СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
METHOD FOR PREPARING BIOLOGICALLY ACTIVE PREPARATION OF SKELETAL MUSCLES

Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии в сфере получения биологически активных средств, и может быть использовано в целях активации репаративных процессов при нарушении трофики и повреждений тканей опорно-двигательного аппарата.
Известны способы получения комплексов биологически активных веществ из различных тканей животных, когда с целью повышения выхода биологически активных продуктов используют органы и ткани животных, находящихся либо в стадии регенерации (Патент РФ №2041715), либо после физических воздействий (Патент РФ №2071335).
Однако в данных способах в качестве сырья не используются скелетные мышцы, хотя они более доступны в качестве объекта для выделения биологически активных веществ, а их масса по отношению к другим органам существенно больше.
В способе получения биологически активного карнозин-анзеринсодержащего комплекса, выделяемого из скелетных мышц (Патент РФ №2255758), обладающего антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, так же как и в двух выше указанных способах ничего не указано о биологически активных характеристиках препаратов по отношению к тканям опорно-двигательного аппарата (кость, мышца, нервы, сухожилия, сосуды).
Самым близким аналогом является способ получения супернатанта из скелетных мышц животных (Ерофеев С.А. и др. Биохимические исследования сыворотки крови и скелетных мышц при удлинении голени аппаратом Илизарова с темпом дистракции 3 мм в сутки в автоматическом режиме // Вестник новых медицинских технологий. 2005. Т.XII, №3-4. С.89-91). В данном способе в качестве сырья используют переднюю большеберцовую мышцу, взятую у собаки с удлиняемой конечности по методу Илизарова с режимом удлинения 1 мм в сутки за 4 приема, полученный материал растирают с кварцевым песком в 0,03М растворе KCl при 5-8°С до получения однородного гомогената, затем гомогенат центрифугируют в течение 10 минут при 14000g, полученный надосадок исследуют.
Задачей настоящего изобретения является разработка относительно простого способа получения из скелетных мышц композиции биологически активных веществ, обладающих биоактивными свойствами по отношению к тканям опорно-двигательного аппарата.
Указанная задача достигается тем, что делают забор материала животного с удлиняемой конечности по методу Илизарова, очищают, растирают его с кварцевым песком в 0,03 М растворе KCl - 1:9 соответственно в течение 5 минут, гомогенат центрифугируют в течение 11 минут, полученный надосадок фильтруют, замораживают при -70°С, лиофильно высушивают, стерилизуют.
Способ поясняют подробным описанием изготовления препарата и клиническими примерами его использования
Способ осуществляется следующим образом.
Переднюю большеберцовую мышцу (и/или длинный разгибатель пальцев), взятую у собаки с удлиняемой конечности на 14-е сутки удлинения по методу Илизарова с режимом удлинения 1 мм в сутки за 4 приема, сразу после забора очищают от остатков жировой и соединительной ткани. Далее материал отмывают от эритроцитов в 0,03М растворе KCl при 5-8°С, измельчают. Измельченную массу на холоду растирают с кварцевым песком в 0,03М растворе KCl при 5-8°С до получения однородного гомогената. Соотношение объемов ткань : экстрагирующий раствор (0,03М KCl) - 1:9. После 5 минут экстрагирования при 5-8°С гомогенат центрифугируют в течение 11 минут при 14000g. Полученный надосадок фильтруют через четыре слоя марли, замораживают при -70°С, лиофильно высушивают, стерилизуют.
Пример выполнения способа.
У экспериментального животного (собака №4590) проводили удлинение костей правой голени по методу Илизарова с режимом удлинения 1 мм в сутки за 4 приема. На 14-е сутки дистракции, после эвтаназии, у этого животного, с удлиняемой конечности была взята передняя большеберцовая мышца. Затем мышцу очистили от остатков жировой и соединительной ткани, отмыли от эритроцитов в 0,03М растворе KCl при 5-8°С, измельчили. Измельченную массу на холоду растерли с кварцевым песком в 0,03М растворе KCl (соотношение объемов ткань : экстрагирующий раствор - 1:9) до получения однородного гомогената. После 5 минут экстрагирования при 5-8°С гомогенат центрифугировали в течение 11 минут при 14000g. Полученный надосадок отфильтровали в пенициллиновые флаконы через четыре слоя марли. После замораживания при -70°С препарат лиофильно высушили, простерилизовали.
Оценка биологической активности препарата.
Пример 1. Полученный от животного №4590 препарат использовали для стимуляции репаративных процессов в тканях опорно-двигательного аппарата на модели удлинения костей голени с режимом удлинения 1,5 мм в сутки за 6 приемов. Препарат, из расчета 1 мг/кг массы тела, растворили в 5 мл физиологического раствора и вводили собаке №♂5035 на 10-е сутки удлинения внутримышечно по 1 мл в проксимальный и дистальный участок передней большеберцовой мышцы удлиняемого сегмента конечности и 1 мл в медиальную головку икроножной мышцы удлиняемого сегмента конечности. Для контроля, собаке №♂5069 на аналогичной модели, в аналогичные сроки, по той же схеме внутримышечно вводили аналогичный объем физиологического раствора.
Комплекс рентгенологических, физиологических, гистоморфологических и биохимических исследований обнаружил значительную активацию у животного №5035, относительно животного №5069, репаративных механизмов в тканях удлиняемого сегмента конечности. В частности, формирование полноценного костного регенерата у животного №5035 отмечалось на 19-е сутки фиксации, у №5069 - на 30-е. Кроме того, у собаки №5035 после введения препарата отмечалась заметная активация мио-, хондро-, остео- и ангиогенеза, уровень белка в скелетных мышцах удлиняемого сегмента был выше относительно животного №5069.
Пример 2. Полученный от животного №4590 препарат использовали для стимуляции процессов роста у крысят-отъемышей. Использовали 6 животных (самцы) из одного помета, из которых трем крысятам на 2-й, 4-й, 6-й неделе онтогенеза внутримышечно вводили 0,1 мл тестируемой композиции, приготовленной на физиологическом растворе из расчета 1 мг/кг массы тела. Трем другим крысятам в эти же сроки внутримышечно вводили 0,1 мл физиологического раствора. Средние значения прироста массы животных, которым вводили тестируемую композицию, были на 27,7% выше прироста массы тела животных, которым вводили физиологический раствор.
Предложенный способ прост в использовании и позволяет получать из доступного материала значительные количества биологический активных веществ, способных стимулировать ростковые и регенеративные процессы в тканях опорно-двигательного аппарата.