Днк-диагностика Opisthorchis felineus по ITS2-последовательностям в промежуточных хозяевах – моллюсках-битиниях

30

ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА

УДК 577.2:575:576.89

ДНК-ДИАГНОСТИКА OPISTHORCHIS FELINEUS ПО ІТ82-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМ В ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ХОЗЯЕВАХ - МОЛЛЮСКАХ-БИТИНИЯХ

Г. Г. Гончаренко

член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой зоологии и охраны природы биологического факультета УО «ГГУ им. Ф. Скорины»

А. Н. Лысенко

младший научный сотрудник, аспирант кафедры зоологии и охраны природы УО «ГГУ им. Ф. Скорины».

Научный руководитель: Г. Г. Гончаренко

А. В. Катохин

заведующий лабораторией молекулярной и клеточной биологии Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

В результате проведенных исследований нами были разработаны и апробированы технологии видоспецифичной ДНК-диагностики для выявления описторхид в моллюсках-битиниях речных водоемов Гомельщины. Установлено, что оптимальными методами выделения геномной ДНК O. felineus являются метод фенольной экстракции и использование ионно-обменной смолы. Подобраны праймеры для амплификации 1Т82-спейсера, позволяющего проводить видовую идентификацию описторхид. Определены параметры ПЦР-анализа, позволяющие получать ампликон ITS2 для видоспецифической идентификации описторха в тканях промежуточного хозяина - моллюска-битинии. Показано, что разработанные ДНК-технологии позволяют оценить степень зараженности битиний O. felineus.

Введение

Описторхоз (opisthorchosis) — опасное заболевание человека, домашних и диких животных, вызываемое паразитированием в желчных протоках печени, желчном пузыре, поджелудочной железе половозрелых особей кошачьей двуустки - Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884). При длительном течении описторхоз вызывает хроническое заболевание печени, желчного пузыря и поджелудочной железы, способствует развитию раку печени и желчных протоков [1]—[4].

Перед попаданием в организм человека и животных O. felineus проходит личиночные стадии развития в промежуточных хозяевах - пресноводных моллюсках Bithynia leachi (Shepard, 1823) и рыбах семейства карповых.

На этих стадиях видовая идентификация представителей семейства Opistorchiidae по морфологическим признакам очень трудоемкая и дорогостоящая, а в ряде случаев просто невозможна.

В связи вышеизложенным разработка эффективных методов видовой диагностики на основе современных молекулярно-генетических технологий (таких, как полимеразная цепная реакция анализа фрагментов ДНК со специфическими праймерами) приобретает особую актуальность.

Целью настоящего исследования была разработка методов ДНК-диагностики по ITS2-последовательностям рибосомального кластера для выявления возбудителей описторхоза в промежуточных хозяевах - моллюсках-битиниях.

Материалы и методы исследования

Объект исследования

В качестве объекта исследования использовались церкарии описторхид, полученных из зараженных моллюсков Bithynia leachi, собранных в период с июня по сентябрь 2011 года на реках Гомельщины: Сож, Березина и Припять. Материал помещали в 70-процентный этанол и хранили при -200 С.

БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ

31

Визуальное обнаружение живых церкарий и их отделение от гепатопанкреаса проводилось с помощью стереоскопического микроскопа МБС-10 (Россия). Для детализации внутреннего строения использовался витальный краситель - нейтральный красный.

Установлено, что кариотип О. felineus состоит из 7 пар хромосом, а величина гаплоидного генома имеет около 300 млн пар нуклеотидов.

Выделение геномной ДНК O. felineus

Для анализа методов выделения общей ДНК описторха нами было проведено вскрытие моллюсков Bithynia leachi с выделением из них гепатопанкреаса [5], содержащего спороцисты с редиями О. felineus, из которых и проводилось выделение ДНК. Выделение геномной ДНК было осуществлено с помощью нескольких методов. Наилучшие результаты были получены с помощью метода фенольной экстракции и с использованием ионно-обменной смолы.

Метод фенольной экстракции

Экстракция. Предварительно гепатопанкреас был помещен в центрифужную пробирку типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, содержащую гидролизирующий экстрагирующий буфер следующего состава: 100 mM раствор Трис, 0,005 M EDTA, 1% лаурилсульфата натрия (SDS) (pH буфера довели до значения 7,8) и 25 мг протеиназы К. Полученную смесь инкубировали при 370 С всю ночь.

Осаждение ДНК. 1. Далее пробу ДНК смешивали с равным объемом фенола или смеси фенол-хлороформ в полипропиленовой пробирке с пластмассовой крышкой. 2. Содержимое пробирки размешивали, пока не образуется эмульсия. 3. После этого проводили центрифугирование при 1600 x g в течение 3 минут при комнатной температуре. Если органическая и водная фазы разделились недостаточно хорошо, центрифугировали еще раз более продолжительное время или при большей скорости. 4. Верхний водный слой переносили пипеткой в новую полипропиленовую пробирку. Промежуточную фазу и нижнюю органическую фазу отбрасывали. Добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа (1:1). Повторяли стадии 2-4. Добавляли равный объем хлороформа и повторяли стадии 2-4 [6].

Очистка препарата ДНК. Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК промывали 1000 мкл 65-процентного этанола, охлажденного до -100 С. После промывания содержимое пробирки центрифугировали при 15 000 х g (Т = 40 С) в течение 10 мин. Повторяли процедуру промывки 2-3 раза для удаления из осадка остатков EDTA.

Лиофилизация препарата ДНК. После промывки этанолом пробирки размещали в штативе горизонтально и, открыв крышки, просушивали осадок ДНК в течение 30-40 минут (Т = 450 С) до полного испарения этанола.

Растворение препарата ДНК. Высушенный осадок растворяли в 30 мкл бидистиллированной и деионизированной воды при 400 С в течение 30 мин. Растворенную ДНК хранить при 40 С для дальнейшего анализа.

Метод выделения ДНК с использованием ионно-обменной смолы

Экстракция. Из печени инвазированного моллюска под бинокулярным микроскопом извлекали спороцисты и отдельные церкарии. Их промывали несколько раз в бидистиллированной воде для предотвращения загрязнения проб посторонней ДНК. Затем спороцисты и церкарии помещали по одному экземпляру в пробирки для ПЦР, куда вносили 50 мкл 5-процентной водной суспензии Chelex 100 (ионно-обменная смола, Bio Rad). В смесь добавляли 1 мкл протеиназы К до конечной концентрации в смеси 100 мкг/мл и инкубировали при 650 С 30 минут. Смесь перемешивали на центрифуге-вортекс Elmi каждые 10 минут.

Осаждение ДНК. Далее смесь термостатировали 8 минут при 990 С и центрифугировали на микроцентрифуге Elmi 3 минуты при 12 500 об/мин. Надосадочную часть переносили в новые пробирки, хранили выделенную ДНК при -200 С [7].

Результаты исследования и их обсуждение

ITS2 ядерного рибосомального кластера как маркер для видовой диагностики описторхид

У эукариотических организмов рибосомальные гены представлены в виде кластеров, расположенных группами на разных хромосомах. В каждый кластер входит три рибосомальных гена (18S, 5,8S и 28S), разделенных участками, так называемыми спейсерами (рисунок 1). Такая конструкция в геноме O. felineus повторена более сотни раз. Весь кластер содержит около 13 000 нуклеотидных пар.

32

ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА

1SS 5ДЗ 2SS

ETS ITS 1 ITS 2

ETS - внешний спейсер и ITS - внутренние спейсеры Рисунок 1 - Схема строения рибосомального кластера

Имеется два внутренних спейсера - ITS1 и ITS2 - один внешний - ETS. Для видовой диагностики учеными с успехом используются рибосомальные гены, поскольку спейсерные участки очень изменчивы по длине и нуклеотидному составу у различных видов плоских червей.

При диагностике описторхоза - заболевания человека и животных, вызываемого кошачьей двуусткой (O. felineus), - в качестве маркера часто используется второй внутренний спейсер (ITS2) размером около 300 н. п.

Использование этого маркера позволяет быстро и с высокой точностью идентифицировать виды описторхид даже для таких особей с практически неразличимыми морфологическими стадиями жизненного цикла, как яйца паразитов [8]-[9].

Конструирование праймеров для амплификации ITS2 спейсера, позволяющего проводить видовую идентификацию описторхид.

Целью разработки ПЦР-детекции была идентификация плоских червей семейства Opisthorchiidae с использованием только одной праймерной системы. Первоочередной задачей было получить простую систему детекции, которая позволила бы распознавать всех описторхид, используя только одно испытание, и в то же время отличать их от других видов Digenea, особенно от представителей близкого семейства Heterophyidae, или так называемых минутных плоских червей, которые паразитируют в кишечнике человека.

Для конструирования праймеров использовалась информация о нуклеотидных последовательностях видов Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus, Pseudamphistomum truncatum и Metorchis xanthosomus, взятых нами из GenBank. Регистрационные номера в GenBank для C. sinensis, обнаруженного в Корее и Китае, AF217094 и AF217099 соответственно, а для O. viverrini - AF408147.

Данные для O. viverrini, обнаруженые в различных областях северо-восточного Таиланда [10], были идентичны и с показанными в GenBank.

Интересно отметить тот факт, что нуклеотидные последовательности ITS2 участка

O. felineus ранее не были опубликованы Мюллером с соавторами в их ключевой работе [8] и не представлены в GenBank. Тем не менее ими была предложена экспериментальная пара праймеров следующего состава: прямой праймер (Fw) OP1: 5-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3 и обратный (Rw) OP2: 5-AGCCTCAACCAAAGACAAAG-3.

Авторы подчеркивают, что следует учитывать возможные перекрестные реакции с ДНК других Дигеней Echinostoma caproni, Fasciola hepatica, Schistosoma mansoni, Holostephanus dubenini и Paracoenogonimusovatus [8].

Таким образом, принимая во внимание все вышеизложенные факторы, при конструировании оптимальных праймеров для выявления видоспецифичных участков ДНК для идентификации Opisthorchis felineus необходимо учитывать два главных параметра:

1) необходимо составлять такие праймеры, чтобы они лежали в консервативной области 5,8 S РНК или 28 S РНК, тогда исключается вероятность того, что он может не сработать для каких-то представителей описторхид;

2) необходимо подбирать праймеры таким образом, чтобы выходить на однораундный ПЦР-анализ.

Последовательность нуклеотидов ДНК спейсерного участка ITS2 (выделен черным) и 38 нуклеотидов прилегающих 5,8 и 28 S рибосомальных генов у O. felineus представлена ниже (www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank ID: EF688132.1).

БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ

33

1 S'ccacgcctgt ccgagggtcg gcttataaac tatcacgacg cccaaaaagt cgtggcttgg

61 gtcttgccag ctggcatgat ttccccacgc atttgtgtgg ggtgccggat ctatggcttt 121 tccccaatgt gccggacgca accatgtctg ggctgactgc ctggatgagg gggtggcggc 181 ggagtcgtgg ctcaattgtt gttgttattg ttgtgaatgt gcgcgctccg ttgttggtcc

241

tttgtctttg gttgaggctc cagtggtggc aatgcattcg atgcaaatct gttttgcact

301 tcggtgctta actttcctga cctcggatc 3'

На первом этапе разработки ДНК-диагностической системы при выявлении видоспецифичных участков ДНК для идентификации описторхид в моллюсках нашей целью было построить прямой праймер, который позволил бы начать амплификацию участка 5,8 S и, соответственно, весь спейсерный участок. После достраивания комплементарной цепочки 3’-5’ в ней был подобран участок, которому комплементарен прямой праймер (Fw) следующего состава: OF1 5’-CGAGGGTCGGCTT AT AAAC-3 ’.

На втором этапе нами был сконструирован обратный праймер (Rv) из 20 нуклеотидов следующего состава: OF2 5’-AGCCTCAACCAAAGACAAAG-3’, позволяющий амплифицировать «горячий» фрагмент спейсерного участка.

Таким образом, сконструированная нами пара праймеров (уточненные Muller et al, 2007) позволяет амплифицировать участок ДНК размером в 248 нуклеотидов.

Однако существует проблема внутривидовой изменчивости O. felineus относительно нуклеотидной последовательности в спейсере ITS2 [11], что требует использования для праймирования высококонсервативных участков ДНК - 5,8 S и 28 S рибосомальных генов. Наиболее перспективным является использование пары праймеров, позволяющее амплифицировать участок ДНК, включающий в себя фрагмент 5,8 S, полную последовательность ITS2 и фрагмент 28 S рДНК.

Так, группа молекулярных генетиков из Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) с успехом использует для амплификации спейсерного участка ITS2 у O. felineus праймеры другого состава: (F) прямой 5'-GAACATCGACATCTTGAACG-3' и (R) обратный 5'-GGAACGACCTGAACACCA-3', позволяющие амплифицировать больший фрагмент ДНК (531 нуклеотид), включающий весь спейсерный участок и прилегающие последовательности 5,8 S и 28 S рибосомальных генов. Эти два праймера были обозначены таким образом: ITS2exFw и ITS2exRv.

Ниже приведена последовательность спейсерного участка ITS2 (выделен черным) и нуклеотидов прилегающих 5,8 S и 28 S рибосомальных генов у O. felineus. В ней отмечены участки, которые использовались при конструировании подходящих праймеров, позволяющих амплифицировать весь участок ITS2 и прилегающие последовательности 5,8 и 28 S.

1 5'gctttgaaca tcgacatctt gaacgcatat tgcggccatg ggtttgcctg tggccacgcc 61 tgtccgaggg tcggcttata aactatcacg acgcccaaaa agtcgtggct tgggtcttgc 121 cagctggcat gatttcccca cgcatttgtg tggggtgccg gatctatggc ttttccccaa 181 tgtgccggac gcaaccatgt ctgggctgac tgcctggatg agggggtggc ggcggagtcg 241 tggctcaatt gttgttgtta ttgttgtgaa tgtgcgcgct ccgttgttgg tcctttgtct 301 ttggttgagg ctccagtgtt ggcaatgcat tcgatgcaaa tctgttttgc acttcggtgc 361 ttaactttcc tgacctcgga tcagacgtga ttacccgctg aatttaagca tatcactaag 421 cggaggaaaa gaaactaaca aggattccct cagtaacggc gagtgaacag ggaaaagccc

481 agcaccgaag cctgtggcca attggtcact aggcaatgtg gtgttcaggt cgttccatag 541 aggt3'

Этапы амплификации ITS2 с полученными праймерами

На следующем этапе наших исследований мы провели сравнительный анализ праймеров по Muller et al, 2007 [8] и Брусенцову и др., 2010 [12] и установили наиболее оптимальный вариант

34

ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА

праймеров, позволяющих амплифицировать фрагмент ДНК O. felineus, содержащий ITS2 участок и прилегающие к нему консервативные области 5,8 и 28 S рибосомальных генов.

ПЦР проводили в объеме 25 мкл. В пронумерованные реакционные ПЦР-пробирки Axygen (США) объемом 0,6 мл вносили смесь, содержащую 2,5 мкл dNTP, по 1 мкл каждого праймера, 2,5 мкл 1х Taq Buffer, 1 мкл Taq-polymerase, 16 мкл Milli-Q Water, 1 мкл исследуемой ДНК. Тщательно перемешивали пипетированием и затем сверху наслаивали 25 мкл минерального масла для ПЦР. После чего пробирки помещали в амплификатор. ПЦР проводили на амплификаторе Терцик (Россия).

После серии проведенных экспериментов были установлены оптимальные термопрофили, позволяющие амплифировать фрагмент ДНК O. felineus, содержащий ITS2 участок и прилегающие к нему консервативные области 5,8 и 28 S рибосомальных генов. Параметры оптимальных термопрофилей приведены ниже:

1 цикл 940 С 3 мин

30 циклов 940 С 45 сек

580 С 30 сек

720 С 60 сек

1 цикл 720 С 5 мин

хранение 100 С

После амплификации полученный раствор с множественными копиями выделенного гена сохраняли в морозильной камере (t ~ -200 C).

Выявление ампликонов проводили с помощью электрофореза в горизонтальной камере SE-1 Helicon (Россия). Электрофоретическое фракционирование проводилось с использованием трис-ацетат-ЭДТА (TAE) буфера (pH = 8,0) в 2-процентном агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. Электрофорез проводили в течение 20-25 минут при напряженности электрического поля 200-250 В.

Визуализацию ампликонов после электрофореза проводили с помощью облучения полученных агарозных гелевых пластин ультрафиолетом (длина волна 360 нм) на специальных установках.

Электрофоретическое выявление ампликонов ITS2 O. felineus в промежуточных хозяевах - моллюсках-битиниях

На рисунке 2 представлена электрофореграмма выделенной геномной ДНК O. felineus (дорожка 1) и продуктов амплификации ДНК с праймерами ITS2exFw/ITS2exRv (дорожка 3). На дорожке 5 представлен спектр образца амплифицированной ДНК при стократном разбавлении. Хорошо видно, что ампликон имеет размер около 530 н. п. Таким образом, подобранные условия амплификации и праймеры позволяют четко выявлять ампликон, содержащий весь спейсер ITS2 и прилегающие участки 5,8 и 28 S рибосомальных генов в исследуемом материале O. felineus.

Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК O. felineus с праймерами ITS2ex.

БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ

35

На рисунке 3 представлена электрофореграмма образцов после амплификации с праймерами OF1/OF2, позволяющими амплифицировать участок ДНК только спейсера ITS2 размером около 250 н. п.

Рисунок 3 - Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК O. felineus с праймерами OF1/OF2

В ходе исследования материала гепатопанкреасов, выделенных из битинид, обитающих в водоемах Гомельщины, на предмет их зараженности описторхидами O. felineus нами была использована пара праймеров ITS2exFw/ITS2exRv. Электрофоретический спектр продуктов амплификации ДНК из материала гепатопанкреасов, выделенных у 6 битиний, представлен на рисунке 4. Хорошо видно, что заражены только моллюски-битинии, образцы которых электрофорезированы на дорожках 2 и 6. Причем битинии заражены именно описторхидами вида O. felineus, поскольку величина выявленных фракций ДНК составляет около 530 н. п. (рисунок 4).

М - ДНК-маркер молекулярных масс, 100bp DNA Ladder;

К- - отрицательный контроль, реакция без ДНК;

К+ - положительный контроль, реакция с ДНК O. felineus Рисунок 4 - Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК O. felineus из материала гепатопанкреасов, выделенных из 6 битинид, обитающих в водоемах Г омельщины

Исходя из полученных на электрофореграмме данных, зараженность битиний описторхидами вида кошачья двуустка составила около 33%.

36

ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА

Выводы

В результате проведенных исследований нами были разработаны и апробированы технологии видоспецифичной ДНК-диагностики для выявления описторхид в моллюсках-битиниях речных водоемов Гомельщины, позволяющие четко идентифицировать описторхид в исследуемом материале. Установлено, что оптимальными методами выделения геномной ДНК

O. felineus являются: метод фенольной экстракции и метод c использованием ионно-обменной смолы. Подобраны праймеры для амплификации ITS2 спейсера, позволяющего проводить видовую идентификацию описторхид. Определены параметры ПЦР-анализа, позволяющие получать ампликон ITS2 для видоспецифической идентификации описторха в тканях промежуточного хозяина - моллюска-битинии.

Исследования проводились в рамках темы ГБЦМ 11-32 «Разработка молекулярногенетических технологий для диагностики возбудителей описторхоза в окончательных и промежуточных хозяевах» (№ 20111158).

Авторы статьи выражают признательность старшему преподавателю кафедры зоологии и охраны природы УО «Гомельский государственный университет имени Ф. Скорины» И. В. Кураченко за оказанную помощь в сборе и обработке экспериментального материала.

Литература

1. King, S. Trematodes of the family Opisorchiidae: a mininreview / S. King, T. Scholz // The Korean Journal of Parasitology. - 2001. - T. 201. - C. 209-221.

2. Савицкий, Б. П. Природные очаги болезней человека в национальных парках Беларуси / Б. П. Савицкий, Л. С. Цвирко, Н. П. Мишаева. - Минск : Бит «Хата», 2002. - С. 262-267.

3. Паразитология и инвазионные болезни животных : метод. указания / М. Ш. Акбаев [и др.]. - М. : МГАВМиБ им. К. И. Скрябина, 2002. - 61 с.

4. Беэр, С. А. Биология возбудителя описторхоза / С. А. Бэер. - М. : Тов-во науч. изд-й КМК,

2005. - 336 с.

5. Методика гельминтологических исследований позвоночных животных : учеб. пособие / Б. В. Ромашов [и др.]. - Воронеж : ВГУ, 2003. - 35 с.

6. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М. : Мир, 1984. - 480 с.

7. Ризевский, С. В. Молекулярно-генетические особенности личинок трематод семейства Schistosomatidae / С. В. Ризевский, Л. Н. Акимова, В. П. Курченко // Тр. БГУ. - 2008. - Т. 3, Ч. 1. - С. 1-14.

8. Muller, B. PCR diagnosis of infections with different species of Opisthorchiidae using a rapid clean-up procedure for stool samples and specific primers / B. Muller, J. Schmidt, H. Mehlhorn // Parasitol Res. - 2007. -V. 100. - P. 905-909.

9. Muller, B. Sensitive and species-specific detection of Clonorchis sinensis by PCR in infected snails and fishes / B. Muller, J. Schmidt, H. Mehlhorn // Parasitol Res. - 2007. - V. 100. - P. 911-914.

10. Nucleotide sequence of mitochondrial CO I and ribosomal ITS II genes of Opisthorchis viverrini in northeast Thailand / K. Ando [et al.] // Southeast Asian J Trop Med Public Health 32 (Suppl 2). - 2001. -

P. 17-22.

11. Оценка генетических отличий Opisthorchis felineus от Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis по ITS2- и С01-последовательностям / А. В. Катохин [и др.] // Доклады Академии наук. - 2008. - Т. 421. -№ 4. - С. 549-552.

12. ДНК-диагностика микст-инвазий Opisthorchis felineus и Metorchis bilis с помощью метода ПЦР / И. И. Брусенцов [и др.] // Медицинская паразитология. - 2010. - № 2. - С. 10-13.

Summary

We developed and approved technologies of species-specific DNA diagnostics for detection opisthorchiids in snails - bithynias the river reservoirs of Gomel region as a result of our researches. It was established, that optimum methods extraction genomic DNA O. felineus are: a phenol extraction method and using of ionic-exchange pitch. Was chose primers for amplification ITS2 spacer, allowing to spend specific identification opisthorchiids. PCR-analysis parametres, allowing to receive amplification products of ITS2 for species-specific identification opisthorchiids in tissue of the intermediate owner - a snail - bithynia were defined. It was shown, that the developed DNA-technologies allow to estimate degree of contaminations bithynias O. felineus.

Поступила в редакцию 19.01.12.