Влияние липополисахарида туляремийного микроба на метаболическую активность фагоцитов

повышение содержания неферментных катионных белков (НКБ) при воздействии на ПЯЛ ДАК-конъюгата в сочетании с АГ + СКВ.

Показано, что как в отдельности, так и в сочетании с АГ или СКВ ДАК-конъюгат активирует синтез ФНО-а перитонеальными макрофагами белых мышей. Наиболее высокие показатели активизации синтеза цитокина зафиксированы при комплексном воздействии на ПМ ДАК-конъюгата, АГ и СКВ.

Главная задача исследования in vivo состояла в том, чтобы проследить реакцию клеток иммунной системы макроорганизма на комплексное воздействие ДАК-конъюгата и иммуномодуляторов.

Установлено, что у морских свинок, получивших парентерально ДАК-конъюгат, во все сроки иммуногенеза (от 3 до 30 сут.) возрастает адгезивная активность перитонеальных макрофагов. В наибольшей мере повышению адгезивной и поглотительной способности фагоцитов морских свинок способствовал ДАК-конъюгат в сочетании с двумя иммуномодуляторами. Отмечен почти двукратный рост показателя завершенности фагоцитоза.

Установлено стимулирующее действие исследованных препаратов на выработку активных форм кислорода в макрофагах при фагоцитозе B. anthracis СТИ во все сроки наблюдения. Пик окислительной активности приходится на 14 сут. после инъекции препаратов.

В процессе иммуногенеза в отдельные сроки установлено повышение активности Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы иммунокомпетентных клеток, что свидетельствует об усилении окисления в них глюкозы в гексозомонофосфатном шунте, наработке НАДФ-Н, активизации бактерицидного метаболизма фагоцитов и, как следствие, — повышении антимикробного потенциала фагоцитирующих клеток. Активация обоих ферментов в клетках крови на 10 сут. после иммунизации животных происходит интенсивнее у особей, вакцинированных комплексом ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и СКВ, чем сибиреязвенной вакциной.

Фагоциты иммунных морских свинок превосходят аналогичные клетки интактных животных и по активности миелопероксидазы. Закономерных различий в активности фермента в зависимости от введенного препарата не выявлено.

В ПЯЛ иммунных морских свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом в сочетании с АГ или СКВ, экзоцитоз неферментных катионных белков при поглощении сибиреязвенного микроба происходит более активно, чем в лейкоцитах как интактных, так и иммунизированных вакцинным штаммом или только ДАК-коньюгатом животных.

Показано, что активность NO-синтазы в ПМ наблюдается уже на третьи сутки после иммунизации морских свинок. ПМ животных, которым ДАК-конъюгат вводили одновременно с АГ и СКВ, на 14 — 21 сут. после вакцинации по интенсивности синтеза монооксида азота превосходили макрофаги животных, получивших вакцину СТИ.

Таким образом, на основании полученных собственных экспериментальных результатов нами исследован механизм действия ДАК-конъюгата и патогенетически обоснована возможность коррекции функционального состояния системы фагоцитирующих сибиреязвенный микроб клеток арабиногалак-таном и скваленом.

Ж.А. Коновалова, В.И. Дубровина, В.В. Войткова, В.Б. Николаев, С.А. Татарников,

Б.Ю. Марков, Ю.О. Попова

влияние липополисахарида тулярЕмийного микроба на метаболическую Активность фагоцитов

ФГУЗ «Научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»

Роспотребнадзора»

Туляремия как нозологическая форма известна уже давно, причины высокой патогенности ее возбудителя остаются нераскрытыми. Слабое врожденное распознавание макроорганизмом Francisella tularensis позволяет бактерии на ранних этапах инфекционного процесса избегать воздействия факторов неспецифической резистентности организма млекопитающих с последующей реализацией своих патогенных свойств. Из числа возможных факторов патогенности может рассматриваться липополиса-харид (ЛПС). Подтверждением этому является устойчивость вирулентных штаммов к бактерицидному действию нормальной сыворотки человека, которое обусловлено особенностями структуры их ЛПС, активирующего систему комплемента по классическому пути. ЛПС F. tularensis не обладает летальной токсичностью для чувствительного хозяина, не является типичным провоспалительным эндотоксином и антагонистом эндотоксина. Предполагается, что за взаимодействие с ЛПС ответственны макрофаги (Павлович Н.В., Тынянова В.И., 2005; Hajjar A.M. и др., 2006).

В связи с этим, сопоставление свойств ЛПС туляремийного микроба разных подвидов и вирулентности взаимодействия позволит внести ясность в понимание закономерностей взаимоотношений «хозяин — паразит».

Цель работы: изучить влияние ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на кислородзависимые ферментативные системы перитонеальных макрофагов.

Для реализации поставленной цели мы исследовали возможность стимуляции ЛПС in vitro функциональной активности перитонеальных макрофагов (ПМ) и полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) лабораторных животных.

Препараты ЛПС выделяли водно-фенольным методом (Адамс Г.А., 1975) из штаммов F. tularensis четырех подвидов: holarctica 15В (вакцинный, НИИЭГ) и И-250 (306); novicida-like И-383 (F 6168); mediaasiatica И-357 (А-120); tularensis И-163 (Schu 11). В качестве типичного S-ЛПС использовали коммерческий препарат ЛПС Salmonella enteritidis («Sigma»). Экспериментальной моделью в опытах служили 593 беспородных, но стандартных по условиям содержания и весу (250 — 300 г) морских свинки. ПМ получали общепринятым методом (Фрейдлин И.С., 1986). Клетки примировали ЛПС в дозе 10 мкг/мл фагоцитов в течение 180 мин. при 37 °С с последующим определением суммарной активности ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте (Сомова Л.М. и др., 2005), ключевого фермента окислительного взрыва - НАДФ-Н-оксидазы (Голубинский Е.П. и др., 1995), миелопероксидазы (МПО) по методу Л.М. Сомовой и др. (2005). Контролем служили интактные клетки. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «Статистика», версия 6 (Новосибирск).

Показано, что препараты ЛПС F. tularensis оказывают слабое стимулирующее воздействие на выработку активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах интактных и вакцинированных живой туляремийной вакциной (ЖТВ) морских свинок. Показатели НСТ-теста в клетках, стимулированных ЛПС, незначительно отличались от контрольных (интактные макрофаги). Препараты ЛПС туляремийного микроба, независимо от фенотипических свойств, оказывают менее выраженное стимулирующее действие на активность кислородзависимого метаболизма (КЗМ) фагоцитов (как интактных, так и вакцинированных животных) по сравнению с ЛПС S. enteritidis. Следует отметить, что ЛПС возбудителя туляремии повышает активность КЗМ в макрофагах морских свинок, вакцинированных ЖТВ, по сравнению с интактными животными в 1,2 раза (р < 0,01). Существенных различий по степени влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на активацию КЗМ у перитонеальных макрофагов не выявлено, однако в случае с ЛПС F. tularensis 15В наблюдается некоторое увеличение показателей «окислительного взрыва» в фагоцитах обеих групп животных по сравнению с другими ЛПС.

Установлено, что исследованные в эксперименте препараты ЛПС туляремийного микроба оказывают стимулирующее воздействие на активацию НАДФ-оксидазного комплекса в макрофагах обеих групп животных по сравнению с контролем. Показано, что активность НАДФ-Н-оксидазы в клетках вакцинированных животных в среднем в 1,2 раза выше, чем у интактных морских свинок (р < 0,01). Наибольшим стимулирующим эффектом обладает ЛПС подвида holarctica. Так, значения показателя активности фермента в ПМ, примированных ЛПС бактерий этого подвида (15В), составили в группе интактных — 0,390 ± 0,001, а вакцинированных ЖТВ морских свинок — 0,482 ± 0,001. Существенных различий между ЛПС туляремийного микроба разных подвидов по степени их воздействия на активность НАДФ-Н-оксидазы ПМ не установлено.

Активация НАДФ-Н-оксидазы в ПМ инкубированных с ЛПС S. enteritidis происходит более интенсивно по сравнению с ЛПС F. tularensis. Так, показатели активности фермента в макрофагах, стимулированных ЛПС S. enteritidis, были в среднем выше в 1,2 — 1,4 раза, чем у аналогичных клеток (интактных и вакцинированных ЖТВ морских свинок), инкубированных с ЛПС туляремийного микроба (р < 0,01).

Исследования, проведенные in vitro показали, что активность МПО в ПЯЛ при стимуляции препаратами ЛПС, полученными из F. tularensis голарктического подвида была выше по сравнению с нестимулированными фагоцитами обеих групп животных. Туляремийный микроб подвидов novicida, mediaasiatica, tularensis ингибировал активность миелопреоксидазного комплекса ПЯЛ, при этом наибольший ингибирующий эффект на каталитическую способность МПО оказывал ЛПС туляремийного микроба неарктического подвида. Активация МПО в ПЯЛ, стимулированных сальмонеллезным ЛПС, происходит более интенсивно в 1,2 раза по сравнению туляремийным ЛПС (р < 0,01).

Результаты экспериментов, проведенных in vitro, свидетельствуют о том, что активация кислородза-висимой системы перитонеальных макрофагов всеми исследованными препаратами ЛПС (в дозе 10 мкг/ мл фагоцитов) была менее выраженной по сравнению с ЛПС S. enteritidis. Вероятным объяснением этому может служить тот факт, что ЛПС туляремийного микроба слабо распознается Toll-подобными рецепторами клеток.

Существенных различий в степени воздействия на активность бактерицидных систем фагоцитов между препаратами ЛПС подвидов holarctica, tularensis, novicida-like не выявлено. Это согласуется с данными литературы о сходстве структуры липида А (биоактивный компонент ЛПС) у указанных выше подвидов (Hajjar A.M. и др., 2006).

Следует отметить, что при слабовыраженной активации кислородзависимой (НСТ-тест, НАДФ-Н-оксидаза, МПО) системы ЛПС разных подвидов туляремийного микроба наибольшим

стимулирующим эффектом обладает препарат, полученный из туляремийного микроба подвида holaгctica. Установлено незначительное по сравнению с другими ЛПС снижение активности ферментов окислительного взрыва фагоцитов (как интактных, так и вакцинированных ЖТВ морских свинок), стимулированных препаратом ЛПС F. tulaгensisИ-163. ЛПС туляремийного микроба подвида novicida-like занимает промежуточное положение по степени влияния на функциональную активность фагоцитарноактивных клеток.

Таким образом, препараты ЛПС (в дозе 10 мкг/мл фагоцитов), выделенные водно-фенольным методом из штаммов F. tulaгensis разных подвидов, стимулируют кислородзависимую систему фагоцитов экспериментальных животных.

Полученные данные, на наш взгляд, имеют прогностическое значение для характеристики тяжести течения патологического процесса, вызванного F. tulaгensis, а также, возможно, для создания новых диагностических и профилактических средств.

О.С. Кравченко, В.В. Парфенова, О.Н. Павлова

АнтиБМотикорЕзистЕнтность БАСТЕрий родА ENTEROCOCCUS, изолированных из воды озера Байкал

Лимнологический институт СО РАН

Изучение возможного поступления бактерий рода ЕМегососс^ в озеро Байкал, их распространение и антибиотикорезистентность привлекает внимание, как с научной, так и с практической точки зрения. Это связано с тем, что в последние годы вода озера Байкал стала использоваться как источник получения питьевой бутилированной воды. Согласно литературным данным, в последние годы роль микроорганизмов, относящихся к роду ЕМегососсш, возросла не столько из-за их широкого распространения, сколько из-за приобретения ими устойчивости к подавляющему большинству доступных антибактериальных препаратов.

Целью данного исследования является изолирование энтерококков из разных районов озера и определение их антибиотикорезистентности в зависимости от экологических условий среды.

В результате проведенных исследований из воды озера Байкал было изолировано 120 штаммов, отнесенных к роду Е^егососс^. Нами изучена лекарственная устойчивость этих штаммов. Антибиотикорезистентность изучалась диско-диффузионным методом, с использованием 8 антибиотиков, как широкого спектра действия, так и с выраженной активностью по отношению к энтерококкам: стрептомицин, тетрациклин, ванкомицин, бензилпенициллин, ципрофлоксацин, эритромицин, гентамицин, рифампицин. Анализ материала проведен по трем группам: чувствительные, промежуточные и устойчивые (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004).

Результаты проведенного исследования в Южном Байкале показали, что выделенные штаммы проявляли наибольшую устойчивость к стрептомицину — 30 % и рифампицину — 22 %. Умеренночувствительную активность проявляли штаммы к циплофлакцину — 41 % и эритромицину — 49 %. Высокой чувствительностью характеризовались культуры энтерококков по отношению к гентамицину

— 89 %, рифампицину — 67 %, бензилпенницилину — 85 % и ванкомицину — 81 %.

В Среднем Байкале высокой чувствительностью характеризовались микроорганизмы по отношению к гентамицину — 94 %, ванкомицину — 86 %, тетрациклину — 75 %, бензилпенницилину — 83 % и рифампицину — 65 %. Выделенные культуры обладали наибольшей устойчивостью к рифампицину — 23 %, а промежуточной чувствительностью к стрептомицину — 23 %, эритромицину — 47 % и циплофлакцину

— 29 %.

Результаты тестирования на лекарственную устойчивость в Северном Байкале показали, что наибольшую устойчивость бактерии проявляли в отношении рифампицина — 33 % и бензилпеницилина

— 33 %, умеренно-чувствительную активность — к эритромицину — 78 %, ципрофлоксацину — 33 % и тетрациклину — 33 %, а наибольшую чувствительность — к гентамицину — 89 % штаммов, ванкомицину

— 78 % и стрептомицину — 78 %.

Проведенные эксперименты характеризуют данные микроорганизмы как антибиотикочувствительные. Бактерии, выделенные из разных районов Байкала, проявляли разную степень устойчивости к антимикробным препаратам, которая была значительно выше у бактерий, выделенных из литоральных областей Южного и Среднего Байкала.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям, гос. контракт № 02.512.11.2168.