СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ МОРСКИХ ЕЖЕЙ
METHOD OF COMPLEX PROCESSING OF ECHINUS

Изобретение относится к технологии комплексной переработки морских гидробионтов, в частности к технологии получения продуктов: суммы хиноидных пигментов (эхинохромы, спинохромы и т.д.), хитозана, кальция из панциря, пептидно-аминокислотного комплекса из целомической жидкости, фосфолипидного концентрата из икры и ферментного комплекса из внутренностей морских ежей, и может быть использовано в рыбообрабатывающей, пищевой, медицинской промышленности, в ветеринарии и косметологии.
Представители типа иглокожих привлекают к себе устойчивое внимание в связи с высоким регенеративным потенциалом. Исключительно важную роль в регенеративных процессах у различных иглокожих играют свободноживущие клетки целомической жидкости - целомоциты. Система целомоцитов иглокожих в целом рассматривается как примитивная система врожденного иммунитета, вероятно, имеющая некоторую степень гомологии с иммунной системой позвоночных. Из экстракта разрушенных клеток целомоцитов зеленых морских ежей выделены пептиды, обладающие антимикробной активностью [Haug Т., Kjuul А.K., Styrvold О.В. et al. Antibacterial activity in Strongylocentrotus droebachiensis (Echinoidea), Cucumaria frondosa (Holothuroidea) and Asterias rubens (Asteroidea) // J Invertebrate Pathology, 2002, 81(2), 94-102].
В последнее время растет интерес к выделению биологически активных субстанций из целомической жидкости из различных многоклеточных организмов. Известен способ выделения фибринолитических ферментов из всего тела или целомической жидкости эхиурид Urechis unicinctus [CN 1834238 A, 20.09.2006]. Выделенный фермент обладает выраженным антикоагуляционным действием и может использоваться для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний.
Из целомоцитов морского кольчатого червя (пескожила) Arenicola marina выделяют пептиды, которые могут быть использованы для борьбы с возбудителями болезней грибкового и бактериального происхождения [RU 2004103808 А, 27.07.2005].
Из скелета морского ежа выделяют различные биологически активные вещества - эхинохром А, ганглиозиды, хитозан, кальций.
Так эхинохром А (2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинон), выделенный из панцирей и игл морских ежей, обитающих в Японском море, и дополнительно преобразованный в динатриевую соль, является действующим началом кардиопротекторного и офтальмологического препарата гистохром [Лекарственный справочник врача-офтальмолога / под ред. Проф. Ю.С.Астахова. - СПб: САГА, 2002. - С.82-83].
Известен способ получения эхинохрома А из морских ежей, заключающийся в том, что свежевыловленного или дефростированного морского ежа промывают водой для удаления механических загрязнений, затем обезжиривают и далее подвергают кислотной экстракции. Полученный экстракт очищают от примесей экстракцией и сублимацией [RU 2283298 С1, 10.09.2006].
Недостатком данного способа является то, что в ходе выделения эхинохрома А происходит потеря других хиноидных пигментов, обладающих также высокой биологической активностью, и не предусматривает глубокой переработки не только внутренностей, но и панциря морского ежа. Предварительная обработка сырья органическими растворителями для удаления веществ белковой и липидной природы является экономически нецелесообразной, поскольку в дальнейшем отсутствует стадия выделения биологически активных веществ из органических вытяжек.
Ганглиозиды (сиалогликосфинголипиды) - гликоконъюгаты, относящиеся к гликосфинголипидам и содержащие в углеводной части молекулы сиаловую кислоту. Ганглиозиды выполняют в организме ряд важнейших функций. Некоторые из этих гликоконъюгатов являются специфическими клеточными рецепторами ряда токсинов, бактерий и вирусов, участвуют в межклеточных взаимодействиях, переносе ионов через биологические мембраны, определяют антигенные свойства клеточной поверхности, рассматриваются как медиаторы иммунного ответа. Описаны примеры применения ганглиозидов в качестве антиаллергических средств.
Коммерчески доступные ганглиозиды выделяют с помощью щелочного гидролиза, ультрафильтрации или колоночной хроматографии. Источником для промышленного выделения ганглиозидов служит головной мозг позвоночных, спинной мозг или молоко млекопитающих.
Панцирь морских ежей содержит значительное количество солей кальция, хитозан. Одним из способов получения кальция из панциря морских ежей является его выделение из измельченного, предварительного замороженного при -10-25°С в течение 30 часов сырья, путем спекания с последующим измельчением и переводом в соль уксусной кислоты [KR 20070077756 А, 29.03.2006]. Недостатком является необходимость предварительной заморозки ежей и то, что не используются другие ценные биологически активные вещества.
Для выделения хитозана используют различные способы. Так известен способ получения хитозана из панцирей ракообразных после измельчения и депротеинизации, экстракцией концентрированным раствором щелочи с последующей очисткой [RU 2332081 С1, 27.08.2008].
Недостатком заявленного способа является использование концентрированных растворов щелочи, проведение стадии нейтрализации. Кроме того, требуется дополнительная стадия депротеинизации для повышения качества получаемого продукта.
Известен способ производства кормовой добавки из отходов от разделки трубача, мидии, морского ежа, заключающийся в обработке 2-12% раствором соляной кислоты, отмывкой до рН 5-5,2, высушивание и измельчение продукта [RU 2086145 С1, 10.08.1997].
Недостатком заявленного способа является использование концентрированного раствора соляной кислоты, проведение стадии нейтрализации.
Наиболее близким к заявленному является способ комплексной переработки плоских морских ежей с последовательным получением ганглиозидов, эхинохрома А, белкового концентрата и минеральной муки. Способ заключается в том, что сырье обрабатывают водным раствором органического комплексообразователя, экстракт концентрируют с получением белкового концентрата, далее к сырью добавляют водный раствор щелочи, осуществляют щелочную экстракцию, затем щелочной экстракт концентрируют с получением концентрата I, далее к сырью добавляют 75-80% спиртовой раствор органического комплексообразователя и настаивают в течение 20 часов, после чего экстракт концентрируют с получением концентрата II, далее к сырью добавляют 10% спиртовой раствор 30% серной кислоты, настаивают, экстракт концентрируют с получением концентрата III; далее к сырью снова добавляют раствор серной кислоты, настаивают и концентрируют, получают концентрат IV; вновь добавляют раствор разбавленной серной кислоты, настаивают, экстракт концентрируют с получением концентрата V; далее очищают I-й, II-й, III-й концентраты в отдельности, при этом для очищения к каждому концентрату добавляют равный объем гексана, смесь перемешивают и оставляют до разделения фаз; для I и II концентратов процедуру повторяют трижды, отделяют нижнюю водно-спиртовую фазу, ее концентрируют досуха и добавляют холодный ацетон, смесь интенсивно взбалтывают и получают ацетоновый экстракт с остатком, нерастворимым в ацетоне, процедуру очистки ацетоном повторяют еще дважды, после удаления ацетона остаток со смесью ганглиозидов сохраняют в этиловом спирте при -4°С; эхинохром А получают из III-го концентрата, для этого к концентрату добавляют равный объем гексана, смесь перемешивают и оставляют до разделения фаз, отбирают нижнюю водно-спиртовую фазу, которую дважды очищают гексаном, далее извлекают хлороформную фракцию с эхинохромом А при объемном соотношении водно-спиртовая фаза/хлороформ 1:2; процедуру повторяют трижды, объединяют полученные хлороформные экстракты и концентрируют, далее очищают от примесей водным раствором соли двухвалентного металла при соотношении хлороформного экстракта 2:1 и концентрируют досуха [RU 2305548 С1, 10.09.2007].
Недостатком данной технологии является то, что в ходе переработки используется незначительная часть биологически активных веществ, содержащихся в морских ежах, не используется целомическая жидкость, панцирь, теряются ценные биологически активные вещества: фосфолипиды, пептиды, аминокислоты, нафтохиноновые пигменты, хитозан, кальций, что не обеспечивает комплексной безотходной переработки сырья. При этом весь еж обрабатывается последовательно большим количеством токсичных органических растворителей, концентрированных кислот и щелочей, что связано с дополнительными материальными затратами и также не желательно для пищевых продуктов. Требует капитальных вложений для решения вопроса утилизации отработанных щелочных, кислотных и жиросодержащих растворов. Таким образом, данная технология является экономически невыгодной.
Задача, решаемая изобретением - безотходная комплексная переработка морских ежей с одновременным получением разных по природе биологически активных веществ: суммы хиноидных пигментов (эхинохромы, спинохромы и т.д.), хитозана, кальция из панциря, пептидно-аминокислотного комплекса из целомической жидкости, фосфолипидного концентрата из икры и ферментного комплекса из внутренностей.
Поставленная задача решена тем, что в известном способе сырье обрабатывают водным раствором органического комплексообразователя, экстракт концентрируют с получением белкового концентрата, далее к сырью добавляют водный раствор щелочи, осуществляют щелочную экстракцию, затем щелочной экстракт концентрируют с получением концентрата I, далее к сырью добавляют 75-80% спиртовой раствор органического комплексообразователя и настаивают в течение 20 часов, после чего экстракт концентрируют с получением концентрата II, далее к сырью добавляют 10% спиртовой раствор 30% серной кислоты, настаивают, экстракт концентрируют с получением концентрата III; далее к сырью снова добавляют раствор серной кислоты, настаивают и концентрируют, получают концентрат IV; вновь добавляют раствор разбавленной серной кислоты, настаивают, экстракт концентрируют с получением концентрата V; далее очищают I-й, II-й, III-й концентраты в отдельности, при этом для очищения к каждому концентрату добавляют равный объем гексана, смесь перемешивают и оставляют до разделения фаз; для I и II концентратов процедуру повторяют трижды, отделяют нижнюю водно-спиртовую фазу, ее концентрируют досуха и добавляют холодный ацетон, смесь интенсивно взбалтывают и получают ацетоновый экстракт с остатком, не растворимым в ацетоне, процедуру очистки ацетоном повторяют еще дважды, после удаления ацетона остаток со смесью ганглиозидов сохраняют в этиловом спирте при -4°С; эхинохром А получают из III-го концентрата, для этого к концентрату добавляют равный объем гексана, смесь перемешивают и оставляют до разделения фаз, отбирают нижнюю водно-спиртовую фазу, которую дважды очищают гексаном, далее извлекают хлороформную фракцию с эхинохромом А при объемном соотношении водно-спиртовая фаза/хлороформ 1:2; процедуру повторяют трижды, объединяют полученные хлороформные экстракты и концентрируют, далее очищают от примесей водным раствором соли двухвалентного металла при соотношении хлороформного экстракта 2:1 и концентрируют досуха, согласно изобретению морских ежей (свежевыловленных или замороженных) предварительно разделывают на четыре фракции, получают икру, целомическую жидкость, внутренности и панцирь и далее проводят извлечение целевых продуктов из каждой фракции раздельно. Для получения пептидов и аминокислот целомическую жидкость обрабатывают спиртом, выпавший осадок отделяют, раствор концентрируют и высушивают остаток. Для получения фосфолипидного концентрата и ганглиозидов икру обрабатывают органическим растворителем, который затем упаривают досуха. Для получения суммы хиноидных пигментов - эхинохромов и спинохромов высушенный панцирь морского ежа измельчают и обрабатывают водным раствором щавелевой кислоты. Далее для выделения пигментов их экстрагируют подходящим растворителем и при необходимости дополнительно очищают. Для выделения хитозана панцирь морского ежа после промывки и высушивания дважды обрабатывают кипящей водой, к полученному раствору после охлаждения добавляют спирт и полученный осадок отфильтровывают. Для получения кальция далее полученный остаток панциря морского ежа подвергают высокотемпературному пиролизу, затем прибавляют эквимолярное количество молочной кислоты и отделяют полученную соль кальция. Внутренности морского ежа высушивают и затем экстрагируют водным раствором спирта для получения ферментов.
Установлено, что с целью снижения затрат растворителей, более полного извлечения целевых продуктов и экономии времени ежей целесообразно предварительно разделать на 4 фракции, извлечь икру, отделить целомическую жидкость, внутренности и панцирь. Каждая из фракций в дальнейшем перерабатывается раздельно.
Из икры извлекают ганглиозиды и фосфолипидный концентрат. К икре прибавляют 4-7 объемов смеси хлороформа и этанола в соотношении 2:0,5 и экстрагируют настаиванием в течение 19-24 ч. Экстракт отделяют и упаривают досуха (ганглиозиды и фосфолипидный концентрат), а оставшуюся икру высушивают и направляют на капсулирование для использования в качестве биологически активной добавки к пище.
Согласно экспериментальным данным из целомической жидкости рационально выделять как минимум 2 продукта: пептидно-аминокислотный комплекс и белковый концентрат. Для этого к целомической жидкости прибавляют 1,5-3 объема спирта этилового (предпочтительно 2-2,5 объема), оставляют на ночь при температуре 3-15°С (предпочтительно 8-12°С) и затем отфильтровывают выпавший осадок (белковый концентрат). Полученный экстракт концентрируют до 0,2-0,5 объемов, декантируют липидный слой, замораживают и лиофильно высушивают. Получают пептидно-аминокислотный комплекс. Белковый концентрат высушивают.
Внутренние органы ежей богаты биологически активными ферментами. Для предотвращения процесса разложения ферментов внутренние органы после разделки ежей высушивают и экстрагируют 50-95% этиловым спиртом (предпочтительно 70%) в соотношении 1:8-1:12. Спиртовую фазу, содержащую ферменты, отфильтровывают.
Панцирь с иголками промывают водой для удаления белковых примесей, измельчают и обрабатывают смесью питьевой воды и органической (щавелевой) кислоты. Затем сумму пигментов экстрагируют хлороформом (или диэтиловым эфиром).
Для повышения эффективности измельчение рекомендуется проводить на аппарате роторно-пульсационного типа.
Остаток панциря морских ежей промывают в реакторе водой, для удаления остаточных растворителей и повышения рН раствора до 5-7. Затем заливают дистиллированной водой в соотношении 0,5-2:8-15 (предпочтительно 1:10) и нагревают при температуре 85-100°С (предпочтительно 98-100°С) в течение 20-50 мин. Полученный отвар сливают и повторяют экстракцию водой в соотношении 1:5 еще раз. Полученные водные экстракты объединяют, концентрируют до 1/5 от первоначального объема и прибавляют спирт в соотношении 1:2,5, оставляют на ночь при температуре 8-12°С и затем отфильтровывают выпавший осадок (хитозан).
Далее остаток панциря подсушивают и нагревают до температуры 1000-1150°С до полного озоления. Затем прибавляют эквимолекулярное количество молочной кислоты и получают лактат кальция.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении спектра биологически активных веществ, получаемых из морских ежей. Заявляемый способ обеспечивает получение из этого сырьевого источника помимо эхинохрома А и фракции суммарных ганглиозидов других отличающихся по природе и полярности ценных биологически активных веществ, а именно сумму хиноидных пигментов, фосфолипиды, пептиды, аминокислоты, хитозан, органический кальций и ферменты.
Технический результат заключается также в том, что предварительная разделка ежей и последующая обработка каждой фракций в отдельности позволяет обеспечить наиболее полное извлечение биологически активных веществ.
Таким образом, в заявляемом способе комплексной переработки морских ежей перед извлечением целевых продуктов проводится разделка ежей на четыре фракции, каждая из которых подлежит полной переработке. В качестве объекта переработки используют морских ежей семейства Strongylocentrotidae.
Осуществление изобретения иллюстрируется, но не ограничивается следующими сравнительными примерами.
Пример 1. 10 кг свежих морских ежей разделывают и собирают по отдельности целомическую жидкость, внутренности, икру и панцирь. К 1,4 кг икры прибавляют 7 л смеси хлороформа и этанола в соотношении 2:0,5 и экстрагируют настаиванием в течение 20 ч. Экстракт отделяют и упаривают досуха (фосфолипидный концентрат), а оставшуюся икру высушивают и направляют на капсулирование. Выход икры составляет около 0,4 кг. Выход фосфолипидного концентрата - около 25 г.
К 3,4 л целомической жидкости прибавляют 8 л спирта этилового, оставляют на ночь при температуре 10°С и затем отфильтровывают выпавший осадок (белковый концентрат). Полученный экстракт концентрируют до 1 л, декантируют липидный слой, содержащий фосфолипиды, замораживают и лиофильно высушивают (пептидно-аминокислотный комплекс). Белковый концентрат высушивают.
0,37 кг внутренних органов высушивают и экстрагируют 70% этиловым спиртом в соотношении 1:10, получая при этом 3,7 л настойки, содержащей ферменты.
4 кг панциря с иголками морских ежей промывают водой для удаления белковых примесей, высушивают при температуре 8-12°С, измельчают и обрабатывают 8 л смеси питьевой воды и щавелевой кислоты. Затем пигменты экстрагируют таким же объемом хлороформа.
Остаток панциря морских ежей промывают в реакторе 5-7 объемами водопроводной воды для удаления остаточных растворителей и повышения рН раствора до 5-7. Затем заливают дистиллированной водой в соотношении 1:10 и нагревают при температуре 98-100°С в течение 30 мин. Полученный отвар сливают и повторяют экстракцию водой в соотношении 1:5 еще раз. Полученные водные экстракты объединяют, концентрируют до 1/5 от первоначального объема и прибавляют спирт в соотношении 1:2,5, оставляют на ночь при температуре 10°С и затем отфильтровывают выпавший осадок (хитозан).
Далее остаток подсушивают и нагревают до температуры 1000-1150°С до полного озоления. Затем прибавляют эквимолекулярное количество молочной кислоты и получают лактат кальция.
Пример 2. Аналогичен примеру 1, отличающийся тем, что:
- экстракцию икры проводят 5,6 л смеси хлороформа и этанола (соотношение 2:0,5). Выход икры составляет около 0,42 кг. Выход фосфолипидного концентрата - около 22 г;
- для экстракции целомической жидкости берут 6,8 л спирта этилового;
- экстракция внутренних органов 70% этиловым спиртом осуществляется в соотношении 1:8; объем получаемой настойки - 2,9 л;
- пигменты экстрагируют эфиром;
- промытый остаток панциря заливают дистиллированной водой в соотношении 1:8 и далее нагревают.
Пример 3. Аналогичен примеру 1, отличающийся тем, что:
- экстракцию икры проводят 9,8 л смеси хлороформа и этанола (соотношение 2:0,5). Выход икры составляет около 0,39 кг. Выход фосфолипидного концентрата - около 30 г;
- для экстракции целомической жидкости берут 8,5 л спирта этилового;
- экстракция внутренних органов 70% этиловым спиртом осуществляется в соотношении 1:12; объем получаемой настойки - 4,4 л;
- промытый остаток панциря заливают дистиллированной водой в соотношении 1:12 и далее нагревают.
Пример 4. Аналогичен примеру 1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют свежемороженого морского ежа, которого размораживают непосредственно перед разделкой.
Пример 5. Аналогичен примеру 2, отличающийся тем, что в качестве сырья используют свежемороженого морского ежа, которого размораживают непосредственно перед разделкой.
Пример 6. Аналогичен примеру 3, отличающийся тем, что в качестве сырья используют свежемороженого морского ежа, которого размораживают непосредственно перед разделкой.