СПОСОБ И СРЕДСТВА ДЛЯ МОНИТОРИНГА НАРУШЕНИЯ ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА В ОРГАНИЗМЕ

1. Способ определения состояния здоровья субъекта, раннего обнаружения повреждения тканей, ранней диагностики и мониторинга заболевания и/или оценки эффективности лечения субъекта с использованием циркулирующих тканевых макрофагов как показателя нарушенного гомеостаза ткани и наличия заболевания, указанный способ включает этапы:
a) обеспечения биологического образца для тестирования от указанного субъекта, причем указанный образец содержит циркулирующие тканевые макрофаги (СТМ);
b) окрашивания указанных СТМ с использованием панели дифференциально меченных различных антител против опорных маркеров CD14, CD16 и CD300e и предпочтительно дополнительно HLADR, с целью идентификации и подсчета различных субпопуляций СТМ;
c) фиксации, пермеабилизации и окрашивания СТМ с использованием одного или нескольких антител для обнаружения против одного или более эпитопов по меньшей мере одного протеазоиндуцированного фрагмента белка, полученного в результате внутриклеточной деградации не принадлежащего СТМ белка, отдельными СТМ в тканях, из которых они происходят, тем самым идентифицируя по меньшей мере одну субпопуляцию циркулирующих тканеспецифических макрофагов (CTSM);
d) анализа с применением многопараметрической проточной цитометрии указанных окрашенных СТМ и CTSM путем селективного пропускания по опорным маркерам CD14, CD16 и CD300e с целью определения количества сигналов каждого определенного меченого антитела, связанного с отдельными клетками;
e) определения относительного и абсолютного количества отдельных клеток в каждой субпопуляции СТМ и каждой специфической субпопуляции CTSM, экспрессирующих каждый из измеренных внутриклеточных эпитопов;
f) расчета (i) относительного и абсолютного количества клеток в каждой субпопуляции СТМ и каждой специфической субпопуляции CTSM, каждое из которых происходит из различных нормальных и измененных тканей, что определяют с помощью оцениваемого набора отдельных протеазоиндуцированных фрагментов белка, и ii) количества связанного с антителами сигнала, ассоциированного с каждым отдельным оцениваемым внутриклеточным пептидом, с целью получения профиля окрашивания CTSM, а также
g) сравнения тестируемого профиля окрашивания CTSM с нормальным профилем окрашивания CTSM для каждой оцениваемой ткани, причем аномальный профиль окрашивания свидетельствует о повреждении тканей, нарушенном гомеостазе ткани, наличии заболевания и/или эффективности лечения по сравнению с устойчивостью.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что b) включает окрашивание антителами к маркерам CD300e, CD14, CD16, HLADR.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап b) дополнительно включает окрашивание антителами к одному или более из маркеров CD45, CD64 и CD36.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что этап b) дополнительно включает окрашивание антителами к одному или более из маркеров CD45, CD64 и CD36.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что этап d) включает выполнение стратегии селективного пропускания, основанной на экспрессии CD300e, CD14 и CD16, предпочтительно CD300e, CD14, CD16 и HLADR, на поверхности клеток, в комбинации с анализом бокового светорассеяния (SSC).
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанная стратегия селективного пропускания состоит из (i) этапа включения для включения как классических моноцитов, так и СТМ, на основании экспрессии CD300e, предпочтительно экспрессии CD300e и HLADR, в сочетании с анализом бокового светорассеяния (SSC), и (ii) последующего этапа идентификации субпопуляций для различения классических CD14high/CD16-моноцитов и СТМ и идентификации субпопуляций в популяции СТМ.
7. Способ по п. 6, включающий одно из следующего:
(i) окрашивание с использованием по меньшей мере CD300e, CD14 и CD16 и селективное пропускание по комбинации SSC и CD300e+-клеток для отбора клеток с низким до среднего SSC, экспрессирующих CD300e;
(ii) окрашивание с использованием по меньшей мере CD300e, CD14, CD16 и HLADR и селективное пропускание по комбинации бокового светорассеяния (SSC) и CD300e+- и HLADR+-клеток для отбора клеток с низким до среднего SSC, одновременно экспрессирующих CD300e и HLADR, либо
(iii) окрашивание с использованием по меньшей мере CD300e, CD14, CD16, CD45 и HLADR, и селективное пропускание по комбинации SSC и CD300e+, CD45+ и HLADR+-клеток, предпочтительно селективное пропускание клеток с CD45 с низким до среднего SSC, одновременно экспрессирующих CD300e и HLADR.
8. Способ по п. 6 или п. 7, отличающийся тем, что указанный этап идентификации субпопуляций включает идентификацию классических (CD14high/CD16-) моноцитов и двух основных субпопуляций СТМ, идентифицируемых как клетки CD14high/CD16low -CD14high/CD16high, CD14low/CD16high и CD14-/CD16high - CD14-/CD16low.
9. Способ по п. 6 или п. 7, отличающийся тем, что указанный этап идентификации субпопуляций СТМ включает:
- селективное пропускание по CD64low, представляющим собой СТМ поздней стадии, в отличие от CD64high, представляющих собой классические моноциты и СТМ ранней стадии, а затем
- различение моноцитов и СТМ путем отбора всех других СТМ-клеток ранней стадии (по сравнению с классическими моноцитами) по фенотипу CD16+/CD14+ и определение всей категории СТМ как CD64low и как CD16+/CD14+/CD64high, а затем
- дальнейшее подразделение отобранных СТМ на основе уровней экспрессии CD64, CD14 и CD16 на отдельные категории, связанные с функциональными свойствами или созреванием, причем предпочтительно указанные отдельные категории представляют собой CD64high/CD14high/CD16low CD64high/CD14high/CD16high, CD64high/CD 14low/CD16high, CD64low/CD14-/CD16high и CD64low/CD14-/CD16low.
10. Способ по п.  9, отличающийся тем, что указанный этап дальнейшего подразделения отобранных СТМ основывается на CD64, CD14, CD16 и CD36, предпочтительно включая идентификацию по меньшей мере одного из следующих субпопуляций СТМ: от CD64high/CD36high/CD14high/CD16low до CD64high/CD36high/CD14high/CD16high, CD64high/CD36high/CD14low/CD16high, CD64low/CD36high/CD14-/CD16high и CD64low/CD14-/CD16low/CD36- до клеток с низким содержанием антигенов.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологический образец для тестирования включает периферическую кровь, асцитную жидкость, плевральный выпот, спинно-мозговую жидкость, костный мозг, лимфатический узел, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость или суспензию одиночных клеток, полученную из плотной ткани.
12. Способ по любому из пп. 1-4, 6, 7, 10 или 11, отличающийся тем, что этап с) включает внутриклеточное окрашивание:
а. одного или более эпитопов одиночного протеазоиндуцированного фрагмента белка, происходящего от процессируемого внутри клетки переработанного тканеспецифического белка;
b. одного или более эпитопов двух или более отдельных протеазоиндуцированных фрагментов белка, происходящих от одного процессируемого внутри клетки тканеспецифического белка;
с. одного или более эпитопов двух или более отдельных протеазоиндуцированных фрагментов белка, происходящих от двух или более процессированных внутри клетки тканеспецифических белков здоровых клеток одиночного органа или ткани;
d. одного или более эпитопов двух или более отдельных протеазоиндуцированных фрагментов белка, происходящих от двух или более процессированных внутри клетки тканеспецифических белков аномальных клеток одиночного органа или ткани;
e. одного или более эпитопов двух или более отдельных протеазоиндуцированных фрагментов белка, происходящих от двух или более процессированных внутри клетки тканеспецифических белков здоровых и аномальных клеток одиночного органа или ткани, включая комбинацию по меньшей мере одного антитела против пептидных эпитопов нормального белка и по меньшей мере одного антитела против пептидных эпитопов аномального белка, а также;
f. одного или более эпитопов двух или более отдельных протеазоиндуцированных фрагментов белка, происходящих от двух или более процессированных внутри клетки тканеспецифических белков здоровых или аномальных клеток из двух или более органов или тканей;
13. Способ по любому из 1-4, 6, 7, 10 или 11, отличающийся тем, что указанное по меньшей мере одно из антител для обнаружения обеспечивает обнаружение одного или нескольких пептидных эпитопов, происходящих от аномального белка, при этом указанный аномальный белок предпочтительно выбран из группы, состоящей из онкогенных белков, мутировавших белков, гибридных белков, белков-производных аллергена и белков, происходящих из патогенного организма, например, вируса, бактерии, паразита или гриба.
14. Способ по любому из 1-4, 6, 7, 10 или 11, отличающийся тем, что панель дифференциально меченных антител состоит из комбинации совместимых флуорохромов, выбранных из флуоресцеинизотиоцианата (FITC), фикоэритрина (РЕ), белка хлорофилла перидиней (PerCP), аллофикоцианина (АРС), Alexa Fluor 488, Alexa 647, Alexa 710, Alexa Fluor 405, цианина 5 (Cy5), цианина 5.5 (Cy5.5), Pacific Blue (PacB), Horizon Violet 450 (HV450), Pacific Orange (PacO), бриллиантового фиолетового (BV), HV500, OC515, Krorne Orange, квантовых точек и их конъюгатов, соединенных с РЕ, АРС или PerCP (например РЕ/Су5, РЕ/Су5.5, РЕ/Су7, PerCP/Су5.5, АРС/Су7, PR-техасский красный, АРССу750) или любого дополнительного совместимого флуорохрома или тандема флуорохромов.
15. Диагностический набор, содержащий, в первом контейнере, дифференциально меченные антитела против набора опорных маркеров, причем указанные опорные маркеры представляют собой CD300e, CD14 и CD16, а также предпочтительно, HLADR, и, необязательно, инструкции по применению указанного набора для идентификации и подсчета по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух, более предпочтительно по меньшей мере трех субпопуляций СТМ.
16. Диагностический набор по п. 15, отличающийся тем, что указанный первый контейнер включает антитела к маркерам CD300e, CD14 и CD16, предпочтительно CD300e, CD14, CD16 и HLADR, более предпочтительно дополнительно включающий по меньшей мере одно антитело, выбранное из группы антител к маркеру CD36, CD64 или CD45.
17. Набор по п. 16, отличающийся тем, что указанный первый контейнер включает антитела против CD300e, CD14, CD16, HLADR, CD45, CD64 и CD36.
18. Набор по любому из пп. 15-17, дополнительно включающий второй контейнер, включающий по меньшей мере одно меченое антитело для обнаружения против одного или более эпитопов по меньшей мере одного протеазоиндуцированного фрагмента белка, полученного при внутриклеточной деградации белка, не принадлежащего СТМ, отдельными СТМ в тканях, из которых они происходят.
19. Набор по п. 18, отличающийся тем, что указанный второй контейнер включает по меньшей мере одно антитело для обнаружения против одного или более протеазоиндуцированного(ых) фрагмента(ов) белка, полученных при внутриклеточной деградации белка эпителия, предпочтительно белка эпителия молочной железы, белка эпителия пищевода, белка эпителия желудка, белка эпителия поджелудочной железы, белка эпителия толстой кишки, белка эпителия прямой и сигмовидной кишки, белка эпителия щитовидной железы, белка эпителия легких или бронхов, белка эпителия предстательной железы, белка эпителия мочевого пузыря, белка эпителия шейки матки, белка эпителия матки, белка меланомы (например, Melan-A), белка клубочка почки, или против другого маркера эпителиальных клеток, дополнительно необязательно включая инструкции по применению при ранней диагностике и мониторинге злокачественных новообразований.
20. Диагностический набор по п. 18, отличающийся тем, что указанный второй контейнер включает по меньшей мере одно антитело для обнаружения одного или более эпитопов, полученных при внутриклеточной деградации белков, специфических для головного мозга и нервов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из Ароε4, белка-предшественника амилоида (АРР), GFAP и миелина, дополнительно необязательно включая инструкции по применению при ранней диагностике и мониторинге болезни Альцгеймера, глиомы или рассеянного склероза.
21. Диагностический набор по п. 19, отличающийся тем, что указанный второй контейнер включает по меньшей мере одно антитело для обнаружения одного или более эпитопов, полученных при внутриклеточной деградации белков, специфических для головного мозга и нервов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из Ароε4, белка-предшественника амилоида (АРР), GFAP и миелина, дополнительно необязательно включая инструкции по применению при ранней диагностике и мониторинге болезни Альцгеймера, глиомы или рассеянного склероза.
22. Диагностический набор по п. 18, отличающийся тем, что указанный второй контейнер включает по меньшей мере одно антитело для обнаружения одного или более эпитопов, полученных при внутриклеточной деградации белков, специфических для сердечной мышцы (например, тропонина или СК-МВ), белков, специфических для почек/клубочка, белков, специфических для печени или белков, специфических для легких, дополнительно необязательно включая инструкции по применению при оценке приживления органа после трансплантации и отторжения трансплантата у пациента, подвергшегося, соответственно, трансплантации сердца, почки, печени или легкого.
23. Диагностический набор по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что указанный второй контейнер включает по меньшей мере одно антитело для обнаружения одного или более эпитопов, полученных при внутриклеточной деградации белков, специфических для сердечной мышцы (например, тропонина или СК-МВ), белков, специфических для почек/клубочка, белков, специфических для печени или белков, специфических для легких, дополнительно необязательно включая инструкции по применению при оценке приживления органа после трансплантации и отторжения трансплантата у пациента, подвергшегося, соответственно, трансплантации сердца, почки, печени или легкого.