КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ CasZ

1. Способ направления полипептида CasZ к целевой последовательности целевой нуклеиновой кислоты,
причем способ включает приведение в контакт целевой нуклеиновой кислоты со сконструированным и/или неприродным комплексом, содержащим:
(а) полипептид CasZ;
(b) CasZ-направляющую РНК, которая содержит направляющую последовательность, которая гибридизируется с целевой последовательностью целевой нуклеиновой кислоты, и содержит область, которая связывается с полипептидом CasZ.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ приводит к модификации целевой нуклеиновой кислоты, модуляции транскрипции с целевой нуклеиновой кислоты или модификации полипептида, связанного с целевой нуклеиновой кислотой.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что целевую нуклеиновую кислоту модифицируют путем расщепления.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что целевая нуклеиновая кислота выбрана из: двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК, РНК, геномной ДНК и внехромосомной ДНК.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что направляющая последовательность и область, которая связывается с полипептидом CasZ, являются гетерологичными по отношению друг к другу.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт приводит к редактированию генома.
7. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт происходит вне бактериальной клетки и вне клетки архей.
8. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт происходит in vitro вне клетки.
9. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт происходит внутри целевой клетки.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт включает: внесение в целевую клетку по меньшей мере одного из:
(a) полипептида CasZ или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CasZ; и
(b) CasZ-направляющей РНК или нуклеиновой кислоты, кодирующей CasZ-направляющую РНК.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид CasZ, представляет собой неприродную последовательность, которая является кодон-оптимизированной для экспрессии в целевой клетке.
12. Способ по любому из пп. 9-11, отличающийся тем, что целевая клетка представляет собой эукариотическую клетку.
13. Способ по любому из пп. 9-12, отличающийся тем, что целевая клетка находится в культуре in vitro.
14. Способ по любому из пп. 9-12, отличающийся тем, что целевая клетка находится in vivo.
15. Способ по любому из пп. 9-12, отличающийся тем, что целевая клетка находится ex vivo.
16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из растительной клетки, клетки гриба, одноклеточного эукариотического организма, клетки млекопитающего, клетки рептилии, клетки насекомого, клетки птицы, клетки рыбы, клетки паразита, клетки членистоногих, клетки беспозвоночного животного, клетки позвоночного животного, клетки грызунов, клетки мыши, клетки крысы, клетки примата, клетки примата, не являющегося человеком, и человеческой клетки.
17. Способ по любому из пп. 9-16, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт дополнительно включает внесение донорной матричной ДНК в целевую клетку.
18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что указанный способ включает приведение в контакт целевой нуклеиновой кислоты с трансактивирующей некодирующей РНК CasZ (транкРНК).
19. Способ по любому из пп. 9-17, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт включает: внесение трансактивирующей некодирующей РНК CasZ (транкРНК) и/или нуклеиновой кислоты, кодирующей транкРНК CasZ, в целевую клетку.
20. Способ по п. 18 или 19, отличающийся тем, что транкРНК содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 70% или более идентичности с последовательностью транкРНК из таблицы 2.
21. Композиция, содержащая сконструированный и/или неприродный комплекс, содержащий:
(a) полипептид CasZ или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид CasZ; и
(b) CasZ-направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную CasZ-направляющую РНК, причем указанная CasZ-направляющая РНК содержит направляющую последовательность, которая комплементарна целевой последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и содержит область, которая может связываться с полипептидом CasZ.
22. Композиция по п. 21, дополнительно содержащая трансактивирующую некодирующую РНК CasZ (транкРНК) или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную транкРНК CasZ.
23. Набор, содержащий сконструированный и/или неприродный комплекс, содержащий:
(a) полипептид CasZ или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид CasZ;
(b) CasZ-направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную CasZ-направляющую РНК, причем указанная CasZ-направляющая РНК содержит направляющую последовательность, которая комплементарна целевой последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и содержит область, которая может связываться с полипептидом CasZ.
24. Набор по п. 23, дополнительно содержащий трансактивирующую некодирующую РНК CasZ (транкРНК) или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную транкРНК CasZ.
25. Генетически модифицированная эукариотическая клетка, содержащая по меньшей мере одно из:
(a) полипептида CasZ или нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный полипептид CasZ;
(b) CasZ-направляющей РНК или нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную CasZ-направляющую РНК, причем указанная CasZ-направляющая РНК содержит направляющую последовательность, которая комплементарна целевой последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и содержит область, которая может связываться с полипептидом CasZ; и
(c) трансактивирующей некодирующей РНК CasZ (транкРНК) или нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную транкРНК CasZ.
26. Композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, характеризующиеся по меньшей мере одним из следующего:
(а) нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид CasZ, содержит нуклеотидную последовательность, которая: (i) кодирует полипептид CasZ и (ii) функционально связана с гетерологичным промотором;
(b) нуклеиновая кислота, кодирующая указанную CasZ-направляющую РНК, содержит нуклеотидную последовательность, которая: (i) кодирует CasZ-направляющую РНК и (ii) функционально связана с гетерологичным промотором; и
(с) нуклеиновая кислота, кодирующая указанный транкРНК CasZ, содержит нуклеотидную последовательность, которая: (i) кодирует транкРНК CasZ и (ii) функционально связана с гетерологичным промотором.
27. Композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, для применения в способе терапевтического лечения пациента.
28. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что по меньшей мере одна из: нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный полипептид CasZ, нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную CasZ-направляющую РНК, и нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную транкРНК CasZ, представляет собой рекомбинантный вектор экспрессии.
29. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что CasZ-направляющая РНК и/или транкРНК CasZ содержат одно или более из: модифицированного азотистого основания, модифицированного остова или неприродной межнуклеозидной связи, модифицированного сахарного фрагмента, закрытой нуклеиновой кислоты, пептидной нуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеотида.
30. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что полипептид CasZ представляет собой вариант полипептида CasZ со сниженной нуклеазной активностью по сравнению с соответствующим белком CasZ дикого типа.
31. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что по меньшей мере одно из: полипептида CasZ, нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CasZ, CasZ-направляющей РНК, нуклеиновой кислоты, кодирующей CasZ-направляющей РНК, транкРНК CasZ и нуклеиновой кислоты, кодирующей транкРНК CasZ; конъюгирован с гетерологичным фрагментом.
32. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по п. 31, отличающиеся тем, что гетерологичный фрагмент представляет собой гетерологичный полипептид.
33. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что полипептид CasZ имеет сниженную нуклеазную активность по сравнению с соответствующим белком CasZ дикого типа и слит с гетерологичным полипептидом.
34. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по п. 33, отличающиеся тем, что гетерологичный полипептид: (i) имеет ДНК-модифицирующую активность, (ii) проявляет способность увеличивать или уменьшать транскрипцию и/или (iii) имеет ферментативную активность, которая модифицирует полипептид, связанный с ДНК.
35. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что полипептид CasZ содержит аминокислотную последовательность, имеющую 70% или более идентичности с белком CasZ согласно фиг. 1 или фиг. 7.
36. Способ, композиция, набор или эукариотическая клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что направляющая последовательность и область, которая связывается с полипептидом CasZ, являются гетерологичными по отношению друг к другу.
37. Способ обнаружения целевой ДНК в образце, причем способ включает:
(а) приведение в контакт образца с:
(i) полипептидом CasZ;
(ii) направляющей РНК, содержащей: область, которая связывается с полипептидом CasZ, и направляющую последовательность, которая гибридизируется с целевой ДНК; и
(iii) детекторной ДНК, которая является одноцепочечной и не гибридизируется с направляющей последовательностью направляющей РНК; и
(b) измерение сигнала пригодного для обнаружения, генерируемого расщеплением одноцепочечной детекторной ДНК при помощи CasZ, таким образом обнаруживая целевую ДНК.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что целевая ДНК является одноцепочечной.
39. Способ по п. 37 или 38, отличающийся тем, что целевая ДНК является двухцепочечной.
40. Способ по любому из пп. 37-39, отличающийся тем, что целевая ДНК представляет собой вирусную ДНК.
41. Способ по любому из пп. 37-40, отличающийся тем, что целевая ДНК представляет собой ДНК паповавируса, гепаднавируса, герпесвируса, аденовируса, поксвируса или парвовируса.
42. Способ по любому из пп. 37-41, отличающийся тем, что полипептид CasZ содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью CasZ, представленной на любой из фиг. 1 и 7.
43. Способ по любому из пп. 37-41, отличающийся тем, что полипептид CasZ представляет собой полипептид Cas14a.
44. Способ по любому из пп. 37-43, отличающийся тем, что образец содержит молекулы ДНК из лизата клеток.
45. Способ по любому из пп. 37-44, отличающийся тем, что образец содержит клетки.
46. Способ по любому из пп. 37-45, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт осуществляют внутри клетки in vitro, ex vivo, или in vivo.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что клетка представляет собой эукариотическую клетку.
48. Способ по любому из пп. 37-47, отличающийся тем, что целевая ДНК может быть обнаружена при концентрации всего 10 мкМ.
49. Способ по любому из пп. 37-48, включающий определение количества целевой ДНК, присутствующей в образце.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанное определение включает:
измерение сигнала пригодного для обнаружения для генерации тестового измерения;
измерение сигнала пригодного для обнаружения, генерируемого эталонным образцом или клеткой, для генерации эталонного измерения; и
сравнение тестового измерения с эталонным измерением, чтобы определить количество целевой ДНК, присутствующей в образце.
51. Способ по любому из пп. 37-50, отличающийся тем, что измерение сигнала пригодного для обнаружения включает одно или более из: обнаружения на основе наночастиц золота, флуоресцентной поляризации, фазового перехода/дисперсии коллоида, электрохимического обнаружения, сенсорного обнаружения при помощи полупроводников.
52. Способ по любому из пп. 37-51, отличающийся тем, что одноцепочечная детекторная ДНК содержит пару красителей, испускающих флуоресценцию.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что пара красителей, испускающих флуоресценцию, генерирует количество сигнала пригодного для обнаружения до расщепления одноцепочечной детекторной ДНК, и количество сигнала пригодного для обнаружения уменьшается после расщепления одноцепочечной детекторной ДНК.
54. Способ по п. 52, отличающийся тем, что одноцепочечная детекторная ДНК генерирует первый сигнал пригодный для обнаружения до расщепления и второй сигнал пригодный для обнаружения после расщепления одноцепочечной детекторной ДНК.
55. Способ по любому из пп. 52-54, отличающийся тем, что пара красителей, испускающих флуоресценцию, представляют собой пару для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
56. Способ по п. 18, отличающийся тем, что количество сигнала пригодного для обнаружения увеличивается после расщепления одноцепочечной детекторной ДНК.
57. Способ по п. 52 или  56, отличающийся тем, что пара красителей, испускающих флуоресценцию, представляет собой пару гаситель/флуорофор.
58. Способ по любому из пп. 52-57, отличающийся тем, что одноцепочечная детекторная ДНК содержит две или более пар красителей, испускающих флуоресценцию.
59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что две или более пар красителей, испускающих флуоресценцию, включают пару для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) и пару гаситель/флуорофор.
60. Способ по любому из пп. 37-59, отличающийся тем, что одноцепочечная детекторная ДНК содержит модифицированное азотистое основание, модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированный линкер нуклеиновой кислоты.
61. Способ по любому из пп. 37-60, отличающийся тем, что указанный способ включает амплификацию нуклеиновых кислот в образце.
62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что указанная амплификация включает изотермическую амплификацию.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что изотермическая амплификация включает рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA - recombinase polymerase amplification).
64. Способ по любому из пп. 61-63, отличающийся тем, что указанная амплификация начинается до приведения в контакт на стадии (а).
65. Способ по любому из пп. 61-63, отличающийся тем, что указанная амплификация начинается вместе с приведением в контакт на стадии (а).
66. Набор для обнаружения целевой ДНК в образце, содержащий:
(а) направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую направляющую РНК; причем направляющая РНК содержит: область, которая связывается с полипептидом CasZ, и направляющую последовательность, которая комплементарна целевой ДНК; и
(b) меченую детекторную ДНК, которая является одноцепочечной и не гибридизируется с направляющей последовательностью направляющей РНК.
67. Набор по п. 66, дополнительно содержащий полипептид CasZ.
68. Набор по п. 67, отличающийся тем, что полипептид CasZ содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью CasZ, представленной на любой из фиг. 1 и 7.
69. Набор по п. 67, отличающийся тем, что полипептид CasZ представляет собой полипептид Cas14a.
70. Набор по любому из пп. 66-69, отличающийся тем, что одноцепочечная детекторная ДНК содержит пару красителей, испускающих флуоресценцию.
71. Набор по п. 70, отличающийся тем, что пара красителей, испускающих флуоресценцию, представляет собой пару для FRET.
72. Набор по п. 70, отличающийся тем, что пара красителей, испускающих флуоресценцию, представляет собой пару гаситель/флуорофор.
73. Набор по любому из пп. 70-72, отличающийся тем, что одноцепочечная детекторная ДНК содержит две или более пар красителей, испускающих флуоресценцию.
74. Набор по п. 73, отличающийся тем, что указанные две или более пар красителей, испускающих флуоресценцию, включают первую пару красителей, испускающих флуоресценцию, которая генерирует первый сигнал пригодный для обнаружения, и вторую пару красителей, испускающих флуоресценцию, которая генерирует второй сигнал пригодный для обнаружения.
75. Набор по любому из пп. 66-74, дополнительно содержащий компоненты для амплификации нуклеиновых кислот.
76. Набор по п. 75, отличающийся тем, что компоненты для амплификации нуклеиновой кислоты представляют собой компоненты для рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA).
77. Способ расщепления одноцепочечной ДНК (оцДНК), причем способ включает:
приведение в контакт популяции нуклеиновых кислот, при этом указанная популяция содержит целевую ДНК и множество нецелевых оцДНК, с:
(i) полипептидом CasZ; и
(ii) направляющей РНК, содержащей: область, которая связывается с полипептидом CasZ, и направляющую последовательность, которая гибридизируется с целевой ДНК,
при этом полипептид CasZ расщепляет нецелевые оцДНК из указанного множества.
78. Способ по п. 77, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт осуществляют внутри клетки in vitro, ex vivo, или in vivo.
79. Способ по п. 78, отличающийся тем, что клетка представляет собой эукариотическую клетку.
80. Способ по п. 79, отличающийся тем, что эукариотическая клетка представляет собой растительную клетку.
81. Способ по любому из пп. 78-80, отличающийся тем, что нецелевые оцДНК являются чужеродными для клетки.
82. Способ по п. 81, отличающийся тем, что нецелевые оцДНК представляют собой вирусные ДНК.
83. Способ по любому из пп. 77-82, отличающийся тем, что целевая ДНК является одноцепочечной.
84. Способ по любому из пп. 77-82, отличающийся тем, что целевая ДНК является двухцепочечной.
85. Способ по любому из пп. 77-84, отличающийся тем, что целевая ДНК представляет собой вирусную ДНК.
86. Способ по любому из пп. 77-84, отличающийся тем, что целевая ДНК представляет собой ДНК паповавируса, гепаднавируса, герпесвируса, аденовируса, поксвируса или парвовируса.