СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ БЕЛКА НА ТКАНИ МОЗГА
WAY OF DETERMINATION OF INFLUENCE OF PROTEIN ON BRAIN TISSUE

Изобретение относится к физиологии, в частности к способу определения воздействия белка на ткани мозга в эксперименте in vitro.
Известен способ определения воздействия белка на ткани мозга [1], принятый за прототип, включающий подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров после инкубации в срезе с исследуемым белком и определение воздействия по сопоставлению параметров исходных и после воздействия.
Цель - определение воздействия белка на ткани мозга при моделировании геморрагического инсульта.
Сущность предложенного способа определения воздействия белка на ткани мозга, включающего подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров после инкубации срезов в среде с исследуемым белком и определение воздействия по сопоставлению параметров исходных с последующими, состоит в исходном взвешивании срезов, инкубации части срезов в среде с белком в концентрации 5-10 мг/мл в течение 30 мин, последующей инкубации всех срезов в аутокрови в течение 360 мин, взвешивании срезов, инкубированных только в аутокрови, обсушивании остальных фильтровальной бумагой и взвешивании обсушенных срезов. При сопоставлении веса срезов, инкубированных только с аутокровью, с исходными определяют прибавку их веса. При сопоставлении обсушенных срезов с весом срезов, не подвергавшихся воздействию белка, определяют способность белка защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте.
Способ поясняется примером определения воздействия на ткани мозга белка теплового шока с молекулярным весом 70 кДа (БТШ70) и дипептида L-карнозина.
Пример 1.
Определение воздействия белка БТШ70 на ткани мозга.
Все переживающие срезы нервных клеток мозга крыс после их приготовления взвешивают на торсионных весах ВТ-500, часть срезов помещают в стеклянные виалы с БТШ70 в концентрации 10 мг/мл, растворимым в физиологическом растворе объемом 1 мл, и выдерживают в нем 30 мин. Виалы устанавливают в аппарате Варбурга "WA-0110" с температурой водяной бани 37±0,2°С и с частотой горизонтального качания 120/мин. Затем инкубационную среду заменяют на аутокровь объемом 2 мл и все срезы в ней выдерживают 360 мин, что моделирует геморрагический инсульт, а 360 мин - продолжительность "терапевтического окна", после которого наступают необратимые нарушения функционирования нервных клеток. Затем срезы извлекают из аутокрови, обсушивают фильтровальной бумагой и снова взвешивают.
При сопоставлении веса срезов после инкубации только с аутокровью с исходными определяют прибавку их веса, их набухание и, соответственно, воспаления.
При сопоставлении веса срезов, прошедших предварительную инкубацию с БТШ70, а затем уже с аутокровью определяют способность белка защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте.
Результаты взвешиваний и сопоставление прибавок веса приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Воздействие БТШ70.
Вес среза при различных видах их инкубации
Средний вес среза (мг)
% изменения веса по отношению к исходному
Вес среза исходный после их изготовления
33
100% (n=8)
Вес среза после инкубации в физиологическом растворе (1 мл)
37
111% (n=8)
Вес среза после инкубации в аутокрови (2 мл)
42
154% (n=12)
Вес среза после предварительной инкубации с БТШ70 (10 мк/мл) и в аутокрови (2 мл)
39
118% (n=16)
Как видно из представленных данных в таблице, аутокровь вызывает значительное набухание нервных клеток, эти данные статистически достоверно отличаются (U=12, n=8 - контроль, n=12 - аутокровь; p≤0,05), что свидетельствует о развитии процессов воспаления в них. Предварительное воздействие на нервные клетки БТШ70 до действия крови протектирует их от сильного набухания и, следовательно, от развития воспалительных процессов в них, различия в весе при этом являются недостоверными (U=25, n=8 - контроль, n=16 - БТШ70; p≥0,05). Это свидетельствует о выраженных антивоспалительных свойствах БТШ70.
Отметим, что при действии БТШ70 процесс набухания срезов ингибировался и составлял не более 18% по сравнению с исходным весом. Следовательно, БТШ70 является надежным нейропротективным, антивоспалительным препаратом при моделировании геморрагического инсульта.
Пример 2.
Определение воздействия белка дипептида L-карнозина на ткани мозга.
Все подготовленные переживающие срезы нервных клеток мозга крыс взвешивают исходно на торсионных весах ВТ-500, затем помещают часть срезов в виалы с L-карнозином в концентрации 5 мг/мл, растворенным в физиологическом растворе объемом 1 мл, и выдерживают в нем 30 мин. Затем все срезы выдерживают 360 мин - продолжительность "терапевтического окна" - в аутокрови. После этого срезы, не инкубировавшиеся в L-карнозине, взвешивают, а остальные - обсушивают фильтровальной бумагой и уже после этого взвешивают. При сопоставлении веса срезов после инкубации с аутокровью и исходного определяли прибавку веса за счет их набухания, характерного для воспаления.
При сопоставлении веса срезов, прошедших предварительную инкубацию с L-карнозином, а затем уже с аутокровью, определяют способность дипептида L-карнозина защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте.
Результаты взвешиваний и сопоставлений прибавок веса приведены в таблице 2.
Таблица 2.
Воздействие дипептида L-карнозина
Вес среза при различных видах их инкубации
Средний вес среза (мг)
% изменения веса по отношению к исходному
Вес среза исходный после их изготовления
24
100% (n=8)
Вес среза после инкубации в физиологическом растворе (1 мл)
27
113% (n=8)
Вес среза после инкубации в аутокрови (2 мл)
42
154% (n=12)
Вес среза после предварительной инкубации с L-карнозином (5 мк/мл) и в аутокрови (2 мл)
26
108% (n=16)
Как видно из представленных данных в таблице, аутокровь вызывает значительное набухание нервных клеток, что свидетельствует о развитии процессов воспаления в них. Различия в весе срезов после инкубации в крови достоверно отличаются от контрольных значений (U=27, n=8 - контроль, n=12 - аутокровь; p≥0,05).
Предварительное воздействие на нервные клетки L-карнозина до действия аутокрови протестирует их от сильного набухания и, следовательно, от развития в них воспалительных процессов. Эти данные статистически достоверно отличаются от контроля (U=19, n=8 - контроль, n=16 - L-карнозин; p≤0,05), что свидетельствует о выраженных антивоспалительных свойствах L-карнозина.
Необходимо отметить, что БТШ70 и L-карнозин имеют эндогенное происхождение и, следовательно, не будут вызывать негативных побочных эффектов, кроме того, известно, что дипептид L-карнозин выполняет функции антиоксиданта [2, 3, 4]. Эти качества придают дополнительные преимущества этим веществам при их использовании в качестве антигеморрагического терапевтического средства при моделировании геморрагического инсульта.
Источники информации
1. Мокрушин А.А., Павлинова Л.И., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Эффекты экзогенного белка теплового шока (hsp70) на глутаматергическую синаптическую передачу в обонятельной коре мозга крыс in vitro // ДАН, 2004, т.395, №4, с.551-553. Прототип.
2. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М.: Изд-во МГУ, 1998. 320 с.
3. Decker E.A. The role of phenolics, conjugated linoleic acid, carnosine, and pyrroloquinoline quinone as nonessential dietary antioxidants // Nutr. Rev.1995. V.53. P.49-58.
4. Decker E.A., Crum A.D., Calvert J.T. Differences in the antioxidant mechanisms of carnosine in the presence of copper and iron // J. Agric. Food Chem. 1992. V.40. P.756-759.