СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИЧИНОК ТОКСОКАР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТОКСОКАРОЗА У КОШЕК
METHOD FOR CULTIVATING TOXOCARA LARVAE FOR DIAGNOSING TOXOCARIASIS IN CATS

Изобретение относится к области медицины, в частности, к ветеринарии, и предназначено для диагностики токсокароза у плотоядных животных, преимущественно, у кошек.
Токсокароз - относительно новая проблема практического здравоохранения. Решение ее в большой степени зависит от целенаправленной совместной работы медицинской и ветеринарной служб, а также внедрения в практику новых методов диагностики, лечения и профилактики.Токсокароз – паразитарное заболевание,  вызываемое гельминтом, который относится к эндопаразитам и локализуется в тонком отделе кишечника семейства псовых и семейства кошачьих.  Большое значение в комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий имеет диагностика ларвальноготоксокароза плотоядных животных. Наиболее эффективны иммунологические методы диагностики, позволяющие обнаруживать в сыворотке крови антигены личинок токсокар, антитела к ним, а также циркулирующие иммунные комплексы. С целью получения антигенов для иммунодиагностических тестов модифицирован метод культивирования личинок токсокар и усовершенствован способ выделения экскреторно-секреторных антигенов. Токсокароз кошек, согласно проведенным  исследованиям и данным мониторинга занимает лидирующую позицию среди встречаемых гельминтозов среди домашних и диких плотоядных животных на территории средней полосы России.
Культивирование яиц  нужно, чтобы извлечь специфический антигендля применения в тест-системе. Чем комфортнее личинкам будет в искусственной среде, тем больше антигена можно будет получить, тем тест будет точнее, (с добавлением глютамина, и др. применяемых  в способе  компонентов противогрибкового и антибактериальноговещества) чтобы подавить образование нежелательных для яиц и личиноктоксокар соседей (бактерий и грибков).
Из уровня техники известны способы диагностики токсокароза у плотоядных животных. Например, известен патент РФ 2567845 МПК G01N33/48, опубл. 10.11.2015 «Способ выделения личинок Т.сanis методом переваривания парахимы лёгких и печени плотоядных животных». Изобретение предназначено для посмертной диагностики токсокары плотоядных животных. Способ сложный, трудоёмкий,  предназначенный для диагностики погибших животных.
Известен также, патент РФ № 2582959 МПК А61К39/44, опубл.27.04.2016. «Тест-система иммуноферментная для определения коклюшных антител в сыворотках крови человека и животных», в котором представлен способ диагностики  для определения коклюшных антител используют иммуноферментную тест-систему, содержащую цельный или стрипированный 96-луночный планшет, сенсибилизированный смесью природного комплекса антигенов Bordetellapertussis, полученного без разделения компонентов и содержащего фимбриальныеагглютиногенытипа 2 и 3, пертактин, коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, и коклюшной суспензией промывающий раствор, конъюгат, субстратный буферный раствор с перекисью водорода и хромогеном, стоп-реагент, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец в виде лиофильно высушенного пула сывороток крови человека или животных с титром коклюшных антител не ниже 1:160, откалиброванного в реакции агглютинации, блокатор в виде 5% раствора казеината натрия в натрий-боратном буферном растворе с рН 8,3. Способ сложный в осуществлении, требующий значительных затрат времени, средств и использования лабораторного оборудования.
Известен способ культивирования личинок нематод подотряда Ascaridata  по патенту РФ № 2580655 МПК A01K67/033, опубл.20.05.2015, в котором обработка ведётся средством для дезинфекции «ДП-2Т», в котором  из-за отсутствия правильной питательной среды для потомства гельминтов происходит большая гибель исследуемых экземпляров, а за счет воздействия химических веществ нарушается чистота эксперимента,что отрицательно влияет на качество диагностики, т.к.,когда воздействуют на оболочки дезинфицирующим химическим средством, то не только разрушают оболочку, но и за счет его соприкосновения с личинкой можно нарушить баланс обменного процесса в ее организме, т.е., она уже будет выделять аг, но с примесью данного вещества или более пассивно, нежели до его воздействия. А значит, в дальнейшем, когда будет подбираться титр аг-ат, он будет неточным.
Наиболее близким по сущности предлагаемого решения и достигаемому результату (прототипом)   является способ, описанный в работе П.А.Солопова, касающейся диагностики токсокароза собак (П.А.Солопов «Иммуноферментный метод диагностики токсокароза собак,сероэпизоотологический мониторинг и терапия». Паразитология., Москва. ГНУ «Всероссийский институт гельминталогии им. К.И. Скрябина» опубл.18.11. 2009. (http://wwwgnuvigis.nxt.ru 18/11/2009).
В упомянутой работе  описано, что с целью получения антигенов для иммунодиагностических тестов модифицирован метод культивирования личинок токсокар и усовершенствован способ выделения экскреторно-секреторных антигенов. Культивирование яиц токсокарвыполняли в среде, содержащей 1 % глютамина, а для контроля - в физиологическом растворе.  Экскреторно-секреторные антигены получали из культуральной жидкости через 5-7 дней после выхода личинок токсокар из яйцевых оболочек. На основе ESAgTox и SomAgTox личинок второй стадии Toxocaracanis разработаны  иммунореагенты для серологического метода диагностики - иммуно-ферментного анализа (ИФА). При изучении специфичности полученных диагностических препаратов установлен диагностический титр для ИФА — 1:200.Результаты изучения специфичности, чувствительности и информативности ИФА при экспериментальном и спонтанном токсокарозе собак по общепринятой схеме позволили определить диагностическую эффективность метода.
C целью проведения сравнительного анализа для культивирования личинок T.cati (семейства кошачьих), брали за основу  схему культивирования личинок T.canis(семейства псовых)., предложенную  Солоповым П.А. Однако, обозначаемые автором параметры культивирования применимы, как показал проведенный опыт,только для яиц T.canis, так как строение оболочечных покровов T. cati  существенно отличаются по устойчивости и временным рамкам развития эмбриональной личинки с последующим переходом в стадию ее подвижности. Кроме вышеобозначенного, параллельно проводимое культивирование по предложенной схеме автором Солоповым П.А. привело к молниеносному распространению побочных микроорганизмов в полученной суспензии и в 70% из 100 к гибели яиц. Следовательно, данный способ диагностики (в частности, культивирование личинок токсокар) оптимален исключительно для T.canis.
Следует отметить, что возбудитель токсокароза собак существенно отличается от кошачьего - у собак свой возбудитель, у кошек свой, они абсолютно разные, в том числе и антигены, которые они выделяют в процессе жизни, тоже существенно различаются.  Строение оболочечных покровов T.cati  существенно отличаются по устойчивости и временным рамкам развития эмбриональной личинки с последующим переходом в стадию ее подвижности.
Задачей настоящего изобретения является усовершенствование способа получения экскреторно-секреторных антигенов, путём  культивирования личинок токсокарT.cati, применяемых при получении   антигенов для иммунодиагностических тестов с целью возможности быстрой  и точной  диагностики токсокароза  у кошек.
Поставленная задача решается за счёт включения в процесс культивирования личинок, после термостатирования суспензии, увеличения дозировки глютамина,  по мере  изменения стадий формирования личинок, а на начальном этапе развития - добавления  в суспензию нистатина и  амоксициллина,  кроме того, за счёт  применения воздействия на суспензию инфракрасной лампы и воздействия  на яйца с личинками ультразвуком,  при их очищении от оболочки.
Технический результат заключается в осуществлении возможности в короткие сроки  проводить культивирование яиц токсокары с максимальным выходом жизнеспособных личинок.
Сущность изобретения заключается  в следующем.
Способ культивирования личинок токсокар для диагностики токсакароза у кошек, включает  предварительное  микроскопирование выделенных неинвазионных яиц T/cati, заливку их 0,9% физиологическим раствором, смывание препарата с помощью физиологического  раствора  в чашку Петри,  термостатирование суспензии, в течение  7 часов при  температуре 39 - 40° с периодическим помешиванием и с добавлением, по мере испарения, 0,9 %  физиологического раствора. В процессе культивирования личинок, после 7 часов выдерживания  в термостате,  в суспензию добавляют 2%-й глютамин в форме порошка с предварительным его растворением в растворе Рингера, в количестве 1,5 гр /2,5 мл. (За счет Рингера происходит быстрое связывание лекарственных веществ с водной средой (они быстрее растворяются) и охотнее потребляются грибками и бактериями, тем самым быстрее их уничтожая (инактивируя). Далее, в процессе изменения стадий формирования личинок,  увеличивают дозировку глютамина до 1,9 гр., а на начальном этапе развития  добавляют  в суспензию 1 раз в 3-5 дней 125 мг нистатина и  250 мг амоксициллина в растворе Рингера,  причём  каждый  препарат добавляют с интервалом в 45 минут. После этого, на полученную суспензию ежедневно воздействуют в течение 25-35 минут  инфракрасной лампой с начала активной стадии личинок (с начала подвижности внутри яиц, для того, чтобы они быстрее обрели подвижность). Затем, полученную суспензию, содержащую инвазионные, подвижные личинки T.cati в яйцевых оболочках, отстаивают в течение 18 часов с целью получения осадка, с последующим удалением надосадочной жидкости. В полученный осадок, на период 15 минут,  погружают ультразвуковой  микрозонд-дезинтегратор с напряжением в 20 кГц для разрушения оболочки яйца при помощи ультразвука (чтобы разрушить оболочки яйца не причинив вреда личинке). После освобождения личинок кошачьей токсокары стадии L2 центрифугируют  культуру в течение 10 минут, освобождая  полученную жидкость от остатков разрушенных оболочечных структур.
Способ осуществляют следующим образом.
0
Вначале проводят обнаружение женских особей кошачьих токсокар (T.cati), определяют их размер, видовые особенности и проводят фиксацию отобранных самок в ёмкости. После этого, путём препарирования извлекают яйца гельмитов. После извлечения материала для культивирования на чашку Петри, яйца заливают 0,9% физиологическим раствором в количестве 14,5 мл, после чего проводят предварительное микроскопирование выделенных неинвазионных яиц T.cati. Затем смывают исследуемый препарат при помощи физиологического раствора обратно в чашку Петри, и отправляют полученную суспензию  в термостат на 7 часов. Термостатируют суспензию при температуре 39-40,  при  периодическом помешивании, с добавлением(по мере его испарения)0,9%  физиологического раствора. После 7-ми часового термостатирования проводят повторную микроскопию суспензии по ранее выделенным точкам для подтверждения жизнеспособности яиц нематоды. Затем производят добавление 2%-ого глютамина в форме порошка, с предварительным его растворением в растворе Рингера, в количестве 1,5 гр /2,5 мл. Далее, в процессе изменения стадий формирования личинок, увеличивают дозировку глютамина до 1,9 гр.  Увеличивая дозу 2% глютамина, активируют  размножение побочной микрофлоры (бактериальной и грибковой) с целью ее подавления. На начальном этапе развития  в суспензию 1 раз в 3-5 дней добавляют 125 мг нистатина и  250 мг амоксициллина в течение 4-х недель, и далее по мере активации подавляемых объектов. Суспензию подготавливают на растворе Рингера (смешивают каждый препарат с раствором Рингера отдельно). Затем, каждое содержимое добавляют в суспензию с интервалом в 45 минут. Далее, ежедневно, в течение 25-35 минут  воздействуют на полученную  суспензию инфракрасной лампой с целью ускорения образования подвижных личинок.
После этого проводят отстаивание полученной суспензии, содержащей инвазионные, подвижные личинки T.cati в яйцевых оболочках в течение 18 часов,  с целью получения осадка. Затем удаляют надосадочную жидкость, а в полученный осадок помещают на 15 минут ультразвуковой микрозонд-дезинтегратор напряжением в 20 кГц. После освобождения личинок кошачьей токсокары стадии L2 очищают жидкость от следов (остатков) разрушенных оболочечных структур путем центрифугирования культуры в течение 10 минут при 2500 об./мин., а в конце процесса проводят контрольную микроскопию с целью определения подвижности и жизнедеятельности инвазионных личинок T.cati.
Пример конкретной реализации способа, подтверждающий его применимость.
- Сначала проводили обнаружение женских особей T.cati, затем, за счет методов гельминтоскопии (макроскопического и микроскопического) определяли размер, учитывали видовые особенности (наличиекутикулярных крыльев, пищевода и т.д.)по установленным морфометрическим параметрам самок T.cati.
0
-Следующим этапом проводили фиксацию отобранных самокиндивидуально, в заранее подготовленные парафиновые ванночки. Для этого подготавливали металлические емкости размером 20*30 глубиной 3-5 см. В металлическую кастрюлю добавляли 300 мл воды и доводили до кипения при температуре 100 С, добавляли 250 гр твердого парафина медицинского, далее помешивали до полного его растворения. Заливали подготовленную металлическую ванночку 250-300 мл полученной смеси и оставляли остывать при комнатной температуре до полного затвердевания.
-Далее, при помощи препаровальных игл фиксировали хвостовой и головной конец каждого паразита в двух проекциях. После фиксации определяли начало маточных петель под контролем электронного трихинеллоскопа и небольшими точечными надрезами, препарировали область локализации матки у самки. После чего петли матки при помощи хирургического пинцета извлекали на чашку Петри диаметром 100мм, и путем последующего препарирования петель матки извлекали яйца гельминта. После окончания извлечения материала для культивирования заливали яйца 0,9% физиологическим раствором в количестве 14,5 мл. Проводили предварительное микроскопирование выделенных неинвазионных яиц T.cati. Определяли типичные морфологические параметры, стадии развития эмбриональной личинки: наличие единичного бластомера, гистогенеза, сформированной личинки, подвижной личинки. Для этого пипеткой в количестве 2-3 капель наносили на предметное стекло полученную суспензию и микроскопировали.
0
- Образцы отбирали в 5-ти точках, по два препарата на каждую точку. Всего 10 образцов. Далее, смывали исследуемый препарат при помощи физиологического раствора и пипетки обратно в чашку Петри, и отправляли полученную суспензию  в термостат при температуре 39-40на 7 часов с периодическим помешиванием и добавлением 0,9%  физиологического  раствора (по мере его испарения), для сохранения оптимально-влажной среды для яиц T.cati. После 7-ми часового термостатирования проводили повторную микроскопию суспензии по ранее выделенным 5-ти точкам для подтверждения жизнеспособности яиц нематоды семейства Toxocaridae (подсчет жизнеспособных яиц, определение стадии развития личинок). По используемой в США систематикe NCBI* вид Toxocaracati включён в род токсокары (лат. Toxocara), который отнесён к семейству Toxocaridae, надсемейству Ascaridoidea, порядку Ascaridida, классу Chromadorea), типу Нематоды или круглые черви (лат. Nematoda).
- Следующим действием было добавление 2%-ого глютамина в форме порошка с предварительным его растворением в растворе Рингера в количестве 1,5 гр /2,5 мл. Далее, в процессе изменения стадий формирования личинок увеличивали дозировку глютамина до 1,9 гр.  Увеличивая дозу 2% глютамина активировали размножение побочной микрофлоры (бактериальной и грибковой) с целью ее подавления. На начальном этапе развития  добавляли в суспензию 1 раз в 3-5 дней 125 мг нистатина (таблетка 500мг,- 1/4 таблетки) и  250 мг амоксициллина (таблетка 500мг,- 1/2 таблетки)  в течение 4-х недель и далее, по мере активации подавляемых объектов. Подготавливали суспензию на растворе Рингера (таблетки измельчали в ступке при помощи пестика до образования порошка) смешивали каждый препарат с раствором Рингера в отдельном химическом стаканчике. Добавляли каждое содержимое с интервалом в 45 минут. А с момента, когда тело личинки внутри яйца полностью сформировалось из бластомера,  для того, чтобы она быстрее обрела подвижность, ежедневно, в течение 30 минут, воздействовали на полученную  суспензию инфракрасной лампой до стабилизации  более 95 % экземпляров.
В ходе опыта было доподлинно установлено и выявлено, что  яйца токсокары кошек более чувствительны и зависимы от прямых солнечных лучей, чем аналогичные собачьи токсокары,  таким образом, воздействие инфракрасного излучения является важным составляющим звеном в цепочке культивирования потомства самки T.cati. Опытным путём было также установлено, что воздействовать на суспензию инфрокрасным излучением целесообразно, в общем,  не более 62 дней.
Затем, в течение 18 часов проводили отстаивание полученной суспензии, содержащей инвазионные, подвижные личинки T.cati в яйцевых оболочках,  с целью получения осадка, а надосадочную жидкость удаляли пипеткой. В полученный осадок помещали на 15 минут ультразвуковой микрозонд-дезинтегратор диаметром 3 мм с напряжением в 20 кГц для разрушения оболочек яиц токсокары ультразвуком. После освобождения личинок кошачьей токсокары стадии L2 очищали жидкость от следов (остатков) разрушенных оболочечных структур путем центрифугирования культуры в течение 10 минут при 2500 об./мин. Проводили контрольную микроскопию с целью определения подвижности и жизнедеятельности инвазионных личинок T.cati.
После выделения экскреторно-секреторного антигена наносили его на лунчатый планшет, далее наносили антитела выделенные на возбудителя из сыворотки крови белого кролика, как наиболее чувствительного из лабораторных животных. И проводили учет реакции при помощи спектрометра. Выделили оптимальный титр антител не менее 1:120.
Полученный результат позволяет выделять токсокароз у кошек на раннем этапе в период острой фазы, когда активен Ig M, а в титрах 1:360-Ig G.  В целях проверки полученного результата делали желатиновую среду, путем нанемения ее в чашки Петри, проделывали лунки, в количестве 20 шт, далее наполняли их антигеном и антителами в полученных титрах и наблюдали реакцию в течение 5 минут с образованием характерных парных белых линий между антителами и антигенами.
В последующем,  диагностирование следует проводить путем нанесения полученного антигена в исследуемых титрах на бумажную тест-полоску. Для диагностики  берут 2-3 капли крови котенка или взрослой кошки и исследуют,  капая на контрольную зону,  меченную антигеном, реакция наблюдается в течение 5 минут путем изменения цвета тест-полоски до темно-оранжевого цвета. В случае отрицательной реакции цвет остается светло-желтым, без изменения.
Следует отметить, что предлагаемая тест-система позволит провести диагностику острой и хронической формы токсокароза не только у домашних кошек, но и у любого представителя семейства кошачьих, в том числе львов и других диких кошек, в особенности, данный актуален для зоопарков и реабилитационных центров диких представителей семейства Felidae. В связи с тем, что на территории нашей страны токсокароз не подлежит обязательной регистрации, количество заболевших животных неизвестно, но ясно, что данное заболевание в более чем два раза превышает имеющиеся по нему показатели. В связи с этим борьба с токсокарозом кошек, как наиболее распространенных питомцев, тесно контактирующих, в частности, с  детьми, должно строго контролироваться и своевременно и точно выявляться, с минимальным количеством времени и затрат на тесты. Предлагаемая схема культивирования будет актуальна и применима с целью получения максимально точной тест-системы для диагностики острой и хронической форм токсокароза именно кошек.
Таким образом, задача, стоящая перед изобретением, решена.