6
ПРОИЗВОДНОЕ ЦИНКОВОГО МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСА ХЛОРИНА-e И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
6
DERIVATIVE OF ZINC METAL COMPLEX CHLORINE-e AND USE THEREOF

6
Предлагаемая группа изобретений относится к области биомедицины, касается производного цинкового металлокомплекса хлорина-е, которое может быть использовано в качестве агента, применяемого в фотодинамической терапии (ФДТ) для диагностики и лечения онкологических заболеваний.
Онкологические заболевания в настоящее время являются одной из острейших медико-социальных проблем человечества. Одним из основных нехирургических методов лечения различных форм опухолевых заболеваний является метод фотодинамической терапии. Однако существующие противоопухолевые препараты имеют ряд серьезных недостатков, среди которых низкая селективность накопления в опухолевых тканях и недостаточная водорастворимость, что приводит к возрастанию токсичности и снижению эффективности ФДТ. Таким образом, создание новых агентов ФДТ с улучшенными фармакокинетическими показателями - актуальная задача здравоохранения. На сегодняшний день известен ряд соединений, способных проявлять световую противоопухолевую токсичность по отношению к опухолевых клеткам. Терапевтическое действие данных молекул-фотосенсибилизаторов обусловлено генерацией активных форм кислорода и радикалов под действием светового излучения, что приводит к активации различных механизмов гибели опухолевых тканей [P. Mroz, A. Yaroslavsky, G.B. Kharkwal, M.R. Hamblin, Cell Death Pathways in Photodynamic Therapy of Cancer, Cancers 3 (2011) 2516-2539].
Известно большое количество фотоактивных соединений на основе хлориновых фотосенсибилизаторов. Некоторые из них успешно применяются в клинической практике.
6
6
Например, ФОТОЛОН (RU 2152790 С1, кл. A61K 31/79, G01N 33/52, опубл. 20.07.2000 г.), основное действующее вещество которого - хлорин-е, представляющий собой 18-карбокси-20-(карбоксиметил)-8-этенил-13-этил-2,3-дигидро-3,7,12,17-тетраметил-21Н,23Н-порфин-2-пропионовую кислоту. В лекарственной форме хлорин-e содержится в виде тринатриевой соли вместе с низкомолекулярным медицинским поливинлпирролидоном.
6
Другой препарат на основе фотосенсибилизатора - РАДАХЛОРИН (RU 2183956 С1, кл. A61K 31/409, А61Р 35/00, опубл. 27.06.2002 г.), являющийся смесью хлорина-е, пурпурина-5, а также хлорина-р6.
6
Еще один известный препарат ФОТОДИТАЗИН (RU 2144538 С1, кл. C07D 487/22, A61K 31/40, А61Р 35/00, опубл. 20.01.1998 г.) представляет собой бис-N-метил-D-глюкаминовую соль хлорина-е в виде водного раствора, содержащего поливинилпирролидон. Выпускается в виде концентрата и геля-пенетратора.
6
6
Кроме этого, эффективным агентом ФДТ является японский препарат NPe (Talaporfin) (US 2008254570 А1, кл. H01L 21/00, опубл. 16.10.2008 г.), представляющий собой натриевую соль N-аспартил-хлорина-e.
6
Одной из важнейших характеристик фотосенсибилизатора является однородность состава. Это связано с тем, что наибольшими квантовыми выходами синглетного кислорода обладают соединения на основе хлорина-е, а примесные компоненты зачастую менее активны.
6
6
6
6
Препараты ФОТОЛОН, ФОТОДИТАЗИН, РАДАХЛОРИН и NPe в настоящее время активно применяются для лечения различных онкологических заболеваний, однако они обладают рядом недостатков, такими как неоднородность состава и низкая селективность накопления в опухолевой ткани, что заметно снижает их общую эффективность. Препараты ФОТОЛОН, ФОТОДИТАЗИН, РАДАХЛОРИН и NPe являются водными растворами, состоящими из основного действующего вещества на основе хлорина-е, а также ряда различных добавок. Количество и состав добавок может варьироваться в различных пределах. Наиболее химически однородный агент - ФОТОДИТАЗИН, однако, он имеет ограниченный срок хранения (порядка 1 года) и только в холодильной камере. Поэтому создание однородного по составу агента ФДТ является перспективным направлением создания новых лекарственных препаратов. Также препараты ФОТОЛОН, ФОТОДИТАЗИН, РАДАХЛОРИН и NPe представляют собой фотосенсибилизирующие агенты 2 поколения, главным недостатком которых служит низкая селективность распределения между здоровой и опухолевой тканями [Materials 2015, 8(7), 4421-4456].
Для повышения селективности накопления фотосенсибилизатора в опухолях создаются фотоактивные гибридные молекулы-конъюгаты с адресными (направляющими) фрагментами.
Например, показано, что молекулы, имеющие в своем составе адресные молекулы, такие как антитела, сиалиловые кислоты, биотин, некоторые пептиды, селективно связывающиеся с опухолевыми клетками, могут значительно снизить токсичность и повысить активность препарата на их основе за счет избирательного связывания с онкоэкспрессируемыми рецепторами на поверхности клеток [J. Pharm. Sci. 103 (2014) 71-77; J. Mater. Chem. В 4 (2016) 6758-6772].
6
Известен препарат на основе конъюгата хлорина-е, связанного с белком трансферрином, рецепторы которого сверхэкспрессируются опухолевыми тканями (US 20020137901 А1, кл. C07K 14/79, A61K 38/00, A61K 41/00, C07K 14/435,опубл. 26.09.2002).
6
Также известен препарат на основе конъюгата хлорина-е, связанного с фолиевой кислотой, которая позволяет провести доставку фотоактивной части непосредственно к опухолевым клеткам за счет связывания с фолатными рецепторами на их поверхности (US 2012059018 A1, A61K 31/519, A61P 35/00,C07D 487/22, опубл. 08.03.2012 г.).
6
Также разработано производное хлорина-е, ковалентно соединенное с олигонуклеотидами, показывающее высокую эффективность связывания со злокачественными новообразованиями (US 20060105974 A1, кл. A61K 48/00, A61K 38/00, A61K 41/00, A61K 47/48, С07Н 21/00, С07Н 21/04, C12N 15/113, опубл. 18.05.2006).
Среди существующих конъюгатов ФДТ наиболее близким к предлагаемому изобретению является конъюгат металлокомплекса пурпуринимида с моно- и дисахаридами (US 2002198157 A1, кл. А61Р 35/00, С07Н 15/26, С07Н 23/00, опубл. 26.12.2002 г.). Данные конъюгаты состоят из фотоактивного ядра на основе металлокомплекса пурпуринимида, связанных с углеводными фрагментами (фиг. 1). Вышеописанные конъюгаты были разработаны в Roswell Park Cancer Institute в группе доктора Pandey. Структуры данных молекулы были выбраны исходя из нацеленности на терапевтическую мишень в виде Галектина-3, экспрессируемого некоторыми опухолевыми клетками. Был синтезирован ряд соединений с различными молекулами углеводов, соединенных с пурпуринимидом, также выбраны несколько типов линкеров для их связи. Показано, что биологическая активность сильно зависит от природы углевода и типа линкера. Например, молекулы, не содержащие углеводных остатков демонстрируют уменьшение активности по сравнению с аналогами с галактозой и лактозой.
Соединение 4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7-ол является активной частью лиганда рецепторов факторов роста эпидермиса (EGFR) и эндотелия сосудов (VEGFR), а так же эффективным ингибитором тирозинкиназ, что делает его потенциально удобным агентом доставки и самостоятельным химиотерапевтическим агентам [J. Med. Chem. 2012, 55, 10797; Clin. Ther. 2011, 33, 315; Clin. Ther. 2012, 34, 221].
6
В задачу изобретения положено создание нового производного цинкового металлокомплекса хлорина-е, связанного посредством химических связей с 4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7-олом, улучшающего биораспределение фото-сенсибилизатора за счет связывания с рецепторами EGFR/VEGFR на поверхности опухолевых клеток, а также его применение в качестве агента для фотодинамической терапии.
Техническим результатом от использования предлагаемой группы изобретений является повышение однородности, улучшение водорастворимости, увеличение селективности накопления опухолевыми тканями по сравнению со здоровыми, снижение системной токсичности.
6
Поставленная задача достигается тем, что производное цинкового металлокомплекса хлорина-е имеет общую формулу:
6
при  производное представляет собой бромид цинкового комплекса 13-(диметилэтиламмонийэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-галактопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е, общей формулы:
6
при  производное представляет собой бромид цинкового комплекса 13-(диметилэтиламмонийэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-глюкопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е общей формулы:
6
при  производное представляет собой цинковый комплекс 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е общей формулы:
6
при  представляет собой цинковый комплекс 13-(N-(2-(2-(2-N-(4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7)-1-оксобутиратоаминоэтокси)этокси)этил))амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-e общей формулы:
Поставленная задача достигается также тем, что полученное производное применяют в качестве агента для фотодинамической терапии.
На фиг. 1 представлены примеры синтезированных конъюгатов пурпуринимида-р6 с моно- и ди-сахарами.
6
На фиг. 2 представлены схемы синтеза Феофорбид-а (2), пропаргиламидфеофорбида-а (3), цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-е (4).
На фиг. 3 представлены схемы синтеза 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозил азида (5), β-D-галактопиранозил азида (6), 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил азида (7), β-D-глюкопиранозил азида (8), гепта-О-ацетил-β-мальтозазида (9), β-мальтозазида (10).
6
На фиг. 4 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(тетра-O-ацетил-1ʺ-дезокси-β-D-галактопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (11).
6
На фиг. 5 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(тетра-O-ацетил-1ʺ-дезокси-β-D-глюкопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (12).
6
На фиг. 6 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(гепта-O-ацетил-1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (13).
6
6
На фиг. 7 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(диметил аминоэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-галактопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (14), бромида цинкового комплекса 13-(триметиламмонийэтил) амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-галактопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (15).
6
6
На фиг. 8 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-глюкопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (16), бромида цинкового комплекса 13-(диметилэтиламмоний этил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-глюкопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (17).
6
На фиг. 9 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (18).
6
6
На фиг. 10 представлена схема синтеза 13-(N-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этил))амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-е (19), цинкового комплекса 13-(N-(2-(2-(2-N-(3-карбокси-1-оксопропил)-аминоэтокси)этокси)этил))амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-e (20).
6
На фиг. 11 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(N-(2-(2-(2-N-(4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7)-1-оксобутиратоаминоэтокси)этокси)-этил))амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-е (22).
6
На фиг. 12 представлена схема синтеза цинкового комплекса 13-(N-(2-(2-(2-N-(4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7)-1-оксобутиратоаминоэтокси)этокси)этил))амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (23).
На фиг. 13 представлены представлены спектры поглощения соединений 15, 17, 18, 23 в воде, концентрация 5 мкМ.
На фиг. 14 представлены спектры флуоресценции соединений 15, 17, 18, 23 в воде, концентрация 5 мкМ.
На фиг. 15 представлена внутриклеточная локализация соединений 15, 17, 18, 23 в клетках линий А431 и СНО. Концентрация 5 мкМ, инкубация 4 часа. λEx.=450 нм; λEm.=600-740 нм.
На фиг. 16 представлена интенсивность флуоресценции клеток после инкубации с соединениями 15, 17, 18, 23 в концентрации 5 мкМ в течение 4 часов.
2
На фиг. 17 представлена зависимость жизнеспособности культур клеток А431 и СНО от концентрации соединений 15, 17, 18 в темноте и при облучении в дозе 20 Дж/см.
2
На фиг. 18 представлена зависимость жизнеспособности культур клеток А431 и СНО от концентрации соединений 23 в темноте и при облучении в дозе 20 Дж/см.
6
Синтез предлагаемого производного цинкового металлокомплекса хлорина-е осуществляют следующим образом.
2
4
3
3
Синтез Феофорбид-а (2) (фиг. 2). В круглодонную колбу с мешалкой помещали 0,500 г метилфеофорбида-а 1 и добавляли 15 мл ацетона. Далее по каплям приливали 0,7 мл концентрированной соляной кислоты. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 48 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в 30 мл хлороформа, экстрагировали водой (3×30 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале CHCl, затем 5% МеОН - 95% CHCl) феофорбид-а (2) получают в виде темно-зеленого порошка (0,430 г, 89%). Соединение известно [J. Org. Chem. 45 (1980) 1969-1674].
3
2
4
3
3
Синтез пропаргиламидфеофорбида-а (3) (фиг. 2). В круглодонную колбу «А» с мешалкой в атмосфере аргона поместили 0,430 г (1 эквивалент) феофорбида-а 2, 0,284 г (2 эквивалента) гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC⋅HCl) и 8 мл CHCl. Перемешивали при 0°С в течение 30 мин. В круглодонной колбе «Б» с мешалкой смешали 0,081 г (2 эквивалента) пропаргиламина, 0,045 г (0,5 эквивалента) DMAP и 8 мл хлороформа, смесь перемешивали 10 минут при 0°С. Затем шприцем перенесли содержимое колбы «Б» в колбу «А» и перемешивали в течение 18 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворили в 30 мл хлороформа, экстрагировали водой (3×30 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале CHCl, затем 2% МеОН - 98% CHCl) пропаргиламид феофорбида-а (3) выделен в виде темно-зеленого порошка (0,395 г, 87%).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDCl, δ, м.д.): 9.49 (br.s, 2Н), 8.63 (s, 1H), 7.98 (dd, J=17.5, 11.5 Hz, 1H), 6.30 (d, J=18.2 Hz, 1H), 6.27 (s, 1H), 6.20 (d, J=19.9 Hz), 5.36 (br. s, 1H), 4.53 (br. s, 1H), 4.27 (br. s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.78-3.55 (m, 7H), 3.41 (s, 3H), 3.25 (s, 3H), 2.70 (br.s, 1H), 2.46 (br. s, 1H), 2.33-2.15 (m, 2H), 1.94 (s, 1H), 1.83 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.68 (t, J=7.6 Hz, 3H), -1.66 (br. s, 2H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDCl, δ, м.д.): 189.36, 172.27, 171.76, 169.56, 137.93, 128.86, 104.64, 104.26, 97.59, 79.16, 64.77, 52.97, 51.52, 50.25, 29.69, 28.83, 23.31, 19.55, 17.19, 12.16, 11.26.
MS (MALDI): m/z 630.1 [M]+.
6
2
4
2
4
3
3
6
Синтез цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-е (4) (фиг. 2). В круглодонную колбу с мешалкой поместили 0,395 г соединения 3 и добавили 16 мл хлороформа, затем к смеси по каплям прибавляли 2 мл N,N-диметилэтилендиамина. Перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в 20 мл хлороформа, экстрагировали водой (3×50 мл), органическую фазу сушили над NaSO. Полученную органическую фазу растворили в 10 мл хлороформа и добавили по каплям диацетат цинка (0,433 г, 5 эквивалентов), растворенный в 4 мл метанола. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворили в 30 мл хлороформа, экстрагировали водой (3×30 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале 5% МеОН - 95% CHCl, затем 15% МеОН - 85% CHCl). Цинковый комплекс функционализированного хлорина-e (4) выделен в виде темно-зеленого порошка (0,402 г, 82%).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDCl, δ, м.д.): 9.51 (s, 2Н), 8.96 (br.s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.34 (t, J=5.4 Hz, 1H), 8.22 (dd, J=17.8, 11.6 Hz, 1H), 6.22 (d, J=17.9 Hz, 1H), 6.00 (d, J=11.6 Hz, 1H), 5.41 (d, J=19.1 Hz, 1H), 5.07 (d, J=18.9 Hz, 1H), 4.42 (q, J=7.0 Hz, 1H), 4.20 (d, J=9.9 Hz, 1H), 3.91-3.75 (m, 6H), 3.69 (br.s, 4H), 3.37 (s, 3H), 3.35 (s, 3H), 3.26-3.16 (m, 3H), 3.05 (t, J=2.3 Hz, 1H), 2.73 (br.s, 6H), 2.47-2.38 (m, 1H), 2.07 (d, J=8.8 Hz, 2H), 1.67 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.61 (d, J=7.0 Hz, 3H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDCl, δ, м.д.): 173.24, 171.72, 170.35, 165.14, 162.77, 151.66, 147.96, 146.14, 144.07, 143.10, 141.20, 140.74, 138.58, 137.23, 133.04, 132.29, 130.66, 119.20, 101.79, 101.75, 99.87, 93.16, 81.19, 72.81, 52.24, 51.65, 46.26, 43.88, 37.46, 32.02, 29.99, 27.78, 22.80, 18.87, 17.89, 12.30, 11.76, 10.93.
MS (MALDI): m/z 779.0 [M]+.
3
2
4
Синтез 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозил азида (5) (фиг. 3). В колбу Шлейка с мешалкой и заполненную аргоном поместили 2 г пентаацетат β-D-галактозы и добавили 20 мл безводного дихлорметана, затем к смеси по каплям прибавляли 1 Моль/л раствор четыреххлористого олова в дихлорметане (2,56 мл, 0,5 эквивалента), затем триметилсилилазид (0,82 мл, 1,2 эквивалента). Перемешивали при 0°С в течение 3 ч. Затем реакционная смесь была разбавлена 80 мл дихлорметана и промыта насыщенным раствором NaHCO (70 мл), водой (50 мл) и насыщенным раствором поваренной соли (50 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 50% ПЭ - 50% EtOAc) 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозил азид (5) выделен в виде белого кристаллического порошка (1,8 г, 95%).
1
3
Спектр Н ЯМР (300 MHz, CDCl, δ, м.д.): 5.42 (dd, J=3.3, 1.0 Hz, 1H), 5.16 (dd, J=10.4, 8.7 Hz, 1H), 5.03 (dd, J=10.3, 3.3 Hz, 1H), 4.59 (d, J=8.7 Hz, 1H), 4.17 (dd, J=6.5, 2.4 Hz, 2H), 4.05-3.98 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.99 (s, 3H).
13
3
Спектр C ЯМР (75 MHz, CDCl, δ, м.д.): 170.51, 170.25, 170.13, 169.51, 88.44, 72.99, 70.85, 68.17, 66.97, 61.36, 20.82.
3
3
3
Синтез β-D-галактопиранозил азида (6) (фиг. 3). В круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали 0,2 г 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозил азида и растворяли его в 4 мл метанола. Далее по каплям прибавляли метилат натрия до образования сильнощелочной среды (рН=11), перемешивали 30 минут. Затем по каплям прибавляли в колбу концентрированную соляную кислоту до нейтральной реакции. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале 20% СН3ОН - 80% CHCl, затем 50% СНОН - 50% CHCl) β-D-галактопиранозил азид (5) выделен в виде белого кристаллического порошка (0,094 г, 95%).
ИК: 2100 см-1 (полоса азидной группы).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): 4.45 (d, J=6.5 Hz, 1H), 3.89 (s, 1H), 3.84-3.71 (m, 2H), 3.65 (d, J=5.8 Hz, 1H), 3.56-3.48 (m, 2H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): 92.61, 78.93, 74.97, 71.98, 70.23, 62.46.
3
2
4
Синтез 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил азида (7) (фиг. 3). В заполненную аргоном колбу Шленка с мешалкой поместили 2 г β-D-пентаацетат глюкозы и добавили 20 мл безводного дихлорметана, затем к смеси по каплям прибавляли 1 Моль/л раствор четыреххлористого олова в дихлорметане (2,56 мл, 0,5 эквивалента), затем триметилсилилазид (0,82 мл, 1,2 эквивалента). Перемешивали при 0°С в течение 3 ч. Затем реакционная смесь была разбавлена 80 мл дихлорметана и промыта насыщенным раствором NaHCO (70 мл), водой (50 мл) и насыщенным раствором поваренной соли (50 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 50% петролейный эфир - 50% EtOAc) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил азид (7) был выделен в виде белого некристаллического порошка (1,66 г, 87%).
1
3
Спектр Н ЯМР (300 MHz, CDCl, δ, м.д.): 5.22 (t, J=9.4 Hz, 1H), 5.10 (t, J=9.7 Hz, 1H), 4.96 (t, J=9.2 Hz, 1H), 4.65 (d, J=8.8 Hz, 1H), 4.22 (ddd, J=14.8, 12.5, 3.5 Hz, 2H), 3.79 (ddd, J=9.9, 4.7, 2.3 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H).
13
3
Спектр С ЯМР (75 MHz, CDCl, δ, м.д.): 169.29, 169.19, 87.91, 74.01, 72.58, 70.61, 67.84, 61.64, 20.57.
3
3
3
3
Синтез β-D-глюкопиранозил азида (8) (фиг. 3). В круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали 0,3 г 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил азида и растворяли его в 4 мл метанола. Далее по каплям прибавляли метилат натрия до образования сильнощелочной среды (рН=11), перемешивали 30 минут. Затем по каплям прибавляли в колбу концентрированную соляную кислоту до нейтральной реакции. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале 20% СНОН - 80% CHCl, затем 50% СНОН - 50% CHCl) β-D-глюкопиранозил азид (8) выделен в виде белого некристаллического порошка (0,165 г, количественно).
ИК: 2098 см-1 (полоса азидной группы).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): 4.50 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.90 (d, J=11.9 Hz, 1H), 3.70 (dd, J=12.0, 5.3 Hz, 1H), 3.43-3.35 (m, 2H), 3.31 (d, J=17.6 Hz, 2H), 3.16 (t, J=8.7 Hz, 1H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): 90.67, 78.76, 76.68, 73.35, 69.70, 61.12.
3
2
4
Синтез гепта-О-ацетил-β-мальтозазида (9) (фиг. 3). В колбу Шленка с мешалкой и заполненную аргоном поместили 1,5 г β-D-октоацетат мальтозы и добавили 20 мл безводного дихлорметана, затем к смеси по каплям прибавляли 1 Моль/л раствор четыреххлористого олова в дихлорметане (1,1 мл, 0,5 эквивалента), затем триметилсилилазид (0,35 мл, 1,2 эквивалента). Перемешивали при 0°С в течение 3 ч. Затем реакционная смесь была разбавлена 80 мл дихлорметана и промыта насыщенным раствором NaHCO (70 мл), водой (50 мл) и насыщенным раствором поваренной соли (50 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент 50% петролейный эфир - 50% EtOAc) гепта-О-ацетил-β-мальтозазид (9) выделен в виде белого кристаллического порошка (1,66 г, 98%).
1
3
Спектр Н ЯМР (300 MHz, CDCl, δ, м.д.): 5.39 (dd, J=12.3, 7.0 Hz, 1H), 5.26 (t, J=8.9 Hz, 1H), 5.05 (t, J=9.9 Hz, 1H), 4.85 (dd, J=10.5, 4.0 Hz, 1H), 4.82-4.68 (m, 2H), 4.50 (dd, J=12.3, 2.5 Hz, 1H), 4.28-4.19 (m, 2H), 4.08-3.91 (m, 2H), 3.78 (ddd, J=9.7, 4.3, 2.6 Hz, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.06-1.98 (m, 15H).
13
3
Спектр C ЯМР (75 MHz, CDCl, δ, м.д.): 170.50, 170.39, 170.08, 169.92, 169.48, 169.39, 95.69, 87.46, 75.08, 74.23, 72.31, 71.47, 69.97, 69.24, 68.62, 67.92, 62.51, 61.44, 20.85, 20.78, 20.69, 20.58.
3
3
Синтез β-мальтозазида (10) (фиг. 3). В круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали 0.3 г гепта-О-ацетил-β-мальтозил азида и растворяли его в 4 мл метанола. Далее по каплям прибавляли метилат натрия до образования сильнощелочной среды (рН=11), перемешивали 30 минут. Затем по каплям прибавляли в колбу концентрированную соляную кислоту до нейтральной реакции. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 50% СНОН - 50% CHCl) (3-мальтозазид (10) выделен в виде белого некристаллического порошка (0,165 г, 89%).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): 5.19 (d, J=3.8 Hz, 1H), 4.55 (d, J=8.6 Hz, 1H), 3.93 (dd, J=12.3, 1.6 Hz, 1H), 3.85 (dd, J=12.6, 3.9 Hz, 2H), 3.74-3.55 (m, 5H), 3.53-3.43 (m, 2H), 3.37 (s, 1H), 3.28 (t, J=9.3 Hz, 1H), 3.22 (t, J=8.8 Hz, 1H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): 102.90, 92.00, 80.65, 78.74, 77.87, 75.05, 74.82, 74.37, 74.14, 71.50, 62.73, 61.96.
3
2
2
4
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(тетра-O-ацетил-1ʺ-дезокси-β-D-галактопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхло-рина-е6 (11) (фиг. 4). В круглодонную колбу, снабженную дефлегматором, помещали 0,06 г соединения 4 и 0,034 г (1,2 эквивалента) 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозил азида 5. Смесь растворяли в 6 мл t-BuOH и 3 мл CHCl. В отдельной колбе смешивали 0,004 г CuSO4⋅5HO, 0,006 г (0,4 эквивалента) аскорбата натрия (AscNa), 0,008 г (0,2 эквивалента) трис(1-бензил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)метил)амина (ТВТА) и 6 мл воды; не растворившиеся частицы твердой фазы разбивали ультразвуком. После этого приготовленный раствор вносили по каплям в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали с помощью магнитной мешалки при 50°С в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в хлороформе, экстрагировали водой (3×30 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале CHCl, затем 20% МеОН - 80% CHCl) целевой конъюгат (11) выделили в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,063 г, 71%).
1
6
Спектр Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): δ 9.52 (s, 1Н), 9.50 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.39 (t, 1H), 8.22 (dd, J=17.8, 11.6 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 6.25-6.17 (m, 2H), 6.00 (d, 1H), 5.56 (t, 2H), 5.51-5.34 (m, 2H), 5.09 (d, J=18.5 Hz, 1H), 4.52 (t, 1H), 4.42 (dd, J=14.3, 7.1 Hz, 1H), 4.31 (d, J=5.6 Hz, 2H), 4.21 (d, J=9.5 Hz, 1H), 4.08 (dd, J=11.6, 5.1 Hz, 1H), 3.95 (dd, J=11.5, 7.2 Hz, 1H), 3.80 (q, J=15.4, 7.8 Hz, 3H), 3.65 (s, 3H), 2.86 (s, 2H), 2.17-2.04 (m, 6H), 1.92 (d, J=1.9 Hz, 6H), 1.77 (s, 3H), 1.66 (t, J=14.2, 6.7 Hz, 3H), 1.60 (d, J=7.8 Hz, 3H).
1
6
Спектр Н ЯМР (101 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): 173.58, 172.24, 170.20, 170.13, 169.69, 168.74, 165.31, 163.04, 151.80, 148.37, 146.26, 145.70, 144.20,143.37, 141.60, 140.92, 138.79, 137.41, 133.27, 132.45, 130.92, 128.99, 127.97, 122.35, 119.41, 102.14, 100.12, 93.38, 84.38, 79.41, 73.11, 70.67, 69.18, 67.84, 67.53, 61.75, 52.60, 51.82, 45.18, 34.22, 28.99, 23.07, 20.66, 20.60, 20.54, 20.22, 19.13, 18.14, 12.54, 11.94, 11.17.
MS (MALDI): m/z 1152.4 [М+].
3
4
2
2
4
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(тетра-O-ацетил-1ʺ-дезокси-β-D-глюкопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлори-на-е6 (12) (фиг. 5). В круглодонную колбу, снабженную дефлегматором, помещали 0,06 г соединения 4, 0,034 г (1,2 эквивалента) 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкогшранозил азида 7. Смесь растворяли в 6 мл t-BuOH и 3 мл CHCl. В отдельной колбе смешивали 0,004 г (2 эквивалента) CuSO⋅5HO, 0,006 г (0,4 эквивалента) аскорбата натрия, 0,008 г (0,2 эквивалента) ТВТА и 6 мл воды; не растворившиеся частицы твердой фазы разбивали ультразвуком. После этого приготовленный раствор вносили по каплям в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали с помощью магнитной мешалки при 50°С в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворили в хлороформе, экстрагировали водой (3×30 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале CHCl, затем 20% МеОН - 80% CHCl.) целевой конъюгат 12 выделили в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,06 г, 67%).
1
6
Спектр Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): 9.51 (d, J=5.6 Hz, 2H), 8.83 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.38 (t, J=5.6 Hz, 1H), 8.22 (dd, J=17.8, 11.5 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 6.30-6.17 (m, 2H), 6.00 (dd, J=11.5, 1.6 Hz, 1H), 5.64-5.37 (m, 4H), 5.18-5.02 (m, 2H), 4.42 (q, J=7.1 Hz, 1H), 4.35-4.18 (m, 4H), 4.13-3.95 (m, 2H), 3.81 (dd, J=15.3, 7.6 Hz, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.53 (d, J=8.5 Hz, 1H), 2.92 (s, 1H), 2.00 (s, 6H), 1.92 (d, J=6.6 Hz, 6H), 1.74 (s, 3H), 1.67 (t, J=8.5 Hz, 3H), 1.59 (d, J=7.1 Hz, 3H).
1
6
Спектр H ЯМР (101 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): 173.29, 171.90, 169.95, 169.52, 169.31, 168.41, 162.76, 151.93, 151.56, 145.62, 143.96, 143.11, 140.66, 138.54, 137.15, 133.01, 132.21, 130.68, 121.78, 101.89, 83.70, 79.19, 73.17, 72.19, 70.00, 67.46, 61.78, 51.60, 33.98, 22.81, 20.42, 20.36, 20.22, 19.89, 18.88, 17.89, 12.30, 11.71, 10.93.
MS (MALDI): m/z 1152.1 [М+].
6
3
3
4
2
2
4
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(гепта-O-ацетил-1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (13) (фиг. 6). В круглодонную колбу, снабженную дефлегматором, помещали 0,06 г соединения 4 и 0,061 г. (1,2 эквивалента) гепта-О-ацетил-β-мальтозазида 9. Смесь растворяли в 6 мл t-BuOH и 3 мл CHCl. Смесь растворяли в 6 мл t-BuOH и 3 мл CHCl. В отдельной колбе смешивали 0,004 г (2 эквивалента) CuSO⋅5HO, 0,006 г (0,4 эквивалента) аскорбата натрия, 0,008 г (0,2 эквивалента) ТВТА и 6 мл воды; не растворившиеся частицы твердой фазы разбивали ультразвуком. После этого приготовленный раствор вносили по каплям в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали с помощью магнитной мешалки при 50°С в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворили в хлороформе, экстрагировали водой (3×30 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале CHCl, затем 20% МеОН - 80% CHCl) целевой конъюгат (13) выделили в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,07 г, 64%).
1
6
Спектр Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): 9.51 (d, J=6.1 Hz, 2H), 8.80 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.37 (t, J=5.3 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.22 (dd, J=17.7, 11.6 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 6.28-6.16 (m, 2H), 6.00 (d, J=11.5 Hz, 1H), 5.62-5.41 (m, 3H), 5.37-5.18 (m, 2H), 5.14-4.85 (m, 3H), 4.47-3.94 (m, 10H), 3.81 (d, J=7.5 Hz, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.53 (d, J=7.9 Hz, 2H), 2.86 (s, 2H), 2.03-1.87 (m, 21H), 1.76-1.52 (m, 12H).
1
6
Спектр Н ЯМР (101 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): 173.30, 171.92, 170.05, 169.96, 169.82, 169.66, 169.50, 169.15, 168.63, 165.05, 162.75, 151.55, 148.11, 146.01, 145.54, 143.95, 143.12, 141.34, 140.65, 138.54, 137.15, 136.22, 133.80, 133.01, 132.19, 130.68, 128.73, 127.72, 121.83, 119.12, 101.90, 101.62, 99.88, 95.72, 93.11, 83.29, 79.19, 74.43, 73.77, 73.33, 70.54, 69.39, 68.90, 68.13, 67.67, 62.82, 61.35, 57.64, 52.33, 51.58, 46.35, 44.79, 37.40, 33.97, 32.13, 30.08, 22.82, 20.49, 20.42, 20.35, 20.31, 20.27, 19.90, 18.88, 17.89, 12.30, 11.70, 10.93.
MS (MALDI): m/z 1442.3 [М+].
6
4
2
3
3
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-галактопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (14) (фиг. 7). В круглодонную колбу, снабженную дефлегматором, помещали 0,1 г соединения 4 и 0,031 г (1,2 эквивалента) β-D-галактопиранозил азида 6, смесь растворяли в 5 мл диметилформамида. В другой круглодонной колбе смешивали 0,010 г (2 эквивалента) CuSO⋅5HO, 0,010 г (0,4 эквивалента) аскорбат натрия, 0,014 г (0,2 эквивалента) ТВТА и 5 мл воды, для ускорения растворения использовали ультразвук. После этого приготовленный раствор вносили по каплям в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали с помощью магнитной мешалки при 50°С в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале 20% СНОН - 80% CHCl, затем 50% СНОН - 50% CHCl) выделяли целевой конъюгат (14) в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,104 г, 83%).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): 9.56 (d, J=12.7 Hz, 2H), 8.64 (s, 1H), 8.12 (dd, J=17.8, 11.5 Hz, 1H), 7.90 (d, J=6.1 Hz, 1H), 6.18 (d, J=18.3 Hz, 1H), 6.00 (d, J=11.4 Hz, 1H), 5.51-5.36 (m, 2H), 5.19 (d, J=18.8 Hz, 1H), 4.43 (d, J=23.5, 11.6 Hz, 1H), 4.31 (q, J=15.4 Hz, 3H), 4.01 (t, J=9.4 Hz, 1H), 3.91-3.79 (m, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.73 (d, J=7.6 Hz, 1H), 3.70-3.65 (m, 2H), 3.65-3.56 (m, 6H), 3.40 (s, 3H), 3.37 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 3.33 (s, J=5.0 Hz, 3H), 2.63 (s, 2H), 2.49-2.39 (m, 1H), 2.25 (s, 6H), 2.11-2.00 (m, 1H), 1.98-1.83 (m, 1H), 1.73 (s, 3H), 1.66 (d, J=7.1 Hz, 3H).
1
3
Спектр H ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): 175.06, 174.12, 165.70, 161.99, 152.80, 147.34, 145.21, 144.92, 143.60, 141.34, 141.24, 138.88, 138.12, 132.98, 132.64, 130.43, 121.43, 119.14, 118.42, 102.25, 101.36, 99.88, 92.71, 88.70, 78.36, 73.80, 69.87, 68.83, 60.83, 52.59, 51.35, 44.10, 37.83, 37.48, 34.13, 32.11, 30.21, 29.24, 22.04, 18.84, 16.75, 10.96, 10.58, 9.71.
MS (MALDI): m/z 983,6. [М+].
6
Синтез бромида цинкового комплекса 13-(диметилэтиламмонийэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-галактопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е, (15) (фиг. 7). В круглодонную колбу с магнитной мешалкой поместили 0,050 г соединения 14, растворили в смеси из 2 мл хлороформа и 3 мл метанола, добавили 2 мл бромистого этила. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Выделено 0,051 г (количественно) аммонийной соли 15 темно-зеленого твердого кристаллического порошка.
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): 9.60 (d, J=24.9 Hz, 2H), 8.69 (s, J=8.0 Hz, 1H), 8.21-8.06 (m, 1H), 7.97 (s, 1H), 6.20 (d, J=17.6 Hz, 1H), 6.03 (d, J=10.3 Hz, 1H), 5.46 (d, J=9.2 Hz, 1H), 5.42-5.07 (m, 2H), 4.53-4.44 (m, 1H), 4.39-4.27 (m, 3H), 4.07 (t, J=9.3 Hz, 1H), 3.95-3.78 (m, 5H), 3.73 (d, J=4.3 Hz, 5H), 3.64 (d, J=4.0 Hz, 4H), 3.10-2.87 (m, 6H), 2.60-2.48 (m, 1H), 2.32-2.21 (m, 1H), 2.21-2.10 (m, 1H), 1.97-1.86 (m, 1H), 1.77 (q, J=7.3 Hz, 3H), 1.71 (d, J=7.0 Hz, 3H).
1
3
Спектр Н ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): δ 175.95, 175.52, 172.99, 167.43, 163.64, 154.51, 149.15, 146.95, 146.37, 145.06, 143.00, 140.31, 139.75, 134.61, 134.39, 131.98, 131.74, 122.89, 120.09, 103.98, 102.59, 101.34, 94.33, 90.12, 79.81, 75.21, 71.33, 70.29, 62.31, 52.88, 51.01, 44.49, 39.81, 35.61, 33.52, 31.49, 23.44, 20.86, 20.28, 18.20, 14.46, 12.38, 12.19, 11.14, 8.38.
6
4
2
3
3
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-глюкопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (16) (фиг. 8). В круглодонную колбу, снабженную дефлегматором, помещали 0,123 г соединения 4 и 0,039 г (1,2 эквивалента) β-D-глюкопиранозил азида 8, смесь растворяли в 5 мл диметилформамида. В другой круглодонной колбе смешивали 0,008 г (2 эквивалента) CuSO⋅5HO, 0,012 г (0,4 эквивалента) аскорбата натрия, 0,016 г (0,2 эквивалента) ТВТА и 5 мл воды, для ускорения растворения использовали ультразвук. После этого приготовленный раствор вносили по каплям в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали с помощью магнитной мешалки при 50°С в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале 20% СНОН - 80% CHCl, затем 50% СНОН - 50% CHCl) целевой конъюгат (16) выделен в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,106 г, 69%).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): δ 9.58 (d, J=13.4 Hz, 2H), 8.66 (s, 1H), 8.14 (dd, J=17.9, 11.5 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 6.20 (d, J=17.9 Hz, 1H), 6.02 (d, J=10.2 Hz, 1H), 5.52-5.41 (m, 2H), 5.22 (d, J=19.0 Hz, 1H), 4.46 (d, J=7.2 Hz, 1H), 4.32 (d, J=2.7 Hz, 3H), 3.90-3.74 (m, 8H), 3.52-3.34 (m, 12H), 2.72 (s, 2H), 2.52-2.39 (m, 1H), 2.33 (s, 6H), 2.31-2.20 (m, 1H), 2.13-2.03 (m, 1H), 1.98-1.87 (m, 1H), 1.75 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.69 (d, J=7.2 Hz, 3H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): 176.70, 175.75, 174.42, 167.35, 163.65, 154.44, 149.33, 148.99, 146.86, 146.37, 145.25, 142.98, 142.91, 140.54, 139.77, 134.65, 134.30, 133.43, 132.07, 123.55, 120.07, 103.90, 103.01, 101.53, 94.38, 89.69, 81.23, 78.62, 74.11, 71.03, 62.51, 59.21, 54.21, 53.00, 45.70, 39.48, 39.05, 35.72, 33.73, 31.82, 23.70, 20.49, 18.40, 12.61, 12.23, 11.36.
MS (MALDI): m/z 984,3. [М+].
Синтез бромида цинкового комплекса 13-(диметилэтиламмонийэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-D-глюкопиранозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлори-на-е6 (17) (фиг. 8). В круглодонную колбу с магнитной мешалкой поместили 0,050 г соединения 16, растворили в смеси из 2 мл хлороформа и 3 мл метанола, добавили 2 мл бромистого этила. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Выделено 0,051 г (количественно) аммонийной соли 17 в виде темно-зеленого твердого кристаллического порошка.
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): 9.59 (d, J=23.1 Hz, 2H), 8.67 (s, J=5.3 Hz, 1H), 8.13 (dd, J=17.9, 11.6 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 6.20 (d, J=17.3 Hz, 1H), 6.03 (d, J=11.5 Hz, 1H), 5.50 (d, J=9.2 Hz, 1H), 5.42-5.09 (m, 2H), 4.48 (d, J=7.1 Hz, 1H), 4.34 (s, 3H), 3.90-3.56 (m, 13H), 3.16 (s, 4H), 3.04 (s, J=15.4 Hz, 2H), 2.59-2.47 (m, 1H), 2.33-2.21 (m, 1H), 2.16-2.07 (m, 1H), 1.97-1.85 (m, 1H), 1.76 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.70 (d, J=7.1 Hz, 3H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): 175.89, 175.43, 170.66, 167.30, 163.50, 154.40, 146.10, 142.87, 140.21, 134.26, 131.64, 123.23, 119.96,108.20,103.84, 102.48, 101.20, 93.86, 89.39, 80.94, 78.31, 73.83, 70.76, 62.21, 53.78, 52.78, 51.01, 44.17, 42.92, 39.95, 39.70, 37.06, 35.46, 33.39, 31.35, 23.36, 20.17, 18.09, 12.28, 12.08, 11.04, 8.35.
6
4
2
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(диметиламиноэтил)амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (18) (фиг. 9). В круглодонную колбу, снабженную дефлегматором, помещали 0,1 г соединения 4 и 0,055 г (1,2 эквивалента) β-D-глюкопиранозил азида 10. Смесь растворяли в 5 мл DMF. Пока смесь перемешивалась, в другой круглодонной колбе смешивали CuSO⋅5HO 0,007 г. (2 экв.), 0,010 г (0,4 эквивалента) аскорбата натрия, 0,014 г (0,2 эквивалента) ТВТА и 5 мл воды, для ускорения растворения использовали ультразвук. После этого приготовленный катализатор вносили по каплям в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали с помощью магнитной мешалки при 50°С в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале 1% триэтиламина - 10% МеОН - 89% CHCl, затем 3% триэтиламина -20% МеОН - 77% CHCl.) целевой конъюгат (18) выделен в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,074 г, 50%).
1
3
Спектр Н ЯМР (400 MHz, CDOD, δ, м.д.): 9.58 (d, J=19.1 Hz, 2H), 8.66 (s, 1H), 8.14 (dd, J=17.8,11.6 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 6.21 (dd, J=17.9, 1.6 Hz, 1H), 6.04 (dd, J=11.5, 1.6 Hz, 1H), 5.56-5.40 (m, 2H), 5.32-5.15 (m, 2H), 4.48 (q, J=7.0 Hz, 1H), 4.33 (s, 3H), 4.09-3.99 (m, 1H), 3.97-3.80 (m, 6H), 3.75 (s, 7H), 3.72-3.54 (m, 8H), 3.46 (s, 3H), 3.40-3.38 (m, 3H), 3.36 (s, J=5.8 Hz, 3H), 2.96 (s, 6H), 2.57-2.43 (m, 1H), 2.37-2.22 (m, 1H), 2.17-2.05 (m, 1H), 2.01-1.86 (m, 1H), 1.76 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.70 (d, J=7.1 Hz, 3H).
13
3
Спектр C ЯМР (101 MHz, CDOD, δ, м.д.): 176.70, 175.75, 167.50, 154.60, 149.20, 147.04, 146.39, 145.26, 143.04, 142.81, 140.65, 139.87,134.71, 134.44, 132.02, 123.51, 120.18, 104.06, 103.12, 102.94, 101.54, 94.42, 89.47, 80.48, 79.69, 78.34, 75.26, 75.06, 74.35, 73.68, 71.69, 62.93, 61.92, 59.21, 53.06, 45.17, 39.82, 38.34, 35.72, 33.66, 32.97, 31.76, 23.92, 23.71, 20.49, 18.40, 12.61, 12.31, 11.36, 9.43.
MS (MALDI): m/z 1145,8. [М+].
6
2
4
2
4
Синтез цинкового комплекса 13-(N-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этил))амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-e (19) (фиг. 10). В круглодонную колбу с мешалкой поместили 0,208 г соединения 3 и добавили 8 мл хлороформа, затем к смеси по каплям прибавляли 1 мл 1,2-бис(2-аминоэтокси)этана и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворили в 20 мл хлороформа, экстрагировали водой (3×50 мл), органическую фазу сушили над NaSO. Полученную органическую фазу растворили в 7 мл хлороформа и добавили по каплям раствор 0,325 г диацетат цинка в 4 мл метанола. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворили в 30 мл хлороформа, экстрагировали водой (3×30 мл). Органическую фазу сушили над NaSO. Целевой аминохлорин (19) выделен в виде темно-зеленого порошка (0,200 г, 72%). Использовали далее без дополнительной очистки.
2
4
3
Синтез цинкового комплекса 13-(N-(2-(2-(2-N-(3-карбокси-1-оксопропил)-аминоэтокси)этокси)этил))амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-e6 (20) (фиг. 10). В круглодонную колбу с мешалкой поместили 0,170 г соединения 19 и добавили 8 мл хлороформа, затем к смеси прибавили 0,026 г (1,3 эквивалента) янтарного ангидрида и 0,026 г (1 эквивалент) диизопропилэтиламина. Перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворили в 20 мл хлороформа, экстрагировали водой (3×50 мл), органическую фазу сушили над NaSO. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 30% МеОН - 70% CHCl) выделен целевой функционализированный хлорин (20) в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,190 г, количественно).
1
6
Спектр Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): 9.50 (d, J=6.3 Hz, 2H), 8.84 (s, 1H), 8.33 (t, J=5.4 Hz, 1H), 8.22 (dd, J=17.8, 11.6 Hz, 1H), 7.95 (t, J=5.3 Hz, 1H), 6.21 (d, J=17.9 Hz, 1H), 6.00 (d, J=11.6 Hz, 1H), 5.43 (d, J=18.7 Hz, 1H), 5.07 (d, J=19.0 Hz, 1H), 4.42 (q, J=7.2 Hz, 1H), 4.20 (d, J=9.9 Hz, 1H), 3.88-3.77 (m, 6H), 3.72 (s, J=4.8 Hz, 3H), 3.69-3.60 (m, 7H), 3.48 (t, J=5.9 Hz, 2H), 3.04 (s, 1H), 2.39 (d, J=6.2 Hz, 3H), 2.33 (d, J=6.1 Hz, 3H), 2.07 (d, J=8.6 Hz, 2H), 1.67 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.60 (d, J=7.0 Hz, 3H).
13
6
Спектр C ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): 206.52, 173.30, 171.74, 171.15, 170.10, 165.01, 162.77, 151.53, 148.17, 145.98, 143.92, 143.13, 141.40, 140.64, 138.64, 137.15, 133.93, 133.00, 132.17, 130.70, 119.13, 101.94, 101.63, 99.90, 93.12, 81.20, 72.81, 69.73, 69.66, 69.22, 68.95, 52.29, 51.60, 46.26, 37.32, 32.07, 30.71, 30.05, 29.31, 27.79, 22.84, 18.89, 17.91, 12.32, 11.65, 10.94.
MS (MALDI): m/z 939,8. [М+].
6
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(N-(2-(2-(2-N-(4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7)-1-оксобутиратоаминоэтокси)этокси)-этил))амид-17(3)-пропаргиламидхлорина-е (22) (фиг. 11). В первую круглодонную колбу с мешалкой поместили 0,095 г соединения 20, 0,038 г (2 эквивалента) EDC⋅HCl и 4 мл диметилформамида. Перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Во вторую колбу с мешалкой добавили 0,073 г (2 эквивалента) 4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7-ола (21), который ранее был синтезирован в соответствии с методикой, известной из патента WO 2010/028254 А2, 0,006 г (0,5 эквивалента) DMAP и 3 мл хлороформа, смесь перемешивали 10 минут при 0°С. Затем шприцем перенесли содержимое второй колбы в первую и перемешивали 18 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале CHCl, затем 4% МеОН - 96% CHCl) целевой конъюгат (22) выделен в виде темно-зеленого порошка (0,075 г, 58%).
6
Спектр 1Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): δ 9.75 (s, 1H), 9.51 (d, J=5.0 Hz, 2H), 8.84 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.32 (t, J=5.4 Hz, 1H), 8.27-8.17 (m, 2H), 8.09 (t, J=5.5 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.71-7.65 (m, 1H), 7.54-7.43 (m, 2H), 7.36 (s, 1H), 6.21 (d, J=19.1 Hz, 1H), 6.00 (d, J=12.7 Hz, 1H), 5.43 (d, J=19.1 Hz, 1H), 5.07 (d, J=18.7 Hz, 1H), 4.41 (q, J=7.2 Hz, 1H), 4.20 (d, J=9.6 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.88-3.77 (m, 5H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.67 (s, 5H), 3.52 (t, J=5.8 Hz, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.05 (t, J=2.4 Hz, 1H), 2.86 (t, J=6.9 Hz, 2H), 2.55 (t, J=7.0 Hz, 2H), 2.06 (d, J=8.9 Hz, 2H), 1.66 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.60 (d, J=7.0 Hz, 3H).
13
6
Спектр C ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): δ 173.28, 171.70, 170.49, 170.46, 170.07, 165.00, 162.77, 157.95, 157.31, 155.45, 153.16, 151.52, 150.23, 148.17, 145.97, 145.18, 145.13, 143.91, 143.12, 141.40, 140.64, 138.67, 137.14, 133.93, 132.99, 132.15, 130.69,129.65, 127.58, 126.01, 125.89, 120.63, 119.53, 119.29, 119.12, 118.10, 118.01, 113.10, 103.47,101.94, 101.62, 99.90, 93.11, 81.18, 79.17, 72.80, 69.74, 69.65, 69.22, 68.94, 56.56, 52.28, 51.57, 46.23, 37.29, 32.07, 30.03, 29.82, 28.94, 27.78, 22.82, 18.86, 17.88, 12.31, 11.63, 10.92.
MS (MALDI): m/z 1286,8. [М+].
6
4
2
3
3
Синтез цинкового комплекса 13-(N-(2-(2-(2-N-(4-((4'-бром-2'-фторфенил)амино)-6-метоксихиназолин-7)-1-оксобутиратоаминоэтокси)этокси)этил))амид-17(3)-(1ʺ-дезокси-β-мальтозил-1ʺ-(1',2',3'-триазол-4'-ил)-метил)амидхлорина-е (23) (фиг. 12). В круглодонную колбу, снабженную дефлегматором, помещали 0,058 г соединения 22, 0,02 г (1,2 эквивалента) β-мальтозазида 10, смесь растворяли в 6 мл диметилформамида. В другой круглодонной колбе смешивали 0,002 г (0,2 эквивалента) CuSO⋅5HO, 0,003 г (0,4 эквивалента) аскорбата натрия, 0,005 г (0,2 эквивалента) ТВТА и 6 мл воды, для ускорения растворения использовали ультразвук. После этого приготовленный катализатор вносили по каплям в реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: вначале 20% МеОН - 80% CHCl, затем 40% МеОН - 60% CHCl) выделяли целевой конъюгат (23) в виде темно-зеленого кристаллического порошка (0,066 г, 88%).
1
6
Спектр Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): δ 9.93 (s, 1Н), 9.50 (d, J=4.8 Hz, 2H), 8.84 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.38-8.31 (m, 1H), 8.26-8.17 (m, 2H), 8.11 (t, J=5.6 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.66 (dd, J=9.9, 1.9 Hz, 1H), 7.52-7.43 (m, 2H), 7.36 (s, 1H), 6.21 (d, J=19.4 Hz, 1H), 5.99 (d, J=11.5 Hz, 1H), 5.72 (d, J=2.9 Hz, 1H), 5.66-5.38 (m, 5H), 5.16-4.88 (m, 5H), 4.59-4.49 (m, 3H), 4.42 (q, J=6.7 Hz, 1H), 4.36-4.18 (m, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.86-3.41 (m, 30Н), 3.13-3.03 (m, 2H), 2.86 (t, J=6.9 Hz, 2H), 2.55 (t, J=7.0 Hz, 2H), 1.66 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.59 (d, J=7.0 Hz, 3H).
13
6
Спектр C ЯМР (400 MHz, DMSO-d, δ, м.д.): δ 173.33, 171.92, 170.53, 170.47, 170.11, 165.08, 162.75,157.35, 153.18, 151.54, 150.21, 148.16, 145.98, 145.18, 145.12, 144.84, 143.91, 143.12, 141.41, 140.64, 138.66, 137.14, 133.91, 132.98, 132.17, 130.70, 129.67, 127.55, 121.86, 120.58, 119.50, 113.15, 103.77, 101.95, 100.91, 87.06, 79.11, 77.92, 76.65, 76.25, 73.53, 73.22, 72.41, 71.52, 69.85, 69.74, 69.66, 69.22, 68.96, 60.74, 60.23, 56.67, 51.62, 34.07, 32.12, 29.84, 28.96, 22.86,18.88, 17.89, 12.32, 11.64, 10.93.
MS (MALDI): m/z 1656,1. [М+].
Анализ спектральных свойств полученных соединений.
6
Спектры поглощения и флуоресценции регистрировали с помощью планшетного спектрофотометра-спектрофлуориметра Synergy Мх (BioTek, США). Для анализа использовали растворы производных хлорина-e в концентрации 5 мкМ. В качестве растворителя использовали деионизированную воду. Спектры поглощения регистрировали в диапазоне длин волн 300-700 нм с шагом 2 нм. Спектры флуоресценции регистрировали при возбуждении на 410 нм, шаг - 2 нм, диапазон регистрации - 550-850 нм.
Коэффициент молярной экстинкции (ε) определяли по формуле:
ε=D/cl, где:
D - оптическая плотность, с - концентрация вещества, l - длина пути.
Квантовый выход флуоресценции исследуемых соединений рассчитывали относительно родамина В (Sigma, США) в воде (0,31). Расчеты производились по формуле:
где:
ϕ1 - квантовый выход флуоресценции исследуемого соединения,
ϕ2 - квантовый выход флуоресценции стандартного соединения;
D1 и D2 - оптические плотности эталонного и исследуемого растворов, соответственно.
Показано, что исследуемые соединения 15, 17, 18, 23 характеризуются интенсивным поглощением в коротковолновой области (полоса Соре) и в длинноволновой области (Q-полоса) (фиг. 13). Максимумы поглощения составили 410 нм и 635 нм соответственно. Коэффициент молярной экстинкции в коротковолновой части спектра значительно выше, что характерно для хромофоров хлоринового ряда (Ferreira et al., 2008; Ormond, Freeman, 2013). Для соединения 23 (с дигалактозилом и вандетанибом) наблюдается смещение пиков в длинноволновую часть спектра (420 нм и 645 нм).
6
Флуоресценция производных хлорина-e регистрируется в длинноволновой области 620-700 нм спектра (фиг. 14), характерной для хлориновых соединений. Пик интенсивности флуоресценции находится на 645 нм.
На основании зарегистрированных спектров флуоресценции и значений экстинкции растворов были рассчитаны значения относительного квантового выхода флуоресценции, представленные в таблице 1. В качестве соединения с известным квантовым выходом флуоресценции использован родамин Б.
Для соединения 23 показано смещение пиков в спектре поглощения, наименьшая интенсивность флуоресценции и низкий уровень квантового выхода флуоресценции. Это может быть связано с агрегацией молекул соединения в водном растворе.
Клеточные культуры.
Исследования внутриклеточной локализации и фотодинамической активности соединений проводились на клеточных культурах:
Линия А-431 - эпидермальная карцинома кожи человека (АТСС CRL-1555™), обладающая высоким уровнем экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (EGFR);
Линия СНО - клетки яичника китайского хомячка (АТСС CRL-9618TM). Клетки неопухолевой природы, экспрессия EGFR отсутствует.
2
Клетки выращивали на питательной среде ИГЛА MEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, США) и 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия) при 37°С и атмосфере 5% CO2. Культивирование проводили в культуральных флаконах площадью 25 см (Corning, США). Клетки пересаживали 3 раза в неделю в соотношении 1:7. Снятие клеток с культурального флакона осуществляли раствором трипсин : ЭДТА (1:1) (ПанЭко, Россия), для отмывки клеток использовали 10 мМ фосфатно-солевой буфер (PBS). Центрифугирование клеток проводилось на центрифуге 541 OR (Eppendorf, Германия). Состояние клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия).
Анализ внутриклеточной локализации соединений.
2
Для исследования внутриклеточной локализации исследуемых соединений суспензию клеток высаживали в тонкодонные 96-луночные планшеты (Corning, США) в концентрации 9×103 клеток на лунку и инкубировали в течение 24 часов при 37°С и атмосфере 5% CO. Затем питательную среду заменяли раствором исследуемого соединения в бессывороточной среде в концентрации 5 мкМ, 200 мкл/лунку, и инкубировали 4 часа. По завершении инкубации клетки трижды отмывали от фотосенсибилизатора и фиксировали 4% раствором формальдегида в течение 30 минут.
Изображения клеток получали с помощью системы лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Axio Observer Z1 LSM 710 (Carl Zeiss, Германия). Флуоресценцию возбуждали на длине волны 405 нм и регистрировали в диапазоне 600-740 нм.
На основании полученных изображений производился анализ поступления соединений в клетки. Количественная оценка интенсивности флуоресценции клеток проводилась с использованием программы ZEN 2012 (Carl Zeiss, Германия).
Исследование внутриклеточной локализации соединений проводилось на клетках с разным уровнем экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Было предположено, что соединение 23 (с дигалактозилом и вандетанибом) может избирательно накапливаться в клетках с высоким уровнем экспрессии EGFR. С этой целью для исследования были выбраны линия СНО, клетки которой не экспрессируют ни EGFR, ни VEGFR (Colagar et al., 2013) и линия А431, клетки которой характеризуются гиперэкспрессией EGFR (Stanton et al., 1994). Уровень экспрессии EGFR в культурах клеток, используемых в лаборатории, был ранее проверен методом проточной цитометрии с окраской антителами, специфичными к данному рецептору (Otvagin et al., 2018).
Анализ флуоресценции клеток после их инкубации с исследуемыми соединениями показал, что соединения 15, 17, 18, 23 быстро накапливаются в клетках (фиг. 15). Характер распределения свидетельствует о том, что все соединения преимущественно локализуются в цитоплазме во внутриклеточных мембранах.
6
Результаты полуколичественной оценки накопления соединений в клеточных линиях представлены на фиг. 16. На интенсивность флуоресценции клеток существенно влияет лиганд, присоединенный к хлорину-е.
Показано, что исследуемые соединения больше накапливаются в клетках неопухолевой природы (СНО). Это может говорить о неспецифическом накопления конъюгатов в клетках - проникновении посредством диффузии. Однако данный вопрос требует дальнейшего изучения.
Анализ фотодинамической активности соединений в отношении клеток опухолевой и неопухолевой природы.
2
Фотодинамическую активность оценивали in vitro. Для этого клетки высаживали на 96-луночный планшет в количестве 4×103 на лунку и инкубировали при 37°С и атмосфере 5% СО в течение 24 часов. Затем питательную среду заменяли 200 мкл бессывороточной среды с фотосенсибилизатором в различных концентрациях и инкубировали клетки в течение 4 часов. После окончания инкубации среду с соединением в лунках планшета заменяли соответствующей ростовой питательной средой. Далее клетки облучали с помощью светодиодного излучателя (Шилягина и др., 2014) в термостатируемых условиях (37°С) на TermoStat plus (Eppendorf, Германия).
2
2
Доза облучения составляла 20 Дж/см на длине волны 670 нм, мощность светового потока - 32 мВт/см, время облучения - 10 минут 25 секунд. Жизнеспособность клеточной культуры оценивали через 24 часа после облучения при помощи МТТ-теста.
МТТ-тест.
Для образования водонерастворимых окрашенных кристаллов формазана в ростовую среду вносили МТТ-реагент (Alfa Aesar, Великобритания) в конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали клетки в течение 4 часов. После отбирали инкубационную среду и добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Измерение оптической плотности полученных в лунке растворов проводили на планшетном спектрофотометре Synergy MX (BioTek, США) на длине волны 570 нм. Жизнеспособность клеток оценивали по отношению значения оптической плотности раствора формазана в каждой пробе к контролю (клетки без фотосенсибилизатора). Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле:
ОПо - усредненная оптическая плотность в лунках с обработанными клетками (за вычетом «бланка»), ОПк - усредненная оптическая плотность в лунках с необработанными клетками (за вычетом «бланка»).
По полученным результатам были построены кривые зависимости «доза-эффект» и рассчитано значение IC50 для каждого соединения (концентрация фотосенсибилизатора, снижающая жизнеспособность клеток на 50%).
Показано, что все исследуемые соединения способны вызывать фотоиндуцированную гибель клеток, однако фотодинамическая активность существенно отличалась в зависимости от присоединенного лиганда.
На рисунках 16 и 17 представлены графики зависимости жизнеспособности клеток А431 и СНО от концентрации соединений 15, 17, 18, 23 в темноте и при освещении.
Для соединении 15, 17, 18 (с углеводными лигандами) темновая токсичность наблюдалась при концентрациях 15-35 мкМ в отношении клеток А431 и 80-90 мкМ в отношении клеток СНО. При облучении в дозе 20 Дж/см2 токсичность существенно возрастала. IC50 (концентрация соединений, при которой наблюдалось снижение жизнеспособности культуры на 50%) во всех случаях не превышала 2,5 мкМ (фиг. 17).
В случае добавления к соединению 18 (с дигалактозилом) в качестве второго лиганда, вандетаниба, наблюдаются изменения цитотоксичности соединения (фиг. 18). У соединения 23 увеличивается фотодинамическая активность и уменьшается темновая токсичность по сравнению с соединением 18. Значения ингибирующей концентрации IC50 всех исследованных соединений представлены в таблице 2.
6
Минимальной темновой токсичностью обладает соединение 23. Максимальная световая токсичность наблюдается у соединений - 17 и 23. Оптимальным отношением темнота/свет обладает соединение 23 (конъюгат цинкового комплекса хлорина-е с дигалактозилом и вандетанибом).
Представленные данные показывают, что наличие гидрофильного производного мальтозы, присоединенного к хлориновому фрагменту, в предлагаемом производном обеспечивает достаточную водорастворимость, позволяет полученным соединениям избирательно накапливаться в опухолевых клетках, что обеспечивает их селективную доставку к опухолевой ткани и снижает их системную токсичность.