ИММУНОЧИП ДЛЯ ТРЕПОНЕМА-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

Область техники, к которой относится полезная модель
Полезная модель относится к области медицины, в частности, к диагностике инфекций, передаваемых половым путем, а именно - к диагностике сифилиса с использованием иммунологических методов исследования.
Полезная модель представляет собой одну из разновидностей биочипов, предназначенных для анализа биологических жидкостей (например, крови), и содержащих рабочую зону с иммобилизованными зондами (белками) для связывания биоспецифических лигандов (антител).
Предшествующий уровень техники
Длительное и скрытое течение сифилиса определило главенствующую роль серологических методов исследования в лабораторной диагностике этого заболевания. Серологическая диагностика сифилиса в Российской Федерации регламентирована приказом Минздрава РФ №87 от 26.03.2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса», в соответствии с которым верификация диагноза осуществляется с использованием неспецифических (нетрепонемных) и специфических (трепонемных) тестов. Нетрепонемные тесты определяют реагиновые антитела к кардиолипиновому антигену и используются, в основном, для скрининга на наличие сифилитической инфекции и при оценке эффективности специфического лечения. В свою очередь трепонемные тесты выявляют трепонема-специфические антитела, распознающие видоспецифические белковые антигены Treponema pallidum. В соответствии с приказом Минздрава РФ №87 от 26.03.2001 г. положительный результат трепонемных тестов является обязательным для подтверждения диагноза «сифилис».
Распространенными трепонемными тестами являются реакция пассивной гемагглютинации - РПГА, реакция иммунофлюоресценции - РИФ, реакция иммобилизации бледных трепонем - РИБТ, иммуноферментный анализ - ИФА. Наиболее же технологичным и точным считается тест с использованием биочипов (иммуночипов), позволяющий производить одновременную детекцию специфических антител к нескольким видоспецифическим антигенам Treponema pallidum. Так из уровня техники известна «Диагностическая тест-система в формате иммуночипа и способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса» [Патент RU 2397178], состоящая из иммуносорбента с раздельно иммобилизованными на нем антигенами Treponema pallidum Тр15, Тр17, TmpA, Тр47, конъюгата и реагентов, необходимых для выявления комплекса «антиген-антитело». Опыт использования данного иммуночипа позволил констатировать наивысшую (100%) специфичность проводимого анализа, однако чувствительность подобного исследования не достигала этого уровня [Смердова М.А., Маркелов М.Л., Гущин А.Е., Судьина А.Е., Шишова А.В., Шипулин Г.А. Разработка экспериментальной тест-системы на основе иммуночипа для серодиагностики сифилиса // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - №6. - С. 54-58]. Причиной недостаточной чувствительности известного иммуночипа являлась частая регистрация трепонема-специфических антител только к одному из четырех раздельно иммобилизированных антигенов Treponema pallidum, что в соответствии с действующим критерием (обнаружение антител к 2 или более антигенам) оставляло подобные сыворотки в зоне диагностической неопределенности.
Наиболее вероятной причиной недостижения поставленной задачи с использованием описанного выше иммуночипа является ограниченное количество иммобилизованных на нем видоспецифических антигенов Treponema pallidum. При этом п. 2 формулы изобретения RU 2397178 предусматривает возможность дополнительной иммобилизации «по крайней мере одного антигена и/или пептида Treponema pallidum, выбранного из Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр0453», однако практическая реализация подобного подхода в доступных источниках научной и научно-технической литературы не описана.
Раскрытие полезной модели
Настоящая полезная модель представляет собой иммуночип для одновременного анализа антител к расширенной панели из 10 антигенов Treponema pallidum, в которой 4 ранее применяемых антигена Тр15, Тр17, Тр47 и TmpA, дополнены вновь полученными рекомбинантными белками Тр0277, Тр0319, Тр0453, Тр0684, Тр0965 и Тр1038.
Иммуночип представляет собой стеклянный слайд размером 75×26 мм (Фиг. 1) с поверхностью, активированной с использованием соединений силана.
На поверхности иммуночипа выделена прямоугольная область (эррей) шириной 8 мм, предназначенная для нанесения антигенов и последующего анализа одного образца сыворотки крови.
2
В пределах эррея на поверхность иммуночипа нанесены микрокапли объемом 0.1 нл, содержащие использованные антигены в концентрации 0.225 мг/мл в смеси с раствором гелеобразующих мономеров метакриламида. Каждый из антигенов нанесен на поверхность иммуночипа в четырех повторностях, схема нанесения приведена на Фиг. 2. Последующая фотоиндуцированная сополимеризация гелевых ячеек вызвана облучением при 350 нм с интенсивностью 0.06 мкВт/см в течение 50 минут при 20°С.
Дополнительно в краевых зонах эррея находятся контрольные ячейки: с БСА для исключения неспецифического связывания; с антителами к IgG человека для подтверждения внесения исследуемого образца сыворотки крови; с IgG человека для подтверждения внесения коньюгата с флуоресцентной меткой; а также 4 ячейки с красителем Су5, маркирующие границы анализируемой области.
Зона эррея закрыта пластиковой инкубационной камерой шириной 13 мм и объемом 60 мкл с отверстиями для введения анализируемого биологического образца (диаметр отверстия 1,5 мм)..
Дополнительными реагентами, необходимыми для использования полезной модели, являются раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов (50мМ фосфатный буфер с 0.05% Tween-20); раствор антител к Fc-фрагменту иммуноглобулина человека, коньюгированных с флуоресцентным красителем Су5; жидкость для промывки иммуночипа (деионизированная вода).
Дополнительным оборудованием, необходимым для использования полезной модели, является установка для количественной детекции флуоресценции (сканер), обеспечивающий возбуждение красителя Су5 при 650 нм и количественную регистрацию флуоресценции при 670 нм.
Осуществление полезной модели
Основной задачей, которую решает настоящая полезная модель, является повышение диагностической чувствительности трепонема-специфической серодиагностики сифилиса.
Достижение этой задачи обеспечивается использованием расширенной панели видоспецифических антигенов Treponema pallidum (Тр15, Тр17, Тр47, TmpA, Тр0277, Тр0319, Тр0453, Тр0684, Тр0965 и Тр1038), по отношению к которым образцы сыворотки крови тестируется на наличие соответствующих трепонема-специфических антител.
Серологическая диагностика сифилиса с помощью иммуночипа осуществляется следующим образом:
1) Анализируемые образцы крови собираются в вакуумные пробирки с коагулянтом, разделяются центрифугированием при 1500 g в течение 15 мин, выворотка направляется на исследование или при необходимости помещается на хранение при -70°С.
2) Перед проведением исследования сыворотки разводятся 1:10 в 50 мМ фосфатном буфере с 0.05% Tween-20, после чего в объеме 60 мкл вносятся в камеру иммуночипа.
3) Иммуночип с исследуемым образцом инкубируются 1 ч при 37°С. На данном этапе происходит взаимодействие присутствующих в сыворотке специфических антител с соответствующими антигенами, иимобилизованными в ячейках на поверхности иммуночипа. Кроме того, присутствующие в сыворотке иммуноглобулины вне зависимости от своей специфичности взаимодействуют с ячейками, содержащими антитела к IgG человека (контроль правильности внесения образца).
4) После завершения инкубации несвязанные антитела удаляют. Для этого чипы ополаскивают деионизированной водой, промывают фосфатным буфером с 0.05% Tween-20 в течение 30 минут на ротационном шейкере при 200 об/мин, вновь ополаскивают деионизированной водой и высушивают в потоке воздуха.
5) В камеру иммуночипа вносят 60 мкл раствора антител к Fc-фрагменту иммуноглобулина человека, коньюгированных с флуоресцентным красителем Су5, после чего повторно инкубируют 1 ч при 37°С. На данном этапе происходит взаимодействие флуоресцентного коньюгата с антителами сыворотки крови, ранее провзаимодействовавшими с иммобилизованными в ячейках иммуночипа антигенами Т. pallidum. Кроме того, флуоресцентный коньюгат взаимодействует с контрольными ячейками, содержащими IgG человека (контроль правильности внесения коньюгата).
6) После завершения повторной инкубации с иммуночипа удаляется реакционная камера, иммуночип промывается деионизированной водой и высушивается в потоке воздуха.
7) Регистрация результатов исследования на иммуночипе проводится с использованием аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов, позволяющего возбуждать флуоресценцию (ФЛ) красителя Су5 при 650 нм и регистрировать ее при 670 нм.
8) Интенсивность ФЛ рассчитывается как средний сигнал от четырех ячеек с одним и тем же антигеном.
порог
9) Пороговый уровень флуоресценции (ФЛ) для каждого использованного рекомбинантного антигена Т. pallidum предварительно определяется на основе реакции с образцами сывороток крови здоровых доноров (Фиг. 3) с поправкой +3σ (квадратическое отклонение для данной выборки).
порог
порог
порог
10) В дальнейшем «положительными» считаются значения флуоресценции, превышающие ФЛ более чем на 10%; «отрицательными» - составляющие менее 90% от ФЛ, а значения ±10% от ФЛ расцениваются как сомнительные («серая зона» диагностического исследования).
Результат исследования на иммуночипе признается корректным при правильной работе всех присутствующих в составе иммуночипа контрольных ячеек: если контрольные ячейки с антителами к IgG человека, а также с IgG человека дают положительный сигнал флуоресценции, а ячейки с БСА и раствором для нанесения ("blank") дают отрицательный сигнал.
Использование заявляемого устройства (иммуночипа) для трепонема-специфической серологической диагностики сифилиса иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Исследована сыворотка крови пациента с предварительным диагнозом «Ранний скрытый сифилис (?)». Ранее полученный результат нетрепонемного теста (реакция плазменных реагинов) - положительный.
При тестировании на иммуночипе (Фиг. 4) получен положительный результат только с одним иммунодоминантным антигеном (Тр17), что позволяет объяснить сомнительный результат ИФА и в соответствии с формулой Патента RU 2397178 оставляет данную сыворотку в зоне диагностической неопределенности.
В то же время использование иммуночипа с расширенной панелью антигенов позволило зафиксировать положительный результат реакции с антигенами Тр0453, Тр0319 и Тр0277, что однозначно указывало на наличие у обследуемого пациента сифилитической инфекции.
Пример 2.
Иммуночип использован для тестирования 85 сывороток больных сифилисом и 46 сывороток здоровых доноров. Результаты исследования на иммуночипе оценены по результатам реакции с 4 традиционно используемыми антигенами Т. pallidum (Тр15, Тр17, Тр47, TmpA) и расширенной панелью из 10 антигенов (Тр15, Тр17, Тр47, TmpA, Тр0453, Тр0319, Тр1038, Тр0965, Тр0277, Тр0684). Результаты диагностической эффективности подобного тестирования оценены в соответствии с ГОСТ Р 53022.3-2008 «Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов».
Использование формального критерия (положительной реакции сыворотки крови с 2 или более антигенами Т. pallidum) свидетельствовало о значимом преимуществе использования расширенной диагностической панели в составе заявляемого иммуночипа. Так использование 4 антигенов позволило получить положительный результат только для 62 из 85 сывороток больных сифилисом, а использование расширенной панели - уже у 78 из 85 сывороток (т.е. на 16 случаев больше). При этом профиль иммунореактивности дополнительно идентифицированных «положительных» сывороток в 12 из 16 случаев включал традиционный антиген Тр17 и впервые использованный рекомбинантный белок Тр0453. Кроме того, в данных образцах зафиксированы антитела к рекомбинантным белкам Тр0277 (3 сыворотки) и Тр0319 (2 сыворотки), в результате чего профиль их иммунореактивности расширялся до 3-4 антигенов. Один вновь достигнутый результат основывался на специфическом взаимодействии с иммунодоминантным антигеном Тр15 и новым белком Тр0453, а еще три «положительные» сыворотки могли быть верифицированы исключительно на основе их реагирования с вновь используемыми антигенами: Тр0319 + Тр0453 и Тр0453 + Тр0965, соответственно. Результат тестирования сывороток здоровых доноров был отрицательным во всех случаях.
Результаты сравнительной оценки чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной ценности, а также интегральной диагностической эффективности иммуночипа с использованием панелей из 4 и 10 антигенов Т. pallidum приведены в Таблице.
Примечания: * - Тр15, Тр17, Тр47, TmpA.
** - Тр15, Тр17, Тр47, TmpA, Тр0453, Тр0319, Тр1038, Тр0965, Тр0277, Тр0684.
Проведенный анализ позволил констатировать 100% значения специфичности как при тестировании на иммуночипе с 4-мя традиционно используемыми антигенами, так и расширенной панелью из 10 антигенов. Вместе с тем использование расширенной панели позволило существенно (с 72,6% до 91,7%) увеличить чувствительность выполняемых диагностических реакций, что нашло свое отражение в увеличении отрицательной предсказательной ценности с 66,7% до 86,8% и значимом повышении общей диагностической эффективности тестирования на заявляемом иммуночипе (до 94,6% против 82,3%).
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 представлена общая конструкция заявляемой полезной модели (иммуночипа) в двух проекциях: а - вид свеху; б - вид сбоку.
На Фиг. 2 представлена схема нанесения антигенов Тр15, Тр17, Тр47, TmpA, Тр0453, Тр0319, Тр1038, Тр0965, Тр0277 и Тр0684 Т. pallidum и контрольных реагентов на поверхность иммуночипа в пределах эррея.
На Фиг. 3 представлен результат анализа сыворотки крови здорового донора с применением заявляемого иммуночипа; отсутствует связывание антител в ячейках с антигенами Т. pallidum при корректной работе контрольных ячеек.
На Фиг. 4 представлен результат анализа сыворотки крови пациента с диагнозом «Ранний скрытый сифилис» с применением заявляемого иммуночипов; регистрируется связывание антител в ячейках с антигенами Тр17, Тр0453, Тр0319 и Тр0277 при корректной работе контрольных ячеек.