Способ непрерывного мониторинга уровня глюкозы в биологической жидкости организма и устройство для его реализации
METHOD FOR CONTINUOUS MONITORING OF GLUCOSE LEVEL IN BIOLOGICAL BODY FLUID AND DEVICE FOR ITS IMPLEMENTATION

Изобретение относится к медицинской технике, в частности к устройствам и способам непрерывного мониторинга уровня глюкозы в крови, использующим низкие частоты.
Актуальность темы определяется широкой распространенностью первичных инсулин-дефицитных состояний. В подавляющем большинстве это сахарный диабет I типа и панкреатогенный диабет как следствие паренхимозамещающих заболеваний и панкреатопривных состояний после хирургического лечения. Результаты исследований показывают эффективность методов непрерывного мониторирования глюкозы для контроля гликемии и профилактики развития фатальных осложнений.
Результаты экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют, что снижение неблагоприятного действия высоких концентраций глюкозы на структуру и функцию органов и тканей организма возможно только при тщательном непрерывном контроле гликемии. Прежде всего, абсолютно необходимым практическим мероприятием представляется разработка новых эффективных методов постоянного автоматического мониторирования уровня глюкозы в крови.
В настоящее время известен метод контроля гликемии системой непрерывного мониторирования глюкозы крови (СНМГ) (CGMC - continuous glucose monitoring system). Это способ оценки гликемии, при котором данные записываются короткими интервалами на протяжении длительного времени. СНМГ состоит из одноразового сенсора, содержащего тест-систему, и монитора или трансмиттера, получающего информацию в режиме реального времени.
В мире накоплен достаточно большой опыт изготовления различных типов биосенсоров, включающих, в том числе, сенсоры как с ферментным, так и с бесферментным окислением глюкозы в биологической жидкости.
В заявке США US 20190142317 «Implantable glucose sensors having a biostable surface» (публ. 16.05.2019 г., МПК A61B 5/145) предложен имплантируемый глюкозный датчик, имеющий биостабильную поверхность, содержащую окислительные ферменты, и способ, позволяющий проводить непрерывный мониторинг глюкозы, используя заявленный датчик. Анализ глюконолактона происходит с помощью оптического метода.
В патенте US 10327686 «Sensor systems, devices, and methods for continuous glucose monitoring» (публ. 25.06.2019 г., МПК A61B 5/145) предлагается импедансный метод исследования биологической жидкости. Применяемый сенсор является ферментным сенсором второго типа. Суть измерения сводится к анализу полного импеданса (реальной и мнимой части) в цепи электродов. Работа идет на частоте 1 кГц. При изменении концентрации глюкозы в растворе происходит изменение двойного приэлектродного слоя (емкости) и, как следствие, изменение реактивной составляющей импеданса. Одновременно меняется за счет проводимости- и действительная часть. Недостатком данного способа является сложность интерпретации полученных результатов: за счет чего происходит изменения емкости. Вклад в формирование этих слоев могут давать и другие вещества.
В патенте US 8676288 «Device and method for determining analyte levels» (публ. 18.03.2014 г., МПК А61В 5/05) приводится разработка достаточно универсального биосенсора, использующего принципы окисления глюкозы как ферментным, так и бесферментным способом. Отличительной особенностью данного устройства является очень большое количество мембран с разной проницаемостью, используемых с целью анализа разных веществ. При применении устройства как сенсора второго поколения в качестве фермента используют глюкозооксидазу, а при анализе веществ тогда используется оптоакустический метод. При работе устройства в качестве сенсора третьего поколения, применяется стандартный амперометрический метод. К недостаткам можно отнести сложность конструкции.
Общим недостатком всех приведенных выше способов и устройств, основанных на измерении с помощью сенсоров второго поколения (ферментных), является неточность измерений, возникающих с течением времени по мере расходования ферментов, и сложность интерпретации полученных результатов.
Достаточно интересным является решение, предложенное в заявке WO 2019160932 «РН modulation device architecture mediating metal oxide catalysis for metabolite sensing» (публ. 22.08.2019 г., МПК A61B 5/145). Сенсор, предлагаемый в этой заявке, предназначен как для измерения уровня кислотности (рН), так и для измерения концентрации глюкозы в биологической жидкости. Для измерения глюкозы используется амперометрический метод с построением вольтамперных характеристик раствора с использованием электродов из золота (платины) и серебра/хлорида серебра, то есть используется датчик 3-го поколения прямого бесферментного окисления. По построенным характеристикам судят о концентрации глюкозы в растворе. Далее полученные данные калибруют по известному раствору. Недостатком предлагаемого решения является то, что датчик достаточно сложен в изготовлении.
Классическое решение трехэлектродной системы биосенсора показано в заявке US 20170276633 «Determining glucose content of a sample» (публ. 28.09.2017 г., МПК G01N 27/327, G01N 33/66). Авторами используется принцип прямого окисления глюкозы с использованием сенсора 3-го поколения. При изготовлении датчика применяется вакуумное нанесение электродов на диэлектрическую подложку для получения пористой структуры с целью увеличения области взаимодействия электродов с исследуемым раствором. Далее применяется стандартный амперометрический метод. К недостаткам предложенного решения можно отнести крайне неудобное наполнение измерительной камеры исследуемой жидкостью.
Отличительной особенностью патента US 10330628 «Glucose-sensing electrode and device with nanoporous layer» (публ. 25.06.2019 г., МПК A61B 5/145, G01N 27/327) является большое количество нанослоев, обеспечивающих корректную работу сенсора. Сам сенсор является классической трех электродной системой 3-го поколения. Измерение концентрации уровня глюкозы происходит путем вычитания из полного тока, протекающего между измерительными электродами, тока, отвечающего за примеси в исследуемом растворе. Полученный разностный ток характеризует уровень глюкозы. Однако, предложенный сенсор очень сложен в изготовлении.
В патенте US 8828200 «Electrochemical sensor for the determination of an analyte concentration» (публ. 09.09.2014 г., МПК A61B 5/145, G01N 27/327) описывается конструкция и применение сенсора третьего поколения. Авторы, применяя известные подходы к измерению глюкозы (амперометрия), создали достаточно универсальную систему с возможностью анализа разных веществ, содержащихся в исследуемой биологической жидкости. К сожалению, биосенсор получился очень сложным в изготовлении.
Наиболее близкими по технической сущности являются способ и устройство, описанные в патенте US 8868151 «Electrochemical impedance spectroscopy enabled continuous glucose monitoring sensor system», МПК A61B 5/14532, публ. 21.10.2014 г. В описанном способе непрерывного мониторинга уровня глюкозы калибруют устройство непрерывного мониторинга уровня глюкозы, размещают его в контакте с биологической жидкостью, затем подают гармонический сигнал (в очень широком диапазоне частот от тысячных долей герца до мегагерца) на электроды. В результате получают двойной слой на них. После этого измеряют ток в цепи и напряжение между электродами. Затем обрабатывают полученные данные с помощью преобразования Фурье и проводят анализ приэлектродных двойных слоев (емкость) и проводимости раствора. Используя эти данные, анализируют состав исследуемой биологической жидкости (получают значения уровня глюкозы в исследуемой биологической жидкости). Устройство непрерывного мониторинга уровня глюкозы, описанное в прототипе, содержит источник гармонических колебаний, соединенный с датчиком, и приемник анализируемого сигнала, при этом датчик включает в себя рабочий электрод и электрод сравнения. Описанный датчик является сенсором второго поколения, то есть для окисления глюкозы используются ферменты. Кроме того, датчик содержит достаточно большое количество мембран с разной проницаемостью для разделения веществ, находящихся в биологической жидкости.
Основным недостатком способа и устройства, выбранных как прототип, является лежащий в их основе процесс ферментного окисления глюкозы. Так как фермент в процессе окисления расходуется, то меняется количество глюконолактона, образующегося в исследуемой области. Это необходимо учитывать, иначе возникнет неоднозначность результата измерения: либо упал уровень сахара, либо изменилось количество фермента. Кроме этого, использование большого набора частот затрудняет анализ полученных результатов. К недостаткам можно отнести и большое количество разнообразных мембран. Фильтрующие свойства мембран приводят к необходимости их постоянной замены. Это обстоятельство не позволяет добиться длительной и устойчивой работы датчиков, сильно усложняет устройство и надежность его при использовании.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа непрерывного мониторинга уровня глюкозы в биологической жидкости организма и устройства для его реализации, обеспечивающих надежное измерение уровня глюкозы за счет проведения прямого электрохимического окисления глюкозы без использования ферментов, используя простой в изготовлении датчик, обеспечивающий более точные измерения.
Технический результат в части способа в предлагаемом изобретении достигается за счет того, что разработанный способ, как и способ - прототип, включает калибровку устройства непрерывного мониторинга уровня глюкозы, размещение его в контакте с биологической жидкостью с образованием двойного слоя на электродах, подачу электрического гармонического сигнала на электроды, измерение тока в цепи и напряжения между ними, обработку полученных данных с помощью преобразования Фурье, анализ полученного спектра и получение значения уровня глюкозы в исследуемой биологической жидкости.
-3
Новым в разработанном способе является то, что калибруют устройство непрерывного мониторинга уровня глюкозы с учетом величин температуры и кислотности исследуемой биологической жидкости, подают электрический гармонический сигнал на заданной частоте в диапазоне 10 - 10 Гц, производят прямое электрохимическое окисление глюкозы на электроде сравнения Ag/AgCl, в полученном спектре анализируют вторую гармонику полученного сигнала и по ее уровню делают вывод о концентрации глюкозы в исследуемой биологической жидкости.
В частном случае реализации разработанного способа по п. 3 формулы после измерения тока в цепи и напряжения между электродами, используют АЦП с разрядностью не ниже 24, выделяют 1,5 периода сигнала, затем производят операцию периодического продолжения для получения 10-20 периодов сигнала, после чего выполняют преобразование Фурье полученного периодического сигнала.
Технический результат в части устройства в предлагаемом изобретении достигается за счет того, что разработанное устройство, так же как и устройство-прототип, содержит источник электрических гармонических колебаний, соединенный с датчиком, который в свою очередь соединен с приемником анализируемого сигнала, при этом датчик содержит рабочий электрод и электрод сравнения.
Новым является то, что датчик дополнительно снабжен измерителями температуры и кислотности биологической жидкости, закрепленными, как и рабочий электрод, и электрод сравнения, на диэлектрической биопассивной подложке, причем электрод сравнения, изготовленный из Ag/AgCl, позволяет осуществлять прямое электрохимическое окисление глюкозы без использования ферментов, кроме того приемник анализируемого сигнала включает в себя АЦП с разрядностью не ниже 24, причем один из входов АЦП соединен с источником электрических гармонических колебаний для получения опорного сигнала.
Авторами предлагается новый способ мониторинга уровня глюкозы в крови человека, который до настоящего времени нигде в мире не применялся, и устройство для его реализации.
Изобретение поясняется следующими фигурами.
На фиг. 1 представлен принцип окисления глюкозы при прямом электрохимическом окислении.
На фиг. 2 приведен макет разработанного датчика.
На фиг. 3 приведена измерительная схема разработанного устройства.
На фиг. 4 приведены результаты измерений токов и напряжений и соответствующие им спектры в разных растворах электролитов.
В настоящее время существует три поколения биосенсоров глюкозы. На фиг. 1 представлен принцип, на котором основан способ детекции глюкозы сенсоров третьего поколения (Ю.В. Тарасов, Ю.И. Филиппов, Е.К. Борисова, Е.А. Федорова, А.Ю. Майоров, М.В. Шестакова. Технологии непрерывного мониторирования глюкозы: успехи и перспективы. // Проблемы эндокринологии. 2015, 61(4):54-72). Такой же принцип окисления глюкозы лежит в основе работы предлагаемого авторами датчика.
На фиг. 2 приведен макет простейшего биосенсора, где показан рабочий электрод 1, изготовленный из золота (Au) и электрод сравнения 2, являющийся хлоридсеребряным электродом (Ag/AgCl). В предлагаемом авторами устройстве расположение электродов в датчике может быть таким же, как на фиг.2 или возможна другая конфигурация электродов. Например, для увеличения площади взаимодействия электродов с электролитом, и, как следствие, повышения чувствительности системы, рабочий электрод 1 и электрод сравнения 2 могут быть выполнены в виде двух гребенчатых электродов, вставленных один в другой.
На фиг. 3 приведена измерительная схема разработанного устройства. Источник электрических гармонических колебаний 3 соединен с датчиком, который размещен в исследуемой биологической жидкости 4. Датчик содержит рабочий электрод 1, электрод сравнения 2 и измерители температуры и кислотности биологической жидкости 4. Для измерения падения напряжения между рабочим электродом 1 и электродом сравнения 2 параллельно датчику подключен первый резистор 5. А для измерения тока, протекающего в цепи, последовательно датчику подключен второй резистор 6. Приемник анализируемого сигнала включает в себя высокоразрядное АЦП 7 (с разрядностью не ниже 24) и блок обработки сигнала 8. Данные о напряжении на датчике поступают на первый вход 9 АЦП 7, данные о величине тока, протекающего в цепи датчика, поступают на второй вход 10 АЦП 7. Для передачи опорного сигнала от источника электрических гармонических колебаний 3 его выход подключен к третьему входу 11 АЦП 7.
Разработанный способ непрерывного мониторинга уровня глюкозы с помощью разработанного устройства по п. 3 формулы реализуют следующим образом.
-3
Вначале устройство непрерывного мониторинга уровня глюкозы калибруют с учетом величин температуры и кислотности, которые могут быть у используемой для исследования жидкости. Затем устройство размещают в контакте с исследуемой биологической жидкостью 4, что приводит к образованию на электродах двойного слоя. От источника электрических гармонических колебаний 3 подают сигнал на рабочий электрод 1 и электрод сравнения 2 на заданной частоте в диапазоне 10 - 10 Гц. При этом на электроде Ag/AgCl, обладающим электрохимической активностью, происходит прямое электрохимическое окисление глюкозы (молекула которой является нейтральной) до глюконовой кислоты с образованием глюконолактона (иона). Таким образом, возникает переменный ток определенной частоты в цепи, в которую входят источник переменного напряжения 3, электрод сравнения 2, рабочий электрод 1 и исследуемая биологическая жидкость 4 (электролит). Данные о величине тока, протекающего в этой цепи, и о напряжении на датчике подают, соответственно, на второй вход 10 и на первый вход 9 АЦП 7. На вход 11 АЦП 7 подают опорный сигнал с генератора 3. Затем все эти данные в цифровом виде отправляют на блок обработки сигнала 8, где они обрабатываются с помощью преобразования Фурье.
Для получения данных о наличии и величине уровня глюкозы в исследуемой биологической жидкости 4 сравнивают спектр опорного сигнала, который получают от источника электрических гармонических колебаний 3, со спектром сигнала, получаемого с датчика во время измерений. Во вновь полученном спектре анализируют появление второй гармоники сигнала и по ее величине делают вывод о концентрации глюкозы в исследуемой биологической жидкости 4.
Появление гармоник выше второго порядка свидетельствует об обнаружении в исследуемой биологической жидкости 4 других веществ, отличных от глюкозы. Причем, характерные частоты, появляющиеся в двойном слое на электроде, и затем обнаруживаемые в спектре, определяются массой молекул анализируемого вещества.
Частоты, необходимые для обнаружения и исследования растворенных в исследуемой жидкости веществ, оцениваются из следующих расчетов. Так, например, концентрацию глюкозы в крови определяют по глюконолактону, содержащемуся в исследуемой биологической жидкости 4.
Время прохождения иона глюконолактона в прикладываемом с помощью электродов электрическом поле вычисляют так:
0
где Тгл - время прохождения глюконолактоном расстояния L,
0
L - расстояние между рабочим электродом 1 и электродом сравнения 2 (зазор),
др
V - дрейфовая скорость иона в прикладываемом электрическом поле.
Дрейфовую скорость получают из выражения, приведенного ниже:
где μ - подвижность иона глюконолактона,
Е - напряженность прикладываемого электрического поля.
На зазор подают сигнал с амплитудой 100 мВ. Подвижность получают из выражения:
где q - заряд иона,
λ - длина свободного пробега иона,
m - масса молекулы воды,
T
V - тепловая скорость молекулы воды.
Длину свободного пробега можно оценить по формуле:
где σ - площадь поперечного сечения молекулы воды,
n - концентрация молекул воды в единице объема.
где m - масса молекулы воды,
k - постоянная Больцмана,
T - температура раствора, н.у. (нормальные условия).
др
-2
-3
При подстановке этих величин в приведенные выше выражения находят дрейфовую скорость (V) иона глюконолактона во внешнем поле Е, прикладывая потенциал к измерительному зазору от источника электрических гармонических колебаний 3. Полученная скорость составляет ~ 1-3⋅10 мм/с. При имеющемся зазоре между электродами ~ 1 мм время прохождения (Тгл) иона глюконолактона составит 10-30 с. Исходя из полученных величин, становится понятно, что подаваемая частота электрического гармонического сигнала должна быть такого же порядка для того, чтобы за полпериода сигнала (электрическое поле не меняет направление) ионы глюконолактона успевали дойти от электрода сравнения 2 (окислительного) до противоположного рабочего электрода 1. Таким образом, эффективная рабочая частота подаваемого электрического гармонического сигнала начинается от ~ 5 мГц (5 10 Гц) и ниже. Однако уход вниз по частоте не желателен в связи с тем, что увеличивается время одного измерения, за которое концентрация глюкозы в исследуемом растворе может измениться.
Результаты измерения, выполненные авторами в соответствии с предлагаемым способом, приведены на фиг. 4. На фиг. 4а, б, в показаны формы сигналов, полученных на датчике, при измерениях в разных исследуемых жидкостях. Наименьшее изменение сигнал претерпевает в дистиллированной воде. Появляющиеся искажения исходного сигнала говорят о появлении нелинейных свойств приэлектродных слоев в исследуемых электролитах. На фиг. 4г, д, е показаны частотные спектры токов и напряжений. На фиг. 4д однозначно видно появление второй гармоники исходного сигнала. Это демонстрирует эффект прямого окисления глюкозы до глюконолактона с последующим преобразованием исходного сигнала на двойном слое. На фиг. 4е демонстрируется появление более высоких частот в спектре измеренного сигнала при погружении датчика в раствор хлорида натрия (NaCl). Это объясняется тем, что ионы хлорида натрия примерно в 3 раза легче, чем ионы глюконолактона. И, как следствие, более легкие ионы будут проходить то же самое расстояние (между электродами) за более короткое время, что соответствует более высокой частоте.
Таким образом, предлагаемое устройство, работающее по заявляемому способу, позволяет судить о наличии глюкозы в растворе. В зависимости от концентрации исследуемого вещества (глюкозы) получаемый сигнал (и соответствующая гармоника) меняется по амплитуде.
Особенностью реализации разработанного способа непрерывного мониторинга уровня глюкозы по п. 2 формулы с помощью разработанного устройства является использование только 1,5 периодов сигнала, которых оказывается достаточно для выделения спектральных составляющих и достоверного анализа уровня глюкозы или других веществ в жидкости. Это сделано с целью уменьшения времени измерения, при этом точно определяют нули сигнала (переход через 0 по времени периодического сигнала), измеренного с помощью 24 разрядного АЦП. Затем этот сигнал запоминается и достраивается (производят операцию периодического продолжения) самоподобно до 10-20 периодов. После этого преобразование Фурье (FFT) выполняют уже от полученного периодически продолженного сигнала. И затем анализируют спектр согласно способу по п. 1 формулы.
Таким образом, разработан новый подход к мониторингу уровня глюкозы в крови человека. В разработанном способе непрерывного мониторинга уровня глюкозы и в устройстве для его реализации используют эффект преобразования частоты исходного сигнала с низким уровнем гармоник на нелинейном двойном слое. В результате подачи переменного напряжения определенной заданной частоты в цепь, в которую входит источник электрических гармонических колебаний, рабочий электрод, электрод сравнения и исследуемый электролит, появляется возможность выделения новых частот, возникающих на границе электролит-электрод (в двойном слое на электродах). Их однозначная связь с уровнем глюкозы в крови человека позволяет предложить новый метод малоинвазивной непрерывной диагностики уровня сахара в биологической жидкости.