СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
HYPOGLYCEMIC AND IMMUNOMODULATORY AGENT PRODUCTION PROCEDURE

Изобретение относится к области фармации и заключается в способе получения лекарственного средства из растительного сырья, обладающего гипогликемической и иммуномодулирующей активностью.
В России трава манжетки зарегистрирована как гомеопатическое средство. Манжетка издавна применяется отечественной народной медициной для лечения различных заболеваний, в том числе и при сахарном диабете в качестве самостоятельного средства или в составе гипогликемических сборов. В настоящее время проводится ряд научных исследований о возможности использования манжетки как лекарственного растения и препаратов из нее в научной медицине [Буданцев А.Л. «Дикорастущие полезные растения России». Буданцев А.Л., Лесиовская Е.Е. СПб., 2001. - 663 с.].
Изучена гемореологическая активность сухого экстракта манжетки обыкновенной, полученного 40% этанолом [Алиев О.И. «Разработка гемореологического средства на основе полифенольного экстракта манжетки обыкновенной». Алиев О.И., Андреева В.Ю., Колтунов А.А. и др. // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Мат. III Международного съезда. - СПб. - 29.06-01.07.1999. - 93 с.].
По современным данным ВОЗ, во всех странах мира насчитывается более 175 млн больных сахарным диабетом. Экспертная оценка распространенности сахарного диабета позволяет считать, что к 2010 г. в мире будет насчитываться более чем 230 млн, а к 2025 г. - 300 млн больных сахарным диабетом, из которых 80-90% приходится на больных диабетом 2-го типа [Балаболкин М.И. «Новые возможности лечения сахарного диабета типа 2». Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Ремедиум, ноябрь 2004 г.].
Интерес вызывают препараты растительного происхождения, содержащие комплекс биологически активных веществ, задача которого не только снижать уровень сахара в крови, но и корректировать осложнения сахарного диабета и сопутствующих заболеваний, а также обладающий низкой токсичностью и не оказывающий побочных эффектов.
В связи с этим актуальным является разработка нового препарата из травы манжетки, обладающего гипогликемической и иммуномодулирующей активностью.
Известен способ получения Р-витаминного средства из надземной части манжетки обыкновенной, проявляющего адаптогенные свойства при экстремальных условиях. Способ получения включает экстракцию 96% этанолом, упаривание, очистку, осаждение и сушку продукта [RU 2128516 С1, 1999.04.10].
Этот способ целесообразно использовать в качестве прототипа вследствие наличия общих этапов получения и схожести сырьевых источников.
Прототип имеет ряд недостатков:
- трудоемкость способа получения;
- использование токсичных веществ (хлороформ, этилацетат) на этапах получения продукта;
- отсутствие параметров стандартизации и контроля качества продукта;
- отсутствие у препарата гипогликемической и иммуномодулирующей активности.
Задача изобретения - получение препарата, содержащего комплекс природных соединений, обладающего гипогликемической и иммуномодулирующей активностью, а также расширение арсенала средств, используемых в комплексном лечении сахарного диабета и заболеваний, связанных с иммунодефицитом. Способ обладает простотой, доступностью и возможностями экстрагента извлекать определенный комплекс биологически активных веществ (БАВ), отсутствием стадий с использованием токсичных веществ, а также достаточной сырьевой базой.
Вода как экстрагент имеет ряд положительных характеристик, и при ее использовании в получении сухого экстракта травы манжетки можно достичь извлечения суммы биологически активных веществ: полисахаридов, полифенольных соединений, флавоноидов, аскорбиновой кислоты и др., которые обуславливают фармакологический эффект.
Существенное влияние на концентрацию действующих веществ и фармакологическую активность конечного продукта оказывает соотношение сырья и экстрагента. Подбор оптимального соотношения проводили путем определения содержания основных групп биологически активных веществ и фармакологической активности при следующих соотношениях: 1:10, 1:20, 1:30. Максимальная концентрация соединений и наиболее выраженный фармакологический эффект наблюдали при соотношении 1:10 (таблицы 1, 2).
Источник получения препарата - трава манжетки (Herba Alchemillae), заготовленная в фазу цветения.
Траву манжетки измельчают до размера частиц >1 мм, ≤3 мм (таблица 3), экстрагируют водой очищенной в соотношении сырье: экстрагент - 1:10 методом ускоренной дробной мацерации в экстракторе при температуре 90-95°С в три этапа: в течение 1 часа, 45 мин и 30 мин. Объединенные извлечения отстаивают, фильтруют, декантируют, упаривают в вакууме до 1/10 объема и высушивают в распылительной сушилке.
Параметры стандартизации конечного продукта
Содержание влаги определяют по методике ГФ XI [Государственная Фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа / МЗ СССР. XI - изд., доп. - М.: Медицина. - 1987. - 336 с.].
Анализ на содержание флавоноидов
Качественное обнаружение.
Реакция с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида. К 0,5 мл раствора А (см. количественное определение) добавляют 1 мл спиртового раствора алюминия хлорида, появляется желтое окрашивание.
Количественное определение флавоноидов.
3
Точную навеску экстракта около 0,3 г помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в небольшом количестве воды очищенной, нагретой до 70°С. Доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 2 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, 1 каплю 0,33% раствора СНСООН, 1 мл 5% раствора гексаметилентетрамина, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор Б).
3
Раствор сравнения: 1 мл раствора А, 1 капля 0,33% раствора СНСООН, 1 мл 5% раствора гексаметилентетрамина перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл и довести объем до метки 96% этиловым спиртом.
Через 30 минут раствор Б и раствор сравнения фильтруют через складчатый беззольный фильтр с помощью стеклянной воронки диаметром 4 см. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 405 нм в кювете толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность комплекса РСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
3
3
Приготовление РСО рутина: около 0,05 г (точная навеска) РСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 часов, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл РСО рутина переносят в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 2% спиртового раствора AlCl, 1 каплю 0,33% раствора СНСООН, 1 мл 5% раствора гексаметилентетрамина, доводят объем раствора 95% спиртом до метки и перемешивают.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляли по формуле:
где D - оптическая плотность исследуемого раствора;
0
D - оптическая плотность РСО рутина;
0
m - навеска стандартного образца рутина, г;
m - навеска экстракта манжетки сухого, г;
W - содержание влаги в экстракте манжетки сухом, %.
в
2
2
Пример: 3 кг травы манжетки, измельченной до размера частиц >1 мм, ≤3 мм, помещают в экстрактор, заливают водой очищенной в соотношении 1:10 с учетом коэффициента водопоглощения сырья (К 2,0)-36 л. Экстрагируют при постоянном перемешивании и нагревании до 90-95°С в течение 1 часа, первое извлечение сливают. Аналогичным образом проводят еще две экстракции по 45 и 30 минут. На 2-м и 3-м этапе сырье вновь заливают водой очищенной в количестве, равном объему слитого извлечения. Далее объединенные извлечения отстаивают, фильтруют, декантируют, упаривают в вакууме при температуре реакционной массы 60±5°С и давлении 0,01 кгс/см (9,81 гПа) до 1/10 объема. Высушивают экстракт в распылительной сушилке в следующем режиме: температура воздуха на входе 130-140°С, на выходе 80-90°С, скорость подачи исходной смеси 2,0-2,5 л/ч, давление сжатого воздуха 5,2 кгс/см (0,52 мПа). Выход целевого продукта 0,615 кг, что составляет 20,5% от массы исходного сырья.
Сухой экстракт представляет собой гигроскопичную массу желто-коричневого или светло-коричневого цвета со слабым специфическим запахом и горьким вкусом, растворим в воде. Содержание флавоноидов 3,77±0,19%, влаги 3,72±0,12%. Срок годности экстракта 3 года.
Фармакологические испытания
50
50
Острая токсичность экстракта травы манжетки изучена на белых мышах обоего пола массой 18-20 г с определением ЛД [Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.41-54]. В каждой серии использовались 6 животных. Наблюдение вели ежечасно в течение суток после введения экстракта травы манжетки. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество растворителя. Результаты обрабатывали по Прозоровскому с вычислением средней смертельной дозы (ЛД) при Р=0,05 [Прозоровский В.В., Прозоровская М.П., Демченко В.М. / Фармакол. и токсикол. - 1978 - N4 - с.497-502].
50
Установлено, экстракт травы манжетки относится к малотоксичным препаратам. Его ЛД 8000 мг/кг.
Гипогликемическая активность экстракта травы манжетки изучена на модели аллоксанового диабета. Опыты выполнены на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г. Экспериментальную гипергликемию моделировали подкожным введением аллоксана в дозе 170 мг/кг.
Экстракт травы манжетки вводили перорально крысам с аллоксановым диабетом в дозах 50, 25 и 12,5 мг/ кг. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество растворителя. Концентрацию глюкозы в крови животных определяли глюкозооксидазным методом [Цюхно З.И., Славнов В.Н., Панченко Н.И. и др., Функциональные методы исследования в эндокринологии, Киев, "Здоровье", 1981. - С.61-64] до введения экстракта манжетки, а также через 30 и 120 мин после него. Крыс лишали пищи за 16 часов до опыта и на время его проведения. Результаты обрабатывали статистически с использованием коэффициента Стьюдента.
Установлено, что фитопрепарат манжетки проявляет гипогликемическую активность на модели аллоксанового диабета. Данный эффект является дозозависимым. Наибольшую гипогликемическую активность экстракт травы манжетки оказал в дозе 50 мг/кг (таблица 4).
Иммуномодулирующая активность экстракта травы манжетки изучена на модели лекарственно индуцированного иммунодефицита, который вызывали однократным внутрибрюшинным введением циклофосфана в дозе 50 мг/кг [Юшков В.В., Юшкова Т.А., Ларионов А.С. Фармакология иммунокорректоров, Екатеринбург, Изд-во ООО «УЦМФИ», 2005. - 164 с.]. Опыты выполнены на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г. Об иммуномодулирующей активности фитопрепарата судили по изменению количества Т- и В-лимфоцитов. Идентификацию Т-лимфоцитов проводили в реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами морской свинки, а В-лимфоцитов с эритроцитами мыши [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: Изд-во ВНИРО, 1995. - 219 с.]. Экстракт травы манжетки в дозе 50 мг/кг вводили перорально.
Установлено, что исследуемый фитопрепарат устранял иммунодефицит. Это проявилось в восстановлении количества как Т-, так и В-лимфоцитов (таблица 5).
Иммуномодулирующую активность экстракта травы манжетки также изучена по его способности влиять на экспрессию Т-зависимого антигена, которую оценивали с помощью реакции активного розеткообразования обработанных трипсином тимоцитов морской свинки [Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. «Тималин и его иммунобиологическая активность» // Иммунология гормонов тимуса / Под ред. Ю.А.Гриневича, В.Ф.Чеботарева. - Киев,1989. - С.125-142]. В качестве маркера при постановке данного теста использовали эритроциты кролика.
Установлено, что экстракт травы манжетки восстанавливал экспрессию рецепторов Т-лимфоцитов, сниженную трипсином. По степени влияния на экспрессию Т-зависимого антигена фитопрепарат не уступал тималину, типичному представителю иммуномодуляторов из группы Т-иммуномиметиков (таблица 6).
Предлагаемый способ позволяет получить малотоксичный препарат с выраженной гипогликемической активностью в сочетании с иммуномодулирующим эффектом, а также контролировать стадии технологического процесса и стандартизовать готовый продукт, удобный для хранения и транспортировки.
Перечисленные преимущества подтверждают перспективность внедрения данного изобретения в фармацевтическую промышленность, что позволит расширить ассортимент лекарственных средств растительного происхождения с гипогликемической и иммуномодулирующей активностью.
Таблица 1
Содержание биологически активных веществ в извлечениях с различными соотношениями сырья и экстрагента
№ п/п
Группы БАВ
Концентрация БАВ,% в соотношении сырье: экстрагент
1:10
1:20
1:30
1
Флавоноиды в пересчете на рутин
0,023±0,001
0,012±0,0002
0,007±0,0001
2
Полисахариды
4,87±0,090
2,72±0,12
1,82±0,08
3
Сумма окисляемых вещества в пересчете на танин
5,44±0,011
5,31±0,050
2,30±0,030
4
Аскорбиновая кислота
3,43±0,34
2,30±0,04
1,70±0,021
Таблица 3
Содержание биологически активных веществ в извлечениях, полученных из сырья манжетки различной степени измельчения
Размер частиц сырья, мм
Содержание БАВ, %
флавоноиды
полисахариды
сумма окисляемых веществ
аскорбиновая кислота
>1,0≤3,0
0,020±0,001
4,75±0,52
5,42±0,064
0,30±0,060
>1,0≤5,0
0,018±0,002
3,43±0,41
4,61±0,035
0,27±0,012
>1,0≤7,0
0,010±0,001
2,79±0,23
2,92±0,061
0,16±0,02
Таблица 5
Влияние экстракта травы манжетки на иммунодефицит
Серии опытов
Доза, мг/кг
Количество животных
Количество
Т-лимфоциты
В-лимфоциты
Контроль
6
55,7±1,5
16,8±1,1
Циклофосфан
50
6
23,5±1,3***<sub>1</sub>
5,2±0,7***<sub>1</sub>
Циклофосфан + Экстракт травы манжетки
50+50
6
45,7±1,4***<sub>1</sub>***<sub>2</sub>
14,0±0,5***<sub>2</sub>
Примечание: *** = р<0,001
1 - по отношению к контролю
2 - по отношению к циклофосфану
Таблица 6
Влияние экстракта травы манжетки на Еа-РОЛ
Серии опытов
Число Еа-РОЛ, %
% восстановления
Контроль-1 (норма)
56,5±1,1
Контроль-2 (после обработки трипсином)
14,0±1,0
Экстракт травы манжетки
40,2±0,9
71,1***<sub>1</sub>
Тимоген
34,8±1,3
61,6***<sub>1</sub>***<sub>2</sub>
Примечание: *** = р<0,001
1 - по отношению к контролю-1
2 - по отношению к контролю-2
Список литературы
1. В.Г.Колб, B.C.Камышников «Клиническая биохимия», Минск, изд-во «Беларусь». 1976, 312 с.
2. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., Л.: Медицинская литература, 1963.
3. Буданцев А.Л. «Дикорастущие полезные растения России». Буданцев А.Л., Лесиовская Е.Е. С.-Петербург. 2001. - 663 с.
4. Алиев О.И. «Разработка гемореологического средства на основе полифенольного экстракта манжетки обыкновенной». Алиев О.И., Андреева В.Ю., Колтунов А.А. и др. // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Мат. III Международного съезда. - СПб. - 29.06-01.07.1999. - 93 с.
5. Балаболкин М.И. «Новые возможности лечения сахарного диабета типа 2». Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Ремедиум, ноябрь 2004 г.
6. Государственная Фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа / МЗ СССР. XI - изд., доп. - М.: Медицина. - 1987. - 336 с.
7. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.41-54.
8. Прозоровский В.В., Прозоровская М.П., Демченко В.М. / Фармакол. и токсикол. - 1978 - N4 - с.497-502.
9. Цюхно З.И., Славнов В.Н., Панченко Н.И. и др., Функциональные методы исследования в эндокринологии, Киев, "Здоровье", 1981. - С.61-64.
10. Юшков В.В., Юшкова Т.А., Ларионов А.С. Фармакология иммунокорректоров, Екатеринбург, Изд-во ООО «УЦМФИ», 2005. - 164 с.
11. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: Изд-во ВНИРО, 1995. - 219 с.
12. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. «Тималин и его иммунобиологическая активность»// Иммунология гормонов тимуса / Под ред. Ю.А.Гриневича, В.Ф.Чеботарева. - Киев, 1989. - С.125-142.