ДИАГНОСТИКА, ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНЕЙ СУСТАВОВ
DIAGNOSIS, PREVENTION AND TREATMENT OF JOINT DISEASES

Болезни суставов представляют собой значительное отягощение для пациента, так как подвижность ног или пальцев может быть значительно ограничена. Распространенным заболеванием суставов является артропатия, одна форма которой представляет собой артрит. Известно более 100 различных форм артрита. Наиболее распространенной формой является остеоартрит, дегенеративное заболевание суставов, которое может быть результатом травмы сустава, инфекции сустава или возраста. Другими формами артрита являются ревматоидный артрит, псориатический артрит и связанные с аутоиммунными заболеваниями. Септический артрит вызывается инфекцией сустава.
Пациенты с артропатией страдают от боли в суставах, которая часто бывает длительной и может быть локализована в пораженном суставе(ах). В пораженном суставе(ах) боль может возникать вследствие воспаления, которое происходит вокруг или внутри сустава, повреждения сустава вследствие болезни, ежедневного износа сустава, мышечного напряжения, вызванного интенсивными движениями против тугоподвижных, болезненных суставов и усталости.
В США артрит является наиболее распространенной причиной инвалидности, и более чем 20 миллионов пациентов испытывают ограничения в своей повседневной жизни. Отсутствие на работе и частые посещения врача пациентами, страдающих артритом, приводят к значительным расходам, которые оцениваются почти в 100 млрд. долларов, из которых почти 50% приходится на неполученный доход.
Многие формы заболевания суставов не могут быть вылечены, и конкретное лечение зависит от конкретного типа заболевания суставов. Лечение включает в себя физиотерапию, изменение образа жизни, ортопедические приспособления, лекарства, а иногда и хирургическая замена суставов. Лекарства могут помочь уменьшить воспаление в суставе, что уменьшает боль. Кроме того, за счет уменьшения воспаления могут быть уменьшены повреждения суставов.
Заболевания суставов могут лечиться либо с помощью системного, либо местного введения подходящих лекарств или с помощью комбинации системного и местного введения. Примеры препаратов для системного введения, используемых для лечения ревматоидного артрита, представляют собой этанерцепт (Enbrel) и инфликсимаб (Remicade) или метотрексат.
Примером для местного лечения является введение кортизона в пораженный сустав. Местное введение препаратов в суставы являются предпочтительными по многим причинам. Системные побочные эффекты могут быть подавлены или полностью предотвращены, и терапевтические концентрации в пораженном участке могут достигаться намного легче. К сожалению, тем не менее отток лекарств, введенных в сустав, очень высок и клиренс синовиальной жидкости может привести к вымыванию препарата в течение суток из области сустава.
Например, было обнаружено, что инъекции в сустав IL-1ra существенно не снижают симптомы остеоартрита (Chevalier et al, J. Rheumatol 32 (2005) 1317-23), и замеченная плохая эффективность была связана с коротким периодом полураспада IL-1ra в синовиальной оболочке (Richette et al. J Rheumatol 35 (2008) 1650-4).
Следовательно, терапевтическая эффективность значительно снижается, и необходимо повторное частое введение, что создает проблемы, так как инъекции в суставы являются обременительной процедурой как для пациента, так и для медицинского специалиста, выполняющего введение.
Различные подходы были протестированы для обеспечения долговременной доставки терапевтических агентов в композициях для местного введения для лечения заболеваний суставов, такими как рецептуры замедленного всасывания или генная терапия. Однако значительные неудачи были зафиксированы при тестировании таких систем доставки. Препятствия остаются при введении малого объема, так как пространство в суставе, доступное для внутрисуставной инъекции, может содержать только 1 мл синовиальной жидкости или меньше. По той же причине, как вязкость инъекционного лекарственного средства, так и размер иглы должны соответствовать требованиям инъекции в небольшое пространство сустава. Кроме того, должен достигаться эффективный контроль профиля действия болезнь-модифицирующего препарата.
В свете вышесказанного существует потребность в создании способа введения, который преодолевает эти недостатки, по меньшей мере частично.
Эта задача достигается с помощью полимерного пролекарства и/или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов.
Предпочтительным является профилактика и/или лечение заболевания суставов.
Кроме того, изобретение относится к полимерному пролекарству и/или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство для применения для внутрисуставной инъекции.
Изобретение также относится к полимерному пролекарству и/или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство, для применения для внутрисуставной инъекции для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов.
Было неожиданно обнаружено, что полимерные пролекарства обеспечивают длительный эффект депо, который полезен для профилактики, диагностики и/или лечения болезни сустава. Такие полимерные пролекарства представляют собой пролекарства, связанные с носителем, в которых носитель представляет собой полимер, к которому присоединены биологически активные фрагменты через обратимые пролекарственные линкеры, и которые высвобождают биологически активные фрагменты из полимерного пролекарства в форме лекарства.
Изобретение также относится к способу профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов, причем указанный способ включает стадию введения терапевтически эффективного количества полимерного пролекарства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
Так как лекарственное средство высвобождается в терапевтически эффективных концентрациях в течение продолжительного периода времени, следует избегать избыточной концентрации лекарственного средства.
В настоящем изобретении термины используются в следующих значениях:
Как применяется в настоящем описании, «болезнь сустава» представляет собой любую болезнь, состояние или заболевание, поразившие один или более суставов млекопитающего.
Термин "внутрисуставное введение" относится к инъекции в сустав. Виды суставов для внутрисуставного введения представляет собой фиброзные суставы, хрящевое соединение и синовиальные суставы. Анатомически суставы, подходящие для внутрисуставного введения в соответствии с изобретением, представляют собой сочленение руки, локтевые суставы, суставы запястья, подмышечные сочленения, грудиноключичный сустав, вертебральные сочленения, височно-нижнечелюстные суставы, крестцово-подвздошные суставы, тазобедренные суставы, коленные суставы, суставы стопы.
Введение полимерного депо по изобретению может быть выполнено в моноартикулярным или полиартикулярным способом, т.е. инъекции могут быть выполнены на одном или более чем на одном суставе.
Как применяется в настоящем описании, термин "гидрогель" означает гидрофильную или амфифильную полимерный сеть, состоящую из гомополимеров или сополимеров, которая нерастворима вследствие наличия ковалентных химических поперечных сшивок. Поперечные сшивки обеспечивают сетевую структуру и физическую целостность. Гидрогели демонстрируют термодинамическую совместимость с водой, что позволяет им набухать в водной среде.
Как применяется в настоящем описании, термин "реагент" означает химическое соединение, которое содержит по меньшей мере одну функциональную группу для реакции с функциональной группой другого реагента или фрагмента.
Как применяется в настоящем описании, термин "реагент основной цепи" означает реагент, который пригоден в качестве исходного материала для формирования гидрогелей. Как применяется в настоящем описании, реагент основной цепи предпочтительно не содержит биоразлагаемые связи. Реагент основной цепи может содержать «разветвляющееся ядро», которое относится к атому или фрагменту которому присоединяется несколько других фрагментов.
Как применяется в настоящем описании, термин "сшивающий реагент" означает линейный или разветвленный реагент, который пригоден в качестве исходного материала для сшивания реагентов основной цепи. Предпочтительно, если сшивающий реагент представляет собой линейное химическое соединение. Сшивающий реагент содержит по меньшей мере две биологически разрушаемые связи.
Как применяется в настоящем описании, термин "фрагмент" означает часть молекулы, в которой отсутствует один или более атом(ов) по сравнению с соответствующим реагентом. Если, например, реагент формулы "Н-Х-Н" реагирует с другим реагентом и становится частью продукта реакции, соответствующий фрагмент продукта реакции имеет структуру "Н-Х-" или "-Х-", тогда каждый "-" указывает на место присоединения к другому фрагменту.
Соответственно, биологически активный фрагмент высвобождается из пролекарства как лекарство.
Соответственно, выражение "в связанной форме" применяется для обозначения соответствующего фрагмента реагента, то есть «лизин в связанной форме» относится к фрагменту лизина, в котором отсутствует один или более атом(ов) лизинового реагента и является частью молекулы.
2
Как применяется в настоящем описании, термин "функциональная группа" означает группу атомов, которые могут реагировать с другими функциональными группами. Функциональные группы включают, но не ограничиваются этим, следующие группы: карбоновая кислота (-(С=O)ОН), первичный или вторичный амин (-NH, -NH-), малеимид, тиол (-SH), сульфоновая кислота (-(O=S=O)OH), карбонат, карбамат (-O(C=O)N<), гидрокси (-ОН), альдегид (-(С=O)Н), кетон (-(С=O)-), гидразин (>N-N<), изоцианат, изотиоцианат, фосфорная кислота (-O(Р=O)ОНОН), фосфоновая кислота O(Р=O)ОНН), галогенацетил, алкилгалогенид, акрилоил, арилфторид, гидроксиламин, дисульфид, винилсульфон, винилкетон, диазоалкан, оксиран и азиридин.
Если химическая функциональная группа соединена с другой функциональной группой, получающаяся химическая структура упоминается как "связь". Например, реакция аминогруппы с карбоксильной группой приводит к амидной связи.
Как применяется в настоящем описании, термин "активированная функциональная группа" означает функциональную группу, которая соединена с активирующей группой, т.е. функциональную группу подвергали реакции с активирующим реагентом. Предпочтительные активированные функциональные группы включают, но не ограничиваются этим, активированные сложноэфирные группы, активированные карбаматные группы, активированные карбонатные группы и активированные тиокарбонатные группы. Предпочтительные активирующие группы выбираются из формул от (f-i) до (f-vi):
где
пунктирные линии указывают присоединение к остальной части молекулы;
b равно 1, 2, 3 или 4; и
H
X представляет собой Cl, Br, I или F.
Соответственно, предпочтительный активированный сложный эфир имеет формулу
где
F
X выбирается из формулы (f-i), (f-ii), (f-iii), (f-iv), (f-v) и (f-vi).
Соответственно, предпочтительный активированный карбамат имеет формулу
где
F
X выбирается из формулы (f-i), (f-ii), (f-iii), (f-iv), (f-v) и (f-vi).
Соответственно, предпочтительный активированный карбонат имеет формулу
где
F
X выбирается из формулы (f-i), (f-ii), (f-iii), (f-iv), (f-v) и (f-vi).
Соответственно, предпочтительный активированный сложный тиоэфир имеет формулу
где
F
X выбирается из формулы (f-i), (f-ii), (f-iii), (f-iv), (f-v) и (f-vi).
Соответственно, "активированная концевая функциональная группа" представляет собой активированную функциональную группу, которая локализована в конце фрагмента или молекулы, то есть представляет собой терминальную активируемую функциональную группу.
Как применяется в настоящем описании, термин "блокирующая группа" означает фрагмент, который необратимо, то есть постоянно, соединен с функциональной группой, чтобы сделать его неспособной реагировать с функциональными группами других реагентов или фрагментов.
Как применяется в настоящем описании, термин "защитная группа" означает фрагмент, который обратимо соединяется с функциональной группой, чтобы сделать ее неспособной к реакции, например, с другой функциональной группой. Подходящими для спирта (-ОН) являются защитные группы, например, ацетильная, бензоильная, бензильная, β-метоксиэтоксиметиловый эфир, диметокситритильная, метоксиметиловый эфир, метокситритильная, п-метоксибензиловый эфир, метилтиометилофый эфир, пивалоильная, тетрагидропиранильная, тритильная, триметилсилильная, трет.-бутилдиметилсилильная, три-изо-пропилсилилоксиметил, триизопропилсилиловый эфир, метиловый эфир, и этоксиэтиловый эфир. Подходящими защитными группами для аминов являются, например, карбобензилокси, п-метоксибензилкарбонильная, трет.-бутилоксикарбонильная, 9-флуоренилметилоксикарбонильная, ацетильная, бензоильная, бензильная, карбаматная, п-метоксибензильная, 3,4-диметоксибензильная, п-метоксифенильная и тозильная. Подходящими защитными группами для карбонила являются, например, ацетальные и кетальные, ацилальные и дитиановые. Подходящими защитными группами для карбоновой кислоты являются, например, сложные метиловые эфиры, сложные бензиловые эфиры, трет.-бутиловые эфиры, 2,6-диметилфенольная, 2,6-диизопропилфенольная, 2,6-ди-трет.-бутилфенольная, силильные эфиры, ортоэфиры и оксазолин. Подходящими защитными группами для фосфата, являются, например, 2-цианоэтильная и метальная.
Как применяется в настоящем описании, термины «обработать» и «обработка» относятся к серии манипуляций, необходимых для выделения и очистки продукта(ов) химической реакции, в частности, полимеризации.
Как применяется в настоящем описании, термин "полимер" означает молекулу, содержащую повторяющиеся структурные единицы, т.е. мономеры, соединенные химическими связями линейным, циклическим, разветвленным, сшитым или дендритным образом или их сочетанием, которые могут быть синтетического или биологического происхождения или сочетанием того и другого. Следует понимать, что полимер может, например, также содержать функциональные группы или защитные группы. Предпочтительно, полимер имеет молекулярную массу по меньшей мере 0,5 кДа, например молекулярная масса по меньшей мере 1 кДа, молекулярная масса по меньшей мере 2 кДа, молекулярная масса по меньшей мере 3 кДа или молекулярная масса по меньшей мере 5 кДа.
Как применяется в настоящем описании, термин «полимерный» означает реагент или фрагмент молекулы, содержащие один или более полимер(ов).
Специалист в данной области техники понимает, что продукты полимеризации, полученные в результате реакции полимеризации не все имеют одинаковую молекулярную массу, а демонстрируют молекулярно-массовое распределение. Следовательно, диапазоны молекулярной массы, молекулярные массы, диапазоны количества мономеров в полимере и количества мономеров в полимере, как применяется в настоящем описании, относятся к среднечисленной молекулярной массе и среднему числу мономеров. Как применяется в настоящем описании, термин "среднечисленная молекулярная масса" означает обычные арифметические значения молекулярных масс отдельных полимеров.
Как применяется в настоящем описании, термин "полимеризация" или "полимеризующийся" означает процесс реакции мономера или макромономерных реагентов в химической реакции с образованием полимерных цепей или сетей, в том числе, но не ограничиваясь этим, гидрогелей.
Как применяется в настоящем описании, термин "макромономер" означает молекулу, которую получают в результате полимеризации мономерных реагентов.
Как применяется в настоящем описании, термин "поликонденсация" или "реакции конденсации" означает химическую реакцию, в которой функциональные группы двух реагентов реагируют с образованием одной молекулы, т.е. продукта реакции, и освобождается низкомолекулярная молекула, например вода.
Как применяется в настоящем описании, термин «суспензионная полимеризация» означает гетерогенную и/или двухфазную реакцию полимеризации, где мономерные реагенты, растворяются в первом растворителе с образованием дисперсной фазы, которая эмульгируются во втором растворителе, образуя непрерывную фазу. В настоящем изобретении, мономерные реагенты представляют собой по меньшей мере один реагент основной цепи и по меньшей мере один сшивающий реагент. Как первый растворитель, так и мономерные реагенты не растворимы во втором растворителе. Такая эмульсия образуется посредством перемешивания, встряхивания, воздействия ультразвука или эмульгирования с помощью Microsieve™, и более предпочтительно при перемешивании или эмульгирования с помощью Microsieve™ и более предпочтительно при перемешивании. Эту эмульсию стабилизируют с помощью соответствующего эмульгатора. Полимеризация инициируется посредством добавления основания в качестве инициатора, который растворим в первом растворителе. Подходящее известное основание, пригодное в качестве инициатора, может быть третичным основанием, например, тетраметилэтилендиамином (TMEDA).
х0
х2
Как применяется в настоящем описании, термин "инертный" относится к фрагменту, который не является химически реактивным, то есть не вступает в реакцию с другими фрагментами или реагентами. Специалист в данной области техники понимает, что термин "инертный" сам по себе не исключает наличие функциональных групп, но понимает, что функциональные группы, присутствующие в потенциально инертном остатке, не реагируют с функциональными группами/фрагментами реагентов, введенных в контакт с инертным остатком, например, в последующих реакциях. В частности, инертный остаток Z не реагирует с А или А или с присутствующими функциональными группами, например, в реагентах с обратимым пролекарственным линкером, лекарствах, реагентах конъюгата обратимого пролекарственного линкерного фрагмента и биологически активного фрагмента или спейсерных агентах, которые могут быть ковалентно конъюгированы с гидрогелем по настоящему изобретению, чтобы получить пролекарство, связанное с гидрогелем по настоящему изобретению.
Как применяется в настоящем описании, термин "несмешиваемый" означает свойство, при котором два вещества не способны объединяться с образованием гомогенной смеси.
2
Как применяется в настоящем описании, термин "полиамин" означает реагент или фрагмент, содержащий более одного амина (-NH- и/или -NH), например от 2 до 64 аминов, от 4 до 48 аминов, от 6 до 32 аминов, от 8 до 24 аминов или от 10 до 16 аминов. Особенно предпочтительные полиамины содержат от 2 до 32 аминов.
2
2
Как применяется в настоящем описании, термин "на основе ПЭГ, содержащий по меньшей мере Х% ПЭГ" по отношению к фрагменту или реагенту, означает, что указанный фрагмент или реагент содержит по меньшей мере Х% (масса/масса) звеньев этиленгликоля (-СНСНО-), где этиленгликолевые звенья могут быть расположены блочным образом, чередуясь, или могут быть распределены случайным образом в пределах фрагмента или реагента и предпочтительно все этиленгликолевые звенья указанного фрагмента или реагента присутствует в одном блоке; остальные массовые проценты фрагмента на основе ПЭГ или реагента находятся в других фрагментах, в особенности выбранных из следующих заместителей и связей:
1-50
2-50
2-50
3-10
- С алкил, С алкенил, С алкинил, С циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил; нафтил; инденил; инданил; и тетралинил; и
- связи, выбранные из группы, содержащей
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы или реагента, и
1
1a
1-6
R и R обозначают независимо друг от друга, выбранные из Н и С алкила.
Выражение "на основе гиалуроновой кислоты", как понимается в настоящем описании, означает, что массовая доля цепей гиалуроновой кислоты в гидрогеле в соответствии с изобретением составляет по меньшей мере 10% по массе, предпочтительно по меньшей мере 20% по массе, и еще более предпочтительно по меньшей мере 25% по массе в расчете на общую массу гидрогеля в соответствии с изобретением. Остальная часть может быть составлена из других полимеров.
1-4
1-4
1-4
1-4
2
2
2
3
2
2
2
2
5
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
1-4
Как применяется в настоящем описании, выражение "C-алкил", одно или в комбинации, означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода. Если она присутствует в конце молекулы, примерами неразветвленных и разветвленных C алкильных групп являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор.-бутил и трет.-бутил. Когда два фрагмента молекулы соединены посредством С алкильной группы, то примерами таких С алкильных групп являются -СН-, -СН-СН-, -СН(СН)-, -СН-СН-СН-, -СН(СН)-, -С(СН)-, -СН-СН-СН-СН- и -СН-СН-СН(СН)-. Каждый атом водорода в С-алкильной группе может быть замещен заместителем, как определено ниже.
1-6
1-6
1-6
1-6
2
2
2
3
2
2
2
2
5
3
2
1-6
Как применяется в настоящем описании, выражение "C алкил", одно или в комбинации, означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода. Если она присутствует в конце молекулы, примерами неразветвленной и разветвленной C алкильных групп являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор.-бутил, трет.-бутил, н-пентил, 2-метилбутил, 2,2-диметилпропил, н-гексил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил и 3,3-диметилпропил. Когда два фрагмента молекулы соединены посредством C алкильной группой, то примерами таких C-алкильных групп являются -СН-, -СН-СН-, -СН(СН)-, -СН-СН-СН-, -СН(СН)- и -С(СН)-. Каждый атом водорода C-алкильной группы может быть замещен заместителем, как определено ниже.
1-20
8-18
1-50
1-20
8-18
1-50
Соответственно, как применяется в настоящем описании, выражение "С-алкил", одно или в комбинации, означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 20 атомов углерода. Выражение "C-алкил", одно или в комбинации, означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 8 до 18 атомов углерода. Соответственно, как применяется в настоящем описании, выражение "С алкил", одно или в комбинации означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 50 атомов углерода. Каждый атом водорода из С алкильной группы, С алкильной группы и С алкильной группы может быть замещен заместителем. В каждом случае алкильная группа, которая может присутствовать в конце молекулы или двух фрагментов молекулы, может быть связана посредством алкильной группы.
2-6
2
3
2
2
2
3
2
2-6
2-6
2-6
Как применяется в настоящем описании, выражение "С-алкенил", одно или в комбинации, означает неразветвленный или разветвленный углеводородный фрагмент, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Если он присутствует в конце молекулы, примерами являются -СН=СН, -СН=СН-СН, -СН-СН=СН, -СН=СНСН-СН и -СН=СН-СН=СН. Когда два фрагмента молекулы соединены посредством С алкенильной группы, то примером такого С алкенила является -СН=СН-. Каждый атом водорода в С алкенильной группе может быть замещен заместителем, как определено ниже. При необходимости, может присутствовать одна или несколько тройных связей.
2-20
2-50
2
3
2
2
2
3
2
2-20
2-50
Соответственно, как применяется в настоящем описании, выражение "С алкенил", один или в комбинации, означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, имеющий от 2 до 20 атомов углерода. Выражение "С-алкенил", одно или в комбинации, означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, имеющий от 2 до 50 атомов углерода. Если он присутствует в конце молекулы, примерами являются -СН=СН, -СН=СН-СН, -СН-СН=СН, -СН=СНСН-СН и -СН=СН-СН=СН. Когда два фрагмента молекулы соединены посредством алкенильной группы, тогда в качестве примера можно, привести, например -СН=СН-. Каждый атом водорода в С алкенильной или С алкенильной группах могут быть замещены заместителем, как определено ниже. При необходимости, может присутствовать одна или несколько тройных связей.
2-6
2
2
2
2
3
2-6
Как применяется в настоящем описании, выражение "С-алкинил", один или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Если он присутствует в конце молекулы, примерами являются -С≡СН, -СН-С≡СН, -СН-СН-С≡СН и -СН-С≡С-СН. Когда два фрагмента молекулы соединены посредством алкинильной группы, то примером такого является: -С≡С-. Каждый атом водорода в С алкинильной группе может быть замещен заместителем, как определено ниже. При необходимости, могут присутствовать одна или несколько двойных связей.
2-20
2-50
2
2
2
2
3
2-20
2-50
Соответственно, как применяется в настоящем описании, выражение "С алкинил", один или в комбинации, означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, имеющий от 2 до 20 атомов углерода, и "С алкинил" один или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, имеющий от 2 до 50 атомов углерода. Если присутствует в конце молекулы, примерами являются -С≡СН, -СН-С≡СН, -СН-СН-С≡СН и -СН-С≡С-СН. Когда два фрагмента молекулы соединены посредством алкинильной группы, то в качестве примера можно представить -С≡С-. Каждый атом водорода в С алкинильной или С алкинильной группе может быть замещен заместителем, как определено ниже. При необходимости могут присутствовать одна или несколько двойных связей.
3-8
3-8
3-8
3-8
3-5
3-10
Как применяется в настоящем описании, выражения "С циклоалкил" или "С циклоалкильное кольцо" означает циклическую алкильную цепь, имеющую от 3 до 8 атомов углерода, которая может быть насыщенной или ненасыщенной, например циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил. Каждый атом водорода циклоалкильного углерода может быть замещен заместителем, как определено ниже. Выражения "С циклоалкил" или "С циклоалкильное кольцо" также включает мостиковые бициклы, такие как норборнан или норборнен. Соответственно, "С-циклоалкил" означает циклоалкил, имеющий от 3 до 5 атомов углерода, и С циклоалкил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода.
3-10
3-10
Соответственно, как это применяется в настоящем описании, выражение "С циклоалкил» означает карбоциклическую кольцевую систему, содержащую от 3 до 10 атомов углерода, которая может быть насыщенной или ненасыщенной, например циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил. Выражение "С циклоалкил" включает также по меньшей мере частично насыщенный карбомоно- и -бициклы.
Как применяется в настоящем описании, термин "галоген" означает фтор, хлор, бром или йод. Особенно предпочтительными является фтор или хлор.
2
Как применяется в настоящем описании, выражение «4-7-членный гетероциклилический» или «4-7-членный гетероцикл» означает кольцо с 4 5, 6 или 7 кольцевыми атомами, которые могут содержать вплоть до максимального числа двойных связей (ароматический или неароматический цикл, который является полностью, частично или ненасыщенным), где по меньшей мере от одного кольцевого атома до 4 кольцевых атомов замещены гетероатомом, выбранными из группы, состоящей из серы (в том числе -S(O)-, -S(O)-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примеры 4-7-членных гетероциклов включают, но не ограничиваются этим: азетидин, оксетан, тиетан, фуран, тиофен, пиррол, пирролин, имидазол, имидазолин, пиразол, пиразолин, оксазол, оксазолин, изоксазол, изоксазолин, тиазол, тиазолин, изотиазол, изотиазолин, тиадиазол, тиадиазолин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, оксазолидин, изоксазолидин, тиазолидин, изотиазолидин, тиадиазолидин, сульфолан, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, имидазолидин, пиридин, пиридазин, пиразин, пиримидин, пиперазин, пиперидин, морфолин, тетразол, триазол, триазолидин, тетразолидин, диазепан, азепин и гомопиперазин. Каждый атом водорода 4-7-членного гетероциклила или 4-7-членной гетероциклической группы могут быть замещен заместителем, как определено ниже.
2
Как применяется в настоящем описании, выражение "8-11-членный гетеробициклил" или "8-11-членный гетеробицикл" означает гетероциклическую систему из двух колец с 8-11 атомами в кольце, где по меньшей мере один кольцевой атом является общим для обоих колец и которые могут содержать вплоть до максимального количества двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью или частично ненасыщенным), где по меньшей мере от одного циклического атома до 6 циклических атомов в кольце замещены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей серы (в том числе -S(O)-, -S(O)-), кислорода и азота (включая =N(O)-) и, где кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примерами 8-11-членного гетеробицикла являются: индол, индолин, бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензизоксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензимидазол, бензимидазолин, хинолин, хиназолин, дигидрохиназолин, хинолин, дигидрохинолин, тетрагидрохинолин, декагидрохинолин, изохинолин, декагидроизохинолин, тетрагидроизохинолин, дигидроизохинолин, бензазепин, пурин и птеридин. Выражение 8-11-членный гетеробицикл также включает спироструктуры двух колец, такие как 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан или мостиковые гетероциклы, такие как 8-аза-бицикло[3.2.1]октан. Каждый атом водорода 8-11-членного гетеробициклила или 8-11-членного гетеробициклического углерода может быть замещен заместителем, как определено ниже.
9
9
9
9
9a
9
9a
9
9a
9
9
9
9a
9b
9
9
9a
9
9
9a
9
9a
9
9a
9
9a
9
9a
9b
9
9a
10
11
11
11
11
11a
11
11
11
11
11
11
11
11a
11
11a
2
2
2
2
2
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
2
2
2
2
Термин "замещенный" означает, что один или более -Н атом(ов) молекулы или фрагмента заменены другим атомом или группой атомов, которые называются "заместитель". Подходящие заместители выбираются из группы, состоящей из галогена; CN; COOR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)OR; N(R)C(O)N(RR); OC(O)N(RR); T; C алкил; C алкенил; или C алкинил, где T; С алкил; C алкенил; и С алкинил являются при необходимости замещенными одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными и где С алкил; С алкенил; и С алкинил, при необходимости прерываются одной или несколькими группой(ами), выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-; -О-; -С(О)-; -C(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)-; -S(O)-; -N(R)S(O)N(R)-; -S-; -N(R)-; -OC(O)R; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)C(O)O-; -N(R)C(O)N(R)-; и -OC(O)N(RR);
где
9
9a
9b
10
11
11
11
11
11a
11
11
11
11
11
11
11
11a
11
11a
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
2
2
2
2
R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; Т; и С алкила; С алкенила; или С алкинила, где Т; С алкил; С алкенил; и С алкинил при необходимости являются замещенными одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными и в которых С алкил; С алкенил и С алкинил, при необходимости прерываются одним или несколькими группой(ами), выбранными из группы, состоящей из Т, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)-; -S(O)-; -N(R)S(O)N(R)-; -S-; -N(R)-; -OC(O)R; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)C(O)O-; -N(R)C(O)N(R)- и -OC(O)N(RR);
3-10
10
T выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; или 8-11-членного гетеробициклила, где Т при необходимости является замещенным одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
10
12
12
12
12
12a
12
12a
12
12a
12
12
12
12a
12b
12
12
12a
12
12
12a
12
12a
12
12a
12
12a
12
12a
12b
12
12a
2
2
2
2
2
1-6
1-6
R представляет собой галоген; CN; оксо (=O); COOR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)OR; N(R)C(O)N(RR); OC(O)N(RR) или C алкил, где C алкил при необходимости является замещенным одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными;
11
11a
12
12a
12b
1-6
1-6
R, R, R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; или С алкил а, где С алкил при необходимости является замещенным одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными.
9
9a
9b
В одном варианте выполнения R, R, R могут быть независимо друг от друга Н.
10
1-6
В одном варианте выполнения R представляет собой C алкил.
В одном варианте выполнения Т представляет собой фенил.
Предпочтительно, максимум 6 Н-атомов в молекуле независимо замещаются заместителем, например 5 Н-атомов независимо замещаются заместителем, 4 Н-атомов независимо замещаются заместителем, 3 Н-атомов независимо замещаются заместителем, 2 Н-атомов независимо замещаются заместителем или 1 Н-атом замещается заместителем.
Как применяется в настоящем описании, термин "прерывается" означает, что между двумя атомами углерода или на конце углеродной цепи между соответствующим атомом углерода и атомом водорода вставлены один или более атом(ов).
Как применяется в настоящем описании, термин "пролекарство" означает соединение, которое подвергается биотрансформации перед демонстрацией своих фармакологических эффектов. Пролекарства могут, таким образом, рассматриваться как биологически активные фрагменты, соединенные с специализированными нетоксичными защитными группами, используемыми временным образом, чтобы изменить или устранить нежелательные свойства в исходной молекуле, то есть в пролекарстве биологически активный фрагмент конъюгирован с помощью обратимой связи со специализированной группой. Это также включает в себя усиление желательных свойств в лекарственном препарате и подавление нежелательных свойств.
Как применяется в настоящем описании, выражение «пролекарство, связанное с носителем" означает пролекарство, содержащее временную связь биологически активного фрагмента с временной группой носителя, что приводит улучшенными физико-химическими или фармакокинетическим свойствам и которая может быть легко удалена in vivo, как правило, посредством гидролитического расщепления, то есть в пролекарстве, связанным с носителем, биологически активный фрагмент конъюгирован с помощью обратимой связи с фрагментом носителя, и что приводит к улучшенным физико-химическим или фармакокинетическим свойствам. При расщеплении обратимой связи биологически активный фрагмент высвобождается в виде соответствующего лекарственного препарата. Соответственно, "полимерное пролекарство" является пролекарством, связанным с носителем, в которой носитель является полимерным.
Как применяется в настоящем описании, выражение «временная защитная группа» означает часть пролекарства, которое не является лекарственным препаратом, таким образом, линкером и носителем и/или любыми необязательными спейсерными фрагментами.
x2
y1
Как применяется в настоящем описании, выражение "обратимый линкерный фрагмент пролекарства" означает фрагмент, который на одном своем конце прикреплен к биологически активному фрагменту D с помощью обратимой связи, а на другом конце прикреплен с помощью постоянной связи, которая в соответствии с настоящим изобретением образуется посредством реакции аминной функциональной группы фрагмента основной цепи или A с A, таким образом соединяя биологически активный фрагмент с гидрогелевым носителем в пролекарстве, связанном с носителем по настоящему изобретению. "Обратимая связь" представляет собой связь, которая является ферментативно гидролитически расщепляемой, т.е. расщепляемой в физиологических условиях (водном буфере при pH 7,4, 37°С) с периодом полураспада в диапазоне от одного часа до двенадцати месяцев.
В отличие от этого, "постоянная связь" или "стабильная связь" не является ферментативно гидролитически расщепляемой в физиологических условиях (водный буфер при pH 7,4, 37°С) с периодом полураспада более двенадцати месяцев.
"Биодеградабельная связь" представляет собой связь, которая является ферментативно и/или неферментативно гидролитически расщепляемой, т.е. расщепляется в физиологических условиях (водном буфере при pH 7,4, 37°С) с периодом полураспада в диапазоне от одного часа до двенадцати месяцев.
Предпочтительно также, чтобы биодеградабельная связь не являлась бы ферментативно гидролитически расщепляемой в физиологических условиях.
Как применяется в настоящем описании, выражение "бесследный пролекарственный линкер" означает обратимый пролекарственный линкер, который при расщеплении высвобождает лекарственное средство в его свободной форме. Как применяется в настоящем описании, выражение "свободная форма" лекарственного препарата означает лекарственный препарат в его немодифицированной, фармакологически активной форме.
Как применяется в настоящем описании, термин "пептид" означает короткий полимер из аминокислотных мономеров, соединенных пептидными связями. Термин "полипептид" означает пептид, содержащий вплоть до 50 аминокислотных мономеров. Термин "белок" означает пептид из более чем 50 аминокислотных мономеров.
Как применяется в настоящем описании, термин "олигонуклеотид" означает короткий полимер нуклеиновой кислоты, содержащий до 100 оснований.
Как применяется в настоящем описании, выражение "фармацевтическая композиция" означает один или более активных ингредиентов и один или более инертных ингредиентов, а также любой продукт, который получается прямо или косвенно при комбинации, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов или в результате диссоциации одного или нескольких ингредиентов, или из других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают любую композицию, полученную посредством смешивания пролекарства, соединенного с носителем, по настоящему изобретению с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.
Как применяется в настоящем описании, термин "вспомогательное вещество" означает разбавитель, адъювант или наполнитель, с которым вводится терапевтическое средство. Такое фармацевтическое вспомогательное вещество может представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включающие вещества, получаемые из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, включая, но не ограничиваясь этим: арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является предпочтительным вспомогательным веществом, когда фармацевтическая композиция вводится перорально. Физиологический раствор и водный раствор декстрозы являются предпочтительными вспомогательными веществами, когда фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина являются предпочтительно используемыми в качестве жидких вспомогательных веществ для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, трегалозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное.
Фармацевтическая композиция, необязательно, может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов, рН буферные агенты, как например, ацетат, сукцинат, трис, карбонат, фосфат, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), MES (2-(N-морфолино) этансульфоновая кислота), или могут содержать поверхностно-активные вещества, такие как Tween, полоксамеры, полоксамины, CHAPS, Igepal, или аминокислоты, такие как, например, глицин, лизин или гистидин. Эти фармацевтические композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с замедленным высвобождением и тому подобное. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и вспомогательными веществами, такими как триглицериды. Пероральные препараты могут включать стандартные вспомогательные вещества, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Примеры подходящих фармацевтических вспомогательных веществ описаны в «Remington Pharmaceutical Sciences» by E.W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество лекарственного препарата или биологически активного вещества, вместе с пригодным количеством вспомогательного вещества так, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения пациенту. Состав должен соответствовать способу введения.
Выражение "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом, такими как ЕМЕА (Европа) и/или FDA (США) и/или любым другим национальным регулирующим органом для применения для животных, предпочтительно у человека.
Как правило, термин "содержать" или "содержащий" охватывает также "состоят из" и "состоящий из".
Настоящее изобретение относится к полимерному пролекарству и/или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство, для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов.
Дополнительно изобретение относится к полимерному пролекарству и/или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство для применения для внутрисуставной инъекции.
Изобретение также относится к полимерному пролекарству и/или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство, для применения для внутрисуставной инъекций для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов.
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к полимерному пролекарству,
(i) в котором полимерное пролекарство содержит полимерный носитель, содержащий по меньшей мере один полимер, и
(ii) в котором один или более биологически активные фрагментов обратимо соединены через обратимые линкерные фрагменты пролекарства с указанным полимерным носителем.
В предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к полимерному пролекарству или его фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство по настоящему изобретению, для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов,
(i) в котором полимерное пролекарство содержит полимерный носитель, содержащий по меньшей мере один полимер, и
(ii) в котором один или более биологически активных фрагментов обратимо соединены через обратимые линкерные фрагменты пролекарства с указанным полимерным носителем.
Полимерное пролекарство или фармацевтическая композиция, содержащая один или более полимерных пролекарств для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов предпочтительно является предназначенной для инъекций в сустав.
Таким образом, в предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к полимерному пролекарству или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения для инъекций в сустав.
Полимерное пролекарство содержит полимерный носитель, причем носитель содержит по меньшей мере один полимер, и к этому полимерному носителю обратимо присоединены одно или нескольких биологически активных фрагментов через обратимые линкерные фрагменты пролекарства, и которые высвобождают биологически активные фрагменты из полимерного пролекарства в качестве лекарственных средств при внутрисуставном введении, т.е. при введении в сустав.
Полимерный носитель содержит, предпочтительно состоит по меньшей мере из одного полимера, который более предпочтительно выбирается из группы полипептидов, поли(акриловых кислот), поли(акрилатов), поли(акриламидов), поли(алкилокси)полимеров, поли(амидов), поли(амидоаминов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(аспартатамида), поли(масляной кислоты), поли(капролактона), поли(карбонатов), поли(цианоакрилатов), поли(диметилакриламида), поли(сложных эфиров), поли(этилена), поли(этиленгликоля), поли(этиленоксида), поли(этилоксазолина), поли(гликолевой кислоты), поли(гидроксиэтилакрилата), поли(гидроксиэтилоксазолина), поли(гидроксипропилметакриламида), поли(гидроксипропил метакрилата), поли(гидроксипропилоксазолина), поли(иминокарбонатов), поли(N-изопропилакриламида), поли(молочной кислоты), поли(молочной-со-гликолевой кислоты), поли(метакриламида), поли(метакрилатов), поли(метилоксазолина), поли(пропилен фумарата), поли(органофосфазенов), поли(сложных ортоэфиров), поли(оксазолинов), поли(пропиленгликоля), поли(силоксанов), поли(уретанов), поли(виниловых спиртов), поли(виниламинов), поли(винилметилового эфира), поли(винилпирролидона), силиконов, рибонуклеиновой кислоты, дезоксирибонуклеиновой кислоты, альбуминов, антител и их фрагментов, белков плазмы крови, коллагенов, эластина, фасцина, фибрина, кератинов, полиаспартата, полиглутамата, проламинов, трансферринов, цитохромов, флавопротеида, гликопротеинов, гемопротеинов, липопротеинов, металлопротеинов, фитохромов, фосфопротеинов, опсинов, агара, агарозы, альгината, арабинанов, арабиногалактанов, каррагинана, целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы и других полимеров на основе углеводов, хитозана, декстрана, декстрина, желатина, гиалуроновой кислоты и производных, маннана, пектинов, рамногалактуронанов, крахмала, гидроксиалкилкрахмала, ксилана и сополимеров и функционализованных производных вышеперечисленного.
В одном варианте выполнения полимерный носитель представляет собой растворимый полимерный носитель. В этом варианте выполнения предпочтительно, чтобы растворимый полимерный носитель содержал, предпочтительно состоял из неразветвленной, разветвленной или дендритный цепи на основе ПЭГ.
В другом варианте выполнения полимерный носитель представляет собой нерастворимый в воде полимерный носитель. В этом варианте выполнения предпочтительно, чтобы водонерастворимый полимерный носитель содержал, предпочтительно состоял из гидрогеля, более предпочтительно гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты или гидрогеля на основе ПЭГ. Наиболее предпочтительно, чтобы водонерастворимый полимерный носитель являлся бы гидрогелем на основе ПЭГ.
Гидрогель представляет собой изделие, имеющее определенную форму, предпочтительно форму микрочастиц. Более предпочтительно, если гидрогель будет в форме гранул микроразмера. Еще более предпочтительно, такие гранулы микроразмера имеют диаметр от 1 до 1000 мкм, более предпочтительно от 5 до 500 мкм, более предпочтительно от 10 до 100 мкм, еще более предпочтительно от 20 до 80 мкм. В равной степени предпочтительными являются гранулы микроразмера с диаметром от 10 до 250 мкм, более предпочтительно от 10 до 200 мкм, еще более предпочтительно от 30 до 190 мкм и наиболее предпочтительно от 50 до 180 мкм. Диаметр гранул измеряют, когда гранулы микроразмера суспендировали в изотоническом водном буфере.
Такой гидрогель может быть полимеризован различными путями, как например, посредством радикальной полимеризации, ионной полимеризации или реакций лигирования. Предпочтительные гидрогели, пролекарства, связанные с гидрогелем и методы их полимеризации раскрыты в WO-A 2006/003014 и WO-2011/012715, которые включены в настоящее описание посредством ссылки во всей полноте.
В особенно предпочтительном варианте выполнения, носитель полимерного пролекарства представляет собой гидрогель, получаемый способом, включающим стадии:
(а) получение смеси, содержащей
2
(a-i) по меньшей мере один реагент основной цепи, где по меньшей мере один реагент основной цепи имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа, и содержит по меньшей мере три амина (-NH и/или -NH-);
(a-ii) по меньшей мере один сшивающий реагент, где по меньшей мере один сшивающий реагент имеет молекулярную массу в диапазоне от 0,5 кДа до 40 кДа или от 0,5 кДа до 15 кДа, предпочтительно от 1 кДа до 40 кДа или от 1 кДа до 10 кДа, еще более предпочтительно от 2 до 40 кДа или от 2 кДа до 5 кДа, еще более предпочтительно от 6 до 40 кДа, по меньшей мере один сшивающий реагент, содержащий
(i) по меньшей мере, две карбонилокси группы (-(С=O)-O- или -O-(С=O)-), и дополнительно
(ii) по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы, выбранные из группы, состоящей из активированных сложноэфирных групп, активированных карбаматных групп, активированных карбонатных групп и активированных тиокарбонатных групп,
и на основе ПЭГ, содержащий по меньшей мере 70% ПЭГ; и
(a-iii) первый растворитель и по меньшей мере второй растворитель, причем второй растворитель не смешивается с первым растворителем,
в массовом соотношении по меньшей мере один реагент основной цепи к по меньшей мере одному сшивающему реагенту в пределах от 1:99 до 99:1;
(b) полимеризация смеси по стадии (а) в суспензионной полимеризации в гидрогель; и
(c) при необходимости обработка гидрогеля.
Смесь на стадии (а) содержит первый растворитель и по меньшей мере второй растворитель. Указанный первый растворитель предпочтительно выбирается из группы, включающей дихлорметан, хлороформ, тетрагидрофуран, этилацетат, диметилформамид, ацетонитрил, диметилсульфоксид, пропиленкарбонат, N-метилпирролидон, метанол, этанол, изопропанол и воду и их смеси.
По меньшей мере один реагент основной цепи и по меньшей мере один сшивающий реагент растворяют в первом растворителе, т.е. дисперсной фазе суспензионной полимеризации. В одном варианте выполнения реагент основной цепи и сшивающий реагент растворяют по отдельности, то есть в разных контейнерах, используя либо тот же самый, либо другой растворитель и предпочтительно используя одинаковый растворитель для обоих реагентов. В другом варианте выполнения реагент основной цепи и сшивающий реагент растворяют вместе, то есть в одном и том же контейнере и, используя одинаковый растворитель.
Подходящим растворителем для реагента основной цепи является органический растворитель. Предпочтительно, растворитель выбирается из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, тетрагидрофурана, этилацетата, диметилформамида, ацетонитрила, диметилсульфоксида, пропиленкарбоната, N-метилпирролидона, метанола, этанола, изопропанола и воды и их смесей. Более предпочтительно, реагент основной цепи растворяется в растворителе, выбранном из группы, включающей ацетонитрил, диметилсульфоксид, метанол или их смеси. Наиболее предпочтительно, реагент основной цепи растворяется в диметилсульфоксиде.
В одном варианте выполнения реагент основной цепи растворяется в растворителе в концентрации от 1 до 300 мг/мл, более предпочтительно от 5 до 60 мг/мл и наиболее предпочтительно от 10 до 40 мг/мл.
Подходящим растворителем для сшивающего реагента является органический растворитель. Предпочтительно, растворитель выбирается из группы, включающей дихлорметан, хлороформ, тетрагидрофуран, этилацетат, диметилформамид, ацетонитрил, диметилсульфоксид, пропиленкарбонат, N-метилпирролидон, метанол, этанол, изопропанол, воду или их смеси. Более предпочтительно, сшивающий реагент растворяют в растворителе, выбранном из группы, включающей диметилформамид, ацетонитрил, диметилсульфоксид, метанол или их смеси. Наиболее предпочтительно, сшивающий агент реагент растворяют в диметилсульфоксиде.
В одном варианте выполнения сшивающий реагент растворяется в растворителе в концентрации в диапазоне от 5 до 500 мг/мл, более предпочтительно от 25 до 300 мг/мл и наиболее предпочтительно от 50 до 200 мг/мл.
По меньшей мере один реагент основной цепи и по меньшей мере один сшивающий реагент смешивают в массовом соотношении в диапазоне от 1:99 до 99:1, например, в соотношении в диапазоне от 2:98 до 90:10, в массовом соотношении в диапазоне от 3:97 до 88:12, в массовом соотношении в диапазоне от 3:96 до 85:15, в массовом соотношении в диапазоне от 2:98 до 90:10, и в массовом соотношении в диапазоне от 5:95 до 80:20; особенно предпочтительным в массовом соотношении от 5:95 до 80:20, в котором первое число указывает реагент основной цепи и второе число относится к сшивающему реагенту.
Предпочтительно, соотношение выбирают таким образом, чтобы смесь на стадии (а) содержала бы молярный избыток аминогрупп из реагента основной цепи по сравнению с активированными функциональными концевыми группами сшивающего реагента. Следовательно, гидрогель, получающийся в результате способа по настоящему изобретению, имеет свободные аминогруппы, которые могут быть применены для соединения пролекарственного линкерного реагента, с гидрогелем, либо непосредственно, либо через спейсерный фрагмент.
5-30
5-30
5-30
6-20
5-16
7-11
По меньшей мере один второй растворитель, т.е. непрерывная фаза суспензионной полимеризации, предпочтительно представляет собой органический растворитель, более предпочтительно органический растворитель, выбранный из группы, включающей неразветвленные, разветвленные или циклические С алканы; неразветвленные, разветвленные или циклические С алкены; неразветвленные, разветвленные или циклические С алкины; неразветвленные или циклические поли(диметилсилоксаны); ароматические С углеводороды и их смеси. Еще более предпочтительно по меньшей мере второй растворитель выбирается из группы, включающей неразветвленные, разветвленные или циклические С алканы; толуол; ксилол; мезитилен; гексаметилдисилоксан или их смеси. Наиболее предпочтительно по меньшей мере второй растворитель выбирается из группы, включающей линейные С алканы, такие как гептан, октан, нонан, декан и ундекан.
Предпочтительно, смесь со стадии (а) дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Предпочтительные поверхностно-активные вещества представляют собой Cithrol DPHS, Hypermer 70А, Hypermer В246, Hypermer 1599A, Hypermer 2296 и Hypermer 1083.
Предпочтительно поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от 0,1 г до 100 г на 1 л общей смеси, то есть суммарно в дисперсной фазе и непрерывной фазе. Более предпочтительно, поверхностно-активное вещество имеет концентрацию 0,5 г до 10 г на 1 л общей смеси, и наиболее предпочтительно поверхностно-активное вещество имеет концентрацию от 0,5 г до 5 г на 1 л общей смеси.
Предпочтительно смесь со стадии (а) представляет собой эмульсию.
Полимеризацию на стадии (b) инициируют посредством добавления основания. Предпочтительно основание представляет собой ненуклеофильное основание, растворимое в алканах, более предпочтительно основание выбирается из N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (TMEDA), 1,4-диметилпиперазина, 4-метилморфолина, 4-этилморфолина, 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, 1,4,7-триметил-1,4,7-триазациклононана, трис[2-(диметиламино)этил]амина, триэтиламина, DIPEA, триметиламина, N,N-диметилэтиламина, N,N,N',N'-тетраметил-1,6-гександиамина, N,N,N',N'',N''-пентаметилдиэтилентриамина, 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, 1,5-диазабицикло[4.3.0]нон-5-ена и гексаметилентетрамина. Еще более предпочтительно, основание выбирается из TMEDA, 1,4-диметилпиперазина, 4-метилморфолина, 4-этилморфолина, 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, 1,4,7-триметил-1,4,7-триазациклононан, трис[2-(диметиламино)этил]амина, 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, 1,5-диазабицикло[4.3.0]нон-5-ена и гексаметилентетрамина. Наиболее предпочтительно, чтобы основанием являлось TMEDA.
Основание добавляют к смеси стадии (а) в количестве от 1 до 500 эквивалентов на активированные функциональные концевые группы в смеси, предпочтительно в количестве от 5 до 50 эквивалентов, более предпочтительно в количестве от 5 до 25 эквивалентов, и наиболее предпочтительно в количестве 10 эквивалентов.
На стадии (b) способа полимеризация гидрогеля по настоящему изобретению представляет собой реакцию конденсации, которая предпочтительно происходит при непрерывном перемешивании смеси со стадии (а). Предпочтительно, окружная скорость конца лопатки (окружная скорость конца лопатки = π × скорость вращения мешалки × диаметр мешалки) находится в диапазоне от 0,2 до 10 метров в секунду (м/с), более предпочтительно от 0,5 до 4 м/с и наиболее предпочтительно от 1 до 2 м/с.
В предпочтительном варианте выполнения стадии (b) реакцию полимеризации проводят в цилиндрическом сосуде, снабженном перегородками. Отношение диаметра к высоте резервуара может составлять от 4:1 до 1:2, более предпочтительно отношение диаметра к высоте сосуда составляет от 2:1 до 1:1.
Предпочтительно реакционный сосуд снабжен мешалкой осевого потока, выбранной из группы, включающей мешалку с наклонными лопастями, мешалку морского типа или Lightnin А-310. Более предпочтительной мешалкой является мешалка с наклонными лопастями.
Стадия (b) может проводиться в широком диапазоне температур, предпочтительно при температуре от 10°С до 100°С, более предпочтительно при температуре от 0°С до 80°С, еще более предпочтительно при температуре 10°С до 50°С и наиболее предпочтительно при температуре окружающей среды. "Температура окружающей среды" относится к температуре, характерной для типичных лабораторных условий и предпочтительно означает температуру в пределах от 17 до 25°С.
Предпочтительно, гидрогель, полученный в результате полимеризации, является формованном изделием, таким как покрытие, сетка, стент, наночастицы или микрочастицы. Более предпочтительно, гидрогель получают в виде гранул наноразмеров, имеющих диаметр от 1 до 500 микрометров, более предпочтительно с диаметром от 10 до 300 микрометров, еще более предпочтительно с диаметром от 20 до 150 микрометров и наиболее предпочтительно с диаметром от 30 до 130 микрометров. Вышеупомянутые диаметры измеряются, когда микрочастицы из гидрогеля полностью гидратированы в воде.
Необязательная стадия (с) включает одну или несколько из следующих стадий:
(c1) удаление избыточной жидкости из реакции полимеризации,
(с2) промывание гидрогеля для удаления растворителей, используемых в процессе полимеризации,
(с3) перенос гидрогеля в буферный раствор,
(с4) фракционирование по размеру/просеивание гидрогеля,
(с5) перенос гидрогеля в контейнер,
(с6) высушивание гидрогеля,
(с7) перенос гидрогеля в определенный растворитель, пригодный для стерилизации, и
(с8) стерилизация гидрогеля, предпочтительно гамма-излучением
Предпочтительно, необязательная стадия (с) включает все из следующих стадий
(c1) удаление избыточной жидкости от реакции полимеризации,
(с2) промывание гидрогеля для удаления растворителей, используемых в процессе полимеризации,
(с3) перенос гидрогеля в буферный раствор,
(с4) фракционирование по размеру/просеивание гидрогеля,
(с5) перенос гидрогеля в контейнер,
(с7) перенос гидрогеля в определенный растворитель, пригодный для стерилизации, и
(с8) стерилизация гидрогеля, предпочтительно гамма-излучением.
По меньшей мере один реагент основной цепи имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа, предпочтительно от 2 до 50 кДа, более предпочтительно от 5 до 30 кДа, еще более предпочтительно от 5 до 25 кДа и наиболее предпочтительно от 5 до 15 кДа.
Предпочтительно, реагент основной цепи на основе ПЭГ содержит по меньшей мере 10% ПЭГ, более предпочтительно содержит по меньшей мере 20% ПЭГ, еще более предпочтительно содержит по меньшей мере 30% ПЭГ и наиболее предпочтительно содержит по меньшей мере 40% ПЭГ.
В одном варианте выполнения реагент основной цепи присутствует в виде своей кислой соли, предпочтительно в виде кислотно-аддитивной соли. Подходящие кислотно-аддитивные соли получают из кислот, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают, но не ограничиваются этим, ацетат, аспартат, бензоат, безилат, бикарбонат, карбонат, бисульфат, сульфат, борат, камзилат, цитрат, эдисилат, эсилат, формиат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, гексафторфосфат, гибензат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, изотионат, лактат, малат, малеат, малонат, мезилат, метилсульфат, нафтилат, никотинат, нитрат, оротат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, сахарат, стеарат, сукцинат, тартрат и тозилат. Особенно предпочтительно, чтобы реагент основной цепи присутствовал бы в виде своей гидрохлоридной соли.
В одном варианте выполнения по меньшей мере один реагент основной цепи выбирается из группы, состоящей из
Соединение формулы (а-I)
где
В представляет собой разветвляющееся ядро,
1-6
2-6
2-6
SP представляет собой спейсерный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из C алкила, С алкенила и С алкинила,
Р представляет собой полимерную цепь на основе ПЭГ, содержащую по меньшей мере 80% ПЭГ, предпочтительно по меньшей мере 85% ПЭГ, более предпочтительно по меньшей мере 90% ПЭГ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% ПЭГ,
1
2
2
Hyp представляет собой фрагмент, содержащий амин (-NH и/или -NH-) или полиамин, содержащий по меньшей мере два амина (-NH и/или -NH-),
х обозначает целое число от 3 до 16,
x1, x2 обозначают независимо друг от друга 0 или 1, при условии, что x1=0, если х2=0,
0
1
2
А, А, А независимо друг от друга выбираются из группы, состоящей из
1
1a
1-6
где R и R независимо друг от друга выбираются из Н и C алкила;
соединения формулы (а-II)
где
Р определен, как указано выше в соединении формулы (а-I),
2
3
2
Hyp, Hyp представляют собой независимо друг от друга полиамин, содержащий по меньшей мере два амина (-NH и/или -NH-) и
3
4
А и А независимо выбираются из группы, состоящей из
1
1a
1-6
где R и R независимо друг от друга выбираются из Н и C алкила;
соединение формулы (а-III)
где
1
Р представляет собой полимерную цепь на основе ПЭГ, содержащую по меньшей мере 80% ПЭГ, предпочтительно по меньшей мере 85% ПЭГ, более предпочтительно по меньшей мере 90% ПЭГ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% ПЭГ,
4
2
Hyp представляет собой полиамин, содержащий по меньшей мере три амина (-NH и/или -NH-), и
5
А выбирается из группы, состоящей из
1
1a
1-6
где R и R независимо друг от друга выбираются из Н и С алкила;
и
соединение формулы (a-IV),
где
5
2
Hyp является полиамином, содержащим по меньшей мере три амина (-NH и/или -NH-), и
6
А выбирается из группы, состоящей из
1
1a
1-6
где R и R независимо друг от друга выбираются из Н и C алкила;
1
1-50
2-50
2-50
1-4
1-4
2
Т выбирается из группы, состоящей из С алкила, С алкенила или С алкинила, фрагмент которого необязательно прерывается одной или более группой(ами), выбранными из -NH-, -N(C алкил)-, -О-, -S-, -С(О)-, -C(O)NH-, -C(O)N(Cалкил)-, -О-С(О)-, -S(O)-, -S(O)-, 4-7-членного гетероциклила, фенила или нафтила.
х
1
2
3
4
5
В следующих разделах термин "Нур" относится к Hyp, Hyp, Hyp, Hyp и Hyp в совокупности.
Предпочтительно, реагент основной цепи представляет собой соединение формулы (а-I), (а-II) или (а-III), более предпочтительно реагент основной цепи представляет собой соединение формулы (а-I) или (а-III), а наиболее предпочтительно реагент основной цепи представляет собой соединение формулы (а-I).
В предпочтительном варианте выполнения в соединении формулы (а-I) х равно 4, 6 или 8. Предпочтительно, в соединении формулы (а-I) х равно 4 или 8, наиболее предпочтительно, х равен 4.
0
1
2
3
4
5
6
В предпочтительном варианте выполнения в соединениях формул (а-I) - (a-IV), А, А, А, А, А, А и А, выбираются из группы, включающей
0
Предпочтительно, когда в соединении формулы ((а-I), А представляет собой
1
Предпочтительно, когда в соединении формулы ((а-I), А представляет собой
2
Предпочтительно, когда в соединении формулы ((а-I), А представляет собой
3
Предпочтительно, когда в соединении формулы ((а-II), А представляет собой
4
и А представляет собой
5
Предпочтительно, когда в соединении формулы ((а-III), А представляет собой
6
Предпочтительно, когда в соединении формулы ((a-IV), А представляет собой
1
1-6
Предпочтительно, когда в соединении формулы ((a-IV), Т выбирается из Н и Салкила.
1
В одном варианте выполнения в соединении формулы (А) разветвляющееся ядро В выбирается из следующих структур:
где
0
пунктирные линии показывают место прикрепления к А, или, если как x1, так и х2 равны 0, к А1,
t равно 1 или 2; предпочтительно t равно 1,
v равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14; предпочтительно, v равно 2, 3, 4, 5, 6; более предпочтительно v равно 2, 4 или 6; наиболее предпочтительно, v равно 2.
В предпочтительном варианте выполнения, В имеет структуру формулы (a-i), (а-ii), (a-iii), (a-iv), (a-v), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (a-x), (a-xiv), (a-xv) или (a-xvi). Более предпочтительно, В имеет структуру формулы (a-iii), (a-iv), (a-v), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (a-x) или (a-iv). Наиболее предпочтительно, В имеет структуру формулы (a-xiv).
0
1
Предпочтительный вариант представляет собой сочетание В и А или, если как x1, так и х2 равны 0, предпочтительная комбинация В и А, которая выбирается из следующих структур:
где
пунктирные линии показывают место прикрепления к SP или, если как x1, так и х2 равны 0, к Р.
0
1
Более предпочтительно, комбинация В и А или, если как x1, так и х2 равны 0, комбинация В и А имеет структуру формулы (b-i), (b-iv), (b-vi) или (b-viii) и наиболее предпочтительно имеет структуру формулы (b-i).
В одном варианте выполнения, x1 и х2 формулы (а-I) равны 0.
В одном варианте выполнения полимерная цепь Р на основе ПЭГ имеет молекулярную массу от 0,3 кДа до 40 кДа; например от 0,4 до 35 кДа, от 0,6 до 38 кДа, от 0,8 до 30 кДа, от 1 до 25 кДа, от 1 до 15 кДа или от 1 до 10 кДа. Наиболее предпочтительно Р имеет молекулярную массу от 1 до 10 кДа.
1
1
В одном варианте выполнения полимерная цепь Р на основе ПЭГ имеет молекулярную массу от 0,3 кДа до 40 кДа; например, от 0,4 до 35 кДа, от 0,6 до 38 кДа, от 0,8 до 30 кДа, от 1 до 25 кДа, от 1 до 15 кДа или от 1 до 10 кДа. Наиболее предпочтительно Р имеет молекулярную массу от 1 до 10 кДа.
В одном варианте выполнения в соединениях формул (а-I) или (а-II) Р имеет структуру формулы (c-i):
где n изменяется в диапазоне от 6 до 900, более предпочтительно n изменяется от 20 до 700 и наиболее предпочтительно n изменяется в диапазоне от 20 до 250.
1
В одном варианте выполнения в соединениях формул (а-III), Р имеет структуру формулы (c-ii):
где
n изменяется в диапазоне от 6 до 900, более предпочтительно n изменяется в диапазоне от 20 до 700 и наиболее предпочтительно n изменяется в диапазоне от 20 до 250;
0
1-6
2-6
2-6
1-4
1-4
2
Т выбирается из группы, включающей С алкил, С алкенил и С алкинил, которые необязательно прерываются одним или несколькими группой(ами), выбранными из -NH-, -N(C алкил)-, -О-, -S-, -С(О)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C алкил)-, -О-С(О)-, -S(O)- или -S(O)-.
х
В одном варианте выполнения в соединениях формул (a-I) - (a-IV), остаток Нур является полиамином и предпочтительно включает в связанной форме и, где это применимо, фрагмент формул (d-i), (d-ii), (d-iii) и/или (d-iv) в R- и/или S-конфигурации:
где
z1, z2, z3, z4, z5, z6 независимо друг от друга равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
х
х
Более предпочтительно Нур включает в связанной форме лизин, орнитин, диаминопропионовую кислоту и/или диаминомасляную кислоту в R- и/или S-конфигурации. Нур включает в связанном виде лизин в R- и/или S-конфигурации.
х
Нур имеет молекулярную массу от 40 Да до 30 кДа, предпочтительно от 0,3 кДа до 25 кДа, более предпочтительно от 0,5 кДа до 20 кДа, еще более предпочтительно от 1 кДа до 20 кДа и наиболее предпочтительно от 2 кДа до 15 кДа.
х
Нур предпочтительно выбирается из группы, состоящей из
фрагмент формулы (e-i)
где
p1 представляет собой целое число от 1 до 5, предпочтительно p1 равно 4, и
2
3
4
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I) и к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II);
фрагмент формулы (e-ii)
где
р2, р3 и р4 являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга обозначает целое число от 1 до 5, предпочтительно р2, р3 и р4 равны 4, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (a-IV);
фрагмент формулы (e-iii)
где
p5-p11 являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга обозначает целое число от 1 до 5, предпочтительно, чтобы р5-p11 были равны 4, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет формулу (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет формулу (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет формулу (a-IV);
фрагмент формулы (e-iv)
где
р12-р26 являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга обозначает целое число от 1 до 5, предпочтительно, чтобы р12-р26 были равны 4, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (a-IV);
фрагмент формулы (e-v)
где
р27 и р28 являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга обозначает целое число от 1 до 5, предпочтительно р27 и р28 равны 4,
q представляет собой целое число от 1 до 8, предпочтительно q равно 2 или 6, а наиболее предпочтительно q равно 6, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (a-IV);
фрагмент формулы (e-vi)
где
Р29 и Р30 являются одинаковыми или различными и каждый независимо от другого обозначает целое число от 2 до 5, предпочтительно Р29 и Р30 равны 3, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (a-IV);
фрагмент формулы (e-vii)
где
р31-р36 являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга обозначает целое число от 2 до 5, предпочтительно, чтобы р31 р36 были равны 3, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (a-IV);
фрагмент формулы (e-viii)
где
р37-р50 являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга и обозначают целое число от 2 до 5, предпочтительно, чтобы р37-р50 были равны 3, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (a-IV); и
фрагмент формулы (e-ix):
где
р51-р80 являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга обозначают целое число от 2 до 5, предпочтительно, чтобы р51-р80 были равны 3, и
2
3
4
5
6
пунктирная линия показывает место присоединения к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), к А или А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III) и к А, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (a-IV); и
где фрагменты (e-i) - (e-v), могут быть в каждом хиральном центре любо R-, либо S-конфигурации, предпочтительно, все хиральные центры фрагмента (e-i) - (e-v) имеют одинаковую конфигурацию.
х
x
х
х
Предпочтительно, Нур имеет структуру формул (e-i), (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vi), (e-vii), (e-viii) или (e-ix). Более предпочтительно, Hyp имеет структуру формул (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vii), (e-viii) или (e-ix), еще более предпочтительно Нур имеет структуру формул (e-ii), (e-iii), (e-vii) или (e-viii) и наиболее предпочтительно Нур имеет структуру формулы (e-iii).
2
1
Если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), предпочтительный фрагмент - А - Hyp представляет собой фрагмент формулы
где
пунктирная линия показывает место присоединения к Р; и
1
Е выбирается из формул (e-i) - (e-ix).
2
3
Если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-II), предпочтительным фрагмент Hyp - А - представляет собой фрагмент формулы
где
пунктирная линия показывает место присоединения к Р; и
1
Е выбирается из формул (e-i) - (e-ix).
4
3
и предпочтительный фрагмент - А - Hyp представляет собой фрагмент формулы
где
пунктирная линия показывает место присоединения к Р; и
1
Е выбирается из формул (e-i) - (e-ix).
5
4
Если реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-III), предпочтительный фрагмент - А - Hyp представляет собой фрагмент формулы
где
1
пунктирная линия показывает место присоединения к Р; и
1
Е выбирается из формул (e-i) - (e-ix).
Более предпочтительно, реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I) и В имеет структуру формулы (a-xiv).
1
Еще более предпочтительно, реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), В имеет структуру формулы (a-xiv), x1 и х2 равны 0, и А представляет собой -О-.
1
Еще более предпочтительно, реагент основной цепи имеет структуру формулы (а-I), В имеет структуру формулы (a-xiv), А обозначает -О-, и Р имеет структуру формулы (c-i).
1
2
1
Еще более предпочтительно, реагент основной цепи соответствует формуле (а-I), В имеет формулу (a-xiv), x1 и х2 равны 0, А обозначает -О-, Р имеет структуру формулы (c-i), А обозначает -NH-(C=O)- и Hyp имеет формулу (e-iii).
Наиболее предпочтительно, реагент основной цепи имеет следующую формулу:
где
n находится в интервале от 10 до 40, предпочтительно от 10 до 30, более предпочтительно от 10 до 20.
Также предпочтительно, n находится в интервале от 20 до 30 кДа и наиболее предпочтительно n равно 28.
1-6
2-6
2-6
2
2
2
3
2
2
2
2
5
3
2
2
2
2
SP обозначает спейсерный фрагмент, выбранный из группы, включающей C алкил, С алкенил и С алкинил, предпочтительно SP обозначает -СН-, -СН-СН-, -СН(СН)-, -СН-СН-СН-, -СН(СН)-, -С(СН)-, -СН=СН- или -СН=СН-, наиболее предпочтительно SP обозначает -СН-, -СН-СН- или -СН=СН-.
По меньшей мере один сшивающий реагент содержит по меньшей мере две карбонилокси группы (-(С=O)-O- или -O-(С=O)-), которые являются биодеградабельными связями. Эти биодеградабельные связи необходимы, чтобы превратить гидрогель в биодеградабельный. Кроме того, по меньшей мере один сшивающий реагент содержит по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы, которые в процессе полимеризации на стадии (b) реагируют с аминами по меньшей мере с одним реагентом основной цепи.
Сшивающий реагент имеет молекулярную массу в диапазоне от 6 до 40 кДа, более предпочтительно в диапазоне от 6 до 30 кДа, еще более предпочтительно в диапазоне от 6 до 20 кДа, еще более предпочтительно в диапазоне от 6 до 15 кДа и наиболее предпочтительно в диапазоне от 6 до 10 кДа.
В равной степени предпочтительном варианте сшивающий реагент имеет молекулярную массу в диапазоне от 0,5 кДа до 15 кДа, предпочтительно от 1 кДа до 10 кДа и наиболее предпочтительно от 2 до 5 кДа.
Сшивающий реагент содержит по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы, выбранные из группы, включающей активированные сложноэфирные группы, активированные карбаматные группы, активированные карбонатные группы и активированные тиокарбонатные группы, которые в процессе полимеризации реагируют с амино-группами реагентов основной цепи, образуя амидные связи.
В одном предпочтительном варианте выполнения сшивающий реагент представляет собой соединение формулы (V-I):
где
1
2
3
4
5
6
6a
каждый D, D, D и D являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга выбирается из группы, включающей -О-, -NR-, -S- и -CRR-;
1
1a
2
2a
3
3a
4
4a
6
6a
7
7
7a
7
1
2
3
4
1a
2a
3a
4a
1
1a
2
2a
3
3a
4
4a
6
6a
1
2
3
4
1a
2a
3a
4a
1-6
3-8
каждый R, R, R, R, R, R, R, R, R и R являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга выбирается из группы, включающей -Н, -OR, -NRR, -SR и C алкил; при необходимости каждая пара(ы) R/R, R/R, R/R и R/R могут независимо образовать химическую связь и/или каждая из пар R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R и R/R независимо друг от друга соединены с атомом, к которому они присоединены, образуют С циклоалкил или, образуя кольцо А, или соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, образуя 4-7-членный гетероциклил или 8-11-членный гетеробициклил или адамантил;
5
1
5
2
5
3
5
4
5
1-6
каждый R независимо выбирается из -Н и C алкила; при необходимости, каждая пара(ы) R/R, R/R, R/R, R/R и могут независимо образовать химическую связь и/или соединены с атомом, к которому они присоединены, образуют 4-7-членный гетероциклил или 8-11-членный гетеробициклил;
1-6
каждый R7, R7a независимо выбирается из Н и С алкила;
А выбирается из группы, состоящей из инденила, инданила и тетралинила;
2
Р представляет собой
m находится в интервале от 120 до 920 или от 10 до 340, предпочтительно от 120 до 460 или от 20 до 220 и более предпочтительно от 120 до 230 или от 45 до 110;
r1, r2, r7, r8 независимо равны 0 или 1;
r3, r6 независимо равны 0, 1, 2, 3 или 4;
r4, r5 независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
s1, s2 независимо равны 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
1
2
Y, Y могут быть одинаковыми или различными, и каждый независимо друг от друга выбираются из формул (f-i) до (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4
H
X обозначает Cl, Br, I, или F.
Предпочтительно, сшивающий реагент представляет собой соединение формулы (V-II):
где
1
2
3
4
5
5
5a
D, D, D и D являются одинаковыми или различными и каждый из них независимо друг от друга выбирается из группы, включающей О, NR, S и CRR;
1
1a
2
2
3
3a
4
4a
5
5a
1
1a
2
2a
3
3a
4
4a
1
2
3
4
1a
2a
3a
4a
1-6
3-8
R, R, R, R, R, R, R, R, R и R могут быть одинаковыми или различными, и каждый независимо от других, выбирается из группы, включающей Н и С алкил; необязательно, один или более из пары(пар) R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R и R/R образуют химическую связь или связаны вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием С циклоалкила, или с образованием кольца А, или связаны вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероциклила или 8-11-членного гетеробициклила или адамантила
А выбирается из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила и тетралинила;
2
Р представляет собой
m находится в интервале от 120 до 920 или от 10 до 340, предпочтительно от 120 до 460 или от 20 до 220 и более предпочтительно от 120 до 230 или от 45 до 110;
r1, r2, r7, r8 независимо равны 0 или 1;
r3, r6 независимо равны 0, 1, 2, 3 или 4;
r4, r5 независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
s1, s2 независимо равны 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
1
2
Y, Y могут быть одинаковыми или различными, и каждый независимо друг от друга выбираются из формул (f-i) до (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4
H
X обозначает Cl, Br, I или F.
Понятно, что фрагменты
представляют, по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы.
1
2
1
2
1
2
Предпочтительно, Y и Y в формуле (V-I) и (V-II) имеют структуру формулы (f-i), (f-ii) или (f-v). Более предпочтительно, Y и Y имеют структуру формулы (f-i) или (f-ii) и наиболее предпочтительно, Y и Y имеют структуру формулы (f-i).
1
2
1
2
Предпочтительно, чтобы оба фрагмента Y и Y в формуле (V-I) и (V-II) имели бы одинаковую структуру. Более предпочтительно, оба фрагмента Y и Y имели бы структуру формулы (f-i).
Предпочтительно, r1 в формуле (V-I) и (V-II) равен 0.
Предпочтительно, r1 и s1 в формуле (V-I) и (V-П) оба равны 0.
1
1a
2
2a
3
3a
4
4a
1
2
3
4
1a
2a
3a
4a
3-8
Предпочтительно, одна или несколько из пары(пар) R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R и R/R в формуле (VI) и (V-II) образуют химическую связь или соединены вместе с атомом, которому они присоединены, с образованием С циклоалкила или с образованием кольца А.
1
2
1a
2a
3
4
3a
4a
Предпочтительно, одна или несколько из пары (пар) R/R, R/R, R/R, R/R в формуле (VI) и (V-II) соединены вместе с атомом, которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероциклила или 8-11-членного гетеробициклила.
Предпочтительно, сшивающий реагентом формулы (V-I) и (V-II), является симметричным, т.е. фрагмент
имеет ту же структуру, что и фрагмент
В одном предпочтительном варианте выполнения s1, s2, r1 и r8 в формуле (V-I) и (V-II), равны 0.
В другом предпочтительном варианте выполнения s1, s2, r1 и r8 в формуле (V-I) и (V-II), равны 0 и r4 в формуле (V-I) и (V-II), и r5 равны 1.
Предпочтительные сшивающие реагенты соответствуют формулам (V-1) - (V-54):
где
каждый сшивающий реагент может быть в виде его рацемической смеси, где это применимо; и
1
2
m, Y и Y обозначают, что указано выше.
Еще более предпочтительными сшивающими реагентами являются соединения формулы (Va-1) - (Va-54):
где
каждый сшивающий реагент может быть в виде его рацемической смеси, где это применимо; и
1
2
m, Y и Y являются такими, как указано выше.
Неожиданно было обнаружено, что применение сшивающих реагентов с разветвлениями, т.е. остатками, отличными от Н, у альфа-углерода карбонилокси-группы, приводит к образованию гидрогелей, которые более устойчивы в отношении ферментативного расщепления, такому как деградация посредством эстераз.
Кроме того, было неожиданно обнаружено, что чем меньше атомов находится между (С=О) карбонилокси-группы и (С=О) соседнего активированного сложного эфира, активированного карбамата, активированного карбоната или активированного тиокарбамата, тем большая устойчивость к деградации полученных гидрогелей, такой как большая устойчивость против деградации посредством эстераз.
Соответственно, сшивающие реагенты V-11-V-53, V-1 и V-2 являются более предпочтительными сшивающими реагентами.
В другом варианте выполнения сшивающие реагенты V-1, V-2, V-5, V-6, V-7, V-8, V-9, V-10, V-11, V-12, V-13, V-14, V-15, V-16, V-17, V-18, V-19, V-20, V-21, V-22, V-23, V-24, V-25, V-26, V-27, V-28, V-29, V-30, V-31, V-32, V-33, V-34, V-35, V-36, V-37, V-38, V-39, V-40, V-41, V-42, V-43, V-44, V-45, V-46, V-47, V-48, V-49, V-50, V-51, V-52, V-53 и V-54 являются предпочтительными сшивающими реагентами. Более предпочтительно, по меньшей мере один сшивающий реагент соответствует формуле V-5, V-6, V-7, V-8, V-9, V-10, V-14, V-22, V-23, V-43, V-44, V-45 или V-46, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере один сшивающий реагент соответствует формуле V-5, V-6, V-9 или V-14.
В другом варианте выполнения сшивающий реагенты Va-1, Va-2, Va-5, Va-6, Va-7, Va-8, Va-9, Va-10, Va-11, Va-12, Va-13, Va-14, Va-15, Va-16, Va-17, Va-18, Va-19, Va-20, Va-21, Va-22, Va-23, Va-24, Va-25, Va-26, Va-27, Va-28, Va-29, Va-30, Va-31, Va-32, Va-33, Va-34, Va-35, Va-36, Va-37, Va-38, Va-39, Va-40, Va-41, Va-42, Va-43, Va-44, Va-45, Va-46, Va-47, Va-48, Va-49, Va-50, Va-51, Va-52, Va-53 и Va-54 являются еще более предпочтительными сшивающими реагентами. Более предпочтительно, по меньшей мере один сшивающий реагент соответствует формуле Va-5, Va-6, Va-7, Va-8, Va-9, Va-10, Va-14, Va-22, Va-23, Va-43, Va-44, Va-45 или Va-46, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере один сшивающий реагент соответствует формуле Va-5, Va-6, Va-9 или Va-14.
Предпочтительные варианты соединения формулы (V-I) и (V-II), как указано выше, применимы, соответственно, к предпочтительным соединениям формулы от (V-1) до (V-53).
2
Гидрогель содержит от 0,01 до 1 ммоль/г первичных аминогрупп (-NH), более предпочтительно, от 0,02 до 0,5 ммоль/г первичных аминогрупп и наиболее предпочтительно от 0,05 до 0,3 ммоль/г первичных аминогрупп. Выражение "X ммоль/г первичных аминогрупп" означает, что 1 г сухого гидрогель содержит X ммоль первичных аминогрупп. Измерение содержания амина в гидрогеле может быть осуществлено в соответствии с литературным источником Gude et al. (Letters in Peptide Science, 2002, 9(4): 203-206, который включен посредством ссылки во всей ее полноте).
Предпочтительно, термин "сухой", как применяется в настоящем описании, означает, имеющий остаточное содержание воды максимум 10%, предпочтительно менее чем 5% и более предпочтительно менее чем 2% (определенное по методу Карла Фишера). Предпочтительным способом сушки является лиофилизация.
В одном варианте выполнения гидрогелевый носитель полимерного пролекарства дополнительно модифицируют перед тем как «обратимый линкер пролекарства-биологически активный фрагмент» конъюгируют с гидрогелем.
Предпочтительно, гидрогель модифицируют посредством способа, включающего следующие стадии
х0
х0
(A) обеспечение гидрогелем, имеющего группы А, в котором группы А представляют собой одинаковые или различные, предпочтительно одинаковые функциональные группы;
(B) необязательно ковалентное конъюгирование спейсерного реагента формулы (VI)
где
2
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
1-4
1-4
2
SP является С алкилом, С алкенилом или С алкинилом, в которых С алкил, С алкенил и С алкинил необязательно прерываются одной группой или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из -NH-, -N(C алкил)-, -О-, -S, -С(О)-, -C(O)NH, -C(O)N(C алкил)-, -О-С(О)-, -S(O)-, -S(O)-, 4-7-членного гетероциклила, фенила и нафтила;
х1
х0
А представляет собой функциональную группу для реакции с А гидрогеля; и
x2
A представляет собой функциональную группу;
х0
к А гидрогеля со стадии (А); и
(С) взаимодействие гидрогеля стадии (А) или стадии (В) с реагентом формулы (VII)
где
х3
А представляет собой функциональную группу; и
Z представляет собой инертный фрагмент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 10 Да до 1000 кДа;
х0
x2
х3
вследствие чего не более 99 мол. % А или A реагируют с А.
х0
1
1
2
Предпочтительно, А стадии (А), выбирается из группы, состоящей из малеимида, амина (-NH или -NH-), гидроксила (-ОН), тиола (-SH), карбоксила (-СООН) и активированного карбоксила (-COY, где Y выбирается из формул (f-i) в (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4;
H
X обозначает Cl, Br, I или F.
х0
Более предпочтительно, А стадии (А) представляет собой амин или малеимид.
х0
Понятно, что функциональные группы А стадии (А) соответствуют аминам по меньшей мере одного реагента основной цепи, если гидрогельный носитель полимерного пролекарства получают по способу, описанному выше.
х0
х1
1
1
1
1
2
В предпочтительном варианте выполнения А стадии (А) представляет собой амин и А стадии (В) представляет собой ClSO-, R(С=O)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, O=C=N-, Y-(C=O)-, Y-C=O)-NH-, или Y-(C=O)-O-,
где
1
1-6
2-6
2-6
3-8
R представляет собой H, C алкил, C алкенил, С алкинил, С циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил или тетралинил; и
1
Y выбирается из формул (f-i) до (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4,
H
X обозначает Cl, Br, I, или F.
х0
х1
1
В другом предпочтительном варианте выполнения А стадии (А) представляет собой гидроксильную группу (-ОН) и А стадии (В) представляет собой O=C=N-, I-, Br-, SCN- или Y-(C=O)-NH-,
1
где Y выбирается из формул (f-i) - (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4,
H
X обозначает Cl, Br, I, или F.
х0
х1
В другом предпочтительном варианте выполнения А стадии (А) представляет собой карбоновую кислоту (-(С=O)ОН) и А стадии (В) представляет собой первичный амин или вторичный амин.
х0
х1
В другом предпочтительном варианте выполнения А стадии (А) представляет собой малеимид и А стадии (b) представляет собой тиол.
х0
х1
1
1
1
х0
х1
1
Более предпочтительно, А стадии (А) представляет собой амин и А стадии (В) представляет собой Y-(C=O)-, Y-(C=O)-NH- или Y-(C=O)-O- и наиболее предпочтительно А стадии (А) представляет собой амин и А стадии (В) представляет собой Y-(C=O)-.
x1
A стадии (В) необязательно может присутствовать в защищенной форме.
Подходящими активирующими реагентами для получения активированной карбоновой кислоты являются, например, N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-3-карбодиимид (EDC), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинфосфоний гексафторфосфат (РуВОР), бромтрипирролидинфосфоний гексафторфосфат (PyBrOP), (1-циано-2-этокси-2-оксиэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбений гексафторфосфат (COMU), 1-гидроксибензотриазол (НОВТ), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAT), O-(6-хлорбензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HCTU), 1-Н-безотриазолий (HBTU), (O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HATU), и O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (TBTU). Эти реагенты коммерчески доступны и хорошо известны специалистам в данной области техники.
x2
1
1a
1b
1
1
0
1
1a
1b
1
1
1
2
3
2
2
Предпочтительно, A стадии (В) выбираются из группы, состоящей из малеимида, -SH, -NH, -SeH, -N, -C≡CH, -CR=CRR, -ОН, -(CH=X)-R, -(C=O)-S-R, -(C=O)-H, -NH-NH, -O-NH, -Ar-X, -Ar-Sn(R)(R)(R), -Ar-B(OH)(OH), Br, I, Y-(C=O)-, Y-(C=O)-NH-, Y-(C=O)-O-,
, и ; с необязательными защитными группами;
где
2
пунктирные линии показывают место присоединения к SP;
X представляет собой О, S, или NH,
0
1
1a
Х представляет собой -ОН, -NRR, -SH или -SeH,
H
X обозначает Cl, Br, I или F;
Ar представляет собой фенил, нафтил, инденил, инданил или тетралинил;
1
1a
1b
1-6
2-6
2-6
3-8
R, R, R являются независимо друг от друга Н, C алкил, С алкенил, С алкинил, С циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил или тетралинил; и
1
Y выбирается из формул (f-i) до (f-vi):
с необязательными защитными группами;
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4,
H
X обозначает Cl, Br, I, или F.
x2
x2
x2
2
Более предпочтительно, A стадии (В) представляет собой -NH, малеимид или тиол и наиболее предпочтительно A стадии (В) представляет собой малеимид. В равной степени предпочтительно, A стадии (В) представляет собой тиол.
x2
A стадии (В) может быть необязательно в защищенной форме.
Если гидрогель стадии (А) ковалентно конъюгирован со спейсерным фрагментом, полученный конъюгат «гидрогель-спейсерный фрагмент» соответствует формуле (VIII):
где
пунктирная линия показывает место присоединения к гидрогелю стадии (А);
у1
х0
х1
А представляет собой связь, образованную между А и А; и
2
x2
SP и A используются как в формуле (VI).
у1
Предпочтительно, А формулы (VIII) представляет собой стабильную связь.
у1
Предпочтительно, А формулы (VIII) выбираются из группы, состоящей из
где
пунктирные линии, помеченные звездочкой, показывают место присоединения к гидрогелю; и
2
немаркированные пунктирные линии показывают место присоединения к SP.
Подходящие условия реакции описаны в разделах примеров и известны специалистам в данной области техники.
Стадию (В) можно проводить в присутствии основания. Подходящие основания включают обычные неорганические или органические основания. К ним предпочтительно относятся гидриды, гидроксиды, амиды, алкоголяты, ацетаты, карбонаты или гидрокарбонаты щелочных или щелочноземельных металлов, такие как, например, гидрид натрия, амид натрия, метоксид натрия, этоксид натрия, трет.-бутоксид калия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, ацетат натрия, ацетат калия, ацетат кальция, ацетат аммония, карбонат натрия, карбонат калия, бикарбонат калия, бикарбонат натрия или карбонат аммония, и третичные амины, такие как триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, N,N-диметиланилин, N,N-диметилбензиламин, пиридин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, N,N-диметиламинопиридин, диазабициклооктан (DABCO), диазабициклононен (DBN), N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA), диазабициклоундецен (DBU) или коллидин.
Стадию (В) можно проводить в присутствии растворителя. Подходящие растворители для проведения стадии (В) по настоящему изобретению включают органические растворители. К ним предпочтительно относятся вода и алифатические, алициклические или ароматические углеводороды, такие как, например, петролейный эфир, гексан, гептан, циклогексан, метилциклогексан, бензол, толуол, ксилол или декалин; галогенированные углеводороды, такие как, например, хлорбензол, дихлорбензол, дихлорметан, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан или трихлорэтан; спирты, такие как метанол, этанол, н- или изопропанол, н-, изо-, втор.- или трет.-бутанол, этандиол, пропан-1,2-диол, этоксиэтанол, метоксиэтанол, монометиловый эфир диэтиленгликоля, диметиловый эфир диэтиленгликоля; ацетонитрил, N-метил-2-пирролидон (NMP), диметилформамид (DMF), диметилсульфоксид (DMSO), N,N-диметилацетамид, нитрометан, нитробензол, гексаметилфосфорамид (НМРТ), 1,3-диметил-2-имидазолидинон (DMI), 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2 (1Н)-пиримидинон (DMPU), этилацетат, ацетон, бутанон; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метил-трет.-бутиловый эфир, метил-трет.-амиловый эфир, диоксан, тетрагидрофуран, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан или анизол; или их смеси. Предпочтительно растворитель выбирается из группы, состоящей из воды, ацетонитрила и N-метил-2-пирролидона.
х3
1
1a
1b
1
1
1
1a
1b
0
2
3
2
2
Предпочтительно, А стадии (С) выбирается из группы, состоящей -SH, -NH, -SeH, -малеимид, -С≡СН, -N, -CR=CRR, -(C=X)-R, -ОН, -(C=O)-S-R, -NH-NH, -O-NH, -Ar-Sn(R)(R)(R), -Ar-B(OH)(OH), -Ar-X,
где
пунктирные линии показывают место присоединения к Z;
X представляет собой О, S, или NH,
0
1
1a
Х -ОН, -NRR, -SH или -SeH;
1
1a
1b
1-6
2-6
2-6
3-8
R, R, R независимо друг от друга обозначают Н, С алкил, C алкенил, C алкинил, С циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил или тетралинил; и
Ar представляет собой фенил, нафтил, инденил, инданил или тетралинил.
1
1
Y представляет собой активированную карбоновую кислоту, активированный карбонат или активированный карбамат, предпочтительно Y выбирается из формул (fi) - (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4,
H
X обозначает Cl, Br, I, или F
1
В предпочтительном варианте выполнения, Y выбирается из формул (fi) - (f-vi):
где
H
пунктирные линии, b и X используются, как указано выше.
х3
х3
Более предпочтительно, А стадии (С) обозначает -SH или -малеимид и наиболее предпочтительно А стадии (С) обозначает -SH.
х3
В другом предпочтительном варианте выполнения А стадии (С) представляет собой формулу (aI)
где
пунктирная линия показывает место присоединения к Z формулы (VII);
0
PG обозначает фрагмент, активирующий серу; и
S представляет собой атом серы;
0
Предпочтительно, PG формулы (AI) выбирается из группы, состоящей из
где
пунктирные линии показывают место присоединения к сере формулы (aI);
Ar представляет ароматическую группу, которая необязательно дополнительно замещена;
01
02
03
04
3
4
4
4
4
4a
4
4
4
4
4
4
4
4a
4
4a
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
2
2
2
2
R, R, R, R независимо друг от друга обозначают -Н; C алкил; C алкенил; или C алкинил, где алкил C; C алкенил; и C алкинил необязательно замещены одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными и в которых C алкил; C алкенил и C алкинил необязательно прерываются одной или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из -Q-, -С(O)O-; -О-; -С(О)-; -C(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)-; -S(O)-; -N(R)S(O)N(R)-; -S-; -N(R)-; -OC(O)R; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)C(O)O-; -N(R)C(O)N(R)- и -OC(O)N(RR);
3-10
3
Q выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; и 8-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
3
5
5
5
5
5a
5
5a
5
5a
5
5
5
5a
5b
5
5
5a
5
5
5a
5
5a
5
5a
5
5a
5
5a
5b
5
5a
2
2
2
2
2
1-6
1-6
R представляет собой галоген; -CN; оксо (=O); -COOR; -OR; -C(O)R; -C(O)N(RR); -S(O)N(RR); -S(O)N(RR); -S(O)R; -S(O)R; -N(R)S(O)N(RR); -SR; -N(RR); -NO; -OC(O)R; -N(R)C(O)R; -N(R)S(O)R; -N(R)S(O)R; -N(R)C(O)OR; -N(R)C(O)N(RR); -OC(O)N(RR); или C алкил, где C алкил необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными; и
4
4a
5
5a
5b
R, R, R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н;
1-6
1-6
или С алкила, где C алкил необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными.
01
03
04
1-6
Предпочтительно, R, R и R обозначают независимо друг от друга С алкил.
02
1-6
Предпочтительно, R выбирается из Н и C алкила.
Предпочтительно Ar выбирается из группы, состоящей из
где
0
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части PG формулы (aI);
W обозначает независимо друг от друга О, S, или N;
W' обозначает N; и
2
где Ar представляет собой необязательно замещенный одним или несколькими заместителем(ями), независимо выбранными из группы, состоящей из NO, Cl и F.
0
Более предпочтительно, PG формулы (aI) выбирается из группы, состоящей из
где
пунктирные линии показывают место присоединения к сере формулы (aI); и
01
02
03
04
Ar, R, R, R и R, используются, как описано выше.
0
Более предпочтительно, PG формулы (aI) обозначает
где
пунктирная линия показывает место присоединения к сере формулы (aI).
3
Ах стадии (С) может быть необязательно в защищенной форме.
x2
X3
Предпочтительными комбинациями A стадии (В) и A стадии (С) являются следующие:
где
X обозначает О, S, или NH;
0
1
1a
Х обозначает -ОН, -NRR, -SH или -SeH;
1
1a
1b
1-6
2-6
2-6
3-8
R, R, R независимо друг от друга выбираются из группы, состоящей из Н, C алкила, С-алкенила, С алкинила, С циклоалкила, содержащих 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил и тетралинил; и
Ar представляет собой фенил, нафтил, инденил, инданил или тетралинил.
x2
х3
0
0
0
0
В другом предпочтительном варианте выполнения A обозначает -SH, а А соответствует формуле (aI), где PG соответствует формуле (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) или (viii). Более предпочтительно, PG формулы (aI) соответствует формуле (i), (ii), (iii), (iv) или (v), и еще более предпочтительно, PG формулы (aI) соответствует формуле (i). Наиболее предпочтительно, PG формулы (aI) соответствует формуле
где
пунктирная линия показывает место присоединения к сере формулы (aI).
x2
х3
1
1
1
x2
х3
1
В одном предпочтительном варианте выполнения, A стадии (В) представляет собой амин, а А стадии (С) представляет собой Y-(C=O)-, Y-(C=O)-NH-, или Y-(C=O)-O- и наиболее предпочтительно A стадии (В) представляет собой амин, а А стадии (С) представляет собой Y-(C=O)-.
x2
х3
В другом предпочтительном варианте выполнения A стадии (В) представляет собой малеимид, а А стадии (С) представляет собой -SH.
х0
х3
1
1
1
1
2
В одном варианте выполнения необязательная стадия (В) опущена, А стадии (А) представляет собой амин, а А стадии (С) представляет собой ClSO-, R(C=O)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, O=C=N-, Y-(C=O)-, Y-(C=O)-NH- или Y-(С=O)-O-,
где
1
1-6
2-6
2-6
3-8
R представляет собой Н, С алкил, С алкенил, С алкинил, С циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил или тетралинил; и
1
Y выбирается из формул (f-i) - (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4,
H
X обозначает Cl, Br, I, или F.
х0
х3
1
В другом варианте выполнения необязательная стадия (В) опущена, А стадии (А) представляет собой гидроксильную группу (-ОН), а А стадии (С) представляет собой O=C=N-, I-, Br-, SCN- или Y-(C=O)-NH-,
1
где Y выбирается из формул (fi) - (f-vi):
где
пунктирные линии показывают место присоединения к остальной части молекулы,
b равно 1, 2, 3 или 4,
H
X обозначает Cl, Br, I, или F.
x0
х3
В другом варианте выполнения необязательная стадия (В) опущена, A стадии (А) представляет собой карбоновую кислоту (-(C=O)ОН), а А стадии (C) представляет собой первичный амин или вторичный амин.
х0
х3
1
1
1
В другом варианте выполнения необязательная стадия (В) опущена, А стадии (А) представляет собой амин, а А стадии (C) представляет собой Y-(C=O)-, Y-(C=O)-NH-, или Y-(C=O)-O-.
х0
х3
В другом варианте выполнения необязательная стадия (В) опущена, А стадии (А) представляет собой малеимид, а А стадии (C) представляет собой тиол.
х0
x3
1
В предпочтительном варианте выполнения необязательная стадия (В) опущена, А стадии (А) представляет собой амин, а A стадии (C) представляет собой Y-(C=O)-.
х0
х3
0
0
0
0
В другом предпочтительном варианте выполнения необязательная стадия (В) опущена, А представляет собой -SH, а А имеет формулу (aI), в которой PG соответствует формуле (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) или (viii). Более предпочтительно, PG формулы (aI) является соединением формулы (i), (ii), (iii), (iv) или (v), и еще более предпочтительно, PG формулы (aI) соответствует формуле (i). Наиболее предпочтительно, PG формулы (aI) соответствует формуле
где
пунктирная линия показывает место присоединения к сере формулы (aI).
Гидрогель, полученный на стадии (С), имеет структуру формулы (IXa) или (IXb):
где
пунктирная линия показывает место присоединения к гидрогелю стадии (А);
y0
х0
x3
A представляет собой связь, образованную между А и A,
у1
А применяется, как указано в формуле (VIII);
у2
x2
х3
А представляет собой связь, образованную между A и А;
2
SP применяется, как указано в формуле (VI); и
Z применяется, как указано в формуле (VII).
у0
у2
Предпочтительно, А стадии (А) и А формулы (IXb), выбираются из группы, состоящей из амида, карбамата,
где
P2
пунктирные линии, помеченные звездочкой, показывают место присоединения к гидрогелю или S, соответственно; и
не маркированные пунктирные линии показывают место присоединения к Z формулы (VII).
1-50
2-50
2-50
3-10
1-50
2-50
2-50
3-10
1-50
2-50
2-50
2
2
2
2
10
9
9
9
9
9a
9
9
9
9
9
9
9
9a
9
9a
В одном варианте выполнения Z на стадии (С) выбирается из группы, состоящей из С алкила, С алкенила, С алкинила, С циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, 8-11-членного гетеробициклила, фенила; нафтила; инденила; инданила и тетралинила; в которых С алкил, С алкенил, С алкинил, С циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил; нафтил; инденил; инданил и тетралинил необязательно замещены одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными и, в которых С алкил; С алкенил; и С алкинил необязательно прерывается одной группой или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-; -О-; -С(О)-; -C(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)-; -S(O)-; -N(R)S(O)N(R)-; -S-; -N(R)-; -OC(O)R; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)C(O)O-; -N(R)C(O)N(R)- и -OC(O)N(RR);
где
9
9a
10
11
11
11
11
11a
11
11
11
11
11
11
11
11a
11
11a
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
2
2
2
2
R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; Т; С алкила; С алкенила и С алкинила, где Т; С алкил; С алкенил и С алкинил необязательно замещены одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными, и где С алкил; С алкенил и С алкинил, необязательно прерываются одной группой или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-; -О-; -С(О)-; -C(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)-; -S(O)-; -N(R)S(O)N(R)-; -S-; -N(R)-; -OC(O)R; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)C(O)O-; -N(R)C(O)N(R)- и -OC(O)N(RR);
3-10
10
T выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; и 8-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
10
12
12
12
12
12a
12
12a
12
12a
12
12
12
12a
12b
12
12
12a
12
12
12a
12
12a
12
12a
12
12a
12
12a
12b
12
12a
2
2
2
2
2
1-6
1-6
R представляет собой галоген; CN; оксо (=О); COOR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)OR; N(R)C(O)N(RR); OC(O)N(RR) или С алкил, С алкил, которые необязательно замещены одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными;
11
11a
12
12a
12b
1-6
1-6
R, R, R, R, R независимо друг от друга выбираются из группы, состоящей из Н; и С алкила, C алкила, которые необязательно замещены одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными.
В другом варианте выполнения Z на стадии (С) представляет собой инертный полимер, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 0,5 кДа до 1000 кДа, предпочтительно имеющий молекулярную массу в диапазоне от 0,5 до 500 кДа, более предпочтительно, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 0,75 до 250 кДа, еще более предпочтительно в диапазоне от 1 до 100 кДа, более предпочтительно от 5 до 60 кДа, еще более предпочтительно от 10 до 50 и наиболее предпочтительно Z имеет молекулярную массу 40 кДа.
Предпочтительно, Z стадии (С) представляет собой инертный полимер, выбранный из группы, включающий в свой состав 2-метакрилоил-оксиэтилфосфорилхолины, поли(акриловые кислоты), поли(акрилаты), поли(акриламиды), поли(алкилокси)полимеры, поли(амиды), поли(амидоамины), поли(аминокислоты), поли(ангидриды), поли(аспартамиды), поли(бутановые кислоты), поли(гликолевые кислоты), полибутилен терефталаты, поли(капролактоны), поли(карбонаты), поли(цианоакрилаты), поли(диметилакриламиды), поли(сложные эфиры), поли(этилены), поли(этиленгликоли), поли(этиленоксиды), поли(этилфосфаты), поли(этилоксазолины), поли(гликолевые кислоты), поли(гидроксиэтилакрилаты), поли(гидроксиэтил-оксазолины), поли(гидроксиметакрилаты), поли(гидроксипропилметакриламиды), поли(гидроксипропилметакрилаты), поли(гидроксипропилоксазолины), поли(иминокарбонаты), поли(молочные кислоты), поли(молочные-со-гликолевые кислоты), поли(метакриламиды), поли(метакрилаты), поли(метилоксазолины), поли(органофосфазены), поли(сложные ортоэфиры), поли(оксазолины), поли(пропиленгликоли), поли(силоксаны), поли(уретаны), поли(виниловые спирты), поли(виниламины), поли(винилметиловые эфиры), поли(винилпирролидоны), силиконы, целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, хитины, хитозаны, декстраны, декстрины, желатины, гиалуроновые кислоты и их производные, функционализированные гиалуроновые кислоты, маннаны, пектины, рамногалактуронаны, крахмалы, гидроксиалкилкрахмалы, гидроксиэтилкрахмалы и другие полимеры на основе углеводов, ксиланы и их сополимеры.
В предпочтительном варианте выполнения Z стадии (С) представляет собой инертный линейный или разветвленный полимер на основе ПЭГ, содержащий по меньшей мере 70% ПЭГ, или полимер на основе гиалуроновой кислоты, содержащей по меньшей мере 70% гиалуроновой кислоты. Более предпочтительно, Z стадии (С) представляет собой инертный линейный или разветвленный полимер на основе ПЭГ, содержащий по меньшей мере 70% ПЭГ, еще более предпочтительно содержит по меньшей мере 80% ПЭГ и наиболее предпочтительно содержит по меньшей мере 90% ПЭГ.
В другом предпочтительном варианте выполнения Z стадии (С) представляет собой цвиттерионный полимер. Предпочтительно, такой цвиттерионный полимер содержит поли(аминокислоты) и/или поли(акрилаты).
Как применяется в настоящем описании, выражение «цвиттерион» и "цвиттерионный" относятся к нейтральной молекуле или фрагменту с положительными и отрицательными зарядами в различных местах в пределах этой молекулы или фрагмента одновременно.
В соответствии с Zhang et al. (Nature Biotechnology, 2013, volume 31, number 6, pages 553-557) гидрогели из цвиттерионных полимеров устойчивы к реакции на инородное тело.
х0
x2
х3
х0
x2
Стадия (С) включает взаимодействие гидрогеля стадии (А) или стадии (В) с реагентом формулы (VII) таким образом, что не более чем 99 мол. % А или A реагируют с А. Это может быть достигнуто, например, посредством реакции по меньшей мере 0,99 химических эквивалентов реагента формулы (VII) по отношению к А или A с гидрогелем на стадии (А) или (В).
х0
x2
х0
x2
х0
x2
Для того чтобы предотвратить реакцию более чем 0,99 химических эквивалентов, реагент формулы (VII) может быть применен в количестве не более 0,99 химических эквивалентов относительно А или A или, альтернативно, контролируется скорость реакции и реакция прерывается, когда в большая часть 0,99 химических эквивалентов по отношению к А или A прореагировали, особенно, когда больше чем 0,99 химических эквивалентов используются. Следует понимать, что также из-за физических ограничений, таких как стерические затруднения, гидрофобные свойства или другие характеристики инертного фрагмента Z, не более чем 0,99 химических эквивалентов могут быть способны вступать в реакцию с А или A, даже если больше химических эквивалентов добавляются в реакцию.
х0
x2
х3
х0
x2
х3
х0
x2
x3
х0
x2
х3
х0
x2
х3
Предпочтительно, стадия (С) включает взаимодействие гидрогеля стадии (А) или стадии (В) с реагентом формулы (VII) таким образом, что не более чем 80 мол. % А или A реагируют с А, еще более предпочтительно таким образом, что не более чем 60 мол. % А или A реагируют с А, еще более предпочтительно, таким образом, что не более чем 40 мол. % А или A реагируют с A, еще более предпочтительно, таким образом, что не более чем 20 мол. % А или A реагируют с А и наиболее предпочтительно, таким образом, что не более чем 15 мол. % А или A реагируют с А.
х0
x2
Это может быть достигнуто, например, посредством реакции не более чем 0,8, 0,6, 0,4, 0,2 или 0,15 химических эквивалентов реагента формулы (VII) по отношению А или A с гидрогелем на стадии (А) или (В), соответственно,
Методы для предотвращения реакции на большее количество химических эквивалентов описаны выше.
х0
х0
На основании измерений количества вещества А стадии (А) и после стадии (С) количество вещества, прореагировавшего с А, можно рассчитать по уравнению (1):
х0
x0
х0
x0
1
2
2
Z
(1) Количество прореагировавшего вещества А в ммоль/г = (A-А) / (A×MW+1),
где
х0
х0
А 1 это количество вещества функциональных групп А гидрогеля на стадии (А) в ммоль/г;
х0
х0
2
А это количество вещества функциональных групп А гидрогеля после стадии (С) в ммоль/г; и
Z
MW молекулярная масса Z в г/ммоль.
x2
Если необязательный спейсерный реагент ковалентно конъюгирован с гидрогелем на стадии (А), расчет количества прореагировавшего A, делается соответственно.
х0
х0
Процент прореагировавших функциональных групп А по отношению к функциональным группам А гидрогеля на стадии (А) рассчитывают в соответствии с уравнением (2):
х0
х0
х0
х0
х0
1
2
2
Z
1
(2) мол.% прореагировавших А=100×[(А-А) / (А × MW+1)]/А,
где переменные используются, как описано выше.
x3
x3
x3
В одном варианте выполнения Z стадии (С) конъюгируют с поверхностью гидрогеля. Это может быть достигнуто посредством выбора размера и структуры реагентов A-Z такими, что они будут слишком большими, чтобы войти в поры или сеть гидрогеля. Соответственно, минимальный размер A-Z зависит от свойств гидрогеля. Специалист в данной области техники однако знает о методах, как проверить, способен ли реагент A-Z входить в гидрогель с применением стандартных экспериментов, например с помощью гель-проникающей хроматографии с гидрогелем в качестве неподвижной фазы.
Биологически активный фрагмент связывается с гидрогелем полимерного пролекарства через обратимый пролекарственный линкер. Обратимые пролекарственные линкеры полимерного пролекарства могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно, обратимые пролекарственные линкеры полимерного пролекарства являются одинаковыми.
Подходящий обратимый пролекарственный линкер может быть выбран в зависимости от одного или нескольких функциональных групп, присутствующих в соответствующем лекарстве биологически активного фрагмента. Подходящие обратимые пролекарственные линкерные фрагменты известны специалистам в данной области техники, и предпочтительные примеры приведены в следующих разделах.
В предпочтительном варианте выполнения обратимые пролекарственные линкерные фрагменты, соединяющие полимерный носитель с биологически активным фрагментом, являются не оставляющими следов пролекарственными линкерами. Предпочтительно, чтобы все обратимые пролекарственные линкерные фрагменты полимерного пролекарства являлись бы не оставляющими следов пролекарственными линкерами.
Предпочтительный обратимый пролекарственный линкер для препаратов, содержащих амины, описан в WO-A 2005/099768. Таким образом, следующие подструктуры выбранные из общих формул (II) и (III), являются предпочтительными вариантами выполнения для конъюгатов «обратимый пролекарственный линкер-биологически активный фрагмент:
1
2
3
4
5
где пунктирная линия показывает место присоединения к полимерному носителю или к спейсерному фрагменту, который соединен с полимерным носителем, и где X, Y, Y, Y, Y, Y, R2, R3, R4, Nu, W, m и D формул (II) и (III) имеют следующий смысл:
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий амин, который присоединен к остальной части субструктуры, показанной в формуле (II) или (III) посредством образования -O-(C=O)-N-; -O-(C=S)-N-; -S-(C=O)-N- или -S-(C=S)-N- связи;
X представляет собой спейсерный фрагмент R5-Y6;
1
2
Y и Y каждый независимо обозначает О, S или NR6;
3
Y представляет собой О или S;
4
Y обозначает О, NR6 или -C(R7)(R8)-;
5
Y обозначает О или S;
Y6 представляет собой О, S, NR6, сукцинимид, малеимид, ненасыщенные связи углерод-углерод или любой гетероатом, содержащий свободную электронную пару или отсутствует;
R2 и R3 независимо выбираются из группы, состоящей из водорода, замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических алкильных или гетероалкильных групп, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов, цианогрупп, нитрогрупп, галогенов, карбоксильных групп, карбоксиалкильных групп, алкилкарбонильных групп и карбоксамидоалкильных групп;
R4 выбирается из группы, состоящей из водорода, замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических алкилов или гетероалкилов, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов, замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических алкокси, замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических гетероалкилокси, арилокси или гетероарилокси, цианогрупп и галогенов;
R5 выбирается из замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов;
R6 выбирается из водорода, замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических алкилов или гетероалкилов, арилов, замещенных арилов и замещенных или незамещенных гетероарилов;
R7 и R8 каждый независимо выбирается из группы, состоящей из водорода, замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических алкилов или гетероалкилов, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов, карбоксиалкильных групп, алкилкарбонильных групп, карбоксиамидоалкилов, цианогрупп и галогенов;
W выбирается из замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических алкилов, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных линейных, разветвленных или циклических гетероалкилов, замещенных или незамещенных гетероарилов;
Nu обозначает нуклеофил;
m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и
Ar представляет собой полизамещенный ароматический углеводород или полизамещенный ароматический гетероцикл.
Необязательно, конъюгаты «обратимый пролекарственный линкер-биологически активный фрагмент» формулы (II) или (III) могут быть дополнительно замещены.
Предпочтительно, Nu формул (II) и (III) выбирается из группы, включающей первичные, вторичные и третичные амины; тиол; карбоновую кислоту; гидроксиламин; гидразин и азотсодержащий гетероарил.
Предпочтительно Ar формул (II) и(III) выбирается из одной из следующих структур:
где каждый В независимо выбирается из О, S, N.
1-6
Предпочтительно, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 и W формул (II) и (III) независимо выбираются из водорода, метила, этила, этокси, метокси и других C линейных, циклических или разветвленных алкилов и гетероалкилов.
Другой подходящий обратимый пролекарственный линкерный фрагмент для препаратов, содержащих амины, описан в WO-A 2006/136586. Соответственно, следующие субструктуры, выбранные из общих формул (IV), (V) и (VI), являются предпочтительными вариантами для конъюгатов «обратимый пролекарственный линкер-биологически активный фрагмент»:
где пунктирная линия показывает место присоединения к гидрогелю или спейсерному фрагменту, который соединен с гидрогелем, и где X, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12 и D формул (IV), (V) и (VI), имеют следующие значения:
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий амин;
X представляет собой спейсер R13-Y1;
Y1 обозначает О, S, NR6, сукцинимид, малеимид, ненасыщенную связь углерод-углерод, или любой гетероатом, содержащий свободную электронную пару, или Y1 отсутствует;
R2 и R3 независимо выбираются из водорода, ацильных групп и защитных групп для гидроксильных групп;
R4-R12 независимо выбираются из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов, циано, нитро, галоген, карбокси и карбоксамида; и
R13 выбирается из замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов.
Необязательно, конъюгаты «обратимый пролекарственный линкер-биологически активный фрагмент» формулы (IV), (V) или (VI) дополнительно замещены.
Другие подходящие обратимые пролекарственные линкерные фрагменты для лекарственных препаратов, содержащие первичный или вторичный амин, описаны в WO-A 2009/095479. Соответственно, предпочтительное полимерное пролекарство указано с учетом пролекарственного конъюгата D-L, в котором
-D обозначает биологически активный фрагмент, содержащий первичный амин или вторичный амин; и
1
-L обозначает не биологически активный линкерный фрагмент -L, представленный формулой (VII),
1
2
1
1a
2
2a
3
3a
где пунктирная линия указывает на место присоединения к первичной или вторичной аминогруппе биологически активного фрагмента D, содержащего амин, посредством образованием амидной связи; и где X, X, X, R, R, R, R, R и R формулы (VII), имеют следующие значения:
4
4a
4
4
4a
5
5a
5
5a
4
4a
4
4a
6
6
4
4a
4
4a
4
4a
X представляет собой C(RR); N(R); О; C(RR)-C(RR); C(RR)-C(RR); C(RR)-N(R); N(R)-C(RR); C(RR)-O или O-C(RR);
1
X представляет собой С; или S(O);
2
7
7a
7
7a
8
8a
X представляет собой C(R, R); или C(R, R)-C(R, R);
3
X обозначает О, S или N-CN;
1
1a
2
2a
3
3a
4
4a
5
5a
6
7
7a
8
8a
1-4
R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; и С алкила; или
1a
4a
1a
5a
4a
5a
4a
5a
7a
8a
необязательно один или более из пар R/R, R/R, R/R, R/R, R/R образуют химическую связь;
1
1a
2
2a
4
4a
5
5a
7
7a
8
8a
3-7
необязательно один или более из пар R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, образуя С циклоалкил; или 4-7-членный гетероциклил;
1
4
1
5
1
6
4
5
7
8
2
3
необязательно один или более из пар R/R, R/R, R/R, R/R, R/R, R/R соединены вместе с атомами, к которым они присоединены, образуя кольцо А;
3
3a
необязательно R/R соединены вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуя 4-7-членный гетероцикл;
3-10
А выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила и 9-11-членного гетеробициклила; и
1
2
3
3a
3
где L замещен одной группой L-Z и необязательно дополнительно замещен при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (VII), не замещен заместителем, предпочтительно при условии, что R и R обозначают независимо друг от друга Н или соединены с N, через SP-гибридизированный атом углерода; и
где
2
L представляет собой одинарную химическую связь или спейсер; и
Z представляет собой полимерный носитель полимерного пролекарства.
3
Предпочтительно, X формулы (VII) представляет собой О.
1
1a
2
2a
3
3a
2
2
2
2
Таким образом, полимерный носитель присоединяется к любому из R, R, R, R, R, R, X или X формулы (VII), либо непосредственно (если L представляет собой одинарную химическую связь) или через спейсерный фрагмент (если L представляет собой спейсер).
1
9
9
9
9
9a
9
9a
9
9a
9
9
9
9a
9b
9
9
9a
9
9
9a
9
9a
9
9a
9
9a
9
9a
9b
9
9a
2
2
2
2
2
1-50
2-50
2-50
Необязательно L в формуле (VII) дополнительно замещен при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (VII), незамещен заместителем. Предпочтительно, один или более дополнительных необязательных заместителей независимо выбираются из группы, состоящей из галогена, CN, COOR, OR, C(O)R, C(O)N(RR), S(O)N(RR), S(O)N(RR), S(O)R, S(O)R, N(R)S(O)N(RR), SR, N(RR), NO, OC(O)R, N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)OR, N(R)C(O)N(RR), OC(O)N(RR), T, C алкила, C алкенила, C алкинила и,
1-50
2-50
2-50
1-50
2-50
2-50
2
2
2
2
10
11
11
11
11
11a
11
11
11
11
11
11
11
11a
11
11a
где Т, С алкил, С алкенил и С алкинил необязательно замещены одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными, и где С алкил; С алкенил и С алкинил, необязательно прерываются одной или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-; -О-; -С(О)-; -C(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)N(R)-; -S(O)-; -S(O)-; -N(R)S(O)N(R)-; -S-; -N(R)-; -OC(O)R; -N(R)C(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)S(O)-; -N(R)C(O)O-; -N(R)C(O)N(R)-; и -OC(O)N(RR);
3-10
10
T выбирается из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, С циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила и 9-11-членного гетеробициклила, где Т представляет собой необязательно замещенный одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными,
9
9a
9b
1-50
2-50
2-50
R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; Т и С алкила; С алкенила и С алкинила,
10
12
12
12
12
12a
12
12a
12
12a
12
12
12
12a
12b
12
12
12a
12
12
12a
12
12a
12
12a
12
12a
12
12a
12b
12
12a
2
2
2
2
2
1-6
1-6
R представляет собой галоген, CN, оксо (=О), COOR, OR, C(O)R, C(O)N(RR), S(O)N(RR), S(O)N(RR), S(O)R, S(O)R, N(R)S(O)N(RR), SR, N(RR), NO, OC(O)R, N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)OR, N(R)C(O)N(RR), OC(O)N(RR) или C алкил, где C алкил необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными,
11
11a
12
12a
12b
1-6
1-6
R, R, R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н или С алкила, где С алкил необязательно замещен одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными.
Термин "прерывается" означает, что вставляется группа между двумя атомами углерода или на конце углеродной цепи между углеродом и водородом.
1
Предпочтительные фрагменты L в соответствии с формулой (VII), которые выбираются из группы, состоящей из:
где
пунктирные линии показывают место присоединения к D формулы (VII);
1-4
R представляет собой Н или С алкил;
Y обозначает NH, О или S; и
1
1a
2
2a
3
3a
4
1
2
R, R, R, R, R, R, R, X, X, X имеют значения, указанные в формуле (VII).
1
Еще более предпочтительные фрагменты L формулы (VII) выбираются из группы, состоящей из:
где
пунктирные линии показывают место присоединения к D формулы (VII), и
1-4
R обозначает Н или С алкил;
Другое предпочтительное полимерное пролекарство указано с учетом конъюгата D-L, в котором
-D является биологически активным фрагментом; и
1
-L не является биологически активным линкерным фрагментом -L, представленным формулой (VIII),
1
1a
где пунктирная линия показывает место присоединения к биологически-активному фрагменту D, содержащему первичный амин или вторичный амин, с образованием амидной связи; и где X, R и R формулы (VIII) имеют следующие значения:
1-50
1-4
X представляет собой Н или С -алкил, необязательно прерванный одной или несколькими группами, выбранными из -NH-, -С(С-алкил) -, -О-, -С(О) - или -C(O)NH-;
1
1a
1
4
R и R независимо выбираются из группы, состоящей из Н и С-С алкила;
1
2
где L замещен одной группой L-Z и необязательно дополнительно замещен; где
2
L представляет одинарную химическую связь или спейсер; и
Z представляет полимерный носитель полимерного пролекарства.
1
1a
2
2
Таким образом, полимерный носитель присоединен к любому из R, R или X в формуле (VIII), либо непосредственно (если L является одинарной химической связью) или через спейсерный фрагмент (если L представляет собой спейсер).
Необязательно, субструктура формулы (VIII), дополнительно замещена.
1
1
Более предпочтительно, L формулы (VIII), содержит один из фрагментов формул (VIIIb) или (VIIIc), где пунктирная линия, отмеченная звездочкой, показывает место присоединения к D с помощью образования амидной связи с ароматической аминогруппой D, и немаркированная пунктирная линия показывает место присоединения к остальной части L формулы (VIII), и в котором структуры формул (VIIIb) и (VIIIc) необязательно дополнительно замещены:
1
Более предпочтительно, L формулы (VIII), содержит один из фрагментов формул (VIIIba), (VIIIca) или (VIIIcb), где пунктирная линия, отмеченная звездочкой показывает место присоединения к D формулы (VIII) посредством образования амидной связи с ароматической аминогруппой D, и немаркированная пунктирная линия показывает место присоединения к остальной части L в формуле (VIII):
Другой подходящий фрагмент обратимого пролекарственного линкера для лекарственных препаратов, содержащих ароматические амины, описан в WO-A 2011/012721. Соответственно, предпочтительное полимерное пролекарство указано с учетом конъюгата D-L, в котором
-D является биологически активным фрагментом; и
1
-L не является биологически активным линкерным фрагментом -L, представленным формулой (IX),
1
2
2
2a
где пунктирная линия указывает на место присоединения к ароматической аминогруппе биологически активного фрагмента D, содержащего ароматический амин, с образованием амидной связи; и где X, X, R и R формулы (IX), имеют следующие значения:
1
1
1a
3-7
X представляет собой C(RR) или циклический фрагмент, выбранный из С циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила и 9-11-членного гетеробициклила,
2
3
3a
3
3
3a
4
4a
3
3a
4
3
4
4a
3
3a
3
3a
X представляет собой химическую связь или выбирается из C(RR), N(R), О, C(RR)-C(RR), C(RR)-N(R), N(R)-C(RR), C(RR)-O и O-C(RR),
1
2
3
3a
3
где в случае, если X представляет собой циклический фрагмент, X представляет собой химическую связь, C(RR), N(R) или О,
1
2
3
3a
1
2
необязательно в случае, если X представляет собой циклический фрагмент и X представляет собой C(RR), порядок следования фрагмента X и фрагмента X, показанный в формуле (IX) может быть изменен,
1
3
4
5
5a
1-4
R, R и R независимо выбираются из группы, состоящей из Н, С алкила и - N(RR),
1a
2
2a
3a
4a
5a
1-4
R, R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, состоящей из Н и C алкила,
2a
2
2a
3a
2a
4a
необязательно одна из пар R/R, R/R, R/R соединена с образованием 4-7-членного по меньшей мере частично насыщенного гетероцикла,
5
6
R обозначает C(O)R,
6
1-4
R обозначает C-алкил,
1a
4a
3a
4a
1a
3a
необязательно, одна из пар R/R, R/R или R/R образует химическую связь; и
1
2
где L замещен одной группой L-Z и необязательно дополнительно замещен; и где
2
L представляет собой одинарную химическую связь или спейсер; и
Z представляет собой полимерный носитель полимерного пролекарства.
1
2
1
1a
2
2a
3
3a
4
5
5a
6
2
2
Таким образом, полимерный носитель присоединен к одному из X, X, R, R R, R, R, R, R, R, R или R формулы (IX), либо непосредственно (если L является одинарной химической связью) или через спейсерный фрагмент (если L представляет собой спейсер).
1
Более предпочтительно, фрагмент L в соответствии с формулой (IX), выбирается из следующих формул:
где пунктирная линия показывает место присоединения к биологически активного фрагмента D, и
1
2
R и R используются, как определено в формуле (IX).
1a
2
2a
3a
4a
5a
1-4
Предпочтительно, R, R, R, R, R и R формулы (IX), независимо выбираются из группы, состоящей из Н, и С алкила.
Другой подходящий обратимый пролекарстввенный линкерный фрагмент для лекарственных препаратов, содержащих ароматический амин, описан в WO 2011/012722. Соответственно, предпочтительная линкерная структура для полимерного пролекарства задается посредством конъюгации D-L, в котором
-D является биологически активный фрагментом; и
1
-L не является биологически активный линкером -L, представленной формулой (X),
1
2
2
где пунктирная линия показывает место присоединения к ароматической аминогруппе биологически активного фрагмента D, содержащего ароматический амин; и где X, X и R формулы (X), имеют следующие значения:
1
1
1a
3-7
X представляет собой C(RR) или циклический фрагмент, выбранный из С циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила и 9-11-членного гетеробициклила;
1
1
где в случае, если X представляет собой циклический фрагмент, указанный циклический фрагмент инкорпорирован через два соседних атомов и кольцевой атом X, который является соседним с атомом углерода амидной связи, является также углеродным атомом;
2
3
3a
3
3
3a
4
4a
3
3a
4
3
4
4a
3
3a
3
3a
X представляет собой химическую связь или выбирается из C(RR), N(R), О, C(RR)-C(RR), C(RR)-N(R), N(R)-C(RR), C(RR)-O и O-C(RR);
1
2
3
3a
3
где в случае, если X представляет собой циклический фрагмент, X представляет собой химическую связь, C(RR), N(R) или О;
1
2
3
3a
1
2
необязательно в случае, если X представляет собой циклический фрагмент и X представляет собой C(RR), порядок следования фрагмента X и фрагмента X, показанный в формуле (X), может быть изменен, и циклический фрагмент является инкорпорированным в субструктуру формулы (X) с помощью двух соседних кольцевых атомов;
1
3
4
5
5a
1-4
R, R и R независимо выбираются из группы, состоящей из Н, C алкила и -N(RR);
1a
2
3a
4a
5a
1-4
R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, состоящей из Н и С алкила;
5
6
R обозначает C(O)R;
6
1-4
R обозначает С-алкил;
1a
4a
3a
4a
1a
3a
необязательно одна из пар R/R, R/R или R/R образует химическую связь при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (X), не замещен;
1
2
где L замещен одной группой L-Z и необязательно дополнительно замещен при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (X), незамещен; и где
2
L представляет собой одинарную химическую связь или спейсер; и
Z представляет собой полимерный носитель полимерного пролекарства.
1
2
1
1a
2
3
3a
4
5
5a
6
2
2
Таким образом, полимерный носитель присоединен к одному из X, X, R, R, R, R, R, R, R, R или R формулы (X), либо непосредственно (если L является одинарной химической связью) или через спейсерный фрагмент (если L представляет собой спейсер).
1
Более предпочтительно, фрагмент L формулы (X) выбирается из группы, состоящей из формул (i) - (xxix):
где пунктирная линия показывает место присоединения D, и
1
1a
2
3
5
R, R, R, R, и R используются, как определено в формуле (X).
1
1
1
1
2
1
2
1-4
Аминозаместитель ароматического фрагмента D образует вместе с карбонильным фрагментом (-С(О)-) с правой стороны L (как показано в формуле (X)) амидную связь между L и D. Как следствие D и L формулы (X) связаны (химически связаны) посредством амидного фрагмента общей структуры Y-C(O)-N(R)-Y. Y обозначает остальные части субструктуры формулы (X) и Y обозначает ароматический фрагмент D. R представляет собой заместитель, такой как С-алкил или, что предпочтительно, водород.
1
1
1
1
1
2
1
1
3-7
Как указано выше, X формулы (X) может также быть циклическим фрагментом, таким как С циклоалкил, фенил или инданил. В случае, если X является таким циклическим фрагментом, соответствующий циклический фрагмент инкорпорируют в L формулы (X) с помощью двух соседних кольцевых атомов (упомянутого циклического фрагмента). Например, если X представляет собой фенил, фенильный фрагмент L связан с X L через первый кольцевой атом (фенил), расположенный в α-положении (соседний) ко второму (фенил) кольцевому атому, который сам по себе связан с углеродным атомом карбонильного фрагмента на правой стороне L в соответствии с формулой (X), т.е. карбонильный фрагмент, который вместе с ароматической аминогруппой D образует амидную связь.
1
Предпочтительно, L формулы (X) определяется следующим образом:
1
1
1a
X представляет собой C(RR), циклогексил, фенил, пиридинил, норборненил, фуранил, пирролил или тиенил,
1
1
где в случае, если X представляет собой циклический фрагмент, указанный циклический фрагмент инкорпорируют в L формулы (X) с помощью двух соседних кольцевых атомов;
2
3
3a
3
3
3a
3
3a
4
4a
X представляет собой химическую связь или выбирается из C(RR), N(R), О, C(RR)-O или C(RR)-C(RR);
1
3
4
5
5a
1-4
R, R и R независимо выбираются из Н, С алкила и -N(RR);
1a
3a
4a
5a
1-4
R, R, R и R независимо выбираются из Н и С алкила;
2
1-4
R обозначает С-алкил;
5
6
R обозначает C(O)R;
6
1-4
R обозначает С-алкил;
1
Более предпочтительно, L формулы (X) выбирается из следующих формул (i) -(xxix):
где пунктирная линия показывает место присоединения к D,
5
6
R обозначает C(O)R, и
1
1a
2
3
6
R, R, R, R и R обозначают независимо друг от друга 1-4 алкил.
Другие подходящие обратимые пролекарственные линкерные фрагменты для лекарственных препаратов, содержащих гидроксильные группы, описаны в WO 2011/012721. Соответственно, предпочтительным полимерным пролекарством дается формула (XI):
где,
0
0
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий гидроксильную группу, содержащий, О, т.е. кислород формулы (XI), который соединен с фрагментом Z через указанный кислород гидроксильной группы; и где Z формулы (XI) имеет следующее значение:
0
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
2
0
1
1
0
1
0
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
2
0
1
1
0
1
1
2
0
1
2
2
2
Z обозначает C(O)-X-Z; C(O)O-X-Z; S(O)-X-Z; C(S)-X-Z; S(O)O-X-Z; S(O)N(R)-X-Z; CH(OR)-X-Z; C(OR)(OR)-X-Z; C(O)N(R)-X-Z; P(=O)(OH)O-X-Z; P(=O)(OR)O-X-Z; P(=O)(SH)O-X-Z; P(=O)(SR)O-X-Z; P(=O)(OR)-X-Z; P(=S)(OH)O-X-Z; P(=S)(OR)O-X-Z; P(=S)(OH)N(R)-X-Z; P(=S)(OR)N(R)-X-Z; P(=O)(OH)N(R)-X-Z или P(=O)(OR)N(R)-X-Z;
1
2
1-6
R, R независимо выбираются из группы, состоящей из C алкила; или
1
2
1-6
R, R совместно образуют С алкиленовую мостиковую группу;
0
0A
0B
m1
m2
Х обозначает (X)-(X);
m1 и m2 независимо равны 0 или 1;
0А
0
Х обозначает Т;
0B
3
1-10
X представляет собой разветвленную или неразветвленную С алкиленовую группу, которая является незамещенной или замещенной одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
3
4
4
4
4
4
4a
4
4a
4
4a
4
4
4
4a
4b
4
4
4a
4
4
4a
4
4a
4
4a
4
4a
4b
4
4a
4
4a
0
2
2
2
2
2
R представляет собой галоген; CN; C(O)R; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)SOR; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR) или T;
4
4a
4b
0
5
1-4
2-4
2-4
1-4
2-4
2-4
R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; Т; С алкила; С алкенила и С алкинила, где С алкил; С алкенил и С алкинил необязательно замещены одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
5
6
6
6
6
6
6a
6
6a
6
6a
6
6
6
6a
6b
6
6
6a
6
6
6a
6
6a
6
6a
6
6a
6b
6
6a
6
6a
2
2
2
2
2
R представляет собой галоген; CN; C(O)R; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)SOR; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR);
6
6a
6b
1-6
2-6
2-6
1-6
2-6
2-6
R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; С алкила; С алкенила и С алкинила, где С алкил; С алкенил и С-алкинил являются необязательно замещенными одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными;
0
0
7
3-7
Т обозначает фенил; нафтил; азуленил; инденил; инданил; С циклоалкил; 3-7-членный гетероциклил; или 8-11-членный гетеробициклил, где Т необязательно замещен одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
7
8
8
8
8
8a
8
8a
8
8a
8
8
8
8a
8b
8
8
8a
8
8
8a
8
8a
8
8a
8
8a
8
8a
8b
8
8a
9
2
2
2
2
2
1-6
2-6
2-6
1-6
2-6
2-6
R обозначает галоген; CN; COOR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)OR; N(R)C(O)N(RR); OC(O)N(RR); оксо (=О), где кольцо является по меньшей мере частично насыщенным; C алкил; С алкенил или С алкинил, где С алкил; С алкенил и С-алкинил необязательно замещены одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
8
8a
8b
10
1-6
2-6
2-6
1-6
2-6
2-6
R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; C алкила; С алкенила и С алкинила, где C алкил; С алкенил и С-алкинил, необязательно замещены одним или несколькими R, которые являются одинаковыми или различными;
9
10
11
11
11
11
11
11a
11
11a
11
11a
11
11
11
11a
11b
11
11
11a
11
11
11a
11
11a
11
11a
11
11a
11b
11
11a
11
11a
2
2
2
2
2
R, R независимо выбираются из группы, состоящей из галогена; CN; C(O)R; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)SOR; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR и OC(O)N(RR);
11
11a
11b
1-6
2-6
1-6
2-6
2-6
R, R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н; C алкила; 2-6 алкенила и С алкинила, где C алкил; С алкенил и С-алкинил необязательно замещены одним или несколькими атомами галогена, которые являются одинаковыми или различными;
1
0
Z означает полимерный носитель полимерного пролекарства, который ковалентно присоединен к Х.
0
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
0
1
2
Предпочтительно, Z обозначает C(O)-X-Z; C(O)O-X-Z или S(O)-X-Z. Более предпочтительно, Z обозначает C(O)-X-Z или C(O)O-X-Z. Еще более предпочтительно, Z обозначает C(O)-X-Z.
0
Предпочтительно, Х является незамещенным.
Предпочтительно, m1 равно 0 и m2 равно 1.
0
0
1
2
0
1
2
1
2
0
2
1-4
2
n
Предпочтительно, X-Z представляет собой C(RR)CH-Z, где R, R независимо выбираются из группы, состоящей из Н и С алкила, при условии, что по меньшей мере один из R, R отличается от Н; или (CH)-Z, где N=3, 4, 5, 6, 7 или 8.
1
0
Предпочтительно, Z ковалентно присоединен к Х через амидную группу.
Другой подходящий обратимый пролекарственный линкерный фрагмент для лекарственных препаратов, содержащих ароматические гидроксильные группы, описан в WO-A 2011/089214. Соответственно, предпочтительный полимерное пролекарство задается посредством конъюгата D-L, в котором
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий ароматическую гидроксильную группу; и
L не является биологически активным линкером, который содержит
1
i) фрагмент L, представленный формулой (XII),
1
1
2
2a
3
3a
где пунктирная линия указывает на место присоединения L к ароматической гидроксильной группе D посредством образования карбаматной группы и R, R, R, R, R и m формулы (XII), имеют следующие значения:
1
1-4
3-7
R выбирается из группы, состоящей из С алкила, гетероалкила, С циклоалкила, и
2
2a
3
3a
1-4
каждый R, каждые R, R, R независимо выбираются из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического С алкила или гетероалкила,
m равно 2, 3 или 4.
2
2
ii) фрагмент L, который является химической связью или спейсером, и L связан с полимерным носителем полимерного пролекарства;
1
2
где L замещен одним L фрагментом.
Необязательно, L дополнительно замещен.
1
2
2a
3
3a
2
2
Таким образом, полимерный носитель присоединяется к любому из R, R, R, R или R формулы (XII), либо непосредственно (если L является одинарной химической связью) или через спейсерный остаток (если L представляет собой спейсер).
Другой подходящий обратимый пролекарственный линкер для лекарственных препаратов, содержащих алифатический амин, описан в WO-A 2011/089216. Соответственно, предпочтительное полимерное пролекарство задается посредством конъюгата D-L,
где
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий алифатический амин; и
L не является биологически активным линкером, содержащим
1
i) фрагмент L, представленного формулой (XIII),
1
1
1
2
2a
3
3a
4
4a
где пунктирная линия указывает на место присоединения к L к алифатической аминогруппе D с образованием амидной связи и где X, R, R, R, R, R, R и R формулы (XIII), имеют следующие значения:
1
1a
X выбирается из О, S и CH-R;
1
1a
3
R и R независимо выбираются из Н, ОН и СН;
2
2a
4
4a
1-4
R, R, R и R независимо выбираются из Н и С алкила;
3
3a
5
1-4
R, R независимо выбираются из Н, С алкила, и R
5
R выбирается из
2
2
ii) фрагмент L, который является химической связью или спейсером, и L связан с Z, который является полимерным носителем полимерного пролекарства;
1
2
где L замещен одним L фрагментом,
необязательно L дополнительно замещен.
1
1
2
2a
3
3a
4
4a
2
2
Таким образом, полимерный носитель присоединяется к одному из X, R, R, R, R, R, R или R формулы (XIII), либо непосредственно (если L является одинарной химической связью) или через спейсерный остаток (если L представляет собой спейсер).
3
3a
5
Предпочтительно, один из пары R/R формулы (XIII) представляет собой Н, а другой выбирается из R.
4
4a
Предпочтительно, один из R/R формулы (XIII) представляет собой Н.
3
3a
4
4a
3
4
3-7
Необязательно одна или несколько из пар R/R, R/R, R/R формулы (XIII) могут независимо образовать один или более циклических фрагментов, выбранных из С циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, или 9-11-членного гетеробициклила.
3
3a
4
4a
1-6
2-6
2-6
Необязательно R, R, R и R формулы (XIII) дополнительно замещены. Подходящие заместители представляют собой алкильные (например, C алкил), алкенильные (например, С алкенил), алкинильные (например, С алкинил), арильные (например, фенил), гетероалкильные, гетероалкенильные, гетероалкинильные, гетероарилльные (например, ароматический 4-7-членный гетероцикл) или галогенные фрагменты.
Другой подходящий обратимый пролекарственный линкерный фрагмент для лекарственных препаратов, содержащих ароматический амин, описан в WO-A 2011/089215. Соответственно, предпочтительное полимерное пролекарство задается посредством конъюгата D-L,
где
D представляет собой ароматический амин, содержащий биологически активный фрагмент; и
L не является биологически активным линкером, содержащий
1
i) фрагмент L, представленный формулой (XIV),
1
1
1a
2
3
3a
4
4a
где пунктирная линия указывает на место присоединения L к ароматической аминогруппе D с образованием амидной связи и где R, R, R, R, R, R и R формулы (XIV), имеют следующие значения:
1
1a
2
3
3a
4
4a
1-4
R, R, R, R, R, R и R независимо выбираются из Н и С алкила,
1
1a
2
3
3a
4
4a
3-7
необязательно любые два из R, R, R, R, R, R и R могут независимо образовать один или более циклических фрагментов, выбранных из С циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила или 9-11-членного гетеробициклила,
1
1a
2
3
3a
4
4a
необязательно R, R, R, R, R, R и R дополнительно замещены; подходящие заместители представляют собой алкильные, алкеновые, алкиновые, арильные, гетероалкильные, гетероалкеновые, гетероалкиновые, гетероарильные или галогенные фрагменты.
2
2
ii) фрагмент L, который является химической связью или спейсером, и L связывается с Z, который является полимерным носителем полимерного пролекарства;
1
2
где L замещен одним фрагментом L,
необязательно L дополнительно замещен.
1-6
2-6
2-6
Подходящие заместители представляют собой алкильные (например, C алкил), алкенильные (например, С алкенил), алкинильные (например, С алкинил), арильные (например, фенил), гетероалкильные, гетероалкенильные, гетероалкинильные, гетероарильные (например, ароматический 4-7-членный гетероцикл) или галогенные фрагменты.
1
1a
2
3
3a
4
4a
2
2
Таким образом, полимерный носитель присоединяется к любому из R, R, R, R, R, R или R формулы (XIV), либо непосредственно (если L является одинарной химической связью) или через спейсерный фрагмент (если L является спейсером).
4
4a
Предпочтительно, один из R или R формулы (XIV) представляет собой Н.
Другой подходящий обратимый пролекарственный линкерный фрагмент описан в патенте США 7585837. Соответственно, предпочтительное полимерное пролекарство задается посредством пролекарственного конъюгата D-L, в котором
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий амин, карбоксил, фосфат, гидроксил или меркаптогруппу; и
L не является биологически активным линкером, содержащий
1
i) фрагмент L, представленный формулой (XV):
1
1
2
3
4
где пунктирная линия указывает на место присоединения L к функциональной группе лекарства D, причем такая функциональная группы выбирается из амино, карбоксила, фосфата, гидроксила и меркапто; и где R, R, R и R формулы (XV), определяются следующим образом:
1
2
5
3
2
3
2
3
2
R и R независимо выбираются из группы, состоящей из водорода, алкила, алкокси, алкоксиалкила, арила, алкарила, аралкила, галогена, нитро, -SOH, -SONHR, амино, аммония, карбоксила, POH, и OPOH;
3
4
5
R, R и R независимо выбираются из группы, состоящей из водорода, алкила, арила и;
2
2
ii) фрагмент L, который является химической связью или спейсером, и L связан с полимерным носителем полимерного пролекарства и
1
2
где L замещен одним L фрагментом.
Необязательно, L дополнительно замещен.
1
2
3
4
2
2
Таким образом, гидрогель прикрепляется к любому из R, R, R или R формулы (XV), либо непосредственно (если L является одинарной химической связью) или через спейсерный остаток (если L представляет собой спейсер).
Другой подходящий обратимый пролекарственный линкерный фрагмент описан в WO-A 2002/089789. Соответственно, предпочтительное полимерное пролекарство показано в формуле (XVI):
1
1
2
1
2
3
4
5
6
где D, X, у, Ar, L, Y, Y, R, R, R, R, R, R формулы (XVI) определяются следующим образом:
D представляет собой биологически активный фрагмент;
1
L представляет собой бифункциональную связывающую группу;
1
2
7
Y и Y обозначают независимо О, S или NR;
1
R представляет собой полимерный носитель;
2-7
1-6
3-12
3-8
1-6
3-8
1-6
1-6
1-6
1-6
R независимо выбираются из группы, состоящей из водорода, C алкилов, С разветвленных алкилов, С циклоалкилов, C замещенных алкилов, С замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C гетероалкилов, замещенных C гетероалкилов, C алкокси, фенокси и C гетероалкокси;
Ar представляет собой фрагмент, который при включении в формулу XI, образует полизамещенный ароматический углеводород или полизамещенную гетероциклическую группу;
Z представляет собой либо химическую связь, либо группу, которая активно транспортируется в клетку-мишень, гидрофобный фрагмент или их комбинации;
у равен 0 или 1;
X представляет собой химическую связь или группу, которая активно транспортируется в клетку-мишень, гидрофобный фрагмент или их комбинации.
Другой подходящий обратимый пролекарственный линкер описан в WO-A 2001/47562. Соответственно, предпочтительным полимерное пролекарство задается формулой (XVII):
где D, L, z и Ar формулы (XVII), имеют следующие значения:
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий амин, содержащий NH;
L представляет собой ковалентную связь, предпочтительно гидролитически стабильную связь;
Ar представляет собой ароматическую группу; и
z представляет собой полимерный носитель.
Еще один подходящий обратимый пролекарственный линкерный фрагмент описан в патенте США 7393953 В2. Соответственно, предпочтительное полимерное пролекарство задается формулой (XVIII):
1
1
где R1, L, Y, р и D формулы (XVIII), имеют следующие значения:
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий гетероароматический амин, связанный через гетероароматический амин группы D с остальной частью субструктуры формулы (XVIII);
1
2
Y представляет собой О, S, или NR;
р равно 0 или 1;
1
2
2
m
2
m
3
2
2
m
4
5
m
4
5
m
8
7
q
3
2
m
4
5
m
3
2
2
m
2
m
3
2
2
m
3
4
5
m
4
5
m
2
2
m
L представляет собой бифункциональный линкер, такой как, например, -NH(CHCHO)(CH)NR-, -NH(CHCHO)C(O)-, -NH(CRR)OC(O)-, -C(O)(CRR)NHC(O)(CRR)NR, -C(O)O(CH)O-, -C(O)(CRR)NR-, -C(O)NH(CHCHO)(CH)NR-, -C(O)O-(CHCHO)NR-, -C(O)NH(CRR)O-, -C(O)O(CRR)O, -C(O)NH(CHCHO)-,
2
3
4
5
7
8
1-6
3-12
3-8
1-6
3-8
1-6
1-6
1-6
1-6
R, R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, состоящей из водорода, C алкилов, C разветвленных алкилов, C циклоалкилов, C замещенных алкилов, С замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C гетероалкилов, замещенных C гетероалкилов, C алкокси, фенокси и C гетероалкокси;
6
1-6
3-12
3-8
1-6
3-8
1-6
1-6
1-6
1-6
2
R выбирается из группы, состоящей из водорода, C алкилов, С разветвленных алкилов, С циклоалкилов, C замещенных алкилов, С замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C гетероалкилов, замещенных C гетероалкилов, C алкокси, фенокси и C гетероалкокси, NO, галогеналкила и галогена; и
m и q выбираются независимо друг от друга, и каждый представляет собой положительное целое число.
Другое предпочтительное полимерное про лекарство задается формулой (XIX):
1
2
3
4
1
где D, R, R, R, R, Y и n формулы (XIX), имеют следующие значения:
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащих карбоксильную группу, содержащий О формулы (XIX),
1
3-10
3-10
R выбирается из группы незамещенного алкила; замещенного алкила; незамещенного фенила; замещенного фенила; незамещенного нафтила; замещенного нафтила; незамещенного инденила; замещенного инденила; незамещенного инданила, замещенного инданила; незамещенного тетралинила; замещенного тетралинила; незамещенного С циклоалкила; замещенного С циклоалкила; незамещенного 4-7-членного гетероциклила; замещенного 4-7-членного гетероциклила; незамещенного 9-11-членного гетеробициклила и замещенного 9-11-членного гетеробициклила;
2
R выбирается из Н, незамещенного алкила и замещенного алкила;
3
4
R и R независимо выбираются из группы, состоящей из Н, незамещенного алкила, замещенного алкила и;
Q обозначает спейсерный фрагмент;
n равен 0 или 1,
1
3
необязательно R и R соединены вместе с атомами, к которым они присоединены, с образованием кольца А,
3-10
А выбирается из группы, состоящей из С циклоалкила; 4-7-членного алифатического гетероциклила и 9-11-членного алифатического гетеробициклила, где А является незамещенным или замещенным;
1
Y представляет собой полимерный носитель.
1
1-6
1-6
1-4
1-4
Предпочтительно R формулы (XIX), является C алкилом или замещенным C-алкилом, более предпочтительно C-алкилом или замещенным С-алкилом.
1
Более предпочтительно R формулы (XIX), выбирается из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор.-бутила, трет.-бутила и бензила.
2
Предпочтительно, R формулы (XIX) представляет собой Н.
3
3
1-6
1-6
1-4
1-4
Предпочтительно, R формулы (XIX), представляет собой Н, С алкил или замещенный C-алкил, более предпочтительно C-алкил или замещенный C-алкил. Более предпочтительно, R выбирается из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор.-бутила, трет.-бутила и бензила.
3
Более предпочтительно, R формулы (XIX) представляет собой Н.
4
4
1-6
1-6
1-4
1-4
Предпочтительно, R формулы (XIX), обозначает S Н, C алкил или замещенный C-алкил, более предпочтительно С-алкил или замещенный С-алкил. Более предпочтительно, R выбирается из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор.-бутила, трет.-бутила, и бензила.
4
Более предпочтительно, R формулы (XIX) представляет собой Н.
1
3
В другом предпочтительном варианте выполнения R и R формулы (XIX) соединены вместе с атомами, к которым они присоединены, с образованиям кольца А, где А выбирается из группы, состоящей из циклопропана, циклобутана, циклопентана, циклогексана и циклогептана.
Другое предпочтительное полимерное пролекарство задается формулой (XX):
1
где D, Y и W формулы (XX) имеют следующие значения:
D представляет собой биологически активный фрагмент, содержащий карбоксильную группу, содержащий О формулы (XX),
1-15
W выбирается из линейного C алкила; и
1
Y представляет собой полимерный носитель полимерного пролекарства.
Полимерное пролекарство содержит один или более биологически активных фрагментов, которые соединены с полимерным носителем посредством обратимых пролекарственных линкеров. В одном варианте выполнения биологически активные фрагменты высвобождаются в сустав из полимерного пролекарства в качестве лекарственных молекул.
В предпочтительном варианте выполнения один или более биологически активных фрагментов полимерных пролекарств, предпочтительно выбирается из группы, состоящей из (i) нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), (ii) модифицирующих заболевание противоревматических препаратов (МЗПРП)), (iii) и кортикостероидов (iv) биологических препаратов (например, антитела, их фрагменты и слитые белки, связывающие белки, пептиды и рекомбинантные белки). Любой специалист в данной области техники легко опознает соединения, принадлежащие к каждой из этих категорий, и такие препараты, принадлежащие к этим категориям, включены в данный документ в качестве пригодных для настоящего изобретения.
Более предпочтительно, один или более биологически активных фрагментов для полимерных пролекарств предпочтительно выбираются из группы, состоящей из (i) нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), (ii) модифицирующих заболевание противоревматических препаратов (МЗПРП), (iii) кортикостероидов и (iv) биологических препаратов (например, антител, их фрагментов и слитых белков, связывающих белков, пептидов и рекомбинантных белков). Любой специалист в данной области техники легко опознает соединения, принадлежащие к каждой из этих категорий, и такие препараты, принадлежащие к этим категориям, включены в данном документ в качестве пригодных для настоящего изобретения.
В другом предпочтительном варианте выполнения один или более биологически активных фрагментов для полимерных пролекарств выбирается из группы, состоящей из индометацина; нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), таких как аспирин, ибупрофен и другие производные пропионовой кислоты (таких как алминопрофен, беноксапрофен, буклоксовая кислота, карпрофен, фенбуфен, фенопрофен, флупрофен, флурбипрофен, индопрофен, кетопрофен, напроксен, миропрофен, оксапрозин, пирпрофен, пранопрофен, супрофен, тиапрофенова кислота и тиоксапрофен); производные уксусной кислоты (такие как индометацин, ацеметацин, альклофенак, клиданак, диклофенак, фенклофенак, фенклозовая кислота, фентиазак, фурофенак, ибуфенак, изоксепак, сулиндак, оксипинак, тиопинак, толметин, зидометацин и зомепирак); производные фенамовой кислоты (такие как флуфенаминовая кислота, меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота, нифлумовая кислота и толфенамовая кислота); производные бифенилкарбоновой кислоты (например, дифлунизал и флуфенизал); оксикамы (например, изоксикам, пироксикам, судоксикам и теноксикам); салицилаты (например, ацетилсалициловая кислота, сульфасалазин) и пиразолоны (например, апазон, бензпиперилон, фепразон, мофебутазон, оксифенбутазон, фенилбутазон) и опиоидных анальгетиков (например, такие как фентанил, морфин, суфентанил, гидроморфон, метадон, оксикодон, бупреморфин); метотрексат, ингибиторы циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) (например, целекоксиб), анти-TNF агенты (такие как адалимумаб, цертолизимаб пегол, этанерцепт, инфликсимаб, голимумаб); анти-IL-1, -6, -12, -15, -18 и -21 и -23 агенты (такие как анакинр, тоцилизумаб); ингибиторы фактора роста нервов, антагонисты рецепторов фактора роста нервов (NGFR), RN64, REGN475, фазинумаб, танезумаб, MEDI578, АВТ110, анти-NGF антитела и производные антител, и анти-NGFR антитела и производные антител; TrkA антагонисты (такие как ARRY-470, FX007, ARRY 872) глюкокортикоиды или стероиды (например, кортизон, преднизолон, дексаметазон, фторметолон, медризон, лотепреднол, флуазакорт, гидрокортизон, преднизолон, бетаметазон, клобетазон, преднизон, метилпреднизолон, триамцинолона гексацетонид, параметазона ацетата, дифлоразон, флуоцинонид, флуоцинолон, триамцинолон, их производные и их смеси); местные анальгетики (например, лидокаин, бупивакаин, прокаин); лефлуномид; иммуномодулирующие агенты (такие как циклоспорин, такролимус, азатиоприн, циклофосфамид, миноциклин, ритуксимаб); соединения золота; D-пеницилламин; сульфасалазин; производные хлорохина (включая, но не ограничиваясь этим, гидроксихлорохин); антитела направленные против CD20, такие как окрелизумаб и офатумумаб; RANKL ингибиторы, такие как деносумаб; TRU-015; INCB018424; VX-V02; костный морфогенетический белок (BMP) (например, BMP-I, ВМР-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8, ВМР-9, ВМР-10, BMP-11, ВМР-12, ВМР-13, ВМР-14, ВМР-15, ВМР-16, ВМР-17, ВМР-18, ВМР-19, ВМР-20, ВМР-21); FGF (факторы роста фибробластов, например, FGF1, FGF2, FGF4, FGF7, FGF10, FGF19, FGF21, FGF23); TGF-β (трансформирующий фактора роста β, такой как TGF β1); гормон роста; IGF (инсулиноподобный фактор роста, такой как IGF-1); NELL пептиды; VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста); PDGF (тромбоцитарный фактор роста); РТН (паратгормон)/PTHrp (РТНрегулируемый белок); оксистеролы; липофильные статины, статины (например, аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин, симвастатин); фактор роста/дифференциации 5 (GDF5); LIM белки минерализации (LMPS); матричные металлопротеиназы; аггреканазы (ADAMTSs); цистеин-зависимые катепсины; факторы роста, и молекулы клеточной адгезии (САМ); бисфосфонаты(ы) (включающие как N-содержащие, так и несодержащие N бисфосфонаты(ы), выбранные из группы, включающей: памидронат, неридронат, олпадронат, алендронат, ибандронат, ризедронат и золедронат. Несодержащими бисфосфонатами, являются, например, этидронат, клодронат и тилудронат).
Более предпочтительно, один или более биологически активных фрагментов для полимерных пролекарств выбирается из группы, состоящей из индометацина; нестероидных противовоспалительные препараты (НПВП), таких как аспирин, ибупрофен и других производных пропионовой кислоты (таких как алминопрофен, беноксапрофен, буклоксовая кислота, карпрофен, фенбуфен, фенопрофен, флупрофен, флурбипрофен, индопрофен, кетопрофен, напроксен, мерипрофен, оксапрозин, пирпрофен, пранопрофен, супрофен, тиапрофеновая кислота и тиоксапрофен); производных уксусной кислоты (таких как индометацин, ацеметацин, альклофенак, клиданак, диклофенак, фенклофенак, фенклозовая кислота, фентиазак, fuirofenac, ибуфенак, изоксепак, сулиндак, оксипинак, тиопинак, толметин зидометацин и зомепирак); производные фенамовой кислоты (такие как флуфенаминовая кислота, меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота, нифлумовая кислота и толфенамовая кислота); производные бифенилкарбоновой кислоты (например, дифлунизал и флуфенизал); оксикамы (например, изоксикам, пироксикам, судоксикам и теноксикам); салицилаты (например, ацетилсалициловая кислота, сульфасалазин) и пиразолоны (например, апазон, бензпиперилон, фепразон, мофебутазон, оксифенбутазон, фенилбутазон) и опиоидные анальгетики (например, такие как фентанил, морфин, суфентанила, гидроморфон, метадон, оксикодон, бупреморфин); метотрексат, ингибиторы циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) (например, целекоксиб), анти-TNF агенты (такие как адалимумаб, цертолизимаб пегол, этанерцепт, инфликсимаб, голимумаб); анти-IL-1, -6, -12, -15, -18 и -21 и -23 агенты (такие как анакинр, тоцилизумаб); глюкокортикоиды или стероиды (например, кортизон, преднизолон, дексаметазон, фторметолон, медризон, лотепреднол, флуазакорт, гидрокортизон, преднизолон, бетаметазон, преднизолон, клобетазон, метилпреднизолон, триамцинолона гексацетонид, параметазона ацетат, дифлоразон, флуоцинонид, флуоцинолон, триамцинолон, их производные и их смеси); местные анальгетики (например, лидокаин, бупивакаин, прокаин); лефлуномид; иммуномодулирующие агенты (такие как циклоспорин, такролимус, азатиоприн, циклофосфамид, миноциклин, ритуксимаб); соединения золота; D-пеницилламин; сульфасалазин; производные хлорохина; окрелизумаб; офатумумаб; деносумаб; TRU-015; INCB018424; VX-V02; костный морфогенетический белок (BMP) (например, BMP-I, ВМР-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8, ВМР-9, ВМР-10, BMP-11, ВМР-12, ВМР-13, ВМР-14, ВМР-15, ВМР-16, ВМР-17, ВМР-18, ВМР-19, ВМР-20, ВМР-21); FGF (факторы роста фибробластов, например, FGF1, FGF2, FGF4, FGF7, FGF10, FGF19, FGF21, FGF23); TGF-β (трансформирующий фактор роста β, такие как TGF β1); гормон роста; IGF (инсулиноподобный фактор роста, такой как IGF-1); NELL пептиды; VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста); PDGF (тромбоцитарный фактор роста); РТН (паратгормон)/ PTHrp (РТНрегулируемый белок); оксистеролы; липофильные статины; фактор роста/дифференциации 5 (GDF5); LIM белки минерализации (LMPS); матричные металлопротеиназы; аггреканазы (ADAMTSs); цистеин-зависимые катепсины; факторы роста; и молекулы клеточной адгезии (САМ).
Один или более биологически активных фрагментов для полимерных пролекарств могут быть также натуральным продуктом, выделенным или синтезированным, и его производным, включая антрахиноны и их пролекарства, такие как реин, диацереин, аргиреин и алоэ-эмодин.
Один или более биологически активных фрагментов для полимерных пролекарств могут также быть ингибиторами митоген-активируемой протеинкиназы (MAP) Р38, такие как FX-005, ARRY-797, дорамапимод, памапимод, SB203580, SB202190, LY2228820, VX-702, РН-797804, ТАК715, VX-745, SCIO469, ORG48762-0, производные пиразолопиридина, R1503, 5-аминопиразол-4-ил кетоны и AMG-548; ингибитор активности матричной металлопротеиназы (ММР), такие, как ALS 1-0635, AC-RCGVPD-NH2 пептид, N-замещенные 4-арилсульфонилпиперидин-4-гидроксамовые кислоты, 4-аминопролины, бензиловые эфиры 6-бензил-5,7-диоксо 6,7-дигидро-5Н-тиазол[3,2-с]пиримидин-2-карбоновой кислоты, 4-[1-метил-2,4-диоксо-6-(3-фенил-проп-1-инил)-1,4-дигидро-2Н-хиназолин-3-ил]бензойные кислоты и галардин; ингибитор тирозин-киназы, такой как генистеин, гербимицин А, 4,5-дианилинофталимид (DAPH), тирфостин AG 82, тирфостин AG 556, антрапиразолоны иматиниб, гефитиниб, эрлотиниб, сунитиниб, полиоксипрегнан полигидроксипрегнан гликозид (PPG) и сорафениб.
В другом предпочтительном варианте выполнения один или более биологически активных фрагментов для полимерных пролекарств представляют собой диагностический агент, такой как контрастирующий агент. Такие агенты известны в данной области техники.
Полимерное пролекарство или фармацевтическая композиция, содержащая полимерное пролекарство, может содержать один или более биологически активных фрагментов. Высвобождение биологически активных фрагментов может происходить с одинаковым или различным периодами полувысвобождения.
В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения полимерное пролекарство содержит дексаметазон в качестве биологически активного фрагмента, т.е. полимерное пролекарство представляет собой полимерное пролекарство дексаметазона.
Предпочтительно, пролекарство дексаметазона содержит гидрогель, более предпочтительно, гидрогель на основе ПЭГ. Предпочтительными вариантами гидрогеля на основе ПЭГ являются такими, как описано выше.
Предпочтительно, пролекарство дексаметазона содержит обратимый пролекарственный линкерный фрагмент формулы (IX).
Еще более предпочтительно, пролекарство дексаметазона соответствует формуле (IXc):
где
n равно 2.
В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения полимерное пролекарство содержит IL-1ra в качестве биологически активного фрагмента, т.е. полимерное пролекарство представляет собой полимерное пролекарство IL-1ra.
Предпочтительно, чтобы пролекарство IL-1ra содержало бы гидрогель, более предпочтительно, гидрогель на основе ПЭГ. Предпочтительными вариантами гидрогеля на основе ПЭГ являются такими, как описано выше.
Предпочтительно, пролекарство IL-1ra содержит обратимый пролекарственный линкерный фрагмент формулы (VII).
Предпочтительно, обратимый пролекарственный линкер формулы (VII) соединен с гидрогелем на основе ПЭГ посредством спейсерного фрагмента. Предпочтительно, спейсерный фрагмент имеет молекулярную массу в диапазоне от 14 г/моль до 750 г/моль.
Предпочтительно, спейсерный фрагмент присоединен к гидрогелю на основе ПЭГ с помощью терминальной группы, выбранной из
В случае, если спейсерный фрагмент имеет такую терминальную группу, предпочтительно, чтобы спейсерный фрагмент имел бы молекулярную массу в диапазоне от 14 г/моль до 500 г/моль, рассчитанной без такой терминальной группы.
Наиболее предпочтительно, чтобы пролекарство IL-1ra было представлено формулой (VIIa) или (VIIb):
где
D представляет собой фрагмент IL-1ra, который соединен с остальной частью молекулы через аминную функциональную группу IL-1ra с образованием амидной связи;
3
3
10b
1-6
R, R и R независимо друг от друга выбираются из Н и C алкила; и
2
SP является спейсерным фрагментом.
10b
10b
10b
10b
Предпочтительно, R формулы (VIIb) представляет собой метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил или трет.-бутил. Более предпочтительно, R формулы (VIIb) представляет собой метил, этил, пропил или изопропил. Еще более предпочтительно, R формулы (VIIb) представляет собой метил или этил, и наиболее предпочтительно, R формулы (VIIb) представляет собой метил.
Полимерное пролекарство или фармацевтическая композиция, содержащая полимерное пролекарство, может быть применены для профилактики, диагностики и/или лечения множества заболеваний суставов.
Болезни суставов, которые могут быть предотвращены, диагностированы и/или вылечены согласно настоящему изобретению, включают (нозология в скобках): инфекционные артропатии (М00-М03), воспалительные полиартропатии (М05-М14), артроз (М15-М19), другие заболевания суставов (М20-М25), и системные заболевания соединительной ткани (М30-М36), дорсопатии (М40-М54), нарушения мягких тканей (М60-М79), остеопатии и хондропатии (М80-М94).
Таким образом, в одном варианте выполнения настоящее изобретение относится к полимерному пролекарству или фармацевтической композиции для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов, где заболевание суставов выбирается из инфекционных артропатии (М00-М03), воспалительных полиартропатии (М05-М14), артрозов (М15-М19), других заболеваний суставов (М20-М25) и системных заболеваний соединительной ткани (М30-М36), дорсопатии (М40-М54), нарушения мягких тканей (М60-М79), остеопатии и хондропатии (М80-М94).
Заболевания суставов включают боль и воспаление после инвазивных процедур, таких как внутрисуставные инъекции, синовиальная аспирация, синовэктомия, хирургия и артроскопические процедуры.
Предпочтительные заболевания суставов представляют собой артрит и родственные заболевания, которые, в частности, выбирается из группы, заболеваний, состоящих из остеоартрита, ревматоидного артрита, ахиллесова тендиниты, ахондроплазия, акромегалическая артропатия, адгезивный капсулита, болезни Стилла, развившаяся у взрослых, анкилозирующего спондилоартрита, анзеринового бурсита, аваскулярного некроза, синдрома Бехчета, двухголового тендинити, болезни Блаунта, бруцеллезного спондилита, бурсита, пяточного бурсити, болезни отложения пирофосфата кальция (CPPD), болезни осаждение кристаллов, синдроми Каплана, кистевого туннельного синдрома, хондрокальциноза, хондромаляциа надколенника, хронического синовита, хронического рецидивирующего мультифокального остеомиелита, синдрома Черджа-Стросса, синдрома Когана, остеопороза, индуцированного кортикостероидами, реберно-грудинного синдрома, КРЕСТ синдрома, криоглобулинемии, дегенеративных заболеваний суставов, дерматомиозита, диабетического пальцевого склероза, диффузногор идиопатического скелетного гиперостоза (DISH), дисцита, дискоидной красной волчанки, медикаментозной красной волчанки, мышечной дистрофии Дюшенна, контрактуры Дюпюитрена, синдромы Элерса-Данлоса, энтеропатического артрита, эпикондилита, эрозивного воспалительного остеоартрита, синдрома сдавления, вызванного физической нагрузкой, болезни Фабри, семейной средиземноморской лихорадки, липогранулематоза Фарбера, синдрома Фелти, фибромиалгим, инфекционной эритемы, плоскостопия, синовита, обусловленного инородным телом, болезни Фрайберга, грибковых артритов, болезни Гоше, гигантского артериита, гонококкового артрита, синдрома Гудпасчера, подагры, гранулематозного артериита, гемартроза, гемохроматоза, пурпуры Шенлейна-Геноха, болезни поверхностного антигена гепатита В, дисплазии тазобедренного сустава, синдроми Гурлера, синдроми гипермобильности, васкулити гиперчувствительности, гипертрофической остеоартропатии, болезни иммунных комплексов, импинджмент-синдроми, артропатии Жакку, ювенильного анкилозирующего спондилоартрита, ювенильного дерматомиозита, ювенильного ревматоидного артрита, болезни Кавасаки, болезни Кинбека, болезни Легг-Кальве-Пертеса, синдрома Леша-Нихана, линейная склеродермия, липоидный дерматоартрита, синдрома Лефгрена, болезни Лайма, злокачественной синовиомы, синдрома Марфана, синдрома медиальной складки, метастатического карциноматозного артрита, смешанной болезни соединительной ткани (MCTD), смешанной криоглобулинемии, мукополисахаридоза, многоочагового ретикулогистиоцитоза, множественной эпифизарной дисплазии, микоплазменного артрита, миофасциального болевого синдрома, неонатальной волчанки, нейрогенной артропатии, подкожного диссеминированного липогранулематоза, охроноза, бурсита локтевого отростка, болезни Осгуда-Шлаттера, остеоартрита, остеохондроматоза, несовершенного костеобразования, остеомаляции, остеомиелита, остеонекроза, остеопороза, перекрывающегося синдрома, пахидермопериостоза, болезни костей Педжета, палиндромного ревматизма, пателлофеморальной болевой синдрома, синдрома Пеллегрини-Штиды, пигментного виллезонодулярного синовит, синдрома грушевидной мышцы, подошвенного фасциита, узелкового полиартрита, ревматической полимиалгии, полимиозита, кисты подколенной ямки, тендинита задней большеберцовой мышцы, болезни Потта, преднадколенникового бурсита, инфекции протезного сустава, эластической псевдоксантомы, псориатического артрита, синдрома Рейно, реактивного артрита/синдрома Рейтера, синдрома рефлекторной симпатической дистрофии, рецидивирующего полихондрита, ахиллобурсита, ревматизма, ревматоидного артрита, ревматоидного васкулита, тендинита мышцы-вращатели плеча, сакроилеита, сальмонелла-остеомиелита, саркоидоза, свинцовой подагры, остеохондроза Шойермана, склеродермии, септического артрита, серонегативного артрита, артрита шигеллы, синдрома "плечо-кисть", серповидноклеточной артропатии, синдрома Шегрена, эпифизеолиза, стеноза позвоночного канала, спондилолиза, стафилококкового артрита, синдрома Стиклера, подострой кожной красной волчанки, синдрома Свита, хореи Сиденгама, сифилитического артрита, системной красной волчанки (СКВ), артериита Такаясу, синдрома предплюсневого канала, теннисного локтя, синдрома Титце, транзиторного остеопороза, травматического артрита, вертлужного бурсита, туберкулезного артрита, язвенного колита, недифференцированной дисплазии соединительной ткани (UCTS), уртикарного васкулита, вирусного артрита, гранулематоза Вегенера, болезни Уиппла, болезни Уилсона и иерсиниозного артрита.
Более предпочтительные заболевания суставов представляют собой остеоартрит и ревматоидный артрит.
В одном варианте выполнения фармацевтическая композиция в дополнение к полимерному пролекарству содержит другие биологически активные фрагменты, либо в их свободной форме или в виде пролекарств.
В одном варианте выполнения настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство по настоящему изобретению, и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ для применения для профилактики, диагностики и/или лечении заболевания суставов.
В другом варианте выполнения настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство по настоящему изобретению, и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.
Вспомогательные вещества могут быть классифицированы как буферные агенты, модификаторы изотоничности, консерванты, стабилизаторы, агенты, препятствующие адсорбции, агентов для защиты от окисления, загустители/агенты, усиливающие вязкость, или другие вспомогательные вещества. В некоторых случаях, эти ингредиенты могут иметь двойные или тройные функции. Фармацевтическая композиция может содержать один или более вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из:
2
3
(i) Буферные агенты: физиологически переносимые буферы для поддержания pH в желаемом диапазоне, например, фосфат натрия, бикарбонат, сукцинат, гистидин, цитрат и ацетат, сульфат, нитрат, хлорид, пируват. Можно также использовать антациды, такие как Mg(ОН) или ZnCO.
Буферная емкость может быть скорректирована в соответствии с условиями, наиболее чувствительными к стабильности pH;
(ii) Модификаторы изотоничности: чтобы свести к минимуму боль, которые могут возникнуть в результате повреждения клеток вследствие различий осмотического давления при инъекции препарата замедленного всасывания. Глицерин и хлорид натрия являются примерами. Эффективные концентрации могут быть определены с помощью осмометрии, используя предполагаемую осмоляльность 285-315 мОсмол/кг для сыворотки;
(iii) Консерванты и/или противомикробные агенты: многодозовые препараты для парентерального введения требуют добавления консервантов в достаточной концентрации, чтобы свести к минимуму риск заражения пациентов после инъекции и соответствующие установленным нормативным требованиям. Типичные консерванты включают м-крезол, фенол, метилпарабен, этилпарабен, бутилпарабен, хлорбутанол, бензиловый спирт, нитрат фенилртути, тимерозол, сорбиновую кислоту, сорбат калия, бензойную кислоту, хлоркрезол и хлорид бензалкония;
(iv) Стабилизаторы: Стабилизация достигается посредством усиления сил стабилизирующих белки, дестабилизацией денатурированного состояния, или посредством прямого связывания вспомогательных веществ с белком. Стабилизаторами могут быть аминокислоты, такие как аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, гистидин, лизин, пролин, сахара, такие как глюкоза, сахароза, трегалоза, полиолы, такие как глицерин, маннит, сорбит, соли, такие как фосфат калия, сульфат натрия, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, гексафосфат, лиганды, такие как ионы двухвалентных металлов (цинк, кальций и т.д.), другие соли или органические молекулы, такие как фенольные производные. Кроме того, могут быть применены олигомеры или полимеры, такие как циклодекстрины, декстран, дендримеры, ПЭГ или ПВП или протамин или HSA;
(v) Агенты, препятствующие адсорбции: В основном ионные или неионные поверхностно-активные вещества или другие белки или растворимые полимеры используются для покрытия или адсорбции конкурентно на внутренней поверхности контейнера для композиций или композиций. Подходящие поверхностно-активные вещества, например, алкилсульфаты, такие как лаурилсульфат аммония и лаурилсульфат натрия; алкиловые эфиры сульфатов, такие как лаурет сульфат натрия и мирет сульфат натрия; сульфонаты, такие как диоктил сульфосукцинат натрия, перфтороктансульфонаты, перфторбутансульфонаты, алкилбензолсульфонаты; фосфаты, такие как алкилариловые эфиры фосфатов и алкиловые эфиры фосфатов; карбоксилаты, такие как соли жирных кислот (мыла) или стеарат натрия, лауроил саркозината натрия, перфторнонатансульфонаты, перфтороктаноат; октенидин дигидрохлорид; четвертичные аммониевые катионы, такие как цетил триметиламмоний бромид, цетилтриметиламмоний хлорид, хлорид цетилпиридиния, полиэтоксилированный талловый амин, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, 5-бром-5-нитро-1,3-диоксан, диметилдиоктадециламмония хлорид, диоктадецилдиметиламмония бромид; цвиттерионы, такие, как 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат, кокамидопропил гидрокси сульфобетаин, аминокислоты, иминокислоты, кокамидопропилбетаин, лецитин; жирные спирты, такие как цетиловый спирт, стеариловый спирт, цетостеариловый спирт, олеиловый спирт; полиоксиэтилен гликолевые эфиры, такие как октаэтиленгликоль монододециловый эфир, пентаэтиленгликоль монододециловый эфир; алкиловые эфиры полиоксипропиленгликоля; глюкозид алкиловые эфиры, такие как децилглюкозид, лаурилглюкозид, октилглюкозид; полиоксиэтилен октил феноловые эфиры, такие как Triton Х-100; полиоксиэтилен-алкилфеноловые эфиры, такие как ноноксинол-9; алкиловые эфиры глицерина, такие как глицериллаурат; алкиловые эфиры сорбитана полиоксиэтилена, такие как полисорбаты; алкиловые эфиры сорбитана; кокамид МЕА и кокамид DEA; додецилдиметиламин оксид; блок-сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, такие как полоксамеры (Pluronic F-68), додециловый эфир ПЭГ (Brij 35), полисорбаты 20 и 80; другие агенты, препятствующие адсорбции, представляют собой декстран, полиэтиленгликоль, ПЭГ-полигистидин, BSA и HSA и желатин. Выбранная концентрация и тип вспомогательного вещества зависит от эффекта, которого требуется избежать, но, как правило, образуется монослой поверхностно-активного вещества на границе раздела при значениях чуть выше значения ККМ;
(vi) Лио- и/или криопротекторы: Во время замораживания или сушки распылением, вспомогательные вещества могут противодействовать дестабилизирующим эффектам, вызванным нарушением водородных связей и удалением воды. Для этой цели могут быть применены сахара и полиолы, но соответствующие положительные эффекты наблюдались также и для поверхностно-активных веществ, аминокислот, неводных растворителей и других пептидов. Трегалоза особенно эффективна для уменьшения агрегации, вызванной увлажнением, она также улучшает термическую стабильность, потенциально вызываемую экспозицией белковых гидрофобных групп в воду. Маннит и сахарозу можно также использовать либо в качестве единственного лио/криопротектора, либо в комбинации друг с другом, в которой более высокие соотношения маннит: сахароза, как известно, увеличивают физическую стабильность лиофилизированного осадка. Маннит также можно комбинировать с трегалозой. Трегалозу можно также комбинировать с сорбитом или сорбит использовать в качестве единственного протектанта. Также могут быть применены крахмал или производные крахмала;
(vii) Агенты для защиты от окисления: антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, эктоин, метионин, глютатион, монотиоглицерин, морин, полиэтиленимин (PEI), пропилгаллат, витамин Е, хелатирующие агенты, такие лимонная кислота, ЭДТА, гексафосфат, тиогликолевая кислота;
(viii) Добавка, усиливающая растекание или диффузию: изменяет проницаемость соединительной ткани посредством гидролиза компонентов внеклеточного матрикса в интерстициальном пространстве, таких как, но не ограничиваясь этим гиалуроновой кислоты, полисахарида, найденного в межклеточном пространстве соединительной ткани. Добавка, усиливающая растекание, такая как, но не ограничиваясь этим, гиалуронидаза временно уменьшает вязкость внеклеточного матрикса и способствует диффузии инъекционных лекарственных препаратов;
(ix) Другие вспомогательные вещества: такие как смачивающие агенты, модификаторы вязкости, антибиотики, гиалуронидаза. Кислоты и основания, такие как соляная кислота и гидроксид натрия являются вспомогательными агентами, необходимыми для регулирования pH в процессе производства;
Фармацевтическая композиция в сухой или жидкой форме может обеспечиваться в виде однодозовой или мультидозовой фармацевтической композиции.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения жидкая или сухая фармацевтическая композиция обеспечивается в виде однократной дозы, что означает, что контейнер, в котором он поступает, содержит одну фармацевтическую дозу.
В качестве альтернативы жидкая или сухая фармацевтическая композиция представляет собой множество доз фармацевтической композиции, означает, что контейнер, в котором она поступает, содержит более одной терапевтической дозы, т.е., композиция многократного приема содержит по меньшей мере 2 дозы. Такие многократные дозы фармацевтической композиции могут быть либо применены для разных пациентов, нуждающихся в этом, либо могут быть применены для одного пациента, причем остальные дозы хранятся после введения первой дозы до тех пор, пока не потребуются.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция находится в контейнере. Подходящие контейнеры для жидких или сухих фармацевтических композиций представляют собой, например, шприцы, флаконы, флаконы с пробкой и уплотнением, ампулы и инъекционные патроны. В частности, жидкая или сухая фармацевтическая композиция обеспечивается в шприце. Если фармацевтическая композиция представляет собой сухую фармацевтическую композицию, контейнер предпочтительно представляет собой двухкамерный шприц. В таком варианте выполнения указанная сухая фармацевтическая композиция обеспечивается в первой камере из двухкамерного шприца, а растворитель обеспечивается во второй камере двухкамерного шприца.
В одном варианте выполнения настоящее изобретение относится контейнеру, содержащему полимерное пролекарство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, в котором контейнер подходит для заполнения инъекционного устройства для применения для профилактики, диагностики и/или лечения болезни суставов.
В другом варианте выполнения настоящее изобретение относится контейнеру, содержащему полимерное пролекарство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, в котором контейнер подходит для заполнения инъекционного устройства.
Перед нанесением сухой фармацевтической композиции нуждающемуся пациенту сухую композицию разводят. Разведение может иметь место в контейнере, в котором сухая композиция обеспечивается, например, во флаконе, шприце, двухкамерном шприце, ампуле и инъекционном картридже. Разведение осуществляется посредством добавления предварительно определенного количества растворителя к сухой композиции. Растворы для разведения должны быть стерильными жидкостями, такими как вода или буфер, которые могут содержать дополнительные добавки, такие как консерванты и/или противомикробные препараты, такие как, например, бензиловый спирт и крезол. Предпочтительно, растворителем является стерильная вода. Если разводят сухую фармацевтическую композицию, это упоминается как "разведение фармацевтической композиции" или "разведенная фармацевтической композиции" или "разведенная композиция".
Дополнительный объект настоящего изобретения относится к способу введения разведенной или жидкой фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов по настоящему изобретению. Предпочтительно, фармацевтическую композицию вводят с помощью внутрисуставной инъекции.
Еще один объект относится к способу приготовления разведенной фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство, для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов, при этом способ содержит стадию
- контактирования сухой фармацевтической композиции с растворителем.
Другим объектом является разведенная фармацевтическая композиция, содержащая полимерное пролекарство для применения в лечении, диагностике и/или профилактики заболеваний суставов по настоящему изобретению, и необязательно один или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.
В случае диагностики, биологически активный фрагмент предпочтительно представляет собой фрагмент, который включает по меньшей мере одну метку, например, флуоресцентную, фосфоресцирующую, люминесцентную или радиоактивную метки.
Другой объект настоящего изобретения представляет собой способ изготовления сухой фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство, для применения для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов. В одном варианте выполнения, например сухую фармацевтическую композицию изготовляют
(i) смешиванием полимерного пролекарства необязательно с одним или несколькими вспомогательными веществами,
(ii) переносом количества, эквивалентного одной или нескольким дозам в подходящий контейнер,
(iii) высушиванием фармацевтической композиции в указанном контейнере, и
(iv) герметизацией контейнера.
Подходящие контейнеры представляют флаконы, шприцы и двухкамерные шприцы, ампулы, и инъекционные картриджи.
Другой объект изобретения представляет собой набор компонентов.
Если устройство для инъекции представляет собой просто шприц для подкожных инъекций, то набор может содержать шприц, иглы и контейнер, содержащий сухую фармацевтическую композицию для применения в шприце, и второй контейнер, содержащий растворитель.
Если фармацевтическая композиция представляет собой жидкую фармацевтическую композицию, то набор может включать шприц, иглы и контейнер, содержащий жидкую фармацевтическую композицию для применения в шприце.
Другой объект настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию для применения для профилактики, диагностики и/или лечении заболевания суставов, содержащуюся в контейнере, пригодном для размещения инъекционного устройства.
В предпочтительном варианте выполнения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению находится в форме инъекции, в частности в шприце.
В более предпочтительных вариантах выполнения инъекционное устройство отличается от простого шприца для подкожных инъекций и поэтому отдельный контейнер с разведенной или жидкой фармацевтической композиции приспособлен для заполнения инъекционного устройства, таким образом, что при применении жидкая фармацевтическая композиция в контейнере находится в жидкостном соединении с выпускным отверстием устройства для инъекций. Примеры инъекционных устройств включают, но не ограничиваются этим: шприцы для подкожных инъекций и шприц-ручка. Особенно предпочтительными являются инъекционные устройства шприц-ручка, в этом случае контейнер представляет собой инъекционный картридж, предпочтительно одноразовый инъекционный картридж. Необязательно, набор компонентов содержит защитное приспособление для иглы, которое может быть применено как крышечка или защитный колпачок иглы после применения для предотвращения травм.
Предпочтительный набор компонентов содержит иглу и контейнер, содержащий фармацевтическую композицию и необязательно дополнительно содержащий растворитель, причем контейнер приспособлен для применения иглы. Предпочтительно, контейнер представляет собой двухкамерный шприц.
Другой объект настоящего изобретения представляет собой медицинское устройство, содержащее по меньшей мере одно полимерное пролекарство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Предпочтительно, например, медицинское устройство представляет собой шприц с иглой, более предпочтительно с тонкой иглой, такой как игла с внутренним диаметром меньше 0,6 мм, предпочтительно игла с внутренним диаметром меньше 0,3 мм, более предпочтительно, игла с внутренним диаметром меньше 0,25 мм, еще более предпочтительно игла с внутренним диаметром меньше 0,2 мм, и наиболее предпочтительно, игла с внутренним диаметром меньше 0,16 мм.
В другом варианте выполнения настоящее изобретение относится к средству доставки лекарств, содержащему полимерное пролекарство или фармацевтическую композицию, содержащую полимерное пролекарство по настоящему изобретению, для применения для профилактики, диагностики и/или лечении заболевания суставов.
Настоящее изобретение также относится к полимерному пролекарству или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство, для получения лекарственного средства для профилактики, диагностики и/или лечения заболевания суставов.
Настоящее изобретение также относится к полимерному пролекарству по настоящему изобретению для применения для профилактики, диагностики и/или лечении заболевания суставов.
Настоящее изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения заболевания суставов, причем указанный способ включает стадию введения терапевтически эффективного количества полимерного пролекарства или фармацевтической композиции, содержащей полимерное пролекарство по настоящему изобретению, пациенту нуждающемуся в этом. Предпочтительно полимерное пролекарство или фармацевтическую композицию, содержащую полимерное пролекарство, вводят посредством внутрисуставной инъекции.
Фиг. 1: Концентрация дексаметазона в плазме после внутрисуставного введения пролекарства «дексаметазон-линкер-гидрогель» 10с.
Примеры
Материалы и методы
Амино 4-arm ПЭГ 5kDa получили от JenKem Technology, Beijing, P.R. China.
N-(3-Малеимидопропил)-21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаокса-генэйкозановая кислота, NHS эфир (Mal-ПЭГ6-NHS) получали от Celares GmbH, Berlin, Germany.
6-(S-Тритилмеркапто) капроновую кислоту получили от Polypeptide, Strasbourg, France.
Boc-4-Аминобутановюу кислоту, Boc-β-аланин, РуВОР и EDC HCl были приобретены у Novabiochem, Darmstadt, Germany.
Дексаметазон получали от Alfa Aesar,
NHS активированный Carboxy-ПЭГ 10 кДа получили от Rapp Polymere, , Germany.
Modmoc-Chloride был заказан у Chemzone, Petaling Jaya, Malaysia
(R),
IL-1ra (Anakinra, Kineret Swedish Orphan Biovitrum AB) готовые к применению шприцы были получены из местной аптеки.
Все другие химические вещества были из Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany.
15-Тритилтио-4,7,10,13-тетраокса-пентадекановую кислоту (Trt-8-ПЭГ4-СООН) получили от Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany.
Очистка с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе:
2
ОФ-ВЭЖХ проводили на колонке 100×20 мм или 100×40 мм С18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5 (Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany) или на колонке 30×150 мм С18 ВЕН 300 10 мкм (Waters), подключенной к Waters 600 HPLC System и Waters 2487 Absorbance detector, если не указано иное. Были применены линейные градиенты раствора А (0,1% TFA или 0,01% HCl в HO) и раствора В (0,1% TFA или 0,01% HCl в ацетонитриле). ВЭЖХ Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали.
Флэш-хроматография
Очистку с помощью флэш-хроматографии проводили на Isolera One system от Biotage AB, Sweden, с применением силикагелевых картриджей Biotage KP-Sil и н-гептана и этилацетата в качестве элюентов. Продукты детектировали при 254 нм.
Для гидрогелевых гранул шприцы, оснащенные полиэтиленовыми фриттами, были применены в качестве реакционных сосудов или для стадий промывки.
PBSTE буфер готовили посредством растворения одной таблетки PBS-Tween (Calbiochem) и 5 мМ ЭДТА в 1 л дистиллированной воды и доведением pH до 7,40 с помощью водного раствора NaOH (4 н.). Полученный раствор затем фильтровали через стерильный 0,22 мкм фильтр на крышке флакона (Nalgene).
Цитратный буфер с pH 6,5 готовили посредством растворения 7,5 ммоль тринатрийцитрата, 140 ммоль NaCl, 0,5 ммоль ЭДТА динатриевой соли и 1,0 мг Полисорбата 80 в 950 мл воды, доведением pH до pH 6,50 добавлением 1 н. HCl и заполнения водой для 1000 мл. Буфер фильтровали через стерильный 0,22 мкм фильтр на крышке флакона Nalgene.
Аналитическую сверхпроизводительную жидкостную хроматографию (СВЭЖХ) - MC проводили на системе Waters Acquity, снабженной колонкой Waters С18 ВЕН300 (2,1×50 мм, размер частиц 1,7 мкм) в сочетании с масс-спектрометром LTQ Orbitrap Discovery от Thermo Scientific или ZQ 4000 ESI instrument (режим анализа положительных ионов) от Waters.
2
2
n
MC продуктов ПЭГ показали серию фрагментов (СНСНО) из-за полидисперсности исходных материалов ПЭГ. Для облегчения интерпретации только один сигнал одного представителя m/z приведен в примерах.
2
4
2
4
Эксклюзионную ВЭЖХ проводили на системе Agilent 1260 с применением колонки TSK-Gel G2000SWXL от Tosoh Bioscience. Буфер подвижной фазы: 1,059 мМ KHSO, 2,966 мМ NaHPO и 300 мМ NaCl, доведенные водой до 980 мл, pH доводили до 7,40 и объем доводили до 1000 мл с последующим добавлением 100 мл абсолютного этанола. Скорость потока: 0,5 мл/мин, время работы 35 мин, детектор с длиной волны: 220 нм, опорная длина волны: 360 нм, калибровали с помощью стандартных растворов IL-1ra перед каждым измерением.
-1
-1
-1
-1
Концентрация IL-1ra в растворе определяли фотометрически при 280 нм с применением коэффициента экстинкции 14077 Мсм для IL1RA и 14202 Мсм для окисленного IL1RA (внутренний дисульфид)/
Количественный аминокислотный анализ (QAAA)
Аликвоту суспензии гидрогеля в водном буфере взвешивали в 10 мл пробирке, предназначенной для работы под давлением. Добавили внутренний стандартный раствор, содержащий аминомасляную кислоту и d8-валин и растворители упаривали. В дополнение к этим образцам, несколько стандартов получали из сток-растворов аминокислот (смеси валина, лейцина, изолейцина и фенилаланина) и внутреннего стандарта. В каждую пробирку добавляли смесь для гидролиза (600 мкл 6 М HCl/TFA 2:1) и мешальник.
Образцы подвергали гидролизу в течение 30 мин при 190°С в микроволновой печи. Гидролизный раствор переносили в мерную колбу 5 мл. Стеклянный сосуд промывали охлажденным 100 мМ цитратным буфером (рН=3,0) и раствор добавляли к мерной колбе. Раствор в мерной колбе нейтрализовали охлажденным 4 М NaOH и мерную колбу заполняли до отметки 100 мМ цитратным буфером (рН=3,0).
Аликвоты из мерных колб разбавляли 1:5 смесью 1:1 100 мМ цитратного буфера (рН=3,0) и 50 мМ HFBA в воде. После встряхивания и центрифугирования супернатант анализировали с помощью ЖХ-МС/МС.
ЖХ-МС/МС осуществляли на Agilent Technologies 1290 Infinity LC в сочетании с Agilent Technologies 6460 Triple Quad с применением колонки Waters Accq-Tag Ultra C18, 2,1×100 мм, 1,7 мкм (0,36 мл/мин, 45°C). Элюент: 0,2% водный HFBA Элюент В: 0,2% HFBA в метаноле. Использовали линейный градиент 15 мин 0,1-38% элюента В.
Количество белка в образце рассчитывали посредством усредненных значений, полученных для содержания валина, лейцина, изолейцина и фенилаланина.
Количественное определение концентрации дексаметазона в плазме проводили с помощью ЖХ-МС/МС-анализа с применением Agilent 1290 UPLC, соединенным с масс-спектрометром Agilent 6460 через зонд ESI. Хроматографию проводили на аналитической колонке Waters Acquity ВЕН С18(100×2,1 мм I.D., размер частиц 1,7 мкм) с предварительным фильтром при скорости потока 0,50 мл/мин (Т=45°С). Воду (UPLC квалификации), содержащую 0,1% муравьиной кислоты использовали в качестве подвижной фазы А и ацетонитрил (UPLC квалификации) с 0,1% муравьиной кислоты использовали в качестве подвижной фазы В. Градиентная система включала короткую изократическую стадию при начальных параметрах 20% В в течение 0,1 мин с последующим линейными градиентными стадиями от 20% В до 50% В в течение 3,9 мин и от 50% до 99% в течение 1,0 мин. Детекцию ионов проводили посредством режима мониторинга множественных реакций (ММР), детектируя переходные пары при m/z 393,2 ионов-предшественников до m/z 373,2 ионов продукта для дексаметазона и m/z 397,2 ионов-предшественников до m/z 377,2 ионов продукта для внутреннего стандарта (IS) D4-дексаметазона.
В размороженные образцы плазмы (100 мкл) в каждый вносили по 90 пг D4-дексаметазона (10 мкл метанольно-водного раствора D4-дексаметазон С=900 пг/мл) и разбавляли 4%-ной фосфорной кислотой. Для удаления плазмы с матрицы и предварительного концентрирования аналита образцы впоследствии экстрагировали затем с помощью твердофазной экстракции (SPE) с применением 96-луночных планшетов Oasis HLB μElution (Waters). Двухступенчатую процедуру промывки с применением 100 мкл 2%-ной фосфорной кислоты и 100 мкл смеси метанол/вода 2:8 (объем/объем) (содержащей 0,1% муравьиной кислоты), за которым следует стадия элюирования с 2×50 мкл смеси метанол/вода 9:1 (объем/объем) (содержащей 0,1% муравьиной кислоты) в 96-луночных планшетах применяли для селективного удаления плазмы с матрицы и количественного извлечения дексаметазона и внутреннего стандарта. Элюаты переносили в пробирки и упаривали досуха при слабом потоке азота при 35°С. Остатки в различные моменты времени восстанавливали в 50 мкл смеси метанол/вода 1:1 (объем/объем) и аликвоты по 10 мкл вводили в систему UPLC-MS.
Контрольные образцы плазмы были применены для получения стандартов калибровок: вносили 100 мкл аликвоты предварительно дозированной пулированной плазмы с различным количеством дексаметазона (30-6000 пг/мл) и внутренний стандарт (900 пг/мл). Образцы обрабатывали и анализировали, как описано выше. Калибровочные кривые получали посредством построения графика отношения площади пика ММР-сигналов дексаметазона и D4-дексаметазона (IS) в зависимости от концентрации аналита. Для количественного определения дексаметазона в образцах плазмы использовали анализ стандартных кривых регрессией по методу взвешенных наименьших квадратов (1/х2) (Agilent MassHunter quantification программное обеспечение).
Пример 1
Синтез реагента основной цепи 1g
Реагент основной цепи 1g синтезировали из амино 4-arm ПЭГ5000 1а согласно следующей схеме:
2
Для синтеза соединения 1b, добавили амино-4 arm ПЭГ5000 1а (MW приблизительно 5200 г/моль, 5,20 г, 1,00 ммоль, HCl-соль) растворяли в 20 мл DMSO (безводный). Добавляли Вос-Lys(Вос)-ОН (2,17 г, 6,25 ммоль) в 5 мл DMSO (безводный), ЕВС HCl (1,15 г, 6,00 ммоль), HOBt HO (0,96 г, 6,25 ммоль) и коллидин (5,20 мл, 40 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре.
2
4
2
4
Реакционную смесь разбавляли 1200 мл дихлорметана и промывали 600 мл 0,1 н. HSO (2×), рассолом (1×), 0,1 М NaOH (2×), и смесью 1/1 (объем/объем) рассол/вода (4×). Водные слои повторно экстрагировали 500 мл дихлорметана. Органические фазы сушили над NaSO, фильтровали и упаривали с получением 6,3 г неочищенного продукта 1b в виде бесцветного масла. Соединение 1b очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ.
Выход 3,85 г (59%) бесцветного стеклообразного продукта 1b.
5+
МС: m/z=1294,4 [М+5Н] (расчетное = 1294,6).
Соединение 1с получали перемешиванием 3,40 г соединения 1b (0,521 ммоль) в 5 мл метанола и 9 мл 4 н. HCl в диоксане при комнатной температуре в течение 15 мин. Летучие вещества удаляли в вакууме. Продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
5+
МС: m/z=1151,9 [M+5Н] (расчетное = 1152,0).
2
Для синтеза соединения 1d, 3,26 г соединения 1с (0,54 ммоль) растворяли в 15 мл DMSO (безводного). Добавляли 2,99 г Boc-Lys (Вос)-ОН (8,64 ммоль) в 15 мл DMSO (безводный), 1,55 г EDC HCl (8,1 ммоль), 1,24 г HOBt⋅HO (8,1 ммоль) и 5,62 мл коллидина (43 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре.
2
4
2
4
Реакционную смесь разбавляли 800 мл дихлорметана и промывали 400 мл 0,1 н. HSO (2×), рассолом (1×), 0,1 M NaOH (2×) и смесью 1/1 (объем/объем) рассол/вода (4×). Водные слои повторно экстрагировали 800 мл дихлорметана. Органические фазы сушили над NaSO, фильтровали и упаривали с получением стеклообразного неочищенного продукта.
Продукт растворяли в дихлорметане и осаждали охлажденным (-18°С) диэтиловым эфиром. Эту процедуру повторяли дважды и осадок сушили в вакууме.
Выход: 4,01 г (89%) бесцветного стекловидного продукта 1d, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
6+
МС: m/z=1405,4 [M+6Н] (расчетное = 1405,4).
Соединение 1e получали посредством перемешивания раствора соединения 1d (3,96 г, 0,47 ммоль) в 7 мл метанола и 20 мл 4 н. HCl в диоксане при комнатной температуре в течение 15 мин. Летучие вещества удаляли в вакууме. Продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
7+
МС: m/z=969,6 [М+7Н] (расчетное = 969,7).
2
Для синтеза соединения 1f соединение 1е (3,55 г, 0,48 ммоль) растворяли в 20 мл DMSO (безводный). Добавляли Вос-Lys (Вос)-ОН (5,32 г, 15,4 ммоль) в 18,8 мл DMSO (безводный), EDC HCl (2,76 г, 14,4 ммоль), HOBt HO (2,20 г, 14,4 ммоль), и 10,0 мл коллидина (76,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре.
2
4
2
4
Реакционную смесь разбавляли 800 мл дихлорметана и промывали 400 мл 0,1 н. HSO (2×), рассолом (1×), 0,1 М NaOH (2×), и смесью 1/1 (объем/объем) рассол/вода (4×). Водные слои повторно экстрагировали 800 мл дихлорметана. Органические фазы сушили над NaSO, фильтровали и упаривали с получением неочищенного продукта 1f в виде бесцветного масла.
Продукт растворяли в дихлорметане и осаждали охлажденным (-18°С) диэтиловым эфиром. Эту стадию повторяли дважды, и осадок сушили в вакууме.
Выход: 4,72 г (82%) бесцветного стекловидного продукта 1f, который использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
8+
МС: m/z=1505,3 [М+8Н] (расчетное = 1505,4).
Реагент основной цепи 1g получали перемешивании раствора соединения 1f (MW приблизительно 12035 г/моль, 4,72 г, 0,39 ммоль) в 20 мл метанола и 40 мл 4 н. HCl в диоксане при комнатной температуре в течение 30 мин. Летучие вещества удаляли в вакууме.
Выход: 3,91 г (100%) стекловидного продукта реагента основной цепи 1g.
9+
МС: m/z=977,2 [М+9Н] (расчетное = 977,4).
Альтернативный путь синтеза на 1g
Для синтеза соединения 1b к суспензии 4-arm-ПЭГ5000 тетраамина (1а) добавили (50,0 г, 10,0 ммоль) в 250 мл изопропиловом спирте (безводного), Вос-Lys (Boc) - OSu (26,6 г, 60,0 ммоль) и DIEA (20,9 мл, 120 ммоль) при 45°С, и смесь перемешивали в течение 30 мин.
Впоследствии добавляли н-пропиламин (2,48 мл, 30,0 ммоль). Через 5 мин раствор разбавляли в 1000 мл МТБЭ и хранили в течение ночи при -20°C без перемешивания. Приблизительно 500 мл супернатанта декантировали и отбрасывали. Добавляли 300 мл холодного МТБЭ и после 1 мин встряхивания продукт собирали фильтрованием через стеклянный фильтр и промывали 500 мл холодного МТБЭ. Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.
Выход: 65,6 г (74%) 1b в виде белого твердого комковатого вещества.
7+
МС: m/z=937,4 [М+7Н] (расчетное = 937,6).
Соединение 1с получали перемешиванием соединения 1b с предыдущей стадии (48,8 г, 7,44 ммоль) в 156 мл 2-пропанола при 40°С. Смесь 196 мл 2-пропанола и 78,3 мл ацетилхлорида добавляли при перемешивании в течение 1-2 мин. Раствор перемешивали при 40°С в течение 30 мин и охлаждали до -30°С в течение ночи без перемешивания. Добавляли 100 мл холодного МТБЭ, суспензию перемешивали в течение 1 мин и охлаждали в течение 1 ч при -30°С. Продукт собирали фильтрованием через стеклянный фильтр и промывали 200 мл холодного МТБЭ. Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.
Выход: 38,9 г (86%) 1 с в виде белого порошка.
6+
МС: m/z=960,1 [М+6Н] (расчетное = 960,2).
-1
Для синтеза соединения 1d Вос-Lys (Вос)-OSu (16,7 г, 37,7 ммоль) и DIPEA (13,1 мл, 75,4 ммоль) добавляли к суспензии 1с из предыдущей стадии (19,0 г, 3,14 ммоль) в 80 мл 2-пропанола при 45°С, и смесь перемешивали в течение 30 мин при 45°С. Впоследствии добавляли н-пропиламин (1,56 мл, 18,9 ммоль). Через 5 мин раствор осаждали 600 мл холодного МТБЭ и центрифугировали (3000 мин, 1 мин). Осадок высушивали в вакууме в течение 1 ч и растворяли в 400 мл ТГФ. Добавляли 200 мл диэтилового эфира, и продукт охлаждали до -30°С в течение 16 ч без перемешивания. Суспензию фильтровали через стеклянный фильтр и промывали 300 мл холодным МТБЭ. Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.
Выход: 21,0 г (80%) 1d в виде белого твердого вещества.
6+
МС: m/z=1405,4 [М+6Н] (расчетное = 1405,4).
Соединение 1е получали, растворяя соединение 1d из предыдущей стадии (15,6 г, 1,86 ммоль) в 3 н. HCl в метаноле (81 мл, 243 ммоль) и перемешивая в течение 90 мин при 40°С. Добавляли 200 мл МеОН и 700 мл изопропилового спирта и смесь хранили в течение 2 ч при -30°С. Для полноты кристаллизации добавляли 100 мл МТБЭ и суспензию хранили при -30°С в течение ночи. Добавляли 250 мл холодного МТБЭ, суспензию перемешивали в течение 1 мин и фильтровали через стеклянный фильтр и промывали 100 мл холодного МТБЭ. Продукт сушили в вакууме.
Выход: 13,2 г (96%) 1е в виде белого порошка.
10+
МС: m/z=679,1 [М+10Н] (расчетное = 679,1).
Для синтеза соединения 1f Вос-Lys(Вос)-OSu (11,9 г, 26,8 ммоль) и DIPEA (9,34 мл, 53,6 ммоль) добавляли к суспензии 1е из предыдущей стадии (8,22 г, 1,12 ммоль) в 165 мл 2-пропанола при 45°С, и смесь перемешивали в течение 30 мин. Впоследствии добавляли н-пропиламин (1,47 мл, 17,9 ммоль). Через 5 мин раствор охлаждали до -18°C в течение 2 ч, Добавляли затем 165 мл холодного МТБЭ, суспензию перемешивали в течение 1 мин и фильтровали через стеклянный фильтр. Впоследствии осадок на фильтре промывали 4×200 мл холодной смеси МТБЭ/изопропиловый спирт 4:1 и 1×200 мл холодного МТБЭ.
Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.
Выход: 12,8 г, MW (90%) 1f в виде бледно-желтого твердого комковатого вещества.
8+
МС: m/z=1505,3 [М+8Н] (расчетное = 1505,4).
2
4
8
4
Реагент основной цепи 1g получали посредством растворения 4АrmПЭГ5 кДа (-LysLysLys(boc)) (1f) (15,5 г, 1,29 ммоль) в 30 мл МеОН и охлаждения до 0°С. 4 н. HCl в диоксане (120 мл, 480 ммоль, охлажденной до 0°С), добавляли в течение 3 мин, и ледяную баню удаляли. Через 20 мин, 3 н. HCl в метаноле (200 мл, 600 ммоль, охлажденной до 0°С) добавляли в течение 15 мин и раствор перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Раствор продукта осаждали 480 мл холодного МТБЭ и центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 1 мин. Осадок сушили в вакууме в течение 1 ч и снова растворяли в 90 мл МеОН, осаждали 240 мл холодного МТБЭ и суспензию центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 1 мин. Продукт 1g сушили в вакууме.
Выход: 11,5 г (89%) в виде бледно-желтых хлопьев.
8+
МС: m/z=1104,9 [М+8Н] (расчетное = 1104,9).
Синтез реагента основной цепи (1h)
Реагент основной цепи 1h синтезировали, как описано для 1g, за исключением применения Boc-D-Lys(BOC)-OSu вместо Boc-Lys(BOC)-OSu.
Выход: 12,99 г (76%) в виде белой пены.
10+
МС: m/z 910,50=[М+10Н] (расчетное = 910,57).
Пример 2
Синтез сшивающего реагента 2d
Сшивающий реагент 2d получали из моно-бензилового эфира адипиновой кислоты (English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347) и ПЭГ2000 в соответствии со следующей схемой:
Раствор ПЭГ 2000 (2а) (11,0 г, 5,5 ммоль) и бензиловый моноэфир адипиновой кислоты (4,8 г, 20,6 ммоль) в дихлорметане (90,0 мл) охлаждали до 0°С. Добавляли дициклогексилкарбодиимид (4,47 г, 21,7 ммоль) с последующим добавлением каталитического количества ЭМАР (5 мг), и раствор перемешивали и давали нагреться до комнатной температуры в течение ночи (12 ч). Колбу хранили при +4°C в течение 5 ч. Твердое вещество отфильтровывали и растворитель полностью удаляли перегонкой в вакууме. Остаток растворяли в 1000 мл смеси диэтиловый эфир/этилацетат 1/1 (объем/объем) и хранили при комнатной температуре в течение 2 часов пока не образовалось небольшое количество хлопьев. Твердое вещество удаляли фильтрованием через слой целита. Раствор хранили в герметично закрытой колбе при -30°C в морозильной камере в течение 12 ч до тех пор, пока кристаллизация не была завершена. Кристаллический продукт фильтровали через стеклянный фильтр и промывали охлажденным диэтиловым эфиром (-30°C). Осадок на фильтре сушили в вакууме.
Выход: 11,6 г (86%) 2b в виде бесцветного твердого вещества. Продукт использовали без дальнейшей очистки на следующей стадии.
3+
МС: m/z=813,1 [М+3Н] (расчетное = 813,3).
В стеклянном автоклаве на 500 мл растворяли ПЭГ2000-бис-адипиновая кислота-бис-бензиловый эфир 2b (13,3 г, 5,5 ммоль) в этилацетате (180 мл) и добавляли 10% палладий на угле (0,4 г). Раствор гидрировали при давлении 6 бар, 40°С до тех пор, пока не прекратилось потребление водорода (5-12 ч). Катализатор удаляли фильтрованием через слой целита и растворитель упаривали в вакууме.
Выход: 12,3 г (количественный) 2 с в виде желтоватого масла. Продукт использовали без дальнейшей очистки на следующей стадии.
3+
МС: m/z=753,1 [М+3Н] (расчетное = 753,2)
Раствор моноэфира ПЭГ2000-бис-адипиновой кислоты 2 с (9,43 г, 4,18 ммоль), N-гидроксисукцинимида (1,92 г, 16,7 ммоль) и дициклогексилкарбодиимида (3,44 г, 16,7 ммоль) в 75 мл дихлорметана (безводный) перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и осадок отфильтровывали. Дихлорметан упаривали и остаток перекристаллизовывали из ТГФ.
Выход: 8,73 г (85%) сшивающего реагента 2d виде бесцветного твердого вещества.
3+
МС: m/z=817,8 [М+3Н] (расчетное = 817,9 г/моль).
Синтез 2е
Соединение 2е синтезировали, как описано для 26. за исключением того, что использовали глутаровую кислоту вместо адипиновой кислоты.
3+
МС: m/z=764,4 [М+3Н] (расчетное = 764,5).
Сшивающий реагент 2k получали из монобензилового эфира изопропилмалоновой кислоты и ПЭГ3300 в соответствии со следующей схемой:
3
4
Для синтеза монобензилового эфира изопропилмалоновой кислоты rac-2h, растворяли изопропилмалоновую кислоту (35,0 г, 239 ммоль), бензиловый спирт (23,3 г, 216 ммоль) и DMAP (1,46 г, 12,0 ммоль) в 100 мл ацетонитрила. Смесь охлаждали до 0°С в бане со льдом. Раствор DCC (49,4 г, 239 ммоль) в 150 мл ацетонитрила добавляли в течение 15 мин при 0°С. Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, после чего твердое вещество отфильтровывали. Фильтрат упаривали при 40°С в вакууме и остаток растворяли в 300 мл МТБЭ. Этот раствор экстрагировали 2×300 мл насыщенным водным раствором NaHCO, затем объединенные водные фазы подкисляли до рН=1-3 с помощью 6 н. соляной кислотой. Полученную эмульсию экстрагировали 2×300 мл МТБЭ и растворитель упаривали. Объединенные органические фазы промывали 200 мл насыщенным водным раствором NaCl и сушили над MgSO. Продукт очищали на 340 г силикагеле с применением смеси этилацетат/гептан (10:90→20:80) в качестве элюента. Элюент упаривали и остаток сушили в вакууме в течение ночи.
Выход 9,62 г (17%) бесцветного масла rac-2h.
+
МС: m/z=237,11 [М+Н] (рассчитано = 237,11).
Для синтеза соединения 2i, монобензиловый эфир изопропилмалоновой кислоты rac-2h (5,73 г, 24,24 ммоль) и ПЭГ3300 (20,0 г, 6,06 ммоль) растворяли в 110 мл дихлорметана и охлаждали в бане со льдом. Добавляли раствор DCC (5,00 г, 24,24 ммоль) и DMAP (37 мг, 0,30 ммоль) в 20 мл дихлорметана. Ледяную баню удаляли и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Полученную суспензию охлаждали до 0°С и твердое вещество отфильтровывали. Растворитель упаривали в вакууме.
Остаток растворяли в 70 мл дихлорметана и разбавляли 800 мл МТБЭ при комнатной температуре. Полученную смесь хранили в течение ночи при -20°С. Осадок собирали посредством фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промывали 650 мл охлажденного МТБЭ (-20°С). Продукт сушили в вакууме в течение ночи. Процедуру осаждения повторяли. Продукт сушили в вакууме в течении ночи.
Выход 20,49 г (90%) белого порошка rac-21
6+
МС: m/z 671,39=[М+6Н] (расчетное = 671,47).
Для синтеза соединения rac-2j, соединение rac-2i (20,38 г, 5,42 ммоль) растворяли в метилацетате (130 мл) и добавляли 242 мг палладия на угле (10%). В атмосфере водорода при атмосферном давлении смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали через слой целлита, и фильтрат упаривали и сушили в вакууме в течение ночи.
Выход 18,24 г (94%) стекловидного твердого вещества rac-2j.
6+
МС: m/z 641,38=[М+6Н] (расчетное = 641,43).
4
Для синтеза соединения rac-2k, соединение rac-2j (11,98 г, 3,35 ммоль) и TSTU (4,03 г, 13,39 ммоль) растворяли в 145 мл дихлорметана при комнатной температуре. Затем добавляли DIPEA (1,73 г, 13,39 ммоль) и смесь перемешивали в течение 45 мин. Полученную суспензию фильтровали и фильтрат промывали 175 мл 0,5 М фосфатным буфером рН=6,5. Органическую фазу разбавляли 350 мл этилацетата. Органическую фазу сушили над MgSO и растворитель упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 100 мл толуола, разбавляли 25 мл МТБЭ при комнатной температуре и хранили в течение ночи при -20°С. Осадок собирали посредством фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3 и промывали 600 мл охлажденного МТБЭ (-20°С). Продукт сушили в вакууме в течение ночи.
Выход 8,50 г (67%) белого порошка rac-2k.
6+
МС: m/z 673,72=[М+6Н] (расчетное = 673,77).
Пример 3
Получение гидрогелевых гранул 3а, 3b, 3с и 3d, содержащих свободные аминогруппы
Получение гидрогелевых гранул 3а, содержащих свободные аминогруппы.
Раствор 1200 мг 1g и 3840 мг 2е в 28,6 мл DMSO добавляли к раствору 425 мг Arlacel P135 (Croda International PLc) в 100 мл гептана. Смесь перемешивали при 650 оборотах в минуту пропеллерной мешалкой в течение 10 мин при 25°С с образованием суспензии в реакторе на 250 мл, снабженном перегородками. Добавляли 4,3 мл TMEDA для осуществления полимеризации. Через 2 ч скорость мешалки уменьшали до 400 оборотов в минуту и смесь перемешивали в течение дополнительных 16 ч. Добавляли 6,6 мл уксусной кислоты, а затем через 10 мин добавляли 50 мл воды и 50 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия. Через 5 мин перемешивание прекращали и водную фазу сливали.
Для фракционирования гранул суспензию вода-гидрогель подвергали влажному просеиванию на 75, 50, 40, 32 и 20 мкм стальных ситах. Фракции гранул, которые были сохранены на 32, 40 и 50 мкм ситах, объединяли и промывали 3 раза водой, 10 раз этанолом и сушили в течение 16 ч при 0,1 мбар с получением 3а в виде белого порошка.
Содержание аминогрупп гидрогеля определяли посредством присоединения Fmoc-аминокислоты к свободным аминогруппам гидрогеля и последующего определения Fmoc, как описано в Gude, М, J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206.
Содержание аминогрупп в 3а была определена в пределах от 0,11 и 0,16 ммоль/г.
Получение гидрогелевых гранул 3b, содержащих свободные аминогруппы.
Раствор 2850 мг 1g и 3705 мг 2d в 32,81 мл DMSO добавляли к раствору 505 мг Arlacel P135 (Croda International PLC) в 120 мл гептана. Смесь перемешивали при 800 оборотах в минуту с пропеллерной мешалкой в течение 10 мин при 25°С с образованием суспензии в реакторе на 250 мл, снабженном перегородками. 9,51 мл TMEDA добавляли дл осуществления полимеризации. Через 2 ч скорость мешалки уменьшали до 400 оборотов в минуту и смесь перемешивали в течение дополнительных 16 ч. Добавляли 14,6 мл уксусной кислоты, а затем через 10 мин добавляли 50 мл воды и 50 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия. Через 5 мин перемешивание прекращали и водную фазу сливали.
Для фракционирования гранул по размерам, суспензию вода-гидрогель подвергали влажному просеиванию на 75, 50, 40, 32 и 20 мкм стальных ситах. Фракции гранул, которые были сохранены на 32, 40 и 50 мкм ситах, объединяли и промывали 3 раза водой, 10 раз этанолом и сушили в течение 16 ч при 0,1 мбар с получением 3b в виде белого порошка.
Получение гидрогелевых гранул 3с, содержащих свободные аминогруппы
Зв синтезировали в соответствии с той же процедурой за исключением того, что 1h использовали вместо 1g.
Содержание аминогрупп в 3b и 3с 0,7-1,0 ммоль/г.
Получение гидрогелевых гранул 3d, содержащих свободные аминогруппы
(ПЭГ-модифицированный гидрогель)
Суспензию гидрогеля 3с в DMSO, соответствующую 460 мг высушенного гидрогеля (425 мкмоль, 1 экв.) помещали в шприц, снабженный полиэтиленовой фриттой, и промывали шесть раз DMSO. Раствор ПЭГ-реагента (NHS-активированный Carboxy-ПЭГ 10 кДа, 850 мг, 85 мкмоль, 0,2 экв., RAPP Polymere, , Germany) в 8 мл DMSO и добавляли 1,5 мл раствора TMEDA в DMSO (127 мкл, 850 мкмоль, 2 экв.), и шприц встряхивали в течение 22 ч при комнатной температуре. ПЭГ модифицированный гидрогель 3d затем промывали 10 раз с 10 мл DMSO, и отбирали аликвоты для определения содержания свободных аминогрупп. Гидрогелевую суспензию хранили при 4°С.
Содержание аминогруппа 3d, как было установлено, равно 0,42-0,46 ммоль/г.
3е получали, как описано для 3а за исключением применения реактора на 1 л с диаметром 100 мм, 400 мл ундекана, 1000 мг 1h, 5698 мг rac-2k, 60,3 г DMSO, 595 мг Cithrol™ DPHS, 4,5 мл TMEDA и 6,7 мл уксусной кислоты с получением 1,24 г (фракции гранул на 100 мкм сите) 3е в виде белого порошка.
Содержание аминогрупп в 3е, как было установлено, равно 0,068 ммоль/г.
3f получали, как описано для 3а за исключением применения 740 мг 1h, 3362 мг rac-2k, 36,9 г DMSO, 365 мг CithrolTM DPHS, 3,3 мл TMEDA и 5,1 мл уксусной кислоты, что приводило к 950 мг (фракции гранул на 75 мкм сите) 3f в виде белого порошка.
Содержание аминогрупп в 3f, как было установлено, равно 0,179 ммоль/г.
Пример 4
Получение суспензии функционализированного малеимидом гидрогеля 4 и определение малеимид-замещения
Гидрогель 3а предварительно промывали смесью DMSO/DIPEA 99/1 (объем/объем), промывали DMSO и инкубировали в течение 45 мин с раствором Mal-ПЭГ6-NHS (2,0 экв. относительно теоретического количества аминогрупп на гидрогеле) в DMSO. Гидрогель промывали пять раз с DMSO и пять раз с сукцинатом pH 3,0 (20 мм, 1 мМ ЭДТА, 0,01% Твин-20). Образец промывали три раза фосфатом натрия pH 6,0 (50 мМ, 50 мМ этаноламина, 0,01% Твин-20) и инкубировали в том же буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем гидрогель промывали пять раз сукцинатом натрия pH 3,0 (20 мМ, 1 мМ ЭДТА, 0,01% Твин-20) и выдерживали в этом буфере, чтобы получить функционализированного малеимидом гидрогель 4 в виде суспензии.
Для определения содержания малеимида аликвоту гидрогеля 4 промывали три раза водой и этанолом каждым. Аликвоту сушили при пониженном давлении и определяли массу гидрогеля в аликвоте. Другую аликвоту гидрогеля 4 подвергали взаимодействию с избытком меркаптоэтанола (в 50 мМ натрий-фосфатной буфере 30 мин при комнатной температуре), и потребление меркаптоэтанола детектировали с помощью теста Эллмана (Ellman, G.L. et al., Biochem. Pharmacol., 1961, 7, 88-95). Рассчитывали содержание малеимида - 0,10-0,15 ммоль/г высушенного гидрогеля.
Пример 5
Получение реагента «бетаметазон-линкер» 5
Реагент «бетаметазон-линкер» 5 синтезировали в соответствии со следующей схемой:
3
4
21-Глицил-бетаметазон получали в соответствии с литературным источником (Benedini, Francesca; Biondi, Stefano; Ongini, Ennio, PCT Int. Appl. (2008), WO 2008095806 A1 20080814). К раствору гидрохлорида 21-глицил-бетаметазона (MW 486 г/моль, 600 мг, 1,2 ммоль) в метиленхлориде (сухой, над молекулярными ситами, 40 мл) добавляли Trt-S-ПЭГ4-COOH (MW 480,6 г/моль, 960 мг, 2,0 ммоль), EDC HCl (191,7 г/моль, 383 мг, 2,0 ммоль) и DIEA (129,2 г/моль, d 0,742 мг/мл, 0,7 мл, 4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Раствор обрабатывали 5%-ным раствором НРО (50 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в 2 мл дихлорметана и 8 мл HFIP. Добавляли 0,4 мл TES и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Летучие вещества удаляли при пониженном давлении и соединение 5 очищали ВЭЖХ с обращенной фазой.
Пример 6
Синтез «бетаметазон-линкер-гидрогель» 6
Суспензию функционализированного малеимидом гидрогеля 4 в сукцинатном буфере pH 3,0 (20 мМ, 1 мМ ЭДТА, 0,01% Твин-20)/ацетонитрил 1/2 (объем/объем), (соответствует 250 мг высушенного гидрогеля, загрузка малеимида 0,1 ммоль/г высушенного гидрогеля) загружали в шприц, снабженный фильтрующей фритой. Гидрогель промывали десять раз смесью ацетонитрил/вода 2/1 (объем/объем), содержащей 0,1% TFA (объем/объем). Раствор «бетаметазон-линкер-гидрогель» 6 (MW 669,8 г/моль, 18,5 мг, 27,5 мкмоль) в смеси ацетонитрил/вода 2/1 (объем/объем), содержащей 0,1% TFA (3,7 мл) втягивали в шприц и встряхивали в течение 2 мин при комнатной температуре чтобы получить стабилизированную суспензию. Добавляли 334 мкл фосфатного буфера (pH 7,4, 0,5 М) и шприц встряхивали при комнатной температуре. Потребление тиола контролировали с помощью теста Эллмана. Гидрогель промывали 10 раз смесью ацетонитрил/вода 1/1 (объем/объем), содержащей 0,1% TFA (объем/объем).
Меркаптоэтанол (47 мкл) растворяли в смеси 1/1 (объем/объем) ацетонитрил/вода с 0,1% TFA (3 мл) и фосфатного буфера (0,5 мл, pH 7,4, 0,5 М). Раствор втягивали в шприц и шприц встряхивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Гидрогель промывали десять раз смесью ацетонитрил/вода 1/1 (объем/объем) с 0,1% TFA и десять раз стерильным сукцинатным буфером (10 мМ, 46 г/л маннита, 0,05% Твин-20, pH доводили до 5,0 с помощью 5 М NaOH). Объем доводили до 5 мл с получением 50 мг/мл «бетаметазон-линкер-гидрогель» 6 в виде суспензии в сукцинатном буфере.
Содержание бетаметазона определяли по потреблению тиола в течение реакции (тест Эллмана).
Пример 7
Кинетика высвобождения in vitro
Аликвоту «бетаметазон-линкер-гидрогель» 6 переносили в шприц, снабженный фильтрующей фриттой и промывали 5 раз фосфатным буфером с рН 7,4 (60 мМ, 3 мМ ЭДТА, 0,01% Твин-20). Гидрогель суспендировали в том же буфере и инкубировали при 37°С. В определенных временных точках (через 1-7 дней времени инкубации каждого) супернатант меняли и высвобожденный бетаметазон можно было измерить с помощью ОФ-ВЭЖХ при 215 нм. УФ-сигналы, коррелирующие с высвобожденным бетаметазоном, интегрировали и строили график в зависимости от времени инкубации.
Программное обеспечение для подбора аппроксимирующей кривой применяли для оценки соответствующего времени полувысвобождения.
Пример 8
Фармакокинетика, фармакодинамика и местная переносимость бетаметазона после внутрисуставной инъекции «бетаметазон-линкер-гидрогель» в антиген-индуцированный артрит кролика
Артрит индуцируется в суставах кролика посредством овальбуминового метода (Horisawa E, Hirota Т, Kawazoe S, Yamada J, Yamamoto H, Takeuchi H, Kawashima Y. Prolonged anti-inflammatory action of DL-lactide/glycolide copolymer nanospheres containing betamethasone sodium phosphate for an intra-articular delivery system in antigen-induced arthritic rabbit, Pharm Res. 2002 Apr; 19(4):403-10.). 14 самцов новозеландских белых кроликов иммунизировали подкожной инъекцией полного адъюванта Фрейда, содержащего 5 мг/мл овальбумина. Через недели после иммунизации индуцировали артрит в левых коленях посредством инъекции 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 5 мг овальбумина. Одновременно 200 мкл суспензии «бетаметазон-линкер-гидрогель» 6, содержащей 3 мг бетаметазона, вводили в суставную полость сустава. Контрольные животные получали суспензионный буфер. По два животных умерщвляли через 4 ч и на 1, 3, 7, 14, 28 и 42 день после повреждения сустава. Цельную кровь собирали через медиальную артерию уха или посредством забора крои из сердца под наркозом. Синовиальную жидкость собирали из обоих коленей. Бетаметазон в плазме и синовиальной жидкости определяли количественно с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии в соответствии с литературным источником (Pereira Ados S, Oliveira LS, Mendes GD, Gabbai JJ, De Nucci G. Quantification of betamethasone in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using atmospheric pressure photoionization in negative mode, J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005 Dec 15; 828(1-2):27-32.). Уменьшение опухания сустава и температуры поверхности кожи, а также качество хряща и гистологическое исследование на биосовместимость осуществляли в соответствии с литературным источником (Horisawa Е, Hirota Т, Kawazoe S, Yamada J, Yamamoto H, Takeuchi H, Kawashima Y. Prolonged anti-inflammatory action of DL-lactide/glycolide copolymer nanospheres containing betamethasone sodium phosphate for an intra-articular delivery system in antigen-induced arthritic rabbit, Pharm Res. 2002 Apr; 19(4):403-10).
Пример 9
Получение реагентов «дексаметазон-линкер» 7а, 7b и 7с
Реагенты «дексаметазон-линкер» 7а, 7b и 7с, синтезировали в соответствии со следующей схемой:
Общая методика синтеза дексаметазоновых полуэфиров дикарбоновых кислот:
Дексаметазон (1 экв.) растворили в растворе дихлорметан/ацетонитрил (5/1, объем/объем, концентрация дексаметазона 5 мг/мл) и добавляли циклический ангидрид (4 экв.) и DМАР (2 экв.). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 2 ч и летучие вещества удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в смеси вода/ацетонитрил (1/1, объем/объем) + 0,1% раствор ТFА и очищали ВЭЖХ на обращенной фазе. Собранные фракции лиофилизовали с получением требуемого продукта в виде белого аморфного твердого вещества.
Синтез реагента «дексаметазон-линкер» 7а:
Соединение 7а синтезировали из 100 мг дексаметазона в соответствии с общей процедурой А с применением янтарного ангидрида.
Выход: 123 мг (0,250 ммоль, 98%).
+
МС: m/z 493,27=[М+Н] (MW рассчитанное = 492,22).
Синтез реагента дексаметазон-линкер» 7b:
Соединение 7b синтезировали из 40 мг дексаметазона в соответствии с общей процедурой А с применением глутарового ангидрида.
Выход: 37 мг (0,073 ммоль, 72%).
+
МС: m/z 507,29=[М+Н] (MW рассчитанное = 506,23).
Синтез реагента «дексаметазон-линкер» 7с:
Соединение 7с синтезировали из 80 мг дексаметазона в соответствии с общей процедурой А с применением дигликолевого ангидрида.
Выход: 93 мг (0,183 ммоль, 90%).
+
МС: m/z 509,25=[М+Н] (MW рассчитанное = 508,21).
Пример 10
Получение реагентов «дексаметазон-линкер» 8а, 8b и 8с
Соединения «дексаметазон-линкер» 8а, 8b и 8с синтезировали в соответствии со следующей схемой:
Общая процедура В для синтеза реагентов «дексаметазон-линкер»:
2
4
Дексаметазон (1 экв.) растворяли в растворе дихлорметан/ацетонитрил (6/1, объем/объем) (концентрация дексаметазона 8 мг/мл) и последовательно добавляли Вос-защищенную аминокислоту (1,5 экв.), DMAP (2,5 экв.) и EDC HCl (2,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и разбавляли дихлорметаном. Раствор промывали три раза водным раствором соляной кислоты (0,1 н.) и один раз рассолом. Органический слой сушили над NaSO, фильтровали и летучие вещества удаляли в вакууме. Затем остаток переносили в раствор HFIP/TFA (1/1, объем/объем) и полученную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 мин. Летучие вещества удаляли при пониженном давлении и остаток снова растворяли в дихлорметане. Затем добавляли DIPEA (3 экв.), DMAP (3 экв.) и глутаровый ангидрид (3 экв.) и полученную в результате смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в растворе смеси вода/ацетонитрил (1/1, объем/объем). Линкерный реагент очищали с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе и последующая лиофилизация собранных фракций приводила к требуемому «дексаметазон-линкер» в виде белого аморфного твердого вещества.
Синтез реагента «дексаметазон-линкер» 8а:
Соединение 8а синтезировали из 150 мг дексаметазона в соответствии с общей процедурой В, используя Вос-глицин в качестве аминокислоты.
Выход: 160 мг (0,284 ммоль, 74%).
+
МС: m/z 564,34=[М+Н] (MW рассчитанное = 563,25).
Синтез реагента «дексаметазон-линкер» 8b:
Соединение 8b синтезировали из 1,4 г дексаметазона в соответствии с общей процедурой В, используя Вос-β-аланин, в качестве аминокислоты.
Выход: 1,593 г (2,758 ммоль, 77%).
+
МС: m/z 578,19=[М+Н] (MW рассчитанное = 577,27).
Синтез реагента «дексаметазон-линкер» 8с:
Соединение 8 с синтезировали из 130 мг дексаметазона в соответствии с общей процедурой В с помощью γ-(Вос-амино)масляной кислоты в качестве аминокислоты.
Выход: 160 мг (0,270 ммоль, 82%).
+
МС: m/z 592,26=[М+Н] (MW рассчитанное = 591,28).
Пример 11
Синтез пролекарства «дексаметазон-линкер-гидрогель» 9а, 9b и 9с
Общая процедура С синтеза пролекарства «дексаметазон-линкер-гидрогель»:
Гидрогель 3b (содержание амина 1 экв.) взвешивали в шприце, снабженном полиэтиленовой фриттой, пять раз промывали DMF и перемешивали в течение 2 ч с 1,3 экв. реагента «дексаметазон-линкер», 1,5 экв. РуВОР и 4 экв. DIPEA в DMF (приблизительно 60 мг гидрогель/мл ЭМР). Пролекарство «дексаметазон-линкер-гидрогель» затем промывали DMF (10 раз), дихлорметаном (10 раз) и этанолом (10 раз) и сушили в вакууме.
Пролекарство «дексаметазон-линкер-гидрогель» 9а, 9b и 9с синтезировали в соответствии с общей процедурой С с применением реагента «дексаметазон-линкер» 7а, 7b и 7с, соответственно.
Загрузку дексаметазона рассчитывали на основе увеличения массы гидрогеля после конъюгации.
Получили загрузку дексаметазон 18-23% (масса дексаметазона/общая масса «дексаметазон-линкер-гидрогель»)
Пример 12
Синтез пролекарства «дексаметазон-линкер-гидрогель» 10а, 10b, 10с и 10d
Общий протокол D для синтеза пролекарства «дексаметазон-линкер-гидрогель»:
Гидрогель 3b (содержание амина 1 экв.) взвешивали в шприце, снабженным полиэтиленовой фриттой, пять раз промывали DMF и встряхивали в течение 2 ч с 1,5 экв. реагентом «дексаметазон-линкер», 2,5 экв. РуВОР и 4 экв. DIPEA в DMF (60 мг гидрогель/мл DMF). Пролекарство «дексаметазон-линкер-гидрогель» затем промывали DMF (10 раз), дихлорметаном (10 раз) и этанолом (10 раз) и сушили в вакууме.
Пролекарство «дексаметазон-линкер-гидрогель» 10а, 10b, 10с и 10d синтезировали в соответствии с общим протоколом D с помощью гидрогелей 3b, 3b, 3d и 3b, соответственно, и реагента «дексаметазон-линкер» 8а, 8b, 8b и 8с соответственно. NMP (90 мг гидрогель/мл NMP) использовали вместо DMF для синтеза 10с.
Загрузку дексаметазона рассчитывали на основе увеличения массы гидрогеля после конъюгации. Получали загрузку дексаметазон 14-17% (масса дексаметазона/общая масса реагента «дексаметазон-линкер»).
Пример 13
In vitro кинетика высвобождения
In vitro кинетика высвобождения при pH 7,40:
Аликвоты пролекарства «дексаметазон-линкер-гидрогель» взвешивали в шприце, снабженным полиэтиленовой фриттой и трижды промывали буфером PBSTE pH 7,40. Шприц заполняли до приблизительно 2 мл тем же буфером и инкубировали при 37°С. В определенных временных точках (через 1-7 дней времени инкубации каждого) супернатант заменяли, и количественно оценивали высвобождение дексаметазона с помощью ОФ-ВЭЖХ при 215 нм. УФ-сигналы, коррелирующие с высвобожденным дексаметазона интегрировали и количество высвободившегося дексаметазона рассчитывали, сравнивая с калибровочной кривой дексаметазона. Строили кривую высвобожденный дексаметазон в зависимости от времени инкубации, и определяли период полувысвобождения с применением программного обеспечения для подбора аппроксимации кривой, предполагая кинетику высвобождения первого порядка.
Период полувысвобождения дексаметазона из пролекарства «дексаметазон-линкер-гидрогель»:
Соединение
pH 7,40
9а
4,8 дней
9b
300 дней
9с
1,6 дней
10а
7,6 дней
10b
46 дней
10c
49 дней
10d
101 день
Пример 14
Фармакокинетика и фармакодинамика дексаметазона после внутрисуставной инъекции «дексаметазон-линкер-гидрогель» при ACLT-индуцированном артрите кроликов
Артрит индуцировали у кроликов Hyla NG (24 недель, средняя масса 4,4 кг) посредством трансекции передней крестообразной связки (ACLT) правого колена. Четыре дня после операции животным вводили внутрь сустава пролекарство «дексаметазон-линкер-гидрогель» 10с (содержание дексаметазона 4,6 мг) в 350 мкл цитратного буфера pH 6,5 или только 350 мкл цитратного буфера. В определенные моменты времени отбирали кровь и определяли концентрации дексаметазона в плазме, как описано в разделе Материалы и методы. Через восемь недель после инъекции животных умерщвляли. Тяжесть макроскопических изменений на хряще правого колена классифицировали по поглощению китайской туши. Интактный хрящ не показал поглощение туши, в то время как увеличение повреждений хряща коррелирует с увеличением поглощения туши. В дексаметазоновой группе исследуемые животные показали меньше признаков деградации хряща по сравнению с контрольной группой. Кроме того почти никаких признаков формирования остеофитов не наблюдалось в дексаметазоновой группе в отличие от контрольной группы, в которой наблюдалось четкое и интенсивное формирование остеофитов. Данные фармакокинетики показали безинтервальный и равномерный профиль высвобождения дексаметазона в течение восьми недель (Фиг. 1).
Пример 15
Синтез линкерного реагента 11с
Линкерный реагент 11с синтезировали в соответствии со следующей схемой:
Синтез 11а:
3
2
4
Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH (1,00 г, 2,43 ммоль) растворяли с DCC (0,70 г, 3,33 ммоль) в дихлорметане (25 мл). Oxyma pure (0,51 г, 3,58 ммоль) и коллидин (0,50 мл, 3,58 ммоль) добавляли одной порцией и раствор N-Boc-этилендиамина (0,41 г, 2,56 ммоль) в дихлорметане (15 мл) добавляли медленно. После перемешивания смеси в течение 90 мин при комнатной температуре образовавшийся осадок отфильтровывали и фильтрат промывали водным раствором HCl (0,1 М, 50 мл). Водный слой экстрагировали дихлорметаном (2×20 мл) и объединенные органические фракции промывали насыщенным водным раствором NaHCO (3×25 мл) и насыщенным раствором соли (1×50 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенное твердое вещество очищали с помощью флэш-хроматографии. Промежуточное N-Boc-N'-(N-Fmoc-4-трет.-бутил-L-аспартоил)-этилендиамин получали в виде белого твердого вещества (0,98 г, 1,77 ммоль, 73%).
+
МС: m/z 554,29=[М+Н], (рассчитанное = 554,29).
N-Вос-N'-(N-Fmoc-4-трет.-бутил-L-аспартоил)этилендиамин (0,98 г, 1,77 ммоль) растворяли в ТГФ (15 мл), добавляли DBU (0,31 мл), и раствор перемешивали в течение 12 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали АсОН (0,5 мл), концентрировали в вакууме и остаток очищали с помощью флэш-хроматографии с получением 11а (0,61 г, 1,77 ммоль, 73% за 2 стадии) в виде белого твердого вещества.
+
МС: m/z 332,38=[М+Н], (рассчитанное = 332,22).
Синтез 11b:
2
4
3
2
4
6-Ацетилтиогексановую кислоту (0,37 г, 1,95 ммоль) растворяли в дихлорметане (19,5 мл) и добавляли Oxyma pure (0,35 г, 2,48 ммоль) и DCC (0,40 г, 1,95 ммоль) одной порцией. Раствор перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтровали, и фильтрат добавили к раствору 11а (0,61 г, 1,77 ммоль) в дихлорметане (10,5 мл). DIPEA (0,46 мл, 2,66 ммоль) добавляли к раствору и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор промывали водным раствором HSO (0,1 М, 2×30 мл), насыщенным водным раствором NaHCO (2×20 мл) и насыщенным раствором соли (1×20 мл). Органический слой сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с получением N-Boc-N'-(Н-6-ацетилтиогексил-4-трет.-бутил-L-аспартоил)этилендиамина (0,65 г, 1,30 ммоль, 73% за 2 стадии) виде белого твердого вещества.
+
МС: m/z 504,27=[М+Н], (рассчитанное = 504,28).
2
2
N-Вос-N'-(N-6-ацетилтиогексил-4-трет.-бутил-L-аспартоил)этилендиамин (0,60 г, 1,18 ммоль) растворяли в TFA (5 мл) и добавляли TES (0,13 мл) и воду (0,13 мл). Смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. TFA удаляли в потоке N, и неочищенный 11b растворяли в HO/ACN 1:1 и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ.
Выход: 0,39 г, 0,85 ммоль (TFA соль), 72%.
+
MC: m/z 348,25=[М+Н], (рассчитанное = 348,16).
Синтез 11с:
2
11b (TFA соль, 0,38 г, 0,80 ммоль) растворяли в DMF (5 мл) и добавляли (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат (0,26 г, 0,88 ммоль) и DIPEA (0,28 мл, 1,6 ммоль). Полученную суспензию разбавляли дихлорметаном (5 мл) и перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Добавляли еще DIPEA (0,28 мл 1,6 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 2 ч. Дихлорметан концентрировали в вакууме, остаток разбавляли HO/ACN 3:1 и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением N-(5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил-оксокарбонил-N'-(N-6-ацетилтиогексил-L-аспартил)-этилендиамина (0,31 г, 0,62 ммоль, 77%) в виде бесцветного масла.
+
MC: m/z 504,16=[М+Н], (рассчитанное = 504,17).
N-(5-Метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил оксокарбонил-N'-(N-6-ацетилтиогексил-L-аспартил)-этилэтилендиамин (150 мг, 0,30 ммоль) растворяли в дихлорметане (17,5 мл) и добавляли NHS (41 мг, 0,36 ммоль), DCC (74 мг, 0,36 ммоль) и DMAP (4 мг, 0,03 ммоль) одной порцией. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и полученную суспензию фильтровали. Осадок промывали небольшим количеством дихлорметана и объединенные фильтраты концентрировали в вакууме. Соединение 11с очищали ОФ-ВЭЖХ с получением бесцветного масла (144 мг, 0,24 ммоль, 80%).
+
MC: m/z 601,18=[М+Н], (рассчитанное = 601,18).
Пример 16
Получение гранул гидрогеля 12, стерилизованных гамма-излучением
60
Суспензию 523 мг гидрогелевых гранул 3е в 10 мл 1% н-пропиламина в NMP облучали гамма-излучением (Со) в дозе 30 кГр при комнатной температуре.
Пример 17
Получение ПЕГилированных гидрогелевых гранул 13а и 13b
Суспензию 523 мг гидрогелевых гранул 12 в 1% н-пропиламине в NMP промывали пять раз NMP и пять раз DMSO. 189 мг NHS-активированный карбокси-ПЭГ 20 кДа растворяли в 3 мл DMSO (37°С) и добавляли к гидрогелевым гранулам. Добавляли 52 мкл TMEDA в 1,5 мл DMSO и смесь перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре. Полученные ПЕГилированные гидрогелевые гранулы 13а промывали пять раз DMSO и NMP каждым и использовали на следующей стадии без дополнительной обработки.
Соединение 13b получали, как описано для 13а за исключением того, что использовали 499 мг гидрогелевых гранул 3f, 390 мг NHS активированного карбокси-ПЭГ 20 кДа и 134 мкл TMEDA.
Пример 18
Получение гидрогелевых гранул, функционализированных малеимидом, 14а и 14b
Гидрогелевые гранулы 13а в NMP промывали два раза 2% DIPEA в NMP. 340 мг Mal-ПЭГ6-PFP растворяли в 2 мл NMP и добавляли к промытым гидрогелевым гранулам 6а. Гидрогелевую суспензию инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученные гидрогелевые гранулы, функционализированные малеимидом, 14а промывали пять раз NMP, водой, смесью вода/этанол ч.д.а. 1/1 и этанолом ч.д.а. каждым. Гидрогелевые гранулы 14а сушили при 0,1 мбар до постоянной массы. Получили содержание малеимида 0,048 ммоль/г.
Соединение 14b получали, как описано для 14а за исключением того, что использовали гидрогелевые гранулы 13b и 450 мг Mal-ПЭГ6-PFP. Получили содержание малеимида 0,104 ммоль/г.
Пример 19
Синтез незащищенного «IL-1ra-линкер» 15с
Незащищенный «IL-1ra-линкер» 15с синтезировали в соответствии со следующей схемой:
Синтез окисленного IL-1ra 15а
1000 мг IL-1ra (Kineret, 10 готовых к применению шприцов, 7450 мкл раствора) разбавляли 30 мл буфера PBSTE. Добавляли раствор 57,4 мг 5,5'-дитиобис (2-нитробензойной кислоты) в 3,54 мл 0,5 М фосфатного буфера, pH 7,4. Смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и у окисленного IL-1ra 15а (образование внутреннего дисульфидного мостика) заменяли буфер на PBSTE буфер.
10+
MC: m/z=1726,54 [М+10Н], (рассчитанное = 1726,56).
Полнота окисления IL-1ra (образование внутреннего дисульфидного мостика) может быть подтверждена с помощью теста на малеимидную реактивность. У окисленного IL-1ra 15а отсутствует малеимидная реактивность вследствие блокировки реактивности цистеина, в то время как IL-1ra показывал полное превращение малеимидного реагента при соотношении 1/1.
Тест на малеимидную реактивность: 2 мкл раствора IL-1ra (23,9 мг/мл), разбавляли 20 мкл PBSTE и подвергали взаимодействию в течение 10 мин с 1,2 мкл 7,5 мг N-малеоил-бета-аланин/мл 0,5 М фосфатного буфера, pH 7,4). Как определено с помощью LCMS, IL-1ra показал полную конверсию с малеимидом в соотношении 1/1, а у окисленного IL-1ra 15а отсутствовала реактивность.
10+
MC (IL-1ra + малеимидный реагент): m/z=1743,61 [М+10Н], (рассчитанное = 1743,67).
10+
МС (окисленный IL-1ra 15а): m/z=1726,54 [М+10Н], (рассчитанное = 1726,56).
Синтез незащищенного «IL-1ra-линкер» 15с
10+
6 мг линкерного реагента 11с растворяли в 100 мкл DMSO с получением концентрации 100 мМ. 115 мкл (0,5 молярного эквивалента линкерного реагента 11с по отношению количеству IL-1ra) добавляли к раствору IL-1ra 15а в PBSTE буфера (17,98 мг/мл, 22,3 мл). Реакционную смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Впоследствии добавляли 2 дополнительных 0,5 молярных эквивалентов линкерного реагента 11с, и после добавления каждого эквивалента реакционную смесь инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, получая смесь IL-1ra 15а и защищенного моноконъюгата «IL-1ra-линкер» 15b. Отношение IL-1ra 15а и защищенного моноконъюгата «IL-1ra-линкер» 15b составляло приблизительно 2/1, как определено с помощью МС [М+10Н]. Буфер заменяли на цитратный буфер pH 6,5. Получали конечный объем 22 мл.
10+
МС (защищенный «IL-1ra-линкер» 15b): m/z=1775,05 [М+10Н], (рассчитанное = 1775,07).
2
2
2
Для удаления защитных групп из 15b 0,5 М NHOH цитратный буфер рН 6,5 (NHOH гидрохлорид растворили в цитратным буфере pH 6,5, pH которого доводили до 6,50 посредством добавления 4 н. NaOH) добавляли до конечной концентрации 70 мМ NHOH к раствору 15b в 22 мл цитратного буфера, pH 6,5. Реакции удаления защитной группы инкубировали при комнатной температуре в течение 6 ч, что приводило к смеси незащищенного «IL-1ra-линкер» 15с и IL-1ra 15а. Смесь концентрировали (Centrifugal Filter Units, Amicon Ultra 15, MWCO 10 кДа), буфер заменяли на цитратный буфер pH 6,5 и фильтровали стерильно через 0,22 мкм шприцевой фильтр.
10+
Получали конечный объем 15 мл и общую концентрацию белка 22,06 мг/мл различных видов IL-1ra. Отношение IL-1ra 15а и незащищенного «IL-1ra-линкер» 15с равно приблизительно 2/1, как определено с помощью МС [М+10Н].
10+
МС (незащищенный «IL-1ra-линкер» 15с): m/z=1755,29 [M+10Н], (рассчитанное = 1755,24).
Пример 20
Синтез пролекарства «IL-1ra-линкер-гидрогель» 16а и 16b
33 мг гидрогелевых гранул, функционализированных малеимидом 14а, промывали пять раз цитратным буфером с pH 6,5. Добавляли 3,4 мл смеси IL-1ra 15a/«IL-1ra-линкер» 15с в цитратном буфере pH 6,5 (22,06 мг общее содержание белка/мл) к гидрогелю и встряхивали в течение ночи при комнатной температуре. Гидрогель промывали 5 раз цитратным буфером с pH 6,5. Для того, чтобы дезактивировать остававшиеся малеимидные группы, добавляли раствор 2,4 мкл меркаптоэтанола в 3 мл цитратного буфера с pH 6,5 к гидрогелю и встряхивали в течение 1 ч. Гидрогель промывали пять раз цитратным буфером с pH 6,5. Восстановление IL-1ra дисульфида осуществляли посредством промывания гидрогеля три раза раствором DTT (0,1 M DTT в 90% PBSTE и 10% 0,5 M фосфатным буфером pH 7,4, pH которого доводили до 7,4). 3 мл раствора ДТТ вводили в гидрогель и суспензию инкубировали в течение 1 сут. при 37°С. Гидрогель промывали двенадцать раз цитратным буфером с pH 6,5. Пролекарство «IL-1ra-линкер-гидрогель» 16а переносили в тарированный флакон и разбавляли цитратным буфером с pH 6,5, чтобы получить сыпучую суспензию.
Загрузку гидрогеля IL-1ra определяли посредством анализа аликвоты пролекарства «IL-1ra-линкер-гидрогель» 16а с помощью количественного аминокислотного анализа (QAAA).
Получали загрузку 0,67 мг IL1ra/мг гидрогеля.
Пролекарство «IL-1ra-линкер-гидрогель» 16b синтезировали соответственно за исключением применения 11 мг гидрогелевых гранул 14b, смеси 3,5 мл IL-1ra 15a/«IL-1ra-линкер» 15с в цитратном буфере с pH 6,5 (22,06 мг/мл) и 0,8 мкл меркаптоэтанола.
Получали загрузку 1,64 мг IL-1ra/мг гидрогеля.
Пример 21
Кинетика высвобождения in vitro - определение время полужизни in vitro
Аликвоты пролекарства «IL-1ra-линкер-гидрогель» 16а или 16b (содержащие приблизительно 5 мг IL-1ra) промывали пять раз буфером PBSTE и инкубировали в приблизительно 1 мл PBSTE при 37°С. Буфер заменяли через различные временные интервалы и высвободившийся IL-1ra количественно определяли с помощью SEC-HPLC при 220 нм. Пики, соответствующие высвобожденному IL-1ra, интегрировали и общее количество высвобожденного IL-1ra рассчитывали в зависимости от общего времени инкубации. Для определения скорости расщепления первого порядка использовали программное обеспечение для подбора аппроксимирующей кривой (GraphPad Prism 5.04). Получали время полувысвобождения 6 недель.
Идентичность высвобожденного IL-1ra подтверждали с помощью SEC-HPLC и MS. Высвобожденный IL-1ra оказался реактивным в малеимидном тесте (пример 19), что подтверждает успешное восстановление дисульфидных связей окисленного IL-1ra на гидрогеле.
Пример 22
Хондрозащитный эффект внутрисуставной инъекции пролекарства «IL-1ra-линкер-гидрогель» в ACLT-индуцированном артрите кроликов
Артрит индуцировали у кроликов самок Hyla NG возраста 24 недель (средняя масса 4,4 кг) посредством трансекции передней крестообразной связки (ACLT) правого колена. Через четыре дня после операции животным вводили внутрь сустава пролекарство «IL-1ra-линкер-гидрогель» 16а (содержащее 7,5 мг IL-1ra) в 350 мкл цитратного буфера с pH 6,5 или только 350 мкл цитратного буфера с pH 6,5. Через восемь недель после инъекции животных умерщвляли. Тяжесть макроскопических изменений на хряще правого колена классифицировали по поглощению китайской туши. Интактный хрящ не показывал поглощение туши, в то время как увеличение повреждений хряща коррелирует с увеличением поглощения туши. В группе IL-1ra хрящ показал гораздо меньше признаков деградации по сравнению с контрольной группой. Формирование остеофитов на медиальном мыщелке было менее интенсивным в группе IL-1ra по сравнению с контрольной группой. В отличие от контрольной группы никаких признаков формирования остеофитов не наблюдалось на плато большеберцовой кости в группе IL-1ra.
Сокращения
ACLT - трансекция передней крестообразной связки
АсОН - уксусная кислота
AcOEt - этилацетат
Bn - бензил
Boc - трет.-бутил оксикарбонил
DBU - 1,3-диазабицикло[5.4.0]ундецен
DCC - N,N-дициклогексилкарбодиимид
DCM - дихлорметан
DIPEA - диизопропилэтиламин
DMAP - диметиламинопиридин
DMF - N,N-диметилформамид
DMSO - диметилсульфоксид
DTT - DL дитиотреитол
EDC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
eq - экв.
EtOH - этанол
Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
HOBt - N-гидроксибензотриазол
iPrOH - 2-пропанол
LCMS - масс-спектрометрия в сочетании с жидкостной хроматографией
Mal - 3-малеимидопропил
Mal-ПЭГ6-NHS - N-(3-малеимидопропил)-21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаокса-генэйкозановая кислота NHS эфир
Me - метил
МеОН - метанол
Mmt - 4-метокситритил
MS, МС - масс-спектр/масс-спектрометрия
МТБЭ - метил-трет.-бутиловый эфир
MW - молекулярная масса
NHS - N-гидроксисукцинимид
PBSTE - фосфатно-солевой буфер с Tween и ЭДТА
ПЭГ - поли(этиленгликоль)
РуВОР - бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидино-фосфонийгексафторфосфат
ОФ-ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография на обращенной фазе
rpm - оборотов в минуту
RT - комнатная температура
SEC - гель-проникающая хроматография
ТСЕР - трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид
TES - триэтилсилан
TFA - трифторуксусная кислота
THF - тетрагидрофуран
TMEDA - N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин
Trt - трифенилметил, тритил
UPLC - ультра жидкостная хроматография
v - объем