Изучение сезонной динамики технохимического состава и активности ферментов гребешка приморского

УДК 66.02:639.4

Н.Н. Ковалев, Г.Н. Ким, Е.В. Михеев, Ю.М. Позднякова, Р.В. Есипенко

ИЗУЧЕНИЕ СЕЗОННОЙ ДИНАМИКИ ТЕХНОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ГРЕБЕШКА ПРИМОРСКОГО

Проведены исследования по содержанию белка, липидов и микроэлементов в мантии и мускуле-замыкателе гребешка приморского (Patinopecten yessoensis). Анализ фракционного состава мышечных белков гребешка показал сезонное изменение в течение весенне-осеннего периода. В мускульных тканях гребешка преимущественно содержатся водо- и щелочерастворимые белки, уровень количественного содержания которых изменяется в течение летнего сезона. Наибольшее содержание исследуемых белков в мускуле гребешка отмечено в мае и июне. Динамика показателей фракционного состава белков совпадает с периодом репродуктивного цикла моллюсков. Определена активность кислых, щелочных и нейтральных протеаз в различных тканях и органах гребешка: в гонадах, гепатопанкреасе и стебельке приморского гребешка. Гонады и гепатопанкреас гребешка характеризуются высокой протеолитической активностью. Возрастание протеолитической активности связано с физиологическими и биохимическими процессами созревания гонад и может быть использовано как дополнительный критерий оценки их зрелости. В гемолимфе моллюсков выявлена незначительная активность кислых и щелочных протеаз в некоторые месяцы летнего периода. Проведено исследование холинэстеразной активности гемолимфы моллюска. Анализ сезонной динамики холинэстеразной и протеолитической активности в гемолимфе моллюска показал зависимость от стадий гаметогенеза и нереста.

Ключевые слова: гребешок, мускул-замыкатель, мантия, гемолимфа, технохимический состав, хо-линэстераза, протеазы.

N.N. Kovalev, G.N. Kim, E.V. Mikheev, Y.M. Pozdnyakova, R.V. Esipenko

RESEARCHING THE SEASONAL DYNAMICS OF TECHNOCHEMICAL COMPOSITION AND ENZYME ACTIVITY IN SCALLOP TISSUE

The researches on the content of protein, lipids and minerals in mantle and adductor muscle of scallop (Patinopecten yessoensis) were conducted. The analysis of fractional composition of scallop muscle protein has shown seasonal variation during the spring and autumn period. The scallop muscle tissues mainly contain water and alkali-soluble proteins. The level of the quantitative content of which varies during the summer season. The highest content of the studied proteins in the scallop muscle was observed in May and June. The dynamics in the indicators of protein fractional composition coincides with the period of the reproductive cycle of mollusks. The activity of acid, alkaline and neutral proteases in different tissues and organs of scallops: in gonads, hepatopancreas and stalk scallop is determined. Gonads and hepatopancreas of scallop are characterized by high proteolytic activity. The increase in the proteolytic activity is associated with physiological and biochemical processes of gonad maturation and can be used as an additional criterion for assessing their maturity. Insignificant activity of acid and alkaline proteases in some summer months is found in the hemolymph of molluscs. The research of the cholinesterase activity of the mollusk hemolymph is conducted. The analysis of seasonal dynamics of cholinesterase and proteolytic activity in the hemolymph of the mollusk has shown the dependence on gameto-genesis and spawning stages.

Key words: scallop, adductor muscle, mantle, hemolymph, technochemical composition, cholinesterase, proteases.

DOI: 10.17217/2079-0333-2016-38-74-80

Введение

Морской гребешок относится к числу ценных морских двустворчатых моллюсков. Это диетический, высокобелковый, низкокалорийный, нежирный морепродукт. Его мясо является источником полноценных белков, водорастворимых витаминов, минеральных, экстрактивных и других биологически активных веществ, улучшающих иммунитет, обмен веществ в организме, усвояемость компонентов пищи.

Добыча гребешка осуществляется, как правило, в летнее время года после его нереста. Однако в связи с изменениями физиологического состояния происходят изменения технохими-ческого состава его мягких тканей, которые до настоящего времени мало исследованы [1].

Двустворчатые моллюски, и в частности гребешок, являются также объектами экологических исследований, так как способны накапливать в своих тканях поллютанты различной химической природы. Проблема мониторинга среды обитания и мест промысла гидробионтов с целью оценки безопасности продукции рыболовства и аквакультуры вследствие широкого применения токсических соединений в быту, производстве и сельском хозяйстве приобретает особую актуальность. Ферменты двустворчатых моллюсков используются как биоиндикатор загрязнения окружающей среды различными поллютантами, в том числе органическими соединениями [2].

Наиболее перспективными для разработки методов оценки загрязнения среды обитания являются гидролазы гидробионтов, отличающиеся высокой чувствительностью и специфичностью к действию пестицидов, токсичных металлов, фосфорорганических соединений и других токсикантов [3].

Целью данной работы являлось исследование сезонной динамики технохимического состава и активности гидролаз различных тканей гребешка приморского РаИпореМеп уезъоетгъ.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовался гребешок приморский (Ра^поре^еп yessoensis), отобранный в бух. Северной с апреля по октябрь 2015 г. (зал. Славянка, Японское море).

Содержание воды в тканях проводили по ГОСТ 7636 [4].

Содержание белка в тканях гидробионтов определяли по методу Лоури [5]. Для щелочерас-творимых белков в качестве растворителя использовали 0,01 N NaOH, для солерастворимых -7%-ный водный раствор №0.

Содержание липидов определяли по методу Фолча [6].

Определение содержания микро- и макроэлементов проводили атомно-абсорбционным методом на спектрофотометре фирмы «SЫmadzu» АA-6800 с использованием пламенного и беспламенного вариантов метода. В качестве атомизатора используется однощелевая горелка, в качестве горючей смеси - ацетилен-воздух. Фон корректировался дейтериевой лампой. В качестве стандартных образцов использовали государственные стандартные образцы растворов металлов - ГСОРМ.

Протеолитическую активность в гемолимфе гребешка определяли по методу Каверзневой [7]. Для этого использовали 2%-ный раствор казеина (в растворимое состояние переводили нагреванием до 100°С) в 0,05 М фосфатном буфере рН 8,0 или 2%-ный раствор гемоглобина в 0,2 М ацетатном буфере (рН 3,4) и в 0,05 М фосфатном (рН 6,0).

Источником фермента холинэстеразы служил центрифугат (1000 g) гемолимфы гребешка. В качестве субстрата холинэстеразы использовали пропионилтиохолин (ПТХ) (1С^ США). Скорость холинэстеразного гидролиза субстрата определяли калориметрическим методом Эллмана [8].

Результаты и обсуждение

При разделке гребешка в пищу используется, как правило, только мускул-замыкатель. Мантия и гонады гребешка либо не используются, либо служат сырьем для получения БАВ и БАД к пище [3]. Вместе с тем данное сырье может служить источником пищевого белка, что может быть подтверждено исследованием их компонентного состава.

Определение компонентного состава тканей гребешка показало, что ткани мускула и мантии сильно обводнены (табл. 1).

Таблица 1

Химический состав мускула и мантии гребешка

Ткань Содержание веществ, % Содержание микроэлементов, мг/кг

вода белок липиды зола Ca Mg K №

Мускул 70-75 72,5 15,5-17 16,3 1,3-1,5 1,4 1,7-1,9 1,8 1702 184 1510 1300

Мантия 79-81 80 10-11,2 10,6 0,9-1,2 1,05 1,8-1,9 1,7 1742 219 1560 1450

Примечание. В числителе указаны вариации значений показателя, в знаменателе - его среднее значение.

Ткани мантии более обводнены, чем ткани мускула. Содержание липидов в тканях составляет не более 1,5%, а золы до 1,9%. Исследованные ткани более всего различаются по содержанию белка: его содержание в мускуле почти на 6% больше, чем в мантии. По химическим показателям мантия и мускул могут быть отнесены к высокобелковому сырью с низким содержанием липидов.

Исследованные ткани гребешка характеризуются высоким содержанием физиологически важных микроэлементов: кальция, калия и натрия. Употребление в пищу 100 г мускула-замыкателя обеспечивает поступление в организм 21% суточной нормы кальция, 7% магия и 6% калия.

Следует отметить, что определение концентрации физиологически важных микроэлементов показало, что по их содержанию изученные ткани гребешка не различались.

Из литературных источников известно, что мантия и мускул гребешка содержат значительные количества витамина В12 (225 мг/г), рибофлавина (92 мг%) и тиамина (90 мг%) [1].

Биологическую ценность мяса в наибольшей степени определяют белки. В составе мяса и мясопродуктов содержатся простые и сложные белки, среди них имеются водо-, соле- и щело-черастворимые, обеспечивающие, например, такие важные показатели, как водоудержание, набухаемость и растворимость. Известно, что белки мяса рыб отличаются по своему составу от белков мяса наземных животных высоким содержанием миофибриллярных белков и низким содержанием белков стромы [9].

Был проведен анализ фракционного состава белков в мантии гребешка. Количественные данные по содержанию отдельных фракций представлены в табл. 2.

Таблица 2

Фракционный состав белков мантии гребешка

Месяц Водорастворимые Щелочерастворимые Солерастворимые

Июль 16,8 13,9 6,8

Август 10,5 11,4 4,5

Из представленных в табл. 2 данных следует, что основным компонентным составом мантии гребешка являются водо- и щелочерастворимые белки. Также показано, что содержание белков

в мантии уменьшалось в течение рассмотренного периода.

Концентрация белков в мускульной ткани зависит от сезона вылова моллюска, стадии его репродуктивного цикла, условий обитания. Проведенное сравнительное исследование фракционного состава белков мускула-замыкателя гребешка показало, что данный показатель значительно изменяется в течение летнего периода (см. рис. 3).

Наибольшее содержание исследуемых белков в мускуле гребешка отмечено в мае и июне (рис. 1). Из представленного рисунка видно, что фракционный состав белков значительно изменяется в течение летнего периода. Для всех белков отмечается тенденция к увеличению их количества с апреля по май, и значительное уменьшение к середине летнего периода (июль). При этом в июле отмечается резкое падение содержания в мускуле со-лерастворимых белков (в 42 раза по сравнению с маем). Динамика показателей фракционного состава белков совпадает с периодом репродуктивного цикла моллюсков.

Активность протеолитических ферментов в различных тканях морских организмов может являться показателем физиологического состояния объектов. Было проведено определение активности кислых, щелочных и нейтральных протеаз в гонадах, гепатопанкреасе и стебельке приморского гребешка (табл. 3).

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

-р'

# ^ ^ 'г

| ' Водорастворимые  Солерастворимые !_| Щелочерастворимые

Рис. 1. Фракционный состав белков (мг/г ткани) мускула-замыкателя

гребешка

Таблица 3

Активность протеолитических ферментов в тканях морского гребешка, Е/г)

Источник/ фермент Протеазы, Е/г

Щелочные Нейтральные Кислые

Гонады $ 0,14 0,048 0,4

Гонады б 0,16 0 0,16

Гепатопанкреас 0,08 0,3 3,6

Стебелек 0 0 0

Протеолитическая активность обнаружена во всех исследуемых тканях гребешка, кроме стебелька, что согласуется с его функциями. Стебелек образуется в особом мешковидном органе и представляет собой стекловидную палочку студенистого вещества, состоящего из белка типа глобулина с адсорбированными в нем ферментами (амилаза и др.), способными гидролизовать углеводы (крахмал, гликоген) [10].

Наибольшая протеолитическая активность обнаружена в кислой зоне рН в гепатопанкреасе гребешка и составила 3,6 Е/г. Полученные значения соответствуют литературным данным, согласно которым наибольшую часть протеаз в гепатопанкреасе двустворчатых моллюсков составляют лизосомальные катепсины, с рН оптимумом 3-5 [11, 12].

Наиболее высокая активность щелочных протеаз определена в мужских гонадах. При этом уровень активности ферментов в гонадах выше, чем в гепатопанкреасе. Этот факт, скорее всего, связан с биологическим состоянием особей, находящихся в преднерестовой стадии, когда гребешок питается неактивно, а активность протеаз в половых продуктах объясняется необходимостью проникновения спермия сквозь вителлиновую оболочку яйцеклетки.

Полученные нами данные согласуются с работой В.А. Мухина, в которой показано, что уровень активности протеиназ в гонадах исландского гребешка коррелирует со стадиями полового цикла. Динамика изменений активности ферментов гребешка является примером эволюционно закрепленной биохимической адаптации и связана с половым циклом этих животных. Зависимость между активностью протеиназ в гонадах исландского гребешка и стадиями полового цикла заключается в возрастании протеолитической активности в гонадах исследуемых видов в период посленерестовой резорбции, и фазе быстрого вителлогенеза у обоих полов, а также в нерестовый период - у самцов. Возрастание протеолитической активности связано с физиологическими и биохимическими процессами созревания гонад и может быть использовано как дополнительный критерий оценки их зрелости [13].

Проводящая система двустворчатых моллюсков представлена гемолимфой. Гемолимфа -жидкость, циркулирующая в сосудах и межклеточных полостях многих беспозвоночных животных (членистоногие, онихофоры, моллюски) с незамкнутой системой кровообращения. Гемолимфа выполняет те же функции, что кровь и лимфа у животных с замкнутой системой кровообращения.

Определение некоторых биохимических показателей гемолимфы гребешка показало, что наибольшее содержание белка отмечается в июле и составляет 1,23 мг/мл. Сравнивая с известными

литературными данными, следует отметить, что в гемолимфе приморского гребешка содержание белка в два раза больше, чем в гемолимфе брюхоногого моллюска Hellix [14], и в пять раз больше, чем у брюхоногого моллюска из Черного моря Viviparus [15].

Определение биохимических показателей гемолимфы гребешка (рис. 2) показало, что концентрация белка значительно снижается в течение весенне-летнего периода. Кроме того, концентрация белка в гемолимфе гребешка также снижается в летне-осенний пе-

1,2

1

1

я 0,8

«5

И

о р 0,6

я1

И

0,4

0,2

о Н—™—|-1-1—тш—I-1—**—

Май Июнь Июль Август Сентябрь Октябрь

Рис. 2. Концентрация белка в гемолимфе гребешка (мг/мл) в различные сезоны

риод (июнь - октябрь) в 2,4 раза. Повышение либо высокие концентрации белка в гемолимфе двустворчатых моллюсков в летний период связаны с активизацией метаболитических процессов во время нереста.

Кроме содержания белка, в гемолимфе гребешка определяли активность некоторых сери-новых гидролаз, являющихся маркерами метаболитических и адаптационных процессов организма [16].

Выявлена незначительная активность кислых и щелочных протеаз в гемолимфе гребешка (табл. 4). Щелочные протеазы проявили активность только в мае (0,009 Е/мг белка) и августе (0,027 Е/мг белка). Также незначительная активность кислых протеаз выявлена в мае. За весь период наблюдений активности нейтральных протеаз в гемолимфе гребешка не обнаружено.

Таблица 4

Активность протеолитических ферментов в гемолимфе гребешка

Дата Активность протеаз, Е/мл

рН 8,0 рН 6,0 рН 3,4

Май 0,01

Июнь 0 0 0

Июль 0 0 0

Август 0,027 (0,002) 0 0

Сентябрь 0 0 0

Октябрь 0 0 0

Следует отметить, что в доступной нам литературе сведений о протеазах гемолимфы гребешка не найдено. Вопрос о составе и сезонной динамике активности протеолитических ферментов данного вида двустворчатых моллюсков требует дальнейшего изучения.

Одним из молекулярных показателей физиологического состояния моллюсков является активность фермента холинэстеразы в гемолимфе [16].

Ранее проведенными исследованиями установлено, что фермент гемолимфы гребешка с наибольшей скоростью гидролизовал ПТХ [17].

Проведенные исследования показали, что отмечается сезонная динамика показателя активности фермента с использованием в качестве субстрата ПТХ (рис. 3).

Рис. 3. Удельная активность ХЭ гемолимфы гребешка

В период с мая по июль активность фермента увеличивалась практически в два раза, что, по-видимому, свидетельствует об активации метаболических процессов. Снижение активности ферментов в июле и сентябре совпадают с периодом нереста гребешка. Связь этих процессов подтверждается холинергической регуляцией репродуктивного цикла у двустворчатых моллюсков [18]. Следует отметить, что вариации уровня активности фермента могут быть также связаны с сезонным колебаниями концентрации белка в гемолимфе гребешка [17].

Заключение

Таким образом, проведенные исследования показали, что мантия и мускул гребешка приморского можно отнести к высокобелковому сырью с низким содержанием липидов. В мускульных тканях гребешка преимущественно содержатся водо- и щелочерастворимые белки, уровень количественного содержания которых изменяется в течение летнего сезона.

Гонады и гепатопанкреас гребешка характеризуются высокой протеолитической активностью, в то время как в гемолимфе моллюсков выявлена незначительная активность кислых и щелочных протеаз в некоторые месяцы летнего периода.

В гемолимфе гребешка определено высокое, по сравнению с другими моллюсками, содержание белка - 1,23 мг/мл. Динамика содержания белка и холинэстеразной активности в гемолимфе гребешка определяются стадиями гаметогенеза и нереста.

Проведенные исследования технохимического состава тканей гребешка позволяют определить оптимальное время его изъятия, а биохимические параметры гемолимфы могут служить показателями его физиологического состояния.

Литература

1. Климова Е.Ю., Лаптева Е.П. Сравнительный анализ технохимических характеристик культивированного и природного гребешка приморского живого // Научные труды Дальрыбвту-за. - 2010. - Т. 22. - С. 326-331.

2. Лукьянова О.Н. Молекулярные биомаркеры. - Владивосток: Изд-во ДВГАУ. - 2001. - 191 с.

3. Пивненко Т.Н., Ковалев Н.Н. Сериновые протеиназы морских организмов: свойства, получение, применение. - Владивосток: Изд-во Дальрыбвтуза, 2015. - 497 с.

4. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. Lowry, N. Rosenbrough, A. Parr, R. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193, № 1. - P. 265-276.

5. ГОСТ 7636-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа.

6. Folch J., Lees M.A Simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue// J Biol. Chem. - 1957. - V. 226, № 1. - P. 497-509.

7. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикладная биохимия и микробиология. - 1971. - Т. 7, № 2. -С. 225-228.

8. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity / G.L. Ellman, K.D. Courtney, V.Jr. Andres, R.M. Featherstone // Biochem. Pharmacol. - 1961. - Vol 7, № 1. -Р.88-95.

9. Биотехнология морепродуктов / Л.С. Байдалинова, А.С Лысова, О.Я. Мезенова и др. - М.: Мир, 2006. - 560 с.

10. Биологическая энциклопедия. Класс двустворчатые моллюски (Bvalva) [Электронный ресурс]. - URL: http://enc-dic.com/enc_biology/Klass-dvustvorchate-vvalva-118/ (дата обращения: 13.10.2016).

11. Крупнова М.Ю., Немова Н.Н., Скидченко В.С. Влияние солей меди и кадмия на активность лизосомальных протеиназ мидий Mytilusedulis L // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Том I. Экологическая физиология и биохимия водных организмов: сб. науч. ст. - Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2010. - C. 84-87.

12. Судник О.А. Технология получения протеолитических ферментов из дрейссены // Рыбная промышленность. - 2009. - № 2. - C. 54-55.

13. Мухин В.А. Протеолитические ферменты в тканях некоторых морских беспозвоночных: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Мурманск, 1998.

14. Ракчий В.К. Межпопуляционные различия биохимических параметров гемолимфы Helix pomatia L. // Научные ведомости. Серия естественные науки, 2011. - Вып. 14. - № 3. -С.145-149.

15. Стадниченко А.П., Киричук Г.Е. Влияние терматодной инвазии и сульфата хрома на содержание общего белка в гемолимфе Viviparus viviparus // Паразитология. - 2002. - Вып. 36, № 3. - С. 240-246.

16. Холинэстеразная активность гемолимфы мидии Grenomytilus Grayanus (DUNKER, 1853) (BIVALVIA: MYTILIDAE), обитающей в импактных природных и антропогенных условиях / Н.Н. Ковалев, В.Я. Кавун, Э.Я. Костецкий, Е.В. Михеев, О.В. Подгурская // Биология моря. -2016. - Т. 42, № 1. - С. 41-47.

17. Михеев Е.В., Есипенко Р.В. Изучение сезонной динамики холинэстеразной активности гемолимфы гребешка приморского // Научные труды Дальрыбвтуза. - 2016. - Т. 38. - С. 88-91.

18. Хотимченко Ю.С., Деридович И.И., Мотавкин П.А. Биология размножения и регуляция гаметогенеза и нереста у иглокожих. - М.: Наука, 1993. - 167 с.

Информация об авторах Information about authors

Ковалев Николай Николаевич - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйствен-ный университет; 90087, Россия, Владивосток; доктор биологических наук, главный научный сотрудник НИЦ «Морские биотехнологии»; kovalevnn61@yandex.ru

Kovalev Nicolay Nicolaevich - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Chief Researcher of Research Center «Marine Biotechnologies»; kovalevnn61@yandex.ru

Ким Георгий Николаевич - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет; 90087, Россия, Владивосток; доктор технических наук, ректор ФГБОУ ВО «Дальрыбвтуз»; festfu@mail.ru

Kim Georgiy Nikolaevich - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Doctor of Technical Sciences, Professor, Rector of Far Eastern State Technical Fisheries University; festfu@mail.ru

Михеев Евгений Валерьевич - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет; 690087, Россия, Владивосток; кандидат технических наук, старший научный сотрудник НИЦ «Морские биотехнологии»; zhenyasuper79@mail.ru

Mikheev Evgeniy Valerevich - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Candidate of Technical Sciences, Senior Researcher of Research Center «Marine Biotechnologies»; zhenyasuper79@mail.ru

Позднякова Юлия Михайловна - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйст-венный университет; 90087, Россия, Владивосток; кандидат технических наук, директор НИЦ «Морские биотехнологии»; pozdnyakova.julia@yandex.ru

Pozdnyakova Yuliya Mikhailovna - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Candidate of Technical Sciences, Director of Research Center «Marine Biotechnologies»; pozdnyakova.julia@yandex.ru

Есипенко Роман Владимирович - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет; 690087, Россия, Владивосток; инженер по оборудованию НИЦ «Морские биотехнологии»; azt@bk.ru

Esipenko Roman Vladimirovich - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Equipment Engineer of Research Center «Marine Biotechnologies»; azt@bk.ru