ПРИМЕНЕНИЕ ТИОСУЛЬФАТА ДЛЯ УСИЛЕНИЯ АНТИПАТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ЛАКТОБАЦИЛЛ
USE OF THIOSULPHATE IN ORDER TO POTENTIATE ANTI-PATHOGEN EFFECT OF LACTOBACILLUS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям, включающим лактобациллы (молочнокислые бактерии) в комбинации с тиосульфатом, в которых тиосульфат усиливает антипатогенное действие указанных лактобацилл.
У здоровой женщины урогенитальная микрофлора включает около 50 различных видов микроорганизмов. 95% популяции этих микроорганизмов состоит из различных штаммов лактобацилл, которые также называются «палочка Дедерлейна». Эти лактобациллы помогают защищать от патогенных микроорганизмов с помощью различных механизмов, включая производство перекиси водорода, молочной кислоты и бактериоцинов, ингибирование адгезии и распространения патогенных микроорганизмов. В частности, эти лактобациллы поддерживают кислый рН, производя молочную кислоту из гликогена, присутствующего во влагалищной слизи. Поэтому ингибируется рост многочисленных патогеннных микроорганизмов в микрофлоре влагалища, таких как вагинальная гарднерелла Gardnerella vaginalis, превотелла Prevotella bivia, гонококк Neisseria gonorrhoeae, микоплазма Mycoplasma, мобилункус Mobiluncus, а также дрожжеподобный грибок кандида альбиканс Candida albicans.
Таким образом, нормальная микрофлора влагалища в основном состоит из лактобацилл, образующих защитную биопленку на поверхности слизистой оболочки. Среди лактобацилл, которые обычно идентифицируются во влагалище, особенно заметны Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus inners и Lactobacillus gasseri.
Вульвовагинальный кандидоз поражает 70-75% женщин в репродуктивном возрасте, по меньшей мере, один раз, а примерно у 40-50% бывает повторно. Частота рецидивов вульвовагинального кандидоза (определяемая как, по меньшей мере, 4 приступа в год, включая два приступа, подтвержденных микологическим исследованием) была оценена в 5-8%. Это доброкачественное заболевание имеет весьма негативное влияние на качество жизни пациентов и вызывает значительные расходы на медицинское обслуживание. Такая патология трудно поддается лечению ввиду многофакторного патогенеза этой болезни.
Традиционная поддерживающая терапия с использованием пероральных или вагинальных противогрибковых перпаратов должна продолжаться, по меньшей мере, 6 месяцев, однако частота рецидивов остается высокой, причем 60-70% женщин имеют рецидив в течение двух месяцев после прекращения лечения. Кроме того, противогрибковые препараты имеют частые побочные эффекты, и их длительное применение может способствовать возникновению бактериального вагиноза.
Бактериальный вагиноз является следствием качественного и количественного дисбаланса нормальной микрофлоры влагалища, который может привести к практически полному исчезновению лактобацилл с перевесом в пользу анаэробной микрофлоры, а также к появлению таких бактерий, как Gardnerella vaginalis и Atopobium vaginae. Бактериальный вагиноз является одной из наиболее частых вагинальных инфекций с частотой случаев от 10 до 15. Это доброкачественное заболевание у женщин может быть опасно во время беременности, поскольку может привести к преждевременным родам, рождению детей с низким весом и самопроизвольным абортам.
Бактериальный вагиноз и другие виды дисбаланса микрофлоры влагалища обычно лечат при помощи антибактериальной терапии. Это лечение имеет типичные недостатки лечения антибиотиками и оказывается все менее эффективным. Кроме того, оно направлено на устранение патогенной микрофлоры, но также нарушает нормальную полезную микрофлору.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Было описано, что пероральное или вагинальное введение «полезных» лактобацилл поддерживает здоровье влагалища. В частности, патентные заявки WO 84/04675, WO 2000/035465, US 2002/0044926 и WO 2006/045475 описывают пероральное или вагинальное введение молочнокислых бактерий для поддержания здоровья влагалища и предупреждения рецидивов вульвовагинального кандидоза.
В патентной заявке WO 2010/004005 сообщается о введении пребиотиков в сочетании с растительным экстрактом, содержащим изофлавоны, для стимуляции развития нормальной микрофлоры влагалища.
Предпочтительными лактобациллами являются Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus и Lactobacillus vaginalis. Патенты US 6093394, US 6468526 и US 7807440, а также патентная заявка US 2010/0151026 описывают введение специфических штаммов Lactobacillus crispatus.
Эти лактобациллы могут быть введены в лиофилизированной форме или в растворе, и, необязательно, в комбинации с другими активными агентами. Действительно, хотя лактобациллы обладают настоящим и общепризнанным антипатогенным действием, этого часто бывает недостаточно для того, чтобы иметь возможность бороться с инфекцией. Научное сообщество деятельно ищет дополнительные активные агенты или агенты, усиливающие антипатогенное действие лактобацилл.
Было предложено вводить лактобациллы в комбинации с противомикробным агентом, где бактерия является микрокапсулированной (ЕР 0732916 В1); в присутствии молочной кислоты и экстракта чеснока (ЕР 1911455 А1); в присутствии гуммиарабика (ЕР 2211640 А1); в присутствии эстрогенов и/или гестагенов (WO 2010/133314); или в присутствии антибиотика и ненасыщенной этерифицированной жирной кислоты (WO 2011/066949).
Результаты, представленные в статье Nivoliez et al. (2012) показывают, что процессы, используемые в производстве пробиотических бактерий, могут играть важную роль для характеристик лактобацилл, полученных в промышленном масштабе.
Тиосульфат натрия используется в качестве наполнителя в многочисленных фармацевтических и ветеринарных композициях, содержащих лактобациллы, таких как композиции TROPHIGIL, PROBIOS и ALLBIO. Кроме того, заявка на патент CN 20091145852 описывает лекарственный препарат, состоящий из экстрактов китайских растений и тиосульфата натрия. Этот лекарственный препарат в особенности предлагается для лечения гонореи.
В этих композициях тиосульфат натрия применяется как наполнитель, а не в качестве активного агента.
Только американская патентная заявка US 2011/0008467 описывает фармацевтические композиции, включающие единственно тиосульфат натрия фармацевтического качества. Предложены следующие виды терапевтического применения: лечение отравлений цианидом или платиной, кальцификации сосудов и дерматологических заболеваний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Антипатогенное действие лактобацилл действительно существует, но в большинстве случаев не является достаточно сильным, чтобы бороться с инфекцией (см. Фигуру 2а), и, таким образом, часто в дополнение к нему необходимо использовать другие активные ингредиенты, такие как антибиотики или противогрибковые средства.
7
10
Настоящее изобретение предлагает средство усиления антипатогенного действия лактобацилл. Изобретатели действительно обнаружили, что комбинация тиосульфата, в частности тиосульфата натрия, и лактобацилл позволяет усиливать антипатогенное действие этих лактобацилл, когда тиосульфат присутствует в концентрации, по меньшей мере, 100 мг на грамм порошка; для порошка, включающего от 10 до 10 КОЕ/г лактобацилл.
Этот «антипатогенный» эффект характеризуется, в частности, с помощью ингибирования роста патогенных микроорганизмов влагалища, таких как Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia и особенно Candida albicans.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, 100 мг/г тиосульфата натрия в комбинации с Lactobacillus crispatus.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
7
10
Настоящее изобретение относится к применению тиосульфата для того, чтобы усилить антипатогенное действие бактерий Lactobacillus, причем тиосульфат находится в количестве, по меньшей мере, 100 мг на грамм порошка; для порошка, включающего от 10 до 10 КОЕ/г лактобацилл.
Определения
Термин «усиливать» означает придавать большую эффективность, повышать благотворное воздействие активного ингредиента. В частности, усиливающий агент (здесь, тиосульфат) сам по себе не действует на патогенные микроорганизмы, однако влияет через посредство лактобацилл, чье антипатогенное действие он усиливает.
2
2
Термин «антипатогенное действие» относится к профилактическому и лечебному действию лактобацилл по отношению к различным патогенным микроорганизмам, рост которых может быть ингибирован присутствием лактобацилл. Этот эффект выражается с помощью различных механизмов: снижение рН, производство перекиси водорода (HO), производство молочной кислоты и/или уксусной кислоты, производство и секреция бактериоцинов, пептидов, органических кислот и короткоцепочечных жирных кислот и ингибирование адгезии и распространения патогенных микроорганизмов. В частности, это антипатогенное действие определяется как степень ингибирования роста патогенных бактерий, а также степень продукции бактериоцинов и пептидных соединений, обладающих антибактериальными свойствами.
Термин «патогенные микроорганизмы» относится ко всем патогенным микроорганизмам, пригодным к тому, чтобы поселиться в урогенитальном тракте, в частности Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma, Mobiluncus, Candida albicans и Candida glabrata, а также к патогенным микроорганизмам, способным вызывать кишечные инфекции, например, таким как Enterobacteriaceae, включая кишечную палочку Escherichia coli, сальмонеллы Salmonella, стафилококки Staphylococcus, клостридии Clostridium difficile и шигеллы Shigella.
Термин «лактобациллы» относится ко всем бактериям рода Lactobacillus, неподвижным, факультативно анаэробным, грамположительным бактериям переменных размеров и форм. Большинство лактобацилл превращает лактозу и другие простые сахара в молочную кислоту. Лактобациллы колонизируют влагалище и желудочно-кишечный тракт и являются важным компонентом эндогенной микрофлоры кишечника и влагалища.
Настоящее изобретение главным образом относится к лактобациллам, составляющим микрофлору влагалища; понятно, однако, что изобретение может быть осуществлено с другими типами лактобацилл, например, присутствующими в желудочно-кишечном тракте (в частности, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei и Lactobacillus rhamnosus).
Термин «колониеобразующие единицы» или «КОЕ» обозначает единицы измерения, общепризнанные специалистами в данной области техники, для количественной оценки бактерий, способных основать колонию.
2
2
3
Термин «тиосульфат» относится к тиосульфат-ионам  Они являются основной формой тиосерной кислоты (HSO), которая нестабильна в водной среде.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения патогенные микроорганизмы, рост которых ингибируется комбинацией тиосульфата и лактобактерий, принадлежит к семейству Candida albicans, Prevotella bivia, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma или Mobiluncus.
Candida albicans является наиболее важным и хорошо известным видом дрожжей рода Candida. Он вызывает грибковые инфекции (кандидиаз или кандидоз) в основном слизистых оболочек пищеварительного тракта и женской репродуктивной системы.
Prevotella bivia является анаэробной бактерией, которая в основном вызывает вагиноз и инфекции мочевыводящих путей.
Gardnerella vaginalis представляет собой бактерию в форме плеоморфной палочки или коккобациллы. Она часто встречается в случаях вагиноза (неспецифического вагинита), либо в качестве единственной патогенной бактерии, либо в комбинации с другими бактериями. Она производит перфорирующий токсин, который поражает только клетки человека. Кроме того, она может встречаться в крови, моче и в глотке.
Mycoplasma является семейством из более чем 100 видов бактерий, которые нечувствительны к таким группам антибиотиков, как пенициллин или бета-лактамы. В частности, Mycoplasma genitalium ответственна за инфекции половых органов (уретрит, цервицит, вагинит, сальпингит) и бесплодие.
Mobiluncus представляет собой анаэробную грамположительную бактерию, часто ассоциированную с Gardnerella vaginalis при бактериальном вагинозе.
Термин «вагиноз» относится к дисбалансу микробной флоры влагалища. Он характеризуется исчезновением лактобацилл и размножением анаэробных бактерий, таких как Gardnerella vaginalis.
Термин «кандидоз» относится к грибковой инфекции, вызванной дрожжами рода Candida. Candida albicans, наиболее распространенный его вид, является частью обычной микрофлоры ротоглотки и пищеварительного тракта, а также может присутствовать в небольшом количестве в нормальной микрофлоре влагалища. Вульвовагинальный кандидоз является довольно частым и может иметь склонность к нескольким рецидивам.
Термин «инфекция мочевыводящих путей» относится к колонизации мочи бактериями, чаще всего выражается в виде симптомов инфекции мочевыводящих путей. Бактериями, о которых наиболее часто идет речь, являются кишечная палочка Escherichia coli (75% случаев), протей Proteus mirabilis и клебсиелла Klebsiella, все три относятся к Enterobacteriaceae (грамотрицательные бациллы).
Согласно настоящему изобретению ни вагиноз, ни кандидоз, ни инфекции мочевыводящих путей не могут рассматриваться в качестве инфекций, передающиеся половым путем, таких как гонорея.
7
10
7
10
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения тиосульфат выбирают из тиосульфата натрия или тиосульфата калия. Предпочтительно, чтобы использовался тиосульфат натрия. Тиосульфат натрия состоит из ионов натрия и ионов тиосульфата. Предпочтительно, чтобы использующееся количество тиосульфата было, по меньшей мере, 100 мг на грамм порошка, предпочтительно, по меньшей мере, 150 мг на грамм порошка, и более предпочтительно, по меньшей мере, 200 мг на грамм порошка, причем, чтобы этот порошок включал молочнокислые бактерии в диапазоне от 10 до 10 КОЕ. Предпочтительно, чтобы количество тиосульфата натрия в конечном продукте было примерно 230 мг на грамм порошка, содержащего от 10 до 10 КОЕ лактобацилл.
8
10
9
10
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения, тиосульфат используют в количестве от примерно 230 мг на грамм порошка, причем порошок включает лактобациллы в диапазоне от 10 до 10 КОЕ на грамм, и более предпочтительно в диапазоне от 10 до 10 КОЕ/грамм. Специалисты в данной области техники, специалисты в области лиофилизации смогут адаптировать количество добавленного до лиофилизации тиосульфата так, чтобы получить требуемое количество порошка, образующегося после лиофилизации. В частности, это окончательное количество тиосульфата натрия получают добавлением 113 г/л тиосульфата натрия в бактериальную культуральную среду перед лиофилизацией. Тем не менее, примеры показывают, что простое добавление 1 г/л тиосульфата в бактериальную культуральную среду делает возможным усиление действия лактобацилл в культуре.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения лактобациллы представляют собой Lactobacillus rhamnosus и/или Lactobacillus crispatus. Особенно предпочтительными штаммами являются, в частности, штамм Lcr35 и штамм BLL2005.
7
10
8
9
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, 100 мг тиосульфата, предпочтительно по меньшей мере 150 мг тиосульфата, и более предпочтительно, по меньшей мере, 200 мг тиосульфата на грамм порошка, в комбинации со штаммом Lactobacillus crispatus. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения количество лактобацилл на грамм композиции должно быть в диапазоне от 10 до 10 КОЕ/г, более предпочтительно в диапазоне от 10 до 10 КОЕ/г.
Предпочтительно, чтобы штамм Lactobacillus crispatus был в лиофилизированной форме. Штамм может быть единственным лиофилизированным элементом композиции, но предпочтительно, чтобы штамм лиофилизировали в среде, включающей дополнительные компоненты, которые должны быть добавлены перед или после стадии лиофилизации. А именно, тиосульфат натрия может быть добавлен перед лиофилизацией, в частности, в количестве 113 г на литр бактериальной культуральной среды. Тиосульфат натрия также может быть добавлен к бактериальной культуральной среде в количестве 1 г/л, 5 г/л, 10 г/л, 20 г/л, 30 г/л, 50 г/л или 100 г/л.
В соответствии с другим конкретным аспектом настоящего изобретения, фармацевтическая композиция дополнительно включает защитную матрицу и/или наполнители, хорошо известные специалистам в данной области техники и, возможно, другие активные ингредиенты, обладающие дополнительным действием.
В частности, эта композиция может включать следующие активные ингредиенты: гормоны (эстриол, прогестерон, и т.д.), противовоспалительные вещества и/или бактерицидные вещества и/или противогрибковые средства. Специалисты в данной области техники смогут определить, какие активные ингредиенты могут быть предпочтительно комбинированы со штаммом Lactobacillus crispatus. Эта композиция также включает, в соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения, некоторые штаммы лактобацилл.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей культуральный супернатант штамма Lactobacillus, предпочтительно Lactobacillus crispatus, культивируемого в присутствии тиосульфата, в частности тиосульфата натрия, в частности, по меньшей мере, в количестве 100 г/л тиосульфата натрия в культуральной среде. Это культуральный супернатант содержит тиосульфат, но не содержит лактобактерии. Он обладает сильным антипатогенным действием.
Как показано в примерах, присутствие тиосульфата усиливает секрецию бактериоцинов, являющихся пептидными соединениями, обладающими антибактериальными свойствами. Таким образом, вероятно «культуральный супернатант», более не содержащий лактобактерии, включает большое количество бактериоцинов, ранее секретированных лактобациллами.
Эти фармацевтические композиции получают для вагинального или перорального введения. В частности, в качестве использующихся лекарственных форм могут быть капсулы, таблетки, кремы, жидкости или масляные суспензии, или любое другое подходящее медицинское средство.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, 100 мг, предпочтительно, по меньшей мере, 150 мг, и более предпочтительно, по меньшей мере, 200 мг тиосульфата на грамм порошка, в комбинации со штаммом Lactobacillus crispatus, для применения в лечении урогенитальных инфекций, таких как вагиноз, кандидоз и инфекции мочевыводящих путей.
8
9
Предпочтительно, чтобы этот состав включал примерно 230 мг тиосульфата натрия в комбинации со штаммом Lactobacillus crispatus в количестве от 10 до 10КОЕ/г.
Оптимальные способы введения, схемы дозирования и лекарственные формы и композиции по настоящему изобретению могут быть определены в соответствии с критериями, как правило, принимающимися во внимание при установлении подходящего для пациента медикаментозного лечения, такими, например, как возраст пациента или его масса, тяжесть общего состояния пациента, переносимость лечения и наблюдаемые побочные эффекты. Урогенитальные инфекции предпочтительно лечить путем введения одной или двух капсул по 350 мг в день.
7
10
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере 100 мг, предпочтительно, по меньшей мере, 150 мг, и более предпочтительно, по меньшей мере, 200 мг тиосульфата на грамм порошка, в комбинации со штаммом Lactobacillus в количестве от 10 до 10 КОЕ, для применения в лечении урогенитальных инфекций, таких как вагиноз, кандидоз и инфекции мочевыводящих путей, путем усиления антипатогенного действия лактобацилл.
Наконец, настоящее изобретение также относится к новому применению тиосульфата, и в частности тиосульфата натрия, для лечения урогенитальных инфекций, таких как вагиноз, кандидоз и инфекции мочевыводящих путей, путем усиления антипатогенного эффекта лактобацилл.
Тиосульфат может быть использован в комбинации с лактобациллами, как описано выше, или введен изолированно с целью усиления антипатогенного действия лактобацилл, эндогенно присутствующих в вагинальной полости.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
10
Фигура 1. Влияние концентрации тиосульфата натрия в препарате штамма L. crispatus BLL2005 на ингибирование патогенных бактерий С. albicans. Результаты выражены в виде десятичного логарифма (log) снижения числа КОЕ между подсчетами количества бактерий в точке ТО и в других точках отбора проб (Т=4 ч, 24 ч и 28 ч).
10
0
Фигура 2. Композиции, включающие различные штаммы лактобацилл без тиосульфата натрия (Фиг. 2А) или в присутствии тиосульфата натрия (Фиг. 2 В), для ингибирования патогенных бактерий С.albicans. Результаты выражены в виде десятичного логарифма (log) снижения числа КОЕ между подсчетами количества бактерий в точке Т и в других точках отбора проб (Т=4 ч, 24 ч и 28 ч).
10
0
Фигура 3. Композиция, включающая штамм L. crispatus BLL2005 без тиосульфата натрия (Фиг. 3А) или в присутствии тиосульфата натрия (Фиг. 3 В), для ингибирования различных патогенных микроорганизмов. Результаты выражены в виде десятичного логарифма (log) снижения числа КОЕ между подсчетами количества бактерий в точке Т и в других точках отбора проб (Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч).
Фигура 4. Влияние изолированного тиосульфата натрия на рост патогенных бактерий С. albicans.
Фигура 5. Влияние «препарата А» в присутствии или в отсутствие L. crispatus на рост патогенных бактерий С. albicans.
Фигура 6. Совместная культура штамма Lcr35 (L rhamnosus), приготовленная вместе с 150 мг тиосульфата (после лиофилизации в конечном продукте) и Candida albicans.
ПРИМЕРЫ
Пример 1.
Комбинация штамма L. crispatus BLL2005 и различных концентраций тиосульфата натрия для ингибирования патогенных бактерий С. albicans.
Проводили испытания совместной инкубации патогенного штамма Candida albicans UMIP48.72 (АТСС10231) и штамма L crispatus BLL2005, приготовленных вместе с различными концентрациями тиосульфата натрия. Базовый препарат соответствует препарату А (см. ниже), в котором варьировали концентрацию тиосульфата натрия. Этот элемент добавляли в конце ферментации перед стадией лиофилизации.
Препарат А включает в себя следующие компоненты:
- Культуральная среда: 116 г/л молока, 15 г/л декстрозы, 10 г/л автолизированных дрожжей, 2 мл/л твина.
- Среда для лиофилизации: 110 г/л молока, 101,5 г/л фруктоолигосахаридов (ФОС), 9,5 мл/л глутамата, 5,25 г/л аскорбиновой кислоты, 113 г/л тиосульфата натрия.
Испытывали следующие препараты (Таблица 1):
Описание протокола:
Использующиеся культуральные среды:
- Для штаммов Lactobacilli: бульон/агар MRS (при 37°C).
- Для патогенных штаммов: бульон и агар Сабуро (при 25°C).
- Культуральная среда для испытаний: однородная смесь двух культуральных сред.
Подготовка инокулята:
- Работа с образцами без холодового блокирования.
- Пробиотический продукт: 0,2 г препарата А помещали в 20 мл бульона MRS, выдерживая в инкубаторе при 37°C в течение 48 часов.
- Патогенный штамм: 0,2 мл помещали в 20 мл бульона Сабуро при температуре 25°C на 48 часов.
- Чистоту штаммов проверяли путем изоляции. Подготовка контролер:
8
- С целью приготовления контроля для патогенных бактерий 5 мл инокулированного бульона Сабуро (титр около 1×10 КОЕ/мл) помещали в 5 мл не подвергнутого инокуляции бульона MRS.
8
- С целью приготовления контролей для пробиотиков 5 мл инокулированного бульона MRS (титр около 1×10 КОЕ/мл) помещали в 5 мл не подвергнутого инокуляции бульона Сабуро.
Помещение инокулятов в контакт друг с другом:
- Помещали 5 мл патогенного штамма к 5 мл пробиотического штамма. Образцы отбирали непосредственно из смеси.
Измерения:
0
- Подсчет количества патогенных и пробиотических бактерий в точках Т, Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч
0
- Определение рН раствора при Т, Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч
Результаты:
10
0
Результаты представлены на Фигуре 1 и в Таблице 2 ниже. Результаты выражены в виде десятичного логарифма (log) снижения числа КОЕ между подсчетами количества бактерий в точке Т и в других точках отбора проб (Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч).
Для всех испытаний количество бактерий штамма BLL2005 во время совместной инкубации остается постоянным.
Вывод:
Этот эксперимент позволяет показать, что при 10 г/л тиосульфата натрия в препарате А штамма L. crispatus BLL2005 после 28 часов совместной инкубации наблюдается увеличение ингибирования патогенного штамма Candida albicans, равное, по меньшей мере, 1 log. При концентрации тиосульфата 75 г/л было получено полное ингибирование патогенного штамма in vitro.
Пример 2.
Комбинация различных штаммов Lactobacillus и тиосульфата натрия для ингибирования патогенных бактерий С. albicans.
Испытуемые штаммы:
Испытывали следующие штаммы в присутствие или в отсутствие «препарата А», включающего 113 г/л тиосульфата натрия (Таблица 3):
Протокол эквивалентен протоколу, описанному в Примере 1.
Для всех испытаний количество бактерий в штаммах лактобацилл во время совместной инкубации остается постоянным.
10
0
Результаты показаны на Фигуре 2. Эти результаты выражали в виде десятичного логарифма (log) снижения числа КОЕ между подсчетами количества бактерий в точке Т и в других точках отбора проб (Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч).
Вывод:
В своем естественном состоянии все испытуемые штаммы Lactobacillus мало способны или вообще не способны ингибировать патогенные бактерии С. albicans (см. Фигуру 2А).
В противоположность этому, если в комбинации со штаммами PB00033, BLL2005 и Lcr35 используют препарат А, то наблюдается полное ингибирование патогенных бактерий после 28 часов совместной инкубации. Комбинация препарата А со штаммами РВ0003 и РВ0004 дает возможность ингибировать патогенные бактерии более, чем на 3 log.
Таким образом, препараты различных видов лактобацилл с тиосульфатом натрия дают возможность для 5 испытуемых штаммов весьма существенно повысить их способность ингибировать патогенные бактерии Candida albicans.
Пример 3.
Комбинация L crispatus BLL2005 и тиосульфата натрия для ингибирования нескольких штаммов патогенных микроорганизмов.
Проводили различные испытания совместной инкубации между различными штаммами Candida и штаммом L. crispatus BLL2005, приготовленными без тиосульфата натрия (Фигура 3А) или согласно составу препарата А (фигура 3В).
Протокол эквивалентен протоколу, описанному в Примере 1.
0
Для всех испытаний количество бактерий в штаммах лактобацилл во время совместной инкубации остается постоянным. Патогенные и пробиотические бактерии подсчитывали в точках Т, Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч. Для всех испытаний количество бактерий в штамме BLL2005 остается постоянным во время совместной инкубации.
10
0
Результаты показаны на Фигуре 3. Эти результаты выражали в виде десятичного логарифма (log) снижения числа КОЕ между подсчетами количества бактерий в точке Т и в других точках отбора проб (Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч).
Вывод:
Препарат А штамма L. crispatus BLL2005 (испытуемая серия: Е115-2005) позволяет после 28 часов совместной инкубации получить большее или равное 3 log ингибирование всех испытуемых штаммов Candida.
Пример 4.
Приготовление «препарата А».
Штамм BLL2005 культивировали в следующей культуральной среде: 116 г/л молока, 15 г/л декстрозы, 10 г/л автолизированных дрожжей, 2 мл/л твина.
8
После инокуляции культуральной среды, ферментацию поддерживали при температуре 37°C с помощью подходящего термостатически регулирующегося устройства в течение от 48 до 72 часов. После завершения ферментации культуру, количество бактерий в которой становилось более или равно 10 КОЕ/мл, переливали в сосуд для смешивания. Культуру быстро встряхивали, чтобы разрушить творог и после лиофилизации добавляли адъюванты: 110 г/л молока, 101,5 г/л ФОС, 9,5 мл/л глутамата натрия, 5,25 г/л аскорбиновой кислоты, 113 г/л тиосульфата натрия.
Затем проводили лиофилизацию в соответствии со стандартными условиями, хорошо известными специалистам в данной области техники: бактерии распределяли в асептических условиях на лотках из нержавеющей стали, быстро замораживали при -40°C, а затем подвергали операции сублимации при -22°C. После этого проводили инкубацию при 37°C.
Затем продукт измельчали и фильтровали в контролируемой атмосфере. Предпочтительно, чтобы полученный порошок мог быть смешан с 1% стеарата магния для того, чтобы облегчить заполнение капсул.
Полученный таким образом порошок распределяли в капсулы размером «0» в количестве 350 мг порошка на капсулу.
Пример 5.
Антипатогенное действие культурального супернатанта препарата А.
Испытывали следующий штамм Candida: РВр0001 - Candida albicans АТСС 10231.
Использующиеся культуральные среды:
- Для штаммов Lactobacilli: бульон/агар MRS (при 37°C).
- Для патогенных штаммов: бульон и агар Сабуро (при 25°C).
- Культуральная среда для испытаний: однородная смесь двух культуральных сред.
Подготовка инокулята:
- Работа с образцами без холодового блокирования.
- Пробиотический продукт: 0,2 г препарата А помещали в 20 мл бульона MRS, выдерживая в инкубаторе при 37°C в течение 48 часов.
- Патогенный штамм: 0,2 мл помещали в 20 мл бульона Сабуро при температуре 25°C на 48 часов.
- Чистоту штаммов проверяли путем изоляции.
Подготовка контролей:
8
- С целью приготовления контроля для патогенных бактерий 5 мл инокулированного бульона Сабуро (титр около 1×10 КОЕ/мл) помещали в 5 мл не подвергнутого инокуляции бульона MRS.
8
- С целью приготовления контролей для пробиотиков 5 мл инокулированного бульона MRS (титр около 1×10 КОЕ/мл) помещали в 5 мл не подвергнутого инокуляции бульона Сабуро.
Помещение инокулятов в контакт друг с другом:
Помещали 5 мл патогенного штамма к 5 мл пробиотического штамма. Супернатант получали центрифугированием при 10000 оборотах в минуту в течение 10 минут, а затем подвергали фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Образцы отбирали непосредственно из смеси.
Результаты:
10
0
Результаты выражали в виде десятичного логарифма (log) снижения числа КОЕ между подсчетами количества бактерий в точке Т и в других точках отбора проб (Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч).
Вывод:
После предварительного культивирования в течение 48 часов в бульоне MRS супернатант препарата А, полученный центрифугированием при 10000 оборотах в минуту в течение 10 минут с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,22 мкм, делает возможным полное ингибирование патогенного штамма С. albicans начиная с 48 часов совместной инкубации.
Пример 6.
Влияние изолированного тиосульфата натрия на рост патогенных бактерий С. albicans.
Описание протокола:
- До выполнения испытаний производили посев и выращивание штамма в течение 66 часов.
- Помещали прекультуру в контакт с тиосульфатом натрия.
- Определяли титр в точках Т=0 ч, Т=24 ч, Т=48 ч, Т=72 ч и Т=96 ч.
Подготовка испытания:
- Патогенный штамм:
- Candida albicans: 0,5 мл штамма из рабочего флакона помещали в 50 мл бульона Сабуро при 25 на 48 часов.
- Тиосульфат: среда MRS (среда de Man, Rogusa и Sharpe) + натрия тиосульфат (ТС) в различных концентрациях, полученных, как показано ниже:
- Среда MRS+1 г/л натрия тиосульфата: 0,3 г ТС помещали в 30 мл бульона
- Среда MRS+3 г/л натрия тиосульфата: 0,1 г ТС помещали в 10 мл бульона
Помещение штамма в контакт с тиосульфатом:
Испытуемая культуральная среда представляет собой гомогенную смесь культуральной среды патогеннного штамма и среды MRS, содержащей тиосульфат натрия.
- Candida albicans + среда MRS + ТС (1 г/л): 5 мл инокулированного бульона Сабуро помещали вместе с патогенным штаммом и 5 мл среды MRS+ТС (1 г/л).
- Candida albicans + среда MRS + ТС (3 г/л): 5 мл инокулированного бульона Сабуро помещали вместе с патогенным штаммом и 5 мл среды MRS + ТС (3 г/л).
- Контроль Candida: 5 мл инокулированного бульона Сабуро помещали вместе с патогенным штаммом и 5 мл бульона MRS.
Результаты представлены на Фигуре 4.
«Препарат А», включающий 113 г/л тиосульфата натрия также испытывали для определения его действия против Candida:
Подготовка контроля Candida:
8
Для приготовления контроля Candida 5 мл инокулированного бульона Сабуро помещали вместе с патогенным штаммом (титр около 1×10 КОЕ/мл) и 5 мл не подвергнутого инокуляции бульона MRS.
0
Отбор проб и определение титра проводили в точках Т, Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч.
Фигура 5 показывает несколько типов культур:
- Контроль «Candida», культивированный изолированно;
- Две серии, включающие штамм BLL2005 в форме препарата А, как описано выше;
- Две серии, включающие изолированный препарат А, в отсутствие бактерий.
Является очевидным, что препарат, содержащий 113 г/л тиосульфата натрия, не имеет ингибирующей активности в отношении роста Candida.
Вывод:
Никакого противогрибкового действия не наблюдается в присутствии тиосульфата натрия, независимо от изучаемой концентрации. Этот эксперимент показывает, что тиосульфат сам по себе не дает возможности ингибировать рост Candida albicans, и что он действует только как агент, усиливающий действие лактобацилл.
Пример 7.
Совместное культивирование штамма Lcr35 (L rhamnosus). приготовленного вместе с 113 г/л тиосульфата и Candida albicans, и производство этим штаммом бактериоцинов в присутствии или в отсутствие тиосульфата.
A. Ингибирование роста Candida albicans в присутствии штамма Lcr35 (L. rhamnosus).
Подсчет количества бактерий показал полное ингибирование патогенного штамма препаратом Lcr35, содержащим 113 г/л тиосульфата в точке Т=24 ч (Фигура 6).
B. Потенцирование тиосульфатом экспрессии генов, кодирующих бактериоцины.
Штамм L. rhamnosus Lcr35 способен ингибировать рост патогенных микроорганизмов. Кроме того, штамм, приготовленный вместе с тиосульфатом, является более эффективным, чем изолированный штамм сам по себе. Для того, чтобы понять механизмы, которые различаются между собой при этих двух условиях, проводили поиск генов, участвующих в продуцировании бактериоцина. В штамме Lcr35 были найдены 7 генов, кодирующих бактериоцины.
Материалы и методы
В литературе различные бактериоцины связывают с молочнокислыми бактериями. Генные последовательности, кодирующие последние были взяты из банка NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), а затем подвергнуты выравниванию с геномами пробиотического штамма по настоящему изобретению при помощи использования BLAST.
Ниже в таблице 7 представлены различные гены, кодирующие бактериоцины, найденных в геномах Lcr35:
Обнаружение и количественное определение целевых генов
Пары специфических праймеров для генов-мишеней были ранее разработаны для того, чтобы проследить их экспрессию при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Две чистые культуры и совместная культура были получены для штамма Lcr35, причем первая из перечисленных получена с нативным пробиотическим штаммом, вторая из перечисленных с препаратом, содержащим 1 г/л тиосульфата, а последняя культура с препаратом, содержащим 113 г/л тиосульфата и С. albicans.
Результаты
См. Таблицу 8 ниже.
Отслеживание экспрессии этих генов с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) показало в случае, когда этот штамм приготовлен вместе с 1 г/л тиосульфата, избыточную экспрессию шести генов, кодирующих бактериоцины. Когда упомянутый препарат включает в себя 113 г/л тиосульфата, 3 гена, участвующих в секреции бактериоцинов, подвергаются более выраженной избыточной экспрессии. Следовательно, присутствие тиосульфата может способствовать секреции бактериоцинов, которые затем участвуют в ингибировании таких патогенных микроорганизмов, как С. albicans.
Таким образом, мы показали, что тиосульфат позволяет усиливать ингибирование лактобациллами патогенных бактерий Candida albicans, заметно облегчая избыточную экспрессию бактериоцинов.
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ:
WO 84/04675
WO 2000/035465
WO 2006/045475
WO 2010/004005
WO 2010/133314
WO 2011/066949
US 2002/0044926
US 6,093,394
US 6,468,526
US 7,807,440
US 2010/0151026
US 2011/0008467
EP 0732916 B1
EP 1911455 A1
EP 2211640 A1
CN 20091145852
ЛИТЕРАТУРА
Nivoliez A, Camares О, Paquet-Gachinat М, Bornes S, Forestier С, Veisseire P. "Influence of manufacturing processes on in vitro properties of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35." J Biotechnol. 2012 Aug 31; 160 (3-4): 236-41. Epub 2012 Apr 19.