СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛЬТОБИОНАТА
METHOD TO PRODUCE MALTOBIONAT

Настоящее изобретение относится к способу консервирования пищевых и кормовых продуктов с помощью антиоксидантов, получаемых непосредственно из крахмала или мальтозы, уже присутствующей в пищевом продукте, при использовании ферментативного процесса. Также настоящее изобретение относится к способу получения мальтобионата из крахмала, содержащегося в продуктах.
Предотвращение окислительного разрушения пищевых или кормовых продуктов очень важно для сохранения качества продуктов. Процесс окисления в продуктах может привести к изменению цвета, вкуса, аромата или другим неприемлемым органолептическим изменениям. Дополнительно, окисление может явиться причиной повреждения незаменимых аминокислот и в результате к потере витаминов. В частности, пищевые продукты, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты, подвержены окислению, что потенциально может привести к прогорканию пищевых продуктов.
Реакция окисления происходит, когда молекула пищевого продукта, например, жирной кислоты, соединяется с кислородом в присутствии свободных радикалов; металлические микроэлементы, такие как металлические микроэлементы, Fe и Cu; или активные формы кислорода, такие как атомарный кислород, пероксиды или гидроксиды. Антиоксиданты используют для подавления этих реакций. Примеры обычно используемых антиоксидантов включают бутилгидроксианизол (BHA) и бутилгидрокситолуол (BHT), которые широко используются в пищевых продуктах с высоким содержанием жиров и масел, наряду с сульфитами, которые используют в первую очередь, как антиоксиданты для предотвращения или снижения обесцвечивания фруктов и овощей. Однако предполагается, что BHA и BHT вызывают опухоли при использовании в высоких концентрациях и, следовательно, не безопасны для здоровья человека, и известно, что сульфиты разрушают витамин B. По этим причинам, обычно предпочтительны биологические или натуральные антиоксиданты, такие как токоферол (Vitamin E), L-аскорбиновая кислота, лимонная кислота, меланоидин, флавоноиды и галловая кислота. Также для решения проблемы с окислением используют хелатирующие агенты, такие как EDTA, сидерохорес (хелатирующие железо агенты из микроорганизмов), лимонную кислоту и лактобионовую кислоту, за счет их способности предотвращать окисление металлических микроэлементов.
В патенте США № 3899604 описывается получение мальтобионической кислоты из мальтозы ферментативным окислением при использовании Pseudomonas gravlolens species и применение мальтобионической кислоты в качестве пищевой добавки; мальтобионическая кислота имеет слабый кислый вкус и также вносит свой вклад в вязкость пищевых продуктов, в которых она содержится. Дополнительно мальтобионическая кислота может усиливать натуральный запах и вкус определенных пищевых продуктов (улучшитель вкуса и запаха), как описано в патенте США № 3829583. Однако нет указаний на то, что мальтобионат оказывает антиоксидантное воздействие на пищевой продукт.
В Европейском патенте № 0384534 B1 описывается получение мальтобионической кислоты из мальтозы ферментативным окислением с использованием штамма Pseudomonas cepacia. Окисление происходит не только во время длительного хранения, но также может возникать в процессе получения продукта, в частности, когда в процессе получения присутствует кислород. Следовательно, продолжает существовать необходимость в получении натуральных антиоксидантов для пищевых продуктов.
Настоящее изобретение относится к способу предотвращения окислительных реакций в пищевых и кормовых продуктах за счет получения мальтобионата из крахмала или мальтозы, присутствующей в пищевом или кормовом продукте, при использовании ферментативного процесса.
Согласно настоящему изобретению окислительные реакции в пищевых и кормовых продуктах могут быть предотвращены или задержаны в процессе их получения мальтобионатом. Насколько известно, мальтобионат впервые используют в качестве антиоксиданта кормового или пищевого продукта в процессе его получения или после него.
Дополнительно настоящее изобретение относится к способу получения мальтобионата из крахмального компонента пищевого или кормового продукта, где он действует как антиоксидант. Следовательно, антиоксидант по настоящему изобретению может быть получен непосредственно из компонентов продукта, обеспечивая таким образом 100% натуральный антиоксидант, что исключает отдельное производство и добавление антиоксиданта.
Определения:
Используемый в данном описании термин «добавка» относится к части помола, которое не является ячменным солодом. Добавка может включать любое растительное сырье, богатое крахмалом, например, неосоложенное зерно простого помола, такое как ячмень, рис, кукуруза, пшеница, рожь, сорго и легко ферментируемый сахар и/или сироп.
Используемый в данном описании термин «фракция, выделенная из пищевого или кормового продукта в процессе его получения» относится к выделенной части, которая по существу содержит все ингредиенты, используемые в норме в той части процесса, где ее выделяют. Предпочтительно фракция имеет повышенное содержание крахмала по сравнению с присутствующим в норме в той части процесса, где ее выделяют. Фракция может быть получена на любой стадии процесса получения и также может быть готовым продуктом. Как оказалось, в случае, когда желательно повышенное содержание крахмала, в выделенную фракцию может быть добавлен ингредиент способа, содержащий дополнительное количество крахмала, или чистый крахмал.
Используемый в данном описании термин «помол» относится, как к сырью, содержащему крахмал, так и к сырью, содержащему сахар, являющемуся основой для получения пива, например, ячменный солод и добавка.
Используемый в данном описании термин «выделенный фермент» относится к полипептиду с описанной ферментативной активностью, где полипептид составляет, по меньшей мере, 20% в чистом виде, предпочтительно, по меньшей мере, 40% в чистом виде, более предпочтительно, по меньшей мере, 60% в чистом виде, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% в чистом виде и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95% в чистом виде, как определено при использовании SDS-PAGE.
Используемый в данном описании термин «солод» относится к любому осоложенному зерну, в частности, ячменю.
4
Используемый в данном описании термин «мальтобионат» относится к мальтобионовой кислоте (CAS Reg. No. 534-42-9; (4-О-альфа-D-глюкопиранозил-D-глюконовая кислота (4-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-gluconic acid)) или ее солям. Подходящие соли включают без ограничения Na-мальтобионат, Ca-мальтобионат, NH-мальтобионат и K-мальтобионат.
Используемый в данном описании термин «замес» относится к суспензии, в которой крахмал содержится в жидкой смеси, включающей помол в воде.
Используемый в данном описании термин «чистая мальтоза» относится к композиции, которая содержит только мальтозу, воду, неорганические соли и потенциально забуферивающий агент, такой как неорганические соли (например, фосфатная соль, карбонатная соль, гидроксосоль и тому подобное), органические соли (цитратнофосфатные, ацетат натрия и тому подобное) и другие органические буферы (например, HEPES, Tris и тому подобное).
3
2-
Используемый в данном описании термин «слабое», противоположный «сильное» основание относится к способности основания диссоциировать. В контексте настоящего изобретения слабое основание определено, как основание с показателем pKb, по меньшей мере, 3,5 (для оснований, способных присоединять два протона, таких как CO , этот показатель pKb относится к первой стадии).
Используемый в данном описании термин «сусло» относится к не ферментированной жидкости, получаемой после экстракции помола в процессе приготовления замеса.
Ферменты.
Мальтобионат может быть получен окислением мальтозы. Окисление может быть проведено при использовании бромида, однако в процессе получения пищевых продуктов это не желательно.
В настоящем изобретении мальтобионат, получаемый из мальтозы, является продуктом ферментативной реакции, в которой оксидоредуктаза имеет субстратную специфичность к мальтозе и катализирует превращение. Оксидоредуктазы представляют собой ферменты, катализирующие переход электронов от одной молекулы к другой. Дегидрогеназы и оксидазы принадлежат к классу ферментов оксидоредуктаз. Обычно, дегидроредуктазы нуждаются в присутствии кофактора, например НАД/НАДФ, или коэнзима флавина, такого как ФАД или ФМН, и это также может быть отнесено к оксидазам. Если не указано иное, ферменты, описанные ниже и описанные в описании, являются выделенными ферментами в присутствии кофактора, если требуется.
2
2
2
2
Одной из категорий оксидоредуктаз, подходящих для применения в настоящем изобретении, являются оксидазы, катализирующие реакцию окисления/восстановления, где молекулярный кислород (O) выступает в качестве акцептора электрона. По этим причинам кислород восстанавливается до воды (HO) или перекиси водорода (HO). В частности, карбогидратоксидаза катализирует превращение мальтозы в мальтоза-дельта-лактон, который сразу же разлагается в воде с получением мальтобионата. В способе выделяется перекись водорода. Схематически реакция может быть описана, как:
2
2
2
2
мальтоза+O+HO→мальтобионат+HO (формула 1)
Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, известны и доступны подходящие карбоксигидратоксидазы, способные превращать мальтозу в мальтобионат. Примеры таких карбоксигидратоксидаз представляют собой альдозооксидазу, целлобиозооксидазу (EC 1.1.99.18), пиранозооксидазу (EC1.1.3.10) и гексозооксидазу (EC1.1.3.5). Для ознакомления EC 1.1.3._, EC 1.2.3._, EC 1.4.3._, и EC 1.5.3._ или аналогичные классы ферментов, основывающиеся на рекомендациях номенклатурного комитета Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)), другие примеры подходящих карбоксигидратоксидаз легко могут быть определены специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение.
Предпочтительная карбоксигидратоксидаза представляет собой микробную карбоксигидратоксидазу, в частности, выделенную карбоксигидратоксидазу.
Гексозооксидаза (EC1.1.3.5) представляет собой карбоксигидратоксидазу, способную окислять некоторые сахариды, включая глюкозу, галактозу, мальтозу, целлобиозу и лактозу. Ферменты, принадлежащие к классу гексозооксидаз, являются предпочтительными ферментами по настоящему изобретению. Гексозооксидазы продуцируют в природе некоторые виды морских водорослей. Такие виды включают, например, обнаруженный в семействе Gigartinaceae, принадлежащий к порядку Gigartinales. Примерами видов гексозооксидаз, продуцируемых морскими водорослями, принадлежащими к Gigartinaceae, являются Chondrus crispus и lridophycus flacci. Также потенциальными источниками гексооксидаз, подходящих для применения по настоящему изобретению, являются другие виды морских водорослей порядка Cryptomeniales, включая виды Euthora cristata. В частности, гексозооксидазы, подходящие для применения по настоящему изобретению, например, экстрагируют из красных морских водорослей lridophycus flaccidum (Bean and Hassid, 1956, J Biol Chem 218: 425-436) или экстрагируют из Chondrus crispus, или Euthora cristata, как описано в WO 96/40935, в которой дополнительно описывается клонирование и рекомбинантная экспрессия гексозооксидаз из Chondrus crispus, приведенная в WO 96/40935, как SEQ ID NO 30 и 31.
Целлобиозооксидаза (EC 1.1.99.18) представляет собой карбоксигидратоксидазу, способную окислять некоторые сахариды, включая целлобиозу, растворимые целлоолигосахариды, лактозу, ксилобиозу и мальтозу. Ферменты, принадлежащие к классу целлобиозооксидаз, также являются предпочтительными ферментами по настоящему изобретению. Целлобиозооксидаза представляет собой внеклеточный фермент, продуцируемый различными древесными грибками, такими как бело-красная плесень Phanerochaete Chrysosporium, бурая гниль Coniophora Puteana и мокрая гниль, такая как, Monilia sp., Chaetomium, cellulolyticum, Myceliophthora (Sporotrichum) thermophila, Sclerotium rolfsii и Humicola insolens (Schou et al., 1998, Biochemical Journal 330: 565-571).
Другие подходящие карбоксигидратоксидазы могут быть получены, например, из митоспоровых Pyrenomycetes, таких как Acremonium, в частности, A. Strictum, депонированный как ATCC 34717 или A. strictum T1 (Lin et al., 1991, Biochimica et Biophysica Acta 1 118: 41-47); A. Fusidioides, депонированный как IFO 6813; или A. Potronii, депонированный как IFO 31 197. В предпочтительном варианте изобретения карбоксигидратоксидазу получают из источника, описанного в (Lin et al., 1991, Biochimica et Biophysica Acta 11 18: 41-47) наряду с описанным в JP5084074. В другом предпочтительном варианте изобретения карбоксигидратоксидазу получают из грибков, принадлежащих к роду Microdochium, более предпочтительно грибки являются Microdochium nivale и еще более предпочтительно грибки являются Microdochium nivale, депонированным, как CBS 100236. Оксидаза, выделенная из CBS 100236, подробно описана в WO 99/31990 (SEQ ID №: 1 и 2 WO 99/31990, введенная в данное описание в качестве ссылки в полном объеме).
Получение мальтобионата ферментацией бактериями рода Pseudomonas, выращенными на субстрате, содержащем мальтозу, описано ранее (США 2496297, США 3862005, США 3899604 и EP384534). Также по настоящему изобретению можно использовать дегидрогеназы. Такие дегидрогеназные ферментные системы могут быть выделены из Psedomonas, в частности из P. ovalis, P. schuylkilliensis, P. graveolens (например, депонированный как IFO 3460), P. tragi, P. iodinum, P. amyloderamosa (например, депонированный как ATCC 21262) или P. cepacia (например, депонированный как CBS 659.88 или CBS 658.88).
Используемое количество оксидазы/дегидрогеназы обычно зависит от конкретных требований и конкретного фермента. Добавляемое количество оксидазы предпочтительно достаточно для получения желаемой степени превращения мальтозы в мальтобионат за определенное время. Обычно, достаточное количество добавляемой оксидазы составляет от около 1 до около 10000 OXU на кг субстрата, предпочтительно от около 5 до около 5000 OXU на кг субстрата, и более предпочтительно от около 5 до около 500 OXU на кг субстрата. Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, известно необходимое количество конкретного фермента для регулирования превращения мальтозы в мальтобионат.
В литературе оксидазная единица (Oxidase Unit (OXU)) в норме определяется, как количество фермента, которое окисляет в определенных условиях один мкмоль мальтозы в минуту. Однако, в примерах, приведенных в данном описании OXU определяют, как один мг чистого оксидазного фермента, как измерено по стандартам для ферментов.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к мальтобионату, получаемому двойной ферментативной катализируемой реакцией. В первой реакции получают мальтозу из крахмальных компонентов, присутствующих в процессе получения пищевого или кормового продукта, с использованием амилазного фермента. Второй реакцией проводят окисление мальтозы до мальтобионата, как указано выше. Две реакции могут быть проведены одновременно или последовательно. В предпочтительном варианте изобретения амилазную реакцию проводят первой с проведением за ней реакции превращения мальтозы в мальтобионат.
Амилаза способна гидролизовать крахмал с получением олигосахаридов в качестве основного продукта, в частности, мальтозы, способ хорошо известен специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Амилаза может быть получена из бактерий или грибков, в частности из штамма Aspergillus, предпочтительно штамма A. niger или A. oryzae, или из штамма Bacillus. Одним из примеров является альфа-амилаза, например, из Bacillus amyloliquefaciens, и амилоглюкозидаза, например, из A. niger. Коммерческие продукты включают BAN и AMG (продукты Novo Nordisk A/S, Дания), Grindamyl A 1000 или A 5000 (доступные от Grindsted Products, Дания) и Amylase H и Amylase P (продукты от Gist-Brocades, Нидерланды). Аналогично может быть использована бета-амилаза или другие ферменты, разлагающие крахмал, с получением в результате мальтозы.
2
2
2
2
2
2
В дополнительном аспекте настоящего изобретения добавляют каталазу (EC 1.1 1.1.6) для предотвращения ограничения реакции, проводимой карбоксигидратоксидазой, и для удаления нежелательного HO в побочном продукте. Каталаза представляет собой фермент, катализирующий реакцию: 2 HO → O+2 HO (формула 2).

Как описано выше, карбоксигидратоксидаза зависима от кислорода, но продуцирует перекись водорода. Преимущество добавления каталазы в способе по настоящему изобретению состоит в том, что карбоксигидратоксидаза обеспечивается кислородом и в то же самое время удаляется перекись водорода, обладающуюя очень сильными окислительными свойствами. Это очень важно в случае, когда мальтобионат получают, как интегрированную часть процесса получения пищевого или кормового продукта. Подходящие каталазы известны специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, например, коммерчески доступная каталаза Catazyme от Novozymes A/S.
Получение.
Получение мальтобионата ферментацией, например, при использовании бактерий рода Pseudomonas, выращенных на субстрате, содержащем мальтозу, хорошо известно из предшествующего уровня техники (США 2496297, США 3862005, США 3899604 и EP 384534). Дополнительно, в WO 99/31990 описывается окисление чистой мальтозы до мальтобионата с использованием карбоксигидратоксидазы.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к получению мальтобионата обработкой крахмала и/или мальтозы, присутствующей изначально, при получении пищевого или кормового продукта, реакцией, которая является отдельной от фактического процесса получения пищевого или кормового продукта. Способ получения мальтобионата включает следующие стадии:
i) получение субстрата, содержащего крахмал и/или мальтозу, применимого в процессе получения пищевого и/или кормового продукта;
ii) превращение крахмала в мальтозу при использовании ферментативной реакции; и
iii) превращение мальтозы в мальтобионат при использовании ферментативной реакции.
Фракция, содержащая крахмал, может быть очищена для повышения содержания крахмала перед превращением в мальтозу. Ферментативная реакция стадии ii) предпочтительно катализирована амилазой. В случае, когда субстрат стадии i) содержит мальтозу, стадия ii) может не проводиться. Ферментативная реакция стадии iii) катализирована оксидоредуктазой/дегидрогеназой, предпочтительно одной из карбоксигидратоксидаз, приведенных выше, еще более предпочтительно одной из гексооксидаз, приведенных выше, и наиболее предпочтительно карбоксигидратоксидазой, получаемой из Microdochium nivale, депонированной как CBS 100236. Стадия ii) и стадия iii) может быть проведена, как одностадийный или двухстадийный процесс, в котором амилаза и карбоксигидратоксидаза могут быть добавлены в реакционную смесь, как вместе, так и амилаза может прореагировать с крахмалом на отдельной стадии перед добавлением карбоксигидратоксидазы в реакционную смесь. Описанный способ позволяет получить почти полное превращение крахмала/мальтозы в мальтобионат, предпочтительно 80%, более предпочтительно 85%, еще более предпочтительно 90%, и даже еще более предпочтительно 95%, наиболее предпочтительно 99%, и даже наиболее предпочтительно 100% крахмала и/или мальтозы в субстрате превращается в мальтобионат. Мальтобионат может быть добавлен обратно в кормовой или пищевой продукт в желаемом количестве. Необязательно мальтобионат, полученный способом, как указано выше, может быть очищен, в случае, когда его чистота недостаточна.
Преимуществом способа является использование компонентов, используемых при поучении пищевого или кормового продукта, следовательно, мальтобионат не получают из какой-либо добавки. Предпочтительно фракция, содержащая крахмал и/или мальтозу, получаемая из пищевого или кормового продукта, включает от 5% до 60%, более предпочтительно от 10% до 40%, еще более предпочтительно от 15% до 30%, даже еще более предпочтительно от 20% до 25% крахмала и/или мальтозы. Дополнительное преимущество способа по настоящему изобретению состоит в том, что другие компоненты пищевого или кормового продукта не усложняют процесс.
Отягощение процесса другими компонентами пищевого или кормового продукта, например, может привести к образованию пены, поскольку реакция с карбоксигидратоксидазой может потребовать добавления кислорода в реакционную смесь, что может привести к возникновению пены в содержащих белок реакционных смесях. Условия для превращения крахмала в мальтозу при использовании амилазы хорошо известны из предшествующего уровня техники. Если требуется, специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, может выбрать условия, совместимые с условиями для превращения мальтозы в мальтобионат, как описано ниже.
Субстрат, включающий крахмал и/или мальтозу, может быть получен, например, в процессе получения пищевого или кормового продукта при использовании в процессе аррорута, ячменя, крахмала, кассавы, кукурузы, маиса, пшена, овса, картофеля, риса, ржи, саго, сои, сорго, сладкого картофеля и/или пшеницы. Процессы получения пищевых продуктов, в которых используют сырье, содержащее изначально крахмал и/или мальтозу, включают, например, пивоварение, производство некоторых вин или спиртов, производство безалкогольных напитков, производство хлебобулочных изделий, производство чипсов или снэковых пищевых продуктов. В частности, при пивоварении мальтоза присутствует изначально, поскольку в процессе затирания она продуцируется для ферментации. А именно, высокое содержание мальтозы имеет сусло. Субстрат, содержащий крахмал и/или мальтозу, используемый в способе по настоящему изобретению, может быть чистым крахмалом, содержащимся в исходном сырье, как указано выше, предпочтительно такое исходное сырье измельчено, например, раздробленно или размолото и суспендировано в воде. В качестве альтернативы, фракция может быть получена со стадии получения пищевого или кормового продукта, такой как получение замеса, сусла, снэкового продукта, картофельных чипсов и безалкогольного напитка. Предпочтительно субстрат, содержащий крахмал и/или мальтозу, используемый в способах по настоящему изобретению, не содержит чистую мальтозу.
Способ получения мальтобионата должен быть проведен в условиях, позволяющих карбоксигидратоксидазе превращать мальтозу в мальтобионат. Такие условия включают без ограничения температуру, pH, кислород, количество и характеристики карбоксигидратоксидазы, другие добавки, такие как, например, каталаза, и время реакции/выдержки.
Подходящее время выдержки предусматривает желаемую степень превращения мальтозы в мальтобионат. Обычно, подходящее время выдержки выбирают от Ѕ часа до 3 дней, предпочтительно от 2 часов до 48 часов, более предпочтительно от 5 часов до 24 часов, наиболее предпочтительно от 8 часов до 18 часов.
Кислород является важным фактором для способа по настоящему изобретению, поскольку при превращении мальтозы в мальтобионат происходит потребление кислорода (см. формулу 1 выше). Следовательно, если кислород контролируют во время первой ферментативной реакции, то обычно наблюдают снижение начального количества кислорода, которое, если, например, обеспечивают постоянный доступ воздуха, когда ферментативная реакция закончится, вернется к приблизительно начальному уровню. Когда уровень кислорода возвращается более чем на 90% от начального уровня, ферментативная реакция заканчивается или, по меньшей мере, значительно замедляется, указывая на то, что весь субстрат (например, крахмал, декстрин и/или мальтоза) превращен в мальтобионат. Следовательно, подходящее время выдержки предпочтительно может составлять такой период времени, который, по меньшей мере, длится до тех пор, пока уровень кислорода в обрабатываемой партии составит более чем около 90% от начального уровня, если по существу желательно максимальное превращение мальтозы. В качестве альтернативы, реакция может контролироваться количеством основания, требуемым для поддержания постоянного рН. Когда количество основания, необходимое для поддержания рН, снижается, то это указывает на то, что реакция заканчивается или, по меньшей мере, значительно замедляется. Однако замедление ферментативной реакции может происходить не только из-за истощения субстрата. Стабильность фермента во времени также является параметром, который может оказывать воздействие на реакцию. Следовательно, если со временем фермент разрушается, это также может явиться причиной замедления реакции. В таком случае добавление субстрата не приведет к повторному повышению кислорода и рН.
Подходящие источники кислорода включают атмосферный воздух (около 20% кислорода), атмосферный воздух, обогащенный кислородом (содержание кислорода >20%), и чистый кислород. Осуществление способа под давлением выше, чем 1 атмосфера, увеличивает растворимость кислорода и может быть предпочтительно при применении. Подача кислорода в процесс может осуществляться, например, непрерывным смешиванием воздуха с реакционной смесью во время выдержки.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В качестве альтернативы, для обеспечения O вводят HO в присутствии каталазы (см. формулу 2 выше). В качестве альтернативы, может быть использована HO, изначально продуцируемая карбоксигидратоксидазой. Применение HO в качестве источника кислорода может быть по существу предпочтительным, когда способ проводят с использованием иммобилизованных ферментов, когда добавление кислорода очень затруднительно или когда образуется пена, например, в реакционных смесях, содержащих белок, что создает проблемы при добавлении кислорода смешиванием воздуха с реакционной смесью. Каталаза может быть добавлена в любое подходящее время, например, вместе с карбоксигидратоксидазой или во время реакции, когда уровень O снижается, предпочтительно каталазу добавляют в начале выдержки (время=0). Преимущество добавления каталазы вместе с карбоксигидратоксидазой состоит в том, что требуемое количество кислорода может быть значительно снижено (на величину до 50%). Следовательно, обеспечение кислородом, например, в форме воздуха, может быть значительно снижено. Фактически при добавлении адекватного количества каталазы вместе с HO можно полностью отменить дополнительное обеспечение кислородом. Такая дополнительно добавляемая HO может быть доступна из коммерческого источника.
2
2
2
2
2
2
Следовательно, в предпочтительном варианте изобретения, по существу весь требуемый для окисления мальтозы до мальтобионата кислород получают добавлением каталазы, которая выделяет требуемый кислород превращением доступной HO. Если количество HO в способе ограниченно, то может быть добавлена дополнительная HO.
Используемый в данном описании термин «по существу весь кислород» используется для описания кислорода, необходимого для адекватного прохождения ферментативной реакции, и по существу, отсутствует необходимость в дополнительном добавлении кислорода для интенсификации процесса.
2
2
2
2
2
2
В предпочтительном варианте изобретения каталазу добавляют в количестве, снижающем концентрацию HO по сравнению с таковой в аналогичных способах без каталазы. Более предпочтительно количество каталазы, добавленной в способе по настоящему изобретению, достаточно для снижения количества HO, по меньшей мере, на 25%, 50%, 75%, 85% или 95% по сравнению со сравнительным контрольным способом, где сравнительным отличием является только то, что не добавляют каталазу, еще более предпочтительно количество каталазы, добавленной в способе по настоящему изобретению, как указанно выше, составляет такое, которого достаточно для достижения 100% снижения количества HO по сравнению со сравнительным контрольным способом, где сравнительным отличием является только то, что не добавляют каталазу. Предпочтительно каталазу добавляют в количестве, которое также улучшает степень превращения мальтозы в мальтобионат.
Обычно температура выдержки зависит от используемой карбоксигидратоксидазы и обычно выбирается согласно оптимальной температуре реакции для карбоксигидратоксидазы. Однако, поскольку при повышении температуры снижается растворимость кислорода, то для получения оптимального процесса следует принимать во внимание другие факторы. Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, известно, как сбалансировать оптимальную температуру в отношении, например, ферментативной активности и растворимости кислорода. Обычно, подходящая температура составляет от 0°C до около 99°C, более предпочтительно от 5°С до 90°C, более предпочтительно от 15°C до 85°C, еще более предпочтительно от 25°C до 80°C, наиболее предпочтительно от 30°C до 60°C.
2
2
3
2
3
2
3
4
2
3
4
4
2
3
Оптимальный pH может варьироваться в зависимости от используемой карбоксигидратоксидазы. Однако, кинетический анализ карбоксигидратоксидазы из Microdochium nivale (Nordkvist et al., 2007, Biotechnol Bioeng 97: 694-707) указывает, что применение сильных оснований (NaOH) может оказать негативное воздействие на стабильность карбоксигидратоксидаз. Дополнительно, в WO 97/004082 описывается, что повышенный выход лактобионата при использовании карбоксигидратоксидазы может быть получен при проведении способа при стабильном рН. Следовательно, для повышения выхода мальтобионата в способе по настоящему изобретению может быть желательно поддерживать стабильный уровень рН при превращении мальтозы в мальтобионат (стадия iii, выше), адекватным добавлением основания. В конкретных вариантах изобретения стабильный pH поддерживают от около 3,0 до около 9,0 добавлением основания. Для поддержания рН в указанных выше пределах может быть использовано любое основание. В принципе в способе может быть применено любое вещество, способное нейтрализовать выделенную кислоту. Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, известно множество оснований, которые могут быть применены в способе по настоящему изобретению, например, сильные основания, такие как Ca(OH), KOH, NaOH и Mg(OH). В предпочтительном варианте изобретения для поддержания рН на стабильном уровне используют слабое основание или карбонат. Примеры слабых оснований включают без ограничения CaCO, NaCO, KCO, (NH)CO и NHOH. В настоящий момент предпочтительными слабыми основаниями являются NHOH и NaCO.
Предпочтительный стабильный pH для конкретного способа может быть определен специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и зависит от множества факторов. Например, если пищевой продукт представляет собой пиво, известно, что рН сусла составляет от около 5,0 до 5,7, предпочтительно от около 5,1 до 5,3. Следовательно, предпочтительно поддерживать стабильный уровень pH около 5,3, т.е. в интервале от 5,0 до 5,6. Предпочтительный рН для другого пищевого/кормового продукта может составлять от 3,0 до 4,0, например, для сока или безалкогольных напитков, таких как кола, или от 4,0 до 5,0, например, для пива или майонеза, или дрессингов; или от 5,6 до 6,5, например, для мясных продуктов; или от 6,6 до 7,5 для молочных и яичных продуктов.
Следует понимать, что pH мальтобионатного продукта или композиции, включающей мальтобионат по настоящему изобретению, также может быть отрегулирован до предпочтительного pH после или в конце проведения ферментативного превращения, например, при достижении 95% от желаемого превращения мальтозы, может быть проведено снижение pH до желаемого уровня.
Используемый в данном описании термин «стабильный уровень рН» включает в объем понятия контроль и поддержание pH во время процесса в конкретных пределах или близко при/к конкретному показателю добавлением основания. Контроль и регулирование/поддержание pH во время ферментативного процесса является стандартной процедурой, которая может быть проведена с очень высокой точностью. Следовательно, стабильный pH может быть показателем, поддерживаемым на постоянном уровне, с варьированием менее чем на 1,5 единицы pH, предпочтительно менее чем на 1,0 единицу pH, более предпочтительно менее чем на 0,5 единицы pH, еще более предпочтительно менее чем на 0,3 единицы pH, даже еще более предпочтительно менее чем на 0,2 или 0,1 единицу pH. Из этого следует, что пределы могут быть определены для конкретного ферментативного процесса по настоящему изобретению, и что pH может контролироваться и поддерживаться с указанной выше степенью точности в этих пределах. В способе по настоящему изобретению конкретные подходящие пределы pH или конкретный показатель pH выбирают из пределов от около pH 3 до около pH 9.
Предпочтительно поддерживать pH на стабильном уровне, как указанно выше, с начала ферментативной реакции. Другими словами, сразу после добавления оксидазы в продукт, содержащий мальтозу, для поддержания стабильного рН добавляют основание, как указанно выше.
В частности, в случае, когда желательно максимальное превращение мальтозы, pH поддерживают на стабильном уровне, как указанно выше, в течение периода времени, который, по меньшей мере, длится до тех пор, пока уровень кислорода в реакционной смеси составит более чем около 90% от начального уровня, или количество основания, используемое для поддержания постоянного рН, соответствует желаемому уровню превращения.
Предпочтительно рН поддерживают на стабильном уровне, как указанно выше, в течение периода времени от 30 минут до 3 дней, предпочтительно от 2 часов до 48 часов, более предпочтительно от 5 часов до 24 часов, наиболее предпочтительно от 8 часов до 18 часов.
В конкретном варианте осуществления изобретения превращение мальтозы в мальтобионат проводят в партии сусла, полученной со стадии затирания. Сусло, содержащее мальтобионат, может быть использовано в качестве ингредиента для партий сусла для получения пива. В другом конкретном варианте изобретения превращение крахмала в мальтозу в мальтобионат проводят в партиях замеса перед стадией затирания. Способ может включать добавление амилазы вместе с карбоксигидратоксидазой. Замес, содержащий мальтобионат, может быть использован в качестве ингредиента на стадиях затирания.
Конкретный аспект настоящего изобретения относится к способу ферментативного превращения мальтозы в мальтобионат с получением повышенного выхода и/или уменьшенного времени реакции. Способ характеризуется следующими стадиями:
i) добавление карбоксигидратоксидазы в субстрат, включающий мальтозу;
ii) выдержку субстрата в условиях, позволяющих карбоксигидратоксидазе превратить мальтозу в мальтобионат; и
iii) поддержание pH на стадии ii) от около 3,0 до около 9,0 добавлением основания.
В конкретном аспекте субстрат, используемый для получения мальтобионата, может содержать чистую мальтозу. Предпочтительно субстрат получают превращением крахмала, например, со стадии получения пищевого или кормового продукта, в мальтозу ферментативной реакцией с использованием, например, амилазы, как указанно выше.
Очевидно, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для промышленного получения мальтобионата per se. Однако способ также может являться частью процесса получения пищевого или кормового продукта, в процессе получения которого изначально присутствует мальтоза.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к получению мальтобионата непосредственно (in situ) в процессе получения пищевого или кормового продукта обработкой крахмала и/или мальтозы, которая изначально присутствует в процессе. Следовательно, в этом аспекте мальтобионат получают в процессе получения пищевого или кормового продукта, без проведения отдельной стадии для проведения реакции, как указанно выше. Способ получения мальтобионата, когда способ интегрирован в процесс получения пищевого или кормового продукта, включает следующие стадии:
i) добавление оксидоредуктаз или дегидрогеназ, предпочтительно карбоксигидратоксидаз в процессе получения пищевого или кормового продукта;
ii) поддержание процесса в условиях, позволяющих ферментативное превращение мальтозы в мальтобионат;
iii) продолжение процесса получения пищевого или кормового продукта.
Ферментативная реакция стадии i) может быть проведена реакцией разрушения крахмала, например, катализированной амилазой, которая может быть проведена, как эндогенно (например, из уже присутствующего в процессе солода), так и экзогенно (например, добавлением перед или совместно с ферментом на стадии i). Карбоксигидратоксидаза и условия прохождения ферментативного превращения по существу те же, как указано выше. Однако в отношении оптимальной температуры следует принимать во внимание, что реакция проходит в процессе получения пищевого/кормового продукта. Следовательно, преимуществом является то, что карбоксигидратоксидаза может действовать при оптимальных для такого процесса температурах. Преимущество получения мальтобионата непосредственно в процессе получения пищевого или кормового продукта состоит в том, что процесс оптимизирован, и нет необходимости в проведении отдельной стадии получения мальтобионата.
В конкретном варианте изобретения мальтобионат получают на стадии получения пива, таком как стадия затирания или стадия ферментации, добавлением на этой стадии карбоксигидратоксидазы и потенциально каталазы. Превращение мальтозы в мальтобионат может проходить в замесе (помол+жидкость), перед процессом затирания или во время процесса затирания, или после варки сусла перед ферментацией, или даже во время ферментации. Однако позднее требуется присутствие в пищевом продукте соответствующих стандарту ферментов. Однако для ферментации сусла в пиво необходимо присутствие в сусле мальтозы. Следовательно, превращение мальтозы в мальтобионат должно быть оптимизировано, таким образом, что мальтоза превращается в мальтобионат только частично. Предпочтительно сусло содержит вплоть до 2% мальтозы, более предпочтительно вплоть до 5% мальтозы и наиболее предпочтительно вплоть до 10% мальтозы.
В процессе затирания обычно проводят ступенчатое контролируемое повышение температуры, где на каждой стадии действие одного фермента преобладает над действием другого, разрушая в результате белки, стенки клеток и крахмал. Профили температуры затирания известны из предшествующего уровня техники. В способе по настоящему изобретению превращение мальтозы в мальтобионат происходит предпочтительно на стадии осахаривания (разрушение крахмала) от 55°C до 66°C. В предпочтительном варианте изобретения карбоксигидратоксидаза активна в этом температурном пределе. В качестве альтернативы, процесс затирания может быть проведен при более низкой температуре, достаточно долго, чтобы позволить осуществиться превращению крахмала в мальтозу в мальтобионат при температуре активности карбоксигидратоксидазы. Амилаза может быть добавлена экзогенно на этой стадии для облегчения превращения крахмала в мальтозу.
В другом варианте изобретения получение мальтобионата проводят после ферментации пива. В этом случае необходимое количество мальтозы обеспечивается вместе с карбоксигидратоксидазой и потенциально каталазой, поскольку вся доступная мальтоза была превращена во время ферментации.
В другом варианте изобретения пищевой продукт представляет собой снэк, характеризующийся высоким содержанием крахмала, то есть >25%, более предпочтительно выше 50% и высоким содержанием липидов, то есть >10, более предпочтительно выше 15%. Амилаза, карбоксигидратоксидаза и, потенциально, каталаза могут быть добавлены в снэковый пищевой продукт в процессе получения вместе с традиционными ингредиентами, например, белками, такими как молоко или сухое молоко, глютеном и соей; яйцами (как цельные яйца, так и яичный желток или белок); шортенингом, таким как гранулированный жир или масло; восстанавливающим агентом, таким как L-цистеин; сахаром; солью, такой как хлорид натрия, ацетат кальция, сульфат натрия или сульфат кальция. Получение мальтобионата непосредственно в снэковом пищевом продукте может до некоторой степени заменить традиционные антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, бромат калия, йодат калия, азодикарбонамид (ADA) или персульфат аммония. В качестве альтернативы, способ может быть проведен в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, где амилазу, карбоксигидратоксидазу и потенциально каталазу добавляют в партию крахмалистого сырья, используемого для получения снэкового пищевого продукта. В таком случае высокая степень превращения мальтозы в мальтобионат может быть гарантирована в такой партии, и часть партии может быть обратно добавлена в процессе получения снэкового пищевого продукта.
Очистка мальтобионата:
Необязательно можно провести очистку мальтобионата любым подходящим способом с получением мальтобионатного продукта или композиции, включающей мальтобионат с желаемой степенью чистоты мальтобионата.
Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, известно, как провести очистку мальтобионата, и в зависимости от конкретных потребностей композиция включает, по меньшей мере, 70% мальтобионата, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% мальтобионата или даже, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 99% мальтобионата.
Подходящие способы очистки мальтобионата включают фильтрацию, ионный обмен, концентрирование и сушку.
Композиция, включающая мальтобионат, может быть использована для получения пищевых продуктов, таких как, например, пищевая добавка или ингредиент пищевого продукта, в частности, в качестве антиоксиданта в пищевом продукте.
Применение мальтобионата в пищевых и кормовых продуктах.
Также настоящее изобретение относится к применению мальтобионата в качестве антиоксиданта в пищевом или кормовом продукте, в частности, в качестве хелатирующего агента.
В одном аспекте настоящего изобретения мальтобионат добавляют в эффективном количестве в пищевой или кормовой продукт. Специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, может определить, какое количество мальтобионата необходимо для получения антиоксидантного воздействия на пищевой или кормовой продукт.
Мальтобионат может быть обеспечен в процессе получения, как указано выше. В случаях, когда в процессе получения изначально отсутствует крахмал или мальтоза, мальтобионат может быть добавлен в процессе получения. В качестве альтернативы, мальтобионат может быть добавлен в готовый кормовой или пищевой продукт.
Целью настоящего изобретение является добавление мальтобионата в пищевой продукт для оказания антиоксидантного воздействия, а не оказания воздействия на вязкость пищевого продукта и его способность усиливать натуральный запах и вкус определенных пищевых продуктов (улучшитель вкуса и аромата).
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1.
Получение мальтобионата.
2
3
Na-мальтобионат получают из мальтозы окислением, катализированным карбоксигидратоксидазой (M. Nivale CBS 100236, как описано в WO99/31990) и каталазой (Catazyme 25L, Novozymes, Дания). Дозировка фермента составляет: карбоксигидратоксидаза 400 мг белкового фермента/кг мальтозы, и каталаза 6 г/кг мальтозы. Мальтозу растворяют в концентрации 10%, при температуре 38°C. Для проведения реакции используют реактор с мешалкой, содержащий 3 л раствора. Во время реакции подают атмосферный воздух 1 л/минута и поддерживают постоянный рН 6,4, непрерывно добавляя 1M раствор NaCO. Общее время реакции составляет 17 часов. По существу во время реакции вся мальтоза превращается в мальтобионовую кислоту.
ПРИМЕР 2.
Антиоксидантное воздействие мальтобионата, измеренное анализом восстановления антиоксидантами железа (Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) assay).
+
+
+
+
Кратко, анализ FRAP проводят следующим образом: комплекс Fe3-трипиридилтриацин (TPTZ) восстанавливается до Fe2-TPTZ при низком pH. Форма Ферро (Fe2) окрашена голубым при измерении спектро-фотометрией при 593 нм. Способ калибруют при использовании раствора Fe2 с известными концентрациями. Более высокая абсорбция означает более высокий антиоксидантный статус. Рабочий реагент для анализа FRAP получают из следующих компонентов:
3
2
3
3
Ацетатный буфер: 3,1 г CHCOONa•3HO и 16 мл конц. CHCOOH в ≈800 мл воды. Проверяют, чтобы pH составлял 3,6. В противном случае регулируют NaOH/CHCOOH. Добавляют воду до 1 л.
3
2
Раствор TPTZ: 10 ммоль/л 2,4,6-три(2-пиридил)-s-триацин (TPTZ) в 40 ммоль/л раствора HCI Fe(III): 20 мМ Fe(III)Cl•6HO.
Рабочий реагент (получают ежедневно): 50 мл ацетатного буфера+5,0 мл раствора TPTZ+5,0 мл раствора Fe(III).
+
Анализ проводят, добавляя 50 мкл образца в 1,5 мл рабочего реагента в 2 мл темные пробирки Эппендорфа с последующим их инкубированием в термомиксере при температуре 37°C в течение 30 минут. Образцы содержат мальтобионат в различной концентрации, стандарт содержит Fe2 и аскорбиновую кислоту, а пустая проба содержит воду. Анализ повторяют трехкратно. Абсорбцию определяют сразу же при 593 нм, более высокая абсорбция - более высокий антиоксидантный статус (↑Abs→Антиоксидант ↑). Результаты приведены в Таблице 1.
Таблица 1Натрий мальтобионат в FRAP (г/л) Abs при 593 нм
Натрий мальтобионат (жидкие концентраты)
Abs среднее
Стандартное отклонение
5%
0,236
0,021
2,50%
0,170
0,002
1%
0,112
0,006
Пустая проба
0,0257
0,00058
Мальтобионат показал антиоксидантную способность, восстанавливая Fe(III) и, следовательно, изменяя абсорбцию благодаря комплексу железо-трипиридилтриацин. Анализ показал очевидный дозазависимый эффект антиоксиданта.
ПРИМЕР 3.
Антиоксидантное воздействие карбоксигидратоксидазы и/или каталазы на пивное сусло.
Пивное сусло получают из 50 г хорошо растворенного ячменного солода в 250 г воды при температуре 53°С. Ячменный солод затирают в течение 30 минут при температуре 52°С, повышая на 1°С/мин в течение 11 минут, в течение 30 минут при температуре 63°С, повышая температуру 1°С/мин в течение 9 минут, в течение 30 минут при температуре 72°С, повышая температуру на 1°С/мин в течение 6 минут, в течение 15 минут при температуре 78°С с последующим охлаждением до 20°С.
2
2
Проводят серии экспериментов с добавлением в сусло карбоксигидратоксидазы и/или каталазы и сравнивают с контрольным образцом. Ферменты добавляют перед стадией затирания. Карбоксигидратоксидазу дозируют согласно активности, измеренной как LOXU, где один LOXU соответствует 1 мг белкового фермента. Каталазу дозируют согласно активности, измеренной как CIU. 1 CIU представляет собой количество фермента, которое расщепляет 1 мкмоль HO в минуту при pH=7,0 и T=25°C.
2+
Для измерения антиоксидантной способности карбоксигидратоксидазы и/или каталазы во все образцы добавляют 1 мМ Fe. Окисление измеряли непрямым методом при использовании комплексного анализа с ксиленолом оранжевым (XO-анализ).
2+
3+
При этом анализе гидропероксидаза сусла окисляет Fe в комплексе ксиленола оранжевого до Fe, который образует окрашенный комплекс с ксиленолом оранжевым. Окисленный комплекс может быть измерен спектрофотометрически, более низкая абсорбция - более высокий антиоксидантный статус (↓ Abs→Antioxidant ↑).
XO рабочий реагент получают из следующих компонентов:
2
4
A: 2,5 мМ аммония-железа сульфат гексагидрат, 1,0 мМ тетранатрия соль ксиленола оранжевого (XO) в 1250 мМ HSO.
B: 4,89 мМ бутилированный гидрокситолуол (BHT) в метаноле.
XO рабочий реагент: смешивают 1 часть A с 9 частями B. Стабилен 1 месяц в холодильнике, если хранить в сосуде темного стекла.
Анализ начинают, добавляя 100 мкл образца в 900 мкл XO рабочего реагента. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут при перемешивании. Каждый образец центрифугируют при 14000 оборотах в минуту при температуре 20°С в течение 10 минут. Абсорбцию супернатанта измеряют спектрофотометрически при 560 нм.
2+
3+
Абсорбция повышена во всех образцах за счет окисления в окрашенном ХО комплексе Fe до Fe. Образцы сусла с 50 LOXU предотвращают окисление по сравнению с контролем (abs=0,410 контроль и 0,257 для 50 LOXU). Воздействие хуже наполовину при дозе 25 LOXU (abs=0,421), однако улучшается при комбинации с 600 CIU каталазы (abs=0,308). 1200 CIU каталазы также предотвращает образование окрашенного комплекса (abs=0,264) и воздействуя дозозависимо, при 600 CIU слабо отличается (abs=0,439) от контроля.