Зависимость эффективности одновременного воздействия гамма-квантов и нейтронов с энергией 14 МэВ от вклада плотноионизирующего компонента

Зависимость эффективности одновременного воздействия гамма-квантов и нейтронов с энергией 14 МэВ от вклада плотноионизирующего компонента

Бекетов Е.Е., Исаева Е.В., Корякин С.Н., Лычагин А.А., Ульяненко С.Е.

ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, Обнинск

Изучено биологическое действие одновременного облучения нейтронами с энергией 14 МэВ и гамма-квантами 60Co с различным вкладом в суммарную дозу плотноионизирующего компонента. В качестве источника нейтронов использовали компактный генератор ИНГ-031 (3Н(а^,п)4Не). Эффективность облучения оценивали по клоногенной активности клеток меланомы B-16. Показано, что одновременное воздействие нейтронами и фотонами обладает наибольшей эффективностью при 30 % вкладе нейтронов. При значениях этого параметра 15 и 30 % выживаемость клеток была меньше теоретических значений, рассчитанных исходя из предположения о независимом действии излучений - наблюдался синергизм. Увеличение доли нейтронов в суммарной дозе до 45 % приводило к снижению эффекта до аддитивного уровня.

Ключевые слова: нейтроны 14 МэВ, меланома B-16, смешанное излучение, синергизм.

Введение

Проблема взаимодействия плотно- и редкоионизирующих излучений имеет важное значение как для комбинированной лучевой терапии, так и при оценке опасности такого смешанного воздействия для человека. Это в полной мере относится как к ядерным катастрофам, так и к определению профессиональных рисков, с которыми сотрудники радиационных объектов сталкиваются ежедневно. Из ряда публикаций известно, что совместное действие редкоионизи-рующего излучения и нейтронов может носить синергический характер [6, 9, 10, 14], что отразится в большей опасности такого смешанного воздействия. Считается, что взаимодействие различных типов излучений, приводящих к образованию сублетальных повреждений при их одиночном действии, может носить синергетический характер.

Большое влияние на биологическое действие гамма-нейтронного излучения имеет вклад каждой составляющей в суммарную дозу. Вместе с тем, постановка экспериментов, необходимых для изучения смешанного действия нейтронов и фотонов, поднимает целый комплекс технических и дозиметрических проблем. Большая часть из них связана с тем, что все нейтронные установки в той или иной мере являются источниками и редкоионизирующего излучения. В одних случаях (ядерные реакторы) редкоионизирующий компонент - неотъемлемая часть пучка, в других - вторичен, т.е. является следствием активации самой установки при облучении.

Известно, что как гамма-, так и нейтронное излучения относятся к косвенно ионизирующим. Фотоны высвобождают в веществе непосредственно ионизирующие частицы - высокоэнергетические вторичные электроны. При нейтронном облучении конечный биологический эффект также связан с ионизацией, производимой опосредованно вторичными частицами: протонами и ядрами отдачи. Преимущественный вклад того или иного вида ядерного взаимодействия нейтронов зависит не только от их энергии, но и от состава облучаемого вещества. Это

Бекетов Е.Е. - науч. сотр.; Исаева Е.В. - ст. науч. сотр., к.б.н.; Корякин С.Н. - вед. науч. сотр., к.б.н.; Лычагин А. А. - зав. лаб., к.ф.-м.н.; Ульяненко С.Е.* - зав. отделом, д.б.н. ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России.

*Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (48439) 9-72-10; e-mail: ustev@mrrc.obninsk.ru.

приводит к тому, что с прохождением через биологическую ткань соотношение нейтронов и фотонов (их вклад в суммарную дозу) изменяется. Так, при облучении фантома пучком моноэнер-гетических (14 МэВ) нейтронов вклад у-излучения на глубине 30 см возрастает до 16 % [9].

Исследование влияния вклада плотноионизирующего компонента в суммарную дозу при одновременном облучении требует решения ещё одной задачи, заключающейся в необходимости иметь в своём распоряжении сразу два компактных источника: редкоионизирующего излучения и нейтронов. В доступной литературе описаны всего две таких установки [9, 10]. Реакторы, служившие во многих исследованиях источником обоих излучений, в свою очередь, не позволяют проводить достаточно гибких экспериментов, которые могли бы дать однозначный ответ на вопрос о влиянии вклада нейтронов на конечный эффект смешанного воздействия.

В одной из ранних работ по изучению смешанного гамма-нейтронного облучения исследовано его влияние на снижение веса селезёнки мышей [12]. Полученные данные указывали на независимый характер действия компонентов смешанного излучения.

В более поздней работе по облучению клеток китайского хомячка линии V79 быстрыми моноэнергетическими нейтронами (15 МэВ) и у-излучением [10] источниками смешанного излучения служили соосно расположенные установка для лучевой терапии на основе 60Co и газомишенный нейтронный источник, обеспечивающий реакцию 210 кэВ дейтронов с мишенью из трития. Вклад нейтронов в суммарную дозу составлял 40 %. Полученные данные свидетельствовали о большей, по сравнению с последовательным действием этих излучений, эффективности режима одновременного облучения. В другом исследовании с использованием той же тест-системы было показано, что наибольшей эффективностью (величиной отличия от ожидаемых значений выживаемости) обладает режим с вкладом нейтронов 20-40 % в суммарную дозу, в то время как облучение со вкладом 60-80 % приводит к аддитивному эффекту [13]. Наличие синергического эффекта было показано и в исследованиях in vivo. Облучение мышей-альбиносов рентгеновским излучением и нейтронами с энергией 3 МэВ с различным вкладом последних привело к повышенному поражению кожных покровов, что было особенно заметно при вкладах нейтронной составляющей от 30 до 50 % [11].

Таким образом, вопрос об эффективности одновременного воздействия нейтронов и фотонов в зависимости от вклада плотноионизирующего компонента остаётся малоизученным и требует более детальных исследований.

Материалы и методы

Меланома B-16. В качестве экспериментальной биологической тест-системы использовали культуру клеток мышиной меланомы В-16 (РОНЦ им. Н.Н. Блохина). Клетки культивировали в монослое в среде RPMI-1640 с добавлением антибиотиков (пенициллин-стрептомицин по 100 ед./мл), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, при температуре +37°C в атмосфере, содержащей 5 % СО2. В качестве культуральной посуды использовали флаконы площадью 25 см3 (Corning).

Облучение культуры клеток проводили при комнатной температуре в состоянии монослоя в поздней лог-фазе в чашках Петри (Corning) диаметром 3,5 см. Эффективность облучения оценивали по клоногенной активности клеток [16]. Для этого облучённые клетки снимали со дна

чашек Петри смесью 0,25 % раствора трипсина с 0,02 % раствором версена в соотношении 1:1, ресуспендировали до получения одиночных клеток и подсчитывали в камере Горяева. После этого клетки в количестве от 1000 до 50000 (в зависимости от дозы облучения) переносили в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 10 см (Corning). В качестве оптимального числа выросших колоний (и посеву в случае необлучённых клеток) принимали значение 1000, что соответствовало посеву в ~15 клеток/см2. К клеткам добавляли среду RPMI-1640 с 10 % фетальной сыворотки и инкубировали в С02-инкубаторе в течение 7-8 дней до формирования видимых невооружённым глазом колоний. По окончании инкубации культуральную среду удаляли, колонии окрашивали 2 % раствором метиленового синего в 50 % этаноле [8]. Подсчёт числа колоний проводили на счётчике Scan 100 (Interscience, Франция). Учитывали колонии, содержащие 50 и более клеток. На каждую экспериментальную точку было подсчитано не менее 600 колоний. Выживаемость клеток определяли как отношение долей клоногенных клеток в экспериментальной и контрольной группах.

Облучение проводили на экспериментальной установке, состоящей из соосно расположенных источников гамма- и нейтронного излучения. В качестве источника гамма-излучения (60Co) использовали установку «Луч» (Еср=1,25 МэВ). Источником нейтронного излучения с энергией 14 МэВ служил импульсный генератор ИНГ-031 (ВНИИ Автоматики им. Н.Л. Духова). Реакция образования нейтронов - ЗН(^,п)4Не. Длительность импульса ~ 1 мкс, частота следования импульсов в экспериментах составляла 50 Гц. Объект облучения - чашки Петри с культурой клеток располагали стопкой (по 3 чашки). Для исключения вклада сопутствующего гамма-излучения в общую дозу облучения на верхнюю чашку ставили свинцовую пластину толщиной 2 мм. Схема облучения на соосной установке изображена на рисунке 1.

Рис. 1. Схема расположения источников излучения и облучаемых чашек Петри

с клетками меланомы.

Для оценки влияния вклада нейтронов на эффективность одновременного воздействия нейтронов и фотонов был поставлен ряд экспериментов в одинаковой конфигурации, со следующими значениями этого параметра: 15, 30 и 45 %. В ходе планирования конфигурации облучения учитывали множество обязательных дозиметрических условий, основным из которых

являлась необходимость минимизировать изменение мощности дозы редкоионизирующего излучения среди всех облучаемых объектов. В данном исследовании отклонение мощности дозы гамма-излучения от среднего значения (0,33 Гр/мин) не превышало 6 %. Таким образом, влияние фактора мощности дозы редкоионизирующего излучения при интерпретации полученных данных не учитывали. В случае нейтронов мощность дозы также может иметь значение при смешанном воздействии [18]. В данной работе облучение проводили в таких диапазонах доз (от

0,3 до 3,7 Гр) и мощностей доз (0,06-0,25 Гр/мин), для которых эффекта мощности дозы обнаружено не было [7].

Статистическую обработку и визуализацию полученных данных проводили с помощью программного пакета Я (версия 2.15) и графического приложения Уеиви (1.15). Считали, что количество сформировавшихся колоний в чашке Петри подчиняется распределению Пуассона [2]: среднее значение числа выросших колоний и его ошибку определяли по формуле (1) [1]. Дозовые зависимости аппроксимировали по линейно-квадратичной модели (2). Теоретические значения выживаемости после смешанного облучения нейтронами и фотонами оценивали, исходя из предположения о независимом действии этих излучений (3).

,

п п

где N - общее количество колоний на всех чашках, п - число чашек.

5 = 100 • ехр[-

Б = 100 • ехр[-

где а1, в1, а2, в - коэффициенты, й1, й2 -доза излучения.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследований представлены на рисунках 2-4. Экспериментальные дозовые зависимости (сплошные линии с точками) изображены вместе с кривыми по ожидаемой выживаемости (пунктирные линии), которые были рассчитаны, исходя из предположения о независимом действии излучений.

Как следует из представленных результатов, при некоторых вкладах нейтронов в суммарную дозу экспериментальные и расчётные кривые не совпадают, то есть действие нейтронов и гамма-излучения не является независимым. Следовательно, характер взаимодействия двух излучений определяется вкладом плотноионизирующей составляющей в общую дозу облучения: при вкладах нейтронов 15 и 30 % выживаемость клеток меланомы меньше, чем можно было ожидать, исходя из предположения о независимом действии излучений, а при вкладе 45 %, наоборот, фактическая выживаемость клеток совпадает с расчётными данными. На основании вышеизложенного, эффект одновременного действия двух излучений разного качества при вкладе нейтронов 15 и 30 % в суммарную дозу можно оценить как синергизм. Этот эффект ранее был обнаружен при взаимодействии и других видов редко- и плотноионизирующих излучений [5, 15].

Доза облучения, Гр

Рис. 2. Зависимость выживаемости клеток меланомы от дозы одновременного воздействия фотонами и нейтронами, при 15 % вкладе последних в дозу.

Доза облучения, Гр

Рис. 3. Зависимость выживаемости клеток меланомы от дозы одновременного воздействия фотонами и нейтронами, при 30 % вкладе последних в дозу.

Доза облучения, Гр

Рис. 4. Зависимость выживаемости клеток меланомы от дозы одновременного воздействия фотонами и нейтронами, при 45 % вкладе последних в дозу.

Полученные данные указывают на существование оптимального для достижения максимального радиобиологического эффекта значения такого параметра смешанного воздействия как вклад плотноионизирующего компонента. В данном случае наибольшая эффективность облучения была достигнута при 30 % значении этого параметра. Облучение в режимах с меньшим и большим вкладами нейтронов приводило к снижению обнаруженного эффекта. Для объяснения полученных результатов следует привести некоторые положения теории синергизма, изложенной в ряде работ [3, 4]. Согласно этим представлениям, если установлено, что два агента могут взаимодействовать синергически, это не означает, что синергизм регистрируется при любых значениях этих агентов. Имеется оптимальное соотношение воздействующих агентов, при котором синергизм достигает максимального значения. Синергизм максимален при одновременном действии обоих агентов. Последовательное их применение, а тем более разнесение их действия во времени, как правило, приводят к снижению синергического взаимодействия. Для объяснения синергического взаимодействия привлекаются два главных механизма: первый из них связан с восстановлением клеток, второй - с образованием субповреждений. В случае одновременного воздействия излучений различного качества более логичным представляется второй подход. С этой точки зрения синергизм комбинированного действия двух агентов обусловлен образованием дополнительных летальных или генетических повреждений за счёт взаимодействия некоторых субповреждений, сформированных каждым агентом.

Известно, что при действии нейтронов преобладает однотрековый механизм повреждения клеток. Тогда с увеличением вклада нейтронного излучения в суммарную дозу возрастает вероятность, что клетка получит нерепарируемые повреждения только от действия этого излу-

чения, добавочная доза гамма-излучения не будет играть роли. Следовательно, эффект синергизма будет наблюдаться при небольших вкладах нейтронной составляющей. Увеличение доли нейтронов приведёт к нивелированию эффекта, о чем свидетельствуют результаты, полученные как в рамках нашего исследования, так и в других работах по этой теме [14, 17]. С учётом полученных в настоящей работе данных можно сделать вывод, что оптимальное значение доли нейтронов в дозе смешанного гамма-нейтронного воздействия для достижения эффекта синергизма находится в пределах от 20 до 40 %. Это отличается от результатов для других видов смешанного излучения, например а-частиц и электронов, для которых наибольший эффект был обнаружен в области вклада плотноионизирующего компонента менее 5 % [5].

Заключение

Проведённые исследования позволили установить, что одновременное действие нейтронов с энергией 14 МэВ и гамма-излучения 60Со на культуру клеток меланомы В-16 может приводить к синергическому эффекту. Наибольшей эффективностью среди изученных режимов такого одновременного воздействия обладало излучение с 30 % вкладом в суммарную дозу плотноионизирующей составляющей. Увеличение этого параметра до 45 % приводило к аддитивному эффекту взаимного действия нейтронов и фотонов. Необходимы дальнейшие исследования эффективности смешанного воздействия в диапазоне вкладов нейтронов от 20 до 40 %. Отдельного рассмотрения требует оценка эффективности одновременного действия гамма-квантов и нейтронов при более высоких вкладах последних: 60-80 %.

Литература

1. Бейли Н. Статистические методы в биологии /пер. с англ. В.П.Смилги; под ред. В.В.Налимова. М.: Мир, 1963. 272 с.

2. Петин В.Г. Генетический контроль модификаций радиочувствительности клеток. М.: Энергоатомиз-дат, 1987. 208 с.

3. Петин В.Г., Комаров В.П. Количественное описание модификации радиочувствительности. М.: Энер-гоатомиздат, 1989. 192 с.

4. Петин В.Г., Рябченко Н.И., Суринов Б.П. Концепции синергизма в радиобиологии //Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. Т. 37, Вып. 4. С. 482-487.

5. Цыб Т.С., Кабакова Н.М., Перевозчиков Н.В. Биологические эффекты у клеток дрожжей Saccharomyces при одновременном действии 20 МэВ электронов и а-частиц 239Pu //3-й Съезд по радиационным исследованиям, Пущино. 1997. Т. 1. С. 137-138.

6. Bird R., Zaider M., Rossi H., Hall E. The sequential irradiation of mammalian cells with X rays and charged particles of high LET //Radiation Research. 1983. V. 93. P. 444-452.

7. Dionet C., Tchirkov A., Alard J. et al. Effects of low-dose neutrons applied at reduced dose rate on human

melanoma cells //Radiation Research. 2000. V. 154. P. 406-411.

8. Guda K., Natale L., Markowitz S. An improved method for staining cell colonies in clonogenic assays //Cytotechnology. 2007. V. 54. P. 85-88.

9. Higgins P., DeLuca P., Gould M. Effect of pulse dose in simultaneous and sequential irradiation of V-79 cells by 14.8-MeV neutrons and 60-Co photons //Radiation Research. 1984. V. 99. P. 591-595.

10. Higgins P., DeLuca P., Pearson D., Gould M. V79 survival following simultaneous or sequential irradiation by 15-MeV neutrons and 60-Co photons //Radiation Research. 1983. V. 95. P. 45-56.

11. Joiner M., Brenner J., Denekamp J., Maughan E. The interaction between X-rays and 3 MeV neutrons in the skin of the mouse foot //International Journal Radiation Biology. 1984. V. 46, N 5. P. 625-638.

12. Jordan D., Clark J., Vogel H. The additivity of Y-rays and fission neutrons in producing spleen weight re-

duction //Radiation Research. 1956. V. 4. P. 77-85.

13. McNally N., de Ronde J., Hinchliffe M. Survival of V79 cells following simultaneous irradiation with X-rays and neutrons in air or hypoxia //International Journal Radiation Biology. 1985. V. 48, N 5. P. 847-855.

14. McNally N., de Ronde J., Hinchliffe M. The effect of sequential irradiation with X-rays and fast neutrons on the survival of V79 Chinese hamster cells //International Journal Radiation Biology. 1984. V. 45, N 4. P. 301 -310.

15. Ngo F., Blakely E., Tobias C. Sequential exposures of mammalian cells to low- and high-LET radiations //Radiation Research. 1981. V. 87. P. 59-78.

16. Puck T., Marcus P. Action of X-rays on mammalian cells //The Journal of Experimental Medicine. 1956. N. 103. P. 653-666.

17. Railton R., Lawson R., Porter D. Interaction of Y-ray and neutron effects on the proliferative capacity of chinese hamster cells //International Journal Radiation Biology. 1975. V. 27, N 1. P. 75-82.

18. Suzuki S. Survival of Chinese hamster V 79 cells after irradiation with a mixture of neutrons and 60Co y-rays: experimental and theoretical analysis of mixed irradiation //Radiation Research. 1993. V. 133. P. 327-333.

Dependence of simultaneous exposure of gamma-rays and neutrons with energy 14 MeV effectiveness on high-LET component contribution

Beketov E.E., Isaeva E.V., Koryakin S.N., Lychagin A.A., Ulyanenko S.E.

Medical Radiological Research Center of the Russian Ministry of Health and Social Development, Obninsk

Biological action of simultaneous irradiation by neutrons with energy 14 MeV and 60Co gamma-rays with different high-LET component contribution to the total dose have been studied. Compact generator ING-031 (3H(d,n)4He) was used as neutron source. Irradiation efficacy was estimated with melanoma B-16 clonogenic assay. It is shown that simultaneous exposure of neutrons and photons is more effective in case of 30 % neutron contribution. At 15 and 3 % values of this parameter cell survival was lower than theoretical values calculated in accordance with independent action of these radiations - synergism was observed. Neutron contribution increase to 45 % resulted in decrease of the effect to additivity.

Keywords: neutrons 14 MeV, melanoma B-16, mixed radiation, synergism.

Beketov E.E. - Researcher; Isaeva E.V. - Senior Researcher, C. Sc., Biol.; Koryakin S.N. - Leading Researcher, C. Sc., Biol.; Lychagin A.A. -Head of Lab., C. Sc., Phys.-Math.; Ulyanenko S.E.* - Head of Dep., D. Sc., Biol. MRRC.

'Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: (48439) 9-72-10; e-mail: ustev@mrrc.obninsk.ru.