Совершенствование метода клонального микроразмножения актинидии и лимонника китайского

С.А. Муратова Д.Г. Шорников М.Б. Янковская Р.В. Папихин

Совершенствование метода клонального

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ АКТИНИДИИ И ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ - проект № 09-04-97500-р_центр_а

УДК 634.74:581.143.6

Проводили работы по оптимизации условий культивирования на различных этапах (введение в культуру, микроразмножение, укоренение) актинидии и лимонника in vitro. Изучено влияние гормонального, минерального и углеводного состава питательных сред на интенсивность пролиферации и ризогенез некоторых сортов актинидии, а также индукцию и рост побегов лимонника китайского в изолированной культуре.

Ключевые слова: биотехнология, клональное микроразмножение, актинидия, лимонник китайский.

Muratova S.A., Shornikov D.G, Yankovskaia M.B., Papikhin R.V. Improvement of clonal micropropagation method for actinidia and Schisandra chinensis plants. Research work for optimization of some environmental conditions on different stages of cultivation (sterilization of plant material, shoot micropropagation and rhyzogenesis) of actinidia and Schisandra chinensis was done. The influence of hormones, mineral compounds and type of carbons source on shoots proliferation and rooting of some actinidia cultivars were investigated. As for Schi-sandra chinensis, only induction and micropropagation of shoots take place in this study.

Key words: biotechnology, clonal micropropagation, actinidia, Schisandra chinensis.

Введение

В настоящее время значительно возрос интерес к нетрадиционным культурам плодовых и ягодных растений, отличающимся, с одной стороны, высоким со-

Муратова С.А., к.б.н.; Шорников Д.Г., к.с.-х.н.;

Янковская М.Б., м. н. с.; Папихин Р.В., к. с. -х. н. - ГНУ ВНИИ селекции и генетики плодовых растений им. И.В. Мичурина

держанием природных антиоксидантов и биологически активных веществ, с другой - привлекательными декоративными характеристиками. К таким популярным растениям относятся ягодные лианы умеренных широт - актинидия и лимонник китайский. Для своевременного удовлетворения потребительского спроса на новые виды и сорта необходимо вместе с традиционными способами размножения широко внедрять новые технологии производства посадочного материала. Клональное микроразмножение является наиболее хорошо разработанным и широко применяемым в разных странах методом прикладной биотехнологии. Использование данного способа в сочетании с термо-и хемотерапией позволяет не только быстро размножить перспективные сорта и гибриды на базе даже единичных исходных экземпляров, но и освободить их от наиболее распространенных вредителей и болезней.

Существующая в настоящий момент в литературе разноречивость рекомендаций по минеральному и гормональному составу сред, используемых для клонального микроразмножения представителей рода Actinidia, делает актуальным совершенствование основных этапов культивирования для отечественных сортов данной культуры.

В последние годы начаты активные работы по размножению лимонника китайского в условиях in vitro. Как следует из обзора проведенных работ, в зависимости от генетических особенностей используемого материала, может иметь место невысокий коэффициент размножения и низкая скорость роста побегов, а также недостаточная эффективность ризогенеза. Это влечёт за собой необходимость модификации отдельных элементов методики с учётом биологических особенностей конкретной формы, а также привлечения различных стимулирующих факторов для прохождения критических этапов культивирования.

Место проведения, объекты и методы исследования

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина. В исследования включены разные виды и сорта актинидии (Actinidia, Lindl.) - сорта актинидии коломикта (A. kolomikta) ВИР 1, Сентябрьская, Университетская, Плоская, Находка, актинидия полигама (A. polygama) - элитная женская форма № 3, а также актинидия пурпурная (A. purpurea) Садовая из коллекции Московского отделения ВИР им. Н.И. Вавилова, актинидия полигама сорт Солнцеликая, актинидия аргута сорт Великанша и сорт Киевская крупноплодная (А. arguta х A. purpurea) из коллекции Волгоградского регионального ботанического сада, лимонник китайский (Schizandra chinensis).

Методика исследования

Культивирование in vitro изолированных тканей и органов ягодных и декоративным растений осуществ-

ляли согласно общепринятым рекомендациям [1] и использовали собственные варианты биотехнологических методик [4]. На различных этапах экспериментальной работы использовали минеральную основу питательных сред MS [9], QL [10] и QL в модификации A. Standardi (1984), WPM [8], c добавлением 10...40 г/л углевода (сахарозы, глюкозы, фруктозы или мальтозы), 100 мг/л мезоинозитола, 100.1000 мг/л гидролизата казеина, 6.7 г/л агара. На этапе размножения лимонника китайского, кроме того, использовали среду Симмондса-Камминга (L6) в нашей модификации.

На этапах введения и микроразмножения применяли регуляторы роста растений: 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин - 0,25.2,0 мг/л, 2-

изопентиламинопурин (2-иП), кинетин - 1,0.5,0 мг/л, гибберелловую кислоту (ГК) - 0,1...2,0 мг/л, Р-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), или р-индолилуксусную кислоту (ИУК) - 0,05.0,2 мг/л и комплекс витаминов по Мурасиге-Скугу. На этапе укоренения микрочеренков концентрацию макросолей и сахарозы снижали вдвое, в среду добавляли ИМК или ИУК в концентрации 0,1.2,0 мг/л. При другом способе укоренения основания черенков замачивали в течение 16 часов в растворе ауксина (50 мг/л), после чего высаживали их на безгормональную среду. Растения культивировали при t = 26 ± 2°С и 16-часовом световом дне.

Результаты исследований

Необходимым условием успешного введения в культуру in vitro является достижение полной стерильности исходного растительного материала с сохранением его жизнеспособности. В настоящее время разработано большое количество разнообразных схем стерилизации, в том числе с применением бытовых дезинфицирующих средств. В качестве альтернативы высокотоксичным препаратам ртути мы использовали коммерческий препарат гипохлорита натрия «Белизна», при разведении стерильной водой в объемном соотношении 1:1.1:3 (в зависимости от типа экс-планта). Данное средство малотоксично для человека и растений и позволяет широко варьировать временной диапазон обработки с учетом степени лигнифика-ции тканей эксплантов. Ягодные культуры лучше приживаются, когда в качестве первичных эксплантов используются апикальные почки и узлы побегов текущего года в фазе активного роста. Эффективная экспозиция стерилизации составляет от 2,5 до 5.8 мин, и обеспечивает выход 60.90% стерильных экс-плантов актинидии и лимонника китайского. В этом случае экспланты переносят стерилизацию с минимальными повреждениями тканей и активно развиваются уже на этапе введения. Узлы зеленых побегов (1.2 почки) с сегментами междоузлий выдерживают экспозицию 7.9 мин.

Для культивирования определенного вида, как правило, подходят не одна, а несколько питательных

сред. Практически все изучаемые нами садовые культуры успешно размножаются на минеральной основе сред MS и QL, что делает дальнейший подбор питательных сред нецелесообразным. В качестве минеральной основы при культивировании сортов актинидии коломикта целесообразно использовать среду QL, а сорта и формы актинидии пурпурной, аргута и поли-гама успешно формируют побеги на среде MS.

Изменение минерального состава питательной среды оказывает существенное влияние на коэффициент размножения лимонника. Лучшие результаты получены на среде QL в модификации А. Standardi (1984). Кроме того, отмечено повышение коэффициента размножения на средах QL (с 1,8 до 2,4) и L6 (с 1,5 до 1,8), содержащих гидролизат казеина, что указывает на стимулирующую роль этого компонента на этапе микроразмножения лимонника. Интенсивность роста побегов лимонника на разных минеральных основах питательных сред изменялась несущественно. Дальнейшие эксперименты проводились по оптимизации баланса источников азота на основе питательной среды QL. Показано, что при полном отсутствии аммонийной и пониженном содержании нитратной форм азота процесс формирования микропобегов существенно замедляется, коэффициент размножения снижается до 0,5 новых побега на эксплант. Наиболее эффективным является сочетание половинной концентрации нитратной формы азота и % концентрации аммонийной формы от полного содержания этих элементов в исходной среде QL, т.к. в данном случае экс-планты отличаются не только усиленным побегообразованием, но и превосходят контроль по средней длине побега.

В качестве традиционного источника углевода при культивировании тканей растений обычно используют сахарозу в концентрации 20.40 г/л. Нами показано, что при размножении ряда видов можно успешно использовать и другие полисахариды: мальтозу, глюкозу и фруктозу. При культивировании разных видов актинидии нами показано, что использование альтернативных источников углевода в ряде случаев может существенно улучшить показатели размножения, достигнутые на среде с традиционно используемым углеводом - сахарозой в концентрации 30 г/л. Хорошие результаты при микроразмножении разных видов актинидии давало использование фруктозы или мальтозы. Например, для культивирования актинидии аргута (сорт Великанша) можно успешно использовать все изучаемые нами углеводы (рисунок 1). При этом на среде с 30 г/л сахарозы (контроль) коэффициент размножения был наименьшим. Таким образом, налицо ярко выраженная видовая и сортовая специфичность изучаемой культуры по отношению к источнику углеводного питания.

Изменение углеводного состава среды оказывало существенное воздействие на размножение и развитие эксплантов лимонника китайского. Используя в качестве источника углевода глюкозу в концентрации 30

г/л, удалось повысить коэффициент размножения лимонника (рисунок 2). Пониженная концентрация (15 г/л) фруктозы, мальтозы и глюкозы более эффективна для размножения побегов этой культуры, чем 15 г/л сахарозы. Глюкоза в этой же концентрации существенно стимулировала рост побегов лимонника, по сравнению с другими углеводами.

сахароза мальтоза фруктоза глюкоза

Рисунок 1 - Влияние типа и концентрации углевода на эффективность размножения актинидии аргута

сахароза мальтоза фруктоза глюкоза

Рисунок 2 - Влияние типа и концентрации углевода на эффективность размножения лимонника китайского

Существенным моментом, обеспечивающим длительное поддержание активно пролиферирующей культуры in vitro, является правильный выбор цито-кинина и его концентрации. Как показали результаты наших исследований, коэффициент размножения разных видов и сортов актинидии значительно выше на зеатине, чем при использовании других регуляторов роста, на что также указывает в своей работе H. Ha-rada (1975) и И.Н. Пронина (200З). Кинетин и 2-иП в концентрации 2 мг/л не обеспечивали достаточную эффективность размножения этой культуры (рисунок

3), хотя в некоторых литературных источниках отмечен положительный эффект от применения 2-иП и 6-БАП, часто в сочетании с гибберелловой кислотой [2, 6]. Сорта актинидии коломикта лучше всего развиваются только на среде QL, содержащей 0,5.2 мг/л зеатина, тогда как формы актинидии пурпурной и ар-гута успешно формируют побеги и на полной среде MS в сочетании с 0,5.2 мг/л БАП. На средах с зеати-ном формируются крепкие побеги длиной до 5.6 см с крупными нормального цвета листьями, но на срезах базальной части микропобегов образуется большое количество каллуса, что несколько затрудняет последующие пересадки. 2-иП эффективен при размножении актинидии в концентрации не менее 5 мг/л. В качестве ауксина лучшие результаты на этапе микроразмножения актинидии дает ИУК в концентрации 0,1.0,2 мг/л. По нашим наблюдениям, для актинидии характерно спонтанное укоренение побегов на средах размножения. Наиболее мощная корневая система на уровне верхней границы питательной среды формируется на средах с 6-БАП и 2-иП.

Рисунок 3 - Эффективность размножения актинидии коломикта (сорт Плоская) на средах с разными цито-кининами (2 мг/л) + ИУК-0,2 мг/л, ГК-0,5 мг/л

Для лимонника китайского вполне приемлемыми оказались среды, содержащие в качестве цитокинина 6-БАП или зеатин до 2 мг/л в сочетании с ИМК

0,1.0,2 мг/л. Средний коэффициент размножения

этой культуры невысок - 2,1_3,7 побега на эксплант

за пассаж. Отличительной особенностью данной культуры является медленный рост in vitro, в связи с чем, для оптимального развития побегов требуется увеличить продолжительность пассажей до 2.3 месяцев, коэффициент размножения и длина побегов при этом возрастают.

Изучая действие разных концентраций 6-БАП на процессы роста побегов лимонника, установили, что концентрация БАП 1.1,5 мг/л является оптимальной (рисунок 4). При анализе полученных данных отмечена следующая тенденция - варьирование концентрации 6-БАП оказывало более существенное влияние на длину формирующихся побегов, а не на их количество.

Эффективность укоренения in vitro во многом определяется биологической предрасположенностью изучаемых генотипов к вегетативному размножению. С высокой частотой в культуре in vitro укореняются разные виды актинидии. Микрочеренки этой культуры формируют корни даже при содержании 0,1 мг/л ИМК в среде, однако в этом случае качественные показатели развития корневой системы обычно хуже, чем при использовании 0,5.1 мг/л индолилмасляной кислоты, в первую очередь, образуется меньшее количество корней на укорененное растение. Применяя оптимальную концентрацию ауксина для каждого вида и сорта, можно добиться существенного увеличения количества корней и их длины (рисунки 5, 6).

I I Коэф. размн. —Длина

10

і Пурпурная а Плоская

I

0,1

0,5

Концентрация ИМК, мг/л

Рисунок 5 - Образование корней у микрочеренков А. пурпурной (Садовая) и А. коломикта (Плоская) при разных концентрациях ИМК

0 0,1 0,5 1

Концентрация ИМК, мг/л

Рисунок 6 - Рост корней на этапе укоренения микрочеренков А. пурпурной (Садовая) и А. коломикта (Плоская) при разных концентрациях ИМК

Концентрация БАП, мг/л

Рисунок 4 - Влияние разных концентраций 6-БАП на размножение и рост побегов лимонника китайского

Морфологические особенности растения, обусловленные генотипом, проявляются на всех этапах культивирования [3], по нашим наблюдениям, в том числе и при адаптации in vivo. Так, растения-регенеранты актинидии пурпурной и аргуты, которые и в естественных условиях обитания превосходят по силе роста актинидию коломикта, уже в первые месяцы выращивания в теплице отличаются более интенсивным приростом побегов (рисунки 7, 8).

0 Пурпурная Q Плоская

16 1 _ 14-

<D

о 12- 10-з

8 -

си

~ 6-о

о 4 -

о

^ 2-

Рисунок 7 - Растение актинидии коломикта из культуры in vitro, после адаптации в теплице

Рисунок 8 - Растение актинидии пурпурной из культуры in vitro, после адаптации в теплице

4

3

2

0

4

0

0

0

Выводы

Таким образом, на основе изменения количественных показателей микропобегов актинидии и лимонника в культуре in vitro, на разных этапах культивирования установлены видо- и сортоспецифические требования новых ягодных лиан к минеральному составу питательных сред, и в особенности, к типу и концентрации источников углеводного питания или экзогенных регуляторов роста. Высокая эффективность культивирования in vitro и относительная легкость перевода в нестерильные условия делает эти растения весьма перспективными объектами тиражирования с применением биотехнологических методов.

Литература

1. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Учебное пособие / Р.Г. Бутенко. - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.-160 с.

2. Высоцкий, В.А. Особенности клонального микроразмножения актинидии / В.А. Высоцкий, Л.В. Бартенева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991. - С.213-216

3. Малаева, Е.В. Использование биотехнологических методов для сохранения и поддержания коллекции актинидии в культуре in vitro / Е.В. Малаева, Л.Н. Коновалова, О.И. Молканова // Плодоводство и ягодоводство. - Т. XXI. - М.: ВСТИСП, 2009. - С.212-218.

4. Муратова, С.А. Размножение садовых культур in vitro: методические рекомендации / С.А. Муратова,

Д.Г. Шорников, М.Б. Янковская. - Мичуринск-наукоград РФ, ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина, 2008. - 68 с.

5. Пронина, И.Н. Микроклональное размножение актинидии коломикта / И.Н. Пронина // Состояние и перспективы развития нетрадиционных садовых культур: материылы междун. научно-метод. конф. -Воронеж: Кварта, 2003.- С. 235-237.

6. Фирсов, А.П. Микроклональное размножение Actinidia kolomicta (Rupr.) Maxim. / А.П. Фирсов, С.В. Долгов // Методы эффективного ведения садоводства: сб. науч. тр. ВНИИС.- Мичуринск,1996.- С. 132-137.

7. Harada, H. In vitro culture of Actinidia chinensis Pl. as a technique for vegetative multiplication / H. Harada // J. of hortic. Sci. - 1975. - V.50, №1 - Р.81-83

8. Lloid, G.B. Commercially feasible micropropagation of mountain laured (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture / G.B. Lloid., B.H McCown.// Comb. Proc. Intl. Plant. Propagators Soc. - 1980. - V.30. - P. 421-442.

9. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - V.15, №13. - Р. 473-497.

10. Quoirin, M. Etude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus / M. Quoirin, P. Lepoivre // Acta Hortic.-1977. - V. 78. - P. 437-442.

11. Standardi, A. Tissue culture propagation of kiwi-fruit / A. Standardi, F. Catalano // Comb. proc. Intern. plant propagators’ soc. - 1984. - Vol.34. - P.236-243.