СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 2 ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ПОСЛЕДСТВИЙ ИШЕМИЧЕСКИ-РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК
METHOD OF AGENT APPLICATION BASED ON HUMAN MODIFIED PEROXYREDOXIN 2 FOR CORRECTING CONSEQUENCES OF ISCHEMIC-REPERFUSIVE KIDNEY DAMAGE

Область техники
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии и может быть использовано для коррекции ишемических и реперфузионных повреждений почек. Предложенное терапевтическое средство и способ его применения может быть использован в терапии патологий почек, которые сопровождаются ишемически-реперфузионным синдромом.
Уровень техники
Ишемически-реперфузионное поражение почек занимает лидирующие позиции по летальности исходов у пациентов при абдоминальных травмах (механические, химические и др.), сосудистых заболеваниях различного происхождения (стенозы почечных артерий, тромбоз и др.), а также после хирургических вмешательствах [Waikar S.S. et al. 2008]. Несмотря на успехи в развитии превентивных и терапевтических методов, до сих пор существует высокий риск развития осложнений, снижающих функциональное состояние органов, подвергнутых ишемически-реперфузионному поражению, тем самым снижая качество и время жизни больных [Coca S. et al. 2009].
Патогенез ишемически-реперфузионных поражений связан с окислительным стрессом, основным направлением в терапии таких патологий является подавление роста активных форм кислорода в пораженных тканях с помощью различных антиоксидантных препаратов как природного, так и синтетического происхождения. Известны способы снижения ишемически-реперфузионного поражения почек у экспериментальных животных путем предварительного внутривенного введения низкомолекулярных антиоксидантных агентов. В качестве таких агентов рассматриваются сложные эфиры аскорбиновой кислоты (аскорбилпальмитата, 2-октадециласкорбат), микронизированную очищенную фракцию флавоноидов (Daflon 500), структурные аналоги α-токоферола (NH-токоферол, ВО-653, Trolox С, Raxofelax), аллопуринол, lazaroid (21- amino steroid) U-74389G, инфиксимаб, а также низкомолекулярные антиоксиданты митохондриально - направленного действия семейства SkQ (10-6'-пластолхинонил-децил-родамин) [Зоров Д.Б. и др., 2013; Меньшикова Е.Б. и др., 2006].
Известны способы комплексного применения низкомолекулярных антиоксидантных агентов: комбинированные композиции на основе фосфатных эфиров аскорбиновой кислоты и α-токоферола (ЕРС-K1) [Oishi K. и др., 2012], композиция на основе аскорбата натрия, N-ацетилцистеина и дефероксамина для инфузионной терапии [Патент США № US 20170333393, 2017], композиция на основе аллопуринола, оксипуринола и дефероксамина для внутривенного введения в комплексе реанимационных мероприятий [Патент США № US 4978668, 1990].
Известны способы использования небольших химически синтезированных соединений, имитирующих каталитические свойства ферментов-антиоксидантов. Такие соединения называются миметиками. Подавляющее число существующих миметиков на сегодняшний день являются миметиками иммитирующие каталитический механизм марганцевой супероксиддисмутазы. Данные соединения представляют собой марганец-органические комплексы, которые подразделяются на три группы. Первая группа, включает в себя ряд макроциклических соединений на основе марганца: М40401, М40403 и М40419. Второй класс представляет собой соединения марганца на основе металлпорфиринов: AEOL-10113 и AEOL-10150 [Thompson J.S. и др., 2010]. Третий класс, это как правило ароматические соединения с этилен- и диамин- заместителями, образующие комплексы с марганцем, например, EUK134 [Chatterjee Р.K. и др., 2004].
В клинической практике известны попытки использования низкомолекулярных антиоксидантов: мексидола [Багов А.Н., 2005] и реамберина для проведения антиоксидантной терапии при ишемически-реперфузионном синдроме [Яковлев А.Ю., 2008].
Наиболее перспективным направлением в антиоксидантной терапии на сегодняшний день, является использование ферментов - антиоксидантов, так как использование ферментов-антиоксидантов, может существенно ускорить лечения острых воспалительных процессов, связанных с окислительным стрессом. Основными преимуществами данного класса веществ является то, что их антиоксидантная эффективность на несколько порядков превосходит широко используемые в настоящее время низкомолекулярные соединения. Кроме того, они не обладают подобного рода цитотоксичностью, как большинство низкомолекулярных соединений.
Среди множества ферментов антиоксидантного действия наибольший интерес представляет семейство пероксиредоксинов (Prx), которые помимо способности к нейтрализации широкого спектра активных форм кислорода обладают другими важными функциями, такими как: шаперонная и сигнально-регуляторная [Rhee S.G. 2016]. На сегодняшний день у млекопитающих идентифицировано 6 типов Prx, которые по числу консервативных остатков цистеина в активном центре и механизмам катализа подразделяются на типичные 2-Cys (Prx1-4), атипичные 2-Cys (Prx5) и 1-Cys (Prx6). Prx1-6 играют важную роль поддержании редокс гомеостаза в организме млекопитающих, как правило их уровень увеличивается при развитии патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса, что способствует нормализации уровня активных форм кислорода в пораженных тканях [Шарапов М.Г. и др., 2014]. Особый интерес среди пероксиредоксинов млекопитающих представляет типичный 2-Cys пероксиредоксин - Prx2, поскольку данный фермент довольно широко представлен в клеточных компартаментах (цитоплазме, ядре), а также тканях/органах млекопитающих. Prx2 способен нейтрализовать широкий спектр перекисных субстратов как неорганической, так и органической природы. В дополнению к пероксидазной активности, Prx2 проявляет шаперонную и сигнально - регуляторную активность, благодаря которым он препятствует окислительной агрегации белков и апоптозу клеток [Wang R. и др., 2016].
В работе [Sharapov M.G. и др., 2019] показан радиозащитный эффект рекомбинантного Prx2 при его внутривенном введении. Введение Prx2 перед облучением в сублетальных и летальных дозах рентгеновского излучения приводил к росту выживаемости облученных животных, сохранению красного костного мозга и быстрой нормализации уровня лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови. Показана нормализация уровня экспрессии маркерных генов в активно пролиферирующих клетках животных при предварительном введении рекомбинантного Prx2 перед облучением, что свидетельствует о нормализации окислительно-восстановительного статуса клеток и тканей. Однако данное исследование не связано с применением пероксиредоксина 2 при ишемически-реперфузионном поражении почек.
В работе [Goncharov R.G. и др., 2019] рассматривается эффективное использование рекомбинантной формы Prx6 в терапии ишемически-реперфузионного поражения почек на экспериментальных животных. В работе показано, что внутривенное введение экзогенного Prx6 перед ишемией-реперфузией способно уменьшать ишемически-реперфузионное поражение почек. Это демонстрируется в снижении смертности животных, сохранении как морфологии почечной ткани, так и фильтрационной способности почек (по креатинину и мочевине), снижении уровня перекисного окисления липидов (по малоновому диальдегиду), нормализации профиля экспрессии маркерных генов антиоксидантного и иммунного ответа, а также регенеративных процессов и апоптотической гибели клеток, приближая их к нормальным значениям.
Известна работа Kubo Е. и соавторов были получены модифицированные формы Prx5 и Prx6, совмещенные с ТАТ-пептидом ВИЧ человека [Kubo Е., et al., 2009]. Такая модификация позволяет более эффективно проникать экзогенному рекомбинантному белку в клетки.
Известны заявки Южной Кореи на изобретения, относящиеся к фармацевтическим композициям для предотвращения и лечения ишемических повреждений мозга [Заявка №KR20140030934] и для лечения воспалений [Заявка № KR 20150004024], композиции которых содержат слитый белок, состоящий из пероксиредоксина 2 и домена транспортного белка (ТАТ). При этом домен транспортного белка, ковалентно связан, по меньшей мере, с одним из N- и С-концов белка пероксиредоксина 2. Домен транспортного белка представляет собой ТАТ пептид ВИЧ или РЕР-1. В тексте заявок не раскрыты примеры применения рекомбинантного белка ТАТ-Prx2 для комбинированного лечения ишемических и реперфузионных повреждений почек млекопитающих.
Задачей данного изобретения является разработка способа коррекции последствий и осложнений от ишемически-реперфузионного синдрома почек млекопитающего, с использованием средства, в состав которого входит слитый бифункциональный рекомбинантный белок на основе антиоксиданта Prx2 и домена транспортного белка (ТАТ).
Поставленная задача повышения эффективности способа коррекции последствий и осложнений от ишемически-реперфузионного синдрома почек, решается путем создания средства, в которое входит новая конструкция химерного рекомбинантного белка ТАТ-Prx2, состоящий из пероксиредоксина Prx2 (SEQ ID NO 1), к N-концу белка пероксиредоксина Prx2 ковалентно присоединена последовательность пептида ТАТ (SEQ ID NO 2), а к С-концу белка пероксиредоксина Prx2 присоединена последовательность из 6-ти остатков гистидина (His-tag) (SEQ ID NO 3). При этом новая конструкция химерного белка, сохраняет как высокую антиоксидантную активность Prx2, так и высокую эффективность для проникновения слитого рекомбинантного белка в клетки печени млекопитающего.
Сущность изобретения
Предметом настоящего изобретения является способ коррекции последствий и осложнений от ишемически-реперфузионного синдрома почек млекопитающего, при котором для повышения защитных функций в организм вводят средство, в состав которого входят: рекомбинантный белок ТАТ-Prx2, стабилизатор манноза и фармацевтически приемлемый растворитель из группы: физиологический раствор, раствор Рингера, где компоненты взяты в следующем соотношении, мас.%:
рекомбинантный белок ТАТ-Prx2
0,1-0,4
стабилизатор манноза
0,01-0,04
фармацевтически приемлемый растворитель
99,89-99,56
Другой аспект изобретения состоит в том, что терапевтически эффективное количество средства вводят млекопитающему однократно. При этом терапевтически эффективное количество средства вводят внутривенно за 15-20 мин до индуцированной ишемии млекопитающего.
Следующий аспект изобретения состоит в том, что средство вводят в дозе от 5 мг/кг до 20 мг/кг массы тела млекопитающего. Предпочтительно в наиболее эффективной терапевтической дозе 10 мг/кг массы тела млекопитающего
Перечень фигур
Фиг. 1. Карта экспрессирующего вектора pET23b, кодирующего белок ТАТ-Prx2 человека.
Фиг. 2. Время циркуляции ТАТ-Prx2 в сыворотке крови после внутривенного введения. Иммуноблоттинг белков сыворотки крови экспериментальных животных. 1-Маркер молекулярной массы белков, кДа; 2,3 - чистый препарата рекомбинантного ТАТ-Prx2 (500 и 100 нг соответственно); 4 - плазма крови контрольных животных, не получавших инъекцию рекомбинантного ТАТ-Prx2; 5-9 - пробы плазмы крови мыши спустя 10, 60, 120, 240, 360 мин, после внутривенного введения 2 мг ТАТ-Prx2.
Фиг. 3. Выживаемость экспериментальных животных в течение пяти суток после 30-ти мин ишемии обеих почек и последующей реперфузии, а также после предварительного введения рекомбинантного пероксиредоксина ТАТ-Prx2 за 15 мин до ишемии. #n=30., р<0,05 для каждой из групп.
Фиг. 4. Концентрация мочевины в крови эксперементальных животных в течение трех суток после 30-ти мин ишемии обеих почек и последующей реперфузии, а также после предварительного введения рекомбинантного пероксиредоксина ТАТ-Prx2 за 15 мин до ишемии. n=50 для каждой из групп., р<0,05 * относительно интактного контроля, #И-Р.
Фиг. 5. Концентрация креатинина в крови эксперементальных животных в течение трех суток после 30-ти мин ишемии обеих почек и последующей реперфузии, а также после предварительного введения рекомбинантного пероксиредоксина ТАТ-Prx2 за 15 мин до ишемии. n=50 для каждой из групп., р<0,05 относительно *интактного контроля, #И-Р.
Фиг. 6. Структура коркового слоя почки мыши после ишемии-реперфузии и предварительного введения рекомбинантного ТАТ-Prx2. Интактный контроль (а) и (г). Ишемия - 30 мин, реперфузия - 24 часа, без лечения (б). Внутривенное введение ТАТ-Prx2 (в) за 15 мин до ишемии - 30 мин, реперфузии - 24 часа. Ишемия - 30 мин, реперфузия - 72 часа, без лечения (д). Внутривенное введение ТАТ-Prx2 (е) за 15 мин до ишемии - 30 мин, реперфузии - 72 часа. Окраска: гемотоксилин-эозин. n=10 для каждой из групп.
Фиг. 7. Содержание малонового диальдегида в тканях почек животных после ишемически-реперфузионного поражения и предварительного введения рекомбинантного ТАТ-Prx2 перед ишемически-реперфузионным поражением. Интактный контроль (1). Ишемия - 30 мин, реперфузия - 24 ч (2). Внутривенное введение ТАТ-Prx2 (3) за 15 мин до ишемии - 30 мин, реперфузии 24 ч. n=5, для каждой из групп, #р<0,05.
Фиг. 8. Активация каспазы-3. Иммуноблоттинг белков почечной ткани для Actp и Casp-3 после 30-ти мин ишемии и предварительного введения фермента ТАТ-Prx2 за 15 мин перед 30-ти мин ишемии с последующей 24 ч реперфузией. 1- интактные мыши; 2- ишемия- 30 мин, реперфузия- 24 ч, без лечения; 3- внутривенное введение ТАТ-Prx2. Данные нормализованы по Actβ. Уровень активации casp-3 определялся отношением pro-casp-3 (35 кДа) к расщепленной casp-3 (17-19 кДа). n=5 для каждой из групп, #р<0,05.
Описание изобретения
При разработке эффективного состава средства для внутривенного введения при коррекции осложнений после ишемически-реперфузинонного поражения почек, было обнаружено, что применение новой конструкции рекомбинантного белка ТАТ-Prx2 привело к повышению устойчивости клеток к ишемически-реперфузионному поражению.
Расположение белка пероксиредоксина Prx2 и транспортного пептида ТАТ в новом химерном рекомбинантном белке ТАТ-Prx2, отличается от известных вариантов [заявка № KR 20140030934 и заявка № KR 20150004024], в которых пептид ТАТ (или РЕР-1) располагается сразу после белка Prx2, который далее связан с His-tag. Новая конструкция бифункционального белка, представленная на карте экспрессирующего вектора pET23b (см. фиг. 1), позволяет увеличить эффективность его проникновения в клетки почечной ткани, т.к. пептид ТАТ ничем не экранирован. Для этого пептид ТАТ ковалентно присоединен к N-концу белка Prx2, что позволяет химерному белку ТАТ-Prx2 эффективно проникать в клетки почечной ткани. Наличие His-tag на С-конце белка ТАТ-Prx2 позволяет проводить одностадийную очистку химерного белка ТАТ-Prx2 с помощью аффинной металл-хелатной хроматографии до высокой степени чистоты (свыше 95%). Таким образом, рекомбинантный белок ТАТ-Prx2 позволяет эффективно защищать клетки ткани почек от ишемически-реперфузионного поражения.
Терапевтически эффективную дозу ТАТ-Prx2 определяют в соответствии с данными об эффективной концентрации ТАТ-Prx2 при защите биомакромолекул от активных форм кислорода in vitro, а также в соответствии с концентрацией экзогенного пероксиредоксина ТАТ-Prx2 в почечной ткани в норме. Диапазон терапевтически эффективных доз ТАТ-Prx2 в жидкой форме препарата может варьировать в зависимости от тяжести поражения и составлять от 5 мг до 20 мг белка на кг массы тела. Введение внутривенное, однократное.
Сохранение структуры и активности ТАТ-Prx2 является принципиальным моментом данного изобретения. Для предотвращения снижения активности белка при его хранении используют способ стабилизации и лиофилизации раствора белка.
Непосредственно перед использованием сухой порошок лиофилизированного ТАТ-Prx2 растворяют в физиологическом растворе, который выбирают из группы: физиологический раствор, раствор Рингера, в требуемой концентрации. Растворы используют сразу.
Основа фармацевтической композиции, входящей в состав средства, содержит следующее соотношение компонентов, мас.%
Антиоксидант, рекомбинантный белок ТАТ-Prx2
0,1-0,4
Стабилизатор манноза
0,01-0,04
Фармацевтически приемлемый растворитель
99,89-99,56
Возможно применение композиции, включающей рекомбинантный белок ТАТ-Prx2 и стабилизатор маннозу, совместно с, по крайней мере, одним терапевтическим агентов широкого спектра действия. Используемый терапевтический агент не должен ингибировать ферментную активность ТАТ-Prx2. Приведенные ниже примеры включают, но не ограничивают варианты использования аналогов действующих веществ, входящих в состав средства.
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1
Опыт проводят на самцах мышей линии BALB/c 8-ми недельного возраста с массой 25-30 г. Моделирование ишемически-реперфузионного поражения проводят под общей анестезией. Для анестезии животных внутримышечно вводят смесь Zoletil-100 (Virbac Sante Animale, Франция) и Rometar-20 (Bioveta, Чехия) в 0,9% растворе NaCl в концентрациях 40 мкг и 7 мкг соответственно, на 1 г веса мыши. Действие анестезии длилось в течении 1,5-2 часов. Операцию на животных проводили согласно процедуре, представленной в работе [Wei Q. и др., 2012], с небольшими модификациями. После начала действия анестезии, животным делаются небольшие латеральные надрезы кожных и мышечных слоев с двух сторон тела, открывая тем самым доступ к почечным артериям и венам. Далее с помощью кровоостанавливающих зажимов проводят одновременное пережатие левых и правых почечных артерий, и вен, что приводит к блокированию притока и оттока крови к тканям почек, т.е. ишемии. Внешним признаком начала ишемии, является изменение цвета почки с бледно-розового до темно-пурпурного. Ишемию выполняют в течение 30 мин, после чего снимают зажимы для восстановления притока и оттока крови (стадия реперфузии). Внешним признаком начала реперфузии является изменение цвета почек с темно-пурпурного до бледно-красного. Латеральные разрезы зашивают и обрабатывают антисептиком. После операции животным были обеспечены кормом и водой ad libitum. Спустя 24 и 72 ч животных умерщвляют декапитацией и производят забор почек, которые делят на три равные части для исследования. Рекомбинантную форму ТАТ-Prx2 вводят через хвостовую вену в конечной концентрации 20 мкг/г массы мыши, за 15 мин до начала ишемии.
Исследование терапевтической эффективности рекомбинантной формы ТАТ-Prx2 включает оценку выживаемости животных, анализ экскреторной функции почек (по мочевине и креатинину), исследование степени подавления развития окислительного стресса в почечной ткани (по малоновому диальдегиду), анализ морфологии почечной ткани и изменение уровня экспрессии маркерных генов в почечной ткани, отражающих апоптоз, воспаление и функциональное состояние почек методом ОТ-ПЦР.
Пример 2. Получение и подготовка средства на основе ТАТ-Prx2
В рамках настоящего изобретения рекомбинантную форму ТАТ-Prx2 получают из клеток штамма E.coli BL21(DE3)(Prx2), трансформированных сконструированным рекомбинантным вектором экспрессии на основе плазмиды pET23b(+).
Присутствие His-tag в структуре белка ТАТ-Prx2 упрощает процедуру очистки рекомбинантного белка благодаря тому, что этот домен специфически связывается с Ni-NTA-агарозой.
2
4
2
4
Бактерии клеток E.Coli BL21(DE3)(TAT-Prx2), включающих себя генно-инженерную конструкцию, кодирующую исследуемый фермент (из объема культуральной среды - 500 мл) ресуспендировали в 8 мл в буфере 12 мМ Трис-HCl, рН 7.8 и 10 мМ имидазола и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (УЗДН-2Т, РФ) при 4°С. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 10000g в течение 20 мин, надосадок фильтровали через 0,45 мкм фильтр («Corning», США) и наносили на колонку («BioRad», США) объемом 10 мл с Ni-NTA-агарозой («Invitrogen», США), которая предварительно была уравновешена тем же буфером. Адсорбцию бактериального лизата на Ni-NTA-агарозе проводили в течение 40 мин при +4°С. Затем колонку промывали 100 мл раствора: 12 мМ Трис-HCl рН 7.8, 150 мМ NaCl, 20 мМ имидазол. Элюцию белка проводили 5 мл буфера: 12 мМ Трис-HCl рН 7.8, 150 мМ NaCl, 250 мМ имидазол. Белок концентрировали с помощью мембранного концентратора VIVASCIENCE 10.000 MWCO («Sartorius», Германия) и в нем же диализовали против буфера 1.7 мМ KHPO, 5.2 мМ NaHPO, 150 мМ NaCl, рН 7.4. Чистота белка согласно электрофорезу в полиакриламидном геле составляла >95%. Выход белка с 1 л культуральной среды составляет примерно 30-40 мг. Полученный белок используют для дальнейших экспериментов.
Полученный ТАТ-Prx2 возможно использовать в жидкой форме, однако белок нестабилен при длительном хранении в растворах, а при многократном (более 3 раз) замораживании/размораживании способен терять активность. В связи с этим, проводят лиофилизацию и стабилизацию рекомбинантного белка для сохранения активности белка при его хранении. Лиофилизированные формы могут быть использованы в дальнейшем для приготовления жидких форм для введения в кровь.
Лиофилизированный препарат ТАТ-Prx2 получают по технологии, включающей как минимум 4 стадии: 1) очистка белка с помощью аффинной хромотографии на Ni-NTA-агарозе; 2) концентрирование фракций до концентрации 5-7 мг/мл, содержащих ТАТ-Prx2 и диализ против деоинизированной воды 3) введение, по крайней мере, одного стабилизатора; 4) процесс лиофилизации при -20°С до образования сухого порошка.
Стабилизаторы необходимы для сохранения активности ТАТ-Prx2 на более длительный срок, не менее одного года, и в более доступных условиях, при температуре от +4 до -20°С в зависимости от срока хранения. Лиофилизированный препарат расфасовывают в стерилизованные в автоклаве при +120°С флаконы (в зависимости от применения по дозам от 1 до 5 мг и хранят при -20°С).
Известно, что манноза выполняет функцию сохранения вторичной структуры пептидов и белков [Rahim А. И др., 2013]. Применение маннозы, в качестве стабилизатора включает, но не ограничивает использование других стабилизаторов. Стабилизаторы могут быть выбраны из группы, состоящей из: а) одного или более моно- или полисахаридов, или сахарных спиртов (мальтоза, глюкоза, лактоза, трегалоза, сахароза, маннит, инозит, галактоза, рибоза, ксилоза, манноза, сахароза, целлобиоза, рафиноза и мальтотриоза, б) аминокислот (аланин, глицин др), в) полипептидов или белков (альбумин).
В связи с тем, что ТАТ-Prx2 является хорошо растворимым белком, для непосредственного приготовления жидкой формы препарата из лиофилизата белка с целью внутривенного введения можно использовать в качестве растворителей водные растворы, физиологический раствор, раствор Рингера и другие сбалансированные солевые растворы.
Непосредственно перед использованием сухой порошок лиофилизированного ТАТ-Prx2 растворяют в физиологическом растворе в требуемой концентрации. Приготовленный раствор белка используют сразу. Для снижения ишемически-реперфузионного поражения в зависимости от тяжести поражения рекомендовано использовать (мас.%) от 0,1 до 0,4% (от 1 до 4 мг/мл) основного действующего вещества ТАТ-Prx2.
Пример 3. Время циркуляции рекомбинантной формы ТАТ-Prx2 в системном кровотоке экспериментальных животных после его внутривенной инъекции
Для определения времени циркуляции рекомбинантного ТАТ-Prx2 в системном кровотоке экспериментальных животных при внутривенном введении в вену вводят ТАТ-Prx2 в количестве 2 мг на животное. Доза 2 мг не является терапевтической, а используется для идентификации экзогенного ТАТ-Prx2 в сыворотке крови с помощью метода иммуноблоттинга. Анализ изменения количества рекомбинантного фермента ТАТ-Prx2 в кровотоке животного проводился в начальный период (10 мин), а также спустя длительное время (60, 120, 240, 360 мин) после внутривенного введения. В качестве детекционной метки выступал His-tag домен расположенный в С-концевой области белка ТАТ-Prx2.
Для идентификации экзогенного TAT-Prx2-His-tag образцы белков сыворотки крови, разделенные в 10% SDS ПААГ на оборудовании Mini Vertical Unit («Amersham», США), переносили на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм Hybond-C («Amersham», США) с помощью прибора для полусухого переноса («Bio-Rad», США). Далее мембрану инкубировали с первичными моноклональными антителами кролика к His-tag домену Prx2 (1:1000, №12698 «Cell Signaling technology», США), а далее с вторичными антителами козы против иммуноглобулинов кролика конъюгированные с пероксидазой хрена (1:1000, №4967, P-GAR Iss, IMTEK, Россия). Детекцию проводили с использованием диаминобензидина, DAB (Amresco, США). Денситометрия была реализована с использованием программного обеспечения ImageJ (www.imagej.nih.gov).
Полученные данные демонстрируют, что в первый час после внутривенного введения ТАТ-Prx2 в крови животного, находиться не менее 75% от исходного количества вводимого белка. С течением времени количество экзогенного фермента ТАТ-Prx2 в сыворотке крови животных снижается и через 4 часа уменьшается примерно в 5 раз. Таким образом, видно, что экзогенный рекомбинантный белок ТАТ-Prx2 присутствуют в крови животного в течении всего ишемического периода (30 мин) в количестве не менее 75%, а при последующей реперфузии по крайней мере в течении первых шести часов реперфузионного периода значительная часть введенного белка ТАТ-Prx2 циркулирует в периферической крови (фиг. 2).
Пример 4. Оценка выживаемости экспериментальных животных после ишемически-реперфузионного поражения почек и предварительного введения рекомбинантной формы ТАТ-Prx2 перед ишемией-реперфузией
Исследование выживаемости экспериментальных животных в течении пяти суток после ишемически-реперфузионного поражения обеих почек и предварительного введения рекомбинантной формы фермента ТАТ-Prx2 за 15 мин до 30-ти минутной ишемии, продемонстрировало его высокую терапевтическую эффективность, где показатели смертности снижены в 2,2 раза по сравнению с животными подвергнутых ишемии-реперфузии без предварительного введения ТАТ-Prx2 (фиг. 3.).
Пример 5. Экскреторная функция почек после ишемически-реперфузионного поражения и предварительного введения рекомбинантной формы ТАТ-Prx2
Исследование экскреторной функции почек по двум маркерам (мочевине и креатинину) в крови животных в течении трех суток реперфузионного периода показало, что при 30-ти мин ишемии наблюдалось увеличение концентрации мочевины в 6,5, а креатинина в 4,5 раза в крови животных спустя сутки реперфузионного периода в сравнении с интактными животными. Предварительная инъекция рекомбинантной формы ТАТ-Prx2 способствовала сохранению экскреторной функции почек, где наблюдалось уменьшение концентрации мочевины и креатинина в 1,2 раза, в сравнении с экспериментальными животными подвергнутых ишемически-реперфузионному повреждению обеих почек без предварительной инъекции ТАТ-Prx2. В течениие последующих трех суток реперфузионного периода у всех выживших экспериментальных животных подвергнутых 30-ти мин ишемии и получавших предварительную инъекцию ТАТ-Prx2 перед ишемически-реперфузионным поражением наблюдалось снижение концентрация мочевины и креатинина в крови до значений чуть выше физиологической нормы. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что предварительное введение ТАТ-Prx2 перед ишемически-реперфузионным поражением способствует значительному сохранению нормальной экскреторной функции почек (фиг. 4 и фиг. 5). Биохимический анализ крови проводили на биохимическом экспресс-анализаторе Reflotron Plus (Roche Diagnostics, Швейцария) в соответствии с инструкцией производителя.
Пример 6. Морфометрический анализ почечной ткани после ишемически-реперфузионного поражения и предварительного введения рекомбинантной формы ТАТ-Prx2
Гистологические исследования коркового слоя почек в течение трех суток реперфузионного периода после 30-ти мин ишемии демонстрировали выраженные морфологические изменения в клубочках нефрона, дистальных и проксимальных канальцах разной степени выраженности. Предварительное внутривенное введение рекомбинантной формы ТАТ-Prx2 перед ишемически-реперфузионным поражением обеих почек снижало степень морфологических изменений почечной ткани на протяжении всего реперфузионного периода (фиг. 6). Суммарные результаты гистологического анализа почечной ткани после ишемии-реперфузии и предварительным введением фермента ТАТ-Prx2 перед ишемически-реперфузионным поражением представлены в (Табл. 1.).
На основании гистологического анализа коркового слоя почки спустя 24 и 72 часа после И-Р можно заключить, что в группе с предварительным введением рекомбинантного ТАТ-Prx2 перед ишемически-реперфузионным поражением (по сравнению с контрольной группой И-Р) снижается степень повреждения почечной ткани у экспериментальных животных.
Пример 7. Уровень развития окислительного стресса в почечной ткани после ишемически-реперфузионного поражения и предварительного введения рекомбинантной формы ТАТ-Prx2
Исследование развития окислительного стресса в почечной ткани по изменению одного из продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА) показало, что применение ТАТ-Prx2 перед ишемически-реперфузионным поражением почек существенно уменьшает степень ПОЛ в ткани примерно в 6 раз в первые сутки реперфузионного периода (фиг. 7). Определение уровня малонового диальдегида (МДА) проводиться по стандартной методике с использованием тиобарбитуровой кислоты (ТБК).
Пример 8. Оценка экспрессии маркерных генов в ткани почек после ишемически-реперфузионного поражения и предварительного введения рекомбинантной формы ТАТ-Prx2
С помощью метода ОТ-ПЦР в реальном времени проведено исследование уровня экспрессии некоторых «стрессовых» генов спустя сутки после ишемически-реперфузионного поражения почек. Были выбраны гены маркеры: повреждения почек (KIM-1, IL-18), воспаления (IL-6, iNOS, eNOS), окислительного стресса (NRF-2), апоптоза (Casp-3; АР-1, NF-kB). Уровень экспрессии генов у интактных животных практически не изменялся. У экспериментальных животных подверженных 30-ти мин ишемии наблюдался значительный рост экспрессии генов в почечной ткани: KIM-1, eNOS, iNOS, АР-1, IL-18, IL-6, NF-kB, NRF-2, casp-3. Предварительное внутривенное введение рекомбинантной формы ТАТ-Prx2 перед И-Р повреждением почек способствовало увеличению экспрессия генов: KIM-1, eNOS, iNOS, IL-6, NF-kB, NRF-2, casp-3, АР-1, а также уменьшению экспрессии генов: IL-18 (Табл. 2).
Таким образом, исследование изменения уровня экспрессии некоторых «стрессовых» генов методом ОТ-ПЦР показало, что предварительное введение рекомбинантной формы пероксиредоксина ТАТ-Prx2 форм за 15-мин до 30-ти минутной ишемии способно нормализовать профиль экспрессии маркерных генов антиоксидантного и иммунного ответа, а также регенеративных процессов и апоптотической гибели клеток, приближая их к нормальным значениям в первые сутки реперфузионного периода.
Пример 9. Оценка уровня активации каспазы-3 в ткани почек после ишемически-реперфузионного поражения и предварительного введения рекомбинантной формы ТАТ-Prx2
Определения уровня активации каспазы-3 в почечной ткани после ишемически-реперфузионного поражения и предварительного введения рекомбинантной формы ТАТ-Prx2 осуществлялось с помощью метода иммуноблоттинга белков почечной ткани.
Для идентификации активации каспазы-3 образцы белков почечной ткани, разделенные в 10% SDS ПААГ на оборудовании Mini Vertical Unit («Amersham», США), переносили на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм Hybond-C («Amersham», США) с помощью прибора для полусухого переноса («Bio-Rad», США). Далее мембрану инкубировали с первичными моноклональными антителами кролика к каспазе-3 (1:1000, №9H19L2 «Thermo Fisher Scientific», США); антителами кролика к β-актину (1:1000, №4967, «Cell Signaling», США), а далее с вторичными антителами козы против иммуноглобулинов кролика конъюгированные с пероксидазой хрена (1:1000, №4967, P-GAR Iss, IMTEK, Россия). Детекцию проводили с использованием диаминобензидина, DAB (Amresco, США). Денситометрия была реализована с использованием программного обеспечения ImageJ (www.imagej.nih.gov). Данные были нормированы на β-актин.
Полученные данные демонстрируют, что в первые сутки в группе после ишемии-реперфузии наблюдается повышенный уровень активации каспазы-3 более чем в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой. Данный факт может свидетельствовать об увеличении аппоптотической гибели клеток в почечной ткани этих экспериментальных групп. Введение ТАТ-Prx2 перед И-Р подавляет активацию каспазы-3 (фиг. 8).
Таким образом, использование предложенного терапевтического средства и способа его применения для коррекции последствий и осложнений ишемических и реперфузионных повреждений почек позволяет предупредить прогрессирование патологических изменений в органе при хирургическом вмешательстве, что оправдывает его использование с лечебной и профилактической целью для противоишемической и противореперфузионной защиты почек.
Промышленная применимость
Заявленный способ коррекции последствий и осложнений от ишемически-реперфузионного синдрома почек позволяет расширить спектр использования средства для снижения поражения органов при реперфузии на моделях in vivo.
Внутривенное введение белка-антиоксиданта рекомбинантного ТАТ-Prx2 в дозе от 5 мг/кг до 20 мг/кг массы тела может найти профилактическое и/или лечебное применение для коррекции последствий и осложнений ишемически-реперфузионного синдрома почек при различных клинических состояниях. Применение средства на основе ТАТ-Prx2 позволяет повысить эффективность и сократить сроки лечения, что объясняется высокой эффективностью ТАТ-Prx2 по сравнению с известными антиоксидантами. ТАТ-Prx2 хорошо растворим в водных растворах, не токсичен и биосовместим с организмом млекопитающих, в том числе и человека.
Предлагаемый способ может быть применим к разным направлениям профилактики и терапии почек при ишемически-реперфузионном синдроме. Способ используют для:
А) терапевтической защиты почек и других органов от гиперпродукции свободных радикалов при кардио-сосудистых вмешательствах, например, при моделировании операций по реваскуляризации миокарда и при оперативных вмешательствах на аорте, с ее пережатием выше чревного ствола.
Б) терапевтической защиты почек от патологических изменений при сосудистых заболеваниях различного происхождения (стенозы, оклюзии, тромбоз почечных артерий и др.).
Источники информации
1. Waikar S.S., Liu K.D., Chertow G.M. Diagnosis, epidemiology and outcomes of acute kidney injury // Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 2008. Vol. 3, №3. P. 844-861.
2. Coca S.G., Yusuf В., Shlipak M.G., Garg A.X., Parikh C.R. Long-term risk of mortality and other adverse outcomes after acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis. // Am J Kidney Dis. 2009; Vol. 53. №6. P. 961-973.
3. Новоселов В.И., Равин B.K., Шарапов М.Г., Софии А.Д., Кукушкин Н.И., Фесенко Е.Е. Модифицированные пероксиредоксины как прототипы лекарственных препаратов мощного антиоксидантного действия. // Биофизика. 2011. Т. 56. №5. С. 873-880.
4. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Моросанова М.А., Янкаускас С.С., Зоров С.Д., Бабенко В.А. Перспективы митохондриальной медицины // Биохимия. 2013. Т. 78. №9. С. 1251-1264.
5. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. Институт физиологии СО РАМН, Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Новосибирская государственная медицинская академия. Москва, 2006.
6. Oishi K., Hagiwara S., Koga S., Kawabe S., Uno Т., Iwasaka H., Noguchi T. The vitamin e derivative, EPC-K1, suppresses inflammation during hepatic ischemia-reperfusion injury and exerts hepatoprotective effects in rats // J. Surg. Res. 2012. Vol. 176. №1. pp. 164-170.
7. Rodrigo Salinas; Ramon et al. Injectable antioxidant formulation for intravenous use of sodium ascorbate in high dosage, n-acetyl cysteine, and deferoxamine; method of administration and use for preventing injury due to reperfusion; and kit, заявка США № US 20170333393 (2017).
8. Babbs; Charles F. et al. Treatment to reduce ischemic tissue injury. Патент США №US 4978688 (1990).
9. Thompson J.S., Chu Y., Glass J., Tapp A.A., Brown S.A. The manganese superoxide dismutase mimetic, M40403, protects adult mice from lethal total body irradiation // Free Radic. Res. 2010. Vol. 44. №5. pp. 529-540.
10. Chatterjee P.K., Patel N.S.A., Kvale E.O., Brown P.A.J., Stewart K.N., Mota-Filipe H., Sharpe M.A., Paola R. Di, Cuzzocrea S., Thiemermann C. EUK-134 reduces renal dysfunction and injury caused by oxidative and nitrosative stress of the kidney II Am. J. Nephrol. 2004. Vol. 24. №2. pp. 165-177.
11. Багов A.H. Исследование органопротекторного действия мексидола в условиях реперфузионного синдрома экспериментально-клиническое исследование: автореф. дис.канд. мед. наук: 14.00.25 - Майкоп, 2005.
12. Яковлев А.Ю. Реамбндерин в практике инфузионной терапии критических состояний. Практические рекомендации. - Санкт-Петербург, 2008. - 32 с.
13. Pvhee S.G. Overview on Peroxiredoxin. // Molecules and cells. 2016. Vol. 39, №1. P. 1-5.
14. Шарапов М.Г., Равин В.К., Новоселов В.И. Пероксиредоксины - многофункциональные ферменты. // Молекулярная биология. 2014. Т. 48. №4. С. 600-628.
15. R. Wang, J. Wei, S. Zhang, X. Wu, J. Guo, M. Liu, K. Du, J. Xu, L. Peng, Z. Lv, W. You, Y. Xiong, Z. Fu, Peroxiredoxin 2 is essential for maintaining cancer stem cell-like phenotype through activation of Hedgehog signaling pathway in colon cancer. // Oncotarget. 2016. Vol. 7. P. 86816-86828.
16. Sharapov M.G., Novoselov VI, Penkov NV, et al. Protective and adaptogenic role of peroxiredoxin 2 (Prx2) in neutralization of oxidative stress induced by ionizing radiation. // Free Radic Biol Med. 2019. Vol. 134. P. 76-86.
17. Goncharov R.G., Rogov K.A., Temnov A.A., Novoselov V.I., Sharapov M.G. Protective role of exogenous recombinant peroxiredoxin-6 under ischemia-reperfusion injury of kidney // Cell Tissue Res, 2019. - Vol. 378., Issue 2., pp. 319-332.
18. Kubo E., Singh D.P., Fatma N., Akagi Y. TAT-mediated peroxiredoxin 5 and 6 protein transduction protects against high-glucose-induced cytotoxicity in retinal pericytes. II Life Sci. 2009; 84(23-24):857-864.
19. Choi Su Young et al. Pharmaceutical composition containing cell-transducing peroxiredoxin 2 fusion protein for brain ischemic damage. Заявка Ю. Кореи № KR 20140030934 (2014).
20. Choi Su Young et al. Composition containing cell-transducing peroxiredoxin 2 fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders. Заявка Ю. Кореи №KR 20150004024 (2015).
21. Wei Q., Dong Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. // American journal of physiology. Renal physiology. 2012. Vol. 303, №11. P. F1487-94.
22. Rahim A., Peters G.H.J., Jalkanen K.J., Westh, P. Effects of mannose, fructose, and fucose on the structure, stability, and hydration of lysozyme in aqueous solution. // Current Physical Chemistry. 2013. Vol. 3. №1. P. 113-125.
--->
Перечень последовательностей
<110>Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
«Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» (ФИЦ ПНЦБИ РАН)
<120>Способ коррекции последствий и осложнений от ишемически-реперфузионного синдрома почек млекопитающего
<210> 1
<211>603
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность Prx2 человека
<400> 1
atggcctccggtaacgcgcgcatcggaaagccagcccctgacttcaaggccacagcggtg60 gttgatggcgccttcaaagaggtgaagctgtcggactacaaagggaagtacgtggtcctc120 tttttctaccctctggacttcacttttgtgtgccccaccgagatcatcgcgttcagcaac180
cgtgcagaggacttccgcaagctgggctgtgaagtgctgggcgtctcggtggactctcag240 ttcacccacctggcttggatcaacaccccccggaaagagggaggcttgggccccctgaac300 atccccctgcttgctgacgtgaccagacgcttgtctgaggattacggcgtgctgaaaaca360 gatgagggcattgcctacaggggcctctttatcatcgatggcaagggtgtccttcgccag420 atcactgttaatgatttgcctgtgggacgctccgtggatgaggctctgcggctggtccag480 gccttccagtacacagacgagcatggggaagtttgtcccgctggctggaagcctggcagt540 gacacgattaagcccaacgtggatgacagcaaggaatatttctccaaacacaattagctc 600
gag              603
<210> 2
<211> 36
<212>PRT
<213>ArtificialSequence
<223>нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая пептид ТАТ (трансактиватора транскрипции ВИЧ).
<400>2
ggccgcaaaa aacgccgcca gcgccgccgc ccgcag      36
<210> 3
<211>18
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<223>нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая 6 остатков гистидина (His-tag).
<400>3
caccaccaccaccaccac           18
<---