Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе меланина из гриба Inonotus obliquus
SARS-COV-2 CORONAVIRUS REPLICATION INHIBITOR BASED ON MELANIN FROM INONOTUS OBLIQUUS FUNGUS

Настоящее изобретение относится к ингибитору репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе меланина из гриба Inonotus obliquus и может быть использовано в биотехнологии, фармацевтической промышленности и медицине.
Вспышка SARS-CoV-2 по всему миру и связанные с ней последствия являются угрозой для общественного здравоохранения и экономики многих стран. Отсутствие специальной терапии против нового вируса и его высокая изменчивость требует создания новых лекарственных средств.
Природные вещества чаги (базидиального гриба Inonotus obliquus) имеют очень широкий спектр различных соединений, которые формируются при тесном взаимодействии березы и гриба [Чага и ее лечебное применение / Под ред. проф. П.К. Булатова, проф. М.П. Березиной, проф. П.А.Якимова / Медгиз, Ленинградское отделение, 1959]. В Сибири и в целом в РФ этот гриб развивается на березе бородавчатой и березе белой (Betula pendula Roth и Betula alba L.), имеет широкий ареал распространения.
После разносторонних клинических и биохимических исследований гриб Inonotus obliquus был разрешен Фармакологическим комитетом Министерства Здравоохранения СССР в 1955 году к использованию в медицине. На основании фармакопейной статьи ФС 42-53-72 готовое сырье гриба Inonotus obliquus имеет следующие показатели:
- экстрактивные вещества - не менее 20%;
- хромогенный комплекс - не менее 50% массы общего сухого остатка экстрактивных веществ;
- влаги - не более 14%;
- золы - не более 14%.
Гриб Inonotus obliquus содержит широкий спектр различных БАВ, среди которых темный пигмент меланин занимает одно из важных мест.
Все виды меланиновых пигментов являются длинноцепочечными полимерами с гигантским молекулярным весом и сложной жидкокристаллической структурой.
Известны сообщения о практическом использовании синтетических, полусинтетических и выделенных из биологических источников меланинов в медицине, косметологии, а благодаря их полупроводниковым свойствам, в технике и электронике.
Меланины, выделенные из микроорганизмов, показывают сходные свойства с меланинами животного происхождения. Это фармакологически активные вещества, обладающие антиоксидантными, антитоксическими, противовоспалительными, иммуностимулирующими свойствами, защищающие от фотодинамических повреждений и др.
Меланины - аморфные высокомолекулярные вещества, не растворимые в воде, минеральных кислотах, органических растворителях; хорошо растворимы в щелочах, а затем выпадают в осадок при подкислении растворов, что используется для их выделения.
По предшественникам меланины разделяют на эумеланины, феомеланины и алломеланины. Эумеланины (черные) и феомеланины (желтые, красные и коричневые) распространены у животных, алломеланины (черные) - в растениях, грибах, бактериях. Предшественник эумеланинов - тирозин, из него в организме получаются пигменты, содержащие С, Н, N и О. Предшественники алломеланинов - дифенолы (пирокатехин и др.), из них образуются меланины, не содержащие азота.
Содержащиеся в грибах пигменты меланины - самые мощные биопротекторы, защищающие живую клетку от неблагоприятных внешних и внутренних воздействий. Это также и самые сильные природные антиоксиданты. Меланины способны нейтрализовать различные свободные радикалы, возникающие в живой клетке под действием проникающей радиации, ультрафиолетового облучения, различных токсинов и ферментов патогенных микроорганизмов. У многих медицинских грибов, прежде всего у трутовиков, содержание меланинов высоко и может достигать 30% сухой массы и даже более. Часть грибных меланинов способна переходить в раствор и может всасываться в желудочно-кишечном тракте, разноситься кровью по организму и защищать живые клетки от разрушительного действия свободных радикалов (http://www.amrita.net.ua/pi/products_id/329).
Установлено, что меланин из чаги Inonotus obliquus и некоторых других трутовых грибов обладает фото- и радиопротекторным, антиоксидантным и генопротекторным свойствами [Щерба В.В., Бабицкая В.Г., Курченко В.П., Иконникова Н.В. Дукулянская Т.А. Антиоксидантные свойства меланиновых пигментов грибного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36. - №5. - С. 569-574; Сушинская Н.В., Курченко В.П., Горовой Л.Ф., Сенюк О.Ф. Получение и использование в медицине меланинов из трутовых грибов // Успехи медицинской микологии. - 2005. - Т. 6. - С. 255-259].
Известно противовирусное средство на основе водорастворимых меланинов, полученных химическим синтезом из следующих компонентов: L-дезоксидопамин, L дезоксидопамин, цистеин, L-дезоксидопамин/глутатион, L-тирозин, серотонин, допамин, адреналин и норадреналин [Патент США №5057325, МПК A61K 31/195, опубл. 1991 г].
Указанное противовирусное средство может полностью или частично защитить в условиях in vitro лимфоциты человека от вируса иммунодефицита (ВИЧ-1 и ВИЧ-2).
Известно противовирусное средство на основе меланина, полученного из природной чаги Inonotus obliquus, которое эффективно против вирусов гриппа, вируса простого герпеса 2 типа, вируса осповакцины, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) [Патент России 2480227, опубл. 27.04.2013]. Выделение меланина из природной чаги проводилось методом шелочного гидролиза [Сушинская Н.В., Курченко В.П., Горовой Л.Ф., Сенюк О.Ф. Получение и использование в медицине меланинов из трутовых грибов // Успехи медицинской микологии. - 2005. - Т. 6. - С. 255-259]. Полученные пигменты идентифицировали при помощи качественных реакций [Кукулянская Т.А., Курченко Н.В., Курченко В.П., Бабицкая В.Г. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании.// Прикладная биохимия и микробиология. 2002. - Т.38. - №1. - С. 68-72]. Поглощение УФ и видимого света водными и щелочными растворами пигмента регистрировали на спектрофотометре (Genesys 5 Spectrophotometers, United States). Спектр поглощения раствора меланина имел форму наклонной прямой, характерную для меланинов грибного происхождения [Бабицкая B. Г., Щерба В.В., Иконникова Н.В. Меланиновый комплекс гриба Inonotus obliquus. II Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36. - №4. - C. 439-444].
Однако в выше приведенных аналогах отсутствуют сведения о противовирусной активности меланина из грибов в отношении коронавируса SARS-CoV-2.
Известны природные соединения, такие как флавоноиды, (https:/bioflavit.ru/wp-content/uploads/Taxifolin-basel-rus2.pdf), которые ингибируют основную протеазу SARS-CoV-1 и их эффективность была продемонстрирована с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) [Pillaiyar, Т., Manickam, М., Namasivayam, V., Hayashi, Y., Jung, S. H. An overview of severe acute respiratory syndrome-coronavirus (SARS-CoV) 3CL protease inhibitors: Peptidomimetics and small molecule chemotherapy. Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59, 6595-6628]. Кроме того, в in vivo экспериментах (-) - таксифолин проявляет активность против других вирусов, таких как вирус Коксаки В4. Известно, что лиственница сибирская (Larix sibirica) вырабатывает (-) - таксифолин, являющийся природным ресурсом для его экстракции. Кроме того, пищевые препараты, содержащие (-) - таксифолин, легко доступны в аптеках и других компаниях, обеспечивая прямой и быстрый доступ к потенциальному противовирусному препарату. Примечательно, что (-) -таксифолин переносит семь водородных связей, что является самым высоким показателем в выборе противовирусных соединений. Поскольку водородные связи являются ключевым фактором, определяющим особенность лекарственного средства (-) - таксифолин может являться природной альтернативой предлагаемым ингибиторам CP-1-CP-11 [Wade, R.С. Goodford, P.J. The role of hydrogen-bonds in drug binding. Progress in clinical and biological research 1989, 289, 433-444].
Известно также, что содержащийся в водорослях гепарин способен блокировать коронавирус SARS-CoV-2 лучше, чем, например, препарат "Ремдесивир", который активно используют в США для лечения COVID-19 [Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 in vitro/ Paul S. Kwon, Hanseul Oh, Seok-Joon Kwon, Weihua Jin, Fuming Zhang, Keith Fraser, Jung Joo Hong, Robert J. Linhardt & Jonathan S. Dordick.- Cell Discovery, volume 6, Article number: 50 (2020)]. Ученые целенаправленно исследовали свойства гепарина - известного всем антикоагулянта. Было доказано, что это вещество обладает исключительным связывающим свойством к спайковому белку (S-белку) SARS-CoV-2 и снижает активность данного вируса.
Известен ингибитор коронавируса SARS-CoV на основе водного растительного экстракта, проявляющего дозозависимую активность против SARS-CoV в тестах на клеточных культурах [заявка США №20080038382, МПК А61Р 31/12, опубл. 14.02.2008 г.]. В качестве водного растительного экстракта он содержит водный экстракт многолетнего травянистого растения Scutellaria spp.(вид рода Шлемник) эффективный для лечения пациента с инфекцией SARS-CoV. Указанное средство ингибирует инфекционность SARS-CoV приблизительно на 50% при самой высокой использованной концентрации (200 мкг/мл). Эффект зависит от дозы, учитывая, что при испытанной более низкой дозе наблюдается меньшее ингибирование. Значительно ингибирование на более высоком уровне было больше, чем рибавирин (100 мкг/мл).
Однако указанный аналог - ингибитор коронавируса SARS-CoV не исследовался на активность против нового коронавируса SARS-CoV-2.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения меланина [заявка США №20110230562, МПК A61K 31/185, С12Р 7/40, опубл. 22.09.2011 г.], включающий: контактирование по меньшей мере одного предшественника в водном растворе с щелочной рН (буфер карбоната натрия с рН примерно 10,6), содержащего по меньшей мере две гидроксильные группы, с металлсодержащим катализатором в присутствии кислорода в течение времени, достаточного для образования меланина. Катализатор выбран из группы, состоящей из комплекса железа, комплекса кобальта, комплекса никеля и салькомина. Предшественник выбран из группы, состоящей из коричной кислоты, кумарина, фенола, гидроксифлаванона, гидроксинафталина, гидроксибензойной кислоты, флавоноида, пирокатехола, гидроксибензальдегида и их комбинаций. Способ предполагает дополнительную очистку меланина, растворимого в воде. Меланин предполагается использовать в способе для лечения или профилактики заболевания у человека или животного, включающем: введение терапевтически эффективного количества меланина против вируса SARS (тяжелый острый респираторный синдром), в частности SARS-CoV). Синтетические меланины могут использоваться в качестве компонентов мультиагентной профилактики или схем лечения, в которых одновременно нацелены множественные механизмы микробной инфекции.
Таким образом, синтетические меланины, полученные с помощью способа-прототипа, активны против некоторых вирусов, включая SARS, а также имеют низкую токсичность по отношению к животным клеткам. Синтетические меланины продемонстрировали активность против SARS от умеренной до высокой в скрининговом анализе.
Однако указанный наиболее близкий аналог - ингибитор коронавируса SARS на основе меланина не исследовался на активность против нового коронавируса SARS-CoV-2.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение ингибитора на основе природного меланина из гриба Inonotus obliquus для предотвращения репликации коронавируса SARS-CoV-2.
Указанный технический результат достигается тем, что в ингибиторе репликации коронавируса SARS на основе меланина, согласно изобретения, в качестве меланина ингибитор содержит природный меланин из базидального гриба Inonotus obliquus, полученный методом щелочного гидролиза (по патенту RU 2480227 С2, опубл.27.04.2013), осаждением кислотой, растворением осадка в аммиачной воде и сушкой конечного продукта при температуре не выше +30-40°С, ингибирующий водный раствор которого в диапазоне 6,218-8,488 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозозависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero.
Изменения в подготовке образцов для испытания на коронавирусе SARS-CoV-2, в основном, связаны с более мягким режимом сушки. Высушивание полученного меланина производят при температуре не выше +30-40°С, что обеспечивает более высокие и стабильные показатели противовирусной активности меланина на клеточной культуре Vero.
Изобретение поясняется чертежами, приведенными на фиг. 1 - результаты измерения ОП (для образцов 20-24 и 20-30 ингибитора) в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат. По оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения.
Ниже приведены варианты получения заявляемого ингибитора репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе меланина, полученного из фармакопейного измельченного базидального гриба Inonotus obliquus.
Пример 1. Получение водорастворимого меланина из аптечной чаги, образец 20-24.
К 5 г сухого измельченного до 1 мм (мельница универсальная MF-10 basik IKA) природного сырья чаги добавили 100 мл 2% NaOH и выдержали в автоклаве 30 минут при избыточном давлении 0,7 атм. Профильтровали через капроновый и бумажный фильтры. Осадили меланин концентрированной соляной кислотой и отцентрифугировали на центрифуге Centra CL3 20 мин при 4000об/мин. Провели 3-х кратное переосаждение 1н соляной кислотой, осадок промыли трижды дистиллированной водой (1:10). Полученный препарат не растворяется в воде, но хорошо растворяется в щелочах. Водорастворимую форму меланина получают тщательным растворением полученного пигмента в 10% водном растворе аммиака, доведя рН до 7-8 с последующим мягким выпариванием остаточного аммиака и воды до сухого состояния при температуре воздушного потока +30°С. Полученный препарат полностью растворим в воде.
Образец для испытания приготовлен путем растворения сухого меланина в дистиллированной воде до концентрации 2 мг в 1 мл.
Получен ингибитор, содержащий водный раствор меланина, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus методом щелочного гидролиза и высушенный при температуре +30°С, ингибирующий водный раствор которого в концентрации 6,218 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозозависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero.
Пример 2. Получение водорастворимого меланина из склероция чаги с березы, образец 20-29.
К 5 г сухого измельченного до 1 мм (мельница универсальная MF-10 basik IKA) природного сырья чаги добавляют 100 мл 2% NaOH и выдерживают 3 раза в термостате при 50°С по 24 часа. После каждой экспозиции сливали надосадочную жидкость и повторяли процесс. Из собранной надосадочной жидкости осаждают меланин концентрированной соляной кислотой и центрифугируют на центрифуге Centra CL3 20 мин при 4000 об/мин для разделения с надосадочной жидкостью. Далее проводят очистку 3-х кратным переосаждением с концентрированной HCl (1:1) до рН от 1,5-2,0, промывают дистиллированной водой в пропорции 1:20, доводят рН до 7-8 10% водным раствором аммиака. Высушивают меланин при температуре +35°С. Образец для испытания приготавливают путем растворения сухого меланина в дистиллированной воде в концентрации 2 мг в 1 мл.
Получен ингибитор, содержащий водный раствор меланина, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus методом щелочного гидролиза и высушенный при +40°С, ингибирующий водный раствор которого в концентрации 8,488 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозозависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero.
Пример 3. Получение водорастворимого меланина из аптечной чаги, образец 20-30.
К 5 г сухого измельченного до 1 мм (мельница универсальная MF-10 basik IKA) природного сырья чаги добавляют 100 мл 2% NaOH и выдерживают 3 раза в термостате при +50°С по 24 часа. После каждой экспозиции сливают надосадочную жидкость и повторяют процесс. Из собранной надосадочной жидкости осаждают меланин концентрированной соляной кислотой и центрифугируют на центрифуге Centra CL3 20 мин при 4000 об/мин для разделения с надосадочной жидкостью. Далее проводят очистку 3-х кратным переосаждением с концентрированной HCl (1:1) до рН 1,5-2,0, промывают дистиллированной водой в пропорции 1:20, доводят рН до 7-8 10%-ным водным раствором аммиака и высушивают при +30°С. Образец для испытания приготовлен путем растворения сухого меланина в дистиллированной воде в концентрации 2 мг в 1 мл.
Получен ингибитор, содержащий водный раствор меланина, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus методом щелочного гидролиза и высушенный при +30°С, ингибирующий водный раствор которого в концентрации 8,188 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозозависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero.
Пример 4. Определение противовирусной активности образцов в отношении коронавируса SARS-Cov-2 в культурах клеток Vero.
Клеточные культуры. В работе использовали перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, полученные из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор. Монослой клеток выращивали в 96-луночных планшетах (по 0,1-0,15 мл/лунку клеточной суспензии с концентрацией 1,0-1,5×105 кл./мл) в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия) в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США) с добавлением пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и амфотерицина В (0,25 мкг/мл) (Antibiotic-Antimycotic (100Х), («Gibco», США). При культивировании клеток с вирусом в качестве поддерживающей среды использовали питательную среду DMEM с антибиотиками, без сыворотки.
Вирус SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 с инфекционным титром 5,0±0,29 (±0,57) lg ТЦЦ50/мл получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
2
Концентрацию вируса определяли путем титрования в культуре клеток Vero при культивировании в течении 3 суток при +37°С, 5% СО и влажности 85-90%. Титры вируса рассчитывали методом Спирмена-Кербера, выражали в десятичных логарифмах 50%-х тканевых цитопатических доз в мл (lg ТЦД50/мл) и представляли в виде М±m (±195) для 95%-го доверительного уровня (195) [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика. 1976; 598 с.; Virology Methods Manual. Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro. AcademicPress. 1996; 374 p.].
Колориметрический метод определения цитотоксичности и противовирусной активности препаратов in vitro.
Исследование цитотоксичности и противовирусной эффективности препаратов проводили колориметрическим методом - по изменению оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощенного живыми клетками в монослое [Oestereich L., Ltidtke A., Wurr S., Rieger Т., Munoz-Fontela С, Gtinther S. Successful treatment of advanced Ebola virus infection with T-705 (favipiravir) in a small animal model // Antiviral Research, 2014., 105: 17-21; Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections // Antiviral Research., 2003., 57:13-23; Paragas J., Whitehouse C. A., Endy T.P., Bray M.A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Antiviral Research. 2004, 62:21-25].
Для оценки эффективности каждого использовали 8 последовательных 3-кратных разведений препаратов. Начальная концентрация экстрактов на планшетах при оценке цитотоксичности и противовирусной активности препаратов составляла 300 мкг/мл.
2
При оценке противовирусной активности препаратов в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток Vero вносили по 0,1 мл разведений экстрактов в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия), а через 2 ч инкубации при +37°С, 5% СО вносили по 0,1 мл разведения вируса в среде DMEM без сыворотки с множественностью инфицирования (MOI) 0,1 ТЦД50/клетку. При такой множественности заражения цитопатическое действие вируса на монослой клеток через 3 суток инкубирования достигает не менее 90% (контроль вируса без внесения препарата). Кроме того, в качестве «контроля клеток» использовали интактный монослой (без внесения вируса и препаратов).
Через 3 суток инкубирования в лунки планшета с монослоем клеток Vero в культуральную среду вносили витальный (прижизненный) краситель нейтральный красный 0,05 мл на 1,5 часа при +37°С. После этого монослой клеток промывали двукратно физраствором, вносили лизирующий буфер и через 30 мин определяли оптическую плотность (ОП).
50
50
50
50
Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного ридера «Multiskan FC» (ThermoScientific, USA). Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат (фиг. 1). При этом по оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения. По показателям ОП рассчитывали 50%-ю токсическую концентрацию (ТС в мкг/мл) и 50%-ю ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC в мкг/мл) препарата при помощи ПО SoftMaxPro-4.0. ТС - это величина концентрации препарата в лунке планшета, разрушающая 50% клеток в монослое. IC - это концентрация препарата, которая ингибирует репликацию вируса и сохраняет 50% клеток жизнеспособными.
50
50
На основании этих показателей рассчитывали индекс селективности (SI) препарата: SI=TC:.IC [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Хабриева Р.У. М.: ОАО «Издательство «Медицина». 2005; 832 с.; Методические рекомендации по изучению специфической активности индукторов интерферонов. Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].
Пример 5. Результаты определения противовирусной активности водорастворимого меланина из чаги в отношении коронавируса SARS-Cov-2 на клетках Vero
В таблице 1 представлены результаты по оценке противовирусной активности меланина из природной чаги в отношении коронавируса, штамма nCov/Victoria/1/2020.
Лучшим образцом меланина по ингибированию репликации коронавируса, штамм nCov/Victoria/1/2020, в клеточной культуре Vero является образец 20-24, полученный методом щелочного гидролиза в автоклаве при экспозиции 30 минут и избыточном давлении 0,7 атм с последующим удалением водного раствора аммиака из продукта при температуре +30°С и доведения его до сухого состояния.
Два образца меланина 20-29 и 20-30 получены из чаги при щелочном гидролизе в термостате при +50°С (3 раза по 24 часа). Образцы чаги различались происхождением. Из аптечной чаги получены образцы меланина 20-24 и 20-30. Образец меланина 20-29 получен из склероция чаги, собранного с березы.
Из полученных данных можно сделать следующие выводы: щелочной гидролиз с помощью автоклава позволяет получить образцы меланина из природного гриба Inonotus obliquus, ингибирующая концентрация которых в подавлении репликации коронавируса, штамма nCov/Victoria/1/2020 в клеточной культуре Vero выше, чем у образцов, полученных в термостате (таблица 1).
50
Для удаления аммиачной воды образцы меланина из чаги предлагается сушить при температуре не выше+30-40°С.Образцы меланина, высушенные при температуре свыше +40-50°С характеризуются более низкой активностью против коронавируса на примере штамма nCov/Victoria/1/2020. Ингибирующая концентрация IC мкг/мл на примере двух образцов, высушенных при +50°С составляла 19,405; 22,992 мкг/мл при одинаковой токсичности 666,7, в то время как у образцов, высушенных при температуре не выше +30-40°С, представленных в таблице 1, IC50 мкг/мл была в пределах 6,2-8,5 мкг/ мл.