Средство с антиагрегационной активностью и способ его получения
AGENT WITH ANTIAGGREGATORY ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Группа изобретений относится к химии и медицине, а именно к фармацевтической химии и фармакологии, и может быть использовано для создания новых лекарственных средств профилактики тромбоза и тромбоэмболических осложнений.
6
2

Известно, что в качестве антиагрегационных средств последнего поколения разрешены к клиническому применению препараты L-цистеинамид, N-(аминоиминометил)-N-(3-меркапто-1-оксопропил)-L-лизилглицил-L-α-аспартил-L-триптофил-L-пролил-, циклический(1-6)-дисульфид («Интегрилин», Glaxo Operations UK Limited, Великобритания), М-(бутилсульфонил)-4-[4-(пиперидил)бутокси]-L-фенилаланин гидрохлорид моногидрат (Тирофибан, «Аграстат», Correvio, Великобритания), F(ab')2 фрагменты мышиных моноклональных антител FRaMon против рецептора фибриногена тромбоцитов - ГП IIb-IIIa («Монафрам», ЗАО «Фрамон», Россия) [см. Holmes L.E. A randomized trial assessing the impact of three different glycoprotein IIb/IIIa antagonists on glycoprotein IIb/IIIa platelet receptor inhibition and clinical endpoints in patients with acute coronary syndromes / L.E. Holmes, R. Gupta, S. Rajendran, J. Luu, J.K. French, C.P. Juergens // Cardiovasc. Ther. - 2016, N21. doi: 10.1111/1755-5922.12203.].
Несмотря на то что данные соединения по результатам клинических исследований оказываются наиболее эффективными в условиях интервеционной кардиологии, применение их ограничено по причине высокой стоимости, развития аутоиммунных реакций [Patrono, С. Antiplatelet agents for the treatment and prevention of atherothrombosis / C. Patrono, F. Andreotti, H. Arnesen // European Heart Journal. - 2011. - Vol. 32. - P. 2922-2932.].
Наиболее близким аналогом изобретения является клопидогрел (метил-(+)-(S)-альфа-(о-хлорфенил)-6,7-дигидротиено[3.2-с]пиридин-5(4H)-ацетат) из известных антиагрегантов, наиболее близкий по химическому строению. [М.Д. Машковский. Лекарственные средства. Том 1, Москва ООО «Новая Волна», изд. С.Б. Дивов, 2002, с. 468.]. Ингибирует агрегацию тромбоцитов, блокируя связывание аденозиндифосфата (АДФ) с рецепторами тромбоцитов. Применяют для профилактики тромбообразования у больных ишемической болезнью сердца (после инфаркта миокарда), при атеросклерозе мозговых и периферических сосудов.
Недостатками данного препарата являются возможные геморрагические явления, тромбопения, лейкопения, агранулоцитоз. Нельзя назначать данный препарат одновременно с антикоагулянтами.
Задачей изобретения является расширение арсенала биологически активных веществ, проявляющих антиагрегационную активность.
Технический результат при использовании изобретения - получение средства с антиагрегационной активностью.
Сущность изобретения: применение L-аспартата кальция тетрагидрата (соединение I) формулы:
в качестве средства, проявляющего антиагрегационную активность.
Известен аспартат кальция, являющийся результатом связывания L-аспарагиновой кислоты с кальцием. Данный препарат производства США используется в качестве биологической активной добавки к пище в качестве источника биодоступного кальция [Кальций биодоступный (аспартат) 1000 мг 60 капе [Электронный ресурс] Режим доступа: https://besuto.com.ua/р525287103-kaltsij-biodostupnyj-aspartat.html Дата доступа: 08.02.2021].
В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности применения L-аспартата кальция в качестве средства, проявляющего антиагрегационную активность, не найдено.
Препаратом сравнения выбрана ацетилсалициловая кислота (2-ацетилоксибензойная кислота), которая длительно и успешно применяется в практической медицине и имеет доказанную эффективность в качестве средства профилактики и лечения тромбоза и тромбоэмболических осложнений [см. 2018 Guidelines for the Early Management of Patients With Acute Ischemic Stroke: A Guideline for Healthcare Professionals From the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke.2018; 49:e138].
Тем не менее, недостатком известного препарата является высокая частота аспиринорезистентности, нежелательные клинические явления в виде ульцерогенного и гемморагических эффектов [Patrono, С. Antiplatelet agents for the treatment and prevention of atherothrombosis / C. Patrono, F. Andreotti, H. Arnesen // European Heart Journal. - 2011. - Vol. 32. - P. 2922-2932.].
Антиагрегационная активность и острая токсичность соединения
-3
2
Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 28 человек. Забор крови для исследования соединений в отношении системы гемостаза проводился из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer (Becton Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (ОАО ТНК «ДАСТАН», Киргизия). Исследование влияния на агрегацию тромбоцитов проводили по методу Born (Born G.G.V. Nature (London). - 1962. - V. 194.) на агрегометре «AT-02» (НПФ «Медтех», Россия). Определение антиагрегационной активности соединения I и ацетилсалициловой кислоты проводили в конечной концентрации 10 моль/л. В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Россия). Проводили оценку максимальной амплитуды агрегации, скорости агрегации, время достижения максимальной амплитуды и дезагрегацию в присутствии изучаемых соединений при агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов оценивали латентный период, во время которого происходит активация фосфолипазы С (что приводит к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А).
Определение острой токсичности соединения I и аспирина проведено на 200 белых мышах самцах в возрасте 2 месяцев со средней массой тела 20-21 г. при внутрибрюшинном способе введения. Животные прошли карантин в течение 14 дней в условиях отдельного бокса вивария кафедры биологической химии БГМУ. Температурный режим помещения вивария поддерживался от +18 до +22°С. Освещение вивария совмещенное (естественное и люминесцентное). Еженедельно в помещении вивария проводилась 20 мин. бактерицидная обработка стационарным настенным бактерицидным облучателем. Животные имели круглосуточный свободный доступ к поилкам, получали набор натуральных продуктов (овощи, зерно) и стандартную диету, представленную в виде экструдированного гранулированного корма для содержания лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков) соответствующий Декларации о соответствии № РОСС RU. ПР 98, Д 00497 до 07.02.2016 г. и содержащий в своем составе пшеницу, ячмень, шрот соевый, муку рыбную, дрожжи, отруби, а также витамины и минеральные вещества, витаминно-минеральный комплекс, растительный жир, антиоксидант.
Исследования выполнялись в соответствии правилами лабораторной практики (GLP), со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» и «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (М., 2012).
При проведении исследований на белых беспородных мышах при внутрибрюшинном введении вещества исследовали в дозах 100-500 мг/кг с шагом в 50 мг/кг. Количество вводимого вещества рассчитывали по объему введенного раствора в зависимости от массы тела с учетом максимально допустимого количества жидкости. Контрольная (интактная) группа животных включена в эксперимент для проведения сравнительной оценки состояния и поведения особей в контрольной и опытных группах. Данная группа животных по окончании первых суток наблюдений исключалась из эксперимента. Наблюдение за опытными группами проводилось в течение 14 суток.
Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 10.0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05. Величину LD50 вычисляли методом пробит-анализа с использованием программы BioStat 5.9 (Analyst Soft Inc.).
Пример 1. Антиагрегационная активность соединения.
Установлено, что введение соединения I в кювету агрегометра приводит к удлинению реакции высвобождения тромбоцитов (lag-периода) на 15,7% (р<0,05), снижению амплитуды агрегации тромбоцитов на 29,4% (р<0,05), скорости агрегации тромбоцитов на 13,6% (р<0,05) и удлинению времени достижения максимальной агрегации на 25,7% (р<0,05) по сравнению с контролем (табл. 1). При этом ацетилсалициловая кислота не влияет на реакцию высвобождения тромбоцитов, уступая соединению I по действию на уровень агрегации тромбоцитов более чем в 2,2 раза (р<0,05), показатели скорости агрегации тромбоцитов на 28,6% (р<0,05) и времени достижения максимума агрегации более чем в 2,4 раза (р<0,05).
Пример 2. Изучение острой токсичности при внутрибрюшинном введении мышам.
В результате исследования установлено, что соединение I согласно классификации химических веществ по параметрам острой токсичности И.В. Березовской и критерию токсичности при оценке опасности химических соединений по И.В. Саноцкому и И.П. Улановой относится к классу малотоксичных веществ (табл. 2).
Таким образом, соединение I является малотоксичным и эффективнее аспирина ингибирует процессы активации и агрегации тромбоцитов.
Наиболее близким аналогом способа получения L-аспартата кальция является способ синтеза аспартата кальция тетрагидрата по схеме:
2
4
3
8
L-Аспартата кальция тетрагидрат, Ca(L-Asp)⋅4HO. Суспензию L-аспарагиновой кислоты (1,33 г, 10,0 ммоль) в 15 мл воды нагревали до 60°С и небольшими порциями добавляли гидроксид кальция (0,76 г, 10,0 ммоль). Полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 3 ч, фильтровали в горячем состоянии и давали медленно остыть до комнатной температуры. Кристаллизация наблюдалась в течение примерно 12 часов. Через несколько дней был достигнут выход 1,4 г (75%). Растворимость в воде 0,028 г/л при 22°С. рН насыщенного раствора 10,50. CHCaNO (243,2). Вычислено: С: 19.75, Н: 5.39, N: 5.76, О: 52.62.Найдено: С: 19,65, Н: 5,28, N: 5,67, О: 53,10 [Schmidbaur, Н., Bach, I., Wilkinson, D.L., & Muller, G. (1989). Metal ion binding by amino acids. Preparation and crystal structures of two calcium L-asparatate hydrates. Chemische Berichte, 122(8), 1439-1444.]. Недостатком прототипа является низкий выход целевого продукта.
Задачей изобретения является расширение арсенала методов синтеза биологически активных веществ, проявляющих антиагрегационную активность.
Технический результат при использовании изобретения - повышение выхода целевого соединения.
Предлагаемый способ получения L-аспартата кальция тетрагидрата формулы:
2
2
осуществляется следующим образом. Суспензию аспарагиновой кислоты в 20 мл воды смешивают с порошком гидроксида кальция (Са(ОН)⋅HO) в мольном соотношении 1:1. Реакционную смесь нагревают при 95°С в течение 40 минут. Гомогенный раствор упаривают и сушат при комнатной температуре до получения целевого продукта.
2
2
4
13
8
f
Пример 3. Синтез аспартата кальция тетрагидрата. К суспензии 6,60 г (0,05 моль) аспарагиновой кислоты в 20 мл воды прибавляют порциями 3,70 г (0,05 моль) гидроксида кальция Са(ОН)⋅HO. Реакционную смесь нагревают при 95°С в течение 40 минут. Гомогенный раствор упаривают и сушат при комнатной температуре. Получают 8,75 г (85,0%) аспартата кальция тетрагидрата, CCCaNO. Аспартат кальция тетрагидрат - продукт белого цвета, хорошо растворим в воде, нерастворим в спирте, ацетоне, т.пл. 98-100°С (из водного ацетона). R 0,61 (этанол - вода - 1:1).
4
13
8
Элементный анализ. Найдено, %: С 19,82; Н 5,44; N 5,79. CHCaNO. Вычислено, %: С 19,75; Н 5,39; N 5,76.
Заявляемое соединение представляет собой белое кристаллическое вещество, хорошо растворимое в воде, нерастворимое в спирте, ацетоне.
-1
2
2
2
ИК спектр, ν, см: 3367 (NH, вал.), 1688, 1647 (C=О, вал.), 1431, 1416 (СН, ножн., СН-СО).
1
2
2
Спектр ЯМР Н (DO), δ, м.д.: 2.76 (2Н, м, β-СН); 3.90 (1H, м, α-СН).