МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
METHOD OF DETERMINING UNSATURATED FATTY ACIDS IN PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTES

1. Цель изобретения - разработать способ оценки развития угрозы гемической анемии у беременных путем определения снижения содержания ненасыщенных жирных кислот в мембранах эритроцитов при нарастании титра антител к цитомегаловирусу, что приводит к повышению содержания в мембранах эритроцитов перекисей жирных кислот и снижению оксигенации гемоглобина.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа оценки развития у беременных гемической анемии вследствие снижения на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции в мембранах эритроцитов ненасыщенных жирных кислот, увеличения количества перекисей жирных кислот, что приводит к подавлению оксигенации гемоглобина.
3. Раскрытие изобретения
Ненасыщенные жирные кислоты в большом количестве находятся в растительных маслах. Они содержат двойные ненасыщенные связи, что придает им высокую биологическую активность и способность к окислению. К широко известным ненасыщенным жирным кислотам относятся олеиновая, линоленовая, линолевая, арахидоновая и другие жирные кислоты. Ненасыщенные жирные кислоты в организме не образуются и должны ежедневно поступать с пищевыми продуктами. В большинстве ненасыщенные жирные кислоты входят в состав мембранных систем клеток. Мононенасыщенные жирные кислоты поддерживают необходимую подвижность клеточных мембран, что облегчает прохождение в клетку полиненасыщенных жирных кислот. Одним их важнейших свойств ненасыщенных жирных кислот является их способность к перекисному окислению [2]. Этот процесс можно рассматривать как регуляторный механизм обновления клеточных мембран и их проницаемости. Однако, если факторы, воздействующие из вне на клеточные мембраны обладают высокой интенсивностью, это может привести к избыточному появлению в клеточных мембранах перекисей жирных кислот, действующих на них деструктивно, равно как и на морфологию и ферментативные процессы всей клетки, а количество самых ненасыщенных жирных кислот в мембране значительно уменьшается. Это приводит к тяжелым морфофункциональным нарушениям в клеточной мембране, поскольку в мембранах содержатся ферменты, активность которых зависит от липидного окружения [3, 6]. Метаболическая активность липидзависимых ферментов определяется изменениями в липидном микроокружении, в состав которых входят в первую очередь ненасыщенные жирные кислоты подвижность липидов определяет конформацию полярных головок. При нарушении содержания ненасыщенных жирных кислот теряется чувствительность к гормонам, так как изменяется функционирование рецепторов мембраны [1]. В мембранах при действии токсинов могут инициироваться процессы окислительного превращения в перекиси жирных кислот [7]. При воздействии аденовирусов отмечается усиление перекисного окисления в клеточных мембранах [3], что приводит к нарушению пентозного цикла в эритроцитах [4] и снижению оксигенации гемоглобина и формированию угрозы развития гемической анемии.
4. Новая техническая задача
Разработать способ определения ненасыщенных жирных кислот в мембранах эритроцитов на фоне обострения у беременных цитомегаловирусной инфекции приводящих к увеличению перекисей жирных кислот в мембранах эритроцитов и снижению оксигенации гемоглобина, что создает угрозу формированию у беременной на третьем триместре гестации гемической анемии.
5. В доступной литературе [3] имеются лишь упоминания, что при наличии в крови аденовирусов в клетках отмечается, что повреждение в силу нарастания перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот клеточных мембран приводит к снижению процесса окислительного фосфорилирования в клетках. В отличие от вышеприведенного прототипа в данной работе исследования конкретно касались мембран эритроцитов периферической крови, в которых гистохимическим методом определяли ненасыщенные жирные кислоты, и при снижении их содержания наблюдалось подавление оксигенации гемоглобина, что создавало угрозу развития гемической анемии.
6. Осуществление изобретения
6.1. Обследованы 25 пациенток 18-25 лет с обострением ХЦМВИ в третьем триместре беременности, контрольную группу составили 20 беременных женщин с ХЦМВИ в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение ХЦМВИ) устанавливался по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК ЦМВ, IgM или увеличение титра антител IgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляли методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», ДНК ЦМВ выявляли методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Россия).
2
2
6.3. Активность ненасыщенных жирных кислот определяли в мембранах эритроцитов периферической крови рожениц, взятую из локтевой вены в количестве 5 мл и помещали ее в пробирку с антикоагулянтом. На предметных стеклах изготовляли из капли этой крови мазки на центрифуге «Stat-Spin-2» (США). Подсушенные при комнатной температуре мазки помещали в 10% раствор нейтрального формалина на 30 мин. После этого мазки можно долго хранить. При выполнении реакции на выявление ненасыщенных жирных кислот подготавливали реактив Шиффа за сутки до выполнения реакции, а накануне реакции раствор надмуравьиновой кислоты из расчета: муравьиновая кислота - 8 мл; НО 30% - 31 мл; концентрированная серная кислота - 0,22 мл.
6.4. Ход реакции.
а) В свежеприготовленную надмуравьиновую кислоту помещают стекла с мазками эритроцитов на 2 часа при комнатной температуре.
б) Промывают 10 мин в проточной водопроводной воде.
в) Помещают в реактив Шиффа на 10 мин.
г) Трижды сменяя через 2 мин, выдерживают в сульфатной воде.
д) Промывают в теплой проточной воде 10 мин.
е) Слегка подсушивают при комнатной температуре.
ж) Обезвоживают в спиртах восходящей крепости, просветляют в ксилоле и заключают в полистерол под покровное стекло на долгое хранение.
Полученные препараты изучают под цифровым микроскопом, соединенным с компьютером с целью проведения цитофотометрического анализа по программе «Scion» (США).
6.5. Содержание перекисей жирных кислот в мембранах эритроцитов определяли по методу М.Т. Луценко, И.А. Андриевской, О.Л. Кутеповой, А.Г. Мироненко, 2014 Патент №2542426 зарегистрирован в Госреестре изобретений РФ. 21.01.2015 [5].
6.6. Содержание оксигемоглобина выполнялось по методу Эвелина и Меллой [8].
1
2
7. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n+n. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений, непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.
8. Полученные данные
В процессе исследования получены следующие результаты. В мембранах эритроцитов беременных, не болевших на всем протяжении гестации, выявляется отчетливо интенсивная реакция на ненасыщенные жирные кислоты величиной до 62,0±1,3 усл. ед. (фиг. 1). При обострении ХЦМВИ до титра антител к ЦМВ 1:1600 количество ненасыщенных жирных кислот снижается до 21,00±0,4 усл. ед. (фиг. 2). При обострении ЦМВИ до титра 1:1600 в мембранах эритроцитов повышалось содержание перекисей жирных кислот до 85,30±1,60 усл. ед.; контроль - 23,0±0,5 усл. ед. (фиг. 3а, б). Содержание оксигемоглобина снижалось при обострении цитомегаловирусной инфекции до 92,0±1,8%. Следовательно, ненасыщенные жирные кислоты под влиянием ЦМВ, внедряющегося в мембрану эритроцитов индуцируют интенсивную реакцию на перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, содержание которых снижалось по мере нарастания в мембранах перекисей жирных кислот, которые подавляют оксигенацию гемоглобина до 92,0±1,8% и создается угроза формирования на третьем триместре гестации гемической анемии.
На фиг. 1 изображена реакция на ненасыщенные жирные кислоты в мембранах эритроцитов рожениц, не болевших на протяжении всего периода гестации. Интенсивность реакции на ненасыщенные жирные кислоты -62,0±1,3 усл. ед. Увеличение - 10×100.
На фиг. 2 изображена реакция на ненасыщенные жирные кислоты в мембранах эритроцитов роженицы, перенесшей обострение ЦМВИ в период гестации. Интенсивность реакции на ненасыщенные жирные кислоты в мембранах эритроцитов снизилась до 21,00±0,4 усл. ед. Увеличение - 10×100.
Источники информации
1. Богач П.Г., Курский М.Д., Кучеренко Н.Е., Рыбальченко В.К. Структура и функция биологических мембран. - Киев.: Вища шк., 1981.
2. Козлов Ю.П. Свободнорадикальное окисление липидов в биомембранах в норме и патологии. Биоантиокислители // Москв. наука. 1985. С. 4-5.
3. Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н. Липиды. - Киев.: Вища шк., 1985. 247 с.
4. Лабори Л. Регуляция обменных процессов. Пер. с француз. М.: Медицина.
1970. 384 с.
5. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Кутепова О.Л., Мироненко А.Г. Патент №254226. Зарегистрирован в Госреестре изобретения РФ 21.01.2015 г.
6. Строев Е.А. Биологшическая химия. М.: Высшая школа. 1986. 479 с.
7. Хорст А. Молекулярные основы патогенеза болезней. М.: 1982. 456 с.
8. Покровский А.А. Биохимические методы исследования. Справочник. М.: Медицина. 1969. 337 с.
На фигуре 3 изображена реакция на перекиси жирных кислот у рожениц:
а - не болевших в период гестации - 23,0±0,5 усл. ед.
б - роженица, перенесшая обострение ЦМВИ до титра 1:1600. Количество перекисей жирных кислот в мембранах эритроцитов - 85,30±1,60 усл. ед. Реакция по Винклеру-Шульце. Увеличение - 15×100.