СПОСОБЫ И СИСТЕМЫ ДЛЯ КАЛИБРОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИБОРА
METHODS AND SYSTEMS FOR BIOLOGICAL INSTRUMENT CALIBRATION

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0001]
В общем случае существует возрастающая потребность в упрощении инсталляции и установки систем для биологического анализа так, чтобы пользователи могли более быстро и эффективно использовать системы для биологического анализа в своих заданных целях.
[0002]
Инсталляция и калибровка лабораторных приборов может быть занимающим много времени и дорогим процессом. Во многих случаях необходимо присутствие инженеров от производителя приборов для проведения этого процесса. Связанные с этим расходы в общем случае ложатся на плечи пользователя. В некоторых случаях опытные пользователи могут успешно калибровать должным образом изготовленные приборы, используя многоэтапные процедуры.  Во время такой калибровки в комбинации с ручными процедурами можно использовать физические стандарты и луночные планшеты.  Ручное выполнение калибровки и проверка данных подвержены ошибкам и могут основываться на ситуативных или субъективных критериях.  В то время как конечный этап верификации системы может обеспечивать устойчивость к принятию субоптимальных калибровок, автоматизация может обеспечить улучшенную объективность и единообразие во время осуществления такой деятельности.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003]
В одном иллюстративном варианте реализации предложен способ калибровки прибора.  Прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков.  Способ включает проведение калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении.  Способ дополнительно включает проведение калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя.  Способ дополнительно включает проведение калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра.  Способ включает проведение валидации с помощью РНКазы Р для проверки возможности прибора различать два разных количества пробы.
[0004]
В другом иллюстративном варианте реализации предложен машиночитаемый запоминающий носитель, кодируемый выполняемыми процессором инструкциями, для калибровки прибора. Прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков. Инструкции включают инструкции для проведения калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении.  Инструкции включают инструкции для проведения калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя.  Инструкции дополнительно включают инструкции для проведения калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра.  Инструкции дополнительно включают инструкции для проведения валидации с помощью РНКазы Р для проверки возможности прибора различать два разных количества пробы.
[0005]
В другом иллюстративном варианте реализации предложена система для калибровки прибора. Прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков. Система включает процессор и память, кодируемую выполняемыми процессором инструкциями.  Инструкции включают инструкции для проведения калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении и проведения калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя.  Инструкции дополнительно включают инструкции для проведения калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра и проведения валидации с помощью РНКазы Р для проверки возможности прибора различать два разных количества пробы.
[0006]
В другом иллюстративном варианте реализации предложена система для калибровки прибора. Прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков. Система включает калибратор ОИ, выполненный с возможностью определять позиции реакционных участков на изображении.  Система включает калибратор чистого красителя, выполненный с возможностью определять вклад флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя.  Система дополнительно включает калибратор нормализации прибора, выполненный с возможностью определять коэффициент нормализации для фильтра.  Прибор включает в себя систему для валидации с помощью РНКазы Р для проверки возможности прибора различать два разных количества пробы.  Система дополнительно включает дисплей, выполненный с возможностью отображать результаты калибровки.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0007]
ФИГ. 1 иллюстрирует технологический процесс калибровки для биологического прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.
[0008]
ФИГ. 2 представляет собой блок-схему, которая иллюстрирует прибор для проведения ПЦР 200, на котором можно осуществлять варианты реализации идей настоящего изобретения.
[0009]
ФИГ. 3 иллюстрирует типовую оптическую систему 300, которую можно применять для визуализации в соответствии с описанными в данном документе вариантами реализации.
[0010]
ФИГ. 4 иллюстрирует типовую компьютерную систему для осуществления различных описанных в данном документе вариантов реализации.
[0011]
ФИГ. 5 иллюстрирует типовую систему распределенной сети в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.
[0012]
ФИГ. 6 иллюстрирует последовательность этапов, применяемых при калибровке приборов для ПЦР.
[0013]
ФИГ. 7 иллюстрирует область интереса для 96-луночного контейнера для проб.
[0014]
ФИГ. 8 представляет собой изображение калибровочного планшета с красителем FAM, находящимся в каждой лунке 96-луночного калибровочного планшета.
[0015]
ФИГ. 9 и 10 иллюстрирует типовую технологическую схему в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения.
[0016]
ФИГ. 11A иллюстрирует калибровочные планшеты с шахматной конфигурацией в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения.
[0017]
ФИГ. 11B представляет собой изображение 96-луночного калибровочного планшета с шахматной конфигурацией на 4 красителя с красителями FAM, VIC, ROX и SYBR в такой же конфигурации, которая проиллюстрирована для планшета 1100 на ФИГ. 11A.
[0018]
ФИГ. 12A иллюстрирует смеси красителей, применяемые в различных вариантах реализации идей настоящего изобретения.
[0019]
ФИГ. 12B иллюстрирует чистые красители и комбинации фильтров основного канала для различных вариантов реализации идей настоящего изобретения.
[0020]
ФИГ. 13 иллюстрирует % отклонения для смесей красителей перед нормализацией в соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения.
[0021]
ФИГ. 14 иллюстрирует % отклонения для смесей красителей после нормализации в соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения.
[0022]
ФИГ. 15 иллюстрирует в увеличенном масштабе % отклонения для смесей красителей после нормализации в соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения.
[0023]
ФИГ. 16 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую процесс нормализации в соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения.
[0024]
ФИГ. 17 иллюстрирует типовой способ валидации прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.
[0025]
ФИГ. 18 иллюстрирует другой типовой способ валидации прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.
[0026]
ФИГ. 19 иллюстрирует определение некоторого количества пороговых значений флуоресценции по данным амплификации в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.
[0027]
ФИГ. 20 иллюстрирует систему для валидации прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.
[0028]
ФИГ. 21 иллюстрирует систему для калибровки прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0029]
Типовые системы для способов, связанных с различными вариантами реализации, описанными в данном документе, включают описанные в заявке на патент США на промышленный образец номер___ (Life Technologies Docket Number LT01000 DES) и предварительной заявке на патент США номер___ (Life Technologies Docket Number LT01011 PRO), и предварительной заявке на патент США номер___ (Life Technologies Docket Number LT01023 PRO), и предварительной заявке на патент США номер___ (Life Technologies Docket Number LT01025 PRO), и предварительной заявке на патент США номер___ (Life Technologies Docket Number LT01028 PRO), и предварительной заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01029 PRO), и предварительной заявке на патент США номер___ (Life Technologies Docket Number LT01032 PRO), и предварительной заявке на патент США номер___ (Life Technologies Docket Number LT01033 PRO), которые все были поданы 6 февраля 2015 г. и в полном объеме также включены в данный документ посредством ссылки.
[0030]
Чтобы обеспечить более полное понимание настоящего изобретения в нижеприведенном описании приведены многочисленные специфические подробности, такие как специфические конфигурации, параметры, примеры и тому подобное.  Однако следует понимать, что такое описание не подразумевает ограничения объема настоящего изобретения, но предназначено для обеспечения лучшего описания типовых вариантов реализации.
[0031]
Прогресс в области калибровки приборов для биологического анализа обеспечивает преимущественную возможность снизить количество ошибок пользователя, снизить количество вводимой пользователем информации и снизить время, необходимое для калибровки прибора для биологического анализа и различных его компонентов для надлежащей и эффективной инсталляции.
[0032]
Таким образом, в соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения в автоматическую систему калибровки и валидации можно водить экспертные знания, обеспечивающие уведомление об успешном/неуспешном прохождении процесса и информацию по выявленным проблемам в случае неуспеха.  Если на приборе не удается провести калибровочный процесс, следует вызвать инженера по эксплуатационному обслуживанию.  Идеи настоящего изобретения могут минимизировать стоимость и время, необходимые для инсталляционных и калибровочных процедур.
[0033]
Следует понимать, что описанные в данном документе способы и системы могут быть осуществлены в отношении различных типов систем, приборов и устройств, таких как системы для биологического анализа.  Например, различные варианты реализации могут быть осуществлены с помощью прибора, системы или устройства, которое позволяет проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для множества проб.  Хотя в общем случае это относится к количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), когда обрабатывается большое количество проб, следует понимать, что в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации можно применять любой подходящий способ ПЦР.  Подходящие способы ПЦР включают, но не ограничиваются этим, например, цифровую ПЦР, аллель-специфическую ПЦР, ассиметричную ПЦР, опосредованную лигированием ПЦР, мультиплексную ПЦР, гнездовую ПЦР, кПЦР, прогулку по геному и мостовую ПЦР.  Кроме того, в контексте данного документа амплификация может включать, например, применение термоциклера, изотермической амплификации, тепловой конвекции, опосредованного инфракрасным излучением циклического изменения температуры или геликаза-зависимой амплификации.
ОБЩИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КАЛИБРОВКИ
[0001]
Биологические приборы часто используются для получения точных и надежных экспериментальных данных.  Регулярная калибровка и техническое обслуживание биологических приборов гарантируют надлежащую и оптимальную работу прибора, что может максимизировать продуктивность, минимизировать дорогостоящие ремонтные работы путем решения потенциальных проблем до их проявления и повысить качество результатов.
[0002]
В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения описанные в данном документе способы калибровки можно осуществлять отдельно или вместе в любой комбинации.  Кроме того, описанные в данном документе способы калибровки можно осуществлять после производства для проведения начальной калибровки или в любое время после начальной установки и применения.  Описанные в данном документе способы калибровки можно осуществлять, например, еженедельно, ежемесячно, раз в полгода, ежегодно или по необходимости.
[0003]
В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения способы калибровки, такие как калибровка области интереса (ОИ), калибровка фона, калибровка однородности, калибровка чистого красителя, нормализация прибора, применяют для определения положения и интенсивности флуоресцентных сигналов в каждом считывании, красителя, ассоциируемого с каждым флуоресцентным сигналом и значимости сигнала.  Кроме того, в соответствии с различными вариантами реализации можно осуществлять автоматическую коррекцию красителя, автоматическую калибровку фона и детекцию планшета для дополнительной оптимизации детекции и считывания показаний красителей, а также определения погрешностей.  Валидация надлежащего функционирования прибора также может автоматически осуществляться системой посредством валидации с помощью РНКазы Р.
[0004]
ФИГ. 1 иллюстрирует типовой технологический процесс калибровки 100, который можно проводить на приборе в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.  Следует понимать, что технологический процесс калибровки 100 является примером, и что описанные в данном документе способы калибровки можно проводить отдельно или в комплекте в любой комбинации и порядке.
[0005]
На этапе 102 проводят калибровку ОИ.  В общем случае калибровка ОИ дает информацию, определяющую положения лунок в поле обзора детектора.  Согласно идеям настоящего изобретения калибровку ОИ можно автоматизировать путем минимизации или исключения вмешательства пользователя.  В различных вариантах реализации этот процесс можно автоматизировать путем обеспечения способов и систем, которые определяют оптимальное время экспозиции для каждого фильтра, используя анализ гистограмм и двоичную схему поиска.  Калибровка ОИ в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации позволяет определять положение лунок на изображении более точно и с меньшим количеством ошибок по сравнению с более ранними способами.  способы и системы для калибровки ОИ в соответствии с различными вариантами реализации дополнительно описаны ниже.
[0006]
На этапе 104 проводят калибровку фона.  Часто детектор считывает некоторое количество сигнала даже в отсутствие пробы, излучающей детектируемый сигнал.  Учет этого фонового сигнала может быть важен, так как фоновый сигнал можно вычитать из считанного сигнала пробы с целью получения более точного измерения сигнала пробы.  Калибровку фона можно проводить, используя планшет с водой для определения фонового сигнала прибора для каждой комбинации фильтр/лунка.  Данный этап может быть автоматизирован, чтобы минимизировать или исключить вмешательство пользователя.  Можно обеспечить автоматическую обработку, которая будет проверять, был ли использован правильный планшет для калибровки фона.  Например, этап 104 обеспечивает возможность оценки уровня сигнала и устранение вероятности использования неправильного тестового планшета, такого как излучающий сильный сигнал тестовый планшет, применяемый для калибровки ОИ.  Если уровень сигнала сильно превышает ожидаемый фоновый уровень, пользователь может быть предупрежден о необходимости внесения надлежащего тестового планшета.  Также на этой стадии можно исследовать загрязнение одной или более лунок тестового планшета, проверяя наличие сильной расходимости уровней сигнала, и в случае обнаружения, запуская предупреждение, указывающее на возможное наличие грязных или загрязненных лунок.  Загрязненные лунки могут приводить к вычитанию неправильного уровня фонового сигнала из уровня сигнала пробы.
[0007]
На этапе 106 проводят калибровку однородности.  В некоторых случаях вариации в геометрии планшета (кривизна, толщина) могут приводить к варьированию считываемых показателей интенсивности по планшету, несмотря на присутствии одинакового количества флуоресцентного красителя в каждой лунке.  Калибровка однородности может калибровать прибор, используя планшет с некоторым количеством красителей так, чтобы ввести поправку на вариации интенсивности вследствие вариаций, связанных с планшетом.  Этап 106 может быть автоматизирован, чтобы минимизировать или исключить вмешательство пользователя.  Часть этой автоматической обработки может включать выявление применения неправильного калибровочного планшета, а также выявление и поправки на пустые или загрязненные лунки в калибровочном планшете.
[0008]
На этапе 108 проводят калибровку чистого красителя.  Калибровка флуоресцентных красителей, применяемых в приборах для кПЦР, позволяет приборному программному обеспечению использовать калибровочные данные, полученные для эталонных красителей, чтобы охарактеризовать и разделить индивидуальный вклад каждого красителя в общую флуоресценцию, измеряемую прибором.  В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения после проведения эксперимента приборное программное обеспечение получает данные в форме исходного спектрального сигнала для каждого считывания.  Программное обеспечение определяет вклад каждого из флуоресцентных красителей, применяемых в каждом реакционном участке, путем сравнения исходных спектров, полученных для каждого красителя, с калибровочными данными чистых спектров.  Когда пользователь сохраняет данные эксперимента после анализа, приборное программное обеспечение хранит чистые спектры вместе с полученными данными флуоресценции для этого эксперимента, а также данные по вкладу каждого флуоресцентного красителя на лунку.  Данный способ дополнительно описан ниже.  Используя калибровку чистого красителя, в соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения, можно использовать меньшее количество калибровочных планшетов, сохраняя средства пользователя и устраняя источники ошибок в калибровке.
[0009]
На этапе 110 проводят калибровку нормализации прибора.  Одной из трудностей, с которыми обычно сталкиваются, является невозможность для исследователей легко сравнивать результаты экспериментов, проводимых на нескольких приборах.  Физические вариации параметров компонентов, таких как, например, источники света, оптические элементы и флуоресцентные датчики, могут приводить к вариации в результатах анализа могущих быть идентичными биологических проб.  Следовательно, существует постоянная необходимость в способах и аппаратах, способствующих минимизации вариаций в компонентах.
[0010]
В случае ПЦР кривые амплификации часто определяют путем нормализации сигнала репортерного красителя относительно пассивного эталонного красителя в том же растворе.  Эту нормализацию можно представить в виде нормализованных значений флуоресценции, обозначаемых «Rn».  Нормализация с помощью пассивного эталона обеспечивает корректные значения Rn даже в случае, когда на общий уровень сигнала влияет объем жидкости или общая интенсивность освещения.  Однако нормализация с помощью пассивного эталона не может работать надлежащим образом, когда в сигнале варьируется соотношение между репортерным красителем и эталонным красителем, например, в случае различий в спектре освещения между разными приборами.  В соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации калибровка нормализации прибора включает считывание флуоресценции от смеси красителей для получения «коэффициента нормализации» для коррекции значений Rn, что требует дополнительных затрат.
[0011]
На этапе 112 проводят валидацию с помощью РНКазы Р.  Проведение валидационного испытания позволяет проверить, функционирует ли прибор надлежащим образом.  Например, валидация с помощью РНКазы Р позволяет определить возможность прибора делать точное различие между двумя разными количествами пробы.  Ранее валидацию с помощью РНКазы Р проводили вручную, используя стандартную кривую, при этом пользователь делал статистические расчеты для валидации прибора.  В соответствии с различными вариантами реализации, описанными в настоящем изобретении, валидация с помощью РНКазы Р может автоматически проводиться системой без использования стандартной кривой.  Различные варианты реализации валидации с помощью РНКазы Р дополнительно описаны ниже.
[0012]
ФИГ. 21 иллюстрирует систему 2100 для калибровки прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.  Система 2100 включает калибратор ОИ 2102, калибратор чистого красителя 2104, калибратор нормализации прибора 2108, валидатор с применение РНКазы Р 2110 и дисплей/GUI 2106.  Калибратор ОИ 2102 выполненный с возможностью определять позиции реакционных участков на изображении.  Калибратор чистого красителя 2104 выполненный с возможностью определять вклад флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя.  Калибратор нормализации прибора 2108 выполненный с возможностью сконфигурирован так, чтобы определять коэффициент нормализации для фильтра.  Валидатор с применением РНКазы Р 2110 выполненный с возможностью проверять возможность прибора различать два разных количества пробы.  Дисплей 2106 выполненный с возможностью отображать результаты калибровки.
[0013]
Идеи настоящего изобретения описаны в отношении приборов для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).  В частности, один вариант реализации идей настоящего изобретения осуществляется для приборов ПЦР-РВ с применением оптической визуализации луночных планшетов.  Такие приборы могут иметь возможность одновременно измерять сигналы от множества проб или точек в аналитических целях и часто требуют калибровки, включая, но не ограничиваясь этим, процессы, включающие: определение ОИ (области интереса), определение фонового сигнала, однородности и спектральную калибровку чистого красителя для многокомпонентного анализа.  Калибровка также может включать проверочную реакцию ПЦР-РВ с применением планшета с известной пробой с ожидаемым результатом.  Специалисту в данной области техники очевидно, что, хотя идеи настоящего изобретения были описаны с помощью примеров, относящихся к приборам ПЦР-РВ, их принципы имеют широкое применение в отношении других форм лабораторных приборов, для которых может требоваться калибровка и верификация для гарантии точности и/или оптимальности результатов.
ПРИБОРЫ ДЛЯ ПЦР
[0014]
Как указано выше, прибором, который можно применять в соответствии с различными вариантами реализации, но без ограничений, является прибор для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).  ФИГ.  2 представляет собой блок-схему, которая иллюстрирует прибор для проведения ПЦР 200, на котором можно осуществлять варианты реализации идей настоящего изобретения.  Прибор для ПЦР 200 может включать нагревательную крышку 210, которая размещается над некоторым количеством проб 212, содержащихся на подложке (не показано).  В различных вариантах реализации подложка может представлять собой стеклянный или пластиковый слайд с множеством участков с пробами, при этом участки с пробами имеют покрытие между участками с пробами и нагревательной крышкой 210.  Некоторые примеры подложек могут включать, но не ограничиваются этим, многолуночный планшет, такой как стандартный микротитровальный 96-луночный, 384-луночный планшет, или микропанель, или в значительной степени плоскую подложку, такую как стеклянный или пластиковый слайд.  Реакционные участки в различных вариантах реализации подложек могут включать углубления, выемки, борозды и их комбинации, упорядоченные в регулярные или нерегулярные структуры, образуемые на поверхности подложки.  Различные варианты реализации приборов для ПЦР включают термоблок 214, элементы для нагревания и охлаждения 216, теплообменник 218, систему управления 220 и пользовательский интерфейс 222.  Различные варианты реализации установки термоблока в соответствии с идеями настоящего изобретения содержат компоненты 214-218 прибора для ПЦР 200 с ФИГ. 2.
[0015]
Прибор для проведения ПЦР в режиме реального времени 200 имеет оптическую систему 224.  На ФИГ.  2 оптическая система 224 может иметь источник света (не показан), который излучает электромагнитную энергию, оптический датчик, детектор или визуализатор (не показан) для получения электромагнитной энергии от проб 212 на подложке и оптику 240, применяемую для направления электромагнитной энергии от каждой пробы ДНК на визуализатор.  В случае вариантов реализации прибора для ПЦР 200 на ФИГ.  2 и прибора для ПЦР в режиме реального времени 200 на ФИГ.  2 систему управления 220 можно использовать для управления функциями детектирующей системы, нагревательной крышки и установки термоблока.  Система управления 220 может быть доступна конечному пользователю через пользовательский интерфейс 222 прибора для ПЦР 200 на ФИГ.  2 и прибора для ПЦР в режиме реального времени 200 на ФИГ. 2. Также компьютерная система 200, изображенная на ФИГ.  2, может служить для обеспечения управления функциями прибора для ПЦР 200 на ФИГ.  2, а также функциями пользовательского интерфейса.  Кроме того, компьютерная система 400 с ФИГ.  4 может обеспечивать функции обработки, вывода данных и составления отчета.  Все такие функции управления прибора могут быть направлены локально на прибор для ПЦР, или же компьютерная система 400 с ФИГ.  4 может обеспечивать удаленное управление частью или всеми управляющими, аналитическими и отчетными функциями, что будет более подробно обсуждено далее.
ОПТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ
[0016]
ФИГ. 3 иллюстрирует типовую оптическую систему 300, которую можно применять для визуализации в соответствии с описанными в данном документе вариантами реализации. Следует понимать, что оптическая система 300 представляет собой типовую оптическую систему, а специалисту в данной области техники понятно, что для получения изображения представляющих интерес объектов можно применять другие оптические системы.  В соответствии с различными вариантами реализации представляющий интерес объект может быть держателем проб, таким как, например, описанный в данном документе калибровочный планшет.  Оптический датчик 302, встроенный в камеру 304, может, например, визуализировать представляющий интерес объект 310.  Оптический датчик 302 может представлять собой ПЗС-датчик, а камера 304 может представлять собой ПЗС-камеру.  Кроме того, оптический датчик включает линзы камеры 306.
[0017]
В зависимости от представляющего интерес объекта можно выбирать фильтр излучения 308 для визуализации представляющего интерес объекта 310 в соответствии с различными вариантами реализации.  В других вариантах реализации фильтр излучения 308 можно заменять для визуализации флуоресцентного излучения, испускаемого представляющим интерес объектом 301.
[0018]
В оптической системе 300 может использоваться источник отраженного света 312 для визуализации представляющего интерес объекта 310.  Свет от источника света 312 может фильтроваться через асферику 314, фокусирующее/разводящее устройство 316 и фильтр возбуждения 318 перед отражением на представляющий интерес объект 310 с помощью делителя пучка 320.  Оптическая система 300 также может содержать полевые линзы 322.  В зависимости от представляющего интерес объекта можно выбирать или заменять фильтр возбуждения 308 для визуализации представляющего интерес объекта 310 в соответствии с различными вариантами реализации.
[0019]
Следующее описание различных вариантов осуществления идей настоящего изобретения представлено в целях иллюстрации и описания.  Оно не является исчерпывающим и не ограничивает идеи настоящего изобретения конкретной раскрытой формой.  С учетом описанных выше идей возможны модификации и вариации, или же они могут возникнуть при практической реализации идей настоящего изобретения.  Кроме того, описанное осуществление включает применение программного обеспечения, но идеи настоящего изобретения могут быть осуществлены в виде комбинации аппаратного обеспечения и программного обеспечения или только аппаратного обеспечения.  Идеи настоящего изобретения могут быть осуществлены с использованием как ориентированных на объект, так и не ориентированных на объект систем программирования.
[0020]
КОМПЬЮТЕРИЗИРОВАННАЯ СИСТЕМА
[0021]
ФИГ. 4 представляет собой блок-схему, которая иллюстрирует компьютерную систему 400, которую можно применять для осуществления функции обработки данных в соответствии с различными вариантами реализации.  Приборы для проведения экспериментов могут быть подсоединены к типовой компьютерной системе 400.  Компьютерная система 400 может включать один или более процессоров, таких как процессор 404.  Процессор 404 можно использовать, применяя механизм обработки общего или специального назначения, такой как, например, микропроцессор, контроллер или другая логика управления.  В этом примере процессор 404 подсоединен к шине 402 или другой среде передачи данных.
[0022]
Кроме того, следует понимать, что компьютерная система 400 по ФИГ.  4 может быть реализована в любой из множества форм, таких как закрепленный в стойке компьютер, универсальный компьютер, суперкомпьютер, сервер, клиент, стационарный компьютер, переносной компьютер, планшетный компьютер, мобильное компьютерное устройство (например, КПК, мобильный телефон, смартфон, портативный компьютер и т.д.), кластерная вычислительная система, нетбук, встроенные системы или любой другой тип компьютерного устройства общего или специального назначения, который может требоваться или подходить для заданного применения или среды.  Кроме того, компьютерная система 400 может включать традиционную сетевую систему, включая клиент-серверную среду и один или более серверов баз данных, или интеграцию с инфраструктурой LIS/LIMS.  В данной области техники известно большое количество традиционных сетевых систем, включая локальную сеть (LAN (от англ. «local area network»)) или глобальную сеть (WAN (от англ. «wide area network»)), и включая беспроводные и/или проводные компоненты.  Кроме того, клиент-серверные среды, серверы баз данных и сети хорошо описаны в данной области техники.  В соответствии с описанными в данном документе различными вариантами реализации компьютерная система 400 может быть выполнена с возможностью подсоединяться к одному или более серверам в распределенной сети.  Компьютерная система 400 может получать информацию или обновления из распределенной сети.  Компьютерная система 400 также может передавать для хранения в распределенной сети информацию, к которой могут иметь доступ другие клиенты, подсоединенные к распределенной сети.
[0023]
Компьютерная система 400 может включать шину 402 или другой механизм взаимодействия для передачи информации и процессор 404, подсоединенный к шине 402 для обработки информации.
[0024]
Компьютерная система 400 также включает память 406, которая может представлять собой оперативное запоминающее устройство (ОЗУ (RAM)) или другое динамическое запоминающее устройство, подсоединенное к шине 402, для хранения инструкций, предназначенных для выполнения процессором 404.  Память 406 также можно использовать для хранения временных переменных или другой промежуточной информации во время выполнения инструкций, предназначенных для выполнения процессором 404.  Компьютерная система 400 дополнительно включает постоянное запоминающее устройство (ПЗУ (ROM)) 408 или другое статическое запоминающее устройство, подсоединенное к шине 402, для хранения статической информации и инструкций для процессора 404.
[0025]
Компьютерная система 400 также может включать запоминающее устройство 410, такое как магнитный диск, оптический диск или твердотельный накопитель (SSD (от англ. «solid state drive»)), подсоединенное к шине 402 для хранения информации и инструкций.  Запоминающее устройство 410 может включать дисковод и интерфейс съемного носителя.  Дисковод может включать дисковод или другой механизм для поддержки стационарных или съемных носителей, такой как дисковод для жестких дисков, дисковод для дискет, накопитель на магнитной ленте, оптический дисковод, дисковод для CD или DVD (R или RW), флеш-накопитель или другой съемный или стационарный дисковод.  Как иллюстрируют эти примеры, носители могут включать машиночитаемые носители с хранимым на них конкретным компьютерным программным обеспечением, инструкциями или данными.
[0026]
В альтернативных вариантах реализации запоминающее устройство 410 может включать другие сходные технические средства для обеспечения возможности загрузки компьютерных программ или других инструкций или данных в компьютерную систему 400.  Такие технические средства могут включать, например, съемное запоминающее устройство и интерфейс, такие как программный картридж и интерфейс картриджа, съемную память (например, флеш-память или другой съемный модуль памяти) и слот памяти, а также другие съемные запоминающие устройства и интерфейсы, которые позволяют переносить программное обеспечение и данные с запоминающего устройства 410 в компьютерную систему 400.
[0027]
Компьютерная система 400 также может включать коммуникационный интерфейс 418.  Коммуникационный интерфейс 418 можно использовать для переноса программного обеспечения и данных между компьютерной системой 400 и внешними устройствами.  Примеры коммуникационного интерфейса 418 могут включать модем, сетевой интерфейс (такой как Ethernet или другая карта NIC), коммуникационный порт (такой как, например, порт USB, последовательный порт RS-232C), слот и карта PCMCIA, Bluetooth и т.д. Программное обеспечение и данные, переносимые через коммуникационный интерфейс 418, имеют форму сигналов, которые могут быть электрическими, электромагнитными, оптическими и/или другими сигналами, которые способен получать коммуникационный интерфейс 418.  Эти сигналы могут быть переданы и получены коммуникационным интерфейсом 418 через канал, такой как беспроводная среда, провод или кабель, оптоволокно или другая коммуникационная среда.  Некоторые примеры каналов включают телефонную линию, соединение через мобильный телефон, RF-соединение, сетевой интерфейс, локальную или глобальную сеть и другие коммуникационные каналы.
[0028]
Компьютерная система 400 может быть подсоединена посредством шины 402 дисплею 412, такому как электронно-лучевая трубка (ЭЛТ (CRT)) или жидкокристаллический дисплей (ЖКД (LCD)), для отображения информации для пользователя компьютера.  Например, устройство для ввода данных 414, включая буквенно-цифровые и другие клавиши, подсоединено к шине 402 для передачи информации и выбора инструкций для процессора 404.  Устройство для ввода данных также может представлять собой дисплей, такой как LCD-дисплей, выполненный с возможностью сенсорного ввода данных.  Другим типом пользовательского устройства для ввода данных является устройство для управления курсором 416, такое как мышка, трекбол или клавиши управления курсором, для передачи управляющей информации и выбора инструкций для процессора 404 и для управления движением курсора на дисплее 412.  Это устройство для ввода данных, как правило, имеет две степени свободы вдоль двух осей, первой оси (например, x) и второй оси (например, y), что позволяет устройству определять положение на плоскости.  Компьютерная система 400 обеспечивает обработку данных и обеспечивает уровень достоверности таких данных. В соответствии с определенными осуществлениями вариантов реализации идей настоящего изобретения обработка данных и значения достоверности обеспечиваются компьютерной системой 400 в ответ на выполнение процессором 404 одной или более последовательностей одной или более инструкций, содержащихся в памяти 406.  Такие инструкции могут быть считаны в память 406 с другого машиночитаемого носителя, такого как, например, запоминающее устройство 410.  Выполнение последовательностей инструкций, содержащихся в памяти 406, приводит к осуществлению процессором 404 описанных в данном документе состояний процесса.  В альтернативном варианте для осуществления идей настоящего изобретения вместо или в комбинации с программными инструкциями можно использовать проводную схему.  Таким образом, осуществления идей настоящего изобретения не ограничены какой-либо конкретной комбинацией проводной схемы и программного обеспечения.
[0029]
Употребляемый в данном документе термин «машиночитаемый носитель» и «компьютерный программный продукт» в общем случае относится к любым носителям, которые участвуют в обеспечении одной или более последовательностей одной или более инструкций для выполнения процессором 404.  Такие инструкции, в общем случае называемые «компьютерным программным кодом» (который может быть представлен в форме компьютерных программ или других схем), при выполнении обеспечивают возможность осуществления компьютерной системой 400 признаков или функций вариантов реализации настоящего изобретения.  Эти и другие формы постоянных машиночитаемых носителей могут быть представлены многими формами, включая, но не ограничиваясь этим, энергонезависимые носители, энергозависимые носители и носители для передачи данных.  Энергонезависимые носители включают, например, твердотельные, оптические или магнитные диски, такие как запоминающее устройство 410.  Энергозависимые носители включают динамическую память, такую как память 406.  Носители для передачи данных включают коаксиальные кабели, медный провод и оптоволокно, включая провода, которые составляют шину 402.
[0030]
Обычные формы машиночитаемых носителей включают, например, дискету, гибкий диск, жесткий диск, магнитную ленту или любой другой магнитный носитель, CD-ROM, любой другой оптический носитель, перфорированные карты, бумажную ленту, любой другой физический носитель с сеткой отверстий, RAM, PROM и EPROM, FLASH-EPROM, любой другой кристалл или картридж памяти, несущую волну, как описано далее в данном документе, или любой другой носитель, с которого может происходить считывание на компьютер.
[0031]
Различные формы машиночитаемых носителей могут быть вовлечены в перенос одной или более последовательностей одной или более инструкций для выполнения процессором 404.  Например, инструкции могут быть изначально перенесены на магнитный диск удаленного компьютера.  Удаленный компьютер может загружать инструкции в свою динамическую память и пересылать инструкции посредством телефонной линии, используя модем.  Модем, находящийся по месту компьютерной системы 400, может получать данные по телефонной линии и использовать инфракрасный передатчик для преобразования данных в инфракрасный сигнал.  Инфракрасный датчик, подсоединенный к шине 402, может получать данные, которые несет инфракрасный сигнал, и передавать данные на шину 402.  Шина 402 передает данные на память 406, от которой процессор 404 получает и исполняет инструкции.  Инструкции, получаемые памятью 406, необязательно могут храниться на запоминающем устройстве 410 как до, так и после выполнения процессором 404.
[0032]
Следует понимать, что в целях ясности в вышеприведенном описании описаны варианты реализации изобретения с отсылкой к разным функциональным единицам и процессорам.  Однако очевидно, что можно применять любое подходящее распределение функциональных возможностей между разными функциональными единицами, процессорами или доменами, не отступая от изобретения.  Например, функциональные возможности, проиллюстрированные, как выполняемые отдельными процессорами или контроллерами, могут осуществляться одним процессором или контроллером.  Следовательно, отсылки к конкретным функциональным единицам следует воспринимать исключительно как отсылки к подходящим средствам для обеспечения описанных функциональных возможностей, а не как указывающие на жесткую логическую или физическую структуру или организацию.
РАСПРЕДЕЛЕННАЯ СИСТЕМА
[0033]
Некоторые из элементов типичной конфигурации сети Интернет показаны на ФИГ.  5, где показано, что некоторое количество клиентских машин 502, возможно находящихся в удаленном локальном офисе, подсоединены к шлюзу/хабу/туннельному серверу/и т.д. 510, который сам подсоединен к интернету 508 посредством соединения, обеспечиваемого некоторым поставщиком услуг Интернета (ISP (от англ. «internet service provider»)) 510.  Также показаны другие возможные клиенты 512, также подсоединенные к интернету 508 посредством подсоединения через ISP 514, причем эти устройства, возможно, обмениваются информацией с центральной лабораторией или офисом, например, посредством подсоединения через ISP 516 к шлюзу/туннельному серверу 518, который подсоединен 520 к различным серверам корпоративного приложения 522, которое может быть подсоединено через другой хаб/маршрутизатор 526 к различным локальным клиентам 530.  Любой из этих серверов 522 может функционировать как сервер разработки для анализа потенциального управления содержимым и осуществления проектных решений, как описано в настоящем изобретении и как более полно описано ниже.
КАЛИБРОВКА ОБЛАСТИ ИНТЕРЕСА (ОИ)
[0034]
Как указано выше, идеи настоящего изобретения описаны в отношении приборов для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). В частности, один вариант реализации идей настоящего изобретения осуществляется для приборов ПЦР-РВ с применением оптической визуализации луночных планшетов. Такие приборы могут иметь возможность одновременно измерять сигналы от множества проб или точек в аналитических целях и часто требуют калибровки.  Примером процесса, который может требовать калибровки, является определение ОИ или области интереса.
[0035]
В общем случае калибровку ОИ можно проводить, используя планшет с сильным излучением в каждой ячейке, соответствующей всем фильтрам.  Это может быть целесообразно, так как ОИ могут не быть идентичными для каждого фильтра.  Разница в ОИ между фильтрами может возникать вследствие небольших угловых различий для фильтров и других спектральных характеристик фильтров.  Таким образом, в различных вариантах реализации проводят калибровку ОИ на фильтр/на лунку (ОИ-НФНЛ).  Эти калибровки ОИ-НФНЛ применимы для определения положений лунок в 96-луночном планшете для каждого фильтра.  Калибровку ОИ можно проводить, используя способ, такой как принцип адаптивного изготовления шаблона, описанный в патенте США  № 6518068 Bl.
[0036]
Согласно идеям настоящего изобретения калибровку ОИ можно автоматизировать путем минимизации или исключения вмешательства пользователя.  В различных вариантах реализации этот процесс можно автоматизировать путем обеспечения программного обеспечения, которое определяет оптимальное время экспозиции для каждого фильтра, используя анализ гистограмм и двоичную схему поиска.  Время экспозиции представляет собой количество времени, необходимого для получения изображения планшета.  Опять же, это значение может варьироваться в соответствии со спектральными характеристиками фильтра.  В общем случае калибровка ОИ дает информацию, определяющую положения лунок в поле обзора детектора. Эта информация может сохраняться в виде шаблонных файлов с глобальным шаблоном или множественными шаблонами, соответствующими разным фильтрам.
[0037]
В процессах калибровки, таких как описанный выше, часто используются проекции рядов и колонок и профили интенсивности.  Это может привести к восприимчивости определения ОИ к артефактам и насыщению внутри лунок, вращению сетки, вариации коэффициентов усиления и оптической радиальной дисторсии.  Следовательно, может быть преимущественным иметь в распоряжении более функциональный способ определения ОИ, чтобы минимизировать такую восприимчивость и устранить дисторсии и другой нежелательный фоновый шум в данных регистрируемого излучения.
[0038]
Фоновым шумом может называться характерный для системы шум, а также другие нежелательные сигналы.  Например, некоторое количество фонового шума в данных может возникать вследствие наличия на подложке физических источников, таких как, например, частицы пыли или царапины.  Другим примером физического источника, который может обеспечивать фоновый шум, является держатель или помещение в кожух, или заключение пробы.  Другой тип фонового шума в данных может появляться вследствие естественного излучения в приборе, такого как отражение или естественная флуоресценция.  Другой тип фонового шума также может быть связан, например, с оптической системой, регистрирующей данные излучения, или источником света.
[0039]
Биологический прибор может регистрировать от нескольких сотен до нескольких тысяч проб, которые все могут иметь очень маленький объем, например, менее одного нанолитра.  Следовательно, можно использовать другие способы устранения фонового шума, одни или в комбинации с описанными в данном документе способами калибровки в соответствии с различными вариантами реализации, чтобы иметь возможность определить и проанализировать данные по излучению от объемов проб.  В некоторых вариантах реализации расположение объемов проб в пределах подложки можно определить более точно для проведения более точного анализа.  Например, в случае анализа способом цифровой ПЦР возможность более точно отличать реакции в объемах проб от не-реакций может обеспечить более точные результаты.  Даже более, в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации можно отличать пустые лунки или сквозные отверстия от объемов проб в лунках или непрореагировавших сквозных отверстий, которые можно также отличать от объемов проб в лунках или прореагировавших сквозных отверстий.
[0040]
В соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации устранение фонового шума может включать анализ и обработку данных изображения.  Указанный способ может включать анализ значений интенсивности данных изображения для интерполяции фонового шума, который может быть удален с изображения подложки.  Расположение областей интереса в пределах изображения также можно определить таким образом.  Устранение фонового шума также может включать интерполяцию данных с областей изображения, которые, как известно, включают области интереса.  После определения фонового шума для всего изображения фоновый шум может быть вычтен из данных изображения.
[0041]
ФИГ. 6 иллюстрирует типовой виртуальный способ 600 в соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения.  Виртуальный способ 600 включает множество установочных подпрограмм для технологического процесса в машиночитаемом формате, которые могут включать подпрограммы для биотехнологического процесса.  ФИГ. 6 представляет собой просто типовой способ, а специалисту в данной области техники в свете данного изобретения будет понятно, что действительное число подпрограмм может варьироваться от по меньшей мере около 2 подпрограмм до большого количества (например, 2-10, 2-20, 2-30, 2-n (где n может быть любым числом подпрограмм от 3-100, 3-1000 и т.д.)).  Каждая установочная подпрограмма 310 - 370 может включать один этап или задачу или, необязательно, может включать более 1 этапа или задачи, также в машиночитаемом формате, а каждый этап может дополнительно включать добавочные необязательные настраиваемые этапы или задачи.  Каждый из необязательных/настраиваемых этапов или задач может иметь один или более необязательных параметров (опций), которые могут просматриваться, перепросматриваться, устанавливаться или настраиваться пользователем.  В некоторых вариантах реализации виртуальный способ по изобретению включает выбор пользователем по меньшей мере одного параметра для каждого необязательного/настраиваемого этапа биотехнологического процесса с помощью графического пользовательского интерфейса (ГПИ) для выбора по меньшей мере одного параметра для каждого необязательного/настраиваемого этапа.  В определенных вариантах реализации каждый этап и каждый параметр подпрограмм технологического процесса доступны для просмотра и, необязательно, редактирования пользователем.  В биоинформационных программах, как правило, некоторые из этих параметров и/или этапов скрыты от пользователей, что приводит к неудовлетворенности пользователя и неэффективности, в особенности, когда результат виртуально поставленного эксперимента не совпадает с ожидаемым результатом для пользователя.
[0042]
Типовой виртуальный способ по изобретению, в общих чертах проиллюстрированный на ФИГ.  6, можно осуществлять (проводить) путем создания по меньшей мере одного файла способа в компьютерной системе (такой, как показана на ФИГ.  4), при этом файл способа содержит машиночитаемые инструкции для множества подпрограмм (10, 20, 30..) настраиваемых этапов (A, B, C), каждый из которых может иметь один или более параметров, которые можно просматривать, выбирать, менять или вводить; и виртуального проведения биотехнологического процесса, содержащего выполнение по меньшей мере одного файла способа, содержащего машиночитаемые инструкции, компьютерной системой для получения по меньшей мере одного биотехнологического продукта.
[0043]
В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один настраиваемый/необязательный параметр выбран из параметра по умолчанию, при этом параметр по умолчанию хранится в компоненте компьютерной системы (таком как запоминающее устройство, база данных и т.д.).
[0044]
Снова обращаясь к ФИГ.  6, первым этапом в расчете положений ОИ является оценка центров исходных ОИ по порогу флуоресценции на этапе 610.  Обеспечивают планшет с пробами, выполненный с возможностью содержать множество биологических проб, и вносят в аналитический прибор с возможностью анализировать биологические пробы посредством процесса ПЦР.  Каждая биологическая проба содержится в лунке для пробы и может быть возбуждена источником света, и в ответ на возбуждение может флуоресцировать на предопределенной длине волны, что можно зарегистрировать с помощью детектора флуоресценции.  Как указано выше в отношении Фиг. 2, источником света 202 может быть лазер, LED или другой тип источника возбуждения с возможностью излучения спектра, который взаимодействует со спектральными компонентами, предназначенными для регистрации системой 200.  Кроме того, биологические пробы могут включать спектрально различимые красители, такие как один или более из FAM, SYBR зеленого, VIC, JOE, TAMRA, NED, CY-3, Техасского красного, CY-5, ROX (пассивный эталон) или любых других флуорохромов, которые излучают сигнал, который можно зарегистрировать.
[0045]
Перед возбуждением биологических проб устанавливают параметры ввода и параметры алгоритма, чтобы обеспечить стартовую точку для определения ОИ.  Параметры ввода могут включать размер лунок, расстояние между центрами лунок, число оптических пикселей на миллиметр и схему планшета.  Схема планшета может включать общее число лунок и конфигурацию лунок для проб.  Часто используемой конфигурацией может быть прямоугольная структура, содержащая множество рядов и множество колонок, однако специалисту в данной области техники понятно, что конфигурация может иметь любую геометрию, подходящую для применяемого прибора.  Более того, общее число лунок может варьироваться.  Специалисту в данной области техники известны конфигурации, включающие всего от 1 лунки до тысяч лунок в одном планшете для проб или структуре для содержания проб.  С помощью параметров алгоритма обнаружения ОИ можно установить приемлемые диапазоны для размера лунок, расстояния между центрами лунок и минимальной степени округлости.  Степень округлости является рассчитываемой величиной и может представлять собой отношение периметра к площади.
[0046]
После определения параметров ввода и параметров алгоритма множество проб возбуждают энергией от подходящего источника света и получают изображения флуоресценции, излучаемой каждой лункой с пробой на планшете для проб.  Изображения флуоресценции планшета для проб дополнительно анализируют, чтобы выбрать варианты ОИ на основании параметров ввода и параметров алгоритма.  Варианты ОИ, которые удовлетворяют параметрам ввода, сохраняют для дополнительного анализа и определяют размер и степень округлости каждой лунки на этапе 620.  Варианты ОИ, которые не удовлетворяют параметрам, могут быть отброшены вместе с любыми не флуоресцирующими локациями.  Оставшиеся варианты ОИ дополнительно оценивают, чтобы определить расстояние между ОИ на основании параметра, определяющего расстояние между лунками, и разрешенным параметром порядка для расстояния между лунками.  ОИ, которые имею центры, находящиеся в непосредственной близости друг к другу согласно параметрам, определяющим расстояние между лунками, можно считать одной лункой для проб, а в качестве ОИ для этой лунки выбирают тот, который имеет наилучшую степень округлости.  После определения вариантов ОИ рассчитывают средний размер лунок, среднее значение приписывают каждой ОИ лунки для проб на этапе 630 и сохраняют исходные оцененные ОИ.
[0047]
Ожидаемые положения лунок упорядочены по сетчатому шаблону на основании параметра, связанного со схемой планшета.  Этот параметр может включать число лунок, число колонок и число рядов, где каждая лунка характеризуется ожидаемым набором координат сетки XY на основании параметра, связанного со схемой планшета.  Теперь, чтобы лучше определить положения каждой исходной ОИ, можно проводить дополнительный анализ исходных оцененных ОИ, который можно назвать построением глобальным координатной сетки.  Первым этапом построения глобальной координатной сетки является анализ центров исходных оцененных ОИ для того, чтобы найти смежные ОИ.  Это можно определить путем сравнения расстояния между центрами ОИ с координатами сетки на основании параметра, связанного со схемой планшета.  Затем для каждой из исходных оцененных ОИ можно определить координаты сетки XY на основании пространственной взаимосвязи между ОИ.
[0048]
Чтобы улучшить точность определения положений ОИ, было бы целесообразно связать координаты между центрами ОИ с координатами решетки на схеме планшета.  Это можно осуществить путем определения и применения функций картирования.  Функции картирования представляют собой пару 2-мерных квадратичных полиномиальных функций.  Эти функции рассчитывают так, чтобы совместить X (или Y) положения на сетке с положением центров ОИ в направлении X (или Y).  После определения функций картирования их можно применять к ожидаемым координатам сетки для достижения двух целей.  Во-первых, может быть улучшена точность определения положений центров ОИ, а во-вторых, может появиться возможность восстановления ОИ, которые не были учтены во время исходного поиска ОИ.
[0049]
Дополнительная коррекция ОИ может обеспечить дополнительные преимущества в оптических характеристиках.  Авторы изобретения обнаружили существование взаимосвязи между размером ОИ и отношением сигнала к шуму (SNR (от англ. «signal-to-noise ratio»).  Специалисту в данной области техники известно, что существует несколько выражений для расчета SNR электрических и оптических систем.  SNR может быть описано, например, Уравнением 1, ниже:
[0050]
где: где: SNR = отношение сигнала к шуму
Sdye plate = сумма интенсивностей всех пикселей в пределах ОИ для изображений красителя
SBG = сумма интенсивностей всех пикселей в пределах ОИ для фоновых изображений
Sdye = сумма интенсивностей всех пикселей в пределах ОИ для красителя
N = число пикселей в пределах ОИ
offset = смещение камеры
G = увеличение камеры
δ2R,y = шум считывания
[0051]
Эксперимент проводили, используя оптическую систему, которая включала шесть пар фильтров.  Каждая пара фильтров включала фильтр возбуждения (Xn) и фильтр излучения (Mn).  Каждый фильтр был чувствителен к узкому диапазону длин волн, который соответствовал частоте возбуждения и частоте излучения красителя, выполненного с возможностью быть совместимым с процессом ПЦР.  Кроме того, ОИ были оптимизированы в соответствии с идеями, представленными в данном документе.  Чтобы исследовать влияние размера ОИ на отношение сигнала к шуму, регистрировали флуоресценцию от 96-луночного планшета для проб, используя 6 пар фильтров.  Радиус каждой ОИ инструментально расширяли на 1 пиксель.  Уравнение 1 использовали для расчета SNR для каждой из 6 пар фильтров и каждого пиксельного увеличения.  Результаты эксперимента приведены ниже в Таблице 1:
ТАБЛИЦА 1
SNR
X1M1
X2M2
X3M3
X4M4
X5M5
X6M6
ΔR = 0
1709,5
2502,7
1840,3
1613,8
1632,4
475,5
ΔR = 1
1808,2
2642,0
1942,7
1706,3
1709,2
<b>496,8</b>
ΔR = 2
<b>1826,6</b>
2677,8
<b>1964,2</b>
<b>1722,7</b>
<b>1718,8</b>
491,2
ΔR = 3
1818,7
<b>2678,7</b>
1958,4
1717,4
1708,2
479,0
ΔR = 4
1802,5
2667,3
1943,1
1697,6
1690,8
464,7
[0052]
Выделенные жирным шрифтом значения определяют наибольшие SNR для каждой из 6 пар фильтров, а увеличение радиуса на 2 пикселя обеспечивает общее улучшение в SNR приблизительно на 6% среди 6 пар фильтров.
[0053]
На ФИГ. 7 приведено изображение планшета для проб с 96 лунками 710.  Каждая из лунок 710 дает флуоресцентное изображение.  После применения идей данного документа проводили оптимизацию ОИ, а синие круги определяют ОИ для каждого положения лунки.
КАЛИБРОВКА ЧИСТОГО КРАСИТЕЛЯ
[0054]
Как описано выше, существует возрастающая потребность в упрощении инсталляции и установки систем для биологического анализа так, чтобы пользователи могли более быстро и эффективно использовать системы для биологического анализа в своих заданных целях.  Эта необходимость очевидна, например, в случае калибровки приборов для биологического анализа и связанных с ними компонентов.  Одной из типовых калибровок является калибровка флуоресцентных красителей для флуоресцентной детекции в системах для биологического анализа, таких как, например, системы для кПЦР.
[0055]
Калибровка флуоресцентных красителей, применяемых в приборах для кПЦР, позволяет приборному программному обеспечению использовать калибровочные данные, полученные для эталонных красителей, чтобы охарактеризовать и разделить индивидуальный вклад каждого красителя в общую флуоресценцию, измеряемую прибором.  После проведения эксперимента приборное программное обеспечение получает данные в форме исходного спектрального сигнала для каждого считывания.  Программное обеспечение определяет вклад каждого из флуоресцентных красителей, применяемых в каждом реакционном участке, путем сравнения исходных спектров, полученных для каждого красителя, с калибровочными данными чистых спектров. Когда пользователь сохраняет данные эксперимента после анализа, приборное программное обеспечение хранит чистые спектры вместе с полученными данными флуоресценции для этого эксперимента, а также данные по вкладу каждого флуоресцентного красителя на лунку.
[0056]
Результатом калибровки красителей для прибора кПЦР, например, является получение спектральных профилей, которые представляют флуоресцентные характеристики каждого эталонного красителя для каждого реакционного участка.  Каждый профиль состоит из набора спектров, которые соответствуют данным флуоресценции, полученным от реакционных участков, таких как лунки, держателя проб, такого как, например, калибровочный планшет или матричная панель.  После калибровки каждого красителя приборное программное обеспечение «извлекает» спектральный профиль для каждого красителя в каждом реакционном участке.  Программа выводит полученные в результате данные для каждого профиля на график зависимости флуоресценции от фильтра.  Когда программа извлекает данные по калибровке красителей, она оценивает флуоресцентный сигнал, генерируемый каждой лункой, с учетом общих спектров для всего калибровочного планшета или матричной панели.  В общем случае спектры красителей считаются приемлемыми, если они имеют максимум в пределах одного фильтра со своей группой, но немного отклоняются от нормы при других длинах волн.
[0057]
При проведении калибровки красителей в держателе проб, таком как калибровочный планшет, реакционные участки (например, лунки) в общем случае содержат одинаковые концентрации красителя, чтобы обеспечить получение чистых спектральных значений для каждой лунки планшета.  На ФИГ. 8 приведено изображение калибровочного планшета с одним красителем (в данном случае - красителем FAM), занимающим каждую лунку 96-луночного калибровочного планшета.  Это позволяет проводить сравнение флуоресцентного сигнала, генерируемого каждой лункой в эксперименте, с чистыми спектрами, полученными для этой лунки.  При применении одного красителя для каждой лунки калибровочного планшета, получаемые в результате сигналы для лунок должны быть аналогичными.  Вариации в спектральных позициях и позициях пиков могут возникать, например, вследствие небольших различий в оптических свойствах и энергии возбуждения между отдельными лунками.  Учет этих вариаций при калибровке красителей теоретически приводит к более точной калибровке красителей.
[0058]
Однако, применение одного красителя на калибровочный планшет может занимать много времени и создавать сложности, в частности, при калибровке большого числа красителей.  Неограничивающие примеры флуоресцентных красителей включают FAM, VIC, ROX, SYBR, MP, ABY, JUN, NED, TAMRA и CY5.  Следовательно, существует необходимость в упрощении процесса калибровки красителей и уменьшении времени, необходимого для калибровки, и, при этом, сохранении качества результатов калибровки красителей.
[0059]
ФИГ. 9 и 10 иллюстрируют блок-схему, изображающую типовой способ 900 калибровки флуоресцентного(ых) красителя(ей) в соответствии в описанными в данном документе вариантами реализации.  Этапы способа 900 могут быть осуществлены процессором 404, как показано на ФИГ.  4. Кроме того, инструкции для выполнения способа процессором 404 могут храниться в памяти 406.
[0060]
Согласно ФИГ.  9 на этапе 902 готовят калибровочные планшеты путем загрузки красителей в реакционные участки подложки для обработки.  Подложка в данном случае представляет собой 96-луночный планшет, хотя можно использовать разные подложки, включая, например, 384-луночный планшет.  В различных вариантах реализации подложка может представлять собой стеклянный или пластиковый слайд с некоторым количеством участков для проб.  Некоторые примеры подложек могут включать, но не ограничиваются этим, многолуночный планшет, такой как стандартный микротитровальный 96-луночный планшет, 384-луночный планшет или микропанель, преимущественно плоскую подложку, такую как стеклянный или пластиковый слайд, или любой другой тип панели или микропанели.  Реакционные участки в различных вариантах реализации подложек могут включать лунки, углубления, выемки, борозды и их комбинации, упорядоченные по регулярному или нерегулярному шаблону на поверхности подложки.  Следовательно, лунки или планшеты упоминаются исключительно в целях приведения примеров и не ограничивают тип реакционного участка или держателя проб, применимых в контексте данного документа.
[0061]
Калибровочные планшеты можно готовить с шахматной конфигурацией, как проиллюстрировано на ФИГ.  11A. Как проиллюстрировано для калибровочных планшетов 1100, 1120 и 1140, сами планшеты могут иметь 96-луночный формат, хотя число лунок на калибровочном планшете можно варьировать в случае необходимости в зависимости, например, от числа красителей, требующих калибровки, формата блока для проб 314 (смотрите ФИГ.  3), где размещается калибровочный планшет, или возможности прибора (например, прибора для ПЦР 300) визуализировать планшеты с разной плотностью лунок.
[0062]
Шахматный шаблон распределения красителей обеспечивает возможность калибровки некоторого количества красителей на калибровочный планшет.  В противоположность калибровке одного красителя на калибровочный планшет, шахматный шаблон обеспечивает преимущество, состоящее в том, что пользователь может использовать меньше планшетов для калибровки группы красителей, тем самым уменьшая количество времени и число этапов, необходимых для калибровки красителей.
[0063]
В варианте реализации, проиллюстрированном на ФИГ.  11A, для калибровки десяти разных красителей применяют три планшета.  Каждый калибровочный планшет 1100/1120/1140 выполненный с возможностью содержать четыре разных красителя в повторяющемся шаблоне чередующихся красителей вдоль лунок в каждом ряду планшета так, что в каждой лунке представлен отдельный краситель в повторяющемся шаблоне (заполненная красителем лунка).  Например, планшет 1100 содержит красители FAM, VIC, ROX и SYBR в чередующихся лунках, проиллюстрированных на примере лунок 1102 (FAM), 1104 (VIC), 1106 (ROX) и 1108 (SYBR); планшет 1120 содержит буфер, краситель MP, краситель ABY и краситель JUN в чередующихся лунках, проиллюстрированных на примере лунок 1122 (буфер), 1124 (MP), 1126 (ABY) и 1128 (JUN); а планшет 1140 содержит краситель NED, краситель TAMRA, краситель CY5 и буфер в чередующихся лунках, проиллюстрированных на примере лунок 1142 (NED), 1144 (TAMRA), 1146 (CY5) и 1148 (буфер).  В этом варианте реализации, так как проводится калибровка только десяти красителей, в планшетах 1120 и 1140 используется буфер для заполнения лунок, не содержащих предназначенный для калибровки краситель.
[0064]
Следует понимать, что вариант реализации на ФИГ.  11 A и 11B является просто примером, а общее число калибруемых красителей, число красителей на планшет и число планшетов могут варьироваться в случае необходимости на основании, например, требований пользователя в отношении калибровки, числа лунок на планшете и вместимости прибора, на котором проводится калибровка.  Например, если бы в варианте реализации, проиллюстрированном на ФИГ.  11A, калибровали бы 12 красителей, для планшетов 1120 и 1140 не потребовался бы буфер, так как в каждом из трех калибровочных планшетов 1100/1120/1140 можно калибровать по четыре красителя, что в общей сумме составляет 12 красителей.
[0065]
Более того, число красителей на планшет может составлять два или более, а максимальное число красителей на планшет зависит, например, от числа лунок на калибровочном планшете, возможности применяемого прибора моделировать полный планшет надлежащим образом (дополнительное объяснение смотрите ниже) и возможности системы визуализации получать приемлемые данные флуоресценции для выбранного планшета.  Например, вместо того, чтобы использовать 96-луночный планшет, как проиллюстрировано на ФИГ.  11A, можно использовать достаточно надежный прибор и связанную с ним систему визуализации, позволяющие использовать 384-луночный калибровочный планшет.  При обеспечении дополнительной плотности лунок можно калибровать больше красителей на планшет, например, 16 красителей на планшет, получая при этом такое же число экспериментальных точек (т.е. заполненных красителем лунок) на краситель (например, 24), необходимых для получения удовлетворительной глобальной модели (более подробное обсуждение приведено ниже).  Например, в случае 384-луночного планшета можно проводить калибровку 10 красителей, используя два планшета и по пять красителей на планшет.
[0066]
Даже тип держателя проб и тип реакционных участков может влиять на возможное число красителей.  Как указано выше, для калибровки можно использовать другие типы держателей проб и реакционных участков.
[0067]
Возвращаясь к ФИГ.  9, на этапе 904 приготовленные калибровочные планшеты с шахматной конфигурацией можно загружать в прибор.  Число планшетов, загружаемых в прибор за один раз, зависит от возможностей и вместимости используемого прибора.  Например, стандартный термоциклер для кПЦР с 96-луночным блоком может вмещать только один калибровочный планшет за один раз.  При этом многоблочные термоциклеры могут иметь несколько блоков, каждый из которых может вмещать калибровочный планшет.  Более того, если калибровочный планшет не используется, в зависимости от применяемого формата держателя проб (например, микропанель или панель микрочипа), в один прибор можно помещать некоторое количество держателей проб, используя, например, загрузочное устройство, подходящее к прибору.
[0068]
На этапе 906 с ФИГ.  9 на приборе, используя связанную с ним оптическую систему визуализации (смотрите, например, ФИГ.  3), получают изображения загруженного калибровочного планшета или планшетов, последовательно или параллельно.  Полученные изображения и связанные с ними данные можно хранить, например, в памяти 406 или на запоминающем устройстве 410 компьютерной системы 400 на ФИГ. 4. С помощью оптической системы визуализации можно получать изображения каждого планшета на каждом оптическом канале.  Число каналов зависит от числа фильтров возбуждения и излучения, имеющихся в системе визуализации.  Например, для оптической системы визуализации, имеющей 6 фильтров возбуждения (Х-фильтры) и 6 фильтров излучения (М-фильтры), общее количество каналов равно 21 и представлено следующими комбинациями фильтров:  X1M1, X1M2, X1M3, X1M4, X1M5, X1M6, X2M2, X2M3, X2M4, X2M5, X2M6, X3M3, X3M4, X3M5, X3M6, X4M4, X4M5, X4M6, X5M5, X5M6 и X6M6.  Число изображений или экспозиций, получаемых на каждом канале, может варьироваться.  Например, с помощью оптической системы визуализации можно получать по два изображения или по две экспозиции на канал.  Число получаемых изображений или экспозиций зависит от потребностей пользователя, так как получение меньшего числа изображений или экспозиций на канал может уменьшать количество времени, необходимого для получения изображений или экспозиций, тогда как получение большего числа изображений или экспозиций обеспечивает большую правдоподобность качественных данных.
[0069]
На этапе 908 с ФИГ. 9 прибор, используя данные, полученные по изображениям или экспозициям, полученным оптической системой визуализации (смотрите, например, ФИГ.  3), определяет пиковый канал для каждого красителя на калибровочном планшете.  Этот пиковый канал для каждого реакционного участка представляет собой канал, на котором конкретный анализируемый краситель демонстрирует наибольшую флуоресценцию для данного реакционного участка.  Определение пикового канала может происходить, например, когда, 95% или более реакционных участков заняты красителем, в случае чего во время калибровки допускается не более 5% выпадающих реакционных участков.  Допустимое процентное содержание выпадающих значений может варьироваться.  Выпадающие реакционные участки можно впоследствии исключить из будущих расчетов и анализа.  Выпадающие значения могут возникать, например, при загрузке неправильных красителей, при загрузке красителей в неправильной конфигурации, при ненадлежащей загрузке красителей или при загрязнении оптических компонентов (например, частицами пыли).  Пиковый канал для каждого красителя на калибровочном планшете может быть определен, например, процессором 404 компьютерной системы 400 с использованием данных, хранимых в памяти 406.  Результаты определения могут сохраняться, например, в памяти 406 или на запоминающем устройстве 410 компьютерной системы 400.
[0070]
В альтернативном варианте собранные данные по флуоресценции, полученные по изображениям или экспозициям, полученным оптической системой визуализации для каждой комбинации фильтров в каждом реакционном участке, можно корректировать путем введения поправок на фон и однородность перед определением пикового канала, используя коэффициенты для фонового компонента и однородности, определяемые известными в данной области техники способами калибровки фона и однородности.
[0071]
На этапе 910 с ФИГ. 9 прибор, используя данные, полученные по изображениям или экспозициям, полученным оптической системой визуализации (смотрите, например, ФИГ. 2), нормализует каждый канал относительно определенного пикового канала с этапа 908 для всех заполненных красителем лунок.  Каждый канал может быть нормализован относительно определенного пикового канала, например, процессором 404 компьютерной системы 200 с использованием данных, хранимых в памяти 406.  Результаты нормализации могут сохраняться, например, в памяти 406 или на запоминающем устройстве 410 компьютерной системы 400.
[0072]
Всем заполненным красителем лункам приписывается базовое количественное значение, относительно которого осуществляется нормализация.  В общем случае, чем больше количественное значение, тем сильнее регистрируемая флуоресценция.  Следовательно, определенный пиковый канал для заданного красителя будет иметь наибольшее количественное значение для этого красителя в заполненных красителем лунках, за исключением выпадающих значений пикового канала.  Вне зависимости от количественного значения в этом пиковом канале, при нормализации это количественное значение в этом канале устанавливается на значение, равное единице.  Затем оставшиеся количественные значения для того же красителя в других каналах корректируются в соответствии с установленным значением, равным единице, для пикового канала.  Например, если для красителя Х пиковый канал А имеет количественное значение 100 в лунках, а другой канал В имеет количественное значение 40 в лунках, после нормализации пиковый канал А устанавливается на 1,0, а канал В устанавливается на 0,40.  Это нормализованное значение также может называться калибровочным коэффициентом, причем для пикового канала калибровочный коэффициент устанавливается на 1,0, как обсуждается выше.
[0073]
В варианте реализации, проиллюстрированном на ФИГ.  11 A и B, в котором четыре красителя равномерно распределены по лункам 96-луночного планшета, число заполненных красителем лунок на краситель будет равно 24.  Число заполненных красителем лунок может варьироваться по ранее обсужденным причинам, таким как, например, число реакционных участков (например, лунок) в держателе проб (например, калибровочном планшете), число красителей, распределенных по держателю для проб.  Например, если три красителя распределены по 96-луночному планшету, число заполненных красителем лунок будет составлять 32 на краситель.  Если шесть красителей распределены по 96-луночному планшету, число заполненных красителем лунок будет составлять 16 на краситель.
[0074]
Согласно ФИГ.  10, на этапе 912 прибор осуществляет глобальное моделирование для всех лунок на краситель.  Чтобы откалибровать краситель для всех лунок в держателе проб, прибор может использовать данные по заполненным красителем лункам для конкретного красителя для моделирования всех лунок, включая лунки без этого конкретного красителя.  Глобальное моделирование может осуществляться, например, процессором 404 компьютерной системы 400 с использованием данных по заполненным красителем лункам для конкретного красителя для моделирования всех лунок.  Получаемая в результате модель может сохраняться, например, в памяти 406 или на запоминающем устройстве 410.  Согласно ФИГ.  11A, для красителя FAM, присутствующего в 24 лунках 1102 планшета 1100, другие 112 лунок на этом планшете не будут заполнены красителем FAM.  Такое же распределение с 24 заполненными/72 незаполненными лунками применимо для каждого красителя на ФИГ. 11A. Число не заполненных красителем лунок зависит от числа заполненных красителем лунок, которое, как обсуждалось выше, может зависеть от разных причин.  В любом случае сумма заполненных и незаполненных красителем лунок для заданного планшета равна числу лунок на этом планшете. На ФИГ. ФИГ. 11B представляет собой изображение 96-луночного калибровочного планшета с шахматной конфигурацией на 4 красителя с красителями FAM, VIC, ROX и SYBR в такой же конфигурации, которая проиллюстрирована для планшета 1100 на ФИГ. 11A.
[0075]
В альтернативном варианте реализации прибор осуществляет глобальное моделирование для всех каналов или тех каналов, которые имеют нормализованное значение, например, превышающее 0,01, или 1% от определенного пикового канала.  Для каналов ниже этого порога прибор осуществляет локальное моделирование (смотрите этап 922 на ФИГ.  10) вместо осуществления глобального моделирования.  Глобальное моделирование может быть необязательным при таких низких уровнях на некоторых каналах, так как регистрируемая флуоресценция является, главным образом, результатом, например, шума или других помех, а не вклада реального калибруемого красителя.
[0076]
При калибровке красителя алгоритм глобального моделирования может служить для получения модели калибровочных коэффициентов для красителей для канала каждого фильтра на основании измеренных калибровочных коэффициентов для красителей из заполненных конкретным красителем лунок.  Например, если на 96-луночном планшете с шахматной конфигурацией конкретным красителем заполнены 24 лунки, для глобального моделирования используются калибровочные коэффициенты для красителей для из этих 24 лунок для получения калибровочных коэффициентов для всех лунок, включая другие незаполненные красителем 72 лунки, и, таким образом, создается модель для всего планшета в расчете на один канал, на один краситель.
[0077]
Двумерная (2D) квадратичная полиномиальная функция является примером функции, которую можно применять в качестве глобальной модели для калибровочных коэффициентов для красителей.  Другие функции глобального моделирования также известны и могут использоваться в данном документе.  Нелинейный алгоритм наименьших квадратов можно использовать для получения 2D квадратичной полиномиальной функции по измеренным калибровочным коэффициентам для красителей в заполненных конкретным красителем лунках путем минимизации невязок моделирования (разницы между значениями, рассчитанными по модели, и измеренными калибровочными коэффициентами для красителей).  В этом случае в качестве алгоритма оптимизации можно применять алгоритм доверительных интервалов Левенберга-Марквардта.  Хотя в данном документе применимы и многие другие алгоритмы оптимизации, другим примером является способ ломаных, ключевой идеей которого является применение способов Гаусса-Ньютона и Коши для расчета этапа оптимизации для оптимизации нелинейных объектов.  В этом подходе функцию объекта аппроксимируют модельной функцией (часто квадратичной) для подмножества области поиска, известного как доверительный интервал. Если модельная функция успешно минимизирует истинную функцию объекта, доверительный интервал расширяют.  И наоборот, если аппроксимация дает слабый результат, интервал сужают и снова применяют модельную функцию.  Для уменьшения влияния больших невязок (наибольшая разница между рассчитанными и измеренными калибровочными коэффициентами) также можно использовать, например, функцию потерь.  Эти большие невязки обычно составляют выбросы оптимизации.
[0078]
На этапе 914 с ФИГ. 10 после моделирования всех лунок в отношении заданного красителя или красителей прибор осуществляет проверку добротности.  Это может гарантировать, что этап глобального моделирования является достаточно надежным.  Проверка добротности может быть осуществлена, например, процессором 404 компьютерной системы 400, при этом результаты будут сохранены, например, в памяти 406 или на запоминающем устройстве 410.  Показатели добротности, как правило, обобщают в себе несоответствия между наблюдаемыми значениями и значениями, ожидаемыми в рамках рассматриваемой модели.  Добротность можно определять многими путями, включая, например, значения коэффициента детерминации R-квадрат и среднеквадратической ошибки (СКО).  R-квадрат, например, представляет собой статистику, которая дает некоторую информацию о добротности модели.  При регрессии коэффициент детерминации R-квадрат является статистическим показателем того, насколько хорошо линия регрессии аппроксимирует реальные экспериментальные точки.  R-квадрат 1 указывает на то, что линия регрессии идеально аппроксимирует данные.  СКО представляет собой квадратный корень из среднеквадратичных отклонений или невязок между наблюдаемыми значениями и значениями, ожидаемыми в рамках рассматриваемой модели.  СКО является хорошим показателем прогнозной точности модели.  СКО 0 указывает на то, что значения, ожидаемые в рамках модели, точно совпадают с наблюдаемыми значениями.
[0079]
На этапе 916 с ФИГ. 10, при хорошей достоверности, прибор выводит матрицу красителя на этапе 918 с ФИГ.  9. Статистически хорошая достоверность может возникать, например, в ходе анализа R-квадрат, когда значения R-квадрат, например, превышают или равны 0,85, или значения СКО, например, меньше или равны 0,01, например, как проиллюстрировано на ФИГ.  10. Матрица красителя может быть подготовлена, например, процессором 204 компьютерной системы 200 и выведена на дисплей 212.
[0080]
На этапе 920 с ФИГ. 10, при плохой достоверности, прибор осуществляет локальное моделирование на этапе 922 с ФИГ.  10. Это может быть необходимо, например, если рассчитанное значение R2 для проверки добротности меньше 0,85, например, а значения СКО превышают 0,01, например.  Локальное моделирование может осуществляться, например, процессором 404 компьютерной системы 400 с использованием данных по заполненным красителем лункам для конкретного красителя, чтобы произвести моделирование для оставшихся не заполненных красителем лунок. Получаемая в результате модель может сохраняться, например, в памяти 406 или на запоминающем устройстве 410.
[0081]
Способ локального моделирования может включать, например, применение калибровочных коэффициентов для окружающих заполненных красителем лунок для того же красителя на планшете.  Например, чтобы определить значение калибровочного коэффициента в не заполненной красителем лунке для конкретного красителя, в локальной модели может использоваться медианное значение для всех заполненных конкретным красителем лунок с одним и тем же красителем, которые находятся в пределах 5x5 локального окна, включающего окружающие лунки, или от целого планшета.  Это медианное значение определяют до завершения полного моделирования планшета.  Затем результатами локального моделирования можно заменить результаты глобального моделирования.
[0082]
По завершению локального моделирования достаточно матрицы красителя, так что прибор выводит матрицу красителя на этапе 918 с ФИГ.  10. Эта матрица красителя служит профилем характеристик флуоресценции каждого калибруемого красителя.  После каждого эксперимента прибор получает данные в форме исходного спектрального сигнала для каждого считывания.  Прибор определяет вклад флуоресцентных красителей, применяемых в каждой реакции, путем сравнения исходных спектров с калибровочными данными чистых спектров матрицы красителя.  Прибор использует калибровочные данные, полученные для эталонных красителей (т.е. матрицы красителя), чтобы охарактеризовать и выделить индивидуальный вклад каждого красителя в общую флуоресценцию, регистрируемую прибором.
КАЛИБРОВКА НОРМАЛИЗАЦИИ ПРИБОРА
[0083]
На сегодняшний день геномный анализ, включая анализ приблизительно 30000 человеческих генов, является главной задачей фундаментальных и прикладных биохимических и фармацевтических исследований.  Такой анализ может помочь в разработке диагностических, медицинских и терапевтических средств для широкого спектра нарушений.  Однако сложность человеческого генома и взаимосвязанные функции генов часто затрудняют эту задачу. Одной из трудностей, с которыми обычно сталкиваются, является невозможность для исследователей легко сравнивать результаты экспериментов, проводимых на нескольких приборах. Физические вариации параметров компонентов, таких как, например, источники света, оптические элементы и флуоресцентные датчики, могут приводить к вариации в результатах анализа могущих быть идентичными биологических проб. Следовательно, существует постоянная необходимость в способах и аппаратах, способствующих минимизации вариаций в компонентах.
[0084]
В случае ПЦР кривые амплификации часто определяют путем нормализации сигнала репортерного красителя относительно пассивного эталонного красителя в том же растворе. Примеры репортерных красителей могут включать, но не ограничиваться этим, FAM, SYBR зеленый, VIC, JOE, TAMRA, NED CY-3, Техасский красный, CY-5.  Примером пассивного эталона может быть, например, но без ограничений, ROX.  Эту нормализацию можно представить в виде нормализованных значений флуоресценции, обозначаемых «Rn». Нормализация с помощью пассивного эталона обеспечивает корректные значения Rn даже в случае, когда на общий уровень сигнала влияет объем жидкости или общая интенсивность освещения. Однако нормализация с помощью пассивного эталона не может работать надлежащим образом, когда в сигнале варьируется соотношение между репортерным красителем и эталонным красителем, например, в случае различий в спектре освещения между разными приборами. Чтобы скорректировать эти различия, можно составлять нормализующие растворы так, чтобы нормализовать соотношение репортера к пассивному эталону.  Примером такого нормализующего раствора может служить 50:50 смесь FAM и ROX, которая может называться нормализующим раствором «FAM/ROX».
[0085]
Данный настоящий способ нормализации прибора, включающий считывание флуоресценции от смеси красителей для получения «нормализующего коэффициента» для коррекции значений Rn, требует дополнительных затрат.  Как правило, он может требовать производства нормализующих растворов и нормализующих планшетов, а также дополнительного времени для проведения дополнительных калибровок.  Кроме того, этот способ работает только в случае смесей красителей, которые калибруются с помощью стандартного набора спаренных фильтров.  Набор спаренных фильтров может представлять собой комбинацию фильтра возбуждения и фильтра излучения.  Специалисту в данной области техники понятно, что включение дополнительного красителя потребовало бы наличия дополнительного нормализующего раствора и калибровочного процесса.
[0086]
Процесс получения для получения нормализующих растворов также вносит свой вклад в вариации в ответе красителей.  Было обнаружено, что может быть трудно контролировать концентрации красителей вследствие отсутствия абсолютного эталона флуоресценции.  Чтобы минимизировать эти погрешности и вариации, может быть целесообразно ориентироваться на соотношение красителей в растворе в пределах +/-15% желаемой смеси или в пределах +/-10% желаемой смеси, получаемой в процессе составления.  Процесс составления, как правило, контролируется недостаточно хорошо, чтобы просто смешать 50:50 смесь красителей и удовлетворить эти требования, следовательно, необходим дополнительный этап в процессе, чтобы скорректировать смесь красителей с помощью флуориметра.
[0087]
Раскрытые выше приемлемые вариации в процентах были определены путем изучения взаимосвязи между вариацией в смеси красителей и Ct.  Ct является стандартной аббревиатурой для «порогового цикла» (англ. «threshold cycle»).  Количественная ПЦР (кПЦР) может обеспечить способ определения количества целевой последовательности или гена, присутствующих в пробе.  Во время ПЦР биологическая проба может, например, подвергаться серии из 35-40 температурных циклов.  Цикл может иметь несколько температур.  Для каждого температурного цикла количество целевой последовательности теоретически может удваиваться и зависит от количества факторов, не представленных в данном документе.  Так как целевая последовательность содержит флуоресцентный краситель, по мере того, как количество целевой последовательности возрастает, т.е. происходит амплификация за 35-40 температурных циклов, раствор пробы флуоресцирует все ярче и ярче после завершения каждого температурного цикла.  Количество флуоресценции, необходимое для регистрации детектором флуоресценции, часто называют «порогом», а номер цикла, при котором регистрируется флуоресценция, называется «пороговым циклом» или Ct.  Следовательно, зная эффективность амплификации и Ct, можно определить количество целевой последовательности в исходной пробе.
[0088]
t
Описанная выше допустимая вариация в процентах также может быть связана со стандартным отклонением изменений C прибора.  Было определено, что вариация +/-15% в смеси красителей может привести к стандартному отклонению 0,2 Ct, которое может составлять 2 стандартных отклонения.
[0089]
Как указано выше, желательно наличие возможности надежного сравнения экспериментальных результатов, полученных на нескольких приборах, при этом вариабельность между приборами часто является проблемой.  Эта вариабельность может происходить из двух источников; вариабельности компонентов прибора, таких как, например, но без ограничений, лампы и фильтры, а также вариабельности с течением времени, такой как, например, старение ламп и фильтров.  Было бы целесообразно осуществить процесс, посредством которого можно проводить надежное, легкое и недорогое сравнение результатов, полученных на нескольких приборах.  Такой процесс раскрыт в представленных в данном документе идеях изобретения.
[0090]
Количество флуоресцентного сигнала от пробы в оптической системе может зависеть от нескольких факторов.  Некоторые из этих факторов включают, но не ограничиваются этим, длину волны света флуоресценции, эффективность детектора на длине волны света флуоресценции, эффективность фильтра излучения, эффективность фильтра возбуждения и эффективность красителя.  Идеи настоящего изобретения предполагают, что вариабельность между приборами можно минимизировать в случае, если физические оптические элементы приборов могут быть нормализованы.
[0091]
В одном варианте реализации нормализующие коэффициенты можно получить из спектров чистого красителя, а не смесей красителей.  Чистые красители может быть получать проще, чем смеси красителей, так как концентрации не должны быть точными, и в них находится только один флуоресцентный компонент.  Эту концепцию проверяли путем нормализации 2 наборов фильтров на приборе, используя 10 чистых красителей и сравнивая результаты с нормализацией, полученной при применении смесей красителей.  Нормализацию осуществляли путем определения поправочного коэффициента для каждого фильтра возбуждения и фильтра излучения.  Полученные в результате поправочные коэффициенты можно использовать для нормализации любой комбинации красителей, даже в случае разных приборов.
[0092]
В другом варианте реализации описанную выше нормализацию применяли к некоторому количеству приборов разного типа.  Было создано восемь растворов смесей красителей и 10 растворов чистых красителей.  Каждый раствор пипетировали в 8 лунок трех 96-луночных планшетов.  Потенциальные пространственные перекрестные помехи минимизировали путем пипетирования через лунку.  Применяемые смеси красителей приведены на ФИГ.  12A, а применяемые чистые красители приведены на ФИГ.  4B.  Кроме того, применяемые приборы включали 6 наборов фильтров.  На ФИГ. 12B дополнительно определены пары фильтров для основного оптического канала для каждого чистого красителя.  Фильтр возбуждения обозначен «X», а фильтр излучения обозначен «M».
[0093]
Чтобы количественно оценить эффективность процесса нормализации, определяли соотношения красителей до и после нормализации.  На ФИГ. 13 приведено отклонение в процентах для смесей красителей от среднего соотношения для 17 тестируемых приборов.  Приборы отложены по оси Х, а отклонение в процентах отложено по оси Y.  Специалист в данной области техники может заметить, что отклонения среди приборов часто превышают желаемые +/-15%, обсуждаемые ранее.  Следовательно, эти данные показывают необходимость улучшенного процесса нормализации, такого как предложенный в настоящем изобретении.
[0094]
Идеи настоящего изобретения применяли ко всем 17 приборам.  Способ нормализации определяет поправочный коэффициент для каждого отдельного фильтра, а не для каждого соотношения красителей.  Так как приборы содержали 6 фильтров возбуждения и 6 фильтров излучения, было определено 12 коэффициентов.  Этот процесс проиллюстрирован на ФИГ.  16 и блок-схеме 1600.  На этапе 1605 получали калибровочные спектры для некоторого количества красителей для некоторого количества комбинаций фильтров.  Для приборов, для которых проводили нормализацию, было 10 чистых красителей и 21 комбинация фильтров.  На этапе 1610 спектры нормализовали так, чтобы максимальный сигнал был равен 1.  На этапе 1615 спектры красителей усредняли по некоторому количеству лунок.  Это усреднение приводит к получению одного спектра на краситель.  Вместе спектры красителей можно называть матрицей красителя «М», содержащей краситель и комбинации фильтров.  В этот момент определяют эталонный прибор.  Эталонный прибор может представлять собой прибор или группу приборов, относительно которых будут нормализоваться тестируемые приборы.  Такой же набор спектров красителей, применяемых в случае тестируемого прибора, можно получить с помощью эталонного(ых) прибора(ов).  В некоторых вариантах реализации эталон может представлять собой группу приборов.  В таком варианте реализации спектры для каждого красителя можно усреднять по группе.  Этот этап представлен на блок-схеме 1600 на этапе 1620.  В качестве примера, эталонные спектры могут называться матрицей «Mref».
[0095]
На этапе 1625 каждому из 12 фильтров присваивается корректировочный коэффициент, изначально установленный на 1.  Может быть целесообразно умножать матрицу «М» на корректировочные коэффициенты, в то же время итеративно модифицируя корректировочные коэффициенты между 0 и граничным значением, предпочтительно между 0,04 и 1, пока разница между матрицей «М» и матрицей «Mref» не будет минимизирована, как показано на этапе 1630.  На этапе 1635 рассчитывают поправочные коэффициенты для каждой пары фильтров.  Поправочный коэффициент для каждой пары фильтров является результатом умножения коэффициента для фильтра возбуждения на коэффициент для фильтра излучения.  Пары фильтров основного канала приведены на ФИГ.  4B. После определения поправочных коэффициентов для каждой пары фильтров коэффициент для каждой пары фильтров можно затем умножать на данные флуоресценции для тестируемого прибора, а также для спектров чистого красителя.  Затем скорректированные спектры чистого красителя можно повторно нормализовать до максимального значения 1, как показано на этапе 1645.  Конечный этап процесса на этапе 1650 состоит в создании многокомпонентных данных.  Специалисту в данной области техники понятно, что процедура создания многокомпонентных данных является результатом произведения данных флуоресценции и псевдообращения матрицы красителя.  Многокомпонентные значения уже являются нормализованными, поэтому необязательно делать поправки на краситель, так как данные были нормализованы на уровне фильтров.
[0096]
После завершения нормализации для всех 17 приборов был рассчитан % отклонение для смесей красителей от среднего соотношения.  Результаты приведены на ФИГ.  14. Эти результаты значительно улучшены по сравнению с данными до нормализации, приведенными на ФИГ.  13.  Нормализованные данные в увеличенном масштабе приведены на ФИГ.  15, при этом отклонения после нормализации были снижены до +/-8%, что намного меньше представленного ранее ожидаемого значения +/-15%.
ВАЛИДАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ РНКАЗЫ Р
[0097]
Как указано выше, важно валидировать прибор, чтобы быть уверенным, что он работает надлежащим образом, в особенности после новой инсталляции или после нескольких применений.  Таким образом, пользователь может быть уверен в том, что экспериментальные результаты и анализ являются точными и надежными.  Ранее, чтобы валидировать прибор, пользователем проводился валидационный анализ на приборе, и пользователь вручную проводил анализ данных по данным амплификации, полученным в проверочном анализе.  Так как анализ данных проводился пользователем вручную, процесс валидации был сильнее подвержен ошибкам и занимал время.
[0098]
В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения предложены способы и системы для автоматической валидации.  Примером валидационного анализа является анализ с РНКазой Р.  Однако, в контексте данного документа, валидационный анализ может представлять собой любой анализ, который имеет известные и надежные свойства и может быть использован для валидации прибора.
[0099]
После инсталляции или после нескольких применений важно проверить, чтобы прибор работал надлежащим образом.  Часто пользователь вручную проводит известный анализ для валидации прибора, такой как анализ с РНКазой Р.  Ген РНКазы Р является однокопийным геном, кодирующим РНК-компонент фермента РНКазы Р.  Его часто используют в качестве валидационного анализа благодаря его известным свойствам и характеристикам.
[00100]
Валидационный планшет предварительно загружают реагентами, необходимыми для детекции и количественной оценки геномных копий пробы.  Например, в планшете для валидации с помощью РНКазы Р каждая лунка содержит мастер-микс для ПЦР, праймеры РНКазы Р, меченый красителем FAM™ зонд и известную концентрацию человеческой геномной ДНК-матрицы.
[00101]
В примере традиционного анализа с РНКазой Р строят стандартную кривую по значениям Ct (пороговый цикл), полученным для набора стандартных реплик (1250, 2500, 5000, 10000 и 20000 копий).  Затем стандартную кривую используют для определения числа копий для двух наборов неизвестных матриц (с популяциями из 5000 и 10000 реплик).  Прибор считается валидированным, если он может демонстрировать способность делать различие между 5000 и 10000 геномными эквивалентами с уровнем достоверности 99,7% для последовательного отбора проб в одной лунке.
[00102]
Чтобы пройти установку, приборы должны демонстрировать способность делать различие между 5000 и 10000 геномными эквивалентами с уровнем достоверности 99,7% для последовательного отбора проб в одной лунке.
[00103]
В соответствии с различными вариантами реализации согласно идеям настоящего изобретения в автоматическую систему калибровки и валидации можно водить экспертные знания, обеспечивающие уведомление об успешном/неуспешном прохождении процесса и информацию по выявленным проблемам в случае неуспеха.  Если на приборе не удается провести процесс валидации, пользователь знает, что можно, например, вызвать инженера по эксплуатационному обслуживанию.  Идеи настоящего изобретения могут минимизировать стоимость и время, необходимые для инсталляционных и калибровочных процедур.
[00104]
Как сказано выше, в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации целью валидационного анализа является подтверждение того, что два разных количества одной пробы достаточно хорошо различимы прибором.  Таким образом могут быть валидированы рабочие характеристики прибора.
[00105]
t
В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения предложен способ и система для автоматической валидации.  Значения порогового цикла (Ct) валидационного анализа анализируются и сравниваются системой для определения того, может ли прибор в достаточной степени различать два количества пробы.  Примером валидационного анализа является анализ с РНКазой Р.  В этом примере система определяет значения C, полученные для проб РНКазы Р с 5000 и 10000 геномными копиями, чтобы определить, являются ли данные для 5000 и 10000 геномных копий в достаточной степени различимыми.  В достаточной степени различимые, в соответствии с описанными в данном документе вариантами реализации, означает, что по меньшей мере 3 стандартных отклонения (3σ) (-99,7%) разделяют амплификационные данные для 5000 и 10000 геномных копий.  Способ в соответствии с различными вариантами реализации дополнительно описан ниже с отсылкой к ФИГ.  17 и 18.
[00106]
ФИГ. 17 иллюстрирует типовой способ валидации прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации. В общем случае его началом является этап 1702, заключающийся в получении амплификационных данных по планшету для валидационного анализа для построения множества амплификационных кривых, каждая из которых соответствует лунке на планшете.
[00107]
Планшеты содержат множество лунок.  В некоторых примерах планшет содержит 96 лунок.  В других примерах планшет содержит 384 лунки.  Часть лунок на планшете могут содержать пробу в первом количестве, а другая часть лунок на планшете могут содержать пробу во втором количестве.  Первое количество и второе количество являются разными.  Второе количество больше, чем первое количество, в различных описанных в данном документе вариантах реализации.  Второе количество может быть в 1,5 раза больше, чем первое количество, в некоторых вариантах реализации.  В других вариантах реализации второе количество может быть в 2 раза больше, чем первое количество.  В соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации второе количество может быть в любое число раз больше, чем первое количество.  В некоторых вариантах реализации первое количество может составлять 5000 геномных копий на лунку, а второе количество может составлять 10000 геномных копий на лунку.
[00108]
Снова согласно ФИГ.  17, на этапе 1704 определяют множество пороговых значений флуоресценции на основании множества построенных амплификационных кривых.  Сравнивают экспоненциальные области множества амплификационных кривых, чтобы определить диапазон значений флуоресценции, в который попадают экспоненциальные области.  Например, определяют диапазон значений флуоресценции от наименьшего значения флуоресценции внизу экспоненциальной области до наибольшего значения флуоресценции вверху экспоненциальной области множества амплификационных кривых.  Диапазон значений флуоресценции используют в автоматическом анализе множества амплификационных кривых, чтобы валидировать прибор в соответствии с вариантами реализации идей настоящего изобретения.
[00109]
Согласно ФИГ. 19, проиллюстрировано множество амплификационных кривых и определение диапазона значений флуоресценции и соответствующего порогового цикла.  Каждая из множества амплификационных кривых включает экспоненциальную область кривой.  На оси 1902 указаны значения флуоресценции.  На оси 1904 проиллюстрировано число циклов.  Диапазон флуоресценции 1906 показывает диапазон значений флуоресценции от наименьшего значения флуоресценции в определенной нижней части экспоненциальной области из множества экспоненциальных областей до наибольшего значения флуоресценции в определенной верхней части экспоненциальной области из множества экспоненциальных областей.  В соответствии с различными вариантами реализации диапазон значений флуоресценции равномерно делят на заданное число для получения набора значений флуоресценции для проведения системой автоматического анализа.  В одном примере диапазон значений флуоресценции 1906 делят на 100, чтобы определить 100 значений флуоресценции для группы пороговых значений флуоресценции.  В некоторых вариантах реализации отбрасывают 5 наибольших значений флуоресценции и 5 наименьших значений флуоресценции так, что анализ проводится для группы из 90 пороговых значений флуоресценции.
[00110]
t
t
Снова согласно ФИГ. 17, на этапе 1706 для каждого значения флуоресценции из набора значений флуоресценции определяют пороговый цикл (C) для каждой из множества амплификационных кривых, построенных для лунок, содержащих первое количество пробы.  Аналогично, для каждого значения флуоресценции из набора значений флуоресценции определяют пороговый цикл (C) для каждой из множества амплификационных кривых, построенных для лунок, содержащих второе количество пробы.
[00111]
t
На этапе 1708, используя значения C для первого и второго количеств для каждого из значений флуоресценции в наборе, определяют, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми.  В достаточной степени различимые, в соответствии с различными вариантами реализации, означает, что применение уравнения (1) приводит к положительному результату по меньшей мере для одного из значений флуоресценции в наборе:
μC
σC
μC
σC
tquant
1
tquant
1
tquant
2
tquant
2
(( - 3) - (( + 3)) (1)
[00112]
t
Уравнение 1 определяет, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, при этом quant2 больше, чем quant1, в соответствии с описанными в данном документе вариантами реализации.  В достаточной степени различимые означает, что по меньшей мере 3 стандартных отклонения (3σ) (-99,7%) разделяют значения C для первого и второго количеств.  Если обнаруживается, что количества являются в достаточной степени различимыми, появляется сообщение для пользователя о том, что прибор валидирован.
[00113]
ФИГ. 18 иллюстрирует другой типовой способ валидации прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации. На этапе 1802 получают амплификационные данные от множества проб, содержащихся в лунках валидационного планшета.  Часть лунок валидационного планшета содержат пробу в первом количестве.  Другая часть лунок валидационного планшета содержат пробу во втором количестве. Первое количество и второе количество являются разными. Второе количество может быть в 1,5 раза больше, чем первое количество, в некоторых вариантах реализации. В других вариантах реализации второе количество может быть в 2 раза больше, чем первое количество. В соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации второе количество может быть в любое число раз больше, чем первое количество. В некоторых вариантах реализации первое количество может составлять 5000 геномных копий на лунку, а второе количество может составлять 10000 геномных копий на лунку.
[00114]
На этапе 1804 определяют первый набор пороговых значений флуоресценции на основании множества построенных амплификационных кривых. Сравнивают экспоненциальные области множества амплификационных кривых, чтобы определить диапазон значений флуоресценции, в который попадают экспоненциальные области. Например, определяют диапазон значений флуоресценции от наименьшего значения флуоресценции внизу экспоненциальной области до наибольшего значения флуоресценции вверху экспоненциальной области множества амплификационных кривых. Диапазон значений флуоресценции используют в автоматическом анализе множества амплификационных кривых, чтобы валидировать прибор в соответствии с вариантами реализации идей настоящего изобретения.
[00115]
В соответствии с различными вариантами реализации диапазон значений флуоресценции равномерно делят на заданное число для получения набора значений флуоресценции для проведения системой автоматического анализа. В одном примере диапазон значений флуоресценции 1906 делят на 100, чтобы определить 100 значений флуоресценции для группы пороговых значений флуоресценции. В некоторых вариантах реализации отбрасывают 5 наибольших значений флуоресценции и 5 наименьших значений флуоресценции так, что анализ проводится для группы из 90 пороговых значений флуоресценции.
[00116]
t
t
IНа этапе 1806 для каждого порога флуоресценции в наборе определяют первый набор значений C для амплификационных кривых, соответствующих первому количеству.  Аналогично, для каждого порога флуоресценции в наборе определяют второй набор значений C для амплификационных кривых, соответствующих второму количеству.  Это повторяют для каждого порогового значения флуоресценции в наборе.
[00117]
t
t
t
t
t
t
t
В некоторых вариантах реализации заданное число выпадающих значений C удаляют из каждой группы значений C перед проведением последующих расчетов.  Например, в некоторых вариантах реализации, если используется 96-луночный планшет, из каждой группы значений C удаляют 6 выпадающих значений.  Выпадающими значениями являются значения C, наиболее удаленные от среднего значения в группе значений C.  В другом примере, если используется 364-луночный планшет, из каждой группы значений C удаляют 10 выпадающих значений.  После удаления выпадающих значений, оставшиеся значения C из каждого набора используют на оставшихся этапах способа.
[00118]
t
t
t
На этапе 1808 для каждого набора значений C рассчитывают среднее.  Другими словами, первое среднее C рассчитывают для первого количества амплификационных кривых, а второе среднее C рассчитывают для второго количества амплификационных кривых для каждого порогового значения флуоресценции в наборе, определенном на этапе 1804.
[00119]
t
Аналогично с этапом 1808, на этапе 1810 рассчитывают 3 стандартных отклонения для каждого набора значений C.  Другими словами, первые 3 стандартных отклонения рассчитывают для первого количества амплификационных кривых, а вторые 3 стандартных отклонения рассчитывают для второго количества амплификационных кривых для каждого порогового значения флуоресценции в наборе, определенном на этапе 1804.
[00120]
t
t
t
Чтобы определить, являются ли значения C для первого количества и второго количества в достаточной степени различимыми, значения C для значения флуоресценции, в соответствии с различными вариантами реализации сравнивают значения C.  В соответствии с различными вариантами реализации для сравнения используют уравнение (2).
μC
σC
μC
σC
tquant
1
tquant
1
tquant
2
tquant
2
(( - 3) - (( - 3)) (2)
[00121]
t
Уравнение 2 определяет, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми в соответствии с описанными в данном документе вариантами реализации.  В достаточной степени различимые означает, что по меньшей мере 3 стандартных отклонения (3σ) (-99,7%) разделяют значения C для первого и второго количеств.
[00122]
На этапе 1814 сравнивают результаты уравнения (2) для всех пороговых значений флуоресценции в группе, чтобы определить максимальное значение.  Если максимальное значение является положительным числом, прибор может в достаточной степени делать различие между первым и вторым количеством, а на этапе 1816 для пользователя появляется сообщение о том, что прибор валидирован.  Если максимальное значение является отрицательным числом, прибор не может в достаточной степени делать различие между первым и вторым количеством, а на этапе 1818 для пользователя появляется сообщение о том, что прибор не прошел валидацию.
[00123]
t
t
ФИГ. 20 иллюстрирует систему 2000 для валидации прибора в соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации.  Система 2000 включает интерфейс прибора для ПЦР 2002, базу данных C 2004, дисплей/GUI 2006, расчетчик C2008 и валидатор 2010.
[00124]
Интерфейс прибора для ПЦР 2002 получает амплификационные данные от прибора для ПЦР для построения амплификационных кривых.  Как описано выше, прибор для ПЦР амплифицирует пробы, содержащиеся на валидационном планшете.  Валидационный планшет включает часть лунок, содержащих пробу в первом количестве, и другую часть лунок, содержащих пробу во втором количестве.  Данные флуоресценции, получаемые вследствие амплификации проб, передаются на прибор для ПЦР 2002.
[00125]
t
t,
t
t
t
После определения набора пороговых значений флуоресценции, как на этапах 1704 и 1804 согласно ФИГ.  17 и 18 соответственно, расчетчик C 2006 рассчитывает первый и второй набор значений C соответствующих амплификационным кривым, построенным для проб в первом количестве и во втором количестве соответственно.  Первый и второй набор значений C рассчитывают для каждого порога флуоресценции в наборе пороговых значений флуоресценции.  Множество наборов значений Cхранятся в базе данных C 2004.
[00126]
Валидатор 2010 определяет, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, как описано для этапа 1708 на ФИГ.  17 и этапов 1810 и 1812 на ФИГ. 18.
[00127]
Дисплей/GUI отображает для пользователя множество амплификационных кривых.  Кроме того, валидатор 2010 определяет, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, дисплей/GUI 2006 выводит для пользователя сообщение о прохождении или непрохождении валидации.
[00128]
t
tquant
1
tquant
1
tquant
2
tquant
2
t
t
tquant
1
tquant
1
tquant
2
tquant
2
μC
σC
μC
σC
μC
σC
μC
σC
Кроме того, можно определить оптимальный порог флуоресценции.  Оптимальный порог флуоресценции можно определить, в соответствии с различными вариантами реализации, выбрав значение C, которое приводит к максимальному разделению между  ( - 3) и (( + 3)). Более того, оптимальный порог флуоресценции также может быть выбран на основании значения C, которое приводит к наименьшему числу определяемых выпадающих значений.  Оптимальный порог флуоресценции также может быть выбран на основании значения C, которое приводит к максимальному разделению между ( - 3) и (( + 3)) с наименьшим числом определяемых выпадающих значений.
АВТОМАТИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ КРАСИТЕЛЯ
[00129]
t
В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения способы автоматической коррекции красителя можно использовать для проведения спектральной калибровки многокомпонентных данных в режиме реального времени.  Автоматическую коррекцию красителя можно проводить в режиме реального времени или после получения амплификационных данных и проведения вторичного анализа.  В алгоритме автоматической коррекции красителя создается многокомпонентная корреляционная матрица.  В соответствии с различными вариантами реализации алгоритм автоматической коррекции красителя корректирует элементы матрицы красителя так, чтобы минимизировать количество недиагональных членов в многокомпонентной корреляционной матрице.  Таким образом минимизируются ошибки в определении C.
АВТОМАТИЧЕСКАЯ КАЛИБРОВКА ФОНА
[00130]
В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения можно проводить автоматическую калибровку фона, чтобы уменьшить необходимость в планшете для калибровки фона и улучшить общую эффективность коррекции фона.
[00131]
Физические загрязнители в блоке (частицы или химические вещества), которые появляются по мере использования прибора, могут отрицательно влиять на результаты анализа системы, искусственным образом завышая некоторые спектральные компоненты анализируемых лунок, которые подвержены загрязнению.  Повторная калибровка может решить эту проблему.  Однако чтобы продлить периоды между необходимыми калибровками, описан способ автоматического расчета/компенсации фоновых изменений после калибровки фона.  Чтобы осуществить автоматическую калибровку фона, проводят способ, используя пустой/незанятый блок.  Эффективное проступание сигнала для расходных материалов (эмпирически определенное) является известным, а эффективные значения углов наклона и уровней смещения для калибровки фона могут быть аппроксимированы с помощью коэффициентов масштабирования, которые решают вопрос эффективного проступания сигнала.
ДЕТЕКЦИЯ ПЛАНШЕТА
[00132]
В соответствии с различными описанными в данном документе вариантами реализации способы детекции планшета можно проводить для определения ошибок в расположении планшета в приборе.
[00133]
Во время использования прибора оптика системы находится у верхней границы (во время простоя) или у нижней границы (во время работы) хода.  Возможность считывать нахождение оптики в промежуточном положении между границами хода не было предусмотрено в аппаратном обеспечении; следовательно, нельзя рассчитывать на значение датчика положения, чтобы определить присутствует или отсутствует планшет или пробирка (где причиной разницы в положении оптики будет добавочная толщина материала от присутствующей пробирки или планшета). Без необходимости в добавочном компоненте для детекции планшета или пробирки (таком как переключатель глубины или датчик положения) для детекции пробы используется детекторная камера в системе.  Однако, так как захватывается только небольшая часть области блока при использовании дискретного и сегрегированного луночного набора линз (каждая линза в наборе фокусирует и собирает свет от одной и только одной лунки), невозможно получить традиционное «фото» расходной плоскости, целиком захватывающее область блока, для обработки изображения.  Так как только сфокусированный свет от каждой лунки собирается и проявляется в виде круглого яркого пятна на детекторе, на регистрируемом изображении отсутствует пространственный или динамический диапазон.  Однако, если оптику перемещают в промежуточное положение, которое позволяет фокусироваться на изоляционной пленке или крышке контейнера, это фокусное пятно можно зафиксировать в виде отраженного изображения (в противоположность флуоресценции, которая представляет собой нормальный сигнал, регистрируемый системой) и использовать для детекции планшета/пробирки.  Пятно фокуса будет меньше лунки, и это будет проявляться на полученном изображении в виде небольшой яркой области по отношению к размеру лунки (известному как область исследования, ОИ).  Зная, что фокусное пятно будет иметь вид ярких пикселей, а все остальные области будут иметь вид более темных пикселей, численный анализ информации об уровне пикселей может дать определения наличия/отсутствия в соответствии с описанными в данном документе вариантами реализации.
НОРМАЛИЗАЦИЯ ПРИБОРА С ПОМОЩЬЮ ОТРАЖАЮЩЕГО МАТЕРИАЛА
[00134]
В соответствии с различными вариантами реализации идей настоящего изобретения нормализацию прибора с помощью отражающего материала, такого как фотодиод, можно использовать для автоматической калибровки прибора после любых исходных калибровок, проведенных после производства или установки.
[00135]
В соответствии с различными вариантами реализации во время производства проводят измерения для стабильного отражающего материала в качестве контроля.  Отражающий материал можно помещать над нагревательной крышкой.  После этого можно проводить измерения для стабильного отражающего материала на всех каналах, чтобы выявить любые изменения или вариабельность.  Любые изменения или вариабельность можно использовать для коррекции коэффициентов цветового баланса, как описано выше в способе калибровки нормализации прибора, для проведения повторной нормализации для изменений в возбуждающем свете.
ПРИМЕРЫ
[00136]
В примере 1 предложен способ калибровки прибора, отличающийся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащий: проведение калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении; проведение калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; проведение калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра; проведение валидации с помощью РНКазы Р для валидации возможности прибора различать два разных количества пробы.
[00137]
В примере 2 предложен пример 1, отличающийся тем, что калибровка ОИ содержит: оценку исходной области интереса (ОИ) по пороговым значениям флуоресценции от каждой лунки с пробой; оценку расположения центров каждой ОИ; оценку размера каждой ОИ; определение среднего размера ОИ из множества реакционных участков; получение моделей глобальной координатной сетки; применение моделей глобальной координатной сетки к ОИ, причем применение моделей глобальной координатной сетки улучшает точность определения расположения центров ОИ; восстановление отсутствующих ОИ; и коррекцию радиуса ОИ, причем коррекция улучшает отношение сигнала к шуму оптической системы.
[00138]
В примере 3 предложен пример 1, отличающийся тем, что калибровка ОИ уменьшает ошибки определения реакционных участков путем минимизации по меньшей мере одного фактора из следующей группы: насыщение красителя во множестве реакционных участков, вращение сетки, вариации коэффициентов усиления и оптическая радиальная дисторсия.
[00139]
В примере 4 предложен пример 1, отличающийся тем, что калибровка чистого красителя содержит: визуализацию держателя проб, загруженного в прибор, на более чем одном канале, причем держатель проб содержит множество реакционных участков и более одного типа красителя, при этом каждый краситель занимает более одного реакционного участка; определение пикового канала для каждого красителя в держателе проб; нормализацию каждого канала относительно пикового канала для каждого красителя; и получение матрицы красителя, содержащей набор эталонных значений для красителя.
[00140]
В примере 5 предложен пример 4, отличающийся тем, что визуализацию держателя проб проводят четыре раза для визуализации четырех разных держателей проб.
[00141]
В примере 6 предложен пример 1, отличающийся тем, что оптическая система содержит множество фильтров возбуждения и множество фильтров излучения, и при этом калибровка нормализации прибора содержит: определение первого поправочного коэффициента для каждого из фильтров возбуждения и фильтров излучения; расчет второго поправочного фактора для пары фильтров, причем каждая пара фильтров содержит один фильтр возбуждения и один фильтр излучения; и применение вторых поправочных коэффициентов к данным по фильтрам.
[00142]
В примере 7 предложен пример 1, отличающийся тем, что коэффициент нормализации для фильтра позволяет сравнивать данные, полученные на приборе, с данными, полученными на втором приборе.
[00143]
t
t
t
В примере 8 предложен пример 1, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р содержит: получение амплификационных данных по валидационному планшету для построения множества амплификационных кривых, причем валидационный планшет включает пробу в первом количестве и во втором количестве, а каждая амплификационная кривая включает экспоненциальную область; определение набора пороговых значений флуоресценции на основании экспоненциальных областей множества амплификационных кривых; определение для каждого порогового значения флуоресценции в наборе первого набора значений порогового цикла (C) амплификационных кривых, построенных для проб в первом количестве, и второго набора значений Cамплификационных кривых, построенных для проб во втором количестве; и расчет, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, на основании значений C для каждого из множества пороговых значений флуоресценции.
[00144]
В примере 9 предложен пример 1, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р проводится процессором, подсоединенным к прибору.
[00145]
В примере 10 предложен пример 8, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р дополнительно содержит: выведение на экран дисплея сообщения о прохождении или непрохождении прибором валидации.
[00146]
В примере 11 предложен пример 1, дополнительно содержащий: проведение автоматической коррекции красителя для спектральной калибровки многокомпонентных данных в режиме реального времени; проведение детекции планшета для определения наличия ошибки в загрузке планшета; проведение автоматической калибровки фона для компенсации фоновых изменений; и проведение нормализации прибора с помощью отражающего материала для выявления любых изменений или вариабельности во флуоресцентном излучении.
[00147]
В примере 12 предложена система для калибровки прибора, отличающаяся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащая: процессор; и память, кодируемую выполняемыми процессором инструкциями, причем инструкции включают инструкции для: проведения калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении; проведения калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; проведения калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра; и проведения валидации с помощью РНКазы Р для валидации возможности прибора различать два разных количества пробы.
[00148]
В примере 13 предложен пример 12, отличающийся тем, что инструкции для калибровки ОИ содержат инструкции для: оценки исходной области интереса (ОИ) по пороговым значениям флуоресценции от каждой лунки с пробой; оценки расположения центров каждой ОИ; оценки размера каждой ОИ; определения среднего размера ОИ из множества реакционных участков; получения моделей глобальной координатной сетки; применения моделей глобальной координатной сетки к ОИ, причем применение моделей глобальной координатной сетки улучшает точность определения расположения центров ОИ; восстановления отсутствующих ОИ; и коррекции радиуса ОИ, причем коррекция улучшает отношение сигнала к шуму оптической системы.
[00149]
В примере 14 предложен пример 12, отличающийся тем, что калибровка ОИ уменьшает ошибки определения реакционных участков путем минимизации по меньшей мере одного фактора из следующей группы: насыщение красителя во множестве реакционных участков, вращение сетки, вариации коэффициентов усиления и оптическая радиальная дисторсия.
[00150]
В примере 15 предложен пример 12, отличающийся тем, что инструкции для калибровки чистого красителя содержат инструкции для: визуализации держателя проб, загруженного в прибор, на более чем одном канале, причем держатель проб содержит множество реакционных участков и более одного типа красителя, при этом каждый краситель занимает более одного реакционного участка; определения пикового канала для каждого красителя в держателе проб; нормализации каждого канала относительно пикового канала для каждого красителя; и получения матрицы красителя, содержащей набор эталонных значений для красителя.
[00151]
В примере 16 предложен пример 15, отличающийся тем, что визуализацию держателя проб проводят четыре раза для визуализации четырех разных держателей проб.
[00152]
В примере 17 предложен пример 12, отличающийся тем, что оптическая система содержит множество фильтров возбуждения и множество фильтров излучения, и при этом калибровка нормализации прибора содержит: определение первого поправочного коэффициента для каждого из фильтров возбуждения и фильтров излучения; расчет второго поправочного фактора для пары фильтров, причем каждая пара фильтров содержит один фильтр возбуждения и один фильтр излучения; и применение вторых поправочных коэффициентов к данным по фильтрам.
[00153]
В примере 18 предложен пример 12, отличающийся тем, что коэффициент нормализации для фильтра позволяет сравнивать данные, полученные на приборе, с данными, полученными на втором приборе.
[00154]
t
t
t
В примере 19 предложен пример 12, отличающийся тем, что инструкции для валидации с помощью РНКазы Р содержат инструкции для: получения амплификационных данных по валидационному планшету для построения множества амплификационных кривых, причем валидационный планшет включает пробу в первом количестве и во втором количестве, а каждая амплификационная кривая включает экспоненциальную область; определения набора пороговых значений флуоресценции на основании экспоненциальных областей множества амплификационных кривых; определения для каждого порогового значения флуоресценции в наборе первого набора значений порогового цикла (C) амплификационных кривых, построенных для проб в первом количестве, и второго набора значений C амплификационных кривых, построенных для проб во втором количестве; и расчет, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, на основании значений C для каждого из множества пороговых значений флуоресценции.
[00155]
В примере 20 предложен пример 12, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р проводится процессором, подсоединенным к прибору.
[00156]
В примере 21 предложен пример 19, отличающийся тем, что инструкции для валидации с помощью РНКазы Р дополнительно содержат инструкции для: выведения на экран дисплея сообщения о прохождении или непрохождении прибором валидации.
[00157]
В примере 22 предложен пример 12, дополнительно содержащий инструкции для: проведения автоматической коррекции красителя для спектральной калибровки многокомпонентных данных в режиме реального времени; проведения детекции планшета для определения наличия ошибки в загрузке планшета; проведения автоматической калибровки фона для компенсации фоновых изменений; и проведения нормализации прибора с помощью отражающего материала для выявления любых изменений или вариабельности во флуоресцентном излучении.
[00158]
В примере 23 предложен машиночитаемый запоминающий носитель, кодируемый выполняемыми процессором инструкциям для калибровки прибора, отличающийся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащий инструкции для: проведения калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении; проведения калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; проведения калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра; и проведения валидации с помощью РНКазы Р для валидации возможности прибора различать два разных количества пробы.
[00159]
В примере 24 предложен пример 23, отличающийся тем, что инструкции для калибровки ОИ содержат инструкции для: оценки исходной области интереса (ОИ) по пороговым значениям флуоресценции от каждой лунки с пробой; оценки расположения центров каждой ОИ; оценки размера каждой ОИ; определения среднего размера ОИ из множества реакционных участков; получения моделей глобальной координатной сетки; применения моделей глобальной координатной сетки к ОИ, причем применение моделей глобальной координатной сетки улучшает точность определения расположения центров ОИ; восстановления отсутствующих ОИ; и коррекции радиуса ОИ, причем коррекция улучшает отношение сигнала к шуму оптической системы.
[00160]
В примере 25 предложен пример 23, отличающийся тем, что калибровка ОИ уменьшает ошибки определения реакционных участков путем минимизации по меньшей мере одного фактора из следующей группы: насыщение красителя во множестве реакционных участков, вращение сетки, вариации коэффициентов усиления и оптическая радиальная дисторсия.
[00161]
В примере 26 предложен пример 23, отличающийся тем, что инструкции для калибровки чистого красителя содержат инструкции для: визуализации держателя проб, загруженного в прибор, на более чем одном канале, причем держатель проб содержит множество реакционных участков и более одного типа красителя, при этом каждый краситель занимает более одного реакционного участка; определения пикового канала для каждого красителя в держателе проб; нормализации каждого канала относительно пикового канала для каждого красителя; и получения матрицы красителя, содержащей набор эталонных значений для красителя.
[00162]
В примере 27 предложен пример 26, отличающийся тем, что визуализацию держателя проб проводят четыре раза для визуализации четырех разных держателей проб.
[00163]
В примере 28 предложен пример 23, отличающийся тем, что оптическая система содержит множество фильтров возбуждения и множество фильтров излучения, и при этом инструкции для калибровки нормализации прибора содержат инструкции для: определения первого поправочного коэффициента для каждого из фильтров возбуждения и фильтров излучения; расчета второго поправочного фактора для пары фильтров, причем каждая пара фильтров содержит один фильтр возбуждения и один фильтр излучения; и применения вторых поправочных коэффициентов к данным по фильтрам.
[00164]
В примере 29 предложен пример 23, отличающийся тем, что коэффициент нормализации для фильтра позволяет сравнивать данные, полученные на приборе, с данными, полученными на втором приборе.
[00165]
t
t
t
В примере 30 предложен пример 23, отличающийся тем, что инструкции для валидации с помощью РНКазы Р содержат инструкции для: получения амплификационных данных по валидационному планшету для построения множества амплификационных кривых, причем валидационный планшет включает пробу в первом количестве и во втором количестве, а каждая амплификационная кривая включает экспоненциальную область; определения набора пороговых значений флуоресценции на основании экспоненциальных областей множества амплификационных кривых; определения для каждого порогового значения флуоресценции в наборе первого набора значений порогового цикла (C) амплификационных кривых, построенных для проб в первом количестве, и второго набора значений C амплификационных кривых, построенных для проб во втором количестве; и расчета, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, на основании значений Cдля каждого из множества пороговых значений флуоресценции.
[00166]
В примере 31 предложен пример 23, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р проводится процессором, подсоединенным к прибору.
[00167]
В примере 32 предложен пример 30, отличающийся тем, что инструкции для валидации с помощью РНКазы Р дополнительно содержат инструкции для: выведения на экран дисплея сообщения о прохождении или непрохождении прибором валидации.
[00168]
В примере 33 предложен пример 23, дополнительно содержащий инструкции для: проведения автоматической коррекции красителя для спектральной калибровки многокомпонентных данных в режиме реального времени; проведения детекции планшета для определения наличия ошибки в загрузке планшета; проведения автоматической калибровки фона для компенсации фоновых изменений; и проведения нормализации прибора с помощью отражающего материала для выявления любых изменений или вариабельности во флуоресцентном излучении.
[00169]
В примере 34 предложена система для калибровки прибора, отличающаяся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащая: калибратор области интереса (ОИ), выполненный с возможностью определять положение реакционных участков на изображении; калибратор чистого красителя, выполненный с возможностью определять вклад флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; калибратор нормализации прибора, выполненный с возможностью определять фактор нормализации для фильтра; валидатор с применением РНКазы Р, выполненный с возможностью проводить валидацию возможности прибора различать два разных количества пробы; и дисплей, выполненный с возможностью отображать результаты калибровки.
[00170]
В примере 35 предложен пример 34, отличающийся тем, что калибратор ОИ сконфигурирован так, чтобы: проводить оценку исходной области интереса (ОИ) по пороговым значениям флуоресценции от каждой лунки с пробой; проводить оценку расположения центров каждой ОИ; проводить оценку размера каждой ОИ; определять средний размер ОИ из множества реакционных участков; продуцировать модели глобальной координатной сетки; применять модели глобальной координатной сетки к ОИ, причем применение моделей глобальной координатной сетки улучшает точность определения расположения центров ОИ; восстанавливать отсутствующие ОИ; и корректировать радиус ОИ, причем коррекция улучшает отношение сигнала к шуму оптической системы.
[00171]
В примере 36 предложен пример 34, отличающийся тем, что калибратор ОИ уменьшает ошибки определения реакционных участков путем минимизации по меньшей мере одного фактора из следующей группы: насыщение красителя во множестве реакционных участков, вращение сетки, вариации коэффициентов усиления и оптическая радиальная дисторсия.
[00172]
В примере 37 предложен пример 34, отличающийся тем, что калибратор чистого красителя выполненный с возможностью: визуализировать держатель проб, загруженного в прибор, на более чем одном канале, причем держатель проб содержит множество реакционных участков и более одного типа красителя, при этом каждый краситель занимает более одного реакционного участка; определять пиковый канал для каждого красителя в держателе проб; нормализовывать каждый канала относительно пикового канала для каждого красителя; и продуцировать матрицу красителя, содержащую набор эталонных значений для красителя.
[00173]
В примере 38 предложен пример 37, отличающийся тем, что калибратор выполненный с возможностью визуализировать держатель проб четыре раза для визуализации четырех разных держателей проб.
[00174]
В примере 39 предложен пример 34, отличающийся тем, что оптическая система содержит множество фильтров возбуждения и множество фильтров излучения, и при этом калибратор нормализации прибора выполненный с возможностью: определять первый поправочный коэффициент для каждого из фильтров возбуждения и фильтров излучения; рассчитывать второго поправочного фактора для пары фильтров, причем каждая пара фильтров содержит один фильтр возбуждения и один фильтр излучения; и применять вторые поправочные коэффициенты к данным по фильтрам.
[00175]
В примере 40 предложен пример 34, отличающийся тем, что фактор нормализации для фильтра позволяет сравнивать данные, полученные на приборе, с данными, полученными на втором приборе.
[00176]
t
t
t
В примере 41 предложен пример 34, отличающийся тем, что валидатор с помощью РНКазы Р выполненный с возможностью: получать амплификационные данные по валидационному планшету для построения множества амплификационных кривых, причем валидационный планшет включает пробу в первом количестве и во втором количестве, а каждая амплификационная кривая включает экспоненциальную область; определять набор пороговых значений флуоресценции на основании экспоненциальных областей множества амплификационных кривых; определять для каждого порогового значения флуоресценции в наборе первого набора значений порогового цикла (C) амплификационных кривых, построенных для проб в первом количестве, и второго набора значений Cамплификационных кривых, построенных для проб во втором количестве; и рассчитывать, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, на основании значений Cдля каждого из множества пороговых значений флуоресценции.
[00177]
В примере 42 предложен пример 41, отличающийся тем, что валидатор с помощью РНКазы Р дополнительно выполненный с возможностью: выводить на экран дисплея сообщения о прохождении или не прохождении прибором валидации.
[00178]
В примере 43 предложен пример 34, дополнительно содержащий: автоматический корректор красителя, выполненный с возможностью проводить спектральную калибровку многокомпонентных данных в режиме реального времени; детектор планшета, выполненный с возможностью определять ошибки в загрузке планшета; автоматический калибратор фона, выполненный с возможностью проводить компенсацию фоновых изменений; и нормализатор прибора, выполненный с возможностью использования отражающего материала для выявления любых изменений или вариабельности во флуоресцентном излучении.
[00179]
В альтернативном примере 44 предложен способ калибровки прибора, отличающийся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащий: проведение калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении; проведение калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; проведение калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра; и проведение валидации с помощью РНКазы Р для валидации возможности прибора различать два разных количества пробы.
[00180]
В примере 45 предложена система для калибровки прибора, отличающаяся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащая: процессор; и память, кодируемую выполняемыми процессором инструкциями, причем инструкции включают инструкции для: проведения калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении; проведения калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; проведения калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра; и проведения валидации с помощью РНКазы Р для валидации возможности прибора различать два разных количества пробы.
[00181]
В примере 46 предложен машиночитаемый запоминающий носитель, кодируемый выполняемыми процессором инструкциям для калибровки прибора, отличающийся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащий инструкции для: проведения калибровки области интереса (ОИ) для определения позиций реакционных участков на изображении; проведения калибровки чистого красителя для определения вклада флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; проведения калибровки нормализации прибора для определения коэффициента нормализации для фильтра; и проведения валидации с помощью РНКазы Р для валидации возможности прибора различать два разных количества пробы.
[00182]
В примере 47 предложена система для калибровки прибора, отличающаяся тем, что прибор включает в себя оптическую систему с возможностью визуализации флуоресцентного излучения от множества реакционных участков, содержащая: калибратор области интереса (ОИ), выполненный с возможностью определять положение положения реакционных участков на изображении; калибратор чистого красителя выполненный с возможностью определять вклад флуоресцентного красителя, применяемого в каждом реакционном участке, путем сравнения исходного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; калибратор нормализации прибора, выполненный с возможностью определять коэффициент нормализации для фильтра; валидатор с применением РНКазы Р, выполненный с возможностью проводить валидацию возможности прибора различать два разных количества пробы; и дисплей, выполненный с возможностью отображать результаты калибровки.
[00183]
В альтернативном примере 48 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что калибровка ОИ содержит: оценку исходной области интереса (ОИ) по пороговым значениям флуоресценции от каждой лунки с пробой; оценку расположения центров каждой ОИ; оценку размера каждой ОИ; определение среднего размера ОИ из множества реакционных участков; получение моделей глобальной координатной сетки; применение моделей глобальной координатной сетки к ОИ, причем применение моделей глобальной координатной сетки улучшает точность определения расположения центров ОИ; восстановление отсутствующих ОИ; и коррекцию радиуса ОИ, причем коррекция улучшает отношение сигнала к шуму оптической системы.
[00184]
В альтернативном примере 49 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что калибровка ОИ уменьшает ошибки определения реакционных участков путем минимизации по меньшей мере одного фактора из следующей группы: насыщение красителя во множестве реакционных участков, вращение сетки, вариации коэффициентов усиления и оптическая радиальная дисторсия.
[00185]
В альтернативном примере 50 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что калибровка чистого красителя содержит: визуализацию держателя проб, загруженного в прибор, на более чем одном канале, причем держатель проб содержит множество реакционных участков и более одного типа красителя, при этом каждый краситель занимает более одного реакционного участка; определение пикового канала для каждого красителя в держателе проб; нормализацию каждого канала относительно пикового канала для каждого красителя; и получение матрицы красителя, содержащей набор эталонных значений для красителя.
[00186]
В альтернативном примере 51 предложен пример 44, 45, 46, 47, 50 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что визуализацию держателя проб проводят четыре раза для визуализации четырех разных держателей проб.
[00187]
В альтернативном примере 52 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что оптическая система содержит множество фильтров возбуждения и множество фильтров излучения, и при этом калибровка нормализации прибора содержит: определение первого поправочного коэффициента для каждого из фильтров возбуждения и фильтров излучения; расчет второго поправочного фактора для пары фильтров, причем каждая пара фильтров содержит один фильтр возбуждения и один фильтр излучения; и применение вторых поправочных коэффициентов к данным по фильтрам.
[00188]
В альтернативном примере 53 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что фактор нормализации для фильтра позволяет сравнивать данные, полученные на приборе, с данными, полученными на втором приборе.
[00189]
t
t
t
В альтернативном примере 54 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р содержит: получение амплификационных данных по валидационному планшету для построения множества амплификационных кривых, причем валидационный планшет включает пробу в первом количестве и во втором количестве, а каждая амплификационная кривая включает экспоненциальную область; определение набора пороговых значений флуоресценции на основании экспоненциальных областей множества амплификационных кривых; определение для каждого порогового значения флуоресценции в наборе первого набора значений порогового цикла (C) амплификационных кривых, построенных для проб в первом количестве, и второго набора значений C амплификационных кривых, построенных для проб во втором количестве; и расчет, являются ли первое и второе количества в достаточной степени различимыми, на основании значений C для каждого из множества пороговых значений флуоресценции.
[00190]
В альтернативном примере 55 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р проводится процессором, подсоединенным к прибору.
[00191]
В альтернативном примере 56 предложен пример 44, 45, 46, 47, 54 или любой из предыдущих примеров, отличающийся тем, что валидация с помощью РНКазы Р дополнительно содержит: выведение на экран дисплея сообщения о прохождении или не прохождении прибором валидации.
[00192]
В альтернативном примере 57 предложен пример 44, 45, 46, 47 или любой из предыдущих примеров, дополнительно содержащий: проведение автоматической коррекции красителя для спектральной калибровки многокомпонентных данных в режиме реального времени; проведение детекции планшета для определения наличия ошибки в загрузке планшета; проведение автоматической калибровки фона для компенсации фоновых изменений; и проведение нормализации прибора с помощью отражающего материала для выявления любых изменений или вариабельности во флуоресцентном излучении.
[00193]
Типовые системы для способов, связанных с различными описанными в данном документе вариантами реализации, включают описанные в следующих заявках:
• заявке на патент США на промышленный образец номер 29/516847, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• заявке на патент США на промышленный образец номер 29/516883; поданной 6 февраля 2015 г.; и
• предварительной заявке на патент США номер 62/112910, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• предварительной заявке на патент США номер 62/113006, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• предварительной заявке на патент США номер 62/113077, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• предварительной заявке на патент США номер 62/113058, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• предварительной заявке на патент США номер 62/112964, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• предварительной заявке на патент США номер 62/113118, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• предварительной заявке на патент США номер 62/113212, поданной 6 февраля 2015 г.; и
• заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01011), поданной 5 февраля 2016 г.; и
• заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01023), поданной 5 февраля 2016 г.; и
• заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01025), поданной 5 февраля 2016 г.; и
• заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01028), поданной 5 февраля 2016 г.; и
• заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01029), поданной 5 февраля 2016 г.; и
• заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01032), поданной 5 февраля 2016 г.,
• заявке на патент США номер ___ (Life Technologies Docket Number LT01033), поданной 5 февраля 2016 г.,
которые все в полном объеме также включены в данный документ посредством ссылки.
[00194]
Хотя различные варианты реализации были описаны в отношении определенных типовых вариантов реализации, примеров и применений, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что можно вносить различные модификации и изменения, не отступая от идей настоящего изобретения.