Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология». Саратов, 6-7 сентября 2011 г

Материалы IIIВсероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология». Саратов, 6-7сентября 2011 г.

ТЕЗИСЫ

Ю.А. Аветисян12, А.Н. Якунин123, В.В. Тучин12 ТЕРМООПТИКА КОМПОЗИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ В БИОМЕДИЦИНСКИХ ПРИМЕНЕНИЯХ

1 Институт проблем точной механики и управления РАН, Саратов

2Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов

3Саратовский государственный технический университет, Саратов

Задачи исследования. В настоящее время активно исследуется возможность использования плазмон-но-резонансных наночастиц в онкологии для лазерного фототермолиза раковых клеток, маркированных такими наночастицами, Вместе с тем, детального изучения кинетики локального распределения температурного поля как в пределах самих поглощающих наночастиц, так и в непосредственной близости от них, насколько нам известно, выполнено не было. Решение этой задачи представляет особый интерес для разработки эффективных алгоритмов управления температурными эффектами на масштабах соизмеримых и меньших размеров наночастиц, что и составляет цель настоящей работы.

Материалы и методы. В настоящей работе на основании решения нестационарного уравнения теплопроводности теоретически исследовалась возможность эффективного термического воздействия импульсного лазерного излучения (с длиной волны ~800нм) на клеточную мембрану в области ее соприкосновения с композитными наночастицами - типичными для экспериментов сферическими нанооболочками, состояшими из диэлектрического ядра (из плавленого кварца радиусом~70нм) и золотого покрытия (толщиной ~15нм).

Результаты и выводы. При облучении рассмотренных наночастиц серией импульсов линейно поляризованного лазерного света пикосекундного диапазона существует эффект пространственновременной локализации температурного поля, характеризующийся следующим:

1. Температурное поле, возникающее в объеме собственно наночастицы и в непосредственной близости от нее, имеет выраженную пространственную неоднородность, которая нарастает во время каждого отдельного импульса накачки и существует некоторое время (~50 пс) после его завершения, что определяет ее «время жизни».

2. Нарушается радиальная симметрия распределения температуры относительно центра нанооболочки, что приводит к заметной неравномерности нагрева наружной поверхности наночастицы и возникновению на ней «горячей» зоны в форме обруча, лежащего в плоскости, ортогональной вектору поляризации облучающего света.

Обнаруженная пространственно-временная локализация температурного поля должна учитываться в таких приложениях, как дефрагментация нанооболочек, лазерная оптопорация клеток, фототермолиз раковых клеток и бактерий, а также фото-термическое вскрытие микро- и нанокапсул с лекарственными препаратами. Использование эффекта пространственно-временной локализации температурного поля перспективно с точки зрения ми-

нимизации травмирующего действия повышенной температуры на живую ткань и предоставляет дополнительные возможности прецизионного управления названными выше процессами.

А .Г. Акопджанов, ВЮ. Науменко, А .И. Сергеев, Н.Л. Шимановский

ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЛОЖНОГО ОКСИДА ЖЕЛЕЗА (МАГНЕТИТА) В КАЧЕСТВЕ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОГО КОНТРАСТНОГО СРЕДСТВА ПРИ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ОПУХОЛЕЙ Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва

Задачи исследования. Наночастицы магнитных материалов, а также системы, в которых магнитные наночастицы распределены в немагнитной среде, представляют большой интерес для современной медицины и фармакологии при разработке методов лечения и диагностики различных заболеваний, в том числе онкологических.

Соизмеримость размера наночастицы и магнитного домена магнетита приводит к появлению явления суперпарамагнетизма. У наночастиц магнетита происходит существенное изменение магнитных свойств с уменьшением размера частиц.

Водные растворы магнетита со средним размером 20-50 нм обладают ферримагнитными свойствами, а при размерах соизмеримых с размером магнитного домена - 5-12 нм суперпарамагнитными.

Такие наночастицы магнетита могут стать оптимальной субстанцией магнитно-резонансного контрастного средства, позволяющего наблюдать очаги заболеваний по двум релаксационным параметрам, в отличии от гадолиний содержащих препаратов.

В связи с этим в работе была поставлена задача разработать способ получения наночастиц магнетита и изучить их способность изменять релаксации Т1 и Т2, т. е. оказывать контрастирующий эффект при проведении МРТ.

Материалы и методы. Исследуемые водные растворы наночастиц магнетита различных размеров были получены химическим способом. В данной работе в качестве ПАВа, останавливающего рост зародышей, использовали лимонную кислоту, которая не обладает оптимальными поверхностноактивными свойствами, но приемлема с биологической точки зрения. В качестве стабилизатора структуры применялся цитрат натрия. Конечное значение рН контрастной жидкости должно соответствовать рН крови.

Результаты. Были исследованы два водных раствора магнетита со средними диаметрами 8,2 и

21,2 нм. Размер частиц определялся с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Парамагнитные (контрастные) сверхмалые наночастицы оксида железа размером 8,2 нм (предварительное название Феротраст) мы сравнили с железосодержащим контрастным средством Резови-стом (Байер Шеринг Фарма АГ). Анализ полученных результатов показал, что Т1-релаксирующая активность Феротраста выше, чем у Резовиста (см. таблицу).

Таблица

Влияние Феротраста и Резовиста на времена релаксации протонов воды (рН 7,3, Т 23 °С)_______________

Концентрация Т1, мсек Т2, мсек

железа, г/л Феротраст Резовист Феротраст Резовист

5,0 5,0 ± 0,2* 8,7 ± 0,3 0,55 ± 0,1* 0,31±0,1

0,50 34 ± 3,0* 43,0 ± 3,0 6,2 ± 0,4 5,3 ± 0,4

0,25 54,0±4,0* 68,0±6,0 12,8±0,5* 10,1±0,4

^статистически значимые отличия раствора от Резовиста при р<0,05.

Исследования, проведенные на лабораторных животных, крысах с онкологическим образованием, показали контрастирующую способность препарата на основе наночастиц сложного оксида железа, а также важнейшее свойство Феротраста накапливаться в опухоли.

Выводы. Разработан способ получения наночастиц оксида железа (Феротраст), обладающий более высокой Т1-релаксирующей активностью по сравнению с аналогом Резовистом и способностью контрастировать опухоль при проведении МРТ.

В.В. Алипов, М.С. Лебедев, ХМ. Цацаев,

ЕА. Добрейкин, Н.В. Алипов, А .И. Урусова ЛАЗЕРНЫЕ НАНОТЕХНОЛОГИИ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХИРУРГИИ ПЕЧЕНИ ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, Саратов

Одним из актуальных и перспективных направлений в экспериментальной онкохирургии является применение лазерного фототермолиза с использованием светопоглощающих наночастиц.

Цель исследования. Разработать и экспериментально обосновать эндоскопические технологии доставки наночастиц меди и лазерного излучения для лечения моделированных образований печени.

Материалы и методы. Для разработки способов доставки наночастиц меди к печени и последующему проведению лазеротерапии проведены серии экспериментов на 85 лабораторных животных (кролики-самцы и белые крысы). Подведение наночастиц к печени проводилось путем выполнения чрескожной пункции в установленной проекции соответствующей доли печени под ультразвуковым контролем (УЗК).

Результаты. В результате 25 экспериментов разработан и запатентован способ моделирования кисты печени с помощью двухканального катетера с баллоном. Применение лазерного излучения («Лазермед- 0110») мощностью 10 Вт позволило экспериментально обосновать целесообразность «лазерной поддержки», что исключает возможность осложнений (кровотечение и желчеистече-ние) пункции. Экспериментально установлено, что введение в полость кисты печени наночастиц меди и применение низкоинтенсивного лазерного излучения ликвидирует микробную обсемененность, приводит к ускорению облитерации полости и замещению её соединительной тканью по сравнению со стандартными методами лечения на 4-5 суток соответственно.

Заключение. Разработаны способы моделирования новообразования печени и малоинвазивной пункции его под контролем УЗИ. Местное введение наночастиц меди в полость моделированной кисты печени и лазерное облучение её в ИК-диапазоне сокращает сроки её закрытия, является профилактикой гнойно-воспалительных осложнений. В перспективе подобный метод может быть применен и при лечении метастазов печени.

НЮ. Анисимова, Ю.И. Должикова, В А. Даванков,

М.И. Будник, М.В. Киселевский

ОЦЕНКА ГЕМОСОВМЕСТИМОСТИ

СВЕРХСШИТЫХ ПОЛИСТИРОЛОВ

СЕРИИ СТИРОСОРБ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Задачи исследования. В настоящее время в качестве неселективного сорбента широкое применение получил модифицированный активированный уголь. Однако показатели биосовместимости этого соединения не являются оптимальными: при контакте гранул этого сорбента с клетками крови отмечается гемолиз эритроцитов и активация агрегации тромбоцитов. Современные достижения в области разработки новых материалов с использованием нанотехнологий расширили спектр потенциально перспективных гемосорбентов. Сверхсшитые полисти-ролы ряда Стиросорб благодаря наличию нано-, микро- и мезопор на поверхности гранул способны элимировать из биологических жидкостей широкий спектр биологически активных молекул. Целью настоящего исследования являлась оценка гемосовместимости сорбентов ряда Стиросорб.

Материалы и методы. Тестируемые сорбенты Стиросорб MN 514, Стиросорб MMN200, которые представляли собой гранулы диаметром 0,3-1,0 мм с развитой внутренней структурой, промывали этанолом, стерильной водой и физиологическим раствором хлорида натрия. В качестве контроля использовали угольный сорбент колонки Adsorba, Sweden. Подготовленными сорбентами (1,3-1,5 г) набивали макеты гемосорбционных колонок через которые фильтровали кровь здорового донора объемом 5 мл. Забор проб для исследования осуществляли через каждые 5 циклов рециркуляции. Оценивали динамику гемолиза эритроцитов и гибель лейкоцитов методом колориметрии, а также агрегацию тромбоцитов методом световой микроскопии.

Результаты и выводы. Полученные данные свидетельствуют о снижении на 28-33 % интенсивности гемолиза эритроцитов и агрегации тромбоцитов в 1,5-1,9 раз при трансфузии через колонки с сорбентами Стиросорб в сравнении с контролем. Воздействие всех трех протестированных сорбентов на гибель лейкоцитов крови было сравнимым по степени интенсивности. Полученные результаты свидетельствуют о том, что протестированные сорбенты Стиросорб MN 514 и Стиросорб MMN200 при гемоперфузии оказывают на эритроциты и лейкоциты человека менее повреждающее действие, чем активированный уголь, широко применяемый для гемосорбции. Этот факт, наряду с установленной ранее способностью эффективно элиминировать из кровотока различные токсины, в том числе бактериальные, а также широкий спектр про- и противовоспалительных факторов позволяет рассматривать эти материалы как перспективные для применения в качестве гемосорбентов в медицинской и ветеринарной практике.

НЮ. Анисимова, Ю.И. Должикова, В А. Даванков, МИ. Будник, М.В. Киселевский ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ СОРБЕНТОВ СЕРИИ СТИРОСОРБ В ТЕРАПИИ ГРИБКОВОГО СЕПСИСА РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Задачи исследования. Ранее проведенные исследования дали основания предполагать возможность элиминации из крови неселективными сорбентами (активированный уголь, сверхсшитые по-листиролы) бактериальных клеток различных ви-

дов. Этот факт, наряду с возможностью сорбции этими материалами широкого спектра медиаторов воспаления, позволяет рассматривать указанные соединения как перспективные для применения в терапии гнойно-септических осложнений. Как известно, в качестве триггерных факторов развития сепсиса могут выступать не только бактерии, но и грибы. Целью данного исследования явилось изучение возможности элиминации сверхсшитыми полистиролами серии Стиросорб клеток грибов. Гранулы сорбентов этой серии имеют развитую внутреннюю и поверхностную структуру, представленную нано-, микро- и мезо порами, что обеспечивает их большую сорбционную емкость.

Материалы и методы. В данном исследовании тестировали образцы Стиросорб MN 514, Стиро-сорб MMN 2QQ и угольный сорбент, являющийся основой колонки Adsorba, Sweden. Сорбентами, промытыми в этиловом спирте и физиологическом растворе, набивали макеты сорбционных колонок.

15 мл суспензии дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisae в физиологическом растворе пропускали по 9 раз через модели колонок. Далее готовили мазки из исходной суспензии и контактировавшей с тестируемыми сорбентами, затем окрашивали их по методу Романовского - Гимзы и определяли относительное количество живых клеток. Кроме того, до и после перфузии определяли концентрацию клеток дрожжей в суспензии.

Результаты и выводы. Опираясь на данные об изменении концентрации дрожжевых клеток после перфузии, можно заключить, что исследуемые сорбенты обладают высокой способностью иммобилизировать на своей поверхности клетки дрожжей. Наибольшую эффективность показал Стиросорб MN 514, сокративший концентрацию клеток в 5,5 раз относительно интактного контроля. Стиросорб MMN 2QQ способствовал снижению числа дрожжей в 4,2 раз, а угольный сорбент - в 3,9 раз. Кроме того, было обнаружено уменьшение относительно интактного контроля количества живых клеток грибов: на 22 % при использовании Стиросорб MN 514 и угольного сорбента, на 1Q % - Стиросорб MMN 2QQ, что, вероятно, являлось следствием повреждения стенки микроорганизма. Учитывая полученные ранее результаты о высоком уровне биосовместимости исследуемых образцов, можно прийти к выводу о возможности рассмотрения наносорбентов серии Стиросорб в качестве перспективных гемосорбентов для лечения больных с сепсисом, являющимся частой причиной смерти онкологических больных в послеоперационный период.

А А. Бабаев, А .В. Алясова, ЕЮ. Конторщикова, АЮ. Барышников, В.В. Новиков СУММАРНАЯ И ОЛИГОМЕРНАЯ ФРАКЦИИ РАСТВОРИМОЙ МОЛЕКУЛЫ CD16 ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Наноструктурное состояние пула растворимых дифференцировочных молекул, определяющееся составом, соотношением и взаимодействием различных белков, может указывать на патогенез, течение и прогноз заболевания. В формировании пула участвуют также растворимая форма белка CD16 и его олигомеры, существование которых показано нами ранее. Молекула CD16 является Fc-рецептором III типа,

присутствует на мембране нейтрофилов, моноцитов, ЫК-клеток. Сывороточный уровень растворимых молекул 0016 в ряде случаев коррелирует с тяжестью течения и стадией онкологических заболеваний (Новиков В.В. и др., 2008).

Целью настоящей работы явилась сравнительная оценка сывороточного уровня суммарной и олигомерной фракций растворимой молекулы

0016 у больных раком легкого и раком тела матки.

В работе использовали образцы сыворотки крови 300 здоровых доноров, 54 больных раком лёгкого, 37 больных раком тела матки. Для выявления в сыворотке крови растворимых молекул 0016 использовали иммуноферментный сендвич-метод с применением моноклональных антител ИКО-116 и поликлональных антител против антигенов моно-нуклеарных клеток крови человека в разных комбинациях. Специфичность выявления оценивали в реакции нейтрализации.

Сывороточное содержание суммарной фракции растворимых молекул 0016 у больных раком легкого было выше нормальных значений в 1,3 раза. Содержание олигомерной фракции растворимых молекул 0016 не менялось. Выявленный характер изменений в содержании разных фракций растворимых молекул 0016 свидетельствует о том, что подъем в содержании суммарной фракции тестированного белка происходит за счет его мономерной формы.

При раке тела матки сывороточное содержание как суммарной, так и олигомерной фракции растворимых молекул 0016 оставалось в пределах нормальных значений.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012годы».

А.В. Бабич, И.В. Быков, В.Ю. Науменко,

А .А . Миронова

ПРИМЕНЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЖЕЛЕЗА

В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОК

Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва

Задачи исследования. На современном этапе развития методов клинической диагностики одной из актуальных задач является повышение чувствительности и разрешающей способности этих методов, которые достигаются при использовании наночастиц. По сравнению с традиционными органическими красителями такие наночастицы обладают уникальными оптическими свойствами, так как их коэффициент молекулярной экстинкции в 10-50 раз выше, чем у органических красителей. Более того, используемые красители для фотодинамиче-ской терапии часто бывают токсичными для клеток. Использование флуоресцентных наночастиц, по сравнению с красителями, дает некоторые преимущества при получении изображения опухоли за счет большего стоксова сдвига, а также благодаря тому, что время жизни флуоресценции наночастиц на порядок больше времени жизни красителей. В данной работе рассматриваются возможности использования наночастиц оксида железа в качестве «квантовых точек» или люминесцентных меток для клеточных структур.

Материалы и методы. При получении образцов клеток Не1а, конъюгированных наночастицами оксида железа, была использована стандартная методика выращивания клеточной популяции. После процесса инкубации клеток к ним добавлялся кол-

лоидный раствор наночастиц железа со средним диаметром частиц, равным 4,8 нм, и проводилось инкубирование в термостате 24 ч. С помощью люминесцентного микроскопа ЕС ЛЮМАМ-РПО11 и фотоаппарата Оапоп 450d были сделаны фотографии отдельных клеток Не1а, конъюгированных с наночастицами оксида железа при ультрафиолетовом освещении и обычном свете.

Результаты. Показано, что только при связывании данных наночастиц с клеточными структурами типа Не1а, они излучают узкую линию спектра на длине волны равной 554 нм, обладая флуоресцентными свойствами, и тем самым создают дополнительные диагностические возможности, которые могут реализоваться при гистологических исследованиях. Визуально, в отдельно выбранной единичной клетке Не1а, зафиксировано пребывание наночастиц железа как внутри клетки, так и на поверхности ее мембран с сохранением общей формы клетки.

Выводы. Металлические наночастицы могут использоваться в качестве контрастирующих веществ в магнитно-резонансной томографии, а также в качестве флуоресцентных меток во флуоресцентной микроскопии и флуоресцентной томографии, как и в других системах получения изображения очагов патологии на основе люминесцентного сигнала меток.

М.С. Бобков, Т.И. Субботина ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫБОРКИ БОЛЬНЫХ РМЖ,

ПОЛУЧАЮЩИХ ЛУЧЕВУЮ ТЕРАПИЮ

Тульский государственный университет, Тула

Цель исследования. Клинико-эпидемиологическое описание контингента больных РМЖ, проходящих лучевую терапию в Тульском областном онкологическом диспансере.

Задачи исследования. Изучить и проанализировать следующие клинико-эпидемиологические показатели: место жительства больных (город / село); возраст больных; стадию заболевания (согласно отечественной классификации); наличие отдалённых метастазов; источник ионизирующего излучения, применяемый при проведении дистанционной гамма-терапии, методику лучевой терапии; вид лучевой терапии.

Материалы и методы. Материалом исследования служили данные клинических наблюдений за больными РМЖ, проходящими лучевую терапию в Тульском областном онкологическом диспансере в период с января по март 2011 г. Анализируемая выборка составила 46 человек.

Результаты. Из всех больных РМЖ, проходящих лучевую терапию в ГУЗ ТООД за отчётный период, городскими жителями являются 38 человек (82,6 % от общего количества пациентов), сельскими - 8 человек (17,4 %). Принадлежность к различным возрастным группам выглядит следующим образом: 30-39 лет - 1 человек (2,2 % от общего количества пациентов); 40-49 лет - 5 человек (10,8 %); 50-59 лет - 18 человек (39,1 %); 60-69 лет - 14 человек (30,5 %); старше 70 лет - 8 человек (17,4 %). Из всей выборки I стадия заболевания имела место у 2 человек (4,3 % от общего количества пациентов); II стадия - у 14 человек (30,5 %); III стадия - у 26 человек (56,5 %); IV стадия - у 4 человек (8,7 %). Отдалённые метастазы были обнаружены у 9 человек (19,6% от общего количества пациентов), в том числе у 2 больных с I стадией заболевания. В подавляющем большинстве случаев (38 человек, или 82,6% от общего количества пациентов) для

проведения дистанционной гамма-терапии использовался линейный ускоритель Е1еЙ:а  с высокой энергией фотонов 18 МэВ и низкой энергией фотонов 6 МэВ, применялась методика классического фракционирования. Исключение составили 8 пациенток (17,4%), лучевая терапия которым проводилась с паллиативной целью методикой среднего фракционирования на кобальтовом гамма-терапевтическом аппарате ТЬега1хоп . Изучая вид лучевой терапии, было установлено, что в 1 случае (2,2 % от общего количества пациентов) гамма-терапия проводилась предоперационно; в 34 случаях (77,9 %) -в послеоперационно; и в 9 случаях (19,9%) - в виде паллиативного лечения.

Выводы. Подавляющее большинство обследованных пациентов являются городскими жителями. Максимальное число случаев РМЖ было выявлено в возрастном диапазоне 50-59 лет, минимальное - в диапазоне 30-39 лет. Наибольшее количество пациенток имеют П-Ш стадию заболевания. В большом количестве случаев выявлено наличие отдалённых метастазов. Линейный ускоритель с использованием фотонов высоких (18 МэВ) и низких (6 МэВ) энергий находит широчайшее применение в лечении больных по радикальной программе, тогда как кобальтовый гамма-терапевтический аппарат используется в основном при паллиативном лечении больных РМЖ. В большинстве случаев лучевая терапия проводилась в послеоперационном плане, однако достаточно часто и в качестве паллиативного лечения. Таким образом, сегодня высокие технологии, тесно интегрированные в повседневную деятельность врача, в том числе радиолога, должны быть направлены на помощь пациенту в его стремлении побороть болезнь, а задача врача -разработать тот уникальный, сугубо персонифицированный план лечения, который позволит достигнуть оптимального результата.

ВА. Богатырев, Л А. Дыкман,

О А. Бибикова, С А. Староверов БИОИМИДЖИНГ РАКОВЫХ КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов

Плазмонно-резонансные частицы (ПРЧ) благородных металлов (золота и серебра) благодаря своим уникальным оптическим и химическим свойствам представляют собой великолепный инструмент для цитологических исследований. ПРЧ могут быть использованы как средство доставки лекарственных соединений внутрь клеток и в качестве оптического зонда (биоимиджинг). В настоящее время предложено множество технологических решений, позволяющих получать плазмонно-резонансные частицы различных размеров и форм с настройкой плазмоного резонанса в видимой и ближней инфракрасной области светового спектра. Химическая инертность, способность противостоять окислению даже в ультрадисперсном (наноразмерном) состоянии делает золотые и серебряные ПРЧ малоцито-токсичными. В то же время поверхность ПРЧ может быть функционализирована биологически нейтральными или специфическими макромолекулами, придавая конъюгатам ПРЧ (маркерам) направленность взаимодействия с экзо- и эндоклеточными молекулярными компонентами. В зависимости от размера и функционализации поверхности ПРЧ могут проникать внутрь клеток за счет эндоцитоза или закрепляться на внешних структурах клеточ-

ной оболочки. Наиболее адекватным из современных методов оптической визуализации ПРЧ является, пожалуй, мультифотонная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия благодаря собственной (очень слабой) люминесценции золота и серебра. Однако, вследствие аномального плазмон-но-резонансного светорассеяния, ПРЧ могут быть сравнительно легко выявлены как методами конфокальной, так и обычной световой микроскопии в режимах регистрации рассеяния (темное поле). Обсуждаются результаты изучения колокализации золотых, серебряных и золото-серебряных ПРЧ с животными клетками различными методами световой микроскопии.

Н.А. Брусенцов1,2, В А. Полянский2, ЮА. Пирогов3, М.В. Гуляев3, И.С. Голубева1, А .В. Жуков2,

о ^ Я А

Н.В. Анисимов , Д.А. Тищенко , Т.Н. Брусенцова , М.П. Никитин4, П.И. Никитин4, М.В. Юрьев4,

А.В. Иванов1

БИОМЕХАНИКА РАЗВИТИЯ ОПУХОЛЕЙ И ИХ ТЕРАПИЯ НАНОПРЕПАРАТАМИ

4РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2НИИММГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 3ЛМРТС МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 4ИОФ РАН им. А.М. Прохорова РАН, Москва

Задачи исследования. Известно отсроченное развитие опухолей как результат терапии первичных опухолей алкилирующими препаратами, вызывающими нарушения генома и мутации клеток. Целью исследования является биомеханика отсроченного развития опухолей, выявление метастазов на ранних стадиях развития и их терапия.

Материалы и методы. В процессе ферримаг-нитной магнитогидродинамичекой термо-полихимиотерапии (ФТТ) самкам мышей С57Б1/6] с опухолями аденокарциномы молочной железы 0а 755 тонкой иглой вводили в опухоль и окружающие ткани магнитоуправляемый 30% золь (300 мкл), полученный на основе декстран-феррита (ДФ) (содержание феррита от 25,2 до 40 мг; цисплатина (ЦП) от 0,02 до 0,1 мг; рН= 6,6; £= +15 мВ; М5 =7,8 кА/м; УАЭ =240 Вт/г железа) и, кроме того, в метастазы и хвостовую вену мышей вводили 0,2 мл золя, содержащего 0,02 мг ЦП.

Результаты и выводы. Индукционный нагрев ДФ-ЦП в переменном магнитном поле приводил к полной регрессии опухолей аденокарциномы 0а 755 у 40 % мышей и к 300% увеличению продолжительности жизни при объеме исходных опухолей ~30 мм3. В эксперименте при своевременном проведении ФТТ наблюдали уменьшение объёма опухоли, связанное с апоптозом. В контроле наблюдали отсроченное развитие опухолей, связанное с дальнейшими глубокими нарушениями генома опухолевых клеток. В процессе высокодозной ФТТ наблюдали полную гибель клеток с различными генетическими нарушениями и наступление длительной ремиссия. У животных с ремиссией опухолей от 90 до 200 дней выявили развитие индуцированных ЦП отдалённых инвазий и метастазов, которые явились началом вторичных солидных опухолей.

Показано что положительный эффект терапии в значительной степени зависит от правильно выбранного сочетания препаратов, своевременного введения и подобранных доз в комбинациях, останавливающих клеточный цикл в соответствующих фазах.

Исследование поддержано Грантами РФФИ: (07-04-92001-ННС_а; 11-01-00051; 10-01-00015; 09-04-12284, 10-02-01182).

И.В. Быков, А .В. Семейкин, Н.Л. Шимановский,

А .Г. Акопджанов, В.Ю. Науменко

ПОЛУЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ

СЛОЖНОГО ОКСИДА ЖЕЛЕЗА (МАГНЕТИТА),

ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ

ДЛЯ КОНТРАСТИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ,

С ПРИГОДНОЙ БИОСОВМЕСТИМОСТЬЮ Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва

Задачи исследования. Наночастицы магнетита Ре304 (Ре0хРе203) представляют интерес в качестве основы для создания магнитно-резонансного контрастного средства при МРТ-диагностике опухолевых заболеваний. Использование наночастиц в биомедицине и фармакологии предполагает выполнения ряда требований: наночастицы должны образовывать устойчивую коллоидную систему, удовлетворять требованиям биосовместимости и иметь фиксированное значение рН. Наночастицы в водных растворах и других биологических средах имеют склонность к агрегации, поэтому практическое использование растворов магнетита сопряжено с их стабилизацией добавлением специальных поверхностно-активных веществ (ПАВ). В задачи исследования входило изучение биосовместимости полученных наночастиц оксида железа в зависимости от их состава.

Материалы и методы. Наночастицы магнетита были получены с помощью реакции Элмора, она достаточно проста и технологична. В качестве ПАВ использовали лимонную кислоту, которая не обладает сильными поверхностно активными свойствами, но приемлема с биологической точки зрения и цитрат натрия. Токсичность наночастиц определяли на культуре клеток НеЬа (эпителиоидный рак шейки матки человека) при времени инкубации 24

ч и с помощью МТТ-теста по методике, утвержденной для доклинических испытаний лекарственных препаратов. Использовались наночастицы с разными физическими параметрами.

Результаты. Исследование показало, что раствор наночастиц с оптимальными магнитными свойствами обладает высокой токсичностью. Снижение концентрации ПАВов, приводило к её росту, из чего следует, что явление вызвано малым размером частиц, а не остатками продуктов химической реакции (см. таблицу). Обработка результатов проводилась с помощью метода Стьюдента-Госсета, с достоверным отличием р < 0,05. Снижение токсичности достигалось увеличением оболочки наночастиц из цитрата натрия. В результате была снижена цитотоксичность предлагаемого средства при незначительном ухудшении магнитных свойств и выбрана оптимальная концентрация ПАВа, которая составила 60 г/л.

Таблица

Зависимость жизнеспособности культуры клеток от концентрации цитрата Ыа при времени инкубации 24 ч

Концентрация цитрата натрия Концентрация наночастиц магнетита

0,5 г/л 0,1 г/л 0,05 г/л

0 г/л 52,01%±16,14% 86,50%±19,53% 87,20%± 11,28%

11 г/л 58,51%±20,86% 68,55%±25,51% 94,41%±14,89%

44 г/л 66,57%±29,99% 102,89%±12,98% 83,11%±22,22%

60 г/л 85,08%±13,87% 98,94%±16,64% 98,23%±19,72%

82 г/л 90,17%±15,79% 110,95%±8,46% 97,24%±4,36%

Выводы. Подобраны нужные концентрации лимонной кислоты и цитрата натрия для получения биосовместимых наночастиц оксида железа, предназначенных для контрастирования опухолевых заболеваний при проведении МРТ.

ПМ. Бычковский1, А А. Кладиев2,

СЮ. Щеголев3,В А. Богатырев3, Т.Л. Юркштович1, Ф.Н. Капуцкий1, С А. Беляев1, С.О. Соломевич1,

С.А. Красный4, Ю.П. Истомин4, Е.Н. Александрова4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА КАК КОРПУСКУЛЯРНОЙ МАТРИЦЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ

ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

1 Учреждение БГУ «НИИ физико-химических проблем», Минск

2ООО «Биотехнологическая компания ТНК», Москва 3Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов 4ГУ «РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова», Минск

Задачи исследования. Получение лекарственных форм противоопухолевых препаратов проспи-дина и цисплатина с использованием наночастиц золота в качестве носителя и исследование их противоопухолевой активности in vitro.

Материалы и методы. Водные растворы коллоидного золота (КЗ) со средним диаметром частиц 25 нм, стабилизированные полиэтиленгликолем, и фармакопейные субстанции цис-диаминдихлорпла-тина (II) и проспидия хлорид. Исследование процесса иммобилизации проспидина и цисплатина КЗ проводили методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, электронной микроскопии, центрифугирования, а также химическими методами анализа. Оценка противоопухолевой активности полученной лекарственной формы проспидина и цисплатина была проведена in vitro на культуре опухолевых клеток HeLa. Для оценки цитостатиче-ского и цитотоксического эффектов препаратов количество выживших клеток сравнивали с числом клеток в контроле с исходным числом клеток до воздействия.

Результаты и выводы. Сорбцию цисплатина и проспидина коллоидным золотом проводили из их водных растворов с концентрациями 8,3х10-5 + 3,3х10-3 и 1,0х10-1 + 4,0х10-1 ммоль/мл соответственно при T = 293+1 K. Показано, что максимальное количество иммобилизованного проспидина составляет 0,36 моль на 1 г используемого раствора коллоидного золота (в пересчете на золото). Максимальное содержание цисплатина в фазе КЗ составляет

36,3 ммоль/г при его концентрации в исходном растворе 3,30х10- ммоль/мл. Противоопухолевая активность проспидина, иммобилизованного на КЗ, практически соответствует активности водного раствора проспидина при значительном уменьшении его содержания. Противоопухолевая активность цисплатина, иммобилизованного на КЗ, оказалась ниже, чем в случае его водного раствора. Результаты данных исследований могут быть использованы для создания новой эффективной лекарственной формы наноонкологических препаратов на основе коллоидного золота с цисплатином и проспидином.

ЮА. Геворкян, ЕМ. Франциянц, С А. Ильченко,

Н.В. Солдаткина, А.В. Дашков ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИХИМИОПРЕПАРАТОВ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ РЕЗЕКТАБЕЛЬНЫМ РАКОМ ЖЕЛУДКА

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону

Задачи исследования. Улучшить результаты лечения больных резектабельным раком желудка путем применения направленной доставки химиопрепаратов через левую желудочную артерию с ис-

пользованием модуляторов (озонированные среды) во время операции гастрэктомии.

Материалы и методы. Проанализированы данные о 30 больных раком желудка Т3-4Ы0-2М0. 6 (20 %) больных находились в возрасте до 50 лет. Морфологически у 20 (66,6 %) больных была установлена аденокарцинома. 15 больным (основная группа) проведено комплексное лечение, включающее гаст-рэктомию и интраоперационную регионарную химиотерапию с озонированными средами. 15 больным (контрольная группа) во время операции гаст-рэктомии проводили внутривенную химиотерапию без озонированных сред. Для проведения регионарной химиотерапии с озонированными средами вводили интраоперационно внутривенно 100 мл озонированной аутокрови (400 мкг/л), в последующем с интер валом 5 мин вводили лейковорин в дозе 100 мг/м и 5-фторурацил в дозе 13,5 мг/кг, а в левую желудочную артерию 50 мл озонированного физиологического раствора (1000 мкг/л), в последующем с инте2рвалом 5 мин вводили оксалиплатин в дозе 85 мг/м2. После 30-минутной экспозиции химиопрепарата в пораженном органе выполняли гастрэктомию. В контрольной группе больным во время операции гастрэктомии вводили внутривенно те же дозы химиопрепаратов.

Результаты. Комплексное лечение больных ре-зектабельным раком желудка с применением химиотерапии с озонированными средами достоверно улучшает клиническое течение послеоперационного периода, достоверно снижает частоту возникновения послеоперационных осложнений на 29,6%, благоприятно влияет на свертывающую систему крови и уменьшает вероятность развития гиперкоагуляции. За время наблюдения (до 12 месяцев) у больных основной группы не выявлено ни одного случая прогрессирования заболевания. В контрольной группе у 3 больных (20 %) выявлены отдаленные метастазы.

Выводы. Применение направленной доставки химиопрепаратов через левую желудочную артерию с использованием модуляторов (озонированные среды) во время операции гастрэктомии достоверно улучшает результаты лечения больных ре-зектабельным раком желудка.

ЮА. Геворкян, Ф.Н. Гречкин, В.Е. Колесников,

Н.В. Солдаткина, А.В. Дашков НАПРАВЛЕННАЯ ДОСТАВКА ХИМИОПРЕПАРАТОВ

В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ МЕТАСТАЗОВ В ПЕЧЕНЬ РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ

ФГУ Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону

Задачи исследования. Улучшить результаты лечения больных с метастазами в печень рака толстой кишки путем применения направленной доставки химиопрепаратов, включающей внутритканевую химиотерапию на аутоплазме.

Материалы и методы. Проанализированы данные 35 больных с нерезектабельным метастатическим поражением печени, ранее леченных комплексным методом по поводу рака толстой кишки в возрасте от 32 до 71 года. 15 больным (основная группа) проведена чрескожная радиочастотная термоабляция (РЧТА) с внутритканевой химиотерапией на аутоплазме. 20 больным (контрольная группа) проведена только стандартная многокурсовая химиотерапия по схеме РОЬРОХ. Для проведения РЧТА с внутритканевой химиотерапией больным

выполняли чрескожную радиочастотную термоаблацию метастазов в печень по стандартной методике под ультразвуковым контролем, после завершения которой через инфузионный насос в электрохирургическом устройстве в ложе подвергшегося термодеструкции метастаза вводили инкубированную аутоплазму с 5-фторурацилом (500 мг на каждый метастаз). Затем больные получили многокурсовую химиотерапию по схеме FOLFOX.

Результаты. Для контроля эффективности лечения больным выполняли в динамике УЗИ-иссле-дование, СКТ. За весь период наблюдения (10 мес.) у 1 (7 %) больного основной группы и у 8 (40 %) больных контрольной группы выявлено прогрессирование метастатического поражения печени (р<0,05).

Вывод. Применение направленной доставки химиопрепаратов, включающей внутритканевую химиотерапию на аутоплазме в комплексе с РЧТА нерезектабельных метастазов в печень, способствует улучшению результатов лечения рака толстой кишки с метастазами в печень.

В.С. Гринёв, А .Ю. Егорова,

Г.С. Терентюк, Е.Е. Фёдоров КОМПЛЕКСЫ ПАЛЛАДИЯ С АЗОПОЛИГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМИ.

СИНТЕЗ И ОЦЕНКА

ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов

В настоящее время ведутся активные поиски веществ, близких по структуре к применяемым противоопухолевым препаратам на основе комплексов платиновых металлов (в частности, цис-платину, карбоплатину и др.); активно изучаются закономерности структура-свойство; предлагаются новые подходы к решению известных проблем современных препаратов. Применение цисплатина ограничивается относительно небольшим диапазоном опухолей, на которые он может успешно воздействовать. Нами была проведена функционали-зация полигетероциклических соединений на основе легкодоступных исходных веществ с помощью реакций азосочетания с солями диазония различных ароматических аминов, в том числе и гетероциклического строения. Полученные арила-зосоединения обладают свойствами лигандов в реакциях комплексообразования, а соответствующие комплексы металлов платиновой группы, исходя из результатов виртуального скрининга с помощью программы PASS, предположительно, должны обладать высокой противоопухолевой активностью (вероятность до 75 %). Поскольку растворимость полученных комплексов в воде невысока, была предложена инъекционная форма на основе фармакопийно разрешённых органических растворителей (ДМСО, ДМФА) и ПАВ, позволяющая получать препарат в мицеллярной форме с концентрацией активного вещества 1 мг/мл. Проведённые предварительные эксперименты с животными по выявлению острой токсичности синтезированных комплексов палладия показали, что предложенная композиция, состоящая из органических растворителей и ПАВ, не является токсичной, а растворимость комплексов в инъекционной форме недостаточна для введения дозы препарата, описанной в литературе, в пересчёте на массу животного. Также, возможно, большой объём молекулы комплекса и то, что в инъекционной форме он находится в мицеллярной форме, затрудняет

мицеллам проникновение через клеточные мембраны. В качестве дальнейшего направления был выбран синтез более компактных молекул азосоединений, а также повышение растворимости получаемых комплексов.

ЛА. Дыкман, С А. Староверов, В А. Богатырев, Н.Г. Хлебцов, СЮ. Щёголев ЗОЛОТЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ В ДИАГНОСТИКЕ

И ХИМИОТЕРАПИИ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов

Первые сведения о коллоидном золоте можно найти в трактатах китайских, арабских и индийских ученых, которые уже в У-ІУ веках до нашей эры получали коллоидное золото и использовали его в лечебных целях. В онкологической практике с 1927 г. коллоидное золото было предложено использовать для облегчения страданий неоперабельных раковых больных. Коллоидные растворы изотопа золота 198Аи успешно использовались в онкотерапии с пятидесятых годов прошлого века. В последние годы золотые наночастицы (ЗНЧ) различных размеров и форм предложено применять в диагностике, лечении и профилактике заболеваний. В частности, ЗНЧ активно используют для идентификации, визуализации и биоимиджинга раковых клеток методами электронной просвечивающей и сканирующей микроскопии, атомно-силовой микроскопии, конфокальной лазерной микроскопии, микроскопии темного поля. Кроме перечисленных способов регистрации биоспецифиче-ских взаимодействий с помощью различных вариантов оптической микроскопии и ЗНЧ, в настоящее время активно развиваются и другие современные методы детекции и биоимиджинга, которые можно объединить под общим названием «методы биофото-ники». К методам биофотоники можно отнести оптическую когерентную томографию, рентгеновскую и магнито-резонансную томографию, фотоакустиче-скую микроскопию и томографию, флуоресцентную корреляционную микроскопию и т.п. Конъюгаты ЗНЧ нашли многочисленные применения в аналитических исследованиях, которые могут быть основаны как на современных инструментальных методах (БЕЫБ, БЕГОА, ЬКЫА и т.д.), так и на простых твердофазных или гомофазных методиках (дот-анализ, иммунохроматография и т.п.). Плазмонная фототермическая лазерная терапия рака с помощью ЗНЧ, впервые описанная в 2003 г., в настоящее время перешла в стадию клинической апробации. Одним из наиболее перспективных и активно развивающихся аспектов использования ЗНЧ в медицине является адресная доставка лекарственных средств. Самыми популярными объектами для адресной доставки являются противоопухолевые препараты. Лекарственный препарат для внутривенного введения на основе конъюгата ЗНЧ с фактором некроза опухолей под названием АигІттипе™ уже прошел вторую стадию клинических испытаний. Обнаружение адъювантных свойств у ЗНЧ создает благоприятные условия для разработки нового поколения вакцин, в том числи и антираковых.

О.Ф. Евстратова, ЛХ. Гаркави, Г.В. Жукова,

ТА. Бартенева, А .И. Михолап, ЕА. Ширнина МЕСТНЫЕ И СИСТЕМНЫЕ ЭФФЕКТЫ НАНОЧАСТИЧ-ФЕРРИМАГНЕТИКОВ У ЖИВОТНЫХ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ ФГУ Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону

Изменение параметров эндогенных электромагнитных излучений при росте злокачественных опухолей, а также важная роль железа и его соединений в обеспечении систем регуляции жизнедеятельности клеток позволили предположить возможность противоопухолевого влияния этих факторов при их самостоятельном использовании. Задача исследования - изучение влияния магнитной жидкости АМ-01 (МЖ), применяемой в качестве монофактора или в комбинации с низкоинтенсивным инфранизкочастотным магнитным полем (ИНЧ МП), на изменения в ткани перевивной саркомы 45 и органах иммунной системы белых беспородных крыс-самцов (30). МЖ (в дозе более 100 мг/кг) вводили подкожно на расстоянии 2-3 см от опухоли, воздействие ИНЧ МП (20 мТл, 7,8 Гц, 15 мин, аппарат «Градиент-3») осуществляли на область опухоли с захватом зоны введения МЖ. Микрокартина опухоли, тимуса и селезенки изучалась с помощью гистохимического метода Браше, использовали морфометрический анализ. Противоопухолевый эффект наблюдали более чем у 50% животных при использовании только МЖ или МЖ в комбинации с ИНЧ МП. У крыс контрольной группы отмечен рост опухоли, в ткани которой наблюдались высокая плотность расположения опухолевых клеток и многочисленные фигуры митоза (7-8 в поле зрения), часто с признаками атипии. Более чем у 33 % животных после воздействия исследованных факторов наблюдали регрессию саркомы 45 с замещением ткани опухоли соединительной тканью, обильно инфильтрированной лимфоцитами, плазмоцитами, макрофагами. При этом выявлены четкие признаки повышения функциональной активность органов иммунной системы (р < 0,05). Так, в тимусе увеличивались размеры долек, площадь коркового вещества (в 3 и более раз), значительно повышалась плотность лимфоклеточной популяции. В селезенке увеличивались число и размеры фолликулов, площадь герминативных центров, в которых была отмечена высокая митотическая активность (до 8-10 фигур митоза в поле зрения). Об активации межклеточных взаимодействий в органах иммунной системы свидетельствовало увеличение контактов тканевых базофилов с тимо-цитами (р < 0,05), а также заметное повышение (до 6-7 в поле зрения, р < 0,05) числа розеткоподобных комплексов из макрофагов и спленоцитов в красной пульпе селезенки.

Н.С. Егоров

БУДУЩЕЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ: ТЕХНОЛОГИИ

ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

ООО ИнтерЛабСервис, Москва

Несмотря на значительные успехи в области здравоохранения в последнее время, онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире. Рак развивается из одной единственной клетки и его развитие может быть инициировано как внешними, так и наследственными генетическими факторами. Шансы выздоровления у онкологических больных значительно возрастают в случае ранней диагностики злокачественных образований, а так же в случае правильного подбора терапии, которая нередко определяется генетическими факторами организма, такими как однонуклеотидные полиморфизмы и аберрации. Секвенирование всего генома является одним из способов изучения онкологических заболеваний.

Это самый мощный диагностический инструмент, который позволяет определять все мутации в геноме больного раком. В настоящее время секвениро-вание нового поколения методом синтеза является одной из самых быстроразвивающихся технологий в мире. В результате научных исследований по данной технологии выходит множество научных статей, посвященных диагностике и терапии рака. В 2004 г. закончился 1-й Геномный проект, который длился 15 лет. Его целью было определение полной нуклеотидной последовательности генома человека. На его реализацию были потрачены колоссальные средства. За один день работы сотня капиллярных секвенаторов могла получать не более 200 мб общей ёмкости данных. Современный секвенатор нового поколения компании Иллюмина HiSeq2000 за один сеанс запуска способен одновременно определить первичную структуру ДНК пяти человеческих геномов с 30-кратным покрытием каждый, что соответствует 600 Гб информации. Весь эксперимент длится всего 8-10 дней и предоставляет исследователю данные с точностью 99,99 %. Персональная система для полногеномного секве-нирования MiSeq является самой уникальной разработкой компании Иллюмина. Эта экономичная система занимает минимальное место в лаборатории и способна осуществлять полногеномное сек-венирование с обработкой результатов всего за 8 ч. Линейка секвенаторов компании Иллюмина подойдут для любых исследований, связанных с секвени-рованием de novo, с более узконаправленным ресе-квенированием, метагеномными исследованиями, а так же для изучения экспрессии генов и белок-белковых взаимодействий. Данные приборы могут быть эффективно использованы как для научных, так и для диагностических целей.

В.В. Елагин1'2, А А. Брилкина1, ЕА. Сергеева3,

В А. Надточенко4, Е.В. Загайнова2 ВОЗДЕЙСТВИЕ

ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫХ НАНОЧАСТИЦ И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

1НА РАКОВЫЕ КЛЕТКИ

1Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 2Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород 34ИПФ РАН, Н. Новгород 4Институт химической физики РАН, Москва

Плазмонно-резонансные золотые наночастицы обладают уникальными оптическими свойствами и могут быть использованы в медицине как для диагностики, так и для терапии патологических состояний. В рамках данного исследования решалось несколько задач. Во-первых, изучались особенности взаимодействия золотых наночастиц, покрытых ПЭГ с различной молекулярной массой, с раковыми клетками. Во-вторых, оценивалась эффективность проведения лазерного воздействия на раковые клетки в присутствии золотых наночастиц.

Материалы и методы. Исследование выполнено на клетках линии SKOV-3. В работе использовали золотые наночастицы в форме стержней, покрытые ПЭГ с молекулярной массой 6000Да и 40000Да. Взаимодействие наночастиц с клетками исследовали методом многофотонной флуоресцентной микроскопии. Лазерное воздействие осуществляли в непрерывном режиме с выходной мощностью от 0,5 до 3 Вт и длительностью 10мин. Оценку жизнеспособности клеток после воздействия проводили методом МТТ-теста.

Результаты. Методом многофотонной флуоресцентной микроскопии было выявлено, что наночастицы, покрытые ПЭГ 6000 Да, проникали в клетки, тогда как частицы, покрытые ПЭГ 40000 Да, обнаруживались на внешней стороне мембраны. При проведении лазерного воздействия на клетки, содержащие наночастицы, отмечалась гибель 33 % клеток уже при 0,5 Вт. По мере увеличения мощности гибель клеток увеличивалась и достигала 89 % при 3 Вт. Воздействие на клетки, не содержащие наночастицы, сопровождалось гибелью 64 % и 72 % только при мощностях 2,5 и 3 Вт.

Выводы. В ходе исследования было установлено, что на способность наночастиц проникать в клетки влияет тип покрытия. Также показано, что наночастицы могут быть использованы в качестве термосенсибилизаторов при проведении лазерной гипертермии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ГК №№ 02.740.11.0713, 14.740.11.1188, договор №

11.034.31.0017), РФФИ (проект № 09-02-00539).

К.В. Ермакова1, З.С. Смирнова1, И.Ю. Кубасова1, Л.М. Борисова1, М.П. Киселева1, Н.А. Оборотова1,

О Л. Орлова1, А.П. Полозкова1, Е.В. Санарова1,

ГА. Меерович2 ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛФ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА ТИОСЕНС ПРИ ФДТ ОЛИГОДЕНДРОГЛИОМЫ 14-4-9 гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ЦЕНИ ИОФ им. А .М. Прохорова РАН, Москва

Существенным недостатком традиционных методов лечения глиом является их низкая эффективность. Средняя продолжительность жизни больных с глиомами после хирургического удаления опухоли, лучевой и химиотерапии не превышает года. В мировой литературе имеются данные об эффективности ФДТ с использованием различных фотосенсибилизаторов при комбинированном лечении злокачественных глиом. С целью повышения уровня накопления фотосенсибилизатора в ткани мозга используют различные системы доставки, в том числе и липосомы.

Цель исследования. Оценка эффективности ФДТ с лиофилизированной липосомальной лекарственной формой отечественного фотосенсибилизатора Тиосенс (Тиосенс-ЛИО) в монотерапии и при комбинированном лечении олигодендроглиомы 14-4-9 (ОДГ).

Материалы и методы. ОДГ перевивали интра-краниально крысам по 1,5 млн. опухолевых клеток. Тиосенс-ЛИО с максимумом поглощения в спектральном диапазоне 720 нм вводили внутривенно в дозе 3 мг/кг на 6 день опыта за 24 ч до проведения ФДТ. Лазерное облучение проводили в дозе 90 Дж/см2. Лизомустин вводили однократно в дозе 80 мг/кг. Критериями эффективности служили увеличение продолжительности жизни опытных крыс по сравнению с контрольными животными (УПЖ, %) и излечение.

Результаты. Установлено, что терапевтическая эффективность ФДТ с использованием Тиосенса-ЛИО при интерстициальном лазерном облучении через трепанационное отверстие составляет 30 % УПЖ. При дополнительной декомпрессионной краниотомии (4х5 мм) и поверхностном лазерном облучении эффективность ФДТ с Тиосенсом не увеличилась, и УПЖ составило 29 %.

Наибольшая эффективность наблюдалась при комбинированном лечении с использованием декомпрессионной краниотомии, ФДТ с Тиосенсом-ЛИО и химиотерапии с Лизомустином. У 43 % крыс отмечалась стойкая ремиссия в течение 6 мес. и отсутствие признаков роста опухоли при аутопсии, что расценивалось как излечение. УПЖ оставшихся 57 % крыс составило 80 %.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности ФДТ с Тиосенсом-ЛИО при комбинированном лечении олигодендроглиомы.

Г.В. Жукова, Т.Н. Гудцкова,

М.И. Брагина, Н.М. Мащенко

ОСОБЕННОСТИ ЭФФЕКТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ОПОСРЕДОВАННОГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ-ФЕРРИМАГНЕТИКОВ И МИКРОВОЛНОВОГО РЕЗОНАНСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

ФГУ Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону

В эксперименте на 73 белых беспородных крысах изучали изменения в ткани перевивной саркомы 45 при опосредованных противоопухолевых эффектах двух различных факторов - микроволнового резонансного излучения (РИ) и наночастиц-

ферримагнетиков (магнитной жидкости). Воздействие низкоинтенсивным (менее 10 мкВт/см) РИ, имеющим частоту, совпадающую с частотой собственного излучения молекулярных кластеров воды (Синицын Н.И., Петросян В.И., Ёлкин В.А. и др., 2002), осуществлялось на голову животного, помещенного в плексигласовую камеру, в течение 3,5 недель. Экспозицию изменяли в течение курса в соответствии с алгоритмами активационной терапии (Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., 1990; Гаркави Л.Х., 2006). Магнитную жидкость АМ-01 на основе Ре304 (МЖ) вводили в разных дозах (более 100 мг/кг) подкожно на расстоянии 2-3 см от опухоли 5-6 раз в течение 3 недель. Ультратонкие срезы изучали и фотографировали на электронном микроскопе 1Е0Ь 1ЕМ-1011. Оба исследованные воздействия оказывали противоопухолевый эффект не менее, чем у 50 % животных в виде регрессии или выраженного торможения роста опухоли (более чем на 70 %). При этом результаты электронно-микрокопического исследования свидетельствовали о сходном влиянии исследованных воздействий на ультраструктурные характеристики некоторых клеток опухоли, повышении степени их дифференцировки, а также об активизации взаимодействий между клетками иммунной системы и клетками опухоли при действии РИ или МЖ. Это выражалось в расширении межклеточных пространств и заполнении их коллагеном, увеличении объема цитоплазмы, восстановлении характерной структуры эндоплазматического рети-кулума, в котором были отмечены протофибриллы коллагена. Были отмечены немногочисленные клетки с признакими апоптоза (маргинация хроматина, фрагментация клетки с образованием апоптозных телец). Контакты клеток иммунной системы с клетками опухоли и друг с другом были весьма многочисленны и носили множественный точечный характер. В зонах контакта в лейкоцитах наблюдалось образование цитоплазматических выростов и признаки активизации синтетических процессов. Меж-

клеточное пространство в зоне контактов макрофагов и клеток опухоли было заполнено электронноплотным содержимым. Отличительной особенностью действия МЖ явилось заметное количество нейтро-филов среди клеток иммунной системы, инфильтрирующих ткань опухоли.

Е.Ю. Златник, Г.И. Закора, Л.В. Передреева НАНОЧАСТИЦЫ МЕТАЛЛОВ КАК НОВЫЕ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ВЕЩЕСТВА

ФГУ Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону

Синтез и исследование биотропных свойств наночастиц различных веществ являются важнейшими инновационными разработками. Цель исследования - изучить возможные антипролиферативные эффекты НЧ. НЧ представляют собой ультрадис-персные порошки металлов (Cu, Zn, Fe и их сплава; размер 30-100 нм), синтезированные на Саратовском плазмохимическом комплексе ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС.

Опыты проводили на культурах опухолевых клеток (К562, HeLa, Х563), на ксенографтах опухолей больных, в эксперименте на перевиваемых опухолях (С37 и С180 мышей, С45 крыс).

Результаты показали, что при инкубации в присутствии НЧ усиливается как апоптотическая, так и некротическая гибель клеток культур. Показано выраженное угнетение их пролиферации и разрушение с явлениями вакуолизации ядра и цитоплазмы, кариопикноза, кариорексиса, кариолизиса. Клетки ксенографтов опухолей (рак легкого) также разрушаются под действием НЧ металлов, более интенсивно при инкубации с НЧСи и НЧZn, чем с НЧFe. Интересно, что при аналогичном культивировании ксенографтов тимуса мышей с НЧ наибольшее повреждающее действие отмечено у НЧFe. При изучении влияния НЧ на рост опухолей in vivo их взвесь вводили в область опухоли. В случае асцитной опухоли С37 после введения НЧ установлено резкое подавление накопления асцитической жидкости и снижение количества в ней живых опухолевых клеток.

Гистологическое исследование выявило обширные поля жировой дистрофии и некроза в опухолевой ткани после введения НЧСи и НЧZn в отличие от действия НЧFe, которые вызывали незначительный эффект. На модели солидной опухоли С180 показано, что введение НЧ способствует полной регрессии опухоли, наиболее быстро развивающейся при введении НЧ сплава и приводящей к существенному (3-4-кратному) повышению продолжительности жизни мышей. На модели С45 крыс продемонстрировано, что пролиферативный потенциал опухоли полностью угнетается при инкубации перевивного материала с НЧ сплава металлов.

Итак, нами установлено выраженное противоопухолевое действие НЧ металлов, реализующееся при локальном введении, причем НЧ Cu, Zn и сплава более активны, чем НЧ Fe. При системном введении мышам без опухолей показано отсутствие выраженного токсического действия исследованных НЧ на органы кроветворения и иммуногенеза. Таким образом, НЧ металлов, в частности Cu, Zn и сплава, могут стать основой для получения нового класса противоопухолевых веществ.

Авторы приносят благодарность профессору Саратовского медуниверситета В.Б. Бородулину за предоставление НЧ.

А.В. Иванов1, А.Б Соловьева2, Н.С. Мелик-Нубаров3, П.И. Толстых4, М.В. Уткина1 РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ

НАНОРАЗМЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ С ПОРФИРИНОВЫМИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРАМИ ДЛЯ ФДТ

ПОВЕРХНОСТНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ,

ГНОЙНЫХ РАН И ТРОФИЧЕСКИХ ЯЗВ

1РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ИХФ им. Н.Н. Семенова РАН, Москва 3МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 4ФГУ «ГНЦ лазерной медицины ФМБА», Москва В настоящее время ФДТ применяют не только при лечении новообразований, но и для лечения гнойных, долго незаживающих ран и трофических язв. Важным преимуществом ФДТ при лечении инфицированных ран является возможность воздействия на устойчивые к действию антибиотиков штаммы бактерий. Нами было обнаружено, что локальное использование фотосенсибилизаторов (ФС), иммобилизованных на некоторых типах ам-фифильных полимеров (АП) позволяет значительно увеличивать эффективность ФДТ. Методами атомно-силовой микроскопии и динамического рассеяния света установлено, что полученные модели лекарственных форм представляют наноразмерные комплексы, размерами от 1Q до 2QQ нм, зависящими от природы составляющих компонентов. Предложен механизм влияния полимеров на фотодинами-ческую эффективность ФС.

Проведены эксперименты in vitro на клеточных культурах и in vivo на лабораторных животных и показано, что комплексы ФС-АП в десять и более раз активнее исходных порфиринов, что позволяет снизить терапевтические дозы используемых ФС. При этом наблюдалось уменьшение количества отдаленных метастазов у лабораторных животных при воздействии на поверхностные опухоли. Показано, что эффективность комплексов при воздействии на опухоли разной природы определяется в первую очередь природой полимера. Созданы макеты лекарственных форм в виде пленок, гелей, спреев. Проведенные пилотные клинические испытания показали высокую эффективность созданных композиций в лечении долго незаживающих ран и ожогов. Предложен высокоэффективный способ лечения гнойных заболеваний мягких тканей, который позволяет предотвращать развитие вторичных некрозов и рост остаточной микрофлоры, обеспечивает стимулирование репаративных процессов и сокращает в 1,5 - 2 раза сроки лечения обширных гнойных ран. Совершенно очевидно, что предлагаемые лекарственные формы ФС найдут также применение при лечении воспалительных, эрозивных и неопластических процессов слизистой оболочки тканей в гинекологии, оториноларингологии и стоматологии, где достаточно широко применяются препараты в виде мазей, гелей и спреев.

Е.В. Игнатьева, НА. Машалова,

Е.В. Санарова, И.В. Ярцева МОДИФИКАЦИЯ

МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЦИТИНА В ЛЕКАРСТВННОЙ ФОРМЕ ТИОСЕНСА

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Тиосенс - комплексное соединение алюминия из класса тиофталоцианинов - получено в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и предназначено для фотодинамиче-

ской терапии опухолей. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН проводятся исследования по разработке лио-филизированной липосомальной лекарственной формы Тиосенса (ЛЛФТ-лио), представляющей собой многокомпонентную композицию, основой которой является яичный лецитин ЕРСS (Lipoid).

Цель исследования. Модификация методики количественного определения лецитина.

Материалы и методы. Образцы модели ЛЛФТ-лио; спектрофотометрия.

Результаты и выводы. Для количественного определения лецитина, самого значительного по массе компонента в ЛЛФТ-лио, предложена спектрофотометрическая методика, основанная на способности фосфолипидов образовывать хорошо растворимые в хлороформе окрашенные комплексы с аммония ферротиоцианатом. Максимум поглощения комплекса, полученного с яичным лецитином ЕРСS (Lipoid), регистрируется при 475 нм. Показано, что ингредиенты ЛЛФТ-лио, включая тиосенс, не оказывают существенного влияния на образование и спектральные характеристики комплекса лецитина с аммония ферротиоцианатом, а также то, что в диапазоне концентраций лецитина от 0,005 до 0,05 мг/мл соблюдается линейная зависимость оптической плотности от концентрации лецитина в растворе. Для определения содержания лецитина в единице лекарственной формы используют калибровочный график. Поскольку в процессе разработки ЛЛФТ-лио был выбран состав лекарственной формы с содержанием лецитина 300 мг во флаконе, для упрощения методики и сокращения времени ее выполнения предложено проводить определение с использованием рабочего стандартного образца (РСО) лецитина. Данный вариант методики обладает достаточной точностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка определения не превышает 2,0 %.

Работа поддержана Правительством г. Москвы.

А.В. Калугин1, Д.В. Новиков1, Е.Ю. Конторщикова2, М.Е. Мамаева3, В.В. Новиков1 ЗАВИСИМОСТЬ

ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ ОТ СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЭНДОМЕТРИЯ

1Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 2Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород

3ФГУ Приволжский окружной медицинский центр ФМБА, Нижний Новгород

Задачи исследования. Биологические чипы являются мощным инструментом изучения генома опухолевой клетки с целью выяснения «молекулярного портрета» опухоли. Среди широкого репертуара опухолеассоциированных генов выделяется группа РТ генов. Целью данной работы явилось сравнение частоты встречаемости мРНК РТ генов со степенью дифференциации аденокарциномы эндометрия.

Материалы и методы. С помощью ОТ-ПЦР было исследовано 33 образца периферической крови и 25 образцов опухолевых очагов больных с гистологически подтверждённым диагнозом аденокарциномы эндометрия I стадии.

Результаты и выводы. При сравнении частоты встречаемости мРНК генов MAGE A(1-6), XAGE1, MAGEC1, NY-ESO-1 и GAGE1-9 в солидных опухолях рака эндометрия с различной степенью дифференциации различий не обнаружено. В перифе-

рической крови при низкодифференцированной карциноме мРНК MAGE A(1-6) (5Q %) и XAGE1 (5Q %) выявлялись в 2 и в 4 раза чаще, чем при умеренно дифференцированной карциноме (22 % -MAGEA и 11 % - XAGE), и в 1,5 и 2 раза чаще, чем при высокодифференцированной карциноме (39 % - MAGEA и 22 % - XAGE). При низкодифференцированной карциноме мРНК NY-ESO-1 (16 %) встречались в 1,5 раза чаще, чем при умеренно дифференцированной карциноме (11 %), и в 3 раза чаще, чем при высокодифференцированной карциноме (5 %). Матричная РНК GAGE1-9 встречалась только в периферической крови при высокодифференцированной (16 %) и умеренно дифференцированной (11 %) карциноме, а мРНК MAGEC1 -только в крови при высокодифференцированной (22 %) и низкодифференцированной (16 %) карциноме. Таким образом, показана зависимость частоты встречаемости мРНК РТ генов в периферической крови больных раком эндометрия от степени дифференциации аденокарциномы.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2DD9-2D13 годы.

А .П. Каплун, А .С. Журавко, В.И. Швец ДОСТАВКА

МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва

Малые интерферирующие РНК (миРНК, siRNA) принимают участие в процессах РНК-интерференции, понижая экспрессию специфических генов, например в противовирусных реакциях и поддержании структуры хроматина. Молекулярные механизмы данных взаимодействий в настоящее время исследуются, в частности, была предложена гипотеза участия малых РНК в РНК-зави-симом метилировании ДНК. Один из протоколов лечения СПИДа и несколько протоколов лечения рака в настоящее время проходят первую стадию клинических испытаний.

Интенсивно исследуется использование миРНК для лечения злокачественных опухолей. Но, как и в случае других противоопухолевых препаратов, направленная доставка в целевые клетки является одной из ключевых задач. Кроме того, РНК довольно лабильная молекула, в биологических жидкостях она легко гидролизуется. И наконец, нуклеиновые кислоты несут значительный отрицательный заряд, что негативно сказывается на их способности проникать через плазматическую мембрану. Обозначенные трудности можно преодолеть включением миРНК в наноносители - в этом случае нуклеиновая кислота будет защищена от действия нуклеаз, с одной стороны, с другой стороны, эффект пассивного нацеливания должен способствовать накоплению в опухоли, и наконец, с третьей стороны, наночастицы могут быть конъюгированы с «молекулярным адресом», что еще в большей степени увеличит селективность доставки терапевтического препарата в опухолевые клетки.

В докладе рассматриваются главные аспекты использования миРНК как противоопухолевых средств: выбор целевого гена, типы наночастиц, используемых для загрузки миРНК, способы модифификации наночастиц для придания им свойств направленного транспорта, преодоления мембраны клеток, главные результаты, полученные с использованием нанотранспорт-ных систем для лечения злокачественных опухолей, перспективы развития данного направления.

П.С. Качесова1, О.Ф. Евстратова1,

И А. Горошинская1, Е.В. Шалашная , В.Б. Бородулин2 ИЗМЕНЕНИЯ В ТКАНИ ОПУХОЛИ ПРИ ВВЕДЕНИИ НАНОЧАСТИЦ ЦИНКА 1И СПЛАВА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

1ФГУ Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону

2ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, Саратов

Интерес изучения действия на организм нано-дисперсных порошков таких биогенных металлов, как цинк (7п), медь (Си), железо (Ре) обусловлен разнообразием их биологических функций. Участие данных элементов в реакциях свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты, регуляции апоптоза, активации протоонкогенов и др., связанных с процессами малигнизации и прогрессии опухоли, позволяет предполагать возможность их влияния на развитие опухоли и состояние механизмов противоопухолевой резистентности. Цель исследования - изучить стуктурно-функциональные изменения в ткани опухоли при воздействии НЧ цинка и сплава (Си-Ре-7п). Эксперимент проводился на белых нелинейных крысах-самках весом 200250 г с перевиваемой саркомой 45 (С-45). Животные были разделены на три группы: первая - введение Нч цинка; вторая - введение Нч сплава; третья - контроль. Порошки металлов суспендировали в физиологическом растворе. Взвесь Нч вводили в опухоль или внутрибрюшинно (1,25 мг/кг массы), суммарная доза составила 10 мг/кг (доза восьмикратного введения). Контрольные животные получали физиологический раствор внутрибрюшинно (0,3 мл). Животных декапитировали на 28-29 сутки после перевивки опухоли. Морфофункциональное состояние опухоли определялось с помощью соответствующих гистохимических методов и последующей морфометрией. В результате проведенных исследований было выявлено, что влияние НЧ на кинетику роста С-45 зависело от способа введения. При внутриопухолевом введении Нч цинка у всех животных была достигнута частичная регрессия опухоли (средний вес опухоли - 1,2±0,6 г, объем -

1,0±0,5 см3). Внутрибрюшинное введение НЧ цинка привело к более интенсивному росту опухоли (увеличение веса на 54,8 % и объема на 28 % по сравнению с контролем). Введение нанодисперсного порошка сплава привело к полной регрессии саркомы у 50 % животных. При внутриопухолевом введении - в 75 % случаев, при внутрибрюшинном

- в 25 % (вес остаточной опухоли 0,0-0,04 г, объем 0,0-0,065 см3). У остальных животных средние значения веса и объема опухоли не отличались от значений в контрольной группе. В контрольной группе у всех животных наблюдался рост С-45 (среднее значение веса опухоли - 5,2±0,7 г; объема - 6,0±0,9 см3); в большинстве полей зрения препарата опухоли наблюдалось плотное расположение опухолевых клеток, содержащих до 6-8 фигур митоза, в том числе - атипичных. Исследование гистопрепаратов, полученных от животных с полной регрессией С-45, показало, что во всех полях зрения наблюдалась регрессия опухолевой ткани и замещение её соединительной тканью, инфильтрированной лимфо-плазмоцитарными элементами и макрофагами. В случаях частичной регрессии С-45 микрокартина опухоли свидетельствовала о дистрофических изменениях большинства опухолевых клеток (в 3/4 полях зрения), с низким (до 3) содержанием в них фигур митоза и инфильтрацией лимофидными

клетками. Обращало внимание, что даже у животных с продолженным ростом опухоли после введения НЧ цинка и сплава выявленная микрокартина ткани опухоли свидетельствовала об ее изменениях: кроме наличия участков некроза, обнаруживались группы дистрофически измененных опухолевых клеток с низкой плотностью их расположения и уменьшением количества фигур митоза. Таким образом, при введении нанодисперсного порошка цинка и сплава (Cu-Fe-Zn) происходит изменение динамики роста опухоли: усиление её роста, полная или частичная регрессия. Интересно, что даже при дальнейшем росте опухоли наблюдаются признаки её структурно-морфологической деструкции.

В.С. Косоруков1, КА. Скрыпник1, Е.М. Трещалина1,

Н.В. Андронова , Т.В. Комарова2, Ю.Л. Дорохов2

ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ

ДЕЙСТВИЕ СУБСТАНЦИИ

РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

ПРОТИВ ОНКОАНТИГЕНА HER2/NEU,

ПОЛУЧЕННОЙ

1ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОДУЦЕНТА

1РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

2МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

Her2/neu - представитель семейства рецепторов эпидермального фактора роста, роль которого в этиологии и патогенезе ряда опухолей, в том числе РМЖ и рака яичников человека, считается доказанной. Примерно у 30 % больных раком молочной железы, так называемых HER2-позитивных и наиболее опасных форм рака, наблюдается суперпродукция этого онкобелка, что вызывает ускоренное метастазирование и устойчивость к терапевтическому воздействию. Известно, что полученные по технологии культивирования клеточных культур рекомбинантные антитела против этого антигена (Герцептин) имеют терапевтически значимый эффект и активно применяются в практике. Нами были созданы рекомбинантные гуманизированные антитела против антигена Her2/neu (Фитогермаб), получаемые с использованием оригинального подхода в растении Nicotianа benthamiana. Полученная субстанция имела достаточную для проведения чистоту и стабильность.

Цель исследования. Изучение противоопухолевого действия рекомбинантного антитела Фито-гермаба на перевиваемом раке молочной железы человека с гиперэкспрессией Her2/neu у иммуно-дефицитных мышей.

Материалы и методы. Перевиваемый рак молочной железы человека SKBR3 представляет собой аденокарциному, содержащую на своей поверхности до 1,6х10 рецепторов Her2/neu на клетку. В исследовании был использован штамм перевиваемого рака яичников человека SKBR3 из Коллекции РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, который формирует стабильные подкожные ксенографты у nude мышей. Клетки имплантировали подкожно в прививочной дозе 3 млн клеток на мышь. На 6-е сутки после прививки опухолевых клеток производили измерение опухолевых узлов и делили животных на три группы - контроль, лечение Фитогер-мабом и лечение препаратом сравнения Герцепти-ном. Лечение антителами проводили инъекциями внутрибрюшинно 9-дневным курсом: 1-я инъекция в дозе 20 мг/кг, вторая инъекция через 24 ч, а остальные 7 инъекций через 48 ч в разовой дозе 10 мг/кг. Курсовая доза составила 100 мг/кг, длительность курса - 15 дней, с 6 по 21 сутки. Контрольной группе вводили растворитель в соответствующих

объемах. Противоопухолевый эффект лечения оценивали по общепринятому показателю торможению роста опухоли (ТРО). Для вычисления Т/С (ГваШвп1/сопО'о1) с помощью электронного измерителя многократно в процессе и после лечения измеряли опухолевые узлы и рассчитывали средние объемы (Уср) в каждой группе. Минимальный критерий эффективности Т/С<42 %.

Результаты. В опытной группе введение Фито-гермаба осуществлялось в запланированном режиме при удовлетворительной переносимости лечения. Ухудшения состояния или гибели мышей в результате введения фитогермаба отмечено не было. В группе Фитогермаба на протяжении всего периода лечения и в течение 1 суток после лечения опухолевые узлы были достоверно в 11 раз меньше, чем в отрицательном контроле. Показатель ТРО на 11, 15, 19 и 22 дни составлял 31 %, 20 %, 14 % и 9 % соответственно (р<0,05). В группе мышей, получавших Герцептин, размеры опухоли были достоверно более чем в 6 раз меньше, чем в группе контроля. ТРО составил 32 %, 22 %, 21 % и 15 % на 11,15,19 и 22 дни соответственно. Статистически достоверных различий с группой Фитогермаба не выявлено.

Заключение. Полученный эффект дает возможность охарактеризовать субмтанцию растительных антител Фитогермаб, как равноэффективную препарату Герцептин в отношении воздействия на аденокарциному молочной железы человека БКБК3.

ЕА. Котова1, А .П. Полозкова1,

Е.В. Игнатьева1,И.И. Краснюк2, Н.А Оборотова1 ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПЕГИЛИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ

1ФОРМЫ ЦИФЕЛИНА гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

2ПМГМУ им. И.М.Сеченова, Москва

Наряду с положительными свойствами обычных липосом (защита от биодеградации, постепенное высвобождение ЛВ, снижение токсичности, пассивное нацеливание в «горячие точки»), появляется нежелательное взаимодействие липосом с белками плазмы, в результате которого полученные комплексы захватываются из кровотока макрофагами ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). Из-за способности блокировать механизмы поглощения липосом клетками РЭС, за счет создания избыточного осмотического давления в примембранной области эффективным подходом является поверхностная модификация везикул гликолипидами, например производными полиэтиленгликоля.

Задачи исследования. Разработать оптимальный состав пегилированной липосомальной формы цифелина.

Материалы и методы. Многослойные липосо-мы (МСЛ) содержали лецитин, холестерин (Хол), ПЭГ-2000-дистеароилфосфатидилэтаноламин и

цифелин в различных молярных соотношениях. После получения липидной пленки ее гидратировали 150 мМ раствором натрия хлорида.

Для получения однослойных липосом проводили экструзию МСЛ через мембранные фильтры 0,2 мкм. Эффективность включения цифелина определяли после стерилизующей фильтрации полученной эмульсии, поскольку неинкорпорированные в липосомальную оболочку кристаллы ЛВ задерживаются на фильтре и легко отделяются.

Количественное содержание цифелина определяли методом спектрофотометрии спиртового разведения полученных фракций и исходных липосо-мальных растворов.

Результаты и выводы. По результатам изучения различных составов липосом можно сделать следующие выводы. Избыточное количество холестерина не включается в мембрану и на стадии образования МСЛ образует обильный кристаллический осадок на дне колбы. Большое количество цифелина остается на фильтре при стерилизующей фильтрации; данное явление обусловлено высоким содержанием липидного производного ПЭГ-2000, которое, встраиваясь в мембрану везикул, занимает возможные участки связывания ЛВ. Введение малых количеств дополнительных компонентов прописи (Хол и ПЭГ-2000-ДСФЭ) также привело к затруднениям: пленку гидратировали длительное время, значительная часть образовала плотную массу и отмылась с колбы только органическим растворителем. Таким образом, разработан состав стерически стабилизированных липосом цифелина с оптимальным молярным соотношением ФХ: Хол: ПЭГ-2000-ДСФХ 165:8:1 и 12,4:1 к цифе-лину с включением ЛВ 98,32 %.

Е.А. Котова1, Е.В. Санарова1, С.Г. Козеев2,

А.В. Ланцова,1 О.Л. Орлова1, С.А. Партолина,1 Е.В. Игнатьева1, И.И. Краснюк2, НА Оборотова1 ОКИСЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ ЛИПОСОМ

1В ПРОЦЕССЕ ЛИОФИЛИЗАЦИИ гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

2ПМГМУ им. ИМ. Сеченова, Москва

Основным деструктивным процессом в липидах является окисление, затрагивающее ненасыщенные связи жирных кислот. Перекисное окисление (ПО) липосомальных фосфолипидов представляет собой типичный свободнорадикальный процесс, продуктами которого являются диеновые конъюгаты, гидроперекиси, альдегидоспирты, окси- и кетокисло-ты, которые отрицательно влияют на качество ли-посомального препарата.

Задачи исследования. Оценить степень окис-ленности липосомальных фосфилипидов по концентрации конечного продукта ПО - малонового диальдегида (МДА) после лиофилизации липосом, полученных различными технологическими методами.

Материалы и методы. Большие многослойные липосомы (БМЛ) содержали лецитин, холестерин, ПЭГ-2000-дистеароилфосфатидилэтаноламин в

молярном соотношении 165:8:1, а в состав с антиоксидантом (АО) добавляли 13 мг 10%-го масляного раствора а-токоферола ацетата. После получения липидной пленки ее гидратировали 150 мМ раствором натрия хлорида. Для получения однослойных липосом применяли три метода: экструзию, измельчение УЗ и гомогенизацию. Моноламеллярные липосомы стерилизовали фильтрацией и смешивали с 40% стерильным раствором сахарозы в соотношении 3:1. Приготовленные образцы дозировали по 5 мл и подвергали сублимационной сушке. Концентрацию МДА определяли по стандартной методике с тиобарбитуровой кислотой.

Результаты. Уровень содержания МДА в БМЛ составил для пустых липосом (ПЛ) - 0,68

нмоль/мл, а для липосом с АО - 0,65 нмоль/мл. Гомогенизация и последующая лиофилизация липо-сом приводили к значительному повышению концентрации МДА (ПЛ - 3,74 нмоль/мл; липосомы с АО - 3,88 нмоль/мл). Содержание МДА после экструзии и лиофилизации ПЛ (3,69 нмоль/мл) и липосом с АО (3,81 нмоль/мл) по сравнению с БМЛ возрастало более чем в 5 раз, а обработанные УЗ и лиофилизированные липосомы имели значения концентрации МДА для ПЛ - 4,93 нмоль/мл, для липосом с АО - 4,64 нмоль/мл.

Выводы. Уровень ПО возрастает при измельчении и лиофилизации липосом. Отрицательное влияние лиофилизации в большей мере выражено для липосом, измельченных УЗ. Степень окислен-ности липидов лиофилизированных липосом, полученных методами гомогенизации и экструзии, менее выражена. Разница концентраций МДА между ПЛ и липосомами с АО незначительна.

Ю.М. Краснопольский1, А.Е. Степанов2, В.И. Швец2 ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ЛИПОСОМ, СОДЕРЖАЩИХ ДОЦЕТАКСЕЛ

1 Национальный технический университет «Харьковский политехнический институт», Харьков 2МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва

Задачи исследования. Широкое распространение получило использование таксанов, в частности доце-таксела (ДТ), в качестве противоопухолевого лекарственного препарата. Доц обладает широким спектром противораковой активности. В то же время ДТ отличает высокая токсичность, а также крайне низкая растворимость в воде, что затрудняет подбор подходящих форм дозировки и значительные технологические трудности при производстве. Одним из приоритетных направлений в развитии современных фармацевтических технологий является разработка и создание терапевтических систем направленного действия, для чего с успехом применяются наносомальные носители лекарственных веществ, которые способны увеличивать нацеленность действия и обеспечивают увеличение биодоступности. Применение липосом (ЛС) в качестве носителей лекарственных веществ позволяет повысить селективность их действия и снизить токсичность. Использование ЛС актуально при лечении ряда заболеваний, в том числе злокачественных образований, когда оптимизация биораспределения сильнодействующих препаратов является решающим фактором для повышения их результативности и улучшения качества жизни пациента. Цель данного исследования заключалась в создании водорастворимой формы ДТ, включенного в липосомы.

Материалы и методы. Приготовление ЛС проводили методами, разработанными нами ранее. Препараты животным вводили внутривенно (в/в) и внутрибрюшинно (в/б). Определение величины частиц ЛС проводили методом фотонной корреляционной спектроскопии. Количественное определение посторонних примесей и содержания ДТ проводили методом ВЭЖХ.

Результаты и выводы. В ходе проведенного исследования изучена зависимость включения ДТ в ЛС при различном соотношении компонентов. При соотношении ДТ: фосфолипиды (ФЛ) выше 1:15 наблюдается полное включение цитостатика в ЛС; также было установлено, что размер ЛС в жидких образцах практически не зависит от соотношения ДТ и липидного компонента. Установлено количество ДТ, включенного в липидный бислой. Введением в состав ЛС дифосфа-тидилглицерина (ДФГ) мы стремились к повышению специфического действия ЛС, содержащих ДТ. Это предположение основано на известном факте взаимодействия ДФГ и ДНК хроматина с образованием структур, способных запускать программированную гибель клетки (апоптоз), в частности опухолевых клеток. После лиофилизации препаратов доказано сохранение размеров ЛС в нанодиапазоне.

Размер ЛС в лиофилизированных образцах зависит от соотношения ДТ/ФЛ и от концентрации липидной субстанции. Увеличение в составе образцов ЛС фосфа-тидилхолина и лактозы стандартизует и стабилизирует ЛС после регидратации.

Изучено влияние температурных параметров растворителя на размер ЛС при регидратации; кроме того, размер ЛС и их стабильность после регидратации зависит от соотношения массы продукта и количества взятого растворителя. Изучены физикохимические свойства ЛС. Проведено изучение токсичности ЛС образцов, содержащих ДТ по сравнению с его свободной формой, определена величина LD50. Использование ЛС форм ДТ продемонстрировало отсутствие снижения токсичности при в/б введении и обнаружен эффект при в/в введении. В докладе представлены данные по изучению цитотоксической активности ЛС препаратов на линейных мышах C57Bl, DBA с перевитыми международными штаммами опухолей: метастазирующая карцинома Льюиса, солидный рак Эрлиха и лимфолейкоз L1210. Установлено, что фармакологическая активность ЛС после регидратации препарата зависит от состава образцов, а именно от соотношения между таксаном, фосфати-дилхолином и криопротектором.

Н.Р. Кузнецова1, Е.В. Свирщевская1,

Н.С. Ситников2, А.С. Шавырин3, И.П. Белецкая4,

А.Ю. Федоров2, Е.Л. Водовозова1 НАНОРАЗМЕРНЫЕ ЛИПОСОМЫ, НАГРУЖЕННЫЕ

ЛИПОФИЛЬНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ АНАЛОГА КОЛХИЦИНА: ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ В КУЛЬТУРАХ

1ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

1ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

2РАН, Москва

2Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

3Институт металлоорганической химии им. ГА. Разуваева РАН, Нижний Новгород 4мГу им. М.В. Ломоносова, Москва

Задачи исследования. Доставка лекарств в опухоли в виде липофильных пролекарств в мембране липосом позволяет уменьшить утечку препарата в процессе циркуляции в кровотоке и при взаимодействии с клеткой-мишенью, а также изменить механизм проникновения лекарства в клетку и его внутриклеточный трафик. В данной работе получены липосомы, несущие сложноэфирные липо-фильные конъюгаты нового антимитотического агента - триазольного производного колхицина (trAzCh), лиганда колхицинового сайта тубулина. Исследована цитотоксичность липосомальных препаратов в сравнении с trAzCh в 6 культурах опухолевых клеток человека.

Материалы и методы. Экструзионные 100-нм-липосомы состава яичный фосфатидилхолин / фос-фатидилинозит из S. cerevisiae / пальмитоильное или олеоильное производные trAzCh (Pam-trAzCh и Ole-trAzCh) 8:1:1 получены на установке MiniExtruder (Avanti, США) при 30 °С. Использовали линии эпителиальных клеток HBL-100 (молочная железа) и HEK-T (почка) и лимфобластных клеток К-562, THP1, RPMI 88 и CCRF-CEM. Цитотоксиче-скую активность определяли с помощью МТТ-теста в течение 72 ч в серии разведений препаратов от 10 мкМ до 1 нМ.

Результаты. Показано, что липосомы среднего диаметра 100 нм количественно включают 10 моль % Pam-trAzCh или Ole-trAzCh. Практически во всех культурах клеток наблюдается одинаковая тенденция: цитотоксичность липосомальных препаратов несколько превышает таковую исходного trAzCh. Значения IC50 для trAzCh - от 0,15 мкМ до 10

мкМ, а для липосом с Раш-1гЛ7СЬ или 01е-1гЛ7СЬ -от 0,05 мкМ до 0,8 мкМ.

Выводы. Можно предположить, что доставка нового антимитотического агента к внутриклеточной мишени - тубулину - облегчается за счет включения его липофильных производных (гидролизуемых эстеразами) в липосомы. Необходимы исследования токсичности липосомальных препаратов нового аналога колхицина на животных.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты № 09-03-00647 и № 10-04-01021) и ФЦП (контракт 16.740.11.0476).

В.Н. Кулаков, А А. Липенгольц БИНАРНАЯ ЛУЧЕВАЯ ТЕРАПИЯ: ПРИНЦИПЫ, ОБЕСПЕЧЕНИЕ, ПЕРСПЕКТИВЫ

Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА РФ, Москва

Дистанционная лучевая терапия (ДЛТ) с использованием ионизирующего излучения в настоящее время является наиболее востребованной терапевтической технологией в лечении злокачественных новообразований. Развитие методов ДЛТ можно разделить на два основных этапа: традиционная ДЛТ - техническое совершенствование медицинских источников ионизирующего излучения, преимущественно гамма-излучателей и электронных ускорителей, а также использование источников адронного излучения (нейтроны, протоны, заряженные ионы).

Широкое клиническое использование адронного излучения ограничивает высокая стоимость аппаратуры - ядерные реакторы, циклотроны и т. д. В традиционной ДЛТ основным источником побочных эффектов является повышенная лучевая нагрузка на нормальные ткани, избежать которую не удается даже в технологиях томотереапии, когда обеспечивается максимально точное наведение потока ионизирующего излучения на мишень.

Дальнейшее развитие лучевой терапии связано, в первую очередь, со становлением бинарных лучевых технологий и их внедрением в клиническую практику.

В работе дается классификация современных технологий для бинарной лучевой терапии (БЛТ) злокачественных новообразований. В отдельную группу объединены БЛТ на основе ионизирующего излучения - потоки нейтронов и рентгеновского излучения. Даются общие представления о механизмах БЛТ: нейтронозахватная (НЗТ), фотонозахватная (ФЗТ) терапии и фотодинамическая терапия (ФДТ). Проводится анализ состояния в мире обеспечения БЛТ основными компонентами - источниками ионизирующего излучения и специальными препаратами, применение которых обеспечивает вторичное локальное выделение энергии, величина которой является губительной для клеток облучаемой мишени.

Потенциальные возможности БЛТ сравниваются с терапевтическими возможностями ФДТ. Обсуждаются терапевтические возможности БЛТ и ФДТ, а также перспективы их широкого клинического применения в терапии злокачественных новообразований.

Основным фактором, тормозящим внедрение технологий БЛТ в клиническую практику, является отсутствие в настоящее время лекарственных средств, обеспечивающих высокий коэффициент дифференциального накопления необходимых элементов (10В, Б1 и других элементов с порядко-

вым номером Z>52). Обсуждаются перспективы применения для поиска эффективных субстанций предложенной нами системы скрининга.

Рассматриваются перспективы различных направлений для создания новых эффективных лекарственных средств для реализации технологий БЛТ. Обсуждаются перспективы реализации дизайна лекарственных средств при современном состоянии развития химии, супрамолекулярной химии и нанотехнологии.

А.В. Ланцова, НА. Оборотова,

Н.М. Перетолчина, Е.В. Санарова

НАНОСТРУКТУРИРОВАННАЯ

ЛИПОСОМАЛЬНАЯ

ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ЛИЗОМУСТИНА

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Одним из основных методов лечения онкологических заболеваний является химиотерапия. Однако эффективность данного метода достаточно низкая, а побочные эффекты, оказываемые на организм пациента, зачастую настолько сильны, что приводят к гибели человека не от основного заболевания, а от воздействия химиопрепарата на ранее здоровые органы и системы организма.

Избирательное поступление препарата непосредственно в опухоль и направленное воздействие на неё позволяет значительно снизить побочное действие на нормальные клетки и максимально увеличить терапевтический эффект лекарственного средства.

Данную ситуацию кардинальным образом может изменить применение наноструктурированных противоопухолевых препаратов.

Лизомустин - оригинальный отечественный противоопухолевый препарат, хлорэтильное производное нитрозомочевины на основе L-гомоцитруллина. Клиническое изучение лизомустина показало эффективность препарата при мелкоклеточном раке легкого и меланоме кожи.

Цель исследования. Для расширения возможностей клинического изучения препарата Лизомустин, разработать наноструктурированную лекарственную форму в виде липосом для внутривенного введения и провести ее биофармацевтическое изучение.

Материалы и методы. Субстанция лизомусти-на (ООО «Академфарм»); «Лизомустин лиофилизат для приготовления раствора для инъекций Q,1 г» (ООО фирма «ГЛЕС»); Липосомальная нанострук-турированная дисперсия лизомустина с использованием дистеaроилфосфaтидилэтaнолaминполиэтиленгликоля-5000 (Avanti Polar Lipids, США) (лаборатории разработки лекарственных форм. НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН).

Результаты и выводы. Разработана нанострук-турированная пегилированная липосомальная лекарственная форма Лизомустина.

Липосомы лизомустина получали гидратацией липидной пленки, образующейся после упаривания в вакууме растворов липидов, водным раствором субстанции лизомустина с последующей экструзией липосомальной дисперсии через поликарбонат-ные мембраны с уменьшающимся диаметром пор.

Показан высокий противоопухолевый эффект наноструктурированной лекарственной формы Ли-зомустина на лимфобластном лейкозе L-121Q во всех тестируемых дозах (125-25Q мг/кг), который выражен в расширение диапазона терапевтических доз и снижение токсичности препарата.

Работа поддержана грантом Президента РФ для молодых российских ученых кандидатов наук.

Г.Н. Маслякова1, А.Б. Бучарская1, Н.А. Наволокин1, А А. Широков2, А .М. Буров

ПРИМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ

МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 1В НАНООНКОЛОГИИ

1ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, Саратов

2Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов

В настоящее время в биомедицинских исследованиях широко применяются нанотехнологии, которые позволяют улучшить раннюю диагностику опухолей за счет повышения качества визуализации, и, следовательно, оптимизировать лечение новообразований. Морфологические методы исследования остаются «золотым» стандартом при диагностике опухолей и определении степени патомор-фоза новообразований при воздействии различных химических и физических факторов, в том числе под влиянием наночастиц.

Цель исследования. Проведение сравнительного анализа информативности различных методов морфологического определения патоморфоза в перевиваемых опухолях лабораторных животных при различных путях введения наночастиц.

Материалы и методы. Наночастицы железа, 30 самцов белых беспородных крыс, перевиваемый рак почки и печени крыс, морфологические методы, морфометрические методы.

Результаты и выводы. При проведении стандартного морфологического исследования с окраской гистологических срезов гематоксилином и эозином существенных различий в опухоли до и после введения наночастиц железа обнаружено не было. При применении морфометрических методик были установлены изменения размера и площади, а также ядерно-цитоплазматического коэффициента в клетках опухоли и количества сосудов, что позволило оценить структурные изменения опухоли. Применение гистохимических методов исследования позволяет выявить нарушения обменных процессов в клетках опухоли, степень выраженности склероза и т.д. Идеальным вариантом дополнительных методов исследования является применение иммуногистохимии, позволяющей судить о пролиферативной активности клеток и степени выраженности апоптоза. Таким образом, для получения полной информации о биологической активности опухоли, степени ее патоморфоза и возможного определения прогноза заболевания необходимо использовать весь комплекс морфологических методов исследования от стандартных окрасок до им-муногистохимических исследований.

О.В. Минаева, Н.Н. Зырняева, Г.С. Столяров,

А А. Фирсов, О.Е. Лунина, НА. Плотникова ИССЛЕДОВАНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ МАГНИТНОЙ ЖИДКОСТИ НА ОСНОВЕ МАГНЕТИТА FE3O4, СТАБИЛИЗИРОВАННОГО ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ

ГОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева, Саранск

Магнитные жидкости (МЖ) могут быть использованы в системах направленной доставки лекарственных препаратов, индукционной гипертермии и различных диагностических методах. Для биомедицинского применения МЖ необходимы данные о ее токсичности.

Цель работы. Исследовать острую токсичность магнитной жидкости на основе магнетита Fe3O4 при

ее внутривенном введении и определить причину гибели животных.

Материал и методы. В данной работе была использована магнитная жидкость на основе магнетита Ре304, стабилизированного олеиновой кислотой. Частицы магнетита в коллоидном растворе имеют преимущественно сферическую форму и размеры 5-15 нм, что подтверждено данными инфракрасной дифрактометрии и электронной микроскопии. Концентрация Ре304 в коллоиде была равна 25 мг/мл. Исследование проводилось на 50 нелинейных половозрелых лабораторных крысах массой 220-280 г. Животные были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой. В контрольной группе животным внутривенно вводили 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В 1-й - 4-й опытных группах внутривенно вводили магнитную жидкость в объемах, обеспечивающих попадание в кровоток 75, 150, 300 и 450 мг/кг Ре304. Павших крыс вскрывали, оценивали макро- и микроскопическую картину внутренних органов. Определяли значение максимально переносимой дозы (МПД), абсолютно смертельной дозы (Ь0100) и среднесмертельной дозы (Ь050). Данные показатели определяли в пересчете на Ре304.

Результаты. Максимально переносимая доза МПД магнитной жидкости составляла 150 мг Ре304 на 1 кг массы тела животного. Абсолютно смертельная доза составляла 450 мг Ре304 на 1 кг массы тела животного, рассчитанное значение среднесмертельной дозы Ь050 составило 378 мг Ре304 на 1 кг массы тела. При введении абсолютно смертельной дозы МЖ смерть животного наступала в течение 1-30 минут после инъекции. Причиной смерти была микроэмболия легочных сосудов, что подтверждалось на вскрытии: находили увеличенные в размерах, полнокровные легкие, расширенные правые камеры сердца и полые вены. При микроскопическом исследовании легких отмечалось полнокровие сосудов, в ряде случаев - лейкоцитарная инфильтрация межальвеолярных перегородок, ателектазы. В других органах значимых макро- и микроскопических изменений не определялось.

Выводы. Магнитная жидкость на основе магнетита Ре304, стабилизированного олеиновой кислотой, является малотоксичным соединением и может быть использована для биомедицинских целей. Однако при ее применении необходимо учитывать возможность отдаленного токсического действия.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента молодым кандидатам наук МК-5268.2011.7.

НА. Наволокин, А.Б. Бучарская, С.М. Кун,

Г.Н. Маслякова, Г.С. Терентюк, Б.Н. Хлебцов,

Н.Г. Хлебцов

ДИНАМИКА

МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ОРГАНАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВНУТРИВЕННОМ ВВЕДЕНИИ НАНООБОЛОЧЕК ЗОЛОТА

ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, Саратов Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов

В мире отмечается неуклонный рост смертности от злокачественных новообразований. Традиционные методы лечения имеют ряд побочных действий и часто малоэффективны, возрастает необходимость разработки новых методов лечения с использованием высоких технологий, в частности ЗНЧ, которые могут применяться для диагностики и лечения опу-

холей. Известно, что золото проявляет высокую химическую активность, обусловленную его физикохимическими свойствами, в связи с чем возникает необходимость в изучении токсичности ЗНЧ.

Цель исследования. Изучить динамику морфологических изменений во внутренних органах лабораторных животных при введении ЗНЧ.

Материалы и методы. Золотые нанооболочки диаметром 160 нм (концентрация золота 153 мкг/мл), белые беспородные крысы - самцы, морфологические методы. Белым беспородным крысам внутривенно вводили в хвостовую вену 1 мл золотых нанооболочек. В динамике через определенные промежутки времени забирались органы для гистологического исследования.

Результаты. В печени через 30 мин наблюдалось незначительное полнокровие и зернистость, вакуолизация цитоплазмы. Через 1,5 ч - умеренное полнокровие внутрипеченочных сосудов и сепарация крови, увеличение клеток Купфера, фрагментация цитоплазмы гепатоцитов. Через 8 ч - умеренное полнокровие и белковая дистрофия гепатоци-тов. В селезенке через 30 мин нет четкого деления на красную и белую пульпу, полнокровие. Через

1,5 ч - умеренное полнокровие, появляется четкая граница. Через 4 ч - выраженное полнокровие и большое количество скопления черных гранул. В почках через 30 мин - неравномерное полнокровие клубочков, дистрофия эпителия извитых и прямых канальцев и отек мозгового вещества. Умеренное полнокровие сосудов и сепарация крови. Через 1,5

ч клубочки малокровные, капсула свободная, эпителий прямых и извитых канальцев дистрофичен. Через 8 ч клубочки обычных размеров, просвет капсулы свободный. Умеренная дистрофия извитых канальцев и полнокровие коры.

Выводы. Морфологические изменения во внутренних органах при внутривенном введении золотых наночастиц зависят от времени и носят обратимый характер.

НА. Наволокин, Г.Н. Маслякова, X.M. Kong,

О.В. Матвеева, А .Б. Бучарская МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВО ВНУТРЕННИХ ОРГАНАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ОДНОКРАТНОМ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ НАНОЧАСТИЦ ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, Саратов

Развитие нанобиотехнологий привело к возникновению новой области медицины - наноонкологии. В настоящее время наиболее перспективными считаются использование НЧ для диагностики в качестве контрастного вещества для магнитнорезонансной томографии. Однако остаются малоизученными факторы потенциальной токсичности НЧ, связанные с высокой реакционной способностью НЧ, поэтому необходимо изучение влияния НЧ железа на живые организмы для выявления наиболее безопасного и эффективного вида частиц для последующего применения их в медицине.

Цель исследования. В экспериментах изучить морфологические изменения в органах лабораторных животных при однократном пероральном введении наночастиц Fe.

Материалы и методы. Наночастицы Fe 70 нм. ± 10нм., 12 самцов белых беспородных мышей и 12 самцов белых беспородных крыс, морфологические методы.

Было выделено 2 группы животных - 6 самцов мышей и 6 крыс, получавших перорально однократно раствор наночастиц Ре (5 мг/кг), 2 контрольные группы (по 6 самцов белых мышей и крыс) получали однократно 1 мл 0,9 % раствора ЫаС1 перорально. Все животные выводились из эксперимента путем декапитации через 2 ч.

Результаты. В толстом и тонком кишечнике как у крыс, так и мышей крипты имели нормальное строение, но в подслизистой тонкого кишечника обнаруживались лимфатические фолликулы без светлого герментативного центра, а также скопления лимфоидных инфильтратов в слизистой оболочке. В печени определялась нормальная архитектоника, отмечалось умеренное полнокровие сосудов и скопление гранул гемосидерина вокруг портальных трактов. В почках при однократном пероральном введении наночастиц клубочки и канальцы не были изменены, отмечалось умеренное полнокровие сосудов мозгового слоя. В селезенке наблюдалось преобладание красной пульпы над белой, в лимфатических фолликулах определялись активные центры и большое скопление гранул гемосидерина.

Выводы. При гистологическом изучении изменения во внутренних органах при введении наночастиц проявлялись в виде нарушения кровонаполнения, повреждения клеток были выражены минимально.

ВЮ. Науменко, А.Г. Акопджанов, НЛ. Шимановский ВОЗМОЖНОСТИ

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НАНОРАЗМЕРНЫХ

И НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ

МАТЕРИАЛОВ В КАЧЕСТВЕ СУБСТАНЦИИ

РЕНТГЕНОКОНТРАСТНОГО СРЕДСТВА,

ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО

ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ

РГМУ им. Н.И. Пирогова, Москва

Задачи исследования. Методика визуализации внутренних органов с применением рентгеноконтрастных средств (РКС) является актуальной и приме -нимой в современной онкологии. У применяемых йодированных препаратов высокая эффективность контрастирования требует применения большой дозы вводимого средства, которая оказывает тиреоста-тический эффект и может быть причиной нефропатии. Для создания РКС без атомов йода предлагается использовать биосовместимые наночастицы оксида железа. Задача исследования - сопоставить размеры частиц и длинны волны рентгеновских квантов или медленных нейтронов для оценки дополнительного рассеивания и, следовательно, увеличения эффективного пути кванта в материале.

Материалы и методы. Приведено теоретическое обоснование увеличения поглощающей способности дополнительным рассеянием на наночастицах. Рассмотрены механизмы рассеяния: рассеяние на границе раздела фаз и когерентного рассеяние рентгеновского излучения.

Результаты. Механизм рассеяния на границе раздела фаз основан на том, что наночастица обладает сильно развитой внутренней поверхностью. При скользящих углах падения кванты испытывают внешнее отражение от поверхности частиц в области малоуглового рассеяния. В случае малого размера и большой концентрации рассеивающих центров вклад такого рассеяния достаточно заметен. Изучен характер зависимости с2реднего угла рассеяния на единицу длину пути (ф$), который свидетельствует о том, что величина среднего угла рассеяния обратно пропорциональна размеру наночастиц. Когерентное рассеяние обусловлено соизмеримостью

размера наночастиц с длиной волны рентгеновского излучения, что приводит к распределению интенсивности излучения по конусу с углом раствора ~Х/а, где X - длина волны излучения, а - размер частицы. Оценен средний квадрат угла рассеяния фотона на единицу длины пути 1вг\ . Решение уравнения (2) переноса (1), с учетом и

дало коэффициент р (3), определяющий во сколько раз увеличивается ослабления пучка рентгеновского излучения в случае наноматериала по сравнению с массивным образцом. При размере частиц 5-9 нм, он оказался равным р«1,32^1,52.

В.Ю. Науменко, А .Г. Акопджанов, И.В. Быков,

НЛ. Шимановский ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ ОКСИДА ЖЕЛЕЗА ДЛЯ ГИПЕРТЕРМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ РГМУ им. Н.И. Пирогова, Москва

В последние годы для профилактики и лечения онкологических заболеваний активно развиваются различные варианты локальной магнитной гипертермии, в которой вводимый в пораженный участок магнитный материал нагревается извне с помощью электромагнитного излучения диапазона 100-800 кГц, которое практически не поглощается тканями организма, но интенсивно взаимодействует с наночастицами ферромагнетиков. В качестве медиаторов наиболее приемлемыми являются наночастицы сложного оксида железа - магнетита, с размером частиц от 30 до 50 нм, характеризующихся температурой Кюри около 42-44 °С, что соответствует температуре гибели онкологических клеток. При достижении данной температуры вследствие магнитного фазового перехода процесс поглощения энергии внешнего излучения частицей прекращается и дальнейшего нагревания не происходит.

Движением таких наночастиц можно управлять посредством наложения внешнего магнитного поля и локализовать их в необходимой области или органе.

Проведенные исследования на различных культурах клеток как здоровых, так и патологических показали, что при специальной модификации поверхности наночастицы сложного оксида железа данного размера безопасны для живой ткани и не оказывают существенного влияния на процессы, происходящие в клетке.

Исследования проводились с помощью МТТ-теста при различных временах инкубирования. Исследование процесса внешнего нагрева клеточных структур при введении в них наночастиц также не выявило отклонений от нормы.

Данный результат позволяет исключить все внешние воздействия, за исключением действия электромагнитного излучения.

Имеются данные о лечении опухолевого образования у лабораторных крыс с глиомой Т-9 и применением магнитной жидкости на основе сложного оксида железа. Препарат вводится непосредственно в опухоль под наркозом, затем опухоль подвергается воздействию внешнего магнитного поля, в результате чего наночастицы железа нагреваются до температуры 45 °С. Опухоли исчезали после трехкратной гипертермии по 30 мин в течение 30 дней (118кВатт,

30,7 кЛ/м) и в течение 3 мес. не рецидивировали.

Таким образом, нанотехнологии с использованием железа позволяют получать эффективные препараты для магнитной гипертермической терапии различных опухолей.

Д.В. Новиков, Т.В. Белова, Е.С. Плеханова,

А .В. Калугин, А .В. Алясова,

Е.Ю. Конторщикова, В.В. Новиков ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ С ПОМОЩЬЮ ДНК-ЧИПА

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

Задачи исследования. Расширение возможностей клинико-лабораторной диагностики и мониторинга онкологических заболеваний в последнее время связывают с созданием нового поколения средств многопараметрической диагностики - биочипов, позволяющих одновременно определять широкий спектр онкологических маркеров разной природы. К таким маркерам относят продукты экспрессии раково-тестикулярных (РТ) генов (от англ. cancer/testis). Одновременное выявление комбинации из нескольких мРНК РТ генов с использованием ДНК-чипа может служить способом обнаружения циркулирующих в периферической крови опухолевых клеток. Задачей настоящего исследования явился анализ частоты обнаружения мРНК РТ генов в периферической крови больных различными онкологическими заболеваниями.

Материалы и методы. В работе использовали образцы периферической крови больных раком эндометрия (РЭ), желудка (РЖ), молочной железы (РМЖ), легкого (РЛ), почки (РП), меланомой и колоректальным раком (КР). Для обнаружения мРНК РТ генов использовали «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР. Результаты реакции оценивали методами электрофореза нуклеиновых кислот или гибридизацией на ДНК-чипе.

Результаты и выводы. Периферическую кровь онкологических больных тестировали на присутствие мРНК шести генов MAGEA, девяти генов GAGE, трех генов SSX, генов NY-ESO-I, XAGE1, MAGEC1, BAGE и TRAG. Установлено, что частота обнаружения мРНК исследуемых генов варьировала в зависимости от заболевания и его стадии. Суммарная частота обнаружения мРНК РТ генов в периферической крови больных РЛ составила 90 %, КР - 80 %, РМЖ - 75 %, РП - 70 %, РЖ - 75 %, РЭ - 45 % и меланомой - 55 %. Таким образом, тест на присутствие мРНК РТ генов применим для обнаружения циркулирующих в периферической крови опухолевых клеток у больных различными формами рака.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы и ФЦП ««Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

С.В. Новикова, НА. Сахарнов, Д.В. Новиков,

А .Д. Перенков, А .В. Алясова

АНАЛИЗ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА а-ЦЕПИ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ПРИ РАКЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

Задачи исследования. Экспрессия альфа цепи рецептора интерлейкина-2 (IL2RA) обнаружена во многих типах опухолевых клеток. Установлено, что экспрессия IL2RA сопровождается повышением уровня пролиферации опухолевых клеток, увеличением уровня экспрессии антиапоптотических белков и повышением устойчивости к лекарствам, что может быть использовано при мониторинге

онкологических заболеваний с использованием биочипов. В настоящее время много внимания уделяется связи метилирования с опухолеобразовани-ем, для ряда генов определен статус метилирования в различных типах опухолей, что используется в качестве диагностического и прогностического маркера при онкологических заболеваниях. Целью настоящей работы явился анализ статуса метилирования промоторного региона гена 1Ь2ЫЛ в клетках опухолевых очагов, полученных от больных раком толстого кишечника.

Материалы и методы. Исследовали 8 образцов опухолевых очагов больных раком толстого кишечника. Характер экспрессии гена 1Ь2ЫЛ определяли методом ОТ-ПЦР с использованием разработанных авторами праймеров. Анализ статуса метилирования промоторной области гена 1Ь2ЫЛ проводили с использованием рестриктаз Нра11, НЬа1, ЛеИ, чувствительных к метилированию СрС-динуклеотидов, и последующей ПЦР. Для оценки полноты гидролиза ДНК использовали плазмиду, содержащую последовательность гена альбумина человека.

Результаты и выводы. Во всех исследованных образцах клеток опухолевых очагов больных раком толстого кишечника обнаружена мРНК гена 1Ь2КЛ. Анализ промоторной области гена 1Ь2ЫЛ с использованием рестриктаз показал метилирование цитозинов в позициях -313, -74, +100, +105, +128, +131, +185, +198, +307 относительно сайта инициации транскрипции во всех исследованных образцах. Высокочувствительный метод анализа метилирования с помощью рестриктаз позволяет выявить метилирование цитозинов в единичных молекулах ДНК. С другой стороны, обнаружение мРНК гена 1Ь2ЫЛ в образцах опухолевых очагов говорит об активности гена, а значит о предполагаемом отсутствии метилирования его промоторной области. Полученные результаты могут свидетельствовать о неоднородности паттерна метилирования гена 1Ь2ЫЛ в клетках одного опухолевого очага.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

И.Н. Павлова, ОМ. Канапацкова, ТА. Федорова ОТДАЛЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ

НАНОРАЗМЕРНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ НУКЛЕИНАТА НАТРИЯ У БОЛЬНЫХ

МЕСТНОРАСПРОСТРАНЕННЫМ РМЖ

НУЗ ДКДна ст. Саратов-1, СГМУ, Саратов

Одним из важных показателей эффективности любого метода лечения является как одногодичная летальность, так и продолжительность жизни больных. В условиях данной работы судьба пациенток прослежена на протяжении пяти лет. Приведенные данные свидетельствуют об уменьшении процента потерь больных в тех подгруппах, где в состав противоопухолевой терапии включался нуклеинат натрия (Нн), разработанный ЗАО «Биоамид» (г. Саратов) на основе микробной биотехнологии и выпускаемый ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) в форме наноразмерных олигонуклеотидов.

Материалы и методы. Была отслежена судьба 240 женщин с диагнозом рак молочной железы 11В-111Л стадии. Группа I - 64 больных, в комплексное лечение которых входил НН; группа II - 176 больных, в комплексное лечение был включен НН. Обследование больных осуществлялось после оконча-

ния каждого этапа лечения, а также в течение 5 лет последующего наблюдения. Обязательно учитывались возникающие в процессе лечения осложнения. Основными критериями эффекта введения НН в комплекс мероприятий являлись изменения параметров иммунитета, пятилетняя выживаемость пациенток и качество жизни больных после лечения.

Результаты и выводы. При анализе показателей клеточного звена иммунитета (СD3+-,СD4+-, СD8+-клетки) через пять лет после лечения в I группе констатировано приближение к исходным величинам уровней СD3+-,СD4+-,СD8+-клеткок, то есть компонентов клеточного звена. Во II группе отмечается лишь тенденция к нарастанию соответствующих показателей. В отношении гуморального звена иммунитета в I групм все показатели значительно отставали от исходного уровня. В отличие от I группы во II групм через пять лет показатели как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета не только восстановились до исходных уровней, но и в некоторых случаях превысили их ^D3+-, СD4+-, СD8+-клетки, IgA, IgG). Все приведенное дает реальные основания для положительного применения препарата НН в процессе комплексного лечения больных раком молочной железы.

Л А. Пашева13, Н.Б. Преснякова2,

О.Н. Горшененко3,ГЛ. Туманина3, В.В. Новиков 1,2 СЫВОРОТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ РАСТВОРИМЫХ МОЛЕКУЛ HLA-I, СБ8 И КОМПЛЕКСОВ HLA-I-CD8 У ДЕТЕЙ С В-КЛЕТОЧНЫМ ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ 1Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 2Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной, Нижний Новгород 3Нижегородская областная детская клиническая больница, Нижний Новгород

Задачи исследования. Наноструктурная организация пула растворимых дифференцировочных молекул и молекул гистосовместимости характеризуется наличием в межклеточном пространстве и биологических жидкостях не только белковых молекул, находящихся в мономерном состоянии, но и различного рода наноразмерных белковых ассоциатов, в частности растворимых комплексов, состоящих из молекул HLA I класса и CD8. Их количественное содержание может быть ассоциировано с особенностями развития онкологических заболеваний (Новиков В.В. и др., 2008). Целью настоящей работы является сравнительное определение среднего уровня растворимых молекул CD8 (sCD8), HLA I класса (sHLA-I) и комплексов HLA-I-CD8 в сыворотке крови здоровых детей и детей с диагнозом В-клеточный острый лимфобластный лейкоз (В-ОЛЛ).

Материалы и методы. Использовано 12 образцов сыворотки крови детей от 2 до 17 лет с диагнозом В-ОЛЛ (в том числе 9 - с иммуноподвариантом пре-пре-В(П) ОЛЛ (common) и 3 - с иммуноподвариантом пре-В (III) ОЛЛ), полученных до начала индукции ремиссии. В качестве контроля исследовали 54 образца сыворотки крови практически здоровых детей сходного возраста. Определение уровня растворимых молекул проводили двухсайтовым иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител серии ИКО.

Результаты и выводы. Выявлено, что содержание молекул sHLA-I, sCD8 и растворимых комплексов HLA-I-CD8 в сыворотке крови как здоро-

вых детей, так и детей, больных В-ОЛЛ, характеризуется высокой вариабельностью. У детей с В-ОЛЛ обнаружено статистически значимое повышение среднего сывороточного уровня молекул зНЬД-1 и комплексов НЬД-1-С08 в 1,56 и 1,9 раза соответственно по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Сывороточный уровень молекул з008 у детей, больных В-ОЛЛ, находился в пределах нормы, однако обнаруживалась статистически незначимая тенденция к повышению.

Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012годы».

А .Д. Перенков1, Д.В. Новиков1, А .В. Алясова1,

А.Ю. Барышников2, В.В. Новиков1 ВСТРЕЧАЕМОСТЬ мРНК ГЕНА CD38 В ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГАХ БОЛЬНЫХ КРР НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЗАБОЛЕВАНИЯ 1НИИ молекулярной биологии и региональной биологии ННГУ им Н.И. Лобачевского, Н. Новгород 2РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Одним из нанобиотехнологических подходов, используемых для мониторинга онкологических заболеваний, является использование биочипов. С их помощью исследуется характер экспрессии генов при онкологических заболеваниях. С038 один из таких генов, что делает его потенциальным кандидатом для включения в биочип. Ген С038 кодирует белок с бифункциональной активностью: цАДФ-рибоза-метаболизирующий фермент и молекула адгезии. Из литературных данных известно, что в нормальной ткани кишечника ген С038 не экспрессируется, а в опухолевых клетках при КРР возможна его активация.

Цель исследования. Изучение частоты обнаружения мРНК гена С038 в опухолевых клетках больных КРР на разных стадиях заболевания.

Материалы и методы. Исследовали 47 образцов опухолевых очагов больных КРР. Матричную РНК молекулы С038 выявляли методом ОТ-ПЦР.

Результаты. Частота обнаружения полноразмерной формы мРНК молекулы С038 у больных колоректальным раком составила 62 % (29 из 47). На фоне полноразмерной формы мРНК у 25,5 % (12 из 47) больных выявлялась альтернативная форма. Проведено сравнение частоты обнаружения мРНК С038 на разных стадиях заболевания и степени дифференци-ровки клеток опухолевого очага. Обнаружено статистически значимое снижение частоты встречаемости мРНК на второй стадии заболевания в сравнении с первой, так же на второй стадии заболевания в опухолевых очагах альтернативная форма мРНК С038 обнаруживалась статистически реже, чем полноразмерная. Выявлена тенденция к увеличению частоты обнаружения мРНК альтернативной формы при уменьшении степени дифференцировки клеток опухоли. Статистически значимых различий по частоте обнаружения мРНК молекулы С038 между больными с наличием и отсутствием метастазов обнаружено не было. Из полученных данных можно сделать предположение, что экспрессия гена С038 ассоциирована с гипо- и гиперметилированием генома, характерного для опухолевого процесса.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Е.С. Плеханова, Д.В. Новиков, Т.В. Белова,

А.В. Калугин, В.В. Новиков РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЧИПА Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

Задачи исследования. Матричная РНК раковотестикулярных генов является маркером опухолевых клеток, применяемым для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. Одновременное обнаружение сразу нескольких мРНК раково-тестикулярных генов позволяет повысить чувствительность и информативность теста. Задачей работы явилась разработка метода мультиплексной ПЦР для обнаружения мРНК 16 раково-тестикулярных генов MAGEA1-6, NY-ESO-1, SSX1,2,4, XAGE-1, MAGE-C, HAGE, MAGE-B1 и 2, TRAG-3.

Материалы и методы. В работе использовали образцы опухолевых очагов рака толстого кишечника и легкого, содержащие мРНК исследуемых генов. Использовали «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР. В первом раунде проводили горячий старт ПЦР. На втором этапе проводили ассиметричную ПЦР, совмещенную с флуоресцентным мечением кДНК. Результаты реакции оценивали методами электрофореза нуклеиновых кислот или гибридизацией на биочипе.

Результаты и выводы. При использовании условий реакции, применяемых для стандартной ОТ-ПЦР, на стадии ассиметричной ПЦР наблюдалась отсутствие наработки некоторых продуктов реакции. При использовании набора праймеров, не образующих димеры между собой, результаты реакции также не удовлетворяли требуемым условиям. Наилучшие результаты наблюдались, когда ампли-фицируемые фрагменты были близки по размеру друг к другу. В итоге была разработана мультиплексная ПЦР для выявления мРНК 16 раковотестикулярных генов с использованием биочипа.

Работа выполнена при поддержке ФЦП ««Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы и ФЦП ««Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

НА. Плужникова

ЭКСПРЕССИЯ МОЛЕКУЛ ИНТЕГРИНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФФЕКТОРОВ

ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ В РАННЕМ ПОСТОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Расширенные хирургические операции у онкологических больных часто сопровождаются развитием системной воспалительной реакций (СВР). Одной из наиболее вероятных причин синдрома СВР является нарушение проницаемости кишечника, способствующая транслокации бактерий и их токсинов в кровяное русло. Бактериальные компоненты посредством Toll-like рецепторов ведут к активации эффекторов врожденного иммунитета, одним из проявлений которой может быть экспрессия молекул адгезии и изменения функциональной активности.

Цель исследования. Установление взаимосвязи между уровнями экспрессии молекул интегринов и цитотоксической активности (ЦА) клеток врожденного иммунитета вследствие расширенных хирургических вмешательства у онкологических больных.

Материалы и методы. Изучен фенотип лимфоцитов крови 10 онкологических больных до и после (24 ч) хирургического вмешательства; функциональность NK-клеток, а также образцы крови здоровых доноров (ЗД) (n=25). Для фенотипирования лейкоцитов использовали антитела к CD11b, CD11c меченные флуорохромами (Becton Dickinson, USA). Для определения индекса ЦА (ИЦА) NK- клеток использовали модель in vivo (мишени-клетки линии K562).

Результаты. У онкологических больных до операции уровень экспрессии молекул адгезии CD11b и 11c на лимфоцитах не отличался от ЗД (р>0,05). Однако уже через 24 ч после хирургического вмешательства обнаруживается значительное увеличение уровня экспрессии рассматриваемых маркеров лимфоцитов больных CD 11b с 47,14 % (33,24-48,45) до 75,1 % (65,47-78,35) и CD1k с 43,95 % (35,42-50,19) до 77,78 % (70,15-80,76) (р<0,05). Следует отметить, что в раннем послеоперационном периоде повышалась доля CD45+16+56+ NK с 15,43 % до 25,42 %, при этом содержание CD45+3+16+56+ NKT-клеток практически не изменялось. Функциональная активность лимфоцитов больных до операции достоверно не отличалась от значений ИЦА ЗД (р>0,05). После хирургического вмешательства у больных на фоне увеличения содержания лимфоцитов (до 61,46) значительно повышалась и ИЦА.

Выводы. Таким образом, можно предположить, что повышенная функциональность эффекторов врожденного иммунитета может быть опосредована повышением уровня экспрессии CD 11b и CD11c, что позволяет NK осуществлять контактное взаимодействие с клетками-мишенями.

НА. Пятаев, О.В. Минаева, Г.С. Столяров,

Н.Н. Зырняева, А .М. Зюзин ВЛИЯНИЕ ПУТИ ВВЕДЕНИЯ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ НА ИХ ТКАНЕВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева, Саранск

Магнитные наночастицы (МНЧ) представляют интерес как средство для направленной доставки химиопрепаратов благодаря возможности управления ими внешним магнитным полем (МП). Вместе с тем, сами наночастицы магнетита в зависимости от химического строения имеют специфические особенности биокинентики и тканевого распределения.

Цель исследования. Изучить зависимость тканевого распределения наночастиц магнетита от их пути введения в условиях воздействия внешнего магнитного поля и без него.

Материалы и методы. Исследовано тканевое распределение коллоидных наночастиц магнетита Fe3O4, стабилизированного олеиновой кислотой, у интактных крыс в условиях воздействия внешнего магнитного поля и без него. Животные разделены на 4 группы по 6 особей в каждой. В 1-й и 3-й группах МНЧ вводились внутривенно, во 2-й и 4-й

- в сонную артерию (интракаротидно). В 3-й и 4-й группах создавали магнитное поле над областью головы с помощью электромагнита. Определяли концентрацию магнетита крови и гомогенатах органов методом магниторезонансной спектроскопии через 3 ч после введения. Рассчитывали концентрационное соотношение ткань/кровь (Kt/b).

Результаты. При введении МНЧ без воздействия магнитного поля наивысшая их концентрация регистрировалась в органах «первого прохождения» - в легком при внутривенном и в головном

мозге при интракаратоидном введении. Отношение концентрации МНЧ в этих тканях к концентрации в крови составило 3,8+Q,2 (в легком) и 4,1+Q,3 (в мозге). Для печени, почек, селезенки и кишечника концентрационное отношение ткань/кровь практически не различалось в группах внутривенного и внутриартериального введения, составляя 2,9-3,2,

3,Q-3,4 и Q,61-Q,83 соответственно.

При внешнем воздействии магнитного поля на область головы концентрационное отношение ткань/плазма в мозге увеличивалось до 5,5+Q,3 и 1Q,8+Q,4 соответственно при внутривенном и ин-тракаротидном введении. При этом сохранялось накопление МНЧ в легких при внутривенном введении (Kt/b =2,8+Q,2). Значения коэффициента ткань/кровь для других органов практически не менялись, а абсолютные значения плазменной и тканевых концентрации были несколько ниже таковых в сериях без применения МП. Механизм задержки МНЧ в органах «первого пассажа» является предметом изучения.

Выводы. При внутривенном и интракаротид-ном введении магнитных наночастиц интактным животным происходит их аккумуляция в органах «первого пассажа» - легком и головном мозге. Максимально высокая концентрация магнитных наночастиц в ткани головного мозга достигается при их интракаротидном введении в условиях воздействия магнитного поля на область головы.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента молодым кандидатам наукМК-5268.2D11.7.

С.Ю. Рахметова

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ

ПРИ ЛЕЧЕНИИ

ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ООО ИнтерЛабСервис, Москва

В современной онкологии молекулярно-генетические исследования являются неотъемлемой частью диагностики и выбора лечения. Благодаря применению новых методов и диагностических возможностей в области генетики было установлено, что каждая опухоль обладает собственными, присущими только ей характеристиками, которые отличаются от клеток здоровых тканей. На основании этих отличий стала возможной разработка лекарственных препаратов, действующих непосредственно на молекулярную мишень в опухолевой клетке, не повреждая серьезным образом другие органы и ткани пациента. Применение таких препаратов носит название «таргетная терапия». Особенность этой терапии заключается в том, что каждый конкретный препарат эффективен лишь в отношении того типа опухолей, который обладает характеристиками «под которые» данный препарат был разработан. Большое значение имеет также выявление наследственно обусловленных форм рака. Применение новых препаратов, ориентированных на «точечное» воздействие на молекулярные механизмы, требует обязательной идентификации генетических нарушений.

Детекция генетических нарушений методом ал-лельспецифичной ПЦР в реальном времени (PCR-HRM) при помощи наборов реагентов QIAGEN позволяет относительно быстро проводить детекцию и количественное определение соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, PI3K, а также выявлять в этих генах новые соматические мутации для определения схемы лечения и контроля эффективности терапии. Метод гарантирует высокую специфичность и чувствительность, позволяя детектировать менее 1 % мутантной ДНК на фоне дикого типа.

Другой актуальный метод количественного определения соматических мутаций в вышеперечисленных генах - пиросеквенирование - определение нуклеотидной последовательности в режиме реального времени, позволяющий детектировать полиморфизмы в гомо- и гетерозиготном состоянии (используются наборы реагентов QIAGEN). Используя метод пиро-секвенирования, также можно определять наиболее часто встречающиеся мутации в генах BRCA1 и BRCA2, являющиеся причиной наследственно обусловленного рака молочной железы, яичников, поджелудочной железы, простаты. (BRCA-скрин, пр-во ФГУП ЦНИИ Эпидемиологии).

Применение современных подходов для выявления соматических мутаций в онкогенах и определения генетической предрасположенности к развитию рака позволяет проводить целенаправленное лечение в зависимости от индивидуального генотипа некоторых видов рака.

В.Д. Румянцева1, И.П. Шилов1, А .И. Панас1,

К.С. Щамхалов1, А.С. Рябов1, А.Ф.Миронов2,

А .В. Иванов3, А Ю. Барышников3 ПОЛУЧЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАНОРАЗМЕРНЫХ ИТТЕРБИЕВЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ

1ДИМЕТОКСИГЕМАТОПОРФИРИНА

1 Институт радиотехники и электроники им. В А. Котельникова РАН, Фрязинский филиал

2МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва

3РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Цель исследования. Синтез и исследование основных фотофизических свойств наноразмерных и нефототоксичных иттербиевых комплексов на основе водорастворимой дикалиевой соли Yb-2,4-диметоксигематопорфирина IX.

Материалы и методы. Осуществлен синтез водорастворимой дикалиевой соли Yb-2,4-диметоксиге-матопорфирина IX. Методом динамического рассеяния света измерено распределение наночастиц Yb-комплексов по размерам в их водных растворах. Для проведения исследований был введен в действие макет лазерного анализатора крови ЛАК-1 (разработка РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва), представляющий собой лазерный корреляционный спектрометр (ЛКС). Изучены также электронные и спектрально-кинетические характеристики комплексов. Измерения спектров поглощения синтезированных комплексов проводили на спектрофлуориметре LS-5B, Perkin Elmer. Изучение люминесцентных и временных характеристик Yb-комплексов осуществлялось на экспериментальном измерительном стробоскопическом стенде, разработанном в ИРЭ им. В.А. Котельникова РАН. Исследования люминесцентного диагностического контрастного индекса (ЛДКИ) проводились на макетном волоконно-лазерном онкофлуориметре.

Эксперименты осуществлялись на мышах-самках линии Balb/C с привитой опухолью Льюиса при дозах препарата на уровне Q,Q1-1Q мг/кг веса. Результаты. Показано, что все синтезированные иттербиевые комплексы на основе 2,4-диметоксигематопорфирина IX обладают узкой и достаточно яркой линией люминесценции, которая находится в диапазоне 975-985 нм, где собственная люминесценция биотканей практически отсутствует. Впервые была обнаружена эмиссионная полоса на 58Q нм, которая отсутствует у безметальных комплексов. Наличие полосы на 58Q нм может быть

обьяснено тем фактом, что использование в качестве матриц для иона УЬ3+ нелинейных сред (порфи-риновая матрица) позволяет сдвигать длину волны генерации лазерного излучения в видимую область спектра благодаря самоудвоению и самосмешива-нию частот. Установлено также, что среднее время жизни люминесценции для синтезированных нами иттербиевых комплексов на основе водорастворимой дикалиевой соли УЬ-2,4-диметоксигемато-порфирина IX составляет 5-10 мксек. При этом достигнут высокий уровень ЛДКИ и накопления в опухоли. Было показано, что ЛДКИ опухоль/мышца для этой субстанции при дозах 0,5-1,0 мг/кг достигал значений вплоть до 10,0. Высокое значение селективности накопления данных субстанций может быть связано с размерностью данных комплексов. Измерения на установке ЛАК-1 показали, что более 95 % от общего количества субстанции имеют размер около 5нм, что составляет половину от размера молекулы сывороточного альбумина человека (САЧ), являющегося основным транспортом доставки белков по кровеносным сосудам.

Выводы. Осуществлен синтез и изучены основные фотофизические свойства наноразмерных и нефототоксичных иттербиевых комплексов на основе водорастворимой дикалиевой соли УЬ-2,4-диметоксигематопорфирина IX. Такие субстанции перспективны для ранней люминесцентной диагностики визуально и эндоскопически доступных форм рака в ИК-диапазоне спектра.

Е.В. Санарова, Е.В. Игнатьева, И.Г. Меерович,

А.П. Полозкова, О.Л. Орлова, З.С. Смирнова,

НА. Оборотова ПАРАМЕТРЫ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛФ ТИОСЕНСА

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Активное применение липосомальных лекарственных форм в онкологии требует отработки технологии их получения. Одним из препаратов, относящихся к фотосенсибилизаторам второго поколения, является Тиосенс, технология получения липо-сомальной лекарственной формы (ЛЛФ) которого требует особых условий и методов в связи с его легкой окисляемостью и нерастворимостью в водных растворителях.

Задачи исследования. Определить критические параметры технологического процесса получения ЛЛФ Тиосенса.

Материалы и методы. Липосомы Тиосенса имели в своем составе лецитин, холестерин и РЕ-РЕС-2000 в молярном соотношении 1/0,22/0,002, соотношение лецитин/препарат составило 270/1. Из хлороформного раствора липидов и препарата получали полупрозрачную пленку путем отгона растворителя на роторном испарителе ВОСШ КсЛауарог Ы-200. Затем полученные мультиламеллярные везикулы фильтровали через фильтры с размером пор 1,2 мкм, и измельчали на гомогенизаторе высокого давления М1егоАшШ7ег М-110Б. После измельчения проводили стерилизующую фильтрацию (размер пор фильтра 0,22 мкм) для отделения невключившегося препарата. К полученной липосомальной дисперсии добавляли раствор сахарозы (криопротектор) в массовом соотношении лецитин/сахароза 1/9 и подвергали лиофилизации.

Результаты и выводы. Было выяснено, что на ЛЛФ в большей степени оказывает влияние качество используемого лецитина; температура получе-

ния липидной пленки и величина вакуума при ее сушке; рН и средний размер везикул липосомаль-ной дисперсии; продолжительность (количество циклов) гомогенизации; уровень окисленности ли-посомальных фосфолипидов и рН измельченной ЛЛФ. Существенным фактором является введение криопротектора и лиофилизация ЛЛФ, при этом также необходимо учитывать химическую структуру криопротектора, его концентрацию и подобрать оптимальный режим лиофильной сушки с учетом физико-химических свойств препарата.

Работа выполнена в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» при финансовой поддержке Правительства г. Москвы.

Е.В. Санарова1, ЕА. Котова1, А.П. Полозкова1,

Е.В. Игнатьева^.В. Ланцова1,Т.В.Денисова2,

И.И. Краснюк2, НА Оборотова1 ИНДЕКС ОКИСЛЕННОСТИ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ НА СТАДИЯХ

1ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва,

2ПМгМу им. И.М. Сеченова, Москва

Важным параметром качества фосфолипидов липосом является индекс окисленности (ИО), который соответствует содержанию конъюгированных диенов, образующихся в результате перекисного определения липидов.

Задачи исследования. Определить тенденцию изменения ИО липосомальных фосфолипидов в течение технологического процесса.

Материалы и методы. Большие многослойные липосомы (БМЛ) содержали лецитин, холестерин, ПЭГ-2000-дистеароилфосфатидилэтаноламин в молярном соотношении 165:8:1, а в состав с антиоксидантом (АО) добавляли 13 мг 10% масляного раствора а-токоферола ацетата. После получения липидной пленки ее гидратировали 150 мМ раствором натрия хлорида. Эмульсии БМЛ фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 1,2 и 0,45 мкм, а для получения однослойных липосом применяли три метода - экструзию, измельчение УЗ и гомогенизацию. ИО оценивали разведением 0,1 мл анализируемого образца липосом 10 мл 95% этанола и измерением оптической плотности спиртового разведения при длинах волн 215, 233, 300 нм.

Результаты. При использовании гомогенизации с целью получения однослойных липосом значения ИО пустых липосом (0,31) и пустых липосом с АО (0,26) увеличивались в 2-2,5 раза относительно БМЛ (0,13). Лиофилизация пустых липосом (ПЛ) вызывала увеличение показателей ИО для обоих типов ли-посом, причем для ПЛ до 0,35, а для пустых липосом с АО до 0,33. ИО ФЛ в экструдированных липосо-мах до и после лиофилизации различался незначительно, а присутствие АО практически не вызывало снижения значений ИО. При оценке окисленности ПЛ, измельченных УЗ, выяснено, что до лиофилизации ИО имел значение 0,34, а после - 0,46. Для ПЛ с АО значения ИО до (0,32) и после лиофилизации (0,42) также ощутимо отличались.

Выводы. Применение УЗ для измельчения липо-сом нецелесообразно в связи с резким увеличением ИО липосомальных фосфолипидов. Экструзия позволяет сохранить низкие показатели ИО, но применение ее в промышленных масштабах нерентабельно, поэтому для получения больших объемов липо-

сом применяют гомогенизацию, обеспечивающую допустимое содержание конъюгированных диенов в липосомах. Использование витамина Е в качестве АО не обеспечивает значительного снижения ИО.

Н.А. Сахарнов1, О.В. Уткин12, Д.В. Новиков1,

ЕЮ. Конторщикова3, В.В. Новиков1 ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АРО-1 В КЛЕТКАХ КРОВИ И ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГОВ БОЛЬНЫХ МИОМОЙ МАТКИ 1НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ имени Н.И. Лобачевского, Н. Новгород 2Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной, Нижний Новгород 3Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород

Цель исследования. Оценка спектра альтернативных форм мРНК Fas в клетках периферической крови и клеток опухолевого очага при миоме матки.

Материалы и методы. Исследовалось 11 образцов периферической крови и 17 образцов клеток опухолевых очагов больных с цитологически и гистологически подтверждённым диагнозом миомы матки, проходивших стационарное лечение в гинекологической клинике Областной больницы им. Н. А. Семашко г. Нижнего Новгорода. Матричную РНК Fas-антигена детектировали методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к местам соединения экзонов пре-мРНК Fas-антигена.

Результаты и выводы. В клетках крови и опухолевых очагов в различных сочетаниях было выявлено 6 альтернативных форм мРНК Fas-антигена, организованных в 6 и 8 спектров соответственно. В клетках периферической крови матричная РНК мембранной формы Fas-антигена детектировалась в 100 % случаев. Матричная РНК доминирующей растворимой формы Fas-рецептора с делецией 6 экзона обнаруживалась в 72,7 % случаев, матричные РНК четырех минорных форм с делециями 3, 4 и 6 экзонов в различных сочетаниях выявлялись с частотой от 9 до 54,5 % случаев. В клетках опухолевых очагов матричная РНК как мембранной, так и доминирующей растворимой формы Fas-антигена детектировались в 58,8 % случаев, матричные РНК двух минорных форм с делециями 3, 4 и 6 экзонов в различных сочетаниях встречались с частотой от

11,7 до 17,6 % случаев. В 29,4 % образцов клеток опухолевых очагов миомы матки не было выявлено ни одной альтернативной формы мРНК Fas-антигена. При этом в образцах крови этих доноров мРНК Fas выявлялась. Отсутствие мРНК mFas в клетках опухолевых очагов может являться одной из возможных причин опухолевого роста вследствие ингибирования апоптоза.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Ю.В. Стукалов, ЕЮ. Колдаева,

ЕЛ. Кадырова, ЕЮ. Григорьева ТОКСИКОЛОГИЯ

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ

НАНОКОНСТРУКЦИЙ

ДЛЯ РАЗРАБОТКИ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

В настоящее время перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний считается таргетная радиоиммунотерапия.

Радиофармпрепараты нового поколения характеризуются высокой эффективностью, клинической и радиационной безопасностью. Такими свойствами, например, обладают фармпрепараты на основе ден-дримеров, которые могут стать универсальной системой доставки альфа- и бета-радионуклидов. Нами предлагается в качестве препаратов для таргетной терапии злокачественных новообразований использовать конструкции на основе синтезированных ден-дримеров. Дендримеры - новый класс синтетических молекул размером до 10 нм. Внешний слой дендримера модифицируется для контроля препарата, гидрофобности ядра и прицельной доставки конструкции внутрь или на поверхность опухолевых клеток. Были разработаны схемы синтеза дендронов окислительно-восстановительных дендримеров нового класса на основе гидрохинонов и проведена их оптимизация. Кроме того, разработаны способы дивергентной и конвергентной сборки таких дендри-меров, а также конструкций вышеупомянутых денд-римеров с опухолеспецифичными агентами, например, моноклональными антителами.

Цель исследования. Определение острой токсичности полученных наноконструкций.

Материалы и методы. Исследования проводили на мышах линии Ва1Ь/е; испытывали дозы в интервале от 150 до 1500 мг/кг массы тела. Параметры токсикометрии определяли по методу Кербера.

Результаты и выводы. Параметры токсикометрии для дендримеров нового класса разного химического строения составляют: порог острого действия (Ь1шае) - 125 + 275 мг/кг массы тела; максимально переносимая доза (МПД) - 140 + 330 мг/кг массы тела; абсолютно смертельная доза (Ь0100) - 411 + 750 мг/кг массы тела; средне смертельная доза (Ь050) - 210 + 480 мг/кг массы тела. Таким образом, зона острого токсического действия позволяет использовать данные соединения для создания препаратов-носителей для таргетной терапии онкологических заболеваний.

И.В. Федосов1, Б.Н.Хлебцов2, А.Н. Якунин3,

ЮА. Аветисян3, В.В. Тучин1,

ЛОКАЛЬНЫЕ ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ЭФФЕКТЫ

НА СУБКЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ

ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ

ЛАЗЕРНЫХ ПУЧКОВ

1С ПЛАЗМОННЫМИ НАНОЧАСТИЦАМИ

Саратовский государственный университет им.

Н.Г. Чернышевского, Саратов

2Институт биохимии и физиологии растений и

микроорганизмов РАН, Саратов

3Институт проблем точной механики и управления

РАН, Саратов

Задачи исследования. Терапевтическое действие лазерного излучения неразрывно связано с процессом гипертермии биотканей, который может являться как основным, так и сопровождающим эффектом. Точная локализация лазер-индуцированной гипертермии возможна путем введения в ткани плазмонно-резонанс-ных частиц благородных металлов, которые сильно поглощают лазерное излучение и преобразуют его в тепловую энергию, нагреваясь до значительной температуры. Оптимизация метода лазер-индуцирован-ной гипертермии требует детального изучения механизмов локального переноса тепловой энергии от наночастиц к окружающим их тканям на субклеточном уровне.

Материалы и методы. Объектом исследования было тепловое поле вблизи наночастицы, помещенной в однородную среду и освещенной пучком

лазерного излучения, а также тепловое поле, создаваемое ансамблем частиц в этой среде. Данные тепловые поля моделировались на основе численных и аналитических решений нестационарного уравнения теплопроводности. Экспериментальное изучение температурных полей осуществлялось методом динамической ультрамикроскопии коллоидных наночастиц. Данный метод заключается в регистрации серии изображения наночастиц в коллоидом растворе при помощи светового ультрамикроскопа. Последующая цифровая обработка серии изображений позволяет оценить параметры теплового (броуновского) и направленного движения наночастиц в пучке лазерного излучения.

Результаты и выводы. В результате нами были оценены профили распределения температуры наночастиц в поперечном сечении лазерного пучка с пространственным разрешением около 1 мкм. Установлено, что нагрев наночастицы не приводит к значительному повышению интенсивности ее теплового движения в жидкости, что может быть вызвано наличием на поверхности наночастицы также молекул стабилизирующего агента. Показана необходимость учета броуновского и направленного движения наночастиц в поле лазерного пучка при оценке эффективности теплопереноса от частицы к среде.

Н.Г. Хлебцов1,2, Л А. Дыкман1, Б.Н. Хлебцов1,

Е.В. Панфилова1, В А. Ханадеев1,

В А. Богатырев1, Г.С. Терентюк2, Е.С. Тучина2,

В.В. Тучин2, В.Д. Румянцева3, А.В. Иванов4 БИОМЕДИЦИНСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ЗОЛОТЫХ

И КОМПОЗИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ 1И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

1Институт биохимии и физиологии растений и

микроорганизмов РАН, Саратов

2Саратовский государственный университет им.

Н. Г. Чернышевского, Саратов

3МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва

4РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Функционализованные золотые наночастицы с контролируемыми геометрическими и оптическими свойствами являются объектом интенсивных исследований и биомедицинских применений, включая геномику, биосенсорику, иммуноанализ, клиническую химию, лазерную фототерапию раковых клеток и опухолей, адресную доставку лекарств, ДНК и антигенов, оптический биоимиджинг и мониторинг клеток и тканей с применением современных систем регистрации. Эти приложения основаны на комбинировании двух принципов: 1) функционализации поверхности для обеспечения коллоидной стабильности и биосовместимости частиц, молекулярного узнавания конъюгатов, эффективности эндоцитоза и т.п.; 2) возбуждении плаз-монных резонансов в видимой или ближней ИК области для получения уникальных оптических свойств. В работе дан обзор полученных к настоящему моменту результатов и актуальных проблем в области биомедицинских приложений золотых наночастиц различного размера, формы и структуры. Основное внимание уделено применению конъюгатов золотых наночастиц с различными молекулами-зондами в биомедицинской диагностике и аналитике, фототермальной и фотодинамической терапии, в качестве носителей целевых молекул, а также иммунологическим, токсикологическим и антимикробным свойствам. Приведены примеры различных плазмонно-резонансных и композитных

наночастиц, синтезируемых в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН. Обсуждаются возможности контролируемого дизайна наноструктур с требуемыми оптическими, фототермическими и фотодинамическими свойствами. В частности, рассматриваются новые типы мультифункциональных композитных наночастиц для терапии и диагностики, которые имеют потенциальные свойства фото-термального нагрева, видимой флуоресценции и ИК-люминесценции, а также фотодинамической активности за счет включения фотосенсибилизатора в структуру наночастиц.

НА. Цыганова1, М.В. Рыжова1, Р.В. Никифоров1, Г.С. Терентюк2, Н.Г.Хлебцов2, Р.М. Хайруллин1 ПРОНИЦАЕМОСТЬ ГЕМАТО-ПЛАЦЕНТАРНОГО БАРЬЕРА БЕЛЫХ КРЫС

ДЛЯ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ

ульяновский государственный университет, Ульяновск

2Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов

Задачи исследования. Изучение степени проницаемости гемато-плацентарного барьера (ГПБ) белых крыс при внутривенном введении золотых наночастиц (ЗНЧ), а также изучение их токсического действия на материнский организм и плод.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на самках белых крыс в стандартных условиях вивария. В хвостовую вену беременным крысам на I стадии становления гемохориальной плаценты (1115 сутки гестации) вводили 1,5 мл суспензии ЗНЧ диаметром 30 нм двукратно через сутки. Контрольной группе беременных самок вводили физраствор аналогичного объема по описанной схеме. Через сутки после второго введения ЗНЧ или физраствора животных выводили из эксперимента. Морфологические изменения оценивали в печени, почках, селезенке и головном мозге самок и эмбрионов.

Результаты. Методом ААС установлено, что после внутривенного введения ЗНЧ в основном накапливаются в печени и селезенке беременной самки. ГПБ оказывается проницаемым для ЗНЧ диаметром 30 нм - содержание золота в эмбрионах экспериментальных животных превышает таковое в эмбрионах контрольной группы. Введение суспензии ЗНЧ диаметром 30 нм не вызывает существенных отклонений в морфологии внутренних органов в сравнении с животными контрольной группы. Для животных обеих групп характерны расширенные капилляры почечных клубочков и переполнение их кровью. Полости капсул нефронов животных после введения ЗНЧ практически не определяется. В отдельных клубочках животных контрольной группы отмечаются умерено расширенные мочевые пространства.

Во многих полях зрения сосуды коркового и мозгового вещества резко расширены, определяется эритростаз, в некоторых - участках гемолиз эритроцитов. Балочная структура печени сохранена у животных обеих групп, гепатоциты нормальной морфологии, в незначительном числе сосудов эритростаз, синусоиды расширены. Нейроциты головного мозга не изменены, сосуды разных калибров расширены, кровенаполонены.

Введение ЗНЧ вызывает полнокровие красной пульпы. Некоторые лимфатические узелки имеют смазанные края, герминативные центры не определяются. Селезенка самок контрольной группы нормального строения.

Выводы. Морфология печени, селезенки и головного мозга плодов контрольной группы и плодов, подвергшихся воздействию раствора золотых наночастиц, не имеет существенных различий.

Е.Г. Чеботарева, Ю.С. Дудакова,

М. Саккала, М. Эльбубу БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ СПЛАВА НАНОЧАСТИЦ ^ ОТ ZN]

НА ОРГАНИЗМ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, Саратов

Свойства наночастиц металлов открывают широкие возможности для создания новых эффективных катализаторов, сенсорных систем, препаратов с высокой биологической активностью для применения в различных областях науки.

Задача исследования. Изучение активности наночастиц сплава биогенных металлов [Ре Си 7п]. Размер частиц 50-60 нм.

Материалы и методы. Экспериментальная работа выполнена на самцах мышей. Объектом исследования являлся нанопорошок сплава наночастиц [Ре Си 7п], который вводился мышам в виде суспензии в дозе 10 мг/кг. Анализ биологического действия оценивался на основании изменения биохимических показателей сыворотки крови.

Результаты и выводы. В ходе выполненной работы было выявлено, что под влиянием наночастиц сплава металлов происходит увеличение концентрации глюкозы на 160 % и пирувата на 220 %, снижение уровня лактата на 26 %. Увеличение глюкозы в крови может быть обусловлено нарушением или отсутствием выработки инсулина поджелудочной железой (о нарушении состояния данного органа косвенно свидетельствует снижение амилазы в сыворотке крови), возможно также взаимодействие частиц [Ре Си 7п] с инсулином (например с сульфгидрильными группами) и инактивация гормона. Вследствие голодания клетки активируются процессы глюконеогенеза. Так как фермент ЛДГ под действием наночастиц инактивируется, то превращение молочной кислоты в пируват также снижается, следовательно, ПВК может образоваться только из гликогенных аминокислот, поэтому в организме происходит усиленный распад белков, о чем свидетельствует повышение концентрации белка в крови на 90 % в опытной группе животных и его альбуминовой фракции на 40 % под влиянием исследуемых наночастиц.

Активные процессы катаболизма белков приводят к образованию конечных продуктов, например креатинина, концентрация которого в экспериментальной группе животных увеличена на 25 % по сравнению с контролем. Уровень мочевины, напротив, снижен на 140 % по сравнению с результатами группы интактных мышей, что может быть обусловлено ингибирующим действием наночастиц [Ре Си 7п] на ферменты орнитинового цикла.

А.Н. Шевченко, В А. Сергань НЕПОСРЕДСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ГОРМОНЧУВСТВИТЕЛЬНЫМ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ФГУ Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону

Задача исследования. Оценка эффективности применения аутогемохимиотерапии у больных анд-

рогенчувствительным раком простаты с метастатическим поражением костей.

Материалы и методы. В исследование были включены 50 больных гормоночувствительной аденокарциномой простаты Т3ЬШМ1Ь, составивших 2 группы. В I группу включены 25 пациентов (средний возраст 69+2,4 лет), получающих бикалутамид (разовая доза 50 мг, курсовая 7500 мг), золедроно-вою кислоту (разовая доза 4 мг, курсовая 16 мг), многокурсовую аутогемохимиотерапию с доцетак-селом (разовая доза 80 мг, курсовая 400 мг) и хирургическую кастрацию.

Во II группу - 25 пациентов (средний возраст 69+2,1 лет), получающих бикалутамид (разовая доза 50 мг, курсовая 7500 мг), золедроновою кислоту (разовая доза 4 мг, курсовая 16 мг), хирургическую кастрацию.

Длительность исследования составила 5 мес. Оценку эффективности режимов лечения пациентов обеих групп проводили на основании динамики клинических симптомов с учетом анализа уровней простатоспецифического антигена (PSA) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, рентгенологических методов обследования: СРКТ органов брюшной полости и малого таза, остеосцинти-графии; для объективизации результатов лечения так же проводился протеомный анализ плазмы крови на основе масс-спектрометрического детектирования (MALDI-TOF-MS Autoflex II, Bruker, США) и идентификации белков в базе Mascot.

Результаты. До начала терапии симптомы в обеих группах были сопоставимы.

В процессе лечения в основной группе пациентов отмечалось более выраженное снижение уровня ПСА, уменьшение затруднения и болей при мочеиспускании, болей в костях, улучшение общего состояния сна, аппетита.

В контрольной группе у 3 пациентов в процессе наблюдения появились новые очаги метастатического поражения костей, наблюдалось увеличение объема метастазов, выявленных до начала лечения.

Выводы. Таким образом, включение в схему терапии больных диссеминированным гормонозависимым раком простаты с метастатическим поражением костей аутогемохимитерапии доцетокселом позволило улучшить непосредственные результаты лечения этой категории больных.

ГМ. Шуб1, О.Г. Шаповал1, В.В. Алипов1,

С.Ю. Доронин2, Р.К. Чернова2 ВЛИЯНИЕ

УЛЬТРАДИСПЕРСНОГО ПОРОШКА МЕДИ НА ДИНАМИКУ РАЗВИТИЯ ПОПУЛЯЦИЙ 1ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, Саратов

2Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов

Задачи исследования. Оценка влияния ультрадисперсного порошка меди на динамику развития популяций штаммов S.aureus, которые являются основными возбудителями бактериемий и инфекций мягких тканей у онкологических больных.

Материалы и методы. В работе использованы 5 штаммов S.aureus: стандартный - S.aureus ATCC 6538P и 4 клинических, выделенных от больных гнойновоспалительными заболеваниями (один из них был устойчив к ампициллину - минимальная ингибирующая концентрация 6 мкг/мл). Опытные штаммы культивировали в мясо-пептонном бульоне, содержащем ультрадисперсный порошок меди в концентрации

1 мг/мл, ампициллин в субингибирующих концентрациях (1/2 минимальной ингибирующей концентрации), а также их сочетания друг с другом. Микробная нагрузка составила 1Q5 м.т./мл по стандарту мутности McFarland. Сразу, через 3 и 7 ч после посева делали мерный высев по 0,1мл на мясо-пептонный агар и, исходя из числа выросших колоний, рассчитывали общее количество клеток в 1 мл (n). Ультрадисперсный порошок меди (с размерами кластерных частиц от 4Q до 25Q нм) получали термолизом оксалата меди, синтезированного из Cu(CH3COO)2 и H2C2O4-2H2O, в токе CO2.

Результаты и выводы. Установлено, что сразу после посева n всех опытных штаммов существенно не отличались и соответствовали микробной нагрузке. Через 3 и 7 ч после посева этот показатель был достоверно ниже по сравнению с контрольными значениями у 2 клинических штаммов (в том числе устойчивого к ампициллину) при культивировании в сочетании антибиотика и ультрадисперсного порошка меди. У остальных штаммов во всех условиях культивирования значения n существенно не отличались. Таким образом, синтезированный нами ультрадисперсный порошок меди оказывает потенцирующее влияние на антимикробную активность ампициллина, однако оно штаммоспецифично.

НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН