СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И СООТВЕТСТВУЮЩЕЕ ДЕТЕКТОРНОЕ УСТРОЙСТВО
METHOD OF DETECTING BACTERIAL ACTIVITY IN A BIOLOGICAL SAMPLE AND A CORRESPONDING DETECTOR DEVICE

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу обнаружения активности и наличия видов бактерий в биологических образцах, в частности, но не только, в образцах крови, с помощью технологии, основанной на газовой хроматографии с помощью детекторного устройства.
Настоящее изобретение также относится к детекторному устройству для обнаружения бактериальной активности в биологическом образце.
Способ по настоящему изобретению может применяться, например, для диагностики человека, а также в области ветеринарии, в области пищевых продуктов и в любых других областях, для обнаружения присутствия бактерий в различных анализируемых биологических образцах.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Быстрое и точное обнаружение бактериальной и микробной активности в биологическом образце является основой для диагностики инфекционных заболеваний и, таким образом, для выработки правильной антибиотической терапии.
Основной прямой способ обнаружения бактериальной активности предполагает помещение биологического образца в культивационную или питательную среду, содержащую специфические питательные элементы, способные усиливать рост бактерий.
Технологии, предполагающие использование культивационной или питательной среды, характеризуются временем ожидания, которое отличается в зависимости от характеристик культивационной или питательной среды и условий, непосредственно усиливающих рост бактерий.
Другой технологией обнаружения присутствия бактерий является анализ газа, находящегося в свободном объеме пробирки или другой подходящей емкости, такой как например те, которые в целом называют сосудами.
Под "свободным объемом" здесь понимается свободное пространство внутри запечатанной пробирки, расположенное над исследуемым образцом.
В настоящее время используются пробирки, на дно которых кладут пластинки, находящиеся в контакте с биологическим образцом, содержащим бактерии, с добавленной культивационной или питательной средой; функцией этих пластинок является абсорбция газов, производимых бактериями.
В патентной заявке US-A-2010/0255529 описывается способ обнаружения газообразных соединений биологического образца при посеве последнего в культивационную среду в пробирке.
2
2
Также в этом документе описывается повторяющееся измерение количества диоксида углерода (СО) с разными интервалами времени для исключения возможных неверных измерений, для определения того, является ли биологический образец положительным или отрицательным, путем измерения увеличения количества СО в сравнении с его обычным содержанием в воздухе, в качестве сигнала, подтверждающего наличие и репликацию бактерий в образце.
2
Если определение CO дает неопределенный результат, то есть, не наблюдается превышения порогового значения допустимости для подтверждения присутствия бактерий, в дополнение к первой стадии инкубирования выполняется вторая стадия инкубирования для повторного создания возможности насыщения газом свободного объема.
2
Эти технологии, хотя и являются улучшенными по сравнению с другими, более традиционными процедурами, требуют времени обнаружения CO, сильно разнящегося в зависимости от количества бактерий в образце, и для обеспечения соответствующего положительного обнаружения присутствия бактерий может потребоваться даже несколько дней инкубации.
Часто случается так, что продолжительность времени обнаружения несопоставима со срочностью получения результата.
2
Известно, что для анализа газа в образце цельной крови можно использовать устройство, захватывающее газ для обнаружения СО. Например, можно использовать устройства, хорошо известные в данной области техники, такие как устройства производства Biomerieux и Becton Dickenson.
2
2
Другие решения из области пищевых продуктов, описанные например в документе F. Gardini et al., Journal of Microbiological Methods 29 (1997), 103-114, предлагают анализировать CO в свободном объеме запечатанной пробирки с образцами пищи, проводя корреляцию количества бактерий в последней только с концентрацией CO, измеренной в свободном объеме.
2
2
Такое решение применимо только в этой определенной области, так как оно позволяет получать информацию о количестве бактерий в пищевом образце при измерении высоких концентраций CO, то есть количеств более 300 м.д. (частей на миллион), что значительно выше, чем количества CO, обычно присутствующие в случае образцов крови.
2
Решение, предлагаемое F. Gardini et al., также требует продолжительного времени для получения результатов, не дающих точных и надежных показателей при количествах CO менее 300 миллионных долей (м.д.).
В качестве альтернативного варианта, присутствие бактерий можно обнаружить путем определения изменения давления, определяемого и измеряемого сенсором, расположенным на самой крышке пробирки, например с помощью устройств Versatrek-Thermofischer.
2
2
2
В другой технологии обнаружения бактериальной активности предлагается оценивать разницу давления внутри пробирки без идентификации измеряемых газов, например CO, O, Н.
Другие известные решения, такие как, например, описанные в WO 2014/128629 (WO'629) и WO 2006/079846 (WO'846), предлагают способы идентификации видов бактерий, присутствующих в анализируемом образце, включающие удаление и анализ газообразных соединений, которые в данном конкретном случае относятся к органическим соединениям или соединениям органического происхождения, присутствующим в свободном объеме.
Эти известные решения предлагают проведение однократного измерения, также называемого одной точкой, которое не дает информации о росте и репликации бактерий, возможно присутствующих в исследуемом образце.
Одной целью настоящего изобретения является усовершенствование способа обнаружения активности и присутствия бактерий в биологическом образце, являющегося быстрым, легко применимым и гарантирующим бесспорные результаты.
2
2
2
2
Другой целью настоящего изобретения является предложение способа, позволяющего обнаруживать присутствие одновременно CO и O, с возможностью одновременно подтвердить, например, увеличение количества CO и уменьшение количества O, который используется для создания связи между углеродом и кислородом. Такое измерение можно проводить в непрерывно измеряемом потоке газообразных компонентов.
2
Другой целью настоящего изобретения является предложение способа, позволяющего сократить количество биологического образца, необходимого для обнаружения присутствия бактерий, что с применением известных способов обнаружения CO в образцах крови требует наличия более 10 мл цельной крови в пробирке.
Авторы данного изобретения разработали, протестировали и проверили на практике данное изобретение, которое преодолевает недостатки существующего уровня техники и служит для достижения этих и других целей и преимуществ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение описано и охарактеризовано в независимых пунктах формулы изобретения, при этом в зависимых пунктах формулы изобретения описаны другие характеристики изобретения или различные варианты его осуществления.
2
2
2
В соответствии с вышеописанными целями, настоящее изобретение относится к способу обнаружения бактериальной активности, то есть, репликации живых бактерий в биологическом образце путем анализа неорганических газообразных соединений, таких как, в частности, но не только, CO, Н, O в свободном объеме запечатанной пробирки, в которую помещен биологический образец.
2
2
Настоящее изобретение основано на том принципе, что один из активных метаболических процессов живых бактерий включает выработку CO при одновременном уменьшении уровня O.
2
2
Измерения CO и O эффективно проводятся в виде динамического измерения, то есть, в непрерывном потоке газообразных соединений в свободном объеме с различной частотой измерений.
2
2
На основе последовательности динамических измерений можно построить временную измерительную кривую, из которой выводится активная динамика бактериальной репликации, которая, в частности, определяется по увеличению CO и уменьшению O, связывающегося с углеродом, в свободном объеме над биологическим образцом, помещенным в запечатанный сосуд.
Этот способ также можно применять для обнаружения грибов и дрожжей, присутствующих в биологических образцах.
2
2
2
В данном способе, таким образом, предлагается удалять газы, содержащиеся в свободном объеме, с целью анализа на содержание неорганических газообразных соединений, таких как, в частности, CO, Н и/или O.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения с целью способствования репликации бактерий, возможно присутствующих в биологическом образце, в свободный объем пробирки предлагается вводить вспомогательные соединения, такие как углеводороды (метан, этан, пропан и другие похожие или сопоставимые вещества), ускоряющие репликацию бактерий.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в сосуды для сбора образцов предлагается вводить лизирующие вещества, разрушающие эритроциты и позволяющие межклеточным бактериям реплицировать в пробирке с образцом.
Обнаружение присутствия неорганических газообразных соединений, например, в момент времени Т0, и повторные анализы через последующие интервалы времени T1, Т2, …, Tn, позволяют создать временную измерительную кривую, что на основе динамики ее роста и, следовательно, экспоненциального измерения, позволяет уменьшить время обнаружения присутствия бактерий путем обнаружения неорганических соединений.
В отличие от решений, известных из уровня техники, данное изобретение позволяет получить кривую измерений и таким образом измерять количества на уровне ppm.
2
В соответствии с возможными вариантами осуществления настоящего изобретения, с его помощью возможно идентифицировать неорганические вещества, коррелирующие с присутствием бактерий в биологическом образце, такие как например СО, в интервале количеств от 1 м.д. до 10 м.д.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, для эффективного роста бактерий предлагается использовать культивационную или питательную среду, содержащую питательные вещества. Таким образом создается благоприятная для роста бактерий среда, что позволяет сократить время, необходимое для анализа.
2
2
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, анализ для определения изменения концентраций CO, Н и/или O проводят с помощью высокоскоростного миниатюрного газового хроматографа с детектором теплопроводности.
В частности, при использовании газового микрохроматографа производится отбор части газа из свободного объема путем введения иглы в пробирку.
В этом варианте игла соединяется с всасывающим устройством, способным к извлечению газа, образующегося в свободном объеме пробирки.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, с помощью второй иглы также предлагается возвратный ввод газа, отобранного из пробирки.
2
2
Возврат газа, взятого из свободного объема в газовый микрохроматограф, позволяет создать циркуляцию газа, облегчающую обнаружение неорганических газообразных веществ с помощью газового микрохроматографа. Измерение в потоке позволяет измерить увеличение значений (дельта) количеств газообразных веществ во времени, с возможностью всасывать доступную газообразную субстанцию насосом, соединенным с иглой. Измерение в постоянном потоке позволяет при следующем отборе образца получить доступный и пригодный к измерению образец газа, и сравнить данные для определения увеличения количества CO и уменьшения количества O между измерениями.
Без такой рециркуляции потока, для следующего отбора образца не будет доступного газа, так как он будет использован при первом отборе образца.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, для перемешивания биологического образца или бактериальной культуры можно использовать магнитный элемент, помещаемый в пробирку. Перемешивание образца в ходе анализа способствует репликации бактерий благодаря лучшему обеспечению питательным материалом в культивационной среде, а также способствует лизису эритроцитов с участием лизирующих веществ.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Эти и другие характеристики настоящего изобретения будут очевидны из последующего описания некоторых вариантов реализации настоящего изобретения, приведенных в качестве неограничивающих примеров со ссылками на приложенный чертеж, на котором
приведено схематическое изображение способа определения по настоящему изобретению.
Для облегчения понимания, где это возможно, для идентификации идентичных общих элементов на чертеже используются одинаковые позиции. Подразумевается, что элементы и характеристики одного варианта реализации настоящего изобретения могут использоваться в других вариантах его реализации без дополнительных пояснений.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2
2
2
Чертеж используется для описания способа обнаружения бактериальной активности, то есть, обнаружения присутствия живых и реплицирующих бактерий, путем определения присутствия и количества СО, Н и/или O в герметично запечатанной пробирке с биологическим образцом.
Например, биологический образец 14 может включать, не ограничиваясь этим, кровь, мочу, слюну, слизь, слезы или другой подходящий образец.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец 14 помещают в пробирку или сосуд 12, подходящим образом запечатанный и стерилизованный.
Пробирка 12 запечатана пробкой 16, которая включает мембрану, например из резины, самогерметизирующуюся, и допускающую введение сквозь нее иглы.
Биологический образец 14 анализируют путем помещения в пробирку 12 минимального количества биологического образца 14, например менее 5 мл.
Этот аспект позволяет эффективно применять данный способ при наличии даже небольших количеств биологического образца 14, например для анализов, проводимых для новорожденных.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, свободный объем 18, находящийся в пробирке 12, определяется как пространство между пробкой 16 и уровнем биологического образца 14, то есть, над биологическим образцом 14.
В свободном объеме 18 происходит накопление газа или летучих веществ, то есть, неорганических газообразных веществ, производимых бактериями (в ходе бактериального катаболизма) при их росте внутри пробирки 12.
2
2
2
Здесь и далее под летучими веществами понимаются неорганические газообразные вещества, такие как CO, Н и/или O, которые в соответствии с их определением в данном описании, не включают органические вещества.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, волюметрически определенное количество газа направляется в детекторное устройство 22, описанное ниже.
Таким образом, предлагается по меньшей мере одна стадия отбора образца летучих веществ из свободного объема 18, находящегося внутри пробирки 12.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, детекторное устройство 22 является газовым хроматографом или газовым микрохроматографом 22 для проведения газохроматографического (GC) анализа.
Газовый микрохроматограф 22, который подходящим образом миниатюризирован до минимального переносимого объема, также оборудован устройством для прокалывания пробки 16.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, для отбора образца летучих веществ из свободного объема 18 предлагается использовать иглосодержащее устройство 20, с помощью которого прокалывают пробку 16 в пробирке 12 и всасывают желаемое количество газа над биологическим образцом 14, содержащим газ, произведенный бактериями.
2
2
2
Образец летучих веществ последовательно анализируется газовым микрохроматографом 22 для обнаружения присутствия и/или измерения количества CO, Н и/или O.
В частности, газовый микрохроматограф 22 включает контрольно-управляющее устройство 28.
2
2
2
В возможных вариантах осуществления настоящего изобретения, газовый микрохроматограф 22 выполнен для идентификации неорганических веществ, таких как, например, CO, Н и/или O, коррелирующих с присутствием бактерий в биологическом образце, в интервале количеств от 1 м.д. до 10 м.д.
2
Контрольно-управляющее устройство 28 способно обработать диаграмму обнаружения CO 30, то есть, образованных газообразных катаболических вещества, присутствующих в свободном объеме 18.
2
2
Далее, альтернативно или дополнительно к измерению CO, контрольно-управляющее устройство 28 способно обработать диаграмму обнаружения O 32.
2
2
Возможность одновременного измерения зависимости содержания двух или более неорганических газообразных веществ, таких как CO и/или O, от времени позволяет сопоставлять соответствующие диаграммы для получения точного, надежного и полного результата.
Более того, измерение производится с возвратом газа в свободный объем после каждого измерения, что позволяет проводить измерения последовательно, и получать данные об изменении содержания каждого вещества с течением времени и тем самым сопоставлять эти данные с бактериальной активностью.
В частности, процедура отбора и последующего возврата образца может предусматривать то, что в момент времени измерения 0, из пробирки отбирают весь газообразный компонент. Второй анализ той же пробирки в момент времени Т1 даст вакуум, то есть отрицательное давление, так как вся субстанция была изъята перед этим.
Таким образом, возврат отобранной субстанции в ту же пробирку позволяет в ходе второго, третьего или четвертого анализа в моменты времени Т0, T1, Т2, Т3 … проводить измерение для оценки компонентов с целью обнаружения бактерий.
В ходе зависимых от времени последовательных измерений в моменты времени Т0, T1, Т2, Т3 … создается возможность определения увеличения или постоянства содержания неорганических компонентов с течением времени. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, иглосодержащее устройство 20 включает иглу 24 для отбора образца летучих веществ из свободного объема 18.
Возможность отбора образца летучих веществ создается благодаря положительному давлению в пробирке 12, что позволяет образцу летучих веществ поступать в газовый микрохроматограф 22.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, образец летучих веществ может быть отобран из пробирки 12 путем всасывания с помощью всасывающего устройства 29, интегрированного в схему иглосодержащего устройства 20 с присоединенной иглой 24, для облегчения измерения газообразных веществ внутри свободного объема 18, также в случае наличия и анализа малых концентраций газообразных веществ, если давление внутри пробирки 12 является равным атмосферному или ниже него.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, иглосодержащее устройство 20 содержит две иглы 24. В частности, вторая игла 24 пригодна для возврата образца газа, отобранного из свободного объема 18 пробирки 12.
Вторая игла 24 может быть присоединена к устройству 33 для ввода образца летучих веществ в пробирку 12.
2
Наличие двух игл 24 позволяет осуществлять рециркуляцию газа внутри пробирки 12, предотвращая время ожидания, ранее описанное применительно к известному уровню техники, при возвращении CO в свободный объем 18.
2
2
2
Также, частота периодического измерения CO и O может быть увеличена с повышением уровня метаболизма бактерий, также способствуя возможному периодическому измерению O. Периодический анализ свободного объема, проводимый с одним или несколькими определенными интервалами, позволяет получить данные динамического измерения, то есть, с зависимостью от времени, как функция от количества присутствующих бактерий. Таким образом, газовый микрохроматограф 22 позволяет измерить растущие количества газообразных субстанций, пригодных для обнаружения и измерения, с возможным построением графика определения газообразных субстанций в зависимости от времени.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец 14 может быть помещен или посеян в пробирку 12, в которой находится культивационная среда.
Биологический образец 14 вместе с культивационной или питательной средой по истечении инкубационного периода образует бактериальную культуру 26.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, данный способ предполагает помещение биологического образца 14 в пробирку 12 в чистом виде, без среды, способствующей росту бактерий.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, в пробирку 12 можно поместить вспомогательные вещества, способные ускорять метаболический процесс у видов бактерий, возможно присутствующих в биологическом образце 14.
Например, под вспомогательными веществами следует понимать газообразные вещества, такие как метан, этан, пропан или другие газообразные, жидкие или твердые вещества.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, в биологический образец 14 или бактериальную культуру 26 могут быть добавлены лизирующие вещества для высвобождения бактерий из эритроцитов.
Например, под связывающими комплексообразующими веществами следует понимать уголь или смолы, или другие вещества, способные оказывать связывающее комплексообразующее действие на антибиотические вещества, присутствующие в образце после начала антибиотической терапии.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, не показанном на чертеже, на дно пробирки 12 помещают магнитный элемент для перемешивания бактериальной культуры 26.
Магнитный элемент взаимодействует с перемешивающим устройством, побуждающим его вращаться, тем самым способствуя контакту бактерий с метаболическими веществами, присутствующими в культурной или питательной среде, увеличивая их рост и улучшая перемешивание лизирующих веществ с целью разрушения эритроцитов, внутри которых могут находиться бактерии.
2
2
Анализ газов, в частности CO и/или O, присутствующих в образце летучих веществ, с помощью газового микрохроматографа 22, позволяет получить результат очень быстро, например, в течение 5-40 секунд.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, данный способ может осуществляться с использованием вакуумных пробирок 12 определенного вида.
В этом варианте возможно отобрать биологический образец 14 напрямую из системы для отбора биологических жидкостей, например крови, напрямую у пациента.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, если это необходимо, способ 10 может включать стадию определения давления в пробирке 12. Таким образом можно определить дополнительный параметр для идентификации вида или класса бактерий, присутствующих в биологическом образце.
Например, возможно обнаружить и измерить газообразные вещества, присутствующие в свободном объеме 18, образованные в результате бактериального катаболизма, и в то же время измерить общее изменение давления в пробирке 12 с помощью миниатюрного сенсора.
Следует понимать, что к способу 10 и детекторному устройству 22, описанным выше, могут применяться модификации и/или добавления деталей, без выхода за рамки области и объема настоящего изобретения. Также понятно, что хотя настоящее изобретение было описано со ссылками на некоторые конкретные примеры его осуществления, специалист в данной области без сомнения сможет реализовать множество других эквивалентных форм способа и детекторного устройства 22, обладающих характеристиками, описанными в настоящей формуле изобретения и тем самым попадающих под область защиты настоящего изобретения.