РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ БЕЛОК СС10 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГРИППА
RECOMBINANT HUMAN CC10 PROTEIN FOR TREATING INFLUENZA

Область техники, к которой относится изобретение
Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам снижения титров вируса in vivo и лечения у пациента вирусной респираторной инфекции. Варианты осуществления настоящего изобретения относятся также к способам лечения гриппозной инфекции, в том числе гриппа типа А, в особенности гриппа H1N1. Кроме того, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам лечения указанных выше инфекций с использованием вводимого интраназально, и/или вводимого внутривенно, и/или вводимого ингаляцией рекомбинантного человеческого белка СС10.
Уровень техники
Белок клеток Клара с молекулярной массой 10 кДа (СС10) или утероглобин (UG) - это небольшой гомодимерный секреторный белок, продуцируемый некоторыми эпителиями слизистой оболочки и другими органами эпителиального происхождения (Mukherjee, 1999). Белок СС10 состоит из содержащих по 70 аминокислотных остатков двух идентичных субъединиц, в каждой из которых лейтмотив вторичной структуры образует «четырехспиральный узел», соединенных во встречно-параллельной ориентации двумя дисульфидными связями между цистеинами 3 и 69', 3' и 69 (Matthews, 1994; Morize, 1997). Белок СС10 - первый представитель пополняемого семейства малых глобулярных белков, имеющих одинаковые вторичную, третичную и четвертичную структуры и, как полагают, выполняющих схожие функции. Оказывается, что его первичной формой является гомодимер, содержащий две дисульфидные связи. У человека основным местом продукции белка СС10 являются легкие, хотя и в некоторых других органах синтезируются небольшие количества мРНК, кодирующей этот белок (Singh, 1987; Sandmoller, 1994). Белок СС10 представляет собой противовоспалительный и иммуномодулирующий белок, который был охарактеризован по его различным взаимодействиям с другими белками, рецепторами и типами клеток (см. обзор в Mukherjee, 1999 и Pilon, 2000). Пониженные уровни продукции белка СС10 или мРНК были обнаружены в различных образцах тканей и биологических жидкостей при целом ряде болезненных состояний, характеризующихся некоторой степенью воспаления, в том числе при пневмонии (Nomori, 1995).
Физиология белка СС10 при различных типах легочной инфекции была исследована на одной линии мышей с нокаутом белка СС10. В двух исследованиях мыши с нокаутом белка СС10 и мыши дикого типа были заражены двумя типичными для человека респираторными патогенами - либо Pseudomonas aeruginosa, либо аденовирусом. У нокаутированных мышей было обнаружено более быстрое исчезновение патогенов с большей нейтрализацией патогенов врожденной иммунной системой, что позволило предположить пользу дефицита белка СС10 в ходе вирусной и бактериальной инфекции (Hayashida, 1999; Harrod, 1998). Это согласуется с более ранними наблюдениями, в которых было отмечено, что белок СС10 является иммуносупрессорным агентом (Dierynck, 1995; 1996). Это указывает на то, что белок СС10 способен подавлять естественную иммунную реакцию на инфекцию, бактериальную или вирусную, включая грипп. Поэтому не следует ожидать того, что введение белка СС10 при наличии вирусной или бактериальной респираторной инфекции принесет пользу пациенту. Впоследствии было отмечено, что восстановление функции СС10 у нокаутированных мышей с помощью рекомбинантного человеческого белка СС10 (rhCC10), введенного перед заражением респираторным синцитиальным вирусом (RSV), приводит к более быстрому исчезновению инфекции, чем у нокаутированных мышей без такого восстановления (Wang, 2003). Однако недавние исследования показали, что белок rhCC10 может предотвращать развитие приобретенного иммунитета, особенно появление антиген-специфических Т-клеток, если он присутствует одновременно с взаимодействием антигена с дендритными клетками (Johansson, 2007). Это вновь указывает на то, что введение белка rhCC10 может не быть полезным для пациента с инфекцией. Таким образом, в настоящее время знания, касающиеся потенциальной опасности или пользы применения белка rhCC10 для лечения респираторной инфекции, противоречивы и не позволяют сделать заключений относительно безопасности и/или эффективности применения белка СС10 для лечения различных типов респираторных инфекций. Нет никакой информации, касающейся действия белка СС10 на гриппозную инфекцию. В данной заявке описаны: прямая проверка эффективности действия белка rhCC10 на грипп типа A in vivo, прямая проверка антивирусного действия белка СС10 на клеточном уровне, механизм его действия и его возможное применение для лечения и/или профилактики вирусной инфекции, в частности гриппозной инфекции.
Вирус гриппа за последние 120 лет был причиной четырех главных вспышек эпидемии (1889, 1918, 1957 и 1968), приведших к гибели во всем мире приблизительно 50÷100 миллионов человек. Вирус гриппа - это ортомиксовирус, РНК-содержащий вирус, который переносится аэрозольным путем, а также при непосредственном контакте зараженных поверхностей со слизистой оболочкой носа, и поражает клетки эпителия респираторного тракта. Гриппозная инфекция может вызвать тяжелые симптомы, в том числе лихорадку, ангину, боли в мышцах, недомогание, потерю веса, респираторную гиперемию, а в некоторых случаях респираторную недостаточность и смерть. Грипп вызывает появление приобретенной иммунной реакции (цитотоксичные Т-клетки и антитела), которая обычно у нормальных здоровых индивидуумов устраняет инфекцию в течение 1÷2 недель. Некоторые подтипы гриппа, заражающие людей, в том числе птичий грипп (H5N1), сезонный грипп (H3N2) и свиной грипп (H1N1), возможно лечить антивирусными средствами, такими как ингибиторы нейраминидазы. Однако высокая скорость мутации вируса гриппа привела к появлению штаммов с лекарственной устойчивостью (Moscona, 2009), так что широкое использование антивирусных средств для профилактики и/или лечения приведет к ускорению развития устойчивости к этим лекарствам. Поэтому для лечения, излечения и профилактики гриппозной инфекции необходимы новые терапевтические средства. Также нет апробированных средств лечения для подавляющего большинства вирусных инфекций респираторного тракта или других систем организма.
Цели изобретения
Далее представлен неисчерпывающий список целей, достигнутых в вариантах осуществления настоящего изобретения.
Целью вариантов осуществления данного изобретения является снижение легочного титра вируса и посредством этого лечение, излечение или профилактика гриппозной инфекции, в частности гриппозной инфекции типа А и в особенности - инфекции штаммом H1N1 вируса гриппа.
Дальнейшей целью вариантов осуществления данного изобретения является снижение легочного титра вируса и лечение, излечение или профилактика гриппозной инфекции путем введения белка СС10 внутривенным путем, ингаляторным путем или интраназальным путем или с сочетанием путей введения.
Другой целью вариантов осуществления данного изобретения является снижение титра вируса и лечение, излечение или профилактика вирусной инфекции путем введения белка СС10 внутривенным путем, ингаляторным путем или интраназальным путем, пероральным путем, интравагинальным путем или с сочетанием путей введения.
Еще одной целью вариантов осуществления данного изобретения является подавление репликации вируса на клеточном уровне путем применения белка СС10 или других представителей семейства секретоглобинов.
Раскрытие изобретения
Эти и иные цели, свойства и преимущества достигаются в вариантах осуществления данного изобретения путем введения белка rhCC10 в диапазоне заданных дозировок с подходящими интервалами или в одной дозе для снижения титра вируса и лечения, излечения или профилактики вирусной инфекции.
Эти и иные цели, свойства и преимущества достигаются в вариантах осуществления данного изобретения путем введения белка СС10 в диапазоне заданных дозировок с подходящими интервалами или в одной дозе, если у пациента диагностирована вирусная инфекция по симптомам, характерным для конкретного вируса, и/или путем выявления вируса стандартными методами в пробах пациента посредством культивирования вируса, иммунологического выявления вируса и/или обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты.
Эти и иные цели, свойства и преимущества достигаются также в вариантах осуществления данного изобретения путем введения белка СС10 в диапазоне заданных дозировок с подходящими интервалами или в одной дозе, если у пациента диагностирована гриппозная инфекция по симптомам лихорадки, миалгии и гиперемии и/или по выявлению вируса гриппа стандартными методами в пробах пациента (носовых смывах, образцах крови или мокроты) путем культивирования вируса, иммунологического выявления вируса и/или обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты.
В определенных аспектах изобретения белок СС10 вводят интраназально в дозе, приблизительно равно распределенной между обеими ноздрями, в диапазоне от 1,5 мкг до 1,5 мг на килограмм массы тела в день, или несколькими дозами, которые в сумме оказываются в этом диапазоне дневных дозировок, для снижения легочного титра вируса и лечения, излечения или профилактики гриппозной инфекции.
В другом аспекте белок СС10 вводят внутривенно в дозе до 10 мг на килограмм массы тела в день или несколькими дозами, которые в сумме оказываются в этом диапазоне дневных дозировок, для лечения, излечения или профилактики гриппозной инфекции.
В другом аспекте белок СС10 нечеловеческого происхождения вводят в данном диапазоне дозировок с подходящими интервалами или в одной дозе, если у пациента диагностирована вирусная инфекция по симптомам, характерным для конкретного вируса, и/или по выявлению вируса стандартными методами в пробах пациента путем культивирования вируса, иммунологического выявления вируса и/или обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты.
В еще одном аспекте другой представитель семейства белков СС10, которые в целом известны как секретоглобины, вводят в данном диапазоне дозировок с подходящими интервалами или в одной дозе, если у пациента диагностирована вирусная инфекция по симптомам, характерным для конкретного вируса, и/или по выявлению вируса стандартными методами в пробах пациента путем культивирования вируса, иммунологического выявления вируса и/или обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты.
Краткое описание иллюстраций
7
50
Фиг.1 - гистограмма, на которой представлена вирусная нагрузка H1N1 на второй день в легких зараженных хлопковых хомяков (cotton rats), которым интраназально вводили белок rhCC10. Вирусный титр выражен в единицах (×10) TCID на грамм ткани.
7
50
Фиг.2 - гистограмма, на которой представлена вирусная нагрузка H1N1 на второй день в легких хлопковых хомяков, которым внутрибрюшинно вводили белок rhCC10. Вирусный титр выражен в единицах (×10) TCID на грамм ткани.
Фиг.3 - гистограмма, на которой представлено подавление белком rhCC10 репликации вируса в культурах клеток. Белок rhCC10 добавляли в культуральную среду клеток НЕр2 в концентрациях 100 мкг/мл, 300 мкг/мл и 1 мг/мл и оставляли на 4 часа. Затем среду удаляли и замещали свежей, клетки заражали RSV в течение 1 часа. Затем клетки промывали для удаления избытка вируса, снова добавляли белок rhCC10 и инкубировали еще в течение часа. Затем клетки промывали для удаления избытка белка СС10. Титры вируса в культуральной среде измеряли на четвертый день после заражения. Каждую концентрация белка СС10 применяли в трех повторностях.
Фиг.4 - сравнение на гистограмме антивирусного действия белка rhCC10 при его введении до заражения и после заражения. Клетки НЕр2 обрабатывали белком rhCC10 при концентрации 1 мг/мл и заражали RSV, как и в случае на фиг.3. Кроме того, 1 мг/мл белка rhCC10 вводили через 1 час после заражения (обработка в день 0), через 24 часа после заражения (обработка в день 1) и через 48 часов после заражения (обработка в день 2). Титры вируса в культуральной среде измеряли на четвертый день после заражения.
Осуществление изобретения
Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к использованию белка СС10 для снижения легочного титра вируса и для лечения, излечения или профилактики гриппозной инфекции. Белок СС10 предпочтительно представляет собой рекомбинантный человеческий белок СС10 (rhCC10), полученный с помощью процессов, описанных в публикации №20030207795 патентной заявки США и в заявке PCT/US 09/43613, каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки, или с помощью любого другого процесса, позволяющего получать белок rhCC10 фармакопейной квалификации. Белок rhCC10 в вариантах осуществления настоящего изобретения возможно вводить совместно с, без, до или после другого интраназального, легочного или системного лечения.
Без ограничения возможных процессов синтеза, которые могут быть использованы для получения человеческого белка СС10, рекомбинантный человеческий белок СС10 (известный также как утероглобин), активный в подавлении вирусной репликации in vitro и in vivo, синтезировали и характеризовали, как описано в публикации №20030207795 патентной заявки США, по которой выдан патент США №7122344.
Препараты белка rhCC10 для интраназального введения, как они описаны в PCT/US 09/43613, представляют собой дальнейшие варианты осуществления настоящего изобретения, которые могут быть использованы для подавления вирусной репликации in vivo, в особенности в носовых проходах и полостях.
Дозировки
При лечении гриппозной инфекции предпочтительно вводить белок rhCC10 интраназально, в каждую ноздрю 1÷3 раза в день в течение 7÷14 дней, через день в течение еще 14 дней, после чего - по необходимости. Более предпочтительно вводить белок rhCC10 сразу после появления у пациента лихорадки, миалгии и гиперемии или диагностирования гриппа.
Процесс производства белка rhCC10 может содержать следующие стадии: а) создание бактериальной системы экспрессии, способной экспрессировать белок rhCC10; b) инокулирование ферментера затравкой, содержащей бактериальную экспрессирующую систему, для получения ферментационной культуры; с) добавление в ферментационную культуру индуцирующего агента для индукции экспрессии белка rhCC10 в бактериальной экспрессирующей системе; d) извлечение экспрессированного на стадии (с) белка rhCC10; и е) очистка излеченного на стадии (d) белка rhCC10, где стадия очистки включает использование, по меньшей мере, одного фильтра и, по меньшей мере, одной ионообменной колонки, как описано в публикации №20030207795 патентной заявки США. Белок rhCC10 также может быть экспрессирован в другой экспрессирующей системе - бактериальной, грибной, из насекомых, из млекопитающих, растительной, и очищен так, чтобы его характеристики соответствовали требованиям к фармацевтическому продукту, пригодному для введения людям с помощью стандартных способов.
Характеристики и результаты испытаний для белка rhCC10 фармакопейной квалификации, согласно публикации №20030207795 патентной заявки США, который может быть использован для снижения титров вируса, включают следующее.
Тест
Характеристика
Цвет
Прозрачный, бесцветный
Внешний вид
Отсутствие мутности
Гомогенность
Гомогенный
Чистота
>95%
Степень агрегации
<5%
Стерильность
Стерильный
Биологическая активность
Положительная
Бактериальная нуклеиновая кислота
<100 пг на дозу
Масс-спектроскопия
набл. 16110
рН
5-8
Изоэлектрическое фокусирование
4,7±1
Свободные тиолы
<10% по массе
ЛАЛ-тест
<5 Ед/мг
Медь
<16 мкМ
2
2
В другом варианте осуществления изобретения белок rhCC10 согласно настоящему изобретению, который подавляет репликацию вируса, ингибирует также фермент фосфолипазу А (PLA), как описано в публикации №20030207795 патентной заявки США.
Для достижения желаемых результатов, дополнительно описанных ниже, сделаны отсылки к способам введения, описанным в следующих вариантах осуществления изобретения.
В одном из вариантов осуществления изобретения можно вводить интраназально дозу или несколько доз белка rhCC10, эквивалентных дозе в диапазоне от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 5 мг на килограмм массы тела в день. В другом варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить в указанном диапазоне дневных доз. В еще одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить в указанном диапазоне дневных доз в течение, по меньшей мере, 7 дней подряд. Еще в одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить в указанном диапазоне дневных доз в течение, по меньшей мере, 14 дней подряд. Еще в одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить в указанном диапазоне доз через день в течение 30 дней подряд. Еще в одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить в убывающих дозах ежедневно в течение 10 дней подряд, причем указанные убывающие дозы представляют собой высокую дозу при каждом введении в течение первых 3 дней, промежуточную дозу при каждом введении в течение следующих 3 дней и низкую дозу при каждом введении в течение последних 4 дней. Еще в одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить в указанном диапазоне доз или убывающими дозами до трех раз в день, приблизительно каждые 8 часов.
В другом варианте осуществления изобретения указанные дозы белка rhCC10 можно вводить пациенту интраназально в виде аэрозоля, в виде интраназального спрея или обмывания, или путем нанесения геля или крема, или другим способом капельного введения в носовые проходы.
В другом варианте осуществления изобретения указанные дозы белка rhCC10 можно вводить пациенту ингаляторно в виде аэрозоля, распылителем или дозирующим ингалятором, или иным способом прямого введения в легкие и дыхательные пути.
В другом варианте осуществления изобретения при лечении или профилактике гриппозной инфекции белок rhCC10 вводят внутривенно в дозах от 15 мкг до 20 мг на килограмм массы тела, 1÷3 раза в день, в течение 7÷14 дней, а затем через день в течение еще 14 дней, после чего - по необходимости. Еще в одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить убывающими дозами ежедневно в течение 10 дней подряд, причем указанные убывающие дозы представляют собой высокую дозу при каждом введении в течение первых 3 дней, промежуточную дозу при каждом введении в течение следующих 3 дней и низкую дозу при каждом введении в течение последних 4 дней. Еще в одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить в указанном диапазоне доз или убывающими дозами до трех раз в день, приблизительно каждые 8 часов.
В другом варианте осуществления изобретения указанные выше дозы белка rhCC10 можно вводить пациенту с использованием сочетания интраназального, ингаляторного и внутривенного путей. В другом варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить, в соответствии с описанными выше способами, до, одновременно или после антивирусной терапии, лечения антибиотиками, лечения противоотечным, антигистаминным, муколитическим, отхаркивающим средством, подавителем образования слизи, сурфактантом, бронхолитическим средством, сосудосуживающим средством, болеутоляющим средством для полостей или другого типового лечения. В еще одном варианте осуществления изобретения белок rhCC10 можно вводить, в соответствии с описанными выше способами, для снижения легочного титра вируса и лечения, излечения или профилактики гриппозной инфекции.
Дозы белка rhCC10 и описанные выше способы введения могут быть использованы ежедневно, более одного раза в день, три раза в день, через день или с убыванием дозы, в зависимости от тяжести подлежащей лечению гриппозной инфекции, общего состояния здоровья пациента и от наличия сопутствующих болезненных состояний. Например, чем тяжелее инфекция, тем большее количество белка rhCC10 может потребоваться для ее эффективного лечения. Очевидно, что врач способен определить необходимые дозы, рецептуры и способы введения на основании симптомов и реакции на лечение пациента в пределах параметров и диапазонов доз, описанных в вариантах осуществления настоящего изобретения.
Рецептуры
Интраназальные рецептуры, устройства и способы, которыми белок rhCC10 можно вводить интраназально, описаны в заявке PCT/US 09/43613, которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. Рецептура белка rhCC10 для внутривенного введения является раствором с концентрацией 5,5 мг/мл в 0,9% солевом физиологическом растворе и описана в публикации №20030207795 патентной заявки США, которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
Пример 1
Размножение и определение титра вируса гриппа
2
50
Подготавливают штамм A/PR/8/34 вируса гриппа A (H1N1), приобретаемый из Американского банка типовых культур (American Type Culture Collection, Manasass, Virginia, USA). Вирус гриппа размножают в культурах клеток MDCK (номер CCL-34 по каталогу АТСС) путем заражения монослоя клеток на стадии 60% слияния (во флаконах объемом 150 см) вирусом гриппа при множественности заражения (MOI) 0,01. Через 3 или 4 дня, когда развился цитопатический процесс и большинство клеток отделилось от поверхности сосуда, извлекают клетки и надосадочные жидкости. Клетки удаляют центрифугированием (800 g), надосадочную жидкость фильтруют (размер пор 0,45 мкм) и центрифугируют (18000 g) в течение 2 часов при 4°С для осаждения вируса. Осадок вируса ресуспендируют в среде DMEM, суспензию разделяют на аликвоты и хранят при -150°С. Титр вируса гриппа определяют, помещая по 0,1 мл из серийных разведений вирусных образцов в монослои клеток MDCK в планшете на 96 ячеек, культивируемых в присутствии 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и трипсина. Через 3 дня регистрируют цитопатическое действие и определяют по методу Kärber дозу 50%-ной инфекции в культуре ткани (TCID).
Обработка легочных тканей для анализа вирусной нагрузки
В асептических условиях извлекают срезы левой и правой долей легких зараженных мышей и хлопковых хомяков, взвешивают их и гомогенизируют в 1 мл среды DMEM в течение 45 с, используя аппарат для разрушения ткани (Biopspec Products Inc., модель 985-370) в режиме 5. Гомогенаты центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин. Осветленные надосадочные жидкости собирают и хранят при -150°С до использования.
Определение титров вируса
1
8
7
9
Титры вируса в запасах размноженного вируса и в гомогенагах легких определяют путем серийных разведений с последующим анализом бляшкобразования (PFA) или анализом образования очагов (FFA). Число бляшкообразующих единиц (БОЕ) и образующих очаги единиц (ООЕ) в 1 мл исходного образца рассчитывают перед началом исследования. Сохраняют один набор образцов вируса, достаточный для проведения PFA и FFA, и после завершения исследований определяют число БОЕ и ООЕ. Серийные разведения культивированного вируса в осветленной среде (DMEM с 1% БСА) готовят в интервале разведений от 10 до 10. Каждое разведение характеризуют с помощью PFA и FFA. Для культивированного вируса гриппа обычно получают титры 10-10БОЕ/мл.
Пример 2
Интраназальное введение белка rhCC10 для снижения легочного титра вируса гриппа
Хлопковые хомяки (S.hispidus), разновидность полевки - это животная модель, в которой вирус гриппа реплицируется и вызывает мягкую респираторную инфекцию (Ottolini, 2005). Животных заражают путем интраназальной инокуляции вируса гриппа и легочные титры вируса достигают максимума через 2 дня (приблизительно 48 часов) после инокуляции. Эту модель используют для определения соединений, ингибирующих репликацию вируса гриппа in vivo.
7
7
50
50
Не содержащие патогенов хлопковые хомяки были получены от Virion Systems, Inc. (Rockville, MD). Всего 18 хлопковых хомяков (S.hispidus, возраст 6-8 недель) были заражены вирусом гриппа типа A (A/PR/8/34), штамм H1N1, путем интраназальной инокуляции, доза для каждого животного составила 10 TCID в объеме 0,1 мл. Шести животным ввели плацебо (0,9% NaCl), шести животным ввели 0,5 мг/кг белка rhCC10 и шести животным ввели 5,0 мг/кт белка rhCC10 путем интраназальной инсталляции за 2 часа до инокуляции вируса. Животных забили на второй день после заражения, когда титры вируса обычно наиболее высоки, и в легочной ткани определили вирусную нагрузку. На фиг.1 показано снижение титра вируса в легочной ткани, которое наблюдали в обеих группах, получивших дозу белка rhCC10. Титр вируса в легких выражен в единицах (×10) TCID/грамм ткани.
Пример 3
Системное введение белка rhCC10 для снижения легочного титра вируса гриппа
7
7
50
50
Всего 18 хлопковых хомяков (S.hispidus, возраст 6-8 недель) были заражены вирусом гриппа типа A (A/PR/8/34), штамм H1N1, путем интраназальной инокуляции, доза для каждого животного составила 10 TCID в объеме 0,1 мл. Шести животным вводили плацебо (солевой физиологический раствор), шести животным вводили 0,5 мг/кг белка rhCC10 и шести животным вводили 5,0 мг/кг белка rhCC10 путем внутрибрюшинной инъекции. Внутрибрюшинный путь введения обеспечивает значительные количества циркулирующего белка rhCC10 и имитирует внутривенное введение людям. Каждое животное получило в общей сложности 6 доз либо плацебо, либо белка rhCC10 приблизительно каждые 12 часов, в том числе две дозы (утром и вечером) в день накануне заражения, две дозы в день заражения и 2 дозы на следующий день после заражения (3 дозы до заражения и 3 дозы после заражения). Животных забили на второй день после заражения, когда титры вируса обычно наиболее высоки, и в легочной ткани определили вирусную нагрузку. Фиг.2 иллюстрирует статистически достоверное снижение (p<0,01) титра вируса в легочной ткани, обнаруженное в группе с дозой 5 мг/кг белка rhCC10, и тенденцию к понижению титра вируса в группе с дозой 0,5 мг/кг. Титр вируса в легких выражен в единицах (×10) TCID/грамм ткани.
На основании изложенного выше было установлено, что белок rhCC10 снижает титр вируса при респираторной инфекции. Это указывает на возможность использования белка rhCC10 для лечения, излечения и/или профилактики гриппозной инфекции. В соответствии с этим варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают основанную на белке rhCC10 терапию с интраназальным и внутривенным введением или с их сочетанием, эффективную для лечения, излечения или профилактики гриппозной инфекции.
Пример 4
Подавление репликации вируса на клеточном уровне с применением СС10
6
50
Клетки НЕр2 (АТСС, Manassas, VA) были использованы для размножения вируса RSV, штамм А-2 (Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia, MD), и получения вирусных рабочих препаратов. Клетки высевали в количестве 50000 клеток на ячейку в планшеты на 48 ячеек и выращивали в минимальной среде Игла (MFM) с 10% сывороткой зародыша теленка (FBS) до приблизительно 80% слияния. Клетки предварительно обрабатывали белком СС10 в 0,5 мл MEM в течение 4 часов. Затем среду заменяли на свежую и клетки заражали вирусом RSV при дозе 1×10 TCID на чашку для культур клеток диаметром 100 мм в течение 1 часа. Неадсорбированный вирус удаляли промыванием и добавляли 0,5 мл среды MEM с 2% FBS, 4 мМ L-глутамина и белок rhCC10. Надосадочные жидкости собирали на четвертый день после заражения и титровали вирус. Фиг.3 показывает, что белок СС10 в концентрации 1 мг/мл практически полностью устраняет продукцию вируса RSV, а при дозах 100 и 300 мкг/мл наблюдается приблизительно 3-кратное ее снижение.
Белок СС10 также подавлял репликацию вируса в клетках, если его вводили через 1, 24 и 48 часов после заражения. Фиг.4 показывает, что белок rhCC10 эффективен в подавлении титра вируса при его введении не только до заражения, но также и после заражения. Это является первым свидетельством непосредственной антивирусной активности белка СС10 на клеточном уровне и иллюстрирует потенциальную пользу белка rhCC10 как средства антивирусной терапии при лечении после заражения.
Пример 5
Механизм антивирусного действия белка СС10
Фенотип эпителиальных клеток дыхательных путей у мышей с нокаутом по СС10 показывает, что в отсутствие белка СС10 распределение внутриклеточных органелл аномально, что имеются аномальным образом стоженные мембранные структуры и что нарушена секреция других белков, производимых клеткой. Авторы предполагают, что этот фенотип означает, что белок СС10 играет активную роль в транспорте секреторных везикул из аппарата Гольджи к плазматической мембране клетки. Белок СС10 модулирует также захват и процессинг антигенов антиген-предъявляющими клетками. Авторы полагают, что эти наблюдения означают, что белок СС10 является важным фактором в транспорте материалов как наружу, так и внутрь у многих типов клеток. Из этого авторы заключают, что белок СС10 подавляет репликацию вируса, препятствуя транспорту вируса в клетку. Поскольку все вирусы используют процессы клеточного транспорта для внедрения в клетку и репликации, следует ожидать, что белок СС10 может подавлять репликацию всех вирусов. Можно также ожидать, что другие секретоглобины, имеющие структуру, подобную белку СС10, также подавляют вирусную репликацию на клеточном уровне. Подобным же образом можно ожидать, что полученные из белка СС10 и других секретоглобинов, модулирующих процессы клеточного транспорта, пептиды также способны подавлять вирусную репликацию.
Ссылки на связанные заявки
Настоящая заявка является международной заявкой РСТ, испрашивающей приоритет по предварительной заявке США №61/252028, поданной 15 октября 2009 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.