СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ СОСУДИСТЫХ ГРАФТОВ МАЛОГО ДИАМЕТРА С МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ
METHOD OF MANUFACTURE OF BIODEGRADABLE VASCULAR GRAFTS OF SMALL DIAMETER WITH MODIFIED SURFACE

Настоящее изобретение относится к медицинской технике и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии для реконструкции поврежденных сосудов малого диаметра и восстановления кровотока в зоне ишемии.
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности и потери трудоспособности населения во всем мире. Для лечения большинства сосудистых заболеваний необходимо проведение хирургического вмешательства с использованием биологических или синтетических протезов для реконструкции поврежденных сосудов, а также восстановления кровотока в обход сосудов, подвергшихся окклюзии, и проведения других шунтирующих операций.
Для замещения пораженных сосудов преимущественно используют аутологичные артерии и/или вены. При этом артерии обладают большей прочностью и долгой проходимостью по сравнению с венами. Тем не менее, количество операций, в которых в качестве шунтов используют аутологичные артерии ограничено. Например, для аортокоронарного шунтирования применяют внутреннюю грудную артерию, лучевую артерию и подкожную вену нижних конечностей.
Однако, в ряде случаев, у пациента невозможно получить аутологичные сосуды для проведения операций в результате реопераций и перенесенных заболеваний. Так, в альтернативных сосудистых протезах нуждаются пациенты с поражением кровеносных сосудов ниже бедренной артерии, которые не имеют собственных сосудов пригодных для проведения операций из-за варикозного расширения вен или предыдущей операции шунтирования.
В свою очередь для реконструкции кровеносных сосудов достаточно широко применяют протезы из синтетических материалов. Наиболее известными являются трансплантаты из полиэтилентерефталата (polyethylene terephthalate, Dacron) и политетрафторэтилена (polytetrafluoroethylene, Teflon) (Roll S,  J, Keil T, Scholz H, Eidt D, Greiner W, Willich SN. Dacron vs. PTFE as bypass materials in peripheral vascular surgery-systematic review and meta-analysis. BMC Surg. 2008; 8:22). Однако данные графты демонстрируют свою эффективность при протезировании сосудов большого диаметра (>6 мм) с высокой скоростью кровотока. Клиническое же применение синтетических протезов для аортокоронарного шунтирования с использованием графтов малого диаметра (<5 мм) привело к негативным последствиям. Низкая проходимость трансплантатов Dacron и Teflon в реконструкции артерий малого диаметра обусловлено низкой скорость кровотока в данных сосудах, что приводит к тромбозу и гиперплазии неоинтимы в зоне анастомоза (J. Chlupac, Е. Filova, L. Bacakova. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. 2009. 58(2); S119-S139).
Возможным решением данной проблемы может стать создание жизнеспособного графта со свойствами, аналогичными нативному кровеносному сосуду, с применением подходов тканевой инженерии. Основная стратегия разработки сосудистых графтов заключается в использовании в качестве основы биодеградируемых матриксов из природных и/или синтетических полимеров. Тканеинеженерный матрикс обеспечивает структурную поддержку для формирования новых тканей и влияет на клеточные функции, такие как адгезия, дифференцировка, миграция и пролиферация, а также секреция компонентов внеклеточного вещества.
Важным моментом в формировании тканеинженерного кровеносного сосуда in vitro и in situ является образование эндотелиального слоя на внутренней поверхности полимерного графта. Слой эндотелиальных клеток улучшает биосовместимость поверхности имплантата, препятствует тромбообразованию и гиперплазии неоинтимы. Поэтому важной задачей является усиление клеточной адгезии и ускорение формирования клеточного слоя на поверхности полимерного матрикса.
Известен искусственный сосудистый графт (WO 2002007646 Int. cl. C12N 15/09, A61L 27/00, A61L 27/38, A61L 27/50, C07K 14/52, C12N 5/10, A61F 2/06; Artificial vascular graft. And method of producing and using same / Flugelman, Moshe, Y. (IL); Preis, Meir (IL); Gluzman, Zoya (IL); Koren, Belly (IL); Weisz, Anat (IL); Cohen, Tzafra (IL); // Applicants: M.G.V.S. LTD (IL), Publ. Data 31.01.2002) предназначенный для замещения поврежденных кровеносных сосудов или использования в качестве шунтов для восстановления кровотока. Сосудистый графт представляет собой синтетическую трубку, внутренняя поверхность которой покрыта эндотелиальными и/или гладкомышечными клеткам, генетически трансформированными для экспрессии как минимум одного ростового фактора или фактора клеточной адгезии.
Графты, предварительно заселенные клетками, после имплантации в кровеносное русло демонстрируют меньше осложнений, характерных для синтетических протезов малого диаметра. Однако, формирование эндотелиального слоя in vitro является длительной и дорогостоящей процедурой, сложно осуществимой в клинической практике. В связи с чем, более перспективными являются подходы к ускорению эндотелизации сосудистых графтов in situ. На скорость эндотелизации оказывают влияние используемые материалы и топография самого графта, а также модификация поверхности ростовыми факторами и/или факторами клеточной адгезии (иммобилизация фибронектина, VEGF, SDF-1α, антител к CD34 и CD31, пептидов CAG (цистеин-аланин-глицин) и RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота) и др.).
В качестве одного из подходов к созданию биодеградируемых сосудистых протезов предложено использование трехмерных матриксов и изделий из коллагена, модифицированных пептидами или другими биологически активными молекулами или клетками, для применения в тканевой инженерии и клеточной терапии (United States Patent 9289533 Int. Cl. C12N 11/02, C07K 14/78/ Collagen scaffold modified by covalent grafting of adhesion molecules, associated methods and use thereof for cardiovascular and thoracic cell therapy and contractile tissue engineering // Schussler; Olivier (Fr); Michelot; Robert (Fr); Assignee Schussler; Olivier (FR); Fil. : 10.06.2008; Date of patent 22.03.2016). Недостатком данного трехмерного матрикса является применение коллагена в качестве основного материала. Коллаген является природным полимером животного происхождения, что может быть причиной возникновения аллергических и иммунных реакций организма на имплантированный материал. Также, коллаген имеет слабые физико-механические свойства, что ограничивает возможность их применения в создании сосудистых протезов.
Известен биодеградируемый сосудистый графт, изготавливаемый методом электроспининга с введением в полимерный каркас биологически активных веществ (Appl. US 2014/0309726 А l: Int. Cl. A61F 2/06, A61L 27/20, A61L 27/54, A61L 27/50. Biodegradable vascular grafts / Yadong Wang (US); appl. no. 14/6365987, filed 16.06.2014; pub. date 16.10.2014.). Представленный сосудистый трансплантат содержит внутренний слой, выполненный из биоразлагаемого полиэфирного соединения - полиглицеролсебаката (PGS), и наружную оболочку, выполненную из поликапролактона (PCL) и/или полимеров или сополимеров гликоевой и молочной кислоты. Для снижения тромбогенных свойств импланта и повышения его биосовместимости, внутреннюю поверхность графта покрывают гепарином, а наружную оболочку пропитывают любыми биологически активным компонент, способствующих регенерации тканей (фактор роста стволовых клеток (SCF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), трансформирующий фактор роста (TGF), фактор роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), колониестимулирующий фактор (CSF), инсулинзависимый фактор роста (IGF), хемоаттрактантную молекулу (SDF), белки внеклеточного матрикса - коллаген, эластин, фибронектин, ламинин и др.). Недостатком способа является отсутствие избирательности введения во внешнюю оболочку биологически активных компонент и белков внеклеточного матрикса. Целесообразность использования предлагаемого большого числа ростовых факторов и белков внеклеточного матрикса сомнительна, так как может привести к неконтролируемой регенерации тканей на месте биодеградируемого сосудистого графта и, как следствие, нежелательным морфологическим проявлениям (несоответствие вновь образованной на фоне подобной стимуляции ткани нормальному морфологическому строению сосудистой стенки, гиперплазия новообразованной ткани с нарушением проходимости сосудистого графта и прочее). Также отсутствует обоснование дозы вводимых веществ, что является очень важным аспектом при стимуляции роста новых тканей и их формировании.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению, является способ модификации биодеградируемых поверхностей тканеинженерных сосудистых графтов на основе поликапролактона пептидами, содержащими RGD-фрагмент (Gabriel М, van Nieuw Amerongen GP, Van Hinsbergh VW, Amerongen AV, Zentner A.J. Biomater. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. Sci. 1 Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition, Vol. 17, No. 5, pp. 567-577 (2006)). Способ включает двухэтапную модификацию поверхности, где на первом этапе, полимер обрабатывают 40% водным раствором этилендиамина, а на втором выполняют модификацию поверхности пептидом, содержащим RGD фрагмент (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), используя в качестве кросс-сшивающего агента глутаровый альдегид.
Однако, на основании литературных данных известно, что использование глутарового альдегида в таком качестве приводит к образованию цитотоксичных продуктов (Gough, J.E., Scotchford, С.A., and Downes, S. Cytotoxicity of glutaraldehyde crosslinked collagen/poly(vinyl alcohol) films is by the mechanism of apoptosis. J Biomed Mater Res V. 61, P. 121, (2002); Hass, V., Luque-Martinez, I.V., Gutierrez, M.F., Moreira, C.G., Gotti, V.B., Feitosa, V.P., Koller, G., Otuki, M.F., Loguercio, A.D., and Reis, A. Collagen cross-linkers on dentin bonding: Stability of the adhesive interfaces, degree of conversion of the adhesive, cytotoxicity and in situ MMP inhibition. Dent Mater 32, 732, 2016), способствует кальцификации (Fahrenholtz, M.M., Wen, S., and Grande-Allen, K.J. Development of a heart valve model surface for optimization of surface modifications. Acta Biomater V. 26, P. 64, (2015).) и развитию воспалительных процессов (Delgado, L.M., Bayon, Y., Pandit, A., and Zeugolis, D.I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part В Rev V. 21, P. 298, (2015)). Техническим результатом предлагаемого изобретения является улучшение эндотелизации и повышение тромборезистентности биодеградируемых сосудистых графтов, изготовленных методом электроспининнга из биодеградируемых полимеров на основе полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) модифицированных пептидами, содержащими RGD-фрагмент и алифатическую аминогруппу, за счет применения кросс-сшивающего реагента на основе бис-пентафторфинилового эфира янтарной кислоты.
Использование биосовместимых и биодеградируемых полимеров в качестве основы для создания сосудистого протеза малого диаметра на сегодняшний день является наиболее перспективным. Комбинация полимеров способна нивелировать недостатки каждого отдельно взятого полимера, тем самым меняя свойства конечного изделия и сроки его резорбции. Известно, что PHBV относится к группе природных полимеров - полигидроксиалканоатов, синтезируемых микроорганизмами, основной компонент продуктов биодеградации которых - мономер p-гидроксимасляной кислоты - естественный компонент обмена веществ, в норме присутствующий в крови и тканях организма, что и обуславливает высокую биосовместимость данного полимера. В свою очередь PCL представляет собой синтетический биодеградируемый гидрофобный полимер, относящийся к полиэфирам, является достаточно прочным и эластичным материалом. PCL имеет длительный срок деградации (до 3 лет), что способствует поддержанию механических свойств и целостности сосудистого графта до формирования новой сосудистой ткани.
В качестве метода изготовления сосудистых графтов используют - электроспиннинг, который позволяет создавать высокопористые материалы, состоящие из нано- и микро- волокон, обладающих большим потенциалом для имитации структуры природного внеклеточного матрикса. Метод электроспиннинга относительно прост и позволяет изготавливать модели с разной морфологией путем изменения параметров процесса.
Созданный таким образом на основе PHBV/PCL трубчатый матрикс обладает большей биосовместимостью и долговечностью, а пористость изделий обеспечивает его высокую растяжимость по сравнению с венами человека.
Модификация поверхностей тканеинженерных графтов пептидами, содержащими RGD-фрагмент и алифатическую аминогруппу (например, циклический c[RGDFK] пептид, RGDK - ε - аминогруппа лизина, AmRGD - ε -аминогруппа аминомасляной кислоты), является наиболее эффективным для стимулирования адгезии клеток к различным поверхностям. Адгезивные RGD-сайты расположены во многих белках внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, витронектин, фибриноген, фактор фон Виллебранда, коллаген, ламинин, остеопонтин и др. (Ulrich Hersel, Claudia Dahmen, Horst Kessler. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 2003; 24: 4385-4415).
Для введения на поверхность сосудистого графта аминогрупп, необходимых для присоединения RGD пептида, был выбран 4,7,10-trioxa-1,13-тридекандиамин. Данный диамин отличается от используемого в прототипе для этих целей - этилендиамина (Gabriel М, van Nieuw Amerongen GP, Van Hinsbergh VW, Amerongen AV, Zentner A.J. Biomater. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. Sci. // Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition, 2006. - Vol. 17. - No. 5. - pp. 567-577) большей длиной и гидрофильностью, что позволяет увеличить стерическую доступность RGD пептидов. В качестве сшивающего реагента использовали бис-пентафторфениловый эфир янтарной кислоты, который менее подвержен гидролизу в водных и водно-органических средах, в сравнении с другими активированными эфирами (Kida S, Maeda М, Hojo К, Eto Y, Nakagawa S, Kawasaki K. Studies on heterobifunctional cross-linking reagents, 6-maleimidohexanoic acid active esters. // Chem. Pharm. Bull., V. 55, P. 685 (2007)), что обеспечивает более полную сшивку между модифицированной поверхностью и RGD-пептидом.
Способ осуществляют следующим образом. Для изготовления биодеградируемого сосудистого графта с модифицированной поверхностью предварительно подготавливают смесь полимеров, содержащую PHBV и PCL в соотношении сухих веществ 1:(0,1-100) соответственно, которую растворяют в хлороформе до концентрации раствора 5-15%. Из смеси полимеров методом электроспиннинга изготавливают пористую полую трубчатую матрицу малого диаметра (<5 мм). Тканеинженерную матрицу последовательно отмывают от масел и пыли, погружая ее в раствор пропан-2-ола и воды в соотношении веществ 1:1 или пропуская соответствующий раствор через матрицу со скоростью 0,1 мл/мин, после чего осуществляют промывку деионизированной водой.
После подготовки биополимерного трубчатого матрикса выполняют двухэтапную модификацию поверхности сосудистого графта малого диаметра. Для этого на первом этапе, с целью активации биополимерного каркаса, внутреннюю поверхность сосудистого графта обрабатывают 10% раствором 4,7,10-trioxa-1,13-тридекандиамина (TTD) в водном растворе пропан-2-ол в соотношении 1:1 при 37°С в течение 30 мин.
После этого графт тщательно последовательно промывают смесью пропан-2-ол и воды в соотношении 1:1, далее деионизированной водой, 0,3% раствором Tween-20 в деионизированной воде. Вторым этапом, внутреннюю поверхность обрабатывают в течение 1 ч 10 мМ раствором бис-пентафторфенилового эфира янтарной кислоты в карбонатном буфере при рН 8.5. Далее графт последовательно отмывают от избытка активированного эфира: сначала 0,3% раствором Tween-20 в деионизированной воде, затем смесью пропан-2-ол - вода 1:1, деионизированной водой. В завершении, внутреннюю поверхность сосудистого графта обрабатывают раствором циклического c[RGDFK] пептида, состоящего из 0,2 мг/мл пептида в 50 мМ карбонатном буфере (рН=8,5) в течение 4 ч при 24°С.
После получения сосудистых графтов малого диаметра с смодифицированной поверхностью выполнили ряд исследований, подтверждающих улучшение эндотелизации и тромборезистентных свойств полученных графтов в сравнении с графтами, изготовленных из полимерной смеси PHBV/PCL без модифицированной поверхности.
5
2
2
Для оценки жизнеспособности клеток из пупочной вены человека выделяли эндотелиальные клетки согласно адаптированному протоколу Jaffe с соавт.(Jaffe ЕА, Nachman RL, Becker CG, Minick CR. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 1973; 52(11):2745-2756). Последующее культивирование клеток осуществляли с использованием наборов Endothelial Cell Culture Medium Kit (BD Bioscience). В эксперименте использовали культуру HUVEC 5 пассажа. Образцы стерильных матриксов (PHBV/PCL) с модифицированной поверхностью и без нее (n=5 для каждой группы в трех дублях) с помощью 0,6% раствора агарозы (Helicon) фиксировали на дно стерильных 24-луночных культуральных планшет. На образцы матриксов вносили по 2,5×10 клеток и культивировали в течение 6 суток. Абсолютное количество клеток на 1 мм поверхности и относительное содержание погибших клеток оценивали с помощью флюоресцентной микроскопии (Axio Observer Z1, Carl Zeiss). Для подготовки образцов к микроскопии их отделяли от агарозы и переносили в стерильный 24-луночный планшет клетками вниз. Подсчет количества клеток проводился в 10 различных полях зрения при увеличении ×200 с последующим пересчетом на 1 мм изучаемой поверхности.
Количество погибших клеток исследовали с помощью комбинированного окрашивания этидия бромидом 0,03 мг/мл (оранжевое окрашивание ядер погибших клеток) и раствором акридинового оранжевого в соотношении 1:10 в фосфатно-солевом буфере (зеленое окрашивание цитоплазмы всех клеток).
Подсчет эндотелиальных клеток после 6 дней культивирования показал их крайне малое количество на немодифицированных каркасах из PHBV/PCL; в то же время модификация полимерных поверхностей RGD-пептидами выражено и статистически значимо повышала клеточную жизнеспособность. При этом, общее число клеток на поверхности модифицированных сосудистых графтах было в 9.7 раз выше в сравнении с их аналогам без модификации при схожем числе мертвых клеток.
Следующим этапом модифицированные сосудистые графты малого диаметра имплантировали в брюшную аорту крыс линии Wistar массой 400-450 г (n=20, по 5 в каждой из четырех групп). После проведения срединной лапаротомии открывали забрюшинное пространство и выделяли аорту. Далее аорту пережимали ниже почечной артерии и выше уровня бифуркации и выполняли последовательнее наложение проксимального и дистального анастамозов. После имплантации разрез ушивали послойно. Спустя 1 месяц животных выводили из эксперимента внутрибрюшинной инъекцией этаминала натрия (100 мг/кг). После эксплантации образцы графтов вместе с прилежащими участками аорты фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 часов. Далее образцы заключали в парафин и изготавливали поперечные срезы толщиной 5 мкм. Полученные препараты окрашивали гематоксилин-эозином и по ван Гизону. Гистологическое исследование осуществляли методом световой микроскопии на микроскопе Axio Imager Al (Carl Zeiss). Для проведения и визуализации иммуногистохимической реакции использовали набор Novocastra (Thermo Scientific) и кроличьи антитела к CD31 (Spring Bioscience).
Гистологическое и иммуногистохимическое исследования спустя месяц после имплантации выявили, что графты из PHBV/PCL без модификации подвергались тромботической окклюзии и не содержали эндотелиальных клеток на внутренней поверхности графта. В то же время на внутренней поверхности модифицированных графтов по предложенной методике наблюдался монослой эндотелиальных клеток. Кроме того, модифицированные графты были полностью проходимыми и не содержали ни тромбов, ни признаков воспаления внутри стенки.
Таким образом, выбранный способ модификации биодеградируемого сосудистого графта малого диаметра обеспечивает большую устойчивость RGD- пептидов к гидролизу в водно-органических средах и доступность для связывания с клетками in situ, что способно обеспечить скорейшую и эффективную эндотелизацию сосудистых протезов малого диаметра после имплантации.