Влияние ксенобиотиков на структурные перестройки цельной крови

УДК, 574.21612.117:612.273

Вестник СПбГУ. Сер. З, 2003, вып. 2

Т. Е. Шумилова, С. И. Никонова, В. И. Шерешков, А. Д. Ноздрачев ВЛИЯНИЕ КСЕНОБИОТИКОВ

НА СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ* '

В пространственной организации внутренней среды организма большую роль играют липофильно-гидрофильные взаимодействия-^^ежду составляющими ее структурными элементами, для реализации которых необходимым условием является присутствие воды. Благодаря своим уникальным свойствам, вода служит не только растворителем для гидрофильных молекул, но и выступает главным структурирующим началом [2]. Именно водная среда создает условия для самопроизвольной сборки и функционирования биологических мембран, в которых с участием гидрофобных взаимодействий создается липидный бислой и внутри- и межмолекулярная архитектура белковых и ли-пидных компонентов. Присутствие воды в самом липидном бислое придает ему свойства лиотропного жидкого кристалла, способного к фазовым переходам в физиологической области температур [4, 9, 24]. Столь же важна роль молекул воды в формировании пространственной структуры белков и полибелковых ансамблей, например, ионных каналов и ферментных систем, на основе "гидрофобно-гидрофильных взаимодействий, которые регулируют их стабильность, а также доступность- к ним экзогенных и эндогенных субсТратов-регуляторов [20]. Несмотря на очевидную важность изучения закономерностей структурных перестроек внутренней среды организма, связанных с изменением состояния межмолекулярных связей воды с гидрофильными и гидрофобными компонентами, объем информации, касающийся этой проблемы, крайне ограничен. В. настоящее время она приобретает особую актуальность в связи со все более ускоряю^ , щимися темпами роста давления антропогенных загрязнителей на окружающую .среду и организм человека и животных. Большинство ксенобиотиков обладают высокой биологической активностью. Взаимодействуя с определенными молекулярными группами важнейших биологических структур, они, в результате перераспределения липофиль-ных и гидрофильных участков, метаболически «связанной» и «свободной» форм воды, вызывают в них конформационные изменения, которые сопровождаются нарушением их функционирования [2, 20]. В рамках представленной проблемы одним из подходов к ее решению является изучение структурных перестроек в биологических системах методами ЭПР-спектрометрии с использованием гидрофильных и липофильных спиновых зондов [3, 22]. В связи с этим данная работа посвящена исследованию влияния ксенобиотиков, относящихся к нитро- и фоефорорганической (ФОС) группам соединений, на состояние цельной крови крыс с помощью изучения поведения введенного в образец крови гидрофильного спинового зонда методом ЭПР-спектрометрии.

Материалы и методы. Эксперименты проводились на самцах крыс \Vistar с массой тела 200-250 г. За сутки до начала исследования животных не кормили. Крысы были разделены на несколько групп псц10 особей в каждой. Одним животным вводили подкожно нитрит натрия (1 и 3 мг/100 г массы), растворенный в 0,5 мл воды, другие получали внутрибрюшинно фосфорорганическое соединение — валексон (фоксим) в виде 0,5 мл водной эмульсии (3,75 и 7,5 мг/100 г массы). Выбор исследуемых ксенобиотиков был продиктован тем, что они относятся к группам соединений, широко используемых в сельскохозяйственном и промышленном производстве [12,13, 27]. Контрольной груп-

© Т. Е. Шумилова, С. И. Никонова, В.И.Шерешков, А. Д. Ноздрачев, 2003

пе подкожно вводили 0,5 мл дистиллированной воды. До инъекции и через час после воздействия под легким эфирным наркозом у экспериментальных животных брали образцы смешанной крови из надрезанного кончика хвоста объемом 0,5 мл. От каждого образца отбирали объем крови, равный 0,2 мл, в него вводили гидрофильный спиновый зонд—2,2,6,6-тетраметил-4-оксипиперидин-1-оксид (танол), который представляет собой нитроксильный радикал, имеющий фрагмент N0 [26].

Изучение структурных перестроек в цельной крови производили с помощью ЭПР-спектрометрии. Сущность метода состоит в измерении вращательной подвижности (у), введенного в кровь спинового зонда, которая является количественным выражением ее микровязкости. Вращательная подвижность зонда вычисляется по данным, получаемым из ЭПР-спектров, представляющих набор трех компонент, являющихся результатом сверхтонкого взаимодействия неспаренного электрона радикала с ядром азота этого зонда. Под воздействием постоянного внешнего магнитного поля (для танола его величина составляет 3300 Гс) происходит расщепление энергетического уровня неспаренного электрона зонда на три подуровня с квантовыми числами (гпх = +1,Ш2 = 0, тз = — 1). В электромагнитном поле на резонансной частоте 9 ГГц получают ЭПР^спектры поглощения СВЧ энергии. .Методически удобнее измерять не уровень поглощения (А), а его первую производную по магнитному полю (<1А/с1Н), которую принято считать спектром - ЭПР. Он имеет вид трех колебаний, каждое из которых соответствует т-ной компоненте спектра и характеризуется определенной шириной и пиковой интенсивностью (рис. 1). Эти показатели связаны с искомым параметром следующим соотношением:

у={А;ДЯо[

где к — 6,73 • Ю-10 с/Гс (константа для данного радикала), АД — дифференциальная ширина линии (Гс), 1т — интенсивность сверхтонкой компоненты спектра, соответствующей т значению магнитного квантового числа ядра азота [22]. При изменении окружения спинового зонда характер спин-спинового взаимодействия его неспаренного электрона с протонами изменяется, что отражается на форме ЭПР-спектров.

Выбор в качестве зонда радикала танола (его структурная формула изображена на рис. 1) был обусловлен тем, что он хорошо растворяется в воде и, следовательно, локализуется в водной части крови (плазме). В отличие от других зондов (например, 5-доксилстеарата) танол не связывается с белками крови — альбуминами и поэтому может выступать в роли индикатора состояния цельной крови, а не ее отдельных компонентов, что позволяет не нарушать ее естественную структуру [26]. Зонд концентрацией 5 • 10~3 моль/л вводили в образец крови объемом 0,2 мл, после чего регистрировали ЭПР-спёктры на спектрометре РЭ-1306 при температуре 20°С. Термостатирование образца осуществляли потоком газообразного азота с точностью ±1 К. Температуру измеряли с помощью термопары, измерительный спай которой находился непосредственно около образца. Чувствительность термопары —70 икВ/К.

Результаты экспериментов подвергали статистической обработке с вычислением средних и средних квадратических отклонений, корреляционной зависимости V от использованных концентраций нитрита натрия и валексона. Достоверность различий V между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Типичные ЭПР-спектры спинового зонда—танола, зарегистрированные до и через чах; после введения животным нитрита натрия и валексона, показаны на рис. 1, Л и Б. Из рисунка видно изменение их формы под воздействием ксенобиотиков, что выражается в уменьшении пиковой интенсивности поглощения

йА/ан

он

нзс\

н,с

У4

1/С3Н

с,н

и—°0

. Рис. 1. ЭПР — спектры спинового зонда танола в образце цельной крови крысы. А (1)— контроль, А (2)—через 1 ч после введения ИаИОг в дозе 5 мг/100 г массы; Б (I) —контроль, Б (2) — через 1 ч после введения валексона в дозе 7,5 мг/100 г массы.

СВЧ-поля неспаренными электронами зонда при переходе их с подуровня то на т+1 и тп_ 1. В результате расчета V по данным ЭПР-спектров было обнаружено, что вещества, относящиеся к различным группам (нитро- и фосфорорганическое соединения) вызывают однонаправленные изменения в водной фазе крови — увеличение вращательной подвижности спинового зонда, что свидетельствует об уменьшении микровязкости цельной крови под влиянием изучаемых токсикантов (рис. 2). Выявлена линейная зависимость микровязкости крови от концентрации препаратов: инъекции нитрита натрия в дозировках 1 и 3 мг/100 г массы приводили к изменению V от 9,8 ± 0,2 • 109 с-1, ее значения в исходном состоянии до 10,4 ± 0,3 • 109 с-1 (р< 0,05) и 11,3 ± 0,4 • 109 с-1 (р< 0,05) соответственно. Введение валексона вызывало рост V от 9,2 ± 0,26 • 169 с-1 (в контроле) до 9,7 ± 0,37 • 109 с-1 (3,75 мг/100 г массы) и —10,2 ± 0,32 • 109 с-1 (7,5 мг/100 г массы) (р < 0,05). Расчеты показали высокий уровень корреляции между концентрацией использованных токсикантов и V (г = 0,997 и г = 1,0 для ЫаМОг и валексона соответственно). У животных, которые получали вместо ксенобиотиков дистиллированную воду, не было отмечено изменений вращательной подвижности зонда в крови через час после воздействия.

Ктювь. являясь сложнейшей системой взаимодействующих друг с другом компо-

С, мг/100 г массы

Рис. 2. Зависимость вращательной подвижности спинового зонда танола (и) от концентрации ксенобиотиков (С) в образце цельной крови крыс.

Сплошная линия — нитрит натрия, прерывистая линия — валексон.

нентов, находящихся в разных фазовых состояниях, функционирует как единое целое и проявляет свойства жидкого кристалла [9, 24]. В связи с этим микровязкость цельной крови, отражая характер межмолекулярного сцепления водной фазы (плазмы) с растворенными в ней компонентами и структурами, входящими в состав форменных элементов крови, является важнейшей характеристикой состояния внутренней среды организма. Показано, например, что усиление гидрофобного компонента частичной заменой воды какой-либо неполярной жидкостью (глицерином или алифатическими спиртами с различной длиной углеводородной цепи), не влияющей на перенос электронов в изучаемой системе, приводили к снижению скорости связывания кислорода молекулами гемоглобина и скорости поглощения Ог суспензией митохондрий [17, 21].

Как показывают результаты проведенных экспериментов, нитрит натрия и валексон, попадая в организм животных, вызывают однонаправленные дозозависимые изменения V. Причем отмечены одинаковые отклонения V от начальных значений на 6 и 5,4% от воздействия низкими дозировками МаИОг и валексона—на 13 и 12% более высокими их концентрациями соответственно. Для выяснения причин столь сходного влияния изучаемых ксенобиотиков на структуру цельной крови, был проведен анализ патогенетического влияния этих веществ в организме млекопитающих. Так, нитрит натрия обладает широким спектром воздействия на окислительно-восстановительные процессы, связанные с энергообразованием в организме. Нитрит легко проходит через мембрат ны клеток, в том числе — эритроцитов [36], и взаимодействует с ионами металлов переменной валентности, и в первую очередь с гемовым и негемовым Ре2+, который входит в состав активных центров важнейших кислородтранспортных белков (гемоглобин, мио-глобин), ферментов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях цикла трикгЕрбоновых кислот, а также активируемых окислами азота внутриклеточных ферментов, регулирующих важнейшие функции клеток [1, 5, 6, 29-31]. Поэтому основным проявлением интоксикации нитрита натрия является гистотоксическая гипоксия, связанная с разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях клеток с аэробным метаболизмом. Повреждение гладкомышечных волокон сосудов в результате этого процесса сопровождается избыточным расслаблением, артерий и арте-риол, нарушением местной регуляции кровообращения, следствием которых является циркуляторная гипоксия. Кроме того, нитритный дефицит Ог в организме усугубляется снижением кислородной емкости крови за счет превращения части гемоглобина в

мет-|и;нитрозогемоглобйн (в использованных нами дозировках — на 4 Мл Ог /100 мл крови) {10, 34].: . "•

В отличие от нитрита натрия валексон относится к ФОС, главным токсическим проявлением которых является их высокая антихолинэстеразная активность [13-15, 32]. Вызываемое ими нарушение метаболизма ацетилхсшина в организме приводит к блокированию синаптической передачи нервных импульсов в структурах центральной и вегетативной нервных систем, а также в поперечно-полосатых и гладких мышцах. Поэтому отравления ФОС прежде всего сопровождаются расстройствами кровообращения центрального и местного происхояздения: угнетение сосудодвигательного центра приводит к нарушениям регуляции артериального, давления и сердечного ритма, а увеличение тонуса гладкой мускулатуры сосудов малого калибра—артериол и прекапил-ляров вызывает увеличение сопротивления кровотоку, снижение скорости движения крови в микрососудистой сети, изменение структуры потока эритроцитов и, как. след- ' ствие, уменьшение доставки кислорода к микроучасткам тканей [8, 11, 15, 16, 25]. Ин-гибирование ФОС дыхательного центра является причиной развития блокады нервно-мышечной проводимости в дыхательной мускулатуре, а также — возникновения брон-хоспазма вследствие увеличения тонуса гладкой мускулатуры бронхов, что влечет за собой рассогласование дыхательных движений и увеличение сопротивления току воздуха в воздухоносных путях (12, 16, 32]. Подобные расстройства внешнего дыхания нередко сопровождаются снижением насыщения крови кислородом, что усугубляет гипоксию, вызванную циркуляторными нарушениями [20].

Таким образом, несмотря на существенное различие механизмов патогенеза использованных в данной работе ксенобиотиков, основным результатом их действия является развитие гипоксического состояния, В свою очередь, известно, что угнетение аэробного энергообразования вызывает стимуляцию анаэробного пути получения энергии. Активация гликолиза приводит к накоплению молочной кислоты и других недоокисленных продуктов в крови и тканях, сдвигая кислотно-щелочной баланс в кислую сторону при нитритной и ФОС интоксикации, что отмечено некоторыми авторами [33, 34]. Увеличение концентрации Н+ даже в узких пределах может вызвать перераспределение гидрофильных и гидрофобных участков белковых молекул, в том числе входящих в состав мембран клеток, изменение прочности сцепления с молекулами воды и нарушение четвертичной структуры с потерей их функциональной способности [20, 35].

Известно также, что. дефицит кислорода в организме инициирует образование активных форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода, гидроксильный радикал и другие перекисные соединения), принимающих участие ^изменении липофиль-ного компонента цельной крови за счет перекисного окислении липидов (ПОЛ), в том числе входящих в состав мембран форменных элементов [18, 23]. На активацию ПОЛ умеренными дозами нитритов (2,5 мг/100 г массы) указывают данные по изучению интенсивности перекисных процессов в клетках печени крыс [28]. Свободнорадикальное окисление вызывает увеличение вязкости мембран в результате уменьшения содержания жидких липидов в бислойных участках, появление поперечных межмолекулярных сшивок и возрастание доли упорядочейвых липидов с ограниченной подвижностью. В результате модифицирующего действия ПОЛ и свободнорадикального повреждения мембранных белков за счет окисления сульфгидрильных групп, разрыва дисульфид- -ных мостиков, образования аддуктов аминокислот в области активных центров ферментов, появления белок-белковых сшивок, а также дефрагментации белков [37, 38] изменяются свойства таких мембранных белков, как Са2+-АТФаза, Ыа+/К+-АТФаза, которые приводят к нарушению ионных транспортных процессов в клетках. Подобные

процессы, по-видимому, имеют место при действии использованных нами ксенобиотиков, на что указывают имеющиеся в литературе данные об уменьшении осмотической резистентности эритроцитов при питритной интоксикации [7], а также — уменьшение концентрации К+ и "увеличение содержания Na+ в плазме при отравлении ФОС [12], что, как правило, сопровождается выходом воды из клеток, уменьшением сил межмолекулярного сцепления между молекулами воды и липофильными молекулярными структурами. Очевидно, увеличение количества свободной воды во внеклеточной жидкости и плазме приводит к уменьшению микровязкости крови, что и было нами зарегистрировано. Следует также отметить, что практически одинаковое увеличение v разными количествами использованных нами ксенобиотиков свидетельствует о более высокой токсичности нитрита натрия по сравнению с валексоном. Действительно, используемый в качестве пестицидов, валексон является одним из- наименее токсичных ФОС для млекопитающих [33], в то время как NaN02 относится к наиболее опасным химикатам. В этой связи такой параметр, как микровязкость цельной крови, может быть использован для оценки состояния внутренней среды организма в экологически неблагоприятных условиях. Однако связь этого показателя с биохимическими и физиологическими изменениямии в организме при воздействии вредных факторов требует дальнейшего изучения.

Таким образом, в результате гипоксии, развивающейся при действии нитритов и ФОС, возникают структурно-функциональные перестройки в цельной крови экспериментальных животных, которые, по-видимому, затрагивают как гидрофильные, так и липофильные компоненты и выражаются в увеличении антагонизма между щши, снижении степени молекулярной упорядоченности внутренней среды организма за счет уменьшения метаболически «связанной» и увеличения «свободной» воды. Этот дисбаланс, очевидно, и является основой для функциональных нарушений, связанных с дефицитом кислорода в организме. . . \

Работа выполнена при поддержке гранта Е02-6.0-19 МО. Summary

Shumilova Т.Е., Nikonova S. Г., Shereshkov V.l., Nozdrachev A.D-. Xenobiotics influence on whole blood structure.

By means of EPR-spectrométry xenobiotics (sodium nitrites and phoxim) influence on the whole blood structure was studied. It was shown that NaNC>2 and phoxim induced dose-depended decrease of rat whole blood microviscosity. The difference of their effects was that the nitrites in the dose 2,5-3 times less than phoxim led to the same changes in lipid-water interaction of whole blood components.

Литература

1. Ажипа Я. И., Каюшин Jl. П., Никишин Е. И. Исследование гипоксии тканей и клеток живых организмов методом электронного парамагнитного резонанса // Биохимия гипоксии. Горький, 1975. С. 7-11. 2. Аксенов С. И. Вода и ее роль в регуляции биологических процессов. М., 1990. 3. Берли-нер Д. Метод спиновых меток. М., 1976. 4. Болис Л., Хофман Д. Ф., Лиф А. Мембраны и болезнь. M., 1980. 5. Ванин А. Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 7. С. 867-869.,6. Ванин А.Ф., Блюменфелъд Л. А., Четвериков А. Г. Исследование методом. ЭПР комплексов неге^Ънового железа в клетках и тканях // Биофизика. 1967. Вып. 5. С. 829-838. 7. Волкова Н. Ф. Изменение системы крови при воздействии некоторых метгемогло-бинообразователей // Проблемы ранней диагностики и профилактики профессиональных заболеваний химической этиологии. Л., 1973. С. 53-58. 8. Громов А.Е., Розентаг В. И. Изменение микроциркуляции при отравлении фосфорорганическими ингибиторами холинэстеразы // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1976. Т. 81, №1. С. 28-30. 9. Дадиванян А. К., Цагикян А. Р., Агасарян В.Ю. // Тез. докл. IV конф. соц. стран по жидким кристаллам. Тбилиси; Д981. С. 167-168. 10. Иваницхая Н. Ф. Методика получения различных стадий гемической гипоксии у крыс введением нитрита натрия // Патологическая

физиология и экспериментальная терапия. 1976. № 3. С. 69-71. 11. Иванов К. П. Основы энергетики. Биологическое окисление и его обеспечение кислородом. СПб., 1993.12. Исламова К. А. Некоторые стороны минерального обмена при интоксикациях хлор- и фосфорорганическими пестицидами // Гигиена применения, токсикология пестицидов и клиника отравлений. Вып. 7. Киев, 1969. С. 503-509. 13. Каган Ю. С. Токсикология фосфорорганических инсектицидов и гигиена труда при их применении. М., 1963. 14. Каган Ю. С. Исследование токсикологии фосфорорганических инсектицидов и акарицидов в СССР // Гигиена и токсикология пестицидов и клиника отравлений. Вып. 5. Киев, 1967. С. 325-352. 15. Каган Ю. С. Токсикология фосфорорганических пестицидов. М., 1977. 16. Каган Ю. С. Общая токсикология пестицидов. Киев, 1981. 17. Калинченко JI. П., Христова М. Л., Шнолъ С. Э. Влияние Ü2, глицерина, алифатических спиртов и возможная роль гидрофобных взаимодействий ft транспорте электронов в митохондриях // Биофизика. 1967. Т. 12. Вып. 5. С. 824-828. 18. Кииза Д. А., Артюх В. П., Стародуб. Н. Ф., Хмельницкий Г. А. Лигандный спектр гемоглобина, активность метгемоглобин-ре-дуктазы и гемолитическая устойчивость эритроцитов при хроническом воздействии нитратов // Укр. биохим. журн. 1992. Т. 64, JV»4. С. 67-72. 19. Колчинская А.З. Вторичная тканевая гипоксия. Киёв, 1983. 20. "Конев С. В. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы. Минск, 1987. 21. ;Крук H.H., Заводни к И. Б. Механизм влияния этанола на функциональные свойства молекулы гемоглобина человека // Биофизика. 2001. Т.46. Вып. 4. С. 601-606. 22. Кузнецов А. Н. Метод спинового зонда. М., 1976. 23. Меерсон Ф. 3., Каган В. Е., Козлов Ю. П. и др. Роль перекисно-го окисления липидов в патогенезе ишемического повреждения и антиоксидантная защита сердца // Кардиология. 1982. Т. 22, №2. С. 81-92. 24. Минц Р. И., Кононенко Е. В. Жидкие кристаллы в биологических системах // Итоги науки и техники. Серия биофизика. Т. 13. М., 1982. 25. Мухтарова Д. Н. Клиника вегетативно-сосудистых нарушений при комбинированном воздействии хлор- и фосфорорганических пестицидов // Гигиена применения, токсикология пестицидов и клиника отравлений. Киев, 1968. С. 493-497. 26. Никонова С. И., Никонов A.M., Шумилова Т.Е., Кисляков Ю. Я. Вращательная подвижность зонда в цельной крови белых крыс // Биофизика. 1991. Т. 36. Вып. 3. С. 511-515. 27. Ополь Н. И., Добрянская Е. В. Нитраты. Кишинев, 1986. 28. Подберезкина Н. Б., Задорина О. В., Андрющенко П. И., Хмелевский Ю. В. Роль процессов перекисного окисления и антиоксидантной защиты при нитритной гипоксии и ее коррекции витаминами // Укр. биохим. журн. 1992. Т. 64, №6. С. 64-70. 29. Реутов В. П., Сорокина Е. Г., Каюшин Л. П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих и нитритредуктазная активность гемсодержащих белков '// Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, №6. С. 31-35. 30. Реутов В. П., Сорокина Е. Г., Пинелис В. Г., Коршунова Т. С., Родионов А. А., Комиссарова Л. X., Кошелеё В. Б., Струкова С. М., Каюшин Л. П., Браке П. Участвуют ли нитритные ионы в регуляции систем внутри- и межклеточной сигнализации? // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, №6. С. 27-31. 31. Реутов В. П., Сорокина Е.Г., Пинелис В. Г., Коршунова Т. С., Родионов A.A., Коше-лев В. Б., Струкова С. М., Каюшин Л. П., Браке П. Компенсаторно-приспособительные механизмы при нитритной гипоксии у крыс // Бюл. эксперимент, биол. и мед. 1993. Т. 116. С. 506-508. 32. Розен-таг В. И., Шерстобитов О. Е. Избирательная токсичность фосфорорганических инсектокарицидов. J1., 1978. 33. Седых А. С., Абеленцева Г. М. Фосфорорганический пестицид валексон // Химия в сельском хозяйстве. 1976. Т. 14, N« 8. С. 31-39. 34. Середенко М.М. Механизмы развития и компенсация гемической гипоксии. Киев, 1987. 35. Fung L. W.-V., Litvin Sh. D., Reid Т. M. Spin-label detection of sickle hemoglobin-membrane interection at physiological pH // Biochemistry. 1983. Vol.22, N 4. P.864-869. 36. May J. M., Qu Zh-Ch., Xia L., Cobb Ch. E. Nitrite uptake and metabolism and oxidant stress in human erythrocytes // Am. J. Physiology (Cell physiology). 2000. Vol.279. P.C1946-C1954. 37. Stadt-man E. R., Oliver C. N. Metal-catalyzed oxidation of proteins. Physiological consequences // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 2005-2008. 38. Starke-Reed P. E., Oliver C. N. Protein oxidation and proteolysis during aging and oxidative stress // Arch. Biochem. Biophys. 1989. Vol.275. P.559-567.

Статья поступила в редакцию 16 января 2003 г.