ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ И ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ
INFLUENZA VIRUS STRAIN FOR PRODUCING LIVE AND INACTIVATED INFLUENZA VACCINE

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа, вызванного пандемически опасными вирусами гриппа птиц. Для производства интраназальной живой гриппозной вакцины (ЖГВ) или инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) предложен реассортантый штамм вируса гриппа A/перепел/Гонконг/97/84(H9N2)(Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A).
Современная эпидемическая ситуация по гриппу характеризуется не только одновременной циркуляцией эпидемических вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и B, но и широким распространением вирусов птичьего гриппа подтипов A(H5N1), A(H7N3) и A(H9N2), способных инфицировать людей. Вирусы птичьего гриппа A(H9N2) обладают даже большим сродством к дыхательным путям человека, чем высокопатогенные вирусы подтипа A(H5N1). Необходимость разработки срочных противопандемических мер, в том числе и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Минздрава РФ [Приказ №40 МЗ РФ РФ от 28.12.2004].
Применяемые в настоящее время для профилактики эпидемического гриппа A вакцины подтипов H1N1 и H3N2 не могут вызывать защитную реакцию в случае широкомасштабной вспышки, вызванной вирусами гриппа подтипа A(H9N2), к которым у подавляющего большинства населения нет иммунитета.
В настоящее время известен реассортантный штамм A/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) [Патент №2318871, опубл. 10.03.2008], предназначенный как для производства живой, так и инактивированной вакцины против птичьего гриппа подтипа Н5. Но он не может дать профилактический эффект в случае распространения вирусов гриппа подтипа A(H9N2).
За рубежом для производства ИГВ подтипа A(H9N2) был использован вирус гриппа A/Гонконг/1073/99(H9N2) антигенной линии G9 [Lancet. - 2003. - Vol. 362. - P.1959-1966]. Однако в процессе производства гриппозных вакцин на основе вирусов птичьего гриппа возникают трудности с накоплением вирусного материала в связи с высокой токсичностью подобных вирусов для куриных эмбрионов. Для создания высокоурожайных вакцинных штаммов применяют генетическую реассортацию с лабораторными штаммами, характеризующимися высокой репродуктивной активностью и безвредностью для человека.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенного вируса гриппа птиц A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2), принадлежащего к антигенной линии G1.
Вакцинный штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) получен в развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) методом классической генетической реассортации апатогенного птичьего вируса A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) с холодоадаптированным штаммом A/Ленинград/134/17/57(H2N2) с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2). Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83].
Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (XA) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) - от безвредного XA донора аттенуации. Из полученных реассортантов выбирают вакцинный кандидат с формулой генома 6:2, наиболее отвечающий требованиям антигенной специфичности, характерной для родительского вируса «дикого» типа, а также соответствующий признакам холодовой адаптации по способности к репродукции при пониженной температуре.
50
50
Анализ генома созданного вакцинного штамма был выполнен с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Klimov A.I. J. Virol. Method. - 1995. - №55. - P.445-446]. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, M и NS обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9I, HindIII, BamHI, AsnI, EcoRI, PvuI, NciI соответственно. Дополнительно копии сегментов РВ1, PA и M были обработаны рестриктазами BstXI, AsnI и BciVI. Было показано, что сайты рестрикции в положениях нуклеотидной цепи, характерные для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2), присутствуют в генах РВ2 (1459), PA (107 и 1045), NP (1066) и M (68 и 969). В то же время было установлено, что утрачены сайты рестрикции в генах РВ1 (819 и 975) и NS (798), что также характерно для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2). Таким образом, было установлено, что реассортант A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) унаследовал 6 генов негликозилированных белков от донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2) (формула генома 6:2). Принадлежность гемагглютинина родительскому штамму «дикого» типа A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Помимо этого было проведено прямое нуклеотидное секвенирование ДНК-копий генов. Штамм является температурочувствительным (разность титров при 33°C и 39°C-7,5 lg ЭИД/мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33°C и 25°C-2,8 lg ЭИД/мл).
Таким образом, представленный вакцинный штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - антигенной специфичностью гемагглютинина вируса «дикого» типа A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2), структурой генома, необходимой для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью, адаптацией к пониженной температуре культивирования, что коррелирует с аттенуацией, характерной для аттенуированного донорского штамма.
Штамм депонирован в коллекции Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под №2631. Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.
50
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°C в течение 48 часов - 7,5 lg ЭИД/0,2 мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512
Паспорт на вакцинный штамм А/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) прилагается (стр.5)
ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма - A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2)
2. Серия - серия 1.
3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:
а) апатогенный птичий вирус - A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2)
б) донор аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2)
4. Количество пассажей - 7 в процессе реассортации
5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции - 34°, 28-30 часов;
б) гемагглютинирующая активность 1:512;
50
в) инфекционная активность 9,3 lg ЭИД/0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;
50
д) разность в показателях инфекционной активности при 34°C и 40°C - 7,8 lg ЭИД/мл;
50
е) разность в показателях инфекционной активности при 34°C и 25°C - 2,8 lg ЭИД/мл;
ж) структура генома реассортанта:
- гены от апатогенного птичьего вируса - HA, NA
- гены от донора аттенуации - PA, РВ1, РВ2, NP, M, NS,
6. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации: 20.12.2010 г.;
б) объем материала во флаконе: 1 мл;
в) количество доз в серии: 2
50
г) инфекционная активность - 8,5 lg ЭИД/0,2 мл
д) гемагглютинируюшая активность - 1:512
7. Рекомендуемое разведение при вакцинации 1:1
8. Антигенная специфичность:
а) гемагглютинина - идентичен вирусу A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) по данным РТГА с крысиной антисывороткой;
б) нейраминидазы - идентична вирусу A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) по данным секвенирования.
9. Безвредность для мышей при подкожном введении - безвреден.
10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 25 декабря 2010 г. - стерилен.
11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.
Результаты доклинических испытаний заявляемого штамма.
1. Штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) проявляет свойства температурочувствительности и холодовой адаптации при культивировании в куриных эмбрионах.
Пример. Полученные данные по репродуктивной активности кандидата в вакцинные штаммы в развивающихся куриных эмбрионах свидетельствовали о приобретении вирусом A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) в результате реассортации ts- и ca-фенотипов, являющихся маркерами аттенуации (Табл. 1).
2. Штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H91N2) безвреден для мышей при интраназальном и введении.
50
50
50
Пример. При интраназальном введении в дозе 6-7 lg ЕИД реассортант был аттенуированным для мышей, репродуцируясь более эффективно в носовых ходах (3,5 lg ЕИД/мл), чем в легочной ткани (1,8 lg ЕИД/мл) (Табл.2).
3. Штамм A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) иммуногенен при введении мышам в виде прототипа ЖГВ интраназально или прототипа ИГВ внутримышечно.
Пример. Оценка гуморального иммунного ответа в сыворотках подопытных животных проводилась через 28 дней после введения препаратов. В иммуноферментном анализе выявлено наличие в сыворотках мышей, иммунизированных реассортантом A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2), специфических иммуноглобулинов классов G и A (IgG и IgA) к вирусам подтипа H9N2 (Табл.3). Выработка локальных антител при интраназальном введении в виде прототипа ЖГВ была значительно выше по сравнению с парентеральным введением инактивированного антигена.
Таким образом, было показано, что реассортантный вакцинный штамм, содержащий HA апатогенного птичьего вируса гриппа A(H9N2), был безвредным и иммуногенным при введении мышам. Заявляемый вакциинный кандидат по результатам испытаний на мышах может быть рекомендован для получения как живой, так и инактивированной гриппозных вакцин, поскольку способен индуцировать иммунный ответ как при интраназальном введении в виде прототипа ЖГВ, так и парентерально в виде прототипа ИГВ. Использование для получения вакцинных штаммов непатогенных вирусов гриппа обеспечивает необходимый уровень безопасности не только при работе с уже готовыми реассортантами, но и в процессе их подготовки.
Таблица 1
Результаты изучения репродукции реассортанта A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) и родительских вирусов различной температуре культивирования в куриных эмбрионах.
Вирус
Характеристика
Репродуктивная активность (m±δ) при температуре инкубации:
34°C
25°C
40°C
A/Ленинград/134/17/57(H2N2)
XA донорский штамм
9,5±0,3
7,3±0,2
1,5±0,0
A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2)
вакцинный кандидат
9,8±0,5
7±0,2
1,8±0,3
A/перепел/Гонконг/6/97(H9N2)
апатогенный вирус птичьего гриппа
8,6±0,3
1,5±0,0
9,2±0,2
Таблица 2
Результаты изучения безвредности реассортантного штамма A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) при интраназальном введении мышам.
Место выделения вируса
Титры вируса (lg ЭИД<sub>50</sub>/0,1 мл, m±δ на 3-й день после интраназального введения:
Лен17/Н9 (10<sup>6</sup>ЭИД<sub>50</sub>)
Лен17/Н9 (10<sup>7</sup> ЭИД<sub>50</sub>)
Лен 17 (10<sup>6</sup> ЭИД<sub>50</sub>)
H9N2-дт (10<sup>6</sup> ЭИД<sub>50</sub>)
носовые ходы
1,1±0,3
3,8±0,2
2,5±0,3
1,8±0,5
легкие
1,5±0,0
1,5±0,0
2,3±0,5
4,9±0,5
Таблица 3
Выработка сывороточных и локальных антител после иммунизации мышей реассортантным вакцинным штаммом A/17/перепел/Гонконг/97/84(H9N2) в виде ЖГВ или ИГВ.
Препарат
Сывороточные антитела
Локальные антитела
РТГА (СГТ)
Тестмикронейтрализации(СГТ)
ИФА, log<sub>10</sub> (m±δ)
ИФА, log<sub>10</sub> (m±δ)
lgG
lgA
lgG
lgA
Лен17/Н9-ЖГВ
5,0
9,1
2,7±0,6
2,9±0,2
1,6±0,9
2,6±0,7
Лен17/Н9-ИГВ
11,9
21,8
3,1±0,2
2,3±0,3
1,0±0,5
1,6±0,7
H9N2-дт
6,6
11,9
2,8±0,2
2,9±0,1
1,5±0,5
1,6±0,4
ИГВ+ЖГВ
11,5
13,2
2,6±0,1
2,5±0,4
1,4±0,5
1,5±0,8
ЖГВ+ИГВ
20,0
17,4
3,2±0,3
2,6±0,1
1,2±0,3
1,3±0,4
Контроль
5,0
10,0
2,2±0,6
2,2±0,5
1,0±0,0
1,0±0,0