Набор учебных штаммов для освоения лабораторной диагностики чумы

НЕПРЕРЫВНОЕ МЕДИЦИНСКОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Набор учебных штаммов для освоения лабораторной диагностики чумы

Сазанова Е.В., ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный

Малюк0ва Т. А., институт "Микроб"», Саратов

Бойко А.В., Вахрушина Н.И., Попов Ю.А.

Государственная политика в области обеспечения биологической безопасности России предусматривает исключение или уменьшение использования в технологических процессах патогенных микроорганизмов. Актуально проведение научных исследований по снижению биологических рисков обучающих технологий путем замены вирулентных штаммов микроорганизмов на авирулентные.

Цель исследования - создание набора учебных штаммов патогенных для человека иерсиний и пасте-релл для совершенствования методического обеспечения и снижения биологических рисков при подготовке специалистов по лабораторной диагностике чумы.

Материал и методы. Исследования штаммов родов Yersinia и Pasteurella проводили с помощью бактериологического, иммунологических (ИФА, МФА), молекулярно-генетических (ПЦР, плазмидный скрининг), биологического методов.

Результаты. Сформирован набор, включающий штаммы Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, P. multocida (III-IV групп патогенности) и штаммы Y. pestis, авирулентные и со сниженной вирулентностью (I группы патогенности).

Заключение. Набор учебных штаммов предлагается для использования при подготовке специалистов в области лабораторной диагностики чумы. Применение учебных штаммов позволяет снизить вероятность лабораторного инфицирования обучающихся, освоить в полном объеме регламентированные методы диагностики чумы, приобрести навыки безопасной работы с патогенными биологическими агентами I группы.

Ключевые слова:

У. ргзИз, учебные штаммы, подготовка специалистов, биологическая безопасность, лабораторная диагностика чумы

Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2017. № 5. С. 22-27.

Статья поступила в редакцию: 06.02.2017. Принята в печать: 30.06.2017.

A kit of practice strains for mastering laboratory diagnostics of plague

Sazanova E.V., Malyukova T.A., Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov

Boyko A.V., Vakhrushina N.I., Popov Yu.A.

State policy in the sphere of biological safety provision requires exclusion or cutting the usage of pathogenic microorganisms in technological processes. Thuswise, it is of relevance to conduct scientific research on biological risk mitigation for educational systems through substitution of virulent strains for avirulent ones.

Aim of the study is to design the kit of practice strains, pathogenic for humans Yersinia and Pasteurella, to develop methodological provision and lower the biological risks in the process of specialist training in laboratory diagnostics of plague.

Material and methods. Studies of strains belonging to Yersinia and Pasteurella genus were performed using bacteriological, immunological (EIA, fluorescent antibody technique), molecular-genetic (PCR, plasmid screening), and biological assays.

Results. The kit, comprising the strains Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, P. multocida (III-IV groups of pathogenicity) and strains Y. pestis, avirulent and with attenuated virulence (I group of pathogenicity) has been produced.

Conclusion. The set of practice strains is recommended for usage in specialist training course in laboratory diagnostics of plague. Application of the dummy strains allows for minimizing the possibility of laboratory infection of trainees, exercising specified methods of plague investigation to the fullest extent, and acquiring the skills of safe working with PBA of the first group of hazard.

Keywords:

Y. pestis, practice strains, specialist training, biological safety, laboratory diagnostics of plague

Infectious Diseases: News, Opinions, Training. 2017; (5): 22-7.

Received: 06.02.2017. Accepted: 30.06.2017.

Согласно концепции «Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности РФ на период до 2025 года и дальнейшую перспективу» [1] необходимо исключить или минимизировать использование в технологических процессах патогенных микроорганизмов. Данный государственный подход необходимо учитывать при совершенствовании обучения персонала для работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) 1-11 групп. В связи с этим актуальным является проведение научных исследований по снижению биологических рисков обучающих технологий путем замены вирулентных штаммов микроорганизмов на учебные штаммы.

В настоящее время при проведении практических занятий на курсах профессиональной переподготовки и повышения квалификации врачей, биологов и лаборантов, проводимых на базе отдела образовательных программ и подготовки специалистов ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»), использование вакцинного штамма возбудителя чумы обеспечивает биологическую безопасность, но дает возможность изучить только часть биологических свойств, характерных для основного подвида биовара оrientalis, и не позволяет освоить в полном объеме биологический метод лабораторной диагностики чумы. Применение вирулентных штаммов обеспечивает реализацию учебного плана, но повышает уровень биориска - вероятность инфицирования обучающихся в связи тем, что они зачастую обладают неустойчивыми навыками выполнения микробиологических манипуляций в соответствии с правилами биологической безопасности. Снижения риска инфицирования можно добиться путем использования в процессе обучения для самостоятельной работы слушателей курсов штаммов Y. pestis со сниженной вирулентностью и авирулентных, т.е. LD50 которых для белых мышей не превышает 1х105 микробных клеток (м.к.) [2].

Проведенный информационный поиск показал отсутствие сведений о штаммах, регламентированных для использования в учебном процессе с целью обучения лабораторной диагностике чумы. Известны различные штаммы

Y. pestis: предназначенные для изучения отдельных генетических особенности возбудителя чумы [3-9], штаммы, резистентные к чумному бактериофагу Л-413 «С» [10, 11], а также тест-штамм Y. pestis, обладающий типичными свойствами культур, выделенных в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы [12]. Вместе с тем использование этих штаммов в учебном процессе имеет ограниченное назначение и не позволяет ознакомиться со всем комплексом типичных и атипичных биологических свойств возбудителя чумы, а также освоить комплекс методов лабораторной диагностики чумы [13].

Цель исследования - создание набора учебных штаммов патогенных для человека иерсиний и пастерелл для совершенствования методического обеспечения учебного процесса и снижения биологических рисков при подготовке специалистов по лабораторной диагностике чумы.

Материал и методы

В работе использованы следующие штаммы: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Pasteurella multocida, отобранные из Государственной коллекции патогенных бактерий (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») на основании паспортных данных с учетом ранее разработанных критериев [14].

Штаммы Y. pestis выращивали на агаре и бульоне Хот-тингера (рН 7,2) при температуре 28±1 °С в течение 48 ч. Штаммы Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica культивировали на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 22±1 °С в течение 48 ч, в бульоне Хоттингера (рН 7,2) при 8±1 °С в течение 24 ч. Штамм P. multocida выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) с добавлением 1% гемолизированной крови при температуре 37±1 °С в течение 24 ч.

Культурально-морфологические, биохимические свойства, чувствительность к бактериофагам изучали с помощью стандартных методов, регламентированных при лабораторной диагностике чумы [2].

Обнаружение видоспецифического антигена фракции 1 (F1) проводили с помощью методов флуоресцирующих антител (МФА), иммуноферментного анализа (ИФА). Использо-

вали сертифицированные диагностические препараты «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие чумные адсорбированные лошадиные сухие (ИДЧЛ)», «Тест-системы иммуноферментные для детекции чумного микроба моно-клональные (ИФАПестФ1-М)». Постановку реакции и учет результатов вели в соответствии с инструкцией.

Характеристику состава основных генов вирулентности осуществляли молекулярно-генетическими методами. ПЦР-анализ проводили с праймерами на плазмидные и хромосомные детерминанты фрагментов генов (pla, irp2, lcrV, cafl, хромосомных локусов 3а и hmsH) с помощью набора реагентов для идентификации штаммов Y. pestis с гибри-дизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени «Ген Yersinia pestis идентификация -РГФ». Скрининг плазмидной ДНК осуществляли по методике С. Кас1о и S.Liu [15].

Вирулентность штаммов оценивали на морских свинках и беспородных белых мышах. Заражали белых мышей подкожно в область внутренней поверхности бедра взвесью микроорганизмов в объеме 0,2 мл. Испытывали 9 доз с десятикратными разведениями 1х109, 1х108, 1х107, 1х106, 1х105,1х104,1х103,1х102, 20 м.к./мл. На каждую дозу брали по 6 белых мышей. Вирулентность 4 штаммов, отобранных в качестве перспективных для применения в учебном процессе при обучении биологическому методу лабораторной диагностике чумы, изучали на морских свинках. Заражали морских свинок подкожно в область внутренней поверхности бедра взвесью в объеме 0,5 мл с концентрациями 1х109, 1х108, 1х107, 1х106, 1х105, 1х104 м.к./мл. На каждую дозу брали по 2 животных. За животными наблюдали в течение 14 дней от момента заражения. Всех павших лабораторных животных вскрывали (191 белая мышь и 6 морских свинок), регистрировали патоморфологическую картину, от каждого лабораторного животного проводили посев паренхиматозных органов (лимфатических узлов, легких, печени, селезенки) на агар Хоттингера рН 7,2 с целью подтверждения тождества с бактериальной культурой, использованной для заражения. LD50 рассчитывали по методу Кербера [16].

Результаты и обсуждение

При создании набора штаммов для освоения лабораторной диагностики чумы учитывали ранее предложенные критерии отбора, основным из которых является отсутствие или снижение вирулентности штаммов, используемых в учебных целях [14].

В процессе подготовки специалистов для работы с ПБА I-II групп на практических занятиях отрабатываются следующие навыки: 1) изучение видовых, морфологических, куль-туральных и физиолого-биохимических свойств возбудителя чумы; биологических особенностей основного подвида, биоваров, штаммов; алгоритма дифференциации основного подвида от неосновных; 2) освоение бактериологического, иммунологических и молекулярно-генетических методов лабораторной диагностики чумы, применяемых для индикации и идентификации; 3) освоение биологического метода лабораторной диагностики чумы; 4) дифференциации Y. pestis

от других патогенных для человека иерсиний, а также па-стерелл, вызывающих массовые эпизоотии среди грызунов и спорадические заболевания людей.

С учетом поставленных задач в учебный набор необходимо включить штаммы со следующими характеристиками.

I. Y. pestis, LD50 для которых - более 105 м.к.; обладающие типичными видовыми культурально-морфологическими свойствами, но отличающиеся:

по способности ферментировать рамнозу, арабинозу, глицерин;

по нитрифицирующей и денитрифицирующей активности для изучения алгоритма дифференциации Y. pestis основного подвида от неосновных подвидов;

по способности к пигментсорбции;

по зависимости роста колоний при 37 °С на питательной среде в условиях дефицита ионов кальция;

по фибринолитической и плазмокоагулазной активности;

по чувствительности к чумным бактериофагам Л413С, Покровской и псевдотуберкулезному бактериофагу Покровской.

Для демонстрации вариантов индикации с помощью регламентированных иммунологических методов МФА, ИФА учебные штаммы должны иметь следующие сочетания 2 плазмид: рFrа+pPst+, рFrа-pPst+, рFrа+pPst, рFrа-pPst.

Учебные штаммы должны иметь различные сочетания генов, детерминирующих вирулентность: pla, 3a, cafl, lcrV, hmsH и irp2, что необходимо для освоения молекулярно-ге-нетических методов при индикации возбудителя чумы.

При заражении лабораторных животных учебные штаммы должны формировать типичные патоморфологические изменения во внутренних органах, накапливаться и обеспечивать стабильное выделение бактериальной культуры при посеве проб внутренних органов животных на питательные среды.

II. Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis, патогенные для человека (возбудители иерсиниоза и псевдотуберкулеза), обладающие типичными видовыми биологическими свойствами и позволяющие провести дифференциацию с Y. pestis, а также имеющие биологические особенности, актуальные при проведении дифференциации с возбудителем чумы.

III. P. multocida - возбудитель пастереллеза, имеющий повсеместное распространение, в том числе на территории природных очагов чумы, вызывающий разлитые эпизоотии среди грызунов и массовый падеж, обладающие типичными видовыми биологическими свойствами, актуальными при дифференциации с Y. pestis.

Исследования проводили поэтапно.

Первый этап - отбор штаммов для дальнейшего изучения. На основании анализа паспортов в соответствии с разработанными критериями к потенциально учебным штаммам были отобраны 19 штаммов Y. pestis, 3 штамма Y. pseudotuberculosis, 1 штамм Y. enterocolitica, 1 штамм P. multocida.

Второй этап - изучение морфологических, культу-ральных и физиолого-биохимических свойств 19 штаммов Y. pestis. Все штаммы обладали типичными видовыми при-

знаками. Анализ фенотипических свойств позволил отнести 6 штаммов Y. pestis к неосновному подвиду caucasica spp. и 13 штаммов - к основному подвиду [17-19]. Штаммы основного подвида разделили на биовары с учетом ряда признаков: ферментации рамнозы, мелибиозы, арабинозы, глицерина; денитрифицирующей способности, продукции пестицина и чувствительности к пестицину I, плазмокоагу-лирующей способности, фибринолитической активности. В результате 1 штамм был отнесен к биовару orientalis, 4 -к биовару medievalis и 9 - к биовару antique.

Чувствительность к пестицину проявили 11 штаммов Y. pestis; пестициногенную, фибринолитическую и коагулаз-ную активность - 9; зависимость роста колоний от ионов кальция при температуре 37 °С - 15, способность к пигмент-сорбции - 8. Полученные данные полностью совпали с моле-кулярно-генетическими характеристиками штаммов.

Чувствительность к чумным бактериофагам: Л413-С (цельному) и Покровской (цельному, в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000) была характерна для 19 штаммов Y. pestis. Кроме того, они проявили чувствительность и к псевдотуберкулезному бактериофагу Покровской (цельный, в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000). Один штамм был резистентен к чумному бактериофагу Л-413.

Все 19 штаммы Y. pestis, имеющие плазмиду pFra, продуцировали антиген FI.

Третий этап - оценка наличия детерминант патогенности (in vitro) была проведена у 19 испытуемых штаммов Y. pestis. По результатам ПЦР отобраны 9 штаммов, перспективных для использования в учебных целях, на основании отсутствия в геноме одной или более основных детерминант патогенности [20, 21]. В выборку вошли геноварианты: рFrа+ pPst+ рСас1+ Pgm- (4 штамма); рFrа+ pPst+ рСас1- Pgm+ (2 штамм); рFrа+ pPst+ рСас1- Pgm- (1 штамм); рFrа+pPstрСаd-Рgm- (1 штамм); рFrа~pPstрСаd-Рgm- (1 штамм).

Проведенный плазмидный скрининг подтвердил наличие автономных плазмид, детектированных в ПЦР. Исключение составил штамм Y. pestis А-819, в клетках которого не обнаружено автономной плазмиды pPst.

В следующий этап для определения степени вирулентности вошли 17 штаммов. Два штамма, резистентных к бактериофагу Л-413 «С», планируется использовать для демонстрации данного свойства при проведении практических занятий.

Четвертый этап - оценка вирулентности 17 штаммов in vivo в результате заражения лабораторных животных штаммами Y. pestis по показателю LD50 У вскрытых лабораторных животных отмечали типичную патоморфологическую картину чумы [2]. При посеве на агар Хоттингера (рН 7,2) измененных участков внутренних органов (лимфатических узлов, паренхиматозных органов) отмечали рост колоний Y. pestis, а также стабильность выделения возбудителя из паренхиматозных органов.

Интерпретацию оценки вирулентности (in vivo) штаммов Y. pestis осуществляли с учетом следующих критериев:

высоковирулентные штаммы - LD50 для белых мышей при подкожном заражении 5-10 м.к.;

слабовирулентные - LD50 более 1-105 м.к.;

авирулентные - LD50 более 1-106 м.к. [6].

В результате 6 штаммов были охарактеризованы как вирулентные, 1 - слабовирулентный, 12 - авирулентные. Таким образом, по критерию «степень вирулентности» и результатам проведенной ранее оценки биологических свойств, важных для лабораторной диагностики чумы, были отобраны 10 штаммов Y. pestis, характеризующихся сниженной вирулентностью. Из них у одного штамма LD50 >105 м.к., у 9 штаммов LD „ >109 м.к.

50

Пятый этап - анализ биологических свойств штаммов Y. pseudotuberculosis (3 штамма), Y. enterocolitica (1 штамм), P. multocida (1 штамм), базовых для их индикации, идентификации и дифференциации от Y.pestis. Все штаммы обладали типичными видовыми свойствами. Совокупность характеристик 3 штаммов Y. pseudotuberculosis позволяет продемонстрировать морфологические, культуральные и физиолого-биохимические особенности, которые необходимо учитывать при дифференциальной диагностике чумы.

Шестой этап - формирование набора штаммов для использования в учебных целях. На основании полученных

Использование набора учебных штаммов для освоения тем учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика чумы»

Тема модуля «Микробиология Штаммы, рекомендованные

и лабораторная диагностика чумы» для использования в учебном процессе

Изучение морфологических, культуральных свойств Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis 521 (2101), Y. pestis КМ 130 (3), Y. pestis 707 «Касуга»

Изучение биологических свойств подвидов и биоваров Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis КМ 260 (5), Y.pestis М-1813 (770 Аст), Y. pestis 652 «Гризель»

Изучение чувствительности к чумным бактериофагам Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis А-819

Изучение способности к пигментсорбции Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis 707 «Касуга»

Изучение зависимости роста штаммов от ионов кальция Y. pestis КМ 130

Лабораторная диагностика чумы иммунологическими методами Y. pestis EV линии НИИЭГ Y. pestis КМ 260

Лабораторная диагностика чумы методом ПЦР Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis КМ 260

Освоение биологического метода лабораторной диагностики чумы Y. pestis М-1813

Дифференциальная лабораторная диагностика чумы Y. enterocolitica Р-74 Е-5В, Y. pseudotuberculosis 85 (837II), Y. pseudotuberculosis 861(II), Y. pseudotuberculosis 67, P. multocida 556

результатов и исходных требований к штаммам бактерий, планируемых к применению при изучении методов лабораторной диагностики чумы, отобраны 10 штаммов Y. pestis (1 вакцинный, 8 авирулентных, 1 со сниженной вирулентностью), 3 штамма Y. pseudotuberculosis, 1 штамм Y. enterocolitica, 1 штамм P. multocida.

Седьмой этап - разработка порядка применения учебного набора штаммов на практических занятиях при освоении модуля «Микробиология и лабораторная диагностика чумы» (см. таблицу).

Таким образом, сформированный набор учебных штаммов бактерий родов Yersinia и Pasteurella позволяет реализовать в полном объеме план учебного модуля «Микробиология

и лабораторная диагностика чумы». Применение штаммов Y. pestis, авирулентных и со сниженной вирулентностью, дает возможность обучающимся на практических занятиях освоить регламентированные методы лабораторной диагностики чумы, приобрести навыки обеспечения биологической безопасности работ с ПБА I группы и минимизировать вероятность лабораторного инфицирования курсантов.

Штаммы бактерий родов Yersinia и Pasteurella, включенные в набор, депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

ФКУЗ Российский научно-исследовательский институт «Микроб», Саратов:

Сазанова Елена Владимировна - научный сотрудник отдела образовательных программ и подготовки специалистов Е-таН: rusrapi@microbe.ru

Малюкова Татьяна Анатольевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела образовательных программ и подготовки специалистов Е-таН: rusrapi@microbe.ru

Бойко Андрей Витальевич - доктор медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела диагностики и инфекционных болезней Е-таН: rusrapi@microbe.ru

Вахрушина Наталья Ивановна - врач-бактериолог отдела питательных сред Е-таН: rusrapi@microbe.ru

Попов Юрий Алексеевич - доктор медицинских наук, заведующий отделом образовательных программ и подготовки специалистов

E-maiL: rusrapi@microbe.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года и дальнейшую перспективу (утв. Президентом РФ 01.11.2013 № Пр-2573). URL: http://docs.cntd.ru/document/499057916 (дата обращения: 11.03.2016).

2. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней : практическое руководство. 2-е изд. / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Куты-рева. М. : Шико, 2013. 560 с.

3. Штамм бактерий Yersinia pestis subsp. pestis КМ 1190 (И-3244), содержащий плазмиду pYX 16, для внутривидовой дифференциации чумного микроба. Патент РФ № 2118362, 1998.

4. Штамм бактерий Yersinia pestis - тест-объект в генетических и микробиологических исследованиях. Патент РФ № 2002802, 1993.

5. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый как тест-объект для уточнения структуры и функции плазмиды кальцийзависимости у возбудителя чумы. Патент РФ № 2034023, 1995.

6. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый для уточнения строения и функции плазмиды синтеза фракции I и токсигенности чумного микроба. Патент РФ № 2034024, 1995.

7. Штамм чумного микроба Yersinia pestis, используемый в качестве тест-объекта для определения строения и функции новой дополнительной плазмиды возбудителя чумы. Патент РФ № 1825375, 1993.

8. Штамм бактерий Yersinia pestis - продуцент фракции I чумного микроба. Патент РФ № 2031938, 1995.

9. Штамм бактерий Yersinia pestis, предназначенный для определения строения и функции новой дополнительной плазмиды мол.м. 19 МД у возбудителя чумы из таласского очага. Патент РФ № 2038376, 1995.

10. Савостина Е.П., Попов Ю.А., Каштанова Т. Н., Яшечкин Ю.А. Анализ геномного полиморфизма типовых и атипичных штаммов возбудителя чумы с использованием полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами // Молекул. генетика. 2004. № 1. С. 22-26.

11. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый в качестве тест-штамма, резистентного к чумному бактериофагу Л-413 «С». Патент РФ № 2203316, 2003.

12. Штамм бактерий Yersinia pestis, используемый в качестве тест-штамма центрально-кавказского высокогорного природного очага чумы. Патент РФ № 2317325, 2008.

13. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики чумы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней : методические указания. МУК 4.2.2940-11. М., 2011.

14. Сазанова Е.В., Малюкова Т.А., Попов Ю.А. Учебные штаммы Yersinia pestis: критерии подбора, принципы применения // Пробл. особо опасных инфекций. 2014. Вып. 3. С. 38-41.

15. Kado С., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. 1981. Vol. 145, N 3. Р. 1365-1373.

16. Ашмарин И.П. Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. : Медгиз, 1962. 180 с.

17. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis,обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 // Молекул. генетика. 2002. № 3. С. 3-23.

18. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. (ред). Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М. : Медицина, 2004. 192 с.

19. Никифоров К.А., Одиноков Г.Н., Новичкова Л.А., Ерошенко Г.А. Дифференциация штаммов Yersinia pest's Алтайско-Гиссарской группы

неосновных подвидов методом ПЦР // Пробл. особо опасных инфекций. 2015. № 1. С. 71-74.

20. Burrows T.W., Bacon G.A. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence // Br. J. Exp. Pathol. 1956. Vol. 37. P. 481-493.

21. Iteman I., Guiyoule A., De Almeida A.M.P., Guilvout I. et aL Relationship between loss of pigmentation and deletion of the chromosomal ironregulated irp2 gene in Yersinia pestis: evidence for separate but related events // Infect. Immun. 1993. Vol. 61. P. 2717-2722.

REFERENCES

1. Basis of the national policy in the field of ensuring chemical and biological security of the Russian Federation for the period until 2025 and for future perspectives

2. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., eds. Laboratory diagnostics of dangerous infectious diseases: practical guidance. 2nd edition. Moscow: Shiko; 2013: 560 p.

3. Strain of Yersinia pestis subsp. pestis bacteria KM 1190

4. The bacterial Yersinia pestis strain is a test sheet in genetic and microbiological studies. Patent of the Russian Federation No. 2002802; 1993.

5. Yersinia pestis bacterium strain, used as a test sheet to refine structure and functions of the calcium-dependence plasmid in plague causative agent. Patent of the Russian Federation No. 2034023; 1995.

6. Yersinia pestis bacterium strain, used to refine structure and functions of fraction I synthesis plasmid and plague microbe toxicity. Patent of the Russian Federation No. 2034024; 1995.

7. Yersinia pestis plague microbe strain which was used as a test sheet for plague pathogen new additional plasmid structure and function determining. Patent of the Russian Federation No. 1825375; 1993.

8. Yersinia pestis bacterium strain is plague microbe fraction I producer. Patent of the Russian Federation No. 2031938; 1995.

9. Yersinia pestis bacterium strain, intended to determine structure and function of a new additional plasmid with MW 19 MD in plague causative agent from the Talas epidemic focus. Patent of the Russian Federation No. 2038376; 1995.

10. Savostina E.P., Popov Yu.A., Kashtanova T. N., Yashechkin Yu.A. An analysis of genome polymorphism of the plague agent

11. Yersinia pestis bacteria strain which is used as a test strain of resistant to plague L-413 "C" bacteriophage. Patent of the Russian Federation No. 2203316; 2003.

12. Yersinia pestis bacteria strain which is used as a test strain of the Central-Caucasian highland natural plague foci. Patent of the Russian Federation No. 2317325; 2008.

13. The order of organization and conduct of plague laboratory diagnostics for laboratories of territorial, regional and federal levels: methodical instructions. MUK 4.2.2940-11. Moscow; 2011.

14. Sazanova E.V., Malyukova T.A., Popov Yu.A. Yersinia pestis Strains: Selection Criteria, Usage Guidelines. Problemy osobo opasnykh infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2014;

15. Kado C., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol. 1981; 145

16. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. Statistical methods in microbiological studies. Leningrad: Medgiz; 1962: 180 p.

17. Anisimov A. P. Yersinia pestis factors which are ensuring circulation and preservation of plague causative agent in natural foci ecosystems. Message 1. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2002;

18. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., eds. Plague natural focuses of Caucasus, Caspian Sea, Central Asia and Siberia. Moscow: Meditsina; 2004: 192 p.

19. Nikiforov K.A., Odinokov G.N., Novichkova L.A., Eroshenko G.A. Differentiation between Yersinia pestis strains of Altaic-Hissar Group of non-main subspecies by means of PCR. Problemy osobo opasnykh infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2015;

20. Burrows T.W., Bacon G.A. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence. Br J Exp Pathol. 1956; 376: 481-93.

21. Iteman I., Guiyoule A., De Almeida A.M.P., Guilvout I., et al. Relationship between loss of pigmentation and deletion of the chromosomal ironregulated irp2 gene in Yersinia pestis: evidence for separate but related events. Infect Immun. 1993; 61: 2717-2.