СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ТУБЕРКУЛЕЗУ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ У ДЕТЕЙ
METHOD OF PREDICTING GENETIC PREDISPOSITION TO TUBERCULOSIS OF RESPIRATORY ORGANS IN CHILDREN

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано при контроле риска заболевания туберкулезом органов дыхания с целью адекватного лечения больного.
Из уровня знаний данной проблемы известно, что каждому человеку свойственна индивидуальная чувствительность к различным патогенным факторам и есть все основания полагать, что генетическая предрасположенность организма к тому или иному заболеванию в конечном звене определяется антигенным составом его тканей. Многочисленными исследованиями установлены как положительные, так и отрицательные ассоциации антигенов HLA с различными заболеваниями, а также то, что сильные и даже умеренно выраженные ассоциативные связи антиген - заболевание выявляются редко. Подавляющее большинство ассоциативных связей относится к слабо выраженным. Вместе с тем слабые ассоциативные связи различных тканевых антигенов обнаружены практически при всех патологических процессах. Это означает, что если отчетливые и умеренно выраженные ассоциации приемлемы для использования в прогнозе только небольшого числа заболеваний и лишь для некоторых людей - носителей определенных антигенов, то слабые ассоциативные связи пригодны для определения степени риска возникновения всех возможных заболеваний у каждого индивида на основе комплексного анализа всех вероятных связей. Работы, проведенные в области экспериментальной иммуногенетики туберкулеза, установили полигенный характер наследования противотуберкулезной резистентности. Важной задачей представляется локализация и идентификация «генов чувствительности», что позволит понять генетические механизмы восприимчивости к туберкулезу и в дальнейшем использовать эти знания в практической медицине.
Проблема стала особенно актуальной в последние годы в связи со значительным ростом числа заболевших туберкулезом в мире. Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, - ежегодно уносит жизни более 1 млн человек (Dye С. et. al., 2005). В нашей стране туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее распространенных инфекций и представляет огромную опасность для здоровья населения. В последние годы туберкулез стал характеризоваться высокой тенденцией к прогрессированию, быстрым развитием каверн, полирезистентностью возбудителя болезни к противотуберкулезным лекарствам (Попович В.К., 2005; Мишин В.Ю., 2008). В 2007 году уровень заболеваемости туберкулезом в Российской Федерации составил 82,6 человека (в 2006 г. - 83 человека) на 100 тысяч населения, заболеваемость туберкулезом детей - 16,4 на 100 тыс. В течение 2007 года от туберкулеза в России умерло 25 900 человек, каждый день от туберкулеза в России умирает 71 человек (Туберкулез в Российской Федерации. Аналитический обзор основных статистических показателей по туберкулезу, используемых в Российской Федерации. Москва, 2007).
Следовательно, одной из важнейших задач, стоящих перед современной медициной, является разработка новых способов предупреждения заболевания.
Известен способ генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания (Довгалюк И.Ф. Роль иммуногенетических факторов в развитии и течении туберкулезной инфекции у детей: дис… д. м.н. - СПб., 1993 г.). В работе решается задача генетического прогноза заболевания и течения туберкулеза органов дыхания у детей. Способ заключается в изучении фенотипических характеристик HLA серологическим методом. Автор рассматривает различную частоту встречаемости фенотипов локусов HLA А, В, С (I класс) и DR у детей с различными проявлениями туберкулеза. Материалом исследования послужили результаты наблюдения детей, находившихся на излечении в клиниках СПбНИИФ в 1988-1991 гг., то есть в период эпидемиологического благополучия по туберкулезу. Несовершенство предложенного способа объясняется тем, что лимфоцитотоксический тест имеет пределы возможности метода и количество специфичностей, определяемых данной методикой, меньше, чем при определении методом полимеразной цепной реакции. Следует констатировать, что определение генетических детерминант туберкулеза представляется трудной задачей, а первоначальные выводы, основанные главным образом на результатах лимфоцитотоксического теста, нуждаются в верификации и в поисках более эффективных подходов в решении данной проблемы.
За ближайший аналог принят «Способ генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания» (патент RU №(11) 2283492 (13) С2, Скворцова Л.А., Павлова М.В., Кондакова М.Н., Павлова И.Е., Бубнова Л.Н., 2004 г.)
Способ осуществляют следующим образом.
1. Выделение ДНК.
Геномную ДНК выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (свежей или замороженной при -20°С), стабилизированной ЭДТА или цитратом натрия (конечная концентрация антикоагулянта 0,5%), с помощью набора реагентов для выделения ДНК "НПФ ДНК-технология" (Москва). Периферическую кровь центрифугируют в пластиковой пробирке типа "Eppendorf" при 13000 g в течение 1 минуты. Затем надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл лизирующего буфера и центрифугируют при 13000 g в течение 1 минуты. Процедуру лизиса повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не становится прозрачной.
После окончательного удаления надосадочной жидкости к осадку мононуклеаров добавляют 60 мкл буфера для протеиназы К, 1 мкл протеиназы К (концентрация 10 мг/мл) и ресуспендируют. Инкубацию с ферментом проводят не менее чем в течение 60 минут при +55°С. Инактивацию протеиназы К после инкубации проводят путем нагревания пробирки на водяной бане при 95°С в течение 10 минут. После охлаждения пробирку центрифугируют при 13000 g в течение 10-15 секунд. Раствор ДНК хранят при +4°С до использования.
2. HLA-DR B1 типирование.
Молекулярное типирование гена DR B1 проводят с использованием панели праймеров, позволяющей выявлять 13 групп его аллелей. Используемый способ включает в себя целую серию амплификации различных участков гена HLA-DR B1 и называется PCR-MSSP-методом (polimerase-chain reaction sequence specific primers mixed) (Алексеев Л.П. и соавт., 1997). Амплификацию проводят на амплификаторе "ТЕРЦИК" ("ДНК-Технология", Москва) в два этапа.
I этап - амплификация II экзона DR B1-гена проводят по следующему температурному режиму:
1) 94°С - 1 мин 1 цикл,
2) 94°С - 0 мин 20 с 7 циклов,
3) 58°С - 0 мин 5 с,
4) 92°С - 0 мин 5 с 28 циклов,
5) 56°С - 0 мин 2 с.
В результате этой амплификации получают продукт длиной 247 или 243 п.н., который затем разводят в 10 раз и используют во втором этапе амплификации. В качестве отрицательного контроля в реакции вместо ДНК используют дистиллированную воду.
II этап - серия амплификации со специфическими парами праймеров по следующему температурно-временному режиму:
1) 93°С - 0 мин 1 с 15 циклов,
2) 62°С - 0 мин 2 с.
Примечание: температурно-временной режим как I, так и II этапов амплификации всегда приводят в прилагаемой к набору реактивов инструкции.
Продукты амплификации оценивают методом гель-электрофореза в 3,2% агарозном геле. Аллельную идентификацию проводят путем сравнения длины полученных продуктов с маркером длин PUC19. Определенный аллель имеет амплификационный продукт определенной длины.
Материалом для выполнения задачи исследования служат результаты динамического наблюдения 50 подростков, больных туберкулезом органов дыхания.
Сопоставление проведено с группой здоровых лиц - жителей Северо-Запада России (346 человек) методом непараметрической статистики.
В результате установлено, что в группе больных туберкулезом органов дыхания по сравнению с контрольной группой достоверно снижена частота встречаемости аллеля HLA-DR B1*01 (2=4.95, р<0,05), что свидетельствует о протективной роли данной специфичности в отношении развития туберкулезной инфекции. Эти данные позволяют расценивать наличие в генотипе HLA-DR B1*01 как протективный генетический фактор, определяющий резистентность к туберкулезу органов дыхания, однако способ не является достоверным по диагностике генетической предрасположенности к туберкулезу, что не позволяет принимать адекватные решения по тактике ведения больных.
Задачей данного способа является повышение эффективности генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания путем выявления значимых показателей генетической предрасположенности к туберкулезу органов дыхания.
Сущностью изобретения является повышение эффективности прогнозирования генетической предрасположенности к туберкулезу органов дыхания и способ прогнозирования, включающий молекулярное типирование генов семейства главного комплекса гистосовместимости посредством полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что при обнаружении аллелей HLA-DR B1*04 и *16 прогнозируют чувствительность к туберкулезу.
Способ осуществляют следующим образом.
Образцы периферической крови собирают и помещают в пробирки с EDTA. ДНК выделяют из мононуклеаров периферической (свежей или замороженной при -20С°) крови пациентов с помощью наборов для выделения ДНК, например, «ООО Лаборатория ИзоГен» (Россия). 200 мкл периферической крови помещают в пробирку с лизирующим раствором. После лизирования в пробирку добавляют магнитный нуклеус и помещают на магнитный штатив. Следующим этапом осуществляют три последовательные отмывки крови для выделения чистой ДНК. После этого водоструйным наносом из пробирки с нуклеусом удаляют отмывающую жидкость и добавляют экстраген. После вортексирования и центрифугирования чистую ДНК помещают в отдельную пробирку.
Принцип действия генотипирования
Праймеры и условия амплификации полимеразной цепной реакции использовались согласно методике Søborg С., et al., 2002.
Тест основан на использовании процесса амплификации (увеличении, умножении) ДНК методом PCR с сиквенс специфическими праймерами (SSP-PCR). Праймеры - олигонуклеотиды размером от 15 до 30 нуклеотидов, соответствующие участкам ДНК-мишени, которая будет амплифицироваться.
При полном совпадении последовательности праймеров с комплиментарной матрицей аллеля амплифицируется выбранная последовательность аллеля, а при несовпадении двух и более оснований нуклеотидной последовательности праймеров с комплементарной матрицей аллеля специфическая реакция не проходит.
Типирование аллелей основано на присутствии или отсутствии PCR продукта, который регистрируют с помощью электрофореза в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в УФ-свете при длине волны 302 нм (в виде светящейся полосы, определяющей аллельную специфичность и гетеро- или гомозиготность данного образца крови).
По наличию или отсутствию специфического фрагмента амплификации определенного размера, соответствующего аллельспецифической или группоспецифической смеси праймеров, проводят типирование локуса HLA-DR B1.
Для определения HLA-DR используют праймеры, например, «ООО Лаборатория ИзоГен» (Россия) и GenePak HLA-DR PCR test. В набор для 50 исследований входили 19 мастер-миксов (аллельные наборы), в каждом мастер-миксе содержится 50 пробирок со своим аллельным вариантом или сочетанием. В каждую пробирку набора добавляют по 5 мкл ДНК, 10 мкл растворителя. Полимеразная цепная реакция проводилась из 15 мкл объема. Амплификация проводится на амплификаторе "ТЕРЦИК" ("ДНК-Технология", Москва) при следующих условиях: шаг 1 - 120 секунд при 95 градусах, 60 секунд при 66 градусах, 120 секунд при 74 градусах; шаг 2 - 60 секунд при 95 градусах, 50 секунд при 64 градусах, 60 секунд при 74 градусах; шаг 3 - 33 цикла по 60 секунд при 95 градусах, 40 секунд при 62 градусах, 60 секунд при 74 градусах; шаг 4 - 120 секунд при 74 градусах. Выявление продуктов амплификации проводили гель-электрофорезом в 12% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.
Для выполнения поставленной задачи проводят молекулярное типирование HLA-генов локуса DR B1* методом полимеразной цепной реакции (PCR-SSP) у 72 детей, больных туберкулезом органов дыхания, и 70 здоровых детей.
Установлено, что для детей, больных туберкулезом, более характерно увеличение частоты встречаемости аллельных специфичностей *04 и *16, тогда как у здоровых обнаружено снижение частоты встречаемости DR B1*04 и специфичности *16 (р<0,05) (таблица 1).
Полученные результаты исследования позволяют рассматривать аллельные специфичности *04 и *16 гена HLA локуса DR B1 локуса гена HLA DR B1 как генетические факторы предрасположенности к заболеванию туберкулезом.
Таблица 1
Частота встречаемости различных аллелей гена HLA локуса DR B1 у здоровых и больных детейМ±m, %
Условные обозначения признаков аллелей
Индивидуальный номер аллелей гена HLA DR B1
Здоровыеn=70
Больныеn=72
χ<sup>2</sup>
P
Нейтральности (общ.)
1
9,3±2,5
4,7±1,8
0,996
0,319
Устойчивости
3
12,4±2,8
5,5±2,0
3,890
0,049
Предрасположенности
4
8,5±2,5
20,4±3,6
8,223
0,005
Нейтральности (общ.)
7
15,5±3,2
14,8±3,1
0,001
1,000
Нейтральности (общ.)
8
7,8±2,4
8,6±2,5
0,001
1,000
Нейтральности (общ.)
10
2,3±1,3
2,3±1,3
0,001
1,000
Устойчивости
11
16,3±3,2
7,8±2,4
4,669
0,031
Устойчивости
12
5,4±2,0
-
7,171
0,008
Нейтральности (общ.)
13
9,3±2,5
10,2±2,7
0,001
1,000
Нейтральности (общ.)
14
4,7±1,9
7,8±2,3
0,706
0,402
Нейтральности (общ.)
15
6,2±2,0
7,0±2,3
0,001
1,000
Предрасположенности
16
2,3±1,3
10,9±2,7
8,752
0,004
Итого:
100
100
* достоверность по отношению к здоровым, р<0,05.
Преимущества способа: за счет использования современных методов генетического типирования повышается точность генетического прогноза заболевания туберкулезом.
Примеры
Пример 1
Анна Ш., 13 лет. Вакцинация БЦЖ в роддоме, рубчик 6 мм. Росла и развивалась соответственно возрасту. Состоит на учете у фтизиопедиатра с 2004 года по поводу контакта с матерью, у которой в декабре 2004 года выявлен инфильтративный туберкулез верхней доли левого легкого с бактериовыделением. В 2007 году мать умерла от прогрессирования туберкулезного процесса в легких.
Динамика туберкулиновых проб у девочки следующая: Реакция на пробу Манту с 2 ТЕ PPD-L
до 2000 года - отрицательная
февраль 2004 г. - инфильтрат 4 мм
декабрь 2004 г. - инфильтрат 14 мм
январь 2006 г. - инфильтрат 8 мм
июнь 2007 г. - инфильтрат 12 мм
октябрь 2007 г. - инфильтрат 10 мм
август 2008 г. - инфильтрат 10 мм
Специфическая «химиопрофилактика» проводилась при нарастании туберкулиновой аллергии: 2 курса изониазидом в 2004-2005 годах и 1 курс -изониазидом в сочетании с пиразинамидом в 2007 году (каждый курс по 3 месяца). В августе 2008 года планировалось снятие с диспансерного учета по истечении срока наблюдения и прекращению контакта, при этом девочка жаловалась на сниженный аппетит, быструю утомляемость. Периферические лимфоузлы были незначительно увеличены в I-II группах, безболезненные. При прохождении контрольного рентгенологического обследования у девочки в легких обнаружена патология и диагностирован инфильтративный туберкулез верхней доли левого легкого (S1-S2) в фазе распада, микобактерии туберкулеза в мокроте не обнаружены.
Определены аллельные специфичности гена HLA DR B1 - *16, *16. Несмотря на проведение регламентированных профилактических мероприятий, ребенок заболел. Колебания уровня туберкулиновой аллергии вполне объяснимы: проводившийся короткий курс антибактериальной терапии при усилении реакции на пробу Манту с 2 ТЕ PPD-L обеспечивал снижение активности локальных тканевых реакций путем сокращения численности и угнетения способности микобактерии туберкулеза к репликации, однако недостаточная продолжительность воздействия антибактериальных препаратов не способствовала стабилизации достигнутого положительного эффекта. В приведенном примере в течение 4 лет наблюдали ребенка с неустойчивым уровнем туберкулиновой аллергии, назначали короткие курсы «химиопрофилактики», которые оказались неэффективными в профилактике дальнейшего прогрессирования инфекции. Обнаружение генетического фактора (аллельная сочетаемость *16, *16) предрасположенности к заболеванию туберкулезом и учет условий внешней среды (контакт с бактериовыделителем) позволили бы своевременно провести достаточный (не менее 6 месяцев) курс комбинированной антибактериальной терапии, достичь стойкого излечения латентного туберкулеза и предотвратить заболевание.
Пример 2
Борис К., 14 лет. Вакцинирован в родильном доме. Имеется поствакцинальный рубчик размером 5 мм. Мальчику ежегодно проводилась туберкулинодиагностика.
Реакция на пробу Манту с 2 ТЕ PPD-L с 1995 по 1998 г.г. - отрицательная. В августе 1999 года - инфильтрат 15 мм. Ребенок взят на учет фтизиопедиатром по поводу первичного инфицирования. Контакт с бактериовыделителем не установлен. В дальнейшем динамика туберкулиновых проб следующая:
август 200 г. - инфильтрат 12 мм
сентябрь 2001 г. - инфильтрат 14 мм
май 2002 г. - инфильтрат 10 мм
июль 2003 г. - инфильтрат 10 мм
За этот период ребенку проведено три курса «химиопрофилактики» изониазидом по 3 месяца. В 2003 году ребенок был снят с учета при стабильной туберкулиновой аллергии, хотя в данном случае наблюдавшуюся монотонную стойкую реакцию на туберкулин следует расценивать как показатель недостаточного угнетения активности туберкулезной инфекции одним противотуберкулезным препаратом и наличия устойчивости значительной части микобактериальной популяции к изониазиду, что мы и наблюдаем в дальнейшем. Результат на пробу Манту с 2 ТЕ PPD-L в октябре 2004 года - инфильтрат 12 мм.
В сентябре 2005 г. - инфильтрат 12 мм.
2006, 2007 г.г. - инфильтрат 10 мм
В 2008 г. - инфильтрат 13 мм.
Заболел остро 14 февраля 2009 года, когда поднялась температура тела до 40°С, появились кашель с мокротой, слабость, снижение аппетита. Лечился симптоматически амбулаторно. Обзорная рентгенограмма органов грудной клетки выполнена 26 февраля 2009 года и ребенок был госпитализирован в районную больницу с диагнозом правосторонней пневмонии. В стационаре мальчик получал комбинированную неспецифическую антибактериальную терапию с физиолечением: УВЧ и электрофорез на область грудной клетки. Состояние ребенка не улучшалось, 23 марта 2009 года выполнена КТ органов грудной клетки и обнаружена в верхней доле и S6 справа массивная воспалительная инфильтрация, очаги полиморфного характера и множественные разных размеров полости распада. Во внутригрудных лимфатических узлах справа - единичные кальцинаты. Реакция на пробу Манту с 2 ТЕ PPD-L 20 марта 2009 года инфильтрат 13 мм. Диагностирован инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе распада с выделением микобактерий, устойчивых к изониазиду. При генотипировании обнаружены аллели *04*04 гена HLA-DR B1. Этот пример свидетельствует о том, что у детей с генетической предрасположенностью к заболеванию туберкулезом общепринятая краткосрочная химиопрофилактика не обеспечивает прогрессирования инфекции и, кроме того, способствует нарастанию лекарственной устойчивости микобактерий. Отсутствие данных генотипирования в данном случае привело к ошибочной тактике лечения в остром периоде заболевания с применением физиопроцедур без этиотропной терапии.
Придерживаясь мнения, что патогенез туберкулеза, как манифестного, так и латентного, одинаковый, мы полагаем, что применение комплекса лечебных мероприятий, направленных на повышение устойчивости к прогрессированию инфекции, должно быть ранним, для чего необходимо ввести в медицинскую практику типирование генов главного комплекса гистосовместимости локуса DR B1 у детей с впервые установленной конверсией туберкулиновой чувствительности.