ПРОИЗВОДСТВО РЕКОМБИНАНТНОГО ЛУБРИЦИНА
PRODUCTION OF RECOMBINANT LUBRICIN

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество американской предварительной патентной заявки №61/894366, зарегистрированной 22 октября 2013 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей ее полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002] Изобретения, раскрытые в настоящем документе, относятся к способам производства коммерческих количеств композиций вещества, содержащего рекомбинантный человекоподобный лубрицин, с использованием трансфицированных клеток. Более конкретно, настоящие изобретения относятся к производству в промышленном масштабе новых форм лубрицина, которые имеют превосходную смазывающую способность и которые могут формулироваться и использоваться для профилактического или терапевтического лечения различных состояний, например, от боли в суставах до болезни сухих глаз.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
et al.
et al.
et al.,
th
[0003] Ген протеогликан 4 (PRG4) кодирует сильно гликозилированные смазывающие поверхность белки, которые называют лубрицином, фактором стимуляции мегакариоцитов (MSF) или белком поверхностной зоны (SZP). (См. публикацию Jay, Curr. Opin. Orthop. 15, 355 (2004); американский патент №6743774; американский патент №6960562). Лубрицин экспрессируется из гена PRG4 (идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO): 2) с полной длиной, охватывающей 12 экзонов, хотя сообщалось о множестве естественных усеченных версий. Большой муциноподобный центральный домен из 940 аминокислот (кодируемый экзоном 6) содержит приблизительно 70+ KEPAPTT-подобных последовательностей и является сильно гликозилированным. Гликопротеин содержит остатки гликозилирования ядра 2 и множество гликанов ядра 1 (О-сцепленные олигосахариды β (1-3) Gal-GalNAc), по меньшей мере последний из которых, как было показано, опосредует его первичную физиологическую функцию, граничную смазку (см. публикацию Jay , Glycoconj J 18, 807 (2001)). Было показано, что PRG4 присутствует на поверхности хряща, синовиальной оболочки, сухожилия и мениска, в слезной пленке и в других анатомических областях. Было показано, что PRG4 способствует граничной смазке соединяющихся суставных хрящевых поверхностей. Было показано, что PRG4 существует не только как мономер, но также и как димер и мультимер, связанный дисульфидной связью через законсервированные богатые цистеином домены как в N-, так и в C-окончаниях, (см. публикации Schmidt , Biochim Biophys Acta. 1790(5):375-84 (2009); Kooyman Paper No. 255, 56 Ann. Meet of Orthop. Res. Soc., 2010).
[0004] На хрящевой границе синовиальных соединений существуют по меньшей мере два действующих физико-химических режима смазки. Эти режимы классифицируются как «жидкостная пленка» и «граница». Рабочие режимы смазки зависят от нормальных и тангенциальных сил, приложенных к соединительным тканям, от относительной скорости тангенциального движения между этими поверхностями, а также от временной истории как нагрузки, так и движения. Коэффициент трения μ (безразмерная величина, отношение измеренной силы трения между двумя входящими в контакт поверхностями, движущимися относительно друг друга, к приложенной нормальной силе), обеспечивает количественную меру смазки.
[0005] Одним типом жидкостной смазки или режима «жидкостной пленки» является гидростатический. В начале нагрузки и обычно в течение некоторого длительного периода тканевая жидкость внутри хряща становится сжатой благодаря двухфазной природе ткани, жидкость также может быть выдавливаться в неровности между суставными поверхностями посредством механизма просачивания. Сжатая тканевая жидкость и захваченный смазочный материал, содержащие гиалуроновую кислоту, могут, следовательно, в значительной степени способствовать перенесению нормальной нагрузки с небольшой силой сопротивления сдвигу, обеспечивая очень низкий коэффициент трения. Кроме того, в начале нагрузки и/или движения могут образовываться пленка под давлением, гидродинамический и эластогидродинамический типы жидкостной пленочной смазки, а сжатие, движение и деформация действуют так, чтобы перемещать вязкий смазочный материал из и/или через зазор между двумя поверхностями, движущимися относительно друг друга.
et al.
et al.
[0006] При граничной смазке нагрузка поддерживается контактом поверхность-поверхность, и связанные с этим фрикционные свойства определяются поверхностными молекулами смазочного материала, то есть разновидностями лубрицина. Этот режим является важным, потому что противоположные слои хряща контактируют на +/- 10% общей площади посредством сцепления, сглаженных неровностей, и это, вероятно, является причиной большей части трения. Граничная смазка, по существу, смягчает «движение рывками» (см. публикацию Meyer , Nanoscience: Friction and Rheology on the Nanometer Scale, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, River Edge, N. J., (2002), pp. 373), то есть спонтанное скачкообразное движение, которое может происходить, когда взаимодействующие принимающие на себя нагрузку поверхности хряща скользят друг по другу, и, следовательно, проявляется как уменьшенное сопротивление как установившемуся движению, так и началу движения. Типичные рисунки износа поверхностей хряща позволяют предположить, что граничная смазка суставного хряща является критичной для защиты и поддержания суставной поверхностной структуры. Например, мыши без лубрицина демонстрируют износ, в отличие от новорожденных мышей, которые еще не приняли нагрузку. (См. публикацию Jay , Arthritis and Rheumatism,56:3662-3669 (2007).
[0007] С увеличением продолжительности нагрузки и диссипацией гидростатического давления покрытые смазочным материалом поверхности принимают на себя все более и более высокую часть нагрузки по сравнению со сжатой жидкостью, и, следовательно, коэффициент μ может все более и более определяться граничным режимом смазки. Следовательно, граничный режим смазки указывается коэффициентом трения во время установившегося скольжения, являющимся инвариантным по отношению к факторам, которые влияют на формирование жидкостной пленки, таким как относительная скорость скольжения и осевая нагрузка. Для суставного хряща было сделано заключение о том, что граничная смазка определенно происходит, хотя и дополняется сжатием жидкости и другими механизмами. Механизм смазки на границе между роговицей и веком во время моргания не подразумевает значительной нагрузки, соответственно ослабляя физико-химические требования для эффективной смазки, и поэтому, вероятно, сильно отличается от смазки хряща. Однако, было предположено, что граничный режим смазки может становиться доминирующим, когда слезная пленка становится недостаточной, как, например, при болезни сухих глаз.
in vitro
[0008] Представляется, что двумя механическими компонентами синовиальной жидкости, которые ответственны за ее замечательные смазывающие свойства, являются лубрицин и гиалуроновая кислота (или гиалуронат или «HA», используемые в дальнейшем взаимозаменяемым образом). Было показано, что лубрицин функционирует как граничный смазочный материал в шарнирных суставах и предохраняет поверхности хрящей от сил трения, клеточной адгезии и отложения белков. Например, американские патенты № 6960562 и № 6743774 раскрывают смазочный полипептид, содержащий по существу изоформы чистого PRG4, а также способы смазки суставов или других тканей путем его назначения системно или непосредственно в ткани. Было показано, что сама по себе гиалуроновая кислота уменьшает коэффициент μ по сравнению с физиологическим раствором (0,12 для гиалуроновой кислоты с концентрацией 3,3 мг/мл против ~0,24 для забуференного фосфатом физиологического раствора) на границе хрящ-хрящ в режиме граничной смазки, а один лубрицин уменьшает коэффициент μ до еще более низких уровней, но синовиальная жидкость, содержащая гиалуроновую кислоту в комбинации с лубрицином, может придавать взаимодействующим поверхностям коэффициент трения, не достижимый одним только лубрицином или синтетическими смесями гиалуроновой кислоты и лубрицина. Ни одна синтетическая композиция лубрицина и гиалуроновой кислоты не была способна полностью воспроизвести низкий коэффициент трения, придаваемый естественной синовиальной жидкостью. Гиалуроновая кислота, полученная из различных источников и имеющая различные молекулярные массы, была проверена в смеси с лубрицинами, экспрессируемыми  из синовиоцитов, бычьими лубрицинами, лубрицинами, извлеченными из синовиальной жидкости и «воссозданными» в гиалуроновой кислоте, а также лубрицинами, экспрессируемыми в микрограммовых количествах в ранних попытках их получения с использованием технологии рекомбинантной ДНК.
[0009] Предыдущие попытки рекомбинантного производства лубрицина полной длины в масштабе, подходящем для коммерческой эксплуатации, не были успешными. Очень низкий, порядка единиц или десятков миллиграмм на литр, объем производства человеческих разновидностей лубрицина, экспрессируемых из клеток яичника китайского хомячка (CHO), считается слишком низким для того, чтобы поддерживать товарный продукт. Одним подходом к решению этой проблемы было сократить количество повторений в экзоне шесть, и, следовательно, уменьшить массу боковых цепей гликозилирования, сохраняя по меньшей мере некоторую смазочную способность (см., например, американские патенты № 7642236 и № 7893029). Этот подход, как сообщается, привел к общему объему производства (перед очисткой) обрезанного конструкта порядка трехсот - четырехсот миллиграммов на литр.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Теперь было обнаружено, что человеческий ген PRG4 может использоваться для производства больших, коммерческих количеств новой, высокогликозилированной человекоподобной формы лубрицина, в дальнейшем упоминаемой как просто «лубрицин», мультимерный лубрицин, rh-лубрицин или rhPRG4. Это достигается, как раскрыто в настоящем документе, путем трансфицирования человеческого гена PRG4 (hPRG4) в некоторые модифицированные клетки яичника китайского хомячка (CHO), которые, как было обнаружено, способны пост-трансляционно гликозилировать экспрессируемые белки в большом масштабе, а затем культивирования клеток в промышленных объемах носителей, например, по меньшей мере 10 литров, более типично по меньшей мере 50 литров, предпочтительно по меньшей мере 100 литров или по меньшей мере 500 литров, и наиболее предпочтительно 1000 литров или более.
[0011] Лубрицин по настоящему изобретению содержит полидисперсные мономерные блоки лубрицина, формирующие димеры и мультимеры, и опционально свободные мономеры. Каждый блок является сильно и переменно гликозилированным, причем боковые цепи гликозидных остатков составляют по меньшей мере 30%, часто 35% или 40%, и возможно до 45% или больше от его молекулярной массы.
et al.
[0012] В природном человеческом лубрицине, гликозилирование состоит из О-сцепленного GalNAc-Gal (N-ацетилгалактозамин-галактоза) дисахарида ядра 1, по меньшей мере 60% которого замещаются на конце сиаловой кислотой, а также гликозилирования ядра 2, включающего в себя добавление к ядру 1 моносахаридов GlcNac (N-ацетилглюкозамин) в различных изомерных конфигурациях. (См., например, публикацию Estrella , Biochem J., 429(2):359-67 (2010)).
[0013] Рекомбинантный материал, произведенный как раскрыто в настоящем документе, является обогащенным гликанами ядра 1 по сравнению с природным человеческим лубрицином. Его гликозилирование содержит по меньшей мере 95% боковых цепей ядра 1, и более вероятно больше чем 98% или 99%. Кроме того, боковые цепи часто являются сульфатированными в такой степени, которая не наблюдается в природном человеческом лубрицине. Это отличает rhPRG4 по настоящему изобретению от природного hPRG4. Считается, что увеличенное содержание сульфатирования добавляет дополнительные отрицательные заряды к муцинозному гликопротеину, что может служить для улучшения его способности отталкивать соседние биомолекулы и таким образом увеличивать его смазывающие свойства, а также придавать жесткость молекулярной структуре, делая ее более жесткой с молекулярной точки зрения, что может способствовать ее способности функционировать с уменьшенным трением в наномасштабе и мезомасштабе.
[0014] Полная длина (необрезанной) последовательности мономера лубрицина (SEQ ID NO:1) содержит 1404 аминокислоты, или приблизительно 151 кДа в капсидном белке. Сигнальной последовательностью человеческого лубрицина являются остатки 1-24 последовательности SEQ ID NO:1. Соответственно, зрелой формой человеческого лубрицина являются остатки 25-1404 последовательности SEQ ID NO:1. Исчерпывающее восстановление рекомбинантного продукта, произведенного в соответствии с раскрытием настоящего документа, дает мономерные разновидности с кажущейся молекулярной массой приблизительно от 300 кДа до 460 кДа, оцениваемой путем сравнения со стандартами молекулярной массы в ряде методик определения молекулярной массы, включая электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS) в трис-ацетате с концентрацией 3-8%. Анализ гликозилирования с использованием методик масс-спектрометрии в комбинации с другими методиками позволяет предположить, что истинная молекулярная масса гликозилированного рекомбинантного мономера (в противоположность выведенной из текучести геля), вероятно находится в диапазоне от 220 до 280 кДа, и вряд ли превышает приблизительно 300 кДа. Из в общей сложности приблизительно 329 возможных О-связей (284 из которых являются треонинами), потенциально доступных в качестве мест О-сцепленного гликозилирования в последовательности мономера лубрицина, замещается их изменяющееся и неизвестное большое число (от 100 до 150, возможно вплоть до 200 или 220). Из общего числа гликозилирований примерно половина содержат два блока сахара (GalNAc-Gal), а другая половина - три блока сахара (GalNAc-Gal-сиаловая кислота). Наиболее многочисленной формой является сульфатированный Gal-GalNac, следующим по численности является сиалированный Gal-GalNac.
[0015] Продукт экспрессии лубрицина является устойчивым, хотя и не иммунным, к распаду на мономерные или димерные разновидности лубрицина. Результаты исчерпывающего восстановления подразумевают, что оно содержит дисульфидные мостики между и внутри мономерных блоков. Кроме того, обработка денатурирующими буферами без восстановления может привести к продуктам с более низкой молекулярной массой, что предполагает четвертичные структуры более высокого порядка, где цепи также удерживаются вместе гидрофобным взаимодействием, образованием водородной связи, физическим переплетением и/или другими нековалентными ассоциациями, обеспечивающими самосборку. Димеры и мультимеры являются полидисперсными. Их молекулярные разновидности обычно имеют молекулярные массы по меньшей мере приблизительно от 450 до 600 кДа, а мультимерные разновидности часто имеют молекулярные массы 2000 кДа или больше. Как правило, некоторые разновидности невосстановленного комплекса по существу не входят в 3-8% гель SDS-PAGE в эксперименте электрофореза. Считается, что более крупные разновидности комплекса содержат от трех до пяти, и возможно до 20 мономерных блоков.
[0016] Не привязываясь к какой-либо конкретной теории, считается, что такие большие надмолекулярные компоненты формируются в зависимости от концентрации мономера/димера. В настоящее время считается, что концентрация мономера/димера по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/мл является оптимальной для спонтанного формирования большого комплекса. Концентрации значительно ниже этой, например, меньше чем приблизительно 0,1 мг/мл, содержат мономеры и димеры, а также лишь незначительное количество комплексного соединения; концентрации значительно выше упомянутой могут формировать агрегаты, видимые невооруженным глазом как белесоватый или мутный раствор. Поверхностно-активные вещества, предпочтительно физиологически совместимые неионогенные поверхностно-активные вещества, которые обычно рассматриваются как безопасные, например, поверхностно-активные вещества на основе полиоксиэтилена, или инертные наполнители могут использоваться для того, чтобы предотвратить формирование больших агрегатов, обеспечивая при этом формирование комплексного соединения, которое, кажется, всегда присутствует вместе с димерными разновидностями.
et al.
[0017] Тестирование препаратов, содержащих лубрицин по настоящему изобретению, показывает, что его смазочные свойства и свойства предохранения ткани под нагрузкой могут превышать аналогичные свойства рекомбинантного лубрицина, известного в данной области техники. Без привязки к какой-либо конкретной теории авторы настоящего изобретения выдвигают гипотезу о том, что в то время как феномен движения рывками происходит во время перемещения несмазанных взаимодействующих тканей под нагрузкой, покрытие из лубрицина по настоящему изобретению может перенести сдвиг с поверхности хряща в слои внутри покрытия из полидисперсного лубрицина. Таким образом, авторы настоящего изобретения полагают, что под нагрузкой и при возвратно-поступательном движении нижележащая поверхность испытывает меньше сдвига, сохраняя его целостность, по мере того, как молекулы лубрицина внутри покрытия накладываются одна на другую, вероятно перегруппировываясь потом, когда нагрузка снимается. (См., например, публикацию Lee , PNAS, 110(7):E567-574 (2013)). Авторы утверждают, что износ сустава не связан напрямую с коэффициентом трения, но в первую очередь связан со скользящим движением рывками, и что различные молекулярные компоненты сустава работают синергично для того, чтобы предотвратить износ.
in vitro
[0018] В любом случае, продукт лубрицина по настоящему изобретению показывает при тестировании выдающиеся смазывающие свойства, приводящие к коэффициентам трения (статического и динамического), которые зачастую находятся в пределах 150%, 120%, 110% или по существу равны коэффициентам трения очищенного природного бычьего лубрицина, измеренным путем тестирования смазки хряща на хряще, как раскрыто в настоящем документе. В этих тестах человекоподобный гликопротеин по настоящему изобретению достигает статических коэффициентов трения, равных или ниже 0,5 и ниже, чем 0,2 (в зависимости от условий теста, как раскрыто в настоящем документе), а также кинетических коэффициентов трения, равных или ниже приблизительно 0,1, причем и тот, и другой коэффициент измеряются с помощью не находящегося под давлением хряща при трении хряща  с постоянной площадью контакта. При комбинировании с гиалуроновой кислотой (HA) эти значения улучшаются до величин ниже приблизительно 0,3 и меньше, чем 0,1, для определенного статического измерения (в зависимости от времени выдержки), и меньше чем 0,1 для кинетического измерения, что является вполне близким к принятому значению для синовиальной жидкости. Соответственно, такие композиции могут резко уменьшить износ сустава.
[0019] Соответственно, один аспект настоящего изобретения представляет собой способ для коммерческого производства лубрицина. В одном варианте осуществления этот способ включает в себя стадии культивирования в некоторой среде клеток яичника китайского хомячка (CHO), трансфицированных и экспрессирующих человеческий ген PRG4, и посттрансляционного гликозилирования продукта экспрессии в течение некоторого времени при условиях культивирования, достаточного для того, чтобы произвести гликопротеин лубрицина, а также очистки гликопротеина лубрицина от упомянутой среды. Например, в некоторых вариантах осуществления гликопротеин лубрицина отделяется от белков клетки-хозяина и других примесей во внеклеточном бульоне для того, чтобы по меньшей мере частично очистить его. Рекомбинантный белок нуждается только в обогащении из среды культивирования вместо очистки до гомогенности, чтобы быть очищенным для целей способа по настоящему изобретению. Этот способ является достаточным для того, чтобы произвести гликопротеин лубрицина, имеющий по меньшей мере 30 мас.% гликозидных остатков при концентрации в среде, равной по меньшей мере 0,4 г/л.
[0020] В некоторых вариантах осуществления клетками CHO являются клетки CHO-M, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий ген PRG4. В других вариантах осуществления клетки CHO трансфицируются первым вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую хроматиновый элемент, и трансфицируются вторым вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий ген PRG4. Хроматиновый элемент может быть граничным элементом, участком прикрепления к ядерному матриксу, участком управления локусом или универсальным хроматиновым открывающим элементом. В одном предпочтительном варианте осуществления хроматиновый элемент является участком прикрепления к ядерному матриксу.
[0021] В других вариантах осуществления клетки CHO трансфицируются первым вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую хроматиновый элемент и кодирующую человеческий ген PRG4, а также трансфицируются вторым вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую хроматиновые элементы и кодирующую человеческий ген PRG4. В одном предпочтительном варианте осуществления хроматиновые элементы в первом и втором векторах являются участками прикрепления к ядерному матриксу.
[0022] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 45% массы димерного или мультимерного гликопротеина лубрицина составляет масса гликозидных остатков. В некоторых вариантах осуществления больше чем 30%, больше чем 35%, больше чем 40%, или больше чем 45% массы димерного или мультимерного гликопротеина лубрицина составляет масса гликозидных остатков. Гликозидные остатки могут отличаться от гликозидных остатков природного человеческого лубрицина, поскольку гликозилирование рекомбинантного человекоподобного лубрицина составляет по меньшей мере 90 мас.%, по меньшей мере 95 мас.%, или по меньшей мере 99 мас.% гликозилирование ядра 1. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления гликозидные остатки являются обогащенными сульфатированными моносахаридами по сравнению с природным человеческим лубрицином.
[0023] Этот процесс неожиданно оказывается способным производить коммерчески целесообразные количества гликопротеина лубрицина полной длины. Например, клетки могут культивироваться в течение некоторого времени и при условиях культивирования, достаточных для того, чтобы произвести концентрации гликопротеина лубрицина в среде культивирования по меньшей мере приблизительно 0,4 г или 0,5 г рекомбинантного лубрицина на литр, предпочтительно по меньшей мере 0,8 г на литр, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 1,0 г лубрицина на литр среды культивирования при ее объеме, например, по меньшей мере приблизительно 10, 50 или 100 л. При его оптимизации этот процесс может производить до 2,0 г/л, по меньшей мере 2,5 г/л или по меньшей мере 3,0 г лубрицина на литр культуры. В зависимости от разработки оптимизированного протокола очистки будет возможно получать по меньшей мере приблизительно 200 мг очищенного рекомбинантного лубрицина на литр, предпочтительно по меньшей мере 300 мг/л, более предпочтительно по меньшей мере 500 мг/л, и наиболее предпочтительно еще больше. Насколько известно заявителям, эти уровни производительности прежде никогда не достигались при рекомбинантной экспрессии какого-либо муциноподобного белка или белка, сравнимого по размеру с лубрицином, и ни одна из предыдущих попыток экспрессии PRG4 не достигла успеха в производстве материала, имеющего свойства описанного в настоящем документе продукта.
[0024] В предпочтительных вариантах осуществления мономерные разновидности лубрицина часто отделяются от питательной среды в смеси с мультимерными разновидностями. Эти мультимерные разновидности содержат большое количество димерных разновидностей лубрицина. Например, в некоторых вариантах осуществления этот способ производит смесь рекомбинантного лубрицина, которая включает в себя мономерные, димерные и мультимерные разновидности лубрицина. В некоторых вариантах осуществления гликопротеин лубрицина содержит по меньшей мере пять связанных дисульфидными мостиками или нековалентно связанных индивидуальных гликозилированных цепей аминокислоты и имеет молекулярную массу по меньшей мере 1200 кДа.
[0025] Гликопротеин, произведенный в соответствии со способами по настоящему изобретению, при тестировании с использованием описанного ниже протокола производит коэффициент трения, приближающийся к самым низким значениям, когда-либо наблюдавшимся для очищенного природного лубрицина млекопитающих. Например, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный гликопротеин лубрицина является мультимерным белком, который производит статический коэффициент трения не более чем 150% от статического коэффициента трения очищенного природного бычьего лубрицина при измерении в тесте трения хряща на хряще. В других вариантах осуществления рекомбинантный гликопротеин лубрицина является мультимерным белком, который производит статический коэффициент трения не более чем 120% от статического коэффициента трения очищенного природного бычьего лубрицина при измерении в тесте трения хряща на хряще. В других вариантах осуществления рекомбинантный гликопротеин лубрицина является мультимерным белком, который производит статический коэффициент трения не более чем 110% от статического коэффициента трения очищенного природного бычьего лубрицина при измерении в тесте трения хряща на хряще.
[0026] Другой аспект настоящего изобретения направлен на композиции рекомбинантного мультимерного гликопротеина лубрицина, экспрессируемого из человеческого гена PRG4 в культуре клетки-хозяина. Рекомбинантный гликопротеин лубрицина состоит по меньшей мере на 30 мас.% из гликозидных остатков и производит динамический коэффициент трения не более чем 150% от динамического коэффициента трения очищенного природного бычьего лубрицина при измерении в тесте трения хряща на хряще.
[0027] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный гликопротеин лубрицина состоит по меньшей мере на 35 мас.%, по меньшей мере на 40 мас.% или по меньшей мере на 45 мас.% из гликозидных остатков.
[0028] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный гликопротеин лубрицина производит динамический коэффициент трения не более чем 110% или не более чем 120% от динамического коэффициента трения очищенного природного бычьего лубрицина при измерении в тесте трения хряща на хряще.
[0029] В некоторых вариантах осуществления гликозидные остатки рекомбинантного лубрицина могут отличаться от гликозидных остатков природного человеческого лубрицина, поскольку гликозилирование рекомбинантного лубрицина составляет по меньшей мере на 90 мас.%, по меньшей мере на 95 мас.%, или по меньшей мере на 99 мас.% гликозилирование ядра 1. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления гликозидные остатки рекомбинантного лубрицина являются обогащенными сульфатированными моносахаридами по сравнению с природным человеческим лубрицином.
[0030] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный лубрицин является смесью мономерных, димерных и мультимерных разновидностей. В некоторых вариантах осуществления лубрицин включает в себя мономерные разновидности. В некоторых вариантах осуществления лубрицин включает в себя димерные разновидности. В некоторых вариантах осуществления лубрицин включает в себя мультимерные разновидности. В некоторых вариантах осуществления лубрицин является смесью мультимерных и мономерных разновидностей.
[0031]В некоторых вариантах осуществления гликопротеин лубрицина содержит по меньшей мере пять связанных дисульфидными мостиками или нековалентно связанных индивидуальных гликозилированных цепей аминокислоты и имеет молекулярную массу по меньшей мере 1200 кДа.
[0032] В некоторых вариантах осуществления композиция рекомбинантного гликопротеина лубрицина дополнительно включает в себя гиалуроновую кислоту или ее соль в смеси с лубрицином.
[0033] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает композицию, представляющую собой раствор, содержащий 100 г человеческого лубрицина, в котором гликозилирование лубрицина является по меньшей мере на 99 мас.% гликозилированием ядра 1. В одном варианте осуществления лубрицин является рекомбинантным человеческим лубрицином. В еще одном варианте осуществления концентрация лубрицина в растворе составляет по меньшей мере 0,5 г/л. В еще одном варианте осуществления этот раствор является средой клеточной культуры.
[0034] Композиции по настоящему изобретению могут использоваться для приготовления медикамента для любого известного или будущего медицинского или другого использования гликопротеина PRG4, включая его использование в качестве покрытия для различных устройств, предназначенных для контакта с телом (см., например, американские патентные заявки № 2009/0068247 и № 2011/0142908); для лечения суставного соединения человека или животного путем улучшения смазки сустава (см. американскую патентную заявку № 2004/0229804) или введения в сустав препаратов, улучшающих скольжение суставных поверхностей (см. американскую патентную заявку № 2008/0287369); для местного нанесения на поверхность ткани, например, во время хирургической операции, для предотвращения последующего формирования спаек или фиброзной соединительной ткани (см. американскую патентную заявку № 2004/0229804); для лечения болезни сухих глаз (см. американскую патентную заявку № 2011/0059902); для лечения ксеростомии (см. американскую патентную заявку № 2013/0039865); для лечения внутритканевого цистита (см. американскую патентную заявку № 2012/0321693); в качестве влагалищного смазочного материала (см. американскую патентную заявку № 2012/0052077); для раствора для хранения и ухода за контактными линзами (см. американскую патентную заявку № 2012/0321611) или для системного введения, например, для предотвращения межклеточной адгезии или подвижности внутри сосудистой сети (см., например, американскую предварительную заявку № 61/908959, зарегистрированную 26 ноября 2013 г.).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0035] Фиг. 1 и Фиг. 2 представляют собой плазмидные карты векторов, используемых при разработке экспрессирующего лубрицин клона клеток CHO-M, используемого в процессе по настоящему изобретению, и кодирующих последовательность полной длины hPRG4.
[0036] Фиг. 3 и Фиг. 4 изображают полиакриламидные гели, полезные для оценки структуры rh-лубрицина по настоящему изобретению.
[0037] Фиг. 5 представляет собой графическое описание производительности одного цикла производства лубрицина, измеряющее количество мкг произведенного лубрицина на литр культуры трансфицированных клеток CHO-M в зависимости от времени. Для каждой даты сбора урожая изображено три столбика. Левый столбик представляет собой «Стандартную кривую 24 июня 2014 г». Средний столбик представляет собой «Стандартную кривую 24 июля 2014 г», и правый столбик представляет собой «Стандартную кривую 25 июля 2014 г».
[0038] Фиг. 6 представляет собой диаграмму, показывающую гликаны ядра 1 rh-лубрицина по настоящему изобретению.
[0039] Фиг. 7 представляет собой хроматограмму с помеченными пиками, показывающую относительное количество различных ди- и трисахаридов, свисающих от остатков SER и THR в rh-лубрицине по настоящему изобретению.
[0040] Фиг. 8 представляет собой диаграмму, показывающую большое разнообразие гликанов, входящих в структуры ядра 2 природного лубрицина, извлеченного из человеческой синовиальной жидкости.
[0041] Фиг. 9 представляет собой хроматограмму с помеченными пиками, показывающую относительное количество различных сахарных остатков в природном человеческом лубрицине.
[0042] Фиг. 10A, 10B и 10C представляют собой графики зависимости поверхностного натяжения от концентрации rhPRG4 и/или концентрации поверхностно-активного вещества полиоксиэтилен, показывающие уменьшение поверхностного натяжения при увеличении концентрации rhPRG4.
[0043] Фиг. 11A и 11B изображают данные, сравнивающие статический (Фиг. 11A) и кинетический (Фиг. 11B) коэффициенты трения раствора rhPRG4 с очищенным природным бычьим PRG4, физиологическим раствором (PBS) и бычьей синовиальной жидкостью при концентрации PRG4 в обоих препаратах, равной 450 мкг/мл. Обозначения a, b и c обозначают статистически значимые различия в результатах (p < 0,05), n=7. В результатах для rh-PRG4 (рекомбинантного) и nPRG4 (природного) не было никаких статистически значимых различий, как указано наличием «b» над каждым столбиком на Фиг. 11B.
[0044] Фиг. 12A-B изображают данные, сравнивающие статический (Фиг. 12A) и кинетический (Фиг. 12B) коэффициенты трения раствора гиалуроновой кислоты плюс rhPRG4 с физиологическим раствором, одним rhPRG4 и бычьей синовиальной жидкостью при концентрации rhPRG4, равной 450 мкг/мл и концентрации гиалуроновой кислоты (1,5 МДальтон), равной 3,33 мг/мл. Обозначения a, b, c и d над каждым столбиком на Фиг. 12B означают статистически значимые различия в результатах (p < 0,05), n=4.
[0045] Фиг. 13 изображает данные, показывающие восстановление смазывающей способности на взаимодействующих поверхностях бычьей ткани после расщепления природного бычьего PRG4 и нанесения rhPRG4.
[0046] Фиг. 14A-D изображают данные, показывающие влияние rhPRG4 на граничную смазку на границе между роговицей и веком у человека (Фиг. 14A - статический, Фиг. 14B - кинетический), а также на границе между человеческой роговицей и PDMS (Фиг. 14C - статический, Фиг. 14D - кинетический) для природного бычьего PRG4 и rhPRG4 с концентрацией 300 мкг/мл в физиологическом растворе и для одного только физиологического раствора. Значения представляют собой среднее±стандартная ошибка среднего (n=6) со средним нормальным напряжением 14,1±2,2, и 16,9±5,3 (среднее±среднеквадратичное отклонение) для границ роговица-веко (AB) и роговица-PDMS (CD), соответственно. Эти данные иллюстрируют практически идентичную смазывающую способность rhPRG4 и очищенного природного PRG4 в задачах смазки с низкой нагрузкой.
[0047] Фиг. 15 представляет собой последовательность аминокислот лубрицина человека полной длины, которая имеет 1404 аминокислот в длину. Остатки сигнальной последовательности (1-24) выделены жирным шрифтом.
[0048] Фиг. 16 представляет собой последовательность аминокислот, кодирующую лубрицин человека полной длины.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
наноразмерных механических свойствах
[0049] Авторы настоящего изобретения исследовали возможности для производства известного человеческого гликопротеина лубрицина с использованием методик рекомбинантной ДНК с целью разработки производственного процесса, включающего в себя суспензию культуры, использующей клетки млекопитающих в бессывороточной среде для выращивания. В отличие от каких-либо известных заявителям предшествующих попыток производства белков с использованием методик рекомбинантной ДНК, цель заключалась в том, чтобы производить коммерческие количества сложного большого биополимера, ценность которого заключается в его , в противоположность его биохимическим свойствам, и эти физические свойства зависели от успешного использования событий посттрансляционного гликозилирования в масштабе, никогда прежде не наблюдавшемся в спроектированной клетке.
[0050] Предыдущие попытки рекомбинантного производства лубрицина полной длины давали выход лишь несколько миллиграмм на литр, и был необходим способ производства с выходом по меньшей мере приблизительно один - два грамма на литр. Обзор литературы не дал сведений ни об успешном рекомбинантном производстве в промышленном масштабе должным образом гликозилированного лубрицина полной длины, ни об экспресии в промышленном масштабе какого-либо муцинового или муциноподобного белка. В результате такого исследования были найдены публикации, содержащие предположения о том, что такой сильно гликозилированный гликопротеин, как лубрицин, было довольно трудно экспрессировать. См., например, американский патент № 7642236, который гласит: «Для того, чтобы оптимизировать параметры экспрессии и исследовать функциональную необходимость всех приблизительно 76-78 KEPAPTT-подобных последовательностей, были разработаны конструкты экспрессии лубрицина, которые обеспечивали синтез белков рекомбинантного лубрицина с различными степенями подстановки О-сцепленного олигосахарида». Данные о производительности рекомбинантных клеточных линий, экспрессирующих обрезанные конструкты лубрицина, в этом патенте не были раскрыты.
et al.
et al.
[0051] Авторы настоящего изобретения искали и в конечном счете наняли компанию Selexis S. A., г. Женева, Швейцария, для производства экспрессирующих лубрицин клональных культур, основываясь частично на опубликованных возможностях технологии Selexis, включающих экспрессирование эпигенетических регуляторов, для улучшения производства трудных для экспрессирования белков. (См. принадлежащие Selexis американские патенты № 7129062 и № 8252917, а также американские патентные заявки № 2011/0061117, № 2012/0231449 и № 2013/0143264, раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки; публикации Girod , Nat Methods 4(9):747-53 (2007); Harraghy , Curr Gene Ther. 8(5):353-66 (2008)).
[0052] Применение технологии Selexis привело к разработке клонов, успешно экспрессирующих лубрицин. После анализа, масштабирования и очистки было обнаружено, что вновь разработанные рекомбинантные способы производства позволяют получать никогда прежде не описанные, мультимерные, сильно и различным образом гликозилированные формы человекоподобного лубрицина, а также выходы, которые имеют беспрецедентные уровни для таких сильно гликозилированных, высокомолекулярных муциноподобных гликопротеинов. Тестирование препаратов, содержащих большое количество новой рекомбинантной формы лубрицина, продемонстрировало неожиданные свойства и позволило производить улучшенные физиологически совместимые композиции для смазки тканей.
Процесс производства rh-лубрицина
Клетки-хозяева
et al.
[0053] Производство клона Selexis было выполнено с использованием ее проприетарной клеточной линии CHO-M, которая содержит основанные на ДНК элементы, которые управляют динамической организацией хроматина, так называемые участки прикрепления к ядерному матриксу. Клеточная линия CHO-M является клеточной линией яичника китайского хомячка, выведенной из клеток CHO-K1 (ATCC, каталожный № CCL-61, лот № 4765275), адаптированной к условиям культивирования без сыворотки и используемой для производства рекомбинантных белков. См. публикацию Girod , Nat Methods 4(9):747-53 (2007) и принадлежащие Selexis американские патенты и публикации, указанные выше, относящиеся к участкам прикрепления к ядерному матриксу (MAR), насчет способов использования MAR для разработки устойчиво высокоэкспрессирующих эукариотических клеточных линий, таких как CHO, а также клеток, трансфицированных для экспрессирования белков, вовлеченных в транслокацию продуктов экспрессии через мембрану ER и/или секрецию через цитоплазматическую мембрану. Клеточная линия CHO-M используется для производства терапевтических рекомбинантных белков и обеспечивает более высокую и более устойчивую экспрессию. Ее использование позволило изолировать клоны, демонстрирующие желаемую интенсивную экспрессию для использования в производстве рекомбинантных белков.
in vitro
et al.
et al.
[0054] Участки прикрепления к ядерному матриксу («MAR») являются последовательностями ДНК, которые связывают изолированные ядерные скелеты или ядерные матриксы  с высоким сродством (см. публикацию Hart , Curr Opin Genet Dev, 8(5):519-25 (1998). По сути, они могут определять границы независимых хроматиновых доменов, так, чтобы только охватывающие цис-регулирующие элементы управляли экспрессией генов внутри домена. Было показано, что последовательности участков прикрепления к ядерному матриксу взаимодействуют с генами-усилителями, увеличивая локальную доступность хроматина (см. публикацию Jenuwein , Nature, 385: 269-272 (1997)), и могут улучшать экспрессию ксеногенных генов в линиях клеточной культуры. Coвместная трансфекция плазмиды, имеющей элемент MAR куриного лизозима 5ʹ, с одним или более векторами экспрессии приводит к увеличенной устойчивой трансгенной экспрессии, которая, как было показано, дает 20-кратное увеличение экспрессии по сравнению с контрольным конструктом.
[0055] Участки прикрепления к ядерному матриксу являются одним типом «хроматинового элемента» (также упоминаются в настоящем документе как генетические элементы Selexis или SGE), которые раскрываются в патентных заявках и публикациях Selexis, на которые сделаны ссылки в настоящем документе. Хроматиновые элементы или SGE используются для того, чтобы предотвратить влияние уровня экспрессии включаемого гена на хроматин, окружающий участок интеграции ксеногенного гена в хозяйскую хромосому. Хроматиновые элементы включают в себя граничные элементы или элементы изолятора (BE), участки прикрепления к ядерному матриксу (MAR), участки управления локусом (LCR), а также универсальные или повсеместные хроматиновые открывающие элементы (UCOE). SGE формируют хроматин, когда вектор экспрессии интегрируется в хромосому клетки-хозяина, и таким образом поддерживают трансген в состоянии высокой транскрипционной активности.
2
[0056] Клетки-хозяева CHO-M культивировались в среде SFM4CHO (HyClone), подкрепленной 8 мМ L-глютамина, гипоксантином и тимидином (1x HT, Invitrogen). Клетки поддерживались в состоянии перемешивания (скорость 120 об/мин, ход 25 мм) в увлажненном инкубаторе при температуре 37°C в атмосфере 5% CO.
Конструирование вектора
[0057] Ген PRG4, кодирующий белок человеческого лубрицина полной длины AA 1404 (SEQ ID NO:2,) вставлялся в векторы плазмиды, доступные коммерчески и составляющие собственность компании Selexis S. A. (г. Женева, Швейцария) для улучшенной экспрессии гена в клетках млекопитающих. Другая последовательность, кодирующая человеческий лубрицин полной длины, является доступной в GenBank под номером доступа NM_005807,3.
[0058] Были созданы два вектора экспрессии. Ген лубрицина клонировался в векторы экспрессии, несущие пуромициновую устойчивость, и в другие векторы экспрессии, несущие гигромициновую устойчивость. Вектор, включающий пуромициновую устойчивость, был обозначен как pSVpuro_C+_EF1alpha(KOZAK-ext9) EGFP_BGH pA>X_S29(2*HindIII, заполненный SalI) (Mw=9861). Вектор, включающий гигромициновую устойчивость, был обозначен как pSVhygro_C+_EF1alpha(KOZAK-ext9) EGFP_BGH pA>X_29(2*HindIII, заполненный SalI) (Mw=10299). Векторы экспрессии содержали бактериальный ген бета-лактамазы из транспозона Tn3 (AmpR), придавая устойчивость к ампициллину, а также бактериальный репликатор ColE1. В качестве производных pGL3Control (Promega) участок терминатора векторов экспрессии содержал ген-усилитель SV40, расположенный после сигнала полиаденилирования BGH. Каждый вектор также включал в себя один человеческий X_29SGE после полигенного экспрессирующего кластера, а также интегрированный ген пуромициновой или гигромициновой устойчивости под управлением промотора SV40. Обозначение X_29SGE относится к генетическому элементу Selexis («SGE»), в данном случае к участку прикрепления к ядерному матриксу (MAR), которые раскрываются в патентных заявках и публикациях Selexis, на которые сделаны ссылки в настоящем документе. Оба вектора экспрессии кодировали интересующий ген (PRG4) под управлением промотора hEF-1-alpha, присоединенного к гену-усилителю CMV. Плазмиды верифицировались путем секвенирования.
[0059] Плазмидные карты вектора, несущего ген устойчивости к пуромицину, а также вектора, несущего ген устойчивости к гигромицину, показаны на Фиг. 1 и Фиг. 2, соответственно.
Трансфекция
[0060] Клетки были трансфицированы путем микропорирования с использованием прибора MicroPorator™ (производства компании NanoEnTek Inc., Корея), определяющего импульсный режим для клеток CHO-M (напряжение 1250 В, продолжительность импульса 20 мс, всего 3 импульса). Эффективность трансфекции параллельно контролировалась с использованием вектора экспрессии GFP, и показала эффективность трансфекции от 50% до 70%. Клетки CHO-M были сначала трансфицированы вектором экспрессии пуромицинового PRG4, и устойчиво трансфицированные клетки были отобраны сначала путем культивирования в среде, содержащей пуромицин. Более конкретно, разбавления были дозированы на 96-луночные пластины, подпитывались в течение последующей недели путем добавления 100 мкл свежей среды отбора ко всем лункам (среда SFM4CHO, подкрепленная 8 мМ L-глютамина, 1x HT, включая 5 мкг/мл пуромицина). Двадцать семь минипулов были перенесены на 24-луночные пластины спустя 15 дней путем переноса всей клеточной суспензии с 96-луночной пластины в одну лунку 24-луночной пластины, примированную той же самой средой. В течение четырех дней надосадочные жидкости 24-луночной пластины были проанализированы, и 14 минипулов были перенесены на 6-луночные пластины (1 мл клеточной суспензии+2 мл свежей среды для выращивания, включая отбор). Восемь наилучшим образом экспрессированных минипулов были расширены три дня спустя путем суспендирования и сбора во вращающиеся пробирки (рабочим объемом 5 мл), и три дня спустя культивировались во встряхиваемых колбах (рабочим объемом 20 мл). Один последующий проход был выполнен перед банкированием.
[0061] Пулы устойчивых клеток были расширены во встряхиваемых колбах для того, чтобы произвести материал, необходимый для предварительных исследований (всего 1-2 мг). Образцы бесклеточной среды были получены путем центрифугирования клеточной культуры при ускорении 800 g в течение 5 мин. Экспрессия рекомбинантного PRG4 анализировалась точечным блот-анализом. Десять микролитров бесклеточной среды (концентрированный образец) были нанесены на мембрану из поливинилиденфторида, и образцы были оставлены для высыхания. Стандартный раствор PRG4 был создан путем последовательного разбавления PRG4 с 80 мкг/мл до 2,5 мкг/мл. Рекомбинантный PRG4 обнаруживался посредством поликлонального антитела, направленного против синтетического белка PRG4 лубрицина (Pierce).
[0062] Клетки из лучших минипулов были затем супертрансфицированы (дополнительная трансфекция уже отобранной популяции минипула) с использованием второго маркерного гена отбора, кассеты устойчивости к гигромицину. Использовался тот же самый протокол трансфекции, который был описан выше. Спустя один день после этой второй трансфекции отбор был запущен в среде SFM4CHO, снова подкрепленной 8 мМ L-глютамина и 1x HT, но включая 1000 мкг/мл гигромицина. После замены среды в течение четырех дней три пула были перенесены на 6-луночные пластины; все три (3) пула были расширены во вращающиеся пробирки (рабочим объемом 5 мл) четыре дня спустя, и во встряхиваемые колбы (рабочим объемом 20 мл) в пределах трех дней.
Генерирование клона
[0063] Супертрансфицированные пулы затем культивировались и анализировались на предмет способности к росту во множественных и последовательных экспериментах в попытке максимизировать свойства клетки.
[0064] В первом эксперименте три супертрансфицированных пула (обозначенных как P01ST, P05ST и P14ST) были перенесены на 6-луночные пластины после замены среды с концентрацией 100 клеток/мл (2 пластины для каждого пула), в полутвердой среде (2x среда SFM4CHO (HyClone) и CloneMatrix (Genetics), включая 8 мМ L-глютамина, 1x HT и Cell Boost 5™ (HyClone) (без отбора). Выращенные на пластине клетки были просмотрены 16 дней спустя (с помощью системы ClonePix™ (Molecular Devices)), и 22 кандидата были отобраны и перенесены на 96-луночные пластины со средой для выращивания, описанной выше (но без отбора). Все 18 растущих кандидатов были перезагружены на 24-луночные пластины шесть дней спустя путем переноса всей клеточной суспензии с соответствующей 96-луночной пластины в одну лунку 24-луночной пластины (примированную 1 мл среды). В пределах трех дней надосадочные жидкости 24-луночной пластины были проанализированы, и 12 кандидатов были перенесены на 6-луночные пластины (1 мл клеточной суспензии+2 мл свежей среды для выращивания, включая отбор). Семь наилучшим образом экспрессирующихся кандидатов были расширены пять дней спустя для культивирования суспензии во вращающихся пробирках (рабочим объемом 5 мл) в среде (без отбора), и в пределах пяти дней во встряхиваемых колбах (рабочим объемом 20 мл).
5
6
6
[0065] Все клеточные линии были банкированы. Эффективность трех наилучших кандидатов сравнивалась во встряхиваемых колбах (посев 3x10 клеток/мл, объем культуры 20 мл) при подпитываемом культивировании (стратегия питания - 16% первоначального объема раствора CB5 (HyClone), 52 мг/мл, подаваемые на 0-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й и 7-й день). К восьмому дню культуры содержали от 4,22×10 до 4,95×10 клеток/мл и имели жизнеспособность от 94% до 96%. Популяции клеток в этих пулах были подсчитаны и разбавлены для одноклеточного выращивания на пластине (концентрация 1 клетка/лунку, две пластины). Одиночные колонии подпитывались путем добавления 100 мкл среды для выращивания на лунку после 11 дней (без отбора). После 17 дней 99 клонов были перезагружены на 24-луночные пластины путем переноса всей клеточной суспензии с соответствующей 96-луночной пластины в одну лунку 24-луночной пластины (примированную 1 мл среды). В пределах четырех дней эти 24 лунки были перенесены на 6-луночные пластин (3 мл свежей среды для выращивания, включая отбор). Восемь клонов были расширены для культивирования суспензии во вращающихся пробирках (рабочим объемом 5 мл) после четырех дней, и все восемь клонов были расширены во встряхиваемые колбы (рабочим объемом 20 мл) после одной замены среды (среда SFM4CHO, подкрепленная 8 мМ L-глютамина и 1x HT). Один последующий проход был выполнен перед банкированием всех кандидатов.
5
6
6
6
6
[0066] Сравнение эффективности пяти наилучших кандидатов выполнялось во встряхиваемых колбах (посев 3x10 клеток/мл, объем культуры 20 мл) при подпитываемом культивировании (стратегия питания - 16% первоначального объема раствора CB5 (HyClone), 52 мг/мл, подаваемые на 0-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й и 7-й день). На третий день количество клеток в соответствующих культурах колебалось от 1,61×10 до 3,46×10 клеток/мл с временами удвоения, меняющимися в пределах от 19,8 до 30,7 час. На восьмой день концентрации клеток колебались от 4,02×10 до 9,48×10 клеток/мл с жизнеспособностью клеток в диапазоне от 88,6% до 97,7%.
6
6
[0067] Во втором эксперименте три различных супертрансфицированных пула (обозначенные как P14STcp08, P05ST11 и P14ST33) были подвергнуты той же самой процедуре, которая описана выше. Это позволило получить четыре клональные клеточные линии. Эффективность этих клонов опять сравнивалась во встряхиваемых колбах, что на восьмой день привело к концентрациям клеток в пределах от 3,5×10 до 9,48×10 клеток/мл с жизнеспособностью от 75,3% до 88,1%.
6
[0068] Клон (P14ST15) из первого круга отбора с системой ClonePix™, описанного выше, который показал на восьмой день 6,03×10 клеток/мл и жизнеспособность 95,5%, был оттаян во встряхиваемой колбе (рабочим объемом 20 мл). Этот кандидат был перенесен на одиночную пластину после одного последовательного прохода при концентрации 200 клеток/мл (1 пластина) в полутвердом носителе, описанном выше, плюс CloneMatrix, включая 8 мМ L-глютамина, 1x HT и Cell Boost 5™, без отбора. Выращенные на пластине клетки были подвергнуты скринингу с использованием системы ClonePix™ 12 дней спустя, 84 клона были выбраны и перенесены на 96-луночные пластины (без отбора). Одиночные колонии подкармливались путем добавления 100 мкл среды для выращивания на лунку. Скрининг надосадочных жидкостей с 96-луночных пластин был проведен спустя 18 дней после выращивания на пластине. 24 показавших наилучший рост клона были перезагружены на 24-луночные пластины путем переноса всей клеточной суспензии с соответствующей 96-луночной пластины в одну лунку 24-луночной пластины (примированную 1 мл среды без отбора). В пределах трех дней надосадочные жидкости 24-луночной пластины были проанализированы, и 12 клонов были перенесены на 6-луночные пластины (1 мл клеточной суспензии+2 мл свежей среды для выращивания, включая отбор). Шесть показавших наилучший рост клонов были расширены четыре дня спустя для культивирования суспензии во вращающихся пробирках (рабочим объемом 5 мл) и в пределах четырех дней во встряхиваемых колбах (рабочим объемом 20 мл). Два последовательных прохода были выполнены перед банкированием. Шесть клональных клеточных линий были банкированы.
6
6
[0069] Эффективность шести наилучших кандидатов сравнивалась во встряхиваемых колбах, как описано выше. На восьмой день плотность клеток колебалась от 9,04×10 до 6,40×10 клеток/мл, а жизнеспособность составляла от 74,6% до 93,1%.
Криоконсервация и тестирование
6
[0070] После множества проходов клональных пулов (от 6 до 31), пулы были сохранены замораживанием в пробирках по 6x10 клеток/пробирку и сохранены в жидком азоте. Отсутствие микоплазмы для всех клеточных линий было подтверждено путем использования комплекта обнаружения микоплазмы VenorGem (Minerva Biolabs). Тесты стерильности были инокулированы и культивированы в соответствии с протоколом изготовителей (Heipha, Caso-Bouillon TSB). Стерильность была подтверждена для всех минипулов и супертрансфицированных минипулов.
Масштабированные культуры
[0071] Для масштабирования была отобрана клеточная линия, обозначенная как P05ST11-cp05. Для 200-литрового прогона использовались следующие условия и протокол:
Сосуд
Биореактор XDR-200
pH
7,1±0,2
Растворенный кислород
50%
Температура
37°C, см. замечания ниже
Начальный объем
100 л
Инокуляционная плотность
1e6 VC/мл
Основная среда
SFM4CHO, подкрепленная 1XHT+(8 мМ) Glutamax (Gibco)
Питание
CellBoost5 (52 г/л) 16 об.% на 0-й, 3-й, 5-й, 7-й день*CellBoost5 (52 г/л) 10 об.% на 10-й и 12-й день, дополнительно при необходимости.
Глюкоза в целевой культуре
Поддерживается 4-4,5 г/лПитание 40%-ым раствором по мере необходимости, см. раздел «Глюкоза/осмолярность» ниже
Добавление WFI
По мере необходимости для того, чтобы поддерживать Осм ≤ 410 мОсм/кг, см. раздел «Глюкоза/осмолярность» ниже
Критерий жизнеспособности клеток для сбора урожая
60%-ая жизнеспособность
Перемешивание
95 об/мин
Конструктивное решение для барботирования газа
(5) просверленных отверстий диаметром 0,5 м в диске с пористостью 2 мкм
Подача Cell Boost™
16%, 52 г/л на 0-й, 3-й, 5-й и 7-й день10%, 52 г/л на 10-й, 12-й день, и дополнительно в случае необходимости
Глюкоза/осмолярность
Протокол измерения: Питание - Измерение глюкозы - Добавление глюкозы в случае необходимости - Измерение осмолярности - Добавление воды в случае необходимостиКритерий глюкозы: 4-4,5 г/лКритерий осмолярности: Если > 410 мОсм, добавить H<sub>2</sub>О до достижения 390 мОсм
Глутамакс/глутамин
Отслеживать глутамин - если падает <0,5 мМ, добавить до 2 мМ
Температурный сдвиг
Сдвинуть до 34°C при 80% или 12x10<sup>6</sup> клеток/мл
Критерий сбора урожая
Жизнеспособность < 60%
6
[0072] Экспрессия rhPRG4 увеличивается в тандеме с плотностью жизнеспособных клеток (VCD) с первого по восьмой дни в культуре объемом 200 литров. VCD выходит на плато на восьмой день, а затем начинает падать, что обычно наблюдается, как только условия становятся неоптимальными для метаболических требований плотной системы клеточной культуры. Несмотря на это, экспрессия rhPRG4 продолжается дальше и его экспрессия в системе культуры с VCD 12-14×10 клеток/мл достигала максимальной концентрации на 13-й день культивирования. Фиг. 5 показывает накопленное количество рекомбинантного лубрицина с течением времени, измеренное с использованием площади под кривой графика высокопроизводительной жидкостной хроматографии (HPLC) и интерпретации этой площади в сравнении с тремя различными калибровочными кривыми, полученными путем HPLC-очистки последовательно разбавленных образцов того, что считается лубрицином по меньшей мере 99%-й чистоты. Как проиллюстрировано, эта процедура оценивала производство рекомбинантного лубрицина около 2,5 г/мл. Дополнительные эксплуатационные прогоны показали изменяющийся выход при измерении с помощью различных методик. Один прогон производил лубрицин на уровне 1,5 г/л при измерении с помощью конкурентной методики ELISA. Другой прогон производил лубрицин на уровне 1,4 г/л.
Очистка рекомбинантного PRG4
[0073] Цель разработки протокола очистки заключается в том, чтобы сохранить смазочную функцию экспрессируемого продукта лубрицина и его мультимерных комплексов, отделяя его от примесей, избегая агрегирования и поддерживая высокий выход. Это представляло собой проблему из-за глубокого гликозилирования лубрицина, его высокой молекулярной массы, его свойства антиадгезии и поверхностной смазки, а также его тенденции формировать комплексы и агрегироваться с образованием нерастворимых микрочастиц с увеличением его чистоты. Ранние эксперименты рекомендовали использовать хроматографию проточного режима для того, чтобы избежать потерь при очистке, поскольку титр лубрицина в собранной среде был высоким. Была разработана стратегия для извлечения примесей с помощью хроматографической адсорбции при сохранении продукта лубрицина в проходящем потоке. В ходе разработки было обнаружено, что выход был чувствительным к использованию компонентов неионогенного поверхностно-активного вещества, такого как, например, полиоксиэтиленовое производное монолаурата сорбитана. Устранение такого поверхностно-активного вещества из пула лубрицина приводило к значительной потере продукта во время ультрафильтрации/диафильтрации и 0,2 мкм-фильтрации после стадий хроматографического разделения. Использование малых концентраций поверхностно-активных веществ, таких как всего 0,1 мас.%, значительно улучшало выход. Методом проб и ошибок было обнаружено, что более низкие концентрации поверхностно-активного вещества успешно выполняли удерживающую функцию и улучшали выход.
[0074] В дополнение к неионогенным поверхностно-активным веществам, используемым в процессе очистки, физиологически совместимые формы инертных наполнителей, таких как [(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат (CHAPS) и/или лизин могут быть смешаны с растворами лубрицина по настоящему изобретению и могут иметь выгодные эффекты в стабилизирующих растворах, например для того, чтобы избежать или уменьшить агрегирование лубрицина в растворах с концентрацией больше чем 0,4 мг/мл или 0,6 мг/мл.
[0075] Итерационное тестирование привело к разработке процедуры очистки, сформулированной ниже.
2
[0076] Среда, очищенная осаждением (100 мл), разбавлялась 5 мл раствора 200 мМ трис и 40 мМ MgCl со значением pH 8,2, и смешивалась с 400 единицами бензоназы (250 ед/мкл, Novagen) для того, чтобы удалить растворимые полинуклеотиды. Этот раствор смешивался в течение четырех часов при комнатной температуре, а затем смешивался с 37,8 г мочевины так, чтобы довести концентрацию мочевины до 6 M, и в результате получалось 120 мл раствора. К этому раствору добавлялся 1N NaOH для доведения значения pH до 11, а также 0,01% Твин-20 (монолаурат сорбитана, Sigma).
4
[0077] После добавления бензоназы материал затем обрабатывался с использованием анионообменной смолы GE Q Big Beads™ при значении pH 11 в присутствии 6 M мочевины и 0,01% Твин-20 в проточном (FT) режиме, при этом примеси связывались со смолой, а продукт нет. Колонка была сначала санирована 0,1N раствором NaOH; затем заряжена 100 мМ NaPO, 1,5 M NaCl при значении pH 7,2; и повторно уравновешена 200 мМ трис-боратом и 6 M мочевиной при значении pH 10. Колонка объемом 30 мл (XK 26×6 см) была затем загружена 120 мл раствора при 4 мл/мл смолы при скорости потока 20 мл/мин (240 см/час) с последующей промывкой уравновешивающим буфером - 100 мМ трис-боратом, 100 мМ NaCl, 6 M мочевиной и 0,01% Твин-20 при значении pH 11. Вскоре после загрузки продукт был собран посредством промывки (общим объемом 290 мл) до прибавления полосы раствора 0,1N NaOH+1M NaCl.
4
4
4
[0078] Этот частично очищенный проточный пул лубрицина был отрегулирован по pH с помощью 1M цитрата со значением pH=7,5, и пропущен через колонку с гидроксиапатитом (BioRad CHT), объем колонки - 14 мл (XK 16×7 см), загрузка колонки - 21 мл загрузки/мл смолы, скорость потока=10 мл/мин (300 см/час). Колонка была сначала санирована раствором 0,1N NaOH и 1 М NaCl, заряжена 500 мМ NaPO с pH 6,5; повторно уравновешена 500 мМ NaPO/6M мочевины с pH 7,4; и загружена 290 мл проточного пула, полученного на предыдущей стадии. После этого выполнялась промывка уравновешивающим буфером из 15 мМ NaPO, 6M мочевины, 0,01% Твин-20 с pH 7,4 для того, чтобы произвести 305 мл проточной жидкости, содержащей продукт.
4
[0079] Прошедшая через гидроксиапатитовую колонку жидкость была доведена до значения pH 4,8 с помощью 1 M цитрата и разбавлена водой, а затем пропущена через смолу GE SP Big Bead, объем колонки - 6 мл (XK 1,6×3 см), загрузка колонки - 58 мл загрузки/мл смолы, скорость потока=6,7 мл/мин (200 см/час). Колонка была сначала санирована раствором 0,5N NaOH, заряжена 100 мМ NaPO и 1,5 M NaCl с pH 7,4; повторно уравновешена 50 мМ цитрата натрия/6M мочевины, 0,01% Твин-20 с pH 4,8; и загружена 350 мл жидкости, полученной на предыдущей стадии. После этого выполнялась промывка уравновешивающим буфером из 50 мМ цитрата натрия/6M мочевины, 0,01% Твин-20 с pH 4,8 для того, чтобы произвести 378 мл проточной жидкости, содержащей продукт. Эта жидкость была затем нейтрализована с помощью 10N NaOH (pH 7,2).
2
2
4
4
[0080] Для того, чтобы сконцентрировать и буферизовать полученную жидкость, продуктовый пул после катионного обмена был отфильтрован с использованием 0,01 м плоской листовой мембраны TangenX с молекулярной массой отсечения 50 кДа (TangenX Technology Corporation), канал экрана LP. Буфером диафильтрации был 10 мМ NaPO, 150 мМ NaCl, pH 7,2 (PBS) и 0,1% Твин-20. После санирования с помощью 0,1N NaOH, промывки водой MilliQ и уравновешивания с помощью 10 мМ NaPO, 150 мМ NaCl, pH 7,2, мембрана была нагружена при 15000 мл/м; поток 70 мл/мин; трансмембранное давление=6-7 фунтов на кв.дюйм; поток фильтрата=5-6 мл/мин, для того, чтобы сконцентрировать раствор до приблизительно 50 мл.
2
2
4
[0081] Наконец, пул продукта после UFDF был подвергнут 0,2 мкм-фильтрации через мембрану Sartorius Sartopore 2, 150-0,015м при нагрузке на мембрану ~17000 мл/м и скорости потока 45-50 мл/мин. Мембрана была сначала примирована 10 мМ NaPO, 150 мМ NaCl, pH 7,4, затем продукт был отфильтрован с последующей прогонкой через фильтр ~40 мл буфера, и наконец фильтр был дренирован.
[0082] В настоящее время исследуются дополнительные инертные наполнители для того, чтобы улучшить извлечение конечного очищенного продукта после UFDF и 0,2 мкм-фильтрации. Эта процедура может давать большие количества продукта на литр собранной среды по меньшей мере с 96%-ой чистотой. Альтернативные стратегии очистки будут очевидны для специалиста в данной области техники.
Характеристика лубрицинового продукта
Электрофорез
[0083] Молекулярная масса основной аминокислотной цепи лубрицина полной длины составляет 150918 Дальтон. Степень и тип гликозилирования изменяются от молекулы к молекуле. Считается, что рекомбинантный PRG4, приготовленный в соответствии с раскрытым в настоящем документе способом как димерные разновидности, имеет среднюю молекулярную массу больше чем приблизительно 450 кДа. Мономеры должны иметь молекулярную массу, равную 220-280 кДа, и не больше чем приблизительно 300 кДа.

[0084] Фиг. 3 изображает окрашенный красителем Кумасси гель rhPRG4 (система электрофореза полиакриламидного геля трис-Ac 3-8% NuPAGE SDS-PAGE, Invitrogen), как невосстановленный после очистки, так и восстановленный и алкилированный. Все пронумерованные полосы были подтверждены с помощью MS/MS как лубрицин, имеющий последовательность аминокислот, соответствующую человеческому PRG4 (номер доступа UniProt Q92954; SEQ ID NO:1). Как проиллюстрировано, рекомбинантный лубрицин, произведенный как описано выше (NR), содержит главные полосы, имеющие приблизительные молекулярные массы, оцененные путем сравнения со стандартами молекулярной массы, ~460 кДа, одну немного выше этого, и одну наверху геля, которая не смогла мигрировать в гель.
[0085] Идентификация посттрансляционных компонентов обработки была выполнена путем разложения rhPRG4 нейраминидазой (NaNase 1) и O-гликозидазой DS одновременно для того, чтобы выявить молекулярную массу аминокислотного ядра rhPRG4, как показано в проходе, помеченном как L-NO на Фиг. 4. Предсказанная молекулярная масса ядра составляет 151 кДа, что экспериментально подтверждается этими 4-12% SDS-PAGE. Разложение с помощью одной только нейраминидазы оказывало понижающий эффект на молекулярную массу, иллюстрируя, что гликозилирование не полностью завершается нейраминовой кислотой. Разложение с помощью O-гликозидазы DS, которая удаляет О-сцепленные остатки β(1-3) GalNAc-Gal и нейраминидазы, подразумевает, что эта партия белка является примерно на 30 мас.% гликозилированной. Разложение с помощью одной только O-гликаназы вероятно является эффективным только для удалении некоторых незакрытых остатков GalNAC-Gal.
Анализ гликозилирования
[0086] Для того, чтобы дополнительно охарактеризовать белок, был проведен и сравнен масс-спектрометрический анализ O-гликанов из рекомбинантного лубрицина и нормального синовиального лубрицина. Вкратце, синовиальный лубрицин был изолирован из синовиальной жидкости с использованием хроматографии диэтиламиноэтилом (DEAE). Рекомбинантный и синовиальный лубрицин были разделены с помощью SDS-PAGE с использованием 3-8% трис-ацетатных гелей перед переносом на мембрану из PVDF. O-гликаны были затем устранены из реплик лубрицина восстановительным β-отщеплением с последующей очисткой для анализа LC-MS/MS. O-гликаны были разделены с помощью хроматографии на пористом графитированном углероде перед анализом MS/MS в отрицательном режиме с использованием зависимого от данных способа на масс-спектрометре с линейной ионной ловушкой LTQ (Thermo Scientific).
[0087] Анализ образца рекомбинантного лубрицина идентифицировал только структуры O-гликана ядра 1 (см. Фиг. 6). Полученная ионная хроматограмма, показывающая идентифицированные гликаны, изображена на Фиг. 7. Сиалированная структура [M-H]-675 показана как два главных пика. Они соответствуют тому же самому изомеру со вторым пиком при времени удержания 21,4 мин, который является химической производной, созданной во время процесса β-отщепления. Были идентифицированы три изомера сульфатированной структуры ([M-H]-464). Также были идентифицированы несколько изомеров моносульфатированной моносиалированной структуры. Дисиалированная структура имелась в очень низком количестве и не могла наблюдаться на хроматографе. Оценка пропорции каждого из идентифицированных гликанов показана в Таблице 1 (обозначения структур сахаров см. на Фиг. 6). Этот анализ объединяет все изомеры, производные и аддукты для каждой из структур в Таблице 1.
[0088]
Таблица 1Процент от каждого из гликанов, идентифицированных на рекомбинантном лубрицине. Данные включают все изомеры, производные и аддукты для каждой из структур, перечисленных в таблице
<img file="00000001.jpg" he="42" wi="153" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[0089] Нормальный человеческий синовиальный лубрицин имеет более широкий диапазон гликанов, проходящих в структуры ядра 2 (см. Фиг. 8). Наиболее многочисленные из этих структур показаны на Фиг. 9.
[0090] Рисунок гликозилирования rh-лубрицина сильно отличается от природного человеческого гликопротеина, как можно легко понять, например, из сравнения Фиг. 7 с Фиг. 9. На природном синовиальном лубрицине сиалированная структура ядра 1 является самым распространенным гликаном, но существует значительное гликозилирование ядра 2 различных видов, и лишь незначительное количество сульфатированных полисахаридов. На рекомбинантном гликопротеине сиалированное и немодифицированное ядро 1 составляет более половины гликанов, а структура сульфатированного ядра 1 составляет приблизительно одну треть идентифицированных O-гликанов, со всеми тремя возможными идентифицированными изомерами.
Физико-химические свойства rh-лубрицина
Подобные поверхностно-активному веществу (амфифильные) свойства
[0091] Важным атрибутом rhPRG4 является его способность покрывать как биологические, так и небиологические поверхности посредством физико-химической адсорбции. Природный PRG4 является поверхностно-активным, и включает в себя конечные глобулярные домены, разделенные большим муциноподобным доменом. Они могут разделяться на полярные и неполярные домены внутри его структуры. Центральный домен муцина, как показано приборными исследованиями поверхностной силы лубрицина человеческой синовиальной жидкости, может сложиться сам на себя, что позволяет сделать предположение о том, что гликозилирования направляются прочь, когда эта ориентация достигается. В целом, домен муцина становится более гидрофильным, чем его N- или C-окончания. Важность этого подтверждается тем фактом, что разрушение гликозилирований будет устранять смазывающую способность (см. публикацию Jay et al., J Glycobiol 2001). Эта амфифильная природа также присутствует в rhPRG4. Это может быть легко измерено путем оценки уменьшения поверхностного натяжения на границе между алифатической и водной фазами.
i
i
[0092] В эксперименте, разработанном для проверки поверхностно-активных свойств rh-лубрицина, изготовленного с использованием процесса по настоящему изобретению, увеличивающаяся концентрация rhPRG4 была представлена в растворе PBS, который был покрыт неразведенным гидрофобным циклогексаном. Кольцо Дю Нуи, размещенное в водной подфазе, содержащей rhPRG4, вытягивалось вверх, и регистрировалось критическое напряжение (Ѓ), при котором кольцо прорывается через границу. Измерения были сделаны пять раз для каждой концентрации в приборе для определения поверхностного натяжения Attension Sigma 702ET. По результатам этих измерений была построена зависимость критического напряжения Ѓ от концентрации rhPRG4, см. Фиг. 10A. Как проиллюстрировано, при увеличении концентрации rhPRG4 в водной подфазе, содержащей PBS, поверхностное натяжение уменьшается.
[0093] Поскольку раствор rh-лубрицина содержал остаточное неионогенное поверхностно-активное вещество (твин-20), эксперимент был повторен для того, чтобы установить, было ли это причиной резкого снижения поверхностного натяжения, вызванного добавлением рекомбинантного продукта, сначала используя различные концентрации одного только поверхностно-активного вещества, а затем с очень низкими концентрациями rhPRG4 по настоящему изобретению. Микролитровые количества поверхностно-активного вещества и PRG4 добавлялись к 15 мл водной подфазы. Результаты показаны на Фиг. 10B и Фиг. 10C. Как проиллюстрировано, один только PRG4 (см. Фиг. 10C) уменьшает поверхностное натяжение лучше, чем одно только коммерческое поверхностно-активное вещество в концентрации 0,1% (см. Фиг. 10B). Таким образом, rhPRG4, содержащий твин в концентрации 0,1% и не содержащий твин, уменьшал поверхностное натяжение PBS и циклогексана больше, чем один только твин в концентрации 0,1% при прочих равных условиях.
[0094] Эти данные показывают, что даже при низких концентрациях rhPRG4 предпочтительно заполняет границу между водной и алифатической фазами, уменьшая поверхностное натяжение. Этот феномен резюмирует взаимодействие связывания с поверхностью, которое требуется для уменьшения трения и подражает поведению природного лубрицина. Кроме того, активность уменьшения поверхностного натяжения может использоваться в качестве процедуры контроля качества при производстве rhPRG4.
Смазывающие свойства
Смазка хряща
[0095] Свежие костно-хрящевые образцы (n=16) были подготовлены для тестирования трения из коленно-бедренной чашечки скелетно зрелых быков, как было описано ранее. Вкратце, ядра (радиус=6 мм) и кольцевидные структуры (внешний радиус=3,2 мм и внутренний радиус=1,5 мм) были взяты из костно-хрящевых блоков, оба с центральными отверстиями (радиус=0,5 мм) для того, чтобы обеспечить сброс давления жидкости. Образцы были энергично промывались в течение ночи в PBS при температуре 4°C для того, чтобы освободить суставную поверхность от остаточной синовиальной жидкости, и это подтверждалось путем проверки на наличие смазки. Образцы были затем заморожены в PBS с ингибиторами протеиназы при температуре -80°C, оттаяны и повторно встряхивались в PBS в течение ночи для того, чтобы дополнительно очистить поверхность от остатков PRG4 на поверхности. Образцы были затем полностью погружены приблизительно в 0,3 мл соответствующих тестовых смазочных материалов (описанных ниже) при температуре 4°C на ночь перед тестированием смазки на следующий день, и снова промывались PBS после каждого теста перед инкубацией в следующем тестовом смазочном материале.
[0096] Для того, чтобы проанализировать способность граничной смазки каждой из форм PRG4 и контрольных образцов с использованием принятого теста трения хряща на хряще, использовался инструмент ELF 3200 производства компании Bose Electroforce (г. Эден-Прери, штат Миннесота). Вкратце, все образцы сжимались с постоянной скоростью 0,002 мм/с до 18% от полной толщины хряща, после чего им было позволено релаксировать в течение 40 мин для сброса давления тканевой жидкости. Затем образцы вращались с эффективной скоростью, которая, как известно, поддерживает режим граничной смазки в не находящейся под давлением границе хрящ-хрящ (0,3 мм/с) при±2 оборотах. После того, как они были оставлены перед скольжением на предварительный неподвижный период длительностью 1200, 120, 12 и 1,2 с, образцы вращались после каждого последующего неподвижного периода на +/-2 оборота. Тестовая последовательность затем повторялась в противоположном направлении вращения на -/+2 оборота.
[0097] Две тестовых последовательности позволяли оценить способность граничной смазки rhPRG4, как одного, так и в комбинации с гиалуроновой кислотой. В обеих тестовых последовательностях PBS служил в качестве отрицательного контрольного смазочного материала, а бычья синовиальная жидкость служила в качестве положительного контрольного смазочного материала. Как rhPRG4, так и очищенный природный бычий PRG4 были приготовлены в PBS с концентрацией 450 мкг/мл, и гиалуроновая кислота (1,5MDA Lifecore Biomedical, г. Часка, штат Миннесота) также была приготовлена в PBS с физиологической концентрацией 3,33 мг/мл. Смазочные материалы были проверены в предполагаемом порядке увеличения смазывающей способности (в порядке уменьшения коэффициента трения). В тестовой последовательности 1, rhPRG4 против nbPRG4, эта последовательность была следующей: PBS, rhPRG4, nbPRG4, синовиальная жидкость (n=7); в тестовой последовательности 2, rhPRG4 против rhPRG4+HA, эта последовательность была следующей: PBS, rhPRG4, rhPRG4+HA, синовиальная жидкость (n=4).
static
eq
kinetic
eq
static
eq
kinetic
eq
kinetic
eq
[0098] Эти два коэффициента трения; статический (μ, N) (сопротивление первоначальному движению из статического состояния) и кинетический (<μ, N>) (сопротивление установившемуся скольжению) были вычислены для каждого смазочного материала, как было описано ранее. Результаты показаны на Фиг. 11 и Фиг. 12. Данные представляются как среднее значение±стандартная ошибка среднего значения. Для оценки влияния смазочного материала и неподвижного периода перед скольжением в качестве повторяемых факторов на μ,N и <μ,N>, с апостериорным тестированием Таки на <μ,N> при продолжительности стационарного периода перед скольжением, равной 1,2 с, использовался дисперсионный анализ ANOVA. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения Systat12 (Systat Software, Inc., г. Ричмонд, штат Калифорния).
[0099] Как показано на Фиг. 11, не было никакой статистически значимой связи между измеренным смазочным свойством, кинетическими коэффициентами трения рекомбинантного PRG4 и немного более низкими значениями природного бычьего PRG4. Как показано на Фиг. 12, rhPRG4 в комбинации с гиалуроновой кислотой улучшает как статическую (см. Фиг. 12A), так и кинетическую (см. Фиг. 12B) смазывающую способность по сравнению с одним только rhPRG4. Все измерения были самыми высокими в PBS и самыми низкими в бычьей синовиальной жидкости, при этом измерения для rh-PRG4 и rhPRG4+HA были промежуточными. Смешанный раствор rhPRG4+HA имел тенденцию к значительно более низкому коэффициенту трения, чем один rhPRG4 (p=0,075), и был статистически подобен бычьей синовиальной жидкости (0,021±0,001, p=0,20).
[00100] Также были приложены усилия для того, чтобы гарантировать удаление природного лубрицина из бычьего хряща, предназначенного для использования в качестве пары трения, с использованием двухчасового ферментативного сбраживания с помощью гиалуронидазы. Сбраживание с помощью гиалуронидазы предназначено для удаления природного PRG4 (P<0,050) из поверхностной зоны эксплантатов хряща. Эта обработка удаляет поверхностный PRG4 без значительного влияния на механические свойства суставного хряща. Нанесение rhPRG4 на эти поверхности и сравнение фрикционного отклика на BSF и контрольный PBS показывает, что низкий COF может быть восстановлен с помощью rhPRG4 по настоящему изобретению. Фиг. 13 показывает значения COF для обработанных гиалуронидазой бычьих эксплантатов хряща внутреннего мыщелка с использованием rhPRG4, BSF и PBS в качестве смазочных материалов. Костно-хрящевые эксплантаты были протестированы с вышеупомянутыми смазочными материалами в соответствии с протоколом, обсужденным выше. Как показано, рекомбинантный человекоподобный PRG4 восстанавливал низкое значение COF (rhPRG4 N=18; BSF N=6; PBS N=8).
Смазка глазной поверхности
[00101] Нормальные человеческие роговицы с 3 мм склеры были получены из хранилища Southern Alberta Lions Eye Bank. Человеческие веки были взяты от свежих трупов по программе завещания тела из Университета Калгари. Разрешение на использование и приобретение этих тканей было получено от Совета по этике исследований в области здравоохранения. Роговицы (n=6) хранились в среде для хранения роговицы на основе сульфата хондроитина (Optisol-GS) при температуре 4°C и использовались в течение 2 недель. Веки (n=6) были заморожены и размораживались во время использования.
[00102] Чистота разновидностей rhPRG4, равная 50%, оценивалась с помощью электрофореза полиакриламидного геля 3-8% трис-ацетата NUPAGE додецилсульфата натрия. Концентрация обогащенного rhPRG4 препарата анализировалась и регулировалась с учетом уровня его чистоты.
[00103] Образцы ткани были установлены на прибор Bose ELF3200 с осевыми и вращательными исполнительными механизмами и датчиками вращающего момента и осевой нагрузки. Резецированная роговица была зафиксирована на конце полусферической пробки из силиконового каучука (радиус=6 мм) путем нанесения цианакрилатного клейкого вещества (суперклея) на склеру. На устройство пробка-роговица был надет рукав из силиконового каучука, который служил для удержания жидкого смазочного материала. Это устройство было затем присоединено к вращательному исполнительному механизму прибора Bose ELF3200, формируя таким образом нижнюю поверхность сочленения. Кольцевидная структура (внешний радиус =3,2 мм, внутренний радиус =1,5 мм) была вырублена из модельного материала PDMS (~0,4 мм толщиной UntrSylgard 184, Dow Corning) или из ткани человеческого века и приклеивалась к держателю кольцевидной структуры. Этот держатель кольцевидной структуры был затем присоединен к линейному исполнительному механизму, формируя таким образом верхнюю поверхность сочленения.
2
eff=
eff=
eff
eff
o
i
o
i
[00104] После установки образцов 0,3 мл тестового смазочного материала было размещено на роговице для того, чтобы сформировать ванну смазочного материала, и контактирующим поверхностям было позволено уравновеситься с тестовым смазочным материалом в течение минимум пяти минут. Образцы ткани вводились в контакт в трех определяемых вручную осевых положениях так, чтобы соответствовать осевым нагрузкам 0,3±0,02, 0,5±0,03, и 0,7±0,03 Н, приводящим к осевым давлениям в пределах от 12,2 до 28,5 кПа на поверхности контакта (24,6 мм). После достижения контакта в данном осевом положении образцы делали четыре оборота в обоих направлениях с четырьмя различными эффективными скоростями скольжения (ν30, 10, 1,0, 0,3 мм/с), где νω⋅r и r=2/3[(r3-r3)/ (r2-r2)]. Осевая нагрузка и вращающий момент измерялись с частотой 20 Гц во время вращения. Между каждым оборотом соблюдалось 12-секундное время выдержки. Каждая тестовая последовательность, описанная ниже, включала в себя стадию предварительной подготовки, на которой ткани подвергались описанному тестовому протоколу в ванне из физиологического раствора.
[00105] Для того, чтобы определить граничную смазывающую способность препарата rhPRG4 на границе человеческая роговица-веко (Тест 1) и человеческая роговица - полидиметилсилоксан (PDMS, Тест 2), использовалась следующая тестовая последовательность: 300 мкг/мл PRG4 в физиологическом растворе, 300 мкг/мл rhPRG4 в физиологическом растворе, затем физиологический раствор (Sensitive Eyes Saline Plus, Bausch & Lomb).
[00106] Для того, чтобы оценить эффективность тестовых смазочных материалов на двух границах, были вычислены статические и кинетические коэффициенты трения. Как проиллюстрировано на Фиг. 14, как PRG4, так и rhPRG4 значительно и схожим образом уменьшали трение на границе человеческая роговица-PDMS (см. Фиг. 14C и Фиг. 14D), а также на границах между веком и роговицей (см. Фиг. 14A и Фиг. 14B).
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> LUBRIS LLC
<120> ПРОИЗВОДСТВО РЕКОМБИНАНТНОГО ЛУБРИЦИНА
<130> LUB-025PC
<140> PCT/US2014/061827
<141> 2014-10-22
<150> 61/894,366
<151> 2013-10-22
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1404
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val
1               5                   10                  15
Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly
20                  25                  30
Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr
35                  40                  45
Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys
50                  55                  60
Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg
65                  70                  75                  80
Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys
85                  90                  95
Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser
100                 105                 110
Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr
115                 120                 125
Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys
130                 135                 140
Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val
145                 150                 155                 160
Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
165                 170                 175
Ser Thr Ile Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg
180                 185                 190
Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr
195                 200                 205
Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser
210                 215                 220
Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr
225                 230                 235                 240
Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys
245                 250                 255
Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys
260                 265                 270
Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu
275                 280                 285
Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr
290                 295                 300
Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp
305                 310                 315                 320
Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu
325                 330                 335
Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
340                 345                 350
Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
355                 360                 365
Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
370                 375                 380
Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
385                 390                 395                 400
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
405                 410                 415
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro
420                 425                 430
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
435                 440                 445
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro
450                 455                 460
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
465                 470                 475                 480
Glu Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
485                 490                 495
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
500                 505                 510
Glu Pro Ser Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
515                 520                 525
Ser Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser
530                 535                 540
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro
545                 550                 555                 560
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro
565                 570                 575
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
580                 585                 590
Ala Pro Thr Thr Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
595                 600                 605
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Leu
610                 615                 620
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Lys Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Lys Pro
625                 630                 635                 640
Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro
645                 650                 655
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ala
660                 665                 670
Ala Pro Asn Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
675                 680                 685
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr
690                 695                 700
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Leu Lys Glu Pro
705                 710                 715                 720
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys Glu Leu Ala Pro Thr
725                 730                 735
Thr Thr Lys Glu Pro Thr Ser Thr Thr Cys Asp Lys Pro Ala Pro Thr
740                 745                 750
Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
755                 760                 765
Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr
770                 775                 780
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys
785                 790                 795                 800
Glu Leu Ala Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp
805                 810                 815
Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys
820                 825                 830
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu
835                 840                 845
Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys
850                 855                 860
Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu
865                 870                 875                 880
Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro
885                 890                 895
Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr
900                 905                 910
Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro
915                 920                 925
Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr
930                 935                 940
Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val
945                 950                 955                 960
Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu
965                 970                 975
Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile
980                 985                 990
Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys  Pro Glu Glu Thr Ala  Lys Pro Lys
995                 1000                 1005
Asp Arg  Ala Thr Asn Ser Lys  Ala Thr Thr Pro Lys  Pro Gln Lys
1010                 1015                 1020
Pro Thr  Lys Ala Pro Lys Lys  Pro Thr Ser Thr Lys  Lys Pro Lys
1025                 1030                 1035
Thr Met  Pro Arg Val Arg Lys  Pro Lys Thr Thr Pro  Thr Pro Arg
1040                 1045                 1050
Lys Met  Thr Ser Thr Met Pro  Glu Leu Asn Pro Thr  Ser Arg Ile
1055                 1060                 1065
Ala Glu  Ala Met Leu Gln Thr  Thr Thr Arg Pro Asn  Gln Thr Pro
1070                 1075                 1080
Asn Ser  Lys Leu Val Glu Val  Asn Pro Lys Ser Glu  Asp Ala Gly
1085                 1090                 1095
Gly Ala  Glu Gly Glu Thr Pro  His Met Leu Leu Arg  Pro His Val
1100                 1105                 1110
Phe Met  Pro Glu Val Thr Pro  Asp Met Asp Tyr Leu  Pro Arg Val
1115                 1120                 1125
Pro Asn  Gln Gly Ile Ile Ile  Asn Pro Met Leu Ser  Asp Glu Thr
1130                 1135                 1140
Asn Ile  Cys Asn Gly Lys Pro  Val Asp Gly Leu Thr  Thr Leu Arg
1145                 1150                 1155
Asn Gly  Thr Leu Val Ala Phe  Arg Gly His Tyr Phe  Trp Met Leu
1160                 1165                 1170
Ser Pro  Phe Ser Pro Pro Ser  Pro Ala Arg Arg Ile  Thr Glu Val
1175                 1180                 1185
Trp Gly  Ile Pro Ser Pro Ile  Asp Thr Val Phe Thr  Arg Cys Asn
1190                 1195                 1200
Cys Glu  Gly Lys Thr Phe Phe  Phe Lys Asp Ser Gln  Tyr Trp Arg
1205                 1210                 1215
Phe Thr  Asn Asp Ile Lys Asp  Ala Gly Tyr Pro Lys  Pro Ile Phe
1220                 1225                 1230
Lys Gly  Phe Gly Gly Leu Thr  Gly Gln Ile Val Ala  Ala Leu Ser
1235                 1240                 1245
Thr Ala  Lys Tyr Lys Asn Trp  Pro Glu Ser Val Tyr  Phe Phe Lys
1250                 1255                 1260
Arg Gly  Gly Ser Ile Gln Gln  Tyr Ile Tyr Lys Gln  Glu Pro Val
1265                 1270                 1275
Gln Lys  Cys Pro Gly Arg Arg  Pro Ala Leu Asn Tyr  Pro Val Tyr
1280                 1285                 1290
Gly Glu  Thr Thr Gln Val Arg  Arg Arg Arg Phe Glu  Arg Ala Ile
1295                 1300                 1305
Gly Pro  Ser Gln Thr His Thr  Ile Arg Ile Gln Tyr  Ser Pro Ala
1310                 1315                 1320
Arg Leu  Ala Tyr Gln Asp Lys  Gly Val Leu His Asn  Glu Val Lys
1325                 1330                 1335
Val Ser  Ile Leu Trp Arg Gly  Leu Pro Asn Val Val  Thr Ser Ala
1340                 1345                 1350
Ile Ser  Leu Pro Asn Ile Arg  Lys Pro Asp Gly Tyr  Asp Tyr Tyr
1355                 1360                 1365
Ala Phe  Ser Lys Asp Gln Tyr  Tyr Asn Ile Asp Val  Pro Ser Arg
1370                 1375                 1380
Thr Ala  Arg Ala Ile Thr Thr  Arg Ser Gly Gln Thr  Leu Ser Lys
1385                 1390                 1395
Val Trp  Tyr Asn Cys Pro
1400
<210> 2
<211> 5041
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 2
gcggccgcga ctattcggta cctgaaaaca acgatggcat ggaaaacact tcccatttac       60
ctgttgttgc tgctgtctgt tttcgtgatt cagcaagttt catctcaaga tttatcaagc      120
tgtgcaggga gatgtgggga agggtattct agagatgcca cctgcaactg tgattataac      180
tgtcaacact acatggagtg ctgccctgat ttcaagagag tctgcactgc ggagctttcc      240
tgtaaaggcc gctgctttga gtccttcgag agagggaggg agtgtgactg cgacgcccaa      300
tgtaagaagt atgacaagtg ctgtcccgat tatgagagtt tctgtgcaga agtgcataat      360
cccacatcac caccatcttc aaagaaagca cctccacctt caggagcatc tcaaaccatc      420
aaatcaacaa ccaaacgttc acccaaacca ccaaacaaga agaagactaa gaaagttata      480
gaatcagagg aaataacaga agaacattct gtttctgaaa atcaagagtc ctcctcctcc      540
tcctcctctt cctcttcttc ttcaacaatt tggaaaatca agtcttccaa aaattcagct      600
gctaatagag aattacagaa gaaactcaaa gtaaaagata acaagaagaa cagaactaaa      660
aagaaaccta cccccaaacc accagttgta gatgaagctg gaagtggatt ggacaatggt      720
gacttcaagg tcacaactcc tgacacgtct accacccaac acaataaagt cagcacatct      780
cccaagatca caacagcaaa accaataaat cccagaccca gtcttccacc taattctgat      840
acatctaaag agacgtcttt gacagtgaat aaagagacaa cagttgaaac taaagaaact      900
actacaacaa ataaacagac ttcaactgat ggaaaagaga agactacttc cgctaaagag      960
acacaaagta tagagaaaac atctgctaaa gatttagcac ccacatctaa agtgctggct     1020
aaacctacac ccaaagctga aactacaacc aaaggccctg ctctcaccac tcccaaggag     1080
cccacgccca ccactcccaa ggagcctgca tctaccacac ccaaagagcc cacacctacc     1140
accatcaagt ctgcacccac cacccccaag gagcctgcac ccaccaccac caagtctgca     1200
cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc accaccaagg agcctgcacc caccactccc     1260
aaggagcctg cacccaccac caccaaggag cctgcaccca ccaccaccaa gtctgcaccc     1320
accactccca aggagcctgc acccaccacc cccaagaagc ctgccccaac tacccccaag     1380
gagcctgcac ccaccactcc caaggagcct acacccacca ctcccaagga gcctgcaccc     1440
accaccaagg agcctgcacc caccactccc aaagagcctg cacccactgc ccccaagaag     1500
cctgccccaa ctacccccaa ggagcctgca cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc     1560
accaccaagg agccttcacc caccactccc aaggagcctg cacccaccac caccaagtct     1620
gcacccacca ctaccaagga gcctgcaccc accactacca agtctgcacc caccactccc     1680
aaggagcctt cacccaccac caccaaggag cctgcaccca ccactcccaa ggagcctgca     1740
cccaccaccc ccaagaagcc tgccccaact acccccaagg agcctgcacc caccactccc     1800
aaggaacctg cacccaccac caccaagaag cctgcaccca ccgctcccaa agagcctgcc     1860
ccaactaccc ccaaggagac tgcacccacc acccccaaga agctcacgcc caccaccccc     1920
gagaagctcg cacccaccac ccctgagaag cccgcaccca ccacccctga ggagctcgca     1980
cccaccaccc ctgaggagcc cacacccacc acccctgagg agcctgctcc caccactccc     2040
aaggcagcgg ctcccaacac ccctaaggag cctgctccaa ctacccctaa ggagcctgct     2100
ccaactaccc ctaaggagcc tgctccaact acccctaagg agactgctcc aactacccct     2160
aaagggactg ctccaactac cctcaaggaa cctgcaccca ctactcccaa gaagcctgcc     2220
cccaaggagc ttgcacccac caccaccaag gagcccacat ccaccacctc tgacaagccc     2280
gctccaacta cccctaaggg gactgctcca actaccccta aggagcctgc tccaactacc     2340
cctaaggagc ctgctccaac tacccctaag gggactgctc caactaccct caaggaacct     2400
gcacccacta ctcccaagaa gcctgccccc aaggagcttg cacccaccac caccaagggg     2460
cccacatcca ccacctctga caagcctgct ccaactacac ctaaggagac tgctccaact     2520
acccccaagg agcctgcacc cactaccccc aagaagcctg ctccaactac tcctgagaca     2580
cctcctccaa ccacttcaga ggtctctact ccaactacca ccaaggagcc taccactatc     2640
cacaaaagcc ctgatgaatc aactcctgag ctttctgcag aacccacacc aaaagctctt     2700
gaaaacagtc ccaaggaacc tggtgtacct acaactaaga ctcctgcagc gactaaacct     2760
gaaatgacta caacagctaa agacaagaca acagaaagag acttacgtac tacacctgaa     2820
actacaactg ctgcacctaa gatgacaaaa gagacagcaa ctacaacaga aaaaactacc     2880
gaatccaaaa taacagctac aaccacacaa gtaacatcta ccacaactca agataccaca     2940
ccattcaaaa ttactactct taaaacaact actcttgcac ccaaagtaac tacaacaaaa     3000
aagacaatta ctaccactga gattatgaac aaacctgaag aaacagctaa accaaaagac     3060
agagctacta attctaaagc gacaactcct aaacctcaaa agccaaccaa agcacccaaa     3120
aaacccactt ctaccaaaaa gccaaaaaca atgcctagag tgagaaaacc aaagacgaca     3180
ccaactcccc gcaagatgac atcaacaatg ccagaattga accctacctc aagaatagca     3240
gaagccatgc tccaaaccac caccagacct aaccaaactc caaactccaa actagttgaa     3300
gtaaatccaa agagtgaaga tgcaggtggt gctgaaggag aaacacctca tatgcttctc     3360
aggccccatg tgttcatgcc tgaagttact cccgacatgg attacttacc gagagtaccc     3420
aatcaaggca ttatcatcaa tcccatgctt tccgatgaga ccaatatatg caatggtaag     3480
ccagtagatg gactgactac tttgcgcaat gggacattag ttgcattccg aggtcattat     3540
ttctggatgc taagtccatt cagtccacca tctccagctc gcagaattac tgaagtttgg     3600
ggtattcctt cccccattga tactgttttt actaggtgca actgtgaagg aaaaactttc     3660
ttctttaagg attctcagta ctggcgtttt accaatgata taaaagatgc agggtacccc     3720
aaaccaattt tcaaaggatt tggaggacta actggacaaa tagtggcagc gctttcaaca     3780
gctaaatata agaactggcc tgaatctgtg tattttttca agagaggtgg cagcattcag     3840
cagtatattt ataaacagga acctgtacag aagtgccctg gaagaaggcc tgctctaaat     3900
tatccagtgt atggagaaat gacacaggtt aggagacgtc gctttgaacg tgctatagga     3960
ccttctcaaa cacacaccat cagaattcaa tattcacctg ccagactggc ttatcaagac     4020
aaaggtgtcc ttcataatga agttaaagtg agtatactgt ggagaggact tccaaatgtg     4080
gttacctcag ctatatcact gcccaacatc agaaaacctg acggctatga ttactatgcc     4140
ttttctaaag atcaatacta taacattgat gtgcctagta gaacagcaag agcaattact     4200
actcgttctg ggcagacctt atccaaagtc tggtacaact gtccttagac tgatgagcaa     4260
aggaggagtc aactaatgaa gaaatgaata ataaattttg acactgaaaa acattttatt     4320
aataaagaat attgacatga gtataccagt ttatatataa aaatgttttt aaacttgaca     4380
atcattacac taaaacagat ttgataatct tattcacagt tgttattgtt tacagaccat     4440
ttaattaata tttcctctgt ttattcctcc tctccctccc attgcatggc tcacacctgt     4500
aaaagaaaaa agaatcaaat tgaatatatc ttttaagaat tcaaaactag tgtattcact     4560
taccctagtt cattataaaa aatatctagg cattgtggat ataaaactgt tgggtattct     4620
acaacttcaa tggaaattat tacaagcaga ttaatccctc tttttgtgac acaagtacaa     4680
tctaaaagtt atattggaaa acatggaaat attaaaattt tacactttta ctagctaaaa     4740
cataatcaca aagctttatc gtgttgtata aaaaaattaa caatataatg gcaataggta     4800
gagatacaac aaatgaatat aacactataa cacttcatat tttccaaatc ttaatttgga     4860
tttaaggaag aaatcaataa atataaaata taagcacata tttattatat atctaaggta     4920
tacaaatctg tctacatgaa gtttacagat tggtaaatat cacctgctca acatgtaatt     4980
atttaataaa actttggaac attaaaaaaa taaattggag gcttaaaaaa aaaaaaaaaa     5040
a                                                                     5041
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
1               5
<---