IN VITRO ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАПИЛЛОМАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ
VITRO DIAGNOSTIC KIT FOR IDENTIFICATION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN CLINICAL SAMPLES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к in vitro диагностическому набору и к способу для идентификации папилломавируса человека (HPV) в клинических образцах. Настоящее изобретение также относится к устройству для применения этого набора и способа.
Более конкретно, в предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к in vitro диагностическому набору для специфического детектирования генотипов папилломавируса человека в клинических образцах с использованием зондов для генотипирования HPV, к платформе, на которой объединены матрицы нуклеиновых кислот, включая зонды, и стандартный лабораторный реакционный сосуд, к устройству для автоматической обработки результатов и к способу диагностики инфекции HPV с использованием этого in vitro диагностического набора.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
До настоящего времени было описано приблизительно 100 типов папилломавируса человека (HPV). Тип HPV считается новым типом, когда по меньшей мере 10% последовательностей генов в областях Е6, Е7 и L1 HPV отличаются от ранее известного типа. Подтипы, или варианты, отличаются от первичного типа менее чем на 2-5%. Эти вирусы имеют тропизм к эпителию человека и связаны с серьезными заболеваниями человека, в частности с карциномой слизистой оболочки половых органов и полости рта.
Приблизительно 50 типов HPV были выделены из аногенитальной слизистой оболочки. Они были подразделены на типы низкого риска (например, тип HPV 6, 11, 42, 43 и 44) и типы высокого риска (например, тип 16, 18, 31, 33 и 45) в зависимости от их связи с раком шейки матки. Детектирование и идентификация типов HPV является крайне важной, так как персистирующая инфекция типов HPV высокого риска является главным этиологическим фактором рака шейки матки.
Детектирование и идентификацию генотипов HPV проводят тестированием ДНК HPV. Эти способы могут выполняться прямым детектированием ДНК HPV или детектированием амплифицированной ДНК HPV. Способы прямого детектирования ДНК HPV включают способ захвата гибридов (НС) от Digene Corp., Gaithersburg, Md., USA и способы гибридизации in situ. Способ НС одобрен FDA и основан на способе усиления сигнала гибридизации. Использующиеся гибридизационные зонды представляют собой HPV-специфические РНК-последовательности. После инкубирования этих зондов с денатурированной ДНК HPV из клинического образца образуются гибриды РНК/ДНК, которые могут быть детектированы с помощью специфического антитела. Способ НС позволяет провести различия типов HPV высокого и низкого риска, но не может идентифицировать тип HPV. Еще одним недостатком этого тест-способа является то, что применение коктейля (смеси) зондов часто приводит к перекрестным реакциям между типами HPV этих двух классов.
Способы идентификации типа HPV посредством амплификации вирусного генома проводили в основном с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Генотипирование HPV может быть выполнено типоспецифической ПЦР с использованием праймеров, которые распознают только один конкретный тип. Альтернативным подходом является применение ПЦР с универсальными праймерами для амплификации всех типов HPV. Папилломавирусы типируют последующим анализом последовательности амплифицированного фрагмента гена. Анализ этой последовательности может проводиться различными способами, такими как секвенирование ДНК, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP) или гибридизация нуклеиновых кислот. Способы гибридизации, такие как обращенная блот-гибридизация, считаются наиболее подходящими для диагностических целей (Kleter et al., J Clin Microbiol. 1999, 37: 2508-21517; Van den Brule et al., J Clin Micrоbiol. 2002, 40: 779-787).
Недавно была разработана технология анализа микроматриц (см., например, патент США No. 5445934). Термин микроматриц обозначает анализ многих малых пятен для облегчения крупномасштабного анализа нуклеиновых кислот, позволяющий проводить одновременно анализ тысяч последовательностей ДНК. Как известно в данной области, обращенный блоттинг обычно проводят на мембранах, тогда как анализ микроматрицы обычно проводят на твердом носителе, и его, кроме того, можно проводить в небольшом масштабе. Технология микроматриц успешно применялась в области диагностики HPV (см. патентные публикации WO0168915 и № СА2484681).
Однако существует отрицательная сторона в применении технологии микроматриц, заключающаяся в том, что требуется дорогостоящее оборудование и трудоемкое манипулирование. Это неудобство было устранено благодаря Заявке на патент № US2005064469, в которой предложена «пробирка-микроматрица». Термин «пробирка-микроматрица» относится к реакционному сосуду, который имеет форму и размер, обычные для реакционного сосуда (например, пробирки Эппендоф по 1,5 мл), с микроматрицей, размещенным на его основании, в которой могут проводиться тесты, основанные на микроматрицах.
ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с описанным выше, целью настоящего изобретения является создание надежного способа для специфической идентификации типов HPV, возможно, присутствующих в клиническом образце.
Более конкретно, целью настоящего изобретения является создание способа специфической идентификации типов HPV с использованием платформы «пробирки-микроматрицы».
Целью настоящего изобретения также является создание зондов для специфического детектирования и/или идентификации различных типов HPV.
Кроме того, целью настоящего изобретения является создание набора для детектирования и/или идентификации типов HPV, содержащего реагенты, протоколы и HPV-специфические зонды, размещенные на «пробирке-микроматрице», позволяющие надежное специфическое детектирование и/или идентификацию типов HPV, возможно, присутствующих в клиническом образце.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту изобретение относится к анализу детектирования и типирования папилломавируса человека (HPV) в образце, причем этот анализ включает: проведение реакции амплификации нуклеиновых кислот в образце, причем эта реакция амплификации предназначена для амплификации мишеневой последовательности HPV неспецифическим для типа образом; получение одноцепочечных олигонуклеотидов из любых продуктов амплификации; гибридизацию одноцепочечного олигонуклеотида, если возможно, со множеством HPV-типоспецифических зондов, обеспеченных на твердом носителе, причем этот носитель расположен в реакционном сосуде, подходящем для содержания этого образца; и детектирование гибридизованных олигонуклеотидов.
К аспектам изобретения также относятся анализ детектирования и типирования папилломавируса человека (HPV) в образце, включающий проведение реакции амплификации нуклеиновых кислот в образце, причем этот образец находится в контакте с твердым носителем, с иммобилизированном на нем множеством HPV-типоспецифических зондов, причем реакция амплификации предназначена для амплификации мишеневой последовательности HPV неспецифическим для типа образом; получение одноцепочечных олигонуклеотидов из любых продуктов амплификации; гибридизацию одноцепочечных олигонуклеотидов, если возможно, со множеством типоспецифических зондов HPV и детектирование гибридизованных олигонуклеотидов.
Реакцией амплификации является предпочтительно ПЦР. Одноцепочечные олигонуклеотиды могут быть получены денатурацией любых присутствующих двухцепочечных олигонуклеотидов, например, путем нагревания. Гибридизацию одноцепочечных олигонуклеотидов, предпочтительно, проводят при строгих условиях; такие условия будут известны специалистам в данной области, и, предпочтительно, включают в себя инкубирование денатурированных олигонуклеотидов с мишенью при 55°С в буфере, содержащем 1×SSC.
В предпочтительных вариантах осуществления, образец и твердый носитель находятся внутри реакционного сосуда; например, сосуда, описанного в US 2005064469.
Предпочтительно, используют зонды, специфические по меньшей мере для типов HPV 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или 42, которые, предпочтительно, выбраны из типов HPV 6, 11, 16, 18, 26, 30, 31, 32, 33, 34/64, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 81, 82, 83, 84, 85 и 89. Эти зонды предпочтительно имеют длину 20-40 нт, предпочтительно 25-35 нт, более предпочтительно 28-32 нт и наиболее предпочтительно приблизительно 30 нт. Все зонды не обязательно должны быть одной и той же длины. Эти зонды предпочтительно являются специфическими в отношении L1-области HPV. Каждый типоспецифический зонд может отличаться от зондов, специфических в отношении другого типа HPV по меньшей мере 1, 2, 3 или предпочтительно более чем 3 нуклеотидами. Предпочтительные зонды выбраны из группы, содержащей SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:133; несколько из этих зондов детектируют один и тот же тип HPV, как описано ниже. Предпочтительно, множество зондов являются специфическими для одного и того же типа HPV и, более предпочтительно, используют по меньшей мере два зонда, специфических для каждого типа HPV. Смеси этих зондов могут быть иммобилизованы в одном и том же местоположении на твердом носителе или каждый типоспецифический зонд может быть иммобилизован в отличающемся положении. Каждый зонд, специфический в отношении одного и того же типа HPV, детектирует отличающуюся часть мишеневой последовательности этого HPV.
Зонды могут находиться на двух повторностях твердого носителя для обеспечения множественных местоположений детектирования на избыточность.
Могут также детектироваться одна или несколько контрольных последовательностей; например, зонд, иммобилизованный на твердом носителе, который не гибридизуется ни с какой мишеневой последовательностью из типов HPV. Этим зондом может быть геномная мишеневая последовательность человека; кроме того, этот анализ может включать амплификацию мишеневой последовательности человека из этого образца и детектирование, произошла ли гибридизация. Дополнительный контроль может быть введен с использованием неспецифически меченных последовательностей, иммобилизованных на этом твердом носителе; детектирование этой метки может гарантировать, что метка работает правильным образом. Еще один контроль может быть обеспечен включением контрольной последовательности амплификации, которая может быть амплифицирована с теми же самыми праймерами, что и мишень человека, но которая будет детектироваться отличающимся олигонуклеотидом на этом твердом носителе. Этот контроль гарантирует, что амплификация работает корректно.
Настоящее изобретение также относится к реакционному сосуду, включающему твердый носитель, имеющий множество HPV-типоспецифических зондов, иммобилизованных на нем. Также изобретение относится к набору для детектирования и типирования HPV, содержащему такой реакционный сосуд вместе со смесью для амплификации нуклеиновых кислот. Эта смесь может содержать HPV-консенсусные праймеры, такие как MY09 и MY11; и, необязательно, НМВ01; праймеры для амплификации мишеневой последовательности человека и контрольную мишеневую последовательность амплификации, включающую последовательности, соответствующие фланкирующим частям последовательности-мишени человека, так что амплификация обеих мишеневых последовательностей будет происходить с использованием одних и тех же праймеров. Этот набор может также включать в себя инструкции для его применения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показано расположение зондов на поверхности микроматрицы с 12×11=132 положениями. Номера соответствуют номеру SEQ ID NO из списка последовательностей. Отдельные зонды фиксировали в двух разных положениях для детектирования 21 различного типа HPV, контроль качества образца ДНК и контроль амплификации. LR = зонды для стандарта местоположения (SEQ ID NO:140 + SEQ ID NO:141).
На фиг.2 показано расположение зондов на поверхности микроматрицы с 12×11=132 положениями. Номера соответствуют номеру SEQ ID NO из списка последовательностей. Отдельные зонды фиксировали в двух разных местоположениях для детектирования 23 различных типов HPV, контроль качества образца ДНК и контроль амплификации. LR = зонды для стандарта местоположения (SEQ ID NO:140 + SEQ ID NO:141).
На Фиг.3 показано расположение зондов на поверхности микроматрицы с 12×11=132 местоположениями. Номера соответствуют номеру SEQ ID NO: из списка последовательностей. Смеси зондов фиксировали в двух разных местоположениях для детектирования 42 различных типов HPV и контроль качества образца ДНК. LR = зонды для стандарта местоположения (SEQ ID NO:140 + SEQ ID NO:141); М1 = SEQ ID NO:76 + SEQ ID NO:77 + SEQ ID NO:78; М2 = SEQ ID NO:122 + SEQ ID NO:123 + SEQ ID NO:124; М3 = SEQ ID NO:116 + SEQ ID NO:117 + SEQ ID NO:118 + SEQ ID NO:119.
На Фиг. 4 показано расположение зондов на поверхности микроматрицы с 12×10=120 положениями. Номера соответствуют номеру SEQ ID NO из списка последовательностей. Отдельные зонды или смеси зондов фиксировали в трех разных местоположениях для детектирования 35 различных типов HPV, контроль качества образца ДНК и контроль амплификации. LR = зонды для стандарта местоположения (SEQ ID NO:140 + SEQ ID NO:141); М1 = SEQ ID NO:76 + SEQ ID NO:77 + SEQ ID NO:78; М2 = SEQ ID NO:122 + SEQ ID NO:123 + SEQ ID NO:124.
На фиг. 5 показано расположение зондов на поверхности микроматрицы с 12×10=120 положениями. Номера соответствуют номеру SEQ ID NO из списка последовательностей. Отдельные зонды фиксировали в двух разных положениях для детектирования 14 различных типов HPV, контроль качества образца ДНК и контроль амплификации. LR = зонды для стандарта местоположения (SEQ ID NO:140 + SEQ ID NO:141); М4 = SEQ ID NO:100 + SEQ ID NO:101 + SEQ ID NO:102.
На фиг. 6 схематически показана рекомбинантная плазмида pPG44, используемая в реакции ПЦР в качестве положительного контроля амплификации.
На фиг. 7 показана фотография «пробирки-матрицы», используемой в настоящем изобретении.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ специфического детектирования и/или идентификации типов HPV предусматривет стадии:
(i) Амплификацию ДНК-образца: ДНК, полученную из клинических образцов, амплифицируют, предпочтительно при помощи ПЦР, с использованием универсальных праймеров для всех известных типов HPV, которые фланкируют геномный район, достаточно разнообразных для возможности дальнейшего генотипирования. Хотя ПЦР является предпочтительным способом амплификации, амплификация мишеневых последовательностей может быть выполнена любым другим способом, известным в данной области (лигазной цепной реакцией, системой амплификации на основе транскрипции, амплификацией замещения цепи и т.д.). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, использовали праймеры MY11 и MY09 (Manos et al., Molecular Diagnostics of Human Cancer; Furth M, Greaves MF, eds.; Cold Spring Harbor Press, 1989, vol. 7: 209-214), которые амплифицируют вариабельный район L1.
Метку вводят в амплифицированную ДНК во время ее амплификации для создания возможности дальнейшего детектирования, предпочтительно метку, которая обеспечивает сигнал, который может быть детектирован колориметрическими способами. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере один из используемых праймеров метят на его 5'-конце биотином. Однако может быть использован любой другой тип метки, известный в данной области (например, дигоксигенин). Кроме того, мечение амплифицированной ДНК может альтернативно достигаться добавлением модифицированных нуклеотидов, несущих метку (например, биотинилированных или содержащих дигоксигенин производных dUTP) в ПЦР-смеси. Могут быть использованы радиоактивные метки или флуорофоры в некоторых вариантах осуществления.
(ii) Гибридизацию: амплифицированную ДНК из стадии (I) денатурируют (например, нагреванием) и наносят в «пробирку-микроматрицу» с одним или несколькими зондами из зондов, показанных в таблице 1 (SEQ ID NO:1-133). Могут быть также использованы другие способы получения одноцепочечной ДНК после амплификации. Каждый зонд, показанный в таблице 1 (SEQ ID NO:1-133), способен к специфической гибридизации с амплифицированным L1-районом из стадии (I) только одного типа HPV и, следовательно, позволяет специфически идентифицировать этот тип HPV, когда этот тип присутствует в биологическом образце. Другие типы HPV в образце могут быть идентифицированы гибридизацией амплифицированной ДНК из указанных типов HPV по меньшей мере с одним, но предпочтительно с несколькими зондами.
(iii) Детектирование: ДНК-гибриды могут быть детектированы узнаванием этой метки по специфическому связыванию с лигандом или посредством иммунодетектирования. В предпочтительном варианте осуществления, метку биотин детектируют по специфическому связыванию со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), и последующему превращению тетраметилбензидина (ТМВ) в синий пигмент, который осаждается в конкретном местоположении, где связан соответствующий специфический зонд. Конъюгаты другого типа, хорошо известные в данной области, могут быть также пригодными для целей настоящего изобретения (например, конъюгат стрептавидин-Au). Вместо этого могут использоваться флуоресцентно меченные системы детектирования, меченные опосредованно или непосредственно. Альтернативно, могут быть использованы другие системы на основе ферментов.
(iv) Анализ и обработка результатов: «пробирки-микроматрицы», обработанные таким образом, могут считываться с использованием простых оптических устройств, таких как оптический микроскоп или ATR01- и ATS-ридеры, изготовляемые CLONDIAC chip technologies GmbH (Jena, Germany).
В альтернативном варианте осуществления стадии амплификации и гибридизации могут выполняться в одной и той же пробирке-микроматрице; то есть, образец добавляют в пробирку-микроматрицу и затем этот образец амплифицируют и гибридизуют с зондами внутри этой пробирки.
Один из способов получения «пробирки-микроматрицы» описан в заявке на патент US2005064469. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, 5'-амино-связанные олигонуклеотидные зонды связывают с поверхностью твердого носителя в известных раздельных местоположениях. Указанные зонды могут быть иммобилизованы по отдельности или в виде смесей с очерченными местоположениями на этом твердом носителе. В предпочтительном варианте осуществления, используют два типоспецифических зонда для каждого типа HPV, что обеспечивает дополнительную гарантию того, что все HPV будут типированы правильно, в том числе варианты, в которых произошли замены нуклеотидов в районе одного типоспецифического зонда. Предпочтительно, используют два типоспецифических зонда, которые способны гибридизоваться в отдельных районах амплифицированного продукта.
Указанные зонды или смеси зондов могут быть иммобилизованы в единственном местоположении твердого носителя, предпочтительно в двух отдельных местоположениях твердого носителя. Фиг. 1-5 в качестве примеров показывают схематические представления различных расположений зондов на поверхности этой микроматрицы.
«Пробирка-микроматрица», используемая в настоящем изобретении, может содержать один или несколько зондов HPV, выбранных из нуклеотидных последовательностей из списка последовательностей (SEQ ID NO:1-133). Кроме того, она может содержать один или несколько зондов для специфического детектирования контролей, таких как контроль реакции ПЦР или адекватности ДНК из этого образца контроля. Кроме того, он может также содержать один или несколько меченых олигонуклеотидов (например, модифицированных биотином олигонуклеотидов) для положительного контроля реакции детектирования и для позиционирования стандарта, так что могут быть определены местоположения всех остальных зондов.
m
Специфические зонды для идентификации типов HPV были сконструированы следующим образом. Последовательности для всех ссылочных HPV (стандартов), депонированных в GenBank, в том числе известных вариантов, для амплифицированного L1-района сопоставляли с использованием общепринятой программы сопоставления нуклеиновых кислот, такой как BloEdit (4.8.6 version; Hall. Nucl. Acids Symp Ser. 1999, 41: 95-98), и определили местоположение районов наиболее вариабельных последовательностей среди различных типов HPV. Для использования в качестве специфических зондов из этих вариабельных последовательностей отбирали потенциальные последовательности олигонуклеотидов, имеющие следующие признаки: длина 20-40 оснований, предпочтительно приблизительная длина 30 оснований; предпочтительно без вторичных структур или нитей последовательного одного и того же нуклеотида, более длинных чем 4 нуклеотида; предпочтительно с отношением G+C 50% и T, как можно более сходной среди всех отобранных зондов; и предпочтительно с ошибочно спаренными нуклеотидами среди последовательностей разных типов HPV, находящимися как можно более в центре последовательности олигонуклеотида.
Каждую потенциальную последовательность зонда, отобранную, как описано выше, сравнивали со всеми известными последовательностями HPV в амплифицированном L1-районе с использованием программы BLAST из NCBI webpage (Altschul et al., Nucleic Acid Res. 1997, 25: 3389-3402). Наконец, зонды, имеющие по меньшей мере три ошибочно спаренных нуклеотида при сравнении со всеми известными типами HPV (за исключением случая, когда их сравнивали с типом HPV, в отношении которого этот олигонуклеотидный зонд был специфическим), отбирали с предпочтением в отношении зондов, имеющих более трех ошибочных спариваний.
Настоящее изобретение относится к зондам для специфического детектирования 42 наиболее клинически важных типов HPV: 6, 11, 16, 18, 26, 30, 31, 32, 33, 34/64, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52. 53, 54, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 81, 82, 83, 84, 85 и 89 (таблица 1; SEQ ID NO:1-133). Последовательности зондов представлены в виде одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов от 5'-конца к 3'-концу. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения, последовательности зондов соответствуют антисмысловой цепи, но любому специалисту с квалификацией в данной области очевидно, что любой из этих зондов может быть использован как таковой или в его комплементарной форме, или в форме его РНК (где Т заменен на U). Зонды по изобретению также могут быть получены путем добавления или изменения одного или нескольких нуклеотидов их последовательностей без значительного влияния на функциональность.
Таблица 1
SEQ ID NO
Название зонда
Тип HPV
Последовательность (5'→3')
<img file="00000001.tif" he="185" wi="149" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000002.tif" he="249" wi="148" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000003.tif" he="191" wi="144" img-content="undefined" img-format="tif" />
Нуклеотиды этих последовательностей имеют следующие обозначения: G=гуанин, А=аденин, Т=тимин, С=цитозин, R=G или A, Y=Е или С, М=А или С, К=G или Т, S=G или C, W=А или Т, Н=А или С или Т, В=G или Т или С, V=G или С или А, D=G или Т и, наконец, N=G или А или Т или С. Нуклеотиды, используемые в изобретении, могут быть рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами и модифицированными нуклеотидами, такими как инозин, или нуклеотидами, содержащими модифицированные группы, которые по существу не изменяют их гибридизационных свойств.
Зонды по настоящему изобретению могут быть получены различными способами, такими как химический синтез (например, общепринятым фосфотриэфирным способом), или способами генетической инженерии, например, молекулярным клонированием рекомбинантных плазмид, в которых были встроены соответствующие нуклеотидные последовательности, и последние могут быть получены расщеплением нуклеазами.
Для некоторых типов HPV зонды конструировали из района последовательности, который содержал отличающиеся нуклеотиды в конкретном положении для различных вариантов указанного типа HPV. В этих случаях, использовали вырожденные зонды, то есть смесь олигонуклеотидов, каждый из которых содержал альтернативные нуклеотиды в указанном положении. Это имеет место для зондов 39C3d [SEQ ID NO:41], 39C4d [SEQ ID NO:43], 45C1d [SEQ ID NO:57], 45C3d [SEQ ID NO:58] 57A1d [SEQ ID NO:74] 59C3_3d [SEQ ID NO:81], 66B1 [SEQ ID NO:91], 66C3d [SEQ ID NO:93] и 83B1d [SEQ ID NO:126]. Альтернативно, эквимолекулярные смеси двух олигонуклеотидов, содержащие точно один и тот же район последовательности, но отличающиеся в нуклеотидном составе для определенных положений, использовали в виде единого зонда (смесь олигонуклеотида 58В1а [SEQ ID NO:77] и 58B1b [SEQ ID NO:78]; 68C4b [SEQ ID NO:100] и 68С4 с [SEQ ID NO:101]; 74A1a [SEQ ID NO:116] и 74A1b [SEQ ID NO:117]; 74B1a [SEQ ID NO:118] и 74B1b [SEQ ID NO:119] и смесь олигонуклеотида 82A2a-AS [SEQ ID NO:122] и 82A2b-AS [SEQ ID NO:123]).
Все зонды, описанные в изобретении, испытывали на специфическую гибридизацию с их мишеневыми последовательностями при тех же самых условиях гибридизации в платформе (позиции) «пробирки-микроматрицы». Этот факт делает возможным применение этих зондов для одновременной идентификации 42 различных типов с использованием этой платформы (позиции) микроматрицы. Высокое число типов HPV, идентифицированных с использованием «пробирки-микроматрицы», развитой в данном изобретении, позволяет рассматривать эту методологию также как прямой способ детектирования, так как остальные типы HPV являются клинически нерелевантными.
Одним из слабых моментов диагностических способов являются ложноотрицательные результаты. В случае данного способа ложные отрицательные результаты могут быть обусловлены образцами ДНК плохого качества или присутствием ингибиторов ДНК-полимеразы в анализируемых образцах. Настоящее изобретение иллюстрирует способ устранения этих ложных отрицательных результатов посредством использования двух типов контролей.
Один контроль, состоящий из амплификации собственной ДНК пациента, используют предпочтительно для гарантии хорошего качества образца ДНК. Любой фрагмент последовательности из ДНК человека может быть использован в качестве мишени для этой цели. Фрагмент из однокопийного гена, такого как ген CFTR, считают особенно подходящей мишенью для положительного контроля качества ДНК в данном изобретении. Были сконструированы праймеры CFTR-F4 (SEQ ID NO:134) и CFTR-R5 (SEQ ID NO:135) для амплификации фрагмента 892 п.н. из гена CFTR. Использование однокопийной против многокопийной мишени и большего размера амплифицированного продукта контроля качества ДНК в сравнении с амплифицированным продуктом HPV, который имеет величину 892 п.н. против 450 п.н., позволило включать праймеры для амплификации CFTR в ту же реакционную смесь, которую использовали для амплификации L1-района генома HPV, с минимальными эффектами конкуренции. Таким образом, контроль качества ДНК может быть выполнен одновременно в той же самой реакционной пробирке, в которой анализируют образец, без влияния на чувствительность детектирования HPV.
Второй контроль может быть использован в качестве положительного контроля амплификации, который детектирует неуспешность ПЦР-реакции, обусловленную, например, присутствием ингибиторов ДНК-полимеразы. В предпочтительном варианте осуществления, положительный контроль амплификации состоит из рекомбинантной плазмиды, которая может быть амплифицирована с использованием тех же праймеров и тех же условий ПЦР, которые используют для амплификации фрагмента гена CFTR. Как размер, так и внутренняя последовательность относительно этих праймеров являются различными между ПЦР-продуктами, происходящими из амплификации гена CFTR и из амплификации рекомбинантной плазмиды. Таким образом, оба типа продуктов амплификации могут быть легко различены при помощи гель-электрофореза или гибридизации со специфическими зондами. Фиг. 6 показывает схематическое представление рекомбинантной плазмиды pPG44, имеющей эти характеристики.
Плазмиду pPG44 конструировали способами молекулярного клонирования. Коротко, ДНК-инсерт, состоящий из фрагмента 1162 п.н. от положения 124 до положения 1285 вектора pBlueScript II SK + (Stratagene, La Jolla, CA, USA), фланкированный праймерами CFTR, CFTR-F4 и CFTR-R5, клонировали в pGEM-T Easy Vector с использованием коммерчески доступного набора из Promega Corporation, Madison, WI, USA. Очищенный препарат полученной рекомбинантной плазмиды pPG44 дополнительно характеризовали с использованием рестрикционных ферментов и анализа последовательности. Плазмиду pPG44 использовали в качестве положительного контроля процесса амплификации в линеаризованной форме.
Присутствие положительного контроля в виде указанной рекомбинантной плазмиды в той же смеси для ПЦР-амплификации, в которой анализируют образец, предотвращает появление ложных отрицательных результатов, т.е. это предотвращает появление отрицательного результата даже в присутствии генома HPV-мишени в этом образце, так как в случае отсутствия генерирования продуктов амплификации следует предположить, что ПЦР-амплификация не работала правильно, и невозможно сделать вывод о присутствии или отсутствии генома HPV в данном образце.
Зонды для специфического детектирования описанных двух типов положительных контролей, то есть контроля качества ДНК и контроля реакции амплификации, обеспечены в таблице 2 (SEQ ID NO:136-139 и SEQ ID NO:145-147). Олигонуклеотидные последовательности без значимой гомологии с любым из амплифицированных продуктов настоящего изобретения также обеспечены в этой таблице 2 (SEQ ID NO:140-141). При иммобилизации на поверхности этой микроматрицы модифицированные биотином олигонуклеотиды SEQ ID NO:140 и SEQ ID NO:141 служат в качестве положительного контроля реакции детектирования ПЦР-продуктов и в качестве стандарта позиционирования, так что может быть определено местоположение всех остальных зондов.
Таблица 2
SEQ ID NO
Название зонда
Тип контроля
Последовательность (5'→3')
136
CFTR-A1-AS
Качество ДНК образца
<img file="00000004.tif" he="3" wi="67" img-content="undefined" img-format="tif" />
137
CFTR-B3
Качество ДНК образца
<img file="00000005.tif" he="5" wi="81" img-content="undefined" img-format="tif" />
145
CFTR-B1-AS
Качество ДНК образца
<img file="00000006.tif" he="4" wi="65" img-content="undefined" img-format="tif" />
146
CFTR-B2
Качество ДНК образца
<img file="00000007.tif" he="4" wi="76" img-content="undefined" img-format="tif" />
138
CIA1-AS
ПЦР-реакция
<img file="00000008.tif" he="4" wi="69" img-content="undefined" img-format="tif" />
139
CIA2-AS
ПЦР-реакция
<img file="00000009.tif" he="4" wi="75" img-content="undefined" img-format="tif" />
147
CIA3-AS
ПЦР-реакция
<img file="00000010.tif" he="5" wi="76" img-content="undefined" img-format="tif" />
140
Маркер-1
Детектирование & местоположение
<img file="00000011.tif" he="4" wi="59" img-content="undefined" img-format="tif" />
141
Маркер-2
Детектирование & местоположение
<img file="00000012.tif" he="4" wi="59" img-content="undefined" img-format="tif" />
Данное изобретение относится также к in vitro диагностическому набору для специфического детектирования типов HPV в клинических образцах. Предпочтительно, указанный набор может включать в себя любой из следующих компонентов или все следующие компоненты: смесь для амплификации, в том числе буфер для амплификации, dNTP, праймеры и контрольную плазмиду; промывочный буфер; реагенты детектирования; пробирку-микроматрицу, включающую в себя твердый носитель, включающий в себя HPV-типоспецифические зонды; реагенты для получения и приготовления образца. Конкретные компоненты будут зависеть от точных условий, при которых должен быть использован этот набор, хотя квалифицированный в данной области специалист сможет определить подходящие компоненты набора и буферные композиции.
ПРИМЕРЫ
Примеры, представленные ниже, даны только для иллюстрации изобретения и никаким образом не ограничивают объем сопроводительной формулы изобретения.
ПРИМЕР 1: получение «пробирок-микроматриц»
«Пробирки-микроматрицы» по изобретению были получены в CLONDIAG chip Technologies GmbH (Jena, Germany) следующим образом. Стандартную реакционную тест-пробирку Eppendorf из полипропилена и имеющую номинальный вмещаемый объем 1,5 мл, модифицировали переплавкой, создавая открытое углубление для носителя микроматрицы с адгезивным краем в пробирке.
Микроматрицы, которые вставляли в эти пробирки, получали с использованием MicroGrid II Arrayer (BioRobotics, Cambridge, Great Britain). Зонды, состоящие из модифицированных на 5'-амино-конце олигонуклеотидов, имеющих последовательность из списка последовательностей, помещали в определенных участках на поверхности эпоксидированного предметного стекла (размер предметного стекла: 75 мм × 25 мм) и ковалентно иммобилизовали. Единая микроматрица включала в себя 12×10=120 или 12×11=132 конкретных положений, в которые могли быть помещены олигонуклеотиды. Эти положения имеют промежутки 0,2 мм, так что ДНК-библиотека, включенная в каждую микроматрицу, покрывала площадь 2,4 мм × 2,4 мм, и, в целом, более 100 идентичных ДНК-библиотек могли бы быть получены таким образом на одном предметном стекле. В зависимости от типа эксперимента, либо единственный зонд, либо смесь зондов могли быть помещены в каждое из этих положений. Обычно, единственные зонды помещали в каждое местоположение при проведении экспериментов по специфичности и чувствительности для отбора зондов. После валидизации этих зондов смеси зондов, способных гибридизоваться в отдельных районах амплифицированного продукта конкретного типа HPV, могли быть помещены в то же самое местоположение при выполнении анализов идентификации генотипов HPV. На фиг. 1-5 показано различное положение зондов в микроматрицах, используемое в настоящем изобретении. В каждую микроматрицу включали два или три повтора для каждого зонда или каждой смеси зондов.
Кроме специфических зондов для генотипирования HPV и для контроля детектирования амплификации и контроля адекватности ДНК, микроматрицы включали в себя ссылочные маркеры в нескольких местоположениях, состоящие из модифицированных на 5'-конце биотином олигонуклеотидов (Маркер-1 [SEQ ID NO:140] и Маркер-2 [SEQ ID NO:141]) без значимой гомологии с любой из амплифицированных последовательностей из этого изобретения. Эти ссылочные маркеры служили как для подтверждения правильного осуществления реакции детектирования, так и для оптической ориентации изображения ридером, так чтобы местоположение всех остальных зондов могли быть определены и данные могли быть анализированы.
Все олигонуклеотиды были помещены на предметное стекло от 1× QMT Spotting Solution I (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Germany). Общая концентрация олигонуклеотидов в каждом растворе для нанесения пятен находится в диапазоне от 2,5 мкМ для ссылочных маркеров до 20 мкМ для специфических зондов. Затем олигонуклеотиды ковалентно связывали с эпоксигруппами на поверхности стекла термообработкой при 60°С в течение 30 минут с последующим многостадийным процессом промывки. Высушенные предметные стекла нарезают на кусочки стекла 3,15 мм × 3,15 мм, которые, строго говоря, и являются тем, что авторы называют микроматрицами. Затем, в конечной стадии изготовления «пробирок-микроматриц» эти микроматрицы вставляют в вышеуказанные модифицированные пробирки Эппендорфа и приклеивают к адгезивному краю. Фиг.7 показывает фотографию «пробирки-матрицы», изготовленной, как описано в данном примере.
ПРИМЕР 2: получение образцов ДНК
2.1. ДНК-стандарты HPV
ДНК HPV, используемыми для оценки специфичности и чувствительности типоспецифических зондов, были либо рекомбинантные плазмиды, содержащие амплифицированный L1-район (типы HPV 6, 11, 13, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 61, 62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 и 89), либо ДНК, экстрагированные из клинических образцов, которые амплифицировали L1-район и были дополнительно охарактеризованы секвенированием ДНК. Рекомбинантные плазмиды конструировали способами молекулярного клонирования. Коротко, амплифицированный L1-район из каждого типа HPV клонировали в pGEM-T Easy Vector с использованием коммерчески доступного набора из Promega Corporation, Madison, WI, USA. Очищенный препарат, полученный из каждой рекомбинантной плазмиды, дополнительно характеризовали анализом последовательности. 1-10 пг плазмидной ДНК использовали в оценке экспериментов по специфичности.
ДНК клеточной линии К562 (Cataloge No. DD2011, Promega Corporation, Madison, WI, USA) использовали для оценки специфичности и чувствительности CFTR-специфических зондов.
2.2. Клинические образцы
Для детектирования HPV необходимо прежде всего отделить ДНК от остального биологического материала. Процедуры получения ДНК изменяются в зависимости от источника образцы. Конкретные примеры представлены для получения ДНК из образцов из различных источников:
2
о
А. Мазки: образцы брали чистым, сухим хлопчатобумажным тампоном. Клетки из клинических мазков извлекали добавлением 1,5 мл солевого раствора непосредственно в контейнер с образцом и интенсивным встряхиванием на вортексе. Материал образца переносили в пробирку Эппендорф на 1,5 мл и осаждали центрифугированием. Супернатант отбрасывали и осажденные клетки суспендировали в 100 мкл лизисного буфера, содержащего 10 мМ Трис-HCl (рН 9,0 при 25°С) 50 мМ KCl, 0,15 мМ MgCl, 0,1% Тритон Х-100, 0,5% Твин 20 и 0,25 мг/мл протеиназы К. Смесь инкубировали при 56С в течение приблизительно 2 часов и протеиназу К инактивировали нагреванием инкубированием этой смеси при 100°С в течение 10 минут. Детрит осаждали центрифугированием и супернатант переносили в чистую и стерильную пробирку. В ПЦР-реакции использовали аликвоту 5 мкл.
В. Суспензии клеток: этот тип образца относится к образцам, используемым в цитологических тестах на основе шеечно-влагалищной жидкости. Шеечные пробы брали кистью или шпателем и ресуспендировали в растворе PreservCyt (Cytus Corp., Marlborough, MA, USA). Аликвоту 1 мл центрифугировали и осадок ресуспендировали в 100 мкл лизисного буфера, такого же, какой использовали с образцами мазков в параграфе А, и протокол продолжали таким же образом, как описано в указанном разделе.
С. Фиксированные формалином и залитые в парафин биопсии: несколько срезов тканей шириной 5 мкм использовали в данном способе, обычно 2-5 срезов, в зависимости от площади поверхности из этой биопсии. Срезы помещали в стерильную пробирку на 1,5 мл и добавляли 100 мкл лизисного буфера, такого же, какой использовали с образцами мазков в параграфе А. Протокол продолжали таким же образом, как описано в указанном разделе, за исключением того, что обработку протеиназой К проводили в течение 3 часов.
Альтернативно, коммерческий набор (NucleoSpin Tissue kit Catalogue No. 635966 из BD Biosciebces Clontech, Palo Alto, CS, USA), предназначенный для выделения ДНК из образцов из различных источников, использовали для обработки мазков, суспензий клеток или фиксированных формалином или залитых в парафин образцов биопсий. В этом случае, начало протокола выделения ДНК было таким же, какое описано в разделах А, В и С. Вместо 100 мкл лизисного буфера к образцу добавляли 180 мкл Буфера Т1. Протокол продолжали в соответствии с указаниями изготовителя для выделения геномной ДНК из клеток и ткани.
Независимо от того, использовали ли этот тип клинического образца или этот способ получения ДНК, отрицательные контроли обрабатывали параллельно с каждой серией образцов. Эти отрицательные контроли, состоящие из 1 мл солевого раствора, обрабатывали таким же образом, какой описан в разделе А.
ПРИМЕР 3: ПЦР-амплификация
2
ПЦР-амплификацию выполняли с использованием консенсусных праймеров MY11 и MY09 (Manos et al., Molecular Diagnostics of Human Cancer; Furth M, Greaves MF, eds.; Cold Spring Harbor Press, 1989, vol. 7: 209-214). Третий праймер, НМВ01, который часто используют в комбинации с MY09 и MY11 для амплификации типа 51 HPV, который не амплифицируется эффективно только с MY09 и MY11 (Hildesheim et al., J Infect Dis. 1994, 169: 235-240), также включали в ПЦР-реакцию. Коротко, ПЦР-реакцию проводили в конечном объеме реакции 50 мкл, содержащем 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl, 0,3 мкМ каждый праймер MY09 и MY11 (SEQ ID NO:142 и 143), 0,03 мкМ праймер НМВ01 (SEQ ID NO:144) 200 мкМ каждый dNTP, 4 единицы AmpliTaq Gold ДНК-полимеразы (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и 5 мкл каждого стандарта ДНК HPV из примера 2.1 или ДНК клинического образца из примера 2.2. Для тестирования пригодности ДНК образца 0,08 мкМ каждого праймера CFTR-F4 и CGTR-R5 (SEQ ID NO:134 и 135) также добавляли к реакционной смеси. Дополнительно, для проверки процесса амплификации и элиминации ложных отрицательных результатов вследствие неуспешности реакции 20 фг внутреннего контроля pPG44 включали в ту же самую реакционную пробирку, в которой анализировали эти образцы. Все прямые праймеры, использованные в ПЦР-реакции (MY11 [SEQ ID NO:143] и CFTR-F4 [SEQ ID NO:134]), были модифицированы биотином на 5'-конце таким образом, что любая амплифицированная ДНК могла быть затем детектирована.
Отрицательные контроли, состоящие из 5 мкл слепых образцов из примера 2.2, или 5 мкл деионизованной воды, обрабатывали параллельно с ДНК образцов. Применение этих типов отрицательных контролей служит для подтверждения, что загрязнения нет ни в одной точке манипулирования с образцом или в установке ПЦР-реакции и что все положительные результаты представляют истинное присутствие ДНК в конкретном образце.
ПЦР-реакции проводили в термоциклере Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Germany), программируемом со следующим профилем циклов: один начальный цикл денатурации при 95°С в течение 9 минут, 45 циклов 30 секунд при 94°С, 60 секунд при 55°С и 90 секунд при 72°С, и один конечный цикл удлинения при 72°С в течение 8 минут. После амплификации 5 мкл каждой реакционной смеси использовали для последующего детектирования со специфическими зондами.
ПРИМЕР 4: одновременная идентификация генотипов HPV с использованием «пробирок-микроматриц»
«Пробирки-микроматрицы» предварительно промывали непосредственно перед использованием добавлением 300 мкл 0,5х ЗФР-Твин 20-буфера в каждую пробирку и перевертыванием пробирок несколько раз. Всю жидкость изнутри каждой пробирки удаляли с использованием пастеровской пипетки с вакуумной системой.
Реакции амплификации из примера 3 денатурировали нагреванием их до 95°С в течение 10 минут и, сразу же после этого, охлаждением их в течение 5 минут на льду. Пять микролитров денатурированной реакции амплификации вносили в «пробирку-микроматрицу», приготовленную в примере 1, вместе с 100 мкл раствора для гибридизации (200 мМ натрий-фосфатаный буфер, pH 7,2; 1× SSC; 0,2% Тритон Х-100; 1 мМ ЭДТА, pH 8,0). Реакцию гибридизации проводили в Thermomixer comfort (Eppendorf, Hamburg, Germany) инкубированием «пробирок-микроматриц» при 55°С в течение одного часа при встряхивании при 550 об/мин. После периода инкубирования реакцию гибридизации удаляли Пастеровской пипеткой, присоединенной к вакуумной системе, и проводили стадию промывания 300 мкл 0,5× ЗФР-Твин 20-буфера.
2
2
Гибридизованную ДНК детектировали инкубированием в 100 мкл раствора 0,075 мкг/мл Поли-НRP-стрептавидина (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA) при 30°С в течение 15 минут со встряхиванием при 550 об/мин. Затем всю жидкость из «пробирки-микроматрицы» быстро удаляли и проводили две стадии промывки, как указано выше. Реакцию развития окраски выполняли в 100 мкл субстрата пероксидазы True Blue™ (KPL, Gaithersburg, MD, USA), который состоит из забуференного раствора, содержащего 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) и НО, инкубированием при 25°С в течение 10 минут. Окрашенные осадки, полученные таким образом, вызывают изменения в прозрачности для света в конкретных местоположениях микроматрицы, которые могут быть считаны с использованием ATR01- или ATS-ридера, изготавливаемого CLONDIAG chip technologies GmbH (Jena, Germany). Необязательно, ATS-ридер может иметь специальную программу, установленную для автоматической обработки результата анализа образцов, полученного с использованием «пробирки-микроматрицы», разработанной в данном изобретении.