Способ модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих
METHOD OF MODIFYING PROLIFERATIVE ACTIVITY OF CELL CULTURES OF MAMMALS

Предполагаемое изобретение относится к области биотехнологии и цитологии, а именно к клеточным технологиям, и может быть также использовано в медицине и ветеринарии для модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих.
В настоящее время, в связи с интенсивным развитием биомедицинских клеточных технологий на передний план выходят проблемы, связанные с масштабным культивированием клеток. Специалисты в области клеточных технологий сталкиваются с необходимостью получения большого количества клеток в короткие сроки, в частности, при лечении многих заболеваний, например, ожогов, что ограничено сравнительно небольшим количеством аутоклеток получаемых при культивировании.
Однако, сама специфика культуральной работы обусловливает необходимость длительного ожидания достаточного количества аутоклеток при их культивировании. Также, существует жесткая зависимость от исходного количества забранного у донора биоматериала.
Для решения указанной проблемы в течение многих лет применяют и разрабатывают различные способы модификации пролиферативной активности культивируемых клеток, основанные на использовании разнообразных добавок для питательных сред. В частности, существуют способы, где применяют сыворотку крови животных и человека, лизаты тромбоцитов, гидролизаты тканей различных живых организмов, гидролизат лактальбумина, триптозу, бактопептон, эмбриональный экстракт, холин, L-глутамин, факторы роста, нуклеиновые кислоты, наночастицы оксида церия и многие другие.
Сыворотка крови является важнейшим компонентом питательных сред, большинство клеточных культур млекопитающих и других позвоночных требуют ее наличия для роста, так как она потенцирует прикрепление и размножение клеток за счет содержания многочисленных факторов роста, факторов адгезии и веществ с антитрипсиновой активностью. В настоящее время при культивировании клеточных культур широко применяется сыворотка крови человека, сыворотка крупного рогатого скота, лошадиная сыворотка, эмбриональная бычья сыворотка, телячья сыворотка, стандартизованная добавка, содержащая сыворотку «MesenCult™» (STEMCELL Technologies Inc., Канада) и многие другие. Ввиду своего натурального происхождения сыворотка крови является одним из самых дорогих компонентов питательной среды, а также имеет непостоянный состав, что оказывает влияние на получаемые результаты при культивировании клеток с ее использованием. В случае содержания различных ингибиторов роста клеток или при контаминации патогенами сыворотка крови становится непригодной для использования в культуральных целях (Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. М.: Бином, 2010).
Также, в качестве компонента культуральных сред для стимуляции культуры клеток популярно использование лизатов тромбоцитов и кондиционированных культуральных сред, что обусловлено наличием в них большого количества биологически активных веществ (патент РФ №2341270, 20.12.2008; патент РФ №2648162, 22.03.2018; патент РФ №2664478, 17.08.2018; патент РФ №2280459, 27.07.2006). Использование их для культивирования клеток имеет схожие недостатки с применением сыворотки крови.
В связи с вышеуказанными недостатками сыворотки крови, лизатов тромбоцитов и кондиционированных культуральных сред разработан ряд добавок на основе гидролизатов и экстрактов полученных, из тканей животных, растений, биомассы бактерий, белков природного происхождения, а также способы их применения (Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. М.: Бином, 2010; Методы культивирования клеток / под ред.: Т.П. Пинаева, М.С. Богдановой. СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2008). В частности, используют экстракт лиофильно высушенной медицинской пиявки (патент РФ №2588666, 10.07.2016), гидролизат сои (патент РФ №2266325, 20.12.2005), гидролизат пшеницы (патент РФ №2383616, 10.03.2010), гидролизат кукурузы (патент США №9534026, 24.12.2014), продукт ферментативного разложения мяса рыб или экстракт из мяса рыб (патент РФ №2333242, 10.09.2008), добавку для стимуляции клеток человека и животных на основе свежеизъятого мозга быка - «LIVECELL» (ИМТЕК, Россия). При их применении риск контаминации клеточной культуры патогенами минимален, особенно при использовании растительного сырья. Однако, в связи с природным происхождением перечисленных продуктов также наблюдается непостоянство их химического состава, обусловленное физиологическими изменениями обмена веществ организмов продуцентов.
В связи с перечисленными недостатками указанных добавок для получения полных питательных сред разработаны бессывороточные среды и добавки на основе биологически активных и питательных веществ неприродного происхождения (Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. М.: Бином, 2010; Методы культивирования клеток / под ред.: Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2008). В частности, используют соединения холина (патент РФ №2563353, 20.09.2015), эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, трийод-L-тиронин, гидрокортизон, инсулиноподобный фактор роста-1, инсулин неживотного вторичного происхождения (патент РФ №2383616, 10.03.2010; патент США №8563303, 16.03.2009), нуклеиновые кислоты и продукты на их основе (патент РФ №2620069, 22.05.2017), наночастицы оксида церия (патент США №8772032 В2, 03.10.2011), экдистероид, его производные и продукты их содержащие (патент РФ №2143884, 10.01.2000), L-глутамин (Eagle Н., Oyama V.I., Levy М., Horton C.L., Fleischman R. The growth response of mammalian cells in tissue culture to L-glutamine and L-glutamic acid // Journal of Biological Chemistry. 1956. V. 218. №. 2. P. 607-616).
Несмотря на то, что использование в составе культуральных сред биологически активных веществ неприродного генеза взамен сыворотки крови и иных компонентов натурального происхождения решает проблему непостоянства состава и снижает вероятность контаминации сред, при их использовании появляются иные трудности. В частности, бессывороточные и не содержащие в своем составе природных компонентов среды хуже поддерживают рост клеточных культур, культивируемые клетки необходимо адаптировать к их использованию, данные среды зачастую являются селективными в отношении культивируемых клеток, также часто требуют включения в состав факторов роста, что приводит к значительному их удорожанию (Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. М.: Бином, 2010; Методы культивирования клеток / под ред.: Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2008).
Ближайшим аналогом предлагаемого способа модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих применением D-аспарагина является введение в состав питательных сред для культивирования клеток L-аспарагина - левовращающего стереоизомера моноамида аспарагиновой кислоты. Использование L-аспарагина в комплексе с другими традиционно используемыми добавками в питательные среды способно эффективно поддерживать пролиферативную активность культивируемых клеток (патент США №06539954, 07.10.1983).
Однако, несмотря на повсеместное применение L-аспарагина в качестве одного из компонентов питательных сред, в том числе бессывороточных и не содержащих природных компонентов, его использование не способно кардинально увеличить пролиферативную активность продуцируемых клеток. При этом L-аспарагин не обладает свойствами модулятора пролиферативной активности, то есть при его использовании нельзя добиться обратимого снижения пролиферативной активности клеток, к примеру, в случае необходимости синхронизации культивируемых клеток по фазе клеточного цикла либо при включении клеток в состав биоинженерных клеточных продуктов.
Задачи:
1) Повышение эффективности культивирования клеток млекопитающих.
2) Повышение эффективности питательной среды для культивирования клеток млекопитающих.
3) Снижение себестоимости культивирования клеток млекопитающих.
4) Расширение базы добавок в питательные среды способных модулировать пролиферативную активность культивируемых клеток млекопитающих.
Сущностью предлагаемого способа модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих с применением D-аспарагина является культивирование клеток млекопитающих в течение 2-48 часов на полной питательной среде, содержащей раствор среды ДМЕМ, 10% сыворотки крови и 1% раствора стрептомицина-пенициллина, с включением в состав питательной среды, в качестве активного компонента, D-аспарагина в концентрации 0,013-0,13 г/л, далее проводят замену питательной среды на ту же, но без D-аспарагина и продолжают культивировать клетки в течение 72 часов.
Техническим результатом предлагаемого способа модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих с применением D-аспарагина является повышение эффективности культивирования клеток млекопитающих, рост эффективности питательной среды для культивирования клеток млекопитающих, снижение себестоимости культивирования клеток млекопитающих, а также - расширение базы добавок в питательные среды способных модулировать пролиферативную активность культивируемых клеток млекопитающих. При кондиционировании клеточной культуры полной питательной средой, содержащей D-аспарагин в концентрации 0,013-0,13 г/л в течение 2-х часов, наблюдается увеличение количества клеток в среднем в 2 раза и сокращение времени удвоения популяции клеток на 17%, что свидетельствует о выраженной стимуляции пролиферативной активности культивируемых клеток. С увеличением времени воздействия полной питательной среды, содержащей D-аспарагин, на культивируемые клетки до 48 часов достигается уменьшение среднего количества клеток в 2,3 раза и увеличение времени удвоения популяции клеток на 21% без снижения их метаболической активности по данным ХТТ-теста.
Предлагаемый способ модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих применением D-аспарагина основан на использовании D-аспарагина в качестве активного вещества, модифицирующего свойства питательной среды, к которой он добавляется.
2
0
0
0
Способ осуществляют следующим образом - D-аспарагин 0,013-0,13 г в форме сухого порошка растворяют в 1 литре полной питательной среды следующего состава: раствор питательной среды ДМЕМ, 10% сыворотки крови и 1% раствор стрептомицина-пенициллина. Процесс проводят в асептических условиях в орбитальном шейкере-инкубаторе при +37°С и 140 rpm. По завершению растворения D-аспарагина в полной питательной среде проводят фильтрацию получившейся смеси через стерильный одноразовый фильтр с размером пор 0,22 мкм. После фильтрации полученная смесь готова к применению. Перед использованием допустимо хранение полученной смеси при +4°С в асептических условиях в течение 1 недели. Для реализации предлагаемого способа модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих предварительно проводят выделение целевых клеток и их культивирование не менее 2-го пассажа, в соответствии со стандартными протоколами (Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. М.: Бином, 2010; Методы культивирования клеток / под ред.: Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2008). После достижения конфлюэнтности 90% полученную клеточную культуру пересевают и культивируют на приготовленном ранее растворе полной питательной среды с D-аспарагином. При этом в зависимости от времени культивирования клеточной культуры на полной питательной среде с D-аспарагином достигается целевой эффект - модификация пролиферативной активности. Для стимуляции пролиферативной активности клеточной культуры ее ведут на приготовленной ранее полной питательной среде с D-аспарагином в концентрации 0,013-0,13 г/л в течение 2-х часов, затем производят замену питательной среды на ту же, но без D-аспарагина и ведут клеточную культуру до 72 часов. Для подавления пролиферативной активности клеточной культуры ее ведут на приготовленной ранее полной питательной среде с D-аспарагином в концентрации 0,013-0,13 г/л в течение 48 часов, затем производят замену питательной среды на ту же, но без D-аспарагина и ведут клеточную культуру до 72 часов. Пролиферативную активность клеточной культуры оценивают по среднему времени удвоения популяции клеток, которое рассчитывают по формуле t=T/log (N/N), где «t» - среднее время удвоения популяции; «Т» - время культивирования клеток; «N» -плотность клеточного монослоя после культивирования; «N» - плотность посева; «log2 (N/N)» - количество удвоений за время Т (Фадеев Ф.А., Луговец Д.В., Улитко М.В., Леонтьев С.Л., Сазонов С.В. Влияние состава ростовой среды и концентрации фетальной сыворотки на пролиферативную активность фибробластов дермы // Гены и клетки. 2016. Т. 11. №. 4. С. 75-79).
D-аспарагин - брутто формула: C4H8N203, молекулярная масса - 132,119 г/моль, химическое название - правовращающий изомер моноамида аспарагиновой кислоты. D-аспарагин представляет собой белый кристаллический порошок без запаха, растворимый в воде. У млекопитающих D-аспарагиновая кислота является одним из метаболитов аминокислотного обмена, определяется в незначительном количестве (в сравнении с ее левовращающим изомером), в том числе, в тканях и органах человека (Armstrong D.W. D-amino acid levels in human physiological fluids // Chirality. - 1993. V. 5. №. 5. P. 375-378). В литературе данные о стимулирующем эффекте D-аспарагина на пролиферацию клеток в культуре отсутствуют. Предполагается, что в основе антипролиферативного эффекта D-аспарагина лежит ингибирование специфических трансаминаз и лактат-дегидрогеназы  A. et al. Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase. Effects of D-amino acids // Journal of Biological Chemistry. 1993. V. 268. №. 36. P. 26941-26949). Важным механизмом антипролиферативного эффекта D-аминокислот является торможение белкового синтеза за счет аминоацилирования тРНК, что подтверждается значительным угнетением синтеза белка при инактивации, либо низкой экспрессии D-аминоацил-тРНК дезацилазы (Yamane Т., Miller D.L., Hopfield J.J. Discrimination between D-and L-tyrosyl transfer ribonucleic acids in peptide chain elongation // Biochemistry. 1981. V. 20. №. 25. P. 7059-7064). У млекопитающих уровень D-аспарагиновой кислоты поддерживается за счет ее инактивации ферментом D-аспартат-оксидазой (Wolosker Н.,  А., Snyder S.H. D-aspartate disposition in neuronal and endocrine tissues: ontogeny, biosynthesis and release // Neuroscience. 2000. V. 100. №. 1. P. 183-189). D-аспартат накапливающийся в составе белков в результате спонтанной рацемизации L-аспартата может восстанавливать свою исходную хиральную форму с помощью фермента L-изоаспартат DL-аспартат О-метил-трансферазы, либо реакций спонтанного деметилирования, функционирование данного фермента критично для нормального деления и дифференцировки клеток (Kim Е. Phenotypic analysis of seizure-prone mice lacking L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase // Journal of Biological Chemistry. 1999. V. 274. №. 29. P. 20671-20678).
2
0
0
0
Способ модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих применением D-аспарагина апробирован на культурах фибробластов второго пассажа (Р2), полученных из биоптатов дермы человека (Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. М.: Бином, 2010). Для реализации предлагаемого способа 0,013-0,13 г сухого порошка D-аспарагина растворяют в 1 литре полной питательной среды следующего состава: раствор питательной среды ДМЕМ, 10% сыворотки крови человека и 1% раствора стрептомицина-пенициллина, при этом D-аспарагин является целевым компонентом. Процесс проводят в асептических условиях в орбитальном шейкере-инкубаторе при +37°С и 140 rpm. По завершению растворения D-аспарагина в полной питательной среде проводят фильтрацию получившейся смеси через стерильный одноразовый фильтр с размером пор 0,22 мкм. После фильтрации полученная смесь готова к применению. До апробации предлагаемого способа дермальные фибробласты человека культивируют в стандартной среде, состоящей из раствора ДМЕМ, 10% сыворотки крови человека и 1% раствора стрептомицина-пенициллина, до достижения конфлюэнтности 90%, а затем производят пересев клеток. Для оценки влияния предлагаемого способа на метаболическую и пролиферативную активность клеток используют две опытные группы фибробластов: 1 группа - фибробласты, культивированные в полной питательной среде с добавлением в нее D-аспарагина в концентрации 0,013 г/л и 2 группа - фибробласты, культивированные в полной питательной среде с добавлением D-аспарагина в концентрации 0,13 г/л. Время культивирования фибробластов в полной питательной среде, содержащей в своем составе D-аспарагин, составляет, соответственно для обеих групп 2, 6, 24 и 48 часов. По истечении времени воздействия полную питательную среду с D-аспарагином заменяют на среду с тем же составом, но без D-аспарагина, и продолжают культивировать клетки до 72 часов с момента засеивания фибробластов. Контролем служат фибробласты, выделенные из дермы человека, культивированные без добавления D-аспарагина до 72 часов. Метаболическую активность клеток оценивают с помощью колориметрического метода с использованием соли тетразолия ХТТ (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилид) (Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.А., Климов В.И., Лебединская Е.В., Миронов А.Н., Меркулов В.А. Перспективные методические подходы к доклиническому исследованию биомедицинских клеточных продуктов и возможные показатели их качества // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015. Т. 53. №. 1. С. 36-44). Пролиферативную активность оценивают по среднему времени удвоения популяции фибробластов, которое рассчитывают по формуле t=T/log (N/N), где «t» -среднее время удвоения популяции; «Т» - время культивирования клеток; «N» - плотность клеточного монослоя после культивирования; «N» -плотность посева; «log2 (N/N)» - количество удвоений за время Т (Фадеев Ф.А., Луговец Д.В., Улитко М.В., Леонтьев С.Л., Сазонов С.В. Влияние состава ростовой среды и концентрации фетальной сыворотки на пролиферативную активность фибробластов дермы // Гены и клетки. 2016. Т. 11. №. 4. С. 75-79). Для исследования морфологии клеток используют цитологический метод с окрашиванием по Романовскому-Гимзе и иммуноцитохимические исследования с антителами к виментину, Ki-67 и р53. Статистическую обработку полученных данных выполняют с применением статистической программы «GraphPad Prism 6.0» (GraphPad Software, США). При сравнении полученных результатов применяют метод однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Критический уровень значимости (p-value) при проверке статистических гипотез принимают равным 0,05.
Сравнительный анализ среднего количества и времени удвоения клеток в контроле (использование полной питательной среды аналогичного состава, но без D-аспарагина) с опытными группами при воздействии полной питательной среды содержащей D-аспарагин в течение 2 часов показывает следующие результаты. В группе №1 отмечается сокращение времени удвоения фибробластов на 17% (р<0,0001) и увеличение их количества в 2 раза, что свидетельствует об их высокой пролиферативной активности. В группе №2 изменения пролиферативной активности менее выраженные: отмечается сокращение времени удвоения в 1,07 раз (р<0,0001) и увеличение количества клеток в 1,4 раза (р<0,05), соответственно. После 6 часов культивирования фибробластов в полной питательной среде с D-аспарагином время удвоения клеток в обеих группах сопоставимо с контролем (р>0,05), количество клеток незначительно увеличивается в 1,09 раз в группе №1 (р<0,01) и в 1,16 раза в группе №2 (р<0,05), соответственно. При 24-часовой инкубации клеток в полной питательной среде с D-аспарагином в группе №1 наблюдают увеличение времени удвоения в 1,07 раз (р<0,0001) и снижение количества фибробластов на 28,3% (р<0,01) по сравнению с контролем, что указывает на выраженное торможение их пролиферации. В группе №2 отсутствуют значимые изменения, время удвоения и количество фибробластов сопоставимо с контролем (р>0,05). При 48-часовой инкубации клеток в полной питательной среде с D-аспарагином наблюдают значительное снижение пролиферации культивируемых клеток. В группе №1 время удвоения популяции клеток увеличивается в 1,37 раза, а их количество снижается в 2,3 раза (р<0,01) по сравнению с контролем. В группе №2 количество клеток снижается на 36,4% (р<0,01), время удвоения популяции клеток увеличивается в 1,2 раза по сравнению с контролем (р<0,05). С помощью ХТТ-теста проводят анализ метаболической активности дермальных фибробластов человека, культивируемых на полной питательной среде с D-аспарагином. В группе №1 при 2-х и 6-часовом воздействии отсутствуют статистически достоверные отличия в метаболической активности культивируемых клеток по сравнению с контролем (р>0,05). При более продолжительном воздействии на культивируемые клетки полной питательной среды с D-аспарагином, процент метаболической активности клеток возрастает по сравнению с контролем, метаболическая активность которого принята за 100%. ХТТ-тест в группе №2 также показывает высокий уровень метаболической активности клеток при 2, 6, 24 и 48 часах их культивирования на полной питательной среде с D-аспарагином. По сравнению с контролем, метаболическая активность клеток в группе №2 повышена на 24-36% (р<0,05). При проведении цитологического исследования клеток в группе №1 подтверждают их «фибробластную» природу по характерной морфологии и экспрессии виментина - маркера фибробластов. В исследуемых образцах из группы №1 клетки обладают высокой пролиферативной активностью, определяемой по экспрессии маркера Ki-67. Так, при воздействии полной питательной средой с D-аспарагином в течение 2, 6 и 24 часов, пролиферативный индекс составляет 70-90%. При культивировании клеток с полной питательной средой, содержащей D-аспарагин в течение 48 часов, наблюдается его выраженное ингибирующее действие на пролиферативную активность клеток, которая снижается до 30% по отношению к контролю. При изучении образцов клеток из группы №2, получаемых при культивировании на полной питательной среде с D-аспарагином в течение 2, 6 и 24 часов, выявляют экспрессию клетками виментина, а также - Ki-67, что свидетельствует о сохранении пролиферативной активности культивируемых фибробластов. Однако, цитологическое исследование по Романовскому-Гимзе показывает реактивно измененные (дистрофичные и полиморфные) клетки с наличием атипичных митозов, что согласовывается с данными, получаемыми при изучении их пролиферативной активности. При воздействии полной питательной средой с D-аспарагином в течение 48 часов, наблюдается выраженное нарушение функциональной активности клеток, что проявляется исчезновением экспрессии клетками виментина, снижением индекса пролиферации до 30%, в сравнении с контролем. Вне зависимости от исследуемой концентрации и сроков культивирования наблюдается негативная ядерная экспрессия белка р53, что свидетельствует о низком онкогенном потенциале культивируемых клеток.
2
0
0
0
Пример 1. На культуре фибробластов второго пассажа (Р2), полученных из биоптата дермы человека, апробирован способ модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих применением D-аспарагина при культивировании клеток на полной питательной среде приготовленной на основе раствора питательной среды ДМЕМ (Gibco), 10% сыворотки крови человека и 1% раствора стрептомицина-пенициллина (ПАНЭКО, Россия) с добавлением 0,013 г D-аспарагина на 1 литр приготовленной смеси. Процесс приготовления полной питательной среды с добавкой D-аспарагина провели в асептических условиях в орбитальном шейкере-инкубаторе при +37°С и 140 rpm. По завершению растворения D-аспарагина в приготовленной полной питательной среде проводили фильтрацию получившейся смеси через стерильный одноразовый фильтр с размером пор 0,22 мкм. После фильтрации полученную смесь хранили в асептических условиях при +4°С не более 1 недели и использовали ее только в течение указанного срока. Время культивирования фибробластов в полной питательной среде с D-аспарагином составляло 2, 6, 24 и 48 часов, соответственно. По истечении времени воздействия полную питательную среду с D-аспарагином, заменяли на ту же среду без D-аспарагина, затем продолжали культивировать клетки до 72 часов с момента засеивания фибробластов. Контролем служили дермальные фибробласты человека, культивированные без добавления D-аспарагина в течение 72 часов. Метаболическую активность клеток оценивали с помощью колориметрического метода с использованием соли тетразолия ХТТ (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилид) (Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.А., Климов В.П., Лебединская Е.В., Миронов А.Н., Меркулов В.А. Перспективные методические подходы к доклиническому исследованию биомедицинских клеточных продуктов и возможные показатели их качества // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015. Т. 53. №. 1. С. 36-44). Оптическую плотность в опытных лунках сравнивали с оптической плотностью контрольных образцов. Процент метаболической активности клеток в опытных образцах рассчитывали относительно метаболической активности контроля, приняв ее за 100%. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм на спектрофотометре SpectraMax 250 (Molecular Devices, США). Пролиферативную активность оценивали по среднему времени удвоения популяции фибробластов, которое рассчитывали по формуле t=T/log (N/N), где «t» - среднее время удвоения популяции; «Т» - время культивирования клеток; «N» - плотность клеточного монослоя после культивирования; «N» - плотность посева; «log2 (N/N)» - количество удвоений за время Т (Фадеев Ф.А., Луговец Д.В., Улитко М.В., Леонтьев С.Л., Сазонов С.В. Влияние состава ростовой среды и концентрации фетальной сыворотки на пролиферативную активность фибробластов дермы // Гены и клетки. 2016. Т. 11. №. 4. С. 75-79). Для исследования морфологии клеток использовали цитологический метод с окрашиванием клеток по Романовскому-Гимзе и иммуноцитохимические исследования с антителами к виментину, Ki-67 и р53. Статистическую обработку полученных данных выполняли с применением статистической программы «GraphPad Prism 6.0» (GraphPad Software, США). При сравнении полученных результатов применяли метод однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Критический уровень значимости (p-value) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.
По данным проведенной апробации выявлена существенная разница в скорости пролиферации клеток в зависимости от времени воздействия полной питательной среды с D-аспарагином в концентрации 0,013 г/л (таблица 1). Анализ среднего количества клеток и времени их удвоения в контроле и опытной группе при воздействии полной питательной среды с D-аспарагином в течение 2 часов показал значительное увеличение количества и сокращение времени удвоения культивируемых клеток (р<0,0001) в опытной группе (таблица 1). После 6 часов культивирования фибробластов в полной питательной среде с D-аспарагином время удвоения клеток достоверно не отличалось от контроля (р>0,05), а количество клеток увеличивалось в 1,09 раз (р<0,01). По данным ХТТ-теста при 2-х и 6-часовом воздействии D-аспарагин не подавлял метаболическую активность клеток. При более длительном воздействии метаболическая активность клеток возрастала по сравнению с контролем (р<0,01) (таблица 1). При 24-часовой инкубации клеток в полной питательной среде с D-аспарагином наблюдалось увеличение времени удвоения в 1,07 раза (р<0,0001) и снижение количества фибробластов на 28,3% (р<0,01) по сравнению с контролем, что указывало на подавление их пролиферации (таблица 1). При 48-часовой инкубации клеток в полной питательной среде с D-аспарагином также наблюдалось значительное снижение их пролиферации: время удвоения популяции клеток увеличилось в 1,37 раза, а количество клеток было снижено в 2,3 раза (р<0,01) по сравнению с контролем (таблица 1).
Фибробласты из дермы человека 2-ой пассаж, культивированные на полной питательной среде с D-аспарагином в концентрации 0,013 г/л в течение 2-х часов подверглись цитологическому и иммуноцитохимическому исследованию: Фиг. 1А) окраска Романовского-Гимзе; Фиг. 1Б) иммуноцитохимическая реакция на виментин; Фиг. 1В) иммуноцитохимическая реакция на Ki-67. При цитологическом исследовании клеток окрашенных по Романовскому-Гимзе выявлена характерная морфология фибробластов (Фиг. 1А), что подтвердилось при обнаружении на них экспрессии маркера фибробластов - виментина (Фиг. 1Б). В исследуемых образцах высокая пролиферативная активность исследуемых клеток подтверждалась высоким уровнем экспрессии маркера Ki-67 (Фиг. 1В).
При культивировании клеток с D-аспарагином в течение 48 часов было выявлено его выраженное ингибирующее действие на пролиферативную активность клеток, которая снизилась до 30% по сравнению с контролем. Вне зависимости от сроков культивирования не было выявлено признаков онкогенности клеток, что было подтверждено нормальным уровнем экспрессии белка р53.
2
0
0
0
Пример 2. На культуре фибробластов второго пассажа (Р2), полученных из биоптата дермы человека, апробирован способ модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих применением D-аспарагина при культивировании клеток на полной питательной среде, приготовленной на основе раствора питательной среды ДМЕМ (Gibco), 10% сыворотки крови человека и 1% раствора стрептомицина-пенициллина (ПАНЭКО, Россия) с добавлением 0,13 г D-аспарагина на 1 литр приготовленной смеси. Процесс приготовления полной питательной среды с добавкой D-аспарагина провели в асептических условиях в орбитальном шейкере инкубаторе при +37°С и 140 rpm. По завершению растворения D-аспарагина в приготовленной полной питательной среде проводили фильтрацию получившейся смеси через стерильный одноразовый фильтр с размером пор 0,22 мкм. После фильтрации полученную смесь хранили в асептических условиях при +4°С не более 1 недели и использовали ее только в течение указанного срока. Время культивирования фибробластов в полной питательной среде с D-аспарагином составляло 2, 6, 24 и 48 часов, соответственно. По истечении времени воздействия полную питательную среду с D-аспарагином, заменяли на ту же среду без D-аспарагина, затем продолжали культивировать клетки до 72 часов с момента засеивания фибробластов. Контролем служили фибробласты, выделенные из дермы человека, культивированные без добавления D-аспарагина в течение 72 часов. Метаболическую активность клеток оценивали с помощью колориметрического метода с использованием соли тетразолия ХТТ (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилид) (Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.А., Климов В.И., Лебединская Е.В., Миронов А.Н., Меркулов В.А. Перспективные методические подходы к доклиническому исследованию биомедицинских клеточных продуктов и возможные показатели их качества // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015. Т. 53. №. 1. С. 36-44). Оптическую плотность в опытных лунках сравнивали с оптической плотностью контрольных образцов. Процент метаболической активности клеток в опытных образцах рассчитывали относительно контроля, приняв его уровень метаболической активности за 100%. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм на спектрофотометре SpectraMax 250 (Molecular Devices, США). Пролиферативную активность оценивали по среднему времени удвоения популяции фибробластов, которое рассчитывали по формуле t=T/log (N/N), где «t» - среднее время удвоения популяции; «Т» - время культивирования клеток; «N» - плотность клеточного монослоя после культивирования; «N» - плотность посева; «log2 (N/N)» - количество удвоений за время Т (Фадеев Ф.А., Луговец Д.В., Улитко М.В., Леонтьев С.Л., Сазонов С.В. Влияние состава ростовой среды и концентрации фетальной сыворотки на пролиферативную активность фибробластов дермы // Гены и клетки. 2016. Т. 11. №. 4. С. 75-79). Для исследования морфологии клеток использовали цитологический метод с окрашиванием клеток по Романовскому-Гимзе и иммуноцитохимические исследования с антителами к виментину, Ki-67 и р53. Статистическую обработку полученных данных выполняли с применением статистической программы «GraphPad Prism 6.0» (GraphPad Software, США). При сравнении полученных результатов применяли метод однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Критический уровень значимости (p-value) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.
По данным проведенного исследования выявлена существенная разница в скорости пролиферации клеток изменявшаяся в зависимости от времени воздействия полной питательной среды с D-аспарагином в концентрации 0,13 г/л (таблица 2). Анализ среднего количества клеток и времени их удвоения в контроле и опытной группе при воздействии полной питательной среды с D-аспарагином в течение 2 часов показал значительное увеличение количества (р<0,05) и сокращение времени удвоения культивируемых клеток (р<0,0001) по сравнению с контролем (таблица 2). После 6 часов культивирования фибробластов в полной питательной среде с D-аспарагином время удвоения клеток достоверно не отличалось от контроля (р>0,05), а их количество увеличилось в 1,16 раз (р<0,05). При 24-часовой инкубации клеток в полной питательной среде с D-аспарагином отсутствовали значимые изменения, время удвоения и количество фибробластов было сопоставимо с контролем (р>0,05) (таблица 2). При 48-часовой инкубации клеток в полной питательной среде с D-аспарагином наблюдалось значительное снижение пролиферации клеток: количество клеток снизилось на 36,4% (р<0,01), а время удвоения их популяции увеличилось в 1,2 раза (р<0,05) по сравнению с контролем (таблица 2).
По данным ХТТ-теста при культивировании фибробластов на полной питательной среде с D-аспарагином в концентрации 0,13 г/л их метаболическая активность возрастала по сравнению с контролем в среднем на 24-36% (р<0,05). Фибробласты из дермы человека 2-ой пассаж, культивированные на полной питательной среде с D-аспарагином в концентрации 0,13 г/л в течение 2-х часов подверглись цитологическому и иммуноцитохимическому исследованию: Фиг. 2А) окраска по Романовскому-Гимзе; Фиг.2 Б) иммуноцитохимическая реакция на виментин; Фиг. 2В) иммуноцитохимическая реакция на Ki-67. При культивировании клеток на полной питательной среде с D-аспарагином в течение 2, 6 и 24 часов пролиферативный индекс составил 70-90%. При культивировании клеток на полной питательной среде с D-аспарагином в течение 48 часов было выявлено его выраженное ингибирующее действие на пролиферативную активность клеток, которая снизилась до 30%, по сравнению с контролем. При иммунноцитохимическом исследовании клеток, полученных при культивировании на полной питательной среде с D-аспарагином в концентрации 0,13 г/л в течение 2, 6 и 24 часов, выявлена экспрессия виментина (Фиг. 2Б), сохранность пролиферативной активности фибробластов подтверждалась обнаруженной экспрессией маркера Ki-67 (Фиг. 2В). Однако, при исследовании микропрепаратов окрашенных по Романовскому-Гимзе выявлены реактивно измененные (дистрофичные и полиморфные) клетки с наличием атипичных митозов, что согласовывалось с данными полученными при изучении их пролиферативной активности (Фиг. 2А). При культивировании фибробластов, на полной питательной среде с D-аспарагином с концентрацией 0,13 г/л в течение 48 часов наблюдалось угнетение экспрессии виментина и снижение индекса пролиферации до 30%, что свидетельствовало о выраженном нарушении их функциональной активности. При этом, вне зависимости от сроков культивирования не выявлено признаков онкогенности клеток, что было подтверждено сохранной экспрессией белка р53.