ЭКСПРЕССИЯ НОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ МЕТОК
EXPRESSION OF NEW CELL MARKS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/516639, поданной 7 июня 2017 г., которая настоящим полностью включена посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который предоставляется в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 30 мая 2018 г., названа 50471-708_601_SL.txt и имеет размер 464445 байт.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Разные виды клеточной терапии являются перспективными для лечения заболеваний, которые не поддаются надлежащему лечению с применением обычных фармацевтических средств. Переливания крови представляли собой первый тип клеточной терапии для лечения гематологических злокачественных новообразований. Недавние достижения технологий выделения и индукции клеток, а также переноса генов позволили генетически модифицировать различные типы клеток (первичные и иммортализованные) для лечения различных заболеваний, например, рака, сердечнососудистых, дерматологических, неврологических и офтальмологических заболеваний. Во многих случаях очень важным является обогащение генетически модифицированного продукта для клеточной терапии для достижения необходимой чистоты, чтобы обеспечить размножение отобранных клеток, представляющих терапевтический интерес, и/или удаление не модифицированных генетически или других типов клеток перед инфузией у пациентов. Кроме того, адоптивная клеточная иммунотерапия с применением, например, цитокинов, химерных антигенных рецепторов (CAR) и Т-клеточных рецепторов (TCR) оказалась очень перспективной в отношении успешного непосредственного уничтожения опухолевых клеток. Несмотря на то, что эта инновационная технология является многообещающей, введение модифицированных иммунных клеток индивидуумам с опухолями сопряжено с некоторыми проблемами для безопасности, например, токсичностью, лизисом опухоли и синдромом высвобождения цитокинов (т.е. «цитокиновой бурей») в случае терапии CAR-T-клетками. Для того чтобы в полной мере воспользоваться терапевтическим потенциалом, который обеспечивают методики адоптивной Т-клеточной иммунотерапии, во время терапии необходимо контролировать побочные эффекты, такие как «цитокиновая буря».
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[0004] Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в этом описании, включены в настоящую заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была конкретно и индивидуально указана для включения посредством ссылки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Согласно настоящему изобретению предложены полипептидные конструкции и полинуклеотиды, которые можно экспрессировать в клетках для устранения одного или более из указанных выше недостатков.
[0006] Предложена полипептидная конструкция и полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, причем указанная полипептидная конструкция содержит усеченный вариант природного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция может дополнительно содержать трансмембранный домен или его фрагмент, сигнальный пептид и/или пептидный линкер. Согласно настоящему изобретению также предложены модифицированные клетки, экспрессирующие полинуклеотиды и полипептидные конструкции. Модифицированные клетки могут экспрессировать полипептидные конструкции на поверхности клетки, что обеспечивает клеточный маркер (или «клеточную метку»), которая согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения однозначно идентифицирует модифицированные клетки.
[0007] Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена полипептидная конструкция и полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, причем указанная полипептидная конструкция содержит усеченный вариант природного полипептида и трансмембранный домен. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения усеченный вариант содержит внеклеточный домен или его часть и трансмембранный домен или его часть. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция может содержать трансмембранный домен и усеченный вариант, происходящие из разных природных белков. В некоторых случаях усеченный вариант трансмембранного домена полипептидной конструкции представляет собой однопроходный трансмембранный домен. В других случаях трансмембранный домен полипептидной конструкции представляет собой многопроходный трансмембранный домен.
[0008] Согласно настоящему изобретению предложена полипептидная конструкция и полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, причем указанная полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен димеризации, который может связывать полипептид клеточной поверхности (например, усеченный вариант, гибридизованный с трансмембранным доменом) на поверхности клетки со вторым полипептидом клеточной поверхности. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения связывание полипептидов клеточной поверхности за счет трансмембранного домена димеризации может усиливать сигнал, происходящий от полипептидов клеточной поверхности, в сравнении с недимеризованной конфигурацией.
[0009] Согласно настоящему изобретению также предложена полипептидная конструкция и полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, причем указанная полипептидная конструкция содержит домены или их фрагменты, которые происходят из различных природных белков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать усеченный вариант природного полипептида, трансмембранный домен, необязательный пептидный линкер, соединяющий усеченный вариант с трансмембранным доменом, и сигнальный пептид, направляющий полипептидную конструкцию к поверхности клетки. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит усеченный вариант или его фрагмент, который происходит из природного белка, отличного от трансмембранного домена или его фрагмента, гибридизованного, непосредственно или косвенно, с усеченным вариантом или его фрагментом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конкретный домен (например, внеклеточный домен) полипептидной конструкции, описанной в настоящей заявке, является химерным и содержит аминокислотные последовательности, происходящие из различных природных белков.
[00010] В некоторых случаях предложены способы и композиции, содержащие полипептидную конструкцию, содержащую полипептид клеточной поверхности и трансмембранный домен димеризации, причем указанный трансмембранный домен димеризации индуцирует димеризацию полипептида клеточной поверхности, и полипептид клеточной поверхности связывает предварительно определенное антитело или его вариант или фрагмент. Согласно настоящему изобретению также предложены полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке.
[00011] Согласно настоящему изобретению предложены способы и композиции, содержащие клеточные метки, которые включают усеченные варианты полипептидов, таких как HER1, CD20, LNGFR и CD52. В некоторых случаях усеченные варианты полипептидов не связывают эндогенный рецептор. Раскрытые усеченные неиммуногенные полипептиды можно применять в качестве клеточных меток, например, в качестве клеточного маркера, маркера истощения или метки для уничтожения.
[00012] Согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие модифицированные клетки, которые экспрессируют полипептидные конструкции или полинуклеотиды, описанные в настоящей заявке. В некоторых случаях модифицированные клетки дополнительно экспрессируют по меньшей мере одно из: химерного антигенного рецептора (CAR), Т-клеточного рецептора (TCR) и/или цитокина.
[00013] Согласно настоящему изобретению предложены способы регулирования активности генетически модифицированных клеток у субъекта (например, проходящего иммунотерапию), включающие обеспечение субъекту генетически модифицированных клеток, кодирующих полинуклеотидную конструкцию, раскрытую в настоящей заявке, а также обеспечение субъекту предварительно определенного партнера по связыванию, который связывает клетки и регулирует их активность. Также предложены системы и наборы для применения в указанных способах.
[00014] Предложена полипептидная конструкция, содержащая поли пептид клеточной поверхности и трансмембранный домен димеризации, причем указанный трансмембранный домен димеризации индуцирует димеризацию указанного полипептида клеточной поверхности, и при этом указанный полипептид клеточной поверхности связывает предварительно определенное антитело или его вариант или фрагмент.
[00015] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид клеточной поверхности содержит по меньшей мере одно из: полипептида HER1, полипептида LNGFR, полипептида CD20 и полипептида CD52. В некоторых случаях указанный полипептид клеточной поверхности содержит полипептид HER1, и указанный полипептид HER1 содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 211, 212, 213, 214, 215, 216 или 217. В некоторых случаях указанный полипептид HER1 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 211, 212, 213, 214, 215, 216 или 217.
[00016] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид клеточной поверхности содержит полипептид CD20, и указанный полипептид CD20 содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 или SEQ ID NO: 220. В некоторых случаях указанный полипептид CD20 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 или SEQ ID NO: 220.
[00017] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид клеточной поверхности содержит полипептид LNGFR, и указанный полипептид LNGFR содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158 или SEQ ID NO: 160. В некоторых случаях указанный полипептид клеточной поверхности содержит полипептид LNGFR, и указанный полипептид LNGFR содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158 или SEQ ID NO: 160.
[00018] В некоторых случаях указанный полипептид клеточной поверхности не связывает эндогенный рецептор. В некоторых случаях указанный трансмембранный домен димеризации может образовывать либо гомодимер, либо гетеродимер с комплементарным доменом димеризации. В некоторых случаях указанный трансмембранный домен димеризации содержит по меньшей мере один остаток цистеина. В некоторых вариантах указанный трансмембранный домен димеризации содержит трансмембранный домен гликофорина А или его фрагмент или вариант, химерный трансмембранный домен гликофорина А-интегрина (33 или его фрагмент или вариант или трансмембранный домен CD3-дзета. В некоторых случаях такой полипептид клеточной поверхности содержит по меньшей мере полипептид HER1.
[00019] В некоторых случаях указанная полипептидная конструкция экспрессируется в модифицированной клетке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная модифицированная клетка представляет собой клетку животного. В некоторых случаях указанная клетка животного представляет собой клетку человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная клетка человека представляет собой Т-клетку или NK-клетку. В некоторых случаях указанная модифицированная клетка дополнительно содержит транспозазу Sleeping Beauty.
[00020] В некоторых случаях указанная модифицированная клетка дополнительно экспрессирует по меньшей мере один дополнительный экзогенный полипептид. В некоторых случаях указанная модифицированная клетка дополнительно экспрессирует по меньшей мере один экзогенный рецепторный полипептид или его фрагмент. В некоторых случаях указанная модифицированная клетка дополнительно экспрессирует по меньшей мере одно из: химерного антигенного рецептора (CAR), Т-кпеточного рецептора (TCR) и цитокина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная модифицированная клетка дополнительно экспрессирует по меньшей мере один CAR, и при этом указанный CAR связывает по меньшей мере одно из: CD19, CD33, ВСМА, CD44, α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 и VEGF-R2.
[00021] В некоторых случаях указанная модифицированная клетка дополнительно экспрессирует по меньшей мере один рекомбинантный цитокин. В некоторых случаях указанный рекомбинантный цитокин содержит по меньшей мере одно из: ИЛ-15, mbИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-21. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная полипептидная конструкция кодируется полинуклеотидом, встроенным в указанную модифицированную клетку с помощью редактирования генома. В некоторых случаях указанное редактирование генома включает применение по меньшей мере системы сайт-специфичной сериновой рекомбиназы. В некоторых случаях указанная полипептидная конструкция содержит линкер, который гибридизует указанный полипептид клеточной поверхности с указанным трансмембранным доменом димеризации. В некоторых случаях гомодимер или гетеродимер полипептида содержит полипептидную конструкцию.
[00022] Предложен полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, содержащую неиммуногенный полипептид клеточной поверхности, гибридизованный с трансмембранным доменом димеризации, причем указанный трансмембранный домен димеризации индуцирует димеризацию указанного полипептида клеточной поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид клеточной поверхности не связывает эндогенный рецептор. В некоторых случаях указанный полипептид клеточной поверхности не обладает какими-либо эндогенными сигнальными или транспортными функциями.
[00023] В некоторых случаях указанный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую по меньшей мере один гетерологичный ген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один гетерологичный ген модулируется с помощью индуцируемого промотора. В некоторых случаях указанный по меньшей мере один гетерологичный ген содержит по меньшей мере одно из: химерного антигенного рецептора (CAR), Т-клеточного рецептора (TCR) и цитокина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один гетерологичный ген содержит указанный CAR, и при этом указанный CAR связывает по меньшей мере одно из: CD19, CD33, ВСМА, CD44, α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 и VEGF-R2.
[00024] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один гетерологичный ген содержит цитокин. В некоторых случаях указанный цитокин содержит по меньшей мере одно из: ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21 и гибрида ИЛ-15 и ИЛ-15Rα. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный цитокин находится в секретируемой форме. В некоторых случаях указанный цитокин находится в связанной с мембраной форме.
[00025] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, содержащую полипептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из линкера 2А, GSG-2A, ликера GSG (SEQ ID NO: 16), линкера SGSG (SEQ ID NO: 18), furinlink, их вариантов и производных. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный линкер 2А представляет собой линкер р2А, линкер Т2А, линкер F2A или линкер Е2А.
[00026] В некоторых случаях указанная полипептидная конструкция действует как метка для обогащения клеток, отбора клеток или индукции гибели клеток в клетках, экспрессирующих указанную молекулу клеточной поверхности. В некоторых случаях указанный полипептид клеточной поверхности содержит по меньшей мере одно из: полипептида HER1, полипептида LNGFR, полипептида CD20 и полипептида CD52. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный трансмембранный домен димеризации содержит трансмембранный домен гликофорина А или его фрагмент или вариант, химерный трансмембранный домен гликофорина А-интегрина β3 или его фрагмент или вариант или трансмембранный домен CD3-дзета.
[00027] В некоторых случаях вектор содержит полинуклеотид. В некоторых случаях указанный вектор представляет собой лентивирусный вектор, ретровирусный вектор или невирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения невирусный вектор представляет собой транспозон Sleeping Beauty. В некоторых случаях указанный полинуклеотид встраивают в модифицированную клетку с помощью редактирования генома. В некоторых случаях указанное редактирование генома включает применение по меньшей мере системы сайт-специфичной сериновой рекомбиназы.
[00028] Предложен способ регулирования активности генетически модифицированных клеток у субъекта, включающий: обеспечение указанному субъекту некоторого количества генетически модифицированных клеток, кодирующих полипептидную конструкцию, содержащую полипептид клеточной поверхности, гибридизованный с трансмембранным доменом димеризации, причем указанный трансмембранный домен димеризации индуцирует димеризацию указанного полипептида клеточной поверхности, и при этом указанный полипептид клеточной поверхности связывает предварительно определенного партнера по связыванию или его вариант или фрагмент; и обеспечение указанному субъекту указанного предварительно определенного партнера по связыванию в количестве, достаточном для связывания и регуляции тем самым активности указанных генетически модифицированных клеток.
[00029] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид клеточной поверхности представляет собой неиммуногенный полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид клеточной поверхности содержит по меньшей мере одно из: полипептида HER1, полипептида LNGFR, полипептида CD20 и полипептида CD52. В некоторых случаях указанный полипептид клеточной поверхности не связывает эндогенный рецептор. В некоторых случаях указанный трансмембранный домен димеризации может образовывать либо гомодимер, либо гетеродимер с комплементарным доменом димеризации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный трансмембранный домен димеризации содержит по меньшей мере один остаток цистеина. В некоторых случаях указанный трансмембранный домен димеризации содержит трансмембранный домен гликофорина А или его фрагмент или вариант, химерный трансмембранный домен гликофорина А-интегрина β3 или его фрагмент или вариант, или трансмембранный домен CD3-дзета.
[00030] В некоторых случаях указанный партнер по связыванию включает антитело или его область, связывающую полипептид клеточной поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит по меньшей мере одно из: моноклонального антитела, scFv, scFab, диатела и антитела верблюдовых. В некоторых случаях указанное антитело включает по меньшей мере одно из: ритуксимаба, цетуксимаба, алемтузумаба, панитумумаба и нецитумумаба.
[00031] В некоторых случаях указанные генетически модифицированные клетки содержат по меньшей мере одно из: Т-кпеток и NK-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна из указанных генетически модифицированных клеток дополнительно экспрессирует по меньшей мере один дополнительный экзогенный полипептид. В некоторых случаях по меньшей мере одна из указанных генетически модифицированных клеток дополнительно экспрессирует по меньшей мере одно из: химерного антигенного рецептора (CAR), Т-клеточного рецептора (TCR) и цитокина. В некоторых случаях по меньшей мере одна из указанных генетически модифицированных клеток дополнительно экспрессирует по меньшей мере один CAR, и при этом указанный CAR связывает по меньшей мере одно из: CD19, CD33, ВСМА, CD44, α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PS MA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 и VEGF-R2.
[00032] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна из указанных генетически модифицированных клеток дополнительно экспрессирует по меньшей мере один рекомбинантный цитокин. В некоторых случаях указанный рекомбинантный цитокин содержит по меньшей мере одно из: ИЛ-15, mbИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-21. В некоторых случаях указанный предварительно определенный партнер по связыванию обеспечен в количестве, достаточном для того чтобы вызвать уменьшение по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с цитокиновой бурей или системным воспалительным ответом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный предварительно определенный партнер по связыванию обеспечен в количестве, достаточном для того чтобы вызвать уменьшение по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с синдромом лизиса опухоли. В некоторых случаях указанная полипептидная конструкция кодируется полинуклеотидом, встроенным в указанные модифицированные клетки с помощью редактирования генома. В некоторых случаях указанное редактирование генома включает применение по меньшей мере системы сайт-специфичной сериновой рекомбиназы.
[00033] Предложен полинукпеотид, кодирующий усеченный неиммуногенный полипептид CD20, который связывает антитело к CD20, причем указанный усеченный неиммуногенный полипептид CD20 не связывает эндогенный рецептор.
[00034] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид CD20 содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 109. В некоторых случаях указанный полипептид CD20 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность SEQ ID NO: 109. В некоторых случаях указанный полипептид CD20 связывает указанное антитело к CD20 с эффективностью связывания, которая составляет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от эффективности связывания нативного CD20. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанное антитело к CD20 включает по меньшей мере одно из: ритуксимаба, цетуксимаба, тозитумомаба, велтузумаба, афутузумаба, блонтуветмаба и обинутузумаба.
[00035] Предложен полинуклеотид, кодирующий усеченный неиммуногенный полипептид HER1, состоящий по меньшей мере из домена III HER1 или его фрагмента и усеченного домена IV HER1, причем указанный полипептид HER1 связывает антитело к HER1, и при этом указанный полипептид HER1 экспрессируется в модифицированной клетке.
[00036] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный усеченный домен IV HER1 содержит усечение по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% указанного домена IV HER1.
[00037] В некоторых случаях указанный усеченный домен IV HER1 содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 203, 204, 205, 206, 207, 208 или 209. В некоторых случаях указанный усеченный домен IV HER1 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 203, 204, 205, 206, 207, 208 или 209. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный домен III HER1 или его фрагмент содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 200. В некоторых случаях указанный домен III HER1 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 200.
[00038] В некоторых случаях указанный полинуклеотид дополнительно кодирует трансмембранный домен CD28 и пептидный линкер для связывания указанного полипептида HER1 с указанным трансмембранным доменом CD28. В некоторых случаях указанный полинуклеотид кодирует полипептидную конструкцию, содержащую полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанное антитело к HER1 включает по меньшей мере одно из: ритуксимаба, цетуксимаба, футуксимаба, депатуксизумаба, имгатузумаба, лапритуксимаба, матузумаба, нецитумумаба, нимотузумаба, панитумумаба и залутумумаба.
[00039] Предложен полинуклеотид, кодирующий усеченный неиммуногенный полипептид CD52, который связывает антитело к CD52, причем указанный усеченный неиммуногенный полипептид CD52 не связывает эндогенный рецептор, и при этом указанный неиммуногенный полипептид CD52 экспрессируется в модифицированной клетке.
[00040] В некоторых случаях указанный полипептид CD52 содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 143. В некоторых случаях указанный полипептид CD52 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 143.
[00041] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид экспрессируется в клетке, дополнительно содержащей по меньшей мере одну последовательность, кодирующую по меньшей мере один гетерологичный ген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один гетерологичный ген модулируется с помощью индуцируемого промотора. В некоторых случаях указанный по меньшей мере один гетерологичный ген содержит по меньшей мере одно из: химерного антигенного рецептора (CAR), Т-клеточного рецептора (TCR) и цитокина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один гетерологичный ген содержит CAR, и при этом указанный CAR связывает по меньшей мере одно из: CD19, CD33, ВСМА, CD44, α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PS MA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 и VEGF-R2.
[00042] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один гетерологичный ген содержит цитокин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный цитокин содержит по меньшей мере одно из: ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21 и гибрида ИЛ-15 и ИЛ-15Rα. В некоторых случаях указанный цитокин находится в секретируемой форме. В некоторых случаях указанный цитокин находится в связанной с мембраной форме.
[00043] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор содержит указанный полинуклеотид. В некоторых случаях указанный вектор представляет собой лентивирусный вектор, ретровирусный вектор или невирусный вектор. В некоторых случаях указанный невирусный вектор представляет собой транспозон Sleeping Beauty. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полинуклеотид встраивают в модифицированную клетку с помощью редактирования генома. В некоторых случаях указанное редактирование генома включает применение по меньшей мере системы сайт-специфичной сериновой рекомбиназы. В некоторых случаях модифицированная клетка кодирует полинуклеотид. В некоторых случаях модифицированная клетка представляет собой Т-клетку или NK-клетку. В некоторых случаях полинуклеотид кодирует полипептид.
[00044] Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения рака, включающий введение субъекту эффективного количества модифицированной клетки, содержащей полинуклеотид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного партнера по связыванию, способного связываться с полипептидом, экспрессированным на указанной модифицированной клетке. В некоторых случаях указанный партнер по связыванию представляет собой антитело.
[00045] Согласно настоящему изобретению предложен способ регулирования активности генетически модифицированных клеток у субъекта, включающий обеспечение указанному субъекту некоторого количества генетически модифицированных клеток, кодирующих полипептидную конструкцию, содержащую полипептид клеточной поверхности, который представляет собой химерный полипептид, содержащий первый усеченный неиммуногенный полипептид и второй усеченный неиммуногенный полипептид, и при этом указанный полипептид клеточной поверхности связывает по меньшей мере одного предварительно определенного партнера по связыванию или его вариант или фрагмент; и обеспечение указанному субъекту указанного предварительно определенного партнера по связыванию в количестве, достаточном для связывания и регуляции тем самым активности указанных генетически модифицированных клеток.
[00046] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный первый усеченный неиммуногенный полипептид содержит фрагмент или производное члена семейства EGFR. В некоторых случаях указанный второй усеченный неиммуногенный полипептид содержит фрагмент или производное члена семейства EGFR. В некоторых случаях указанный первый усеченный неиммуногенный полипептид содержит полипептид HER1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид HER1 содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 211, 212, 213, 214, 215, 216 или 217. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид HER1 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 211, 212, 213, 214, 215, 216 или 217. В некоторых случаях указанный полипептид HER1 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 211.
[00047] В некоторых случаях указанный второй усеченный неиммуногенный полипептид содержит по меньшей мере одно из: полипептида HER2, полипептида ErbB3 и полипептида ErbB4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная полипептидная конструкция содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101 или SEQ ID NO: 105.
[00048] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один предварительно определенный партнер по связыванию связывает указанный полипептид HER1. В некоторых случаях указанный по меньшей мере один предварительно определенный партнер по связыванию включает по меньшей мере одно из: ритуксимаба, цетуксимаба, футуксимаба, депатуксизумаба, имгатузумаба, лапритуксимаба, матузумаба, нецитумумаба, нимотузумаба, панитумумаба и залутумумаба. В некоторых случаях указанный по меньшей мере один предварительно определенный партнер по связыванию дополнительно содержит второго предварительно определенного партнера по связыванию, который связывает указанный второй усеченный неиммуногенный полипептид. В некоторых случаях указанный второй усеченный неиммуногенный полипептид представляет собой полипептид HER2, а указанный второй предварительно определенный партнер по связыванию представляет собой пертузумаб.
[00049] В некоторых случаях указанная полипептидная конструкция дополнительно содержит сигнальный пептид. В некоторых случаях указанная полипептидная конструкция дополнительно содержит трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный трансмембранный домен содержит трансмембранный домен димеризации. В некоторых случаях указанный трансмембранный домен димеризации содержит трансмембранный домен гликофорина А, химерный трансмембранный домен гликофорина А-интегрина β3 или трансмембранный домен CD3-дзета. В некоторых случаях указанный трансмембранный домен димеризации содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 32. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный трансмембранный домен димеризации содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 32.
[00050] В некоторых случаях указанный первый усеченный неиммуногенный полипептид содержит полипептид CD20. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный полипептид CD20 содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 или SEQ ID NO: 220. В некоторых случаях указанный полипептид CD20 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 или SEQ ID NO: 220. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один предварительно определенный партнер по связыванию содержит по меньшей мере одно из: ритуксимаба, тозитумомаба, велтузумаба, афутузумаба, блонтуветмаба и обинутузумаба.
[00051] Предложена полипептидная конструкция, содержащая усеченный неиммуногенный полипептид HER1, состоящий из домена III HER1 и усеченного домена IV HER1, причем указанный полипептид HER1 связывает антитело к HER1; трансмембранный домен CD28; и пептидный линкер для связывания указанного полипептида HER1 с указанным трансмембранным доменом CD28; при этом указанная полипептидная конструкция экспрессируется в модифицированной клетке.
[00052] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный домен III HER1 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 200, и указанный домен IV HER1 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 203. В некоторых случаях указанный трансмембранный домен CD28 содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, и указанный пептидный линкер содержит пептидный линкер G4S (SEQ ID NO: 221). В некоторых случаях указанный пептидный линкер G4S (SEQ ID NO: 221) содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная полипептидная конструкция содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57.
[00053] В некоторых случаях указанное антитело к HER1 включает по меньшей мере одно из: ритуксимаба, цетуксимаба, футуксимаба, депатуксизумаба, имгатузумаба, лапритуксимаба, матузумаба, нецитумумаба, нимотузумаба, панитумумаба и залутумумаба.
[00054] Предложена полипептидная конструкция, содержащая усеченный неиммуногенный полипептид CD20, причем указанный полипептид CD20 связывает антитело к CD20; при этом указанная полипептидная конструкция экспрессируется в модифицированной клетке.
[00055] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная полипептидная конструкция по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 109. В некоторых случаях указанная полипептидная конструкция содержит полипептидную последовательность, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109. В некоторых случаях указанное антитело KCD20 содержит по меньшей мере одно из: ритуксимаба, тозитумомаба, велтузумаба, афутузумаба, блонтуветмаба и обинутузумаба.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[00056] Признаки настоящего изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Признаки и преимущества настоящего изобретения будут более понятны с помощью ссылки на следующее подробное описание, в котором изложены иллюстративные варианты реализации, в которых применяются принципы настоящего изобретения, и прилагаемые чертежи на которых:
[00057] На ФИГ. 1 показаны уровни экспрессии полноразмерной клеточной метки CD20 (соответствующей SEQ ID NO: 107) и двух форм усеченного CD20 (CD20t1, соответствующий SEQ ID NO: 109, и CD20t4, соответствующий SEQ ID NO: 115) в клетках HEK-293Т, согласно результатам детектирования методом проточной цитометрии с применением ритуксимаба, по сравнению с контрольной клеточной меткой. Заштрихованные области обозначают ложно-трансфецированные контрольные клетки, тогда как незаштрихованные области обозначают экспрессию клеточных меток из трансфецированных клеток. Каждую трансфекцию выполняли стремя повторами.
[00058] На ФИГ. 2 показана совместная экспрессия клеточной метки CD20t1 (соответствующей SEQ ID NO: 109; ось у) и химерного антигенного рецептора (CAR; ось х) в мононуклеарных клетках периферической крови человека (МКПК), совместно трансфецированных транспозонными векторами Sleeping Beauty, кодирующими оба гена (правая панель), по сравнению с нетрансфецированными клетками (левая панель).
[00059] На ФИГ. 3 показана специфичная дозозависимая антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ) (представленная как относительная индукция; ось у), индуцированная ритуксимабом в клеточной линии Jurkat, трансфецированной CD20t-1. Нетрансфецированные исходные клетки Jurkat и неспецифичное антитело цетуксимаб не проявляли активность.
[00060] На ФИГ. 4А представлена схематическая диаграмма, иллюстрирующая варианты реализации полипептидной конструкции, описанной в настоящей заявке. На верхней панели показан вариант реализации полипептидной конструкции, содержащей сигнальный пептид для направления полипептидной конструкции к клеточной поверхности, усеченный вариант природного полипептида, необязательный линкер и трансмембранный (ТМ) домен. Нижняя панель иллюстрирует вариант реализации полипептидной конструкции, экспрессируемой в модифицированной клетке, описанной в настоящей заявке. Полипептидная конструкция присоединена к клеточной поверхности трансмембранным (ТМ) доменом, который гибридизован с усеченным вариантом, ориентированным во внеклеточное пространство, с помощью необязательного пептидного линкера. В показанном варианте реализации линкер служит в качестве удлинителя, чтобы направить и отдалить усеченный вариант от клеточной поверхности, оптимизируя таким образом связывание антитела или партнера по связыванию (представленного антителом к усеченному варианту) с эпитопом усеченного варианта.
[00061] На ФИГ. 4В представлена схематическая диаграмма, иллюстрирующая вариант реализации полипептидной конструкции, описанной в настоящей заявке. Усеченный вариант и необязательный линкер на ФИГ. 4А заменены на ФИГ. 4b доменом III HER(m) и доменом IV HER(n), где m и n представляют любого члена семейства EGFR/HER, включая HER1, HER2, ErbB3 и ErbB4 (т.е. m=1-4 и n=1-4, но n≠м). В показанном варианте реализации каждый из домена III HER(m) и домена IV HER(n) представляет разные эпитопы, которые распознаются разными антителами (т.е. антителами к HER(m) и HER(n), соответственно).
[00062] На ФИГ. 4С представлена схематическая диаграмма, иллюстрирующая конкретный вариант реализации, в котором домен III HER(m) на ФИГ. 4В соответствует домену III EGFR, распознаваемому антителом к EGFR, который гибридизован на С-конце с доменом IV либо HER2, либо ErbB3, либо ErbB4, за которым следует домен ТМ.
[00063] На ФИГ. 4D показана экспрессия усеченного полипептида HER1 (HER1t), экспрессированного в донорских МКПК человека, трансфецированных различными химерами EGFR-Erb4 (усеченный EGFR-ErbB4 (JM-a), соответствующий SEQ ID NO: 101, и усеченный EGFR-ErbB4 (JM-b), соответствующий SEQ ID NO: 105) и окрашенных с применением антитела к HER1t («окрашивание») по сравнению с контролем изотипа («изотип») и контрольными клетками, которые не были трансфецированы HER1t.
[00064] На ФИГ. 4Е показана экспрессия полипептида HER1t в донорских МКПК человека, трансфецированных различными вариантами HER1t (HER1t1, соответствующий SEQ ID NO: 57, HER1t2, соответствующий SEQ ID NO: 59, HER1t3, соответствующий SEQ ID NO: 61, HER1t4, соответствующий SEQ ID NO: 63, HER1t5, соответствующий SEQ ID NO: 65, HER1t6, соответствующий SEQ ID NO: 67, и HER1t7, соответствующий SEQ ID NO: 69), по сравнению с контрольными клетками, которые не были трансфецированы HER1t.
[00065] На ФИГ. 5А показано детектирование на основе антител экспрессии HER1t1 (соответствующий SEQ ID NO: 57; ось у) и экспрессии CAR (ось х), измеренной методом проточной цитометрии в клетках, совместно трансфецированных лентивирусным вектором, кодирующим оба белка (правая панель), по сравнению с контрольными клетками, не трансфецированными HER1t или CAR (левая панель).
[00066] На ФИГ. 5В показаны уровни HER1t1 (соответствующий SEQ ID NO: 57; ось у) и CAR (ось х) в клетках, трансфецированных транспозонными векторами Sleeping Beauty, кодирующими только CAR (левая панель) и CAR вместе с HER1t1 (правая панель), и окрашенных антителом к HER1 и CAR-специфичными белками (нижняя панель), по сравнению с контролем изотипа (верхняя панель).
[00067] На ФИГ. 6 показана активность АЗКЦ, опосредуемая цетуксимабом и алемтузумабом (выраженная как % специфичного уничтожения; ось у) в NK-клетках (слева), CD16-NK-клетках (в центре) и CD16 NK-клетках, трансфецированных CAR и HER1t1 (справа). Цетуксимаб проявил специфичную АЗКЦ в присутствии HER1t1.
[00068] На ФИГ. 7А показана экспрессия CAR и клеточной метки HER1t1 (соответствующей SEQ ID NO: 57), измеренная методом проточной цитометрии в генетически модифицированной репортерной линии клеток SUP-T1 (SUP-T1/CAR-HER1t1). Линия клеток SUP-T1/CAR-HER1t1 была отсортирована с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) для обогащения по высокому (средняя панель) или среднему (правая панель) уровню экспрессии HER1t1, согласно результатам детектирования методом проточной цитометрии. На левой панели показано окрашивание SUP-T1/CAR-HER1t1 с применением антитела для контроля изотипа для проточной цитометрии. На ФИГ. 7В показана специфичная АЗКЦ (представленная как относительная индукция; ось у) клеточной линии SUP-T1/CAR-HER1t1, индуцированная цетуксимабом, которая зависит от экспрессии HER1t1, а также от уровней дозы цетуксимаба. Неспецифичное антитело ритуксимаб не проявило АЗКЦ SUP-T1/CAR-HER1H.
[00069] На ФИГ. 8 показан анализ методом Вестерн-блоттинга, показывающий экспрессию клеточной метки HER1t1 в генетически модифицированных линиях клеток SUP-T1. Дорожка 1: только антитело, введенное в/б; Дорожка 2: только клетки Jurkat; Дорожка 3: SUPT1/HER1t1 (высокие уровни HER1t1); Дорожка 4: SUPT1/HER1t1 (низкие уровни HER1t1); Дорожка 5: клетки А431, экспрессирующие полноразмерный HER1; Дорожка 6: маркер. Жирная стрелка указывает на белок, аффинно осажденный цетуксимабом во всех линиях, кроме А431. HER1t1 соответствует SEQ ID NO: 57.
[00070] На ФИГ. 9 показана эффективность устранения CD19 CAR-T-клеток, совместно экспрессирующих клеточную метку HER1t1, посредством АЗКЦ (левая панель) и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) (правая панель) в присутствии цетуксимаба или неспецифичного антитела ритуксимаба.
[00071] На ФИГ. 10 представлена схематическая диаграмма, показывающая различные варианты реализации полипептидных конструкций, описанных в настоящей заявке. Усеченные клеточные метки первого поколения (вверху) содержат усеченный вариант и недимеризующийся трансмембранный домен (ТМ), соединенные необязательным пептидным линкером. Усеченные клеточные метки следующего поколения (нижняя панель) содержат трансмембранный домен димеризации n (ТМ-А), который облегчает димеризацию усеченных вариантов на клеточной поверхности. В обоих случаях антитело к усеченному варианту связывается с эпитопом на усеченном варианте.
[00072] На ФИГ. 11 показаны уровни экспрессии CD19 CAR в первичных Т-клетках, модифицированных для совместной экспрессии CD19 CAR и клеточной метки HER1t. Применяемые клеточные метки HERtl включают усеченный полипептид HER1 с трансмембранным доменом димеризации (варианты HER1t8, соответствующие SEQ ID NO: 71, HER1t9, соответствующий SEQ ID NO: 75, и HER1t10, соответствующий SEQ ID NO: 79), и полипептидную конструкцию, содержащую усеченный полипептид HER1 без трансмембранного домена димеризации (HER1t1, соответствующий SEQ ID NO: 57) по сравнению с Т-клетками, экспрессирующими только CD19 CAR (% от исходного).
[00073] На ФИГ. 12 показаны уровни экспрессии клеточной метки HER1t в первичных Т-клетках, модифицированных для совместной экспрессии CD19 CAR и клеточной метки HER1t. Применяемые клеточные метки HER1t включают усеченный полипептид HER1 с трансмембранным доменом димеризации (варианты HER1t8, соответствующие SEQ ID NO: 71, HER1t9, соответствующий SEQ ID NO: 75, и HER1t10, соответствующий SEQ ID NO: 79), и полипептидную конструкцию, содержащую усеченный полипептид HER1 без домена димеризации (HER1t1, соответствующий SEQ ID NO: 57), по сравнению с Т-клетками, экспрессирующими только CD19 CAR (% от исходного).
[00074] На ФИГ. 13А и ФИГ. 13В показаны более благоприятные эффекты опосредуемой цетуксимабом АЗКЦ (представленные как % специфичного лизиса; ось у) CD19 CAR-T-клеток-мишеней, совместно экспрессирующих полипептидную конструкцию, содержащую усеченный полипептид HER1 с доменом димеризации (варианты HER1t8, соответствующие SEQ ID NO: 71, HER1t9, соответствующий SEQ ID NO: 75, и HER1t10, соответствующий SEQ ID NO: 79), в сравнении с полипептидной конструкцией, содержащей усеченный полипептид HER1 без домена димеризации (контроль HER1t, соответствующий SEQ ID NO: 57). NK-клетки применяли в качестве эффекторных клеток. Ритуксимаб применяли в качестве контрольного неспецифичного антитела для анализа АЗКЦ.
[00075] На ФИГ. 14 показано селективное устранение генетически модифицированных Т-клеток (CD19 CAR-mblL-15-Т-клеток), экспрессирующих HER1t1, с помощью опосредуемой цетуксимабом АЗКЦ.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[00076] Нижеследующее описание и примеры подробно иллюстрируют варианты реализации настоящего изобретения. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами реализации, описанными в настоящей заявке, и, соответственно, может изменяться. Специалисты в данной области техники поймут, что существует множество вариаций и модификаций настоящего изобретения, которые включены в его объем.
[00077] Подразумевается, что все термины соответствуют пониманию специалиста в данной области техники. Если не указано иное, все технические и научные термины используются в настоящей заявке в значении, соответствующем обычному пониманию специалиста в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
[00078] Заголовки разделов, используемые в настоящей заявке, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие описанный объект изобретения.
[00079] Несмотря на то, что различные признаки настоящего изобретения могут быть описаны применительно к одному варианту реализации, признаки также могут быть представлены по отдельности или в любой подходящей комбинации. И наоборот, несмотря на то, что для ясности настоящее изобретение может быть описано в настоящей заявке применительно к отдельным вариантам реализации, настоящее изобретение также может быть реализовано в одном варианте реализации.
[00080] Следующие определения дополняют определения в данной области техники и относятся к данной заявке и не должны быть отнесены к какому-либо связанному или несвязанному делу, например, любому общедоступному патенту или заявке. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке, могут применяться на практике для тестирования настоящего изобретения, в настоящей заявке описаны предпочтительные материалы и способы. Соответственно, используемая в настоящей заявке терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения.
[00081] В настоящей заявке применение единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. Следует отметить, что в настоящем описании формы, обозначающие элемент в единственном числе (соотв. «а» или «an» в исходном тексте на английском языке), включают множественные ссылки, если контекст явно не предписывает иное. В настоящей заявке применение «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, применение термина «включающий», а также других форм, таких как «включают», «включает» и «включенный», не является ограничивающим.
[00082] Ссылка в описании на «некоторые варианты реализации», «вариант реализации», «один вариант реализации» или «другие варианты реализации» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантами реализации, включены по меньшей мере в некоторые варианты реализации, но не обязательно во все варианты реализации, настоящего изобретения.
[00083] В данном описании и формуле слова «содержащий» (и любая форма «содержащий», такая как «содержат» и «содержит»), «имеющий» (и любая форма «имеющий», такая как «имеют» и «имеет»), «включающий» (и любая форма «включающий», такая как «включает» и «включают») или «заключающий» (и любая форма «заключающий», такая как «заключает» и «заключают») являются включающими или открытыми и не исключают дополнительные, не указанные элементы или этапы способа. Предусмотрено, что любой вариант реализации, обсуждаемый в данном описании, может быть реализован в отношении любого способа или композиции согласно настоящему изобретению, и наоборот. Кроме того, композиции согласно настоящему изобретению можно применять для достижения способов согласно настоящему изобретению.
[00084] В настоящей заявке термин «примерно» в отношении эталонного числового значения и его грамматические эквиваленты могут включать само числовое значение и диапазон значений плюс или минус 10% от этого числового значения. Например, количество «примерно 10» включает 10 и любые количества от 9 до 11. Например, термин «примерно» по отношению к контрольному числовому значению также может включать диапазон значений плюс или минус 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от этого значения.
[00085] Под «выделенный» подразумевают извлечение нуклеиновой кислоты из ее природного окружения. Под «очищенный» подразумевают, что степень чистоты данной нуклеиновой кислоты, независимо от того, была ли она извлечена из природы (включая геномную ДНК и мРНК) или синтезирована (включая кДНК) и/или амплифицирована в лабораторных условиях, была повышена, причем «чистота» это относительный термин, а не «абсолютная чистота». Однако следует понимать, что нуклеиновые кислоты и белки могут быть изготовлены с разбавителями или адъювантами и, тем не менее, являются выделенными для практических целей. Например, нуклеиновые кислоты, как правило, смешивают с приемлемым носителем или разбавителем при использовании для введения в клетки.
[00086] В настоящей заявке термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, как рибонуклеотидов, так и дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин включает двухцепочечную и одноцепочечную ДНК, триплексную ДНК, а также двухцепочечную и одноцепочечную РНК. Он также включает модифицированные, например, с помощью метилирования и/или кэппирования, и немодифицированные формы полинуклеотида. Термин также подразумевает включение молекул, которые включают неприродные или синтетические нуклеотиды, а также аналоги нуклеотидов.
[00087] «Полипептид» используется взаимозаменяемо с терминами «полипептиды» и «белок (белки)» и относится к полимеру из остатков аминокислот.«Зрелый белок» представляет собой белок, который является полноразмерным и который необязательно включает гликозилирование или другие модификации, типичные для белка в данном клеточном окружении.
[00088] Поли пептиды и белки, раскрытые в настоящей заявке (включая их функциональные части и функциональные варианты), могут содержать синтетические аминокислоты вместо одной или более природных аминокислот. Такие синтетические аминокислоты известны в данной области техники и включают, например, аминоциклогексанкарбоновую кислоту, норлейцин, α-амино-н-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометилцистеин, транс-3- и транс-4-гидроксипролин, 4-аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, 4-хлорфенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β-фенилсерин, β-гидроксифенилаланин, фенилглицин, α-нафтилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты, N'-бензил-N'-метиллизин, N',N'-дибензиллизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогептанкарбоновую кислоту, α-(2-амино-2-норборнан)карбоновую кислоту, α,γ-диаминомасляную кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин и α-трет-бутил глицин. Согласно настоящему изобретению также предусмотрено, что экспрессия полипептидов, описанных в настоящей заявке, в модифицированной клетке может быть ассоциирована с посттрансляционными модификациями одной или более аминокислот полипептидных конструкций. Неограничивающие примеры посттрансляционных модификаций включают фосфорилирование, ацилирование, включая ацетилирование и формилирование, гликозилирование (включая N-связанное и О-связанное), амидирование, гидроксилирование, алкилирование, включая метилирование и этилирование, убиквитилирование, добавление пирролидонкарбоновой кислоты, образование дисульфидных мостиков, сульфатирование, миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование, фарнезилирование, геранилирование, глипиацию, липоилирование и йодирование.
[00089] В настоящей заявке «антитело» относится к моноклональным или поликлональным антителам. Полное антитело, как правило, состоит из четырех полипептидов: двух идентичных копий полипептида тяжелой (Н) цепи и двух идентичных копий полипептида легкой (L) цепи. Каждая из тяжелых цепей содержит одну N-концевую вариабельную область (VH) и три С-концевые константные области (СН1, СН2 и СН3), и каждая легкая цепь содержит одну N-концевую вариабельную область (VL) и одну С-концевую константную область (CL). Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт антитела. Области VH и VL имеют сходную общую структуру, причем каждая область содержит четыре каркасных участка, последовательности которых относительно консервативны. Каркасные участки соединены тремя областями, определяющими комплементарность (CDR). Три CDR, известные как CDR1, CDR2 и CDR3, образуют «гипервариабельный участок» антитела, который отвечает за связывание антигена.
[00090] «Фрагмент или домен распознавания антигена» относится к молекуле или части молекулы, которая специфично связывается с антигеном. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент распознавания антигена представляет собой антитело, антителоподобную молекулу или ее фрагмент, и антиген представляет собой опухолевый антиген.
[00091] «Антителоподобные молекулы» могут представлять собой, например, белки, которые являются членами суперсемейства Ig, которые способны селективно связывать партнера. Молекулы ГКГС и Т-клеточные рецепторы представляют собой такие молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело подобная молекула представляет собой TCR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения TCR был модифицирован для увеличения его аффинности связывания с ГКГС.
2
[00092] Термины «фрагмент антитела», «антительный фрагмент», «функциональный фрагмент антитела» и «антигенсвязывающая часть» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо для обозначения одного или более фрагментов или частей антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (см., в целом, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). Фрагмент антитела желательно содержит, например, один или более CDR, вариабельных областей (или их частей), константных областей (или их частей) или их комбинации. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, (i) фрагмент Fab, который представляет собой одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (ii) фрагмент F(ab'), который представляет собой двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным мостиком в области стебля; (iii) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (iv) одноцепочечный Fv (scFv), который представляет собой одновалентную молекулу, состоящую из двух доменов фрагмента Fv (т.е. VL и VH), соединенных синтетическим линкером, который позволяет синтезировать два домена в виде одной полипептидной цепи (см., например, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); и Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)), и (v) диатело, которое представляет собой димер полипептидных цепей, причем каждая полипептидная цепь содержит VH, соединенную с VL пептидным линкером, который слишком короткий, чтобы допустить спаривание между VH и VL на одной и той же полипептидной цепи, что способствует спариванию комплементарных доменов на разных полипептидных цепях VH-VL с получением димерной молекулы, имеющей два функциональных сайта связывания антигена. Фрагменты антител известны в данной области техники и более подробно описаны, например, в патенте США №8603950.
[00093] Нуклеиновые кислоты и/или последовательности нуклеиновых кислот являются «гомологичными», если они получены, естественным или искусственным путем, из общей наследственной нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты. Белки и/или белковые последовательности являются гомологичными, если кодирующие их ДНК получены, естественным или искусственным путем, из общей наследственной нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты. Гомологичные молекулы могут быть названы гомологами. Например, любые природные белки, описанные в настоящей заявке, могут быть модифицированы с помощью любого доступного способа мутагенеза. При экспрессии эта подвергнутая мутагенезу нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который гомологичен белку, кодируемому исходной нуклеиновой кислотой. Гомология обычно рассчитывается на основании идентичности последовательностей между двумя или более нуклеиновыми кислотами или белками (или их последовательностями). Точный процент идентичности между последовательностями, который можно применять для установления гомологии, варьируется в зависимости от рассматриваемой нуклеиновой кислоты и белка, но для установления гомологии обычно используется только 25% идентичность последовательностей. Более высокие уровни идентичности последовательности, например, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% или более, также можно применять для установления гомологии.
[00094] Термины «идентичный» или «идентичность последовательности», применительно к двум последовательностям нуклеиновых кислот или аминокислотным последовательностям полипептидов, относятся к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия в указанном окне сравнения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид в настоящей заявке по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% или 100% идентичен эталонному поли пептиду или его фрагменту, например, согласно результатам измерения с помощью BLASTP (или CLUSTAL, или любого другого доступного программного обеспечения для выравнивания) с применением параметров по умолчанию. Аналогичным образом, нуклеиновые кислоты также могут быть описаны со ссылкой на исходную нуклеиновую кислоту, например, они могут быть на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% или 100% идентичны эталонной нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, например, согласно результатам измерения с помощью BLASTN (или CLUSTAL, или любого другого доступного программного обеспечения для выравнивания) с применением параметров по умолчанию. Когда говорят, что одна молекула имеет определенный процент идентичности последовательности с большей молекулой, это означает, что при оптимальном выравнивании двух молекул указанный процент остатков в меньшей молекуле совпадает с остатками в большей молекуле в соответствии с порядком, в котором оптимально выравнены две молекулы.
[00095] «Транспозон» или «транспонируемый элемент» (ТЕ) представляет собой векторную последовательность ДНК, которая может изменять свое положение в геноме, иногда создавая или обращая мутации и изменяя размер генома клетки. Транспозиция часто приводит к дублированию ТЕ. ТЕ класса I копируются в два этапа: сначала они транскрибируются с ДНК в РНК, а затем полученная РНК обратно транскрибируется в ДНК. Эта скопированная ДНК затем вставляется в новом положении в геном. Этап обратной транскрипции катализируется обратной транскриптазой, которая может кодироваться самим ТЕ. Характеристики ретротранспозонов сходны с ретровирусами, таким как ВИЧ. Механизм транспонирования «вырезание и вставка» ТЕ класса II не включает промежуточную РНК. Транспозиции катализируются несколькими ферментами-транспозазами. Некоторые транспозазы неспецифично связываются с любым сайтом-мишенью в ДНК, тогда как другие связываются с конкретными целевыми последовательностями ДНК. Транспозаза делает ступенчатый разрез в целевом сайте, что приводит к получению одноцепочечных 5- или 3-выступов ДНК (липкие концы). На этом этапе вырезается ДНК-транспозон, который затем лигируется в новый сайт-мишень; этот процесс включает активность ДНК-полимеразы, которая заполняет пропуски, и ДНК-лигазы, которая смыкает сахарофосфатный остов. Это приводит к дублированию сайта-мишени. Сайты вставки ДНК-транспозонов могут быть идентифицированы по коротким прямым повторам, которые могут быть созданы с помощью ступенчатого разреза в ДНК-мишени и заполнения ДНК-полимеразой, после чего следует ряд инвертированных повторов, важных для вырезания ТЕ транспозазой. ТЕ, использующие механизм «вырезание и вставка», могут дублироваться, если их транспозиция происходит во время S-фазы клеточного цикла, когда донорный сайт уже реплицирован, но сайт-мишень еще не реплицирован. Транспозиция может быть классифицирована как «автономная» или «неавтономная» в ТЕ обоих класса I и класса II. Автономные ТЕ могут перемещаться самостоятельно, в то время как неавтономные ТЕ для перемещения нуждаются в другом ТЕ. Это часто происходит потому, что неавтономные ТЕ лишены транспозазы (для класса II) или обратной транскриптазы (для класса I).
[00096] «Транспозаза» относится к ферменту, который связывается с концом транспозона и катализирует перемещение транспозона в другую часть генома с помощью механизма вырезания и вставки или механизма репликационной транспозиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каталитическую активность транспозазы можно применять для перемещения гена (ов) из вектора в геном.
[00097] Последовательности нуклеиновой кислоты и векторы, раскрытые или предусмотренные в настоящей заявке, могут быть введены в клетку с помощью «трансфекции», «трансформации», «нуклеофекции» или «трансдукции». В настоящей заявке «трансфекция», «трансформация» или «трансдукция» относятся к введению одного или более экзогенных полинуклеотидов в клетку-хозяина с применением физических или химических способов. Многие методики трансфекции известны в данной области техники и включают, например, совместное осаждение ДНК с фосфатом кальция (см., например, Murray Е.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-декстран; электропорацию; опосредуемую катионными липосомами трансфекцию; облегчаемую частицами вольфрама бомбардировку микрочастицами (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и совместное осаждение ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)); и нуклеофекцию (Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003). Фаговые или вирусные векторы могут быть введены в клетки-хозяева после размножения инфекционных частиц в подходящих упаковывающих клетках, многие из которых доступны коммерчески.
[00098] В настоящей заявке «опухолевый антиген» относится к любому антигенному веществу, вырабатываемому или сверхэкспрессируемому в опухолевых клетках. Например, он может запускать иммунный ответ у хозяина. Согласно другому варианту для целей настоящего изобретения опухолевые антигены могут представлять собой белки, которые экспрессируются как здоровыми, так и опухолевыми клетками, но поскольку они идентифицируют определенный тип опухоли, то являются подходящей терапевтической мишенью.
[00099] «Промотор» относится к области полинуклеотида, которая инициирует транскрипцию кодирующей последовательности. Промоторы расположены возле сайтов начала транскрипции генов, на одной и той же цепи и в 5'-направлении от ДНК (в направлении 5'-области смысловой цепи). Некоторые промоторы являются конститутивными, поскольку они активны в клетке при любых обстоятельствах, тогда как другие являются регулируемыми, поскольку они становятся активными в ответ на специфические стимулы, например, индуцируемый промотор.
[000100] Термин «активность промотора» относится к степени экспрессии нуклеотидной последовательности, которая функционально соединена с промотором, активность которого измеряют. Активность промотора может быть измерена непосредственно путем определения количества полученного РНК-транскрипта, например, с помощью Нозерн-блоттинга, или косвенно путем определения количества продукта, кодируемого присоединенной последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как репортерная последовательность нуклеиновой кислоты, соединенная с промотором.
[000101] В настоящей заявке «индуцируемый промотор» относится к промотору, активность которого индуцируется в присутствии или в отсутствие транскрипционных регуляторов, например, биотических или абиотических факторов. Индуцируемые промоторы являются подходящими, поскольку экспрессия генов, функционально соединенных с ними, может быть включена или выключена на определенных стадиях развития организма или в конкретной ткани. Примерами индуцируемых промоторов являются регулируемые спиртом промоторы, регулируемые тетрациклином промоторы, регулируемые стероидом промоторы, регулируемые металлом промоторы, регулируемые патогенезом промоторы, регулируемые температурой промоторы и регулируемые светом промоторы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор является частью генетического переключателя.
[000102] В настоящей заявке термин «энхансер» относится к последовательности ДНК, которая увеличивает транскрипцию, например, последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она функционально соединена. Энхансеры могут быть расположены на расстоянии многих тысяч пар оснований от кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты и могут опосредовать связывание регуляторных факторов, профили метилирования ДНК или изменения в структуре ДНК. Большое количество энхансеров из различных источников хорошо известны в данной области техники и доступны как клонированные полинуклеотиды или внутри них (например, из хранилищ, таких как АТСС, а также из других коммерческих или индивидуальных источников). Ряд полинуклеотидов, содержащих промоторы (такие как обычно используемый промотор CMV), также содержат энхансерные последовательности. Энхансеры могут быть расположены в 5'-направлении, в пределах или в 3'-направлении относительно кодирующих последовательностей. Термин «энхансеры Ig» относится к энхансерным элементам, происходящим из энхансерных областей, картированных в пределах локуса иммуноглобулина (Ig) (такие энхансеры включают, например, 5'-энхансеры тяжелой цепи (мю), 5'-энхансеры легкой цепи (каппа), интронные энхансеры каппа и мю, а также 3'-энхансеры (см. в общих чертах Paul W. Е. (ed), Fundamental Immunology, 3 изд., Raven Press, New York (1993), pages 353-363; и патент США №5885827).
[000103] В настоящей заявке «кодирующая последовательность» относится к сегменту полинуклеотида, который кодирует полипептид. Область или последовательность ограничена старт-кодоном ближе к 5'-концу и стоп-кодоном ближе к 3'-концу. Кодирующие последовательности также могут упоминаться как открытые рамки считывания.
[000104] В настоящей заявке «функционально соединенный» относится к физическому и/или функциональному соединению сегмента ДНК с другим сегментом ДНК так, чтобы обеспечить функционирование сегментов в соответствии с предусмотренными для них способами. Последовательность ДНК, кодирующая генный продукт, функционально соединена с регуляторной последовательностью, если она соединена с регуляторной последовательностью, такой как, например, промоторы, энхансеры и/или сайленсеры, таким способом, который позволяет модулировать транскрипцию последовательности ДНК, непосредственно или косвенно. Например, последовательность ДНК функционально соединена с промотором, если она лигирована с промотором в 3'-направлении относительно сайта инициации транскрипции промотора, в правильной рамке считывания относительно сайта инициации транскрипции и обеспечивает процесс продления транскрипции вдоль последовательности ДНК. Энхансер или сайленсер функционально соединен с последовательностью ДНК, кодирующей генный продукт, если он лигирован с последовательностью ДНК таким образом, чтобы увеличивать или уменьшать, соответственно, транскрипцию последовательности ДНК. Энхансеры и сайленсеры могут быть расположены в 5'-направлении, в 3'-направлении относительно кодирующих областей последовательности ДНК или могут быть встроены в них. ДНК сигнальной последовательности функционально соединена с ДНК, кодирующей полипептид, если сигнальная последовательность экспрессируется в виде пре-белка, который участвует в секреции полипептида. Соединение последовательностей ДНК с регуляторными последовательностями, как правило, осуществляют путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции или за счет адаптеров или линкеров, вставленных в последовательность с применением рестрикционных эндонукпеаз, известных специалисту в данной области техники.
[000105] Термин «транскрипционный регулятор» относится к биохимическому элементу, функция которого заключается в предотвращении или ингибировании транскрипции последовательности ДНК, управляемой промотором, при определенных условиях окружающей среды (например, репрессор или ядерный ингибирующий белок), или в обеспечении или стимуляции транскрипции последовательности ДНК, управляемой промотором, при определенных условиях окружающей среды (например, индуктор или энхансер).
[000106] Термин «индукция» относится к увеличению транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, активности промотора и/или экспрессии, вызванной транскрипционным регулятором, относительно некоторого начального уровня транскрипции.
[000107] «Целевой» ген или «гетерологичный» ген или «представляющий интерес ген (GOI)» относится к гену, введенному в клетку-хозяина с помощью переноса гена.
[000108] В настоящей заявке «рекомбиназа» относится к группе ферментов, которые могут облегчать сайт-специфичную рекомбинацию между определенными сайтами, при этом сайты физически отделены на одной молекуле ДНК или сайты находятся на отдельных молекулах ДНК. Последовательности ДНК определенных сайтов рекомбинации не обязательно идентичны. Инициация рекомбинации зависит от взаимодействия белок-ДНК, в группе имеется большое количество белков, которые катализируют интеграцию и вырезание фага (например, λ-интеграза, фС31), разделение кольцевых плазмид (например, Tn3, гамма-дельта, Cre, Flp), инверсию ДНК для экспрессии чередующихся генов (например, Hin, Gin, Pin), сборку генов во время развития (например, гены фиксации азота Anabaena) и транспозицию (например, транспозон IS607). Большинство сайт-специфичных рекомбиназ относятся к одному из двух семейств, основанных на эволюционной и механистической взаимосвязи. Они включают семейство λ-интегразы или тирозиновых рекомбиназ (например, Cre, Flp, Xer D) и семейство резолвазы/интегразы или семейство сериновых рекомбиназ (например, фС31, ТР901-1, Tn3, гамма-дельта).
[000109] «Рекомбинационные сайты присоединения» представляют собой специфические полинуклеотидные последовательности, которые распознаются ферментами-рекомбиназами, описанными в настоящей заявке. Как правило, участвуют два разных сайта (называемых «комплементарными сайтами»), один из которых присутствует в нуклеиновой кислоте-мишени (например, в хромосоме или эписоме эукариота или прокариота), а другой присутствует в нуклеиновой кислоте, которая должна быть интегрирована в целевой сайт рекомбинации. В настоящей заявке используются термины «attB» и «attP», которые относятся к сайтам присоединения (или рекомбинации), происходящим из бактериальной мишени и фага-донора, соответственно, несмотря на то, что сайты рекомбинации для конкретных ферментов могут иметь разные названия. Сайты рекомбинации, как правило, включают левое и правое плечи, разделенные коровой или спейсерной областью. Таким образом, сайт рекомбинации attB состоит из ВОВ', где В и В' представляют собой левое и правое плечи, соответственно, а О представляет собой коровую область. Аналогичным образом, attP представляет собой POP', где Р и Р' представляют собой плечи, а О также представляет собой коровую область. После рекомбинации между сайтами attB и attP и сопутствующей интеграции нуклеиновой кислоты в мишень сайты рекомбинации, которые фланкируют интегрированную ДНК, называют «attL» и «attR». Сайты attL и attR, используя терминологию выше, таким образом, состоят из ВОР' и РОВ'', соответственно. В некоторых представлениях в настоящей заявке «О» опущен, и attB и attP, например, обозначены как ВВ' и РР', соответственно.
[000110] Термин «редактирование гена» или «редактирование генома» относится к вставке, удалению или замене нуклеотидов ДНК в геноме живого организма. Как правило, при редактировании генома применяют модифицированные нуклеазы, которые могут создавать сайт-специфичные двухцепочечные разрывы в заранее определенном месте генома. Согласно настоящему изобретению предусмотрены любые средства для редактирования геномов. Неограничивающие примеры методик редактирования генома включают CRISPR, Argonaute и системы сайт-специфичных сериновых рекомбиназ AttSite. В настоящей заявке «система редактирования генов CRISPR» из «системы CRISPR» относится к любому направляемому РНК и опосредуемому белком Cas процессу для нацеливания изменения в последовательности ДНК на конкретную область генома. В настоящей заявке «система редактирования генов Argonaute» относится к любому направляемому одноцепочечной ДНК и опосредуемому эндонуклеазой Argonaute процессу для нацеливания изменения в последовательности ДНК на конкретную область генома. В настоящей заявке «система редактирования генов AttSite» или «система редактирования генов с помощью сайт-специфичной сериновой рекомбиназы» или «система сайт-специфичной сериновой рекомбиназы» относятся к любому процессу, который включает обеспечение эукариотической клетки, которая содержит первый рекомбинационный сайт присоединения и второй рекомбинационный сайт присоединения; приведение первого и второго рекомбинационных сайтов присоединения в контакт с полипептидом прокариотической рекомбиназы, что приводит к рекомбинации между рекомбинационными сайтами присоединения, причем указанный полипептид рекомбиназы может опосредовать рекомбинацию между первым и вторым рекомбинационными сайтами присоединения, при этом первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой рекомбинационный сайт присоединения фагового генома (attP) или рекомбинационный сайт присоединения бактериального генома (attB), второй рекомбинационный сайт представляет собой attB или attP, и рекомбиназа выбрана из группы, состоящей из рекомбиназы фага Listeria monocytogenes, рекомбиназы фага Streptococcus pyogenes, рекомбиназы фага Bacillus subtilis, рекомбиназы фага Mycobacterium tuberculosis и рекомбиназы фага Mycobacterium smegmatis, при условии, что если первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attB, второй рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attP, и если первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attP, второй рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attB. Примеры вариантов реализации системы сериновой рекомбиназы AttSite представлены в патенте США №9034650, который включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[000111] В настоящей заявке термин «эндогенный», применительно к молекуле, такой как полинуклеотид или полипептид, относится к природной форме молекулы, которая может быть обнаружена в клетке или организме дикого типа. Молекула, которая обнаружена в организме эндогенно, может быть противопоставлена модифицированной молекуле, описанной в настоящей заявке, которая обычно не встречается в природе. Например, модифицированная молекула может содержать вариант природного полипептида или полинуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант природного полипептида представляет собой усеченный вариант природного полипептида. В настоящей заявке термин «усеченный вариант» относится к белку или полипептиду, в котором отсутствует одна или более последовательностей аминокислот и/или доменов относительно эндогенного варианта белка или полипептида. Например, у усеченного варианта, встроенного в полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке, может отсутствовать последовательность аминокислот, которая соответствует домену (например, внутриклеточному сигнальному домену, трансмембранному домену, лигандсвязывающему домену и т.д.), обычно присутствующему в эндогенном белке. Природный вариант усеченного полипептида может происходить из любого организма, включая виды млекопитающих, такие как мыши, крысы, кролики и человек. Модифицированные полинуклеотиды и полипептиды, описанные в настоящей заявке, могут быть экспрессированы в модифицированной клетке. В настоящей заявке модифицированная клетка представляет собой клетку, которая была модифицирована относительно ее природного или эндогенного состояния. Примером модифицированной клетки является клетка, описанная в настоящей заявке, которая была модифицирована (например, путем трансфекции полинуклеотида в клетку), чтобы кодировать усеченный вариант природного полипептида или усеченный вариант природного полинуклеотида.
Полипептидные конструкции
[000112] В настоящей заявке раскрыты полипептидные конструкции, полинуклеотиды, кодирующие их, модифицированные клетки, несущие и/или экспрессирующие полипептидные конструкции и полинуклеотиды, и способы регуляции активности модифицированных клеток. Модифицированные клетки, описанные в настоящей заявке, могут включать иммунные эффекторные клетки, модифицированные для кодирования и экспрессии цитокинов, химерных антигенных рецепторов и Т-клеточных рецепторов.
[000113] В настоящей заявке термин «регулирование» или «регуляция», применительно к модифицированным клеткам или полипептидным конструкциям, экспрессируемым в них, в целом относится к регуляции активности или количества модифицированных клеток после введения субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения регулирование активности модифицированных клеток относится к истощению (деплеции) модифицированных клеток у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения регулирование активности модифицированных клеток относится к истощению некоторых модифицированных клеток у субъекта в результате введения субъекту некоторого количества антитела или партнера по связыванию, который связывает полипептидную конструкцию, экспрессируемую на модифицированных клетках. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения регулирование активности модифицированных клеток относится к истощению модифицированных клеток в результате активации гибели клеток посредством связывания антитела или партнера по связыванию с полипептидной конструкцией, описанной в настоящей заявке, экспрессируемой или ассоциированной с указанной модифицированной клеткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения регулирование активности модифицированных клеток относится к активации пути АЗКЦ или КЗЦ в модифицированных клетках.
[000114] Полипептиды, полинуклеотиды и модифицированные клетки, раскрытые в настоящей заявке, в совокупности представляют собой набор терапевтических средств, которые можно применять для улучшения эффективности обычных видов иммунотерапии и, в частности, адоптивной клеточной терапии. Например, модифицированные клетки, описанные в настоящей заявке, могут кодировать и экспрессировать полипептидную конструкцию на поверхности клетки в виде новой клеточной метки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточная метка может функционировать как клеточный маркер, который помечает, маркирует или отмечает клетку, экспрессирующую клеточную метку, как модифицированную клетку. В вариантах реализации, в которых клеточная метка была модифицирована для устранения эпитопов, распознаваемых эндогенными белками, такая клеточная метка может функционировать для однозначной дифференцировки модифицированной клетки от других клеток в организме, например, во время адоптивной клеточной иммунотерапии.
[000115] В других примерах полипептиды, полинуклеотиды и модифицированные клетки, описанные в настоящей заявке, можно применять для сведения к минимуму или устранения разных видов токсичности иммунотерапии у субъектов, если безопасность вызывает беспокойство (например, из-за вероятности начала цитокиновой бури). Описанные в настоящей заявке клеточные метки могут содержать один или более эпитопов, распознаваемых антителом, введенным во время иммунотерапии, чтобы индуцировать клеточный механизм, который будет замедлять терапевтический результат и/или уменьшать возможные побочные эффекты терапии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело связывается с эпитопом для индукции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и/или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ). Соответственно, клеточные метки, описанные в настоящей заявке, могут обеспечивать маркер истощения или «метку для уничтожения», уникальную для модифицированных клеток, что позволяет практикующим врачам контролировать терапевтический результат и тем самым оптимизировать эффективность и безопасность терапии.
[000116] Иммунотерапевтический арсенал, описанный в настоящей заявке, улучшает обычную иммунотерапию, обеспечивая возможность контроля адоптивных клеточных терапевтических вмешательств. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные клетки могут быть сенсибилизированы к стратегиям истощения клеток путем экспрессии полипептидной конструкции, способной димеризоваться или мультимеризоваться на поверхности модифицированных клеток. Такие димеризованные или мультимеризованные полипептиды можно применять для усиления сигнала истощения и тем самым быстро подавлять или устранять терапию модифицированными иммунными клетками у субъектов, которые склонны к возникновению связанных с терапией побочных эффектов или испытывают их. Введение модифицированных клеток, экспрессирующих димеризующуюся или мультимеризующуюся полипептидную конструкцию, может обеспечить дополнительный контроль и оптимизацию вмешательств, истощающих клетки. Согласно дополнительным вариантам реализации практическое применение полинуклеотидных конструкций, раскрытых в настоящей заявке, в качестве части системы «переключателя на уничтожение» (или «переключателя на самоубийство»), в которой применяется индуцируемый промотор, может обеспечить контроль момента экспрессии конкретной полипептидной конструкции, что создает дополнительные контрольные точки иммунотерапии как на транскрипционном, так и на посттрансляционном уровнях.
[000117] В другом варианте реализации клеточные метки, описанные в настоящей заявке, можно применять для обогащения модифицированных клеток, которые специфически экспрессируют такие клеточные метки. Например, клеточные метки можно применять для обогащения определенных модифицированных клеток, чтобы выделить определенные модифицированные клетки, которые экспрессируют только такие клеточной метки, для достижения необходимой чистоты, чтобы обеспечить размножение отобранных клеток, представляющих терапевтический интерес. При необходимости можно применять различные способы, такие как FACS, очистка на колонке или способы на основе магнитных гранул.
[000118] Полипептидные конструкции, раскрытые в настоящей заявке, могут содержать один или более доменов или их конкретных фрагментов. Как правило, полипептидная конструкция может содержать последовательность сигнального пептида, внеклеточный домен, пептидный линкер и трансмембранный домен, функция каждого из которых заключается в придании полипептидной конструкции конкретного целевого свойства. Например, полипептидная конструкция может содержать сигнальный пептид для посттрансляционного направления полипептидной конструкции к клеточной поверхности; трансмембранный домен для присоединения полипептидного домена к клетке; внеклеточную часть, которая может содержать усеченный вариант природного полипептида; и пептидный линкер, соединяющий трансмембранный домен с внеклеточной частью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пептидный линкер функционирует как внеклеточное удлинение пептида, чтобы разместить внеклеточную часть полипептида во внеклеточном матриксе и тем самым сделать его доступным для придания функциональности клеточной метки (например, для презентации или удлинения эпитопа, чтобы обеспечить доступ для связывания антитела). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения один или более из указанных выше доменов могут не присутствовать в полипептидной конструкции. Например, полипептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может быть модифицирована так, чтобы не содержать пептидный линкерный домен. В других вариантах реализации полипептидная конструкция содержит один или более доменов, происходящих из различных белков (т.е. полипептидная конструкция является химерной).
[000119] В настоящей заявке термин «внеклеточный», применительно к части полипептидной конструкции, относится к аминокислотам полипептида, которые расположены на внешней стороне клеточной мембраны. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внеклеточная часть может упоминаться как полипептид клеточной поверхности. Как правило, часть (например, дистальная часть) полипептида клеточной поверхности выступает или дистально выдается во внеклеточное пространство относительно плазматической мембраны клетки. В некоторых случаях выступающая часть может быть связана и, следовательно, распознается антителом или антигенраспознающим полипептидом, который имеет структуру, комплементарную и специфичную для структуры выступающей части. Полипептид клеточной поверхности может включать полипептиды или их фрагменты, которые встречаются в природе на поверхности клетки, а также полипептиды или их фрагменты, которые не обнаруживаются в природе на поверхности клетки (например, усеченный вариант природного полипептида).
[000120] Внеклеточная часть или полипептид клеточной поверхности может включать усеченный вариант природного полипептида. Усеченный вариант может, например, выступать от наружной части плазматической мембраны (например, за счет линкера, соединенного с трансмембранным доменом или смежного с ним) во внеклеточное пространство. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения в усеченном варианте отсутствуют аминокислоты, которые в природном варианте полипептида являются частью внутриклеточного домена и/или трансмембранного домена. Усеченный вариант может быть модифицирован из эндогенного полипептида любым способом, чтобы получить внеклеточную часть клеточной метки. Например, усеченный вариант может быть модифицирован, чтобы восстановить или устранить аминокислоты, которые обычно составляют эпитоп во внеклеточном домене, который может распознаваться эндогенным белком, таким как антиген или рецептор. За счет удаления аминокислот, которые обычно взаимодействуют (например, в клеточных сигнальных путях) с внеклеточными молекулами, усеченный вариант можно сделать нереактивным или иммунологически/эпитопически молчащим на поверхности клетки, или уменьшить или свести к минимуму его реактивность или связывание с эндогенными молекулами. В настоящей заявке предусмотрена любая модификация природного полипептида для удаления природных эпитопов, включая усечение всего или части внеклеточного домена и удаление одной или более аминокислот, которые образуют часть эпитопа или посттрансляционно модифицированы для образования части эпитопа.
[000121] Несмотря на то, что усеченный вариант, описанный в настоящей заявке, может быть эпитопически молчащим в отношении эндогенных сигнальных путей, усеченный вариант может содержать один или более эпитопов, которые могут быть распознаны молекулой (например, антителом), которая обычно не вступает в контакт с поверхностью клетки, соответствующей модифицированной клетке, описанной в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело или партнер по связыванию, специфичные в отношении эпитопа усеченного варианта, вводят экзогенно (например, во время иммунотерапии с применением адоптированных клеток). В этом отношении эпитоп усеченного варианта, который может быть распознан введенным антителом или его фрагментом, может называться неактивным или латентным. Таким образом, клеточная метка, встроенная в клеточную поверхность модифицированной клетки, применяемой для адоптивной иммунотерапии, может содержать эпитоп, который является неактивным до момента введения соответствующей молекулы субъекту для запуска или активации клеточной метки (т.е. за счет распознавания эпитопа). Такой эпитоп не нарушает терапевтический результат модифицированных клеток, в случае если терапия продолжается, как предусмотрено (т.е. эпитоп остается молчащим или латентным), но содержит триггер, который может быть активирован для подавления клеточного результата, если по какой-либо причине иммунотерапия должна быть подавлена. Согласно настоящему изобретению предусмотрено применение любого антитела или небольшой молекулы, которые способны распознавать эпитоп клеточной метки для подавления терапевтического результата модифицированной клетки, экспрессирующей метку, за счет устранения таких клеток (например, за счет АЗКЦ или КЗЦ). Неограничивающие примеры антител, которые можно применять для распознавания эпитопа внеклеточного домена (например, усеченного варианта) клеточной метки, включают ритуксимаб, цетуксимаб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, бригатиниб, икотиниб, осимертиниб, панитумумаб, залутумумаб, нимотузумаб, матузумаб, афутузумаб, блонтуветмаб, обинутузумаб, ибритумомаб тиуксетан, тозитумомаб, офатумумаб, окаратузумаб, окрелизумаб, TRU-015 (трубион), велтузумаб (IMMU-106), алемтузумаб, ANT1034, HI 186(Bio Rad), YTH34.5 (Bio Rad) и YTH66.9HL (Bio-Rad), трастузумаб и пертузумаб.
[000122] Другим примером модификации, которая может быть внесена в эндогенный полипептид для получения усеченного варианта, предусмотренного в настоящей заявке, является удаление одной или более аминокислот, которые обычно вносят вклад или участвуют во внутриклеточных сигнальных и/или транспортных путях. Усечение эндогенного поли пептида для удаления сигнальных доменов усиливает функцию клеточного маркера как неактивного, индуцируемого клеточного маркера, который в неактивном состоянии не нарушает клеточные функции (например, в адоптированных клетках во время адоптивной клеточной терапии).
[000123] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности полипептидной конструкции может содержать усеченный вариант рецепторной тирозинкиназы. Неограничивающие примеры включают усеченный вариант рецептора из семейства рецепторов EGF (например, усеченный вариант HER1), семейства рецепторов PDGF, семейства рецепторов VEGF, семейства рецепторов инсулина, семейства рецепторов FGF, семейства рецепторов Trk и семейства рецепторов Eph. В других вариантах реализации полипептид клеточной поверхности может содержать усеченный вариант белка CD (например, CD20 или CD52) или усеченный вариант LNFGR (CD271).
[000124] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности клеточной метки может содержать усеченный вариант, который был модифицирован для удаления трансмембранного домена и внутриклеточной сигнальной части природного или эндогенного полипептида. Усечение трансмембранного домена и внутриклеточной сигнальной части освобождает поверхностную или внеклеточную часть полипептида от его эндогенной части, например, делая ее доступной для встраивания в химерную полипептидную конструкцию, которая содержит полипептид клеточной поверхности, гибридизованный с трансмембранным доменом (например, за счет линкера), происходящим из другого природного белка. Такие химерные полипептидные конструкции, в свою очередь, могут придавать полипептиду клеточной поверхности (например, усеченному варианту) измененную активность или характеристики по сравнению с эндогенным вариантом полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности способен димеризоваться при экспрессии в химерной полипептидной конструкции.
[000125] Согласно настоящему изобретению предусмотрена экспрессия нескольких различных полипептидных конструкций в одной и той же модифицированной клетке. Например, клетка, раскрытая в настоящей заявке, может экспрессировать несколько полипептидных конструкций, которые различаются по идентичности полипептида клеточной поверхности и/или трансмембранного домена.
[000126] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать полипептид клеточной поверхности, содержащий усеченный вариант природного полипептида, трансмембранный домен, гибридизованный с полипептидом клеточной поверхности, необязательный линкер, соединяющий усеченный вариант с трансмембранным доменом, и сигнальный пептид, направляющий клеточную метку к поверхности модифицированной клетки.
Сигнальный пептид
[000127] Сигнальный пептид представляет собой последовательность аминокислот, как правило, расположенную на N-конце вновь синтезированного белка или полипептида, которая направляет белок или полипептид к клеточной поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сигнальный пептид направляет полипептид к клеточной поверхности для вставки (например, за счет трансмембранного домена) в клеточную мембрану. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, синтезируется с сигнальным пептидом, но затем подвергается посттрансляционному процессингу для отщепления сигнального пептида, поэтому зрелая полипептидная конструкция не содержит аминокислотную последовательность сигнального пептида. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения последовательность сигнального пептида не отщепляется и остается в зрелой полипептидной конструкции.
[000128] Согласно настоящему изобретению предложена полипептидная конструкция, содержащая любой известный или неизвестный сигнальный пептид, способный направлять и/или переносить полипептидную конструкцию к поверхности клетки. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит сигнальную последовательность, соответствующую сигнальному пептиду ГМ-КCФRα, каппа Ig, иммуноглобулина Е, CD8α, TVB2 (Т21А), CD52 или низкоаффинного рецептора фактора роста нервов (LNGFR, TNFRSF16).
[000129] Согласно вариантам реализации сигнальный пептид кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; или SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; и SEQ ID NO: 14.
Пептидный линкер
[000130] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать пептидный линкер для соединения домена или его фрагмента полипептидной конструкции с другим доменом или его фрагментом поли пептидной конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пептидный линкер соединяет трансмембранный домен полипептидной конструкции с полипептидом клеточной поверхности (например, усеченным вариантом природного полипептида) полипептидной конструкции. Например, полипептидная конструкция может содержать пептидный линкер, содержащий линкер GSG (SEQ ID NO: 16), линкер SGSG (SEQ ID NO: 18), линкер (G4S)3 (SEQ ID NO: 20), линкер (G4S)4 (SEQ ID NO: 22) и/или линкер Уитлоу.
[000131] Согласно настоящему изобретению предложен пептидный линкер любой длины или размера для соединения трансмембранного домена с полипептидом клеточной поверхности (например, усеченным вариантом). Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения размер пептидного линкера подобран так, чтобы поддерживать между усеченным вариантом и трансмембранным доменом расстояние, примерно равное расстоянию, которое существует между природным неусеченным вариантом полипептида и его эндогенным трансмембранным доменом. Согласно вариантам реализации усеченные варианты, описанные в настоящей заявке, соединены с трансмембранным доменом за счет линкеров G4S разного размера (G4S)n, где n=0, 1, 2, 3, 4, 5 (SEQ ID NO: 222), чтобы поддерживать «природное» расстояние между HER1t и трансмембранным белком. Например, если два разных усеченных варианта одного и того же природного полипептида имеют разную длину, усеченный вариант меньшей длины может быть компенсирован линкером большего размера, чтобы расположить оба усеченных варианта приблизительно на одинаковом расстоянии от поверхности клетки.
[000132] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения пептидный линкер можно применять для соединения доменов или их частей, отличных от трансмембранного домена. Например, пептидный линкер может соединять два белковых фрагмента полипептида клеточной поверхности. В некоторых случаях полипептид клеточной поверхности может быть химерным и может содержать усеченные варианты из множества природных полипептидов, которые могут быть соединены за счет пептидного линкера. Примером является полипептидная конструкция, содержащая HER1t вместе с одним или более усеченными вариантами другого члена семейства EGFR (например, HER2, ErbB3 и ErbB4). В других случаях полипептид клеточной поверхности может содержать конкатемер из двух или более копий усеченного варианта, соединенных за счет пептидного линкера (например, SEQ ID NO: 123, содержащая две копии усеченного полипептида CD20, соединенные за счет линкера SGS).
[000133] Согласно вариантам реализации пептидный линкер кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; и SEQ ID NO: 23. В вариантах реализации пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; и SEQ ID NO: 24.
Трансмембранный домен
[000134] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать трансмембранный домен, который может быть вставлен в плазматическую мембрану для присоединения полипептидной конструкции к поверхности клетки. Согласно настоящему изобретению предложена полипептидная конструкция, содержащая один или более любых известных или неизвестных трансмембранных доменов или их фрагментов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен полипептидной конструкции может содержать трансмембранный домен, происходящий из одного или более природных белков и/или гомологичный им. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен полипептидной конструкции содержит аминокислотную последовательность, соответствующую трансмембранному домену одного природного белка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен полипептидной конструкции содержит химерный трансмембранный домен, содержащий аминокислотные последовательности, происходящие из двух или более природных белков.
[000135] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать трансмембранный домен, который является однопроходным или многопроходным. CD8α представляет собой пример белка, имеющего однопроходный трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, раскрытая в настоящей заявке, содержит трансмембранный домен, соответствующий и/или гомологичный трансмембранному домену или его фрагменту из белка CD8α. Согласно вариантам реализации трансмембранный домен полипептидной конструкции кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 33. Согласно вариантам реализации трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34.
[000136] Примером многопроходного белка является CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен полипептидной конструкции может содержать трансмембранный домен, соответствующий и/или гомологичный трансмембранному домену или его фрагменту из белка CD28. Согласно вариантам реализации трансмембранный домен полипептидной конструкции кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 35. Согласно вариантам реализации трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36.
[000137] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен димеризации. В настоящей заявке «трансмембранный домен димеризации» относится к трансмембранному домену или его фрагменту, который способен физически взаимодействовать или «димеризоваться» внутри плазматической мембраны клетки со вторым трансмембранным доменом или его фрагментом. Как правило, трансмембранный домен димеризации содержится в первой полипептидной конструкции, которая димеризуется за счет трансмембранного домена димеризации со вторым полипептидом. Если трансмембранный домен димеризации первого полипептида гибридизован на своем дистальном (ориентированном во внеклеточное пространство) конце с первым полипептидом клеточной поверхности, и трансмембранный домен димеризации второго полипептида гибридизован на своем дистальном конце со вторым полипептидом клеточной поверхности, физическое взаимодействие первого и второго трансмембранных доменов внутри клеточной мембраны может приводить к димеризации первого и второго полипептидов клеточной поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен может мультимеризоваться с образованием тримера, тетрамера или мультимера.
[000138] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен димеризации индуцирует димеризацию полипептидов клеточной поверхности без потребности в каком-либо внеклеточном индуцирующем агенте (например, лиганде или антителе, специфичном в отношении эпитопа полипептида клеточной поверхности). Например, трансмембранный домен димеризации может индуцировать димеризацию полипептида клеточной поверхности путем спонтанного физического взаимодействия или связывания со вторым трансмембранным доменом димеризации внутри клеточной мембраны клетки. Таким образом, следует понимать, что клетка, экспрессирующая полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке, может экспонировать димеризованные полипептиды клеточной поверхности на поверхности клетки перед введением любого внеклеточного агента, связывающегося с клеточной поверхностью, содержащего антитело, белок, лиганд или молекулу, описанные в настоящей заявке. Димеризация полипептидов клеточной поверхности за счет трансмембранного домена димеризации может повысить эффективность клетки, экспрессирующей такую полипептидную конструкцию, в отношении усиленного клеточного ответа, когда димеризованные полипептиды клеточной поверхности вступают в контакт и распознают лиганд или антитело. Например, если полипептидная конструкция содержит полипептид клеточной поверхности, содержащий HER1t, пара полипептидов клеточной поверхности HER1t может быть димеризована до или во время контакта с агентом, индуцирующим КЗЦ или АЗКЦ, таким как цетуксимаб. В результате димеризованной конфигурации полипептидов клеточной поверхности, связывающих цетуксимаб, введение связывающего агента во время стресса (например, во время цитокиновой бури) может усиливать цитотоксический эффект, что повышает вероятность уничтожения клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент, который связывается с полипептидом клеточной поверхности (например, димеризованным полипептидом клеточной поверхности) для индукции клеточного ответа в модифицированной клетке, экспрессирующей полипептидную конструкцию, раскрытую в настоящей заявке, обеспечивается экзогенно и/или не существует эндогенно. Согласно настоящему изобретению предложен трансмембранный домен димеризации для облегчения димеризации любого полипептида клеточной поверхности, включая усеченные варианты природных полипептидов, такие как HER1t, LNGFRt, CD20t и CD52t.
[000139] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен димеризации может образовывать ковалентную связь со вторым трансмембранным доменом, чтобы индуцировать димеризацию полипептида клеточной поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ковалентное соединение представляет собой дисульфидную связь, образованную между остатками аминокислоты цистеина, присутствующими в каждом из смежных трансмембранных доменов. В других вариантах реализации трансмембранный домен димеризации внутри клеточной мембраны может образовывать нековалентное соединение со вторым трансмембранным доменом, чтобы индуцировать димеризацию полипептида клеточной поверхности.
[000140] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать трансмембранный домен димеризации, который физически взаимодействует с другим трансмембранным доменом димеризации. В таких случаях первый и второй трансмембранные домены димеризации соответствующей первой и второй полипептидных конструкций могут иметь либо одинаковую аминокислотную последовательность (т.е. гомодимер по отношению к трансмембранному домену димеризации), либо разные аминокислотные последовательности (т.е. гетеродимер по отношению к трансмембранному домену димеризации). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения каждый соответствующий трансмембранный домен димеризации из димеризованной пары полипептидов содержит по меньшей мере один остаток цистеина, который опосредует образование дисульфидного мостика между соответствующими остатками цистеина в первом и втором трансмембранных доменах димеризации.
[000141] Трансмембранный домен полипептидной конструкции может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую и/или гомологичную аминокислотной последовательности белка гликофорина А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность гликофорина А, встроенная в полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке, содержит трансмембранный домен гликофорина А или его фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен полипептидной конструкции может содержать одну или более аминокислот, которые обычно фланкируют трансмембранный домен гликофорина А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая весь трансмембранный домен гликофорина А или его часть, способна димеризоваться (например, гомодимеризоваться) со второй полипептидной конструкцией, содержащей весь трансмембранный домен гликофорина А или его часть. В таких случаях аминокислотная последовательность, встроенная в полипептидную конструкцию из гликофорина А, может определять трансмембранный домен димеризации. Например, домен димеризации гликофорина А может содержать мотив димеризации GXXXG.
[000142] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, содержащий по меньшей мере аминокислоты E91-R116 гликофорина А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, содержащий по меньшей мере аминокислоты 192-1114 гликофорина А. Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, соответствующий домену гликофорина А или его фрагменту, кодируемому полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 27. Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, соответствующий домену гликофорина А или его части, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 28.
[000143] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать трансмембранный домен, который представляет собой химеру аминокислотных последовательностей из двух или более природных полипептидов. Например, трансмембранный домен может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую домену гликофорина А или его части, соединенную или гибридизованную с аминокислотной последовательностью из второго белка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такой химерный трансмембранный домен способен к димеризации со вторым трансмембранным доменом (например, химерным или нехимерным) и, соответственно, содержит трансмембранный домен димеризации. Например, аминокислотная последовательность, соответствующая трансмембранному домену гликофорина А или его фрагменту, может быть гибридизована с аминокислотной последовательностью, соответствующей домену интегрина β3 или его фрагменту, с образованием химерного трансмембранного домена полипептидной конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, содержащий аминокислоты I92-L109 гликофорина А, гибридизованные с аминокислотами A737-W741 интегрина β3. Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, соответствующий химерной последовательности гликофорина А-интегрина β3, кодируемой полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 29. Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30.
[000144] Трансмембранный домен полипептидной конструкции может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую и/или гомологичную аминокислотной последовательности в пределах трансмембранного домена дзета-цепи CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая трансмембранный домен дзета-цепи CD3 или его фрагмент, способна димеризоваться (например, гомодимеризоваться) со второй полипептидной конструкцией, содержащей трансмембранный домен или его фрагмент трансмембранного домена дзета-цепи CD3. В таких случаях аминокислотная последовательность, соответствующая трансмембранному домену дзета-цепи CD3, может определять трансмембранный домен димеризации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 31. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31. Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.
[000145] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен полинуклеотидной конструкции в настоящей заявке может содержать аминокислотную последовательность, соответствующую и/или гомологичную трансмембранному домену или его фрагменту из белков CTLA4 (белок 4 цитотоксических Т-лимфоцитов) и/или LNGFR (TNFRSF16). Например, полипептидная конструкция может содержать трансмембранный домен, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO 39. Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция содержит трансмембранный домен, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 40.
Усеченные варианты
[000146] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать полипептид клеточной поверхности, соединенный с трансмембранным доменом. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности содержит усеченный вариант природного полипептида. Согласно настоящему изобретению предложен широкий спектр природных полипептидов в качестве предшественника или субстрата для получения усеченного варианта, встроенного в полипептидную конструкцию. Каждый предшественник природного полипептида может дополнительно подвергаться множеству различных усечений, чтобы получить большое количество возможных усеченных вариантов для применения в полипептидных конструкциях, описанных в настоящей заявке.
[000147] Примеры предшественников включают предшественника изоформы а рецептора эпидермального фактора роста (EGFR или HER1) (например, SEQ ID NO: 50); предшественника изоформы а рецепторной тирозинкиназы ErbB2 (HER2) (например, SEQ ID NO: 51); предшественника изоформы 1 рецепторной тирозинкиназы ErbB3 (HER3) (например, SEQ ID NO: 52), предшественника изоформы JM-a/CVT-1 рецепторной тирозинкиназы ErbB4 (HER4) (например, SEQ ID NO: 53), изоформы JM-b, изоформы Х7 рецепторной тирозинкиназы ErbB4 (HER4) (например, SEQ ID NO: 54), предшественника CD20 (например, SEQ ID NO: 108), предшественника CD52 и предшественника LNGFR (например, SEQ ID NO: 154).
[000148] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности содержит усеченный полипептид HER1 (обозначенный в настоящей заявке HER1t или EGFRt). Природный HER1 содержит внеклеточную область, содержащую домен I, II, III и IV, трансмембранный домен и внутриклеточную тирозинкиназную и регуляторную область. Известно, что определенные антитела, способные индуцировать АЗКЦ (например, панитумумаб и цетуксимаб), связываются с доменом III эндогенного HER1.
[000149] Согласно настоящему изобретению предложены полипептидные конструкции, содержащие полипептиды HER1, которые усечены по любым аминокислотам, доменам или фрагментам эндогенного HER1. Согласно настоящему изобретению полипептид HER1 может содержать полипептид HER1t. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1 состоит или по существу состоит из полипептида HER1t. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1 может содержать полипептид HER1t в дополнение к другим доменам HER1 (например, трансмембранному домену HER1). Согласно вариантам реализации полипептид HER1 может не содержать внутриклеточный домен или его фрагмент, обычно обнаруживаемый в HER1, включая тирозинкиназный домен и регуляторную область. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1 может не содержать трансмембранный домен или его фрагмент, обычно обнаруживаемый в HER1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1 может не содержать внеклеточный домен или его фрагмент, обычно обнаруживаемый в HER1, включая весь домен I, домен II и домен IV или его часть, обычно обнаруживаемые в HER1.
[000150] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности содержит полипептид HER1t, в котором отсутствует фрагмент домена III, обычно обнаруживаемый в HER1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1t состоит или по существу состоит из всего домена III эндогенного белка HER1 или его части. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1t состоит или по существу состоит из всего домена III эндогенного белка HER1. В одном варианте реализации домен III HER1t, встроенный в полипептид клеточной поверхности, кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 199. Водном варианте реализации домен III HER1t, встроенный в полипептид клеточной поверхности, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 200.
[000151] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1t, встроенный в полипептид клеточной поверхности, содержит домен IV эндогенного HER1 или его фрагмент. Эндогенный домен IV HER1 может кодироваться полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 201. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения эндогенный домен IV HER1t по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 202. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1t, встроенный в полипептид клеточной поверхности, может содержать усеченный домен IV. Усеченный домен IV HER1t может содержать усечение по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% домена IV природного HER1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения усеченный домен IV HER1t, встроенный в полипептид клеточной поверхности, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 и SEQ ID NO: 209.
[000152] Полипептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать полипептид HER1t, содержащий домен III и домен IV HER1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид HER1t содержит домен III и домен IV HER1, которые по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичны аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 210.
[000153] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать полипептид HER1t, содержащий домен III и фрагмент домена IV HER1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид HER1t по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216 и SEQ ID NO: 217.
[000154] Природный HER1 также содержит множество пар дисульфидных связей в домене IV. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения усеченный домен IV HER1t может содержать усечение в таких положениях, чтобы сохранить пары дисульфидных связей. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения варианты HER1t, описанные в настоящей заявке, соединены с трансмембранным доменом за счет линкеров G4S разного размера (G4S)n, где n=0, 1,2, 3, 4, 5 (SEQ ID NO: 222), чтобы поддерживать «природное» расстояние между HER1t и трансмембранным белком. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения 7-членный линкер между доменом IV и трансмембранным доменом EGFR может быть дополнительно удален, поскольку этот линкер участвует в димеризации рецепторов EGFR, что приводит к активации лигандом EGF.
[000155] Полипептид HER1t, встроенный в полипептид клеточной поверхности, описанный в настоящей заявке, может содержать эпитоп, который может быть распознан экзогенно введенным партнером по связыванию или антителом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид HER1t может содержать цетуксимабсвязывающий домен, чтобы облегчать нацеленное истощение клеток, экспрессирующих полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке. Истощение может быть вызвано, например, гибелью клеток в результате КЗЦ и/или АЗКЦ. Неограничивающие примеры молекул, которые могут быть эндогенно введены для связывания и/или распознавания эпитопа на полипептиде клеточной поверхности, содержащем HER1t, могут включать цетуксимаб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, бригатиниб, икотиниб, осимертиниб, панитумумаб, залутумумаб, нимотузумаб и матузумаб. Согласно различным вариантам реализации антитело может представлять собой моноклональное антитело, scFv, scFab, диатело или антитело верблюдовых. Согласно другому варианту реализации антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством или токсином.
[000156] Полипептид клеточной поверхности, встроенный в полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке, может содержать усеченные варианты множества различных природных полипептидов. Например, полипептид клеточной поверхности может содержать полипептидную химеру, содержащую множество усеченных полипептидов из семейства EGFR. На ФИГ. 4 В показан вариант реализации полипептидной конструкции, придающей функциональность клеточной метки, причем полипептид клеточной поверхности содержит домен III из одного члена семейства HER/EGFR (HER(m)) и домен IV или его фрагмент из другого члена семейства HER/EGFR (HER(n)). Согласно настоящему изобретению предложены химерные полипептиды клеточной поверхности, содержащие любую комбинацию внеклеточных доменов из двух или более из EGFR/HER1, HER2, ErbB3 и ErbB4. На ФИГ. 4С изображен конкретный случай, когда домен III происходит из EGFR/HER1. Преимущество таких химерных полипептидов клеточной поверхности заключается в том, что каждое отдельное усечение может удалять эпитопы из соответствующего природного полипептида, которые склонны к связыванию эндогенных молекул, сохраняя при этом эпитоп, который может быть распознан экзогенно введенным антителом во время адоптивной клеточной терапии. Например, если химерный полипептид клеточной поверхности содержит домен III из EGFR и домен IV из HER2, модифицированные клетки, экспрессирующие полипептид, могут быть восприимчивы к обоим антителам цетуксимабу (распознающему домен III EGFR) и трастузумабу (распознающему домен IV HER2). Таким образом, химерные полипептиды клеточной поверхности, описанные в настоящей заявке, обеспечивают дополнительный механизм контроля поведения иммунных клеток во время иммунотерапии, обеспечивая сайты связывания для множества антибиотиков/партнеров по связыванию. Например, в ситуации, когда субъект, испытывающий побочные эффекты во время адоптивной клеточной терапии, не отвечает на введенный антибиотик (например, цетуксимаб), мишенью которого является эпитоп на одном из усеченных вариантов в химерном полипептиде клеточной поверхности, субъекту может быть введено другое антитело (например, трастузумаб), мишенью которого является та же модифицированная клетка за счет другого эпитопа на другом усеченном варианте химерного полипептида клеточной поверхности.
[000157] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности может быть гибридизован с трансмембранным доменом, который гомологичен члену семейства EGFR. Например, трансмембранный домен может соответствовать трансмембранному домену из EGFR/HER1, HER2, ErbB3 или ErbB4. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен может быть гомологичен трансмембранному домену, не относящемуся к EGFR, включая трансмембранный домен, соответствующий SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 40.
[000158] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности может содержать химеру полипептида HER1t и усеченного полипептида HER2 (HER2t) или его фрагмента. Например, полипептидная конструкция может содержать полипептид HER1t/EGFRt, содержащий домен III HER1, и полипептид HER2t, содержащий домен IV HER2, и трансмембранный домен HER2. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности EGFR-HER2, гибридизованный с трансмембранным доменом HER2, может кодироваться полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 92 (дельта 16). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности EGFR-HER2, гибридизованный с трансмембранным доменом HER2, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 93 (дельта 16).
[000159] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности может содержать химеру полипептида HER1t и усеченного полипептида ErbB3 (ErbB3t) или его фрагмента. Например, полипептидная конструкция может содержать полипептид HER1t/EGFRt, содержащий домен III HER1, и полипептид ErbB3t, содержащий домен IV ErbB3, и трансмембранный домен ErbB3. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности EGFR-ErbB3, гибридизованный с трансмембранным доменом ErbB3, может кодироваться полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 96. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности EGFR-ErbB3, гибридизованный с трансмембранным доменом ErbB3, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 97.
[000160] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности может содержать химеру полипептида HER1t и усеченного полипептида ErbB4 (ErbB4t) или его фрагмента. Например, полипептидная конструкция может содержать полипептид HER1t/EGFRt, содержащий домен III, и полипептид ErbB4t, содержащий домен IV ErbB4, и трансмембранный домен ErbB4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид ErbB4t может содержать внеклеточный околомембранный домен JM-a, кодируемый альтернативным транскриптом ErbB4 JM-a. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид ErbB4t может содержать внеклеточный околомембранный домен JM-b, кодируемый альтернативным транскриптом ErbB4 JM-b. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности, гибридизованный с трансмембранным доменом ErbB4, может кодироваться полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 100 (EGFR-ErbB4 (JM-a)) и SEQ ID NO: 104 (EGFR-ErbB4 (JM-b)). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химерный полипептид клеточной поверхности EGFR-ErbB4, гибридизованный с трансмембранным доменом ErbB4, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 101 (EGFR-ErbB4 (JM-a)) и SEQ ID NO: 105 (EGFR-ErbB4 (JM-b)).
[000161] Полипептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать любую комбинацию сигнального пептида, полипептида клеточной поверхности, содержащего полипептид HER1t (например, содержащего только HER1t или химерный полипептид, содержащий HER1t), трансмембранного домена и необязательного линкера. Например, полипептидная конструкция может содержать полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид HER1t, или химерный полипептид, содержащий HER1t, соединенный или гибридизованный с производным или фрагментом трансмембранного домена CD28 за счет линкера (например, одной или более (например, 1-4) копий (G4S (SEQ ID NO: 221))). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности может содержать полипептид HER1t, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 56 (HER1t1); SEQ ID NO: 58 (HER1t2); SEQ ID NO: 60 (HER1t3); SEQ ID NO: 62 (HER1t4); SEQ ID NO: 64 (HER1t5); SEQ ID NO: 66 (HER1t6); SEQ ID NO: 68 (HER1t7); SEQ ID NO: 72 (HER1t8); SEQ ID NO: 76 (HER1t9); SEQ ID NO: 80 (HER1t10); и SEQ ID NO: 84 (HER1t11). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности может содержать полипептид HER1t, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 55 (HER1t); SEQ ID NO: 57 (HER1t1); SEQ ID NO: 59 (HER1t2); SEQ ID NO: 61 (HER1t3); SEQ ID NO: 63 (HER1t4); SEQ ID NO: 65 (HER1t5); SEQ ID NO: 67 (HER1t6); SEQ ID NO: 69 (HER1t7); SEQ ID NO: 73(HER1t8); SEQ ID NO: 77 (HER1t9); SEQ ID NO: 81 (HER1t10); и SEQ ID NO: 85 (HER1t11).
[000162] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция может содержать сигнальный пептид, полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид HER1t, или химерный полипептид, содержащий полипептид HER1t, трансмембранный домен, содержащий трансмембранный домен димеризации, и линкер для соединения трансмембранного домена и полипептида клеточной поверхности. Например, полипептидная конструкция может содержать сигнальный пептид каппа Ig, конкретный усеченный вариант HER1, линкер (например, (G4S)4 (SEQ ID NO: 22)) и трансмембранный домен димеризации (например, содержащий I92-I114 гликофорина А или трансмембранный домен из CD3-дзета). Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция, содержащая полипептид HER1t и трансмембранный домен димеризации, кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 70 (гликофорин A; HER1t8); SEQ ID NO: 74 (гликофорин A; HER1t9); SEQ ID NO: 78 (гликофорин A; HER1t10); и SEQ ID NO: 82 (CD3-дзета; HER1t11). Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция, содержащая полипептид HER1t и трансмембранный домен димеризации, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 71 (гликофорин A; HER1t8); SEQ ID NO: 75 (гликофорин A; HER1t9); SEQ ID NO: 79 (гликофорин A; HER1t10); и SEQ ID NO: 83 (CD3-дзета; HER1t11).
[000163] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция может содержать полипептид клеточной поверхности, содержащий химеру HER1t-HER2t, соединенную с трансмембранным доменом HER2. Химера усеченных HER1t-HER2t и трансмембранный домен могут быть дополнительно соединены с сигнальным пептидом (например, ГМ-КСФRα), который направляет полипептидную конструкцию к клеточной поверхности. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция кодируется полинуклеотидом, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 90 (дельта 16). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 91 (дельта 16).
[000164] В другом примере полипептидная конструкция может содержать полипептид клеточной поверхности, содержащий химеру HER1t-ErbB3t, соединенную с трансмембранным доменом ErbB3. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химера HER1t-ErbB3t и трансмембранный домен дополнительно соединены с сигнальным пептидом (например, ГМ-КCФRα), который направляет полипептидную конструкцию к клеточной поверхности. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция кодируется полинуклеотидом, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 94. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 95.
[000165] В еще одном примере полипептидная конструкция может содержать полипептид клеточной поверхности, содержащий химеру HER1t-ErbB4t, соединенную с трансмембранным доменом ErbB4. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения химера HER1t-ErbB4t и трансмембранный домен дополнительно соединены с сигнальным пептидом (например, ГМ-КСФRα), который направляет полипептидную конструкцию к клеточной поверхности. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция кодируется полинуклеотидом, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 98 (вариант JM-а) и SEQ ID NO: 102 (вариант JM-b). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 99 (вариант JM-a) и SEQ ID NO: 103 (вариант JM-b).
[000166] Полипептидная конструкция, содержащая полипептид HER1t, может содержать любой сигнальный пептид, способный направлять полипептидную конструкцию к клеточной поверхности. Например, полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид HER1t (например, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216 и SEQ ID NO: 217, может быть гибридизован с сигнальным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 2 (ГМ-КСФRα), SEQ ID NO: 4 (каппа Ig), SEQ ID NO: 6 (иммуноглобулин E), SEQ ID NO: 8 (CD8α), SEQ ID NO: 10 (TVB2), SEQ ID NO: 12 (CD52) или SEQ ID NO: 14 (LNFGR).
[000167] Полипептидная конструкция, содержащая полипептид HER1t, может содержать любой трансмембранный домен, включая трансмембранный домен, который не содержит домен димеризации. Например, полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид HER1t (например, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216 и SEQ ID NO: 217), может быть соединен с трансмембранным доменом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 26 (гликофорин A E91-R116), SEQ ID NO: 28 (гликофорин А I92-I114), SEQ ID NO: 30 (гликофорин А(I92-L109).интегрин β3 (A737-W741), SEQ ID NO: 32 (дзета-цепь CD3), SEQ ID NO: 34 (CD8α), SEQ ID NO: 36 (CD28), SEQ ID NO: 38 (CTLA4) и SEQ ID NO: 40 (LNGFR).
[000168] Полипептидная конструкция, содержащая полипептид HER1t, может содержать любой пептидный линкер (или согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не содержит пептидный линкер). Например, полипептид клеточной поверхности, содержащий HER1t (например, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216 и SEQ ID NO: 217), может быть гибридизован с пептидным линкером, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 16 (GSG), SEQ ID NO: 18 (SGSG), SEQ ID NO: 20 ((G4S)3), SEQ ID NO: 22 ((G4S)4) и SEQ ID NO: 24 (Уитлоу).
[000169] Поли пептид клеточной поверхности может содержать усеченный полипептид CD. Например, полипептид клеточной поверхности может содержать усеченный полипептид CD20 (называемый в настоящей заявке CD20t). Природный полипептид CD20 представляет собой многопроходный трансмембранный белок, кодируемый геном 1 подсемейства А семейства генов, кодирующих белки с 4 трансмембранными доменами (MS4A1). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения полноразмерный CD20 может кодироваться полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 106, и полноразмерная аминокислотная последовательность CD20 может соответствовать аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 107. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD20 содержит 4 прохода трансмембранного домена, содержащих аминокислоты 57-78, 85-105, 121-141 и 189-209. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD20 содержит 2 внеклеточных домена, содержащих аминокислоты 79-84 и 142-188. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD20 содержит 3 цитоплазматических домена, содержащих аминокислоты 1-56, 106-120 и 210-297.
[000170] Согласно настоящему изобретению предложены полипептидные конструкции, содержащие полипептиды CD20, которые усечены по любым аминокислотам, доменам или фрагментам эндогенного CD20. Согласно настоящему изобретению полипептид CD20 может содержать полипептид CD20t. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD20 состоит или по существу состоит из полипептида CD20t. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD20 может содержать полипептид CD20t в дополнение к другому домену CD20 или его части (например, трансмембранному домену CD20 и/или цитоплазматическому домену). Например, полипептид CD20 может быть усечен по внутриклеточному цитоплазматическому (например, сигнальному) домену или его части, трансмембранному (например, спиральному) домену или его части и/или внеклеточному домену или его части. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в полипептиде CD20 могут отсутствовать несколько доменов или несколько частей домена относительно полипептида дикого типа. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид CD20 содержит М1-Е263 эндогенного CD20 (SEQ ID NO: 109; CD20I1), M117-N214 эндогенного CD20 (SEQ ID NO: 111 (CD20t2), M1-N214 эндогенного CD20 (SEQ ID NO: 115; CD20t4), V82-N214 эндогенного CD20 (SEQ ID NO: 117; CD20t5) или V82-I186 эндогенного CD20 (SEQ ID NO: 119, CD20t6).
[000171] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид CD20t может содержать внеклеточный домен или его фрагмент. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид CD20t по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 220. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD20t может быть соединен с трансмембранным доменом или его фрагментом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит полипептид CD20t, соединенный с трансмембранным доменом CD20. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t, соединенный с трансмембранным доменом CD20, кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 108 (CD20t1, кодирующий М1-Е263); SEQ ID NO: 110 (CD20t2, кодирующий M117-N214); SEQ ID NO: 114 (CD20t4, кодирующий M1-N214); SEQ ID NO: 116 (CD20t5, кодирующий V82-N214); SEQ ID NO: 118 (CD20t6, кодирующий V82-I186); SEQ ID NO: 132 (CD20t13, кодирующий M1-A54 ИС111-Р297); SEQ ID NO: 134 (CD20t14, кодирующий M1-A54 и C111-E281); SEQ ID NO: 136 (CD20t15, кодирующий M1-A54 и C111-E263); SEQ ID NO: 138 (CD20t16, кодирующий M1-A54 и C111-V228); и SEQ ID NO: 140 (CD20t17, кодирующий M1-V8 и C111-P297). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t, соединенный с трансмембранным доменом CD20, может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 109 (CD20t1: М1-Е263); SEQ ID NO: 111 (CD20t2: M117-N214); SEQ ID NO: 115 (CD20t4: M1-N214); SEQ ID NO: 117 (CD20t5: V82-N214); SEQ ID NO: 119 (CD20t6: V82-I186); SEQ ID NO: 133 (CD20t13: M1-A54 и C111-P297); SEQ ID NO: 135 (CD20t14: M1-A54 и C111-E281); SEQ ID NO: 137 (CD20t15: M1-A54 и С111-Е263); SEQ ID NO: 139 (CD20t16: M1-A54 и C111-V228); и SEQ ID NO: 141 (CD20t17: M1-V8 и C111-P297).
[000172] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD20t может сохранять по меньшей мере одну копию связывающего ритуксимаб мимотопа эндогенного CD20, описанного в Philip et al., (2014), «А highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell tHERapy,» Blood: 124: 1277-1287. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или более копий связывающего ритуксимаб эпитопа CD20t могут быть гибридизованы с одной или более аминокислотными последовательностями, происходящими из CD-34, такими как 40 аминоконцевых аминокислот CD34, которые облегчают связывание моноклонального антитела к CD34. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в полипептиде CD20t может быть удалено несколько доменов или может быть удалена часть нескольких доменов.
[000173] Полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид CD20t, может содержать эпитоп, который может быть распознан экзогенно введенным антителом или партнером по связыванию. Например, полипептид CD20t, включенный в полипептид клеточной поверхности, может содержать связывающий ритуксимаб домен, чтобы облегчить нацеленное истощение клеток, экспрессирующих полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке (например, за счет КЗЦ и/или антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ)). Неограничивающие примеры антител, которые можно применять для связывания с эпитопом полипептида клеточной поверхности, содержащего полипептид CD20t, включают ритуксимаб, hOUBM3/6, афутузумаб, блонтуветмаб, обинутузумаб, ибритумомаб тиуксетан, тозитумомаб, офатумумаб, окаратузумаб, окрелизумаб, TRU-015 (трубион) и велтузумаб (IMMU-106). Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения антитело может представлять собой монокпональное антитело, scFv, scFab, диатело или антитело верблюдовых. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством или токсином. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD20t содержит эпитоп, обнаруженный во внеклеточном домене эндогенного CD20. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпитоп полипептида CD20t содержит аминокислоты 170-185 эндогенного CD20. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпитоп полипептида CD20t содержит аминокислоты 170-173 и 182-185 эндогенного CD20.
[000174] Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид CD20t, является химерным для усеченного варианта одного или более дополнительных полипептидов. Например, химерный полипептид клеточной поверхности может содержать полипептид CD20t и усеченный полипептид CD8α (CD8αt).
[000175] Поли пептид клеточной поверхности может дополнительно содержать несколько последовательностей CD20t, соединенных вместе в качестве конкатемера. Например, полипептид клеточной поверхности может содержать одну и ту же аминокислотную последовательность CD20t, повторяемую последовательно, или разные варианты CD20t, соединенные вместе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотные последовательности CD20t соединены вместе в полипептиде клеточной поверхности с помощью пептидного линкера. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения линкер SGS или SG4S (SEQ ID NO: 223) можно применять для соединения вместе повторяющихся аминокислотных последовательностей CD20 в полипептиде клеточной поверхности (например, см. SEQ ID NO: 123 (линкер SGS) и SEQ ID NO: 129 (линкер SG4S (SEQ ID NO: 223)), который дополнительно содержит полипептид клеточной поверхности, соединенный с трансмембранным доменом CD28 с помощью линкера SG4S (SEQ ID NO: 223).
[000176] Поли пептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может содержать любую комбинацию сигнального пептида, полипептида клеточной поверхности, содержащего полипептид CD20t (например, содержащий только CD20t или химеру CD20t), трансмембранного домена и необязательного линкера. Например, полипептидная конструкция может содержать линкер SG4S (SEQ ID NO: 223), который соединяет или гибридизует полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид CD20t, с трансмембранным доменом. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен происходит из трансмембранного домена или его фрагмента CD20, CD28 или CD8α или гомологичен им. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая CD20t, кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, выбранную из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 112 (CD20t3, кодирующий CD20t (К142-S188), и трансмембранный домен CD8α (I183-T203)); SEQ ID NO: 120 (CD20t7, кодирующий CD20t (P160-Q187), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172)); SEQ ID NO: 122 (CD20t8, кодирующий конкатемер CD20t (P160-Q187, отделенный линкером SGS), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172)); SEQ ID NO: 124 (CD20t9, кодирующий CD20t (P160-Q187), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD8α (P120-V201)); SEQ ID NO: 126 (CD20t10, кодирующий CD20t (C167-C183), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172); SEQ ID NO: 128 (CD20t11, кодирующий конкатемер CD20 (C167-C183, отделенный линкером SG4S (SEQ ID NO: 223)), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172); и SEQ ID NO: 130 (CD20t12, кодирующий CD20t (C167-C183), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD8α (P120-V201)). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая CD20t, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 113 (CD20t3; CD20t (K142-S188) и трансмембранный домен CD8α (I183-T203)); SEQ ID NO: 121 (CD20t7, кодирующий CD20t (P160-Q187), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172)); SEQ ID NO: 123 (CD20t8, кодирующий конкатемер CD20t (P160-Q187, отделенный линкером SGS), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172)); SEQ ID NO: 125 (CD20t9, кодирующий CD20t (P160-Q187), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD8α (P120-V201)); SEQ ID NO: 127 (CD20t10, кодирующий CD20t (C167-C183), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172); SEQ ID NO: 129 (CD20t11, кодирующий конкатемер CD20 (C167-C183, отделенный линкером SG4S (SEQ ID NO: 223)), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD28 (I96-D172); и SEQ ID NO: 131 (CD20t12, кодирующий CD20t (C167-C183), линкер SG4S (SEQ ID NO: 223) и трансмембранный домен CD8α (P120-V201)).
[000177] Поли пептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t, может содержать любой сигнальный пептид, способный направлять полипептидную конструкцию к клеточной поверхности. Например, полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t (например, полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 220), может быть гибридизована с сигнальным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 2 (ГМ-КСФRα), SEQ ID NO: 4 (каппа Ig), SEQ ID NO: 6 (иммуноглобулина E), SEQ ID NO: 8 (CD8α), SEQ ID NO: 10 (TVB2), SEQ ID NO: 12 (CD52) или SEQ ID NO: 14 (LNFGR).
[000178] Полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t, может содержать любой трансмембранный домен, включая трансмембранный домен, который содержит домен димеризации или не содержит домен димеризации. Например, полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t (например, полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 220), может быть гибридизована с трансмембранным доменом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 26 (гликофорин A E91-R116), SEQ ID NO: 28 (гликофорин А 192-1114), SEQ ID NO: 30 (гликофорин А (I92-L109).интегрин β3 (A737-W741), SEQ ID NO: 32 (дзета-цепь CD3), SEQ ID NO: 34 (CD8α), SEQ ID NO: 36 (CD28), SEQ ID NO: 38 (CTLA4) и SEQ ID NO: 40 (LNGFR). Полипептидные конструкции, содержащие CD20t, могут дополнительно содержать трансмембранные домены, происходящие из CD28 и/или CD8α или гомологичные им.
[000179] Поли пептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t, может содержать любой пептидный линкер (или согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не содержит пептидный линкер). Например, полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD20t (например, полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 220), может быть гибридизована с пептидным линкером, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 16 (GSG), SEQ ID NO: 18 (SGSG), SEQ ID NO: 20 ((G4S)3), SEQ ID NO: 22 ((G4S)4) и SEQ ID NO: 24 (Уитлоу).
[000180] Другим примером полипептида CD, который может быть усечен и встроен в клеточную метку, описанную в настоящей заявке, является CD52. CD52 встречается эндогенно у человека как пептид из 12 аминокислот, соединенный на своем С-конце с гликозилфосфатидилинозитольным (GPI) якорем. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гликофосфатидилинозитол (GPI) можно применять для прикрепления полипептидов, описанных в настоящей заявке, к поверхности клетки.
[000181] Согласно настоящему изобретению предложены полипептидные конструкции, содержащие полипептиды CD52, которые усечены по любым аминокислотам, доменам или фрагментам эндогенного CD52. Согласно настоящему изобретению полипептид CD52 может содержать усеченный полипептид CD52 (CD52t). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD52 состоит или по существу состоит из полипептида клеточной поверхности, содержащего полипептид CD52t. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD52 может содержать полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид CD52t в дополнение к другим доменам CD52 (например, сигнальному пептиду CD52).
[000182] Согласно настоящему изобретению предложены полипептидные конструкции, которые содержат полипептид клеточной поверхности, содержащий усеченный полипептид CD52t. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид CD52t соединен с сигнальным пептидом CD52 для направления усеченного варианта к клеточной поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид CD52t, может содержать один или более эпитопов, которые могут распознаваться экзогенно введенным антителом или партнером по связыванию. Например, полипептид CD52t может содержать один или более связывающих алемтузумаб доменов и тем самым облегчать нацеленное истощение клеток, экспрессирующих полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нацеленное истощение может быть результатом опосредуемой алемтузумабом КЗЦ и/или АЗКЦ, или другого клеточного механизма, который опосредует цитотоксические эффекты распознавания алемтузумаба. Неограничивающие примеры молекул, направленных против CD52, которые могут распознавать полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид CD52t, включают алемтузумаб, ANT1034, HI 186(Bio Rad), YTH34.5 (Bio Rad) и YTH66.9HL (Bio-Rad). Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения антитело может представлять собой моноклональное антитело, scFv, scFab, диатело или антитело верблюдовых. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотидная последовательность, кодирующая эпитоп CD52, содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 142. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения эпитоп CD52 по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 143.
[000183] Полипептидная конструкция, описанная в настоящей заявке, может иметь несколько эпитопов, которые могут быть распознаны антителом или партнером по связыванию. Например, в случае полипептида CD52t, полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD52t, может содержать несколько эпитопов, специфичных для партнера по связыванию (например, алемтузумаба). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид CD52t содержит несколько копий (например, по меньшей мере две копии, по меньшей мере три копии, по меньшей мере четыре копии, по меньшей мере пять копий, по меньшей мере шесть копий или по меньшей мере десять копий) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 143. Каждая копия или повтор аминокислотной последовательности могут быть отделены в полипептидной конструкции линкером (например, линкером Уитлоу). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит сигнальный пептид CD52, соединенный с одной или более копиями полипептида CD52t, гибридизованного с линкером Уитлоу, который соединен (например, с помощью одной или более копий линкера (G4S) (SEQ ID NO: 221)) с трансмембранным доменом (например, трансмембранным доменом CD28 или его фрагментом). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD52t, кодируется полинуклеотидом, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 144 (CD52t1; кодирующей одну копию эпитопа/линкера), SEQ ID NO: 146 (CD52t2; кодирующей две копии эпитопа/линкера) и SEQ ID NO: 148 (CD52t3; кодирующей три копии эпитопа/линкера). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид, содержащий полипептид CD52t, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 145 (CD52t1; кодирующей одну копию эпитопа/линкера;), SEQ ID NO: 147 (CD52t2; кодирующей две копии эпитопа/линкера) и SEQ ID NO: 149 (CD52t3; кодирующей три копии эпитопа/линкера).
[000184] Поли пептидная конструкция, содержащая полипептид CD52t, может содержать любой трансмембранный домен, включая трансмембранный домен, который содержит домен димеризации или не содержит домен димеризации. Например, полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид CD52t, может быть гибридизован за счет линкера (например, линкера 3xGS (SEQ ID NO: 224)) с трансмембранным доменом, содержащим трансмембранный домен димеризации (например, происходящий из трансмембранного домена гликофорина А или гликофорина А-интегрина β3 или гомологичный им). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD52t, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 150 (CD52t4; сигнальный пептид CD52, пептидный линкер 3xGS (SEQ ID NO: 224) и трансмембранный домен гликофорина A), SEQ ID NO: 151 (CD52t5; сигнальный пептид CD52, пептидный линкер 3×GS (SEQ ID NO: 224) и трансмембранный домен гликофорина А) и SEQ ID NO: 152 (CD52t6; сигнальный пептид CD52, линкер 3×GS (SEQ ID NO: 224) и трансмембранный домен гликофорина А-интегрина β3).
[000185] Согласно вариантам реализации полипептидная конструкция, содержащая полипептид CD52t (например, SEQ ID NO: 143), который может быть соединен с сигнальным пептидом CD52, чтобы получить аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149), может быть соединена с трансмембранным доменом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 26 (гликофорин А E91-R116), SEQ ID NO: 28 (гликофорин А I92-I114), SEQ ID NO: 30 (гликофорин А(I92-L109).интегрин β3 (A737-W741), SEQ ID NO: 32 (дзета-цепь CD3), SEQ ID NO: 34 (CD8α), SEQ ID NO: 36 (CD28), SEQ ID NO: 38 (CTLA4) и SEQ ID NO: 40 (LNGFR).
[000186] Поли пептидная конструкция, содержащая полипептид CD52t, может содержать любой сигнальный пептид, способный направлять полипептидную конструкцию к клеточной поверхности. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид CD52t соединен с сигнальным пептидом CD52 (например, полипептидная конструкция содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 149). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит поли пептид CD52t (например, SEQ ID NO: 143), соединенный с сигнальным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 2 (ГМ-КСФRα), SEQ ID NO: 4 (каппа Ig), SEQ ID NO: 6 (иммуноглобулин E), SEQ ID NO: 8 (CD8α), SEQ ID NO: 10 (TVB2), SEQ ID NO: 12 (CD52) или SEQ ID NO: 14 (LNFGR).
[000187] Поли пептидная конструкция, содержащая полипептид CD52t, может содержать любой пептидный линкер (или согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не содержит пептидный линкер). Например, полипептид клеточной поверхности, содержащий CD52t (например, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 143), может быть гибридизован с пептидным линкером, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 16 (GSG), SEQ ID NO: 18 (SGSG), SEQ ID NO: 20 ((G4S)3), SEQ ID NO: 22 ((G4S)4) и SEQ ID NO: 24 (Уитлоу).
[000188] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид клеточной поверхности может содержать усеченный вариант полипептида из суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF). Например, LNGFR представляет собой однопроходный трансмембранный гликопротеин типа I, имеющий внеклеточный домен со свернутой структурой, частично обусловленной образованием дисульфидной связи между остатками цистеина в белке. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий LNGFR или его часть, содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155 (кодирующей K29-N250 внеклеточного домена LNGFR), SEQ ID NO: 157 (кодирующей E65-N250, включая остатки цистеина 2, 3, 4, способные образовывать дисульфидные связи) и SEQ ID NO: 159 (кодирующей R108-N250, включая остатки цистеина 3, 4, способные образовывать дисульфидные связи). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения LNGFR по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156 (содержащей K29-N250 внеклеточного домена LNGFR), SEQ ID NO: 158 (содержащей E65-N250, включая остатки цистеина 2, 3, 4, способные образовывать дисульфидные связи) и SEQ ID NO: 160 (содержащей R108-N250, включая остатки цистеина 3, 4, способные образовывать дисульфидные связи).
[000189] Согласно настоящему изобретению предложены полипептидные конструкции, содержащие полипептиды LNGFR, которые усечены по любым аминокислотам, доменам или фрагментам эндогенного LNGFR. Согласно настоящему изобретению полипептид LNGFR может содержать полипептид LNGFRt. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид LNGFR состоит или по существу состоит из полипептида клеточной поверхности, содержащего полипептид LNGFRt. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид LNGFR может содержать полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид LNGFRt в дополнение к другим доменам LNGFR (например, трансмембранному домену LNGFR).
[000190] Поли пептидная конструкция может содержать усеченный полипептид LNGFR (в настоящей заявке LNGFRt), причем любой его домен или фрагмент усечен относительно белка дикого типа. Например, полипептид LNGFRt может быть усечен по одному или более из трансмембранного домена или его части, внутриклеточного домена или его части или внеклеточного домена или его части. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид LNGFRt может быть усечен по одному или более повторам TNFR-Cys, которые образуют природный связывающий домен для его лигандов (например, NGF, BDNF, NTF3 и NTF4). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция содержит полипептид LNGFRt, содержащий весь внеклеточный домен (SEQ ID NO: 156). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая полипептид LNGFRt, гибридизована с трансмембранным доменом LNGFR. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий полипептид LNGFRt, соединенный с трансмембранным доменом LNGFR, содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 161 (LNGFRt1). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид LNGFRt, соединенный с трансмембранным доменом LNGFR, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 162 (LNGFRt1).
[000191] Полипептидная конструкция, содержащая полипептид LNGFRt, может содержать любой трансмембранный домен, включая трансмембранный домен, который содержит домен димеризации или не содержит домен димеризации. Например, полипептидная конструкция может содержать полипептид LNGFRt, соединенный с трансмембранным доменом LNGFR или его фрагментом. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид LNGFRt может быть гибридизован (например, за счет линкера) с трансмембранным доменом или его фрагментом, происходящим из другого полипептида, включая трансмембранный домен, способный к димеризации. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая полипептид LNGFRt, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 163 (LNGFRt2; полный внеклеточный домен LNGFR; линкер GS и трансмембранный домен CD28); SEQ ID NO: 164 (LNGFRt3; фрагмент внеклеточного домена LNGFR, включая остатки цистеина 2-4, пептидный линкер GS и трансмембранный домен CD28), SEQ ID NO: 165 (LNGFRt3; фрагмент внеклеточного домена LNGFR, включая остатки цистеина 3-4, пептидный линкер GS и трансмембранный домен CD28); SEQ ID NO: 166 (LNGFRt5; фрагмент внеклеточного домена LNGFR, включая остатки цистеина 3-4, линкер GS и трансмембранный домен гликофорина A), SEQ ID NO: 167 (LNGFRt6; фрагмент внеклеточного домена LNGFR, включая остатки цистеина 3-4, линкер GS и трансмембранный домен гликофорина А); и SEQ ID NO: 168 (LNGFRt7; фрагмент внеклеточного домена LNGFR, содержащий остатки цистеина 3-4, линкер GS и трансмембранный домен гликофорина А-интегрина β3).
[000192] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая полипептид LNGFRt, может быть гибридизована с трансмембранным доменом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 26 (гликофорин A E91-R116), SEQ ID NO: 28 (гликофорин А I92-I114), SEQ ID NO: 30 (гликофорин А(I92-L109).интегрин β3 (A737-W741), SEQ ID NO: 32 (дзета-цепь CD3), SEQ ID NO: 34 (CD8α), SEQ ID NO: 36 (CD28), SEQ ID NO: 38 (CTLA4) и SEQ ID NO: 40 (LNGFR).
[000193] Полипептидная конструкция, содержащая полипептид LNGFRt, может содержать любой сигнальный пептид, способный направлять полипептидную конструкцию к клеточной поверхности. Например, полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид LNGFRt, может быть гибридизован с сигнальным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 2 (ГМ-КСФRα), SEQ ID NO: 4 (каппа Ig), SEQ ID NO: 6 (иммуноглобулин E), SEQ ID NO: 8 (CD8α), SEQ ID NO: 10 (TVB2), SEQ ID NO: 12 (CD52) или SEQ ID NO: 14 (LNFGR).
[000194] Полипептидная конструкция, содержащая полипептид LNGFRt, может содержать любой пептидный линкер (или согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не содержит пептидный линкер). Например, полипептид клеточной поверхности, содержащий полипептид LNGFRt, может быть гибридизован с пептидным линкером, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 16 (GSG), SEQ ID NO: 18 (SGSG), SEQ ID NO: 20 ((G4S)3), SEQ ID NO: 22 ((G4S)4) и SEQ ID NO: 24 (Уитлоу).
Полинуклеотидные конструкции
Вектор
[000195] Полипептидные конструкции, описанные в настоящей заявке, могут кодироваться одним или более полинуклеотидами, встроенными в модифицированную клетку с помощью вектора. В настоящей заявке «вектор экспрессии» или «вектор» представляет собой любой генетический элемент, например, плазмиду, хромосому, вирус, транспозон, который функционирует как автономная единица репликации полинуклеотида внутри клетки (т.е. способен к репликации под собственным контролем) или становится способным к репликации путем вставки в хромосому клетки-хозяина с помощью присоединения к нему другого полинуклеотидного сегмента, чтобы осуществить репликацию и/или экспрессию присоединенного сегмента. Подходящие векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, транспозоны, бактериофаги и космиды. Векторы могут содержать полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для осуществления лигирования или вставки вектора в целевую клетку-хозяина и для осуществления экспрессии присоединенного сегмента. Такие последовательности различаются в зависимости от организма хозяина; они включают промоторные последовательности для осуществления транскрипции, энхансерные последовательности для усиления транскрипции, последовательности сайтов связывания рибосомы и последовательности терминации транскрипции и трансляции. Согласно другому варианту векторы экспрессии могут быть способны непосредственно экспрессировать закодированные в них продукты последовательности нуклеиновой кислоты без лигирования или интеграции вектора в последовательности ДНК клетки-хозяина.
[000196] Вектор также может содержать «ген селективного маркера». В настоящей заявке термин «ген селективного маркера» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая позволяет осуществлять специфический положительный или отрицательный отбор клеток, экспрессирующих последовательность нуклеиновой кислоты, в присутствии соответствующего селективного агента. Подходящие селективные маркерные гены известны в данной области техники и описаны, например, в международных публикациях заявок на патент WO 1992/08796 и WO 1994/28143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980); и патентах США №№5122464 и 5770359.
[000197] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой «эписомальный вектор экспрессии» или «эписому», которые способны реплицироваться в клетке-хозяине и сохраняются как внехромосомный сегмент ДНК в клетке-хозяине в присутствии соответствующего селективного давления (см. например, Conese et al., Gene THERapy, 11:1735-1742 (2004)). Типичные коммерчески доступные эписомальные векторы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, эписомальные плазмиды, в которых применяется ядерный антиген 1 вируса Эпштейна-Барр (EBNA1) и точка начала репликации (oriP) вируса Эпштейна-Барр (EBV). Векторы pREP4, рСЕР4, pREP7 и pcDNA3.1 от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США) и рВК-CMV от Stratagene (Ла-Йолла, Калифорния, США) представляют собой неограничивающие примеры эписомального вектора, в котором применяется Т-антиген и точка начала репликации SV40 вместо EBNA1 и oriP.
[000198] Согласно настоящему изобретению предложена полипептидная конструкция, которая может содержать сигнальный пептид, трансмембранный домен, полипептид клеточной поверхности, содержащий усеченный вариант природного полипептида, и необязательный пептидный линкер, соединяющий трансмембранный домен с полипептидом клеточной поверхности. Например, на ФИГ. 4А проиллюстрирован вариант реализации полипептидной конструкции, обладающей функцией клеточной метки. Усеченный вариант выступает во внеклеточный матрикс за счет пептидного линкера, соединяющегося с трансмембранным доменом. Усеченный вариант может содержать один или более эпитопов для антитела, направленного против усеченного варианта (например, добавленного экзогенно), которое может распознавать и связываться с усеченным вариантом/клеточной меткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывание антитела с усеченным вариантом может привести к истощению клеток (например, за счет АЗКЦ), что может быть благоприятным, например, во время адоптивной клеточной терапии, когда клетка была модифицирована для экспрессии одной или более дополнительных молекул, таких как цитокин, TCR и/или CAR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения разные полипептидные конструкции содержат константный трансмембранный домен и сигнальный пептид, но различаются по идентичности усеченного варианта, встроенного в полипептидную конструкцию. Например, разные полипептидные конструкции могут содержать разные усеченные варианты одного и того же природного полипептида. Если две полипептидные конструкции содержат разные усеченные варианты одного и того же природного полипептида, полипептидные конструкции могут дополнительно различаться в зависимости от наличия/отсутствия пептидного линкера в полипептидной конструкции или длины пептидного линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пептидный линкер каждой полипептидной конструкции имеет такой размер, чтобы поддерживать относительно постоянное расстояние между дистальным концом конкретного усеченного варианта и поверхностью клетки.
[000199] Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды и способы применения полинуклеотидов, чтобы облегчить конструирование полипептидных конструкций для применения во время иммунотерапии. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид может содержать вектор, содержащий последовательность, кодирующую сигнальный пептид и трансмембранный домен (например, как содержащий трансмембранный домен димеризации, так и не содержащий его). Вектор может обеспечивать клонирование вставки между сигнальным пептидом и трансмембранным доменом так, что вставка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный усеченный вариант и необязательно пептидный линкер. Согласно другому варианту могут быть предложены векторы, которые содержат полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид, конкретный усеченный вариант и необязательно линкер, и обеспечивают вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей трансмембранный домен, рядом с кодирующей последовательностью для усеченного варианта или линкера. Настоящее изобретение позволяет облегчать получение полипептидных конструкций, содержащих любую комбинацию сигнального пептида, усеченного варианта, трансмембранного домена и линкера, обеспечивая ряд векторов, которые сохраняют конкретный домен или домены в качестве константных в готовой полипептидной конструкции, но позволяют осуществлять обмен домена, который может варьироваться между полипептидными конструкциями.
Модификации вектора
[000200] Полинуклеотидный вектор, пригодный для способов и композиций, описанных в настоящей заявке, может представлять собой вектор, соответствующий стандартам Надлежащей производственной практики (GMP). Например, вектор по стандартам GMP может быть чище, чем вектор, не соответствующий стандартам GMP. В некоторых случаях чистота может быть измерена с помощью бионагрузки. Например, бионагрузка может представлять собой наличие или отсутствие аэробов, анаэробов, спорообразователей, грибков или их комбинаций в векторной композиции. В некоторых случаях чистый вектор может иметь низкое содержание эндотоксинов или не содержать эндотоксины. Чистоту также можно измерить с помощью секвенирования двойной цепи с применением прохода от праймера («primer-walking»). Идентичность плазмиды может быть источником определения чистоты вектора. Вектор по стандартам GMP в соответствии с настоящим изобретением может быть на 10-99% более чистым, чем вектор, не соответствующий стандартам GMP. Вектор по стандартам GMP может быть на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% более чистым, чем вектор, не соответствующий требованиям GMP, как измерено на основании наличия бионагрузки, эндотоксина, секвенирования или их комбинаций.
[000201] В некоторых случаях в конце программы первого гена применяется последовательность терминатора. Последовательность терминатора может гарантировать, что синтез транскрипта заканчивается до начала программы второго гена. Например, векторы экспрессии могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны с 5', а иногда и из 3', нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области могут содержать нуклеотидные сегменты, транскрибированные как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК. Клетки, содержащие вектор экспрессии, выращивают в условиях, которые обеспечивают экспрессию целевого полипептида, либо in vivo, либо in vitro.
[000202] В некоторых случаях на конце первого полипептида, кодируемого полинуклеотидом в векторе, можно применять спейсерную последовательность. В других случаях спейсерная последовательность может применяться на конце второго гена в векторе. Спейсерную последовательность также можно применять после первого гена и второго гена в векторе.
[000203] Эти векторы можно применять для экспрессии полипептида, кодируемого геном или частью представляющего интерес гена. Часть гена или ген могут быть вставлены с применением любого способа, будь то вирусного или невирусного. Например, способ может представлять собой невирусную методику.
Дополнительные признаки, кодируемые конструкциями
[000204] Полинуклеотиды, раскрытые в настоящей заявке, могут кодировать один или более белков в дополнение к полинуклеотидным конструкциям, описанным выше, или одновременно с ними. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные конструкции могут быть соединены с химерным антигенным рецептором (CAR), Т-клеточным рецептором (TCR) и/или цитокином.
Химерные рецепторы
2
3
[000205] Некоторые варианты реализации, описанные в настоящей заявке, включают полинуклеотид, который кодирует химерный рецептор, экспрессируемый на поверхности клетки. В некоторых случаях химерный рецептор содержит антигенсвязывающую область, которая обеспечивает распознавание и связывание с антигеном, например, опухолевым антигеном, таким как ассоциированный с опухолью антиген или специфический для опухоли антиген. В некоторых случаях антигенсвязывающая область содержит антитело или его связывающий фрагмент, например, Fab, Fab', F(ab'), F(ab'), scFv, sc(Fv)2, dsFv, диатело, минитело и нанотело или их связывающие фрагменты. В некоторых случаях антигенсвязывающая область содержит scFv. В некоторых случаях химерный рецептор содержит scFv (например, химерный антигенный рецептор (CAR)). В некоторых случаях химерный антигенный рецептор содержит рецептор распознавания структур. В других случаях химерный рецептор содержит модифицированный Т-клеточный рецептор (TCR).
Химерные антигенные рецепторы (CAR)
[000206] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка, экспрессирующая полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке, также экспрессирует один или более химерных антигенных рецепторов (CAR).
[000207] Химерный антигенный рецептор (CAR), описанный в настоящей заявке, представляет собой модифицированный рецептор, который придает экзогенную специфичность иммунной эффекторной клетке. В некоторых случаях CAR содержит внеклеточный домен (эктодомен), который содержит антигенсвязывающий домен, область стебля, трансмембранный домен и внутриклеточный (эндодомен) домен. В некоторых случаях внутриклеточный домен дополнительно содержит один или более внутриклеточных сигнальных доменов. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит антигенсвязывающий домен, область стебля, трансмембранный домен, один или более ко стимулирующих доменов и сигнальный домен для активации Т-клеток.
[000208] Согласно вариантам реализации CAR согласно настоящему изобретению содержит специфичный в отношении мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающим фрагментом. Согласно вариантам реализации CAR согласно настоящему изобретению модифицирован для нацеливания на опухолевый антиген, представляющий интерес, путем модификации целевого антигенсвязывающего фрагмента, который специфично связывается с заранее определенным антигеном в опухолевой клетке. Применительно к настоящему изобретению «опухолевый антиген» или «антиген гиперпролиферативного нарушения» или «антиген, ассоциированный с гиперпролиферативным нарушением» относится к антигенам, которые являются общими для конкретных гиперпролиферативных нарушений, таких как рак.
2
2
[000209] Антигенсвязывающий домен может содержать области, определяющие комплементарность, моноклонального антитела, вариабельные области моноклонального антитела и/или их антигенсвязывающие фрагменты. Область, определяющая комплементарность (CDR), представляет собой короткую аминокислотную последовательность, обнаруженную в вариабельных доменах белков антигенного рецептора (например, иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора), которая принимает структуру, комплементарную структуре антигена, и, следовательно, обеспечивает специфичность рецептора в отношении этого конкретного антигена. Каждая полипептидная цепь антигенного рецептора может содержать три CDR (CDR1, CDR2 и CDR3). В некоторых случаях антигенсвязывающий домен содержит F(ab'), Fab', Fab, Fv или scFv. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой scFv. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой Fab. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой Fab'. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой F(ab'). В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой Fv.
[000210] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR, описанный в настоящей заявке, содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с эпитопом на CD19, CD20, CD33, CD44, ВСМА, CD123, EGFRvIII, α-рецепторе фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающем фолат белке, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелине, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72 или VEGF-R2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR, описанный в настоящей заявке, содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с эпитопом на CD19, CD33, ВСМА, CD44, α-рецепторе фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающем фолат белке, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелине, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 и VEGF-R2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR, описанный в настоящей заявке, содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с эпитопом на CD19 или CD33. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с эпитопом на CD19. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с эпитопом на CD33. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения CAR или химерный рецептор, или антигенсвязывающий полипептид, описанный в настоящей заявке, содержит аутоантиген или антигенсвязывающую область, которая связывается с эпитопом на HLA-A2, гликопротеине миелина олигодендроцитов (MOG), факторе VIII (FVIII), MAdCAMI, SDF1 или коллагене типа II.
[000211] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотиды, полипептиды и способы, описанные в настоящей заявке, можно применять для лечения гиперпролиферативного заболевания, такого как рак, аутоиммунного заболевания, или для лечения инфекции, такой как вирусная, бактериальная или паразитарная инфекция. Согласно некоторым аспектам антиген представляет собой антиген, который повышен в раковых клетках, в аутоиммунных клетках или в клетках, которые инфицированы вирусом, бактериями или паразитом. Патогены, которые могут являться мишенями, включают, но не ограничиваются ими, таких патогенов как плазмодий, трипаносома, Aspergillus, Candida, вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, HSV, HPV, RSV, EBV, CMV, вирус JC, вирус ВК или вирус Эбола. Аутоиммунные заболевания могут включать болезнь «трансплантат против хозяина», ревматоидный артрит, волчанку, целиакию, болезнь Крона, синдром Шегрена, ревматическую полимиалгию, рассеянный склероз, нейромиелит зрительного нерва, анкилозирующий спондилит, диабет 1 типа, очаговую алопецию, васкулит, височный артериит, буллезный пемфигоид, псориаз, обыкновенную пузырчатку или аутоиммунный увеит.
[000212] Патоген, распознаваемый CAR, может представлять собой по существу любой вид патогена, но согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения патоген представляет собой грибок, бактерии или вирус. Примеры вирусных патогенов включают членов семейств Adenoviridae, вирус Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирус (CMV), респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус JC, вирус ВК, HPV, HSV, семейство вирусов HHV, семейство вирусов гепатита, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae и Togaviridae. Примерные патогенные вирусы вызывают оспу, грипп, эпидемический паротит, корь, ветряную оспу, лихорадку Эбола и краснуху. Примерные патогенные грибки включают Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis и Stachybotrys. Примерные патогенные бактерии включают Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Staphylococcus, Helicobacter, E, coil, Rickettsia, Bacillus, Bordetella, Chlamydia, Spirochetes и Salmonella. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рецептор распознавания патогена Dectin-1 можно применять для получения CAR, который распознает углеводную структуру на клеточной стенке грибков, таких как Aspergillus. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CAR могут быть получены на основе антитела, распознающего вирусные детерминанты (например, гликопротеины из CMV и Эбола), чтобы остановить вирусные инфекции и патологию.
[000213] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения область «стебля» или область «спейсера», или «шарнира» применяется для соединения антигенсвязывающего домена с трансмембранным доменом. В некоторых случаях «домен стебля» или «область стебля» содержат любой олигонуклеотид или полипептид, функция которого заключается в соединении трансмембранного домена либо с внеклеточным доменом, либо с цитоплазматическим доменом в полипептидной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения он достаточно гибок, чтобы обеспечить ориентацию антигенсвязывающего домена в разных направлениях для облегчения распознавания антигена. В некоторых случаях область стебля содержит шарнирную область из IgG1. В других случаях область стебля содержит область иммуноглобулина СН2СН3 и необязательно части CD3. В некоторых случаях область стебля содержит шарнирную область CD8α, шарнирную область IgG4-Fc из 12 аминокислот (ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 225)) или шарнирные области lgG4, описанные в WO/2016/073755.
[000214] Трансмембранный домен может происходить как из природного, так и из синтетического источника. Если источник является природным, домен может происходить из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Подходящие трансмембранные домены могут включать трансмембранную область (области) альфа, бета или дзета-цепи Т-клеточного рецептора; или трансмембранную область из CD28, CD3-эпсилон, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. Согласно другому варианту трансмембранный домен может быть синтетическим и может содержать гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения триплет фенилаланина, триптофана и валина находится на одном или обоих концах синтетического трансмембранного домена. Необязательно короткий олигонуклеотидный или полипептидный линкер, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, длиной от 2 до 10 аминокислот, может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер представляет собой глицин-сериновый линкер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит трансмембранный домен CD8α или трансмембранный домен CD3ζ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит трансмембранный домен CD8α. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит трансмембранный домен CD3ζ. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит трансмембранный домен димеризации.
[000215] Внутриклеточный домен может содержать один или более костимулирующих доменов. Примерные костимулирующие домены включают, но не ограничиваются ими, CD8, CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмент или комбинацию. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит один или более или два или более ко стимулирующих доменов, выбранных из CD8, CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит один или более или два или более ко стимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит один или более или два или более ко стимулирующих доменов, выбранных из CD8, CD28, 4-1 ВВ (CD137) или их фрагмента или комбинации. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит один или более или два или более костимулирующих доменов, выбранных из CD28, 4-1 ВВ (CD137) или их фрагмента или комбинации. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит костимулирующие домены CD28 и 4-1 ВВ (CD137) или их соответствующие фрагменты. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит костимулирующие домены CD28 и ОХ40 (CD134) или их соответствующие фрагменты. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит костимулирующие домены CD8 и CD28 или их соответствующие фрагменты. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит костимулирующие домены CD28 или их фрагмент. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит костимулирующие домены 4-1 ВВ (CD137) или их фрагмент. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит костимулирующие домены ОХ40 (CD134) или их фрагмент. В некоторых случаях CAR, описанный в настоящей заявке, содержит костимулирующие домены CD8 или их фрагмент.
[000216] Внутриклеточный сигнальный домен, также известный как цитоплазматический домен, CAR согласно настоящему изобретению обуславливает активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую был помещен CAR. Термин «эффекторная функция» относится к специализированной функции клетки. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или вспомогательную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин «внутриклеточный сигнальный домен» относится к части белка, которая передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Несмотря на то, что обычно можно применять полный внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях нет необходимости использовать полную цепь. В той степени, в которой применяется усеченная часть внутриклеточного сигнального домена, такая усеченная часть может применяться вместо интактной цепи, при условии, что она передает сигнал эффекторной функции. Таким образом, термин «внутриклеточный сигнальный домен» подразумевает включение любой усеченной части внутриклеточного сигнального домена, достаточной для передачи сигнала эффекторной функции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный домен дополнительно содержит сигнальный домен для активации Т-клеток. В некоторых случаях сигнальный домен для активации Т-клеток содержит домен, полученный из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b или CD66d. В некоторых случаях сигнальный домен для активации Т-клеток содержит домен, происходящий из CD3ζ.
[000217] Термин «функциональная часть», применительно к CAR, относится к любой части или фрагменту CAR согласно настоящему изобретению, причем эта часть или фрагмент сохраняет биологическую активность CAR, частью которого она (он) является (исходный CAR). В отношении последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный CAR, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональную часть CAR, может кодировать белок, содержащий, например, примерно 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% или более исходного CAR.
[000218] В настоящей заявке термин «функциональный вариант» относится к полипептиду или белку, обладающему существенной или значительной идентичностью последовательности или сходством с эталонным полипептидом, и сохраняющему биологическую активность эталонного полипептида, вариантом которого он является. Функциональные варианты включают, например, те варианты CAR, описанные в настоящей заявке (исходный CAR), которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени в сходной степени, той же степени или в большей степени, как и исходный CAR. Применительно к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный CAR, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный вариант CAR, может быть, например, примерно на 10%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 50%, примерно на 65%, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 95% или примерно на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный CAR.
[000219] Полинуклеотидные конструкции, раскрытые в настоящей заявке, могут быть экспрессированы совместно с CAR в модифицированной клетке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция и CAR могут кодироваться одним транскриптом. Преимущество кодирования полипептидной конструкции, содержащей усеченный вариант и CAR в одном и том же транскрипте, заключается в том, что модифицированная клетка, вырабатывающая белок CAR, также с достаточной вероятностью вырабатывает полипептидную конструкцию. Соответственно, если во время иммунотерапии требуется вмешательство для уменьшения экспрессии CAR (например, для уменьшения побочных эффектов терапии), модифицированная клетка, экспрессирующая полипептидные конструкции совместно с CAR, может быть активирована для ответа в относительно короткий промежуток времени на введение экзогенных антител, которые нацелены на клеточные метки, обеспеченные усеченными вариантами, раскрытыми в настоящей заявке.
CD19-специфичные CAR
[000220] CD19 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности из суперсемейства иммуноглобулинов. В некоторых случаях CD19 был обнаружен в плотных опухолях, таких как рак поджелудочной железы, рак печени и рак простаты.
[000221] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент CAR, описанный в настоящей заявке, является специфичным для CD19. CD19-специфичный CAR, экспрессируемый на клеточной поверхности, может перенаправлять специфичность Т-клеток к CD19 человека. Согласно вариантам реализации антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), содержащий вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела к CD19, специфичного в отношении целевого антигена, соединенные гибким линкером, таким как глицин-сериновый линкер или линкер Уитлоу. Согласно вариантам реализации scFv представляют собой SJ25C1 и/или FMC63. Согласно вариантам реализации scFv является гуманизированным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH и VL, которые направленно соединены, например, от N- к С-концу, VH-линкер-VL или VL-линкер-VH.
[000222] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичный CAR, в котором антигенсвязывающий домен содержит scFv, который связывает CD19. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19.
[000223] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается JCAR014, JCAR015, JCAR017 или 19-28z CAR (Juno THERapeutics). Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, в которой антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается JCAR014, JCAR015, JCAR017 или 19-28z CAR (Juno THERapeutics). В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена СD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более ко стимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000224] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, содержащую антигенсвязывающий домен scFv, причем указанный антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается JCAR014, JCAR015, JCAR017 или 19-28z CAR (Juno THERapeutics). В некоторых случаях С019-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000225] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD19-специфичная CAR-T-клетка, описанная в настоящей заявке, содержит антитело к CD19, описанное в US20160152723.
[000226] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается КТЕ-С19 (Kite Pharma, Inc.). Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, в которой антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается КТЕ-С19. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000227] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, содержащую антигенсвязывающий домен scFv, причем указанный антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается КТЕ-С19. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000228] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD19-специфичная CAR-T-клетка, описанная в настоящей заявке, содержит антитело к CD19, описанное в WO 2015187528, или его фрагмент или производное.
[000229] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается CTL019 (Novartis). Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, в которой антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается CTL019. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000230] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, содержащую антигенсвязывающий домен scFv, причем указанный антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается CTL019. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается UCART19 (Cellectis). Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, в которой антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается UCART19. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12,OX40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000231] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, содержащую антигенсвязывающий домен scFv, и причем указанный антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается UCART19. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000232] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается ВРХ-401 (Bellicum). Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, в которой антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается ВРХ-401. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000233] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-клетку, содержащую антигенсвязывающий домен scFv, причем указанный антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается ВРХ-401. В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000234] В некоторых случаях антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается блинатумомабом (Amgen), колтуксимабравтанзином (ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis), MOR208 (Morphosys AG/Xencor Inc.), MEDI-551 (Medimmune), денинтузумабмафодотином (Seattle Genetics), B4 (или DI-B4) (Merck Serono), таплитумомабпапатоксом (National Cancer Institute), XmAb 5871 (Amgen/Xencor, Inc.), MDX-1342 (Medarex) или AFM11 (Affimed). В некоторых случаях CD19-специфичный CAR дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
2
[000235] Некоторые варианты реализации, описанные в настоящей заявке, включают CD19-специфичную CAR-T-кпетку, в которой антигенсвязывающий домен содержит F(ab'), Fab', Fab, Fv или scFv. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается блинатумомабом (Amgen), колтуксимабравтанзином (ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis), MOR208 (Morphosys AG/Xencor Inc.), MEDI-551 (Medimmune), денинтузумабмафодотином (Seattle Genetics), B4 (или DI-B4) (Merck Serono), таплитумомабпапатоксом (National Cancer Institute), XmAb 5871 (Amgen/Xencor, Inc.), MDX-1342 (Medarex) или AFM11 (Affimed). В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-кпетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000236] В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка, описанная в настоящей заявке, содержит антигенсвязывающий домен scFv, причем указанный антигенсвязывающий домен распознает эпитоп на CD19, который также распознается блинатумомабом (Amgen), колтуксимабравтанзином (ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis), MOR208 (Morphosys AG/Xencor Inc.), MEDI-551 (Medimmune), денинтузумабмафодотином (Seattle Genetics), B4 (или DI-B4) (Merck Serono), таплитумомабпапатоксом (National Cancer Institute), XmAb 5871 (Amgen/Xencor, Inc.), MDX-1342 (Medarex) или AFM11 (Affimed). В некоторых случаях CD19-специфичная CAR-T-клетка дополнительно содержит трансмембранный домен, выбранный из трансмембранного домена CD8-альфа или трансмембранного домена CD3ζ; один или более костимулирующих доменов, выбранных из CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, ОХ40 (CD134) или их фрагмента или комбинации; и сигнальный домен из CD3ζ.
[000237] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий CAR, содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, включающего SEQ ID NO: 169 (кодирующую CD19-CD3ζ CAR), SEQ ID NO: 171 (кодирующую CD19-CD137-CD3ζ CAR), SEQ ID NO: 173 (кодирующую CD19-CD28-CD3ζ CAR) и SEQ ID NO: 175 (кодирующую CD19-CD28-CDζ CAR, дополнительно содержащий спейсер Fc IgG4). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность, содержащая CAR, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 170 (CD19-CD3ζ CAR), SEQ ID NO: 172 (CD19-CD137-CD3ζ CAR), SEQ ID NO: 174 (CD19-CD28-CD3ζ CAR) и SEQ ID NO: 176 (CD19-CD28-CD3ζ CAR, дополнительно содержащий спейсер Fc IgG4).
[000238] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, раскрытый в настоящей заявке, может содержать оптимизированную по кодонам последовательность кДНК, кодирующую CAR, направленный против CD19, и расщепляемый линкер Т2А, соединяющийся с полипептидом клеточной поверхности (например, HER1t). Например, цитотоксические Т-лимфоциты могут быть модифицированы для экспрессии CD19-специфичного химерного антигенного рецептора (CAR), который передает сигналы за счет цитоплазматического костимулирующего домена (CD28), гибридизованного с цитоплазматическим доменом CD3ζ;. Этот полипептид может дополнительно содержать С-концевой расщепляемый линкер 2А, за которым следует, например, внеклеточная метка клетки, содержащая, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, усеченный HER1 человека (HER1t), усеченный CD20 (CD20t), усеченный CD52 (CD52t) или усеченный LNGFR (LNGFRt). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид может содержать полипептидную конструкцию, содержащую усеченный вариант, предшествующий CD19-специфичному CAR (например, посредством расщепляемого линкера Р2А).
[000239] Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды и полипептиды, кодирующие CAR и любую полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая CAR, направленный против CD19, расщепляемый линкер Т2А и полипептид клеточной поверхности, кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 181 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.Р2А.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t1 из SEQ ID NO: 56) и SEQ ID NO: 185 (CD19-CD137-CD3ζ CAR.E2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t7 из SEQ ID NO: 68).
[000240] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая CAR, направленный против CD19, расщепляемый линкер Т2А и полипептид клеточной поверхности, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 179 (CD19-CD137-CD3ζ CAR.T2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t из SEQ ID NO: 55), SEQ ID NO: 180 (CD19-CD137-CD3ζ CAR.T2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t из SEQ ID NO: 55), SEQ ID NO: 182 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.P2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t1 из SEQ ID NO: 57), SEQ ID NO: 183 (сигнальный пептид каппа Ig.HER1t1.Р2А.сигнальный пептид CD8α.CD19-CD28-CD3ζ CAR, где HER1t1 из SEQ ID NO: 57), SEQ ID NO: 184 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.фурин-T2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t1 из SEQ ID NO: 57), SEQ ID NO: 186 (CD19-CD137-CD3ζ CAR.E2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t7 из SEQ ID NO: 69), SEQ ID NO: 187 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.фурин-T2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t8 из SEQ ID NO: 73), SEQ ID NO: 188 (CD19-CD137-CD3ζ CAR.E2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t8 из SEQ ID NO: 73), SEQ ID NO: 189 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.фурин-Т2А.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t9 из SEQ ID NO: 77), SEQ ID NO: 190 (CD19-CD137-CD3ζ CAR.E2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t9 из SEQ ID NO: 77), SEQ ID NO: 191 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.фурин-T2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t10 из SEQ ID NO: 81), SEQ ID NO: 192 (CD19-CD137-CD3ζ CAR.E2A.сигнальный пептид каппа Ig.HER1t10 из SEQ ID NO: 81), SEQ ID NO: 194 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.P2A.CD20), SEQ ID NO: 195 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.P2A.CD20t1 из SEQ ID NO: 109), SEQ ID NO: 196 (CD19-CD28-CD3ζ CAR.P2A.CD20t4 из SEQ ID NO: 115), SEQ ID NO: 197 (CD52t3.P2A.сигнальный пептид CD8α.CD19-CD28-CD3ζ CAR, где CD52t3 из SEQ ID NO: 149) и SEQ ID NO: 198 (сигнальный пептид каппа Ig.LNGFRt4.P2A.сигнальный пептид CD8a.CD19-CD28-CD3ζ CAR, где LNGFRt4 из SEQ ID NO: 165).
Модифицированный Т-клеточный рецептор (TCR)
[000241] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, описанным в настоящей заявке, содержит модифицированный Т-клеточный рецептор. Т-кпеточный рецептор (TCR) состоит из двух цепей (αβ или γδ), которые спариваются на поверхности Т-клетки с образованием гетеродимерного рецептора. В некоторых случаях αβ TCR экспрессируется на большинстве Т-клеток в организме и, как известно, участвует в распознавании специфичных ГКГС-ограниченных антигенов. Каждая α- и β-цепь состоит из двух доменов: константного домена (С), который присоединяет белок к клеточной мембране и ассоциирован с инвариантными субъединицами сигнального аппарата CD3; и вариабельного домена (V), который обеспечивает распознавание антигена с помощью шести петель, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR). В некоторых случаях каждый из V-доменов содержит три CDR; например, CDR1, CDR2 и CDR3, при этом CDR3 является гипервариабельным участком. Эти CDR взаимодействуют с комплексом, образованным антигенным пептидом, связанным с белком, кодируемым главным комплексом гистосовместимости (пепГКГС) (например, комплексом HLA-A, HLA-В, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA или HLA-DRB1). В некоторых случаях константный домен дополнительно содержит соединяющую область, которая соединяет константный домен с вариабельным доменом. В некоторых случаях бета-цепь дополнительно содержит короткую область разнообразия, которая составляет часть соединяющей области.
[000242] В некоторых случаях такие TCR способны взаимодействовать со специфическим опухолевым антигеном, например, NY-ESO, Mage A3, Titin. В других случаях такие TCR способны взаимодействовать со специфическими неоантигенами, экспрессируемыми в опухоли пациента (т.е. специфические для пациента соматические, несинонимические мутации, экспрессируемые опухолями). В некоторых случаях аффинность модифицированных TCR может быть повышена.
[000243] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения TCR описан с применением номенклатуры TCR Международной базы данных по иммуногенетике (IMGT), а также ссылок на последовательности TCR из общедоступной базой данных IMGT. Например, может существовать несколько типов вариабельных областей альфа-цепи (Vα) и несколько типов вариабельных областей бета-цепи (Vβ), отличающихся своим каркасом, последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3. Как таковой, тип Vα может упоминаться в номенклатуре IMGT с помощью уникального номера TRAV. Например, «TRAV21» определяет область Vα TCR, имеющую уникальный каркас и последовательности CDR1 и CDR2, и последовательность CDR3, которая частично определена аминокислотной последовательностью, сохраняющейся среди разных TCR, но которая также содержит аминокислотную последовательность, которая варьируется среди разных TCR. Аналогичным образом, «TRBV5-1» определяет область Vβ TCR, имеющую уникальный каркас и последовательности CDR1 и CDR2, но только с частично определенной последовательностью CDR3.
[000244] В некоторых случаях область разнообразия бета-цепи упоминается в номенклатуре IMGT как аббревиатура TRBD.
[000245] В некоторых случаях уникальные последовательности, определенные с помощью номенклатуры IMGT, широко известны и доступны для тех, кто работает в области TCR. Например, их можно найти в общедоступной базе данных IMGT и в «Т cell Receptor Factsbook», (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8.
[000246] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения αβ-гетеродимерный TCR, например, трансфецируют в виде полноразмерных цепей, имеющих оба цитоплазматический и трансмембранный домены. В некоторых случаях TCR содержат введенную дисульфидную связь между остатками соответствующих константных доменов, как описано, например, в WO 2006/000830.
[000247] В некоторых случаях TCR, описанные в настоящей заявке, имеют одноцепочечный формат, например, см. WO 2004/033685. Одноцепочечные форматы включают полипептиды αβ TCR типов Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, Vα-Cα-L-Vβ-Cβ, где Vα и Vβ представляют собой вариабельные области α и β TCR, соответственно, Сα и Сβ представляют собой константные области α и β TCR, соответственно, и L представляет собой последовательность линкера. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения одноцепочечные TCR согласно настоящему изобретению могут иметь введенную дисульфидную связь между остатками соответствующих константных доменов, как описано в WO 2004/033685.
[000248] TCR, описанный в настоящей заявке, может быть ассоциирован с детектируемой меткой, терапевтическим агентом или модифицирующим ФК фрагментом.
[000249] Примерные детектируемые метки для диагностических целей включают, но не ограничиваются ими, флуоресцентные метки, радиоактивные метки, ферменты, зонды нуклеиновых кислот и контрастные реагенты.
[000250] Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды и полипептиды, кодирующие TCR и любую полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, раскрытый в настоящей заявке, может содержать оптимизированную по кодонам последовательность кДНК, кодирующую TCR и расщепляемый линкер Т2А, соединяющийся с полипептидом клеточной поверхности (например, HER1t). Например, цитотоксический Т-лимфоцит может быть модифицирован для экспрессии полипептида TCR, который дополнительно содержит С-концевой расщепляемый линкер 2А, за которым следует, например, внеклеточная метка клетки, содержащая, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, усеченный HER1 человека (HER1t), усеченный CD20 (CD20t), усеченный CD52 (CD52t) или усеченный LNGFR (LNGFRt). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид может содержать полипептидную конструкцию, содержащую усеченный вариант, предшествующий TCR (например, присоединенный за счет расщепляемого линкера Р2А).
Цитокины
[000251] Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептидные клеточные метки и цитокин, или их вариант или производное, а также способы и системы, содержащие вышеуказанное. Цитокин представляет собой вид небольших белков с массой примерно 5-20 кДа, которые участвуют в клеточной сигнализации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитокины могут быть связаны с мембраной или могут быть секретируемыми. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения цитокины могут быть внутриклеточными. В некоторых случаях цитокины включают хемокины, интерфероны, интерлейкины, колониестимулирующие факторы или факторы некроза опухолей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хемокины играют роль хемоаттрактанта для направления миграции клеток и подразделяются на четыре подсемейства: СХС, СС, СХ3С и ХС.Неограничивающие примерные хемокины включают хемокины из подсемейства СС: CCL1, CCL2 (МСР-1), CCL3, CCL4, CCL5 (RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9 (или CCL10), CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 и CCL28; подсемейства СХС: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16 и CXCL17; подсемейства ХС: XCL1 и XCL2; и подсемейства СХ3С: CX3CL1.
[000252] Интерфероны (ИФН) содержат интерферона типа I (например, ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ε, ИФН-κ и ИФН-ω), интерферон типа II (например, ИФН-γ) и интерферон типа III. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ИФН-α дополнительно классифицируется примерно на 13 подтипов, включая ИФНА1, ИФНА2, ИФНА4, ИФНА5, ИФНА6, ИФНА7, ИФНА8, ИФНА10, ИФНА13, ИФНА14, ИФНА16, ИФНА17 и ИФНА21.
[000253] Интерлейкины экспрессируются лейкоцитами или белыми клетками крови и стимулируют развитие и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов и гемопоэтических клеток. Примерные интерлейкины включают ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8 (CXCL8), ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-19, ИЛ-20, ИЛ-21, ИЛ-22, ИЛ-23, ИЛ-24, ИЛ-25, ИЛ-26, ИЛ-27, ИЛ-28, ИЛ-29, ИЛ-30, ИЛ-31, ИЛ-32, ИЛ-33, ИЛ-35 и ИЛ-36.
[000254] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения интерлейкин содержит mbИЛ-15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения mbИЛ-15 представляет собой связанный с мембраной химерный ИЛ-15, который может быть совместно экспрессирован с модифицированной эффекторной клеткой, описанной в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения mbИЛ-15 содержит полноразмерный ИЛ-15 (например, нативный полипептид ИЛ-15) или его фрагмент или вариант, гибридизованный в рамке с полноразмерным ИЛ-ISRα, его функциональным фрагментом или вариантом. В некоторых случаях ИЛ-15 опосредовано соединен с ИЛ-ISRα посредством линкера. В некоторых случаях mbИЛ-15 представляет собой тот, который описан в Hurton et al., «TetHERed IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,» PNAS 2016. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения mbИЛ-15 кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 177. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения mbИЛ-15 по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 178.
[000255] Согласно другому аспекту интерлейкин может содержать ИЛ-12. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ИЛ-12 представляет собой одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12), чувствительный к протеазе ИЛ-12, дестабилизированный ИЛ-12, связанный с мембраной ИЛ-12, интеркалированный ИЛ-12. В некоторых случаях варианты ИЛ-12 представляют собой те, которые описаны в WO 2015/095249, WO 2016/048903, WO 2017/062953, которые все полностью включены посредством ссылки.
[000256] Факторы некроза опухоли (TNF) представляют собой группу цитокинов, которые модулируют апоптоз. В некоторых случаях семейство TNF содержит примерно 19 членов, включая, но не ограничиваясь ими, TNFα, лимфотоксин-альфа (LT-альфа), лимфотоксин-бета (LT-бета), Т-клеточный антиген gp39 (CD40L), CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L и TNF-связанный лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL).
[000257] Колониестимулирующие факторы (КСФ) представляют собой секретируемые гликопротеины, которые взаимодействуют с рецепторными белками на поверхности гемопоэтических стволовых клеток, что впоследствии модулирует пролиферацию и дифференцировку клеток в специфические типы клеток крови. В некоторых случаях КСФ включает макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-КСФ) или промегапоэтин.
[000258] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитокин представляет собой связанный с мембраной цитокин, который совместно экспрессируется с химерным антигенным рецептором и/или TCR, описанными в настоящей заявке.
[000259] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один или более способов, описанных в настоящей заявке, дополнительно включают введение цитокина. В некоторых случаях цитокин включает хемокин, интерферон, интерлейкин, колониестимулирующий фактор или фактор некроза опухоли. В некоторых случаях один или более способов, описанных в настоящей заявке, дополнительно включают введение цитокина, выбранного изхемокина, интерферона, интерлейкина, колониестимулирующего фактора или фактора некроза опухоли. В некоторых случаях один или более способов, описанных в настоящей заявке, дополнительно включают введение цитокина, выбранного из ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-21, ИФН-γ или TNF-α.
[000260] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, раскрытый в настоящей заявке, может содержать оптимизированную по кодонам последовательность кДНК, кодирующую цитокин и расщепляемый линкер Т2А, соединяющийся с полипептидом клеточной поверхности (например, HER1t). Например, цитотоксический Т-лимфоцит может быть модифицирован для экспрессии полипептида, содержащего цитокин и дополнительно содержащего расщепляемый линкер 2А, за которым следует, например, внеклеточная метка клетки, содержащая, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, усеченный HER1 человека (HER1t), усеченный CD20 (CD20t), усеченный CD52 (CD52t) или усеченный LNGFR (LNGFRt). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид может содержать полипептидную конструкцию, содержащую усеченный вариант, предшествующий цитокину (например, присоединенному за счет расщепляемого линкера Р2А).
[000261] Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды и полипептиды, кодирующие цитокин и любую полипептидную конструкцию, описанную в настоящей заявке. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидная конструкция, содержащая цитокин, расщепляемый линкер Т2А и полипептид клеточной поверхности, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 193 (связанный с мембраной ИЛ-15.T2A.HER1t1 из SEQ ID NO: 57).
IRES и линкеры
[000262] Также раскрыты конструкции, содержащие линкеры и элементы IRES для облегчения экспрессии и функциональности полинуклеотидов и полипептидов, описанных в настоящей заявке.
Элементы IRES
[000263] В настоящей заявке термин «сайт внутренней посадки рибосомы (IRES)» может быть предназначен для обозначения сайта внутренней посадки рибосомы. В векторе, содержащем последовательность IRES, первый ген может транслироваться с помощью кэп-зависимого механизма сканирования рибосомой со своей собственной 5'-НТО, тогда как трансляция последующего гена может быть осуществлена с помощью непосредственного привлечения рибосомы к IRES кэп-независимым способом. Последовательность IRES может обеспечивать связывание эукариотических рибосом и начало трансляции без связывания с 5'-кэппированным концом. Последовательность IRES может обеспечить экспрессию нескольких генов с одного транскрипта (Mountford and Smith 1995).
[000264] В настоящей заявке термин «САР» или «кэп» относится к модифицированному нуклеотиду, обычно 7-метилгуанозину, соединенному 3' к 5' (7meG-ppp-G) с 5'-концом эукариотической мРНК, который является обязательным элементом в нормальном пути инициации трансляции во время экспрессии белка с этой мРНК.
[000265] В определенных случаях область IRES может происходить из вируса, такого как пикорнавирус, вирус энцефаломиокардита, последовательности IRES вируса гепатита С. В других случаях последовательность IRES может происходить из вируса энцефаломиокардита. В настоящей заявке термин «EMCV» или «вирус энцефаломиокардита» относится к изоляту любого члена или штамму вида вируса энцефаломиокардита из рода, принадлежащего семейству Picornaviridae. Примеры включают: вирусный штамм EMCV-R (Rueckert), вирус Columbia-SK. В некоторых случаях можно применять клеточный элемент IRES, такой как IRES эукариотического фактора инициации 4G, белка, связывающего тяжелые цепи иммуноглобулина, протоонкогена с-myc, фактора роста эндотелия сосудов, фактора роста фибробластов-1 или любую их комбинацию или модификацию. В некоторых случаях клеточный IRES может иметь повышенную экспрессию генов по сравнению с вирусным IRES.
[000266] В векторе может применяться вирусная или клеточная последовательность IRES или их комбинация. IRES может происходить из вируса энцефаломиокардита (EMCV) или полиовируса (PV). В некоторых случаях элемент IRES выбран из группы, состоящей из полиовируса (PV), вируса энцефаломиелита (EMCV), вируса ящура (FMDV), тешовируса свиней-1 (PTV-1), ахивируса (AiV), вируса долины Сенека (SW), вируса гепатита С (HCV), вируса классической чумы свиней (CSFV), вируса иммунодефицита человека-2 (ВИЧ-2), вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), вируса лейкоза мышей Молони (MoMLV), вируса иммунодефицита кошек (FIV), вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), латентного цитомегаловируса человека (pUL138), вируса Эпштейна-Барр (EBNA-1), герпесвируса болезни Марека (MDV RLORF9), полицистронной 19S SV40 (SV40 19S), вируса Rhopalosiphum padi (RhPV), вируса паралича сверчка (CrPV), пикорнаподобного вируса Ectropis obliqua (EoPV), вируса кишечного тракта Plautia stali (PSIV), вируса триатомы (TrV), дицистровируса паралича пчел (IAPV, KBV), вируса реверсии смородины черной (BRV), вируса перерывов цветка пеларгонии (PFBV), вируса кольцевой пятнистости гибискуса (HCRSV), заражающего крестоцветных тобамовируса (CrTMV), полеровируса скручивания листьев картофеля (PLRV), вируса гравировки табака (TEV), вируса Giardia lamblia (GLV), РНК-вируса лейшманий 1 (LRV-1) и их комбинаций или модификаций. В некоторых случаях IRES выбран из группы, состоящей из Apaf-1, XIAP, HIAP2/C-IAP1, DAP5, Bcl-2, c-myc, САТ-1, INR, дифференцировочного LEF-1, PDGF2, HIF-1a, VEGF, FGF2, BiP, BAG-1, CIRP, p53, SHMT1, PITSLREp58, CDK1, Rpr, hid, hsp70, grim, ski, Antennapedia, dFoxO, dlnR, Adh-Adhr, HSP101, ADH, URE-2,GPR1, NCE102, YMR181a, MSN1, BOI1, FLO8, GIC1 и любых их комбинаций или модификаций.
[000267] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения IRES представляет собой IRES EMCV, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5% или 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 49.
[000268] Если элемент IRES включен между двумя открытыми рамками считывания (ORF), инициация трансляции может происходить с помощью канонического 5'-m7GpppN кэп-зависимого механизма в первой ORF и кэп-независимого механизма во второй ORF после элемента IRES.
[000269] В некоторых случаях гены могут быть соединены с помощью сайта внутренней посадки рибосомы (IRES). IRES может обеспечить одновременную экспрессию нескольких генов. Например, последовательность IRES может обеспечить получение нескольких белков с одного транскрипта мРНК. Рибосомы могут связываться с IRES независимым от 5'-кэпа способом и инициировать трансляцию.
[000270] В некоторых случаях последовательность IRES может содержать 500 пар оснований или примерно столько. Последовательность IRES может содержать от 300 пар оснований до 1000 пар оснований. Например, IRES может содержать 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 пар оснований в длину.
[000271] В некоторых случаях экспрессия 3'-концевого гена в векторе, содержащем последовательность IRES, может быть снижена. Например, ген, расположенный после последовательности IRES, может иметь сниженную экспрессию по сравнению с геном, предшествующим последовательности IRES. Снижение экспрессии может составлять от 1% до 99% по сравнению с предшествующим геном.
Линкеры
[000272] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотидный линкер можно применять в полинуклеотиде, описанном в настоящей заявке. Полинуклеотидный линкер может представлять собой двухцепочечный сегмент ДНК, содержащий целевые сайты рестрикции, которые могут быть добавлены для создания концевых структур, которые совместимы с вектором, содержащим полинуклеотид, описанный в настоящей заявке. В некоторых случаях полинуклеотидный линкер можно применять для модификации векторов, содержащих полинуклеотиды, описанные в настоящей заявке. Например, модификация вектора, содержащего полинуклеотидный линкер, может представлять собой изменение в сайте множественного клонирования или добавление полигистидинового хвоста. Полинуклеотидные линкеры также можно применять для того чтобы адаптировать концы ДНК-вставки с тупыми концами для клонирования в расщепленный ферментом рестрикции вектор с липкими концами. Применение полинуклеотидных линкеров может быть более эффективным, чем лигирование по тупым концам в вектор, и может обеспечить способ высвобождения вставки из вектора в последующих приложениях. В некоторых случаях вставка может представлять собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, подходящие для терапевтических приложений.
[000273] Полинуклеотидный линкер может представлять собой олигомер. Полинуклеотидный линкер может представлять собой двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК или их комбинацию. В некоторых случаях линкер может представлять собой РНК. В некоторых случаях полинуклеотидный линкер может быть лигирован в вектор, содержащий полинуклеотид, описанный в настоящей заявке, с помощью лигазы Т4. Для того чтобы облегчить лигирование к композиции, содержащей вставку и вектор, может быть добавлен избыток полинуклеотидных линкеров. В некоторых случаях вставку и вектор предварительно обрабатывают перед введением линкера. Например, предварительная обработка метилазой может предотвратить нежелательное расщепление ДНК-вставки.
[000274] Согласно вариантам реализации полинуклеотидный линкер содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5% или 100% идентична нуклеотидной последовательности области 2А (Р2А) тешовируса свиней-1 (SEQ ID NO: 41); области 2А (Е2А) вируса ринита лошадей A (SEQ ID NO: 43); области 2А (Т2А) вируса Thosea asigna (SEQ ID NO: 45); или области 2A (F2A) вируса ящура (SEQ ID NO: 47).
[000275] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения два или более полипептидов, кодируемых полинуклеотидом, описанным в настоящей заявке, могут быть разделены промежуточной последовательностью, кодирующей промежуточный линкерный полипептид. В настоящей заявке термин «промежуточный линкерный полипептид», относящийся к аминокислотной последовательности, разделяющей два или более полипептидов, кодируемых полинуклеотидом, отличается от термина «пептидный линкер», который относится к последовательности аминокислот, которая необязательно включена в полипептидную конструкцию, раскрытую в настоящей заявке, для соединения трансмембранного домена с полипептидом клеточной поверхности (например, содержащим усеченный вариант природного полипептида). В определенных случаях промежуточный линкерный полипептид представляет собой чувствительный к расщеплению промежуточный линкерный полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды, представляющие интерес, экспрессируются в виде гибридных белков, соединенных чувствительным к расщеплению промежуточным линкерным полипептидом. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения чувствительный (ые) к расщеплению промежуточный (ые) линкерный (ые) полипептид (ы) может (могут) представлять собой любой один или более из: F/T2A, Т2А, р2А, 2А, GSG-p2A, линкер GSG (SEQ ID NO: 16) и варианты furinlink.
[000276] Согласно вариантам реализации промежуточный линкерный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5% или 100% идентична аминокислотной последовательности области 2А (Р2А) тешовируса свиней-1 (SEQ ID NO: 41); области 2А (Е2А) вируса ринита лошадей A (SEQ ID NO: 44); области 2А (Т2А) вируса Thosea asigna (SEQ ID NO: 46); или области 2A (F2A) вируса ящура (SEQ ID NO: 48).
[000277] В некоторых случаях можно применять вирусную последовательность 2А. Элементы 2А могут быть короче IRES и содержат от 5 до 100 пар оснований. В некоторых случаях последовательность 2А может содержать 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 100 нуклеотидов в длину. Соединенные с помощью 2А гены могут быть экспрессированы в одной открытой рамке считывания, и «ауторасщепление» может происходить котрансляционно между двумя последними аминокислотами, GP, на С-конце полипептида 2А, что приводит к получению равных количеств экспрессированных белков.
[000278] Вирусная последовательность 2А может содержать примерно 20 аминокислот.В некоторых случаях вирусная последовательность 2А может содержать консенсусный мотив Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro (SEQ ID NO: 229). Последовательность консенсусного мотива может действовать котрансляционно.
Например, образование нормальной пептидной связи между остатками глицина и пролина может быть предотвращено, что может привести к проскакиванию рибосомы и расщеплению растущего полипептида. Этот эффект может привести к получению эквимолярных уровней продуктов нескольких генов.
[000279] Пептид 2А может обеспечить трансляцию нескольких белков в одной открытой рамке считывания с получением полипептида, который впоследствии может быть расщеплен на отдельные полипептиды с помощью механизма проскока рибосомы (Funston, Kallioinen et al. 2008). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность 2А может включать: F/T2A, Т2А, р2А, 2А, Т2А, Е2А, F2A и BmCPV2A, BmIFV2A, а также любую их комбинацию.
[000280] В некоторых случаях вектор может содержать последовательность IRES и полинуклеотидную линкерную последовательность 2А. В других случаях экспрессия нескольких генов, соединенных пептидами 2А, может быть облегчена с помощью спейсерной последовательности (GSG (SEQ ID NO: 16)) перед пептидами 2А. В некоторых случаях конструкции могут объединять спейсеры, линкеры, адаптеры, промоторы или их комбинации. Например, конструкция может содержать спейсер (SGSG (SEQ ID NO: 18) или GSG (SEQ ID NO: 16)) и промежуточный полипептидный линкер с сайтом расщепления фурином (R-A-K-R (SEQ ID NO: 230)) с различными пептидами 2А. Спейсер может представлять собой I-Ceui. В некоторых случаях линкер может быть модифицирован. Например, линкер может быть сконструирован для придания химических характеристик, таких как гидрофобность. В некоторых случаях по меньшей мере две линкерные последовательности могут приводить к получению одного и того же белка. В других случаях в векторе можно применять несколько линкеров.
[000281] В определенных случаях промежуточный линкерный полипептид может содержать аминокислотную последовательность «RAKR (SEQ ID NO: 230)». В определенных случаях фуриновый промежуточный линкерный полипептид может кодироваться полинуклеотидной последовательностью, содержащей «AGAGCTAAGAGG (SEQ ID NO: 231)».
[000282] В определенных случаях промежуточный линкерный полипептид может представлять собой линкер, содержащий последовательность, раскрытую в таблице ниже:
[000283] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер можно применять в полинуклеотиде, описанном в настоящей заявке. Линкер может представлять собой гибкий линкер, жесткий линкер, расщепляемый в условиях in vivo линкер или любую их комбинацию. В некоторых случаях линкер может соединять функциональные домены вместе (как в гибких и жестких линкерах) или высвобождать свободный функциональный домен в условиях in vivo, как в расщепляемых in vivo линкерах.
[000284] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотидные линкеры и промежуточные линкерные полипептиды могут улучшать биологическую активность, повышать выход экспрессии и обеспечивать достижение целевых фармакокинетических профилей.
[000285] В некоторых случаях последовательность промежуточного линкерного полипептида, описанная в настоящей заявке, может включать гибкий линкер. Гибкие линкеры можно применять, если присоединенный домен требует определенной степени перемещения или взаимодействия. Гибкие линкеры могут состоять из небольших неполярных (например, Gly) или полярных (например, Ser или Thr) аминокислот.Гибкий линкер может иметь последовательности, в основном состоящие из участков из остатков Gly и Ser (линкер «GS»). Пример гибкого линкера может иметь последовательность (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 221; например, SEQ ID NO: 20 или 22). Длина этого примерного GS-линкера может быть оптимизирована путем корректировки числа копий «п», чтобы достичь соответствующего разделения функциональных доменов или поддержать необходимые междоменные взаимодействия. Помимо линкеров GS для рекомбинантных гибридных белков можно применять другие гибкие линкеры. В некоторых случаях гибкие линкеры также могут быть богаты небольшими или полярными аминокислотами, такими как Gly и Ser, но могут содержать дополнительные аминокислоты, такие как Thr и Ala, для поддержания гибкости. В других случаях полярные аминокислоты, такие как Lys и Glu, можно применять для улучшения растворимости.
[000286] Гибкие линкеры, включенные в линкерные последовательности, описанные в настоящей заявке, могут быть богаты небольшими или полярными аминокислотами, такими как Gly и Ser, чтобы обеспечить хорошую гибкость и растворимость. Гибкие линкеры могут быть подходящим выбором, если для доменов гибридного белка желательны определенные перемещения или взаимодействия. Кроме того, несмотря на то, что гибкие линкеры могут не содержать жесткие структуры, они могут служить в качестве пассивного линкера для поддержания расстояния между функциональными доменами. Длина гибкого линкера может быть скорректирована, чтобы обеспечить правильное складывание или достичь оптимальной биологической активности гибридных белков.
[000287] В некоторых случаях промежуточный линкерный полипептид, описанный в настоящей заявке, может дополнительно содержать жесткий линкер. Жесткий линкер можно применять для поддержания фиксированного расстояния между доменами полипептида. Примерами жестких линкеров могут быть: образующие альфа-спираль линкеры, богатая Pro последовательность, (ХР)n, остов X-Pro (SEQ ID NO: 239), A(EAAAK)nA (SEQ ID NO: 240) (n=2-5), в качестве нескольких примеров. Жесткие линкеры могут проявлять относительно жесткие структуры, принимая форму α-спиральных структур или за счет содержания нескольких остатков Pro в некоторых случаях.
[000288] Промежуточный линкерный полипептид, описанный в настоящей заявке, может быть расщепляемым в некоторых случаях. В других случаях промежуточный линкерный полипептид не является расщепляемым. Линкеры, которые не являются расщепляемыми, могут ковалентно соединять вместе функциональные домены, чтобы они функционировали как одна молекула в ходе процесса в условиях in vivo или процесса в условиях ex vivo. Промежуточный линкерный поли пептид также может быть расщепляемым в условиях in vivo. Расщепляемый промежуточный линкерный полипептид может быть введен, например, для высвобождения свободных функциональных доменов в условиях in vivo. Промежуточный линкерный полипептид может быть расщеплен, например, присутствующими восстанавливающими реагентами и протеазами. Например, восстановление дисульфидной связи можно применять для получения расщепляемого промежуточного линкерного полипептида. В случае дисульфидного промежуточного линкерного полипептида расщепление может произойти в результате обмена дисульфида с тиолом, таким как глутатион. В других случаях расщепление промежуточного линкерного полипептида в рекомбинантном гибридном белке в условиях in vivo также может осуществляться протеазами, которые могут экспрессироваться в условиях in vivo при патологических состояниях (например, при раке или воспалении), в специфических клетках или тканях или ограниченно внутри определенных клеточных компартментов. В некоторых случаях расщепляемый промежуточный линкерный полипептид может обеспечивать нацеленное расщепление. Например, специфичность многих протеаз может обеспечить более медленное расщепление промежуточного линкерного полипептида в ограниченных компартментах. Расщепляемый промежуточный линкерный полипептид также может содержать гидразон, пептиды, дисульфид или простой тиоэфир. Например, гидразон может придавать стабильность в сыворотке. В других случаях гидразон может обеспечивать расщепление в кислотном компартменте. Кислотный компартмент может иметь рН до примерно 7. Линкер также может включать простой тиоэфир. Простой тиоэфир может быть невосстанавливаемым и/или может быть сконструирован для внутриклеточного протеолитического разрушения.
[000289] Линкер может представлять собой модифицированный линкер. Способы конструирования линкеров могут быть вычислительными. В некоторых случаях вычислительные способы могут включать графические методики. Вычислительные способы можно применять для поиска подходящих пептидов в библиотеках трехмерных пептидных структур, полученных из баз данных. Например, Банк данных белков в Брукхейвене (PDB) можно использовать для определения пространственного расстояния между выбранными аминокислотами линкера.
[000290] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную конструкцию, содержащую полипептид фурина и полипептид 2А, причем полипептид фурина и полипептид 2А соединены промежуточным линкерным полипептидом, содержащим по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты. В некоторых случаях по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты выбраны из перечня, состоящего из глицина (Gly) (G), аланина (Ala) (А), валина (Val) (V), лейцина (Leu) (L), изолейцина (Ile) (I), пролина (Pro) (Р), фенилаланина (Phe) (F), метионина (Met) (М), триптофана (Trp) (W).
Экспрессия полипептидных конструкций
[000291] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотиды и полипептиды, описанные в настоящей заявке, могут быть конститутивно экспрессированы, например, с применением конститутивных промоторов вирусных и невирусных систем доставки (см. ниже). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные конструкции, полинуклеотиды и способы согласно настоящему изобретению могут быть реализованы в системе переключения гена. Термин «переключение гена» относится к комбинации элемента ответа, ассоциированного с промотором, и, например, системы на основе EcR, которая, в присутствии одного или более лигандов, модулирует экспрессию гена, в который встроены элемент ответа и промотор. Жестко регулируемые индуцируемые системы экспрессии генов или переключатели гена можно применять для различных приложений, таких как генная терапия, крупномасштабное получение белков в клетках, клеточные анализы с высокой пропускной способностью, функциональная геномика и регуляция признаков у трансгенных растений и животных. Такие индуцируемые системы экспрессии генов могут включать индуцируемые лигандом системы экспрессии гетерологичных генов.
[000292] В раннем варианте переключателя гена на основе EcR применяли полипептиды EcR Drosophila melanogaster (DmEcR) и RXR Mus musculus (MmRXR), и было показано, что в присутствии стероида, понастерона А, эти рецепторы трансактивируют репортерные гены в линиях клеток млекопитающих и у трансгенных мышей (Christopherson et al., 1992; No et al., 1996). Later, Suhr et al., 1998 показали, что нестероидный агонист экдизона, тебуфенозид, индуцировал высокий уровень трансактивации репортерных генов в клетках млекопитающих с помощью EcR Bombyx mori(BmEcR) в отсутствие экзогенного гетеродимерного партнера.
[000293] В международных заявках на патент №PCT/US97/05330 (WO 97/38117) и PCT/US99/08381 (WO 99/58155) раскрыты способы модуляции экспрессии экзогенного гена, в которых конструкцию ДНК, содержащую экзогенный ген и элемент ответа на экдизон, активируют с помощью второй конструкции ДНК, содержащей рецептор экдизона, который в присутствии его лиганда и необязательно в присутствии рецептора, способного действовать в качестве молчащего партнера, связывается с элементом ответа на экдизон, чтобы индуцировать экспрессию гена. В этом примере рецептор экдизона был выделен из Drosophila melanogaster. Как правило, такие системы требуют присутствия молчащего партнера, предпочтительно ретиноидного Х-рецептора (RXR), чтобы обеспечить оптимальную активацию. В клетках млекопитающих рецептор экдизона насекомых (EcR) способен гетеродимеризоваться с ретиноидным Х-рецептором млекопитающих (RXR), что позволяет применять его для регуляции экспрессии генов-мишеней или гетерологичных генов зависимым от лиганда способом. В международной заявке на патент №PCT/US98/14215 (WO 99/02683) раскрыто, что рецептор экдизона, выделенный из тутового шелкопряда Bombyx mori, функционирует в системах млекопитающих без потребности в экзогенном партнере для димеризации.
[000294] В патенте США №6265173 раскрыто, что различные члены суперсемейства рецепторов стероидных/тиреоидных гормонов могут объединяться с рецептором ultraspiracle (USP) Drosophila melanogaster или его фрагментами, содержащими по меньшей мере домен димеризации USP, для применения в системе экспрессии генов. В патенте США №5880333 описана гетеродимерная система EcR и ultraspiracle (USP) Drosophila melanogaster, применяемая в растениях, в которой домен трансактивации и ДНК-связывающий домен расположены на двух разных гибридных белках. В каждом из этих случаев домен трансактивации и ДНК-связывающий домен (либо как нативный EcR, как в международной заявке на патент №PCT/US98/14215, либо как модифицированный EcR, как в международной заявке на патент №PCT/US97/05330) были встроены в одну молекулу, а другие гетеродимерные партнеры, либо USP, либо RXR, применяли в их нативном состоянии.
[000295] В международной заявке на патент №PCT/US01/0905 раскрыта индуцируемая система экспрессии генов на основе рецептора экдизона, в которой трансактивирующие и связывающие ДНК домены отделены друг от друга путем размещения их на двух разных белках, что приводит к значительно сниженной неспецифической активности в отсутствие лиганда и значительно повышенной активности, по сравнению с неспецифической активностью, в присутствии лиганда. Эта двухгибридная система является значительно улучшенной индуцируемой системой модуляции экспрессии генов по сравнению с двумя системами, раскрытыми в заявках PCT/US97/05330 и PCT/US98/14215. Предполагается, что в двухгибридной системе применяется способность пары взаимодействующих белков приводить домен активации транскрипции в более благоприятное положение относительно ДНК-связывающего домена так, что при связывании ДНК-связывающего домена с ДНК-связывающим сайтом на гене домен трансактивации более эффективно активирует промотор (см., например, патент США №5283173). Двухгибридная система экспрессии генов содержит две кассеты экспрессии генов; первая кодирует ДНК-связывающий домен, гибридизованный с полипептидом ядерного рецептора, а вторая кодирует домен трансактивации, гибридизованный с другим полипептидом ядерного рецептора. Предполагается, что в присутствии лиганда происходит индукция конформационного изменения, которое стимулирует взаимодействие первого полипептида со вторым полипептидом, что приводит к димеризации ДНК-связывающего домена и домена трансактивации. Поскольку ДНК-связывающий домен и домен трансактивации находятся на двух разных молекулах, неспецифическая активность в отсутствие лиганда значительно снижена.
[000296] Рецептор экдизона (EcR) является членом суперсемейства ядерных рецепторов и классифицируется как группа Н подсемейства 1 (называемая в настоящей заявке «ядерные рецепторы группы Н»). Члены каждой группы имеют 40-60% идентичность аминокислот в домене Е (связывание лиганда) (Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163). В дополнение к рецептору экдизона другие члены группы Н подсемейства 1 ядерных рецепторов включают: повсеместный рецептор (UR), орфанный рецептор 1 (OR-1), ядерный рецептор 1 стероидного гормона (NER-1), RXR-взаимодействующий белок 15 (RIP-15), печеночный Х-рецептор β (LXRβ), белок, сходный с рецептором стероидных гормонов (RLD-1), печеночный Х-рецептор (LXR), печеночный Х-рецептор α (LXRα), фарнезоидный Х-рецептор (FXR), взаимодействующий с рецептором белок 14 (RIP-14) и рецептор фарнезола (HRR-1).
[000297] В некоторых случаях индуцируемый промотор может представлять собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом, состоящий из двух полипептидов переключатель гена на основе рецептора экдизона, такой как переключатель генов RHEOSWITCH корпорации Intrexon. В некоторых случаях переключатель гена может быть выбран из компонентов на основе рецептора экдизона, как описано, но не ограничиваясь ими, в любой из систем, описанных в: PCT/US2001/009050 (WO 2001/070816); патентах США №№7091038; 7776587; 7807417; 8202718; PCT/US2001/030608 (WO 2002/029075); патентах США №№8105825; 8168426; PCT/1J52002/005235 (WO 2002/066613); заявке США №10/468200 (публикация США №20120167239); PCT/US2002/005706 (WO 2002/066614); патентах США №№7531326; 8236556; 8598409; PCT/U52002/005090 (WO 2002/066612); патенте США №8715959 (публикация США №20060100416); PCT/US2002/005234 (WO 2003/027266); патентах США №№7601508; 7829676; 7919269; 8030067; PCT/U52002/005708 (WO 2002/066615); заявке США №10/468192 (публикация США №20110212528); PCT/US2002/005026 (WO 2003/027289); патентах США №№7563879; 8021878; 8497093; PCT/US2005/015089 (WO 2005/108617); патенте США №7935510; 8076454; PCT/U52008/011270 (WO 2009/045370); заявке США №12/241018 (публикация США №20090136465); PCT/US2008/011563 (WO 2009/048560); заявке США №12/247738 (публикация США №20090123441); PCT/US2009/005510 (WO 2010/042189); заявке США №13/123129 (публикация США №20110268766); PCT/US2011/029682 (WO 2011/119773); заявке США №13/636473 (публикация США №20130195800); PCT/US2012/027515 (WO 2012/122025); и патенте США №9402919, каждый из которых полностью включен посредством ссылки.
Модифицированные эффекторные клетки
[000298] Предложены эффекторные клетки, модифицированные для экспрессии одной или более полипептидных конструкций, способных функционировать в эффекторных клетках в качестве клеточных меток.
[000299] В настоящей заявке термин «Т-клетка» или «Т-лимфоцит» представляет собой тип лимфоцита, который играет основную роль в клеточном иммунитете. Их можно отличить от других лимфоцитов, таких как В-клетки и природные клетки-киллеры (NK-клетки), по наличию Т-клеточного рецептора (TCR) на поверхности клетки.
[000300] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные эффекторные клетки представляют собой модифицированные иммунные клетки, которые включают Т-клетки и/или природные клетки-киллеры. Т-клетки или Т-лимфоциты представляют собой подтип белых клеток крови, которые участвуют в клеточном иммунитете. Примерные Т-клетки включают хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-клетки, ТН17-клетки, стволовые Т-клетки памяти (TSCM), наивные Т-клетки, Т-клетки памяти, эффекторные Т-клетки, регуляторные Т-клетки или природные киллерные Т-клетки.
[000301] Хелперные Т-клетки (ТН клетки) помогают другим белым клеткам крови в иммунологических процессах, включая созревание В-клеток в плазматические клетки и В-клетки памяти и активацию цитотоксических Т-клеток и макрофагов. В некоторых случаях ТН-клетки известны как CD4+ Т-клетки из-за экспрессии гликопротеина CD4 на поверхности клеток. Хелперные Т-клетки активируются при презентировании им пептидных антигенов молекулами ГКГС класса II, которые экспрессируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). После активации они быстро делятся и секретируют небольшие белки, называемые цитокинами, которые регулируют или помогают в активном иммунном ответе. Эти клетки могут дифференцироваться в один из нескольких подтипов, включая ТН1, ТН2, ТН3, ТН17, ТН9 или TFH, которые секретируют разные цитокины, чтобы облегчить различные типы иммунных ответов. Передача сигналов от АПК направляет Т-клетки в конкретные подтипы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в настоящей заявке секретируемые цитокины могут быть рекомбинантными.
[000302] Цитотоксические Т-клетки (ТС-клетки или ЦТЛ) разрушают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки, а также участвуют в отторжении трансплантата. Эти клетки также известны как CD8+Т-клетки, поскольку они экспрессируют гликопротеин CD8 на своей поверхности. Эти клетки распознают свои мишени путем связывания с антигеном, ассоциированным с молекулами ГКГС класса I, которые присутствуют на поверхности всех ядросодержащих клеток. С помощью ИЛ-10, аденозина и других молекул, секретируемых регуляторными Т-клетками, CD8+ клетки можно инактивировать до энергического состояния, что предотвращает аутоиммунные заболевания.
[000303] Т-клетки памяти представляют собой подгруппу антигенспецифичных Т-клеток, которые сохраняются в течение длительного времени после того, как инфекция прошла. Они быстро размножаются, давая большое количество эффекторных Т-клеток при повторном воздействии своего когнатного антигена, что обеспечивает иммунную систему «памятью» против прошлых инфекций. Т-клетки памяти включают подтипы: стволовых Т-клеток памяти (TSCM), Т-клеток центральной памяти (клетки ТСМ) и два типа эффекторных Т-клеток памяти (клетки ТЕМ и клетки TEMRA). Клетки памяти могут представлять собой либо CD4+, либо CD8+. Т-клетки памяти могут экспрессировать белки клеточной поверхности CD45RO, CD45RA и/или CCR7.
[000304] Регуляторные Т-клетки (Treg-клетки), ранее известные как супрессорные Т-клетки, участвуют в поддержании иммунологической толерантности. Их основная роль заключается в том, чтобы отключить опосредуемый Т-клетками иммунитет к концу иммунной реакции и подавить аутореактивные Т-клетки, которые избежали процесса отрицательного отбора в тимусе.
[000305] Природные киллерные Т-клетки (NKT-клетки) служат посредниками между адаптивной иммунной системой и врожденной иммунной системой. В отличие от обычных Т-клеток, которые распознают пептидные антигены, презентированные молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), NKT-клетки распознают гликолипидный антиген, презентированный молекулой, называемой CD1d. После активации эти клетки могут выполнять функции, приписываемые как Th, так и Тс-клеткам (т.е. выработка цитокинов и высвобождение цитолитических/уничтожающих клетки молекул). Они также способны распознавать и уничтожать некоторые опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусами герпеса.
[000306] Природные клетки-киллеры (NK) представляют собой тип цитотоксических лимфоцитов врожденной иммунной системы. В некоторых случаях NK-клетки обеспечивают защиту первой линии от вирусных инфекций и/или образования опухолей. NK-клетки могут обнаруживать ГКГС, презентированный на инфицированных или раковых клетках, вызывая высвобождение цитокинов, и впоследствии индуцируют лизис и апоптоз. NK-клетки могут дополнительно обнаруживать стрессовые клетки в отсутствие антител и/или ГКГС, что обеспечивает быстрый иммунный ответ.
Системы доставки на основе вирусов
[000307] Согласно настоящему изобретению предложены системы доставки, такие как системы на основе вирусов, в которые вставлена нуклеиновая кислота, описанная в настоящей заявке. Типичные вирусные векторы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, векторы на основе аденоассоциированного вируса, векторы на основе аденовируса (например, система Рег.Сб на основе аденовируса, доступная от Crucell, Inc. (Лейден, Нидерланды)), векторы на основе лентивируса (например, pLPI на основе лентивируса от Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США)), ретровирусные векторы (например, pFB-ERV плюс pCFB-EGSH) и векторы на основе вируса герпеса. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Векторы, происходящие из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долговременного переноса гена, поскольку они обеспечивают долговременную стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы имеют дополнительное преимущество в сравнении с векторами, происходящими из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мышей, заключающееся в том, что они могут трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также обладают дополнительным преимуществом, таким как низкая иммуногенность. В дополнительном варианте реализации вирусный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса. В дополнительном варианте реализации вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. Обычно, и согласно вариантам реализации, подходящий вектор содержит точку начала репликации, функциональную по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные сайты рестрикционных эндонуклеаз и один или более селективных маркеров (например, WO 01/96584; WO 01/29058; и патент США №6326193).
[000308] Дополнительные подходящие векторы включают интегрирующиеся векторы экспрессии, которые могут случайным образом интегрироваться в ДНК клетки-хозяина или могут содержать сайт рекомбинации, чтобы обеспечить специфичную рекомбинацию между вектором экспрессии и хромосомой клетки-хозяина. В таких интегрирующихся векторах экспрессии могут применяться эндогенные последовательности контроля экспрессии из хромосом клетки-хозяина для осуществления экспрессии целевого белка. Примеры векторов, которые интегрируются сайт-специфичным образом, включают, например, компоненты системы flp-in от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США) (например, pcDNATM5/FRT) или систему cre-lox, например, которую можно найти в основных векторах pExchange-6 от Stratagene (Ла-Йолла, Калифорния, США). Примеры векторов, которые случайным образом интегрируются в хромосомы клетки-хозяина, включают, например, pcDNA3.1 (при введении в отсутствие Т-антигена) от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США) и pCI или pFN10A (ACT) FLEXITM от Promega (Мэдисон, Висконсин, США). Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Как правило, они расположены в области 30-110 п. о. в 5'-направлении от стартового сайта, несмотря на то, что недавно было показано, что ряд промоторов также содержат функциональные элементы, расположенные в 3'-направлении от стартового сайта. Расстояние между промоторными элементами часто является нестрогим так, что функция промотора сохраняется, когда элементы инвертированы или перемещены относительно друг друга. В промоторе тимидинкиназы (tk) расстояние между промоторными элементами может быть увеличено до 50 п. о., прежде чем активность начнет снижаться. По-видимому, в зависимости от промотора отдельные элементы могут функционировать либо совместно, либо независимо, чтобы активировать транскрипцию.
[000309] Одним примером подходящего промотора является последовательность немедленно раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Эта промоторная последовательность является сильной конститутивной промоторной последовательностью, способной стимулировать высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально соединенной с ней.
[000310] Другим примером подходящего промотора является промотор фактора элонгации человека 1-альфа 1 (hEF1a1). Согласно вариантам реализации векторная конструкция, содержащая CAR и/или TCR согласно настоящему изобретению, содержит функциональные варианты hEF1a1.
[000311] Однако также можно применять другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь ими, ранний промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор MoMuLV, промотор вируса птичьего лейкоза, немедленно ранний промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, но не ограничиваясь ими, промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. Кроме того, настоящее изобретение не должно быть ограничено применением конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также предусмотрены как часть настоящего изобретения. Применение индуцируемого промотора обеспечивает молекулярный переключатель, способный включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально соединен, когда такая экспрессия желательна, или выключать экспрессию, когда экспрессия нежелательна. Примеры индуцируемых промоторов включают, но не ограничиваются ими, металлотиониновый промотор, глюкокортикоидный промотор, прогестероновый промотор и тетрациклиновый промотор.
[000312] Для того чтобы оценить экспрессию полипептида CAR или TCR или его частей вектор экспрессии, который должен быть введен в клетку, также может содержать либо ген селективного маркера, либо ген репортера, либо их обоих, чтобы облегчить идентификацию и отбор экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые необходимо трансфецировать или инфицировать с помощью вирусных векторов. Согласно другим аспектам носителем селективного маркера может быть отдельный фрагмент ДНК, и он может применяться при процедуре котрансфекции. Как селективные маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями, чтобы обеспечить экспрессию в клетках-хозяевах. Подходящие селективные маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как ген устойчивости к неомицину (neo) и ген устойчивости к ампициллину и тому подобное. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в качестве селективного маркерного гена можно применять метку на основе усеченного рецептора эпидермального фактора роста (HER1t).
[000313] Репортерные гены можно применять для идентификации потенциально трансфецированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. Обычно репортерный ген представляет собой ген, который не присутствует или не экспрессируется реципиентным организмом или тканью и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется посредством некоторого легко обнаруживаемого свойства, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена оценивают в подходящее время после введения ДНК в реципиентные клетки. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)). Подходящие системы экспрессии хорошо известны и могут быть получены с применением известных методик или получены коммерчески. Обычно конструкция с минимальной 5'-фланкирующей областью, проявляющая самый высокий уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируется как промотор. Такие промоторные области могут быть соединены с репортерным геном и могут применяться для оценки способности агентов модулировать транскрипцию, управляемую промотором.
[000314] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторы содержат промотор hEF1a1 для управления экспрессией трансгенов, последовательность полиА бычьего гормона роста для усиления транскрипции, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE), а также последовательности LTR, происходящие из плазмиды pFUGW.
[000315] Способы введения генов в клетку и их экспрессии известны в данной области техники. В случае вектора экспрессии вектор может быть легко введен в клетку хозяина, например, в клетку млекопитающего, бактерии, дрожжей или насекомого, любым способом, известным в данной области техники. Например, вектор экспрессии может быть перенесен в клетку хозяина с помощью физического, химического или биологического способа.
[000316] Физические способы введения полинуклеотида в клетку хозяина включают осаждение с фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и тому подобное. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в данной области техники. См., например, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)). Согласно вариантам реализации способ введения полинуклеотида в клетку хозяина представляет собой трансфекцию фосфатом кальция или трансфекцию полиэтиленимином (PEI).
[000317] Биологические способы введения полинуклеотида, представляющего интерес, в клетку-хозяина включают применение ДНК- и РНК-векторов. Вирусные векторы и, в частности, ретровирусные векторы, стали наиболее широко используемым способом вставки генов млекопитающим, например, в клетки человека. Другие вирусные векторы могут происходить из лентивирусов, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т.п. См., например, патенты США №№5350674 и 5585362.
[000318] Химические способы введения полинуклеотида в клетку хозяина включают коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии типа «масло-в-воде», мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Примерная коллоидная система для применения в качестве носителя для доставки в условиях in vitro и in vivo представляет собой липосому (например, искусственную мембранную везикулу).
[000319] В том случае, если применяется вирусная система доставки, примерным носителем для доставки является липосома. Предусмотрено применение липидных составов для введения нуклеиновых кислот в клетку хозяина (в условиях in vitro, ex vivo или in vivo). Согласно другому аспекту нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с липидом. Нуклеиновая кислота, ассоциированная с липидом, может быть инкапсулирована в водной внутренней среде липосомы, вкраплена в липидный бислой липосомы, присоединена к липосоме за счет соединяющей молекулы, которая ассоциирована как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, встроенным в липосому, может образовывать комплекс с липосомой, может быть диспергирована в растворе, содержащем липид, смешана с липидом, комбинирована с липидом, может содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться в мицелле или образовывать комплекс с ней или иным образом ассоциирована с липидом. Композиции, ассоциированные с липидом, липидом/ДНК или липидом/вектором экспрессии, не ограничиваются какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в двухслойной структуре, в виде мицелл, или в «сжатой» структуре. Они также могут быть просто вкраплены в раствор, возможно, образуя агрегаты, которые не являются однородными по размеру или форме. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут представлять собой природные или синтетические липиды. Например, липиды включают жировые капли, которые естественным образом встречаются в цитоплазме, а также класс соединений, которые содержат длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.
[000320] Липиды, подходящие для применения, могут быть получены из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин («DMPC») может быть получен от Sigma, Сент-Луис, Миссури, США; дицетилфосфат («DCP») может быть получен от K&K Laboratories (Плейнвью, Нью-Йорк, США); холестерин («Choi») может быть получен от Calbiochem-Behring; димиристилфосфатидилглицерин («DMPG») и другие липиды могут быть получены от Avanti Polar Lipids, Inc. (Бирмингем, Алабама, США). Маточные растворы липидов в хлороформе или хлороформе/метаноле могут храниться при температуре примерно -20°С. Хлороформ применяется в качестве единственного растворителя, поскольку он испаряется легче, чем метанол. «Липосома» это общий термин, включающий множество одно- и многослойных липидных носителей, образованных в результате получения замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы могут быть охарактеризованы как имеющие везикулярные структуры с фосфолипидной двухслойной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются спонтанно при суспендировании фосфолипидов в избытке водного раствора. Липидные компоненты подвергаются самопроизвольной перегруппировке перед образованием замкнутых структур и захватом воды и растворенных аналитов между липидными бислоями (Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)). Однако также предусмотрены композиции, структуры которых в растворе отличаются от нормальной везикулярной структуры. Например, липиды могут приобретать мицеллярную структуру или просто существовать в виде неоднородных агрегатов липидных молекул. Также предусмотрены комплексы липофектамин-нуклеиновая кислота.
Невирусные системы доставки
[000321] В некоторых случаях полинуклеотиды, кодирующие клеточные метки, описанные в настоящей заявке, также могут быть введены в Т-клетки с применением невирусных систем доставки, таких как «транспозонная система Sleeping Beauty (SB)», которая относится к синтетической системе ДНК-транспозона для введения последовательностей ДНК в хромосомы позвоночных. Некоторые примерные варианты реализации системы описаны, например, в патентах США №№6489458 и 8227432. транспозонная система Sleeping Beauty состоит из транспозазы Sleeping Beauty (SB) и транспозона SB. Согласно вариантам реализации транспозонная система Sleeping Beauty может включать транспозонную систему SB11, транспозонную систему SB100X или транспозонную систему SB110.
[000322] ДНК-транспозоны перемещаются из одного сайта ДНК в другой с помощью простого способа вырезания и вставки. Транспозиция представляет собой точный процесс, при котором определенный сегмент ДНК вырезается из одной молекулы ДНК и перемещается в другой сайт в той же или другой молекуле ДНК или геноме. Как и другие транспозазы типа Tc1/mariner транспозаза SB вставляет транспозон в динуклеотидную пару оснований ТА в реципиентной последовательности ДНК. Сайт вставки может быть в другом месте в той же молекуле ДНК или в другой молекуле ДНК (или хромосоме). В геномах млекопитающих, включая человека, существует приблизительно 200 миллионов сайтов ТА. Сайт вставки ТА дублируется в процессе интеграции транспозона. Такое дублирование последовательности ТА является отличительной чертой транспозиции и используется для выяснения механизма в некоторых экспериментах. Транспозаза может кодироваться либо внутри транспозона, либо транспозаза может поставляться другим источником, например, источником ДНК или мРНК, в этом случае транспозон становится неавтономным элементом. Неавтономные транспозоны являются наиболее подходящими в качестве генетических инструментов, поскольку после вставки они не могут самостоятельно продолжать вырезание и повторную вставку. Представляется возможным применять транспозоны SB в качестве невирусных векторов для введения генов в геномы позвоночных животных и для генной терапии. В общих чертах, система Sleeping Beauty (SB) (Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010)) была адаптирована для генетической модификации Т-клеток (Cooper et al., Blood 105:1622-31, (2005)). Это включало два этапа: (i) электроперенос ДНК-плазмид, экспрессирующих транспозон SB [т.е. химерный антигенный рецептор (CAR) для перенаправления специфичности Т-клеток (Jin et al., Gene THER 18:849-56, (2011); Kebriaei et al., Hum Gene THER 23:444-50, (2012)] и транспозазу SB, и (ii) выращивание и размножение Т-клеток, стабильно экспрессирующих интегрированные элементы, на оригинальных искусственных антигенпрезентирующих клетках (АаРС), происходящих из линии клеток K562 (также известной как АаРС (активирующие и стимулирующие размножение клетки). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения транспозонная система SB включает кодирующую последовательность, кодирующую связанный с мембраной ИЛ-15 и/или химерный антигенный рецептор. Такие системы описаны, например, в Singh et al., Cancer Res (8):68 (2008). April 15, 2008 и Maiti et al., J ImmunotHER. 36(2): 112-123 (2013), полностью включенных в настоящую заявку посредством ссылки. В определенных вариантах реализации ДНК-плазмиду, экспрессирующую транспозон SB, содержащий CAR или TCR, а также цитокин и полипептидную клеточную метку, вводят с помощью электропорации в эффекторную клетку, которую затем вводят пациенту без дальнейшего выращивания или размножения.
[000323] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий CAR или TCR, или цитокин и одну или более полипептидных клеточных меток в модифицированной эффекторной клетке, описанной в настоящей заявке, кодируется в одном или более транспозонных векторах на основе ДНК-плазмиды, а транспозаза SB кодируется в отдельном векторе. Согласно вариантам реализации полипептидная клеточная метка кодируется в транспозонном векторе на основе ДНК-плазмиды, CAR или TCR, или цитокин кодируется во втором транспозонном векторе на основе ДНК-плазмиды, а транспозаза SB кодируется в третьем векторе на основе ДНК-плазмиды. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR или TCR и цитокин и полипептидная клеточная метка кодируются в одном транспозоне.
[000324] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды, описанные в настоящей заявке, обеспечивают предохранительный механизм, позволяя истощать инфузированные CAR-T-клетки с помощью введения одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) антител или любого антитела, которое распознает полипептидную конструкцию, чтобы индуцировать путь истощения клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты HER1t, описанные в настоящей заявке, обеспечивают предохранительный механизм, связываясь с введенным цетуксимабом и обеспечивая истощение клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты CD20t также обеспечивают предохранительный механизм, позволяя истощать инфузированные CAR-T-клетки с помощью введения одобренной FDA терапии ритуксимабом.
[000325] Независимо от способа, применяемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку хозяина, или иного воздействия на клетку ингибитора согласно настоящему изобретению, для того чтобы подтвердить наличие рекомбинантной последовательности ДНК в клетке хозяине, могут быть выполнены различные анализы. Такие анализы включают, например, молекулярные анализы, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как Саузерн-блоттинг и Нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; «биохимические» анализы, такие как обнаружение наличия или отсутствия конкретного пептида, например, иммунологическими средствами (ИФА и Вестерн-блоттинг) или анализы, описанные в настоящей заявке, для идентификации агентов, включенных в объем настоящего изобретения.
[000326] Согласно вариантам реализации модифицированную эффекторную клетку, описанную в настоящей заявке, и другие генетические элементы доставляют в клетку с применением транспозонной системы SB11, транспозонной системы SB100X, транспозонной системы SB110, транспозонной системы piggyBac (см., например, Wilson et al, «PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,» Molecular THERapy 15:139-145 (2007), которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки) и/или транспозонной системы piggyBac (см., например, Mitra et al., «Functional characterization of piggyBac from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,» Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013). Дополнительные транспозазы и транспозонные системы представлены в патентах США №№6489458; 6613752, 7148203; 7985739; 8227432; 9228180; публикации патента США №2011/0117072; Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene THER., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 и в Ivies et al., Cell. 91(4):501-10, (1997), каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. Дополнительные подходящие невирусные системы могут включать интегрирующиеся векторы экспрессии, которые могут случайным образом интегрироваться в ДНК клетки хозяина, или могут содержать сайт рекомбинации, чтобы обеспечить специфичную рекомбинацию между вектором экспрессии и хромосомой клетки хозяина. Нацеленная интеграция трансгенов в предварительно определенные генетические локусы является желательной целью для многих приложений. Сначала в геномный сайт вставляют первый сайт рекомбинации для сайт-специфичной рекомбиназы, либо в случайном, либо в заранее определенном месте. Затем клетки трансфецируют плазмидой, несущей ген или ДНК, представляющие интерес, второй сайт рекомбинации и источник рекомбиназы (плазмиду для экспрессии, РНК, белок или экспрессируемую вирусом рекомбиназу). Рекомбинация между первым и вторым сайтами рекомбинации приводит к интеграции плазмидной ДНК.
[000327] В таких интегрирующихся векторах экспрессии для экспрессии целевого белка могут применяться эндогенные последовательности контроля экспрессии из хромосом клетки-хозяина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нацеленную интеграцию стимулируют с помощью наличия последовательностей на донорном полинуклеотиде, которые гомологичны последовательностям, фланкирующим сайт интеграции. Например, нацеленная интеграция с применением донорных полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, может быть достигнута с помощью обычных методик трансфекции, например, методик, применяемых для выключения или вставки генов путем гомологичной рекомбинации. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения нацеленную интеграцию стимулируют с помощью как наличия последовательностей на донорном полинуклеотиде, которые гомологичны последовательностям, фланкирующим сайт интеграции, так и приведения клеток в контакт с донорным полинуклеотидом в присутствии сайт-специфичной рекомбиназы. Под сайт-специфичной рекомбиназой или просто рекомбиназой подразумевают полипептид, который катализирует консервативную сайт-специфичную рекомбинацию между своими совместимыми сайтами рекомбинации. В настоящей заявке сайт-специфичная рекомбиназа включает нативные полипептиды, а также производные, варианты и/или фрагменты, которые сохраняют активность, и нативные полинуклеотиды, производные, варианты и/или фрагменты, которые кодируют рекомбиназу, которая сохраняет активность.
[000328] Согласно настоящему изобретению также предложена система для интеграции гетерологичных генов в клетке-хозяине, причем указанная система содержит одну или более кассет экспрессии генов. В некоторых случаях система содержит первую кассету экспрессии генов, содержащую первый полинуклеотид, кодирующий первую полипептидную конструкцию. В других случаях система может содержать вторую кассету экспрессии генов, содержащую второй полинуклеотид, кодирующий вторую полипептидную конструкцию. В других случаях система может содержать третью кассету экспрессии генов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения система содержит рекомбинантные сайты присоединения; и сери новую рекомбиназу; так, что при контакте указанной клетки-хозяина с по меньшей мере указанной первой кассетой экспрессии генов в присутствии указанной сериновой рекомбиназы указанные гетерологичные гены интегрируются в указанную клетку-хозяина.
[000329] В некоторых случаях система дополнительно содержит лиганд; так, что при контакте с указанной клеткой-хозяином в присутствии указанного лиганда указанный гетерологичный ген экспрессируется в указанной клетке-хозяине. В одном случае система также содержит рекомбинантные сайты присоединения. В некоторых случаях один рекомбинационный сайт присоединения представляет собой рекомбинационный сайт присоединения из фагового генома (attP) или рекомбинационный сайт присоединения из бактериального генома (attB). В одном случае клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В другом случае клетка-хозяин представляет собой клетку человека. В других случаях клетка-хозяин представляет собой Т-клетку или NK-клетку.
[000330] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гетерологичный ген в системе, описанной выше, содержит CAR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR связывает по меньшей мере одно из: CD19, CD33, ВСМА, CD44,α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 и VEGF-R2.
[000331] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения система содержит гетерологичный ген, содержащий цитокин. В некоторых случаях цитокин содержит по меньшей мере одно из: ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, а также гибрид ИЛ-15 и ИЛ-15Rα. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит гетерологичный ген, содержащий по меньшей мере одну клеточную метку, описанную в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная клеточная метка содержит по меньшей мере одно из: полипептида HER1, полипептида LNGFR, полипептида CD20 и полипептида CD52. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения mbИЛ-15 кодируется с клеточной меткой. Примеры клеточных меток могут включать усеченный: полипептид HER1, полипептид LNGFR, полипептид CD20, полипептид CD52 или любые другие подходящие клеточные метки для применения для истощения или в качестве переключателя для уничтожения, или маркера обогащения.
[000332] Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения указанная система содержится в одном или более векторах. В одном случае система содержится в одном векторе. В одном случае первая кассета экспрессии генов, вторая кассета экспрессии генов и рекомбинантные сайты присоединения содержатся в одном векторе. В одном случае первая кассета экспрессии генов, вторая кассета экспрессии генов, третья кассета экспрессии генов и рекомбинантные сайты присоединения содержатся в одном векторе. В другом случае сериновая рекомбиназа представляет собой SF370. В других случаях сериновая рекомбиназа находится в отдельном векторе.
[000333] Рекомбиназы могут быть введены в клетку-мишень до, одновременно или после введения нацеливающего вектора. Рекомбиназа может быть непосредственно введена в клетку в виде белка, например, с применением липосом, покрытых частиц или микроинъекции. Согласно другому варианту полинуклеотид, либо ДНК, либо информационная РНК, кодирующий рекомбиназу, может быть введен в клетку с применением подходящего вектора экспрессии. Нацеливающие компоненты вектора, описанные выше, можно применять при конструировании кассет экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие рекомбиназу, представляющую интерес.Однако экспрессия рекомбиназы может регулироваться другими способами, например, экспрессию рекомбиназы можно контролировать с помощью регулируемого промотора (т.е. промотора, экспрессия которого может быть селективно индуцирована или репрессирована).
[000334] Рекомбиназы для применения при реализации настоящего изобретения могут быть получены рекомбинантно или очищены, как описано ранее. Полипептиды, имеющие целевую рекомбиназную активность, могут быть очищены до желаемой степени чистоты с помощью способов, известных в данной области техники для осаждения белка сульфатом аммония и очистки, включая, но не ограничиваясь ими, фракционирование по размеру, аффинную хроматографию, ВЭЖХ, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию на гепарин-агарозе (например, Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998.)
[000335] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения рекомбиназы могут быть введены в эукариотические клетки, которые содержат рекомбинационные сайты присоединения и в которых желательна рекомбинация, с помощью любого подходящего способа. Способы введения функциональных белков в клетки, например, с помощью микроинъекции или других способов, хорошо известны в данной области техники. Введение очищенного белка рекомбиназы обеспечивает кратковременное наличие белка и его функции, что часто является предпочтительным вариантом реализации. Согласно другому варианту ген, кодирующий рекомбиназу, может быть включен в вектор экспрессии, применяемый для трансформации клетки, в котором кодирующий рекомбиназу полинуклеотид функционально соединен с промотором, который опосредует экспрессию полинуклеотида в эукариотической клетке. Полипептид рекомбиназы также может быть введен в эукариотическую клетку с помощью информационной РНК, которая кодирует полипептид рекомбиназы. Обычно предпочтительно, чтобы рекомбиназа присутствовала только в течение времени, которое необходимо для вставки фрагментов нуклеиновой кислоты в модифицируемый геном. Таким образом, отсутствие постоянного наличия, ассоциированного с большинством векторов экспрессии, как ожидается, не будет неблагоприятным. Ген рекомбиназы может быть введен в клетку до, после или одновременно с введением экзогенного полинуклеотида, представляющего интерес.Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения ген рекомбиназы присутствует в векторе, который несет полинуклеотид, который должен быть вставлен; ген рекомбиназы даже может быть включен в полинуклеотид. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения ген рекомбиназы вводят в трансгенный эукариотический организм. Могут быть получены трансгенные клетки или животные, которые экспрессируют рекомбиназу конститутивно или под контролем клеточноспецифических, тканеспецифических, специфических для стадии развития, специфических для органелл промоторов или промоторов, индуцируемых или репрессируемых небольшой молекулой. Рекомбиназы также могут быть экспрессированы в виде гибридного белка с другими пептидами, белками, сигнальными пептидами ядерной локализации, сигнальными пептидами или специфическими для органелл сигнальными пептидами (например, транзитными пептидами митохондрий или хлоропластов для облегчения рекомбинации в митохондриях или хлоропластах).
[000336] Например, рекомбиназа может быть из семейств интеграз или резолваз. Семейство рекомбиназ-интеграз насчитывает более ста членов и включает, например, FLP, Cre и лямбда-интегразу. Семейство интеграз, также называемое тирозиновое семейство или семейство лямбда-интеграз, использует каталитическую гидроксильную группу тирозина для нуклеофильной атаки на фосфодиэфирную связь ДНК. Как правило, члены тирозинового семейства сначала надрезают ДНК, которая позже образует разрыв двойной цепи. Примеры интеграз из тирозинового семейства включают Cre, FLP, SSV1 и лямбда (А) интегразу. В семействе резолваз, также известном как семейство сериновых рекомбиназ, консервативный сериновый остаток образует ковалентную связь с сайтом-мишенью ДНК (Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16).
[000337] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения рекомбиназа представляет собой выделенную полинуклеотидную последовательность, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует рекомбиназу, выбранную из группы, состоящей из рекомбиназы SPβc2, рекомбиназы SF370.1, рекомбиназы Bxb1, рекомбиназы А118 и рекомбиназы φRv1. Примеры сериновых рекомбиназ подробно описаны в патенте США №9034652, полностью включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[000338] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способ сайт-специфичной рекомбинации включает обеспечение первого сайта рекомбинации и второго сайта рекомбинации; приведение первого и второго сайтов рекомбинации в контакт с полипептидом прокариотической рекомбиназы, что приводит к рекомбинации между сайтами рекомбинации, причем указанный полипептид рекомбиназы может опосредовать рекомбинацию между первым и вторым сайтами рекомбинации, при этом первый сайт рекомбинации представляет собой attP или attB, второй сайт рекомбинации представляет собой attB или attP, и рекомбиназа выбрана из группы, состоящей из рекомбиназы фага Listeria monocytogenes, рекомбиназы фага Streptococcus pyogenes, рекомбиназы фага Bacillus subtilis, рекомбиназы фага Mycobacterium tuberculosis и рекомбиназы фага Mycobacterium smegmatis, при условии, что если первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attB, второй рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attP, и если первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attP, второй рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attB. Согласно дополнительным вариантам реализации предложено введение сайт-специфичной рекомбиназы в клетку, геном которой должен быть модифицирован. Один вариант реализации относится к способу получения сайт-специфичной рекомбинации в эукариотической клетке, включающему обеспечение эукариотической клетки, которая содержит первый рекомбинационный сайт присоединения и второй рекомбинационный сайт присоединения; приведение первого и второго ре комбинационных сайтов присоединения в контакт с полипептидом прокариотической рекомбиназы, что приводит к рекомбинации между рекомбинационными сайтами присоединения, причем указанный полипептид рекомбиназы может опосредовать рекомбинацию между первым и вторым рекомбинационными сайтами присоединения, при этом первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой рекомбинационный сайт присоединения из фагового генома (attP) или рекомбинационный сайт присоединения из бактериального генома (attB), второй рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attB или attP, и рекомбиназа выбрана из группы, состоящей из рекомбиназы фага Listeria monocytogenes, рекомбиназы фага Streptococcus pyogenes, рекомбиназы фага Bacillus subtilis, рекомбиназы фага Mycobacterium tuberculosis и рекомбиназы фага Mycobacterium smegmatis, при условии, что если первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attB, второй рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attP, и если первый рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attP, второй рекомбинационный сайт присоединения представляет собой attB. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения рекомбиназа выбрана из группы, состоящей из рекомбиназы А118, рекомбиназы SF370.1, рекомбиназы SPβc2, рекомбиназы φRv1 и рекомбиназы Bxb1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения рекомбинация приводит к интеграции.
Источники иммунных эффекторных клеток
[000339] Согласно определенным аспектам варианты реализации, описанные в настоящей заявке, включают способы получения и/или размножения антигенспецифичных перенаправленных иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток или NK Т-клеток), которые включают трансфекцию клеток вектором экспрессии, содержащим конструкцию ДНК (или РНК), кодирующую полипептидную конструкцию, затем необязательно стимуляцию клеток с применением фидерных клеток, рекомбинантного антигена или антитела к рецептору, чтобы вызвать пролиферацию клеток. Согласно определенным аспектам клетка (или популяция клеток), модифицированная для экспрессии CAR или TCR, представляет собой стволовую клетку, индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (иПСК), иммунную эффекторную клетку или предшественник этих клеток.
[000340] Источники иммунных эффекторных клеток могут включать как аллогенные, так и аутологичные источники. В некоторых случаях иммунные эффекторные клетки могут быть дифференцированы из стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Таким образом, клетка для модификации в соответствии с вариантами реализации может быть выделена из пуповинной крови, периферической крови, эмбриональных стволовых клеток человека или иПСК. Например, аллогенные Т-клетки могут быть модифицированы для включения химерного антигенного рецептора (и необязательно без функционального TCR). Согласно некоторым аспектам иммунные эффекторные клетки представляют собой первичные Т-клетки человека, такие как Т-клетки, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК). МКПК могут быть собраны из периферической крови или после стимуляции Г-КСФ (гранулоцитарным колониестимулирующим фактором) из костного мозга или пуповинной крови. После трансфекции или трансдукции (например, с применением конструкции для экспрессии CAR) клетки могут быть немедленно введены путем инфузии или могут быть криоконсервированы. Согласно определенным аспектам после трансфекции клетки можно размножать в течение дней, недель или месяцев в условиях ex vivo в виде общей популяции через примерно 1, 2, 3, 4, 5 дней или более после переноса гена в клетки. Согласно дополнительному аспекту после трансфекции трансфектантов клонируют, и клон, проявляющий наличие отдельной интегрированной или поддерживаемой эписомально кассеты экспрессии или плазмиды, а также экспрессию химерного антигенного рецептора, размножают в условиях ex vivo. Клон, отобранный для размножения, демонстрирует способность специфично распознавать и лизировать экспрессирующие антиген клетки-мишени. Рекомбинантные Т-клетки могут быть размножены путем стимуляции ИЛ-2 или другими цитокинами, связывающими общую гамма-цепь (например, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-21 и другими). Рекомбинантные Т-клетки могут быть размножены путем стимуляции с применением искусственных антигенпрезентирующих клеток. Рекомбинантные Т-клетки могут быть размножены на искусственной антигенпрезентирующей клетке или с помощью антитела, такого как ОКТЗ, которое сшивает CD3 на поверхности Т-клеток. Подгруппы рекомбинантных Т-клеток могут быть дополнительно отобраны с применением способов выделения на основе магнитных гранул и/или технологии сортировки клеток с активированной флуоресценцией, и затем могут быть культивированы с АаРС. Согласно дополнительному аспекту генетически модифицированные клетки могут быть криоконсервированы.
2+
2+
[000341] Т-клетки также могут быть получены из ряда источников, включая периферическую кровь, костный мозг, ткань лимфатического узла, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоль (инфильтрирующие опухоль лимфоциты). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения можно применять любое количество линий Т-клеток, доступных в данной области техники. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки могут быть получены из единицы крови, взятой у субъекта, с применением любого количества методик, известных специалисту в данной области, таких как разделение в Ficoll. Согласно вариантам реализации клетки из циркулирующей крови индивидуума получают с помощью афереза. Продукт афереза, как правило, содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие белые клетки крови, красные клетки крови и тромбоциты. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения клетки, собранные с помощью афереза, могут быть промыты для удаления плазматической фракции и для помещения клеток в соответствующий буфер или среды для последующих этапов обработки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения клетки промывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Согласно другому варианту раствор для промывания не содержит кальций и может не содержать магний или может не содержать многие, или даже все, двухвалентные катионы. Начальные этапы активации в отсутствие кальция приводят к усиленной активации. Специалисты в данной области техники легко поймут, что этап промывки можно осуществлять с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, таких как применение полуавтоматической проточной центрифуги (например, клеточный процессор Cobe 2991, Baxter CytoMate или Haemonetics Cell Saver 5) в соответствии с инструкциями производителя. После промывки клетки могут быть ресуспендированы в различных биосовместимых буферах, таких как, например, не содержащий Са, не содержащий Mg ФСБ, PlasmaLyte А или другой солевой раствор с буфером или без него. Согласно другому варианту нежелательные компоненты образца афереза могут быть удалены, и клетки непосредственно ре суспендируют в культуральных средах.
+
+
+
+
+
+
+
+
[000342] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса красных клеток крови и истощения моноцитов, например, с помощью центрифугирования в градиенте PERCOLL или проточного элютриационного центрифугирования. Специфическая субпопуляция Т-клеток, такая как CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA и CD45RO Т-клетки, может быть дополнительно выделена с помощью методик положительного или отрицательного отбора. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CD14 клетки истощают из популяции Т-клеток. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения Т-клетки выделяют путем инкубации с гранулами, конъюгированными с антителами к CD3/CD28 (т.е. 3×28), такими как DYNABEADS М-450 CD3/CD28 Т, в течение периода времени, достаточного для положительного отбора целевых Т-клеток. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения период времени составляет примерно 30 минут.Согласно дополнительному варианту реализации период времени составляет от 30 минут до 36 часов или более, включая все целочисленные значения между ними. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения период времени составляет от 10 до 24 часов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения период инкубации составляет 24 часа. Для выделения Т-клеток у пациентов с лейкозом применение более длительного времени инкубации, такого как 24 часа, может увеличить выход клеток. Более длительные периоды времени инкубации можно применять для выделения Т-клеток в любой ситуации, когда Т-клеток мало по сравнению с другими типами клеток, например, при выделении инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ИОЛ) из опухолевой ткани или у индивидуумов с подавленным иммунитетом. Кроме того, применение более длительных периодов времени инкубации может повысить эффективность захвата CD8Т-клеток. Таким образом, простое сокращение или увеличение времени, в течение которого Т-клетки могут связываться с гранулами CD3/CD28, и/или увеличение или уменьшение соотношения гранул и Т-клеток (как описано далее в настоящей заявке), можно обеспечить преимущественный отбор субпопуляции Т-клеток по наличию какого-либо признака или его отсутствию в начале культивирования или в другие моменты времени в ходе процесса. Кроме того, с помощью увеличения или уменьшения соотношения антител к CD3 и/или антител к CD28 на гранулах или другой поверхности, субпопуляции Т-клеток могут быть преимущественно отобраны по наличию какого-либо признака или его отсутствию в начале культивирования или в другие желательные моменты времени. Специалист в данной области техники поймет, что применительно к настоящему изобретению также можно применять несколько раундов отбора. В определенных вариантах реализации может быть желательным выполнение процедуры отбора и применение «неотобранных» клеток в процессе активации и размножения. «Неотобранные» клетки также могут быть подвергнуты дополнительным раундам отбора.
+
+
+
+
+
[000343] Обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора можно осуществлять с применением комбинации антител, направленных к поверхностным маркерам, уникальным для отрицательно отобранных клеток. Один способ заключается в сортировке и/или отборе клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которой применяется набор моноклональных антител, направленных к маркерам клеточной поверхности, присутствующим на отрицательно отобранных клетках. Например, для обогащения CD4 клеток путем отрицательного отбора коктейль из моноклональных антител, как правило, содержит антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения желательным может быть обогащение или положительный отбор регуляторных Т-клеток, которые обычно экспрессируют CD4, CD25, CD62Lhi, GITR и FoxP3. Альтернативно, в определенных вариантах реализации регуляторные Т-клетки истощают с помощью гранул, конъюгированных с антителом к CD25, или другого подобного способа отбора.
+
[000344] Для выделения целевой популяции клеток путем положительного или отрицательного отбора можно варьировать концентрацию клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения желательным может быть значительное уменьшение объема, в котором смешивают гранулы и клетки (т.е. увеличение концентрации клеток), чтобы обеспечить максимальный контакт клеток и гранул. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения применяют концентрацию 2 миллиарда клеток/мл. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения применяют концентрацию 1 миллиард клеток/мл. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения применяют более 100 миллионов клеток/мл. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения применяют концентрацию клеток 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения применяют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения можно применять концентрации 125 или 150 миллионов клеток/мл. Применение высоких концентраций может привести к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножению клеток. Кроме того, применение высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут слабо экспрессировать представляющие интерес антигены-мишени, такие как CD28-отрицательные Т-клетки, или из образцов, в которых присутствует много опухолевых клеток (например, лейкемическая кровь, опухолевая ткань и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и их получение может быть желательным. Например, применение высокой концентрации клеток позволяет более эффективно отбирать CD8 Т-клетки, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.
+
+
6
5
6
[000345] В связанном варианте реализации желательным может быть применение более низких концентраций клеток. В результате значительного разбавления смеси Т-клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы) взаимодействия между частицами и клетками сведены к минимуму. Это позволяет отбирать клетки, которые экспрессируют большие количества целевых антигенов, которые будут связаны с частицами. Например, CD4 Т-клетки экспрессируют более высокие уровни CD28 и захватываются более эффективно, чем CD8 Т-клетки в разбавленных концентрациях. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения применяемая концентрация клеток составляет 5×10/мл. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения применяемая концентрация может составлять от примерно 1×10/мл до 1×10/мл, включая любое целочисленное значение между ними.
[000346] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения клетки можно инкубировать на вращающемся устройстве в течение различных промежутков времени с разными скоростями либо при 2-10°С, либо при комнатной температуре.
[000347] Т-клетки для стимуляции также могут быть заморожены после этапа промывки. После этапа промывки, который позволяет удалить плазму и тромбоциты, клетки могут быть суспендированы в растворе для замораживания. Несмотря на то, что многие растворы и параметры для замораживания известны в данной области техники и будут пригодны в данном случае, один способ включает применение ФСБ, содержащего 20% ДМСО и 8% сывороточного альбумина человека, или культуральных сред, содержащих 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% сывороточного альбумина человека и 7,5% ДМСО, или 31,25% PlasmaLyte A, 31,25% декстрозы 5%, 0,45% NaCl, 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% сывороточного альбумина человека и 7,5% ДМСО, или других подходящих сред для замораживания клеток, содержащих, например, Hespan и PlasmaLyte А, затем клетки замораживают до -80°С со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе резервуара для хранения жидкого азота. Можно применять другие способы контролируемого замораживания, а также неконтролируемое замораживание сразу при -20°С или в жидком азоте.
[000348] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения криоконсервированные клетки оттаивают и промывают, как описано в настоящей заявке, и оставляют в покое на один час при комнатной температуре перед активацией с применением способов согласно настоящему изобретению.
[000349] Согласно настоящему изобретению также предусмотрен сбор образцов крови или продукта афереза у субъекта в период времени, предшествующий тому, когда могут потребоваться размноженные клетки, описанные в настоящей заявке. В связи с этим источник клеток, которые будут размножены, может быть собран в любой необходимый момент времени, и целевые клетки, такие как Т-клетки, могут быть выделены и заморожены для последующего применения в Т-клеточной терапии для любого числа заболеваний или состояний, для которых Т-клеточная терапия может быть благоприятной, таких как те, которые описаны в настоящей заявке. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения образец крови или продукт афереза собирают у в основном здорового субъекта. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения образец крови или продукт афереза собирают у в основном здорового субъекта, который подвержен риску развития заболевания, но у которого еще не развилось заболевание, и представляющие интерес клетки выделяют и замораживают для последующего применения. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки могут быть размножены, заморожены и применены позднее. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения образцы отбирают у пациента вскоре после постановки диагноза конкретного заболевания, описанного в настоящей заявке, но до начала любого лечения. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения клетки выделяют из образца крови или продукта афереза у субъекта до начала любого количества соответствующих способов лечения, включая, но не ограничиваясь этим, лечение с применением таких агентов как натализумаб, эфализумаб, противовирусных агентов, химиотерапии, облучения, иммуносупрессорных агентов, таких как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антител или других иммуноабляционных агентов, таких как САМРАТН, антител к CD3, цитоксана, флударабина, циклоспорина, FK506, рапамицина, микофеноловой кислоты, стероидов, FR901228 и облучения. Эти лекарственные средства ингибируют кальций-зависимую фосфатазу кальцинейрин (циклоспорин и FK506) или ингибируют киназу p70S6, которая важна для индуцированной фактором роста передачи сигналов (рапамицин) (Liu et al., Cell 66:807-815, (1991); Henderson et al., Immun 73:316-321, (1991); Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993)). Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения клетки выделяют для пациента и замораживают для последующего применения в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга или стволовых клеток, абляционной терапией Т-клеток с применением любых химиотерапевтических агентов, таких как флударабин, наружной дистанционной лучевой терапией (XRT), циклофосфамидом или антителами, такими как ОКТ3 или САМРАТН. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения клетки выделяют заранее, и они могут быть заморожены для последующего применения для лечения после абляционной терапии В-клеток, например, агентами, которые реагируют с CD20, например, ритуксаном.
[000350] Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения Т-клетки получают от пациента непосредственно после лечения. В связи с этим было обнаружено, что после определенных способов лечения рака, в частности, способов лечения лекарственными средствами, которые повреждают иммунную систему, вскоре после лечения в течение периода, когда пациенты обычно будут восстанавливаться от лечения, качество полученных Т-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности размножаться в условиях ex vivo. Аналогичным образом, после манипуляций ех vivo с применением способов, описанных в настоящей заявке, эти клетки могут находиться в предпочтительном состоянии для повышенного приживления и размножения в условиях in vivo. Таким образом, применительно к настоящему изобретению предусмотрен сбор клеток крови, включая Т-клетки, дендритные клетки или другие клетки гемопоэтической линии, во время этой фазы восстановления. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения схемы мобилизации (например, мобилизация с помощью ГМ-КСФ) и кондиционирования можно применять для создания у субъекта состояния, при котором стимулируется репопуляция, рециркуляция, регенерация и/или размножение конкретных типов клеток, в частности, в определенном временном окне после терапии. Иллюстративные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.
Активация и размножение Т-клеток
[000351] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки, содержащие полинуклеотиды и полипептиды, описанные в настоящей заявке, могут быть необязательно активированы и размножены обычно с применением способов, описанных, например, в патентах США №№6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; и публикации заявки на патент США №20060121005.
[000352] «Адоптивный перенос Т-клеток» относится к выделению и размножению ех vivo специфических для опухоли Т-клеток, чтобы получить большее количество Т-клеток, чем то, которое можно было бы получить с помощью только вакцинации или естественного опухолевого ответа пациента. Специфические для опухоли Т-клетки затем вводят путем инфузии пациентам, страдающим раком, чтобы придать их иммунной системе способность подавлять оставшуюся опухоль с помощью Т-клеток, которые могут атаковать и уничтожать рак. Существует много форм адоптивной Т-клеточной терапии, применяемой для лечения рака; культивирование инфильтрирующих опухоль лимфоцитов или ИОЛ, выделение и размножение одной конкретной Т-клетки или клона и даже применение Т-клеток, которые были модифицированы для эффективного распознавания и атаки опухолей.
+
+
[000353] В некоторых случаях Т-клетки, описанные в настоящей заявке, размножают с помощью контакта с поверхностью, к которой присоединен агент, стимулирующий сигнал, ассоциированный с комплексом CD3/TCR, и лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, популяции Т-клеток можно стимулировать, как описано в настоящей заявке, например, с помощью контакта с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом или с антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или с помощью контакта с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в комбинации с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток применяют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяция Т-клеток может быть приведена в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Чтобы стимулировать пролиферацию как CD4 Т-клеток, так и CD8 Т-клеток применяют антитело к CD3 и антитело к CD28. Примеры антитела к CD28 включают 9.3, В-Т3, XR-CD28 (Diaclone, Безансон, Франция), также можно применять другие способы, общеизвестные в данной области техники (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998); Haanen et al., J. Exp.Med. 190(9): 13191328, (1999); Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, (1999)).
[000354] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения первичный стимулирующий сигнал и костимулирующий сигнал для Т-клеток могут быть обеспечены с помощью различных протоколов. Например, агенты, обеспечивающие каждый сигнал, могут находиться в растворе или могут быть связаны с поверхностью. Если агенты связаны с поверхностью, они могут быть связаны с одной и той же поверхностью (т.е. в «цис» форме) или с отдельными поверхностями (т.е. в «транс» форме). Согласно другому варианту один агент может быть связан с поверхностью, а другой агент может находиться в растворе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент, обеспечивающий ко стимулирующий сигнал, связан с поверхностью клетки, а агент, обеспечивающий первичный активирующий сигнал, находится в растворе или связан с поверхностью. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения оба агента могут находиться в растворе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения агенты могут быть в растворимой форме и затем сшиты с поверхностью, такой как клетка, экспрессирующая рецепторы Fc, или антитело или другой связывающий агент, который будет связываться с агентами. В этом отношении см., например, публикации заявок на патент США №№20040101519 и 20060034810, в которых описаны искусственные антигенпрезентирующие клетки (иАПК), которые предусмотрены для применения при активации и размножении Т-клеток в настоящем изобретении.
+
[000355] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения два агента иммобилизованы на гранулах, либо на одной и той же грануле, т.е. «цис», либо на отдельных гранулах, т.е. «транс». Например, агент, обеспечивающий первичный активирующий сигнал, представляет собой антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, а агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, представляет собой антитело к CD28 или его антигенсвязывающий фрагмент; и оба агента совместно иммобилизованы на одной и той же грануле в эквивалентных молекулярных количествах. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения каждое антитело, связанное с гранулами для размножения CD4 Т-клеток и выращивания Т-клеток, применяют в соотношении 1:1. Согласно определенным аспектам настоящего изобретения применяют такое соотношение антител к CD3:CD28, связанных с гранулами, при котором наблюдается увеличение размножения Т-клеток по сравнению с размножением, наблюдаемым при применении соотношения 1:1. Согласно одному конкретному варианту реализации наблюдается увеличение от примерно 1 до примерно 3 раз по сравнению с размножением, наблюдаемым при применении соотношения 1:1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения соотношение антител к CD3:CD28, связанных с гранулами, находится в диапазоне от 100:1 до 1:100 и всех целочисленных значений между ними. Согласно одному аспекту настоящего изобретения с частицами связано большее количество антитела к CD28, чем антитела к CD3, т.е. соотношение CD3:CD28 составляет менее единицы. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения соотношение антитела к CD28 и антитела к CD3, связанных с гранулами, превышает 2:1. Согласно одному конкретному варианту реализации применяют соотношение 1:100 антител к CD3:CD28, связанных с гранулами. Согласно другому варианту реализации применяют соотношение 1:75 антител к CD3:CD28, связанных с гранулами. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения применяют соотношение 1:50 антител к CD3:CD28, связанных с гранулами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения применяют соотношение 1:30 антител к CD3:CD28, связанных с гранулами. Согласно вариантам реализации применяют соотношение 1:10 антител к CD3:CD28, связанных с гранулами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения применяют соотношение 1:3 антител к CD3:CD28, связанных с гранулами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения применяют соотношение 3:1 антител к CD3:CD28, связанных с гранулами.
[000356] Для стимуляции Т-клеток или других клеток-мишеней можно применять соотношения частиц и клеток от 1:500 до 500:1 и любые целочисленные значения между ними. Обычные специалисты в данной области техники смогут легко понять, что соотношение частиц и клеток может зависеть от размера частиц относительно клетки-мишени. Например, небольшие гранулы могут связать только несколько клеток, в то время как большие гранулы могут связывать много клеток. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения соотношение клеток и частиц находится в диапазоне от 1:100 до 100:1 и любых целочисленных значений между ними, и согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения соотношение составляет от 1:9 до 9:1 и любые целочисленные значения между ними, которые можно применять для стимуляции Т-клеток. Соотношение частиц, связанных с антителом к CD3 и антителом к CD28, и Т-клеток, которое приводит к стимуляции Т-клеток, может варьироваться, как указано выше, однако определенные значения включают 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1, при этом одно соотношение составляет по меньшей мере 1:1 частиц на Т-клетку. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения применяют соотношение частиц и клеток, составляющее 1:1 или менее. Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего изобретения соотношение частица: клетка составляет 1:5. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения соотношение частиц и клеток может варьироваться в зависимости от дня стимуляции. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения соотношение частиц и клеток составляет от 1:1 до 10:1 в первый день, и дополнительные частицы добавляют к клеткам каждый день или через день после этого в течение до 10 дней при конечных соотношениях от 1:1 до 1:10 (на основании количества клеток в день добавления). Согласно одному конкретному варианту реализации соотношение частиц и клеток составляет 1:1 в первый день стимуляции и корректируется до 1:5 на третий и пятый дни стимуляции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения частицы добавляют ежедневно или через день до конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:5 на третий и пятый дни стимуляции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соотношение частиц и клеток составляет 2:1 в первый день стимуляции и корректируется до 1:10 на третий и пятый дни стимуляции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения частицы добавляют ежедневно или через день до конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:10 на третий и пятый дни стимуляции. Специалист в данной области техники поймет, что множество других соотношений могут быть подходящими для применения в настоящем изобретении. В частности, соотношения будут варьироваться в зависимости от размера частицы, а также от размера и типа клетки.
[000357] Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения клетки, такие как Т-клетки, комбинируют с покрытыми агентом гранулами, после этого гранулы и клетки разделяют, а затем клетки культивируют. В альтернативном варианте реализации перед культивированием покрытые агентом гранулы и клетки не разделяют, а совместно культивируют. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения гранулы и клетки сначала концентрируют путем приложения силы, такой как магнитная сила, это приводит к повышенному лигированию маркеров клеточной поверхности, что индуцирует стимуляцию клеток.
4
9
+
[000358] Например, белки клеточной поверхности можно лигировать, обеспечивая контакт парамагнитных гранул, к которым присоединено антитело к CD3 и антитело к CD28 (3×28 гранулы), с Т-клетками. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения клетки (например, 10-10 Т-клеток) и гранулы (например, парамагнитные гранулы DYNABEADS M-450 CD3/CD28 Т в соотношении 1:1 или MACS MicroBeads от Miltenyi Biotec) комбинируют в буфере, например, ФСБ (без двухвалентных катионов, таких как кальций и магний). Также обычные специалисты в данной области техники смогут легко определить любую концентрацию клеток, которую можно применять. Например, клетка-мишень может быть очень редкой в образце и может составлять только 0,01% образца, или весь образец (т.е. 100%) может состоять из клеток-мишеней, представляющих интерес. Соответственно, любое количество клеток включено в объем настоящего изобретения. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения желательным может быть значительное уменьшение объема, в котором смешивают частицы и клетки (т.е. увеличение концентрации клеток), чтобы обеспечить максимальный контакт клеток и частиц. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения применяют концентрацию примерно 2 миллиарда клеток/мл. Согласно другому варианту реализации применяют более 100 миллионов клеток/мл. Согласно дополнительному варианту реализации применяют концентрацию клеток 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения применяют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения можно применять концентрации 125 или 150 миллионов клеток/мл. Применение высоких концентраций может привести к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножению клеток. Кроме того, применение высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут слабо экспрессировать представляющие интерес антигены-мишени, такие как CD28-отрицательные Т-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и их получение является желательным в определенных вариантах реализации настоящего изобретения. Например, применение высокой концентрации клеток позволяет более эффективно отбирать CD8 Т-клетки, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.
2
[000359] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения смесь можно культивировать от нескольких часов (примерно 3 часа) до примерно 14 дней или любого целочисленного количества часов между ними. Согласно другому варианту реализации смесь можно культивировать в течение 21 дня. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение примерно восьми дней. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение 2-3 дней. Также желательными могут быть несколько циклов стимуляции, поэтому время культивирования Т-клеток может составлять 60 дней или более. Условия, подходящие для культивирования Т-клеток, включают подходящие среды (например, минимальные питательные среды или среды RPMI 1640 или X-vivo 15 (Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, фетальную бычью сыворотку или сыворотку человека), интерлейкин-2 (ИЛ-2), инсулин, ИФН-γ, ИЛ-4, ИЛ-7, ГМ-КСФ, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-15, TGF-бета и TNF-альфа или любые другие добавки для выращивания клеток, известные специалисту в данной области техники. Другие добавки для выращивания клеток включают, но не ограничиваются ими, сурфакгант, плазманат и восстанавливающие агенты, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, альфа-МЕМ, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, Optimizer, с добавленными аминокислотами, пируватом натрия и витаминами, либо бессывороточные, либо дополненные соответствующим количеством сыворотки (или плазмы) или определенным набором гормонов и/или количеством цитокина(ов), достаточным для выращивания и размножения Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включены только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые должны быть введены субъекту путем инфузии. Клетки-мишени поддерживают в условиях, необходимых для поддержания размножения, например, при подходящей температуре (например, 37°С) и атмосфере (например, воздух плюс 5% CO).
+
+
[000360] Т-клетки, которые подвергали стимуляции различной продолжительности, могут проявлять различные характеристики. Например, типичные продукты крови или мононуклеарных клеток периферической крови, полученных с помощью афереза, содержат популяцию хелперных Т-клеток (ТН, CD4), которая больше, чем популяция цитотоксических или супрессорных Т-клеток (ТС, CD8). Размножение Т-клеток в условиях ex vivo с помощью стимуляции рецепторов CD3 и CD28 приводит к получению популяции Т-клеток, которая состоит преимущественно из ТН-клеток до примерно 8-9 дней, тогда как примерно через 8-9 дней популяция Т-клеток содержит все большую популяцию ТС-клеток. Соответственно, в зависимости от цели лечения введение субъекту путем инфузии популяции Т-клеток, содержащей преимущественно ТН-клетки, может быть предпочтительным. Аналогичным образом, если была выделена антигенспецифичная подгруппа ТС-клеток, размножение этой подгруппы в большей степени может быть благоприятным.
[000361] Кроме того, помимо маркеров CD4 и CD8, другие фенотипические маркеры значительно различаются, но в значительной степени воспроизводимо, в ходе процесса размножения клеток. Таким образом, такая воспроизводимость обеспечивает возможность адаптации продукта активированных Т-клеток для конкретных целей.
[000362] В некоторых случаях иммунные эффекторные клетки согласно вариантам реализации (например, Т-клетки) совместно культивируют с активирующими и стимулирующими размножение клетками (АаРС), чтобы облегчить размножение клеток. АаРС также могут называться искусственными антигенпрезентирующими клетками (иАПК). Например, антигенпрезентирующие клетки (АПК) можно применять при получении терапевтических композиций и продуктов для клеточной терапии согласно вариантам реализации. Согласно одному аспекту АаРС могут представлять собой генетически модифицированные клетки K562. Общие рекомендации относительно получения и применения антигенпрезентирующих систем, см., например, в патентах США №№6225042, 6355479, 6362001 и 6790662; публикациях заявок на патент США №№2009/0017000 и 2009/0004142; и международной публикации №WO2007/103009, каждый из которых включен посредством ссылки. Согласно другому дополнительному аспекту вариантов реализации культивирование генетически модифицированных CAR-клеток включает культивирование генетически модифицированных CAR-клеток в присутствии дендритных клеток или активирующих и стимулирующих размножение клеток (АаРС), которые стимулируют размножение CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток. Согласно другим дополнительным аспектам АаРС содержат CAR-связывающее антитело или его фрагмент, экспрессируемый на поверхности АаРС. АаРС могут содержать дополнительные молекулы, которые активируют или костимулируют Т-клетки в некоторых случаях. Дополнительные молекулы могут содержать, в некоторых случаях, связанные с мембраной цитокины Cy. Согласно другим дополнительным аспектам АаРС инактивируют или облучают, или их тестировали, чтобы определить наличие и подтвердить отсутствие инфекционных материалов. Согласно другим дополнительным аспектам культивирование трансгенных CAR-клеток в присутствии АаРС включает культивирование трансгенных CAR-клеток в среде, содержащей растворимые цитокины, такие как ИЛ-15, ИЛ-21 и/или ИЛ-2. Клетки можно культивировать в соотношении от примерно 10:1 до примерно 1:10; от примерно 3:1 до примерно 1:5; от примерно 1:1 до примерно 1:3 (соотношение эффекторных клеток и АаРС); или в любом диапазоне соотношений, который может быть получен из указанных значений. Например, совместная культура Т-клеток и АаРС может быть в соотношении примерно 1:1, примерно 1:2 или примерно 1:3.
[000363] Согласно одному аспекту АаРС могут экспрессировать CD137L. Согласно некоторым аспектам АаРС могут дополнительно экспрессировать антиген, на который нацелена CAR-клетка. Согласно другим аспектам АаРС могут дополнительно экспрессировать CD19, CD64, CD86 или mIL15. Согласно определенным аспектам АаРС могут экспрессировать по меньшей мере один клон антитела к CD3, такой как, например, ОКТ3 и/или UCHT1. Согласно одному аспекту АаРС могут быть обработаны (например, облучены или обработаны митомицином С), чтобы устранить их способность к размножению. Согласно одному аспекту АаРС могли быть протестированы, чтобы определить наличие или подтвердить отсутствие инфекционных материалов. Способы получения таких АаРС известны в данной области техники. Согласно одному аспекту культивирование популяции CAR-модифицированных Т-клеток с АаРС может включать культивирование клеток в соотношении от примерно 10:1 до примерно 1:10; от примерно 3:1 до примерно 1:5; от примерно 1:1 до примерно 1:3 (соотношение Т-клеток и АаРС); или в любом диапазоне соотношений, который может быть получен из указанных значений. Например, совместная культура Т-клеток и АаРС может быть в соотношении примерно 1:1, примерно 1:2 или примерно 1:3. Согласно одному аспекту этап культивирования может дополнительно включать культивирование с аминобисфосфонатом (например, золедроновой кислотой).
+
[000364] Согласно дополнительному аспекту популяцию CAR-T-клеток культивируют и/или стимулируют в течение не более чем 7, 14, 21, 28, 35, 42 дней, 49, 56, 63 или 70 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию CAR-T-клеток культивируют и/или стимулируют в течение по меньшей мере 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или более дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию CAR-T-клеток культивируют и/или стимулируют в течение по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию CAR-T-клеток культивируют и/или стимулируют в течение по меньшей мере 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 или более дней. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения стимуляция включает совместное культивирование CAR-T-клеток с АаРС, чтобы стимулировать размножение CAR-положительных Т-клеток. Согласно другому аспекту популяцию генетически модифицированных CAR-клеток стимулируют с применением не более чем: 1Х стимуляции, 2Х стимуляций, 3Х стимуляций, 4Х стимуляций, 5Х стимуляций, 5Х стимуляций, 6Х стимуляций, 7Х стимуляций, 8Х стимуляций, 9Х стимуляций или 10Х стимуляций. В некоторых случаях генетически модифицированные клетки не культивируют в условиях ex vivo в присутствии АаРС. В некоторых конкретных случаях способ согласно варианту реализации дополнительно включает обогащение клеточной популяции CAR-экспрессирующими иммунными эффекторными клетками (например, Т-клетками) после этапа трансфекции и/или культивирования. Обогащение может включать сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS) и сортировку клеток, экспрессирующих CAR. Согласно дополнительному аспекту сортировка для получения CAR-экспрессирующих клеток включает применение CAR-связывающего антитела. Обогащение также может включать истощение CD56 клеток. Согласно еще одному дополнительному аспекту варианта реализации способ дополнительно включает криоконсервацию образца популяции генетически модифицированных CAR-клеток.
[000365] В некоторых случаях АаРС инкубируют с пептидом оптимальной длины, что обеспечивает непосредственное связывание пептида с молекулой ГКГС без дополнительного процессинга. Согласно другому варианту клетки могут экспрессировать представляющий интерес антиген (т.е., в случае независимого от ГКГС распознавания антигена). Кроме того, в некоторых случаях АПК могут экспрессировать антитело, которое связывается либо с конкретным полипептидом CAR, либо с полипептидами CAR в целом (например, универсальная активирующая и стимулирующая размножение клетка (уАПК). Такие способы раскрыты в WO/2014/190273, которой включен в настоящую заявку посредством ссылки. В дополнение к молекулам пептид-ГКГС или антигенам, представляющим интерес, системы АаРС также могут содержать по меньшей мере одну экзогенную вспомогательную молекулу. Можно применять любое подходящее количество и комбинацию вспомогательных молекул. Вспомогательная молекула может быть выбрана из вспомогательных молекул, таких как костимулирующие молекулы и молекулы адгезии. Примерные костимулирующие молекулы включают CD70 и В7.1 (В7.1 ранее был известен как В7 и также известен как CD80), которые, помимо прочего, связываются с молекулами CD28 и/или CTLA-4 на поверхности Т-клеток, тем самым влияя, например, на размножение Т-клеток, дифференцировку Th1, кратковременное выживание Т-клеток и секрецию цитокинов, таких как интерлейкин (ИЛ)-2. Молекулы адгезии могут включать связывающие углеводы гликопротеины, такие как селектины, трансмембранные связывающие гликопротеины, такие как интегрины, кальций-зависимые белки, такие как кадгерины, и белки суперсемейства однопроходных трансмембранных иммуноглобулинов (Ig), такие как молекулы межклеточной адгезии (ICAM), которые стимулируют, например, контакты клетка-клетка или клетка-матрикс. Примерные молекулы адгезии включают LFA-3 и ICAM, такую как ICAM-1. Методики, способы и реагенты, подходящие для отбора, клонирования, получения и экспрессии примерных вспомогательных молекул, включая костимулирующие молекулы и молекулы адгезии, приведены, например, в патентах США №№6225042, 6355479 и 6362001, включенных в настоящую заявку посредством ссылки.
[000366] Клетки, отобранные для превращения в АаРС, предпочтительно имеют дефекты внутриклеточного процессинга антигена, внутриклеточного переноса пептидов и/или внутриклеточной загрузки молекулы ГКГС класса 1 или класса II пептидом или являются пойкилотермными (т.е. менее чувствительными к температурному воздействию, чем линии клеток млекопитающих), или обладают как дефектами, так и пойкилотермными свойствами. Предпочтительно клетки, отобранные для превращения в АаРС, также не способны экспрессировать по меньшей мере одного эндогенного партнера (например, эндогенную молекулу ГКГС класса 1 или класса II и/или эндогенные вспомогательные молекулы, как описано выше) экзогенной молекулы ГКГС класса 1 или класса II и компонентов вспомогательных молекул, которые вводят в клетки. Кроме того, АаРС предпочтительно сохраняют дефекты и пойкилотермные свойства, которыми обладали клетки перед их модификацией для получения АаРС. Примерные АаРС представляют собой или происходят из линии клеток, дефицитных по транспортеру, ассоциированному с процессингом антигена (ТАР), такой как линия клеток насекомых. Примерная линия пойкилотермных клеток насекомых представляет собой линию клеток дрозофилы, такую как линия клеток Schneider 2 (см., например, Schneider 1972). Иллюстративные способы получения, выращивания и культивирования клеток Schneider 2 представлены в патентах США №№6225042, 6355479 и 6362001.
[000367] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения АаРС также подвергают циклу замораживания-оттаивания. В примерном цикле замораживания-оттаивания АаРС могут быть заморожены путем приведения подходящего сосуда, содержащего АаРС, в контакт с соответствующим количеством жидкого азота, твердого диоксида углерода (т.е. сухого льда) или аналогичного низкотемпературного материала так, что происходит быстрое замерзание. Затем замороженные АПК оттаивают либо путем извлечения АаРС из низкотемпературного материала и воздействия условий окружающей комнатной температуры, либо с помощью облегченного процесса оттаивания, в котором применяют умеренно теплую водяную баню или теплую руку, чтобы способствовать более короткому времени оттаивания. Кроме того, АаРС могут быть заморожены и храниться в течение длительного периода времени перед оттаиванием. Замороженные АаРС также могут быть подвергнуты оттаиванию и затем лиофилизированы перед дальнейшим применением. Предпочтительно консерванты, которые могут отрицательно повлиять на процедуры замораживания-оттаивания, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), полиэтиленгликоли (ПЭГ) и другие консерванты, отсутствуют в средах, содержащих АаРС, которые подвергают циклу замораживания-оттаивания, или по существу удалены, например, путем переноса АаРС в среды, которые по существу не содержат такие консерванты.
[000368] Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения ксеногенная нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, эндогенная по отношению к АаРС, могут быть инактивированы путем сшивания так, что после инактивации по существу не происходит размножение клеток, репликация или экспрессия нуклеиновой кислоты. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения АаРС инактивируют в момент времени после экспрессии экзогенного ГКГС и вспомогательных молекул, презентации таких молекул на поверхности АаРС и загрузки презентированых молекул ГКГС отобранным пептидом или пептидами. Соответственно, такие инактивированные и нагруженные отобранным пептидом АаРС, несмотря на то, что по существу они лишены способности к пролиферации или репликации, сохраняют функцию презентации отобранного пептида. Предпочтительно сшивание также позволяет получить АаРС, которые по существу не содержат загрязняющие микроорганизмы, такие как бактерии и вирусы, без значительного снижения антигенпрезентирующей клеточной функции АаРС. Таким образом, сшивание поддерживает важные функции АаРС и при этом помогает уменьшить проблемы с безопасностью продукта для клеточной терапии, разработанного с применением АаРС. Способы, связанные со сшивкой и АаРС, описаны, например, в публикации заявки на патент США №20090017000, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки.
[000369] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения дополнительно предложена модифицированная антигенпрезентирующая клетка (АПК). Такие клетки можно применять, например, как описано выше, для размножения иммунных эффекторных клеток в условиях ex vivo. Согласно дополнительным аспектам модифицированные АПК могут быть введены пациенту как таковые, что стимулирует размножение иммунных эффекторных клеток в условиях in vivo. Модифицированные АПК согласно вариантам реализации можно применять как таковые в качестве терапевтического агента. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные АПК можно применять в качестве терапевтического агента, который может стимулировать активацию эндогенных иммунных эффекторных клеток, специфичных в отношении антигена-мишени, и/или увеличивать активность или стойкость адаптивно перенесенных иммунных эффекторных клеток, специфичных в отношении антигена-мишени.
[000370] В настоящей заявке термин «модифицированная АПК» относится к клетке(ам), которая(ые) содержит(ат) по меньшей мере первый трансген, причем указанный первый трансген кодирует HLA. Такие модифицированные АПК могут дополнительно содержать второй трансген для экспрессии антигена таким образом, что антиген презентирован на поверхности на АПК в комплексе с HLA. Согласно некоторым аспектам модифицированная АПК может представлять собой тип клеток, который презентирует антигены (например, дендритная клетка). Согласно дополнительным аспектам модифицированная АПК может быть получена из типа клеток, который обычно не презентирует антигены, такого как Т-клетка или предшественник Т-клетки (называемый «Т-АПК»). Таким образом, в некоторых аспектах модифицированная АПК согласно вариантам реализации содержит первый трансген, кодирующий антиген-мишень, и второй трансген, кодирующий антиген лейкоцитов человека (HLA), так, что HLA экспрессируется на поверхности модифицированной АПК в комплексе с эпитопом антигена-мишени. Согласно определенным аспектам HLA, экспрессированный в модифицированной АПК, представляет собой HLA-A2.
[000371] Согласно некоторым аспектам модифицированная АПК согласно вариантам реализации может дополнительно содержать по меньшей мере третий трансген, кодирующий костимулирующую молекулу. Костимулирующая молекула может представлять собой костимулирующий цитокин, который может представлять собой связанный с мембраной цитокин Cy. Согласно определенным аспектам костимулирующий цитокин представляет собой ИЛ-15, такой как связанный с мембраной ИЛ-15. Согласно некоторым дополнительным аспектам модифицированная АПК может содержать редактированный (или удаленный) ген. Например, ингибирующий ген, такой как PD-1, LIM-3, CTLA-4 или TCR, может быть редактирован для уменьшения или устранения экспрессии гена. Модифицированная АПК согласно вариантам реализации может дополнительно содержать трансген, кодирующий любой антиген-мишень, представляющий интерес. Например, антиген-мишень может представлять собой антиген инфекционного заболевания или ассоциированный с опухолью антиген (ТАА).
Место оказания медицинской помощи
[000372] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения иммунные эффекторные клетки, описанные в настоящей заявке, модифицированы в месте оказания медицинской помощи. В некоторых случаях место оказания медицинской помощи находится в больнице или в учреждении (например, медицинском учреждении) поблизости от субъекта, нуждающегося в лечении. Субъект проходит аферез, и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) или субпопуляция МКПК могут быть обогащены, например, с помощью элютриации или разделения в фиколле. Обогащенные МКПК или субпопуляция МКПК могут быть криоконсервированы в любом подходящем растворе для криоконсервации перед дальнейшей обработкой. В одном случае процесс элютриации выполняют с применением буферного раствора, содержащего сывороточный альбумин человека. Иммунные эффекторные клетки, такие как Т-клетки, могут быть выделены с помощью способов отбора, описанных в настоящей заявке. В одном случае способ отбора Т-клеток включает гранулы, специфичные в отношении CD3 и CD8 на Т-клетках. В одном случае гранулы могут представлять собой парамагнитные гранулы. Собранные иммунные эффекторные клетки могут быть подвергнуты криоконсервации в любом подходящем растворе для криоконсервации перед модификацией. Иммунные эффекторные клетки можно оттаивать в промежуток времени до 24 часов, 36 часов, 48 часов, 72 часов или 96 часов перед инфузией. Перед модификацией оттаявшие клетки могут быть помещены в буфер для культивирования клеток, например, в буфер для культивирования клеток (например, RPMI), дополненный фетальной бычьей сывороткой (FBS), или могут быть помещены в буфер, который содержит цитокины, такие как ИЛ-2 и ИЛ-21. Согласно другому аспекту собранные иммунные эффекторные клетки могут быть немедленно модифицированы без необходимости в криоконсервации.
[000373] В некоторых случаях иммунные эффекторные клетки модифицируют с помощью модификации/введения химерного рецептора, одной или более клеточных меток, описанных в настоящей заявке, и/или цитокина в иммунные эффекторные клетки, которые затем быстро вводят субъекту путем инфузии. В некоторых случаях источники иммунных эффекторных клеток могут включать как аллогенные, так и аутологичные источники. В одном случае иммунные эффекторные клетки могут представлять собой Т-клетки или NK-клетки. В одном случае химерный рецептор может представлять собой CD19 CAR. В другом случае химерный рецептор может представлять собой CD33CAR. В дополнительном случае химерный рецептор может представлять собой MUC16 CAR. В другом случае цитокин может представлять собой mbИЛ-15. В одном случае mbИЛ-15 имеет последовательность SEQ ID NO: 178 или ее вариант или фрагмент. В одном случае клеточная метка может иметь последовательность SEQ ID NO: 57. В еще одном случае экспрессия mbИЛ-15 модулируется с помощью систем экспрессии с лиганд-индуцируемым переключателем гена, описанных в настоящей заявке. Например, лиганд, такой как веледимекс, может быть доставлен субъекту для модуляции экспрессии mbИЛ-15. Согласно другому аспекту обеспечено 5 мг, 10 мг, 15 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 50 мг, 60 мг, 70 мг, 80 мг, 90 мг или 100 мг веледимекса. Согласно дополнительному аспекту обеспечены более низкие дозы веледимекса, например, 0,5 мг, 1 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг или 20 мг. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения веледимекс вводят субъекту за 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 день до инфузии модифицированных иммунных эффекторных клеток. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения веледимекс вводят субъекту после инфузии модифицированных иммунных эффекторных клеток примерно один раз каждые 12 часов, примерно один раз каждые 24 часа, примерно один раз каждые 36 часов или примерно один раз каждые 48 часов, в течение эффективного периода времени. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения эффективный период времени для введения веледимекса составляет примерно: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 дней. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения веледимекс можно повторно вводить после периода отдыха, после перерыва в приеме лекарственного средства или во время рецидива у субъекта.
[000374] В определенных случаях, когда наблюдают нежелательное воздействие на субъекта или когда лечение не требуется, клеточная метка может быть активирована, например, с помощью цетуксимаба, для условной абляции в условиях in vivo модифицированных иммунных эффекторных клеток, содержащих клеточные метки, такие как метки на основе усеченного рецептора эпидермального фактора роста (варианты HER1t), описанные в настоящей заявке.
[000375] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такие иммунные эффекторные клетки модифицируют с помощью конструкций, введенных методом электропорации. В одном случае электропорацию выполняют с помощью электропораторов, таких как электропораторы Nucleofector™ от Lonza. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вектор, содержащий вышеупомянутые конструкции, представляет собой невирусный или вирусный вектор. В одном случае невирусный вектор содержит систему транспозон-транспозаза Sleeping Beauty. В одном случае иммунные эффекторные клетки подвергают зле ктро по рации с применением определенной последовательности. Например, иммунные эффекторные клетки могут быть подвергнуты электропорации с применением одного транспозона и затем ДНК, кодирующей транспозазу, а после этого вторым транспозоном. В другом случае иммунные эффекторные клетки могут быть подвергнуты электропорации с применением всех транспозонов и транспозазы одновременно. В другом случае иммунные эффекторные клетки могут быть подвергнуты электропорации с применением транспозазы и затем одновременно обоими транспозонами или одним транспозоном. При последовательной электропорации иммунные эффекторные клетки могут находиться в состоянии покоя в течение некоторого периода времени до следующего этапа электропорации.
[000376] В некоторых случаях модифицированные иммунные эффекторные клетки не проходят этап размножения и активации. В некоторых случаях модифицированные иммунные эффекторные клетки не проходят этап инкубации или культивирования (например, размножение в условиях ex vivd). В определенных случаях модифицированные иммунные эффекторные клетки помещают перед инфузией в буфер, который содержит ИЛ-2 и ИЛ-21. В других случаях модифицированные иммунные эффекторные клетки помещают или они находятся в состоянии покоя в буфере для культивирования клеток перед инфузией, например, в буфере для культивирования клеток (например, RPMI), дополненном фетальной бычьей сывороткой (FBS). Перед инфузией модифицированные иммунные эффекторные клетки могут быть собраны, промыты и приготовлены в солевом буфере при подготовке к инфузии субъекту.
[000377] В одном случае субъект подвергался лимфоистощению перед инфузией. В других случаях лимфоистощение не требуется, и модифицированные иммунные эффекторные клетки быстро вводят субъекту путем инфузии. Примерные схемы лимфоистощения приведены в таблицах 2 и 3 ниже:
[000378] В другом случае субъект подвергается минимальному лимфоистощению. В настоящей заявке минимальное лимфоистощение относится к сокращенному протоколу лимфоистощения, при котором субъекту можно проводить инфузию в течение 1 дня, 2 дней или 3 дней после схемы лимфоистощения. В одном случае сокращенный протокол лимфоистощения может включать более низкие дозы флударабина и/или циклофосфамида. В другом случае сокращенный протокол лимфоистощения может включать укороченный период лимфоистощения, например, 1 день или 2 дня.
[000379] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения иммунные эффекторные клетки модифицируют с помощью модификации/введения химерного рецептора и цитокина в указанные иммунные эффекторные клетки с последующим быстрым введением субъекту путем инфузии. В других случаях иммунные эффекторные клетки модифицируют с помощью модификации/введения химерного рецептора и цитокина в указанные клетки с последующим введением субъекту путем инфузии в течение по меньшей мере: 0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 часов. В других случаях иммунные эффекторные клетки модифицируют с помощью модификации/введения химерного рецептора и цитокина в иммунные эффекторные клетки с последующим введением субъекту путем инфузии через 0 дней, <1 день, <2 дня, <3 дня, <4 дня, <5 дней, <6 дней или <7 дней.
+
+
4
9
4
5
5
6
6
7
4
5
5
6
6
7
2
4
[000380] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некоторое количество модифицированных эффекторных клеток вводят субъекту, нуждающемуся в этом, при этом количество определяют на основании эффективности и возможной индукции токсичности, ассоциированной с цитокинами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения модифицированные эффекторные клетки представляют собой клетки CAR и CD3. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет >10, но ≤10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет >10, но ≤10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет >10, но ≤10 модифицированных эффекторных клеток/кг. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения более низкая доза >10, но ≤10модифицированных эффекторных клеток/кг может быть введена путем инфузии.
[000381] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения модифицированные иммунные эффекторные клетки нацелены на рак за счет местной доставки непосредственно в опухолевую ткань. Например, при раке яичника модифицированные иммунные эффекторные клетки могут быть доставлены внутрибрюшинно (в/б) в брюшной отдел или брюшную полость. Такая в/б доставка может быть выполнена через порт или ранее существовавший порт, помещенный для доставки химиотерапевтических лекарственных средств. Другие способы местной доставки модифицированных иммунных эффекторных клеток могут включать инфузию через катетер в резекционную полость, внутриопухолевую инъекцию под ультразвуковым контролем, инфузию печеночной артерии или внутриплевральную доставку.
[000382] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект, нуждающийся в этом, может начинать терапию первой дозой модифицированных иммунных эффекторных клеток, доставленной в/б, с последующей второй дозой модифицированных иммунных эффекторных клеток, доставленной в/в. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения после второй дозы модифицированных иммунных эффекторных клеток могут следовать последующие дозы, которые могут быть доставлены в/в или в/б. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения продолжительность интервала между первой и второй или дополнительной последующей дозой может составлять примерно: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 дней. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения продолжительность интервала между первой и второй или дополнительной последующей дозой может составлять примерно:0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 месяцев. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения продолжительность интервала между первой и второй или дополнительной последующей дозой может составлять примерно: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет.
2
9
2
5
2
4
5
6
7
8
9
[000383] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения катетер может быть помещен в опухоль или очаг метастазирования для дальнейшего введения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 доз модифицированных иммунных эффекторных клеток. В некоторых случаях дозы модифицированных эффекторных клеток могут составлять от примерно 10 примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В тех случаях, когда наблюдается токсичность, дозы модифицированных эффекторных клеток могут составлять от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях дозы модифицированных эффекторных клеток могут начинаться от примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг, и последующие дозы могут быть увеличены до примерно: 10, 10, 10, 10, 10 или 10 модифицированных эффекторных клеток/кг.
[000384] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способ стимуляции пролиферации и/или выживания модифицированных клеток включает получение образца клеток от субъекта и трансфекцию клеток из образца клеток одним или более полинуклеотидами, которые содержат один или более транспозонов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения транспозоны кодируют химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток и транспозазу, эффективную для интеграции указанных одного или более полинуклеотидов в геном указанных клеток, чтобы обеспечить популяцию модифицированных клеток. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения транспозоны кодируют химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток, полипептиды переключателя гена для лиганд-индуцируемого контроля цитокина и транспозазу, эффективную для интеграции указанных одного или более полинуклеотидов в геном указанных клеток, чтобы обеспечить популяцию модифицированных клеток. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды переключателя гена содержат i) первый полипептид переключателя гена, который содержит ДНК-связывающий домен, гибридизованный с первым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора, и ii) второй полипептид переключателя гена, который содержит домен трансактивации, гибридизованный со вторым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый полипептид переключателя гена и второй полипептид переключателя гена соединены линкером. В одном случае перед введением модифицированных клеток субъекту лимфоистощение не требуется. В одном случае способ размножения модифицированных клеток в условиях in vivo включает получение образца клеток от субъекта и трансфекцию клеток из образца клеток одним или более полинуклеотидами, которые содержат один или более транспозонов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения транспозон(ы), содержащий(ие) химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток; и транспозазу, эффективную для интеграции указанных одного или более полинуклеотидов в геном указанных клеток, вводят с помощью электропорации в образец клеток, чтобы обеспечить популяцию модифицированных клеток. Согласно дополнительному варианту реализации транспозоны кодируют химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток, полипептиды переключателя гена для лиганд-индуцируемого контроля цитокина и транспозазу, эффективную для интеграции указанных одного или более полинукпеотидов в геном указанных клеток, чтобы обеспечить популяцию модифицированных клеток. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды переключателя гена содержат i) первый полипептид переключателя гена, который содержит ДНК-связывающий домен, гибридизованный с первым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора, и ii) второй полипептид переключателя гена, который содержит домен трансакгивации, гибридизованный со вторым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый полипептид переключателя гена и второй полипептид переключателя гена соединены линкером. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения один транспозон может содержать химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток, таких как HER1t или любые варианты, описанные в настоящей заявке. В одном случае перед введением модифицированных клеток субъекту лимфоистощение не требуется.
[000385] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ повышения стойкости в условиях in vivo модифицированных клеток у субъекта, нуждающегося в этом, включает получение образца клеток от субъекта и трансфекцию клеток из образца клеток одним или более полинуклеотидами, которые содержат один или более транспозонов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения транспозон(ы), содержащий(ие) химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток; и транспозазу, эффективную для интеграции указанных одного или более полинуклеотидов в геном указанных клеток, вводят с помощью электропорации в образец клеток, чтобы обеспечить популяцию модифицированных клеток. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения отдельный транспозон может содержать химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток, таких как HER1t или любые варианты, описанные в настоящей заявке. В некоторых случаях один или более транспозонов кодируют химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток, полипептиды переключателя гена для лиганд-индуцируемого контроля цитокина и транспозазу, эффективную для интеграции ДНК в геном указанных клеток, чтобы обеспечить популяцию модифицированных клеток. В некоторых случаях полипептиды переключателя гена содержат i) первый полипептид переключателя гена, который содержит ДНК-связывающий домен, гибридизованный с первым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора, и ii) второй полипептид переключателя гена, который содержит домен трансактивации, гибридизованный со вторым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора, причем указанные первый полипептид переключателя гена и второй полипептид переключателя гена соединены линкером. В одном случае перед введением модифицированных клеток субъекту лимфоистощение не требуется.
[000386] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ лечения субъекта с плотной опухолью включает получение образца клеток от субъекта, трансфекцию клеток образца одним или более полинуклеотидами, которые содержат один или более транспозонов, и введение популяции модифицированных клеток субъекту. В одном случае перед введением модифицированных клеток субъекту лимфоистощение не требуется. В некоторых случаях один или более транспозонов кодируют химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток и транспозазу, эффективную для интеграции ДНК в геном клеток. В некоторых случаях один или более транспозонов кодируют химерный антигенный рецептор (CAR), цитокин, одну или более клеточных меток, полипептиды переключателя гена для лиганд-индуцируемого контроля цитокина и транспозазу, эффективную для интеграции ДНК в геном клеток. В некоторых случаях полипептиды переключателя гена содержат: i) первый полипептид переключателя гена, который содержит ДНК-связывающий домен, гибридизованный с первым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора, и ii) второй полипептид переключателя гена, который содержит домен трансактивации, гибридизованный со вторым лигандсвязывающим доменом ядерного рецептора, причем указанные первый полипептид переключателя гена и второй полипептид переключателя гена соединены линкером. В некоторых случаях клетки трансфецируют с помощью электропорации. В некоторых случаях полинуклеотиды, кодирующие полипептиды переключателя гена, модулируют с помощью промотора. В некоторых случаях промотор представляет собой тканеспецифический промотор или промотор EF1A или его функциональный вариант. В некоторых случаях тканеспецифический промотор содержит Т-клеточный элемент ответа или элемент ответа NFAT. В некоторых случаях цитокин содержит по меньшей мере одно из: ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-12, ИЛ-21, гибрида ИЛ-15, ИЛ-15R или варианта ИЛ-15. В некоторых случаях цитокин находится в секретируемой форме. В некоторых случаях цитокин находится в связанной с мембраной форме. В некоторых случаях клетки представляют собой NK-клетки, NKT-клетки, Т-клетки или клетки-предшественники Т-клеток. В некоторых случаях клетки вводят субъекту (например, путем инфузии модифицированных клеток субъекту). В некоторых случаях способ дополнительно включает введение эффективного количества лиганда (например, веледимекса) для индукции экспрессии цитокина. В некоторых случаях CAR способен связывать по меньшей мере одно из: CD19, CD33, ВСМА, CD44, α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, MUC-16, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 и VEGF-R2. В некоторых случаях транспозаза представляет собой Тс1-подобную транспозазу лососевого типа. В некоторых случаях транспозаза представляет собой транспозазу SB11 или SB100x. В других случаях транспозаза представляет собой PiggyBac. В некоторых случаях клеточная метка содержит по меньшей мере один из HER1t1.
Показания к применению
[000387] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящей заявке раскрыты способы введения модифицированной эффекторной клетки, кодирующей полинуклеотид, описанный в настоящей заявке, субъекту, имеющему нарушение, например, рак или инфекционное заболевание. В некоторых случаях рак представляет собой рак, ассоциированный с экспрессией CD19, CD20, CD33, CD44, ВСМА, CD123, EGFRvIII, α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72 или VEGF-R2.
[000388] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящей заявке раскрыты способы введения полинуклеотида, полипептида или модифицированной эффекторной клетки, кодирующей полинуклеотид, описанных в настоящей заявке, субъекту, имеющему рак, ассоциированный со сверхэкспрессией CD19. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящей заявке раскрыты способы введения модифицированной эффекторной клетки субъекту, имеющему рак, ассоциированный со сверхэкспрессией CD33. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящей заявке раскрыты способы введения модифицированной эффекторной клетки субъекту, имеющему рак, ассоциированный со сверхэкспрессией CD44, ВСМА, CD123, EGFRvIII, α-рецептора фолата, CAIX, CD30, ROR1, СЕА, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, связывающего фолат белка, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, мезотелина, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72 или VEGF-R2. В некоторых случаях рак представляет собой метастатический рак. В других случаях рак представляет собой рецидивирующий или рефракторный рак.
[000389] В некоторых случаях рак представляет собой плотную опухоль или гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых случаях рак представляет собой плотную опухоль. В других случаях рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых случаях рак представляет собой метастатический рак. В некоторых случаях рак представляет собой рецидивирующий или рефракторный рак.
[000390] В некоторых случаях рак представляет собой плотную опухоль. Примерные плотные опухоли включают, но не ограничиваются ими, рак анального канала; рак аппендикса; рак желчных протоков (т.е. холангиокарциному); рак мочевого пузыря; опухоль головного мозга; рак молочной железы; рак шейки матки; рак толстой кишки; рак с неизвестным первичным происхождением (CUP); рак пищевода; рак глаз; рак маточной трубы; гастроэнтерологический рак; рак почек; рак печени; рак легких; медуллобластому; меланому; рак полости рта; рак яичников; рак поджелудочной железы; заболевание паращитовидной железы; рак полового члена; опухоль гипофиза; рак простаты; рак прямой кишки; рак кожи; рак желудка; рак яичек; рак горла; рак щитовидной железы; рак матки; рак влагалища; или рак вульвы.
[000391] В некоторых случаях рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование включает лимфому, лейкоз, миелому или В-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование включает лимфому, лейкоз или миелому. В некоторых случаях примерные гематологические злокачественные новообразования включают хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МЛЛ), ХЛЛ высокого риска, не-ХЛЛ/МЛЛ лимфому, пролимфоцитарный лейкоз (PLL), фолликулярную лимфому (ФЛ), диффузную крупнокпеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), макроглобулинемию Вальденегрема, множественную миелому, внеузловую В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, узловую В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому Беркитта, В-клеточную лимфому высокой степени злокачественности, отличную от лимфомы Беркитта, первичную средостенную В-клеточную лимфому (PMBL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки, миелому плазматических клеток, плазмоцитому, средостенную (тимусную) круп но клеточную В-кпеточную лимфому, внутрисосудистую крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную выпотную лимфому или лимфоматоидный гранулематоз. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование включает миелолейкоз. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование включает острый миелолейкоз (ОМЛ) или хронический миелолейкоз (ХМЛ).
[000392] В некоторых случаях в настоящей заявке раскрыты способы введения модифицированной эффекторной клетки, описанной в настоящей заявке, субъекту, имеющему гематологическое злокачественное новообразование, выбранное из хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (МЛЛ), ХЛЛ высокого риска, не-ХЛЛ/МЛЛ лимфомы, пролимфоцитарного лейкоза (PLL), фолликулярной лимфомы (ФЛ), диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL), лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL), макроглобулинемии Вальденстрема, множественной миеломы, внеузловой В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, узловой В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы Беркитта, В-клеточной лимфомы высокой степени злокачественности, отличной от лимфомы Беркитта, первичной средостенной В-клеточной лимфомы (PMBL), иммунобластной крупноклеточной лимфомы, В-лимфобластной лимфомы из клеток-предшественников, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки, миеломы плазматических клеток, плазмоцитомы, средостенной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы, внутрисосуд истой крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы или лимфоматоидного гранулематоза. В некоторых случаях в настоящей заявке раскрыты способы введения модифицированной эффекторной клетки субъекту, имеющему гематологическое злокачественное новообразование, выбранное из ОМЛ или ХМЛ.
[000393] В других случаях в настоящей заявке раскрыты способы введения субъекту, имеющему инфекцию, вызванную инфекционным заболеванием. Инфекционное заболевание может представлять собой заболевание, возникшее в результате бактериальной, вирусной или грибковой инфекции. В других случаях примерные вирусные патогены включают патогенов из семейств Adenoviridae, вирус Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирус (CMV), респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус JC, вирус BK, HSV, семейства вирусов HHV, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae и Togaviridae. Примерные патогенные вирусы вызывают оспу, грипп, эпидемический паротит, корь, ветряную оспу, лихорадку Эбола и краснуху. Примерные патогенные грибки включают Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis и Stachybotrys. Примерные патогенные бактерии включают Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Staphylococcus, Helicobacter, E. coli, Rickettsia, Bacillus, Bordetella, Chlamydia, Spirochetes и Salmonella.
Дозы модифицированных эффекторных клеток
2
9
3
9
4
9
5
9
5
8
5
7
6
9
6
8
7
9
5
6
6
7
7
8
8
9
9
8
7
6
5
[000394] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъекту, нуждающемуся в этом, вводят некоторое количество модифицированных эффекторных клеток, причем количество определяют на основании эффективности и возможности индукции токсичности, ассоциированной с цитокинами. В некоторых случаях количество модифицированных иммунных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных иммунных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных иммунных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных иммунных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных иммунных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных иммунных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет примерно 10модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных эффекторных клеток составляет примерно 10 модифицированных эффекторных клеток/кг.
2
4
5
9
5
8
5
7
6
9
6
8
7
9
5
6
6
7
7
8
8
9
9
8
7
6
5
[000395] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные эффекторные клетки представляют собой модифицированные Т-клетки. В некоторых случаях модифицированные Т-клетки представляют собой CAR-T-клетки. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-Т-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-Т-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-Т-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-Т-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-Т-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-Т-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-Т-клеток/кг. В некоторых случаях количество CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг.
2
9
3
9
4
9
5
9
5
8
5
7
6
9
6
8
7
9
5
6
6
7
7
8
8
9
9
8
7
6
5
4
3
2
[000396] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR-Т-клетки представляют собой CD19-специфичные CAR-T-клетки. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR-T-клетки представляют собой CD19-специфичные CAR-T-клетки. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CAR-T-клетки представляют собой CD19-специфичные CAR-T-клетки. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-Т-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-T-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг. В некоторых случаях количество CD19-специфичных CAR-Т-клеток составляет примерно 10 CAR-T-клеток/кг.
2
9
3
9
4
9
5
9
5
8
5
7
6
9
6
8
7
9
5
6
6
7
7
8
8
9
9
8
7
6
5
4
3
2
[000397] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные Т-клетки представляют собой модифицированные TCR-T-клетки. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-T-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет от примерно 10 до примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг. В некоторых случаях количество модифицированных TCR-клеток составляет примерно 10 TCR-клеток/кг.
Фармацевтические композиции и лекарственные формы
[000398] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящей заявке раскрыты композиции, содержащие полинуклеотид или полипептид, описанные в настоящей заявке, для введения субъекту. В некоторых случаях предусмотрены композиции модифицированных эффекторных клеток, кодирующих полинукпеотид или полипептид, раскрытые в настоящей заявке, и необязательно содержащие цитокин и/или дополнительный терапевтический агент. В некоторых случаях предусмотрены векторы, кодирующие полипептидные конструкции для экспрессии клеточных меток для модификации эффекторной клетки.
[000399] В некоторых случаях фармацевтические композиции модифицированной эффекторной клетки или вектора, кодирующего полипептидные конструкции и химерный антигенный рецептор, изготавливают обычным способом с применением одного или более физиологически приемлемых носителей, включая вспомогательные вещества и вспомогательные агенты, которые облегчают обработку активных соединений с получением препаратов, которые можно применять фармацевтически. Надлежащий состав зависит от выбранного пути введения. Краткое описание фармацевтических композиций, описанных в настоящей заявке, можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 изд. (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; под ред. Liberman, H.A. and Lachman, L, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; и Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7 изд. (Lippincott Williams & Wilkins1999).
[000400] Фармацевтические композиции необязательно изготавливают обычным способом, таким как, только в качестве примера, способы обычного смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, капсулирования, захвата или компрессии.
[000401] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения композиции также могут содержать один или более агентов для корректировки рН или буферных агентов, включая кислоты, такие как уксусная, борная, лимонная, молочная, фосфорная и соляная кислоты; основания, такие как гидроксид натрия, фосфат натрия, борат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, лактат натрия и трис-гидроксиметиламинометан; и буферы, такие как цитрат/декстроза, бикарбонат натрия и хлорид аммония. Такие кислоты, основания и буферы включены в количестве, необходимом для поддержания рН композиции в приемлемом диапазоне.
[000402] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиции также могут содержать одну или более солей в количестве, необходимом для доведения осмоляльности композиции до приемлемого диапазона. Такие соли включают соли, содержащие катионы натрия, калия или аммония и анионы хлорида, цитрата аскорбата, бората, фосфата, бикарбоната, сульфата, тиосульфата или бисульфита; подходящие соли включают хлорид натрия, хлорид калия, тиосульфат натрия, бисульфит натрия и сульфат аммония.
[000403] Фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, вводят с помощью любого подходящего пути введения, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный, парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутримышечный, внутримозговый, внутрицеребровентрикулярный, внутрисуставной, внутрибрюшинный или внутричерепной), интраназальный, буккальный, подъязычный или ректальный пути введения. В некоторых случаях фармацевтическая композиция изготовлена для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного, внутримозгового, внутрицеребровентрикулярного, внутрисуставного, внутрибрюшинного или внутричерепного) введения.
[000404] Фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, изготовлены в виде любой подходящей лекарственной формы, включая, но не ограничиваясь ими, водные пероральные дисперсии, жидкости, гели, сиропы, эликсиры, пастообразные смеси, суспензии и тому подобное, для перорального приема индивидуумом, подлежащим лечению, твердые пероральные лекарственные формы, аэрозоли, составы с контролируемым высвобождением, составы с быстрым плавлением, шипучие составы, лиофилизированные составы, таблетки, порошки, пилюли, драже, капсулы, составы с отсроченным высвобождением, составы с пролонгированным высвобождением, составы с импульсным высвобождением, составы с множественными частицами и смешанные составы с немедленным высвобождением и контролируемым высвобождением. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции изготовлены в виде капсул. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции изготовлены в виде растворов (например, для внутривенного введения). В некоторых случаях фармацевтическая композиция изготовлена в виде инфузии. В некоторых случаях фармацевтическая композиция изготовлена в виде инъекции.
[000405] Фармацевтические твердые лекарственные формы, описанные в настоящей заявке, необязательно содержат соединение, описанное в настоящей заявке, и одну или более фармацевтически приемлемых добавок, таких как совместимый носитель, связующее вещество, наполняющий агент, суспендирующий агент, ароматизирующий агент, подслащающий агент, дезинтегрирующий агент, диспергирующий агент, сурфактант, смазывающее вещество, краситель, разбавитель, солюбилизатор, увлажняющий агент, пластификатор, стабилизатор, усилитель проникновения, смачивающий агент, противовспенивающий агент, антиоксидант, консервант или одна или более их комбинаций.
[000406] Согласно другим аспектам композиции заключают в пленочное покрытие, используя стандартные процедуры покрытия, такие как те, которые описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20 изд. (2000). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции изготовлены в виде частиц (например, для введения с помощью капсулы), и некоторые или все частицы являются покрытыми. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции изготовлены в виде частиц (например, для введения с помощью капсулы), и некоторые или все частицы являются микрокапсулированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции изготовлены в виде частиц (например, для введения с помощью капсулы), и некоторые или все частицы не являются микрокапсулированными и не имеют покрытия.
[000407] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения композиции согласно настоящему изобретению также могут содержать один или более консервантов для ингибирования микробной активности. Подходящие консерванты включают ртутьсодержащие вещества, такие как мерфен и тиомерсал; стабилизированный диоксид хлора; и соединения четвертичного аммония, такие как хлорид бензалкония, бромид цетилтриметиламмония и хлорид цетилпиридиния.
[000408] «Пролиферативное заболевание», как упоминается в настоящей заявке, означает комплексное понятие, согласно которому избыточная пролиферация клеток и обновление клеточного матрикса вносят значительный вклад в патогенез ряда заболеваний, включая рак.
[000409] В настоящей заявке термин «пациент» относится к субъекту-млекопитающему, у которого диагностировано и имеется подозрение на наличие или развитие физиологического состояния, например, рака, аутоиммунного состояния или инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения термин «пациент» относится к субъекту-млекопитающему с более высокой, чем средняя, вероятностью развития рака. Примеры пациентов могут включать человека, человекообразных обезьян, собак, свиней, крупный рогатый скот, кошек, лошадей, коз, овец, грызунов и других млекопитающих, которые могут получить пользу от видов терапии, описанных в настоящей заявке. Примеры пациентов-людей могут включать мужчину и/или женщину.
[000410] «Введение» упоминается в настоящей заявке как обеспечение пациенту композиций согласно настоящему изобретению. Например, но не ограничиваясь этим, введение композиции, например, инъекцию, можно выполнять с помощью внутривенной (в/в) инъекции, подкожной (п/к) инъекции, внутрикожной (в/к) инъекции, внутрибрюшинной (в/б) инъекции или внутримышечной (в/м) инъекции. Можно применять один или более таких путей. Парентеральное введение можно осуществлять, например, с помощью болюсной инъекции или постепенной перфузии в течение некоторого времени. Альтернативно или одновременно введение можно осуществлять пероральным путем. Помимо этого введение также можно осуществлять путем хирургического размещения болюса или клеточной массы или размещения медицинского устройства.
[000411] «Пациент, нуждающийся в этом» или «субъект, нуждающийся в этом» упоминается в настоящей заявке как пациент или субъект, у которого диагностировано или имеется подозрение на наличие заболевания или нарушения, например, но не ограничиваясь этим, пролиферативного нарушения, такого как рак. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения у пациента или субъекта имеется или вероятно может развиться плотная опухоль или лейкоз. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лейкоз может представлять собой, например, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый миелолейкоз (ОМЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) и хронический миелолейкоз (ХМЛ).
[000412] Композиции согласно настоящему изобретению могут содержать клетки-хозяева, экспрессирующие последовательности нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, или вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, в количестве, которое эффективно для лечения или предотвращения пролиферативных нарушений. В настоящей заявке термины «лечение», «лечащий» и тому подобные относятся к получению целевого фармакологического и/или физиологического эффекта. Согласно вариантам реализации эффект является терапевтическим, т.е. эффект частично или полностью излечивает заболевание и/или нежелательный симптом, относящийся к заболеванию. С этой целью способ согласно настоящему изобретению включает введение «терапевтически эффективного количества» композиции, содержащей клетки-хозяева, экспрессирующие последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, или вектор, содержащий последовательности нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
[000413] «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения целевого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов как патологическое состояние, возраст, пол и масса индивидуума и способность последовательностей нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению вызывать целевой ответ у индивидуума.
[000414] Согласно другому варианту фармакологический и/или физиологический эффект может быть «профилактическим», т.е. эффект полностью или частично предотвращает заболевание или его симптом.
[000415] «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения целевого профилактического результата (например, предотвращения начала заболевания).
[000416] «Противовспенивающие агенты» уменьшают пенообразование во время обработки, которое может привести к коагуляции водных дисперсий, образованию пузырьков в готовой пленке или обычно нарушает обработку. Примерные Противовспенивающие агенты включают кремниевые эмульсии или сесквиолеат сорбитана.
[000417] «Антиоксиданты» включают, например, бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), аскорбат натрия, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия и токоферол. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения антиоксиданты повышают химическую стабильность, в случае необходимости.
[000418] Применение антиоксидантов, хелатирующих металлы агентов, тиолсодержащих соединений и других общих стабилизирующих агентов может быть благоприятным для составов, описанных в настоящей заявке. Примеры таких стабилизирующих агентов включают, но не ограничиваются ими: (а) от примерно 0,5% до примерно 2% масс./об. глицерина, (b) от примерно 0,1% до примерно 1% масс./об. метионина, (с) от примерно 0,1% до примерно 2% масс./об. монотиоглицерина, (d) от примерно 1 мМ до примерно 10 мМ ЭДТА, (е) от примерно 0,01% до примерно 2% масс./об. аскорбиновой кислоты, (f) от 0,003% до примерно 0,02% масс./об. полисорбата 80, (g) от 0,001% до примерно 0,05% масс./об. полисорбата 20, (h) аргинин, (i) гепарин, (j) декстрансульфат, (k) циклодекстрины, (l) полисульфат пентозана и другие гепариноиды, (m) двухвалентные катионы, такие как магний и цинк; или (n) их комбинации.
[000419] «Связующие вещества» придают когезивные свойства и включают, например, альгиновую кислоту и ее соли; производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза (например, Methocel), гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза (например, Klucel), этилцеллюлоза (например, Ethocel) и микрокристаллическая целлюлоза (например, Avicel); микрокристаллическую декстрозу; амилозу; алюмосиликат магния; полисахаридные кислоты; бентониты; желатин; сополимер поливинилпирролидон/винилацетат; кросповидон; повидон; крахмал; предварительно желатинизированный крахмал; трагакант, декстрин, сахар, такой как сахароза (например, Dipac), глюкоза, декстроза, мелассы, маннит, сорбит, ксилит (например, Xylitab) и лактоза; натуральную или синтетическую камедь, такую как гуммиарабик, трагакант, гаттиевую камедь, экстракт слизи из оболочки семян подорожника рода Plantago, поливинилпирролидон (например, Polyvidone CL, Kollidon CL, Polyplasdone XL-10), арабогалактан лиственницы, Veegum, полиэтиленгликоль, воски, альгинат натрия и тому подобное.
[000420] «Носитель» или «транспортирующие материалы» включают любые обычно применяемые вспомогательные вещества в фармацевтической области и должны быть выбраны на основании совместимости с соединениями, раскрытыми в настоящей заявке, такими как соединения ибрутиниба, и противораковым агентом, и свойствами профиля высвобождения целевой лекарственной формы. Примерные транспортирующие материалы включают, например, связующие агенты, суспендирующие агенты, дезинтегрирующие агенты, наполняющие агенты, сурфактанты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смазывающие материалы, смачивающие агенты, разбавители и тому подобное. «Фармацевтически совместимые транспортирующие материалы» могут включать, но не ограничиваются ими, гуммиарабик, желатин, коллоидный диоксид кремния, глицерофосфат кальция, лактат кальция, мальтодекстрин, глицерин, силикат магния, поливинилпирролидон (ПВП), холестерин, сложные эфиры холестерина, казеинат натрия, лецитин сои, таурохолевую кислоту, фосфотидилхолин, хлорид натрия, трехзамещенный фосфат кальция, двузамещенный фосфат калия, целлюлозу и конъюгаты целлюлозы, сахара, стеароиллактилат натрия, каррагинан, моноглицерид, диглицерид, предварительно желатинизированный крахмал и тому подобное. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 изд. (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John Е., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; под ред. Liberman, H.A. and Lachman, L, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; и Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7 изд. (Lippincott Williams & Wilkins 1999).
[000421] «Диспергирующие агенты» и/или «агенты, модулирующие вязкость» включают материалы, которые позволяют контролировать диффузию и гомогенность лекарственного средства с помощью жидких сред или способа грануляции, или способа смешивания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эти агенты также улучшают эффективность покрытия или разрушения матрикса. Примерные облегчающие диффузию агенты/диспергирующие агенты включают, например, гидрофильные полимеры, электролиты, Tween 60 или 80, ПЭГ, поливинилпирролидон (ПВП; коммерчески известный как Plasdone) и диспергирующие агенты на основе углеводов, такие как, например, гидроксипропилцеллюлозы (например, НРС, HPC-SL и HPC-L), гидроксипропилметилцеллюлозы (например, НРМС K100, НРМС K4M, НРМС K15M и НРМС K100M), карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетат-стеарат гидроксипропилметилцеллюлозы (АСГПМЦ), некристаллическая целлюлоза, алюмосиликат магния, триэтаноламин, поливиниловый спирт (ПВС), сополимер винилпирролидон/винилацетат (S630), полимер 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенола с этиленоксидом и формальдегидом (также известный как тилоксапол), полоксамеры (например, Pluronics F68, F88 и F108, которые являются блок-сополимерами этиленоксида и пропиленоксида); и полоксамины (например, Tetronic 908, также известный как полоксамин 908, который представляет собой тетрафункциональный блок-сополимер, полученный в результате последовательного добавления пропиленоксида и этиленоксида к этилендиамину (BASF Corporation, Парсипани, Нью-Джерси, США)), поливинилпирролидон K12, поливинилпирролидон K17, поливинилпирролидон K25 или поливинилпирролидон K30, сополимер поливинилпирролидон/винилацетат (S-630), полиэтиленгликоль, например, полиэтиленгликоль может иметь молекулярную массу от примерно 300 до примерно 6000, или от примерно 3350 до примерно 4000, или от примерно 7000 до примерно 5400, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, полисорбат-80, альгинат натрия, камеди, такие как, например, трагакантовая камедь и гуммиарабик, гуаровая камедь, ксантаны, включая ксантановую камедь, сахара, целлюлозы, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия, полисорбат-80, альгинат натрия, полиэтоксилированный монолаурат сорбитана, полиэтоксилированный монолаурат сорбитана, повидон, карбомеры, поливиниловый спирт (ПВС), альгинаты, хитозаны и их комбинации. В качестве диспергирующих агентов также можно применять пластификаторы, такие как целлюлоза или триэтилцеллюлоза. Диспергирующие агенты, особенно подходящие для липосомальных дисперсий и самопроизвольно эмульгирующихся дисперсий, включают димиристоилфосфатидилхолин, природный фосфатидилхолин из яиц, природный фосфатидилглицерин из яиц, холестерин и изопропилмиристат.
[000422] В композициях согласно настоящему изобретению также можно применять комбинации одного или более облегчающих эрозию агентов с одним или более облегчающими диффузию агентами.
[000423] Термин «разбавитель» относится к химическим соединениям, которые применяют для разбавления представляющего интерес соединения перед доставкой. Разбавители также можно применять для стабилизации соединений, поскольку они могут обеспечить более стабильную среду. Соли, растворенные в забуференных растворах (которые также могут обеспечивать контроль или поддержание рН), применяют в данной области техники в качестве разбавителей, включая, но не ограничиваясь этим, забуференный фосфатом солевой раствор. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения разбавители увеличивают общую массу композиции для облегчения прессования или создают достаточную общую массу для гомогенной смеси для заполнения капсул. Такие соединения включают, например, лактозу, крахмал, маннит, сорбит, декстрозу, микрокристаллическую целлюлозу, такую как Avicel, двухосновный фосфат кальция, дигидрат двузамещенного фосфата кальция; трехзамещенный фосфат кальция, фосфат кальция; безводную лактозу, высушенную распылением лактозу; предварительно желатинизированный крахмал, прессуемый сахар, такой как Di-Pac (Amstar); маннит, гидроксипропилметилцеллюлозу, стеарат-ацетат гидроксипропилметилцеллюлозы, разбавители на основе сахарозы, кондитерский сахар; моногидрат одноосновного сульфата кальция, дигидрат сульфата кальция; тригидрат лактата кальция, декстраты; гидролизованные сухие вещества злаков, амилозу; порошкообразную целлюлозу, карбонат кальция; глицин, каолин; маннит, хлорид натрия; инозит, бентонит и тому подобное.
[000424] «Наполняющие агенты» включают такие соединения как лактоза, карбонат кальция, фосфат кальция, двухосновный фосфат кальция, сульфат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, порошок целлюлозы, декстроза, декстраты, декстран, крахмалы, предварительно желатинизированный крахмал, сахароза, ксилит, лакгит, маннит, сорбит, хлорид натрия, полиэтиленгликоль и тому подобное.
[000425] «Смазывающие агенты» и «облегчающие скольжение агенты» представляют собой соединения, которые предотвращают, уменьшают или ингибируют адгезию или трение материалов. Примерные смазывающие агенты включают, например, стеариновую кислоту, гидроксид кальция, тальк, стеарилфумарат натрия, углеводород, такой как минеральное масло, или гидрогенизированное растительное масло, такое как гидрогенизированное соевое масло (Sterotex), высшие жирные кислоты и их соли со щелочными металлами и щелочноземельными металлами, такими как алюминий, кальций, магний, цинк, стеариновую кислоту, стеараты натрия, глицерин, тальк, воски, Stearowet, борную кислоту, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, лейцин, полиэтилен гликоль (например, ПЭГ-4000) или метоксиполиэтиленгликоль, такой как Carbowax™, олеат натрия, бензоат натрия, глицерилбегенат, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат магния или натрия, коллоидный диоксид кремния, такой как Syloid™, Cab-O-Sil, крахмал, такой как кукурузный крахмал, силиконовое масло, сурфактант и тому подобное.
[000426] «Пластификаторы» представляют собой соединения, применяемые для смягчения материала для микрокапсулирования или пленочных покрытий, чтобы сделать их менее хрупкими. Подходящие пластификаторы включают, например, полиэтиленгликоли, такие как ПЭГ300, ПЭГ400, ПЭГ600, ПЭГ 1450, ПЭГ3350 и ПЭГ800, стеариновую кислоту, пропиленгликоль, олеиновую кислоту, триэтилцеллюлозу и триацетин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пластификаторы также могут действовать как диспергирующие агенты или смачивающие агенты.
[000427] «Солюбилизаторы» включают такие соединения как триацетин, триэтилцитрат, этилолеат, этилкаприлат, лаурилсульфат натрия, докузат натрия, витамин Е ТПГС, диметилацетамид, N-метилпирролидон, N-гидроксиэтилпирролидон, поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилциклодекстрины, этанол, н-бутанол, изопропиловый спирт, холестерин, соли желчных кислот, полиэтиленгликоль 200-600, гликофурол, транскутол, пропиленгликоль и диметилизосорбид и тому подобное.
[000428] «Стабилизаторы» включают такие соединения как любые антиоксидантные агенты, буферы, кислоты, консерванты и тому подобное.
[000429] «Суспендирующие агенты» включают такие соединения как поливинилпирролидон, например, поливинилпирролидон K12, поливинилпирролидон K17, поливинилпирролидон K25 или поливинилпирролидон K30, сополимер винилпирролидон/винилацетат (S630), полиэтиленгликоль, например, полиэтиленгликоль может иметь молекулярную массу от примерно 300 до примерно 6000, или от примерно 3350 до примерно 4000, или от примерно 7000 до примерно 5400, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, ацетат-стеарат гидроксиметилцеллюлозы, полисорбат-80, гидроксиэтилцеллюлозу, альгинат натрия, камеди, такие как, например, трагакантовая камедь и гуммиарабик, гуаровая камедь, ксантаны, включая ксантановую камедь, сахара, производные целлюлозы, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, полисорбат-80, альгинат натрия, полиэтоксилированный монолаурат сорбитана, полиэтоксилированный монолаурат сорбитана, повидон и тому подобное.
[000430] «Сурфактанты» включают такие соединения как лаурилсульфат натрия, докузат натрия, Tween 60 или 80, триацетин, витамин Е ТПГС, моноолеат сорбитана, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, полисорбаты, полаксомеры, соли желчных кислот, глицерилмоностеарат, сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, например, Pluronic (BASF) и тому подобное. Некоторые другие сурфактанты включают полиоксиэтиленглицериды жирных кислот и растительные масла, например, полиоксиэтилен (60)-гидрогенизированное касторовое масло; и полиоксиэтиленовые простые алкилэфиры и алкилфениловые простые эфиры, например, окгоксинол 10, октоксинол 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сурфактанты могут быть включены для повышения физической стабильности или для других целей.
[000431] «Повышающие вязкость агенты» включают, например, метилцеллюлозу, ксантановую камедь, карбокси метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, ацетат-стеарат гидроксипропилметилцеллюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, карбомер, поливиниловый спирт, альгинаты, гуммиарабик, хитозаны и их комбинации.
[000432] «Смачивающие агенты» включают такие соединения как олеиновая кислота, глицерилмоностеарат, моноолеат сорбитана, монолаурат сорбитана, олеат триэтаноламина, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, монолаурат полиоксиэтиленсорбитана, докузат натрия, олеат натрия, лаурилсульфат натрия, доккузат натрия, триацетин, Tween 80, витамин Е ТПГС, соли аммония и тому подобное.
Наборы/изделие промышленного производства
[000433] Согласно определенным вариантам реализации в настоящей заявке раскрыты наборы и изделия промышленного производства для применения с одним или более способами, описанными в настоящей заявке. Такие наборы содержат носитель, упаковку или контейнер, который разделен на отделы, чтобы вместить один или более контейнеров, таких как флаконы, пробирки и тому подобное, каждый из контейнеров содержит один или более отдельных элементов для применения в способе, описанном в настоящей заявке. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. В одном варианте контейнеры изготавливают из различных материалов, таких как стекло или пластик.
[000434] Изделия промышленного производства согласно настоящему изобретению содержат упаковочные материалы. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваются ими, блистерные упаковки, бутылки, пробирки, пакеты, контейнеры, бутылки и любой упаковочный материал, подходящий для выбранного состава и предполагаемого способа введения и лечения.
[000435] Например, контейнер(ы) содержит(ат) клетки, кодирующие полипептидные конструкции, экспрессирующие один или более усеченных неиммуногенных полипептидов, описанных в настоящей заявке (например, CD20 или CD52). Необязательно клетки могут дополнительно содержать один или более гетерологичных генов, например, ген, кодирующий CAR, Т-клеточный рецептор и/или цитокин. Такие наборы необязательно содержат идентифицирующее описание или этикетку, или инструкции, относящиеся к их применению в способах, описанных в настоящей заявке.
[000436] Набор, как правило, содержит этикетки, в которых перечислено содержимое и/или инструкции по применению, а также вкладыши в упаковку с инструкциями по применению. Как правило, также включен набор инструкций.
[000437] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения этикетка находится на контейнере или ассоциирована с ним. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения этикетка находится на контейнере, если буквы, цифры или другие символы, составляющие этикетку, прикреплены, отлиты или вытравлены на самом контейнере; этикетка ассоциирована с контейнером, если она присутствует внутри емкости или держателя, который также удерживает контейнер, например, как вкладыш в упаковку с инструкциями по применению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения этикетка используется для указания того, что содержимое должно применяться для конкретного терапевтического приложения. На этикетке также указаны инструкции по применению содержимого, например, в описанных в настоящей заявке способах.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
[000438] Ниже представлен типичный перечень определенных последовательностей, включенных в варианты реализации, представленные в настоящей заявке.
ПРИМЕРЫ
[000439] Примеры приведены только для иллюстративных целей, а не для ограничения объема формулы изобретения, представленной в настоящей заявке.
Пример 1. Экспрессия и активность полипептидной конструкции усеченного CD20 (CD20t) в качестве клеточной метки
[000440] Клетки HEK-293Т трансфецировали CD20 дикого типа, усеченными клеточными метками CD20, а также положительным контролем для антитела к CD20 ритуксимаба. Экспрессию измеряли методом проточной цитометрии с применением ритуксимаба. Как показано на ФИГ. 1, усеченный вариант CD20, CD20t1 (SEQ ID NO: 109), проявил стабильную экспрессию при детектировании с помощью ритуксимаба относительно варианта CD20t4 (SEQ ID NO: 115). Эти данные указывают на то, что только конкретные усечения в эндогенном полипептиде CD20 могут быть совместимы с применением CD20t в качестве клеточной метки.
[000441] МКПК человека подвергали нуклеофекции с применением транспозона Sleeping Beauty, кодирующего CAR и клеточную метку CD20t1, а также плазмиды с транспозазой Sleeping Beauty. Совместную экспрессию CAR и CD20t измеряли методом проточной цитометрии. На ФИГ. 2 показано, что CD20t1 (SEQ ID NO: 109; ось у) и CAR (ось х) совместно экспрессируются из конструкции CAR-CD20t1 по сравнению с нетрансфецированными клетками.
[000442] Индуцированная специфичным антителом к CD20 АЗКЦ усеченных клеточных меток CD20
[000443] Репортерную линию клеток Jurkat модифицировали для стабильной экспрессии клеточной метки CD20t1. Экспрессию CD20t1 подтверждали методом проточной цитометрии с помощью окрашивания ритуксимабом. Способность ритуксимаба специфично устранять CD20t1-экспрессирующие клетки-мишени Jurkat измеряли в анализе цитотоксичности in vitro. На ФИГ. 3 показана индуцированная ритуксимабом активность АЗКЦ линии клеток, экспрессирующих CD20t1. Для сравнения, обработка цетуксимабом, направленным против EGFR, не оказывала влияния на активность АЗКЦ.
Пример 2. Экспрессия полипептидной конструкции усеченного HER1 (HER1t) в качестве клеточной метки
Экспрессия химерных клеточных меток
+
[000444] Новые химерные клеточные метки получали с применением домена III гена HER1 и домена IV генов HER2, 3 или 4. Химерные клеточные метки HER1-ErBB4 экспрессировали в первичных клетках человека. Домен III гена HER1 генетически гибридизовали с доменом IV варианта JM-a или JM-b гена ErbB4 и доменом ТМ гена ErbB4, чтобы получить химерные клеточные метки. Сигнальный пептид ГМ-КСФ-альфа применяли в качестве сигнального пептида для направления химерных клеточных меток к клеточной поверхности. Клеточные метки HER1-ErbB4 (усеченный EGFR-ErbB4 (JM-a), соответствующий SEQ ID NO: 101, и усеченный EGFR-ErbB4 (JM-b), соответствующий SEQ ID NO: 105), клонировали в остов вектора pCDNA3.1 вместе с контрольной клеточной меткой HER1t и трансфецировали с помощью электропорации в первичные МКПК человека. Экспрессию клеточных меток HER1-ErbB4 подтверждали в CD3 Т-клетках методом проточной цитометрии с применением специфичного антитела к HER1, цетуксимаба. Как показано на Фигуре 4D, трансдуцированные Т-клетки экспрессировали высокие уровни химерных клеточных меток после трансфекции. Результаты окрашивания изотипическим антителом, а также нетрансфецированные контрольные клетки свидетельствовали о специфичности окрашивания клеточных меток цетуксимабом.
Экспрессия усеченных клеточных меток HER1t
+
[000445] Различные усеченные клеточные метки конструировали, как изображено на схеме, показанной на ФИГ. 4А. Усеченные варианты HER1t (HER1t1, соответствующий SEQ ID NO: 57, HER1t2, соответствующий SEQ ID NO: 59, HER1t3, соответствующий SEQ ID NO: 61, HER1t4, соответствующий SEQ ID NO: 63, HER1t5, соответствующий SEQ ID NO: 65, HER1t6 соответствующий SEQ ID NO: 67, и HER1t7, соответствующий SEQ ID NO: 69) вместе с контрольной клеточной меткой HER1t клонировали в остов вектора pCDNA3.1 для испытания экспрессии. Эти векторы экспрессии трансфецировали с помощью электропорации в первичные МКПК человека. Экспрессию усеченных клеточных меток подтверждали в CD3 Т-клетках методом проточной цитометрии с применением специфичного антитела к HER1, цетуксимаба. Как показано на Фигуре 4Е, Т-клетки экспрессировали высокие уровни клеточных меток после трансфекции. Результаты окрашивания изотипическим антителом, а также нетрансфецированные контрольные клетки свидетельствовали о специфичности окрашивания клеточных меток цетуксимабом.
[000446] Самоинактивирующиеся лентивирусные векторы, кодирующие либо только CAR, либо CAR, а также усеченную клеточную метку HER1t1, получали для оценки совместной экспрессии обоих генов. Общую популяцию активированных Т-клеток человека трансдуцировали лентивирусными векторами, и экспрессию обоих CAR и HER1t1 измеряли после трансдукции методом проточной цитометрии с применением гибридного белка CAR-специфичного антигена-Fc и антитела к HER1, цетуксимаба, соответственно. Как показано на правой панели ФИГ. 5А и ФИГ. 5В, трансдуцированные Т-клетки совместно экспрессировали оба CAR (ось х) и HER1t (ось у). На левой панели ФИГ. 5А показано минимальное неспецифичное окрашивание, наблюдаемое в нетрансдуцированных Т-клетках. На левой панели ФИГ. 5В показана экспрессия CAR, но не HER1t, при трансдукции Т-клеток лентивирусным вектором, кодирующим только CAR.
Анализ линий клеток, экспрессирующих усеченную клеточную метку HER1t, методом Вестерн-блоттинга
[000447] Линию клеток SUP-T1 генетически модифицировали для экспрессии HER1t1 (SUP-T1/HER1t1). Линию клеток SUP-T1/HER1t1 сортировали методом FACS в отношении либо высокого (высокий), либо низкого (низкий) уровня экспрессии HER1t1, измеренного с помощью проточной цитометрии. Экспрессию усеченной клеточной метки HER1t подтверждали в линиях клеток SUP-T1/HER1t1 (высокий) и SUP-T1/HER1t1 (низкий) с помощью Вестерн-блоттинга. Антитело к HER1, цетуксимаб, инкубировали с экстрактами линии клеток SUP-T1/CAR/HER1t1 или контрольной линии клеток (Jurkat и А431), чтобы обеспечить связывание антитела с белками клеточных меток, происходящими из HER1. Комплекс антитело/антиген затем осаждали с применением агарозных гранул, связанных с белком A/G. Затем этот образец разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ для анализа методом Вестерн-блоттинга с применением антитела к HER1. Результаты Вестерн-блоттинга, представленные на ФИГ. 8, подтверждали экспрессию HER1t1 в линиях клеток SUPT1/HER1t1. Интенсивность HER1t1 ниже в линии клеток SUP-T1/HER1t1 (низкий) по сравнению с линией клеток SUP-T1/HER1t1 (высокий). Полноразмерный HER1 детектировали в линии клеток для положительного контроля А431. В немодифицированной линии клеток Jurkat экспрессия HER1 не была обнаружена. Фиг. 8: Дорожка 1: только антитело, введенное в/б; Дорожка 2: только клетки Jurkat; Дорожка 3: SUPT1/HER1t1 (высокий уровень HER1t1); Дорожка 4: SUPT1/HER1t1 (более низкие уровни HER1t1); Дорожка 5: клетки А431, экспрессирующие полноразмерный HER1; Дорожка 6: маркер. Жирная стрелка указывает на белок, осажденный цетуксимабом в дорожках, кроме дорожки 5, где она относится к полноразмерному HER1.
Пример 3. Индуцированная антителом к HER1 АЗКЦ и КЗЦ клеток, экспрессирующих усеченную клеточную метку HER1t
+
+
+
+
+
[000448] Функциональность клеточной метки HER1t1 в анализе АЗКЦ оценивали с применением линии МК-клеток. Исходную линию NK-клеток модифицировали для экспрессии варианта рецептора CD16, чтобы индуцировать АЗКЦ. Линию CD16 NK-клеток дополнительно модифицировали для совместной экспрессии CAR и клеточной метки HER1t1. Исходные линии клеток NK, CD16 NK и CD16/CAR/HER1t1 NK анализировали для определения АЗКЦ в присутствии либо антитела к HER1, цетуксимаба, либо алемтузумаба в качестве положительного контроля, способного связывать CD52 на NK-клетках. Как показано на ФИГ. 6, АЗКЦ наблюдали только тогда, когда NK-клетки экспрессировали CD16, как и ожидалось, поскольку связывание антител с CD16 индуцировало эффекторную функцию. Кроме того, алемтузумаб был способен индуцировать АЗКЦ NK-клеток, вне зависимости от экспрессии ими клеточной метки HER1t, при условии, что они экспрессировали CD16. Напротив, цетуксимаб индуцировал АЗКЦ только при экспрессии обоих HER1t1 и CD16, что подтверждает специфичность.
+
[000449] Репортерную линию клеток SUP-T1 (линия Т-лимфоцитов человека) генетически модифицировали для совместной экспрессии CAR и HER1t1 (SUP-T1/CAR/HER1t1). Линию клеток SUP-T1/CAR/HER1t1 сортировали методом FACS в отношении высокого (высокий) или среднего (средний) уровня экспрессии HER1t1, измеренного с помощью проточной цитометрии, чтобы оценить эффект плотности клеточной метки на клеточной поверхности на АЗКЦ с применением антитела к HER1. На ФИГ. 7А показаны уровни экспрессии CAR и HER1t1 в отсортированных популяциях SUP-T1/CAR/HER1t1. На левой панели ФИГ. 7А показано окрашивание только изотипическим антителом, на средней панели показана высокая экспрессия HER1t, а на правой панели показана средняя экспрессия HER1t, согласно данным проточной цитометрии. Поскольку гены CAR и HER1t1 экспрессируются с одного и того же транскрипта, сортировка клеток по HER1t1 также влияла на экспрессию CAR аналогичным образом. Линии клеток SUP-T1/CAR/HER1t1 с высоким и средним уровнями экспрессии тестировали в анализе АЗКЦ с применением цетуксимаба или неспецифичного ритуксимаба в качестве контроля. Для анализа применяли соотношение эффекторных клеток (Е) и HER1t1 клеток-мишеней (Т), составляющее 5:1. АЗКЦ количественно определяли как относительную индукцию экспрессии репортерного гена. Как показано на ФИГ. 7В, цетуксимаб специфично индуцировал АЗКЦ в линии клеток, экспрессирующих HER1t1, зависимым от дозы образом. Кроме того, индукция АЗКЦ зависела от уровня экспрессии HER1t1 на клеточной поверхности.
+
+
+
+
4
+
5
+
+
+
+
[000450] Донорские МКПК человека трансфецировали с помощью электропорации, применяя два транспозонных вектора Sleeping Beauty для экспрессии CD19 CAR и клеточной метки HER1t1 вместе с транспозазой SB11, чтобы перенаправить специфичность Т-клеток. На следующий день после трансфекции (1 день) клетки подсчитывали и экспрессию CAR измеряли с помощью проточной цитометрии. CAR-T-клетки стимулировали с применением АаРС, либо γ-облученных (100 Гр), либо обработанных митомицином С, в соотношении 1:1 в течение 4 циклов стимуляции. Применяемые клетки АаРС представляли собой K562-АаРС, экспрессирующие антиген CD19. Культуры дополняли только ИЛ-21 (30 нг/мл) для первого цикла стимуляции, а затем рекомбинантным ИЛ-2 человека (50 МЕ/мл) и ИЛ-21 (30 нг/мл) (Pepro Tech) для оставшихся стимуляций. Культуры Т-клеток фенотипировали в конце каждого цикла стимуляции, который, как правило, длился 7 дней. Культуры фенотипировали для определения экспрессии CAR с помощью многопараметрической проточной цитометрии с применением белка L или антиидиотипического антитела, которое распознает CD19 CAR. Способность цетуксимаба специфично устранять CD19 GAR/HER1t1 Т-клетки в условиях in vitro тестировали в анализах АЗКЦ и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ). CSFE-меченые CD19 CAR/HER1t1 Т-клетки-мишени (Т) (5×10 клеток/лунку) инкубировали с линией эффекторных CD16 NK-клеток (Е) (2,5×10 клеток/лунку) при соотношении Е:Т равном 5:1 с 5 мкг/мл цетуксимаба или ритуксимаба в течение 2-24 часов с тремя повторами. Для анализа КЗЦ применяли 10% кроличью сыворотку, либо инактивированную нагреванием (HI), либо неинактивированную, а также 30% сыворотку человека, либо инактивированную нагреванием (HI), либо неинактивированную. Клетки окрашивали DAPI, и данные получали с помощью инструмента iQUE Screener plus. Количество живых клеток регистрировали для каждого состояния. Как показано на ФИГ. 9 (левая панель), цетуксимаб индуцировал специфичную цитотоксичность CD19 CAR/HER1t1 Т-клеток, о чем свидетельствует низкое количество живых клеток в анализе АЗКЦ. Как показано на ФИГ. 9 (правая панель), цетуксимаб индуцировал специфичную цитотоксичность CD19 CAR/HER1t1 Т-клеток, о чем свидетельствует низкое количество живых клеток в анализе КЗЦ, в котором сыворотка человека или кролика не была инактивирована нагреванием.
Пример 4. Конструкции «переключателя для уничтожения»/клеточной метки следующего поколения усиливают АЗКЦ и КЗЦ
[000451] На ФИГ. 10 представлена схематическая диаграмма сравнения дизайна полипептидных конструкций первого поколения и следующего поколения, содержащих усеченные клеточные метки. Усеченные клеточные метки первого поколения (вверху) содержат усеченный вариант и недимеризующийся трансмембранный домен (ТМ), соединенные необязательным пептидным линкером. Усеченные клеточные метки следующего поколения (нижняя панель) содержат домен мультимеризации для получения клеточных меток, которые способны мультимеризоваться на поверхности клетки. В примере, изображенном на нижней панели ФИГ. 10, используется трансмембранный домен (ТМ-А), способный гомодимеризоваться, чтобы индуцировать образование димеров клеточной метки на поверхности клетки. Несмотря на то, что показана гомодимеризация полипептидов клеточной поверхности, также возможно образование гетеродимеров на клеточной поверхности, если клетки модифицированы для совместной экспрессии полипептидных конструкций, имеющих разные полипептиды клеточной поверхности. В полипептидных конструкциях как первого поколения, так и следующего поколения антитело к усеченному варианту или другой связывающий домен распознает и связывается с усеченным вариантом. Для таких конструкций следующего поколения димеризация полипептидов клеточной поверхности может увеличить авидность и усилить сигнальный эффект, индуцированный связыванием антитела, по сравнению с конструкциями первого поколения, а также улучшить очистку и сортировку клеток с применением мультимерной клеточной метки.
+
[000452] Донорные МКПК человека трансфецировали (0 день) с помощью электропорации, применяя транспозонные векторы Sleeping Beauty, сконструированные для совместной экспрессии CD19 CAR и клеточных меток HER1t первого или следующего поколений вместе с транспозазой SB11, чтобы перенаправить специфичность Т-клеток. На следующий день после трансфекции (1 день) клетки подсчитывали, и экспрессию CAR измеряли с помощью проточной цитометрии. Клетки CAR-T стимулировали с применением АаРС, либо γ-облученных (100 Гр), либо обработанных митомицином С, в соотношении 1:1 в течение 4 циклов стимуляции. Применяемые клетки АаРС представляли собой K562-АаРС, экспрессирующие антиген CD19. Культуры дополняли только ИЛ-21 (30 нг/мл) для первого раунда стимуляции, а затем рекомбинантным ИЛ-2 человека (50 МЕ/мл) и ИЛ-21 (30 нг/мл) (Pepro Tech) для оставшихся стимуляций. Культуры Т-клеток фенотипировали в конце каждого цикла стимуляции, который, как правило, длился 7 дней. Культуры фенотипировали для определения экспрессии CAR с помощью многопараметрической проточной цитометрии с применением либо белка L, либо антиидиотипического антитела, которое распознавало CD19 CAR, и антитела к HER1, цетуксимаба, которое распознавало различные усеченные клеточные метки HER1t. На ФИГ. 11 показано, что экспрессия CD19 CAR не изменяется с течением времени в полипептидных конструкциях следующего поколения, содержащих варианты HER1t (например, HER1t8, соответствующий SEQ ID NO: 71, HER1t9, соответствующий SEQ ID NO: 75, и HER1t10, соответствующий SEQ ID NO: 79) по сравнению с полипептидной конструкцией первого поколения (HER1t1, соответствующий SEQ ID NO: 57) и контрольной линией клеток, которая не экспрессирует HER1t. Процент CD3 Т-клеток, экспрессирующих CD19 CAR, в различных культурах, представлен в таблице 4.
+
[000453] На ФИГ. 12 показано, что линии клеток, экспрессирующие полипептидные конструкции следующего поколения, содержащие варианты HER1t с трансмембранным доменом димеризации (варианты HER1t8, соответствующие SEQ ID NO: 71, HER1t9, соответствующий SEQ ID NO: 75, и HER1t10, соответствующий SEQ ID NO: 79), имеют сходные уровни экспрессии HER1t с течением времени, как и линия, экспрессирующая полипептидную конструкцию HER1t первого поколения (HER1t1, соответствующий SEQ ID NO: 57). В культуре, трансфецированной только транспозоном CAR, экспрессия HER1t не была обнаружена. В таблице 5 показан процент CD3 Т-клеток, экспрессирующих варианты HER1t, в различных культурах, тогда как в таблице 6 показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) HER1t на 14, 21 и 28 день из ФИГ. 12.
6
4
4
+
6
4
[000454] CD19 CAR-T-клетки, экспрессирующие варианты HER1t следующего поколения, испытывали для определения АЗКЦ, индуцированной цетуксимабом, в анализе in vitro и сравнивали по эффективности с конструкцией HER1t первого поколения. CD19 CAR-T-клетки-мишени (Т) метили CFSE в концентрации 0,0005 мкМ для CAR-T-клеток, экспрессирующих варианты HER1t, и 0,01 мкМ для CAR-T-клеток без HER1t. Клетки-мишени суспендировали в количестве 0,8×10 клеток/мл, смешивали в соотношении 1:1 и высевали в количестве 4×10 клеток/50 мкл/лунку (в каждом случае по 2×10 клеток/50 мкл/лунку). Затем эффекторные CD16 NK-клетки (Е) собирали, промывали и ресуспендировали при 0,2×10 клеток/мл. Затем клетки высевали в количестве 2×10 клеток/100 мкл/лунку (Е:Т=0,5:1). Антитела ритуксимаб или цетуксимаб готовили в концентрации 0,4 мкг/мл вместе с контрольным раствором, в котором отсутствовало антитело, и растворы добавляли в лунки следующим образом: (i) контрольное антитело ритуксимаб (антитело к CD20): 50 мкл/лунку в конечной концентрации 0,1 мкг/мл в каждой лунке; (ii) цетуксимаб (антитело к HER1): 50 мкл/лунку в конечной концентрации 0,1 мкг/мл в каждой лунке; (iii) контрольный раствор (без антител): 50 мкл/лунку в конечной концентрации 0 мкг/мл в каждой лунке. Конечный объем в каждой лунке доводили до 200 мкл. Растворы хорошо перемешивали и культивировали в течение 4, 8, 16 и 24 часов. После инкубации клетки промывали и окрашивали CD3-BW86 в присутствии блока Fc человека. Затем клетки дважды промывали буфером для FACS, ресуспендировали в 50 мкл буфера для FAC, содержащего 7AAD, в течение 10 минут и затем анализировали. На ФИГ. 13А-В показано, что полипептидные конструкции следующего поколения HER1t, содержащие потенциально димеризованные варианты HER1t на полипептидах клеточной поверхности (HER1t8, HER1t9 и HER1t10), опосредуют улучшенную АЗКЦ по сравнению с полипептидными конструкциями, содержащими недимеризующийся трансмембранный домен (контроль HER1t), в присутствии цетуксимаба.
+
+
+
+
+
+
+
-
[000455] Исследования в условиях in vitro проводили для подтверждения способности цетуксимаба индуцировать АЗКЦ против CD19CAR-mbIL15-T-клеток. CD19CAR-mbIL15-T-клетки получали с помощью электропереноса транспозонов CD19 CAR и mbИЛ15-HER1t и транспозазы SB11. Генетически модифицированные Т-клетки подвергали количественному размножению в условиях ex vivo на облученных фидерных клетках CD19 для анализа АЗКЦ. Благодаря бицистронному дизайну транспозона mbИЛ15-HER1t CD19CAR-mblL-15-T-клетки совместно экспрессировали HER1t1 при экспрессии mbИЛ15. CD19 CARmbIL15-HER1tneg Т-клетки для отрицательного контроля, у которых отсутствует экспрессия mbIL15-HER1t, полученные с помощью трансфекции транспозона CD19 CAR и транспозазы SB11, количественно размножали в условиях ех vivo с применением тех же фидерных клеток CD19. Размноженные аллогенные NK-клетки, которые экспрессируют эндогенный FcR, применяли в качестве эффекторных клеток и совместно культивировали в течение ночи с мечеными CAR Т-клетками при соотношении Е:Т равном 10:1 в присутствии 10 мкг/мл цетуксимаба или антитела к CD20 (ритуксимаба), которое служило отрицательным контролем. mbIL15-HER1t Т-клетки, оставшиеся в культуре после обработки антителами, определяли с помощью проточной цитометрии для расчета процента уничтожения. Добавление цетуксимаба привело к устранению >90% популяции mbIL15-HER1t CD19-mbIL15-CAR Т-клеток (Фигура 14). Ритуксимаб показал более низкий уровень неспецифичного устранения CD19-mbIL15-CAR-T-кпеток. Цетуксимаб не проявил значительный уровень лизиса CARmbIL15-HER1tneg Т-клеток, что подтверждает HERH-специфичный механизм действия. Концентрация цетуксимаба 10 мкг/мл, применяемая в этом эксперименте, находится в пределах диапазона, ранее сообщавшегося у пациентов, которым вводили цетуксимаб. Эти данные подтверждают применение цетуксимаба для истощения CD19CAR mbIL15-T-клеток, если необходимо из-за развития неблагоприятных клинических эффектов.
[000456] Исследование в условиях in vivo проводили на мышах NSG. В 0 день 5Е6 CAR-HER1t1 Т-клетки и 5Е6 KHYG-1-CD16high клетки вводили путем внутрибрюшинной (в/б) инъекции каждой мыши. В тот же день мышей рандомизировали и вводили солевой раствор или цетуксимаб (0,5 мг: в/б). Перитонеальный лаваж собирали в 1 день и проводили оценку с помощью проточной цитометрии, чтобы оценить частоту CAR-HER1t1 Т-клеток у мышей в обеих группах. Также подсчитывали абсолютное количество CAR-HER1t1 Т-клеток. Данные (не показаны) демонстрируют способность цетуксимаба специфично устранять CAR-T-клетки, экспрессирующие метку HER1t1, в отличие от мышей, получавших солевой раствор.
[000457] Несмотря на то, что в настоящей заявке были представлены и описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, специалисты в данной области техники поймут, что такие варианты реализации представлены только в качестве примера. Многочисленные варианты, изменения и замены станут теперь понятны для специалистов в данной области техники без отступления от настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантов реализации, описанных в настоящей заявке, или комбинации одного или более из этих вариантов реализации или аспектов, описанных в них, можно применять при практическом применении настоящего изобретения. Предусмотрено, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, включая тем самым способы и структуры в пределах объема этой формулы изобретения и их эквиваленты.