Способ получения константной линии сахарной свеклы, устойчивой к глифосату
METHOD FOR OBTAINING A CONSTANT LINE OF SUGAR BEET RESISTANT TO GLYPHOSATE

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к способу получения константной линии сахарной свеклы, устойчивой к глифосату, путем создания толерантных к глифосату форм сахарной свеклы в качестве доноров устойчивости на базе отечественных раздельноплодных линий.
В настоящее время в разных странах мира возделываются биотехнологические гибриды сахарной свеклы, в процессе создания которых использовались биотехнологические приемы классической селекции.
Известны устойчивые к глифосату растения и способы, связанные с ними (патент №2627169, авторы Чиккилло Роберт М., Йеркс Карла, Робинсон Эндрю Э.). Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты для обеспечения в растении устойчивости к глифосату, а также к экспрессирующему вектору, клетке-хозяину, растения, части растения, семени растения, культуре ткани растения, ее содержащего, также раскрыты способ получения трансгенного растения, части растения, органа растения, семени растения или клетки растения, которая устойчива к глифосату, и способ обеспечения устойчивости к глифосату в растении и использование вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение также относится к способу борьбы с сорняками на возделываемой посевной площади, содержащей устойчивые к гербицидам растения или устойчивые к гербицидам семена растения, предусматривающему внесение на возделываемую посевную площадь достаточного количества глифосата для борьбы с сорняками на возделываемой посевной площади без существенного влияния на указанные семя или растение.
Данный метод трудоемок, включает в себя ряд сложных манипуляций, требующих дорогостоящего оборудования и специально оснащенных лабораторий, что является существенными недостатками.
Известен способ получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы (патент №2278162, авторы Гапоненко А.К., Скрябин К.Г., Мишуткина Я.В.) с использованием Agrobacterium tumefaciens, включающую Agrobacterium-опосредованную трансформацию культивированных in vitro меристематических клеток семядольных узлов сахарной свеклы, не вступивших в стадию каллусообразования или регенерации побегов.
Данный способ представляет собой дорогостоящую «операцию», удачное завершение которой ставиться под сомнение своей сложностью и многоступенчатостью, что, в свою очередь, является существенным недостатком.
В нашей стране задания по генной инженерии впервые были отражены в 2012 г. в Комплексной программе развития биотехнологий в период до 2020 г. «БИО-2020», которая была ориентирована на стабильное развитие сельскохозяйственного производства, решение проблемы продовольственной безопасности, получение высококачественных, экологически чистых продуктов питания. В области растениеводства наиболее приоритетным направлением признавалось создание новых гибридов сахарной свеклы, в том числе с использованием генной инженерии. В том же году на Первомайской селекционно-опытной станции сахарной свеклы, в связи с отсутствием специальной лаборатории генной инженерии, началось поисковое изучение селекционных материалов с целью получения таких гибридов методами классической селекции, главными из которых потея скрещивание гетерозиготных форм с признаками толерантности к глифосату с линиями сахарной свеклы кубанской селекции.
Исследования продолжаются по дарственному заданию «Создать принципиально новые формы сахарной свеклы, устойчивые к гербицидам, на основе изучения гетерозиготных материалов сахарной свеклы» задание №0693-2014-0002). Основой этого проекта является улучшение генотипа и создание константных линий - доноров устойчивости к глифосату, с последующим использованием их в качестве компонентов МС-гибридов, обладающих новыми хозяйственно ценными признаками и производство гибридных семян.
Производству стали нужны новые формы свеклы, позволяющие сократить объемы применяемых гербицидов и затраты на защиту свеклы, и, таким образом, свести к минимуму вред гербицидов для окружающей среды и здоровья человека.
Как известно, самый большой урон продуктивности большинству полевых культур, в том числе и сахарной свекле, наносят сорняки. Они, в конкурентной борьбе за почвенное питание, влагу и свет нередко снижают урожайность и сбор сахара свеклы до 25 и более процентов. Нередко сорняки не только приводят к значительным потерям величины и качества урожая, но и создают проблемы в процессе выращивания и уборки корнеплодов, уборки семенных растений и доведения до посевных кондиций вороха семян сахарной свеклы, поэтому особое значение ныне придается созданию форм, обладающих толерантностью к конкретному гербициду. За последние два десятилетия важным достижением ученых в области генетики и селекции сахарной свеклы стало создание высокорентабельных гибридов, обладающих толерантностью к глифосату - гербициду сплошного действия, наименее вредоносному для теплокровных и наиболее эффективно контролирующему засоренность посевов.
Техническим результатом предлагаемого способа является улучшение генотипа и создание константных линий сахарной свеклы - доноров устойчивости к глифосату, обладающих новыми хозяйственно ценными признаками, а также производство гибридных семян.
Технический результат достигается тем, что способ получения константной линии сахарной свеклы, устойчивой к глифосату, включает использование предлагаемых частично устойчивых гетерозиготных материалов сахарной свеклы неизвестного происхождения, принудительные самоопыления, анализирующие скрещивания, размножение по типу сибсов, применение парных и групповых изоляторов, обработку растений подопытных форм первого года вегетации в фазе первой-второй пары настоящих листьев глифосатом, отличается тем, что обработку глифосатом осуществляли в дозе 2,0 л/га.
Новизна заявленного способа обусловлена тем, что предлагается осуществлять обработку растений подопытных форм первого года вегетации в фазе первой-второй пары настоящих листьев глифосатом в дозе 2,0 л/га, для улучшения генотипа и создания константных линий сахарной свеклы - доноров устойчивости к глифосату, обладающих новыми хозяйственно ценными признаками.
По данным патентной литературы не обнаружено аналогичное техническое решение, что позволяет судить об изобретательском уровне предлагаемого способа.
Способ осуществляется следующим образом.
Результаты исследований включают данные учетов и наблюдений отдельных выборочно взятых опытов.
Опрыскивание растений 1-го и 2-го года вегетации в полевых условиях проводили дозированно ранцевым опрыскивателем. Контрольным вариантом во всех опытах служил стандарт - гибрид Кубанский МС 95.
В таблице 1 представлены результаты тестирования наиболее ценных толерантных к глифосату форм сахарной свеклы в течение 2012-2015 гг.
Изучаемые формы в различной степени были толерантные к воздействию глифосата (от 48 до 100%) и нуждаются в подтверждении своей устойчивости в последующих поколениях, так как определить среди них генотип MMRR и MMRr пока не представляется возможным.
В 2016 году продолжалось самоопыление или скрещивание их с обычными и частично толерантными МС-линиями с каталожными номерами 380 и 384 на пространственно изолированных участках («клумбах»), а отдельные размножали при свободном переопылении в пределах участка («в чистоте»).
Так, на участке («клумбе») №2 размножали в большом объеме толерантную к глифосату в дозе 2,0 л/га mm ТМС-линию под номером 384 (таблица 2). Гибридизацию с толерантными к глифосату опылителями на пространственно изолированных участках проводили и с обычными (не устойчивыми к глифосату) стерильными формами МС 12171, МС 12173, МС 27038 и МС СЭС-1. Всего было получено 27 пробных (экспериментальных) МС гибридов с разной степенью устойчивости. Наиболее устойчивые из них (тестирование в лабораторных условиях) показаны в таблице 3.
1
На отдельных участках в условиях строгой изоляции продолжались исследования по созданию толерантных стерильных линий. Результаты - тестирования их на устойчивость к глифосату в дозе 2,0 л/га представлены в таблице 4. Линии с каталожными номерами 498, 516, 528, 531 и 533 как самые устойчивые включены в программу дальнейших исследований.
В мелкоделяночных опытах 2016 года применяли однократное опрыскивание раундапом в мае. Учет устойчивости проведен 23 мая. На делянках, где не применяли глифосат, пришлось трижды в период вегетации использовать ручную прополку, против «нулевой» ручной прополки на делянках с растениями, толерантными к глифосату. Контролем служил стандартный гибрид Кубанский МС 95, не устойчивый к глифосату.
Растения стандарта и сорные растения, в зависимости от видового состава, погибали на 7-10-й день после опрыскивания глифосатом. Наиболее устойчивым оказался горец вьюнковый: погибал на 17-19-й день.
Продуктивность первых ТМС-гибридов сахарной свеклы показана в таблице 5. Достоверных различий по урожайности, сахаристости и технологическим качествам в мелкоделяночных опытах по сравнению с контролем не получено. Наибольшую устойчивость показали гибриды с каталожными номерами 469 и 471.
На основании выполненных исследований можно сделать следующие предварительные выводы:
1
1. В наших опытах при скрещивании большинства форм неизвестного происхождения и местных селекционных материалов в потомствах F, как и следовало ожидать, наблюдалась гетерозиготность Т-форм сахарной свеклы, используемых в качестве реципиентов для доноров толерантности.
2. При инцухтировании вновь созданных Т-форм в отдельных случаях наблюдалась полная толерантность потомства. Это можно объяснить доминантностью одного из родителей по признаку RR. Достоверность этих предположений будет проверяться в повторных опытах по инцухтированию и скрещиванию с рецессивными по толерантности МС-формами.
3. Проявление признака частичной устойчивости к глифосату в дозе 2,0 л/га наблюдалось не только при скрещивании МС-растений с ТОп., но и в отдельных случаях при скрещивании в изоляторах ТОп с О-типами и с ММ-опылителями без кастрации растений, что свидетельствует о наличии перекрестной совместимости таких экземпляров растений. Получены первые в разной степени толерантные к глифосату стерильные и фертильные формы.
4. На первом этапе селекции, когда еще не созданы линии О-типа, роль отцовского компонента гибрида могут выполнить многосемянные RR-линии (ТОп), способные к перекрестной совместимости с МС-линиями, а на перспективу - и с МС сингл-кроссами. Такие линии должны проверяться по признакам толерантности, синхронности цветения, самофертильности и перекрестной совместимости, а родительские компоненты гибридов анализироваться по комбинационной способности (урожайность, сахаристость и другие показатели).
5. На пространственно изолированных участках («клумбах») и групповых изоляторах получены семена первых 27 пробных МС-гибридов с разной степенью толерантности к глифосату, в количестве достаточном для сравнительного испытания и предварительной оценки по комбинационной способности. Опылителем для них служили многосемянные Т-формы, а в качестве материнского компонента использовали МС-тестер и ТМС-формы происхождения и местных седекционных материалов в потомствах F1, как и следовало ожидать, наблюдалась гетерозиготность Т-форм сахарной свеклы, используемых в качестве. В последующие годы большое внимание будет уделяться созданию и поддержанию односемянных закрепителей стерильности (ЗС) с генотипом RR Nxxzz mm, поддерживающих полную стерильность односемянного материнского МС-компонента, толерантного к глифосату (RR Sxxzz mm).
6. На данном этапе исследований крайне важно сосредоточить усилия генетиков и биотехнологов на разработке методов ускорения и достоверного определения (диагностики) результатов генетических изменений у реципиентов и доноров устойчивости к глифосату. Можно надеяться, что когда-либо в научных учреждениях появятся лаборатории генной инженерии и это значительно ускорит создание более ценного исходного материала.