Влияние соединения мт-279 и мексидола на течение метаболических процессов при экспериментальной ишемии головного мозга

6. Khasina E.I., Tiupeleev P. A., Sgrebneva M.N. Gastroprotective effect of zosterin, a pectin from seagrass Zostera marina L. // Orient. Pharmacy Experim. Med. 2004. Vol. 4, No. 4. P. 253-260.

7. Khotimchenko Yu.S. Polysorbovit: properties and using of pectin preparations. Seoul: Korea Health Policy news, 2003. 91 p.

8. Lengsfeld C., Deters A., Faller G., Hensel A. High molecular weight polysaccharides from black currant seeds inhibit adhesion of Helicobacter pylori to human gastric mucosa // Planta Med. 2004. Vol. 70, No. 7. P. 620-523.

9. Pauls F.N., Wick A.M., McKay E.M. An assay method for antiulcer substances // Gastroenterology. 1947. No. 8. P. 774-782.

10. Paulsen B.S., Barsett H. Bioactive pectic polysaccharides // Adv. Polym. Sci. 2005. Vol. 186. P. 69-101.

11. Pectins and pectinases / eds. H.A. Shols, R.G.F. Visser, A.G.J. Vor-agen. Wageningen: Wageningen Academic Publishers, 2009. Pt. 5. Health aspects of pectins. P. 293-325.

12. Sun X.B., Matsumoto T., Yamada H. Effect of a polysaccharides fraction from the root of Bupleurumfalcatum L. on experimental gastric ulcer models in rats and mice // J. Pharm. Pharmacol. 1991. Vol. 43, No. 10. P. 699-704.

13. Sun X.B., Matsumoto T., Yamada H. Anti-ulcer activity and mode of action of the polysaccharide fraction from the leaves of Panax ginseng // Planta Med. 1992. Vol. 58. P. 432-435.

14. Wang Q., Pagan J., Shi J. Pectin from fruits // Functional foods: biochemical and proccessing aspects / eds. J.X. Shi, G. Mazza. Roca Barton: CRS Press, 2002. P. 263-310.

15. Yarnell E. Plant chemistry in veterinary medicine: medicinal constituents and their mechanism of action // Veterinary herbal medicine / eds. S.G. Wynn, B. Fougere. St.-Louis: Mosby, 2007. P. 159-183.

Поступила в редакцию 18.12.2012.

PROTECTIVE ACTION OF AMARANTH PECTIN IN GASTROPATHY INDUCED NONSTEROIDAL ANTI-FLAMMATORY DRUGS E.I. Khasina1, L.I. Moiseenko2

1 V.L. Komarov Gornotayozhnaya Station FEB RAS (26 Solnechnaya St. Gornotayozhnoye settl. Ussuriysk 692533 Russian Federation),

2 Interdepartamental Research Education Centre “Plant Resources” (V.L. Komarov Gornotayozhnaya Station FEB RAS - Vladivostok State University of Economics and Service, 41 Gogolya St.

Vladivostok 690014 Russian Federation)

Summary - The protective effect of amaranth pectin from Ama-ranthus cruenthus L. (fam. Amaranthaceae) against damage of the stomach induced by nonsteroidal anti-flammatory drugs (NSAIDs) indomethacin and meloxicam in male Wistar rats was studied. Oral administration of amaranth pectin (100 mg/kg) prevented gastric injury formation. The data obtained demonstrated that amaranth pectin enhances resistance of the stomach tissue to NSAIDs. It was shown to possess a gastroprotective effect, which is accompanied by diminution of the number and sizes of destructive regions in the gastric mucosa during the ulcer affection, as well as reduction of ATP and glycogen deficit, decrease of lactate excess, and normalization of the energy balance in the gastric tissue. According to its antiulcer effect, amaranth pectin may be recommended for application in prevention and treatment of stomach diseases together with the basic therapy.

Key words: pectin, gastropathy, indomethacin, meloxicam.

Pacific Medical Journal, 2013, No. 2, p. 18-21.

УДК 616.831-005.1-021.6-085.2:547

влияние соединения МТ-279 И МЕКСИдОЛА НА ТЕЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИх ПРОЦЕССОв при экспериментальной ишемии головного мозга

Л.И. Маринич1, Г.И. Степанюк1, Н.Г. Черноиван1, А.Ю. Воскобойник2

1 Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И. Пирогова (Украина, 21018, г. Винница, ул. Пирогова, 56),

2 Запорожский государственный медицинский университет (Украина, 69035, г. Запорожье, пр-т Маяковского, 26) Ключевые слова: острое нарушение мозгового кровообращения, биоэнергетические процессы, нейропротекторы.

В эксперименте на 49 крысах моделью острого нарушения мозгового кровообращения проанализировано изменение биоэнергетических процессов под влиянием соединения МТ-279 (10 мг/кг внутрибрюшинно) и мексидола (100 мг/кг внут-рибрюшинно). Установлено, что курсовое (14 дней) введение указанных веществ нормализирует биоэнергетические процессы путем восстановления аэробного гликолиза, предупреждает развитие метаболического ацидоза, снижая уровень лактата и повышая уровень глюкозы в ишемизированном полушарии. Отмеченные эффекты, по мнению авторов, являются одним из механизмов защитного действия на ишемизированный мозг изучаемых веществ.

В структуре заболеваемости ишемический инсульт занимает первое место среди всех видов острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК), зачастую приводя к стойкому нарушению трудоспособности. Гипоксия, возникающая вследствие снижения перфузии тканей мозга, представляется сложным фазовым процессом, в основе которого лежат последовательные изменения свойств митохондриального ферментного

Маринич Любовь Ивановна - заочный аспирант кафедры фармакологи ВНМУ им. Н.И. Пирогова; e-mail: lyuba27@gmail.com

комплекса. Стадии гипоксии находятся в тесном соотношении с содержанием в нейронах аденозинтрифосфата (АТФ) и ведущими энергозависимыми процессами. В то же время значительное увеличение концентрации аденозинмонофосфата (АМФ) приводит к активации протеинкиназной системы, что служит дополнительным механизмом гибели клеточных мембран [1]. Первоочередной задачей церебропротекции при ОНМК является устранение процессов энергетического дисбаланса, развитие которого является ключевым звеном в патогенезе данного патологического состояния [2].

Несмотря на появление на фармакологическом рынке новых нейропротекторов проблема создания качественного препарата с минимальным количеством побочных эффектов здесь остается открытой [11]. Арсенал современных нейропротекторов представлен несколькими десятками лекарственных средств (пи-рацетам, мексидол, церебролизин, кортексин и др), которые могут влиять на разные звенья патогенеза ишемического повреждения головного мозга. Практически всем им присущи побочные эффекты, которые

значительно ограничивают применение [3]. Поиск средств, которые корригируют метаболические нарушения в ишемизированом мозге является актуальной задачей современной фармакологи [6].

В предыдущих скрининговых исследованиях нами установлено, что соединение МТ-279 - натриевая соль 3-(2-оксо-3-фенил-2Н-[1,2,4]триазино[2,3-с]хиназо-лин-6-иЛ)-пропановой кислоты - осуществляет защиту ишемизированного мозга в эксперименте, что проявлялось уменьшением смертности и отсрочкой гибели животных в критический период ОНМК, а также снижением активности нейронспецифической энолазы и нормализацией кислотно-щелочного равновесия и уровня Са2+ в крови [4, 12, 13].

Влияние МТ-279 на биоэнергетические процессы в ишемизированном головном мозге раньше не изучалось, что и явилось основанием для проведения данного исследования. Целью настоящей работы послужило выяснение возможного механизма нейро-протекторного действия МТ-279. Препаратом сравнения выбран мексидол («Мирфарм», Россия), который широко используется для профилактики ишемических инсультов [8].

Материал и методы. Исследования проведены на 49 нелинейных крысах обоего пола массой 170-210 г, разбитых на 4 группы:

1-я группа - интактные животные (7 крыс),

2-я группа - 14 животных с ОНМК без лечения (контрольная группа),

3-я группа - 14 животных с ОНМК, леченных МТ-279,

4-я группа - 14 животных с ОНМК, леченных мекси-долом.

ОНМК моделировали под пропофоловым наркозом (60 мг/кг внутрибрюшинно) путем односторонней оклюзии правой общей сонной артерии до места ее бифуркации. Лечение проводили ежедневно, суточную дозу исследуемых веществ делили на два приема и вводили с интервалом в 12 часов. Первое введение выполняли через час после моделирования ОНМК, последнее - на 14-е сутки. Соединение МТ-279 и мексидол исследовали в оптимальных церебро-протекторных дозах (соответственно 10 и 100 мг/кг внутрибрюшинно), заимствованных из литературы [9]. Крысы контрольной группы получали эквивалентное по обьему количество 0,9 % раствора №С1 (2 мл/кг внутрибрюшинно). Эффективность терапии оценивали на 5-е и 15-е сутки после моделирования ОНМК. Крыс выводили из опыта путем передозировки эфира в соответствии с правилами и международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (86/609/ЕС).

Ишемизированое полушарие головного мозга выделяли в холодовой камере (-2 °С) и замораживали в жидком азоте. Цитозольную фракцию отделяли методом дифференциального центрифугирования (15 000 g). Экстракцию липидов проводили при помощи метода, описанного Р. Кейтс (1974). Безбелковый

экстракт получали путем добавления точной навески гомогената тканей мозга до хлорной кислоты (0,6М) c последующей нейтрализацией 5,0М К2СО3. Показатели энергетического обмена в безбелковом экстракте мозга - содержание адениловых нуклеотидов, креа-тинфосфата, лактата, пирувата гликогена и глюкозы определяли по методу, описаному В.В. Меньшиковым и М.И. Прохоровой [5, 10].

Для определения адениловых нуклеотидов применяли тонкошаровую хроматографию с использованием диоксана, изопропанола, аммиака и пластин «Силуфон» [5]. Ход определения: 0,2 мл тканевого экстракта наносили на стартовую линию пластины и хроматографировали в системе «диоксанизопропанол-вода-амми-ак» (4 : 2 : 4 : 1). АТФ, аденозиндифосфат (АДФ) и АМФ идентифицировали в ультрафиолете в хроматошаре УФС-365. Пробы энолировали 4 мл 0,1н соляной кислоты и спектрофотометрировали при 260 нм.

Метод количественного определения лактата состоял в том, что в присутствии лактатдегидрогеназы молочная кислота переходит в пировиноградную, при этом связывание пирувата, который образуется в ходе реакции гидразинглицериновим буфером, способствует полному окислению лактата. Образование восста-новленой формы никотинамидадениндинуклеотида, которая эквивалента количеству окисленого лактата, регистрировали спектрофотометрическим методом при длине волны 340 нм.

Метод определения пирувата основывался на том, что в присутствии лактатдегидрогеназы пируват восстанавливается до лактата. Количество использованного в реакции пирувата эквивалентно количеству восстановленного никотинамидадениндинуклеотида, уменьшение которого регистрировалось на спектрофотометре при длине волны 340 нм.

Энергетический заряд вычисляли по формуле D.E. Atkinson [14].

Уровень креатинфосфата в головном мозге определяли по методу P. Erliton [15] на спектрофотометре при длине волны 525 нм. Содержание гликогена исследовали по методу, описанному В.В. Меньшиковым [5]. Для этого порошок ткани мозга, которую замораживали, обрабатывали горячей смесью спирта со щелочами. При следующем резком охлаждении выпадал осадок гликогена, который отмывали от примесей горячей хлороформно-метаноловой смесью. Высушенный осадок гликогена подвергался гидролизу, после чего в нем определяли содержание глюкозы, по которому вычисляли содержание гликогена.

Концентрацию глюкозы определяли стандартным ортотолуидиновым методом, когда глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием перекиси водорода, который под действием пероксидазы окисляет ортото-луидин с образованием синего хромогена. Обе реакции осуществляются одновременно при рН 4,8.

Цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением t-критерия Стью-дента.

АТФ, мкмоль/г ткани АДФ, мкмоль/г ткани

Таблица

Влияние соединения МТ-279 и мексидола на биоэнергетический метаболизм ишемизированного мозга в эксперименте

Показатель

1-я группа

2-я группа

5-е сутки

15-е сутки

3-я группа

5-е сутки

15-е сутки

4-я группа

5-е сутки

15-е сутки

2,18±0,08

1,05±0,051

1,55±0,06‘

1,37±0,041, 2

1,98±0,072

1,14±0,061, 2

2,02±0,092

0,51±0,04

0,38±0,021

0,42±0,031

0,45±0,03

0,49±0,03

0,46±0,04

0,48±0,05

МФ, мкмоль/г ткани

0,14±0,01

0,45±0,031

0,41±0,021

0,29±0,031, 2

0,20±0,032

0,26±0,021, 2

0,18±0,022

нергетический заряд

0,860

0,659

0,739

0,756

0,833

0,770

0,846

реатинфосфат, мкмоль/г ткани

2,92±0,18

1,58±0,111

1,96±0,121

2,02±0,141, 2

2,63±0,132

2,12±0,161, 2

2,78±0,182

икоген, мг/г ткани

1,64±0,12

0,98±0,101

1,25±0,101

1,30±0,111, 2

1,48±0,12

1,34±0,112

1,72±0,132

юкоза, мкмоль/г ткани

1,58±0,14

0,78±0,111

1,07±0,081

1,26±0,081, 2

1,43±0,112

1,28±0,121, 2

1,62±0,122

актат, мкмоль/г ткани

2,66±0,21

6,83±0,421

4,84±0,341

3,98±0,311, 2

3,42±0,281, 2

4,12±0,321, 2

3,53±0,291, 2

ируват, мкмоль/г ткани

0,29±0,01

0,14±0,011

0,19±0,011

0,19±0,011, 2

0,24±0,021, 2

0,20±0,021,

0,26±0,011, 2

актат : пируват

9,12±1,14

48,1±3,421

25,20±2,261

20,90±1,831, 2

14,10±1,141, 2

20,40±1,781, 2

12,90±1,341, 2

1 Разница с 1-й (интактной) группой статистически значима.

2 Разница со 2-й (контрольной) группой статистически значима.

Результаты исследования. У животных контрольной группы в ишемизированном полушарии регистрировались глубокие нарушения биоэнергетических процессов, которые в наибольшей степени проявились на 5-е сутки эксперимента. В указанный период в клетках регистрировалось вероятное снижение содержания АТФ и АДФ соответственно на 52 и 25 % в среднем при определенном нарастании уровня АМФ. Это сопровождалось снижением показателя энергетического заряда мозга. Содержание креатинфосфата в мозге животных 2-й группы достоверно снижалось (в среднем на 46 %) относительно интактных крыс, что свидетельствовало о значительной деградации энергетических ресурсов в ишемизированных клетках головного мозга (табл.).

Параллельно с энергодефицитом в ишемизирова-ном полушарии наблюдалось усиление анаэробного гликолиза, на что указывало вероятное нарастание концентрации лактата (в среднем на 157 %) при одновременном снижении (в среднем на 51 %) уровня пирувата. При этом показатель соотношения «лактат : пируват» достоверно увеличивался (в среднем в 5,3 раза) относительно показателя 1-й группы. В указанный период эксперимента в ишемизированом мозге наблюдалось также достоверное снижение содержания гликогена (на 40 %) и глюкозы (в среднем на 51 %). На 15-е сутки эксперимента указанные нарушения биоэнергетического метаболизма в нейронах ишемизи-рованого полушария сохранялись, но интенсивность их была значительно ниже, чем в предыдущий срок исследования (табл.).

Курсовое лечение соединением МТ-279, как и лечение мексидолом, сопровождалось положительной динамикой показателей энергообеспечения нейронов ишемизированого полушария головного мозга в оба срока исследования. Так, на 5-е сутки эксперимента на фоне введения МТ-279 практически в такой же степени, как и под действием мексидола, наблюдалось нарастание уровней АТФ соответственно на 30 и 34 %

относительно контрольних животных и АДФ - соответственно на 18 и 21 % в среднем при определенном снижении содержания АМФ. Указанные изменения сопровождались увеличением в ишемизированных тканях содержания креатинфосфата (на 28 и 34 %), а также нарастанием величины показателя энергетического заряда головного мозга (табл.).

Указанная динамика показателей макроэргических структур и энергетического заряда в тканях ишемизированного полушария на фоне введения как МТ-279, так и мексидола сохранялись и на 15-е сутки эксперимента, достигая практически уровня интактных крыс. Под влиянием МТ-279 и мексидола наблюдалось уменьшение метаболического ацидоза в тканях ишемизированного мозга животных, что четко проявилось уже на 5-е сутки эксперимента: концентрация молочной кислоты снизилась в среднем на 42 и 40 % соответственно. При этом уровень пирувата увеличился относительно контроля на 34 и 34 % в 3-й и 4-й группах соотвественно. На способность обоих веществ устранять признаки цитоплазматического ацидоза при ОНМК указывало также достоверное снижение показателя «лактат : пиру-ват» в указанный период эксперимента. На 15-е стуки под действием обоих веществ в пораженном полушарии зарегистрировано восстановление содержания лактата и пирувата, однако эти показатели не достигали уровня интактных животных, что может быть признаком снижения под влиянием МТ-279, как и мексидола, активности реакции анаэробного гликолиза. Это подтверждается вероятным ростом на фоне указанных параметров концентрации глюкозы в тканях ишемизированного мозга: на 5-е сутки она увеличилась в среднем на 61 и 64 % в 3-й и 4-й группах соответственно по сравнению с контролем (табл.).

Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного исследования показали, что курсовое введение крысам с моделью ОНМК соединения МТ-279 так же, как и мексидола, приводит к нормализации

биоэнергетических процессов начиная уже с 5-х суток эксперимента - периода, который наиболее четко иллюстрирует патологические изменения в ишемизированном головном мозге [1, 11].

Это проявлялось в оба срока эксперимента вероятным ростом в тканях ишемизированного полушария уровней АТФ, АДФ и креатинфосфата при определенном снижении уровня АМФ. Указанные изменения макроэргов, вероятно, связаны со способностью исследуемых веществ восстанавливать в поврежденном головном мозге аэробный гликолиз и улучшать функционирование цикла Кребса [8].

Вместе с этим терапия ОНМК у крыс МТ-279 и мексидолом сопровождалась ослаблением метаболического ацидоза, на что указывало достоверное снижение уровня лактата в тканях ишемизованного мозга при определенном росте уровня пирувата. В пользу способности МТ-279, как и референс-препарата, устранять проявления ацидоза также свидетельствовало снижение показателя «лактат : пируват».

Важным нейропротекторным фактором в условиях ОНМК можно считать также способность МТ-279, как и мексидола, повышать уровень глюкозы в клетках, которая, как известно, является не только энергетическим, но и пластическим материалом, особенно в головном мозге [7].

В ходе проведенного исследования также установлено, что под воздействием исследуемых веществ нормализация биоэнергетических процессов в мозге животных с ОНМК происходила на фоне достоверного роста в нем содержания глюкозы начиная с 5-х суток исследования. Это коррелировало с уменьшением запасов гликогена, что может быть свидетельством усиления процессов гликогенолиза на фоне лечения соединением МТ-279 и мексидолом. При этом уровень глюкозы под влиянием обоих веществ на 15-е сутки эксперимента практически достигал показателя интактных животных.

На основании проведенного исследования можно сделать заключение, что лечение крыс с ОНМК соединением МТ-279 так же, как и мексидолом, предупреждает развитие глубоких нарушений биоэнергетических процессов и цитоплазматического ацидоза в пораженном ишемией головном мозге животных. По величине защитного эффекта в указанных условиях соединение МТ-279 практически сопоставимо с эталонным нейропротектором. Такое действие обоих веществ, вероятно, является одним из механизмов защиты ишемизированной ткани, потому что энергодефицит и метаболический ацидоз относятся к наиболее весомым факторам, от которых зависят глубина и распространенность некротического поражения мозга [1]. Литература

1. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001. 328 с.

2. Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Молекулярная фармакология антигипоксантов. СПб.: Изд-во Н-Л, 2004. 361 с.

3. Зозуля И.С., Мартынюк В.Ю., Майструк О.А. Нейропротекторы, ноотропы, нейрометаболиты в интенсивной терапии

поражений нервной системы. Киев: Интермед, 2005. 130 с.

4. Маринич Л.И., Степанюк Г.И., Берест Г.Г. Сравнительное влияние производного 1,2,4-триазино-хиназолина и вин-поцетина на активность NSE у наркотизированных котов с экспериментальной ишемией головного мозга // Фармация Украины: доклинические исследования лекарственных средств: тез. докл. Харьков: НФаУ 2010. С. 87.

5. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 365 с.

6. Мищенко Т.С., Яворская В.А., Бурчинский С.Г. Эффективная профилактика острых нарушений мозгового кровообращения - основа здоровья нации // Здоровье Украины. 2007. №9 (166). С. 30-31.

7. Острая церебральная недостаточность / Черний В.И., Ель-ский В.Н., Городник Г.А. и др. Донецк: Заславский А.Ю., 2008. 440 с.

8. Островая Т.В., Черний В. И., Городник Г. А. и др. Исследование влияния мексидола на функциональное состояние ЦНС у больных с ишемическим инсультом // Международный неврологический журнал. 2005. № 4 (4). С. 23-26.

9. Островая Т.В., Черний И.В., Городник Г.А. и др. Исследование влияния мексидола на функциональное состояние ЦНС у больных с ишемическим инсультом // Международный неврологический журнал. 2005. № 4 (4). С. 34-37.

10. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований. Л.: Изд-во Ленинградского ин-та, 1982. 272 с.

11. Рациональная нейропротекция / Беленчев И.Ф., Черний В.И.,. Колесник Ю.М. и др. Донецк: Заславский А.Ю., 2009. 262 с.

12. Степанюк Г.И. Маринич Л.И. Берест Г.Г. и др. Скрининг це-ребропротекторного действия среди производных 1,2,4-три-азино-хиназолина в условиях острой экспериментальной ишемии головного мозга // Фармакология и лекарственная токсикология. 2010. № 1-2 (14-15). С. 75-78.

13. Степанюк Г.И., Маринич Л.И., Ходаковский А.А. и др. Влияние производного 6-замещенных 3Я-2Ы-[1,2,4]триазино [^З-^хиназолин^-онов (соединения МТ-279) на состояние кислотно-щелочного равновесия и уровень Са2+ в крови гербел с моделью острого нарушения мозгового кровообращения // Фармакология и лекарственная токсикология. 2012. № 1 (26). С. 19-23.

14. Atkinson D.E. Citrate and the citrate cycle in the regulation of energy metabolism // The metabolic roles of citrate. New York: Academic Press, 1968. Р 23-40.

15. Erlington D.E., Eldsen S.R., Congh N. The estimation of creatine and oliacetyl // Biochem. J. 1954. No. 1. P 203-204.

Поступила в редакцию 07.03.2013.

effects OF COMPOUND MT-279 AND MExIDOL on the course of metabolic processes in case of experimental cerebral ischemia

L.I. Marinich1, G.I. Stepanyuk1, N.G. Chernoivan1,

A.Yu. Voskoboynik2

1 Vinnitsa National Medical University named after N.I. Pirogov

Summary - The paper analyses changing bioenergetic processes caused by compound MT-279 (10 mg/kg intraperitoneally) and Mexidol (100 mg/kg intraperitoneally) during the experiment on 49 rats with acute cerebrovascular accident. A 14-day continuous infusion of these substances is known to normalise bioenergetic processes by restoring aerobic glycolysis, prevent metabolic acidosis, thus decreasing lactate level and increasing glucose level in the ischemia-affected hemisphere. The authors consider the effects exhibited by these substances to be one of the defence mechanisms in the ischemia-affected brain.

Key words: acute cerebrovascular accident, bioenergetic processes, neuroprotectants.

Pacific Medical Journal, 2013, No. 2, p. 21-24.