-7,32 (м, 1H), 7,15-7,00 (м, 3H), 5,70 (с, 2H), 4,17-4,03 (м, 4H), 3,32 (д, частично скрытый пиком воды, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHFNOP·1,6HO: C, 54,75; H, 5,14; N, 16,55%, Найдено C, 54,60; H, 5,21; N,16,60%.
1
3
2
27
25
8
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (1,32 г, 8,20 ммоль) и воды (1,4 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли 37% водный раствор HCl (1,38 мл, 16,4 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 45°C (температура бани) в течение 25 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (2,36 г, 42,0 ммоль) растворяли в воде (7 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 229 (1,85 г, 3,28 ммоль) и ТГФ (7 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (4 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (139 мг, 3,28 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Охлажденный раствор B добавляли и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=10:1). После перемешивания еще в течение 30 минут смесь выливали в воду (200 мл). Добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (4×30 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением (2E)-4-(диметиламино)-N-(4-{[1-(3-фторбензил)-1H-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)-2-бутенамида (2) (1,55 г, 95%) в виде бледно-желтого твердого вещества, т.пл. 240-243; ВЭЖХ: чистота 96,7%; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,87 (с, 1H), 10,29 (с, 1H), 9,01 (с, 1H), 8,98 (с, 1H), 8,53 (с, 1H), 8,18 (д, J=0,7 Гц, 1H), 8,16 (д, J=0,4 Гц, 1Н), 7,73 (шир.д, J=9,0 Гц, 1H), 7,70 (дд, J=9,0, 1,7 Гц, 1H), 7,41-7,33 (м, 1H), 7,14-7,02 (м, 3H), 6,87 (дт, J=15,4, 6,0 Гц, 1H), 6,52 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 5,70 (с, 2H), 3,09 (дд, J=6,0, 1,1 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHFNO·1,2HO: C, 62,59;: H, 5,33; N, 21,63%, Найдено C, 62,59; H, 5,25; N,21,59%.
1.1.1.3 Получение (2E)-N-{4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}-4-(диметиламино)-2-бутенамида (3) (схема 2)
2
3
3
2
19
13
5
2
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3H)-она (200) (1,65 г, 10,0 ммоль), тионилхлорида (30 мл) и каталитического количества DMF (3 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 2 часов 30 минут с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 40°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 3-хлор-4-(пиридин-2-илметокси)анилина (2,58 г, 11,0 ммоль) в безводном DMA (15 мл). Остаток 3-хлор-4-(пиридин-2-илметокси)анилина промывали дополнительным количеством DMA (2×5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь выливали в воду (300 мл). pH доводили до примерно 9 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (300 мл). Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (4×50 мл). Смесь перемешивали с горячим (примерно 50°C) ацетоном (300 мл) в течение 15 минут. Нерастворимые вещества отфильтровывали и фильтрат упаривали при пониженном давлении с получением N-(3-хлор-4-(пиридин-2-илметокси)фенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (203) (3,18 г, 83%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 216-219°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,04 (с, 1H), 8,94 (с, 1H), 8,69 (с, 1H), 8,63-8,57 (м, 1H), 8,22 (шир.с, 1H), 8,08 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,85 (тд, J=7,7, 1,8 Гц, 1H), 7,75 (дд, J=9,0, 2,6 Гц, 1H), 7,59 (шир.д, J=7,8 Гц, 1H), 7,40-7,35 (м, 1H), 7,32 (д, J=9,0 Гц, 1H), 5,31 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHC1FNO·0,9HO: C, 57,34; H, 3,75; N, 17,60, Найдено C, 57,46; H, 3,82; N,17,63.
4
6
1
3
2
27
23
6
Смесь соединения 203 (3,07 г, 8,04 ммоль) и 4-метоксибензиламина (10,6 мл, 80,4 ммоль) в безводном DMSO (20 мл) перемешивали в атмосфере азота при 70°C (температура бани) в течение 118 часов. Смесь затем охлаждали и добавляли петролейный эфир (200 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (200 мл). Добавляли воду (200 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи (22 часа). Смесь фильтровали и твердое вещество промывали водой (5×30 мл), затем петролейным эфиром (3×30 мл). Липкое желтое/оранжевое твердое вещество перемешивали с ацетоном (150 мл) при комнатной температуре в течение 20 минут. Медленно добавляли воду (150 мл) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение 45 минут. Тонкодисперсное твердое вещество собирали при помощи вакуум-фильтрации, промывали смесью вода/ацетон (1:1) (4×20 мл), петролейным эфиром (3×20 мл) и сушили в вакууме над силикагелем/KOH с получением чистого N-(3-хлор-4-(пиридин-2-илметокси)фенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (212) (3,08 г, 77%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 182-184°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,60 (с, 1H), 8,72 (с, 1H), 8,64-8,56 (м, 1H), 8,33 (с, 1H), 8,01 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,88 (тд, J=7,7, 1,8 Гц, 1Н), 7,71 (дд, J=9,0, 2,6 Гц, 1Н), 7,58 (д, J=7,7 Гц), 7,42-7,19 (м, 5H), 7,15 (с, 1H), 6,93-6,84 (м, 2H), 5,25 (с, 2H), 4,48 (д, J=6,3 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHClNO·0,6 ацетон: С, 64,80; H, 5,02; N, 15,74%, Найдено С, 64,47; H, 5,00; N, 15,95%.
3
3
2
19
15
6
2
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 212 (2,88 г, 5,77 ммоль) и DCM (60 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,38 мл, 57,7 ммоль) с последующим добавлением анизола (1,27 мл, 11,5 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре. Через 72 часа добавляли еще одну партию трифторуксусной кислоты (4,38 мл, 57,7 ммоль) и продолжали перемешивание в течение 49 часов. Смесь выливали в петролейный эфир (250 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 20 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (250 мл). Полученный остаток в виде твердого вещества растворяли в ацетоне (150 мл) и добавляли 5M NH (125 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Твердое вещество собирали и промывали последовательно смесью ацетон/вода (1:4) (5×30 мл), петролейный эфир/этилацетат=3:1 (5×30 мл) и сушили с получением N-(3-хлор-4-(пиридин-2-илметокси)фенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (221) (1,94 г, 89%), т.пл. 247-250°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,64 (с, 1H), 8,68 (с, 1H), 8,62-8,56 (м, 1H), 8,33 (с, 1H), 8,06 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,88 (тд, J=7,7, 1,8 Гц, 1H), 7,73 (дд, J=9,0, 2,6 Гц, 1H), 7,58 (шир.д, J=7,8 Гц, 1H), 7,40-7,34 (м, 1H), 7,26 (д, J=9,0 Гц, 1H), 7,12 (с, 1H), 6,23 (с, 2H), 5,29 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHC1NO·1,5HO: C, 56,23; H, 4,47; N, 20,71%, Найдено C, 56,55; H, 4,45; N, 20,42%.
1
3
2
25
26
6
5
2
К перемешиваемой смеси CDI (2,25 г, 13,9 ммоль) и безводного ТГФ (9 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (2,43 г, 12,4 ммоль) в ТГФ (7 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли смесь соединения 221 (1,88 г, 4,96 ммоль) в смешанном растворителе, состоящем из безводного ТГФ (10 мл) и DMA (16 мл), и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=15:1). После перемешивания в течение 17 часов смесь выливали в воду (300 мл) и перемешивали с петролейным эфиром (300 мл) при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (300 мл). Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×20 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(3-хлор-4-(пиридин-2-илметокси)фениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (230) (2,56 г, 93%); т.пл. 113-116°C; H ЯМР δ [(CD)SO] : 10,82 (с, 1H), 10,25 (с, 1H), 8,99 (с, 1H), 8,84 (с, 1H), 8,63-8,56 (м, 2H), 7,96 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,88 (тд J=7,7, 1,8 Гц, 1H), 7,70 (дд, J=8,9, 2,6 Гц, 1H), 7,59 (шир.д, J=7,8 Гц, 1H), 7,41-7,34 (м, 1H), 7,28 (д, J=9,0 Гц, 3H), 4,16-4,03 (м, 4H), 3,31 (д, частично скрытый пиком воды, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHClNOP·1,2HO: C, 51,90; H, 4,95; N, 14,53%, Найдено C, 51,85; H, 4,94; N, 14,52%.
1
3
2
25
24
7
2
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (1,76 г, 11,0 ммоль) и воды (1,8 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли водный 37% раствор HCl (1,84 мл, 21,9 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 50°C (температура бани) в течение 22 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (3,14 г, 56,1 ммоль) растворяли в воде (9 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 230 (2,44 г, 4,38 ммоль) и ТГФ (9 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (6 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (186 мг, 4,38 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Охлажденный раствор B добавляли и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=10:1). После перемешивания в течение 30 минут смесь выливали в воду (300 мл). Добавляли петролейный эфир (400 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (4×30 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением соединения 3 (1,79 г, 83%), которое имело чистоту только 87%, как было обнаружено методом ВЭЖХ. Таким образом, образец перемешивали с теплым MeOH (200 мл) в течение 30 минут и охлаждали до комнатной температуры. Нерастворимые вещества отфильтровывали и к фильтратам добавляли один объем воды для осаждения нужного продукта. Твердое вещество собирали, промывали смесью вода/MeOH=1:1 несколько раз и сушили с получением (2E)-N-{4-[3-хлор-4-(2-пиридинилметокси)анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}-4-(диметиламино)-2-бутенамида (3) (1,54 г, 72%) в виде бледно-желтого твердого вещества, т.пл. 196-199; ВЭЖХ: чистота 94,6%; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,88 (с, 1H), 10,19 (с, 1H), 8,99 (с, 1H), 8,64-8,55 (м, 2H), 8,00 (д, J=2,5 Гц, 1H), 7,88 (тд, J=7,7, 1,8 Гц, 1H), 7,73 (шир.дд, J=8,9, 2,5 Гц, 1H), 7,59 (шир.д, J=7,8 Гц, 1H), 7,41-7,34 (м, 1H), 7,28 (д, J=9,0 Гц, 1H), 6,87 (дт, J=15,4, 6,1 Гц, 1H), 6,51 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 5,30 (с, 2H), 3,09 (дд, J=6,1, 1,2 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHClNO·1,5HO: C, 58,08; H, 5,26; N, 18,97%, Найдено С, 58,17; H, 5,36; N, 19,00%.
1.1.1.4 Получение (2Е)-N-[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (схема 2)
2
3
3
2
13
7
2
4
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3H)-она (200) (1,50 г, 9,09 ммоль), тионилхлорида (20 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 1,5 часов с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 50°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 3,4-дихлоранилина (1,62 г, 10,0 ммоль) в безводном DMA (15 мл). Остаток 3,4-дихлоранилина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Смесь выливали в воду (200 мл). pH доводили до примерно 8 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром. Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (5×25 мл). Смесь сушили в вакууме над силикагелем/KOH в течение ночи с получением N-(3,4-дихлорфенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (204) (2,81 г, 100%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 262-264°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,17 (с, 1H), 8,99 (с, 1H), 8,79 (с, 1H), 8,35 (д, J=2,5 Гц, 1H), 8,26 (плохо разрешаемый д, J=0,7 Гц, 1H), 7,92 (дд, J=8,8, 2,5 Гц, 1H), 7,69 (д, J=8,8 Гц, 1H). Анал. Рассчитано для CHClFN: C, 50,51; H, 2,28; N, 18,12, Найдено C, 50,50; H, 2,27; N, 18,42.
4
6
1
3
2
21
17
2
5
Смесь соединения 204 (2,95 г, 9,55 ммоль) и 4-метоксибензиламина (12,6 мл, 95,5 ммоль) в безводном DMSO (20 мл) перемешивали в атмосфере азота при 52°C (температура бани) в течение 10 дней. Раствор затем охлаждали и добавляли петролейный эфир (200 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (2×200 мл). Добавляли воду (200 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Смесь фильтровали, и твердое вещество промывали водой (5×30 мл), затем петролейным эфиром (3×30 мл). Липкое желтое/оранжевое твердое вещество перемешивали с ацетоном (100 мл) при 35-45°C (внутренняя температура) в течение 10 минут. Добавляли воду (100 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Твердое вещество собирали при помощи вакуум-фильтрации, промывали смесью вода/ацетон (1:1) (5×20 мл) и сушили в вакууме над силикагелем/KOH с получением чистого N-(3,4-дихлорфенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (213) (2,59 г, 64%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 209-211°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,76 (с, 1H), 8,77 (с, 1H), 8,42 (с, 1H), 8,30 (плохо разрешаемый д, J=2,1 Гц, 1H), 7,89 (дд, J=8,8, 2,1 Гц, 1H), 7,64 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,38-7,25 (м, 3H), 7,17 (с, 1H), 6,92-6,83 (м, 2H), 4,49 (д, J=6,3 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHClNO: C, 59,17; H, 4,02; N, 16,43%, Найдено C, 58,93; H, 4,17; N, 16,12%.
3
3
2
13
9
2
5
2
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 213 (2,50 г, 5,86 ммоль) и DCM (60 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,49 мл, 58,6 ммоль) с последующим добавлением анизола (1,28 мл, 11,7 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 43 часов. Смесь выливали в петролейный эфир (600 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 20 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл). К оставшемуся твердому веществу добавляли 5M NH (80 мл) при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Твердое вещество собирали и промывали последовательно водой (6×10 мл), смесью петролейный эфир-этилацетат=3:1 (3×20 мл) и сушили с получением N-(3,4-дихлорфенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (222) (1,76 г, 98%), т.пл. 277-280°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,83 (с, 1H), 8,73 (с, 1H), 8,42 (с, 1H), 8,34 (д, J=2,5 Гц, 1H), 7,92 (дд, J=8,8, 2,5 Гц, 1H), 7,63 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,14 (с, 1H), 6,30 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHClN·0,5HO: С, 49,54; H, 3,20; N, 22,22, Найдено С, 49,70; H, 3,08; N, 22,28.
1
3
2
19
20
2
5
4
2
К перемешиваемой смеси CDI (1,98 г, 12,2 ммоль) и безводного ТГФ (8 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (2,18 г, 11,1 ммоль) в ТГФ (6 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли раствор соединения 222 (1,70 г, 5,56 ммоль) в смешанном растворителе, состоящем из безводного ТГФ (6 мл) и DMA (7 мл), и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=15:1). После перемешивания в течение ночи (17 часов) реакционную смесь выливали в воду (300 мл) и перемешивали с петролейным эфиром (400 мл) при комнатной температуре в течение 20 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (400 мл). Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×30 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(3,4-дихлорфениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (231) (2,56 г, 95%); т.пл. 121-124°C; H ЯМР δ [(CD)SO]: 10,86 (с, 1H), 10,42 (с, 1H), 9,04 (с, 1H), 8,87 (с, 1H), 8,67 (с, 1H), 8,24 (д, J=2,2 Гц, 1H), 7,89 (дд, J=8,8, 2,2 Гц, 1H), 7,65 (д, J=8,8 Гц, 1H), 4,16-4,04 (м, 4H), 3,32 (д, частично скрытый пиком воды, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHClNOP·HO: C, 45,43; H, 4,42; N, 13,94%, Найдено С, 45,37; H, 4,20; N, 13,81%.
1
3
2
19
18
2
6
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (2,08 г, 12,9 ммоль) и воды (2,2 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли 37% водный раствор HCl (2,16 мл, 25,7 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 40°C (температура бани) в течение 20 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (1,84 г, 32,9 ммоль) растворяли в воде (10 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 231 (2,49 г, 5,14 ммоль) и ТГФ (10 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (5,5 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (218 мг, 5,14 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Добавляли охлажденный раствор B и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=10:1). Через 15 минут было обнаружено, что осталось примерно 20% соединения 231. Снова добавляли KOH (0,40 г, 7,14 ммоль) в виде твердого вещества. После перемешивания еще в течение 15 минут смесь выливали в воду (300 мл). Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (4×30 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением (2Е)-N-[4-(3,4-(дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (4) (2,03 г, 95%) в виде бежевого твердого вещества, т.пл. 161-164°C; ВЭЖХ: чистота 98,6%; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,92 (с, 1H), 10,36 (с, 1H), 9,09-8,95 (м, 2H), 8,67 (шир.с, 1H), 8,27 (шир.с, 1H), 7,92 (шир.д, J=7,8 Гц, 1H), 7,65 (д, J=8,8, 1H), 6,88 (дт, J=15,4, 6,0 Гц, 1H), 6,52 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 3,09 (дд, J=6,0, 1,2 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHClNO·1,2HO: С, 51,99; H, 4,69; N, 19,15, Найдено С, 51,93; H, 4,59; N, 19,15.
1.1.1.5 Получение (2Е)-N-[4-(3-бром-4-хлораналино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (5) (схема 2)
2
3
3
2
13
7
4
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3H)-она (200) (1,50 г, 9,09 ммоль), тионилхлорида (20 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 3 часов с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 40°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 3-бром-4-хлоранилина (2,07 г, 10,0 ммоль) в безводном DMA (15 мл). Остаток 3-бром-4-хлоранилина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 19 часов. Смесь выливали в воду (200 мл). pH доводили до примерно 8 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром. Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (4×20 мл). Смесь сушили в вакууме над силикагелем/KOH в течение ночи с получением N-(3-бром-4-хлорфенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (205) (3,20 г, 99%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 271-275°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,15 (с, 1H), 8,99 (с, 1H), 8,79 (с, 1H), 8,45 (д, J=2,5 Гц, 1H), 8,26 (шир.с, 1H), 7,98 (дд, J=8,8, 2,5 Гц, 1H), 7,69 (д, J=8,8 Гц, 1H). Анал. Рассчитано для CHBrClFN: C, 44,16; H, 2,00; N, 15,85, Найдено C, 44,21; H, 1,87; N, 15,98.
4
6
1
3
2
21
17
5
Смесь соединения 205 (3,09 г, 8,74 ммоль) и 4-метоксибензиламина (11,5 мл, 87,4 ммоль) в безводном DMSO (20 мл) перемешивали в атмосфере азота при 58-60°C (температура бани) в течение недели. Раствор затем охлаждали и добавляли петролейный эфир (300 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли еще раз с петролейным эфиром (300 мл). Добавляли воду (250 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Желтое/оранжевое твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (5×20 мл), затем петролейным эфиром (3×30 мл). Липкое желтое/оранжевое твердое вещество растворяли в ацетоне (150 мл) при 45°C (температура бани). Смесь фильтровали для удаления нерастворимых примесей. К фильтрату добавляли воду (400 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Твердое вещество собирали при помощи вакуум-фильтрации, промывали водой (5×25 мл), петролейным эфиром (3×30 мл) и сушили в вакууме над силикагелем/KOH с получением чистого N-(3-бром-4-хлорфенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (214) (3,01 г, 73%) в виде зеленовато-желтого твердого вещества, т.пл. 207-210°С; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,74 (с, 1H), 8,77 (с, 1H), 8,41 (с, 1H), 8,39 (д, J=2,4 Гц, 1H), 7,96 (дд, J=8,8, 2,4 Гц, 1H), 7,64 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,38-7,25 (м, 3H), 7,17 (с, 1H), 6,92-6,85 (м, 2H), 4,49 (д, J=6,3 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHBrClNO: C, 53,58; H, 3,64; N, 14,88%, Найдено C, 53,84; H, 3,55; N, 14,63%.
3
3
2
13
9
5
2
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 214 (2,92 г, 6,20 ммоль) и DCM (60 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,75 мл, 62,0 ммоль) с последующим добавлением анизола (1,36 мл, 12,4 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 42 часов. Смесь выливали в петролейный эфир (600 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 20 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл). К оставшемуся твердому веществу добавляли 5M NH (80 мл) при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Твердое вещество собирали и промывали последовательно водой (6×10 мл), смесью петролейный эфир-этилацетат=3:1 (3×20 мл) и сушили с получением N-(3-бром-4-хлорфенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (223) (2,17 г, 100%), т.пл. 271-274°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,82 (с, 1H), 8,72 (с, 1H), 8,44 (д, J=2,3 Гц, 1H), 8,42 (с, 1H), 7,97 (дд, J=8,8, 2,3 Гц, 1H), 7,62 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,14 (с, 1H), 6,30 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHBrClN·0,6HO: C, 43,20; H, 2,85; N, 19,38, Найдено С, 43,00; H, 2,95; N, 19,12.
1
3
2
19
20
5
4
2
К перемешиваемой смеси CDI (1,20 г, 7,42 ммоль) и безводного ТГФ (5 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (1,45 г, 7,42 ммоль) в ТГФ (4 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли раствор соединения 223 (2,00 г, 5,71 ммоль) в смеси растворителей безводного ТГФ (6 мл) и DMA (7 мл) и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=10:1), и было обнаружено, что через 1 час реакция была завершена только примерно на 60%. Таким образом, еще одну партию реагента получали из CDI [0,87 г, 5,37 ммоль; безводный ТГФ (2,5 мл)] и 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты [0,72 г, 5,37 ммоль); ТГФ (3 мл)] и добавляли к реакционной смеси. Смесь продолжали перемешивать в течение 3 часов при 40°C. Реакционную смесь выливали в воду (300 мл) и перемешивали с петролейным эфиром (400 мл) при комнатной температуре в течение 20 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (400 мл). Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×30 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(3-бром-4-хлорфениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (232) (2,85 г, 94%); т.пл. 113-116°C; H ЯМР δ [(CD)SO]: 10,86 (с, 1H), 10,40 (с, 1H), 9,04 (с, 1H), 8,87 (с, 1H), 8,67 (с, 1H), 8,34 (д, J=2,3 Гц, 1H), 7,94 (дд, J=8,8, 2,3 Гц, 1H), 7,65 (д, J=8,8Гц, 1H), 4,16-4,03 (м, 4H), 3,32 (д, частично скрытый пиком воды, 2H), 1,26 (т, J=7,1 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHBrClNOP·HO: C, 41,74; H, 4,06; N, 12,81%, Найдено C, 42,01; H, 3,90; N, 12,78%.
1
3
2
19
18
6
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (2,11 г, 13,1 ммоль) и воды (2,2 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли 37% водный раствор HCl (2,19 мл, 26,1 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 40°C (температура бани) в течение 21 часа. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (1,87 г, 33,4 ммоль) растворяли в воде (10 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 232 (2,76 г, 5,22 ммоль) и ТГФ (10 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (5,5 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (221 мг, 5,22 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Добавляли охлажденный раствор B и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=10:1). Через 35 минут смесь выливали в воду (300 мл). Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (4×30 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением (2Е)-N-[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (5) (2,37 г, 98%) в виде бледно-желтого твердого вещества, т.пл. 168-171; ВЭЖХ: чистота 96,8%; H ЯМРδ [(CD)SO] 10,92 (с, 1H), 10,34 (с, 1H), 9,10-8,95 (м, 2H), 8,67 (шир.с, 1H), 8,38 (шир.с, 1H), 7,97 (шир.д, J=8,3 Гц, 1H), 7,65 (д, J=8,8, 1H), 6,88 (дт, J=15,4, 6,0 Гц, 1H), 6,52 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 3,09 (дд, J=6,0, 1,1 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHBrClNO·HO: C, 47,57; H, 4,20; N, 17,52, Найдено C, 47,80; H, 4,25; N, 17,51.
1.1.1.6 Получение (2Е)-N-[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (6) (схема 2)
2
3
3
2
13
7
4
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3Н)-она (200) (1,65 г, 10,0 ммоль), тионилхлорида (20 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 3 часов с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 50°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 4-бром-3-хлоранилина (2,27 г, 11,0 ммоль) в безводном DMA (15 мл). Остаток 4-бром-3-хлоранилина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь выливали в воду (250 мл). pH доводили до примерно 8 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром. Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (4×20 мл). Смесь сушили в вакууме над силикагелем/KOH в течение ночи с получением N-(4-бром-3-хлорфенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (206) (3,31 г, 94%) в виде бежевого твердого вещества, т.пл. 258-261°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,17 (с, 1H), 8,99 (с, 1H), 8,79 (с, 1H), 8,35 (шир.с, 1H), 8,27 (с, 1H), 7,93-7,74 (м, 2H). Анал. Рассчитано для CHBrClFN: C, 44,16; H, 2,00; N, 15,85, Найдено C, 43,96; H, 1,96; N, 15,60.
4
6
1
3
2
21
17
5
(
Смесь соединения 206 (3,22 г, 9,11 ммоль) и 4-метоксибензиламина (11,95 мл, 91,1 ммоль) в безводном DMSO (24 мл) перемешивали в атмосфере азота при 70°C (температура бани) в течение 113 часов. Раствор затем охлаждали и перемешивали с петролейным эфиром (300 мл) при комнатной температуре в течение 20 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли еще раз с петролейным эфиром (300 мл). Добавляли воду (300 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (4×20 мл). Липкое желтое/оранжевое твердое вещество растворяли в ацетоне (80 мл) при 40°C (температура бани). Добавляли воду (80 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Твердое вещество собирали при помощи вакуум-фильтрации, промывали смесью ацетон/вода=1:1 (5×20 мл) и сушили в вакууме над силикагелем/KOH с получением чистого N-(4-бром-3-хлорфенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (215) (3,63 г, 85%) в виде зеленовато-желтого твердого вещества, т.пл. 175-177°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,77 (с, 1H), 8,77 (с, 1H), 8,42 (с, 1H), 8,30 (шир.с, 1H), 7,83 (шир.д, J=8,2, 1H), 7,77 (д, J=8,7 Гц, 1H), 7,43-7,26 (м, 3H), 7,17 (с, 1H), 6,88 (шир.д, J=8,3 Гц, 2H), 4,49д, J=5,6 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHBrClNO·ацетон: C, 54,51; H, 4,38; N, 13,24%, Найдено C, 54,83; H, 4,31; N, 13,15%.
3
3
2
13
9
5
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 215 (3,55 г, 7,56 ммоль) и DCM (75 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5,82 мл, 75,6 ммоль) с последующим добавлением анизола (1,66 мл, 15,1 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 46 часов. Смесь выливали в петролейный эфир (400 мл) и остаток промывали при помощи MeOH. После перемешивания при комнатной температуре в течение примерно 20 минут слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (400 мл). К оставшемуся твердому веществу добавляли 5M NH (100 мл) при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Твердое вещество собирали и промывали водой (5×20 мл) и сушили с получением N-(4-бром-3-хлорфенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (224) (2,41 г, 91%), т.пл. 272-275°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,83 (с, 1H), 8,73 (с, 1H), 8,42 (с, 1H), 8,34 (д, J=2,0 Гц, 1H), 7,84 (дд, J=8,8, 2,0 Гц, 1H), 7,75 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,14 (с, 1H), 6,31 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHBrClN·0,2MeOH: C, 45,15; H, 2,73; N, 19,36, Найдено C, 44,84; H, 2,52; N, 19,29.
1
3
2
19
20
5
4
2
К перемешиваемой смеси CDI (2,97 г, 18,3 ммоль) и безводного ТГФ (12 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (3,2 г, 16,3 ммоль) в ТГФ (10 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли раствор соединения 224 (2,29 г, 6,53 ммоль) в смеси растворителей безводного ТГФ (8 мл) и DMA (9 мл) и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=10:1), и было обнаружено, что через 3 часа реакция была завершена примерно на 80%. Таким образом, еще одну партию реагента получали из CDI [0,59 г, 3,66 ммоль; безводного ТГФ (2,5 мл)] и 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты [0,64 г, 3,26 ммоль); ТГФ (2 мл)] и добавляли к реакционной смеси. Смесь продолжали перемешивать в течение 1 часа при 40°C. Реакционную смесь выливали в воду (500 мл) и перемешивали с петролейным эфиром (500 мл) при комнатной температуре в течение ночи. Слой петролейного эфира сливали. Смесь перемешивали с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл) в течение 10 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×30 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(4-бром-3-хлорфениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (233) (3,26 г, 95%); т.пл. 121-124°C; H ЯМР δ [(CD)SO]: 10,89 (с, 1H), 10,43 (с, 1H), 9,04 (с, 1H), 8,88 (с, 1H), 8,68 (с, 1H), 8,24 (д, J=2,1 Гц, 1H), 7,82 (дд, J=8,8, 2,1 Гц, 1H), 7,78 (д, J=8,8 Гц, 1H), 4,17-4,00 (м, 4H), 3,32 (д, J=21,5, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHBrClNOP·0,5HO: C, 42,44; H, 3,94; N, 13,02%, Найдено С, 42,42; H, 3,99; N, 12,98%.
1
3
2
19
18
6
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (2,42 г, 15,0 ммоль) и воды (2,5 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли 37% водный раствор HCl (2,52 мл, 30,0 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 40°C (температура бани) в течение 48 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (4,30 г, 76,8 ммоль) растворяли в воде (13 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 233 (3,17 г, 6,00 ммоль) и ТГФ (13 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли миниммальное количество DMA (6,5 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (254 мг, 6,00 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Добавляли охлажденный раствор B и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=20:1). Через 40 минут смесь выливали в воду (300 мл). Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×30 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением (2Е)-N-[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (6) (2,71 г, 98%) в виде бежевого твердого вещества, т.пл. 176-179; ВЭЖХ: чистота 97,8%; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,95 (с, 1H), 10,37 (с, 1H), 9,04 (с, 1H), 9,00 (с, 1H), 8,68 (с, 1H), 8,27 (шир.с, 1H), 7,84 (шир.д, J=8,3 Гц, 1H), 7,78 (д, J=8,8, 1H), 6,87 (дт, J=15,5, 6,0 Гц, 1H), 6,52 (шир.д, J=15,5 Гц, 1H), 3,09 (шир.д, J=5,4 Гц, 2H), 2,18 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHBrClNO·HO: C, 47,57; H, 4,20; N, 17,52, Найдено С, 47,95; H, 4,16; N, 17,31.
1.1.1.7 Получение (2Е)-N-[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (7) (схема 2)
2
3
3
2
13
7
2
4
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3Н)-она (200) (1,65 г, 10,0 ммоль), тионилхлорида (20 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 5 часов с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 50°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 3,4-диброманилина (2,76 г, 11,0 ммоль) в безводном DMA (5 мл). Остаток 3,4-диброманилина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 19 часов. Смесь выливали в воду (300 мл). pH доводили до примерно 8 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром. Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали последовательно водой (5×25 мл) и смесью петролейный эфир/этилацетат (10:1) (4×25 мл). Смесь сушили в вакууме над силикагелем/KOH в течение ночи с получением N-(3,4-дибромфенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (207) (3,50 г, 88%) в виде бежевого твердого вещества, т.пл. 262-264°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,14 (шир.с, 1H), 8,98 (с, 1H), 8,78 (с, 1H), 8,45 (шир.с, 1H), 8,26 (с, 1H), 7,91 (шир.д, J=7,8, 2,5 Гц, 1H), 7,80 (д, J=8,7 Гц, 1H). Анал. Рассчитано для CHBrFN; C, 39,23; H, 1,77; N, 14,08, Найдено C, 39,23; H, 1,79; N, 13,86.
4
6
1
3
2
21
17
2
5
Смесь соединения 207 (3,40 г, 8,54 ммоль) и 4-метоксибензиламина (11,2 мл, 85,4 ммоль) в безводном DMSO (22 мл) перемешивали в атмосфере азота при 70°C (температура бани) в течение 138 часов. Смесь затем охлаждали и выливали в воду (400 мл). Добавляли петролейный эфир (400 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (400 мл). Смесь фильтровали и твердое вещество промывали водой (3×30 мл). Липкое желтое/оранжевое твердое вещество перемешивали с ацетоном (100 мл) при комнатной температуре в течение примерно 30 минут с получением тонкодисперсного оранжевого осадка. Добавляли воду (200 мл) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение 2 часов. Твердое вещество собирали при помощи вакуум-фильтрации, промывали смесью вода/ацетон (2:1) (5×30 мл) и сушили в вакууме над силикагелем/KOH с получением чистого N-(3,4-дибромфенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (216) (4,16 г, 95%) в виде зеленовато-желтого твердого вещества, т.пл. 166-169°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,72 (с, 1H), 8,77 (с, 1H), 8,42 (с, 1H), 8,40 (шир.с, 1H), 7,89 (шир.д, J=7,7 Гц, 1H), 7,76 (д, J=8,7 Гц, 1H), 7,40-7,25 (м, 3H), 7,17 (с, 1H), 6,88 (шир.д, J=8,3 Гц, 2H), 4,49 (д, J=5,9 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHBrNO·0,25 гексан: C, 50,35; H, 3,85; N, 13,05%, Найдено C, 50,56; H, 3,54; N,12,87%.
3
3
2
13
9
2
5
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 216 (4,08 г, 7,92 ммоль) и DCM (80 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (6,07 мл, 79,2 ммоль) с последующим добавлением анизола (1,73 мл, 15,8 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 46 часов. Смесь выливали в петролейный эфир (500 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 15 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (400 мл). Полученный остаток в виде твердого вещества растворяли в минимальном количестве MeOH (120 мл) и добавляли 5M NH (150 мл) при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Твердое вещество собирали и промывали последовательно водой (5×20 мл), смесью петролейный эфир-этилацетат=5:1 (5×20 мл) и сушили с получением N-(3,4-дибромфенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (225) (2,47 г, 79%), т.пл. 265-268°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,80 (с, 1H), 8,72 (с, 1H), 8,44 (д, J=2,2 Гц, 1H), 8,42 (с, 1H), 7,90 (дд, J=8,8, 2,2 Гц, 1H), 7,74 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,14 (с, 1H), 6,30 (с, 2H). Анал. Рассчитано для CHBrN·0,1 гексан: C, 40,47; H, 2,60; N, 17,35, Найдено С, 40,16; H, 2,45; N, 17,20.
1
3
2
19
20
2
5
4
К перемешиваемой смеси CDI (2,74 г, 16,9 ммоль) и безводного ТГФ (13 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (2,96 г, 15,1 ммоль) в ТГФ (10 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли раствор соединения 225 (2,38 г, 6,02 ммоль) в смеси растворителей безводного ТГФ (7 мл) и DMA (8 мл) и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=15:1). После перемешивания в течение 4 часов реакционную смесь выливали в воду (250 мл) и перемешивали с петролейным эфиром (350 мл) при комнатной температуре в течение 20 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (200 мл). Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×30 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(3,4-дибромфениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (234) (3,28 г, 95%); т.пл. 120-124°C; H ЯМР δ [(CD)SO]: 10,89 (с, 1H), 10,41 (с, 1H), 9,04 (с, 1H), 8,88 (с, 1H), 8,67 (с, 1H), 8,34 (д, J=2,5 Гц, 1H), 7,87 (дд, J=8,8, 2,5 Гц, 1H), 7,77 (д, J=8,8 Гц, 1H), 4,17-4,03 (м, 4H), 3,32 (д, J=21,6 Гц, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHBrNOP: С, 39,81; H, 3,52; N, 12,22%, Найдено С, 39,48; H, 3,78; N, 11,79%.
1
3
2
19
18
2
6
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (2,25 г, 14,0 ммоль) и воды (2,4 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли 37% водный раствор HCl (2,35 мл, 28,0 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 45°C (температура бани) в течение 23 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (4,02 г, 71,7 ммоль) растворяли в воде (12 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 234 (3,21 г, 5,60 ммоль) и ТГФ (12 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (6 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (237 мг, 5,60 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Добавляли охлажденный раствор B и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=25:1). Через 1 час смесь выливали в воду (200 мл). Добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (200 мл) и перемешивали в течение 15 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×20 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением (2Е)-N-[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (7) (2,76 г, 98%) в виде бежевого твердого вещества, т.пл. 176-179°C; ВЭЖХ: чистота 97,2%; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,95 (с, 1H), 10,35 (с, 1H), 9,03 (с, 1H), 9,00 (с, 1H), 8,67 (шир.с, 1H), 8,37 (шир.с, 1H), 7,89 (шир.д, J=7,8 Гц, 1H), 7,77 (д, J=8,8, 1H), 6,87 (дт, J=15,4, 6,0 Гц, 1H), 6,52 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 3,08 (шир.д, J=5,3 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHBrNO·0,5HO: C, 44,30; H, 3,72; N, 16,31, Найдено С, 44,24; H, 3,81; N, 15,98.
1.1.1.8 Получение (2Е)-4-(диметиламино)-N-[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-2-бутенамида (8) (схема 2)
2
3
3
2
15
8
2
4
2
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3H)-она (200) (1,65 г, 10,0 ммоль), тионилхлорида (20 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 1 часа с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 45°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 3-этинил-4-фторанилина (J. Org. Chem., 1981, 46, 2280-2286) (1,49 г, 11,0 ммоль) и безводного DMA (15 мл). Остаток 3-этинил-4-фторанилина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 часов. Смесь выливали в воду (300 мл). pH доводили до примерно 9 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (300 мл). Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (5×50 мл); смесью этилацетат/петролейный эфир (1:10) (4×50 мл) и сушили с получением N-(3-этинил-4-фторфенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (208) (2,39 г, 85%) в виде бледно-коричневого твердого вещества, т.пл. 223-226°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,10 (с, 1H), 8,96 (с, 1H), 8,73 (с, 1H), 8,24 (шир.с, 1H), 8,12 (дд, J=6,4, 2,8 Гц, 1H), 7,96-7,88 (м, 1H), 7,39 (т, J=9,1 Гц, 1H), 4,54 (с, 1H). Анал. Рассчитано для CHFN·1,8HO: C, 57,25; H, 3,72; N, 17,80, Найдено C, 57,27; H, 3,49; N,17,90.
4
6
1
3
2
23
18
5
Смесь соединения 208 (2,31 г, 8,19 ммоль) и 4-метоксибензиламина (10,7 мл, 81,9 ммоль) в безводном DMSO (20 мл) перемешивали в атмосфере азота при 70°C (температура бани) в течение 118 часов. Смесь охлаждали и добавляли петролейный эфир (300 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл). Добавляли воду (300 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Смесь фильтровали и промывали липкое твердое вещество водой (5×30 мл). Липкое твердое вещество перемешивали с теплым MeOH (70 мл) в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры твердое вещество собирали; промывали холодным MeOH (3×10 мл) и сушили в вакууме над силикагелем/KOH с получением чистого N-(3-этинил-4-фторфенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (217) (0,92 г, 28%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 197-199°C. Фильтрат упаривали досуха с получением оранжевой/янтарного цвета смолы, которую наносили на колонку с диоксидом кремния [этилацетат/петролейный эфир (2:1)] с получением дополнительного количества соединения 217 (0,96 г, 29%). H ЯМР δ [(CD)SO] 9,66 (с, 1H), 8,74 (с, 1H), 8,36 (с, 1H), 8,08-8,02 (м, 1H), 7,93-7,85 (м, 1H), 7,39-7,13 (м, 5H), 6,88 (шир.д, J=8,7 Гц, 2H), 4,54-4,44 (м, 3H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHFNO·0,15MeOH: C, 68,79; H, 4,64; N, 17,33%, Найдено C, 69,09; H, 4,62; N, 16,97%.
3
3
2
15
10
5
2
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 217 (2,12 г, 5,32 ммоль) и DCM (55 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (3,70 мл, 48,3 ммоль) с последующим добавлением анизола (1,17 мл, 10,6 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 78 часов. Смесь выливали в петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 20 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл). Полученный остаток в виде твердого вещества растворяли в ацетоне (25 мл) и добавляли 5M NH (100 мл) при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 40 минут. Твердое вещество собирали и промывали последовательно смесью ацетон/вода (1:5) (5×20 мл), петролейный эфир/этилацетат=3:1 (5×20 мл) и сушили с получением N-(3-этинил-4-фторфенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (226) (1,31 г, 89%), т.пл. 218-222°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,72 (с, 1H), 8,70 (с, 1H), 8,36 (с, 1H), 8,10 (дд, J=6,4, 2,7 Гц, 1H), 7,96-7,87 (м, 1H), 7,33 (т, J=9,1 Гц, 1H), 7,13 (с, 1H), 6,26 (с, 2H), 4,50 (с, 1H). Анал. Рассчитано для CHFN·0,8HO·0,25 этилацетат: C, 60,87; H, 4,34; N, 22,18%, Найдено C, 60,67; H, 4,15; N, 22,11%.
1
3
2
21
21
5
4
К перемешиваемой смеси GDI (2,01 г, 12,4 ммоль) и безводного ТГФ (9 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (2,18 г, 11,1 ммоль) в ТГФ (7 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли смесь соединения 226 (1,24 г, 4,44 ммоль) в смешанном растворителе, состоящем из безводного ТГФ (5 мл) и DMA (6 мл), и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=30:1). После перемешивания в течение 22 часов смесь выливали в воду (200 мл) и остаток промывали при помощи MeOH. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (150 мл). Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×20 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(3-этинил-4-фторфениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (235) (1,85 г, 91%); т.пл. 103-106°C; H ЯМР δ [(CD)SO]: 10,84 (с, 1H), 10,33 (с, 1H), 9,01 (с, 1H), 8,86 (с, 1H), 8,61 (с, 1H), 8,01 (дд, J=6,4, 2,7 Гц, 1H), 7,92-7,83 (м, 1H), 7,35 (т, J=9,1 Гц, 1H), 4,51 (с, 1H), 4,17-4,03 (м, 4H), 3,32 (д, частично скрытый пиком воды, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHFNOP·MeOH: C, 53,99; H, 5,15; N, 14,31%, Найдено C, 54,21; H, 4,94; N, 14,43%.
1
3
2
21
19
6
2
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (1,56 г, 9,70 ммоль) и воды (1,6 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли 37% водный раствор HCl (1,62 мл, 19,3 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 45°C (температура бани) в течение 25 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (2,76 г, 49,3 ммоль) растворяли в воде (8 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 235 (1,76 г, 3,85 ммоль) и ТГФ (8 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (4 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (163 мг, 3,85 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Добавляли охлажденный раствор B и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=10:1). После перемешивания в течение 30 минут смесь выливали в воду (300 мл). Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали в течение 10 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (4×20 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением соединения 8 (1,38 г, 92%), которое имело чистоту только 89,7%, как было обнаружено методом ВЭЖХ. Таким образом, образец перемешивали с MeOH (примерно 40 мл) в течение 30 минут. Нерастворимое вещество отфильтровывали и к фильтратам добавляли один объем воды для осаждения нужного продукта. Твердое вещество собирали, промывали смесью вода/MeOH=3:1 (3×15 мл) и сушили с получением (2Е)-4-(диметиламино)-N-[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-2-бутенамида (8) (1,28 г, 85%) в виде желтого/коричневого твердого вещества, т.пл. 152-155°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,93 (с, 1H), 10,29 (с, 1H), 9,02 (с, 1H), 8,99 (с, 1H), 8,61 (с, 1H), 8,04 (дд, J=6,4, 2,7 Гц, 1H), 7,94-7,85 (м, 1H), 7,35 (т, J=9,1 Гц, 1H), 6,87 (дт, J=15,4, 6,0 Гц, 1H), 6,52 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 4,53 (с, 1H), 3,09 (шир.д, J=6,0 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHFNO·0,8HO·0,7MeOH: C, 61,00; H, 5,52; N, 19,67%, Найдено C, 61,26; H, 5,25; N, 19,47%.
1.1.1.9 Получение (2E)-N-[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид (9) (схема 2)
2
3
3
2
15
8
4
2
1
Гетерогенную смесь 6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4(3Н)-она (200) (1,65 г, 10,0 ммоль), тионилхлорида (20 мл) и каталитического количества DMF (2 капли) перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 24 часов с получением гомогенной смеси. Смесь упаривали при пониженном давлении при 45°C (температура бани) с получением светло-коричневого твердого вещества. К этому твердому веществу добавляли раствор 3-этинил-4-хлоранилина (J. Org. Chem., 1981, 46, 2280-2286) (1,67 г, 11,0 ммоль) и безводного DMA (15 мл). Остаток 3-этинил-4-хлоранилина промывали дополнительным количеством DMA (2×2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь выливали в воду (300 мл) и остаток промывали при помощи MeOH. pH доводили до примерно 9 с использованием водного раствора NaCO при комнатной температуре. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (300 мл). Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (5×25 мл); смесью этилацетат/петролейный эфир (1:10) (4×25 мл) и сушили с получением N-(3-этинил-4-хлорфенил)-6-фторпиридо[3,4-d]пиримидин-4-амина (209) (3,0 г, 100%) в виде бледно-коричневого твердого вещества, т.пл. 218-222°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,13 (с, 1H), 8,98 (с, 1H), 8,77 (с, 1H), 8,32-8,22 (м, 2H), 7,95 (дд, J=8,8, 2,6 Гц, 1H), 7,61 (д, J=8,8 Гц, 1H), 4,60 (с, 1H). Анал. Рассчитано для CHClFN·0,5HO·0,5MeOH: C, 57,51; H, 3,43; N, 17,31, Найдено C, 57,33; H, 3,13; N, 17,10.
4
3
2
23
18
5
4
6
1
Смесь соединения 209 (3,07 г, 10,3 ммоль) и 4-метоксибензиламина (13,5 мл, 103 ммоль) в безводном DMSO (27 мл) перемешивали в атмосфере азота при 70°C (температура бани) в течение 141 часов. Смесь охлаждали и добавляли петролейный эфир (300 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смеси давали разделиться на слои и слой петролейного эфира сливали. Эту процедуру повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (300 мл). Добавляли воду (300 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь фильтровали и промывали липкое твердое вещество водой (4×20 мл). Липкое твердое вещество растворяли в минимальном количестве ацетона (50 мл) и добавляли воду (200 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи (22 часов). Снова образовывалось липкое твердое вещество. Таким образом, продукт экстрагировали в этилацетат, который затем промывали водой несколько раз, сушили (MgSO) и упаривали. Неочищенный продукт наносили на колонку с диоксидом кремния (дихлорметан/MeOH=50:1) с получением N-(4-хлор-3-этинилфенил)-N-(4-метоксибензил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (218) (2,30 г, 54%) в виде зеленовато-желтого твердого вещества, т.пл. 201-203°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,72 (с, 1H), 8,76 (с, 1H), 8,40 (с, 1H), 8,19 (д, J=2,5 Гц, 1H), 7,96 (дд, J=8,9, 2,5 Гц, 1H), 7,56 (д, J=8,9 Гц, 1H), 7,39-7,28 (м, 3H), 7,17 (с, 1H), 6,93-6,82 (м, 2H), 4,59 (с, 1H), 4,49 (д, J=6,3 Гц, 2H), 3,71 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHClNO·0,18 гексан: C, 67,04; H, 4,80; N, 16,23%, Найдено C, 66,76; H, 4,79; N, 15,96%.
3
3
2
15
10
5
2
4
1
К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 218 (2,27 г, 5,46 ммоль) и DCM (55 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,2 мл, 54,6 ммоль) с последующим добавлением анизола (1,2 мл, 10,9 ммоль) и смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 50 часов. Смесь выливали в петролейный эфир (400 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 30 минут. Слой петролейного эфира сливали и отбрасывали. Способ повторяли с использованием дополнительного количества петролейного эфира (400 мл). Полученный остаток в виде твердого вещества растворяли в ацетоне (30 мл) и добавляли 5M NH (150 мл) при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Твердое вещество собирали и промывали последовательно смесью ацетон/вода (1:5) (5×20 мл), петролейный эфир/этилацетат=10:1 (5×20 мл) и сушили с получением N-(4-хлор-3-этинилфенил)пиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамина (227) (1,54 г, 95%), т.пл. 210-213°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 9,77 (с, 1H), 8,71 (с, 1H), 8,40 (с, 1H), 8,24 (д, J=2,6 Гц, 1H), 7,97 (дд, J=8,8, 2,6 Гц, 1H), 7,55 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,14 (с, 1H), 6,29 (с, 2H), 4,56 (с, 1H). Анал. Рассчитано для CHClN·1,3HO·0,5 ацетон: С, 56,92; H, 4,52; N, 20,11%, Найдено С, 56,81; H, 4,22; N, 19,82%.
1
3
2
21
21
5
4
2
К перемешиваемой смеси CDI (2,14 г, 13,2 ммоль) и безводного ТГФ (10 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли раствор 2-(диэтоксифосфорил)уксусной кислоты (2,31 г, 11,8 ммоль) в ТГФ (8 мл). После добавления реакционную смесь продолжали перемешивать при 40°C (температура бани) в течение 15 минут (до момента, когда выделение газов прекращалось). Добавляли смесь соединения 227 (1,39 г, 4,70 ммоль) в смешанном растворителе, состоящем из безводного ТГФ (6 мл) и DMA (7 мл), и продолжали перемешивание при 40°C. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (дихлорметан-MeOH=15:1). После перемешивания в течение 3 часов смесь выливали в воду (300 мл) и остаток промывали при помощи MeOH. Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение мин. Слой петролейного эфира сливали. Это снова повторяли с петролейным эфиром (200 мл). Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×30 мл) и сушили с получением диэтил 2-(4-(4-хлор-3-этинилфениламино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-иламино)-2-оксоэтилфосфоната (236) (2,03 г, 91%); т.пл. 124-127°C; H ЯМР δ [(CD)SO]: 10,86 (с, 1H), 10,37 (с, 1H), 9,03 (с, 1H), 8,87 (с, 1H), 8,65 (с, 1H), 8,14 (шир.с, 1H), 7,93 (шир.д, J=8,8 Гц, 1H), 7,35 (д, J=8,8 Гц, 1H), 4,58 (с, 1H), 4,20-4,00 (м, 4H), 3,30 (д, частично скрытый пиком воды, 2H), 1,26 (т, J=7,0 Гц, 6H). Анал. Рассчитано для CHC1NOP·HO·0,2THF: C, 51,72; H, 4,90; N, 13,83%, Найдено C, 52,06; H, 4,82; N, 13,70%.
1
3
2
21
19
6
К перемешиваемой смеси 2,2-диэтокси-N,N-диметилэтанамина (1,67 г, 10,4 ммоль) и воды (1,8 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли 37% водный раствор HCl (1,75 мл, 20,8 ммоль). После добавления смесь перемешивали при 45°C (температура бани) в течение 27 часов. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором A. KOH (2,98 г, 53,2 ммоль) растворяли в воде (9 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь охлаждали до 0°C (температура бани). Это называли раствором B. К перемешиваемой гетерогенной смеси соединения 236 (1,97 г, 4,16 ммоль) и ТГФ (9 мл) при комнатной температуре и в атмосфере азота добавляли минимальное количество DMA (4,5 мл) с получением гомогенного раствора. Добавляли LiCl (176 мг, 4,16 ммоль) и перемешивали при 0°C (температура бани) в течение 15 минут. Добавляли охлажденный раствор B и перемешивали при 0°C в течение 2 минут. Затем добавляли охлажденный раствор А и конечную реакционную смесь продолжали перемешивать при 0°C в атмосфере азота. Реакцию отслеживали при помощи ТСХ (DCM-MeOH=10:1). После перемешивания в течение 35 минут смесь выливали в воду (300 мл). Добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Слой петролейного эфира сливали. Снова добавляли петролейный эфир (300 мл) и перемешивали в течение 10 минут. Твердое вещество собирали с использованием вакуум-фильтрации; промывали водой (5×20 мл); смесью петролейный эфир/этилацетат=10:1 (3×30 мл); сушили при пониженном давлении над силикагелем/KOH с получением соединения 9 (1,61 г, 95%), которое имело чистоту только 85,2%, как было обнаружено методом ВЭЖХ. Таким образом, образец очищали на колонке с диоксидом кремния (этилацетат/MeOH=10:1). Фракции, содержащие нужный продукт, объединяли и упаривали с получением желтого/оранжевого твердого вещества. Твердое вещество растворяли в теплом этилацетате (30 мл) и осаждали при помощи петролейного эфира (90 мл). Твердое вещество собирали; промывали смесью петролейный эфир/этилацетат=3:1 (3×20 мл) и сушили с получением (2E)-N-[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]-4-(диметиламино)-2-бутенамида (9) (1,1 г, 65%) в виде желтого/оранжевого твердого вещества, т.пл. 173-176°C; H ЯМР δ [(CD)SO] 10,92 (с, 1H), 10,31 (с, 1H), 9,03 (с, 1H), 9,00 (с, 1H), 8,66 (с, 1H), 8,18 (д, J=2,2 Гц, 1H), 7,96 (дд, J=8,9, 2,2 Гц, 1H), 7,57 (д, J=8,9 Гц, 1H), 6,88 (дт, J=15,4, 6,0 Гц, 1H), 6,52 (шир.д, J=15,4 Гц, 1H), 4,58 (с, 1H), 3,09 (шир.д, J=5,8 Гц, 2H), 2,19 (с, 6H). Анал. Рассчитано для CHClNO·0,8MeOH·0,1 этилацетат: C, 60,42; H, 5,25; N, 19,04%, Найдено C, 60,15; H, 4,90; N, 18,76%.
1.1.2 Синтез α-метилбромидных триггеров
1.1.2.1 Получение 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазола (239) (схема 3)
Способ 1
2
3
3
1
К суспензии соединения 237 (20,0 г, 157,36 ммоль) (получено в соответствии со способом, описанным в Chauviére et al, J. Med. Chem. 2003, 46, 427-440) и KCO (32,62 г, 236,04 ммоль) в DMF (200 мл) при 0°C добавляли по каплям метилиодид (14,70 мл, 236,04 ммоль). Полученной смеси давали нагреться до комнатной температуры и затем перемешивали в течение 2 часов, затем избыточное количество метилиодида выпаривали при комнатной температуре. Осадок удаляли фильтрованием и DMF фильтрат концентрировали при пониженном давлении при 45-50°C. Полученный остаток полностью экстрагировали при помощи MeCN/DCM (1:9) и объединенные экстракты фильтровали через короткую колонку с силикагелем. После удаления растворителей неочищенный продукт перекристаллизовывали из MeCN и толуола с получением соединения 238 в виде не совсем белого кристаллического твердого вещества (15,74 г, 71%), т.пл. 161-163°C. ЯМР (CDCl) δ 7,33 (с, 1H), 3,65 (с, 3H), 2,63 (с, 3H). Идентично тому, как было описано ранее (Hosmane et al, J. Org. Chem., 1985, 50(26), 5892-5).
1
79/81
3
5
6
3
2
5
7
3
2
Раствор соединения 238 (4,00 г, 28,34 ммоль) и NBS (5,30 г, 29,78 ммоль) в MeCN (200 мл) подвергали облучению при температуре кипения с обратным холодильником в течение 2 часов с использованием 1000 Ватт лампы накаливания с нитью из галогенида вольфрама. Приблизительно 1/2 часть растворителя удаляли в вакууме, затем добавляли воду (100 мл). Дальнейшее концентрирование при пониженном давлении давало белый осадок, который собирали фильтрованием, промывали водой и сушили в вакууме с получением 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазола (239) (4,69 г, 75%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 130-132°C. ЯМР (CDCl, 400МГц) δ 7,74 (с, 1H), 4,50 (с, 2H), 3,83 (с, 3H). Идентично тому, как было описано ранее (Stribbling et al, международная патентная публикация РСТ WO 2008/039087). Анализ найдено: C, 27,81; Н, 3,27; N, 19,05. CHBrNO·0,04 гексан требуется: C, 28,16; Н, 2,96; N, 18,80. HRMS (FAB+) найдено: 219,97220, 221,97018 (M+1), расчитано для CH BrNO: 219,97216, 221,97012.
Способ 2
2
3
1
Соединение 237 (120 г, 0,94 моль), ΚСО (259,8 г, 1,88 моль) и ацетонитрил (2 л) загружали в 5-л 3-горлую колбу и смесь охлаждали до 0°C при перемешивании при 200 об/мин. Диметилсульфат (DMS) (97,8 мл, 1,03 моль) медленно добавляли через шприцевой насос в течение 2 часов. Через 2 часа реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и выдерживали в течение ночи. Твердые вещества фильтровали через целит (120 г) и 5-л колбу промывали ацетонитрилом (200 мл). Твердые вещества промывали ацетонитрилом (2×500 мл) до полного удаления продукта. Раствор разбавляли 75% насыщенным солевым раствором (1 л) и ацетонитрил удаляли при помощи роторного испарителя. Полученную суспензию экстрагировали дихлорметаном (4×1 л). Объединенные органические слои фильтровали, затем добавляли толуол (1 л) и дихлорметан удаляли при помощи роторного испарителя. Полученную суспензию фильтровали и фильтровальную лепешку промывали толуолом (2×1 л). Влажное твердое вещество выделяли в виде не совсем белого твердое вещества (121 г). Влажное твердое вещество перекристаллизовывали из воды (1 л) и твердые частицы промывали гептаном (1 л). Твердое вещество сушили в 40°C вакуумной печи в течение ночи. Соединение 238 выделяли в виде белого твердого вещества (86,6 г, 67%). Данные Н ЯМР идентичны описанным выше.
2
3
2
2
5
2
2
5
1
20-л реактор снабжали вводом для N, холодильником, датчиком температуры и устройством для воздушного перемешивания. В реактор загружали соединение 238 (100 г, 0,71 моль), 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (DBDMH) (203,0 г, 0,71 моль), 2,2'-азобисизобутиронитрил (AIBN) (45,97 г, 0,28 моль) и дихлорметан (6 л). Реакционную смесь нагревали при температуре кипения с обратным холодильником и перемешивали гомогенный раствор при 150 об/мин. Через 100 часов реакционную смесь выдерживали при 20°C в течение 36 часов, затем реакционную смесь гасили 10% раствором NaHCO (1,5 л) и 10% раствором NaSO (1 л) до достижения pH 7 и отрицательной реакции на KI-индикаторную бумагу (примечание: наблюдали некоторое выделение газа и небольшую экзотерму [6°C] в процессе добавления NaSO). Органический слой отделяли и фильтровали, затем добавляли воду (1 л) и дихлорметан удаляли при помощи роторного испарителя. Полученную суспензию фильтровали с получением светло-желтого твердого вещества, которое снова суспендировали в толуоле (500 мл) при 50°C в течение 2,5 часов, затем охлаждали до комнатной температуры. Последующее фильтрование давало твердое вещество, которое сушили при 40°C в вакуумной печи в течение ночи, затем суспендировали в толуоле (500 мл) при 100°C в течение 1 часа. После охлаждения до комнатной температуры суспензию фильтровали с получением твердого вещества, которое сушили в 40°C вакуумной печи в течение ночи с получением 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазола (239) (63,3 г, 38%) в виде светло-желтого твердого вещества. Данные Н ЯМР идентичны описанным выше.
1.1.2.2 Получение 5-(бромметил)-1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазола (244) (схема 4)
2
3
3
1
К суспензии соединения 240 (50,0 г, 393,39 ммоль) и KCO (81,55 г, 590,08 ммоль) в DMF (300 мл) при 0°C добавляли по каплям метилиодид (36,74 мл, 590,08 ммоль). Полученной смеси давали нагреться до комнатной температуры и затем перемешивали в течение 2 часов, затем избыточное количество метилиодида выпаривали при комнатной температуре. Осадок удаляли фильтрованием и DMF фильтрат концентрировали при пониженном давлении при 45-50°C. Полученный остаток полностью экстрагировали при помощи MeCN/DCM (1:9) и фильтровали через короткую колонку с силикагелем. После удаления растворителей неочищенный продукт перекристаллизовывали из MeCN (содержащего небольшое количество MeOH) и толуола с получением соединения 241 (52,22 г, 94,0%) в виде белого кристаллического твердого вещества. Н ЯМР (CDCl) δ 7,66 (с, 1H), 3,67 (с, 3H), 2,43 (с, 3H). LR-MS (APCI+ve): m/e 142,5 (M+1). Идентичны данным, приведенным ранее (Rav-Acha and Cohen, J. Org. Chem. 1981, 46(23), 4717-4720).
Раствор соединения 241 (33,0 г, 233,83 ммоль) и трет-бутил дихлорацетата (64,90 г, 350,74 ммоль) (получен из дихлорацетилхлорида, трет-бутанола и триэтиламина в DCM) в DMF (400 мл) добавляли по каплям к суспензии трет-бутоксида калия (91,83 г, 818,40 ммоль) в DMF (400 мл) при температуре в пределах от -35 до -25°C (баня сухой лед/MeCN). Полученную смесь перемешивали при -25°C еще в течение 20 минут, затем выливали в 0,5н раствор HCl (приблизительно 1000 мл). Стандартная обработка смесью этилацетат/вода и колоночная хроматография на силикагеле с элюированием смесью этилацетат/гексан (3:2) затем давали неочищенное соединение 242 в виде темного твердого вещества (23,83 г, 35%), которое использовали без дополнительной очистки. LR-MS (APCI+ve) m/e 290,5/292,5 (3:1, M+1).
3
3
1
Соединение 242, полученное выше (23,83 г, 82,25 ммоль), обрабатывали кипящей уксусной кислотой (120 мл) в течение 45 минут, затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Стандартная обработка остатка смесью NaHCO/DCM с последующей колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием этилацетатом затем давали соединение 243 (10,00 г, 64%) в виде белого твердого вещества. H ЯМР (CDCl) δ 5,03 (с, 2H), 3,67 (с, 3Н), 2,46 (с, 3Н). LR-MS (APCI+ve): m/e 190,4/192,4 (3:1, M+1).
2
3
5
6
3
2
1
Суспензию соединения 243 (10,00 г, 52,74 ммоль) и LiBr (4,80 г, 55,20 ммоль) в этилацетате (500 мл) нагревали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 4 часов, затем подвергали стандартной этилацетатной/водной обработке. Полученное таким образом твердое вещество обрабатывали снова при помощи LiBr/этилацетата, как описано выше. Неочищенный продукт затем осаждали из DCM/i-PrO путем добавления гексана с получением 5-(бромметил)-1,2-диметил-4-нитро-1H-имидазола (244) (11,46 г, 93%) в виде не совсем белого твердого вещества. H ЯМР (CDCl) δ 4,88 (с, 2H), 3,64 (с, 3H), 2,46 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHBrNO·0,04 гексан: С, 28,16; H, 2,96; N, 18,80%, Найдено: С, 27,81; H, 3,27; N, 19,05%. LR-MS (APCI+ve): m/e 234,4/236,4 (1:1, M+1).
1.1.2.3 Получение 5-(бромметил)-2-этил-1-метил-4-нитро-1Н-имидазола (250) (схема 5)
1
3
5
6
3
2
К суспензии соединения 238 (12,65 г, 90,00 ммоль) в хлороформе (100 мл) медленно добавляли бром (5,53 мл, 108,00 ммоль). Полученную смесь затем перемешивали в течение 2 часов, затем добавляли воду (130 мл). Хлороформ затем удаляли путем дистилляции, и полученный осадок собирали фильтрованием, промывали водой и сушили в вакууме с получением соединения 245 (15,50 г, 79%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 180-181°C, идентичного приведенным ранее данным (Pyman and Timmis, J. Chem. Soc., Trans., 1923, 123, 494-503). H ЯМР (CDCl) δ 3,63 (с, 3H), 2,69 (с, 3H). Анал. Рассчитано для CHBrNO: С, 27,29; H, 2,75; N, 19,10%. Найдено: С, 27,56; H, 2,83; N, 19,10%. LR-MS (APCI+ve): m/e 220,3/222,3 (1:1, M+1).
1
3
5
5
2
3
2
Раствор соединения 245 (2,20 г, 10,0 ммоль) и N-бромсукцинимида (NBS) (1,96 г, 11,0 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) подвергали тепловому излучению при температуре кипения с обратным холодильником в течение 2 часов при помощи лампы накаливания 1000 Ватт с нитью из галогенида вольфрама. Приблизительно 1/2 часть растворителя затем удаляли на роторном испарителе, затем добавляли такой же объем воды. Дальнейшее упаривание давало белый осадок, который собирали фильтрованием, промывали водой и сушили в вакууме с получением соединения 246 (2,84 г, 95%) в виде белого твердого вещества. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) д 4,88 (с, 2H), 3,74 (с, 3H). Анал. найдено: C, 20,36; H, 1,74; N, 13,98, CHBrNO требуется: C, 20,09; H, 1,69; N, 14,06. LR-MS (+): m/e 234,4/ 236,4 (1:1, M+1), 298,3/300,3/302,3 (1:2:1, M+1).
1
3
7
8
3
4
m/e
К раствору соединения 246 (2,80 г, 9,36 ммоль) в DMF (30 мл) добавляли безводный ацетат натрия (1,92 г, 23,4 ммоль). Смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре, затем осуществляли стандартную водную/этилацетатную обработку с получением соединения 247 (2,54 г, 98%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 110-112°C. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) д 5,50 (с, 2H), 3,74 (с, 3H), 2,11 (с, 3H). Анал. найдено: C, 30,48; H, 2,82; N, 15,13, CHBrNO требуется: C, 30,24; H, 2,90; N, 15,11. LR-MS (+): 278,4/ 280,4 (1:1, M+1).
1
3
9
13
3
4
m/e
Смесь соединения 247 (1,90 г, 6,83 ммоль), тетраэтилолова (5,42 мл, 27,34 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладия (790 мг, 0,68 ммоль) в NMP (20 мл) нагревали при 110-120°C в течение 5 часов, затем подвергали стандартной водной/этилацетатной обработке. Полученный неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией с элюированием смесью MeCN/DCM (1:5), затем осаждали из DCM путем добавления гексана, с получением соединения 248 (1,04 г, 67%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 71-73°C. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 5,48 (с, 2H), 3,64 (с, 3Н), 2,76 (кв., J=7,43 Гц, 2H), 2,10 (с, 3Н), 1,37 (т, J=7,43 Гц, 3Н). Анал. найдено: С, 48,11; H, 5,90; N, 18,23%. CHNO·0,04 гексан требуется: С, 48,11; H, 5,92; N, 18,22%. LR-MS (+): 228,5 (M+1).
2
3
3
7
11
3
3
1
К раствору соединения 248 (1,25 г, 5,50 ммоль) в MeOH (10 мл) добавляли безводный KCO (1,52 г, 11,0 ммоль). После перемешивания в течение 20 минут растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток растворяли в DCM, фильтровали через слой силикагеля и промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением белых кристаллов, которые собирали фильтрованием и промывали смесью этилацетат/гексан (1:1), с получением соединения 249 (949 мг, 93%) в виде белого кристаллического твердого вещества, т.пл. 153-155°C. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 4,96 (д, J=6,80 Гц, 2H), 3,67 (с, 3H), 2,79 (т, J=6,80 Гц, 1H), 2,74 (кв., J=7,50 Гц, 2H), 1,36 (т, J=7,50 Гц, 3H). Анал. найдено: C, 45,71; H, 6,07; N, 22,87%. CHNO требуется: C, 45,40; H, 5,99; N, 22,68%. LR-MS (+): m/e 186,5 (M+1).
1
1
3
7
10
3
2
m/e
К раствору соединения 249 (685 мг, 3,70 ммоль) в DCM (30 мл) при 0°C добавляли триэтиламин (0,773 мл, 5,55 ммоль) с последующим добавлением по каплям MsCl (0,344 мл, 4,44 ммоль). После перемешивания в течение 45 минут смесь промывали два раза насыщенным водным раствором хлорида аммония и один раз насыщенным солевым раствором, затем сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали через целит. Концентрирование фильтрата в вакууме давало белое твердое вещество (971 мг), которое по данным Н ЯМР, представляло собой смесь мезилата и α-метилхлорида (3:1), и которое использовали непосредственно на следующей стадии. Раствор этого твердого вещества (968 мг) в ТГФ (50 мл) обрабатывали при помощи LiBr (6,39 г, 86,85 ммоль) при температуре кипения с обратным холодильником в течение 0,5 часа. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении и полученный остаток распределяли между водой и этилацетатом. Органическую фазу промывали водой два раза и насыщенным солевым раствором один раз, затем сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали через целит. Растворитель удаляли в вакууме с получением 5-(бромметил)-2-этил-1-метил-4-нитро-1H-имидазола (250) (851 мг, 93%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 91-93°C. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 4,88 (с, 2H), 3,65 (с, 3H), 2,76 (кв., J=7,60 Гц, 2H), 1,37 (т, J=7,60 Гц, 3H). Анал. найдено: C, 34,41; H, 4,07; N, 16,96%. CHBrNO·0,04EtOAc требуется: C, 34,18; H, 4,13; N, 16,70%. LR-MS (+): 248,4/250,4 (1:1, M+1).
1.1.2.4 Получение 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-2-карбонитрила (264) (схема 7)
Способ 1
2
3
1
6
К раствору соединения 246 (1,40 г, 4,68 ммоль) в DMA (14 мл), содержащем несколько капель воды, добавляли KCO (647 мг, 4,68 ммоль). Полученный раствор перемешивали в течение ночи, затем осуществляли стандартную этилацетатную обработку с последующей колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью MeCN/DCM (5:95-15:85), с получением соединения 262 (330 мг, 30%) в виде не совсем белого твердого вещества. H ЯМР (d-DMSO, 400 МГц) δ 5,56 (т, J=5,8 Гц, 1H), 4,86 (д, J=5,8 Гц, 2H), 3,70 (с, 3H). LR-MS (+): m/e 236,5/238,5 (1:1, M+1).
2
2
3
4
3
1
1
J=
Смесь соединения 262 (300 мг, 1,27 ммоль), Zn(CN) (90 мг, 0,76 ммоль), цинкового порошка (10 мг, 0,15 ммоль), Pd(dba) (23 мг, 0,025 ммоль) и dppf (28 мг, 0,051 ммоль) в DMA (3 мл) перемешивали в атмосфере азота при 120°C в течение 3,5 часов. Стандартная обработка при помощи водного NHCl/этилацетата с последующей колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью этилацетат/гексан (1:1-2:1) затем давали соединение 263 (180 мг) в виде не совсем белого твердого вещества, которое по данным Н ЯМР содержало небольшое количество непрореагировавшего исходного вещества 262 и которое использовали непосредственно на следующей стадии. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 5,09 (д, J=6,7 Гц, 2H), 4,00 (с, 3H), 2,49 (т,6,7 Гц, 1H).
4
4
3
1
1
К раствору соединения 263 (173 мг, примерно 0,93 ммоль) в ТГФ (10 мл) при 0°C добавляли MsCl (0,088 мл, 1,14 ммоль) с последующим добавлением по каплям DIPEA (0,182 мл, 1,04 ммоль). После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь подвергали стандартной обработке при помощи водного NHC1/этилацетата с получением желтого масла (237 мг; смесь мезилата и α-метилхлорида по данным Н ЯМР), которое использовали непосредственно. К раствору этого масла (235 мг, примерно 0,90 ммоль) в ТГФ (10 мл) добавляли LiBr (1,57 г, 18,06 ммоль). После нагревания при температуре кипения с обратным холодильником в течение 0,5 часа растворитель удаляли в вакууме и остаток подвергали стандартной обработке при помощи водного NHC1/этилацетата. Неочищенный продукт далее очищали колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью этилацетат/гексан (1:4-1:2) с получением 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-2-карбонитрила (264) (65 мг, 21% от трех стадий) в виде розового масла. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 4,86 (с, 2H), 3,95 (с, 3H). LR-MS (+):m/e 277,6/279,6 (1:1, M+1+MeOH).
Способ 2
2
2
3
3
6
6
4
2
1
Смесь соединения 245 (1,10 г, 5,00 ммоль), Zn(CN) (352 мг, 3,00 ммоль), цинкового порошка (39 мг, 0,60 ммоль), Pd(dba) (92 мг, 0,10 ммоль) и dppf (11 мг, 0,20 ммоль) в DMA (10 мл) перемешивали в атмосфере азота при 120°C в течение 3 часов. Реакционную смесь затем разбавляли водой и подвергали стандартной этилацетатной обработке с последующей колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью этилацетат/гексан (3:4 затем 1:1) с получением соединения 265 (657 мг, 79%) в виде не совсем белого твердого вещества, т.пл. 99-101°C. H ЯМР (CDCl) δ 3,84 (с, 3H), 2,72 (с, 3H). Анал. найдено: C, 43,64; H, 3,58; N, 33,86, CHNO требуется: C, 43,38; H, 3,64; N, 33,72.
1
79/81
79/81
+
3
6
5
4
2
6
5
4
2
Смесь соединения 265 (166 мг, 1,00 ммоль), 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоина (DBDMH) (286 мг, 1,00 ммоль), 2,2'-азобисизобутиронитрила (AIBN) (66 мг, 0,40 ммоль) в дихлорметане (10 мл) нагревали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 5 дней, затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью этилацетат/гексан (1:2 затем 1:1) с получением 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-2-карбонитрила (264) (137 мг, 56%) в виде бесцветного масла. Н ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 4,86 (с, 2H), 3,95 (с, 3Н). Анал. найдено: С, 30,17; H, 1,99; N, 22,25. CHBrNO·0,07EtOAc требуется: С, 30,03; H, 2,23; N, 22,30. HRMS (ESI+, Br) Найдено: m/z 266,9490/268,9475 (M+Na), рассчитано для CH BrNNaO : 266,9488/268,9468.
1.1.2.5 Получение 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-2-карбоксамида (266) (схема 7)
2
4
3
2
6
8
4
3
1
79/81
79/81
Раствор 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-2-карбонитрила (264) (70 мг, 0,29 ммоль) в 90% HSO (1 мл) нагревали при 65-70°C в течение 1 часа, затем разбавляли водой и подвергали стандартной этилацетатной обработке с получением 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-1H-имидазол-2-карбоксамида (266) (67 мг, 84%), в виде белого твердого вещества, т.пл. 220-222°C. H ЯМР [(CD)SO] δ 8,18 (с, 1H), 7,87 (с, 1H), 5,05 (с, 2H), 4,02 (с, 3Н), HR-MS (APCI+, Br) найдено: m/z 262,9770/264,9752 (M+1), рассчитано для CH BrNO+: 262,9774/264,9754.
1.1.2.6 Получение 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1Н-имидазола (270) (схема 8)
1
1
3
3
2
3
m/e
Смесь соединения 247 (500 мг, 1,80 ммоль), трибутил(1-пропинил)олова (1,64 мл, 5,39 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладия (416 мг, 0,36 ммоль) в NMP (15 мл) нагревали при 80°C в течение ночи (14 часов), затем подвергали стандартной водно-этилацетатной обработке. Полученный неочищенный продукт далее очищали колоночной флэш-хроматографией с элюированием смесью MeCN/DCM (градиент от 1:20 до 1:5) с получением соединения 267 (147 мг, 34%) в виде белого твердого вещества, H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 5,47 (с, 2H), 3,77 (с, 3Н), 2,14 (с, 3Н), 2,10 (с, 3Н). LR-MS (+): 238,5 (M+1);с последующим получением соединения 268 (105 мг, 30%) также в виде белого твердого вещества, H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 4,96 (д, J=7,0 Гц, 2H), 3,79 (с, 3H), 2,60 (т, J=7,0 Гц, 1H), 2,14 (с, 3H). LR-MS (+): m/e 196,5 (M+1). Соединение 268 получали с количественным выходом путем обработки соединения 267 при помощи KCO в MeOH.
1
1
3
К раствору соединения 268 (110 мг, 0,56 ммоль) в DCM (10 мл) при 0°C добавляли метиламин (0,118 мл, 0,84 ммоль) с последующим добавлением по каплям MsCl (0,052 мл, 0,68 ммоль). По прошествии 30 минут при 0°C и 30 минут при комнатной температуре смесь промывали два раза насыщенным водным раствором хлорида аммония и насыщенным солевым раствором, затем сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали через целит. Концентрирование при пониженном давлении давало соединение(я) 269 (5 мг, ~94%) в виде не совсем белого твердого вещества, которое по данным Н ЯМР представляло собой смесь мезилата и хлорида (3,6:1), и которое использовали без дополнительной очистки. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) мезилата: δ 5,62 (с, 2H), 3,81 (с, 3Н), 3,13 (с, 3Н), 2,15 (с, 3Н); хлорида: δ 5,02 (с, 2H), 3,79 (с, 3H), 2,14 (с, 3H). LR-MS (+): 274,5 (M+1 мезилата); 214,4/216,4 (3:1, M+1 хлорида).
1
3
m/e
Смесь 269 (145 мг, -0,53 ммоль) обрабатывали при помощи LiBr (922 мг, 10,61 ммоль) в кипящем ТГФ (10 мл) в течение 30 минут. ТГФ затем удаляли в вакууме и полученный остаток распределяли между водой и этилацетатом. Органическую фазу промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали через целит, затем концентрировали в вакууме. Полученный таким образом неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией с элюированием смесью этилацетат/гексан (1:1) с получением 5-(бромметил)-1-метил-4-нитро-2-(1-пропинил)-1H-имидазола (270) (95 мг, 69%) в виде белого твердого вещества. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 4,86 (с, 2H), 3,76 (с, 3H), 2,14 (с, 3H). LR-MS (+): 258,5/260,5 (1:1, M+1).
1.1.3 Синтез четвертичных аммониевых солей, являющихся пролекарствами
Способ A: Получение пролекарств в форме четвертичных аммониевых солей в N-метил-2-пирролидиноне (NMP) с последующим осаждением ацетонитрилом.
К раствору диметиламин-содержащего ингибитора киназы формулы I в NMP при комнатной температуре добавляли α-метилбромидный триггер (1,0-1,2 экв.). Полученную смесь перемешивали в течение ночи (~15 часов). Ацетонитрил затем добавляли по каплям к реакционной смеси при постоянном перемешивании до тех пор, пока не началось образование осадка. Полученную смесь затем перемешивали еще в течение 2 часов, затем осадок собирали фильтрованием или путем центрифугирования, промывали ацетонитрилом, этилацетатом и гексаном. Сушка в вакууме затем давала пролекарство в форме четвертичной аммониевой соли в виде белого или не совсем белого твердого вещества. При необходимости продукт подвергали дополнительной очистке путем перекристаллизации из NMP и MeCN.
1.1.3.1 Получение (2Е)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (12) (схема 10)
1
3
2
31
30
2
9
4
2
Взаимодействие соединения 1 (500 мг, 0,96 ммоль) в NMP (1,2 мл) с α-метилбромидом 239 (231 мг, 1,05 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-4-[(4-{3-хлор-4-[(3-хлорбензил)окси]анилино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (12) (517 мг, 73%), т.пл. 182-186°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,28 (с, 1H), 10,25 (с, 1H), 9,04 (с, 1H), 8,98 (с, 1H), 8,61 (с, 1H), 8,14 (с, 1H), 7,98 (д, J=2,5 Гц, 1H), 7,74-7,72 (дд, J=8,9, 2,5 Гц, 1H), 7,56 (с, 1H), 7,47-7,40 (м, 3H), 7,28 (д, J=9,1 Гц, 1H), 7,06-6,98 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,26 (с, 2H), 5,05 (шир., 2H), 4,44 (д, J=7,1 Гц, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,13 (с, 6H). Анал. найдено: С, 48,93; H, 3,92; N, 16,27. CHBrClNO·HO·0,1 EtOAc требуется: С, 48,96; H, 4,29; N, 16,37.
1.1.3.2 Получение (2Е)-4-[(4-{3-фторбензил)-1Н-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (13) (схема 10)
1
3
2
32
31
11
3
2
Взаимодействие соединения 2 (500 мг, 1,01 ммоль) в NMP (1,8 мл) с α-метилбромидом 239 (244 мг, 1,11 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-4-[(4-{3-фторбензил)-1Н-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (13) (538 мг, 74%), т.пл. 183-187°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,27 (с, 1H), 10,35 (с, 1H), 9,02 (с, 2H), 8,56 (с, 1H), 8,17-8,14 (м, 3H), 7,75-7,69 (м, 2H), 7,40-7,35 (м, 1H), 7,12-6,99 (м, 4H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,71 (с, 2H), 5,05 (шир., 2H), 4,44 (д, J=7,0 Гц, 2H), 3,87 (с, 3H), 3,13 (с, 6H). Анал. найдено: C, 51,71; H, 4,53; N, 20,33, CHBrFNO·1,5HO·0,1EtOAc требуется: C, 51,72; H, 4,66; N, 20,48.
1.1.3.3 Получение (2Е)-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1Н-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (14) (схема 11)
1
3
2
33
33
11
2
Взаимодействие соединения 2 (100 мг, 0,20 ммоль) в NMP (0,5 мл) с α-метилбромидом 244 (52 мг, 0,22 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-N-[(1,2-диметил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-[(4-{[1-(3-фторбензил)-1Н-индазол-5-ил]амино}пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил)амино]-N,N-диметил-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (14) (93 мг, 63%), т.пл. 188-192°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,27 (с, 1H), 10,38 (с, 1H), 9,03 (с, 2H), 8,56 (с, 1H), 8,17 (с, 2H), 7,76-7,68 (м, 2H), 7,40-7,35 (м, 1H), 7,12-6,99 (м, 4H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,71 (с, 2H), 5,05 (шир., 2H), 4,43 (д, J=6,8 Гц, 2H), 3,75 (с, 3H), 3,11 (с, 6H), 2,44 (с, 3H). Анал. найдено: C, 50,81; H, 4,76; N, 19,42. CHBrFNO·2,9HO требуется: C, 50,63; H, 5,00; N, 19,64.
1.1.3.4 Получение (2Е)-4-{(4-[3-хлор-4-[(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (15) (схема 10)
1
3
2
30
30
10
4
2
Взаимодействие соединения 3 (500 мг, 1,02 ммоль) в NMP (1 мл) с α-метилбромидом 239 (225 мг, 1,02 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-4-{(4-[3-хлор-4-[(2-пиридинилметокси)анилино]пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил}амино)-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (15) (610 мг, 84%), т.пл. 189-191°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,28 (с, 1H), 10,25 (с, 1H), 9,04 (с, 2H), 8,98 (с, 1H), 8,61-8,60 (м, 2H), 8,14 (с, 1H), 7,99 (д, J=2,5 Гц, 1H), 7,91-7,87 (дт, J=1,6, 7,7 Гц, 1H), 7,74-7,71 (дд, J=2,5, 8,94 Гц, 1H), 7,59 (д, J=7,8 Гц, 1H), 7,39-7,36 (дд,J=5,3, 7,0 Гц, 1H), 7,29 (д, J=9,0 Гц, 1H), 7,06-6,98 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,31 (с, 2H), 5,05 (шир., 2H), 4,44 (д, J=7,1 Гц, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,11 (с, 6H). Анал. найдено: C, 48,65; H, 4,34; N, 18,58. CHBrClNO·1,8HO требуется: C, 48,54; H, 4,56:, N, 18,87.
1.1.3.5 Получение (2Е)-4-{[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (16) (схема 10)
1
3
2
24
24
2
9
3
2
,
Взаимодействие соединения 4 (500 мг, 1,20 ммоль) в NMP (1,2 мл) с α-метилбромидом 239 (290 мг, 1,32 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-4-{[4-(3,4-дихлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (16) (648 мг, 85%), т.пл. 191-195°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,32 (с, 1H), 10,41 (с, 1H), 9,09 (с, 1H), 9,02 (с, 1H), 8,71 (с, 1H), 8,27 (д, J=2,4 Гц, 1H), 8,14 (с, 1H), 7,93-7,90 (дд, J=8,8, 2,4 Гц, 1H), 7,67 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,07-6,99 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,06 (шир., 2H), 4,45 (д, J=7,2 Гц, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,13 (с, 6H). Анал. найдено: С, 43,86; H, 3,82; N, 18,79. CHBrClNO·HO·01EtOAc требуется: С, 44,13; H, 4,07; N, 18,98.
1.1.3.6 Получение (2Е)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (17) (схема 10)
1
3
2
24
24
2
9
3
2
Взаимодействие соединения 5 (500 мг, 1,08 ммоль) в NMP (1,2 мл) с α-метилбромидом 239 (262 мг, 1,19 ммоль) в соответствии со способом А давало ((2Е)-4-{[4-(3-бром-4-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (17) (650 мг, 88%), т.пл. 200-204°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,32 (с, 1H), 10,40 (с, 1H), 9,08 (с, 1H), 9,02 (с, 1H), 8,70 (с, 1H), 8,37 (д, J=2,5 Гц, 1H), 8,14 (с, 1H), 7,98-7,95 (дд, J=8,8, 2,5 Гц, 1H), 7,66 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,06-6,99 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,3 Гц, 1H), 5,05 (шир., 2H), 4,44 (д, J=7,2 Гц, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,13 (с, 6H). Анал. найдено: С, 41,16; H, 3,67; N, 17,55. CHBrClNO·HO·0,1EtOAc требуется: С, 41,36; H, 3,81; N, 17,79.
1.1.3.7 Получение (2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (18) (схема 10)
1
3
2
24
24
2
9
3
2
Взаимодействие соединения 6 (700 мг, 1,52 ммоль) в NMP (1,5 мл) с α-метилбромидом 239 (367 мг, 1,67 ммоль) в соответствии со способом А давало ((2Е)-4-{[4-(4-бром-3-хлоранилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (18) (875 мг, 85%), т.пл. 209-213°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,35 (с, 1H), 10,43 (с, 1H), 9,09 (с, 1H), 9,03 (с, 1H), 8,71 (с, 1H), 8,27 (д, J=2,1 Гц, 1H), 8,15 (с, 1H), 7,86-7,78 (м, 2H), 7,07-6,99 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,3 Гц, 1H), 5,05 (шир., 2H), 4,44 (д, J=6,8 Гц, 2H), 3,87 (с, 3H), 3,12 (с, 6H). Анал. найдено: С, 40,97; H, 3,68; N, 18,03. CHBrClNO·1,2HO требуется: С, 40,98; H, 3,78; N, 17,92.
1.1.3.8 Получение (2Е)-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (19) (схема 10)
1
3
2
24
24
3
9
3
2
Взаимодействие соединения 7 (700 мг, 1,38 ммоль) в NMP (1,5 мл) с α-метилбромидом 239 (335 мг, 1,52 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-4-{[4-(3,4-диброманилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (19) (840 мг, 84%), т.пл. 215-219°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,35 (с, 1H), 10,41 (с, 1H), 9,09 (с, 1H), 9,02 (с, 1H), 8,71 (с, 1H), 8,37 (д, J=2,1 Гц, 1H), 8,14 (с, 1H), 7,91-7,88 (дд, J=8,8, 2,2 Гц, 1H), 7,79 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,07-7,01 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,04 (шир., 2H), 4,44 (д, J=7,1 Гц, 2H), 3,87 (с, 3H), 3,12 (с, 6H). Анал. найдено: С, 38,79; H, 3,34; N, 16,70. CHBrNO·HO требуется: С, 38,73; H, 3,52; N, 16,94.
1.1.3.9 Получение (2Е)-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (20) (схема 10)
1
3
2
26
25
9
3
2
Взаимодействие соединения 8 (586 мг, 1,50 ммоль) в NMP (1 мл) с α-метилбромидом 239 (363 мг, 1,65 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-4-{[4-(3-этинил-4-фторанилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (20) (645 мг, 70%), т.пл. 198°C (разл.). H ЯМР [(CD)SO] δ 11,31 (с, 1H), 10,36 (с, 1H), 9,06 (с, 1H), 9,00 (с, 1H), 8,65 (с, 1H), 8,14 (с, 1H), 8,03 (шир., 1H), 7,88 (шир., 1H), 7,36 (т, J=9,1 Гц, 1H), 7,06-6,99 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,06 (шир., 2 H), 4,53 (с, 1H), 4,45(д, J=7,0 Гц, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,13 (с, 6H). Анал. найдено: С, 48,61; H, 4,37; N, 18,78. CHBrFNO·2HO·0,2EtOAc требуется: С, 48,47; H, 4,64; N, 18,98.
1.1.3.10 Получение (2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромида (21) (схема 10)
1
3
2
26
25
9
3
2
Взаимодействие соединения 9 (500 мг, 1,23 ммоль) в NMP (1,2 мл) с α-метилбромидом 239 (297 мг, 1,35 ммоль) в соответствии со способом А давало (2Е)-4-{[4-(4-хлор-3-этиниланилино)пиридо[3,4-d]пиримидин-6-ил]амино}-N,N-диметил-N-[(1-метил-4-нитро-1Н-имидазол-5-ил)метил]-4-оксо-2-бутен-1-аммонийбромид (21) (630 мг, 82%), т.пл. 199-202°C (разл.). Н ЯМР [(CD)SO] δ 11,34 (с, 1H), 10,39 (с, 1H), 9,08 (с, 1H), 9,02 (с, 1H), 8,69 (с, 1H), 8,17 (д, J=2,5 Гц, 1H), 8,14 (с, 1H), 7,96-7,93 (дд, J=8,9, 2,5 Гц, 1H), 7,59 (д, J=8,9 Гц, 1H), 7,06-6,99 (м, 1H), 6,80 (д, J=15,2 Гц, 1H), 5,05 (шир., 2H), 4,60 (с, 1H), 4,44 (д, J=7,0 Гц, 2H), 3,87 (с, 3H), 3,12 (с, 6H). Анал. найдено: С, 48,16; H, 4,22; N, 19,19. CHBrClNO·1,2HO·0,1EtOAc требуется: С, 48,24; H, 4,32; N, 19,18.
2. Эффективность соединений
2.1 Активность ингибирования клеточного роста
2.1.1. Ингибиторы киназы Pan-erbB
Ингибиторы киназы формулы I (соединения 1-9) испытывали на их способность ингибировать пролиферацию трех клеточных линий карциномы человека, выбранных для возможности сравнения с описанным в литературе случаем: A431 (эпидермоид), которая сверхэкспрессирует erbB1 (EGFR); H1975 (немелкоклеточная карцинома легкого), которая сверхэкспрессирует erbB1 L858R/T790M двойную мутантную форму erbB1, которая, как это известно, сообщает резистентность к одобренному обратимому ингибитору erbB1 эрлотинибу, и SKOV3 (яичник), которая сверхэкспрессирует erbB2 (HER2). Клетки подвергали воздействию испытываемых соединений в течение 24 часов в кислородных условиях или в течение 4 часов в условиях кислородной недостаточности, затем в течение 20 часов в кислородных условиях. Затем их промывали для удаления лекарственного средства и инкубировали еще в течение 4 дней, после чего их окрашивали сульфородамином B для определения клеточного роста. Рассчитывали концентрацию соединения, необходимую для ингибирования клеточного роста на 50% относительно необработанных контрольных лунок, т.е. значение ИК50.
Результаты представлены в таблице 1.
<img file="00000032.tif" he="89" wi="146" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечания к таблице 1
<sup>а</sup>кривые доза соединения-ответ определяли при 10 концентрациях. Клетки подвергали воздействию испытываемых соединений в течение 24 часов, затем их промывали (×3) не содержащей лекарственное средство средой. Значения ИК50 (мкмоль/л) представляют собой концентрации, необходимые для ингибирования клеточного роста на 50% относительно необработанных контролей. Значения представляют собой среднее от 2-8 независимых определений (%CV<20 во всех случаях). <sup>b</sup>Эксперимент осуществляли исключительно в кислородных условиях.
<sup>c</sup>В течение первых 4 часов 24-часовой обработки лекарственным средством обработку осуществляли в бескислородных условиях. <sup>d</sup>Отношение гипоксической цитотоксичности = кратное изменение полученного в процессе эксперимента значения ИК50 для клеток, которые в течение 4 часов подвергали гипоксическим условиям, относительно клеток, подвергаемых только кислородным условиям.
Необратимые erbB1, 2, 4 ингибиторы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 более сильно ингибировали пролиферацию аэробных A431 клеток (значения ИК50=0,28-0,005 мкмоль/л), чем H1975 (значения ИК50=1,3-0,15 мкмоль/л) и SKOV3 (значения ИК50=1,8-0,2 мкмоль/л) клеток, и не показали какого-либо существенного изменения активности, когда клетки в течение 4 часов подвергали гипоксическим условиям, при показателе HCR внутри эксперимента в пределах от 0,5 до 3,3 для всех соединений в этих трех клеточных линиях.
2.1.2 Пролекарства ингибиторов pan-erbB
Выбранные пролекарственные соединения формулы III (соединения 12-21) испытывали на их способность ингибировать пролиферацию трех клеточных линий карциномы человека, выбранных для возможности сравнения с описанным в литературе случаем: A431 (эпидермоид), которая сверхэкспрессирует erbB1 (EGFR); H1975 (немелкоклеточная карцинома легкого), которая сверхэкспрессирует erbB1 L858R/T790M двойную мутантную форму erbB1, которая, как это известно, сообщает резистентность к одобренному обратимому ингибитору erbB1 эрлотинибу, и SKOV3 (яичник), которая сверхэкспрессирует erbB2 (HER2). Клетки подвергали воздействию испытываемых соединений в течение 24 часов в кислородных условиях или в течение 4 часов в условиях кислородной недостаточности, затем в течение 20 часов в кислородных условиях. Затем их промывали для удаления лекарственного средства и инкубировали еще в течение 4 дней, после чего их окрашивали сульфородамином B для определения клеточного роста. Рассчитывали концентрацию соединения, необходимую для ингибирования клеточного роста на 50% относительно необработанных контрольных лунок, т.е. значение ИК50.
Результаты представлены в таблице 2.
<img file="00000033.tif" he="98" wi="143" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечания к таблице 2
<sup>а</sup>кривые доза соединения-ответ определяли при 10 концентрациях. Клетки подвергали воздействию испытываемых соединений в течение 24 часов, затем их промывали (×3) не содержащей лекарственное средство средой. Значения ИК50 (мкмоль/л) представляют собой концентрации, необходимые для ингибирования клеточного роста на 50% относительно
необработанных контролей. Значения представляют собой среднее от 2-8 независимых определений (%CV<20 во всех случаях). <sup>b</sup>Эксперимент осуществляли исключительно в кислородных условиях. <sup>c</sup>В течение первых 4 часов 24-часовой обработки лекарственным средством обработку осуществляли в бескислородных условиях. <sup>d</sup>Отношение гипоксической цитотоксичности = кратное изменение полученного в процессе эксперимента значения ИК50 для клеток, которые в течение 4 часов подвергали гипоксическим условиям, относительно клеток, подвергаемых только кислородным условиям.
Все из пролекарств (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21) таблицы 2 были значительно более активны в ингибировании роста всех трех клеточных линий после того как клетки подвергали кислородному голоданию в течение 4 часов. Отношения гипоксической цитотоксичности (HCR) находились в пределах от 8 до 96 в A431 клетках, от 14 до 89 в H1975 клетках и от 15 до 528 в SKOV3 клетках, что соответствует гипоксия-селективному восстановлению 4-нитроимидазольного восстановительного триггера с последующей фрагментацией триггера с высвобождением необратимого ингибитора erbB1, 2, 4.
2.2. Активность ингибирования клеточных ферментов
Соединения 3, 5 и 6 испытывали на их способность ингибировать автофосфорилирование erbB1 (EGFR) и p44/42 MAPK (Erk1/2) в EGF-стимулированных A431 клетках с использованием метода вестерн-иммуноблоттинга для измерения фосфо-erbB1 и фосфо-Erk1/2 состояния.
A431 клетки высевали в 6-луночные планшеты (с αMEM + 5% FCS). На следующий день планшеты промывали один раз бессывороточной средой и выращивали в течение 18 часов в бессывороточной среде (αMEM), затем обрабатывали различными концентрациями ингибитора или пролекарства в течение 1 часа и затем стимулировали в течение 15 минут при помощи 100 нг/мл эпидермального ростового фактора (лиганд EGF рецептора). Затем клетки промывали охлажденным льдом PBS и лизировали в модифицированном RIPA буфере на льду (30 минут). Лизаты обрабатывали в устройстве для перемешивания с завихрением и очищали путем цетрифугирования, после чего концентрации белка в образцах определяли при помощи BCA анализа. Для вестерн-блоттинга 5 мкг общего количества белка/лунка нагружали на NuPAGE 4-12% гель и осуществляли обработку при 150В (1 час), после чего переносили на 0,45 мкм нитроцеллюлозную мембрану с последующим блокированием в течение 1 часа при помощи 2% BSA в TBS-Tween 0,1%. Все антитела разбавляли в 2% BSA TBS-Tween 0,1%. Для детекции фосфо-EGFR (Tyr 1068) моноклональное антитело (1:500; Cell Signalling #2234) инкубировали в течение ночи при 4°C и связывание определяли с использованием козлиного-анти-кроличьего-IgG-HRP конъюгированного вторичного антитела (1:5000; Santa Cruz #SC2054; 3h RT). Для детекции последующего фосфо-p44/42 MAPK(Erk 1/2) (Thr202/Tyr 204) моноклональное антитело (Cell Signalling #4370) использовали при 1:500 разведении. Пятно затем обрабатывали козьим анти-кроличьим IgG-HRP-конъюгированным вторичным антителом (Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-2054) в течение трех часов при соотношении 1:5000. Для нормализации на какую-либо неточность при нагрузке геля каждое пятно зондировали при помощи анти-β-актинового антитела (Abacus ALS # MAB-1501R, 1:2000 разведение). На следующий день пятно обрабатывали козьим анти-мышиным IgG-HRP-конъюгированным вторичным антителом (Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-2055) в течение одного часа при соотношении 1:5000. Полосы белка визуализировали с использованием реагента для детекции в вестерн-блот анализе Amersham ECL Plus (GE Healthcare RPN2132). Денситометрию определяли с использованием программы Image J. Значения, нормализованные к β-актину, использовали для построения графика при помощи SigmaPlot 11.0.
Было показано, что соединения 3, 5 и 6 являются сильными ингибиторами клеточного erbB1 (фиг. 12A, 13A и 14A, соответственно) со значениями ИК50 0,0483, 0,0395 и 0,0250 мкМ, соответственно. Кроме того, супрессия фосфорилирования EGFR в клетках A431 сопровождалась координированной потерей последующего фосфорилирования p44/42 MAPK(Erk 1/2) (Thr202/Tyr 204), указывая на модуляцию сигнальной сети, которая определяется EGFR активностью (фиг. 12B, 13B и 14B, соответственно). В отличие от этого, пролекарство 15 в виде производного четвертичной аммониевой соли было в 110 раз менее эффективным (ИК50 5,29 мкМ; фиг. 15A и фиг. 16) при ингибировании автофосфорилирования erbB1 в интактных A431 клетках по сравнению с его соответствующим ингибитором, соединением 3 (фиг. 12A). Подобную потерю активности наблюдали для фосфорилирования p44/42 MAPK(Erk 1/2) (Thr202/Tyr 204) (ИК50 0,179 мкМ и 8,9 мкМ для соединения 3 и пролекарства 15, соответственно (ср. фиг. 12B и фиг. 15B), что указывает на менее эффективную модуляцию нижеследующей сигнальной сети, которая определяется EGFR активностью. При нанесении на график денситометрических показателей соответствующей полосы для определения дозозависимого ингибирования фосфо-EGFR (скорректированного на β-актин) можно видеть, что пролекарство 15 дезактивировано в 110 раз больше по сравнению с соединением 3. Эту потерю активности ингибирования клеточного erbB1 для пролекарств преимущественно относят за счет клеточного вытеснения пролекарств из-за присутствия положительно заряженной четвертичной аммониевой соли.
2.3 Радиолитическое восстановление
Электрон-аффинные пролекарства могут быть селективно восстановлены способами высвобождения 1 электрона в гипоксических областях солидных опухолей, в отличие от нормальных кислородных условий в нормальных тканях, с образованием или высвобождением цитотоксичного эффектора (Brown and Wilson, Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 437-447). Пролекарство должно содержать триггерную часть, обладающую 1-электронным потенциалом восстановления, E(1), в пределах от -0,6 В до -0,2 В, и предпочтительно в пределах от -0,5 В до -0,3 В против NHE. Е(1) значения для многих соединений могут быть получены из литературы (например, Wardman, P. J. Phys. Chem. Ref. Data, 1989, 18, 1637-1755.), или могут быть определены различными способами. Метод импульсного радиолиза, например, используют для измерения константы равновесия между радикальными анионами пролекарств, образованными при их 1-электронном восстановлении, и ссылочными стандартами, такими как соединениями виологена и хинона, и на основании этих данных можно рассчитать значения E(1) для соединений. (Meisel and Czapski. J. Phys. Chem., 1975, 79, 1503-1509). Значения Е(1) для пролекарств 13, 15-19 измеряли методом импульсного радиолиза, и они были определены в пределах от -0,428 В до -0,417 В (таблица 3). Считают, что все они имеют подходящие значения Е(1), что делает возможным ферментативное образование их радикальных анионов в биологическом контексте.
2
2
-
-
-1
Пролекарства, обладающие подходящими значениями Е(1), могут быть испытаны на их способность к высвобождению эффекторных групп с использованием различных способов, после радиолиза пролекарств в растворе. Например, масс-спектрометрия (MS) и/или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) до и после радиолиза определяют исходное соединение и продукты, образованные в результате радиолиза. Некоторые 1-электронные восстановители могут быть получены путем радиолиза растворов, содержащих различные растворенные вещества. Например, CO радикал, образованный в γ-облученных растворах, содержащих формиатные ионы, имеет низкое значение Е(1) -1,90 В (Schwarz et al, Inorg. Chem., 1985, 24, 433-439.), и легко происходит передача электрона в соединения с более высоким Е(1). В используемых условиях облучения концентрирацию 0,66 мкМ в 1-электронных восстановительных эквивалентах (CO  радикал) получают на Гр(Грэй) (Дж. кг) поглощенной дозы излучения. (Mulazzani et al, J. Phys. Chem., 1980, 90, 5347-5352). Путем сравнения потери концентрации пролекарства с концентрацией восстановительных эквивалентов, образованных в результате радиолиза раствора, можно определить необходимо ли одно- или мульти-электронное восстановление для полной потери каждого пролекарства. Типично, доказательства 1-электронного удаления пролекарства ищут после переноса 0,95 восстановительных эквивалентов в пролекарство, чтобы свести к минимуму мульти-электронное восстановление той же самой молекулы пролекарства. В случае 1-электронного удаления пролекарства это часто указывает на фрагментацию его радикального аниона. Это заключение также подтверждается совместной ВЭЖХ-MS идентификацией высвобожденного цитотоксичного эффектора и продуктов, образуемых из переходного радикала бензильного типа (например, метил-нитроароматическое соединение (MNA), образованное путем отщепления H-атома). Было показано, что это происходит в случае некоторых родственных арилметильных четвертичных азотистых ипритов. (Anderson et al. J. Phys. Chem., 1997, 101, 9704-9709; Wilson et al. Radiat. Res., 1998, 149, 237-245). Данные, полученные для пролекарства 17, согласуются с расходом при 1-электронном восстановительном уровне (>50% потеря пролекарства при уровне 0,95 восстановительных эквивалентов) высвобожденным эффектором (соединение 5), определенным методом ВЭЖХ-MS, таблица 3.
2
Желательно, чтобы восстановительные пролекарства выбирали таким образом, чтобы они имели контролируемые константы скорости фрагментации при 1-электронном восстановлении триггерной части. Хотя быстрая фрагментация для высвобождения высоких концентраций цитотоксичных эффекторов в гипоксических областях опухолевых клеток является желательной, для клеток нормальных тканей в нормальных кислородных условиях это не так. Константа скорости обратного окисления кислородом 1-электроно-восстановленных пролекарств на основе нитроарена, kO, которая эффективно ингибирует высвобождение эффектора, представлена следующим выражением:- (Wardman et al, Biochem. Soc. Symp., 1995, 61, 171-194; Anderson et al, Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 2167-2174.)
-
-1
-1
-1
-1
in vitro
где Е(1)C/Cпредставляет собой 1-электрон восстановительный потенциал пролекарства. Это означает, для предпочтительного диапазона E(1) от -0,5 В до -0,3 В, что константы скорости псевдо 1-го порядка для этого обратного окисления в нормальных клетках (которые могут иметь, в физиологических условиях, такую низкую концентрацию кислорода как 10 мкМ) снижаются от 130 сек до 13 сек. Следовательно, в предпочтительном диапазоне E(1) для пролекарства, диапазоны скорости фрагментации, делающие возможным достаточное обратное окисление в ткани, содержащей нормальное количество кислорода и поэтому сообщающие гипоксия-селективную фрагментацию пролекарству (например, 5:1), наиболее предпочтительно находятся в области примерно 20-300 сек для пролекарств в верхних пределах желательного E(1) и примерно 20-300 сек для пролекарств в нижних пределах желательного E(1). Константы скорости для фрагментации, kfrag, 1-электрон восстановленных пролекарств можно измерить с использованием импульсного радиолиза для наблюдения образования спектра поглощения с разрешением по времени радикала бензильного типа, образованного при фрагментации радикального аниона. (Anderson et al, J. Phys. Chem. A, 1997, 101, 9704-9709). Значения kfrag для пролекарств 13, 15-17 измеряли методом импульсного радиолиза, и они представлены в таблице 3. Все из этих пролекарств имеют скорости фрагментации при 1-электронном восстановлении в гипоксических условиях в желательных пределах, что согласуется с тем, что они показывают приемлемые показатели гипоксической цитотоксичности (HCR)  в A431, H1975 и SKOV3 клеточных анти-пролиферативных анализах (таблица 3).
<img file="00000035.tif" he="68" wi="108" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечания к таблице 3
<sup>a</sup>Определяли по отношению к метилвиологену, E(1)MV<sup>2+</sup>/MV<sup>+</sup>=-447±7 мВ. <sup>b</sup>Данные импульсного радиолиза для образования радикалов бензильного типа с поглощением в области 360-390 нм. <sup>c</sup>Измерения методом ВЭЖХ-MS при 0,95 восстановительных эквивалентах; >50% указывает фрагментацию при 1-электронном восстановлении. <sup>d</sup>Детекция метил-нитроароматического (MNA) соединения методом ВЭЖХ-MS.
2.3.1 Экспериментальная процедура радиолитического восстановления
60
-1
-
2
2
Относительные активности иллюстративных пролекарств в растворе с высвобождением эффекторов при введении восстановительных эквивалентов определяли при помощи Co γ-излучателя. Пролекарства растворяли в воде Millipore (содержащей добавленный формиат натрия, 50 мМ, забуференный при pH 7 при помощи 5 мМ фосфата натрия) при концентрации 50 мкМ или ниже. Растворы, содержащиеся в герметично закрытых стеклянных флаконах, постоянно насыщали ΝΟ газом в течение 30 минут, затем осуществляли радиолиз при мощности дозы облучения 7,5 Гр мин, предварительно определенной с использованием дозиметрии Fricke (Fricke and Hart, "Chemical Dosimetry" in Radiation Dosimetry Vol. 2, Atttix, F.H.; Roesch, W.C.; Tochilin, E. (Eds.), Academic Press, New York, 1966, pp 167-239). В используемых условиях облучения, указанных выше, концентрацию 0,66 мкМ в 1-электронных восстановительных эквивалентах (CO  радикал) получали в расчете на Гр (Mulazzani et al, J. Phys. Chem., 90, 5347-5352, 1980.) и пролекарства (P) восстанавливали путем переноса электрона.
Потерю пролекарства 17 и образование его эффектора 5 отслеживали методом ВЭЖХ-масс-спектрофотометрии (MS) в двух идентичных облучаемых образцах. Определяли процент ослабления концентрации пролекарств и образование эффекторов при 0,95 уровне восстановительных эквивалентов. Кроме того, осуществляли детекцию метил-нитроароматического соединения из пролекарства 17. Пролекарства, демонстрирующие >50% уменьшение концентрации при 0,95 уровне восстановительных эквивалентов, показывают 1-электронную стехиометрию.
2
Импульсный радиолиз использовали для отслеживания 1-электронного восстановления и стабильности соединений в реальном времени. Использовали линейный ускоритель, производящий короткие импульсы высокоэнергетических электронов (2-3 Гр за 200 нсек 4MeV), снабженный системой быстрой спектрофотометрической детекции. (Anderson et al, J. Phys. Chem. A, 101, 9704-9709, 1997). Пролекарства растворяли в NO-насыщенных растворах, содержащих формиатные ионы, как описано выше, что после импульсного радиолиза приводило к быстрому образованию радикальных анионов соединений в течение нескольких микросекунд. Скорость фрагментации определяли путем анализа кинетическипх переходов при длине волны, соответствующей образованию радикала бензильного типа триггерной части. (Bays et al, J. Am. Chem. Soc., 105, 320-324, 1983; Anderson et al, J. Phys. Chem. A, 101, 9704-9709, 1997).
In vivo
2.4  эффективность соединений по настоящему изобретению
Способы
Специфических свободных от патогена самок NIH-III “голых” мышей, происходящих от селекционных мышей, поставляемых Charles River Laboratories (Wilmington, MA), размещали группами по 4-6 мышей в помещении с контролируемой температурой (22±2°C) с 12-часовым циклом свет/темнота, и они получали ad libitum воду и стандартный корм для грызунов (Harlan Teklad diet 2018i). Все животные были одинаково идентифицируемыми по номеру на ушной метке.
6
3
2
Свежесобранные клеточные суспензии подкожно инокулировали (100 мкл) в правый бок с 5×10 H1975 или A431 клеток в PBS. Средний диаметр опухоли усредняли, исходя из самого большого диаметра (длина), умноженного на показатель перпендикулярного измерения (ширина). Объем опухоли (мм) рассчитывали с использованием формулы (L×w)×π/6 (где L=длина и w=ширина в мм карциномы).
Процедура эксперимента задержки роста
3
Лечение начинали, когда опухолии достигали объема приблизительно 250 мм, как это определяли при помощи циркуля. Все лекарсвенные средства вводили путем интраперитонеальной инъекции при дозах объемом 10-20 мл/кг. Мышам вводили лекарственное средство при MTD (максимально переносимая доза) по схеме q3dx4, q5dx4 или q7dx4, и рост опухоли измеряли при помощи циркуля через каждые 3-5 дней в течение 30-дневного испытания. Мышей отбраковывали, если они проявляли признаки токсичности или если потеря массы тела превышала 20% от исходной массы. Во всех экспериментах с животными следовали протоколам, одобренным Animal Ethics Committee of The University of Auckland.
Мышей, имеющих опухоли, рандомизированно распределяли по группам обработки, когда диаметр опухоли достигал размера, требующего лечения. Животных отбраковывали, если ксенотрансплантаты показывали признаки: (i) присоединения к нижележащей мышце (из-за риска локальной инвазии), (ii) признаки изъязвления или (iii) вялый рост опухоли. Введение лекарственного средства начинали в день распределения.
В процессе и после обработки регулярно измеряли размер опухоли и массу тела. Животных отбраковывали, если (i) средний диаметр опухоли превышал 5 мм (конечная точка выживания), (ii) потеря массы тела превышала 20% от исходной массы до начала обработки, (iii) есть признаки пролонгированного или чрезмерного заболевания или (iv) появлялись признаки изъязвления опухоли. Эксперимент завершали в день 21 (A431 опухоли) или день 30 (H1975 опухоли) после начала обработки.
Анализ эффективности
4
4
4
4
4
50
Отмечали время, в течение которого индивидуальные опухоли увеличивались в объеме в 4 раза по сравнению с днем 1 обработки (RTV). Среднее значение RTV рассчитывали для каждой группы и разницу в RTV между контрольной группой и группой обработки выражали как задержку роста опухоли (TGD) в днях. Значения RTV нормализовали для любого отклонения объема обрабатываемой опухоли в день 0. Строили графики Каплана-Мейера и рассчитывали среднее значение выживаемости (ТΤΕ). Статистическую значимость любых несовпадений общего времени выживания для достижения RTV между группами обработки и контроля анализировали с использованием статистического критерия Log Rank P.
Токсичность
Регистрировали самые низкие показатели потери массы тела (независимые от времени максимальные показатели) для каждой группы обработки. Любые признаки связанного с обработкой распространения заболевания были задокументированы. Приемлемую токсичность определяли как среднюю потерю массы тела в группе, не превышающую 15% в ходе испытания, индивидуальную потерю массы тела в группе, не превышающую 20%, и индивидуальную потерю массы тела в группе, не превышающую 10% в течение любого 24-часового периода. Регистрировали случаи всех непредусмотренных смертей.
Результаты
Кривые среднего роста опухолей после обработки представлены на фиг. 1-11. Сводные таблицы, показывающие эффект соединений на токсичность и их эффективность, представлены в таблицах 4-6 ниже.
3
3
3
3
В целом, девять ингибиторов киназы и девять пролекарств вводили мышам, имеющим ксенотранслантаты человеческой H1975 или A431 опухоли. Средний (± стандартное отклонение) объем опухоли в начале обработки был 245 мм±60 мм для H1975 опухолей и 268 мм±124 мм для A431 опухолей.
При переносимых уровнях доз все ингибиторы киназы задерживали рост опухоли. Эта задержка роста опухоли была особенно существенной для соединений 2-9 при введении при q3dx4 (P<0,05, log-rank критерий) как в H1975 (фиг. 1-3), так и A431 (Фиг. 4) опухолях. Наблюдали лишь незначительную потерю массы тела во всех группах обработки, хотя имел место 1 случай смерти после обработки соединениями 5 и 7 у мышей с ксенотранслантатом H1975 (таблица 4).
<img file="00000037.tif" he="106" wi="159" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечания к таблице 4
<sup>а</sup>Вводили в лактатном буфере (pH4) путем интраперитонеальной инъекции (<0,02 мл/г); <sup>b</sup>все случаи гибели животных считали связанными с лекарственным средством; <sup>c</sup>Среднее значение самых низких показателей потери массы тела (независимые от времени максимальные показатели) относительно массы тела в день 0 (%) для каждого индивидуального случая; <sup>d</sup>Задержку роста опухоли рассчитывали как % увеличения времени, необходимого для достижения объема опухоли, в 4 раза превышающего объем в начале обработки (RTV<sup>4</sup>; относительно объема в день 0) относительно роста в контрольной группе; <sup>е</sup>анализ выживаемости с использованием Log Rank критерия Каплана-Мейера в группе обработки соединением относительно обрабатываемого буфером контроля, принимая RTV<sup>4</sup> как конечную точку выживания.
Аналогичным образом, пролекарства (соединения 12, 13, 15-21) все существенно задерживали рост опухоли в H1975 (фиг. 5-7) или A431 (фиг. 8) моделях ксенотранслантатов после обработки по схеме q3dx4 (P<0,05, log-rank критерий). Снова, наблюдали лишь незначительную потерю массы тела во всех группах обработки, хотя имел место 1 случай смерти после обработки соединением 19 (таблица 5).
<img file="00000038.tif" he="105" wi="158" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечания к таблице 5
<sup>а</sup>Вводили в лактатном буфере (pH4) путем интраперитонеальной инъекции (<0,02 мл/г); <sup>b</sup>все случаи гибели животных считали связанными с лекарственным средством; <sup>c</sup>Среднее значение самых низких показателей потери массы тела (независимые от времени максимальные показатели) относительно массы тела в день 0 (%) для каждого индивидуального случая; <sup>d</sup>Задержку роста опухоли рассчитывали как % увеличения времени,
необходимого для достижения объема опухоли, в 4 раза превышающего объем в начале обработки (RTV<sup>4</sup>; относительно объема в день 0) относительно роста в контрольной группе; <sup>е</sup>анализ выживаемости с использованием Log Rank критерия Каплана-Мейера в группе обработки соединением относительно обрабатываемого буфером контроля, принимая RTV<sup>4</sup> как конечную точку выживания.
Введение пролекарств 15 и 17, наряду с родственными им ингибиторами киназы 3 и 5, соответственно, показало продленный период задержки роста H1975 опухолей для пролекарств по сравнению с ингибиторами киназы (фиг. 9-10).
Пролекарство 17 испытывали с использованием нескольких схем введения: q3dx4, q5dx4 и q7dx4 при его q3dx4 MTD. При всех 3 схемах введения соединение 17 существенно задерживало рост опухоли в H1975 опухолях по сравнению с контролями (фиг. 11). Нет никакой статистически значимой разницы в росте опухолей между этими 3 схемами введения. Потеря массы тела была самой большой после q3dx4 введения и минимальной после q7dx4 введения (таблица 6). Однако имел место 1 случай смерти в q7dx4 группе обработки. Неясно, связана ли эта смерть с лекарственным средством или нет. Соединение 17 также вводили при q3dx4 и q5dx4 при его q3dx4 MTD мышам с ксентрансплантатом A431, при этом обе схемы введения вызывали одинаковую задержку роста A431 опухоли и одинаковую потерю массы тела у животных (таблица 6).
<img file="00000039.tif" he="76" wi="159" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечания к таблице 4
<sup>а</sup>Вводили в лактатном буфере (pH4) путем интраперитонеальной инъекции (<0,02 мл/г); <sup>b</sup>все случаи гибели животных считали связанными с лекарственным средством; <sup>c</sup>Среднее значение самых низких показателей потери массы тела (независимые от времени максимальные показатели) относительно массы тела в день 0 (%) для каждого индивидуального случая; <sup>d</sup>Задержку роста опухоли рассчитывали как % увеличения времени, необходимого для достижения объема опухоли, в 4 раза превышающего объем в начале обработки (RTV<sup>4</sup>; относительно объема в день 0) относительно роста в контрольной группе; <sup>е</sup>анализ выживаемости с использованием Log Rank критерия Каплана-Мейера в группе обработки соединением относительно обрабатываемого буфером контроля, принимая RTV<sup>4</sup> как конечную точку выживания.
in vitro
in vivo
В целом,  и  данные активности иллюстрируют эффективность соединений по настоящему изобретению как ингибиторов киназы. Соединения поэтому являются подходящими для применения в киназа-ингибиторной терапии. Особенно это касается случая с восстановительными пролекарствами и лечения рака, поскольку опухоли обычно имеют гипоксические области. Пролекарства восстанавливаются в гипоксических условиях с высвобождением исходного ингибитора киназы и обеспечивают эффект прицельного действия на опухоль.
Пролекарства 15, 17 и 18 считаются особенно перспективными терапевтическими кандидатами.
Хотя настоящее изобретение в широком смысле описано выше, специалистам в данной области должно быть понятно, что конкретное описание является число иллюстративным, и что возможны изменения без отступления от настоящего изобретения, определенного далее в формуле изобретения.
Все публикации, на которые были сделаны ссылки выше, включены в настоящую заявку во всей их полноте.