МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АННЕКСИНА А3 ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КАРЦИНОМЫ ПРОСТАТЫ
ANNEXIN A3 MONOCLONAL ANTIBODIES FOR DETECTION OF PROSTATE CARCINOMA

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу диагноза карциномы простаты, включающему определение аннексина A3, особенно внеклеточного аннексина A3 с помощью высокоспецифических антител, особенно моноклональных антител. Настоящее изобретение дополнительно относится к реагенту для анализа, содержащему такие антитела.
Уровень техники
У мужчин карцинома простаты занимает первое место по частоте возникновения злокачественных заболеваний и, несмотря на умеренную биологическую агрессивность по сравнению с другими видами опухолей, второе по смертности, вызванной раком (Greenlee et al., 2000). Существуют прекрасные варианты лечения для местноограниченных стадий, а именно хирургия (Huland, 2001a) и/или рентгенотерапия (Wiegel, 1998), тогда как в случае запущенных стадий могут быть использованы только временно эффективные методы гормональной абляции. Вновь происходящее развитие первоначальной болезни во время гормонального абляционного лечения, обычно после 2-3 лет, рассматривается как состояние устойчивости к гормонам. В настоящее время для гормонально устойчивой карциномы простаты существуют только паллиативные варианты лечения (Кnох & Мооrе, 2001).
Следовательно, критически важным является диагностировать карциному простаты на ранней стадии. Для первичной диагностики карциномы простаты (Stamey et al., 1987) и последующих действий (Haese et al., 1999) пригодным является PSA, простатоспецифический антиген, высокочувствительный сывороточный опухолевый маркер.
Так как PSA является в большой степени органоспецифическим, а не опухолеспецифическим, доброкачественная болезнь простаты также может быть связана с увеличением PSA, выходя за предел 4 нг/мл, считающийся верхним пределом, Последующее инвазивное получение, по меньшей мере, 10 пункционных биопсий простаты (извлекаемых трансректально), в настоящее время представляет собой «золотой стандарт» доказательной диагностики карциномы простаты в этой ситуации (Miller & Weiβbach, 1999a,b). До 25% пациентов страдает от связанных с этим сложностей, которым, тем не менее, предоставляют необходимую дальнейшую консультацию (13% пациентов) и госпитализацию (около 6% пораженных болезнью пациентов) (Lujan et al., 2001; Djavan et al., 2001). Кроме риска заражения мочевого протока или риска простатита, как дополнительные нежелательные случаи преобладают кровоизлияние и болезненность операции, которые в некоторых учреждениях предупреждают с помощью местного обезболивания (Irani et al., 1997; Issa et al., 2000; Alavi et al., 2001). Пункционная биопсия, осуществляемая примерно в случае 75% пациентов, имеющих значения PSA в пределе между 4-10 нг/мл, будет показывать отрицательный результат, что является благоприятным диагностическим результатом (Huland, 200 lb). Если показание для выполнения пункционных биопсий простаты будет считаться полученным уже при значениях PSA, начиная от 2,5 нг/мл, как сейчас предложено некоторыми авторами (Djavan et al., 1999; Okihara et al., 2001), такой инвазивный способ медицинского осмотра будет ожидать каждого четвертого мужчину в возрасте между 50 и 75 годами (Huland, 2001b).
Серьезный интерес для диагностики карциномы простаты представляют новые маркеры с повышенной специфичностью по сравнению с PSA, включая его подвиды, (Jung et al., 2001; Makinen et al., 2001), так как они могут лучше определить показания для выполнения инвазивных пункционных биопсий и, таким образом, могут уменьшить количество пациентов, которые должны подвергнуться этому обследованию. Так, опухолевым маркером с выдающейся специфичностью, подходящим также для полученного неинвазивным путем пробного материала, подобного плазме или моче, полученной после ректального исследования/массажа, может быть недавно охарактеризованный маркер аннексии A3 (ANXA3) (Wozny et al., 2006).
2+
Точнее, ANXA3 является необычным представителем семейства аннексинов, класс Са эффекторных белков, которые осуществляют свои многосторонние действия посредством связывания с отдельными фосфолипидами. Они могут образовывать сети на мембранной поверхности и могут, таким образом, организовывать мембранные микродомены и центры рекрутинга (recruiting foci) для взаимодействующих белков (Gerke et al., 2005).
В связи с этим аннексины играют важную роль в клеточной дифференцировке, миграции клеток и также в иммуномодуляции. Кроме мембранной структуры и мембранного транспорта существуют также мембрано- и фосфолипиднезависимые белок-белковые взаимодействия аннексинов (Rescher & Gerke 2004; Gerke & Moss, 2002). Как основные компоненты матриксных везикул аннексины участвуют в образовании хряща и минерализации костей (Wang et al., 2003). Дифференциальная экспрессия ANXA3 является особенно интересной в отношении необычной частоты появления остеобластных костных метастазов в случае карциномы простаты (Keller et al., 2001).
ANXA3 встречается внутриклеточно, так же как и внеклеточно (Carlson et al., 2004), например, в экзосомах в моче (Pisitkun et al., 2004). Экзосомы представляют собой производные так называемых "мультивезикулярных телец" и могут играть альтернативную, но решающую роль в презентации антигена иммунными клетками (Schartz et al., 2002). Экзосомы, определяемые в моче, являются, возможно, идентичными так называемым простасомам, уже описанным раньше (Arienti et al., 2004; Utieg et al., 2003), в любом случае и те и другие содержат ANXA3.
Белковые биомаркеры для лечения или диагностики рака простаты и других эпителиальных раков мочеполового тракта описаны в патентах США 2005130876, WO 03086461, WO 2005078124, европейских патентах ЕР 05011042.8 и ЕР 05026092.6.
Предшествующие способы для определения ANXA3, однако, страдают от низкой специфичности доступных антител, которые демонстрируют значительную перекрестную реактивность по отношению к другим аннексинам. Таким образом, целью настоящего изобретения было обеспечение способа для обнаружения карциномы простаты, дающего возможность высокоспецифического диагноза на ранней стадии болезни.
Раскрытие изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностирования рака, в котором образец исследуют на наличие и/или количество аннексина A3 (ANX A3) с помощью антитела, специфического к аннексину A3, которое имеет низкую перекрестную реактивность к другим аннексинам.
Следующим аспектом настоящего изобретения является реагент для анализа для диагностирования рака, включающий, по меньшей мере, одно антитело, специфическое к аннексину A3, которое имеет низкую перекрестную реактивность к другим аннексинам.
Следующим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного вещества антитело, специфическое к аннексину A3, которое имеет низкую перекрестную реактивность к другим аннексинам, для производства медикамента для лечения рака.
Еще одним аспектом изобретения является антитело, специфическое к аннексину A3, которое имеет низкую перекрестную реактивность к другим аннексинам.
Следующим аспектом настоящего изобретения является клетка, особенно клетка гибридомы, производящая антитело, как описано выше.
2
Термин „антитело" при использовании в настоящей заявке также включает фрагменты антитела, имеющие, по меньшей мере, один антигенсвязывающий домен, такой как фрагменты Fab или фрагменты F(ab') или рекомбинантные антитела, такие как одноцепочечные антитела или их фрагменты, такие как фрагменты Fv.
Предпочтительно, антитело не имеет определимой перекрестной реактивности к другим аннексинам, таким как аннексии 5, аннексии 6 и/или аннексии 8, при определении с помощью денситометрического анализа вестерн-блотов после окрашивания серебром. Предпочтительно, антитело является моноклональным антителом или смесью моноклональных антител. Моноклональное антитело может также быть химерным моноклональным антителом или гуманизированным моноклональным антителом, получаемым посредством гуманизирования не являющейся человеческой константной области и не обязательно вариабельного каркасного участка. Однако некоторые высокоспецифические поликлональные антисыворотки также являются применимыми в способе настоящего изобретения.
Предпочтительные моноклональные антитела могут быть получены иммунизированием экспериментального животного, например мыши, крысы, кролика и т.д., очищенным ANXA3 или его фрагментами, особенно его N-концевыми фрагментами, и получением клеток гибридомы, производящих желаемые моноклональные антитела в соответствии со стандартными способами. Более предпочтительно, антитело является направленным против эпитопа в N-концевой области человеческого аннексина A3 (также обозначенного как аннексии III, липокортин III, плацентарный антикоагулянтый белок III (РАР-III), 35-альфа кальцимедин или инозитол-1,2-циклическая фосфат-2-фосфогидролаза), особенно в области аминокислот 1-16 человеческого аннексина A3 (GenBank, инвентарный №Р12429). Предпочтительно, антитело связывается с поверхностью раковых клеток.
Предпочтительные моноклональные антитела могут быть получены иммунизированием экспериментального животного, например мыши, крысы, кролика и т.д., очищенным ANXA3 или его фрагментами, особенно фрагментами, включающими 16 N-концевых аминокислот, например фрагментами подобными ANX A3 (АА 1-324), ANX A3 (АА 1-159) или ANX A3 (АА 1-106); и получением клеток гибридомы, производящих желаемые моноклональные антитела в соответствии со стандартными способами. Как объяснено выше, моноклональные антитела, обладающие желаемой специфичностью, могут быть получены методами скрининга, использующими вышеуказанные или подобные фрагменты для картирования эпитопов, и соответствующим отбором (селекцией) моноклональных антител, специфически связанных с N-концевыми частями ANXA3. Особенно предпочтительным также является использование нативного человеческого ANXA3, например выделенного из нейтрофилов человека, в качестве иммуногена для получения моноклональных антител.
Затем, предпочтительные моноклональные человеческие антитела, направленные против ANXA3, можно получить от человеческих индивидуумов, например, пациентов с раком или других индивидуумов. В-клетки, производящие антитела, могут быть выделены из указанных индивидуумов по стандартным методикам.
В особенно предпочтительном варианте осуществления антитело является моноклональным антителом, выбранным из антитела, произведенного клеточными линиями гибридомы tgc 5 ProII6G7(DSM ACC2778), tgc 6 ProIII1G11 (DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5(DSM ACC2780), tgc 8 ProIIIlEl(DSM ACC2781), tgc 13 ProI/5G9, tgc 12 ProIII/4B11, tgc 14 ProVIII/3D7, или антителом, которое связывается с теми же эпитопами на аннексине A3. Антитела, связывающиеся с теми же эпитопами, могут быть определены с помощью конкурентных экспериментов в соответствии со стандартными протоколами. Вышеупомянутые гибридомные клеточные линии помещены на хранение 5 мая 2006 (DSM ACC2778, DSM ACC2779, DSM ACC2780 и DSM ACC2781) и 5 июня 2007 (tgc 13 ProI/5G9, tgc 12 РrоIII/4В11, tgc 14 ProVIII/3D7) в DMSZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, согласно Будапештскому договору.
В следующем предпочтительном варианте осуществления антитело является моноклональным антителом, направленным против эпитопа на аннексине A3, содержащего последовательность, выбранную из:
(1) VRDYPDFSPSVD (SEQ ID NO:1);
(ii) MLISILTERSNA (SEQ ID NO:2);
(iii) GDFRKALLTLADGRRDESLKVDEHLAKQ (SEQ ID NO:3);
(iv) KLTFDEYRNISQKDIVDSIKGELSG (SEQ ID NO:4);
(v) IMVSRSEIDLLDIRTEF (SEQ ID NO:5);
(vi) YSAIKSDTSGDYEITLL (SEQ ID NO:6),
или ее частичную непрерывную последовательность с длиной, по меньшей мере, 6 аминокислот.
Особенно предпочтительной частичной последовательностью SEQ ID NO:1 является DYPDFSPSV. Особенно предпочтительной частичной последовательностью SEQ ID NO:2 является LISILTERS. Особенно предпочтительной частичной последовательностью SEQ SEQ ID NO:3 является FRKALL или SLKVDEHLA. Особенно предпочтительной частичной последовательностью SEQ ID NO:4 является TFDEYRNIS. Особенно предпочтительной частичной последовательностью SEQ ID NO:5 является SRSEIDLLD. Особенно предпочтительной частичной последовательностью SEQ ID NO:6 является AIKSDTSGDEYEI. Примером антитела, направленного против эпитопа в SEQ ID NO:1 является tgct Pro VII 5С5 (DSM ACC2780). Примерами антител, направленных против эпитопа в SEQ ID NO:2 являются tgc5 ProII 6G7 (DSM ACC2778) и tgc6 ProIII 1611 (DSM ACC2779). Примерами антител, направленных против эпитопов в С-концевой области человеческого ANXA3, являются tgc 13 ProI/5G9, tgc 12 ProIII/4B11 и tgc 14 ProVIII/3D7. В особенности предпочтительными антителами являются направленные против эпитопа в SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:6.
Более того, антитела, направленные против эпитопов в SEQ ID NO:1-6 могут быть получены иммунизированием экспериментального животного полипептидами или пептидами, содержащими последовательности эпитопа, например рекомбинантным человеческим ANXA3, гомологичными полипептидами от других видов или фрагментами этого.
Рак, который можно диагностировать согласно настоящему изобретению, предпочтительно является раком мочеполового и/или желудочно-кишечного тракта, таким как рак простаты, мочевого пузыря, почки, мочеиспускательного канала, яичника, матки или толстой кишки. Конкретно, рак представляет собой эпителиальный рак. В особенно предпочтительном варианте осуществления рак является раком простаты.
Способ настоящего изобретения может быть осуществлен в любом аналитическом формате, подходящем для иммунологических определений. В некоторых аналитических форматах предпочтительно использовать антитело, которое несет группу-метку, например видимый маркер, такой как латекс или частицу золота, флуоресцентную маркерную группу, ферментную маркерную группу и т.д. Коньюгаты антител и групп-меток могут быть получены по стандартным методикам, например через ковалентное связывание химически активных боковых аминокислотных групп антитела, таких как карбокси, амино, и/или тиоловых групп с группами-метками, например, через бифункциональные спейсерные молекулы.
Образец предпочтительно является полученным от человека. В особенно предпочтительном варианте осуществления способ изобретения является неинвазивной диагностической процедурой, в котором образец может быть, например, образцом мочи, особенно образцом мочи, полученным после ректального исследования/массажа, или образцом фекалиев. При необходимости образец может быть подвергнут процедурам предварительной обработки, например гель-фильтрации.
Образец можно подвергнуть процедуре фракционирования, которая позволяет разделить обнаружение внеклеточного или внутриклеточного ANXA3. Например, образец можно центрифугировать для получения клеточного осадка и супернатанта, в соответствии с чем внутриклеточный аннексин A3 определяют в клеточном осадке, а внеклеточный аннексин A3 определяют в супернатанте. В особенно предпочтительном варианте осуществления способ включает селективное обнаружение внеклеточного ANXA3.
В следующем варианте осуществления способ изобретения может быть гистохимической методикой, в которой образец может быть образцом ткани, особенно биопсией, например пункционной биопсией. В гистохимической методике селективное обнаружение внеклеточного ANXA3 может быть выполнено посредством определения локализации ANXA3 в образце.
В способе изобретения образец классифицируют как указывающий на рак, например рак простаты, когда относительное содержание внеклеточного ANXA3 понижено в супернатанте образца, например мочи, полученной после ректального исследования/массажа, после центрифугирования с низкой скоростью или в соответствующих осадках, по сравнению с нераковыми пациентами с целым рядом состояний в диапазоне от доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН), фиброза, хронического простатита до простатической интраэпителиальной неоплазии различных стадий (PIN1-3). По сравнению с полностью здоровыми пациентами относительные содержания ANXA3 кажутся повышенными и в осадках и в супернатантах. В совокупности любой тип соотношения или комбинации общих количеств или концентраций ANXA3 в супернатантах и/или осадках мочи, полученной после ректального исследования/массажа, которую используют для диагностической дискриминации различных упомянутых состояний, является включенным в настоящее изобретение.
Настоящее изобретение охватывает по существу любой набор граничных значений, касающихся относительных содержаний ANXA3 в различных внутриклеточных и внеклеточных фракциях образца, например мочи, полученной после ректального исследования/массажа, которые могут быть получены с помощью любого типа дифференциального центрифугирования, и связанные соотношения для диагностических целей.
Способ настоящего изобретения может дополнительно включать обнаружение дополнительных маркеров злокачественной болезни, например маркеров рака. Обнаружение дополнительных маркеров может быть выполнено в том же самом образце, в котором определяется ANXA3, или в разных образцах, например в образцах крови, сыворотки и/или плазмы. Особенно предпочтительным является обнаружение маркеров в крови, сыворотке или плазме, особенно, по меньшей мере, одного члена калликреинового семейства протеаз, такого как простатоспецифический антиген (PSA) и/или, по меньшей мере, одного эпителиального клеточного маркера, особенно простатоспецифического мембранного антигена (PSMA).
Диагностический способ изобретения может включать определение стадии болезни, в котором проводится дифференциация между предраковой стадией, такой как PIN, и стадией ракового заболевания. Определение стадии болезни основывается на гистологической классификации клиническими патологами, причем стандартная классификация раков простаты осуществляется согласно шкале Глисона, но существуют другие способы определения стадии, группирующие раковые заболевания в три группы по увеличению тяжести болезни. До сих пор такие способы определения стадии в большой степени зависят от морфологического критерия и нуждаются в опытных экспертах. Для нераковых случаев описаны вышеупомянутые состояния в пределах от доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН), фиброза, хронического простатита до простатической интраэпителиальной неоплазии различных стадий (PIN 1-3). Настоящее изобретение относится к любому типу стратификации рака простаты или связанных с простатой нераковых стадий с использованием показателя, связанного с ANXA3, при подходящем наборе пороговых значений из любого типа фракции мочи, полученной после ректального исследования/массажа, или любого другого образца.
Настоящее изобретение также относится к применению вышеупомянутых антител в фармацевтике, например для производства медикамента для лечения рака, особенно рака мочеполового и/или желудочно-кишечного тракта, как описано выше, конкретнее рака простаты. В этом варианте осуществления изобретения антитело является предпочтительно химерным или гуманизированным моноклональным антителом, имеющим константные человеческие области, например константные человеческие IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 области, и необязательно гуманизированные каркасные участки. Альтернативно, антитело может быть человеческим антителом, которое может быть получено из сыворотки человеческих индивидуумов. Терапевтическое антитело предпочтительно связывается с поверхностью раковых клеток, например клеток рака простаты.
Терапевтическое антитело может быть связано с эффекторной молекулой, например радиоактивной и/или цитотоксической молекулой. При терапевтическом применении антитела могут быть введены в терапевтически эффективной дозе, например от 110 до 5000 мкг в день вплоть до 4000-1000 мкг в день, предпочтительно введены вливанием, в зависимости от типа и тяжести болезни. Антитела могут быть введены известными способами, например парентерально, согласно стандартным протоколам, известным для введения других антител, таких как трастузумаб, ритуксимаб, цетуксимаб и т.д. Введение антител можно комбинировать с другими видами лечения, например, введением других противоопухолевых антител, введением цитотоксических препаратов, хирургией и/или рентгенотерапией.
Далее настоящее изобретение будет объяснено более подробно с помощью фигур и примеров.
Описание фигур
Фигура 1: Общее представление о структуре аннексина A3 (А) и рекомбинантных фрагментов аннекисна A3, использованных для картирования эпитопов моноклональных антител; на основе такого типа скрининга посредством картирования эпитопов были отобраны моноклональные антитела, которые являются предметом настоящей патентной заявки.
Фигура 2: Очистка фрагмента vANA-5 человеческого аннексина A3 (аминокислоты 107-243): электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na (SDS-PAGE) хроматографически очищенного vANA-5.
Фигура 3: Очистка фрагмента vANA-7 человеческого аннексина A3 (аминокислоты 1-106): SDS-PAGE хроматографически очищеннного vANA-7.
Фигура 4: Очистка фрагмента vANA-1 аннексина A3 (аминокислоты 1-324): SDS-PAGE хроматографически очищенного vANA-1.
Фигура 5: Тестирование фрагмента vANA-1 на планшете для ELISA: фиолетовый - аннексии A3-специфическая антисыворотка; синий - «нулевая» сыворотка: преиммунная сыворотка кролика.
Фигура 6: Специфичность анти-ANXA3 антител: дорожки 1-9 и 2D-вестерн-блот взяты из Wozny et al., 2006; дорожки 10-19 показывают различные моноклональные анти-ANXA3 антитела, как объяснено в тексте. Они демонстрируют по существу отсутствие перекрестной реактивности к любому другому белку других аннексинов.
Фигура 7: Денситометрическое количественное определение анти-АНХА3-окрашивания после обработки ECL вестерн-блотов полных клеточных лизатов клеток РС3 демонстрирует высокую специфичность моноклонального антитела tgc7 ProVII5C5 (DSM АСС2780).
Фигура 8: Калибровка анти-ANХА3-основанного ELISA с vANA-1 в качестве антигена, цветную реакцию останавливали после 15 (А), 30 (В) и 45 (С) мин.
Фигура 9: Обнаружение ANXA3 в супернатантах мочи, полученной после ректального исследования/массажа, после стандартного центрифугирования с низкой скоростью; A, D: 15 мин; В, Е: 30 мин и С, F: 45 мин обработки; верхние кривые были получены после гель-фильтрации (GF) для удаления мочевины.
Фигура 10: Кривая зависимости чувствительности от специфичности (ROC-кривая) для диагностического исследования на основе анти-ANХА3, с помощью ELISA, как показано на фигуре 6, и учитывая 200 пациентов со значениями PSA в пределах 4-10 нг/мл; AUROC составляет 0,823, показывая 90% специфичность при 70% чувствительности для этого значительной совокупности в "серой зоне" PSA.
Фигура 11: Поликлональная сыворотка, использованная в Wozny et al., 2006 (см. фигуру 1), только незначительно связывается с поверхностями клеток РС-3.
Фигура 12: Обнаружение поверхностного-ANХА3 на клетках PC-3 с помощью tgc7 ProVII5C5 (DSM АСС2780); антитело было использовано в концентрациях, указанных на графиках. В качестве вторичного антитела использовали антимышь-IgG-FITC в разведении 1:50, окрашивающий объем составлял 100 мкл титра антител.
Эти результаты показывают поверхностную локализацию ANXA3 в данной клеточной линии рака простаты, который потенциально может быть использован терапевтически.
Фигура 13: С использованием перекрывающихся пептидных последовательностей, покрывающих антигенную область ANXA3, шесть эпитопов были обнаружены и определены как способствующие высокоспецифическому связыванию поликлональной антисыворотки. Ближайшими к двум эпитопам в N-концевой области (которые распознаются tgc5 Pro II6G7=DSM ACC2778; tgc6 ProIII1G11=DSM ACC2779; tgc7 ProVII5C5=DSM АСС2780) являются четыре дополнительных эпитопа, которые показаны более подробно на фигуре 14.
Фигура 14: Общее представление о последовательности человеческого ANXA3 и его антигенных областей (темно-фиолетовая нижняя линия): поликлональная АВ1 является высокоспецифической поликлональной антисывороткой, связывающейся исключительно с ANXA3, с отсутствием перекрестной реактивности к другим аннексинам или любым другим антигенам (как показано с помощью двухмерных (20)-вестерн-блотов и масс-спектрометрии, фигура 1). Поликлональная АВ2 направлена против эпитопов 3 и 4; МАВ1 представляет собой tgc7 ProVII5C5=DSM ACC2780, и МАВ 2 означает и tgc5 Pro II6G7=DSM ACC2778 и tgc6 ProIII1G11=DSM ACC2779; рекомбинантные фрагменты ANXA3 1-8 были использованы для соответствующих иммунизации.
Фигура 15: Схематическое изображение кристаллической структуры ANXA3 человека.
Осуществление изобретения
Примеры
Пример 1
Получение специфических моноклональных антител, направленных против ANXA3
Рекомбинантные растворимые фрагменты аннексина человека A3, vANA-5 (AA 107-243), vANA-7 (AA 1-106), vANA-1 (AA 1-324), vANA-2 (AA 1-159), vANA-3 (AA 35-159), vANA-4 (AA 191-324) и vANA-6 (AA 107-190) были клонированы и экспрессированы в Е.соli и потом хроматографически очищены. Общий вид структуры аннексина A3 и его рекомбинантных фрагментов показан на фигуре 1.
Фигуры 2, 3 и 4 показывают окрашенные кумасси 1D гели рекомбинантных растворимых ANXA3 фрагментов vANA-5, vANA-7 и vANA-1, очищенных с помощью стандартных хроматографических методов.
Был разработан метод скрининга положительных клеток гибридомы после слияния и во время клонирования антителопродуцирующих клеток, антианнексин A3 ELISA на основе фрагмента vANA-1 (фиг.5). Для достижения инклюзивного распознавания антител, которые связываются с нативными эпигонами ANXA3, рекомбинатный vANA-1 ренатурировали перед связыванием на планшетах для ELISA. Рекомбинатный vANA-1 наносили в концентрации 1 мкг/лунку на планшеты для ELISA. Функциональность планшетов для ELISA проверяли с помощью поликлональной анти-ANXA3 сыворотки.
Фигура 6 демонстрирует изображение в псевдоцветах спектра реактивности поликлональной сыворотки по отношению к доброкачественному и раковому образцу ткани простаты. Раковый образец показан нанесенным на полиакриламидный гель для двухмерного электрофореза 2D-PAGE. Подавляющая часть сигнала получена от цепочки из четырех пятен, которые были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии как ANXA3. Такие изображения в псевдоцветах спектра отражают более глубокий динамический диапазон, чем позволяют одноцветные шкалы серых тонов. Интенсивность сигналов не-ANХА3 всегда является близкой к фоновой, будучи представлена синими (близко к фоновым) пикселами. Степень этого различия между специфическими и неспецифическими сигналами показана на дорожках 8 и 9 на фигуре 6, которая представляет результаты в одноцветной шкале серых тонов.
Далее эта ситуация подчеркнута профилями сигналов (дорожки 10-19) различных титров моноклональных антител tgc5 Pro II6G7=DSM ACC2778 (дорожки 10 и 11); tgc6 ProIIIlGll (DSM ACC2779) (дорожки 15 и 16); tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780) (дорожки 12-14); tgc8 ProIII1E1 (DSM ACC2781) (дорожки 17-19); которые показывают даже низкую перекрестную реактивность.
Как показано на фигуре 6, моноклональные антитела, которые являются предметом настоящего изобретения, по существу не имеют перекрестной реактивности с другими аннексинами. Тогда как поликлональная сыворотка от Wozny et al. 2006 имеет некоторую остаточную перекрестную реактивность с ANXA6, окрашивание моноклональными антителами (биопсии пациента с раком простаты и клеточной линии рака простаты РС3), показанное на правой стороне фигуры 6, вызывает меньше чем 1% фонового окрашивания при других положениях, чем 33 kДа для ANXA3.
Фигура 7 показывает денситометрическое определение количества анти-ANХА3 окрашивания после электрохемилюминесцентной проявки изображения (ECL). Вестерн-блот полного клеточного лизата клеток РС3 был проанализирован с антителом tgc7 ProVII5C5 (DSM 2780). Была обнаружена только одна полоса, соответствующая ANXA3. Перекрестная реактивность практически отсутствует.
Пример 2
Определение специфичности антител в образце мочи, полученной после ректального исследования/массажа, и в тканевых срезах.
Моноклональные антитела Примера 1 были использованы в формате ELISA, как описано выше для обнаружения ANXA3 в супернатантах мочи, полученной после ректального исследования/массажа пациентов с раком.
Как показано на фигуре 8, для калибровки планшеты для ELISA был покрыты tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), и была проведена детекция серии разведении vANA-1 (20-0,3 нг/лунку) с использованием биотинилированного tgc5 Pro II6G7 (DSM ACC2778) и авидин-HRP с ТМВ в качестве субстрата. Ферментативную цветную реакцию останавливали после 15, 30 и 45 мин, как указано.
На фигуре 9 показано обнаружение ANXA3 в супернатантах мочи, полученной после ректального исследования/массажа, взятой у пациентов. Образец центрифугировали согласно стандартным клиническим способам при низкой скорости. Сигналы были улучшены предшествующей гель-фильтрацией (GF), которая существенно удаляет мочевину, которая может повлиять на вестерн-блоты полиакриламидных гелей для одномерного электрофореза (ID PAGE).
Антитела также тестировали в процедуре иммуногистохимического окрашивания тканевых срезов. Высокая внутриклеточная концентрация ANXA3 была обнаружена в нормальном эпителии простаты. Во время развития болезни от PIN до карциномы обнаружено очевидное местное увеличение ANXA3, локализованного внеклеточно. Эти окрашенные области биопсий, однако, не представляют или не дают возможности сделать общие оценки количественных взаимоотношений диагностических распределений ANXA3 между супернатантами и осадками мочи, полученной после ректального исследования/массажа. Это несложно, так как биопсии являются скорее качественными и не могут всесторонне представлять области простаты ракового (или) доброкачественного свойства.
Пример 3
Клинические исследования по обнаружению ANXA3 в образцах мочи, полученной после ректального исследования/массажа.
Было выполнено многоцентровое слепое клиническое исследование для определения чувствительности и специфичности диагностирования карциномы простаты на основе неинвазивного обнаружения ANXA3 в жидкостях тела, особенно в моче, полученной после ректального исследования/массажа.
3.1. Пациенты и контроли
А. Пациенты с гистологически подтвержденной карциномой простаты (РСА группа): n=около 200.
В. Пациенты без карциномы простаты, как определено с помощью гистологического тестирования (контрольная группа): n=около 300.
3.2. Взятие и обработка образцов
3.2.1. Сыворотка и плазма
Для обычного определения уровня PSA в сыворотке внутривенно отбирали пробу в пробирку для сыворотки. Далее, дополнительно отстаивали 1-2 мл сыворотки и хранили в замороженном при низкой температуре состоянии. Данный образец крови затем исследовали на PSA. Взятие образца крови проводили до того, как осуществляли пункционную биопсию простаты или ректальную пальпацию.
3.2.2. Осадок мочи, полученной после ректального исследования/массажа
После 20 сек пальпации и массирования простаты пациента просили опорожнить мочевой пузырь. Мочу, полученную после ректального исследования/массажа, обрабатывали по опубликованным методикам (I.Rehman, A.R.Azzouzi, J.W.F.Catto, S.Allen, S.S.Cross, K.Feeley, M.Meuth, & F.C.Hamdy, Proteomic analysis of voided urine after prostatic massage from patients with prostate cancer: A pilot study, Urology 64 (6), 2004, 1238-1243; С.Goessi, M.Müller, R.Heicappell, H.Krause, B.Straub, M.Schrader & K.Miller, DNA-based detection of prostate cancer in urine after prostatic massage. Urology 58 (3), 2001, 335-338), и продукты хранили при -80°С.
Подобно сыворотке мочу, полученную после ректального исследования/массажа, отбирали, если возможно, перед выполнением пункционной биопсии простаты.
3.3 Результаты
Примерно у 200 PSA положительных пациентов определение ANXA3 в осадках и супернатантах образцов мочи, полученной после ректального исследования/массажа, показало чувствительность около 90% и специфичность около 80%.
Как показано на фигуре 10, ROC-значения для показаний на основе ANXA3 в супернатантах (u.anx.tot) у пациентов с PSA в пределах 2-6 нг/мл составляли 0,8, в пределах PSA-значений 4-10 нг/мл ROC-значения составляли 0,85 и в целой совокупности всех пациентов и во всех пределах PSA-значений, ROC-значения для ANXA3 составляли 0,74.
Характерная ROC-кривая на фигуре 10 для пациентов со значением PSA между 4 и 10 нг/мл показывает диагностическую значимость, в особенности в этой важной серой зоне PSA (где специфичность PSA является очень низкой (Roddam AW, Duffy MJ, Hamdy FC, Ward AM, Patnick J, Price CP Rimmer J, Sturgeon C, White P, Alien NE; On behalf of the NHS Prostate Cancer Risk Management Programme. Use of prostate-specific antigen (PSA) isoforms for the detection of prostate cancer in men with a PSA level of 2-10 ng/ml: systematic review and meta-analysis. Eur Urol. 2005 Sep; 48(3):386-99; discussion 398-9. Review. PMID: 15982797; Stamey ТА, Caldwell M, McNeal JE, Nolley R, Hemenez M, Downs J. The prostate specific antigen era in the United States is over for prostate cancer: what happened in the last 20 years? J Urol. 2004 Oct; 172(4 Pt 1):1297-301. PMID: 15371827)), ROC-кривые представляют собой стандартные способы клинической статистики и хорошо описаны, например, в http://www.anaesthetist.com/mnm/stats/roc/.
Пример 4
Связывание моноклональных антител с раковыми клетками
Моноклональные анти-ANХА3 антитела являются пригодными в качестве поверхностных маркеров для диагностического (патологическая гистология) и терапевтического использования.
В частности, как показано в нижеследующем с помощью проточной цитометрии, моноклональное антитело специфически связывается с N-концевым эпитопом, tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780) связывается с внеклеточными местами связывания клеточной линии рака простаты (РС-3 клетки, АТСС, DCV-1017, Version 08-2004) кальцийзависимым образом.
Неспецифическое связывание оценивали во время каждого эксперимента посредством инкубации только с вторичными антителами и с помощью использования неспецифических и неродственных контрольных антител (моноклональных и поликлональных).
Фигура 11 показывает, что поликлональная сыворотка, использованная в Wozny et al., 2006 (см. фигуру 6), только незначительно связывается с поверхностями клеток PC-3.
Клетки промывали соответствующим буфером и инкубировали на льду в течение 30 мин при разведениях, указанных на фигуре 11. Позже все образцы инкубировали со 100 мкл FITC-связанными антикроличьими вторичными антителами при разведении 1:50. После стадий промывки 12,000 клеток каждого образца исследовали с помощью проточной цитометрии, как показано.
По существу, поликлональная сыворотка не приводила к значительному увеличению интенсивности флуоресценции в целом ряде разведении и в сравнении с контрольной сывороткой. Таким образом, поверхностная экспрессия ANXA3 на клетках PC-3 может быть не видна на этой стадии, вероятно вследствие того, что концентрация специфических антител в поликлональной сыворотке является слишком низкой.
Однако, как показано на фигуре 12, моноклональное антитело tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780) действительно связывается концентрационно- и кальцийзависимым образом с поверхностными эпитопами клеток PC-3.
Пример 5
Картирование эпитопов
После использования перекрывающихся пептидных последовательностей, покрывающих всю антигенную область аннекина A3 (ANXA3), мы сделали вывод, что только шесть эпитопов являются ответственными за высокоспецифичное связывание, как показано на фигурах 13 и 14 при анализе связывания высокоспецифичного поликлонального антитела (см. фиг.1). Специфичность поликлональной антисыворотки была проверена с помощью вестерн-блотов 2D-PAGE и масс-спектрометрии. То же самое относилось к моноклональным антителам tgc5 Pro II6G7=DSM ACC2778; tgc6 ProIIIlGll=DSM ACC2779; tgc7 ProVII5C5=DSM ACC2780; tgc 13 Prol/5G9; tgc 12 ProIIIMBI 1; tgc 14 ProVIII/3D7.
Картирование эпитопов показало, что по соседству с двумя эпитопами в N-концевой области имеются также вклады от 2 эпитопов в средней области и от 2 эпитопов в С-концевой области ANXA3 (фиг.13).
Локализация этих эпитопов (обозначенных как эпитопы 1-6) на ANXA3 человека показана на фиг.14.
Кристаллическая структура ANXA3 человека, показанная в виде обзорного представления на фиг. 14 (http://www.pdb.org/pdb/files/laxn.pdb и http://www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=1AXN), предполагает, что эпитопы 1, 2, 5 и 6, вместе образуют домен при нативной укладке ANXA3. Поэтому мы приступили к выделению человеческого ANXA3 из нейтрофилов и иммунизировали кроликов этим материалом для того, чтобы получить соответствующие антитела. Эти антитела направлены против нативного ANXA3; мы вновь проводили скрининг и отбор на самую высокую специфичность, причем антитела, связывающиеся с доменами, содержащими соответствующие эпитопы 1, 2, 5 и 6, являются особенно пригодными для диагностических и терапевтических целей.