НОВАЯ ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
NOVEL IMMUNOTHERAPEUTIC COMPOSITION AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в целом относится к иммунотерапевтической композиции. Более конкретно, настоящее изобретение относится к иммунотерапевтической композиции, которая иммунологически взаимодействует с T-лимфоцитами у субъектов с аллергией на арахис или аллергией на другие древесные орехи. Данная композиция предпочтительно вступает в иммунологическое взаимодействие с T-клетками у субъектов с аллергией на аллергены Ara h 1 и/или Ara h 2. Композиция согласно настоящему изобретению является применимой в терапевтическом или профилактическом лечении состояний, характеризующихся аномальным, неадекватным или по другим причинам нежелательным иммунным ответом на арахис, Ara h 1, и/или Ara h 2, или их производное или гомолог.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Библиографические детали публикаций, на которые в данном описании делается ссылка по автору, в алфавитном порядке собраны в конце описания.
В данном описании ссылка на любой предшествующий уровень техники не является признанием или какой-либо формой предположения о том, что этот предшествующий уровень техники является частью общедоступных сведений, и не должна признаваться таковой.
et al. J Am Acad Dermatol
Lancet.
et al.
J Allergy Clin Immunol
Current Opinion in Allergy & Immunology.
et al. J Allergy Clin Immunol.
выше
et al.
Paediatrics
et al.
Clin Exp Allergy
et al
Med. J. Aust.
Аллергия на арахис является опасным для жизни и неизлечимым расстройством, поражающим примерно 1% всего населения (Husain. 66(1):136-43, 2012, Burks, 371(9623):1538-46, 2008). Оно характеризуется внезапным возникновением анафилаксии, которая может наблюдаться при воздействии незначительных количеств белков арахиса (Hourihane ,  100: 596-600, 1997; Pumphrey, 4(4):285-90, 2004). Анафилаксия, индуцированная арахисом, наиболее часто ассоциирована с летальным исходом или с опасными для жизни симптомами (Bock 119(4):1016-8, 2007; Burks 2008,). Белки арахиса часто являются скрытыми в очевидно безопасных пищевых продуктах, так что случайный контакт случается у вплоть до 50% пациентов в течение 5 лет (Sicherer ,  102: e6, 1998). Неудивительно, что аллергия на арахис и древесные орехи ассоциирована со значительными психологическими трудностями как для пациентов, так и лиц, осуществляющих уход, как и в случае с теми, кто страдает хроническими инвалидизирующими болезнями, такими как ревматоидный артрит (Primeau ,  30: 1135-43, 2000; Kemp .  188(9):503-4, 2008). Лечение, первоочередной задачей которого является устранение аллергии на арахис и древесные орехи как причины летального исхода, также является необходимым для устранения хронической психологической отягощенности у субъектов с аллергией на арахис.
et al.
et al.
J Allergy Clin Immunol
et al.
et al.
J Allergy Clin Immunol
et al. J. Allergy Clin. Immunol.
et al. J. Allergy Clin. Immunol.
et al.
Allergy
et al. J Allergy Clin Immunol.
et al. J Allergy Clin Immunol.
et al. Clin Exp Allergy.
Clin Exp Allergy.
et al. Int Arch Allergy Immunol.
et al. J Allergy Clin Immunol.
et al. J Allergy Clin Immunol.
et al.
Allergy
et al. J. Allergy Clin. Immunol.
К настоящему времени, попытки иммунотерапии аллергии на арахис привели к очень ограниченному успеху. Nelson  показали, что клиническая десенсибилизация в отношении арахиса может быть индуцирована с применением протокола интенсивной иммунотерапии c нефракционированным экстрактом арахиса, но эта клиническая десенсибилизация утрачивается у примерно половины субъектов при введении поддерживающих доз и, кроме того, эти инъекции ассоциированы с частыми эпизодами анафилаксии у большинства субъектов как на протяжении фазы повышения дозы, так и поддерживающей фазы (Nelson ,  99: 744-51, 1997). Oppenheimer  продемонстрировали аналогичные результаты в своем исследовании, еще раз показав, что активная терапия с использованием нефракционированного экстракта арахиса ассоциирована с высокой частотой системной анафилаксии. Сбор данных в этом исследовании был прекращен после введения экстракта арахиса субъекту, рандомизированному в группу плацебо, что в результате привело  к его смерти, подчеркивая опасную природу этого состояния (Oppenheimer ,  90: 256-62, 1992). Недавние исследования пероральной иммунотерапии с использованием муки из цельного арахиса подтверждают, что десенсибилизация является практически осуществимой, но наблюдаемые нежелательные реакции указывают на главные проблемы, связанные с безопасностью (Hofmann 124, 286, 2009; Jones 24, 292, 2009; Clark 64, 1218, 2009; Varshney 127(3):654-60, 2011; Varshney124(6):1351-2, 2009; Anagnostou 41(9):1273-81, 2011; Allen &O'Hehir. 41(9):1172-4, 2011; Yu 159(2):179-182, 2012; Thyagarajan 126(1):31-2, 2010; Blumchen 126(1):83-91, 2010). Даже исключая детей, предрасположенных к развитию тяжелых симптомов или астмы, в двух исследованиях сообщалось об анафилактическом шоке, в одном случае при начальной пищевой провокационной пробе (Clark 64, 1218, 2009), а в другом - в ходе лечения ребенка, у которого ранее не наблюдалась анафилаксия (Hofmann 124, 286, 2009).
et al.
Int Arch Allergy Appl Immunol
, J Allergy Clin Immunol.
, Nature Reviews: Drug Discovery.
, J Allergy Clin Immunol.
H
Разработка новых стратегий для решения проблем, связанных с иммунотерапией аллергеном, зависит от правильного понимания иммунологической основы успешной иммунотерапии, а также ее побочных эффектов. Уже давно было установлено, что осложнения, связанные с иммунотерапией аллергеном, обусловлены перекрестным сшиванием IgE, и что это воздействие не требуется для того, чтобы такая терапия была эффективной (Litwin ,  87: 361-61, 998). Также известно, что одним из критически важных для выработки толерантности воздействий традиционной (подкожная инъекция, или сублингвальное, или пероральное введение нефракционированного экстракта аллергена) иммунотерапии является ее способность изменять преобладающий фенотип специфических T-клеток с T2 на регуляторный фенотип. Эти регуляторные T-клетки осуществляют воздействие посредством продукции противовоспалительных цитокинов IL-10 и/или TGFβ. (Akdis & Akdis 123:735-46, 2009; Akdis & Akdis8:645-60. 2009; Akdis & Akdis127:18-27, 2011).
et al
Pharmacology & Therapeutics
et al. J Allergy Clin Immunol.
et al. Clin Exp Allergy
et al. J Allergy Clin Immunol.
et al.
Am J Respir Crit Care Med
et al.
J Allergy Clin Immunol
et al.
J Allergy Clin Immunol
et al. Lancet
et al.
Clin Exp Allergy
et al. Allergy
et al. J Allergy Clin Immunol.
Allergy.
et al. Expert Opin. Investig. Drugs.
©
Ключевое отличие ответа с участием антител и ответа с участием лимфоцитов связано с распознаванием антигена, причем антитела распознают конформационные B-клеточные эпитопы в зависимости от молекулярной третичной структуры, тогда как CD4+ T-клетки распознают короткие линейные пептиды. На этом отличии по распознаванию антигена основаны многие новые стратегии иммунотерапии, в том числе те, в которых используются пептиды на основе T-клеточных эпитопов, мутанты B-клеточных эпитопов и измененные пептидные лиганды (Rolland .  121:273-284, 2009). Все эти способы основываются на изменении или отсутствии молекулярной третичной структуры, так что не происходит перекрестное сшивание IgE и активация эффекторных клеток. Пептидная иммунотерапия является способом, для которого существуют доказательства эффективности, задокументированные как в случае аллергии на кошачью перхоть, так и аллергии на пчелиный яд. В трех различных исследованиях показано, что при отсутствии каких-либо системных побочных эффектов можно достичь клинической и иммунологической толерантности к основному аллергену пчелиного яда - фосфолипазе A2 (PLA2) с использованием последовательностей, содержащих T-клеточный эпитоп (Muller  101: 747-54, 1998; Tarzi . 36: 465-74, 2006; Fellrath 111: 854-61, 2003), тогда как в нескольких исследованиях продемонстрировано, что пептиды на основе структуры основного кошачьего аллергена Fel d 1 можно применять для индукции ослабленных клинических ответов (Norman ,  154: 1623-8, 1996; Marcotte ,  101: 506-13, 1998; Pene ,  102: 571-8, 1998; Oldfield360:47-53, 2002; Alexander  35: 52-8, 2004; Alexander 60:1269-74, 2005). Совсем недавно, в исследовании фазы IIa была подтверждена безопасность, переносимость и потенциальная эффективность смеси семи пептидов из Fel d 1 (Toleromune Cat, Cicassia Ltd., Оксфорд, Великобритания) (Worm 127: 89-97, 2011), причем в настоящее время продолжаются исследования фазы IIb (Moldaver & Larche. 66: 784-91, 2011; Worm  22(10): 1347-1357, 2013). Важным для разработки этих стратегий является удерживание T-клеточных эпитопов, достаточное для обеспечения возможности индукции изменения фенотипа T-клеток.
Allergy
et al
Proc Natl Acad Sci U S A
+
Способность связываться непосредственно с молекулами MHC класса II обеспечивает презентацию пептидов непрофессиональными или незрелыми APC без провоспалительных и костимуляторных сигналов, что способствует индукции толерантности, анергии и/или супрессивной активности в отношении T-клеток, участвующих в ответе (Moldaver & Larche, 66: 784-91, 2011) и/или других CD4 T-клеток, которые экспрессируют MHC класса II. Это также обеспечивает презентацию этих пептидов с более высокой частотой, чем пептидов, процессированных из целой молекулы (Santambrogio . , 1999, 96:15056-61), и, поскольку они также являются более безопасными, чем целый аллерген, пептиды можно давать при более высоких концентрациях, таким образом обеспечивая более эффективное изменение T-клеточных ответов.
et al
Clin Exp Allergy
et al
J Pept Sci
et al
Mol Immunol
et al
Allergy
et al
J Exp Med
et al
Vaccine
Что важно, целенаправленное воздействие на T-клетки, специфичные в отношении доминантных T-клеточных эпитопов основных аллергенов, может изменять ответы в отношении цельных экстрактов аллергена (связанная супрессия). Во многих исследованиях, в которых сообщается об успешной пептидной иммунотерапии в мышиных моделях аллергии, продемонстрировано, что введение пептидов на основе доминантных T-клеточных эпитопов основных аллергенов индуцировало толерантность не только к этим пептидам, но также к очищенному аллергену и цельным экстрактам аллергена (Yang .  40(4):668-78, 2010; Yoshitomi . . 13(8):499-503, 2007; Marazuela . . 45(2):438-45, 2008; Rupa . . 67(1):74-82, 2012; Hoyne . . 178(5):1783-8, 1993; Hall . . 21(5-6):549-61, 2003).
Следовательно, существует потребность как в идентификации основных аллергенов арахиса, так и, кроме того, в идентификации T-клеточных эпитопов этих аллергенов. Идентификация, характеристика и анализ этих T-клеточных эпитопов являются критически важными для разработки специфической иммунотерапевтической или профилактической методики. В связи с этим, несмотря на то, что ранее осуществляли анализ молекул аллергена арахиса Ara h 1 и/или Ara h 2, идентификация коровых участков T-клеточных эпитопов является необходимой для разработки эффективной вакцины.
В ходе работе, которая привела к настоящему изобретению, были идентифицированы коровые участки доминантных HLA-вырожденных T-клеточных эпитопов Ara h 1 и/или Ara h 2. Эта группа коровых участков T-клеточных эпитопов является уникальной в контексте ее высокого уровня эффективности. В отличие от ранее исследованных 20-мерных пептидов Ara h 1 и/или Ara h 2, которые были идентифицированы только исходя из их способности демонстрировать некоторый уровень T-клеточной реактивности, был идентифицирован выбранный набор коровых участков T-клеточных эпитопов, которые являются иммунодоминантными, по сравнению с другими пептидными фрагментами Ara h 1 и/или Ara h 2, а также являются HLA-вырожденными в том смысле, что они связываются с двумя или более типами HLA. Более того, многие из этих коровых участков T-клеточных эпитопов презентируются молекулами HLA-DQ. Молекулы HLA-DQ являются более консервативными в смешанных популяциях, чем молекулы HLA-DR. Следовательно, пептиды, презентированные на HLA-DQ, обеспечивают более широкий охват популяции.
С использованием дополнительных данных было определено, что специфическая подгруппа из семи этих пептидов, которые содержат T-клеточные эпитопы как Ara h 1, так и Ara h 2, обеспечивает особенно эффективные иммунологические результаты. Следовательно, идентификация этой группы пептидов с уникальной эффективностью обеспечила возможность разработки особенно эффективных терапевтических профилактических способов для лечения состояний, характеризующихся аномальными, неадекватными или по другим причинам нежелательными иммунными ответами на Ara h 1, и/или Ara h 2, или их производное или гомолог, форм аллергии на другие древесные орехи или аллергены в композиции, такой как продукты питания, содержащей молекулы Ara h 1 и/или Ara h 2.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
По всему данному описанию и в формуле изобретения, изложенной ниже, если исходя из контекста не требуется иное, слово “содержать” и вариации, такие как “содержит” и “содержащий”, следует понимать как подразумевающие включение указанного единого целого, или стадии, или группы единых целых или стадий, но не исключение какого-либо единого целого, или стадии, или группы единых целых или стадий.
Используемое в данном документе выражение “происходящий из” следует рассматривать как означающее, что конкретное единое целое или группа единых целых берет начало из указанного объекта, но не обязательно непосредственно получена из указанного источника. Кроме того, используемые в данном документе формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.
Если не указано иное, все технические и научные выражения, используемые в данном документе, имеют такое значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение.
Настоящее описание содержит информацию об аминокислотных последовательностях, подготовленную при помощи программы PatentIn версии 3.5, представленную в данном документе после списка цитированной литературы. Каждая аминокислотная последовательность идентифицирована в перечне последовательностей при помощи цифрового индикатора <210>, за которым следует идентификатор последовательности (например, <210>1, <210>2 и т. д.). Длина, тип последовательности (белок и т. д.) и организм-источник для каждой последовательности указан при помощи информации, представленной в полях цифровых индикаторов <211>, <212> и <213>, соответственно. Аминокислотные последовательности, на которые приведены ссылки в данном описании, идентифицированы при помощи индикатора SEQ ID NO:, за которым следует идентификатор последовательности (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и т. д.). Идентификатор последовательности, на который приведены ссылки в данном описании, соответствует информации, представленной в поле цифрового индикатора <400> в перечне последовательностей, за которым следует идентификатор последовательности (например, <400>1, <400>2 и т. д.). Таким образом, SEQ ID NO:1, как детально указано в данном описании, соответствует последовательности, указанной как <400>1 в перечне последовательностей.
Один аспект настоящего изобретения направлен на иммуномодулирующую композицию, содержащую по меньшей мере пять участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPXEQHLM (SEQ ID NO:7)
(viii) ENNQRXMXEA (SEQ ID NO:8)
или их функциональных производных или гомологов, где остаток X представляет собой цистеин или серин, и при этом указанная композиция содержит по меньшей мере один участок T-клеточного эпитопа, выбранный из SEQ ID NO: 1-6, и по меньшей мере один участок T-клеточного эпитопа, выбранный из SEQ ID NO: 7-8.
В другом аспекте указанный LRPXEQHLM представляет собой LRPSEQHLM (SEQ ID NO:137).
В другом аспекте указанный ENNQRXMXEA представляет собой ENNQRSMSEA (SEQ ID NO:138).
В соответствии с данными аспектами и вариантами осуществления настоящего изобретения, указанная композиция содержит по меньшей мере 6 указанных участков T-клеточных эпитопов.
В дополнительном аспекте указанная композиция содержит по меньшей мере 7 указанных участков T-клеточных эпитопов.
В дополнительном аспекте указанная композиция содержит каждый из указанных 8 участков T-клеточных эпитопов.
В другом аспекте предусматривается иммуномодулирующая композиция, содержащая каждый из участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPXEQHLM (SEQ ID NO:7)
(viii) ENNQRXMXEA (SEQ ID NO:8)
или их функциональных производных или гомологов, где указанный остаток X представляет собой цистеин или серин.
В другом аспекте предусматривается иммуномодулирующая композиция, содержащая каждый из участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPSEQHLM (SEQ ID NO:137)
(viii) ENNQRSMSEA (SEQ ID NO:138)
или их функциональных производных или гомологов.
В связанном аспекте настоящее изобретение направлено на иммуномодулирующую композицию, содержащую один или несколько пептидов, причем каждый из этих пептидов имеет длину до 60 смежных аминокислот, и эти пептиды предусматривают каждую из комбинаций участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2, детально описанных выше в данном документе.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение направлено на иммуномодулирующую композицию, содержащую один или несколько пептидов, причем каждый из этих пептидов имеет длину до 60 смежных аминокислот, и эти пептиды предусматривают каждый из участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPSEQHLM (SEQ ID NO:7)
(viii) ENNQRSMSEA (SEQ ID NO:8)
или их функциональных производных или гомологов.
В другом аспекте указанные пептиды или участки T-клеточных эпитопов способны модифицировать функцию T-клеток в случае презентации T-клеткам, выделенным от субъектов, имеющих состояние, характеризующееся аномальным, нежелательным или по другим причинам неадекватным иммунным ответом на Ara h 1, и/или Ara h 2, или аллерген, присутствующий в композиции, такой как продукт питания, содержащей Ara h 1 и/или Ara h 2, но эти пептиды неспособны связываться с Ara h 1-специфичными и/или Ara h 2-специфичными IgE.
В соответствии с данными аспектами, указанные пептиды выбраны из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPXEQHLM (SEQ ID NO:15)
(vii) EFENNQRXMXEALQ (SEQ ID NO:16)
(viii) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:17)
(ix) GDVFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO:18)
(x) SQLERANLRPXEQHLM (SEQ ID NO:19)
(xi) ELNEFENNQRXMXEALQ (SEQ ID NO:20)
(xii) FQNLQNHRIV (SEQ ID NO:21)
(xiii) RIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:22)
(xiv) ENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:23)
(xv) EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24)
(xvi) EFENNQRXMXEALQQI (SEQ ID NO:25)
(xvii) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:26)
(xviii) ELNEFENNQRXMXEALQQI (SEQ ID NO:27)
(xx) WSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:28)
(xxi) GDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:29)
или их функциональных производных или гомологов, где остаток X представляет собой цистеин или серин.
В одном варианте осуществления указанный остаток X представляет собой серин.
В дополнительном аспекте указанные пептиды выбраны из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ ID NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ ID NO:32)
(viii) EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24)
(ix) EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33)
или их функциональных производных или гомологов.
В другом аспекте указанная иммуномодулирующая композиция содержит каждый из T-клеточных пептидов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11);
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12);
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:34) и/или EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24);
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13);
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14);
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ ID NO:31); и
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ ID NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33).
или их функциональных производных или гомологов.
В дополнительном аспекте авторы настоящего изобретения создали предпочтительный набор из семи пептидов, пять из которых содержат T-клеточные эпитопы Ara h 1 и два из которых содержат T-клеточные эпитопы Ara h 2, которые функционируют особенно эффективно при совместном введении для индукции десенсибилизации или толерантности, и, таким образом, либо профилактического, либо терапевтического лечения гиперчувствительности к композициям, таким как продукты питания, содержащим Ara h 1 и/или Ara h 2. Эти пептиды являются следующими:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4) и/или EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24),
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33),
В другом аспекте предусматривается иммуномодулирующая композиция, содержащая каждый из T-клеточных пептидов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4) и/или EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24),
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33),
В другом аспекте предусматривается композиция, содержащая каждый из T-клеточных пептидов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:30)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4) и/или EVKPDKKNPQLD (SEQ ID NO:24),
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33),
причем эти пептиды способны уменьшать гиперчувствительность к Ara h 1 и/или Ara h 2 или гиперчувствительность к композиции, содержащей Ara h 1 и/или Ara h 2, при введении субъекту, имеющему состояние, характеризующееся указанной гиперчувствительностью.
Настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую пептиды, определенные выше в данном документе. При этом следует понимать, что настоящая композиция может содержать дополнительные компоненты, такие как дополнительные пептиды. Примеры других пептидов, которые могут быть включены в композицию, без ограничения включают:
(i) ALMLPHFNSKAMVIVVV (SEQ ID NO:34)
(ii) NNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO:35)
(iii) SQLERANLRPXEQ (SEQ ID NO:36)
(iv) ELNEFENNQRXM (SEQ ID NO:37)
(v) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:38)
(vi) NNFGKLFEVKPDKKNPQL (SEQ ID NO:40)
(vii) SQLERANLRPXEQH (SEQ ID NO:41)
(viii) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO:42)
(ix) RELRNLPQQXGLRA (SEQ ID NO:43)
(x) KAMVIVVVNKG (SEQ ID NO:44)
(xi) AMVIVVVNKGTGNLELV (SEQ ID NO:45)
(xii) VVNKGTGNLELVAVRK (SEQ ID NO:46)
или их функциональные производных или гомологи, где остаток X представляет собой цистеин или серин.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает композицию на основе молекулы нуклеиновой кислоты, содержащую одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют T-клеточные эпитопы и пептиды, определенные выше в данном документе, или их производное, гомолог или аналог, или являются комплементарными последовательности, которая их кодирует.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения и/или профилактики состояния у субъекта, причем это состояние характеризуется аномальным, нежелательным или по другим причинам неадекватным иммунным ответом на Ara h 1, и/или Ara h 2, или аллерген в композиции, содержащей Ara h 1 и/или Ara h 2, при этом указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества иммуномодулирующей композиции, определенной выше в данном документе, в течение периода времени и при условиях, достаточных для устранения или уменьшения присутствия или функционирования у указанного субъекта T-клеток, направленных против указанного Ara h 1, и/или Ara h 2, или другого аллергена.
В дополнительном аспекте указанное состояние представляет собой гиперчувствительность к разновидностям арахиса или древесным орехам, которые содержат Ara h 1 и Ara h 2 или молекулы, подобные Ara h 1 или подобные Ara h 2, таким как разновидности лещины, разновидности миндаля или разновидности бразильского ореха.
В другом аспекте указанный способ обеспечивает десенсибилизацию или индуцирует иммунологическую толерантность к Ara h 1, и/или Ara h 2, или другому аллергену из указанной композиции.
В другом аспекте указанную десенсибилизация или толератность обеспечивают путем индукции анергии или апоптоза T-клеток.
В другом аспекте указанную десенсибилизацию или толерантность обеспечивают путем индукции Treg клеток, специфичных в отношении Ara h 1 или Ara h 2.
Дополнительный аспект настоящего изобретения предусматривает применение иммуномодулирующей композиции, определенной выше в данном документе, для получения лекарственного препарата для лечения состояния у млекопитающего, причем это состояние характеризуется аномальным, нежелательным или по другим причинам неадекватным иммунным ответом на Ara h 1 и/или Ara h 2.
Предпочтительно указанное состояние представляет собой гиперчувствительность к разновидностям арахиса или древесному ореху, который содержит Ara h 1, и/или Ara h 2, или молекулы, подобные Ara h 1 и/или подобные Ara h 2, такому как лещина.
В другом дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает вакцину, содержащую композицию, определенную выше в данном документе, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями. Указанную композицию называют активным ингредиентом.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композициям, определенным выше в данном документе, применяемым в способе согласно настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
НаФигуре 1представлено графическое изображение скрининга при помощи CFSE в отношении пептид-специфичных T-клеток из PBMC.(A) CFSE-меченые PBMC от субъекта с аллергией на арахис инкубировали с экстрактом из цельного арахиса или Vax (набором из 7 пептидов). В прямоугольниках показан процент активированных пролиферирующих CD4+ T-клеток (CD25+CFSElo). SI указывает на кратное увеличение активации T-клеток по сравнению с контролем без антигена. (B) Подтверждение активации и пролиферации CD4+ T-клеток из PBMC от донора с аллергией на арахис в ответ на Vax (набор из 7 пептидов) для 7 субъектов (во всех случаях наблюдали положительное значение SI > 2,5).
На Фигуре 2 представлено графическое изображение теста активации базофилов (BAT)(A) графики FACS, на которых показано, что кровь от субъекта с аллергией на арахис инкубировали с экстрактом из цельного арахиса или Vax (набор из 7 пептидов). Базофилы идентифицировали как клетки IgEhi (прямоугольник, первый график), и активированные базофилы идентифицировали как CD63hi (прямоугольники, графики 2-4). (B) Данные BAT и (C) данные высвобождения гистамина (измеренные при помощи коммерческого набора) для субъекта с аллергией на арахис, полученные после инкубации с возрастающими концентрациями (мкг/мл) экстракта из цельного арахиса или Vax. Положительные контроли представляют собой антитела к IgE и fMLP. Экстракт из цельного арахиса приводит к высокому уровню активации базофилов и высвобождения гистамина, но Vax не приводит к этому. Представлены данные для 14 протестированных субъектов с аллергией на арахис.
НаФигуре 3 представлено схематическое изображение способа, используемого для идентификации доминантных эпитопов основных аллергенов арахиса Ara h 1 и Ara h 2.
На Фигуре 4 представлено графическое изображение анализа при помощи CFSE продолжительностью 7 дней, разработанного для выявления способности доминантных 20-мерных пептидов индуцировать пролиферацию T-клеток в цельном образце PBMC от доноров с аллергией на арахис. При помощи чисел в прямоугольниках указан % делящихся (низкое значение CFSE) CD4+ T-клеток, причем SI = кратное увеличение количества делящихся клеток по сравнению с нестимулированным контролем.
НаФигуре 5представлено графическое изображение, демонстрирующее частоту ответа линий T-клеток на 20-мерные пептиды Ara h 1. В прямоугольниках указаны 9 доминантных 20-меров, выбранных в конечном итоге (исходя из множества параметров).
На Фигуре 6 представлено графическое изображение скрининга PBMC с использованием доминантных 20-меров Ara h 1. Тестировали способность доминантных 20-меров целенаправленно воздействовать на специфические CD4+ T-клетки из PBMC от доноров с аллергией на арахис.
На Фигуре 7 представлено графическое изображение, демонстрирующее частоту ответа линий T-клеток на 20-мерные пептиды Ara h 2 и количество специфических TCL на 20-мер. В прямоугольниках указаны 4 доминантных 20-мера, выбранные в конечном итоге исходя из множества параметров.
На Фигуре 8представлено графическое изображение результатов картирования коровых T-клеточных эпитопов.
На Фигуре 9 представлено графическое изображение HLA-рестрикции доминантных T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2.
3
На Фигуре 10представлено графическое изображение распознавания T-клетками пептидов, в которых выбранные остатки цистеина были замещены остатками серина. Пролиферация TCL в ответ на 'исходные' (содержащие цистеин) пептиды Ara h 2 или таковые с заменой на серин, определенная при помощи поглощения H-тимидина. На диаграммах показаны репрезентативные TCL для каждого эпитопа (среднее значение cpm для лунок в повторностях +SD). A) Ara h 2 (32-44), B) Ara h 2 (37-47); C) Ara h 2 (91-102); D) Ara h 2 (95-107); E) Ara h 2 (128-141).
НаФигуре 11представлено графическое изображение продукции цитокинов T-клетками в ответ на пептиды, в которых выбранные остатки цистеина были замещены остатками серина. Секреция цитокинов в ответ на 'исходные' пептиды Ara h 2 или таковые с заменой цистеина определена при помощи ELISPOT. На диаграммах показаны репрезентативные TCL, специфичные в отношении каждого эпитопа (среднее значение бляшек для лунок в повторностях +SD). IL-4, черные столбцы; IL-5, заштрихованные столбцы; IFN-γ, белые столбцы; A) Ara h 2 (32-44), B) Ara h 2 (37-47); C) Ara h 2 (91-102); D) Ara h 2 (95-107); E) Ara h 2 (128-141).
На Фигуре 12 представлено графическое изображение ответов PBMC на объединенные образцы пептидов по сравнению с цельным арахисом. Пептиды, включенные в каждый объединенный образец, показаны в таблице 23. Для критерия знаковых рангов Уилкоксона для связанных выборок показаны p-значения (для непараметрических данных).
На Фигуре 13 представлено графическое изображение ответов PBMC на объединенные образцы пептидов по сравнению с цельным арахисом. Пептиды, включенные в каждый объединенный образец, показаны в таблице 23. Для критерия знаковых рангов Уилкоксона для связанных выборок показаны p-значения (для непараметрических данных).
На Фигуре 14представлено графическое изображение, на котором представлены T-клеточные ответы PBMC на объединенный образец 7 предпочтительных пептидов. Статистический анализ: критерий Краскела-Уоллиса для непараметрических данных с апостериорными поправками Данна для тестирования на предмет различий между несколькими группами. *данные, нормализованные в отношении % ответа на цельный арахис по причине вариации величин ответов у различных субъектов в различных когортах, которые анализировали с использованием различных объединенных образцов.
На Фигуре 15 представлено графическое изображение индуцированного пептидом Ara h 2 ингибирования пролиферации T-клеток.
На Фигуре 16 представлено графическое изображение индуцированного пептидом Ara h 1 ингибирования пролиферации T-клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение отчасти основывается на идентификации группы эпитопов Ara h 1 и Ara h 2, которые, при совместном введении в группе по меньшей мере из пяти, приводят к более эффективным иммунологическим результатам, чем любой из этих эпитопов, применяемый либо отдельно, либо вместе с другими комбинациями этих или других пептидов Ara h 1 или Ara h 2. В частности, было определено, что применение всех восьми эпитопов приводит к особенно и исключительно эффективным функциональным результатам, в особенности, если эти восемь эпитопов вводятся в контексте семи пептидов, приведенных в качестве примера в данном документе. Создание данной композиции обеспечило возможность разработки значительно более эффективных терапевтических и профилактических композиций и подходов к лечению, чем те, которые были доступны к настоящему времени, для лечения состояний, таких как, без ограничения, аллергия на арахис.
Следовательно, один аспект настоящего изобретения направлен на иммуномодулирующую композицию, содержащую по меньшей мере пять участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPXEQHLM (SEQ ID NO:7)
(viii) ENNQRXMXEA (SEQ ID NO:8)
или их функциональных производных или гомологов, где остаток X представляет собой цистеин или серин, и при этом указанная композиция содержит по меньшей мере один участок T-клеточного эпитопа, выбранный из SEQ ID NO: 1-6, и по меньшей мере один участок T-клеточного эпитопа, выбранный из SEQ ID NO: 7-8.
В одном варианте осуществления указанный LRPXEQHLM представляет собой LRPSEQHLM (SEQ ID NO:137).
В другом варианте осуществления указанный ENNQRXMXEA представляет собой ENNQRSMSEA (SEQ ID NO:138).
В соответствии с данными аспектами и вариантами осуществления настоящего изобретения, указанная композиция содержит по меньшей мере 6 указанных участков T-клеточных эпитопов.
В дополнительном варианте осуществления указанная композиция содержит по меньшей мере 7 указанных участков T-клеточных эпитопов.
В дополнительном варианте осуществления указанная композиция содержит каждый из указанных 8 участков T-клеточных эпитопов.
В соответствии с данным вариантом осуществления, таким образом, предусматривается иммуномодулирующая композиция, содержащая каждый из участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPXEQHLM (SEQ ID NO:7)
(viii) ENNQRXMXEA (SEQ ID NO:8)
или их функциональных производных или гомологов, где указанный остаток X представляет собой цистеин или серин.
В другом варианте осуществления предусматривается иммуномодулирующая композиция, содержащая каждый из участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPSEQHLM (SEQ ID NO:137)
(viii) ENNQRSMSEA (SEQ ID NO:138)
или их функциональных производных или гомологов.
В связанном аспекте настоящее изобретение направлено на иммуномодулирующую композицию, содержащую один или несколько пептидов, причем каждый из этих пептидов имеет длину до 60 смежных аминокислот, и эти пептиды предусматривают каждую из комбинаций участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2, детально описанных выше в данном документе.
В соответствии с данным аспектом, настоящее изобретение направлено на иммуномодулирующую композицию, содержащую один или несколько пептидов, причем каждый из этих пептидов имеет длину до 60 смежных аминокислот, и эти пептиды предусматривают каждый из участков T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO:1)
(ii) IVQIEA (SEQ ID NO:2)
(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO:3)
(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(v) EGALML (SEQ ID NO:5)
(vi) IMPAAHP (SEQ ID NO:6)
(vii) LRPSEQHLM (SEQ ID NO:7)
(viii) ENNQRSMSEA (SEQ ID NO:8)
или их функциональных производных или гомологов.
В другом варианте осуществления согласно предыдущим аспектам настоящего изобретения указанные пептиды или участки T-клеточных эпитопов способны модифицировать функцию T-клеток в случае презентации T-клеткам, выделенным от субъектов, имеющих состояние, характеризующееся аномальным, нежелательным или по другим причинам неадекватным иммунным ответом на Ara h 1, и/или Ara h 2, или аллерген, присутствующий в композиции, такой как продукт питания, содержащей Ara h 1 и/или Ara h 2, но эти пептиды неспособны связываться с Ara h 1-специфичными и/или Ara h 2-специфичными IgE.
et al.
Clin Exp Allergy
et al.
Allergy
et al
Clin Exp Allergy
et al
Clin Exp Allergy
et al
Clin Immunol
et al
Allergy
et al
Pediatr Allergy Immunol
et al
Allergy
et al
Int Arch Allergy Immunol
et al
J Microbiol Immunol Infect
et al
Clin Exp Allergy
et al
Allergy
Без ограничения настоящего изобретения каким-либо образом, разновидности арахиса содержат много белков, при этом количество различимых полос, видимых при SDS-PAGE, зависит от применяемой методики. До 53 полос являются видимыми при жидкостной хроматографии высокого давления (de Jong ,  28: 743-51, 1998). Только два из этих белков обоснованно классифицируются как основные аллергены с применением стандартных критериев, при этом IgE-реактивность наблюдается у более чем 50% популяции с аллергией на арахис; причем эти белки называются Ara h 1 и Ara h 2 (Burks ,  53: 725-30, 1998). Несмотря на то, что в ряде исследований было показано, что Ara h 2 является более сильным из этих двух аллергенов (Blanc . . 2009; 39(8):1277-85; Koppelman . . 2004; 34(4):583-90; Palmer . . 2005; 115(3):302-12), Ara h 1 также играет основную роль в патогенезе аллергии на арахис, причем в многочисленных исследованиях сообщается о сильных корреляциях тяжести симптомов и IgE-реактивности как в отношении Ara h 1, так и в отношении Ara h 2 (Glaumann . . 2012; 67(2):242-7; Chiang . . 2009; 21(2 Pt 2):e429-38; Asarnoj . . 2010, 65(9):1189-95; Moverare .  2011; 156(3):282-90; Lin . . 2012; Peeters . . 2007; 37(1):108-15). Ara h 1 является наиболее распространенным основным антигеном арахиса, на него приходится 12-16% от общего белка арахиса (Koppelman . . 2001; 56(2):132-7).
et al
Clin. Exp. Allergy
Без ограничения настоящего изобретения каким-либо образом, аллерген Ara h 1 представляет собой 7S гликопротеин, накапливающийся в семенах, или вицилин. Концентрация Ara h 1 у разновидностей арахиса возрастает вместе с размером зерна (4-16 мг экстрагированного Ara h 1/г арахиса), так что экспрессия белка ассоциирована со зрелостью арахиса (Pomés . 2006,  36(6):824-30). Ara h 1 представляет собой гомотример, удерживаемый вместе благодаря гидрофобным областям на дистальных концах мономеров, где расположено большинство B-клеточных эпитопов, связывающихся с IgE. Каждый 64,5 кДа мономер содержит мотив cupin, который состоит из двух β-бочонков, каждый из которых связан с петлевым доменом α-спиралей.
Int Arch Allergy Immunol
выше
et al.
et al.
Clin Exp Allergy
выше
et al.
Int Arch Allergy Immunol
Ara h 2 представляет собой гликопротеин, который был идентифицирован как представитель семейства конглютинов, накапливающихся в семенах. 20% молекулярной массы Ara h 2 представляют собой углеводные боковые цепи, и при этом при SDS-PAGE он перемещается в виде дублета со средней молекулярной массой 17,5 кДа (Burks et al,  119:165-172, 1992). Он был охарактеризован как основной аллерген исходя из его реактивности с 6 из 6 протестированных сывороток (Burks et al, 1992, ). Другие данные также подтвердили его важное значение; причем Clarke продемонстрировал, что у 71% субъектов наблюдались специфичные IgE к Ara h 2 при вестерн-блоттинге с использованием неочищенного экстракта арахиса. Kleber-Janke  продемонстрировали, что у 85% субъектов при вестерн-блоттинге наблюдались IgE к его рекомбиантной форме, и при этом для группы de Jong было показано, что примерно 78% его группы демонстрировали специфичные IgE к очищенному природному Ara h 2 (Clarke ,  28: 1251-7, 1998; de Jong et al, 1998, ; Kleber-Janke ,  119: 265-274, 1999).
Ссылку на “Ara h 1” следует понимать как ссылку на все формы этой молекулы, в том числе ссылку на любые изоформы, которые могут возникнуть в результате альтернативного сплайсинга мРНК Ara h 1, или функциональные мутантные или полиморфные формы Ara h 1. Также ее следует понимать как охватывающую любой белок, кодируемый геном Ara h 1, любую субъединицу полипептида, например, формы-предшественники, которые могут образоваться, независимо от того, существуют ли они в виде мономера, мультимера или белка слияния. Она также предусматривает ссылку на аналоги или эквиваленты Ara h 1, например, которые могут возникать, если продукт, который в естественных условиях содержит Ara h 1, получают синтетическим путем с целью получения продукта, такого как пищевая добавка. Настоящее изобретение, таким образом, предусматривает T-клеточные эпитопы и способы их применения в диагностике и лечении любого состояния, характеризующегося гиперчувствительностью к молекуле Ara h 1 или молекуле, подобной Ara h 1, такого как аллергия на арахис, или аллергия на древесный орех, или аллергия на антиген, присутствующий в композиции, такой как продукт питания, причем композиция также содержит Ara h 1. Предпочтительно указанный Ara h 1 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO:9, и при этом Ara h 2 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10.
Ссылку на “T-клетки” следует понимать как ссылку на любую клетку, содержащую T-клеточный рецептор. При этом T-клеточный рецептор может содержать любую одну или несколько цепей α, β, γ или δ. Не предполагается ограничение настоящего изобретения конкретным функциональным подклассом T-клеток, несмотря на то, что в предпочтительном варианте осуществления данная T-клетка представляет собой T-хелпер и более предпочтительно клетку Th2-типа и/или Treg клетку. При этом ссылку на “модификацию функции T-клетки” следует понимать как ссылку на модификацию любой одной или нескольких функций, которые T-клетка способна выполнять. Например, данная функция может представлять собой пролиферацию, дифференцировку или другую форму функциональной активности клетки, такую как продукция цитокинов. В одном варианте осуществления данная функциональная активность представляет собой пролиферацию.
in vitro
in vivo
В контексте “модификации функции” T-клеток, выделенных от субъектов, имеющих состояние, характеризующееся аномальным, нежелательным или неадекватным иммунным ответом на Ara h 1, и/или Ara h 2, или на композицию, которая содержит Ara h 1 и/или Ara h 2, следует понимать, что это не обязательно является ссылкой на модификацию функции всех T-клеток в данном биологическом образце, но, вероятно, фактически отражает модификацию функционирования только некоторых из T-клеток в образце. Например, только часть T-хелперов в данном образце T-клеток может давать функциональный ответ на контакт с данным пептидом. Следует понимать, что такой частичный ответ попадает в пределы объема настоящего изобретения. Также следует понимать, что T-клетки, полученные от субъекта, могут быть свежеотобранными T-клетками или они могут подвергаться некоторой форме  или  манипуляции перед тестированием. Например, линии T-клеток могут быть получены из образца клеток, и эти линии T-клеток затем образуют популяцию T-клеток, полученных от субъекта, тестирование которой осуществляют в соответствии с настоящим изобретением. В тех случаях, когда данная функциональная активность представляет собой пролиферацию T-клеток, анализ пролиферации T-клеток предпочтительно осуществляют так, как раскрыто в данном документе. Еще более предпочтительно данная модификация функции T-клеток представляет собой индукцию пролиферации. При этом ссылку на "Ara h 1-реактивные" или "Arah 2-реактивные" T-клетки следует понимать как ссылку на T-клетку, которая дает функциональный ответ на опосредованную HLA презентацию T-клеточного эпитопа Ara h 1 и/или Ara h 2, соответственно. Аналогично, ссылку на “Ara h 1-специфичные” или "Ara h 2-специфичные" IgE следует понимать как ссылку на IgE, направленные против B-клеточных эпитопов Ara h 1 или Ara h 2, соответственно.
Ссылку на “аномальный, нежелательный или по другим причинам неадекватный” иммунный ответ следует понимать как ссылку на любую форму физиологической активности, которая предусматривает активацию и/или функционирование одной или нескольких иммунных клеток, причем неадекватность этой активности заключается в неадекватном типе или развитии ее неадекватной степени. Он может быть аномальным в том смысле, что, в соответствии с известными принципами иммунологии, он либо не должен возникать тогда, когда он возникает, либо, в ином случае, должен возникать тогда, когда он не возникает. В другом примере, иммунный ответ может быть неадекватным в том смысле, что хотя он и представляет собой физиологически нормальный ответ, он является ненужным и/или нежелательным, например, как в случае реакции гиперчувствительности I типа на безвредные аллергены. В контексте настоящего изобретения этот иммунный ответ может быть направлен против Ara h 1 и/или Ara h 2, или он может быть направлен против другого аллергена, который присутствует в композиции вместе с Ara h 1 и/или Ara h 2. Без ограничения настоящего изобретения какой-либо теорией или механизмом действия, было определено, что даже если реакция гиперчувствительности направлена против аллергена, отличного от Ara h 1 и/или Ara h 2, причем этот аллерген присутствует в композиции, которая все же содержит Ara h 1 и/или Ara h 2, лечение посредством способа согласно настоящему изобретению, направленное против Ara h 1 и/или Ara h 2 все же индуцирует благоприятное модулирование функций Th2 и Treg, так что существующая гиперчувствительность к неродственному аллергену все же уменьшается. Предпочтительно указанным иммунным ответом является гиперчувствительность к арахису.
“Гиперчувствительность к арахису” означает индукцию клинических симптомов опосредованной IgE гиперчувствительности к арахису. Однако следует понимать, что несмотря на то, что клинические симптомы могут быть очевидными, не у всех этих индивидов обязательно будут проявляться выявляемые уровни сывороточного IgE, специфичного к арахису, что измеряют при помощи системы Kallestad Allercoat EAST (Sanofi-Pasteur Diagnostics, США), тем не менее все же следует понимать, что эти индивиды охвачены объемом определения, относящегося к таким, у которых проявляется “гиперчувствительность к арахису”. В альтернативном варианте, можно осуществлять тестирование с использованием любой из систем EAST, Pharmacia или UniCap или кожную скарификационную пробу с аллергеном. Ссылку на “гиперчувствительность к Ara h 1 и/или Ara h 2” следует понимать как имеющую соответствующее значение в контексте реактивности в отношении белка Ara h 1 и/или Ara h 2.
В соответствии с предыдущими аспектами, указанные пептиды выбраны из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPXEQHLM (SEQ ID NO:15)
(vii) EFENNQRXMXEALQ (SEQ ID NO:16)
(viii) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:17)
(ix) GDVFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO:18)
(x) SQLERANLRPXEQHLM (SEQ ID NO:19)
(xi) ELNEFENNQRXMXEALQ (SEQ ID NO:20)
(xii) FQNLQNHRIV (SEQ ID NO:21)
(xiii) RIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:22)
(xiv) ENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:23)
(xv) EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24)
(xvi) EFENNQRXMXEALQQI (SEQ ID NO:25)
(xvii) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:26)
(xviii) ELNEFENNQRXMXEALQQI (SEQ ID NO:27)
(xx) WSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:28)
(xxi) GDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:29)
или их функциональных производных или гомологов, где остаток X представляет собой цистеин или серин.
В одном варианте осуществления указанный остаток X представляет собой серин.
Предпочтительно указанные пептиды выбраны из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4)
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ ID NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ ID NO:32)
(viii) EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24)
(ix) EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33)
или их функциональных производных или гомологов.
В другом варианте осуществления указанная иммуномодулирующая композиция содержит каждый из T-клеточных пептидов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11);
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12);
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:34) и/или EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24);
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13);
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14);
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ ID NO:31); и
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ ID NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33).
или их функциональных производных или гомологов.
Уменьшение гиперчувствительности к арахису, Ara h 1 и Ara h 2 (и в целом гиперчувствительности к аллергену) более детально обсуждается далее в данном документе. Вкратце, однако, это может принимать форму либо частичной, либо полной десенсибилизации или толеризации индивида в отношении конкретно Ara h 1 и Ara h 2 или арахиса или других белков в целом.
Ссылка на “пептид” предусматривает ссылку на пептид, полипептид, или белок, или их части. Пептид может быть гликозилированным или негликозилированным и/или может содержать ряд других молекул, слитых, соединенных, связанных или иным образом ассоциированных с белком, таких как аминокислоты, липиды, углеводы или другие пептиды, полипептиды или белки. Далее в данном документе ссылка на “пептид” предусматривает пептид, содержащий последовательность аминокислот, а также пептид, ассоциированный с другими молекулами, такими как аминокислоты, липиды, углеводы или другие пептиды, полипептиды или белки.
“Производные” предусматривают фрагменты, части, сегменты и варианты из природных, синтетических или рекомбинантных источников, в том числе белки слияния. Части или фрагменты предусматривают, например, активные участки данного пептида. Производные могут быть получены в результате вставки, делеции или замены аминокислот. Производные со вставкой аминокислот предусматривают слияния по амино- и/или карбокси-концу, а также вставки одной или нескольких аминокислот внутрь последовательности. К вариантам аминокислотной последовательности со вставкой относятся варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков введены в предварительно определенный участок белка, при этом также возможна случайная вставка с подходящим скринингом полученного в результате продукта. Варианты с делецией характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности.
К вариантам с заменой аминокислот относятся варианты, в которых по меньшей мере один остаток в последовательности был удален, а другой остаток вставлен на его место. Примером вариантов с заменой аминокислот являются консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены, как правило, предусматривают замены в пределах следующих групп: глицин и аланин; валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; а также фенилаланин и тирозин. Добавления к аминокислотным последовательностям предусматривают слияния с другими пептидами, полипептидами или белками. В одном варианте осуществления остатки цистеина заменены серином, как приведено в качестве примера в данном документе.
Химические и функциональные эквиваленты данного пептида следует понимать как молекулы, демонстрирующие любую одну или несколько из функциональных активностей этих молекул, и при этом они могут быть получены из любого источника, например, путем химического синтеза, или идентифицированы посредством способов скрининга, таких как скрининг продуктов природного происхождения.
Гомологи предусматривают пептиды, полученные из разновидностей, отличных от разновидностей арахиса, такие как пептиды, полученные из других древесных орехов.
Аналоги, которые предусматриваются в данном документе, без ограничения подразумевают модификацию боковых цепей, включение неприродных аминокислот и/или их производных в ходе синтеза пептида, полипептида или белка и применение сшивающих средств и других способов, которые накладывают конформационные ограничения на белковые молекулы или их аналоги. Мутанты предусматривают молекулы, которые демонстрируют модифицированную функциональную активность (например, пептиды Ara h 1, которые характеризуются одним или несколькими T-клеточными эпитопами, но характеризуются отсутствием B-клеточной реактивности).
Примеры модификаций боковых цепей, которые предусматриваются согласно настоящему изобретению, подразумевают модификации аминогрупп, например, путем восстановительного алкилирования посредством реакции с альдегидом с последующим восстановлением NaBH4; амидирование метилацетимидатом; ацилирование уксусным ангидридом; карбамоилирование аминогрупп цианатом; тринитробензилирование аминогрупп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS); ацилирование аминогрупп янтарным ангидридом и тетрагидрофталевым ангидридом; а также пиридоксилирование лизина пиридоксаль-5-фосфатом с последующим восстановлением NaBH4.
Гуанидиновая группа остатков аргинина может быть модифицирована посредством образования гетероциклических продуктов конденсации с реактивами, такими как 2,3-бутандион, фенилглиоксаль и глиоксаль. Карбоксильная группа может быть модифицирована путем активации карбодиимидом посредствомобразованияO-ацилизомочевины с последующей дальнейшей дериватизацией, например, с использованием соответствующего амида. Сульфгидрильные группы могут быть модифицированы посредством способов, таких как карбоксиметилирование йодуксусной кислотой или йодацетамидом; окисление цистеиновой кислоты надмуравьиной кислотой; образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями; реакция с малеимидом, малеиновым ангидридом или другим замещенным малеимидом; образование ртутьсодержащих производных с использованием 4-хлорортутьбензоата, 4-хлорортутьфенилсульфоновой кислоты, хлорида фенилртути, 2-хлорортуть-4-нитрофенола и других ртутьсодержащих соединений; карбамоилирование цианатом при щелочном pH. Остатки триптофана могут быть модифицированы путем, например, окисления N-бромсукцинимидом или алкилирования индольного кольца 2-гидрокси-5-нитробензилбромидом или сульфенилгалогенидами. В случае остатков тирозина, они могут быть изменены путем нитрования тетранитрометаном с образованием 3-нитротирозинового производного.
Модификацию имидазольного кольца остатка гистидина можно осуществлять путем алкилирования производными йодуксусной кислоты или N-карбоэтоксилирования диэтилпирокарбонатом.
Примеры включения неприродных аминокислот и производных в ходе синтеза белка без ограничения предусматривают применение норлейцина, 4-аминомасляной кислоты, 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты, 6-аминогексановой кислоты, трет-бутилглицина, норвалина, фенилглицина, орнитина, саркозина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты, 2-тиенилаланина и/или D-изомеров аминокислот. Перечень неприродных аминокислот, которые предусматриваются в данном документе, представлен в таблице 1.
Можно использовать сшивающие средства, например, для стабилизации 3D конформаций с применением гомобифункциональных сшивающих средств, таких как бифункциональные сложные имидоэфиры со спейсерными группами (CH2)n, причем от n=1 до n=6, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры и гетеробифункциональные реактивы, которые обычно содержат фрагмент, способный вступать в реакцию с амином, например, N-гидроксисукцинимид, и фрагмент, способный вступать в реакцию с другой специфической группой.
Возможно модифицировать структуру пептида в соответствии с настоящим изобретением для различных целей, например, для повышения растворимости, увеличения терапевтической или профилактической эффективности, увеличения стабильности или повышения устойчивости к протеолитическому распаду. Можно получить модифицированный пептид, в котором была изменена аминокислотная последовательность, например, путем аминокислотной замены, делеции или добавления, для модификации иммуногенности и/или уменьшения аллергенности. Аналогично, к пептидам согласно настоящему изобретению можно добавлять компоненты с получением одного и того же результата.
Например, пептид можно модифицировать так, что он характеризуется способностью индуцировать анергию T-клеток. В этом случае, остатки, критически важные для связывания с T-клеточным рецептором, можно определять при помощи известных методик (например, замены каждого остатка и определения наличия или отсутствия T-клеточной реактивности). В одном примере эти остатки, которые, как показано, являются необходимыми для взаимодействия с T-клеточным рецептором, можно модифицировать путем замещения необходимой аминокислоты другим, предпочтительно аналогичным аминокислотным остатком (консервативная замена), наличие которого, как показано, изменяет T-клеточную реактивность или функционирование T-клеток. Кроме того, эти аминокислотные остатки, которые не являются необходимыми для взаимодействия с T-клеточным рецептором, можно модифицировать путем замещения другой аминокислотой, включение которой впоследствии может изменять T-клеточную реактивность или функционирование T-клеток, но не предотвращает, например, связывание с соответствующими белками MHC. В другом примере можно создать мутантные пептиды, которые характеризуются нормальным связыванием с T-клетками, но нарушенным связыванием с IgE.
Приведенные в качестве примера консервативные замены детально описаны ниже и включают следующие.
<b>Исходный остаток</b>
<b>Замены, приведенные в качестве примера</b>
Ala
Ser
Arg
Lys
Asn
Gln, His
Asp
Glu
Cys
Ser, Ala
Gln
Asn
Glu
Asp
Gly
Pro
His
Asn, Gln
Ile
Leu, Val
Leu
Ile, Val
Lys
Arg, Gln, Glu
Met
Leu, Ile
Phe
Met, Leu, Tyr
Ser
Thr
Thr
Ser
Trp
Tyr
Tyr
Trp, Phe
Val
Ile, Leu
Такие модификации приведут в результате к получению молекул, попадающих в пределы объема выражения “мутанты” данного пептида, как определено в данном документе. Следует понимать, что выражение “мутанты” означает ссылку на пептиды, которые характеризуются одной или несколькими структурными особенностями или функциональными активностями, которые отличаются от тех, которыми характеризуются соответствующие немутированные пептиды.
Пептиды согласно настоящему изобретению также можно модифицировать так, чтобы они включали один или несколько полиморфизмов, возникающих в результате природного аллельного разнообразия, и при этом можно осуществлять замены с введением D-аминокислот, аминокислот, отличных от природных, или аналогов аминокислот в пептиды с получением модифицированных пептидов, попадающих в пределы объема настоящего изобретения. Пептиды также можно модифицировать посредством конъюгирования с полиэтиленгликолем (PEG) при помощи известных методик. Также можно добавлять репортерные группы для облегчения очистки и потенциального повышения растворимости пептидов в соответствии с настоящим изобретением. Другие хорошо известные типы модификации, предусматривающие вставку сайтов расщепления для специфической эндопротеазы, добавление функциональных групп или замещение гидрофобных остатков менее гидрофобными остатками, а также сайт-направленный мутагенез ДНК, кодирующей пептиды согласно настоящему изобретению также можно применять для введения модификаций, которые могут быть применимыми для широкого спектра целей. Различные модификации пептидов в соответствии с настоящим изобретением, которые были упомянуты выше, упоминаются только в качестве примера и предназначены исключительно для того, чтобы показать широкий спектр модификаций, которые можно осуществлять.
Как детально описано ниже в данном документе, настоящее изобретение предусматривает пептиды, которые сохраняют все или некоторые из их способностей взаимодействовать с T-клетками, но характеризуются частично или полностью ингибированной, нарушенной или иным образом сниженной реактивностью, опосредованной антителами. Снижения реактивности, опосредованной антителами, можно достичь посредством любого подходящего способа, причем эти способы будут хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, в тех случаях, когда B-клеточный эпитоп определяется его линейной аминокислотной последовательностью, можно добавлять, удалять или заменять один или несколько аминокислотных остатков для ее превращения в мутированную линейную последовательность, которая отличается от последовательности, встречающейся в природе. В тех случаях, когда этот эпитоп может дополнительно или альтернативно определяться как конформационный эпитоп, можно обеспечивать нарушение этой конформации посредством нарушения 2-мерной или, в тех случаях, когда существуют гомодимеры или гетеродимеры, 3-мерной структуры пептида. Это можно осуществлять, например, посредством нарушения образования связей, таких как дисульфидные связи, которые, как известно, стабилизируют 2-мерные и/или 3-мерные структуры. В контексте T-клеточных эпитопов, определенных выше в данном документе, эти участки T-клеточных эпитопов не являются B-клеточными эпитопами.
В связанном аспекте авторы настоящего изобретения создали предпочтительный набор из семи пептидов, пять из которых содержат T-клеточные эпитопы Ara h 1 и два из которых содержат T-клеточные эпитопы Ara h 2, которые функционируют особенно эффективно при совместном введении для индукции десенсибилизации или толерантности, и, таким образом, либо профилактического, либо терапевтического лечения гиперчувствительности к композициям, таким как продукты питания, содержащим Ara h 1 и/или Ara h 2. Эти пептиды являются следующими:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4) и/или EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24),
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33),
Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления предусматривается иммуномодулирующая композиция, содержащая каждый из T-клеточных пептидов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4) и/или EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24),
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33),
В дополнительном аспекте предусматривается композиция, содержащая каждый из T-клеточных пептидов Ara h 1 и Ara h 2 из перечня, состоящего из:
(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO:11)
(ii) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12)
(iii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO:4) и/или EVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:24),
(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:13)
(v) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:14)
(vi) ANLRPSEQHLM (SEQ NO:31)
(vii) EFENNQRSMSEALQ (SEQ NO:32) и/или EFENNQRSMSEALQQI (SEQ ID NO:33),
причем эти пептиды способны уменьшать гиперчувствительность к Ara h 1 и/или Ara h 2 или гиперчувствительность к композиции, содержащей Ara h 1 и/или Ara h 2, при введении субъекту, имеющему состояние, характеризующееся указанной гиперчувствительностью.
Пептиды согласно настоящему изобретению можно получать посредством рекомбинантных способов или способов химического синтеза. В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения предусматривается рекомбинантный пептид или его мутант, который предпочтительно вступает в иммунологическую реакцию с T-клетками от индивидов с гиперчувствительностью к арахису, причем он экспрессируется посредством экспрессии в клетке-хозяине, трансформированной вектором, кодирующим последовательность пептида согласно настоящему изобретению. Пептид может быть слитым с другим пептидом, полипептидом или белком. В альтернативном варианте, пептид может быть получен посредством методик химического синтеза, например, посредством метода твердофазного синтеза Меррифилда. Более того, несмотря на то, что синтетические пептиды с последовательностью, приведенной выше, представляют собой предпочтительный вариант осуществления, настоящее изобретение также охватывает биологически чистые препараты пептидов, встречающихся в природе, или их фрагментов. “Биологически чистый” означает препарат, содержащий по меньшей мере приблизительно 60%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70% или предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% или более при определении по весу, активности или при помощи других подходящих способов.
Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает пептиды, которые содержат по меньшей мере один коровый участок T-клеточного эпитопа Ara h 1 и/или Ara h 2, как определено выше в данном документе, в сочетании с другими аминокислотами (которые могут быть или могут не быть встречающимися в природе) или другими химическими веществами. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения такие пептиды могут содержать один или несколько эпитопов Ara h 1 и/или Ara h 2, причем эти эпитопы представляют собой коровые участки T-клеточных эпитопов. Пептиды с одним или несколькими T-клеточными эпитопами Ara h 1 и/или Ara h 2 являются необходимыми для улучшенной терапевтической эффективности.
Как детально описано ниже в данном документе, настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую пептиды, определенные выше в данном документе. При этом следует понимать, что настоящая композиция может содержать дополнительные компоненты, такие как дополнительные пептиды. Эти пептиды могут охватывать, например, части участков корового минимального эпитопа. В альтернативном варианте, они могут не содержать какую-либо часть T-клеточного эпитопа, раскрытого в данном документе, но могут быть включены по другим причинам. Примеры других пептидов, которые могут быть включены в композицию, без ограничения включают:
(i) ALMLPHFNSKAMVIVVV (SEQ ID NO:34)
(ii) NNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO:35)
(iii) SQLERANLRPXEQ (SEQ ID NO:36)
(iv) ELNEFENNQRXM (SEQ ID NO:37)
(v) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQD (SEQ ID NO:38)
(vi) NNFGKLFEVKPDKKNPQL (SEQ ID NO:40)
(vii) SQLERANLRPXEQH (SEQ ID NO:41)
(viii) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO:42)
(ix) RELRNLPQQXGLRA (SEQ ID NO:43)
(x) KAMVIVVVNKG (SEQ ID NO:44)
(xi) AMVIVVVNKGTGNLELV (SEQ ID NO:45)
(xii) VVNKGTGNLELVAVRK (SEQ ID NO:46)
или их функциональные производных или гомологи, где остаток X представляет собой цистеин или серин.
Также могут быть включены пептиды или молекулы, которые могут быть преимущественными с учетом обстоятельств конкретной ситуации.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает композицию на основе молекулы нуклеиновой кислоты, содержащую одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют T-клеточные эпитопы и пептиды, определенные выше в данном документе, или их производное, гомолог или аналог, или являются комплементарными последовательности, которая их кодирует.
Следует понимать, что ссылка на “пептиды” предусматривает ссылку на пептиды, содержащие один или несколько T-клеточных эпитопов. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая данный пептид, предпочтительно представляет собой последовательность дезоксирибонуклеиновых кислот, например, кДНК или геномную последовательность. Геномная последовательность может содержать экзоны и интроны. Геномная последовательность также может содержать промоторный участок или другие регуляторные участки.
E. coli
Молекула нуклеиновой кислоты может быть лигирована в вектор экспрессии, способный экспрессироваться в прокариотической клетке (например, ) или эукариотической клетке (например, клетках дрожжей, клетках грибов, клетках насекомых, клетках млекопитающих или клетках растений). Молекула нуклеиновой кислоты может быть лигирована, или слита, или иным образом ассоциирована с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей другой объект, такой как, например, сигнальный пептид. Она также может содержать дополнительную информацию в виде нуклеотидной последовательности, слитой, соединенной или иным образом ассоциированой с ней либо по 3'-концевой части, либо по 5'-концевой части или по обеим из 3'- и 5'-концевых частей. Молекула нуклеиновой кислоты также может быть частью вектора, например, вектора экспрессии. Последний вариант осуществления обеспечивает получение рекомбинантных форм данного пептида, причем эти формы охвачены настоящим изобретением.
Такие нуклеиновые кислоты могут быть применимыми для рекомбинантного получения T-клеточных эпитопов Ara h 1 и/или Ara h 2 или белков, содержащих их, посредством вставки в соответствующий вектор и трансфекции подходящей линии клеток. Такие векторы экспрессии и линии клеток-хозяев также образуют аспект настоящего изобретения.
В ходе получения пептидов при помощи рекомбинантных методик клетки-хозяева, трансформированные нуклеиновой кислотой с последовательностью, кодирующей пептид в соответствии с настоящим изобретением, или функциональным эквивалентом последовательности нуклеиновой кислоты, культивируют в среде, подходящей для определенных рассматриваемых клеток. Затем пептиды можно очищать от среды для культивирования клеток, клеток-хозяев или и того, и другого при помощи методик, хорошо известных из уровня техники, таких как ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, ультрафильтрация, электрофорез или иммуноаффинная очистка с использованием антител, специфичных в отношении пептида.
E. coli
et al.
et al
Embo J., 6:
Cell., 30:
et al
Gene., 54:
Нуклеиновые кислоты, кодирующие Ara h 1, и/или Ara h 2, или пептиды, содержащие коровые участки T-клеточных эпитопов Ara h 1 и/или Ara h 2, могут экспрессироваться в бактериальных клетках, например, , клетках насекомых, клетках дрожжей или млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO). Подходящие векторы экспрессии, промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии указаны в Sambruck  (1989). Другие подходящие векторы экспрессии, промоторы, энхансеры и другие элементы, связанные с экспрессией, хорошо известны специалистам в данной области техники. Примеры подходящих векторов экспрессии для дрожжей предусматривают Yep Sec 1 (Balderi ., 1987, 229-234); pMFa (Kurjan and Herskowitz., 1982, 933-943); JRY88 (Schultz ., 1987, 113-123) и pYES2 (Invitrogen Corporation, Сан-Диего, Калифорния). Эти векторы являются общедоступными, так же, как и бакуловирусные системы экспрессии и системы экспрессии для млекопитающих. Например, коммерчески доступной является бакуловируная система (ParMingen, Сан-Диего, Калифорния) для экспрессии в клетках насекомых, при этом коммерчески доступным является вектор pMsg (Pharmacia, Пискатауэй, Нью-Джерси) для экспрессии в клетках млекопитающих.
E. coli
et al
Gene., 69:
et al
J. Virol., 64:
et al
Bio Techniques., 8:
E. coli,
E. coli
Для экспрессии в  подходящие векторы экспрессии предусматривают, среди прочих, pTrc (Amann ., 1998, 301-315), pGex (Amrad Corporation, Мельбурн, Австралия); pMal (N.E. Biolabs, Беверли, Массачуссетс); pRit5 (Pharmacia, Пискатауэй, Нью-Джерси); pEt-11d (Novagen, Мадисон, Висконсин) (Jameel ., 1990, 3963-3966) и pSem (Knapp ., 1990, 280-281). Применение pTRC и pEt-11d, например, приведет к экспрессии неслитого белка. Применение pMal, pRit5, pSem и pGex приведет к экспрессии аллергена, слитого с белком, связывающим мальтозу E (pMal), белком A (pRit5), усеченной галактозидазой (PSEM) или глутатион-S-трансферазой (pGex). Если T-клеточный эпитоп Ara h 1 или пептид, содержащий его, экспрессируется в виде белка слияния, особенно преимущественным является введение сайта расщепления для фермента по месту слияния между белком-носителем и рассматриваемым пептидом. Пептид согласно настоящему изобретению затем может быть выделен из белка слияния посредством ферментативного расщепления по сайту для фермента и биохимической очистки при помощи традиционных методик для очистки белков и пептидов. Различные векторы также содержат различные промоторные участки, обеспечивающие конститутивную или индуцируемую экспрессию или индукцию температурой. Дополнительно, подходящей может быть экспрессия рекомбинантных пептидов в различных хозяевах, относящихся к  которые характеризуются измененной способностью к разложению рекомбинантно экспрессируемых белков. В альтернативном варианте, преимущественным может быть такое изменение последовательности нуклеиновой кислоты, при котором в ней используются кодоны, предпочтительно используемые , при этом такое изменение нуклеиновой кислоты не будет оказывать влияние на аминокислотную последовательность экспрессируемых белков.
et al
Клетки-хозяева можно трансформировать с тем, чтобы они экспрессировали нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, при помощи традиционных методик, таких как копреципитация фосфатом кальция или хлоридом кальция, DEAE-декстран-опосредованная трансфекция или электропорация. Подходящие способы трансформации клеток-хозяев можно найти в Sambruck . (1989) и других лабораторных руководствах. Последовательности нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению также можно получить путем химического синтеза при помощи стандартных методик.
В дополнение к рекомбинантному получению пептидов в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновые кислоты можно использовать в качестве зондов для экспериментальных целей или целей очистки.
Идентификация и синтез пептидов, раскрытых в данном документе, в настоящее время обеспечивают разработку ряда протоколов профилактического и терапевтического лечения для применения в отношении состояний иммунной системы, связанных с арахисом. Также обеспечивается разработка реактивов для использования в них. Следовательно, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает применение пептидов или их функциональных производных, гомологов или аналогов для терапевтического и/или профилактического лечения пациентов. Эти способы лечения без ограничения предусматривают следующее.
(i) Введение данных пептидов пациенту в качестве средств для десенсибилизации или индукции иммунологической толерантности к арахису, Ara h 1, и/или Ara h 2, или молекулам, подобным Ara h 1 и/или подобным Ara h 2. Это можно осуществлять, например, путем индукции анергии или апоптоза Th2, направленных против Ara h 1 и/или Ara h 2. В предпочтительном варианте осуществления такой результат обеспечивают путем применения пептидов, которые поддерживают реактивность в отношении T-клеточных эпитопов, но которые неспособны связываться с IgE. В альтернативном варианте, можно использовать протоколы лечения, которые основываются на введении специфических концентраций данного пептида в соответствии со специальной схемой для индукции толерантности. При помощи таких методик можно предотвращать гиперчувствительность к Ara h 1 и/или Ara h 2, или они могут уменьшать тяжесть гиперчувствительности к Ara h 1 и/или Ara h 2 или чувствительности к аллергену, присутствующему в композиции, содержащей Ara h 1 и/или Ara h 2, например, аллергии на арахис. В данном документе ссылку на лечение чувствительности к Ara h 1 и/или Ara h 2 следует понимать как охватывающую своим объемом лечение состояний, характеризующихся чувствительностью к композициям, которые содержат Ara h 1 и/или Ara h 2, таким как разновидности арахиса в целом, даже если чувствительность направлена против аллергена, отличного от Ara h 1 и/или Ara h 2.
et al
British Medical Journal 302
Предпочтительно такие схемы лечения способны модифицировать T-клеточный ответ или как B-, так и T-клеточный ответ рассматриваемого индивида. Как используется в данном документе, модификация аллергической реакции у индивида, страдающего гиперчувствительностью к арахису, может быть определена как индуцирующая либо отсутствие ответа, либо ослабление симптомов, обусловленных молекулой Ara h 1, как определено при помощи стандартных клинических методик (Varney . 1991 :265-269). Ослабление симптомов предусматривает любое уменьшение аллергической реакции у индивида в отношении Ara h 1 после завершения схемы лечения. Это ослабление может быть субъективным или клинически определенным, например, с применением стандартных пищевых провокационных проб или стандартных кожных проб, известных из уровня техники.
Воздействие пептидов согласно настоящему изобретению на индивида может приводить к толеризации или анергизации соответствующих субпопуляций T-клеток, так что они утрачивают способность отвечать на Ara h 1 и/или Ara h 2 и не участвуют в стимуляции иммунного ответа при таком воздействии. Предпочтительно пептиды в соответствии с настоящим изобретением сохранят иммунодоминантные T-клеточные эпитопы, но будут характеризоваться нарушенным связыванием с IgE. Кроме того, даже если предметом обсуждения не является аллерген Ara h 1 и/или Ara h 2, но оно направлено на другой аллерген, который присутствует в той же композиции, что и Ara h 1 и/или Ara h 2 (например, другой аллерген арахиса), иммунизация при помощи Ara h 1 и/или Ara h 2 все же может индуцировать неспецифический супрессивный эффект, воздействие которого уменьшает степень гиперчувствительности к этому аллергену.
Введение пептида согласно настоящему изобретению может модифицировать профиль секреции цитокинов по сравнению с воздействием встречающегося в природе аллергена Ara h 1 и/или Ara h 2. Это воздействие также может влиять на субпопуляции T-клеток, которые в норме участвуют в аллергической реакции с тем, чтобы они мигрировали из места или мест, обычно подверженных воздействию аллергена, и в место или места терапевтического введения. Это перераспределение субпопуляций T-клеток может устранять или уменьшать способность иммунной системы индивида стимулировать обычный иммунный ответ в месте, обычно подверженном воздействию аллергена, что приводит в результате к ослаблению симптомов аллергии.
Модификацию B-клеточного ответа можно осуществлять, например, посредством модулирования профиля цитокинов, продуцируемых T-клетками, как детально описано выше. В частности, снижение продукции IL-4 и IL-13, происходящих из T-клеток, таким образом, приводит к снижению синтеза IgE.
(ii) Пептиды согласно настоящему изобретению можно применять в качестве адсорбента для устранения T-клеток, направленных против Ara h 1 и/или Ara h 2, из биологического образца или у пациента.
Следовательно, в другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения и/или профилактики состояния у субъекта, причем это состояние характеризуется аномальным, нежелательным или по другим причинам неадекватным иммунным ответом на Ara h 1, и/или Ara h 2, или аллерген в композиции, содержащей Ara h 1 и/или Ara h 2, при этом указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества иммуномодулирующей композиции, определенной выше в данном документе, в течение периода времени и при условиях, достаточных для устранения или уменьшения присутствия или функционирования у указанного субъекта T-клеток, направленных против указанного Ara h 1, и/или Ara h 2, или другого аллергена.
Предпочтительно указанное состояние представляет собой гиперчувствительность к разновидностям арахиса или древесным орехам, которые содержат Ara h 1 и Ara h 2 или молекулы, подобные Ara h 1 или подобные Ara h 2, таким как разновидности лещины, разновидности миндаля или разновидности бразильского ореха.
В одном варианте осуществления указанный способ обеспечивает десенсибилизацию или индуцирует иммунологическую толерантность к Ara h 1, и/или Ara h 2, или другому аллергену из указанной композиции.
В другом варианте осуществления указанную десенсибилизацию или толерантность обеспечивают путем индукции анергии или апоптоза T-клеток.
В другом варианте осуществления указанную десенсибилизацию или толерантность обеспечивают путем индукции Treg клеток, специфичных в отношении Ara h 1 или Ara h 2.
“Эффективное количество” означает количество, необходимое, по меньшей мере частично, для того, чтобы достичь необходимого иммунного ответа, или отсрочить манифестацию, или замедлить прогрессирование, или в полной мере воспрепятствовать манифестации или прогрессированию определенного состояния, лечение которого осуществляется. Количество варьирует в зависимости от здоровья и физического состояния индивида, подлежащего лечению, таксономической группы индивида, подлежащего лечению, необходимой степени защиты, состава композиции, оценки медико-санитарной обстановки и других соответствующих факторов. Ожидается, что количество будет попадать в относительно широкий диапазон, который может быть определен посредством обычных методик.
Субъектом для лечения или профилактики, как правило, является млекопитающее, такое как без ограничения человек, примат, сельскохозяйственное животное (например, овца, крупный рогатый скот, лошадь, осел, свинья), домашнее животное (например, собака, кошка), лабораторное животное (например, мышь, кролик, крыса, морская свинка, хомячок), содержащееся в неволе дикое животное (например, лисица, олень). Предпочтительно млекопитающим является человек или примат. Наиболее предпочтительно млекопитающим является человек.
В данном документе ссылку на “лечение” и “профилактику” следует рассматривать в ее наиболее широком контексте. Выражение “лечение” не обязательно подразумевает, что субъекта лечат до полного выздоровления. Аналогично, “профилактика” не обязательно означает, что у субъекта не будет развиваться болезненное состояние. Следовательно, лечение и профилактика предусматривают устранение симптомов определенного состояния, или предупреждение, или уменьшение риска развития определенного состояния иным образом. Выражение “профилактика” может рассматриваться как уменьшение тяжести или манифестации определенного состояния. “Лечение” также может уменьшать тяжесть существующего состояния.
Введение композиции согласно настоящему изобретению (в данном документе называемой “средством”) в форме фармацевтической композиции можно осуществлять любым удобным способом. Средство в форме фармацевтической композиции, как предусматривается, демонстрирует терапевтическую активность при введении в количестве, которое зависит от конкретного случая. Эта вариация зависит, например, от человека или животного и выбранного средства. Применимым может быть широкий диапазон доз. В зависимости от пациента, можно вводить, например, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 1 мг средства на дозу. Режим дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, несколько разделенных доз можно вводить раз в день, раз в неделю, раз в месяц или через другие подходящие интервалы времени или, как показано, доза может быть пропорционально уменьшена, как указано в требованиях для конкретной ситуации. В другом примере, указанную композицию изначально вводят для индукции толерантности и затем, при необходимости, осуществляют бустерные введения композиции для поддержания толерантности. Эти бустерные дозы можно вводить, например, раз в месяц, и при этом их можно вводить в течение любого периода времени, в том числе всей жизни пациента.
Средство можно вводить удобным способом, например, пероральным, внутривенным (в случае растворимости в воде), интраперитонеальным, внутримышечным, подкожным, интрадермальным (с использованием или без использования традиционной иглы или другого устройства для трансдермальной доставки), трансдермальным, интраназальным, сублингвальным путем или при помощи суппозитория или имплантации (например, с использованием молекул с медленным высвобождением). Предпочтительно указанную композицию вводят интрадермально. Средство можно вводить в форме фармацевтически приемлемых нетоксичных солей, таких как соли присоединения кислоты или комплексы с металлами, например, с цинком, железом или т. п. (которые считаются солями для целей данной заявки). Такими иллюстративными солями присоединения кислоты являются гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат, малеат, ацетат, цитрат, бензоат, сукцинат, малат, аскорбат, тартрат и т. п. Если активный ингредиент подлежит введению в форме таблетки, таблетка может содержать связующее вещество, такое как трагакант, кукурузный крахмал или желатин; вещество для улучшения распадаемости, такое как альгиновая кислота; и скользящее вещество, такое как стеарат магния.
В соответствии с данными способами, средство, определенное в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить совместно с одним или несколькими другими соединениями или молекулами. “Совместно вводимый” означает одновременное введение в одном и том же составе или в двух различных составах посредством одинаковых или различных путей или последовательное введение посредством одинаковых или различных путей. “Последовательное” введение означает наличие временного интервала в течение секунд, минут, часов или дней между введением двух типов молекул. Эти молекулы можно вводить в любом порядке. Также следует понимать, что пептиды согласно настоящему изобретению сами по себе можно вводить одновременно или последовательно. Их можно вводить в виде одной или нескольких композиций, либо одновременно, либо последовательно. Например, некоторые пептиды можно составлять в одном составе, а другие - в отдельном составе; причем эти два состава в каждой группе считаются одним. В альтернативном варианте можно получать дополнительные отдельные составы и вводить, либо одновременно в разные места, либо последовательно. Специалисту в данной области техники хорошо известно создание и получение продукции в виде соответствующего состава или смеси составов.
Другой аспект настоящего изобретения предусматривает применение иммуномодулирующей композиции, определенной выше в данном документе, для получения лекарственного препарата для лечения состояния у млекопитающего, причем это состояние характеризуется аномальным, нежелательным или по другим причинам неадекватным иммунным ответом на Ara h 1 и/или Ara h 2.
Предпочтительно указанное состояние представляет собой гиперчувствительность к разновидностям арахиса или древесному ореху, который содержит Ara h 1, и/или Ara h 2, или молекулы, подобные Ara h 1 и/или подобные Ara h 2, такому как лещина.
В другом дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает вакцину, содержащую композицию, определенную выше в данном документе, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями. Указанную композицию называют активным ингредиентом.
Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (в случае растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии, или могут быть в форме крема или другой форме, подходящей для местного применения. Они должны быть стабильными при условиях получения и хранения и должны быть защищены от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерол, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т. п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно сохранять, например, путем применения вещества для покрытия оболочкой, такого как лецитин, посредством сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращения воздействия микроорганизмов можно добиться при помощи различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т. п. Вещества для регулирования тоничности применяются для поддержания изотоничности препарата по отношению к плазме крови человека и, таким образом, предотвращают повреждение тканей. Часто используемые вещества, регулирующие тоничность, предусматривают декстрозу, трегалозу, глицерин и маннит. Глицерол и хлорид натрия являются другими вариантами, но они используются не так часто. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических средств, например, сахаров или хлорида натрия. Пролонгированного поглощения инъекционных композиций можно добиться посредством применения в композициях средств, замедляющих поглощение, например, моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные инъекционные растворы получают путем включения активных соединений при требуемом количестве в соответствующем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии получают путем включения различных простерилизованных активных ингредиентов в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, предпочтительные способы получения представляют собой вакуумную сушку и методику лиофильной сушки, при помощи которых получают порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным необходимым ингредиентом из его раствора, ранее простерилизованного фильтрацией.
В случае подходящей защиты активных ингредиентов их можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или с усвояемым пищевым носителем, или их можно заключить в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, или их можно спрессовать в таблетки, или их можно непосредственно включать в продукт питания, входящий в состав рациона. Для перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено вместе со вспомогательными веществами и применяться в форме таблеток для проглатывания, буккальных таблеток, пастилок, капсул, настоек, суспензий, сиропов, облаток и т. п. Такие композиции и препараты должны содержать по меньшей мере 1% по весу активного соединения. Процентное содержание в композициях и препаратах, разумеется, может варьировать и, в целях удобства, может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 80% веса единицы. Количество активного соединения в таких терапевтически применимых композициях является таким, что будет получена подходящая дозировка. Предпочтительные композиции или препараты в соответствии с настоящим изобретением получают таким образом, что единичная лекарственная форма для перорального введения содержит от приблизительно 0,1 мкг до 1000 мкг активного соединения.
Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т. п. также могут содержать компоненты, перечисленные далее в данном документе: связующее вещество, такое как камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; вспомогательные вещества, такие как вторичный кислый фосфат кальция; вещество для улучшения распадаемости, такое как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и т. п.; скользящее вещество, такое как стеарат магния; и при этом можно добавлять подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или ароматизирующее вещество, такое как мята перечная, масло грушанки или вишневый ароматизатор. Если единичная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к материалам вышеуказанного типа, жидкий носитель. Различные другие материалы могут присутствовать в качестве веществ для покрытия оболочкой или могут иным образом модифицировать физическую форму единицы дозирования. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты оболочкой с использованием шеллака, сахара или и того, и другого. Сироп или настойка может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилапарабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, такой как вишневая или апельсиновая ароматизирующая добавка. Разумеется, любой материал, используемый для получения любой единичной лекарственной формы, должен быть фармацевтически чистым и фактически нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активное соединение (соединения) может быть включено в препараты и составы с замедленным высвобождением.
Фармацевтическая композиция также может содержать наследственные молекулы, такие как вектор, способный трансфицировать клетки-мишени, где вектор несет молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующее средство. Вектор может представлять собой, например, вирусный вектор.
Пути введения без ограничения включают респираторный (например, интраназальный или пероральный посредством аэрозоля), интратрахеальный, назофарингеальный, внутривенный, интраперитонеальный, подкожный, интракраниальный, интрадермальный, трансдермальный, внутримышечный, интраокулярный, интратекальный, интрацеребральный, интраназальный, инфузионный, пероральный, ректальный, посредством капельницы для внутривенного вливания, пластыря, имплантата и сублингвальный. Предпочтительно указанный путь введения является подкожным, интрадермальным, трансдермальным или интраназальным.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композициям, определенным выше в данном документе, применяемым в способе согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно описывается посредством ссылки на следующие неограничивающие примеры.
ПРИМЕР 1
Ara h 1 и Ara h 2 являются наиболее аллергенными и распространенными белками арахиса, что делает пептиды, содержащие их доминантные T-клеточные эпитопы, необходимыми для включения в терапию. Другим важным соображением при выборе пептидов для иммунотерапии является то, могут ли они презентироваться различными молекулами MHC класса II (молекулами HLA у человека) и, таким образом, быть подходящими для лечения генетически разнообразной человеческой популяции. HLA-рестрикцию презентации пептидов T-клеткам тестировали при помощи блокирующих антител и HLA-генотипирования, и при этом было показано, что каждый идентифицированный T-клеточный эпитоп мог презентироваться на двух или более различных молекулах HLA. Более того, было продемонстрировано, что идентифицированные T-клеточные эпитопы совместно презентировались на комбинации молекул HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP (таблица 2). Включение HLA-DQ- и -DP-рестриктированных T-клеточных эпитопов является особенно преимущественным для терапевтического средства, поскольку эти HLA-типы являются более консервативными в смешанных популяциях, чем молекулы HLA-DR, что обеспечивает возможность более широкого охвата популяции с использованием меньшего количества последовательностей T-клеточных эпитопов.
Смежные или перекрывающиеся T-клеточные эпитопы объединяли в одиночные пептиды (длиной < 20 аминокислот) для того, чтобы свести к минимуму количество пептидов в конечном терапевтическом наборе, в результате чего получили три кандидатных пептида из Ara h 2 и семь из Ara h 1. Поскольку остатки цистеина могут приводить к проблемам со стабильностью пептида и биологической активностью, остатки цистеина заменяли структурно консервативными, но менее активными остатками серина. Также осуществляли незначительные изменения двух пептидов Ara h 1 для улучшения стабильности и/или растворимости (таблица 2). Во всех случаях было подтверждено, что сохранялась T-клеточная реактивность в отношении вариантного пептида.
Таблица 2. Терапевтические кандидатные пептиды Ara h 1 и Ara h 2
<b>Последовательность</b>
<b>HLA</b>
<b>Последовательность</b>
<b>HLA</b>
FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV
DR
KAMVIVVVNKGTGNLELVAVDR
DR
*STRSSENNEGVIVKVSKE<sup>1</sup>
DQ
*GDVFIMPAAHPVAINASS<b>E</b><sup>2</sup>
DQ+DR
NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ
DR
*SQLERANLRP<b>S</b>EQHLM<sup>3</sup>
DP+DQ+DR
VEIKEGALMLPHFNSKA
DQ+DR
*ELNEFENNQR<b>S</b>M<b>S</b>EALQ<sup>3</sup>
DR+DQ
ALMLPHFNSKAMVIVVV
DR
*RELRNLPQQ<b>S</b>GLRA<sup>3</sup>
DR
Пептиды Ara h 1 затенены; пептиды Ara h 2 незатенены. В столбце HLA показаны типы HLA, которые, как известно, презентируют T-клеточный эпитоп (эпитопы) в пептиде. *Пептиды изменены для улучшения свойств;
'W' удалено с N-конца.
'E' (из нативной последовательности) добавлено к C-концу.
Жирным показано замещение цистеина серином.
1
2
3
При помощи доклинического скрининга подтверждали T-клеточную реактивность PBMC в отношении этих пептидов (Фиг. 1), отсутствие активации воспалительных клеток (Фиг. 2) и стабильность в сыворотке крови в дополнительной когорте с аллергией на арахис (n = 40). Было подтверждено распознавание T-клетками из PBMC одного или нескольких из этих десяти пептидов у 100% субъектов (n = 20), которые участвовали в анализе, причем с 50-90% уровнем ответа на каждый пептид. К настоящему времени анализы явно продемонстрировали, что десять пептидов в таблице 2, приведенной выше, обеспечивают достаточную, практически осуществимую и подходящую смесь.
ПРИМЕР 2
<b>Краткий обзор стадий</b>
<b>1) Идентификация доминантных T-клеточных эпитопов основных аллергенов арахиса Ara h 1 и Ara h 2 (Фигуры 3 и 4)</b>
Выделяли CD4+ T-клетки, специфичные в отношении Ara h 1 или Ara h 2, из PBMC от субъектов с аллергией на арахис.
Определяли специфичность T-клеток в отношении перекрывающихся 20-мерных пептидов, охватывающих полную последовательность Ara h 1 (Фигуры 5 и 6) или 2 (Фигура 7).
Выбирали доминантные 20-меры и картировали в них последовательности коровых T-клеточных эпитопов (Фигура 8).
<b>2) Определение HLA-рестрикции коровых T-клеточных эпитопов </b>
Блокировали презентацию T-клеточных эпитопов специфичным T-клеткам при помощи антител к HLA (Фигура 9).
HLA-генотипированных субъектов использовали для картирования T-клеточных эпитопов.
Дополнительно оценивали вырожденность T-клеточных эпитопов по связыванию с HLA при помощи алгоритмов.
<b>3) Создание терапевтических кандидатных пептидов</b>
Остатки цистеина замещали остатками серина.
Объединяли перекрывающиеся T-клеточные эпитопы в одиночные пептиды длиной ≤ 20 аминокислот (10 пептидов) (таблицы 16-18)
Создавали более короткие варианты пептидов исходя из одиночных T-клеточных эпитопов (13 пептидов).
Синтезировали все 23 пептида с обеспечением > 95% чистоты, соответствующей GLP, и определяли растворимость в растворах.
<b>4) Выбор и тестирование конечной терапевтической смеси</b>
Сравнивали T-клеточную реактивность PBMC в отношении всех 23 пептидов в когорте с аллергией на арахис и выбирали 7 пептидов для конечного терапевтического средства.
Оценивали T-клеточный ответ PBMC на смесь из 7 пептидов при 2 терапевтических дозах в когорте с аллергией на арахис.
Тестировали ответ базофилов на смесь из 7 пептидов при 4-log диапазоне дозы в когорте с аллергией на арахис
Материалы и способы
Субъекты
: Взрослых субъектов с аллергией на арахис рекрутировали из аллергологической клиники Альфреда (The Alfred Allergy Clinic), Мельбурн, Австралия. У субъектов с аллергией на арахис наблюдались клинические симптомы IgE-опосредованной аллергии на арахис и балл CAP для арахис-специфичных IgE составлял ≥ 2 (≥ 1,16 тысяч единиц активности/л; Pharmacia CAP SystemTM, Pharmacia Diagnostics, Уппсала, Швеция), и у многих в анамнезе была анафилаксия. Некоторых субъектов генотипировали (HLA-DRB1, -DQB1 и -DPB1, экзон 2) в Victorian Transplantation and Immunogenetics Service. Исследование было одобрено этическими комитетами университета Монаша и клиники Альфреда, и при этом информированное согласие в письменной форме получали от каждого субъекта.
Антигены
et al.
Clin Exp Allergy
et al.
Clin Exp Allergy.
et al.
Int Arch Allergy Immunol.
: Неочищенный экстракт арахиса (CPE) получали из коммерческих разновидностей несоленого сухого обжаренного арахиса в соответствии с описанием в другом документе (de Leon . 2003;33(9):1273-80), диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) и стерилизовали посредством фильтрации (0,2 мкм). Природные Ara h 1 и Ara h 2 из CPE обогащали c использованием опубликованных методик (de Jong EC  1998;28(6):743-51). Вкратце, CPE буферизовали в 20 мМ бис-трис-пропане (TBP), pH 7,2, с использованием колонок Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech S.A., Обань, Франция) и загружали на 5 мл колонку Mono-Q 10/10 (Pharmacia FPLC System, Сент-Олбанс, Великобритания) уравновешенную TBP. После промывания TBP использовали линейный градиент 30 мл 0-1M NaCl/TBP для элюирования связанных белков (1 мл/мин). Фракции объемом 0,5 мл анализировали при помощи SDS-PAGE, и объединяли те, которые содержали Ara h 1 или Ara h 2 с минимальным количеством других белков, и диализовали против PBS. Содержание эндотоксинов составляло 1,7, 4,0 и 78,0 EU/мг для CPE, Ara h 1 и Ara h 2 соответственно (Endpoint Chromogenic LAL assay, Lonza, Волкерсвиль, США). Пептиды (Mimotopes, Виктория, Австралия, и GenScript USA Inc, Нью-Джерси, США) разводили при 1-4 мг/мл в 10% диметилсульфоксиде/PBS (наборы 20-меров и усеченных пептидов) или PBS, 1-2% уксусной кислоте или 0,1M буферных растворах бикарбоната аммония, как было указано (синтезированные на заказ пептиды коровых эпитопов). Подтверждали, что все антигены не были ни митогенными, ни токсичными в соответствии с описанием (Eusebius NP ,  2002;127(3):234-44).
Получение линий CD4+ T-клеток (TCL), специфичных в отношении Ara h 1 и Ara h 2
et al.
J Immunol Methods
et al.
J Allergy Clin Immunol.
et al
J Allergy Clin Immunol.
: Олигоклональные TCL, специфичные в отношении Ara h 1 или Ara h 2, получали из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от субъекта с аллергией на арахис при помощи методики с использованием сукцинимидилового эфира 5,6-карбоксифлуоресцеиндиацетата (CFSE). (Mannering SI , . 2005;298(1-2):83-92; Prickett SR, , 2011;127(3):608-15 e1-5). Вкратце, культивирование осуществляли в RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина-стрептомицина и 5% AB-сыворотки человека (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США) (cRPMI). PBMC метили 0,1 мкМ CFSE (Molecular Probes, Юджин, США) и культивировали (2,5 × 106/мл) с cRPMI отдельно, CPE (100 мкг/мл), Ara h 1 или Ara h 2 (10 мкг/мл), объединенными образцами 20-мерных пептидов Ara h 1 или Ara h 2 (10 мкг/мл/пептид) или столбнячным анатоксином в качестве контроля (TT; 10 LfU/мл; Statens Serum Institute, Копенгаген, Дания) в течение 7 дней при 37°C. После окрашивания CD4-PE и 7AAD (BD Pharmingen, Сан-Диего, США), клетки CD4+CFSEdim7AAD отсортировывали (10 клеток/лунка) в 96-луночные планшеты с U-образными лунками, содержащими облученные аллогенные фидерные клетки, антитела к CD3 (OKT-3), rIL-2 (Cetus, Эмеривиль, США) и фунгизон (Invitrogen, Карлсбад, США), как было описано. Клетки подпитывали rIL-2 при необходимости и через 10-14 дней переносили в 48-луночные планшеты и тестировали в отношении пролиферации в ответ на Ara h 1 или Ara h 2 (10 мкг/мл). Размножали TCL, положительные по Ara h 1 или Ara h 2, с использованием антител к CD3 и rIL-2 в культуральных флаконах T25 (BD, Франклин Лейкс, США) в течение 10-12 дней, затем тестировали в отношении специфичности (пролиферации) в отношении перекрывающихся 20-мерных пептидов, охватывающих соответствующую последовательность (10 мкг/мл). Последовательности коровых эпитопов картировали в пределах выбранных 20-меров при помощи наборов пептидов, усеченных c N- или C-конца 20-мера, как было описано (Prickett SR, c.  2011;127(3):608-15 e1-5).
Анализы с использованием T-клеток
3
4
4
3
3
. Все культивирования осуществляли в RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина-стрептомицина и 5% человеческой сыворотки AB (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США) (cRPMI). Индуцированную антигеном пролиферацию TCL оценивали при помощи следующих анализов с поглощением 3H-тимидина (H-TdR): анализы осуществляли на 72-часовых культурах в двух повторностях или трех повторностях в 96-луночных планшетах с U-образными лунками, содержащими 1 × 10 T-клеток/лунка, 1 × 10 облученных (5000 рад) аутологичных EBV-трансформированных PBMC (EBV-B-клеток) в качестве антиген-презентирующих клеток и указанные антигены. В качестве отрицательного контроля использовали cRPMI отдельно. К клеткам в импульсном режиме добавляли H-тимидин (H-TdR; 0,5 мкКи/лунка) в течение последних 16 часов и регистрировали поглощение в виде среднего значения числа импульсов в минуту (cpm) для культур в повторностях. Индекс стимуляции (SI; cpm для стимулированных антигеном T-клеток/cpm для нестимулированных T-клеток) ≥ 2,5 считался положительным, и при этом все положительные ответы были подтверждены в ≥ 2 анализах. Для обеспечения выявления индуцированной пептидом пролиферации CD4+ T-клеток в цельном образце PBMC получали 7-дневные культуры CFSE-меченых PBMC, как описано для получения TCL, с добавлением антител к CD25 (BD) для оценки активации T-клеток в дополнение к пролиферации. Анализировали по меньшей мере 10000 CD4+ T-клеток на образец и рассчитывали SI как процент клеток CD4+CFSElo (пролиферировавших), CD4+CD25+ (активированных) или CD4+CD25+CFSElo (активированных и пролиферировавших) при использовании антигена, деленный на процент для такой же популяции без антигена (фон). Анализ клеток CD4+CD25+CFSElo (активированных и пролиферировавших) обеспечивает наиболее чувствительный способ выявления T-клеточных ответов с обозначением SI ≥ 1,5 как положительного.
Анализы с блокированием HLA класса II
4
: T-клетки и облученные EBV-B-клетки (1 × 10 каждых) инкубировали c 0,1-10 мкг/мл блокирующего моноклонального антитела (mAb) против HLA-DR (L243, BD Pharmingen), HLA-DQ (SVP-L3), или HLA-DP (B7/21), или антител изотипического контроля (IgG2a: BD Pharmingen; IgG1: BioLegend, Сан-Диего, США) в течение 1 часа при 37°C перед добавлением пептидов (2-10 мкг/мл) или CPE (100 мкг/мл) и тестированием пролиферативного ответа, описанным выше.
Анализы цитокинов при помощи ELISPOT
5
: Планшеты MAIP ELISPOT (Millipore, Биллерика, США) покрывали в течение ночи при 4°C 10 мкг/мл антител к IL-4, IFN-γ или IL-5 (eBioscience, Сан-Диего, США) в PBS. Лунки блокировали (cRPMI, 1 час, 37°C), затем добавляли PBMC (3,5 × 10) или T-клетки и облученные EBV-B-клетки (1 × 104 каждых) в 100 мкл культур в двух повторностях с CPE (100 мкг/мл), nAra h 2 (10 мкг/мл) или пептидами (10 мкг/мл). В качестве контролей использовали cRPMI отдельно, TT (10 lfU/мл) и фитогемагглютинин (1 мкг/мл; Sigma-Aldrich). Через 48 часов культивирования при 37°C планшеты инкубировали с биотинилированными антителами к IL-4, IL-5 или IFN-γ (eBioscience) (1 мкг/мл PBS, 2 часа), с последующим добавлением ExtrAvidin-щелочной фосфатазы (Sigma-Aldrich) (1/3000 PBS, 2 часа) перед проявлением при помощи субстрата для щелочной фосфатазы (Bio-Rad). Когда в лунках положительного контроля появлялись пятна, планшеты промывали, сушили на воздухе и считывали (ридер AID ELISPOT 4.0 h, Autoimmun Diagnostika, Штрасберг, Германия).
Тест активации базофилов
et al.,
J Immunol
: Активацию базофилов оценивали при помощи повышения экспрессии CD63, выявляемого при помощи проточной цитометрии, как описано (Drew AC, . 2004;173(9):5872-9). Положительные контроли представляли собой антитело кролика к IgE человека (7,5 мкг/мл; DAKO Corporation, Калифорния, США), N-формилметионинлейцинфенилаланин (fMLP) (0,4 мкг/мл; Sigma) и CPE. CPE тестировали в 3 log диапазоне концентрации (50, 5 и 0,5 мкг/мл), и объединенные образцы пептидов тестировали в 4-log диапазоне концентрации (50, 5, 0,5 и 0,05 мкг/мл). Высвобождение гистамина оценивали при помощи наборов Histamine Release и Histamine ELISA (IBL International GmbH, Гамбург, Германия) согласно инструкциям производителя.
Результаты
Факторы, которые учитывали при выборе доминантных 20-меров, включали:
• частоту ответа,
• количество специфических TCL, полученных на пациента/преобладание специфических T-клеток в PBMC от пациента;
• величину T-клеточного ответа,
• паттерны T-клеточных ответов (комбинации пептидов, распознаваемые у одних и тех же и различных субъектов),
• способность к прямому целенаправленному воздействию пептида на специфические T-клетки из целой популяции PBMC (скрининг при помощи CFSE),
• однородность T-клеточных ответов,
• идентификацию корового T-клеточного эпитопа (эпитопов) в пределах 20-мерного пептида.
Выбор доминантных 20-меров Ara h 1
145 линий T-клеток, специфичных в отношении Ara h 1 (TCL), получали от 18 доноров с аллергией на арахис, и при этом 65/69 перекрывающихся 20-мерных пептидов, охватывающих Ara h 1, распознавались этими TCL (см. таблицу 3 и Фигуру 5). 14 из этих 65 20-меров выбирали как наиболее часто распознаваемые (4-6 респондеров из 18; 22-33%) (номера пептидов 23, 24, 26, 38, 40, 44-51 и 57). Из этих 14 пептидов выбирали 9 для дополнительного анализа (номера пептидов 23, 24, 40, 46, 47, 49, 50, 51 и 57) (таблица 4).
Этот выбор осуществляли исходя из количества специфических TCL на субъекта, величины ответа с участием TCL, воспроизводимости ответа с участием TCL и способности целенаправленно воздействовать на специфические T-клетки в PBMC. 9 выбранных 20-меров характеризовались следующим:
• совместно распознавались TCL от 16 из 18 субъектов (89%) в этой когорте;
• как правило, индуцировали сильные и однородные ответы в специфических TCL;
• каждый распознавался несколькими TCL от многих респондеров;
• каждый был способным целенаправленно воздействовать на специфические T-клетки в PBMC от донора (совместно индуцируют выявляемые T-клеточные ответы PBMC у 18/20 дополнительных субъектов, причем на 20-мер приходилось 8-16 респондеров (40-80%).
Один или несколько из девяти 20-меров распознавались T-клетками у 35 (92%) из 38 субъектов, причем анализ осуществляли посредством выделения TCL и/или скрининга при помощи CFSE (таблица 3).
Таблица 3
Пролиферативные ответы (поглощение тимидина) TCL на 20-мерные пептиды Ara h 1. В таблице показаны значения SI (= кратное увеличение пролиферации TCL с использованием пептида по сравнению с пролиферацией у нестимулированных TCL). Показаны только индексы стимуляции (SI) ≥ 2,5. Для субъектов с несколькими TCL, специфичными в отношении данного 20-мера, показано наибольшее значение SI. Темно-серый, SI ≥ 2,5 < 5,0; SI ≥ 5,0. В конечном итоге, выбрали 9 доминантных пептидов, показанных в таблице 4.
Таблица 4. Краткое описание выбора доминантных 20-меров Ara h 1
Пептид №
Остатки
Последовательность
23
199-218
FDQRSRQFQNLQNHRIVQIE (SEQ ID NO:47)
24
208-227
NLQNHRIVQIEAKPNTLVLP (SEQ ID NO:48)
40
352-371
RWSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:49)
46
406-425
DLSNNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO:50)
47
415-434
FEVKPDKKNPQLQDLDMMLT (SEQ ID NO:51)
49
433-452
LTCVEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO:52)
50
442-461
ALMLPHFNSKAMVIVVVNKG (SEQ ID NO:53)
51
451-470
KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO:120)
57
505-524
KEGDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO:55)
Скрининг PBMC с использованием доминантных 20-меров Ara h 1
В таблице 5 показано, что ≥ 1 доминантного 20-мерного пептида распознавался 18/20 (или 22/24 из всех данных). Каждый 20-мерный пептид распознавался по меньшей мере 7 субъектами. Объединяли данные CFSE и TCL: распознавание подтверждалось у 43/45 субъектов.
Таблица 5
Значения SI индуцированной пептидом пролиферации для 24 субъектов. На верхней панели показана новая когорта доноров с аллергией на арахис (отличная от когорты, используемой для получения TCL). На нижней панели показаны 4 субъекта из когорты, используемой для получения TCL, с объединенными результатами из верхней и нижней панелей.
CPE, неочищенный экстракт арахиса; +ve, положительные; nt, не тестировали (исходные растворы пептидов, не доступные на момент тестирования); серый, индексы стимуляции ≥ 1,1< 2,5; черный, индексы стимуляции ≥ 2,5.
Выбор доминантных 20-меров Ara h 2
69 линий T-клеток, специфичных в отношении Ara h 2 (TCL), получали от 16 доноров с аллергией на арахис, и при этом 16/17 перекрывающихся 20-мерных пептидов, охватывающих Ara h 2, распознавались этими TCL (таблица 6). 4 из этих 16 20-меров выбирали как наиболее часто распознаваемые (каждый с 7-9 респондерами из 16; 44-46%) (номера пептидов 4, 5, 11, 15) (Фигура 7). Этот выбор осуществляли исходя из количества специфических TCL на субъекта, величины ответа с участием TCL, воспроизводимости ответа с участием TCL и способности целенаправленно воздействовать на специфические T-клетки в PBMC. 4 выбранных 20-мерных пептидов характеризовались следующим:
• совместно распознавались TCL от всех 16 субъектов (100%) в этой когорте;
• как правило, индуцировали сильные и однородные ответы в специфических TCL;
• каждый распознавался несколькими TCL от многих респондеров;
• совместно распознавались ~80% из всех 69 TCL;
• каждый был способным целенаправленно воздействовать на специфические T-клетки в PBMC от донора (выявляемые T-клеточные ответы PBMC продемонстрированы у 6 протестированных субъектов).
Один или несколько из четырех 20-меров распознавались T-клетками у 16/16 (100%) субъектов, причем анализ осуществляли посредством выделения TCL и/или скрининга при помощи CFSE (таблица 6).
Таблица 6
Пролиферативные ответы (поглощение тимидина) TCL на 20-мерные пептиды Ara h 2. В таблице показаны значения SI (= кратное увеличение пролиферации TCL с использованием пептида по сравнению с пролиферацией у нестимулированных TCL). Показаны только индексы стимуляции (≥ 2,5): серый, ≥ 2,5 ≤ 5,0; черный, > 5,0. A) TCL, стимулируемые антигеном; B) TCL, стимулируемые пептидом. Доминантные 20-меры указаны в таблице 7.
Таблица 7. Краткое описание выбора доминантных 20-меров Ara h 2
Название
Остатки
Последовательность
20-мер 4
28-47
RRCQSQLERANLRPCEQHLM (SEQ ID NO:56)
20-мер 5
37-56
ANLRPCEQHLMQKIQRDEDS (SEQ ID NO:57)
20-мер 11
91-110
ELNEFENNQRCMCEALQQIM (SEQ ID NO:58)
20-мер 15
127-146
KRELRNLPQQCGLRAPQRCD (SEQ ID NO:59)
Картирование коровых T-клеточных эпитопов
Технический подход
+
TCL от различных субъектов использовали для картирования каждого корового T-клеточного эпитопа. Точные T-клеточные эпитопы варьировали у различных TCL и субъектов. Минимальную последовательность, стимулирующую T-клетки (коровый эпитоп) в пределах каждого выбранного 20-мера определяли путем тестирования пролиферации реактивных TCL от различных субъектов с получением наборов усеченных пептидов (Фигура 8). Количество остатков, требуемых для индукции максимальной пролиферации T-клеток, варьировало от 6 до 19 аминокислот для различных TCL и/или субъектов (таблицы 8 и 9). По причине вариации количества фланкирующих остатков, требуемых для оптимального распознавания эпитопа, считалось, что TCL распознают один и тот же эпитоп, если пептиды, содержащие общую коровую последовательность, индуцируют распознавание. Исходя из этого критерия, идентифицировали десять различных эпитопов Ara h 1 и 5 различных эпитопов Ara h 2 для CD4 T-клеток ('консолидированные эпитопы', таблицы 8 и 9) с общими последовательностями 'минимального корового эпитопа', варьирующими от 5 до 12 аминокислот (подчеркнутые последовательности, таблицы 8 и 9). Последовательности 'консолидированного эпитопа' представляли собой минимальные последовательности, охватывающие все остатки, требуемые для оптимальной T-клеточной реактивности, у различных субъектов для обеспечения распознавания, наиболее широкого из возможного.
Коровые T-клеточные эпитопы, обнаруживаемые в доминатных 20-мерах Ara h 1
(i)
Последовательности коровых T-клеточных эпитопов картировали в пределах доминантных 20-мерных пептидов Ara h 1. Идентифицировали 10 T-клеточных эпитопов Ara h 1 ('консолидированных T-клеточных эпитопов'), в том числе 4 пары перекрывающихся T-клеточных эпитопов. (Таблица 8)Таблица 8
Коровые T-клеточные эпитопы, обнаруживаемые в доминатных 20-мерах Ara h 2
(ii)
Последовательности коровых T-клеточных эпитопов картировали в пределах доминантных 20-мерных пептидов Ara h 2. Идентифицировали 5 T-клеточных эпитопов Ara h 2 ('консолидированных T-клеточных эпитопов'), в том числе 2 пары перекрывающихся T-клеточных эпитопов (таблица 9).
Таблица 9
HLA-рестрикция T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2
Распознавание T-клетками доминантных T-клеточных эпитопов блокировали моноклональными антителами против HLA-DP, HLA-DQ или HLA-DR (Фигура 9). Некоторые T-клеточные эпитопы презентировались как на молекулах HLA-DR, так и на HLA-DQ, тогда как T-клеточные эпитопы совместно презентировались на HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR (таблица 10).
Таблица 10
<b>Информация о пептиде</b>
<b>Последовательность T-клеточного эпитопа</b>
<b>Остатки</b>
<b>длина</b>
<b>HLA-рестрикция</b>
<b>Доминантные T-клеточные эпитопы Ara h 1</b>
23 коровый
FQNLQNHRIV
206-215
10 аминокислот
HLA-DR
24 коровый
RIVQIEAKPNTLV
213-225
13 аминокислот
HLA-DR
40 коровый
WSTRSSENNEGVIVKVSKE
353-371
19 аминокислот
HLA-DQ
46 коровый
NNFGKLFEVKPDKKNPQ
409-425
17 аминокислот
HLA-DR
47 коровый
EVKPDKKNPQLQ
416-427
12 аминокислот
HLA-DR
коровый 49
VEIKEGALMLPHFNSKA
436-452
17 аминокислот
HLA-DQ
50 коровый
ALMLPHFNSKAMVIVVV
442-458
17 аминокислот
HLA-DR
50/51 коровый
KAMVIVVVNKG
451-461
11 аминокислот
HLA-DR
51 'коровый'
KAMVIVVVNKGTGNLELVAV
451-470
20 аминокислот
HLA-DR
57 коровый
GDVFIMPAAHPVAINASS
507-525
19 аминокислот
HLA-DR или HLA-DQ
<b>Доминантные T-клеточные эпитопы Ara h 2</b>
4 коровый
SQLERANLRPCEQ
32-44
13 аминокислот
HLA-DP
4/5 коровый
ANLRPCEQHLM
37-47
11 аминокислот
HLA-DR или HLA-DQ
10 коровый
ELNEFENNQRCM
91-102
12 аминокислот
HLA-DR
10/11 коровый
EFENNQRCMCEALQ
94-107
14 аминокислот
HLA-DQ
15 коровый
RELRNLPQQCGLRA
128-141
14 аминокислот
HLA-DR
HLA-рестрикция презентации T-клеточных эпитопов Ara h 1 и Ara h 2
HLA-типирование осуществляли у субъектов с использованием TCL, распознающих доминантные T-клеточные эпитопы, для оценки подтипов HLA, потенциально способных презентировать эпитопы T-клеткам. Отсутствие у субъектов общих аллелей HLA, распознающих T-клеточные эпитопы с подтвержденной рестрикцией HLA-DR/DQ/DP, указывало на вырожденность T-клеточных эпитопов по связыванию с HLA. Результаты для Ara h 1 показаны в таблице 11, а результаты для Ara h 2 - в таблице 12.
Таблица 11
При помощи выделения серым указаны T-клеточные эпитопы, включенные в рассматриваемую смесь 7 пептидов
20-мер
T-клеточный эпитоп
Субъект
HLA-рестрикция
Соответствующий аллель (аллели) HLA
23
(206-215)
18
HLA-DR
DRB1 04:05
DRB1 15:01
3
HLA-DR
DRB1 03:01
DRB1 08:01
24
(213-225)
12
HLA-DR
DRB1 08:01
DRB1 10:01
10
HLA-DR
DRB1 11:01
DRB1 15:01
40
(353-371)
4
HLA-DQ
DQB1 03:01
DQB1 06:02
13
HLA-DQ
DQB1 03:01
DQB1 06:02
14
nt
DQB1 06:09
46
(409-425)
16
HLA-DR
DRB1 04:04
DRB1 13:01
15
nt
DRB1 03:01P
DRB1 04:01
47
(416-427)
16
HLA-DR
DRB1 04:04
DRB1 13:01
15
nt
DRB1 03:01P
DRB1 04:01
49
(436-452)
18
HLA-DQ
DQB1 03:02
DQB1 06:02
HLA-DR
DRB1 04:05
DRB1 15:01
50
(442-458)
17
HLA-DR
DRB1 11:04
DRB1 15:01
9
HLA-DR
DRB1 09:01
DRB1 13:01
50+51
(451-461)
12
HLA-DR
DRB1 08:01
DRB1 10:01
6
HLA-DR
DRB1 04:01
DRB1 04:04
51
(452-470)
10
HLA-DR
DRB1 11:01
DRB1 15:01
14
nt
DRB1 13:02
57
(507-524)
17
HLA-DR
DRB1 11:04
DRB1 15:01
13
HLA-DQ
DQB1 03:01
DQB1 06:02
Nt = HLA-рестрикцию не тестировали
HLA-рестрикция презентации эпитопов Ara h 2
Таблица 12
T-клеточный эпитоп
<b>HLA-генотипирование субъектов с распознаванием каждого T-клеточного эпитопа</b>
Известная HLA-рестрикция
DR B1
DQ B1
DP B1
A: SQ<u>LERANLRPC</u>EQ
1201G
1501
0301
0602
0902/1301
0401
DP
1001
0801
0402
0501
0301G
0401
DP
0301
0801
0201G
0402
0301G
0401
NT
0404
0401
0302
0402
0902/1301
0401
NT
B: AN<u>LRPCEQHLM</u>
0901
1301
0303
0603
0301G
0402/0602
DR
1201G
1501
0301
0602
1301/0902
0401
DR
0301
1302
0201G
0609
0101
0401
DQ
1302
0609
0501
0402/0602
DQ
C: E<u>LNEFENNQRCM</u>
1201G
1501
0301
0602
1301/0902
0401
DR
1101
1501
0301G
0602
0401
DR
D: EF<u>ENNQRCMCEA</u>LQ
1201G
1501
0301
0602
1301/0902
0401
DQ
0103
0401
0302
0501
0301G
0201
DQ
1001
0801
0402
0501
0301G
0401
NT
0404
0401
0302
0402
0902/1301
0401
NT
1302
0609
0501
0402/0602
NT
0701
1501
0201G
0602
0201
0401
NT
1101
1501
0301G
0602
0301G
0401
NT
E: R<u>ELRNLPQQCG</u>LRA
1101
1501
0301G
0602
0401
DR
0405
1501
NA
0602
0301G
0401
DR
0404
1301
0302
0603
0201
0401
DR
0901
1301
0303
0603
0301G
0402/0602
NT
1302
0609
0501
0402/0602
NT
1101
1501
0301G
0602
0401
NT
0701
1501
0201G
0602
0201
0401
NT
0404
0401
0301G
0302
0201
0401
NT
HLA-DQB1
HLA-DRB1
Отсутствие общего аллеля  у всех субъектов, у которых распознавание T-клеточного эпитопа Ara h 2 (95-107) блокировали при помощи антитела к HLA-DQ, указывало на то, что T-клеточные эпитопы должны презентироваться несколькими молекулами HLA-DQB1. Аналогично, разнообразие аллелей  у субъектов, у которых распознавание T-клеточных эпитопов Ara h 2 (127-141) или (37-47) блокировали при помощи антитела к HLA-DR, указывало на вырожденность обоих T-клеточных эпитопов по связыванию с несколькими молекулами HLA-DRB1.
Кроме презентации по меньшей мере 2 молекулами HLA-DR, T-клеточный эпитоп Ara h 2 (37-47) также презентировался HLA-DQB1*06:09, поскольку у обоих субъектов, у которых этот T-клеточный эпитоп распознавался в контексте HLA-DQ, был этот аллель, а у субъекта 9 он был единственным присутствующим аллелем DQB1.
DPB1*04:01
DRB1*15:01
Поскольку аллели  или  присутствовали у всех субъектов, у которых распознавались T-клеточные эпитопы Ara h 2 (32-44) (блокировали при помощи антитела к HLA-DP) или (95-107) (блокировали при помощи антитела к HLA-DR), соответственно, вырожденность этих T-клеточных эпитопов не могла быть определена. Однако, поскольку DPB1*0401 и DRB1*1501 являются преобладающими в популяциях по всему миру, T-клеточные эпитопы, которые презентируются этими молекулами HLA, будут распознаваться во многих случаях.
Общие аллели отсутствовали у двух или более субъектов, у которых доминантные консолидированные T-клеточные эпитопы Ara h 1 распознавались с участием данного типа HLA, что, таким образом, продемонстрировало, что каждый из идентифицированных T-клеточных эпитопов Ara h 1 также презентировался 2 или более различными молекулами HLA.
Предсказание мотивов, связывающихся с HLA: 20-мерные пептиды Ara h 1
В таблице 13 представлено краткое описание результатов для алгоритма предсказания мотивов, связывающихся с HLA-DR, в доминантных 20-мерах Ara h 1.
Таблица 13
Предсказание мотивов, связывающихся с HLA: 20-мерные пептиды Ara h 2
В таблице 14 представлено краткое описание результатов для 2 алгоритмов предсказания мотивов, связывающихся с HLA-DR, в 3 доминантных 20-мерах Ara h 2 (примечание: результаты предсказания не показаны для доминатного '20-мера 5', и фактические эпитопы не перекрываются с '20-мером 4').
Таблица 14
<b>Название 20-мера</b>
<b>Последовательность</b>
<b>Остатки</b>
пептид 4 Ara h 2
RRCQSQLERANLRPCEQHLM (SEQ ID NO:122)
28-47
пептид 11 Ara h 2
ELNEFENNQRCMCEALQQIM (SEQ ID NO:123)
91-110
пептид 15 Ara h 2
KRELRNLPQQCGLRAPQRCD (SEQ ID NO:124)
127-146
Таблица 15
При помощи выделения указаны особенно часто встречающиеся аллели в популяциях европеоидов.
(SEQ ID NO:126)(SEQ ID NO:130)(SEQ ID NO:128)(SEQ ID NO:127)(SEQ ID NO:129)(SEQ ID NO:125)
Улучшение пептидов для терапевтической доставки
Потенциально проблематичные остатки цистеина были замещены структурно консервативными, но менее химически активными остатками серина. Подтверждали, что T-клеточная реактивность была сохранена (Фигуры 10 и 11). Содержащие серин пептиды на основе T-клеточных эпитопов характеризовались T-клеточными ответами, сравнимыми с нативными пептидами, содержащими цистеин.
Объединение перекрывающихся T-клеточных эпитопов Ara h 1 в одиночные пептиды длиной ≤20 аминокислот
Таблица 16
При помощи выделения серым указаны пары перекрывающихся консолидированных T-клеточных эпитопов, объединенные в одиночные пептиды для дополнительного анализа, изложенного в тексте. * При помощи звездочек и прямоугольников указаны семь кандидатных пептидов Ara h 1, предложенных для применения в терапевтическом средстве.
Объединение перекрывающихся T-клеточных эпитопов Ara h 2 в одиночные пептиды длиной ≤20 аминокислот
Таблица 17
<b>Доминантные 20-меры</b>
<b>Коровые эпитопы</b>
<b>Кандидатные пептиды</b>
Остатки
Последовательность
Остатки
Последовательность
Остатки
Последовательность
28-47
RRCQSQLERANLRPCEQHLM
32-44
(SEQ ID NO:94)SQLERANLRPCEQ
32-47 C42S
(SEQ ID NO:141)SQLERANLRPSEQHLM
37-47
ANLRPCEQHLM
82-101
SQHQERCCNELNEFENNQRC
91-102
ELNEFENNQRCM
91-107 C[101+103]S
(SEQ ID NO:142)ELNEFENNQRSMSEALQ
91-110
ELNEFENNQRCMCEALQQIM
95-107
(SEQ ID NO:140)EFENNQRCMCEALQ
127-146
KRELRNLPQQCGLRAPQRCD
128-141
RELRNLPQQCGLRA
128-141 C137S
RELRNLPQQSGLRA
Обобщенные кандидатные пептиды Ara h 1 и Ara h 2
Всего было 10 кандидатных пептидов: 7 из Ara h 1 и 3 из Ara h 2 (таблица 18).
Таблица 18
<b>Информация о пептиде</b>
<b>Последовательность</b>
<b>Остатки</b>
<b>длина</b>
<b>HLA-рестрикция</b>
<b>Доминантные T-клеточные эпитопы Ara h 1</b>
23+24 коровый
FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV
206-225
20 аминокислот
HLA-DR
40 коровый
WSTRSSENNEGVIVKVSKE
353-371
19 аминокислот
HLA-DQ
46+47 коровый
NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ
409-427
19 аминокислот
HLA-DR
коровый 49
VEIKEGALMLPHFNSKA
436-452
17 аминокислот
HLA-DQ
50 коровый
ALMLPHFNSKAMVIVVV
442-458
17 аминокислот
HLA-DR
51 'коровый'
KAMVIVVVNKGTGNLELVAV
451-470
20 аминокислот
HLA-DR
57 коровый
GDVFIMPAAHPVAINASS
507-525
19 аминокислот
HLA-DR или HLA-DQ
<b>Доминантные T-клеточные эпитопы Ara h 2</b>
4+4/5 коровый
SQLERANLRPSEQHLM
32-47 C42S
16 аминокислот
HLA-DP, -DQ или DP
10+10/11 коровый
ELNEFENNQRSMSEALQ
91-107 C[101+103]S
17 аминокислот
HLA-DR или -DQ
15 коровый
RELRNLPQQSGLRA
128-141
14 аминокислот
HLA-DR
Также создавали 13 дополнительных более коротких вариантов пептидов (исходя из одиночных T-клеточных эпитопов) для сравнения. Некоторые последовательности были удлинены или укорочены (наряду с нативными последовательностями и остатками, критически важными для распознавания T-клетками) для улучшения свойств пептидов, связанных с получением и растворимостью. Это приводило в результате к панели из 23 кандидатных пептидов для сравнения. Подробности относительно пептидов обобщены в таблице 19.
Все из пептидов в таблице 18 получали с 95-99,9% чистотой, и определяли растворимость в растворах. Затем сравнивали T-клеточные ответы на каждый из этих пептидов при 2 дозах с использованием PBMC от 25 субъектов с аллергией на арахис для выбора конечной терапевтической комбинации.
Таблица 19
• Примечание относительно буферов: сначала все пептиды испытывали в PBS; затем использовали 0,1M NH4HCO3, если предполагалось, что для последовательности предпочтительным является высокое значение pH, или 1% уксусную кислоту для низкого значения pH; причем если не был растворимым в 1% уксусной кислоте, увеличивали до 2, 5, 10% и т. д.
• N-концевую 'W' удаляли из 'пептида 2 для улучшения стабильности и простоты синтеза.
• C-концевую 'E' добавляли в 'пептид 7 для улучшения растворимости (в ином случае пептид был нерастворимым, за исключением токсичных буферов)
Критерии выбора конечных пептидов
Цели:
Доведение до максимума охвата популяции и/или T-клеточной реактивности и в то же время сведение к минимуму количества и/или длины последовательностей.
Расширенные критерии выбора пептидов:
• сравнение T-клеточных ответов в ходе скрининга 23 пептидов;
• предшествующие данные относительно T-клеточной реактивности (для отдельных T-клеточных эпитопов/пептидов);
• последовательность (простота получения/растворимость);
• HLA-рестрикция (наиболее вырожденные и HLA-DQ-рестриктированные T-клеточные эпитопы).
Критерии выбора исходя из данных скрининга 23 пептидов:
• главные критерии оценки основаны на значениях SI для клеток CD25+CFSE-low;
• частота ответа на пептид у донора при одной или обеих концентрациях;
• сравнение ответов на длинные варианты и короткие варианты;
• сила/однородность ответов (т.е. у тех субъектов, у которых наблюдается ответ на обе концентрации, по сравнению с теми, у которых наблюдается ответ только на одну концентрацию);
• паттерны ответов.
В таблице 20 показан анализ T-клеточных ответов PBMC на полный набор из 23 кандидатных пептидов у 34 субъектов с аллергией на арахис. Эти данные демонстрируют значения SI для % CD25+CFSElow CD4+ T-клеток с использованием пептида/без стимуляции.
Данные сгруппированы для длинной и короткой версии каждого участка, содержащего T-клеточный эпитоп (см. рамки вокруг столбцов; например, 1-ая 'группа' = пептиды 1, 23 и 24 [пептид 1 объединяет перекрывающиеся пептиды 23 и 24, каждый из которых содержит отдельный T-клеточный эпитоп]). В кратком описании в нижней части каждой группы приведены комментарии относительно оптимального пептида, выбранного из этой группы. (Данные демонстрируют значения SI для % CD25+CFSElow CD4+ T-клеток с использованием пептида/без стимуляции).
Данные отсортированы в порядке убывания для 50 мкг образца длинной версии для каждой 'группы' пептидов (или 10 мкг образца, если ответы были лучше при этой дозе). В каждой строке в группе пептидов показаны данные для одного субъекта, но порядок субъектов различается в каждой группе пептидов.
Таблица 20. Краткое описание ответов на панель из 23 пептидов в расширенной когорте из 34
При помощи темно-серых прямоугольников указаны группы с допустимыми альтернативными пептидами для добавления/замены в рассматриваемомобъединенном образце.
Таблица 20 (продолжение)
Таблица 20 (продолжение)
Таблица 21. Альтернативное краткое описание T-клеточных ответов PBMC на полный набор кандидатных пептидов у 25 субъектов с аллергией на арахис
Таблица 21 (продолжение)
Краткое описание ответов на панель из 23 пептидов в когорте из 34
Данные указывают на то, что выбранные 7 пептидов представляют собой наилучшую комбинацию, однако, при помощи прямоугольников указаны группы, содержащие другие пептиды, приемлемые в качестве замен (или добавлений) в рассматриваемом объединенном образце.
Например:
1) пептидом 3 можно было бы заместить пептид 15;
2) пептидом 8 можно было бы заместить пептид 21;
3) пептидом 9 можно было бы заместить пептид 23;
Таблица 22. Краткое описание ответов на каждый пептид из смеси 7 пептидов в когорте из 39
Краткое описание ответов на каждый пептид из смеси 7 пептидов в когорте из 39
• Во всех случаях распознавался 1 или несколько пептидов,
• у 13/39 (33%) распознавались 100% пептидов,
• у 21/39 (54%) распознавались >85% (6 или более) пептидов,
• у 31/39 (79%) распознавались >70% (5 или более) пептидов,
• каждый пептид распознавался по меньшей мере у 25/39 субъектов (64%).
У всех из 74 протестированных субъектов наблюдалась реакция по меньшей мере на 1 пептид из 7 выбранных пептидов.
Ответы на различные объединенные образцы пептидов
Таблица 23
Примечание: В таблице 19 представлены последовательности для каждого из пептидов 1-23.
Объединенный образец 1 = 7 x исходных 'кандидатов' Ara h 1.
Объединенный образец 2 = 3 x исходных 'кандидатов' Ara h 2.
Объединенный образец 3 = 10 x смесь вышеуказанных 2 объединенных образцов (Ara h 1 и 2).
(охват последовательности Ara h 1, эквивалентный объединенному образцу 1
Объединенный образец 4 = 3 x 'кандидатов' Ara h 1 + 5 x более коротких вариантов ).
охват последовательности Ara h 2, эквивалентный объединенному образцу 2
Объединенный образец 5 = 5 x более коротких (одиночный эпитоп) вариантов кандидатов Ara h 2 ().
Таблица 24. Улучшенный объединенный образец пептидов
<b>Пептид Vax</b>
<b>Исходное название</b>
<b>№</b>
<b>HLA</b>
<b>Последовательность</b>
<b>Остатки</b>
<b>аминокислоты</b>
<b>Примечания</b>
Коровый 23+24
1
DR
FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV
Ara h 1 [206-225]
20
Содержит 2 основных эпитопа Ara h 1, присутствующих в запатентованном Ara h 1 для T-клеток
Коровый 40
2
DQ
STRSSENNEGVIVKVSKE
Ara h 1 [354-371]
18
*ключевая последовательность, выделенная в запатентованном Ara h 1, но короче на один остаток для обеспечения стабильности; при этом содержит один основной T-клеточный эпитоп Ara h 1
Коровый 47
15
DR
EVKPDKKNPQLQ
Ara h 1 [416-427]
12
Укороченная версия кандидатного пептида в запатентованном Ara h 1; при этом содержит 1 T-клеточный эпитоп Ara h 1.Индуцированы эквивалентные T-клеточные ответы на более длинную версию, содержащую дополнительный T-клеточный эпитоп, при скрининге 25 новых субъектов
Коровый 49
4
DR/DQ
VEIKEGALMLPHFNSKA
Ara h 1 [436-452]
17
*ключевая последовательность, выделенная в запатентованном Ara h 1
Коровый 57 (короткий)
19
DR/DQ
VFIMPAAHPVAINASS
Ara h 1 [509-524]
16
*укороченная версия ключевой последовательности, выделенной в запатентованном Ara h 1;более простое получение и более растворимая;при этом индуцированы эквивалентные T-клеточные ответы на более длинную версию, содержащую дополнительный эпитоп, при скрининге 25 новых субъектов
B
21
DR/DQ
ANLRPSEQHLM
Ara h 2 [37-47] C42S
11
Индуцированы эквивалентные T-клеточные ответы на более длинную версию, содержащую дополнительный T-клеточный эпитоп, при скрининге 25 новых субъектов
D
23
DQ
EFENNQRSMSEALQ
Ara h 2 [94-107] C[101+103]S
14
Индуцированы эквивалентные T-клеточные ответы на более длинную версию, содержащую дополнительный T-клеточный эпитоп, при скрининге 25 новых субъектов;при этом он длиннее на один остаток, чем коровый T-клеточный эпитоп, представленный в документе, который имеет отношение к Ara h 2.
Объединенный образец 7a = 5 x Ara h 1 + 3 x Ara h 2 для 'улучшенного' объединенного образца (такой же, что и конечный объединенный образец, но с дополнительным T-клеточным эпитопом Ara h 2).
Объединенный образец 7b = 5 x Ara h 1 + 3 x Ara h 2 для 'улучшенного' объединенного образца 7.
Ответы базофилов на объединенный образец 7 пептидов (объединенный образец 7b)
Данные относительно реактивности базофилов собирали для 14 субъектов с аллергией на арахис после инкубации с арахисом (CPE) или объединенным образцом 7 пептидов (объединенный образец 7b) при 3-4 log диапазоне концентрации (мкг/мл) (Фигура 2). У этих субъектов активацию базофилов и высвобождение гистамина индуцировали цельным арахисом и положительными контролями, но не смесью 7 пептидов.
Перед выбором объединенных образцов 7a и 7b. Объединенные образцы 7a и 7b последовательно создавали и тестировали.
T-клеточные ответы PBMC сравнивали с таковыми для цельного арахиса и объединенных образцов пептидов 1-5 из таблицы 23. (Фигуры 12 и 13). Что касается объединенных образцов 1-5, ни один из этих объединенных образцов не был способен индуцировать положительный T-клеточный ответ у всех протестированных субъектов. Почти все ответы на объединенный образец пептидов были значительно ниже, чем на цельный арахис (при протестированных концентрациях), и при этом для каждого из объединенных образцов 2, 3 и 4 только у одного субъекта наблюдался больший или одинаковый ответ на эти пептиды по сравнению с цельным арахисом. Что касается объединенных образцов 7a и 7b, 100% ответ был описан для объединенных образцов 7a и 7b (SI > 1,5). Объединенные образцы 7a и 7b индуцировали сопоставимые или большие ответы, чем цельный арахис, у многих субъектов, причем у 6/30 = ≥100 для ответа на CPE, у 6/30 = 50-80% ответа на CPE.
При сравнении T-клеточных ответов PBMC на объединенный образец 7 пептидов (Фигура 14) не наблюдались значимые различия между объединенными образцами 7a и 7b (сравнение парных данных; n = 15 на группу; при этом добавление 3-его пептида Ara h 2 не приводило к какому-либо преимуществу). Не наблюдались значимые различия при сравнении полных наборов данных для объединенного образца 7b (n=30) с когортой для объединенного образца 7a при помощи непарного критерия Манна-Уитни для непараметрических данных; p = 0,9).
Вкратце, оба объединенных образца 7a и 7b были значимо лучше, чем другие 5 протестированных объединенных образцов. Не наблюдались значимые различия для объединенного образца 7a по сравнению с объединенным образцом 7b. Объединенный образец 7b распознавался у 100% протестированных субъектов и индуцировал сопоставимые или большие T-клеточные ответы PBMC, чем арахис, у более 33% субъектов. Объединенные образцы 1-5 не распознавались у 100% субъектов и очень редко индуцировали одинаковые ответы по сравнению с цельным арахисом.
ТАБЛИЦА 25. Более подробное описание стадий и данных
<b>Подход</b>
<b>Результаты</b>
<b>1) Идентификация доминантных T-клеточных эпитопов основных аллергенов арахиса Ara h 1 и Ara h 2</b>
Выделяли CD4+ T-клетки, специфичные в отношении Ara h 1 или Ara h 2, из PBMC от субъектов с аллергией на арахис.
145 линий T-клеток, специфичных в отношении Ara h 1 (TCL) (18 субъектов).69 TCL, специфичных в отношении Ara h 2 (16 субъектов).Всего = 214 TCL от 20 субъектов.
Определяли специфичность в отношении перекрывающихся 20-мерных пептидов, охватывающих всю последовательность Ara h 1 или 2и выбирали доминантные 20-меры.
9 (из 69) доминантных 20-меров Ara h 1.4 (из 17) доминантных 20-меров Ara h 2.
Подтверждали, что доминантные 20-меры могли целенаправленно воздействовать на T-клетки из PBMC у субъектов с аллергией на арахис (скрининги при помощи CFSE).
≥ 1 20-мер Ara h 1 выявляли у 17/19.≥ 1 20-мер Ara h 2 выявляли у 6/6.
Оценивали общую частоту респондеров (объединенные данные, полученные из данных TCL и скринингов при помощи CFSE).
≥ 1 доминантный 20-мер Ara h 1 распознавался у 43/45. ≥ 1 доминантный 20-мер Ara h 2 распознавался у 16/16.
Картировали последовательности коровых T-клеточных эпитопов в пределах доминантных 20-меров.
10 доминантных коровых T-клеточных эпитопов Ara h 1.5 доминантных коровых T-клеточных эпитопов Ara h 2.
<b>2) Определение HLA-рестрикции коровых T-клеточных эпитопов</b>
Блокировали презентацию T-клеточных эпитопов специфичным TCL при помощи антител к HLA.HLA-генотипированных субъектов использовали для получения TCL.
HLA-DR и/или -DQ-рестриктированные T-клеточные эпитопы Ara h 1.HLA-DR, -DQ и/или -DP-рестриктированные T-клеточные эпитопы Ara h 2.Все T-клеточные эпитопы презентировались ≥ 1 молекулой HLA.
Оценивали вырожденность по связыванию с HLA при помощи алгоритмов.
Характеризующиеся сильным связыванием и вырожденные связывающиеся мотивы во всех T-клеточных эпитопах.
<b>3) Создание терапевтических кандидатных пептидов</b>
Остатки цистеина замещали остатками серина.
Все варианты с серином сохраняли T-клеточную реактивность.
Объединяли перекрывающиеся T-клеточные эпитопы в пептиды длиной ≤ 20 аминокислот.Создавали более короткие варианты с одиночными T-клеточными эпитопами.
7 кандидатных пептидов Ara h 1 (Prickett et al 2013).3 кандидатных пептида Ara h 2 (Prickett et al 2011).13 более коротких вариантов вышеуказанных кандидатных пептидов.
Синтезировали все 23 пептида с обеспечением чистоты, соответствующей GLP. Определяли растворимость в подходящих растворах.
Все пептиды получали с 95-99,9% чистотой.22/23 пептидов были растворимыми в PBS, 0,1M NH4HCO3 или 1-2% уксусной кислоте (1 нерастворимый пептид создавали заново, и в настоящее время новая версия является растворимой; пептид 7 в таблице 18).
<b>4) Выбор и тестирование конечной терапевтической смеси</b>
Сравнивали T-клеточную реактивность PBMC в отношении всех 23 пептидов (2 дозы) в новой когорте с аллергией на арахис.
Осуществляли скрининг 34 субъектов с использованием всех 23 пептидов.Определяли оптимальные комбинации пептидов.
Пептиды, выбранные для конечного терапевтического средства(с учетом T-клеточных ответов, свойств пептидов, частоты ответа, HLA-рестрикции, патентов).
Выбрали 7 пептидов (5xAra h 1 и 2xAra h 2).Презентировались на HLA-DR (5/7) и/или HLA-DQ (5/7).1-7 пептидов распознавались у 56/56 доноров.
Оценивали T-клеточный ответ PBMC на смесь из 7 пептидов при 2 терапевтических дозах в когорте с аллергией на арахис.
T-клеточный ответ наблюдался у 24/25 субъектов (часто сопоставимый или больше, чем ответ на арахис).
ПРИМЕР 3
Анергия T-клеток, индуцированная пептидом Ara h 2, в TCC, специфичных в отношении эпитопов Ara h 2
(Фигура 15)
6
4
5
T-клетки (1 x 10/мл) из клона T-клеток человека, специфичных в отношении пептида Ara h 2, культивировали в течение 16 часов в присутствии пептида Ara h 2 (ANLRPSEQHLM (SEQ ID NO:31; заштрихованная) при 100 мкг/мл в отсутствие вспомогательных клеток или в полной среде* отдельно (без Ag). Затем T-клетки тщательно промывали и повторно стимулировали (10/лунка) с использованием полной среды отдельно, 50 ед./мл IL-2 или иммуногенной концентрации пептида Ara h 2 (10 мкг/мл) в присутствии облученных аутологичных PBMC (10/лунка) в качестве вспомогательных клеток. Пролиферацию, которая коррелировала с включением меченого тритием тимидина, определяли в момент времени 72 часа. Результаты выражали в виде среднего значения cpm +SD для культур в трех повторностях. *Полная среда: RPMI + 5% сыворотка AB + Pen/Strep/L-глутамин + 10 ед./мл IL-2.
Анергия, индуцированная пептидом Ara h 1, в TCC, специфичных в отношении эпитопов Ara h 1
(Фигура 16)
6
4
5
T-клетки (1 x 10/мл) из клона T-клеток человека, специфичных в отношении пептида Ara h 1, культивировали в течение 16 часов в присутствии пептида Ara h 1 (STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO:12; заштрихованная) или несоответствующего пептида Pas n 1 гречки заметной при 100 мкг/мл в отсутствие вспомогательных клеток или в полной среде* отдельно (без Ag). Затем T-клетки тщательно промывали и повторно стимулировали (10/лунка) с использованием полной среды отдельно, 50 ед./мл IL-2 или иммуногенной концентрации пептида Ara h 1 (10 мкг/мл) в присутствии облученных аутологичных PBMC (10/лунка) в качестве вспомогательных клеток. Пролиферацию, которая коррелировала с включением меченого тритием тимидина, определяли в момент времени 72 часа. Результаты выражали в виде среднего значения cpm для культур в трех повторностях. *Полная среда: RPMI + 5% сыворотка AB + Pen/Strep/L-глутамин + 10 ед./мл IL-2.
Специалисты в данной области техники поймут, что настоящее изобретение, описанное в данном документе, допускает вариации и модификации, отличные от тех, которые были описаны специально. Следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все такие вариации и модификации. Настоящее изобретение также охватывает все стадии, признаки, композиции и соединения, на которые делается ссылка в данном описании или указанные в нем, отдельно или в совокупности, а также любую комбинацию и все комбинации любых двух или более указанных стадий или признаков.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
, J Allergy Clin Immunol.
Akdis & Akdis 123:735-46, 2009
, Nature Reviews: Drug Discovery.
Akdis & Akdis8:645-60. 2009
, J Allergy Clin Immunol.
Akdis & Akdis127:18-27, 2011
et al.
Clin Exp Allergy
Alexander  35: 52-8, 2004
et al. Allergy
Alexander 60:1269-74, 2005
Clin Exp Allergy.
Allen &O'Hehir. 41(9):1172-4, 2011
et al
Gene., 69:
Amann ., 1998, 301-315
et al. Clin Exp Allergy.
Anagnostou 41(9):1273-81, 2011
et al.
Anaesthesia
Apostolou E  2006. Anaphylaxis to Gelofusine confirmed by an in vitro basophil activation test: a case series. ; 61(3):264
et al
Allergy
Asarnoj . . 2010, 65(9):1189-95
et al
Embo J., 6:
Balderi ., 1987, 229-234
et al
Clin Exp Allergy
Blanc . . 2009; 39(8):1277-85
et al. J Allergy Clin Immunol.
Blumchen 126(1):83-91, 2010
et al. J Allergy Clin Immunol.
Bock 119(4):1016-8, 2007
Int Arch Allergy Immunol
Burks et al,  119:165-172, 1992
et al.
Allergy
Burks ,  53: 725-30, 1998
Burks AW. 2008. Peanut allergy. Lancet;371(9623):1538
et al
Pediatr Allergy Immunol
Chiang . . 2009; 21(2 Pt 2):e429-38
et al.
Clin Exp Allergy
Clarke ,  28: 1251-7, 1998
et al.
Allergy
Clark 64, 1218, 2009
et al.
Clin Exp Allergy
de Jong ,  28: 743-51, 1998
et al.
Clin Exp Allergy
de Leon MP , Suphioglu, C. 2003. Immunological analysis of allergenic cross-reactivity between peanut and tree nuts. ; 33(9):1273
et al.
J Immunol
Drew AC  2004. Hypoallergenic variants of the major latex allergen Hev b 6.01 retaining human T lymphocyte reactivity. : 173(9):5872-9
Int Arch Allergy Immunol.
Eusebius NP, Papalia L, Suphioglu C, McLellan SC, Varney M, Rolland JM, et al. Oligoclonal analysis of the atopic T cell response to the group 1 allergen of Cynodon dactylon (bermuda grass) pollen: pre- and post-allergen-specific immunotherapy.  2002;127(3):234-44
et al. J Allergy Clin Immunol.
Fellrath 111: 854-61, 2003
et al
Allergy
Glaumann . . 2012; 67(2):242-7
et al
Vaccine
Hall . . 21(5-6):549-61, 2003
et al. J. Allergy Clin. Immunol.
Hofmann 124, 286, 2009
et al.
J Allergy Clin Immunol
Hourihane ,  100: 596-600, 1997
et al
J Exp Med
Hoyne . . 178(5):1783-8, 1993
Husain Z, Schwartz RA. 2012. Peanut allergy: an increasingly common life-threatening disorder. J Am Acad Dermato1;66(1):136
et al
J. Virol., 64:
Jameel ., 1990, 3963-3966
et al. J. Allergy Clin. Immunol.
Jones 24, 292, 2009
et al
Med. J. Aust.
Kemp .  188(9):503-4, 2008
et al.
Int Arch Allergy Immunol
Kleber-Janke ,  119: 265-274, 1999
et al
Bio Techniques., 8:
Knapp ., 1990, 280-281
et al
Allergy
Koppelman . . 2001; 56(2):132-7
et al
Clin Exp Allergy
Koppelman . . 2004; 34(4):583-90
Cell., 30:
Kurjan and Herskowitz., 1982, 933-943
Clin Exp Allergy
Larch M. 2008. Of cats and men: immunodominance and the role of HLA-DP/DQ. ; 38(11):1709
et al
J Microbiol Immunol Infect
Lin . . 2012
et al.
Int Arch Allergy Appl Immunol
Litwin ,  87: 361-61, 998
J Immunol Methods
Mannering SI, Dromey JA, Morris JS, Thearle DJ, Jensen KP, Harrison LC. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. . 2005;298(1-2):83-92
et al
Mol Immunol
Marazuela . . 45(2):438-45, 2008
et al.
J Allergy Clin Immunol
Marcotte ,  101: 506-13, 1998
Mittag D, et al. 2010. The effector T cell response to ryegrass pollen is counter-regulated by simultaneous induction of regulatory T cells. J Immunol; 184(9);4708
Allergy
Moldaver & Larche, 66: 784-91, 2011
et al
Int Arch Allergy Immunol
Moverare .  2011; 156(3):282-90
et al. J Allergy Clin Immunol.
Muller  101: 747-54, 1998
et al.
J Allergy Clin Immunol
Nelson ,  99: 744-51, 1997
et al.
Allergy
Nopp A,  2006. Basophil allergen threshold sensitivity: a useful approach to anti-IgE treatment efficacy evaluation. ; 61(3):298
et al.
Am J Respir Crit Care Med
Norman ,  154: 1623-8, 1996
et al.
Am J Respir Crit Care Med
O'Hehir RE,  2009. House dust mite sublingual immunotherapy: the role of TGF-beta and functional regulatory T cells. ; 180(10):936
et al. Lancet
Oldfield360:47-53, 2002
et al.
J Allergy Clin Immunol
Oppenheimer ,  90: 256-62, 1992
et al
Clin Immunol
Palmer . . 2005; 115(3):302-12
et al
Clin Exp Allergy
Peeters . . 2007; 37(1):108-15
et al.
J Allergy Clin Immunol
Pene ,  102: 571-8, 1998
et al
Clin. Exp. Allergy
Pomés . 2006,  36(6):824-30
et al.
J Allergy Clin Immunol
Prickett SR  2011. Ara h 2 peptides containing dominant CD4+ T-cell epitopes: candidates for a peanut allergy therapeutic. ; 127(3):608
et al.
Clin Exp Allergy
Primeau ,  30: 1135-43, 2000
Current Opinion in Allergy & Immunology.
Pumphrey, 4(4):285-90, 2004
et al
Pharmacology & Therapeutics
Rolland .  121:273-284, 2009
et al
Allergy
Rupa . . 67(1):74-82, 2012
et al
Sambruck  (1989)
et al
Proc Natl Acad Sci U S A
Santambrogio . , 1999, 96:15056-61
et al
Gene., 54:
Schultz ., 1987, 113-123
et al.
Paediatrics
Sicherer ,  102: e6, 1998
et al. Clin Exp Allergy
Tarzi . 36: 465-74, 2006
et al. J Allergy Clin Immunol.
Thyagarajan 126(1):31-2, 2010
et al
British Medical Journal 302
Varney . 1991 :265-269
et al. J Allergy Clin Immunol.
Varshney124(6):1351-2, 2009
et al. J Allergy Clin Immunol.
Varshney 127(3):654-60, 2011
et al. J Allergy Clin Immunol.
Worm 127: 89-97, 2011
et al. Expert Opin. Investig. Drugs.
Worm  22(10): 1347-1357, 2013
et al
Clin Exp Allergy
Yang .  40(4):668-78, 2010
et al
J Pept Sci
Yoshitomi . . 13(8):499-503, 2007
et al. Int Arch Allergy Immunol.
Yu 159(2):179-182, 2012
et al.
J Immunol
Zaunders JJ,  2009. High levels of human antigen-specific CD4+ T cells in peripheral blood revealed by stimulated coexpression of CD25 and CD134 (OX40). ; 183(4):2827