Популяции лимфоцитов Th1, Th17, Th1/Th17 при туберкулезе легких

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

заболевания. Формирование эффективного противотуберкулезного иммунного ответа сопряжено с формированием иммунных комплексов, содержащих исключительно IgG3. Наличие иммунных комплексов, состоящих в основном из IgE, могут способствовать прогрессирова-нию болезни.

Цель. Определение уровня и изотипа иммуноглобулинов IgG и IgE у больных туберкулезом легких.

Материалы и методы. За период с 2015-2016 гг. на базе ФГБУ «СПбНИИФ» Министерства здравоохранения РФ обследовано 50 больных туберкулезом легких с бакте-риовыделением. Комплекс диагностики включал оценку клинической симптоматики, рентгенологические и бактериологические методы. Определение иммунных комплексов, содержащих IgE, IgG3, IgG1, IgG1 + IgG3, IgG1 + IgE (с помощью метода динамического светорассеяния). Обработка материала проводилась с использованием программы Statistica 7.0. Мы применили критерий хи-квадрат (х2). Различия считались достоверными при р < 0,05.

Результаты. Иммунные комплексы определялись у всех пациентов в рассеивании 7,25±0,34%, так же как IgG1 - 4,3±0,25% и IgE - 3,48%, в 98% (49/50) были IgG3 — 3,2%±0,37%. Фракции иммуноглобулинов G и E имели место в 88,0% (44\50) IgG1 + IgG3 — 3,76% и несколько реже в 74,0% (37/50) IgG1 + E — 5,71%, тогда как имели место только в 30,0% (15/50) IgG3 + IgE — 2,09.

Заключение. Определение в одинаковом проценте случаев IgG1 и IgG3 (100%), также как IgE (100%) может свидетельствовать о полноправном запуске аллергической реакции при туберкулезе, что может объяснять появление в IgG1 + E и IgG3 + E комплексов. Полученные данные могут объяснять запуск иного механизма, нежели только инфекционный, в развитии туберкулеза.

МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТЯЖЕСТЬЮ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

Никитина И.Ю.1, Пантелеев А.В.1, Ганусов В.В.2, Лядова И.В.1

1ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия 2 Университет Теннесси, Ноксвилл, Теннесси, США

Исследования в области иммунопатогенеза туберкулеза (ТБ) являются актуальными и направлены на выяснение роли различных популяций клеток врожденного и адаптивного иммунитета в развитии противотуберкулезного ответа. Изменения соотношения между различными параметрами иммунного ответа являются факторами, влияющими на течение инфекции, и могут быть использованы для оценки активности ТБ и эффектности проводимой терапии.

В связи с этим целью исследования явился многопараметрический анализ различных популяций иммунных клеток и анализ их взаимосвязи с особенностями течения ТБ.

Материалы и методы. В исследование было включено 50 больных ТБ легких. С помощью проточной цито-метрии были получены данные о 54 иммунологических показателях: Т- и B-лимфоцитах (CD4+, CD8+, CD19+), NK-клеток (CD16/56+); лимфоцитах CD4, продуцирующих различные комбинации цитокинов IFNy, TNFa и IL-2 и других. Тяжесть ТБ определяли, оценивая фор-

му легочной патологии, уровень бактериовыделения, степень распространенности и деструкции в легких и тяжесть интоксикации.

Для статистического анализа применяли корреляционный метод, кластерный анализ, множественную линейную регрессию. Точность статистических результатов подтверждали, используя метод «ресемплинга» данных и проверки статистических гипотез на 1000 псевдовыборках (метод "bootstrapping").

Результаты. Корреляционный анализ с критическим уровнем p-value = 0,006 выявил, что основными иммунологическими коррелятами клинических параметров были популяции лейкоцитов. В частности, процент лимфоцитов обратно коррелировал со всеми клиническими проявлениями ТБ, кроме формы легочной патологии. Наиболее достоверными были прямые корреляции между процентом нейтрофилов, степенью деструкции в легких и уровнем бактериовыделения (p = 2 х 10-5 и p = 0,01 соответственно). Кластерный анализ с использованием метода "bootstrapping" подтвердил, что ассоциации между популяцией нейтрофилов, степенью деструкции легочной ткани и уровнем бактериовыделения сохраняются в псевдовыборках (70 и 50% соответственно). Множественная регрессия показала, что одним из основных факторов, влияющих на изменение числа нейтрофилов в крови является степень деструкции в легких.

Заключение. Тяжесть ТБ не определяется недостаточностью «протективного» иммунного ответа лимфоцитов Th1, а возможно зависит от патологической иммуноре-активности организма, ассоциированной с повышенным содержанием популяций нейтрофилов.

Работа поддержана грантом РНФ № 15-15-00136.

ПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ Th1, Th17, Th1/Th17 ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

Пантелеев А.В., Никитина И.Ю., Горелова Л.А., Космиади Г.А., Лядова И.В.

ФГБНУ«Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия

Введение. Протекция против туберкулеза (ТБ) была первоначально ассоциирована с генерацией лимфоцитов Th1 и продукцией ими IFNy. Более поздние исследования показали вклад других популяций Т-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов в контроль над микобактери-ями (Mtb), в частности — лимфоцитов Th17 и IL-17. При этом некоторые исследования поставили под вопрос роль и механизмы протективной активности лимфоцитов Th1 при ТБ, а при ряде других патологий были описаны популяции клеток, коэкспрессирующих цитокины типа 1 и IL-17, а также рецепторы, характерные для популяций Th1 и Th17. Роль и относительный вклад этих популяций в противотуберкулезный иммунный ответ и патологию при ТБ остается не до конца установленной.

Цель. Фенотипическая и функциональная характеристика лимфоцитов Th1, Th17 и Th1/Th17 и анализ количественных параметров их ответа при туберкулезе легких у людей.

Материалы и методы. В исследование были включены больные ТБ легких, проходящие лечение в ФГБНУ «ЦНИИТ», здоровые люди, находящиеся в контакте с больными ТБ, здоровые доноры, не имеющие установленных контактов с больными ТБ. Клетки крови стимулировали антигенами Mtb и с помощью проточной

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Иммунология туберкулеза Immunology of tuberculosis

цитометрии определяли содержание Mtb-специфичных лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy, IL-17, и одновременно IFNy и IL-17, экспрессию на них рецепторов CXCR3, CCR6, CD161, отличающих популяции лимфоцитов Th1, Th17 и Th1/Th17, экспрессию маркеров диффе-ренцировки и функционального истощения клеток. Аналогичный подход был использован для определения содержания популяций Th1, Th17, Th1/Th17 в очаге инфекции в легочной ткани.

Результаты. Показано, что в крови больных ТБ и «контактов» среди лимфоцитов CD4+, экспрессирующих хемо-киновые рецепторы, преобладают лимфоциты с фенотипом CXCR3+CCR6+, характерным для популяции Th1/Th17. Среди Mtb-специфичных лимфоцитов CD4+, у больных ТБ и «контактов» преобладают лимфоциты IFNy+IL-17-; содержание лимфоцитов IL-17+ существенно ниже, содержание лимфоцитов IFNy+IL-17+ незначительно. Несмотря на функциональную принадлежность лимфоцитов IFNy+IL-17- к популяции Th1, их фенотип отличается от фенотипа «классических» лимфоцитов Th1 и характеризуется коэкспрессией рецепторов CXCR3, CCR6, CD161 («гибридный» фенотип, характерный для популяции Th1/Th17). Проведен сравнительный анализ фенотипа, степени диф-ференцировки, содержания лимфоцитов Th1, Th17, Th1/ Th17 в крови больных ТБ и «контактов», в крови больных ТБ с различным течением ТБ процесса, в крови и легких больных ТБ. Полученные результаты позволяют предположить, что популяция Mtb-специфичных лимфоцитов IFNy+IL-17-, экспрессирующих фенотип CXCR3+CCR6+, является менее дифференцированной по сравнению с популяцией «классических» лимфоцитов Th1, а увеличение содержания последних ассоциировано с большей активностью и тяжестью инфекционного процесса.

Заключение. Полученные результаты выявляют специфические характеристики ответа Th1 при ТБ, к которым относится преобладание среди Mtb-специфичных лимфоцитов CD4+ клеток-продуцентов IFNy и экспрессия данными клетками «гибридного» фенотипа CXCR3+CCR6+/ CD161+. Увеличение содержания лимфоцитов Th1 в популяции CXCR3+CCR6- отмечается при активном ТБ.

Работа поддержана грантом РНФ 15-15-00136.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СУПРЕССИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

Уразова О.И., Есимова И.Е., Кононова Т.Е., Захарова П.В., Колобовникова Ю.В., Чурина Е.Г.

Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия

Многие инфекционные возбудители (в том числе Mycobacterium tuberculosis) способны вызывать супрессию иммунного ответа. Немаловажная роль в ее развитии отводится Т-регуляторным лимфоцитам (Treg), реализующим свое иммуносупрессорное действие посредством экспрессии поверхностных (CD25, CTLA-4) и внутриклеточных (транскрипционный фактор FoxP3) молекул, гранзим-опосредованного цитолиза и секреции ингибиторных ци-токинов (IL-10 и TGF-ß). Однако остаются дискуссионными вопросы о том, какие конкретные патогенетические факторы и механизмы лежат в основе Treg-опосредованной иммуносупрессии при туберкулезе легких.

Цель. Определить роль и молекулярные механизмы Treg-опосредованной иммуносупрессии в иммунопатоге-незе туберкулеза легких.

Материалы и методы. Обследованы 217 больных (149 мужчин и 68 женщин 41,94±10,63 лет) с впервые выявленным инфильтративным и диссеминированным туберкулезом легких (ИТЛ, ДТЛ) до лечения. Материал исследования: выделенные из крови лимфоциты и эо-зинофилы, ДНК, РНК. Методы исследования: иммуно-фенотипирование Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD25+, CD28+, CTLA-4+, FoxP3+, IL-2+), оценка in vitro секреции IL-2, IL-10, TGF-Р и содержания активных форм транскрипционных факторов внутриклеточной трансдукции сигнала (NF-kB, AP-1 и NFAT2) в Т-лимфоцитах при моделировании in vitro их рецептор-зависимой активации с применением методов иммуноферментного анализа и проточной цитометрии, определение полиморфизмов генов цитокинов IL-10, TGF-Р и мРНК гена FoxP3 с использованием ПЦР.

Результаты. У больных ТЛ увеличение количества CD3+CD4+CD25high, CD4+CD25+FoxP3+, CD4+CD25-FoxP3+ Treg в крови сочеталось с повышением экспрессии мРНК гена FoxP3 в лимфоцитах и гиперсекрецией in vitro ингибиторных Treg-цитокинов IL-10, TGF-p с наибольшей выраженностью при ДТЛ (соответственно, 1,12%, 4,88%, 7,25%, 27,72 отн.ед., 30,93 пг/мл, 1227,71 пг/мл; p < 0,01-0,001). Выявлены ассоциации между базальной и BCG-индуцированной in vitro гиперсекрецией IL-10, TGF-P и носительством полиморфных вариантов генов С-592А гена IL10 (аллель А и генотипы СА, АА) и C-509T гена TGFe (аллель Т и генотипы СТ, ТТ), что свидетельствует о генетически детерминированной предрасположенности к иммуносупрессии у больных ТЛ. Однако Treg реализуют свое иммуносупрессорное действие не только посредством цитокинов, но и контактным способом — через экспрессию ингибиторной молекулы CTLA4 (инактивирует молекулы костимуляции на антигенпре-зентирующих клетках (АРС) и Т-лимфоцитах). При этом блокируются не только внеклеточный этап активации Т-лимфоцитов (посредством костимуляции при контакте с АРС), но и внутриклеточный — проведение сигнала активации от поверхности клетки к генам синтеза IL-2 и его рецептора при участии транскрипционных факторов NF-kB, AP-1 и NFAT2, на что указывают результаты моделирования in vitro CD3/CD28-зависимой активации Т-лимфоцитов у больных ТЛ — снижение численности NF-kB+, AP-1+, NFAT2+ и (до 9,80%) CD28+IL-2+ активированных Т-клеток при повышении количества Treg с фенотипом CD3+CTLA4+ (более 20%) (р < 0,001). У 18% больных ТЛ увеличение числа и цитокинсекреторной активности FoxР3+Treg ассоциировалось с эозинофиль-ным лейкоцитозом до лечения (до [0,97±0,11] х 109/л, более выраженным при ДТЛ, чем при ИТЛ) во взаимосвязи с деструктивными изменениями и замедлением темпов рассасывания инфильтратов в легких. Обнаружены корреляции между количеством иммуносупрес-сорных Treg в крови и показателями пролиферации (отрицательные) и апоптоза (положительные) лимфоцитов, снижением базальной и BCG-индуцированной in vitro секреции IL-2 мононуклеарными лейкоцитами (10,59 и 33,85 пг/мл, р < 0,05) при повышении базальной и BCG-индуцированной in vitro секреции IL-2 эозинофильными гранулоцитами (666,23 и 670,45 пг/мл, р < 0,05) у больных ДТЛ. Ввиду того, что IL-2 — медиатор, в комбинации с TGF-Р активирующий конверсию и функции Treg, гиперсекрецию IL-2 эозинофильными гранулоцитами в сочетании с эозинофильной реакцией крови можно рас-