КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ОРГАНОИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ УКАЗАННЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

1. Способ культивирования эпителиальных стволовых клеток или выделенных фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, где способ включает
предоставление внеклеточного матрикса,
инкубацию эпителиальной стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани, содержащего указанные эпителиальные стволовые клетки, с внеклеточным матриксом,
культивирование стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани в присутствии клеточной культуральной среды, содержащей базальную среду для клеток животного или человека, в которую добавлены:
ингибитор морфогенетического белка кости (BMP),
от 5 до 500 нг/мл митогенного фактора роста,
и необязательно агонист Wnt.
2. Способ по п.1, в котором эпителиальные стволовые клетки представляют собой нормальные эпителиальные клетки или эпителиальные клетки аденомы, и агонист Wnt добавляют, когда культивируют нормальные эпителиальные клетки.
3. Способ по п.1, где указанный ингибитор BMP выбран из Noggin, DAN и DAN-подобных белков, включая Cerberus и Gremlin.
4. Способ по п.1, где указанный агонист Wnt выбран из одного или нескольких из Wnt, R-спондина 1-4, Norrin и ингибитора GSK.
5. Способ по п.1, где указанный агонист Wnt содержит R-спондин 1-4 и/или Wnt-3а.
6. Способ по п.1, где указанный митогенный фактор роста выбран из группы, состоящей из EGF, TGF-альфа, FGF, BDNF и KGF.
7. Способ по п.6, где указанный митогенный фактор роста представляет собой EGF.
8. Способ по п.1, где ингибитор BMP представляет собой Noggin, митогенный фактор роста представляет собой эпидермальный фактор роста (EGF), и агонист Wnt представляет собой один из R-спондинов 1-4.
9. Способ по п.1, где указанная культуральная среда дополнительно содержит ингибитор Rock (Rho-киназа), необязательно выбранный из Y-27632, фасудила и Н-1152.
10. Способ по п.1, где указанная культуральная среда дополнительно содержит агонист notch.
11. Клеточная культуральная среда, содержащая базальную среду для клеток животного или человека, в которую добавлен ингибитор морфогенетического белка кости (BMP) и, митогенный фактор роста, в количестве, в частности, от 5 до 500 нг/мл.
12. Клеточная культуральная среда по п.11, где митогенетический фактор роста выбран из одного или нескольких митогенных факторов роста из группы, состоящей из эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста-альфа (TGF-альфа), фибробластного фактора роста (FGF), происходящий из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF) и фактор роста кератиноцитов (KGF), в частности, митогенетический фактор роста представляет собой EGF
13. Клеточная культуральная среда по п.11, которая дополнительно содержит агонист Wnt, в частности, любой из R-спондинов 1-4, и/или где ингибитор BMP представляет собой Noggin, и где среда необязательно дополнена В27, N2 и N-ацетилцистеином.
14. Клеточная культуральная среда по п.13, где ингибитор BMP представляет собой Noggin, митогенетический фактор роста представляет собой EGF и агонист Wnt представляет собой один из R-спондинов 1-4.
15. Клеточная культуральная среда по п.11, в комбинации с внеклеточным матриксом, в частности, с внеклеточным матриксом. который содержит коллаген и ламинин, в частности с Matrigel™.
16. Клеточная культуральная среда по п.13, в комбинации с внеклеточным матриксом, в частности, с внеклеточным матриксом, который содержит коллаген и ламинин, в частности с Matrigel™.
17. Клеточная культуральная среда по п.15, где культуральная среда добавлена к или включена во внеклеточный матрикс.
18. Клеточная культуральная среда по п.16, где культуральная среда добавлена к или включена во внеклеточный матрикс.
19. Применение культуральной среды по любому из пп.11-18 для культивирования эпителиальных стволовых клеток, выделенных фрагментов тканей или выделенных органоидных структур на или во внеклеточном матриксе.
20. Применение по п.19, где эпителиальные стволовые клетки представляют собой нормальные эпителиальные клетки или эпителиальные клетки аденомы.
21. Способ культивирования трехмерного тканевого органоида в присутствии внеклеточного матрикса, где способ включает культивирование органоида в культуральной среде по любому из пп.11-18.
22. Способ по п.21, где указанный трехмерный тканевой органоид культивируется в среде, содержащей Noggin, EGF и, необязательно, R-спондин 1 и/или Wnt-3а в качестве агониста Wnt.
23. Способ получения органоида путем культивирования эпителиальных стволовых клеток толстого или тонкого кишечника или фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, в частности, выделенные крипты толстого или тонкого кишечника, используя способ по любому из пп.1-10, где, в частности, стадия культивирования включает культивирование указанных эпителиальных стволовых клеток толстого или тонкого кишечника или фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, в частности, выделенные крипты толстого или тонкого кишечника, в контакте с внеклеточным матриксом в среде, содержащей Noggin, EGF, и R-спондин 1 и/или Wnt-3 в качестве агониста Wnt, дополненной В27, N2 и N-ацетилцистеином.
24. Способ получения органоида поджелудочной железы, путем культивирования эпителиальных стволовых клеток поджелудочной железы или фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, используя способ по любому из пп.1-10, где, в частности, стадия культивирования включает культивирование указанных эпителиальных стволовых клеток поджелудочной железы или фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, в контакте с внеклеточным матриксом на первой стадии в среде, содержащей EGF, KGF или FGF, и R-спондин 1 в качестве агониста Wnt, дополненной В27, N2 и N-ацетилцистеином, и затем на второй стадии в среде, содержащей EGF и R-спондин 1 в качестве агониста Wnt, дополненной В27, N2 и N-ацетилцистеином.
25. Способ получения желудочного органоида путем культивирования эпителиальных стволовых клеток желудка или фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, используя способ по любому из пп.1-10, где, в частности, стадия культивирования включает культивирование указанных эпителиальных стволовых клеток желудка или фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, в контакте с внеклеточным матриксом на первой стадии в среде, содержащей Noggin в качестве ингибитора BMP, эпидермальный фактор роста и FGF 10 в качестве митогенного фактора роста, R-спондин 1 и Wnt-3 а в качестве агониста Wnt, и дополнительно содержащей В27, N2, N-ацетилцистеин, и затем на второй стадии в среде, содержащей эпидермальный фактор роста и R-спондин 1 и Wnt-3а в качестве агониста Wnt, Noggin и FGF10, дополненной В27, N2 и N-ацетилцистеином, где концентрация Wnt-3 на второй стадии снижена по сравнению с концентрацией Wnt-3а, присутствующей на первой стадии.
26. Трехмерный органоид, полученный способом по любому из пп.1-10 или по любому из пп.21-25.
27. Трехмерный органоид по п.26, где органоид происходит из эпителиальных стволовых клеток тонкого кишечника, эпителиальных стволовых клеток поджелудочной железы или эпителиальных стволовых клеток желудка.
28. Трехмерный органоид по п.26, где в указанном органоиде отсутствуют клетки, которые не являются эпителиальными.
29. Трехмерный органоид по п.27, где в указанном органоиде отсутствуют клетки, которые не являются эпителиальными.
30. Трехмерный органоид по п.29, содержащий центральный просвет.
31. Трехмерный органоид по любому из пп.26-29, содержащий центральный просвет.
32. Трехмерный органоид по любому из пп.26-30, содержащий домены подобные криптам, окружающие центральный просвет, выстилаемый эпителиальными доменами подобными ворсинкам, которые являются эпителиальными доменами, включающими дифференцированные типы клеток, и где в органоиде отсутствуют клетки, которые не являются эпителиальными.
33. Трехмерный органоид по любому из пп.26-29, включающий структуры, подобные островкам поджелудочной железы, которые являются эпителиальными доменами, включающими дифференцированные типы клеток, и где в органоиде отсутствуют клетки, которые не являются эпителиальными.
34. Трехмерный органоид по любому из пп.26-30, где органоид происходит из одной или более клеток аденомы и имеет структуру подобную пузырю, в которой клетки беспорядочно ориентированы по направлению к периферии или к центральному просвету.
35. Применение органоидов по любому из пп.26-34 в скрининге при разработке лекарственных средств, в анализе токсичности или в регенеративной медицине.
36. Потомство клеток или органоидов, культивируемых с использованием культуральной среды по любому из пп.11-18.
37. Потомство клеток или органоидов по п.36, применяемое
a) в анализе токсичности или в регенеративной медицине; и/или
b) для идентификации лекарств которые специфически нацелены на клетки эпиталиальной карциномы, в сравнении с клетками эпиталиальной аденомы или нормальными клетками эпителия, включая реверсию клеток карциномы; и/или
c) для определения in vitro метаболической стабильности или метаболического профиля лекарств-кандидатов.