Ректальные суппозитории на основе модифицированного бактериофага MS2 для таргетной терапии злокачественных солидных опухолей
RECTAL SUPPOSITORIES BASED ON MODIFIED BACTERIOPHAGE MS2 FOR TARGETED THERAPY OF MALIGNANT SOLID TUMOURS

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, биотехнологии и может быть использовано для создания лекарственной формы противоопухолевого препарата широкого спектра действия.
v
3
v
5
В патенте RU 2599462 С1, 10.10.2015 предложен способ полисигнальной активации апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей посредством адресной доставки солей таллия в клетки-мишени. В качестве носителя солей таллия как цитотоксического агента предлагается использовать поверхностно модифицированные вирионы бактериофага MS2. Модификация заключается в ковалентной пришивке циклического пептидного лиганда iRGD к капсидным белкам фага, что обеспечивает высокоспецифическое взаимодействие фаговых частиц с интегринами ab и ab. Следствием такого лиганд-рецепторного взаимодействия является проникновение фаговых частиц в клетки опухоли, а также питающие опухоль сосуды. Внутриклеточный таллий активирует апоптоз злокачественных солидных опухолей и оказывает эффективное пролонгированное цитотоксическое действие при минимальном побочном воздействии на нормальные клетки организма.
В практике клинического применения бактериофагов как терапевтических агентов известно два основных способа их введения: местный и энтеральный (ФС 42-3236-95 Бактериофаг стафилококковый жидкий; ФС 42-3243-95 Бактериофаг стрептококковый жидкий; ФС 42-16ВС-86 Бактериофаг сальмонеллезных групп ABCDE жидкий и сухой с кислотоустойчивым покрытием; ФС 42-2460-95 Бактериофаг дизентерийный поливалентный жидкий). Среди энтеральных лекарственных форм бактериофагов значительное место занимают ректальные суппозитории (Функнер Е.В. «Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов». Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. медицинских наук. – Пермь, 2007. – 24 с.; RU 2366437 С2, 10.09.2009;  RU 2188629  С1, 10.09.20002;  Патент RU 2622762 С1, 19.06.2017). Ректальные суппозитории обеспечивают быстрое проникновение бактериофагов в кровь, легкие, печень, желчный пузырь,  почки, мочевой пузырь, тонкий и толстый кишечник, при этом сохраняется интактность вирионов, т.е. их биологическая активность. Универсальность ректальной формы продемонстрирована на лечебных препаратах бактериофагов, специфичных к большой группе патогенных и условно-патогенных бактерий-хозяев, куда входят: стафилококки, стрептококки, энтерококки, кишечная палочка, сальмонеллы, шигеллы, протей, клебсиеллы, псевдомонады, ацинетобактер, листерии.
В то же время, применение ректальных суппозиториев как способа доставки  именно противоопухолевых препаратов остается весьма редким событием (Патент KZ 21098 «Способ лечения опухолевых заболеваний» Францев А.П.(KZ), Францева И.А.(KZ)). В приведенном патенте описаны суппозитории, пригодные для терапии онкологических больных с применением пептидов, белков, липополисахаридов, полисахаридов.
Задачей настоящего изобретения является разработка лекарственной формы препарата таллийсодержащего бактериофага MS2, обладающей высокой биологической доступностью и ускоренным терапевтическим эффектом, разработка суппозиторной лекарственной формы, предназначенной для лечения злокачественных солидных опухолей.
Технический результат заключается в расширении арсенала средств указанного назначения за счет создания лекарственной формы, обладающей высокой биологической доступностью и ускоренным терапевтическим эффектом.
Технический результат достигается тем, что фармацевтическая композиция для лечения злокачественных солидных опухолей,  выполненная в форме ректальных суппозиториев  содержит поверхностно модифицированный бактериофаг MS2 в качестве активного компонента и гидрофильную суппозиторную основу при их  массовом соотношении 1:1.
Гидрофильная  суппозиторная основа содержит желатин, глицерин и  карбонатно-бикарбонатный буфер.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для лечения злокачественных солидных опухолей, выполненная в форме суппозиториев, характеризующаяся тем, что содержит поверхностно модифицированный бактериофаг MS2 в качестве активного компонента и гидрофильную суппозиторную основу при их  массовом соотношении 1:1.
Заявляемая композиция на основе поверхностно модифицированного бактериофага MS2 для таргетной терапия злокачественных солидных опухолей является новой и в литературе не описанной.
v
3
v
5
Активация апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей, осуществляется посредством адресной доставки солей таллия к клеткам опухоли.  Для обеспечения адресности формируют iRGD модифицированный вирион фага MS2, который содержит геномную РНК с солями таллия, при этом проникновение вириона в клетки злокачественных солидных опухолей обеспечивается за счет взаимодействия iRGD с интегринами ab и ab. Сердцевина модифицированного вириона фага MS2 содержит геномную РНК и соль таллия. Полисигнальная активация апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей солями одновалентного таллия обеспечивает комплексное воздействие на клетки злокачественных солидных опухолей и основана на одновременном повреждении мембраны митохондрий и связывании с ДНК и РНК. Такая форма активации апоптоза клеток позволяет обеспечить эффективное пролонгированное цитотоксическое воздействие на очаговые и метастатические скопления клеток злокачественных солидных опухолей при минимизации нежелательных побочных воздействий на здоровые клетки организма.
Для изготовления лекарственной формы готовая жидкая субстанция поверхностно модифицированного бактериофага должна соответствовать следующим показателям:
- cодержание общего белка (ГФ XIII, ОФС.1.2.3.0012.15) – 0,025 мкг/мл;
3
- содержание TlNO, инкапсулированного в бактериофаг (определяется методом масс-спектрометрии на VARIAN 820-MS или аналогичном оборудовании) – 36 мкг/мл;
- размер частиц бактериофага MS2 (определяется методом динамического рассеивания света на Horiba SZ-100 или аналогичном оборудовании) – от 27 до 31 нм;
9
- титр бактериофага MS2 (определяется методом агаровых слоев по Грациа на тест-штамме E. coli HfrC) – 1х10БОЕ/мл;
TM
- цитотоксическая активность бактериофага MS2 на культуре клеток (линия ТНРI, ATCC TIB-202) – 50% ингибирование клеточной пролиферации in vitro.
В качестве наполнителя для суппозиторной лекарственной формы используют гидрофильные основы, содержащие вещества, разрешенные Государственной Фармакопеей РФ. В частности, могут быть использованы желатино-глицериновая основа, мыльно-глицериновая основа,  а также полиэтиленоксидная основа.  Их характерной особенностью  является хорошая растворимость в воде. Гидрофильные суппозитории, легко растворяются при ректальном применении, равномерно распределяя по слизистой лекарственные вещества, оказывающие на организм как местное, так и резорбтивное действие.
Суппозитории обеспечивают быстрое попадание лекарственных веществ непосредственно в общий кровоток. Они снижают воздействие на печень, аллергическое действие и побочные эффекты препарата, обеспечивают независимость эффекта всасывания препарата от  приема пищи.
Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1.  Получение высокого титра фага MS2 проводили по методу, описанному в уровне техники (Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. РНК-трансдукция неинфекционными вирионами фага MS2 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2002, №3, стр. 56 -63). Контролями служили секвенирование ОТ-ПЦР фрагмента геномной РНК, а также определение титра методом агаровых слоев (Gratia A. Numerical Relations between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage // Ann. Inst. Pasteur 1936, v.57, p. 652). Концентрирование вирионов фага, проводили после осветления клеточного лизата центрифугированием (15000 об/мин) с последующим осаждением ПЭГ-6000 в присутствии NaCl, как известно специалистам. Концентрирование препарата фага так же проводили обезвоживанием сухим сефадексом G-10.
Пример 2. Наполнение сердцевины вирионов фага MS2 солями таллия.
A. Методом вакуумной сушки, когда проводили сушку смеси препарата фага с растворами таллия.
Б. Методом разборки - сборки, когда его проводили по протоколу, известному специалистам (US Patent 8987173), выдерживая фаг 24 часа в буфере ST (50 mM трис, 100 mM NaCl) в присутствии 0.25М ТМАО и 0,1М соли таллия. Затем раствор центрифугировали при 10,000g 10 минут. Супернатант смешивали с ПЭГ6000 и NaCl до конечной концентрации 12,5% и 0.5М, соответственно. Через 2 часа раствор осаждали центрифугированием (17,800g в течение 45 минут) при 4°C. Осадок растворяли в минимальном количестве ST буфера и вновь осаждали при 10,000g в течение 10 минут. Надосадок фракционировали и фракции, соответствующие интактным капсулам вируса MS2, собирали и после хранили в 4°С в ST буфере.
Пример 3. Модификация поверхности вирионов пептидами.
А. Синтез пептидов со структурой (NH2)GGGCRGDK/RGPD/EC(COOH).
Пептид синтезировали методом твердофазного пептидного синтеза ис-ходя из Fmoc-аминокислот на автоматическом пептидном синтезаторе 433А Applied Biosystems на смоле с присоединенным остатком Fmoc-Cys(Acm). Использовали следующие производные аминокислот: Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro. Снятие Fmoc-защитной группы с N-концевой альфа-аминогруппы растущей пептидной цепи проводили 22%-ным раствором 4-метилпиперидина в N-диметилформамиде (Алешина Е.Ю., Пындык Н.В., Мойса А.А., Санжаков М.А., Харыбин О.Н., Николаев Е.Н., Колесанова Е.Ф. Синтез фрагмента P-амилоида 5RHDSGY10 и его изомеров. Биомед. химия, 2008, т. 54, №2, 154-166). Присоединение аминокислот к растущей пептидной цепи (кроме Fmoc-Cys(Acm)) осуществляли с предварительной активацией Fmoc-аминокислот гексафторфос-фатом 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния в присутствии 1-гидроксибензо-триазола и 2,4,6-коллидина согласно процедуре FastMoc, описанной в инструкции к синтезатору. Fmoc-Cys(Acm) присоединяли с активацией in situ, используя в качестве активатора диизопропилкарбодиимид в присутствии 1-гидроксибензотриазола. По окончании синтеза пептид снимали со смолы обработкой смесью трифторуксусной кислоты, три-(изопропил)-силана, 3,6-диокса-1,8-октандитиола и воды (в объемном соотношении 94:1:2,5:2,5) и осаждали метил-трет-бутиловым эфиром. Осадок пептида растворяли в 10%-ном водном ацетонитриле с 0,1% трифторуксусной кислоты, и полученный раствор подвергали очистке методом ВЭЖХ на колонке Zorbax SB-C8, 21,2×250 мм, 7 мкм в градиенте концентрации ацетонитрила в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты. Фракцию, содержащую целевой пептид, собирали и упаривали под вакуумом и затем проводили удаление защитных Acm-групп с остатков цистеина с одновременным формированием дисульфидного мостика по известной методике (Fernando Albericio et al. Preparation and handling of peptides containing methionine and cysteine // In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Eds. W.C. Chang and P.D. White. Oxford University Press, 2000). Пептид подвергали повторной очистке методом ВЭЖХ на той же колонке, фракцию целевого пептида упаривали под вакуумом.
Б. Ковалентное связывание пептида с оболочкой фаговых частиц  про-водили с использованием диметиладипимидата в соответствии со стандарт-ной процедурой, известной специалистам (M.H.V. Van Regenmortel, S. Muller. Synthetic peptides as antigens. Elsevier, 1999, pp. 88-90).
Пример 4. Изготовление лекарственной формы.
о
о
о
В асептических условиях смешивают в колбе  42,5 мл стерильного   натрия карбонат-бикарбонатного буферного раствора и  100,0 г желатина. Смесь выдерживают для набухания в течение 60 мин. при комнатной температуре. Колбу с набухшим желатином помещают в водяную баню при температуре 60С и растворяют при постоянном перемешивании. Добавляют в колбу с желатином 40,4 мл глицерина, предварительно прогретого до той же температуры. Полученную смесь стерилизуют в автоклаве. После стерилизации остуженный до 45С желатиновый наполнитель смешивают со стерильным жидким поверхностно модифицированным бактериофагом, полученным по вышеописанной методике, предварительно прогретым до 37С, в массовом соотношении 1:1 при постоянном перемешивании. Полученную смесь разливают в  специальные стерильные формы. Заполненные формы охлаждают до полного застывания желатина, затем разбирают в асептических условиях, готовые суппозитории упаковывают в блистер. Контроль суппозиториев проводят согласно требованиям Государственной Фармакопеи РФ.
о
о
о
Пример 5.   В асептических условиях смешивают в колбе  21,3 мл стерильного   натрия карбонат-бикарбонатного буферного раствора и  50,0 г желатина. Смесь выдерживают для набухания в течение 60 мин. при комнатной температуре. Колбу с набухшим желатином помещают в водяную баню при температуре 60С и растворяют при постоянном перемешивании. Добавляют в колбу с желатином 20,2 мл глицерина, предварительно прогретого до той же температуры. Полученную смесь стерилизуют в автоклаве. После стерилизации остуженный до 45С желатиновый наполнитель смешивают со стерильным жидким поверхностно модифицированным бактериофагом, полученным по вышеописанной методике, предварительно прогретым до 37С, в массовом соотношении 1:1 при постоянном перемешивании. Полученную смесь разливают в  специальные стерильные формы. Заполненные формы охлаждают до полного застывания желатина, затем разбирают в асептических условиях, готовые суппозитории упаковывают в блистер. Контроль суппозиториев проводят согласно требованиям Государственной Фармакопеи РФ.
Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает создание лекарственной формы препарата таллийсодержащего бактериофага MS2, обладающей высокой биологической доступностью и ускоренным терапевтическим эффектом.