РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ РАСТВОРЫ С ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ
RADIOPHARMACEUTICAL SOLUTIONS WITH PREFERRED PROPERTIES

Область техники, к которой относится изобретение
224
212
212
Настоящее изобретение относится к радиофармацевтическому раствору, содержащему свободный/не находящийся в комплексе/нехелатированный Ra и комплексообразователь, способный захватывать/образовывать комплекс/хелатировать Pb и/или Bi. Такой раствор можно использовать для медицинских целей, включая лечение злокачественной опухоли. Дополнительные аспекты изобретения относятся к наборам и способам предоставления конкретных растворов.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Направленная радионуклидная терапия альфа-частицами является перспективным терапевтическим способом против злокачественных и незлокачественных заболеваний. Испускающие альфа-частицы радионуклиды являются высоко цитотоксичными, и продуцируемые альфа-частицы обладают высокой линейной энергией, которая доставляет большое количество ионизации на коротком расстоянии, вызывая разрушение ДНК в результате высокого уровня не поддающихся репарации разрывов двойной цепи.
Таким образом, при использовании альфа-излучающих радионуклидов важным является, чтобы они достигали мишени и не высвобождались из обеспечивающего направленную доставку соединения, чтобы они не продуцировали долгоживущих дочерних нуклидов, которые диффундируют от материнского нуклида, т.к. это может приводить к токсичности в отдаленных тканях.
Существует сравнительно немного альфа-излучателей, рассматриваемых для медицинских применений. В данной области существует проблема поиска радионуклида с подходящим времени полужизни, способностями к распаду, химическими свойствами и дочерними продуктами, которые являются подходящими для разработки различных видов медицинского лечения.
226
224
1/2
1/2
Радий является очень важным для развития радиохимии, а также он использовался первыми исследователями радиоонкологии для лечения злокачественной опухоли брахитерапией (т.е. испускающими излучение иглами или зернами, помещаемыми в опухоли или вблизи от опухолей. Сначала использовали Ra с периодом полураспада (t) 1600 лет. Затем на протяжении нескольких десятилетий в Германии использовалиRa (t=3,66 суток) в виде инъекционных препаратов хлорида радия для паллиативного лечения анкилозирующего спондилита (AS) вследствие его природного остеотропного свойства, самый тяжелый из щелочноземельных элементов.
224
Несмотря на то, то его вновь использовали после разработки улучшенных способов очистки в течение короткого периода времени приблизительно в 2000 г., от его использования в конечном итоге отказались частично вследствие опасений из-за поздних эффектов и появления новых способов лечения AS. Таким образом, в настоящее время Ra не используют в качестве радиофармацевтического средства, ведущие эксперты в данной области и не рассматривают его как одного из возможных кандидатов для альфа-терапии.
224
224
Тем не менее, проводится исследования по использованию нагруженных Ra стержней для локальной брахитерапии внутри опухоли/радоновой диффузионной терапии, но в них не используют водные растворы Ra для терапии.
223
Недавно другой изотоп радия Ra в форме инъецируемой растворенной соли получил регистрационное удостоверение в качестве лечения скелетных метастазов в результате кастрации при резистентном раке предстательной железы.
223
224
1/2
1/2
При сравнении Ra (t=11,4 суток) с Ra (t=3,6 суток) в принципе оба обладают соответствующими периодами полураспада для радиофармацевтических применений, что позволяет централизовано производить и доставлять конечному пользователю, и оба характеризуются тремя альфа-излучающими поколениями в своих цепочек распадов, и ряды продуцируют сходное количество альф-частиц (фигуры 1 и 2) с общим уровнем энергии альфа-частиц приблизительно 26-28 МэВ для цепочек распадов.
223
223
211
212
224
224
212
223
224
1/2
1/2
При сравнении цепочек распадов продукты распада Ra элементов Rn, Pb и Bi обладают значительно более короткими периодами полураспада, что уменьшает проблему поглощения дочерних нуклеотидов в не являющихся мишенями клетках и тканях. Эти отличия являются особенно важными для продуктов распада свинца, т.к. они могут накапливаться в гематопоэтических клетках и тканях и в почках, соответственно. В рядуRaPb (t=36,1 мин) приводит к меньшему воздействию на нормальные ткани по сравнению с Pb (t=10,6 часов) из ряда Ra. Несмотря на то, что Ra очищают от Pb непосредственно перед инъекцией, Ra характеризуется значительно меньшим воздействием продуктов распада на нормальную ткань. Такая очистка является нецелесообразной, т.к. для нее необходимым является проведение лабораторных способов в больнице, где используют продукт, или чтобы получение и использование являлись территориально ограниченными. Именно поэтому временные рамки для использования Ra, который ранее поставляли Altmann Terapie, Salzgitter, Germany для AS, составляли только 6 часов. Его можно было использовать за 3 часа до или через три часа после момента калибровки. Вероятно, в значительной степени вследствие кроткого периода хранения продукта (в дополнение к повышенной конкуренции с новыми лекарственными средствами для AS) и, таким образом, логистики и ограничений со стороны предложения от продукта отказались.
224
224
212
212
212
in vivo
На данный момент раствор Ra для инъекции пациентам не используют. Вместо него разрабатывают ионообменное вещество на основе источников Ra для выделения Pb для использования Pb в радиоиммунотерапии. Свинец 212 сам по себе является бета-излучателем, но распадается до альфа-излучателя Bi и, таким образом, его считают подходящим в качестве источника  для терапии альфа-частицами.
224
212
212
212
и/п
Таким образом, в настоящее время Ra рассматривают только как нуклеотид-источник пригодного с медицинской точки зрения Pb. Вследствие относительно короткого периода полураспада Pb ожидают, что он наиболее хорошо подходит для лечения заболевания с поражением одного отдела, при котором радиоиммуноконъюгат инъецируют непосредственно в область, например, интраперитонеальную (и/п) полость, где высокая концентрация продукта может направленно воздействовать на злокачественный асцит и микрометастазы в полости. Период полураспада 10,6 часов Pb может являться предпочтительным, т.к. только небольшое количество просачивается  полости до того, как радиоактивность исчезает.
224
212
224
Если радий рассматривают для терапии заболеваний костей, его следует поддерживать в состоянии катионов, т.к. это обеспечивает то, что радий, так называемое "тропное к объему кости вещество", встроится в минеральные вещества костной ткани, что приведет к удержанию дочерних нуклидов. Это является особенно важным для Ra, т.к. некоторые из дочерних нуклидов, в частности Pb, обладают значительными периодами полураспада, что обеспечивает трансорганное перераспределение, если остаются свободными в физиологических жидкостях, таких как кровь, слюна или лимфатическая жидкость. На фигуре 4 приведен основной вид облучения цепочки распада Ra.
224
224
Фармакопейную статью об использовании Ra при анкилозирующем спондилите разработали органы здравоохранения Германии приблизительно 10 лет назад, когда Altmann Terapie (Salzgitter, Germany) предпринимал попытки повторного введения раствора Ra в качестве лечения анкилозирующего спондилита на основании запатентованного способа получения, обеспечивающего высокоочищенный продукт.
224
212
224
212
224
224
212
212
212
224
212
1/2
В цепочке распада Ra образуется дочерний продукт Pb (t=10,6 часов). Он характеризуется другим биораспределением по сравнению с Ra материнским нуклидом при совместной инъекции пациентам. Это приводит к меньшей начальной активности в тканях-мишенях и большей активности в не являющихся мишенью тканях, таких как клетки крови, в частности гематопоэтические клетки и ткани, и костный мозг и почки. Число атомов Pb по сравнению с Ra в продукте в радиоактивном равновесии составляет менее 14%. Однако вследствие того, что Ra быстро переходит из крови в костную систему или выводится, а Pb в значительной степени удерживается гематопоэтическими клетками и тканями, токсикологический вклад Pb, который приводит к образованию альфа-излучателя Bi, является важным. Единственным путем решения этой проблемы на современно уровне знаний в данной области является использование Ra в короткий промежуток времени после очистки, как предполагают до того, как произошел значительной рост уровня Pb.
206
212
212
213
225
Описано использование поглотителя дочерних продуктов в экспериментальном радиофармацевтическом исследовании: Jones et al. (1996) исследовали пероральное введение в течение нескольких суток не рассматриваемых в качестве мишеней дитиольных хелатирующих средств 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновой кислоты (DMPS) и мезо-2,3-димеркаптоянтарной кислоты (DMSA) для улучшения клиренса Bi из почками у мышей и выявили улучшенный клиренс почками DMPS. Их целью являлось использование перорального хелата в качестве возможных адъювантов для снижения или предотвращения радиотоксичности при альфа-радиоиммунотерапии с антителами против рецептора интерлейкина 2 (IL-2R), нагруженными Pb или Bi. Jaggi et al. (2005) использовали пероральную хелаторную терапию для снижения накопления в почках Bi, образующегося из Ac. Их целью являлось повышение экскреции нежелательного дочернего продукта. Они не добавляли хелатор к радиофармацевтическому средству, а только описывают его использование в качестве перорального лекарственного препарата в питьевой воде до инъекции радиофармацевтического средства и после нее.
223
224
223
В отношении терапии костной ткани Ra считают более подходящим, чем Ra, т.к. Ra характеризуется дочерними нуклидами с более короткими периодами полураспада и, таким образом, меньшими проблемами перемещения. Недавно радий-223 одобрили для терапии пациентов с гормонорефрактерными метастазами в костной системе при раке предстательной железы.
224
224
224
212
224
224
Ранее проводили тестирование растворимой соли Ra при терапии злокачественной опухоли, но отказались от этого вследствие того неблагоприятных свойств и неэффективности. Было определено, что вследствие короткого периода полураспада Ra и его инъецируемых дочерних продуктов, мягкая ткань(и) подвергаются облучению. Другими словами, в случае Ra период полураспада дочерних продуктов, в частности Pb, является относительно длинным, по сравнению с материнскими нуклидами, и происходит большее воздействие на мягкую ткань. Таким образом, в данной области известно, что Ra имеет неблагоприятный дочерний нуклеотид, ограничивающий его использование в радиофармацевтических растворах. Также в вышедшем недавно обзоре старших экспертов в данной области Ra не был указан среди радионуклидов-кандидатов, рассматриваемых для радиофармацевтической терапии в качестве излучателя альфа-частиц.
Понятие циркулирующих опухолевых клеток (CTC) в последнее время получало большое внимание, т.к. CTC может играть критическую роль в развитии опухолевых метастазов. Известно, что злокачественные опухоли, которые приводят к образованию метастазов в костной системе, такие как, например, рак предстательной железы, молочной железы, легкого и множественная миелома, могут характеризоваться наличием жизнеспособных циркулирующих в крови злокачественных клеток, которые могли распространяться из первичных или метастатических опухолей. Это означает, что даже если проводят лечение метастазов в костях, то могут образовываться новые очаги в результате оседания CTC в костных или других тканях.
Радий 223, используемый против костных метастазов в настоящее время, является чистым остеофилом и не решает проблему CTC. Таким образом, существует необходимость в области альфа-фармацевтических терапевтических средств для костей продукта, который может решать проблему CTC.
in vivo
in vivo
224
223
223
211
223
224
212
224
223
224
224
212
224
Образование дочерних нуклидов в инъецируемых препаратах и  является возможной проблемой для Ra и в меньшей степени для Ra, т.к. первыми продуктами распада в двух цепочках распадов для обоих изотопов является радон, который является высоко диффузионным. Однако литературные данные указывают на то, что это является меньшей из проблем при образовании , т.к. радий является тропным к объему кости и встраивается в костный матрикс. Также помогает то, что поглощение в костную систему внутривенного радия происходит практически мгновенно и интестинально, и в меньшей степени с мочой элиминация происходит быстро, что приводит к элиминации из крови в течение минуты после инъекции. Следует отметить, что элиминация с мочой, по-видимому, является более выраженной у грызунов по сравнению с людьми, у которых элиминация с калом является основным путем. Как описано Nilsson et al. (2005), через 10 минут после инъекции происходит снижение радия в крови на 88%. В случае, когда рассматривают, что радий локализуется в костной системе, для Ra было описано равновесие Bi и Ra в кости через несколько часов. Для Ra на основании данных, полученных для животных, и экстраполяции для взрослого человека на двух различных моделях была выявлена доля Pb к Ra 0,88 и 1,0, т.е., практически полное удерживание дочерних продуктов. Эти данные указывают на высокое удержание дочерних нуклидов в кости для Ra и Ra. Для Ra значительный вклад в захват мягкими тканями продуктов распада, таким образом, вероятно, обусловлен совместно вводимым дочерним нуклидом. Таким образом, необходимой является разработка способов регуляции дочерних нуклидов по меньшей мере Pb в инъекционных препаратах на основе Ra.
224
Этого достигали посредством новых растворов Ra, описываемых в настоящем описании.
Сущность изобретения
224
212
224
212
212
212
224
212
in vivo
Настоящее изобретение относится к радиофармацевтическим композициям, содержащим материнский нуклид Ra, его дочерний нуклид Pb и комплексообразователь, который образует комплекс с дочерним нуклидом. Несмотря на то, что Ra направлено попадает в кость в своей не связанной в комплексе форме, вариант осуществления композиции содержит комплексообразователь EDTMP, которые образует комплекс с Pb и конкретно направленно доставляет его в кость, таким образом, устраняя и/или сводя к минимуму нежелательные побочные эффекты и/или нецелевые эффекты, обуславливаемые Pb. Это видно при сравнении, например, фиг. 3A и фиг. 3B. В другом варианте осуществления комплексообразователь представляет собой меченное TCMC моноклональное антитело, например, трастузумаб (герцептин), обеспечивает конкретную направленную доставку Pb в кровь. Такая доставка является неожиданным свойством, очень пригодным в ситуации когда, например, существуют циркулирующие в крови опухолевые клетки. Таким образом, например, можно получать терапевтическую эффективность выше и наряду с эффективностью, доступной с Ra, направленным посредством конкретной регуляции направленной доставки Pb посредством остеотропного EDTMP и циркулирующего в крови меченного TCMC моноклонального антитела. Исследования  на мышах представлены в примере 12, демонстрирующем улучшение по сравнению с золотым стандартом протокола лечения.
224
212
Целью настоящего изобретения является предоставление радиофармацевтического раствора, содержащего Ra и комплекс, способный захватывать по меньшей мере Pb.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплекс содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из ациклических хелаторов, циклических хелаторов, криптандов, краун-эфиров, порфиринов или циклических или нециклических полифосфонатов, DOTMP, EDTMP, бисфосфоната, памидроната, конъюгированного с DOTA, памидроната, конъюгированного с TCMC, конъюгированной с антителом DOTA и конъюгированного с антителом TCMC.
212
212
В другом варианте осуществления настоящего изобретения Pb и/или Bi связаны в комплекс (остеотропным) EDTMP.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения комплексообразователь конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из моноклонального, поликлонального антитела, фрагмента антитела, синтетического белка, пептида, витамина или производного витамина.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения комплексообразователь представляет собой хелатор TCMC, конъюгированный с соединением, выбранным из группы, состоящей из моноклонального, поликлонального антитела, фрагмента антитела, синтетического белка, пептида, витамина или производного витамина.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к набору, содержащему первый флакон, содержащий радиофармацевтический раствор по настоящему изобретению, и второй флакон, содержащий нейтрализующий раствор для регуляции pH и/или изотоничности радиофармацевтического раствора перед введением пациенту.
224
Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему первый флакон, содержащий меченный хелатом белок или пептид, второй флакон, содержащий раствор Ra.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к радиофармацевтическому раствору по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к радиофармацевтическому раствору по настоящему изобретению для применения в лечении заболевания костной системы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболевание костной системы выбрано из группы, состоящей из метастазов в костной системе от злокачественных опухолей до рака молочной железы, предстательной железы, почки, легкого, кости или множественной миеломы, или незлокачественных заболеваний, вызывающих нежелательную кальцификацию, включая анкилозирующий спондилит.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу лечения злокачественного или незлокачественного заболевания путем введения радиофармацевтического раствора по настоящему изобретению нуждающемуся в этом индивидууму.
224
224
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу предоставления раствора Ra, содержащего белок-комплекс или пептид-комплекс, содержащий смесь меченного хелатом белка, например, моноклонального антитела, или пептида с раствором, содержащим Ra.
Краткое описание чертежей
224
На фигуре 1 представлен распад Ra и дочерних продуктов.
223
На фигуре 2 представлен распад Ra и дочерних продуктов.
224
212
224
212
224
212
На фигуре 3A представлено биораспределение Ra и продуктов распада Pb в растворе без хелатора у бестимусных мышей. На фигуре 3B представлено биораспределение раствора Ra, содержащего EDTMP в качестве хелатора для продуктов распада Pb, у бестимусных мышей. На фигуре 3 C представлено биораспределение раствора Ra, содержащего TCMC-трастузумаб (герцептин) в качестве хелатора для продуктов распада Pb, у бестимусных мышей.
224
224
224
На фигуре 4 представлены основные радиационные свойства ряда Ra. Среднее за трансформацию Ra вследствие ветвления. Учитывают только рентгеновские лучи или гамма-излучение выше 1% эффективной распространенности. Это добавляет к общей эффективной энергии приблизительно 26,5 МэВ альфа или 0,7 МэВ бета при полном распаде Ra и дочерних продуктов.
212
224
На фигуре 5 представлен прирост Pb от чистого источника Ra 10 МБк. Изменения уровня активности. Начальная активность 10 МБк чистого 224-Ra.
212
224
На фигуре 6A представлены профили тонкослойной хроматографии (TLC) Pb в растворе Ra в равновесном состоянии с нуклеотидами продуктов распада без комплексообразователей EDTMP и DOTMP и с ними.
212
224
212
На фигуре 6B представлены профили тонкослойной хроматографии (TLC) Pb в растворе Ra в равновесном состоянии с нуклеотидами продуктов распада без комплексообразователей и с ними. На фигуре 6B представлены профили TLC для Pb в присутствии конъюгатов антитело-TCMC или DOTA и антитела без хелатора.
212
На фигуре 7 представлены отношения поглощения* для Pb для кости в сравнении с кровью и для кости в сравнении с почками.
223
224
212
На фигуре 8 представлено сравнение данных для Ra и Ra+Pb-EDTMP на модели MDA-MB-231 (SA) на бестимусных мышах. *Из Suominen et al., J Natl Cancer Inst, 2013, 105: 908-916, фигура 6, p. 915.
Настоящее изобретение более подробно описано ниже, как следует ниже.
Подробное описание изобретения
Некоторые используемые сокращенные обозначения
DOTMP - 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетра(метиленфосфоновая кислота)
EDTMP - этилендиаминтетра(метиленфосфоновая кислота)
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
p-SCN-Bn-DOTA - 2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота
DOTA - 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота, а также используемый для бензил-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (например, конъюгированной с моноклональным антителом)
p-SCN-Bn-TCMC - 2-(4-изотиоцианотобензил)-1,4,7,10-тетрааза-1,4,7,10-тетра-(2-карбамонилметил)циклододекан
TCMC - 1,4,7,10-тетрааза-1,4,7,10-тетра-(2-карбамонилметил)-циклододекан, а также используемый для бензил-1,4,7,10-тетрааза-1,4,7,10-тетра-(2-карбамонилметил)циклододекан (например, конъюгированный с моноклональным антителом)
mAb - моноклональное антитело.
Аналогичные сокращенные обозначения в следующем ниже описании используют для кислот, солей или частично или полностью диссоциированных вариантов хелаторов.
224
Неожиданно было сделано открытие, что возможно приводить в прочный комплекс дочерний нуклид в присутствии радия с тестируемыми комплексообразующими соединениями, EDTMP и моноклональным антителом, конъюгированным с хелаторами TCMC и DOTA, и одновременно сохранять радий (Ra) в основном в виде не входящего в состав комплекса катиона полностью направленного на доставку в кость.
Радиофармацевтический раствор
224
212
Целью настоящего изобретения является предоставление радиофармацевтического раствора, содержащего Ra и комплекс, способный захватывать по меньшей мере Pb.
224
212
Таким образом, один из аспектов изобретения относится к радиофармацевтическому раствору, содержащему не входящий в состав комплекса Ra и комплексы между комплексообразователем и Pb. Предпочтительно комплексообразователь выбран из группы, состоящей из ациклических хелаторов, циклических хелаторов, криптандов, краун-эфиров, порфиринов или циклических или нециклических полифосфонатов, DOTMP, EDTMP, бисфосфонатов, памидроната, конъюгированного с DOTA, памидроната, конъюгированного с TCMC, конъюгированной с антителом DOTA и конъюгированного с антителом TCMC. Даже более предпочтительно комплексообразователь представляет собой циклический хелатор или ациклический хелатор.
212
224
212
224
Следует понимать, что комплексообразователь по изобретению также может включать производные указанных выше соединений (такие как производные EDTMP, DOTA и TCMC). Также следует понимать, что такие производные могут сохранять способность образовывать комплекс с Pb с более высокой устойчивой стабильностью, по сравнению с Ra. Таким образом в альтернативном варианте осуществления комплексообразователь выбран из группы состоящей из ациклических хелаторов, циклических хелаторов, криптандов, краун-эфиров, порфиринов или циклических или нециклических полифосфонатов, DOTMP, EDTMP, бисфосфонат, памидроната, конъюгированного с DOTA, памидроната, конъюгированного с TCMC, конъюгированной с антителом DOTA, конъюгированного с антителом TCMC или производных любого из этих соединений; где указанные производные образуют комплекс с Pb с более высокой устойчивой стабильностью, по сравнению с Ra.
пара
Подходящие хелаторы включают производные DOTA, такие как -изотиоцианатобензил-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (p-SCN-Bz-DOTA) и DOTA-NHS-сложный эфир.
224
212
Другой аспект изобретения относится к радиофармацевтическому раствору, содержащему Ra, Pb и комплексообразователь, выбранный из группы, состоящей из EDTMP, конъюгированной с антителом DOTA или конъюгированного с антителом TCMC.
212
В одном из вариантов осуществления комплексообразователь способен образовывать комплекс по меньшей мере с Pb.
224
212
В другом варианте осуществления комплексообразователь способен образовывать комплекс с дочерним нуклидом Ra, таким как Pb, в фармацевтическом растворе.
224
224
В еще одном другом варианте осуществления комплексообразователь не образует комплекс с Ra или по существу не образует комплекс с Ra в фармацевтическом растворе.
212
224
В еще одном дополнительном варианте осуществления комплексообразователь образует комплекс с более высокой устойчивой стабильностью с Pb по сравнению с Ra.
212
224
В одном из вариантов осуществления устойчивая стабильность для Pb составляет по меньшей мере двукратную аффинность к Ra, такую как по меньшей мере в четыре раза выше, такую как по меньшей мере в 8 раз выше, или такую как по меньшей мере в 10 раз выше.
224
in vivo
В другом варианте осуществления комплексообразователь не влияет или по существу не влияет на биораспределение Ra .
212
224
В примере 6 (фигуры 3A в сравнении с 3B) можно видеть, что, когда в качестве комплексообразующего/хелатирующего средства используют EDTMP, Pb перераспределяется преимущественно в костях, тогда как на распределение Ra практически не оказывается влияния.
212
224
В примере 9 (фигуры 3A в сравнении 3C) можно видеть, что, когда в качестве комплексообразующего/хелатирующего средства используют TCMC-герцептин, Pb перераспределяется преимущественно в крови, тогда как на распределение Ra практически не оказывается влияния.
224
212
224
В еще одном другом варианте осуществления комплексообразователь выбран из группы, состоящей из ациклических хелаторов, циклических хелаторов, криптандов, краун-эфиров, порфиринов или циклических или нециклических полифосфонатов, DOTMP, EDTMP, бисфосфоната, памидроната, конъюгированного с DOTA, памидроната, конъюгированного с TCMC, конъюгированной с антителом DOTA и конъюгированного с антителом TCMC, где комплексообразователь способен образовывать комплекс с дочерним нуклидом Ra, таким как Pb, в фармацевтическом растворе, и где комплексообразователь не образует комплекс с Ra в фармацевтическом растворе.
В предпочтительном варианте осуществления указанный комплексообразователь выбран из группы, состоящей из EDTMP, конъюгированной с антителом DOTA или конъюгированного с антителом TCMC.
224
212
В дополнительном варианте осуществления количество Ra и Pb находится в радиоактивном равновесии.
212
224
В еще одном дополнительном варианте осуществления отношение активностей (в МБк) Pb к Ra составляет от 0,5 до 2, такое как 0,8-1,5, или такой как 0,8-1,3, или предпочтительно такое как 0,9-1,15.
212
224
212
224
212
224
212
224
В контексте настоящего изобретения термин "радиоактивное равновесие" относится к отношению в МБк двух радионуклидов, которое является одинаковым или по существу одинаковым в течение длительного периода времени. Термин "отношение активностей" например, Pb к Ra относится к отношению МБк Pb к Ra. На фигуре 5 приведена таблица (таблица 2), демонстрирующая изменение этого отношения активности во времени. Можно видеть, что через двое суток устанавливалось радиоактивное равновесие 1,1 для отношения активностей Pb к Ra (7,3 делимое на 6,8). Таким образом, на фигуре 5 также можно видеть, что радиоактивное равновесие между Pb и Ra наступает приблизительно через 2 суток.
212
in vivo
in vitro
В контексте настоящего изобретения, термины "комплексообразователь", "поглотитель" и "хелатирующее средство" используют взаимозаменяемо. Термины относятся к средствам, способным образовывать комплексы с Pb, предпочтительно посредством хелатирования и со значительной прочностью, как измеряют в тестируемых системах, при этом на радий не оказывает существенного влияния присутствие комплекса как измеряют в тестируемых системах. Тестируемые системы: биораспределение икатионообменная смола или картридж для удержания по размеру и концентрирования в центрифуге для связывания хелат-антитело с радионуклидом.
В контексте настоящего изобретения "захватывающий" (или образующий комплекс) определяют как по меньшей мере на 50% связанный в соответствие с тонкослойной хроматографией (TLC), концентрирующим разделением в центрифуге или профилями биораспределения.
212
Таким образом, например, по меньшей мере на 50% меньше поглощается кровью Pb с низкомолекулярным хелатором. В случае конъюгированного с антителом хелатора, где поглощение кровью не является надежным показателем, по меньшей мере 50% связывания согласно анализам TLC.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связывание составляет по меньшей мере 60%.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения связывание составляет по меньшей мере 70%.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения связывание составляет по меньшей мере 80%.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения связывание составляет по меньшей мере 85%.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения связывание составляет по меньшей мере 90%.
212
Соединение или соединения также способны захватывать еще радионуклиды наряду с Pb.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплекс содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из ациклических хелаторов, циклических хелаторов, криптандов, краун-эфиров, порфиринов или циклических или нециклических полифосфонатов, DOTMP, EDTMP, бисфосфоната, памидроната, конъюгированного с DOTA, памидроната, конъюгированного с TCMC, конъюгированной с антителом DOTA и конъюгированного с антителом TCMC.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплекс содержится в концентрации от 1 нг/мл до 1 г/мл.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения комплекс содержится в концентрации от 100 нг до 10 мг/мл.
Комплекс может содержать одно, два, три, четыре, пять или более соединений.
212
212
В другом варианте осуществления настоящего изобретения Pb и/или Bi образуют комплекс с остеотропным EDTMP.
В одном из вариантов осуществления объем раствора составляет от 100 мкл до 1000 мл, такой как от 500 мкл до 100 мл, 1 мл до 10 мл.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения радиоактивность раствора составляет от 1 кБк до 1 ГБк, такую как от 10 кБк до 100 МБк, такую как от 100 кБк до 10 МБк.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения радиоактивность раствора составляет от 100 кБк до 100 МБк.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения комплексообразователь конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из моноклонального, поликлонального антитела, фрагмента антитела, синтетического белка, пептида, гормона или производного гормона, или витамина или производного витамина, например, биотина и фолата.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения комплексообразователь представляет собой хелатор TCMC, конъюгированный с соединением, выбранным из группы, состоящей из моноклонального, поликлонального антитела, фрагмента антитела, синтетического белка, пептида, гормона или производного гормона, или витамина или производного витамина.
224
224
212
212
212
224
В целях дозирования вводимые растворы Ra следует хранить в течение некоторого времени, например, 1 сутки или более предпочтительно по меньшей мере двое суток, так как 1-2 суток или 1-3 суток, для установления равновесия между Ra и Pb/Bi. Это обеспечивает отношения активностей Pb к Ra от 0,83 до 1,14. Это, например, может проводить производитель путем простого удержания продукта на сутки или приблизительно перед отправкой.
Важным является сохранение радия в виде по существу не входящего в состав комплекса или входящего в состав слабого комплекса катиона, т.к. это обеспечивает максимальное поглощение в кости и костных метастазах, а также обеспечивает благоприятное выведение элиминируемого продукта в основном через кишечник.
212
Добавлением комплексообразователя к раствору радия радиоактивный дочерний нуклид можно делать остеотропным или направленным на опухоль и увеличивать терапевтический потенциал раствора радия вместо вреда для здоровья. Однако комплексообразователь должен представлять собой комплексообразователь, который не оказывает отрицательного влияния на остеотропный свойства радия. Например, EDTMP может захватывать Pb, образующийся в растворе радия во время транспортировки и хранения между местом производства и больницами, в которых продукт будут вводить.
224
Хотя возможно снижать подверженность добавлением радиолитических ингибиторов, направленные на опухоль белки или пептиды часто являются в большей степени подверженными радиолизу, и, вероятно, их надо поставлять в формате набора, где таким образом их добавляют в диапазоне от нескольких часов до нескольких минут до введения растворов Ra при относительно больших сроках годности.
in vivo
212
212
212
212
212
224
В данной области известно, что каликсарены и EDTA до некоторой степени могут образовывать комплекс с радием, а также образовывать комплекс со свинцом и висмутом. Однако в настоящей работе авторы обнаружили хелаторы, которые оставляют радий в основном в не связанном в комплексе состоянии или слабо связанном в комплексе состоянии, как определяют измерениями биораспределения , при этом которые способны быстро и с соответствующей стабильностью образовывать комплекс с самым долгоживущим дочерним нуклидом Pb. Селективное комплексообразование можно использовать для получения по меньшей мере остеотропного или направленного на опухоль свинца при сохранении благоприятных свойства радия в отношении лечения склеротических поражений, таких как метастазы в костной системе. Комплекс Pb, который направлен на кость или опухолевые клетки, образует альфа-излучатель Bi в результате распада Pb. Таким образом, бета-излучатель Pb используют в качестве косвенного альфа-источника для облучения представляющих интерес клеток или ткани. Другие возможные хелаты, которые могут являться подходящими для захвата дочерних нуклидов Ra, кроме TCMC и DOTA включают, но не ограничиваются ими, порфирины, производные DTPA и DTPA, а также связанную с карбоксилом DOTA.
224
212
212
212
224
212
212
212
224
212
212
211
223
223
in vivo
В настоящее время свинец 212 является самым долгоживущим из продуктов распада Ra, и наиболее важным является связывание его в комплекс, т.к. он является одним из источников  короткоживущего альфа-излучателя Bi. Если Pb-хелат поглощается в кости или в опухолевых клетках, то также вероятно, что Bi удерживается в мишени. В растворе Ra в равновесном состоянии с продуктами распада находится более чем в 10 раз больше атомов Pb по сравнению с атомами Bi. Таким образом, количество радиации, генерируемой атомами Bi в этих растворах, является умеренной и, вероятно, не имеет токсикологической значимости по сравнению с рядами распада Ra и Bi. Количество Bi является сравнимым с количеством Pb, который опосредованно продуцирует альфа-частицу в ряде Ra, и это не являлось серьезной проблемой для регистрации и клинического применения Ra в равновесном состоянии с продуктами распада.
212
Однако если необходимым будет являться хелатирование также Bi в большей степени в инъецируемом препарате, в некоторых случаях необходимым по меньшей мере может являться добавление стабилизатора, такого NaI или HI, т.к. висмут в водных растворах, как правило, существует в состоянии, в меньшей степени подходящим для хелатирования.
223
По сравнению с существующим в настоящее время одобренным альфа-фармацевтическим препаратом для лечения метастазов в костной системе, т.е. Ra, новые растворы, описываемые в настоящем описании, могут обеспечивать в одном из вариантов осуществления продукт с улучшенными свойствами для лечения метастазов в костной системе, т.к. дочерний нуклид можно делать направленным на циркулирующие злокачественные клетки и до некоторой степени также на метастазы в мягких тканях. Это может предотвращать рецидив реколонизации злокачественной опухоли костной системы, обусловленной CTC.
224
223
Другой аспект заключается в том, что более короткий период полураспада Ra по сравнению с Ra может являться фактически благоприятным, т.к. радий встраивается в костный матрикс. Вследствие высокой плотности минерального вещества кости диапазон альфа-частиц сильно снижается в кости по сравнению с мягкими тканями. Особенно в быстро минерализующихся областях, таких как костные метастазы злокачественной опухоли, процесс встраивания может иметь значение при использовании тропного к объему кости альфа-фармацевтического препарата.
224
Таким образом, Ra может улучшать дозу облучения опухоли, т.к. в среднем он будет в меньшей степени встраиваться во время распада.
224
Заболевания, для которых можно использовать новые растворы Ra, включают, но не ограничиваются ими, первичные и метастатические злокачественные опухоли, аутоиммунные заболевания и артериолосклероз. Продукт можно вводить внутривенно или местно, включая интраперитонеально, или в условиях перфузии конечностей.
224
Хелаторы, используемые в новых растворах могут представлять собой ациклические, а также циклические хелаторы и криптанды, краун-эфиры, порфирины или циклические или нециклические полифосфонаты, включая DOTMP и EDTMP. Также в качестве поглотитель в растворе Ra можно использовать бисфосфонат, например, памидронат, конъюгированный с DOTA, TCMC или аналогичным соединением.
212
224
224
224
223
Можно утверждать, что количество Pb в терапевтическом растворе Ra может являться от умеренного до среднего (т.е. при равновесии приблизительно 1,1 раз по сравнению с Ra). Если допускают аналогичное дозирование Ra как проводят с Ra у пациентов, но корректируют на разницу периода полураспада, приблизительно 150 кБк на кг массы тела будет составлять вводимую дозу.
212
212
212
212
212
При равновесии это преобразовалось бы в дозу конъюгата Pb-антитело 11,5 МБк в 5 литрах крови у пациента массой 70 кг (если Pb количественно хелатировать). Число циркулирующих опухолевых клеток, как правило, составляет менее 10 клеток на мл, таким образом, в 5 л крови содержится менее 50000 опухолевых клеток в целом. Если только 1 из 100000 инъецируемых молекул конъюгата Pb-антитело связывается с опухолевыми клетками, это будет означать по меньшей мере 0,0023 Бк на клетку, эквивалентно приблизительно 127 атомам Pb, связанным с клеткой, что было бы крайне разрушительным, как опубликовано, что в среднем 25 Pb, связанных с клеткой, уничтожит 90% популяции клеток.
153
Ранее предлагали объединять радий и фосфонаты и более предпочтительно бисфосфонаты при лечении метастазов злокачественной опухоли в костной системе. Однако предлагали использовать два соединения раздельно друг от друга, т.к. предпочтительной являлась инъекция в различные моменты времени. Применение фосфонатов не являлось показанным для образования комплексов с радионуклидами. Основной целью являлось использование фармакологически активных количеств фосфонатов в качестве вторичного лечения костей радием. Также предпочтительным являлось использование не образующих комплексов бисфосфонаты, таким образом, из этого не следует использование EDTMP или аналогичного соединения в качестве добавки к растворам радия для образования комплекса с дочерними нуклидами. В то время общеизвестным являлось то, что EDTMP могут образовывать комплексы с щелочноземельными металлами, т.к. в данной области было известно, что Sm-EDTMP может приводить к образованию комплекса с кальцием в крови и вызывать гипокальцемию.
212
212
224
Однако в настоящей работе авторы продемонстрировали, что при использовании умеренных количеств EDTMP возможно связывать в комплекс Bi и Pb без существенного снижения остеотропных свойств Ra.
Настоящий отчет впервые представляет добавление комплексообразующего фосфоната к раствору радия. Показано, что возможно получать селективное образование комплексов с дочерним нуклидом без существенного влияния на свойства направленного на кость действия радия. Это является важным, т.к. несмотря на то, что комплексообразующие фосфонаты являются остеофилами, для радия демонстрируют даже более высокую способность направленного действия на кости по сравнению с фосфонатами. Таким образом, очень предпочтительным является, чтобы мечение дочерних нуклидов не вызывало снижение поглощения костной системой радия.
177
153
227
225
212
212
224
224
212
in situ
Касательно направленной доставки в кость фосфонатами в данной области известно, что радионуклиды, такие как Lu, Sm, Th и Ac, входящие с состав комплекса с фосфонатами, могут направленно воздействовать на кость. В опубликованном ранее сообщении, также показано, что радионуклиды Pb и Bi могут входить в состав комплекса с EDTMP и DOTMP. Однако мечение проводили при высоком pH, а также необходимым является очистка ионообменным веществом после мечения. Таким образом, из этого не следует использование мечения  в присутствии радия без влияния на радий и без очистки, как продемонстрировано в настоящей заявке. Таким образом, авторы в настоящем описании представляют новый способ использования EDTMP в качестве поглотителя дочерних нуклидов в растворе Ra, который (1) улучшает дозу облучения для кости на единицу вводимого Ra и (2) значительно снижает поглощение Pb гематопоэтическими клетками и тканями, что по существу приводит к лучшим соотношениям облучения, которое получают мишени и немишени.
224
Растворы, используемые для Ra и образования комплекса с дочерними нуклидами, могут содержать радиолитические ингибиторы и другие модификаторы, подходящие для медицинского вводимого раствора, известного в данной области.
Раствор также может представлять собой фармацевтическую композицию.
Как правило, важным элементом фармацевтической композиции является буферный раствор, который в значительной степени поддерживает химическую целостность радиоиммуноконъюгата и является физиологически приемлемым для инфузии пациентам.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или адъювантов.
Приемлемые фармацевтические носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферы, наполнители, изотонические растворы и т.д. Более конкретно фармацевтический носитель может представлять собой, но не ограничен ими, нормальный физиологический раствор (0,9%), полунормальный физиологический раствор, лактат Рингера, 5% декстрозу, 3,3% декстрозу/0,3% физиологический раствор. Физиологически приемлемый носитель может содержать противорадиолитический стабилизатор, например, аскорбиновую кислоту, которая защищает целостность радиофармацевтического средства во время хранения и транспортировки.
Наборы
Раствор следуют получать физиологически подходящими для инъекций в централизованном месте производства или получать системой наборов, как правило, из 2-4 флаконов, которая является физиологически подходящей для инъекции после объединения флаконов набора.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к набору, содержащему первый флакон, содержащий радиофармацевтический раствор по настоящему изобретению, и второй флакон, содержащий нейтрализующий раствор для регуляции pH и/или изотоничности радиофармацевтического раствора перед введением пациенту.
224
Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему первый флакон, содержащий хелат (комплексообразователь), конъюгированный с белком или пептидом, или смесями белков или пептидов, и второй флакон, содержащий раствор Ra.
224
220
Вследствие того, что цепочка распадов Ra включает дочерний нуклид радон, который может диффундировать в воздух, флаконы, содержащие продукты необходимо хорошо запечатывать для предотвращения утечки Rn.
224
212
212
Вследствие природы альфа-излучения, для которой характерна высокая локализация, радиолиз следует рассматривать как возможную проблему, и радиофармацевтическое средство необходимо конструировать для сведения к минимуму этого явления. Как известно в данной области радиоактивно меченые антитела подвергаются радиолизу, и, таким образом, система набора может являться преимуществом для растворов Ra, которые необходимо комбинировать с хелатором, конъюгированным антителами, для захвата Pb и/или Bi.
224
Для моноклонального антитела, как правило, рекомендуется сохранять самостоятельную дозу продуцирующего альфа-частицы радиофармацевтического раствора ниже 0,5 кГр для устранения пониженных свойств связывания вследствие радиолиза. Таким образом, систему набора, где добавляют конъюгированной с хелатором антитело к раствору Ra (включая дочерние продукты) в течение периода от нескольких часов до 10 минут до инъекции, рекомендуют для концентрированных растворов, предназначенных для удаленной доставки.
Дополнительный аспект изобретения относится к набору, содержащему:
- первый флакон, содержащий радиофармацевтический раствор по изобретению, и
- второй флакон, содержащий нейтрализующий раствор для регуляции pH и/или изотоничности радиофармацевтического раствора перед введением пациенту.
Еще одни аспект относится к набору, содержащему:
224
- первый флакон, содержащий раствор Ra;
224
212
224
- второй флакон, содержащий комплексообразователь, выбранный из группы, состоящей из ациклических хелаторов, циклических хелаторов, криптандов, краун-эфиров, порфиринов или циклических или нециклических полифосфонатов, DOTMP, EDTMP, бисфосфоната, памидроната, конъюгированного с DOTA, памидроната, конъюгированного с TCMC, конъюгированной с антителом DOTA и конъюгированного с антителом TCMC, где комплексообразователь способен образовывать комплекс с дочерним нуклидом Ra, таким как Pb, и где комплексообразователь не образует (или по существу не образует) комплекс с Ra в фармацевтическом растворе; и
- необязательно инструкции по смешиванию первого флакона и второго флакона, получая таким образом фармацевтическую композицию, готовую для введения пациенту от 1 минуты до 12 часов после смешивания.
В предпочтительном варианте осуществления указанный комплексообразователь выбран из группы, состоящей из EDTMP, конъюгированной с антителом DOTA или конъюгированного с антителом TCMC.
224
224
В конкретном варианте осуществления термин "раствор Ra" следует понимать следящим образом: Ra находится в свободном состоянии в растворе и не связан, например, с поверхностью, такой как смола.
В одном из вариантов осуществления набор содержит третий флакон, содержащий нейтрализующий раствор для регуляции pH и/или изотоничности радиофармацевтического раствора перед введением пациенту.
224
212
В еще одном предпочтительном варианте осуществления количество Ra и Pb находится в радиоактивном равновесии в первом флаконе.
212
224
В еще одном другом предпочтительном варианте осуществления отношение активностей (МБк) Pb к Ra в первом флаконе составляет от 0,5 до 2, такое как 0,8-1,5, или такое как 0,8-1,3, или такое как 0,9-1,15.
В еще одном варианте осуществления радиоактивность первого флакона находится в диапазоне от 100 кБк до 100 МБк.
224
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгированного с хелатором антитело добавляют к раствору Ra (включая дочерние продукты) в течение от 30 минут до 5 часов до инъекции, так как за 1-3 часа до инъекции.
224
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгированное с хелатором антитело добавляют к растворуRa (включая дочерние продукты) в течение от 1 мины до 20 минут до инъекции.
224
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгированное с хелатором антитело добавляют к раствору Ra (включая дочерние продукты) в течение от 1 мины до 10 минут до инъекции.
224
212
212
Набор с меченным хелатом белком или пептидом в одном флаконе и раствор Ra в другом флаконе, где содержимое двух флаконов смешивают в течение от 12 часов до 1 минуты перед введением, также является частью изобретения. В одном из вариантов осуществления проводят смешивание в течение от нескольких часов (таких как 5) до 30 минут перед введением пациенту, чтобы Pb и/или Bi связать с хелатом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения содержимое двух флаконов смешивают в течение периода от 30 мин до 1 часа до инъекции.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения содержимое двух флаконов смешивают в течение периода от 1 минуты до 20 минут до инъекции.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения содержимое двух флаконов смешивают в течение периода от 1 минуты до 10 минут до инъекции.
212
Необязательно можно использовать третий флакон, содержащий жидкость, используемую для разбавления и регуляции изотоничности перед введением радиофармацевтического раствора. Этот третий флакон может содержать EDTMP, который может хелатировать Bi, при необходимости.
Виды медицинского использования
224
Описываемые новые способы и растворы, таким образом, решили основную проблему, касающуюся применения Ra в ядерной медицине.
Таким образом, новыми составами можно лечить два типа заболеваний:
1. Связанные только с костями заболевания или склеротические заболевания радием и дочерним нуклидом, связанным в комплекс фосфонатом.
212
212
2. Связанное с костями заболевание с компонентами мягкой ткани или циркулирующими клетками-мишенями радием и дочерним нуклидом, входящим в состав комплекса с конъюгатом хелат-моноклональное антитело или аналогичными белковыми или пептидными конъюгатами. Конкретный вариант осуществления этого относится к случаю, когда Pb конъюгирован с белковым или пептидным хелатом, и Bi связан в комплекс остеофилом, например, EDTMP.
Белки или пептиды можно использовать с настоящим изобретением, включая белки и пептиды, направленно воздействующие на остеосаркому, рак легких, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак щитовидной железы.
Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к радиофармацевтическому раствору по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
В еще одном дополнительном аспекте настоящего изобретения изобретение относится к набору по настоящему изобретению, где набор предназначен для применения в качестве лекарственного средства.
В еще одном другом варианте осуществления раствор вводят в дозе в диапазоне 50-150 кБк, таком как 50-100 кБк на кг массы тела.
9
10
В еще одном другом варианте осуществления дозирование находится в диапазоне от 8×10 до 8×10 атомов Ra на кг.
223
В примере 12 (и на фигуре 8) можно видеть, что аналогичный эффект как для Ra можно получать с гораздо меньшим дозированием (на 28% меньшим дозированием) композиции по изобретению в исследовании на мышах.
Еще одни другой аспект настоящего изобретения относится к радиофармацевтическому раствору по настоящему изобретению для применения для лечения заболевания костной системы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболевание костной системы выбрано из группы, состоящей из метастазов в костной системе от злокачественных опухолей до рака молочной железы, предстательной железы, почки, легких, кости или множественной миеломы, или незлокачественных заболеваний, приводящих к нежелательной кальцификации, включая анкилозирующий спондилит.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу лечения злокачественного или незлокачественного заболевания путем введения радиофармацевтического раствора по настоящему изобретению нуждающемуся в этом индивидууму.
Способ получения
224
В настоящем документе описаны новые способы, которыми можно получать раствор Ra, подходящий для лечения заболеваний костной системы, включая первичную или метастатическую злокачественную опухоль, в которых используют централизованное производство и доставку до нескольких суток и/или хранение перед введением пациентам.
224
224
Кроме того, такой раствор может обеспечивать более высокую начальную дозу облучения опухоли по сравнению с раствором чистого Ra, т.к. дочерние продукты обеспечат дополнительную дозу опухоли, когда им сообщит остеотропные или направленные на опухоль свойства указанный выше хелатирующий комплекс. Это может делать растворы Ra более эффективными при терапии злокачественных опухолей, т.к. материнский нуклид может направленно воздействовать на заболевание костей, тогда как самый долгоживущий дочерний нуклид можно посредством добавляемого комплекса направлять на поиск и разрушение циркулирующих злокачественных клеток в крови, альтернативно делать более чистым остеофилом путем образования комплекса с фосфонатом.
224
224
Новые процедуры и способы, предоставленные в настоящем описании, обеспечивают получение и транспортировку Ra с большим сроком хранения сутки или даже до недели или больше, т.к. "проблемный" дочерний нуклид может захватываться направленными на опухоль хелатами и фактически повышать терапевтические свойства растворов Ra.
224
212
224
Это открытие является важным, т.к. Ra считали менее пригодным, например, для терапии злокачественных опухолей против метастазов в костной системе вследствие дочерних продуктов с существенными периодами полураспада, в частности Pb, который будет присутствовать в значительных количествах через несколько часов после получения раствора чистого Ra.
224
212
Это стало возможным благодаря новым фармацевтическим растворам, описываемым в настоящем описании, где Ra направлен на кость и костные метастазы, тогда как Pb можно делать направленным на циркулирующие опухолевые клетки в зависимости от используемого конъюгата хелат-антитело. Фармацевтический раствор можно получать в соответствии с "конъектурными требованиями" в зависимости от первичной опухоли, от которой происходят метастазы в костной системе. Существует несколько антител с селективностью к различным антигенам, экспрессируемым, например, при раке предстательной железы, молочной железы, легкого, кости, почки, щитовидной железы и множественной миеломе.
224
224
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способу предоставления раствора Ra, содержащего белок-комплекс или пептид-комплекс, содержащий смесь меченного хелатом белка или пептида с раствором, содержащим Ra.
Таким образом, новое изобретение, описываем в настоящем описании, можно использовать в качестве чистого остеофила при комбинации с EDTMP или аналогичным соединением, или если у пациентов присутствуют измеряемые CTC, или подозревают, что они присутствуют, можно использовать в качестве комбинации лечения костных метастазов и CTC или метастазов мягких тканей, таким образом, добавляя новый аспект к альфа-фармацевтическим средствам против связанного с костями заболевания, т.е. дополнительное профилактическое действие, предотвращающее осаждение жизнеспособных CTC в костной системе или мягких тканях.
Еще один другой аспект изобретения относится к способу предоставления радиофармацевтического раствора по изобретению, где способ включает:
224
212
a) предоставление первой композиции, где количество Ra и Pb находится в радиоактивном равновесии;
224
212
224
b) предоставление второй композиции, содержащей комплексообразователь, выбранный из группы, состоящей из ациклических хелаторов, циклических хелаторов, криптандов, краун-эфиров, порфиринов или циклических или нециклических полифосфонатов, DOTMP, EDTMP, бисфосфоната, памидроната, конъюгированного с DOTA, памидроната, конъюгированного с TCMC, конъюгированной с антителом DOTA и конъюгированного с антителом TCMC, где комплексообразователь способен образовывать комплекс с дочерним нуклидом Ra, таким как Pb, и где комплексообразователь не образует комплекс с Ra; и
c) смешивание первой композиции и второй композиции, таким образом, получая фармацевтический раствор по изобретению.
Предпочтительно первая и вторая композиции представляют собой жидкие растворы.
212
224
В одном из вариантов осуществления отношение активностей (Бк) Pb к Ra в первой композиции составляет от 0,5 до 2, такое как 0,8-1,5, или такое как 0,8-1,3, или такое как 0,9-1,15.
В еще одном другом варианте осуществления указанный комплексообразователь выбран из группы, состоящей из EDTMP, конъюгированной с антителом DOTA или конъюгированного с антителом TCMC.
В другом варианте осуществления указанную стадию смешивания c) проводят в течение периода от 1 минуты до 12 часов перед использованием в качестве лекарственного средства, такого как от 30 минут до 5 часов.
Новые и неожиданные открытия являются таким, как указано ниже:
212
212
in situ
1. Растворы радия можно обрабатывать комплексообразующими фосфонатами или конъюгированными с комплексами антителами, не вызывая образования комплексов радия и приводя к пониженному поглощению радия костями, при этом образуя комплексы Pb и/или Bi  без необходимости очистки перед использованием.
in situ
2. Дочерние нуклиды, образующиеся во время транспортировки и хранения можно эффективно связывать в комплексы  с получением раствора радия с улучшенными свойствами дочерних нуклидов.
224
212
Раствор Ra можно хранить или транспортировать в течение нескольких суток, и все же основную часть образуемого Pb можно связывать в комплекс, т.е. по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и даже более предпочтительно 95-100% в зависимости от количества добавляемого комплексообразователя.
224
224
212
224
212
Это является важным, т.к. это обеспечивает радиофармацевтическое средство с лучшими общими отношениями направленного на мишень действия к побочному действию по сравнению с существующими составами радия, как продемонстрировано в следующих ниже примерах, и позволяет использовать раствор Ra, который транспортировали и хранили в течение нескольких суток. Фактически следует что, можно не использовать свежеприготовленные растворы Ra со сроком годности только несколько часов, как в способе Altmann Terapie, т.к. предпочтительным может являться новый способ, в котором Pb достигает равновесия или близко к равновесию, т.е. по меньшей мере 1 сутки/или более, для получения воспроизводимого и определенного отношения Ra к Pb во вводимом радиофармацевтическом растворе.
in situ
Авторы также подтвердили, что другие комплексы наряду с фосфонатами, можно метить дочерним нуклидом  в растворах радия, не оказывая существенного влияния на радий, например, конъюгаты хелат-антитело добавляли к раствору радия и демонстрировали соответствующее мечение дочернего нуклида при существенном сохранении химической целостности радия, таким образом, возможно получать раствор радия, где один или более дочерних нуклидов входят в состав комплекса с направленными на опухоль молекулами с получением фармацевтического раствора с биспецифическими свойствами направленного воздействия, например, радия, направленного на заболевание костной системы, и хелатного комплекса с дочерними нуклидами, направленными на антиген опухолевой клетки на циркулирующих опухолевых клетках и т.д. В качестве конкретного варианта осуществления один дочерний нуклид можно связывать в комплекс с моноклональным антителом, а другой с фосфонатом.
212
224
212
224
212
212
in vivo
Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к раствору с радием, содержащим TCMC, конъюгированный с белком или пептидом, предпочтительно моноклональным антителом, где антитело направлено на антиген на злокачественных клетках молочной железы, предстательной железы, легкого, почки, кости или множественной миеломы. В случае если оставит раствор на период от нескольких минут до нескольких суток, образуемый Pb в основном будет связываться с конъюгатом TCMC-антитело. Когда такой раствор инъецируют пациенту со злокачественной опухолью, Ra защищает костную ткань от разрушения, уничтожая опухолевые клетки на поверхности кости и в костной системе, и меченное Pb антитело уничтожает циркулирующие клетки, находящиеся вне радиуса действия облучения радия. Таким образом, то, что ранее являлась проблемой свободных дочерних нуклидов с нежелательным биораспределением, сделали преимуществом для ряда Ra путем использования настоящего изобретения. Особенно привлекательным является использование интернализующегося антигена в качестве мишени, т.к. Pb-конъюгаты являются особенно эффективными в качестве источника  альфа-излучателей при таких условиях, где альфа-излучающий дочерний Bi находится в клетках-мишенях (Boudousq et al., 2013).
224
В одном из вариантов осуществления радиофармацевтический препарат поставляют готовым к применению, например, во флаконе с мембраной для забора раствора шприцом или даже в виде предварительно заполненного шприца, готового к применению. Во втором варианте осуществления продукт можно поставлять в формате набора, состоящего из флакона с раствором Ra, второго флакона с раствором хелатора и необязательно третьего раствора с буфером для состава для регуляции концентрации и/или pH, и т.д. Хелатор, в случае если он является фосфонатом, конъюгатом хелатор-антитело или аналогичным соединением, добавляют к раствору Ra и перемешивают в течение периода от нескольких минут до нескольких часов, наиболее предпочтительно 5-60 минут перед тем как в продукт в случае необходимости добавляют буфер для состава, и вводят его пациенту.
Примеры
Пример 1. Расчет уровня дочерних нуклидов
Pb в результате распада
Ra в различные моменты времени
212
224
Предшествующий уровень техники
212
224
Pb, образующейся после получения радиофармацевтического средства на основе чистого Ra может представлять собой проблему, т.к. он обладает отличными и нежелательными свойства по сравнению с материнским нуклидом. Например, известно, что радий может направленно воздействовать на кость и костные метастазы, но продукты распада свинца характеризуются нежелательным накоплением в гематопоэтических клетках и тканях, и в почках.
Способ
212
224
Прирост Pb из чистого источника Ra рассчитывали с использованием универсального калькулятора активности.
Результаты
212
224
На фигуре 5 представлено количество Pb в различные моменты времени после получения фармацевтического раствора чистого Ra и хранения в газонепроницаемом контейнере.
Заключение
224
212
224
Данные демонстрируют, что значительное количество дочернего нуклида присутствует в относительно короткие временные рамки, что усложняет возможное централизованное производство и поставку радиофармацевтических средств на основе Ra. Следует отметить, что отношение Pb к Ra в растворе достигает 1 через 36 часов и в дальнейшем постепенно увеличивается приблизительно до 1,1, значение при котором оно остается в остальное время до полного распада.
Пример 2: Получение радионуклидов и подсчет радиоактивных образцов
228
3
В дальнейшем всю работу с концентрированными радиоактивными препаратами, включая выпаривание растворителя и т.д. проводили в защитной камере с перчатками. Источник Th в 1 M HNO приобретали от коммерческого поставщика. Ac-смолу получали от Eichrom Technologies LLC (Lisle, IL, USA) в форме предварительно упакованного картриджа.
Для использования меньшего объема растворителей приблизительно тридцать процентов веществ в картридже (картридж 1) экстрагировали и переупаковывали в меньшую колонку (картридж 2), состоящую из 1 мл фильтрационной колонки (Isolute SPE, Biotage AB, Uppsala, Sweden).
228
3
2
2
Взвесь, представляющую собой 20% от исходного содержимого картриджа, использовали для иммобилизации Th в 500 микролитрах 1 M HNO, к которой добавляли 500 микролитров 1 M HCl и инкубировали встряхиванием флакона (4 мл флакон, E-C sample, Wheaton, Millville, NJ, USA) в течение по меньшей мере 4 часов. В картридж 2 добавляли небольшое количество (приблизительно 0,1 мл) Ac-смолы. Затем взвесь добавляли в картридж 2 с использованием предварительно заполненного вещества в качестве удерживающего слоя. Радий можно элюировать из картриджа 2 в 2 мл 1 M HCl. 2 мл раствора радия выпаривали досуха с использованием термостата и продувки флакона газом N через тефлоновую впускную и выпускную трубку в каучуковой/тефлоновой мембране на флаконе, и направляя кислотные пары в химический стакан с насыщенным NaOH потоком газа N.
3
3
3
2
212
224
224
224
228
Остаток растворяли в 0,5 мл 1 M HNO и нагружали в картридж 3, состоящий из 1 мл колонки Isolute, упакованной приблизительно 250 мг катионообменной смолы Dowex. Картридж 3 промывали 7 мл 1 M HNO, которая удаляла Pb, и в заключение 3-4 мл 8 M HNO для элюирования Ra. Элюат Ra выпаривали досуха с использованием термостата и потока газа N, и остаток можно было растворять в 0,1 M HCl. Как правило, более 70% Ra, содержащегося в источнике Th, можно былого экстрагировать и очищать описываемыми способами.
224
228
Радиоактивные образцы измеряли на счетчике Cobra II Autogamma (Packard Instruments, Downer Grove, IL, USA). Во время экстракции Ra из источника Th использовали калибровочный стандарт дозы CRC-25R (Capintec Inc., Ramsey, NJ, USA).
224
212
212
Для определения распределения Ra, Pb и Bi в режиме реального времени в образцах использовали охлажденный жидким азотом детектор HPGe (GWC6021, Canberra Industries, Meriden CT, USA). Это комбинировали с анализатором цифровых сигналов DSA 1000 и программным обеспечением Genie 2000 (Canberra).
Пример 3: Определение общей скорости счета для
Pb в смеси
Pb/
Ra до того, как наступает радиоактивное равновесие
212
212
224
212
224
После более чем 3 суток, т.е. "равновесия" образец для практических целей характеризовался 1,1 раз Pb по сравнению с Ra.
212
212
212
224
Несмотря на то, что является ли Pb выше или ниже, чем равновесие, можно предполагать, что оно наступает через 3 суток, т.к. избыток Pb снижается на 99%, и прирост Pb от Ra практически конкурирует с "равновесием".
212
224
212
224
212
220
212
224
Использование счетчика Cobra II Autogamma с окном подсчета, установленным на 70-80 кэВ, дает в основном Pb с очень незначительным вкладом от других радионуклидов в ряде Ra. Радий 224 следует подсчитывать опосредованно, когда исходный Pb убывает, и наступает равновесие между Ra и Pb (приблизительно через 3 суток). Для такого непрямого подсчета необходимо, чтобы образец хранился в относительно газонепроницаемых контейнерах, т.к. иначе Rn может утекать, препятствуя наступлению равновесия радионуклидов 1,1 между Pb и Ra.
212
212
Вследствие того, что отбор проб и подсчет могут проводить в разные моменты времени, общую скорость счета для Pb можно корректировать для распада для определения общей скорости счета Pb в момент времени отбора проб.
Пример 4: Анализы тонкослойной хроматографии
Тонкослойную хроматографию (TLC) проводили с использованием хроматографических полосок (модель № 150-772, Biodex Medical Systems Inc, Shirley, NY, USA). Небольшой химический стакан приблизительно с 0,5 мл 0,9% NaCl использовали для помещения полосок с пятном образца. К полоске, как правило, добавляли 1-4 мкл образца приблизительно на 10% выше конца полоски. Затем границу растворителя двигали приблизительно до 20% от верхнего края полоски, полоску разрезали напополам и каждую половину помещали в 5 мл тестовую пробирку для подсчета. В этой системе радиоактивно меченое антитело и свободный радионуклид не мигрирует из нижней половины, тогда как радионуклид, входящий в состав комплекса с EDTA, мигрирует в верхнюю половину. Буфер для состава (FB), состоящий из 7,5% сывороточного альбумина человека и 5 мМ EDTA в DPBS и доведенный приблизительно до pH 7 NaOH, смешивали с конъюгатами антитела в отношении 2:1 в течение по меньшей мере 5 минут перед нанесением на полоски для определения свободного радионуклида.
Анализ EDTMP проводили без буфера для состава (FB) (фигура 6A,). Мечение радионуклида EDTMP измеряли по величине миграции в верхнюю половину полосок. DOTMP мигрировал слабо в этой системе и, таким образом, эти растворы необходимо было обрабатывать FB для измерения свободного радионуклида в верхней половине полоски (фигура 6A).
Заключение
212
224
На основании тонкослойного анализа продемонстрировано, что умеренные количества EDTMP и DOTMP приблизительно 0,011-0,012 мМ могут образовывать комплекс с Pb аналогичным образом как большие количества EDTA приблизительно 3,3 мМ в растворе Ra.
Пример 5: Хелатирование
in situ
Pb в растворе
Ra
212
224
224
224
212
224
212
in situ
Сначала растворы Ra в 0,1 M HCl нейтрализовали 1 M NaOH и добавляли EDTMP к раствору с получением pH незначительно ниже нейтрального. В дальнейших экспериментах для реакций использовали отношение 10:1 Ra в 0,1 M HCl и 5 M ацетата аммония перед добавлением хелаторов, что приводило к диапазону pH 5,5-7. Время реакции от 30 минут до нескольких суток при комнатной температуре тестировали для EDTMP с хорошим выходом мечения (как правило, выше 90% в соответствие с TLC), когда использовали концентрации приблизительно 4-8 мг/мл EDTMP в реакционных растворах. Таким образом, EDTMP, по-видимому, является хорошим поглотителем Pb в растворе Ra. Касательно DOTMP мечение являлось менее эффективным приблизительно 70% мечения для 7 мг/мл при комнатной температуре и временем реакции приблизительно 1 час. Выход мечения DOTMP можно улучшать регуляцией концентрации хелатора или времени реакции и т.д. Следует отметить, что последующие эксперименты с использованием EDTMP и буферов на основе ацетата аммония демонстрировали хорошее мечение Pb также в растворах радия с pH от 5,5 до 7, как определяют тонкослойной хроматографией (фигура 6A).
224
212
Длительное поглощение тестировали, оставляя раствор Ra с EDTMP (приблизительно 6 мг/мл), забуференный приблизительно до pH 6 ацетатом аммония, в течение 7 суток при комнатной температуре. Анализ профиля распределения Pb проводили с использованием TLC, как описано.
Результаты
Через 7 суток по меньшей мере 93% активности выявляли в верхней половине полоски TLC, соответствующей активности, ассоциированной с EDTMP.
Заключение
212
224
224
212
224
in situ
in situ
Возможно эффективно хелатировать Pb, образуемый в растворе Ra, посредством EDTMP. Таким образом, возможно получать готовые к применению растворы Ra с остеотропным хелатором, который поглощает Pb , таким образом, получая раствор Ra с улучшенным сроком годности для применения в качестве радиофармацевтического средства, направленного на костную ткань.
224
224
224
224
В качестве альтернативы можно использовать набор для мечения, где EDTMP добавляют к полученному несколько суток назад раствору Ra в период от нескольких минут до нескольких часов перед введением. Такой набор для мечения также обеспечивает централизованное производство Ra, т.к. набор можно очень просто использовать для растворов Ra от нескольких суток до более чем недели после даты производства Ra.
224
212
В эксперименте с полученным 8 суток назад раствором Ra в 0,1 M HCl и 0,5 M ацетата аммония добавляли EDTMP до концентрации приблизительно 7 мг/мл. Через 10 минут и 1 час уравновешивания при комнатной температуре анализы TLC демонстрировали то, что 91% и 93%, соответственно, Pb являлся связанным с EDTMP.
Тестировали растворы EDTMP, получаемые в период до 4 месяцев назад, и выявляли, что они являются функциональными, таким образом, EDTMP, по-видимому, хорошо подходит для использования в формате набора.
Пример 6: Биораспределение
Ra со значительными количествами
Pb с EDTMP и без него у мышей
224
212
Предшествующий уровень техники
224
224
224
Основной задачей являлось исследование биораспределения инъецируемых радионуклидов с EDTMP или без него. Использовали содержащий EDTMP раствор и контрольный физиологический раствор, соответственно, Ra в равновесном состоянии с дочерними радионуклидами. Материалы и способы: эксперименты на животных проводили в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в научных целях. Бестимусные мыши являлись взрослыми и в возрасте более 6 месяцев. Получаемый 3 суток назад раствор 0,1 M HCl, содержащий Ra разделяли надвое. В одну часть добавляли EDMP и 1 M NaOH для доведения pH приблизительно до 8, до конечной концентрации EDTMP 5 мг на мл (раствор A). Другую часть доводили 1 M NaOH приблизительно до pH 7 (раствор B). Каждый раствор фильтровали в стерильных условиях через 13 мм 0,2 мкм шприц-фильтр Acrodisc (Pall Life Science, Port Washington, NY, USA) с мембраной Supor. Затем каждой мыши вводили 100 мкл с приблизительно 20 кБк Ra посредством инъекции в хвостовую вену.
Результаты
212
212
224
212
224
Как представлено на фигурах 3A и 3B, наблюдали существенное улучшение распределения Pb при добавлении EDTMP. Поглощение мягкой тканью и кровью значительно снижалось, при этом направленность на костную ткань являлась аналогичной свободному Pb. Таким образом, добавлением EDTMP к раствору Ra значительно улучшали отношения костной ткани к мягкой ткани для Pb. Не наблюдали значимого изменения распределения Ra при добавлении EDTMP, как продемонстрировано на фигуре 3A и 3B.
Заключение
224
212
224
Добавление EDTMP к растворам Ra улучшает биораспределение Pb без значительных изменений биораспределения Ra.
Пример 7: Мечение конъюгированного с хелатором антитела
Pb
in situ
в растворе
Ra
212
224
Предшествующий уровень техники
212
212
224
С точки зрения логистики преимуществом является то, что радиофармацевтическое средство можно получать в централизованном производстве и транспортировать конечному пользователю. Образуемый Pb поглощается хелатором для сведения к минимуму инъекции свободного Pb, когда используют Ra.
Способы
224
Ra получали и очищали, как описано в пример 2. Меченные TCMC и DOTA моноклональные антитела получали с использованием антител, очищенных на центрифужном концентраторе (Vivaspin 4 или 20, 50000 MWCO, Sartorius Stedim, Goettingen, Germany), и добавляли 150 мМ карбонатного буфера, pH 8,5-9. Концентрация антитела, как правило, составляла 20-30 мг/мл, и добавляли p-SCN-Bn-TCMC или p-SCN-Bn-DOTA (Macrocyclics Inc, Dallas, Tx, USA) с использованием отношений антитела к хелатору 1:9 или 1:5, соответственно. По меньшей мере через два часа инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 0,1 M глицина в карбонатном буфере (pH приблизительно 8,5) и дополнительной инкубацией в течение 10 минут перед очисткой и заменой буфера на 0,9% NaCl с использованием центрифужного концентратора (Vivaspin). В качестве исходных растворов использовали концентрации хелатор-антитело 15-35 мг/мл в 0,9% NaCl.
224
В 2 мл пробирку Eppendorf добавляли, как правило, 40 мкл Ra в 0,1 M HCl, 5 мкл 5 M ацетата аммония, 5-10 мкл (15-30 мг/мл) меченного TCMC или DOTA антитела в 0,9% хлориде натрия. Этот способ тестировали для 4 различных конъюгатов антитела, включая такие как трастузумаб (герцептин), ритуксимаб, цетуксимаб и OI-3 моноклональное антитело мыши. Определяли, что pH находится в диапазоне 5,4-6,0 путем нанесения 1 мкл на индикаторную бумагу для определения pH (№ 1.09564.0003 и 1.09556.003 от Merck KGaA, Darmstadt, Germany) и определения цвета. Реакцию проводили при комнатной температуре.
В некоторых из экспериментов проводили параллельное взаимодействие контрольного раствора с теми же ингредиентами за исключением того, что антитело не содержало TCMC или DOTA, в тех же условиях. Через 30 и 100 минут отбирали 5 мкл и перемешивали с 10 мкл буфера для состава (FB), состоящего из 7,5% сывороточного альбумина человека и 5 мМ EDTA в DPBS. По меньшей мере через 10 минут отбирали 1-4 мкл смеси продукта/FB и помещали на полоску для тонкослойной хроматографии (Biodex). Аналогичную процедуру проводили с контрольным раствором. Полоски элюировали в 0,9% растворе NaCl, а когда верхняя граница растворителя достигала практически верхней части, удаляли полоску, разрезали напополам и проводили подсчет в нижней и верхней части раздельно на гамма-счетчике Cobra II (как описано ранее).
Результаты
212
212
224
212
224
224
212
Профили тонкослойной хроматографии приведены на фигуре 6B. Как правило, более 90% активности выявляли в нижней части полоски для тонкослойной хроматографии для конъюгата TCMC- и DOTA-антитело. В контроле, который включал буфер для состава (FB) с EDTA (фигура 6A), как правило, выявляли более 97% активности в верхней части полоски, что означает, что Pb находился в свободном состоянии, не образуя комплекс с EDTA. Это демонстрирует, что конъюгированные с TCMC и DOTA антитела могут являться эффективными поглотителями Pb в растворе Ra. В заключении возможно использовать конъюгат TCMC или DOTA-антитело для поглощения Pb в растворе Ra, таким образом, позволяя получать фармацевтический раствор с двойными свойствами направленного воздействия, т.е. остеофильный Ra и направленный на антиген конъюгатPb.
224
В последующем эксперименте в раствор Ra добавляли меченное TCMC конъюгат моноклонального антитела chOI-3 (химерного OI-3) (приблизительно до 1,5 мг/мл), забуферировали приблизительно до pH 5,5 ацетатом аммония и хранили в течение 7 суток при комнатной температуре. Затем отбирали образцы и смешивали 1:2 с буфером для состава (как описано) и через 5 минут или больше наносили на полоски для TLC, как описано. Выявлено, что в среднем 95,6% удерживалось с белком (нижняя часть полоски).
Заключения
212
224
224
in situ
Меченное TCMC антитело эффективно поглощает/образует комплекс с Pb в растворе Ra в течении нескольких суток. Таким образом, показано, что для растворов Ra с конъюгатом хелат-антитело возможным является централизованное производства, для которого требуется хранение и транспортировка в течение нескольких суток.
Пример 8: Эксперимент по связыванию клеток радиоактивно меченым моноклональным антителом в смеси с
Ra
224
Предшествующий уровень техники
212
212
224
212
Линия клеток OHS остеосаркомы человека экспрессирует Her-2 (относительно слабо) и MUC-18 (умеренно). Таким образом, их использовали для оценки доли связывания клеток конъюгированного с хелатором антител против Her-2 и MUC-18 трастузумаб и chOI-3, соответственно. Радий 224 растворяли в 0,1 M HCl и оставляли в течение двух суток для установления равновесия Pb и Bi. Для доведения pH добавляли 12 мкл 5 M ацетата аммония в не содержащей металлы воде к 100 мкл Ra в 0,1 M HCl, а затем добавляли 200 мкг меченного TCMC трастузумаба. Через 30 минут тонкослойной хроматографией подтверждали, что более 90% Pb поглощалось хелатором. Реакционную смесь фильтровали в стерильных условиях с использованием 13 мм шприц-фильтра и тестировали продукт на связывание клеток с использованием приблизительно 10 миллиона клеток в 0,2 мл DPBS с 0,5% BSA. Клетки блокировали инкубацией с 20 мкг того же антитела в течение 15 минут (для измерения неспецифического связывания) или оставляли неблокированными перед добавлением в каждую пробирку реакционного раствора приблизительно с 10 нг конъюгата хелат-антитело, смешанного с радионуклидом. Через 1 час инкубации пробирки измеряли на гамма-счетчике Cobra II для определения добавленной активности. Затем клетки промывали три раза 0,5 мл DPBS/0,5% BSA вихревым перемешиванием, центрифугирование и удалением супернатанта, а затем в пробирках измеряли активность связывания клеток. Процент связанного с клетками конъюгата антитела определяли как связанный после промывания, деленный на добавленное время активности 100.
Результаты
212
212
224
in situ
Когда проводили корректировку на распад и радиохимическую чистоту и вычитали неспецифическое связывание, выявляли, что 64,3-72,2% меченных Pb антител специфически связывались с клетками. В этом одноточечном анализе это указывает на соответствующие свойства направленного воздействия конъюгата Pb-антитело, образуемого в растворе Ra.
Заключение
212
224
in situ
Показано, что можно получать меченные Pb конъюгаты с соответствующими направленными на опухоль свойствами в растворе Ra.
Пример 9: Биораспределение
Ra/
Pb с меченным TCMC моноклональным антителом у мышей
224
212
Предшествующий уровень техники
224
212
Исследуют, можно ли использовать растворы Ra/Pb для получения котерапевтических средств направленных на костную систему и опухолевые клетки.
Материалы и способы
224
212
224
212
224
В полученный сути назад раствор Ra, как описано в пример 6, добавляли NaOH, 5 M ацетата аммония и меченный TCMC трастузумаб таким же образом, как в примере 7, и хранили в течение ночи. К раствору добавляли не содержащую металлы воду в отношении 1:1, фильтровали в стерильных условиях с использованием 13 мм 0,2 мкм шприц-фильтра Acrodisc (Pall Life Science, Port Washington, NY, USA) с мембраной Supor. Способность связывать клетки компонентом меченного Pb антитела в растворе Ra подтверждали, как в примере 8. Эксперименты на животных проводили в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в научных целях. Животных подвергали эвтаназии и перед тем как их препарировать отбирали кровь из сердца. Образцы мочи, крови и ткани помещали в 5 мл пробирки. Массу пробирок измеряли до и после добавления образцов для определения точной массы образца. Содержание радиоактивности измеряли гамма-счетчиком Cobra. Образцы регистрировали непосредственно после диссекции и снова через 3-4 суток, когда устанавливалось радиоактивное равновесие для определения содержания Pb и Ra, соответственно.
Результаты
212
212
212
212
212
212
224
Профили биораспределения приведены на фигуре 3C. Для Pb демонстрировали профиль распределения, как и ожидалось для радиоактивно меченого антитело, т.е. высокая активность в крови и богатых кровью тканях и низкая активность в бедренной кости и черепе. По сравнению со свободным Pb (фигура 3 A) конъюгированный с TCMC-трастузумабом (герцептином) Pb значительно меньше поглощался в бедренной кости и черепе, при этом уровень активности в крови и богатых кровью органах являлся выше. Следует отметить, что качество распределения отличается в крови для свободного Pb и Pb-TCMC-герцептин, т.к. последний циркулирует с медленным клиренсом из крови, но не поглощается клетками крови как свободный Pb. Для Ra демонстрировали сильное поглощение бедренной костью и черепом и слабое поглощение в крови, и оно являлся очень похожим на то, что выявляли в биораспределении не содержащего хелатора раствора радия (фигура 3A).
212
212
212
224
212
212
212
212
На фигуре 7 представлены отношения поглощения для костной ткани в сравнении с кровью и костной ткани в сравнении с почкой для Pb, PB-EDTMP и Pb-TCMC-трастузумаб в растворе Ra. Отношения демонстрирую улучшенные отношения костной ткани к крови и костной ткани к почке для Pb-EDTMP по сравнению с не состоящем в комплексе Pb. Однако для Pb-TCMC-герцептина отношения костной ткани к крови являлись ниже, чем для свободного Pb. Это ожидаемо, т.к. макромолекулярные моноклональные антитела выводятся медленно из крови по сравнению с соединениями с наименьшей молекулярной массой. Это может являться преимуществом при направленном воздействии на циркулирующие опухолевые клетки, т.к. повышенное время удержания в крови повышает вероятность связывания с клетками-мишенями в кровотоке. Также следует отметить, что для альфа-частиц с коротким диапазон излучения эффект связанного с клетками радионуклида может являться гораздо более сильным по сравнению с циркулирующим радионуклидом вследствие непосредственной близости к ДНК для связанной клетки по сравнению со свободно циркулирующим радионуклидом.
Заключение
212
224
224
212
212
224
Меченное хелатором моноклональное антитело может эффективно поглощать Pb, не снижая остеотропные свойства Ra в радиофармацевтических растворах, содержащих два радионуклиды. Таким образом, показана возможность получать свойства двойного направленного воздействия Ra/Pb добавлением комплексообразователей к растворам, таким образом, усиливая терапевтический потенциал радиофармацевтического раствора и снижая возможное нежелательное поглощение Pb в гематопоэтических клетках и тканях при поддержании остеотропных свойств Ra.
Пример 10: Система набора для устранения радиолиза
224
212
224
6
-1
11
224
224
1/2
1/2
Вследствие природы альфа-излучения, для которой характерна высокая локализация, радиолиз следует рассматривать как возможную проблему и радиофармацевтическое средство необходимо конструировать так, что сводить его к минимуму. Как известно в данной области, радиоактивно меченые антитела подвергаются радиолизу и, таким образом, система набора может являться предпочтительной для растворов Ra, которые необходим объединять с конъюгированными с хелатором антителами для захвата Pb. Когда Ra находится в равновесном состоянии с продуктами распада, он продуцирует приблизительно 28 МэВ за распад полной цепочки. Таким образом, раствор 1 МБк/мл содержит N=A/λ=10 сек/(0,693/[3,64×24×3600 сек])=4,53×10 атомов Ra, где N представляет собой число атомов, и A представляет собой активность в Бк, и A представляет собой постоянную радиоактивного распада, которая равна ln2/t, и t представляет собой период полураспада Ra.
224
11
-13
-3
224
Дозу облучения, D, определяют как энергию на массу, т.е. Дж/кг в единицах СИ. Для полного распада 1 МБк Ra в 1 мл водной жидкости она будет количественно равна D=(4,53×10×28 МэВ x 1,6×10 Дж/МэВ)/10 кг=2029 Гр, т.е. за один период полураспада 3,64 суток раствор 1 МБк/мл Ra в равновесном состоянии с дочерними продуктами подвергается приблизительно 1 кГр самооблучению. Для моноклонального антитела, как правило, рекомендуют сохранять самостоятельную дозу радиофармацевтического раствора ниже 0,5 кГр для устранения пониженных свойств связывания вследствие радиолиза.
224
224
Таким образом, рекомендуют систему набора, где конъюгированное с хелатором антитело добавляют, например, шприцом во флакон, содержащий раствор Ra (включая дочерние продукты), в период от нескольких часов до нескольких минут до того, как продукт вводят пациенту, для концентрированных растворов Ra с продуктами распада, подходящих для транспортировки на большие расстояния.
212
224
224
212
224
212
224
224
224
212
Пример захвата Pb конъюгатом TCMC-моноклональное антитело в полученном 7 суток назад растворе Ra. К раствору Ra, полученному одну неделю назад, добавляли 10% ацетат аммония и TCMC-ритуксимаб (до конечной концентрации приблизительно 5 мг/мл) до конечного объема и pH приблизительно 0,1 мл и 5,5, соответственно, и хранили при комнатной температуре в течение ночи. Через 18 часов отбирают образец и смешивают с буфером для состава, как описано. Анализ TLC демонстрировал, что 91% активности Pb составлял связанный белок, т.е. в нижней половине полоски для TLC, как определяют гамма-радиометрией. Это демонстрирует, что набор с флаконом, содержащим раствор Ra, и отдельный флакон с меченным хелатором белком или аналогичным соединением, можно комбинировать и использовать для захвата Pb в Ra через несколько суток после даты производства Ra, таким образом, получая остеофил Ra с направленным на опухоль комплексом с Pb с коротким времени реакции для предотвращения радиолитического разрушения продукта.
224
Подтверждали, что реагенты отличные от Ra можно хранить несколько недель/или месяцев без потери их функции, таким образом, они являются хорошо подходящими для применения в формате набора.
Заключение
224
212
212
224
Аналогичный формат набора сделает возможным использование растворов Ra в равновесном состоянии с Pb для получения на месте радиофармацевтического средства с двойным направленным действием с остеотропным радием и направленным на опухолевые клетки конъюгатом Pb-антитело на основании получаемого централизовано Ra, что обеспечивает возможность транспортировки на большие расстояния до нескольких суток, при этом устраняя радиолиз радиоиммуноконъюгата добавлением конъюгата антитело перед введением пациенту.
Пример 11: Циркулирующие опухолевые клетки
Циркулирующие опухолевые клетки могут приводить к возникновению новых опухолевых очагов в костной ткани или мягких тканях и могут быть устранены новым радиофармацевтическим раствором, описываемым в настоящем описании.
212
224
224
224
223
Можно утверждать, что количество Pb в терапевтическом растворе Ra может являться от умеренного до незначительного (т.е. при равновесии приблизительно 1,1 раз по сравнению с Ra). Если предполагают аналогичное дозирование Ra, как проводят с Ra у пациентов, но корректируют на разницу периода полураспада, приблизительно 150 кБк на кг массы тела будет являться вводимой дозой. Это является только примером, и дозирование может существенно отличаться в зависимости от заболевания, и того, какой уровень побочных эффектов является приемлемым.
212
212
212
212
При равновесии 150 кБк на кг массы тела преобразуются в дозу конъюгата Pb-антитело приблизительно 11,5 МБк в 5 литрах крову у пациента массой 70 кг. Число циркулирующих опухолевых клеток, как правило, составляет менее 10 клеток на мл, таким образом, в 5 л крови содержится менее 50000 опухолевых клеток в целом. Если только 1 из 100000 инъецируемых конъюгатов Pb-антитело связывается с опухолевыми клетками, это будет означать 0,0023 Бк на клетку, эквивалентно 127 атомам Pb, связанным с клеткой, что было бы крайне разрушительным, как опубликовано, что в среднем 25 Pb, связанных с клеткой, уничтожит 90% популяции клеток.
212
Число атомов, связанных с клеткой зависит от удельной активности конъюгированного с Pb антител и числа антигенов, доступных на клетках-мишенях. Недавно в клиническом исследовании оценивали меченный свинцом 212 TCMC-трастузумаб с удельной активностью приблизительно 37 МБк/мг (1 мКи/мг).
212
212
212
212
Меченное Pb моноклональное антитело с удельной активность 37 МБк на мг характеризуется отношением атом Pb к молекуле антитела 1:1973, т.е. очень немного молекул антител являются фактически радиоактивно меченными. Для получения 90% уровня гибели клеток Pb 25 атомов на клетку, необходимым является связывание 49325 молекул антител на клетку. Это можно получать, т.к. некоторые опухолеассоциированные антигены экспрессируются на уровнях, превышающий этот. Также это является возможным с химической точки зрения, т.к. возможно конъюгировать, как правило, от 1 до 5 единиц хелатора на молекулу антитела без потери антигенсвязывающих свойств, таким образом, очень небольшая часть хелаторных групп фактически занята Pb во время и после введения радиоактивной метки.
Заключение.
212
224
224
Меченное Pb антитело в радиофармацевтическом средстве на основе Ra с двойным направленным действием можно получать с высоким терапевтическим потенциалом против циркулирующих опухолевых клеток на уровнях Ra, подходящих для лечения опухолей кости.
Пример 12 - Исследования
in vivo
на мышах
Предшествующий уровень техники
224
212
212
224
223
Для того, чтобы подчеркнуть преимущество композиции, содержащей не входящий в состав комплекса Ra и остеотропный связанный в комплекс с EDTMP Pb, проводили исследование, демонстрирующее эффект остеотропной смеси Pb-EDTMP+Ra (пример 12A) и сравнивали его с эффектом одобренного FDA лекарственного средства ксофиго (Ra) (пример 12B). Сравнение данных примеров A и B приведено на фигуре 8.
Пример 12A
Предшествующий уровень техники и способы
224
212
224
212
5
224
212
Противоопухолевую активность остеотропных средств можно тестировать на моделях метастазов в костной системе на животных. Получали EDTMP (контрольный раствор) и Ra+Pb-EDTMP (тестируемый раствор) и хранили до наступления равновесия между Ra и Pb в последнем перед введением. Тестируемые и контрольные растворы поставляли от Pharmatest Services Ltd, Finland, подрядная исследовательская организация (CRO), и тестировали в их виварии. Использовали модель рака молочной железы MDA-MB-231 (SA) на бестимусных мышах. Это модель приводит к образованию очагов в костях и остеолизу вследствие метастазов в костной системе, и в дальнейшем также к метастазам в мягких тканях. Самкам бестимусных мышей в возрасте от четырех до пяти недель инокулировали 10 клеток в 0,1 мл PBS на сутки 0. На сутки 2 вводили 0,9% NaCl или 25 мкг/кг массы тела EDTMP в контрольные группы, и 45, 91 и 179 кБк/кг Ra уравновешенного с комплексом Pb-EDTMP трем группам обработки. Каждая группа включала 12 животных. Животных умерщвляли, когда наблюдали симптомы опухолей (например, паралич верхних или нижних конечностей, кахексию, потерю массы тела 20% или более или затрудненность дыхания). При необходимости индивидуально использовали обработку анальгетиками во время последних суток исследования.
Результаты
224
212
224
212
224
212
Для животных в контрольных группах демонстрировали медиану выживаемости 22 и 23 суток соответственно. Не наблюдали значимого отличия между двумя контрольными группами. Группы обработки характеризовались медианой выживаемости 25, 28 и 31 суток для 45, 91 и 179 кБк/кг Ra/Pb-EDTMP, соответственно. Все три группы обработки характеризовались статистически значимым увеличением продолжительности жизни по сравнению с контрольными группами. Опухолевые нагрузки в очагах в костях в момент умерщвления мышей являлись значительно пониженными у мышей, которых обрабатывали Ra/Pb-EDTMP, по сравнению с контрольными мышами. Площадь остеолиза в момент умерщвления являлась значительно сниженной для групп обработки 91 и 179 кБк/кг Ra/Pb-EDTMP по сравнению с контрольной группой EDTMP.
Пример 12B
223
Pharmatest Services Ltd, Finland, та же CRO, ранее использовала ту же модель рака молочной железы MDA-MB-231 (SA) на бестимусных мышах для исследования эффекта Ra (ксофиго), одобренного FDA соединение. См. Survival benefit with radium-223 dichloride in a mouse model of breast cancer bone metastasis. Suominen et al., J Natl Cancer Inst, 2013 Jun 19, 105(12):908-16, doi: 10.1093/jnci/djtll6, Epub 2013 May 16.
224
223
223
224
Следует отметить следующее: вследствие различия периодов полураспада Ra (3,6 суток) и Ra (11,4 суток) 1 Бк Ra составляет приблизительно больше в 3,2 раз числа атомов радия по сравнению с 1 Бк Ra.
224
10
223
11
224
212
223
224
212
223
При сравнении результатов примеров A и B (фигура 8) очевидно, что несмотря на дозирование атомов Ra (8,6×10), где только 24% дозирований приходилось на атомы Ra (3,6×10), преимущества выживаемости, обеспечиваемое Ra+Pb-EDTMP (41%), являлось аналогичным преимуществу выживаемости, обеспечиваемом Ra (43%). Кроме того, следует отметить, что аналогичное преимущество выживаемости получали для на 28% более низкого дозирования в отношении кБк/кг Ra/Pb-EDTMP (179 кБк/кг) по сравнению с Ra (250 кБк/кг).
223
224
224
212
223
224
212
223
Кроме того, следует отметить, что оба материнских нуклида Ra и Ra (включая их дочерние нуклиды) продуцировали 28-29 МэВ облучения во время полного распада и приводили к образованию четырех альфа-частиц каждый. Несмотря на эти сходства свойств распада, число атомов Ra (дозирование в пересчете на атомы) и дозирование активности, необходимое для получения аналогичного преимущество выживания для Ra/Pb-EDTMP, составляет только 24% и 72%, соответственно, от необходимого для Ra (когда оба материнских нуклида находятся в равновесном состоянии с их дочерними нуклидами). Таким образом, для раствора Ra+Pb-EDTMP демонстрировали неожиданно высокую противоопухолевую активность при гораздо более низком дозировании в отношении атомов Ra и радиоактивности на массу тела по сравнению с раствором Ra, используемым Suominen et al.
Заключение
224
212
223
224
223
224
223
Результаты в примере 12 демонстрируют перспективный с терапевтической точки зрения и неожиданно высокий эффект низких доз Ra+Pb-EDTMP по сравнению с одобренным в наносящее время золотым стандартом FDA в данной области (ксофиго), демонстрируя аналогичные эффекты преимущества выживаемости только с 24% радиоактивных атомов и только 72% дозирования облучения по сравнению с Ra. В дополнение к терапевтическому преимуществу этот неожиданный эффект имеет несколько других важных признаков, включая, например, то, что качается побочных эффектов, риска во время обработки и т.д. Кроме того, с использованием Ra вместо Ra пациент подвергается облучению в течение более короткого периода после лечения, т.к. период полураспада Ra является меньше одной трети периода полураспада Ra. Таким образом, композиция по настоящему изобретению представляет неожиданные результаты по сравнению с актуальным эталоном лечения.
Пример 13: Измерение свойств комплекса с использованием EDTMP в растворе
Ra в равновесном состоянии с
Pb
224
212
Предшествующий уровень техники
224
В получаемый несколько суток назад раствор Ra добавляли EDTMP до 5 мг/мл и оценивали связывание радионуклидов на катионообменной смоле.
Способ
212
224
212
224
212
212
1 мл колонку Isolute наполняли приблизительно 250 мг катионообменной смолы Dowex (50 W X 8, hydrogen form, Sigma-Aldrich). Ионообменную колонку промывали 1 M NaOH и потом 0,9% NaCl до тех пор, пока pH элюата не составлял приблизительно 7. Это обеспечивает возможность хранить элюат приблизительно при нейтральном pH. Затем раствор радия добавляли к катионообменной смоле и элюировали 4 мл 0,9% раствора NaCl. Элюат собирали в 4 пробирки по 1 мл в каждую. Затем пробирки и колонки с катионообменной смолой регистрировали сразу же с использованием гамма-счетчика для определения Pb и повторно регистрировали позже для определения Ra, как описано в пример 3. Для Pb более 95% элюировали физиологическим раствором, что указывает на образование комплекса с EDTMP. Ra количественно удерживается на катионообменной смоле, т.е. менее чем 1% элюировали физиологическим раствором. Когда контрольный раствор без EDTMP элюировали через катионообменную смолу, основная часть Pb удерживалась на катионообменной смоле, что указывает на то, что значительное элюирование Pb с EDTMP являлось обмусленным образованию комплексов.
Заключение
212
224
Радий 224 в значительной степени удерживался на катионообменной смоле, тогда как Pb легок элюировали, когда раствор EDTMP, смешанный с радионуклидом, нагружали в катионообменная смолу и элюировали изотоническим физиологическим раствором. Это демонстрирует, что Ra сохраняет свои свойства свободного катиона в растворе EDTMP, способном образовывать комплекс с дочерним нуклидом.
Пример 14. Свойства комплексообразования меченного TCMC или DOTA моноклонального антитела в смеси с
Ra и
Pb, оцениваемые картриджем для удержания по размеру и микроконцентрирования в центрифуге
224
212
224
212
212
212
224
С использованием фильтровальной установки для центрифуги с границей пропускания 30 кДа (Vivaspin 4 или 20, Sartorius Stedim, Goettingen, Germany) показано, что Ra в растворе можно эффективно отделять от TCMC- или DOTA-конъюгатов промыванием 0,9% раствором NaCl. Начиная с 2 мл и концентрируя приблизительно до 0,25 мл, удаляли >85% радия из конъюгата Pb-антитело в концентрате с высоким удержанием >80% Pb в концентрате, таким образом, продемонстрировано, что конъюгаты TCMC- и DOTA-антитело могут поглощать/образовывать комплекс с Pb, не образуя в значительной степени комплексов с Ra.
Заключение
212
224
Оценка с использованием установок для микроконцентрации, которые концентрируют высокомолекулярные соединения, включая радиоактивно меченное моноклональное антитело, указывала на то, что Pb входил в состав комплекса с хелатором-моноклональным антителом, тогда как Ra не удерживался комплексообразователем.
Ссылки
Jaggi JS, Kappel BJ, McDevitt MR, Sgouros G, Flombaum CD, Cabassa C, Scheinberg DA. Efforts to control the errant products of a targeted in vivo generator. Cancer Res. 2005 Jun 1;65(11):4888-95.
Jones SB, Tiffany U, Garmestani K, Gansow OA, Kozak RW. Evaluation of dithiol chelating agents as potential adjuvants for anti-IL-2 receptor lead or bismuth alpha radioimmunotherapy. Nucl Med Biol. 1996 Feb;23(2): 105-13.
Nilsson S, Larsen RH, Fossa SD, Balteskard L, Borch KW, Westlin JE, Salberg G, Bruland OS. First clinical experience with alpha-emitting radium-223 in the treatment of skeletal metastases. Clin Cancer Res. 2005 Jun 15;11(12):4451-9.