СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
METHOD OF DIAGNOSTICS OF NEURODEGENERATIVE DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу диагностики нейродегенеративных заболеваний, в частности, болезни Альцгеймера.
Предшествующий уровень техники
Диагностировать нейродегенеративные заболевания непросто. Так, для болезни Альцгеймера, согласно общепринятому критерию "NINCDS-ADRDA" (McKhann et al., (1984) Neurology 34:939-944), различие проводят между возможной, вероятной и достоверной болезнью Альцгеймера, с возможностью поставить достоверный диагноз болезни Альцгеймера только после смерти, после аутопсии пациента и нейропатологического обследования головного мозга, выявляющего наличие, с одной стороны, сенильных бляшек и, с другой стороны, нейрофибриллярной дегенерации.
Диагностика возможной или вероятной болезни Альцгеймера основана главным образом на клинических критериях и нейропсихологических тестах, целью которых является, во-первых, установить, проявляется ли у индивидуума синдром деменции, как правило, согласно критериям DSM IV (Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders, 4th edition, American Psychiatric Association, 1994), а затем определить этиологию деменции. Критерии деменции, главным образом, включают сочетание нарушения памяти и нарушения других когнитивных функций, влияющих на социально-профессиональную деятельность и приводящих к ухудшению по сравнению с прежней функциональной деятельностью. Диагноз подтверждают наблюдением за прогрессированием пациента, которое дает возможность определить причины деменция, в частности исключить другие причины снижения когнитивных функций. В этом отношении томография головного мозга является важным элементом диагностики посредством оценки локальной атрофии гиппокампа, которая, тем не менее, может присутствовать при других заболеваниях, поражающих людей пожилого возраста, и посредством исключения других причин когнитивного нарушения, таких как последствия инсультов.
Однако полагают, что, как правило, только приблизительно 85% случаев вероятной болезни Альцгеймера подтверждают после смерти. 15% ложноположительных результатов, как правило, являются следствием других нейродегенеративных заболеваний, таких как лобно-височная деменция, включая, в частности, деменцию с тельцами Леви (Delacourte (1998) Annales de Biologie Clinque 56:133-142). Таким образом, современным методам диагностики болезни Альцгеймера не хватает специфичности. Кроме того, бывает так, что между началом заболевания, определяемым появлением первых когнитивных нарушений, и первыми симптомами деменции, которые могут обуславливать постановку диагноза возможной или вероятной болезни Альцгеймера, может проходить период более 10 лет (Amieva et al., (2008) Ann. Neurol. 64:479-480). Таким образом, в настоящее время диагноз болезни Альцгеймера устанавливают с опозданием, когда заболевание находится на очень поздней стадии. Однако для того, чтобы современное лечение, предусмотренное для болезни Альцгеймера, являлось эффективным, его необходимо проводить сразу после начала патологического процесса, например, когда индивидуум, которого необходимо лечить, проявляет только умеренные когнитивные нарушения (MCI), что подразумевает возможность рано диагностировать заболевание.
1-42
Фактически, для улучшения диагностики болезни Альцгеймера можно проводить дополнительные обследования, такие как анализ биохимических маркеров в цереброспинальной жидкости пациентов. Так было показано, в частности, что определение уровней пептида β-амилоида (Aβ42) в цереброспинальной жидкости и общего уровня тау-белка (ассоциированных с тубулином единиц), т.е. в фосфорилированной форме и в нефосфорилированной форме, позволяет диагностировать болезнь Альцгеймера с чувствительностью 92% и специфичностью 89% (Sunderland et al., (2003) JAMA 289:2094-2103). С тех пор в дополнение к Aβ42 и общему тау (T-tau) добавили третий маркер, а именно фосфорилированный тау (ptau), в частности фосфорилированный по треонину 181 (ptau181). Кроме того, удалось продемонстрировать, что сочетание этих трех маркеров позволяет детектировать начинающуюся болезнь Альцгеймера у страдающих MCI индивидуумов с чувствительностью 83% и специфичностью 72% (Matteson et al., (2009) JAMA 302:385-393).
Однако в настоящее время эти анализы не проводят как общепринятые, частично вследствие того, что преимущество, которое они обеспечивают в отношении достоверности и заблаговременности диагностики болезни Альцгеймера, не является достаточным для подтверждения использования указанных анализов как общепринятых.
Двухцепочечная РНК-зависимая протеинкиназа (PKR) представляет собой серин/треониновую киназу, основной мишенью которой является эукариотический фактор инициации трансляции 2α (eIF2α). PKR существует в форме, активируемой фосфорилированием треонина в положении 446 и/или треонина в положении 451. Удалось продемонстрировать высокие уровни активированной PKR, в частности в головном мозге пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, болезнью Хантингтона и болезнью Крейтцфельдта-Якоба, а также в лимфоцитах крови пациентов, страдающих болезнью болезнь Альцгеймера (для обзора см. Hugon et al., (2009) Expert Rev. Neurother. 9:1455-1457).
Описание изобретения
Изобретение следует из демонстрации авторами настоящего изобретения того, что определение уровня PKR, в частности в ее фосфорилированной активированной форме, в цереброспинальной жидкости индивидуумов является пригодным для избирательной и специфичной диагностики болезни Альцгеймера у этих индивидуумов, включая начинающуюся или раннюю необязательно бессимптомную стадию заболевания.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики, в частности in vitro, нейродегенеративного заболевания у индивидуума, где:
- определяют уровень двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) в биологическом образце индивидуума, в частности в образце цереброспинальной жидкости,
- на основании этого делают вывод, страдает ли индивидуум нейродегенеративным заболеванием.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики, в частности in vitro, нейродегенеративного заболевания у индивидуума, где:
- определяют отношение уровня активированной PKR к общему уровню PKR в биологическом образце индивидуума, в частности в образце цереброспинальной жидкости,
- на основании этого делают вывод, страдает ли индивидуум нейродегенеративным заболеванием.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики, в частности in vitro, нейродегенеративного заболевания у индивидуума, не проявляющего симптома деменции, где:
- определяют уровень двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) в биологическом образце индивидуума, в частности в образце цереброспинальной жидкости,
- на основании этого делают вывод, страдает ли индивидуум нейродегенеративным заболеванием.
Настоящее изобретение также относится к способу, в частности in vitro, определения риска того, что будет ли индивидуум, не проявляющий симптома нейродегенеративного заболевания, страдать нейродегенеративным заболеванием, где:
- определяют уровень двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) в биологическом образце индивидуума, в частности в образце цереброспинальной жидкости,
- на основании этого делают вывод о том, что подвергается ли индивидуум риску развития нейродегенеративного заболевания.
Как указано в настоящем описании, выражение "нейродегенеративное заболевание" означает нейродегенеративное заболевание, т.е. заболевание с прогрессирующей деградацией, затрагивающей нервную систему и, в частности, головной мозг.
Предпочтительно, нейродегенеративное заболевание по изобретению представляет собой деменцию. Специалистам в данной области хорошо известна деменция; как правило, полагают, что деменция характеризуется прогрессирующим нарушением умственных функций индивидуума, таким образом, включающих его способность адаптироваться к его окружению, в частности при новых ситуациях, что приводит к потере самостоятельности. Предпочтительно симптомы деменции согласно изобретению представляют собой симптомы, в частности, описанные в Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders, 4th edition (1994) американской психиатрической ассоциации (DSM IV) для деменции по типу болезни Альцгеймера, а именно:
A. Развитие множественных когнитивных нарушений, манифестирующих при этом посредством:
1) нарушения памяти (понижение способности запоминать новую информацию и вспоминать ранее усвоенную информацию);
2) одним (или более) из следующих когнитивных нарушений:
a) афазией (нарушением речи),
b) апраксией (пониженной способностью выполнять двигательную деятельность несмотря на интактные двигательные функции),
c) агнозией (неспособностью узнавать или определять объекты несмотря на интактные сенсорные функции),
d) нарушением организаторских функций (т.е. планирования, организации, разделения на последовательности, абстрактного мышления).
B. Когнитивные расстройства по критериям A1 и A2, каждые вызывающие значительные нарушения социальной или профессиональной деятельности и представляющие значительное ухудшение по сравнению с прежним уровнем деятельности.
C. Прогрессирование, которое характеризуется прогрессирующим началом и продолжительным снижением когнитивной функции.
D. Когнитивные расстройства по критериям A1 и A2, не вызванные чем-либо из следующего:
1) другими заболеваниями нервной системы, вызывающими прогрессирующее снижение когнитивных функций и ухудшение памяти (например, цереброваскулярной болезнью, болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона, субдуральной гематомой, нормотензивной гидроцефалией, опухолью головного мозга);
2) системными заболеваниями, для которых известно, что они вызывают деменцию (например, гипотиреоидизмом, недостатком витамина B12 или фолиевой кислоты, недостатком ниацина, гиперкальциемией, нейросифилисом, инфекцией ВИЧ);
3) вызванные веществами заболевания.
E. Ухудшения возникают не только при делирии.
F. Нарушение наилучшим образом можно объяснить, как являющееся вызванным другим заболеванием первой оси (Axis I) (в соответствии с DSM IV, т.е. требующее немедленного рассмотрения) (например, большим депрессивным расстройством или шизофренией).
Предпочтительно нейродегенеративное заболевание согласно изобретению выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, болезни Крейтцфельдта-Якоба и болезни Паркинсона.
В частности предпочтительно нейродегенеративное заболевание согласно изобретению представляет собой болезнь Альцгеймера.
Индивидуум согласно изобретению предпочтительно представляет собой человеческое существо. Индивидуум согласно изобретению может проявлять один или более симптомов деменции или страдать деменцией.
Индивидуум согласно изобретению также может не страдать деменцией или не проявлять какого-либо симптома деменции. Не проявляя деменцию, индивидуум согласно изобретению может страдать когнитивным нарушением, в частности умеренными когнитивными нарушениями (MCI), хорошо известными специалистам в данной области, и в частности описанными Petersen et al., (1999) Arch. Neurol. 56:303-308. Как правило, индивидуума определяют как страдающего MCI в случае субъективных жалоб ассоциированных с объективно заметным ухудшением показателей памяти с сохранением когнитивных и умственных функций и целостности повседневной деятельности. Предпочтительно индивидуум с MCI по изобретению имеет балл по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE), в частности по общепринятой версии Groupe de Reflexion sur les Evaulations Cognitives (GRECO) [группа наблюдений оценки когнитивных функций], который выше балла, соответствующего 5 процентили, в зависимости от его возраста и его социокультурного уровня. Кроме того, индивидуум согласно изобретению также может не проявлять какого-либо когнитивного нарушения.
Когда индивидуум по изобретению не страдает деменцией, в частности болезнью Альцгеймера, или не проявляет какого-либо симптома деменции, главным образом болезни Альцгеймера, в частности, главным образом, когда указанный индивидуум страдает MCI, способы по изобретению в частности позволяют определять страдает ли индивидуум деменцией, в частности болезнью Альцгеймера, на начинающейся или ранней, даже бессимптомной стадии или подвергается ли индивидуум риску развития деменции, в частности болезни Альцгеймера.
1-42
Аналогично, предпочтительно уровень в образцах цереброспинальной жидкости индивидуума по меньшей мере одного биологического маркера нейродегенеративного заболевания является нормальным. Как понимают в настоящем описании, уровень биологического маркера нейродегенеративного заболевания, как указано, является нормальным, когда его уровень меньше, чем пороговая величина, общепринятая специалистами в данной области для постановки диагноза у индивидуума как страдающего нейродегенеративным заболеванием, с которым ассоциирован маркер. Специалистам в данной области известны многие биологические маркеры нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера. Предпочтительно биологический маркер нейродегенеративного заболевания по изобретению представляет собой биологический маркер болезни Альцгеймера, в частности выбранный из группы, состоящей из маркера β-амилоида (Aβ), в частности β-амилоида (Aβ42), общего тау (T-tau) и фосфорилированного тау (ptau), в частности фосфорилированного по треонину 181 (ptau181). Эти маркеры и способ определения их уровня в образцах цереброспинальной жидкости хорошо известны специалистам в данной области и, в частности, описаны у Sunderland et al., (2003) JAMA 289:2094-2103, Blennow et al., (2006) Lancet 368:387-403 и у Mattson et al., (2009) JAMA 302:385-393.
Двухцепочечная РНК-зависимая протеинкиназа (PKR), также известная как E2AK2, хорошо известна специалистам в данной области и, в частности, описана в статье Hugon et al., (2009) Expert Rev. Neurother. 9:1455-1457 или посредством ссылки доступа P19525 базы данных UniProtKB. Как понимают в настоящем описании, выражение "двухцепочечная РНК-зависимая протеинкиназа" или "PKR" относится без исключений к нефосфорилированной PKR, к фосфорилированной PKR (pPKR) по треонину в положении 446 (pPKR446) и/или по треонину в положении 451 (pPKR451), или ко всем таким формам PKR. Общее количество фосфорилированных и нефосфорилированных форм PKR в биологическом образце по изобретению также известно как общая PKR.
Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов осуществления способа диагностики или определения риска по изобретению делают вывод о том, что индивидуум страдает нейродегенеративным заболеванием, в частности болезнью Альцгеймера, исходя из уровня фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце, уровня общей PKR в образце или отношения уровня фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце к уровню общей PKR в образце. В другом предпочтительном варианте осуществления способа диагностики или определения риска по изобретению делают вывод о том, что индивидуум страдает нейродегенеративным заболеванием, в частности болезнью Альцгеймера, исходя из сравнения:
- уровня фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце, уровня общей PKR в образце или отношения уровня фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце к уровню общей PKR в образце, и
- по меньшей мере одного предопределенного значения, в частности когда уровень фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце, уровень общей PKR в образце или отношение уровня фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце к уровню общей PKR в образце больше предопределенного значения.
Специалисты в данной области могут легко определять предопределенное значение по изобретению. В частности оно может являться средним уровнем PKR по изобретению или кратным число большим, чем 1 этого среднего уровня в образцах CSF контрольных индивидуумов, не страдающих когнитивным нарушением. Оно также может являться пороговой величиной, полученной из кривых операционных характеристик приемника (ROC), установленных для общей PKR, фосфорилированной PKR, в частности pPKR446 или отношения уровня фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце к уровню общей PKR в образце, фиксируя конкретные значения избирательности и специфичности, в частности для максимального увеличения суммы избирательности и специфичности, как проиллюстрировано в следующих ниже примерах. Таким образом, например, согласно изобретению индивидууму будет поставлен диагноз как страдающий болезнью Альцгеймера, если отношение уровня фосфорилированной PKR, в частности pPKR446, в образце к уровню общей PKR в образце больше 0,76 или 0,77.
Кроме того, в другом конкретном варианте осуществления способ диагностики или определения риска по изобретению также включает определение уровня по меньшей мере одного другого биологического маркера нейродегенеративного заболевания, в частности болезни Альцгеймера, как определено выше.
Биологический образец по изобретению предпочтительно представляет собой жидкий биологический образец, более предпочтительно цереброспинальную жидкость (CSF). Специалистам в данной области хорошо известно, как получать CSF у индивидуума, например, посредством люмбальной пункции.
Предпочтительно в способе по изобретению уровень PKR по изобретению в биологическом образце по изобретению определяют иммунологическим способом, т.е. способом с использованием антител, в частности моноклональных антитела, фрагментов антител, содержащих участок антитела, который специфически связывается с антигеном, или еще аптамеры, специфически направленные против PKR, т.е. которые главным образом не связываются с каким-либо другим компонентом биологического образца, в частности образца CSF. Как станет ясно специалистам в данной области, антитела, которые используют для определения уровня общей PKR, направлены против участка PKR, не модифицированного фосфорилированием; наоборот, антитела, которые используют для определения уровня pPKR446 или pPKR451, связываются с фосфорилированным участком PKR (а не с тем же самым участком, когда он не фосфорилирован). Такие антитела к PKR хорошо известны специалистам в данной области. Иммунологические способы по изобретению хорошо известны специалистам в данной области и включают, в частности, Вестерн-блоттинг или способ ELISA.
Изобретение дополнительно проиллюстрировано неограничивающим образом посредством фигур и примеров, которые следуют ниже.
Описание фигур
Фигуры 1, 2 и 3
На фигурах 1-3 приведены отображения уровней в виде диаграммы типа "ящик с усами" (относительные единицы), измеренных в CSF пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (AD), общей PKR (PKR) (фигура 1), pPKR446 (pPKR) (фигура 2) и отношения pPKR446/общая PKR, умноженного на 100 (pPKR/PKR), (фигура 3) в сравнении с аналогичными параметрами, измеренными в CSF контрольных индивидуумов, не страдающих когнитивным нарушением (контроль).
Фигуры 4, 5 и 6
На фигурах 4-6 представлены ROC-кривые, показывающие избирательность (ось y) и 1-специфичность (ось y) диагностики болезни Альцгеймера на основе уровня общей PKR (фигура 4), pPKR446 (фигура 5) и отношения pPKR446/общая PKR (фигура 6).
Фигура 7
На фигуре 7 представлена взаимосвязь отношения pPKR446/общая PKR, умноженного на 100 (pPKR/PKR, y-ось, относительные единицы), и уровня ptau181 (ptau, ось x, пг/мл) в CSF, а также прямая соответствующей линейной корреляции.
Фигура 8
На фигуре 8 представлено отношение уровня pPKR446 к уровню общей PKR (ось y, относительные единицы) в CSF пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (AD), в частности с нормальными (AD-PLn) или средними (AD-PLi) уровнями маркеров Aβ42, T-tau и ptau181; контрольных индивидуумов без когнитивного нарушения (HC); контроля с когнитивным нарушением, не связанным с болезнью Альцгеймера (CC); индивидуумов с алкогольной деменцией (OH) и индивидуумов с умеренными когнитивными нарушениями (MCI).
Фигуры 9, 10, 11
На фигурах 9-11 представлены, соответственно, уровни общей PKR и pPKR446 (в единицах оптической плотности) в CSF, а также отношение pPKR446/общей PKR (без единиц измерения), измеренные в примере 3 у контрольных индивидуумов (NC), индивидуумов, страдающих амнестическими умеренными когнитивными нарушениями (MCI), и у индивидуумов, страдающих болезнью Альцгеймера. Сплошными горизонтальными линиями представлены средние значения и пунктирными горизонтальными линиями представлено пороговое значение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
1. Пациенты и способы
Пациенты
В исследование включили 46 пациентов, выявленных как страдающих болезнью Альцгеймера (AD), и 39 контрольных индивидуумов, не страдающих болезнью Альцгеймера. Пациентов с AD включали на основании критериев NINCDS-ADRDA. Все пациенты поступали из Centre Mémoire [центра памяти] больницы Ларибуазьер (Париж, Франция). Ни один из контрольных индивидуумов не проявлял какого-либо когнитивного нарушения и не отвечал критериям болезни Альцгеймера. Образцы цереброспинальной жидкости (CSF) собирали после люмбальной пункции общепринятым диагностическим способом, в сочетании с неврологическим обследованием, общепринятыми анализами крови, нейропсихологическими тестами и МРТ головного мозга. Исследование было одобрено этическим комитетом больницы Пари Нор Биша.
Вестерн-блоттинг анализ CSF: определение уровней общей PKR и фосфорилированной по треонину 446 PKR (pPKR446)
Образцы CSF предварительно обрабатывали на колонке (ProteoExtract™, Calbiochem) для удаления альбумина и IgGs, а затем подготавливали стандартными способами для Вестерн-блоттинга. Концентрации белков определяли с использованием набора Micro BCA Protein Assay (Thermo Scientific) по инструкциям производителя. Образцы CSF разделяли на 4-12% полиакриламидном геле NuPAGE BisTris (Invitrogen), а затем электрофоретически переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Healthcare). Мембраны инкубировали с первичными антителами кролика, распознающими, соответственно, pPKR446 специфически к фосфорилированному треонину 446, и все белки PKR (SantaCruz) блокировали в 5% молоке в PBS, а затем инкубировали в присутствии флуорофора IR Dye™ 800, связанного с антителами против кролика (Rockland Immunochemical Inc.), разбавленными 1/5000. Связанные белки визуализировали посредством системы визуализации Odyssey (LI-COR Biosciences), а затем количественно определяли денситометрией с использованием программного обеспечения Multigauge (Fuji). Отношение pPKR446/общая PKR определяли для каждого пациента и для каждого контрольного индивидуума. Все результаты корректировали относительно внутреннего контроля (головного мозга человека, страдающего болезнью Альцгеймера). Статистический анализ количественного определения проводили посредством программного обеспечения Prism версия 5 (GraphPad).
1-42
Анализ CSF ELISA: β-амилоид (Aβ42), общего тау (T-tau), фосфорилированного по треонину 181 тау (ptau181)
Уровни Aβ42, T-tau и ptau181 определяли ELISA (Innotest tests Abeta, Innotests tau, Innotests p181tau, Innogenetics, Ghent, Belgium) в тех же самых образцах CSF, которые использовали для определения уровней общей PKR и pPKR446 по инструкциям производителя.
Статистический анализ
Для характеристики пациентов и контролей использовали описательную статистку. Группы сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента для непрерывных измерений и критерия хи-квадрат для пропорций. Распределения уровней общей PKR и ppKR446, а также отношения уровня pPKR446 к уровню общей PKR (pPKR446/общая PKR) в двух группах (пациенты и контроли) выражали графическим способом в виде диаграммы типа "ящик с усами". Анализ ROC-кривых (операционных характеристик приемника) использовали для определения лучших пороговых значений для уровня измеряемых маркеров CSF и расчета площади под кривой (AUC). Лучшие пороговые значения определяли, как дающие наиболее высокую сумму чувствительности и специфичности. Также определяли коэффициент корреляции Спирмена, с одной стороны, между PKR и pPKR446 и, с другой стороны, между Aβ42, T-tau и ptau.
2. Результаты
Характеристики обследованных индивидуумов приведены ниже в таблице 1
Таблица 1Характеристики индивидуумов в исследовании
Контроли
Болезнь Альцгеймера (AD)
(N=39)
(N=46)
P
Возраст, годы
69,5 (10,8)
70,7 (8,9)
0,59
Количество женщин (%)
21 (62)
26 (57)
0,64
MMSE
27,1 (2,9)
19,4 (6,4)
<0,001
Aβ42, пг/мл
798,7 (121,6)
409,8 (149,1)
<0,001
T-tau, пг/мл
189,2 (55,1)
598,0 (328,0)
<0,001
ptau, пг/мл
42,5 (11,4)
107,6 (51,9)
<0,001
Общая PKR, относительные единицы
53,7 (10,6)
71,9 (12,2)
<0,001
pPKR446, относительные единицы
30,9 (19,5)
94,9 (38,5)
<0,001
Отношение pPKR446/PKR
0,59 (2,47)
1,28 (3,71)
<0,001
За исключением количества женщин, указанные значения обозначают среднее значение индивидуумов, стандартное отклонение указано в скобках. MMSE: балл по краткой шкале оценки психического статуса.
Данные в таблице указывают на то, что средние значения концентраций PKR и активированной PKR (pPKR446) и отношения концентраций pPKR446/PKR значительно выше в CSF пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера по сравнению с контрольными индивидуумами.
Эти наблюдения подтверждены полностью для данных посредством отображений в виде диаграммы типа "ящик с усами", приведенных на фигурах 1, 2 и 3. В частности, совокупность значений, полученных для концентраций pPKR446 и отношения pPKR446/общей PKR у контрольных индивидуумов, значительно ниже, чем у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера.
Кроме того, были построены ROC-кривые для общей PKR, pPKR446 и отношения pPKR446/общая PKR. Полученных из этих кривых данные чувствительности и специфичности приведены ниже в таблице 2.
Таблица 2Площадь под кривой (AUC) ROC-кривых
Биомаркеры
AUC
Пороговое значение
Чувствительность
Специфичность
Корректно отобранные
Общая PKR
0,87
62
76,1
79,5
77,7
pPKR446
0,96
40
100
76,9
89,4
pPKR446/ общая PKR
0,96
77
97,8
87,2
92,9
Aβ42
0,95
584
94,4
90,9
91,9
T-tau
0,97
282
93,2
100
95,2
ptau181
0,98
61
90,9
100
93,6
Использование уровней общей PKR и, главным образом, активированной PKR (pPKR446), и отношения pPKR446/общая PKR позволяет выявлять пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. В частности, наблюдали, что определение уровня активированной PKR (pPKR446) и отношения pPKR446/общая PKR позволяет с большей чувствительностью определять болезнь Альцгеймера, чем это обеспечивает диагностика маркеров Aβ42, T-tau и ptau181.
Коэффициенты корреляции Спирмена, с одной стороны, между маркерами Aβ42, T-tau и ptau181 и, с другой стороны, между маркерами общей PKR, pPKR446 и pPKR446/общей PKR приведены ниже в таблице 3 и на фигуре 7.
Таблица 3Коэффициенты корреляции Спирмена
Aβ42
T-tau
ptau181
Коэффициент корреляции
P
Коэффициент корреляции
P
Коэффициент корреляции
P
Общая PKR
-0,37
0,003
0,45
<0,001
0,46
<0,001
pPKR446
-0,47
<0,001
0,56
<0,001
0,58
<0,001
pPKR446/ общая PKR
-0,47
<0,001
0,56
<0,001
0,57
<0,001
Коэффициенты корреляции Спирмена, с одной стороны, между маркерами Aβ42, T-tau и ptau181 и, с другой стороны, между маркерами общей PKR, pPKR446 и pPKR446/PKR являются относительно низкими. Таким образом, по-видимому, эти две группы маркеров являются относительно независимыми друг от друга, что позволяет предположить, что комбинация маркеров по изобретению с Aβ42, T-tau и ptau181 может улучшить диагностическую эффективность последних.
Пример 2
Способом из примера 1 авторы изобретения также сравнивали отношение уровня pPKR446 к уровню общей PKR в CSF пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (AD), выбранных как указано в примере 1, где аналогичное отношение измеряли в CSF контрольных индивидуумов без когнитивного нарушения (HC), контрольных индивидуумов с когнитивным нарушением, не связанным с болезнью Альцгеймера (например, как следствие депрессии или другого психического расстройства, лобно-височной деменции, сосудистой деменции или болезни телец Леви) (CC), индивидуумов с алкогольной деменцией (OH) и индивидуумов с умеренными когнитивными нарушениями (MCI) (фигура 8).
Наблюдали, что среднее значение отношения pPKR446/обшая PKR является выше в CSF у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, чем в CSF контрольных индивидуумов без когнитивного нарушения (как уже было видно из примера 1), а также в CSF индивидуумов с алкогольной деменций, среднее значение соотношения у которых, кроме того, является сходным со значением контролей без когнитивного нарушения. В данном случае это указывает на то, что увеличение отношения pPKR446/общая PKR является специфичным для болезни Альцгеймера и, вероятно в более общем смысле, для нейродегенеративной деменции.
Также наблюдали, что среднее значение отношения pPKR446/общая PKR в CSF индивидуумов, страдающих умеренными когнитивными нарушениями (MCI), является промежуточным по сравнению с аналогичным показателем пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, и аналогичным показателем контрольных индивидуумов без когнитивного нарушения. С учетом того, что годовой показатель перехода индивидуумов с MCI в индивидуумы, страдающие болезнью Альцгеймера, составляет приблизительно 15%, у некоторых индивидуумов в дальнейшем не развивается болезнь Альцгеймера, вероятно, что увеличение отношения pPKR446/общая PKR у индивидуумов, страдающих MCI, указывает на наличие начинающейся или ранней стадии болезни Альцгеймера (т.е. до появления симптомов деменции), или что оно указывает на то, что индивидуумы подвержены риску развития болезни Альцгеймера в ближайшее время. Кроме того, среднее значение отношения pPKR446/общая PKR в CSF контрольных индивидуумов с когнитивным нарушением, не связанным с болезнью Альцгеймера, является сходным с аналогичным показателем контролей без когнитивного нарушения, что свидетельствует о том, что увеличение отношения pPKR446/общая PKR у индивидуумов, страдающих MCI, является специфичным для болезни Альцгеймера и, вероятно в более общем смысле, для нейродегенеративных нарушений.
Наконец, наблюдали, что, хотя у некоторых из пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, выявлены уровни маркеров Aβ42, T-tau и ptau181 в CSF, которые являются нормальными (AD-PLn) или промежуточными, т.е. между границей нормы и границей патологии (AD-PLi), значение отношения pPKR446/общая PKR является повышенным, что указывает на то, что это отношение можно использовать для выявления пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, которых невозможно выявить с использованием общепринятых маркеров.
Пример 3
Проводили клиническое исследование дополнительно к исследованию примера 1.
1. Пациенты и способы
Пациенты
В течение одного года в исследование включили 119 индивидуумов, последовательно посещавших Centre Mémoire [центр памяти] больницы Ларибуазьер (Париж, Франция) за анализом цереброспинальной жидкости (CSF) для исследования когнитивных нарушений. Из исследования исключили, вследствие их небольшого количества, 5 индивидуумов с лобно-височной деменцией или болезнью телец Леви и 6 индивидуумов, перенесших инсульт, с баллом по ишемической шкале Хачинского выше 4 или страдающих сердечно-сосудистым заболеванием с последствием, видимым на МРТ головного мозга (многочисленные инсульты крупных сосудов, единичный инсульт, расположенный в стратегической зоне, многочисленные базальные ганглии, лакуны в белом веществе, обширные перивентрикулярные повреждения белого вещества). Перед постановкой диагноза всех индивидуумов подвергали стандартизированному клиническому обследованию, включающему историю болезни (анамнез) и физические и неврологические обследования. Лабораторные анализы проводили для всех индивидуумов, включая измерение уровней кобаламина и фолата в сыворотке, биохимический анализ крови, анализы функции щитовидной железы, серологию сифилиса, определение уровней C-белка, клинический анализ крови и МРТ головного мозга. Диагноз устанавливала многопрофильная бригада неврологов и нейропсихологов, специализирующихся на когнитивных нарушениях. Диагноз болезни Альцгеймера устанавливали согласно критериям NINCDS-ADRDA (McKhann et al., (1984) Neurology 34:939-44), и индивидуумы, страдающие амнестическими умеренными когнитивными нарушениями (MCI), отвечали общепринятым критериям (Petersen et al., (2001) Arch. Neurol. 58:1985-92). Исследование было одобрено этическим комитетом университетского госпитального центра Парижа (CEERB CHU Bichat, Paris, France). Все индивидуумы и медперсонал давали свое письменное согласие о том, что информированы касательно анализа CSF.
Способы, относящиеся к CSF
Люмбальные пункции проводили у индивидуумов натощак в течение месяца после клинического диагноза. CSF собирали в 12 мл полипропиленовые пробирки. Через два часа образцы CSF центрифугировали при 1800g в течение 10 мин при 4ºC. Небольшое количество CSF использовали для общепринятых анализов, включая подсчет общего количества клеток, бактериологический анализ и уровни общей глюкозы и белка. CSF порционно разделяли в 500 мкл полипропиленовые пробирки и хранили при -80ºC до проведения анализа. Уровни Aβ42, T-tau и ptau181 в CSF измеряли с использованием сэндвич-анализа Innotest ELISA по инструкциям производителя (Innogenetics, Ghent, Belgium). Критерии позитивности биомаркеров определяли в зависимости от отклонений от нормы уровней Aβ42, T-tau и ptau181 согласно пороговым значениям, используемым в Centre Mémoire [центре памяти] больницы Ларибуазьер (Aβ42<500 пг/мл, T-tau>302 пг/мл, ptau181>65 пг/мл). Серию биологических анализов проводили в одной лаборатории. Бригаду биологов, привлеченных к анализу CSF, не информировали о клиническом диагнозе. Качество анализов CSF было признано Европейским консорциумом (программа контроля качества биомаркеров CSF ассоциации Альцгеймера).
Определение уровней общей PKR и pPKR446 в CSF
Для удаления альбумина IgGs образцы CSF предварительно обрабатывали на колонке (ProteoExtract™, Calbiochem, Darmstadt, Germany) по инструкциям производителя. В кратком изложении, в колонку добавляли 800 мкл уравновешивающего буфера для ее регидратации. Затем 300 мкл каждого образца CSF помещали в отдельные одноразовые колонки и элюировали гравитацией. Профильтрованные образцы получали после элюирования колонки посредством двух промываний буфером для специфического связывания, поставляемого производителем. Образцы, из которых удалили IgG и альбумином, разделяли на аликвоты и хранили при -20ºC. Эффективность этапа фильтрации оценивали анализом иммунного мечения с использованием антитела, направленного против сывороточного альбумина человека (Santa Cruz, Danvers, MA, United States). Концентрации белков определяли с использованием набора Micro BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Cergy-Pontoise, France) по инструкциям производителя.
Белковые образцы CSF разделяли на 4-12% полиакриламидном геле NuPAGE BisTris (Invitrogen), а затем электрофоретически переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom) при 400 мА на гель в 25 мМ Трисе (pH 8,3), 200 мМ глицина и 20% этанола. После переноса нитроцеллюлозные мембраны блокировали в 5% (масса/объем) молоке в TBS, а затем инкубировали с первичным антителом.
Использовали следующие первичные антитела. Антитело кролика к PKR446 (Santa Cruz), антитело кролика к PKR (Cell Signaling, Beverly, MA, United States), антитело мыши к сывороточному альбумину (Santa Cruz). В качестве вторичных антител использовали антитела к IgG мыши, конъюгированные с флуорофором IR Dye™ 700DX, и антитела к IgG кролика, конъюгированные с флуорофором IR Dye™ (Rockland Immunochemical Inc., Gilbertsville, PA, United States). Связанные белки визуализировали с использованием системы визуализации Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, United States), а затем количественно определяли денситометрией с использованием программного обеспечения Multigauge (Fuji film, Tokyo, Japan). Измерения выражали в единицах оптической плотности (ODU).
Для оценки достоверности измерений уровней общей PKR и pPKR446 авторы изобретения проводили исследование повторного тестирования на CSF 25 случайным образом выбранных индивидуумов и рассчитывали коэффициент внутригрупповой корреляции между двумя последовательными измерениями уровней общей PKR и pPKR446.
Статистические анализы
2
Характеристики индивидуумов представляли согласно их клиническому диагнозу (неврологические контроли или контроли (NC), умеренные когнитивные нарушения (MCI) и болезнь Альцгеймера (AD)) и сравнивали между тремя группах с использованием критерия χ для дискретных переменных и дисперсионного анализа для непрерывных переменных. Анализ ROC-кривых (операционных характеристик приемника) использовали для определения дискриминирующей способности общей PKR, pPKR446 и отношения pPKR446/общей PKR для отличия NC от AD индивидуумов. Оптимальные пороговые значения определяли, увеличивая индекс Юдена (чувствительность + специфичность - 100). Корреляцию между различными биомаркерами оценивали с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Все значения p являлись двусторонними, и P-значение менее или равное 0,05 считали статистически значимым. Статистические анализы проводили с использованием программного обеспечения SAS версия 9,2 (SAS Institute, Cary, North Carolina, Unites States) и программного обеспечения Stata версия 10,0 (Statacorp LP, College Station, Texas, United States).
2. Результаты
Из числа включенных 108 индивидуумов исключили 6 AD, 10 контролей (NC) и 1 MCI ввиду технических причин, связанных с анализом CSF (8 вследствие недостаточного количества CSF и 9 вследствие того, что концентрация белка в CSF являлась очень низкой). Эти индивидуумы не отличались от включенных индивидуумов в отношении возраста и гендерного соотношения. Таким образом, в конечном итоге в исследование включили всего 91 индивидуум (AD, n=45; амнестические MCI, n=11; NC, n=35). Индивидуумов NC направляли в Centre Mémoire [центр памяти] больницы Ларибуазьер на основании жалоб (большое тревожное депрессивное расстройство 14, осложнение после инсульта 5, алкогольная деменция 4, синдром апноэ во сне 2, синдром Шегрена 2, саркоидоз 1, рассеянный склероз 2, боковой амиотрофический склероз 1, болезнь Лайма 1, нормотензивная гидроцефалия 1, эпилепсия 1, периферическая нейропатия 1).
Клинические характеристики индивидуумов AD, MCI и NC приведены ниже в таблице 4.
Таблица 4Характеристики индивидуумов в исследовании
Характеристики
NC
MCI
AD
(n=35)
(n=11)
(n=45)
P
Возраст (годы)
64,0 (9,2)
76,9 (10,5)
70,8 (9,1)
<0,001
Женщины, n (%)
23 (65,7)
7 (63,6)
28 (62,2)
0,95
MMSE
25,7 (3,4)
24,1 (1,7)
19,6 (6,5)
0,001
Биомаркеры CSF (пг/мл)
Aβ42
808,8 (183,9)
608,7 (276,4)
414,7 (150,6)
<0,001
T-tau
189,6 (59,2)
316,1 (124,2)
590,7 (328,7)
<0,001
ptau181
45,1 (12,8)
63,1 (18,8)
106,3 (52,5)
<0,001
PKR# в CSF
Общая PKR
52,2 (9,6)
75,3 (21,6)
72,5 (12,6)
<0,001
pPKR446
29,0 (13,9)
85,0 (40,4)
92,3 (38,0)
<0,001
pPKR446/общая PKR
0,55 (0,23)
1,10 (0,37)
1,25 (0,38)
<0,001
За исключением количества женщин, указанные значения обозначают среднее значение индивидуумов, стандартное отклонение указано в скобках; MMSE: балл по краткой шкале оценки психического статуса; # единицы оптической плотности.
Средний возраст немного ниже у индивидуумов NC по сравнению с индивидуумами AD. Биомаркеры CSF Aβ42, T-tau и ptau181 являются достоверно различными у индивидуумов AD и MCI по сравнению с индивидуумами NC. Определение уровней общей PKR и pPKR446, и отношения pPKR446/общая PKR проводят в одних и тех же образцах CSF для трех групп индивидуумов. Уровень общей PKR, и в частности уровень pPKR446, является повышенным у индивидуумов AD.
В частности наблюдали, что существует статистически значимое отличие между тремя группами в отношении уровней общей PKR и pPKR446, и отношения pPKR446/общая PKR. Например, средний уровень pPKR составляет 29,0+/-13,9 у индивидуумов NC, 85,0+/-40,4 у индивидуумов MCI и 92,3+/-38,0 у индивидуумов AD (ODU). Это также видно на фигурах 9-11, на которых приведены результаты индивидуумов и определенное ниже пороговое значение.
Ниже в таблице 5 приведены результаты ROC-кривых, построенных для уровня общей PKR, уровня pPKR446 и отношения pPKR446/общая PKR, касательно дискриминации между индивидуумами AD и NC.
Таблица 5Площадь под кривой (AUC) ROC-кривых
Биомаркеры
AUC (SE)
Пороговое значение
Чувствительность (%)
Специфичность (%)
Юден
Aβ42
0,95 (0,02)
606
96,7
88,9
0,86
T-tau
0,95 (0,02)
282
91,1
96,7
0,88
ptau181
0,95 (0,02)
61
88,9
90,0
0,79
Общая PKR
0,90 (0,03)
57,8
91,1
71,4
0,63
pPKR446
0,98 (0,01)
51,8
91,1
94,3
0,85
pPKR446/общая PKR
0,95 (0,02)
0,76
95,6
82,9
0,79
SE: стандартная ошибка
Площадь под кривой (AUC) равна 0,98 для pPKR446 и 0,95 для pPKR446/общая PKR. Таким образом, пороговое значение 51,8 ODU для pPKR446 позволяет отличать индивидуумов AD от индивидуумов NC с чувствительностью 91,1% и специфичностью 94,3%. Эти значения являются того же порядка, что и значения, определенные для Aβ42, T-tau и ptau181 в одних и тех же образцах CSF. Следует отметить, что значение AUC, ассоциированное с pPKR446 является лучшим независимо от рассматриваемого маркера, включая общепринятые маркеры CSF Aβ42, T-tau и ptau181.
Повторное тестирование, т.е. двойное определение уровней маркеров в одном и том же образце для исследования достоверности измерения, проводили на 25 образцах CSF (10 NC, 2 MCI и 13 AD). Можно было продемонстрировать надежные значения коэффициентов внутригрупповой корреляции между двумя последовательными измерениями общей PKR и pPKR446 (соответственно 0,94 и 0,97).
С другой стороны, невозможно было обнаружить корреляцию между уровнями общей PKR и pPKR446 и возрастом или баллами MMSE. Кроме того, наблюдали, что у индивидуумов AD уровень pPKR44 6 более повышен у мужчин, чем у женщин.
Авторы изобретения также исследовали корреляцию между уровнем общей PKR, уровнем pPKR446, отношением pPKR446/общая PKR и уровнями Aβ42, T-tau и ptau181 у индивидуумов AD и NC (таблица 6).
Таблица 6Корреляция между уровнем общей PKR, уровнем pPKR446,отношением pPKR446/общая PKR и уровнями Aβ42, T-tau и ptau181
Коэффициент корреляции Пирсона
Aβ42
T-tau
ptau181
r
p
r
p
r
p
AD (n=45) общая PKR
-0,10
0,33
0,29
0,06
0,31
0,041
pPKR446
0,04
0,79
0,17
0,26
030
0,045
pPKR446/общая PKR
0,14
0,36
0,05
0,73
0,19
0,21
NC (n=35) общая PKR
-0,12
0,51
0,17
0,36
0,20
0,40
pPKR446
-0,02
0,90
0,27
0,15
0,04
0,83
pPKR446/общая PKR
0,06
0,77
0,25
0,18
0,15
0,44
Наблюдали, что у индивидуумов AD концентрации ptau181 коррелируют с уровнями общей PKR и pPKR446 но с низким коэффициентом корреляции. С другой стороны, не обнаружено корреляции между уровнями общей PKR или pPKR446 и уровнями Aβ42 и T-tau у индивидуумов AD. Кроме того, не удалось обнаружить корреляцию между уровнем общей PKR или уровнем pPKR446 и уровнями Aβ42, T-tau и ptau181 у индивидуумов NC.
Таким образом, это указывает на то, что уровень общей PKR, уровень pPKR446 или отношение pPKR446/общая PKR обеспечивают информацию, главным образом, независимую в отношении общепринятых маркеров CSF, таким образом, позволяя, в частности, ожидать, что комбинация уровня общей PKR, уровня pPKR446, или отношения pPKR446 с уровнями Aβ42, T-tau и ptau181 позволила бы улучшить эффективность современных анализов, основанных на этих маркерах.
Кроме того, авторы изобретения наблюдали, что у 45 индивидуумов AD, для показанных 6 образцов CSF, которые не соответствовали критериям позитивности для уровней Aβ42, T-tau и ptau181, но, тем не менее, для которых показаны повышенные уровни pPKR446 и отношения pPKR446/общая PKR (таблица 7).
Таблица 7Определение уровня общей PKR, уровня pPKR446 и отношение pPKR446/общая PKR у индивидуумов AD, у которых уровни Aβ42, T-tau и ptau181 являются нормальными
Биомаркеры
Индивидуумы
Пол
Возраст
Диагноз
MMSE
Aβ42
T-tau
ptau181
T-PKR
pPKR
pPKR/T-PKR
Пациент 1
F
77,5
AD
26
647
195
41
49,8
73,7
1,48
Пациент 2
F
82,2
AD
27
802
282
59
57,9
55,3
0,96
Пациент 3
F
81,6
AD
22
865
184
47
53,6
63,1
1,18
Пациент 4
F
88,0
AD
19
641
191
46
85,2
92,6
1,09
Пациент 5
M
66,7
AD
26
279
195
56
84,5
141,1
1,67
Пациент 6
F
67,8
AD
26
751
420
74
68,9
135,7
1,97
T-PKR=общая PKR; pPKR=pPKR446
Таким образом, повышение общей PKR и pPKR446 может свидетельствовать об аномалии, хотя общепринятыми биомаркерами ее не выявляют, что увеличивает их преимущество и подтверждает, что биомаркеры по изобретению обеспечивают информацию, которая по существу не зависит от информации, полученной от общепринятых биомаркеров.
Наконец, авторы изобретения провели сравнение уровней различных биомаркеров у индивидуумов MCI (таблица 8).
Таблица 8Определение уровня общей PKR, уровня pPKR446 и отношения pPKR446/общая PKR у индивидуумов с амнестическими MCI
Индивидуумы
Пол
Возраст
MCI
MMSE
Aβ42
T-tau
p181tau
T-PKR
pPKR
pPKR/T-PKR
Пациент 1
F
76·7
Стабильный
26
924
399
85
90,9
131,6
1,45
Пациент 2
F
82·1
Перешедший
22
664
206
35
55,9
72,4
1,29
Пациент 3
F
85·3
Стабильный
24
312
288
59
113,2
72,6
0,64
Пациент 4
M
82·4
Перешедший
26
870
328
79-5
64,5
43,5
0,67
Пациент 5
F
79·5
Перешедший
26
447
270
44
102,5
154,9
1,51
Пациент 6
F
86·5
Стабильный
24
265
602
89
94,0
126,6
1,34
Пациент 7
F
66·9
Стабильный
24
854
253
64
53,3
51,4
0,97
Пациент 8
M
49·9
Стабильный
23
309
109
36
49,9
20,5
0,41
Пациент 9
F
79·6
Стабильный
27
332
357
58
72,4
98,8
1,36
Пациент 10
M
74·5
Перешедший
22
795
358
74
59,4
79,6
1,34
Пациент 11
M
83·2
Перешедший
23
924
307
71
72,2
82,8
1,15
T-PKR=общая PKR;pPKR=pPKR446;Стабильный указывает на отсутствие перехода в болезнь Альцгеймера в течение периода исследования;Перешедший указывает на переход в болезнь Альцгеймера в течение периода исследования
Наблюдали, что для порогового значения 51,8 ODU в отношении уровня pPKR446 у 81,8% индивидуумов с амнестическими MCI обнаружили аномальные уровни pPKR446. Из числа пяти индивидуумов, у которых развивалась болезнь Альцгеймера в течение периода исследования, длившегося 1 год, только у одного из индивидуумов обнаружили нормальные уровни общей PKR и pPKR446. Для сравнения, только у одного из пяти индивидуумов обнаружили аномальный уровень Aβ42 и только у трех из пяти индивидуумов обнаружили аномальный уровень T-tau и ptau181. Таким образом, следует, что биомаркеры по изобретению могут являться более чувствительными, чем Aβ42, T-tau и ptau181 для выявления среди индивидуумов MCI тех, кто находится на ранней, бессимптомной стадии болезни Альцгеймера, или тех, кто подвергается риску развития болезни Альцгеймера в ближайшее время.
Кроме того, среди шести стабильных пациентов MCI для четырех обнаружили аномальные уровни общей PKR и pPKR446. Исследование в течение более длительного периода времени позволит определить, будет ли действительно у этих индивидуумов развиваться болезнь Альцгеймера.