СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ТРОКСЕРУТИНА, ДЕКСПАНТЕНОЛА, БЕНЗОКАИНА И МЕТИЛПАРАГИДРОКСИБЕНЗОАТА В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ
METHOD OF DETERMINING CONTENT OF TROXERUTIN, DEXPANTHENOL, BENZOCAINE AND METHYL PARAHYDROXYBENZOATE IN MEDICAL DRUG BY HPLC

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других исследованиях для определения троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственных препаратах.
В фармацевтической промышленности продолжает развиваться тенденция к производству лекарственных препаратов, содержащих несколько действующих веществ. Преимущество таких лекарственных препаратов заключается в том, что они вызывают значительный лечебный эффект при отсутствии или минимуме отрицательных влияний на организм. Это свойство обусловлено введением в препарат малых доз отдельных ингредиентов. Проблема обеспечения и контроля качества таких препаратов связана, с одной стороны, с малыми дозами, с другой - с различной химической природой входящих ингредиентов. Решить данную проблему можно с помощью эффективных способов определения количественного состава. К таким способам относится метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
4
Известен способ определения декспантенола в лекарственных препаратах методом ВЭЖХ в изократическом режиме с использованием хроматографической колонки размером 250×4,0 мм, заполненной сорбентом с размером частиц 5 мкм, со стационарной фазой С, в качестве подвижной фазы используют смесь 0,01 М раствор ортофосфорной кислоты с ацетонитрилом в соотношении 90:10 (ФСП 8444-07 ЛСР-001794/08-170308).
Известен способ определения декспантенола и метилпарагидроксибензоата (нипагина) в аэрозольном препарате «Декспантенол» методом ВЭЖХ (Ж. Аналитическая химия, 2008, том 63, №9, с.962-968). Декспантенол и метилпарагидроксибензоат (нипагин) в известном способе определяют в изократическом режиме, используя для определения декспантенола в качестве подвижной фазы смесь метанола и 0,01 М ортофосфорной кислоты (10:90), а для определения метилпарагидроксибензоата (нипагина) - смесь ацетонитрила и воды (40:60).
Известен способ определения троксерутина и метилпарагидроксибензоата (нипагина) в фармацевтической композиции методом ВЭЖХ (патент США №7026360).
Однако ни один из известных способов не позволяет количественно определить троксерутин, декспантенол, бензокаин и метилпарагидроксибензоат при одновременном их присутствии в лекарственных препаратах.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа одновременного определения троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в составе лекарственного препарата.
Поставленная задача решается предлагаемым способом определения содержания троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате, включающим извлечение троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата из анализируемого лекарственного препарата, хроматографирование извлечения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с разделением на колонке С18 размером 50×2,0 мм, заполненной носителем зернением 2,0 мкм, или размером 150×4,6 мм, заполненной носителем зернением 5,0 мкм, с использованием в качестве подвижных фаз смеси 0,05% раствора кислоты ортофосфорной с ацетонитрилом для хроматографии в соотношении от 90:10 до 95:5 (pH 2,4) и ацетонитрила в режиме линейного градиента, на хроматографе с использованием ультрафиолетового детектора, после чего на основании расчетных формул определяют содержания троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в создании эффективного способа, позволяющего с высокой точностью определить содержание троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате. Кроме того, данный способ прост в исполнении и экономичен.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:
раствор испытуемого лекарственного препарата и раствор стандартного образца (СО) последовательно хроматографируют на жидкостном хроматографе фирмы Waters, США с УФ-детектором при длинах волн 206 нм, 256 нм, и 288 нм и хроматографической колонкой С18 размером 50×2,0 мм, заполненной обращенно-фазным носителем зернением 2,0 мкм, или размером 150×4,6 мм, заполненной обращенно-фазным носителем зернением 5,0 мкм, в режиме линейного градиента с использованием в качестве подвижной фазы (ПФ):
- смеси 0,05% раствора кислоты ортофосфорной pH 2,4 с ацетонитрилом для хроматографии в соотношении от 90:10 до 95:5 - фаза А;
- ацетонитрила для хроматографии - фаза В;
получая не менее трех хроматограмм каждого раствора.
Находят площади пиков определяемых веществ на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов и по формуле рассчитывают их содержание в анализируемом препарате.
Примеры конкретного применения предлагаемого способа.
Количественное определение троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате, выполненном в виде геля
Пример 1
Для приготовления испытуемого раствора около 2,5 г (точная навеска) геля помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл, прибавляют 35 мл смеси раствора кальция хлорида с ацетонитрилом (3:2), интенсивно перемешивают до растворения основы при нагревании в водяной бане при температуре 60°C в течение 3 мин, охлаждают и фильтруют через фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 50 мл. Коническую колбу и фильтр обмывают 10 мл смеси раствора кальция хлорида с ацетонитрилом (3:2), собирая промывные воды в ту же мерную колбу, доводят объем раствора той же смесью до метки и перемешивают. 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора смесью 0,05% раствора кислоты ортофосфорной с ацетонитрилом (95:5), перемешивают и фильтруют через фильтр «синяя лента», отбрасывая первые порции (около 10 мл) фильтрата (испытуемый раствор).
Для приготовления раствора CO бензокаина и метилпарагидроксибензоата берут около 0,05 г (точная навеска) CO бензокаина и около 0,075 г (точная навеска) CO метилпарагидроксибензоата, растворяют в смеси раствора кальция хлорида с ацетонитрилом (3:2) в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора той же смесью до метки и перемешивают (раствор А).
Для приготовления раствора CO троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата берут около 0,01 г (точная навеска) троксерутина и около 0,05 г (точная навеска) декспантенола, растворяют в смеси 0,05% раствора кислоты ортофосфорной с ацетонитрилом (95:5) в мерной колбе вместимостью 100 мл, прибавляют 1 мл раствора А, доводят объем раствора смесью 0,05% раствора кислоты ортофосфорной с ацетонитрилом (95:5) до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр «синяя лента», отбрасывая первые порции (около 10 мл) фильтрата (раствор Б).
По 20 мкл испытуемого раствора и раствора Б СО последовательно хроматографируют на жидкостном хроматографе с УФ-детектором и колонкой 150×4,6 мм с обращенно-фазным носителем Purospher STAR RP-18е с размером частиц 5,0 мкм в режиме линейного градиента, с использованием в качестве ПФ смеси фазы А (с pH 2,4) и фазы В (ацетонитрил для хроматографии). Получают не менее 3 хроматограмм каждого раствора.
Состав ПФ в течение анализа изменяется по следующей программе:
Время в мин
Длина волны в нм
Фаза А, %
Фаза В, %
0
206
100
0
4,5
-//-
100
0
5,0
-//-
60
40
6,0
256
60
40
9,5
288
60
40
11,5
-//-
60
40
Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин. Длина волны УФ-детектора - 206 нм для декспантенола; 256 нм для троксерутина и метилпарагидроксибензоата; 288 нм для бензокаина.
Рассчитывают площади пиков определяемых компонентов и находят количество каждого компонента в анализируемом лекарственном препарате по формуле:
K
CT
где S и S - средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах растворов испытуемого и СО соответственно;
1
V - объем раствора А CO, взятый для приготовления раствора Б CO, в миллилитрах;
2
V - объем раствора А CO в миллилитрах;
ст
н
m и m - массы стандарта определяемого вещества в растворе CO и навески лекарственного препарата, взятой для приготовления испытуемого раствора, соответственно, в граммах.
Хроматограмма испытуемого раствора лекарственного препарата, выполненного в виде геля, содержащего троксерутин, декспантенол, бензокаин и метилпарагидроксибензоат, с использованием колонки 150×4,6 мм с обращенно-фазным носителем Purospher STAR RP-18e с размером частиц 5 мкм представлена на фиг.1.
Пример 2
Для приготовления испытуемого раствора около 2,5 г (точная навеска) геля помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл, прибавляют 35 мл смеси раствора кальция хлорида с ацетонитрилом (3:2), интенсивно перемешивают до растворения основы при нагревании в водяной бане при температуре 60°C в течение 3 мин, охлаждают и фильтруют через фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 50 мл. Коническую колбу и фильтр обмывают 10 мл смеси раствора кальция хлорида с ацетонитрилом (3:2), собирая промывные воды в ту же мерную колбу, доводят объем раствора той же смесью до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора смесью 0,05% раствора кислоты ортофосфорной с ацетонитрилом (95:5), перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр, отбрасывая первые порции (около 5 мл) фильтрата (испытуемый раствор).
Для приготовления раствора CO бензокаина и метилпарагидроксибензоата берут около 0,05 г (точная навеска) CO бензокаина и около 0,075 г (точная навеска) CO метилпарагидроксибензоата, растворяют в смеси раствора кальция хлорида с ацетонитрилом (3:2) в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора той же смесью до метки и перемешивают (раствор А).
Для приготовления раствора CO троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата берут около 0,01 г (точная навеска) троксерутина и около 0,05 г (точная навеска) декспантенола, растворяют в смеси 0,05% раствора кислоты ортофосфорной с ацетонитрилом (95:5) в мерной колбе вместимостью 100 мл, прибавляют 1 мл раствора А, доводят объем раствора смесью 0,05% раствора кислоты ортофосфорной с ацетонитрилом (95:5) до метки и перемешивают (раствор Б).
5 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора смесью 0,05% раствора ортофосфорной кислоты с ацетонитрилом (95:5) до метки, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр, отбрасывая первую порцию (около 5 мл) фильтрата (раствор В).
По 10 мкл испытуемого раствора и раствора В СО последовательно хроматографируют на жидкостном хроматографе с УФ-детектором и колонкой 50×2,0 мм с обращенно-фазным носителем YMC-UltraHT Pro C18 с размером частиц 2,0 мкм в режиме линейного градиента, с использованием в качестве ПФ смеси фазы А (с pH 2,4) и фазы В (ацетонитрил для хроматографии). Получают не менее 3 хроматограмм каждого раствора. Состав ПФ в течение анализа изменяется по следующей программе:
Время в мин
Длина волны в нм
Фаза А, %
Фаза В, %
0
206
100
0
1,0
256
-//-
-//-
1,7
288
-//-
-//-
2,00
-//-
50
50
Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин. Длина волны УФ-детектора - 206 нм для декспантенола; 256 нм для троксерутина и метилпарагидроксибензоата; 288 нм для бензокаина.
Рассчитывают площади пиков определяемых компонентов и находят количество каждого компонента в анализируемом лекарственном препарате по формуле:
K
CT
где S и S - средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах растворов испытуемого и CO соответственно;
1
V - объем раствора А CO, взятый для приготовления раствора Б СО, в миллилитрах;
2
V - объем раствора А СО в миллилитрах;
ст
н
m и m - массы стандарта определяемого вещества в растворе СО и навески лекарственного препарата, взятой для приготовления испытуемого раствора, соответственно, в граммах.
Хроматограмма испытуемого раствора лекарственного препарата, выполненного в виде геля, содержащего троксерутин, декспантенол, бензокаин и метилпарагидроксибензоат, с использованием колонки 50×2,0 мм с обращенно-фазным носителем YMC-UltraHT Pro С18 с размером частиц 2,0 мкм представлена на фиг.2.
Статистическую обработку результатов, полученных при использовании предлагаемого способа, проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи СССР, XI изд.
Таблица 1
Результаты испытаний лекарственного препарата, выполненного в виде геля, содержащего троксерутин, декспантенол, бензокаин и метилпарагидроксибензоат (пример 1)
Компоненты
Содержание в одном грамме геля, г (n=9; Р=0,95)
Норма
Х<sub>ср.</sub>
S<sup>2</sup>
S
ΔХ
ε, %
Троксерутин
0,018-0,022
0,0192
0,1619×10<sup>-6</sup>
0,4024×10<sup>-3</sup>
0,1423×10<sup>-3</sup>
0,7
Декспантенол
0,09-0,11
0,1007
3,7061×10<sup>-6</sup>
1,9251×10<sup>-3</sup>
0,6806×10<sup>-3</sup>
0,7
Бензокаин
0,0009-0,0011
9,70×10<sup>-4</sup>
6,0203×10<sup>-10</sup>
2,4536×10<sup>-5</sup>
8,6749×10<sup>-6</sup>
0,9
Метилпарагидроксибензоат
0,0012-0,0018
0,00148
1,2758×10<sup>-9</sup>
3,5718×10<sup>-5</sup>
1,2628×10<sup>-5</sup>
0,9
Таблица 2
Результаты испытаний лекарственного препарата, выполненного в виде геля, содержащего троксерутин, декспантенол, бензокаин и метилпарагидроксибензоат (пример 2)
Компонен-ты
Содержание в одном грамме геля, г (n=9; Р=0,95)
Норма
Х<sub>ср.</sub>
S<sup>2</sup>
S
ΔХ
ε, %
Троксерутин
0,018-0,022
0,0205
0,2875×10<sup>-6</sup>
0,5362×10<sup>-3</sup>
0,1896×10<sup>-3</sup>
0,9
Декспантенол
0,09-0,11
0,0981
2,4094×10<sup>-6</sup>
1,5522×10<sup>-3</sup>
0,5488×10<sup>-3</sup>
0,6
Бензокаин
0,0009-0,0011
9,85×10<sup>-4</sup>
9,7125×10<sup>-10</sup>
3,1165×10<sup>-5</sup>
1,102×10<sup>-5</sup>
1,1
Метилпарагидроксибензоат
0,0012-0,0018
0,00148
1,1465×10<sup>-9</sup>
3,3860×10<sup>-5</sup>
1,1971×10<sup>-5</sup>
0,8
Как видно из полученных результатов, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью определить содержание троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате.