НОВЫЙ ПЕПТИД
NEW PEPTIDE

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому пептиду и конкретнее, к пептиду для промотирования регенерации твердой ткани и/или тканей пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, полинуклеотиду, кодирующему пептид, экспрессирующему вектору, включающему полинуклеотид, и фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид, квазилекарственной композиции для профилактики или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид, и композиции функционального продукта здорового питания для профилактики или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид.
2. Уровень техники
Пульпа зуба представляет собой соединительную ткань, богатую нервами и сосудами, которая занимает пульповую камеру внутри зуба и простирается до наружной поверхности дентина. Нарушения, происходящие в пульпе зуба, называют заболеваниями пульпы зуба.
Существует много причин заболеваний пульпы зуба, но в большинстве случаев заболевания пульпы зуба вызываются бактериальными инфекциями из-за кариеса или инфекциями в пульпе зуба через перфорацию, излом, трещины или пародонтальный карман. Наружные раны, царапины, трещины в зубах или трение или тепло от стоматологического оборудования также могут вызвать заболевания пульпы зубов. Пульпит, вызванный бактериальной инфекцией, может привести к заболеваниям верхушек корней зубов и периодонтальным заболеваниям. Заболевания пульпы зубов впоследствии развиваются до гиперимии пульпы, пульпита и некроза пульпы. Некроз пульпы может привести к периапикальным заболеваниям или нарушениям во всем зубе, поскольку гибель пульпы зуба предотвращает поступление крови в пульпу зуба, и таким образом теряется ткань всего зуба.
Для лечения заболеваний пульпы или периапикальных заболеваний используют материалы для покрытия пульпы и пломбировочные материалы Пульп Канал, и как правило используют гидроксиды кальция, МТА (минеральный триоксидный агрегат), гуттаперчу и т.д. МТА показывает терапевтическое действие, поскольку он имеет способность герметизировать места просачивания и является биосовместимым. Однако применение МТА затруднено из-за его относительно высокой стоимости как стоматологического восстановительного материала и выцветания, ведущего к эстетической проблеме. Гуттаперча имеет относительно низкую стоимость и имеет превосходные реологические свойства. Однако не существует физиологически приемлемого способа, который не вызывает потери жизнеспособности пульпы. До настоящего времени консервативное лечение заболеваний дентина и пульпы имеет проблемы слабых или хрупких зубов или реинфекции.
in vivo
Периодонтальная ткань (периодонт) представляет собой сложный орган, состоящий из эпителиальной ткани, мягкой соединительной ткани и кальцифицированной соединительной ткани. Структура периодонта состоит из десны, периодонтальной связки (PDL), цемента и альвеолярного отростка. Фибробласты десны и фибробласты периодонтальной связки являются основными клеточными компонентами мягкой соединительной ткани десны и образуют и поддерживают межклеточный матрикс. Кроме того, фибробласты десны вовлечены, главным образом, в поддержание соединительной ткани десны, в то время как фибробласты периодонтальной связки имеют уникальную функцию образования периодонтальной связки и вовлечены в замещение и восстановление примыкающего альвеолярного отростка и цемента . Когда имеет место периодонтальное заболевание, клинически кровотечение из десны и опухание, образование пародонтального кармана и разрушение альвеолярного отростка могут привести к потери зубов.
Так как конечной целью лечения периодонтальных заболеваний является восстановление поврежденной соединительной ткани, цемента и альвеолярного отростка, для этого необходимы не только восстановление периодонтальной связки, поддерживающей альвеолярный отросток, но также регенерация альвеолярного отростка и цемента, чего можно достичь с помощью периодонтальной связки.
Поэтому активно проводятся многие исследования для разработки терапевтических средств, способных эффективно лечить заболевания дентина-пульпы зубов или периодонтальные заболевания. Например, в публикации патента Кореи № 2012-0089547 раскрывается композиция для образования твердой ткани или регенерации тканей дентина или пульпы, включающая в качестве активного ингредиента амелобласты, апикальные клетки зачатка или их культуры, и в публикации патента Кореи № 2009-0033643 раскрываются новые стволовые клетки зубов, полученные из зубных фолликулов, и способ их выращивания. Кроме того, в публикации патента Кореи № 2016-0105627 раскрывается фармацевтическая композиция для лечения периодонтальных заболеваний, включающая кондиционированную среду для преамелобластов.
Авторы настоящего изобретения приложили много усилий для разработки средства, способного более эффективно лечить заболевания дентина-пульпы зубов и/или периодонтальные заболевания, вызывающие повреждение альвеолярного отростка и цемента. В результате они разработали пептид, показывающий действие лечения клетками для промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или ткани пульпы зубов, и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, посредством чего осуществили настоящее изобретение.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Осуществление концепций настоящего изобретения может приводить к пептиду для промотирования регенерации твердой ткани и/или ткани пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к полинуклеотиду, кодирующему пептид.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к экспрессирующему вектору, включающему полинуклеотид.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к квазилекарственной композиции для профилактики или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к композиции здорового функционального продукта питания для профилактики или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к способу профилактики или лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающему введение композиции, включающей пептид, субъекту, исключая людей.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к способу промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или ткани пульпы зубов, включающему введение субъекту композиции, включающей пептид. Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к применению пептида для промотирования регенерации твердой ткани и/или ткани пульпы зубов.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к применению пептида в профилактике или лечении заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, включающему аминокислотную последовательность следующей формулы 1
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5 (формула 1),
в которой R1 и R2 представляют собой аргинин (R), лизин (K), глутамин (Q) или аспарагин (N), соответственно;
R3, R4 и R5 представляют собой аргинин (R) или лизин (K), соответственно.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, в котором R1 представляет собой глутамин (Q), R2 представляет собой аргинин (R).
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, в котором R1 представляет собой аргинин (R) или лизин (К), и R2 представляет собой глутамин (Q).
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, в котором R1 и R2 представляют собой глутамин (Q), соответственно.
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, в котором R1 представляет собой аргинин (R) или лизин (К), и R2 представляет собой аргинин (R).
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, в котором R1 представляет собой глутамин (Q), аргинин (R) или лизин (К), и R2 представляет собой лизин (К).
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, в котором R1 представляет собой аргинин (R), лизин (К), глутамин (Q) или аспарагин (N), R2 представляет собой аргинин (R), лизин (К), глутамин (Q) или аспарагин (N), по меньшей мере один из R1 или R2 представляет собой аспарагин (N).
2
2
2
2
2
Осуществление концепций настоящего изобретения также может приводить к пептиду, причем пептид подвергают по N- или С-концу ацилированию, амидированию или метилированию; введению D-аминокислоты; модификации пептидной связи CH-NH, CH-S, CH-S=0, CH-CH; модификации основной цепи или модификации боковой цепи.
Результат изобретения
Пептид по настоящему изобретению показывает превосходное действие промотирования регенерации твердой ткани и/или тканей пульпы. Следовательно, его можно широко применять для разработки различных средств для профилактики или лечения заболеваний дентина-пульпы зубов или для профилактики или лечения периодонтальных заболеваний, вызывающих повреждение в кости и/или цементе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1А представляет собой диаграмму, показывающую результаты сравнения уровней экспрессии дентинсиалофосфопротеина (Dspp), маркерного гена дифференцировки одонтопластов в клетках пульпы зубов человека (hDPC), обработанных новым пептидом по настоящему изобретению.
Фиг. 1В представляет собой другую диаграмму, показывающую результат сравнения уровней экспрессии Dspp, маркерного гена дифференцировки одонтопластов в клетках пульпы зубов человека (hDPC), обработанных новым пептидом по настоящему изобретению.
Фиг. 1С представляет собой диаграмму, показывающую результаты сравнения уровней экспрессии Nestin - генов маркера дифференцировки одонтопластов в клетках пульпы зубов человека (hDPC), обработанных пептидом по настоящему изобретению.
Фиг. 2А представляет собой диаграмму, показывающую результаты сравнения уровней экспрессии BSP - маркерного гена дифференцировки костной ткани и цемента, в человеческих мезенхимальных стволовых клетках, полученных из костного мозга (hBMSC), обработанных новым пептидом по настоящему изобретению.
Фиг. 2В представляет собой другую диаграмму, показывающую результаты сравнения уровней экспрессии BSP - маркерного гена дифференцировки костной ткани и цемента, в человеческих мезенхимальных стволовых клетках, полученных из костного мозга (hBMSC), обработанных новым пептидом по настоящему изобретению.
in vivo
Фиг. 3 показывает результаты измерения количества твердой ткани, вновь образовавшейся в течение 6 недель  с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC).
Фиг. 4 представляет микроскопические изображения, показывающие гистоморфологический анализ твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC) образовавшейся в течение 6 недель in vivo, на которых А-D показывают результаты трансплантации контрольного импланта, полученного путем смешивания hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, и на которых Е-Н показывают результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC, 100 мг НА/ТСР и 10 мкг пептида (группа 3) в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, соответственно (масштаб: А, Е - 500 мкм, В, F - 200 мкм, С, G - 100 мкм, D, Н - 50 мкм).
Фиг. 5 представляет микроскопические изображения, показывающие уровень образования коллагена в твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зуба человека (hDPC) за 6 недель in vivo, на которых А-D показывают результаты трансплантации контрольного импланта, полученного путем смешивания hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, и на которых Е-Н показывают результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC, 100 мг НА/ТСР и 10 мкг пептида (группа 3) в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, соответственно (масштаб: А, Е - 500 мкм, В, F - 200 мкм, С, G - 100 мкм, D, Н - 50 мкм).
Фиг. 6 показывает иммуноокрашенные изображения, показывающие, с использованием метода иммунного окрашивания, анализ уровня экспрессии DSP и маркерного гена дифференцировки одонтопластов в твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зуба человека (hDPC) за 6 недель in vivo, на которых А показывает результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, и на которых В показывает результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC, 100 мг НА/ТСР и 10 мкг пептида (группа 3) в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель у мыши с ослабленной иммунной системой. А и В являются изображениями образовавшейся твердой ткани, иммуноокрашенными с использованием анти-DSP антитела. С представляет собой отрицательный контроль иммуногистохимического анализа при обработке только вторичными антителами. Стрелки на А и В показывают экспрессию DSP во вновь образовавшейся кальцифицированной ткани. Масштаб 50 мкм.
Фиг. 7 показывает результат измерения количества твердой ткани, вновь образовавшейся с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC) за 12 недель in vivo.
Фиг. 8 представляет микроскопические изображения, показывающие гистоморфологический анализ твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC) за 12 недель in vivo, на которых A-D показывают результаты трансплантации контрольного импланта, полученного путем смешивания hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, и на которых Е-Н показывают результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC, 100 мг НА/ТСР и 10 мкг пептида (группа 3) в 0,5% фибриновом геле, за 12 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, соответственно (масштаб: А, Е - 500 мкм, В, F - 200 мкм, С, G - 100 мкм, D, Н - 50 мкм).
Фиг. 9 представляет микроскопические изображения, показывающие уровень образования коллагена в твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC) за 12 недель in vivo, на которых A-D показывают результаты трансплантации контрольного импланта, полученного путем смешивания hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 12 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, и на которой Е-Н показывают результаты трансплантации имплантата, полученного путем смешивания hDPC, 100 мг НА/ТСР и 10 мкг пептида (группа 3) в 0,5% фибриновом геле, за 12 недель у мыши с ослабленной иммунной системой, соответственно (масштаб: А, Е - 500 мкм, В, F - 200 мкм, С, G - 100 мкм, D, Н - 50 мкм).
Фиг. 10 представляет иммуноокрашенные изображения, показывающие с использованием метода иммунного окрашивания, анализ уровня экспрессии DSP - маркерного гена дифференцировки одонтопластов в твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зуба человека (hDPC) за 6 недель in vivo, на которых А показывает результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, у мыши с ослабленной иммунной системой за 12 недель, и на которых В показывает результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC, 100 мг НА/ТСР и 10 мкг пептида (группа 3) в 0,5% фибриновом геле, у мыши с ослабленной иммунной системой за 12 недель. А и В являются изображениями образовавшейся твердой ткани, иммуноокрашенными с использованием анти-DSP антитела. С представляет собой отрицательный контроль иммуногистохимического анализа при обработке только вторичными антителами. Стрелки на А и В показывают экспрессию DSP в образовавшейся заново кальцифицированной ткани. Масштаб 50 мкм.
Фиг. 11 представляет полученные на сканирующем электронном микроскопе (SEM) изображения, показывающие анализ твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зуба человека (hDPC) за 12 недель in vivo, на которыхй А показывает результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, у мыши с ослабленной иммунной системой за 12 недель, и на которых В показывает результаты трансплантации импланта, полученного путем смешивания hDPC, 100 мг НА/ТСР и 10 мкг пептида (группа 3) в 0,5% фибриновом геле, у мыши с ослабленной иммунной системой за 12 недель.
Фиг. 12 показывает на SEM изображениях, что дентинные канальцы поврежденного дентина регенерируются и закрываются физиологическим дентином. По отдельности В, С и D на фиг.12 являются увеличенными изображениями А на фиг.12, соответственно. И F, G и Н на фиг.12 являются увеличенными изображениями Е на фиг.12, соответственно. (Масштаб: А - 1 мм, В - 50 мкм, С - 20 мкм, D - 10 мкм, Е - 1 мм, F - 50 мкм, G - 20 мкм, Н - 10 мкм).
Фиг. 13 показывает на SEM изображениях, что дентинные канальцы, обнаженные на поверхности поврежденного дентина, закрыты за счет физиологической реминерализации. По отдельности В, С и D на фиг.13 являются увеличенными изображениями А на фиг.13, соответственно. И F, G и Н на фиг.13 являются увеличенными изображениями Е на фиг.13, соответственно. (Масштаб: А - 1 мм, В - 50 мкм, С - 20 мкм, D - 10 мкм, Е - 1 мм, F - 50 мкм, G - 20 мкм, Н - 10 мкм).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
Авторы настоящего изобретения провели ряд исследований для разработки средства, способного более эффективно лечить заболевания дентина-пульпы зубов и/или периодонтальные заболевания. В результате они разработали новый пептид, включающий или состоящий из 7 аминокислот.
Вновь разработанный пептид получен путем замены части аминокислотной последовательности пептида, который может показывать терапевтическое действие при заболеваниях дентина или пульпы зубов. Подтверждено, что вновь разработанный пептид может повышать уровни экспрессии Dspp (дентинсиалофосфопротеина) и Nestin, которые являются маркерными генами дифференцировки одонтопластов, показывая посредством этого действие промотирования регенерации дентина, и кроме того возможно повышение уровня BSP (костного сиалопротеина), который является маркерным геном остеобластов и цементобластов, показывая посредством этого действие промотирования регенерации костной ткани и цемента.
Кроме того, получен имплант, включающий пептид вместе с клетками пульпы зубов человека, и полученный имплант трансплантирован в подкожную ткань мыши с ослабленным иммунитетом, и через 6 недель - 12 недель трансплантированную ткань анализируют. В результате обнаружено, что in vivo образовалась дентин/пульпоподобная ткань, имеющая морфологию, наиболее схожую с тканью дентина/пульпы зубов, и in vivo образовалась костноподобная ткань, имеющая морфологию, наиболее схожую с костной тканью. Уровень продуцирования коллагена повысился, и повысился уровень экспрессии DSP, который является генным маркером специфической дифференцировки одонтобластов.
Кроме того, проверяли морфологию трансплантированной ткани под сканирующим электронным микроскопом. В результате наблюдали остеобластоподобные клетки вместе с образовавшейся твердой тканью, подтвердили, что процессы в дендритных клетках также простираются до образовавшейся твердой ткани. Кроме того, подтвердилась типичная характеристика, что у остеобластов и цементобластов на поверхности образовавшейся твердой ткани кубическая форма.
Итак, можно видеть, что пептид по настоящему изобретению может показывать действия промотирования регенерации твердой ткани и/или пульпы зуба и лечения заболеваний дентина/пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний. О пептиде по настоящему изобретению, обладающем такими действиями, до сих пор никогда не сообщалось, и его впервые разработали авторы настоящего изобретения.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к пептиду для промотирования регенерации твердой ткани и/или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, причем пептид включает аминокислотную последовательность следующей формулы 1:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5 (формула 1),
в которой R1 и R2 представляют собой аргинин (R), лизин (K), глутамин (Q) или аспарагин (N);
R3, R4, и R5 представляют собой аргинин (R) или лизин (K), соответственно.
Термин «твердая ткань», используемый в настоящем описании, относится к относительно твердой ткани скелета, включая кость, гиалиновый хрящ и волокнистый хрящ. В одном аспекте согласно настоящему изобретению твердая ткань может включать дентин, кость и цемент.
Термин «дентин», используемый в настоящем описании, относится к желтовато-белой твердой ткани, которая составляет большую часть зуба. Дентин не выходит на поверхность зуба, поскольку он покрыт эмалью в коронке зуба и цементом в корне. Однако дентин может подвергаться воздействию в верхушечной части корня или на окклюзионной поверхности коронки зуба, так как эмаль истирается с возрастом. Дентин является видом костноподобной ткани, но он отличается от обычной костной ткани тем, что клеточные тела дентина остаются в пульпе зуба, хотя их процессы простираются в дентинные канальцы.
Термин «цемент» в настоящем изобретении относится к тонкой пленке формы, в которой кости, покрывающие корни зубов (корни) и другие части млекопитающего, слегка деформированы. Цемент состоит на 50% из неорганического вещества и на 50% из увлажненного органического вещества, желтого по цвету, и показывает меньшую твердость, чем дентин или эмаль. Цемент включает волокна периодонтальной связки, которые соединяют зуб с альвеолярной костью, и когда десны инфицированы бактериями, происходит дегенерация цемента, окружающего зубы, и волокна периодонтальной связки в деформированном цементе, которые соединяют зубы и альвеолярные кости, не держат зубы, и зубы будут качаться. Для того, чтобы лечить такую дегенерацию цемента, используют метод удаления дегенерированного цемента и промотирования образования нового цемента.
Пептид по настоящему изобретению отличается тем, что он может повышать уровни экспрессии генов Dspp и Nestin, которые являются маркерными генами дифференцировки одонтобластов, уровень экспрессии генов BSP (костного сиалопротеина), которые являются маркерными генами дифференцировки остеобластов и цементобластов, и когда пептид трансплантируют вместе с клетками пульпы зубов человека, клетки пульпы зубов человека образуют подобную дентину/пульпе зубов ткань и костноподобную ткань.
Пептид по настоящему изобретению включает варианты этого пептида, имеющие последовательность, включающую один или несколько аминокислотных остатков, отличающихся от остатков в аминокислотной последовательности пептида по настоящему изобретению, до тех пор, пока они могут промотировать регенерацию твердой ткани, подобной дентину, кости и цементу, и/или пульпы зубов и оказывать терапевтическое действие при заболеваниях дентина/пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваниях.
Аминокислотные замены в белках и полипептидах, которые обычно не изменяют молекулярную активность, известны в технике. Наиболее часто происходят замены аминокислотных остатков Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly в обоих направлениях. Пептид может включать пептиды, которые имеют улучшенную структурную устойчивость против нагревания, pH и т.д., или улучшенную способность промотировать регенерацию твердой ткани, подобной дентину, кости и цементу, и/или пульпы зубов из-за изменения или модификации аминокислотной последовательности.
Аминокислотные изменения осуществляют на основании относительного подобия заместителей боковых цепей аминокислот, такого как гидрофобность, гидрофильность, заряд, размер и т.п. Так как все семь аминокислот, составляющих пептид по настоящему изобретению, соответствуют гидрофильным аминокислотам, относительное подобие заместителей боковых цепей аминокислот у них высокое. Соответственно, даже если аминокислоты, составляющие пептид SEQ ID NO: 1, заменены другими аминокислотами, имеющими свойства гидрофильности, в силу их структурного подобия может обнаружиться действие пептида по настоящему изобретению. Например, хотя глутамин, который является кислой аминокислотой в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, заменяется кислой аминокислотой аспарагином или щелочной аминокислотой лизином или аргинином, можно получить действие пептида по настоящему изобретению как таковое; хотя аргинин, который является щелочной аминокислотой в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, заменяется щелочной аминокислотой лизином или кислой аминокислотой глутамином или аспарагином, можно получить действие пептида по настоящему изобретению как таковое; хотя аргинин, который является щелочной аминокислотой в позиции 5 пептида SEQ ID NO: 1, заменяется щелочной аминокислотой лизином, можно получить действие пептида по настоящему изобретению как таковое; хотя лизин, который является щелочной аминокислотой в позиции 6 или 7 пептида SEQ ID NO: 1, заменяется щелочной аминокислотой аргинином, можно получить действие пептида по настоящему изобретению как таковое.
По существу, хотя кислые аминокислоты или щелочные аминокислоты, составляющие пептид по настоящему изобретению, заменяются аминокислотами, имеющими такие же свойства, или заменяются другими кислыми аминокислотами или щелочными аминокислотами соответственно, действие пептида по настоящему изобретению можно получить как таковое. Следовательно, очевидно, что вариант пептида, имеющий последовательность, включающую один или несколько аминокислотных остатков, отличающихся от остатков аминокислотной последовательности, составляющей пептид по настоящему изобретению, также включен в объем охраны пептида по настоящему изобретению.
Кроме того, хотя выбранные произвольно аминокислоты добавляются по N-концу или С-концу пептида по настоящему изобретению, можно получить действие пептида по настоящему изобретению как таковое. Следовательно, пептид, полученный путем добавления произвольных аминокислот по N-концу или С-концу пептида по настоящему изобретению, также включен в объем охраны пептида по настоящему изобретению. Например, примером может являться пептид, полученный путем добавления 1-300 аминокислот по N-концу или С-концу пептида по настоящему изобретению, другим примером может являться пептид, полученный путем добавления 1-100 аминокислот по N-концу или С-концу пептида по настоящему изобретению, и еще одним примером может являться пептид, полученный путем добавления 1-24 аминокислот по N-концу или С-концу пептида по настоящему изобретению.
2
2
2
2
2
Пептид по настоящему изобретению можно химически модифицировать или ввести защитную органическую группу по N-концу и/или С-концу, или можно модифицировать путем добавления аминокислот по концу пептида для того, чтобы защитить пептид от протеазы in vivo и для усиления его устойчивости. В частности, так как химически синтезированные пептиды имеют заряды по N-концу и С-концу, можно выполнить N-концевое ацетилирование, N-концевое метилирование и/или С-концевое амидирование, или можно включить введение D-аминокислоты, модификацию пептидной связи, такой как CH-NH, CH-S, CH-S=0, CH-CH, модификацию основной цепи или модификацию боковой цепи для того, чтобы удалить заряд, но без ограничения указанным. Способы получения пептидомиметиков хорошо известны в технике, например, можно обратиться к описанию в Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992).
Термин «модификация основной цепи», используемый в настоящем описании, относится к прямой модификации аминокислот, составляющих пептидную цепь, аналогами аминокислот, в которых основная цепь (главная цепь) относится к каркасу в форме цепи или кольца из аминокислот, составляющих пептид. Аналог аминокислоты относится к аминокислоте, модифицированной путем замены атомов водорода на азот или α-углерод основной цепи аминокислоты.
Термин «модификация боковой цепи», используемый в настоящем описании, относится к модификации боковых цепей аминокислот путем использования химического материала, в которых боковые цепи аминокислот относятся к атомным группам, ответвляющимся от каркаса в форме цепи или кольца из аминокислот, составляющих пептид. Примеры модификации боковых цепей пептида могут включать модификацию аминогруппы, такую как восстановительное алкилирование; амидирование метилацетамидатом; алкилирование уксусным ангидридом; карбамилирование аминогрупп цианатом; тринитрбензилирование аминокислот 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS); алкилирование аминогрупп янтарным ангидридом и пиридоксилирование пиридоксаль-5-фосфатом с последующим восстановлением NaBH4.
Кроме того, пептид по настоящему изобретению можно использовать один или в комбинации с различными носителями, одобренными для лекарственного средства, такими как органический растворитель. Для того, чтобы улучшить устойчивость и эффективность, пептид по настоящему изобретению также можно использовать, включая углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстран, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, комплексообразователи, низкомолекулярные белки, другие стабилизаторы и т.д.
Согласно одному воплощению настоящего изобретения, синтезировано 128 соответствующих формуле 1 видов пептидов по настоящему изобретению с проверкой действия пептидов на уровень экспрессии гена Dspp, который является маркерным геном дифференцировки одонтобластов. В результате подтверждено, что все уровни мРНК маркерного гена дифференцировки одонтобластов Dspp в клетках пульпы зубов человека, которые обрабатывали 128 видами пептидов, были в 8 раз выше, в 6 раз выше, в 3 раза выше или по меньшей мере в 1,5 раза выше, чем уровень мРНК гена Dspp, который измеряли в клетках пульпы зубов человека (контрольная группа), которые не обрабатывали ни одним из пептидов по настоящему изобретению (фиг. 1А, фиг. 1В и таблицы 18-33).
Как сообщалось до сих пор, известно, что уровень мРНК DSPP повышается, дифференцировка одонтобластов и регенерация дентина промотируются и, следовательно, можно видеть, что 128 видов пептидов, показывающих действие повышения уровня мРНК гена Dspp, могут показывать действие промотирования дифференцировки одонтобластов и регенерации дентина (Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp. 24874-24880, 2003; William T. Butler et al., Connective Tissue Research, 44(Suppl. 1): 171-178, 2003.
Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения действие синтезированных пептидов распространяется на уровень экспрессии гена BSP, которые является маркерным геном дифференцировки остеобластов/цементобластов. В результате подтверждено, что все уровни мРНК BSP - маркерного гена дифференцировки остеобластов/цементобластов, в клетках пульпы зубов человека, которые обрабатывали 128 видами пептидов, были в 13 раз выше, в 12 раз выше, в 9 раз выше или по меньшей мере в 3 раза выше, чем уровень мРНК гена BSP, который измеряли в клетках пульпы зубов человека (контрольная группа), которые не обрабатывали ни одним из пептидов по настоящему изобретению (фиг. 2А, фиг. 2В).
Известно, что уровень мРНК BSP повышается, промотируются дифференцировка остеобластов/цементобластов и дифференцировка костной ткани и цемента, и, следовательно, можно видеть, что 128 видов пептидов, показывающих действие повышения уровня мРНК гена BSP, могут показывать действие промотирования дифференцировки остеобластов/цементобластов одонтобластов и дифференцировки одонтобластов и регенерации дентина. В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему пептид.
Полинуклеотид можно модифицировать путем замены, делеции или вставки одного или нескольких оснований или их комбинацией. Когда нуклеотидную последовательность получают химическим синтезом, а синтетические способы широко известны в технике, например, можно использовать способ, описанный в литературе (Engels and Uhlmann, Angew. Chem. Int.Ed Engl., 37:73-127, 1988), и нуклеотидную последовательность можно синтезировать методами триэфирным, фосфитным, фосфорамидитным и Н-фосфатным, ПЦР и другими методами с аутопраймерами, синтезом олигонуклеотидов на твердых носителях и т.д. Например, полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, включающему полинуклеотид, трансформанту, включающему экспрессирующий вектор, и способу получения пептида с использованием трансформанта.
Термин «экспрессирующий вектор», используемый в настоящем описании, относится к рекомбинантному вектору, способному экспрессировать целевой пептид в клетке-хозяине, и относится к генетической конструкции, включающей существенные регуляторные элементы, которые операбельно соединены для экспрессии генной вставки. Экспрессирующий вектор включает экспрессирующие регуляторные последовательности, такие как инициирующий кодон, стоп-кодон, промотор, оператор и т.д. Инициирующий кодон и стоп-кодон обычно рассматриваются как часть нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и необходимы для функциональности в индивидууме, которому введена генетическая конструкция, и должны находиться в рамке с кодирующей последовательностью. Промотор вектора может быть конститутивным или индуцибельным.
Термин «операбельно соединены», используемый в настоящем описании, относится к функциональной связи между контрольной последовательностью экспрессии нуклеиновой кислоты и нуклеотидной последовательностью, кодирующей целевой белок или РНК, таким образом, чтобы допустить общее функционирование. Например, для влияния на экспрессию кодирующей последовательности промотор может быть операбельно связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок или РНК. Операбельную связь с экспрессирующим вектором можно получить путем использования методов генетической рекомбинанции, хорошо известных в технике, и можно выполнить сайт-специфическое расщепление ДНК и лигирование с использованием ферментов, как правило, известных в технике.
Кроме того, экспрессирующий вектор может включать сигнальные последовательности для разрядки пептида для промотирования выделения пептида из культуры клеток. Также могут потребоваться специфические сигналы инициации для эффективной трансляции встроенных нуклеотидных последовательностей. Эти сигналы включают инициирующий кодон ATG и соседние последовательности. В некоторых случаях должны быть предоставлены экзогенные контрольные сигналы трансляции, включая инициирующий кодон ATG. Эти экзогенные контрольные сигналы трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение - как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии можно усилить путем введения соответствующих энхансеров транскрипции или трансляции.
Кроме того, экспрессирующий вектор также может включать белок tag, который можно, необязательно, удалить с помощью эндопептидазы для того, чтобы облегчить обнаружение пептида.
Термин «tag», используемый в настоящем описании, относится к молекуле, которая проявляет поддающуюся количественному определению активность или характеристику. Tag может включать флуоресцентные молекулы, включающие химический флуоресцент, такой как флуоресцеин, и флуоресцент-полипептид, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), или родственные белки, и эпитопы tag, такие как Мус tag, Flag tag, His-tag, лейцин tag, IgG tag, стрептавидин tag, и т.д. В частности, если используют эпитоп tag, можно использовать пептид tag, состоящий предпочтительно из 6 или большего числа аминокислотных остатков, и предпочтительнее, из примерно 8-50 аминокислотных остатков.
В настоящем изобретении экспрессирующий вектор может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую описанный выше пептид для промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний по настоящему изобретению. Вектор, используемый в настоящем описании, не ограничивается до тех пор, пока он может продуцировать пептид. Предпочтительно вектор может представлять собой плазмидную ДНК, фаговую ДНК и т.д. Предпочтительнее вектор может представлять собой коммерчески разработанную плазмиду (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP и т.д.), плазмиду, полученную из E. coli (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 и т.д.), плазмиду, полученную из Bacillus subtilis (pUB110, pTP5 и т.д.), плазмиду, полученную из дрожжей (YEp13, YEp24, YCp50 и т.д.), фаговую ДНК (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP и т.д.), вирусный вектор животного происхождения (ретровирус, аденовирус, вирус осповакцины и т.д.), вирус насекомых (бакуловирус и т.д.) или подобное. В случае экспрессирующего вектора предпочтительно выбирают и используют клетку-хозяина, наиболее подходящую для предполагаемого использования, поскольку уровень экспрессии и модификация белка изменяются в зависимости от вида клетки-хозяина.
Трансфоромант по настоящему изобретению можно получить путем трансформации хозяина экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, и трансформант может экспрессировать полинуклеотид в экспрессирующем векторе, продуцируя таким образом пептид. Трансформацию можно выполнить различными способами. Способ трансформации особо не ограничивается до тех пор, пока он может продуцировать пептид. Можно использовать преципитацию CaCl2, способ Ханахана, который является улучшенным способом преципитации CaCl2 за счет использования ДМСО (диметилсульфоксида) как восстановителя, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, слияние протопластов, перемешивание с использованием карбидокремниевого волокна, трансформацию, опосредуемую Agrobacterium, ПЭГ-опосредуемую трансформацию, трансформацию, опосредуемую сульфатом декстрана, липофектамином или осушением/ингибированием, и т.д. Хозяин, используемый для получения трансофрманта, особо не ограничивается до тех пор, пока он может продуцировать пептид по настоящему изобретению. Хозяин может представлять собой клетки бактерий, таких как E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, и т.д.; клетки дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и т.д.; клетки грибов, таких как Pichia pastoris, и т.д.; клетки насекомых, таких как Drosophila, клетки Spodoptera Sf9 и т.д.; клетки животных такие как CHO, COS, NSO, 293, клетки меланомы Bowes и т.д.; и клетки растений.
Трансформант можно использовать в способе получения пептида для промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний по настоящему изобретению. Конкретно способ продуцирования пептида для промотирования регенерации дентина или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина или пульпы зубов по настоящему изобретению может включать (а) культивирование трансформанта для получения культуры; и (b) извлечение пептида по настоящему изобретению из культуры.
Термин «культивирование», используемый в настоящем описании, относится к способу допущения роста микроорганизма в условиях искусственной регулируемой окружающей среды. В настоящем изобретении способ культивирования трансформанта можно выполнить методом, хорошо известным в технике. Конкретно культивирование особо не ограничивается до тех пор, пока им можно экспрессировать и продуцировать пептид для промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний по настоящему изобретению, и культивирование можно выполнять периодическим процессом, периодическим процессом с подпиткой или повторяющимся периодическим процессом с подпиткой.
Среда, используемая при культивировании, включает подходящие источники углерода, источники азота, аминокислоты, витамины и т.д. и должна соответственно удовлетворять требованиям специфического штамма, при регулировке температуры, рН и т.д. в аэробных условиях. Пригодные источники углерода могут включать, кроме смешанных сахаров глюкозы и ксилозы как основного источника углерода, сахара и углеводы, такие как сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и т.д., жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота или линолевая кислота, спирты, такие как глицерин или этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества можно использовать одни или в комбинации. Пригодные источники азота могут включать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония или нитрат аммония; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин или глутамин; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, кукурузный ликер, гидролизат казеина, рыбная мука или продукты ее ферментативного гидролиза, обезжиренный соевый жмых или продукты его ферментативного гидролиза, и т.д. Эти источники азота можно использовать одни или в комбинации. Среда может включать в качестве источников фосфора одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия и соответствующие натрийсодержащие соли. Пригодные источники фосфора могут включать дигидрофосфат калия, дикалийгидрофосфат или соответствующие натрийсодержащие соли. Также неорганические соединения могут включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат магния и карбонат кальция. Кроме указанных выше материалов можно использовать существенные для роста материалы, такие как аминокислоты и витамины.
Кроме того, в культуральной среде можно использовать соответствующие предшественники. Во время культивирования вышеописанные материалы можно соответственно добавлять к культуре периодически, периодически с подпиткой или непрерывно, но без ограничения указанным. Можно соответственно регулировать рН культуры, используя щелочное соединение, такое как гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак, или кислое соединение, такое как фосфорная кислота или серная кислота.
Кроме того, образование пузырьков можно подавлять, используя пеногаситель, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты. Для того, чтобы поддерживать аэробное состояние, в культуру можно нагнетать кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Температура культуры обычно составляет 27°С-37°С, предпочтительно 30°С-35°С. Культивирование продолжают до тех пор, пока не получат желательный уровень продукции пептида. Это достигается за 10-100 часов.
Кроме того, извлечение пептида из культуры можно выполнять способом, известным в технике. Конкретно, способ извлечения особо не ограничивается до тех пор, пока им можно извлечь полученный пептид. Предпочтительно можно использовать способ, такой как центрифугирование, фильтрация, экстрагирование, распыление, сушка, выпаривание, преципитация, кристаллизация, электрофорез, фракционное растворение (например, преципитация сульфатом аммония), хроматография (например, ионообменная, аффинная, гидрофобная и эксклюзионная) и т.д.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид.
Как описано выше, когда пептид для промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний по настоящему изобретению трансплантируют в организм вместе с клетками пульпы зубов человека, может быть промотировано образование клетками пульпы зубов человека ткани, подобной дентину/пульпе зубов, и когда пептид применяют в месте поврежденного дентина или пульпы зубов, может образоваться такой же физиологический дентин, который наблюдают как естественный дентин в зубе человека. Следовательно, пептид можно использовать как активный ингредиент фармацевтической композиции для лечения заболеваний дентина-пульпы зубов, которые вызваны повреждением дентина или пульпы зубов.
Пептид, включенный в фармацевтическую композицию, можно использовать в форме мономерного пептида или в форме полипептида из 2 или больше повторов пептида, и пептид также можно использовать в комплексной форме лекарственного средства, имеющего терапевтическое действие при заболеваниях дентина или пульпы зубов, присоединенного по N-концу или С-концу пептида.
Термин «заболевания дентина-пульпы зубов», используемый в настоящем описании, относится ко всем заболеваниям, вызванным повреждением ткани пульпы зубов и дентина, соединенного с пульпой зуба, из-за повреждения тканей дентина и пульпы зубов.
В настоящем изобретении заболевания дентина-пульпы зубов особо не ограничиваются до тех пор, пока пептид по настоящему изобретению проявляет терапевтическое действие при заболеваниях, и заболевания дентина или пульпы зубов могут включать, например, повышенную чувствительность дентина, гиперемию пульпы, пульпит, дегенерацию пульпы, некроз пульпы, гангренозный пульпит и т.д.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения периодонтальных заболеваний, включающей пептид. Как описано выше, когда пептид для промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний по настоящему изобретению трансплантируют в организм вместе с клетками пульпы зубов человека, может промотироваться образование костноподобной ткани клетками пульпы зубов человека. Следовательно, пептид можно использовать в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции для лечения периодонтальных заболеваний, которые вызваны повреждением кости и/или цемента.
Пептид, включенный в фармацевтическую композицию, можно использовать как форму одного пептида или в форме полипептида из 2 или больше повторов пептида, и пептид также можно использовать в форме комплекса с лекарственным средством, имеющим терапевтическое действие при заболеваниях дентина или пульпы зубов, присоединенным по N-концу или С-концу пептида.
Термин «периодонтальное заболевание», используемый в настоящем описании, также относится к хроническому периодонтиту, относится к заболеванию, которое инфицирует периодонтальную связку и соседние ткани путем заражения бактериями в промежутке между десной и зубом, в зависимости от тяжести заболевания его подразделяют на гингивит или периодонтит. При начале периодонтального заболевания воспаление прогрессирует, и большинство тканей повреждается с образованием периодонтального кармана. Известно, что когда периодонтит усугубляется и периодонтальный карман становится глубже, периодонтальный карман вызывает воспаление периодонтальной связки и в итоге вызывает потерю костной массы.
В настоящем изобретении периодонтальные заболевания особо не ограничиваются, пока пептид по настоящему изобретению проявляет терапевтическое действие при заболеваниях, и заболевания дентина или пульпы зубов могут включать, например, гингивит, периодонтит, периодонтальный карман или периодонтальный абсцесс, и т.д.
Термин «предупреждение», используемый в настоящем описании, обозначает все действия, с помощью которых появление заболеваний дентина-пульпы зубов ограничивается или задерживается путем введения фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний дентина-пульпы зубов, включающей пептид по настоящему изобретению.
Термин «лечение», используемый в настоящем описании, обозначает все действия, с помощью которых заболевания дентина-пульпы зубов лечат путем промотирования регенерации дентина или пульпы зубов путем введения фармацевтической композиции, включающей пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, субъекту, нуждающемуся в лечении заболеваний дентина-пульпы зубов, или все действия, которые выполняют путем введения фармацевтической композиции, включающей пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, индивидууму, нуждающемуся в лечении периодонтальных заболеваний, путем промотирования регенерации костной ткани и/или цемента.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получить в форме фармацевтической композиции для лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, также включающей, кроме пептида, соответствующий носитель (природный или искусственный носитель), эксципиент или разбавитель, обычно используемые при получении фармацевтических композиций. Достойно внимания, что фармацевтическую композицию согласно стандартному методу можно составить в форме стерильного раствора для инъекции, который можно вводить в место индукции заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний. В настоящем изобретении носитель, эксципиент и разбавитель, которые можно включать в фармацевтическую композицию, могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритритол, мальтитол, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральные масла, коллаген и т.д. При составлении могут быть использованы обычно используемые разбавители или эксципиенты, такие как наполнитель, экстендер, связующее вещество, смачиватель, дезинтегратор, поверхностно-активное вещество и т.д. В частности, могут быть включены стерильный водный раствор, неводный растворитель, суспензия, эмульсия, высушенный вымораживанием препарат, суппозиторий, мазь (например, прокладка для пульпы и т.д.). Как неводные растворители или основы суспензии можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, эфиры для инъекции, такие как этилолеат, и т.д. В качестве основы для суппозиториев можно использовать витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновый жир, глицерожелатин и т.д.
Содержание пептида в фармацевтической композиции по настоящему изобретению особо не ограничивается, но пептид можно включать в количестве 0,0001 мас.% - 50 мас.%, предпочтительнее 0,01 мас.% - 20 мас.% относительно общей массы конечной композиции.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в фармацевтически эффективном количестве. Термин «фармацевтически эффективное количество», используемый в настоящем описании, относится к количеству, достаточному для лечения или предупреждения заболеваний при разумном соотношении польза/риск, приемлемом в медицине для любого лечения или предупреждения. Эффективный уровень дозировки можно определить в зависимости от факторов, включающих тяжесть заболевания, активность лекарственного средства, возраст, массу тела, состояние здоровья пациента, чувствительность к лекарственному средству, время введения, путь введения и скорость экскреции композиции по настоящему изобретению, длительность лечения, лекарства, смешанные или вводимые совместно с композицией по настоящему изобретению, и других факторов, известных в области медицины. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с известной фармацевтической композицией для лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний. Важно, из-за всех описанных выше факторов, вводить композицию в минимальном количестве, которое может показать максимальное действие, не вызывая побочного действия.
Дозу для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут определить специалисты в данной области техники на основании цели применения, тяжести заболевания, возраста, массы тела, пола и истории болезни пациента, вида материала, используемого в качестве активного ингредиента, и т.д. Например, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в дозе примерно 0,1 нг/кг - примерно 100 мг/кг. Предпочтительно доза примерно 1 нг/кг - примерно 10 мг/кг для взрослого человека и частота введения композиции по настоящему изобретению особо не ограничиваются. Однако композицию можно вводить один раз или несколько раз в день в разделенных дозах. Доза введения не ограничивает объем настоящего изобретения в каком-либо аспекте.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний дентина-пульпы зубов, включающему введение фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции человеку или субъекту с заболеваниями дентина-пульпы зубов, исключая людей.
Термин «субъект», используемый в настоящем описании, может включать млекопитающих, включая людей, крыс, домашний скот и т.д., нуждающихся в лечении заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний без ограничения, но люди могут быть исключены из субъектов, имеющих вышеуказанные заболевания.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению для лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний можно вводить любым обычным путем до тех пор, пока фармацевтическая композиция способна достигать ткани-мишени. Фармацевтическую композицию можно вводить, но без особых ограничений, внутриротовым введением, внутриротовой инъекцией и т.д., в зависимости от цели.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к квазилекарственной композиции для профилактики или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов, включающей пептид.
Термин «облегчение», используемый в настоящем описании, обозначает все действия, которые по меньшей мере снижают параметр, относящийся к состояниям, от которых лечат, например, степень или симптом.
В настоящем изобретении облегчение следует интерпретировать как все действия, с помощью которых симптомы заболеваний дентина-пульпы зубов повернулись к лучшему или благоприятно модифицированы путем промотирования регенерации дентина-пульпы зубов, или симптомы периодонтальных заболеваний повернулись к лучшему или благоприятно модифицированы путем промотирования регенерации костной ткани и/или цемента, за счет введения субъекту, нуждающемуся в лечении заболеваний дентина или пульпы зубов, фармацевтической композиции, включающей пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента.
Термин «квазилекарственное средство», используемый в настоящем описании, относится к изделию, имеющему более слабое действие, чем лекарственные средства, среди изделий, используемых для диагностики, лечения, улучшения, облегчения, ухода или предупреждения заболеваний человека или животных. Например, согласно Закону о фармацевтической деятельности, квазилекарственными средствами являются средства, за исключением изделий, используемых как лекарственные средства, включающие изделия, изготовленные из волокон или резины, которые используются для лечения или предупреждения заболеваний человека или животных, изделия иные, чем инструмент или машина или их аналоги, которые имеют умеренное действие или не имеют прямого влияния на организм человека, изделия, которые используются для дезинфекции или борьбы с паразитами для предупреждения инфекционных заболеваний.
В настоящем изобретении вид препарата квазилекарственной композиции, включающей пептид, особо не ограничивается, но квазилекарственная композиция может представлять собой, например, антисептические ополаскиватели для полости рта, продукты для гигиены полости рта, зубные пасты, мази для полости рта и т.д.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции функционального продукта здорового питания для профилактики или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающей пептид.
Термин «продукт питания», используемый в настоящем описании, включает мясные продукты, колбасы, хлебобулочные изделия, шоколадные продукты, конфеты, сухие завтраки, кондитерские изделия, пиццы, лапшу рамен, другие макаронные изделия, гумми, молочные продукты, включая мороженое, различные супы, напитки, чаи, алкогольные напитки и витаминные комплексы, диетические функциональные продукты, диетические продукты и т.д., и питание включает все пищевые продукты в обычном значении этого термина.
Термин «функциональный продукт питания» является термином, равнозначным для специального продукта питания для поддержания здоровья (FoSHU), и относится к продукту питания с высоким медицинским эффектом, который обработан для эффективного проявления биологической модулирующей функции, а также для предоставления питательных веществ. В настоящем описании термин «функциональный» указывает на благоприятное действие для здоровья человека, такое как регуляция питательных веществ для структуры и функционирования человеческого организма, физиологического действия и т.д. Продукт питания по настоящему изобретению можно получить согласно способу, обычно используемому в технике, и после получения продукта можно добавить исходные материалы и ингредиенты, обычно используемые в технике. Кроме того, состав продукта не ограничивается до тех пор, пока состав признается продуктом питания. Композицию продукта питания по настоящему изобретению можно получить в виде различных препаратов. Так как продукт питания используется как исходные материалы, непохожий на обычные лекарственные средства, композиция продукта лишена побочных действий, которые могут иметь место, когда лекарство принимают в течение длительного периода, и может иметь превосходную переносимость. Поэтому продукт питания по настоящему изобретению можно принимать как добавку для усиления действий предотвращения или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний.
Здоровое питание обозначает питание, имеющее действие активного поддержания или промотирования состояния здоровья по сравнению с обычными продуктами питания, и продукт пищевая добавка для здоровья обозначает продукт питания для укрепления здоровья. При необходимости термины «функциональный здоровый продукт питания», «здоровый продукт питания» и «пищевая добавка для укрепления здоровья» могут использоваться взаимозаменяемо.
Конкретно функциональный продукт здорового питания представляет собой продукт питания, полученный путем добавления пептида по настоящему изобретению к пищевым материалам, таким как напитки, чаи, специи, гумми, кондитерские изделия и т.д., или полученные в виде капсулы, порошка, суспензии и т.д. Функциональный продукт здорового питания означает, что он оказывает специфическое действие на здоровье, когда его потребляют, но в отличие от обычных лекарственных средств, функциональный продукт здорового питания имеет преимущество отсутствия побочного действия, которое может иметь место, когда лекарство принимают длительное время, поскольку в нем в качестве исходных материалов используются пищевые продукты.
Так как композиция продукта питания по настоящему изобретению обычно проглатывается, ожидается, что композиция продукта питания покажет высокую эффективность при предупреждении или улучшении при заболеваниях дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваниях. Таким образом, ее можно применять с большой пользой.
Композиция продукта питания может также включать физиологически приемлемый носитель. Вид носителя особо не ограничивается. Можно использовать любой носитель в той же степени, в какой его обычно используют в технике.
Кроме того, композиция продукта питания может включать дополнительные ингредиенты, которые обычно используются в пищевых композициях для улучшения запаха, вкуса, вида и т.д. Например, композиция продукта питания может включать витамины А, С, D, E, В1, B2, B6, B12, ниацин, биотин, фолат, пантотеновую кислоту и т.д. Кроме того, композиция продукта питания также может включать минералы, такие как Zn, Fe, Ca, Cr, Mg, Mn, Cu и т.д. Кроме того, композиция продукта питания также может включать аминокислоты, такие как лизин, триптофан, цистеин и т.д. Кроме того, композиция продукта питания также может включать добавки к пищевому продукту, такие как консерванты (аскорбат калия, бензоат натрия, салициловая кислота, дегидроацетат натрия и т.д.), дезинфицирующие средства (хлорная известь, гипохлорит натрия и т.д.), антиоксиданты (бутилгидроксианизол (ВНА), бутилгидрокситолуол (ВНТ) и т.д.), красители (деготь и т.д.), проявители красителей (нитрит натрия и т.д.), отбеливатели (сульфит натрия), приправы (глутамат натрия (MSG) и т.д.), подсластители (дульцин, цикламат натрия, сахарин и т.д.), ароматизаторы (ванилин, лактоны и т.д.), способствующие набуханию вещества (квасцы, D-битартрат калия и т.д.), обогатители, эмульгаторы, загустители (адгезивные пасты), пленкообразователи, средства на основе камеди, пеногасители, растворители, улучшители и т.д. Добавки можно выбрать и использовать в соответствующем количестве согласно типам продуктов питания.
Пептид по настоящему изобретению можно добавлять как он есть или его можно использовать в сочетании с другими продуктами питания или пищевыми ингредиентами согласно стандартному методу, или можно использовать соответственно согласно стандартному методу. Смешиваемые количества активного ингредиента можно соответственно определить в зависимости от цели применения (профилактическая, оздоровительная или лечение). Как правило, после получения пищевого продукта или напитка композиция продукта питания по настоящему изобретению может быть добавлена в количестве 50 массовых частей или меньше, конкретно 20 массовых частей или меньше, относительно общей массы пищевого продукта или напитка. Однако, когда предполагается длительное поглощение для здоровья и гигиенической цели, композиция продукта питания может быть включена в количестве ниже указанного интервала. Кроме того, так как не существует проблемы безопасности, активный ингредиент можно использовать в количестве, превышающем верхний интервал.
Композицию продукта питания по настоящему изобретению можно использовать в качестве, например, композиции напитка для здоровья. В этом случае композиция напитка для здоровья может дополнительно включать различные отдушки или природные углеводы, как в обычных напитках. Природные углеводы могут включать моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза; дисахариды, такие как мальтоза и сахароза; полисахариды, такие как декстрин и циклодекстрин; и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит и эритритол. Подсластители могут представлять собой натуральные подсластители, такие как тауматин или экстракт стевии, или синтетические подсластители, такие как сахарин или аспартам. Природные углеводы обычно можно использовать в количестве примерно 0,01 г-0,04 г и конкретно примерно 0,02 г-0,03 г на 100 мл композиции напитка для здоровья по настоящему изобретению.
Кроме того, композиция напитка для здоровья может включать различные питательные вещества, витамины, минералы, отдушки, красители, пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, модификаторы рН, стабилизаторы, антисептики, глицерин, спирты, карбонизаторы и т.д. Кроме того, композиция напитка для здоровья может включать фруктовую мякоть, используемую для получения натуральных фруктовых соков, натуральных плодово-ягодных напитков или овощных напитков. Эти ингредиенты можно использовать по отдельности или в комбинации. Пропорция добавки не является критичной, но обычно выбирают от 0,01 мас. частей до 0,1 мас. частей на 100 мас. частей композиции напитка для здоровья по настоящему изобретению.
Композиция продукта питания по настоящему изобретению может включать пептид по настоящему изобретению в различных мас.% до тех пор, пока она может проявлять действие предотвращения или облегчения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний. Конкретно пептид по настоящему изобретению может быть включен в количестве 0,00001 мас.%-100 мас.% или 0,01 мас.%-80 мас.% относительно общей массы композиции продукта питания, но не ограничивается этим.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения или лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний, включающему введение субъекту композиции, включающей пептид.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу промотирования регенерации дентина или тканей пульпы зубов и/или твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, включающему введение субъекту композиции, включающей пептид.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению пептида, включающего аминокислотную последовательность приведенной далее формулы 1, или композиции, включающей пептид, при промотировании регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов, и лечении заболеваний дентина-пульпы зубов или периодонтальных заболеваний:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5 (формула 1),
в которой R1 и R2 представляют собой аргинин (R), лизин (K), глутамин (Q) или аспарагин (N), соответственно;
R3, R4, и R5 представляют собой аргинин (R) или лизин (K), соответственно.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению пептида, включающего любую одну аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1-128, или композиции, включающей пептид, при промотировании регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов и лечении заболеваний дентина-пульпы зубов или периодонтальных заболеваний.
Далее настоящее изобретение будет описываться подробнее с обращением к примерам. Однако эти примеры приводятся только с целью пояснения, и объем настоящего изобретения этими примерами не ограничивается.
Пример 1. Методы и материалы
Синтез пептида для промотирования генерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов и лечения заболеваний дентина-пульпы зубов и/или периодонтальных заболеваний
Авторы настоящего изобретения синтезировали пептид (SEQ ID NO: 1), показывающий действие промотирования регенерации твердой ткани, включая дентин, кость и цемент, и/или пульпы зубов, по методу с 9-флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc), и они синтезировали пептиды характерных групп (таблицы 1-16) путем замены аминокислот синтезированного пептида.
N-KYQRRKK-C (SEQ ID NO: 1)
Сначала синтезируют пептиды группы 1, используя пептид SEQ ID NO: 1, путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 1).
[Таблица 1]
Пептиды группы 1
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
1
KYQRRKK
2
KYQRRKR
3
KYQRRRK
4
KYQRRRR
5
KYQRKKK
6
KYQRKRK
7
KYQRKKR
8
KYQRKRR
Затем синтезируют пептиды группы 2 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 2).
[Таблица 2]
Пептиды группы 2
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
9
KYRQRKK
10
KYRQRKR
11
KYRQRRK
12
KYRQRRR
13
KYRQKKK
14
KYRQKRK
15
KYRQKKR
16
KYRQKRR
Затем синтезируют пептиды группы 3 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 3).
[Таблица 3]
Пептиды группы 3
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
17
KYKQRKK
18
KYKQRKR
19
KYKQRRK
20
KYKQRRR
21
KYKQKKK
22
KYKQKRK
23
KYKQKKR
24
KYKQKRR
Затем синтезируют пептиды группы 4 путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 4).
[Таблица 4]
Пептиды группы 4
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
25
KYQQRKK
26
KYQQRKR
27
KYQQRRK
28
KYQQRRR
29
KYQQKKK
30
KYQQKRK
31
KYQQKKR
32
KYQQKRR
Затем синтезируют пептиды группы 5 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 5).
[Таблица 5]
Пептиды группы 5
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
33
KYRRRKK
34
KYRRRKR
35
KYRRRRK
36
KYRRRRR
37
KYRRKKK
38
KYRRKRK
39
KYRRKKR
40
KYRRKRR
Затем синтезируют пептиды группы 6 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 6).
[Таблица 6]
Пептиды группы 6
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
41
KYKRRKK
42
KYKRRKR
43
KYKRRRK
44
KYKRRRR
45
KYKRKKK
46
KYKRKRK
47
KYKRKKR
48
KYKRKRR
Затем синтезируют пептиды группы 7 путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 7).
[Таблица 7]
Пептиды группы 7
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
49
KYQKRKK
50
KYQKRKR
51
KYQKRRK
52
KYQKRRR
53
KYQKKKK
54
KYQKKRK
55
KYQKKKR
56
KYQKKRR
Затем синтезируют пептиды группы 8 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 аспарагином, путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 8).
[Таблица 8]
Пептиды группы 8
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
57
KYNKRKK
58
KYNKRKR
59
KYNKRRK
60
KYNKRRR
61
KYNKKKK
62
KYNKKRK
63
KYNKKKR
64
KYNKKRR
Затем синтезируют пептиды группы 9 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 аспарагином, путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 9).
[Таблица 9]
Пептиды группы 9
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
65
KYNRRKK
66
KYNRRKR
67
KYNRRRK
68
KYNRRRR
69
KYNRKKK
70
KYNRKRK
71
KYNRKKR
72
KYNRKRR
Затем синтезируют пептиды группы 10 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 аспарагином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 10).
[Таблица 10]
Пептиды группы 10
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
73
KYRNRKK
74
KYRNRKR
75
KYRNRRK
76
KYRNRRR
77
KYRNKKK
78
KYRNKRK
79
KYRNKKR
80
KYRNKRR
Затем синтезируют пептиды группы 11 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 аспарагином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 11).
[Таблица 11]
Пептиды группы 11
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
81
KYKNRKK
82
KYKNRKR
83
KYKNRRK
84
KYKNRRR
85
KYKNKKK
86
KYKNKRK
87
KYKNKKR
88
KYKNKRR
Затем синтезируют пептиды группы 12 путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 аспарагином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 12).
[Таблица 12]
Пептиды группы 12
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
89
KYQNRKK
90
KYQNRKR
91
KYQNRRK
92
KYQNRRR
93
KYQNKKK
94
KYQNKRK
95
KYQNKKR
96
KYQNKRR
Затем синтезируют пептиды группы 13 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 аспарагином, путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 13).
[Таблица 13]
Пептиды группы 13
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
97
KYNQRKK
98
KYNQRKR
99
KYNQRRK
100
KYNQRRR
101
KYNQKKK
102
KYNQKRK
103
KYNQKKR
104
KYNQKRR
Затем синтезируют пептиды группы 14 путем замены аминокислоты в позициях 3 и 4 пептида SEQ ID NO: 1 аспарагином, путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 14).
[Таблица 14]
Пептиды группы 14
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
105
KYNNRKK
106
KYNNRKR
107
KYNNRRK
108
KYNNRRR
109
KYNNKKK
110
KYNNKRK
111
KYNNKKR
112
KYNNKRR
Затем синтезируют пептиды группы 15 путем замены аминокислоты в позиции 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в позиции 4 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 15).
[Таблица 15]
Пептиды группы 15
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
113
KYRKRKK
114
KYRKRKR
115
KYRKRRK
116
KYRKRRR
117
KYRKKKK
118
KYRKKRK
119
KYRKKKR
120
KYRKKRR
Наконец, синтезируют пептиды группы 16 путем замены аминокислоты в позициях 3 и 4 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены любой аминокислоты в позициях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (таблица 16).
[Таблица 16]
Пептиды группы 16
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность (N-C)
121
KYKKRKK
122
KYKKRKR
123
KYKKRRK
124
KYKKRRR
125
KYKKKKK
126
KYKKKRK
127
KYKKKKR
128
KYKKKRR
Пример 1-2. Клеточная культура
2
Клетки культивируют в содержащей примерно 37% СО увлажненной атмосфере при 37°С. Кроме того, их используют в эксперименте. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (hBMSC) закупают у Lonza (LONZA, Швейцария) и используют. hBMSC культивируют в культуральной среде альфа-MEM(α-MEM) (Invitrogen), содержащей 10% инактивированной нагреванием бычьей сыворотки.
Пример 1-3. Выделение и культивирование взятых у человека клеток пульпы зубов
Клетки пульпы зубов человека выделяют из зубов мудрости 10 взрослых людей (возраст 18-22) на факультете стоматологии, Сеульский Национальный Университет. Подробно, все эксперименты выполняют после утверждения Институциональным наблюдательным советом и информированного согласия от пациентов. Зубы мудрости разрушают согласно методу Jung HS et al. (J. Mol. Histol.(2011)) для обнажения пульпы зубов, и ткани пульпы отделяют пинцетом. Каждую из выделенных тканей пульпы зубов нарезают на мелкие кусочки лезвием бритвы, помещают в 60-мм чашку, накрывают покровным стеклом и затем культивируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла. Известно, что клетки пульпы зубов человека в различных условиях могут дифференцировать в одонтобласты, остеобласты, цементобласты и клетки периодонтальной связки (Tissue Eng., Part A., 2014, Apr; 20 (7-8): 1342-51).
Пример 1-4. Анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР (RT-PCR)) и ПЦР в реальном времени
Полную РНК экстрагируют из клеток пульпы зубов человека (hDPC), а мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (hBMSC) реагентом тризол. Используют для синтеза кДНК 2 мкг полной РНК, 1 мкл обратной транскриптазы и 0,5 мкг олиго (олиго; dT). Синтезированную кДНК используют в полимеразной цепной реакции в реальном времени. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени выполняют на системе обнаружения последовательности ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) и SYBR GREEN PCR Master Mix (Takara, Япония). Полимеразную цепную реакцию в реальном времени выполняют в условиях 94°C, 1 мин; 95°C, 15 с; 60°C, 34 с, в течение 40 циклов. Результаты анализируют методом сравнения пороговых циклов (СТ). И используют праймеры, указанные далее (таблица 17).
[Таблица 17]
<Полные списки праймеров Human для ПЦР в реальном времени >
Ген
Праймер (5'-3')
hDspp
Прямой
CAACCATAGAGAAAGCAAACGCG
Обратный
TTTCTGTTGCCACTGCTGGGAC
hNestin
Прямой
AGCCCTGACCACTCCAGTTTAG
Обратный
CCCTCTATGGCTGTTTCTTTCTCT
hBSP
Прямой
GAATGGCCTGTGCTTTCTCAA
Обратный
TCGGATGAGTCACTACTGCCC
hGAPDH
Прямой
CCATGGAGAAGGCTGGGG
Обратный
CAAAGTTCTCATGGATGACC
Пример 1-5. Трансплантация in vivo и гистоморфологический анализ
6
Клетки пульпы зубов человека (hDPC) извлекают и используют для экспериментов по трансплантации in vivo. Клетки пульпы зубов человека (2×10) смешивают со 100 мг одного керамического порошка гидроксиапатит/трикальцийфосфат (HA/TCP) (Zimmer, США) или и с пептидом по изобретению (10 мкг) с 0,5% фибриновым гелем, соответственно, и затем полученный имплант трансплантируют мышам с ослабленной иммунной системой (NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN), и мышей выращивают в течение 6 и 12 недель.
После этого собирают образцы тканей и фиксируют в 4% параформальдегиде, декальцифицируют в 10% ЭДТК (рН 7,4), заделывают в парафине, окрашивают гематоксилином-эозином (Н-Е) (Vector Labs) или проводят иммуногистохимический анализ. При иммуногистохимическом анализе белки обнаруживают с помощью анти-DSP антител, разбавленных 1:150, как первичного антигена, и козьего антикроличьего IgG (Vector Labs), меченного биотином, как вторичного антигена.
Окрашивание коллагена проводят, используя набор для окрашивания Masson's Trichrome Stain Kit (кат. 25088-100) от Polysciences, co.
Количественный анализ вновь образовавшейся твердой ткани проводят с использованием программы LS starter (OLYMPUS Soft Imaging Solution, Muster, Германия). Долю вновь образовавшейся твердой ткани вычисляют как процент площади вновь образовавшейся твердой ткани в общей площади.
Пример 1-6. Анализ методом сканирующей электронной микроскопии
Образцы тканей фиксируют в буфере 2,5% глутаральдегида/0,1 М какодилат в течение 30 минут и проводят реакцию в растворе, содержащем 1% тетраоксида осмия в 0,1 М какодилатном буфере, в течение 1 часа. Затем образцы тканей быстро обезвоживают и сушат с использованием этанола, и затем на образцы тканей наносят золото и проводят наблюдения с помощью сканирующего электронного микроскопа (S-4700, HITACHI, Токио, Япония).
Пример 1-7. Статистический анализ
Статистический анализ выполняют с использованием t-критерия Стъюдента. Весь статистический анализ выполняют с помощью программы SPSS, версия 19.0.
Пример 2. Экспериментальные результаты
Пример 2-1. Действие пептидов для промотирования регенерации дентина или ткани пульпы зубов и лечения заболеваний дентина или пульпы зубов на уровень экспрессии маркерного гена дифференцировки одонтобластов Dspp
Ген Dspp используют в качестве маркера дифференцировки одонтобластов, и он известен как существенный ген для кальцификации дентина. Поэтому подтверждают, что пептид по настоящему изобретению имеет действие промотирования экспрессии гена Dspp, который является маркерным геном дифференцировки одонтобластов и промотирует образование одонтобластов и дентина.
Клетки пульпы зубов человека (hDPC), культивированные в примере 1-3, обрабатывают пептидами (концентрация 10 мкг/мл) каждой группы, синтезированными в примере 1-1, и культивируют в течение 48 часов. Затем измеряют уровни мРНК маркерного гена дифференцировки одонтобластов Dspp, экспрессированного в клетках пульпы зубов человека, и вычисляют отношение измеренного уровня мРНК Dspp относительно уровня мРНК Dspp, измеренного в контрольной группе, соответственно (таблицы 18-33).
При этом сравнивают среднюю величину уровней мРНК гена Dspp, измеренных соответственно для пептидов каждой группы из таблиц 1-3 для каждой группы (фиг. 1А). Конкретно, новые пептиды по настоящему изобретению, не имеющие замены или неполной последовательности аминокислот нуклеотидных последовательностей, группируют как показано в таблицах 1-3, и новые пептиды каждой группы используют для экспрессии маркерного гена дифференцировки бластных клеток Dspp в клетках пульпы зубов человека. В результате, для показа действия, на фиг. 1А приводится диаграмма, показывающая среднюю величину уровня мРНК Dspp в клетках пульпы зубов человека, измеренного количественной ПЦР в реальном времени, для каждой группы. В этом случае в качестве контроля используют клетки пульпы зубов человека, которые не обрабатываются пептидом по настоящему изобретению.
Кроме того, сравнивают среднюю величину уровней мРНК гена Dspp, измеренных соответственно для пептидов каждой группы из таблиц 4-16 (фиг. 1В). Конкретно, новые пептиды по настоящему изобретению, не имеющие замены или неполной последовательности аминокислот последовательностей оснований, группируют как показано в таблицах 4-16, и новые пептиды каждой группы экспрессируются при экспрессии маркерного гена дифференцировки бластных клеток Dspp в клетках пульпы зубов человека. В результате, для показа действия, на фиг. 1В приводится диаграмма, показывающая среднюю величину уровня мРНК Dspp в клетках пульпы зубов человека, измеренного количественной ПЦР в реальном времени, для каждой группы. В этом случае в качестве контроля используют клетки пульпы зубов человека, которые не обрабатываются пептидом по настоящему изобретению.
Уровень экспрессии гена Dspp измеряют анализом методом ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени, описанным в примере 1-4. В связи с этим ген GAPDH используют в качестве внутреннего контроля. Эксперименты выполняют, повторяя трехкратно, и затем за измеренные величины принимают средние значения и стандартные отклонения. Последовательность оснований праймеров описана выше в таблице 17.
[Таблица 18]
Действие пептидов группы 1 на уровень мРНК гена Dspp
Уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
1
7,371
0,093
2
7,171
0,121
3
6,512
0,209
4
7,071
0,192
5
6,893
0,07
6
6,931
0,119
7
6,881
0,321
8
6,531
0,2025
[Таблица 19]
Действие пептидов группы 2 на уровень мРНК гена Dspp
Уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
9
7,543
0,132
10
6,996
0,352
11
7,385
0,271
12
7,548
0,327
13
6,655
0,377
14
6,839
0,241
15
6,764
0,289
16
7,739
0,357
[Таблица 20]
Действие пептидов группы 3 на уровень мРНК гена Dspp
Уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
17
7,712
0,219
18
7,319
0,192
19
7,931
0,192
20
7,553
0,299
21
7,893
0,132
22
7,412
0,372
23
9,171
0,381
24
8,512
0,411
[Таблица 21]
Действие пептидов группы 4 на уровень мРНК гена Dspp
Уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
25
2,491
0,453
26
2,623
0,273
27
2,213
0,302
28
2,781
0,5
29
2,926
0,292
30
2,011
0,311
31
2,432
0,52
32
2,303
0,299
[Таблица 22]
Действие пептидов группы 5 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
33
3,615
0,53
34
3,727
0,495
35
3,017
0,293
36
3,256
0,444
37
3,303
0,671
38
2,099
0,506
39
3,412
0,279
40
3,109
0,395
[Таблица 23]
Действие пептидов группы 6 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
41
2,937
0,333
42
2,808
0,501
43
2,435
0,432
44
2,517
0,296
45
3,051
0,433
46
2,733
0,198
47
2,439
0,287
48
2,602
0,333
[Таблица 24]
Действие пептидов группы 7 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
49
1,631
0,137
50
1,803
0,208
51
1,569
0,111
52
1,949
0,327
53
1,422
0,09
54
1,638
0,214
55
2
0,396
56
1,909
0,55
[Таблица 25]
Действие пептидов группы 8 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
57
2,415
0,375
58
2,677
0,601
59
2,463
0,222
60
2,089
0,163
61
1,909
0,307
62
2,752
0,482
63
2,373
0,394
64
1,829
0,201
[Таблица 26]
Действие пептидов группы 9 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
65
2,201
0,461
66
2,072
0,366
67
2,452
0,509
68
2,343
0,419
69
1,899
0,382
70
1,947
0,247
71
2,052
0,233
72
1,739
0,188
[Таблица 27]
Действие пептидов группы 10 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
73
2,208
0,366
74
2,105
0,273
75
2,624
0,522
76
2,394
0,432
77
1,939
0,337
78
2,109
0,159
79
2,403
0,601
80
2,636
0,573
[Таблица 28]
Действие пептидов группы 11 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
81
1,757
0,372
82
1,909
0,269
83
2,001
0,227
84
2,101
0,373
85
1,838
0,401
86
1,736
0,317
87
1,888
0,444
88
1,539
0,132
[Таблица 29]
Действие пептидов группы 12 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
89
1,635
0,214
90
1,797
0,323
91
1,913
0,333
92
1,498
0,111
93
1,892
0,274
94
1,487
0,099
95
1,939
0,295
96
2,011
0,199
[Таблица 30]
Действие пептидов группы 13 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
97
1,515
0,107
98
1,479
0,106
99
1,737
0,207
100
1,599
0,166
101
1,674
0,109
102
1,855
0,299
103
1,737
0,107
104
1,878
0,201
[Таблица 31]
Действие пептидов группы 14 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
105
1,664
0,085
106
1,673
0,207
107
1,935
0,372
108
1,495
0,091
109
1,756
0,201
110
1,595
0,099
111
1,918
0,175
112
1,699
0,143
[Таблица 32]
Действие пептидов группы 15 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
113
1,778
0,205
114
1,849
0,337
115
1,707
0,199
116
1,693
0,075
117
1,929
0,193
118
2,015
0,151
119
2,121
0,337
120
1,878
0,116
[Таблица 33]
Действие пептидов группы 16 на уровень мРНК гена Dspp
Уровен мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Среднее
Стандартное отклонение
121
2,024
0,298
122
1,979
0,303
123
1,837
0,111
124
2,017
0,402
125
2,082
0,377
126
1,798
0,163
127
1,888
0,099
128
1,765
0,375
Фиг. 1А представляет собой диаграмму, показывающую результаты сравнения уровней экспрессии дентинсиалофосфопротеина (Dspp) - маркерного гена дифференцировки одонтобластов, в клетках пульпы зубов человека (hDPC), обработанных новым пептидом по настоящему изобретению. Обратившись к фиг. 1А и таблице 18 - таблице 20, при сравнении уровней мРНК маркерного гена дифференцировки одонтобластов Dspp, измеренных в клетках пульпы зубов человека (контроль), необработанных пептидом по настоящему изобретению, можно видеть, что когда клетки обрабатывают пептидом по настоящему изобретению, все уровни мРНК гена Dspp возрастают примерно в 6-8 раз. В частности, при обработке пептидами группы 3 величина уровня экспрессии мРНК Dspp наибольшая. Фиг. 1В представляет собой другую диаграмму, показывающую результат сравнения уровней экспрессии маркерного гена дифференцировки одонтобластов Dspp в клетках пульпы зубов человека (hDPC), обработанных новым пептидом по настоящему изобретению. Обратившись к фиг. 1В и таблице 21 - таблице 33, при сравнении уровней мРНК маркерного гена дифференцировки одонтобластов Dspp, измеренных в клетках пульпы зубов человека (контроль) без обработки пептидом по настоящему изобретению, можно видеть, что когда клетки обрабатывают пептидом по настоящему изобретению, все уровни мРНК гена Dspp возрастают примерно в 1,5-3 раза.
Пример 2-2. Действие пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей пульпы зубов и лечения заболеваний пульпы зубов на уровни экспрессии маркерного гена дифференцировки одонтобластов Nestin
Результаты примера 2-1 показывают, что пептиды по настоящему изобретению могут повышать уровень мРНК Dspp, например, все группы пептидов могут повышать уровень мРНК гена Dspp больше, чем в 1,5 раза и даже больше, чем в 3 раза, и в частности, пептиды группы 1 и группы 3 могут повышать уровень мРНК Dspp по меньшей мере в 6 раз или больше.
Соответственно, проверяют, могут ли пептиды группы 1 и группы 3 повышать уровни мРНК других маркерных генов дифференцировки одонтобластов Nestin.
Коротко, эксперименты выполняют тем же и подобным способом, как в примере 2-1, за исключением того, что используют указанные далее праймеры. Измеряют действие пептидов по настоящему изобретению на уровни экспрессии генов Nestin, и вычисленные средние величины сравнивают между группами (фиг. 1С). В связи с этим, в качестве контрольной группы используют клетки пульпы зубов человека, которые не обрабатывают ни одним из пептидов по настоящему изобретению.
Фиг. 1С представляет собой диаграмму, показывающую результаты сравнения уровней экспрессии Nestin - маркерных генов дифференцировки одонтобластов, в клетках пульпы зубов человека (hDPC), обработанных пептидом по настоящему изобретению. Как видно на фиг. 1С, при сравнении группы, обработанной пептидом по настоящему изобретению (группа 1, 2, 3), с контрольной группой, можно видеть, что уровень экспрессии гена Nestin, который является маркером дифференцировки одонтобластов, повышается в 5 раз или больше.
Указанные выше гены Dspp и Nestin известны как гены, вовлеченные в дифференцировку одонтобластов и минерализацию дентина, что означает, что пептиды по настоящему изобретению могут показывать действие промотирования регенерации дентина.
Пример 2-3. Действие пептида для промотирования регенерации остеобластов и/или цементобластов и лечения периодонтальных заболеваний на уровни эксперссии гена BSP - маркерного гена дифференцировки остеобластов и цементобластов
Ген BSP используется как маркер дифференцировки остеобластов и цементобластов и известен как существенный ген для кальцификации костной ткани и цемента. Поэтому для того, чтобы подтвердить действие нового пептида по настоящему изобретению на экспрессию гена BSP - маркерного гена дифференцировки костных стволовых клеток и клеток цемента, взятые у человека мезенхимальные стволовые клетки культивируют, следуя способу, описанному выше в примере 1-2 (после обработки каждой группой пептидов в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга человека (hBMSC)), и подтверждают экспрессию гена BSP ПЦР в реальном времени.
Коротко, за исключением использования другого праймера, выполняют те же процедуры, что в примере 2-1 и измеряют действие пептида по настоящему изобретению на уровень экспрессии гена BSP, и измерения проводят для каждой группы. Сравнивают средние уровни (фиг. 2А, фиг. 2В). Конкретно, каждая группа новых пептидов по настоящему изобретению, сгруппированных так, как показано в таблицах 1-3, экспрессирует маркерный ген дифференцировки костной ткани и цемента BSP (костный сиалопротеин) в мезенхимальных стволовых клетках человека (hBMSC). Как результат, на фиг. 2А для демонстрации действия, показан результат измерения уровня мРНК BSP в мезенхимальных стволовых клетках человека количественной ПЦР в реальном времени. Кроме того, для новых пептидов по настоящему изобретению, сгруппированных так, как показано в таблицах 4-16, как результат, на фиг. 2В для демонстрации действия каждой группы новых пептидов на экспрессию маркерного гена дифференцировки костной ткани и цемента BSP показан результат измерения уровня мРНК BSP в мезенхимальных стволовых клетках человека количественной ПЦР в реальном времени.
На этот раз происходит обработка пептидом в концентрации 10 мкг/мл. К тому же в качестве контроля используют мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека, необработанные пептидом по настоящему изобретению.
Фиг. 2А представляет собой диаграмму, показывающую результаты сравнения уровня экспрессии маркерного гена дифференцировки клеток костной ткани и цемента BSP в мезенхимальных стволовых клетках человека (hBMSC), обработанных пептидом по настоящему изобретению. Как видно из фиг. 2А, в группе, обработанной пептидом по настоящему изобретению (группы 1, 2, 3), экспрессия гена BSP возрастает примерно в 9-13 раз или больше по сравнению с контролем. В частности, обработка пептидом группы 3 показывает наибольшую величину экспрессии мРНК BSP.
Фиг. 2В представляет собой диаграмму, показывающую результаты сравнения уровня экспрессии маркерного гена дифференцировки клеток костной ткани и цемента BSP в мезенхимальных стволовых клетках человека (hBMSC), обработанных пептидом по настоящему изобретению. Как видно из фиг. 2В, можно обнаружить, что в группе, обработанной пептидом по настоящему изобретению (группа 4 - группа 16), экспрессия гена BSP возрастает примерно в 3-9 раз или больше по сравнению с контролем. В частности, обработка пептидом группы 11 показывает наибольшую величину экспрессии мРНК BSP.
Так как ген BSP используется как маркер дифференцировки остеобластов и цементобластов и известен как ген, вовлеченный в процесс кальцификации костной ткани и цемента, проводят анализ, что пептид по настоящему изобретению может оказывать действие промотирования регенерации клеток костной ткани и цемента.
Пример 2-4. Образование твердой ткани из клеток пульпы зубов человека (hDPC) новыми пептидами in vivo за 6 недель
(1) Гистоморфологический анализ
Фиг. 1А, фиг. 1В, фиг. 1С, фиг. 2А и фиг. 2В имеют основой результаты экспериментов in vitro, для того, чтобы измерить действие пептида по настоящему изобретению на образование твердой ткани in vivo, проводят процедуры как в примере 1-5, описанном выше. Как описано, клетки пульпы зубов человека (hDPC) и 100 мг гидроксиапатита/трикальцийфосфата (НА/ТСР) смешивают с 0,5 мкг фибринового геля, соответственно, с 10 мкг петидов из группы 3 (например, SEQ ID NO: 24), и получают имплант. Имплант трансплантируют в подкожную ткань мыши с ослабленной иммунной системой. На этот раз в качестве контроля используют трансплантированный имплант, не содержащий пептид по настоящему изобретению. Через 6 недель после трансплантации, как описано выше в примере 1-5, берут образец, и затем вновь образованную твердую ткань анализируют количественно с использованием программы LS starter, и показывают результаты на фиг. 3.
Фиг. 3 показывает результаты измерения количества твердой ткани, образовавшейся вновь за 6 недель in vivo с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC). Как видно на фиг. 3, отношение твердой ткани, образовавшейся через 6 недель после трансплантации, возрастает примерно в 2 раза или больше в группе, обработанной новым пептидом (группа 3, 29,6%), по сравнению с контролем (контроль 13,5%).
Фиг. 4 представляет собой микроскопические изображения, показывающие гистоморфологический анализ твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC) in vivo в течение 6 недель, А-D показывают результаты трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой контрольного импланта, полученного смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель, и Е-Н показывают результаты за 6 недель трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, соответственно, вместе с 10 мкг пептида группы 3 (масштаб А, Е - 500 мкм; В, F - 200 мкм; C, G - 100 мкм; D, H - 50 мкм).
Как видно на фиг. 4, как результат гистоморфологического анализа с окрашиванием гематоксилином-эозином, в контрольной группе (фиг. 4А - фиг. 4D), не содержащей пептид по настоящему изобретению, и группе, содержащей пептид по настоящему изобретению (фиг. 4Е - фиг. 4Н), наблюдают, что костноподобная ткань и ткань, подобная дентину-пульпе зубов, образуются в субстрате кальцифицированной ткани вокруг частиц НА/ТСР.
(2) Анализ с окрашиванием коллагена
Коллаген является наиболее распространенным органическим матриксом в дентине, кости и цементе и служит для аккомодации осажденных минералов. Соответственно, выполняют окрашивание коллагена для гистоморфологического анализа для подтверждения накопления белка коллагена в кальцифицированной ткани, образовавшейся в каждой экспериментальной группе.
Фиг. 5 показывает микроскопические изображения, показывающие уровень образования в твердой ткани коллагена in vivo в течение 6 недель с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC), A-D показывают результаты трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой контрольного импланта, полученного смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель, и Е-Н показывают результаты за 6 недель трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, соответственно, вместе с 10 мкг пептида группы 3 (масштаб А, Е - 500 мкм; В, F - 200 мкм; C, G - 100 мкм; D, H - 50 мкм). Образовавшуюся твердую ткань окрашивают по методу окрашивания коллагена (окрашивание трихромом по Массону).
Как видно на фиг. 5, сравнение с контрольной группой (фиг. 5А-5D) группы, содержащей пептид по настоящему изобретению (фиг. 5Е-5Н), подтверждает, что уровень образования коллагена повышается.
(3) Иммуногистохимический анализ
Экспрессию специфического маркерного гена дифференцировки одонтобластов DSP подтверждают иммуногистохимическим анализом.
Фиг. 6 представляет собой картину иммуноокрашивания, показывающую результаты анализа уровня экспрессии маркерного гена дифференцировки бластных клеток DSP в твердой ткани, образовавшейся в течение 6 недель in vivo с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC), с использованием метода иммуноокрашивания, A-D показывают результаты трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой контрольного импланта, полученного смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 6 недель, и Е-Н показывают результаты за 6 недель трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, соответственно, вместе с 10 мкг пептида группы 3. А и В иммуноокрашены с использованием анти-DSP антитела. С представляет собой отрицательный контроль в иммуногистохимическом анализе при обработке только вторичными антителами. Стрелки на А и В показывают экспрессию DSP во вновь образовавшейся кальцифицированной ткани. Масштаб 50 мкм.
Как видно из фиг. 6, в контрольной группе (фиг. 6А) во вновь образовавшейся ткани, подобной дентину-пульпе зубов, DSP слабо экспрессируется, но в группе, содержащей пептид по настоящему изобретению кальцифицированная ткань, в которой DSP образовался заново (фиг. 6В), экспрессируется значительно. Фиг. 6С показывает, что по иммуногистохимическому анализу обработанная вторичными антителами группа отрицательного контроля не окрашивается в связи с DSP.
Пример 2-5. Образование клеток пульпы зубов человека (hDPC) твердой ткани с помощью новых пептидов in vivo за 12 недель
За исключением выращивания имплантированных мышей в течение 12 недель, выполняют способ примера 2-4 для анализа образования твердой ткани в клетках пульпы зубов человека.
Фиг. 7 показывает результаты измерения количества вновь образовавшейся in vivo в течение 12 недель твердой ткани с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC). Как видно из фиг. 7, отношение твердой ткани через 12 недель после трансплантации возрастает примерно в 2 раза или больше в группе, обработанной новым пептидом (группа 3, 39,5%), по сравнению с контролем (контроль, 23,7%).
Фиг. 8 представляет собой микроскопические изображения, показывающие картину гистоморфологического анализа твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC) in vivo за 12 недель, A-D показывают результаты трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой контрольного импланта, полученного смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 12 недель, и Е-Н показывают результаты за 12 недель трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, соответственно, вместе с 10 мкг пептида группы 3 (масштаб А, Е - 500 мкм; В, F - 200 мкм; C, G - 100 мкм; D, H - 50 мкм).
Как видно из фиг. 8, в результате гистоморфологического анализа через окрашивание гематоксилином-эозином, подобно случаю на фигуре 4 (6 недель после трансплантации) в контрольной группе (фиг. 8А - фиг. 8D), не содержащей пептид по настоящему изобретению, и группе, содержащей пептид по настоящему изобретению (фиг. 8Е - фиг. 8Н), наблюдают, что в субстрате кальцифицированной ткани вокруг частиц НА/ТСР образовалась костноподобная ткань и ткань, подобная дентину-пульпе зубов.
(2) Анализ с окрашиванием коллагена
Окрашивание коллагена выполняют для подтверждения гистоморфологическим анализом накопления белка коллагена в кальцифицированной ткани, образовавшейся в каждой экспериментальной группе в примере 2-5.
Фиг. 9 показывает микроскопические изображения, показывающие уровень образования в твердой ткани коллагена in vivo в течение 12 недель с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC), A-D показывают результаты трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой контрольного импланта, полученного смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 12 недель, и Е-Н показывают результаты за 12 недель трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, соответственно, вместе с 10 мкг пептида группы 3 (масштаб А, Е - 500 мкм; В, F - 200 мкм; C, G - 100 мкм; D, H - 50 мкм). Образовавшуюся твердую ткань окрашивают по методу окрашивания коллагена (окрашивание трихромом по Массону).
Как видно на фиг. 9, при сравнении с контрольной группой (фиг. 9А-9D) подтверждается, что уровень образования коллагена в группе, содержащей пептид по настоящему изобретению (фиг. 9Е-9Н), возрастает.
(3) Иммуногистохимический анализ
Экспрессию специфического маркерного гена дифференцировки одонтобластов DSP подтверждают иммуногистохимическим анализом.
Фиг. 10 представляет собой картину иммуноокрашивания, показывающую анализ с использованием метода иммуноокрашивания уровня экспрессии маркерного гена дифференцировки бластных клеток DSP в твердой ткани, образовавшейся в течение 12 недель in vivo с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC), A-D показывают результаты трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой контрольного импланта, полученного смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, за 12 недель, и Е-Н показывают результаты за 12 недель трансплантации мыши с ослабленной иммунной системой hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, соответственно, вместе с 10 мкг пептида группы 3. А и В иммуноокрашены с использованием анти-DSP антитела. С представляет собой отрицательный контроль в иммуногистохимическом анализе при обработке только вторичными антителами. Стрелки на А и В показывают экспрессию DSP во вновь образовавшейся кальцифицированной ткани. Масштаб 50 мкм.
Как видно из фиг. 10, в контрольной группе (фиг. 10А) во вновь образовавшейся ткани, подобной дентину-пульпе зубов, DSP слабо экспрессируется, но в группе, содержащей пептид по настоящему изобретению, кальцифицировнная ткань, в которой DSP образовался заново (фиг. 6В), экспрессируется значительно. Фиг. 10С показывает, что по иммуногистохимическому анализу обработанная вторичными антителами группа отрицательного контроля не окрашивается в связи с DSP.
При суммировании результатов примеров 2-4 и 2-5 обнаружено, что новый пептид по настоящему изобретению показывает действие, способное промотировать регенерацию комплексов тканей дентин/пульпа зубов и костноподобных/цементоподобных тканей.
Пример 2-6. Анализ клеток трансплантированной ткани с использованием сканирующего электронного микроскопа
Выполняют анализ методом примера 1-6 с помощью сканирующего электронного микроскопа для того, чтобы подтвердить дифференцировку клеток пульпы зубов человека (hDPC) в одонотобласты или остеобласты/цементобласты в контрольной группе и экспериментальной группе, обработанной новым пептидом, в течение 12 недель после трансплантации.
Через 12 недель выполняют анализ методом примера 1-6 с помощью сканирующего электронного микроскопа для того, чтобы подтвердить различие в дифференцировке клеток пульпы зубов человека (hDPC) в одонотобласты или остеобласты/цементобласты между экспериментальной группой, обработанной новым пептидом, и контрольной группой.
Фиг. 11 представляет собой изображение, показывающее анализ с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) твердой ткани, образовавшейся с использованием клеток пульпы зубов человека (hDPC) in vivo в течение 12 недель, на котором А соответствует контрольному импланту, полученному смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР в 0,5% фибриновом геле, В и С соответствуют импланту, полученному смешиванием hDPC и 100 мг НА/ТСР с 10 мкг пептидов группы 3, соответственно, в 0,5% фибриновом геле. Показан результат имплантации импланта мыши с ослабленной иммунной системой за 12 недель. Масштаб 10 мкм. Образовавшуюся твердую ткань наблюдают по клеткам с использованием сканирующего электронного микроскопа.
В контрольной группе, обработанной только hDPC, некоторые одонтобластоподобные клетки образовались за счет одонтобластических процессов вокруг образовавшейся твердой ткани (фиг. 11А). В группе, обработанной пептидом по настоящему изобретению (например, пептидом группы 3), наблюдают одонтобластоподобные клетки вместе с образовавшейся твердой тканью, и одонтобластические процессы распространились также на образовавшуюся твердую ткань (фиг. 11В). Кроме того, в группе, обработанной пептидом по настоящему изобретению, подтверждается, что проявляются свойства типичных остеобластов/цементобластов кубической формы, связанных с поверхностью образовавшейся твердой ткани (фиг. 11С).
Следовательно, обнаружено, что пептид по настоящему изобретению может эффективно образовывать одонтобласты и остеобласты/цементобласты.
Пример 2-7. Тест обтурации дентинных канальцев
Используют стоматологический бор для того, чтобы в премоляре 12-месячной собаки удалить эмаль в области шейки зуба и обнажить дентин. Премоляр с обнаженным дентином хорошо промывают до полного удаления фрагментов эмали-дентина, образовавшихся во время формирования воронки, с последующим удалением влаги.
На вход дентинного канальца на участке обнаженного дентина наносят 1,5 мкг пептида (SEQ ID NO: 24) (группа 3) по настоящему изобретению, и через 3 недели взрослую собаку усыпляют для извлечения зуба. Затем получают образец извлеченного зуба, используя алмазную пилу.
При этом, для того, чтобы подтвердить действие обтурации нового пептида по настоящему изобретению на обнаженный дентинный каналец, способность закрывать дентинный каналец оценивают с помощью сканирующего электронного микроскопа, и результаты приводятся на фиг. 12.
Конкретно, как видно на фиг. 12А и фиг. 12Е, после отрезания нижней части участка поврежденного дентина наблюдают за нижней поверхностью (выделенная часть) среза. В результате сканирования с помощью сканирующего электронного микроскопа подтверждается, что контрольная группа без какой-либо обработки показывает дентальные канальцы нижней части поврежденного дентина (фиг. 12А-фиг. 12D). С другой стороны, в экспериментальной группе, обработанной пептидом, можно видеть, что обнаженные дентинные канальцы закрыты путем физиологической реминерализации (фиг. 12Е-фиг. 12Н).
Пример 2-8. Исследование поврежденного участка поверхности дентина in vivo
Получают образцы зубов взрослых собак таким же способом, как в примере 2-7.
При этом, для того, чтобы подтвердить действие обтурации нового пептида по настоящему изобретению на обнаженный дентинный каналец, способность закрывать дентинные канальцы на поверхности участка оценивают с помощью сканирующего электронного микроскопа, и результаты приводятся на фиг. 13.
В результате исследования с помощью сканирующего электронного микроскопа подтверждается, что дентальные канальцы на поверхности поврежденного дентина в контрольной группе без какой-либо обработки обнажены (фиг. 13А-фиг. 13D). С другой стороны, в экспериментальной группе, обработанной пептидом, можно видеть, что обнаженные дентинные канальцы закрыты (фиг. 13Е-фиг. 13Н).
Это исследование поддержано Корейским институтом оценки промышленных технологий (KEIT) и финансировано министерством торговли, промышленности и энергетики в 2017 (10078369, «Development of desensitizer using functional peptide inducing dentin regeneration»).
Хотя одно или несколько воплощений настоящего изобретения описаны со ссылкой на фигуры, специалистам в данной области техники будет понятно, что в них можно осуществить различные изменения в форме и деталях без отхода от сущности и объема настоящего изобретения.
--->
<110>  HysensBio
<120>  Новый пептид
<130>  LP171007KRPRI
<160>  128
<170>  KoPatentIn 3.0
<210>  1
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  1
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys
1        5
<210>  2
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  2
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg
1        5
<210>  3
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  3
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys
1        5
<210>  4
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  4
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg
1        5
<210>  5
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  5
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys
1        5
<210>  6
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  6
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys
1        5
<210>  7
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  7
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg
1        5
<210>  8
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  8
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg
1        5
<210>  9
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  9
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys
1        5
<210>  10
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  10
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg
1        5
<210>  11
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  11
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys
1        5
<210>  12
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  12
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg
1        5
<210>  13
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  13
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys
1        5
<210>  14
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  14
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys
1        5
<210>  15
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  15
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg
1        5
<210>  16
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  16
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg
1        5
<210>  17
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  17
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys
1        5
<210>  18
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  НОвый пептид
<400>  18
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg
1        5
<210>  19
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  19
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys
1        5
<210>  20
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  20
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg
1        5
<210>  21
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  21
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys
1        5
<210>  22
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  22
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys
1        5
<210>  23
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  23
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg
1        5
<210>  24
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  24
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg
1        5
<210>  25
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  25
Lys Tyr Gln Gln Arg Lys Lys
1        5
<210>  26
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  26
Lys Tyr Gln Gln Arg Lys Arg
1        5
<210>  27
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  27
Lys Tyr Gln Gln Arg Arg Lys
1        5
<210>  28
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  28
Lys Tyr Gln Gln Arg Arg Arg
1        5
<210>  29
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  29
Lys Tyr Gln Gln Lys Lys Lys
1        5
<210>  30
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  30
Lys Tyr Gln Gln Lys Arg Lys
1        5
<210>  31
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  31
Lys Tyr Gln Gln Lys Lys Arg
1        5
<210>  32
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  32
Lys Tyr Gln Gln Lys Arg Arg
1        5
<210>  33
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  33
Lys Tyr Arg Arg Arg Lys Lys
1        5
<210>  34
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  34
Lys Tyr Arg Arg Arg Lys Arg
1        5
<210>  35
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  35
Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Lys
1        5
<210>  36
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  36
Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Arg
1        5
<210>  37
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  37
Lys Tyr Arg Arg Lys Lys Lys
1        5
<210>  38
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  38
Lys Tyr Arg Arg Lys Arg Lys
1        5
<210>  39
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  39
Lys Tyr Arg Arg Lys Lys Arg
1        5
<210>  40
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  40
Lys Tyr Arg Arg Lys Arg Arg
1        5
<210>  41
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  41
Lys Tyr Lys Arg Arg Lys Lys
1        5
<210>  42
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  42
Lys Tyr Lys Arg Arg Lys Arg
1        5
<210>  43
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  43
Lys Tyr Lys Arg Arg Arg Lys
1        5
<210>  44
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  44
Lys Tyr Lys Arg Arg Arg Arg
1        5
<210>  45
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  45
Lys Tyr Lys Arg Lys Lys Lys
1        5
<210>  46
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  46
Lys Tyr Lys Arg Lys Arg Lys
1        5
<210>  47
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  47
Lys Tyr Lys Arg Lys Lys Arg
1        5
<210>  48
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  48
Lys Tyr Lys Arg Lys Arg Arg
1        5
<210>  49
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  49
Lys Tyr Gln Lys Arg Lys Lys
1        5
<210>  50
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  50
Lys Tyr Gln Lys Arg Lys Arg
1        5
<210>  51
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  51
Lys Tyr Gln Lys Arg Arg Lys
1        5
<210>  52
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  52
Lys Tyr Gln Lys Arg Arg Arg
1        5
<210>  53
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  53
Lys Tyr Gln Lys Lys Lys Lys
1        5
<210>  54
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  54
Lys Tyr Gln Lys Lys Arg Lys
1        5
<210>  55
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  55
Lys Tyr Gln Lys Lys Lys Arg
1        5
<210>  56
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  56
Lys Tyr Gln Lys Lys Arg Arg
1        5
<210>  57
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  57
Lys Tyr Asn Lys Arg Lys Lys
1        5
<210>  58
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  58
Lys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg
1        5
<210>  59
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  59
Lys Tyr Asn Lys Arg Arg Lys
1        5
<210>  60
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  60
Lys Tyr Asn Lys Arg Arg Arg
1        5
<210>  61
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  61
Lys Tyr Asn Lys Lys Lys Lys
1        5
<210>  62
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  62
Lys Tyr Asn Lys Lys Arg Lys
1        5
<210>  63
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  63
Lys Tyr Asn Lys Lys Lys Arg
1        5
<210>  64
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  64
Lys Tyr Asn Lys Lys Arg Arg
1        5
<210>  65
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  65
Lys Tyr Asn Arg Arg Lys Lys
1        5
<210>  66
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  66
Lys Tyr Asn Arg Arg Lys Arg
1        5
<210>  67
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  67
Lys Tyr Asn Arg Arg Arg Lys
1        5
<210>  68
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  68
Lys Tyr Asn Arg Arg Arg Arg
1        5
<210>  69
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  69
Lys Tyr Asn Arg Lys Lys Lys
1        5
<210>  70
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  70
Lys Tyr Asn Arg Lys Arg Lys
1        5
<210>  71
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  71
Lys Tyr Asn Arg Lys Lys Arg
1        5
<210>  72
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  72
Lys Tyr Asn Arg Lys Arg Arg
1        5
<210>  73
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  73
Lys Tyr Arg Asn Arg Lys Lys
1        5
<210>  74
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  74
Lys Tyr Arg Asn Arg Lys Arg
1        5
<210>  75
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  75
Lys Tyr Arg Asn Arg Arg Lys
1        5
<210>  76
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  76
Lys Tyr Arg Asn Arg Arg Arg
1        5
<210>  77
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  77
Lys Tyr Arg Asn Lys Lys Lys
1        5
<210>  78
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  78
Lys Tyr Arg Asn Lys Arg Lys
1        5
<210>  79
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  79
Lys Tyr Arg Asn Lys Lys Arg
1        5
<210>  80
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  80
Lys Tyr Arg Asn Lys Arg Arg
1        5
<210>  81
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  81
Lys Tyr Lys Asn Arg Lys Lys
1        5
<210>  82
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  82
Lys Tyr Lys Asn Arg Lys Arg
1        5
<210>  83
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  83
Lys Tyr Lys Asn Arg Arg Lys
1        5
<210>  84
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  84
Lys Tyr Lys Asn Arg Arg Arg
1        5
<210>  85
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  85
Lys Tyr Lys Asn Lys Lys Lys
1        5
<210>  86
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  86
Lys Tyr Lys Asn Lys Arg Lys
1        5
<210>  87
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  87
Lys Tyr Lys Asn Lys Lys Arg
1        5
<210>  88
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  88
Lys Tyr Lys Asn Lys Arg Arg
1        5
<210>  89
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  89
Lys Tyr Gln Asn Arg Lys Lys
1        5
<210>  90
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  90
Lys Tyr Gln Asn Arg Lys Arg
1        5
<210>  91
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  91
Lys Tyr Gln Asn Arg Arg Lys
1        5
<210>  92
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  92
Lys Tyr Gln Asn Arg Arg Arg
1        5
<210>  93
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  93
Lys Tyr Gln Asn Lys Lys Lys
1        5
<210>  94
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  94
Lys Tyr Gln Asn Lys Arg Lys
1        5
<210>  95
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  95
Lys Tyr Gln Asn Lys Lys Arg
1        5
<210>  96
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  96
Lys Tyr Gln Asn Lys Arg Arg
1        5
<210>  97
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  97
Lys Tyr Asn Gln Arg Lys Lys
1        5
<210>  98
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  98
Lys Tyr Asn Gln Arg Lys Arg
1        5
<210>  99
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  99
Lys Tyr Asn Gln Arg Arg Lys
1        5
<210>  100
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  100
Lys Tyr Asn Gln Arg Arg Arg
1        5
<210>  101
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  101
Lys Tyr Asn Gln Lys Lys Lys
1        5
<210>  102
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  102
Lys Tyr Asn Gln Lys Arg Lys
1        5
<210>  103
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  103
Lys Tyr Asn Gln Lys Lys Arg
1        5
<210>  104
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  104
Lys Tyr Asn Gln Lys Arg Arg
1        5
<210>  105
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  105
Lys Tyr Asn Asn Arg Lys Lys
1        5
<210>  106
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  106
Lys Tyr Asn Asn Arg Lys Arg
1        5
<210>  107
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  107
Lys Tyr Asn Asn Arg Arg Lys
1        5
<210>  108
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  108
Lys Tyr Asn Asn Arg Arg Arg
1        5
<210>  109
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  109
Lys Tyr Asn Asn Lys Lys Lys
1        5
<210>  110
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  110
Lys Tyr Asn Asn Lys Arg Lys
1        5
<210>  111
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  111
Lys Tyr Asn Asn Lys Lys Arg
1        5
<210>  112
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  112
Lys Tyr Asn Asn Lys Arg Arg
1        5
<210>  113
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  113
Lys Tyr Arg Lys Arg Lys Lys
1        5
<210>  114
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  114
Lys Tyr Arg Lys Arg Lys Arg
1        5
<210>  115
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  115
Lys Tyr Arg Lys Arg Arg Lys
1        5
<210>  116
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  116
Lys Tyr Arg Lys Arg Arg Arg
1        5
<210>  117
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  117
Lys Tyr Arg Lys Lys Lys Lys
1        5
<210>  118
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  118
Lys Tyr Arg Lys Lys Arg Lys
1        5
<210>  119
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  119
Lys Tyr Arg Asn Lys Lys Arg
1        5
<210>  120
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  120
Lys Tyr Arg Asn Lys Arg Arg
1        5
<210>  121
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  121
Lys Tyr Lys Lys Arg Lys Lys
1        5
<210>  122
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  122
Lys Tyr Lys Lys Arg Lys Arg
1        5
<210>  123
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  123
Lys Tyr Lys Lys Arg Arg Lys
1        5
<210>  124
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  124
Lys Tyr Lys Lys Arg Arg Arg
1        5
<210>  125
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  125
Lys Tyr Lys Lys Lys Lys Lys
1        5
<210>  126
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  126
Lys Tyr Lys Lys Lys Arg Lys
1        5
<210>  127
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  127
Lys Tyr Lys Lys Lys Lys Arg
1        5
<210>  128
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Новый пептид
<400>  128
Lys Tyr Lys Lys Lys Arg Arg
1        5
<---