СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКРИСТАЛЛОВ СОЛЕЙ СЕРОТОНИНА КРИСТАЛЛИЗАЦИЕЙ ИЗ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ
METHOD OF PRODUCING MONOCRYSTALS OF SEROTONIN SALTS BY CRYSTALLISATION FROM AQUEOUS SOLUTIONS

Изобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности, в частности к производству биологически активных веществ, которые могут быть использованы как биологически активные добавки. Более конкретно, улучшенный способ получения монокристаллов солей серотонина при кристаллизации из водных растворов.
Нейромедиатор серотонин участвует в различных физиологических аспектах жизнедеятельности человека и животных. Серотонин является стимулятором гладкой мускулатуры, перистальтики и секреторной активности желудочно-кишечного тракта; увеличивает капиллярную стабильность, участвует в регуляции цикла сон - бодрствование и других значимых процессах [Mohammad-Zadeh L.F., Moses L., Gwaltney-Brant S.M. Serotonin: a review. // Journal of veterinary pharmacology and therapeutics. 2008. Vol.31, №3. P.187-199., Berger M., Gray J. a. Roth B.L. The expanded biology of serotonin. // Annual review of medicine. 2009. Vol.60. P.355-366]. Достоверно известно, что уровень содержания нейротрансмиттеров в целом и серотонина в частности в значительной мере определяет поведенческие возможности животного или человека, его настроение, тонус и социальное поведение (McGuire, M.T., Troishi A., 1998. Darwinian psychiatry. New York: Oxford University Press, J.H. Tumer, Handbook of Social theory // Springer, 2000, 745p.), что впервые было показано на приматах (R.D. Masters, M.T. McGuire, The Neurotransmitter Revolution: Serotonin, Social Behavior, and the Law // Southern Illinois University, 1994, 285p.). Столь обширные и различные свойства серотонина в организме человека принято связывать с его конформационными особенностями, что позволяет серотонину эффективно связываться с рецепторами, отвечающими за различные функции [Akhrem A. et al. Theoretical Investigation of the Conformational Mobility of the serotonin molecule and several of its analogs // Theoretical and Experimental Chemistry. 1978. Vol.13, №5. P.682-686.]. Изучение конформаций в различных солях серотонина эффективнее всего проводить в кристаллическом состоянии методом монокристальной дифракции.
Согласно последней версии Кембриджского банка структурных данных (февраль 2013) на сегодняшний день выращены кристаллы и расшифрована внутренняя структура только трех солей серотонина (оксалата серотонина, серотонина креатинин сульфата моногидрата, пикрата моногидрата серотонина). Авторами были отмечены сложности при использовании традиционных техник кристаллизации солей серотонина. Четвертая структура (адипинат серотонина) была расшифрована нами при использовании кристалла, выращенного предлагаемым методом.
При расшифровке структуры оксалата серотонина использовался кристалл из коммерческого порошкового препарата Sigma Co., St. Louis, а попытка кристаллизовать из метанола не увенчалась успехом - кристаллы быстро деградировали на воздухе [Aniy A. et al. The Crystal Structure of Serotonin Hydrogen Oxalate // Acta Chem. Scand. A. 1978. Vol.32, №3. P.267-270].
Для получения кристаллов серотонина креатинин сульфата моногидрата и пикрата моногидрата серотонина использовалась техника медленного охлаждения водного раствора, что привело к изменению цвета кристалла серотонина креатинин сульфата и было отмечено авторами [Thewalt U., Bugg C.E. The crystal and molecular structure of serotonin picrate monohydrate // Acta Crystallographica Section В Structural Crystallography and Crystal Chemistry. International Union of Crystallography, 1972. Vol.28, №1. P.82-92, Karle I.L., Dragonette K.S., Brenner S. a. The crystal and molecular structure of the serotonin-creatinine sulphate complex // Acta Crystallographica. International Union of Crystallography, 1965. Vol.19, №5. P.713-716].
Общим недостатком перечисленных методов является значительная деградация солей серотонина, что диагностируется изменением цвета. Химическая деградация биологически активных аминов (в том числе и серотонина) является общей проблемой для данного класса соединений и происходит из-за продолжительного нахождения в жидкой фазе в процессе кристаллизации.
Задача изобретения состоит в создании способа получения монокристаллов солей серотонина из водных растворов, техническим результатом которого является получение монокристаллов солей серотонина правильной формы без признаков деградации, позволяющих проводить изучение внутренней структуры и конформационных особенностей серотонина в твердой фазе
Поставленная задача решена созданием способа, в котором получают насыщенный при температуре 25±3°C раствор соли, затем нагревают раствор до температуры 40-50°C и добавляют не более 50% от растворенного при 25±3°C количества исходной соли, после чего осуществляют последовательное охлаждение до 4±2°C, затем  до -18±2°C до полной заморозки раствора, затем размораживают при комнатной температуре (25±3°C) с образованием монокристаллов исходной соли серотонина, маточный раствор отделяют декантацией.
В качестве исходной соли были использованы адипинат серотонина и серотонин креатинин сульфат моногидрат.
Пример 1. В 3-4 мл дистиллированной воды при 25±3°C растворяли навеску адипината серотонина до получения насыщенного раствора. Таким образом подготавливали 5 образцов, которые затем нагревали до 35, 40, 45, 50 55°C, добавляя не более 50% количества адипината серотонина от растворенного при 25±3°C. Растворы последовательно охлаждали при комнатной температуре (25±3°C) в течение нескольких минут, затем в холодильной камере (+4±2°C), затем в морозильной камере (-18±2°C) до полной заморозки раствора. Растворы размораживали при комнатной температуре (25±3°C), маточный раствор отделяли от осадка декантацией непосредственно после разморозки. На дне и стенках сосуда наблюдались ровные кристаллы правильной формы без признаков деградации серотонина в адипинате серотонина (прозрачный цвет). Кристаллы адипината серотонина представляли собой пластинки со средним размером 0,15×0,12×0,05 мм (±0,02 мм в каждой плоскости).
Добавление более 50% количества адипината серотонина от растворенного при 25±3°C приводит к быстрой деградации серотонина в жидкой фазе, получить кристаллы без признаков деградации невозможно.
Полученные кристаллы были использованы в дифракционных экспериментах и впервые была установлена внутренняя структура кристаллического адипината серотонина, определены конформационные особенности молекулы серотонина в данной адипиновой соли в твердой фазе в сравнении с известными солями серотонина.
Кристаллические продукты исследовали методами рентгеноструктурного анализа (Oxford Diffraction Gemini R Ultra difractometer, Mo Kα излучение). Расшифровка и анализ полученных данных проводились с использованием программ: CrysAlis PRO; SHELXS97, SHELXL97, Olex2 vl.2. Mercury 3.0, Platon and CrystalExplorer.
Результаты варьирования температурного диапазона при нагревании раствора адипината серотонина приведены в таблице 1.
Таблица 1
Температура нагревания
Цвет кристаллов
Количество и качественная оценка размеров кристаллов
Результат
35°C
Прозрачный
Много, средний размер не превышает 0,10×0,08×0,03 мм (±0,01 мм в каждой плоскости)
-
40°C
Прозрачный
Мало, средний размер 0,15×0,12×0,05 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
+
45°C
Прозрачный
Мало, средний размер 0,15×0,12×0,05 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
+
50°C
Прозрачный
Мало, средний размер 0,15×0,12×0,05 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
+
55°C
Бурый
Мало, средний размер 0,15×0,12×0,05 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
-
Пример 2. В 3-4 мл дистиллированной воды при 25±3°C растворяли навеску серотонина креатинин сульфата моногидрата до получения насыщенного раствора. Таким образом подготавливали 5 образцов, которые затем нагревали до 35, 40, 45, 50 55°C, добавляя серотонин креатинин сульфат моногидрат в количестве не более 50% от растворенной при 25±3°C исходной соли. Растворы последовательно охлаждали при комнатной температуре (25±3°C) в течение нескольких минут, затем в холодильной камере (4±2°C), затем в морозильной камере (-18±2°C) до полной заморозки раствора. Растворы размораживали при комнатной температуре (25±3°C), маточный раствор отделяли от твердой фазы декантацией непосредственно после разморозки. На дне и стенках сосуда наблюдались ровные кристаллы правильной формы без признаков деградации серотонина в серотонине креатинин сульфата моногидрата (прозрачный цвет). Кристаллы серотонина креатинин сульфата моногидрата представляли собой пластинки со средним размером 0,30×0,20×0,08 мм.
Добавление более 50% количества серотонина креатинин сульфата моногидрата от растворенного при 25±3°C приводит к быстрой деградации серотонина в жидкой фазе, получить кристаллы без признаков деградации невозможно.
На основе полученных кристаллов были проведены дифракционные эксперименты, установлена внутренняя структура кристаллического серотонина креатинин сульфата моногидрата, определены конформационные особенности молекулы серотонина в комплексе креатинин сульфата моногидрата в твердой фазе.
Кристаллические продукты исследовали методами рентгеноструктурного анализа (Oxford Diffraction Gemini R Ultra diffractometer, Mo Kα излучение). Расшифровка и анализ полученных данных проводились с использованием программ: CrysAlis PRO; SHELXS97, SHELXL97, Olex2 vl.2, Mercury 3.0, Platon and CrystalExplorer.
Результаты варьирования температурного диапазона при нагревании раствора приведены в таблице 2.
Таблица 2
Температура нагревания
Цвет кристаллов
Количество и качественная оценка размеров кристаллов
Результат
35°C
Прозрачный
Много, средний размер не превышает 0,15×0,12×0,05 мм (±0,01 мм в каждой плоскости)
-
40°C
Прозрачный
Мало, средний размер 0,30×0,20×0,08 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
+
45°C
Прозрачный
Мало, средний размер 0,30×0,20×0,08 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
+
50°C
Прозрачный
Мало, средний размер 0,30×0,20×0,08 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
+
55°C
Бурый
Мало, средний размер 0,30×0,20×0,08 мм (±0,02 мм в каждой плоскости)
-