Аэробные метилобактерии прибрежных гидротерм озера Байкал (Республика Бурятия

Литература

1. Дагурова О.П. Влияние микроорганизмов мелководных осадков озера Байкал на качество воды / О.П. Дагурова, Л.П. Козырева, Б.Б. Намсараев // Фундаментальные проблемы воды и водных ресурсов на рубеже третьего тысячелетия: материалы междунар. науч. конф. (3-7 сентября 2000).- Томск, 2000. - С. 508-511.

2. Кузнецов С.И. Методы изучения водных микроорганизмов / С.И. Кузнецов, Г.А. Дубинина.- М.: Наука, 1989.- 288 с.

3. Максимова Э.А. Микробиология вод Байкала / Э.А. Максимова, В.Н. Максимов. Иркутск: Изд-во Иркутск. ун-та, 1989. - 168 с.

4. Намсараев Б.Б. Микробиологические процессы круговорота углерода в донных осадках озера Байкал / Б.Б. Намсараев, Т.И. Земская. - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2000. - 160 с.

5. Романенко В.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов: лабораторное руководство / В.И. Романенко, С.И. Кузнецов. - Л.: Наука, 1974.- 194 с.

6. Pfenning N., Lippert K.D. Uber vitamin Bir-Bedurfnis phototropher schweferel baktrien // Arch. Microbiol. - 1996. - V.55. -

3. P. 245-266.

Literature:

1. Dagurova O.P., Kozyreva L.P., Namsaraev B.B. Influence microorganisms of water deposits of Baikal Lake to water quality // Fundamental problems of water and water resource on III thousand years boundary: materials of International scientific conference. (Tomsk, 3-4 of September 2000). Tomsk, 2000. - P. 508-511.

2. Kuznetsov S.I., Dubinina G.A. Study water microorganisms methods. - Moscow: Nauka, 1989. - 288 p.

3. Maksimova E.A., Maksimov V.N. Baikal water microbiology. - Irkutsk: Izdatelstvo IGU, 1989. - 168 p.

4. Namsaraev B.B., Zemskaya T.I. Microbiological processes of carbon rotation in bottom deposits of Baikal lake. - Novosibirsk: SO RAN, 2000. - 160 p.

5. Romanenko V.I., Kuznetsov S.I. Microorganism ecology of fresh reservoir: laboratory guide. - Leningrad: Nauka, 1974. - 194 p.

Сведения об авторах

Г аранкина Валентина Петровна - аспирант лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ.

E-mail: G_val_82@mail.ru

Дагурова Ольга Павловна - канд. биол. наук, старший нанучный сотрудник ИОЭБ СО РАН, лаборатория микробиологии, Сахьяновой, 6, 670047.

Дамбаев Вячеслав Борисович - канд. биол. наук, младший научный сотрудник ИОЭБ СО РАН, лаборатория микробиологии, Сахьяновой, 6, 670047.

Бурюхаев Савелий Петрович - канд. биол. наук, научный сотрудник ИОЭБ СО РАН, лаборатория микробиологии, Сахьяновой, 6, 670047, старший преподаватель кафедры экспериментальной биологии БГУ.

Data on authors

Garankina Valentina Petrovna - post-graduare student of microbiology laboratory of ICEB SD RAS.

Dagurova Olga Pavlovna - candidate of biology science, senior research worker of ICEB SD RAS, microbiology laboratory.

Dambaev Vyacheslav Borisovich - candidate of biology science, junior research worker of ICEB SD RAS, microbiology laboratory.

Buryukhaev Sergei Petrovich - candidate of biology science, scientific worker, senior teacher of experimental biology department of BSU.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 08-04-98018-р_сибирь_а, программы Президиума СО РАН №17.9, МО РФ РНП 2.1.1/2165 и НОЦ «Байкал»

УДК 553.23

ББК 28.082 (2РОС. Бур) Т.С. Зеленкина, Б.Ц. Ешинимаев, О.П. Дагурова

АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ ПРИБРЕЖНЫХ ГИДРОТЕРМ ОЗЕРА БАЙКАЛ

Изучено разнообразие аэробных метилобактерий в грунтах гидротерм Змеиный, Сухая и Горячинск, расположенных на восточном побережье озера Байкал. Было выделено 6 чистых культур аэробных метилобактерий, представленных алкалофильными и нейтрофильными мезофилами. Филогенетический анализ гена 16S рРНК выделенных изолятов показал, что 5 изолятов наиболее близки к роду Bacillus (98-99%). Один штамм был идентифицирован как Exiguobacterium aurantiacum (100% сходства).

Ключевые слова: аэробные метилобактерии, грунты гидротерм Змеиный, Сухая, Горячинск, алкалофиль-ные, нейтрофильные мезофилы.

T.S. Zelenkina, B.Ts. Eshinimaev, O.P. Dagurova AEROBIC METHYLOBACTERIA OF THE BAIKAL COASTAL HYDROTHERMS

Diversity of aerobic methylobacteria in sediments of hydrotherms Zmeinaya, Sukhaya and Goryachinsk situated on East Coast of Lake Baikal was investigated. Six pure cultures of methylobacteria were isolated; it represented by alkaliphilic and neutrophilic mesophiles. The phylogenetic analysis of the 16S rRNA genes showed that 5 isolated were closed to Bacillus (9899% identity). Only one strain belongs to the genus Exiguobacterium aurantiacum (100% identity).

Key words: aerobic methylobacteria, sediments of hydrotherms Zmeinaya, Sukhaya and Goryachinsk, alkaliphilic, neutrophilic mesophiles.

Аэробные метилобактерии, усваивающие биогенные и антропогенные Ci-субстраты, широко распространены в природе. В водных экосистемах аэробные метилобактерии играют существенную роль в круговороте биогенных элементов. К настоящему времени наиболее полно исследованы аэробные метилобактерии в морских экосистемах, в водоемах, имеющих высокие значения pH и солености, а также в корнях и коре растений [1-4]. Однако имеется весьма ограниченная информация об аэробных метилобактериях экстремальных экосистем, включая гидротермальные источники. Целью данного исследования является выделение и идентификация аэробных метилобактерий в грунтах прибрежных гидротерм озера Байкал.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были пробы грунтов из гидротерм Змеиный, Горячинск и Сухая, выходы которых расположены в прибрежной зоне восточного побережья озера Байкал. Температура воды на изли-вах гидротерм Змеиный и Сухая составляла 45оС, в источнике Горячинск 51оС. Источники относятся к низкоминерализованным гидротермам (0,5-0,6 г/дм3) со слабощелочным значением pH (8,4-9,4).

Для получения накопительных культур аэробных метилобактерий использовали среду «М» с добавлением 0,2-0,5% NaCl, содержащую (г/л): КН2РО4 - 1,0; KNO3 - 1,0; MgSO47H2O - 0,2 и 1 мл/л раствора микроэлементов (мг): FeNH4-цитрат - 300; CaCl22H2O - 300; MnCl24H2O - 50; ZnSO47H2O - 50; CuSO45H2O - 5; Н2О - 100 мл. Соответствующие природному образцу значения pH устанавливали, добавляя Na-карбонатный буфер в конечной концентрации 50-100 мМ. После стерилизации в среды вносили 0.5% (об./об.) метанола как источник углерода и 0,05% (об./об.) дрожжевого автолизата в качестве источника витаминов. Культивирование проводили при температурах 29, 37 и 45оС.

Выделение ДНК из культур и ПЦР-амплификацию проводили известными методами [5, 6]. Нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов определяли на автоматическом секвенаторе CEQ 2000XL Beckman Coulter (США) с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Perkin Elmer», США) согласно инструкциям фирмы-производителя. Для сравнения нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК (1500 п.н.) с таковыми в GenBank использовали программу NCBI BLAST (http//www.ncbi .nlm .nih .gov/Blast), для выравнивания- программу Clustal W (версия 1.3). Филогенетическое дерево было построено с использованием программы Treecon W (версия 1.3).

Результаты и их обсуждение

Из проб грунтов исследуемых источников нами было выделено 6 штаммов аэробных факультативных метилобактерий. 5 штаммов представлены грамположительными подвижными спорообразующими палочками (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика выделенных штаммов аэробных метилобактерий

Штамм Г идротерма Спорообразование Подвижность Окраска по Граму

C2 Сухая + + +

Z1 Змеиный + + +

Z3 Змеиный + + +

G1 Г орячинск + + +

G4b Г орячинск + + +

G6 Г орячинск - + +

Исследование экофизиологии культур метилобактерий, выделенных из гидротерм, показало, что они способны развиваться в диапазоне температур от 29 до 37оС. Все штаммы являются мезофилами (рис.1). Культуры изолированы из гидротерм со слабощелочной реакцией среды. Рост наблюдался в широком диапазоне значений pH - от 6,0 до 10, наиболее активный рост был отмечен при рН 7,5-9,0. Штаммы С2, 71 и в1 являются алкалофильными мезофилами, штаммы 73, в4Ь, в6 - нейтрофиль-ными мезофилами. По отношению к минерализации среды выделенные культуры проявили наибольший рост на среде, содержащей 2 г/л. У культур - в1 и 71 оптимум солености проявился при 2 и 5 г/л, соответственно. Все культуры растут в диапазоне содержания №С1 от 0 до 50 г/л.

OD 1

ф C2

Z1

Z3

0,5 G1

0,4 - Ж G4b

0,3 - • G6

0 -

4 в 16 29 37 45 54 ToC

D O

\ t C2

Z1

Z3

0,5 - G1

0,4 - Ж G4b

G6

0 -

0 2 5 10 20 30 40 50 NacI, %

Рис.1. Зависимость интенсивности роста культур метилобактерий от температуры, pH и NaCl.

Культуры использовали широкий спектр субстратов, представленный следующими группами:

1) пентозы: арабиноза;

2) гексозы: галактоза, глюкоза, манноза, фруктоза;

3) дезоксигексозы: рамноза;

4) олигосахариды: лактоза, мальтоза, раффиноза, сахароза;

5) спирты: глицерин, маннит, дульцит, сорбит, этанол;

6) витамины: инозит.

Все штаммы способны утилизировать многие органические соединения, наиболее активно использовались углеводы группы гексоз. Из группы олигосахаридов наиболее потребляемыми являются сахароза и мальтоза по сравнению с лактозой и рафинозой. Большинство культур использует для роста глюкозу, маннозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу. Рост отсутствовал на дульците, саркозине и глицерине.

Ь

0.1

н

94 г ШтаммZ1 lOOfL,

100

100

Штамм Z3

Bacillus cohnii

----Bacillus halmapalus DSM8723

1 Bacillus horikoshi DSM8719 Bacillus halodurans XJU2 Bacillus halodurans Штамм G1 Штамм C2 - Bacillus methanolis

г------Bacillus firmus S-26

\ 100 [• Штамм G4b

L Bacillus pseudofirmus DSM8715

10C

100(— Штамм G6

oop L і

Exiguobacterium aurantiacum DSM6703

Рис.2. Филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 168 рРНК

Филогенетический анализ гена 16S рРНК выделенных штаммов показал, что штаммы Z1 и Z3 наиболее близки к Bacillus cohnii (94 и 100% сходства соответственно), штаммы G1 и C5 близки к Bacillus halodurans (100% сходства) (рис.2). Ранее была отмечена способность представителей рода Bacillus к ме-тилотрофии, описан и исследован термотолерантный метилотрофный вид Bacillus methanolicus [7].

Один штамм G6 наиболее близок к Exiguobacterium aurantiacum (100% сходства). Нужно отметить, что ранее не был отмечен рост Exiguobacterium aurantiacum на метаноле и нами впервые установлена способность данного вида к метилотрофии.

Таким образом, выделенные из грунтов гидротерм Бурятии метилобактерии представлены алка-лофильными и нейтрофильными мезофилами и в основном принадлежат к роду Bacillus. Они являются факультативными метилобактериями, использующими широкий спектр субстратов.

Литература

1. Доронина Н.В. Methylarcula marina и Methylarcula terricola: новые аэробы с окружающей среды побережий / Н.В. Доронина, Т.А. Тоурова, Л.А. Трощенко // Микробиология. 2000, сент.

2. Доронина Н.В. Новая алкафильная и холифильная метилотропическая бактерия восточной Монголии / Н.В. Доронина, Ц. Дармаева, Я.А. Троценко // Микробиология. Т.53. С. 223-229.

3. Доронина Н.В. Новые алкафильные, холифильные, метилотропические бактерии с содового озера Южного Транс-байкалья / Н.В. Доронина, Ц. Дармаева, Я.А. Троценко // Микробиология. 2003. Т. 26. С.382-389.

4. Доронина Н.В. Микробиология / Н.В. Доронина, Е.Т. Иванова, Н.Т. Сузина, Ю.А. Троценко // Микробиология 2003. Т. 26. С.382-389.

5. Мармур Я.А. Процедура изоляции дезоксирибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов / Я.А. Мармур // Молекулярная биология. 1961. Т. 3.

6. Арфман Н. Новые виды терматолерантной, метаноловой, бактерии / Н. Арфман, Л. Дижкуйзен, Г. Киргоф, В. Людвиг, Х. Шлейфер, Е.С. Висыгина, К.М. Чумаков, Н.И. Говорухина, Ю.А. Троценко, Д. Уайт. 1992, июль; 42(3); 39-45.

Literature

1. Doronina N.V., Tourova T.P., Trotschenko L.A. Methylarcula marina and Methylarcula terricola: novel aerobic, moderately halophilic, facultatively methylotrophic bacteria from coastal saline environments. Mikrobiologiya // 2000 Sep.

2. Doronina N.V., Darmaeva Ts., Trotsenko Ya.A. Methylofaga alcalica, a new alcaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium from the East Mongolian saline soda lake. Mikrobiologiya.2003. V.53. P.223-229.

3. Doronina N.V., Darmaeva Ts., Trotsenko Ya.A. Methylofaga natronica sp.nov., a new alcaliphilic and moderately halophilic, restricted-facultatively methylotrophic bacterium from soda lake of the Southern Transbaikal Region // Mikrobiologiya.2003. V.26. P.382-389.

4. Doronina N.V., Ivanova E.G., Suzina N.G., Trotsenko Yu.A. Methanotrops and methylobacterium are discovered in the tissue of arboreal vegetables in winter // Mikrobiologiya. 2004. V.73, № 6.P.817-824.

5. Marmur Ya.A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // Molekulyarnaya biologiya, 1961, V.3, P.208-214.

6. Arfman N., Dihkuizen L., Kirgof G., Ludwig W., Schleifer K.H., Busygina E.S., Chumakov K.M., Govorukhina N.I., Trotsenko Yu.A., White D. et al. A new species of thermotolerant, methanol-utilizing, endospore-forming bacteria. Bacteriol. 1992 Jul; 42(3):439-45.

Сведения об авторах

Зеленкина Татьяна Савельевна - младший научный сотрудник лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, 670047, тел. (3012)434902, факс (3012)433034, e-mail:tatjana-zelenkina@rambler.ru

Ешинимаев Булат Цыденжапович - научный сотрудник лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино (Моск.обл.), e-mail: bulat2001@mail.ru

Дагурова Ольга Павловна - канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ, тел. (3012)434902, факс (3012)433034, e-mail: dagur-ol@mail.ru

Data on authors

Zelenkina Tatyana Savelievna - younior research worker of microbiology laboratory of ICEB SD RUS, Ulan-Ude.

Eshinimaev Bulat Tsydenzhapovich - scientific worker of radiaction isotopes laboratory of IBFM named by G.K. Skryabin RAS, Puschino.

Dagurova Olga Pavlovna - candidate of biology science, senior scientific worker of microbiology laboratory of ICEB SD RAS, Ulan-Ude, Sakhyanova str. 6.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №08-04-98014, МО РФ РНП 2.1.1/2165, Президиума СО РАН №17.9.