Особенности химического сдвига ядер 31Р фосфолипидов плазматической мембраны клеток Escherichia coli, индуцированного 2,4,6-тринитротолуолом

УДК 579.234

Б. М. Куриненко, Т. Зинкевич, А. Г. Крушельницкий,

В. Я. Пономарев, Г. Ю. Яковлева

ОСОБЕННОСТИ ХИМИЧЕСКОГО СДВИГА ЯДЕР 31Р ФОСФОЛИПИДОВ

ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI,

ИНДУЦИРОВАННОГО 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛОМ

Ключевые слова: ЯМР-спектроскопия, фосфолипиды, Escherichia coli, 2,4.6-тринитротолуол (ТНТ).

С помощью ЯМР-спектроскопии ядер 31Р фосфолипидов оценили влияние 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ) на клетки Escherichia coli. Установлено, что в процессе микробной трансформации ТНТ дисперсия химических сдвигов ядер 3IP фосфолипидов плазматической мембраны клеток исчезает, что свидетельствует о структурных перестройках мембраны. Анализ установленных изменений позволил обосновать предположение о переходе плазматической мембраны клеток Escherichia coli в процессе трансформации ТНТ из жидкокристаллического состояния в гель.

Keywords: NMR-spectroscopy, phospholipids, Escherichia coli, 2,4.6-trinitrotoluene (TNT).

Using NMR-spectroscopy of nucleus of 3IP from phospholipids we assessed the effects of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) to cells of Escherichia coli. Found that in the microbial transformation of TNT the dispersion of chemical shiftings of the nucleus of 3IP from phospholipids of cells’ plasma membrane disappears, indicating of structural changes of the membrane. Analysis of the changes set can justify the assumption of the transition ofplasma membrane of Escherichia coli by transformation of TNT from liquid crystalline state to a gel.

Введение

2,4.6-Тринитротолуол (ТНТ), высокотоксичное и трудноразлагаемое неприродное соединение, вызывает у бактерий целый ряд структурных изменений и изменений метаболизма. Однако, до сих пор не показано наличие изменений в плазматической мембране клеток бактерий. Вместе с тем известно, что на первых этапах трансформации ТНТ в среде культивирования происходит аккумуляция активных форм кислорода (АФК) [1, 2]. Одним из следствий окислительного стресса является перекисное окисление липидов, которое может привести к изменению физических свойств мембраны. Вследствие этого целью данной работы являлась оценка структурных изменений мембран клеток Escherichia coli, культивированных в присутствии ТНТ, методом ЯМР-спектроскопии ядер 31Р фосфолипидов мембран.

Материалы и методы исследования

В работе использовали штамм Escherichia coli К12. Культивирование вели на синтетической среде М9 [3, 4] с добавлением глюкозы 0.4%, гидролизата казеина 0.2%. В опытный вариант добавляли ТНТ в концентрации 200 мг/л. После 4 ч культивирования клетки дважды отмывали 0.5% NaCl. Осажденную центрифугированием биомассу использовали как объект исследования.

Для оценки состояния мембраны использовали ЯМР-спектроскопию ядер 31Р. Эксперименты были выполнены на спектрометре Брукер AVANCE 400 при комнатной температуре. Спектры ядер 31P получали при вращении образца (клеточной биомассы) под магическим углом со скоростью 6 кГц.

Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе “Origin 6.1”. В работе все эксперименты были проведе-

ны не менее чем в трех повторностях. Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение с в ней не превышало 13 %. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности Р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В спектре 3^ клеток инокулята Е. свИ К12 наблюдается несколько сигналов: два интенсивных с химическим сдвигом 0,93 и 0,02 p.p.m., положение которых соответствует сигналам фосфолипидов [5], два слабых (-11,3 и -12,79 p.p.m.) соответствующих сигналам АТФ [6] и другим нуклеотидам, а также два пика боковых линий от вращения под магическим углом, появляющиеся в результате неполного усреднения тензора анизотропии химического сдвига ядер 31Р в фосфолипидах (рис. 1). После 4 часов культивирования клеток в отсутствие ТНТ расстояние между интенсивными сигналами ядер 31Р фосфолипидов увеличивается за счет изменения химических сдвигов (1.38 и -0,13 p.p.m.), менее интенсивные сигналы АТФ и других нуклеотидов не изменяются и не сдвигаются (рис. 2, А). Наличие двух сигналов 3^ в мембранах клеток контроля, культивируемых в отсутствие ТНТ, свидетельствует о том, что либо химический состав липидов, либо структура мембраны гетерогенны и могут быть разделены как минимум на две фракции.

При добавлении в среду культивирования ТНТ форма сигналов 31Р фосфолипидов меняется, два пика большой интенсивности сливаются в один с химическим сдвигом 0,63 p.p.m. (рис. 2, Б). Форма сигнала, принадлежащего нуклеотидам и АТФ не меняется, но его интенсивность снижается по сравнению с сигналом клеток, культивируемых без ТНТ. Уменьшение интенсивности этого сигнала в присутствии ТНТ, вероятно, связано со снижением пула восстановленных кофакторов (NAD(F)H), о чем сообщалось ранее для данного штамма [7].

Рис. 1 - Спектры ЯМР ядер Р клеток инокулята Е. еоИ К12 в нулевой момент времени: 1 - фосфолипиды; 2 - АТФ и другие нуклеотиды; 3 - боковые линии от вращения под магическим углом

г. р_р_т_

структура фосфолипидов в мембране становится более гомогенной то есть, различия в химическом строении тех групп, которые окружают ядра 31P фосфолипидов, минимальны. Однозначно объяснить причину такого усреднения на данном этапе затруднительно, так как не представляется возможным точно определить структурные элементы мембраны, обуславливающие химический сдвиг ядер 31P фосфолипидов. Достаточно вероятна возможность изменения структуры или пространственной ориентации основного компонента мембран бактерий -фосфолипидов. Для такого предположения есть все основания - взаимодействие формирующего ближний порядок окружения 31P фосфолипидов с ТНТ, с продуктами его трансформации, а также изменения структуры этого окружения под действием свободных радикалов, образующимися при трансформации ТНТ клетками бактерий [1, 2]. Наиболее вероятным содержанием такого изменения мембраны является её переход из жидкокристаллического состояния в гель.

Литература

1. Науменко, Е.А. Участие кислорода в бактериальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола / Е. А. Науменко, А. В. Наумов, Е. С. Суворова, Р. Герлах, М. А. Зиган-шин, А. П. Ложкин, Н. И. Силкин, Р. П. Наумова // Биохимия. - 2008. - Т.73. - №4. - С.463-469.

2. Kumagai, Y. Nitric oxide synthase (nNOS) catalyzes one-electron reduction of 2,4,6-trinitrotoluene, resulting in decreased nitric oxide production and increased nNOS gene expression: implication for oxidative stress / Y. Kumagai, M. Kikushima, Y. Nakai, N. Shimojo, M. Kunimoto // Free Radicals Biology & Medicine. - 2004. - V.37. - № 3. -P.350-357.

3. Миллер, Д. Эксперименты в молекулярной генетике / Д. Миллер // М.: Мир, 1976. - 395 с.

4. Евтюгин, В.Г. Электронно-микроскопическое исследование морфологических изменений клеток кишечной палочки в условиях голодового стресса / В.Г.Евтюгин, А.Б.Маргулис, О.Н.Ильинская, М.К.Кадиров // Вестник Казанского технологического университета.- 2011.-№12.- С.167-171.

5. Jurgen, Schiller 31P NMR Spectroscopy of Phospholipids: From Micelles to membranes [Text] / Jurgen Schiller, Matthias Muller, Beate Fuchs, Klaus Arnold and Daniel Huster // Current Analytical Chemistry.- 2007.- N3.- P. 283301.

6. Elke M., Lomeier-Vogel In vivo 31Р Nuclear Magnetic Resonance Investigation of Tellurite Toxiciti in Escherichia coli / Elke M.Lomeier-Vogel, Shiela Ung, and R. J. Turner // App. And Envirom. Microbiol.- 2004.- P.7342-7347.

7. Куриненко, Б.М. Чувствительность различных штаммов Escherichia coli к токсическому действию 2,4,6 -тринитротолуола] / Б.М. Куриненко, Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология.-2005. -Т.41, № 1.-С.53-57.

дипЕса! сднг.р-р-н.

Рис. 2 - Спектры ЯМР ядер 31Р клеток Е. еоИ К12, культивируемых 4 часа на синтетической среде:

1 - клетки инокулята, 2 - клетки культивируемые без ТНТ; 3 - клетки культивируемые в присутствии ТНТ

Отсутствие дисперсии химического сдвига ядер 31Р липидов в структуре фосфолипидов клеток, культивируемых с ТНТ, свидетельствует о том, что

© Б. М. Куриненко - д-р биол. наук, проф. каф. микробиологии К(П)ФУ; Т. Зинкевич - м.н.с. КФТИ РАН, tatyana-vilkova@yandex.ru; А. Г. Крушельницкий - д-р физ.-мат. наук, проф. каф. микробиологии К(П)ФУ; В. Я. Пономарев - канд. техн. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, v.y.ponomarev@gmail.com; Г. Ю. Яковлева - канд. биол. наук, доц. каф. микробиологии К(П)ФУ.