УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ МОЛЕКУЛ ЧЕРЕЗ БАРЬЕР
DEVICE AND METHOD OF MEASURING CONCENTRATION OF MOLECULES THROUGH BARRIER

Данная заявка претендует на приоритет по предварительной патентной заявке номер 60/598896, поданной 5 августа 2004 г.
Предпосылки создания изобретения
1. Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к устройству и способу обнаружения определенных молекул, в частности к устройству и способу обнаружения и/или определения концентраций молекул через барьер. Изобретение позволяет сделать вывод о наличии или концентрации молекул-мишеней с одной стороны барьера на основе анализа молекул-зондов, которые обладают сродством, то есть притягиваются или отталкиваются молекулами-мишенями, и которые находятся с другой стороны барьера.
Хотя описание данного изобретения относится к "молекулам", изобретение не ограничено определением молекул как таковых, но широко применимо для обнаружения и/или определения концентрации составных частей молекул, в том числе отдельных атомов, а также для обнаружения химических объектов как органических, так и неорганических, образованных молекулами или группами молекул. Более того, измерительные агенты, используемые для обнаружения объектов-мишеней могут включать в себя составные части молекул, в том числе отдельные атомы, а также химические объекты как органические, так и неорганические, образованные молекулами или группами молекул. Следовательно, тогда как обнаружение молекул представляет собой частный случай осуществления изобретения, данное изобретение в своей наиболее широкой форме относится к обнаружению и/или управлению объектами-мишенями, включая химические соединения, атомы и молекулы в целом, через барьер с помощью комплементарных измерительных агентов, также включающих химические соединения, атомы и молекулы в целом.
В одном примере изобретение позволяет бесконтактно измерять уровень глюкозы в крови с помощью внешнего датчика на основе изменений ориентации молекул глюкозоксидазы, суспендированной в геле или другой гелеподобной вязкой матрице, при помещении датчика на кожу пациента. Ориентацию можно определить, наблюдая за изменениями электрических характеристик геля, таких как сопротивление, или отслеживая любое другое ориентационно-зависимое свойство геля или его составляющих, включая магнитные или оптические свойства. Присутствие молекул-мишеней также может быть зафиксировано путем определения свойств геля, которые зависят от чувствительных к сродству характеристик молекул, отличных от ориентации, таких как изменения в перемещении молекул-зондов в геле под действием приложенного поля.
В качестве другого примера, изобретение может быть использовано для обнаружения антител, специфичных к с-реактивному белку (СРБ), на основе ориентации СРБ-специфичных моноклональных антител, суспендированных в геле.
2. Описание предшествующего уровня техники
В настоящее время определение многих физиологических параметров проводится только путем забора крови или других жидкостей пациента для анализа в лабораторных условиях. Забор крови требует квалифицированного специалиста и представляет собой болезненную, неудобную и дорогостоящую процедуру, которая также может привести к заражению. В результате многие патологии остаются необнаруженными вплоть до относительно поздних стадий, в то время как обнаружить другие чрезвычайно сложно.
Примером болезни, требующей частого забора крови на анализ, является диабет. Было сделано множество попыток разработки не причиняющего боли бесконтактного внешнего прибора для отслеживания уровня глюкозы. Различные подходы включали электрохимические и спектроскопические техники, такие как спектроскопия в ближней инфракрасной области и спектроскопия комбинационного рассеяния. Однако, несмотря на приложенные усилия, ни один из этих методов не привел к разработке бесконтактного прибора или способа, позволяющего измерять уровень глюкозы in vivo, который был бы достаточно точным, достоверным, удобным и рентабельным для постоянного использования.
Данное изобретение основано на другом подходе для in vivo анализа крови или компонентов тканей, таких как глюкоза. Вместо попытки непосредственного измерения концентраций компонентов, в изобретении используются молекулярные или атомные силы, приводящие к возникновению химических взаимодействий и протеканию химических реакций, именуемые здесь "сродством", для обнаружения и определения концентрации атомов и молекул с одной стороны барьера на основе поведения комплементарных атомов или молекул с другой стороны барьера. Недавно проводившиеся исследования подобных сил сродства методом атомно-силовой микроскопии показали, что эти силы способны разрывать прочные химические связи. См., например, Grandbois et al., "Affinity Imaging of Red Blood Cells Using an Atomic Force Microscope", Journal of Histochemistry and Cytochemistry, vol.48, pp.719-724 (May, 2000); Grubmuller et al., "Ligand Binding: Molecular Mechanics Calculation of the Streptavidin-Biotin Rupture Force", National Library of Medicine, Science, 16:271 (5251:954-5 (Fb. 1996); Moy et al., "Intermolecular Forces and Energies Between Ligands and Receptors", National Library of Medicine, Science, 266(5183):257-9 (October, 1994); and Moy et al. "Adhesion Forces Between Individual Ligand-Receptor Pairs", National Library of Medicine, Science. 264(5157):415-7 (April, 1994).
Химические соединения или химические структурные составляющие, в том числе атомы и молекулы, которые определенным образом притягиваются друг к другу, находясь в непосредственной близости друг от друга, будут ориентироваться так, чтобы максимально увеличить притяжение (или минимизировать отталкивание), и будут стремиться устранить подобные силы, сближаясь или отталкиваясь, для достижения состояния с наименьшей энергией между взаимно притягивающимися и отталкивающимися молекулярными парами. В природе существуют многочисленные примеры таких взаимных сил притяжения и отталкивания, включая образование или диссоциацию соединений и расширения или сжатия. Силы, приводящие к "сродству" между молекулами, могут быть электростатическими, магнитными, ядерными или их совокупностью, но для всех них справедлив принцип, согласно которому система стремится перейти в состояние с наименьшей возможной энергией.
Молекулярные силы притяжения являются в большинстве случаев результатом взаимодействия молекул посредством комплементарных электрических зарядов, возникающих на участках, которые отвечают за химическое связывание, или эпитопах. Подобное притяжение приводит к тому, что молекулы ориентируются определенным образом, когда среда, в которой находятся молекулы, позволяет такую ориентацию, чтобы максимально увеличить силы притяжения в комплементарных молекулярных парах, стремящихся к образованию химической связи.
Таким образом, например, пары фермент-субстрат и антиген-антитело "находят" друг друга, и подобный поиск взаимодействующих молекул со временем оканчивается связыванием молекулярных пар. Предпосылкой для такого связывания является соответствующая пространственная ориентация молекул в растворе. Предполагается, что пары взаимодействующих молекул, впоследствии связывающихся друг с другом, должны пройти несколько последовательных стадий, предшествующих связыванию. Предложены следующие стадии:
1. Молекулы растворяют в жидкой среде, такой как вода.
2. Их сближают с комплементарными молекулами путем перемешивания или другими способами.
3. Молекулы ориентируются в пространстве таким образом, что их активные участки располагаются напротив друг друга.
4. Затем молекулы связываются друг с другом, и впоследствии за счет такого присоединения и взаимодействия достигают состояния с наименьшей энергией.
На фиг.1 схематично изображен способ, которым первая молекула МЗ связывается со второй молекулой ММ. Данное изобретение основано на принципе, который заключается в том, что если можно измерить силы притяжения или определить ориентацию взаимно притягивающихся молекулярных пар, высокоспецифичных в отношении друг друга, то можно зафиксировать присутствие "комплементарных им молекул" даже до того, как те молекулы соединятся или прореагируют друг с другом. Изобретение также основано на принципе, согласно которому чем выше концентрация комплементарных молекул в непосредственной близости друг от друга, тем больше сумма сил притяжения между ними, при этом молекулярная ориентация будет происходить быстрее и при больших расстояниях между комплементарными молекулами. До настоящего времени данные принципы не использовались для обнаружения и/или определения концентрации химических соединений, молекул или атомов через барьер.
Сущность изобретения
Соответственно, задачей данного изобретения являлась разработка устройства и способа обнаружения и измерения концентрации молекул на расстоянии и/или через барьер, которые были бы просты в применении и не требовали бы использования радиационной или сложной вычислительной техники.
Эти задачи были выполнены, в соответствии с принципами предпочтительного варианта осуществления изобретения, с использованием принципа химического/электростатического притяжения (здесь и далее "сродства"), то есть сродства между заряженными молекулами, которое вызывает их химические взаимодействия и реакции, для обнаружения и определения концентрации молекул с одной стороны барьера на основе поведения соответствующих атомов или молекул с другой стороны барьера.
Таким образом, в данном изобретении разработаны способ и устройство, которые функционируют за счет измерения сил, оказывающих влияние на молекулярную ориентацию одной определенной комплементарной молекулы из пары молекул, имеющих сродство (молекулы-зонда) или, по меньшей мере, приводящих к такой ориентации, с целью идентификации и определения концентрации "другой" молекулы из этой пары ("молекулы-мишени"), когда другая молекула находится от нее на расстоянии, достаточном для того, чтобы силы притяжения вызывали событие на молекулярном уровне, такое как вращение.
Необходимо иметь в виду, что, хотя данное изобретение описано как применимое для обнаружения молекул, способ и устройство, предлагаемые изобретением, могут также использоваться для обнаружения других химических объектов как неорганических, так и органических, образованных молекулами или группами молекул, и составных частей молекул, таких как отдельные атомы или группы атомов. Более того, хотя изобретение описано как предназначенное для обнаружения молекул через барьер, способ и устройство, предлагаемые данным изобретением, могут также использоваться для обнаружения молекул на расстоянии, даже в отсутствие физического барьера.
Как отмечалось выше, одним из измеряемых проявлений сил взаимодействия между молекулами является пространственная ориентация определенных молекул, которую можно определить множеством способов в зависимости от свойств молекул-зондов и материала или раствора, где находятся молекулы. Заявленное изобретение не предполагается ограничивать конкретным механизмом определения ориентации, оно предназначено для использования со всеми подобными устройствами при условии, что определение ориентации используется для обнаружения и измерения концентрации комплементарных взаимно притягивающихся пар молекул, когда молекулы сближены друг с другом так, что силы оказывается достаточно для изменения пространственной ориентации молекул.
Для определения пространственной ориентации могут применяться следующие принципы.
1. Скорость и амплитуда молекулярной переориентации связаны с концентрацией комплементарных молекул, со сродством комплементарных молекул друг к другу и с расстоянием между ними.
2. Скорость ориентации обратно пропорциональна расстоянию между молекулярными парами и прямо пропорциональна их сродству друг к другу.
3. Если каким-либо образом измеряется или величина подобных "сил сродства", или скорость и амплитуда ориентации молекулярной пары, то такие величины должны быть связаны с концентрацией молекулярных пар даже до связывания молекулярных пар.
4. В случае достаточно высокого сродства молекулярных пар электростатические силы могут быть измерены, даже если молекулярные пары сближены, но все же находятся на значительном расстоянии друг от друга, как, например, при наличии барьеров, таких как мембраны и воздух. Ожидается, что природа барьера также будет оказывать значительное влияние на величину сродства, такого как электростатические силы взаимодействия между парами.
Хотя все предпочтительные варианты осуществления изобретения, описанные здесь, включают в себя обнаружение извне биохимических аналитов в организме, будет понятно, что принципы данного изобретения также могут быть перенесены на область использования проявлений сил сродства для целей, отличных от "обнаружения", т.е. изменения физических или химических свойств измерительных агентов или молекул-мишеней могут быть использованы для некоторых заранее заданных целей, отличных от простого обнаружения биохимических аналитов, например, для инициирования некоторого действия или реакции через барьер и на расстоянии, передачи сообщения и так далее.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 схематично изображен принцип молекулярного сродства, использованный в предпочтительных вариантах осуществления изобретения.
На фиг.2(а) схематично изображен измерительный зонд, сконструированный в соответствии с принципами данного изобретения.
Фиг.2(b) иллюстрирует измерительный зонд с фиг.2(а) после того, как он был размещен в непосредственной близости от разделяющей мембраны, и молекулы-мишени, расположенные с другой стороны мембраны.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Фиг.2(а) иллюстрирует гель-мембранный зонд, сконструированный в соответствии с принципами предпочтительного варианта осуществления данного изобретения. Измерительный зонд включает в себя
- множество молекул-зондов, обладающих сродством к молекулам-мишеням, концентрацию которых требуется измерить;
- раствор, который позволяет молекулам-зондам изменять свою ориентацию, когда они притягиваются или отталкиваются молекулами-мишенями;
- устройство для определения ориентации молекул-зондов.
Тип молекул, используемых в качестве молекул-зондов, зависит от типа молекул-мишеней. Например, если в качестве молекулы-мишени выступает антитело, то молекулой-зондом может быть антиген. С другой стороны, для измерения концентрации фермента можно использовать соответствующий субстрат или продукт реакции. Предпочтительные варианты осуществления изобретения, в принципе, применимы для любых двух типов молекул, которые притягивают или отталкивают друг друга на молекулярном уровне с силой, достаточной для проявления эффектов на расстоянии или через барьер, разделяющий молекулы-зонды и молекулы-мишени в процессе измерения.
Примером пары фермент-субстрат, к которой могут применяться принципы данного изобретения, является пара фермент - глюкоза, такая как глюкозоксидаза - глюкоза, глюкозодегидрогеназа - глюкоза и глюкозомутаротаза - глюкоза. Уровень глюкозы, известной также как сахар крови, обычно измеряют при диабете. В качестве примера соответствующей пары антитело - антиген выступает пара СРБ-специфичное моноклональное антитело - СРБ, обнаружение которого в крови используется для определения наличия и опасности инфекций в организме. С другой стороны, молекулой-мишенью может быть антиген, а молекулой-зондом может быть антитело.
Другие примеры молекул-мишеней, для которых может применяться прибор, предлагаемый изобретением, включают иммуноглобулины, такие как IgG, IgM и IgA, а также липопротеины. Кроме того, прибор может использоваться для бесконтактного определения аллергических реакций, трудно диагностируемых болезней или инфекций, вызванных микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии, и любого другого типа инфекции или реакции иммунной системы на химические или биологические объекты.
Раствор, в котором суспендированы или каким-то другим образом распределены молекулы-зонды, будет зависеть от типа молекулы-зонда. Так, в приведенном примере раствор представляет собой гель. С другой стороны, в качестве носителей молекул-зондов можно использовать жидкости, твердые тела или другие материалы, которые позволяют молекулам изменять ориентацию в ответ на присутствие молекулы-мишени. Более того, раствор, содержащий молекулы-зонды, может включать в себя кофакторы, необходимые для увеличения сил притяжения или отталкивания.
В примере, который иллюстрируют фиг.2(а) и 2(b), электроды помещены с каждой стороны раствора для измерения сопротивления раствора приложенному электрическому току. Изменение сопротивления ΔR слоя геля, обогащенного молекулами-зондами (МЗ), оказавшимися в непосредственной близости от комплементарных молекул-мишеней (ММ), находящихся с другой стороны барьера, например, кожи пациента, является функцией (f) от сродства (а) или силы притяжения/отталкивания в паре МЗ-ММ, концентрации молекул-мишеней СММ и обратного расстояния между комплементарными молекулами. Математически это можно выразить так:
где ΔR=RB - RM, RB - сопротивление слоя геля до того, как он оказывается в непосредственной близости от молекул-мишеней, RM - сопротивление слоя геля после того, как он оказывается в непосредственной близости от молекул-мишеней, в качестве (f) выступает любая функция, линейная или нелинейная, которая описывает зависимость между ΔR и aCMM/d, причем как функция (f), так и переменная сродства (а) зависят от природы пары сродства.
Помимо сопротивления и проводимости, существует несколько способов, позволяющих определить молекулярную ориентацию с использованием этого принципа, в том числе регистрация изменений в спектрах ядерного магнитного резонанса (ЯМР) молекул или других свойств раствора, включая электрические, магнитные или оптические свойства, на которые оказывает влияние молекулярная ориентация. Специалистам в данной области техники будет понятно, что измерительные молекулы-зонды могут быть модифицированы, например, путем введения химически меченных кофакторов и т.д. для увеличения сил сродства к молекулам-мишеням.
Более того, специалистам в данной области техники будет понятно, что пространственная ориентация не является единственным свойством молекул, зависящим от наличия молекул-мишеней. Например, силы сродства могут влиять на явление электрофореза, во время которого молекулы перемещаются в геле под действием приложенного поля. Для специалистов в данной области будет очевидно, что изменения в таком перемещении могут быть использованы вместо или в дополнение к ориентации для обнаружения сил сродства между молекулами-зондами и молекулами-мишенями.
Практическое применение
Для практического применения датчика, изображенного на фиг.2(а) и 2(b), необходим зонд, который способен вызывать равномерное вращение молекул в образце, содержащем молекулы-зонды, с тем, чтобы создать фон, относительно которого могут быть зафиксированы изменения, вызванные присутствием молекул-мишеней. Для многих приложений необходимо достичь по меньшей мере 98% вращения. Данное однонаправленное вращение молекул-зондов может быть подтверждено стандартными методами флуоресцентной оптической спектроскопии.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения для достижения требуемого однонаправленного вращения можно приложить однородный однонаправленный ток к раствору молекул-зондов, равномерно нанесенному на измерительную пленку или однородно распределенному в гелеподобной среде. Однородный ток и его проверка производится электрофоретическим прибором, способным к индуцированию однонаправленного тока и измерению проводимости по всем направлениям в плоскости, которая в настоящее время считается перпендикулярной приложенному току. Прибор роликового типа для нанесения геля контролируемой температуры может быть использован для достижения однородного нанесения раствора молекул-зондов, предпочтительно однородным слоем толщиной от нескольких ангстрем (для размещения по меньшей мере одного слоя молекул-зондов и обеспечения беспрепятственного молекулярного вращения) до нескольких миллиметров. Как один из возможных примеров, гелеподобной средой может быть неполярный гель, легко растворимый в воде и способный образовывать однородный раствор молекул-зондов, и который представляет собой жидкость при температуре 40-60°С и находится в гелеподобном твердом состоянии при температуре 5-40°С.
При достижении однородного вращения молекул-зондов применение данного изобретения требует наблюдения за молекулярной ориентацией, предпочтительно с точностью вращения в пределах ±5%, что также может быть подтверждено методом флуоресцентной спектроскопии при помощи молекул-зондов, помеченных флуоресцентными метками.
Как только становится возможно "увидеть" пространственную конфигурацию равномерно вращающихся молекул, можно использовать коммерчески доступные измерительные приборы для измерения изменений тока, изменений направления приложенного тока, а также изменения напряжения для данной равномерно покрытой гелем пленки. Затем необходимо определить электропроводность пленки при разных углах по отношению к приложенному электрофоретическому току в "выключенном" состоянии, т.е. в отсутствие потенциала электрофоретического поля. Коммерчески доступные измерительные приборы в настоящее время способны измерять сопротивление параллельно и перпендикулярно направлению тока в трехмерном режиме, с интервалами в 10°±2°, полностью покрывая диапазон углов в 360°. Ключевым моментом является способность измерять достаточно малые изменения в сопротивлении вследствие электрического импеданса, вызванного молекулярным вращением на пути приложенного тока.
Гелевую среду следует выбирать таким образом, чтобы наблюдались значительные изменения в направленной проводимости между электрофоретической проводимостью и проводимостью, перпендикулярной к электрофоретическому полю, при минимальном времени, необходимом для полного вращения молекул-зондов при постоянных значениях напряжения и силы тока. Широко используемые гелевые среды включают полиакриламидный гель и агарозные гели. Для каждого выбранного геля необходимо измерять специфические электрофоретические параметры молекул-зондов для каждого конкретного устройства как функцию концентрации, температуры и состава растворителя.
Для того чтобы представленный в изобретении сенсор был способен детектировать вращение измерительных молекул-зондов в ответ на присутствие молекул-мишеней, как описано выше, полезно определить точное влияние вращения измерительных молекул-зондов на проводимость или сопротивление гелевого раствора. Это может быть проделано при помощи измерения проводимости с использованием электрофоретических электродов при нулевых значениях остаточного электрофоретического тока и напряжения, и измерений в плоскости, перпендикулярной к направлению приложенного электрофоретического тока, с шагом 10°. Таким образом, сенсор определяет зависимость измеряемых изменений проводимости или сопротивления как функцию от (а) направления измеряемого тока относительно электрофоретического тока, приложенного к гелевой среде, (b) концентрации измерительных молекул, растворенных в геле, и (с) времени приложения электрофоретического поля, необходимого для полного однородного вращения измерительных молекул. Для отслеживания и проверки вращения молекул-зондов может использоваться флуоресцентный оптический прибор для определения вращения.
Как только установлена зависимость между приложенным током и вращением измерительных молекул, влияние концентрации раствора и близости молекул-мишеней на проводимость и сопротивление гелевого раствора может быть установлено путем измерения проводимости и сопротивления гелевого раствора для разных растворов молекул-мишеней. Если обнаружено измеримое изменение вращения измерительных молекул, то может быть установлена взаимосвязь между расстоянием до молекул-мишеней и вращением измерительных молекул для различных молекулярных пар. Вращение измерительных молекул в ответ на наличие в непосредственной близости молекул-мишеней также может быть подтверждено методом флуоресцентной оптической спектроскопии.
Прототип зонда (датчика)
Прототип зонда 1, который может быть использован для проверки изменений в направленной проводимости или сопротивлении при вращении измерительных молекул, определения состава и толщины гелевой среды и выбора измерительных молекул и их концентрации, необходимой для обеспечения требуемой чувствительности, показан на фиг.3. Прототип такого зонда представляет собой модифицированную электрофоретическую ячейку, включающую цилиндрический корпус 2 с электродами 3 и 4, расположенными в верхней и нижней частях, соответственно, для создания электрофоретического поля в покрытой гелем мембране 5, обернутой вокруг цилиндра. Наличие электрофоретического поля приводит к тому, что молекулы-зонды в геле ориентируются относительно поля, после чего прекращается подача тока к электродам, либо их влияние нейтрализуется или устраняется, а затем производится измерение сопротивления пленки, покрытой гелем, перпендикулярно поверхности пленки и по всем направлениям в ее плоскости. Как указано выше, когда найден подходящий гель и установлена корреляция между вращением измерительных молекул и сопротивлением покрытой гелем пленки, можно проводить измерения в присутствии молекул-мишеней, например, при контакте покрытой гелем мембраны с сосудом, заполненным раствором молекул-мишеней.
Для следующего этапа проверки зонд должен обладать чувствительностью, достаточной для того, чтобы приводить к измеримому изменению в сопротивлении при изменении количества вращающихся измерительных молекул в пределах ±5%, точностью, достаточной для достижения значения вариационного коэффициента в ±10% для стандартного раствора молекул-мишеней на верхнем пределе клинического нормального диапазона, и надежностью, достаточной для воспроизведения стандартных кривых чистого раствора молекул-мишеней с эквимолярными смесями неспецифичных гомологов с вариационным коэффициентом, не превосходящим ±15%.
В конечном счете, версия зонда, используемая на практике, должна обладать чувствительностью, составляющей по меньшей мере ±2%, точностью ±5% и надежностью, в случае использования образца сыворотки/крови пациента со следующими минимальными значениями параметра корреляции по отношению к стандартному методу сравнения, коэффициентом регрессии 0,9±0,1, наклоном кривой регрессии 0,9±0,15 и при пересечении оси Y, составляющей ±10% от нижнего предела нормального клинического диапазона.
Таким образом, описав предпочтительный вариант осуществления данного изобретения достаточно подробно, чтобы специалисты в этой области техники могли создать и использовать устройство, предлагаемое изобретением, тем не менее, понятно, что различные изменения и модификации описанного осуществления изобретения могут быть сделаны в пределах объема, охватываемого заявленным изобретением, при этом подразумевается, что данное изобретение не ограничено вышеприведенным описанием или сопутствующими чертежами и должно определяться только в соответствии с приложенной формулой изобретения.