СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ
METHOD OF INCREASING SENSITIVITY OF MICROORGANISMS TO ANTIMICROBIAL AGENTS

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии. Данное техническое решение может быть использовано для преодоления антибиотикоустойчивости микроорганизмов и повышения эффективности антибактериальной терапии.
Несмотря на непрерывный интенсивный поток и разработку новых антибактериальных препаратов, проблема борьбы с инфекционно-воспалительными заболеваниями остается одной из наиболее сложных и актуальных проблем для врачей во всем мире. Применение антибиотиков в медицине способствует появлению и распространению лекарственной устойчивости [Палий Г.К., Палий И.Г. Характеристика антибиотикочувствительности возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний // сайт: http://www.provisor.com.ua/archive/2000/N12/antibact.php].
Известны способы повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам путем воздействия различных средств и химических препаратов, протеолитических бактериальных ферментов, ферментов животного происхождения. Одними из таких средств являются различные минеральные воды [патенты RU на изобретения №2207863, 2230563, 2246541, 2255746, заявка RU на изобретение №2003103843].
Однако повышение чувствительности при использовании данных средств крайне незначительно, не обладает статистической достоверностью и не достигает того уровня, который при использовании дискодиффузионного метода позволяет считать штамм чувствительным к данному антибиотику. Изменения количественных показателей чувствительности штаммов колеблются в пределах погрешности.
Известен также «Способ повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам» [патент RU на изобретение №2052198], основанный на воздействии препарата бактериального происхождения. В качестве активного вещества, оказывающего одновременно бактерицидное, противоспалительное и иммуностимулирующее действие, используют водный раствор пиластина. In vitro используют пиластин в конечной концентрации 0,1-0,4%, при этом осуществляют инкубацию микроорганизмов с пиластином в течение трех дней. Пиластин местно используют в течение трех дней в концентрации 0,01-0,04%.
Однако использование пиластина может привести к развитию аллергических реакций. Данный препарат противопоказан при гиперчувствительности и нарушениях целостности кожи, что затрудняет его применение при местном лечении раневой инфекции (инструкция по применению; http://healthoffice.ru/content/pilastin). Кроме того, применение данного способа требует продолжительного времени воздействия препаратом, а именно в течение 3-х суток, что удлиняет сроки достижения необходимого эффекта.
Известен также способ повышения антибиотикочувствительности микроорганизмов [патент RU на изобретение №2053773], заключающийся в проведении последовательной или одновременной с антибиотиками обработки антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов 2,5-5 мг/л растворами серебра, полученными электролитическим методом и доведенными до изотоничности добавлением хлористого натрия.
Однако данный способ предполагает использование в качестве сырья серебра, которое является более дорогостоящим материалом, по сравнению с медью. Кроме того, данный способ предполагает совместное действие серебра и антибиотиков, что не всегда эффективно при лечении раневой инфекции, вызванной антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов, так как в клинической практике требуется различные методы введения антибактериальных препаратов (парентеральный, пероральные и т.д.), а не только местные.
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам [Изучение влияния наночастиц металлов на чувствительность к антибиотикам клинических штаммов микроорганизмов / И.В. Бабушкина [и др.]//Вестник новых медицинских технологий. 2011. Т. XVIII, №2. С.511-513], заключающийся в воздействии на микроорганизмы суспензией наночастиц меди, железа, цинка и их сплавом в концентрации 0,01 мг/мл в течение 30 минут.
Однако предлагаемый способ эффективен в отношении штаммов Pseudomonas aeruginosa и предполагает восстановление чувствительности только к одному из антибиотиков группы цефапоспоринов - цефтазидиму.
Задачей заявляемого изобретения является обеспечение значимого увеличения количественных значений антибиотикочувствительности микроорганизмов и возможность повышения чувствительности к широко применяемым в мире дешевым антибиотикам, в частности к гентамицину и ампицилину.
Сущность заявляемого изобретения характеризуется тем, что готовят две взвеси путем добавления в изотонический раствор NaCl: наночастиц меди до достижения их концентрации 0,01-0,05 мг/мл и микроорганизмов до достижения их концентрации 30-40 тыс. КОЕ/мл; приготавливают суспензию этилендиаминтетрауксусной кислоты ЭДТА путем ее разведения в дистиллированной воде из расчета 0,1-0,2:1 соответственно, добавляют в данную суспензию NaOH до получения раствора ЭДТА с рН=7,6-8; соединяют приготовленные взвеси и раствор ЭДТА в следующих соотношениях, мас.%:
взвесь наночастиц меди - 70-85,
взвесь микроорганизмов - 10-20,
раствор ЭДТА - 5-10,
и инкубируют в шейкере при 100-150 об/мин и температуре 36-38°C в течение 40-60 минут; высевают полученную биомассу на твердую питательную среду объемом 20-25 мл в количестве 0,1-0,12 мл и инкубируют в термостате при температуре 36-38°C в течение 18-24 часов, при этом в качестве микроорганизмов используют клинические полиантибиотикорезистентные штаммы Escherichia coli (Е. coli).
Заявляется также способ с вышеописанными признаками, в котором в качестве твердой питательной среды используют мясопептонный агар.
Технический результат заявляемого изобретения.
Поставленная ранее задача достигается путем использования в способе определенных компонентов, их процентных соотношений и разработанных авторами технических параметров проводимых при осуществлении данного способа манипуляций. Наночастицы меди обеспечивают элиминацию внехромосомного генетического материала - плазмидной ДНК, несущей гены антибиотикорезистентности. Таким образом, применение именно наночастиц меди позволяет полностью разрушить плазмидные ДНК, что обеспечивает значимое увеличение количественных значений чувствительности к обозначенным ранее антибиотикам - гентамицину и ампицилину. Последние широко применимы в мире, дешевы и на данный момент времени отмечается большой процент микроорганизмов с устойчивостью к ним. Использование ЭДТА обеспечивает повышение проницаемости мембраны бактериальной клетки для наночастиц металлов, облегчение проникновения наночастиц меди к генетическому материалу бактериальной клетки и осуществление изменений в нем, обеспечивающих повышение антибиотикочувствительности штаммов.
Способ повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам осуществляют следующим образом. Готовят взвеси. Для этого добавляют в изотонический раствор NaCl в отдельных емкостях наночастицы меди до достижения их концентрации во взвеси 0,01-0,05 мг/мл и микроорганизмы - клинические полиантибиотикорезистентные штаммы Е. coli до достижения их концентрации 30-40 тыс. КОЕ/мл. Приготавливают суспензию ЭДТА путем ее разведения в дистиллированной воде из расчета 0,1-0,2:1 соответственно. Под контролем рН-метра добавляют в полученную суспензию NaOH до получения раствора ЭДТА с рН=7,6-8 при постоянном перемешивании. Затем соединяют приготовленные взвеси и раствор ЭДТА в следующих соотношениях: 70-85% взвеси наночастиц меди, 10-20% взвеси микроорганизмов и 5-10% раствора ЭДТА. Полученную смесь инкубируют при температуре 36-38°C и 100-150 об/мин в течение 40-60 минут. Высевают полученную биомассу на твердую питательную среду объемом 20-25 мл в количестве 0,1-0,12 мл и инкубируют в термостате при температуре 36-38°C в течение 18-24 часов. В большинстве случаев в качестве твердой питательной среды используют мясопептонный агар.
Пример.
Выделили от больных с гнойными осложнениями травматолого-ортопедического профиля 10 клинических штаммов Е. coli с устойчивостью к ампилициллину и гентамицину. Штаммы микроорганизмов культивировали на мясопептонном агаре в термостате в течение 24 часов при температуре 37°C. Затем приготовили 10 пробирок, содержащих по 0,85 мл взвеси наночастиц меди с концентрацией 0,01 мг/мл в изотоническом растворе NaCl; 10 пробирок, содержащих 0,85 мл изотонического раствора NaCl; 20 пробирок, содержащих по 0,1 мл взвеси ранее выделенных микроорганизмов с концентрацией 30 тыс. КОЕ/мл в изотоническом растворе NaCl по две на каждый штамм. Подготовили также по описанному выше способу 1 мл раствора ЭДТА с рН=8. Соединили содержимое пробирок таким образом, что получили 10 пробирок со смесью взвеси каждого из микроорганизмов с взвесью наночастиц меди (опытная группа) и 10 пробирок со смесью взвеси каждого из микроорганизмов с изотоническим раствором (группа сравнения). Добавили в каждую из 20 полученных пробирок по 0,05 мл заранее приготовленного раствора ЭДТА. Инкубировали полученные смеси в шейкере в течение 30 минут при 100 об/мин и температуре 37°C. После высевали на отдельные чашки с мясопептонным агаром по 0,1 мл каждой из полученной биомассы и инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов. По окончании срока инкубации производили изучение чувствительности выросших штаммов микроорганизмов к антимикробным препаратам - гентамицину, ампициллину диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».
В результате проведенных исследований было установлено следующее.
Антибиотикочувствительность клинических штаммов Е. coli составила:
Антибиотики
Диаметр зоны задержки роста Е. coli, мм
Гентамицин
6,2±1,3
Ампициллин
9,0±1,7
Динамика изменения антибиотикочувствительности клинических штаммов Escherichia coli:
Антибиотики
Диаметр зоны задержки роста Е. coli, мм
Инкубация с изотоническим раствором
Инкубация со взвесью наночастиц меди и раствором ЭДТА
Гентамицин
6,7±1,4
15,1±1,1*
Ампициллин
9,1±1,4
18,1±0,5*
Примечание: *р<0,001, где р - уровень достоверности различий показателей по отношению к группе сравнения.
В связи с вышеуказанными количественными параметрами, было отмечено следующее. У микроорганизмов в группе сравнения не было выявлено статистически достоверного изменения зоны задержки роста в отношении ампициллина и гентамицина. У микроорганизмов опытной группы наблюдалось статистически достоверное увеличение зоны задержки роста в отношении изучаемых антибиотиков. В соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» антибиотикорезистентные клинические штаммы Е. coli в опытной группе значительно повысили чувствительность к антибиотикам, в частности к гентамицину и ампициллину, являющимся препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных штаммами Е. coli.