Кинетика и механизм термоинактивации рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica

УДК 577.158.54

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ ТЕРМОИНАКТИВАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ Lucióla Mingrelica

И. А. Лундовских, Е. И. Дементьева*, Н. Н. Угарова

Исследованы субъединичные взаимодействия и механизм термоинактивации рекомбинант-ной люциферазы светляков Lucióla mingrelica. Методами ультрацентрифугирования и гель-фильтрации показано присутствие мономеров и димеров в растворе активного фермента и тримеров для инактивированной люциферазы. Кинетическими методами показано, что и ди-мер и мономер каталитически активны, причем активность мономеров в составе димера в два раза выше, чем в свободном состоянии. Предложена кинетическая схема термоинактивации люциферазы, включающая обратимую диссоциацию активных димеров в активные мономеры, инактивацию мономеров, агрегацию неактивных мономеров. Показано, что тер-моинактивированная люцифераза при охлаждении способна самопроизвольно восстанавливать каталитическую активность за счет ассоциации обратимо инактивированных мономеров в активные димеры.

Люцифераза светляков катализирует окисление люци-ферина в присутствии аденозинтрифосфата (АТР) и ионов Mg , сопровождающееся излучением видимого света. На основе люциферин-люциферазной системы получены высокоэффективные реагенты, позволяющие определять ультрамалые (10-14 моль и ниже) количества АТР [1, 2]. Поскольку даже фемтомолярные количества люциферазы легко регистрируются биолюминесцентным методом, ген люциферазы используется в качестве маркерного при изучении процессов транскрипции и трансляции генетического материала, а также при выяснении роли шаперонов в сворачивании белков in vivo [3, 4]. Практическое использование фермента ограничивается его низкой стабильностью в растворе, особенно при повышенной температуре. Выяснение механизма термоинактивации позволит предложить методы стабилизации люциферазы.

Использованная в нашей работе рекомбинантная люцифераза светляков L. mingrelica по аминокислотному составу и физико-химическим свойствам аналогична на-тивной люциферазе, выделяемой из светляков [5]. Вопрос об олигомерной структуре люцифераз светляков и о том, какая частица обладает каталитической активностью, до сих пор остается открытым. Еще в 1982 г. в работах нашей лаборатории по изучению термонактивации натив-ной люциферазы светляков L. mingrelica было показано, что инактивация фермента включает в себя диссоциацию димерной формы фермента на менее стабильные мономеры [6]. В ранних работах по исследованию люцифера-

зы светляков Р. рутаНя было обнаружено существование мономеров и димеров люциферазы с молекулярной массой 50-52 и 92-95 кДа соответственно [7, 8], распад димеров на мономеры наблюдали в присутствии гуанидинхло-рида и додецилсульфата натрия. Методами гель-фильтрации и равновесного центрифугирования показано, что люциферазы светляков Р. рутаИя и Р. рennsylvanica представляют собой мономеры, способные ассоциировать в димеры, тогда как активная люцифераза жуков-щелкунов Р. plagiophthalamus находится преимущественно в димер-ной форме [9]. Все люциферазы способны образовывать и агрегаты более высоких порядков. Гель-фильтрация люциферазы Р. рутаИя в присутствии 0,2 % Твин-20 показала наличие мономера; для инактивированной люциферазы наблюдали также тримеры [10, 11]. На результаты экспериментов по определению молекулярной массы методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования могут значительно влиять условия эксперимента и предварительного хранения фермента. Замораживание-размораживание препаратов люциферазы, присутствие поверхностно-активных веществ могут приводить к инактивации фермента и/или диссоциации олигомерных частиц на субъединицы. Авторы не всегда приводят данные по изменению активности люциферазы в ходе экспериментов, что затрудняет сравнение данных, полученных при разных условиях.

В литературе отмечалось, что термоденатурированная люцифераза светляков Р. рутаШ не способна к самопроизвольной реактивации, но восстановление каталитичес-

*Адресат для переписки.

кои активности возможно в присутствии шаперонов DnaK, DnaJ и GrpE [3]. Рекомбинантная люцифераза светляков L. mingrelica внутри клеток E. coli приобретает каталитически активную конформацию при участии шапе-рона DnaK и АТР [12]. Целью настоящей работы является исследование субъединичных взаимодействий в люцифе-разе светляков L. mingrelica, их роли в процессе термоинактивации, а также выяснение возможности самопроизвольной реактивации фермента.

Экспериментальная часть

Использовали рекомбинантную люциферазу светляков L. mingrelica, которую выделяли из клеток E. coli, штамм LE 392, несущих плазмиду pLR с геном люциферазы [5], и очищали до гомогенного состояния [13]. Носитель для хроматографии Superdex-200 и набор для определения молекулярной массы белков методом гель-фильтрации были фирмы «Amersham Pharmacia Biotech», АТР («Reanal», Венгрия), кислоты и соли марки «ос.ч.». Растворы готовили на деионизованной воде.

Активность люциферазы измеряли по величине максимальной интенсивности биолюминесценции при насыщающих концентрациях субстратов (1,3 мМ АТР и 0,3 мМ LH2) на люминометре 1250 («LKB-Wallac») и выражали в условных единицах: 1 усл. ед. = 10 квант/с.

Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации. Гомогенные препараты люциферазы (0,5 мл) пропускали через колонку (1,6x70 см) с Superdex-200, уравновешенную 0,1 М Трис-ацетатным буфером (2 мМ ЭДТА, 60 мМ MgSO4, рН 7,8). За элюцией фермента следили по поглощению раствора при 280 нм и по активности люциферазы. Молекулярную массу люциферазы определяли по калибровочному графику зависимости logMr от Kav, построенному для данной колонки с помощью набора белков с известной молекулярной массой.

Седиментацию раствора люциферазы (0,2 мг/мл) проводили в аналитической ультрацентрифуге Spinco, модель Е («Beckman»), снабженной абсорбционной сканирующей системой (49 000 об/мин, 10°). Коэффициенты седиментации рассчитывали с поправкой на вязкость и плотность растворов.

Термоинактивация рекомбинантной люциферазы. Растворы люциферазы (0,01-100 мкг/мл) в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (2 мМ ЭДТА, 60 мМ MgSO4, 1 мМ дитиотреитол, рН 7,8) инкубировали при 8-42°. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты (0,9 мл) и измеряли интенсивность биолюминесценции при добавлении 90 мкл раствора субстратов (12 мМ АТР, 3 мМ LH2).

Результаты и их обсуждение

Молекулярные формы люциферазы светляков L. mingrelica. Для выяснения возможности существования различных молекулярных форм рекомбинантной люцифе-

разы светляков Ь. mingrelica использовали седиментаци-онный анализ и гель-фильтрацию. Для препарата люциферазы с высокой удельной активностью методом седиментации были обнаружены мономеры (60 кДа) и незначительное количество димеров (112 кДа). Если люциферазу предварительно инкубировать в течение 2 мин при 42°, то можно обнаружить только мономеры; а после инкубации при 42° в течение 10 мин - мономеры и агрегаты большего порядка. Однако определение активности люциферазы показало, что в ходе ультрацентрифугирования происходит значительная инактивация фермента. Аналитическая гель-фильтрация активной люциферазы показала присутствие двух зон, обладающих каталитической активностью, соответствующих белкам с молекулярной массой 60±4 и 124±7 кДа. Однако и в этом случае наблюдается сильное разбавление образца и частичная инактивация люциферазы, поэтому невозможно точно определить удельную активность мономерных и димерных частиц. Таким образом, методы ультрацентрифугирования и гель-фильтрации качественно показывают наличие в водном растворе фермента активных мономеров и димеров, а в случае термоинактивированной люциферазы и более высокомолекулярных агрегатов. Для исследования процессов ассоциации-диссоциации и механизма термоинактивации рекомбинантной люциферазы были использованы кинетические методы.

Удельная активность мономера и димера люциферазы. Для субъединичных ферментов, олигомерные формы которых обладают различной активностью, характерно изменение активности с течением времени при разбавлении раствора [14]. Были получены зависимости активности люциферазы от времени для растворов с начальной концентрацией фермента от 5,3-10-6 до 5,3 1012 М при 8 и 22о в условиях, когда не наблюдается термоинактивации

lg «у,

13,7

13,6

13,5-

13,4-

13,3

-12

-10

lg И„

Рис. 1. Зависимость равновесной удельной активности (а

усл.

ед./моль) рекомбинантной люциферазы светляков L. mingrelica от концентрации фермента ( [£]0, М) при 8°. Условия: 0,1 М Трис-ацетатный буфер, 2 мМ ЭДТА, 60 мМ MgSO4, 6,5 мМ ДТТ, рН 7,8

10 ВМУ Химия, № 6

Т а б л и ц а 1

Кинетические параметры системы димер - мономер рекомбинантной люциферазы светляков Ь. шщгеИеа при 8-22°

Т, °С Кдис, М Уд. активность димера, усл. ед./моль Уд. активность мономера, усл. ед./моль £д„с, мин 1 ¿ас, М 1 мин 1 £ин мономера, мин 1

8 3,810-9 (4,4 ± 0,2)1013 (2,1 ± 0,1)1013 (1,1 ± 0,1)10-2 2,9106 (1,4 ± 0,3)10-4

22 3,010-8 (5,3 ± 0,2)1013 (2,4 ± 0,1)1013 0,1±0,01 3,4106 (6,5 ± 0,5)10 3

люциферазы. При концентрации фермента 5,3• 10- М и менее удельная активность люциферазы уменьшалась в течение 60 мин, достигая равновесного значения, и затем оставалась постоянной в течение нескольких часов. Зависимость равновесных значений удельной активности лю-циферазы (ауд р) от ее концентрации (рис. 1) показывает существование двух форм люциферазы, причем обе обладают каталитической активностью. Экстраполяцией значений ауд к бесконечно большим концентрациям фермента определена удельная активность димера а2уд. Удельная активность мономера (а1 ) и константа диссоциации (Кдис= 1/Кас) были определены по уравнению [14]:

2 К,

а уд - а 1 ,уд

( а

1 ,уд а 2 ,уд

)

Т, °С Кдис, М £дис, мин-1 ¿ас, М 1мин 1 ¿"ни, мин-1

30 1,6310-7 0,22 ± 0,01 1,35106 0,020 ± 0,003

37 3,310-7 0,40 ± 0,05 1,21106 0,028 ± 0,005

42 7,510-7 0,7 ± 0,1 0,93106 0,061 ± 0,005

циях фермента kни эф характеризует kни мономера. Инактивация димера при данных условиях не наблюдалась, поэтому процесс инактивации люциферазы при 8°С может быть описан схемой 1 .

С х е м а 1

Е„

2Е

21

Рассчитанные значения кинетических параметров приведены в табл. 1. Таким образом, при 8° и димер, и мономер люциферазы обладают каталитической активностью, и мономер в составе димера в два раза более активен, чем в свободном состоянии.

Кинетика инактивации люциферазы при 8-22°. При длительном инкубировании (около 20 ч) разбавленных растворов люциферазы (1010 М и ниже) при 8° наблюдается инактивация фермента. Кривые инактивации спрямлялись в координатах первого порядка, откуда были рассчитаны эффективные константы инактивации (kни эф). Значения kни эф зависят от начальной концентрации фермента, увеличиваясь с ростом доли мономера в растворе. При концентрациях фермента ниже 1010 М доля мономера составляет более 90%, поэтому при малых концентра-

Т а б л и ц а 2

Кинетические параметры инактивации рекомбинантной люциферазы Ь. шщгеИеа при 30—42°С

E2 - активный димер, E - активный мономер, I - неактивный мономер

Зависимости активности люциферазы от времени при различных концентрациях белка, полученные при 22°, аналогичны зависимостям, полученным при 8°, только инактивация фермента протекает быстрее. Сравнение кинетических параметров, рассчитанных для этих двух значений температур (табл. 1), показывает, что удельная активность димера и мономера люцифе-разы при 22° немного выше, чем при 8°, что понятно, так как 22° - температура, близкая к оптимальной для люциферазы. При переходе от 8 к 22° Kдис возрастает

Рис. 2. Кинетика термоинактивации рекомбинантной люциферазы Ь. mingrelica при 30°. Концентрация фермента: 1 - 3,410-7 М, 2 - 0,910-7 М, 5 - 0,310-7 М, 4 - 0,110-7 М. Условия см. в подписи к рис. 1

к

ин

почти на порядок, в основном за счет увеличения кдис димеров. Стабильность мономера люциферазы при 22° в 50 раз ниже, чем при 8°. Таким образом, процесс инактивации люциферазы в интервале температур 8-22° хорошо описывается схемой 1 .

Кинетика инактивации люциферазы при повышенных температурах. На кинетических кривых инактивации в полулогарифмических координатах, полученных при 3042°, имеется излом, свидетельствующий о том, что инактивация люциферазы включает быструю и медленную стадии (рис. 2 для 30°, аналогичные кривые получены для 37-42°). Положение излома зависит от концентрации фермента, наклон начальных участков кинетических кривых при концентрациях фермента 0,1-10-7- 3,4-10-7 М совпадает, однако наклон вторых участков тем больше, чем ниже концентрация люциферазы. Такой вид кинетических кривых типичен для инактивации ферментов по диссоциативному механизму [15, 16] (схема 2).

С х е м а 2

к ин, эф

Е2

21

21'

2 ( а

)

Е2 - активный димер, I - неактивный мономер, способный к обратимой ренатурации, Г - необратимо инактивированный мономер, Кдис- константа равновесия между активными димерами и неактивными мономерами

Обратимая диссоциация более стабильного димера на мономеры, которые далее инактивируют необратимо, определяет наличие излома, который проявляется только в температурном интервале, когда кт>>к'ин, и при концентрации фермента, приблизительно равной численному значению константы диссоциации. Как показано выше, стабильность мономера быстро уменьшается с повышением температуры. При повышенных температурах мономер, по-видимому, настолько быстро теряет свою активность, что ею можно пренебречь, и кривые инактивации хорошо описываются схемой, где активный димер диссоциирует на неактивные мономеры.

Константы индивидуальных стадий процесса, описываемого схемой 2, определяли по уравнениям [15, 16]:

где Е0 - начальная концентрация фермента, а0 и а -удельная активность фермента в начальный и текущий момент времени, ат - удельная активность фермента в момент излома т на кинетических кривых инактивации в полулогарифмических координатах (пересечение двух экспонент).

Кинетические параметры инактивации люциферазы Ь. mingrelica при 30-42° приведены в табл. 2. С повышением температуры растут константы диссоциации димера (к ) и инактивации мономера (к/ин), константа диссоциации (Кдис) и незначительно уменьшается кас.

Реактивация люциферазы Ь. mingrelica. Если первая стадия процесса термоинактивации (схема 2) обратима, то при снятиии денатурирующего воздействия должна наблюдаться реактивация люциферазы. Действительно, инак-тивированная люцифераза самопроизвольно восстанавливает каталитическую активность после быстрого охлаждения во льду. При этом если остаточная активность люци-феразы соответствует начальному участку кинетической кривой инактивации (рис. 2), то активность восстанавливается практически полностью. При более глубоких степенях инактивации наблюдается лишь частичная реактивация.

Кинетические кривые реактивации при разных начальных концентрациях фермента спрямляются в координатах {1/С; время} с наклоном, равным 2кас, что соответствует реакции второго порядка (рис. 3), а именно ассоциации неактивных мономеров с образованием активных диме-ров. Экспериментально определенное значение кас равно (3,1 ± 0,2)-106 М-1 мин-1, что близко к константе ассоциации (кас) активных мономеров фермента при низких температурах (табл. 1).

Механизм инактивации рекомбинантной люциферазы светляков Ь. mingrelica. Общая схема термоинактивации люциферазы светляков может быть представлена следующим образом:

С х е м а 3

к дис = 4 [ Е ]

а 0 - а т

Е2 <--> 2Е <--> 21 —> 21' —> Б

к

ин

а

0

т

к

дис

ас

к

к

к

дис

ин

агр

2

0

к

а 0 а

т

ас

а 1 а

а 0 -2 а 0

3 , =__к

2 дис '

мо инактивированный и необратимо инактивированный мономеры люциферазы соответственно; О — агрегаты необратимо инактивированного фермента

2

Е2 - активный димер, Е, I и I - активный, обрати

2

11 ВМУ химия, № 6

1/С, М"1

4-10'-

2-10'-

0 1 2 3~

Время, мин

Рис. 3. Реактивация термоинактивированной люциферазы.

Условия см. в подписи к рис. 1

При различных температурах экспериментально проявляются различные стадии процесса инактивации. При температурах ниже 22о процесс инактивации фермента описывается первыми двумя стадиями схемы 3, тогда как при повышенных температурах соотношение скоростей отдельных стадий таково, что первые две обратимые стадии кинетически проявляются как диссоциация активного димера на неактивные мономеры. Необратимая стадия инактивации связана с разворачиванием инактивированных молекул фермента и их последующей агрегацией сначала в триме-ры, а затем и агрегаты более высоких порядков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д. // Биохимия. 1993.

58. C. 1351.

2. Gould S.J., Subramani S. // Anal. Biochem. 1988. 175 P. 5.

3. Schruder H., Langer T., Hartl F.-U., Bukau B. // EMBO J. 1993.

12. P. 4137.

4. Frydman J., Hartl F.-U. // Science. 1996. 272. P. 1497.

5. Lundovskikh I.A., Leontieva O.V., Dementieva E.I., Ugarova N.N.

// Bioluminescence and chemiluminescence. Perspectives for the 21 century. Eds. A. Roda, M. Pazzagli, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Chicheste, 1998. P. 420.

6. Бровко Л. Ю., Беляева Е. И., Угарова Н. Н. // Биохимия. 1982.

47. C. 760.

7. Travis J., McElroy W.D. // Biochemistry. 1966. 5. P. 2170.

8. Denburg J.L., McElroy W.D. // Biochemistry. 1970. 9. P. 4619.

9. Hannah R.R., McCaslin D.R., Wood K. V. // In: Bioluminescence and

chemiluminescence. Perspectives for the 21 century. Eds. A. Roda, M. Pazzagli, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Chichester, 1998. P. 361.

10. Herbst R., Schfer U, Seckler R. // J. Biol. Chem. 1997. 272. P. 7099.

11. Herbst R., Gast K., Seckler R. // Biochemistry. 1998. 37. P. 6586.

12. Леонтьева О.В., Угарова Н.Н. // Биохимия. 1996. 61. C. 725.

13. Дементьева Е. И., Кутузова Г. Д., Железнова Е. Е., Лундовс-ких И. А., Угарова Н. Н. // Биохимия. 1996. 61. C. 156.

14. Курганов Б.И. // Аллостерические ферменты. М.: Наука, 1978.

15. Полторак О.М., Чухрай Е.С. // ЖФХ. 1995. 69. C. 330.

16. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Торшин И.Ю. // Биохимия. 1998. 63. C. 360.

Поступила в редакцию 20.06.00