Репаративная регенерации костной ткани в условиях местного применения культивированных аллофибробластов у экспериментальных животных

УДК: 616.71-003.93:612.05-092.4

РЕПАРАТИВНАЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ В УСЛОВИЯХ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ АЛЛОФИБРОБЛАСТОВ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

А.А.ТАШПУЛАТОВ, Э.Ю.ВАЛИЕВ

Reparative bone tissue regeneration in a local application of cultured allofibroblast in experimental animals

A.A.TASHPULATOV, E.Y.VALIEV

Республиканский научный центр экстренной медицинской помощи

В эксперименте на 45 крысах изучено влияние культивированных аллофибробластов на заживление сегментарных дефектов (2,5 мм) диафиза бедренной кости. Сравнительный анализ показал, что имплантируемая культура аллофибробластов обладает выраженными остеоиндуктивными свойствами, что способствует активизации репаративного остеогенеза, сокращению сроков образования, созревания и ремоделирова-ния костной мозоли, сращения перелома. Заживление костного дефекта в условиях стимуляции с подсадкой аллогенных фибробластов протекает без хондроматозной реакции.

Ключевые слова: костная ткань, остеогенез, регенерация, культивация аллофибробластов.

The effect of cultured allofibroblasts on the healing of femur diaphysis segmental defects (2.5 mm) has been studied In experiments on 45 rats . Comparative analysis of the results showed that implantable culture of allofibroblasts has the expressed osteoinductive features which help to enhance the reparative osteogenesis, shortening of the formation, maturation and remodeling of the callus, fracture healing. Healing of bone defect in stimulation with allogeneic fibroblasts replanting primary callus cellular fibrous tissue occurs without hondromatose reaction.

Key words: bone tissue, bone formation, regeneration, cultured allofibroblasts.

Проблема репаративной регенерации кости среди теоретических основ ортопедии и травматологии занимает одно из центральных мест. Ещё во времена Гиппократа с целью стимуляции регенерации костной ткани применяли различные средства. Об актуальности этой проблемы свидетельствует большое число работ, посвященных этому разделу хирургии. Результаты лечения костных повреждений зависят от многочисленных факторов [6,12-14]. Обширные костные дефекты, системный остеопороз, нарушение кровоснабжения зоны перелома, наследственные заболевания соединительной ткани, ослабление организма, связанное с перенесенными заболеваниями, являются неблагоприятными условиями для восстановления поврежденных костей, которое может оказаться неполноценным или замедленным. В таких случаях необходима стимуляция репаративного остеогенеза [9-11].

По данным разных авторов, процесс лечения 625% переломов длинных костей осложняется несращениями и развитием ложных суставов [5,7,8]. В настоящее время активно ведется поиск новых технологий, которые позволили бы ускорить образование костной ткани. В связи с этим клиницисты стремятся к оптимизации остеорепарации с использованием различных факторов, в том числе мумие, ретаболила, оротата калия, кальцитрина, антиоксидантов, электромагнитного поля, электретов, лазерного излучения, низкомолекулярных пептидов, даларина и др. [1,3,4].

В последние годы в качестве возможного способа стимуляции процесса репарации предлагаются регенеративные методики с использованием культивированных аллофибробластов (АФ). Сообщают об обнадеживающих ранних клинических результатах их применения. Фибробласты - основные клетки соединительной ткани, которые имеют мезенхимальное происхождение и морфологически характеризуются как клетки круглой или удлиненной, веретенообразной пло-

ской формы с отростками и плоским овальным ядром. Фибробласты синтезируют тропоколлаген, предшественник коллагена, межклеточный матрикс и основное вещество соединительной ткани, аморфное желепо-добное вещество, заполняющее пространство между клетками и волокнами соединительной ткани [2].

Количество предложенных методов свидетельствует о необходимости продолжения поиска более совершенных, доступных, экономически менее затратных способов стимуляции репаративного остеоге-неза, которые позволили бы сохранить достоинства традиционных методов и максимально сократить их недостатки.

Таким образом, высокая частота повреждений костей, большой процент осложнений после традиционных методов лечения переломов, значительные показатели инвалидизации трудоспособного населения диктуют необходимость дальнейшей разработки рациональных способов стимуляции репаративного ос-теогенеза, которые позволили бы улучшить результаты лечения.

Цель исследования — изучить влияние культивированных аллофибробластов на репаративный остео-генез в эксперименте.

Материал и методы

Исследования проводились на 45 беспородных 5-6 -месячных крысах массой 210 ± 30 г, содержавшихся в условиях вивария, натощак с 9:00 до 11:00 утра. Уход и содержание экспериментальных животных были стандартными и соответствовали принципам Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Крысы выращивались в условиях вивария экспериментального отдела РНЦЭМП при 12-часовом периоде освещения, комнатной температуре 20±2°С, влажности 50-70%.

Кормление животных осуществлялось согласно установленному рациону с применением комбикорма для лабораторных крыс и мышей.

В работе использовались культивированные алло-фибробласты, основные клетки соединительной ткани. В основной опытной группе оценивалось влияние порошка кальция карбоната. Кальций карбонат - порошок или кристалл белого цвета без запаха и вкуса. Практически нерастворим в воде, растворим в разведенных соляной и азотной кислотах с выделением углекислого газа. Содержит 40% кальция.

Животные были разделены на 3 группы по 15 особей в каждой: 1-я контрольная группа, 2-я опытная группа АФ, 3-я опытная группа кальций карбонат.

Под внутримышечным наркозом (0,5 мл кетамина) производили разрез кожи и мышц в проекции средней трети правого бедра. Тупым и острым путем обнажали переднюю поверхность бедренной кости на уровне средней трети. Далее с помощью шаровидной фрезы диаметром 2,5 мм производили трепанацию бедренной кости в средней трети диафизарной зоны с формированием дефекта диаметром и глубиной до 3,5 мм с обнажением костномозгового канала. В дефект имплантировали исследуемый материал. Послеоперационную рану послойно ушивали наглухо.

Животным 1-й контрольной группы в костный дефект ничего не вводили, 2-й в дефект имплантировали культивированные аллофибробласты, 3-й - порошок кальция карбоната. Животных выводили из опыта на 7-, 14- и 30-е сутки после операции (по 5 животных на каждый срок). Эвтаназию осуществляли внутривенным введением летальных доз наркотических средств. При выведении животного из опыта выделяли бедренную кость, материал оценивали макроскопически. Далее производили рентгеноисследование макропрепарата.

Исследуемый материал (бедренную кость) фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина (рН 7,2-7,4), затем декальцинировали в 5% растворе азотной кислоты, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Ван-Гизону и изучали в светооптическом микроскопе. Анализ и фотографирование гистологических препаратов проводили под световым микроскопом Karl Zeiss (ФРГ).

Результаты и обсуждение

Рентгенологически во всех группах на 7-, 14- и 30-е сутки эксперимента отмечалось формирование выраженной периостальной костной мозоли в виде веретенообразного затемнения в области костного дефекта. В поздние сроки наблюдения, через 1 месяц костная мозоль имела большую плотность. Наблюдалось активное формирование кортикальных пластин и редукция периостальной костной мозоли (рис. 1). В трех группах животных рентгеновская картина была одинаковой.

Морфологическое исследование показало, что на 7 -й день после подсадки на дефект диафизарной части бедренной кости животных аллогенных фибробластов формируется предварительная клеточно-волокнистая мозоль. Первичная мозоль, состоящая из волокнистой соединительной ткани и тонкостенных сосудов, формировалась в периостальной зоне за счет как проли-

ферации аллогенных фибробластов, так и местных фибробластов надкостницы (рис. 2).

Образование предварительной соединительнотканной мозоли начиналась с кровоизлияния в состав подсаженной клеточной культуры с осаждением в межклеточном пространстве кровяных элементов, в основном эритроцитов и фибрина. Процесс формирования предварительной мозоли начинался с дифференциации аллогенных клеток в активизированные фибробласты удлиненной и веретенообразной формы, которые начинали вырабатывать коллагеновые волокна и образовывали клеточно-волокнистые тяжи. Эти тяжи продвигались в сторону дефекта и плотно соединялись с костным веществом сломанной кости с образованием частокола, из почти параллельно расположенных балок.

Необходимо отметить, что при формировании предварительной костной мозоли за счет аллогенных фибробластов пролиферация соединительнотканных элементов со стороны эндоста имела значительно меньшую степень выраженности. Костный дефект при этом восстанавливался за счет периостальных разрастаний клеточно-волокнистых структур из аллогенных фибробластов.

На 14-й день эксперимента наблюдалась постепенная дифференцировка аллогенной соединительнотканной мозоли в предварительную костную мозоль, начиная со стороны периостальной поверхности костных отломков. Такая картина была связана с активацией аллогенных фибробластов, дифференцировкой их в остеобласты в зоне повреждения. Костеобразующие клетки появлялись со стороны периоста и, интенсивно размножаясь, превращались в остеогенную фиброретикуляр-ную ткань с распространением в сторону дефекта, формируя малообызвествленные костные балки (рис. 3).

При этом происходило размножение остеобластов, дифференциация коллагеновых волокон и склеивание их вначале в грубые пучки, а потом в сплошную массу грубопучкового остеоида. В составе формирующейся костной мозоли определялось наличие большого количества промежутков, состоящих из мягкотканых клеточных элементов и кровеносных сосудов.

Через 1 месяц от начала эксперимента в составе предварительной костной мозоли происходило утолщение пучков грубоволокнистого остеоида, накопление в них извести с образованием дополнительных балок между пучками. Позднее между отдельными балками, образующими первичную систему костных регенератов, появлялись поперечные перемычки. На периферии костной мозоли отдельные остеоидные пучки смыкались своими периферическими концами, образуя, таким образом, первичные гаверсовы каналы, заполненные волокнистой тканью и капиллярами.

В случаях, когда костный дефект глубокий и доходил до костного мозга, отмечалось образование пе-риостальной хрящевой массы, образующей плотный субстрат, создающий благоприятную почву для возникновения в пределах его новых костных структур. При этом вновь возникшее и сформировавшееся хрящевое вещество подвергалось частичной резорбции. Из его остатков развивались новые костные структуры. Иными словами, в пределах костного дефекта развертывались процессы так называемого хондропла-

Рис. 1. Рентгенокартина регенерации костной ткани экспериментальных животных: I — контрольная группа, II — культивированные аллофибробласты, III — кальция карбонат; А — 7-е сутки, В — 14-е сутки, С — 30-е сутки.

Рис. 2. Пролиферации аллогенных фибробластов и местных фибробластов надкостницы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок.10, об.40.

Рис. 3. Остеогенная фиброретикулярная ткань с формированием малообызвествленных костных балок (14 сут.). Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок.10, об.40.

Рис. 4. Хондропластические образования кости в пределах костного дефекта. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок.10, об.40.

стического образования кости (рис. 4).

Необходимо отметить, что при подсадке аллогенных фибробластов хондропластическое костеоб-разование происходило только со стороны перио-стальной поверхности кости, а в эндостальной части ни в одном случае не выявлено образование хрящевой массы, отмечались только фибробластиче-ские реакции.

Заключение

Доказано стимулирующее воздействие аллогенных фибробластов на течение процесса регенерации костной ткани в эксперименте. Отличие кост-

ной мозоли при использовании кальция карбоната на костный дефект заключались в том, что за счет избыточного содержания солей кальция в составе формирующейся предварительной костной мозоли все клеточные элементы были более крупными и обогащенными кристаллами минералов. В составе предварительной мозоли за счет меньшего количества сосудов со стороны эндоста наблюдалась усиленная пролиферация соединительнотканных клеток и развитие фиб-ропластической ткани, которые сопровождались вторичной резорбцией компактной кости.

Выводы

1. Заживление костного дефекта в условиях стимуляции с подсадкой аллогенных фибробластов, первичная костная мозоль клеточно-волокнистой ткани протекают без хондроматозной реакции.

2. При больших дефектах компактной кости, доходящих до костного мозга, отмечалось образование хрящевых масс, хондропластических костных структур, а также сложного переплета пучков коллагеновых волокон. Последние со временем подвергались перестройке и замещению новыми костными генерациями.

3. При формировании окончательной костной ткани из грубоволокнистой кости процесс перестройки осуществляется массивным рассасыванием беспорядочных мягких старых структур и заменой их новыми, упорядоченными образованиями гаверсовых каналов.

Литература

1. Бетинарь, Н.Р., Концевая С Ю.Стимуляция остеоге-неза при переломах костей у собак при использовании цитоксической остеогенной сыворотки. Материалы 12-го Международного ветеринарного конгресса М. ООО Испо-Сервис 2004; 106-108.

2. Бобро Л.И. Фибробласты и их значение в тканевых реакщях. Арх пат 1990; 12: 65-68.

3. Бурейко Л.Н., Реутов П.С., Третьяков А.С., Калугин А.В. Комплексное лечение несросшихся переломов и ложных суставов костей конечностей с использованием костной пластики и лазерного излучения. Деминерализованный костный трансплантат и его применение. СПб 1993; 111-114.

4. Гололобов В.Г. Регенерация костной ткани при заживлении механических и огнестрельных переломов. Автореф. дис.... д-ра мед. наук. СПб 1996; 40.

5. Гололобов В.Г. Регенерация костной ткани при заживлении огнестрельных переломов. СПб Петербург XXI век 1997; 160.

6. Грачев И.Р. Комплексная оптимизация остеорепа-рации при лечении переломов длинных костей

конечностей. Автореф. дис.... канд. мед. наук. СПб

1992; 16.

7. Гунько И.И., Верлов Г.А., Величко П.С., Наумович С.А. Влияние переменного магнитного поля на ос-теогенез в эксперименте. Здравоохр Белоруссии 1992; 9: 32-35.

8. Лузянин В.Б., Савченко В.И., Колчанов Н. и др. Дозированная нагрузка в восстановительном лечении больных с диафизарными переломами голе-ни.Вопр курортол, физиотер и ЛФК 2002; 4: 39-41.

9. Романов Н. Биологическое действие вибрации и звука. М Наука 1991.

10.Федоров B.H.. Влияние антиоксидантов на репара-

тивную регенерацию костной ткани (экспериментальное исследование) Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М 1991; 18.

11.Lin C., Sun J.S., Hou S.M. External fixation with or without supplementary intramedullary Kirschner wires in the treatment of distal radial fractures. Canad J Surg 2004; 47(6): 431-437.

12.Mangano C., Bartolucci E.G., Mazzocco C. A new porous hydroxyapatite for promotion of bone regeneration in maxillary sinus augmentation: clinical and his-tologic study in humans. Int J Oral Maxillofac. Implants 2003;18: 23-30.

13.Qu S.X., Guo X., Weng J. et al. Evaluation of the expression of collagen type I in porous calcium phosphate ceramics implanted in an extra-osseous site. Biomaterials 2004; 25: 659-667.

14.Sonobe M., Hattori K., Tomita N. et al. Stimulatory effects of statins on bone marrow-derived mesenchy-mal stem cells. Study of a new therapeutic agent for fracture. Biomed Mater Eng 2005; 15(4): 261-181.

УСТИРИЛГАН АЛЛОФИБРОБЛАСТЛАРНИ МА^АЛЛИЙ КУЛЛАШ ШАРОИТИДА ТАЖРИБАВИЙ ХАЙВОНЛАР СУЯК ТУКИМАЛАРИНИНГ РЕПАРАТИВ РЕГЕНЕРАЦИЯСИ А.А.Ташпулатов, Э.Ю.Валиев Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази

Устирилган аллофибробластларнинг сон суяги диафизининг сегментар нуксони (2,5 мм) битишига таъсири 45 нафар каламушларда утказилган тажриба-ларда урганилди. Имплантация килинган аллофибробластларнинг экини кучли остеоиндуктив хусусиятлар-га булиб, репаратив остеогенезнинг фаоллашувига, суяк кадоги хосил булиши, етилиши ва шаклланиши мухлатларининг кискаришига хамда синган жой бити-шига кумаклашиши муаллифлар томонидан аникланди. Аллоген фибробластларни экиш ёрдамида стимуляция килиш шароитида суяк дефектларининг битиши хондроматоз реакциясиз кечиши курсатилган.

Контакт: Ташпулатов Ахрор Аскарович.

Ташкент, Хамзинский р-н, ул. Хосият, 5.

Тел.: +99897-446-5508.

E-mail: tashpulatov80@mail.ru