Способ цифровой микроскопии нативной крови
METHOD FOR DIGITAL MICROSCOPY OF NATIVE BLOOD

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, для исследования с использованием цифровой микроскопии нативного препарата нефиксированной, неизмененной физическими и химическими воздействиями крови преимущественно в светлом поле.
Исследования крови с диагностической целью в широком прикладном аспекте идут по двум основным путям: исследования клеток крови и исследования биохимического состава плазмы. И если в области изучения биохимического состава плазмы научные исследования продвинулись значительно, то в изучении свойств клеточного массива крови наблюдается уход от персонифицированного анализа к массовому автоматизированному скринингу с химическими и физическими воздействием на клеточный массив крови.
В то же время, кровь как живую ткань определяют именно клетки крови, поскольку это ее живые структуры. От функциональности клеток крови зависят основные параметры микроциркуляции в тканях, их жизнеобеспечение, иммунная защита и состояние организма в целом.
Критериями полноценной функциональности клеток крови являются их морфологические и динамические характеристики. Для эритроцитов полноценная функциональность определяется такими морфологическими параметрами, как размеры клеток, их форма и хромия (окраска). Чем больше процент морфологически измененных и разрушенных эритроцитов в крови (при их нормальном количестве), тем более выражена гипоксия тканей и нарушения микроциркуляции [2, 4].
Для лейкоцитов полноценная функциональность определяется более сложно, но, тем не менее морфологические и динамические характеристики такие, как фагоцитарная активность, морфология ядра, наличие юных клеток, имеют решающее значение.
Широко встречающаяся в практике ситуация, когда при нормальном общем количестве лейкоцитов и нормальной формуле крови выявляется клинический синдром иммунодефицита, влекущий за собой дорогостоящие иммунологические обследования. В то же время, отклонения от нормы в сложных иммунологических исследованиях, прежде всего, являются опосредованными последствиями нарушенной морфологии и фагоцитарной активности клеток белой крови [13].
Для функциональности клеток очень важна оценка состояния плазмы. Но свойства плазмы изучаются современной практикой только в аспекте ее биохимического состава, в то время как оптические ее характеристики также несут высокую информационную составляющую о гомеостазе и его нарушениях.
В настоящее время клеточный состав крови и ее общие морфофункциональные характеристики определяются несколькими основными способами, которые относят к категории общего анализа крови [6].
Способ количественной оценки форменных элементов крови в камере Горяева [6]. К недостаткам метода относятся: добавление химических реагентов, многослойность препарата, оптические ограничения вследствие малого увеличения (объектив 8×, окуляр 10×). Поэтому метод не позволяет проводить оценку морфологических и функциональных характеристик клеток крови и оптических характеристик плазмы.
В лабораторной практике продолжает применяться способ морфологического исследования препарата крови [6], для чего готовят мазок крови, который высушивают, фиксируют и окрашивают по различным методикам, микроскопируют препарат на малом увеличении (объектив 8×-40×, окуляр 10×-15×) и определяют популяционную принадлежность, размер клеток, частично оценивается форма клеток. При подготовке мазка клетки крови подвергаются значительной деформации, вследствие чего невозможно достоверно оценить их форму. Как следствие, имеет место большая погрешность в оценке форм эритроцитов и низкая информативность метода в оценке степени выраженности пойкилоцитоза. Метод не позволяет оценить функциональные свойства эритроцитов и лейкоцитов, оптически исследовать плазму на возможные объекты. Метод отличается большой трудоемкостью и относительно малой точностью.
В настоящее время оба указанных выше способа значительно вытесняются автоматизированным анализом крови. Принцип работы большинства приборов основан на механизме импедансного счетчика. Число импульсов счетчика пропорционально количеству частиц. Амплитуда импульсов пропорциональна величине объема клетки. В красной крови измеряемыми являются всего лишь два основных параметра: количество эритроцитов и гемоглобин. Остальные параметры красной крови рассчитываются математически и значимо усредняются. Поэтому, например, необходимо иметь в виду, что средний объем эритроцитов (MCV) может иметь нормальное значение при наличии у пациента одновременно выраженного макро- и микроцитоза и большом количестве аномальных эритроцитов, например, при серповидно-клеточной анемии, выраженном пойкилоцитозе [5]. Таким образом, наблюдается высокая вероятность достаточно большой погрешности в параметре «отклонение от среднего объема и распределение эритроцитов по объему».
Кроме того, автоматическими гемоанализаторами не определяется форма эритроцитов и процент измененных по форме эритроцитов, не исследуются особенности распределения гемоглобина в эритроцитах.
Лейкоциты определяются в большинстве анализаторов также методом импеданса (по Коултеру) по количеству и амплитуде импульсов. В современных анализаторах дифференцировка и подсчет лейкоцитов проводится с помощью метода проточной цитометрии, который дает возможность дифференцировать все популяции лейкоцитов. К недостаткам относится и то, что не проводится эффективная дифференцировка и подсчет незрелых форм гранулоцитов (промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные). При оценке лейкоцитарного ростка анализаторы не позволяют выявлять изменения ядер и цитоплазмы, патологическую зернистость. Большинство параметров, как и при оценке эритроцитов, являются расчетными и усредненными, что в совокупности с множественностью условий ложноположительных и ложноотрицательных результатов приводят к высокой погрешности анализа.
Один из наиболее важных и грозных феноменов реологии крови и системы микроциркуляции - это процессы тромбообразования и сосудистого тромбоза, инициация которых обусловливается внутрисосудистой агрегацией преимущественно эритроцитов [7, 8], поэтому необходимость контроля агрегации эритроцитов абсолютно очевидна. Проблема заключается в достоверности результатов существующих способов, которые сложны в исполнении, анализе и выполняются на разных приборах без единой стандартизации.
Важным объектом визуализации в нативной крови являются фибриновые мономеры. Фибрин - белок воспаления, гемостаза и гомеостаза. При многих заболеваниях и патологических состояниях (геморрагические и ишемические инсульты, атеросклероз, инфаркт миокарда, операционные травмы, кесарево сечение и т.д.) возникает необходимость определения содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови. Тем не менее, в силу дороговизны и сложности способы определения фибриновых мономеров в плазме не приобрели достаточной актуальности в практике и в основном продолжают использоваться лишь в научных целях [9].
Во всех современных способах кровь центрифугируют, разделяют на фракции, добавляют в нее различные реагенты, что с одной стороны значимо усложняет и делает более дорогим исследование крови. С другой стороны, физические и химические воздействия на кровь изменяют естественное состояние клеток крови и не позволяют дать полностью объективную характеристику анализа.
В настоящее время нативная кровь без химических и значимых физических воздействий в клинической и научной практике исследуется только в узком спектре, например, в микробиологических анализах [11]. Эти исследования проводят в темном поле, фазовом контрасте, посредством люминесцентной микроскопии. Определяют микроорганизмы, которые вследствие своей прозрачной структуры хорошо видны при использовании перечисленных выше методов контрастирования. Недостатком данных методов является то, что все они проводятся на малом увеличении. Кроме того, общая информативность препарата, просмотренного с контрастированием, в части комплексной оценки клеток крови и характеристик плазмы незначительная.
Достаточно длительное время в медицине кровь исследовали исключительно в ее нативном состоянии, то есть живые клетки в свежей капле крови без применения каких-либо реактивов. Способ «микроскопического исследования свежей капли крови» широко применялся вплоть до начала 20-х годов XX века [12]. Метод оценивал общую характеристику всех клеток крови, наличие бластных форм, инфекционных и паразитарных форм в плазме, состояние плазмы. В силу оптических ограничений существующего в то время уровня техники (увеличение препарата не более, чем в 400 раз) и перехода на массовые исследования, данный метод был постепенно вытеснен другими более сложными лабораторными методами, позволяющими оценить большое количество параметров крови. Но вместе с тем была утеряна персонификация подхода и весомая часть информационного ресурса такого анализа.
Известен способ подготовки нативных препаратов крови к исследованию [SU 1712821, А1, 24.07.1989] путем приготовления мазков с последующим облучением монохроматическим светом с длиной волны для эритроцитов 588 нм, для лейкоцитов - 747 нм.
Способ предназначен для исследования морфологии эритроцитов и лейкоцитов в неокрашенном препарате крови. Кровь для исследования эритроцитов и лейкоцитов берут традиционным способом. Исследование проводят в монохроматическом свете в раздавленной капле нативной крови под иммерсионным объективом 90×, окулярами 10-15×. Особенностью способа является то, что, исследуется раздавленная капля нативной крови, мазок нативной неокрашенной и нефикированной крови с целью большего контраста эритроцитов и лейкоцитов облучается монохромотическим светом длиной волны для эритроцитов 588 нм, для лейкоцитов 547 нм, изображение исследуется непосредственно через окуляры микроскопа.
Недостатком метода является то, что, несмотря на использование монохроматического света, разрешающая способность и общее полезное увеличение не более 1350 раз, которое дает используемая оптическая система не позволяет достичь высокой точности микроскопии клеток крови и оптической визуализации объектов плазмы. Кроме того, в способе используется раздавленная капля нативной крови, что не позволяет сохранить жизнеспособность клеток и изучить их свойства в их прижизненном состоянии. Перечисленные недостатки существенно суживают диапазон диагностики патологических изменений клеток крови при заболеваниях, не позволяют провести качественную и количественную оценку плазмы.
Предлагаемое изобретение, благодаря использующемуся в нем современному уровню техники, дает возможность проводить световую микроскопию нативного препарата крови на новом техническом уровне с новым диагностическим диапазоном, что, позволяет расширить клинические возможности общего анализа крови и компенсировать выше названные недостатки существующих способов исследования клеток крови и объектов плазмы, визуально доступных при оптической микроскии.
Известен также способ, примером реализации которого является работа устройства [US 6690466, 02.08.2001 г.] включающего предметный столик, осветитель, содержащий несколько источников излучения и оптическую систему доставки излучения этих источников до оптической поверхности предметного столика, оптическую систему формирования изображения, электронный приемник изображения, расположенный так, что его приемная площадка через оптическую систему формирования изображения оптически сопряжена с оптической поверхностью предметного столика, а также блок управления и обработки изображения, электрически соединенный с электронным приемником изображения и источниками излучения. В качестве осветителя в устройстве использована спектральная проекционная система, а источниками излучения являются светодиоды, способные излучать свет в различных спектральных диапазонах.
Недостатком этого способа также является то, что он обеспечивает малое поле зрение при использовании оптической системы с большим увеличением. При увеличении поля зрения резко снижается качество регистрируемого изображения из-за возрастания пространственной неоднородности засветки поля предмета, что не позволяет использовать его для проведения исследования малоразмерных предметов, в частности, более качественную и более точную световую микроскопию нативного препарата крови.
Известен также способ, примером реализации которого является работа устройства [US 6452625, 17.09.2002 г.], включающего оптический микроскоп, включающего штатив, внутри которого размещены осветитель, предметный столик, оптическая система, электронный приемник изображения, блок управления и обработки изображения, электрически соединенный с электронным приемником изображения, дисплей, электрически соединенный с блоком управления и обработки изображения, причем, осветитель установлен таким образом, чтобы излучаемый им свет освещал предметный столик, проходил через оптическую систему и попадал на электронный приемник изображения, электронный приемник изображения расположен так, что его приемная площадка через оптическую систему оптически сопряжена с оптической поверхностью предметного столика, а оптическая система представляет собой компонент из набора сменных объективов с различным увеличением и выполнена с возможностью ее выведения из оптического тракта.
Основным недостатком известного способа является то, что он обеспечивает малое поле зрение при использовании оптической системы с большим увеличением. При увеличении поля зрения резко снижается качество регистрируемого изображения из-за возрастания пространственной неоднородности засветки поля препарата, что не позволяет использовать его для проведения исследования биологических микропрепаратов, в частности, более качественную и более точную световую микроскопию нативного препарата крови.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ регистрации изображения с помощью устройства для проведения микроскопии [RU 65495, C12Q 1/00, 05.03.2007 г.], содержащее оптический микроскоп с тринокулярным тубусом, предметный столик, широкополосный осветитель, установленную на тринокулярном тубусе цифровую видеокамеру, соединенный с ней компьютер, программный блок управления, состоящий в том, что исследуемый препарат размещают на оптической поверхности предметного столика, освещают исследуемый препарат излучением осветителя, формируют изображение исследуемого предмета на приемной площадке электронного приемника изображения, преобразуют электрические сигналы с выхода электронного приемника изображения в массив цифровых данных изображения исследуемого препарата с выводом на монитор компьютера, реализация перечисленных выше операцией обеспечивается соответствующим программным обеспечением.
Особенностью данного способа является то, что в устройстве используется предметный столик с автоматизированным управлением, цифровая камера с прямым подключением к монитору компьютера, на неимерсионном объективе исследуется окрашенный мазок крови, который разбивают на отдельные поля зрения, вводят их в память управляющего компьютера в виде серии цифровых кадров, которые анализируют, идентифицируют, статистически обрабатывают и сохраняют в базе данных компьютера.
Недостатком наиболее близкого технического решения является то, что оно не обеспечивает требуемую точность микроскопию нативной крови при использовании иммерсионного объектива. Это вызвано относительно высокими оптическими ограничениями, связанными с максимально возможными увеличением и разрешающей способностью, которые могут быть обеспечены проведением известных операций способа. Увеличение исследуемого препарата при реализации известного способа и соответствующего ему устройства составляет не более 2000 раз. Это ограничение не позволяет производить более качественную и более точную световую микроскопию нативного препарата крови.
Задача, решаемая в изобретении относительно способа цифровой микроскопии нативной крови, заключается в создании способа, обеспечивающего повышение точности микроскопического анализа препарата нативной крови при увеличении, позволяющем провести качественную и количественную оценку клеток и плазмы и обеспечить, за счет этого, повышение точности микроскопии нативной крови, в частности:
- оценки морфофункционального состояния клеток крови на предмет эритропатий (морфологически измененных эритроцитов), патологической агрегации эритроцитов, наличия юных и бластных форм клеток, дисфункций лейкоцитов;
- оценки оптической чистоты плазмы (фибриновые мономеры, биологические контаминанты, другие оптически визуализируемые объекты);
- косвенной экспресс оценки микроциркуляторного русла, гипоксии тканей и уровня гидратации организма по морфофункциональным характеристистикам клеток и плазмы.
Требуемый технический результат заключается в повышении точности и достоверности микроскопии нативной крови посредством повышения общего полезного увеличения и улучшения качества изображения.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе цифровой микроскопии нативной крови, состоящем в том, что исследуемый препарат размещают на оптической поверхности предметного столика, освещают его широкополосным либо монохроматическим излучением с помощью оптических средств доставки излучения этого источника до оптической поверхности предметного столика, формируют оптическое изображение исследуемого препарата с использованием оптических средств увеличения изображения, переносят оптическое изображение исследуемого препарата на фоточувствительную поверхность приемного элемента электронного приемника изображения и проводят микроскопию исследуемого препарата, согласно изобретению, в качестве исследуемого препарата используют каплю крови, взятую у пациента, которую сразу накрывают покровным стеклом без усилий, общую длительность процедуры забора крови и микроскопии ограничивают 10-12 минутами, а в качестве оптических средств увеличения изображения используют микроскоп с объективом 100× с фокусным расстоянием на бесконечность, в качестве электронного приемника изображения используют видеокамеру без видеокуляра, а при переносе оптического изображения исследуемого препарата на фоточувствительную поверхность приемного элемента электронного приемника изображения, подают мнимое изображение исследуемого препарата от объектива микроскопа на электронную матрицу видеокамеры, которая формирует видеосигнал с последующей передачей его на монитор для проведения микроскопии исследуемого препарата.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, в способе цифровой микроскопии нативной крови при проведении микроскопии определяют клеточно-плазменное соотношение в виде отношения площади, занимаемой клетками, к площади, занимаемой плазмой.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, в способе цифровой микроскопии нативной крови при проведении микроскопии определяют морфологию эритроцитов на предмет эритропатий с оценкой изменений формы, размера, хромии и степени ее выраженности.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что в способе цифровой микроскопии нативной крови при проведении микроскопии определяют резистентность мембран эритроцитов по степени эхиноцитарной трансформации эритроцитов и по количеству эхиноцитов.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, в способе цифровой микроскопии нативной крови при проведении микроскопии определяют степень агрегации эритроцитов и степень ее выраженности.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, в способе цифровой микроскопии нативной крови при проведении микроскопии определяют функциональное состояние лейкоцитов путем определения подвижности, величины, формы клеток и их ядер.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, в способе цифровой микроскопии нативной крови при проведении микроскопии определяют наличие в плазме биологических контаминантов и фибриновых мономеров.
На чертеже представлена структурная схема устройства для реализации предложенного способа цифровой микроскопии нативной крови.
Устройство содержит лабораторный оптический микроскоп 1 с объективом, преимущественно 100×, с фокусным расстоянием на бесконечность, с предметным столиком 2, с осветителем 3 с широкополосным или монохроматическим излучением и иммерсионным объективом 4, c-mount-адаптер 6, используемый для соединения лабораторного микроскопа 1 и электронной видеокамеры 7, которая соединяется с помощью высокочастотного коаксиального кабеля 8 с внешним цифровым электронным устройством захвата видеосигнала 9, которое электрически 10 подключено через USB порт или IEEE 1394 порт или HDMI порт к компьютеру 12 или подключено по коаксиальному кабелю 11 непосредственно к монитору телевизора 12.
В устройстве используется электронная видеокамера 7 в корпусном исполнении без объектива, со стандартной резьбой крепления под c-mount-адаптер 6. C-mount-адаптер 6 не имеет линз масштабирования. Электронная видеокамера 7 может иметь аналоговый или цифровой интерфейс выхода видеосигнала, подключение производится через BNC разъем, который по коаксиальному кабелю подключается к электронному устройству захвата видеосигнала 9. Коаксиальный кабель 8 имеет BNC-разъем к видеокамере 7 и RCA-разъем к электронному устройству захвата видеосигнала 9. В этой конструкции объективом для электронной видеокамеры служит собственная оптическая система лабораторного микроскопа 1 без дополнительных линз масштабирования c-mount-адаптера 6 и объектива видеокамеры 5, чем достигается прямое попадание сформированного объективом лабораторного микроскопа 1 мнимого изображения на матрицу видеокамеры 7 и выводом его на экран монитора компьютера 12. При этом происходит полное совмещение оптической системы лабораторного микроскопа 1 и электронной матрицы видеокамеры 7, что дает возможность получения дополнительного полезного увеличения и полной реализации разрешающей способности лабораторного микроскопа 1 для оптической системы глаза при просмотре видеоизображения на мониторе компьютера 12.
Сочетание в устройстве объектива 100× с фокусным расстоянием на бесконечность и видеокамеры, при искусственном освещении позволяет воспринимать диапазон излучения более коротких длин волн 375-400 нм, что способствует увеличению разрешающей способности в 1,5-2 раза конечного изображения на мониторе.
Мнимое изображение с объектива микроскопа непосредственно попадает на электронную матрицу видеокамеры, которая формирует видеосигнал с последующей передачей в аналоговом или цифровом режиме на монитор, что позволяет просматривать нативный препарат (в частности, крови) в режиме визуализации движущихся объектов с геометрическим увеличением более чем 4000-10000 раз.
В таблице 1 представлены примеры реализуемых приближенных значений общего увеличения устройства в различной конфигурации оборудования.
Таким образом, предложенное конструктивное решение дает возможность повысить разрешающую способность микроскопа на иммерсионном объективе 100× с фокусным расстоянием на бесконечность и максимально ее реализовать за счет общего полезного увеличения.
Зарегистрированное видеоизображение, преобразованное в массив цифровых данных и сохраненное в памяти компьютера, может быть использовано для последующей обработки, анализа, архивирования и записи полученных данных на цифровые носители. Устройство дает возможность наблюдения микропрепарата одновременно большим количеством специалистов путем вывода видеоизображения на дисплей в реальном времени и возможностью передачи видеоизображения на расстоянии посредством телекоммуникаций и WEB-технологий, для проведения видеоконференций и консультаций.
Заявляемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Предложенный способ цифровой микроскопии нативной крови осуществляется следующим образом.
Технология проведения микроскопии.
Подготовка предметных и покровных стекол для исследования:
- замачивание стекол в специальном растворе Никифорова (этиловый спирт 96° + эфир) с целью обезжиривания (не менее 1 часа);
- тщательная натирка стекол нетканой салфеткой до визуальной прозрачности;
- предварительный контрольный просмотр стекол перед исследованием при увеличении под объективом 40× на мониторе компьютера на предмет наличия возможных артефактов.
Взятие крови:
- кровь для исследования берут капиллярную (можно венозную), в основном из безымянного или среднего пальца; возможно взятие крови из других участков тела;
- палец тщательно протирается спиртовой салфеткой, затем высушивается стерильной сухой марлевой салфеткой;
- прокол пальца производят с использованием одноразового скарификатора;
- каплю крови помещают на середину покровного стекла путем прикосновения капли крови к стеклу и от угла накрывают покровным стеклом (без усилий - во избежание раздавливания клеток крови и появления артефактов); кровь под стеклом должна распределиться равномерно монослоем и клетки крови должны остаться неповрежденными (первые 1-2 капли крови снимаются и помещаются на предметное стекло в боковой его части).
Анализ препарата.
Полученный препарат крови помещают на предметный столик микроскопа и просматривают на мониторе компьютера с фото и видеозаписью. Время просмотра ограничивается 10-12 минутами. Препарат просматривается в светлом поле обзорно на малом (объектив 40×), а затем на большом увеличении с иммерсией (объектив 100×), что дает общее увеличение при просмотре на мониторе свыше 2500 раз при объективе 40×, при объективе 100× увеличение свыше 4000-10000 раз. Это увеличение превышает возможное общее увеличение в окулярах в 4-10 раз. При необходимости препарат можно оценить в темном поле.
Просмотр на малом увеличении применяют для обзорного анализа препарата, в том числе его периферии.
Для морфофункционального анализа клеток проводится оценка препарата в его центральной части на большом увеличении с иммерсионным объективом 100×, путем последовательного просмотра всех полей зрения.
В процессе просмотра препарата проводятся необходимые измерения клеток и объектов крови с помощью окулярного микрометра с последующим экспресс анализом полученных данных, которые заносятся в базы программного обеспечения для последующего детализированного анализа и статистической обработки.
При необходимости проводится обмен данными с удаленными пользователями для проведения телеконсультаций.
Оцениваемые параметры (на основании обследования 325 пациентов).
1. Проводится оценка клеточно-плазменного соотношения (КПС). Оценивается визуальное соотношение суммарно во всех полях зрения площади, занимаемой клетками, к площади плазмы. Данный показатель коррелирует с лабораторным гематокритом и является одним из основных параметров, определяющим реологические свойства крови, показателем состояния микроциркуляторного кровотока. Возможность оценки КПС в экспресс режиме без применения дополнительного лабораторного оборудования позволяет оперативно выявлять изменения данного показателя и проводить своевременную и контролируемую в амбулаторных условиях коррекцию реологии крови.
2. Оценка морфологии эритроцитов на предмет эритропатий (нарушения размеров, формы, хромии), оценка резистентности мембран, агрегации и степени выраженности этих изменений. Оценка проводилась по наличию эритроцитов, морфологически измененных (по размерам, форме, хромии), наличию эхиноцитов, наличию агрегатов эритроцитов.
В группе обследованных выше названные изменения, в зависимости от степени их выраженности, коррелировали клинически с гипоксическими состояниями 1-2 степени выраженности, несмотря на то, что общее количество эритроцитов оставалось нормальным.
Учитывая то, что гипоксия - это состояние, которое является патогенетической основой для развития целого ряда заболеваний, выявление эритропатий имеет большое клиническое и прогностическое значение. С другой стороны, цитоскелет эритроцитов деформируется при ряде заболеваний, вызывая анемические гипоксические состояния, которые поддерживают прогрессирование уже сформировавшейся болезни.
Пойкилоцитоз, анизоцитоз и анизохромия, эхиноцитоз проявлялись клинически гипоксическими состояниями уже при 15-18% измененных клеток.
Метод оценки нативного препарата позволяет оценить резистентность мембраны эритроцита непосредственно в течение 2-3 минут после приготовления препарата и помещения его под объектив микроскопа. Нарушение резистентности мембран эритроцитов определяли, как по степени эхиноцитарной трансформации эритроцитов (образование эхиноцитов 1-3 порядка), так и по количеству эхиноцитов.
Оценка степени агрегации эритроцитов и степени ее выраженности проводилась через 3-4 минуты от начала исследования. Определялось количество свободных эритроцитов, а также размер, форма и плотность агрегатов. Оценка проводилась по 10 полям зрения в центре капли. Рыхлые короткие агрегаты расценивались как вариант нормы. Агрегаты, занимающие все поля зрения с аглютинированными эритроцитами (с потерей клеточной формы) оценивались как сладж синдром.
3. Оценка лейкоцитов. Определялась подвижность клеток, их величина и форма, цитоплазма, в том числе патологическая зернистость в ней, морфология, величина ядер и ядерно-цитоплазменного соотношения. В частности, при нормальном общем количестве лейкоцитов у 52% обследованных обнаруживались функциональные либо патологические изменения лейкоцитов, которые выражались в следующих признаках:
- снижение подвижности у лейкоцитов фагоцитарного ряда, определяемую по форме клетки;
- наличие в крови промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, лейкоцитов с пикнотическими ядрами, с токсической зернистостью плазматических клеток;
- значимое увеличение больших форм лимфоцитов.
Эти нарушения белой крови выявлены у следующих групп пациентов: у часто болеющих детей и взрослых; у пациентов с опухолевыми заболеваниями, анемиями; у лиц с аутоиммунной патологией.
Поскольку именно функциональными свойствами лейкоцитов обуславливается эффективность всей мощи неспецифического иммунитета, синдром иммунодефицита, выявляющийся при различных заболеваниях, можно диагностировать без дорогостоящих иммунологических исследований.
4. Оценка плазмы на наличие фибриновых мономеров. Они имеют вид тонких нежных либо грубых нитей, создавая картину «исчерченности препарата». Предложенный способ позволяет за считанные минуты без применения каких-либо дополнительных реагентов визуально зафиксировать наличие нитей фибрина и продуктов его деградации. Обнаружена четкая закономерность их появления и выраженности, которая коррелирует с наличием в анамнезе либо клинически зафиксированного атеросклеротического процесса с повышенной активностью свертывающей системы, либо хронического воспалительного процесса (54%), что позволяет использовать этот признак, как маркер выше названных заболеваний.
5. Оценка плазмы на наличие в ней биологических контаминантов. Благодаря полученному общему полезному увеличению на мониторе, превышающем в 4-10 раз увеличение в окулярах микроскопа, визуализации поддаются живые биообъекты в крови: от резидентной микрофлоры организма, до различных патологических форм. Разрешающая способность и общее увеличение оптического комплекса позволяют наблюдать любые живые объекты от 0,15 мкм: это бактерии, грибковая флора, простейшие, гельминты. Таким образом, анализ нативной крови дает возможность экспресс оценки латентно протекающей инфекционной нагрузки на иммунную систему и организм человека, являясь в большинстве случаев ведущим причинным фактором возникновения заболевания либо его поддержания. В то же самое время не только анализы - прототипы, но и биохимические, бактериологические анализы не выявляют патогенных объектов в крови, вследствие либо их низкого титра, либо отсутствия специфических сред.
В таблице 2 представлены результаты обследования пациентов с качественно-количественным анализом нативного препарата крови. Число обследованных - 325 в возрасте старше 18 лет.
Примеры из клинической практики.
12
Пациент А. 20 лет. Жалобы: в течение недели головные боли, слабость. В анамнезе работы с ацетоном. Общий анализ крови. RBC- 4×10. Лекоцитарная формула - небольшой палочкоядерный сдвиг. СОЭ 25 мм/ч. RDW 15%. Других особенностей стандартным автоматизированным анализом крови не выявлено. При исследовании нативного препарата крови с выведением изображения на монитор четко выявляется выраженная эхиноцитарная трансформация эритроцитов (2-3 ст.) во всех полях зрения. Заключение. Токсическое отравление ацетоном. Эхиноцитоз 3 степени.
12
Пациент Б. 39 лет. Жалобы на одышку, слабость, эпизодически тяжесть в области сердца, повышение артериального давления, частые простудные заболевания. Два года назад оперирован по поводу стентирования коронарной артерии. Ds. ИБС. Атеросклероз коронарных артерий. Гипертоническая болезнь 2 ст. Принимает варфарин, статины, мочегонные. АД 160/95, ЧСС 64. Анализ крови: RBC 5,2×10, СОЭ 30 мм/ч, Hg180 г/л, НСТ - 61%. Холестерин и липидный профиль в норме. MHO 2,8. Остальные показатели в норме.
КПС резкий сдвиг в сторону клеток и дефицит плазмы. Сдвиг значительно больше выражен, чем изменения показывает величина лабораторного гематокрита. Признаки дегидратации. Агрегация эритроцитов незначительная, обусловлена дефицитом жидкой части плазмы. Значительно снижена подвижность нейтрофилов. Заключение: нарушение реологии крови и микроциркуляции в тканях, иммунодефицитное состояние. Под контролем нативной крови проведен подбор терапии, направленной на оптимизацию реологии крови и водно-солевого обмена. Фото 2 через 2 недели после терапии.
Пациентка А 52 года. Наблюдается амбулаторно по поводу гипертонической болезни и метаболического синдрома. Ds. Гипертоническая болезнь 2 ст. Сахарный диабет 2 типа. Избыточный вес 2-3 ст. Хронический холецистит.
АД 150/100, ЧСС 68, RBC 3,9×1012, СОЭ 22 мм/ч, Hg110 г/л, НСТ - 55%. Холестерин и липидный профиль в норме. Коагулограмма в пределах нормы.
В течение 5 лет принимала медикаментозную терапию по поводу СД и ГБ. Развитие заболеваний неуклонно прогрессировало. Исследование нативной крови проводится в присутствии пациентки с возможностью ее участия в оценке собственного состояния.
КПС резко сдвинуто в сторону клеток, дефицит жидкой части плазмы, плотная агрегация эритроцитов с переходом в сладж, выпадение фибрина, биологические контаминанты на фото в режиме видео отчетливо дифференцируются как кокковые формы бактерий. Заключение: по данным исследования микроциркуляторные нарушения с высоким риском внутрисосудистого тромбоза за счет эритроцитарного сладжа, повышения активности метаболизма фибрина и дефицита жидкой части плазмы; биологические контаминанты в плазме, вызывающие и поддерживающие напряжение иммунной системы. Рекомендована оптимизация водно-солевого и углеводного обмена с минимизацией медикаментозных средств, детоксикационная программа.
Приведенные примеры применения предполагаемого изобретения показывают его полезность для диагностики заболеваний людей в медицине, науке, производстве диагностического оборудования. Применение заявляемого способа диагностики способствует выявлению заболеваний на ранних стадиях, когда лечение наиболее эффективно, производится с меньшей затратой лечебных препаратов, труда и времени медицинских работников, с наименьшим ущербом для здоровья пациентов - по сравнению с лечением болезней в поздней, запущенной стадии.
Таким образом, благодаря усовершенствованию известного способа достигается требуемый технический результат, заключающийся в повышении точности и достоверности микроскопии нативной крови.
Использованные источники.
1. Атлас микроскопии нативной крови. / Морылева О.Н. под ред. Анисимова О.О. - М., «Типография Новости», 2009 - 104С.
2. Боровская М.К. и соавт. Структурно-функциональная мембрана эритроцита и ее изменения при патологиях разного генеза / Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2010, №3(73).
3. Иванова Т.В. Введение в прикладную и компьютерную оптику. Конспект лекций. СПб: СПб ГИТМО (ТУ), 2002 - 92С.
4. Козинец Г.И. Клетки крови и костного мозга / М: МИА, 2004 - 203С.
5. "Методические рекомендации. Гематологические анализаторы. Интерпретация анализа крови" (утв. Минздравсоцразвития РФ 21.03.2007 N 2050-РХ
6. Методы клинических лабораторных исследований / под ред. B.C. Камышникова / Изд: МЕДпресс инфо, 2016, 736С.
7. Муравьев Л.В., Тихомирова И.А., Борисов Д.В. Анализ влияния плазменных и клеточных факторов на агрегацию эритроцитов разных возрастных популяций. Физиология человека, 2002, Т. 28, №4, С. 144-148.
8. Фирсов Н.Н., Сирко И.В., Приезжев А.В. Современные проблемы агрегометрии цельной крови. Тромбоз, гемостаз и реология. 2000, №2 (2), С. 9-11.
9. RU 2433412. Способ определения фибриномономеров в крови, 2010 г.
10. RU 2572335. Способ оценки состояния цитоскелета эритроцита, 2016 г.
11. Приказ МЗ РФ №64 от 21.02.2000. «Номенклатура клинических лабораторных исследований, применяемых в целях диагностики болезней и слежения за состоянием пациентов в учреждениях здравоохранения РФ».
12. «Руководство по клиническим способам исследования и применение их в частной врачебной диагностике», проф. A. Eulle, проф. W. Kolle, проф. W. Weintraud.
13. W. Kern. PDQ Hematology. - B.C. Decker. Published October 2002. - 440 pages.
14. SU 1712821 A1, Способ подготовки нативных препаратов клеток крови к исследованию. 24.07.1989 г.
15. US №5835265, 10.07.1998 г. Устройство формирования изображения с большой числовой апертурой.
16. US 6690466, Спектральная система визуализации, 02.08.2001 г.
17. US 6452625, Компактный видеомикроскоп, 17.09.2002 г.
18. US №6594075, 15.07.2003. Микроскоп с электронным датчиком изображения.
19. RU №2271556, 23.07.2004. Видеомикроскоп и способ регистрации изображения с его помощью.
20. US №7199823, 03.04.2007. Способ и устройство для улучшения работы в режиме реального времени устройства съемки изображения для микроскопа.
21. RU 65495, Аппаратно-программный комплекс для определения микробного статуса, C12Q 1/00, 05.03.2007 г.
22. А.Ф. Мельканович. Фотографические средства и их эксплуатация. Издание МО СССР, М., 1984.