ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО (SCHISANDRA CHINENSIS (TURCZ.) BAILL.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO
NUTRIENT MEDIUM FOR MICROREPRODUCTION OF CHINESE MAGNOLIA (SCHISANDRA CHINENSIS (TURCZ) BAILL) IN CONDITIONS IN VITRO

Использование: биотехнология и сельское хозяйство.
Сущность изобретения: Питательная среда, содержащая (мг/л): аммоний азотнокислый 400,0±12,0; калий азотнокислый 1800,0±54,0; магний сернокислый 360,0±10,8; калий фосфорнокислый 270,0±8,1; кальций азотнокислый 1200,0±36,0; железо сернокислое 27,8±0,83; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3±1,1; марганец сернокислый 1,0±0,03; борную кислоту 6,2±0,19; цинк сернокислый 8,6±0,26; натрий молибденовокислый 0,25±0,008; медь сернокислую 0,025±0,001; кобальт хлористый 0,025±0,001; калий йодистый 0,08±0,002; тиамин 0,4±0,01; пиридоксин 0,5±0,02; никотиновую кислоту 0,5±0,02; глицин 2,0±0,06; инозитол 100,0±3,0; гидролизат казеина 250,0±7,5; глюкозу 15000,0±450,0; агар 7000,0±210,0; 6-бензиламинопурин 1,0±0,03; индолилмасляную кислоту 0,1±0,003 и воду до 1 л. Заявляемое изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано для мультипликации культур, трудно размножаемых вегетативным способом.
Лимонник китайский (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) является ценным лекарственным растением, богатым биологически активными веществами и микроэлементами, и относится к трудно укореняемым культурам, вегетативное размножение которых методом зеленого черенкования затруднено и характеризуется низкой эффективностью. В настоящее время получены первые сорта этой нетрадиционной культуры, поэтому разработка результативных способов размножения, позволяющих сохранить сортовые признаки у вегетативного потомства, особенно актуальна.
Альтернативой зеленому черенкованию является метод клонального микроразмножения через культуру меристем, высокая эффективность которого уже доказана на примере многих сельскохозяйственных, декоративных и древесных растений. Однако до настоящего времени так и не определен состав питательной среды, обеспечивающей интенсивное формирование микропобегов лимонника из изолированных меристем. Этим объясняется то, что попытки культивировать лимонник in vitro так немногочисленны и пока что не принесли существенных положительных результатов.
Известна питательная среда, содержащая минеральную основу по Mura-shige-Skoog [1], зеатин 0,1 мг/л или 2-iP 1 мг/л и 1-3 мл/л настойки семян лимонника [3].
Также известна питательная среда, содержащая макроэлементы по Mura-shige-Skoog [1] и микроэлементы по Harada [4], мезоинозит 100 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамин 0,5 мг/л, пиридоксин 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, гидролизат казеина 500 мг/л, сахарозу 30 г/л, агар 7 г/л, а также 2-iP 5 мг/л или 6-БАП 0,25-0,5 мг/л [5].
Общими недостатками этих сред являются практически полное отсутствие коэффициента размножения, некроз тканей и высокий уровень гибели эксплантов, достигающий 65-70%. В результате за весь период культивирования получены лишь единичные регенеранты, высота которых не превышала 8-10 мм.
Известна питательная среда по прописи Lloyd-McCown [6] содержащая 6-БАП 1 мг/л, сахарозу 30 г/л и агар 7 г/л [7].
Несмотря на высокий коэффициент размножения, данная среда эффективна только когда в качестве первичных эксплантов используют семена с зародышем, а не почки, что не позволяет сохранить у вегетативного потомства генетические признаки материнского растения, и следовательно, не пригодна для микроразмножения сортов и ценных генотипов лимонника.
Наиболее близкой по своей сущности к заявленному изобретению является питательная среда, включающая макроэлементы по Murashige-Skoog [1], микроэлементы по Harada [4], мезоинозит 100 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиа-мин 0,5 мг/л, пиридоксин 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, гидролизат казеина 500 мг/л, сахарозу 30 г/л, агар 7 г/л, а так же 6-БАП 1 мг/л, ИМК 0,3 мг/л [8].
Недостатками прототипа являются длительный лаг-период (в течение нескольких месяцев) на этапе введения в культуру и постепенная гибель меристем в процессе культивирования. Данная пропись питательной среды не позволяет в полной мере реализовать регенерационный потенциал лимонника и получать побеги длиной свыше 1,5 см, пригодные для укоренения in vitro.
Целью изобретения является повышение коэффициента размножения и увеличение длины формирующихся побегов лимонника китайского в культуре in vitro.
Цель достигается за счет того, что питательная среда содержит (мг/л): аммоний азотнокислый 400,0±12,0; калий азотнокислый 1800,0±54,0; магний сернокислый 360,0±10,8; калий фосфорнокислый 270,0±8,1; кальций азотнокислый 1200,0±36,0; железо сернокислое 27,8±0,83; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3±1,1; марганец сернокислый 1,0±0,03; борную кислоту 6,2±0,19; цинк сернокислый 8,6±0,26; натрий молибденовокислый 0,25±0,008; медь сернокислую 0,025±0,001; кобальт хлористый 0,025±0,001; калий йодистый 0,08±0,002; тиамин 0,4±0,01; пиридоксин 0,5±0,02; никотиновую кислоту 0,5±0,02; глицин 2,0±0,06; инозитол 100,0±3,0; гидролизат казеина 250,0±7,5; глюкозу 15000,0±450,0; агар 7000,0±210,0; 6-бензиламинопурин 1,0±0,03; индолилмасляную кислоту 0,1±0,003 и воду до 1 л.
Пример 1. Экспланты лимонника, полученные из стерильных апикальных и латеральных почек, помещали на питательную среду, содержащую минеральную основу по Quoirin-Lepoivre в модификации Standardi-Catalano [2], витамины по Murashige-Skoog [1], регуляторы роста 6-БАП и ИМК, а также различные концентрации гидролизата казеина по вариантам.
Как следует из данных, представленных на фиг.1-2, гидролизат казеина в концентрации 250 мг/л значительно усиливал побегообразование лимонника in vitro. При этом микрочеренки в данном варианте опыта уже на 12 сутки культивирования и далее в течение пассажа превосходили контроль по величине коэффициента размножения. Различия существенны при пятипроцентном уровне значимости нулевой гипотезы (α=0,05).
Пример 2. Экспланты лимонника, полученные из стерильных апикальных и латеральных почек, в контроле помещали на среду по прописи Murashige-Skoog [1], в опыте - на питательную среду по Quoirin-Lepoivre в модификации Standardi-Catalano [2]. Среды включали одинаковый набор витаминов по Мурасиге-Скугу и регуляторов роста (6-БАП, ИМК). Каждый вариант дополнительно разбивали еще на два, содержащих 250 мг/л гидролизата казеина и без него (фиг.3). Экспланты, культивируемые на модифицированной среде QL, как с гидролизатом казеина так и без него существенно превосходили по коэффициенту размножения соответствующие контрольные варианты на среде Мурасиге-Скуга при пятипроцентном уровне значимости нулевой гипотезы (α=0,05), что подтверждает непригодность минеральной основы среды Мурасиге-Скуга для микроразмножения лимонника и демонстрирует явное преимущество предложенной модифицированной прописи перед существующими аналогами (фиг.4).
Пример 3. Экспланты лимонника, полученные из стерильных апикальных и латеральных почек, помещали на питательную среду заявленного состава, содержавшую 6-БАП, ИМК, гидролизат казеина 250 мг/л и различные типы и концентрации сахаров по вариантам (фиг.5). Замена в среде сахарозы на глюкозу в концентрации 15 г/л позволила существенно увеличить среднюю длину побега лимонника и получить в достаточном количестве побеги длиной свыше 1,5 см, пригодные для укоренения in vitro (фиг.6). Различия существенны при пятипроцентном уровне значимости нулевой гипотезы (α=0,05).
Представленные результаты исследований доказывают, что предлагаемая питательная среда для микроразмножения лимонника китайского впервые позволяет достигнуть коэффициента размножения, равного в среднем 2,2-2,4 новых побега на эксплант при средней длине побега 25,7 мм, используя в качестве эксплантов апикальные и латеральные почки, чего не удавалось добиться на известных средах-аналогах.
Источники информации
1. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol.5., №95 - P.473-497.
2. Standardi A., Catalano F. Tissue culture propagation of kiwifruit // Comb. proc. Intern, plant propagators' soc. - 1984. - vol.34. - P.236-243.
3. Туть Е.А. Ускорение вегетативного размножения оздоровленного посадочного материала актинидии и лимонника. Автореф. дис. … канд. с.-х. наук. - М., 2007. - 22 с.
4. Harada H. A new method for obtaining protoplasts from mesophyll cells // Z. Plantzenphysiol. - 1973. - vol.69. - №1. - P.77-80.
5. Туть Е.А., Упадышев М.Т. Особенности микроразмножения актинидии и лимонника китайского // Сельскохозяйственная биология. - 2008. - №3. - С.96-101.
6. Lloyd G., McCown В. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture // Comb. Proc. Intl. Prop. Soc. - 1980. - vol. 30. - P.421-427.
7. Hong M.H., Kim O.T., Park J.I., Hwang B. Micropropagation of Schisandra chinensis Baillon using glucose from cotyledonary nodes // J. of Plant Biology. - 2004. - vol. 47, №3. - P.270-274.
8. Упадышев М.Т., Туть Е.А. Особенности размножения актинидии и лимонника китайского in vitro и зелеными черенками // Плодоводство и ягодоводство в России: Сб. науч. работ. - М.: ВСТИСП, 2004. - T.XI. - С.200-209.