Ассоциативное картирование у растений (обзор)

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 5

Обзоры, проблемы, итоги

УДК 631.52:575:58.084

АССОЦИАТИВНОЕ КАРТИРОВАНИЕ У РАСТЕНИЙ

Ю.В. ЧЕСНОКОВ, А.М. АРТЕМЬЕВА

Дается определение подходу, основанному на ассоциативном картировании при генетических исследованиях. Проводится его сравнение с традиционным методом картирования контролирующих количественные признаки хромосомных локусов (QTL) по генетической и селекционной перспективности (кратко перечислены основные этапы QTL-картирования, описана концепция неравновесного сцепления, подробно рассмотрен принцип ассоциативного картирования — современного метода ДНК-генотипирования). На конкретных примерах показано, что ассоциативное картирование позволяет не только осуществлять анализ, классифицировать и группировать естественные и селекционные популяции (дикие виды, примитивные формы, сорта, линии), сохраняемые в генных банках генетических ресурсов растений, но и более эффективно использовать их в практической селекции с целью улучшения возделываемых культур.

Ключевые слова: неравновесное сцепление, ассоциативное картирование, растения, практическое применение.

Keywords: linkage disequilibrium, association mapping, plants, practice.

Несмотря на значительные успехи генетики и селекции в области растениеводства, связанные прежде всего с развитием и применением молекуляр-ныж маркеров и маркерной помощи селекции, узкий генетический базис современных сортов сельскохозяйственных растений остается серьезной преградой для их улучшения и поддержания стабильно высокой продуктивности. Причиной тому высокая чувствительность генетически однородных сортов к существующим и потенциальным абиотическим и биотическим стрессам, а также возрастание требований к качеству сельскохозяйственной продукции, включая медицинские аспекты питания (1). В этих условиях коллекции мировых генетических ресурсов растений (ГРР), включая дикие виды, староместные и созданные на их основе современные селекционные сорта, становятся важнейшим резервуаром природной генетической изменчивости, которая представляет собой следствие происходивших в протяженном временном промежутке эволюционно-генетических событий — адаптации к стрессам и одомашнивания (2, 3). Эффективное использование ex situ сохраняемых ГРР, в том числе современного селекционного материала (инбредные, мутантные, реком-бинантные линии), в практической селекции жизненно необходимо. Однако такие хозяйственно важные признаки, как продуктивность и качество, устойчивость к различным стрессам, а также некоторые формы устойчивости к заболеваниям, как правило, не только полигенны, но и «многофакторны» и зачастую сильно зависят от взаимодействия генотип—среда (2, 4). Контроль подобных сложных признаков обычно связывают с локусами количественных признаков, или QTL (5). В то же время идентифицировать QTL только на основе классического фенотипического анализа довольно трудно (6). Выявление хозяйственно ценных QTL относится к агрономически важным задачам, а их использование для улучшения возделываемых видов растений все чаще требует установления точного местоположения идентифицированных QTL на хромосомах, что на современном этапе развития генетики и селекции достигается с помощью молекулярных маркеров (4, 5). В этой связи важнейшей целью любого генетического картирования становится определение нейтрально наследуемых маркеров в непосредственной близости от генетических детерминант (локусов или генов), контролирующих проявление тех или иных, в том числе

количественных, признаков. Генетическое картирование QTL на современном этапе преимущественно осуществляют двумя способами: с помощью экспериментальный популяций (так назы1ваемые двуродительские картирующие популяции), то есть методом картирования локусов количественный признаков, или QTL-картированием, и посредством использования генотипов из естественныж популяций или образцов из коллекций ГРР, то есть на основе подхода, названного картированием по неравновесному сцеплению, или ассоциативным картированием. Детали традиционного QTL-картирования быши описаны нами ранее (5). Для того чтобы сравнить генетическую и селекционную перспективность указанныж альтернативныж подходов, в настоящей работе кратко перечислены основные этапы QTL-картирования, описана концепция неравновесного сцепления, подробно рассмотрен принцип ассоциативного картирования — современного метода ДНК-генотипирования, позволяющего проводить скрининг образцов ГРР или селекционного материала с высоким разрешением одновременно по широкому кругу аллелей.

Н е р а в н о в е с н о е с ц е п л е н и е. Впервые термин «неравновесное сцепление» (linkage disequlibrium; LD), как и сама концепция LD, были предложены H.S. Jennings в 1917 году. Позже неравновесное сцепление стало также известно как «неравновесие гаметной фазы», «гаметическое неравновесие» и «аллельная ассоциация». В отечественной литературе первое упоминание о неравновесном сцеплении и о возможности его использования в практической селекции растений, а также для установления эволюционных отношений у различныгх видов растительных форм приведено в 1985 году в монографии А.А. Жученко и А.Б. Короля (2). В современной трактовке LD — это существование корреляции между полиморфизмами, например на уровне единичного нуклеотида (так называемые SNP — single nucleotide polymorphism) или любых других генетически маркированных локусов, вследствие наличия у них общей истории мутаций и рекомбинаций. Под историей мы будем понимать череду генетических событий (мутаций или рекомбинаций), происходивших в определенный временной (исторический) промежуток. В целом для родственных или случайно эволюционно сопряженных популяций с независимо сегрегирующими локусами в отсутствие отбора, мутаций или миграции их полиморфныгх локусов будет характерно генетическое состояние равновесного сцепления. В противоположность этому взаимосвязь, отбор и примесь (то есть привнесение в популяцию новых генотипов с новыми генами и/или аллелями) увеличивают уровень LD.

Термины «сцепление» и «LD» часто путают. Следует помнить, что хотя сцепление и LD связаны друг с другом, это совершенно разные понятия. Сцепление имеет отношение к совместному наследованию локусов вследствие их физического сцепления (связи) на хромосоме, в то время как LD касается корреляции между аллелями в популяции. Путаница происходит потому, что тесное генетическое сцепление может приводить к высокому неравновесному сцеплению. Так, если расстояние между двумя мутациями составляет несколько оснований, то, скорее всего, селекционное давление и дрейф у них были одинаковыми на протяжении определенного промежутка времени. Поскольку рекомбинация между близко расположенными основаниями — явление редкое, то совместное присутствие (наследование друг с другом) этих генетических локусов или SNP высоко коррелирует и тесное сцепление приведет к высоким значениям неравновесного сцепления. И наоборот, SNP на разныгх хромосомах испыпывают неодинаковое давление отбора и сегрегируют независимо друг от друга, поэтому эти SNP имеют очень низкий уровень корреляции друг с другом и, как следствие, низкое неравновесное сцепление.

В целом сцепление — это присутствие в одной группе сцепления/хромосоме пары (или большего числа) локусов/генов. Сцепленность

нормально проявляется как статистическая тенденция совместного наследования связанных аллелей. Например, поскольку цвет волос и глаз сцеплены, то ребенок, унаследовавший цвет глаз одного родителя, вероятно, также унаследует и цвет его волос. И наоборот, не унаследовав цвет глаз, он, скорее всего, не сможет унаследовать и цвет волос. Дети относительно редко наследуют только один из сцепленных признаков, хотя это все же может случаться благодаря кроссинговеру, действию которого, вероятнее всего, подвержены локусы в удаленных участках хромосомы. На этих принципах базируется техника картографирования хромосом.

Установление сцепления между генами в популяционной генетике человека проводят на основании статистического анализа сегрегации признаков в семьях с разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют метод оценки максимального правдоподобия (7, 8), для чего подсчитывают десятичный логарифм шансов — LOD (logarithm of the odds) (9), где шансы (odds) выражаются как отношение вероятности того, что два гена в наблюдаемой родословной сцеплены (0 < Q < 0,5), к той же вероятности при отсутствии сцепления (Q = 0,5). Если значение LOD > +3, гены локализованы в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная оценка соответствует наибольшему значению LOD. При значениях LOD < -2 гены не сцеплены, то есть локализованы в разных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. Статистическую обработку родословных обычно проводят с помощью компьютерных программ, самые известные из которых LIPED, CRIMAP и LINKAGE (10, 11). Тот же принцип оценки сцепления стал применяться в популяционной генетике растений (5, 8).

В то же время, как отмечалось выше, неравновесное сцепление в популяции — это статистическая тенденция некоторых аллелей находиться (в соматических клетках или гаметах) вместе с иными конкретными аллелями в другом локусе. Проще говоря, LD — неслучайная ассоциация аллелей в разных локусах. Например, если наблюдается склонность особей, проявляющих признак А, обнаруживать и признак Б (причем эти признаки, взятые вместе, имеют адаптивные преимущества по сравнению с тем, когда они проявляются врозь, в силу чего будет повышена частота такого дуэта, трио и т.д. относительно прочих комбинаций), то она может указывать на неравновесное сцепление. Проявляется неравновесное сцепление как тенденция частоты комбинаций аллелей в различныгх локусах отклоняться от частот, ожидаемых отдельно для каждого из аллелей в популяции.

И з м е р е н и е н е р а в н о в е с н о г о с ц е п л е н и я. Для расчета неравновесного сцепления было предложено множество статистических подходов. В ряде работ (12, 13) достаточно подробно рассмотрены преимущества и недостатки каждого из них. Наиболее распространенными статистическими характеристиками, используемыми для измерения LD, служат r2 и D'. Чтобы разобраться в них, представим пару локусов с аллелями А и а в одном и B и b — в другом локусе. Если каждый локус будет иметь ал-лельные частоты соответственно пА, па, пв и пъ, то результирующие частоты гаплотипов можно выразить как пав, паь, пав и паь. Поскольку основной компонент всех LD статистик — установление различия между наблюдаемыми и ожидаемыми частотами гаплотипов, величину D в этом случае выиисляют как Dab = (пав - па пв). Отличительная особенность этих математических показателей лежит в установлении пропорций такого различия.

Первую из двух величин, r2, также обозначаемую в научной литературе Д2, рассчитывают так:

, 2 = (Dab )2 .

ПА П а ПВ ПЬ

Показатель r2 можно представить как квадрат корреляционного ко-

эффициента двух локусов (14). Однако если у двух локусов не проявляются идентичные частоты аллелей, величина, равная 1, для этого показателя невозможна. Статистическую достоверность (Р) для LD обычно вычисляют, используя либо точный тест Фишера (15) для сравнения сайтов с двумя аллелями в каждом локусе, либо мультифакториальный анализ пермутаций (8) для сравнения сайтов, содержащих более чем два аллеля в каждом или в обоих сайтах.

Альтернативно величину LD, обозначаемую D' (16), вычисляют следующим образом:

\D'\ =_(Dab 22__для Dab > 0

mmOn, папв)

и

D'\=_2__для Dab > 0.

mm

D' устанавливают на основе наблюдаемых частот аллелей, поэтому величина указанного показателя варьирует от 0 до 1, даже если аллельные частоты для локусов различны. D' будет меньше 1 только в случае, когда имеются все четыре возможных гаплотипа (от haploid/genotype). Это означает, что предполагаемая рекомбинация произошла между двумя локусами.

Хотя ни r2, ни D' не бесспорны при анализе образцов малых размеров и/или с низкими частотами аллелей, каждый из них имеет свои преимущества. В то время как r2 «суммирует» обе (рекомбинационную и мутационную) истории, D' «замеряет» только рекомбинационную и вследствие этого представляет собой статистически более аккуратный параметр при установлении рекомбинационных различий. Однако D' строго зависит от малого размера образца, что выражается в высокой степени неустойчивости его поведения при сравнении локусов с низкими аллельными частотами. Это происходит из-за уменьшения вероятности обнаружения всех четырех аллельных комбинаций с низкой частотой полиморфизма, даже если локусы не связаны. Поэтому при ассоциативных исследованиях предпочтительней использовать показатель r2 как указывающий на возможную корреляцию маркеров с нужным QTL. Детали расчетов значений r2 и D ', а также гипотетические сценарии неравновесного сцепления между сцепленными полиморфными локусами, причиной полиморфизма которых были различные мутационные и рекомби-национные истории (события), демонстрирующие поведение величин r2 и D ', приведены в специальных обзорах (17, 18).

Т р а д и ц и о н н о е к а р т и р о в а н и е QTL. Прежде чем рассмотреть основные преимущества ассоциативного картирования у растений, а также примеры его практического применения, проанализируем и кратко обсудим некоторые особенности картирования QTL, основанного на двуродительском скрещивании. Подробно методология и основные принципы двуродительского картирования локусов количественных признаков, включая построение молекулярно-генетических карт групп сцепления у различных видов высших растений, описаны нами ранее (5).

Для идентификации и традиционного картирования QTL необходимо, во-первых, создать картирующие популяции. Обычно таковыми бывают генотипы F2, беккроссные формы (BC), линии двойных гаплоидов (DH), ре-комбинантные инбредные линии (RIL) или почти изогенные линии (NIL), полученные в результате скрещивания двух родительских генотипов, отличающихся друг от друга по признаку или признакам, которые необходимо изучить. Во-вторых, должен быть идентифицирован и генотипирован набор полиморфных ДНК-маркеров, позволяющий различать родительские генотипы и сегрегирующие линии картирующей популяции. Для этого, прежде всего, оценивают родительские формы, и если выбранный для генотипирования

молекулярный маркер оказывается полиморфным, то все особи (линии) картирующей популяции генотипируют такими проявившими полиморфизм у родителей маркерами. Полученные генотипические маркерные данные картирующей популяции используют для построения генетической карты сцепления. Готовые карты сцепления представляют собой графическое изображение порядка (позиция) и сцепления (относительная генетическая дистанция в сантиморганидах — сМ) молекулярных маркеров вдоль групп сцепления или сегментов отдельных хромосом. Это достигается посредством определения уровня рекомбинации между маркерными локусами. В-третьих, такие насыщенные молекулярными маркерами картирующие популяции, включающие большое число потомков или линий (как правило, не менее 100-150) оценивают в различных условиях окружающей среды для установления расщепления по анализируемому признаку среди изучаемых потомков или линий соответствующей картирующей популяции. Если порядок молекулярных маркеров, которыми насыщена картирующая популяция, статистически коррелирует с фенотипическими признаками составляющих ее особей, а РТЬ, определяющие изучаемый признак, — с близко расположенными к этим локу-сам маркерами, то такие РТЬ считаются идентифицированными.

Точность рТЬ-картирования в значительной степени зависит от генетической изменчивости (или генетических предпосылок), охватываемой картирующей популяцией, размера самой картирующей популяции и числа задействованных маркерных локусов. Если РТЬ, определяющие проявление изучаемого признака, аккуратно идентифицированы методом картирования локусов количественных признаков, то в этом случае маркеры представляют собой наиболее эффективный инструмент для улучшения возделываемых растений. Такой инструмент помогает мобилизовать нужные гены или локусы хромосом из донорных линий в реципиентном организме посредством так называемой маркерной помощи селекции (отбору). Хотя традиционное рТЬ-картирование остается и будет оставаться важным приемом идентификации желаемых генов/локусов в хромосомах растений, оно уже стало своеобразным «современным классическим методом» анализа, в целом достаточно недешевым. К тому же этот подход имеет низкое разрешение и дает возможность оценить всего нескольких аллелей за довольно длительный период времени. Так, из-за ограниченного числа рекомбинационных событий на протяжении создания картирующей популяции анализ сцепления у растений позволяет определять положение РТЬ лишь в очень узком интервале — как правило, от 10 до 20 сМ. Это служит одним из основных препятствий, не позволяющих проводить тонкое картирование. Однако указанные ограничения можно преодолеть при использовании ассоциативного картирования.

А с с о ц и а т и в н о е к а р т и р о в а н и е к а к а л ь т е р н а-т и в н ы й п о д х о д. Ассоциативное картирование (рис. 1), также известное как картирование по неравновесию или ЬБ картирование, возникло как инструмент для установления изменчивости сложных признаков, вплоть до установления полиморфизма единичного нуклеотида. Этот подход, используя в качестве субъекта исследований исторические и эволюционные рекомбинационные события, реализуют на популяционном уровне (19, 20). В качестве новой современной альтернативы традиционному анализу сцепления ассоциативное картирование обладает тремя основными преимуществами: увеличивается разрешение картирования, сокращается время исследования и, наконец, появляется возможность одновременно изучать большое число аллелей (21). С переходом от популяций, полученных в двуродительском скрещивании, к естественным популяциям линий или образцов коллекций ГРР и от традиционного рТЬ-картиро-вания к ЬБ ассоциативному анализу исследователи получили новый мощ-

ный инструмент картирования интересующих их генов (22). Можно ожидать,

А Б

Рис. 1. Сравнение анализа сцепления, проводимого с помощью традиционных двуродительских картирующих популяций и ассоциативного картирования, выполняемого с использованием разнотипных образцов коллекций.

Как анализ сцепления, так и ассоциативное исследование основываются на ко-наследовании функциональных полиморфизмов и прилегающих последовательностей ДНК. Различие заключается в том, что в случае традиционного сцепления (А, в качестве примера взята популяция F2) реализуется всего несколько возможностей для осуществления рекомбинации при скрещивании определенной пары родителей, дающих семьи и линии с известной родословной, что и приводит к низкому разрешению картирования. В ассоциативном картировании (Б, показаны только гомозиготы) многочисленные рекомбинационные события и естественное генетическое разнообразие позволяют проводить картирование с высоким разрешением. Неравновесное сцепление между функциональным локусом (звездочкой обозначен мутантный аллель) и молекулярными маркерами обычно низко, за исключением тех, что находятся друг от друга на очень близком расстоянии.

что подобная смена направления вектора усилий при идентификации и локализации генов/локусов хромосом приведет к более эффективному использованию естественного генетического разнообразия мировых ГРР, сохраняемых ex situ. LD связано с исторически неравным и разнородным уровнем рекомбинации специфичных аллелей в различных локусах, определяющих проявление изучаемой генетической изменчивости в популяции. Такое неравновесное сцепление может быть установлено статистически и уже широко используется для картирования и даже клонирования генов, контролирующих сложные признаки у человека (19, 23-25).

В целом преимущества ассоциативных исследований популяций перед традиционным QTL-картированием двуродительского скрещивания заключаются в выборе в качестве объекта исследований образцов из коллекции ГРР или особей из природной популяции, что экономит время и средства (нет необходимости проводить утомительные двуродительские скрещивания и создавать на их основе дорогие картирующие популяции), в доступности большего числа различных ботанических форм, что расширяет основу для установления корреляций «маркер—признак» (то есть одновременно оценивается много аллелей), в привлечении накопленных ранее данных оценки ГРР и, наконец, в возможности использовать для анализа большинство рекомби-национных событий, произошедших в процессе значительного числа мейозов и реализовавшихся при образовании существующей зародышевой плазмы ГРР, что позволяет проводить картирование с высоким разрешением (26-28).

У^фшансированием.

Рис. 2. Принципиальная схема сравнения широкогеномного ассоциативного картирования и ассоциативного картирования генов-кандидатов. Включение популяционной структуры и взаимосвязи (К) или их сочетание при конечном ассоциативном анализе зависят от генетической основы взаимоотношений, способа ассоциативного картирования и дивергенции оцениваемых признаков. ГРР — генетические ресурсы растений; Е — остаточная изменчивость.

Таким образом, можно предложить обобщенный подход по популяци-онному ассоциативному картированию у растений (рис. 2) (при условии, что особи или образцы, из которых будет составлена картирующая популяция, предварительно оценены и структурированы по ботаническим, молекулярно-генетическим и/или каким-либо иным признакам). Методически такой подход будет включать следующие этапы. Из природной популяции или коллекции ГРР отбирают группы генотипов с максимально широким представительством изучаемого генетического разнообразия. Затем проводят измерение фенотипи-ческих характеристик (урожайность, качество, устойчивость и т.п.) у отобранных популяционных групп (предпочтительно в различных экологических условиях и в нескольких экспериментальных повторностях). Далее выполняют ге-нотипирование особей картирующей популяции доступными молекулярными маркерами. На следующем этапе определяют количество меры (установление границ) ЬБ у генома избранной популяции с помощью подходящих для таких целей молекулярных маркеров. После этого оценивается структура популяции (степень генетической дифференциации среди групп особей в отобранной популяции) и родство (коэффициент связанности между парами всех особей образца). Наконец, на основании информации, полученной посредством количественного определения ЬБ в структуре популяции, а также сведений о корреляции фенотипических и генотипических/гаплотипических данных, установленной с помощью соответствующего статистического подхода, выявляются «маркерные метки», расположенные в непосредственной близости от локусов хромосом или генов целевого признака.

Полученной информации вполне достаточно, чтобы клонировать специфичный ген или гены, контролирующие изучаемый РТЬ. Такие гены впоследствии, как правило, аннотируют для определения их точной био-

логической функции, что относится к задачам по управлению и эффективному использованию ГРР. Причем следует помнить, что в качестве стартовой точки ассоциативного картирования крайне важно получить информацию о системе или принципе проявления LD для геномных районов у изучаемых организмов, а также специфичности пределов LD у различных изучаемых популяций или групп, что требуется для планирования и эффективного проведения достоверного ассоциативного картирования (29, 30). Строго говоря, в зависимости от используемой методологии в каждом конкретном случае стратегический подход будет иным. Однако это нисколько не противоречит описанной выше схеме типизированного методического подхода популяционного LD-картирования.

Широкогеномное ассоциативное картирование (см. рис. 2) предполагает в качестве обязательного условия наличие высокоемкостных ДНК-секвенаторов или высокоплотностных олиго-ДНК-чипов для эффективной идентификации SNP с такой разрешающей плотностью, которая аккуратно и точно отражает широкогеномную LD-структуру и разнообразие гаплотипов. Соответствие секвенирующего инструментария поставленным задачам зависит от числа SNP, необходимого для эффективного широкогеномного сканирования в ассоциируемой популяции. Например, десятки и сотни тысяч SNP-маркеров требуются для результативного широкогеномного сканирования у растений кукурузы и подсолнечника, имеющих низкое LD и высокую плотность гаплотипов. В этом случае Roche/454 GS FLX (31) и Illumina/1 G Genome Analyzer (www.illumina.com) служат идеальными платформами для идентификации числа SNP посредством короткого ресеквенирования аллель-ных фрагментов ДНК у нескольких генетически различных особей. После идентификации SNP различные ДНК-array платформы могут быть использованы для одновременного генотипирования тысяч целевых SNP. Цена вопроса очень высока. Например, стоимость анализа на секвенаторе Applied Biosystems ABI37390XL соответственно в 2,5 и в 7,0 раза больше, чем на секвенато-рах Illumina/Solexa's Genetic Analyzer и Roche/454 GS FLX (32). Проведение подобного рода анализов требует объединенных (прежде всего финансовых) усилий нескольких лабораторий или учреждений. Подробности этого подхода описаны в соответствующих источниках (33).

П р а к т и ч е с к о е п р и м е н е н и е а с с о ц и а т и в н о г о к а р т и р о в а н и я у р а с т е н и й. Первые ассоциативные исследования у растений были проведены на овсе (34) и рисе (35). Позднее ассоциативное картирование было применено на свекле, ячмене, кукурузе, пшенице, картофеле и арабидопсисе. Для этого авторы устанавливали популяционный уровень LD, принимая во внимание (для выявления нужных ассоциаций) структуру популяций. Так, в одной из работ (26) сообщалось об ассоциации AFLP (amplified fragment length polymorphism) маркеров с генами раннего цветения у свеклы. У ячменя урожайность и ее стабильность, время цветения, высота растений, устойчивость к бурой ржавчине и некоторые другие признаки были ассоциированы с разными типами молекулярных маркеров (27, 28, 36, 37). У кукурузы молекулярные SSR (simple sequence repeats) и SNP маркеры использовали для выявления ассоциаций между временем цветения и высотой растения (38, 39). У пшеницы первое ассоциативное картирование хозяйственно ценных признаков (размер зерна и качество размола) было проведено на образцах коллекции озимой пшеницы США также с помощью SSR-маркеров (40). Этот подход был успешно применен и у тетраплоидного картофеля в отношении устойчивости к ряду заболеваний (41-43). К настоящему времени ассоциативное картирование распространили и на древесные виды растений (44). В частности, у лесных древесных популяций были изучены ассоциации полиморфизма циннамоил-СоА-редуктазы (ЦСР), определяющей

угол направления микрофибриллы весеннего слоя древесины (45), и полиморфизм гена, ответственного, как предполагают авторы, за стресс плотности стояния, показатели жизнеспособности и биологической продуктивности леса (44). В научной литературе можно найти примеры ассоциативного картирования у кормовых видов растений, с успехом примененного при анализе холодоустойчивости, времени цветения, содержания водорастворимых углеводов и качества фуража (46-48).

У основного модельного объекта высших растительных организмов — арабидопсиса также было осуществлено ассоциативное картирование признаков, и полная пригодность настоящего подхода в отношении данного вида достаточно хорошо задокументирована. Так, сравнительно недавно (49) был выявлен полиморфизм генов-кандидатов (SPS1, MAX1 и MAX2), ассоциированных с архитектурой ветвления, при изучении 36 вовлеченных в развитие ветвей генов, генотипированных у 96 образцов арабидопсиса из Центральной Европы.

В России единственным примером успешного поиска ассоциаций молекулярных маркеров с ценными признаками, в том числе картирования генетических локусов количественных признаков у растений, пока остаются наши исследования, выполненные в сотрудничестве с зарубежными коллегами (50-54) и осуществленные впервые во Всероссийском НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР) для вида Brassica rapa L., который включает экономически значимые в мировом растениеводстве масличные и овощные культуры. Первый признак, подвергшийся анализу, — время перехода растения в репродуктивную фазу онтогенеза, то есть важнейший показатель развития, определяющий продуктивность и качество возделываемых растений. Следует отметить, что характерной особенностью этих работ было то, что сначала исследования проводили на искусственных двуродительских популяциях — линиях двойных гаплоидов, затем проанализировали образцы ГР B. rapa, представляющие собой естественные популяции, и на заключительном этапе сравнили результаты, полученные обоими методами.

Материалом 3-летних исследований при QTL-анализе служили дву-родительские расщепляющиеся популяции линий двойных гаплоидов, полученные от скрещивания листовой/черешковой китайской капусты и масличного желтого сарсона (DH38, 68 линий) и корнеплодной японской репы и желтого сарсона (DH30, 44 линии). Для ассоциативного картирования использовали образцы из стержневой коллекции ВИР, состоящей из 96 (в ряде экспериментов — 102) сортов-популяций, в большинстве своем местных, и включающей все ботанические подвиды, разновидности и морфологические типы различного эколого-географического происхождения, а также в некоторых экспериментах — формы из стержневой коллекции Университета Вагенингена (Нидерланды) (137 образцов).

В результате анализа изменчивости позиций генетических локусов (QTL), контролирующих признак времени перехода к цветению, по годам было выявлено, что для популяции DH38 QTL в отдельные годы находятся во 2-й, 3-й и 10-й группах сцепления. Эти данные согласуются с результатами, полученными для той же картирующей популяции в Нидерландах (55). Анализ погодных условий вегетационных периодов в период исследований заставляет предположить, что действие указанных QTL проявляется в относительно жаркую погоду при отсутствии яровизирующих температур. В то же время нами найден QTL, расположенный в 7-й группе сцепления, который стабильно проявлял действие в течение всех лет выращивания, хотя для него отмечены невысокие значение LOD (1,16-1,74). В исследованиях, проведенных в Нидерландах, QTL в хромосоме R07 найден у популяции F2, полученной при использовании той же родительской пары. Нами установлены AFLP- и SSR-маркеры, сцепленные с выявленными генетическими локусами.

При поиске ассоциаций маркеров с признаками в естественных гетерозиготных и гетерогенных популяциях из двух стержневых коллекций генетическое разнообразие, выраженное через аллельный полиморфизм набора SSR-маркеров, отнесли к наблюдаемому фенотипическому варьированию признаков листа и стручка, архитектоники растения и времени цветения, используя для этого данные полевых экспериментов. Выполненный анализ популяционной структуры показал наличие в объединенной стержневой коллекции (образцы из ВИР и Университета Вагенингена) пяти подгрупп.

Для ассоциативного картирования времени цветения с помощью генов-кандидатов использовали биаллельный CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) маркер BrFLC1, локализованный в 10-й группе сцепления, и мультиаллельный SSR-маркер BrFLC2 (16 аллелей), картированный во 2-й группе сцепления. Найдено, что оба маркера в значительной степени ассоциированы с признаком времени начала цветения, но их эффекты ограничены несколькими культурами и/или аллелями. Так, CAPS-маркер BrFLC1 показал высокую степень ассоциации со временем цветения у китайской капусты, японских листовых овощей и яровых масличных из коллекции ВИР. Значительная ассоциация с признаком была найдена для трех аллелей второго маркера, BrFLC2, которые у корнеплодной репы встречались с достаточно высокой частотой, но в некоторых культурах — с низкой. На основании полученных результатов мы пришли в выводу, что численно популяция (коллекция) для ассоциативного картирования должна быть увеличена (не менее 50-70 образцов каждой культуры), а гетерогенные образцы для облегчения фенотипирования и генотипирования необходимо фиксировать (например, через культуру микроспор).

При анализе ассоциаций с признаком времени начала цветения на материале стержневой коллекции B. rapa из ВИР были найдены два SSR-маркера: для раннего времени цветения — биаллельный Br372 маркер, локализованный в 7-й группе сцепления, для позднего цветения — мультиаллельный ВС89 из 6-й группы. Также для раннего начала цветения установлены два молекулярных маркера, полученных на основе мобильных элементов II класса САСТА, локализация которых в геноме пока неизвестна. Построение дендрограммы, устанавливающей взаимоотношения между маркерами SSR и S-SAP (sequence-specific amplification polymorphism) (созданы на основе выявленных у B. rapa мобильных элементов САСТА), с выделением кластера маркеров, ассоциированных с ранним и полным появлением цветоносного стебля (стеблевание), а также цветением, позволило наглядно продемонстрировать выявленные ассоциации молекулярных маркеров — одного SSR (e66-165) и двух S-SAP (CAT-CAG-700-88 и CGT-700-480) с хозяйственно ценными признаками цветения (рис. 3).

Таким образом, использование искусственных двуродительских сегрегирующих и естественных популяций для поиска ассоциаций различных типов молекулярных маркеров с признаком времени перехода к цветению привело к сходным результатам и позволило найти и картировать генетические локусы, расположенные во 2-й, 10-й и 7-й группах сцепления B. rapa, что может служить основой для маркерной помощи селекции при реализации селекционных программ по переносу генов и/или локусов хромосом, определяющих указанные хозяйственно ценные признаки, из изученных образцов ГР B. rapa в соответствующие селекционные линии или сорта.

В целом ассоциативное картирование у образцов ГРР, обладающих известным происхождением и установленной родословной, достаточно привлекательно для точного, аккуратного и безошибочного нахождения лучших аллелей, в которых нуждается практическая селекция, и/или которые могут ускорить процесс маркерной помощи селекции. Так, картирование in silico

(при котором LD-картирование базируется на фенотипических, генотипиче-ских данных и родословных, полученных в процессе реализации селекционных программ) (56, 57) существенно дополняет общее ассоциативному картированию у собранных и структурированных ГРР. Установление ассоциаций

Рис. 3. Фрагмент дендрограммы, показывающей взаимоотношения между SSR- и S-SAP-маркерами с выделением кластера маркеров (e66-165, CAT-CAG-700-88 и CGT-700-480), ассоциированных с ранним (start bolt) (1), полным (total bolt) (2) стеблеванием и цветением (total flowering) (3).

внутри и между различными образцами и объектами коллекций ГРР может помочь в идентификации лучших аллелей, по каким-либо причинам не выявленных селекционной практикой, и, кроме того, облегчить перенос этих аллелей в нужные селекционные линии и сорта. Так, в одном из недавних исследований по ассоциативному картированию был идентифицирован ло-кус, контролирующий ликопен-е-циклазу (lcyE), необходимую для изменения биосинтеза а- и p-каротина у различных инбредных линий кукурузы (58). Найденные ассоциации авторы верифицировали посредством сегрегационного анализа/картирования, анализа экспрессии гена и мутагенеза. Поскольку у различных генотипов кукурузы корреляции между присутствием р-каротина и окраской зерна (определенной как оттенки желтого) очень низки, скрининг образцов ГРР и прямой отбор желаемых аллелей lcyE с помощью молекулярных маркеров позволили селекционерам получить линии кукурузы с повышенным содержанием провитамина А более эффективно и к тому же с меньшими затратами, чем потребовалось бы при использовании классического скрининга и отбора по фенотипу (окраске зерна).

Подводя итог, следует отметить, что основные принципы ассоциативного картирования разработаны для множества растительных видов. Установление ассоциативных взаимосвязей даст ценную информацию, необходимую для осуществления целенаправленной идентификации и локализации ге-нов/локусов хромосом, определяющих хозяйственно ценные признаки, а

также лучшего понимания различных генетических и статистических аспектов ассоциативного картирования. В то же время теоретические исследования в сочетании с экспериментальными результатами позволят развивать общие принципы ассоциативного картирования. Как ожидается, генетическое разнообразие и фенотипирование снова привлекут к себе внимание, так как исследователи станут лучше понимать, насколько они важны. В конечном счете объектом изучения станут разнообразные свойства и характеристики, имеющие не только экономическое, но и эволюционное значение, причем у самых разнообразных растительных объектов. При этом благодаря совместным усилиям разных научных групп поиск аллелей, наиболее подходящих для улучшения хозяйственно ценных признаков, будет значительно облегчен.

Итак, методология ассоциативного картирования, основанного на установлении неравновесного сцепления, которая была исходно разработана для изучения генетики человека, нашла применение при исследовании и скрининге генетических ресурсов растений, в особенности после успешной минимизации ложных ассоциаций. Примеры анализа, выполненного на генетических ресурсах различных видов растений, включая модельный объект — арабидопсис, а также разнообразные сельскохозяйственные культуры, свидетельствуют о развитии геномики возделываемых растений и важной роли такого научного инструмента, как ассоциативное картирование. Это хороший индикатор перспективы будущего применения указанного подхода в отношении других, не исследованных ранее видов растений. Вполне возможно, что подобные эксперименты уже сейчас ведутся во многих лабораториях мира. Завершение в ближайшем будущем проектов по секвенированию геномов ряда видов культивируемых растений, безусловно, создаст базис для широкогеномных ассоциативных исследований и приведет к обнаружению редко проявляющихся, но общих по распространенности вариантов признаков, а также к установлению эпигеномных деталей экспрессии интересующих исследователя свойств растений (подобное с большим успехом уже происходит в генетике человека). Все это позволит не только обеспечить селекционные и геномные программы более мощным инструментарием по ассоциативному картированию с целью установления достоверных функциональных ассоциаций, определяющих генетическое разнообразие, но и эффективно использовать полученные результаты в практической генетике и селекции растений.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. V a n E s b r o e c k G.A., B o w m a n D.T., M a y O.L., C a l h o u n D.S. Genetic similarity indices for ancestral cotton cultivars and their impact on genetic diversity estimates of modern cultivars. Crop Sci., 1999, 39: 323-328.

2. Ж у ч е н к о А.А., К о р о л ь А.Б. Рекомбинация в эволюции и селекции. М., 1985.

3. M e i l l u e r B.A., H o d g k i n T. In situ conservation of crop wild relatives: status and trends. Biodiversity and Conservation, 2004, 13: 663-684.

4. C o l l a r d B.C.Y., J a h u f e r M.Z.Z., B r o u w e r J.B., P a n g E.C.K. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: the basic concepts. Euphytica, 2005, 142: 169-196.

5. Ч е с н о к о в Ю.В. Картирование локусов количественных признаков у растений. СПб, 2009.

6. М е р е ж к о А.Ф. Генетический анализ количественных признаков для расширения задач селекции растений. Генетика, 1994, 30: 1317-1325.

7. K a o F.T. Somatic cell genetics and gene mapping. Int. Rev. Cytol., 1983, 85: 109-146.

8. W e i r B.S. Genetic data analysis II. Sunderland, MA. Sinauer, 1996.

9. M o r t o n N.E. Sequential test for the detection of linkage. Am. J. Hum. Gen., 1955, 7: 277-318.

10. O t t J. Analysis of human genetic linkage. Baltimore, 1985.

11. T e r w i l l i g e r J.D., O t t J. Handbook of human genetic linkage. Baltimore, 1994.

12. D e l v i n B., R i s c h N. A comparison of linkage disequilibrium measures for fine-scale mapping. Genomics, 1995, 29: 311-322.

13. J o r d e L.B. Linkage disequilibrium and the search for complex disease genes. Genome Res., 2000, 10: 1435-1444.

14. H i l l W.G., R o b e r s o n A. Linkage disequilibrium in finite populations. Theor. Appl. Genet., 1969, 38: 226-231.

15. F i s h e r R.A. The logic of inductive inference. J. R. Stat. Soc. Ser. A, 1935, 98: 39-54.

16. L e w o n t i n R.C. The interaction selection and linkage. I. General considerations; heterotic models. Genetics, 1964, 49: 49-67.

17. R a f a l s k i A. Applications of single nucleotide polymorphysms in crop genetics. Curr. Opin. Plant Biol., 2002, 5: 94-100.

18. G a u t B.S., L o n g AD. The lowdown on linkage disequilibrium. The Plant Cell, 2003, 15: 1502-1506.

19. R i s c h N., M e r i k a n g a s K. The future of genetic studies of complex human diseases. Science, 1996, 273: 1516-1517.

20. N o r d b o r d M., T a v a r e S. Linkage disequilibrium: What history has to tell us. Trends Genet., 2002, 18: 83-90.

21. Y u J., B u c k l e r E.S. Genetic association mapping and genome organization of maize. Curr. Opin. Biotechnol., 2006, 17: 155-160.

22. G o l d s h t e i n D.B., W e a l e M.E. Population genomics: linkage disequilibrium holds the key. Curr. Biol., 2001, 11: R576-R579.

23. W e i s s K.M., C l a r k A.G. Linkage disequlibrium and mapping human traits. Trends Genet., 2002, 18: 19-24.

24. C h a p m a n J.M., C o o p e r D.J., T o d d J.A., C l a y t o n D.G. Detecting disease associations due to linkage disequilibrium using haplotype tags: a class of tests and the determinants of statistical power. Human Heredity, 2003, 56: 18-31.

25. T a n i g u c h i H., L o w e C.E., C o o p e r J.D. e.a. Discovery, linkage disequilibrium and association analyses of polymorphysms of the immune compliment inhibitor, decay-accelerating factor gene (DAF/CD55) in type 1 diabetes. BMC Genetics, 2006, 7: article 22.

26. H a n s e n M., K r a f t T., G a n e s t a m S., S a l l T., N i l s s o n N.-O. Linkage disequilibrium mapping of the bolting gene in see beet using AFLP markers. Genet. Res., 2001, 77: 61-66.

27. K r a a k m a n A.T.W., N i k s R.E., V a n d e n B e r g P.M.M.M., S t a m P., V a n E u w i j k F.A. Linkage disequilibrium mapping of yield and yield stability in modern spring barley cultivars. Genetics, 2004, 168: 435-446.

28. K r a a k m a n A.T.W., M a r t i n e z F., M u s s i r a l i e v B., V a n E u w i j k F.A., N i k s R.E. Linkage disequilibrium mapping of morphological, resistance, and other agronomically relevant traits in modern spring barley cultivars. Mol. Breed., 2006, 17: 41-58.

29. N o r d b o r d M., B o r e v i t z J.O., B e r g e l s o n J. e.a. The extent of linkage disequilibrium in Arabidopsis thaliana. Nature Genetics, 2002, 30: 190-192.

30. N o r d b o r d M., H u T.T., I s h i n o Y. e.a. The pattern of polymorphysm in Arabidopsis thaliana. PLoS Biology, 2005, 3: e196.

31. M a r g u l i e s M., E g h o l m M., A l t m a n W.E., A t t i y a S. e.a. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature, 2005, 437: 376.

32. S a l i s b u r y M. Next-gen sequencing: The waiting game. Genome Technol., 2007, 72: 26-28.

33. The Wellcome Trust Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature, 2007, 447: 661-678.

34. B e e r S.C., S i r i p o o n w i w a t W., O' D o n o u g h u e L.S., S o u z a E., M a t-t h e w D., S o r r e l s M.E. Association between molecular markers and quantitative traits in an oat germplasm pool: can we infer linkage? Journal of Agricultural Genomics, 1997, 3: paper197.

35. V i r k P.S., F o r d - L l o y d B.V., J a c k s o n M.T., P o o n i H.S., C l e m e n o T.P., N e w b u r y H.J. Predicting quantitative variation within rice germplasm using molecular markers. Heredity, 1996, 76: 296-304.

36. I g a r t u a E., C a s a s A.M., C i u d a d F., M o n t o y a J.L., R o m a g o s a I. RFLP markers associated with major genes controlling heading date evaluated in a barley germ plasm pool. Heredity, 1999, 83: 551-559.

37. I v a n d i c V., T h o m a s W.T.B., N e v o E., Z h a n g Z., F o r s t e r B.P. Associations of simple sequence repeats with quantitative traits variation including biotic and abiotic stress tolerance in Hordeum spontaneum. Plant Breed., 2003, 122: 300-304.

38. R e m i n g t o n D.L., T h o r n s b e r r y J.M., M a t s u o k a Y. e.a. Structure of linkage disequilibrium and phenotypic associations in maze genome. PNAS USA, 2001, 98: 11479-11484.

39. T h o r n s b e r r y J.M., G o o d m a n M.M., D o e b l e y J., K r e s o v i c h S., N i e l s e n D., B u c k l e r E.S. D)warf8 polymorphisms associate with variation in flowering time. Nature Genetics, 2001, 28: 286-289.

40. B r e s e n g h e l l o F., S o r r e l l s M.E. Associating mapping of kernel size and milling quality in wheat (Triticum aestivum L.) cultivars. Genetics, 2006, 172: 1165-1177.

41. M a l o s e t t i M., V a n d e r L i n d e n C.G., V o s m a n B., V a n E u w i j k F.A. A mixed-model approach to association mapping using pedigree information with an illustration of resistance to Phytophtora infestans in potato. Genetics, 2007, 175: 879-889.

42. G e b h a r d t C., B a l l v o r a A., W a l k e m e i e r B., O b e r h a g e m a n n P., S s c h u l e r K. Assessing genetic potential in germplasm collection of crop plants by marker-trait association: a case study of potatoes with quantitative variation of resistance to late blight and maturity type. Mol. Breed., 2004, 13: 93-102.

43. S i m k o I., C o s t a n z o S., H a y n e s K.G., C h r i s t B.J., J o n e s W. Linkage disequilibrium mapping of a Virticillium dahliae resistance quantitative trait locus in tetraploid potato (Solanum tuberosum) through a candidate gene approach. Theor. Appl. Genet., 2004, 108: 217-224.

44. W i l c o x P.L., E c h t E.C., B u r d o n R.D. Gene-assisted selection: applications of association genetics for forest for forest tree breeding. In: Association mapping in plants /N.C. Ora-guzie, E.H.A. Rikkerink, S.E. Gardiner, H.N. De Silva (eds.). N.Y., 2007: 211-247.

45. T h u m m a B.R., N o l a n M.F., E v a n s R., M o r a n G.F. Polymorphisms in cin-

nomoyl CoA reductase (CCR) are associated with variation in microfibril angle in Eucalyptus ssp. Genetics, 2005, 171: 1257-1265.

46. G u i l l e t - C l a u d e C., B i r o l l e a u - T o u c h a r d C., M a n i c a c c i D. e.a. Genetic diversity associated with variation silage corn digestibility for three O-methyltransferase genes involved in lignin biosynthesis. Theor. Appl. Genet., 2004, 110: 126-135.

47. G u i l l e t - C l a u d e C., B i r o l l e a u - T o u c h a r d C., M a n i c a c c i D. e.a. Nucleotide diversity of the ZmPox3 maize peroxidase gene: relationship between a MITE insertion in exon 2 and variation in forage maize digestibility. BMC Genetics, 2004, 5: 1-11.

48. D o b r o w o l s k i M.P., F o r s t e r J.W. Linkage disequilibrium-based association mapping in forage species. In: Association mapping in plants /N.C. Oraguzie, E.H.A. Rikkerink, S.E. Gardiner, H.N. De Silva (eds.). N.Y., 2007: 197-210.

49. E h r e n r e i c h I.M., S t a f f o r d P.A., P u r u g g a n a n M.D. The genetic architecture of shoot branching in Arabidopsis thaliana: comparative assessment of candidate gene associations vs. quantitative trait locus mapping. Genetics, 2007, 176: 1223-1236.

50. А р т е м ь е в а А.М., К а л и н и н а Е.Н., Ч е с н о к о в Ю.В. Картирование QTL морфологических признаков и времени перехода к цветению вида Brassica rapa L. Мат. докл. I Межд. науч.-практ. конф. «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур: Традиции и перспективы». М., 2008, т. 2: 56-58.

51. A r t e m y e v a A.M., K a l i n i n a E.N., Z h a o J., L o u P., P i n o D e l C a r p i o D., C h e s n o k o v Yu.V., B o n n e m a A.B. Evaluation of QTL for phenotypic characters of Brassica rapa. Proc. 5th ISHS International Symposium on Brassicas and 16th Crucifer Genetic Workshop. Lillehammer, Norway, 2008: 127.

52. А р т е м ь е в а А.М., Ч е с н о к о в Ю.В. Картирование QTL признаков продуктивности вида Brassica rapa L. Тр. Всерос. конф. с междю. участием «Продукционный процесс растений: теория и практика эффективного и ресурсосберегающего управления». СПб, 2009: 98-99.

53. A r t e m y e v a A.M., K a l i n i n a E.N., Z h a o J., P i n o D e l C a r p i o D., C h e s-n o k o v Yu.V., B o n n e m a A.B. Identification of QTLs for leaf traits in Brassica rapa L. in Russia. Abstr. of 2nd Int. Symp. on Genomics of Plant Genetic Resources. Bologna, Italy, 2010: 117.

54. Z h a o J., A r t e m y e v a A.M., P i n o D e l C a r p i o D., B a s n e t R.K., Z h a n g N., G a o J., L i F., B u c h e r J., W a n g X., V i s s e r R.G.F., B o n n e m a G. Design of a Brassica rapa core collection for association mapping studies. Genome, 2010, 53: 884-898.

55. L o u P., Z h a o J.J., K i m J.S. e.a. Quantitative trait loci for flowering time and morphological traits in multiple populations of Brassica rapa. J. Exp. Bot., 2007, 58: 4005-4016.

56. A r b e l b i d e M., Y u J., B e r n a r d o R. Power of mixed model QTL mapping from pheno-typic, pedigree and marker data in a self pollinated crops. Theor. Appl. Genet., 2006, 112: 876-884.

57. P a r i s s e a u x B., B e r n a r d o R. In silico mapping of quantitative loci in maize. Theor. Appl. Genet., 2004, 109: 508-514.

58. H a r j e s C.E., R o c h e f o r d T.R., B a i L. e.a. Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification. Science, 2008, 319: 330-333.

59. B e r n a r d o R. Breeding for quantitative traits in plants. Woodbury, MN, 2002.

60. B e r n a r d o R. Parental selection, number of breeding populations, and size of each population in inbred development. Theor. Appl. Genet., 2003, 107: 1252-1256.

61. B e r n a r d o R., C h a r c o s s e t A. Usefulness of gene information in marker-assisted recurrent selection: A simulation appraisal. Crop Sci., 2006, 46: 614-621.

62. J o h n s o n R. Marker-assisted selection. Plant Breed. Rev., 2004, 24: 293-309.

63. B e r n a r d o R., Y u J. Prospects for genomewide selection for quantitative traits in maize. Crop Sci., 2007, 47: 1082-1090.

64. E s t i v i l l X., A r m e n g o l L. Copy number variants and common disorders: filling the gaps and exploring complexity in genome-wide association studies. PLoS Genetics, 2007, 3: 1787-1799.

ГНУ Всероссийский НИИ растениеводства Поступила в редакцию

им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии, 25 июля 2011 года

197000 г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42-44, e-mail: yu.chesnokov@vir.nw.ru; akme11@yandex.ru

ASSOCIATION MAPPING IN PLANTS

Yu.V. Chesnokov, A.M. Artem 'eva S u m m a r y

This article gives a definition of the approach, based on association mapping during genetic researches. The authors make a comparison of this method with traditional method of quantitative trait loci mapping method (QTL). The main stages of QTL-mapping are briefly presented, the conception of nonequilibrium linkage is described. In detail the principle has been given of association mapping — the current method of DNA-genotyping. Based on concrete examples it has been shown that association mapping allows not only to do analysis, classification and group formation of natural and breeding population (wild species, primitive forms, varieties, lines), conserved in Gene Banks of plant genetic resources, but more effective use them in practical breeding with the aim of crops improving.