ПЕПТИД, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ HSP70, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА, СОДЕРЖАЩАЯ ТАКОЙ ПЕПТИД, ИНДУКТОР ИММУННОГО ОТВЕТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-ПРЕЗЕНТИРУЮЩЕЙ КЛЕТКИ
PEPTID, OBTAINED FROM HSP70, A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF CANCER, CONTAINING SUCH PEPTID, IMMUNE RESPONSE INDUCTOR AND METHOD FOR OBTAINING ANTIGEN-PRESENTING PATH

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Настоящее изобретение предлагает полученный из HSP70 пептид, более конкретно, иммуногенный пептид, участвующий в презентации антигена T-клетке посредством связывания с человеческим лейкоцитарным антигеном, фармацевтическую композицию для лечения или профилактики рака, содержащую такой пептид, индуктор иммунного ответа, способ получения антиген-презентирующей клетки и др.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Существует гипотеза, что в живом организме периодически появляются раковые клетки и существует естественный иммунитет, направленный против специфического ракового антигена, образующегося в раковых клетках, и индуцирующий специфический иммунный ответ, включающий в себя уничтожение раковых клеток лимфоцитами и другими клетками.
[0003] Для распознавания антигена, образующегося в раковых клетках, требуется наличие комплекса человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), присутствующего на поверхности клетки, и лимфоцита. Молекулы HLA, как основного антигена гистосовместимости, условно подразделяют на молекулы класса I (HLA типа A, B и C) и молекулы класса II (HLA типа DP, DQ и DR). Реакция уничтожения раковой клетки цитотоксической T-клеткой (CTL) индуцируется в результате специфического распознавания ракового антигена (эпитопа CTL), состоящего из 8-11 аминокислот и презентированного молекулой HLA класса I на поверхности раковой клетки, рецептором T-клеточного антигена (TCR), присутствующим на CTL.
[0004] Поиск иммуногенных пептидов в настоящее время проводят с учетом их применения, например, для лечения или профилактики разных заболеваний, связанных с иммунной системой; например, в выложенном патенте Японии № 08-151396 описан олигопептид, состоящий из конкретной аминокислотной последовательности и обладающий HLA-связывающей способностью.
Список литературы
Патентные документы
[0005] Патентный документ 1: выложенный патент Японии № 08-151396
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА
[0006] Известно много пептидов, обладающих HLA-связывающей способностью; однако еще существует потребность в пептидах, которые можно использовать для лечения или профилактики разных раковых заболеваний. Поскольку ген HLA характеризуется высокой степенью полиморфизма, также существует потребность в иммуногенных пептидах разных типов, каждый из которых совместим с разными типами HLA.
РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ
[0007] С учетом описанных выше обстоятельств, целью настоящего изобретения является получение иммуногенного пептида, способного связываться с молекулой HLA класса I, в частности, пептида, способного индуцировать CTL, получение фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака с использованием пептида, стимулятора иммунитета, и разработка способа получения антиген-презентирующей клетки.
[0008] А именно, настоящее изобретение включает в себя нижеследующие пункты.
(1) Пептид, содержащий 8 или более последовательных аминокислотных остатков одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15, и состоящий из 11 или менеее аминокислотных остатков.
(2) Пептид по пункту (1), аминокислотная последовательность которого содержит 1 или более аминокислотных замен, вставок, делеций или добавлений, причем пептид является иммуногенным.
(3) Пептид по пункту (2), аминокислотная последовательность которого содержит замену аминокислоты в положении 2 на тирозин, фенилаланин, метионин, триптофан, валин, лейцин или глутамин, и/или замену C-концевой аминокислоты на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан, метионин или валин.
(4) Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая пептид по любому из пунктов (1)-(3).
(5) Фармацевтическая композиция по пункту (4), где композиция находится в виде вакцины.
(6) Фармацевтическая композиция по пункту (4) или (5), где пептид может связываться с молекулами HLA одного или более типов.
(7) Индуктор иммунитета, содержащий пептид по любому из пунктов (1)-(3).
(8) Индуктор иммунитета по пункту (7), где индуктор индуцирует цитотоксическую T-клетку.
(9) Индуктор иммунитета по пункту (7) или (8), где пептид может связываться с молекулами HLA одного или более типов.
(10) Способ получения антиген-презентирующей клетки, обладающей CTL-индуцирующей активностью, где способ включает в себя стадию приведения пептида по любому из пунктов (1)-(3) в контакт с антиген-презентирующей клеткой in vitro.
ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] В последние годы среди способов лечения рака большое внимание уделяется иммунотерапии. Есть все основания предполагать, что пептид настоящего изобретения можно использовать в качестве противораковой вакцины, поскольку он обладает способностью связываться с HLA и эффективно индуцировать CTL. Кроме того, предусматривается его применение в разных способах иммунотерапии, в частности, в иммунотерапии с использованием дендритных клеток.
[0010] Семейство белков теплового шока (HSP) участвует в выполнении ряда клеточных функций, таких как укладка, транспорт, модификация и защита белка, например, в качестве молекулярного шаперона (Zugel, U. and Kaufmann, S.H.: Role of heat-shock proteins in protection from and pathogenesis of infectious diseases., Clin. Microbiol. Rev. 12: 19-39, 1999). HSP подразделяют на 8 семейств: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, HSP28, HSP27 и HSP25, в зависимости от размера их молекул. Кроме того, известно, что HSP участвуют в процессе гибели клеток (апоптоз), в связи с чем их условно подразделяют на 2 группы: группа, ингибирующая апоптоз, и группа, индуцирующая апоптоз.
[0011] HSP70 представляет собой белок теплового шока, ингибирующий апоптоз, причем показано, что высокий уровень экспрессии HSP70 связан с выживанием клеток в разных условиях, например, при злокачественной трансформации клеток. И действительно, описано, что белок HSP 70, из которого получают пептид настоящего изобретения, экспрессируется при разных раковых заболеваниях (например,
1. Yoshida et al., Anticancer Res. 2009 Feb;29(2):539-44
2. Ciocca DR, Clark GM, Tandon AK, Fuqua SA, Welch WJ and McGuire WL: Heat-shock protein hsp70 in patients with axillary lymph node-negative breast cancer: prognostic implications. J Natl Cancer Inst 85: 570-574, 1993
3. Kaur J and Ralhan R: Differential expression of 70-kDa heatshock protein in human oral tumorigenesis. Int J Cancer 63: 774-779, 1995
4. Park CS, Joo IS, Song SY, Kim DS, Bae DS and Lee JH: An immunohistochemical analysis of heat-shock protein 70, p53, and estrogen receptor status in carcinoma of the uterine cervix. Gynecol Oncol 74: 53-60, 1999
5. Cornford PA, Dodson AR, Parsons KF, Desmond AD, Woolfenden A, Fordham M, Neoptolemos JP, Ke Y and Foster C: Heat-shock protein expression independently predicts clinical outcome in prostate cancer. Cancer Res 60: 7099-7105, 2000
6. Malusecka E, Zborek A, Krzyzowska-Gruca S and Krawczyk Z: Expression of heat-shock proteins HSP70 and HSP27 in primary non-small cell lung carcinomas. An immunohistochemical study. Anticancer Res 21: 1015-1021, 2001
7. Chuma M, Sakamoto M, Yamazaki K, Ohta T, Ohki M, Asaka M and Hirohashi S: Expression profiling in multistage hepatocarcinogenesis: identification of HSP70 as a molecular marker of early hepatocellular carcinoma. Hepatology 37: 198-207, 2003
8. Castle PE, Ashfaq R, Ansari F and Muller CY: Immunohistochemical evaluation of heat-shock proteins in normal and preinvasive lesions of the cervix. Cancer Lett 229: 245-252, 2005
9. Kurahashi T, Miyake H, Hara I and Fujisawa M: Expression of major heat-shock proteins in prostate cancer: correlation with clinicopathological outcomes in patients undergoing radical prostatectomy. J Urol 177: 757-761, 2007).
[0012] Конкретный пептид настоящего изобретения способен связываться с HLA разных типов. Следовательно, пептид настоящего изобретения можно использовать, например, для разработки противораковой вакцины и терапии на основе дендритных клеток, подходящих для применения у весьма широкой группы раковых пациентов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0013]
[Фигура 1] На фигуре 1 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ELISPOT (число IFN-γ-продуцирующих клеток), где образцы пациентов с раком печени (тип HLA: 02: 01/24:02), получающих терапию дендритными клетками HSP70, стимулируют пептидом SEQ ID NO: 7, 9 или 15.
[Фигура 2] На фигуре 2 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ELISPOT (число IFN-γ-продуцирующих клеток), где образцы пациентов с раком печени (тип HLA: 02: 01/33:03), получающих терапию дендритными клетками HSP70, стимулируют пептидом SEQ ID NO: 7, 9 или 15.
[Фигура 3] На фигуре 3 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ELISPOT (число IFN-γ-продуцирующих клеток), где образцы пациентов с раком печени (тип HLA: 02: 06/24:02), получающих терапию дендритными клетками HSP70, стимулируют пептидом SEQ ID NO: 7, 9 или 15.
[Фигура 4] На фигуре 4 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ELISA (число IFN-γ-продуцирующих клеток), где образцы пациентов с раком печени (тип HLA: 24: 02/26:01), получающих терапию дендритными клетками HSP70, стимулируют пептидом SEQ ID NO: 7, 9 или 15.
[Фигура 5] На фигуре 5 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ELISA (число IFN-γ-продуцирующих клеток), где образцы пациентов с раком печени (тип HLA: 24: 02/26:01), получающих терапию дендритными клетками HSP70, стимулируют пептидом SEQ ID NO: 5, 6, 7, 9, 10 или 15.
[Фигура 6] На фигуре 6 приведен график, демонстрирующий результаты анализа ELISA (число IFN-γ-продуцирующих клеток), где образцы пациентов с раком печени (тип HLA: 24: 02/24:02), получающих терапию дендритными клетками HSP70, стимулируют пептидом SEQ ID NO: 5, 6, 7, 9 или 10.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0014] 1. Иммуногенный пептид
Каждый пептид настоящего изобретения содержит 8 или более последовательных аминокислотных остатков одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15 и состоит, в общей сложности, из 11 или менее, предпочтительно, из 10 или менее, более предпочтительно, из 9 или менее аминокислотных остатков. Пептид настоящего изобретения может представлять собой пептид, имеющий одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15. Пептид настоящего изобретения получают из HSP70, который представляет собой один из белков теплового шока. Выбирают аминокислотную последовательность, связывающая способность которой в отношении молекулы HLA характеризуется значением -log Kd 3 или более, причем связывающую способность предсказывают, используя гипотезу, полученную с помощью метода активного обучения (выложенный патент Японии № 08-151396), на основе аминокислотных последовательностей, составляющих HSP70.
[0015] В таблице 1 приведены аминокислотные последовательности пептидов настоящего изобретения и теоретические оценки их способности связываться с HLA.
[Таблица 1]
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:)
Положение в HSP70
Теоретическая оценка связывания
с A*24:02
с A*02:01
с A*02:06
GVPQIEVTF (SEQ ID NO: 1)
470
6,8692
4,1663
4,1952
TFDVSILTI (SEQ ID NO: 2)
204
5,407
4,4626
4,2078
FYPEEISSM (SEQ ID NO: 3)
114
5,4008
4,1076
4,6748
KLLQDFFNG (SEQ ID NO: 4)
348
4,9877
4,8334
4,7267
VLVGGSTRI (SEQ ID NO: 5)
335
4,9353
4,6469
4,8296
MVLTKMKEI (SEQ ID NO: 6)
122
4,7341
4,1818
5,093
YGAAVQAAI (SEQ ID NO: 7)
371
4,6632
4,9012
4,2215
LLLDVAPLS (SEQ ID NO: 8)
392
4,4106
5,5399
5,3719
AMTKDNNLL (SEQ ID NO: 9)
448
5,6852
4,9114
3,9638
ITRARFEEL (SEQ ID NO: 10)
297
5,0063
3,8722
5,0269
NLLGRFELS (SEQ ID NO: 11)
454
4,3151
5,0725
5,4672
AQIHDLVLV (SEQ ID NO: 12)
329
4,1429
5,0029
5,5161
YAFNMKSAV (SEQ ID NO: 13)
545
3,1481
5,0986
5,022
NQPGVLIQV (SEQ ID NO: 14)
434
3,9589
5,2086
6,1881
SVTNAVITV (SEQ ID NO: 15)
138
3,4149
4,8686
6,0256
[0016] Пептид настоящего изобретения обладает способностью связываться с HLA и иммуногенностью (далее его иногда называют просто "HLA-пептид" или "иммуногенный пептид"). В данном описании термин "иммуногенность" относится к способности индуцировать иммунный ответ и, например, к CTL-индуцирующей активности, то есть, к цитотоксической активности в отношении раковых клеток.
[0017] В предпочтительном варианте осуществления пептид настоящего изобретения представляет собой мульти-HLA-пептид, способный связываться с разными аллелотипами HLA-A гена A. Например, пептид SEQ ID NO: 7 способен прочно связываться с продуктом гена HLA-A*24:02 (молекула HLA-A*24:02), продуктом гена HLA-A*02:01 (молекула HLA-A*02:01) и продуктом гена HLA-A*02:06 (молекула HLA-A*02:06), и обладает высокой иммуногенностью.
[0018] Подтип HLA, с которым может связываться пептид настоящего изобретения, не ограничивается HLA-A*24:02, HLA-A*02:01 или HLA-A*02:06. Однако указанные подтипы HLA встречаются примерно у 85% жителей Востока, включая Японию, и примерно у 55% жителей Запада; следовательно, можно предположить, что мульти-HLA-пептид настоящего изобретения позволит охватить широкую группу пациентов, например, при применении в качестве иммунотерапии.
[0019] Пептид настоящего изобретения можно модифицировать по аминокислотным остаткам, составляющим аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-15, или их части, при условии сохранения иммуногенности. Каждая из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15 подразумевает статус, присутствующий на антиген-презентирующей клетке; однако, если пептид настоящего изобретения вводят непосредственно в организм, пептид может претерпевать изменения, например, отщепление концевых участков в пищеварительных органах и т.п., в зависимости от способа введения. Следовательно, перед внедрением в антиген-презентирующую клетку, пептид настоящего изобретения может находиться в виде предшественника, образованного в результате добавления одного или более аминокислотных остатков и т.п. к N-концу и/или C-концу, так что аминокислотная последовательность, выбранная из SEQ ID NO: 1-15, сохраняется после связывания с заранее определенной молекулой HLA класса I на антиген-презентирующей клетке.
[0020] Кроме того, пептид настоящего изобретения может содержать 1 или более замен, вставок, делеций или добавлений аминокислотных остатков, и/или он может содержать такие модификации, как добавление сахарной цепи, окисление и/или фосфорилирование боковой цепи, при условии, что пептид при этом сохраняет желательную иммуногенность. В данном документе термин "аминокислота" используется в самом широком смысле и включает в себя, помимо природных аминокислот, искусственные варианты и производные аминокислот. В соответствии с данным описанием, примеры аминокислот включают в себя природные L-аминокислоты, входящие в состав белков; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производныеаминокислот; природные аминокислоты, не входящие в состав белков, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин; а также химически синтезированные соединения, имеющие свойства, которые в данной области известны как свойства, характерные для аминокислот. Примеры неприродных аминокислот включают в себя α-метиламинокислоты (такие как α-метилаланин), D-аминокислоты, гистидин-подобные аминокислоты(такие как β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин и α-метилгистидин), аминокислоты, содержащие внешний метилен на боковой цепи ("гомо"-аминокислоты), и аминокислоты, в которых карбоксильная функциональная группа на боковой цепи замещена сульфоновой кислой группой (такие как цистеиновая кислота).
[0021] В случае замены аминокислотного остатка и т.п., с учетом непрерывности пептидной последовательности, обладающей связывающей способностью в отношении HLA (J. Immunol., 152: p3913, 1994; Immunogenetics, 41: p178, 1995; J. Immunol., 155: p4307, 1994), специалисты в данной области могут соответствующим образом заменить аминокислотный остаток, являющийся составной частью пептида настоящего изобретения.
[0022] Более конкретно, в случае пептида, связывающегося с молекулой HLA-A*24:02, аминокислоту в положении 2 пептида можно заменить на тирозин, фенилаланин, метионин или триптофан, и/или C-концевую аминокислоту можно заменить на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. В случае пептида, связывающегося с молекулой HLA-A*02:01, аминокислоту в положении 2 можно заменить на лейцин или метионин, и/или C-концевую аминокислоту можно заменить на валин или лейцин. Кроме того, в случае пептида, связывающегося с молекулой HLA-A*02:06, аминокислоту в положении 2 можно заменить на валин или глутамин, и/или C-концевую аминокислоту можно заменить на валин или лейцин.
[0023] Пептид настоящего изобретения можно получить с помощью способа, известного специалистам в данной области. Например, его можно искусственно синтезировать, используя твердофазный метод, такой как Fmoc-метод или tBoc-метод, или жидкофазный метод. Целевой пептид также можно получить путем экспрессии полинуклеотида, кодирующего пептид настоящего изобретения, или рекомбинантного вектора, содержащего такой полинуклеотид. Каждый из полученных таким образом пептидов можно идентифицировать с помощью метода, известного специалистам в данном области. Например, пептид можно идентифицировать методом деградации по Эдману или методом масс-спектрометрии.
[0024] 2. Фармацевтическая композиция
Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака настоящего изобретения содержит, в качестве активного ингредиента, например, пептид, содержащий 8 или более последовательных аминокислотных остатков из одной или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 1-15, и состоящий, в общей сложности, из 11 или менее, предпочтительно, из 10 или менее, более предпочтительно, из 9 или менее аминокислотных остатков. Пептид, входящий в состав фармацевтической композиции, может представлять собой пептид, имеющий одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15. Пептид имеет указанное выше определение.
[0025] Пептид настоящего изобретения, представленный на антиген-презентирующей клетке, индуцирует CTL, а индуцированный CTL повреждает раковую клетку. Таким образом, активный ингредиент фармацевтической композиции настоящего изобретения не ограничивается пептидом настоящего изобретения и может представлять собой компонент, способный непосредственно или косвенно индуцировать CTL, такой как полинуклеотид, кодирующий пептид, или вектор, содержащий полинуклеотид, или антиген-презентирующая клетка, представляющая комплекс пептида и молекулы HLA на своей поверхности, или экзосома, секретированная из антиген-презентирующей клетки, или их сочетание. Примеры подходящей антиген-презентирующей клетки включают в себя макрофаг и дендритную клетку; однако предпочтительно использовать дендритную клетку, которая обладает высокой CTL-индуцирующей способностью. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать и другие ингредиенты, традиционно используемые для противораковой терапии, такие как хемокин, цитокин, фактор некроза опухоли и химиотерапевтическое средство. Доза пептида может составлять, например, примерно от 1 до 10 мг/сутки для взрослого пациента. Однако доза может варьировать в зависимости от возраста и массы тела пациента, способа введения и т.п., и поэтому нужную дозу определяет специалист в данной области.
[0026] Полагают, что фармацевтическая композиция настоящего изобретения может способствовать уничтожению раковых клеток, например, посредством нижеследующего механизма действия, но не ограничиваясь им. В результате введения фармацевтической композиции настоящего изобретения конкретному раковому пациенту пептид, входящий в состав фармацевтической композиции, предоставляется в виде формы, связанной с молекулой HLA, на поверхности антиген-презентирующей клетки. В результате распознавания пептида на такой антиген-презентирующей клетке происходит активация CTL, затем их пролиферация и поступление в кровоток. Когда пептид-специфический CTL попадает в раковую ткань, он распознает такой же пептид, полученный из специфического ракового антигена, в природе связанный с молекулой HLA, присутствующей на поверхности раковой клетки, и уничтожает раковую клетку. Такой процесс является составной частью способа лечения рака.
[0027] Фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно использовать не только для лечения, но и для профилактики рака. Например, фармацевтическая композиция настоящего изобретения после введения в организм здорового человека индуцирует CTL, индуцированные цитотоксические T-клетки остаются в организме и при появлении отдельных раковых клеток могут уничтожать их. Подобным образом, композицию можно вводить в организм человека после лечения рака для предотвращения рецидива.
[0028] Любой рак, сопровождающийся экспрессией HSP70, рассматривается как рак, подлежащий лечению или профилактике. Более конкретные примеры представляющего интерес рака включают в себя, без ограничения, рак поджелудочной железы, печеночно-клеточный рак, рак простаты, рак легкого, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак крови, опухоль мозга, рак почки и рак кожи. Например, поскольку HSP70, из которого получают пептид настоящего изобретения, экспрессируется на повышенном уровне при печеночно-клеточном раке, полагают, что пептид настоящего изобретения можно эффективно использовать для лечения или профилактики данного рака. Если присутствует несколько видов рака, подлежащих лечению или профилактике, можно использовать фармацевтическую композицию настоящего изобретения, содержащую несколько активных ингредиентов, включающих в себя иммуногенный пептид.
[0029] Фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно растворить в водном растворителе, получить в виде фармацевтически приемлемой соли и использовать для введения пациентам. Примеры такой фармацевтически приемлемой соли включают в себя форму, забуференную при физиологическом значении pH в виде физиологически приемлемой водорастворимой соли, такой как соль натрия, калия, магния или кальция. Помимо водорастворимого растворителя можно использовать также растворитель, не растворимый в воде; примеры такого не растворимого в воде растворителя включают в себя спирты, такие как этанол и пропиленгликоль.
[0030] Фармацевтическая композиция настоящего варианта осуществления может содержать средства, предназначенные для разных целей; примеры таких средств включают в себя консерванты и забуферивающие средства. Примеры консервантов включают в себя бисульфит натрия, бисульфат натрия, тиосульфат натрия, бензалкония хлорид, хлорбутанол, тимеросал, ацетат фенилртути, нитрат фенилртути, метилпарабен, поливиниловый спирт, фенилэтиловый спирт, аммиак, дитиотреитол и бета-меркаптоэтанол. Примеры забуферивающих средств включают в себя карбонат натрия, борат натрия, фосфат натрия, ацетат натрия и бикарбонат натрия. Указанные средства могут присутствовать в количестве, обеспечивающем поддержание pH системы от 2 до 9, предпочтительно от 4 до 8.
[0031] Вид лекарственной формы фармацевтической композиции настоящего изобретения специально не ограничивается; однако если композиция находится в виде вакцины, примеры лекарственных форм включают в себя растворы для инъекций (внутримышечных, подкожных и внутрикожных), пероральные композиции и назальные капли. Если фармацевтическая композиция настоящего изобретения находится в виде вакцины, она может представлять собой смесь вакцин, содержащую несколько активных ингредиентов. Например, такая вакцина может содержать два или более пептидов, выбранных из SEQ ID NO: 1-15, или она может содержать совокупность активных ингредиентов в сочетании с другими активными ингредиентами.
[0032] Вакцина настоящего изобретения может содержать инертный ингредиент, который представляет собой ингредиент, отличный от фармацевтической композиции, не обладающий собственной активностью, но способствующий дополнительному усилению эффекта фармацевтической композиции, используемой в качестве вакцины. Примеры инертного ингредиента включают в себя адъювант и токсоид. Примеры адъюванта включают в себя, без ограничения, адъюванты осадочного типа, такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия и фосфат кальция, и масляные адъюванты, такие как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда.
[0033] Если фармацевтическая композиция настоящего изобретения находится в виде вакцины, ее предпочтительно вводят в организм путем инъекции или инфузии, например, путем внутрикожного, подкожного или внутримышечного введения, путем дермального введения, или путем ингаляции через слизистую оболочку носа, зева и т.п. Ее однократную дозу можно установить в диапазоне от дозы, способной заметно индуцировать цитотоксические T-клетки, до дозы, способной вызвать повреждение значительного числа нераковых клеток.
[0034] Фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно использовать не только для введения в организм человека, но и для применения вне организма. Более конкретно, фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно использовать для стимуляции антиген-презентирующих клеток in vitro или ex vivo с целью повышения их CTL-индуцирующей активности. Например, если фармацевтическую композицию настоящего изобретения используют для лечения рака с применением дендритных клеток, композицию можно привести в контакт с антиген-презентирующими клетками, такими как дендритные клетки, полученные заранее от пациента, нуждающегося в лечении или профилактике рака, с последующим введением антиген-презентирующих клеток пациенту путем возвращения их в организм пациента. Пептид, входящий в состав фармацевтической композиции, можно ввести в антиген-презентирующие клетки, например, путем липофекции или инъекции. Если в таком способе применения используют полинуклеотид, кодирующий пептид настоящего изобретения, указанный полинуклеотид можно ввести в антиген-презентирующие клетки с помощью известного в данной области метода. Например, полученные от пациента антиген-презентирующие клетки можно трансформировать in vitro представляющим интерес полинуклеотидом, или вектором, кодирующим полинуклеотид, с помощью такого метода, как липофекция, электропорация, микроинъекция, гибридизация клеток, применение DEAE-декстрана, кальций-фосфатный метод и т.п.
[0035] 3. Индуктор иммунитета
Индуктор иммунитета настоящего изобретения содержит, в качестве активного ингредиента, например, пептид, содержащий 8 или более последовательных аминокислотных остатков из одной или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 1-15, и состоящий, в общей сложности, из 11 или менее, предпочтительно, из 10 или менее, более предпочтительно, из 9 или менее аминокислотных остатков. Пептид, входящий в состав индуктора иммунитета, может представлять собой пептид, имеющий одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15. Пептид имеет указанное выше определение.
[0036] Полагают, что пептид настоящего изобретения, представленный на антиген-презентирующей клетке, будет индуцировать иммунитет. Таким образом, активный ингредиент индуктора имунитета настоящего изобретения не ограничивается пептидом настоящего изобретения и может представлять собой компонент, способный непосредственно или косвенно индуцировать иммунитет, такой как полинуклеотид, кодирующий пептид настоящего изобретения, или вектор экспресии, содержащий указанный полинуклеотид, или антиген-презентирующая клетка, представляющая комплекс пептида и молекулы HLA на своей поверхности, или экзосома, секретированная из антиген-презентирующей клетки, или их сочетание. Примеры подходящей антиген-презентирующей клетки включают в себя макрофаг и дендритную клетку; однако предпочтительно использовать дендритную клетку, которая обладает высокой CTL-индуцирующей способностью.
[0037] Индуктор имунитета настоящего изобретения можно использовать не только для введения в организм человека, но и для применения вне организма. Более конкретно, индуктор имунитета настоящего изобретения можно использовать для стимуляции антиген-презентирующих клеток in vitro или ex vivo с целью повышения их CTL-индуцирующей активности. Например, если индуктор имунитета настоящего изобретения используют в способе терапии с применением дендритных клеток, индуктор можно привести в контакт с антиген-презентирующими клетками, такими как дендритные клетки, полученные заранее от пациента, нуждающегося в индукции иммунитета, с последующим введением антиген-презентирующих клеток пациенту путем возвращения их в организм пациента. Пептид, входящий в состав индуктора имунитета, можно ввести в антиген-презентирующие клетки, например, путем трансфекции с использованием липосом (метод липофекции) или инъекции. Если в таком способе применения используют полинуклеотид, кодирующий пептид настоящего изобретения, указанный полинуклеотид можно ввести в антиген-презентирующие клетки с помощью известного в данной области метода. Например, полученные от пациента антиген-презентирующие клетки можно трансформировать in vitro представляющим интерес полинуклеотидом, или вектором, обеспечивающим экспрессию указанного полинуклеотида, с помощью такого метода, как липофекция, электропорация, микроинъекция, гибридизация клеток, применение DEAE-декстрана, кальций-фосфатный метод и т.п.
51
[0038] В данном описании термин "индукция иммунитета" относится к индукции иммунного ответа, например, к повышению CTL-индуцирующей активности антиген-презентирующей клетки, и к дополнительному повышению цитотоксической активности CTL против раковых клеток. В данном описании термин "индукция CTL" относится к индукции или пролиферации CTL, специфически распознающих конкретный антиген, или к дифференциации наивных T-клеток в эффекторные клетки, способные уничтожать клетки-мишени (цитотоксическая активность), такие как раковые клетки, и/или к увеличению цитотоксической активности CTL в результате представления пептида настоящего изобретения на поверхности антиген-презентирующей клетки in vitro или in vivo. CTL-индуцирующую активность можно измерить путем анализа продукции цитокинов (например, интерферона (IFN)-γ)), опосредованной CTL. Например, CTL-индуцирующую активность можно измерить путем определения увеличения числа цитокин-продуцирующих клеток, индуцированных из клеток-предшественников под действием антиген-презентирующих клеток, таких как моноциты периферической крови, стимулированные пептидом настоящего изобретения, с помощью известного высокочувствительного иммуноанализа, такого как ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot). Цитотоксическую активность также можно измерить с помощью известного метода, такого как анализ высвобождения Cr. Если активность заметно увеличивается по сравнению с контролем, например, на 5% или более, на 10% или более, на 20% или более, предпочтительно, на 50% или более, можно сделать вывод об индукции иммунитета или CTL.
[0039] 4. Способ получения антиген-презентирующей клетки
Способ получения антиген-презентирующей клетки настоящего изобретения включает в себя стадию приведения в контакт, например, пептида, содержащего 8 или более последовательных аминокислотных остатков из одной или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 1-15, и состоящего, в общей сложности, из 11 или менее, предпочтительно, из 10 или менее, более предпочтительно, из 9 или менее аминокислотных остатков, и антиген-презентирующей клетки in vitro. Пептид, используемый в способе получения настоящего изобретения, может представлять собой пептид, имеющий одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15. Пептид имеет указанное выше определение.
[0040] Предполагается, что пептид, используемый в способе получения настоящего изобретения, связывается с молекулой HLA класса I на поверхности антиген-презентирующей клетки и предоставляется CTL как антигенный пептид, способный индуцировать CTL-активность антиген-презентирующей клетки. Компонент, приводимый в контакт с антиген-презентирующей клеткой, не ограничивается пептидом настоящего изобретения, он может представлять собой любой компонент, способный непосредственно или косвенно индуцировать CTL, такой как полинуклеотид, кодирующий указанный пептид, или вектор, содержащий указанный полинуклеотид, или антиген-презентирующая клетка, представляющая комплекс пептида и молекулы HLA на своей поверхности, или экзосома, секретированная из антиген-презентирующей клетки, или их сочетание. Примеры подходящей антиген-презентирующей клетки включают в себя макрофаг и дендритную клетку; однако предпочтительно использовать дендритную клетку, которая обладает высокой CTL-индуцирующей способностью.
[0041] Антиген-презентирующую клетку, полученную с помощью способа настоящего изобретения, можно использовать не только в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции или индуктора иммунитета, но и для проведения иммунотерапии и т.п. Например, если антиген-презентирующие клетки используют в способе терапии с применением дендритных клеток, полученные клетки можно привести в контакт с антиген-презентирующими клетками, такими как дендритные клетки, обладающие низкой CTL-индуцирующей способностью и полученные заранее от пациента, нуждающегося в индукции иммунитета, с последующим введением антиген-презентирующих клеток пациенту путем возвращения их в организм пациента. Пептид настоящего изобретения можно ввести в антиген-презентирующие клетки, например, путем трансфекции с использованием липосом (метод липофекции) или инъекции. Если в таком способе применения используют полинуклеотид, кодирующий пептид настоящего изобретения, указанный полинуклеотид можно ввести в антиген-презентирующие клетки с помощью известного в данной области метода. Например, полученные от пациента антиген-презентирующие клетки можно трансформировать in vitro представляющим интерес полинуклеотидом, или вектором, обеспечивающим экспрессию указанного полинуклеотида, с помощью такого метода, как липофекция, электропорация, микроинъекция, гибридизация клеток, применение DEAE-декстрана, кальций-фосфатный метод и т.п.
Пример 1
[0042] Далее настоящее изобретение описывается более подробно с использованием Примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается указанными примерами.
[0043] В данном примере процедуры прогнозирования, эксперимента и анализа проводят с использованием экспериментального метода активного обучения, описанного в международной публикации № WO 2006/004182. Порядок эксперимента определяется посредством повторения нижеследующих стадий как единого целого.
[0044] (1) Проверяют алгоритм обучения низкой категории, описанный ниже. Данный алгоритм включает в себя генерирование ряда гипотез на основе случайной перевыборки из накопленных данных, и выбор точки, в которой вариантность предсказанных значений случайно сгенерированных точек запроса-кандидатов (пептидов) является максимальной, в качестве точки запроса, подлежащей исследованию.
[0045] (2) Пептид в выбранной точке запроса получают с помощью описанных ниже способов синтеза и очистки. С помощью описанного ниже эксперимента измеряют фактическую связывающую способность и результаты добавляют к накопленным данным.
9
[0046] Такой способ активного обучения позволяет уменьшить число экспериментов по анализу связывания, необходимых для тестирования всех 5 сотен миллиардов (=20) или более веществ-кандидатов, представляющих собой HLA-связывающие пептиды, состоящие из 9 аминокислотных остатков.
[0047] Используя описанный выше порядок эксперимента, экстрагируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-15.
[0048] <Синтез и очистка пептида>
Пептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-15, синтезируют вручную с помощью твердофазного метода Меррифильда, используя Fmoc-аминокислот. После удаления защитных групп полученный пептид подвергают очистке методом ВЭЖХ на обращенной фазе, используя колонку C18, с достижением чистоты 95% или более. Идентификацию пептидов и подтверждение степени их чистоты осуществляют методом масс-спектрометрии MALDI-TOF (AB SCIEX MALDI-TOF/TOF5800). Количественное определение пептида проводят с помощью анализа Micro BCA (Thermo Scienftific Co., Ltd.), используя BSA в качестве стандартного белка.
[0049] <Анализ связывания пептида с молекулой HLA-A*24:02>
Способность каждого пептида связываться с молекулой HLA-A*24:02, как продуктом гена HLA-A*24:02, измеряют, используя клетки C1R-A24, экспрессирующие молекулу HLA-A*24:02 (клетки, полученные профессором Masafumi Takeguchi, университет Кумамото, подарены старшим доцентом Masaki Yasukawa, университет Эхиме, с разрешения).
[0050] Вначале клетки C1R-A24 подвергают воздействию кислых условий, pH 3,3, в течение 30 секунд, чтобы вызвать диссоциацию и удалить эндогенные пептиды, изначально связанные с молекулой HLA-A*24:02, и легкую цепь, β2m, которая обычно связана с молекулами HLA класса I. После нейтрализации к клеткам C1R-A24 добавляют очищенный β2m и затем серийные разведения пептидов. Все смеси инкубируют на льду в течение 4 часов. Комплекс из 3 молекул (MHC-pep), содержащий молекулу HLA-A*24:02, пептид и β2m, который был отсоединен в процессе инкубации, окрашивают моноклональным антителом 17A12, меченным флуоресцентной меткой и распознающим данный комплекс.
[0051] Затем измеряют число MHC-pep на клетке C1R-A24 (пропорциональное интенсивности флуоресценции меченного антитела) с помощью флуоресцентного клеточного анализатора, FACScan (Becton, Dickinson and Company). Константу диссоциации (значение Kd) комплекса, образованного молекулой HLA-A*24:02 и пептидом, рассчитывают, исходя из среднего значения интенсивности флуоресценции на клетку, с помощью метода, опубликованного ранее авторами настоящего изобретения (Udaka et al., Immunogenetics, 51, 816-828, 2000).
[0052] <Анализ связывания пептида с молекулой HLA-A*02:01>
Способность каждого пептида связываться с молекулой HLA-A*02:01, как продуктом гена HLA-A*24:02, измеряют, используя клеточную линию T2 (полученную от ATCC), экспрессирующую молекулу HLA-A*02:01.
[0053] Клетки T2 и очищенный β2m добавляют к серийным разведениям пептида, связывающая способность которого подлежит измерению, и инкубируют при 37°C в течение 4 часов. Молекулу HLA-A*02:01, уровень экспрессии которой увеличивается в зависимости от концентрации в течение данного периода времени, окрашивают комплекс-специфичным моноклональным антителом, меченным флуоресцентной меткой, BB7.2.
[0054] Затем с помощью проточного цитометра измеряют количество флуоресценции, приходящееся на одну клетку, и рассчитывают константу диссоциации (значение Kd) с помощью метода, опубликованного ранее авторами настоящего изобретения (Udaka et al., Immunogenetics, 51, 816-828, 2000).
[0055] <Анализ связывания пептида с молекулой HLA-A*02:06>
Способность каждого пептида связываться с молекулой HLA-A*02:06, как продуктом гена HLA-A*02:06, измеряют, используя клетки RA2.6 (клеточная линия, недавно полученная в университете Коти), где кДНК гена HLA-A*02:06 вводят в RMAS в виде мышиный TAP (транспортер, ассоциированный с процессингом антигена)-дефицитной клеточной линии.
[0056] Вначале клетки RA2.6 культивируют в течение ночи при 26°C, чтобы накопить молекулы HLA-A*02:06, не связанные с пептидом, на поверхности клетки. Затем добавляют серийные разведения пептида и инкубируют при 26°C в течение 60 минут.
[0057] Затем смесь культивируют при 35°C в течение 4 часов, что приводит к денатурации пустой молекулы HLA-A*02:06, не связанной с пептидом, и к утрате ее стерической структуры. Добавляют меченное флуоресцентной меткой моноклональное антитело BB7.2, специфически распознающее связанную с пептидом молекулу HLA-A*02:06, и инкубируют на льду в течение 20 минут для развития окрашивания.
[0058] Затем с помощью проточного цитометра измеряют количество флуоресценции, приходящееся на одну клетку, и рассчитывают константу диссоциации (значение Kd) с помощью метода, опубликованного ранее авторами настоящего изобретения (Udaka et al., Immunogenetics, 51, 816-828, 2000).
[0059] <Результаты анализа связывания>
Результаты анализов связывания пептидов настоящего изобретения с каждой молекулой HLA показаны в нижеследующей таблице 2.
[Tаблица 2]
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:)
Положение в HSP70
Результаты анализа связывания
с A*24:02
с A*02:01
с A*02:06
GVPQIEVTF (SEQ ID NO: 1)
470
-6,451225173
>-3
-5,130417023
TFDVSILTI (SEQ ID NO: 2)
204
-6,238032253
>-3
>-3
FYPEEISSM (SEQ ID NO: 3)
114
-7,66350091
>-3
>-3
KLLQDFFNG (SEQ ID NO: 4)
348
>-3
-4,958921074
-5,268061867
VLVGGSTRI (SEQ ID NO: 5)
335
-6,172930121
-4,860260368
-5,069659334
MVLTKMKEI (SEQ ID NO: 6)
122
-5,818975521
-4,58642391
-5,532894759
YGAAVQAAI (SEQ ID NO: 7)
371
-5,502072835
-4,904317969
-5,37221634
LLLDVAPLS (SEQ ID NO: 8)
392
> -3
-6,059683064
-6,171355699
AMTKDNNLL (SEQ ID NO: 9)
448
-5,492398754
-5,559823762
-4,275867751
ITRARFEEL (SEQ ID NO: 10)
297
-5,206187958
-4,325522946
-5,579932749
NLLGRFELS (SEQ ID NO: 11)
454
>-3
-4,559640805
-5,175394643
AQIHDLVLV (SEQ ID NO: 12)
329
>-3
-6,147821579
-6,44597639
YAFNMKSAV (SEQ ID NO: 13)
545
>-3
-5,09069
-5,020701151
NQPGVLIQV (SEQ ID NO: 14)
434
>-3
-5,909585202
-6,417158659
SVTNAVITV (SEQ ID NO: 15)
138
-4,370281453
-4,76157
-5,594226356
[0060] Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-15 получают из полноразмерной последовательности предопределенного геномного белка HSP70, описанной в SEQ ID NO: 16.
[0061] <Тестирование пептидов на способность индуцировать иммунитет>
(1) Получение пептид-стимулированной дендритной клетки
День 0-9 (индукция дендритной клетки)
Моноциты выделяют из периферической крови пациента, страдающего от печеночно-клеточного рака, методом лейкафереза. Выделенные моноциты культивируют в течение 6 дней в присутствии 800 ед/мл GM-CSF и 500 ед/мл IL-4. Кроме того, к культуральному раствору добавляют 300 ед/мл TNF-α и культивируют в течение 4 дней, чтобы индуцировать зрелые дендритные клетки. Затем методом электропорации вводят мРНК HSP70, получая дендритные клетки, презентирующие полученный из HSP70 антигенный пептид.
7
7
7
[0062] Дендритные клетки, стимулированные 1×10, 2×10 или 3×10 мРНК HSP70 (HSP70-дендритные клетки) вводят в бедро пациента с печеночно-клеточным раком путем подкожной инъекции (терапия с использованием HSP70-дендритных клеток). Подкожное введение HSP70-дендритных клеток, полученных с помощью такого же метода, повторяют каждые 3 недели. Из моноцитов периферической крови, полученных путем фереза от пациента с раком печени, получавшего 2 раза или более терапию дендритными клетками HSP70, получают клеточную фракцию, прилипшую к культуральной колбе, и культивируют ее в среде AIM-CM (торговое наименование "Gibco", от Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) при 37°C в течение 10 дней. В процессе культивирования на 0 и 3 день добавляют 15 мкл IL-4 и 30 мкл гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF), а на 5 день добавляют 15 мкл IL-4, 30 мкл GM-CSF и 75 мкл фактора некроза опухоли (TNF)-α.
[0063]
День 10 (стимуляция пептидом и выделение дендритных клеток)
Дендритные клетки, индуцированные из моноцитов, извлекают из среды AIM-CM и добавляют каждый из пептидов настоящего изобретения (SEQ ID NO: 5, 6, 7, 9, 10 и 15) в концентрации 20 мкг/мл. Затем среду, содержащую дендритные клетки, культивируют при 37°C в течение 2 часов. Нижеследующие пептиды используют в качестве положительных и отрицательных контролей.
Положительный контроль для HLA-A24:02 (EBV LMP2, 419-427: TYGPVFMCL (SEQ ID NO: 17))
Отрицательный контроль для HLA-A24:02 (HIV env gp160, 584-592: RYLRDQQLL (SEQ ID NO: 18))
Положительный контроль для HLA-A02:01 (Flu A MP, 58-66: GILGFVFTL (SEQ ID NO: 19))
Отрицательный контроль для HLA-A02:01 (HIV gap p17, 77-85: SLYNTVATL (SEQ ID NO: 20))
Положительный контроль для HLA-A02:06 (EBV LMP2 453-461: LTAGFLIFL (SEQ ID NO: 21))
Отрицательный контроль для HLA-A02:06 (HIV gap p24 341-349: ATLEEMMTA (SEQ ID NO: 22))
[0064] Дендритные клетки извлекают, промывают 3 раза или более достаточным количеством среды AIM-CM и считают.
[0065] (2) Получение клеток CD8T
День 0-9
Из моноцитов периферической крови, полученных путем фереза от пациента с раком печени, получавшего 2 раза или более терапию дендритными клетками HSP70, получают плавающую клеточную фракцию (включающую в себя лимфоциты), не прилипающую к культуральной колбе, и культивируют ее в среде AIM-CM (от GIBCO Co., Ltd.) при 37°C в течение 10 дней. В процессе культивирования на 4 и 6 день к среде добавляют 40 мкл IL-2.
[0066]
День 10
С помощью набора для негативного отбора CD8 (от Miltenyi Biotec) клетки CD8T отделяют от среды и считают.
[0067] (3) Совместное культивирование
Дендритные клетки и клетки CD8T, полученные на описанных выше стадиях (1) и (2), совместно культивируют в среде AIM при 37°C в нижеследующих условиях.
5
Клетки CD8T: 5×10 клеток/лунку
5
Дендритные клетки: 2×10 клеток/лунку
[0068]
День 12 или 13
К вышеуказанной среде добавляют 0,4 мл/лунку среды AIM-CM, содержащей IL-2 в количестве 20 ед/мл.
[0069] (4) Анализ ELISPOT
День 17
4
Клетки CD8T добавляют в 96-луночный планшет для ELISPOT (Millipore), покрытый моноклональным антителом против IFN-γ (Mabtech AB), в количестве 2×10 клеток/лунку. Для каждого образца используют 3 или более лунок. В каждую лунку добавляют 100 мкл AIM-V (торговой наименование "Gibco" от Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.). 96-луночный планшет для ELISPOT культивируют при 37°C.
[0070]
День 18
В каждую лунку добавляют антитело против IFN-γ и затем подвергают его взаимодействию со вторичным антителом, меченным ферментом HRP, чтобы измерить число IFN-γ-продуцирующих клеток посредством цветной реакции. Типичные результаты анализа ELISPOT, полученные для пациентов, имеющих тип HLA 02:01/24:02, показаны на фигуре 1; полученные для пациентов 02:01/33:03, показаны на фигуре 2; полученные для пациентов 02:06/24:02, показаны на фигуре 3. На каждой фигуре показаны результаты, представляющие собой среднее значение от 5 анализов.
[0071] (5) Анализ ELISA
День 17
На 7 день культуральный супернатант, полученный путем совместного культивирования T-клеток и дендритных клеток, стимулированных каждым из вышеуказанных пептидов, разводят до 4 уровней, ×1, ×5, ×25 и ×125, чтобы определить уровень разведения, не обеспечивающий предел измерения при использовании набора для определения человеческого IFN-γ ELISA MAX Deluxe (BioLegend Inc.). Затем каждый образец измеряют 3 раза при при определенном уровне разведения. Типичные результаты анализа ELISA, полученные для пациентов, имеющих тип HLA 24:02/26:01, показаны на фигурах 4 и 5, а полученные для пациентов 24:02/24:02, показаны на фигуре 6.
[0072] Настоящее изобретение описано выше посредством примера. Данный пример является только иллюстративным и для специалистов в данной области должно быть очевидно, что можно осуществлять разные модификации, которые входят в объем настоящего изобретения.