СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ПОЧЕК
METHOD FOR PREDICTION OF CHRONIC KIDNEY DISEASE RISK

Настоящее изобретение относится к области заболеваний почек, в частности, к способам прогнозирования риска развития хронического заболевания почек(CKD) или риска ухудшения функции почек у здоровых или практически здоровых индивидуумов (например, индивидуумов без диабета, индивидуумов без сердечно-сосудистых заболеваний и т.д.) или у индивидуумов, страдающих заболеваниями, такими как гипертензия, аутоиммунное заболевание, метаболический синдром, диабет, и/или сердечнососудистое заболевание, где индивидуумы в последнем случае не страдают CKD, с использованием проэнкефалина (PENK) в качестве биомаркера, уровень которого измеряют способами, представленными в настоящем описании.
При оцениваемом распространении 8-16% по всему миру и ожидаемом непропорциональном росте развития заболеваний в развивающихся странах, CKD становится возрастающей проблемой здравоохранения. Как правило, CKD определяют и стадируют посредством измерения скорости клубочковой фильтрации (GFR) и альбуминурии. Этиология CKD сложна, и полагают, что в ее патофизиологию вовлечены гипертензия, диабет и метаболический синдром. Функция почек влияет на гемодинамическое, сосудистое, воспалительное и метаболическое заболевание по причине своей роли в циркуляции, и, следовательно, сниженная функция почек связана с повышенным риском сердечно-сосудистых явлений, госпитализации и гибели. Таким образом, важны скрининг и раннее определение сниженной функции почек, и, таким образом, рекомендуют скрининг конкретных групп риска, таких как индивидуумы с семейной предрасположенностью, а также пациенты с диабетом, гипертензией, сердечнососудистым заболеванием, аутоиммунными заболеваниями и индивидуумы со структурным заболеванием мочевыделительной системы. Общеупотребительными маркерами функции почек являются креатинин и цистатин C. Однако, сывороточный креатинин и оцениваемая GFR (eGFR) весьма нечувствительны в отношении определения индивидуумов с высоким риском CKD. Таким образом, существует потребность в идентификации новых и более чувствительных биомаркеров.
Энкефалины были первыми эндогенными опиоидами, открытыми в 1975 году. Они кодируются геном PENK на хромосоме 8, и, аналогично другим нейропептидам, биосинтез активных энкефалинов включает несколько стадий, включая протеолитическое расщепление пробелка-предшественника проэнкефалина (PENK), посредством чего образуются четыре копии метионинэнкефалина и одна копия каждого лейцинэнкефалина, гекса- и окта-пептида. Предшественник PENK продуцируется по всему телу в нейронах, а также в ненервных клетках. Хотя энкефалины открыты почти 40 лет назад, их роль до сир пор не совсем понятна. В двух более ранних обсервационных исследованиях выявляли, что энкефалины участвуют в функции почек. Недавно обнаружено, что уровни PENK в плазме ассоциированы со сниженной eGFR и прогнозом после острого инфаркта миокарда.
Ранее показано, что детекция проэнкефалина может быть полезной в (a) диагностике или мониторинге функции почек у индивидуума, или (b) диагностике дисфункции почек у индивидуума, или (c) прогнозировании или мониторинге риска неблагоприятных явлений у индивидуума с заболеванием, где указанное неблагоприятное явление выбрано из группы, содержащей ухудшение дисфункции почек, включая почечную недостаточность, утрату функции почек и заболевание почек терминальной стадии или гибель по причине дисфункции почек, включая почечную недостаточность, утрату функции почек и заболевание почек терминальной стадии, или (d) прогнозировании или мониторинге успешности терапии или вмешательства. Однако, было неизвестно, что проэнкефалин служит в качестве биомаркера при прогнозировании риска развития хронического заболевания почек у индивидуумов, являющихся здоровыми, практически здоровыми индивидуумов или пациентов, например, с метаболическим синдромом, сердечнососудистым заболеванием, аутоиммунными заболеваниями, гипертензией, диабетом, или индивидуумов с повышенным риском развития последних состояний, но не страдающих заболеванием почек, в частности, CKD.
2
2
Хроническое заболевание почек (CKD) можно отличать от острой почечной недостаточности (AKI) и острых заболеваний почек (AKD) при определении конкретных функциональных и структурных параметров. В то время как CKD отличается GFR <60 мл/мин на 1,73 м в течение >3 месяцев и повреждением почек в течение >3 месяцев (Kidney International Supplements, 2013; Vol. 3: 19-62), при AKI нет необходимости в структурных критериях, но обнаруживают повышение сывороточного креатинина (SCr) на 50% в течение 7 дней, повышение на 0,3 мг/дл (26,5 мкмоль/л) или олигурию. Дополнительными критериями CKD (любой из следующих критериев присутствует в течение >3 месяцев) являются маркеры повреждения почек, например, альбуминурия в качестве маркера повышенной проницаемость клубочкового фильтра (скорость экскреции альбумина [AER] ≥30 мг/24 часа; соотношение альбумина и креатинина [ACR] ≥30 мг/ммоль); аномалии мочевого осадка (например, нарушения с изолированной невидимой (микроскопической) гематурией с нормальной морфологией эритроцитов (RBC) (анизоцитозом) в гломерулярной базальной мембране (GBM), RBC определяют при пролиферативном гломерулонефрите, WBS определяют при пиелонефрите или интерстициальном нефрите, овальные жировые тельца или жир определяют при заболеваниях с протеинурией); электролитные и другие аномалии по причине канальцевых нарушений; аномалии, определяемые при гистологии или предполагаемые (например, заболевания с вовлечением клубочков, такие как диабет, аутоиммунные заболевания, использование лекарственных средств, неоплазия, сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, гипертензия, ишемия, васкулит, тромботическая микроангиопатия, тубулоинтерстициальные заболевания, например, инфекции, камни, обструкция, токсичность лекарственных средств, а также кистозные и врожденные заболевания); структурные аномалии, определяемые посредством визуализации (ультразвукового исследования, компьютерной томографии и магнитно-резонансной томографии с изотопным сканированием или без него, ангиографии), такие как поликистоз почек, дисплазия почек, гидронефроз по причине обструкции, кортикальное рубцевание по причине инфарктов, пиелонефрит или нарушение, ассоциированное с везикоуретеральным рефлюксом, объемные образования почки или увеличенные почки по причине инфильтративных заболеваний, стеноз почечной артерии, небольшие и гиперэхогенные почки и трансплантация почек в анамнезе. Кроме того, AKD отличается структурным повреждением почек в течение <3 месяцев и функциональными критериями, также обнаруживаемыми при AKI, или GFR <60 мл/мин на 1,73 м в течение <3 месяцев, или снижением GFR на ≥35%, или повышением SCr на >50% в течение <3 месяцев (Kidney International Supplements, Vol. 2, Issue 1, March 2012, pp. 19-36). Важно правильно различать эти разные нозологические единицы. Настоящее изобретение относится к новому маркеру, подходящему для прогнозирования риска развития CKD у здоровых индивидуумов, практически здоровых индивидуумов, индивидуумов с аутоиммунным и/или сердечнососудистым заболеванием, и/или гипертензией, и/или диабетом, и/или метаболическим синдромом. Очевидно, что раннее определение потенциального риска в этих группах пациентов будет приносить значительную пользу, в частности, в том, что может быть полезной профилактика развития или дальнейшего прогрессирования CKD.
Объектом по настоящему изобретению является способ прогнозирования риска развития хронического заболевания почек (CKD) у индивидуума, включающий:
a) определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
b) определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где уровень выше порогового значения является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где индивидуум выбран из группы, содержащей
(i) здоровых индивидуумов,
(ii) индивидуумов с заболеванием, не имеющих CKD.
2
Индивидуумы, упомянутые в (i) и (ii) и способах прогнозирования риска развития CKD, упомянутой в настоящем описании ниже, предпочтительно имеют оцениваемый уровень клубочковой фильтрации (eGFR) более 60 мл/мин/1,73 м в течение >3 месяцев.
Объектом по настоящему изобретению является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума, включающий:
⋅ определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где индивидуум выбран из группы, содержащей здоровых индивидуумов, практически здоровых индивидуумов, индивидуумов с заболеванием (например, метаболическим синдромом, диабетом, ожирением, сердечнососудистым заболеванием или явлениями, гипертензией и/или аутоиммунным заболеванием) на момент получения образца физиологической жидкости из указанного индивидуума, где указанный индивидуум не страдает заболеванием почек.
Объектом по настоящему изобретению является дополнительный способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума, включающий:
⋅определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где индивидуум имеет диагностированное острое сердечнососудистое явление или сердечнососудистое заболевание на момент получения образца физиологической жидкости из указанного индивидуума, где указанное сердечнососудистое явление выбрано из группы, содержащей инфаркт миокарда, инсульт, острую сердечную недостаточность, и где указанный индивидуум не страдает заболеванием почек, и где сердечнососудистое заболевание выбрано из группы, содержащей ишемическую болезнь сердца, заболевание сердца, ассоциированное с хронической или острой цереброваскулярной болезнью, или заболевание, вызывающее сердечно-сосудистые явления, такое как атеросклероз или сердечная недостаточность и т.д., где индивидуум, страдающий указанным заболеванием сердца, не страдает заболеванием почек.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума, включающий:
⋅ определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где индивидуум имеет диагностированное аутоиммунное заболевание на момент получения образца физиологической жидкости из указанного индивидуума, где указанный индивидуум не страдает заболеванием почек.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума по любому из предшествующих вариантов осуществления, включающий:
⋅ определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
1c
где определяют по меньшей мере один дополнительный параметр, выбранный из группы, содержащей: возраст, пол, систолическое артериальное давление и/или диастолическое артериальное давление (SBP и/или DBP), антигипертензивное лечение (AHT), индекс массы тела (BMI), жировую массу тела, массу нежировых тканей, обхват талии, соотношение талии и бедер, курение в настоящее время, наследственность в отношении диабета, уровень креатинина в сыворотке, уровень цистатина C, сердечнососудистое заболевание (CVD), общий холестерин, триглицериды, липопротеины низкой плотности (LDL-C), липопротеины высокой плотности (HDL-C), глюкозу в цельной крови или плазме, инсулин в плазме, HOMA (инсулин (мкЕд./мл)×глюкоза (ммоль/л)/22,5) и/или HbA (%), необязательно, дополнительно включающий определение статуса генетических маркеров.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума по любому из предшествующих вариантов осуществления, включающий:
⋅ определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где определяют группу клинических и лабораторных параметров, содержащую: уровень глюкозы натощак, систолическое артериальное давление, антигипертензивное лечение и индекс массы тела.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума по любому из предшествующих вариантов осуществления, включающий:
⋅ определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где фрагмент проэнкефалина содержит проэнкефалин A 119-159 (MR-PENK; SEQ ID NO: 6), или его фрагмент, или фрагменты, содержащие MR-PENK. MR-PENK, или его фрагменты, или фрагменты, содержащие MR-PENK, можно определять с использованием иммунологического анализа или масс-спектрометрии.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума по любому из предшествующих вариантов осуществления, включающий:
⋅ определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где указанный способ осуществляют, по меньшей мере, однократно в момент времени t0 и, необязательно, по меньшей мере в один или несколько последующих моментов времени (t1…tn) для мониторинга риска развития CKD.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума по любому из предшествующих вариантов осуществления, включающий:
⋅определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD,
где физиологическую жидкость индивидуума с уровнем проэнкефалина выше конкретного порогового уровня, необязательно, по сравнению со средним значением проэнкефалина у очевидно здоровых индивидуумов, классифицируют как соответствующую повышенному риску развития CKD. По изобретению указанное пороговое значение, ассоциированное с повышенным риском развития CKD, может составлять от 30 до 80 пмоль/л, более предпочтительно - от 35 до 60 пмоль/л, даже более предпочтительно - от 40 до 50 пмоль/л, наиболее предпочтительно - от 41 до 49 пмоль/л.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD у индивидуума по любому из предшествующих вариантов осуществления, включающий:
⋅ определение уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и
⋅ определение корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD, дополнительно включающий стадию выбора подходящих терапевтических или профилактических мер, если уровень проэнкефалина или его фрагментов выше порогового значения, предпочтительно, пороговое значение, ассоциированное с повышенным риском развития CKD, может составлять от 30 до 80 пмоль/л, более предпочтительно - от 35 до 60 пмоль/л, даже более предпочтительно - от 40 до 50 пмоль/л, наиболее предпочтительно - от 41 до 49 пмоль/л.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек у
(i) здоровых индивидуумов или
(ii) индивидуумов с заболеванием с дисфункцией почек или без нее,
где указанный способ включает стадии (a) определения уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и (b) определения корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, где уровень выше порогового значения является прогностическим для повышенного риска ухудшения функции или дисфункция почек в группах пациентов (i) или (ii). По изобретению указанное пороговое значение, ассоциированное с повышенным риском ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, может составлять от 30 до 80 пмоль/л, более предпочтительно - от 35 до 60 пмоль/л, даже более предпочтительно - от 40 до 50 пмоль/л, наиболее предпочтительно - от 41 до 49 пмоль/л.
2
2
2
2
2
Индивидуума можно выбирать из группы, содержащей здоровых индивидуумов, например, индивидуумов с eGFR более 90 мл/мин/1,73 м или более 60 мл/мин/1,73 м, практически здоровых индивидуумов, например, индивидуумов с eGFR более 90 мл/мин/1,73 м или более 60 мл/мин/1,73 м, индивидуумов с заболеванием (например, с метаболическим синдромом, диабетом, ожирением, сердечнососудистым заболеванием или явлениями, как определено в настоящем описании, гипертензией, аутоиммунным заболеванием, как определено в настоящем описании) на момент получения образца физиологической жидкости из указанного индивидуума, где указанный индивидуум не страдает заболеванием почек. Группа индивидуумов (ii), которую можно анализировать указанным выше способом, также содержит индивидуумов с острой почечной недостаточностью (AKI). Острая почечная недостаточность включает широкий спектр повреждений почек помимо почечной недостаточности. Пациенты с AKI, подвергнутые способам прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, упомянутых в отношении вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, включают пациентов с хроническим заболеванием почек (взрослых с eGFR менее 60 мл/мин/1,73 м), сердечной недостаточностью, заболеванием печени, диабетом, острой почечной недостаточностью в анамнезе, олигоурией (диурез менее 0,5 мл/кг/час), неврологическими или когнитивными нарушениями или инвалидностью, которые могут означать ограниченный доступ к жидкостям по причине зависимости от опекуна, гиповолемии, использования лекарственных средств с нефротоксическим потенциалом (таких как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства [НПВС], аминогликозиды, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента [ACE], антагонисты рецептора ангиотензина II [ARB] и диуретики) в течение последней недели, особенно при гиповолемии, использования йодсодержащих контрастных веществ в течение последней недели, симптомов урологической обструкции или урологической обструкции в анамнезе или состояний, которые могут приводить к обструкции, сепсисом, ухудшением оценки по шкале раннего предупреждения, возрастом 65 лет или более, гипертензией. В рамках изобретения термин "ухудшение функции или дисфункции почек" означает переход от менее тяжелой степени AKI в соответствии с критериями RIFLE к более тяжелой степени, что включает отдельные критерии, касающиеся креатинина сыворотки и диуреза (UO). В терминах критериев креатинина сыворотки это означает переход от "стадии риска" (1,5-кратный повышенный креатинин) к "стадии повреждения" (2-кратный повышенный креатинин) или далее к "стадии недостаточности" (3-кратный креатинин или креатинин >4 мг/дл) или хуже, необязательно, с сопутствующим снижением eGFR. В рамках изобретения термин "улучшение функции или дисфункции почек" означает переход в противоположном направлении, например, от "стадии недостаточности" к "стадии риска" или лучше.
Объектом по настоящему изобретению также является способ, определенный в предыдущем параграфе, где определяют по меньшей мере один дополнительный параметр, выбранный из группы, содержащей: возраст, пол, систолическое артериальное давление и/или диастолическое артериальное давление (SBP и/или DBP), антигипертензивное лечение (AHT), индекс массы тела (BMI), жировую массу тела, массу нежировых тканей, обхват талии, соотношение талии и бедер, курение в настоящее время, наследственность в отношении диабета, уровень креатинина в сыворотке, уровень цистатина C, сердечнососудистое заболевание (CVD), общий холестерин, триглицериды, липопротеины низкой плотности (LDL-C), липопротеины высокой плотности (HDL-C), уровень глюкозы в цельной крови или плазме, инсулин в плазме, HOMA (инсулин (мкЕд./мл)×глюкоза (ммоль/л)/22,5) и/или HbA1c (%), необязательно, дополнительно включающий определение статуса генетических маркеров. В одном подварианте осуществления настоящего изобретения, относящемся к способу, определенному в предыдущем параграфе, указанная группа содержит уровень глюкозы натощак, систолическое артериальное давление, антигипертензивное лечение и BMI. Уровень проэнкефалина или его фрагментов можно определять с помощью иммунологического анализа или любыми другими подходящими способами, например, с помощью масс-спектрометрии. В указанных способах PENK или MR-PENK (SEQ ID NO: 6) или его фрагмент, представленные в настоящем описании, можно использовать в качестве мишени для иммунологического анализа.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, как описано в представленных выше параграфах, где указанный способ осуществляют, по меньшей мере, однократно в момент времени t0 и, необязательно, по меньшей мере в один или несколько последующих моментов времени (t1…tn) для мониторинга ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, как описано в представленных выше параграфах, где исследуют физиологическую жидкость индивидуума с уровнем проэнкефалина выше конкретного порогового уровня, необязательно, по сравнению со средним значением проэнкефалина у очевидно здоровых индивидуумов.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, как описано в представленных выше параграфах, где связывающее средство, специфически связывающееся с PENK или его фрагментом, выбрано из группы, содержащей антитело, фрагмент антитела или неиммуноглобулиновый каркас, связывающиеся с проэнкефалином или его фрагментами. В этих способах также можно использовать анализ, включающий два связывающих средства, связывающихся с двумя различными областями в аминокислотной последовательности проэнкефалина [SEQ ID NO: 1]. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные два связывающих средства связываются с двумя различными областями в аминокислотной последовательности MR-PENK [SEQ ID NO: 6]. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные два связывающих средства связываются с двумя различными областями в аминокислотной последовательности MR-PENK [SEQ ID NO: 6], представляющими собой аминокислоты 133-140 (SEQ ID NO: 13) и аминокислоты 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, как описано в представленных выше параграфах, где анализ используют для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, как определено в настоящем описании.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, как описано в представленных выше параграфах, дополнительно включающий осуществление стадии выбора подходящих терапевтических или профилактических мер, если уровень проэнкефалина или его фрагментов выше порогового значения, предпочтительно, порогового значения от 30 до 80 пмоль/л, более предпочтительно - от 35 до 60 пмоль/л, даже более предпочтительно - от 40 до 50 пмоль/л, наиболее предпочтительно - от 41 до 49 пмоль/л.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, как описано в представленных выше параграфах, где указанное определение проэнкефалина или его фрагментов осуществляют неоднократно.
2
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD, как определено в любом из предшествующих параграфов, где указанный здоровый или практически здоровый индивидуум имеет eGFR более 60 мл/мин/1,73 м на исходном уровне. В контексте по настоящему изобретению термин "здоровый" означает, что интересующий индивидуум не страдает каким-либо заболеванием. В контексте по настоящему изобретению термин "практически здоровый" означает, что интересующий индивидуум не страдает каким-либо диагностированным заболеванием или имеет диагностированное заболевание или нарушение, отличающееся от заболеваний, представленных в настоящем описании, т.е. гипертензии, сердечно-сосудистого заболевания, метаболического синдрома, диабета и/или аутоиммунного заболевания, и не страдает заболеванием почек. Термин "здоровый индивидуум" также включает группу индивидуумов, являющихся добровольными донорами органов, например, индивидуумов, являющихся потенциальными донорами почек. Этих доноров можно тестировать способами по настоящему изобретению для исключения этих индивидуумов, как доноров почек, имеющих повышенный риск развития хронического заболевания почек.
В рамках изобретения термин "аутоиммунное заболевание" относится к заболеванию, возникающему при аномальном иммунном ответе организма на вещества и ткани, в норме присутствующие в организме, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, содержащей синдром Шегрена; аутоиммунные заболевания почек, например, SLE, аутоиммунные дегенеративные заболевания суставов, в частности, ревматоидный артрит; или аутоиммунные заболевания центральной нервной системы, например, рассеянный склероз, аутоиммунные заболевания кожи, например, псориаз, и любое другое аутоиммунное заболевание.
1c
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD, как определено в любом из предшествующих параграфов, где дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, содержащей возраст, пол, систолическое артериальное давление и/или диастолическое артериальное давление (SBP и/или DBP), антигипертензивное лечение (AHT), индекс массы тела, жировую массу тела, массу нежировых тканей, обхват талии, соотношение талии и бедер, курение в настоящее время, наследственность в отношении диабета, уровень креатинина в сыворотке, уровень цистатина C и предшествующее сердечнососудистое заболевание (CVD). Кроме того, рассматривают определение дополнительных параметров, например, общего холестерина (ммоль/л), триглицеридов (ммоль/л), липопротеинов низкой плотности (LDL-C) (ммоль/л), липопротеинов высокой плотности (HDL-C) (ммоль/л), глюкозы цельной крови (ммоль/л), инсулина в плазме (мМЕ), HOMA (инсулин*глюкоза/22,5), и/или HbA (%). Кроме того, рассматривают анализ статуса генетических маркеров с использованием, например, полногеномного исследования. Кроме того, в способах прогнозирования риска CKD, представленных в настоящем описании, рассматривают измерение следующих параметров в комбинации: уровня проэнкефалина, уровня глюкозы натощак, систолического артериального давления, антигипертензивного лечения и BMI.
В одном из вариантов осуществления изобретения образец выбран из группы, содержащей образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинномозговой жидкости (CSF), образец слюны и образец мочи или экстракт любого из указанных выше образцов.
Проэнкефалин или их фрагменты можно измерять в образцах индивидуумов натощак или не натощак. Уровень натощак означает уровень в условиях отсутствия приема пищи за 10 часов или, предпочтительно, 12 часов перед забором крови.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD, как определено в любом из предшествующих параграфов, где уровень проэнкефалина или его фрагментов, имеющих по меньшей мере длину 5 аминокислот, или по меньшей мере 6 аминокислот, или по меньшей мере 7 аминокислот, или по меньшей мере 8 аминокислот, или по меньшей мере 9 аминокислот, или по меньшей мере 10 аминокислот, или по меньшей мере 12 аминокислот, определяют с помощью диагностического анализа, предпочтительно, посредством иммунологического анализа. Фрагмент проэнкефалина может содержать проэнкефалин 119-159 (SEQ ID NO: 6) или являться его подходящим фрагментом, имеющим указанную выше длину.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD, как определено в любом из предшествующих параграфов, где указанный способ осуществляют неоднократно для мониторинга риска развития CKD. Указанный мониторинг можно осуществлять для оценки ответа указанного индивидуума на предпринимаемые профилактические и/или терапевтические меры.
2
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD, как определено в любом из предшествующих параграфов, где указанный способ осуществляют для стратификации указанных индивидуумов на группы риска, как дополнительно описано ниже. В конкретных вариантах осуществления изобретения способы используют для стратификации индивидуумов на группы риска CKD, например, с низким риском, средним риском или высоким риском развития CKD. Низкий риск развития CKD означает, что значение проэнкефалина, по существу, не повышено по сравнению с заранее определенным значением у здоровых индивидуумов, у которых не развилась CKD. Средний риск существует, когда уровень проэнкефалина повышен по сравнению с заранее определенным значением у здоровых индивидуумов, у которых не развилась CKD, и высокий риск существует, когда уровень проэнкефалина значительно повышен при измерении на исходном уровне и продолжает повышаться при последующем анализе. Независимо от повышенного или значительно повышенного уровня, индивидуум может не иметь сниженную eGFR (т.е. eGFR составляет >60 мл/мин/1,73 м).
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования риска развития CKD, как определено в любом из предшествующих параграфов, где физиологическая жидкость индивидуума с "повышенным уровнем" проэнкефалина или его фрагмента, как описано в настоящем описании, имеет уровень выше конкретного порогового уровня.
Термин "фрагмент PENK" означает любой фрагмент, который можно определять любым из способов, представленных в настоящем описании, например, с использованием иммунологического анализа или любого другого способа, такого как спектрометрия, например, масс-спектрометрия. Предпочтительно, фрагменты имеют длину по меньшей мере 5 аминокислот, или по меньшей мере 6 аминокислот, или по меньшей мере 7 аминокислот, или по меньшей мере 8 аминокислот, или по меньшей мере 9 аминокислот, или по меньшей мере 10 аминокислот, или по меньшей мере 12 аминокислот. Конкретные фрагменты также описывают в списке последовательностей, и они содержат, например, MR-PENK и его фрагменты, фрагменты, содержащие MR-PENK, которые можно определять с использованием способов, анализов и связывающих средств, представленных в настоящем описании.
Выражение "повышенный уровень" означает уровень выше конкретного порогового уровня.
Radiology
Пороговое значение можно определять посредством измерения образцов от индивидуумов, у которых развилось конкретное состояние (например, CKD), и образцов от индивидуумов, у которых не развилось состояние. Одной из возможностей определения порогового значения является вычисление кривых зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (кривых ROC) при построении значения переменной относительно ее соответствующей частоты в "нормальной" популяции (например, индивидуумов, у которых не развилось состояние ожирения) и популяции с "заболеванием" (например, индивидуумов, у которых развилось состояние ожирения). Распределение уровней маркеров в случае индивидуумов, у которых развилось или не развилось конкретное состояние, вероятно, перекрывается. В таких условиях при тесте не отличают полностью "нормальную" популяцию от популяции с "заболеванием" с 100% точностью, и площадь перекрывания указывает на то, где при тесте не могут отличать "нормальную" популяцию от популяции с "заболеванием". Выбирают пороговое значение, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, как маркер изменяется при "заболевании") результат теста считают аномальным и ниже которого результат теста считают нормальным. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что наблюдаемое измерение позволит осуществить правильную идентификацию состояния. Кривые ROC можно использовать даже тогда, когда в результате теста не обязательно получают точное число. Можно строить кривую ROC при условии, что можно ранжировать результаты. Например, результаты теста на образцах из популяции с "заболеванием" можно ранжировать по степени (например 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Это ранжирование может коррелировать с результатами в "нормальной" популяции, и можно получать кривую ROC. Эти способы хорошо известны в этой области (Hanley et al. 1982. 143: 29-36). Предпочтительно, пороговое значение выбирают так, чтобы получать площадь под кривой ROC приблизительно более 0,5, более предпочтительно - приблизительно более 0,7, еще более предпочтительно - приблизительно более 0,8, даже более предпочтительно - приблизительно более 0,85, и наиболее предпочтительно - приблизительно более 0,9. Термин "приблизительно" в этом контексте относится к +/-5% от указанного измерения. Горизонтальная ось кривой ROC представляет собой (1-специфичность), повышающуюся с повышением количества ложноположительных результатов. Вертикальная ось кривой представляет собой чувствительность, повышающуюся с повышением количества истинноположительных результатов. Таким образом, в случае конкретного выбранного порогового значения можно определять значение (1-специфичность) и можно получать соответствующую чувствительность. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что измеряемый уровень маркера позволит правильно идентифицировать заболевание или состояние. Таким образом, площадь под кривой ROC можно использовать для определения эффективности теста. Отношение шансов является мерой величины эффекта, посредством которой описывают силу ассоциации или зависимость между двумя бинарными значениями данных (например, отношение шансов возникновения явления в тест-отрицательной группе к шансам его появления в тест-положительной группе).
Уровни порогового значения можно получать, например, при анализа Каплана-Мейер, где частота заболевания или вероятность серьезного состояния и/или гибели коррелирует, например, с квартилями соответствующих маркеров в популяции. В соответствии с этим анализом индивидуумы с уровнями маркеров выше 75-ой процентили имеют значимо повышенный риск развития заболеваний по изобретению. Этот результат дополнительно подтверждают с помощью анализа регрессии Кокса с поправкой на классические факторы риска. Наиболее высокая квартиль относительно всех других индивидуумов значимо ассоциирована с повышенным риском развития заболевания или вероятностью серьезного состояния и/или гибели по изобретению.
Другими предпочтительными пороговыми значениями являются, например, 90-ая, 95-ая или 99-ая процентиль референсной популяции. Используя более высокую, чем 75-ая, процентиль, можно снижать количество идентифицированных ложноположительных индивидуумов, но можно упустить определение индивидуумов, имеющих умеренный, но все еще повышенный риск. Таким образом, можно адаптировать пороговое значение в зависимости от того, считают ли его более подходящим для идентификации большинства индивидуумов с риском за счет идентификации "ложноположительных", или считают ли более подходящей идентификацию, в основном, индивидуумов с высоким риском за счет упущения нескольких индивидуумов с умеренным риском.
Специалисту в этой области известно, как определять такие статистически значимые уровни.
Объектом по настоящему изобретению также является устройство для использования в месте наблюдения за пациентом для осуществления способа, включающего стадии (a) определения уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума; и (b) определения корреляции указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском развития CKD, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития CKD, упомянутого в любом из предшествующих параграфов. Указанное устройство для использования в месте наблюдения за пациентом также можно использовать в способах прогнозирования ухудшения или улучшения функции или дисфункции почек, как определено в настоящем описании выше.
Объектом по настоящему изобретению является применение проэнкефалина (PENK) или его фрагментов в качестве маркера в прогнозировании риска развития CKD у здоровых индивидуумов и индивидуумов с заболеванием. Неожиданно обнаружено, что PENK или фрагменты являются мощными и значимыми биомаркерами в прогнозировании риска развития CKD.
По настоящему изобретению иммунореактивный аналит, используемый в способах, представленных в настоящем описании, не является лейэнкефалином и метэнкефалином. В конкретном варианте осуществления указанный иммунореактивный аналит является проэнкефалином средней области (MR-PENK) или его фрагментом, содержащим по меньшей мере 5 аминокислот. Таким образом, при использовании в способах по настоящему изобретению связывающего средства, связывающегося с областью в аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK) в физиологической жидкости, термин "определение уровня PENK или его фрагментов по меньшей мере из 5 аминокислот в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума" эквивалентен термину "определение уровня иммунореактивного аналита с использованием по меньшей мере одного связывающего средства, связывающегося с областью в аминокислотной последовательности PENK, в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума". В конкретном варианте осуществления в способах по настоящему изобретению используют связывающее средство, связывающееся с областью в аминокислотной последовательности PENK, в физиологической жидкости. В конкретном варианте осуществления указанное связывающее средство, используемое в способах по настоящему изобретению, не связывается с областью в аминокислотной последовательности лейэнкефалина или метэнкефалина в физиологической жидкости. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с MR-PENK или его фрагментом, содержащим по меньшей мере 5 аминокислот.
В рамках изобретения термин "индивидуум" относится к живому человеку или не являющемуся человеком организму. Предпочтительно, в настоящем описании индивидуум является человеком. Индивидуум может являться здоровым, практически здоровым, он может являться индивидуумом с заболеванием без CKD или, если не указано иначе, может иметь диагноз клинически проявляющегося нарушения или заболевания, выбранного из группы, содержащей гипертензию, ожирение, сердечно-сосудистые заболевания, метаболический синдром, диабет и аутоиммунные заболевания.
2
2
2
2
В соответствии с предшествующими вариантами осуществления повышенная концентрация проэнкефалина или его фрагментов свидетельствует о риске развития CKD у индивидуумов, являющихся здоровыми, практически здоровыми или имеющих диагностированные упомянутые в настоящем описании нарушения или заболевания, но не имеющих CKD. В вариантах осуществления настоящего изобретения риск развития CKD повышается, если индивидуум имеет повышенную концентрацию проэнкефалина или его фрагментов и одновременно имеет eGFR >60 мл/мин/1,73 м. В дополнительных вариантах осуществления риск развития CKD повышается, если индивидуум имеет повышенную концентрацию проэнкефалина или его фрагментов и одновременно имеет eGFR >60 мл/мин/1,73 м,и индивидуум имеет снижение уровня глюкозы натощак и/или повышения цистатина C и/или креатинина в плазме при повторении способов, представленных в настоящем описании. Например, если пациент имеет повышенную концентрацию проэнкефалина или его фрагментов и одновременно имеет eGFR >60 мл/мин/1,73 м на исходном уровне (t0), и имеет повышенную концентрацию проэнкефалина или его фрагментов и одновременно имеет eGFR >60 мл/мин/1,73 м и демонстрирует снижение уровня глюкозы натощак и/или повышение цистатина C и/или креатинина в плазме в один или несколько более поздних моментов времени (t1, t2,…tn), риск развития CKD повышается. Другими словами, возникновение риска можно мониторировать способами, представленными в настоящем описании.
Кроме того, снижение eGFR в течение конкретного периода времени в комбинации с повышением уровня проэнкефалина или его фрагментов, необязательно, с сопутствующим снижением уровня глюкозы натощак и/или повышением цистатина C и/или креатинина в плазме в один или несколько более поздних моментов времени (t1, t2…tn) можно определять способами, представленными в настоящем описании. Дальнейшее повышение уровня проэнкефалина или его фрагментов, необязательно, с сопутствующим снижением уровня глюкозы натощак и/или повышением цистатина C и/или креатинина с течением времени ассоциировано с повышенным риском развития CKD.
2
В соответствии со способами по настоящему изобретению после измерения на исходном уровне (t0) можно осуществлять дополнительные измерения (t1-tn) при необходимости, например, каждый месяц, с интервалами 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяца и т.д. Интервалы между двумя измерениями не обязательно должны быть идентичными. Например, если на исходном уровне (t0) у индивидуума измеряют повышенный уровень проэнкефалина, в то время как eGFR составляет >60 мл/мин/1,73 м, следующее измерение (t1) можно осуществлять вскоре после t0 для проверки того, снижается ли уровень проэнкефалина, остается на повышенном уровне или даже повышается, и желательными являются соответствующие медицинские вмешательства, т.е. средства, вводимые для снижения артериального давления, снижение потребления белка, снижение потребления соли, необязательно, введение средств для снижения концентраций мочевой кислоты и/или модификация образа жизни, например, диета, учитывающая подходящее потребление солей, фосфата, калия и белка по показаниям, снижение массы тела, достижение более здоровой массы тела (BMI 20-25 в соответствии с конкретными демографическими условиями страны), прекращение курения, физическая активность, совместимая с состоянием сердечнососудистой системы и переносимостью и т.д. Аналогично, при измерении важных кофакторов, ассоциированных с повышенным риском развития CKD, наблюдают снижение уровня глюкозы натощак и/или повышения цистатина C и/или креатинина в плазме, измерения любым из способов, представленных в настоящем описании, необходимо повторять с более короткими интервалами для мониторинга развития этих факторов и уровня проэнкефалина или его фрагментов.
И снова, учитывая результаты, полученные при измерениях проэнкефалина или его фрагментов, можно осуществлять подходящие медицинские вмешательства, описанные выше, и/или модификацию образа жизни, снижение массы тела, антигипертензивное лечение, лечение противодиабетическими лекарственными средствами, иммуномодулирующими лекарственными средствами (например, метотрексатом, кортикостероидами, биологическими средствами, например, антителами или другими связывающими средствами или модуляторами, воздействующими на иммунные клетки или цитокины, вовлеченные в регуляцию иммунного ответа, такие как ИЛ-6, ИЛ-2 (адалимумаб, намилумаб и т.д.)). Таким образом, настоящее изобретение не только относится к способам измерения для прогнозирования риска у индивидуумов, представленных в настоящем описании, но также и к способам лечения или профилактики нарушений, заболеваний или клинических состояний, которые могут повышать риск развития CKD при отсутствии адекватного лечения. Терапия или вмешательство, поддерживающие или заменяющие функцию почек, могут включать различные способы заместительной почечной терапии, включая, в качестве неограничивающих примеров, гемодиализ, перитонеальный диализ, гемофильтрацию и трансплантацию почек.
При последующем измерении относительное изменение проэнкефалина или его фрагментов коррелирует с улучшением (снижением проэнкефалина или его фрагментов) и ухудшением (повышением проэнкефалина или его фрагментов) риска развития CKD.
Проэнкефалин или его фрагменты превосходят другие маркеры функции/дисфункции почек при диагностике и последующем исследовании (NGAL, креатинин крови, клиренс креатинина, цистатин C, мочевина). Превосходство означает более высокую специфичность, более высокую чувствительность и лучшую корреляцию с клиническими конечными точками. Также в этом аспекте проэнкефалин или его фрагменты превосходят указанные выше клинические маркеры.
Следует понимать, что в одном из вариантов осуществления изобретения термин "фрагменты проэнкефалина" также включают лейэнкефалин и метэнкефалин.
Объектом по настоящему изобретению также являются способы, где уровень проэнкефалина или его фрагментов по меньшей мере из 5 аминокислот определяют с использованием связывающего средства, по меньшей мере одного связывающего средства, к проэнкефалину или его фрагментам по меньшей мере из 5 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное связывающее средство выбрано из группы, содержащей антитело, фрагмент антитела или неиммуноглобулиновый каркас, связывающийся с проэнкефалином или его фрагментами по меньшей мере из 5 аминокислот. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с областью с последовательностями, выбранными из группы, содержащей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В конкретном варианте осуществления указанное связывающее средство не связывается с энкефалиновыми пептидами метэнкефалином (SEQ ID NO: 3) и лейэнкефалином (SEQ ID NO: 4).
В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, содержащей SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В другом конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с областью с последовательностями, выбранными из группы, содержащей SEQ ID NO: 2, 5, 6 и 10. В другом конкретном варианте осуществления указанное связывающее средство связывается с проэнкефалином 119-159, фрагментом проэнкефалина средней области, MR-PENK (SEQ ID NO: 6).
Проэнкефалин имеет следующую последовательность:
SEQ ID NO: 1 (проэнкефалин (1-243)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMKКДАEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQLEDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGFMRF
Фрагменты проэнкефалина, которые можно определять в физиологической жидкости, можно выбирать, например, из группы следующих фрагментов:
SEQ ID NO: 2 (синэнкефалин, проэнкефалин 1-73)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLA
SEQ ID NO: 3 (метэнкефалин)
YGGFM
SEQ ID NO: 4 (лейэнкефалин)
YGGFL
SEQ ID NO: 5 (проэнкефалин 90-109)
MDELYPMEPEEEANGSEILA
SEQ ID NO 6: (проэнкефалин 119-159, фрагмент проэнкефалина средней области, MR-PENK)
DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS
SEQ ID NO: 7 (метэнкефалин-Arg-Gly-Leu)
YGGFMRGL
SEQ ID NO: 8 (проэнкефалин 172-183)
SPQLEDEAKELQ
SEQ ID NO: 9 (проэнкефалин 193-203)
VGRPEWWMDYQ
SEQ ID NO: 10 (проэнкефалин 213-234)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEME
SEQ ID NO: 11 (проэнкефалин 213-241)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF M
SEQ ID NO: 12 (метэнкефалин-Arg-Phe)
YGGFMRF
Определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, включая лейэнкефалин и метэнкефалин, может означать, что определяют иммунореактивность в отношении проэнкефалина или его фрагментов, включая лейэнкефалин и метэнкефалин. Связывающее средство, используемое для определения проэнкефалина или его фрагментов, включая лейэнкефалин и метэнкефалин, в зависимости от области связывания, может связываться с несколькими указанными выше молекулами. Это очевидно специалисту в этой области. Таким образом, по настоящему изобретению уровень иммунореактивного аналита определяют в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума, с использованием по меньшей мере одного связывающего средства, связывающегося с областью в аминокислотной последовательности любого из указанного выше пептида и пептидных фрагментов (т.е. проэнкефалина и фрагментов в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-12); и он коррелирует с конкретными вариантами осуществления, имеющими клиническое значение.
В более конкретном варианте осуществления способов по настоящему изобретению определяют уровень MR-PENK (SEQ ID NO: 6: проэнкефалин 119-159, фрагмент проэнкефалина средней области, MR-PENK).
В более конкретном варианте осуществления уровень иммунореактивного аналита определяют с использованием по меньшей мере одного связывающего средства, связывающегося с MR-PENK, и впоследствии он коррелирует с указанными выше вариантами осуществления изобретения в конкретных вариантах осуществления, имеющих клиническое значение, например, определение корреляции указанного уровня иммунореактивного аналита с риском развития CKD у индивидуума. Альтернативно, уровень любого из указанных выше аналитов можно определять другими аналитическими способами, например, масс-спектроскопией.
В конкретном варианте осуществления уровень иммунореактивного аналита определяют с использованием по меньшей мере одного связывающего средства, связывающегося с областью в аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, содержащей проэнкефалин или его фрагменты по меньшей мере из 5 аминокислот, или по меньшей мере 6 аминокислот, или по меньшей мере 7 аминокислот, или по меньшей мере 8 аминокислот, или по меньшей мере 9 аминокислот, или по меньшей мере 10 аминокислот, или по меньшей мере 12 аминокислот. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с областью с последовательностями, выбранными из группы, содержащей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10.
В конкретном варианте осуществления указанное связывающее средство не связывается с энкефалиновыми пептидами метэнкефалином, приведенным в SEQ ID NO: 3, и лейэнкефалином, приведенным в SEQ ID NO: 4.
В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с областью с последовательностями, выбранными из группы, содержащей SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 и 10.
В другом конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с областью с последовательностями, выбранными из группы, содержащей SEQ ID NO: 2, 5, 6, и 10.
В другом конкретном варианте осуществления указанное связывающее средство связывается с проэнкефалином 119-159, фрагментом проэнкефалина средней области, MR-PENK (SEQ ID NO: 6).
Указанное выше связывающее средство связывается с указанными пептидами в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное связывающее средство выбрано из группы, содержащей антитело, фрагмент антитела или неиммуноглобулиновый каркас, связывающиеся с проэнкефалином или его фрагментами по меньшей мере из 5 аминокислот, или по меньшей мере 6 аминокислот, или по меньшей мере 7 аминокислот, или по меньшей мере 8 аминокислот, или по меньшей мере 9 аминокислот, или по меньшей мере 10 аминокислот, или по меньшей мере 12 аминокислот.
В более конкретном варианте осуществления уровень иммунореактивного аналита определяют в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума, с использованием по меньшей мере одного связывающего средства, связывающегося с областью в аминокислотной последовательности проэнкефалина 119-159, фрагмента проэнкефалина средней области, MR-PENK (SEQ ID NO: 6).
В конкретном варианте осуществления уровень проэнкефалина или его фрагментов измеряют с помощью иммунологического анализа с использованием антител или фрагментов антител, связывающихся с проэнкефалином или его фрагментами. Иммунологический анализ, который может быть полезен для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов по меньшей мере из 5 аминокислот, может включать стадии, используемые в примерах и упомянутые в формуле изобретения. Все пороговые значения и значения должны иметь корреляцию с тестом и калибровкой, используемых в соответствии с примерами. Специалист в этой области может знать о том, что на абсолютное значение порогового значения может оказывать влияние используемая калибровка. Это означает, что все значения и пороговые значения, указанные в настоящем описании, следует понимать в контексте используемой калибровки.
3

По изобретению связывающее средство для проэнкефалина или его фрагментов выбрано из группы, состоящей из антител, например IgG, типичного полноразмерного иммуноглобулина, или фрагментов антител, содержащих, по меньшей мере, F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, например, химически соединенных антител (антигенсвязывающего фрагмента), включая, в качестве неограничивающих примеров, Fab-фрагменты, включая Fab-минитела, одноцепочечное Fab-антитело, моновалентное-Fab антитело с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; бивалентный Fab (миниантитело), димеризованное с доменом CH; бивалентный Fab или мультивалентный Fab, например, образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации доменов dHLX, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагментов, scFv-фрагментов, мультимеризированных мультивалентных или/и полиспецифических scFv-фрагментов, бивалентных и/или биспецифических диател, BITE (биспецифических T-клеточных рекрутеров), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из иного класса, чем G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов Верблюжьих или рыб. В предпочтительных вариантах осуществления связывающие средства являются антителами, полученными, как описано в заявке PCT № PCT/EP2013/070470.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
В конкретном варианте осуществления уровень проэнкефалина или его фрагментов измеряют с использованием анализа с использованием связывающих средств, выбранных из группы, содержащей аптамеры, неиммуноглобулиновые каркасы, как более подробно описано ниже, связывающиеся с проэнкефалином или его фрагментами. Связывающие средства, которые можно использовать для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, демонстрируют константу аффинности к проэнкефалину по меньшей мере 10 M, предпочтительно - 10 M, предпочтительная константа аффинности составляет более 10 M, наиболее предпочтительно - более 10 M. Специалисту в этой области известно, что можно рассматривать компенсацию более низкой аффинности, используя более высокую дозу соединений, и эта мера не выходит за рамки объема изобретения. Аффинность связывания можно определять способом Biacore, предлагаемым в качестве сервисного анализа, например, в Biaffin, Kassel, Germany (http://www.biaffin.com/de/).
Контрольный образец проэнкефалина человека доступен в ICI-Diagnostics, Berlin, Germany http://www.ici-diagnostics.com/. Анализ также можно калибровать с помощью синтетического (в экспериментах авторы настоящего изобретения использовали синтетический MR-PENK, SEQ ID NO: 6) или рекомбинантного проэнкефалина или его фрагментов.
В дополнение к антителам, в этой области хорошо известны другие биополимерные каркасы для усложнения целевой молекулы, и их используют для получения высокоспецифичных целевых биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. Неиммуноглобулиновые каркасы могут являться белковыми каркасами, и их можно использовать в качестве миметиков антител, т.к. они способны связываться с лигандами или антигенами. Неиммуноглобулиновые каркасы можно выбирать из группы, содержащей неиммуноглобулиновые каркасы на основе тетранектина (например, описываемые в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описываемые в EP 1266 025; каркасы на основе липокалина (например, описываемые в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например, описываемые в WO 2011/073214), каркасы для переноса (например, описываемые в US 2004/0023334), каркасы из протеина A (например, описываемые в EP 2231860), каркасы на основе анкириновых повторов (например, описываемые в WO 2010/060748), микропротеиновые каркасы (предпочтительно, микропротеины, образующий цистиновый узел) (например, описываемые в EP 2314308), каркасы на основе домена Fyn SH3 (например, описываемые в WO 2011/023685), каркасы на основе домена EGFR-A (например, описываемые в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Кунитца (например, описываемые в EP 1941867).
Пороговое значение для прогнозирования риска развития CKD может составлять от 30 до 80 пмоль/л MR-PENK, более предпочтительно - от 35 до 60 пмоль/л, даже более предпочтительно - от 40 до 50 пмоль/л, наиболее предпочтительно - от 41 до 49 пмоль/л.
В одном конкретном варианте осуществления уровень проэнкефалина измеряют с использованием иммунологического анализа, и указанное связывающее средство является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с проэнкефалином или его фрагментами по меньшей мере из 5 аминокислот.
В одном конкретном варианте осуществления используемый анализ включает два связывающих средства, связывающихся с двумя разными эпитопами в проэнкефалине, содержащими аминокислоты 133-140 (SEQ ID NO: 13) и аминокислоты 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждый из указанных эпитопов содержит по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления чувствительность указанного анализа для определения проэнкефалина или его фрагментов составляет <15 пмоль/л, предпочтительно <10 пмоль/л и более предпочтительно <6 пмоль/л.
Объектом по настоящему изобретению является применение по меньшей мере одного связывающего средства, связывающегося с эпитопом в аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, содержащей пептиды и фрагменты SEQ ID NO: 1-12, в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума, в способе прогнозирования или мониторинга риска развития CKD.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанное связывающее средство выбрано из группы, содержащей антитело, фрагмент антитела или неиммуноглобулиновый каркас, связывающиеся с проэнкефалином или его фрагментами по меньшей мере из 5 аминокислот. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с эпитопом с последовательностями, выбранными из группы, содержащей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В конкретном варианте осуществления указанное связывающее средство не связывается с энкефалиновыми пептидами метэнкефалином, приведенном в SEQ ID NO: 3, и лейэнкефалином, приведенном в SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с эпитопом в последовательностях, выбранных из группы, содержащей SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В другом конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее средство связывается с эпитопом с последовательностями, выбранными из группы, содержащей SEQ ID NO: 2, 5, 6, и 10. В другом конкретном варианте осуществления указанное связывающее средство связывается с проэнкефалином 119-159, фрагментом проэнкефалина средней области, MR-PENK. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере одно связывающее средство связывается с эпитопом в аминокислотной последовательности проэнкефалина 119-159, фрагмента проэнкефалина средней области, MR-PENK (SEQ ID NO: 6) в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума, более конкретно - с аминокислотами 133-140 (SEQ ID NO: 13) и/или аминокислотами 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждый из указанных эпитопов содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
8
-1
Таким образом, в соответствии со способами по настоящему изобретению уровень иммунореактивности указанного выше связывающего средства определяют в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума. Уровень иммунореактивности означает концентрацию аналита, определяемую количественно, полуколичественно или качественно посредством реакции связывания связывающего средства с таким аналитом, где связывающее средство предпочтительно имеет константу аффинности для связывания с аналитом по меньшей мере 10 M, и связывающее средство может являться антителом, или фрагментом антитела, или неиммуноглобулиновым каркасом, и реакция связывания является иммунологическим анализом.
Способы по настоящему изобретению с использованием PENK и его фрагментов, особенно MR-PENK, значительно превосходят способы и биомаркеры, используемые на предшествующем уровне техники для прогнозирования или мониторинга риска развития CKD у здоровых индивидуумов, практически здоровых индивидуумов или пациентов, страдающих нарушениями или заболеваниями, описываемыми в предшествующих разделах (например, гипертензией, сердечнососудистым заболеванием, аутоиммунным заболеванием, диабетом или метаболическим синдромом и т.д.).
PENK и его фрагменты в качестве биомаркера для указанного выше применения являются маркером, не зависящим от воспаления. Это является важным признаком, т.к. большинство из известных почечных биомаркеров, подобных NGAL и KIM-1, зависят от воспаления, что означает, что, если индивидуум имеет воспаление, например, сепсис, повышение NGAL или KIM-1 может являться результатом воспаления или функции/дисфункции почек. Таким образом, можно не осуществлять дифференциальную диагностику, по меньшей мере, не с использованием простого порогового значения (означающего одно (1) пороговое значение), не зависящего от конкретной исследуемой выборки пациентов. В случае NGAL и KIM-1 каждый пациент имеет "индивидуальное" пороговое значение для функции/дисфункции почек в зависимости от статуса воспаления указанного индивидуума, что делает клиническое применение этих почечных маркеров затруднительным при некоторых заболеваниях и невозможным при других. В отличие от этого, можно использовать одно отдельное пороговое значение, не зависящее от статуса воспаления индивидуума, в соответствии со способами по настоящему изобретению для всех индивидуумов. Это делает способы по настоящему изобретению подходящими для рутинного клинического применения в отличие от указанных выше маркеров. PENK и его фрагменты в качестве биомаркера в способах по настоящему изобретению, особенно MR-PENK, отражают "реальную" функцию почек. И наоборот, NGAL и KIM-1 отражает и повреждение почек, и воспаление.
Таким образом, объектом по настоящему изобретению является способ прогнозирования или мониторинга риска развития CKD, где используют пороговое значение, не зависящее от статуса воспаления.
Другим преимуществом указанных выше способов и применения PENK и его фрагментов в качестве биомаркера является то, что PENK и фрагменты в качестве биомаркеров являются очень ранними биомаркерами функции почек, дисфункции почек и риска неблагоприятного явления, успешности терапии или вмешательства. Термин "очень ранний" означает, например, что он присутствует в физиологической жидкости индивидуума с риском развития CKD раньше, чем креатинин или NGAL.
Объектом по настоящему изобретению также является способ прогнозирования или мониторинга риска развития CKD у индивидуума по любому из предшествующих вариантов осуществления, где уровень проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума, используют в отдельности или в комбинации с другими прогностически применимыми лабораторными или клиническими параметрами, которые можно выбирать из следующих альтернатив:
⋅ Сравнения с медианой уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума, в группе заранее определенных образцов в популяции "здоровых" или "практически здоровых" индивидуумов, предпочтительно, индивидуумов, не демонстрирующих дополнительные клинические признаки и/или не имеющих лабораторные маркеры факторов, ассоциированных с повышенным риском развития CKD (например, высокого систолического артериального давления, высокого BMI, высокого уровня глюкозы натощак, гипертензии и т.д.),
⋅ Сравнения с квантилью уровня проэнкефалина или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из указанного индивидуума, в группе заранее определенных образцов в популяции "здоровых" или "практически здоровых" индивидуумов, как указано выше,
⋅ Вычисления на основе регрессионного анализа пропорциональных рисков Кокса или с использованием вычислений индекса риска, такого как NRI(остаточный индекс реклассификации) или IDI (интегрированный индекс дискриминации).
Можно определять указанный по меньшей мере один дополнительный лабораторный или клинический параметр, выбранный из группы, содержащей: возраст, пол, общее состояние здоровья, массу тела, измерение сахара крови, измерение альбумина, NGAL, цистатин C, клиренс креатинина, креатинин, мочевину и оценку по шкале Apache.
Объектом по изобретению дополнительно является анализ для определения проэнкефалина и фрагментов проэнкефалина в образце, содержащем два связывающих средства, связывающихся с двумя различными эпитопами проэнкефалина, состоящими из аминокислот 133-140 (SEQ ID NO: 13) и аминокислот 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждый из указанных эпитопов содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления связывающие средства являются антителами, полученными, как описано в заявке PCT № PCT/EP2013/070470.
Одним из вариантов осуществления изобретения может являться так называемый тест POC (для использования в месте наблюдения за пациентом), тестовая технология, позволяющая осуществлять тест в течение менее 1 часа вблизи пациента без потребности в полностью автоматизированной системе анализа. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографического тестирования.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение уровня PENK в способах, представленных в настоящем описании, предпочтительно осуществляют с использованием иммунологического анализа. В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ является иммунологическим анализом сэндвич-типа с использованием любого типа технологии детекции, включая, в качестве неограничивающих примеров, ферментативную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ. В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ является ферментативным анализом мечения сэндвич-типа. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, BiomerieuxVidas, Alere Triage.
Известно множество иммунологических анализов, и их можно использовать для анализов и способов по настоящему изобретению, они включают: радиоиммунологические анализы ("RIA"), гомогенные иммунологические анализы с ферментативным усилением ("EMIT"), твердофазные иммуноферментные анализы ("ELISA"), иммунологический анализ реактивации апофермента ("ARIS"), иммунологические анализы с использованием тест-полосок и иммунохроматографические анализы.
В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одно из указанных двух связывающих средств метят для детекции. Предпочтительные способы детекции включают иммунологические анализы в различных форматах, таких как, например, радиоиммунологический анализ (RIA), хемилюминесцентные и флуоресцентные иммунологические анализы, ферментативные иммунологические анализы (ELISA), анализы частиц с использованием Luminex, белковые микроматричные анализы и форматы экспресс-тестов, такие как, например, иммунохроматографические тесты с тест-полосками.
В предпочтительном варианте осуществления указанная метка выбрана из группы, содержащей хемилюминесцентную метку, ферментативную метку, флуоресцентную метку, метку радиоактивного йода.
Анализы могут являться гомогенными или гетерогенными анализами, конкурентными и неконкурентными анализами. В одном из вариантов осуществления анализ находится в форме анализа сэндвич-типа, являющегося неконкурентным иммунологическим анализом, где молекула, подлежащая детекции и/или количественному анализу, связана с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, частицей, поверхностью лунки или другого контейнера, чипа или тест-полоски, и второе антитело является антителом, меченым, например, красителем, радиоактивным изотопом или реакционноспособным или каталитически активным остатком. Затем количество меченого антитела, связанного с аналитом, измеряют подходящим способом. Общая композиция и способы, связанные с "анализами сэндвич-типа", хорошо известны специалисту в этой области.
В контексте по настоящему изобретению флуоресцентные анализы включают использование красителей, которые, например, можно выбирать из группы, содержащей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7- гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4,5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, зеленый родамин, красный родамин, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, бромид этидия, акридиновые красители, карбазоловые красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п. В контексте по настоящему изобретению хемилюминесцентные анализы включают использование красителей, основанное на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в (24). Хемилюминесцентная метка может являться акридиновой сложноэфирной меткой, стероидными метками, включающими изолюминоловые метки, и т.п. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются акридиновые сложные эфиры.
Ферментативные метки могут являться лактатдегидрогеназой (LDH), креатинкиназой (CK), щелочной фосфатазой, аспартатаминотрансферазой (AST), аланинаминотрансферазой (ALT), кислой фосфатазой, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназой и т.п.
8
-10
Как указано в настоящем описании, "анализ" или "диагностический анализ" может принадлежать к любому типу, используемому в области диагностики. Такой анализ может иметь в своей основе связывание аналита, подлежащего детекции, с одним или несколькими зондами захвата с конкретной аффинностью. Учитывая взаимодействие между молекулами захвата и молекулами-мишенями или интересующими молекулами, константа аффинности предпочтительно составляет более 10 M.
В контексте по настоящему изобретению "молекулами связывающего средства" являются молекулы, которые можно использовать для связывания молекул-мишеней или интересующих молекул, т.е. аналитов (т.е. в контексте по настоящему изобретению PENK и его фрагментов), из образца. Таким образом, молекулы связывающего средства необходимо соответствующим образом сформировать, пространственно и в терминах признаков поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, для специфического связывания молекул-мишеней или интересующих молекул. Таким образом, связывание, например, может быть опосредовано ионными, ван-дер-ваальсовыми, пи-пи-, сигма-пи-, гидрофобными или водородными связями или комбинацией двух или более указанных выше взаимодействий между молекулами захвата и молекулами-мишенями или интересующими молекулами. В контексте по настоящему изобретению молекулы связывающего средства, например, можно выбирать из группы, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу ПНК, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно, молекулы связывающего средства являются антителами, включая его фрагменты с достаточной аффинностью к мишени или интересующей молекуле, и включая рекомбинантные антитела или рекомбинантные фрагменты антител, а также химически и/или биохимические модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученных из варианта цепи с длиной по меньшей мере 12 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одно из указанных двух связывающих средств связано с твердой фазой, такой как магнитные частицы и полистироловые поверхности.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одно из указанных двух связывающих средств метят для детекции. Примеры меток представлены выше.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения о меньшей мере одно из указанных двух связывающих средств связано с твердой фазой. Примеры твердых фаз представлены выше. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная метка выбрана из группы, содержащей хемилюминесцентную метку, ферментативную метку, флуоресцентную метку, метку радиоактивного йода. Дополнительным объектом по настоящему изобретению является набор, включающий анализ по настоящему изобретению, где компоненты указанного анализа могут содержаться в одном или нескольких контейнерах.
В одном из вариантов осуществления объектом по настоящему изобретению является устройство для использования в месте наблюдения за пациентом для осуществления способа по изобретению, где указанное устройство POC содержит по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела против аминокислот 133-140 (SEQ ID NO: 13) или аминокислот 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
В другом варианте осуществления объектом по настоящему изобретению является устройство для использования в месте наблюдения за пациентом для осуществления способа по изобретению, где указанное устройство POC содержит по меньшей мере два антитела или фрагмента антител против аминокислот 133-140 (SEQ ID NO: 13) и аминокислот 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления объектом по настоящему изобретению является набор для осуществления способа по изобретению, где указанное устройство для использования в месте наблюдения за пациентом содержит по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела против аминокислот 133-140 (SEQ ID NO: 13) или аминокислот 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот. В одном из вариантов осуществления объектом по настоящему изобретению является набор для осуществления способа по изобретению, где указанное устройство для использования в месте наблюдения за пациентом содержит по меньшей мере два антитела или фрагмента антител против аминокислот 133-140 (SEQ ID NO: 13) и аминокислот 152-159 (SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
Примеры
Пример 1 - Получение антитела
Антитела получали, как описано в заявке PCT № PCT/EP2013/070470.
Пример 2 - PENK у здоровых индивидуумов
Здоровых индивидуумов (n=4211, средний возраст 56 лет) исследовали с использованием анализа MR-PENK. Среднее значение составляло 44,7 пмоль/л MR-PENK, наименьшее значение составляло 9 пмоль/л, и 99-аяпроцентиль составляла 80 пмоль/л. Т.к. чувствительность анализа составляла 5,5 пмоль/л, 100% всех здоровых индивидуумов были определимы с использованием описанного анализа MR-PENK.
Пример 3 - Клиническое исследование и статистический анализ полученных результатов
2
Сравнительная популяция для этого исследования представляет собой популяционное проспективное исследование из Malmö, Sweden, (Malmö Diet and Cancer Study MDCS), в котором 28098 здоровых мужчин и женщин, рожденных в 1923-1945 гг. и 1923-1950 гг., участвовали в начальном исследовании с 1991 по 1996 год. Общий коэффициент участия составлял приблизительно 40,8%. Включали индивидуумов из 6103 случайным образом выбранных участников из MDCS, подвергнутых дополнительному фенотипированию, осуществляли исследования эпидемиологии заболевания сонной артерии в MDC Cardiovascular Cohort (MDC-CC) с 1991 по 1994 год. В течение последующего повторного исследования эту случайную выборку повторно приглашали на последующее повторное исследование с 2007 по 2012 год. Из них 3734 индивидуумов были живы и не эмигрировали из Швеции (N=4924), посетив последующее повторное исследование. После исключения всех индивидуумов без уровней MR-PENK, измеренных на исходном уровне (n=1460), тестировали ассоциацию между ранним изменением eGFR, креатинина плазмы и цистатина C плазмы у 2801, 2843 и 2978 индивидуумов, соответственно, измерения для которых были доступны при обоих исследованиях. Взаимосвязь между концентрацией MR-PENK на исходном уровне и наличием CKD при последующем повторном исследовании оценивали всего у 2567 участников с eGFR более 60 мл/мин/1,73 м на исходном уровне.
Всех участников подвергали физикальному осмотру при начальном исследовании, и дипломированные медицинские сестры оценивали следующие антропометрические характеристики: рост (см), масса тела (кг), обхват талии, а также обхват бедер. Обученный персонал измерял систолическое и диастолическое артериальное давление (мм рт.ст.) после 10 минут покоя. Массу нежировых тканей и жировую массу тела оценивали с использованием анализа биоэлектрического сопротивления (одночастотные анализы, BIA 103; JRL Systems, Detroit, MI). На вопросы, касающиеся социо-экономического статуса, факторов образа жизни и анамнеза, участники отвечали с помощью самостоятельно заполняемого опросника. Получали образцы крови не натощак, незамедлительно замораживали их до -80°C и хранили в биологическом банке, доступном для выделения ДНК. Участник MDC-CC также предоставлял образцы крови натощак, в которых измеряли креатинин (мкмоль/л) и цистатин C (мг/л) плазмы. Кроме того, количественно определяли общий холестерин (ммоль/л), триглицериды (TG) (ммоль/л), липопротеины низкой плотности (LDL-C) (ммоль/л), липопротеины высокой плотности (HDL-C) (ммоль/л), глюкозу цельной крови (ммоль/л), инсулин в плазме (мкЕд./мл), HOMA (инсулин*глюкоза/22,5), HbA1c (%) и измеряли артериальное давление в положении лежа с использованием ртутного сфигмоманометра после 10 мин покоя.
В течение последующего повторного исследования (2007-2012) измеряли следующие антропометрические характеристики: рост (м), массу тела (кг), обхват талии и бедер (см), систолическое и диастолическое артериальное давление (SBP и DBP) (мм рт.ст.), следуя протоколу, схожему с начальным исследованием. Дополнительные концентрации холестерина (ммоль/л), триглицеридов (ммоль/л), HDL-C (ммоль/л), глюкозы (ммоль/л), креатинина (мкмоль/л), цистатина C (мг/л) количественно анализировали в образцах крови натощак.
2
MR-PENK измеряли в образцах плазмы натощак от 4634 участников начального исследования MDC-CC с использованием хемилюминесцентного иммунологического анализа сэндвич-типа. Для 1460 индивидуумов уровни MR-PENK в плазме натощак отсутствовали. Они были немного моложе, имели значительно более высокий BMI и креатинин плазмы, а также более низкое систолическое артериальное давление, уровень глюкозы натощак и концентрацию HbA1c в начальном исследовании MDC, но они не отличались по полу, липидам плазмы, цистатину C или антигипертензивному лечению от включенных участников (дополнительная таблица T1). Для достижения нормального распределения авторы настоящего изобретения преобразовывали концентрацию с положительной ассиметрией MR-PENK плазмы натощак с использованием натурального логарифма. Кроме того, непрерывные концентрации MR-PENK делили на тертили, определяя первую тертиль (наименьшая концентрация MR-PENK) в качестве референса. По причине того, что женщины имели немного более высокую среднюю концентрацию MR-PENK на исходном уровне по сравнению с мужчинами (значение P при одностороннем ANOVA <0,000001), уровни MR-PENK в плазме натощак сначала группировали по полу, а затем комбинировали эти группы. При исследовании на исходном уровне и последующем исследовании концентрации креатинина и цистатина C анализировали в плазме и представляли в мкмоль/л и мг/л, соответственно. CKD определяли как наличие оцениваемой GFR (eGFR) менее 60 мл/мин/1,73 м, вычисленной по представленному ранее уравнению CKD-EPI-2012, в котором участвуют концентрацию креатинина в крови, а также цистатина C.
Статистические анализы
2
2
Ассоциацию между концентрацией MR-PENK в плазме натощак на исходном уровне и риск CKD при последующем повторном исследовании анализировали с использованием логистической регрессии с поправкой на последующий период наблюдения в годах, возраст, пол, GFR (мл/мин/1,73 м) и распространенные факторы риска для функции почек на исходном уровне (систолическое артериальное давление, BMI (кг/м), уровень глюкозы натощак и антигипертензивное лечение).
Уравнение 1: Пример среднего изменения массы тела (кг) на год последующего периода наблюдения
Для клинических эпидемиологических анализов использовали SPSS (версия 21, IBM) и все анализы корректировали по полу и возрасту. Дополнительные поправки на ковариаты в конкретных моделях приведены в разделе результатов. Отвергали нулевую гипотезу, если наблюдали 2-стороннее значение P менее 0,05 и ассоциацию считали статистически значимой.
Перекрестные анализы между MR-PENK и функцией почек при начальном MDC (1991-1994)
таблица 1
Высокие уровни MR-PENK были значимо ассоциированы с более старшим возрастом и снижением нескольких антропометрических характеристик у мужчин и женщин. Кроме того, концентрации TG, глюкозы плазмы натощак, инсулина в плазме и HBbA1c снижались с повышением MR-PENK. Уровни креатинина и цистатина C были значимо выше у индивидуумов в наиболее высокой тертили (). При использовании дополнительной поправки основной модели (возраст и пол) на BMI, жировую массу тела, концентрацию глюкозы в плазме натощак, массу нежировых тканей, цистатин C или eGFR не определяли того, что любая из этих ковариат регулировала наблюдаемые ассоциации между концентрацией MR-PENK и тестируемыми фенотипическими характеристиками.
Таблица 1
1
Перекрестная взаимосвязь между тертилями уровней MR-PENK и фенотипическими характеристиками участников начального исследования Malmö Diet and Cancer Study (1991-1994)
n
Концентрация MR-проэнкефалина в плазме натощак<sup>2</sup>
Значение <i>P</i><sup>3</sup>
Низкая
Средняя
Высокая
Возраст (годы)
4634
57,56 (0,153)
58,04 (0,153)
59,12 (0,153)
<0,000001
BMI (кг/м<sup>2</sup>)
4630
26,69 (0,099)
25,80 (0,098)
24,96 (0,099)
<0,000001
Обхват талии (см)
4629
87,65 (0,255)
84,85 (0,254)
83,00 (0,255)
<0,000001
SBP (мм рт.ст.)
4634
144,42 (0,459)
141,58 (0,458)
141,334 (0,460)
0,000002
DBP (мм рт.ст.)
4634
88,36 (0,237)
87,07 (0,236)
86,78 (0,237)
0,000003
Глюкоза (ммоль/л)<sup>4</sup>
4616
6,04 (0,039)
5,71 (0,039)
5,56 (0,039)
<0,000001
Креатинин (мкмоль/л)
4541
81,80 (0,370)
84,73 (0,368)
88,96 (0,370)
<0,000001
Цистатин C (мг/л)
4310
0,75 (0,004)
0,78 (0,004)
0,83 (0,004)
<0,000001
eGFR CKD-EPI 2012
4252
93,33 (0,302)
89,82 (0,302)
85,20 (0,305)
<0,000001
Антигипертензивное лечение (%)
789
17,0
16,3
17,8
/<sup>5</sup>
1
2
3
4
5
как среднее и SE; специфичные по полу MR-PENK пороговые значения тертили в пмоль/л, Мужчины: низкая: среднее значение 33,08 (18,30-38,50), среднее: среднее значение 42,45 (38,60-46,60), высокая: среднее значение 55,45 (46,70-164,70), Женщины: низкая: среднее значение 37,06 (9,00-43,00), средняя: среднее значение 47,40 (43,10-51,70), высокая: среднее значение 61,71 (51,80-518,10); общая линейная модель с поправкой на возраст и пол; концентрацию в цельной крови натощак преобразовывали в значение для плазмы, умножая его на 1,11; SBP=систолическое артериальное давление; DBP=диастолическое артериальное давление; критерий хи-квадрат
Проспективные изменения функции почек при последующем повторном исследовании относительно концентрации MR-PENK в плазме натощак в начальном исследовании
2
trend
trend
trend
таблица 2
Затем исследовали взаимосвязь между концентрацией MR-PENK в плазме натощак на исходном уровне и изменением фенотипических характеристик между начальным и последующим повторным исследованием у 2908 участников MDC-CC. Снижение eGFR, а также повышение цистатина C и креатинина плазмы были значимыми в линейной модели с поправкой на возраст при последующем исследовании, пол и соответствующие исходные значения. На год периода последующего наблюдения мужчин и женщин классифицировали в наиболее высокую тертиль концентрации MR-PENK на исходном уровне, eGFR снижалась на 1,543 мл/мин/1,73 м (P<0,001), в то время как цистатин C и креатинин плазмы повышались на 0,026 мг/л (P<0,01) и 0,222 мкмоль/л (P<0,00001), соответственно ().
Таблица 2
Ассоциация между тертилями MR-PENK в плазме натощак в начальном исследовании (1991-1996) и средними изменениями функции почек и других клинических характеристик на год в течение последующего повторного исследования (2007-2012) в Malmö Diet and Cancer Study
N (%)
n
Концентрация MR-проэнкефалина в плазме натощак
Значение <i>P</i><sup>1</sup>
Низкая971 (33,4)
Средняя965 (33,2)
Высокая972 (33,2)
BMI (кг/м<sup>2</sup>)
2903
0,080 (0,005)
0,080 (0,005)
0,083 (0,005)
0,710206
Обхват талии (см)
2905
0,602 (0,015)
0,564 (0,015)
0,557(0,015)
0,033180
SBP (мм рт.ст.)
2903
0,270 (0,035)
0,199 (0,035)
0,248 (0,035)
0,655250
DBP (мм рт.ст.)
2902
-0,161 (0,019)
-0,194 (0,019)
-0,211 (0,019)
0,069642
Глюкоза (ммоль/л)<sup>2</sup>
2897
0,0045 (0,000)
0,0042 (0,000)
0,0039 (0,000)
0,002307
Креатинин (мкмоль/л)
2767
-0,066 (0,043)
-0,034 (0,043)
0,222 (0,043)
0,000003
Цистатин C (мг/л)
2636
0,023 (0,001)
0,023 (0,001)
0,026 (0,001)
0,007428
<b>eGFR CKD-EPI 2012</b>
2601
-1,412 (0,026)
-1,412 (0,0269)
-1,543 (0,026)
0,000593
Частота CKD (%)
2819
233 (24,4)
298 (31,3)
422 (44,3)
< 0,0001
1
2
в общей линейной модели с поправкой на возраст в период последующего наблюдения, пол и значение на исходном уровне; BSA=площадь поверхности тела; различия вычисляли, преобразуя исходное значение в цельной крови натощак в значение в плазме (×1,11); SBP=систолическое артериальное давление; DBP=диастолическое артериальное давление;
Проспективный анализ ассоциации между уровнями MR-PENK в плазме натощак на исходном уровне и CKD при последующем повторном исследовании
2
trend
trend
trend
trend
trend
Распространенность CKD с учетом eGFR выше 60 мл/мин/1,73 м составляла 32,3% у 2567 участников в середине последующего периода наблюдения 16,6 лет (диапазон 13,42-20,35 лет). Вероятность события в течение периода последующего наблюдения составляла 19,46 на 1000 человеко-лет, и частота CKD была значимо больше у женщин, чем у мужчин (20,93 по сравнению с 17,31 на 1000 человеко-лет; 2-кратное значение P<0,001). Авторы настоящего изобретения наблюдали значительное повышение риска развития CKD в последующем повторном исследовании с повышением уровней MR-PENK в основной скорректированной модели логистической регрессии (OR:1,165 на повышение в 1 SD; P=0,012). Мужчины и женщины, имеющие высокую исходную концентрацию MR-PENK, имели на 1/3 более высокий риск развития CKD по сравнению с индивидуумами, имеющими низкие уровни на исходном уровне (OR: 1,34; 95% CI: 1,061-1,701). Ассоциация являлась более сильной, когда авторы настоящего изобретения добавляли дополнительный фактор риска для функции почек, такой как глюкоза в плазме натощак, систолическое артериальное давление, антигипертензивное лечение и BMI на исходном уровне, в модель, что приводило к OR 1,236 на повышение 1 SD концентрации p-ENK (P<0,01). Участники с наиболее высокими по сравнению с наименьшими уровнями MR-PENK на исходном уровне имели на 51,4% повышенный риск развития CKD (95% CI 1,184-1,936). При осуществлении специфического по полу, многофакторного скорректированного анализа повышение риска для высокой концентрации MR-PENK на исходном уровне являлось сравнимым у женщин (P=0,005), хотя у мужчин тенденция являлась схожей, но не значимой (P=0,08). Однако, при введении перекрестного произведения пола и тертилей концентрации MR-PENK в многофакторную скорректированную модель не наблюдали взаимодействие в случае MR-PENK и пола (P=0,99). В случае анализов чувствительности исключали преобладающих пациентов с диабетом и сердечнососудистыми заболеваниями в начальном MDC в качестве потенциальных факторов риска CKD, что не изменяло результаты оставшихся 2452 индивидуумов (OR=1,528 в случае наиболее высокой концентрации MR-PENK на исходном уровне; 95% CI 1,188-1,965).