СПОСОБЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ИНТЕРСТИЦИАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ
METHODS FOR PREDICTING RISK OF INTERSTITIAL PNEUMONIA

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент Соединенных Штатов Америки №61/764986, поданной 14 февраля 2013 г., полное содержание которой включено в настоящую заявку.
ЗАЯВЛЕНИЕ О ГОСУДАРСТВЕННОЙ ПОДДЕРЖКЕ
[0002] Настоящее изобретение было сделано при государственной поддержке по грантам под номерами R01-HL095393, R01-HL097163, P01-HL092870, RC2-HL101715, U01-HL089897, U01-HL089856, U01-HL108642 и P50-HL0894932, предоставленным Национальным институтом болезней сердца, легких и крови, и по гранту под номером 1I01BX001534, предоставленному Управлением по делам ветеранов. Государство имеет определенные права на настоящее изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение в целом относится к биомаркерам, способам и аналитическим наборам для идентификации лиц с подозрением на интерстициальное заболевание легких и оценки прогноза для указанных лиц.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Идиопатическая интерстициальная пневмония (ИИП; IIP) представляет собой группу заболеваний легких, обычно характеризующихся фиброзом легких или прогрессирующим образованием рубцовой ткани в интерстиции альвеол, которые могут приводить к значительной смертности и заболеваемости в связи с гипоксемической дыхательной недостаточностью. Хотя некоторые формы фиброза легких ассоциированы с известными типами воздействия окружающей среды (например, асбестом), лекарственной токсичностью, воздействием радиации или коллагенозом сосудов (например, склеродермой), ИИП не имеет известной этиологии. Наиболее распространенной и тяжелой формой ИИП является идиопатический фиброз легких (ИФЛ; IPF), при котором средняя выживаемость после постановки диагноза составляет 2-3 года. Терапевтических средств для лечения ИФЛ, одобренных для применения в США, нет, и единственным вмешательством, позволяющим продлить жизнь, является пересадка легких. Хотя при всех типах ИИП клиническое течение варьирует, часто указанные заболевания прогрессируют до терминального заболевания легких и летального исхода. Хотя представляется, что риск развития ИИП, вероятно, определяется множественными генетическими вариантами и токсинами в окружающей среде, причины возникновения ИИП только начинают проясняться.
[0005] Существует потребность в идентификации генетических вариантов, действующих независимо или в сочетании, которые являются показателями различных гистологических типов интерстициальных заболеваний легких, а также в способах идентификации указанных генетических вариантов у индивидуума, которому поставлен диагноз, или у которого предполагается предрасположенность к развитию интерстициального заболевания легких. В настоящей заявке предложены варианты решения данной и других проблем, существующих в данной области.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] В настоящей заявке предложены способы и материалы для определения того, что у субъекта (например, индивидуума) имеется интерстициальное заболевание легких или риск развития указанного заболевания легких, такого как интерстициальная пневмония (например, СИП, ИФЛ или ИИП). Также предложены способы определения прогноза для индивидуума, которому поставлен диагноз или у которого подозревается интерстициальное заболевание легких (например, индивидуум с интерстициальной пневмонией в семейном анамнезе). Согласно некоторым вариантам реализации указанным интерстициальным заболеванием легких является фиброзная интерстициальная пневмония, такая как идиопатический фиброз легких или семейная интерстициальная пневмония. Согласно некоторым вариантам реализации указанным индивидуумом является человек.
[0007] Также в настоящей заявке предложены способы определения генетического варианта (например, однонуклеотидного полиморфизма) у субъекта с интерстициальным заболеванием легких. Указанные способы включают определение полиморфизма, описанного ниже, в биологическом образце, полученном от человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает получение и/или анализ биологического образца. Как описано ниже, согласно некоторым вариантам реализации указанным полиморфизмом является rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2301160, rs3829223 или rs2857476. Согласно некоторым вариантам реализации генетический вариант выбран из любого SNP, перечисленного в таблицах 1 и 2.
[0008] Также в настоящей заявке предложены способы лечения интерстициального заболевания легких у субъекта, нуждающегося в таком лечении, например, у субъекта, которому поставлен диагноз, или который вероятно страдает интерстициальным заболеванием легких, при помощи способов, описываемых в настоящей заявке. Указанный способ включает определение генетического варианта, который описан ниже, в биологическом образце субъекта, и введение эффективного количества средства для борьбы с интерстициальным заболеванием легких. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает получение и/или анализ указанного биологического образца. Как описано ниже, согласно некоторым вариантам реализации указанным генетическим вариантом является полиморфизм rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2301160, rs3829223 и/или rs2857476. Согласно некоторым вариантам реализации генетический вариант выбран из одного из SNP, перечисленных в таблицах 1 и 2.
[0009] Один вариант реализации настоящего изобретения относится к способу, который включает определение одного или более генетических вариантов (например, полиморфизм в маркерном гене или нескольких маркерных генах) в биологическом образце, полученном от индивидуума. Указанные полиморфизмы выбирают из rs2736100, rs2076295, rs3778337, rs4727443, rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2034650, rs1992272, rs1981997, rs17563986, rs8070723, rs12610495, rs2109069, rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430.
[0010] Согласно близкому варианту реализации указанный полиморфизм выбирают из группы, состоящей из rs2736100, rs2076295, rs3778337, rs4727443, rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2034650, rs1992272, rs1981997, rs17563986, rs8070723, rs12610495 и rs2109069. Согласно некоторым вариантам реализации указанное определение включает определение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 указанных полиморфизмов в любом сочетании.
[0011] Согласно близкому варианту реализации указанный полиморфизм выбирают из группы, состоящей из rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2301160, rs3829223 и rs2857476. Согласно некоторым вариантам реализации указанное определение включает определение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 из указанных полиморфизмов в любом сочетании.
[0012] Согласно близкому варианту реализации указанный полиморфизм выбирают из группы, состоящей из rs2736100, rs868903, rs1881984 и rs2853676. Согласно некоторым вариантам реализации указанное определение включает определение по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 из указанных полиморфизмов в любом сочетании.
[0013] Согласно близкому варианту реализации указанным полиморфизмом является rs868903.
[0014] Согласно близкому варианту реализации полиморфизм выбирают из группы, состоящей из rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430. Согласно некоторым вариантам реализации указанное определение включает определение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 из указанных полиморфизмов в любом сочетании.
[0015] Согласно близким вариантам реализации указанный способ включает определение одного или более дополнительных полиморфизмов в биологическом образце, полученном от индивидуума, причем указанным полиморфизмом является rs35705950.
[0016] Согласно близким вариантам реализации индивидуум может быть гомозиготным по одному или более полиморфизмам, перечисленным выше. Согласно другим родственным вариантам реализации индивидуум может быть гетерозиготным по одному или более полиморфизмам, перечисленным выше.
[0017] Согласно каждому из указанных вариантов реализации определение по меньшей мере одного из указанных полиморфизмов указывает на то, что у индивидуума измененный риск развития интерстициального заболевания легких (например, у индивидуума повышен или снижен риск развития интерстициального заболевания легких).
[0018] Согласно некоторым вариантам реализации у индивидуума повышен риск развития спорадического интерстициального заболевания легких. Согласно некоторым вариантам реализации у индивидуума повышен риск развития семейного интерстициального заболевания легких. Согласно некоторым вариантам реализации у индивидуума повышен риск развития идиопатического фиброза легких (ИФЛ). Согласно другим вариантам реализации у индивидуума снижен риск развития спорадического ИИП. Согласно некоторым вариантам реализации у индивидуума снижен риск развития семейного ИИП. Согласно некоторым вариантам реализации у индивидуума снижен риск развития идиопатического фиброза легких (ИФЛ).
[0019] Согласно указанным вариантам реализации определение по меньшей мере одного полиморфизма может указывать на прогрессирование у индивидуума интерстициального заболевания легких. Согласно некоторым вариантам реализации определение по меньшей мере одного из полиморфизмов может указывать на отсутствие прогрессирования интерстициального заболевания легких, или на медленное прогрессирование интерстициального заболевания легких у индивидуума. Согласно некоторым вариантам реализации определение по меньшей мере одного из указанных полиморфизмов может указывать на быстрое прогрессирование интерстициального заболевания легких у индивидуума.
[0020] Согласно каждому из указанных вариантов реализации присутствие одного или более из указанных полиморфизмов можно сравнивать с контролем, таким как стандартный набор или эталонная группа полиморфизмов, для которых была показана взаимосвязь с риском развития интерстициального заболевания легких, диагнозом специфического интерстициального заболевания легких, прогрессированием интерстициального заболевания легких, клиническим исходом интерстициального заболевания легких у индивидуума или способностью отвечать на лечение интерстициального заболевания легких, которые определяют в соответствии со статистической процедурой прогнозирования риска.
[0021] Согласно одному варианту реализации настоящего способа присутствие полиморфизмов можно определить путем получения пробы ДНК от индивидуума и определения наличия или отсутствия указанного полиморфизма в конкретном локусе. Согласно некоторым вариантам реализации наличие или отсутствие указанного полиморфизма определяют по меньшей мере одним способом, выбранным из мультиплексной локус-специфичной ПЦР-амплификации, мультиплексного удлинения на одно основание (SBE) на основе локус-специфичных ампликонов, и мультиплексного разделения продуктов SBE с применением матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF).
[0022] Согласно другому варианту реализации данного способа присутствие маркера определяют путем получения РНК из биологического образца (например, образца ткани); создания кДНК на основе указанной РНК; необязательной амплификации кДНК с зондами или праймерами для генетических локализаций, содержащих полиморфизмы; определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного из указанных полиморфизмов в биологическом образце.
[0023] Указанные способы могут включать сравнение присутствия одного или более полиморфизмов в биологическом образце со стандартным набором одного или более полиморфизмов, для которых была показана корреляция с развитием интерстициального легочного заболевания или прогрессированием данного заболевания у индивидуума с таким диагнозом (например, одно из стабильных заболеваний ИИП или медленно, сильно или быстро прогрессирующих ИИП), или с контролем или стандартным набором одного или более полиморфизмов, для которых была показана корреляция с отсутствием развития интерстициального заболевания легких или с отсутствием развития патологических симптомов данного заболевания, таких как образование рубцов в легких (фиброз). Согласно данному варианту реализации индивидуума идентифицируют как индивидуума с измененным риском (например, повышенным или пониженным риском) развития или прогрессирования (например, быстрого, медленного прогрессирования или отсутствия прогрессирования) при развитии интерстициального заболевания легких или патологических проявлений интерстициального заболевания легких (образования рубцов в легких (фиброза)), если наличие или отсутствие одного или более полиморфизмов соответствует стандартному набору одного или более полиморфизмов, для которых была показана корреляция с риском развития интерстициального заболевания легких, или тяжестью или степенью прогрессирования интерстициального заболевания легких. В качестве альтернативы, у индивидуума можно прогнозировать сниженный риск или отсутствие развития интерстициального заболевания легких, или отсутствие прогресса с патологическими проявлениями интерстициального заболевания легких, если наличие одного или более полиморфизмов не соответствует стандартному набору одного или более полиморфизмов.
[0024] Один вариант реализации указанных способов определения того, повышен или понижен у индивидуума риск развития интерстициального заболевания легких, или повышен или понижен у него риск быстрого прогрессирования с образованием рубцов в легких (фиброзом), включает определение наличия по меньшей мере одного полиморфизма, выбираемого из полиморфизмов, перечисленных выше, таких как любой один или более из SNP, перечисленных в таблицах 1 и 2, например, rs35705950, rs868903, rs2736100, rs2853676, rs1881984, rs2736100, rs2609255, rs10484326, rs2076295, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs1278769, rs12610495 и rs2109069. Наличие по меньшей мере одного из полиморфизмов указывает на то, что у пациента разовьется или будет прогрессировать (например, быстро прогрессировать) с образованием рубцов в легких (фиброзом) интерстициальное заболевание легких.
[0025] Указанные варианты реализации могут включать проведение этапа наблюдения за индивидуумом, такого как клиническая оценка, компьютерная томография грудной клетки (КТ грудной клетки) и экспертная оценка рентгенолога.
[0026] Другой вариант настоящего изобретения включает тест-систему для прогнозирования потребности в лечении (например, паллиативной терапии или пересадке легких) у индивидуума, которому поставлен диагноз интерстициального заболевания легких. Указанная тест-система включает средства для определения наличия по меньшей мере одного полиморфизма, выбираемого из группы, состоящей из rs35705950, rs868903, rs2736100, rs2853676, rs1881984, rs2736100, rs2609255, rs10484326, rs2076295, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs1278769, rs12610495 и rs2109069. Согласно одному варианту реализации тест-системы указанные средства определения полиморфизма включают зонд для нуклеиновых кислот, содержащий по меньшей мере от 10 до 50 соседних нуклеотидов нуклеотидной последовательности, содержащей указанный полиморфизм. Такие зонды для нуклеиновых кислот помещают на поверхности для проведения анализа, которая может включать чип, матрицу или жидкостную карту. Указанная тест-система может включать контроль, выбираемый из информации, содержащей заданный полиморфизм или набор полиморфизмов, для которых была установлена корреляция с риском развития интерстициального заболевания легких, или прогрессирования интерстициального заболевания легких, или увеличенной или уменьшенной продолжительностью жизни у пациентов с интерстициальным заболеванием легких.
[0027] Согласно любому варианту реализации настоящего изобретения этап определения может включать без ограничений применение зонда для нуклеиновых кислот, который гибридизуется по меньшей мере с одной генетической локализацией, содержащей указанный полиморфизм. Согласно одному аспекту указанным зондом может быть химерный зонд (например, который гибридизуется с локализациями более чем одного полиморфизма). Согласно другому аспекту указанный этап определения может включать определение нескольких копий полиморфизма в одной или более клетках в биологическом образце (т.е., определение того, является индивидуум гетерозиготой или гомозиготой по данному полиморфизму).
[0028] Согласно одному аспекту данного варианта реализации указанный этап сравнения включает сравнение наличия одного или более полиморфизмов в биологическом образце с контрольным набором полиморфизмов, полученным от пациентов с быстро прогрессирующим интерстициальным заболеванием легких, или с контрольным набором полиморфизмов, полученным от пациентов с медленно прогрессирующим или не прогрессирующим интерстициальным заболеванием легких.
[0029] Согласно любому варианту реализации настоящего изобретения указанный индивидуум может быть избран для оценки риска развития у него интерстициального заболевания легких или для диагностики или составления прогноза (например, прогнозируется ли прогрессирование или нет, или медленный или быстрый прогресс при патологических характеристиках интерстициального заболевания легких, таких как образование рубца в легких) посредством оценки независимых клинических переменных, включая гистологическое представление и/или маркер(ы) в ткани легких индивидуума.
[0030] Также в настоящей заявке предложены способы определения уровня экспрессии одного или более маркерных генов (например, биомаркеров) у человека с интерстициальным заболеванием легких. Указанный способ включает определение уровня одного или более маркерных генов, описанных ниже, в биологическом образце человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает получение и/или анализ указанного биологического образца. Как описано ниже, согласно некоторым вариантам реализации, указанным маркерным геном является TERT, MUC2, TOLLIP, DSP, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13А, OBFC1, АТР11А, IVD, CRHR1, IMPS, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69 или их гомологи или варианты. Согласно некоторым вариантам реализации указанный маркерный ген выбирают из TERT, MUC2, TOLLIP, их вариантов и гомологов.
[0031] Также в настоящей заявке предложены способы лечения интерстициального заболевания легких у субъекта, нуждающегося в таком лечении. Указанный способ включает определение уровня одного или более маркерных генов, описанных ниже, в биологическом образце человека и введение эффективного количества средства для борьбы с интерстициальным заболеванием легких. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает получение и/или анализ указанного биологического образца. Как описано ниже, согласно некоторым вариантам реализации, указанным маркерным геном является TERT, MUC2, TOLLIP, DSP, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологи или варианты.
[0032] Один вариант реализации настоящего изобретения относится к способу, который включает определение уровня экспрессии генов (например, экспрессии РНК или белка) маркерного гена или множества маркерных генов в биологическом образце, полученном от индивидуума. Указанный маркерный ген(ы) выбирают из маркерного гена, обладающего по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбираемой из: TERT (обратная транскриптаза теломеразы; NC 000005.9; AY407349); TOLLIP (толл-взаимодействующий белок; NC 000011.9; AY419805), MUC2 (муцин2, образующий олигомерную слизь/гель; NC_000011.9; DQ036653), DSP (десмоплакин; NC_000006.11; DQ030635), DISP2 (отправленный гомолог 2; NC_000015.9), МАРТ (ассоциированный с микротрубочками белок тау; NC_000017.10; AY413628), DPP9 (дипептидил-пептидаза 9; NC_000019.9; DQ053109), CSMD1 (CUB и множественные домены Суши 1; NC_000008.10; DQ037810), MYNN (мионеврин; NC_000003.11; AY407169), LRRC34 (богатый лейцином повтор, содержащий 34; NC_000003.11), FAM13A (семейство со сходством последовательностей 13, член А; NC_000004.11), OBFC1 (олигонуклеотид/олигосахарид-связывающий карман, содержащий 1; NC_000010.10), АТР11А (АТФаза, VI класс, тип 11А; NC_000013.10), IVD (изовалерил-КоА-дегидрогеназа; NC_000015.9; AY418331), CRHR1 (рецептор кортикотропин-рилизинг фактора 1; NC_000017.10; AY414327), IMP5 (импортин 5; NC_000013.10), LOC100128977 (антисмысловая РНК МАРТ 1; NC_000017.10), KIAA1267 (регуляторный комплекс NSL КАТ8, субъединица 1; NC_000017.10; NG_032784), NSF (N-этиленамид-чувствительный фактор; NC 000017.10), WNT3 (семейство сайтов интеграции типа бескрылых MMTV, член 3; NC_000017.10; AY413892), C17orf69 (CRHR1 интронный транскрипт 1 (небелковое кодирование; NC_000017.10). Согласно некоторым вариантам реализации маркерные гены обладают по меньшей мере 95% идентичностью на промежутке по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 80, 100, 200 или более идущих подряд нуклеотидов избранного гена. Согласно некоторым вариантам реализации указанный маркерный ген является гомологом или вариантом по меньшей мере одного из перечисленных выше, который, хотя и отличается от избранного маркерного гена, включает ту же генетическую вариацию.
[0033] Согласно близкому варианту реализации указанный маркерный ген(ы) выбирают из маркерного гена, обладающего последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбираемой из множества маркерных генов, содержащих MUC5B, и по меньшей мере одного маркерного гена с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной (например, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности на промежутке 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 80, 100, 200 или более идущих подряд нуклеотидов) последовательности, выбранной из группы, состоящей из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69. Опять же, указанный маркерный ген может быть гомологом или вариантом избранного маркерного гена, который включает тот же генетический вариант.
[0034] Согласно близкому варианту реализации указанный маркерный ген(ы) выбирают из маркерного гена, обладающего последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной (например, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности) на промежутке 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 80, 100, 200 или более идущих подряд нуклеотидов последовательности, выбираемой из множества маркерных генов, включающего набор генов TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, или их гомологов или вариантов. Согласно близкому варианту реализации указанный маркерный ген(ы) выбирают из маркерного гена, обладающего последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбираемой из множества маркерных генов, включающего набор генов TERT, MUC2, TOLLIP, или их гомологов или вариантов.
[0035] Согласно близкому варианту реализации указанный маркерный ген(ы) выбирают из маркерного гена, обладающего последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной (например, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности) последовательности, выбираемой из множества маркерных генов, включающего набор генов TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, 0BFC1, TOLLIP, ATP11A, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов. Согласно близким вариантам реализации указанные способы могут дополнительно включать определение уровня экспрессии генов (например, экспрессии РНК или белка) одного или более дополнительных маркерных генов в биологическом образце, полученной от индивидуума. Указанный дополнительный маркерный ген(ы) выбирают из маркерного гена, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична (например, по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична) последовательности, выбираемой из MUC5B и TERC, SFTPC и SFTPA2. Согласно близким вариантам реализации указанным дополнительным маркерным геном является MUC5B.
[0036] Согласно близкому варианту реализации определение уровня экспрессии маркерного гена(ов) можно проводить путем определения полипептидов, кодируемых указанными маркерными генами, и/или фрагментов полипептидов указанных маркерных генов, и/или полинуклеотида (например, мРНК), который полностью комплементарен по меньшей мере части указанных маркерных генов.
[0037] Согласно некоторым вариантам реализации определение повышенной экспрессии маркеров указывает на то, что у индивидуума повышен риск развития интерстициального заболевания легких. Согласно некоторым вариантам реализации у указанного индивидуума есть риск развития спорадической ИИП. Согласно некоторым вариантам реализации у указанного индивидуума есть риск развития семейной ИИП. Согласно некоторым вариантам реализации у указанного индивидуума есть риск развития идиопатического фиброза легких (ИФЛ).
[0038] Согласно некоторым вариантам реализации гены, определяемые согласно настоящему способу, обладают 100% идентичностью последовательностей с соответствующими маркерными генами.
[0039] Согласно каждому из указанных вариантов реализации уровень по меньшей мере одного из множества маркеров можно определять и сравнивать со стандартным уровнем или диапазоном нормальных значений экспрессии генов, которые можно определять в соответствии со статистической процедурой для прогнозирования риска.
[0040] Согласно одному варианту реализации данного способа наличие полипептидов можно определять при помощи реагента, который специфически связывается с указанным полипептидом или его фрагментом. Согласно одному варианту реализации указанный реагент выбирают из группы, состоящей из антитела, производного антитела и фрагмента антитела.
[0041] Согласно другому варианту реализации данного способа наличие маркера определяют путем получения РНК из образца ткани субъекта; генерирования кДНК из указанной РНК; амплификации указанной кДНК при помощи зондов и праймеров для указанных маркерных генов; получения из амплифицированной кДНК уровня экспрессии продуктов в указанном образце.
[0042] Указанные способы могут включать сравнение уровня экспрессии указанного маркерного гена или множества маркерных генов, в биологическом образце с контрольным уровнем указанного маркерного гена(ов), включая: контрольный уровень маркерного гена, для которого была показана корреляция с диагнозом, развитием или прогрессированием интерстициального заболевания легких. Согласно данным вариантам реализации у индивидуума прогнозируют развитие или прогрессирование с патологическими проявлениями интерстициального заболевания легких (такого как образование рубцов в легких (фиброза)), если уровень экспрессии маркерного гена в биологическом образце индивидуума статистически близок или больше, чем контрольный уровень экспрессии маркерного гена, для которого была показана корреляция с частотой возникновения интерстициального заболевания легких или с развитием интерстициального заболевания легких, или с прогрессированием интерстициального заболевания легких. В качестве альтернативы у индивидуума прогнозируют отсутствие развития или прогрессирования, или медленное прогрессирование интерстициального заболевания легких, если уровень маркерного гена в биологическом образце индивидуума статистически меньше, чем контрольный уровень маркерного гена, для которого была показана корреляция с частотой возникновения интерстициального заболевания легких или с развитием интерстициального заболевания легких, или с прогрессированием интерстициального заболевания легких.
[0043] Кроме того, или в качестве альтернативы, данные варианты реализации могут включать сравнение уровня экспрессии маркерного гена или множества маркерных генов в биологическом образце с уровнем указанного маркерного гена(ов) у второго индивидуума, у которого развилось или прогрессировало интерстициальное заболевание легких. Согласно данному варианту реализации у индивидуума прогнозируют развитие или прогрессирование интерстициального заболевания легких, если уровень экспрессии маркерного гена в биологическом образце указанного индивидуума статистически близок или больше, чем уровень экспрессии указанного маркерного гена(ов) у второго индивидуума. В качестве альтернативы, у индивидуума прогнозируют отсутствие развития или прогрессирования интерстициального заболевания легких, если уровень маркерного гена в биологическом образце индивидуума меньше, чем уровень экспрессии маркерного гена(ов) у второго индивидуума.
[0044] Один вариант реализации указанных способов определения того, разовьется ли или будет ли быстро прогрессировать образование рубцов в легких (фиброз) или интерстициальное заболевание легких, включает определение уровня экспрессии гена, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична последовательности каждого из MUC5B, DSP и DPP9, или их гомологов или вариантов, в биологическом образце, полученном от индивидуума. Согласно некоторым вариантам реализации определяемые гены предпочтительно обладают 100% идентичностью последовательности с соответствующими маркерными генами. Указанный способ также можно реализовывать посредством определения уровня полипептидов, кодируемых указанными генами, и/или фрагментов полипептидов, и/или полинуклеотидов, которые полностью комплементарны указанным генам. Согласно данному варианту реализации повышенный уровень экспрессии множества маркеров указывает на то, что у индивидуума либо разовьется, либо будет быстро прогрессировать с образованием рубцов в легких (фиброзом) интерстициальное заболевание легких.
[0045] Еще один вариант реализации настоящего изобретения включает способ мониторинга прогрессирования интерстициального заболевания легких у субъекта путем измерения уровня экспрессии одного или более (например, множества) маркерных генов, перечисленных выше, в первом биологическом образце, полученном от субъекта, и сравнение указанного уровня экспрессии с контролем. Согласно близким вариантам реализации предложен способ мониторинга прогрессирования интерстициального заболевания легких у субъекта путем измерения уровня экспрессии множества маркерных генов в первом биологическом образце, полученном от субъекта, измерения уровня указанного множества маркеров во втором биологическом образце, полученном от указанного субъекта и сравнения уровня маркеров в первом образце с уровнем маркера, измеренным во втором образце. Согласно данному варианту реализации указанное множество маркерных генов выбирают из маркерных генов с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбранной из маркерных генов, перечисленных выше. В качестве альтернативы, согласно данному варианту реализации указанное множество маркерных генов выбирают из маркерных генов с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбранной из MUC5B, DSP и DPP9 или их гомологов или вариантов. Предпочтительно, второй биологический образец отбирают у субъекта в момент времени, более поздний, чем время отбора первого биологического образца. В качестве альтернативы, первый биологический образец и второй биологический образец отбирают у субъекта более одного раза, в некотором временном диапазоне.
[0046] Согласно близкому варианту реализации определение уровня экспрессии маркерного гена(ов) можно проводить путем определения полипептидов, кодируемых указанными маркерными генами, и/или фрагментов полипептидов маркерных генов, и/или полинуклеотидов, которые полностью комплементарны по меньшей мере части указанных маркерных генов. Согласно некоторым вариантам реализации гены, определяемые при реализации данных способов, обладают 100% идентичностью с соответствующими маркерными генами.
[0047] Указанные варианты реализации могут включать проведение этапа наблюдения, такого как компьютерная томография грудной клетки (КТ грудной клетки) и экспертная оценка рентгенолога.
[0048] Другой вариант реализации настоящего изобретения включает способ оценки эффективности лечения интерстициального заболевания легких у субъекта посредством сравнения уровня экспрессии маркерного гена, определяемого в первом биологическом образце, полученном от указанного субъекта, с контрольным значением, ассоциированным с развитием или прогрессированием интерстициального заболевания легких. Другой вариант реализации настоящего изобретения включает способ оценки эффективности лечения интерстициального заболевания легких у субъекта посредством сравнения уровня экспрессии маркерного гена, определяемого в первом биологическом образце, полученном от указанного субъекта, с уровнем экспрессии маркерного гена во втором образце, полученном от субъекта в более поздний момент времени, и проведения этапа наблюдения, такого как компьютерная томография грудной клетки (КТ грудной клетки) или экспертная оценка образца легких рентгенологом. Согласно данному варианту реализации снижение уровня маркера во втором образце по сравнению с первой пробой указывает на то, что лечение интерстициального заболевания легких у субъекта эффективно. Согласно некоторым вариантам реализации указанный первый образец отбирают до начала лечения субъекта, а второй образец отбирают после проведения лечения субъекта. Согласно другому варианту реализации образы получают, и сравнение повторяют в определенном временном диапазоне. Согласно данному варианту реализации указанное множество маркерных генов выбирают из маркерных генов с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбранной из маркерных генов, перечисленных выше. В качестве альтернативы, согласно данному варианту реализации указанное множество маркерных генов выбирают из маркерных генов с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбранной из MUC5B, DSP и DPP9 или их гомологов или вариантов.
[0049] Согласно близкому варианту реализации определение уровня экспрессии маркерного гена(ов) можно проводить путем определения полипептидов, кодируемых указанными маркерными генами, и/или фрагментов полипептидов маркерных генов, и/или полинуклеотидов, которые полностью комплементарны по меньшей мере части указанных маркерных генов. Согласно некоторым вариантам реализации гены, определяемые при реализации данных способов, обладают 100% идентичностью с соответствующими маркерными генами.
[0050] Другой вариант реализации настоящего изобретения включает тест-систему для прогнозирования необходимости в пересадке легких индивидууму, которому поставлен диагноз интерстициального заболевания легких. Указанная тест-система включает средства для определения экспрессии маркерного гена или множества маркерных генов с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательностям, выбранным из MUC5B, DSP и DPP9, или их гомологов или вариантов. Согласно некоторым вариантам реализации гены, определяемые согласно указанным способам обладают 100% идентичностью последовательностей с соответствующим маркерным геном.
[0051] Согласно одному варианту реализации тест-системы указанные средства определения включают зонд для нуклеиновых кислот, содержащий по меньшей мере от 10 до 50 (например, 10, 15, 20, 25, 30, 10-50, 20-40, 10-100, 50-100, и т.д.) идущих подряд нуклеотидов маркерного гена(ов), или комплементарных им нуклеотидных последовательностей. Согласно другому варианту реализации тест-системы указанные средства определения включают связывающие лиганды, которые специфически распознают полипептиды, кодируемые указанными маркерными генами. Такие связывающие лиганды могут включать антитела, антиген-связывающие производные антител или, антиген-связывающие фрагменты антител. Указанные зонды для нуклеиновых кислот и/или связывающие лиганды могут располагаться на поверхности для анализа, такой как гранула, микрожидкостная поверхность, чип, матрица или жидкостная карта.
[0052] Указанная тест-система может включать контроль, выбранный из информации, содержащей заданный контрольный уровень маркерного гена, для которого была установлена корреляция с прогрессирование или продолжительностью жизни у пациентов с интерстициальным заболеванием легких.
[0053] Согласно любому из вариантов реализации настоящего изобретения этап определения может включать без ограничений применения зонда для нуклеиновых кислот, который гибридизуется по меньшей мере с одним из маркерных генов. Согласно одному аспекту указанным зондом может быть химерный зонд (например, который гибридизуется с более чем одним биомаркерным геном). Согласно другому аспекту указанный этап определения может включать определение нескольких копий биомаркерных генов на клетку в одной или более клетках в биологическом образце, и/или определение амплификации биомаркерных генов на клетку в одной или более клетках в биологическом образце. Согласно некоторым вариантам реализации этап определения экспрессии генов проводят с применением матрицы определения профиля генной экспрессии TaqMan, которая описана в патентах США №6514750, 6942837, 7211443 и 7235406, каждый из которых включен в виде ссылки на его полное содержание.
[0054] Согласно одному аспекту настоящего изобретения указанный этап сравнения включает сравнение уровня биомаркера в биологическом образце с контрольным уровнем биомаркера в одной или более контрольных образцах, полученных от пациентов с быстро прогрессирующим интерстициальным заболеванием легких. Согласно одному аспекту указанным контрольным уровнем биомаркера является уровень, для которого была установлена корреляция с медленным прогрессированием или отсутствием прогрессирования интерстициального заболевания легких.
[0055] Согласно любому из вариантов реализации настоящего изобретения отбор индивидуума, у которого прогнозируется развитие или наличие интерстициального заболевания легких, может включать оценку независимой клинической переменной, включая гистологическое представление и/или маркер(ы) в ткани легких указанного индивидуума.
[0056] Также предложены способы определения, есть ли у человека риск развития интерстициального заболевания легких, включающие: определение в биологическом образце, полученном от субъекта, по меньшей мере одного из:
a) наличие генетического варианта, выбираемого из группы, состоящей из: rs2736100, rs2076295, rs3778337, rs4727443, rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2034650, rs1992272, rs1981997, rs17563986, rs8070723, rs12610495, rs2109069, rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430;
b) уровень экспрессии маркерного гена или множества маркерных генов, выбранных из группы, состоящей из: маркерного гена с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности, выбираемой из группы, состоящей из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, АТР11А, IVD, CRHR1, IМР5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
c) полипептиды, кодируемые маркерными генами в соответствии с b);
d) фрагменты полипептидов в соответствии с с); и
e) полинуклеотид, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с b);
причем наличие по меньшей мере одного генетического варианта, полипептида, фрагмента и/или комплементарного полинуклеотида, и/или повышение или снижение экспрессии маркерного гена указывает на то, что у субъекта есть интерстициальное заболевание легких или риск его развития. Согласно некоторым вариантам реализации наличие генетического варианта определяют при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции). Согласно некоторым вариантам реализации наличие генетического варианта определяют путем определения Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET). Согласно некоторым вариантам реализации наличие генетического варианта определяют путем определения наличия или уровня экспрессии полипептида, например, при помощи антитела, антиген-связывающего производного антитела и антиген-связывающего фрагмента антитела, специфичного для данного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации указанным интерстициальным заболеванием легких является фиброзирующее заболевание легких, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), семейная интерстициальная пневмония (СИП) или идиопатическая интерстициальная пневмония (ИИП).
[0057] Также предложены способы мониторинга прогрессирования интерстициального заболевания легких у человека, включающие i) измерение уровня экспрессии множества маркерных генов в первом биологическом образце, полученном от субъекта, причем указанное множество маркеров включает множество маркеров, выбранных из группы, состоящей из:
a) маркерного гена с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, ATP11A, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
b) полипептидов, кодируемых маркерными генами в соответствии с а);
c) фрагментов полипептидов в соответствии с b); и
d) полинуклеотида, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с а);
ii) измерение уровня экспрессии указанного множества маркеров во втором биологическом образце, полученном от субъекта; и
iii) сравнение уровня экспрессии маркера, измеренного в первом образце, с уровнем маркера, измеренного во втором образце. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ дополнительно включает измерение уровня экспрессии множества маркеров по меньшей мере в одном дополнительном биологическом образце, полученном от субъекта по меньшей мере в одни дополнительный момент времени, и сравнение уровня экспрессии маркеров, измеренного в первом и втором образце с уровнем маркера по меньшей мере в одном дополнительном образце. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ дополнительно включает рекомендацию пройти лечение интерстициального заболевания легких, когда уровень экспрессии указанного маркера во втором образце выше, чем в первом образце. Согласно некоторым вариантам реализации указанным интерстициальным заболеванием легких является фиброзирующее заболевание легких, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), семейная интерстициальная пневмония (СИП) или идиопатическая интерстициальная пневмония (ИИП).
[0058] Также предложены способы оценки эффективности лечения интерстициального заболевания легких у человека, способы, включающие:
0
определение уровня экспрессии маркера, измеряемого в первом образце, полученном от субъекта в момент времени t, причем указанный маркер выбирают из группы, состоящей из
a) маркерного гена с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
b) полипептидов, кодируемых маркерными генами в соответствии с а);
c) фрагментов полипептидов в соответствии с b); и
d) полинуклеотида, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с а);
1
ii) определение уровня экспрессии маркера во втором образце, полученном от субъекта в момент времени t, и
iii) проведение этапа наблюдения, выбранного из проведения КТ грудной клетки и проведения медико-патологического исследования ткани легких, полученной от субъекта;
0
1
0
1
0
причем снижение уровня экспрессии указанного маркера во втором образце по сравнению с первым образцом указывает на то, что лечение интерстициального заболевания легких у данного субъекта эффективно. Согласно некоторым вариантам реализации момент времени t является моментом до начала лечения субъекта, а момент времени t является моментом после того, как было проведено лечение субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации момент времени t является моментом после того, как лечение субъекта было проведено, а момент времени t является моментом, более поздним, чем момент t, после того, как лечение субъекта было проведено. Согласно некоторым вариантам реализации лечение проводят многократно. Согласно некоторым вариантам реализации сравнение повторяют для биологических проб, полученных от субъекта в определенном временном диапазоне.
Также предложены тест-системы для прогнозирования ответа на лечение интерстициального заболевания легких у человека, включающие средства для определения по меньшей мере одного из:
a) наличие генетического варианта, выбираемого из группы, состоящей из: rs2736100, rs2076295, rs3778337, rs4727443, rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2034650, rs1992272, rs1981997, rs17563986, rs8070723, rs12610495, rs2109069, rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430; и
b) уровень экспрессии маркерного гена или множества маркерных генов, выбранных из группы, состоящей из: маркерного гена с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
c) полипептиды, кодируемые маркерными генами в соответствии с b);
d) фрагменты полипептидов в соответствии с с); и
e) полинуклеотид, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с b). Согласно некоторым вариантам реализации средства определения включают зонды для нуклеиновых кислот, содержащие по меньшей мере от 10 до 50 соседних нуклеотидов нуклеотидной последовательности, содержащей маркерные полиморфизмы или ген(ы), или комплементарную им нуклеотидную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации средства определения включают праймеры или зонды для нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с последовательностью, соседствующей или содержащей генетический вариант(ы) (а). Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере один из указанных праймеров или зондов помечен акцептором Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET), и по меньшей мере один из указанных праймеров или зондов помечен донором FRET. Согласно некоторым вариантам реализации средства определения включают связывающие лиганды, которые специфически распознают полипептиды, кодируемые указанными маркерными генами (например, антитело, антиген-связывающее производное антитела или антиген-связывающий фрагмент антитела). Согласно некоторым вариантам реализации средства определения включают по меньшей мере один зонд для нуклеиновых кислот и/или связывающие лиганды, расположенные на поверхности для анализа (например, чип, гранула, микрожидкостная поверхность или жидкостная карта). Согласно некоторым вариантам реализации указанные зонды содержат комплементарные нуклеотидные последовательности по меньшей мере к 10-50 идущим подряд нуклеотидам указанных маркерных генов.
[0059] Кроме того, предложены наборы для предсказания, диагностирования или прогнозирования интерстициального заболевания легких. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор содержит по меньшей мере один зонд или праймер для нуклеиновых кислот для определения генетического варианта в гене, выбираемом из группы, состоящей из: TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, MUC5B, АТР11А, IVD, CRHR1, IМР5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, C17orf69 и WNT3. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает реагенты для амплификации избранного генетического варианта(ов), например, праймеры, которые амплифицируют нуклеиновую кислоту в избранном гене, полимеразу (например, термостабильную полимеразу, такую как Taq или другую ДНК- или РНК-полимеразу), буферы и др. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один зонд или праймер комплементарен варианту нуклеотида (например, рецессивному SNP) генетического варианта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один зонд или праймер комплементарен (или гибридизуется) нуклеотидной последовательности избранного генетического варианта или продукту его амплификации. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один зонд или праймер содержит метку. Согласно некоторым вариантам реализации указанной меткой является флуоресцентная метка, или донор или акцептор FRET. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает по меньшей мере один зонд или праймер, меченный акцептором Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET), и по меньшей мере один зонд или праймер помечен донором FRET. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает по меньшей мере один зонд или праймер, каждый для определения генетического варианта среди по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 из перечисленных генов в любом сочетании. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один зонд или праймер включен в матрицу, гранулу, микрожидкостную поверхность или чип. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает по меньшей мере один контрольный образец, например, содержащий нуклеиновую кислоту с доминантным аллелем по меньшей мере одного избранного генетического варианта, или содержащий нуклеиновую кислоту с полиморфным аллелем по меньшей мере одного избранного генетического варианта.
[0060] Кроме того, предложены наборы для предсказания, диагностирования или прогнозирования интерстициального заболевания легких, включающие по меньшей мере один зонд или праймер для нуклеиновых кислот для определения генетического варианта, выбранного из группы, состоящей из: rs2736100, rs2076295, rs3778337, rs4727443, rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2034650, rs1992272, rs1981997, rs17563986, rs8070723, rs12610495, rs2109069, rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает реагенты для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей генетический вариант (например, праймеры для ПЦР на любой стороне указанного полиморфного нуклеотида, полимераза, буфер и др.). Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один зонд или праймер комплементарен альтернативному нуклеотиду (например, SNP) генетического варианта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один зонд или праймер комплементарен (гибридизуется) полинуклеотидной последовательности избранного генетического варианта или продукту его амплификации. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере один зонд или праймер содержит метку. Согласно некоторым вариантам реализации указанной меткой является флуоресцентная метка, или донор или акцептор FRET. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает по меньшей мере один зонд или праймер, меченный акцептором Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET), и по меньшей мере один зонд или праймер помечен донором FRET. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает по меньшей мере один зонд или праймер, каждый для определения генетического варианта среди по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45 из перечисленных выше вариантов в любом сочетании. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один зонд или праймер включен в матрицу, гранулу, микрожидкостную поверхность или чип. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает по меньшей мере одну контрольную пробу, например, содержащую нуклеиновую кислоту с доминантным аллелем по меньшей мере одного избранного генетического варианта, или содержащую нуклеиновую кислоту с полиморфным аллелем по меньшей мере одного избранного генетического варианта.
[0061] Кроме того, предложены комплексы in vitro, образуемые при определении биомаркера (например, генетического варианта), ассоциированного с интерстициальным заболеванием легких (например, фиброзирующее заболевание легких, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), семейная интерстициальная пневмония (СИП) или идиопатическая интерстициальная пневмония (ИИП)). Указанным интерстициальным заболеванием легких может быть фиброзирующее заболевание легких. Указанным интерстициальным заболеванием легких может быть ИФЛ. Указанным интерстициальным заболеванием легких может быть СИП. Указанным интерстициальным заболеванием легких может быть ИИП. Согласно некоторым вариантам реализации указанный комплекс содержит первый зонд для нуклеиновых кислот, гибридизуемый с нуклеиновой кислотой генетического варианта, причем указанная нуклеиновая кислота генетического варианта включает генетический вариант с последовательностью гена TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, MUC5B, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3 или C17orf69, причем указанная нуклеиновая кислота генетического варианта извлекается у субъекта, страдающего или предположительно страдающего интерстициальным заболеванием легких, или является продуктом амплификации нуклеиновой кислоты, извлекаемой у субъекта, страдающего или предположительно страдающего интерстициальным заболеванием легких. Согласно некоторым вариантам реализации указанный комплекс дополнительно содержит второй меченный зонд для нуклеиновой кислоты, гибридизуемый с указанной нуклеиновой кислотой генетического варианта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный первый зонд для нуклеиновых кислот содержит первую метку, а указанный второй зонд для нуклеиновых кислот содержит вторую метку, причем указанные первый и второй меченные зонды для нуклеиновых кислот способны к Ферстеровскому резонансному переносу энергии (FRET). Согласно некоторым вариантам реализации указанный комплекс также содержит полимеразу (например, термостабильную полимеразу или другую ДНК- или РНК-полимеразу) или лигазу. Согласно некоторым вариантам реализации указанный комплекс дополнительно содержит праймер для нуклеиновых кислот, гибридизуемый с нуклеиновой кислотой генетического варианта.
[0062] Другие свойства и преимущества данного изобретения станут более очевидными специалистам в данной области техники из следующего подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
-
[0063] На Фигуре 1 показаны результаты GWAS при 439 828 SNP для 1616 пациентов и 4683 контрольных субъектов в соответствии с аддитивной моделью. SNP выше красной линии были значимыми для всего генома при Р<5×10-8. Указанные SNP и SNP между красной и синей линией, соответствующие 5×108<Р-значение<0,0001 были выбраны для наблюдения у 876 пациентов и 1890 контрольных субъектов.
[0064] На Фигуре 2 показаны локус-специфичные графики, соответствующие результатов GWAS с целью обнаружения для всех локусов, достигающих значимости для всего генома при анализе GWAS с целью обнаружения и при мета-анализе обнаружения и результатов репликации.
[0065] На Фигуре 3 показаны локус-специфичные графики, соответствующие результатам GWAS с целью обнаружения для четырех дополнительных локусов, достигающих значимости для всего генома после мета-анализа обнаружения и результатов репликации.
[0066] На Фигуре 4 показана относительная экспрессия DSP в ткани легких среди 100 пациентов и 94 контрольных субъектов а) относительная экспрессия в зависимости от статуса пациент/контроль b) относительная экспрессия в зависимости от генотипа rs2076295 в DSP.
[0067] На Фигуре 5 показан график квантиль-квантиль (Q-Q) распределения наблюдаемого р-значения от ожидаемого р-значения a Quantile-Quantile (Q-Q) GWAS в целом по 439828 SNP высокого качества.
[0068] На Фигуре 6 показаны хромосомные локализации, SNP и гены для локусов со значимостью для всего генома.
[0069] На Фигуре 7 показано неравновесное сцепление (LD) среди SNP со значимостью для всего генома в 11p15 и rs35705950. Цветом показана оценка D=1, белым - оценка D=0. Числа в квадратах соответствуют r2*100. Оценки основаны на объединенным генотипах пациентов и контрольных субъектов, которые применялись при анализе в таблице 2 и таблице 6.
[0070] На Фигуре 8 коротко охарактеризовано масштабное сканирование генома с использованием анализа сцепления в семьях с интерстициальным заболеванием легких, где в качестве прогностического фактора был выявлен полиморфизм rs3570950.
[0071] На Фигуре 9 показаны отношения шансов того, что SNP в MUC2, MUC5AC и MUC5B ассоциированы с интерстициальным заболеванием легких.
[0072] На Фигуре 10 показано подтверждение значимости SNP в промоторе MUC5B -S3570950 в разных исследуемых группах.
[0073] На Фигуре 11 показано увеличенное время выживания, ассоциированное с носительством SNP rs3570950 у пациентов с интерстициальным заболеванием легких.
[0074] На Фигуре 12 показано увеличенное время выживания, ассоциированное с носительством SNP rs3570950 у пациентов с интерстициальным заболеванием легких в разных исследуемых группах.
[0075] На Фигуре 13 в разных исследуемых группах сравнивается увеличенное время выживания, ассоциированное с носительством SNP rs3570950 у пациентов с интерстициальным заболеванием легких.
[0076] На Фигуре 14 показана структура гена MUC5B и влияние SNP rs3570950.
[0077] На Фигуре 15 сравнивается экспрессия MUC5B в ткани здоровых легких и легких при ИФЛ.
[0078] На Фигуре 16 показана экспрессия MUC5B в ткани здоровых легких и легких при ИФЛ у индивидуумов-носителей генов дикого типа (GC) и варианта MUC5B (GT или ТТ).
[0079] На Фигуре 17 показано, что экспрессия MUC5B и поверхностно-активного белка С (SPC) повышена в ткани легких при ИФЛ.
[0080] На Фигуре 18 охарактеризованы эффекты, ассоциированные с SNP rs3570950 в MUC5B.
[0081] На Фигуре 19 сравниваются эффекты генетики для генов, ассоциированных с фиброзом легких.
[0082] На Фигуре 20 показана фибротическая ткань легких у пациентов-носителей SNP rs3570950.
[0083] На Фигуре 21 показана повышенная вероятность развития интерстициального заболевания легких у пациентов-носителей по меньшей мере одного варианта аллеля rs3570950.
[0084] На Фигуре 22 сравниваются эффекты генетики для генов, ассоциированных с фиброзом легких.
[0085] На Фигуре 23 охарактеризовано общегеномное исследование ассоциаций (GWAS) для генетических маркеров, ассоциированных с разными интерстициальными заболеваниями легких.
[0086] На Фигуре 24 показано географическое происхождение индивидуумов, рассматриваемых в исследовании.
[0087] На Фигуре 25 показан общий обзор результатов GWAS.
[0088] На Фигуре 26 показана генетическая локализация SNP, ассоциированных с интерстициальным заболеванием легких.
[0089] На Фигуре 27 показана относительная частота фибротических состояний в популяции, которая подверглась генотипированию и репликации.
[0090] На Фигуре 28 показана генетическая локализация SNP, ассоциированных с интерстициальным заболеванием легких в популяции, подвергшейся репликации.
[0091] На Фигуре 29 показаны объединенные результаты исследований GWAS и локализации SNP, ассоциированных с интерстициальным заболеванием легких.
[0092] На Фигуре 30 показано влияние родословной на SNP в хромосоме 17q21.
[0093] На Фигуре 31 показаны отношения шансов (OR) и Р-значения для влияния родословной на разные SNP в хромосоме 17q21.
[0094] На Фигуре 32 показаны OR и Р-значения для ассоциации SNP в промоторе MUC5B с интерстициальным заболеванием легких.
[0095] На Фигуре 33 обобщены результаты GWAS при интерстициальном заболевании легких в отношении локализации SNP.
[0096] На Фигуре 34 обобщены результаты GWAS при интерстициальном заболевании легких в отношении локализации SNP.
[0097] На Фигуре 35 обобщены результаты GWAS при интерстициальном заболевании легких в отношении функции генов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
th
[0098] Если не указано другое, технические и научные термины, применяемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые обычно подразумевают специалисты в данной области техники. См., например, Lackie, Dictionary of Cell and Molecular Biology, Elsevier (4 ed. 2007); Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Подразумевается, что неопределенные артикли означают «один или более». Подразумевается, что термин «включать» и его варианты, такие как «включает» и «включающий», когда они идут перед перечислением этапа или элемента, обозначают, что добавление дополнительных этапов или элементов не обязательно, но не исключается. Следующие определения приведены, чтобы облегчить понимание определенных терминов, часто применяемых в настоящей заявке, но не предназначены для ограничения области настоящего изобретения.
[0099] Подразумевается, что термины «субъект», «пациент», «индивидуум» и др. не должны быть ограничивающими и в целом могут быть взаимозаменяемы. То есть, индивидуум, описываемый как «пациент» не обязательно страдает конкретным заболеванием, а, возможно, просто обратился за медицинской помощью.
[0100] Термины «контроль», «контрольный образец» или «контрольное значение» относится к образцу, который служит эталоном, как правило, известным эталоном для сравнения с исследуемым образцом. Например, исследуемый образец можно отбирать у пациента, у которого подозревается конкретное заболевание легких, и сравнивать с образцами, полученными от пациента с установленным заболеванием легких, у установленного носителя полиморфизма, или у индивидуума, о котором известно, что он здоров (нет заболевания). Контролем может также быть репрезентативное среднее значение, собранное для популяции сходных индивидуумов, например, для пациентов с заболеванием легких или здоровых индивидуумов со сходным анамнезом, того же возраста, массы и т.д. Контрольное значение также можно получить для того же индивидуума, например, на основании ранее полученного образца, до заболевания или до лечения. Специалист в данной области техники должен понимать, что контроль может быть предназначен для оценки любого числа параметров.
[0101] Специалист в данной области техники должен понимать, какой контроль полезен в конкретной ситуации, и должен быть способен проанализировать данные на основании сравнения контрольных значений. Контроль также полезен для определения значимости данных. Например, если значения для конкретного параметра изменчивы в широком диапазоне, колебание в исследуемых образцах не следует рассматривать как значимое.
[0102] Термин «нуклеиновая кислота» относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме, и к комплементарным им формам. Термины «нуклеиновая кислота», «олигонуклеотид» или «полинуклеотид» или их грамматические эквиваленты в настоящей заявке означают по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных друг с другом. Обычно олигонуклеотиды состоят приблизительно из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50 или более нуклеотидов, приблизительно до 100 нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды представляют собой полимеры любой длины, включая большую длину, например, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10000 и т.д. Как правило, термин «нуклеотид» относится к единичному блоку полинуклеотида, т.е., мономеру. Нуклеотиды могут быть рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами или их модифицированными вариантами.
[0103] В настоящей заявке термин генетический вариант» относится к мутации, однонуклеотидному полиморфизму (SNP), варианту, возникшему вследствие делении, варианту, возникшему вследствие миссенс-мутации, вставки, инверсии, или к варианту по числу копий. Генетический вариант можно применять как биомаркер, и он может приводить к повышенному или пониженному уровню экспрессии, или дифференциальной модификации.
[0104] Термин «биомаркер» относится к биометрическому показателю, который можно определять в биологическом образце (или образце, полученном из биологического образца или переработанном из биологического образца) и сравнивать с контрольным образцом, в качестве показателя конкретного патологического состояния. Примеры биомаркеров включают генетические варианты, повышенный или пониженный уровень экспрессии (определяемый путем выявления открытия хроматина, продукта транскрипции или продукта трансляции), и дифференциальную модификацию (например, метилирование нуклеиновых кислот или фосфорилирование, гликозилирование или мультимеризацию белков). Под «маркерным геном» понимают ген, на который влияет биомаркер. Т.е., маркерный ген может включать генетический вариант в геномной форме, может экспрессироваться на более высоком или низком уровне, или может быть дифференциально модифицирован, в качестве показателя конкретного патологического состояния, например, интерстициального заболевания легких.
[0105] Термины «зонд» или «праймер» относятся к одному или более фрагментам нуклеиновых кислот, специфическую гибридизацию которых с образцом можно определить. Зонд или праймер может быть любой длины в зависимости от конкретной технологии, которую требуется применить. Например, праймеры для ПЦР обычно включают от 10 до 40 нуклеотидов, а зонды для нуклеиновых кислот, например, для саузерн-блоттинга, могут содержать более сотни нуклеотидов. Указанные зонды или праймеры могут быть немеченными или меченными, как описано ниже, так, чтобы их связывание с целевой последовательностью можно было определить (например, при помощи донорной или акцепторной метки для FRET). Зонд или праймер можно сконструировать на основе одной или более конкретных (заранее выбранных) частей хромосомы, например, одного или более клонов, выделенной целой хромосомы или фрагмента хромосомы, или коллекции продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Длина и структурная сложность нуклеиновой кислоты, фиксированной на целевом элементе, не критичны для настоящего изобретения. Специалист в данной области техники может скорректировать данные факторы, чтобы обеспечить оптимальную гибридизацию и генерацию сигнала для конкретных процедур гибридизации и детекции, и чтобы обеспечить требуемое разрешение между разными генами или геномными локализациями.
[0106] Зонды и праймеры можно также закрепить на твердой поверхности (например, нитроцеллюлозе, стекле, кварце, плавленом кварце), как на матрице. Также для данной цели можно применять технологии получения матриц с высокой плотностью (см., например, Fodor (1991) Science 767-773; Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Патент США №5143854). Специалист в данной области техники должен понимать, что точную последовательность конкретных зондов и праймеров можно модифицировать по сравнению с целевой последовательностью в определенной степени, чтобы получить зонды, которые «по существу идентичны» или «по существу комплементарны» целевой последовательности, но сохраняют способность к специфическому связыванию (например, к специфической гибридизации) с теми же мишенями, из которых они были получены.
[0107] Зонд или праймер «делает возможным определение» генетического варианта, если он комплементарен области, которая охватывает указанный генетический вариант или соседствует с ним. Например, чтобы определить SNP можно сконструировать праймеры на любой стороне SNP, и достройку праймера, применяемую для определения идентичности нуклеотида в определенном положении SNP. Согласно некоторым вариантам реализации применяют FRET-меченные праймеры (по меньшей мере один меченный донором FRET, и по меньшей мере один меченный акцептором FRET), так что сигнал FRET будет определяться только при гибридизации обоих праймеров. Согласно некоторым вариантам реализации зонд применяют при таких условиях, при которых он гибридизуется только с генетическим вариантом или только с доминантной последовательностью.
[0108] Опять же в контексте нуклеиновых кислот термин «способен к гибридизации» относится к полинуклеотидной последовательности, которая образует связи Уотсона-Крика с комплементарной последовательностью. Специалист в данной области техники должен понимать, что процент комплементарности не обязательно должен быть 100%, чтобы прошла гибридизация, в зависимости от длины полинуклеотидов, длины комплементарно области (например, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, или более оснований) и строгости условий. Например, полинуклеотид (например, праймер или зонд) может быть способен к связыванию с полинуклеотидом, обладающим 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%), 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарностью на протяжении комплементарной области. В контексте определения генетических вариантов, допустимый процент комплементарности или число несоответствий может варьировать в зависимости от технологии, применяемой для определения (см. ниже).
[0109] В контексте нуклеиновых кислот термин «продукт амплификации» относится к нуклеиновой кислоте (например, полинуклеотиду), который образуется вследствие реакции амплификации, например ПЦР и ее вариантов, ПЦР в режиме реального времени, реакции замещения цепи (SDR), лигазной цепной реакции (LCR), транскрипционно-опосредованной амплификации (ТМА) или Q-бета-репликации. Для того чтобы избежать повторного добавления полимеразы на протяжении процедур амплификации, которые подразумевают применение циклических или экстремальных температур (например, ПЦР и ее варианты), можно применять термостабильную полимеразу, например, Taq,
32
3
[0110] Термины «метка», «определяемый фрагмент», «определяемый агент» и подобные относятся к композиции, определяемой при помощи спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунологических, химических или других способов. Например, полезные метки включают флуоресцентные красители, люминесцентные агенты, радиоактивные изотопы (например, Р, Н), электронно-плотные реагенты, ферменты, биотин, дигоксигенин или гаптены и белки, или другие фрагменты, которые можно сделать определяемыми, например, за счет сродства. Можно применять любые способы, известные в технике для конъюгации нуклеиновой кислоты или другой биомолекулы с меткой, например, применение способов, описанных у Hermanson, Bioconiugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego. Термин «маркер» можно применять в качестве синонима термина «метка», но, как правило, он обозначает фрагмент на основе сродства, например, «His-метка» для очистки или «стрептавидиновая метка», которая взаимодействует с биотином.
[0111] Под «меченной» молекулой (например, нуклеиновой кислотой, белком или антителом) понимают молекулу, которая связана, ковалентно - посредством линкера или связана химически, либо нековалентно - посредством ионных, вандерваальсовых, электростатических или водородных связей с меткой, так, что отсутствие или наличие указанной молекулы можно определять по наличию метки, связанной с указанной молекулой.
0
0
0
0
6
[0112] Ферстеровский резонансный перенос энергии (сокращенно FRET), также называемый флуоресцентным резонансным переносом энергии, представляет собой механизм, описывающий перенос энергии между двумя хромофорами. Хромофор-донор (донор FRET), изначально находящийся в состоянии с возбужденным электроном, может переносить энергию на хромофор-акцептор (акцептор FRET), который как правило находится на расстоянии менее 10 нм, посредством безызлучательного диполь-дипольного взаимодействия. Энергия, переносимая к акцептору FRET, определяется как излучение света (энергии), когда донор и акцептор FRET находятся близко друг к другу. Под «сигналом FRET», таким образом, понимают сигнал, который генерируется за счет испускания света от акцептора. Эффективность Ферстеровского резонансного переноса энергии между красителями - донором и акцептором, деленное на расстояние R, определяется по формуле Е=1/[1+(R/R)], где R - это Ферстеровский радиус пары донор-акцептор, при котором . R составляет приблизительно 50-60  для некоторых часто применяемых пар красителей (например, Су3-Су5). Сигнал FRET изменяется в зависимости от расстояния в 6-ой степени. Если пара донор-акцептор расположена на расстоянии, приблизительно равном R, небольшое изменение в диапазоне расстояний от 1  до 50  можно измерить с максимальным отношением сигнал-шум. При применении современной технологии доступна параллельная визуализация многих индивидуальных пар FRET за 1 мс или быстрее.
[0113] Термин «пара FRET» относится к паре из донора FRET и акцептора FRET, которая позволяет проводить детекцию FRET.
[0114] В настоящей заявке термины «флуорофор», «краситель», «флуоресцентная молекула», «флуоресцентный краситель», «краситель FRET» и подобные применяются в качестве синонимов, если не указано другое.
[0115] Предполагается, что в настоящей заявке термины «лечить» и «предупреждать» не являются абсолютными терминами. Лечение может обозначать любую отсрочку начала, уменьшение частоты или тяжести симптомов, облегчение симптомов, повышение комфорта пациента и/или улучшение дыхательной функции, и т.д. Действие лечения можно сравнивать с отдельным индивидуумом или совокупностью индивидуумов, не подвергающихся указанному лечению, или с тем же пациентом до лечения или после прекращения лечения.
[0116] Термин «предупреждать» относится к уменьшению частоты возникновения симптомов заболевания легких у пациента. Как указано выше, профилактика может быть полной (симптомы не определяются) или частичной, при которой наблюдаются симптомы, менее выраженные по сравнению с теми, которые наблюдались бы вероятно в отсутствии лечения.
[0117] В настоящей заявке термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству терапевтического агента, достаточному для облегчения расстройства, описываемого выше. Например, для заданного параметра терапевтически эффективное количество будет демонстрировать увеличение или уменьшение параметра по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% или по меньше мере на 100%. Терапевтическую эффективность можно также выражать в «разах» увеличения или уменьшения. Например, терапевтически эффективное количество может демонстрировать 1,2-, 1,5-, 2-, 5- или более кратное действие по сравнению с контролем.
[0118] Термин «диагноз» относится к относительной вероятности того, что у субъекта есть заболевание легких. Аналогично, термин «прогноз» относится к относительной вероятности того, что у субъекта может быть определенный исход в будущем. Например, в контексте настоящего изобретения термин «прогноз» может относиться к вероятности того, что у индивидуума разовьется заболевание легких, или к вероятной тяжести указанного заболевания (например, тяжести симптомов, частоте функционального ухудшения, выживанию и т.д.). Предполагается, что указанные термины не являются абсолютными, что должно быть понятно специалистам в данной области медицинской диагностики.
[0119] Термины «коррелирующий» или «ассоциированный» применительно к определению фактора риска развития заболевания легких относятся к сравнению наличия или объема фактора риска (например, нарушенная регуляция или генетическое изменение в гене муцина) у индивидуума с наличием или объемом данного фактора риска у лиц с установленным заболеванием легких или риском развития заболевания легких или у лиц с установленным отсутствием заболевания легких, и установлению повышенной или пониженной вероятности наличия/развития заболевания легких у индивидуума на основании результата(ов) анализа.
[0120] Авторы настоящего изобретения отрыли полиморфизмы и профиль экспрессии генов, которые вносят серьезный вклад в риск развития ИИП. Данное открытие включает восемь новых локусов генетического риска (4q22, 6р24, 7q22, 10q24, 13q34, 15q14-15, 17q21 и 19p13), и роль вариантов риска в трех ранее описанных генах/локусах (TERC [3q26], TERT [5р15] и MUC5B [11р15]) при ИИП. До настоящего открытия было известно только два гена, для которых была показана воспроизводимая взаимосвязь вариантов с ИИП - TERT и MUC5B. В совокупности распространенные варианты риска для ИИП указывают на то, что данное заболевание преимущественно обусловлено дефектами в иммунной защите организма, межклеточной адгезии и ранним старением клеток. Указанные вывод можно применять для направленных интервенционных исследований и лечения данного комплексного заболевания.
[0121] Согласно одному из определений под биологическим маркером понимают «характеристика, которую можно объективно измерить и оценить как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологического ответа на лечебное воздействие». Рабочая группа по определению термина биомаркеры NIH (Национальный институт здравоохранения) (1998). Также биологические маркеры включают спектры или наборы характеристик, указывающих на определенные биологические процессы («панель маркеров»). Уровень маркера может увеличиваться или уменьшаться, чтобы он указывал на конкретное биологическое явление или процесс. Кроме того, если уровень маркера типично изменяется в отсутствии конкретного биологического процесса, постоянный уровень может указывать на протекание такого процесса.
[0122] Уровень маркера может иметь абсолютное значение (например, мольная концентрация молекулы в биологическом образце или наличие или отсутствие полиморфизма) или относительное значение (например, относительная концентрация двух молекул в биологическом образце). Частное или произведение двух или более показателей также можно применять в качестве маркера. Например, некоторые врачи применяют в качестве маркера риска развития ишемической болезни сердца уровень общего холестерина в крови, а другие применяют отношение уровня общего холестерина к уровню холестерина ЛПВП (липопротеинов высокой плотности).
[0123] В данном изобретении маркеры преимущественно применяют для диагностических и прогностических целей. Однако их можно применять также и для целей терапии, лекарственного скрининга и стратификации индивидуумов (например, чтобы группировать индивидуумов в несколько «подгрупп» для оценки), а также для других целей, описываемых в настоящей заявке, включая оценку эффективности средств лечения интерстициального заболевания легких.
[0124] Реализация настоящего изобретения на практике подразумевает, если не указано другое, применение традиционных способов аналитической биохимии, микробиологии, молекулярной биологии и технологий рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам в данной области техники. Такие способы подробно объяснены в литературе. (См., например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2000; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (Hames & Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (Hames & Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I & II (Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, Vol. I & II (Fields and Knipe, eds.)).
[0125] Терминология, применяемая в настоящей заявке, предназначена для описания конкретных вариантов реализации и не должна быть ограничивающей. В настоящей заявке формы единственного числа включают объекты во множественном числе, если из содержания и контекста явно не следует другое. Таким образом, например, упоминание «маркера» включает сочетание двух или более таких маркеров. Если не указано другое, все научные и технические термины следует понимать как имеющие те же значения, которые применяются обычно в той области техники, к которой они принадлежат. В целях настоящего изобретения ниже даны определения следующих терминов.
[0126] В настоящей заявке термин «маркер» включает маркеры-полипептиды и маркеры-полинуклеотиды. Для наглядности аспекты настоящего изобретения будут описаны применительно к «маркерам-полипептидам» и «маркерам-полинуклеотидам». Однако предполагается, что заявления, сделанные в настоящей заявке, относительно "маркеров-полипептидов» должны быть применимы к другим полипептидам в настоящем изобретении. Аналогично, что заявления, сделанные в настоящей заявке, относительно маркеров-«полинуклеотидов» должны быть применимы к другим полинуклеотидам в настоящем изобретении, соответственно. Таким образом, например, предполагается, полинуклеотид, раскрываемый как кодирующий «маркер-полипептид» должен включать полинуклеотид, который кодирует маркер-полипептид, полипептид с последовательностью, по существу идентичной маркеру-полипептиду, модифицированные маркеры-полипептиды, фрагменты маркера-полипептида, предшественники маркера-полипептида и образующиеся впоследствии маркеры-полипептиды, а также молекулы, которые содержат маркер-полипептид, гомологичный полипептид, модифицированный маркер-полипептид или фрагмент, предшественник или образующийся впоследствии маркер-полипептид (например, гибридный белок).
[0127] В настоящей заявке термин «полипептид» относится к полимеру из аминокислотных остатков, который содержит по меньшей мере 5 идущих подряд аминокислотных остатков, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, или более аминокислотных остатков, включая все целые числа до полной длины полипептида. Полипептид может состоять из двух или более полипептидных цепей. Полипептид включает белок, пептид, олигопептид и аминокислоту. Полипептид может быть линейным или разветвленным. Полипептид может содержать остатки модифицированных аминокислот, аналоги аминокислот или остатки не существующих в природе аминокислот, и они могут чередоваться с остатками неаминокислот. В настоящее определение включены полимеры из аминокислот, которые были модифицированы, природным путем или путем воздействия, например, образования дисульфидных связей, гликозилирования, липидизации, метилирования, ацелирования, фосфорилирования, или путем манипулирования, такого как конъюгация с компонентом-меткой. Также определение включает антитела, вырабатываемые субъектом в ответ на гиперэкспрессию маркерных полипептидов.
[0128] В настоящей заявке термин «фрагмент» полипептида относится к множеству аминокислотных остатков, которое короче, чем полноразмерный полипептид. Например, фрагмент конкретного полипептида может содержать по меньшей мере 5 идущих подряд аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 идущих подряд аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 идущих подряд аминокислотных остатков или по меньшей мере 30 идущих подряд аминокислотных остатков от полноразмерного полипептида. В настоящей заявке термин «фрагмент» полинуклеотида относится к полимеру из остатков нуклеотидов, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере 5, 10 или 15 идущих подряд остатков нуклеотидов, по меньшей мере 30 идущих подряд остатков нуклеотидов, по меньшей мере 60 идущих подряд остатков нуклеотидов или по меньшей мере 90% последовательности указанного полинуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент представляет собой домен (например, функциональный домен) полноразмерного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент представляет собой полноразмерный полипептид минус указанный домен. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент представляет собой антигенный фрагмент, и размер такого фрагмента может зависеть от таких факторов, как то, является ли эпитоп, распознаваемый антителом, линейным эпитопом или конформационным эпитопом. Таким образом, некоторые антигенные фрагменты могут состоять из более длинных сегментов, а другие могут состоять более коротких фрагментов (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, или более аминокислот, включая каждое целое число до полноразмерного полипептида). Специалисты в данной области техники хорошо знакомы со способами выбора антигенных фрагментов, связываемых антиген-связывающими антителами, производными и фрагментами антител.
[0129] Согласно некоторым вариантам реализации маркерный полипептид является участником биологического пути. В настоящей заявке термин «предшественник» или «образующееся впоследствии вещество» относится к молекулам, которые предшествуют или возникают после указанного маркерного полипептида или полинуклеотида в биологическом пути. Таким образом, когда маркерный полипептид или маркерный полинуклеотид идентифицирован как член одного или более биологических путей, настоящее изобретение может включать дополнительные предшественники или образующиеся впоследствии участники указанного биологического пути. Такая идентификация биологических путей и их участников входит в компетенцию специалистов в данной области техники.
[0130] В настоящей заявке термин «полинуклеотид» относится к одному нуклеотиду или полимеру из остатков нуклеотидов любой длины. Указанный полинуклеотид может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги, и может быть двухцепочечным или одноцепочечным. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды (например, метилированные), аналоги нуклеотидов или несуществующие в природе нуклеотиды, и они могут чередоваться с остатками ненуклеотидов. Например, полинуклеотид включает ген, фрагмент гена, кДНК, изолированную ДНК, мРНК, тРНК, рРНК, изолированную РНК с любой последовательностью, рекомбинантные полинуклеотиды, праймеры, зонды, плазмиды и векторы. Данное определение включает в себя полимеры нуклеиновых кислот, которые были модифицированы, природным путем или путем воздействия.
[0131] В настоящей заявке термин «компонент» (например, маркер) относится к «дифференциально экспрессируемому» в одном образце по сравнению с другим образцом компоненту, когда способ, применяемый для определения указанного компонента показывает разный уровень активности применительно к двум указанным образцам. Уровень компонента считается «повышенным» в первом образце, если способ определения компонента показывает, что уровень активности указанного компонента выше в первом образце, чем во втором образце (или если компонент определяется в первом образце, но не определяется во втором образце). Напротив, уровень компонента считается «пониженным» в первом образце, если способ определения компонента показывает, что уровень активности указанного компонента ниже в первом образце, чем во втором образце (или если компонент определяется во втором образце, но не определяется в первом образце). В частности, уровень маркера считается «повышенным» или «пониженным» в образце (или наборе образцов), полученном от субъекта с интерстициальным заболеванием легких (или у субъекта с подозрением на интерстициальное заболевание легких, или с риском развития интерстициального заболевания легких), если уровень активности указанного маркера выше или ниже, соответственно, по сравнению с уровнем маркера в образце (или наборе образцов), полученном от субъекта без интерстициального заболевания легких, или по сравнению с эталонным значением или диапазоном значений.
[0132] Маркеры, идентифицированные как экспрессируемые при интерстициальном заболевании легких, представляют значительный биологический интерес. Было проведено общегеномное исследование ассоциаций (GWAS) типа «случай-контроль» (1616 пациентов и 4683 контрольных субъектов) и исследование на основе репликации (876 пациентов и 1890 контрольных субъектов) ИИП. В группу пациентов были включены все типы фибротической ИИП, поскольку: а) установить различие между диагнозами ИИП часто проблематично из-за существенного клинического, патологического и рентгенологического перекрывания; и b) существуют убедительные доказательства общей для всех форм генетической предрасположенности. В группу пациентов также были включены семейные и спорадические ИИП, поскольку для вариантов MUC5B, TERT, TERC и SFTPC есть данные в пользу того, что спорадическая ИИП генетически сходна с семейной формой данного заболевания. Результаты показывают, что ИИП вызывается несколькими генетическими вариантами, которые действуют независимо или в сочетании, и одни и те же генетические варианты могут приводить к разным гистологическим типам ИИП.
[0133] Как более подробно объяснено ниже, когда профиль полиморфизмов и экспрессии генов сравнивали с клиническими параметрами и распространенными вариантами, ассоциированными с риском ИИП, результаты показали, что данное заболевание преимущественно обусловлено дефектами в иммунной защите организма, межклеточной адгезии и ранним старением клеток. Указанные выводы можно применять для направленных интервенционных исследований при данном комплексном заболевании.
[0134] Помимо открытия биомаркеров, которые можно применять индивидуально или в любом сочетании при анализе и в наборах для диагностики, прогнозирования или другой оценки или исследования интерстициального заболевания легких, указанные биомаркеры, о которых ранее не было известно, что они играют определенную роль в патологическом процессе интерстициального заболевания легких, можно сейчас изучать более подробно и/или применять в качестве мишеней для открытия других модуляторов заболевания или лекарственных средств. Маркеры согласно настоящему изобретению включают полиморфизмы: rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430. Также маркеры согласно настоящему изобретению включают повышенную экспрессию следующих генов: TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3 и C17orf69.
[0135] Если известно название гена, можно получить белок (также называемый в настоящей заявке «полным белком»; обозначается как «белок») и другие пептидные фрагменты таких измеряемых белков (любыми способами), и такие другие пептидные фрагменты включены в область настоящего изобретения. Способы согласно настоящему изобретению можно применять для оценки фрагментов продуктов экспрессии перечисленных генов, а также молекул, которые содержат всю перечисленную молекулу, или по меньшей мере ее значительную часть (например, поддающийся измерению уникальный эпитоп), и перечисленные версии маркеров. Следовательно, такие фрагменты, более крупные молекулы и модифицированные версии включены в область настоящего изобретения.
[0136] Гомологи и аллели маркеров согласно настоящему изобретению можно идентифицировать при помощи традиционных технологий. В настоящей заявке гомолог гена или полипептида, например, из организма человека или другого животного, обладает высокой степенью структурного и функционального сходства с идентифицированным геном или полипептидом. Специалисты в данной области техники должны быть знакомы с идентификацией гомологов маркерных полипептидов, идентифицированных в настоящей заявке, характерных для организма человека или другого организма. Как правило, гибридизация нуклеиновых кислот является подходящим способом идентификации гомологичных последовательностей другого вида (например, человека, коровы, овцы), которые соответствуют известной последовательности. Для идентификации родственных последовательностей нуклеиновых кислот с избранным процентом идентичности можно применять стандартные процедуры гибридизации нуклеиновых кислот. Например, можно сконструировать библиотеку кДНК, обратно транскрибируемых с мРНК избранной ткани (например, толстой кишки) и применить нуклеиновые кислоты, которые кодируют идентифицированные в настоящей заявке полипептиды, для скрининга библиотеки с целью выявления родственных нуклеотидных последовательностей. Такой скрининг предпочтительно проводят с применением условий высокой строгости (описанных в другом разделе настоящей заявке) с целью идентификации тех последовательностей, которые близкородственны на основании идентичности последовательностей. Нуклеиновые кислоты, идентифицированные таким образом, можно подвергать трансляции с получением полипептидов, и для указанных полипептидов можно оценивать активность.
[0137] Кроме того, настоящее изобретение включает полинуклеотиды и полипептиды, которые обладают по существу идентичными последовательностями с маркерами согласно настоящему изобретению. В настоящей заявке два полинуклеотида или полипептида «обладают по существу идентичными последовательностями», если последовательности идентичны по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 99% или 100%, когда сравнивают аминокислотные последовательности, или когда полинуклеотиды (например, полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептид) способны образовать стабильный дуплекс с каждым другим при строгих условиях гибридизации. В контексте настоящего изобретения генетический вариант можно определить в маркерном гене, даже если указанный маркерный ген содержит более одного сайта генетических вариаций. То есть, избранный генетический вариант можно определить в исследуемом образце, например, полученном от индивидуума с подозрением на интерстициальное заболевание легких, путем определения последовательности маркерного гена, содержащего указанный генетический вариант, и сравнения с последовательностью маркерного гена из контроля или контрольной популяции. Исследуемые и контрольные полноразмерные последовательности маркерных генов могут включать более одного генетического варианта, и, таким образом, могут отличаться друг от друга, т.е., могут не быть идентичны на 100%. Специалист в данной области техники должен понимать, что указанный генетический вариант можно определить в последовательности, которая меньше, чем полноразмерная последовательность маркерного гена, например, при помощи ПЦР для амплификации фрагмента маркерного гена, который включает сайт генетического варианта, или при помощи зонда, который комплементарен последовательности, включающей сайт генетического варианта. В тех случаях, когда аспекты или варианты реализации относятся к идентичности последовательностей, идентичность последовательностей может относиться к части последовательности, раскрываемой в настоящей заявке (например, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, или более оснований нуклеиновых кислот).
[0138] В полипептид могут быть внесены консервативные аминокислотные замены с получением функционально эквивалентных вариантов вышеупомянутых полипептидов, т.е., указанные варианты сохраняют функциональные характеристики указанного полипептида. В настоящей заявке термин «консервативная аминокислотная замена» относится к аминокислотной замене, которая не изменяет относительного заряда или размера белка, в котором происходит аминокислотная замена. Специалист в данной области техники может получить варианты в соответствии со способами изменения полипептидной последовательности. Например, если будет определено, что пептид является полипептидом, ассоциированным с интерстициальным заболеванием легких, можно внести консервативные замены в аминокислотную последовательность указанного пептида, и полипептид будет сохранять свои характеристики по специфическому связыванию антител. Кроме того, специалисты в данной области техники должны понимать, что аллельные варианты и SNP будут приводить к образованию по существу сходных полипептидов и таких же или по существу сходных фрагментов.
[0139] Был проведен целый ряд сравнительных исследований с целью идентификации маркеров с применением разных групп индивидуумов с интерстициальным заболеванием легких и без интерстициального заболевания легких (например, «контроль»). В таблицах перечислены маркеры, для которых было показано, что они присутствуют или дифференциально экспрессируются со статистической значимостью. Следовательно, указанные биомаркеры являются индикаторами интерстициального заболевания легких и прогрессирования заболевания. В случае, когда статистическая значимость маркерного полипептида была показана в многих исследованиях, приведены данные, связанные с наблюдениями с наибольшей статистической значимостью. Следовательно, согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены полипептиды-биомаркеры интерстициального заболевания легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид, обладающей последовательностью, по существу идентичной последовательности маркерного полипептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена молекула, которая содержит вышеупомянутый полипептид или полинуклеотид. В настоящей заявке соединение называют «изолированным», когда оно было отделено по меньшей мере от одного компонента, с которым оно ассоциировано в природе. Например, полипептид можно считать изолированным, если он отделен от примесей, включая метаболиты, полинуклеотиды и другие полипептиды. Изолированные молекулы можно либо получить синтетическим путем, либо очистить от их природного окружения. Для получения и выделения молекул согласно настоящему изобретению можно применять методологии количественного определения, известные в технике.
[0140] Некоторые колебания заложены в самой природе измерений физических и химических характеристик указанных маркеров. Размах колебаний зависит в некоторой степени от воспроизводимости средств разделения и специфичности и чувствительности средств детекции, применяемых при измерении. Предпочтительно, способ и технология, применяемые при измерении указанных маркеров, должны быть чувствительными и воспроизводимыми.
[0141] Данные, приведенные в таблицах, отражают способ, который применялся для определения маркеров. Когда образец обрабатывают и анализируют, как описано в разделе «Примеры», время удерживания приблизительно равно значению, установленному для данного маркера; то есть, приблизительно в пределах 10% от заявленного значения, приблизительно в пределах 5% от заявленного значения или приблизительно в пределах 1% от заявленного значения, и указанный маркер демонстрирует отношение заряда к массе, приблизительно равное значению, установленному для данного маркера; то есть, приблизительно в пределах 10% от заявленного значения, приблизительно в пределах 5% от заявленного значения или приблизительно в пределах 1% от заявленного значения.
[0142] Другой аспект настоящего изобретения относится к тест-системе, включающей множество антител, или их антиген-связывающих фрагментов, или аптамеров для определения экспрессии биомаркеров, дифференциально экспрессируемых у индивидуумов с интерстициальным заболеванием легких. Указанное множество антител, или их антиген-связывающих фрагментов, или аптамеров включает антитела, или их антиген-связывающие фрагменты, или аптамеры, которые селективно связываются с белками, дифференциально экспрессируемыми у индивидуумов с интерстициальным заболеванием легких, и которые можно определять как продукты белков с применением антител или аптамеров. Кроме того, указанное множество антител, или их антиген-связывающих фрагментов, или аптамеров включает антитела, или их антиген-связывающие фрагменты, или аптамеры, которые селективно связываются с белками или их частями (пептидами), кодируемыми любым из генов, перечисленных в таблицах, приведенных в настоящей заявке.
[0143] Определенные варианты реализации настоящего изобретения основаны на применении множества биомаркеров, которые были идентифицированы в настоящей заявке как присутствующие или дифференциально экспрессируемые у субъектов с интерстициальным заболеванием легких. В настоящей заявке подразумевается, что термины «пациент», «субъект, который страдает интерстициальным заболеванием легких», «субъект, который страдает интерстициальной пневмонией», «пациент с интерстициальным заболеванием легких», «субъект с интерстициальной пневмонией» и др. должны обозначать субъектов, которым был поставлен диагноз интерстициального заболевания легких (например, ИИП, ИФЛ, СИП). Подразумевается, что термины «не-субъект», «здоровый «индивидуум», «субъект, который не страдает интерстициальным заболеванием легких» и др. должны обозначать субъекта, которому не был поставлен диагноз интерстициального заболевания легких. Субъект без интерстициального заболевания легких может быть здоровым и не страдать другими заболеваниями, или может страдать заболеванием, отличным от интерстициального заболевания легких.
[0144] Множество биомаркеров в упомянутых выше пределах включает по меньшей мере два или более биомаркера (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 и т.д. с шагом, равным целому числу, вплоть до всех раскрываемых биомаркеров), и включает любое сочетание таких биомаркеров. Такие биомаркеры выбирают из любого из полиморфизмов или полипептидов, кодируемых любым из генов, перечисленных в указанных таблицах. Согласно некоторым вариантам реализации множество биомаркеров, применяемых в настоящем изобретении, включают по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 или все биомаркеры, для которых было продемонстрировано, что они являются прогностическим фактором развития, прогрессирования или клинического исхода у индивидуума, которому поставлен диагноз интерстициального заболевания легких, такого как интерстициальная пневмония, или есть подозрение на указанное заболевание.
[0145] Маркерные полипептиды или полинуклеотиды согласно настоящему изобретению применимы при реализации способов диагностики интерстициального заболевания легких, определения степени и/или тяжести указанного заболевания, мониторинга прогрессирования указанного заболевания, ответа на лечение и/или необходимости пересадки легких. Также указанные маркеры применимы при реализации способов лечения интерстициального заболевания легких и для оценки эффективности лечения данного заболевания. Такие способы можно применять у человека или субъектов, отличных от людей. Указанные маркеры также можно применять в виде фармацевтических композиций или в наборах. Указанные маркеры можно применять для скрининга соединений-кандидатов, которые модулируют их экспрессию. Также указанные маркеры можно применять для скрининга препаратов-кандидатов для лечения интерстициального заболевания легких. Такие способы скрининга можно применять у человека или субъектов, отличных от людей.
[0146] Маркерные полипептиды можно выделять при помощи любого подходящего способа, известного в технике. Нативные маркерные полипептиды можно очищать из природных источников при помощи стандартных способов, известных в технике (например, хроматография, центрифугирование, дифференциальная растворимость, иммунологический анализ). Согласно одному варианту реализации маркерные полипептиды можно выделять из пробы сыворотки крови при помощи хроматографических способов, раскрываемых в настоящей заявке. Согласно другому варианту реализации, маркерные полипептиды можно выделять из образца посредством контактирования образца с антителами или аптамерами, связанными с субстратом, которые специфически связываются с указанным маркером.
[0147] Маркерные полинуклеотиды могут обнаруживаться в геномной ДНК, кДНК или транскриптах мРНК, и могут включать полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложены полинуклеотиды, которые кодируют полипептид с последовательностью, по существу идентичной последовательности маркерного полипептида, или молекулы, которая содержит такой полипептид.
[0148] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен полинуклеотид, который кодирует полипептид, являющийся фрагментом, предшественником или образующимся впоследствии продуктом, или модифицированной версией маркера, или молекулу, которая содержит такой полипептид.
[0149] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложены полинуклеотиды, которые обладают существенным сходством последовательностей с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, являющийся фрагментом, предшественником, образующимся впоследствии продуктом или модифицированной версией маркера, или молекулу, которая содержит такой полипептид. Два полинуклеотида обладают «по существу идентичными последовательностями», если последовательности идентичны по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% или по меньшей мере приблизительно на 99%, когда сравниваются аминокислотные последовательности, или если полинуклеотиды способны образовать стабильный дуплекс с каждым другим при строгих условиях гибридизации. Такие условия раскрываются в других разделах настоящей заявки. Как описано выше в отношении полипептидов, настоящее изобретение включает полинуклеотиды, которые являются аллельными вариантами, результатом SNP, или, вариантами в кодонах, альтернативных тем, которая присутствуют в природных материалах, что неотделимо от вырожденности генетического кода.
[0150] Согласно некоторым вариантам реализации описываемые полинуклеотиды можно применять в качестве суррогатных маркеров интерстициального заболевания легких. Так, например, если уровень полинуклеотидного маркера повышен у субъекта с интерстициальным заболеванием легких, вместо указанного маркерного полипептида можно рассматривать повышение уровня мРНК, которая кодирует маркерный полипептид (например, для диагностирования интерстициального заболевания легких у субъекта).
[0151] Маркерные полинуклеотиды можно выделять при помощи любого подходящего способа, известного в технике. Нативные маркерные полинуклеотиды можно очищать из природных источников при помощи стандартных способов, известных в технике. Согласно одному варианту реализации маркерный полинуклеотид можно выделить посредством контактирования смеси с зондами, связанными с субстратом, которые комплементарны указанному маркерному полинуклеотиду при условиях гибридизации.
[0152] В качестве альтернативы маркерные полинуклеотиды можно синтезировать при помощи любого подходящего химического или рекомбинантного способа, известного в технике. Согласно одному варианту реализации, например, указанные маркеры можно синтезировать при помощи способов и технологий органической химии. Согласно другому варианту реализации указанный маркерный полинуклеотид можно получить посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
-6
-7
-8
[0153] Также настоящее изобретение включает молекулы, которые специфически связываются с маркерными полипептидами или полинуклеотидами согласно настоящему изобретению. Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены молекулы, которые специфически связываются с маркерным полипептидом или маркерным полинуклеотидом. В настоящей заявке термин «специфическое связывание» относится к взаимодействию между связывающимися парами (например, антителом и антигеном, или аптамером и его мишенью). Согласно некоторым вариантам реализации указанное взаимодействие характеризуется константой сродства не больше 10 молей/литр, не больше 10 молей/литр, не больше 10 молей/литр. Согласно другим вариантам реализации фраза «специфически связывается» относится к специфическому связыванию одного белка с другим (например, антитело, его фрагмент или партнер по связыванию с антигеном), причем уровень связывания, измеряемый при помощи любого стандартного анализа (например, иммунологический анализ), статистически значимо выше, чем фоновый контроль для данного типа анализа. Например, при проведении иммунологического анализа, контроль как правило включает реакционную лунку/пробирку, которая содержит антитело или только антиген-связывающий фрагмент (т.е., в отсутствии антигена), причем величину химической активности (например, неспецифического связывания с лункой) антитела или его антиген-связывающего фрагмента в отсутствии антигена рассматривают как фоновую. Связывание можно измерить при помощи разных способов, стандартных для техники, включая иммуноферментный анализ (например, ELISA), иммуноблоттинг и др.).
[0154] Связывающие молекулы включают антитела, аптамеры и фрагменты антител. В настоящей заявке термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулина, таким как моноклональные и поликлональные антитела, но также и к биспецифическим антителам, гуманизированным антителам, химерным антителам, антиидиопатическим (анти-ID) антителам, одноцепочечным антителам, фрагментам Fab, фрагментам F(ab'), гибридным белкам и любым модификациям вышеуказанных молекул, которые содержат сайт распознавания антигена заданной специфичности. В настоящей заявке под аптамером понимают несуществующую в природе нуклеиновую кислоту с желаемым действием на мишень. Желаемое действие включает без ограничений связывание с мишенью, каталитическое изменение мишени, реагирование с мишенью таким образом, что оно модифицирует/изменяет мишень или функциональную активность мишени, ковалентное присоединение к мишени в качестве суицидного ингибитора, облегчение реакции между мишенью и другой молекулой. Согласно некоторым вариантам реализации указанное действие представляет собой специфическое аффинное связывание с молекулой-мишенью, такой, что молекула мишень обладает трехмерной химической структурой, отличной от полинуклеотида, который связывается с лигандом-нуклеиновой кислотой по механизму, который преимущественно зависит от спаривания оснований по Уотсону-Крику или связывания тройной спирали, причем лиганд-нуклеиновая кислота, выполняющая известную физиологическую функцию, будучи связанной с указанной молекулой-мишенью.
[0155] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены антитела или аптамеры, которые специфически связываются с маркерным SNP, или с молекулой, которая содержит вышеупомянутый компонент (например, белок, содержащий полипептид, кодируемый маркерным геном).
[0156] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложены антитела или аптамеры, которые специфически связываются с полипептидом, последовательность которого по существу идентична последовательности маркерного гена, или с молекулой, которая содержит вышеупомянутый полипептид.
[0157] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложены антитела или аптамеры, которые специфически связываются с маркерным полипептидом или маркерным полинуклеотидом, который структурно отличается от маркера, особо указанного в таблицах, представленных в настоящей заявке, но проявляющего те же функции или свойства, или с молекулой, которая содержит вышеупомянутый компонентом.
[0158] Другой вариант реализации настоящего изобретения относится к множеству аптамеров, антител или их антиген-связывающих фрагментов, применяемых для определения экспрессии биомаркеров, дифференциально экспрессируемых у индивидуумов с интерстициальной пневмонией. Указанное множество аптамеров, антител или их антиген-связывающих фрагментов включает антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые селективно связываются с белками, дифференциально экспрессируемыми у индивидуумов с интерстициальным заболеванием легких, и которые можно определять как белковые продукты при помощи антител. Кроме того, указанное множество аптамеров, антител или их антиген-связывающих фрагментов включает антитела или их антиген- связывающие фрагменты, которые селективно связываются с белками или их частями (пептидами), кодируемыми любым из генов из таблиц, приведенных в настоящей заявке.
[0159] Согласно настоящему изобретению множество аптамеров, антител или их антиген-связывающих фрагментов относится по меньшей мере к 2, и более предпочтительно по меньшей мере к 3, и более предпочтительно по меньшей мере к 4, и более предпочтительно по меньшей мере к 5, и более предпочтительно по меньшей мере к 6, и более предпочтительно по меньшей мере к 7, и более предпочтительно по меньшей мере к 8, и более предпочтительно по меньшей мере к 9, и более предпочтительно по меньшей мере к 10 и т.д., с шагом в один, вплоть до любого подходящего количества антител или их антиген-связывающих фрагментов, включая согласно некоторым вариантам реализации антитела, представляющие все биомаркеры, описываемые в настоящей заявке, или их антиген-связывающие фрагменты.
[0160] Определенные антитела, которые специфически связываются с маркерными полипептидами или маркерными полинуклеотидами согласно настоящему изобретению, уже могут быть доступны и/или доступны для приобретения из коммерческих источников. В любом случае антитела согласно настоящему изобретению можно получить при помощи любых подходящих способов, известных в технике. Например, антитела можно получить путем иммунизации животного-хозяина маркером или его иммуногенным фрагментом (при необходимости конъюгированным с носителем). Для усиления иммунологического ответа можно применять адъюванты (например, адъювант Фрейнда). Затем у иммунизированного животного можно выделить сыворотку крови, содержащую поликлональные антитела с высоким сродством к конкретному антигенному детерминанту, и очистить их.
[0161] В качестве альтернативы, у иммунизированного животного можно отобрать вырабатывающую антитела ткань, приготовить из органа гомогенат ткани и объединить его с культивируемыми раковыми клетками. Можно отобрать гибридные клетки, которые вырабатывают моноклональные антитела, специфичные по отношению к маркеру. В качестве альтернативы, антитела согласно настоящему изобретению можно получить посредством химического синтеза или посредством рекомбинантной экспрессии. Например, полинуклеотид, который кодирует указанное антитело, можно применять для конструирования вектора экспрессии для выработки антитела. Антитела согласно настоящему изобретению можно также сгенерировать при помощи разных способов фагового дисплея, известных в технике.
[0162] Антитела или аптамеры, которые специфически связываются с маркерами согласно настоящему изобретению, можно применять, например, при реализации способов определения биомаркеров согласно настоящему изобретению с применением способов и технологий, хорошо известных в технике. Например, согласно некоторым вариантам реализации антитела конъюгированы с определяемой молекулой или фрагментом (например, красителем и ферментом), и их можно применять при ELISA или сэндвич-анализе для определения маркеров согласно настоящему изобретению.
[0163] Согласно другому варианту реализации антитела или аптамеры к маркерному полипептиду или маркерному полинуклеотиду согласно настоящему изобретению можно применять для анализа образов ткани (например, тонкий срез коркового слоя) с целью обнаружения маркера. Антитела или аптамеры могут специфически связываться с указанным маркером, если таковой присутствует в срезах ткани, и это позволяет определить локализацию маркера в данной ткани. Аналогично антитела или аптамеры, меченные радиоизотопом, можно применять для визуализации in vivo или для терапевтического применения.
[0164] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены композиции, содержащие маркерный полипептид или полинуклеотид согласно настоящему изобретению, связывающую молекулу, которая специфически связывается с маркерным полипептидом или полинуклеотидом (например, антитело или аптамер), ингибитор маркерного полипептида или полинуклеотида или другую молекулу, которая может повышать или понижать уровень активности маркерного полипептида или полинуклеотида. Такие композиции могут быть терапевтическими композициями, представленными в форме, пригодной для терапевтического применения.
[0165] В качестве альтернативы, согласно настоящему изобретению предложена композиция, которая содержит компонент, который является фрагментом, модификацией, предшественником или образующимся впоследствии продуктом маркера согласно настоящему изобретению, или молекулу, которая содержит вышеупомянутый компонент.
[0166] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, которая содержит полинуклеотид, который связывается с полипептидом, или молекулу, которая содержит вышеупомянутый полинуклеотид.
[0167] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, которая содержит антитело или аптамер, который специфически связывается с полипептидом, или молекула, которая содержит вышеупомянутое антитело или аптамер.
Способы определения генетического варианта
[0168] Также согласно настоящему изобретению предложены способы определения биомаркеров согласно настоящему изобретению. Реализация настоящего изобретения на практике подразумевает, если не указано другое, применение традиционных способов аналитической биохимии, микробиологии, молекулярной биологии и технологий рекомбинантных ДНК в пределах данной области техники. Такие способы подробно объяснены в литературе. (См., например, Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2000; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I & II (P. Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, Vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)).
[0169] Способы согласно настоящему изобретению не ограничиваются каким-либо конкретным путем определения наличия или отсутствия варианта (например, SNP) и могут подразумевать применение любого подходящего способа для определения наличия или отсутствия варианта(ов), и в технике известен целый ряд способов определения. Для определения генетического варианта можно применять динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH). Генотипирование на основе DASH основывается на различиях в температурах плавления ДНК, которые возникают вследствие нестабильности оснований, спаренных вопреки принципам комплементарности. Процесс может быть в большой степени автоматизирован и включает несколько простых принципов. Таким образом, согласно аспектам и вариантам реализации, описанным в настоящей заявке, предложены способы оценки наличия или отсутствия SNP в образце (например, биологическом образце), полученном от субъекта с подозрением на интерстициальное заболевание легких или страдающего данным заболеванием (например, на основании семейного анамнеза). Согласно определенным вариантам реализации проводят скрининг одного или более SNP в одном или более образцах, полученных от субъекта. Указанные SNP могут быть ассоциированы с одним или более генами, например с одним или более генами или другими генами, ассоциированными с секрецией слизи, которые раскрываются в настоящей заявке.
[0170] Как правило, целевой геномный сегмент амплифицируют и отделяют от нецелевой последовательности, например, путем применения биотинилированного праймера и хроматографии. Можно разработать зонд, чтобы он специфически гибридизовался с последовательностью варианта или с последовательностью доминантного аллеля. Указанный зонд можно пометить молекулой, которая флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК, либо добавлять его в присутствии такой молекулы. Затем интенсивность сигнала измеряют по мере того, как температура увеличивается, пока не будет определена Tm. Несоответствующая последовательность (последовательность генетического варианта или доминантного аллеля, в зависимости от дизайна зонда) будет приводить к тому, что Tm будет ниже ожидаемой.
[0171] Генотипирование на основе DASH основано на количественно измеримом изменении Tm, и таким образом возможно измерение многих типов мутаций, не только SNP. Другие преимущества DASH включают способность данного способа к работе с зондами без меток, а также простые дизайн и условия достижения результата данного способа.
[0172] Также для определения генетического варианта можно применять молекулярные маяки. Данный способ основан на применении специфически разработанного одноцепочечного олигонуклеотидного зонда. Олигонуклеотид конструируют таким образом, чтобы на каждом конце были комплементарные области, и между ними была расположена последовательность зонда. Такой дизайн позволяет образоваться структуре шпильки или «петли-на-стебле» в ее естественном, изолированном состоянии. К одному концу присоединяют флуорофор, а к другому концу - гаситель флуоресценции. Благодаря структуре зонда типа «петли-на-стебле» флуорофор оказывается в непосредственной близости с гасителем, что не позволяет молекуле испускать флуоресценцию. Также молекулу конструируют таким образом, чтобы только последовательность зонда была комплементарна последовательности целевой геномной ДНК.
[0173] Если последовательность зонда в молекулярном маяке встречается со своей целевой последовательностью геномной ДНК во время анализа, она отжигается и гибридизуется. Благодаря длине последовательности зонда шпилечный сегмент зонда будет денатурировать в пользу образования более длинного, более стабильного гибрида зонд-мишень. Данное конформационное изменение позволяет флуорофору и гасителю оказаться уже не в такой близости друг к другу благодаря шпилечной организации, что позволяет молекуле флуоресцировать.
[0174] Если, с другой стороны, последовательность зонда встречается с целевой последовательностью всего лишь с одним некомплементарным нуклеотидом, молекулярный маяк может преимущественно оставаться в своем естественном шпилечном состоянии, и флуоресценции наблюдаться не будет, поскольку флуорофор остается погашенным. Уникальный дизайн таких молекулярных маяков позволяет проводить простой диагностический анализ по идентификации SNP в заданной локализации. Если один молекулярный маяк сконструирован так, чтобы соответствовать аллелю дикого типа, а другой, чтобы соответствовать мутантному аллелю, указанные два маяка можно применять для идентификации генотипа индивидуума. Если во время анализа определяется длина волны только флуорофора первого зонда, то такой индивидуум гомозиготен по дикому типу. Если определяется длина волны только флуорофора второго зонда, то такой индивидуум гомозиготен по мутантному аллелю. И наконец, если определяются обе длины волны, оба молекулярных маяка должны гибридизоваться со своими комплементами, и, таким образом, у индивидуума должны содержаться оба аллеля, и он гетерозиготен.
[0175] Также для определения генетических вариантов можно применять микроматрицу. На маленьком чипе можно расположить сотни тысяч зондов, что позволяет исследовать одновременно множество генетических вариантов или SNP. Поскольку аллели с SNP различаются только по одному нуклеотиду, и поскольку трудно достичь оптимальных условий гибридизации для всех зондов на матрице, целевая ДНК имеет возможность гибридизоваться с некомплементарными зондами. С этим можно бороться путем применения нескольких излишних зондов для исследования каждого SNP. Зонды можно сконструировать так, чтобы они содержали сайт SNP в нескольких различных локализациях, также содержащие несоответствия аллелю SNP. Путем сравнения дифференциальной величины гибридизации целевой ДНК с каждым из указанных излишних зондов можно определить специфичные гомозиготные и гетерозиготные аллели.
[0176] Для определения генетических вариантов и SNP можно применять полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP). RFLP основан на применении многих разных рестриктаз и на их высоком сродстве к уникальным и специфическим сайтам рестрикции. Путем применения расщепления в образце генома и определения длины фрагментов путем анализа подвижности в геле можно установить, расщепляют ли ферменты ожидаемые сайты рестрикции. Неспособность расщеплять образец генома приводит к образованию идентифицируемо большего фрагмента, чем ожидалось, что означает, что присутствует мутация в точке сайта рестрикции, которая обеспечивает защиту от нуклеазной активности.
[0177] Для определения генетических вариантов можно применять способы, основанные на ПЦР и амплификации. Например, ПЦР с четырьмя праймерами подразумевает применение двух пар праймеров для амплификации двух аллелей в одной реакции ПЦР. Праймеры конструируют так, чтобы две пары праймеров перекрывались в локализации SNP, но каждый строго соответствовал одному из возможных аллелей. Как следствие, если данный аллель присутствует в реакции ПЦР, пара праймеров, специфичная для данного аллеля, будет выдавать продукт, но не альтернативный аллель с другой аллельной последовательностью. Две указанный пары праймеров можно сконструировать так, чтобы их продукты ПЦР обладали существенно различной длиной для получения легко различимых полос на гель-электрофорезе, или так, чтобы они содержали разные метки.
[0178] Также для определения генетических вариантов можно применять достройку праймера. Достройка праймера включает в себя, во-первых, гибридизацию зонда с основаниями, расположенными в последовательности непосредственно перед нуклеотидом SNP, и, во-вторых, проведение «реакции минисеквенирования», при которой ДНК-полимераза достраивает гибридизованный праймер путем добавления основания, которое комплементарно основанию SNP. Включенное основание, которое обнаруживается, определяет наличие или отсутствие аллеля с SNP. Поскольку достройка праймера основана на работе фермента ДНК-полимеразы с высокой точностью, данный метод как правило очень надежный. Достройка праймеров позволяет проводить генотипирование большинства SNP при очень близких условиях реакции, что делает данный способ очень гибким. Способ достройки праймеров применяют в целом ряде форматов анализа, и детекцию можно проводить, например, при помощи флуоресцентных меток или масс-спектрометрии.
[0179] Достройка праймеров может включать включение либо флуоресцентно меченного ddNTP, либо флуоресцентно меченных дезоксинуклеотидов (dNTP). В случае ddNTP зонды гибридизуются с целевой ДНК непосредственно выше SNP нуклеотида в последовательности, и один ddNTP, комплементарный указанному аллелю SNP, добавляется к 3'-концу зонда (отсутствующий 3'-гидроксил в дидезоксинуклеотид препятствует добавлению последующих нуклеотидов). Каждый ddNTP мечен разным флуоресцентным сигналом, что позволяет определять все четыре аллеля в одной и той же реакции. В случае dNTP аллель-специфичные зонды содержат 3'-основания, которые комплементарны каждому из исследуемых аллелей SNP. Если целевая ДНК содержит аллель, комплементарный 3'-основанию указанного зонда, целевая ДНК будет полностью гибридизоваться с зондом, и ДНК-полимераза сможет провести достройку на 3'-конце зонда. Это определяется по включению флуоресцентно меченных dNTP в конец зонда. Если целевая ДНК не содержит аллеля, комплементарного 3'-основанию зонда, целевая ДНК будет демонстрировать ошибочное спаривание на 3'-конце зонда, и ДНК-полимераза не сможет провести достройку на 3'-конце зонда.
[0180] Способ генотипирования SNP iPLEX основан на несколько ином подходе, и подразумевает определение при помощи масс-спектрометрии. Зонды достройки конструируют таким образом, чтобы в смеси для ПЦР можно было амплифицировать и анализировать много разных SNP. В реакции достройки применяют ddNTP, как было описано выше, но определение аллеля SNP зависит от реальной массы продукта достройки, а не флуоресцентной молекулы. Указанный способ предназначен для работы в диапазоне от низкой до умеренно высокой производительности, и не предназначен для сканирования всего генома.
[0181] Однако способы достройки праймеров пригодны для анализа с высокой производительностью. Зонды для достройки праймеров можно располагать на предметном стекле, что позволяет проводить одновременное генотипирование многих SNP. Данная технология, которая в широком смысле называется упорядоченной достройкой праймеров (APEX), имеет несколько преимуществ по сравнению со способами, основанными на дифференциальной гибридизации зондов. Если сравнивать, способы APEX обладают большей различающей способностью, чем способы на основе дифференциальной гибридизации, поскольку при их применении часто бывает невозможно достичь оптимальных условий гибридизации для тысяч зондов на микроматрицах ДНК (обычно данная проблема решается путем применения большого избытка зондов).
[0182] Также для определения генетических вариантов можно применять лигирование олигонуклеотидных зондов. ДНК-лигаза катализирует сшивание 3'-конца фрагмента ДНК с 5'-концом, непосредственно соседствующим с указанным фрагментом ДНК. Данный механизм можно применять для исследования SNP путем гибридизации двух зондов, непосредственно над полиморфным сайтом SNP, в результате чего сшивка может возникать, если зонды идентичны целевой ДНК. Например, можно сконструировать два зонда; аллель-специфичный зонд, который гибридизуется с целевой ДНК так, что основание на 3'-конце располагается непосредственно над нуклеотидом SNP, и второй зонд, который гибридизуется с матрицей выше (в комплементарной нити ниже) полиморфного сайта SNP, обеспечивая реакцию сшивки на 5'-конце. Если аллель-специфичный зонд соответствует целевой ДНК, он будет полностью гибридизоваться с указанной целевой ДНК, и может произойти сшивка. Как правило сшивка не происходит в присутствии некомплементарного 3'-основания. Сшитые или несшитые продукты можно определить при помощи гель-электрофореза, масс-спектрометрии MALDI-TOF или капиллярного электрофореза.
[0183] Для определения генетических вариантов можно применять 5'-нуклеазную активность ДНК-полимеразы Taq. Анализ проводят одновременно с реакцией ПЦР, и результаты можно считывать в реальном времени. Данный анализ требует применения прямых и обратных праймеров для ПЦР, которые будут амплифицировать область, которая включает полиморфный сайт SNP. Распознавание аллеля достигается при помощи FRET, и одного или двух аллель-специфичных зондов, которые гибридизуются с полиморфным сайтой SNP. Указанные зонды содержат флуорофор, присоединенный к 5'-концу, и гаситель, присоединенный к 3'-концу. Хотя указанный зонд интактный, гаситель может оставаться в непосредственной близости к флуорофору, исключая возможность сигнала от флуорофора. Во время этапа амплификации ПЦР, если аллель-специфичный зонд абсолютно комплементарен аллелю SNP, он будет связываться с нитью целевой ДНК, а затем будет деградировать благодаря 5'-нуклеазной активности полимеразы Taq, поскольку она достраивает ДНК из праймеров ПЦР. Деградация зонда приводит к отделению флуорофора от молекулы гасителя и к генерированию поддающегося определению сигнала. Если аллель-специфичный зонд не абсолютно комплементарен, он будет демонстрировать более низкую температуру плавления и не будет эффективно связываться. Это не позволяет нуклеазе действовать на зонд.
[0184] Определение посредством Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) можно применять для определения достройки праймеров и реакций сшивки, когда две метки располагают в непосредственной близости друг от друга. Также его можно применять в 5'-нуклеазной реакции, реакции молекулярных маяков и в реакции инвазивного расщепления, когда пару соседствующих донора/акцептора разделяют путем расщепления или разрушения структуры типа «петля-на-стебле», которая удерживает их вместе. FRET происходит, когда удовлетворяются два условия. Во-первых, спектр излучения флуоресцентного красителя-донора должен перекрываться с длиной волны возбуждения красителя-акцептора. Во-вторых, указанные два красителя должны быть близко расположены друг к другу, поскольку перенос энергии быстро уменьшается при увеличении расстояния. Именно необходимость близости делает FRET хорошим способом определения для целого ряда механизмов различения аллелей.
[0185] Для FRET можно применять целый ряд красителей, и они хорошо известны в технике. Наиболее распространенные красители включают флуоресцеин, цианиновые красители (Су3-Су7), родаминовые красители (например, родамин 6G), красители серии Alexa (Alexa 405 - Alexa 730). Некоторые из указанных красителей применялись в сетях FRET (с многими донорами и акцепторами). Оптические приборы для визуализации всех их требуют применения детекции в диапазоне от УФ области до ближней ИК (например, Alex 405 - Су7), и серии красителей Atto (Atto-Tec GmbH). Серия красителей Alexa от компании «Invitrogen» охватывает весь спектральный диапазон. Они очень яркие и фотостабильные.
[0186] Примеры пар красителей для меток для FRET включают Alexa-405/Alex-488, Alexa-488/Alexa-546, Alexa-532/Alexa-594, Alexa-594/Alexa-680, Alexa-594/Alexa-700, Alexa-700/Alexa-790, Су3/Су5, Су3.5/Су5.5, родамин-зеленый/родамин-красный и др. Также можно применять флуоресцентные наночастицы металлов, такие как нанокластеры серебра и золота (Richards et al. (2008) J Am Chem Soc 130:5038-39; Vosch et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:12616-21; Petty and Dickson (2003) J Am Chem Soc 125:7780-81. На выбор красителя может влиять доступность фильтров, дихроичных зеркал, мультрихроичных зеркал и лазеров.
Способы определения маркеров, включая уровень экспрессии полинуклеотидов и полипептидов
[0187] Маркеры согласно настоящему изобретению можно определять при помощи любого способа, известного специалистам в данной области техники, включая без ограничений LC-MS (жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию), GC-MS (газовую хроматографию-масс-спектрометрию), иммунологический анализ, гибридизацию и ферментный анализ. Определение может быть количественным и качественным. Доступны самые разные стандартные способы, включая масс-спектрометрию, хроматографическое разделение, двухмерное разделение в геле, анализ связывания (например, иммунологический анализ), анализ конкурентного ингибирования и т.д. Любой эффективный способ, известный в технике для измерения наличия/отсутствия, уровня активности полипептида или полинуклеотида, включен в настоящую заявку. Специалист в данной области техники должен быть способен определить, какой способ будет наиболее подходящим для измерения специфического маркера. Таким образом, например, ELISA может наилучшим образом подходить для применения в кабинете врача, тогда как в клинической лаборатории наиболее подходящим может стать измерение, которое требует более утонченного инструментария. Независимо от избранного способа важно, чтобы измерения были воспроизводимыми.
[0188] Маркеры согласно настоящему изобретению можно измерять при помощи масс-спектрометрии, которая позволяет напрямую измерять анализируемые вещества с высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Доступен целый ряд масс-спектрометрических способов. Ионизация электрораспылением (ESI), например, позволяет количественно оценивать различия относительных концентраций разных видов в одном образце в сравнении с другим; при применении нормировки можно получить абсолютные количественные показатели (например, с применением внутреннего стандарта). Также для определения того, присутствует ли маркер, и для определения относительного или абсолютного уровня маркера можно применять матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI) или близкую технологию SELDI («Ciphergen, Inc.»). Масс-спектрометры, которые позволяют проводить времяпролетные (TOF) измерения, обладают высокой точностью и разрешением, и позволяют измерять виды с низкой распространенностью, даже в сложных матрицах, таких как сыворотка или спинномозговая жидкость.
[0189] Для маркерных белков количественное определение может быть основано на получении производных в сочетании с присоединением изотопных меток, которые называются кодируемыми изотопами аффинные метки («ICAT»). При реализации данного и других близких способов специфическую аминокислоту в двух образцах дифференциально метят изотопами и впоследствии отделяют от пептидного фона посредством твердофазного захвата, отмывки и высвобождения. Интенсивность сигнала от двух молекул из двух источников с разными изотопными метками затем можно точно количественно оценить относительно друг друга. Также количественный анализ может быть основан на способе изотопного разведения, при котором к белку или пептиду, который требуется измерять, добавляют пептид или белок с изотопной меткой. Кроме того, количественную оценку можно проводить также без изотопных стандартов на основании прямых показателей интенсивности для анализируемого вещества в сравнении с другим измерением стандарта в сходной матрице.
[0190] Кроме того, для разделения белков применялись одномерные и двухмерные гели, и количественная оценка пятен в гелях проводили при помощи окрашивания серебром, флуоресценции или радиоактивного мечения. Указанные дифференциально окрашенные пятна определяли при помощи масс-спектрометрии и идентифицировали при помощи тандемной масс-спектрометрии.
[0191] Согласно одному варианту реализации указанные маркеры определяют при помощи масс-спектрометрии в сочетании с технологией разделения, такой как жидкостная хроматография-масс-спектрометрия или газовая хроматография-масс-спектрометрия. В частности, объединение жидкостной хроматографии с обращенной фазой с высоким разрешением и времяпролетной (TOF) ESI масс-спектрометрии с высокой точностью определяемых масс позволяет проводить спектральные измерения интенсивности для большого числа биомолекул из относительно малого количества любого сложного биологического материала. Анализ проб, проводимый таким образом, позволяет определять и количественно оценивать заданный маркер (и охарактеризовать его по времени удержания и m/z).
[0192] Как должны понимать специалисты в данной области техники, в сочетании с масс-спектрометрией можно применять многие другие технологии разделения. Например, в продаже доступен широкий выбор колонок для разделения. Кроме того, разделение можно проводить при помощи индивидуально изготовленных хроматографических поверхностей (например, бусина, на которой был прикреплен специфический маркерный реагент). Молекулы, удерживаемые на носителе, впоследствии можно десорбировать для анализа путем масс-спектрометрии.
[0193] Анализ посредством жидкостной-хроматографии-масс-спектрометрии позволяет получить спектр интенсивностей по массам, пики на котором соответствуют разным компонентам пробы, причем каждый компонент имеет характерное отношение масса-заряд (m/z) и время удерживания (RT). Наличие пика с m/z и RT маркера указывает на то, что маркер присутствует. Пик, соответствующий маркеру, можно сравнивать с соответствующим пиком из другого спектра (например, для контрольного образца), чтобы провести сравнительное измерение. Можно применять любой способ нормировки, известный в технике (например, внутренний стандарт), когда желательно количественное измерение. Для разделения перекрывающихся пиков доступна программа, проводящая «деконволюцию». Время удерживания зависит в некоторой степени от условий, применяемых при проведении разделения путем жидкостной хроматографии. Подходящие условия, которые применяются для получения времен удерживания, показанных в таблицах, приведены в разделе «Примеры». Масс-спектрометр предпочтительно позволяет получить высокую точность определения масс и высокое разрешение по массе. Точность масс хорошо откалиброванного инструмента Micromass TOF, например, по сообщениям составляет 5 мДа, а разрешение m/Δm превышает 5000.
[0194] Согласно некоторым вариантам реализации уровень маркеров можно определить при помощи стандартного иммунологического анализа, такого как сэндвич-ELISA с применением подобранных пар антител и хемилюминесцентной детекции. Обычно применяют коммерческие или изготовленные на заказ моноклональные или поликлональные антитела. Однако указанный анализ можно адаптировать для применения с другими реагентами, которые специфически связываются с маркером. Для определения концентрации маркеров на основании данных анализа применяют стандартные протоколы и способы анализа данных.
[0195] Целый ряд анализов, описанных выше, основан на применении реагента, который специфически связывается с маркером. Любая молекула, которая специфически связывается с маркером, включена в область настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации указанными связывающими молекулами являются антитела или фрагменты антител. Согласно другим вариантам реализации указанными связывающими молекулами являются соединения - не антитела, такие как аптамеры. Так, например, указанной связывающей молекулой может быть фермент, для которого указанный маркер является субстратом. Указанные связывающие молекулы могут распознавать любой эпитоп маркеров-мишеней.
[0196] Как описано выше, связывающие молекулы можно идентифицировать и получить при помощи любого способа, принятого в технике. Способы получения и идентификации антител и фрагментов антител, специфических для определенного анализируемого вещества, хорошо известны. Примеры других способов, применяемых для идентификации связывающих молекул, включают анализ связывания со случайными библиотеками пептидов (например, фаговый дисплей), и способы разработки, основанные на анализе структуры маркера.
[0197] Маркеры согласно настоящему изобретению также можно определять и измерять при помощи получения целого ряда химических производных или реакционных технологий, известных в технике. Реагенты для применения при реализации таких технологий известны в технике, и есть в продаже для определенных классов целевых молекул.
[0198] И наконец, технологии хроматографического разделения, описанные выше, также можно сочетать с технологией анализа, отличной от спектрометрии, такой как флуоресцентное определение меченных молекул, ЯМР, капиллярное УФ определение, испарительное светорассеяние или электрохимическое определение.
[0199] Измерение относительного количества РНК или маркерного белка согласно настоящему изобретению можно проводить любым способом, известным в технике (см., например, Sambrook, J., Fritsh, Е. F., and Maniatis, Т. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Обычные методологии определения РНК включают экстракцию РНК из образца клеток или ткани, последующую гибридизацию меченного зонда (например, комплементарного нуклеотида), специфичного в отношении целевой РНК, с экстрагированной РНК, и определение зонда (например, нозерн-блоттинг). Обычные методологии определения белка включают экстракцию белка из образца клеток или ткани, последующую гибридизацию меченного зонда (например, антитела), специфичного в отношении целевого белка с пробой белка, и определение зонда. Указанной группой-меткой может быть радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Определение специфического белка и полинуклеотидов также можно оценить при помощи гель-электрофореза, колоночной хроматографии, прямого секвенирования или количественную ПЦР (в случае полинуклеотидов) среди многих прочих технологий, хорошо известных специалистам в данной области техники.
[0200] Определение наличия или количества копий всех или части маркерных генов согласно настоящему изобретению можно проводить при помощи любого способа, известного в технике. Обычно бывает удобно оценивать наличие и/или количество ДНК или кДНК при помощи саузерн-блоттинга, при котором из образца клеток или ткани экстрагируют всю ДНК, ее гибридизуют с меченным зондом (например, комплементарной молекулой ДНК), и проводят определение указанного зонда. Указанной группой-меткой может быть радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Другие полезные способы определения и/или количественной оценки ДНК включают прямое секвенирование, гель электрофорез, колоночную хроматографию, или количественную ПЦР, хорошо известные специалистам в данной области техники.
[0201] Сходство полинуклеотидов можно оценивать путем гибридизации между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами с комплементарными или частично комплементарными последовательностями. Такие эксперименты хорошо известны в технике. Гибридизация и условия отмывки высокой строгости, согласно определению в настоящей заявке, относятся к условиям, которые позволяют выделять молекулы нуклеиновых кислот, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере 80% с молекулами нуклеиновых кислот, которые применяют в качестве зонда в реакции гибридизации (т.е., условия, допускающие приблизительно 20% или менее некомплементарных нуклеотидов).
+
+
m
m
[0202] Гибридизация и условия отмывки очень высокой строгости, согласно определению в настоящей заявке, относятся к условиям, которые позволяют выделять молекулы нуклеиновых кислот, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере приблизительно 90% с молекулой нуклеиновой кислоты, которую применяют в качестве зонда в реакции гибридизации (т.е., условия, допускающие приблизительно 10% или менее некомплементарных нуклеотидов). Как обсуждалось выше, специалист в данной области техники может применять формулу, приведенную у Meinkoth et al., ibid, для расчета соответствующих условий гибридизации и отмывки для достижения указанного конкретного уровня комплементарности нуклеотидов. Такие условия могут варьировать в зависимости от того, образуется ли гибриды ДНК:РНК или ДНК:ДНК. Расчетная температура плавления для гибридов ДНК:ДНК на 10°C меньше, чем для гибридов ДНК:РНК. Согласно конкретным вариантам реализации строгие условия гибридизации для гибридов ДНК:ДНК включают гибридизацию при ионной силе 6Х (раствор цитрата и хлорида натрия) (0,9М Na) при температуре приблизительно от 20°C до приблизительно 35°C (более низкая строгость), более предпочтительно от приблизительно 28°C до приблизительно 40°C (более строгие условия), и даже более предпочтительно от приблизительно 35°C до приблизительно 45°C (еще более строгие условия), при соответствующих условиях отмывки. Согласно конкретным вариантам реализации строгие условия гибридизации для гибридов ДНК:РНК включают гибридизацию при ионной силе 6Х (0,9М Na) при температуре приблизительно от 30°C до приблизительно 45°C (более низкая строгость), более предпочтительно от приблизительно 38°C до приблизительно 50°C, и даже более предпочтительно от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C, при условиях отмывки сходной строгости. Указанные значения основаны на расчетах температуры плавления для молекул больше чем приблизительно из 100 нуклеотидов, 0% формамида и содержания G+С приблизительно 40%. В качестве альтернативы, Tm можно рассчитывать эмпирически, как указано в Sambrook et al., supra, страницы 9.31-9.62. Как правило, условия отмывки должны быть как можно более строгими, и должны соответствовать избранным условиям гибридизации. Например, условия гибридизации могут включать сочетание концентрации соли и температуры, которая приблизительно на 20-25°C ниже расчетной T для конкретного гибрида, а условия отмывки как правило включают сочетание концентрации соли и температуры, которая приблизительно на 12-20°C ниже расчетной T для конкретного гибрида. Один пример условий гибридизации, подходящих для применения с гибридами ДНК:ДНК, включает 2-24-часовую гибридизацию при 6Х SSC (50% формамида) при приблизительно 42°C, после которой идут этапы отмывки, которые включают одну или более отмывок при комнатной температуре при приблизительно 2Х SSC, а затем дополнительные этапы отмывки при более высоким температурах и более низкой ионной силе (например, по меньшей мере одна отмывка при приблизительно 37°C и приблизительно 0,1Х-0,5Х SSC, затем по меньшей мере одна отмывка приблизительно при 68°C и приблизительно 0,1Х-0,5Х SSC). Другие условия гибридизации и, например, условия, наиболее применимые для матриц нуклеиновых кислот, должны быть известны специалистам в данной области техники.
Диагностика, мониторинг и лечение интерстициального заболевания легких
[0202] Настоящее изобретение включает способы диагностики интерстициального заболевания легких, такого как интерстициальная пневмония, идиопатическая интерстициальная пневмония, семейная интерстициальная пневмония, идиопатический фиброз легких и др., способы стратификации пациентов среди других типов интерстициального заболевания легких и/или исключения других типов заболевания легких, которые вызывают сходные симптомы и демонстрируют сходные отклонения на рентгенограмме грудной клетки, и связанные с ними способы. Как правило, ожидается, что биомаркеры, описываемые в настоящей заявке, можно измерять в сочетании с другими признаками, симптомами и клиническими пробами для оценки интерстициального заболевания легких, такими как рентгенограммы, патологическая оценка ткани легких или биомаркеры интерстициального заболевания легких, описанные в литературе. Аналогично, можно измерять в сочетании более одного биомаркера согласно настоящему изобретению. Измерение уровня биомаркеров согласно настоящему изобретению вместе с другими маркерами, известными в технике, включая маркеры, особо перечисленные в настоящей заявке, попадают в область настоящего изобретения. Маркеры, соответствующие данному варианту реализации, включают маркеры, для которых было идентифицировано присутствие или повышение уровня в пробах, полученных из биологических, и особенно из ткани легких, образцов, по сравнению с пробами из нормальных или контрольных образцов. Другие маркеры, соответствующие данному варианту реализации, включают фрагменты, предшественники, образующиеся впоследствии продукты и модифицированные версии таких маркеров, полипептиды, обладающие существенной идентичностью последовательности с такими маркерами. Другие соответствующие маркеры для данного варианта реализации должны быть очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения.
[0203] В настоящей заявке термин «интерстициальное заболевание легких» или «ILD» применяется в соответствии с его простым и ординарным значением, принятым в технике. Интерстициальными заболеваниями легких являются заболевания, поражающие интерстиций. ILD могут характеризоваться учащенным дыханием, хроническим кашлем, утомлением и слабостью, потерей аппетита и/или быстрой утратой функции. Когда аспект или вариант реализации настоящего изобретения относится к ILD, указанным ILD может быть ИИП. Когда аспект или вариант реализации настоящего изобретения относится к ILD, указанным ILD может быть СИП. Когда аспект или вариант реализации настоящего изобретения относится к ILD, указанным ILD может быть ИФЛ. Когда аспект или вариант реализации настоящего изобретения относится к ILD, указанным ILD может быть ИИП. Дополнительные фибротические заболевания легких включают острую интерстициальную пневмонию (АГР), респираторное ассоциированное с бронхитом интерстициальное заболевание легких (RBILD), десквамативную интерстициальную пневмонию (DIP), неспецифическую интерстициальную пневмонию (NSIP), облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией (ВООР). АГР быстро прогрессирует и гистологически отличается от интерстициальной пневмонии. Патологическая картина представляет собой картину, образующуюся из диффузного повреждения альвеол (DAD), которое также обнаруживается при синдроме острой дыхательной недостаточности (ARDS) и других острых интерстициальных пневмониях известной причины (см. Clinical Atlas of Interstitial Lung Disease (2006 ed.) pp 61-63).
[0204] RBILD характеризуется воспалительными поражениями дыхательных бронхиол у курильщиков Гистологическая картина RBILD характеризуется накоплением пигментированных макрофагов в дыхательных бронхиолах и окружающей легочной ткани, изменчивым перибронхиальным фибротическим уплотнением альвеолярных перегородок, и минимальным ассоциированным интрамуральным воспалением (см. Wells et al. (2003) Sem Respir. Crit. Care Med. vol. 24).
[0205] DIP представляет собой редкое интерстициальное заболевание легких, характеризуемое скоплением макрофагов в больших количествах в альвеолярных пространствах, ассоциированным с воспалением и/или фиброзом. Указанные макрофаги часто содержат пигмент со светло-коричневой окраской. Часто присутствуют лимфоидные узелки, а также редкие, но различимые инфильтраты эозинофилов. DIP чаще всего возникает у курильщиков (см. Tazelaar et al. (Sep. 21, 2010) Histopathology).
[0206] NSIP характеризуется по патологической картине однородным интерстициальным воспалением и фиброзом, появляющимися за короткий период времени. NSIP отличается от других интерстициальных заболеваний легких тем, что при ней как правило благоприятный прогноз. Кроме того, временная однородность паренхиматозных изменений, наблюдаемых при NSIP, значительно отличается от временной неоднородности при обычной интерстициальной пневмонии (см. Coche et al. (2001) Brit J Radiol74:189).
[0207] ВООР, в отличие от NSIP, может приводить к летальному исходу за несколько дней с начала первых острых симптомов. Она характеризуется быстрым началом синдрома острой дыхательной недостаточности; следовательно, клинически, быстро прогрессирующая ВООР, может быть неотличима от острой интерстициальной пневмонии. Гистологические признаки включают кластеры одноядерных воспалительных клеток, которые образуют гранулярную ткань и пробку в дистальных дыхательных путях и альвеолярном пространстве. Такие пробки из гранулярной ткани могут образовывать полипы, которые мигрируют в альвеолярные ходы, или могут в некоторых очагах присоединяться к стенке, (см. White & Ruth-Saad (2007) Crit. Care Nurse 27:53).
[0208] Более подробную информацию о характеристиках и свойствах и средствах для лечения указанных заболеваний можно найти, например, на интернет-сайте Американской ассоциации пульмонологов lungusa.org/lung-disease/pulmonary-fibrosis. Диагностические показатели расстройств со стороны легких включают биопсию (например, видеоторакоскопическая операция или хирургическая биопсия легких), компьютерная томография высокого разрешения (HRTC) или основные показатели дыхания, такие как объем форсированного выдоха (FEV1), жизненная емкость легких (ЖЕЛ), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ) и FEV1/ФЖЕЛ.
[0209] Идиопатические интерстициальные пневмонии (ИИП) могут включать идиопатический фиброз легких и семейную интерстициальную пневмонию (СИП). Идиопатические интерстициальные пневмонии (ИИП) представляют собой подгруппу диффузных интерстициальных заболеваний легких неизвестной этиологии (термин «идиопатическая» указывает на неизвестную этиологию). ИИП характеризуются увеличением интерстициального компартмента (т.е., части паренхимы легких, зажатой между базальной мембраной эпителия и эндотелия) с инфильтратом. Инфильтрат может сопровождаться фиброзом, либо в форме аномальных отложений коллагена, либо в форме пролиферации фибробластов, способных к синтезу коллагена.
[0210] Идиопатический фиброз легких (ИФЛ) возникает у тысяч людей по всему миру, и за последние 10 лет распространенность данного заболевания увеличилась вдвое. Начало ИФЛ приходится на возраст 50-70 лет и сопровождается прогрессирующей одышкой и гипоксемией. Средняя продолжительность жизни после возникновения ИФЛ составляет 3-5 лет. Этиология и патогенез данного патологического состояния до конца не ясны. Приблизительно 5-20 процентов всех случаев ИФЛ связаны с семейным анамнезом, и наследование, по-видимому, является аутосомно-доминантным.
[0211] В настоящей заявке предложены способы определения того, страдает ли субъект интерстициальным заболеванием легких. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены способы диагностики интерстициального заболевания легких у субъекта. Указанные способы включают получение биологического образца у субъекта с подозрением на интерстициальную пневмонию или с риском развития интерстициального заболевания легких, определение наличия или уровня активности одного или более биомаркеров в указанном образце и сравнение результата с наличием, уровнем активности маркера(ов) в образце, полученном от контрольного или здорового субъекта, или с эталонным диапазоном или значением. В настоящей заявке термин «биологический образец» включает образец любой жидкой среды или ткани организма (например, слизи, цельной крови, периферических мононуклеарных клеток крови (РВМС), сыворотки, плазмы, крови, спинномозговой жидкости, мочи, слюны, такни легких).
[0212] Специалист в данной области техники должен понимать, что проба крови или материал буккального мазка предположительно содержит ту же информацию о генетических последовательностях, что и клетка легких. Для определения заданного уровня экспрессии обычно применяют образцы ткани легких и другие биологические жидкие среды. Биологические образцы могут включать образец слизистой оболочки легких или биологическую жидкую среду, такую как кровь или компоненты крови (плазма, сыворотка), мокрота, слизь, моча, слюна и др. Образец слизистой оболочки легких можно отобрать при помощи способов, известных в технике, например, биопсийная бронхиальная щеточка или конденсат выдыхаемого воздуха. Дополнительные способы включают биопсию бронхов, смывы из бронхов, бронхоальвеолярное орошение, полное орошение легких, трансэндоскопическую биопсию, трансэндоскопический катетер и транстрахеальную промывку. Обзор часто применяемых технологий, включая сравнение и вопросы безопасности, представлен у Busse et al. (2005) Am J Respir Crit Care Med 172: 807-816. Для способов орошения бронхоскоп можно вводить на желаемый уровень дыхательных путей. Выделяют небольшой объем стерильной, физиологически приемлемой жидкости (например, забуференного физиологического раствора) и сразу же отсасывают его. Материал смыва содержит клетки со слизистой оболочки и внешнего слоя эпителия (Riise et al. (1996) Eur Resp J9: 1665). Для применения биопсийной бронхиальной щеточки можно применять стерильную, нераздражающую (например, нейлоновую) цитологическую щеточку. Можно проводить многократные заборы щеточкой, чтобы гарантировать репрезентативный набор образцов. Затем щеточку взбалтывают в физиологически приемлемой жидкости, и клетки и обломки клеток разделяют при помощи стандартных способов (Riise et al. (1992) Eur Resp J 5:382). Клеточные компоненты можно выделить при помощи способов, известных в технике, например, центрифугирования. Аналогично, субклеточные компоненты (например, экзосомы или везикулы) можно выделить при помощи известных способов или коммерческих продуктов для разделения (доступны от компаний «BioCat», «System Bio», «Bioscientific, etc.»). Примеры способов описаны, например, у Thery et al. (2006) Current Prot. Cell Biol.
[0213] Как правило, стандартный уровень или диапазон эталонных значений для биомаркера получают путем измерения того же маркера в наборе нормальных контролей. Измерение стандартного уровня или диапазона эталонных значений не обязательно проводить одновременно; это может быть историческое измерение. Предпочтительно, нормальный контроль соответствует индивидууму по некоторым показателям (например, возраст). В зависимости от различий между измеренным и стандартным уровнем или диапазоном эталонных значений индивидууму может быть поставлен интерстициального заболевания легких или отсутствие интерстициального заболевания легких. Согласно некоторым вариантам реализации интерстициальное заболевание легких диагностируется у индивидуума, если уровень экспрессии биомаркера или биомаркеров в образце, полученном от индивидуума, статически более близок к уровню экспрессии биомаркера или биомаркеров, который ассоциирован с интерстициальным заболеванием легких, чем к уровню экспрессии биомаркера или биомаркеров, который был ассоциирован с нормальным контролем.
[0214] В настоящей заявке понятие интерстициального заболевания легких включает целый ряд родственных, но различающихся патологических состояний. Можно провести классификацию, и указанные типы можно также подразделить на подтипы. Подразумевается, что любые и все различные формы интерстициального заболевания легких попадают в область настоящего изобретения. Действительно, поскольку согласно изобретению предложен способ выделения подгрупп индивидуумов на основании измерения уровня биомаркера, композиции и способы согласно настоящему изобретению можно применять для обнаружения и определения различных форм указанного заболевания.
[0215] Способы согласно настоящему изобретению можно применять для постановки диагноза интерстициальной пневмонии, независимо от другой информации, такой как симптомы индивидуума или результаты клинических или параклинических исследований. Однако способы согласно настоящему изобретению можно применять в сочетании с такими другими экспериментальными данными.
[0216] Поскольку диагностика редко основывается только на результатах одного исследования, указанный способ можно применять для определения того, что у определенного субъекта с большей вероятностью есть интерстициальное заболевание легких, чем нет, или с большей вероятностью есть интерстициальное заболевание легких, чем другое заболевание, на основании различий между измеренным и стандартным уровнем, или диапазоном эталонных значений указанного биомаркера. Так, например, у индивидуума с предполагаемым диагнозом интерстициального заболевания легких, может быть диагностирована «большая вероятность» или «меньшая вероятность» наличия интерстициального заболевания легких в свете информации, полученной посредством способа согласно настоящему изобретению. Если измеряется множество биомаркеров, по меньшей мере один и вплоть до всех измеряемых биомаркеров должны отличаться, в соответствующем направлении, для субъекта, у которого планируется поставить диагноз (или большая вероятность) наличия интерстициального заболевания легких. Согласно некоторым вариантам реализации такое различие является статистически значимым.
[0217] Биологический образец может быть из любой ткани или жидкой среды, включая сыворотку или образец ткани, но можно применять другие биологические жидкие среды или ткань. Возможные биологические жидкие среды включают без ограничений цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), плазму, мочу, слюну и ткань легких. Согласно некоторым вариантам реализации уровень маркера можно сравнивать с уровнем другого маркера или некоторого другого компонента в другой ткани, жидкой среде или биологическом «компартменте». Таким образом, можно проводить дифференциальное сравнение маркера в ткани и сыворотке. Также в область настоящего изобретения входит сравнение уровня маркера с уровнем другого маркера или определенного другого компонента в том же компартменте.
[0218] Как должно быть очевидно специалистам в данной области техники, приведенное выше описание не ограничивается постановкой начального диагноза интерстициального заболевания легких, но также применимо к подтверждению предварительного диагноза интерстициального заболевания легких или «исключения» такого диагноза. Кроме того, повышенный или пониженный уровень активности биомаркера(ов) в образце, полученной от субъекта с подозрением на интерстициальное заболевание легких или с риском развития интерстициального заболевания легких (например, с генетической предрасположенностью) указывает на то, что субъект страдает интерстициальным заболеванием легких или имеет риск его развития.
[0219] На основании указанного диагноза врач может далее определить курс лечения интерстициального заболевания легких. Варианты лечения ограничены, но они могут включать паллиативные меры, противозастойные средства, обезволивающие средства, иммуносупрессоры, пересадку легких. Кроме того, на основании настоящего изобретения лечение может включать направленную генную терапию или терапию антителами с целью снижения или коррекции экспрессии раскрываемых биомаркеров до более нормального уровня. Лечение можно корректировать со временем, в зависимости от непрерывного мониторинга состояния субъекта, например, измерения уровня экспрессии раскрываемых в настоящей заявке биомаркеров, или других показателей, таких как рентгенология, кислородная емкость, уровень комфорта и др.
[0220] Также согласно настоящему изобретению предложен способ определения риска развития интерстициального заболевания легких у субъекта, способ, включающий отбор биологического образца у субъекта, определение наличия, уровня или активности маркера в образце, и сравнение результата с наличием, уровнем или активностью указанного маркера в образце, полученном у субъекта без интерстициального заболевания легких, или с диапазоном эталонных значений или значением, причем наличие, увеличение или снижение уровня маркера коррелирует с риском развития интерстициального заболевания легких.
[0221] Также согласно настоящему изобретению предложены способы определения стадии и тяжести интерстициального заболевания легких, способ, включающий отбор биологического образца у субъекта, определение наличия, уровня или активности маркера в образце, и сравнение результата с наличием, уровнем или активностью указанного маркера в образце, полученном у контрольного или здорового субъекта, или с диапазоном эталонных значений или значением, причем наличие, увеличение или снижение уровня маркера коррелирует со стадией или тяжестью развития интерстициального заболевания легких.
[0222] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта, страдающего интерстициальным заболеванием легких, способ, включающий отбор биологического образца у субъекта, определение наличия, уровня или активности маркера в образце, и сравнение результата с наличием, уровнем или активностью указанного маркера во втором образце, полученном от того же субъекта в более поздний момент времени, или с диапазоном эталонных значений или значением, причем наличие, увеличение уровня маркера коррелирует с прогрессированием интерстициального заболевания легких.
[0223] Значимое различие при повышении измеряемого значения одного или более маркерных генов указывает на то, что у индивидуума есть (или более высокая вероятность наличия, или риск наличия, или риск развития, или повышенный риск прогрессирования) интерстициальное заболевание легких. Если измеряют только один биомаркер, то значение должно повышаться, чтобы указывать на интерстициальное заболевание легких. Если измеряют более одного биомаркера, то на диагноз интерстициальной пневмонии легких может указывать изменение только одного биомаркера, всех биомаркеров или любого числа между ними. Согласно некоторым вариантам реализации измеряют несколько маркеров, и на диагноз интерстициального заболевания легких указывает изменение нескольких маркеров. Например, панель маркеров может включать маркеры, уровень или активность которых увеличивается в образцах, полученных от субъекта с интерстициальным заболеванием легких, по сравнению с образцами, полученными от субъекта без интерстициального заболевания легких. Можно проводить измерения (i) биомаркера согласно настоящему изобретению, (ii) биомаркера согласно настоящему изобретению и другого фактора, о котором известно, что он ассоциирован с интерстициальным заболеванием легких (например, компьютерная томограмма); (iii) множества биомаркеров согласно настоящему изобретению, (iv) множества биомаркеров, включающего по меньшей мере один биомаркер согласно настоящему изобретению, и по меньшей мере один биомаркер, описанный в литературе; (v) биомаркера или множества биомаркеров согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одной клинической независимой переменной, которая может включать возраст индивидуума, результаты патологической оценки, и (vi) любого сочетания из вышеперечисленных пунктов. Кроме того, объем изменений уровня биомаркеров может указывать на относительную вероятность прогрессирования заболевания.
[0224] Указанный маркер(ы) можно определять в любом биологическом образце, полученном от субъекта, любым подходящим способом, известным в технике (например, иммунологический анализ, анализ на основе гибридизации). Предпочтительно, указанный маркер(ы) определяют в образце цельной крови, полученной от индивидуума.
1
0
1
0
2
n
[0225] Согласно альтернативному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ мониторинга интерстициального заболевания легких у пациента в течение определенного времени с целью определения того, прогрессирует ли заболевание. Специфические технологии, применяемые при осуществлении данного варианта реализации, сходны с технологиями, применяемыми для вариантов реализации, описанных выше. Данный способ реализуют путем отбора биологического образца, такого как сыворотка или ткань легких, у субъекта в определенный момент времени (t); измерения уровня по меньшей мере одного из биомаркеров в указанном биологическом образце; и сравнения измеренного уровня с уровнем, измеренным для биологического образца, полученного от того же субъекта в более ранний момент времени (t). В зависимости от различий между измеренными уровнями, видно, повышен, понижен или остается неизменным уровень маркера в промежутке времени (t-t). Дополнительное отклонение маркера в направлении, указывающем на интерстициальную пневмонию, или измерение дополнительных маркеров интерстициального заболевания легких, уровень которых повышен, может указывать на прогрессирование заболевания в течение данного интервала. Последующий забор образцов и измерение можно проводить столько раз, сколько требуется в диапазоне времен от t до t.
[0226] Возможность отслеживания состояния индивидуума путем последовательного определения уровня маркера может представлять собой ценный клинический подход. Взамен ограниченного «моментального снимка», предоставляемого однократным исследованием, такой мониторинг может выявить тенденцию в уровне маркера во времени. Помимо выявления прогрессирования заболевания, отслеживание уровня маркера у индивидуума можно применять для прогнозирования обострений или для определения клинического течения заболевания. Например, как должно быть очевидно специалистам в данной области техники, биомаркеры согласно настоящему изобретению можно дополнительно исследовать для различения любой из всех известных форм интерстициального заболевания легких или любого из позднее описанных типов или подтипов данного заболевания. Кроме того, чувствительность и специфичность любого способа согласно настоящему изобретению можно исследовать дополнительно в том, что касается различения интерстициального заболевания легких и других заболеваний, или прогнозирования рецидива или ремиссии.
[0227] Аналогично, введение лекарственного препарата или сочетания лекарственных препаратов можно оценивать или повторно оценивать в свете результатов анализа согласно настоящему изобретению. Например, лекарственный препарат(ы) можно вводить по-разному в разных популяциях субъектов, и измерения, соответствующие введению, анализируют, определяя, являются значимыми различия в профиле биомаркера согласно настоящему изобретению до и после введения препарата. Также можно напрямую сравнивать друг с другом результаты разных режимов лечения. В качестве альтернативы результаты анализа могут указывать на предпочтительность одного режима лекарственной терапии по сравнению с другим, или указывать на то, что следует или не следует применять особый режим лекарственной терапии у индивидуума с интерстициальной пневмонией. Согласно одному варианту реализации выявление повышенного уровня маркерных генов согласно настоящему изобретению у индивидуума с интерстициальным заболеванием легких указывает на плохой прогноз. Согласно другому варианту реализации отсутствие повышенного уровня маркерных генов согласно настоящему изобретению у индивидуума с интерстициальным заболеванием легких указывает на хороший прогноз.
[0228] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены способы скрининга соединений-кандидатов для применения в качестве терапевтических соединений при лечении интерстициального заболевания легких. Согласно одному варианту реализации указанный способ включает скрининг соединений-кандидатов с целью выявления соединений, которые демонстрируют клинический прогресс после введения пациенту с интерстициальным заболеванием легких, у которого в образце ткани легких был показан повышенный уровень маркеров согласно настоящему изобретению.
0
1
[0229] Аналогично, маркеры согласно настоящему изобретению можно применять для оценки эффективности лечебного воздействия на субъекта. Такой же подход, как описан выше, можно применять, с той разницей, что будет начато подходящее лечение, или продолжающееся лечение будет изменено, перед вторым измерением (т.е., после t и перед t). Указанным лечением может быть любое лечебное воздействие, такое как введение лекарственного препарата, ограничение диеты или операция, и его можно проводить по любому подходящему графику в течение любого периода времени, которые подходят для данного воздействия. Затем можно сравнить измерения до и после и определить, оказало ли лечение действие. Как должны понимать специалисты в данной области техники, определение может быть затруднено из-за других накладывающихся процессов (например, обострение заболевания в тот же период времени).
0
1
2
n
[0230] Согласно дополнительному варианту реализации указанные маркеры можно применять для скрининга лекарственных препаратов-кандидатов, например, в клиническом исследовании, чтобы определить, эффективен ли лекарственный препарат-кандидат при лечении интерстициального заболевания легких. В момент времени t у каждого субъекта из популяции субъектов с диагнозом интерстициальной пневмонии отбирают биологический образец. Затем, проводят анализ образца каждого субъекта с целью измерения уровня биологического маркера. Согласно некоторым вариантам реализации отслеживают только один маркер, а согласно другим вариантам реализации отслеживают сочетание маркеров, вплоть до полного набора маркеров, предложенных в настоящей заявке. Затем части субпопуляции из той же популяции субъектов вводят заданную дозу лекарственного препарата-кандидата. Введение лекарственного препарата можно выполнять по определенному подходящему графику в течение любого периода времени. В некоторых случаях разным субъектам в указанной субпопуляции вводят разные дозы, или препарат вводят разными путями. В момент времени t, после введения препарата у указанной субпопуляции отбирают биологический образец, и для полученных биологических образцов проводят тот же анализ, который ранее проводили для получения измеренных значений. Как и раньше, последующий отбор образцов и измерения можно проводить столько раз, сколько требуется в диапазоне моментов времени t-t. При таком исследовании в роли контрольной группы выступает другая субпопуляция субъектов, которой вводят плацебо. В отношении контрольной группы повторяют ту же процедуру: получение биологического образца, обработка образца и измерение уровня биологических маркеров с получением карты измерений.
[0231] Также можно оценивать специфические дозы и пути введения. Способ реализуют путем введения лекарственного препарата-кандидата в заданной дозе или заданным путем субъектам с интерстициальным заболеванием легких; отбора биологических образцов, таких как сыворотка или ткань, у субъекта; измерения уровня по меньшей мере одного из биомаркеров в каждом из биологических образцов; и сравнение измеренного уровня для каждого образца с другими пробами и/или стандартным уровнем. Как правило, стандартный уровень получают путем измерения уровня того же маркера или маркеров у субъекта до введения лекарственного препарата. В зависимости от различия между измеренными и стандартными уровнями препарат можно рассматривать как оказывающий действие на интерстициальное заболевание легких. Если измеряют несколько биомаркеров, по меньшей мере один и вплоть до всех биомаркеров должны меняться, в ожидаемом направлении, чтобы препарат можно было считать эффективным. Предпочтительно, чтобы препарат можно было считать эффективным, должно меняться несколько маркеров, и предпочтительно такое изменение должно быть статистически значимым.
[0232] Как должно быть очевидно специалистам в данной области техники, приведенное выше описание не ограничивается лекарственным препаратом-кандидатом, но применимо и к определению того, является ли определенное лечебное воздействие эффективным при лечении интерстициального заболевания легких.
[0233] Согласно типичному варианту реализации для исследования выбирают популяцию субъектов, страдающих интерстициальным заболеванием легких. Указанную популяцию как правило выбирают на основании стандартных протоколов отбора субъектов для клинического исследования. Например, такие субъекты в целом здоровы, не принимают других лекарственных препаратов и демонстрируют равномерное распределение по возрасту и полу. Указанную популяция субъектов можно также разделить на несколько групп; например, разные субпопуляции могут страдать разными типами расстройства, на которое направлен лекарственный препарат-кандидат, или страдать им в разной степени. Стратификацию популяции индивидуумов можно проводить на основании уровней биомаркеров согласно настоящему изобретению.
[0234] Как правило, при разработке исследования требуется учесть целый ряд статистических соображений, чтобы гарантировать, что после введения лекарственного препарата можно будет выявить статистически значимые различия. Объем изменений уровня биомаркера зависит от целого ряда факторов, включая концентрацию препарата, дозу препарата и режим введения препарата. Специалистам в области статистики должно быть понятно, как определять соответствующий объем популяции субъектов. Предпочтительно, исследование разрабатывают так, чтобы определять относительно малую величину эффекта.
0
[0235] Необязательно субъекты могут проходить период «отмывки» от предыдущего применения любых других лекарственных препаратов в течение соответствующего периода времени. Период отмывки позволяет устранить действие предшествующих лекарственных препаратов так, чтобы можно было сделать точные измерения в исходном состоянии. В момент времени t у каждого субъекта в популяции отбирают биологический образец. Затем проводят анализ или разные типы анализа для образца от каждого субъекта, чтобы измерить уровень конкретных биомаркеров согласно настоящему изобретению. При анализе можно применять традиционные способы и реагенты, как описано выше. Если указанным образцом является кровь, указанный анализ как правило проводят с применением сыворотки или плазмы. Для других жидких сред или тканей по мере необходимости включают дополнительные этапы подготовки образца, до проведения такого анализа. При анализе измеряют по меньшей мере один из биологических маркеров, описываемых в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации, отслеживают только один маркер, а согласно другим вариантам реализации отслеживают сочетание факторов, вплоть до полного числа маркеров. Также маркеры можно отслеживать в сочетании с другими измерениями и факторами, ассоциированными с интерстициальным заболеванием легких (например, МРТ-визуализация). Количество биологических маркеров, значения которых измеряют, зависит, например, от доступности реактивов для анализа, биологической жидкой среды и других ресурсов.
1
1
0
1
0
2
n
[0236] Затем, заданную дозу лекарственного препарата-кандидата вводят части или субпопуляции из той же популяции субъектов. Введение лекарственного препарата можно проводить по любому подходящему графику в течение любого периода времени, а указанная субпопуляция может включать некоторых или всех субъектов в популяции. В некоторых случаях разным субъектам вводят разные дозы в пределах одной субпопуляции, или лекарственный препарат вводят разными путями. Подходящие дозы и пути введения зависят от специфических свойств лекарственного препарата. В момент времени t, после введения препарата у субпопуляции отбирают другой биологический образец («образец t»). Как правило, указанный образец должен быть того же типа и должен также обрабатываться, как образец, полученный от популяции субъектов перед введением препарата («образец t»). Для измерения значений в отношении образца t проводят тот же анализ, что и в отношении образца t. Последующий отбор образцов и измерение можно проводить столько раз, сколько потребуется, в диапазоне моментов времени t-t.
[0237] Как правило, в качестве контрольной группы применяют другую субпопуляцию субъектов, которой вводят плацебо. Затем для контрольной группы выполняют ту же процедуру: получение биологического образца, обработка образца и измерение биологических маркеров для получения результатов измерений. Кроме того, разные лекарственные препараты можно вводить любому числу разных субпопуляций для сравнения эффектов нескольких препаратов. Как должно быть очевидно специалистам в данной области техники, приведенное выше описание является весьма упрощенным описанием способа проведения клинического исследования. Клинические исследования имеют гораздо больше требований к процедуре, и следует понимать, что способ, применяемый обычно, отвечает всем таким требованиям.
1
0
[0238] Парные измерения разных биомаркеров сейчас доступны для каждого субъекта. Результаты разных измерений сравнивают и анализируют, определяя, изменился ли уровень биологических маркеров в ожидаемом направлении для группы конкретного лекарственного препарата, но не для группы плацебо, указывая на то, что лекарственный препарат-кандидат эффективен при лечении данного заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации каждое такое изменение является статистически значимым. Результаты измерений в момент времени t для группы, получавшей лекарственный препарат-кандидат сравнивают со стандартными значениями, предпочтительно с результатами измерений, полученными до введения лекарственного препарата данной группе, т.е. в момент времени t. Как правило, такое сравнение принимает вид статистического анализа результатов измерений для всей популяции до введения и после введения лекарственного препарата или плацебо. Для определения того, являются ли изменения уровня биологического маркера статистически значимыми можно применять любой традиционный статистический способ. Например, можно проводить парное сравнение для каждого биомаркера с применением параметрического парного t-критерия или непараметрического знакового критерия или рангового критерия, в зависимости от распределения данных.
[0239] Кроме того, применять можно критерии, чтобы продемонстрировать, что статистически значимые изменения, обнаруженные в группе лекарственного препарата, не обнаруживаются в группе плацебо. Без таких критериев нельзя определить, возникают ли наблюдаемые изменения у всех индивидуумов, и, следовательно, не являются результатом введения лекарственного препарата-кандидата.
[0240] Показатели экспрессии маркерных генов выше в образцах, полученных от индивидуумов с интерстициальным заболеванием легких. Значимое снижение результатов измерения для экспрессии одного или маркеров более маркеров указывает на то, что лекарственный препарат эффективен. Если измеряют только один биомаркер, то значение должно уменьшаться, чтобы указывать на эффективность. Если измеряют более одного биомаркера, то на эффективность лекарственного препарата может указывать изменение уровня только одного биомаркера, всех биомаркеров или любого числа между ними. Согласно некоторым вариантам реализации измеряют несколько биомаркеров, и на эффективность лекарственного препарата указывают изменения в уровне нескольких маркеров. Можно проводить измерения как биомаркеров согласно настоящему изобретению, так и других измеряемых факторов, ассоциированных с интерстициальным заболеванием легких. Кроме того, объем уменьшения уровня гена-биомаркера может быть относительной эффективности лекарственного препарата.
[0241] Помимо определения того, является ли конкретный лекарственный препарат эффективным при лечении интерстициального заболевания легких, биомаркеры согласно настоящему изобретению можно применять также для изучения эффектов дозы лекарственного препарата-кандидата. Существует множество различных способов для оценки разных доз. Например, разные дозы препарата можно вводить в разных популяциях субъектов, и анализировать измерения, соответствующие каждой дозе, чтобы определить, являются ли различия уровня описанных в настоящей заявке биомаркеров до и после введения препарата значимыми. Таким образом, требуется минимальная доза, при которой можно оценить изменение. Кроме того, результаты для разных доз можно сравнивать друг с другом, чтобы оценить, как уровень каждого биомаркера ведет себя в зависимости от дозы. На основании результатов скрининга лекарственных препаратов маркеры согласно настоящем изобретению можно применять в качестве терагностиков; то есть, их можно применять для разработки индивидуальных режимов медикаментозного лечения.
Наборы
[0242] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен набор для определения маркерных полинуклеотидов или полипептидов согласно настоящему изобретению. Указанные наборы можно получать в виде тест-системы, включающей любой из реагентов для анализа, контроль для анализа, протоколы, примерные результаты анализа или сочетание указанных компонентов, разработанных, чтобы обеспечить пользователя средствами для оценки уровня экспрессии маркера(ов) согласно настоящему изобретению.
[0243] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен набор для диагностики интерстициального заболевания легких у индивидуума, включающий реагенты для определения по меньшей мере одного маркерного полипептида или полинуклеотида в биологическим образце, полученном от субъекта.
[0244] Наборы согласно настоящему изобретению могут включать один или более из следующих компонентов: антитело, причем указанное антитело специфически связывается с маркерным полипептидом, меченный партнер антитела по связыванию, твердая фаза, на которой закрепляют указанное антитело или его партнер по связыванию, полинуклеотидный зонд, который может гибридизоваться с маркерным полинуклеотидом, пары праймеров, которые при соответствующих условиях реагирования могут инициировать амплификацию по меньшей мере части маркерного полинуклеотида или полинуклеотида, кодирующего маркерный полипептид (например. Посредством ПЦР), инструкции по тому, как применять указанный набор, и этикетка или листок-вкладыш, где указано одобрение надзорных органов для диагностического или терапевтического применения.
[0245] Также настоящее изобретение включает микроматрицы из полинуклеотидов или полипептидов, содержащие полипептиды согласно настоящему изобретению, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению или молекулы, такие как антитела, которые специфически связываются с полипептидами и полинуклеотидами согласно настоящему изобретению. Согласно данному аспекту настоящего изобретения для оценки экспрессии бимаркеров-полипептидов и/или идентификации биологических компонентов, которые связываются с такими полипептидами, применяют стандартные технологии. Технология белковых микроматриц хорошо известна специалистам в данной области техники и основана без ограничений на получении матрицы из заданных пептидов или белков на фиксированном субстрате, связывании молекул-мишеней или биологических компонентов с указанными пептидами, и оценке такого связывания. Матрицы из полинуклеотидов, особенно матрицы, которые связываются с полипептидами согласно настоящему изобретению, также можно применять для диагностических приложений, таких как идентификация субъектов, страдающих заболеванием, которое характеризуется экспрессией полипептидов-биомаркеров, например, интерстициальным заболеванием легких.
[0246] Тест-системы согласно настоящему изобретению могут включать средства определения уровня амплификации маркерного гена(ов) и/или уровня полисомии маркерного гена(ов) в образце клеток легких. Предпочтительно, тест-система также включает один или более контролей. Указанный контроль может включать: (i) контрольный образец для определения интерстициального заболевания легких у индивидуума; (ii) контрольный образец для определения отсутствия интерстициального заболевания легких; и (iii) информацию, содержащую предварительно определенный контрольный уровень маркерных генов, которые требуется измерять для диагностики или оценки прогрессирования интерстициального заболевания легких.
[0247] Согласно другому варианту реализации средства определения уровня экспрессии маркера(ов) согласно настоящему изобретению могут представлять собой реагенты любого типа, которые включают без ограничений антитела и их антиген-связывающие фрагменты, пептиды, партнеры по связыванию, аптамеры, ферменты и малые молекулы. Также могут быть включены дополнительные реагенты, применимые для проведения анализа с применением таких средств определения, такие как реагенты для проведения иммуногистохимического анализа или другого анализа связывания.
3
125
35
14
32
[0248] Средства определения в составе тест-системы согласно настоящему изобретению можно сочетать с определяемыми маркерными группами или определяемыми метками. Такой маркерной группой может быть любая подходящая маркерная группа, которая позволяет проводить обнаружение реагентов, применяемых при определении рассматриваемого гена или белка, и включает без ограничений любую композицию или метку, определяемую спектроскопическими, фотохимическими, электрическими, оптическими или химическими способами. Применимые метки согласно настоящему изобретению включают: биотин для окрашивания меченным конъюгатом стрептавидина, магнитные гранулы (например, Dynabeads™), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок и подобные), радиоактивные метки (например, Н, I, S, С или Р), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, часто применяемые при ELISA) и колориметрические метки, такие как гранулы из коллоидного золота или цветного стекла или пластика (например, полистирол, полипропилен, латекс и др.).
[0249] Кроме того, средства определения в составе тест-системы согласно настоящему изобретению можно закрепить на субстрате. Такой субстрат может включать любой подходящий субстрат для прикрепления реагента для определения, так чтобы его можно было применять при реализации ранее описанных способов определения. Если кратко, субстрат, подходящий для прикрепления средств определения, включает любую твердую подложку, такую как твердая органическая, биополимерная или неорганическая подложка, которая может образовывать связи со средствами определения, не оказывая значительного влияния на активность и/или способность средств определения к обнаружению желаемой молекулы. Примеры твердых органических подложек включают полимеры, такие как полистирол, нейлон, фенолформальдегидные смолы и акриловые сополимеры (например, полиакриламидный гель). Также указанный набор может включать подходящие реагенты для определения реагентов и/или для мечения положительного или отрицательного контроля, растворы для отмывки, буферы для разведения и подобное. Также указанная тест-система может включать набор письменных инструкций по применению указанной системы и интерпретации результатов.
[0250] Также указанная тест-система может включать средства определения контрольного маркера, который характерен для того типа клеток, который отбирают, которые могут быть реагентом любого типа, который можно применять при реализации способов определения наличия известного маркера (на уровне нуклеиновой кислоты или белка) в образце, как например, при реализации способа определения наличия биомаркера согласно настоящему изобретению. В частности, указанные средства отличаются тем, что они позволяют идентифицировать специфический маркер того типа клеток, который анализируют, и который положительно идентифицирует данный тип клеток. Например, при анализе на наличие интерстициального заболевания легких желательно проводить скрининг клеток легких по уровню экспрессии и/или биологической активности биомаркера. Следовательно, средства определения контрольного маркера позволяют идентифицировать маркер, который характерен для клеток легких, так что клетка отличима от клеток других типов. Такие средства увеличивают точность и специфичность анализа согласно настоящему изобретению. Такие средства определения контрольного маркера включают без ограничений: зонд, который гибридизуется при строгих условиях гибридизации с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей маркерный белок; праймеры ПЦР, которые амплифицируют такую молекулу нуклеиновой кислоты; аптамер, который специфически связывается с отличным по конформации сайтом на молекуле-мишени; и/или антитело, его антиген-связывающий сайт или антиген-связывающий пептид, который селективно связывается с контрольным маркером в указанном образце. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности для маркеров многих клеток известны в технике, и их можно применять для получения таких реагентов для определения.
[0251] Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает (или по существу состоит из перечисленным компонентов) праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению генетического варианта, например, описанного выше, в зависимости от избранного метода определения. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению генетического варианта в области, выбираемой из группы, состоящей из 5р15, 6р24, 7q22, 11р15, 15q14-15, 17q21, 19р13 и 8р23. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 6р24 (например, rs2076295 или rs3778337). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 7q22 (например, rs4727443). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 11р15 (например, rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs2334659, rs7122936). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 5р15 (например, rs2736100). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 15q14-15 (например, rs2034650, rs1992272). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 17q21 (например, rs1981997, rs17563986, rs8070723). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 9р13 (например, rs12610495, rs2109069). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или по меньшей мере один зонд, способные к определению по меньшей мере одного генетического варианта в 8р23 (например, rs1379326). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры или зонды, способные к определению более чем одного (например, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20 или более) генетических вариантов в 5р15, 6р24, 7q22, 11р15, 15q14-15, 17q21, 19р13 и 8р23 в любом сочетании.
[0252] Согласно некоторым вариантам реализации указанные праймеры и/или зонды содержат метку, например, флуоресцентную метку или метку FRET. Согласно некоторым вариантам реализации указанные праймеры и/или зонды не содержат метки. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает праймеры и/или зонды, которые позволяют определять последовательность аллеля варианта и последовательность доминантного аллеля в избранном сайте генетической вариации, например, при помощи разных меток, или разработанные для генерирования амплификации, или продукты достройки праймера с разными массами.
[0253] Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор дополнительно включает по меньшей мере один контрольный образец, например, образец(ы) с доминантным аллелем в избранном сайте(ах) генетической вариации, или образец(ы) с вариантом аллеля в избранном сайте(ах) генетической вариации.
Комплексы in vitro
[0254] В настоящей заявке предложены комплексы нуклеиновых кислот, например, образующихся в ходе анализа in vitro, указывающие на наличие последовательности генетического варианта. Специалисты в данной области техники должны понимать, что комплекс нуклеиновых кислот может быть образован также и для определения наличия последовательности доминантного аллеля, в зависимости от дизайна зонда или праймера, например, при анализе с целью различения гомозиготных и гетерозиготных субъектов.
[0255] Согласно некоторым вариантам реализации указанный комплекс содержит первую нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой генетического варианта, причем нуклеиновая кислота указанного генетического варианта является генетическим вариантом в области, выбираемой из 5р15, 6р24, 7q22, 11p15, 15q14-15, 17q21, 19p13 и 8p23, или в гене, выбираемом из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, MUC5B, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF и WNT3. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновая кислота указанного генетического варианта является продуктом амплификации. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновая кислота указанного генетического варианта является геномной ДНК, например, полученной от субъекта, у которого есть или подозревается интерстициальное заболевание легких. Согласно некоторым вариантам реализации указанная первая нуклеиновая кислота является продуктом амплификации или продуктом достройки праймера. Согласно некоторым вариантам реализации указанная первая нуклеиновая кислота содержит метку. Согласно некоторым вариантам реализации указанный комплекс нуклеиновых кислот содержит вторую нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой генетического варианта. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вторая нуклеиновая кислота содержит метку, например, с FRET или другой флуоресцентной меткой. Согласно некоторым вариантам реализации указанные первая и вторая нуклеиновые кислоты образуют пару FRET, когда гибридизуется с последовательностью генетического варианта.
[0256] Согласно некоторым вариантам реализации комплекс нуклеиновых кислот дополнительно содержит фермент, такой как ДНК-полимераза (например, стандартная ДНК-полимераза или термостабильная полимераза, такая Taq) или лигаза.
[0257] Настоящее изобретение включает без ограничений следующие варианты реализации:
[0258] 1. Способ определения, прогнозируется ли у индивидуума развитие и/или быстрое прогрессирование интерстициальной пневмонии, включающий: определение в биологическом образце, полученном от индивидуума, по меньшей мере одного из:
a) наличие маркерного полиморфизма, выбираемого из группы, состоящей из: rs2736100, rs2076295, rs3778337, rs4727443, rs868903, rs7934606, rs6421972, rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2034650, rs1992272, rs1981997, rs17563986, rs8070723, rs12610495, rs2109069, rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430; и,
b) уровень экспрессии маркерного гена или множества маркерных генов, выбранных из группы, состоящей из: маркерного гена, обладающего по меньшей мере 95% идентичностью по меньшей мере с последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из: MUC5B, TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, ATP11A, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
c) полипептиды, кодируемые маркерными генами в соответствии с b);
d) фрагменты полипептидов в соответствии с с); и
e) полинуклеотид, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с b);
причем наличие указанного множества маркеров указывает на то, разовьется ли у индивидуума интерстициальная пневмония или разовьется ли прогрессирующая ИИП.
[0259] 2. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что определяемые гены обладают 100% идентичностью с соответствующим маркерным геном согласно п. b).
[0260] 3. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что наличие или уровень по меньшей мере одного из множества маркеров определяют и сравнивают со стандартным уровнем или эталонным набором.
[0261] 4. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что стандартный уровень или эталонный набор определяют в соответствии со статистической процедурой для прогнозирования риска.
[0262] 5. Способ согласно варианту реализации 4, отличающийся тем, что указанная статистическая процедура для прогнозирования риска включает применение суммы экспрессии гена маркера или маркеров или наличия или отсутствия набора маркеров, взвешенные по коэффициенту пропорциональных рисков.
[0263] 6. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что наличие по меньшей мере одного маркера определяют путем обнаружения наличия или отсутствия, или уровня экспрессии полипептида.
[0264] 7. Способ согласно варианту реализации 6, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает определение наличия полипептида с применением реагента, который специфически связывается с указанным полипептидом или его фрагментом.
[0265] 8. Способ согласно варианту реализации 7, отличающийся тем, что указанный реагент выбирают из группы, состоящей из антитела, производного антитела и фрагмента антитела.
[0266] 9. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что наличие маркера определяют путем получения последовательности геномной ДНК в локусе полиморфизма.
[0267] 10. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что наличие маркера определяют путем получения РНК из биологического образца; генерирования кДНК из указанной РНК; амплификации указанной кДНК при помощи зондов или праймеров для маркерных генов; получения на основании амплифицированной кДНК уровня экспрессии указанных генов или продуктов экспрессии генов в образце.
[0268] 11. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что указанным индивидуумом является человек.
[0269] 12. Способ согласно варианту реализации 1, дополнительно включающий:
a) сравнение уровня экспрессии маркерного гена или множества маркерных генов в биологическом образце с контрольным уровнем маркерного гена(ов), выбранных из группы, состоящей из:
контрольного уровня маркерного гена, для которого была показана корреляция с интерстициальным заболеванием легких, риском развития ИИП, или наличием или прогрессированием интерстициальной пневмонии; и
контрольного уровня маркерного гена, для которого была показана корреляция с медленным прогрессированием или отсутствием прогрессирования интерстициального заболевания легких или интерстициальной пневмонии, или низким риском развития ИИП; и
b) выбор индивидуума, у которого прогнозируется быстрое прогрессирование развития интерстициальной пневмонии, если уровень экспрессии маркерного гена в биологическом образце индивидуума статистически близок или выше, чем контрольный уровень экспрессии маркерного гена, для которого была показана корреляция с интерстициальным заболеванием легких или быстрым прогрессированием интерстициальной пневмонии, или
с) выбор индивидуума, у которого не прогнозируется развитие интерстициальной пневмонии, или прогнозируется медленное ее прогрессирование, если уровень экспрессии маркерного гена в биологическом образце индивидуума статистически ниже, чем контрольный уровень экспрессии маркерного гена, для которого была показана корреляция с интерстициальным заболеванием легких или быстрым прогрессированием интерстициальной пневмонии.
[0270] 13. Способ согласно варианту реализации 1, дополнительно включающий:
сравнение наличия полиморфизма, в биологическом образце с набором генетических вариантов или полиморфных маркеров для индивидуума или контрольной группы, у которых развилась интерстициальная пневмония, и,
выбор индивидуума, у которого прогнозируется развитие или прогрессирование интерстициальной пневмонии, если полиморфные маркеры, присутствующие в биологическом образце, идентичны или статистически близки набору полиморфных маркеров у указанного индивидуума или контрольной группы, или,
выбор индивидуума, у которого прогнозируется развитие или быстрое прогрессирование интерстициальной пневмонии, если полиморфные маркеры, присутствующие в биологическом образце, не идентичны или статистически не близки набору генетических вариантов или полиморфных маркеров у указанного индивидуума или контрольной группы.
[0271] 14. Способ мониторинга прогрессирования интерстициального заболевания легких или интерстициальной пневмонии у субъекта, включающий:
i) измерение уровня экспрессии множества маркерных генов в первом биологическом образце, полученном от субъекта, отличающееся тем, что указанное множество маркеров включает множество маркеров, выбранных из группы, состоящей из: маркерного гена, обладающего по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из MUC5B, TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, ATP11A, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
b) полипептидов, кодируемых маркерными генами в соответствии с а);
с) фрагментов полипептидов в соответствии с b); и
е) полинуклеотида, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с b);
ii) измерение уровня экспрессии множества маркерных генов во втором биологическом образце, полученном от субъекта; и
iii) сравнение уровня экспрессии маркера, измеренного в первом образце, с уровнем маркера, измеренным во втором образце.
[0272] 15. Способ согласно варианту реализации 14, отличающийся тем, что определяемые маркерные гены на 100% идентичны по последовательности соответствующему маркерному гену в пункте а).
[0273] 16. Способ согласно варианту реализации 14, дополнительно включающий проведение этапа наблюдения, выбираемого из компьютерной томографии грудной клетки и патологического исследования тканей легких, полученных от субъекта.
0
1
[0274] 17. Способ согласно варианту реализации 14, отличающийся тем, что указанный первый биологический образец отбирают у субъекта в момент времени t, а второй биологический образец отбирают у субъекта в момент времени t.
[0275] 18. Способ согласно варианту реализации 14, отличающийся тем, что указанный первый биологический образец и указанный второй биологический образец отбирают у субъекта более одного раза в течение некоторого временного диапазона.
[0276] 19. Способ оценки эффективности лечения интерстициального заболевания легких или интерстициальной пневмонии у субъекта, способ, включающий сравнение:
0
i) уровня экспрессии маркера, измеренного в первой пробе, полученной от субъекта в момент времени t, отличающийся тем, что указанный маркер выбирают из группы, состоящей из
а) маркерного гена, обладающего по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, АТР11А, TVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
b) полипептидов, кодируемых маркерными генами в соответствии с а)
c) фрагментов полипептидов в соответствии b); и
d) полинуклеотида, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с а);
1
ii) уровня маркера во втором биологическом образце, полученном от субъекта в момент времени t; и,
iii) проведение этапа наблюдения, выбираемого из компьютерной томографии грудной клетки и патологического исследования тканей легких, полученных от субъекта;
отличающийся тем, что уменьшение уровня экспрессии во втором образце по сравнению с первым образцом указывает на то, что средство эффективно при лечении интерстициальной пневмонии у субъекта.
[0277] 20. Способ согласно варианту реализации 19, отличающийся тем, что указанные гены на 100% идентичны по последовательности соответствующему маркерному гену в пункте а).
0
1
[0278] 21. Способ согласно варианту реализации 19, отличающийся тем, что момент времени t является моментом до проведения лечения субъекта, а момент времени t является моментом после проведения лечения субъекта.
[0279] 22. Способ согласно варианту реализации 19, отличающийся тем, что сравнение повторяют в определенном временном диапазоне.
[0280] 23. Тест-система для прогнозирования результата терапии у индивидуума при интерстициальной пневмонии, включающая средства определения по меньшей мере одного из перечисленных:
а) наличие маркерного полиморфизма, выбираемого из группы, состоящей из: rs2736100, rs2076295, rs3778337, rs4727443, rs868903, rs7934606, rs6421972, 25 rs7480563, rs7942850, rs4077759, rs2334659, rs7122936, rs2034650, rs1992272, rs1981997, rs17563986, rs8070723, rs12610495, rs2109069, rs1379326, rs1881984, rs10936599, rs1997392, rs6793295, rs2609255, rs2853676, rs10484326, rs10748858, rs2067832, rs11191865, rs2301160, rs3829223, rs2857476, rs1278769, rs1007177, rs10518693, rs393152, rs12373139, rs17690703, rs2532274, rs2532269, rs2668692, rs169201, rs199533 и rs415430; и,
b) уровень экспрессии маркерного гена или множества маркерных генов, выбранных из группы, состоящей из: маркерного гена, обладающего по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из TERT, DSP, MUC2, DISP2, МАРТ, DPP9, CSMD1, MYNN, LRRC34, FAM13A, OBFC1, TOLLIP, АТР11А, IVD, CRHR1, IMP5, LOC100128977, KIAA1267, NSF, WNT3, C17orf69, или их гомологов или вариантов;
c) полипептиды, кодируемые маркерными генами в соответствии с b)
d) фрагменты полипептидов в соответствии с); и
e) полинуклеотид, который полностью комплементарен по меньшей мере части маркерного гена в соответствии с b);
[0281] 24. Тест-система согласно варианту реализации 23, отличающаяся тем, что средства определения включают зонды для нуклеиновых кислот, содержащие по меньшей мере от 10 до 50 идущих подряд нуклеотидов указанных маркерных полиморфизмов или гена(ов), или комплементарные их нуклеотидным последовательностям.
[0282] 25. Тест-система согласно варианту реализации 23, отличающаяся тем, что средства определения включают связывающие лиганды, которые специфически распознают полипептиды, кодируемые указанными маркерными генами.
[0283] 26. Тест-система согласно варианту реализации 23, отличающаяся тем, что определяемые гены на 100% идентичны по последовательности соответствующему маркерному гену в пункте b).
[0284] 27. Тест-система согласно варианту реализации 23, отличающаяся тем, что средства определения включают по меньшей мере один зонд для нуклеиновой кислоты и связывающие лиганды, размещенные на поверхности для анализа.
[0285] 28. Тест-система согласно варианту реализации 27, отличающаяся тем, что указанная поверхность для анализа включает чип, матрицу или жидкостную карту.
[0286] 29. Тест-система согласно варианту реализации 28, отличающаяся тем, что указанные зонды содержат нуклеиновые кислоты, которые комплементарны последовательностям по меньшей мере из 10-50 нуклеотидов указанных маркерных генов.
[0287] 30. Тест-система согласно варианту реализации 28, отличающаяся тем, что указанные связывающие агенты включают антитела или их связывающие фрагменты.
[0288] 31. Тест-система согласно варианту реализации 23, дополнительно включающая: контроль, выбираемый из информации, содержащей предварительно определенный контрольный уровень, или набор генетических вариантов или полиморфных маркеров, для которых была показана корреляция с диагнозом, развитием, прогрессированием или продолжительностью жизни у пациентов с интерстициальным заболеванием легких или ИИП.
[0289] 32. Способ определения уровня экспрессии одного или более маркерных генов у человека с интерстициальной пневмонией, включающий:
отбор биологического образца у индивидуума с интерстициальной пневмонией;
определение уровня экспрессии гена, выбираемого из TERT, MUC2, TOLLIP, MUC5B, DPP9, DSP, их гомологов или вариантов, в одной или более клетках указанного биологического образца, полученного от индивидуума.
[0290] 33. Способ согласно варианту реализации 32, дополнительно включающий определение уровня экспрессии гена выбираемого из TERT, MUC2, TOLLIP, MUC5B, DPP9, DSP, их гомологов или вариантов, в одной или более клетках указанного биологического образца, полученного от индивидуума.
[0291] 34. Способ согласно варианту реализации 32, дополнительно включающий определение уровня экспрессии гена, выбираемого из MUC5B, TERC, SFTPC SFTPA2, их гомологов и вариантов, в одной или более клетках указанного биологического образца, полученного от индивидуума.
[0292] 35. Способ лечения интерстициальной пневмонии у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий:
определение уровня одного или более маркерных генов, выбранных из TERT, MUC2, TOLLIP, MUC5B, DPP9, DSP или их гомологов или вариантов, в биологическом образце, полученном от человека; и,
введение эффективного количества средства для лечения интерстициальной пневмонии.
[0293] 36. Способ согласно варианту реализации 35, дополнительно включающий определение уровня экспрессии гена, выбираемого из TERT, MUC2, TOLLIP, MUC5B, DPP9, DSP, их гомологов или вариантов, в одной или более клетках указанного биологического образца, полученного от индивидуума.
[0294] 37. Способ согласно варианту реализации 35, дополнительно включающий определение уровня экспрессии гена, выбираемого из MUC5B, TERC, SFTPC SFTPA2, их гомологов или вариантов, в одной или более клетках указанного биологического образца, полученного от индивидуума.
[0295] Примеры, приведенные ниже, иллюстрируют специфические варианты реализации настоящего изобретения, и разные его варианты применения. Они приведены только в пояснительных целях, и не следует воспринимать их как ограничение настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
[0296] В настоящей заявке приведено общегеномное исследование ассоциаций типа «случай-контроль» (GWAS; 1616 пациентов и 4683 контрольных субъекта) и исследование репликации (876 пациентов и 1890 контрольных субъектов) с участием индивидуумов с ИИП, включая все типы фибротической ИИП. Разные типы ИИП были включены в данное исследование, потому что: а) провести дифференциальную диагностику между разными типами ИИП часто проблематично из-за существенного клинического, патологического и рентгенологического перекрывания; и b) есть убедительные доказательства общей для всех них генетической предрасположенности (например, в более 40% семей с СИП среди больных членов семьи обнаруживается более чем один тип ИИП). В данное исследование были включены образцы, полученные у индивидуумов и с семейной, и со спорадической ИИП, поскольку данные для вариантов MUC5B, TERT, TERC и SFTPC указывают на то, что спорадическая ИИП генетически сходна с семейной формой данного заболевания.
[0297] В попытке выявить дополнительные генетические факторы риска, которые в совокупности расширяют наше представление о ИИП, авторы настоящего изобретения провели общегеномное исследование ассоциаций типа «случай-контроль» (GWAS; 1616 пациентов и 4683 контрольных субъекта) и исследование репликации (876 пациентов и 1890 контрольных субъектов) ИИП. В группу пациентов были включены все типы фибротической ИИП. Также авторы изобретения включили в исследование как семейную, так и спорадическую ИИП.
Исследуемые популяции
[0298] Определение пациентов. Мы применяли стандартные критерии, установленные Американским торакальным обществом / Европейским респираторным обществом для определения диагностической классификации всех пациентов на этапах исследования и репликации. Мы исключали случаи с известной этиологией развития фибротической ИИП, включая инфекции, системные расстройства или значимые воздействия окружающей среды (например асбест). Чтобы максимизировать статистическую мощность и минимизировать потенциальное искажение вследствие происхождения, мы включали только европеоидов - не латиноамериканцев (NHW) в исследовании GWAS и репликации. Все субъекты давали письменное информированное согласие как часть одобренных Экспертным советом организации протоколов в соответствии с их требованиями, а исследование GWAS было одобрено экспертным советом Еврейского национального института здравоохранения и Объединенным экспертным советом Колорадо (COMIRB).
[0299] Фаза исследования GWAS. Мы генотипировали 1914 пациентов с ИИП из 7 когорт (семейная интерстициальная пневмония [n=566], популяция исследования Еврейского национального института здравоохранения с ИИП [n=238], исследования ИФЛ InterMune [n=720], UCSF [n=66], популяция с ИИП из Университета Вандербилта [n=105] и Исследовательский консорциум по получению ткани легких Национального института болезней сердца, легких и крови [n=219]), и сравнивали их с генотипами, полученными для 4683 контрольных субъектов вне исследований. После контроля качества генотипов в анализ мы включили 1616 случаев.
[0300] Семья с семейной интерстициальной пневмонией (СИП) определяется по наличию по меньшей мере 2 случаев точно установленной или вероятной ИИП у индивидуумов, генетически родственных в пределах 3 степеней родства. Набор семей на базе трех крупных специализированных центров (Университет Вандербилта, университет Дьюка и Еврейский национальный институт здравоохранения) продолжался с 1999 года. Мы включили только 1 случай ИИП среди родственников первой степени. Когорта пациентов с ИИП из Еврейского национального института здравоохранения состояла из пациентов со спорадической ИИП, которые прошли клиническую оценку и были включены в программу Еврейского национального института здравоохранения как часть протоколов исследования, ассоциированных с лечебной работой. Были описаны подробные критерии включения для пациентов из интервенционного исследования Intermune ИФЛ γ-интерферон. Если кратко, пригодные для участия пациенты страдали ИФЛ, их возраст составлял от 40 до 79 лет, клинические симптомы наблюдались по меньшей мере 3 месяца, а признаки прогрессирования заболевания отмечались в предыдущие 12 месяцев. Мы включали всех подходящих пациентов, независимо от назначенного лечения. Исследовательский консорциум по получению ткани легких Национального института болезней сердца, легких и крови (NHLBI LTRC) был учрежден для получения ткани легких и ДНК для научного сообщества. Мы включали ДНК от тех субъектов, которым был поставлен диагноз ИИП.
[0301] Мы применяли деидентифицированные контрольные генотипы в Центре по изучению генетического полиморфизма у человека (СЕРН) как часть других исследований. Потенциальным контрольным материалом служили субъекты - NHW, прошедшие генотипирование на той же платформе, что и наши пациенты, и одобренные надлежащим образом для применения их в качестве контроля в других исследованиях. Мы отбирали субъектов в качестве контроля из расчета 3 контрольных субъекта на 1 пациента, на основании генетического сходства с пациентами, которые преодолели порог контроля качества генотипирования (см. раздел «Статистический анализ» ниже).
[0302] Репликация. Для репликации наиболее частых SNP из GWAS мы генотипировали всего 1027 NHW пациента с ИИП и 2138 NHW контрольных субъекта. Контрольные субъекты для репликации были из индивидуальных групп репликации (n=138), и одна подгруппа (n=2000) контрольных субъектов - из исследования генов при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Мы выбирали контрольных субъектов, чтобы достичь соответствия по частоте для репликации пациентов по возрасту и полу. После контроля качества мы включили в анализ 876 пациентов и 1890 контрольных субъектов.
[0303] Экспрессия. Мы измеряли экспрессию генов в подгруппе пациентов с ИИП из Исследовательского консорциума по получению ткани легких и Еврейского национального института здравоохранения из GWAS (n=100) и в подгруппе контрольных субъектов из Еврейского национального института здравоохранения (n=94). Из Международного института усовершенствований в области медицины (Эдисон, Нью-Джерси) были получены образцы целых легких. Для подходящих пациентов и контрольных субъектов из биопсии ткани легких, доступной для анализа, было достаточно РНК; пациентов с ИФЛ выбирали с большим предпочтением, чем с диагнозами других ИИП. У контрольных субъектов из Еврейского национального института здравоохранения также были доступны данные об SNP во всем геноме.
Получение, хранение и контроль качества ДНК
[0304] Геномную ДНК выделяли как из цельной крови, так из полученной путем биопсии ткани легких на автоматической платформе Autopure LS («Qiagen») или Qiacube («Qiagen»), соответственно. Перед экстракцией на платформе Qiacube с применением набора DNAeasy, фибротическую ткань легких сначала гомогенизировали с применением пробирок Lysing Matrix D и настольного гомогенизатора FastPrep-24 («MPBiomedicals»). После выделения ДНК анализировали и определяли концентрацию и чистоту на спектрофотометре NanoDrop ND-1000. Образцы исключались, если концентрация ДНК была <50 нг/мкл, или отношение А260/А280 выходило за пределы диапазона 1,7-2,0.
[0305] Перед передачей в Национальный центр генотипирования (CNG) все образцы подвергали повторной количественной оценке с применением набора для анализа двухцепочечных ДНК Quant-iT PicoGreen («Invitrogen»), нормировали на 1×TE, и помещали аликвоты в пробирки с завинчивающейся пробкой с индивидуальным штрих-кодом. Из-за ограничений по объему у робота, манипулирующего с жидкостями, абсолютный минимум количества для передачи в CNG был 30 мкл при 50 нг/мл. Если образцы не удовлетворяли данному минимальному количеству, проводили альтернативную экстракцию, или образец исключали из исследования.
[0306] По получении образцов для репликации, их переносили в совместимые с роботом планшеты на 96 лунок, проводили количественную оценку при помощи PicoGreen и нормировали на 1×TE. В соответствии с инструкциями по передаче BMGC 400 нг ДНК передавали для каждого члена GWAS и когорт репликации. Стремясь минимизировать смещение, связанное с эффектами партий, пробы разливали в планшеты на 96 лунок случайным образом во всех когортах с двумя повторами на планшет, с применением робота, манипулирующего с жидкостями, Tecan Evo200.
Генотипирование всего генома
[0307] Образцы ДНК со штрих-кодами получали в стандартных пробирках вместе с информацией об образце, и подвергали строгому контролю качества (QC). Определяли концентрацию, фрагментацию и ответ на ПЦР. Образцы, полученные у пациентов и контрольных субъектов, распределяли случайным образом в планшетах на 96 лунок. Обработку проводили под полным контролем со стороны системы контроля за лабораторной информацией (LIMS) в полностью автоматизированной системе Illumina BeadLab, оборудованной 8 роботами, манипулирующими с жидкостями, Tecan, 6 ридерами Illumina BeadArray и 2 Illumina iScans. Генотипирование проводили при помощи четырехугольной матрицы Illumina Human610. Генотипирорвание путем репликации
[0308] Мы генотипировали 198 SNP с Р-значением менее 0,0001 (см. «Статистический анализ») у 1027 независимых пациентов и 2000 контрольных субъектов с генами ХОБЛ. Также мы генотипировали SNP в промоторе MUC5B rs35705950, который не находится на гранулярном чипе the Illumina 660 Quad, чтобы была возможность скорректировать репликацию SNP в хромосоме 11p15 на rs35705950. Кроме того, чтобы можно было применить дополнительные объединенные статистические критерии (с применением первичных генотипов от пациентов из исследования GWAS, а также пациентов и контрольных случаев из исследования репликации) с корректировкой по независимым переменным, которые не были доступны для контрольных субъектов за пределами исследования, мы также генотипировали подгруппу пациентов из исследования GWAS. Подробности анализа, направленного на валидацию, приведены ниже. После контроля качества генотипирования мы включили 876 пациентов и 1890 контрольных субъектов в репликационный анализ, а также 859 пациентов H3GWAS. - в объединенный анализ.
[0309] Перед генотипированием все образцы проходили контроль качества посредством количественной ПЦР в режиме реального времени («QC1») и униплекс-генотипирования с применением Taqman («QC2»). Образцы, которые не прошли QC1 или QC2, хотя и проходили этап генотипирования, позже из анализа исключались.
[0310] Генотипирование с целью валидации выполняли с применением сочетания мультиплексного (Sequenom iPLEX) и униплексного анализа (Taqman). Сначала в отношении входного набора из 198 SNP (Таблица 3) проводили анализ, разработанный для мультиплексного генотипирования Sequenom iPLEX, с применением комбинированных веб-ориентированных (AssayDesigner Suite, доступен на интернет-сайте sequenom.com) и настольных (AssayDesigner) программных средств («Sequenom», Сан-Диего). Из 198 входных SNP, 193 были успешно занесены в набор из 6 анализов со следующей плексностью: 35, 35, 35, 35, 31 и 22 SNP. Генотипирование Sequenom iPLEX основано на мультиплексной локус-специфичной амплификации SNP, мультиплексной одноосновной достройке (SBE) на основе локус-специфичных ампликонов, мультиплексном разрешении продуктов SBE путем распознавания азотистых оснований с применением матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF).
[0311] Праймеры для секвеном-анализа приобретали у компании IDT (Коралвилль, Айова), и все этапы процедуры iPLEX проводили с применением реагентов и способов от компании «Sequenom» (Сан-Диего, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Реакции проводили в планшетах на 384 лунки и анализировали их при помощи анализатора Sequenom MassARRAY 4 с реагентами iPLEX Gold и матрицами SpectroCHIP. Результаты анализировали при помощи коммерческой программы (Typer 4, Sequenom) в сочетании с пользовательскими инструментами для управления данными. Из 193 анализов в 6 мультиплексах 179 успешно прошли генерирование приемлемых данных генотипирования.
[0312] Оставшиеся 5 SNP, которые не были успешно включены в оригинальный дизайн Sequenom iPLEX (rs2736100, rs35705950, rs13225346, rs10822856, rs10139381, rs10751635), a также шестой SNP (rs3 5 705950), опубликованный в ранее проведенных исследованиях, генотипировали при помощи коммерческого анализа Taqman («Life Technologies)), Сан-Диего, Калифорния). Номера rs dbSNP указанных SNP, а также идентификационные номера коммерческих продуктов, применяемых для анализа, показаны в таблице 3. Реакции проводили в планшетах на 384 лунки, и считывание флуоресценции проводили с применением системы детекции последовательностей Applied Biosystems ABI 7900НТ («Applied Biosystems», Фостер сити, Калифорния).
Экспрессия генов
[0313] Тотальную РНК выделяли из приблизительно 30 г быстрозамороженной или законсервированной с сохранением РНК ткани легких при помощи набора Ambion mirVana («Life Technologies»). Концентрацию РНК определяли при помощи прибора Nanodrop ND-1000 («Thermo Scientific»), а целостность РНК определяли при помощи 2100 Bioanalyzer («Agilent»). Одноцепочечную конверсию кДНК проводили при помощи системы синтеза Superscript III First-Strand («Invitrogen»), а анализ экспрессии проводили при помощи предварительного разработанного цикла анализа Taqman на инструменте для ПЦР в режиме реального времени Viia7 («Life Technologies»). (DPP9: анализ для вариантов Hs00373589; DSP: Hs00189422 и DSP 1 включает Hs00950584; FAM13A: Hs00208453; IVD: Hs01064832; MUC5B: Hs00861588; MUC2: Hs00149374; OBFC1: Hs00998588; WNT3: Hs00902257; WNT9B: Hs00916642; GAPDH: 4333764F). Все анализы проводили трехкратно, и в качестве эндогенного контроля применяли GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу). В качестве дополнительного контроля один образец на планшет проходил весь цикл анализа в двух экземплярах с этапа конверсии кДНК.
Статистический анализ
[0314] Выбор контрольных субъектов за пределами исследования для обнаружения GWAS. Анализ происхождения проводили при помощи программы EIGENSTRAT3.0. Данные НарМар и образцы контрольных субъектов-европейцев применяли в качестве представителей европейской, восточно-африканской и восточно-азиатской популяций, чтобы вывести главные составляющие происхождения-информации, которые проецировались на образцы пациентов и контрольных субъектов. Образцы предположительно не от европейцев помечали как выбросы и исключали из последующего анализа. Мы получили данные о контрольных субъектах с близким генетическим соответствием с пациентами из большой базы данных анонимных генотипов европейцев. Из указанной базы данных мы выбирали подгруппу данных о контрольных генотипах, чтобы получить три соответствующих контроля для одного пациента с применением подхода, основанного на кластеризации методом опорных векторов (R-пакет "e1071"), после которого применяли алгоритм парного сравнения с образцом (R-пакет "optmatch"). При таком отборе коэффициент геномной инфляции (оцениваемый при корректировке на структуру популяции при помощи программы GEMMA) составил 0,99.
[0315] Исключение родственников первой степени. Мы включили только одного индивидуума среди родственников первой степени на основании оценочного коэффициента родства ≥0,45. Для оценки процентного колебания риска развития заболевания, обусловленного SNP GWAS, которые чувствительны к неявному родству, мы дополнительно исключили только одного индивидуума среди лиц с оценочным коэффициентом родства >0,025.
[0316] Исключение индивидуумов и определение приоритета SNP для исследования GWAS. Помимо индивидуумов, исключенных лабораторией, мы исключали индивидуумов с 1) признаками того, что они являются генетическим выбросом на основании попарной оценки идентичности по состоянию (IBS) с 5-м ближайшим соседним значением, которое было >4 стандартных отклонений от средней попарной оценки IBS среди всех пар, 2) неразрешенный подбор по полу между клиническими и геномными данными, 3) гетерозиготность среди SNP больше или меньше, чем 4 стандартных отклонения от средней гетерозиготности среди всех индивидуумов, и 4) генотип затрагивает менее чем 98% SNP, которые прошли лабораторный контроль качества. На основании данного контроля качества были исключены 298 пациентов и 165 контрольных субъектов. Помимо показателей лабораторного контроля качества мы присваивали приоритет сигналам ассоциации для контроля, основанного на других критериях. Мы проверяли дифференциальные пропуски при помощи критерия хи-квадрат для долей пропусков между пациентами и контрольными субъектами и отход от HWE при помощи 1-df испытания на адекватность. Мы присваивали приоритет SNP с: 1) MAF (частота минорного аллеля) >0,05, 2) р-значение HWE>0,0001 для пациентов и контрольных субъектов, оцениваемых по-отдельности, 3) р-значение для дифференциальных пропусков между пациентами и контрольными субъектами 0,001, если менее 2% пропусков и >0,05, если процент пропусков от 2% до 5%.
[0317] Проверка ассоциаций GWAS. Мы проверяли наличие ассоциаций между каждым SNP и ИИП при помощи подхода точной смешанной модели, чтобы учесть и неявную связанность, и популяционную стратификацию среди наших пациентов и контрольных субъектов, которые представлены в пакете программ общегеномных ассоциаций в эффективной смешанной модели (GEMMA). Мы проверяли наличие ассоциации в соответствии с аддитивной моделью для нашего основного анализа и впоследствии брали минимум р-значений рецессивной и доминантной модели, если подгонка аддитивной моделью существенно (р<0.05) отклонялась от линейной регрессии, которая предполагала независимость между образцами (такой критерий в настоящее время не подлежит внедрению в программу GEMMA). Во всех моделях мы проводили корректировку по полу. Мы сравнивали распределение р-значений, полученных в аддитивной модели, с р-значениями, ожидаемыми в соответствии с нулевой гипотезой об отсутствии ассоциаций по всему геному, и приводили квантиль-квантиль (график Q-Q) и коэффициент геномной инфляции (X) для проверки отсутствия систематической ошибки из-за экспериментальных или других вносящих ошибку факторов, таких как стратификация популяции. Мы выбирали все SNP с р-значением <0,0001 для прослеживания в популяциях для репликации, и визуально оценивали спектры генотипов с целью выявления всех 198 выбранных SNP, чтобы гарантировать качество сигналов от генотипов. Мы рассчитывали отношение шансов и 95% доверительные интервалы (ДИ) на основании логистической регрессионной модели, скорректированной по полу, которая предполагала независимость между пациентами и контрольными субъектами, поскольку линейная модель в GEMMA основана на применении ссылки на идентификационную информацию, а не функцию связи с логарифмом отношения шансов. Сами по себе ДИ могут быть несколько уже, чем ДИ, основанные на полной смешанной модели.
[0318] Ассоциации при репликации. Мы проверяли наличие ассоциаций между каждым SNP, подвергнутом репликации, и ИИП у пациентов и контрольных субъектов, для которых была проведена репликация, с применением общедоступной программы SNPGWA (см. электронные адреса размещения). Мы проверяли наличие ассоциаций в соответствии с генетической моделью на основе GWAS, которая давала минимальное р-значение (143 в соответствии с аддитивной моделью, 24 в соответствии с доминантной моделью и 31 в соответствии с рецессивной моделью), р-значение <0,0025 считалось статистически значимой репликацией для 20 GWAS SNP, значимых для всего генома, р-значения для других 178 SNP применяли для мета-анализа когорт из GWAS и репликации.
[0319] Мета-анализ. Для получения объединенного показателя ассоциаций между каждым из 181 успешно генотипированных SNP в наборе для репликации и ИИП, мы проводили мета-анализ результатов GWAS и репликации. Мы применяли взвешенный инвертированный нормальный метод. Пусть Zi (i=GWAS или репликация) будет критерием значимости из критерия ассоциации в i-том исследовании, a vi (i=GWAS или репликация) будет соответствующим весом. Здесь мы брали вес как квадратный корень из общего объема выборки в i-том исследовании, поскольку оценки эффекта из GWAS и репликации были не на одинаковой шкале. Следует отметить, что данный способ позволяет точно рассчитать направленность ассоциации. Таким образом, ассоциации высокой значимости с конфликтующими направлениями не проявляют сильной статистической ассоциации. Для проведения своего мета-анализа мы применяли программу METAL (доступную на интернет-сайте sph.umich.edu/csg/abecasis/metal/). SNP с PJoint<5×10-8 считались статически значимыми для всего генома. Мы создали локус-специфичные графики результатов исследования GWAS для всех локусов, которые были значимыми для всего генома по результатам мета-анализа.
[0320] Модели с многими SNP. Чтобы оценить независимость эффектов значимых для всего генома SNP по результатам мета-анализа, мы применяли логистическую регрессионную модель в каждом локусе с применением объединенной группы пациентов (GWAS и репликация) и контрольных субъектов из исследования репликации. Точнее говоря, в каждом локусе с SNP, значимым для всего генома, мы проверяли наличие ассоциаций между ИИП и каждым из SNP другой панели валидации в том локусе после корректировки на наиболее значимо ассоциированные SNP d том локусе (в хромосоме 11p15 мы проводили корректировку на rs35705950). Чтобы оценить надежность ассоциацию каждого SNP с эффектами возраста в дополнение к полу, мы проверяли наличие ассоциаций между ИИП и каждым SNP, скорректированным на возраст и пол.
[0321] Анализ экспрессии. Мы оценивали дифференциальную экспрессию генов в легких между 100 пациентами и 94 контрольными субъектами с применением двухвыборочного t-критерия. Также мы оценивали дифференциальную экспрессию в зависимости от генотипа с применением объединенной группы пациентов и контрольных субъектов посредством ANOVA (дисперсионный анализ) среди трех групп с разными генотипами, если в группе не оказывалось <5 индивидуумов; в данном случае мы формировали группы редких гомозигот и гетерозигот. р-значение <0,05 считалось статистически значимым.
Результаты
Общегеномное исследование
[0322] Мы генотипировали 1914 самостоятельно обратившихся европеоидных пациентов-не латиноамериканцев с фибротической ИИП на гранулярном чипе Illumina 660 Quad. Из них 14, 126, 8 и 150 были исключены на основании того, что они были генетическим выбросом, были родственником первой степени другого пациента, обладали высокой степенью гетерозиготности, или у них было пропущено >2% генотипов среди всех SNP, соответственно (см. «Статистические способы»); в анализ было включено 1616 пациентов. Из 15 352 контрольных субъектов вне исследования, также генотипированных на гранулярном чипе Illumina 660 Quad, мы применили данные о 4683 контрольных субъектах, наиболее близких генетически нашим пациентам на основании общегеномного сравнения идентичности-по-состоянию.
[0323] Мы сравнивали пациентов с ИИП и контрольных субъектов по 439 828 SNP с 1) MAF>0,05, 2) p-значение HWE>0,0001 для пациентов и контрольных субъектов, оцениваемых по-отдельности, и 3) р-значение для дифференциальных пропусков между пациентами и контрольными субъектами >0,001, если менее 2% пропусков и >0,05, если процент пропусков от 2% до 5%. Ни график «квантиль-квантиль» для р-значений (Фигура 5), ни расчетный коэффициент геномной инфляции 0,99 не указывали на какие-либо систематические ошибки, такие как ошибки, связанные со стратификацией популяции. При применении аддитивной модели для минорного аллеля в каждом SNP мы выявили 19 SNP, соответствующие 7 хромосомным расположениям, с ассоциациями, значимыми для всего генома (Р<5×10-8) (Фигура 1 и таблица 1). Мы выявили еще один значимый для всего генома SNP (rs1379326), соответствующий уникальному локусу, при применении рецессивной модели (таблица 1).
Репликация и мета-анализ
[0324] Мы выбрали 20 значимых для всего генома SNP, и еще 178 SNP с р-значением 5×10-8<Р-value<0,0001 (SNP между верхней и нижней линией на Фигуре 1; см. таблицы 3 и 4, где указано расположение, генотип SNP и информация о HWE, и таблицу 5, где приведена информация об ассоциациях для всех 198 SNP) для генотипирования в когорте для репликации из 1027 пациентов с ИИП и 2138 контрольных субъектов. После контроля качества генотипа мы включили 876 пациентов и 1890 контрольных субъектов, успешно генотипированных по 181 SNP. 13 из 20 значимых для всего генома SNP были ассоциированы с ИИП в когорте репликации с Р<0,0025, что соответствует консервативной поправке Бонферрони для 20 критериев (таблица 1, средние колонки). Восемнадцать из 20 значимых для всего генома SNP, соответствующие 7 локусам, из исследования GWAS (Фигура 2) в мета-анализе оказались значимыми для всего генома (таблица 1, последняя колонка). Еще 25 SNP, соответствующие 9 хромосомным расположениям (5 перекрывающихся с локусами GWAS и 4 дополнительных локуса (Фигура 3)), в мета-анализе оказались значимыми для всего генома (таблица 1).
-
-
-
[0325] SNP с самой высокой ассоциацией в исследовании GWAS - rs868903 (PGWAS=1.3×1022; PMeta=9.2×1026), находится в промоторе гена MUC5B в хромосоме 11р15, о котором сообщалось, что он ассоциирован с ИФЛ и СИП, что было подтверждено в других исследованиях. Десять дополнительных SNP в области MUC5B, включая SNP в генах MUC2 и TOLLIP, также были значимыми для всего генома в объединенном анализе и не демонстрировали сильного неравновесного сцепления (LD) с rs868903 (Фигура 2d). SNP rs2736100 (PMeta=1.7×1019) и rs2853676 (PMeta=3.3×10-8) в хромосоме 5р15 находятся в гене TERT (Фигура 2а), a rs1881984 (PMeta=4.5×10-8) находится вблизи гена TERC (Фигура 3а); сообщалось, что редкие мутации в TERT и TERC ассоциированы с СИП и ИИП, и также ранее сообщалось, что rs2736100 находится в гене TERT. Остальные 8 значимых для всего генома локусов являются новыми локусами ИИП (Фигура 6). Пять из сигналов ассоциации в хромосомах 4q22, 6р24, 10q24, 13q34 и 19р13, по-видимому, локализованы в отдельных генах. SNP rs2609255 (PMeta=2.2×10-11) расположен в гене FAM13A (семейство со сходством последовательностей 13, член А) в хромосоме 4q22 (Фигура 3b). SNP rs10484326 (PMeta=5,5×10-9) и rs2076295 (PMeta=1,1×10-19) находятся в гене DSP (десмоплакин) в хромосоме 6р24 (Фигура 2b). SNP rsl0748858 (PMeta=2,7×10-8), rs2067832 (PMeta=3,7×10-8) и rs11191865 (PMeta=2,4×10-8) находятся в гене OBFC1 gene (олигонуклеотид-связывающий карман, содержащий 1) в хромосоме 10q24 (Фигура 3с). SNP rs1278769 (PMeta=6,7×10-9) находится в гене АТР11А (АТФаза, класс VI, тип ПА) в хромосоме 13q34 (Фигура 3d). SNP rs12610495 (PMeta=1,7×10-12) и rs2109069 (PMeta=2,4×10-11) находятся в гене DPP9 (дипептидилпептидаза 9) в хромосоме 19р13 (Фигура 2g). Другие три хромосомные области (7q22, 15q14-15 и 17q21) либо содержали не значимые SNP в любом из генов, либо SNP со значимыми ассоциациями в нескольких генах (таблица 1 и Фигура 2с, 2е, 2f). Расчетное отношение шансов (OR) для всех значимых для всего генома SNP варьировало в диапазоне -1,1-~1,6 (Таблица 1; OR для MAF, которое меньше 1, соответствует OR для основного аллеля в том же диапазоне).
Исследование скорректированных моделей для значимых для всего генома SNP
[0326] Чтобы скорректировать обнаруженный ранее SNP в промоторе гена MUC5B (rs35705950; не на гранулярном чипе Illumina 660 Quad), мы генотипировали подгруппу пациентов из исследования GWAS на той же платформе и в то же время, что и пациентов из исследования репликации для SNP, перечисленных в таблице 1. Мы объединили первичные генотипы указанных пациентов (n=859) с генотипами пациентов из исследования репликации и контрольных субъектов для проведения объединенного анализа.
[0327] Чтобы оценить сведения о нескольких независимых сигналах ассоциации в каждой области, мы проверяли наличие ассоциации с каждым SNP в конкретной области после корректировки на наиболее значимый SNP в данной области, основываясь на данных мета-анализа. Для области хромосомы 11p15 мы провели корректировку на rs35705950, опираясь на наши предыдущие результаты и силу ассоциации, которую мы выявили между rs35705950 и ИИП в популяции нашего текущего исследования (OR [95% ДИ]: 4,51 [3,91, 5,21], PJoint=7,21×10-95). После корректировки на rs35705950, только один из SNP в хромосоме 11р15 (rs4077759) оставался номинально ассоциирован с ИИП (Р=0,03; таблица 2), а rs35705950 оставался высоко значимым во всех моделях, что указывает на то, что ассоциации, которые мы наблюдали с другими SNP, были связаны со слабым LD с rs35705950 (см. Фигуру 6, где показаны LD среди SNP). Уменьшение значимости SNP в других областях после корректировки на самые распространенные SNP согласовывалось с LD среди SNP (таблица 6) и не свидетельствовало о нескольких сигналах ассоциаций. Примечательно, что SNP rs1881984 вблизи гена TERC уже не является значимым после корректировки на SNP rs6793295 в гене LRRC34.
[0328] И наконец, мы провели корректировку на возраст помимо корректировки на пол для всех значимых для всего генома SNP; за исключением rs7942850 в хромосоме 11 (скорректированный по Пейджу = 0,06) все SNP после корректировки сохраняли значимость (таблица 6).
Экспрессия ключевых генов в ткани легких
[0329] Мы измеряли экспрессию генов DPP9, DSP, FAM13A, IVD, MUC5B, MUC2, DISP2, OBFC1, WNT3 и WNT9B в ткани легких, полученной от 100 пациентов с ИФЛ и 94 контрольных субъектов, при помощи количественной ПЦР и прошедшего валидацию анализа Taqman Genotyping Assays («Applied Biosystems», Форстер сити, Калифорния), чтобы оценить различия между пациентами и контрольными субъектами и проверить ассоциацию между генотипами для SNP с наиболее высокой ассоциацией в каждом гене с экспрессией такого гена. Мы подтвердили, что наши результаты из менее крупного исследования, согласно которым ген MUC5B в большей степени экспрессируется в ткани легких пациентов, чем у контрольных субъектов (Р=5,6×10-11), но в подтверждение наших предыдущих выводов для rs35705950 среди пациентов с ИФЛ rs868903 не был ассоциирован с экспрессией MUC5B. DSP экспрессировался в большей степени у пациентов, чем у контрольных субъектов (Р=0,0002), и экспрессия отличалась по генотипу в rs2076295 (Р=0,002); относительная экспрессия DSP повышалась при увеличении числа копий предположительно связанного с риском аллеля (Фигура 4). Существует две изоформы десмоплакина, генерируемые при альтернативном сплайсинге. rs2076295 содержится в сайте связывания для фактора транскрипции PU.1, для которого было показано участие в альтернативном сплайсинге целевых генов; однако мы не увидели доказательств дифференциального эффекта генотипа rs2076295 на экспрессию основной изоформы по сравнению с альтернативной изоформой. Есть номинальные свидетельства в пользу более выраженной экспрессии DPP9 у пациентов по сравнению с контрольными субъектами (Р=0,03), но ни rs12610495 (Р=0,46), ни rs2109069 (Р=0,72) не были ассоциированы с экспрессией DPP9. Ни FAM13A, IVD, ни OBFC1 не демонстрировали различий в экспрессии между пациентами и контрольными субъектами или по генотипу (все Р>0,12); MUC2, DISP2, WNT3 и WNT9B демонстрировали низкую экспрессию или ее отсутствие в образцах легких.
Процентное колебание риска заболевания, обусловленного SNP GWAS
[0330] Мы оценивали процент риска заболевания, обусловленного всеми 439 828 SNP из GWAS для ассоциации с применением модели компонентов дисперсии в диапазоне оценок для ИИП (50 на 100000-100 на 100000). Мы обнаружили, что SNP GWAS по оценкам обусловливали 30% (со. 2%) - 33% (со. 3%) риска ИИП. Поскольку мы не включали SNP в промоторе гена MUC5B (rs35705950) в данный анализ, это консервативная оценка вклада распространенных SNP в риск ИИП.
Обсуждение
[0331] Перечисленные результаты представляют убедительное доказательство того, что обычная генетическая вариация вносит важный вклад в риск развития интерстициального заболевания легких, такого как ИИП. Мы идентифицировали 8 новых генетических локусов, связанных с риском (4q22, 6р24, 7q22, 10q24, 13q34, 15q14-15, 17q21 и 19p13), и подтвердили роль вариантов риска в трех ранее описанных генах/локусах (TERC [3q26], TERT [5p15] и MUC5B [11p15]) при ИИП. До появления настоящего сообщения было известно только два гена с воспроизводимой ассоциацией с ИИП-TERT и MUC5B. В совокупности распространенные варианты риска, ассоциированные с ИИП, указывают на то, что данное заболевание преимущественно обусловлено дефектами в иммунной защите организма, межклеточной адгезии и ранним старением клеток. Кроме того, указанные выводы можно применять для направленных интервенционных исследований при данном комплексном заболевании.
[0332] По-видимому, секретируемые муцины (MUC5B) в мелких дистальных дыхательных путях играют определенную роль в развитии ИИП. Указанные данные не указывают на сильный эффект SNP в других генах (MUC2 или TOLLIP) в области 11p15 после учета эффекта SNP в промоторе MUC5B rs35705950, который ранее мы идентифицировали как ключевой фактор риска для развития ИИП. SNP rs868903 в промоторе гена MUC5B, который был одним из наиболее сильно ассоциированных SNP в исследовании GWAS, репликации и мета-анализе, не является сильным LD (r2=0,13) с rs35705950 и расположен ближе к сайту начала транскрипции MUC5B, чем (3 кб и 1.5 кб, соответственно). Хотя концентрация MUC5B в ткани легких пациентов с ИИП выше, чем у контрольных субъектов, ни один из указанных вариантов промотора MUC5B, по-видимому, не обусловливает полностью повышенную экспрессию MUC5B у пациентов с ИИП, что указывает на то, что определенную роль при данном заболевании играют варианты других генов или токсины из окружающей среды. Нарушенная регуляция муцинов в легких, вероятно, инициирует усугубление фибропролиферации по одному из следующих механизмов: 1) изменение защитных механизмов слизистой оболочки; 2) препятствование восстановлению альвеол; или 3) прямая цитотоксичность (стресс эндоплазматического ретикулума или апоптоз), стимулирующая фибропролиферативный ответ, инициируемый избыточной выработкой муцинов в легких.
[0333] По-видимому определенную роль при ИИП играют гены, которые поддерживают длину теломер. До появления настоящего сообщения ассоциации между фиброзом легких и TERT и TERC включали редкие варианты TERT и TERC и распространенный вариант TERT. Мутации в указанных генах ассоциированы с укороченными теломерами в эпителиальных клетках альвеол, что указывает на то, что указанные варианты гена могут увеличивать риск фиброза легких за счет усиления апоптоза или некроза альвеолярного эпителия. Кроме того, была показана взаимосвязь между врожденным дискератозом - врожденным расстройством, которое напоминает преждевременное старение и часто включает фиброз легких, и мутациями в TERT и TERC. Настоящее исследование GWAS позволило выявить распространенные варианты в TERT и близлежащем TERC и в другом гене, которые влияют на длину теломер, OBFC1 (Pmeta=2,4×10-08). Была показана взаимосвязь между распространенным вариантом OBFC1 и длиной теломер в двух исследованиях GWAS, проведенных для длины теломер в лейкоцитах человека в общей популяции. Представляется, что риск, ассоциированный с указанными генами, не ограничивается редкими вариантами, но представляет собой обычное колебание риска. В совокупности указанные выводы подчеркивают важность длины теломер и раннего старения клеток в патогенезе фиброза легких.
[0334] Указанные результаты указывают на участие изменения в межклеточной адгезии в формировании риска развития ИИП. Была показана сильная взаимосвязь вариантов в гене DSP с ИИП, и с экспрессией DSP в ткани легких у пациентов с ИИП. Ген DSP кодирует белок десмоплакин - компонент десмосомы, адгезивную внутриклеточную молекулу, которая прочно соединяет соседние клетки и образует динамическую структуру с другими белками (плакогобин и плакофилины), которые прикрепляют цитоскелет к мембране клетки. Десмосомы особенно важны для поддержания целостности тканей, которые подвергаются механической нагрузке (такие как периферическая часть легких), и есть убедительные доказательства того, что перестройка десмосомы нарушает гомеостаз в эпителии. Была показана взаимосвязь мутаций в DSP с аритмогенной дисплазией правого желудочка, кератодермой и алопецией, что указывает на непосредственное участие десмоплакина в заболеваниях с утратой целостности ткани. Более конкретно, была показана взаимосвязь мутаций в DSP с интерстициальным фиброзом сердца на основании гиперэкспрессии в ткани сердца мышей. Дополнительный потенциальный механизм участия DSP - это изменения в сигнальном пути wnt/β-катенина, которые неизменно наблюдались при фиброзе легких. Было показано, что десмоплакин влияет на сигнальный путь wnt/β-катенина посредством регуляции другого компонента десмосомы - γ-катенина. Указанные исследования и результат, согласно которому гиперэкспрессия DSP при ИИП ассоциирована с аллелем rs2076295, дает весомые биохимические и биологические доказательства в пользу роли генетической вариации DSP в развитии фиброза легких.
[0335] Указанные результаты указывают на вклад других молекул клеточной адгезии в риск развития ИИП. Ген DPP6 является членом того же семейства белков, что и белок активации фибробластов, для которого было показано, что он экспрессируется в очагах фибробластов, но не в соседней здоровой ткани легких при ИФЛ. DPP9 экспрессируется в эпителии, и было показано, что он изменяет адгезию клеток эмбриональной почки человека. Кроме того, ген катенин-кадерин-ассоциированного белка альфа 3 (CTNNA3) был почти также значим при объединенном анализе (Pmeta=9,8×10-07), расположен в 10q22, и представляет собой молекулу адгезии, которая физически взаимодействует с β-катенином и опосредует адгезию клеток. В совокупности указанные результаты предполагают, что фиброз легких вызывается дефектами в межклеточной адгезии или дефектами в цитоскелете, которые не позволяют легким приспосабливаться к нагрузке, ассоциированной с механическим растяжением легких.
[0336] FAM13A представляет собой ген сигнальной трансдукции, который ответственен за гипоксию, и недавно было показано, что SNP (rs7671167) в указанном гене защищает от хронической обструктивной болезни легких. Другие значимые для всего генома локусы не были так хорошо локализованы в отдельном гене, хотя появляются интересные кандидаты. Существует несколько маркеров, ассоциированных с ИИП, которые находятся в сильном LD в хромосоме 17q21, которые перекрывают 1,14 Мб. Очевидным кандидатом среди таких генов является ген WNT3, учитывая, что при ИИП наблюдаются изменения в передаче сигнала с wnt; однако мы не нашли доказательств экспрессии WNT3 в легких. 17q21 представляет собой структурно сложную генетическую область с крупным (>1 Мб) полиморфизмом инверсии и связанными с заболеванием менее крупными вариантами по числу копий (CNV). Интересно, что гены LRRC37A и LRRC37A2 в данной области принадлежат тому же семейству, что и ген LRRC34 в хромосоме 3, соседствующий с геном TERC, который демонстрирует один наиболее сильный сигнал ассоциации в образцах для репликации. И в области хромосомы 17q21, и в области комплекса муцинов хромосомы 11q15, вероятно, что необходимо глубокое секвенирование и измерение числа копий на основе матрицы с последующим функциональным исследованием предположительных генов/аллелей/CNV, чтобы более точно охарактеризовать генетическую архитектуру указанных выявленных ассоциаций с ИИП. Хотя было сделано предположение, что фиброз легких возникает вследствие активации связанных с развитием сигнальных путей, указанные результаты указывают на то, что данные механизмы вторичны по отношению к первичному дефекту в иммунной защите и межклеточной адгезии. Поскольку гены, участвующие в поддержании целостности эпителия легких (DSP, DPP9 и CTNNA3), и муцины легких (MUC5B) являются генетическими вариантами риска, дефекты в указанных механизмах, вероятно, вносят основной вклад в развитие фиброза легких. Учитывая важность внешних воздействий (например, воздействие курения, асбеста и оксида кремния) в развитии других форм интерстициального заболевания легких, логично, что распространенные вдыхаемые частицы, такие как частицы, связанные с курением или загрязнением воздуха, через годы вызывают усугубленное интерстициальное поражение у людей, у которых есть дефекты в иммунной защите легких или межклеточной адгезии. Укорочение теломер и последующее раннее старение клеток, вероятно, изменяет иммунную защиту или может усиливать «провокацию для иммунной системы» в легких, аналогично асбесту или курению. Таким образом, избыточное повреждение легких из-за усиленного воздействия окружающей среды, эндогенных дефектов в критичных гомеостатических механизмах или из-за незначительных дефектов иммунной защиты может с годами приводить к развитию фиброза легких. Следует уделять больше внимания иммунной защите и межклеточной адгезии, когда рассматриваются мишени для лекарственной терапии при данном комплексном заболевании.
[0337] Настоящие результаты должны существенно повлиять на будущие генетические, диагностические и фармакологические исследования ИИП. В совокупности SNP GWAS, описанные в настоящей заявке, объясняют приблизительно одну треть вариабельности риска развития ИИП, что указывает на то, что есть основания для дальнейшего изучения распространенной вариации с более крупными когортами в дополнение к исследованиям редких вариаций, эпигенетических свойств и взаимодействий ген-окружающая среда. Хотя клинические проявления указанных заболеваний были хорошо определены, становится все более понятно, что каждый тип ИИП вызывается вариантами в нескольких генах, которые, вероятно, имеют разный прогноз и по-разному могут отвечать на фармакологическое воздействие. Следовательно, генотипирование субъектов с ИИП в будущих исследованиях пробных лекарственных средств может предоставить информацию для разработки препаратов путем идентификации агентов, которые эффективны у избранных пациентов. Фактически недостаток внимания к фармакогенетическим подходам в исследованиях ИИП может объяснить, почему было найдено мало агентов, изменяющих течение данных заболеваний. Кроме того, генетическая гетерогенность ИИП указывает на то, что описание генетических вариантов полезно при переопределении типов ИИП, так что мы можем предоставлять более точную прогностическую информацию для пациентов и их семей.
[0338] Следует понимать, что примеры и варианты реализации, описываемые в настоящей заявке, предназначены только для целей иллюстрации, что специалистами в данной области техники могут быть предложены различные модификации или изменения в свете их, и они включены в дух и сферу настоящей заявки и в область прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты, заявки на патенты, интернет-сайты и базы данных, цитируемые в настоящей заявке, включены в нее посредством ссылки на их полное содержание для любых целей.