КОЛОНОЧНЫЕ СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ВЕКТОРА НА ОСНОВЕ AAV
COLUMN-BASED METHODS FOR CLEANING VECTOR BASED ON AAV

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Эта заявка на патент испрашивает приоритет заявки на патент США номер 62/527633, поданной 30 июня 2017; заявки на патент США номер 62/531744, поданной 12 июля 2017; и заявки на патент США номер 62/567905, поданной 4 октября 2017. Полное содержание указанных выше заявок включено в настоящий документ посредством ссылки, включая текст целиком, все таблицы, чертежи и последовательности во всей своей полноте.
ВВЕДЕНИЕ
Доставка генов является перспективным способом лечения приобретенных и наследственных заболеваний. Описан ряд вирусных систем для переноса генов, включая системы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV).
AAV - это зависимый от вируса-помощника ДНК-содержащий парвовирус, принадлежащий к роду Dependovirus. Для осуществления продуктивной инфекции AAV необходимы функциональные элементы вируса-помощника, например, аденовируса, вируса герпеса или коровьей оспы. В отсутствие функциональных элементов вируса-помощника AAV находится в латентном состоянии, встраивая свой геном в хромосому клетки-хозяина. Последующее инфицирование вирусом-помощником способствует репликации интегрированного вирусного генома с образованием инфекционных частиц AAV.
AAV имеет широкий спектр хозяев и способен реплицироваться в клетках любых видов в присутствии подходящего вируса-помощника. Например, человеческий AAV будет реплицироваться в клетках собаки, ко-инфицированных аденовирусом собак. AAV не ассоциирован с какими-либо заболеваниями человека или животных и при интеграции, по-видимому, не оказывает негативного влияния на биологические свойства клетки-хозяина.
Векторы на основе AAV могут быть сконструированы таким образом, что они содержат нужную гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты (например, выбранный ген, кодирующий терапевтический белок, ингибирующую нуклеиновую кислоту, такую как антисмысловая молекула, рибозим, микроРНК и т.д.), путем удаления, полностью или частично, внутренней части генома AAV и вставки нужной последовательности нуклеиновой кислоты между ITR. ITR остаются функциональными в таких векторах, благодаря чему может реплицироваться и упаковываться rAAV, содержащий нужную гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты также обычно связана с промоторной последовательностью, способной управлять экспрессией нуклеиновой кислоты в клетках-мишенях пациента. Сигналы терминации, такие как сайты полиаденилирования, также могут быть включены в вектор.
Конструирование инфекционных рекомбинантных AAV векторов (rAAV) было описано в ряде публикаций. Смотрите, например, патенты США номер 5173414 и 5139941; международные опубликованные заявки на патент номер WO 92/01070 и WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; и Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801.
В ранних фазах нескольких клинических испытаний, проведенных несколькими группами, было показано, что векторы на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV) имеют отличную перспективу для терапевтического применения. Разработка этого нового класса биологических препаратов с целью их утверждения будет включать усовершенствование способов определения характеристик вектора и контроля качества, в том числе лучшее понимание того, как дизайн вектора и параметры производственного процесса влияют на состав примесей в векторах клинической степени чистоты.
Важной целью при разработке систем получения и очистки rAAV является реализация стратегий по минимизации/контролю образования примесей в процессе получения rAAV, таких как белки, нуклеиновые кислоты и примеси, связанные с вектором, включая AAV дикого типа/псевдо дикого типа (wtAAV) и остаточные примеси ДНК, инкапсидированные в AAV. Удаление примесей в векторах на основе AAV затруднено из-за способа получения векторов на основе rAAV. В одном из способов получения векторы на основе rAAV получают путем временной трансфекции с использованием трех плазмид. Для получения векторов на основе rAAV в клетки вводится значительное количество плазмидной ДНК. Кроме того, когда векторы на основе rAAV высвобождаются из продуцирующих клеток, вместе с ними высвобождаются также клеточные белки и нуклеиновые кислоты. Учитывая, что только около 1% биомассы приходится на вектор rAAV, очень сложным оказывается очистить векторы на основе rAAV до такого уровня чистоты, чтобы можно было использовать их в качестве клинического препарата для генной терапии человека. (Smith PH Wright JF. Qu G. et al 2003, Mo. Therapy, 7:8348; Chadeuf G. et al, Mo. Therapy 2005, 12:744. Report from the CHMP gene therapy expert group meeting. European Medicines Agency EMEA/CHMP 2005, 183989/2004).
Разработка производственных процессов для очистки рекомбинантного AAV как препарата для лечения заболеваний человека должна вестись в направлении следующих целей: 1) стабильные показатели чистоты, эффективности и безопасности вектора; 2) стабильность производственного процесса; и 3) приемлемая цена производства. Современные масштабируемые процессы очистки векторов на основе AAV, соответствующие «отраслевым стандартам», не обеспечивают адекватного удаления примесей, что важно для достижения первой цели, указанной выше (стабильные показатели чистоты, эффективности и безопасности вектора). Кроме того, неспособность адекватно удалять примеси с использованием современных стандартных масштабируемых процессов очистки связана с тем, что: 1) разработка процессов очистки вирусных препаратов, таких как рекомбинантный AAV, для применений, отличных от вакцин (в случае вакцин иммунный ответ обычно желателен и не требует предотвращения), представляет собой относительно новое явление; 2) многие группы, участвовавшие в разработке масштабируемых процессов очистки векторов на основе AAV, не знали о высоком уровне примесей, связанных с вектором, и/или предположили, что такие примеси не будут вносить вклад в клинически значимую иммуногенность вектора; и 3) технически сложно разработать масштабируемые процессы очистки, подходящие для промышленного производства векторов на основе rAAV.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены способы очистки и получения векторных частиц на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). Способы по настоящему изобретению включают, по меньшей мере, 2 стадии колоночной хроматографии.
В одном из вариантов осуществления способ включает стадии: (a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток; (b) необязательно концентрирования урожая клеток, полученных на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток; (c) лизиса урожая клеток, полученных на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата; (d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами; (e) необязательно фильтрации лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата; (f) нанесения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), очищенного лизата, полученного на стадии (e), или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для катионообменной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления элюата с колонки для получения разбавленного элюата с колонки; (g) нанесение элюата с колонки или разбавленного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для анионообменной хроматографии для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки; (h) нанесения второго элюата с колонки или концентрированного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования третьего элюата с колонки для получения концентрированного третьего элюата с колонки; и (i) фильтрации третьего элюата с колонки или концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
В другом варианте осуществления способ включает стадии: (a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток; (b) необязательно концентрирования урожая клеток, полученных на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток; (c) лизиса урожая клеток, полученных на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата; (d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами; (e) необязательно фильтрации лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата; (f) нанесения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), очищенного лизата, полученного на стадии (e), или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для катионообменной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования элюата с колонки для получения концентрированного элюата с колонки; (g) нанесения элюата с колонки или концентрированного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки; (h) нанесения второго элюата с колонки или концентрированного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), на колонку для анионообменной хроматографии для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления третьего элюата с колонки для получения разбавленного третьего элюата с колонки; и (i) фильтрации третьего элюата с колонки или концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h) для получения очищенных векторных частиц rAAV.
В еще одном варианте осуществления способ включает стадии: (a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток; (b) необязательно концентрирования урожая клеток, полученных на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток; (c) лизиса урожая клеток, полученных на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата; (d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами; (e) необязательно фильтрации лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата; (f) нанесения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), очищенного лизата, полученного на стадии (e), или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для катионообменной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления элюата с колонки для получения разбавленного элюата с колонки; (g) нанесение элюата с колонки или разбавленного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для анионообменной хроматографии для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки; (h) фильтрации второго элюата с колонки или концентрированного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g) для получения очищенных векторных частиц rAAV.
В дополнительном варианте осуществления способ включает стадии: (a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток; (b) необязательно концентрирования урожая клеток, полученных на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток; (c) лизиса урожая клеток, полученных на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата; (d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами; (e) необязательно фильтрации лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата; (f) нанесения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), или очищенного лизата или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для AAV аффинной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления элюата с колонки для получения разбавленного элюата с колонки; (g) нанесение элюата с колонки или разбавленного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для анионообменной хроматографии для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки; (h) необязательно нанесения второго элюата с колонки или концентрированного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования третьего элюата с колонки для получения концентрированного третьего элюата с колонки; и (i) фильтрации второго элюата с колонки или разбавленного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), или фильтрации третьего элюата с колонки или концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
В еще одном варианте осуществления способ включает стадии: (a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток; (b) необязательно концентрирования урожая клеток, полученных на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток; (c) лизиса урожая клеток, полученных на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата; (d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами; (e) необязательно фильтрации лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата; (f) нанесения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), или очищенного лизата или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для AAV аффинной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования элюата с колонки для получения концентрированного элюата с колонки; (g) нанесения элюата с колонки или концентрированного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления второго элюата с колонки для получения разбавленного второго элюата с колонки; (h) необязательно нанесения второго элюата с колонки или концентрированного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g) на колонку для анионообменной хроматографии для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления третьего элюата с колонки для получения разбавленного третьего элюата с колонки; и (i) фильтрации второго элюата с колонки или разбавленного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), или фильтрации третьего элюата с колонки или концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению концентрирование на стадии (b) и/или на стадии (f) и/или на стадии (g) и/или на стадии (h) осуществляется посредством ультрафильтрации/диафильтрации, например, путем тангенциальной поточной фильтрации (TFF).
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению концентрирование на стадии (b) приводит к уменьшению объема собранных клеток и супернатанта клеточной культуры примерно в 2-20 раз.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению концентрирование на стадии (f) и/или на стадии (g) и/или на стадии (h) приводит к уменьшению объема элюата с колонки примерно в 5-20 раз.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению лизис урожая клеток, полученного на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), осуществляется физическим или химическим способом. Неограничивающие примеры физических способов включают микрофлюидизацию и гомогенизацию. Неограничивающие примеры химических способов включают детергенты. Детергенты включают неионные и ионные детергенты. Неограничивающие примеры неионных детергентов включают Тритон X-100. Неограничивающими примерами концентраций детергентов являются концентрации в диапазоне примерно от 0,1 до 1,0%, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению стадия (d) включает обработку нуклеазой, что приводит к уменьшению контаминации нуклеиновыми кислотами. Неограничивающие примеры нуклеаз включают бензоназу.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению фильтрация очищенного лизата или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), осуществляется с помощью фильтра. Неограничивающими примерами фильтров являются фильтры, имеющие диаметр пор в диапазоне примерно от 0,1 до 10 микрон, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению разбавление очищенного лизата, полученного на стадии (e), осуществляется водным фосфатным, ацетатным или Tris буферным раствором. Неограничивающими примерами pH раствора является pH в диапазоне примерно от 4,0 до 7,4, включительно. Неограничивающими примерами pH раствора Tris является pH выше 7,5, например, примерно от 8,0 до 9,0, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению разбавление элюата с колонки, полученного на стадии (f), или второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), осуществляется водным фосфатным, ацетатным или Tris буферным раствором. Неограничивающими примерами pH раствора является pH в диапазоне примерно от 4,0 до 7,4, включительно. Неограничивающими примерами pH раствора Tris является pH выше 7,5, например, примерно от 8,0 до 9,0, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторые частицы rAAV, полученные на стадии (i), составлены с сурфактантом для получения композиции вектора на основе AAV.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению анионообменная колоночная хроматография на стадии (f), (g) и/или (h) включает колоночную хроматографию с полиэтиленгликолем (ПЭГ).
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению колонку для анионообменной хроматографии на стадии (g) и/или (h) промывают раствором ПЭГ перед элюцией векторных частиц rAAV с колонки.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне примерно от 1000 до 80000 г/моль, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению ПЭГ имеет концентрацию от примерно 4% до примерно 10%, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению колонку для анионообменной хроматографии на стадии (g) и/или (h) промывают водным раствором сурфактанта перед элюцией векторных частиц rAAV с колонки.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению колонку для катионообменной хроматографии на стадии (f) промывают раствором сурфактанта перед элюцией векторных частиц rAAV с колонки.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению раствор ПЭГ и/или раствор сурфактанта включает водный Tris-Cl/NaCl буфер, водный фосфат/NaCl буфер или водный ацетат/NaCl буфер.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению NaCl в буфере или растворе имеет концентрацию примерно 20-300 мМ NaCl, включительно, или примерно 50-250 мМ NaCl, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению сурфактант включает катионный или анионный сурфактант.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению сурфактант включает сурфактант с двенадцатью углеродами в цепи.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению сурфактант включает хлорид додецилтриметиламмония (DTAC) или саркозил.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV элюируют с анионообменной колонки на стадии (f), (g) и/или (h) водным Tris-Cl/NaCl буфером.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению Tris-Cl/NaCl буфер содержит 100-400 мМ NaCl, включительно, и необязательно имеет pH в диапазоне от примерно 7,5 до примерно 9,0, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению анионообменную колонку на стадии (f), (g) и/или (h) промывают водным Tris-Cl/NaCl буфером.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению NaCl в водном Tris-Cl/NaCl буфере имеет концентрацию в диапазоне примерно 75-125 мМ, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению водный Tris-Cl/NaCl буфер имеет pH от примерно 7,5 до примерно 9,0, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению анионообменную колонку на стадии (f), (g) и/или (h) промывают один или несколько раз для уменьшения количества пустых капсидов AAV во втором или третьем элюате с колонки.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению промывка анионообменной колонки приводит к удалению пустых капсидов AAV с колонки перед удалением rAAV и/или вместо rAAV, что приводит к уменьшению количества пустых капсидов AAV во втором или третьем элюате с колонки.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению промывка анионообменной колонки приводит к удалению, по меньшей мере, примерно 50% от общего количества пустых капсидов AAV с колонки перед удалением rAAV и/или вместо rAAV, что приводит к уменьшению количества пустых капсидов AAV во втором или третьем элюате с колонки примерно на 50%.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению NaCl в водном Tris-Cl/NaCl буфере имеет концентрацию в диапазоне примерно 110-120 мМ, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению соотношение и/или количество элюируемых векторных частиц rAAV и пустых капсидов AAV контролируется промывочным буфером.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы элюируют с катионообменной колонки на стадии (f) в водном фосфат/NaCl буфере или в водном ацетат/NaCl буфере. Неограничивающим примером концентраций NaCl в буфере является диапазон концентраций примерно 125-500 мМ NaCl, включительно. Неограничивающим примером pH буфера является диапазон pH от примерно 5,5 до примерно 7,5, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению анионообменная колонка на стадии (f), (g) и/или (h) содержит функциональную группу четвертичного аммония, такую как кватернизованный полиэтиленимин.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению диапазон разделения/фракционирования (молекулярная масса) колонки для эксклюзионной (SEC) хроматографии на стадии (g) и/или (h) составляет от примерно 10000 до примерно 600000, включительно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению катионообменная колонка на стадии (f) содержит функциональную группу сульфоновой кислоты, такую как сульфопропиловая группа.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению колонка для AAV аффинной хроматографии содержит белок или лиганд, который связывается с капсидным белком AAV. Неограничивающие примеры белка включают антитело, которое связывается с капсидным белком AAV. Более конкретные неограничивающие примеры включают одноцепочечное антитело Llama (Camelid), которое связывается с капсидным белком AAV.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению способ исключает стадию ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, антисмысловой молекулы, микроРНК, рибозима и малых РНК, образующих шпильки shRNA.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (СТГ), паратиреоидного гормона (ПТГ), рилизинг-фактора гормона роста (СРФ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), эритропоэтина (EPO), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), инсулиноподобных факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, костного морфогенетического белка (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), нейротурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, sonic hedgehog и тирозингидроксилазы.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (TPO), интерлейкинов (от IL1 до IL-17), моноцитарного хемоаттрактантного белка, фактора, ингибирующего лейкемию, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, Fas лиганда, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, лиганда flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, Т-клеточных рецепторов, химерных Т-клеточных рецепторов, одноцепочечных Т-клеточных рецепторов, молекул MHC I класса и II класса.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV содержат трансген, кодирующий белок, необходимый для коррекции врожденных нарушений метаболизма, выбранный из группы, состоящей из карбамоилсинтетазы I, орнитинтранскарбамилазы, аргининосукцинат-синтетазы, аргининосукцинат-лиазы, аргиназы, фумарилацетоацетат-гидролазы, фенилаланин-гидроксилазы, альфа-1 антитрипсина, глюкозо-6-фосфатазы, порфобилиногендезаминазы, фактора V, фактора VIII, фактора IX, цистатион бета-синтазы, декарбоксилазы кетокислот с разветвленной цепью, альбумина, изовалерил-СоА-дегидрогеназы, пропионил-КоА-карбоксилазы, метилмалонил-КоА-мутазы, глутарил-КоА-дегидрогеназы, инсулина, бета-глюкозидазы, пируваткарбоксилазы, печеночной фосфорилазы, киназы фосфорилазы, глициндекарбоксилазы, RPE65, H-белка, T-белка, последовательности трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR) и последовательности кДНК дистрофина.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует фактор VIII или фактор IX.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению этим способом получают приблизительно 50-90% от общего количества векторных частиц rAAV из урожая клеток, полученного на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b).
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению этим способом получают векторные частицы rAAV более высокой степени чистоты, чем векторные частицы rAAV, получаемые или очищаемые однократной очисткой на аффинной AAV колонке.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению стадии (c) и (d) осуществляются по существу одновременно.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению концентрация NaCl регулируется таким образом, чтобы она находилась в диапазоне примерно 100-400 мМ NaCl, включительно, или в диапазоне примерно 140-300 мМ NaCl, включительно, после стадии (c) но перед стадией (f).
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV созданы на основе AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10 и Rh74.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV содержат капсидную последовательность, на 70% или больше идентичную капсидной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению векторные частицы rAAV содержат последовательность ITR, на 70% или больше идентичную последовательности ITR AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10 или Rh74.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению клетки представляют собой суспензию или прикрепленные (адгезивные) клетки.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению клетками являются клетки млекопитающих. Неограничивающие примеры включают клетки HEK, такие как клетки HEK-293.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению способ реализуется в соответствии с любым из вариантов колонок, условий, концентраций, молярности, объема, емкости, скорости потока, давления, материала, температуры, pH или стадии, приведенных в любом из примеров 1-3.
В конкретных аспектах способов по настоящему изобретению лизис клеток и/или подготовка перед очисткой на колонке, как указано в настоящем документе, осуществляется в соответствии с любым из вариантов условий, концентраций, молярности, объема, емкости, скорости потока, давления, материала, температуры, pH или стадии, приведенных в примере 4.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 демонстрирует проведение колоночной хроматографии CEX (Poros 50HS) → AEX (Poros 50HQ) > UF > SEC (Superdex 200 prep grade) начального объема урожая rAAV, 500-600 мл, который может быть масштабирован до больших объемов, чтобы значительно увеличить продукцию rAAV (например, 1,2 литра или больше).
Фиг. 2 демонстрирует проведение колоночной хроматографии CEX (Poros 50HS) → AEX (Poros 50HQ) начального объема урожая rAAV, 500-600 мл, который может быть масштабирован до больших объемов, чтобы значительно увеличить продукцию rAAV (например, 1,2 литра или больше).
Фиг. 3 демонстрирует проведение колоночной хроматографии CEX (Poros 50HS) → UF > SEC (Superdex 200 prep grade) > AEX (Poros 50HQ) начального объема урожая rAAV, 500-600 мл, который может быть масштабирован до больших объемов, чтобы значительно увеличить продукцию rAAV (например, 1,2 литра или больше).
Фиг. 4 демонстрирует проведение колоночной хроматографии аффинная (AVB Sepharose HP) → AEX (Poros 50HQ) начального объема урожая rAAV, 500-600 мл, который может быть масштабирован до больших объемов, чтобы значительно увеличить продукцию rAAV (например, 1,2 литра или больше). После элюции с аффинной колонки низким значением pH (около 7,5 мл элюата) добавляют 4,5 мл нейтрализующего раствора с высоким pH с последующим добавлением около 120 мл 5 мМ Tris-Cl pH 8,5/40 мМ раствора NaCl для достижения полного объема загрузки, около 132 мл для колонки AEX (Poros 50HQ).
Фиг.5 демонстрирует схему технологического процесса.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В настоящем изобретении предложены способы очистки и получения векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), которые могут быть масштабированы до больших объемов. Например, суспензионная культура объемом 5, 10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-200 или больше литров. В настоящем изобретении предложены способы очистки и получения векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), которые также применимы к широкому спектру серотипов/капсидных вариантов AAV. Способы по настоящему изобретению, применяемые для очистки или получения вектора на основе rAAV, включают удаление примесей, связанных с процессом производства. Способы по настоящему изобретению включают уникальную комбинацию хроматографических стадий и стадий технологического процесса, которые обеспечивают масштабируемость, для очистки множества различных серотипов/псевдотипов векторов rAAV.
Примеси включают примеси, связанные с процессом производства вектора AAV, которые включают белки, нуклеиновые кислоты (например, ДНК), клеточные компоненты, такие как внутриклеточные и мембранные компоненты, представляющие собой примеси, отличные от векторов AAV. Термин «примеси, связанные с процессом производства» относится к любым компонентам, выделяющимся в процессе очистки и получения AAV, и не являющимся собственно частицами rAAV.
Термин «собственно векторы rAAV» относится к векторным частицам rAAV, содержащим гетерологичную нуклеиновую кислоту (например, трансген), способным инфицировать клетки-мишени. Фраза исключает пустые капсиды AAV, векторы AAV без полноразмерной вставки в упакованном геноме или векторы AAV, содержащие контаминирующие нуклеиновые кислоты клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления термин «собственно векторы rAAV» относится к векторным частицам rAAV, которые также не содержат контаминирующих плазмидных последовательностей в упакованном геноме вектора.
Термины «пустые капсиды» и «пустые частицы» относятся к частицам или вирионам AAV, которые содержат капсидную оболочку AAV, но в них полностью или частично отсутствует геном, содержащий гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, фланкированную с одной или обеих сторон ITR AAV. Такие пустые капсиды не функционируют для переноса гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или клетки организма.
Термин «вектор» относится к небольшому носителю молекулы нуклеиновой кислоты, плазмиде, вирусу (например, вектору rAAV) или другому носителю, которым можно манипулировать путем вставки или включения нуклеиновой кислоты. Векторы можно использовать для генетических манипуляций (то есть «клонирующие векторы»), для введения/переноса полинуклеотидов в клетки и для транскрипции или трансляции вставленного полинуклеотида в клетках. «Экспрессирующий вектор» представляет собой вектор, который содержит последовательность гена или нуклеиновой кислоты с необходимыми регуляторными областями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине. Векторная последовательность нуклеиновой кислоты обычно содержит, по меньшей мере, точку начала репликации для размножения в клетке и необязательно дополнительные элементы, такие как гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, элемент контроля экспрессии (например, промотор, энхансер), интрон, инвертированные концевые повторы (ITR), опционально селектируемый маркер, сигнал полиаденилирования.
Вектор rAAV образован на основе аденоассоциированного вируса. Векторы AAV применяются в качестве векторов для генной терапии, поскольку с их помощью можно вводить нуклеиновые кислоты/генетический материал в клетки, так что нуклеиновые кислоты/генетический материал могут сохраняться в клетках. Поскольку AAV не ассоциированы с патогенным заболеванием у людей, векторы rAAV могут доставлять гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот (например, терапевтические белки и агенты) пациентам, не вызывая значительного патогенеза или заболевания AAV.
Термин «рекомбинантный», относящийся к вектору, такому как векторы rAAV, а также к последовательностям, таким как рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что композиции были получены (то есть сконструированы) способом, который обычно не встречается в природе. Конкретным примером рекомбинантного вектора AAV может являться нуклеиновая кислота, которая обычно не присутствует в геноме AAV дикого типа и встроена в вирусный геном. Примером может являться нуклеиновая кислота (например, ген), кодирующая терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность, которая клонирована в вектор с 5’, 3’ и/или интронными областями, с которыми ген обычно ассоциирован в геноме AAV. Хотя термин «рекомбинантный» не всегда используется в настоящем документе применительно к векторам AAV, а также к последовательностям, таким как полинуклеотиды, очевидно включены также рекомбинантные формы, включая векторы AAV, полинуклеотиды и т.д., несмотря на любое подобное упущение.
«Вектор на основе rAAV» или «вектор rAAV» образован из генома вируса дикого типа, такого как AAV, с использованием молекулярных способов, путем удаления генома дикого типа из генома AAV и замены его на ненативную (гетерологичную) нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность. Как правило, в случае AAV в векторе rAAV сохраняются одна или обе последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) генома AAV. rAAV отличается от генома AAV, поскольку весь или часть генома AAV заменены ненативной последовательностью по отношению к геномной нуклеиновой кислоте AAV, такой как гетерологичная нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность. Следовательно, включение ненативной последовательности определяет AAV как «рекомбинантный» вектор AAV, который можно называть «вектором rAAV».
ex vivo
in vitro
in vivo
Последовательность рекомбинантного вектора AAV может быть упакована в именуемую в настоящем документе «частицу» для последующего инфицирования (трансдукции) клетки ,  или . Когда рекомбинантная векторная последовательность инкапсидируется или упаковывается в частицу AAV, частица также может именоваться как «rAAV» или «частица rAAV» или «вирион rAAV». Такие rAAV, частицы rAAV и вирионы rAAV включают белки, которые инкапсидируют или заключают в себе геном вектора. Конкретные примеры в случае AAV включают капсидные белки.
Термин «геном» вектора относится к той части рекомбинантной плазмидной последовательности, которая в конечном итоге упаковывается или инкапсидируется с образованием частицы rAAV. В случаях, когда рекомбинантные плазмиды используются для конструирования или производства рекомбинантных векторов AAV, геном вектора AAV не включает часть «плазмиды», которая не соответствует векторной геномной последовательности рекомбинантной плазмиды. Эта не векторная часть генома рекомбинантной плазмиды именуется «плазмидный остов», который важен для клонирования и амплификации плазмиды, процесса, необходимого для размножения и продукции рекомбинантного вируса, но который сам по себе не упакован или инкапсидирован в частицы rAAV. Таким образом, термин «геном» вектора относится к нуклеиновой кислоте, которая упакована или инкапсидирована в rAAV.
Термин «вспомогательные функциональные элементы для AAV» относится к кодирующим последовательностям (белкам), полученным из AAV, которые могут экспрессироваться с образованием продуктов генов AAV и векторов AAV, которые, в свою очередь, функционируют в транс-положении и для обеспечения продуктивной репликации и упаковки AAV. Таким образом, вспомогательные функциональные элементы AAV включают открытые рамки считывания (ORF) AAV, включая rep, cap и другие, например, AAP для определенных серотипов AAV. Было показано, что продукты экспрессии Rep обладают многими функциями, включая, среди прочего: распознавание, связывание и никирование точки начала репликации ДНК AAV; ДНК-хеликазную активность; и модуляцию транскрипции с AAV (или других гетерологичных) промоторов. Продукты экспрессии Cap (капсиды) обеспечивают необходимые функции при упаковке. Вспомогательные функциональные элементы AAV используются в транс-положении для дополнения функциональных элементов AAV, которые отсутствуют в геномах вектороа AAV.
Термин «вспомогательная конструкция для AAV» обычно относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидные последовательности, обеспечивающие функции AAV, удаленные из вектора AAV, который должен использоваться, например, для получения трансдуцирующего вектора AVV для доставки субъекту путем генной терапии интересующей последовательности нуклеиновой кислоты. Вспомогательные конструкции для AAV обычно используются для обеспечения временной экспрессии генов AAV rep и/или cap для восполнения отсутствующих функций AAV, необходимых для репликации вектора AAV. Как правило, вспомогательные конструкции не имеют ITR AAV и не могут самореплицироваться и самостоятельно упаковываться. Вспомогательные конструкции AAV могут быть в форме плазмиды, фага, транспозона, космиды, вируса или вириона. Был описан ряд вспомогательных конструкций для AAV, таких как плазмиды pAAV/Ad и pIM29+45, которые кодируют как продукт экспрессии Rep, так и продукт экспрессии Cap (Смотрите, например, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; и McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945). Был описан ряд других векторов, которые кодируют продукты экспрессии Rep и/или Cap (Смотрите, например, патенты США номер 5139941 и 6376237).
Термин «вспомогательные функции» относится к вирусным (не связанным с AAV) и/или клеточным функциям, от которых зависит репликация AAV. Термин включает белки и РНК, которые необходимы для репликации AAV, включая фрагменты, вовлеченные в активацию транскрипции генов AAV, стадиеспецифический сплайсинг мРНК AAV, репликацию ДНК AAV, синтез продуктов экспрессии Cap и упаковку капсида AAV. Вирусные вспомогательные функциональные элементы могут происходить от любого из известных вирусов-помощников, таких как аденовирус, вирус герпеса (кроме вируса простого герпеса 1 типа) и вирус коровьей оспы.
Термин «вспомогательный вектор» обычно относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотидные последовательности, обеспечивающие вспомогательные функции. Такие последовательности могут находиться во вспомогательном векторе и трансфицироваться в подходящую клетку-хозяина. Вспомогательный вектор способен поддерживать продукцию вириона rAAV в клетке-хозяине. Вспомогательные векторы могут быть в форме плазмиды, фага, транспозона или космиды. Кроме того, для осуществления вспомогательных функций не требуется полный набор генов аденовируса. Например, сообщалось, что аденовирусные мутанты, неспособные к репликации ДНК и позднему синтезу генов, допускают репликацию AAV (Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317). Аналогично, мутанты в областях E2B и E3, как было показано, поддерживают репликацию AAV, что указывает на то, что области E2B и E3, вероятно, не требуются для обеспечения вспомогательных функций (Carter et al., (1983) Virology 126:505). Аденовирусы, дефектные в области E1 или у которых удалена область E4, не могут поддерживать репликацию AAV. Таким образом, области E1A и E4 кажутся, прямо или косвенно, необходимыми для репликации AAV (Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505). Другие охарактеризованные аденовирусные мутанты включают: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), supra); и E4 (Carter et al.(1983), supra; Carter (1995)). Исследования вспомогательных функций, обеспечиваемых аденовирусами, имеющими мутации в кодирующей области E1B, дали противоречивые результаты, но E1B55k может быть необходима для продукции вириона AAV, а E1B19k - нет (Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210). Кроме того, в международной публикации номер WO 97/17458 и в Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, описаны вспомогательные векторы, кодирующие различные гены аденовируса. Примеры вспомогательных векторов включают РНК кодирующую область VA аденовируса, кодирующую область ORF6 аденовируса E4, кодирующую область E2A 72 кД аденовируса, кодирующую область E1A аденовируса и область E1B аденовируса, в которой отсутствует интактная кодирующая область E1B55k. Такие вспомогательные векторы описаны, например, в международной публикации номер WO 01/83797.
В настоящем документе термин «серотип» означает отличительную особенность, используемую для обозначения AAV, имеющего капсид, который серологически отличается от других серотипов AAV. Серологические особенности определяются по отсутствию перекрестной реактивности между антителами к разным AAV. Различия в перекрестной реактивности обычно обусловлены различиями в последовательностях капсидных белков/антигенных детерминант (например, из-за различий последовательностей VP1, VP2 и/или VP3 серотипов AAV).
Согласно традиционному определению, серотип означает, что интересующий вирус был протестирован на присутствие нейтрализующее
й активности в сыворотке, специфичной ко всем существующим и охарактеризованным серотипам, и при этом не было обнаружено никаких антител, которые нейтрализуют интересующий вирус. При обнаружении встречающихся в природе изолятов вируса и/или при получении капсидных мутантов, они могут либо иметь, либо не иметь серологические различия с любым из существующих в настоящее время серотипов. Таким образом, в тех случаях, когда новый вирус (например, AAV) не имеет серологических отличий, этот новый вирус (например, AAV) будет подгруппой или вариантом соответствующего серотипа. Для многих мутантных вирусов с модификациями капсидной последовательности еще предстоит провести серологическое тестирование на нейтрализующую активность, чтобы определить, имеют ли они другой серотип в соответствии с традиционным определением серотипа. Соответственно, для удобства и во избежание повторений термин «серотип» в широком смысле относится как к серологически различным вирусам (например, AAV), так и к вирусам (например, AAV), которые не являются серологически различными и могут представлять собой подгруппу или вариант данного серотипа.
Векторы rAAV включают любой вирусный штамм или серотип. В качестве неограничивающего примера, плазмида или геном вектора или частица (капсид) rAAV могут быть основаны на любом серотипе AAV, таком как, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11. Такие векторы могут быть основаны на одном и том же штамме или серотипе (или подгруппе или варианте) или могут отличаться друг от друга. В качестве неограничивающего примера плазмида или геном вектора или частица (капсид) rAAV, основанные на геноме одного серотипа, могут быть идентичны одному или нескольким капсидным белкам, упаковывающим вектор. Кроме того, плазмида или геном вектора rAAV могут быть основаны на геноме серотипа AAV (например, AAV2), отличающемся одним или несколькими капсидными белками, упаковывающими геном вектора, и в этом случае по меньшей мере один из трех капсидных белков может иметь, например, последовательность AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или их варианты. Следовательно, векторы rAAV включают генные/белковые последовательности, идентичные генным/белковым последовательностям, характерным для конкретного серотипа, а также для смешанных серотипов.
В различных примерах вариантов осуществления вектор rAAV включает или содержит последовательность капсида, которая, по меньшей мере, на 70% или больше (например, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.) идентична одной или нескольким последовательностям капсидных белков AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. В различных примерах вариантов осуществления вектор rAAV включает или содержит последовательность, которая, по меньшей мере, 70% или больше (e.g., 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.) идентична ITR одного или нескольких AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10 или Rh74.
rAAV, такой как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 и их варианты, гибридные и химерные последовательности, могут быть сконструированы с помощью рекомбинантных способов, известных специалисту в данной области, для включения одной или нескольких гетерологичных полинуклеотидных последовательностей (трансгенов), фланкированных одной или несколькими функциональными последовательностями ITR AAV. У таких векторов один или несколько генов AAV дикого типа полностью или частично удалены, но при этом они сохраняют, по меньшей мере, одну функциональную фланкирующую ITR последовательность, необходимую для выживания, репликации и упаковки рекомбинантного вектора в векторную частицу rAAV. Поэтому геном вектора rAAV будет включать в цис-положении последовательности, необходимые для репликации и упаковки (например, функциональные последовательности ITR).
Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, а также сплайсированную или не сплайсированную мРНК, рРНК, тРНК и ингибирующую ДНК или РНК (интерферирующая РНК, например, (sh)РНК с малой или короткой шпилькой, микроРНК, малая интерферирующая (ми)РНК, транс-сплайсинговая РНК или антисмысловая РНК). Нуклеиновые кислоты включают встречающиеся в природе, синтетические и намеренно модифицированные или измененные полинуклеотиды. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или трехцепочечными, линейными или кольцевыми и могут иметь любую длину. При обсуждении нуклеиновых кислот последовательность или структура конкретного полинуклеотида записываются в настоящем документе, как это принято, в направлении от 5'-конца к 3'-концу.
Термин «гетерологичная» последовательность нуклеиновой кислоты относится к полинуклеотиду, вставленному в плазмиду или вектор AAV, для опосредованного вектором переноса/доставки полинуклеотида в клетку. Гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот отличаются от нуклеиновой кислоты AAV, то есть не являются нативными по отношению к нуклеиновой кислоте AAV. После переноса/доставки в клетку гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в векторе, может экспрессироваться (например, транскрибироваться и транслироваться, если необходимо). Альтернативно, гетерологичный полинуклеотид, содержащийся в векторе и перенесенный/доставленный в клетку, не обязательно должен экспрессироваться. Хотя термин «гетерологичный» применительно к последовательностям нуклеиновой кислоты и полинуклеотидам не всегда используется в настоящем документе, ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты или полинуклеотид даже в отсутствие этого модификатора «гетерологичный» подразумевает включение гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты и полинуклеотидов.
«Полипептиды», «белки» и «пептиды», кодируемые «последовательностью нуклеиновой кислоты», включают полноразмерные нативные последовательности, как в случае белков, встречающихся в природе, так и в случае функциональных подпоследовательностей, модифицированных форм или вариантов последовательности, при условии, что подпоследовательность, модифицированная форма или вариант сохраняют некоторую степень функциональности нативного полноразмерного белка. Такие полипептиды, белки и пептиды, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот, могут быть, но не обязательно, идентичными эндогенному белку, который является дефектным или экспрессия которого недостаточна или недостаточна у млекопитающего, подвергаемого терапии.
Термин «трансген» используется в настоящем документе для удобства обозначения нуклеиновой кислоты (например, гетерологичной), которая предназначена для введения или была введена в клетку или организм. Трансгены включают любую нуклеиновую кислоту, такую как гетерологичная нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность.
В клетку, содержащую трансген, трансген был введен/перенесен посредством плазмиды или вектора AAV, «трансдукции» или «трансфекции» клетки. Термины «трансдуцировать» и «трансфицировать» относятся к введению молекулы, такой как нуклеиновая кислота, в клетку-хозяина (например, HEK293) или клетки организма. Трансген может быть или может не быть интегрирован в геномную нуклеиновую кислоту клетки-реципиента. Если введенная нуклеиновая кислота интегрируется в нуклеиновую кислоту (геномную ДНК) клетки или организма-реципиента, она может стабильно присутствовать в этой клетке или организме и далее передаваться или наследоваться клетками-потомками или организмами-потомками клеток-реципиента или клеток организм.
Термин «клетка-хозяин» обозначает, например, микроорганизмы, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки млекопитающих, которые могут быть использованы или были использованы в качестве реципиентов векторной плазмиды AAV, вспомогательной конструкции AAV, вспомогательного вектора или другой транспортной ДНК. Термин включает потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Таким образом, «клетка-хозяин» обычно относится к клетке, которая была трансфицирована экзогенной последовательностью ДНК. Понятно, что потомство одной родительской клетки может не обязательно быть полностью идентичным по морфологии или геному с исходной родительской клеткой вследствие естественной, случайной или преднамеренной мутации. Примеры клеток-хозяев включают человеческие эмбриональные клетки почек (HEK), такие как HEK293.
«Трансдуцированная клетка» представляет собой клетку, в которую введен трансген. Соответственно, «трансдуцированная» клетка означает генетическое изменение в клетке после включения экзогенной молекулы, например, нуклеиновой кислоты (например, трансгена) в клетку. Таким образом, «трансдуцированная» клетка представляет собой клетку или ее потомство, в которую была введена экзогенная нуклеиновая кислота. Клетка (клетки) может размножаться (культивироваться), при этом экспрессируется введенный белок или транскрибируется нуклеиновая кислота, или вектор, такой как rAAV, продуцируется клеткой. Для способов и применений в рамках генной терапии трансдуцированная клетка может находиться в субъекте.
В настоящем документе термин «стабильный» по отношению к клетке или «стабильно интегрированный» означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, такие как селектируемый маркер или гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, или плазмида, или вектор, были вставлены в хромосому (например, путем гомологичной рекомбинации, негомологичного соединения концов, трансфекции и т.п.) или сохраняются в клетке-реципиенте или организме-хозяине внехромосомно, оставаясь в хромосоме или сохраняясь внехромосомно в течение определенного периода времени. В культуре клеток последовательности нуклеиновой кислоты, такие как гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты или плазмида, или вектор, вставленные в хромосому, могут сохраняться в хромосоме на протяжении большого количества клеточных пассажей.
in vitro
Термин «линия клеток», или «клеточная линия» относится к популяции клеток, способных к непрерывному или длительному росту и делению  в соответствующих условиях культивирования. Клеточные линии могут быть, но не обязательно, клонами одной клетки-предшественника. В клеточных линиях могут происходить спонтанные или индуцированные изменения в кариотипе в процессе поддержания линии клеток или при переносе таких клонов, а также во время длительного пассирования в культуре ткани. Таким образом, клетки-потомки, полученные из клеточной линии, могут не быть точно идентичными клеткам или культурам-предшественникам. Примером клеточной линии, применимой для способов очистки по настоящему изобретению, является HEK293.
Термин «элемент контроля экспрессии» относится к последовательности (последовательностям) нуклеиновой кислоты, которые влияют на экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты. Элементы контроля, включая элементы контроля экспрессии, упоминаемые в настоящем документе, такие как промоторы и энхансеры. Векторы rAAV могут включать один или несколько «элементов контроля экспрессии». Как правило, такие элементы включаются для обеспечения правильной транскрипции гетерологичного полинуклеотида и, если необходимо, трансляции (например, промотор, энхансер, сигнал сплайсинга для интронов, способствующий сохранению правильной рамки считывания гена и обеспечения правильной трансляции мРНК, стоп-кодоны и т.д.). Такие элементы как правило действуют в цис-положении и именуются «цис-действующими» элементами, но могут действовать также в транс-положении.
Контроль экспрессии может осуществляться на уровне транскрипции, трансляции, сплайсинга, стабильности информационной РНК и т.д. Как правило, элемент контроля экспрессии, который модулирует транскрипцию, располагается рядом с 5'-концом (то есть, «перед») транскрибируемой нуклеиновой кислоты. Элементы контроля экспрессии также могут быть расположены на 3'-конце (то есть «после») транскрибируемой последовательности или внутри транскрипта (например, в интроне). Элементы контроля экспрессии могут быть расположены рядом или на расстоянии от транскрибируемой последовательности (например, на расстоянии 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-500 или более нуклеотидов от полинуклеотида), даже на значительном расстоянии. Тем не менее, из-за ограничений по длине векторов rAAV элементы контроля экспрессии обычно находятся в пределах 1-1000 нуклеотидов от транскрибируемой нуклеиновой кислоты.
Функционально, экспрессия функционально связанной нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, частично контролируется элементом (например, промотором), так что этот элемент модулирует транскрипцию нуклеиновой кислоты и, при необходимости, трансляцию транскрипта. Конкретным примером элемента контроля экспрессии является промотор, который обычно расположен в левее (с 5'-конца от) транскрибируемой последовательности. Промотор, как правило, увеличивает количество транскриптов, экспрессируемых с функционально связанной нуклеиновой кислоты, по сравнению с количеством транскриптов, экспрессируемых в отсутствие промотора.
В настоящем документе термин «энхансер» может относиться к последовательности, которая расположена рядом с последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как селектируемый маркер, или гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Энхансерные элементы обычно расположены перед промоторным элементом, но также функционируют и могут быть расположены после или внутри последовательности. Следовательно, энхансерный элемент может быть расположен до или после, например, в пределах 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или более пар оснований от последовательности нуклеиновой кислоты, такой как селектируемый маркер, и/или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность. Энхансерные элементы обычно увеличивают экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты по сравнению с экспрессией, обеспечиваемой промоторным элементом.
Термин «функционально связанный» означает, что регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, расположены в подходящих положениях относительно последовательности, чтобы влиять на экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты. Это же определение иногда применяется к расположению последовательностей нуклеиновых кислот и элементов контроля транскрипции (например, промоторов, энхансеров и терминаторов) в экспрессирующем векторе, например, в векторе rAAV.
В примере элемента контроля экспрессии он функционально связан с нуклеиновой кислотой таким образом, что элемент контроля модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Более конкретно, например, то, что две последовательности ДНК являются функционально связанными, означает, что две ДНК расположены (цис или транс) таким образом, что, по меньшей мере, одна из последовательностей ДНК способна оказывать физиологическое воздействие на другую последовательность.
Соответственно, дополнительные элементы для векторов включают, без ограничения, элемент контроля экспрессии (например, промотор/энхансер), сигнал терминации транскрипции или стоп-кодон, 5'- или 3'-нетранслируемые области (например, последовательности полиаденилирования (полиА)), которые фланкируют последовательность, например, одна или несколько копий последовательности ITR AAV, или интрон.
Дополнительные элементы включают, например, полинуклеотидные последовательности филлеры или спейсеры, например, обеспечивающие лучшую упаковку и снижающие количество контаминирующей нуклеиновой кислоты. Векторы AAV, как правило, включают вставки ДНК, имеющие размер в диапазоне от примерно 4 до примерно 5,2 т.п.н. или немного больше. Таким образом, для более коротких последовательностей необходимо включение филлера или спейсера, чтобы отрегулировать длину примерно до нормального размера геномной последовательности вируса, приемлемой для упаковки вектора в частицу rAAV. В различных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты филлера/спейсера представляет собой нетранслируемый (не кодирующий белок) сегмент нуклеиновой кислоты. Для последовательности нуклеиновой кислоты менее 4,7 Кб, полинуклеотидная последовательность филлера или спейсера будет иметь такую длину, чтобы суммарная (например, после вставки в вектор) последовательность имела длину примерно 3,0-5,5 Кб или примерно 4,0-5,0 Кб, или примерно 4,3-4,8 Кб.
«Терапевтический белок» в одном из вариантов осуществления представляет собой пептид или белок, который может ослаблять или уменьшать симптомы, возникающие вследствие недостаточного количества, отсутствия или дефекта белка в клетке или у субъекта. «Терапевтический» белок, кодируемый трансгеном, может принести пользу субъекту, например, исправить генетический дефект, исправить недостаточность (экспрессии или функциональности) гена и т.п.
Неограничивающие примеры гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих продукты генов (например, терапевтические белки), применяемых в соответствии с настоящим изобретением, включают те, которые могут применяться для лечения заболевания или расстройства, включая, но не ограничиваясь этим, нарушения «гемостаза» или нарушения свертываемости крови, такие как гемофилия А, пациенты с гемофилией А и ингибиторными антителами, гемофилия В, дефицит факторов свертывания крови VII, VIII, IX и X, XI, V, XII, II, фактора фон Виллебранда, комбинированный дефицит FV/FVIII, талассемия, дефицит эпоксидредуктазы С1 витамина К, дефицит гамма-карбоксилазы; анемию, кровотечение, связанное с травмой, повреждение, тромбоз, тромбоцитопению, инсульт, коагулопатию, синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром); чрезмерную антикоагуляция, связанную с гепарином, гепарином с низкой молекулярной массой, пентасахаридом, варфарином, низкомолекулярными антитромботиками (т.е. ингибиторами FXa); и расстройства тромбоцитов, такие как синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцманна и дефицит пула тромбоцитов.
in vitro
Молекулы нуклеиновых кислот, векторы, такие как векторы для клонирования, экспрессирующие векторы (например, геномы векторов) и плазмиды, могут быть получены с использованием способов рекомбинантных ДНК. Доступность информации о нуклеотидных последовательностях позволяет получать молекулы нуклеиновых кислот различными способами. Например, гетерологичная нуклеиновая кислота, кодирующая Фактор IX (FIX), содержащая вектор или плазмиду, может быть получена различными стандартными способами клонирования, с помощью технологии рекомбинантных ДНК, посредством экспрессии в клетках или  трансляции и путем химического синтеза. Чистоту полинуклеотидов можно определить с помощью секвенирования, гель-электрофореза и т.п. способов. Например, нуклеиновые кислоты могут быть выделены с помощью способов гибридизации или компьютерных способов скрининга базы данных. Такие способы включают, но не ограничиваясь этим: (1) гибридизацию библиотек геномной ДНК или кДНК с зондами для обнаружения гомологичных нуклеотидных последовательностей; (2) скрининг с использованием антител для выявления полипептидов, имеющих общие структурные особенности, например, с использованием библиотеки экспрессии; (3) полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на геномной ДНК или кДНК с использованием праймеров, отжигающихся на интересуемую последовательность нуклеиновой кислоты; (4) компьютерный поиск родственных последовательностей по базам данных последовательностей; и (5) дифференциальный скрининг библиотеки вычитаемых нуклеиновых кислот.
in vivo
Термин «выделенный», когда он используется в качестве модификатора композиции, означает, что композиции созданы руками человека или выделены, полностью или, по меньшей мере, частично, из их природного окружения . Как правило, выделенные композиции по существу не содержат одного или нескольких материалов, с которыми они обычно ассоциированы в природе, например, одного или нескольких белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, клеточных мембран.
Что касается белка, в настоящем документе иногда используется термин «выделенный белок» или «выделенный и очищенный белок». Этот термин относится в первую очередь к белку, продуцируемому вследствие экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. Альтернативно, этот термин может относиться к белку, который был достаточно хорошо отделен от других белков, с которыми он был ассоциирован в природных условиях, так что он существует «по существу в чистой» форме.
Термин «выделенный» не исключает комбинации, получаемой рукой человека, например, рекомбинантный rAAV и фармацевтическая композиция. Термин «выделенный» также не исключает альтернативные физические формы композиции, такие как гибриды/химеры, мультимеры/олигомеры, модификации (например, фосфорилирование, гликозилирование, липидирование) или дериватизированные формы, или формы, экспрессируемые в клетках-хозяевах, полученных рукой человека.
Термин «по существу чистый» относится к препарату, содержащему, по меньшей мере, 50-60% по массе представляющего интерес соединения (например, нуклеиновую кислоту, олигонуклеотид, белок и т.д.). Препарат может содержать, по меньшей мере, 75% по массе или примерно 90-99% по массе представляющего интерес соединения. Чистоту оценивают способами, подходящими для представляющего интерес соединения (например, хроматографическими способами, электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле, ВЭЖХ анализом и т.п.).
Фраза «состоящий в основном из» при ссылке на конкретную нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность означает последовательность, имеющую свойства данной последовательности. Например, при использовании в отношении аминокислотной последовательности фраза включает последовательность как таковую и молекулярные модификации, которые не влияют на основные и новые характеристики последовательности.
Способы, известные в данной области, для получения вирионов rAAV: например, трансфекция с использованием вектора AAV и вспомогательных последовательностей AAV в сочетании с коинфекцией одним вирусом-помощником AAV (например, аденовирусом, вирусом герпеса или вирусом коровьей оспы) или трансфекция рекомбинантным вектором AAV, вектором-помощником AAV и вспомогательным вектором. Неограничивающие способы получения вирионов rAAV описаны, например, в патентах США номер 6001650 и 6004797, международной заявке PCT/US16/64414 (опубликована как WO 2017/096039) и предварительных заявках на патент США номер 62/516432 и 62/531626. После образования рекомбинантного вектора rAAV (то есть продукции вектора в системах клеточных культур) вирионы rAAV могут быть получены из клеток-хозяев и супернатанта клеточной культуры и очищены, как изложено в настоящем документе.
На первой стадии обычно собирают клетки-хозяев, которые продуцируют вирионы rAAV, необязательно в сочетании со сбором супернатанта клеточной культуры (среды), в которой культивируют клетки-хозяев (суспензионные или адгезивные), продуцирующие вирионы rAAV. В описанных в настоящем документе способах собранные клетки и, необязательно, супернатант клеточной культуры могут использоваться без изменений, в зависимости от ситуации, или могут быть сконцентрированы. Кроме того, если инфекция осуществляется для экспрессии вспомогательных функциональных элементов, остаточный вирус-помощник может быть инактивирован. Например, аденовирус может быть инактивирован нагреванием до температуры приблизительно 60°С в течение, например, 20 минут или более, при этом инактивируется только вирус-помощник, поскольку AAV является термостабильным, тогда как аденовирус-помощник является термолабильным.
Клетки и/или супернатант урожая лизируют путем разрушения клеток, например, химическими или физическими способами, такими как обработка детергентом, микрофлюидизация и/или гомогенизация, для высвобождения частиц rAAV. Во время лизиса клеток или после лизиса клеток может быть добавлена нуклеаза, такая как бензоназа, для разрушения контаминирующей ДНК. Как правило, полученный лизат осветляют для удаления клеточного дебриса, например, путем фильтрации, центрифугирования, для получения осветленного клеточного лизата. В конкретном примере лизат фильтруют через фильтр с размером пор микронного диаметра (такой как фильтр с размером пор 0,1-10,0 мкм, например, фильтр с размером пор 0,45 мкм и/или размером пор 0,2 мкм), чтобы получить осветленный лизат.
Лизат (необязательно осветленный) содержит частицы AAV (собственно векторы rAAV и пустые капсиды AAV) и примеси, связанные с процессом производства вектора AAV, такие как растворимые клеточные компоненты из клеток-хозяев, которые могут включать, среди прочего, клеточные белки, липиды и/или нуклеиновые кислоты, и компоненты среды для культивирования клеток. Затем необязательно осветленный лизат подвергают дополнительным стадиям очистки для очистки частиц AAV (включая собственно векторы rAAV) от примесей с помощью хроматографии. Осветленный лизат может быть разбавлен или сконцентрирован подходящим буфером перед первым этапом хроматографии.
Как раскрыто в настоящем документе, после лизиса клеток, необязательного осветления и необязательного разбавления или концентрирования для очистки частиц rAAV применяется множество последовательных хроматографических стадий. Такие способы обычно исключают стадию ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия.
Как раскрыто в настоящем документе, первая стадия хроматографии может представлять собой катионообменную хроматографию или анионообменную хроматографию. Если первая стадия хроматографии представляет собой катионообменную хроматографию, вторая стадия хроматографии может представлять собой анионообменную хроматографию или эксклюзионную хроматографию (SEC). Таким образом, в одном из способов очистки rAAV очистка осуществляется с помощью катионообменной хроматографии с последующей очисткой с помощью анионообменной хроматографии.
Альтернативно, если первой стадией хроматографии является катионообменная хроматография, второй стадией хроматографии может быть эксклюзионная хроматография (SEC). Таким образом, в другом способе очистки rAAV очистка осуществляется с помощью катионообменной хроматографии с последующей очисткой с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC).
Как также раскрыто в настоящем документе, первая стадия хроматографии может представлять собой аффинную хроматографию. Если первым этапом хроматографии является аффинная хроматография, вторым этапом хроматографии может быть анионообменная хроматография. Таким образом, в еще одном способе очистки rAAV очистка осуществляется с помощью аффинной хроматографии с последующей очисткой с помощью анионообменной хроматографии.
Необязательно, к вышеуказанным стадиям хроматографии может быть добавлена третья хроматография. Как правило, необязательная третья хроматографическая стадия следует за стадиями катионообменной, анионообменной, эксклюзионной или аффинной хроматографии.
Таким образом, в дополнительном способе очистки rAAV очистка осуществляется с помощью катионообменной хроматографии с последующей очисткой с помощью анионообменной хроматографии с последующей очисткой с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). И в еще одном дополнительном способе очистки rAAV очистка осуществляется с помощью катионообменной хроматографии с последующей очисткой с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с последующей очисткой с помощью анионообменной хроматографии.
В еще одном дополнительном способе очистки rAAV очистка осуществляется с помощью аффинной хроматографии с последующей очисткой с помощью анионообменной хроматографии с последующей очисткой с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). В еще одном способе очистки rAAV очистка осуществляется с помощью аффинной хроматографии с последующей очисткой с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с последующей очисткой с помощью анионообменной хроматографии.

Катионообменная хроматография служит для отделения частиц AAV от клеточных и других компонентов, присутствующих в осветленном лизате и/или элюате с колонки после эксклюзионной хроматографии. Примеры сильных катионообменных смол, способных связывать частицы rAAV в широком диапазоне рН, включают, без ограничения, любые смолы на основе сульфоновой кислоты, на что указывает присутствие сульфонатной функциональной группы, в том числе арил- и алкилзамещенных сульфонатов, таких как сульфопропил или сульфоэтил. Типичные матрицы включают, но не ограничиваясь этим, POROS HS, POROS HS 50, POROS XS, POROS SP и POROS S (сильные катионообменники от Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA). Дополнительные примеры включают Capto S, Capto S ImpAct, Capto S ImpRes (сильные катионообменники от GE Healthcare, Marlborough, MA) и коммерческие серии смол DOWEX, AMBERLITE и AMBERLYST от Aldrich Chemical Company (Milliwaukee, WI). Слабые катионообменные смолы включают, без ограничения, любые смолы на основе карбоновых кислот. Примеры катионообменных смол также включают карбоксиметильные (CM), фосфо (на основе фосфатной функциональной группы), метилсульфонатные (S) и сульфопропиловые (SP) смолы.
Анионообменная хроматография служит для отделения частиц AAV от белков, клеточных и других компонентов, присутствующих в осветленном лизате и/или элюате с колонки после эксклюзионной хроматографии. Анионообменную хроматографию также можно использовать для контроля количества пустых капсидов AAV в элюате. Например, анионообменную колонку, со связанным с ней вектором rAAV, можно промыть средней концентрацией NaCl (например, около 100-125 мМ, например, 110-115 мМ), и элюировать часть пустых капсидов, не элюировав при этом векторы rAAV. Впоследствии вектор rAAV, связанный с анионообменной колонкой, может быть элюирован более высокой концентрацией NaCl (например, около 130-300 мМ NaCl), и получения таким образом элюата с колонки с уменьшенными количеством пустых капсидов AAV и пропорционально увеличенными количествами rAAV.
Примеры анионообменных смол включают, без ограничения, смолы на основе полиаминовых смол и других смол. Примеры сильных анионообменных смол включают смолы на основе, в основном, кватернизованного атома азота, в том числе, без ограничения, смолы на основе солей четвертичного аммония, такие как триалкилбензиламмонийные смолы. Подходящие смолы для обменной хроматографии включают, без ограничения, MACRO PREP Q (сильный анионообменник от BioRad, Hercules, Calif.); UNOSPHERE Q (сильный анионообменник от BioRad, Hercules, Calif.); POROS 50HQ (сильный анионообменник от Applied Biosystems, Foster City, Calif.); POROS XQ (сильный анионообменник от Applied Biosystems, Foster City, Calif.); POROS 50D (слабый анионообменник от Applied Biosystems, Foster City, Calif.); POROS 50PI (слабый анионообменник от Applied Biosystems, Foster City, Calif.); Capto Q, Capto XQ, Capto Q ImpRes и SOURCE 30Q (сильный анионообменник от GE healthcare, Marlborough, MA); DEAE SEPHAROSE (слабый анионообменник от Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.); Q SEPHAROSE (сильный анионообменник от Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Дополнительные примеры анионообменных смол включают смолы с аминоэтильными (AE), диэтиламиноэтильными (DEAE), диэтиламинопропильными (DEPE) и четвертичными аминоэтильными (QAE) группами.
Среду для хроматографии, для катионообменной, анионообменной, эксклюзионной и аффинной, можно уравновешивать, промывать и элюировать различными буферами при различных условиях, таких как рН и объем буфера. Нижеследующее предназначено для описания конкретных неограничивающих примеров, но не предназначено для ограничения изобретения.
Колонка для катионообменной хроматографии может быть уравновешена стандартными буферами и в соответствии со спецификациями производителя. Например, среда для хроматографии может быть уравновешена 5-100 мМ или 10-50 мМ фосфатным буфером, например, 10-30 мМ, и хлоридом натрия. После уравновешивания на колонку наносится образец. Затем хроматографическую среду промывают, по меньшей мере, один раз или более, например, 2-10 раз. Элюция с хроматографической среды осуществляется буфером с высоким содержанием соли, по меньшей мере, один раз, но также элюция может быть проведено 2 или более раз тем же буфером или буфером с более высоким содержанием соли.
Типичные буферы для уравновешивания, промывочные и элюирующие растворы для катионообменной хроматографии имеют подходящий pH в диапазоне примерно от 3 до 8, более типично от 4 до 7,5, такой как 6,0-6,5, 6,5-7,0, 7,0-7,5 или любой рН в пределах указанных диапазонов, например, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 или 7,4.
Подходящие буферы для уравновешивания, промывочные и элюирующие растворы для катионообменных колонок известны в данной области и обычно являются анионными. Такие буферы включают, без ограничения, буферы, содержащие следующие буферные ионы: фосфат, ацетат, цитрат, борат или сульфат.
В одном из вариантов осуществления среду для катионообменной хроматографии сначала уравновешивают, наносят образец и промывают низкой концентрацией соли, например, 10-150 мМ NaCl, такой как 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 60-125 мМ или любой концентрацией в пределах этих диапазонов, например, 100 мМ.
После первой промывки среда для хроматографии может быть обработана более высокой концентрацией соли, чтобы элюировать примеси, например, более высокой концентрацией NaCl, или другим буфером с большей ионной силой. После элюции с колонки дополнительных примесей, для элюции частиц rAAV ионная сила буфера может быть увеличена с помощью соли, такой как NaCl, KCl, сульфат, формиат или ацетат, и извлечена. В одном из возможных вариантов осуществления элюция проводится высокой концентрацией соли, например, 200-500 мМ NaCl, или любой концентрацией в пределах этих диапазонов, например, 250 мМ, 300 мМ, 350 мМ или 400 мМ.
В буферы для уравновешивающие, промывочные и элюирующие растворы могут быть включены дополнительные компоненты. Например, промывочный буфер для катионообменной хроматографии может включать анионный сурфактант, такой как саркозил (например, 1-10 мМ), промывочный буфер для анионообменной хроматографии может включать катионный сурфактант, такой как хлорид додецилтриметиламмония (например, 1-10 мМ).
Типичные буферы для уравновешивания, промывочные и элюирующие растворы для анионообменной хроматографии имеют pH в диапазоне примерно 7,5-12, более типично, примерно 8,0-10, и еще более типично, примерно 8,0-9,0, например, pH 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0.
Подходящие буферы для уравновешивания, промывочные и элюирующие растворы для анионообменных колонок обычно имеют катионную или цвиттерионную природу. Такие буферы включают, без ограничения, буферы, содержащие следующие буферные агенты: N-метилпиперазин; пиперазин; Bis-Tris; Bis-Tris пропан; триэтаноламин; Tris; N-метилдиэтаноламин; 1,3-диаминопропан; этаноламин; уксусную кислоту и тому подобное. Чтобы элюировать образец, ионную силу исходного буфера увеличивают, используя соль, такую как NaCl, KCl, сульфат, формиат или ацетат. Такие буферы для уравновешивания, промывочные и элюирующие растворы могут содержать вышеуказанные буферные агенты в концентрации от примерно 5 до 100 мМ, более типично от примерно 10 до 50 мМ.
В одном из вариантов осуществления среду для анионообменной хроматографии сначала уравновешивают, наносят образец и промывают низкой концентрацией соли, например, 50-150 мМ NaCl, такой как 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-100 мМ или любой концентрацией в пределах этих диапазонов. После первой промывки среда для хроматографии может быть обработана более высокой концентрацией соли, чтобы элюировать примеси, такие как пустые капсиды AAV, например, более высокой концентрацией NaCl, или другим буфером с большей ионной силой. Одним из примеров буфера для использования в качестве второго буфера является Tris-буфер с концентрацией NaCl примерно 110 мМ-125 мМ или любой концентрацией в указанных пределах.
После элюции с колонки дополнительных примесей, частицы rAAV могут быть извлечены элюцией буфером с более высокой концентрацией соли. Одним из примеров элюирующего буфера является Tris-буфер с концентрацией NaCl 125 мМ или более, например, 125-150 мМ, 150-200 мМ или 200-250 мМ NaCl, или любой концентрацией в указанных пределах.
В промывочные растворы для анионообменных колонок может быть включен полиэтиленгликоль (ПЭГ). Такая хроматография называется колоночной хроматографией с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Промывочные растворы с ПЭГ можно наносить на анионообменную хроматографическую колонку перед элюцией векторных частиц AAV.
Обычно ПЭГ в таких промывочных растворах имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне примерно от 1000 до 80000 г/моль, включительно. Типичное количество ПЭГ в таких промывочных растворах находится в диапазоне от примерно 0,1% до примерно 20% ПЭГ или представляет собой любое количество в пределах этих заявленных диапазонов, или от примерно 1% до примерно 10% ПЭГ или любое количество в указанных пределах.
Среда для эксклюзионной хроматографии (SEC) может быть уравновешена стандартными буферами и в соответствии со спецификациями производителя. Например, среда для хроматографии может быть уравновешена фосфатным буфером с концентрацией, например, примерно 1-5 мМ, 5-50 мМ или 5-25 мМ, и NaCl с концентрацией, например, примерно 50-100 мМ, 100-150 мМ, 150-200 мМ, 200-250 мМ, 250-300 мМ или 300-400 мМ, или любой концентрацией в указанных пределах.
После уравновешивания наносится образец. Далее собирается элюат, содержащий частицы rAAV. Для более полного извлечения частиц rAAV могут использоваться дополнительные объемы буфера (например, фосфатного буфера), исходя из количества среды для хроматографии и/или размера колонки.
В конкретных вариантах осуществления среда для эксклюзионной хроматографии имеет диапазон разделения (молекулярный вес) от 10000 до 600000 включительно. Конкретные смолы (среды), подходящие для эксклюзионной хроматографии, включают, без ограничения, частицы или шарики из пористой целлюлозы, поперечно сшитой агарозы (Sepharose, GE Healthcare, Marlborough, MA), поперечно сшитого декстрана (Sephadex, GE Healthcare, Marlborough, MA), стирол-дивинилбензола (Dianon HP-20), полиакриламида (Bio Gel), метакрилата (Toyopearl) и стекла с заданным размером пор.
Аффинные колонки обычно состоят из лиганда, связанного или конъюгированного с субстратом. Конкретные примеры лигандов включают AAV-связывающие антитела. Такие субстраты включают сефарозу и другие материалы, обычно используемые в таких применениях для аффинной очистки, и могут быть изготовлены или являются коммерчески доступными (например, AVB Sepharose™ High Performance, GE Healthcare, Marlborough, MA).
Подходящие буферы для уравновешивания, промывочные и элюирующие растворы для аффинных колонок известны обычно содержат Tris или ацетат. Например, среда для аффинной хроматографии может быть уравновешена Tris буфером с концентрацией, например, примерно 1-5 мМ, 5-50 мМ или 5-20 мМ, и NaCl с концентрацией, например, примерно 50-100 мМ, 100- 150 мМ, 150-200 мМ, 200-250 мМ, 250-300 мМ или или любой концентрацией в указанных пределах.
Типичные буферы для уравновешивания для аффинной хроматографии имеют pH в диапазоне примерно 7,5-9, более типично, примерно 8,0-8,5, и еще более типично, примерно 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 или 8,5.
После уравновешивания наносится образец. Далее частицы rAAV элюируют с аффинной колонки путем снижения рН буфера ниже 7,0. Элюирующий буфер может содержать ацетат, и pH буфера обычно меньше 5,0, более типично меньше 4,0, например, меньше 3,0, более конкретно, примерно между 2,0 и 3,0, или любой pH в указанных пределах.
Объемы буферов для уравновешивания, промывочных и элюирующих растворов могут меняться в зависимости от количества среды для хроматографии и/или размера колонки для более полного извлечения частиц rAAV. Типичные объемы составляют 1-10 объемов колонки.
Элюат с колонки собирают после проведения элюата/фильтрата через каждую из стадий хроматографии. AAV могут быть обнаружены во фракциях с использованием стандартных способов, таких как мониторинг поглощения УФ-излучения при 260 и 280 нм.
Использование катионной или анионообменной среды для хроматографии, природа используемой среды (т.е. сильные или слабые ионообменники), концентрация соли, используемый буфер и pH могут варьироваться в зависимости от капсида AAV (то есть серотипа или псевдотипа капсида AAV). Тогда как структура капсидов AAV может не сильно различаться по размеру и форме, капсиды могут иметь разные аминокислотные последовательности, что приводит к тонким различиям в топологии молекул и распределении поверхностного заряда. Таким образом, ожидается, что варианты капсидной последовательности будут поддаваться очистке способами по изобретению, и подходящие способы могут быть определены путем методичного подбора среды для хроматографии и скрининга буферов с целью выявления различных условий для варианта капсида AAV, которые могут применяться для очистки частиц rAAV.
Элюаты, содержащие частицы rAAV, после любой стадии катионообменной, анионообменной, эксклюзионной и/или аффинной хроматографии, описанные в настоящем документе, если необходимо, могут быть эффективно сконцентрированы путем ультрафильтрации/диафильтрации. Уменьшение объема может контролироваться специалистом в данной области. В конкретных неограничивающих примерах достигается уменьшение объема примерно в 1-30 раз, включительно. Таким образом, уменьшение в 1 раз уменьшает объем наполовину, например, 1000 мл сконцентрированы до 500 мл. 10-кратное уменьшение означает уменьшение объема в 10 раз, например, 2000 мл сконцентрированы до 200 мл. 20-кратное уменьшение означает уменьшение объема в 20 раз, например, 2000 мл сконцентрированы до 100 мл. 30-кратное уменьшение означает уменьшение объема в 30 раз, например, 2000 мл сконцентрированы до 66,67 мл.
Неограничивающим примером ультрафильтрации/диафильтрации является тангенциальная проточная фильтрация (TFF). Например, мембрана из полых волокон с номинальным размером пор, соответствующим молекулярной массе 100 кДа, так что вектор AAV может быть выделен в больших количествах из большого объема элюата.
Клеточный лизат и элюаты с колонки, содержащие частицы rAAV, после любой из стадий катионообменной, анионообменной, эксклюзионной или аффинной хроматографии, описанные в настоящем документе, если необходимо, могут быть разбавлены. Типичные разведения составляют 25-100%, в 1-2 раза, в 2-5 раз или до любого объема, или в любое количество раз в указанных пределах.
Способы по настоящему изобретению обеспечивают извлечение значительного количества частиц rAAV. Например, способы по настоящему изобретению обеспечивают извлечение приблизительно 40-70% частиц rAAV от общего количества векторных частиц rAAV из клеток-хозяев и собранного супернатанта от клеточной культуры-хозяина. В другом примере частицы rAAV присутствуют в конечном (например, после третьей колонки) элюате в концентрации примерно 100 мг/мл. Векторные частицы rAAV могут присутствовать в конечном (например, после третьей колонки) элюате в концентрации примерно 1010-1011 частиц на мл или более, 1011-1012 частиц на мл, 1012-1013 частиц на мл.
Альтернативно, если концентрации векторных частиц rAAV меньше, очищенные частицы rAAV могут быть сконцентрированы. Например, очищенные частицы AAV могут быть сконцентрированы ультрафильтрацией/диафильтрацией (например, TFF). Если необходимы более высокие концентрации вектора, очищенные частицы AAV могут быть сконцентрированы до 1012-1013 частиц на мл или более, 1013-1014 частиц на мл или более с помощью ультрафильтрации/диафильтрации (например, TFF) или даже более.
В других вариантах осуществления частицы rAAV с упакованными геномами (т.е. собственно векторные частицы rAAV) «по существу не содержат «примесей нуклеиновых кислот, инкапсидированных в AAV», когда, по меньшей мере, примерно 30% или больше присутствующих вирионов представляют собой частицы rAAV с упакованными геномами (т.е., собственно векторные частицы rAAV). При продукции частиц rAAV с упакованными геномами (т.е. собственно векторных частиц rAAV), по существу, не содержащих примесей нуклеиновых кислот, инкапсидированных в AAV, количество продукта, содержащего примеси нуклеиновых кислот, инкапсидированные в AAV, может составлять от примерно 40% до примерно 20% или менее, от примерно 20% до примерно 10% или менее, от примерно 10% до примерно 5% или менее, от примерно 5% до примерно 1% или менее 1%.
Способы определения инфекционного титра вектора AAV, содержащего трансген, известны в данной области (смотрите, например, Zhen et al., (2004) Hum. Gene Ther. (2004) 15:709). Известны способы оценки пустых капсидов и векторных частиц AAV с упакованными геномами (смотрите, например, Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128).
Чтобы определить наличие или количество деградированного/денатурированного капсида, очищенный AAV может быть подвергнут электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле, для этого может использоваться любой гель, с помощью которого можно разделить три капсидных белка, например, градиентный гель, после разделения образца в геле, его переносят на найлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Далее используют антитела против капсидных белков AAV в качестве первичных антител, которые связываются с денатурированными капсидными белками (смотрите, например, Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293). Для обнаружения первичного антитела используется вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом. Связывание между первичным и вторичным антителами детектируется полуколичественно и таким образом определяется количество капсидов. Другим способом может быть аналитическая ВЭЖХ с колонкой для SEC или аналитическое ультрацентрифугирование.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя при практическом применении или испытании настоящего изобретения могут использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, подходящие способы и материалы описаны в настоящем документе.
Все упомянутые в настоящем документе заявки, публикации, патенты и другие ссылки, ссылки на GenBank и ATCC включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае противоречий, для проверки будет применяться спецификация, включая определения.
Все раскрытые в настоящем документе характеристики могут быть объединены в любой комбинации. Каждая характеристика, раскрытая в описании, может быть заменена альтернативной характеристикой, служащей той же, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если прямо не указано иное, раскрытые характеристики (например, последовательности нуклеиновой кислоты, векторы, векторы rAAV и т.д.) являются одним из примеров эквивалентных или сходных характеристик.
В настоящем документе формы единственного числа включают также референтов множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, например, ссылка на «вектор AAV» или «частицу AAV» включает множество таких векторов AAV и частиц AAV, а ссылка на «клетку» или «клетку-хозяина» включает множество клеток и клеток-хозяев.
В настоящем документе термин «примерно» означает значения, которые находятся в пределах 10% (плюс или минус) от заданного значения.
В настоящем документе все числовые значения или числовые диапазоны включают целые числа в таких диапазонах и доли значений или дробные числа в пределах диапазонов, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, в качестве иллюстрации, ссылка на идентичность на 80% или более включает 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% и т.д., а также 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% и т.д., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и т.д., и т.п.
Ссылка на целое число, которое больше или меньше, включает любое число, большее или меньшее, чем заданное число, соответственно. Так, например, ссылка на число меньше 100 включает 99, 98, 97 и т.д. вплоть до цифры один (1); а ссылка на число меньше 10 включает 9, 8, 7 и т.д. вплоть до цифры один (1).
В настоящем документе все числовые значения или диапазоны включены. Кроме того, все числовые значения или диапазоны включают доли значений и целых чисел в пределах таких диапазонов и дробные числа в пределах таких диапазонов, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, в качестве иллюстрации, ссылка на числовой диапазон, такой как 1-10, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., и т.п. Ссылка на диапазон 1-50, следовательно, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д., до 50 включительно, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и т.д., и т.п.
Ссылка на ряд диапазонов включает диапазоны, которые объединяют граничные значения различных диапазонов. Таким образом, в качестве иллюстрации, ссылка на ряд диапазонов, например, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000, включает диапазоны 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000 и т.п.
Изобретение в целом раскрыто в настоящем документе с использованием утвердительного языка для описания многочисленных вариантов осуществления и аспектов. Изобретение также, в частности, включает варианты осуществления, в которых исключается конкретный объект, полностью или частично, такой как вещества или материалы, стадии способа и условия, протоколы или методики. Например, в некоторых вариантах осуществления или аспектах изобретения исключаются материалы и/или стадии способа. Таким образом, даже если изобретение в целом не описывается в настоящем документе в тех терминах, которые изобретение не включает, аспекты, которые прямо не исключены в настоящем изобретении, тем не менее, раскрыты в настоящем документе.
Был описан ряд вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, специалист в данной области техники, не отступая от сущности и объема изобретения, может внести различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Соответственно, нижеследующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения объема заявленного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Примеры первой колонки, катионообменной или аффинной
1.1. Катионообменная колонка, Poros50 HS (или Poros XS от ThermoFisher). Прекондиционирование, уравновешивание, нанесение материала, промывка и элюция
1.1.1. Примеры буферов
1.1.1.1. Буфер, pH, проводимость
Прекондиционирование: вода для инъекций
3x буфер для разбавления: 60мМ Na-фосфат, pH 7,3
Буфер для уравновешивания: 20мМ Na-фосфат, pH 7,3, 100мМ NaCl
Промывочный буфер 1 и 3: 20мМ Na-фосфат, pH 7,3, 100мМ NaCl
Промывочный буфер 2: 20мМ Na-фосфат, pH 7,3, 100мМ NaCl, сурфактант (5мМ), такой как саркозил
Элюирующий буфер: 20мМ Na-фосфат, pH 7,3, 300мМ NaCl (может быть больше 300мМ, например, 300-400, например, 400мМ NaCl).
При сборе элюата основываться либо на объеме элюирующего буфера (например, элюат собирается после сбора объема пика, расположенного перед главным пиком, заданного заранее), либо на увеличении оптической плотности A280, например, повышение на 1 мЕОП по сравнению с базовым поглощением A280.
Раствор для стрипования: с высокой концентрацией соли, например, 1M NaCl
Раствор для санификации: 1M NaCl, 1N NaOH
Раствор для хранения: примерно 22,5% этанол (например, 18-22,5%)
1.1.2. Пример подготовки колонки
1.1.2.1. Прекондиционирование нисходящим потоком (4 объема колонки) воды для инъекций
1.1.2.2. Уравновешивание нисходящим потоком (4 объема колонки) буфера для уравновешивания
1.1.3. Пример очистки
1.1.3.1. Нанесение на колонку образца материала в режиме нисходящего потока (25 объемов колонки)
1.1.3.2. Промывка 1 нисходящим потоком (4 объема колонки) промывочного буфера 1
1.1.3.3. Промывка 2 нисходящим потоком (6 объемов колонки) промывочного буфера 2
1.1.3.4. Промывка 3 нисходящим потоком (8 объемов колонки) промывочного буфера 3
1.1.4. Пример блокирующего (промывочного) объема (объемов), определяемого в зависимости от масштаба, размера колонки
1.1.5. Емкость связывания: 2,5-3x нагрузка (Poros50 HS) с или без ультрафильтрации/диафильтрации
1.1.6. Примерная скорость потока: 150 см/ч - 300 см/ч
1.1.7. Допустимая нагрузка: 10 л или больше
1.1.8. Ожидаемое извлечение: 60-90%
1.2. Аффинная колонка, AVB-Sepharose HP
1.2.1. Список буферов
1.2.1.1. Буфер (pH, проводимость), каждый блокирующий объем
1.2.1.2. Примеры буферов/растворов
Буфер для уравновешивания: 20мМ Tris, pH 8,0, 250мМ NaCl
Элюирующий буфер: 10мМ Na-ацетат, pH 2,5, 250мМ NaCl
Нейтрализующий буфер: 1M Tris-Cl, pH 10,5
Раствор для санификации: PAB (120мМ фосфорная кислота, 167мМ уксусная кислота, 2,2% бензиловый спирт)
Раствор для хранения: примерно 22,5% этанол (например, 18-22,5%)
1.2.2. Примерная скорость потока: примерно 150 см/ч или больше
1.2.3. Ожидаемое извлечение: 70-90% (капсид вириона AAV), 15-70% (геномы векторов)
Пример 2
Примеры второй колонки, анионообменной или эксклюзионной
1.3. Анионообменная колонка, Poros 50HQ (Poros XQ от ThermoFisher). Прекондиционирование, уравновешивание, нанесение материала, промывка и элюция:
выполняет двойную функцию (дальнейшая очистка & контроль соотношения пустых и не пустых векторов)
1.3.1. Примеры буферов
1.3.1.1. Буфер, pH, проводимость, каждый блокирующий объем
Прекондиционирование: вода для инъекций
3x (или 4x) буфер для разбавления: примерно 60мМ (или примерно 80мМ) Tris, pH 8,5 (например, после разбавления, материал наносится в 10-50мМ Tris, pH 8,0-8,5, 100мМ NaCl)
Буфер для уравновешивания (и промывочный буфер 1): 20мМ Tris, pH 8,5, 100мМ NaCl
Промывочный буфер 2 (для удаления пустых капсидов AAV): 20мМ Tris, pH 8,5, 115mM NaCl
Элюирующий буфер: 20мМ Tris, pH 8,5, NaCl ≥ 120 мМ, например, 200мМ NaCl
Буфер для стрипования колонки: 1М NaCl
Раствор для санификации: 1 н. NaOH
Раствор для хранения: примерно 22,5% этанол (например, 18-22,5%)
1.3.2. Пример подготовки колонки
1.3.2.1. Прекондиционирование нисходящим потоком (5 объемов колонки) воды для инъекций
1.3.2.2. Уравновешивание нисходящим потоком (4 объема колонки) буфера для уравновешивания
1.3.3. Пример очистки
1.3.3.1. Нанесение на колонку элюата после катионообменной хроматографии & разбавленного элюата в режиме нисходящего потока (50 объемов колонки)
1.3.3.2. Промывка 1 нисходящим потоком (5 объемов колонки) буфера для уравновешивания
1.3.3.3. Элюция 1 (удаление пустых капсидов) нисходящим потоком (3 объема колонки) элюирующего буфера 1
1.3.3.4. Элюция 2 (извлечение не пустых векторов AAV) нисходящим потоком (3 объема колонки) элюирующего буфера 2
1.3.4. Примерная скорость потока: 150 см/ч - 300 см/ч
1.4. Колонка для эксклюзионной хроматографии, SEC (например, Superdex 200 prep grade от GE healthcare), опционально
1.4.1. Примеры буферов
1.4.1.1. Буфер, pH, проводимость, каждый блокирующий объем
Прекондиционирование: вода для инъекций
Буфер для уравновешивания, промывочный буфер & элюирующий буфер: 10мМ Na-фосфат, pH 7,2, 150-300мМ NaCl (более высокие концентрации NaCl, например, 300мМ, должны улучшать извлечение вектора AAV (геномы векторов).
При сборе элюата основываться либо на объеме элюирующего буфера (например, элюат собирается после сбора объема пика, расположенного перед главным пиком, заданного заранее), либо на увеличении оптической плотности A280, например, повышение на 1 мЕОП по сравнению с базовым поглощением A280.
Раствор для санификации: 0,5 н. NaOH
Раствор для хранения: 22,5% этанол (например, 18-22,5%)
1.4.2. Пример подготовки колонки
1.4.2.1. Прекондиционирование нисходящим потоком (2 объема колонки) воды для инъекций
1.4.2.2. Уравновешивание нисходящим потоком (2 объема колонки) буфера для уравновешивания (PBS 300)
1.4.3. Пример очистки
1.4.3.1. Нанесение на колонку материала в режиме нисходящего потока (0,05 объемов колонки)
1.4.4. Элюция нисходящим потоком (1,5 объема колонки) буфера для уравновешивания (dPBS)
1.4.5. Пример допустимой нагрузки: ≤5% объема колонки
1.4.6. Примерная скорость потока: 45 см/ч
1.4.7. При сборе элюата основываться либо на объеме элюирующего буфера, либо на оптической плотности A280
Пример 3
Пример третьей колонки, эксклюзионной или анионообменной. Третья колонка является необязательной, и может не потребоваться в том случае, когда первой колонкой является аффинная колонка (например, AVB-Sepharose HP). Применение третьей колонки также зависит от того, какая колонка применялась в качестве второй колонки (SEC> HQ или HQ> SEC и т.п.).
1.5. Колонка для эксклюзионной хроматографии, SEC (например, Superdex 200 prep grade от GE healthcare), опционально
1.5.1. Примеры буферов
1.5.1.1. Буфер, pH, проводимость, каждый блокирующий объем
Прекондиционирование: вода для инъекций
Буфер для уравновешивания и подвижный буфер: 10мМ Na-P, pH 7,2, 150-300мМ NaCl (более высокие концентрации NaCl, например, 300мМ, должны улучшать извлечение вектора AAV (геномы векторов)
При сборе элюата основываться либо на объеме элюирующего буфера (например, элюат собирается после сбора объема пика, расположенного перед главным пиком, заданного заранее), либо на увеличении оптической плотности A280, например, повышение на 1 mAu по сравнению с базовым поглощением A280.
Раствор для санификации: 0,5 н. NaOH
Раствор для хранения: 22,5% этанол
1.5.2. Пример подготовки колонки
1.5.2.1. Прекондиционирование нисходящим потоком (2 объема колонки) воды для инъекций
1.5.2.2. Уравновешивание нисходящим потоком (2 объема колонки) буфера для уравновешивания (PBS 300)
1.5.3. Пример очистки
1.5.3.1. Нанесение на колонку материала в режиме нисходящего потока (0,05 объемов колонки)
1.5.3.2. Элюция нисходящим потоком (1,5 объема колонки) буфера для уравновешивания (dPBS)
1.5.4. Пример допустимой нагрузки: ≤5% объема колонки
1.5.5. Примерная скорость потока: 45 см/ч
1.5.6. При сборе элюата основываться либо на объеме элюирующего буфера, либо на оптической плотности A280
1.6. Анионообменная колонка, Poros 50HQ (Poros XQ от ThermoFisher), выполняет двойную функцию (дальнейшая очистка rAAV & контроль соотношения пустых и не пустых векторов rAAV). Прекондиционирование, уравновешивание, нанесение материала, промывка и элюция
1.6.1. Примеры буферов
1.6.1.1. Буфер, pH, проводимость, каждый блокирующий объем
Прекондиционирование: вода для инъекций
3x (или 4x) буфер для разбавления: 60мМ (или 80мМ) Tris, pH 8,5 (например, после разбавления, материал наносится в 10-50мМ Tris, pH 8,0-8,5, 100мМ NaCl)
Буфер для уравновешивания (и промывочный буфер 1): 20мМ Tris, pH 8,5, 100мМ NaCl
Промывочный буфер 2 (для удаления пустых капсидов AAV): 20мМ Tris, pH 8,5, 115mM NaCl
Элюирующий буфер: 20мМ Tris, pH 8,5, NaCl ≥ 120 мМ, например, 200мМ NaCl
Буфер для стрипования колонки: 1М NaCl
Раствор для санификации: 1 н. NaOH
Раствор для хранения: примерно 22,5% этанол (например, 18-22,5%)
1.6.2. Пример подготовки колонки
1.6.2.1. Прекондиционирование нисходящим потоком (5 объемов колонки) воды для инъекций
1.6.2.2. Уравновешивание нисходящим потоком (4 объема колонки) буфера для уравновешивания
1.6.3. Пример очистки
1.6.3.1. Нанесение на колонку элюата после катионообменной хроматографии & разбавленного элюата в режиме нисходящего потока (50 объемов колонки)
1.6.3.2. Промывка 1 нисходящим потоком (5 объемов колонки) буфера для уравновешивания
1.6.3.3. Элюция 1 (удаление пустых капсидов) нисходящим потоком (3 объема колонки) элюирующего буфера 1
1.6.3.4. Элюция 2 (извлечение не пустых векторов AAV) нисходящим потоком (3 объема колонки) элюирующего буфера 2
1.6.4. Пример скорости потока: 150 см/ч - 300 см/ч
Пример 4
Пример лизиса клеток и подготовки перед очисткой на колонке.
1. Лизис клеток, химический или физический
1.1 Пример химического способа лизиса
1.6.5. Тритон X-100 или аналогичный неионный сурфактант
Конечная концентрация, 0,1%-1%
Время инкубации, до 1 часа
Скорость перемешивания ротора обычно составляет примерно 400~600 об/мин (или больше)
Температура инкубация составляет примерно 25-37°C (например, 37°C)
1.6.6. Бензоназа
Конечная концентрация, ≥50 ед/мл, например, 100 ед/мл
Обработка может проводиться одновременно или после сурфактанта.
2
Концентрация MgCl составляет 1,0-5,0мМ (например, 2 мМ)
1.1.3. Дополнительная соль для лучшего выделения вектора AAV в процессе или после стадии фильтрации
Конечная концентрация NaCl составляет 200-400мМ (например, 300мМ)
NaCl, также могут использоваться другие эквиваленты NaCl
1.7. Пример физического способа лизиса (микрофлюидизация, гомогенизация и др.)
1.7.1. Рабочие условия (из расчета на 10 л культуры адгезивных клеток, объем культуры может быть увеличен)
Давление приблизительно < 5000 psi
Температура приблизительно 18-25°C
1.7.2. Буфер для предварительной обработки & чейз буфер
Буфер, pH, проводимость
Все зависит от условий нанесения на первую колонку; в большинстве случаев буфер для DF - это тот же или эквивалентный буфер, который применяется для уравновешивания первой колонки. Если первой колонкой является HS, PBS может быть общим буфером.
2
При обработке бензоназой значения pH и проводимости должны находиться в рабочем диапазоне значений pH и проводимости для бензоназы (например, pH примерно 6,5-8,5, проводимость >15 мСм/см). Типичное количество бензоназы для расщепления ДНК составляет 100-200 Ед/мл. Для надлежащего расщепления необходимо добавить 2 мМ MgCl.
Объем
: Объем буфера для предварительной обработки должен быть больше, чем объем удерживания системы (в большинстве случаев этот объем в три раза больше объема удерживания).
: Объем чейз буфера составляет 5-10% от объема образца.
2. Тангенциальная поточная фильтрация (TFF, также известная как, UF/DF), опционально
2.1. TFF с картриджами с полыми волокнами
2.1.1. В случае 10 л клеточной культуры
TFF проводится до лизиса клеток
2
Фильтры, такие как картриджи GE с полыми волокнами UFP-100-C-9A (1,2 м) на 10 л
Емкость. По предварительным данным для 20 л также подходят картриджи с полыми волокнами UFP-100-C-9A.
TFF проводится до лизиса клеток или после лизиса клеток. TFR проводится до лизиса клеток
Максимальное давление. TMP. ≥5 psig в случае проведения до лизиса клеток (5-10 psi в случае проведения после лизиса клеток)
Буфер для предварительной обработки или чейз буфер. (В случае катионообменной HS) в качестве первой колонки приемлемым буфером является 20мМ фосфатный буфер, pH 7-7,5/ 100-150мМ NaCl (В случае анионообменной HQ) в качестве первой колонки приемлемым буфером является 20мМ Tris, pH 7,5-8,5/ 100-150мМ NaCl.
2.1.2. В случае ультрафильтрации для концентрирования интермедиата очищенного вектора AAV перед нанесением на колонку для SEC
TFF для концентрирования элюата после анионообменной колонки (Poros 50 HQ) до примерно 5% от объема колонки SEC
Материал: элюат после Poros 50HQ объемом 0,75 объемов колонки
Конфигурация: UFP-C-100-4MA с полыми волокнами (в случае начального объема 10 л)
Промывочный объем (объем удерживания): ~45 мл
Буфер для уравновешивания: PBS300 (10мМ Na-P, pH 7,2/300мМ NaCl)
Буфер для санификации:1 н. NaOH
Те же условия применимы для культуры адгезивных клеток.
TFF может быть проведена до лизиса клеток или после лизиса клеток.
2.1.3. TFF для составления конечной композиции и удаления возможных низкомолекулярных примесей
Материал: элюат после Poros50 HQ (или пик при SEC, соответствующий вектору)
Конфигурация: UFP-C-100-4MA с полыми волокнами (в случае начального объема 10 л)
Промывочный объем (объем удерживания): ~45 мл
Буфер для уравновешивания: PBS180 (10мМ Na-P, pH 7,3/ 180мМ NaCl)
Буфер для диафильтрации: PBS180 (10мМ Na-P, pH 7,3/ 180мМ NaCl)
Буфер для санификации: 1 н. NaOH
Целевая концентрация: 1,0E+13 геномов векторов/мл
Диафильтрация: Объем в 12 раз больше целевого объема UF (5,0E+12 геномов векторов/мл)
2.2. Система фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF) или TFF с модулем со спирально-витой мембраной или с плоской мембраной являются альтернативой TFF с картриджем с полыми волокнами
3. Осветление & Фильтрация
3.1. Глубинный фильтр
Варианты фильтра включают Clarisolve 20MS (0,5-20 мкМ), фильтры серии Sartoclear DL (10-1 мкМ) или Millistak C0HC или D0HC (0,65-8 мкМ)
2
Емкость может составлять 1 л/25 см.
2
2
Максимальная скорость потока, примерно 250 мл/мин/25 см (10 мл/мин/см)
Максимальное рабочее давление примерно ~32psig
Подходящим буфером для кондиционирования может быть PBS300
Количество стадий фильтрации (один или два, фильтр грубой очистки, затем фильтр тонкой очистки): Возможна одна стадия: фильтр грубой очистки
3.2. Millipore SHC (0,5/0,2 мкМ) или Sartopore 2 (0,45/0,2 мкМ, Sartorius)
2
Емкость примерно 500 мл/500 см (немного помогает 0,2% Тритон X-100, увеличение на 10-20%)
2
2
Максимальная скорость потока примерно 1000 мл/мин/500 см (2 мл/мин/см)
Максимальное рабочее давление примерно ~35psig
Примером буфера для кондиционирования является PBS300
2
На последнем этапе емкость может быть меньше (требуется примерно 55 maxi Sartopore 2 (1,8 м)); если это 2-й этап фильтрации, емкость может быть увеличена
3.3. Для 10 л культуры адгезивных клеток в качестве примера
2
Для объема культуры 10 л может применяться Sartopore 2 MaxiCaps (1,2 м)
Этот же фильтр может применяться для объема культуры 20 л.
Проводимость буфера для предварительной обработки & чейз буфер может составлять примерно 15-30 мСм/см, чтобы предотвратить потенциальное взаимодействие между вектором AAV и мембраной.
Пример 5
1.0 Желательные критерии, применяемые для процесса наработки вектора rAAV с 1,2 л и больших объемов, разработанного для объема 500-600 мл урожая rAAV
1.1 Вектор rAAV (например, LK03-FVIII), собранный из 1,2 л суспензионной культуры биореактора
Критерии процесса
Единицы
Способы, применяемые для анализа
Продукция (титр) на урожай
≥ 5×1010 геномов векторов (вг)/мл
кПЦР
1.2 Очистка вектора rAAV из 1,2 л суспензионной культуры биореактора
Критерии процесса
Единицы
Способы, применяемые для анализа
Извлечение вектора
≥ 30% очищенного вектора
кПЦР
Титр конечной композиции вектора
≥ 5×10<sup>12</sup> вг/мл
кПЦР
Соотношение пустых/не пустых частиц в конечной композиции вектора
≤ 5
OD<sub>260</sub>/OD<sub>280</sub>
Внешний вид очищенного вектора
Прозрачный бесцветный раствор без видимых частиц
Визуальный осмотр
Примесь клеточной ДНК в конечной композиции вектора
Результат анализа, ≤ 100 пг/10<sup>9</sup> вг
кПЦР
Примесь плазмидной ДНК в конечной композиции вектора
Результат анализа, ≤ 100 пг/10<sup>9</sup> вг
кПЦР
Примесь клеточного белка в конечной композиции вектора
Результат анализа, < 30 нг/мл
ELISA
Примесь бензоназы в конечной композиции вектора
Результат анализа, < 0,10 нг/мл
ELISA
Примесь AdE1 в конечной композиции вектора
Результат анализа, ≤ 100 пг/10<sup>9</sup> вг
кПЦР
pH конечной композиции вектора
7,3 ± 0,5
Измерение pH растворов на USP<791>
Пример 6
2.0 Наработка вектора rAAV (например, LK03-FVIII) из 1,2 л суспензионной культуры биореактора
2.1 Схема технологического процесса приведена на Фигуре 5, где представлен пример схемы технологического процесса для той части процесса выделения и очистки вектора rAAV, которая относится к сбору клеток.
Пример 7
Как раскрыто в настоящем документе, способы лизиса, число колонок и тип колонок могут быть выбраны и использованы в различном порядке.
4.0 Хроматографический процесс для 1,2 л суспензионной культуры биореактора
4.1 Параметры, варьируемые в процессе хроматографической очискти вектора rAAV (например, LK03-FVIII)
4.1.1 Следующие параметры разработаны для хроматографической части процесса выделения и очистки вектора rAAV:
Стадия
Параметры процесса
1-ая хроматографическая колонка
POROS 50HS (CEX) - катионообменная
AVB Sepharose High Performance (аффинная)
2-ая хроматографическая колонка
смола POROS 50HQ (AEX) - анионообменная
Superdex 200 Prep Grade (SEC)
3-ая хроматографическая колонка
смола POROS 50HQ (AEX) - анионообменная
Superdex 200 Prep Grade (SEC)
Необязательно
4.2 Неограничивающие примеры порядка стадий очистки на колонках (A-E):
1-ая колонка, катионообменная (Poros 50HS) → 2-ая колонка, анионообменная (например, Poros 50HQ)
1-ая колонка, катионообменная (Poros 50HS) → 2-ая колонка, анионообменная (например, Poros 50HQ) → 3-ая колонка, эксклюзионная (например, Superdex 200 PG),
1-ая колонка, катионообменная (Poros 50HS) → 2-ая колонка, эксклюзионная (например, Superdex 200 PG) → 3-ая колонка, анионообменная (например, Poros 50HQ)
1-ая колонка, аффинная (AVB Sepharose HP) → 2-ая колонка, анионообменная (например, Poros 50HQ) → 3-ая колонка (опционально), эксклюзионная (например, Superdex 200 PG)
1-ая колонка, аффинная (AVB Sepharose HP) → 2-ая колонка, эксклюзионная (например, Superdex 200 PG) → 3-ая колонка (опционально), анионообменная (например, Poros 50HQ)
Пример 8
Типичные капсидные белки (VP1) AAV.
Капсидный белок VP1 AAV-SPK (SEQ ID NO:1)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ
121 AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDS
181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV
241 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ
301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED
421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW
481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS
541 GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS
601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP
661 PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
Капсидный белок VP1 AAV-LK03 (SEQ ID NO:2)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  SPARK THERAPEUTICS, INC.
Oh, Younghoon
Qu, Guang
<120>  КОЛОНОЧНЫЕ СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ВЕКТОРА НА ОСНОВЕ AAV
<130>  023637-0460469
<140>  PCT/US2018/040430
<141>  2018-06-29
<150>  62/527,633
<151>  2017-06-30
<150>  62/531,744
<151>  2017-07-12
<150>  62/567,905
<151>  2017-10-04
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  738
<212>  PRT
<213>  Адено-ассоциированный вирус
<400>  1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405                 410                 415
Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450                 455                 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala
580                 585                 590
Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705                 710                 715                 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
Asn Leu
<210>  2
<211>  736
<212>  PRT
<213>  Adeno-associated virus
<400>  2
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435                 440                 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565                 570                 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580                 585                 590
Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725                 730                 735
<---