СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
MEANS FOR CATTLE LEUKEMIA PREVENTION AND METHOD FOR ITS APPLICATION

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и может быть использовано для профилактики лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения и обеспечивает пожизненную устойчивость животных к вирусу лейкоза.
Известны средства для профилактики лейкоза крупного рогатого скота и способы профилактики заболевания с использованием этих средств.
Известна инактивированная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота (см. авторское свидетельство СССР №820015 по кл. А61К 39/12, опуб. 23.10.87), содержащая белковые фракции р25 и gP70, выделенные из лейкоцитарных клеток периферической крови больных лейкозом животных.
Полученный антиген-белковый иммунизирующий агент вводят телятам в возрасте 1-3 месяца с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Иммунизацию проводят трехкратно с интервалом 10-12 дней.
Известна также инактивированная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота (см. патент РФ №2202367 по кл. МПК А61К 39/12, опуб. 20.04.2003), содержащая вируссодержащие лейкоцитарные клетки периферической крови животных. Иммунизацию животных проводят подкожно трехкратно с интервалом 10-14 дней. Животных вакцинируют в возрасте от 2-х месяцев до 2-х лет.
Однако, применение вакцин не нашло широкого практического использования из-за отсутствия средств коррекции иммунологической недостаточности и образования антител с низким титром.
Известны различные препараты для профилактики лейкоза крупного рогатого скота.
В частности, известно применение янтарного биостимулятора (см. патент РФ №2420275 по кл. МПК А61К 31/194, опуб. 10.06.2011), поликарбоксиэтилена (см. патент РФ №2421184 по кл. МПК 2421184, опуб. 20.06.2011), метронидазола и норсульфазола или сульфадимезина (см. патент РФ №2300883 по кл. МПК А61К 67/02, опуб. 20.06.2007), лигфола (см. патент РФ №2320357 по кл. МПК А61К 36/00, опуб. 27.03.2008) и других.
Однако, воздействие этих препаратов на иммунную систему при лейкозе не изучено и практического применения эти препараты не нашли.
В частности, метронидазол и сульфаниламиды обладают бактерицидным, а не вирулицидным действием, что не позволяет оказывать специфическое действие на вирус лейкоза. Лигфол представляет собой гидролизат природного лигнина, действующим началом которого являются гуминовые вещества. Лигфол проявляет стресс-корректорное и адаптогенное действие, инъекции болезненны и вызывают длительное беспокойство животных. Воздействие янтарного биостимулятора, представляющего собой смесь янтарной кислоты и антисептика стимулятора Дорогова (АСД) фракция №2, как и любого биологически-активного препарата, также изучено мало и требует дополнительных исследований.
Наиболее близким к заявляемому является профилактика лейкоза крупного рогатого скота на основе туберкулезного анатоксина (см. патент РФ №2396978 по кл. МПК А61К 39/295, опуб. 20.08.2010). Туберкулезный анатоксин вводят подкожно за 20-30 суток до вакцинации инактивированной вакциной против лейкоза КРС. Туберкулезный анатоксин получают (см., например, патент РФ №2392002 по кл. МПК А61К 39/00, опуб. 20.06.2010) путем детоксикации туберкулезных экзо- и эндотоксинов двумя детоксикаторами - 0,2% раствором формалина в течение 7-9 суток при 42-45°C и 0,5% раствором этония в течение 7-9 суток при 42-45°C.
Однако, в известном способе профилактики лейкоза используют сам продукт разрушения микобактерий, а не выделенную из него белковую фракцию. Продукт разрушения содержит и белки, и липиды, и полисахариды. Липиды и полисахариды увеличивают иммуногенную нагрузку на организм животных, изменяют состояние гомеостаза и препятствуют целенаправленному иммунному ответу на белки микобактерий, что, в конченом итоге, снижает эффективность профилактических мер и не обеспечивает пожизненной устойчивости животных к заболеванию.
Изобретение направлено на решение задачи расширения спектра профилактических препаратов и формирования новых подходов к проблеме профилактики лейкоза крупного рогатого скота, позволяющих обеспечить пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом.
Достигаемый при этом технический результат заключается в создании средства и способа профилактики лейкоза крупного рогатого скота, позволяющих эффективно и с минимальными затратами обеспечить целенаправленный иммунный ответ путем активизации клеточного иммунитета против вируса лейкоза крупного рогатого скота за счет увеличения количества киллерных клеток.
Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, а именно - средство для профилактики лейкоза КРС и способ его применения.
Указанный технический результат в части самого средства достигается тем, что средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, согласно изобретению, содержит водорастворимую белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенную из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, фосфатно-солевой буферный раствор, водный раствор муравьиного альдегида и изотонический раствор натрия хлорида при следующем соотношении компонентов, мас. %:
водорастворимая белковая фракция
с молекулярной массой 18-20 кДа,
выделенная из продуктов разрушения
микобактерий туберкулеза
0,05-0,125%
фосфатно-солевой буферный раствор
9,95-24,875
водный раствор муравьиного альдегида
0,025-0,046
изотонический раствор натрия хлорида
остальное
Указанный технический результат в части способа применения этого средства достигается тем, что телятам 1-9-дневного возраста вводят однократно внутримышечно в дозе 4,0-6,0 мл средство, содержащее водорастворимую белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенную из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, фосфатно-солевой буферный раствор, водный раствор муравьиного альдегида и изотонический раствор натрия хлорида при следующем соотношении компонентов, мас. %:
водорастворимая белковая фракция
с молекулярной массой 18-20 кДа,
выделенная из продуктов разрушения
микобактерий туберкулеза
0,05-0,125%
фосфатно-солевой буферный раствор
9,95-24,875
водный раствор муравьиного альдегида
0,025-0,046
изотонический раствор натрия хлорида
остальное
Указанные признаки являются существенными и достаточными для получения требуемого технического результата.
0.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано средства для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, обеспечивающего пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом за счет активизации клеточного иммунитета путем увеличения количества киллерных клеток. Смесь выделенной из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза водорастворимой белковой фракции с молекулярной массой 18-20 кДа в фосфатно-солевом буферном растворе с растворами муравьиного альдегида и хлорида натрия обеспечивает активизацию киллерной системы защиты, а именно - вовлечение в иммунный ответ субпопуляции Т-лимфоцитов: Th
В заявляемом средстве для профилактики лейкоза крупного рогатого скота используют смесь раствора муравьиного альдегида с изотоническим раствором хорда натрия не в качестве детоксикатора, а в качестве компонента, обеспечивающего стабилизацию иммунного ответа на уровне киллерной системы.
Введение только белковой фракции или только муравьиного альдегида не дает желаемого результата. Только синергизм компонентов и экспериментальным путем подобранные их соотношения позволили получить высокий эффект устойчивости животных к заражению лейкозом за счет активизации киллерной системы. При этом концентрация муравьиного альдегида не изменяет структуру белкового компонента микобактерий.
Авторами найден новый, неочевидный подход к решению задачи профилактики лейкоза КРС путем использования смеси компонентов (белковой фракции с определенной молекулярной массой, выделенной из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза и смеси растворов муравьиного альдегида и хлорида натрия) для увеличения количества киллерных клеток иммунной системы.
Известно, что киллерные клетки тормозят развитие опухолевых клеток (см., например, патент РФ №2443411 по кл. МПК А61К 9/08, опубл. 27.02.2012; патент РФ №2262941 по кл. МПК А61К 35/16, опуб. 27.10.2005). Однако они используются исключительно для лечения заболевания.
Использование механизма увеличения киллерных клеток иммунной системы для профилактики лейкоза неизвестно и нигде не описано.
Также неизвестно использование белковой фракции, выделенной из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, для профилактики лейкоза.
Введение средства телятам до 10-дневного возраста (т.е. в неонатальный период) на основе смеси выделенной белковой фракции с раствором муравьиного альдегида для профилактики лейкоза крупного рогатого скота также неизвестно.
Обработка телят в неонатальный период данным средством объясняется тем, что у таких телят при рождении гуморальный иммунитет отсутствует, а клеточный достаточно развит. Активизация клеточного иммунитета в столь раннем возрасте и, как следствие, киллерной системы иммунитета, обеспечивает пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом.
Известно, что за клеточный иммунитет отвечают цитотоксические Т-лимфоциты CD8 и воспалительные Т-лимфоциты CD4 (Тh1), за гуморальный - Т-хелперные лимфоциты CD4 (Th2) и В-лимфоциты.
В данном изобретении решена задача активизации эффективного иммунитета против лейкоза путем увеличения цитотоксических лимфоцитов (CD8) и воспалительных Т-лимфоцитов CD4 (Th1), уменьшения Т-хелперных лимфоцитов CD4 (Th2) и увеличения количества третьей субпопуляции Т-лимфоцитов - Th0.
Таким образом, в организме животных заранее создаются условия для увеличения количества киллерных клеток, которые, являясь барьером, препятствуют развитию опухолевых клеток. Данный механизм позволяет сохранить баланс клеточного и гуморального иммунитетов, который поддерживается на протяжении всей жизни.
Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется рисунком 1, на котором представлена хроматограмма белковой фракции, выделенной из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза бычьего вида M.bovis (штамм №8).
Средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота готовят следующим образом.
В качестве продуктов разрушения возбудителя туберкулеза используют ППД-туберкулин для млекопитающих, полученный из штамма M.bovis №8 и представляющий собой прозрачную жидкость светло-коричневого цвета (см. Инструкцию по применению туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, утвержденную заместителем Руководителя Россельхознадзора 30.09.2011).
Для получения белковой фракции жидкость с продуктами разрушения возбудителя осаждают солевым раствором (например, сульфатом аммония) и центрифугируют. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в солевом буферном растворе.
Проводят диализ, доводят рН раствора до 7,0-7,4, после чего определяют концентрацию белка общепринятыми методами, в частности - методом Лоури.
Выбор значений показателя рН растворителя объясняется значением показателя в клетках организма. Общеизвестно (см., например, http://zenslim.ru/content), что в клетках организма рН имеет значение около 7,0, во внеклеточной жидкости - 7,4.
Молекулярную массу белка определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC), которую проводили, в частности, на жидкостном хроматографе «Стайер», с использованием спектрофотометрического детектора А214 (длина волны 214 нм). Для разделения использовали колонку BioSep-SEC-S 2000 5 мкм 145А, 300×7,8 мм. В качестве элюента применяли 0,01М фосфатно-солевой буфер, скорость потока - 1 мл в минуту, либо 0,01М фосфатносолевой буфер с 0,025% раствором азида натрия рН 6,8 и при скорости потока 2 мл в минуту.
В качестве стандартов использовали бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 64-70 кДа, лактоферрин с молекулярной массой 75-80 кДа и папаин с молекулярной массой 20 кДа.
Учитывали такие стандартные показатели, как время задержки образца на колонке или время ретракции (RT, мин), интенсивность пиков по высоте (mAU) и относительно количественное содержание вещества, которое определялось как % отношения каждого пика к общей площади пиков (А, %).
Основные белки в выделенной из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза бычьего вида M.bovis (штамм №8) имели молекулярную массу 18-20 кДа (см. рис.1).
В таблице 1 представлен результат хроматографии композиции на основе белковой фракции, выделенной из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза.
Далее смешивают полученную белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа в буферном растворе, в котором содержится от 4,8 мг/мл до 5,2 мг/мл белка (т.е. от 0,48% до 0,52%), с изотоническим раствором хлорида натрия 085,-0,95% концентрации.
Для приготовления 50% раствора белковой фракции берут 1 часть буферного раствора с белком и добавляют 1 часть изотонического раствора.
Состав полученной смеси будет следующим:
- белковая фракция - 0,24%-0,26%,
- фосфатно-солевой буферный раствор - 49,74%-49,76%,
- раствор хлорида натрия - остальное.
При приготовлении 20% раствора белковой фракции состав полученной смеси будет следующим:
- белковая фракция - 0,096% - 0,104%,
- фосфатно-солевой буферный раствор - 49,896%-49,904%
- раствор хлорида натрия - остальное.
Далее готовят смесь водного раствора муравьиного альдегида с изотоническим раствором натрия хлорида.
Для этого берут 0,15-0,25 мл 36,5-37,5%-ного медицинского раствора муравьиного альдегида (формальдегида), добавляют его в 99,75-99,85 мл изотонического 0,85%-ного (или 0,95%-ного) раствора хлорида натрия. Смесь растворов тщательно перемешивают.
Соотношение частей компонентов раствора муравьиного альдегида и изотонического раствора хлорида натрия были подобраны экспериментальным путем.
При приготовлении препарата из 37%-ного раствора муравьиного альдегида конечная концентрация муравьиного альдегида в полученном препарате будет составлять 0,055-0,0925 мас. %.
Затем смешивают полученную смесь растворов: белковой фракции в буферном и изотоническом растворах со смесью растворов муравьиного альдегида и изотоническим раствором хлорида натрия.
Пример 1 приготовления средства для профилактики лейкоза
Берут 100 мл ППД-туберкулин для млекопитающих, полученный из штамма M.bovis №8. Из него готовят белковую фракцию следующим образом.
К 100 мл туберкулина добавляют 42 г сульфата аммония для осаждения белка, центрифугируют при 4500 об/мин. в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в 1 мл 0,01М раствора фосфатно-солевого буфера. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01М растворе фосфатно-солевого буфера в течение 24 часов, доводят рН раствора до 7,2-7,4, после чего определяют концентрацию белка методом Лоури на биохимическом анализаторе StatFax 3300.
Количество белковой фракции из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза составляло 5,0 мг/мл.
Аналогично описанному в примере 1 были получены белковые фракции из других партий ППД-туберкулина. Количество белка везде варьировалось от 4,8 до 5,2 мг/мл.
Далее смешивают полученную белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа в буферном растворе, в котором содержится 5 мг/мл белка (т.е. 0,5%), с изотоническим раствором хлорида натрия 085,-0,95% концентрации.
Затем готовят смесь водного раствора муравьиного альдегида с изотоническим раствором хлорида натрия.
Для этого берут 0,2 мл 37%-ного медицинского раствора муравьиного альдегида (формальдегида), добавляют его в 99,8 мл изотонического 0,85%-ного раствора хлорида натрия. Смесь растворов тщательно перемешивают. Конечная концентрация муравьиного альдегида в полученном препарате будет составлять 0,074 мас. %.
Смешивают белковую фракцию в фосфатно-солевом буферном растворе со смесью растворов муравьиного альдегида и натрия хлорида в равных соотношениях -1:1.
Содержание компонентов препарата будет следующим, мас. %:
водорастворимая белковая фракция
с молекулярной массой 18-20 кДа,
выделенная из продуктов разрушения
микобактерий штамма M.bovis №8
0,125
фосфатно-солевой буферный раствор
24,875
водный раствор муравьиного альдегида
0,037
изотонический раствор натрия хлорида
остальное
Аналогично описанному готовили препарат из белковых фракций с содержанием белка от 0,48% и 0,52%.
Пример 2. Обоснование количественного содержания компонентов в препарате.
В экспериментах было использовано 120 телят 2-9-дневного возраста, из которых 108 вводили средство в дозах от 4 до 6 мл для профилактики лейкоза при разных количественных содержаниях компонентов.
При этом 12 голов были контрольными, которым вводили физиологический раствор в дозе 5 мл на голову.
Результаты представлены в таблице 2.
В контрольной группе из 12 голов пало 4 головы, что составило 33,3%.
Пример 3.
Для обоснования увеличения количества киллерных клеток в организме животных (нетелей и коров) проводили иммунологические исследования крови животных, обработанных в возрасте 2-9 дней средством для профилактики лейкоза крупного рогатого скота:
- нетелей 2,5-летнего возраста,
- коров 5-летнего возраста,
Результаты представлены в таблице 3.
Из таблицы 3 следует, что у 2,5-годовалых нетелей регистрируется снижение соотношения Т-хелперов к Т-супрессорам (Тх/Тс) и увеличение количества третьей субпопуляции Т-лимфоцитов - Th0.
У 5-летних (опытных) коров регистрируется достоверное повышение содержания всех фракций лимфоцитов (Т и В) при сохранении повышенного содержания Th0 (киллеров).
Результаты серологических исследований на наличие антител к вирусу лейкоза, проведенные в реакции иммунодиффузии, у нетелей и коров в возрасте соответственно 2,5 года и 5 лет были отрицательны.
Таким образом, заявляемое средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, а также способ его применения обеспечивают пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом путем активизации клеточного иммунитета против вируса лейкоза крупного рогатого скота за счет увеличения количества киллерных клеток.