ИНДУКЦИЯ ОСТЕОГЕНЕЗА ПУТЕМ ВНЕДРЕНИЯ РНК, КОДИРУЮЩЕЙ КОСТНЫЙ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ БЕЛОК (КМБ)
INDUCTION OF OSTEOGENESIS BY INTRODUCTION OF RNA CODING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN (BMP)

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей полирибонуклеотид (РНК) с последовательностью, кодирующей костный морфогенетический белок (КМБ), для применения в (i) лечении или предупреждении костного заболевания, костного расстройства или костного повреждения, и/или (ii) индукции или повышения остеогенной дифференциации, остеогенеза, окостенения, регенерации костей и/или морфогенеза костей у пациента. Настоящее изобретение относится к соответствующим молекулам РНК, кодирующим КМБ (РНК КМБ), в частности в химически модифицированной форме. Настоящее изобретение относится к комплексам, которые включают или образуют комплекс с РНК КМБ, в частности к соответствующим комплексам для трансфекции, например, к комплексам липофекции, магнитофекции и магнитолипофекции. Настоящее изобретение также относится к носителю и несущей подложке, которая нагружена РНК или комплексом, и к фармацевтической композиции, включающей указанный носитель или несущую подложку. Настоящее изобретение также относится к матриксу или каркасу для устойчивой доставки мРНК и ее применения в регенерации кости in vivo, ex vivo и in vitro.
Костная ткань представляет тип плотной соединительной ткани, в основном состоящей из коллагена и гидроксиапатита. Заселенная тремя основными типами клеток - остеобластами, остеокластами и остеоцитами - костная ткань обеспечивает защиту другим органам, поддерживает тело и обеспечивает движение (Balmayor в кн.: «Mesenchymal Stem Cell Therapy», под ред. Chase & Vemuri, изд-во Humana Press, Нью-Йорк, 2012, 101-116). Кости также вырабатывают красные и белые кровяные клетки в костном мозге, а также хранят все полезные для жизни минералы (Carmona в кн.: «Bone Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General 2004», Департамент здравоохранения и социальных служб США, Управление генерального хирурга, Роквилл, Мэриленд). Когда костная ткань повреждена, происходит процесс окостенения, в ходе которого возможно восстановление нормальной функции ткани. Процесс заживления обычно включает скоординированные ответы костного мозга, кортикального слоя кости, надкостницы и окружающих мягких тканей, включающие регуляцию клеточной пролиферации, миграции и дифференциации (Dimitriou, Injury 36(12), 2005, 1392-1404, Einhorn, Clin Orthop Relat Res 355, 1998, 7-21). Многие регуляторные молекулы, например, факторы роста фибробластов (fibroblast growth factors - FGF), костные морфогенетические белки (КМБ), тромбоцитарный фактор роста и фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor - VEGF), участвуют в регуляции нового формирования кости. Из-за выделения цитокинов, гипоксии и сосудистых нарушений клетки рекрутируются к месту перелома.
Лечение переломов представляет комплексный физиологический процесс. По разным причинам этот процесс может потерпеть неудачу и, например, приведет к замедленной консолидации переломов или к несрастающимся переломам. Лечение в основном направляют на интенсификацию клеточных процессов, которые приводят к заживлению перелома. В то же время, биоматериалы часто используются для обеспечения механической поддержки в месте перелома (Tanner, JR Soc Interface 5, 2010, 541-557, Tanner, Proc Inst Mech Eng H 224(12), 2010, 1359-1372), а также в качестве платформы для доставки требуемых факторов роста (Mourino, Expert Opin Drug Deliv 10(10), 2013, 1353-1365, Romagnoli, Clin Cases Miner Bone Metab 10(3), 2013, 155-161).
Костные морфогенетические белки являются наиболее важными факторами роста, участвующими в регенерации костей (Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(2-3), 2008, 81-96, Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(1), 2008, 1-13, Urist, Clin Orthop Relat Res 53, 1967, 243-283). Они регулируют остеогенез на двух разных уровнях: (1) коммитирование скелетных клеток-предшественников и (2) созревание остеобластов в период постнатального развития (Yamaguchi, Endocr Rev 21(4), 2000, 393-411). В частности было установлено, что КМБ-2 эффективен в индукции остеогенеза как in vitro, так и in vivo (Keibi, Injury 42(8), 2011, 814-820, Katagiri, J Cell Biol 127(6 Pt 1), 1994, 1755-1766, Shekaran. Biomaterials, 2014). Однако лечение костных нарушений костными морфогенетическими белками (в частности рекомбинантным КМБ-2) дорого и КМБ требуются в концентрациях, превышающих физиологические значения, что приводит к риску тяжелых побочных эффектов, например, к воспалению и формированию костей с нарушенной структурой (Zara, Tissue Engineering: Part A 17(9 & 10), 2011, 1389-1399).
В настоящее время ряд исследователей изучает возможность переноса гена в костную ткань с терапевтической целью. Были продемонстрированы некоторые преимущества внедрения генов по сравнению с внедрением белка. К ним относят гибкость экспрессии белка, которая может быть локальной и фокальной или, если необходимо, диссиминированной. Кроме того, белки вырабатываются внутриклеточно. Таким образом, это облегчает терапевтические подходы. В отличие от рекомбинантного эквивалента, поступление белка, осуществляемый через перенос гена, происходит в результате его биосинтеза, что исключает загрязнение в переменном процентном содержании неправильно сложенными и, возможно, антигенными молекулами (Evans, Adv Drug Deliv Rev 64(12), 2012, 1331-1340). Кроме того, белки могут экспрессироваться в течение длительных периодов времени, и уровень трансгенной экспрессии можно регулировать. Таким образом, используемые во время лечения дозы терапевтических белков снижают (Evans, 2012, см. выше). Было показано, что перенос генов с использованием плазмидной ДНК, кодирующей КМБ-2, обладает некоторым потенциалом для заживления и регенерации кости (Lu, J Biomater Sci Polym Ed 23(1-4), 2012, 509-526, Chang, Neurosurgery 65, 2009, 75-81, Park, Gene Ther 10(13), 2003, 1089-1098).
Однако, несмотря на некоторые преимущества, используемые в настоящее время вирусные векторы для генной доставки связаны с проблемами безопасности, включая сильную иммуногенность и инсерционный мутагенез. Невирусные векторы ограничены низкой эффективностью переноса гена (Evans, 2012, см. выше). В основном недостатком невирусных векторов является недостаточный транспорт плазмидной ДНК в ядро.
Альтернативой генной терапии на основе ДНК является доставка матричной РНК (мРНК). Ранее транскрипционная терапия, использующая мРНК, вызвала огромный интерес, поскольку является более безопасным заменителем генной и рекомбинантной белковой терапии. Матричная РНК не создает риска иммуногенности или потенциальной мутагенности, которые связаны с рекомбинантным белком и генной терапией, соответственно. Молекулы мРНК не являются ни источником риска иммуногенности, ни потенциальной мутагенности, которые свойственны рекомбинантным белкам и генной терапии, соответственно. Дополнительное техническое преимущество заключается в том, что молекулам мРНК необходимо только достичь цитоплазмы для проявления активности, а ДНК требуется достичь ядра (Yamamoto, European JouРНКl of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71, 2009, 484-489, Tavernier, JouРНКl of Controlled Release 150, 2011, 238-247). Соответственно, применение мРНК представляет основопологающую терапию для широкого применения в медицине по разным показателям (Yamamoto, European JouРНКl of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71, 2009, 484-4891, Tavernier, JouРНКl of Controlled Release 150, 2011, 238-247, Kormann, Nature Biotechnology 29, 2011, 154-157, Esteller, Nature Review Genetics 12, 2011, 861-874). В частности, в последнее время мРНК стала альтернативой невирусной генной терапии. Поскольку мРНК функционирует в цитоплазме, преодолеваются ограничения, связанные с переносом через ядерную мембрану, поскольку они не имеют отношения к транскрипционной терапии на основе мРНК.
Хотя мРНК, очевидно, представляет мощный инструмент для многих вариантов лечения, клиническое применение до сих пор ограничено (например, вакцины против рака) из-за сильной иммунногенности и ограниченной стабильности обычных мРНК (Van Tendeloo, Curr Opin Mol Ther 9(5), 2007, 423-431).
Holtkamp установил повышение стабильности мРНК в результате присоединения хвоста поли(А) длиной 120 нуклеотидов (Blood 108(13), 2006, 4009-4017). Кроме того, Holtkamp также сообщает об исследовании оптимизации UTR для достижения стабильности и эффективности трансляции (Holtkamp, см. выше). Кроме того, сообщают, что химические модификации мРНК приводят к повышению стабильности и к снижению активации врожденной иммунной системы. В частности, сообщают, что формирование и терапевтический потенциал химически модифицированной мРНК (хмРНК), которая кодирует терапевтический мышиный эритропоэтин (ЕРО) и поверхностно-активный белок В (SP-B), индуцируют кроветворение и обладает потенциалом для лечения летального врожденного заболевания легкого, соответственно (Kormann, Nat Biotechnol 29(2), 2011, 154-157). Кроме того, применяют коллагеновые губки в качестве 3D матриц для нагрузки ДНК или хмРНК, а также высева на них клеток (Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218, Recchhenrich, Biomaterials 32, 2011, 1996-2003, Scherer, Journal of Gene Medicine 4, 2002, 634-643, Elangovan, Journal of Controlled Release 218, 2015, 22-28, WO 01/00708). В предшествующих исследованиях показано, что по сравнению с двумерными клеточными культурами (2D), основанными на культивировании в чашках Петри, культивирование клеток в трехмерных каркасах (3D) больше напоминает ситуацию in vivo в отношении формы клеток, клеточной передачи сигналов и клеточного поведения, которые могут влиять на экспрессию гена в клетках (Mueller-Klieser, American JouРНКl of Physiology-Cell Physiology, 273, 1997, C1109-C1123). Коллагеновые губки представляют вариант матриц 3D, которые могут модифицировать миграцию, прикрепление, адгезию и, в некоторых случаях, дифференциацию клеток (Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218). Кроме того, лечение аллергической астмы с помощью хмРНК, кодирующей фактор транскрипции FOXP3, предложен Mays (J Clin Invest 123(3), 2013, 1216-1228). В качестве терапевтического инструмента для лечения заболеваний, связанных с недостаточными или дефектными генами или белками, также применяют хмРНК, описанную в WO 2011/012316. В общем, появляющиеся методы лечения на основе транскрипции с использованием хмРНК, представляются более безопасными, и, возможно, в перспективе они заменят генную и рекомбинантную белковую терапию. Однако их применение ограничено из-за кратковременности трансляции и относительно низкой стабильности хмРНК по сравнению с ДНК. Кроме того, например, в тех случаях, когда используют хмРНК ЕРО, повторное применение/ введение необходимо для успешного лечения (требуется постоянная адаптация гематокрита).
Более перспективным подходом в генной терапии является применение генетически модифицированных аутологичных тканевых трансплантатов для восстановления дефектной ткани. Такая терапевтическая стратегия направлена на стимулирование процесса заживления путем доставки генов в результате минимально проводимых манипуляций в аутологичную ткань, которая содержит клетки-предшественники, и способна заполнять объем индуктивного или проводящего каркаса (Evans, Eur Cell Mater 18, 2009, 96-111, Evans, Tissue Eng 13(8), 2007, 1987-1993). Например, известно, что жировая ткань обладает остеопрогениторными клетками, она может быть природным опорным материалом и ее легко получить (Evans, 2009, см. выше, Dragoo, Plast Reconstr Surg 115(6), 2005, 1665-1673). Эванс (2009, см. выше) использует трансплантаты жировой и мышечной ткани, трансдуцированные аденовирусом, несущим кДНК КМБ-2 человека для восстановления дефектов кости и хряща. Однако этот подход также имеет описанные выше недостатки.
В последние годы устойчивые системы доставки генов или лекарственных средств представляют все больший интерес, поскольку они не требуют повторного дозирования. В результате пациенты могут использовать лекарственные средства с большей легкостью, и это может привести к лучшему применению терапевтических подходов (Bartus, Science 281, 1998, 1161). В случае применения РНК-терапии такие замедленные системы доставки могут быть особенно приемлемы, когда требуется длительная экспрессия белка, например при заболеваниях костей. Тем не менее, эффективных способов устойчивой доставки РНК пока нет.
Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в обеспечении улучшенных средств и способов медицинского вмешательства, связанных с костью.
Техническая проблема решается с помощью вариантов осуществления, описанных в формуле изобретения.
Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полирибонуклеотид (РНК) с последовательностью, которая кодирует костный морфогенетический белок (КМБ) для использования в
(i) лечении или предупреждении костного заболевания, костного расстройства или костного повреждения, и/или
(ii) индукции или повышении остеогенной дифференциации, остеогенеза, окостенения, костной регенерации и/или костного морфогенеза у пациента.
Настоящее изобретение также относится к способу
(i) лечения или предупреждения костного заболевания, костного расстройства или костного повреждения, и/или
(ii) индукции или повышения остеогенной дифференциации, остеогенеза, окостенения, костной регенерации и/или костного морфогенеза
(у пациента, нуждающегося в этом) причем указанный способ включает стадию введения пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества (фармацевтической композиции, включающей) РНК с последовательностью, кодирующей КМБ.
Настоящее изобретение решает указанные выше технические проблемы, что показано ниже и в прилагаемых примерах, поскольку неожиданно было установлено, что РНК, кодирующая (а) КМБ, в частности хмРНК, кодирующая КМБ-2 человека (SEQ ID NO: 3, кодируемая SEQ ID NO: 1, хмРНК КМБ-2 человека), или КМБ-7 человека (SEQ ID NO: 4, кодируемая SEQ ID NO: 2, чКМБ-7 хмРНК), индуцирует/повышает остеогенез. Поэтому в контексте настоящего изобретения было установлено, что РНК, кодирующая (а) КМБ, может с успехом применяться в терапии по регенерации кости на основе транскрипции и в лечении или предупреждении заболеваний костей, расстройств или повреждений, соответственно.
Кроме того, в контексте настоящего изобретения установлено, что единственная обработка КМБ-кодирующей РНК (РНК КМБ) достаточна для полноценного лечения (или предупреждения) заболеваний, расстройств или травм, связанных с костями. Следовательно, одно из преимуществ средств и способов по настоящему изобретению заключается в том, что РНК КМБ необходимо вводить только один раз.
Другое преимущество средств и способов по настоящему изобретению заключается в том, что альтернативный генной терапии на основе ДНК и традиционной транскрипционной терапии вариант можно применять без соответствующих ограничений, например, вирусных и невирусных векторов, и без недостатков, касающихся безопасности и/или ограниченной стабильности/экспрессивности.
Другим преимуществом применения РНК в связи с настоящим изобретением является возможность регулирования длительности лечения (в отличие от применения векторов ДНК). Например, в случае индукции стволовых клеток желательно, чтобы факторы транскрипции были только временно активными для перепрограммирования соматических клеток в стволовые клетки. Через дозированное введение соответствующей РНК, кодирующей (а) КМБ, активность контролируют по прошествии длительного времени. В отличие от такого способа в ранее разработанных методах существует риск от интеграции введенных генов, что может привести к осложнениям, например, к развитию опухолей, а также может сделать невозможным контролирование продолжительности действия.
Настоящее изобретение в частности основывается на экспериментах, описанных в прилагаемых примерах.
Эти примеры, наряду с прочим, показывают, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), например, КММСК и ЖМСК), трансфецированные РНК КМБ (например, хмРНК чКМБ-2 или хмРНК чКМБ-7), секретируют повышенные уровни биологически активного КМБ (например, КМБ-2 или КМБ-7), в частности, на длительной основе (например, в течение 7 суток). Такие уровни секретируемого белка эффективны в индукции дифференциации остеогенеза (в экспериментах in vitro). Это было показано с помощью экспрессии остеогенных маркеров, в частности, путем определения повышенных уровней щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase - ALP), установленных в трансфецированных клетках, повышенной экспрессии RunX2, ALP, остерикса, остеокальцина, остеопонтина и коллагена I типа (определение методом количественной полимеразной цепной реакции реального времени - РВ-кПЦР). Кроме того, об этом может свидетельствовать (in vitro) минерализация (минеральное отложение в матриксе). Минерализацию фиксируют по положительному окрашиванию ализарином красным, которое наступает через 2 недели после трансфекции (МСК с соответствующей хмРНК). Остеогенный потенциал РНК КМБ (например, хмРНК чКМБ-2 и хмРНК чКМБ-7) также показан для жировой ткани человека, трансфецированной соответствующей РНК КМБ (ex vivo). Жировая ткань человека также дает остеогенный ответ (in vitro), что показано экспрессией чКМБ-2, RunX2, ALP и коллагена I типа.
В контексте настоящего изобретения показано, что условия трансфекции могут быть оптимизированы для получения повышенной эффективности трансфекции, даже с минимальной цитотоксичностью. В этом контексте трансфекцию МСК хмРНК сначала исследуют с помощью нескольких реагентов для трансфекции и разных репортерных хмРНК (флуоресцентных белков). Достигают высокой эффективности трансфекции, которая приводит к устойчивой экспрессии белка (до 5 суток). Пик экспрессии обычно наблюдают между 24 и 48 ч после трансфекции.
Кроме того, осуществляют скрининг цитотоксичности для определения биосовместимости комплексов, применяемых для трансфекции МСК. На основании результатов экспрессии и жизнеспособности клеток отбирают наилучшие протоколы трансфекции для дальнейшей трансфекции клеток (МСК) РНК КМБ (например, хмРНК чКМБ-2 или хмРНК чКМБ-7). В частности, установлено с помощью люциферазы Metridia в качестве репортерной системы, что реагент DreamFect Gold (DF-Gold) весьма эффективный невирусный липидный энхансер для доставки (хм)РНК в клетки. Комплексы DF-Gold/(xм)РНК высоко эффективны для трансфекции (хм)РНК, но при этом незначительно воздействуют на клетки. В контексте настоящего изобретения в прилагаемых примерах применяют липофекцию и магнитофекцию для трансфекции. Таким образом, сильное повышение эффективности трансфекции получают с разными (хм)РНК, в частности для двух разных первичных типов клеток, ЖМСК и КММСК. В частности, показано, что перенос РНК КМБ (например, хмРНК чКМБ-2 или хмРНК чКМБ-7) в клетки (например, в МСК, такие как КММСК и ЖМСК) как липофекцией, так и магнитофекцией, поддерживает in vitro остеогенез.
Наивысшей эффективности трансфекции достигают магнитофекцией, в частности, когда магнитофекцию применяют в отношении МСК (например, КММСК или ЖМСК).
Считают, что КММСК сложны для трансфекции (Lakshmipathy, Stem cells 22(4), 2004, 531-543). Однако в контексте настоящего изобретения показано, что даже в случае КММСК можно достичь эффективной трансфекции с помощью магнитофекции магнитными липоплексами хмРНК eGFP с выходом 80% положительных клеток через 24 ч. Сходным образом, при использовании хмРНК чКМБ-2 в клетках ЖМСК фиксируют шестикратное увеличение индекса эффективности магнитофекции (Magnetofection Advantage Index - MAI). В частности, чКМБ-2-трансфецированные ЖМСК способны секретировать существенно большие количества чКМБ-2 по сравнению с нетрансфецированными клетками на протяжении до 7 суток. В этом случае наблюдают плато в экспрессии белка между 24 и 72 ч. Этот эффект также может быть полезен для терапевтического действия хмРНК чКМБ-2 (или другой РНК КМБ) в соответствии с настоящим изобретением. Несомненно, в результате постоянной выработки чКМБ-2 (или другого КМБ) трансфецированными клетками экспрессия гена остеогенеза и минерацизация также повышаются.
Кроме того, ЖМСК, трансфецированные с помощью магнитофекции, проявляют повышенную экспрессию фактора транскрипции RunX2, остеопонтина и щелочной фосфатазы, а также повышенное отложение минералов. Без опоры на какую-либо теорию, следует отметить, что экспрессия RunX2 отражает роль фактора транскрипции RunX2 в контроле прогрессирования остеогенной дифференциации. ЖМСК, трансфецированные хмРНК чКМБ-2 с помощью магнитоффекции, показывают самую высокую и устойчивую экспрессию RunX2, которая, в свою очередь, хорошо коррелирует с более выраженным остеогенезом, наблюдаемым в этих образцах in vitro.
В принципе, описанное выше для КМБ-2, в контексте настоящего изобретения также относится к КМБ-7. В частности, чКМБ-7-трансфецированные ЖМСК способны секретировать существенно более высокие количества чКМБ-7 по сравнению с клетками, не подвергшимися трансфекции, на протяжении 3 суток. В этом случае наблюдают максимальную экспрессию белка через 24 ч после трансфекции. Исследуют две разные дозы хмРНК чКМБ-7, а именно 20 и 32 пг/клетку. Клетки, трансфецированные 20 пг/клетку, проявляют существенно большую секрецию чКМБ-7 по сравнению с дозой 32 пг/клетку. Трансфецированные ЖМСК способны минерализовывать матрикс, проявляя повышенный остеогенез в таких образцах in vitro.
Уже упоминалось и ниже продемонстрировано в настоящем изобретении, что биопсии жировой ткани, трансфецированные хмРНК чКМБ-2 (или другой РНК КМБ), экспрессируют повышенный уровень чКМБ-2 (или уровень другого КМБ), который в свою очередь повышает регуляцию экспрессии нескольких остеогенных маркеров при культивировании in vitro в течение до 7 суток. Основываясь на этих результатах можно сделать вывод, что жировые имплантаты, трансфецированные чКМБ-2 (жировые имплантаты, трансфецированные другим КМБ), могут быть эффективным источником чКМБ-2 (или другого КМБ) и соответствующих клеток-предшественниц для репарации аутологичной ткани. Таким образом, полученные в настоящем изобретении результаты in vitro показывают, что РНК КМБ, в частности хмРНК чКМБ-2 и хмРНК чКМБ-7, представляют шаг вперед в применении технологии трансплантации аутологичной ткани для костной регенерации. Это позволяет избежать применения вирусных векторов и связанных с ними недостатков (проблем безопасности и др., см. выше).
Прилагаемые примеры и приведенное здесь описание дополнительно предусматривают надежную основу для исследований, касающихся формирования костей, на клинически значимых моделях животных. Такие исследования могут быть легко выполнены квалифицированными специалистами.
Соответствующим примером, не ограничивающим рамок охвата настоящего изобретения, является хмРНК чКМБ-2, которую пересаживают на материал костного имплантата и вводят in vivo при костном дефекте некритического размера в бедро крыс. Результат, полученный микрокомпьютерной томографией (Micro Computer Tomography - μСТ) подтверждает терапевтический эффект хмРНК чКМБ-2 в лечении костей. У таких животных, обработанных хмРНК чКМБ-2, наблюдают стимуляцию остеогенеза in vivo. Напротив, у животных, обработанных неспецифической хмРНК (например, хмРНК, кодирующей люциферазу светлячка (firefly luciferase - FFL)), остеогенеза не наблюдают. Это свидетельствует о том, что хмРНК чКМБ-2 опосредует терапевтическую экспрессию чКМБ-2 in vivo в месте дефекта кости, вызывая остеогенез.
В контексте настоящего изобретения также показано, что носитель/несущие тела (например, коллагеновые губки или фибриновые сгустки) могут быть частью эффективной системы трансфекции при нагрузке РНК, в частности КМБ-кодирующей РНК, а также когда клетки, подвергаемые трансфекции, высевают на них. Таким образом, носители/несущие тела могут функционировать в качестве 3D-матриц при регенерации кости. Кроме того, в настоящем изобретении установлено, что носители/несущие тела (например, коллагеновые губки или фибриновые сгустки) можно применять не только в качестве 3D-каркаса для высева клеток, но также в качестве депо для устойчивой доставки РНК (в частности КМБ-кодирующей РНК, например, хмРНК или даже химически немодифицированной КМБ-кодирующей РНК).
В частности, что показано в прилагаемых примерах, сначала коллагеновые губки предварительно нагружают (м)РНК, содержащей липоплексы, и высушивают в вакууме. Затем высушенные нагруженные губки применяют в качестве 3D-матриц для высева клеток. Следовательно, настоящее изобретение также относится к системе доставки, которая объединяет и упрощает процесс высева клеток и трансфекции (м)РНК, проводя их в один этап. Кроме того, коллагеновые губки, нагруженные (м)РНК, проявляют способность к замедленной доставке. Таким образом, они могут преодолеть быструю и краткосрочную выработку белков относительно классической 2D трансфекции мРНК. В качестве примера клинического применения была исследована регенерация костей in vitro и in vivo с использованием коллагеновых губок, нагруженных (м)РНК чКМБ-2. Кроме того, для исследования потенциала высушенных в вакууме нагруженных (м)РНК коллагеновых губок в качестве готовых к применению биопродуктов, их срок годности был успешно оценен в длительном анализе стабильности. Следовательно, изобретение также обеспечивает устойчивую доставку из депо (м)РНК. Это открывает новые пути для удобной и безопасной замены генной терапии в клинических подходах.
Неожиданно в настоящем изобретении удалось продемонстрировать, что немодифицированная (м)РНК также может быть успешно использована для целей генной терапии, в частности, если она является частью системы доставки/депо, описанной в настоящем изобретении, предусматривающем введение с помощью такой системы/депо.
Другим преимуществом настоящего изобретения является высокая эффективность трансфекции клеток (близкая к 100%) и низкая клеточная токсичность. Уже упоминалось, что высушенные для повышения стабильности под вакуумом РНК, в частности при нагрузке на коллагеновые губки, стабильны в течение длительного времени (например, в течение, по меньшей мере, 6 месяцев при комнатной температуре). Кроме того, в настоящем изобретении регенерация кости in vitro (с клетками МС3Т3-Е1 и МСК) и in vivo (при повреждении бедра крысы) при использовании РНК чКМБ-2 подтверждает эффективность системы в доклиническом применении.
В целом, настоящее изобретение, среди прочего, предусматривает для нагрузки (высушенной в вакууме) РНК носитель (коллагеновые губки) в качестве стабильных и эффективных систем доставки РНК для длительной экспрессии белка, тем самым, делая транскрипционную терапию на шаг ближе к клиническим применениям. В частности, настоящее изобретение показало безопасность, эффективность и стабильность нагруженных РНК высушенных в вакууме коллагеновых губок в качестве готовых к применению биопродуктов. Соответствующая технология без применения вирусов и генов обеспечивает устойчивую систему доставки РНК, которая не зависит от модификаций РНК, типа клеток и плотности клеток. Изучение дифференциации кости in vitro и in vivo с помощью этой технологии подтверждает возможность применять в медицине РНК-нагруженные высушенные в вакууме коллагеновые губки, когда замедленное поступление белка соответствует цели терапии. Это исследование по степени безопасности открывает новые пути для более простых, но перспективных применений матричной РНК, которые превосходят основанную на ДНК генную терапию.
Настоящее изобретение дополнительно относится к следующим положениям:
1. Фармацевтическая композиция, включающая полирибонуклеотид (РНК) с последовательностью, кодирующей костный морфогенетический белок (КМБ) для применения в:
(i) лечении или предупреждении костного заболевания, костного расстройства или костного повреждения, и/или
(ii) индукции или повышении остеогенной дифференциации, остеогенеза, окостенения, костной регенерации и/или костного морфогенеза
у пациента.
2. Фармацевтическая композиция по пункту 1, в которой указанный КМБ является КМБ-2 или КМБ-7.
3. Фармацевтическая композиция по пунктам 1-2, в которой указанная РНК инкапсулирована.
4 Фармацевтическая композиция по пунктам 1-3, в которой указанная РНК трансфецирована липофекцией.
5. Фармацевтическая композиция по пунктам 1-4, в которой указанная РНК трансфецирована магнитофекцией.
6. Фармацевтическая композиция по пункту 5, дополнительно включающая магнитные наночастицы (МНЧ).
7. Фармацевтическая композиция по пунктам 4-6, дополнительно включающая реагент для липосомальной трансфекции (РЛТ).
8. Фармацевтическая композиция по пункту 7, в которой соотношение массы указанного РЛТ к массе указанной РНК составляет от 2 до 20 мкг указанного РЛТ на мкг указанной РНК.
9. Фармацевтическая композиция по пунктам 7-8, в которой соотношение указанных МНЧ к указанному РЛТ к указанной РНК составляет 0,5 (масса железа) : примерно от 2 до 5 или от 4 до 7 (масса) : примерно 1 (масса), соответственно.
10. Фармацевтическая композиция по пунктам 1-9, в которой доставку РНК осуществляют vivo.
11. Фармацевтическая композиция по пункту 10, в которой указанную РНК вводят непосредственно в кость или костную ткань указанного пациента.
12. Фармацевтическая композиция по пунктам 1-9, в которой указанную РНК внедряют в клетки ex vivo, которые вводят пациенту.
13. Фармацевтическая композиция по пункту 12, в котором указанную РНК внедряют в клетки указанного пациента ех vivo, и в котором указанные клетки, в которые была внедрена указанная РНК, вводят указанному пациенту.
14. Фармацевтическая композиция по пунктам 12-13, в которой указанные клетки являются остеопрогениторными клетками.
15. Фармацевтическая композиция по пунктам 12-14, в которой указанные клетки являются мезенхимальными стволовыми клетками (МСК).
16. Фармацевтическая композиция по пункту 15, в которой указанные МСК являются мезенхимальными стволовыми клетками (ЖМСК), производными от жировой ткани или производными от костного мозга МСК (КММСК).
17. РНК, последовательность которой кодирует КМБ-2 или КМБ-7, причем 25% остатков цитидина в указанной РНК являются 5-метилцитидинами (m5С) и 25% уридинов указанной РНК являются 2-тиоуридинами (s2U).
18. Фармацевтическая композиция по пунктам 1-16, в которой указанная РНК является РНК по пункту 17.
В принципе фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предусмотрена для лечения или предупреждения какого-либо заболевания, расстройства, дефекта или повреждения, которое связано, ассоциировано, связано физиологически или затрагивает кости (и в настоящем описании просто называется заболеванием костей). В этом контексте РНК по настоящему изобретению может применяться для лечения или предупреждения заболеваний костей таким образом, что в клетке или в ткани, в которые интродуцируют РНК, (а) могут быть сформированы КМБ, которые естественным образом не экспрессируются или экспрессируются в недостаточном количестве. РНК может применяться в двух следующих случаях: (i) если КМБ не образуется из-за недостаточности гена, а также из-за заболевания или (ii) если интродукция КМБ полезна для организма. РНК также может применяться для пополнения КМБ, который не экспрессируется в требуемом количестве.
В частности, заболевание костей, которое нужно лечить или предотвращать в соответствии с настоящим изобретением, ассоциировано или физиологически связано с (функцией) одного или нескольких КМБ, например, КМБ-1, КМБ-2, КМБ-3, КМБ-4, КМБ-5, КМБ-6, КМБ-7, КМБ-8а, КМБ-8б, КМБ-10 и/или КМБ-15, предпочтительно КМБ-7, более предпочтительно КМБ-2. В частности, лечение заболевания костей в соответствии с настоящим изобретением представляет такое заболевание костей (определенное на основании симптомов), которое можно лечить, предупреждать или облегчать путем доставки, индукции и/или увеличения (функции) одного или нескольких КМБ.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также применяют для индукции или повышения степени остеогенной дифференциации (например, дифференциации МСК в остеогенные клетки), остеогенеза, окостенения, регенерации костей, морфогенеза костей, формирования костей, роста костей, минерализации и/или кальцификации, в частности у пациента, и особенно в контексте лечения или предупреждения заболевания костей по настоящему изобретению.
Многие виды заболеваний костей известны в данной области и описаны, например, в работе Evans (2012, см. выше), в частности в табл. 1. Примерами заболеваний костей, подлежащих лечению или предотвращению в контексте настоящего изобретения, являются несовершенный остеогенез (моногенное доминантно-негативное генетическое заболевание), (дегенеративный) остеопороз, (остеопорозные) переломы, несрастание перелома, дефекты костей, сегментальные дефекты, костные кисты, спондилозис, аваскулярный некроз, опухоли костей (например, остеосаркома, саркома Юинга), остеолиз (например, остеолиз, индуцированный раком, асептическое расшатывание).
Особой областью применения, в которой можно использовать РНК КМБ по настоящему изобретению, является регенеративная медицина, связанная с костями. В контексте болезненных процессов или старения возникают дегенеративные заболевания костей, которые можно лечить, смягчать, предотвращать или даже излечивать путем введения (а) КМБ, в частности, если КМБ выработано слишком мало или совсем нет, но не из-за болезни или процессов старения. Путем интродукции значимой РНК КМБ, кодирующей (а) КМБ, дегенеративный процесс может быть остановлен или даже может быть инициирована регенерация. В связи с этим в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения костным заболеванием, которое лечат или предупреждают по настоящему изобретению, является дегенеративное костное заболевание. К примерам дегенеративных костных заболеваний наряду с другими относят дегенеративный остеопороз, спондилозис (также называемый прогрессирующим дегенеративным артритом), остеомаляцию и рахит.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению предусматривают для лечения костей. Например, остеопорозные переломы, несрастание перелома, сегментальные дефекты, костные кисты, спондилозис, аваскулярный некроз предусматривают лечить в контексте настоящего изобретения.
В частности, несрастания перелома, сегментальные костные дефекты и переломы, особенно остеопорозные переломы, являются объектами для обработки, предупреждения и/или лечения в соответствии с настоящим изобретением.
РНК, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, также может воздействовать на течение костного заболевания. Примерами являются костные заболевания, которые не являются непосредственно связанными с генным нарушением, но на течение которых можно позитивно воздействовать с помощью экспрессии РНК КМБ. Примерами являются белки КМБ для лечения костей в качестве факторов «тканевой инженерии».
КМБ, кодируемыми РНК по настоящему изобретению, могут быть КМБ-1, КМБ-2, КМБ-3, КМБ-4, КМБ-5, КМБ-6, КМБ-7, КМБ-8а, КМБ-8b, КМБ-10 и/или КМБ-15, предпочтительно КМБ-7, более предпочтительно, КМБ-2. Предпочтительными КМБ для применения по настоящему изобретению являются КМБ человека (чКМБ). В данной области известно чКМБ, например, описанные Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(2-3) см. выше, Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(1) см. выше, Urist, см. выше). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности КМБ человека доступны в базах данных в данной области (например, NCBI по адресу: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Примеры соответствующей информации из баз данных перечислены в табл. 5, см. ниже.
Определенная нуклеотидная последовательность чКМБ-2 представлена в SEQ ID NO: 1. Определенная нуклеотидная последовательность чКМБ-7 представлена в SEQ ID NO: 2. Определенная аминокислотная последовательность чКМБ-2 представлена в SEQ ID NO: 3. Определенная аминокислотная последовательность чКМБ-7 представлена в SEQ ID NO: 4.
В контексте настоящего изобретения предполагают, что понятие «КМБ» (или «РНК КМБ») также включает функциональные фрагменты и варианты соответствующего КМБ (или соответствующей РНК КМБ).
Помимо самой РНК КМБ, варианты РНК КМБ также можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Вариант РНК КМБ может структурно отличаться от самой РНК КМБ, но по-прежнему функционально активен таким же образом, что и сама РНК КМБ. В частности предусматривают вариант РНК КМБ, кодирующий белок, способный функционировать в качестве соответствующего самого КМБ, т.е. способный ингибировать активность морфогенеза костей. Точнее вариант РНК КМБ предназначен для кодирования белка, способного регулировать остеогенез. В этом контексте остеогенез может регулироваться на двух разных уровнях: (i) коммитирование скелетных прогениторных клеток, и/или (ii) вызревание остеобластов на стадии постнатального развития. По существу вариант РНК КМБ предназначен кодировать белок, способный индуцировать или повышать остеогенную дифференциацию, остеогенез, окостенение, регенерацию костей и/или морфогенез костей. Специалист в данной области может определить, действительно ли данный вариант РНК КМБ функционирует так же, как и сама соответствующая РНК КМБ, например, кодирует белок, способный ингибировать активность костного морфогенеза. Для этого специалист в данной области может полагаться на соответствующие средства и методы предшествующего уровня техники (см. выше описание Yamaguchi), используемые в прилагаемых примерах. Например, специалист в данной области может определить, действительно ли данный вариант РНК КМБ индуцирует остеогенез in vitro, ex vivo и/или in vivo (например, как определено в примерах 5 или 7, соответственно).
В принципе, чем больше вариант РНК КМБ схож с самой соответствующей РНК КМБ, тем более предпочтительным вариантом он является.
Определенная РНК КМБ или вариант РНК КМБ в соответствии с настоящим изобретением может быть РНК, выбранной из группы, состоящей из:
(а) РНК, кодирующей аминокислотную последовательность КМБ-1, КМБ-2 (особенно предпочтительная), КМБ-3, КМБ-4, КМБ-5, КМБ-6, КМБ-7 (предпочтительная), КМБ-8а, КМБ-8b, КМБ-10 или КМБ-15, например, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4,
(б) РНК, кодирующей аминокислотную последовательность КМБ-1, КМБ-2 (особенно предпочтительная), КМБ-3, КМБ-4, КМБ-5, КМБ-6, КМБ-7 (предпочтительная), КМБ-8а, КМБ-8b, КМБ-10 или КМБ-15, имеющую одно или несколько аминокислотных замещений, инсерций и/или делеций, например, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, имеющую один или несколько аминокислотных остатков, замещенных, инсертированных и/или делегированных (причем указанная РНК кодирует белок, способный ингибировать активность костного морфогенеза),
(в) РНК (кодируемой нуклеотидной последовательностью), которая гибридизуется с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность КМБ-1, КМБ-2 (особенно предпочтительная), КМБ-3, КМБ-4, КМБ-5, КМБ-6, КМБ-7 (предпочтительная), КМБ-8а, КМБ-8б, КМБ-10 или КМБ-15, например, кодирующей аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 (где указанная РНК кодирует белок, способный ингибировать морфогенетическую активность костей), и
(г) РНК, кодирующей аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности (полной длины) КМБ-1, КМБ-2 (особенно предпочтительная), КМБ-3, КМБ-4, КМБ-5, КМБ-6, КМБ-7 (предпочтительная), КМБ-8а, КМБ-8b, КМБ-10 или КМБ-15, например, аминокислотной последовательности (полной длины) представленной в виде SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 (где указанная РНК кодирует белок, способный ингибировать активность по костному морфогенезу).
В контексте настоящего изобретения понятие «один или несколько аминокислотных остатков замещены, инсертированы и/или делегированы» в частности означает, что не более 500, не более 400, не более 300, не более 200, не более 100, не более 50, не более 30, не более 20, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или 1 аминокислотного остатка, замещено, инсертировано и/или делетировано. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения это понятие означает одну или несколько аминокислотных замен, предпочтительно консервативных аминокислотных замен, например, не более 500, не более 400, не более 300, не более 200, не более 100, не более 50, не более 30, не более 20, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или 1 (консервативного) аминокислотного замещения (замещений).
В контексте настоящего изобретения понятие «гибридизация» означает, что гибридизация происходит между одной молекулой нуклеиновой кислоты и другой (комплементарной) молекулой нуклеиновой кислоты. Гибридизацию двух молекул нуклеиновой кислоты как правило производят в обычных условиях. В контексте настоящего изобретения предпочтительны жесткие условия гибридизации. Условия гибридизации описаны, например, Sambrook и Russell в кн.: «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 2001, изд-во CSH Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, США. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «гибридизация» означает, что гибридизацию производят при следующих (жестких) условиях:
2
4
Буфер для гибридизации: 2 × SSC, предпочтительно 1 × SSC; 10 × раствор Денхардта (Fikoll 400 + ПЭГ + БСА, соотношение 1:1:1); 0,1% SDS; 5 мМ EDTA; 50 мМ NaHPO, 250 мкг/мл ДНК спермы сельди, 50 мкг/мл тРНК, или 0,25 М натриево-фосфатный буфер, рН 7,2, 1 мМ EDTA, 7% SDS.
Температура гибридизации: 60°С, предпочтительно 65°С.
Буфер для промывки: 2 × SSC, предпочтительно 1 × SSC, более предпочтительно 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
Температура для промывки: 60°С, предпочтительно 65°С.
Отмечено, что РНК, кодирующая функциональный фрагмент КМБ, также может быть применена в соответствии с настоящим изобретением. Понятие «функциональный» в этом контексте означает, что фрагмент функционально активен в той же степени, что и соответствующая полной длины РНК КМБ. В частности функционально активным фрагментом КМБ является такой фрагмент КМБ, который сохраняет способность проявлять активность костного морфогенеза. То, что было сказано в настоящем изобретении выше в отношении
функциональной активности варианта РНК КМБ, также относится к функциональному фрагменту КМБ mutatis mutandis (с соответствующими поправками).
Определенный (функциональный) фрагмент КМБ может быть аминокислотным отрезком, состоящим, по меньшей мере из 50, по меньшей мере из 100, по меньшей мере из 150, по меньшей мере из 200, по меньшей мере из 300, по меньшей мере из 500 или по меньшей мере из 700 (последовательных) аминокислотных остатков соответствующего КМБ.
РНК КМБ, кодирующая функциональный фрагмент белка, кодируемого каким-либо из описанных в настоящем изобретении вариантов РНК КМБ, также может применяться в контексте настоящего изобретения. К тому же такая РНК КМБ предназначена для кодирования белка, способного функционировать в качестве соответствующего КМБ, т.е. способного ингибировать костную морфогенетическую активность. Сказанное в настоящем изобретении выше относительно функциональной активности варианта РНК КМБ и фрагмента КМБ, также применимо к такой РНК КМБ, mutatis mutandis (с соответствующими поправками).
В принципе, значение термина «РНК КМБ» в настоящем изобретении охватывает все: (1) описанную в настоящем изобретении РНК, кодирующую сам КМБ и КМБ полной длины, соответственно, (ii) описанный в настоящем изобретении вариант РНК, кодирующий вариант КМБ, и (iii) описанную в настоящем изобретении РНК, кодирующую (вариант) функционального фрагмента КМБ.
Приведенные в виде иллюстраций нуклеотидные последовательности РНК КМБ/конструкций РНК КМБ, предусмотренных для применения в соответствии с настоящим изобретением, описаны в SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30 (обе (хм)РНК чКМБ-2) и SEQ ID NO: 29 ((хм)РНК чКМБ-7).
В контексте настоящего изобретения понятие «РНК» следует относить к какой-либо молекуле полирибонуклеотида, которая, если она входит в клетку, пригодна для экспрессии белка или его функционального фрагмента, или может быть переведена в белок или его функциональный фрагмент. Термин «белок» здесь охватывает какую-либо аминокислотную последовательность, то есть цепи из двух или более аминокислотных остатков, каждый из которых связан пептидными связями, а также включает пептиды и гибридные белки.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения РНК для применения в соответствии с настоящим изобретением, например, для включения в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, является матричной РНК (мРНК). Это означает, что в соответствии с таким вариантом осуществления настоящего изобретения любая из описанных здесь РНК может быть в форме мРНК.
Применяемая РНК может быть двухцепочечной РНК (например, из-за меж- или внутримолекулярной гибридизации) или, предпочтительно, одноцепочечной РНК (которая, однако, может включать, по меньшей мере (а) двухцепочечную часть (части) из-за межмолекулярной гибридизации, например (а) шпильки)).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения РНК, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, является неприродной РНК, в частности неприродной мРНК.
РНК, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, может быть химически модифицированной РНК (хмРНК), что, в принципе, предпочтительно. Такие хмРНК известны в данной области и, описаны, например, Kormann (см. выше). Mays (см. выше) и в WO 2011/012316. В частности, применяемая хмРНК может быть хмРНК, описанной в WO 2011/012316.
Предпочтительно, если РНК, и особенно хмРНК, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, обладает повышенной стабильностью и/или пониженной иммуногенностью. В частности, предусматривают, что РНК, и особенно хмРНК, аннулирует взаимодействие РНК с Toll-подобными рецепторами и/или с индуцируемым ретиноевой кислотой геном I (retinoid-inducible gene I - RIG-I). В принципе это относится к какой-либо из хмРНК, описанной в настоящем изобретении.
Иммуногенность и стабильность могут быть определены известным способом.
Для определения иммуногенности РНК можно применить разные методы, известные специалистам в данной области. Весьма подходящим методом является определение воспалительных маркеров в клетках в качестве реакции на введение РНК. Обычно измеряют цитокины, которые связаны с воспалением, например, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-8, IL-6, IL-12 или другие цитокины, известные специалистам в данной области. Экспрессию маркеров активации дендритных клеток также можно применять для оценки иммуногенности. Еще одним признаком иммунологической реакции является обнаружение связывания с Toll-подобными рецепторами TLR-3, TLR-7 и TLR-8, а также с геликазой RIG-1.
Иммуногенность обычно определяют по отношению к контролю. В общем, метод заключается в том, что РНК, которую используют в соответствии с настоящим изобретением, вводят в клетки и определяют секрецию воспалительных маркеров на протяжении определенного времени в качестве реакции на введенную РНК. В качестве стандарта, используемого для сравнения, могут применять РНК, о которой известно, что она не вызывает иммунного ответа или иммунный ответ слабый, причем в этом случае иммунный ответ на РНК, применяемую в соответствии с настоящим изобретением, лежит в том же диапазоне и не повышается. При использовании РНК по настоящему изобретению предусматривают, что иммунный ответ ниже, по меньшей мере, на 30%, как правило, по меньшей мере, на 50% или даже на 75%, или даже полностью отсутствует.
Иммуногенность можно определить путем измерения вышеуказанных факторов, в частности путем измерения уровней TNF-α и IL-8, а также способности связываться с TLR-3, TLR-7, TLR-8 и геликазой RIG-1. Для того чтобы установить, обладает ли (м)РНК требуемой низкой иммуногенностью, измеряют количество одного или нескольких из указанных выше факторов после введения соответствующего полирибонуклеотида. Так, например, количество исследуемой (м)РНК можно вводить мышам через хвостовую вену или внутрибрюшинно, после чего один или несколько из указанных выше факторов можно измерить в крови после заранее определенного периода, например, через 7 или 14 суток. Затем количество фактора сопоставляют с количеством фактора, присутствующего в крови необработанных животных. Установлено, что для определения иммуногенности очень важно определить связывающую способность с TLR-3, TLR-7, TLR-8 и/или геликазой RIG-1. Уровни TNF-α и уровни IL-8 также являются ценными показателями. С (м)РНК для применения в настоящем изобретении, например, можно снизить связывающую способность с TLR-3, TLR-7, TLR-8 и RIG-1, по меньшей мере, на 50% по сравнению с немодифицированной РНК. Обычно можно снизить связывание с указанными факторами, по меньшей мере, на 75% или даже на 80%. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способность связываться с TLR-3, TLR-7, TLR-8 и RIG-1 лежит в том же диапазоне для (м)РНК, применяемой по настоящему изобретению, также для животных, которым не вводили мРНК. Иначе говоря, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают, что (м)РНК по настоящему изобретению практически не вызывает воспалительных или иммунологических реакций.
В частности предусматривают, что РНК, используемая в соответствии с настоящим изобретением, обладает такой низкой иммуногенностью, что общее состояние пациента не изменяется. Таким образом, незначительное увеличение указанных факторов может переноситься до тех пор, пока общее состояние в результате не ухудшится.
Дополнительными свойствами (м)РНК, которые можно применять по настоящему изобретению, являются ее эффективность и стабильность. Для этого важны эффективность транскрипции, эффективность трансфекции, эффективность трансляции и продолжительность экспрессии белка, которые могут быть определены известными методами.
Эффективность транскрипции показывает, насколько эффективно РНК может быть получена из ДНК. Здесь могут возникать проблемы из-за применения большого количества модифицированных нуклеотидов. РНК, модифицированная в соответствии с настоящим изобретением, может быть получена при высокой эффективности транскрипции.
Конкретной РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, является РНК, которая имеет (химически) модифицированные цитидиновые нуклеотиды и/или (химически) модифицированные уридиновые нуклеотиды. Такие РНК описаны, например, в WO 2011/012316.
Примеры соответствующих (химических) модификаций представлены в табл. 4. Предпочтительным модифицированным цитидином является 5-метилцитидин (m5С). Предпочтительным модифицированным уридином является 2-тиоуридин (s2U).
В частности, хмРНК, применяемой в настоящем изобретении, может быть РНК, которая содержит 5-50% модифицированных остатков цитидина и/или 5-50% модифицированных остатков уридина, и 50-95% немодифицированных нуклеотидов цитидина и/или 50-95% немодифицированных нуклеотидов уридина. Нуклеотиды аденозин и гуанозин могут быть немодифицированными или частично модифицированными, но предпочтительно они присутствуют в немодифицированной форме. Предпочтительно, 7,5-35% нуклеотидов цитидина и/или уридина модифицированы, и, более предпочтительно, содержание модифицированных нуклеотидов лежит в диапазоне 15-25% и/или содержание модифицированных уридиновых нуклеотидов в диапазоне 15-25%.
(0.25)
(0.25)
Одним из примеров хмРНК, которая не ограничивает настоящее изобретение и может быть в нем применена, является РНК, в которой примерно 25% цитидинов указанной РНК являются модифицированными цитидинами (например, 5-метилцитидины (m5С)) и/или примерно 25% уридинов указанной РНК являются модифицированными уридинами (например, 2-тиоуридинами (s2U)) (m5Сs2UРНК). Соответствующие нуклеотиды аденозина и гуанозина предпочтительно присутствуют в немодифицированной форме.
Однако в другом варианте осуществления настоящего изобретения РНК для применения по настоящему изобретению также может не быть хмРНК, т.е. РНК может быть химически немодифицированной. В таком варианте осуществления настоящего изобретения химически немодифицированная РНК может быть неприродной или, предпочтительно, природной РНК. В частности, предполагают, что химически немодифицированная РНК для применения по настоящему изобретению включает только немодифицированные, т.е. природные остатки нуклеозидов, а именно природные аденозины, гуанозины, цитидины и уридины. Другие природные нуклеозиды, в принципе, также могут быть включены (например, инозины, тимидины и др.). В частности, РНК может отличаться от описанной выше хмРНК, и, например, может отличаться от хмРНК, описанной в WO 2011/012316. Однако нехимически модифицированная РНК для применения по настоящему изобретению может обладать пониженной иммуногенностью и, например, может аннулировать взаимодействие (м)РНК с Toll-подобными рецепторами и с ретиноид-индуцибельным геном I (RIG-I). Особенно при нагрузке на матрикс или каркас, т.е. носитель, в соответствии с настоящим изобретением и приведенном в настоящем описании, преимущество имеет нехимически модифицированная РНК. По существу, нехимически модифицированная РНК также обладает, например, длительным временем существования. Это делает соответствующий носитель, нагруженный нехимически модифицированной РНК, желательным депо для устойчивой/замедленной доставки РНК. Другое преимущество нехимически модифицированной РНК заключается в том, что не требуется стадия химической модификации применяемой РНК.
Таким образом, также предусматривают, что фармацевтическую композицию для применения в настоящем изобретении, а также матрикс или каркас, т.е. носитель, перерабатывают по настоящему изобретению для устойчивой/замедленной доставки РНК, в частности, нехимически модифицированной РНК для применения в соответствии с настоящим изобретением. Точнее, фармацевтическая композиция или матрикс/каркас могут быть переработаны в качестве системы, например, депо, для устойчивой и/или замедленной доставки РНК. Ниже в описании подробно изложено, что для этого предпочтительно, чтобы РНК присутствовала в форме комплекса в соответствии с настоящим изобретением, и чтобы матрикс/каркас представлял коллагеновую губку, которая может быть высушена в вакууме и/или заморожена, и на которую нагружена РНК.
В принципе, (м)РНК для применения в настоящим изобретении можно применять непосредственно как таковые. Однако также возможно (дополнительно) модифицировать мРНК, например, для создания (дополнительных) полезных свойств. Во-первых, мРНК может быть модифицирована путем присоединения других кодирующих или некодирующих последовательностей цепей. Во-вторых, она может быть модифицирована путем связывания дополнительных молекул с функциональными группами, имеющимися у модифицированных нуклеотидов.
В этом контексте РНК, применяемая по настоящему изобретению, может иметь дополнительные функциональные области и/или 3'- или 5'-некодирующие области. 3'- и/или 5'-некодирующие области могут быть областями, естественным образом фланкирующими кодируемый белок (КМБ), или искусственными последовательностями, которые способствуют стабилизации РНК. Специалисты в данной области могут определить соответствующие последовательности, в каждом случае с помощью обычных экспериментов.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения РНК содержит кэп m7GpppG, внутренний сайт связывания рибосомы (internal ribosome entry site - IRES) и/или поли-А-хвост с 3'-конца, в частности для улучшения трансляции. РНК может иметь дополнительные области активации трансляции.
Существенным является то, что для обеспечения функции КМБ или его функционального фрагмента для лечения, ослабления костного заболевания или его предупреждения, применяют (м)РНК.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения (м)РНК для применения можно комбинировать с целевыми лигандами, которые связываются с поверхностными рецепторами, специфичными для клеток-мишеней, таким образом, что возможна трансфекция клеток-мишеней через рецептор. Для этой цели, в первую очередь носители, пригодные для введения (м)РНК в клетки, или же сама (м)РНК могут быть модифицированы лигандом. Примерами соответствующих носителей для интродукции (м)РНК в клетки являются катионные агенты. К ним относятся катионные липиды, катионные полимеры, а также наночастицы, нанокапсулы, магнитные наночастицы и наноэмульсии. Подходящие носители известны специалистам в данной области и описаны в специальной литературе. Соответствующие лиганды также хорошо известны специалистам в данной области, описаны в литературе и доступны. В качестве лигандов можно применять трансферрин, лактоферрин, кленбутерол, сахар, уроновые кислоты, антитела, аптамеры и т.д. Примеры таких носителей и лигандов также описаны в настоящем изобретении.
Выше упоминалось, что сама (м)РНК может быть модифицирована с помощью лиганда. Для этой цели предпочтительными являются (м)РНК с модифицированными нуклеозидами, которые имеют первичную аминогруппу или азидогруппу во 2'-положении рибозы. Примеры можно найти в таблице 4. Такие модификации особенно предпочтительны, поскольку они способствуют биологической активности. С помощью таких модификаций лиганд может быть легко включен путем образования амидов или с помощью клик-химии, например, методами биоконъюгации.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения последовательность РНК (аптамер), которая может связываться с белками, например, рецепторами, интродуцируют с 5'-конца (м)РНК. Преимущество такой процедуры заключается в том, что лиганд может быть легко интродуцирован непосредственно в матрицу на уровне ДНК и клонирован и интродуцирован в (м)РНК, например, с помощью трансляции in vitro (in vitro translation - IVT). Поэтому последующей модификации (м)РНК с помощью лиганда больше не требуется.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения (м)РНК модифицируют с помощью дополнительной модификации инертными полимерами, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ). Способы такой модификации известны специалистам, и могут быть применены методы, известные для лигандов. Так, например, в небольшой части модифицированных нуклеотидов, примененных в (м)РНК, может быть предусмотрен сайт связывания для полиэтиленгликоля, с которым ПЭГ связывается после транскрипции. Полиэтиленгликоль служит для внеклеточной стабилизации (м)РНК, то есть он защищает молекулу полирибонуклеотида до тех пор, пока она не поступит в клетку. При входе в клетку ПЭГ отщепляется. Следовательно, связь между ПЭГ и РНК предпочтительно разработана таким образом, что облегчается расщепление при входе в клетку. Для этого, например, может быть предусмотрена функциональная группа, отщепление которой рН-зависимое. Другие молекулы, стабилизирующие РНК, также могут быть получены через соответствующие активные сайты модифицированных нуклеотидов. Таким способом (м)РНК может быть защищена стерической стабилизацией от ферментативного разрушения и предотвращения взаимодействия с компонентами биологических жидкостей. Модифицированную таким образом (м)РНК можно назвать «невидимой» (м)РНК.
Предпочтительный способ защиты и стабилизации РНК описан в патенте ЕР 1198489, сущность которого описана в настоящем изобретении. РНК, используемая в соответствии с настоящим изобретением, может быть защищена способами, описанными в ЕР 1198489. Было установлено, что, во-первых, РНК также может быть преимущественно стабилизирована и защищена этим методом, а во-вторых, что активность РНК, обработанной таким образом, не ограничена или существенно не ограничена. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения РНК обрабатывают в соответствии с ЕР 1198489.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения РНК (мРНК, хмРНК и др.), применяемая по настоящему изобретению, может быть инкапсулирована, т.е. заключена в капсулы. Например, капсулы могут быть нанокапсулами. Соответствующие капсулы известны в данной области, а также описаны в настоящем изобретении.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно включает один или несколько агентов или один или несколько реагентов для доставки и/или интродукции РНК в клетку-мишень или в ткань-мишень. В частности, предполагают, что такой агент (агенты) или реагент (реагенты) поддерживают доставку и/или интродукцию РНК в клетку или ткань. Такие агенты или реагенты можно вводить вместе с РНК. РНК для доставки/интродукции также может быть соединена (например, ковалентно или в комплексе) с таким/такими агентами или реагентами или не соединена с ними. Соответствующие агенты или реагенты известны в данной области (см., например, Tavernier, J Control Release 150(3), 2011, 238-247) и являются, например, выбранными из группы, включающей липиды и липосомы, мицеллы, полимеры и дендримеры наряду с прочими. Конкретными примерами агентов и реагентов являются DOTAP (1,2-диолеил-3-триметиламмонийпропан), DODAP (1,2-диолеил-3-диметиламмонийпропан), DOTMA (1,2-ди-0-октадеценил-3-триметиламмонийпропан), ХТС (2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан) и МС3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-di((9Z,12Z)-октадека-9,12-диэнил)тетрагидро-3аН-циклогепта[d][1,3]диоксол-5-амин)), NC98-5 (4,7,13-трис(3-оксо-3-(ундециламино)пропил)-N1,N16-диундецил-4,7,10,13-тетраазагексадекан-1,16-диамид), С12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, 1,2-дистеарилокси-N,N-диметил-3-аминопропан или «DSDMA», 1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан или «DODMA», 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан или «DLinDMA», 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметил-3-аминопропан или «DLenDMA», N-диолеил-N,N-диметиламмоний хлорид или «DODAC», N,N-дистеарил-N,N-диметиламмоний бромид или «DDAB», N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмоний бромид или «DMRIE», 3-диметиламино-2-(колест-5-ен-3-бета-оксибутан-4-окси)-1-(цис,цис-9,12-октадекадиенокси)пропан или «CLinDMA», 2-[5'-(колест-5-ен-3-бета-окси)-3'-оксапентокси)-3-диметил-1-(цис,цис-9',1-2'-октадекадиенокси)пропан или «CpLinDMA», N,N-диметил-3,4-диолеилоксибензиламин или «DMOBA», 1,2-N,N'-диолеилкарбамил-3-диметиламинопропан или «DOcarbDAP», 2,3-дилинолеоилокси-N,N-диметилпропиламин или «DLinDAP», 1,2-N,N'-дилинолеоилкарбамил-3-диметиламинопропан или «DLincarbDAP», 1,2-дилинолеоилкарбамил-3-диметиламинопропан или «DLinCDAP», 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан или «DLin-K-DMA», 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан или «DLin-K-XTC2-DMA», или их смеси (Heyes, J Controlled Release 107, 2005, 276-287, Morrissey, Nat. Biotechnol. 23(8), 2005, 1003-1007, WO 2005/121348). Другими примерами являются DC-хол(N,N-диметил-N-этилкарбоксамидхолестерин), 1,4-бис(3-N-олеиламино-пропил)пиперазин (Gao, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 1991, 280, Wolf с соавтю, BioTechniques 23, 1997, 139, US 5744335). Другими примерами являются LIPOFECTIN (DOTMA : DOPE) (фирма Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), LIPOFECTAMINE (DOSPA : DOPE) (фирма Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000 (фирма Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS) и EFFECTENE. Другими примерами являются модифицированные и немодифицированные полиакрилаты, полиалкилцианоакрилаты, полилактид, сополимер полилактида и полигликолида, поликапролактоны, декстран, альбумин, желатин, альгинат, коллаген, хитозан, циклодекстрины, полилизин, полиаргинин, олиго/полиамины и полиэтиленимин.
Агенты или реагенты могут быть олигомерами, полимерами или липидоидами. Они могут включать олиго(алкиленаминные) части, например, свойственные олиго(алкиленаминным) частям, описанным в РСТ/ЕР 2014/063756. В частности, агенты или реагенты могут быть олигомерами, полимерами или липидоидами, описанными в РСТ/ЕР 2014/063756. Одним из основных свойств таких конкретных агентов или реагентов является то, что они содержат следующую общую структуру формулы (I):
Такими агентами или реагентами могут быть (включение компонента) олиго(алкиленамин), выбранный из:
а) олигомера или полимера, включающего множество групп формулы (II) в качестве боковой цепи и/или концевой группы:
2
6
где переменные a, b, p, m, n и от R до R являются следующими, независимо для каждой группы формулы (II) в множестве таких групп:
а означает 1 и b означает целое число от 2 до 4, или а означает целое число от 2 до 4 и b означает 1,
p означает 1 или 2,
m означает 1 или 2, n означает 0 или 1 и m+n≥2, и
2
5
7
7
7
7
7
7
2
2
2
2
2
2
2
3
18
3
18
с R по R независимо друг от друга, выбраны из водорода, групп -СН-CH(OH)-R, -CH(R)-CH-ОН, -СН-СН-(С=O)-O-R, -CH-CH-(C=O)-NH-R или -CH-R, где R выбран из С-C алкила или С-C алкенила, имеющего одну двойную связь С-С, защитной группы для аминогруппы, и цепи поли(этиленгликоля),
6
7
7
7
7
7
7
2
2
2
2
2
2
2
3
18
3
18
2
R выбран из водорода, групп -CH-CH(OH)-R, -CH(R)-CH-OH, -СН-CH-(C=O)-O-R, -CH-CH-(C=O)-NH-R или -CH-R, где R выбран из С-C алкила или С-C алкенила, имеющего одну двойную связь С-С, защитной группы для аминогруппы, -C(NH)-NH, цепи поли(этиленгликоля) и рецепторного лиганда,
и где один или несколько атомов азота, указанных в формуле (II), могут быть протонированными для обеспечения катионной группы формулы (II),
б) олигомер или полимер, включающий множество групп формулы (III) в виде повторяющихся единиц:
2
5
где переменные a, b, p, m, n и с R по R выражены следующим образом, независимо для каждой группы формулы (III) в множестве таких групп:
а означает 1 и b означает целое число от 2 до 4, или а означает целое число от 2 до 4 и b означает 1,
p означает 1 или 2,
m означает 1 или 2, n означает 0 или 1 и m+n≥2, и
2
5
7
7
7
7
7
7
2
2
2
2
2
2
2
3
18
3
18
2
с R по R независимо друг от друга, выбраны из водорода, групп -СН-CH(OH)-R, -CH(R)-CH-OH, -CH-CH-(C=O)-O-R или -CH-CH-(C=O)-NH-R или -CH-R где R выбран из С-C алкила или С-C алкенила, имеющего одну двойную связь С-С, защитной группы для аминогруппы, -C(NH)-NH, и цепи поли(этиленгликоля),
и где один или несколько атомов азота, указанных в формуле (III), могут быть протонированными для обеспечения катионной группы формулы (III), и
в) липидоид формулы (IV):
1
6
где переменные a, b, p, m, n и с R по R выражены следующим образом:
а означает 1 и b означает целое число от 2 до 4, или а означает целое число от 2 до 4 и b означает 1,
p означает 1 или 2,
m означает 1 или 2, n означает 0 или 1 и m+n≥2, и
1
6
7
7
7
7
7
7
1
6
7
7
7
7
7
7
2
2
2
2
2
2
2
3
18
3
18
2
2
2
2
2
2
2
2
3
18
3
18
от R до R независимо друг от друга выбраны из водорода, группы -СН-CH(OH)-R, -CH(R)-CH-OH, -CH-CH-(C=O)-O-R, -CH-CH-(C=O)-NH-R или -CH-R, где R выбран из С-C алкила или С-C алкенила, имеющего одну двойную связь С-С, защитной группы для аминогруппы,-C(NH)-NH, цепи поли(этиленгликоля), рецепторного лиганда; предусматривают, что, по меньшей мере, два остатка среди от R от R являются группой -CH-CH(OH)-R, -CH(R)-СН-ОН, -CH-CH-(C=O)-O-R, -CH-CH-(C=O)-NH-R или -CH-R, где R выбран из С-C алкила или С-C алкенила, имеющего одну двойную связь С-С,
и где один или несколько атомов азота, указанных в формуле (IV), могут быть протонированными для обеспечения катионного липидоида формулы (IV).
В более конкретном объекте, такие агенты или реагенты могут быть (компонентом, включающим) олиго(алкиленовый амин), выбранный из а) и б), где
а) является олигомером или полимером, включающим множество групп формулы (IIa) в качестве боковой цепи и/или концевой группы:
,
2
6
где a, b, m, n и от R до R, такие же, что и определенные выше, и где один или несколько атомов азота, указанных в формуле (IIa), могут быть протонированы для получения катионной олигомерной или полимерной структуры, и
б) является олигомером или полимером, включающим множество групп формулы (IIIa) в качестве повторяющихся единиц:
,
2
5
где a, b, m, n и от R до R означают то же, что указано выше, и где один или несколько атомов азота, указанных в формуле (IIIa), могут быть протонированными для обеспечения структуры катионного олигомера или полимера.
В другом более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такие агенты и реагенты могут быть (компонентом, включающим) олиго(алкиленовый амин), выбранный из липидоида, имеющего страктуру формулы (IVa):
,
1
6
где a, b, m, n и от R до R означают то же, что указано выше, и где один или несколько атомов азота, указанных в формуле (IVa), могут быть протонированными для обеспечения катионного липидоида.
Что касается таких агентов и реагентов, в формулах (II), (IIа), (III), (IIIa), (IV) или (IVa) n может означать 1, или m может означать 1 и n может означать 1.
Кроме того, что касается таких агентов и реагентов, в формулах (II), (IIа), (III), (IIIa), (IV) или (IVa) а может означать 1 и b может означать 2, или а может означать 2 и b может означать 1.
В одном из определенных объектов олигомер, полимер или липидоид может быть катионным (например, протонированным) олигомером, полимером или липидоидом.
Одним из примеров такого олигомера, полимера или липидоида, не ограничивающим рамок охвата настоящего изобретения, который может быть применен в контексте настоящего изобретения, является катионный липид, который получают перемешиванием 100 мг N,N'-бис(2-аминоэтил)-1,3-пропандиамина (0,623 мМ) с 575,07 мг 1,2-эпоксидодекана (3,12 мМ, (N-1) эквивалент, где N означает 2× количество первичного амина плюс 1× количество вторичного амина на олиго(алкиленамин)) и перемешивают в течение 96 ч при 80°С в постоянном режиме. Такой олигомер, полимер или липидоид также обозначают липидоид «С12-(2-3-2)».
Агентом или реагентом, в частности полимером, для применения по настоящему изобретению может быть сополимер, в частности статистический сополимер. Такой сополимер может быть сополимером, содержащим статистическую/случайную сборку повторяющихся единиц алкиленамина переменной длины (например, в противоположность менее предпочтительному полимеру, который содержит аналогичные сборки повторяющихся единиц алкиленамина определенной длины). Сополимер может быть катионным (например, протонированным) сополимером. Сополимеры для применения в соответствии с настоящим изобретением известны в данной области и описаны, например, в ЕР 14199439.2, WO 01/00708, EP-A1 1198489 и СА-А1 2377207.
В частности, сополимер может быть статистическим сополимером, включающим множество повторяющих единиц (а), независимо выбранных из повторяющихся единиц следующих формул (а1) и (а2):
, и
множество повторяющих единиц (б), независимо выбранных из повторяющихся единиц следующих формул от (б1) до (б4):
где мольное соотношение повторяющихся единиц (а) к сумме повторяющихся единиц (б) лежит в диапазоне от 0,7/1,0 до 1,0/0,7, и
где один или несколько атомов азота в повторяющихся единицах (а) и/или (б), содержащихся в сополимере, могут быть протонированными для обеспечения катионного сополимера.
Сополимер может быть статистическим сополимером, где какие-либо повторяющиеся единицы (а) и какие-либо повторяющиеся единицы (б) статистически распределены в макромолекуле сополимера. Обычно его получают из сополимеризации смеси мономеров, дающей во время реакции полимеризации повторяющиеся единицы (а) с мономерами, дающими во время реакции полимеризации повторяющиеся единицы (б). Предпочтительно, сополимер является случайным сополимером, в котором какие-либо повторяющиеся единицы (а) и какие-либо повторяющиеся единицы (б) распределены случайным образом в макромолекуле полимера.
Сополимер в соответствии с настоящим изобретением может быть линейным, разветвленным или древовидным сополимером. Специалистам известно, что повторяющаяся единица формулы (а1), (б1) или (б3) с двумя валентностями (то есть с открытыми связями к соседним единицам) приводит к линейному распространению структуры сополимера. Так, линейный сополимер по настоящему изобретению содержит повторяющиеся единицы формулы (а1) и один или несколько типов повторяющихся единиц формул (б1) и (б3), но не повторяющиеся единицы формулы (а2), (б2) или (б4). Из последующего описания следует, что наличие повторяющейся единицы формулы (а2), (б2) или (б4) с тремя валентностями обеспечивает точку ветвления в структуре сополимера. Таким образом, разветвленный сополимер содержит один или несколько типов повторяющихся единиц формул (а2), (б2) и (б4) и может дополнительно содержать один или несколько типов повторяющихся единиц формул (а1), (б1) и (б3).
Сополимер в соответствии с настоящим изобретением содержит множество повторяющихся единиц (а), независимо выбранных из повторяющихся единиц формул (а1) и (а2), определенных выше, и множество повторяющихся единиц (б), независимо выбранных из повторяющихся единиц формул (б1)-(б4), описанных выше. Предпочтительными являются сополимеры, содержащие множество повторяющихся единиц (а), независимо выбранных из повторяющихся единиц формул (а1) и (а2), описанных выше, и множество повторяющихся единиц (б), независимо выбранных из повторяющихся единиц формул (б1) и (б2), описанных выше.
Также предпочтительно, если сополимер в соответствии с настоящим изобретением представляет разветвленный сополимер, содержащий один или несколько типов повторяющихся единиц, выбранных из повторяющихся единиц (а2), (б2) и (б4), и который необязательно дополнительно содержит один или несколько типов повторяющихся единиц формул (а1), (б1) и (б3), и, в частности, сополимер, содержащий повторяющиеся единицы формулы (а2) и один или несколько типов повторяющихся единиц формул (б2) и (б4), и который необязательно дополнительно содержит один или несколько типов повторяющихся единиц формул (а1), (б1) и (б3). В соответствии с вышеизложенным более предпочтительным сополимером является такой разветвленный сополимер, который включает повторяющиеся единицы формулы (а2) и повторяющиеся единицы формулы (б2) и который необязательно дополнительно содержит один или несколько типов повторяющихся единиц формул (а1) и (б1).
В сополимерах по настоящему изобретению общее количество повторяющихся единиц (а) и повторяющихся единиц (б) обычно составляет 20 или более, предпочтительно 50 или более и более предпочтительно 100 или более. Обычно общее количество повторяющихся единиц (а) и повторяющихся единиц (б) составляет 10000 или менее, предпочтительно 5000 или менее, более предпочтительно 1000 или менее.
Кроме того, для сополимеров в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, чтобы повторяющиеся единицы (а) и (б) составляли 80 мол. % или более, более предпочтительно 90 мол. % или более от всех повторяющихся единиц в сополимере. Кроме того, предпочтительными являются сополимеры, в которых повторяющиеся единицы (а), выбранные из (а1) и (а2), и повторяющиеся единицы (б), выбранные из (б1) и (б2), составляют до 80 мол. % или более, более предпочтительно 90 мол. % или более от всех повторяющиеся единиц в сополимере. Наиболее предпочтительно, если все повторяющиеся единицы в сополимере являются повторяющимися единицами (а) или (б), в частности, если все повторяющиеся единицы в сополимере являются повторяющимися единицами (а), выбранными из (а1) и (а2), или повторяющимися единицами (б), выбранными из (б1) и (б2).
Средняя молекулярная масса сополимера в соответствии с настоящим изобретением по данным измерений, например, с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру относительно линейных поли(этиленоксидных) стандартов, обычно составляет от 1000 до 500000 Да, предпочтительно от 2500 до 250000 Да и более предпочтительно 5000-50000 Да или меньше.
Концевые группы сополимера в соответствии с настоящим изобретением обычно содержат группы одного или нескольких типов (в), независимо выбранных из приведенных ниже групп формул (в1)-(в3), предпочтительно из групп формул (в1) и (в2):
.
Предпочтительно, концевые группы сополимера состоят из одного или нескольких типов групп (в), независимо выбранных из групп приведенных ниже формул (в1)-(в3), предпочтительно из групп формул (в1) и (в2). Специалистам очевидно, что число концевых групп зависит от структуры сополимера в соответствии с настоящим изобретением. Если линейный сополимер имеет только два конца, то большее число концевых групп содержится в разветвленном, в частности в дендровидном сополимере. Из приводимого ниже следует, что один или несколько атомов азота концевых групп (в), содержащихся в сополимере, могут быть протонированы для получения катионного сополимера.
В сополимере в соответствии с настоящим изобретением молярное отношение суммы повторяющихся единиц (а) к сумме повторяющихся единиц (б) лежит в диапазоне от 0,7/1,0 до 1,0/0,7, предпочтительно в диапазоне от 0,8/1,0 до 1,0/0,8. Это молярное соотношение может быть определено, например, методом ЯМР. Таким образом, следует учитывать, что это соотношение обычно определяют для множества макромолекул сополимера в соответствии с настоящим изобретением и обычно указывает на общее отношение суммы повторяющихся единиц (а) к сумме повторяющихся единиц (б) в множестве макромолекул.
a
a
Выше было указано, что один или несколько атомов азота в сополимере в соответствии с настоящим изобретением могут быть протонированы для получения сополимера в катионной форме, обычно в олигокатионной или поликатионной форме. Очевидно, что первичные, вторичные или третичные аминогруппы в повторяющихся звеньях (а) или (б) или в концевых группах (в) могут действовать в качестве акцепторов протонов, особенно в воде и водных растворах, включая физиологические жидкости. Таким образом, сополимеры по настоящему изобретению обычно имеют общий положительный заряд в водном растворе при рН ниже 7,5. Водный раствор по настоящему изобретению является раствором, в котором растворитель содержит 50 об. % или более, предпочтительно 80 или 90 об. % или более, и наиболее предпочтительно 100 об. % воды. Кроме того, если композиции по настоящему изобретению находятся в контакте с физиологической жидкостью, имеющей рН ниже 7,5, включая, например, кровь и легочную жидкость, они обычно содержат повторяющиеся звенья (а) и (б), где атомы азота протонированы. Величины pK сополимеров, используемых в композициях по настоящему изобретению, могут быть определены кислотно-щелочным титрованием, используя автоматизированный титратор pK. Затем результирующий заряд при данной величине рН может быть рассчитан, например, из уравнения Хендерсона-Хассельбаха. Какой-либо заряд может быть распределен по нескольким базовым центрам и не может быть непременно отнесен к одной точке. Обычно в растворах с физиологическим значением рН сополимеры, используемые в композициях по настоящему изобретению, содержат повторяющиеся единицы с аминогруппами в протонированном состоянии и повторяющиеся единицы с аминогруппами в непротонированном состоянии.
Однако, специалистам очевидно, что сополимеры по настоящему изобретению, а также композиции по настоящему изобретению, также могут быть представлены в виде сухой соли, которая содержит сополимер в катионной форме.
3
Из последующего описания следует, что противоионы (анионы) для положительных зарядов протонированных аминогрупп в композициях по настоящему изобретению, включающих сополимер и нуклеиновую кислоту, в частности РНК, предпочтительно одноцепочечную РНК, например мРНК, обычно обеспечиваются анионными частями молекулы, содержащимися в нуклеиновой кислоте. Если положительно заряженные группы присутствуют в избытке по сравнению с анионными частями в нуклеиновой кислоте, положительные заряды могут быть сбалансированы другими анионами, в частности теми, которые обычно встречаются в физиологических жидкостях, таких как Cl- или HCO-.
В соответствии с вышеизложенным предпочтительным сополимером по настоящему изобретению является произвольный сополимер, в котором
80 мольных % или более всех повторяющихся единиц, более предпочтительно, всех повторяющихся единиц, образуются
множеством повторяющихся единиц (а), независимо выбранных из повторяющихся единиц следующих формул (а1) и (а2):
, и
множество повторяющихся единиц (б), независимо выбранных из повторяющихся единиц следующих формул (б1) и (б2):
,
где мольное соотношение суммы повторяющихся единиц (а) к сумме повторяющихся единиц (б) лежит в пределах от 0,7/1,0 до 1,0/0,7, более предпочтительно в пределах от 0,8/1,0 до 1,0/0,8,
где концевые группы сополимера сформированы
группами (в), независимо выбранными из групп формулы (в1) и (в2):
, и
где один или несколько атомов азота в повторяющихся единицах (а), и/или (б), и/или в концевых группах (в), содержащихся в сополимере, могут быть протонированы для получения катионного сополимера. Кроме того, предпочтительно, чтобы сополимер представлял собой разветвленный сополимер, включающий единицы (а2) и (б2), необязательно вместе с единицами (а1) и/или (б1).
Сополимеры в соответствии с настоящим изобретением могут быть легко получены с помощью процедур, аналогичных тем, которые известны для получения полиалкилениминов, например, разветвленных или линейных полиэтилениминов (ПЭИ). Очевидно, что мономеры, используемые для получения сополимеров, должны быть соответствующим образом скорректированы. В контексте настоящего изобретения установлено, что мономеры могут легко вступать в реакцию количественно, при этом соотношение единиц (а) и (б) в сополимере могут регулироваться путем изменения соотношения мономеров в смеси мономеров, подверженных полимеризации. Хотя полиэтиленимин может быть получен, например, путем полимеризации с раскрытием кольца азиридина, сополимеры по настоящему изобретению могут быть получены путем полимеризации с раскрытием кольца смеси мономеров, состоящей из азиридина, азетидина и, где применимо, пирролидина или, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, азиридина и азетидина. Очевидно, что выражение «где применимо» относится к наличию или отсутствию повторяющихся единиц (б3) и (б4) или концевых групп (в3), которые могут быть образованы пирролидином. Полимеризация с открытием кольца незамещенных циклических аминов обычно приводит к разветвленным сополимерам. Линейные сополимеры в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены, например, путем полимеризации соответствующих N-замещенных азиридинов, N-замещенных азетидинов и N-замещенных пирролидинов или N-замещенных азиридинов и N-замещенных азетидинов, которые могут сопровождаться, например, гидролитическим расщеплением N-заместителей, присоединенных к формируемой полиалкилениминной цепи, например, по аналогии с процедурой, опубликованной в работе Weyts и Goethals, Polymer Bulletin, 19(1), 1988, 13-19.
Для получения дендримера (или дендритного сополимера) можно сходным образом применить стратегии синтеза, которые известны для получения полиэтилениминных или полипропиленаминных дендримеров. Полипропилениминовые дендримеры можно синтезировать из строительных блоков акрилонитрила путем добавления повторяющейся последовательности Михаэля к первичному амину с последующим гетерогенно катализируемым гидрированием (Newkome и Shreiner, Polymer 49, 2008, 1-173; De Brabander-Van Den Berg с соавт., Macromolecular Symposia 77(1), 1994, 51-62). Полиэтилениминные дендримеры можно получить путем добавления повторяющейся последовательности Михаэля винилбромидного связывающего блока к первичному амину с последующей конверсией алкилбромида к амину, используя метод синтеза аминов по Габриэлю (Yemul и Imae, Colloid Polym Sci 286, 2008, 747-752). Следовательно, специалист в данной области может получить не только дендримеры со строго переменными слоями, например, пропиленимином и этиленимином. Сходным образом могут быть получены дендримерные генерации со слоями, содержащими или состоящими из случайных композиций повторяющихся звеньев формулы (а2), (б2) и (б4) и последовательно повторяющихся единиц (а2) и (б2).
Полимеризацию с раскрытием кольца азиридина и азетидина, или азиридина, азетидина и пирролидина можно проводить в растворе, например, в воде. Общую концентрацию мономера существенно не ограничивают, типичные концентрации варьируются от 10 мас. % до 80 мас. %, предпочтительно от 30 мас. % до 60 мас. %. Обычно полимеризацию инициируют протонами, при этом предпочтительно добавить в реакционную систему кислоту Бренстеда, в частности минеральную кислоту, например, серную кислоту. Обычно достаточно небольших количеств кислоты, например, от 0,001 до 0,01 эквивалента относительно общей концентрации мономеров. Реакцию осуществляют при подходящих показателях, например, в температурном диапазоне 50-150°С, в частности 90-140°С. В этих диапазонах высокомолекулярные сополимеры обычно получают при более высоких температурах, а сополимеры меньшей молекулярной массы - при пониженных температурах.
В принципе, липидоид является предпочтительным агентом или реагентом для применения по настоящему изобретению, в частности по сравнению с олигомером и, более специфично, с полимером.
Другими примерами одного или нескольких агентов или одного или нескольких реагентов для доставки и/или интродукции РНК в клетку-мишень или в ткань-мишень являются реагенты для липосомальной трансфекции (РЛТ) и магнитные частицы (МЧ), описанные в настоящем изобретении.
Одним из механизмов доставки и/или интродукции РНК в клетки-мишени или в ткани-мишени является трансфекция. В связи с этим, одним из объектов настоящего изобретения является РНК, которую предполагают внедрить в клетку-мишень или в ткань-мишень и которая должна быть доставлена/введена путем трансфекции и/или подготовлена для трансфекции. Средства и методы трансфекции РНК известны в данной области, например, описаны в публикациях Tavernier (см. выше), Yamamoto (Eur J Pharm Biopharm. 71(3), 2009, 484-489), Kormann (Nat Biotechnol. 29(2), 2011, 154-157).
Конкретными типами трансфекции являются липофекция, магнитофекция или магнетолипофекция. В контексте настоящего изобретения хороших результатов добиваются с этими типами трансфекции. Получают особенно хорошие результаты при магнитофекции и чрезвычайно хорошие результаты при магнитолипофекции.
Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяемая РНК может быть получена
Следовательно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используемая РНК может быть получена для липофекции, для трансфекции путем липофекции, доставлена/введена посредством липофекции и/или через липофекцию.
С учетом вышесказанного, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может (дополнительно) включать, по меньшей мере, один липид или липосомальный реагент для трансфекции, или энхансер (РЛТ). РНК для применения по настоящему изобретению может быть включена, объединена в комплекс и/или доставлена с помощью РЛТ. В частности, применяемая РНК может быть включена и/или доставлена с помощью (соответствующих) комплексов, включающих РНК и РЛТ. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может (дополнительно) включать комплексы для липофекции.
В данной области известны РЛТ, например, от фирмы OzBiosciences, Марсель, Франция. РЛТ для применения по настоящему изобретению могут быть выбраны из описанных выше агентов или реагентов для доставки и/или интродукции РНК в целевые клетки и ткани. Например, такими РЛТ могут быть липиды и липидоиды, предпочтительно катионные липиды или катионные липидоиды, например, липидоиды, описанные в РСТ/ЕР2014/063756 (например, С12-(2-3-2)), описанные в ЕР 2285772 липиды (например, Dogtor) и липополиамины, описанные в ЕР 1003711 (например, DreamFect™ и DreamFect Gold™). Определенные РЛТ могут быть выбраны из группы, включающей:
(i) C12-(2-3-2),
(ii) DreamFect™, предпочтительно DreamFect Gold™ (DF™/DF-Gold™, фирма OzBiosciences, Марсель, Франция);
(iii) Dogtor (фирма OzBiosciences, Марсель, Франция), и
(iv) РЛТ типа липофектамина, например, Lipofectamine 2000 (фирма Invitrogene, Калифорния, США).
В принципе, Dogtor является предпочтительным, DreamFect™ - более предпочтительным и DF-Gold™ и С12-(2-3-2) еще более предпочтительными РЛТ.
РЛТ типа Dogtor описаны, например, в ЕР 2285772. РЛТ типа DF™ или DF-Gold™ описаны, например, в ЕР 1003711. В принципе, олигомеры, полимеры или липидоиды, описанные в РСТ/ЕР 2014/063756, определенные катионные липиды, описанные в ЕР 2285772, и определенные липополиамины, описанные в ЕР 1003711, являются предпочтительными РЛТ в соответствии с настоящим изобретением. РЛТ типа С12-(2-3-2) и DF-Gold™ являются наиболее предпочтительными.
Примерами комплексов липофекции, не ограничивающими области охвата настоящего изобретения, являются липоплексы DF-Gold™/РНК и липоплексы С12-(2-3-2)/РНК.
Описанные в настоящем изобретении агенты и реагенты для доставки и/или интродукции РНК в целевую клетку или ткань, а также описанные в настоящем изобретении РЛТ, могут быть объединены с одним или несколькими (например, двумя, тремя или четырьмя) дополнительными липидами (например, с холестерином, DOPE и/или ПЭГ-липидами (например, DMPE-PEG)). Такие дополнительные липиды могут поддерживать требуемую функцию агентов/реагентов и РЛТ (поддерживать и/или повышать доставку и/или интродукцию РНК в клетку или ткань и улучшать эффективность трансфекции, соответственно) и функцию соответствующих «хэлперных липидов». Специфическими примерами таких «хэлперных липидов» являются холестерин, DPPC, DOPE и/или ПЭГ-липиды, например, DMPE-PEG, DMG-PEG (например, DMG-PEG2k). Дополнительные липиды (например, «хэлперные липиды») также могут быть частью (частями) описанных в настоящем изобретении комплексов/частиц. Специалист в данной области может получить комплексы/частицы в соответствии с настоящим изобретением. Примеры дополнительных липидов (например, «хэлперные липиды») также известны в данной области. Специалист в данной области способен выбрать соответствующие дополнительные липиды (например, «хэлперные липиды») и соотношения агентов/реагентов/РЛТ и дополнительных липидов (например, «хэлперных липидов»). Такие соотношения могут быть мольными соотношениями 1-4:1-5, 3-4:4-6, примерно 4 : примерно 5, примерно 4 : примерно 5,3 агентов/реагентов/РЛТ : дополнительный липил(липиды) (предпочтительны более узкие диапазоны). Например, агенты/реагенты/РЛТ можно комбинировать с тремя дополнительными липидами, например, с холестерином, DOPE и DMPE-PEG, в мольном соотношении 8:5,3:4,4:0,9, соответственно, или, более конкретно, 8:5,29:4,41:0,88, соответственно.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения применяемая РНК может быть получена для магнитофекции, подготовлена для трансфекции путем магнитофекцией, доставлена/интродуцирована с помощью магнитофекции и/или введена через магнитофекцию. Принципы магнитофекции известны в данной области и описаны, например, в WO 02/00870.
В соответствии с этим, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может (дополнительно) включать, по меньшей мере, один тип магнитных частиц (МЧ), в частности, по меньшей мере, один тип магнитных наночастиц (МНЧ). Применяемая РНК может состоять в комплексе с МЧ или может быть доставлена с помощью МЧ. В частности, применяемая РНК может быть включена в комплексы для магнитофекции или может быть доставлена с помощью (соответствующих) комплексов для магнитофекции, включающих РНК и МЧ. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может (дополнительно) включать комплексы для магнитофекции.
МЧ (или МНЧ) для применения по настоящему изобретению могут быть из ядра и оболочки, МЧ из оксида железа и оксида кремния и/или (разветвленным)ПЭИ-декорированные МЧ. Одним из вариантов МЧ (или МНЧ) могут быть МЧ (или МНЧ) с покрытием SiOx/фосфонат-ПЭИ, далее называемыми SO-Mag6-115 МЧ (или МНЧ). МЧ (или МНЧ) могут быть получены в соответствии с прилагаемыми примерами и, например, по Mykhaylyk (в кн.: «Liposomes, Methods in Molecular Biology», под ред. Weissig, Т. 605, изд-во Humana Press-Springer, Нью Йорк, 2010, 487-525; Pharm Res 29(5), 2012, 1344-1365).
Одним примеров, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения, является комплекс для магнитофекции SO-Mag6-115 МЧ (или МНЧ)/РНК. Далее МЧ (или МНЧ) и соответствующие комплексы для магнитофекции описаны в WO 02/00870.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплекс для магнитофекции может включать третий компонент и, следовательно, могут быть в виде магнитных триплексов. Третьим компонентом могут быть РЛТ (например, описанные выше). Магнитные триплексы можно назвать комплексами для магнитолипофекции, например, комплексы для магнитолипофекции, описанные ниже.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяемая РНК может быть получена для магнитолипофекции, подготовлена для трансфекции путем магнитолипофекции, доставлена/интродуцирована с помощью магнитолипофекции и/или введена через магнитолипофекцию.
В принципе, магнитолипофекция сочетает в себе липофекцию и магнитофекцию и, в частности, обладает преимуществами обоих подходов к трансфекции. Таким образом, в принципе то, что было сказано выше в отношении липофекции и магнитофекции, также относится к магнитолипоферированию, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
Относительно магнитолипофекции следует отметить, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может (дополнительно) включать, по крайней мере, один из комплексов магнитолипофекции (также называемый магнитным липоплексом). РНК для применения по настоящему изобретению может быть включена, объединена в комплекс и/или доставлена с помощью такого комплекса. Комплекс для магнитолипофекции может быть магнитным триплексом и может, например, включать РНК, по меньшей мере, один вид МЧ (согласно определению выше) и, по меньшей мере, один вид РЛТ (согласно определению выше).
Одним из примеров, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения, является комплекс для магнитолипофекции SO-Mag6-115 МЧ (или МЧН)/DF-Gold/РНК.
В принципе, применимые соотношения между компонентами (например, РНК, РЛТ, МЧ) комплексов для трансфекции по настоящему изобретению, могут быть легко определены специалистами. Соответствующее руководство представлено, например, в работах Kormann (см. выше). Mays (см. выше), WO 02/00870 и в прилагаемых примерах.
Выше в настоящем изобретении отмечено, что определение конкретных соотношений чрезвычайно полезно, например, приводит к высокоэффективной и/или эффективной трансфекции.
Такие конкретные соотношения означают соотношения масс РЛТ и РНК, которые варьируют примерно от 1 до 40 мкг, от 5 до 35 мкг, от 10 до 30 мкг, от 15 до 25 мкг, от 17 до 23 мкг, от 18 до 22 мкг, от 19 до 21 мкг, от 1 до 20 мкг, от 2 до 20 мкг, от 3 до 20 мкг, от 1 до 15 мкг, от 2 до 15 мкг, от 3 до 15 мкг, от 1 до 10 мкг, от 2 до 10 мкг, от 3 до 10 мкг, от 4 до 10 мкг, от 5 до 10 мкг, от 4 до 12 мкг, от 5 до 11 мкг, от 6 до 10 мкг или от 7 до 9 мкг РЛТ на мкг РНК. Сходным образом, в частности, если РЛТ получают в виде раствора РЛТ (например, в примерах настоящего описания), такие соотношения означают соотношения объема к массе раствора РЛТ к РНК, варьирующей от 0,5 до 15 мкл, от 0,5 до 10 мкл, от 0,5 до 8 мкл, от 1 до 15 мкл, от 1 до 10 мкл, от 1 до 8 мкл, от 1 до 6 мкл, от 1,5 до 5,5 мкл, от 2 до 5 мкл, от 3 до 4 мкл, от 1 до 3 мкл, от 4 до 6 мкл, от 1,5 до 2,5 мкл, от 4,5 до 5,5 мкл, от 1,7 до 2,3 мкл или от 4,7 до 5,3 мкл раствора РЛТ на мкг РНК. В принципе, предпочтительны более узкие диапазоны. В этом контексте, предпочтительным РЛТ является DreamFect™ или, более предпочтительно, DF-Gold™ или С12-(2-3-2). Предпочтительной РНК является РНК КМБ-7 или, более предпочтительно, РНК КМБ-2.
Другим примером соотношений РЛТ и РНК представляют соотношения N/P, равное величине, примерно от 4 до 12, предпочтительно примерно от 6 до 10, предпочтительно примерно от 9 до 11 и более предпочтительно примерно 8, где N/P означает мольное соотношение аминогруппы РЛТ к фосфатной группе РНК.
В частности, если клетки, например, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (ЖМСК), которые предназначены для трансфекции, такие соотношения масс РЛТ к РНК находятся в пределах, варьирующих примерно от 5 до 35 мкг, от 10 до 30 мкг, от 15 до 25 мкг, от 17 до 23 мкг, от 18 до 22 мкг или от 19 до 21 мкг РЛТ на мкг РНК. Аналогичным образом, в частности, если РЛТ приготовлены в виде раствора РЛТ (например, описанного в прилагаемых примерах), такими соотношениями являются соотношение объема раствора РЛТ к массе РНК, варьирующими от 4 до 6 мкл, от 4,5 до 5,5 мкл или от 4,7 до 5,3 мкл указанного раствора РЛТ на мкг указанного РНК. В принципе предпочтительны более узкие диапазоны. Наиболее предпочтительные соотношения (приводящие к высокоэффективной и эффективной трансфекции ЖМСК) представляют соотношение массы РЛТ к массе РНК, примерно 20 мкг РЛТ к мкг РНК, и/или соотношения объемов раствора РЛТ к массе РНК, примерно около 5 мкл раствора РЛТ к мкг РНК. Сказанное выше относительно предпочтительных РЛТ и/или РНК, также применимо в данном случае, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
В частности, если трансфецируют клетки, например, производные от костного мозга МСК (КММСК), такие соотношения массы РЛТ к массе РНК варьируют примерно от 4 до 12 мкг, от 5 до 11 мкг, от 6 до 10 мкг или от 7 до 9 мкг РЛТ на мкг РНК. Сходным образом, в частности, если РЛТ получают в виде раствора РЛТ (например, в примерах настоящего описания), такие соотношения означают соотношения объема раствора РЛТ к массе к РНК, варьирующего от 1 до 3 мкл, от 1,5 до 2,5 мкл, от 1,7 до 2,3 мкл раствора РЛТ на мкг РНК. В принципе, предпочтительны более узкие диапазоны. Наиболее предпочтительны соотношения (приводящие к высоко эффективной и эффективной трансфекции КММСК) массы РЛТ к массе РНК примерно 8 мкг РЛТ на мкг РНК, и/или соотношения объема раствора РЛТ к массе РНК примерно 2 мкл раствора РЛТ к мкг РНК. Сказанное выше относительно предпочтительных РЛТ и/или РНК, также применимо в данном случае, mutatis mutandis (изменив то, что следует). Другие подобные соотношения представляют соотношения массы железа МЧ к массе РНК, варьирующие от 0,05 до 5 мкг, от 0,05 до 3 мкг, от 0,05 до 1 мкг, от 0,07 до 5 мкг, от 0,1 до 5 мкг, от 0,1 до 1 мкг, от 0,2 до 0,8 мкг, от 0,3 до 0,7 мкг или от 0,4 до 0,6 мкг (массы железа) МЧ на мкг РНК. В принципе, предпочтительны более узкие диапазоны. Наиболее предпочтительными соотношениями являются соотношения массы железа МЧ к массе РНК, примерно 0,5 мкг МЧ к мкг РНК. В этом контексте предпочтительными МЧ являются SO-Mag6-115 МЧ (или, более предпочтительно, МНЧ). Предпочтительной является РНК КМБ-7 или, более предпочтительной, КМБ-2 РНК.
Другие подобные соотношения представляют соотношения массы железа МЧ к массе РЛТ, варьирующие примерно от 0,05 до 5 мкг, от 0,05 до 3 мкг, от 0,05 до 1 мкг, от 0,07 до 5 мкг, от 0,1 до 5 мкг, от 0,1 до 1 мкг, от 0,2 до 0,8 мкг, от 0,3 до 0,7 мкг или от 0,4 до 0,6 мкг (массы железа) МЧ к примерно 12-20 мкг (предпочтительно примерно к 16 мкг) РЛТ. Сходным образом, в частности, если РЛТ получают в виде растворов РЛТ (например, в прилагаемых примерах), такие соотношения массы железа МЧ к объему раствора РЛТ варьируют от 0,05 до 5 мкг, от 0,05 до 3 мкг, от 0,05 до 1 мкг, от 0,07 до 5 мкг, от 0,1 до 5 мкг, от 0,1 до 1 мкг, от 0,2 до 0,8 мкг, от 0,3 до 0,7 мкг или от 0,4 до 0,6 мкг (массы железа) указанных МЧ на 4 мкл указанного раствора РЛТ. В принципе, предпочтительны более узкие диапазоны. Наиболее предпочтительны соотношения массы железа МЧ к массе РЛТ примерно от 0,5 мкг МЧ к примерно от 12 до 20 мкг (предпочтительно примерно на 16 мкг) РЛТ, и/или массы железа МЧ к объему РЛТ примерно от 0,5 мкг МЧ на 4 мкл раствора РЛТ. В этом контексте предпочтительными МЧ являются SO-Mag6-115 МЧ (или, более предпочтительными, МНЧ). Предпочтительным РЛТ является DreamFect™ или, более предпочтительным, DF-Gold™ C12-(2-3-2).
Кроме того, такие соотношения представляют соотношение масс железа МЧ, РЛТ, РНК, варьирующие от 0,05 до 5 мкг, от 0,05 до 3 мкг, от 0,05 до 1 мкг, от 0,07 до 5 мкг, от 0,1 от 5 мкг, от 0,1 до 1 мкг, от 0,2 до 0,8 мкг, от 0,3 до 0,7 мкг или от 0,4 до 0,6 мкг (масса железа) указанных МЧ к от 1 до 40 мкг, от 5 до 35 мкг, от 10 до 30 мкг, от 15 до 25 мкг, от 17 до 23 мкг, от 18 до 22 мкг, от 19 до 21 мкг, от 1 до 20 мкг, от 2 до 20 мкг, от 3 до 20 мкг, от 1 до 15 мкг, от 2 до 15 мкг, от 3 до 15 мкг, от 1 до 10 мкг, от 2 до 10 мкг, от 3 до 10 мкг, от 4 до 10 мкг, от 5 от 10 мкг, от 4 до 12 мкг, от 5 до 11 мкг, от 6 до 10 мкг или от 7 до 9 мкг РЛТ к от 0,1 до 10 мкг, от 0,1 до 7 мкг, от 0,1 до 4 мкг, от 0,4 до 10 мкг, от 0,7 до 10 мкг, от 0,7 до 4 мкг, от 0,8 до 3 мкг, от 0,9 до 2 мкг, от 0,5 до 1,5 мкг или от 0,7 до 1,3 мкг РНК. Сходным образом, в частности, если РЛТ получают в виде растворов РЛТ (например, описанных в прилагаемых примерах), такие соотношения представляют соотношения массы МЧ к объему раствора РЛТ к массе РНК, варьирующие от 0,05 до 5 мкг, от 0,05 до 3 мкг, от 0,05 до 1 мкг, от 0,07 до 5 мкг, от 0,1 до 5 мкг, от 0,1 до 1 мкг, от 0,2 до 0,8 мкг, от 0,3 до 0,7 мкг или от 0,4 до 0,6 мкг (масса железа) указанных МЧ: от 0,4 до 40 мкл, от 0,4 до 20 мкл, от 0,4 до 10 мкл, от 0,8 до 40 мкл, от 2 до 40 мкл, от 2 до 10 мкл, от 2 до 8 мкл, от 2 до 6 мкл, или от 3 до 5 мкл указанного раствора РЛТ: от 0,1 до 10 мкг, от 0,1 до 7 мкг, от 0,1 до 4 мкг, от 0,4 до 10 мкг, от 0,7 до 10 мкг, от 0,7 до 4 мкг, от 0,8 до 3 мкг, от 0,9 до 2 мкг, от 0,5 до 1,5 мкг или от 0,7 до 1,3 мкг указанной РНК. В принципе предпочтительны более узкие диапазоны. Наиболее предпочтительным является соотношения масс МЧ, РЛТ, РНК, примерно составляющее 0,5 мкг МЧ к примерно от 12 до 20 мкг (предпочтительно примерно на 16 мкг) РЛТ к примерно 1 мкг РНК, и/или соотношения массы железа МЧ к объему раствора РЛТ к РНК примерно 0,5 мкг указанных МЧ к примерно 4 мкл раствора РЛТ: примерно 1 мкг указанной РНК. Сказанное выше относительно предпочтительных РЛТ, РНК и/или МЧ, также применимо в данном варианте в настоящем изобретении, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
Концентрация раствора РЛТ, применяемого по настоящему изобретению, может варьировать примерно от 0,1 до 10, от 0,5 до 8, от 1 до 7, от 2 до 6, от 3 до 5 или от 1 до 2 мкг РЛТ на мкл (предпочтительны более узкие диапазоны). Примерами концентраций, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения, являются примерные концентрации 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 мкг РЛТ на мкл. Предпочтительны 2 или 4 мкг РЛТ на мкл.
Формирование комплекса для применения в настоящем изобретении может быть при концентрациях РНК, например, примерно от 50 мкг/мл до примерно 350 мкг/мл, предпочтительно примерно от 100 мкг/мл до примерно 300 мкг/мл, более предпочтительно примерно от 150 мкг/мл до примерно 250 мкг/мл и наиболее предпочтительно примерно от 200 мкг/мл.
Чтобы получить стабильную и адекватную экспрессию белков, кодируемых РНК, важно, чтобы РНК достигла целевых клеток в достаточном количестве. Это и, соответственно, эффективность трансфекции, можно определить по метке после введения меченой РНК, для этого определяют содержание РНК по измерению метки. Для определения метки можно применять проточную цитометрию. Когда нанесение метки заключается в привнесении флуоресцентной молекулы, эффективность трансфекции можно рассчитать, например, в виде процента клеток в популяции, у которых интенсивность флуоресценции выше по сравнению с контрольными клетками, которые были обработаны только ФСБ. РНК, используемая в соответствии с изобретением, может быть получена эффективно, а эффективность трансфекции может быть высокой.
Эффективность трансляции обозначает эффективность, с которой РНК транслируется в белок. Чем выше эффективность трансляции, тем ниже может быть доза РНК, которую следует применить для лечения. Эффективность трансляции может быть определена путем сравнения степени трансляции РНК, предназначенной для применения в настоящем изобретении, со степенью трансляции контрольной РНК. В принципе, эффективность трансляции РНК по настоящему изобретению может быть несколько ниже. Однако это может компенсироваться повышенной стабильностью, проявляемой в более длительной экспрессии белка.
В принципе, режим дозировки активных соединений/фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть определен лечащим врачом, например, по клиническим признакам. В области медицины известно, что дозы для какого-либо конкретного пациента зависят от многих факторов, включая размер, массу, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие препараты, которые могут вводиться одновременно. Однако квалифицированный специалист/лечащий врач безусловно может определить (терапевтически) эффективную концентрацию (концентрации) и/или дозы, например, in vivo или ex vivo. Соответствующие образцы могут быть взяты, например, из кости (например, подходящим зондом), и могут быть определены активные соединения (КМБ и/или подходящие маркеры), и их соответствующие концентрации в образцах, например, методом ВЭЖХ.
Определение концентраций активного соединения может быть произведено для пациентов, здоровых людей и для животных, например, лабораторных животных, трансгенных животных, (например, трансгенных мышей, крыс, свиней и др.). Предполагают, что концентрации активного соединения, например, в кости, например, могут быть определены для (здоровых) добровольцев, и могут быть установлены соответствующие схемы введения для пациентов (людей). Например, зависимости от дозировки (например, от вводимых доз в сравнении с концентрацией/дозировкой, обнаруженной в различных местах кости), может быть определена стандартными методами, известными в данной области. К другим методам относят, но ими перечень не ограничивают, выявление меченых пептидов in vivo (например, с помощью соответствующих методов нанесения метки, например, радиоактивной, флуоресцентной и др.) или физиологические/биохимические исследования. Соответственно, можно определить дозировку активных соединений, предназначенных для введения, которые нужно вводить для получения желаемой концентрации активных соединений в определенной части кости. Эти и другие методы определения таких концентраций также известны в данной области.
В частности, соответствующие дозы РНК, подлежащей трансфекции в соответствии с настоящим изобретением (например, мкг РНК на клетку), могут быть легко определены специалистом. Соответствующие методики представлены, например, Kormann (см. выше). Mays (см. выше), в WO 02/00870 и в прилагаемых примерах.
Доза, используемая в каждом случае, может зависеть от функции РНК КМБ. Выше было указано, что продолжительность действия РНК может быть скорректирована. Доза и/или длительность лечения также может зависеть от определенного показания к применению. Если, например, РНК применяют для хронической терапии костного заболевания из-за дефицитного гена КМБ, активность будет проявляться как можно дольше, в то время как другие показания могут быть специальное скорректированы к подходящему временному окну. Таким образом, могут быть установлены соответствующие дозы.
Однако в контексте настоящего изобретения установлено, что определенные дозы чрезвычайно полезны, в частности, поскольку они приводят к высокоэффективной и/или эффективной трансфекции.
Такие определенные дозы РНК, подлежащие трансфекции, варьируют от 0,5 до 100 пг, от 0,5 до 70 пг, от 0,5 до 40 пг, от 5 до 100 пг, от 10 до 100 пг, от 1 до 50 пг, от 5 до 40 пг, от 10 до 30 или от 15 до 25 пг РНК на клетку (подлежащую трансфекции). В принципе предпочтительны более узкие диапазоны. Наиболее предпочтительными дозами являются дозы примерно в 20 пг РНК на клетку (подлежащую трансфекции). Указанные выше дозы (диапазоны) особенно полезны, если РНК должна быть доставлена (в клетки или ткани) ех vivo или in vitro.
В настоящем изобретении предусматривают фармацевтическую композицию, которая включает матрикс или каркас, и которые в настоящем изобретении и в данной области техники называют «носителями». В настоящем изобретении предусматривают, что применяемую РНК добавляют к носителю или нагружают в/на носитель. Точнее предусматривают включение в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению комбинацию носителя и комплекса, который содержит применяемую РНК, и который также может быть добавлен к носителю или может быть нагружен в/на носитель. Иначе говоря, предусматривают, что РНК нагружают в/на носитель или добавляют к носителю в форме такого комплекса. Сказанное выше относительно комплекса и РНК также применимо в данном случае в настоящем изобретении, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
В контексте настоящего изобретения носитель является телом или веществом, которое может контактировать in vivo, ex vivo или in vitro с клетками или тканью, которые подвергаются трансформации/трансфекции. Предусматривают, что носитель содержит предназначенную для использования РНК в соответствии с настоящим изобретением и, необязательно, носитель засевают клетками для трансформации/трансфекции. В частности предусматривают, что описываемая РНК включается в комплекс в соответствии с описанием настоящего изобретения. Применяемые в настоящем изобретении носители известны в данной области и описаны, например, в WO 01/00708 и [10-12]. Помимо РНК, другие соединения, например, низкомолекулярные и/или цитокины могут быть нагружены в/на носитель. Это может, например, усилить иммиграцию высеваемых клеток (в носитель) и/или улучшить эффективность трансфекции.
Носитель может быть материалом, соединение с которым происходит за счет связывания, т.е. с твердым веществом, в частности предпочтительно с пластичным или деформируемым твердым веществом, например, с гелем, губкой, фольгой, порошком, гранулами или полосками. Носитель может состоять из биологически нерассасываемого или, предпочтительно, биологически рассасываемого материала.
Носитель также может быть получен перекрестным сшиванием (со)полимеров по настоящему изобретению, предпочтительно в присутствии РНК. Таким образом, например, возможна интродукция известных генных векторов (голых) РНК, липоплексов, полиплексов и др., химически немодифицированных или химически модифицированных, в перекрестно сшитых полимерах по настоящему изобретению. С этой целью происходит поперечная сшивка, например in situ, в присутствии генного вектора, олигонуклеотида и т.д., путем добавления агента, запускающего поперечную сшивку в водном или органическом растворителе. Природа агента поперечной сшивки зависит от структуры сополимера. Поэтому, например, полимерная основа (как, например, показанная на фиг. 2 в WO 01/00708) может быть сшита путем добавления дитиолов, например, цитеинилцистеина или дитиолов, отличающихся от аминокислотноподобных дитиолов. Перекрестное сшивание (со)полимеров, содержащих карбоновую кислоту, может происходить путем добавления каких-либо диаминов по ходу активации карбоновой кислоты (например, реакция карбоновой кислоты с активированным эфиром in situ) (Nathan с соавт., Macromolecules 25, 1992, 4476-4484). Полимерный каркас с первичными или вторичными аминами может возникать, например, путем добавления активированной дикарбоновой кислоты. После поперечной сшивки препарат можно высушить до образования пленки.
Примером биологически нерассасываемого материала является силикон (например, для катетеров). Но также можно использовать различные биологически нерассасываемые материалы, которые могут быть введены в организм подобно имплантатам и/или их уже используют, например, в пластической хирургии. К таким примерам относят политетрафторэтилен (PTFE, например, для замены сосудов), полиуретан (например, для катетеров), материалы из металла (например, медицинская сталь, сплав титана для эндопротезов, металлические сетки, используемые в качестве поддержки сосудов (стенты)).
Предпочтительно, носителем является биологически рассасываемые материалы. Примерами таких материалов являются фибриновые клеи или фибриновые сгустки (например, получаемые из тромбина или фибриногена), хитин, оксицеллюлоза, желатин, карбонаты полиэтиленгликоля, алифатические полиэфиры, например, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и полученные из них аминокислотные соединения, например, полиамиды и полиуретаны или полиэфиры и соответствующие смешанные полимеры. Кроме того, какой-либо другой биологически разрушаемый полимер можно использовать в качестве носителя, в частности так называемые самополимеризующиеся адгезивы на основе гидрогелей. В частности, какие-либо материалы пригодны в качестве биологически рассасывающихся материалов, которые в организме могут быть разрушены ферментативно и/или за счет гидролитических процессов. Их примерами являются также определенные биологически рассасывающиеся химические соединения, например, сульфат кальция, трикальцийфосфат, гидроксиапатит, полиангидриды, носители, полученные из очищенных белков или частично очищенного внеклеточного матрикса. Коллаген в качестве носителя особенно предпочтителен, в частности предпочтителен коллагеновый матрикс, полученный из коллагена хряща и кожи, например, от фирм Sigma или Collagen Corporation. Примеры получения коллагеновых матриксов описаны, например, в US 4394370 и US 4975527. Носителем может быть фибрин и, в частности, фибриновый сгусток.
Намного предпочтительнее носитель, полученный из коллагена, и особенно предпочтительным носителем является коллагеновая губка. Коллагеновые губки известны в данной области (например, WO 01/00708, Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752, Meinel, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002, Kempen, Biomaterials 30, 2009, 2816-2825), и их можно приобрести, например, под названием «KOLLAGEN resorb™» на фирме Resorba (Нюренберг, Германия).
В общем, отрицательно заряженные полисахариды, например, глюкозаминогликаны, связываются с коллагеном через ионные взаимодействия. Связывание может происходить с положительно заряженными аминокислотами в коллагеновых фибриллах (лизином, гидроксилизином и аргинином) или даже с отрицательно заряженными аминокислотами, опосредованными двухвалентными катионами, например, кальцием. Кроме того, на ионные связывающие свойства коллагена могут направленно влиять путем предварительной обработки кислотным или щелочным раствором с последующей лиофилизацией. С помощью этих методов, известных в химии коллагена, можно напитывать коллагеновые материалы суспензиями РНК (например, в составе описанных здесь комплексов) в соответствии с настоящим изобретением для получения ионного связывания между коллагеном в качестве материала носителя и РНК и комплексами РНК, соответственно, для использования в соответствии с настоящим изобретением.
В коллагене положительно заряженные аминокислоты не концентрируются в коротких катионных участках. Однако такие структурные особенности носителя полезны для эффективного связывания РНК. Для достижения более прочного связывания с материалом носителя его можно дополнительно изменить за счет катионных веществ, связывающих РНК, например, пептидов (Plank с соавт., Human Gene Therapy 10, 1999, 319-333) или полиэтиленимина (ПЭИ). Для этой цели коллагеновую губку модифицируют, например, с помощью бифункционального связывающего реагента сукцинимидилпиридилдитиопропионата (СПДП). Полиэтиленимин дериватизируют иминотиоланом, что приводит к введению тиольных групп. Катионный пептид, подлежащий связыванию, несет цистеин на С-конце. Тиольные группы реагируют с СПДП-дериватизированной коллагеновой губкой за счет образования дисульфидных мостиков. Полученные таким образом измененные губки должны плотно связываться с РНК, и предполагают, что высвобождение РНК произойдет с требуемой длительной задержкой по времени.
Для получения матрикса/каркаса, т.е. носителя, нагруженного используемой по настоящему изобретению РНК, например, сухой (коллагеновый) материал, можно инкубировать с комплексами РНК/(полимер), например, в растворе примерно 5% лиопротектора, предпочтительно примерно 2% глюкозы. Нагруженный носитель, например губку, затем можно лиофилизировать и/или высушить в вакууме.
В общем, нагруженный РНК носитель в соответствии с настоящим изобретением может быть получен путем контактирования соответствующего носителя с РНК, в частности, в соответствии с описанием в настоящем изобретении комплекса так, что носитель адсорбирует РНК, или соответствующий комплекс, или связывает его таким образом, что он может снова высвобождаться, предпочтительно замедленно. Соответствующие методы известны специалистам в данной области (Bonadio с соавт., Nat. Med., 5 (7), 1999, 753-759, Shea с соавт., Nat. Biotechnol. 17 (6), 1999, 551-554). Например, в настоящем изобретении описывают получение комбинации коллагеновой губки или фибринового сгустка в качестве носителя и комплекса РНК/РЛТ.
В принципе, РНК, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, может быть доставлена/введена каким-либо соответствующим путем или способом доставки/введения.
Применяемая по настоящему изобретению РНК может быть введена известным способом непосредственно пациентам, которым требуется белок или фрагмент белка, кодируемые РНК, поскольку заболевание вызвано дефицитом соответствующего гена. Для этого РНК может быть переработана в фармацевтический препарат с обычными фармацевтически приемлемыми добавками. Форма препарата зависит от локализации и природы введения. Поскольку в одном из объектов настоящего изобретения РНК, используемая в соответствии с настоящим изобретением, отличается особенно высокой стабильностью, она может быть переработана многими способами, в зависимости от того, где и в какой форме ее следует использовать. Например, РНК может быть лиофилизирована, переработана в определенной форме, например, ее измельчают или перемалывают и хранят, а затем восстанавливают, когда требуется, при этом биологическая активность сохраняется.
В одном из объектов по настоящему изобретению фармацевтическую композицию (или содержащуюся в ней РНК) доставляют/вводят генной терапией или подготавливают для генной терапии. В частности, генная терапия предусматривает транскрипционную терапию, точнее, замещающую транскрипционную терапию.
РНК, например, при нагрузке (например, в форме комплекса) на носитель, может быть доставлена/введена in vivo или ex vivo. Соответствующие пути и способы доставки/введения известны в данной области, например, описаны в публикациях Mitragotri (Nat Rev Drug Discov 13(9), 2014, 55-72), Tavernier (см. выше) и Yin (Nat Rev Genet 15(8), 2014, 541-55). Например, РНК, например, при нагрузке (например, в форме комплекса) на носитель, может быть трансфецирована в клетки, предпочтительно в клетки высших эукариот, предпочтительно позвоночных, особенно млекопитающих, in vitro, in vivo и ex vivo. Установлено, что в соответствии с настоящим изобретением предусмотренные средства и методы особенно полезны для подходов доставки/введения in vivo и ех vivo.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения РНК может быть доставлена/введена in vivo. В соответствии с таким вариантом осуществления настоящего изобретения РНК (или включающая ее фармацевтическая композиция) может быть получена для доставки/введения in vivo и/или ее доставляют/вводят in vivo.
В связи с применением in vivo, например, возможно интродуцировать РНК, например, при нагрузке на носитель (например, в форме комплекса), непосредственно в виде имплантата, например, в форме губки, или сгустка, или покрытия, например, на замену сустава или в качестве эндопротеза (например, для улучшения целостности ткани). Кроме того, переработка покровных материалов возможна в форме порошков, которые целенаправленно интродуцируют и фиксируют в организме с помощью систем тканевого клея (например, фибринового клея) и становятся эффективными в форме депо (в результате трансфекции).
В частности, предусматривают, что РНК будет доставлена/введена в ткань пациента или в непосредственной близости от этой ткани, в частности, в такую ткань, в которой требуется индукция роста кости, регенерация кости, формирование кости, остеогенез, окостенение и тому подобное. Такая ткань может быть, например, самой костной тканью. Следовательно, РНК может быть доставлена/введена непосредственно в кость или костную ткань пациента. Например, РНК может быть непосредственно применена в месте повреждения кости или в непосредственной близости от этого места. Ткань может быть и другой тканью, например, мышечной. В этом случае индуцированная РНК может вызвать эктопическое формирование кости. Для этих целей, а также для других целей доставки/введения in vivo, РНК, например, в форме описанного в настоящем изобретении комплекса, может быть добавлена или нагружена в матрикс или каркас, то есть носитель, согласно описанному выше (например, коллаген/коллагеновые губки, фибрин/фибриновые сгустки, титановые пленки, гепарино-хитозановый матрикс, гидроксиапатит). В частности, предполагают, что это происходит до имплантации. Однако РНК также может быть доставлена/введена без матрикса или каркаса. В принципе, (непосредственное) применение РНК для лечения (предупреждения или излечения) заболевания костей (например, дефекта кости или перелома) может следовать тем же процедурам, которые описаны для (прямого) введения рекомбинантных белков, например, рекомбинантных ЧКМБ-2 и чКМБ-7 (см., например, Katanec, Coll Antropol 38(1), 2014, 325-330, , Open Dent J 6, 2012, 51-55, Docherty Skogh, Plast Reconstr Surg 123(6), 2009, 192e-3e, Baltzer, Orthop Rev (Pavia) 4(1), 2012, e4, Heliotis, Int J Oral Maxillofac Surg 35(3), 2006, 265-269, van den Bergh, J Clin Periodontol 27(9), 2000, 627-36). РНК также может быть добавлена к костным цементам или наполнителям костей. В этом контексте может быть получен пастообразный продукт. Это может быть дополнительно применено к лечению дефекта кости. В принципе, РНК также может быть непосредственно введена в кость инъекцией, например, без матрикса или каркаса. Однако, прямая инъекция с матриксом или каркасом, в принципе, также возможна.
В другом объекте РНК может быть доставлена/введена ex vivo. В соответствии с этим объектом РНК (или включающая ее фармацевтическая композиция) может быть получена для доставки/введения ех vivo и/или она предназначена для доставки/введения ех vivo. Например, РНК может быть доставлена/введена ех vivo в клетки (например, костные клетки), которые должны вводиться пациенту, т.е. которые могут вводить пациенту в трансфецированной (генетически модифицированной) форме. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения РНК доставляют/вводят ех vivo в клетки (например, костные клетки) пациента, и указанные клетки, которым была доставлена/введена РНК, повторно вводят тому же пациенту, т.е. клетки в трансфецированной (генетически модифицированной) форме повторно вводят этому пациенту. Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения клетки получают именно от того пациента, которого лечат.
Клетки, которые предназначены для реинтродукции пациенту, могут быть какими-либо клетками, подходящими для этой цели. Клетки могут быть, например, остеопрогениторными клетками. Они могут быть мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), например, мышечными мезенхимальным стволовым клетками (ММСК) или, предпочтительно, мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из жировой ткани (ЖМСК) или мезенхимальными стволовыми клетками из костного мозга (КММСК).
В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения доставка/введение РНК (или включающей ее фармацевтической композиции) ех vivo получают для доставки/введения через аутологичный тканевый трансплантат и/или предусматривают для доставки/введения через аутологичный тканевый трансплантат. В частности предполагают, что аутологичный тканевый трансплантат, в частности, включенные в него клетки, трансфецируют и, следовательно, генетически модифицируют в соответствии со средствами и способами, описанными в настоящем изобретении, т.е. экспрессирует один или несколько описанных в настоящем изобретении КМБ в результате доставки/введения ex vivo РНК (или ее фармацевтической композиции) в соответствии с настоящим изобретением. Точнее, предусматривают, что аутологичный тканевый трансплантат, в частности входящие в него клетки, трансфецируют или собираются трансфецировать в соответствии с настоящим изобретением, т.е. одним или несколькими из описанных в настоящем изобретении РНК КМБ соответствующими средствами и методами трансфекции. Сказанное в настоящем изобретении относительно средств и методов также применимо в данном варианте настоящего изобретения, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
Аутологический тканевый трансплантат, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может включать прогениторные клетки. В частности предусматривают включение остеопрогениторных клеток. Аутологический тканевый трансплантат может включать мышечные клетки или жировые клетки (например, ЖМСК). Аутологический тканевый трансплантат может включать костные клетки, например, остеобласты, остеокласты и/или остеоциты. В конкретном объекте настоящего изобретения, аутологичный тканевый трансплантат состоит из пульпы или включает ее. Пульпа может включать какую-либо из описанных в настоящем изобретении (костных) клеток, которые должны быть или были трансфецированы в соответствии с настоящим изобретением, т.е. которые должны быть или были генетически модифицированы в соответствии с настоящим изобретением для экспрессии КМБ.
В принципе, подходящие средства и методы для доставки/трансфекции ех vivo РНК КМБ известны в данной области, а также описаны в прилагаемых примерах. Однако в контексте одного из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают, что РНК КМБ доставляют/трансфецируют в среде Opti-MEM (Gibco™, фирма Invitrogen, Калифорния, США). Установлено, что чрезвычайно высокой эффективности доставки/трансфекции добиваются с помощью среды этого типа.
Также с целью доставки/введения ех vivo, РНК, например, в форме комплекса, может быть добавлена или нагружена в/на матрикс или каркас, т.е. носитель, согласно приведенному выше описанию (например, коллаген/коллагеновые губки, фибрин/фибриновые сгустки, титановые пленки, матрикс гепарин-хитозан, гидроксиапатит).
В частности, в настоящем изобретении предусматривают, что носитель/несущее тело на первой стадии предварительно нагружают РНК или, предпочтительно, комплексом РНК, необязательно высушивают (например, в вакууме и/или лиофильно) и на второй стадии высевают клетки, в которые РНК должна быть доставлена/введена (например, трансфекцией).
Для сушки лиопротектор (например, сахарозу) могут добавлять к комплексу РНК/РНК в соответствующей концентрации (например, в концентрации примерно от 1% до примерно 6%, предпочтительно примерно от 2% до примерно 5% или, в частности, примерно 5%, примерно 3% или, что наиболее предпочтительно, примерно 2%).
Эффективность трансфекции и/или жизнеспособность клеток на носителе, нагруженном РНК, можно подвергать мониторингу (например, согласно описанию в прилагаемых примерах). Носители с низкой активностью в этом отношении могут быть отсортированы.
Носитель, нагруженный РНК, в частности, если он обладает хорошей активностью, может быть введен пациенту. В принципе клетки, которые были трансфецированы РНК в контексте настоящего изобретения для описанных целей ex vivo, затем могут быть доставлены/введены, предпочтительно вместе с матриксом/каркасом, в/на которые они нагружены, описанным выше способом, который применим для целей in vivo. Например, он может быть введен в ткань пациента или вблизи ткани пациента, в частности ткани, в которой желательна индукция роста костей, регенерация кости, формирование костей, остеогенез, окостенение и т.п. Опять же, эта ткань может быть самой костной тканью, но также и другими тканями, например, мышечной тканью. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения он может быть непосредственно помещен/имплантирован в место костного дефекта или рядом с ним.
Описанные выше РНК-нагруженные носители, средства и методы их доставки/введения и получения особенно применимы при пересадке аутологичной ткани, в частности, при пересадке аутологичной ткани, описанной в настоящем изобретении. Сказанное в настоящем изобретении относительно средств и методов также применимо в данном варианте настоящего изобретения, mutatis mutandis (изменив то, что следует). В частности, носитель может быть засеян соответствующими прогениторными клетками, например, остеопрогениторными клетками или костными клетками, например, остеобластами, остеокластами и/или остеоцитами, такими МСК, как ММСК или ЖМСК и др.
Нагруженный РНК носитель, описанный в настоящем изобретении, особенно применим для устойчивой/замедленной доставки РНК, например, в качестве депо для высвобождения РНК, в частности устойчивой/замедленной доставки РНК, и в качестве систем (устойчивой/замедленной) доставки РНК, соответственно. В принципе, это применимо по отношению к in vivo, in vitro и ex vivo доставке/введению, но особенно к описанным в настоящем изобретении способам доставки/введения in vivo.
Значимость устойчивой/замедленной доставки известна в данной области и, соответственно, применяется в контексте настоящего изобретения. Например, устойчивое/замедленное высвобождение РНК может быть доставкой РНК, в частности, в фармацевтически активном количестве РНК, на протяжении периода, составляющего, по меньшей мере, одни сутки, двое суток, трои суток, четверо суток, пятеро суток, шестеро суток, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев или шесть месяцев. В принципе, предпочтительны более длительные периоды. Специалист в данной области может легко изготовить нагруженный РНК носитель/несущие тела, подходящие для осуществления в соответствии с настоящим изобретением. Для этой цели специалист может положиться на соответствующие средства и методы, известные в данной области (Chevally, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218) и изложенные в настоящем описании и в прилагаемых примерах. Например, специалист может применить описанные выше стадии метода. Например, стадия высева клеток и, возможно, связанные с ней стадии, могут быть пропущены, если РНК-нагруженный носитель получают для целей доставки/введения in vivo по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к соответствующим средствам и методам получения РНК-нагруженного носителя.
Например, количество РНК или РНК, нагруженной на носитель/несущее тело, в соответствии с настоящим изобретением может быть в диапазоне примерно от 0,1 мкг до примерно 10 мкг, предпочтительно примерно от 0,5 мкг до примерно 8 мкг, предпочтительно примерно от 1 мкг до примерно 6 мкг, предпочтительно примерно от 1,5 мкг до примерно 5 мкг и наиболее предпочтительно примерно от 2 до примерно 3,5 мкг на носитель/несущее тело. Количество клеток, высеянных в/на носитель/несущее тело, например, может быть примерно от 5000 до примерно 50000, предпочтительно примерно от 7500 до примерно 40000, предпочтительно примерно от 10000 до примерно 30000 на носитель/несущее тело. В особых случаях количество высеянных клеток составляет примерно 10000, примерно 20000 и примерно 30000 на несущее тело.
3
3
3
В качестве примера, не ограничивающего области охвата настоящего изобретения, указанные выше величины в частности применимы к несущему телу, например, описанному в контексте настоящего изобретения (т.е.: от 5 до 7 мм в диаметре и толщиной примерно от 1 до 2 мм, объемом примерно около 50 мм). Несущее тело, применяемое по настоящему изобретению, например, может быть диском в диаметре примерно от 1 мм до нескольких см в диаметре (например, примерно 5 см в диаметре) и толщиной примерно от 2 мм до 2 см, в зависимости от формы и диаметра, например, костного фрагмента, который предполагают лечить. По грубой оценке объем составляет от нескольких мм до см. В принципе, форма несущего тела (например, диска) например, может быть адаптирована к форме костного фрагмента или может быть иной соответствующей формы. Например, несущее тело может вместо округлой формы иметь неправильную форму.
В общем, несущее тело (например, (коллагеновая) губка) может быть адаптировано для конкретного применения. Например, его форма может быть адаптирована к перелому кости, повреждению кости, полости в кости (например, вызванной костным переломом, костным повреждением, кистой (зубной) и др.) и т.д., которые планируют лечить. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают, что форма несущего тела подгоняется к костному перелому/костной полости. Иначе говоря, несущее тело может иметь ту же форму, что и костный вырост/полость в кости. В частности, предусматривают, что несущее тело, будучи имплантированным в место повреждения/за местом повреждения кости (например, костного выроста/повреждения кости) схоже, вместе с оставшейся частью (частями) кости, с первоначальной формой кости.
Обычно несущее тело может быть сжимающимся (например, (коллагеновой) губкой). Следовательно, исходная форма несущего тела может быть несколько увеличена по сравнению с костным фрагментом, костной полостью и т.д., которые предназначены для лечения, но может быть сжата до размера костного фрагмента, костной полости и т.д. таким образом, чтобы напоминать первоначальную форму кости после имплантации. Кроме того, в связи с описанным несущее тело может быть, например, коллагеновой губкой или фибриновым сгустком (например, описанными в настоящем изобретении). Величины, например количества РНК и/или клеток, которые должны быть нагружены в/на определенное несущее тело, могут быть легко адаптированы специалистом/лечащим врачом.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают РНК на полимере, который задерживает высвобождение, например, на носителе для покрытия имплантатов. Для этой цели РНК можно применять в этом качестве или в качестве РНК, например, защищенную покровным полимером и/или полимерным комплексом.
Более того, имплантаты являются дополнительным вариантом введения РНК. На поверхности соответствующего имплантата может быть покрытие полимера с замедленным высвобождением, который содержит РНК, кодирующую (а) КМБ, например, в качестве полезного фактора (факторов) для вживления имплантата. В соответствии с настоящим изобретением предусматривают оба типа покрытий, т.е. те, которые содержат (м)РНК, кодирующую только один фактор (КМБ), а также покрытия, которые содержат (м)РНК, которые кодируют несколько факторов (КМБ). Различные факторы (КМБ) также могут быть предусмотрены в такой форме, чтобы они высвобождались с интервалами.
Выражение «РНК, которая кодирует один или несколько факторов (КМБ)», следует относить к последовательности РНК, которая кодирует более одного белка, в единичной форме или в виде гибридного белка, а смесь различных последовательностей РНК, которые кодируют разные (КМБ) белки, где каждая последовательность РНК кодирует один белок.
Предназначенную для применения в настоящем изобретении (м)РНК можно преимущественно использовать для стимуляции врастания имплантированных протезов. Если есть возможность на поверхность вставляемых протезов, например, зубных имплантатов, эндопротезов тазобедренного сустава, эндопротезов коленного сустава или тел слияния позвонков, инсертировать (м)РНК, применяемую в соответствии с настоящим изобретением, то можно высвобождать (а) КМБ, которые могут стимулировать врастание и другие функции, необходимые для вновь уставленных протезов. Таким образом, например, введение биологически активных веществ, например, ростовых факторов, например, КМБ-2 или КМБ-7, в контексте имплантации протезов или после имплантации могут быть применены в соответствии с настоящим изобретением. В таком варианте осуществления настоящего изобретения применяемая РНК, которая кодирует (а) КМБ, может быть нанесена на имплантат в составе покрытия, высвобождающего РНК (по данным измерения), и затем постепенно высвобождается из него (по данным измерения), например таким образом, что клетки вблизи имплантата могут непрерывно или периодически вырабатывать и при необходимости высвобождать требуемые факторы. Системное введение (м)РНК также возможно. Могут быть случаи, когда трансляция (м)РНК в клетках, которые не содержат дефекта генов, нежелательна, например, из-за возможности возникновения нежелательных побочных эффектов. Для того чтобы (м)РНК избирательно транслировалась только в клетках, которые нуждаются в кодируемом белке, например, в клетках, в которых существует дефект гена, соответствующий вектор может быть дополнен последовательностями, которые позволяют направленно воздействовать на ткань, например, за счет лигандов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения последовательности, с которыми связываются эндогенные микро-РНК, которые не экспрессируются в клетке-мишени, могут быть добавлены к вектору, который содержит (м)РНК таким образом, что (м)РНК разрушается во всех клетках, которые содержат соответствующие эндогенные микро-РНК, в то время как они сохраняются в клетках-мишенях. Таким образом, побочные эффекты могут быть сведены к минимуму.
Если РНК вводят системно, ее обычно перерабатывают в жидкую инъекционную форму с обычными добавками, например, регулирующими тоничность агентами и стабилизаторами, предпочтительно в виде стандартной лекарственной формы. В качестве стабилизаторов применяют известные соединения, например, липиды, полимеры и наносистемы или липосомы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают композицию, применимую для парентерального введения.
Известны обычные носители, как правило, биосовместимые, то есть фармацевтически приемлемые, синтетические, природные или смешанные природно-синтетические полимеры, способность к высвобождению которых может быть специально отрегулирована, и поэтому не требуется их более подробного объяснения в настоящем изобретении. Применяют, например, полилактидные/гликолидные полимеры. Таким образом, можно, например, избирательно высвобождать требуемые факторы непрерывно, с перерывами, в течение более длительного или более короткого времени и в определенном месте.
РНК, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, в частности, может быть предусмотрена для высокой стабильности, которая приводит к долговременной экспрессии белка. Например, если РНК предусмотрена для лечения или предупреждения заболеваний костей из-за дефектов генов, то чем дольше РНК сохраняется в клетке, тем более значимой она может быть. Чем быстрее РНК разрушается, тем быстрее заканчивается экспрессия белка, и в некоторых случаях необходимо чаще вводить РНК. И, напротив, при стабильной РНК, которая сохраняется в клетке в течение длительного времени, частота дозирования может быть значительно уменьшена. Установлено, что применяемая по настоящему изобретению РНК (в частности хмРНК) стабильно экспрессируется до 4 недель. Следовательно, очень длительное время действующая РНК может быть применена, если в этом есть потребность. Экспрессия РНК, которая может длиться до 4 недель, таким образом, идеально подходит для лечения хронических заболеваний костей. Соответствующую РНК следует вводить изредка (например, каждые 4 недели) или даже однократно.
В этом контексте, в настоящем изобретении предусматривают, что однократное лечение РНК КМБ является достаточным для полноценного и даже исчерпывающего лечения (или профилактики) заболеваний, расстройств или травм, связанных с костями. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают для однократного введения/обработки и/или предполагают вводить только один раз/в качестве единственного введения. Последующего второго введения/обработки (или даже дополнительных последующих введений/обработок) не требуется в соответствии с данным вариантом осуществления настоящего изобретения.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения, например, когда РНК предназначена только для временной экспрессии, длительность экспрессии белка может регулироваться путем воздействия на стабильность. Еще одно важное свойство РНК заключается в том, что длительность действия может быть выборочно определена через стабильность таким образом, что длительность экспрессии белка может быть настроена так, что она длится определенное требуемое время (см. выше).
Стабильность мРНК по настоящему изобретению может быть определена известными методами. Особенно применимы методы определения жизнеспособности клеток, которые содержат РНК, по сравнению с клетками, которые не содержат РНК. Продуктивность кодируемого белка (КМБ) может подвергаться мониторингу. При этом понятие «стабильность РНК» означает, что при введении в клетку РНК может экспрессировать требуемый белок, или способна транслировать белок или его функциональный фрагмент, причем РНК сохраняет способность к экспрессии в течение длительного периода, а не разрушается и не инактивируется сразу после введения в клетку.
Способ тестирования стабильности и времени выживания РНК в клетке заключается в определении того, как долго белок, кодируемый РНК, обнаруживают в клетке или фиксируют его функцию. Способы такого тестирования описаны в примерах. Так, например, (м)РНК с последовательностью, кодирующей репортерную молекулу, можно вводить в клетку по выбору вместе с РНК, кодирующей необходимый белок, и после определенного времени определяют наличие репортерной молекулы и, необязательно, кодируемого белка. Соответствующие репортерные молекулы известны в данной области, и те, которые обычно используют, также можно применить в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения красный флуоресцирующий белок (red fluorescing protein - RFP) используют в качестве репортерной молекулы.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предназначена для введения пациенту, предпочтительно человеку. Однако, описанные в настоящем изобретении костные заболевания (и близкие состояния) также можно лечить или предупреждать у животных, например, у домашних животных (например, собак, кошек, кроликов, крыс и мышей), сельскохозяйственных животных (например, коров, свиней, овец), лошадей, пони, а также птиц (например, кур, индюков, попугаев).
Какую-либо фармацевтическую композицию по настоящему изобретению предусматривают вместе с инструкцией или с инструкцией-вкладышем. Инструкция/вкладыш может включать руководство для специалистов/лечащих врачей по лечению или предупреждению заболевания или расстройства, описанного в настоящем изобретении (заболевания костей), в соответствии с настоящим изобретением. В частности, инструкция/вкладыш может включать руководство, касающееся описанного в настоящем изобретении способа доставки/введения и режима доставки/введения, соответственно (например, пути доставки/введения, режима дозирования, времени доставки/введения, частоты доставки/введения). В частности, инструкция по эксплуатации/вкладыш могут представлять инструкцию о том, что фармацевтическая композиция предназначена для однократного введения/лечения и/или должна вводиться только один раз/в виде однократного лечения. Инструкция по эксплуатации/вкладыши могут дополнительно включать информацию о том, что последующее, второе, введение/лечение (или даже дальнейшие последующие введения/лечения) не требуется. В принципе, сказанное в описании настоящего изобретения по поводу способа доставки/введения и режима доставки/введения, соответственно, например, в отношении доставки/введения ex vivo или in vivo пропорций МЧ, РЛТ и/или РНК и дозы могут быть включены в инструкции/вкладыши.
Настоящее изобретение также относится к (хм)РНК КМБ согласно описанию настоящего изобретения. Сказанное в настоящем изобретении относительно КМБ и РНК также применимо в данном варианте настоящего изобретения, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
Одним из предпочтительных примеров (хм)РНК КМБ по настоящему изобретению, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения, является РНК, последовательность которой кодирует КМБ (например КМБ-2 или КМБ-7), или функциональный фрагмент КМБ, где от 5 до 50%, от 7,5 до 30%, от 15 до 25 или, предпочтительно, примерно 25% цитидинов указанной РНК являются химически модифицированными цитидинами (например, 5-метилцитидины (m5С)) и/или от 5 до 50%, от 7,5 до 30%, от 15 до 25 или, предпочтительно, примерно 25% уридинов указанной РНК являются химически модифицированными уридинами (например, 2-тиоуридины (s2U)).
Один из объектов настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, в частности к описанной в настоящем изобретении фармацевтической композиции, включающей КМБ-кодирующую РНК, в частности вышеописанную КМБ-кодирующую РНК, предпочтительно в форме комплекса по описанию настоящего изобретения, и, более предпочтительно, в форме РНК-нагруженного носителя по описанию настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к комплексам, описанным в настоящем изобретении, т.е. к комплексам, которые включают или которые объединены с (хм)РНК, описанной в настоящем изобретении. В частности, настоящее изобретение относится к комплексам для трансфекции, описанным в настоящем изобретении (например, к комплексам для липофекции, магнитофекции и комплексам магнитолипофекции). В принципе, сказанное в настоящем изобретении относится к КМБ, РНК, РЛТ, МЧ и другим важным составляющим комплексов, также описанным в настоящем изобретении, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
Одним из предпочтительных примеров комплексов, не ограничивающих рамок охвате настоящего изобретения, является комплекс, который включает/объединен с последовательностью, которая кодирует КМБ (например КМБ-2 или КМБ-7), или функциональный фрагмент КМБ, где от 5 до 50%, от 7,5 до 30%, от 15 до 25, или, предпочтительно, примерно 25% цитидинов указанной РНК являются химически модифицированными цитидинами (например, 5-метилцитидины (m5С)) и/или от 5 до 50%, от 7,5 до 30%, от 15 до 25, или, предпочтительно, примерно 25% уридинов указанной РНК являются химически модифицированными уридинами (например, 2-тиоуридины (s2U)). Более конкретно, такой комплекс может включать один или несколько РЛТ (например, Lipofectamine 2000, Dogtor, DreamFect™ или, предпочтительно, DF-Gold™ или С12-(2-3-2)) и/или МЧ (например, МЧ, состоящие из ядра и оболочки, МЧ из оксида железа оксида кремния и/или (разветвленные) ПЭИ-декорированные МЧ, например, МЧ с SiOx/фосфонат-ПЭИ покрытием (например, SO-Mag6-115 МЧ)) согласно описанию настоящего изобретения. Еще более конкретно, МР, РЛТ и/или РНК могут быть включены в такой комплекс (или в другие комплексы по настоящему изобретению) в соответствующих пропорциях, описанных выше. В частности, эти соотношения могут быть
соотношениями массы РЛТ к массе РНК, а именно примерно 8 мкг или примерно 20 мкг указанного РЛТ на мкг указанной РНК,
соотношениями объема раствора РЛТ к массе РНК, а именно примерно 2 мкл или примерно 5 мкл указанного раствора РЛТ на мкг указанной РНК,
соотношениями массы МЧ к массе РНК, а именно примерно 0,5 мкг указанных МЧ на мкг указанной РНК,
соотношениями массы железа МЧ к массе РЛТ, а именно примерно 0,5 мкг указанных МЧ на примерно от 12 до 20 мкг (предпочтительно примерно на 16 мкг) указанного РЛТ,
соотношениями массы железа МЧ к раствору РЛТ, а именно примерно 0,5 мкг указанных МЧ примерно к 4 мкл указанного раствора РЛТ,
соотношениями железа масса/масса/масса по описанию настоящего изобретения, например, соотношения по железу масса/объем/масса примерно 0,5 мкг указанных МЧ к примерно от 12 до 20 мкг (предпочтительно примерно к 16 мкг) указанного РЛТ к примерно 1 мкг указанной РНК, и/или
соотношениями железа масса/объем/масса по описанию настоящего изобретения, например, по железу соотношения масса/объем/масса примерно 0,5 мкг указанных МЧ к примерно 4 мкл указанного раствора РЛТ: примерно 1 мкг указанной РНК.
Такой комплекс (или другие комплексы по настоящему изобретению) также могут включать один или несколько дополнительных липидов (например, «хэлперных липидов»). Сказанное выше о соответствующих других липидах (например, «хэлперных липидах») также применимо в настоящем варианте, mutatis mutandis (изменив то, что следует).
Кроме того, описанные выше РНК и комплексы предназначены для применения в соответствии со средствами и методами настоящего изобретения. В этом контексте предусматривают включение РНК или комплексов в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая включает (хм)РНК КМБ или комплекс, описанные в настоящем изобретении.
РНК КМБ и соответствующие комплексы могут быть легко получены в соответствии с известными в данной области средствами и методами, а также средствами и методами, описанными в настоящем описании и в прилагаемых примерах. Например, РНК КМБ может быть получена системами транскрипции in vitro и, следовательно, может быть транскрибирована in vitro РНК КМБ (IVT РНК КМБ). В этом контексте, например, может быть применим метод, в котором РНК КМБ, применяемую по настоящему изобретению, получают транскрипцией in vitro из смеси АТФ, ЦТФ, ГТФ и УТФ. Материалы, необходимые для осуществления транскрипции in vitro, известны в данной области и коммерчески доступны, в частности буферы, ферменты и смеси нуклеотидов. Природа ДНК, используемой для получения РНК, которую можно применять по настоящему изобретению, не является принципиально важной. Обычно это может быть клонированная ДНК.
Другой объект настоящего изобретения относится к описанному в настоящем изобретении матриксу или каркасу/носителю/несущему телу, т.е. к матриксу/ каркасу/носителю/несущему телу, нагруженному применяемой в настоящем изобретении РНК, например, в форме описанного в настоящее изобретении комплекса, и на который, необязательно, дополнительно высевают клетки, описанные в настоящем изобретении.
Еще один объект настоящего изобретения также относится к описанной в настоящем изобретении фармацевтической композиции, которая включает описанные в настоящем изобретении нагруженные РНК матрикс/каркас/носитель/несущее тело. Настоящее изобретение также предусматривает описанный в настоящем изобретении РНК-нагруженный носитель в качестве удобного в применении биопродукта, в частности, для применения в регенерации костей и/или в лечении описанных в настоящем изобретении заболеваний костей.
Настоящее изобретение также относится к применению матрикса/ каркаса/носителя/несущего тела, фармацевтической композиции или биопродукта, переработанных для устойчивой и/или замедленной доставки, а также в качестве устойчивой системы доставки/депо, соответственно.
Настоящее изобретение дополнительно описывают, ссылаясь на фигуры и примеры, которые не ограничивают области охвата настоящего изобретения.
Фигуры
Фиг. 1. Определение целостности и размера модифицированных мРНК, используя нативный агарозный гель-электрофорез. Перемешивают хмРНК и коммерческую смесь RiboRuler RNA ladder high range с RiboRuler формамидом, содержащим нагружаемый краситель, и инкубируют в течение 10 мин при 70°С. Затем образцы охлаждают на льду и наносят на агарозный гель. Выявление осуществляют окрашиванием этидиумбромидом и визуализируют с помощью Intas Gel Imaging System.
пДНК
хмРНК
Фиг. 2. (А) Кинетика экспрессии люциферазы Metridia ЖМСК, трансфецированными комплексами хмРНК MetLuc, сформированными с применением Lipofectamine2000 (LF), Dogtor, DF-Gold или рПЭИ в качестве энхансеров при дозе хмРНК 20 пг/клетку и (Б) выживаемость клеток через 5 и 24 ч после трансфекции. Существенное различие между контрольными клетками, не подвергнутыми трансфекции (100% выживаемость клеток), и трансфецированными клетками, обозначают значком (*). (В) Сравнение зависимости от времени профиля экспрессии репортеров в ЖМСК после трансфекции липоплексами DF-Gold пДНК или хмРНК, каждая их которых кодирует MetLuc. Площади под кривыми «пДНК» и «хмРНК», AUC и AUC, рассчитывают путем объединения данных в точках между 0 и 120 ч. Существенное отличие данных по пДНК и хмРНК обозначают значком (*).
MF
LF
Фиг. 3. Экспрессия репортеров Tomato, eGFP и MetLuc в ЖМСК и КММСК после трансфекции липоплексами DF-Gold/хмРНК и магнитными триплексами DF-Gold/SO-Mag6-115/хмРНК. Применяемая доза хмРНК составляет 20 пг/клетку. Флуоресцентное микроскопирование клеток через 24 ч после трансфекции комплексами: (А) хмРНК tomato N1 и (Б) хмРНК eGFP. Масштаб шкалы 250 мкм. (В) Результаты FACS по проценту клеток, экспрессирующих eGFP через 24 ч после трансфекции комплексами хмРНК eGFP. Показано существенное различие между нетрансфецированными и подвергнутыми липофекции (*) или магнитофекции клетками (**), а также между результатами по липофекции и магнитофекции . (Г) Динамика экспрессии люциферазы Metridia показана для клеток обоих типов, трансфецированных комплексами хмРНК MetLuc. Существенную разницу показывают между магнитофекцией и липофекцией, обозначаемых значками (*) и (**) для ЖМСК и КММСК, соответственно. Для расчета MAI нормализуют область под кривой «магнитофекции» AUC относительно области под кривой «липофекции» AUC для обоих типов клеток - КММСК и ЖМСК.
MF
LF
ref
Фиг. 4. Выработка чКМБ-2 в ЖМСК в разное время после трансфекции липоплексами DF-Gold/хмРНК и магнитными триплексами DF-Gold/SO-Mag6-115/хмРНК. Выработку чКМБ-2 нормализуют по применяемой дозе хмРНК чКМБ-2 (20 пг/клетку). (А) Влияние культуральной среды (остеогенной среды при сравнении со средой Opti-MEM), применяемой при трансфекции, на содержание секретированного чКМБ-2, измеряемого в супернатанте; значок (*) обозначает существенное различие между сравниваемыми группами. (Б) Содержание эндогенного чКМБ-2 (хмРНК (-)) и чКМБ-2, вырабатываемого трансфецированными клетками (хмРНК (+)), по результату измерения в супернатанте (секретированный чКМБ-2) и в клеточном лизате (внутриклеточный чКМБ-2) через 1, 2 и 3 суток после трансфекции. (*) обозначает существенное различие по секретированному чКМБ-2 между необработанными и трансфецированными клетками. Значок (**) обозначает существенное различие между секретированным и внутриклеточным чКМБ-2 для трансфецированных клеток за время наблюдения, (#) означает существенное различие в секреции чКМБ-2 при липофекции и магнитофекции. (В) Динамика суммарного содержания чКМБ-2 (секретированного + внутриклеточного) в трансфецированных клетках. Для расчета MAI=6,0, область под кривой «магнитофекции» AUC нормализуют относительно области под кривой «липофекции» AUC после вычитания области под кривой «необработанные клетки» AUC, показывающей уровень эндогенного чКМБ-2.
Фиг. 5. Активность щелочной фосфатазы (ALP) клеток, трансфецированных липоплексами DF-Gold/хмРНК. (А) Окращивание ALP через 12 суток после трансфекции. (Б) Активность ALP на 3, 7 и 12 сутки после трансфекции. Значок (*) обозначает существенное различие между нетрансфецированными и трансфецированными клетками и значок (**) между 3 и 12 сутками после трансфекции. Повышение экспрессии генов, связанных с костями, после липофекции и магнитофекции ЖМСК комплексами хмРНК чКМБ-2 при используемой дозе хмРНК 20 пг/клетку. Кратность увеличения экспрессии (В) RunX2, (Г) Osx, (Д) ALP, (Е) Coll I, (Ж) OPN и (З) OCN на 3, 7, 14 и 21 сутки после трансфекции. Серые полоски представляют липофекцию комплексами DF-Gold/хмРНК, а заштрихованные полоски представляют магнитофекцию триплексами SO-Mag6-115/DF-Gold/хмPHK. Обозначение (*) соответствует существенному различию между группами липофекции и магнитофекции при равном времени наблюдения. Обозначение (**) соответствует существенному различию при сравнении в разное время после трансфекции для группы липофекции и  группы магнитофекции.
Фиг. 6. Минерализация ЖМСК после липофекции и магнитофекции. Окрашивание ализарином красным через 21 сутки после трансфекции: (А) нетрансфецированные клетки, (Б) клетки после магнитофекции и (В) клетки после липофекции. (Г) Количественное определение окрашивания ализарином красным через 14 и 21 сутки после трансфекции. Значительные различия между нетрансфецированными и трансфецированными клетками обозначают значком (*) и сравнение по-разному трансфецированных клеток .
Фиг. 7. Трансфекция 3 мм дисков жировой ткани липоплексами DF-Gold/хмРНК при соотношении объема энхансера к массе хмРНК 4 и дозе 5 мкг хмРНК чКМБ-2 или хмРНК tomato N1 на диск. (А) Изображение флуоресцентной микроскопии жирового диска, взятое через 24 часа после трансфекции комплексами хмРНК tomato N1. Масштаб шкалы 500 мкм. Индукция экспрессии генов, связанных с костью, после липофекции дисков жировой ткани комплексами DF-Gold /хмРНК чКМБ-2. Кратное увеличение экспрессии (Б) чКМБ-2, (В) RunX2, (Г) ALP и (Д) Coll I. Суммарную РНК экстрагируют и осуществляют РВ-ПЦР через 3 и 7 суток после трансфекции. Экспрессию оценивают в виде кратности индукции по сравнению с нетрансфецированными контролями. Все значения нормируют по бета-тубулину. Значок (*) обозначает существенное различие между 3 и 7 сутками после трансфекции для экспрессии ALP и Coll I.
Фиг. 8. В ЖМСК образуется чКМБ-7 в разное время после трансфекции липоплексами DF-Gold/хмРНК и магнитными триплексами DF-Gold/SO-Mag6-115/хмРНК. Выработанный чКМБ-7 нормализуют по применяемой дозе хмРНК чКМБ-7 (20 и 32 пг/клетку).
Фиг. 9. Минерализация ЖМСК после липофекции DF-Gold/хмРНК чКМБ-7 и магнитофекции триплексами SO-Mag6-115/DF-Gold/хмPHK чКМБ-7. Применяемые дозы хмРНК составляют 20 и 32 пг/клетку. Окрашивание ализарином красным после трансфекции на 21 сутки: (А) нетрансфецированные клетки, (Б-В) клетки после липофекции и (В-Г) клетки после магнитофекции.
Фиг. 10. Экспрессия MetLuc в разное время после трансфекции ЖМСК липоплексами DF-Gold/ мРНК MetLuc. Отношение объема DF-Gold к массе мРНК находится в диапазоне от 0,5 до 5 мкл DF-Gold на мкг мРНК для применяемых доз мРНК 2,5, 5, 10 и 20 пг/клетку.
Фиг. 11. Экспрессия MetLuc в разное время после трансфекции КММСК липоплексами DF-Gold/мРНК MetLuc. Отношение объема DF-Gold к массе мРНК находится в диапазоне от 0,5 до 5 мкл DF-Gold на мкг мРНК для применяемых доз мРНК 2,5, 5, 10 и 20 пг/клетку.
Фиг. 12. Гистограммы, полученные методом жидкостной цитометрии, для клеток (А) ЖМСК и (Б) КММСК через 24 ч после трансфекции мРНК липоплексами DF-Gold/мРНК eGFP при соотношении DF-Gold-к-мРНК, равном 4 (липофекция), и магнитными триплексами DF-Gold/SO-Mag6-115/MPHK eGFP при соотношении массы Fe к массе мРНК 0,5 (магнитофекция).
Фиг. 13. РНК КМБ-2, пересаженная на материалы костного имплантата - результаты μCT - целая кость. Реконструкция μСТ 3D и продольные срезы, полученные для всех групп через 2 недели обработки. (А) фибрин, (Б) С12-(2-3-2)/хмРНК FFL и (В) С12-(2-3-2)/хмРНК чКМБ-2. Область образования каллуса была выявлена путем установки одинаковых пороговых значений (2500-4500) в программном обеспечении ImageJ для всех образцов. (Г) Количественная оценка формирования каллюса, рассчитанная по ImageJ.
Фиг. 14. Нагрузка комплекса и высев клеток на коллагеновые губки. (А) Сканирующая электронная микроскопия высушенных в вакууме коллагеновых губок, незагруженных и нагруженных липоплексами РНК Luc SNIM (средний гидродинамический диаметр липоплекса: 65,8 нм). (Б) Флуоресцентная микроскопия клеток NIH3T3, 30 ч после высева на коллагеновые губки, нагруженные мРНК tdTomato, где 10% мРНК tdTomato помечены флуоресцеинизотианатом (FITC). (В) Окрашивание гематоксилином клеток NIH3T3 через 7 суток после высева на коллагеновые губки. Ядра клеток окрашиваются гематоксилином в темно-синий цвет. Масштаб шкалы 100 мкм. Левый край верхней панели соответствует поверхности коллагеновой губки.
Фиг. 15. Эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток через 48 ч после высева клеток NIH3T3 на коллагеновые губки, нагруженные мРНК eGFP - комплексами. (А) Флуоресцентная микроскопия при увеличении 4× (JULY™): экспрессия мРНК eGFP в клетках NIH3T3. (Б) Анализ FACS: очевидный сдвиг средней флуоресцентной интенсивности в клетках NIH3T3, трансфецированных 100 пг/клетку мРНК eGFP, по сравнению с нетрансфецированными клетками. (В) Анализ FACS: Корреляция дозы мРНК с интенсивностью соответствующей трансфекции. (Г) и (Д) Анализ FACS окрашиванием пропидием йодитом (PI) и методом WST, соответственно, показывают жизнеспособность клеток примерно равную 60-70%. Все данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение исходя из величин трех повторов.
Фиг. 16. Кинетика экспрессии мРНК люциферазы Metridia в 2D культуре клеток против 3D культуры клеток NIH3T3. Супернатанты собирают каждые 24 ч после трансфекции и сразу измеряют экспрессию Met luc. Все представленные данные означают среднюю величину по трем повторам ± стандартное отклонение. Ось Y является логарифмической шкалой.
Фиг. 17. Кинетика экспрессии люциферазы Metridia на коллагеновых губках при разной плотности клеток МСК. Количество липоплексов мРНК в этих экспериментах составляет 50 пг/клетку. Супернатанты собирают каждые 24 ч после трансфекции и хранят при -20°С. Через 8 суток определяют экспрессию люциферазы Metridia во всех временных точках. Все представленные данные означают среднюю величину по трем повторам ± стандартное отклонение. Ось Y представляет логарифмическую шкалу.
Фиг. 18. Иммуногистохимический анализ регенерации костей in vivo. (A). Окрашивание минерализованной костной ткани. Красные прямоугольники показывают, где губки помещены на место дефекта бедренной кости. Черные зоны высоко минерализованы. (Б). Формирование каллюса в надкостничной области. (В). Фрагмент формирования фиброзной ткани. (Г). Фрагмент формирования остеоида. Величины сравнивают с применением Т-теста (n=9).
Фиг. 19. Экспрессия чКМБ-2 клетками МСК, высеянными на коллагеновые губки, нагруженные мРНК чКМБ-2. Исследуют три разные дозы. Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение исходя из величин трех повторов.
Фиг. 20. Дифференциация костей in vitro. Результаты количественной ПЦР реального времени (РВ-кПЦР): кратное увеличение экспрессии маркеров остеобластов на 7 и 14 сутки после высева клеток на коллагеновые губки, нагруженные хмРНК чКМБ-2. Представленные данные означают среднюю величину по трем повторам ± стандартное отклонение. (А). Клетки МС3Т3-Е1: величины нормализуют по экспрессии GAPDH. Данные выражают в виде кратности увеличения относительно нетрансфецированных клеток в 3D. (Б). МСК: величины нормализуют по экспрессии β-тубулина. Данные выражают в виде кратности увеличения относительно нетрансфецированных клеток в 2D и сравнивают с применением множественного Т-теста.
Фиг. 21. Регенерация костей in vivo. (А). Изображения μСТ бедренной кости крысы через 2 недели после трансплантации. Красные участки представляют вновь сформированные участки кости. (Б). Анализ μСТ для оценки формирования участков костей через 2 недели после трансплантации. Величины сравнивают, используя t-тест (n=9).
Фиг. 22. Стабильность высушенных в вакууме липоплексов мРНК на коллагеновых губках. Коллагеновые губки, нагруженные мРНК Metluc и высушенные в вакууме в течение 2 ч, затем запечатывают в вакууме и хранят при комнатной температуре. В разное время после сушки в вакууме планшеты открывают и клетки NIH3T3 высевают на губки. Экспрессию Met Luc измеряют через 24 ч после высева клеток. Все данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение исходя из результатов трех повторов. Ось Y представляет логарифмическую шкалу.
Фиг. 23. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) коллагеновых губок до и после сушки в вакууме. Масштаб шкалы 200 мкм.
Фиг. 24. Кинетика экспрессии Metluc после трансфекции SNIM Metluc или мРНК Metluc без модификации в клетки NIH3T3 на коллагеновых губках. Супернатанты собирают каждые 24 ч после трансфекции и хранят при -20°С. Через 10 суток измеряют экспрессию люциферазы Metridia для всех временных точек. Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение исходя из результатов трех повторов. Ось Y представляет логарифмическую шкалу.
Фиг. 25. Влияние вакуумной сушки на кинетику экспрессии Metluc в клетках NIH3T3 на коллагеновых губках. Супернатанты собирают каждые 24 ч после трансфекции и хранят при -20°С. Через 5 суток измеряют экспрессию люциферазы Metridia для всех временных точек. Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение исходя из результатов трех повторов. Ось Y представляет логарифмическую шкалу.
Фиг. 26. Метод FACS: изучение положительных (CD90 и CD29) и отрицательных (CD45, CD106 и CD31) маркеров для МСК после выделения из жировой ткани крысы. IgM, K-FITC, IgG1, K-FITC и IgG1, K-PE используют в качестве контролей.
Фиг. 27. Макроскопические изменения морфологии губок в ходе дифференциации. Изображения получают из 96-луночного планшета через 7 суток после высева МСК на губки.
Фиг. 28. Остеогенный эффект in vivo коллагеновых губок, нагруженных липоплексами хмРНК чКМБ-2, в разных частях кости. Результаты сравнивают, используя T-test.
Фиг. 29. Результаты μСТ: воздействие хмРНК чКМБ-2-нагруженных коллагеновых губок на регенерацию костей in vivo через две недели после хирургического вмешательства. Желтые участки соответствуют вновь сформированным костям.
Фиг. 30. (А) Минерализация ткани существенно возрастает при нагрузке имплантатов хмРНК, кодирующей чКМБ-2, в костный мозг бедренных костей крысы. (Б) Формирование ткани надкостницы существенно повышается вследствие имплантации коллагеновых губок, нагруженных хмРНК, кодирующей чКМБ-2. (В). Фиброзная ткань по отношению к общему объему (Fb.V/TV) существенно возрастает при обработке коллагеновыми губками, нагруженными хмРНК чКМБ-2. (Г). Формирование остеоидов по отношению к общему объему (OV/TV) возрастает при обработке коллагеновыми губками, нагруженными хмРНК чКМБ-2. (Д). Меньшая костная резорбция является следствием имплантации коллагеновых губок, нагруженных хмРНК, кодирующих чКМБ-2.
В настоящем описании цитируют ряд документов, в том числе патентных заявок. Сущность этих документов включена в настоящее описание в виде ссылок. Точнее, все цитируемые документы включены в настоящее изобретение в виде ссылок таким образом, что сущность каждого отдельного документа конкретно и специфически включена в качестве ссылки.
Ниже настоящее изобретение описывают с помощью примеров, которые являются иллюстративным материалом и не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения.
Пример 1.
Материалы и методы (особенно относящиеся к примерам 1-7).
Материалы. Минимальная эссенциальная среда Игла, модифицированная по способу Дюльбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium - DMEM), фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без кальция и магния (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium - DPBS), фетальная сыворотка теленка (Fetal Bovine Serum - FBS), пенициллин/стрептомицин (Penicillin/Streptomycin - P/S) и раствор аккутазы приобретают на фирме РАА Laboratories GmbH (Pasching, Австрия). Среду Opti-MEM и коллагеназу II типа получают от Gibco™ (фирма Invitrogen, Калифорния, США). Ficoll-Paque™ производит фирма GE Healthcare Ltd. (Коннектикут, США). Тетраэтилортосиликат, 3-(тригидроксилил)пропилметилфосфонат и разветвленный полиэтиленимин (рПЭИ) получают от фирмы Sigma-Aldrich (Миссури, США). Остальные реагенты и материалы получают от фирмы Sigma-Aldrich если не указано иначе. 24-луночный магнитный планшет (фирма OzBiosciences, Марсель, Франция) применяют для экспериментов по магнитофекции.
Животные. Самок крыс Sprague Dawley (250-300 г) приобретают на фирме Charles River Laboratories (Sulzfeld, Германия) и используют для изоляции мезенхимальных стволовых клеток как жировой, так и костной ткани. Животных подвергают эвтаназии асфиксией двуокисью углерода непосредственно перед отбором ткани. Используемые процедуры одобрены местным комитетом по этике и их выполняют в соответствии с законом Германии о защите животных
2
2
Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток крысы. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (КММСК) выделяют по ранее описанному протоколу (Balmayor, Biores Open Access 2(5), 2013, 346-355). Вкратце, бедренные и берцовые кости тщательно очищают от окружающей ткани, срезают эпифизы и инкубируют в стерильной среде DMEM, содержащей 2,5 мг/мл коллагеназы II типа при 37°С и 5% СО в течение 2 ч. После промывки костного мозга полноценной средой DMEM (т.е. обогащенной 10% ФСБ и 1% P/S), клетки осаждают и ресуспендируют в свежей полноценной среде DMEM. Затем фракцию мононуклеарных клеток собирают центрифугированием в градиенте плотности, используя Ficoll-Paque™ (в режиме 500 g, 30 мин), промывают и ресуспендируют в полноценной среде DMEM. Клетки высЕвают с плотностью 3000 клеток/см. После 24 ч культивирования культуральную среду заменяют для удаления неприкрепившихся клеток.
2
Для выделения жировых мезенхимальных стволовых клеток (ЖМСК), жировую ткань выделяют из брошной области, нарезают маленькими кусочками миллиметровых размеров и переносят в фалькон, содержащий стерильную среду DPBS. После нескольких стадий промывки DPBS, кусочки жира инкубируют в 0,5 мг/мл растворе коллагеназы II типа при 37°С в течение 30 мин. Затем полноценную культуральную среду DMEM вносят для остановки действия коллагеназы и смесь центрифугируют в режиме 600 g в течение 10 мин. Полученный осадок из клеток ресуспендируют в полноценной культуральной среде DMEM, суспензию клеток фильтруют через фильтр с ячейками 40 мкм (фирма BD Falcon, Нью-Джерси, США) и высевают в количестве 3000 клеток/см.
2
2
Клетки обоих типов, КММСК и ЖМСК, размножают и культивируют при 37°С и 5% СО, используя полноценную среду DMEM. Для экспериментов по трансфекции и дифференциации клетки используют до 6 пассажей. По ходу культивирования среду заменяют каждые третьи сутки и клетки поддерживают при 37°С и 5% СО. Описание обоих типов выделенных МСК осуществляют по протоколам, описанным Balmayor (2013, см. выше).
2
Ex vivo культура жировой ткани человека. Свежую подкожную жировую ткань человека получают от здоровых пациентов, подвергающихся восстановительной хирургии, с письменного согласия информированных пациентов при одобрении местного этического комитета университетской больницы «Klinikum rechts der Isar» в Техническом университете Мюнхена, Германия. Жировую ткань человека иссекают из кожи и сосудов в стерильных условиях. Затем ткани тщательно нарезают слоями толщиной примерно 1 мм. После этого применяют иглу для биопсии кожи (3 мм) для получения круглых однообразных эксплантов размером 3 мм × 1 мм в соответствии с протоколом, описанным Evans (2009, см. выше). Получаемые эксплантаты промывают трижды стерильной средой DPBS и помещают в чашки Петри диаметром 35 мм. Затем их культивируют при 37°С и 5% СО в полноценной среде DMEM в течение до 7 суток. Производят замену культуральной среды, сначала через 2 ч и затем каждые 24 ч культивирования для обеспечения условий хорошего насыщения кислородом (Puri, J Lipid Res 48(2), 2007, 465-471).
Магнитные наночастицы из оксида железа и оксида кремния. Магнитные наночастицы из оксида железа и оксида кремния, состоящие из ядра и оболочки, синтезируют по ранее описанному методу (Mykhaylyk, Liposomal magnetofection, в кн.: «Methods in Molecular Biology», под ред. Weissig, Т. 605, 2010, изд-во Humana Press-Springer, Нью Йорк, 487-525, Mykhaylyk, Pharm Res 29(5), 2012, 1344-1365). Сначала осаждают гидроксид Fe(II)/Fe(III) из водного раствора солей железа и трансформируют в магнитное «ядро» наночастиц. Затем поверхность наночастиц стабилизируют с помощью совместной конденсации тетраэтилортосиликата (tetraethyl orthosilicate - TEOS) и 3-(тригидроксилил) пропилметилфосфоната (3-(trihydroxysilyl)propylmethylphosphonate - ТНРМР), формируя покрытие из оксида кремния с фосфонатными группами на поверхности. В итоге водный раствор разветвленного полиэтиленимина (ПЭИ) массой 25 кДа рН 7,0 применяют при соотношении массы ПЭИ к массе железа 11,5% для декорирования поверхности частиц. Получаемые магнитные наночастицы с SiOx/фосфонат-ПЭИ-покрытием могут дополнительно упоминаться в качестве SO-Mag6-115 МНЧ или в качестве МНЧ. Подробное описание физико-химических свойств таких наночастиц дано Mykhaylyk (см. выше). Вкратце, частицы имеют характеристики среднего гидратированного диаметра Dh=97±14 (ИПД=0,32±0,03) и электрокинетический потенциал ζ=+34,1±2,7 при суспендировании в воде, определенные по динамическому рассеянию света (ДРС), используя систему Zetasizer Nano ZS фирмы Malvern Instruments (Herrenberg, Германия).
Получение химически модифицированной матричной РНК, кодирующей MetLuc, eGFP, tomato и КМБ-2 человека. Плазмидные векторы, содержащие кодон-оптимизированные открытые рамки считывания люциферазы Metridia (Metridia longa), и мРНК КМБ-2 человека синтезируют и клонируют по сайтам BamHI-EcoRI плазмиды pVAXA120 с помощью GeneArt (фирма Life Technologies, Калифорния, США). eGFP вырезают из peGFP-N1 (фирма Clontech, Калифорния, США), используя NotI-HindIII и клонируют в EcoRI-HindIII плазмиды pVAXA120 через лигирование наполовину по тупым концам. Кодирующую последовательность для Tomato вырезают с помощью NotI-KpnI из ptd Tomato-N1 (фирма Clonetech, Калифорния, США) и лигируют по сайтам EcoRI-KpnI в pVAXA120 через лигирование наполовину по тупым концам. Вектор pVAXA120 описан ранее (Kormann, Nat Biotechnol 29(2), 2011, 154-157) и его конструируют путем клонирования отрезка из 120 As между сайтами PstI-NotI в pVAX1 (фирма Invitrogen, Калифорния, США).
7,3'-O
Для получения матриц для транскрипции in vitro (in vitro transcription - IVT) указанные выше плазмиды ДНК (рДНК) (т.е. pVAXA120-MetLuc, pVAXA120-eGFP, pVAXA120-Tomato или рVAXA120-чКМБ-2) линеаризуют с помощью рестриктазного расщепления NotI. Матрицу рДНК дополнительно очищают осаждением хлороформом и метанолом. IVT осуществляют с помощью набора для высокопродуктивной транскрипции in vitro RiboMAX™ Large Scale РНК Production System-T7 (фирма Promega, Висконсин, США). Для синтеза кэпированных мРНК антиреверсный аналог кэпа (ARCA, m GpppG, фирма Jena Biosciences, Йена, Германия) применяют для того, чтобы убедиться в инкорпорации кэпа только в нужной ориентации. Для выработки модифицированных мРНК 25% цитидин-5'-трифосфата и уридин-5'-трифосфата замещают 5-метилцитидин-5'-трифосфатом и 2-тиоуридин-5'-трифосфатом (фирма Jena Biosciences, Jena, Германия). Очистку получаемых модифицированных мРНК осуществляют путем осаждения ацетатом аммония. Целостность и размеры получаемых модифицированных мРНК подтверждают нативным агарозным гель-электрофорезом.
Формирование и описание комплексов для трансфекции. Липоплексы и полиплексы всегда свежеприготовленные путем перемешивания отобранных реагентов для липидной трансфекции, например, Lipofectamine2000 (фирма Invitrogene, Калифорния, США), DreamFect Gold (DF-Gold) и Dogtor (фирма OzBiosciences, Марсель, Франция) или рПЭИ с соответствующими хмРНК. Соотношения объема-к-массе реагентов для липосомальной трансфекции к хмРНК выбирают по инструкциям производителя (т.е. 2 мкл Lipofectamine2000, или 4 мкл DF-Gold, или 4 мкл Dogtor, соответственно, на мкг мРНК). В случае рПЭИ, получают раствор 10 мг/мл воды и рН доводят до 7,0 перед применением. Комплексы формируют перемешиванием растворов рПЭИ и хмРНК при N/P=8 с последующим инкубированием в течение 20 мин при комнатной температуре для осуществления сборки. Для получения магнитных липоплексов перемешивают равные объемы водной суспензии МНЧ SO-Mag6-115 (0,1 мкг Fe/мкл) и разведения DF-Gold (80 мкл DF-Gold разводят до 100 мкл водой). Затем добавляют равный объем разведения хмРНК (0,2 мкг/мкл воды, или 150 мМ NaCl, или среды Opti-MEM без добавок), тщательно перемешивают и смесь хранят при комнатной температуре в течение 20 мин. Образующееся соотношение компонентов в комплексах SO-Mag6-115/DF-Gold/хмPHK составляет 0,5:4:1 (железа масса/объем/масса). Комплексы характеризуют по средним гидродинамическим диаметрам (Dh), индексу полидисперсности (ИПД) и дзета-потенциалам (ζ), используя методы динамического рассеяния света (ДРС) (табл. 1).
4
2
Протокол трансфекции в клетках ЖМСК и КММСК. Для трансфекции ЖМСК и КММСК высевают в количестве 1,25×10 клеток/см в 24-луночные планшеты. Через 24 ч инкубирования культуральную среду замещают свежей средой Opti-MEM без добавок. Получают 100 мкл липоплексов или рПЭИ-комплексов, содержащих 20 пг/клетку хмРНК (т.е. хмРНК люциферазы Metridia (MetLuc - Metridia luciferase), улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP - Enhanced green fluorescent protein) или tomato) по приведенному выше описанию и добавляют к клеткам. Через 5 после трансфекции среду замещают полноценной средой DMEM. Клетки дополнительно культивируют в стандартных условиях на протяжении до 10 суток до оценки результатов. Для дальнейшего повышения эффективности трансфекции SO-Mag6-115 МНЧ связывают с реагентом для липидной трансфекции и хмРНК в магнитные SO-Mag6-115 частицы/DF-Gold/xМРНК липоплексы при соотношении железа массы/объема/массы 0,5:4:1 согласно описанному выше. Для трансфекции 100 мкл магнитных липоплексов, содержащих 20 пг хмРНК/клетку (т.е. хмРНК MetLuc, eGFP или tomato) вносят в культуру клеток ЖМСК или КММСК и применяют магнитное поле путем помещения планшета с культурой клеток на 24-луночный магнитный планшет на 30 мин. Затем магнитный планшет удаляют и трансфекцию заканчивают. Все трансфекции на протяжении всего исследования проводят в трех повторах. Для количественного описания эффекта магнитофекции на эффективность трансфекции рассчитывают MAI следующим образом:
где AUC означает величину области под кривой для кинетики экспрессии целевого белка (MetLuc и чКМБ-2) после магнитофекции (MF) и липофекции (LF), соответственно.
Одна из задач исследования заключается в сравнении ЖМСК и КММСК в терминах эффективности трансфекции. Для этого выбирают соотношения объема-к-массе для реагентов для трансфекции к мРНК по инструкциям производителя равными для обоих тиов клеток. Однако, оптимизацию протокола проведения трансфекции проводят дополнительно для обоих типов клеток, используя соотношение DF-Gold/хмРНК от 0,5 до 5 мкл реагента для трансфекции на мкг нуклеиновой кислоты в дозах 2,5, 5, 10 и 20 пг/клетку. См. подробности на фиг 10-12 и в соответствующих разделах примеров.
2
max
Оценка активности люциферазы Metridia в трансфецированных клетках. Люцифераза Metridia катализирует окисление целентеразина для получения целентерамида, СО и света (λ 480 нм). Основываясь на этой реакции, целентеразин может быть применен в качестве субстрата для определения многих секретируемых люцифераз (Inouye, Protein Expr Purif 88(1), 2013, 150-156). В настоящем изобретении применяют нативный целентеразин (фирма Synchem OHG, Felsberg, Германия) для оценки активности MetLuc. Вкратце, равные объемы по 50 мкл супернатанта (полученного от трансфецированных клеток через 5 ч, 1, 2, 3, 5 и 7 суток после трансфекции) и раствора целентеразина (50 мкМ в дегазированном буфере фосфата натрия при рН 7,0) перемешивают в белых непрозрачных 96-луночных планшетах. Интенсивность люминесценции измеряют в световых единицах на единицу времени или в относительных световых единицах (relative light units - RLU) при комнатной температуре, используя лабораторный счетчик Wallac Victor 1420 multilabel counter (фирма PerkinElmer, Массачусетс, США). Все образцы измеряют в трех повторах. Активность MetLuc выражают в нормализованных относительных световых единицах, рассчитываемых по следующему уравнению:
Нормализованные
1
2
где RLU являются значениями, полученными на приборе, V соответствует объему супернатанта, отобранного для измерения, и V означает общий объем супернатанта в мл.
Клетки, положительные по улучшенному зеленому флуоресцирующему белку (Enhanced Green Fluorescent Protein - eGFP). Для оценки эффективности трансфекции в процентах eGFP-положительных клеток, трансфецированные клетки хмРНК eGFP исследуют методом жидкостной цитометрии. Для этого через 24 ч после трансфекции клетки дважды промывают DPBS и отсоединяют с помощью 100 мкл аккутазы на лунку 24-луночного планшета. Затем планшет с культурой клеток центрифугируют в режиме 500 g в течение 10 мин и клетки ресуспендируют в DPBS (2% ФСБ). Анализ методом жидкостной цитометрии проводят на анализаторе MACSQuant Analyzer (фирма Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Германия), накапливая, по меньшей мере, 5000 событий на образец.
Клетки, экспрессирующие улучшенный зеленый флуоресцирующий белок и tomato. ЖМСК и КММСК, трансфецированные хмРНК eGFP и tomato визуализируют через 24 ч после трансфекции с помощью флуоресцентного микроскопа (Biorevo BZ9000, фирма Keyence, Осака, Япония).
Скрининг цитотоксичности комплексов химически модифицированной мРНК. Скрининг цитотоксичности осуществляют путем трансфекции ЖМСК разными MetLuc хмРНК комплексами с последующим анализом респираторной активности клеток (жизнеспособности) через 5 и 24 ч после трансфекции, используя стандартный анализ MTS, выполняемый в трех повторах по инструкциям производителя (CellTiter 96, фирма Promega, Висконсин, США). Подробности эксперимента описаны в настоящем изобретении.
Выработка КМБ-2 трансфецированными клетками. Описанные выше протоколы по липофекции и магнитофекции применяют для доставки чКМБ-2 хмРНК в ЖМСК. Трансфекции проводят, используя 20 или 32 пг чКМБ-2 хмРНК/клетку. В определенные временные точки уровни секретируемого и ассоциированного с клетками КМБ-2 человека определяют в супернатантах и клеточных лизатах, соответственно, методом ферментсвязанного иммуносорбентного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA, Quantikine, фирма R&D Systems, Миннесота, США) по инструкциям призводителя. Поглощение измеряют при 450 нм, используя лабораторный счетчик Wallac Victor 1420 multilabel counter (фирма PerkinElmer, Массачусетс, США). Коррекцию длины волны устанавливают при 570 нм. Эксперименты проводят в трех повторах, и определяют концентрацию белка, используя стандартную кривую (диапазон: 0-4000 пг/мл чКМБ-2).
Кроме того, клетки также трансфецируют в присутствии остеогенной среды (т.е. 2% ФСБ, 10 мМ β-глицерофосфата, 200 мкМ аскорбиновой кислоты). Остеогенную среду приготавливают без дексаметазона. Так, значимую информацию можно получить относительно остеогенной способности высвобождаемого клетками чКМБ-2 в последующих экспрериментах.
Трансфекция хмРНК чКМБ-2 в первичную ткань человека. Трансфекцию эксплантатов проводят по протоколу, ранее описанному Evans (2009, см. выше), с незначительными модификациями. Вкратце, промытые диски жировой ткани человека помещают в 48-луночные планшеты и трансфецируют 5 мкг хмРНК чКМБ-2 или хмРНК tomato, используя липоплексы DF-Gold (4 мкл DF-Gold/1 мкг хмРНК). По 80 мкл суспензии, содержащей комплексы, непосредственно наносят шприцом на диски ткани. Планшеты возвращают в инкубатор на 1 ч. Затем 500 мкл свежей без добавок среды Opti-MEM вносят в каждую лунку, содержащую трансфецированные трансплантаты, и инкубируют в течение дополнительных 5 ч. Затем культуральную среду заменяют остеогенной средой и эксплантаты дополнительно культивируют согласно описанному ранее в течение 3 и 7 суток. Все трансфекции тканевых трансплантатов проводят на свежей выделенной ткани в стерильных условиях. Диски жировой ткани, трансфецированные хмРНК tomato, визуализируют через 24 ч после трансфекции с помощью флуоресцентного микроскопа (Biorevo BZ9000, фирма Keyence, Osaka, Япония).
Остеогенез in vitro. ЖМСК, трансфецированные хмРНК чКМБ-2, культивируют при остеогенной стимуляции для оценки способности хмРНК чКМБ-2 индуцировать остеогенез in vitro. Оба метода, липофекции и магнитофекции, применяют для переноса хмРНК чКМБ-2 в клетки, что было описано ранее. Через 5 ч после трансфекции среду заменяют остеогенной средой без дексаметазона. Трансфецированные клетки поддерживают в остеогенной среде на протяжении до 21 суток и частичную замену среды проводят каждые трое суток (т.е. половину объема заменяют свежей остеогенной средой). Нетрансфецированные клетки, культивируемые в тех же условиях, применяют в качестве контроля. После остеогенеза in vitro оценивают экспрессию связанных с костями генов и наличие минерализации.
Активность щелочной фосфатазы (Alkaline phosphatase - ALP). Активность щелочной фосфатазы оценивают на 3, 7 и 12 сутки после трансфекции. Для этой цели применяют колориметрическое исследование с использованием щелочной фосфатазы (abhvf Abcam, Кэмбридж, Великобритания) по инструкциям производителя.
Метод исследования основан на применении о-нитрофенилфосфата (p-nitrophenyl phosphate -pNPP) в качестве субстрата для фосфатазы. pNPP дефосфорилируют в присутствии ALP. В результате формируется соединение желтого цвета p-нитрофенол (p-nitrophenol - pNP), которое отличается максимальной абсорбцией при 405 нм. Исследование ALP осуществляют по инструкциям производителя. Вкратце, трансфецированные клетки дважды промывают DPBS и затем инкубируют с буфером для исследования в течение 20 мин при комнатной температуре. После тщательной гомогенизации клеток монослоя образцы центрифугируют для удаления нерастворимого материала. Раствор pNPP добавляют к образцам, инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин и защищают от света. Выработку pNP определяют путем измерения поглощения света при 405 нм, используя многоканальный счетчик согласно ранее описанному выше. Содержание pNP рассчитывают по стандартной кривой. Во всех случаях проводят оценку по трем повторам.
Кроме того, в фиксированных клетках окрашивают ALP путем инкубирования с окрашивающей смесью соли быстрого голубого В и нафтола AS-MX фосфата (Сох, J Histochem Cytochem 47(11), 1999, 1443-1456) в течение 30 мин при 37°С. Окрашивающий раствор отмывают с помощью DPBS и клетки анализируют под микроскопом. Участки, окрашенные в пурпурный цвет, рассматривают в качестве положительных.
Количественная полимеразная цепная реакция реального времени (РВ-ПЦР). На 3, 7, 14 и 21 сутки после трансфекции хмРНК чКМБ-2 клетки дважды промывают DPBS и затем лизируют TRIzol (фирма Life technology. Калифорния, США). Суммарную РНК выделяют методом с применением фенола/хлороформа. Концентрацию РНК и ее чистоту определяют спектрофотометрически, используя спектрофотометр BioPhotometer plus UV (фирма Eppendorf AG, Hamburg, Германия). Первую цепь кДНК получают обратной транскрипцией из суммарной РНК с помощью набора First Strand cDNA Synthesis Kit (фирма Thermo Scientific, Массачусетс, США) по инструкциям производителя. Экспрессию связанных с костями генов определяют с помощью реального времени количественной обратной полимеразной цепной реакции (РВ-ПЦР). Праймеры амплификации перечислены в табл. 2. Применяют реагент SsoFast Eva Green Supermix (фирма Bio-Rad Laboratories Inc., Калифорния, США) и осуществляют РВ-ПЦР на приборе Bio-Rad CFX96 thermal cycler (фирма Bio-Rad Laboratories Inc., Калифорния, США).
В случае трансфецированной жировой ткани суммарную РНК экстрагируют через 3 и 7 суток после трансфекции. Промытые ткани помещают в реагент РНКlater (фирма Qiagen GmbH, Hilden, Германия) по инструкциям производителя. Перед экстракцией РНК ткани гомогенизируют в TRIzol с помощью ручного гомогенизатора (РТ1200Е Polytron, фирма Kinematica GmbH, Eschbach, Германия). Экстракцию РНК, синтез кДНК и РВ-ПЦР проводят, используя те же протоколы, которые указаны выше для клеток. Анализируют уровни экспрессии чКМБ-2, RunX2, ALP и Coll I. Праймеры для амплификации перечислены в табл. 3.
D качестве контрольного гена везде был выбран ген бета-тубулина. Данные выражают в виде кратности индукции при сравнении с контролями, т.е. клетками и тканями, не подвергшимися трансфекции, соответственно.
Окрашивание ализарином красным и количественная оценка. После трансфекции на 14 и 21 сутки окрашивание ализарином красным проводят для оценки отложений кальция в клетках, трансфецированных комплексом хмРНК чКМБ-2. Такие отложения кальция могут быть индикаторами дифференциации при остеогенезе ЖМСК. Вкратце, фиксированные этанолом клетки инкубируют с раствором ализарина красного (5 мг/мл в DPBS) в течение 15 мин при комнатной температуре. Окрашенные клетки активно промывают для удаления неспецифического окрашивания и/или возможных осадков. Минерализованные узелки и отложения кальция окрашиваются и выглядят в виде красных пятен, указывающих на остеогенез. Краситель ализарин красный затем экстрагируют 100 мМ цетилпиридинием хлоридом при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем измеряют поглощение при 570 нм. Эксперименты проводят в трех повторах, и результаты излагают в сравнении с контрольными клетками, не подвергшимися трансфекции.
Статистический анализ. Все полученные величины представляют в среднем значении ± стандартное отклонение. Статистический анализ выполняют, используя программное обеспечение GraphPad Prism version 6.00 (фирма GraphPad Software, Калифорния, США). Нормальное распределение данных исследуют методом Shapiro-Wilk. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим применением критерия Тьюки для множественного сравнения применяют для анализа экспрессии MetLuc в трансфецированных клетках при использовании разных реагентов для проведения трансфекции (фиг. 2А) и результатов жидкостной цитометрии (фиг. 3В). Также применяют критерий Стьюдента при анализе двух независимых образцов. Сатистический анализ проводят в соответствии с рекомендациями используемых компьютерных программ. Вероятность p<0,05 рассматривают в качестве существенной. Площадь под кривой (Area under the curve - AUC) рассчитывают, используя программное обеспечение Origin Pro 9G (Microcall software; фирма OriginLab Corp, Массачусетс, США).
Выработка химически модифицированных мРНК. Получают хмРНК, кодирующие eGFP, Tomato, MetLuc и КМБ-2 человека, используя опубликованный протокол (Kormann, см. выше). Размер молекул и качество полученных хмРНК анализируют электрофорезом в агарозном геле (фиг. 1). Могут быть определены все хмРНК ожидаемого размера и без признаков разрушения (нет размазывания) или без дополнительных побочных продуктов (без дополнительных полос неустановленного размера).
Метод MTS. Монослой клеток обрабатывают 200 мкл/лунку раствора реагента MTS (соотношение 5:1 в MEM без сыворотки и без фенолового красного) и инкубируют в течение 3 ч в стандартных условиях культивирования при изоляции от света. Из каждой лунки 100 мкл среды переносят в 96-луночный планшет и определяют поглощение при 490 нм, используя лабораторный счетчик Wallac Victor 1420 multilabel counter (фирма PerkinElmer, Массачусетс, США). Латексный каучук применяют для индукции гибели клеток (положительный контроль) (Balmayor, 2013, см. выше). Необработанные клетки применяют в качестве отрицательного контроля (т.е. 100% выживание клеток).
Составы хмРНК для тестирования in vivo.
С12-(2-3-2)/хмРНК липоидные составы. Катионный липид (обозначаемый «С12-(2-3-2)») получают перемешиванием 100 мг N,N'-бис(2-амноэтил)-1,3-пропандиамин (0,623 мМ) with 575,07 мг 1,2-эпоксидодекан (3,12 мМ, (N-1) эквивалент где N означает 2× количество первичного амина плюс 1× количество вторичного амина на олиго(алкиленамин)) и перемешивают в течение 96 ч при 80°С в постоянном режиме. Липоидные частицы перерабатывают, используя катионный липид С12-(2-3-2), хэлперные липиды DOPE и холестерин и ПЭГ-липид DMPE-PEG 2k в мольных соотношениях 8:5,29:4,41:0,88. Вкратце, должные объемы маточного раствора каждого липида комбинируют в абсолютном этаноле для достижения концентраций 50, 20, 20 и 20 мг/мл, соответственно. Итоговый раствор доводят до 200 мкл. Формирование липосом достигают быстрой заменой растворителя. Затем 200 мкл смеси липосом смешивают с 800 мкл хмРНК (т.е. хмРНК чКМБ-2 или хмРНК FFL) в цитратном буфере. В итоге концентрацию хмРНК фиксируют на величине 200 мкг/мл при соотношении N/P равном 17. Через 30 мин инкубирования при комнатной температуре липоплексы диализируют против воды в течение ночи.
Сгустки фибрина, содержащие С12-(2-3-2)/хмРНК липоиды для тестирования in vivo. Сгустки фибрина, содержащие комплексы С12-(2-3-2)/хмРНК, получают непосредственно перед имплантацией. Для этого комплексы С12-(2-3-2)/хмРНК чКМБ-2 и С12-(2-3-2)/хмРНК FFL, оба содержащие 2,5 мкг хмРНК, независимо перемешивают с 50 мкл фибриногена (3000 KIU/мл, набор Tissucol, фирма Baxter, Unterschleiβheim, Германия) и лиофилизируют. Порошок фибриногена-хмРНК регидратируют стерильной водой за 30 мин до начала хирургической процедуры. После полной гомогенизации фибриноген-С12-(2-3-2)/хмРНК перемешивают с 50 мкл тромбина (4 ЕД/мл, набор Tissucol, фирма Baxter, Unterschleiβheim, Германия) и допускают сворачивание в течение 2 мин. В качестве контроля сгусток фибрина получают, следую описанной выше процедуре, но при полном отсутствии хмРНК.
Дефект некритического размера: применение хмРНК чКМБ-2 - для тестирования in vivo. В стерильных условиях вызывают транскортикальное повреждение кости размером 3 мм. Повреждение костей производят с двух сторон в середине диафиза бедренной кости у 18 самцов крыс Sprague-Dawley (фирма Charles River Laboratories, Suizfeld, Германия). Крыс массой от 650 до 750 г рандомизируют и делят на три группы (по 6 животных в группе): фибрин (т.е. контрольная группа); фибрин + 2,5 мкг хмРНК FFL и фибрин + 2,5 мкг хмРНК чКМБ-2.
Анестезию производят внутримышечной инъекцией смеси 110 мг/кг кетамина (кетанест S, 25 мг/мл, фирма Pfizer, Karlsruhe, Германия) и 12 мг/кг ксилазина (ромпун, 20 мг/мл, Bayer, Leverkusen, Германия). Просверливают отверстие 3 мм в середине ствола бедренной кости и орошают 0,9% раствором хлорида натрия (фирма B-Braun, Melsungen, Германия). В соответствии с группами, повреждение кости заполняют 100 мкл фибриновых сгустков, получаемых непосредственно перед имплантацией. Таким образом, сгустки переносят из эппендорфов с помощью щипцов и помещают в повреждение кости, полностью его закрывая.
Крысы получают анальгетик карпрофен (римадил, фирма Pfizer, Карлсруэ, Германия) (4 мг/кг) подкожно раз в сутки в течение 4 суток.
Через две недели после хирургического вмешательства крыс умерщвляют под общей анестезией с помощью большой дозы пентобарбитала (120 мг/кг, Eutha77, фирма Essex Pharma, Hamburg, Германия) инъекцией в сердце. Бедренные кости отделяют и хранят в растворе формалина (нейтрально забуференного, 10%, фирма Sigma-Aldrich, МО, США) в течение 24 ч. Затем образцы переносят в 80% этанол до последующей обработки.
Метод микрокомпьютерной томографии для тестирования in vivo. Все эксплантированные бедра исследуют методом микрокомпьютерной томографии (Micro Computer Tomography analysis - μСТ) (μСТ 40; фирма Scanco Medical AG, Bassersdorf, Швейцария). Используют следующие настройки для измерений. Приращение устанавливают на 157 мкм с углом 0°. Размер векселей изображений устанавливают на 8000 мкм при общем количестве срезов 665. Следовательно, каждый образец исследуют с общим интервалом 5,32 мм в продольном направлении. Время интегрирования пучка устанавливают на максимум 300 мсек и получают три комплекта данных для каждой точки измерения (среднюю величину этих значений применяют для последующих расчетов). Оборудование для μСТ калибруют один раз в неделю с помощью гидроксиапатитового фантома.
Структуры минерализованных костей и трабекулярных каллюсов анализируют с помощью алгоритма 3D-сегментации с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальный институт здоровья, Мэриленд, США). Данные μСТ переносят в 3D-слой, установленный плагином KHK_microCT, любезно предоставленный профессором Karl Heinz Kunzelmann (Департамент оперативной/восстановительной стоматологии. Университет Людвига-Максимилиана, Мюнхен, Германия). Для разделения уровней плотности минерализованной кости и каллюса вводят порог изображения в градациях серого в интервале значений 2500-4500 для двух интервалов плотности, которые исследуют. Другой плагин под названием BoneJ затем используют для 3D-изображения и количественной оценки структуры каллюса. Единственное числовое значение, которое было учтено, это объем кости (BV) для сравнения количества вновь образованного каллюса каждого образца. Количество автоматически переводят в метрические величины с помощью плагина KHK_microCT, указанного выше. Подробные 3D-изображения структуры каллюса получают с помощью встроенного плагина, обозначаемого «3D-viewer».
Пример 2. Оптимизация соотношения DF-Gold-к-мРНК для трансфекции в ЖМСК и КММСК.
Для дальнейшей оптимизации протокола трансфекции ЖМСК и КММСК с использованием липоплексов мРНК с DF-Gold рассматривают различные параметры. Соотношение объем/масса DF-Gold-к-мРНК исследуют от 0,5 до 5 мкл энхансера на мкг нуклеиновой кислоты при дозах 2,5, 5, 10 и 20 пг/клетку. Результаты показаны на фиг. 10 и 11. Для обоих типов клеток устанавливают оптимальную дозу 20 пг мРНК/клетку. Кроме того, устанавливают, что наилучшими количествами применяемого энхансера являются 5 мкл DF-Gold/мкг мРНК для ЖМСК и 2 мкл DF-Gold/мкг мРНК для КММСК.
Пример 3. Эффективная доставка хмРНК в стволовые клетки с помощью липо- и магнитофекции.
Во-первых, исследуют эффективность различных реагентов для трансфекции хмРНК жировых стволовых клеток, производных жировой ткани (ЖМСК). На фиг. 2А показывают кинетику экспрессии люциферазы Metridia в течение до 120 часов после трансфекции. Для всех тестируемых реагентов максимальную экспрессию получают через 24 часа после трансфекции. Наименее эффективным реагентом среди всех является рПЭИ, и не наблюдают существенной экспрессии с рПЭИ для какой-либо из измеренных временных точек (р>0,05). Различные реагенты на основе липидов различаются при кинетике экспрессии MetLuc. Хотя наблюдают наивысшую экспрессию с Lipofectamine2000 через 24 ч (р<0,0001), ее протяженность самая краткая с низкой активностью MetLuc через 48 часов или в последующий период. С другой стороны, DreamFect Gold (DF-Gold) и Dogtor, хотя и несколько менее эффективны в течение 24 часов по сравнению с Lipofectamine2000, поддерживают экспрессию MetLuc до 120 ч. Помимо эффективности трансфекции, также тестируют цитотоксичность различных реагентов для трансфекции в отношении ЖМСК. Комплексы MetLuc хмРНК с Lipofectamine2000 наиболее токсичны в отношении жизнеспособности клеток, уменьшаются до менее чем 75% в течение 5 ч (фиг. 2Б). Комплексы DF-Gold и рПЭИ приводят к умеренной цитотоксичности с более чем 80% жизнеспособностью клеток в обеих измеренных временных точках. Не наблюдают статистически значимой разницы между жизнеспособностью клеток DF-Gold-трансфецированных клеток и нетрансфецированного контроля через 24 часа после трансфекции (р=0,06).
Исходя из потребности в более длительной трансгенной экспрессии (до 120 ч после трансфекции) и низкой токсичности, отбирают DF-Gold для трансфекции хмРНК в мезенхимальные стволовые клетки (ЖМСК и КММСК). Дозу хмРНК на клетку оптимизируют для клеток обоих типов. В результате получают в качестве оптимальной дозы для трансфекции 20 пг/клетку. Данные представлены на фиг. 10 и фиг. 11. Соотношение объем/масса DF-Gold-к-хмРНК устанавливают равным 4 (по инструкциям производителя) в течение более точного сравнения между ЖМСК и КММСК. Тем не менее, это соотношение также усовершенствуют для обоих типов клеток. Результаты показывают соотношение объем/масса 5 для ЖМСК и 2 для КММСК (фиг. 10 и фиг. 11).
Поскольку плазмидную ДНК (пДНК) обычно используют в качестве невирусного вектора для генной трансфекции, после трансфекции экспрессию MetLuc сравнивают либо с хмРНК MetLuc, либо с ее плазмидным аналогом (pVAXA120-MetLuc). Несмотря на то, что создается впечатление о повышенной экспрессии через 24 ч после липофекции клеток пДНК, начиная с 48 ч до конца времени наблюдения 120 ч, в этом контексте экспрессия хмРНК сохраняется на высоком уровне по сравнению с пДНК, содержание которой резко снижается. Не опираясь на какую-либо теорию, устойчивая экспрессия может быть доказательством лучшей защиты мРНК от разрушения и показателем стабилизации хмРНК, например, из-за соответствующих липоплексов, используемых в соответствии с изобретением (например, DF-GoldTM/хмРНК).
пДНК
хмРНК
8
8
Сравнивают эффективность экспрессию целевого белка после липофекции пДНК и хмРНК, кодирующих MetLuc (фиг. 2В). Через 24 ч после трансфекции, эффективность трансфекции почти в два раза выше для пДНКА-трансфецированных ЖМСК (р=0,005). Однако через 48 часов и 120 часов после трансфекции уровни экспрессии MetLuc существенно выше для клеток, трансфецированных хмРНК (р=0,0002) и остаются существенно выше до 120 часов после трансфекции (р=0,007). Области под кривыми «пДНК» и «хмРНК», AUC=1,71×10 (нормализованные RLU×ч) и AUC=1,68×10 (нормализованные RLU×ч), рассчитанные путем интеграции данных между нулем и 120 ч, показывают, что доставка хмРНК может привести к «биодоступности» белка-мишени, подобно той, которую достигают после доставки пДНК.
Для дальнейшего повышения эффективности трансфекции хмРНК применяют магнитофекцию. Для этой цели используют ПЭИ-декорированные магнитные наночастицы с сердцевиной из оксида железа с покрытием из диоксида кремния (т.е. SO Mag6-115). Наночастицам SO-Mag6-115 свойственен гидродинамический диаметр примерно 96±14 нм и высокоположительный дзета-потенциал 34±3 мВ. Магнитные наночастицы оказались стабильными в водной суспензии, что можно наблюдать визуально. Не наблюдают выпадения осадка в воде, 150 мМ NaCl или клеточной культуральной среде. Кроме того, наночастицы дают четкий ответ на внешнее приложение магнитного поля.
В экспериментах по магнитофекции КММСК трансфецируют при параллельном контроле с применением ЖМСК. Магнитофекция показывает существенное повышение эффективности трансфекции для клеток обоих типлв по сравнению с липофекцией (фиг. 3). Методом жидкостной цитометрии показано, что среди eGFP-трансфецированных клеток через 24 ч после трансфекции положительных клеток установлено 59,7% (ЖМСК) и 73,2% (КММСК) (фиг. 3В). Напротив, только 37,5% (ЖМСК) и 38,9% (КММСК) становятся положительными по eGFP при использовании метода липофекции (т.е. DF-Gold в качестве трансфецирующего реагента). Типичные гистограммы представлены на фиг. 12. Данные, полученные методом жидкостной цитометрии, соответствуют данным, полученным флуоресцентной микроскопией при использовании MetLuc (фиг. 3А, Б и Г). На фиг. 3А четко показывают повышенный процент трансфецированных КММСК, экспрессирующих белок tomato при применении магнитофекции для переноса хмРНК tomato в клетки. Аналогичные закономерности наблюдают после доставки хмРНК, кодирующей eGFP, по анализу изображений флуоресцентной микроскопии ЖМСК и КММСК, экспрессирующих eGFP (фиг. 3Б). Сходным образом, фиг. 3Г показывает существенно большую экспрессию MetLuc через 24 ч после трансляции обоих типов клеток, ЖМСК и КММСК, трансфецированных хмРНК MetLuc методом магнитофекции (р<0,0001).
Установлено, что очевидно более выраженный эффект магнитофекции в отношении КММСК. На фиг. 3Г показаны индексы эффективности магнитофекции (MAI) для обоих типов клеток. Установлено увеличение MAI в 4,4 и в 2,4 раза по активности MetLuc для КММСК и ЖМСК, соответственно. Эти данные свидетельствуют о существенном повышении экспрессии белка в клетках МСК обоих типов при использовании магнитофекции.
Пример 4. Повышенная секреция чКМБ-2 трансфецированными стволовыми клетками.
Трансфекцию хмРНК чКМБ-2 осуществляют в среде Opti-MEM, а также в присутствии остеогенной среды из-за важности остеогенных условий в последующих экспериментах. Интересно, что трансфекция в среде Opti-MEM с последующей ее заменой через 5 ч на остеогенную среду, как представляется, не влияет на эффективность трансфекции (фиг. 4А). Наблюдают существенно сниженную экспрессию чКМБ-2, когда трансфекцию осуществляют в присутствии остеогенной среды (р<0,05). На фиг. 4Б показывают содержание секретированного и ассоциированного с клетками чКМБ-2, определенного количественно в лизатах клеток и супернатантах трансфецированных клеток в разное время после трансфекции. Существенно более высокие уровни чКМБ-2 определяют в образцах от трансфецированных клеток по сравнению с контрольными нетрансфецированными клетками (р<0,001). Максимальную экспрессию чКМБ-2 наблюдают через 48 ч после трансфекции. Внутриклеточные уровни чКМБ-2 существенно снижаются через 48 ч (р=0,007). Несмотря на высокие внутриклеточные уровни чКМБ-2, трансфецированные ЖМСК секретируют существенно более высокие уровни чКМБ-2 до 7 суток после трансфекции (фиг. 4Б и В) (р=0,0008). На фиг. 4Б и 4В показывают уровни чКМБ-2 в образцах от магнитофецированных клеток. Общий выработанный клетками чКМБ-2 составляет примерно 700 пг/мкг хмРНК (фиг. 4В). Представляют 6-кратное увеличение индекса эффективности магнитофекции (MAI) по сравнению с уровнями чКМБ-2, достигаемыми после липофекции (фиг. 4В). Повышенные уровни чКМБ-2, наблюдаемые при магнитофекции, согласуются с повышенными эффективностями трансфекции и экспрессии, наблюдаемыми для хмРНК, кодирующих репортеры eGFP (фиг. 3Б, фиг. 12), MetLuc (фиг. 3Г) и Tomato (фиг. 3А). Стоит отметить то обстоятельство, что внутриклеточные уровни чКМБ-2 в трансфецированных клетках также значительно увеличены при использовании магнитофекции (р<0,0003). На фиг. 4Б показано, что внутриклеточное количество чКМБ-2 почти такое же, что и секретированный чКМБ-2 через 24 ч после трансфекции (р=0,8). По истечении этого времени трансфецированные клетки способны выделять значительно более высокие количества чКМБ-2 по сравнению с уровнями, определенными количественно в клеточном лизате (р<0,001).
Пример 5. Доставка хмРНК чКМБ-2 индуцирует in vitro остеогенез в ЖМСК.
В качестве первого признака остеогенеза in vitro рассматривают активность щелочной фосфатазы (ALP) в чКМБ-2-трансфецированных ЖМСК. Через 12 суток после переноса хмРНК чКМБ-2 наблюдают повышенную экспрессию ALP в трансфецированных клетках (фиг. 5А и Б). Подсчет активности ALP показывает, что существенное повышение возникает к седьмым суткам и сохраняется до 12 суток в трансфецированных клетках при сравнении с контрольными группами (фиг. 5Б, р<0,01).
Затем в разное время подсчитывают степень экспрессии генов, связанных с остеогенезом, методом полимеразной цепной реакции реального времени (РВ-ПЦР) (фиг. 5В-З). В обеих группах (липофекции и магнитофекции) отмечают повышение экспрессии RunX2, Osterix, ALP, Coll I, остеопонтина и остеокальцина на протяжении некоторого времени по сравнению с группой нетрансфецированных клеток. Интересно отметить, что экспрессия RunX2, ALP и OPN существенно выше в группе магнитофекции при сравнении с группой липофекции на 14 сутки после трансфекции. Особенно в случае OPN, магнитофекция приводит к постоянно высокой экспрессии после 14 суток. С другой стороны, наблюдают снижение экспрессии RunX2 только после 14 суток в группе магнитофекции.
Окрашивание азарином красным (фиг. 6Б и В) показывает, что количество кальцинированных узелков в группах трансфецированных клеток очевидно выше, чем у нетрансфецированных клеток (фиг. 6А). Кроме того, после липофекции окрашивание очевидно более интенсивное при пониженной дозе хмРНК чКМБ-2 (т.е. 20 пг/клетку, фиг. 6В). Это соответствует оптимизированной дозе, установленной путем экспериментов по титрованию с применением хмРНК MetLuc (фиг. 10). При повышенной дозе 32 пг/клетку минерализация заметно слабее (фиг. В справа). Однако она становится сильнее, когда применяют магнитофекцию для передачи хмРНК (фиг. 6Б).
Количественный анализ с окрашиванием ализарином красным подтверждает эти результаты. На фиг. 6Г показана существенно большая минерализация в группе с меньшей дозой (20 пг/клетку) по сравнению с повышенной дозой (32 пг/клетку) при применении липоплексов (p<0,0001). Со временем минерализация повышается по мере культивирования в клетках, трансфецированных 20 пг хмРНК чКМБ-2. С помощью применения магнитофекции в группе повышенного дозирования выявляют существенно большую минерализацию (р=0,04 в течение 14 суток и р=0,007 в течение 21 суток, фиг. 6Г). Более того, это четко отмечают уже через 14 суток после трансфекции.
Пример 6. Трансфекция жировой ткани человека индуцирует генную экспрессию in vitro.
Жировую ткань челоевка трансфецируют хмРНК DF-Gold /tomato N1 или комплексами хмРНК DF-Gold /чКМБ-2. На фиг. 7А показано, что большое число клеток в дисках жировой ткани становятся tomato N1-положительными после трансфекции. Для чКМБ-2-трансфецированных дисков РВ-ПЦР показывает 4-кратное превышение экспрессии чКМБ-2 в трансфецированной ткани по сравнению с необработанными эксплантами (фиг.7Б). Кроме того, повышение экспрессии генов, связанных с костями, например, RunX2, Osterix и Coll I, четко наблюдают в трансфецированной ткани, культивируемой в остеогенных условиях, по сравнению с контролями. В случае ALP и Coll I их экспрессия увеличивается значительно, начиная с 3 суток до 7 суток после трансфекции (р<0,001).
Пример 7. В течение двух недель in vivo хмРНК КМБ-2 примерно удваивает формирование костей.
На фиг. 13А-В показывают μСТ 3D-реконструкцию и продольные срезы для всех исследуемых групп через 2 недели обработки. Признак формирования новой кости можно наблюдаться в срезах μСТ группы С12-(2-3-2)/хмРНК чКМБ-2. Напротив, в группах фибрина или С12-(2-3-2)/хмРНК FFL не наблюдают признаков нового формирования кости. Эту модель применяют для определения влияния хмРНК чКМБ-2 в процессе самопроизвольного лечения костей. На фиг. 13Г показывают результаты количественного анализа количества формирования каллюса для всех групп. Такие данные μСТ показывают существенное повышение формирования каллюса через 2 недели у животных, обработанных фибрином, содержащим С12-(2-3-2)/хмРНК чКМБ-2 (р<0,05), при сравнении с контрольными групами. Нет существенного различия между группами применения фибрина и фибрин-содержащих С12-(2-3-2)/хмРНК FFL. В таких группах не наблюдают существенного формирования каллюса.
Полученные результаты μCT показывают терапевтический эффект хмРНК чКМБ-2 в лечении костей. У таких животных, обработанных хмРНК чКМБ-2, очевидно присутствует остеогенез. Напротив, у животных, обработанных неспецифической хмРНК (т.е. хмРНК FFL), не наблюдают остеогенеза. Отсюда следует, что хмРНК чКМБ опосредует терапевтическую экспрессию чКМБ-2 по месту дефекта кости, вызывая остеогенез.
Дополнительные материалы и методы (особенно относящиеся к примерам 8-14).
Материалы. Среда Игла, модифицированная по способу Дюльбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium - DMEM), альфа-минимальная среда основного состава (alpha Minimum essential medium - α-MEM), фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без кальция и магния (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium - DPBS), фетальная сыворотка теленка (Fetal Bovine Serum - FBS), пенициллин/стрептомицин (Penicillin/Streptomycin - P/S), 0,05% трипсин-EDTA и коллагеназа I и II типа от фирмы Gibco by фирма Life Technologies GmbH (Darmstadt, Германия).
Хэлперные липиды, включая 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) и холестерин, поставляет фирма Avanti Polar Lipids INC, (Алабама, США). Другие необходимые материалы для получения комплексов, например, этанол и 1,2-димиристоил-sn-глицерин, метоксиполиэтиленгликоль (DMG-PEG) 2 кДа, приобретают у фирмы CarlRoth (Карлсруэ, Германия) и фирмы Nof America Corporation (Нью-Йорк, США), соответственно. Коллагеновые губки с торговым названием «KOLLAGEN resorb™» приобретают у фирмы Resorba (, Германия). Другие реагенты и материалы приобретают у фирмы Sigma-Aldrich, если не указано иное.
Получение комплекса. Катионный липид С12-(2-3-2) (от фирмы Ethris GmbH, который также обозначают «С12 ЕРЕ») применяют в качестве трансфецирующего агента, не являющегося вирусом, наряду с DPPC и холестерином в качестве хэлперных липидов и DMG-PEG2k в качестве пэгилированного липида.
Комплексы РНК формируют при концентрации РНК 200 мкг/мл и соотношении N/P=8, которое означает мольное отношение аминогруппы липидов к фосфатной группе РНК. Комплексы индуцируют самосборкой путем быстрой инъекции этанового раствора липидной фазы внутрь водной фазы, содержащей хмРНК, используя инсулиновые шприцы, с последующим 15-секундным встряхиванием на шейкере vortex на высокой скорости и 30-минутным инкубированием при комнатной температуре. Синтезированные липоплексы диализируют против воды (бидистиллята), используя диализные кассеты, отсекающие вещества с молекулярной массой более 7 кДа (фирма Pierce, США), с одной заменой бидистиллята через 30 мин с последующим диализом в течение ночи.
Измерение размера частиц и дзета-потенциала. Размер частиц липоплексов измеряют методом лазерного рассеяния света, используя Zetasizer (фирма Malvern Instruments, Вустер, Великобритания). Прозрачную одноразовую кювету заполняют 750 мкл комплексов и осуществляют 30 и 300 измерений для определения размера частиц и оценки поверхностного заряда, соответственно.
Анализ люциферазы Metridia. Кинетику экспрессии репортерной мРНК люциферазы Metridia применяют для тестирования качества коллагеновых губок для устойчивой доставки мРНК. Для этого супернатант культуры клеток собирают каждые 24 ч после трансфекции и замещают новой средой. Собранные среды или немедленно обрабатывают для измерения, или замораживают при -20°С до последнего дня проведения эксперимента, чтобы измерить все образцы сразу. Для количественной оценки экспрессии Metluc по 80 мкл супернатанта аккуратно перемешивают, помещают в черные 96-луночные планшеты (фирма Costar, Нью-Йорк, США) с 30 мкл 0,05 мМ Coelenterazine (фирма Synchem, Felsberg, Германия) и измеряют, используя люминесцентный ридер (Wallac Victor, фирма Perkin-Elmer Life Sciences) в трех повторах.
2
2
Выделение и размножение мезенхимальных стволовых клеток крысы (МСК). Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга крысы (КММСК) приобретают у фирмы Ethris GmbH. Жировые мезенхимальные стволовые клетки (ЖМСК) выделяют из жировой ткани самца крысы. По данной методике жировые ткани разрезают на миллиметровые кусочки и переносят в пробирку фалькон (фирма Corning Inc., Нью-Йорк, США), содержащую стерильную среду DPBS, и промывают несколько раз DPBS. Затем кусочки жировой ткани инкубируют в растворе коллагеназы II типа (0,4 мг/мл) во влажной среде при 37°С в течение 30 мин. Затем активность коллагеназы останавливают добавлением полноценной культуральной среды DMEM (DMEM, содержащей 10 об. % FBS и 1 об. % пенициллина/стрептомицина), и смесь центрифугируют в режиме 600 g в течение 10 мин. Верхний слой жира собирают и ресуспендируют в полноценной культуральной среде DMEM. На следующей стадии суспензию клеток фильтруют через сито с размером пор 40 мкм (фирма Corning Inc., Нью-Йорк, США), высевают в колбу Т75cm (фирма Corning Inc., Нью-Йорк, США) и помещают во влажную среду при 37°С и 5% СО в полноценной среде DMEM [20]. Для удаления неприкрепившихся клеток среду заменяют на следующий день. Клетки размножают до плотности 1500-3000 клеток/см и среду заменяют каждые трое суток. В этом исследовании клетки применяют до 6 пересева.
2
Постановка эксперимента. Коллагеновые губки нарезают на маленькие кусочки (6 мм в диаметре), используя перфоратор (фирма VBS Lochzange, номер в каталоге 19970181). Кусочки помещают в стерильные плоскодонные лунки полипропиленового 96-луночного планшета без нанесенного покрытия (фирма Eppendorf, Гамбург, Германия). По 50 мкл липоплексов в сахарозе (2%) в качестве лиопротектора наносят по каплям на каждый кусочек и инкубируют в течение 90 мин при комнатной температуре, чтобы полностью пропитать губки. Нагруженные губки затем помещают в глубокий вакуум (фирма Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Германия) и высушивают, по меньшей мере, 2 ч при 0,05 мбар. После этого, на губки или высевают клетки, или губки высушивают в вакууме и хранят при комнатной температуре до использования. Если высевают клетки, то требуемую плотность клеток в 50 мкл полноценной среды (полноценной среды DMEM для клеток NIH3T3 и МСК) добавляют к каждой губке, после чего инкубируют 30 мин во влажной среде при 37°С и 5% СО. При инкубировании клетки следует высевать на коллагеновые губки таким образом, чтобы они не могли прикрепиться и расти в полипропиленовом планшете без покрытия. Затем по 200 мкл полноценной среды добавляют в лунки, после чего планшеты инкубируют в инкубаторе для культур клеток.
Всю процедуру проводят в стерильных условиях с использованием ламинарного колпака (фирма BDK Luft und reinraumtechnik GmbH, Sonnenbuhl-Genkingen, Германия). Кроме того, избегают пластиковых материалов из-за высокого электростатического заряда коллагеновых губок.
Эффективность переноса хмРНК. Методом FACS оценивают эффективность трансфекции хмРНК в системе 3D. Для этого каждую губку инкубируют с 300 ЕД/мл коллагеназы I типа в сбалансированном солевом растворе Хэнкса ( balanced salt solution - HBSS) с кальцием и магнием в течение от 4 до 7 ч. При инкубировании губки несколько раз осматривают, чтобы убедиться в полной утилизации коллагена. Клетки центрифугируют в режиме 5000 g в течение 5 мин, после чего промывают DPBS. На следующей стадии клетки инкубируют в течение 5 мин при 37°С с 10 мкл 0,05% трипсина-EDTA для повышения разобщения клеток. Разобщение клеток останавливают добавлением 90 мкл DPBS, содержащей 2% FBS, в каждую лунку.
Анализ методом FACS осуществляют, используя жидкостной цитометр Attune NxT (фирма Life technologies, Нью-Йорк, США). Перед каждым экспериментом проводят калибровку прибора, используя гранулы для калибровки (Molecular probes, фирма Life technologies, Нью-Йорк, США). Обрывки клеток удаляют, используя прямое и боковое пропускание. Клетки, не подвергшиеся трансфекции и выращенные в условиях 2D и 3D, используют в качестве отрицательных контролей для коррекции флуоресцентного канала для обнаружения флуоресценции eGFP. Данные, полученные в трех повторах, анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo_V10.
2
Определение гибели/выживания клеток. Жизнеспособность клеток оценивают, используя окрашивание пропидием иодидом и WST метод. Для обоих исследований применяют высушенные в вакууме коллагеновые губки, нагруженные разными дозами комплекса хмРНК eGFP. Высевают 10000 клеток NIH3T3 на губку в полноценной среде DMEM и инкубируют во влажных условиях при 37°С и 5% CO в течение 48 ч.
Для живого-мертвого окрашивания клетки подготавливают для анализа FACS в соответствии с описанным ранее. Затем в каждую лунку добавляют разведение 1:1000 исходного раствора с концентрацией 1 мг/мл раствора пропидия йодида непосредственно перед измерением.
Выживаемость клеток также оценивают с помощью анализа реакции WST в соответствии с инструкциями производителя (набор II для колориметрического определения жизнеспособности клеток (WST-1), фирма Promokine, Гейдельберг, Германия). Перед добавлением реагента WST супернатант отсасывают пипеткой и опять спускают в лунки трижды, чтобы получить гомогенизированный раствор из губок в каждой лунке. Затем 100 мкл супернатанта переносят в 96-луночный планшет новой культуры клеток (фирма Corning Inc., Нью-Йорк, США) для измерения. В качестве контроля используют супернатант из лунок с нетрансфецированными клетками. Абсорбцию измеряют при 450 нм с использованием лабораторного счетчика Wallac Victor multilabel counter (фирма Perkin-Elmer Life Sciences, Массачусетс, США) в трех повторах.
2
Секреция чКМБ-2 клетками МСК, культивируемыми на коллагеновых матриксах, нагруженных хмРНК-чКМБ-2. Образцы среды от МСК, трансфецированных разными дозами липоплексов хмРНК чКМБ-2, собирают через 24 ч после трансфекции и определяют концентрацию чКМБ-2 с помощью набора human BMP-2 ELISA по инструкциям производителя (фирма R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Эксперименты проводят в трех повторах и концентрацию белка определяют, используя стандартную кривую (r=0,99).
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) применяют для описания морфологии коллагеновых губок и для оценки нагруженных на них комплексов мРНК. На все образцы наносят золото и палладий в соотношении 60/40, используя установку для нанесения напылением (Edwards sputter coater S150B, фирма HHV Ltd, Западный Сассекс, Великобритания). Для СЭМ используют растровый электронный микроскоп Zeiss-Leo DSM 982 Gemini (фирма фирма FELMI-ZFE, Graz, Austria) при напряжении 1,2 кВ.
Окрашивание гематоксилином клеток, высеянных на коллагеновые губки. Через 24 ч после высева клеток NIH3T3 на коллагеновые губки, клетки фиксируют 4% формальдегидом в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), РН 7,4, в течение ночи при комнатной температуре. Затем коллагеновые губки обезвоживают и погружают в парафин. Из срезов толщиной 7 мкм удаляют парафин и срезы окрашивают гематоксилином по стандартным протоколам.
2
Выделение РНК и полимеразная цепная реакция реального времени (РВ-ПЦР). Через 7 и 14 суток после высева клеток на коллагеновые губки, нагруженные чКМБ-2, соответствующий объем коллагеназы I в сбалансированном солевом растворе Хэнкса вносят в каждую лунку для достижения конечной концентрации коллагеназы I типа 300 ЕД/мл. Затем планшеты инкубируют в течение от 4 до 7 ч во влажной атмосфере при 37°С и 5% CO. Затем коллагеновые губки полностью растворяют, клетки центрифугируют в режиме 500 g в течение 5 мин, супернатант удаляют и клетки лизируют реагентом TRIzol (Ambion, фирма life technologies, Darmstadt, Германия) для выделения суммарной РНК, следуя инструкциям производителя.
Концентрацию РНК и ее чистоту определяют с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000C (фирма Thermo Scientific, Делавэр, США). Обратной транскрипцией получают кДНК первой цепи с 450 нг суммарной РНК с помощью набора First Strand cDNA Synthesis Kit (фирма Thermo Scientific, Darmstadt, Германия) по инструкциям производителя. Для каждой из чКМБ-2-трансфецированных и нетрансфецированных групп применяют по 15 губок, и лизированные клетки объединяют для выделения РНК.
Для оценки экспрессии связанных с костями генов применяют Advanced Universal SYBR Green Supermix (фирма Bio-Rad, Мюнхен, Германия) для осуществления количественной ПЦР реального времени (n=3). ПЦР осуществляют на термоциклере Light Cycler 96 (фирма Roche, Mannheim, Германия). Уровни экспрессии целевых генов нормализуют по уровню экспрессии GAPDH (для клеток МС3Т3-Е1) и бета-тубулина (для МСК). Данные выражают в виде кратности индукции относительно контролей, т.е. нетрансфецированных клеток МС3Т3-Е1 в культуре 3D и нетрансфецированных клеток МСК в культуре 2D. Последовательности праймеров перечислены в направлении от 5' к 3':
Праймеры мыши для экспериментов по регенерации костей в клетках МС3Т3-Е1:
Праймеры крысы для экспериментов по регенерации костей в клетках МСК:
2
Дифференциация костей in vitro. На коллагеновые губки нагружают 3 мкг липоплексов мРНК чКМБ-2 в 2% сахарозе и высушивают в вакууме согласно ранее описанному. На следующей стадии 30000 свежевыделенных ЖМСК крысы в 50 мкл DMEM высевают на каждую коллагеновую губку и инкубируют в течение 30 мин при 37°С во влажной атмосфере 5% СО для надежного прикрепления клеток к коллагеновой губке. Затем 250 мкл остеогенной среды (DMEM + 2% FBS + 10 мМ β-глицерофосфат + 200 мкМ L-аскорбиновой кислоты + 1% пенициллина/стрептомицина) вносят в каждую лунку. Половину среды обновляют каждые 2-3 суток. Отрицательные контроли, включающие нетрансфецированные клетки в 3D (высеянные на коллагеновые губки) и 2D (высеянные в обычные колбы для культуры клеток) обрабатывают также как и трансфецированные клетки в 3D. На 7 и 14 сутки после высева у клеток исследуют экспрессию остеогенных маркеров методом РВ-ПЦР.
Дифференциация костей in vivo. Эксперименты по имплантации in vivo планируют в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals; National Research Council (US) Committee, National Academies Press (US), 2011). В общей сложности используют 9 крыс Sprague-Dawley (6-месячные самцы, средняя масса тела 600-700 г; фирма Janvier, Le Genest-St-Isles, Франция). У каждой крысы дефект бедренной кости левой ноги обрабатывают пустой коллагеновой губкой (отрицательный контроль), а дефект правой бедренной кости лечат губкой, нагруженной 2,5 мкг хмРНК чКМБ-2. Чтобы избежать инфекции и облегчить боль во время операции и после нее назначают обычные антибиотики и анальгетики, анестезируют, используя комбинацию медетонидила (Domitor, Orion pharma, Espoo, Finland; 135 мкг/кг), мидазолама (фирма Dormicum, Unterhaching, Германия; 2,5 мг/кг) и фентанила (фирма Duragesic, Beerse, Бельгия; 5 мкг/кг).
После бритья и дезинфекции небольшие мелкие разрезы кожи производят в боковой внешней области. Глубокий дефект кости производят в центральной части бедренной кости, используя сверло для костей с внешним диаметром 2 мм.
После внесения каркасов в места повреждений применяют поливиниловую мембрану для покрытия области имплантата для минимизирования способности к самовосстановлению надкостницы. В заключение наносят 4-0 викриловых шва для закрытия надкостницы и расположенной сверху кожи. Крыс скарифицируют через 2 недели, используя пентобарбитал натрия (Narcoren, фирма Merial GmbH, Hallbergmoos, Германия; 400 мг/кг) и образцы отбирают для μСТ и гистологического аналоза.
Анализ методом микрокомпьютерной томографии (μСТ). Для количественной оценки образования кости проводят трехмерную рентгеновскую микрокомпьютерную томографию (μСТ) с использованием томографа μСТ 40 (фирма Scanco Medical, Bassersdorf, Швейцария). Объем костей измеряют для сравнения количеств новообразованного каллюса каждого образца (дефекты, обработанные пустыми коллагеновыми губками, и дефекты, обработанные коллагеновыми губками, нагруженными хмРНК чКМБ-2).
Гистологическое исследование дефектов бедренной кости крысы. Качественные и морфологические признаки регенерации кости были исследуют с помощью гистологического препарата. Бедренные кости обезвоживают в серии градиентных растворов этанола от 40% до 100% и погружают в метакрилатную смолу (Technovit 7200, фирма Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Германия). Тонкие срезы (около 30 мкм) получают и окрашивают красителем Levai Laczko, после чего просматривают под световым микроскопом [Donath и Breuner, J. Oral Pathology (11), 1982, 318-326; Laczko и Levai (31), Mikroskopie, 1975, 1-4].
Статистический анализ. Статистический анализ осуществляют, используя GraphPad Prism version 6.05 для Windows (фирма GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния). Статистическую значимость определяют, используя t-критерий и множественный t-критерий. Вероятность р<0,05 рассматривают в качестве существенной.
Пример 8. Формирование дополнительного, альтернативного, комплекса хмРНК с С12-(2-3-2).
Катионный липид фирмы Ethris GmbH используют в качестве невирусного вектора для создания стабильного липоплекса с хмРНК на основе электростатического взаимодействия между положительными аминогруппами липида и отрицательных фосфатных групп хмРНК (Anderson, Human Gene Therapy 14, 2003, 191-202).
Чтобы стабилизировать структуру липоплекса и уменьшить утечку, липид Ethris снабжают двумя хэлперными липидами, называемыми 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолином (DPPC) и холестерином (Anderson, Drug Delivery 11, 2004, 33-39; Liang, Journal of Colliod and Interface Science 278, 2004, 53-62). В конце к липидной смеси добавляя 1,2-димиристоил-sn-глицерин, метоксиполиэтиленгликоль (DMG-PEG) 2 кДа, чтобы получить ПЭГелированную липосому. Установлено, что ПЭГелирование улучшает физико-химическую характеристику состава липосом путем повышения растворимости в воде, защиты от ферментативного разрушения и ограничения иммуногенных и антигенных реакций (Milla, Current Drug Metabolism 13, 2012, 105-119). В итоге соотношение N/P для всей смеси этановых липидов составляет 8/5,29/4,41/0,88 для мольных соотношений аминогруппы C12-(2-3-2)/DPPC/ холестерина/DMG-PEG, соответственно, к одной фосфатной группе молекулы хмРНК. Биофизические свойства липоплексов хмРНК приведены в табл. 6. Гидродинамический диаметр для всех продуктов составляет приблизительно 50 нм с индексом полидисперсности, близким к 0,1, что указывает на гомогенность продукта. Кроме того, суммарные поверхностные заряды для всех комплексов слабо положительные, близкие к нейтральным.
Пример 9. Нагрузка хмРНК комплексов и высев клеток на коллагеновые губки.
Перед нагрузкой на коллагеновые губки к растворам липоплекса хмРНК добавляют лиопротектант 2% сахарозу. Лиопротектанты поддерживают целостность биологической системы при обезвоживании в ходе сушки в вакууме (Kannan, Journal Liposome Research, 2014, 1-9). Визуализация губок с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показывает, что высушенная в вакууме коллагеновая губка, содержащая 2% сахарозы, напоминает закрытую емкость с более мелкими порами по сравнению с тем, что было до вакуумной сушкой (фиг. 23).
Для подтверждения возможности загрузки липпоплексов хмРНК на губки, хмРНК-нагруженные губки исследуют СЭМ, и липоплексы, содержащие хмРНК, обнаруживают на коллагеновых губках (фиг. 14А).
Чтобы исследовать загрузку хмРНК, а также клеточную трансфекцию на коллагеновых губках, губки нагружали 2 мкг липоплексов хмРНК tdTomato, где 10% хмРНК tdTomato ковалентно конъюгированы с FITC. Степень дисперсности клеток и липоплексов хмРНК на губках, а также эффективность трансфекции, визуализируют, используя флуоресцентный микроскоп Leica DMi8 (фирма Leica microsystems, Heerbrugg, Швейцария) через 30 часов после высева клеток NIH3T3. На фиг. 14Б показано, что клетки трансфецированы и экспрессируют белок tdTomato (красные пятна), преимущественно в местах с высокой концентрацией хмРНК (зеленые пятна).
Для исследования поведения клеток на 3D-матриксе, подтверждают иммиграцию клеток NIH3T3 в коллагеновые губки окрашиванием гематоксилином вертикального разреза губки через семь суток после высева клеток NIH3T3. Из фиг. 1В следует, что клетки могут иммигрировать в губку и использовать весь матрикс для роста и передачи сигнала, что наиболее вероятно напоминает ситуацию in vivo.
Во-первых, было показано, что клетки могут расти внутри 3D матриксов коллагеновых губок. Другие исследования также показали, что коллагеновые губки являются подходящим 3D-каркасом для культивирования клеток, что в свою очередь улучшает передачу клеточного сигнала и поведение клеток, а также влияет на экспрессию генов в клетках (Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218). Кроме того, визуализируют равномерное распределение липоплексов хмРНК и клеток с использованием SEM и флуоресцентной микроскопии с флуоресцентно-мечеными хмРНК (фиг. 14).
Пример 10. Эффективность трансфекции и выживаемость клеток на коллагеновых губках.
Для проверки эффективности и безопасности трансфекции клеток на коллагеновых губках, экспрессию хмРНК eGFP в линии клеток NIH3T3 оценивают на 48 ч после трансфекции. Во-первых, позитивные eGFP-экспрессирующие клетки визуализируют, используя флуоресцентного микроскопа JULY™ (фирма Baker and Baker, Ruskinn, США) (фиг. 15А). Для количественной оценки этих результатов проводят анализ FACS и наблюдают значительное увеличение средней интенсивности флуоресценции в трансфецированных клетках (фиг. 15Б). В экспериментах по изучению зависимости от дозирования наблюдают 100% эффективность трансфекции при использовании повышенных количеств хмРНК на клетку (фиг. 15В).
В клинических условиях решающим фактором становится не только эффективность трансфекции, но и клеточная токсичность. Поэтому помимо экспрессии GFP, жизнеспособность клеток также определяют количественно через 48 ч после трансфекции в двух независимых экспериментах, используя два разных метода, а именно окрашивание пропидием йодидом (PI) с последующим анализом FACS, и анализ WST. Сопоставимые результаты по жизнеспособности клеток в диапазоне 60-70% получают обоими методами (фиг. 15Г и Д). В отличие от эффективности трансфекции, когда при эффективности наблюдают повышение зависимости от дозы, эффективность жизнеспособности клеток оказывается независимой от дозы.
Количественная оценка эффективности трансфекции хмРНК eGFP на коллагеновых губках по данным метода FACS показывает замечательно высокую эффективность нашей технологии, которая достигает 100% трансфецированных клеток (фиг. 15Б и В). Для подтверждения метода по настоящему изобретению также оценивали жизнеспособность клеток и установили, что назависимая от дозы жизнеспособность клеток составляет примерно 60-70%, что приемлемо для описываемых в настоящем изобретении подходов как in vitro, так и in vivo (фиг. 15Г и Д). Независимость от дозы в исследовании жизнеспособности клеток может быть результатом равномерного распределения клеток в 3D матриксе, которое может очень напоминать ситуацию in vivo и улучшать передачу клеточного сигнала и пролиферацию (Mueller-Klieser, American Journal of Physiology-Cell Physiology 273, 1997, C1109-C1123), поскольку клетки могут переносить даже высокие дозы комплексов хмРНК. Такая дозо-независимая тенденция в проявлении жизнеспособности клеток может быть особенно полезна, если общая эффективность низкая и требуются более высокие дозы хмРНК.
Пример 11. Функция коллагеновых губок в качестве депо для устойчивой доставки хмРНК.
Чтобы исследовать, могут ли коллагеновые губки обеспечить систему устойчивой доставки в клетки хмРНК, кинетику экспрессии люциферазы Metridia (Met luc) на хмРНК в клетках NIH3T3 измеряют каждые 24 ч и сравнивают культуры 2D и 3D (фиг. 16).
Из этих результатов следует, что коллагеновые губки проявляют свойства устойчивой системы доставки хмРНК с плато экспрессии белка в течение шести последующих суток. Кроме того, в потивоположность культуре 2D, которая практически не показывает экспрессии через 8 суток, хмРНК-нагруженные коллагеновые губки показывают относительно высокий уровень экспрессии даже через 11 суток при повышенных дозах хмРНК.
Схожие результаты получают путем нагрузки немодифицированных мРНК-содержащих липоплексов на коллагеновые губки (фиг. 24). Тем не менее, система потеряла эффективность по задержке доставки при использовании коллагеновых губок, не высушенных в вакууме (фиг. 25). Это предоставляет доказательства, что вакуумная сушка является важным и принципиальным этапом для обеспечения системы устойчивой доставки хмРНК в указанных условиях.
На следующей стадии систему исследуют на первичных клетках, используя мезенхимальные стволовые клетки крысы (МСК), выделенные из костного мозга (КММСК) и жировой ткани (ЖМСК). Используя оба типа клеток, кинетику экспрессии Met luc определяют путем высева, повышая число клеток на коллагеновых губках, нагруженных липоплексом. На фиг. 17 показано, что независимо от плотности клеток, МСК, высеянные на коллагеновые губки, нагруженные комплексом, проявляют пролонгированную экспрессию белка в течение, по меньшей мере, четырех последующих суток. Поскольку не наблюдают существенного повышения экспрессии Met luc при повышенной плотности клеток (>10000 клеток/губку), дополнительные эксперименты проводят, используя от 10000 до 20000 клеток/губку.
Кинетику экспрессии хмРНК люциферазы Metridia измеряют для оценки способности коллагеновых губок к устойчивой доставке хмРНК, используя линию клеток (фиг. 16) и первичные клетки при различной плотностью клеток (фиг. 17), а также модифицированные и немодифицированные мРНК (фиг. 24). Основываясь на результатах кинетики, высушенные в вакууме хмРНК-нагруженные коллагеновые губки обеспечивают надежную устойчивую систему доставки хмРНК, которая представляет независимую форму модификации РНК, типа клеток и плотности клеток, даже для первичных клеток, которые более чувствительны к контактному ингибированию и плотности клеток [21]. Такая система будет очень полезной в случае отсутствия источника клеток и образцов от пациентов, когда также возможен переход к низкой плотности клеток. Для получения такой замедленной системы доставки, вакуумная сушка, по-видимому, играет решающую роль, поскольку экспрессия хмРНК в тех губках, которые не высушивали, снижается быстрее (рис. 25). Пролонгированное высвобождение хмРНК после вакуумной сушки может быть не связано с терапией, а вызвано закрытостью структур высушенных в вакууме колагеновых губок (фиг. 23), поскольку замкнутым в таких структурах липоплексам требуется время или для контакта с клетками, или для высвобождения из матрикса [10]. Равномерное распределение высушенных в вакууме липоплексов хмРНК на коллагеновых губках (фиг. 14А) может быть еще одной причиной для выражения устойчивого состояния в течение нескольких суток без пиков эффективности трансфекции или быстрого высвобождения (Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752).
Высушивание в вакууме имеет еще одно важное свойство, заключающееся в том, что комплексы хмРНК на высушенных в вакууме коллагеновых губках стабильны, по меньшей мере, в течение 6 месяцев при комнатной температуре (фиг. 22, также см. пример 14). Этот существенный срок хранения для очень чувствительной молекулы мРНК впервые был достигнут в настоящем исследовании. Это, в свою очередь, может увеличить срок годности и упростить применение для интенсивной терапии с применением хмРНК и приближает клиническое применение хмРНК.
После того, как разработка системы по настоящему изобретению была должным образом оптимизирована для доставки репортерных хмРНК в линию клеток, а также в первичные клетки, предусматриваемую в настоящем изобретении систему исследуют для выяснения физиологического эффекта, а именно формирования кости при использовании хмРНК чКМБ-2.
Пример 12. Дифференциация клеток in vitro.
Для подтверждения создания системы устойчивой доставки хмРНК по проявлению физиологического эффекта, разрабатывают два эксперимента по костной дифференциации in vitro с двумя разными клетками, а именно МС3Т3-Е1 и МСК, используя липоплексы хмРНК чКМБ-2 (Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752, Meine, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002, Kim, Biomaterials 28, 2007, 1830-1837).
Для подтверждения костной дифференциации в клетках типа остеобластов (МС3Т3-Е1), через 7 и 14 суток после высева клеток на хмРНК чКМБ-2-нагруженные коллагеновые губки осуществляют количественную полимеразную цепную реакцию реального времени (РВ-кПЦР) для количественной оценки остеогенных маркеров (OCN и ALP). Нетрансфецированные клетки, высеянные на ненагруженные коллагеновые губки, используют в качестве отрицательного контроля. На фиг. 20А показано, что оба маркера четко экспрессируются в обеих временных точках, и экспрессия возрастает к 14 суткам.
На следующей стадии те же условия применяют для осуществления костной дифференциации in vitro, используя МСК. Во-первых, свеже выделенные МСК оценивают по положительным и отрицательным маркерам, используя метод FACS (фиг. 26). Затем высевают МСК на коллагеновые губки, нагруженные липоплексами хмРНК чКМБ-2. Через 24 ч после трансфекции количественно оценивают экспрессию чКМБ-2 в супернатанте, используя метод ELISA (фиг. 19). Через 7 и 14 суток устанавливают экспрессию остеогенных маркеров RUNX2, OSX, OCN и ALP), используя РВ-кПЦР. Неожиданно было установлено, что все маркеры экспрессируются на высоком уровне, не только в трансфецированных, но также и в нетрансфецированных МСК, высеянных на коллагеновый каркас 3D. Поэтому, культуру нетрансфецированных МСК при обычном высеве 2D (стандартное культивирование культуры клеток на чашках Петри) обрабатывают точно так же, как и клетки, высеянные в 3D (на той же среде и при таких же промываниях), выбирают в качестве отрицательного контроля для нормализации экспрессии различных маркеров, наблюдаемых в клетках в 3D. На фиг. 20Б показано, что культивирование только в коллагеновом матриксе 3D существенно повышает регуляцию экспрессии остеогенных маркеров в МСК.
Для дифференциации костей in vitro используют линию клеток типа остеобластов (МС3Т3-Е1) и МСК, которые высевают на хмРНК чКМБ-2-нагруженные коллагеновые губки [10, 19] (фиг. 20). В случае клеток МС3Т3-Е1, мРНК чКМБ-2 оказывает существенное воздействие на инициирование формирования костей, поскольку экспрессия остеогенных маркеров была в несколько раз выше в трансфецированных клетках по сравнению с нетрансфецированными клетками, высеваемыми на коллагеновые каркасы 3D (фиг. 20А).
Напротив, почти не было существенной разницы в экспрессии остеогенных маркеров между чКМБ-2-трансфецированными и чКМБ-2-нетрансфецированными МСК на коллагеновых губках (рис. 20Б). Однако экспрессия чКМБ-2 клетками МСК, высеянными на коллагеновую губку, нагруженную чКМБ-2, ранее была обнаружена методом ELISA (фиг. 19). Согласно этим данным, сами коллагеновые губки могут инициировать костную регенерацию в МСК in vitro. Ранее также было показано, что коллагеновые губки могут инициировать хондрогенез (Bosnakovski, Biotechnology and Bioengineering 93, 2006, 1152-1163). Другим объяснением этого явления являются резкие макроскопические изменения в трансфецированных и нетрансфецированных коллагеновых губках, содержащих МСК (рис. 27). К 7 суткам губки, нагруженные чКМБ-2, выглядят боле рыхлыми и увеличенными в размере, хотя ненагруженные губки со временем сжимаются и сокращаются. Поскольку МСК слишком сближаются в ненагруженных сжатых губках, они могут утрачивать свою многополярность и начинают перепрограммирование в терминально-дифференцированные клетки (Sekiya, Stem Cells 20, 2002, 530-541, Coulter, PNAS 97, 2000, 3213-3218), а поскольку они растут в остеогенной среде, наиболее вероятна остеогенная дифференциация.
Пример 13. Дифференциация клеток in vivo.
Активность по регенерации кости in vivo оценивают по модели дефекта бедра крысы. Высушенные в вакууме коллагеновые губки, хмРНК чКМБ-2-нагруженные и ненагруженные, используют для обработки дефектов бедер двух групп животных, экспериментальной и контрольной, соответственно. В частности, полученные губки имплантируют в повреждения кости диаметром 2 мм, нанесенные в центральной части бедренной кости крысы. Для визуализации и количественной оценки результата лечения кости через две недели после хирургического вмешательства проводят микрокомпьютерную томографию (μСТ). На фиг. 21А показано, что больше вновь сформированной кости наблюдают в группе, обработанной хмРНК чКМБ-2. Количественная оценка результатов также показывает, что хмРНК чКМБ-2-нагруженные коллагеновые губки могут существенно увеличить регенерацию кости по сравнению с пустыми коллагеновыми губками (фиг. 21Б). Влияние чКМБ-2 на формирование каллюса также хорошо видно в 3D модели при сканировании методом μСТ (фиг. 29). Более подробно, дальнейший анализ с помощью μСТ в разных частях кости (периостальной, кортикальной и мозговой) показал самую высокую регенерацию кости в медуллярной области (фиг. 27), где действительно присутствует множество стволовых клеток костного мозга.
Для подтверждения нового образования кости также применяют метод иммуногистохимии через 2 недели, а более высокие минерализованные костные ткани обнаруживают в группе, обработанной хмРНК чКМБ-2. Подобно результатам μСТ, высокоминерализованные области (черные на фигурах иммуногистохимии) наблюдают в основном в мозговых частях костей (фиг. 18А). Более того, гистологический анализ в области надкостницы показывает значительное увеличение образования каллуса в группе, обработанной хмРНК чКМБ-2, по сравнению с контролем (фиг. 18Б). Дальнейший анализ показал, что значительно больше фиброзной ткани сформировано в группе, обработанной хмРНК чКМБ-2-нагруженными губками, по сравнению с группой, в которой обрабатывают пустыми губками (фиг. 18В). В процессе заживления костей фиброзные ткани могут вызывать индукцию образования остеоидов и регенерации кости (Luellmann-Rauch, De , 2008). Соответственно, на фиг. 18Г показывают более активное формирование остеоида в группе лечения хмРНК чКМБ-2.
Для тестирования системы доставки хмРНК по настоящему изобретению в предклинических исследованиях, хмРНК-нагруженные коллагеновые губки применяют для формирования костей in vivo, используя хмРНК чКМБ-2. In vivo воздействие химически модифицированных комплексов хмРНК КМБ-2 с ПЭИ на формирование костей было опубликовано ранее (Elangovan, см. выше).
Однако в настоящем исследовании применяют липоплексы хмРНК чКМБ-2 с половинным размером комплексов ПЭИ (табл. 6), которые могут улучшить поглощение клеток in vitro, а также фармакокинетику и биораспределение in vivo (Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752; Albanese, Annual Review of Biomedical Engineering 14, 2012, 1-16). Затем липоплексы хмРНК чКМБ-2 стабилизируют на коллагеновых губках вакуумной сушкой и получают готовые к применению биопродукты. В итоге эффективность биопродуктов по настоящему изобретению оценивают на модели животных, чтобы доказать функциональность способа по настоящему изобретению по доставке хмРНК чКМБ-2 для регенерации кости in vivo.
Различные исследования подтверждают влияние белка КМБ-2 на конструирование костной ткани при использовании различных носителей (Meinel, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002, Kempen, Biomaterials 30, 2009, 2816-2825). Однако в настоящее время коллаген является единственным одобренным FDA носителем для рекомбинантного чКМБ-2. Поэтому в этом исследовании была исследована эффективность коллагена в качестве носителя для стабилизированных хмРНК чКМБ-2.
Для проведения эксперимента in vivo нагруженные и ненагруженные коллагеновые губки имплантируют в места повреждения бедер крыс. Через две недели крыс умерщвляют и оценивают образование костей с использованием μСТ и иммуногистохимии. Полученные результаты близки к результатам регенерации кости in vitro в клетках МС3Т3-Е1. Результаты полученные как методом μCT, так и методом иммуногистохимии, показывают, что существенно более значительное образование костей происходит в местах повреждений, обработанных коллагеном, нагруженным хмРНК чКМБ-2, по сравнению с пустым коллагеном (фиг. 21, 18А-Б и фиг. 29). Дальнейший анализ в разных частях кости (периостальной, кортикальной и мозговой) показывает, что максимальное формирование кости происходит в мозговой области (фиг. 28, фиг. 21А и фиг. 18А). Хотя для идеальной тканевой инженерии новообразование кости должно происходить в основном в области коры, образование кости в мозговой части связано с размещением коллагеновых губок в местах повреждения костей. В исследовании настоящего изобретения нагруженные и ненагруженные коллагеновые губки помещают во все повреждение кости (а не только в кортикальную часть). Так как мозговая часть содержит гораздо больше КММСК по сравнению с другими частями кости, в ней происходит максимальное образование кости. Другими словами, чтобы увидеть формирование кортикальной части кости, коллагеновые губки, нагруженные хмРНК чКМБ-2, следует размещать только в области коры, что невозможно на моделях крысы из-за небольшого размера костей крыс. Другие публикации, в которых используют такую же модель животных для обработки рекомбинантным белком КМБ-2, также показывают большее образование кости в мозговой части по сравнению с кортикальной через 2 недели. Однако большее формирование кости в кортикальной части наблюдают через 4 недели (Keibi, Injury 42, 2011, 814-820). Поэтому дополнительные исследования в более поздних временных точках могут быть полезны для исследования регенерации кости в области коры.
Дальнейший гистологический анализ показывает, что в группе, обработанной чКМБ-2 (фиг. 18В), сформировано больше фиброзной ткани. Это также можно рассматривать в качестве признака формирования костной ткани, поскольку в процессе заживления кости фиброзные ткани проявляют тенденцию становиться функциональной фиброзной тканью, а затем образовывать остеоиды (Luellmann-Rauch, De Boeck Supervrieur, 2008). Аналогичным образом, в группе, обработанной хмРНК чКМБ-2 (фиг. 18Г), наблюдают большее образование остеоидов.
Эти результаты отличаются от того, что было обнаружено при регенерации кости in vitro с использованием МСК, где хмРНК чКМБ-2-нагруженные и ненагруженные коллагеновые губки работают почти одинаково при костном формировании (фиг. 20Б). Эта разница может быть связана с различиями в условиях in vitro и in vivo, поскольку многие факторы могут влиять на действие КМБ и коллагеновых губок для регенерации кости in vivo, например, наличие небольших молекул, факторов роста и цитокинов (Lynch, Journal of Periodontology 62, 1991, 710-716, Wan, PNASA 105, 2008, 868-691, Mountziaris, Tissue Engineering Part B: Reviews 14, 2008, 179-186). Такие факторы отсутствуют в ситуации in vitro, и, следовательно, результаты in vivo могут точно не соответствовать результатам in vitro. Соответственно, коллагеновые губки и другие носители, описанные в настоящем изобретении, могут быть предварительно нагружены не только требуемыми липоплексами хмРНК, но также небольшими молекулами и цитокинами, что может усилить иммиграцию МСК внутрь губок (Xu, Oncology Reports 23, 2010, 1561-1567, Wu, Stem Cell Reviews and Reports 8, 2012, 243-250) и, таким образом, улучшить эффективность трансфекции.
Дополнительные результаты, полученные методом гистоморфометрии костей:
После вскрытия отбирают бедренные кости, которые освобождают от окружающих мягких тканей и затем фиксируют в 4% параформальдегиде в течение 24 ч. Затем образцы обезвоживают путем погружения в растворы спирта и ксилена ступенчато изменяющейся концентрации и в итоге погружают в метилметакрилат (ММА). Затем получают поперечные микросрезы, которые окрашивают по протоколу Von Kossa толуидином синим и тартрат-устойчивой кислой фосфатазой (Tartrate Resistant Acid Phosphatase - TRAcP).
Зону высверленного отверстия делят на четыре теоретические области для гистофотометрии, а именно:
- периостальную область вокруг высверленного отверстия (M1),
- область видимого высверленного отверстия внутри компактного вещества кости, в которую помещают имплантат (М2),
- область высверленного отверстия внутри костного мозга, в которую также помещают часть имплантата (М3)
- определенную область, окружающую область высверленного отверстия внутри костного мозга, в которую был помещен имплантат (М4).
Срезы, окрашенные по Von Kossa, исследуют на минерализацию ткани, которая свидетельствует об образовании новой кости. Используя эту процедуру (р=0,01 с использованием U-теста Манна-Уитни) установили, что большее количество минерализованной ткани на объем ткани (BV/TV) находится в области М4 в просверленном отверстии, которое имплантировано коллагеновой губкой, нагруженной хмРНК, кодирующей чКМБ-2, что свидетельствует об улучшении формирования кости на внешней поверхности имплантата в костном мозге. Ожидают формирование кости при такой локализации, хотя гематопоэтические стволовые клетки, скорее всего, будут наиболее интенсивно контактировать с имплантатом на периферийной поверхности (фиг. 30А).
Периостальная область, окружающая высверленное отверстие (M1), содержит повышенное количество ткани в целом в костях, имплантированных губками, нагруженными хмРНК, кодирующими чКМБ-2, по сравнению с костями, имплантированными только пустыми губками, что указывает на повышенную остеогенную активность, являющуюся следствием сверхэкспрессии функционального чКМБ-2 (фиг. 30Б).
Изучение срезов, окрашенных толуолом синим, показывает существенно большее содержание фиброзной ткани в области высверленных отверстий в компактном веществе кости (М2) при имплантации коллагеновых губок, нагруженных хмРНК, кодирующей чКМБ-2 (фиг. 30В). Кроме того, наблюдают не только повышенное количество фиброзной ткани, но также повышенное формирование фиброзной ткани в плане последующего образования остеоидов (фиг. 30Г), что указывает на повышенное образование внеклеточного матрикса в виде предшественников новой формирующейся костной ткани.
Окрашивание TRAcP показывает существенно меньшее количество остеокластов на миллиметр периметра кости (N.Oc/B.Pm) в области компактов (М2) при обработке коллагеновыми губками, нагруженными хмРНК, кодирующей чКМБ-2, что указывает на уменьшение резорбции кости из-за воспалительных процессов на поверхность кости просверленного отверстия (фиг. 30Д).
Пример 14. Анализ стабильности высушенных в вакууме липоплексов хмРНК на коллагеновых губках.
Проводят длительную оценку с целью выяснения срока годности высушенных в вакууме хмРНК-липоплексов на коллагеновых губках в виде биопродуктов. Для этой цели 96-луночные планшеты, содержащие высушенные в вакууме липоплексы Met luc хмРНК на коллагеновых губках, запаивают в вакууме и хранят при комнатной температуре. В определенное время один из планшетов применяют для высева клеток NIH3T3 на губки. Через 24 ч после высева клеток измеряют экспрессию люциферазы Metridia. Образцы экспрессии в планшетах хранят в течение разного времени и затем сравнивают с планшетом, который используют сразу после вакуумной сушки (временная точка = 0). На фиг. 9 показано, что независимо от применяемых доз хмРНК высушенные в вакууме комплексы хмРНК на коллагеновых губках стабильны, по меньшей мере, в течение 6 месяцев при комнатной температуре.
Настоящее изобретение относится к следующим таблицам:
Литература
1. Balmayor, Stem Cell Therapy for Bone Disorders. В кн.: «Mesenchymal Stem Cell Therapy» под ред. Chase L.G. и Vemuri M.C., изд-во Humana Press, Нью Йорк, 2012, 101-116.
2. Carmona в кн.: «Bone Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General 2004», Департамент здравоохранения и социальных служб США, Управление генерального хирурга, Роквилл, Мэриленд.
3. Dimitriou, Injury 36(12), 2005, 1392-1404.
4. Einhorn, din Orthop Relat Res 355, 1998, 7-21.
5. Tanner, J R Soc Interface 5, 2010, 541-557.
6. Tanner, Proc Inst Mech Eng H 224(12), 2010, 1359-1372.
7. Mourino, Expert Opin Drug Deliv 10(10), 2013, 1353-1365.
8. Romagnoli, Clin Cases Miner Bone Metab 10(3), 2013, 155-161.
9. Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(2-3), 2008, 81-96.
10. Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(1), 2008, 1-13.
11. Urist, Clin Orthop Relat Res 53, 1967, 243-283.
12. Yamaguchi, Endocr Rev 21(4), 2000, 393-411.
13. Keibl, Injury 42(8), 2011, 814-820.
14. Katagiri, J Cell Biol 127(6 Pt 1), 1994, 1755-1766.
15. Shekaran, Bone regeneration using an alpha 2 beta 1 integrin-specific hydrogel as a BMP-2 delivery vehicle. Biomaterials, 2014.
16. Evans, Adv Drug Deliv Rev 64(12), 2012, 1331-1340.
17. Lu, J Biomater Sci Polym Ed 23(1-4), 2012, 509-526.
18. Chang, Neurosurgery 65, 2009, 75-81.
19. Park, Gene Ther 10(13), 2003, 1089-1098.
20. Van Tendeloo, Curr Opin Mol Ther 9(5), 2007, 423-431.
21. Holtkamp, Blood 108(13), 2006, 4009-4017.
22. Kormann, Nat Biotechnol 29(2), 2011, 154-157.
23. Mays, J din Invest 123(3), 2013, 1216-1228.
24. Balmayor, Biores Open Access 2(5), 2013, 346-355.
25. Evans, Eur Cell Mater 18, 2009, 96-111.
26. Puri, J Lipid Res 48(2), 2007, 465-471.
27. Mykhaylyk, Liposomal magnetofection. In: Weissig V (ed.) Liposomes, Methods in Molecular Biology, T. 605. Humana Press-Springer, Нью Йорк 2010, 487-525.
28. Mykhaylyk, Pharm Res 29 (5), 2012, 1344-1365.
29. Inouye, Protein Expr Purif 88 (1), 2013, 150-156.
30. Cox, J Histochem Cytochem 47 (11), 1999, 1443-1456.
31. Lakshmipatiya, stvolovyye kletki 22 (4), 2004, 531-543.
32. Evans,  Eng 13 (8), 2007, 1987-1993.
33. Dragoo, Plast Reconstr Surg 115 (6), 2005, 1665-1673.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЭТРИС ГМБХ
<120> ИНДУКЦИЯ ОСТЕОГЕНЕЗА ПУТЕМ ВНЕДРЕНИЯ РНК, КОДИРУЮЩЕЙ КОСТНЫЙ
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ БЕЛОК (КМБ)
<130> X2050 PCT S3
<150> EP 14 19 2539.6
<151> 2014-11-10
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 1191
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..1191
<223> /таблица генетического кода transl_table=1
<400> 1
atg gtg gcc ggg acc cgc tgt ctt cta gcg ttg ctg ctt ccc cag gtc      48
Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val
1               5                   10                  15
ctc ctg ggc ggc gcg gct ggc ctc gtt ccg gag ctg ggc cgc agg aag      96
Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys
20                  25                  30
ttc gcg gcg gcg tcg tcg ggc cgc ccc tca tcc cag ccc tct gac gag     144
Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu
35                  40                  45
gtc ctg agc gag ttc gag ttg cgg ctg ctc agc atg ttc ggc ctg aaa     192
Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys
50                  55                  60
cag aga ccc acc ccc agc agg gac gcc gtg gtg ccc ccc tac atg cta     240
Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu
65                  70                  75                  80
gac ctg tat cgc agg cac tca ggt cag ccg ggc tca ccc gcc cca gac     288
Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp
85                  90                  95
cac cgg ttg gag agg gca gcc agc cga gcc aac act gtg cgc agc ttc     336
His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe
100                 105                 110
cac cat gaa gaa tct ttg gaa gaa cta cca gaa acg agt ggg aaa aca     384
His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr
115                 120                 125
acc cgg aga ttc ttc ttt aat tta agt tct atc ccc acg gag gag ttt     432
Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe
130                 135                 140
atc acc tca gca gag ctt cag gtt ttc cga gaa cag atg caa gat gct     480
Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala
145                 150                 155                 160
tta gga aac aat agc agt ttc cat cac cga att aat att tat gaa atc     528
Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile
165                 170                 175
ata aaa cct gca aca gcc aac tcg aaa ttc ccc gtg acc aga ctt ttg     576
Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu
180                 185                 190
gac acc agg ttg gtg aat cag aat gca agc agg tgg gaa agt ttt gat     624
Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp
195                 200                 205
gtc acc ccc gct gtg atg cgg tgg act gca cag gga cac gcc aac cat     672
Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His
210                 215                 220
gga ttc gtg gtg gaa gtg gcc cac ttg gag gag aaa caa ggt gtc tcc     720
Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser
225                 230                 235                 240
aag aga cat gtt agg ata agc agg tct ttg cac caa gat gaa cac agc     768
Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser
245                 250                 255
tgg tca cag ata agg cca ttg cta gta act ttt ggc cat gat gga aaa     816
Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys
260                 265                 270
ggg cat cct ctc cac aaa aga gaa aaa cgt caa gcc aaa cac aaa cag     864
Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln
275                 280                 285
cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga cac cct ttg tac gtg gac     912
Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp
290                 295                 300
ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att gtg gct ccc ccg ggg tat     960
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr
305                 310                 315                 320
cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct ttt cct ctg gct gat cat    1008
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
325                 330                 335
ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt cag acg ttg gtc aac tct gtt    1056
Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
340                 345                 350
aac tct aag att cct aag gca tgc tgt gtc ccg aca gaa ctc agt gct    1104
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
355                 360                 365
atc tcg atg ctg tac ctt gac gag aat gaa aag gtt gta tta aag aac    1152
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
370                 375                 380
tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt ggg tgt cgc tag                1191
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
385                 390                 395
<210> 2
<211> 1296
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..1296
<223> / таблица генетического кода transl_table=1
<400> 2
atg cac gtg cgc tca ctg cga gct gcg gcg ccg cac agc ttc gtg gcg      48
Met His Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala
1               5                   10                  15
ctc tgg gca ccc ctg ttc ctg ctg cgc tcc gcc ctg gcc gac ttc agc      96
Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser
20                  25                  30
ctg gac aac gag gtg cac tcg agc ttc atc cac cgg cgc ctc cgc agc     144
Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser
35                  40                  45
cag gag cgg cgg gag atg cag cgc gag atc ctc tcc att ttg ggc ttg     192
Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu
50                  55                  60
ccc cac cgc ccg cgc ccg cac ctc cag ggc aag cac aac tcg gca ccc     240
Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro
65                  70                  75                  80
atg ttc atg ctg gac ctg tac aac gcc atg gcg gtg gag gag ggc ggc     288
Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly
85                  90                  95
ggg ccc ggc ggc cag ggc ttc tcc tac ccc tac aag gcc gtc ttc agt     336
Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser
100                 105                 110
acc cag ggc ccc cct ctg gcc agc ctg caa gat agc cat ttc ctc acc     384
Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr
115                 120                 125
gac gcc gac atg gtc atg agc ttc gtc aac ctc gtg gaa cat gac aag     432
Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys
130                 135                 140
gaa ttc ttc cac cca cgc tac cac cat cga gag ttc cgg ttt gat ctt     480
Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu
145                 150                 155                 160
tcc aag atc cca gaa ggg gaa gct gtc acg gca gcc gaa ttc cgg atc     528
Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile
165                 170                 175
tac aag gac tac atc cgg gaa cgc ttc gac aat gag acg ttc cgg atc     576
Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg Ile
180                 185                 190
agc gtt tat cag gtg ctc cag gag cac ttg ggc agg gaa tcg gat ctc     624
Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu
195                 200                 205
ttc ctg ctc gac agc cgt acc ctc tgg gcc tcg gag gag ggc tgg ctg     672
Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu
210                 215                 220
gtg ttt gac atc aca gcc acc agc aac cac tgg gtg gtc aat ccg cgg     720
Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg
225                 230                 235                 240
cac aac ctg ggc ctg cag ctc tcg gtg gag acg ctg gat ggg cag agc     768
His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp Gly Gln Ser
245                 250                 255
atc aac ccc aag ttg gcg ggc ctg att ggg cgg cac ggg ccc cag aac     816
Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gln Asn
260                 265                 270
aag cag ccc ttc atg gtg gct ttc ttc aag gcc acg gag gtc cac ttc     864
Lys Gln Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu Val His Phe
275                 280                 285
cgc agc atc cgg tcc acg ggg agc aaa cag cgc agc cag aac cgc tcc     912
Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser
290                 295                 300
aag acg ccc aag aac cag gaa gcc ctg cgg atg gcc aac gtg gca gag     960
Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu
305                 310                 315                 320
aac agc agc agc gac cag agg cag gcc tgt aag aag cac gag ctg tat    1008
Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr
325                 330                 335
gtc agc ttc cga gac ctg ggc tgg cag gac tgg atc atc gcg cct gaa    1056
Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu
340                 345                 350
ggc tac gcc gcc tac tac tgt gag ggg gag tgt gcc ttc cct ctg aac    1104
Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn
355                 360                 365
tcc tac atg aac gcc acc aac cac gcc atc gtg cag acg ctg gtc cac    1152
Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His
370                 375                 380
ttc atc aac ccg gaa acg gtg ccc aag ccc tgc tgt gcg ccc acg cag    1200
Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln
385                 390                 395                 400
ctc aat gcc atc tcc gtc ctc tac ttc gat gac agc tcc aac gtc atc    1248
Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile
405                 410                 415
ctg aag aaa tac aga aac atg gtg gtc cgg gcc tgt ggc tgc cac tag    1296
Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His
420                 425                 430
<210> 3
<211> 396
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> [Кодирующая последовательность]:1..1191 из SEQ ID NO 1
<400> 3
Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val
1               5                   10                  15
Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys
20                  25                  30
Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu
35                  40                  45
Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys
50                  55                  60
Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu
65                  70                  75                  80
Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp
85                  90                  95
His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe
100                 105                 110
His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr
115                 120                 125
Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe
130                 135                 140
Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala
145                 150                 155                 160
Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile
165                 170                 175
Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu
180                 185                 190
Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp
195                 200                 205
Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His
210                 215                 220
Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser
225                 230                 235                 240
Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser
245                 250                 255
Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys
260                 265                 270
Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln
275                 280                 285
Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp
290                 295                 300
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr
305                 310                 315                 320
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
325                 330                 335
Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
340                 345                 350
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
355                 360                 365
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
370                 375                 380
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
385                 390                 395
<210> 4
<211> 431
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> [Кодирующая последовательность]:1..1296 из SEQ ID NO 2
<400> 4
Met His Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala
1               5                   10                  15
Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser
20                  25                  30
Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser
35                  40                  45
Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu
50                  55                  60
Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro
65                  70                  75                  80
Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly
85                  90                  95
Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser
100                 105                 110
Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr
115                 120                 125
Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys
130                 135                 140
Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu
145                 150                 155                 160
Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile
165                 170                 175
Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg Ile
180                 185                 190
Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu
195                 200                 205
Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu
210                 215                 220
Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg
225                 230                 235                 240
His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp Gly Gln Ser
245                 250                 255
Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gln Asn
260                 265                 270
Lys Gln Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu Val His Phe
275                 280                 285
Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser
290                 295                 300
Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu
305                 310                 315                 320
Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr
325                 330                 335
Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu
340                 345                 350
Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn
355                 360                 365
Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His
370                 375                 380
Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln
385                 390                 395                 400
Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile
405                 410                 415
Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His
420                 425                 430
<210> 5
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 5
ccgtgtcagc aaaacttctt t                                              21
<210> 6
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 6
gctcacgtcg ctcatcttg                                                 19
<210> 7
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 7
tggaacactg ggtcccata                                                 19
<210> 8
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 8
gacctggtct tccctccaa                                                 19
<210> 9
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 9
cccaactgtc aggagctaga g                                              21
<210> 10
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 10
gatgtggcgg ctgtgaat                                                  18
<210> 11
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 11
tgcttgaaga cctatgtggg ta                                             22
<210> 12
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 12
aaaggcagca tttggggtat                                                20
<210> 13
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 13
acggcagctt cagctttg                                                  18
<210> 14
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 14
gaggcagaga gagggaacag                                                20
<210> 15
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 15
atcgacagtc aggcgagttc                                                20
<210> 16
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 16
gctgtgaaac tcgtggctct                                                20
<210> 17
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 17
ctgatgagca gggcgagt                                                  18
<210> 18
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 18
tccgagaagt tcttaagcct ca                                             22
<210> 19
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 19
ccccctacat gctagacctg t                                              21
<210> 20
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 20
cactcgtttc tggtagttct tcc                                            23
<210> 21
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 21
tgcctaggcg catttcaggt gc                                             22
<210> 22
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 22
tgaggtgact ggcggggtgt                                                20
<210> 23
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 23
acgtggctaa gaatgtcatc                                                20
<210> 24
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 24
ctggtaggcg atgtcctta                                                 19
<210> 25
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 25
cagccgcttc acctacagc                                                 19
<210> 26
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 26
ttttgtattc aatcactgtc ttgcc                                          25
<210> 27
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер
<400> 27
gagggcgagg acgaggctta                                                20
<210> 28
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер
<400> 28
tctaacagag gcaaaactga gcacc                                          25
<210> 29
<211> 1674
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность некэпированной мРНК чКМБ2 после линеаризации вектора рестриктазой XbaI
<400> 29
gagaataact tgcgcacccc actttgcgcc ggtgcctttg ccccagcgga gcctgcttcg      60
ccatctccga gccccaccgc ccctccactc ctcggccttg cccgacactg agacgctgtt     120
cccagcgtga aaagagagac tgcgcggccg gcacccggga gaaggaggag gcaaagaaaa     180
ggaacggaca ttcggtcctt gcgccaggtc ctttgaccag agtttttcca tgtggacgct     240
ctttcaatgg acgtgtcccc gcgtgcttct tagacggact gcggtctcct aaaggtcggc     300
caccatggtc gccggcacca gatgtctgct ggctctgctg ctgcctcagg tgctgctggg     360
cggagctgcc ggactggtgc ctgagctggg cagaagaaag ttcgccgctg ccagctctgg     420
cagacccagc agccagcctt ccgacgaggt gctgagcgag ttcgagctgc ggctgctgag     480
catgttcggc ctgaagcaga ggcccacccc cagcagagat gccgtggtgc ccccctacat     540
gctggacctg tacagacggc acagcggaca gcctggaagc cctgcccctg accacagact     600
ggaaagagcc gccagccggg ccaacaccgt gcggagcttt caccacgagg aaagcctgga     660
agaactgccc gagacaagcg gcaagaccac ccggcggttc tttttcaacc tgtcctccat     720
ccccaccgaa gagttcatca ccagcgccga actccaggtg ttccgcgagc agatgcagga     780
cgccctgggc aacaacagct catttcacca ccggatcaac atctacgaga tcatcaagcc     840
cgccaccgcc aacagcaagt tccccgtgac ccggctgctg gacacccggc tggtcaacca     900
gaacgccagc agatgggaga gcttcgacgt gacccctgcc gtgatgagat ggaccgccca     960
gggccacgcc aaccacggct ttgtggtgga agtggcccac ctggaagaga agcagggcgt    1020
gtccaagcgg cacgtgcgga tcagcagaag cctgcaccag gacgagcaca gctggtccca    1080
gatccggccc ctgctggtca ccttcggcca cgatggcaag ggccaccccc tgcacaagag    1140
agagaagcgg caggccaagc acaagcagcg gaagcggctg aagtccagct gcaagcggca    1200
ccccctgtac gtggacttca gcgacgtggg ctggaacgac tggatcgtgg cccctcccgg    1260
ctaccacgcc ttctactgcc acggcgagtg ccccttcccc ctggccgacc acctgaacag    1320
caccaaccac gccatcgtgc agaccctggt caacagcgtg aactccaaga tccccaaggc    1380
ctgctgcgtg cccaccgagc tgagcgccat cagcatgctg tacctggacg agaacgagaa    1440
ggtggtgctg aagaactacc aggacatggt ggtggaaggc tgtggctgta gatgatacag    1500
caaaattaaa tacataaata tatatataga attctgcaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag cggccgctcg agtc          1674
<210> 30
<211> 1661
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность некэпированной мРНК чКМБ2 после линеаризации вектора рестриктазой NotI
<400> 30
gagaataact tgcgcacccc actttgcgcc ggtgcctttg ccccagcgga gcctgcttcg      60
ccatctccga gccccaccgc ccctccactc ctcggccttg cccgacactg agacgctgtt     120
cccagcgtga aaagagagac tgcgcggccg gcacccggga gaaggaggag gcaaagaaaa     180
ggaacggaca ttcggtcctt gcgccaggtc ctttgaccag agtttttcca tgtggacgct     240
ctttcaatgg acgtgtcccc gcgtgcttct tagacggact gcggtctcct aaaggtcggc     300
caccatggtc gccggcacca gatgtctgct ggctctgctg ctgcctcagg tgctgctggg     360
cggagctgcc ggactggtgc ctgagctggg cagaagaaag ttcgccgctg ccagctctgg     420
cagacccagc agccagcctt ccgacgaggt gctgagcgag ttcgagctgc ggctgctgag     480
catgttcggc ctgaagcaga ggcccacccc cagcagagat gccgtggtgc ccccctacat     540
gctggacctg tacagacggc acagcggaca gcctggaagc cctgcccctg accacagact     600
ggaaagagcc gccagccggg ccaacaccgt gcggagcttt caccacgagg aaagcctgga     660
agaactgccc gagacaagcg gcaagaccac ccggcggttc tttttcaacc tgtcctccat     720
ccccaccgaa gagttcatca ccagcgccga actccaggtg ttccgcgagc agatgcagga     780
cgccctgggc aacaacagct catttcacca ccggatcaac atctacgaga tcatcaagcc     840
cgccaccgcc aacagcaagt tccccgtgac ccggctgctg gacacccggc tggtcaacca     900
gaacgccagc agatgggaga gcttcgacgt gacccctgcc gtgatgagat ggaccgccca     960
gggccacgcc aaccacggct ttgtggtgga agtggcccac ctggaagaga agcagggcgt    1020
gtccaagcgg cacgtgcgga tcagcagaag cctgcaccag gacgagcaca gctggtccca    1080
gatccggccc ctgctggtca ccttcggcca cgatggcaag ggccaccccc tgcacaagag    1140
agagaagcgg caggccaagc acaagcagcg gaagcggctg aagtccagct gcaagcggca    1200
ccccctgtac gtggacttca gcgacgtggg ctggaacgac tggatcgtgg cccctcccgg    1260
ctaccacgcc ttctactgcc acggcgagtg ccccttcccc ctggccgacc acctgaacag    1320
caccaaccac gccatcgtgc agaccctggt caacagcgtg aactccaaga tccccaaggc    1380
ctgctgcgtg cccaccgagc tgagcgccat cagcatgctg tacctggacg agaacgagaa    1440
ggtggtgctg aagaactacc aggacatggt ggtggaaggc tgtggctgta gatgatacag    1500
caaaattaaa tacataaata tatatataga attctgcaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag c                        1661
<210> 31
<211> 1489
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность некэпированной мРНК чКМБ7 после линеаризации вектора рестриктазой NotI
<400> 31
gagacccaag ctggctagcg tttaaactta agcttggtac cgagctcgga tccgccacca      60
tgcacgtacg cagtcttagg gctgctgccc cacacagctt tgtggccctg tgggcacccc     120
tctttctgct taggtctgct cttgccgact tttcactgga caacgaggtc cattcctcat     180
ttatccaccg tcgactgaga agccaagaga ggcgggaaat gcagcgcgag attttgtcta     240
tcctgggatt gccccataga cctcgtcccc atctccaagg gaaacacaac tctgctccca     300
tgttcatgct ggatctgtac aatgccatgg cagtggagga aggtggtggc ccaggaggac     360
agggcttctc ctatccgtac aaggccgtct tttccaccca aggtccaccg ttggcgagtc     420
tccaggattc ccatttcctg accgatgcgg acatggtgat gtcattcgtg aacctggtgg     480
aacacgacaa agagttcttt caccccaggt atcaccacag agagttccgc ttcgacttga     540
gtaaaatccc tgagggagaa gccgttactg ccgccgagtt tcgcatttac aaggactaca     600
ttcgggagag gttcgataac gaaaccttcc ggatatccgt gtatcaggtg ctgcaagagc     660
atctggggag agagtccgat ctcttcctcc tggacagtag gacactgtgg gcgtctgagg     720
aaggctggct tgtgttcgac ataactgcca cgagcaatca ctgggttgta aacccaaggc     780
ataacctggg gcttcagctg tctgtcgaga cactggatgg gcagagcatc aatcccaaac     840
tggctgggtt gatcggacgc catggtccac agaacaaaca gcctttcatg gtagctttct     900
ttaaggccac agaagtgcac tttcggagta ttcggagcac tggcagcaaa cagagaagcc     960
agaatagatc caagacccct aagaatcagg aagccctgcg gatggcaaat gtggcggaga    1020
atagcagctc agatcagaga caggcttgca agaagcatga actgtatgtg tcttttcgag    1080
atctcggatg gcaggactgg attatcgcac cagagggcta tgctgcctac tattgcgaag    1140
gcgagtgcgc atttcctctg aacagctaca tgaacgcaac caatcatgcc attgtccaaa    1200
cactcgttca cttcatcaat ccggaaactg tgcctaaacc ctgttgtgca cctacgcagc    1260
tgaacgctat atctgttctg tactttgacg attcatccaa cgtcatcctc aagaagtacc    1320
gcaatatggt tgtccgagca tgcggctgtc actgagaatt cctgcagaaa aaaaaaaaaa    1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagc                1489
<210> 32
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер мыши
<400> 32
gtgccctgac tgaggctgtc                                                20
<210> 33
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер мыши
<400> 33
ggatcatcgt gtcctgctca c                                              21
<210> 34
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер мыши
<400> 34
ccgggagcag tgtgagctta                                                20
<210> 35
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер мыши
<400> 35
tagatgcgtt tgtaggcggt c                                              21
<210> 36
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер мыши
<400> 36
gcacagtcaa ggccgagaat                                                20
<210> 37
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер мыши
<400> 37
gccttctcca tggtggtgaa                                                20
<210> 38
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер крысы
<400> 38
ccgtgtcagc aaaacttctt t                                              21
<210> 39
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер крысы
<400> 39
gctcacgtcg ctcatcttg                                                 19
<210> 40
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер крысы
<400> 40
cccaactgtc aggagctaga g                                              21
<210> 41
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер крысы
<400> 41
gatgtggcgg ctgtgaat                                                  18
<210> 42
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер крысы
<400> 42
acggcagctt cagctttg                                                  18
<210> 43
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер крысы
<400> 43
gaggcagaga gagggaacag                                                20
<210> 44
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер крысы
<400> 44
tggaacactg ggtcccata                                                 19
<210> 45
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер крысы
<400> 45
gacctggtct tccctccaa                                                 19
<210> 46
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> прямой праймер крысы
<400> 46
ctgatgagca gggcgagt                                                  18
<210> 47
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> обратный праймер крысы
<400> 47
tccgagaagt tcttaagcct ca                                             22
<---