ШТАММ MYROIDES ODORATIMIMUS ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ АФЛАТОКСИНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
MYROIDES ODORATIMIMUS STRAIN FOR BIOLOGICAL CONTROL FOR EFFECTIVE DEGRADATION OF AFLATOXIN AND ITS APPLICATION

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
[001] Настоящее изобретение относится к области микроорганизмов и, в частности, относится к штамму Myroides odoratimimus для биологического контроля для эффективной деградации афлатоксина и его применению.
Описание известного уровня техники
[002] Aspergillus flavus представляет собой патогенный гриб, который может продуцировать тип в высокой степени канцерогенного и высокотоксичного грибного токсина, афлатоксина, включающего семейства B, G и M, где B1 является наиболее распространенным и наиболее токсичным. Афлатоксин может повсеместно загрязнять пищевые культуры, такие как виды арахиса, кукуруза и т. д., и серьезно угрожать здоровью людей и домашнего скота, что приводит к значительным экономическим потерям. Следовательно, необходимо срочно усовершенствовать обработку от загрязнения Aspergillus flavus и токсинами.
[003] Традиционные способы удаления афлатоксина B1 (AFB1) в основном включают адсорбцию, экстракцию, термическую обработку, радиационную обработку, кислотно-щелочную обработку и окислительно-восстановительную обработку, которые иногда затратны по времени и усилиям, имеют низкую скорость детоксикации и могут легко вызвать потерю питательных веществ. Однако биологический способ имеет преимущества в отношении безопасности, высокой эффективности и долгосрочности. Следовательно, для сельскохозяйственной промышленности и экономических выгод Китая очень важно увеличить количество исследований в области биологической обработки от афлатоксина.
[004] Бактериальная и метаболическая биодеградация афлатоксина не являются широко известными. Stenotrophomonas maltophilia, проверенный с применением куморовой среды, как проведено Guan Shu, Li Junxia et al., способен к деградации афлатоксина со скоростью деградации 82,5%. Wang Ning et al. изучили оранжево-красный штамм Myxococcus из фекалий серых тонкотелых обезьян и обнаружили, что скорость деградации AFB1 составляет 78,2% при оптимальных условиях культивирования. В существующем уровне техники не было сообщений о применении Myroides odoratimimus для деградации афлатоксина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[005] Техническая проблема, решаемая с помощью настоящего изобретения, заключается в предоставлении штамма 3J2MO Myroides odoratimimus для биологического контроля для эффективной деградации афлатоксина и его применении ввиду недостатков существующего уровня техники. Штамм 3J2MO Myroides odoratimimus для биологического контроля по настоящему изобретению способен в значительной степени к деградации афлатоксина.
[006] С целью решения вышеупомянутой технической проблемы, техническое решение, принятое согласно настоящему изобретению, заключается в описанном ниже.
[007] Штамм 3J2MO Myroides odoratimimus для биологического контроля был депонирован в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) 13 июня 2017 года с адресом депонирования: Уханьский университет, Ухань, Китай и под номером депонирования в CCTCC № M 2017329.
[008] По настоящему изобретению 100 мкл почвы после градиентного разбавления, собранной с арахисового поля в Хуангпи, Хубэй, размазывают по твердой культуральной среде лизогенного бульона (LB) для культивирования. Выращенные бактерии отбирают с помощью инокуляционной петли и переносят в свежую твердую культуральную среду LB для посева в чашку штрихами. После нескольких пересадок отбирают одну колонию. Штамм 3J2MO, характеризующийся значительным эффектом деградации в отношении афлатоксина, подвергают скринингу в эксперименте по деградации афлатоксина и депонируют в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) с адресом депонирования: Уханьский университет, Ухань, Китай и под номером депонирования в CCTCC № M 2017329. Тип штамма идентифицируют с применением специфической в отношении 16S rDNA технологии амплификации в сочетании с морфологическими характеристиками и физиологическими и биохимическими экспериментами. Из результата видно, что штамм представляет собой штамм Myroides odoratimimus, принадлежащий к Актиномицетам, род Brevibacterium.
Таблица 1. Главные биологические характеристики Myroides odoratimimus 3J2MO
[009] Предоставлен препарат для деградации афлатоксина, который включает фермент Myroides odoratimimus 3J2MO.
[0010] В соответствии с решением, полученная форма препарата представляет собой жидкость, распыляемый порошок, сухой смачиваемый порошок или сухую смачиваемую гранулу.
7
[0011] В соответствии с решением препарат является жидким, и конечная концентрация Myroides odoratimimus 3J2MO в препарате составляет (1-9) × 10 КОЕ/мл.
7
[0012] В соответствии с решением препарат представляет собой ферментативный бульон c Myroides odoratimimus 3J2MO, а конечная концентрация Myroides odoratimimus 3J2MO в ферментативном бульоне c Myroides odoratimimus 3J2MO составляет (1-9) × 10 КОЕ/мл.
o
[0013] В соответствии с решением способ получения ферментативного бульона c Myroides odoratimimus 3J2MO заключается в следующем. Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию Myroides odoratimimus, переносят в жидкую культуральную среду LB и культивируют со встряхиванием в течение от 12 часов до 24 часов. Захватывают от 1% до 3% культурального бульона, переносят в свежую жидкую культуральную среду LB и культивируют со встряхиванием в течение от 12 часов до 4 часов с получением ферментативного бульона c антагонистическим штаммом 3J2MO Myroides odoratimimus.
[0014] Представлен способ деградации афлатоксина, и конкретный способ применения заключается в следующем. Препарат для деградации афлатоксина наносят или распыляют на поверхность биологического образца или смешивают с биологическим образцом для деградации афлатоксина, для предотвращения и устранения загрязнения афлатоксином биологического образца.
[0015] Представлен способ деградации афлатоксина, и конкретный способ применения заключается в следующем. Ферментативный бульон c Myroides odoratimimus 3J2MO наносят или распыляют на поверхность биологического образца или смешивают с биологическим образцом для деградации афлатоксина, для предотвращения и устранения загрязнения афлатоксином биологического образца.
[0016] Благоприятные эффекты настоящего изобретения
[0017] В настоящем изобретении впервые предусмотрен штамм 3J2MO Myroides odoratimimus с хорошим эффектом деградации в отношении афлатоксина из почвы.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0018] По настоящему изобретению 100 мкл почвы после градиентного разбавления, собранной с арахисового поля в Хуангпи, Хубэй, размазывают по твердой культуральной среде лизогенного бульона (LB) для культивирования. Выращенные бактерии отбирают с помощью инокуляционной петли и переносят в свежую твердую культуральную среду LB для посева в чашку штрихами. После нескольких пересадок отбирают одну колонию. Штамм 3J2MO, характеризующийся значительным эффектом деградации в отношении афлатоксина, подвергают скринингу в эксперименте по деградации афлатоксина и депонируют в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) под номером депонирования в CCTCC № M 2017329.
[0019] Вариант осуществления 1
o
-1
o
-1
[0020] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию Myroides odoratimimus , переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.
7
o
[0021] 2) Стандартный раствор афлатоксина B1 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10 КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28C и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.
[0022] 3) Измеряют содержание афлатоксина B1 в культуральном бульоне (таблица 2).
Таблица 2. Эффект деградации бактерий для биологического контроля в отношении афлатоксина
[0023] Из результатов эксперимента видно, что скорость деградации штамма Myroides odoratimimus CCTCC № M 2017329 афлатоксина составляет приблизительно 95,61%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина.
[0024] Вариант осуществления 2
5
[0025] Бобы арахиса, полученные с арахисового поля Хубэй, измельчают в порошок и 0,5 г порошка арахиса взвешивают в чашке Петри. Добавляют 500 мкл раствора спор Aspergillus flavus, продуцирующего токсин (5 × 10/мл), и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 7 дней.
o
[0026] Ферментативный бульон из 500 мкл штамма CCTCC № M 20177329 добавляют к порошку арахиса, заполненному спорами, такое же количество культуральной среды LB используют в качестве контроля и культивируют в культуральной среде при 28С в течение 5 дней с 3 повторами на эксперимент.
[0027] Добавляют 15 мл 70% метиловового спирта и помещают в шейкер на 30 минут после встряхивания. Добавляют 8 мл сверхчистой воды к 3 мл супернатанта для перемешивания и центрифугирования.
[0028] Отбирают 8 мл супернатанта и определяют содержание афлатоксина В1 с помощью иммуноаффинной колонки, способом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (таблица 3), с 3 повторами на эксперимент.
Таблица 3. Эффект обработки бактерий для биологического контроля в отношении арахиса, загрязненного Aspergillus flavus
[0029] Из результатов эксперимента видно, что уровень профилактики и контроля штамма CCTCC № M 2017329, влияющий на выработку токсина Aspergillus flavus на арахисе, составляет приблизительно 98,76%, что указывает на то, что штамм обладает хорошим эффектом обработки в отношении арахиса, загрязненного Aspergillus flavus.
[0030] Вариант осуществления 3
o
-1
o
-1
[0031] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.
7
o
[0032] 2) Стандартный раствор афлатоксина B2 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10 КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28C и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.
[0033] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина B2 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.
[0034] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина B2 составляет 96,23%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина B2.
[0035] Вариант осуществления 4
o
-1
o
-1
[0036] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.
7
o
[0037] 2) Стандартный раствор афлатоксина G1 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10 КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28C и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.
[0038] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина G1 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.
[0039] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина G1 составляет 96,73%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина G1.
[0040] Вариант осуществления 5
o
-1
o
-1
[0041] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.
7
o
[0042] 2) Стандартный раствор афлатоксина G2 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10 КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28C и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.
[0043] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина G2 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.
[0044] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина G2 составляет 97,55%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина G2.
[0045] Вариант осуществления 6
o
-1
o
-1
[0046] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28C и 200 об.·мин. в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.
7
o
[0047] 2) Стандартный раствор афлатоксина M1 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10 КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28C и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.
[0048] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина M1 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.
[0049] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина M1 составляет 97,55%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина M1.
[0050] Вариант осуществления 7
[0051] Используется тот же способ, что и в патентном документе CN 105925513 A. Сравниваются эффекты деградации в отношении афлатоксина B1 штаммом Flavobacterium под номером депонирования в CICC 20907 в патентном документе и штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus по настоящему изобретению. Результаты сравнения показаны в таблице 4. Из результатов видно, что способность к деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина B1, обеспечиваемая по настоящему изобретению, значительно превышает способность к деградации штаммом CICC 20907 Flavobacterium афлатоксина B1 по патентному документу CN 105925513 A.
Таблица 4. Сравнение способности к деградации афлатоксина B1 по настоящему изобретению и штаммом CICC 20907 Flavobacterium согласно патенту 105925513 A
[0052] В сочетании вариантов осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 штамм CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus по настоящему изобретению обладает очень сильной способностью к деградации всех пяти типов распространенных афлатоксинов. После изучения отечественных и зарубежных ссылок, штамм с такой сильной способностью к деградации пяти типов распространенных афлатоксинов не был обнаружен внутри страны и за рубежом.