СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПЕРСИСТЕНЦИИ ОНКОГЕННЫХ ТИПОВ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА В ЦЕРВИКАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ
METHOD FOR PREDICTION OF PERSISTENCE OF ONCOGENIC HUMAN PAPILLOMA VIRUS IN CERVICAL EPITHELIUM

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и дерматовенерологии. Метод основан на использовании иммунологических показателей для прогноза персистирующего течения генитальной папилломавирусной инфекции.
Папилломавирусная инфекция (ПВИ) является одной из наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) число инфицированных за последние десять лет увеличилось более чем в 10 раз, достигнув 23,5% [Белокриницкая Т.Е. Типирование вирусов папиллом при заболеваниях шейки матки / Т.Е.Белокриницкая, Ю.Н.Пономарева, Е.Н.Бунина // Вестн. Новосиб. гос. ун-та. - 2005. - Т.3, вып.2. - С.10-13; Козаченко В.П. Иммунопрофилактика рака шейки матки / В.П.Козаченко, Г.З.Чкадуа, К.И.Жорданиа и др. // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2009. - №1-2. - C.112-115].
Чрезвычайно важной представляется проблема ПВИ в связи с онкогенным потенциалом вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска, который по данным ВОЗ признан этиологическим агентом рака шейки матки (РШМ). Несмотря на высокую распространенность и онкогенный потенциал ВПЧ, высокий процент самопроизвольного регресса ПВИ свидетельствуют о том, что инфицирование является необходимым, но недостаточным условием для возникновения РШМ [Новик В.И. Факторы эффективности цитологического скрининга рака шейки матки / В.И.Новик // Онкологический журнал. - 2006. - №1. - С.47-49]. По данным литературы главным фактором риска развития неопластической патологии является персистенция онкогенных типов ВПЧ [Einstein M.H. Acquired immune response to oncogenic human papillomavirus associated with prophylactic cervical cancer vaccines / M.H.Einstein // Cancer Immunol. Immunother. - 2008. - Vol.57(4). - P.443-451; Manavi M. Human papillomavims DNA integration and messenger RNA transcription in cervical low- and high-risk / M.Manavi, G.Hudelist, A.Fink-Retter et al. //Int. Gynecol. Cancer. - 2008. - №18. - P.285-294; Carcopino X. Evaluation of type-specific HPV persistence and high-risk HPV viral load quantitation in HPV positive women under 30 with normal cervical cytology / X.Carcopino, N.Bolger, M.Henry et al. // J. Med. Virol. - 2011. - Vol.83, №4. - P.637-643]. Считается, что канцерогенез является следствием "персистентных инфекций ВПЧ высокого риска" продолжительностью более 6 месяцев [Вакцины для профилактики рака шейки матки. / Под ред. П.Л.Стерна, Г.С.Китченера; пер. с англ. под общ. ред. Г.Т.Сухих, В.Н.Прилепской. - M.: МЕДпресс-информ, 2011. - 192 с.; Bhat P. Regulation of immune response to HPV-infection and during HPV-detected immunotherapy / P.Bhat // Immunological reviews. - 2011. - Vol.239. - P.85-94]. Тем не менее, понятие "персистирующая инфекция" - это только условное определение и не включает никакого функционального или механистического критерия, который бы опирался на молекулярные события, необходимые для развития канцерогенеза, вызванного ВПЧ. И хотя в настоящее время данный термин широко используется, крайне необходимо дифференцировать точно клинически значимые фазы течения инфекций ВПЧ высокого риска на основе молекулярных показателей [Doeberitz M.K. p16ink4a в качестве биомаркера для дифференциировки репликативных и трансформируемых инфекций ВПЧ высокого риска: теоретическая концепция и ее потенциальное влияние на диагностику // HPV-Today. - 2009. - Р.7-8].
В современной диагностике ПВИ применяются различные методы, в том числе клинико-визуальный метод, кольпоскопия, цитологическое исследование мазков и гистологическое исследование прицельно взятого биоптата шейки матки, молекулярно-биологические методы (полимеразная цепная реакция - ПЦР или тест DIGENE).
Анализ данных показал, что цитологический метод и кольпоскопическое исследование не всегда бывают достаточными для диагностики ПВИ, качество которой повышается при сочетанном использовании ВПЧ-диагностики и, в частности, некоторых биомаркеров. В настоящее время предложены новые молекулярно-биологические тесты, направленные на определение активности ВПЧ и оценку ближайших перспектив течения инфекции. Их называют молекулярными биомаркерами. Они классифицируются на две группы: компоненты продукции вируса папилломы и компоненты клетки-хозяина. Примерами служат PreTect ВПЧ-Proofer (NorChip), разработанный для определения полноразмерной мРНК генов Е6 и Е7 ВПЧ, присутствие которой в клиническом материале ассоциировано с повышенным риском неопластической прогрессии.
Тест CINtec pl6ink4a представляет собой маркер цервикального дискариоза, созданный как показатель изменения состояния клетки-хозяина. Сверхэкспрессия pl6ink4a происходит вследствие инактивации гена ретинобластомы онкогенным белком вируса Е7. Результаты исследований Klaes и соавт. показали, что использование данного биомаркера для диагностики ЦИН может значительно снизить количество неясных цитологических мазков при скрининге и помочь в установке диагноза и оценке прогноза течения инфекции.
В России в настоящее время все эти методы практически не используются в качестве первичного теста обследования шейки матки, поскольку их внедрение требует серьезного технического перевооружения клинических лабораторий и специальной подготовки персонала. Кроме того, эти методы должны пройти масштабные клинические исследования.
Клинические наблюдения, а также данные экспериментальных исследований свидетельствуют о ведущей роли иммунной системы в контроле возникновения, течения и исхода ПВИ [Кузнецова Ю.Н. Комплексная терапия манифестных проявлений папилломавирусной инфекции урогенитального тракта / Ю.Н.Кузнецова, Н.П.Евстигнеева, Т.А.Обоскалова // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. - 2009. - Т.3, №3. - С.27-31; Stanley M. Immune responses to human papillomavirus / M. Stanley // Vaccine. - 2006. - Vol.24. - P.16-22]. Поскольку ВПЧ эпителиотропен, особо важное значение имеет состояние системы местной защиты органов репродуктивной системы. У здоровых женщин в результате нормальной работы иммунной системы и механизмов контроля над пролиферацией ВПЧ-инфекция часто имеет транзиторный характер, и вирус спонтанно элиминируется в течение 6-12 месяцев, не вызывая серьезных поражений эпителия. Стойкое угнетение местного иммунитета обусловливает способность ВПЧ к длительной персистенции, что, в свою очередь, может приводить к появлению и разрастанию участков пораженного эпителия по типу тяжелой дисплазии.
Учитывая тот факт, что персистенция ВПЧ высокого риска является ключевым событием в малигнизации клеток, своевременное определение риска развития персистирующего инфекционного процесса позволит контролировать течение ПВИ, повысить эффективность первичного скрининга РШМ и лечения ВПЧ-индуцированных заболеваний шейки матки.
В патенте РФ №2379690, дата публикации 20.01.2010, предложен способ диагностики ПВИ на основании сбора анамнеза и комплексного клинико-лабораторного обследования. В качестве анамнестических признаков принимают отягощенную онкологическую наследственность, раннее начало половой жизни, возраст до 20 лет и промискуитет. В качестве клинических признаков используют аногенитальные бородавки, эрозии и эктопии шейки матки, контактную кровоточивость, Ovuli nabotti, воспалительные заболевания органов малого таза и наличие внутриматочной спирали. В качестве лабораторных признаков принимают инфекции, передаваемые половым путем, микстинфицирование, дефицит лактобактерий, дисбиоз влагалища, вызванный условно-патогенной флорой, бактериальный вагиноз, вирус-вирусные ассоциации, урогенитальный герпес, урогенитальную микоплазменную инфекцию, урогенитальную уреплазменную инфекцию, урогенитальный кандидоз, урогенитальную хламидийную инфекцию и инфицирование различными генотипами ВПЧ. Затем каждый из признаков оценивают по балльной системе согласно таблице «Дифференциальные признаки транзиторной и персистирующей латентной папилломавирусной инфекции», и при наличии у пациента 55-86 баллов диагностируют персистирующее течение папилломавирусной инфекции, при наличии 0-31 балла диагностируют транзиторное течение ПВИ, а при 32-54 баллах пациентов подвергают дополнительному обследованию. Для улучшения диагностики могут дополнительно учитываться такие лабораторные признаки, как средний уровень концентрации онкобелка, ИФН-α, ФНО-α, средний уровень пролактина в сыворотке крови, средний уровень интерферона α и γ в секрете цервикального канала и средний уровень секреторных иммуноглобулинов класса А. Недостатком данного изобретения является необходимость проведения большого объема исследований, что подразумевает определенные материальные затраты, а также увеличивает время для постановки диагноза. Более того, отсутствуют данные о специфичности и чувствительности предложенной технологии.
В патенте РФ №2142640, дата публикации 10.12.1999, предложен способ диагностики ПВИ нижнего отдела генитального тракта, основанный на спектрофотометрическом определении содержания железа и активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и гамма-глутамилтранспептидазы в отделяемом влагалища, растворенном в изотоническом растворе. Однако концентрация данных показателей может динамически меняться под мультифакторным воздействием и не является вирус-специфическим маркером. В то же время метод не позволяет оценить вероятность хронизации инфекционного процесса либо элиминации вируса.
Целью изобретения является разработка высокочувствительного и специфичного способа ранней диагностики персистирующего течения ПВИ, что послужит основой для изменения тактических подходов к лечению ВПЧ-инфицированных женщин. Мы предлагаем использовать иммунологические показатели цервикальной слизи как маркеры персистенции генитальной ПВИ.
Для решения поставленной задачи было проведено обследование 120 женщин с наличием ВПЧ высокого риска в цервикальном канале. Критериями включения в исследование стали папилломавирусная инфекция, подтвержденная методом ПЦР, возраст - от 18 до 45 лет, первая фаза менструального цикла. В обследования не вошли беременные пациентки, пациентки с эктрагенитальными заболеваниями в стадии декомпенсации, инфекционными заболеваниями в стадии обострения, с хламидийной, цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекциями урогенительного тракта, а также с опухолевой патологией.
Для установления факта персистенции ВПЧ высокого риска всем женщинам проводили повторное ВПЧ-тестирование через 6 и 12 месяцев после первичного обнаружения вируса. На основании полученных данных ретроспективно все пациентки были разделены на две группы: I группу составили 68 пациенток с отрицательными результатами ВПЧ-тестирования через 6 и 12 месяцев после первичного выявления ВПЧ высокого риска (транзиторное течение ПВИ); II группу вошли 52 женщины с положительным ВПЧ-тестом через 6 и 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ).
Контрольную группу составили 32 женщины без ВПЧ высокого риска, клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии.
Все пациентки прошли обязательный объем диагностических исследований, который включал в себя:

1. Молекулярно-биологические методы исследования цервикальных соскобов: выявление и дифференциация ВПЧ высокого риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов с помощью тест-системы «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва). Количественное определение ДНК ВПЧ высокого риска проводили с помощью тест-системы «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва). Результаты концентрации ДНК ВПЧ выражались в lg (ВПЧ на 100 тыс. клеток человека) и оценивались следующим образом: вирусная нагрузка менее 3 - малозначимая, от 3 до 5 - значимая и более 5 - повышенная. Исследования проводили методом ПЦР в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия).
2. Иммунологические методы: исследовалась цервикальная слизь в первую фазу менструального цикла, в которой определяли:
- общее количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание жизнеспособных нейтрофилов, показатели функциональной активности нейтрофилов с оценкой фагоцитарных реакций и содержания лизосом (Фрейдлин И.С., 1986), кислородозависимый метаболизм в НСТ тесте (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979);
- концентрации иммуноглобулинов А, М, G (Ig A, Ig M, Ig G) определяли с помощью тест-систем ООО «Хема» (г.Москва), секреторного Ig A (sig A) - тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г.Новосибирск) методом ИФА;
- определение уровней ИФН-α, ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-1РА, ФНО-α проводили методом ИФА с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (г.Санкт-Петербург).
3. Статистические методы. Результаты оценивали с помощью пакетов «Statistica 6.0» и MedCalc 10.2.0.0 с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m). Анализ количественных признаков проводился с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Для оценки диагностической эффективности иммунологических показателей цервикальной слизи и построения математических моделей использовали бинарную логистическую регрессию. Во всех случаях различия, связи и зависимости считали статистически значимыми при p<0,05.
В результате проведенных исследований были зарегистрированы достоверные отличия многих иммунологических показателей у пациенток с транзиторной и персистирующей ПВИ. Это дает возможность разработки молекулярно-биологических и иммунологических критериев для прогнозирования течения ПВИ и определения ее длительности.
Авторами впервые предложен способ использования иммунологических показателей для формирования групп риска персистенции онкогенных типов ВПЧ в цервикальном эпителии, который может быть применен в качестве дополнительного метода диагностики в структуре комплексного обследования ВПЧ-инфицированных женщин.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
<mrow><msubsup><mi>χ</mi><mrow><mo stretchy="false">[</mo><mn>2</mn><mo stretchy="false">]</mo></mrow><mn>2</mn></msubsup><mo>=</mo><mn>22,707</mn></mrow>
Все ВПЧ-инфицированные женщины на основании результатов повторного ВПЧ-тестирования через 6 и 12 месяцев после первичного обнаружения вируса были разделены на две группы: I группа - транзиторное течение ПВИ; II группа - персистирующее течение ПВИ. Для интересующего перехода полученная модель содержала по два показателя, для каждого из которых приводится коэффициент регрессии (см. таблицу). Для прогноза развития персистирующего течения инфекции у женщин с ПВИ такими показателями стали: Ig А цервикальной слизи (г/л) и ИФН-α цервикальной слизи (пг/мл). Полученная модель является статистически значимой (
; Р<0,0001) и в 88,89% случаев прогнозирует развитие персистирующего течения у женщин с ПВИ шейки матки.
Модель логистической регрессии имеет вид
<mrow><mi>Л</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mo stretchy="false">(</mo><mi>P</mi><mo stretchy="false">)</mo><mo>=</mo><mi>К</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mo>+</mo><msub><mi>a</mi><mn>1</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>1</mn></msub><mo>+</mo><msub><mi>a</mi><mn>2</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>2</mn></msub><mo>+</mo><mo>…</mo><msub><mi>a</mi><mi>n</mi></msub><msub><mi>X</mi><mi>n</mi></msub><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mo stretchy="false">(</mo><mn>1</mn><mo stretchy="false">)</mo></mrow>
a
i
i
где Р - вероятность отнесения пациента к группе риска,  - коэффициенты регрессии, X - значения вошедших в модель показателей.
Зная коэффициенты регрессии, рассчитывается Логит (Р) и далее - само значение Р:
<mrow><mi>P</mi><mo>=</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mn>1</mn><mrow><mn>1</mn><mo>+</mo><msup><mi>e</mi><mrow><mo>−</mo><mi>Л</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mo stretchy="false">(</mo><mi>P</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></msup></mrow></mfrac></mrow><mo>)</mo></mrow><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mo stretchy="false">(</mo><mn>2</mn><mo stretchy="false">)</mo></mrow>
где е - константна, равная 2,718281828.
Применение данных формул подразумевает формальную подстановку значений показателей, полученных при обследовании женщины, и вычисление значения вероятности отнесения женщины к группе риска. Если Р<0,5, женщину следует причислить к группе 0 - отсутствие риска, если Р≥0,5 - к группе 1 - наличие риска.
Для иллюстрации практического применения математической модели приводим клинические примеры.
Пример 1. Пациентка А., 23 года, обратилась в женскую консультацию МУЗ ГКБ №2 г.Челябинска с целью профилактического обследования на ИППП. Результаты ПЦР-анализа показали отсутствие хламидийной, цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекций урогенитального тракта. Тест на определение ДНК ВПЧ высокого риска дал положительный результат. При проведении иммунологического исследования получены следующие показатели: Ig A = 0,32 г/л и ИФН-α слизи=215,5 пг/мл. Данные показатели были подставлены в полученную формулу:
Логит(Р)=-1,2352+(17,8125)×0,32 (г/л)+(-0,0012)×215,5 (пг/мл)= 4,206200.
<mrow><mi>P</mi><mo>=</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mn>1</mn><mrow><mn>1</mn><mo>+</mo><msup><mrow><mn>2,718281828</mn></mrow><mrow><mo>−</mo><mn>4.206200</mn></mrow></msup></mrow></mfrac></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mn>0,985316</mn></mrow>
Поскольку Р больше 0,5, то данная пациентка попадает в группу риска развития персистирующего течения ПВИ.
Пример 2. Пациентка Б., 25 лет, обратилась в женскую консультацию МУЗ ГКБ №2 г.Челябинска. На основании клинико-анамнестических, кольпоскопических и гистологических данных обследования ей выставлен диагноз: Эктопия шейки матки. Обследование на обнаружение ВПЧ ранее не проходила. Результаты ПЦР-анализа показали отсутствие хламидийной, цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекций урогенитального тракта, выявлен ВПЧ 31 типа. При проведении иммунологического исследования получены следующие показатели: IgA цервикальной слизи = 0,24 г/л и ИФН-α цервикальной слизи = 258,63 пг/мл. Данные показатели были подставлены в полученную формулу:
Логит (Р)=-1,2352+(17,8125)×0,24+(-0,0012)×258,63=2,729444.
<mrow><mi>P</mi><mo>=</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mn>1</mn><mrow><mn>1</mn><mo>+</mo><msup><mrow><mn>2,718281828</mn></mrow><mrow><mo>−</mo><mn>2,729444</mn></mrow></msup></mrow></mfrac></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mn>0,93874</mn></mrow>
Поскольку Р больше 0,5, то данную пациентку с ПВИ следует причислить к группе риска развития персистирующего течения ПВИ. При повторном обследовании пациентки через 8 месяцев подтвердился диагноз папилломавирусной инфекции, обусловленной ВПЧ 31 типа.
Пример 3. Пациентка М., 24 года, обратилась в женскую консультацию МУЗ ГКБ №2 г.Челябинска. На основании клинико-анамнестических, кольпоскопических и гистологических данных обследования ей выставлен диагноз: Хронический цервицит. Обследование на обнаружение ВПЧ ранее не проходила. Результаты ПЦР-анализа показали отсутствие хламидийной, цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекций урогенитального тракта, выявлен ВПЧ 52 типа. При проведении иммунологического исследования цервикальной слизи получены следующие показатели: с показателями Ig A равным 0,018 г/л и ИФН-α равным 450 пг/мл. Данные показатели были подставлены в полученную формулу:
Логит (Р)=-1,2352+(17,8125)×0,018+(-0,0012)×450=1,454575.
<mrow><mi>P</mi><mo>=</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mn>1</mn><mrow><mn>1</mn><mo>+</mo><msup><mrow><mn>2,718281828</mn></mrow><mrow><mo>−</mo><mn>1,454575</mn></mrow></msup></mrow></mfrac></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mn>0,1892985</mn></mrow>
Поскольку Р меньше 0,5, то для данной пациентки с ПВИ нет оснований причислять ее к группе риска развития персистирующего течения ПВИ. При повторном обследовании пациентки через 6 месяцев получен отрицательный результат ВПЧ-тестирования.
Параметры и характеристики логистической регрессии для прогноза развития и длительности персистирующего течения папилломавирусной инфекции
Показатели
Коэффициент регрессии ± станд. ошибка
Отношение шансов (95% ДИ)
Оценка значимости, Р
Транзиторное течение ПВИ - персистирующее течение ПВИ
Ig А цервикальной слизи (г/л)
17,8125±06,9563
5,4(0,65±12,00)
0,010
ИФН-α цервикальной слизи (пг/мл)
-0,0012±0,0007
0,9988(0,99-1,00)
0,063
Константа
-1,2352
Модель полностью: <maths num="7"><math display="block"><mrow><msubsup><mi>χ</mi><mrow><mo stretchy="false">[</mo><mn>2</mn><mo stretchy="false">]</mo></mrow><mn>2</mn></msubsup><mo>=</mo><mn>22,707</mn></mrow></math><img file="00000007.tif" he="8" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
; Р=0,0001; чувствительность - 88,89%; специфичность - 75%; площадь под ROC-кривой - 0,917±0,0501.