Особенности индивидуального и совместного действия комплексона ОЭДФ и КВЧ- излучения на рост хлебопекарных дрожжей Saccharamyces cerevisiae

A. Ю. Крыницкая, М. Н Астраханцева, П. П. Суханов,

B. С. Гамаюрова

ОСОБЕННОСТИ ИНДИВИДУАЛЬНОГО И СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСОНА ОЭДФ И КВЧ- ИЗЛУЧЕНИЯ НА РОСТ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ 8АССНАКАМУСЕ8

СЕКЕУШАЕ

В статье рассматривается влияние физических и химических факторов (ЭМИ КВЧ и комплексона ОЭДФ), а так же их совместное действие на рост и основных технологические показатели хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Выдвигаются предположения о возможных механизмах действия этих факторов на микробную культуру. Проводился структурно-динамический анализ образцов дрожжей методом ядерного магнитного резонанса.

Введение

Повышение эффективности производства хлебопекарных дрожжей и улучшение их качества является одной из важнейших экономических и технологических задач, существующих в пищевой промышленности. Основное внимание исследователей, занимающихся решением этой проблемы, направлено на использование методов гибридизации и селекции с целью получения новых рас дрожжей, обладающих повышенной активностью. Наряду с этим, имеют право на существование иные научно-методологические подходы, как к созданию, так и к способам интенсификации уже имеющихся технологически ценных форм микроорганизмов, основанные на применении к ним внешних стимулирующих и ингибирующих воздействий. Согласно литературным данным одним из наиболее мощных

воздействий является изменение состава среды [1,2]. Варьирование соотношения органического и неорганического субстратов, изменение минерального состава питательной среды, введение дополнительных биологически-активных веществ - все это существенно влияет на регуляцию микробного метаболизма. При этом одним из эффективных инструментов изменения ионного состава питательной среды являются комплексообразующие агенты. Особая ценность этих соединений заключается в их субстратной селективности, которая в значительной степени зависит от pH среды. Например, известно, что комплексон оксиэтилендифосфоновая кислота (ОЭДФК) в слабокислых средах связывает ионы двухвалентных металлов, в особенности ионы кальция [3]. Последние имеют высокую биологическую активность и являются регуляторами микробного метаболизма [4].

Другим регулятором метаболизма клеток является излучение миллиметрового (мм) диапазона нетепловой интенсивности [5,6]. В литературе имеются данные о влиянии электромагнитного излучения мм-диапазона (КВЧ) на поведение водорослей [7] и простейших животных [8]. Брюхова с соавторами также показала возможность использования КВЧ - излучения для повышения активности пивоваренных дрожжей [9,10].

В связи с этим целью настоящей работы стало исследование индивидуального и кумулятивного действия комплексона ОЭДФК и КВЧ - излучения на рост и физиологи-

Результаты и их обсуждение

Целью работы явилось исследование влияния комплсксона ОЭДФ в диапазоне концентраций 0,001 +2,0 г/л на рост дрожжей ЗассЬагошусез сегеу1$1ае раса 509, а также определение влияния ЭМИ миллиметрового диапазона на тот же штамм. В ходе эксперимента предполагалось определить оптимальные для роста дрожжей концентрации комплексона, оптимальную частоту излучения и исследовать их совместное действие.

Первым этапом эксперимента было определение влияния различных концентраций комплексона на рост культуры и на основные технологические показатели. Результаты представлены на рисунке 1.

2 140

4

о

Э* 120

«

Ц ш

о4

80 60 40 20 0

0,001 0ДЭ1 0,1 & . 2 южтраль

Концентрация ГОЭДФ, г/л

Рис. 1 - Уровень биомассы 8ассЬагошусе8 сегеу181ае 509 в зависимости от концентрации комплексона

При действии ОЭДФ (рис. 1) наблюдается три уровня относительного прироста биомассы - при концентрации хелатирующего агента 0,01 г/л; 1,0 г/л; 2,0 г/л. По сравнению с контролем прирост биомассы составил 118%; 111%; 103% соответственно. Следует отметигь, что наибольший стимулирующий эффект проявляется при действии комплексона в наименьшей из стимулирующих концентраций. Концентрации 0,001 г/л и 0,1 г/л ингибируют рост дрожжей. Наибольшим ингибирующим действием в исследуемом диапазоне обладает концентрация ОЭДФ 0,001 г/л.

При исследовании технологических показателей дрожжей выявлено, что присутствие комплексона в концентрации 0,01 г/л не влечет за собой ухудшения как органолептических, так и физико-химических показателей. Подъемная сила дрожжей в этом варианте не ниже, чем у контрольного образца.

Вторым этапом работы являлось изучение влияния электромагнитного излучения на культуру дрожжей. Диапазон исследуемых частот составлял от 53,77 до 54,57ГГц с шагом 0,2 ГГц. На рисунке 2 представлена диаграмма зависимости концентрации биомассы от частоты излучений.

53,77 53,97 54,17 54,37 54,57 контроль

Частота облучения, ГГц

Рис. 2 - Уровень биомассы в зависимости от частоты облучения

Наибольший прирост биомассы (рис. 2) наблюдается при частоте облучения 54,17 ГГц. Эту частоту можно назвать оптимальной. При уменьшении и увеличении частоты облучения относительно оптимальной уровень прироста биомассы значительно снижается по сравнению с контролем. При этом наименьший уровень прироста биомассы получен при действии ЭМИ с частотой 54,37ГГц и составил 76% по отношению к контролю.

При анализе технологических показателей дрожжей, облученных частотой 54,17ГГц, выявлено, что подъемная сила увеличилась в 1,7 раза (табл. 1). Уровень зимаз-ной активности, зарегистрированный в опытном варианте, составил 60 минут, при 45 минут для контрольных дрожжей. Это свидетельствует о частичном снижении активности ферментов утилизации глюкозы, однако оба показателя лежат в пределах, допускаемых ГОСТом 171-81. Вместе с тем практически в 1,5 раза увеличился уровень мальтазпой активности. Принимая во внимание, что именно мальтоза, полученная при расщеплении крахмала муки, является субстратом для развития хлебопекарных дрожжей в процессе тес-товедения, а дрожжи с высокой мальтазной активностью ускоряют процессы созревания теста, можно говорить о повышении приспособляемости дрожжей к реальным технологическим условиям.

Таким образом, облучение ЭМИ оптимальной частоты приводит в целом к улучшению качества дрожжей.

Таблица 1 - Технологические показатели дрожжей ЗассЬагошусев сегеУ181ае, подвергнутых облучению

Технологические показатели Частота 54,17 ГГц Контроль

Подъемная сила, мин 24,5 42

Зимазная активность, мин 60 45

Мальтазная активность, мин 100 150

Таким образом, воздействие как электромагнитного излучения крайне высокой частоты, так и выбранного комплексообразующего агента приводит к повышению концентрации дрожжей. В связи с этим представляло интерес исследовать характер совместного действия этих факторов. Результаты представлены на рисунке 3.

12 345 678 контроль

Условия воздействия

Рис. 3 - Совместное влияние комплексона и ЭМИ: 1 - оптимальное излу чение; 2 -ингибирующее излучение; 3-оптимальная концентрация комплексона; 4 -ингибирующая концентрация комплексона; 5 - ингибирующая концентрация комплексона и ингибирующее излучение; 6 - оптимальная концентрация комплексона и ингибирующее излучение; 7 - оптимальное излучение и ингибирующая концентрация комплексона; 8 - оптимальное излучение и оптимальная концентрация комплексона

Можно было ожидагь, что при совместном действии оптимальной частоты излучения и оптимальной концентрации комплексона прирост биомассы будет значительно выше уже достигнутых уровней. Однако в этом варианте наблюдается значительное ингибирование роста исследуемой культуры (80% по отношению к контролю).

Совместное действие ингибирующего излучения и ингибирующей концентрации комплексона привело к уменьшению прироста биомассы по сравнению с контрольным образцом (98%). Однако обращает на себя внимание тот факт, что это значение выше, чем уровни биомассы, отмеченные при ингибирующем действии этих факторов в отдельности. То есть происходит частичное нивелирование отрицательного действия каждого из этих факторов при их совместном действии.

Прирост биомассы при совместном действии ингибирующей частоты и оптимальной концентрации комплексона составил 89%. Это больше, чем прирост биомассы при действии ингибирующего излучения в отдельности (76%), но в то же время меньше, чем при влиянии только оптимальной концентрации комплексона (118%). Таким образом, позитивное действие, которое оказал комплексон, подавляется ингибирующим действием излучения.

Действие оптимальной частоты излучения и ингибирующей концентрации комплексона привело к повышению уровня биомассы по сравнению с конфолем на 3%. Сле-

дует напомнить, что при оптимальной частоте излучения был достигнут уровень биомассы 103%, а при ингибирующей концентрации комплексона 88%.

Очевидно, что подобное проявление действия комплексообразующих компонентов и ЭМИ возможно только в том случае, если механизмы их действия на дрожжевую культуру отличны друг от друга.

Для подтверждения выдвинутой гипотезы был проведен структурно-динамический анализ импульсным методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР релаксометрия представляет собой один из эффективнейших методов неразрушающего контроля за структурно-динамическим состоянием любой динамической системы. Это особенно ценно в случае анализа поведения живых микроорганизмов. Анализ относительных изменений в строении и поведении биомассы или ее отдельных компонентов помогает понять механизмы процессов, влияющих на результативность культивирования.

Основные результаты ЯМР анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Параметры ЯМР-релаксации высушенной биомассы , подвергнутой воздействию различных физико-химических факторов

Образцы № фазы (0 Время синн-спиновой релаксации Тгь мс Населенности (относительное содержание) динамических фаз, Рь %

ЭМИ КВЧ комплексон ЭМИ КВЧ комплексон

1 19,6 — 70 —

Контроль 2 0,22 0,135 12 38

3 0,020** 0,018 18 62

С максимальным 1 19,5 — 43 —

приростом биомассы 2 0,28 ** 0,134 23 37

3 0,024 0,015 34 63

1 11,6 — 77 —

С максимальной потерей биомассы 2 0,14 0,085 10 40

3 0,018 0,019 13 60

* - для получения сухих образцов свободная вода предварительно удалялась путем центрифугирования при 3000 об/мин, после чего образцы высушивались до постоянного веса при 70°С в течение 10 и 20 минут.

** - получены путем ручного сшивания ССИ и СПИ в ходе автоматизированного обсчета экспериментальных данных с помощью ЭВМ.

Облученные ЭМИ КВЧ образцы отличаются от полностью высушенных систем с комплексоном наличием длинного времени Т21

соответствует молекулам воды, связанным (сорбированным) на внешней поверхности клеток. Судя по значениям Тг| и относительному содержанию (Р|) остальных двух динамических фаз, а также учитывая природу высокомолекулярных соединений, образующих дрожжевые клетки, в ходе дальнейшего анализа будем исходить из того, что более заторможенная по молекулярной подвижности фаза (характеризуемая релаксационными параметрами Т22 и Рг) сформирована либо гибкоцепными (макро)молекулами, либо их водными растворами или комплексами. Тогда третья фаза (Т23, Рз) с наиболее коротким временем спин-спиновой релаксации, характерным для жесткоцепных полимеров (в том числе -для производных целлюлозы), закономерно связана с поведением твердоподобных высокомолекулярных соединений в составе клеточных стенок. Тогда относительно высокое содержание подобных структур в высушенных клетках (Рз) может объясняться значительным обезвоживанием протоплазмы (Т22, Рг) в процессе ее центрифугирования и высокотемпературной обработки.

Из табл. 2 также следует, что при любом воздействии соотношение внутриклеточных фаз (Рг и Рз) между собой остается практически постоянным, хотя их релаксационные параметры (Т22 и Тгз) меняются существенно. Это свидетельствует как об устойчивости состава соответствующих структур, так и об относительной мобильности протоносодержащих соединений внутри клеточного пространства, включая стенки дрожжевых клеток. При этом времена Т22 образцов, содержащих внеклеточную воду, в 1,5-2 раза выше аналогичных показателей для сухих дрожжей (не содержащих воды, адсорбированной на поверхности клеток (Т21)). Подобная закономерность типична для обменных процессов (Т21<—>Тг2) в жидкой фазе и в данном случае вполне закономерна для систем с проницаемыми для низкомолекулярных соединений (в частности, воды) перегородками (клеточными оболочками). Отсюда можно так же предположить, что рассматриваемые виды воздействия на микроорганизмы (ЭМИ КВЧ и комплексон) принципиально не нарушают функции клеточных оболочек (например, вплоть до полной потери их проницаемости), хотя и способны влиять на скорость или механизмы соответствующих процессов с участием обо-лочечных структур дрожжевых клеток. Например, характер воздействия ЭМИ КВЧ заметно влияет на соотношение населенностей 1 и 2 фазы (Р1 и Рг): стимулирование роста микроорганизмов сопровождается падением отношения Р1/Р2 (43/23 по сравнению с 70/12), в то время как ингибированию роста клеточной массы соответствует некоторый рост того же соотношения (77/10 по сравнению с 70/12). Поскольку условия сушки этих образцов были одинаковыми, полученный результат можно связать с динамикой обмена (константой равновесия) молекул НгО (Р1«-»Рг), расположенных на поверхности и внутри клеточного пространства. Тогда наблюдаемые изменения Р1/Р2 можно связать со сдвигом равновесия обменного процесса (НгОвнешняя^НгОвнутренняя) через клеточные оболочки. Но, поскольку, при этом соотношение Р2/Р3 остается постоянным, то данные изменения нельзя объяснить поведением только абсолютных концентраций воды внутри клеток. Поэтому, остается предположить, что обратное отношение Р2/Р1 характеризует пропускную способность (пористость, проницаемость) клеточных оболочек. Эго означает, что стимуляция роста биомассы под воздействием ЭМИ КВЧ обусловлена, в том числе, ростом проницаемости оболочек, а ингибирование того же процесса сопровождается падением пропускной способности соответствующих каналов. Это также подтверждается поведением времен релаксации второй и третьей фаз (Т22 и Т23): их ростом в случае стимулирования и падением при ингибировании дрожжевого роста.

Характерно, что изменения в релаксационных параметрах биомассы, культивировавшейся в присутствии химически активной добавки (комплексона) не во всем коррели-

руют с аналогичными параметрами облученных микроорганизмов. В частности, образец сухой биомассы, полученной в присутствии оптимальной концентрации комплексона, отличается от контрольного пониженным значением времени Тгз, в то время как ингибирующая концентрация добавки приводит к формированию биомассы с меньшей величиной Т22, при сохранении значения Тгз близким к контрольному. Отсюда можно предположить, что в случае ингибирования роста биомассы комплексоном клеточная оболочка микроорганизма практически не меняется, в то время как активность более подвижной фазы (протоплазмы) заметно падает. При оптимальных концентрациях комплексона наблюдаемые изменения в релаксационных параметрах могут объясняться более противоречивыми причинами: сохранением активности протоплазмы (Т22) на фоне перегруппировки клеточных оболочек в направлении их уплотнения - о чем свидетельствует падение Тгз-Таким образом, при ингибировании под воздействием любого из рассмотренных факторов происходит падение активности большинства компонентов клеточной структуры. В то же время при стимулировании создаются благоприятные условия для повышения активности протоплазмы, в том числе за счет роста проницаемости цитоплазматической мембраны и сокращения периплазматического пространства.

Таким образом, наблюдаемые изменения времен Т22 и Тгз облученных образцов коррелируют между собой (меняются симбатно), что можно объяснить взаимным влиянием (взаимосвязью) поведения протоплазмы со структурными переходами в клеточных оболочках, меняющими их проницаемость и однозначно воздействующими на транспортные процессы внутри и вне клетки (между клеткой и внешней средой). В то же время, влияние комплексонов на оболочки дрожжевых клеток оказывается более противоречивым: ингибирующая концентрация комплексона никак не затрагивает клеточную оболочку как таковую, но подавляет активность протоплазмы, по-видимому, вследствие проникновения внутрь последней через оболочку. И наоборот, стимулирующая концентрация комплексона (на порядок превышающая ингибирующую) оказывает влияние на клеточную оболочку, почти не затрагивая протоплазму.

В целом данные ЯМР-релаксометрии подтверждают выдвинутое предположение о различной природе механизмов влияния ЭМИ КВЧ и комплексонов на процессы метаболизма дрожжевых клеток. В случае излучения можно предположить, что мы имеем дело с одновременным воздействием излучения на динамику конформационных переходов и соотношение конформеров в составе биополимеров независимо от места их локализации. Это закономерно приводит к перераспределению свободного объема в системе и (или) активизации одной из возможных изомерных форм у склонных к таутомерным переходам реакционно-способных центров клетки. Химически активная добавка по своей природе не способна одновременно воздействовать на все компоненты клеточной структуры, в результате чего ее эффективность существенно зависит от концентрации и характера воздействия на внешнюю границу дрожжевой клетки (оболочку). В случае незначительных структурных перегруппировок в исходно проницаемой для комплексона клеточной оболочке атакующая ее молекула комплексона сохраняет возможность проникновения внутрь микроорганизма и воздействия на его протоплазму. В то же время, при значительном уплотнении оболочки после ее частичного разрушения комплексоном (например, в результате изъятия из состава оболочки объемных ионов двухвалентных металлов - например, кальция, магния, и т.п.) вероятность преодоления перестроившегося участка клеточной оболочки резко уменьшается для того же комплексона, но не для большинства остальных участников процессов клеточного метаболизма.

Таким образом, различия в механизмах влияния ЭМИ КВЧ и комплексонов на проницаемость клеточных оболочек позволяют объяснить наблюдаемые особенности роста активности и массы микроорганизмов при совместном воздействии на них факторов физической и физико-химической природы (рис.З, табл.2).

Экспериментальная часть

Объектом исследования являлась культура хлебопекарных дрожжей БассЬаготусез сеге-у1з1ае раса 509.

В работе применялся комплексон ОЭДФ (гидрооксиэтилидендифосфоновая кислота), который является структурным аналогом пирофосфата - природного регулятора кальциевого обмена.

Облучение культуры проводили на генераторе ЭМИ ГЧ-142 с выходной мощностью 100 мВт/см2. Диапазон исследуемых частот составлял от 53,77 ГГц до 54,57ГГц с шагом 0,2 ГГц. При культивировании дрожжей использовались две среды. Плотная питательная среда Громыко [11] использовалась для хранения музейной культуры, получения свежей культуры дрожжей и посевного материала. Жидкая питательная среда Сабуро [11] использовалась для ферментации. Стерилизацию сред проводили в течение 30 минут при давлении 0,5 ати [11].

В ходе работы были использованы растворы комплексонов в следующих концентрациях: 2 г/л; 1 г/л; 10'1 г/л; 10 2 г/л; 10'3 г/л. Растворы готовили путем последовательного разведения исходного раствора.

Культивирование начинали с пересева музейной культуры на косяки с твердой питательной средой Громыко, с последующим выдерживанием в термостате при температуре 35°С в течение двух суток. Выросшую культуру смывали с косяков стерильным физиологическим раствором. Дрожжевую суспензию в количестве 0,1 мл заливали в чашки Петри со средой Громыко и выдерживали в течение двух суток при температуре 35°С. Полученный в чашках газон выросшей культуры подвергали облучению определенной длиной волны. Время экспозиции оставалось постоянным в течение всего эксперимента и составляло 5 минут. С облученных чашек производили засев дрожжей в колбы со средой Сабуро.

С необлученных чашек также делали засев дрожжей в колбы со средой и добавляли по 1 мл комплексона соответствующей концентрации. Культивирование продолжалось в течении 24 часов при температуре 35°С на воздушных качалках при частоте 180 об/мин. Контрольный опыт проводился в аналогичных условиях без облучения и без добавления комплексонов.

Концентрацию биомассы определяли турбидиметрическим методом. Измерение биомассы проводим при длине волны 490 нм [12].

Замеры оптической плотности проводили после пересева на жидкую питательную среду до культивирования и через сутки - по окончании процесса культивирования. В ходе работы определяли технологические показатели - зимазная и мальтазная активности [13] и подъёмная сила дрожжей, которая определялась ускоренным методом [14]. Для проведения анализов, по истечении времени культивирования, дрожжевые клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Высушенные до постоянного веса образцы дрожжей были подвергнуты структурно-динамическому анализу импульсным методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Исследование контрольных и модифицированных кульгур проводилось при нормальных условиях на лабораторном ЯМР- релаксометре с рабочей частотой 19 Мгц и временем нечувствительности приемо-передающего тракта 7 мкс. Поведение спадов свободной индукции (ССИ) оценивалось после прохождения 90° - градусного импульса, а спадов поперечной намагниченности (СПН) - из отклика на последовательность КПМГ с последующим определением релаксационных параметров [15].

Литература

1. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 567с.

2. Культивирование микроорганизмов. / Под ред. Позмоговой ИЛ. II Итоги науки и техники. Серия

«Микробиология». 1991. Т.24.

3. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3-х томах. М.: Мир, 1985.

4. Т.А. Матковская, К.И. Попов, Э.А. Юрьева Бифосфонаты: свойства, строение и применение в медицине. М.: Химия, 2001. 224с.

5. Бецкий О.В., Лебедева Н.Н. II Миллиметровые волны в биологии и медицине. 2001. №3(24). С.5 -19.

6. Девятков Н.Д., Бецкий О.В., Голант М.Б. II Биологические эффекты электромагнитных полей. Вопросы их использования и нормирования. Пущино: научный центр биологических исследований АН СССР. 1986. С.75-94.

7. Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н. II 10 Росс, симпозиум с международным участием « Миллиметровые волны в медицине и биологии» Сб. докл. М., 1995. С. 100-102.

8. Сб. трудов симпозиума «Применение миллиметровых волн в биологии и медицине» ЗАО «МТА -КВЧ», 2003.

9. БрюховаА.К., Исаева B.C., Раттель Н.Н. Влияние электромагнитного излучения мм диапазона (ЭМИ) на пивоваренные дрожжи. М.: ИРЭ АН СССР, 1987.

10. Брюхова А.К., Голант М.Б., Двадцатова Е.А., Реброва Т.Б. II Электронная промышленность. 1985. Вып.1. С.6.

11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. проф. Н.С. Егорова. М.: Изд. МГУ, 1983. 222с.

12. Методы общей бактериологии/ Под. ред. Ф. Герхардта. T.l. М.: Мир, 1983. 536с.

13. Лабораторный практикум по общей технологии пищевых производств/ А.А. Виноградова, Г.М. Мелькина, Л.А. Фомичева и др.// Под. ред. Л.П. Ковальской. М.: Агропромиздат, 1991. 335с.

14. Т.П. Слюсаренко. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. 208с.

15. Т. Фаррар, Э.Беккер. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. М.: Мир, 1973. 193 с.

© А. Ю. Крыницкая - канд. бнол. наук, доц. каф промышленной биотехнологии КГТУ; М. Н. Астраханцева - ассист. той же кафедры; П. П. Суханов - д-р хим. наук, проф. той же кафедры; В.

С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии КГТУ.