СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ

1. Способ получения промышленного продукта, включающий стадии:
i) получение вегетирующей части растения, имеющей общее содержание неполярных липидов по меньшей мере около 3%, предпочтительно по меньшей мере около 5% или по меньшей мере около 7% (мас./мас., сухой вес),
ii) либо
a) превращение по меньшей мере некоторых липидов в вегетирующей части растения со стадии i) в промышленный продукт с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации, в отношении липидов in situ в переработанной вегетирующей части растения, либо
b) физическая переработка вегетирующей части растения со стадии i), и последовательное или одновременное превращение по меньшей мере некоторых липидов в вегетирующей части растения в промышленный продукт с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации, в отношении липидов в переработанной вегетирующей части растения, и
iii) выделение промышленного продукта,
с получением посредством этого промышленного продукта.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадия физической переработки вегетирующей части растения включает одно или более из раскатывания, прессования, размола или измельчения вегетирующей части растения или нечеловеческого организма или его части.
3. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий стадии:
(a) экстракция по меньшей мере некоторого содержания неполярных липидов в вегетирующей части растения в виде неполярных липидов, и
(b) выделение экстрагированных неполярных липидов,
при этом стадии (а) и (b) выполняют до стадии превращения по меньшей мере некоторых липидов в вегетирующей части растения в промышленный продукт.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что экстрагированные неполярные липиды содержат триацилглицерины, при этом указанные триацилглицерины составляют по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% экстрагированных липидов.
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что промышленный продукт представляет собой углеводородный продукт, такой как сложные эфиры жирных кислот, предпочтительно метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, такой как метан, этан или длинноцепочечный алкан, смесь длинноцепочечных алканов, алкен, биотопливо, монооксид углерода и/или газообразный водород, биоспирт, такой как этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля.
6. Способ получения экстрагированных липидов, включающий стадии:
i) получение нечеловеческого организма или его части, содержащей один или более экзогенный полинуклеотид (-ов) и повышенную концентрацию одного или более неполярного липида (-ов), по сравнению с соответствующим нечеловеческим организмом или его частью, соответственно, не содержащей одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов),
ii) экстракция липидов из нечеловеческого организма или его части, и
iii) выделение экстрагированных липидов,
с получением посредством этого экстрагированных липидов, при этом один или более экзогенных полинуклеотидов функционально связаны с промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в нечеловеческом организме или его части, и при этом применима одна или более, или все из характеристик: (а) один или более экзогенный полинуклеотид (-ов) содержит первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одной или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в нечеловеческом организме или его части, и второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов,
(b) если нечеловеческий организм представляет собой растение, то вегетирующая часть растения имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере около 3%, более предпочтительно по меньшей мере около 5%, по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14% или более предпочтительно по меньшей мере около 15% (мас./мас., сухой вес), (с) нечеловеческий организм представляет собой водоросли, выбранные из группы, состоящей из диатомовых водорослей (бациллариофиты), зеленых водорослей (хлорофиты), сине-зеленых водорослей (цианофиты), золотисто-коричневых водорослей (хризофиты), гаптофитов, коричневых водорослей и гетероконтных водорослей,
(d) один или более неполярный липид (-ов) содержит жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любую из двух, трех, четырех, пяти или шести из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей,
(e) общее содержание жирных кислот в неполярном липиде (-ах) составляет по меньшей мере на 2% больше олеиновой кислоты и/или по меньшей мере на 2% меньше пальмитиновой кислоты, чем неполярный липид (-ы) в соответствующем нечеловеческом организме или его части, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов,
(f) неполярный липид (-ы) содержит измененную концентрацию общих стеролов, предпочтительно свободных (неэстерифицированных) стеролов, стероиловых эфиров, стероил-гликозидов, относительно неполярного липида (-ов) в соответствующем нечеловеческом организме или его части, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов,
(g) неполярный липид (-ы) содержит воски и/или восковые эфиры, и
(h) нечеловеческий организм или его часть представляет собой один член из объединенной популяции или совокупности по меньшей мере из 1000 таких нечеловеческих организмов или их частей, соответственно, из которых экстрагированы липиды.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что один или более экзогенный полинуклеотид (-ов) содержит первый экзогенный полинуклеотид и второй экзогенный полинуклеотид, и при этом применима одна или более, или все из характеристик (b)-(h).
8. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что
(i) нечеловеческий организм представляет собой растение, водоросль или организм, подходящий для ферментации, такой как грибы, или
(ii) часть нечеловеческого организма представляет собой семя, плод или вегетирующую часть растения.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанная часть представляет собой семя растения, а экстрагированный липид представляет собой масло семян.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что растение представляет собой, или вегетирующая часть растения получена из видов, выбранных из группы, состоящей из Acrocomia aculeate (пальма макауба), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (арахис), Astrocaryum murumuru (мурумуру), Astrocaryum vulgare (tuсuma), Attalea geraensis (Indaia-rateiro), Attalea humilis (американская масличная пальма), Attalea oleifera (andaia), Attalea phalerata (урикури), Attalea speciosa (бабассу), Avena sativa (овес), Beta vulgaris (сахарная свекла), виды Brassica, такие как Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (канола), Camelina sativa (ложный лен), Cannabis sativa (конопля), Carthamus tinctorius (сафлор), Caryocar brasiliense (кариокар), Cocos nucifera (кокосовый орех), Crambe abyssinica (абиссинская капуста), Cucumis melo (дыня), Elaeis guineensis (африканская пальма), Glycine max (соя), Gossypium hirsutum (хлопок), виды Helianthus, такие как Helianthus annuus (подсолнечник), Hordeum vulgare (ячмень), Jatropha curcas (лекарственный орех), Joannesia princeps (ореховое дерево apapa), виды Lemna (ряска), такие как Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (ряска горбатая), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (ойтикика), Linum usitatissimum (лен), Lupinus angustifolius (люпин), Mauritia flexuosa (пальма бурити), Maximiliana maripa (пальма инайа), виды Miscanthus, такие как Miscanthus x giganteus и Miscanthus sinensis, виды Nicotiana (табак), такие как Nicotiana tabacum или Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba-do-azeite), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque), виды Oryza (рис), такие как Oryza sativa и Oryza glaberrima, Panicum virgatum (просо прутьевидное), Paraqueiba paraensis (марь), Persea amencana (авокадо), Pongamia pinnata (индийский бук), Populus trichocarpa, Ricinus communis (клещевина обыкновенная), виды Saccharum (сахарный тростник), Sesamum indicum (кунжут), Solanum tuberosum (картофель), виды Sorghum, такие как Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (купуасу), виды Trifolium, Trithrinax brasiliensis (бразильская игольчатая пальма), виды Triticum (пшеница), такие как Triticum aestivum и Zea mays (кукуруза).
11. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного масла канолы, включающий стадии:
i) получение семян канолы, содержащих по меньшей мере 45 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян канолы, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого масла канолы.
12. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного кукурузного масла, включающий стадии:
i) получение кукурузных семян, содержащих по меньшей мере 5 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян кукурузы, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого кукурузного масла.
13. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного соевого масла, включающий стадии:
i) получение соевых семян, содержащих по меньшей мере 20 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян сои, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого соевого масла.
14. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного масла семян люпина, включающий стадии:
i) получение семян люпина, содержащих по меньшей мере 10 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян люпина, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого масла семян люпина.
15. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного арахисового масла, включающий стадии:
i) получение арахисовых орехов, содержащих по меньшей мере 50 мас. % масла,
ii) экстракция масла из арахисовых орехов, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого арахисового масла.
16. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного подсолнечного масла, включающий стадии:
i) получение семян подсолнечника, содержащих по меньшей мере 50 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян подсолнечника, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого подсолнечного масла.
17. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного хлопкового масла, включающий стадии:
i) получение семян хлопка, содержащих по меньшей мере 41 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян хлопка, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого хлопкового масла.
18. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного сафлорового масла, включающий стадии:
i) получение сафлоровых семян, содержащих по меньшей мере 35 мас. % масла,
ii) экстракция масла из сафлоровых семян, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого сафлорового масла.
19. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного масла семян льна, включающий стадии:
i) получение семян льна, содержащих по меньшей мере 36 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян льна, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого масла семян льна.
20. Способ по п. 6 или 7, являющимся способом получения экстрагированного рыжикового масла, включающий стадии:
i) получение семян Camelina sativa, содержащих по меньшей мере 36 мас. % масла,
ii) экстракция масла из семян Camelina sativa, и
iii) выделение масла, причем выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
с получением посредством этого рыжикового масла.
21. Способ по п. 6 или 7, который включает одно или более из высушивания, раскатывания, прессования, измельчения или помола вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, или семян и/или очистку экстрагированных липидов или масла.
22. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что нечеловеческий организм, содержащий один или более экзогенный полинуклеотид (-ов), представляет собой жировые грибки, такие как жировые дрожжи.
23. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что в процессе экстракции используют органический растворитель для экстрагирования масла.
24. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что включает выделение экстрагированных липидов или масла путем его сбора в контейнер и/или выполнение одного или более из дегумирования, дезодорации, обесцвечивания, высушивания, фракционирования экстрагированных липидов или масла, удаления по меньшей мере некоторых восков и/или восковых эфиров из экстрагированных липидов или масла, или анализа состава жирных кислот экстрагированных липидов или масла.
25. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что объем экстрагированных липидов или масла составляет по меньшей мере 1 л.
26. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что применима одна или более, или все из следующих характеристик:
(i) экстрагированные липиды или масло содержат триацилглицерины, при этом триацилглицерины составляют по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% или 96% от экстрагированных липидов или масла,
(ii) экстрагированные липиды или масло содержат свободные стеролы, стероиловые эфиры, стероил-гликозиды, воски или восковые эфиры или любую их комбинацию, и
(iii) общее содержание стерола и/или композиции в экстрагированных липидах или масле существенно отличается от содержания стерола и/или композиции в экстрагированных липидах или масле, полученных из соответствующего нечеловеческого организма или его части, или семян.
27. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает превращение экстрагированных липидов или масла в промышленный продукт.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что промышленный продукт представляет собой углеводородный продукт, такой как сложные эфиры жирных кислот, предпочтительно метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, такой как метан, этан или длинноцепочечный алкан, смесь длинноцепочечных алканов, алкен, биотопливо, монооксид углерода и/или газообразный водород, биоспирт, такой как этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля.
29. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения или часть нечеловеческого организма представляет собой наземную часть растения или зеленую часть растения, такую как лист или стебель растения.
30. Способ по п. 1 или 6, дополнительно включающий стадию сбора вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, предпочтительно с помощью механической уборочной машины, или способом, включающим фильтрацию, центрифугирование, осаждение, флотацию или флокуляцию водорослевых или грибковых организмов, таким как регуляция рН среды.
31. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что применима одна или более, или все из следующих характеристик:
(i) концентрация одного или более неполярных липидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении, чем концентрация в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, соответственно, не содержащих одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов),
(ii) концентрация одного или более неполярных липидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, соответственно, не содержащих одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов),
(iii) общее содержание неполярных липидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении, чем концентрация в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, соответственно, не содержащих одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов),
(iv) общее содержание неполярных липидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, соответственно, не содержащих одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов),
(v) концентрация одного или более неполярных липидов и/или общее содержание неполярных липидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении и/или по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, соответственно, которые не содержат одного или более экзогенного полинуклеотида и которые содержат экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT1 Arabidopsis thaliana,
(vi) содержание TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG в липидах в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в липидах, экстрагированных из них, по меньшей мере на 10% больше в относительном выражении, чем содержание TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG в липидах в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, не содержащих одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов), или в соответствующих липидах, экстрагированных из них, соответственно, и
(vii) общее содержание полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) в липидах в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, и/или в экстрагированных из них липидах увеличивается или снижается, по сравнению с общим содержанием PUFA в липидах в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, не содержащих одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов), или в соответствующих липидах, экстрагированных из них, соответственно.
32. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что концентрация PUFA в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, и/или в липидах, экстрагированных из них, увеличивается или снижается, по сравнению с концентрацией PUFA в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в соответствующих липидах, экстрагированных из них, соответственно, при этом полиненасыщенная жирная кислота представляет собой эйкозадиеновую кислоту, арахидоновую кислоту (ARA), альфа-линоленовую кислоту (ALA), стеаридоновую кислоту (SDA), эйкозатриеновую кислоту (ЕТЕ), эйкозатетраеновую кислоту (ЕТА), эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), докозапентаеновую кислоту (DPA), докозагексаеновую кислоту (DHA) или комбинацию двух или более из них.
33. Способ по п. 6, отличающийся тем, что соответствующая вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть представляет собой нетрансгенную вегетирующую часть растения, нечеловеческий организм или его часть, соответственно.
34. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что применима одна или более, или все из следующих характеристик
(i) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 20% (мол. %), по меньшей мере 22% (мол. %), по меньшей мере 30% (мол. %), по меньшей мере 40% (мол. %), по меньшей мере 50% (мол. %), по меньшей мере 60% (мол. %), предпочтительно по меньшей мере 65% или по меньшей мере 66% (мол. %) от общего содержания жирных кислот в неполярных липидах или масле в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семянах,
ii) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 20% (мол. %), по меньшей мере 22% (мол. %), по меньшей мере 30% (мол. %), по меньшей мере 40% (мол. %), по меньшей мере 50% (мол. %), по меньшей мере 60% (мол. %), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол. %) или по меньшей мере 66% (мол. %) от общего содержания жирных кислот в экстрагированных липидах или масле,
(iii) неполярные липиды или масло в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах содержат жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей, и
(iv) экстрагированные липиды или масло содержат гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей.
35. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что концентрация липидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах и/или в экстрагированных липидах, или масле может быть определена анализом с использованием газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, полученных из экстрагированных липидов или масла.
36. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что этот способ дополнительно включает сбор вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, или семян из растения.
37. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена содержат первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно, и второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов, при этом первый и второй экзогенный полинуклеотиды функционально связаны с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что первый экзогенный полинуклеотид кодирует фактор транскрипции Wrinkled 1 (WRI1), фактор транскрипции Leafy Cotyledon 1 (Lec1), фактор транскрипции Leafy Cotyledon 2 (LEC2), фактор транскрипции Fus3, фактор транскрипции ABI3, фактор транскрипции Dof4, фактор транскрипции BABY BOOM (ВВМ) или фактор транскрипции Dofl 1.
39. Способ по п. 37, отличающийся тем, что второй экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий активностью моноацилглицерин-ацилтренсферазы (MGAT) и/или активностью диацилглицерин-ацилтрансферазы (DGAT), или активностью глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (GPAT).
40. Способ по п. 37, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена дополнительно содержат третий или более экзогенный полинуклеотид (-ы), который кодирует одно или более, или все, или любую комбинацию из следующих:
i) дополнительную НК или полипептид фактора транскрипции, который увеличивает экспрессию одного или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в нечеловеческом организме или его части,
ii) дополнительную РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов,
iii) полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, предпочтительно олеозин, такой как полиолеозин или калеозин, более предпочтительно полиолеозин,
iv) молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, участвующий в биосинтезе крахмала, такой как полипептид АГФазы,
v) молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, участвующий в разложении липидов, и/или который снижает содержание липидов, такой как липаза, такая как полипептид CGi58, или
vi) полипептид молчащего супрессора,
при этом третий или более экзогенный полинуклеотид (-ы) функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида (-ов) в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что третий полинуклеотид кодирует олеозин, такой как полиолеозин или калеозин.
42. Способ по п. 37, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена содержат один или более экзогенный полинуклеотид (-ы), который кодирует:
i) фактор транскрипции Wrinkled 1 (WRI1) и DGAT,
ii) фактор транскрипции WRI1 и DGAT, и олеозин,
iii) фактор транскрипции WRI1, DGAT, MGAT и олеозин,
iv) моноацилглицерин-ацилтрансферазу (MGAT),
v) диацилглицерин-ацилтрансферазу 2 (DGAT2),
vi) MGAT и глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазу (GPAT),
vii) MGAT и DGAT,
viii) MGAT, GPAT и DGAT,
ix) фактор транскрипции WRI1 и MGAT,
x) фактор транскрипции WRI1, DGAT и MGAT,
xi) фактор транскрипции WRI1, DGAT, MGAT, олеозин и GPAT,
xii) DGAT и олеозин, или
xiii) MGAT и олеозин, и
xiv) необязательно полипептид молчащего супрессора,
где каждый из одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов) функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что
(i) GPAT также обладает активностью фосфатазы для выработки MAG, такой как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность GPAT4 или GPAT6 Arabidopsis, и/или
(ii) DGAT представляет собой DGAT1 или DGAT2, и/или
(iii) MGAT представляет собой MGAT1 или MGAT2.
44. Способ по п. 37, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена содержат:
i) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, и второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1,
ii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, и третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин,
iii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2,
iv) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
v) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
vi) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58,
vii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
viii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2,
ix) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, пятый экзогенный полинулеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и шестой экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что применима одна или более из следующих характеристик:
i) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие DGAT и олеозин, функционально связаны с конститутивным промотором или промотором, активным в зеленых тканях растения по меньшей мере до и вплоть до цветения, который может направлять экспрессию полинуклеотидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах,
ii) экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1 и молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, функционально связан с конститутивным промотором, промотором, активным в зеленых тканях растения по меньшей мере до и вплоть до цветения, или с индуцибельным промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, и
iii) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие LEC2, ВВМ и/или MGAT2, функционально связаны с индуцибельным промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах.
46. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14%, или более предпочтительно по меньшей мере около 15% (мас./мас., сухой вес).
47. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения имеет общее содержание TAG по меньшей мере 7%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14%, более предпочтительно по меньшей мере около 15%, или более предпочтительно по меньшей мере около 17% (мас./мас., сухой вес).
48. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена, предпочтительно вегетирующая часть растения содержит первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, при этом вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена обладают одной или более, или всеми из следующих характеристик:
i) общее содержание липидов составляет по меньшей мере 8%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 14% или по меньшей мере 15,5% (мас. % от сухого веса или веса семян),
ii) по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз или по меньшей мере в 10 раз более высокое общее содержание липидов в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
iii) общее содержание TAG составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 6,5% или по меньшей мере 7% (вес. % от сухого веса или веса семян),
iv) по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 100 раз более высокое общее содержание TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
v) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 15%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 22 мас. % от жирных кислот в TAG,
vi) по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз или по меньшей мере в 17 раз более высокая концентрация олеиновой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
vii) пальмитиновая кислота составляет по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 33 мас. % от жирных кислот в TAG,
viii) по меньшей мере в 1,5 раза более высокая концентрация пальмитиновой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
ix) линолевая кислота составляет по меньшей мере 22%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 34 мас. % от жирных кислот в TAG,
x) α-линоленовая кислота составляет менее 20%, менее 15%, менее 11% или менее 8 мас. % от жирных кислот в TAG, и
xi) по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 8 раз более низкая концентрация α-линоленовой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов.
49. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена, предпочтительно вегетирующая часть растения содержит первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, при этом вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена обладают одной или более, или всеми из следующих характеристик:
i) общее содержание TAG составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 12,5%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 17% (мас. % от сухого веса или веса семян),
ii) по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 100 раз более высокое общее содержание TAG в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
iii) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 19%, по меньшей мере 22% или по меньшей мере 25 мас. % от жирных кислот в TAG,
iv) по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 17 раз или по меньшей мере в 19 раз более высокая концентрация олеиновой кислоты в TAG в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
v) пальмитиновая кислота составляет по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25% или по меньшей мере 28 мас. % от жирных кислот в TAG,
vi) по меньшей мере в 1,25 раза более высокая концентрация пальмитиновой кислоты в TAG в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
vii) линолевая кислота составляет по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20 мас. % от жирных кислот в TAG,
viii) α-линоленовая кислота составляет менее 15%, менее 11% или менее 8 мас. % от жирных кислот в TAG, и
ix) по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 8 раз более низкая концентрация α-линоленовой кислоты в TAG в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов.
50. Способ по п. 42, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена ниже как любая из SEQ ID NO: 231-278,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена ниже как любая из SEQ ID NO: 279-337, или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) нуклеотиды, которые гибридизуются с любым из i) - iii) при жестких условиях.
51. Способ по п. 42, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 204-211, 338-346,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 83, 212-219, 347-355, или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
52. Способ по п. 42, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 1-44,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 45-82 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
53. Способ по п. 42, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий GPAT, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 84-143,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 144-203 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
54. Способ по п. 42, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT2, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 204-211,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 212-219 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
55. Способ по п. 42, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 389-408,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 362-388 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
56. Способ по п. 44, отличающийся тем, что полипептид CGi58 содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 422-428,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 429-436 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
57. Способ по п. 44, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 437-439,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 442-444 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
58. Способ по п. 44, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий ВВМ, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 440 или 441,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 445 или 446, или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
59. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена содержат одно или более из следующих:
(i) одна или более внедренных мутаций в гене, который кодирует эндогенный фермент растения, вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, или семян, соответственно, или
(ii) экзогенный полинуклеотид, который понижающе регулирует выработку и/или активность эндогенного фермента растения, вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, или семян, соответственно,
при этом каждый эндогенный фермент выбран из группы, состоящей из DGAT, sn-1 глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (sn-1 GPAT), 1-ацил-глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (LPAAT), ацил-СоА: лизофосфатидилхолин-ацилтрансферазы (LPCAT), фосфатазы фосфатидных кислот (РАР), фермента, участвующего в биосинтезе крахмала, такого как пирофосфорилаза (АДФ)-глюкозы (АГФаза), десатуразы жирных кислот, такой как десатураза жирных кислот Δ12 (FAD2), полипептида, участвующего в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза, такая как полипептид CGi58, или комбинации двух или более из них.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что экзогенный полинуклеотид выбран из группы, состоящей из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида, каталитического полинуклеотида, микро РНК, полинуклеотида, который кодирует полипептид, который связывается с эндогенным ферментом, двухцепочечной молекулы РНК или процессированной молекулы РНК, полученной из нее.
61. Способ по п. 1 или 6, отличающийся тем, что общие неполярные липиды, экстрагированные липиды или масло содержат:
(i) неполярные липиды, которые представляют собой TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG, и
(ii) специфическую PUFA, которая представляет собой EDA, ARA, SDA, ETA, ЕРА, DPA, DHA, при этом концентрация специфической PUFA составляет по меньшей мере 1% от общего содержания жирных кислот в неполярных липидах, или комбинацию двух или более из специфических PUFA, или
(iii) жирную кислоту, которая содержится в концентрации по меньшей мере 1% от общего содержания жирных кислот в неполярных липидах, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть или вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей.
62. Растение, содержащее вегетирующую часть, или его вегетирующая часть, отличающееся тем, что указанная вегетирующая часть имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере около 3%, более предпочтительно по меньшей мере около 5%, предпочтительно по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14% или более предпочтительно по меньшей мере около 15% (мас./мас., сухой вес), при этом неполярные липиды содержат по меньшей мере 90% триацилглицеринов (TAG).
63. Растение по п. 62, являющееся канолой, содержащей семена канолы, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 45 мас. %.
64. Растение по п. 62, являющееся кукурузой, содержащей семена кукурузы, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 5 мас. %.
65. Растение по п. 62, являющееся соей, содержащей семена сои, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 20 мас. %.
66. Растение по п. 62, являющееся люпином, содержащим семена люпина, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 10 мас. %.
67. Растение по п. 62, являющееся арахисом, содержащим арахисовые орехи, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 50 мас. %.
68. Растение по п. 62, являющееся подсолнечником, содержащим семена подсолнечника, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 50 мас. %.
69. Растение п. 62, являющееся хлопчатником, содержащим семена хлопчатника, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 41 мас. %.
70. Растение по п. 62, являющееся сафлором, содержащим семена сафлора, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 35 мас. %.
71. Растение по п. 62, являющееся льном, содержащим семена льна, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 36 мас. %.
72. Растение по п. 62, являющееся Camelina sativa, содержащим семена Camelina sativa, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 36 мас. %.
73. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, которая обладает одной или более, или всеми из следующих характеристик:
(i) олеиновая кислота в вегетирующей части растения или в семенах растения находится в эстерифицированной или неэстерифицированной форме, при этом по меньшей мере 20% (мол. %), по меньшей мере 22% (мол. %), по меньшей мере 30% (мол. %), по меньшей мере 40% (мол. %), по меньшей мере 50% (мол.%) или по меньшей мере 60% (мол. %), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол. %) или по меньшей мере 66% (мол. %) от общих жирных в содержании липидов в вегетирующей части или в семенах составляет олеиновая кислота,
(ii) олеиновая кислота в вегетирующей части растения или в семенах растения находится в эстерифицированной форме в неполярных липидах, при этом по меньшей мере 20% (мол. %), по меньшей мере 22% (мол. %), по меньшей мере 30% (мол. %), по меньшей мере 40% (мол. %), по меньшей мере 50% (мол. %) или по меньшей мере 60% (мол. %), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол. %) или по меньшей мере 66% (мол. %) от общих жирных кислот в содержании неполярных липидов в вегетирующей части или в семенах составляет олеиновая кислота,
(iii) модифицированная жирная кислота в вегетирующей части или в семенах растения находится в эстерифицированной или неэстерифицированной форме, предпочтительно в эстерифицированной форме в неполярных липидах вегетирующей части растения или семян, при этом указанная модифицированная жирная кислота содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей, и
(iv) воски и/или восковые эфиры в неполярных липидах вегетирующей части растения или в семенах растения.
74. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62 или 63, которое представляет собой члена популяции или группы по меньшей мере из около 1000 таких растений или частей.
75. Растение по п. 62, которое является частью популяции по меньшей мере из около 1000 растений, каждое из которых представляет собой растение по п. 62, выращенное в поле.
76. Вегетирующая часть растения по п. 62, которая входит в группу по меньшей мере из около 1000 вегетирующих частей растений, каждая из которых представляет собой вегетирующую часть растения по п. 62, при этом указанные вегетирующие части растения собраны из растений, выращенных в поле.
77. Нечеловеческий организм или его часть, содержащий один или более экзогенный полинуклеотид (-ов) и повышенную концентрацию одного или более неполярного липида (-ов), по сравнению с соответствующим нечеловеческим организмом или его частью, не содержащими одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов), при этом каждый из одного или более экзогенных полинуклеотидов функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида в нечеловеческом организме или его части, и при этом применима одна или более, или все из следующих характеристик:
(i) один или более экзогенный полинуклеотид (-ы) содержит первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий РНК или полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в нечеловеческом организме или его части, и второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов,
(ii) если нечеловеческий организм представляет собой растение, то вегетирующая часть этого растения имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере около 3%, более предпочтительно по меньшей мере около 5%, предпочтительно по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14% или более предпочтительно по меньшей мере около 15% (мас./мас., сухой вес),
(iii) нечеловеческий организм представляет собой водоросли, выбранные из группы, состоящей из диатомовых водорослей (бациллариофиты), зеленых водорослей (хлорофиты), сине-зеленых водорослей (цианофиты), золотисто-коричневых водорослей (хризофиты), гаптофитов, коричневых водорослей и гетероконтных водорослей,
(iv) неполярный липид (-ы) содержит жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей,
(v) нечеловеческий организм или его часть содержит олеиновую кислоту в эстерифицированной или неэстерифицированной форме в его липидах, при этом по меньшей мере 20% (мол. %), по меньшей мере 22% (мол. %), по меньшей мере 30% (мол. %), по меньшей мере 40% (мол. %), по меньшей мере 50% (мол. %) или по меньшей мере 60% (мол. %), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол. %) или по меньшей мере 66% (мол.%) от общих жирных кислот в липидах нечеловеческого организма или его части составляет олеиновая кислота,
(vi) нечеловеческий организм или его часть содержит олеиновую кислоту в эстерифицированной форме в его неполярных липидах, при этом по меньшей мере 20% (мол. %), по меньшей мере 22% (мол. %), по меньшей мере 30% (мол. %), по меньшей мере 40% (мол. %), по меньшей мере 50% (мол. %) или по меньшей мере 60% (мол. %), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол. %) или по меньшей мере 66% (мол. %) от общих жирных кислот в неполярных липидах растения или вегетирующей части растения составляет олеиновая кислота,
(vii) общее содержание жирных кислот в липидах нечеловеческого организма или его части составляет по меньшей мере на 2% больше олеиновой кислоты и/или по меньшей мере на 2% меньше пальмитиновой кислоты, чем в липидах в соответствующем нечеловеческом организме или его части, не содержащих одного или более экзогенных полинуклеотидов,
(viii) общее содержание жирных кислот в неполярных липидах вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, или семян составляет по меньшей мере на 2% больше олеиновой кислоты и/или по меньшей мере на 2% меньше пальмитиновой кислоты, чем в неполярных липидах в соответствующей вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, не содержащих одного или более экзогенных полинуклеотидов,
(ix) неполярный липид (-ы) содержит измененную концентрацию общих стеролов, предпочтительно свободных стеролов, стероиловых эфиров и/или стероил-гликозидов,
(x) неполярный липид (-ы) содержит воски и/или восковые эфиры, и
(xi) нечеловеческий организм или его часть представляет собой одного члена популяции или совокупности по меньшей мере примерно из 1000 таких нечеловеческих организмов или их частей.
78. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77, отличающийся тем, что один или более экзогенный полинуклеотид (-ы) содержит первый экзогенный полинуклеотид и второй экзогенный полинуклеотид, и при этом применима одна или более, или все из характеристик (ii)-(xi).
79. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, отличающийся тем, что указанный неполярный организм представляет собой растение, водоросль или организм, подходящий для ферментации, такой как грибы.
80. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, отличающийся тем, что указанная часть нечеловеческого организма представляет собой семя, плод или вегетирующую часть растения, такую как наземная часть растения или зеленая часть, такая как лист или стебель.
81. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть по п. 80 или 81, отличающееся тем, что растение представляет собой Acrocomia aculeate (пальма макауба), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (арахис), Astrocaryum murumuru (мурумуру), Astrocaryum vulgare (тукума), Attalea geraensis (Indaia-rateiro), Attalea humilis (американская масличная пальма), Attalea oleifera (andaia), Attalea phalerata (урикури), Attalea speciosa (бабассу), Avena sativa (овес), Beta vulgaris (сахарная свекла), виды Brassica, такие как Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (канола), Camelina sativa (ложный лен), Cannabis sativa (конопля), Carthamus tinctorius (сафлор), Caryocar brasiliense (кариокар), Cocos nucifera (кокосовый орех), Crambe abyssinica (абиссинская капуста), Cucumis melo (дыня), Elaeis guineensis (африканская пальма), Glycine max (соя), Gossypium hirsutum (хлопок), виды Helianthus, такие как Helianthus annuus (подсолнечник), Hordeum vulgare (ячмень), Jatropha curcas (лекарственный орех), Joannesia princeps (ореховое дерево apapa), виды Lemna (ряска), такие как Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (ряска горбатая), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (ойтикика), Linum usitatissimum (лен), Lupinus angustifolius (люпин), Mauritia flexuosa (пальма бурити), Maximiliana maripa (пальма инайа), виды Miscanthus, такие как Miscanthus x giganteus и Miscanthus sinensis, виды Nicotiana (табак), такие как Nicotiana tabacum или Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba-do-azeite), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque), виды Oryza (рис), такие как Oryza sativa и Oryza glaberrima, Panicum virgatum (просо прутьевидное), Paraqueiba paraensis (марь), Persea amencana (авокадо), Pongamia pinnata (индийский бук), Populus trichocarpa, Ricinus communis (клещевина обыкновенная), виды Saccharum (сахарный тростник), Sesamum indicum (кунжут), Solanum tuberosum (картофель), виды Sorghum, такие как Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (купуасу), виды Trifolium, Trithrinax brasiliensis (бразильская игольчатая пальма), виды Triticum (пшеница), такие как Triticum aestivum и Zea mays (кукуруза).
82. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, отличающийся тем, что указанный нечеловеческий организм представляет собой грибы, предпочтительно жировые грибы, такие как жировые дрожжи.
83. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, отличающийся тем, что общее содержание стерола и/или композиции в неполярных липидах существенно отличается от общего содержания стирола и/или композиции в неполярных липидах в соответствующем нечеловеческом организме или его части, не содержащих одного или более экзогенных полинуклеотидов.
84. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, отличающийся тем, что повышенная концентрация одного или более неполярного липида (-ов) является такой, что применима одна или более, или все из следующих характеристик:
(i) концентрация по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении, чем концентрация в соответствующем нечеловеческом организме или его части,
(ii) концентрация по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем в соответствующем нечеловеческом организме или его части,
(iii) общее содержание неполярных липидов в нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении, чем содержание в соответствующем нечеловеческом организме или его части, соответственно,
(iv) общее содержание неполярных липидов в нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем содержание в соответствующем нечеловеческом организме или его части, соответственно, и
(v) концентрация одного или более неполярного липида (-ов) и/или общее содержание неполярных липидов в нечеловеческом организме или его части по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении и/или по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем в соответствующем нечеловеческом организме или его части, соответственно, не содержащих одного или более экзогенных полинуклеотидов, и которые содержат экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT1 Arabidopsis thaliana.
85. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, который содержит:
(i) содержание TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG, которое по меньшей мере на 10% больше в относительном выражении, чем содержание TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG в соответствующем нечеловеческом организме или его части, и/или
(ii) общее содержание полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), которое является повышенным или пониженным, по сравнению с общим содержанием PUFA в соответствующем нечеловеческом организме или его части.
86. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, содержащий повышенную концентрацию PUFA, по сравнению с концентрацией PUFA в соответствующем нечеловеческом организме или его части, не содержащих одного или более экзогенных полинуклеотидов, при этом PUFA представляет собой эйкозадиеновую кислоту, арахидоновую кислоту (ARA), альфалиноленовую кислоту (ALA), стеаридоновую кислоту (SDA), эйкозатриеновую кислоту (ЕТЕ), эйкозатетраеновую кислоту (ЕТА), эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), докозапентаеновую кислоту (DPA), докозагексаеновую кислоту (DHA) или комбинацию двух или более из них.
87. Растение или вегетирующая часть по п. 62, отличающееся тем, что общее содержание неполярных липидов или одного или более неполярных липидов, и/или концентрация олеиновой кислоты или PUFA в растении или его вегетирующей части может быть определено анализом с использованием газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, полученных из растения или его вегетирующей части.
88. Нечеловеческий организм или его часть по п. 77 или 78, отличающийся тем, что концентрация общих неполярных липидов или одного или более неполярных липидов, и/или концентрация олеиновой кислоты или PUFA в нечеловеческом организме или его части может быть определена анализом с использованием газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, полученных из нечеловеческого организма или его части.
89. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, которые содержат первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в растении, вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно, и второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов, при этом каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида в растении, вегетирующей части растения или в нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно.
90. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что первый экзогенный полинуклеотид кодирует фактор транскрипции Wrinkled 1 (WRI1), фактор транскрипции Leafy Cotyledon 1 (Lec1), фактор транскрипции Leafy Cotyledon 2 (LEC2), фактор транскрипции Fus3, фактор транскрипции ABI3, фактор транскрипции Dof4, фактор транскрипции BABY BOOM (ВВМ) или фактор транскрипции Dofl 1.
91. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что второй экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, обладающий активностью моноацилглицерин-ацилтрансферазы (MGAT), и/или активностью диацилглицерин-ацилтрансферазы (DGAT), или активностью глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (GPAT).
92. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена дополнительно содержат третий или более экзогенный полинуклеотид (-ы), который кодирует одно или более, или любую комбинацию из следующих:
i) дополнительную РНК или полипептид фактора транскрипции, который увеличивает экспрессию одного или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в нечеловеческом организме или его части,
ii) дополнительную РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов,
iii) полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, предпочтительно олеозин, такой как полиолеозин или калеозин, более предпочтительно полиолеозин,
iv) молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, участвующий в биосинтезе крахмала, такой как полипептид АГФазы,
v) молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, участвующий в разложении липидов, и/или который снижает содержание липидов, такой как липаза, такая как полипептид CGi58, или
vi) полипептид молчащего супрессора, при этом третий или более экзогенный полинуклеотид (-ы) функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида (-ов) в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно.
93. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 92, отличающиеся тем, что третий полинуклеотид кодирует олеозин, такой как полиолеозин или калеозин.
94. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена содержат один или более экзогенных полинуклеотидов, которые кодируют:
i) фактор транскрипции Wrinkled 1 (WRI1) и DGAT,
ii) фактор транскрипции WRI1 и DGAT, и олеозин,
iii) фактор транскрипции WRI1, DGAT, MGAT и олеозин,
iv) моноацилглицерин-ацилтрансферазу (MGAT),
v) диацилглицерин-ацилтрансферазу 2 (DGAT2),
vi) MGAT и глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазу (GPAT),
vii) MGAT и DGAT,
viii) MGAT, GPAT и DGAT,
ix) фактор транскрипции WRI1 и MGAT,
x) фактор транскрипции WRI1, DGAT и MGAT
xi) фактор транскрипции WRJ1, DGAT, MGAT, олеозин и GPAT,
xii) DGAT и олеозин, или
xiii) MGAT и олеозин, и
xiv) необязательно полипептид молчащего супрессора,
где каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида в растении, вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, соответственно.
95. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть по п. 94, отличающиеся тем, что
(i) GPAT также обладает активностью фосфатазы для выработки MAG, такой как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность GPAT4 или GPAT6 Arabidopsis, и/или
(ii) DGAT представляет собой DGAT1 или DGAT2, и/или
(iii) MGAT представляет собой MGAT1 или MGAT2.
96. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 94, отличающиеся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена содержат:
i) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, и второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1,
ii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WPJ1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, и третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин,
iii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2,
iv) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
v) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
vi) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58,
vii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
viii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2,
ix) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, пятый экзогенный полинулеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и шестой экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ.
97. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 96, отличающиеся тем, что применима одна или более из следующих характеристик:
i) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие DGAT и олеозин, функционально связаны с конститутивным промотором или промотором, активным в зеленых тканях растения по меньшей мере до и вплоть до цветения, который может направлять экспрессию полинуклеотидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах,
ii) экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, функционально связан с конститутивным промотором, промотором, активным в зеленых тканях растения по меньшей мере до и вплоть до цветения, или с индуцибельным промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, и
iii) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие LEC2, ВВМ и/или MGAT2, функционально связаны с индуцибельным промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотидов в вегетирующей части растения, нечеловеческом организме или его части, или в семенах.
98. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что вегетирующая часть растения имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14% или более предпочтительно по меньшей мере около 15% (мас./мас., сухой вес или вес семян).
99. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что вегетирующая часть растения имеет общее содержание TAG по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14%, более предпочтительно по меньшей мере около 15% или более предпочтительно по меньшей мере около 17% (мас./мас., сухой вес или вес семян).
100. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, которые содержат первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, при этом вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена обладают одной или более, или всеми следующими характеристиками:
i) общее содержание липидов составляет по меньшей мере 8%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 14% или по меньшей мере 15,5 мас. %,
ii) по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз или по меньшей мере в 10 раз более высокое общее содержание липидов в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
iii) общее содержание TAG составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 6,5% или по меньшей мере 7% (вес. % от сухого веса или веса семян),
iv) по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 100 раз более высокое общее содержание TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
v) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 15%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 22% (мас. % от сухого веса или веса семян) жирных кислот в TAG,
vi) по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз или по меньшей мере в 17 раз более высокая концентрация олеиновой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
vii) пальмитиновая кислота составляет по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 33 мас. % жирных кислот в TAG,
viii) по меньшей мере в 1,5 раза более высокая концентрация пальмитиновой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
ix) линолевая кислота составляет по меньшей мере 22%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 34 мас. % жирных кислот в TAG,
x) α-линоленвоая кислота составляет менее 20%, менее 15%, менее 11% или менее 8 мас. % жирных кислот в TAG, и
xi) по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 8 раз более низкая концентрация α-линоленовой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов.
101. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена, предпочтительно вегетирующая часть растения содержат первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, при этом вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена, обладают одной или более, или всеми следующими характеристиками:
i) общее содержание TAG составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 12,5%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 17% (мас. % от сухого веса или веса семян),
ii) по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 100 раз более высокое содержание TAG в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
iii) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 19%, по меньшей мере 22% или по меньшей мере 25 мас. % от жирных кислот в TAG,
iv) по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 17 раз или по меньшей мере в 19 раз более высокая концентрация олеиновой кислоты в TAG вегетирующей части растения или нечеловеческого организма, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
v) пальмитиновая кислота составляет по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25% или по меньшей мере 28 мас. % от жирных кислот в TAG,
vi) по меньшей мере в 1,25 раза более высокая концентрация пальмитиновой кислоты в TAG в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов,
vii) линолевая кислота составляет по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20 мас. % от жирных кислот в TAG,
viii) α-линоленовая кислота составляет менее 15%, менее 11% или менее 8 мас. % от жирных кислот в TAG, и
ix) по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 8 раз более низкая концентрация α-линоленовой кислоты TAG в вегетирующей части растения или нечеловеческом организме, по сравнению с соответствующей вегетирующей частью растения или нечеловеческим организмом, не содержащим экзогенных полинуклеотидов.
102. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 94, отличающиеся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена ниже как любая из SEQ ID NO: 231-278,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена ниже как любая из SEQ ID NO: 279-337, или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
103. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 94, отличающиеся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 204-211,338-346,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 83, 212-219,347-355, или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
104. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 94, отличающиеся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 1-44,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 45-82 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
105. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 94, отличающиеся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий GPAT, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 84-143,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 144-203 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
106. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 94, отличающиеся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT2, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 204-211,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 212-219 или их биологически активный фрагмент,
iii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
107. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 94, отличающиеся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, содержит одно или более из следующих:
i) нуклеотиды, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 389-408,
ii) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена далее как любая из SEQ ID NO: 362-388 или их биологически активный фрагмент,
iii) последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
iv) полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) при жестких условиях.
108. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, которые содержат
(i) одну или более внедренных мутаций в гене, который кодирует эндогенный фермент растения, вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, или семян, соответственно, и/или
(ii) экзогенный полинуклеотид, который понижающе регулирует выработку и/или активность эндогенного фермента растения, вегетирующей части растения, нечеловеческого организма или его части, или семян, соответственно,
при этом каждый эндогенный фермент выбран из группы, состоящей из DGAT, sn-1 глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (sn-1 GPAT), 1-ацил-глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (LPAAT), ацил-СоА: лизофосфатидилхолин-ацилтрансферазы (LPCAT), фосфатазы фосфатидных кислот (РАР), фермента, участвующего в биосинтезе крахмала, такого как пирофосфорилаза (АДФ)-глюкозы (АГФаза), десатуразы жирных кислот, такой как десатураза жирных кислот Δ12 (FAD2), полипептида, участвующего в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза, такая как полипептид CGi58, или комбинации двух или более из них.
109. Растение, вегетирующая часть растения, нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 108, отличающиеся тем, что экзогенный полинуклеотид выбран из группы, состоящей из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида, каталитического полинуклеотида, микроРНК, полинуклеотида, который кодирует полипептид, который связывается с эндогенным ферментом, двухцепочечной молекулы РНК или процессированной молекулы РНК, полученной из нее.
110. Растение или вегетирующая часть растения по п. 62, или нечеловеческий организм или его часть, или семена по п. 77, отличающиеся тем, что неполярные липиды
(i) содержат TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG, и
(ii) содержат специфическую PUFA, которая представляет собой EDA, ARA, SDA, ETA, ЕРА, DPA или DHA, при этом концентрация специфической PUFA составляет по меньшей мере 1% от общего содержания жирных кислот в неполярных липидах, или комбинацию двух или более из специфических PUFA, или
(iii) содержат кислоту, которая содержится в концентрации по меньшей мере 1% от общего содержания жирных кислот в неполярных липидах, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть или вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей.
111. Семена, полученные из растения по п. 62 или нечеловеческого организма по п. 77.
112. Семена по п. 111, которые содержат один или более экзогенных полинуклеотидов, как описано в п. 94.
113. Рекомбинантная клетка, содержащая один или более экзогенный полинуклеотид (-ов) и повышенную концентрацию одного или более неполярного липида (-ов), по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей одного или более экзогенного полинуклеотида (-ов),
при этом каждый из одного или более экзогенных полинуклеотидов функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке, и при этом применима одна или более, или все из следующих характеристик:
(a) один или более экзогенный полинуклеотид (-ов) содержит первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в нечеловеческом организме или его части, и второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов,
(b) если клетка представляет собой клетку вегетирующей части растения, то эта клетка имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере около 3%, более предпочтительно по меньшей мере около 5%, предпочтительно по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14% или более предпочтительно по меньшей мере около 15% (мас./мас.),
(c) клетка представляет собой водоросли, выбранные из группы, состоящей из диатомовых водорослей (бациллариофиты), зеленых водорослей (хлорофиты), сине-зеленых водорослей (цианофиты), золотисто-коричневых водорослей (хризофиты), гаптофитов, коричневых водорослей и гетероконтных водорослей,
(d) один или более неполярный липид (-ов) содержит жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей,
(e) общее содержание жирных кислот в неполярном липиде (-ах) составляет по меньшей мере на 2% больше олеиновой кислоты и/или по меньшей мере на 2% меньше пальмитиновой кислоты, чем в неполярном липиде (-ах) в соответствующей клетке, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов,
(f) неполярный липид (-ы) содержит измененную концентрацию общих стеролов, предпочтительно свободных (неэстерифицированных) стеролов, стероиловых эфиров, стероил-гликозидов, по сравнению с неполярным липидом(-ами) в соответствующей клетке, не содержащее одного или более экзогенных полинуклеотидов,
(g) неполярный липид (-ы) содержит воски и/или восковые эфиры, и
(h) клетка представляет собой одного члена популяции или группы по меньшей мере из около 1000 таких клеток.
114. Клетка по п. 113, отличающаяся тем, что один или более экзогенный полинуклеотид (-ов) содержит первый экзогенный полинуклеотид и второй экзогенный полинуклеотид, и при этом применима одна или более, или все характеристики (b) - (h).
115. Способ получения клетки с улучшенной способностью вырабатывать один или более неполярных липидов, включающий стадии:
i) внедрение в клетку одного или более экзогенных полинуклеотидов,
ii) экспрессия одного или более экзогенных полинуклеотидов в клетке или ее клетках-потомках,
iii) анализ содержания липидов в клетке или в клетках-потомках, и
iv) отбор клетки или клетки-потомка, имеющей повышенную концентрацию одного или более неполярных липидов, по сравнению с соответствующей клеткой или клеткой-потомком, не содержащей экзогенных полинуклеотидов, при этом один или более экзогенных полинуклеотидов кодируют
i) фактор транскрипции Wrinkled 1 (WRI1) и DGAT,
ii) фактор транскрипции WRI1 и DGAT, и олеозин,
iii) фактор транскрипции WRI1, DGAT, MGAT и олеозин,
iv) моноацилглицерин-ацилтрансферазу (MGAT),
v) диацилглицерин-ацилтрансферазу 2 (DGAT2),
vi) MGAT и глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазу (GPAT),
vii) MGAT и DGAT,
viii) MGAT, GPAT и DGAT,
x) фактор транскрипции WRI1 и MGAT,
x) фактор транскрипции WRI1, DGAT и MGAT,
xi) фактор транскрипции WRI1, DGAT, MGAT, олеозин и GPAT,
xii) DGAT и олеозин, или
xiii) MGAT и олеозин, и
xiv) необязательно полипептид молчащего супрессора,
при этом каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию экзогенного полинуклеотида в клетке или в клетке-потомке.
116. Способ по п. 115, отличающийся тем, что выбранная клетка или клетка-потомок содержит:
i) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, и второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1,
ii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, и третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин,
iii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2,
iv) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
v) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
vi) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58,
vii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ,
viii) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, и пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2,
ix) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, пятый экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, предпочтительно MGAT2, и шестой экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2 или ВВМ.
117. Способ по п. 115 или 116, отличающийся тем, что один или более экзогенных полинуклеотидов устойчиво интегрированы в геном клетки или клетки-потомка.
118. Способ по п. 117, дополнительно включающий стадию регенерации трансгенного растения из клетки или клетки-потомка, содержащей один или более экзогенных полинуклеотидов.
119. Способ по п. 118, отличающийся тем, что стадию регенерации трансгенного растения выполняют до стадии экспрессии одного или более экзогенных полинуклеотидов в клетке или ее клетке-потомке, и/или до стадии анализа содержания липидов в клетке или клетке-потомке, и/или до стадии отбора клетки или клетки-потомка, обладающей повышенной концентрацией одного или более неполярных липидов.
120. Способ по п. 118 или 119, который дополнительно включает стадию получения семян или растения-потомка из трансгенного растения, при этом семена или растение-потомок содержи один или более экзогенных полинуклеотидов.
121. Применение первого полинуклеотида, кодирующего РНК или полипептид фактора транскрипции, который увеличивает экспрессию одного или более гликолитических или жирнокислотных биосинтетических генов в клетке, нечеловеческом организме или его части, или в семенах, вместе со вторым полинуклеотидом, который кодирует РНК или полипептид, участвующий в биосинтезе одного или более неполярных липидов, для получения трансгенной клетки, трансгенного нечеловеческого организма или его части, или трансгенных семян, обладающих улучшенной способностью вырабатывать один или более неполярных липидов, по сравнению с соответствующей клеткой, нечеловеческим организмом или его частью, или с семенами, не содержащими первого и второго полинуклеотидов, при этом и первый, и второй полинуклеотиды являются экзогенными для клетки, нечеловеческого организма или его части, или для семян, и каждый из них функционально связан с промотором, который может направлять экспрессию полинуклеотида в трансгенной клетке, трансгенном нечеловеческом организме или его части, или в трансгенных семенах, соответственно.
122. Способ получения семян, включающий:
i) выращивание растения по п. 62 и
ii) сбор семян из растения.
123. Способ по п. 122, который включает выращивание популяции по меньшей мере из около 1000 растений, при этом каждое из них представляет собой растение по п. 62 и сбор семян из этой популяции растений.
124. Способ получения синтетического дизельного топлива, включающий:
i) превращение липидов в вегетирующей части растения по п. 62 или в нечеловеческом организме или его части по п. 77, в синтез-газ путем газификации, и
ii) превращение синтез-газа в биотопливо с использованием металлического катализатора или микробного катализатора.