ВАРИАНТЫ, КОМПОЗИЦИИ И МЕТОДЫ ПРИМЕНЕНИЯ ХОМИНГ-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ PD-1

1. Полипептид, содержащий вариант хоминг-эндонуклеазы (HE), который расщепляет сайт-мишень в человеческом гене запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1).
2. Полипептид по п. 1, где вариант HE представляет собой вариант хоминг-эндонуклеазы LAGLIDADG (LHE).
3. Полипептид по п. 1 или 2, где указанный полипептид содержит биологически активный фрагмент варианта HE.
4. Полипептид по п. 3, где в биологически активном фрагменте отсутствуют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 N-концевых аминокислот по сравнению с соответствующей HE дикого типа.
5. Полипептид по п. 4, где в биологически активном фрагменте отсутствуют 4 N-концевые аминокислоты по сравнению с соответствующей HE дикого типа.
6. Полипептид по п. 4, где в биологически активном фрагменте отсутствуют 8 N-концевых аминокислот по сравнению с соответствующей HE дикого типа.
7. Полипептид по п. 3, где в биологически активном фрагменте отсутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 С-концевых аминокислот по сравнению с соответствующей HE дикого типа.
8. Полипептид по п. 7, где в биологически активном фрагменте отсутствует С-концевая аминокислота по сравнению с соответствующей HE дикого типа.
9. Полипептид по п. 7, где в биологически активном фрагменте отсутствуют две С-концевые аминокислоты по сравнению с соответствующей HE дикого типа.
10. Полипептид по любому из пп. 1-9, где вариант HE представляет собой вариант LHE, выбранный из группы, состоящей из: I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI и I-Vdi141I.
11. Полипептид по любому из пп. 1-10, где вариант HE представляет собой вариант LHE, выбранный из группы, состоящей из I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI и SmaMI.
12. Полипептид по любому из пп. 1-11, где вариант HE представляет собой вариант I-OnuI LHE.
13. Полипептид по любому из пп. 1-12, где вариант HE содержит одну или более аминокислотных замен в интерфейсе распознавания ДНК в положениях аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: 19, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 76 77, 78, 80, 82, 168, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 223, 225, 227, 229, 231, 232, 234, 236, 238 и 240 аминокислотной последовательности I-OnuI LHE, указанной в SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
14. Полипептид по любому из пп. 1-13, где вариант HE содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или еще более предпочтительно - по меньшей мере 40 или более аминокислотных замен в интерфейс распознавания ДНК в положениях аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: 19, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 76 77, 78, 80, 82, 168, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 223, 225, 227, 229, 231, 232, 234, 236, 238 и 240 аминокислотной последовательности I-OnuI LHE, указанной в SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
15. Полипептид по любому из пп. 1-14, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 5 PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно, по меньшей мере 25, более предпочтительно, по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более аминокислотных замен по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из положений: 26, 28, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 76, 78, 80, 138, 143, 159, 168, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 197, 199, 201, 203, 207, 223, 224, 225, 227, 229, 232, 236 и 238 любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
16. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 5 PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или еще более предпочтительно по меньшей мере 40 или более из следующих аминокислотных замен: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40K, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, S72R, N75S, A76Y, S78K, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, S201M, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E и V238E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
17. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 5 PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более, или все из следующих аминокислотных замен: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40K, E42R, G44R, Q46E, T48D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, S78K, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, K225R, K229I, F232K, D236E и V238E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
18. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 5 PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более, или все из следующих аминокислотных замен: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72R, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E и V238E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
19. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 5 PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более, или все из следующих аминокислотных замен: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E и V238E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
20. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 5 PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более, или все из следующих аминокислотных замен: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, K225R, F232K, D236E и V238E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
21. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 5 PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более, или все из следующих аминокислотных замен: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201M, T203G, Y223R, K225R, F232K, D236E и V238E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
22. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или еще более предпочтительно по меньшей мере 40 или более аминокислотных замен по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из положений: 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 75, 76, 78, 80, 100, 132, 138, 143, 155, 159, 178, 180, 184, 186, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 201, 203, 207, 223, 225, 227, 232, 236, 238 и 240 любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
23. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или еще более предпочтительно по меньшей мере 40 или более из следующих аминокислотных замен: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46A, Q46T, T48V, T48M, V68I, V68S, A70T, A70Y, A70L, S72D, S72N, N75R, N75H, A76Y, S78R, S78T, K80R, K80C, K80E, K80V, T82F, T82Y, I100V, V132A, L138M, T143N, S155G, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R и T240E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
24. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более, или все из следующих аминокислотных замен: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46A, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R и T240E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
25. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более, или все из следующих аминокислотных замен: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80C, I100V, V132A, L138M, T143N, S155G, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R и T240E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
26. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит, по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно, по меньшей мере 25, более предпочтительно, по меньшей мере 35 или даже еще более предпочтительно по меньшей мере 40 или более или все из следующих аминокислотных замен: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68I, A70T, S72N, N75H, A76Y, S78T, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R и T240E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
27. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более или все из следующих аминокислотных замен: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70Y, S72N, N75H, A76Y, K80E, T82F, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R и T240E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
28. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более или все из следующих аминокислотных замен: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70L, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R и T240E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
29. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 1 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более или все из следующих аминокислотных замен: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70T, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R и T240E любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
30. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 2 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более аминокислотных замен по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из положений: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 78, 80, 82, 116, 138, 143, 159, 168, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 199, 203, 207, 225, 227, 229, 232, 236 и 238 любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
31. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 2 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более аминокислотных замен по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из положений: S24C, L26Q, R28Y, R28H, R30S, N32V, N32L, K34N, K34R, S35N, S35T, S36R, V37S, V37T, G38R, G38K, S40R, T41A, E42R, G44S, G44R, Q46E, Q46A, T48E, V68I, A70N, S72I, D74N, N75T, N75R, A76S, A76R, S78R, K80S, T82G, T82R, V116L, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203A, T203S, K207R, K225N, K225T, K227W, K227S, K229A, K229P, F232R, W234A, W234D, D236E и V238R любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
32. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 2 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более из или всех следующих аминокислотных замен: L26Q, R28Y, R30S, N32V, K34N, S35N, S36R, V37S, G38R, S40R, T41A, E42R, G44R, Q46A, T48E, A70N, S72I, N75T, A76S, S78R, K80S, T82G, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203A, K207R, K225N, K227W, K229A, F232R, W234A, D236E и V238R любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
33. Полипептид по любому из пп. 1-15, где вариант HE расщепляет сайт-мишень экзона 2 гена PD-1 и содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 или даже более предпочтительно по меньшей мере 40 или более из или всех следующих аминокислотных замен: S24C, R28H, N32L, K34R, S35T, V37T, G38K, S40R, E42R, G44S, Q46E, T48E, V68I, A70N, S72I, D74N, N75R, A76R, S78R, K80S, T82R, V116L, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203S, K207R, K225T, K227S, K229P, F232R, W234D, D236E и V238R любой из SEQ ID NO: 1-5, или соответствующий биологически активный фрагмент.
34. Полипептид по любому из пп. 1-33, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% или даже более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 6-14 и 60-63, или соответствующий биологически активный фрагмент.
35. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или соответствующий биологически активный фрагмент.
36. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или соответствующий биологически активный фрагмент.
37. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или соответствующий биологически активный фрагмент.
38. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или соответствующий биологически активный фрагмент.
39. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, или соответствующий биологически активный фрагмент.
40. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, или соответствующий биологически активный фрагмент.
41. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, или соответствующий биологически активный фрагмент.
42. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, или соответствующий биологически активный фрагмент.
43. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, или соответствующий биологически активный фрагмент.
44. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60, или соответствующий биологически активный фрагмент.
45. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61, или соответствующий биологически активный фрагмент.
46. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, или соответствующий биологически активный фрагмент.
47. Полипептид по любому из пп. 1-34, где вариант HE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или соответствующий биологически активный фрагмент.
48. Полипептид по любому из пп. 1-21 и 30-39, где указанный полипептид связывает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25.
49. Полипептид по любому из пп. 1-14, 22-29, 40-41 и 44-47, где указанный полипептид связывает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.
50. Полипептид по любому из пп. 1-14, 30-33 и 42-43, где указанный полипептид связывает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35.
51. Полипептид по любому из пп. 1-50, дополнительно содержащий ДНК-связывающий домен.
52. Полипептид по п. 51, где ДНК-связывающий домен выбран из группы, состоящей из ДНК-связывающего домена TALE и ДНК-связывающего домена типа «цинковые пальцы».
53. Полипептид по п. 52, где ДНК-связывающий домен TALE содержит от приблизительно 9,5 единиц повтора TALE до приблизительно 15,5 единиц повтора TALE.
54. Полипептид по п. 52 или 53, где ДНК-связывающий домен TALE связывает полинуклеотидную последовательность в гене PD-1.
55. Полипептид по любому из пп. 52-54, где ДНК-связывающий домен TALE связывает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.
56. Полипептид по п. 55, где указанный полипептид связывает и расщепляет полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.
57. Полипептид по любому из пп. 52-54, где ДНК-связывающий домен TALE связывает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31.
58. Полипептид по п. 57, где указанный полипептид связывает и расщепляет полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32.
59. Полипептид по любому из пп. 52-54, где ДНК-связывающий домен TALE связывает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36.
60. Полипептид по п. 59, где указанный полипептид связывает и расщепляет полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37.
61. Полипептид по п. 52, где ДНК-связывающий домен типа «цинковые пальцы» содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 мотивов «цинковые пальцы».
62. Полипептид по любому из пп. 1-61, дополнительно содержащий пептидный линкер и фермент, изменяющий структуру концов, или соответствующий биологически активный фрагмент.
63. Полипептид по любому из пп. 1-61, дополнительно содержащий вирусный саморасщепляемый пептид 2А и фермент, изменяющий структуру концов, или соответствующий биологически активный фрагмент.
64. Полипептид по п. 62 или 63, где фермент, изменяющий структуру концов, или соответствующий биологически активный фрагмент обладает 5'-3'-экзонуклеазной, 5'-3' щелочной экзонуклеазной, 3'-5', 5'-flap-экзонуклеазной, геликазной или матрично-независимой ДНК-полимеразной активностью.
65. Полипептид по любому из пп. 62-64, где фермент, изменяющий структуру концов, содержит Trex2 или соответствующий биологически активный фрагмент.
66. Полипептид по любому из пп. 1-65, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 15-23 и 64, или соответствующий биологически активный фрагмент.
67. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или соответствующий биологически активный фрагмент.
68. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или соответствующий биологически активный фрагмент.
69. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, или соответствующий биологически активный фрагмент.
70. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, или соответствующий биологически активный фрагмент.
71. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, или соответствующий биологически активный фрагмент.
72. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, или соответствующий биологически активный фрагмент.
73. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, или соответствующий биологически активный фрагмент.
74. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, или соответствующий биологически активный фрагмент.
75. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, или соответствующий биологически активный фрагмент.
76. Полипептид по п. 66, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64, или соответствующий биологически активный фрагмент.
77. Полипептид по любому из пп. 1-61, где указанный полипептид расщепляет ген PD-1 человека на полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 25, 27, 30, 32, 35 или 37.
78. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-77.
79. мРНК, кодирующая полипептид по любому из пп. 1-77.
80. кДНК, кодирующая полипептид по любому из пп. 1-77.
81. Вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-77.
82. Клетка, содержащая полипептид по любому из пп. 1-77.
83. Клетка, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-77.
84. Клетка, содержащая вектор по п. 81.
85. Клетка, содержащая одну или более модификаций генома, введенных полипептидом по любому из пп. 1-77.
86. Клетка по любому из пп. 82-85, где указанная клетка содержит полинуклеотид, кодирующий один или более из энхансеров иммунопотенции, демпферов иммуносупрессивного сигнала или сконструированных рецепторов антигена.
87. Клетка по п. 86, где полинуклеотид дополнительно содержит промотор РНК-полимеразы II, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим энхансер иммунопотенции, демпфер иммуносупрессивного сигнала или сконструированный рецептор антигена.
88. Клетка по п. 87, где промотор РНК-полимеразы II выбран из группы, состоящей из короткого промотора EF1α, длинного промотора EF1α, локуса человека ROSA 26, промотора убиквитина C (UBC), промотора фосфоглицераткиназы-1 (PGK), энхансера цитомегаловируса/промотора β-актина курицы (CAG), промотора β-актина и энхансера вируса миелопролиферативной саркомы с делецией опосредующего отрицательную регуляцию участка, с заменой на праймер-связывающий сайт из dl587rev (MND).
89. Клетка по любому из пп. 86-88, где полинуклеотид дополнительно кодирует один или более саморасщепляемых вирусных пептидов, функционально связанных, рассеянных между и/или фланкирующих энхансер иммунопотенции, демпфер иммуносупрессивного сигнала или сконструированный рецептор антигена.
90. Клетка по п. 89, где саморасщепляемый вирусный пептид представляет собой пептид 2А.
91. Клетка по любому из пп. 86-90, где полинуклеотид дополнительно содержит гетерологичный сигнал полиаденилирования.
92. Клетка по любому из пп. 86-91, где демпфер иммуносупрессивного сигнала включает ферментативную функцию, которая противодействует иммуносупрессорному фактору.
93. Клетка по п. 92, где демпфер иммуносупрессивного сигнала включает кинурениназную активность.
94. Клетка по любому из пп. 86-91, где демпфер иммуносупрессивного сигнала содержит:
(a) экзодомен, который связывает иммуносупрессивный фактор, причем, необязательно, указанный экзодомен представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;
(b) экзодомен, который связывает иммуносупрессивный фактор и трансмембранный домен; или
(c) экзодомен, который связывает иммуносупрессивный фактор, трансмембранный домен и модифицированный эндодомен, который не способен трансдуцировать иммуносупрессивные сигналы в клетку.
95. Клетка по любому из пп. 86-91, где демпфер иммуносупрессивного сигнала представляет собой доминантный отрицательный рецептор TGFβRII.
96. Клетка по любому из пп. 86-91, где энхансер иммунопотенции выбран из группы, состоящей из молекулы биспецифического Т-клеточного активатора (BiTE), иммуноопотенцирующего фактора и флип-рецептора.
97. Клетка по п. 96, где иммунопотенцирующий фактор выбран из группы, состоящей из цитокина, хемокина, цитотоксина, рецептора цитокинов и их вариантов.
98. Клетка по п. 97, где цитокин выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21.
99. Клетка по п. 97, где цитокин выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21, и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
100. Клетка по п. 97, где цитокин представляет собой IL-7 и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
101. Клетка по п. 97, где цитокин представляет собой IL-12 и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
102. Клетка по п. 97, где цитокин представляет собой IL-15 и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
103. Клетка по п. 96, где флип-рецептор содержит экзодомен PD-1 и трансмембранный домен; и эндодомен из CD28, CD134, CD137, CD278 и/или CD3ζ, слитые в рамке с C-концевым концом трансмембранного домена PD-1.
104. Клетка по п. 96, где флип-рецептор содержит экзодомен PD-1; трансмембранный домен, выделенный из полипептида CD3, CD4, CD8α, CD28, CD134 или CD137; и эндодомен из CD28, CD134, CD137, CD278 и/или CD3ζ, слитые в рамке с C-концевым концом экзодомена PD-1.
105. Клетка по п. 96, где флип-рецептор содержит экзодомен PD-1; и трансмембранный домен и эндодомен, выделенные из полипептида CD3, CD4, CD8α, CD28, CD134 или CD137, слитых в рамке с C-концевым концом экзодомена PD-1.
106. Клетка по любому из пп. 86-91, где сконструированный рецептор антигена выбран из группы, состоящей из сконструированного TCR, CAR, рецептора Daric или дзетакина.
107. Клетка по п. 106, где сконструированный рецептор не встроен в ген PD-1.
108. Клетка по любому из пп. 86-91, где полинуклеотид, кодирующий один или более энхансеров иммунопотенции, демпферов иммуносупрессивного сигнала или сконструированных рецепторов антигена, встроен в ген PD-1.
109. Клетка по любому из пп. 86-91, где донорная матрица репарации, содержащая полинуклеотид, кодирующий один или более из энхансеров иммунопотенции, демпферов иммуносупрессивного сигнала или сконструированных рецепторов антигена, встроена в ген PD-1 на сайте двухцепочечного разрыва ДНК, введенного полипептидом по любому из пп. 1-77.
110. Клетка по любому из пп. 82-109, где указанная клетка представляет собой гемопоэтическую клетку.
111. Клетка по любому из пп. 82-110, где указанная клетка представляет собой Т-клетку.
112. Клетка по любому из пп. 82-111, где указанная клетка представляет собой CD3+, CD4+ и/или CD8+ клетку.
113. Клетка по любому из пп. 82-112, где указанная клетка представляет собой иммунную эффекторную клетку.
114. Клетка по п. 82, где указанная клетка представляет собой цитотоксические T-лимфоциты (CTL), инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) или хелперные T-клетки.
115. Клетка по любому из пп. 83-113, где указанная клетка представляет собой клетку-природный киллер (NK) или T-клетку-природный киллер (NKT).
116. Клетка по любому из пп. 82-115, где источником клетки являются мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинная кровь, ткань тимуса, ткань из места инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки или опухоль.
117. Клетка по любому из пп. 82-116, где указанная клетка содержит одну или более модифицированных аллелей PD-1.
118. Клетка по п. 117, где одна или более модифицированных аллелей PD-1 являются нефункциональными или имеют существенно сниженную функцию PD-1 и/или внутриклеточную передачу сигналов.
119. Клетка по любому из пп. 82-118, где указанная клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер иммунопотенции, демпфер иммуносупрессивного сигнала или сконструированный рецептор антигена, введенный в один или более модифицированных аллелей PD-1.
120. Клетка по любому из пп. 82-118, где указанная клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер иммунопотенции или демпфер иммуносупрессивного сигнала, введенный в одну или более модифицированных аллелей PD-1, и клетка дополнительно содержит сконструированный рецептор антигена, который не введен в одну или более модифицированных аллелей PD-1.
121. Совокупность клеток, содержащая одну или более клеток по любому из пп. 82-120.
122. Композиция, содержащая одну или более клеток по любому из пп. 82-121.
123. Композиция, содержащая одну или более клеток по любому из пп. 82-121 и физиологически приемлемый носитель.
124. Способ редактирования гена PD-1 человека в клетке, включающий: введение полинуклеотида, кодирующего полипептид по любому из пп. 1-77, в клетку, причем экспрессия указанного полипептида создает двухцепочечный разрыв на сайте-мишени в гене PD-1 человека.
125. Способ редактирования гена PD-1 человека в клетке, включающий: введение полинуклеотида, кодирующего полипептид по любому из пп. 1-77, в клетку, причем экспрессия полипептида создает двухцепочечный разрыв на сайте-мишени в гене PD-1 человека, и при этом такой разрыв репарирован негомологичным соединением концов (NHEJ).
126. Способ редактирования гена PD-1 человека в клетке, включающий: введение полинуклеотида, кодирующего полипептид по любому из пп. 1-77, и донорной матрицы репарации, в клетку, причем экспрессия указанного полипептида создает двухцепочечный разрыв на сайте-мишени в гене PD-1 человека, а донорная матрица репарации встроена в ген PD-1 человека посредством гомологичной репарации (HDR) на сайте двухцепочечного разрыва (DSB).
127. Способ по любому из пп. 124-126, отличающийся тем, что клетка представляет собой гемопоэтическую клетку.
128. Способ по любому из пп. 124-127, отличающийся тем, что клетка представляет собой Т- клетку.
129. Способ по любому из пп. 124-128, отличающийся тем, что клетка представляет собой CD3+, CD4+ и/или CD8+ клетку.
130. Способ по любому из пп. 124-129, отличающийся тем, что клетка представляет собой иммунную эффекторную клетку.
131. Способ по любому из пп. 124-130, отличающийся тем, что клетка представляет собой цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) или хелперные Т-клетки.
132. Способ по любому из пп. 124-130, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку-природный киллер (NK) или T-клетку-природный киллер (NKT).
133. Способ по любому из пп. 124-132, отличающийся тем, что источником клеток являются мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинная кровь, ткань тимуса, ткань из места инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки или опухоль.
134. Способ по любому из пп. 124-133, отличающийся тем, что полинуклеотид, кодирующий полипептид, представляет собой мРНК.
135. Способ по любому из пп. 124-134, отличающийся тем, что в клетку вводят полинуклеотид, кодирующий 3'-5'-экзонуклеазу.
136. Способ по любому из пп. 124-134, отличающийся тем, что в клетку вводят полинуклеотид, кодирующий Trex2 или соответствующий биологически активный фрагмент.
137. Способ по любому из пп. 124-136, отличающийся тем, что донорная матрица репарации кодирует ген PD-1 или его часть, содержащие одну или более мутаций по сравнению с геном PD-1 дикого типа.
138. Способ по любому из пп. 124-136, отличающийся тем, что донорная матрица репарации кодирует один или более из: энхансера иммунопотенции, демпфера иммуносупрессивного сигнала или сконструированного рецептора антигена.
139. Способ по п. 138, отличающийся тем, что донорная матрица репарации дополнительно содержит промотор РНК-полимеразы II, функционально связанный с энхансером иммунопотенции, демпфером иммуносупрессивного сигнала или сконструированным рецептором антигена.
140. Способ по п. 139, отличающийся тем, что промотор РНК-полимеразы II выбран из группы, состоящей из короткого промотора EF1α, длинного промотора EF1α, локуса человека ROSA 26, промотора убиквитина C (UBC), промотора фосфоглицераткиназы-1 (PGK), энхансера цитомегаловируса/промотора β-актина курицы (CAG), промотора β-актина и энхансера вируса миелопролиферативной саркомы с делецией опосредующего отрицательную регуляцию участка, с заменой на праймер-связывающий сайт из dl587rev (MND).
141. Способ по любому из пп. 138-140, отличающийся тем, что донорная матрица репарации дополнительно кодирует один или более саморасщепляемых вирусных пептидов, функционально связанных, рассеянных между и/или фланкирующих энхансер иммунопотенции, демпфер иммуносупрессивного сигнала или сконструированный рецептор антигена.
142. Способ по п. 141, отличающийся тем, что саморасщепляемый вирусный пептид представляет собой пептид 2А.
143. Способ по любому из пп. 138-142, отличающийся тем, что донорная матрица репарации дополнительно содержит гетерологичный сигнал полиаденилирования.
144. Способ по любому из пп. 138-143, отличающийся тем, что демпфер иммуносупрессивного сигнала содержит ферментативную функцию, которая противодействует иммуносупрессорному фактору.
145. Способ по п. 144, отличающийся тем, что демпфер иммуносупрессивного сигнала содержит кинурениназную активность.
146. Способ по любому из пп. 138-143, отличающийся тем, что демпфер иммуносупрессивного сигнала содержит:
(a) экзодомен, который связывает иммуносупрессивный фактор, причем, необязательно, указанный экзодомен представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент;
(b) экзодомен, который связывает иммуносупрессивный фактор и трансмембранный домен; или
(c) экзодомен, который связывает иммуносупрессивный фактор, трансмембранный домен и модифицированный эндодомен, который не способен трансдуцировать иммуносупрессивные сигналы в клетку.
147. Способ по любому из пп. 138-143, отличающийся тем, что демпфер иммуносупрессивного сигнала представляет собой доминантный отрицательный рецептор TGFβRII.
148. Способ по любому из пп. 138-143, отличающийся тем, что энхансер иммунопотенции выбран из группы, состоящей из: молекулы биспецифического Т-клеточного активатора (BiTE), иммуноопотенцирующего фактора и флип-рецептора.
149. Способ по п. 148, отличающийся тем, что иммунопотенцирующий фактор выбран из группы, состоящей из цитокина, хемокина, цитотоксина, рецептора цитокина и их вариантов.
150. Способ по п. 149, отличающийся тем, что цитокин выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21.
151. Способ по п. 149, отличающийся тем, что цитокин выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21, и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
152. Способ по п. 149, отличающийся тем, что цитокин представляет собой IL-7 и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
153. Способ по п. 149, отличающийся тем, что цитокин представляет собой IL-12 и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
154. Способ по п. 149, отличающийся тем, что цитокин представляет собой IL-15 и функционально связан с эндогенным промотором PD-1.
155. Способ по п. 148, отличающийся тем, что флип-рецептор содержит экзодомен PD-1 и трансмембранный домен; и эндодомен из CD28, CD134, CD137, CD278 и/или CD3ζ, слитые в рамке с C-концевым концом трансмембранного домена PD-1.
156. Способ по п. 148, отличающийся тем, что флип-рецептор содержит экзодомен PD-1; трансмембранный домен, выделенный из полипептида CD3, CD4, CD8α, CD28, CD134 или CD137; и эндодомен из CD28, CD134, CD137, CD278 и/или CD3ζ, слитые в рамке с C-концевым концом экзодомена PD-1.
157. Способ по п. 148, отличающийся тем, что флип-рецептор содержит экзодомен PD-1; и трансмембранный домен и эндодомен, выделенные из полипептида CD3, CD4, CD8α, CD28, CD134 или CD137, слитые в рамке с C-концевым концом экзодомена PD-1.
158. Способ по любому из пп. 138-143, отличающийся тем, что сконструированный рецептор антигена выбран из группы, состоящей из: сконструированного TCR, CAR, Daric или дзетакина.
159. Способ по любому из пп. 138-158, отличающийся тем, что донорная матрица репарации включает 5'-гомологичное плечо, гомологичное 5'-последовательности гена PD-1 человека DSB, и 3'- гомологичное плечо, гомологичное 3'-последовательности гена PD-1 человека DSB.
160. Способ по п. 159, отличающийся тем, что длины 5'- и 3'-гомологичных плеч выбраны независимо от приблизительно 100 до приблизительно 2500 п. н.
161. Способ по п. 159 или 160, отличающийся тем, что длины 5' и 3'- гомологичных плеч независимо выбраны от приблизительно 600 до приблизительно 1500 п. н.
162. Способ по любому из пп. 159-161, отличающийся тем, что 5'-гомологичное плечо составляет приблизительно 1500 п. н., а 3'-гомологичное плечо составляет приблизительно 1000 п. н.
163. Способ по любому из пп. 159-162, отличающийся тем, что 5-'гомологичное плечо составляет приблизительно 600 п. н., а 3'-гомологичное плечо составляет приблизительно 600 п. н.
164. Способ по любому из пп. 159-163, отличающийся тем, что для введения донорной матрицы репарации в клетку используют вирусный вектор.
165. Способ по п. 164, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой рекомбинантный адено-ассоциированный вирусный вектор (rAAV) или ретровирус.
166. Способ по п. 165, отличающийся тем, что rAAV имеет один или более ITR из AAV2.
167. Способ по п. 165 или 166, отличающийся тем, что rAAV имеет серотип, выбранный из группы, состоящей из: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и AAV10.
168. Способ по любому из пп. 165-167, отличающийся тем, что rAAV имеет серотип AAV2 или AAV6.
169. Способ по п. 165, отличающийся тем, что ретровирус представляет собой лентивирус.
170. Способ по п. 169, отличающийся тем, что лентивирус представляет собой лентивирус с дефицитом интегразы (IDLV).
171. Способ лечения, предотвращения или ослабления по меньшей мере одного симптома рака, инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания и иммунодефицита или состояния, ассоциированного с ними, включающий введение субъекту эффективного количества композиции по п. 122. или 123.
172. Способ лечения солидного рака, включающий введение субъекту эффективного количества композиции по п. 122 или 123.
173. Способ по п. 172, отличающийся тем, что солидный рак включает рак печени, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак простаты, рак яичка, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, саркому, рак головы и шеи, рак кости, рак щитовидной железы, рак почки или рак кожи.
174. Способ лечения гематологической злокачественной опухоли, включающий введение субъекту эффективного количества композиции по п. 122 или 123.
175. Способ по п. 174, отличающийся тем, что гематологическим злокачественным новообразованием является лейкоз, лимфома или множественная миелома.