ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА В РЕАКЦИЯХ РАСЩЕПЛЕНИЯ

1. Система ферментативной детекции для обнаружения в испытуемом образце активности расщепления ферментом, способным расщеплять субстрат, причем эта система включает:
(i) индикаторную молекулу для добавления к испытуемому образцу, причем указанная индикаторная молекула содержит:
(а) область расщепления, содержащую по меньшей мере один сайт расщепления, который может расщепляться указанным ферментом, если присутствует указанная ферментативная активность расщепления;
(б) сайт захвата, который остается интактным после расщепления индикаторной молекулы; и
при этом расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию нового сайта связывания;
(ii) зону захвата для фиксации испытуемого образца, при этом зона захвата включает молекулы захвата, способные к связыванию с сайтом захвата индикаторной молекулы независимо от того, расщеплена или нет индикаторная молекула, с целью иммобилизации индикаторной молекулы, включая новый сайт связывания; и
(iii) связывающие молекулы, способные к связыванию с новым сайтом связывания, при этом связывающие молекулы не способны к связыванию с индикаторной молекулой, если расщепление не произошло и пока расщепление не произойдет.
2. Система ферментативной детекции по п. 1, в которой расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию двух фрагментов области расщепления, из которых по меньшей мере один фрагмент остается связанным с сайтом захвата, и связывающие молекулы обладают способностью связываться с фрагментом индикаторной молекулы, содержащей по меньшей мере один фрагмент области расщепления, связанный с сайтом захвата.
3. Система ферментативной детекции по п. 1 или 2, в которой расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию двух отдельных фрагментов индикаторной молекулы.
4. Система ферментативной детекции по п. 1 или 2, в которой индикаторная молекула является пространственно затрудненной, так что расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию двух фрагментов области расщепления индикаторной молекулы, которые остаются связанными друг с другом.
5. Система ферментативной детекции по п. 1 или 2, в которой связывающие молекулы после расщепления связываются с областью расщепления.
6. Система ферментативной детекции по п. 5, в которой связывающие молекулы после расщепления связываются с обоими фрагментами области расщепления индикаторной молекулы.
7. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2 или 6, в которой по меньшей мере один сайт расщепления содержит пептидную связь, локализованную между двумя аминокислотными остатками.
8. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2 или 6, в которой фермент, обладающий способностью расщеплять субстрат, представляет собой протеазу.
9. Система ферментативной детекции по п. 8, в которой протеаза представляет собой матриксную металлопротеиназу.
10. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению специфическими протеазами.
11. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению специфическими матриксными металлопротеиназами.
12. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13 и/или ММР-9.
13. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13, 9, 2, 12 и 8, необязательно в таком порядке предпочтения.
14. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, в которой сайт расщепления находится в пределах аминокислотной последовательности GPQGIFGQ (SEQ ID NO: 1), после расщепления образующей фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность GPQG, и фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность IFGQ.
15. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, в которой связывающая молекула представляет собой антитело.
16. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, в которой сайт захвата содержит молекулу биотина, а зона захвата содержит молекулу стрептавидина.
17. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6 или 9, которая включает твердый носитель, с которым связываются молекулы захвата с образованием зоны захвата.
18. Система ферментативной детекции по п. 17, в которой твердый носитель включает также зону нанесения образца, в которую вводится образец.
19. Система ферментативной детекции по п. 17, в которой твердый носитель включает также контрольную зону ниже зоны захвата относительно зоны нанесения образца, содержащую дополнительные связывающие молекулы, которые связываются со связывающими молекулами, с целью показать успешное завершение анализа с использованием этой системы.
20. Система ферментативной детекции по п. 17, в которой твердый носитель содержит хроматографическую среду.
21. Способ обнаружения наличия или отсутствия в испытуемом образце активности расщепления ферментом, способным расщеплять субстрат, причем этот способ включает:
(i) приведение индикаторной молекулы в контакт с испытуемым образцом, при этом индикаторная молекула содержит:
(а) область расщепления, содержащую по меньшей мере один сайт расщепления, который может расщепляться указанным ферментом, если указанный фермент обладает активностью расщепления; и
(б) сайт захвата, который остается интактным после расщепления индикаторной молекулы;
при этом расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию нового сайта связывания;
(ii) добавление к испытуемому образцу связывающих молекул, способных к связыванию с новым сайтом связывания, при этом связывающие молекулы не обладают способностью связываться с индикаторной молекулой, если расщепление не произошло и пока расщепление не произойдет;
(iii) захват фрагмента индикаторной молекулы, содержащего новый сайт связывания в зоне захвата, путем связывания молекул захвата в зоне захвата с сайтом захвата, причем указанные молекулы захвата способны связываться с сайтом захвата независимо от того, расщеплена или нет индикаторная молекула; и
(iv) детекцию расщепления по меньшей мере по одному сайту расщепления путем определения связывания связывающих молекул с новым сайтом связывания в индикаторной молекуле, захваченной в зоне захвата.
22. Способ диагностики респираторного заболевания в испытуемом образце путем обнаружения активности расщепления ферментом (ферментативной активности расщепления), способным расщеплять субстрат, причем этот способ включает:
(i) приведение индикаторной молекулы в контакт с испытуемым образцом, при этом индикаторная молекула содержит:
(а) область расщепления, содержащую по меньшей мере один сайт расщепления, который может расщепляться указанным ферментом, если указанный фермент обладает активностью расщепления; и
(б) сайт захвата, который остается интактным после расщепления индикаторной молекулы;
при этом расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию нового сайта связывания;
(ii) добавление к испытуемому образцу связывающих молекул, способных к связыванию с новым сайтом связывания, при этом связывающие молекулы не обладают способностью связываться с индикаторной молекулой, если расщепление не произошло и пока расщепление не произойдет;
(iii) захват фрагмента индикаторной молекулы, содержащего новый сайт связывания в зоне захвата, путем связывания молекул захвата в зоне захвата с сайтом захвата, причем указанные молекулы захвата способны связываться с сайтом захвата независимо от того, расщеплена или нет индикаторная молекула; и
(iv) детекцию расщепления по меньшей мере по одному сайту расщепления путем определения связывания связывающих молекул с новым сайтом связывания в индикаторной молекуле, захваченной в зоне захвата, при этом повышенная по сравнению с контрольными данными степень расщепления свидетельствует о наличии респираторного заболевания.
23. Способ по п. 22, в котором респираторное заболевание представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких или воспаление дыхательных путей в результате кистозного фиброза.
24. Способ по любому из пп. 21-23, в котором расщепление по меньшей мере по одному сайту приводит к образованию двух фрагментов области расщепления, из которых по меньшей мере один фрагмент остается связанным с сайтом захвата, а связывающие молекулы способны связываться с фрагментом индикаторной молекулы, содержащим по меньшей мере один фрагмент области расщепления, связанный с сайтом захвата.
25. Способ по любому из пп. 21-23, в котором расщепление по меньшей мере одного сайта расщепления приводит к образованию двух отдельных фрагментов индикаторной молекулы.
26. Способ по любому из пп. 21-23, в котором индикаторная молекула является пространственно затрудненной, в результате чего расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию двух фрагментов индикаторной молекулы, которые остаются связанными друг с другом.
27. Способ по любому из пп. 21-23, в котором связывающие молекулы связываются с областью расщепления после расщепления.
28. Способ по п. 27, в котором связывающие молекулы связываются с обоими фрагментами области расщепления индикаторной молекулы после расщепления.
29. Способ по любому из пп. 21-23 или 28, в котором по меньшей мере один сайт расщепления содержит пептидную связь, локализованную между двумя аминокислотными остатками.
30. Способ по любому из пп. 21-23 или 28, в котором фермент, обладающий способностью расщеплять субстрат, представляет собой протеазу.
31. Способ по п. 30, в котором протеаза представляет собой матриксную металлопротеиназу.
32. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению специфическими протеазами.
33. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению матриксными металлопротеиназами.
34. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13 и/или ММР-9.
35. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13, 9, 2, 8 и 12, необязательно в таком порядке предпочтения.
36. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором сайт расщепления находится в пределах аминокислотной последовательности GPQGIFGQ (SEQ ID NO: 1), после расщепления образующей фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность GPQG, и фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность IFGQ.
37. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором связывающая молекула представляет собой антитело.
38. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором сайт захвата содержит молекулу биотина, а зона захвата содержит молекулу стрептавидина.
39. Способ по любому из пп. 21-23, 28 или 31, в котором система включает твердый носитель, с которым связываются молекулы захвата с образованием зоны захвата.
40. Способ по п. 39, в котором твердый носитель включает также зону нанесения образца, в которую вводится образец.
41. Способ по п. 39, в котором, твердый носитель включает также контрольную зону ниже зоны захвата относительно зоны нанесения образца, содержащую дополнительные связывающие молекулы, которые связываются со связывающими молекулами, с целью показать успешное завершение анализа с использованием этой системы.
42. Способ по п. 35, в котором, твердый носитель содержит хроматографическую среду.
43. Способ по п. 35, в котором испытуемый образец и индикаторную молекулу смешивают перед нанесением испытуемого образца на твердый носитель.
44. Антитело, которое связывается с аминокислотной последовательностью GPQG, но не с аминокислотной последовательностью GPQGIFGQ (SEQ ID NO: 1).
45. Антитело, которое связывается с аминокислотной последовательностью IFGQ, но не с аминокислотной последовательностью GPQGIFGQ (SEQ ID NO: 1).
46. Набор для ферментативной детекции для обнаружения в испытуемом образце активности расщепления ферментом, способным расщеплять субстрат, причем этот набор включает:
(i) индикаторную молекулу для добавления к испытуемому образцу, причем указанная молекула содержит
(а) область расщепления, содержащую по меньшей мере один сайт расщепления, который может расщепляться указанным ферментом, если присутствует указанная ферментативная активность расщепления; и
(б) сайт захвата, который остается интактным после расщепления индикаторной молекулы;
при этом расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию нового сайта связывания;
(ii) молекулы захвата, способные связываться с сайтом захвата индикаторной молекулы независимо от того, расщеплена или нет индикаторная молекула;
(iii) твердый носитель, с которым могут связываться молекулы захвата (т.е. способны связываться или уже связаны) с образованием зоны захвата для фиксации испытуемого образца;
(iv) связывающие молекулы, способные к связыванию с новым сайтом связывания, при этом связывающие молекулы не способны к связыванию с индикаторной молекулой, если расщепление не произошло и пока расщепление не произойдет.
47. Набор для ферментативной детекции по п. 46, где расщепление по меньшей мере по одному сайту приводит к образованию двух фрагментов области расщепления, из которых по меньшей мере один фрагмент остается связанным с сайтом захвата, а связывающие молекулы способны связываться с фрагментом индикаторной молекулы, содержащим по меньшей мере один фрагмент области расщепления, связанный с сайтом захвата.
48. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46 или 47, где расщепление по меньшей мере одного сайта расщепления приводит к образованию двух отдельных фрагментов индикаторной молекулы.
49. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46 или 47, где индикаторная молекула является пространственно затрудненной, в результате чего расщепление по меньшей мере по одному сайту расщепления приводит к образованию двух фрагментов индикаторной молекулы, которые остаются связанными друг с другом.
50. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46 или 47, где связывающие молекулы связываются с областью расщепления после расщепления.
51. Набор для ферментативной детекции по п. 50, в котором связывающие молекулы связываются с обоими фрагментами области расщепления индикаторной молекулы после расщепления.
52. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47 или 51, в котором по меньшей мере один сайт расщепления содержит пептидную связь, локализованную между двумя аминокислотными остатками.
53. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47 или 51, в котором фермент, обладающий способностью расщеплять субстрат, представляет собой протеазу.
54. Набор для ферментативной детекции по п. 53, в котором протеаза представляет собой матриксную металлопротеиназу.
55. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению специфическими протеазами.
56. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению матриксными металлопротеиназами.
57. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13 и/или ММР-9.
58. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13, 9, 2, 8 и 12, необязательно в таком порядке предпочтения.
59. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором сайт расщепления находится в пределах аминокислотной последовательности GPQGIFGQ (SEQ ID NO: 1), после расщепления образующей фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность GPQG, и фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность IFGQ.
60. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором связывающая молекула представляет собой антитело.
61. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором сайт захвата содержит молекулу биотина.
62. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором молекула захвата представляет собой молекулу стрептавидина
63. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, включающий твердый носитель, с которым связываются молекулы захвата с образованием зоны захвата.
64. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, в котором твердый носитель включает также зону нанесения образца, в которую вводится образец.
65. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51 или 54, включающий также дополнительные связывающие молекулы, способные связываться со связывающими молекулами.
66. Набор для ферментативной детекции по п. 65, где твердый носитель содержит также контрольную зону ниже зоны захвата относительно зоны нанесения образца, с которой могут связываться дополнительные связывающие молекулы.
67. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51, 54 или 66, в котором, твердый носитель содержит хроматографическую среду.
68. Применение системы ферментативной детекции по любому из пп. 1-20 для диагностики респираторного заболевания в испытуемом образце.
69. Применение способа по любому из пп. 21-43 для диагностики респираторного заболевания в испытуемом образце.
70. Применение набора для ферментативной детекции по любому из пп. 46-62 для диагностики респираторного заболевания в испытуемом образце.
71. Применение по любому из пп. 68-70, где респираторное заболевание представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких или воспаление дыхательных путей в результате кистозного фиброза.
72. Индикаторная молекула для применения с целью обнаружения наличия в испытуемом образце активности расщепления ферментом, способным расщеплять субстрат, причем эта индикаторная молекула включает:
(а) область расщепления, содержащую по меньшей мере один сайт расщепления, который может расщепляться указанным ферментом, если присутствует указанная ферментативная активность расщепления; и
(б) сайт захвата, который остается интактным после расщепления индикаторной молекулы; и
(в) каркасную молекулу, которая связывает по меньшей мере два фрагмента индикаторной молекулы по меньшей мере вне одного сайта расщепления, необязательно вне области расщепления;
причем каркасная молекула также делает индикаторную молекулу структурно затрудненной таким образом, что расщепление по меньшей мере одного сайта расщепления вызывает образование нового сайта связывания, с которым связываются связывающие молекулы, но при этом связывающие молекулы неспособны связываться с индикаторной молекулой, если расщепление не произошло и пока расщепление не произойдет.
73. Индикаторная молекула по п. 72, в которой новый сайт связывания реализует новую структурную конформацию индикаторной молекулы.
74. Индикаторная молекула по п. 72 или 73, в которой новый сайт связывания содержит по меньшей мере участок области расщепления.
75. Индикаторная молекула по п. 72 или 73, в которой новый сайт связывания содержит по меньшей мере участок каркасной молекулы.
76. Индикаторная молекула по п. 72 или 73, в которой новый сайт связывания содержит участок обоих из по меньшей мере двух фрагментов индикаторной молекулы, образовавшихся при расщеплении.
77. Индикаторная молекула по п. 72 или 73, в которой новый сайт связывания включает сайт расщепления.
78. Индикаторная молекула по п. 72 или 73, в которой сайт расщепления является специфическим для расщепления протеазой.
79. Индикаторная молекула по п. 78, при этом протеаза представляет собой матриксную металлопротеиназу.
80. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению специфическими протеазами.
81. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению специфическими матриксными металлопротеиназами.
82. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13 и/или ММР-9.
83. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, в которой по меньшей мере один сайт расщепления склонен к расщеплению с помощью ММР-13, 9, 2, 12 и 8, необязательно в таком порядке предпочтения.
84. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, в которой по меньшей мере один сайт расщепления находится в пределах последовательности GPQGIFGQ (SEQ ID NO: 1), после расщепления образующей фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность GPQG, и фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность IFQG.
85. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, которая содержит каркасную молекулу, выбранную из каркасных молекул, показанных на фигуре 14 или 15.
86. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, при этом связывающая молекула представляет собой антитело.
87. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, при этом сайт захвата содержит молекулу биотина.
88. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73 или 79, при этом каркасная молекула представляет собой молекулу гетероароматического соединения.
89. Индикаторная молекула по п. 86, при этом молекула гетероароматического соединения содержит по меньшей мере два бензильных атома галогена в качестве заместителей.
90. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73, 79 или 89, при этом указанная каркасная молекула представляет собой молекулу галогенметиларена.
91. Индикаторная молекула по п. 90, в которой указанный галогенметиларен выбран из группы, состоящей из бис(бромметил)бензола, трис(бромметил)бензола и тетра(бромметил)бензола или их производного.
92. Индикаторная молекула по любому из пп. 72-73, 79, 89 или 91, при этом указанная каркасная молекула выбрана из группы, состоящей из орто-, мета- и пара-бис(бромметил)бензолов, необязательно из 1,2-бис(бромметил)бензола, 1,3-бис(бромметил)бензола и 1,4-бис(бромметил)бензола, или из других замещенных галогенметиларенов, таких как 1,3,5-трис(бромметил)бензол, 1,2,4,5-тетракис(бромметил)бензол и 1,2,3,4,5,6-гексакис(бромметил)бензол, или из полициклических галогенсодержащих метиларенов, таких как 2,7-бис(бромметил)нафталин, 1,4-бис(бромметил)нафталин, 1,8-бис(бромметил)нафталин, 1,3-бис(бромметил)нафталин, 1,2-бис(бромметил)нафталин, 2,3-бис(бромметил)нафталин, 2,6-бис(бромметил)нафталин, 1,2,3,4-тетракис(бромметил)-нафталин, 9,10-бис(бромметил)фенантрен, 5,10-бис(бромметил)антрацен и 1-(бромметил)-3-[3-(бромметил)бензил]бензол, или из метилзамещенных галогенсодержащих метиларенов, таких как 1,3-бис(бромметил)-5-метилбензол, 2,5-бис(бромметил)-1,3-диметилбензол, 2,5-бис(бромметил)-1,4-диметилбензол, 2,4-бис(бромметил)-1,3,5-триметилбензол и 3,6-бис(бромметил)дурол (тетраметилбензол), или из нитрозамещенных галогенсодержащих метиларенов, таких как 3,4-бис(бромметил)нитробензол и 2,3-бис(бромметил)нитробензол, или из гидроксизамещенных галогенсодержащих метиларенов, таких как 1,3-бис(бромметил)-5-гидроксибензол, или из цианозамещенных галогенсодержащих метиларенов, таких как 2,6-бис(бромметил)бензонитрил, или из метоксизамещенных галогенсодержащих метиларенов, таких как 1,3-бис(бромметил)-5-метоксибензол, 1,3-бис(бромметил)-2-метокси-5-метилбензол, 1,3-бис(бромметил)-5-гидроксибензол, 2,3-бис(бромметил)-1,4-диметоксибензол и 2,5-бис(бромметил)-1,4-диметоксибензол.
93. Система ферментативной детекции по любому из пп. 1-2, 6, 9, 18-20, включающая индикаторную молекулу по любому из пп. 72-92.
94. Способ по любому из пп. 21-23, 28, 31 или 40-43, включающий индикаторную молекулу по любому из пп. 72-92.
95. Набор для ферментативной детекции по любому из пп. 46-47, 51, 54 или 66, включающий индикаторную молекулу по любому из пп. 72-92.
96. Применение индикаторной молекулы по любому из пп. 72-92 для обнаружения присутствия в испытуемом образце ферментативной активности расщепления.
97. Индикаторная молекула формулы I или II (необязательно не содержащая тирозинового остатка).