СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСАНТОГУМОЛА
PROCESS FOR PREPARATION OF XANTHOHUMOL

Согласно настоящему изобретению предложен способ получения ксантогумола высокой чистоты из постэкстракционного отработанного хмеля, гранулированного хмеля или хмеля. Из-за высокой степени чистоты полученного ксантогумола его можно успешно применять в биологически активных пищевых добавках, напитках и в качестве ингредиента лекарственных продуктов.
Ксантогумол (Xn), или ((Е)-1-[2,4-дигидрокси-6-метокси-3-(3-метилбут-2-енил)-фенил]-3-(4-гидроксифенил)проп-2-ен-1-он) представляет собой встречающееся в природе соединение группы пренилированных халконов, его основным источником является женское соцветие Humulus Lupus (хмель). Он присутствует в пиве только в следовых количествах. Соединение состоит из двух бензольных колец, соединенных α,β-ненасыщенным карбонильным фрагментом:
Присутствие в молекуле свободной гидроксильной группы делает ее легко изомеризующейся в соответствующий флаванон - промежуточное соединение в пути биосинтеза флавоноидов. В отличие от других ингредиентов хмеля, ксантогумол является более липофильным, что связано с наличием пренилированного заместителя в его структуре. Следует отметить, что в живых биологических системах пренилированные (фарнезил- или геранилгеранил) фрагменты облегчают присоединение многочисленных внутриклеточных молекул к клеточной мембране, определяя их соответствующие действия. Схожим образом предполагается, что в случае ксантогумола такие фрагменты могут существенно регулировать биологическую активность соединения, и более того, влиять на его физико-химические свойства и внутриклеточное распределение.
In vitro и in vivo исследования также позволяют предположить, что ксантогумол снижает воспалительные и окислительные процессы с помощью различных механизмов. Главными из них являются: устранение свободных радикалов кислорода и их активных форм (RTF), ингибирование активности циклооксигеназы (ЦОГ I и ЦОГ II), снижение выработки простагландина, NO, ФНОα, NF-кВ и нейтрализация пероксидного окисления фосфолипидов мембраны.
Антиоксидантная и противовоспалительная активность ксантогумола связана с присутствием гидроксильных групп и пренилированного заместителя в его молекуле. Важное значение имеет также α, β-ненасыщенный карбонильный фрагмент. Фрагмент участвует в реакции Михаэля с биологически важными нуклеофилами, например: L-цистеин в белках и другие молекулы, содержащие сульфгидрильную группу. Таким образом были получены ковалентные аддукты, которые вызывают потерю биологической активности различных молекул, связанных с ксантогумолом.
Широкий спектр активности ксантогумола, вероятно, обусловлен способностью соединения связывать важные биологические молекулы. Одним из наиболее известных примеров является влияние ксантогумола на полимераза-альфа-синтетазу, топоизомеразу I, щелочную фосфатазу, ароматазу, диацилглицеролацилтрансферазу, белки сигнального пути МАРК, FAK-киназу, протеинкиназу В и STAT или NF-кВ факторы транскрипции. Xn-индуцированное снижение активности указанных белков вызывает плейотропные клеточные эффекты как следствие пролиферации, клеточного цикла, адгезии и нарушений миграции в опухолевых клетках.
Также заслуживает внимания информация о его нейропротекторных свойствах. В крысиной модели МСАО-индуцированной фокальной ишемии, которая отражает фокальную ишемию головного мозга in vivo, ксантогумол значительно уменьшает область ишемического некроза мозга. Таким образом, предполагается, что ксантогумол уменьшает также нейротоксический эффект, вызванный β-амилоидным пептидом (Аβ). Известно, что Аβ является промежуточным звеном свободно-радикального механизма и является одной из основных причин болезни Альцгеймера путем увеличения выработки свободных радикалов и пероксидного окисления липидов в нервных клетках, что, в свою очередь, приводит к их апоптозу.
Кроме того, помимо его влияния на рецепторы механизм активности ксантогумола может быть связан с его избирательной активностью по отношению к липидным мембранам. Исследования механизмов взаимодействия ксантогумола с модельными липидными мембранами указывают на масштабное изменение динамических и структурных свойств мембраны. Даже очень малые концентрации ксантогумола сильно взаимодействуют с гидрофильными фрагментами липидной мембраны, оказывая влияние на изменение толщины бислоя. Известно также, что неоникотиноиды, из-за их высокой гидрофобности, очень легко проходят сквозь липидные мембраны. Взаимодействие ксантогумола с липидной мембраной может значительно уменьшать ее проницаемость для неоникотиноидов, что может объяснять его высокую активность, помимо блокирования никотиновых рецепторов.
Что касается его химического состава, ксантогумол представляет собой полифенол, тем не менее, в отличие от полифенолов, он с трудом растворяется в горячей воде, но легко растворяется в спиртах или смесях вода/спирт.
Хорошим источником ксантогумола является постэкстракционный отработанный хмель, который содержит отходы производства экстракта хмеля, применяемого в пивоваренной промышленности для производства пива. Постэкстракционный отработанный хмель, по оценкам, содержит до 1% ксантогумола, в зависимости от вида хмеля.
В данной области техники известны многочисленные способы получения ксантогумола. В заявке на патент ФРГ 19939350 А1 раскрыт способ получения обогащенного ксантогумолом экстракта хмеля, где для экстракции применяются смеси воды и этанола. Полученный экстракт содержит от 5 до 15% ксантогумола.
2
В Европейском патенте 1424385 В1 раскрыт способ извлечения ксантогумола из неочищенного материала, содержащего ксантогумол, путем применения сжатого CO в качестве растворителя при давлении выше 500 бар и при температурах выше 60°C.
В заявке на патент КНР 101440029 раскрыт способ извлечения ксантогумола из хмеля и продуктов, содержащих ксантогумол, где экстрагирование органическим растворителем при воздействии ультразвука проводится с последующим смешиванием с диатомитом, фильтрованием, промывкой смесью водой/метанол, концентрированием, осаждением и сушкой с получением ксантогумола с чистотой 86%.
В патенте ЕР 2187899 В1 раскрыт способ получения композиции с высоким содержанием ксантогумола из хмеля, в котором к раствору, содержащему ксантогумол, добавляют соль до концентрации в диапазоне от 0,05 до 5,0 М, с последующим повышением рН до от 10,5 до 12,0, фильтрованием полученного осадка, подкислением фильтрата до рН 7-8 с получением осадка ксантогумола с чистотой 40-95%.
В заявке на патент США 11/790365 раскрыт способ получения порошка с высоким (60-90%) содержанием ксантогумола, включающий суспендирование экстракта, обогащенного ксантогумолом, в щелочном растворе, отделение нерастворимых продуктов, нейтрализацию и осаждение растворенного ксантогумола кислотой и выделение продукта.
В патенте КНР 101433592 раскрыто применение различных адсорбционных смол для получения ксантогумола высокой чистоты.
В заключение, из анализа уровня техники однозначно следует, что существует потребность в разработке простого и недорогого способа получения ксантогумола высокой чистоты.
Указанная задача решается с помощью недавно разработанного способа получения ксантогумола из постэкстракционного отработанного хмеля, гранулированного хмеля или хмеля.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения ксантогумола, в котором:
а) экстракт, содержащий ксантогумол, смешивают с водой;
б) к полученной смеси добавляют раствор соли переходного металла;
в) полученный осадок ксантогумола собирают и высушивают с получением ксантогумола с чистотой выше 90%.
Предпочтительно, чтобы на этапе б) концентрацию соли в смеси устанавливали в диапазоне от 0,001 М до 10 М, более предпочтительно на этапе б) концентрацию соли в смеси устанавливали в диапазоне от 0,001 М до 0,05 М или выше 5 М.
Предпочтительно, дополнительно после того, как добавляют соль на этапе б:
б1) раствор подщелачивают до уровня рН выше 7;
б2) первый осадок отфильтровывают, и фильтрат подкисляют до уровня рН ниже 7;
б3) подкисленный фильтрат концентрируют с получением осадка ксантогумола.
Предпочтительно на этапе б1) раствор подщелачивают до уровня рН в диапазоне от 7,5 до 10,5 или выше 12.
Предпочтительно экстракт, содержащий ксантогумол, получают путем экстракции постэкстракционного отработанного хмеля, хмеля, гранулированного хмеля или их смеси с органическим смешивающимся с водой растворителем, причем указанный растворитель используется в количестве от 0,1 до 10 литров на 1 кг сырья.
Предпочтительно в качестве органического смешивающегося с водой растворителя применяют кетоны и спирты или их смесь, более предпочтительно в качестве органического смешивающегося с водой растворителя применяют ацетон, метанол, этанол, пропанол или их смесь.
Предпочтительно, экстракцию проводят при температуре в диапазоне от 5 до 65°C.
Предпочтительно, экстракт, содержащий ксантогумол, смешивают с водой в соотношении в диапазоне от 0,1 до 5 литров воды на 1 литр экстракта, более предпочтительно экстракт, содержащий ксантогумол, смешивают с водой в соотношении в диапазоне от 1 до 3 литров воды на 1 литр экстракта.
Предпочтительно на этапе б) обеспечивают концентрацию соли переходного металла в диапазоне от 0,01 М до 0,05 М.
Предпочтительно в качестве соли переходного металла применяют соль меди (II) или соль цинка (II).
Предпочтительно в качестве соли переходного металла применяют хлорид, нитрат или сульфат.
Предпочтительно в качестве соли переходного металла применяют сульфат меди (II), хлорид меди (II), хлорид цинка (II) или сульфат цинка (II).
Способ согласно настоящему изобретению позволяет получить ксантогумол с чистотой не менее 90% (обычно выше 95%) с хорошим выходом. Способ согласно настоящему изобретению не требует применения сложных хроматографических систем или смол на подложке.
Чистоту полученного ксантогумола определяли методом ВЭЖХ на колонке SUPELCOSIL LC-PAH 15 см × 4,6 мм, с размером зерна 5 мкм, температура колонки 20°C, фаза А - 95% ацетонитрил 0,3% НСООН; Фаза Б - 2% ацетонитрил 0,3% НСООН, линейная скорость потока 2 мл/мин, ввод пробы по 20 мкл, детектирование на длине волны 370 и 290 нм.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими демонстрационными примерами.
Пример 1
2
Взвешивали 250 г постэкстракционного отработанного хмеля и заливали ацетоном (0,75 л). После механического перемешивания в течение 1 ч полученный экстракт отфильтровывали через фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат (0,65 л) промывали водой (1,3 л). Затем в раствор добавляли водный раствор CuCl (концентрация 10 г/л) объемом 300 мл на 1 л фильтрата (конечная концентрация 0,022 М). После добавления хлорида меди рН раствора стабилизировался на уровне ~4,5. Практически сразу после вливания хлорида меди в экстракте произошло выпадение осадка в виде агломератов зеленого материала, состоящего из остаточных гумулонов и хлорофилла, выделяющегося из желтого раствора, в котором был обнаружен ксантогумол. Через час добавляли раствор NaOH для осаждения избытка меди путем повышения рН до примерно 10. Через 1 ч наблюдалось образование осадка в виде мутной массы и осадка гидроксида меди на дне сосуда. Осадки отфильтровывали на фильтровальной бумаге. Полученный фильтрат подкисляли HCl до рН 6 и концентрировали на роторном испарителе с получением осадка кристаллического ксантогумола, который отфильтровывали и сушили в печи (температура 50-60°C) с получением 206 мг ксантогумола с чистотой 97,8% по данным ВЭЖХ. Выход процесса экстракции ксантогумола составил 82% в расчете на общее содержание ксантогумола в отработанном хмеле.
Пример 2
Ксантогумол получали, как в примере 1, за исключением того, что после добавления хлорида меди выпавший зеленый осадок отфильтровывали и фильтрат концентрировали на роторном испарителе, с получением осадка кристаллического ксантогумола чистотой 90,8% по данным ВЭЖХ.
Пример 3
4
Ксантогумол получали, как в примере 1, за исключением того, что хлорид меди заменяли раствором сульфата цинка (ZnSO) в концентрации 10 г/л. После добавления раствора соли цинка рН раствора стабилизировался на уровне ~6 и наблюдалось выпадение осадка. Примерно через час добавляли NaOH с увеличением рН до примерно 10. Через 1 ч наблюдалось дальнейшее выпадение осадка на дне сосуда. Осадок отфильтровывали на фильтровальной бумаге. Полученный фильтрат подкисляли HCl до рН 6 и концентрировали на роторном испарителе с получением осадка кристаллического ксантогумола, который отфильтровывали и сушили в печи (температура 50-60°C) с получением ксантогумола с чистотой 97,8% по данным ВЭЖХ с выходом 79% в расчете на общее содержание ксантогумола в отработанном хмеле.
Пример 4
2
Взвешивали 250 г постэкстракционного отработанного хмеля и заливали 0,75 л чистого метанола. После механического перемешивания в течение 1 ч полученный экстракт отфильтровывали на фильтровальной бумаге. Полученный фильтрат заливали водой в объемном соотношении 1:2 (одна часть фильтрата на две части воды). Затем в раствор добавляли водный раствор CuCl (концентрация 10 г/л) объемом 300 мл на 1 л фильтрата (конечная концентрация соли 0,022 М). Через 1 ч в экстракте наблюдалось выпадение осадка в виде агломератов зеленого материала, отделяющегося от желтого раствора. Затем добавляли NaOH для повышения рН до 10. Через 1 ч наблюдалось выпадение мутного зеленого осадка на дне сосуда. Образовавшийся экстракт фильтровали на фильтровальной бумаге. Полученный экстракт подкисляли HCl до рН 6. Оставшееся количество растворителя удаляли на роторном испарителе и получали суспензию кристаллов ксантогумола. Суспензию фильтровали через фильтровальную бумагу с получением ксантогумола, который сушили в сушильном шкафу при температуре 55°C с получением 196 мг ксантогумола с чистотой 95,8% с выходом около 78% в расчете на общее содержание ксантогумола в отработанном хмеле.
Пример 5
4
Ксантогумол получали, как в примере 4, за исключением того, что вместо хлорида меди (II) применяли сульфат меди (II) (CuSO) в концентрации 10 г/л и получали ксантогумол с чистотой 94,8%.
Пример 6
Ксантогумол получали, как в примере 1, за исключением того, что более применяли более высокие концентрации хлорида меди (II) - в диапазоне от 0,022 М до 0,044 М. Получали ксантогумол с чистотой в диапазоне 96,3-97,8%.
Пример 7
2
Ксантогумол получали, как в примере 1, за исключением того, что соотношение экстракта из первого этапа к количеству добавленного раствора составляло 1:1, и применяли концентрацию CuCl, равную 0,022 М, с получением ксантогумола с чистотой 96,8%.
Пример 8
2
Ксантогумол получали, как в примере 1, за исключением того, что применяли 2-пропанол вместо ацетона и концентрацию CuCl, равную 0,022 М, с получением ксантогумола с чистотой 93,8%.
Сравнительный пример 1
Взвешивали 250 г постэкстракционного отработанного хмеля и заливали ацетоном (0,75 л). После механического перемешивания в течение 1 ч полученный экстракт отфильтровывали через фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат концентрировали с получением ксантогумола с чистотой 32,8%.
Сравнительный пример 2
Взвешивали 250 г постэкстракционного отработанного хмеля и заливали ацетоном (0,75 л). После механического перемешивания в течение 1 ч полученный экстракт отфильтровывали через фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат (0,65 л) заливали водой (1,3 л). Затем в раствор добавляли водный раствор NaCl (концентрация 30 г/л) объемом 300 мл на 1 л фильтрата. Затем добавляли NaOH для повышения рН до примерно 12. Образовавшийся осадок отфильтровывали через фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат подкисляли HCl до рН 5 и концентрировали на роторном испарителе с получением осадка ксантогумола, который отфильтровывали и сушили в печи (температура 50-60°C) с получением ксантогумола с чистотой 84,8% по данным ВЭЖХ.
Сравнительный пример 3
Ксантогумол получали, как в сравнительном примере 2, за исключением того, что NaCl не использовали. Ксантогумол получали с чистотой 58% по данным ВЭЖХ - в результате подщелачивания только до рН 12.
На основании описанных выше демонстрационных примеров может быть установлено, что способ согласно настоящему изобретению позволяет получить ксантогумол высокой чистоты исключительно простым и недорогим способом. Для специалиста в данной области техники очевидно, что ксантогумол, полученный способом согласно изобретению, может быть дополнительно очищен в соответствии с известными способами.