Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для выявления фенольных и фурановых соединений в выдержанных зерновых дистиллятах

физические и химические методы переработки сельхозпродукции

УДК 621.039.75

Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для выявления фенольных и фурановых соединений в выдержанных зерновых дистиллятах

м. Э. МЕДРИШ, канд. техн. наук; И. М. АБРАМОВА, д-р техн. наук; Д. А. ГАВРИЛОВА; С. В. ПАВЛЕНКО ВНИИ пищевой биотехнологии — филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва

наиболее распространенным способам фальсификации спиртных напитков относятся частичная полная замена сырья, предусмотренного рецептурой, на более дешевое и низкокачественное, использование ароматизаторов (идентичных натуральным и искусственных) и купажирование выдержанных зерновых дистиллятов, не прошедших обязательной технологической выдержки, «моделирование» возраста спиртных напитков путем введения в их состав дубовых экстрактов, жженого сахара, настоев растительного сырья с высоким содержанием дубильных веществ [1].

Важнейшим условием установления подлинности спиртных напитков является установление контакта зернового дистиллята с древесиной дуба и времени его выдержки. Одним из ключевых показателей, позволяющим судить о продолжительности контакта зернового дистиллята с древесиной дуба является соотношение фенольных и фурановых соединений.

Распространенным методом идентификации подлинности виски, коньяка и других спиртных напитков является измерение молярного коэффициента поглощения растворов дистиллятов при длинах волн 200 и 280 нм. Однако в связи с тем, что в фальсифицированные напитки добавляют компоненты с высоким содержанием дубильных веществ, имеющих полосу поглощения в той же области спектра, вышеуказанный метод применяться не может [2].

Для определения фенольных и фурановых соединений также применяются методы обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с различными типами детектирования: спектрофотометричес-ким [3], флуориметрическим [4], электрохимическим [5]. Наиболее часто используют диодно-матричный [6] и спектрофотометрический детекторы, так как фенольные и фурановые соединения характеризуются сильным поглощением в УФ области. Но применение диодно-матрич-ного детектирования ограничено из-за его высокой стоимости. Вследствие существенного различия в полярности соединений с различными заместителями в ароматическом кольце в основном используется градиентное элюирование в широком диапазоне концентраций органического компонента подвижной фазы.

Образование фенольных и фурановых соединений во время выдержки дистиллята происходит за счет составляющих дубовой древесины: дубильных веществ (галловая и эллаговая кислоты), продуктов распада целлюлоз, геми-целлюлоз (фурфурол, 5-МФ и 5-ГМФ) и низкомолекулярных производных лигнина (конифериловый альдегид,

ванилин, ванилиновая кислота, синаповый альдегид, синаповая кислота, сиреневый альдегид, сиреневая кислота, 4-гидроксибензальдегид, п-кумаровая кислота). Качественный химический состав и количественное содержание компонентов в различных образцах спиртных напитков могут существенно отличаться, что обусловлено рядом факторов: время контакта с древесиной дуба, кратность использования бочки, температура в процессе выдержки и др. [7].

Поэтому актуальным направлением исследований является разработка высокочувствительной методики, которая позволила бы проводить покомпонентное определение содержания фенольных и фурановых соединений в спиртных напитках, полученных из выдержанных зерновых дистиллятов, дифференцировать выдержанные зерновые дистилляты по возрасту, а также выявлять фальсифицированную продукцию.

Объектами исследования служили: метанол (HPLC); уксусная кислота, муравьиная кислота «ОСЧ», 5-гидрок-симетилфурфурол, фурфурол, 5-метилфурфурол, ванилин, синаповый альдегид, 4-гидроксибензальдегид, кони-фериловый альдегид, галловая кислота, ванилиновая кислота, сиреневая кислота, синаповая кислота, эллаговая кислота, п-кумаровая кислота фирмы MERCK (Канада); образцы вискового дистиллята; спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Все растворы готовили с применением деионизованной воды с электропроводимостью менее 18 мОм/см.

Разделение фенольных и фурановых соединений проводили с использованием жидкостного хроматографа Shimadzu LC-20 (Япония), оборудованного насосом, обеспечивающим одновременную подачу четырех растворителей, термостатом хроматографических колонок, двух-волновым спектрофотометрическим детектором SPD-20A и программным обеспечением обработки хроматографических данных LC Solution. Неподвижная фаза — колонка SUPELCOSIL LC-18 (25 см х 4,6 мм, 5 мкм); подвижная фаза — метанол, 0,5%-ная уксусная кислота, метанол; 2%-ная муравьиная кислота, метанол. Скорость подачи элюента (градиентный режим) — 0,6 см3/мин. Градиент: 5 мин — 95% 0,5%-ной уксусной кислоты, 5% метанола; 10 мин — 85% 0,5%-ной уксусной кислоты, 15% метанола; 45 мин — 60% 0,5%-ной уксусной кислоты, 40% метанола; 55 мин — 2% 0,5%-ной уксусной кислоты, 98% метанола; 60 мин — 95% 0,5%-ной уксусной кислоты, 5% метанола; 10 мин — кондиционирование колонки. Детектирование — спектрофотометрическое при длине волны 280 нм. Объем вводимой пробы 20 мкл.

[тЛ/

]е!ес!ог В:280нм

4 2 3 , Л -^.-ИЛ-1 6 Л 7 9 10 и 12 13 V*л * Лл4 / И» ''-

...............     I  1 11 I 1 1 11 I 1 11 ....... 11 1 1 I 1 1 11 I .........Г1 1'гI 111

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 мин

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма смеси фенольных и фурановых соединений: 1 — галловая кислота; 2 — 5-гидроксиметилфурфу-рол; 3 — фурфурол; 4 — 4-гидроксибензальдегид; 5 — ванилиновая кислота; 6 — 5-метилфурфурол; 7 — сиреневая кислота; 8 — ванилин; 9 — сиреневый альдегид; 10 — п-кумаровая кислота; 11 — конифериловый альдегид; 12 — синаповый альдегид; 13 — эллаговая кислота. Условия разделения: элюент — метанол, 0,5%-ная уксусная кислота

Рис. 2. Хроматограмма смеси фенольных и фурановых соединений: 1 — галловая кислота; 2 — 5-гидроксиметилфурфу-рол; 3 — фурфурол; 4 — 4-гидроксибензальдегид; 5 — ванилиновая кислота; 6 — 5-метилфурфурол; 7 — сиреневая кислота; 8 — ванилин; 9 — сиреневый альдегид; 10 — п-кумаровая кислота; 11 — конифериловый альдегид; 12 — синаповый альдегид; 13 — эллаговая кислота. Условия разделения: элюент — метанол, 2%-ная муравьиная кислота

Рис. 3. Хроматограмма смеси фенольных и фурановых соединений:1 — галловая кислота; 2 — 5-гидроксиметилфурфу-рол; 3 — фурфурол; 4 — 4-гидроксибензальдегид; 5 — ванилиновая кислота; 6 — 5-метилфурфурол; 7 — сиреневая кислота; 8 — ванилин; 9 — сиреневый альдегид; 10 — п-кумаровая кислота; 11 — конифериловый альдегид; 12 — синаповый альдегид; 13 — эллаговая кислота. Условия разделения: температура термостатирования колонки 25 °С. Элюент — метанол; 0,5%-ная уксусная кислота

Рис. 5. Хроматограмма образца зернового дистиллята.

I — галловая кислота, 0,1 мг/дм3; 2 — 5-гидроксиметилфур-фурол, 2,4 мг/дм3; 3 — фурфурол, 0,1 мг/дм3; 4 — 4-гидроксибензальдегид, 0,1 мг/дм3; 5 — ванилиновая кислота, 0,1 мг/дм3; 6 — 5-метилфурфурол, 0,8мг/дм3; 7 — сиреневая кислота, 0,8мг/дм3; 8 — ванилин, 0,1 мг/дм3; 9 — сиреневый альдегид, 0,3мг/дм3; 10 — п-кумаровая кислота, 0,3мг/дм3;

II — конифериловый альдегид, 0,1 мг/дм3; 12 — синаповый альдегид, 0,1 мг/дм3; 13 — эллаговая кислота, 0,4 мг/дм3. Условия разделения: температура термостатирования колонки 40 °С. Элюент — метанол, 0,5%-ная уксусная кислота. Скорость потока элюента — 0,6см3/мин, режим элюирования — градиентный. Детектор спектрофотомет-рический, длина волны детектирования 280 нм

Для достижения максимального разделения необходимого количества компонентов все эксперименты проводили в градиентном режиме элюирования. Варьиро-

Рис. 4. Хроматограмма смеси фенольных и фурановых соединений:1 — галловая кислота; 2 — 5-гидроксиметилфур-фурол; 3 — фурфурол; 4 — 4-гидроксибензальдегид; 5 — ванилиновая кислота; 6 — 5-метилфурфурол; 7 — сиреневая кислота; 8 — ванилин; 9 — сиреневый альдегид; 10 — п-кумаровая кислота; 11 — конифериловый альдегид; 12 — синаповый альдегид; 13 — эллаговая кислота. Условия разделения: температура термостатирования колонки 40 °С. Элюент — метанол, 0,5%-ная уксусная кислота

вание состава подвижной фазы и температуры термоста-тирования колонки позволило подобрать оптимальные условия разделения с максимальным разрешением всех пиков.

На рис. 1, 2 представлены хроматограммы смеси фенольных и фурановых соединений, полученные с использованием элюентов.

Из хроматограмм видно, что наилучшее разделение достигается при использовании элюента — метанол, 0,5%-ная уксусная кислота. На второй хроматограмме пики 2, 3 не разделяются.

На рис. 3, 4 представлены хроматограммы смеси фенольных и фурановых соединений при температурах термостатирования колонки 25 и 40 °С соответственно. Элюент — метанол, 0,5%-ная уксусная кислота.

Из приведенных хроматограмм видно, что оптимальное разрешение пиков достигается при температуре тер-мостатирования колонки 40 °С, дальнейшее увеличение температуры не оказывает положительного влияния на разделение пиков.

С использованием подобранных условий были проанализированы образцы выдержанного зернового дистиллята. Пробоподготовка заключалась в фильтровании образца через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (рис. 5).

В процессе исследований подобраны оптимальные условия определения фенольных и фурановых соединений в выдержанных зерновых дистиллятах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием. Получен-

Литература

1. Макаров, С.Ю. Основы технологии виски / С. Ю. Макаров. — М.: Пробел-2000, 2011. — С. 196.

2. Савчук, С. А. Идентификация винодельческой продукции методами высокоэффективной хроматографии и спектрометрии / С. А. Савчук, В. Н. Власов // Виноград и вино России. — 2000. — № 5. — С. 5-12.

3. Lobo, I. Determination of phenolic compoumnds from oxidation of lignin lake sediments by high-performance liquid chromatography / I. Lobo, A. A. Mozeto, Q. B. Cass // Chromatographia. — 2000. — Vol. 52. — № 11/12. — P. 727-731.

4. Rodriguez-Delgado, M. A. Separation of phenolic compounds by high-performamce liquid chromatography with absorbance and fluorimetric detection / M. A. Rodriguez-Delgado // J. Chro-matogr. A. — 2001. — Vol. 912. — № 2. — P. 249-257.

5. Jandera, P. RP-HPLC analysis of phenolic compounds and fla-vonoids in beverages and plant extracts using CoulArray detector / P Jandera // J. Sep. Sci. — 2005. — Vol. 28. — P. 1005-1022.

6. Урсул, О. Н. Исследование физико-химических процессов при выдержке коньячных спиртов / О. Н. Урсул, И. М. Почицкая, В. П. Курченко // Пищевая промышленность. — 2009. — № 4 (2). — С. 81-89.

7. Урсул, о. Н. Оценка подлинности коньячной продукции / О. Н. Урсул, В. П. Курченко, И. М. Почицкая // Труды БГУ. — 2009. — Т 4. — C. 11.

ные результаты в дальнейшем будут использованы для разработки методики количественного определения фенольных и фурановых соединений в выдержанных зерновых дистиллятах и приготовленных из них спиртных напитках.

References

1. Makarov S. Yu. Osnovy tekhnologii viski [Basics of whiskey technology]. Moscow, Probel-2000 Publ., 2011. 196 p.

2. Savchuk S. A., Vlasov V. N. [Identification of wine production using high-performance chromatography and spectrometry]. Vinograd i vino Rossii, 2000, no. 5, pp. 5—12.

3. Lobo I., Mozeto A. A., Cass Q. B. Determination of phenolic compoumnds from oxidation of lignin lake sediments by highperformance liquid chromatography. Chromatographia, 2000, vol. 52, no. 11/12, pp. 727-731.

4. Rodriguez-Delgado M. A. Separation of phenolic compounds by high-performamce liquid chromatography with absorbance and fluorimetric detection. J. Chromatogr. A., 2001, vol. 912, no. 2, pp. 249-257.

5. Jandera P. RP-HPLC analysis of phenolic compounds and flavonoids in beverages and plant extracts using CoulArray detector. J. Sep. Sci., 2005, vol. 28, pp. 1005-1022.

6. Ursul O. N., Pochitskaya I. M., Kurchenko V. P. [Investigation of physical and chemical processes with aging of cognac spirits]. Pishchevayapromyshlennost', 2009, no. 4

7. Ursul O. N., Kurchenko V. P., Pochitskaya I. M. [Evaluation of the authenticity of cognac products]. Trudy BGU, 2009, vol. 4, p. 11.

Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для выявления фенольных и фурановых соединений в выдержанных зерновых дистиллятах

Ключевые слова

выдержанные зерновые дистилляты; высокоэффективная жидкостная хроматография; спектрофотометрический детектор; фенольные соединения; фурановые соединения.

Реферат

Важнейшие задачи в области производства спиртных напитков — повышение их качества и борьба с фальсификацией. Фенольные и фурановые соединения образуются в процессе хранения продукта в контакте с древесиной дуба и являются одними из основных маркеров, позволяющих выявлять фальсифицированную продукцию. Реализация мер по повышению качества испытаний алкогольной продукции и сырья для ее производства включает применение и внедрение современных инструментальных методов. Актуальным направлением исследований в данной области является разработка высокочувствительной методики определения содержания фенольных и фура-новых соединений в спиртных напитках, полученных из выдержанных зерновых дистиллятов. Одним из наиболее высокочувствительных и точных методов анализа фенольных и фурановых соединений является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием. В результате проведенных исследований подобраны оптимальные условия применения данного метода для определения фенольных и фурановых соединений в выдержанных зерновых дистиллятах. Установлено, что оптимальное разделение фенольных и фурановых соединений достигается при использовании 0,5%-ной уксусной кислоты и метанола в качестве элюента и скорости подачи элюента 0,6 см3/мин (градиентный режим). Подобрана оптимальная температура термостатирова-ния колонки (40 °С) и длина волны детектирования (280 нм). Пробоподготовка образцов выдержанных дистиллятов заключалась в фильтровании их через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Установленные оптимальные условия будут использованы для разработки методики количественного определения фенольных и фурановых соединений в выдержанных зерновых дистиллятах и приготовленных из них спиртных напитках.

Авторы

Медриш Марина Эдуардовна, канд. техн. наук; Абрамова Ирина Михайловна, д-р техн. наук; Гаврилова Дарья Алексеевна; Павленко Светлана Владимировна ВНИИ пищевой биотехнологии —

филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи,

111033, Москва, ул. Самокатная, д. 4б,

medrishm@mail.ru, i-abramova@mail.ru, tehnohimkontrol@mail.ru

The use of High-performance Liquid chromatography to identify phenolic and Furan compounds in Aged Grain Distillates

Key words

aged grain distillates; high-performance liquid chromatography; spectrophotometric detector; phenolic compounds; furan compounds.

abstract

The most important tasks in the field of the production of alcoholic beverages are to improve their quality and combat falsification. Phenolic and furan compounds are formed during the storage of the product in contact with the oak wood and are one of the main markers for detecting falsified products. Implementation of measures to improve the quality of alcohol products and raw materials for its production includes the use and implementation of modern instrumental methods. The actual direction of research in this area is the development of a highly sensitive technique for determining the content of phenolic and furan compounds in alcoholic beverages obtained from aged grain distillates. One of the most highly sensitive and accurate methods for analyzing phenolic and furan compounds is the highperformance liquid chromatography method with spectrophotometric detection. As a result of the research, the optimal conditions for using this method for determining phenolic and furan compounds in aged grain distillates were chosen. It was found that the optimum separation of phenolic and furan compounds is achieved using 0.5% acetic acid and methanol as the eluent and a feed rate of the eluent of 0.6 cm3/min (gradient mode). Optimal temperature of the column temperature control (40 °C) and detection wavelength (280 nm) were selected. Sample preparation of aged distillates consisted of filtering them through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 pm. The established optimal conditions will be used to develop a methodology for the quantitative determination of phenolic and furan compounds in aged grain distillates and alcoholic beverages prepared from them.

Authors

Medrish Marina Eduardovna, Candidate of Technical Sciences; Abramova Irina Mikhailovna, Doctor of Technical Sciences; Gavrilova Darya Alekseevna; Pavlenko Svetlana Vladimirovna

All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology — branch of FRC of Nutrition, Biotechnologie and Food Safety, 4b Samokatnaya str., Moscow, 111033, Russia, medrishm@mail.ru, i-abramova@mail.ru, tehnohimkontrol@mail.ru