СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ НА ФРУКТОЗНОЙ СРЕДЕ
METHOD FOR PRODUCING A BIOLOGICAL PREPARATION FOR STIMULATING PLANT GROWTH ON A FRUCTOSE MEDIUM

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к производству препарата, используемого в качестве стимулятора роста сельскохозяйственных культур растений.
Известен препарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, включающий комплекс штаммов бактерий Pseudomonas species 7Г, Pseudomonas species 7Г2К, Pseudomonas species 17-2, взятых в соотношении 1:2:1-2:1:2 с концентрацией (2-5)⋅1010 кл/мл и дополнительно содержащий гуматы с микроэлементами (RU 2130264, МПК A01N 63/00, опубл. 20.05.1999). Недостатками известного препарата являются длительность его получения вследствие использования комплекса штаммов.
Известен препарат «Экстрагран» для стимуляции роста и защиты растений от болезней, содержащий штаммы микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. ВНИИСХМ №Д138 и Azotobacter vinelandii var. НП ВНИИСХМ №Д24 с титром клеток (0,8-1,2)⋅108 КОЕ/мл, взятых в соотношении (1,8-2,2): 1, а также гуматы с микроэлементами (RU 2302114, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, C12R 1/065, C12R 1/07, опубл. 10.07.2007). Недостатком данного препарата является то, что бактерии Bacillus mycoides var являются споровыми. В связи с чем невозможно спрогнозировать и получить заявленный титр клеток вследствие ранения готового препарата.
Известен препарат для стимуляции роста растений, содержащий суспензию клеток штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens HI6 в концентрации (2-4)⋅109 КОЕ/мл. Препарат позволяет повысить урожай растений за счет стимулирующей активности, но не защищает растения от широкого спектра фитопатогенов (RU 2001950, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 30.10.1993).
Известен штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, проявляющий антагонистическую активность по отношению к фитопатогеннь м грибам Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, usarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium funiculosum (RU 2203945, МПК A01N 63/00, C1: N 1/20, опубл. 10.05.2003). Известный штамм используется только в качестве препарата п ютив заболеваний пшеницы, также отсутствуют сведения о его ростостимулирующем действии. В свою очередь при получении препарата в состав среды входят такие компоненты как пептон и дрожжевой экстракт, что значительно повышает его стоимость.
Известен штамм бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4, полученный методом аналитической селекции природных изолятов по принципу отбора продуцентов, обладающих достаточно высокой антагонистической активностью по отношению к грибам-фитопатогенам, вызывающим корневые гнили пшеницы (RU 2245918, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, C12R 1:065, опубл. 10.02.2005).
Известен способ получения препарата для стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных культур и сам препарат для стимуляции роста, и защиты сельскохозяйственных культур (RU 2675503 С1, C12N 1/20, опубл. 19.12.2018). Способ включает раздельное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5787 в мелассной среде до достижения титра не менее 500 млн кл/мл. Затем полученные маточные культуры засевают в питательную мелассную среду в соотношении 2:1 и выращивают совместно до достижения титра клеток не менее 1010 КОЕ/мл в течение 20-22 ч. Недостатком данного способа являются длительное время получения препарата, быстрое снижение жизнеспособности Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 в результате хранения препарата, резкое снижение эффективности ростостимулирующих свойств препарата после 72 ч хранения. Кроме того, недостатком получаемого препарата является невысокая активность стимуляции растений и незначительное содержание фитогормонов, инициирующих рост растений.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения нового биологического препарата, эффективно влияющего на стимуляцию роста сельскохозяйственных культур на основе биомассы консорциума микроорганизмов, г также в снижении времени получения препарата и повышение жизнеспособности микроорганизмов в ходе хранения препарата.
Для решения данной задачи в настоящем изобретении предложен способ получения препарата для стимуляции растений при совместном культивировании грибов и бактерий S.cerevisiae, которые являются продуцентами индол-3-уксусной кислоты, а также впервые предложен способ получение биологического препарата для стимуляции роста растений в состав которого входят микроорганизмы рода Pseudomonas и рода Saccharomyces.
Технический результат достигается, тем что способ получения биологического препарата для стимуляции роста растений за счет высокого содержание WYK в культуральной жидкости включает совместное культивирование штаммов бактерий Рseudomonas chloraphis subsp.auerofaciens B-5326 и Saccharomyces cerevisiae Y-4317. При этом штаммы бактерий раздельно засевают в питательную фруктозную среду и культивируют в условиях аэрации до достижения титра не менее 500 млн кл/мл, получая маточные культуры, которые засевают в питательную среду на основе мелассы в соотношении 2:1 и выращивают до достижения титра клеток не менее 1010-1011 КОЕ/мл, а продолжительность ферментации составляет 17-18 ч.
В заявляемом способе используется два штамма микроорганизмов: Pseudomonas chlororaphis штамм В-5326 и Saccharomyces cerevisiae Y-4317 В качестве посадочного материала использовали: бактерии Pseudomonas chlororaphis штамм В-5326. Впервые этот микроорганизм был выделен из нефтеносной почвы, г. Дробыч (Украина) и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов; грибы Saccharom/ ces cerevisiae штамм Y-4317, выделенный впервые из плодов винограда, с. Ерси (Россия, Дагестан) и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов одушевляли на базе производственной лаборатории ООО НПО ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ в шейкере-инкубаторе «SPH-2102» (Минск, Беларусь). Эти бактерии используются в качестве инокулянта для почвы в сельском хозяйстве и садоводстве. Они могут действовать как средство биоконтроля против некоторых грибковых патогенов растений посредством производства антибиотиков феназинового типа. Также микроорганизмы описываемого вида способны воздействовать на иммунитет растения путем опосредованного оздоровления ризосферы, позитивно влиять на структуру урожая, производить фитогормоны и факторы роста. Кроме того, бактерии рода Pseudomonas увеличивают всхожесть семян, способствуют лучшей перезимовке и позитивно влияют на рекультивацию почв, загрязненных углеводородами.
В свою очередь штаммы микроорганизмов Saccharomyces erevisiae Y-4317 относящиеся к дрожжам - типичные обитатели филлосферы, но их фитогормональная активность дрожжей была мало исследована и только в последнее время ей начали уделять должное внимание. Экспериментальным способом было обнаружено, что данный штамм микроорганизмов способен синтезировать ИУК и стимулировать рост и развитие растений.
Способ получения биологического препарата осуществляется следующим образом.
Предварительно получают маточные культуры микроорганизмов. При этом хранение штаммов продуцентов осуществляют на скошенном питательном агаре.
Состав среды для культивирования бактерии Pseudomonas chlororaphis В-5326., г/л: фруктоза - 8,0; дрожжевой экстракт - 2,0; пептон - 8,0; агар-агар 15,0; NaCl 3.0; рН среды 6,8-7,0.
2
4
Состав среды для культивирования Saccharomyces cerevisia Y-4317, г/л: фруктоза - 20,0; пептон - 10; KHPO - 1; агар-агар -1 5,0; рН среды - 6,8-7,0.
Питательный агар стерилизуют при 1 атм в течение 45 мин в автоклаве «BioRus LDZX-75KBS» (Минск, Белорусь). Культуры штаммов микроорганизмов засевают на приготовленный агар и затем культивируют в течение 2-3 сут при температуре 28°C.
Штаммы бактерий отдельно переносят в питательную среду и культивируют в шейкере-инкубаторе до достижения титра не менее 400 млн кл/мл.
Выращивание бинокуляра проводят в шейкере-инкубаторе при 120 об/мин и температуре 30°С в течение 20 ч. Маточные культуры вносятся в произволе венную фруктозную среду из расчета 3-5% от засеваемого объема приготовляемого препарата. Соотношение вносимых штаммов составляет 2:1. Выращивание осуществляли при 150 об/мин и температуре 30°С в течение 18 ч до достижения титра клеток не менее 109-1010 КОЕ/ дл.
2
4
Состав среды для совместного выращивания г/л: фруктоза - 20,0; пептон - 10; дрожжевой экстракт - 2,0; KHPO-1; NaCl 2.0; рН среды - 6,8-7,0.
В результате получают концентрированный биологический препарат, который далее используется для приготовления рабочего раствора. Рабочий раствор используют для корневой и внекорневой обработки растений, обработки почвы и семян. Препарат представляет собой культуральную жидкость микроорганизмов.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
2
4
Штаммы микроорганизмов Saccharomyces cerevisiae Y-4. 17 и Pseudomonas chloraphis subsp.auerofaciens В-5326 выращивали в колбах шейкере-инкубаторе. Состав среды для совместного выращивания г/л: фруктоза - 20,0; пептон - 10; дрожжевой экстракт - 2,0; KHPO -1; NaCl 2.0; рН среды - 6,8-7,0. Режимы культивирования: 120 об/мин, 20 часов, температура 28°С. Максимальный титр 109 КОЕ/мл. Рабочий раствор для обработки растений готовили следующим образом: 1 мл концентрированного биологического препарата разводили в 100 мл воды.
Влияние препарата на ростовые показатели (энергия прорастания и процент всхожести, длину стебля) осуществляли на разных сортах озимой пшеницы: Мироновский 808; Московский 39; Скипетр. Семена пшеницы в количестве 500 шт. замачивали рабочим раствором культуральной жидкости в течение 30 минут. Далее семена перемещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную водой. На 3 сутки определяли энергию прорастания, на 7 сутки - всхожесть.
Объем корневой системы определяли методом Д.А. Сабинина и И.И. Колосова. 24-дневные растения пшеницы укрепляли с помощью ваты в отверстия разрезанной пополам пробки. Обе половинки пробки связывали по окружности ниткой и давали стечь раствору с корней. Последние прилипшие к корням капли жидкости удаляли с помощью влажной фильтровальной бумаги. Отмечали положение мениска А в пипетке объемометра, соответствующее положению воды в цилиндре, и погружали корни в цилиндр так, чтобы пробка с закрепленными в ней растениями лежала на цилиндре. В результате погружения корневой системы в объемометр уровень жидкости в цилиндре повысится и вызовет сдвиг мениска в пипетке до положения В1. После этого корни вынимали из цилиндра, давали стечь воде и, не меняя наклона пипетки, доливали в цилиндр воду, пока мениск в пипетке не займет положение А1. Затем при том же положении пипетки приливали из бюретки в цилиндр такое количество воды, при котором мениск займет положение В1. Прилитый из бюретки объем воды равен объему измеряемых корней. Определение повторяли 2-3 раза и рассчитывали среднюю величину.
Пример 2.
2
4
Штаммы микроорганизмов Saccharomyces cerevisiae Y-4317 и Pseudomonas chloraphis subsp.auerofaciens В-5326 выращивали в колбах shaking incubator SPH-21-02. Состав среды для совместного выращивания г/л: фруктоза - 20,0; пептон -10; дрожжевой экстракт - 2,0; KHPO -1; NaCl 2.0; рН среды - 6,8-7,0. Режимы культивирования: 130 об/мин, 18 часов, температура 30°С. Максимальный титр 1010 КОЕ/мл. Рабочий раствор для обработки растений готовили следующим образом: 1 мл концентрированного биологического препарата разводили в 100 мл воды.
Влияние препарата на ростовые показатели (энергия прорастания и процент всхожести, длину стебля) осуществляли на разных сортах озимой пшеницы: Мироновский 808; Московский 39; Скипетр. Семена пшеницы в количестве 500 шт. замачивали рабочим раствором культуральной жидкости в течение 30 минут. Далее семена перемещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную водой. На 3 сутки определяют энергию прорастания, на 7 сутки - всхожесть.
Объем корневой системы определяли методом Д.A. Сатинина и И.И. Колосова. 24-дневные растения пшеницы укрепляли с помощью ваты в отверстия разрезанной пополам пробки. Обе половинки пробки связывали по окружности ниткой и давали стечь раствору с корней. Последние прилипшие к корням капли жидкости удаляли с помощью влажной фильтровальной бумаги. Отмечали положение мениска А в пипетке объемометра, соответствующее положению воды в цилиндре, и погружали корни в цилиндр так, чтобы пробка с закрепленными в ней растениями лежала на цилиндре. В результате погружения корневой системы в объемометр уровень жидкости в цилиндре повысится и вызовет сдвиг мениска в пипетке до положения В1. После этого корни вынимали из цилиндра, давали стечь воде и, не меняя наклона пипетки, доливали в цилиндр воду, пока мениск в пипетке не займет положение А1. Затем при том же положении пипетки приливали из бюретки в цилиндр такое количество воды, при котором мениск займет положение В1. Прилитый из бюретки объем воды равен объему измеряемых корней. Определение повторяли 2-3 раза и рассчитывали среднюю величину.
На фиг. 1 показано влияние биопрепарата на основе Saccharomyces cerevisiae Y-4317 и Pseudomonas chloraphis subsp.auerofaciens В-5326 на высоту побегов 24-дневных растений пшеницы.
На фиг. 2 показано влияние биопрепарата на основе Saccharomyces cerevisiae Y-4317 и Pseudomonas chloraphis subsp.auerofaciens В-5326 на развитие корневой системы у 24-дневных растений пшеницы.
На фиг. 3 показано влияние культуральной жидкости исследуемых микроорганизмов на процент всхожесть семян.
На фиг. 4 показано содержание ИУК в культуральной жидкости исследуемых микроорганизмов.
На фиг. 5 показано влияние S. cerevisiae на жизнеспособность P. chlororaphis в течении 72 ч культивирования.
Таким образом, экспериментально доказано, что штаммы Sasscharomyces cerevisiae Y-4317 и Pseudomonas chloraphis subsp.auerofaciens В-5326 при совместном действии способны стимулировать рост и развитие растений. Так, высота побега растений, обработанных препаратом, по сравнению с контрольными растениями увеличилась на 30%, объем корневой системы на 25%, всхожесть семян от 20-35% в зависимости от сорта пшеницы. Кроме того, заявляемый способ позволяет в получаемом препарате увеличить количество жизнеспособных клеток Pseudomonas chloraphis subsp.auerofaciens В-5326 при культивировании совместно с грибами.