Способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток
METHOD FOR ACTIVATING BACILLUS SUBTILIS VKPM B-12079 BACTERIA SPORES BEFORE DETERMINING NUMBER OF VIABLE CELLS

Область техники
Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и может быть использовано для уменьшения времени активации и повышения эффективности и безопасности метода количественного определения жизнеспособных клеток Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.
Препараты на основе Bacillus subtilis используются для получения пробиотических средств, биоконсервантов, биологических фунгицидов, биологических дезинфектанов и. т.д. Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 составляет основу кормовой добавки «Энзимспорин». Поскольку, количество жизнеспособных микроорганизмов в готовом продукте, является одним из важных показателем его качества, искажение этих результатов недопустимо.
Известен способ определения количества живых микроорганизмов (метод Коха), заключающийся в высеве микробных суспензий на плотную питательную среду. Данный способ включает в себя последовательные десятикратные разведения микробной суспензии, высев конечного разведения на плотную питательную среду, инкубацию в условиях, определяемых видом микроорганизма, подсчет выросших колоний и определение количества живых клеток в единице объема исследуемой микробной суспензии [1].
Недостатком является то, что не учитывается специфика спорообразующих микроорганизмов, так как спорообразующим бактериям (в. т.ч. Bacillus subtilis ВКПМ В-12079) для прорастания споры необходимо 2-3 часа в обычных условия или активация перед приготовлением суспензии [2].
В качестве прототипа выбран метод определения количества жизнеспособных споровых бактерий, указанный в СТО 40092868-0003-2016 (стандарт ООО «Алтбиотех» Фермасил, технические условия СТО 33976740-0001-2017) кормовая добавка «Энзимспорин».
,
Определение количества жизнеспособных клеток бактерий проводят путем высева соответствующего разведения пробы на агаризованную среду. Для этого от каждой партии биопрепарата отбирают навеску массой 1,0 г. Отобранные пробы в  асептических условиях разводят стерильным физиологическим раствором в пробирках объема 10 мл. Содержимое пробирок перемешивают до гомогенной суспензии на водяной бане при температуре 80 С° в течение 15 минут. Из полученной взвеси готовят серию десятикратных разведений. Из двух последних разведений делают высевы на чашки Петри. Чашки с посевом помещают в термостат на 24 часа, при температуре 37 С°.
Недостатками данного метода являются:
- трудоемкость;
- работа с горячей водяной баней является опасной;
- затраты времени, для подготовки водяной бани, прогрева пробирок и охлаждение пробирок до комнатной температуры;
- если для приготовления суспензии использовали споры, которые были активированы кратковременным прогреванием, это может привести к увеличению процента проросших спор [2]. Что в свою очередь, может исказить результат анализа готового биологического продукта.
Метод определения количества жизнеспособных клеток Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 является основным в процессе технологического контроля и контроля качества готовой продукции биологических препаратов. Искажение его результатов негативно скажется на технологическом процессе и качестве готового биопрепарата.
Цель изобретения - разработка быстрого, безопасного, эффективного метода активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в процессе определения количества жизнеспособных клеток бактерий споровых микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.
В предложенном способе технический результат достигается тем, что сухие лиофилизированные споры Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 активируют ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт перед приготовлением микробной суспензии. Затем проводят стандартный метод последовательных десятикратных разведений с высевом в чашки Петри с агаризованной средой. Таким образом, время активации снижается с 15 минут до 15-20 секунд, устраняется стадия прогрева на водяной бане, что повышает безопасность работ, после разведения на твердую среду будут высеяны вегетативных клеток, а не спор, что повышает точность результатов и соответствует методу Коха.
Описание изобретения
Способ осуществляется следующим образом.
0,1 г сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 помещают в асептических условиях в стерильную микропробирку на 1,5 мл, которую плотно закрывают. Затем производят активацию спор ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт определенное время (пример). Для обработки спор может быть использована любая ультразвуковая установка, соответствующая заявленным выше параметрам. Затем, в микропробирку добавляют 1 мл питательной среды, которую предварительно готовят, при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизуют при 1,1 атм. в течение 40 мин.
Затем 1 мл суспензии из микропробирки переносят в пробирку с 9 мл раствора хлорида натрия с массовой долей хлорида натрия 8,5 г/л и далее производят разбавление стандартным метод последовательных десятикратных разведений с высевом в чашки Петри со стандартной агаризованной средой. Чашки помещают в термостат на 24 часа, температура 37 С°. Затем осуществляют подсчет колоний, с учетом разведений и навески сухих спор.
Пример 1.
0,1 г сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 помещают в асептических условиях в стерильную микропробирку на 1,5 мл, которую плотно закрывают. Затем производят активацию спор ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт определенное время от 5 до 60 сек. После этого в микропробирку добавляют 1 мл питательной среды, которую предварительно готовят, при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизация при 1,1 атм. в течение 40 мин.
Далее, методом микрокопирования, оценивалось, какое количество спор и вегетативных клеток, вышедших из спор, в процессе активации ультразвуком, находится в пробе, в зависимости от времени воздействия ультразвука на споры. Количество микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ- В-12079 определялось для каждой пробы стандартным методом десятикратных разведений (метод Коха) после проведения активации. Все опыты проводились в семикратном повторении.
Из приведенных данных видно, что активация ультразвуком в течение 15-20 сек. способствует ускоренному выходу Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 из спор за счет механического повреждения споры, т.е. через 40 минут, к окончанию процесса десятикратных разбавлений, 95-99% спор перейдет в вегетативное состояние. Без активации, процесс выхода из спор занимает 2-3 часа [2]. В этом случае, на твердую агаризованную среду происходит высев спор, а не вегетативных клеток, что может исказить результат.
При активации более 20 сек. начинается рост численности микроорганизмов, за счет стимулирующего действия ультразвука со 100 до 151% [3]. Это приводит к искажению данных об исходном количестве спор в пробе.
Таким образом, оптимальное время активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт составляет 15-20 сек. Предложенный способ позволяет:
- уменьшить время активации с 15 минут до 15-20 секунд;
- устраняется стадия прогрева на водяной бане, что повышает безопасность работ;
- после разведения на твердую агаризованную среду высевают вегетативные клетки, а не споры, что повышает точность результатов.
Литература
1. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. Пущино, 1990. - 187 с.
2. Ноздрин Г.А. Научные основы применения пробиотиков в птицеводстве. - Новосиб. гос. аграр. ун-т. - Новосибирск, 2005. - 224 с.
3. Бойко С.С., Яценко Е.С. Влияние ультразвука на Bacillus subtilis в процессе стационарного культивирования // Технологии и оборудование химической, биотехнологический и пищевой промышленности. Материалы X Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием. - Бийск, 2017. - С. 321-324.