Изучение кинетики накопления и инактивации ингибиторов трипсина и химотрипсина из белого лепестка. Разработка технологии получения соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина

лученные данные представлены на рис.1. Из рисунка 1 следует, что в исследуемом диапазоне рН наблюдается три пика: при рН 5, 6 и 9. Из литературных данных известно, что рН 9 соответствует изоэлектрической точке лактоферрина и лактопероксидазы, рН 6 - имунноглобулинам, рН 5 - лактоглобулину. Отсюда видно, что из концентрата целесообразно осадить имунноглобулины и лактоферрин вместе с пероксидазой. Осаждать лактоглобуллин нецелесообразно, в связи с тем, что его молекулярная масса составляет 18200 Да, и в концентрате его концентрация невысока. Данные белки были последовательно осаждены из концентрата, обработаны спиртом и высушены на воздухе. Молекулярно-массовый состав полученных изолятов был изучен методом гель-хроматографии на колонке, заполненной сефадексом G-200. Полученные результаты представлены на рисунках 2 и 3. На рисунке 2 максимальному пику соответствуют имунноглобулины, а на рисунке 3 - лактоферрину и лактопероксидазе.Выяснили, что содержание белка в изолятах 35-50%. Это говорит о том, что изоляты загрязнены минеральными примесями, то есть требуется дополнительная очистка диафильтрацией или переосаждением. Изолят, полученный при осаждении концентрата в рН 9,0, содержал смесь лактоферрина и лактопероксидазы, следовательно, требуется разделение этих белков. Ранее было описано, что пермеат содержит ценные белки, такие как а-лактоальбумин и ß-лактоглобулин. Возможность их выделения из пермеата будет предметом дальнейших исследований.

Список литературы

1. Залашко, М.В. Биотехнология переработки молочной сыворотки - М.: Агропромиз-дат, 1990.- 192 с.

2. Павлов, В.А. Резервы повышения эффективности переработки творожной сыворотки. Обзорная информация,-М.: АгроНИИТЭИММП, 1987. - 127 с.

3. Кравченко, Э.Ф. Использование молочной сыворотки в России и за рубежом/

3.Ф.Кравченко, Т.А.Волкова //Молочная промышленность - 2005.- № 4. - С. 15-19.

4. Храмцов, А.Г. Технология продуктов из молочной сыворотки/ А.Г.Храмцов, П.Г.Нестеренко.-М.: Дели принт, 2004. - 587 с.

5. Храмцов, А.Г. Молочная сыворотка.- М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.

6. Kerstin Plate Isolation of bovine lactoferrin, lactoperoxidase and enzymatically prepared lactoferricin from proteolytic digestion of bovine lactoferrin using adsorptive membrane chromatography/ Kerstin Plate, Sascha Beutel, Heinrich Buchholz et al. //Journal of chromatography А. - 2006. - V.1117. - Р. 81-86.

7. Linda Pedersen Whey proteins as a model system for chromatographic separation of pro-teins/ Linda Pedersen, Jorgen Mollerup, Ernst Hansen et al. //Journal of chromatography B. -2003. - V.790. - Р. 161-173.

УДК: 577.112.083 Н.В. Хабибулина

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ НАКОПЛЕНИЯ И ИНАКТИВАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА И ХИМОТРИПСИНА ИЗ БЕЛОГО ЛЕПЕСТКА. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СОЕВЫХ ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА И ХИМОТРИПСИНА

The influence of temperature, pH and the continiouns of extraction on the accumulation of soybean trypsine and chymotrypsine inhibitors from white let soybeans was learned. It has been observed that temperature does not have a significant influence on the process and the maintenance of inhibitors in the alkaline solution is 1,5 times greater than in the acid solution. The conditions for the industrial manufacture of soybean inhibitors has been selected.

Изучено влияние температуры, pH и времени экстракции на накопление соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина из белого лепестка. Установлено, что температура не оказывает заметного влияния на процесс, и содержание ингибитора в щелочной области в 1,5 раза выше, чем в кислой. Подобраны условия промышленного получения соевых ингибиторов.

Соя (лат. Glycine max) - бобовое растение, являющееся ценным сырьем для получения ряда продуктов как пищевого, так и промышленного назначения. Одним из самых ценных продуктов, получаемых из сои, является соевый белок. Однако, помимо полезных компонентов, в сое содержится ряд веществ, определяющих ее антипитательные свойства, основными из которых являются ингибиторы трипсина и химотрипсина. Так как эти ферменты являются основными пищеварительными ферментами человека и млекопитающих, употребление необработанных соевых бобов в пищу может вызвать гипертрофию поджелудочной железы, потому что соевые ингибиторы связываются с вышеуказанными ферментами в комплексы, лишенные каталитической активности, что приводит к повышенной выработке ферментов. В связи с этим необходима очистка соевого белка от ингибиторов.

Тем не менее, ингибиторы сами по себе обладают рядом полезных свойств (радиопротекторные, иммуностимулирующие, антиканцерогенные), поэтому целесообразно получение ингибиторов в чистом виде. По этим причинам целью данной работы явился подбор оптимальных условий для выделения соевых ингибиторов из доступного сырья - белого лепестка, представляющего собой сухой остаток после отжима соевого масла.

При проведении исследований использовались следующие методики.

1. Выделение «глобулиновой» фракции дрожжевого белка из дрожжевого экстракта. Для этого готовили 10%-ную суспензию дрожжей р. Candida maltosa, проводили экстракцию при 900С в течение трех часов, в полученном экстракте осаждали белок при pH 4,5, осадок промывали ацетоном и высушивали.

2. Экстракция белковых веществ из белого лепестка. Для проведения экстракции готовят 10%-ную суспензию белого лепестка, устанавливают pH 11 или pH 2 (для щелочной и кислотной экстракции соответственно) и проводят экстракцию. Отработанную биомассу сои отфильтровывали. Полученные экстракты и явились объектами данного исследования.

3. Гидролиз дрожжевого белка и соевого экстракта трипсином и химотрипсином.

4. Ультрафильтрация.

5. Диафильтрация

6. Гель-хроматография.

7. Осаждение белка органическими растворителями.

8. Определение белка колориметрическим модифицированным методом Лоури, который предполагает раздельное определение высоко- и низкомолекулярной фракции белка. Эти фракции разделяют путем добавления 50%-ной ТХУ.

Работу проводили с экстрактами белковых веществ белого лепестка. В ходе работы осуществляли контроль содержания соевых ингибиторов и белковых веществ в экстракте в зависимости от температуры экстракции, времени экстрагирования и pH. Было показано, что накопление ингибиторов в экстракте происходит симбатно с накоплением белковых веществ. Также было показано, что температура экстракции не оказывает существенного влияния на содержание белка и ингибиторов в экстракте (интер-

вал температур - 20 - 450С).

Определение содержания ингибиторов проводилось путем гидролиза дрожжевого белка с добавлением экстрактов трипсином и химотрипсином в сравнении с контролем - гидролизатом дрожжевого белка без добавления экстрактов. В пробах определяли содержание белковых веществ модифицированным методом Лоури. В ходе исследований было установлено, что при щелочной экстракции (pH=11) ингибиторов извлекается примерно в 1,5 раза больше, чем при кислотной (pH=2) (рис.1).

Из литературных данных известно, что соевые ингибиторы являются термолабильными, поэтому их для их инактивации можно предложить прогрев экстрактов до 900С. Было установлено, что при прогреве в течение 15 мин достигается инактивация ингибиторов на 93 - 95%. Таким образом, было показано, что 15 минут прогрева достаточно для практически полной инактивации ингибиторов, полученный после прогрева экстракт может быть направлен на получение белкового изолята.

Выделение ингибиторов предполагается проводить в ходе получения белкового изолята, поэтому для выделения которого была выбрана кислотная экстракция. Известно, что белковый изолят, получаемый из кислотного экстракта, обладает более высоким качеством и меньшей токсичностью для микроорганизмов, чем щелочной. Кроме того, щелочные экстракты получаются более окрашенными, а также в них возможно образование оснований Шиффа, являющихся токсичными продуктами. Однако выше отмечалось, что ингибиторы имеют важное практическое значениие, поэтому представляет интерес их выделение в очищенном виде. Выделение ингибиторов проводили по следующей схеме. Полученный экстракт из белого лепестка концентрировали на ультрафильтрационной ячейке (мембрана с размером пор 100 кDa) в 2,5 раза, концентрат после этого процесса направляли на получение белкового изолята, а пермеат использовали для выделения ингибиторов.

Такой выбор мембраны связан с тем, что высокомолекулярные соевые белки имеют молекулярную массу свыше 50 ^а, а соевые ингибиторы подразделяются на две группы: ингибиторы Кунитца (молекулярная масса 20-25 ^а) и ингибиторы Бау-мана-Бирка (молекулярная масса 6-10 Ша). Было показано, что в ходе ультрафильтрации на мембране с размером пор 100 Ша 75-80% ингибиторов переходят в пермеат.

На следующем этапе проводилась ультрафильтрация пермеата с использованием мембраны с размеров пор 20 ^а - для разделения ингибиторов. Путем гидролиза дрожжевого белка по вышеописанной методике установлено, что пермеат после мембраны 20 ^а содержит только ингибитор Баумана-Бирка, в то время как концентрат содержит оба ингибитора. Полученные концентрат и пермеат были исследованы методом гель-хроматографии на колонке, заполненной сефадексом G-50 (диапазон разделяемых молекулярных масс от 1,5 до 30 кДа). На хроматограмме, соответствующей концентрату, были получены два ярко выраженных пика, соответствующие ингибиторам Кунитца и Баумана-Бирка по молекулярным массам (рис.2). На хроматограмме, соответствующей пермеату, был получен один выраженный пик, соответствующий ингибитору Баумана-Бирка (рис.3).

Для очистки концентрата от ингибитора с меньшей молекулярной массой был использован метод диафильтрации. При этом концентрат разбавлялся равным объемом дистиллированной воды и повторно подавался на ультрафильтрационную ячейку с мембраной на 20 кДа. Было показано, что в ходе первой диафильтрации содержание ингибитора Баумана-Бирка уменьшалось в 2,5 раза по сравнению с исходным, после второй диофильтрации уменьшение также было заметным, в то время как после третьей диафильтрации уменьшение содержания ингибитора Баумана-Бирка было незначи-

тельным. Поэтому целесообразно ограничиваться двумя диафильтрациями (табл.1).

Выделение ингибитора Кунитца из промытого диафильтрацией концентрата проводилось с помощью осаждения его из концентрата этиловым спиртом. Такой выбор растворителя связан с тем, что ингибитор Кунитца является водорастворимым, а ингибитор Баумана-Бирка - спирторастворимым, следовательно, при обработке спиртом выпадать в осадок он не будет. Был подобран оптимальный гидромодуль для данного процесса, он составил 1:1. Выделение ингибитора Баумана-Бирка из пермеата проводилось путем осаждения его ацетоном. Оптимальным для данного процесса является гидромодуль 1:2.

Табл. 1. Содержание ингибитора Баумана-Бирка в концентратах до и после диафильтрации

Исследуемый экстракт

исх.

после после после конц. 1-ой д/ф 2-ой д/ф 3-ей д/ф Содержание ингибитора Баумана-Бирка 0,67 0,24 0,16 0,14

Осадки были высушены и проверены на ингибирующую активность с помощью контрольного гидролиза. При этом при добавлении ингибитора Кунитца наблюдалось ингибирование трипсина на 40% при практически полном отсутствии ингибирования химотрипсина, что соответствует литературным данным (ингибитор Кунитца воздействует только на трипсин). При добавлении ингибитора Баумана-Бирка наблюдалось заметное ингибирование как трипсина, так и химотрипсина, что также соответствует литературным данным.

Рис. 1. Степень ингибирования трипсина и химот-

рипсина ингибиторами в составе щелочного и кислого экстракта

Рис. 2. Гель-хроматограмма концентрата, полученного на мембране 20 кБа

Рис. 3. Гель-хроматограмма пермеата, полученного на мембране 20 кБа

Из ранее разработанной технологии получения белкового изолята известно, что возможен четырехкратный возврат пермеата после ультрафильтрации с использованием мембраны на 100 кБа на стадию экстракции (для увеличения концентрации белковых веществ в экстракте) для кислотной экстракции и двукратный - для щелочной без потери

питательных свойств белкового изолята и накопления токсичных продуктов. Так как ингибиторы извлекаются симбатно с белковыми веществами, такой прием применим и для выделения соевых ингибиторов. Большим числом кратности возврата также обуславливается выбор кислотной экстракции для выделения соевых ингибиторов.

В промышленных условиях для выделения ингибиторов можно использовать не только осаждение органическими растворителями, но также концентрирование перме-ата и концентрата после разделения на мембране 20 кДа с помощью вакуум-выпаривания с последующим осаждением ингибиторов в изоэлектрических точках, а также непосредственно сушка сконцентрированных растворов, что и будет являться предметом дальнейших исследований. Также предполагается изучение свойств полученных ингибиторов, в том числе и проверка их на радиопротекторность.

Список литературы

1. Вишнякова, М.А. Горох, бобы, фасоль... /Вишнякова М.А., Яньков И.И., Булынцев С.В., Буравцева Т.В., Петрова М.В.- Санкт-Петербург: Агропромиздат, 2001 - 221 с.

2. Nicholas Castimpoolas. Isoelectric focusing in narrow pH gradients of Kunitz and Bow-man-Birk soybean trypsin inhibitors / Nicholas Castimpoolas // Separation Science and Technology. - 1979. - 4:6 - P. 483-492

3. H. Frokier. Characterization of proteintype proteinase inhibitors by high performance capillary electrophoresis / H. Frokier, K. Mortensen, H. Sorensen and S. Sorensen // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. - 1996. - 9:1 - P. 57-67

4. R.A. Perez-Maldonado. Effects of heat treatment on the nutritional value of raw soybean selected for low trypsin inhibitor activity / R.A. Perez-Maldonado, P.F. Mannion and D.J. Farell // British Poultry Science. - 2002. - 44:2 - P. 299-308

УДК: 577.112.083 Хоанг Тхи Минь Нгует

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

ПОЛУЧЕНИЕ КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА НА ОСНОВЕ СТОЧНЫХ ВОД ПРОИЗВОДСТВА БЕЛКОВОГО ИЗОЛЯТА СОИ

Chosen the best possible conditions for wastewater treatment in the production of soy protein isolates: advisable to use as a sorbent in a concentration monocalciumfosfat 4%, sorption of driving for 30 minutes at a temperature of 20 ° C. This is achieved almost complete sewage treatment from protein, declining ratio of carbon: nitrogen to 1:10, which allows data to run-off at the station biological wastewater treatment.

Подобраны оптимальные условия для очистки сточных вод в производстве изолята белка сои: целесообразно использовать в качестве сорбента монокальцийфосфат в концентрации 4%, сорбцию проводить в течение 30 мин при температуре 20оС. При этом достигается практически полная очистка стоков от белков, происходит снижение соотношения углерод: азот до уровня 1:10, что позволяет направлять данные стоки на станции биологической очистки сточных вод.

При выделении изолята белка сои было показано, что сточные воды (ОБС), образующиеся в данном производстве, содержат (3,6±0,3) % СВ, которые представлены в основном соединениями белковой и углеводной природы в крайне неблагополучном для микробиологических станций водоочистки соотношении 27:6. ОБС характеризуются высокими показателями ХПК и БПК. Ввиду высокого содержания органи-