Способ оценки показателей окислительной модификации белков молока коров
METHOD FOR ESTIMATION OF COW MILK PROTEIN OXIDATIVE MODIFICATION INDICATORS

Изобретение относится к биологической химии, а именно к биохимии животных, и может быть использовано для определения выраженности карбонильного стресса при послеродовом эндометрите у коров.
Известен способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях, включающий определение количества карбонильных продуктов. Оценку степени окислительной модификации белков (ОМБ) в биологическом материале осуществляют при расчете площади под кривой спектра ОМБ, которая равна сумме площадей альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) нейтрального и основного характера:
-
где
-
-
[Патент №2524667 G01N 33/52, 27.07.2014].
Недостатком известного способа оценки является большой фактический материал, перегруженный числовыми значениями, что затрудняет оценку и анализ полученного материала.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ оценки показателей окислительной модификации белков молока крупного рогатого скота, включающий определение содержания карбонилированных белков по реакции взаимодействия окисленных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) и образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали спектрофотометрически при следующих длинах волн: 274, 356, 370, 430 и 530 нм. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 [Высокогорский В.Е. Сравнительная оценка показателей окислительной модификации белков молока крупного рогатого скота различных эколого-географических зон Омской области / В.Е. Высокогорский, Ю.А. Подольникова, О.Н. Лазарева // Фундаментальные исследования. - 2014. - №12, ч. 4. - С. 760-761].
Недостатком данного способа является высокая трудоемкость оценки.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является снижение трудоемкости оценки.
Технический результат достигается тем, что способ оценки показателей окислительной модификации белков молока коров, включающий определение содержания карбонилированных белков, оценку показателей осуществляют по коэффициенту интенсивности карбонильного стресса, который рассчитывают по формуле:
c
КДНФГ нейтр
КДНФГ осн
K=С/ С, где
c
K - коэффициент интенсивности карбонильного стресса;
КДНФГ нейтр
С - содержание кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера е.о.п./мл;
КДНФГ осн
С - содержание кетон-динитрофенилгидразонов основного характера е.о.п./мл;
c
причем K=1,5-1,9 свидетельствует о ранней стадии развития карбонильного стресса у коров;
c
K=2,0-3,4 свидетельствует об отсутствии карбонильного стресса у клинически здоровых коров;
c
K=3,5-4,5 свидетельствует о поздней стадии развития карбонильного стресса у коров.
Определение оценки показателей окислительной модификации белков молока коров по коэффициенту интенсивности карбонильного стресса снижает трудоемкость оценки показателей за счет определения меньшего количества показателей.
При остром и хроническом эндометрите увеличивается содержание кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера. Однако при остром эндометрите возрастает количество кетон-динитрофенилгидразонов основного характера, при хроническом эндометрите значительно увеличивается содержание кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера. Вышеуказанные изменения влияют на коэффициент интенсивности карбонильного стресса, что позволяет быстро оценить степень окислительной модификации белков молока коров, т.е. снижает трудоемкость при оценке показателей окислительной модификации белков.
Исследовали 3 группы коров по 25 в каждой группе. Первая группа - коровы с острым послеродовым эндометритом; вторая группа - коровы клинически здоровые животные; третья группа - коровы с хроническим послеродовым эндометритом.
В основе способа определения продуктов окислительной модификации белков лежит метод R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой. Способ оценки показателей окислительной модификации белков молока коров осуществляют следующим образом.
Берут пробы молока у каждой коровы от всех трех групп коров и исследуют следующим образом. Исследуемое молоко от коров первой группы (с острым послеродовым эндометритом) в количестве 0,2 мл вносят в пробирку и разводят добавлением 0,6 мл дистиллированной воды. Затем в 2 другие пробирки вносят по 0,2 мл разведенного молока и добавляют 1,8 мл 20% ТХУ кислоты. В одну из пробирок - опытную, добавляют 2 мл 0,1 М 2,4-ДНФГ, растворенного в 2 М растворе HCl, а в другую - контрольную - 2 мл 2М HCl без 2,4-ДНФГ. Осуществляют инкубацию при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы обеих пробирок центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об/мин.
Надосадочную жидкость сливают, осадок трижды промывают смесью этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и остатка 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Отмытый осадок подсушивают с целью удаления остатков этанол-этилацетата. К подсушенному осадку добавляют по 5 мл 8М мочевины и выдерживают 5 мин в кипящей бане до полного растворения осадка.
КДНФГ нейтр
КДНФГ осн
Производят замер оптической плотности опытной пробы против контрольной пробы при длинах волн: 370, 530 нм в кварцевых кюветах с толщиной оптического слоя 1 см. Определяют С - содержание кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера, е.о.п.; С - содержание кетон-динитрофенилгидразонов основного характера, е.о.п.
Рассчитывают коэффициент интенсивности карбонильного стресса по формуле:
c
КДНФГ нейтр
КДНФГ осн
K=С/ С, где
c
K - коэффициент интенсивности карбонильного стресса;
КДНФГ нейтр
С - содержание кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера, е.о.п./мл;
КДНФГ осн
С - содержание кетон-динитрофенилгидразонов основного характера, е.о.п./мл.
Коэффициент интенсивности карбонильного стресса во всех пробах молока от коров первой группы оказался в диапазоне 1,5-1,9, что свидетельствует о ранней стадии развития карбонильного стресса у коров.
Пробы молока от коров второй группы (клинически здоровые коровы) исследуют аналогично пробам молока первой группы коров. Коэффициент интенсивности карбонильного стресса во всех пробах молока от коров второй группы оказался в диапазоне 2,0-3,4, что свидетельствует об отсутствии карбонильного стресса у клинически здоровых коров.
Пробы молока от коров третьей группы (с хроническим послеродовым эндометритом) исследуют аналогично пробам молока первой группы коров. Коэффициент интенсивности карбонильного стресса во всех пробах молока от коров из второй группы оказался в диапазоне 3,5-4,5, что свидетельствует о поздней стадии развития карбонильного стресса у коров.
Предлагаемый способ оценки показателей окислительной модификации белков молока коров обеспечивает сокращение трудоемкости оценки за счет необходимости для расчета коэффициента интенсивности карбонильного стресса определять меньшее количество показателей. Трудоемкость проведения оценки предлагаемым способом снижается на 60%.
Способ оценки показателей окислительной модификации белков молока коров апробирован в лаборатории кафедры продуктов питания и пищевой биотехнологии ФГБОУ ВО Омский ГАУ.
Заявляемый способ прост и экономичен в осуществлении. Расчет коэффициента интенсивности карбонильного стресса позволяет выявить глубокие нарушения соотношений производных аминокислот нейтрального и основного характера, что повышает информативную ценность лабораторного исследования.
Заявляемый способ оценки показателей окислительной модификации белков молока коров может быть использован в ветеринарной лабораторной диагностике для определения стадии развития карбонильного стресса при послеродовом эндометрите и коррекции лечения и рациона питания коров.