Идентификация используемых в мясной промышленности стартовых культур

ЕРШЕН

СТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ

Идентификация используемых

в мясной промышленности стартовых культур

Машенцева Н. Г., канд. техн. наук

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Стартовые культуры на протяжении многих лет используются в мясной промышленности для интенсификации процессов ферментации мясного сырья. Поиск перспективных промышленно-ценных штаммов - трудоемкий процесс. Один из основных этапов этого процесса -идентификация вновь выделенных микроорганизмов и их неверная идентификация не только не позволит получить продукт с заданными свойствами и характеристиками, но и может нести угрозу безопасности потребителей.

Традиционными методами консервирования мяса являются посол, сушка и ферментация, которая осуществляется с помощью бактерий, дрожжей и ми-целиальных грибов. Срок годности ферментированных продуктов продлевается благодаря естественной полезной микрофлоре мяса, нитрита натрия и высокой концентрации соли.

В настоящее время ряд компаний выпускает бактериальные препараты, представляющие смесь молочнокислых бактерий, микрококков, стафилококков, педиококков (Lactobacillus spp., Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus xylosus и Staphylococcus carnosus), дрожжей и грибов (Debaryomyces hansenii, Candida famata, Penicillium chrysogenum, Penicillium nalgiovense, Penicillium camembertii) для обеспечения доминирования этих микроорганизмов в течение всего процесса созревания, получения соответствующего аромата, более быстрого цветообразования и для длительного антагонистического эффекта в отношении санитарно-по-казательной микрофлоры.

Для того, чтобы тот или иной микроорганизм можно было бы использовать в пищевой промышленности, он должен быть правильно идентифицирован и назван согласно Международному кодексу номенклатуры бактерий (http://www. bacterio. cict. fr). Для характеристики микроорганизмов используются разнообразные признаки: морфологические, цитологические, культуральные, физиологические, биохимические, иммунологические и другие. Однако определение вида микроорганизма представляет собой серьезную проблему. В последние годы систематика и филогения микроорганизмов строятся на различиях в структуре генома и переходят в область геносистематики, основанной на новейших достижениях молекулярной биологии.

Успехи молекулярной биологии позволили сделать важный шаг на пути создания систематики прокариотов: в 60-х годах прошлого века было установлено, что все свойства организма определяются уникальными молекулами ДНК, поэтому бактерии было предложено классифицировать путем сравнения их геномов. О возможности использования нуклеотидных последовательностей, то есть первичной структуры клеточных макромолекул - носителей информации,

для филогенетической классификации живых организмов впервые заявили Э. Цукеркандль и Л. Полинг (Ленгелер Й., 2005). На основании выявления степени сходства генетического материала оказалось возможным делать вывод о степени родства между организмами. Первоначально для таксономических целей сравнивали молярное содержание ГЦ пар (суммы гуанина и цитозина) в процентах от общего количества оснований ДНК у разных объектов. Этот показатель у прокариотов колеблется от 25 до 75 %. Выбор ГЦ-пар обусловлен тем, что, гуанин-цитозин участки более устойчивы к термическому разрушению вследствие существования между ними трех водородных связей, тогда как между А и Т (аденином и тимином) имеются только две. Однако ГЦ-показа-тель дает возможность только для грубого сравнения геномов. Между организмами с одинаковым нукле-отидным составом ДНК возможно как сходство, так и различие, поскольку генетическое кодирование основано не только на определенном содержании оснований в единице кодирования (триплете), но и на их взаимном расположении.

Более чувствительный метод оценки генетического сходства - это сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК, принадлежащих разным организмам, методом ДНК-ДНК-гибридизации. На практике чаще всего проводят гибридизацию ДНК неизвестного микроорганизма с ДНК типового штамма. Метод наиболее полезен для классификации на уровне вида, то есть в случае высокой степени гомологии, и мало информативен для классификации объектов на уровне высоких таксонов (царств, порядков, семейств), что приводит к несовпадению выводов, сделанных на основании фенотипических признаков и ДН К-гибридизации. В целом же значение данных о строении ДНК для систематики прокариотов огромно, так как позволяет перейти от установления степени сходства к выводам о степени родства между организмами.

Помимо анализа молекул ДНК для установления степени родства между прокариотами разработаны методы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Это могут быть белки (ферредоксины, цитохромы и др.) или рибосомальные РНК (рРНК), используемые

ВСЕ О МЯСЕ, 6-2007-

11

в качестве филогенетических маркеров.

Идентификация микроорганизма включает в себя описание самого штамма и сравнение его с ранее классифицированными микроорганизмами. Поэтому микроорганизм может быть идентифицирован, то есть, определен как идентичный конкретному таксону, только в том случае, если этот таксон уже известен. Микроорганизмы, которые ранее не были выделены, должны быть идентифицированы вначале как новые и затем классифицированы в рамках существующей таксономии, и названы согласно Международному кодексу номенклатуры бактерий (http: //www.bacterio.cict.fr).

Идентификация микроорганизмов, кандидатов в стартовые культуры, в МГУ прикладной биотехнологии проводится в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ (Аргентина, 2001; Канада, 2002), а именно: идентификацию на уровне штамма (генетическое типирование) рекомендуется проводить методом пульс-электрофореза в полиакриламидном геле (PFGE) или же методом ПЦР с анализом полиморфизма случайно амплифицированных последовательностей ДНК (RAPD). Таксономический статус микроорганизма устанавливается на основании фенотипических свойств в сочетании с генетической идентификацией, используя такие методы, как ДНК-ДНК-гибридизация, сиквенс 16S рРНК и другие. Окончательно для подтверждения идентичности штамма тем микроорганизмам, таксономический статус которых уже установлен, должны быть использованы молекулярно-биологические базы данных, такие как база данных по рибосомам (Ribosomal data base project, RDP; http://rdp.cme.msu.edu/).

Для изучения степени родства (гомологии) выделенных штаммов был проведен анализ нуклеотидных последовательностей вариабельных участков 16S рРНК, который рассмотрим на примере штамма 21(B-8654) подробно.

ДНК бактерии для амплификации выделяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно протоколу Genomic DNA Purification Kit (Fermentas, Литва). Амплификацию фрагментов 16S рРНК с использованием обратного 8f и прямого 1492r прайме-ров проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 30 мМ Трис (pH 8,4), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ дНТФ, 50 пМ* каждого праймера, 0,75 U Hot Taq полимеразы и 10 нг бактериальной ДНК. Обратный 8f (aga-gtt- tga-tcc-tgg-ctc-ag) и прямой 1492r (ggt-tac-cct-tgt-tac-gac-tt) праймеры были синтезированы ЗАО «Синтол», Россия и являются домен-специфичными для амплификации эубактериальной 16S рРНК. Все реактивы были предоставлены фирмой Fermentas, Литва.

Амплификацию проводили на приборе ТП4-ПЦР-01-Терцик (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) при следующих условиях: начальная денатурация при температуре 95 °С, в течение 3 мин, затем 35 циклов (95 °С, 30 с; 57 °С, 30 с; 72 °С, 1 мин 30 с), конечная стадия при температуре 72 °С, в течение

5 мин. Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза. Продукт амплификации участка 16S рРНК штамма 21 размером около 1500 п. н., после электрофореза в агарозном геле, был визуализирован в УФ-свете на приборе УФ-трансиллюминатора УВТ-1 (ООО Biokom, Москва, Россия) при помощи программы BioTest: (рис. 1):

Нуклеотидная последовательность амплифициро-ванного участка 16S рРНК штамма 21 была получена в результате секвенирования на автоматическом секвенаторе CEQ 8000 Genetic Analysis System (Be-ckman Coulter, США). Первичный поиск по молеку-лярно-биологической базе данных рибосомальных последовательностей Ribosomal Database Project-II (http://rdp.cme.msu.edu) показал, что штамм 21 принадлежит к домену Bacteria, отделу Firmicutes, классу Bacillus, порядку Lactobacillales, семейству Lactobacillaceae, роду Lactobacillus.

Далее был проведен анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемого штамма и референтных штаммов из базы данных генетических последовательностей GeneBee BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI).

Уровень сходства последовательностей 16S рРНК изучаемого штамма был наиболее высоким (98,2 %) со штаммами Lactobacillus plantarum JCM 1149; D79210; WCFS1; AL935253; AL935260; AL935255; AL935258; Chikuso-1; AB104855; L137 и AB112083. Со штаммами Lactobacillus paraplantarum DSM 10667T; AJ306297 уровень сходства составлял 77,9%. Согласно существующим критериям штамм был отнесен к виду Lactobacillus plantarum.

Филогенетические взаимоотношения микроорганизмов, установленные на основании сравнительного

* пМ (пмоль) - пикомоль, равен 10-12 моль

Рис. 1. Картина гель-электрофореза нуклеотидной последовательности 16S рРНК штамма 21 при различных температурах отжига

М - маркер GeneRuler™ 1kb DNA Ladder: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000,3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.; К - контроль, проба без добавления ДНК

ОВЕРШЕНСТВРВАНИЕ ТЕХНРЛОШИ

анализа нуклеотидных последовательностей, можно представить в виде дендрограммы (филогенетического дерева), условного графического изображения, отражающего предполагаемые родственные связи между генетическими макромолекулами, биологическими видами или более высокими таксонами (рис. 2).

Масштаб в нижней части рисунка 0,1 соответствует генетическому расстоянию 10%, то есть десять нуклеотидных замен на каждые 100 нуклеотидов.

Для штамма 21 результаты секвенирования вариабельных участков 16S рРНК позволили однозначно отнести его к виду Lactobacillus plantarum, так как гомология с другими штаммами вида Lactobacillus plantarum была 98%, а с видом Lactobacillus paraplan-tarum - только 77,9%. В большинстве случаев результаты секвенирования и программа BLAST позволили отнести штаммы к двум, а в некоторых случаях и к четырем-пяти видам с одинаковым процентом гомо-

логии. Для тех микроорганизмов, у которых процент гомологии отличался на одну единицу, однозначно определить вид также не представлялось возможным. В этих случаях рекомендуется применять метод ПЦР с использованием видоспецифических праймеров рибосомальных последовательностей.

Видоспецифическая ПЦР - быстрый и надежный метод, позволяющий охарактеризовать микробное сообщество без его разделения до отдельных колоний. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для искомого микроорганизма фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов.

Денитрифицирующие грамположительные, катала-зоположительные стафилококки, например, Staphylo-

L.prcas0i2 L.prcaseiS

j«

J-.plantarm >— Lplantarê L.penlosus !Lplantar3 L.sp 10776 Lb revis hAF090328 D377B& AB024299

Lfarclmin L.alimenta rPed.pentos lABQ18215 iPe<s.acWii -AB019213 AB018214

AFO03757

21.txt

_i—Ped.parvut

damnos L.maniholv

Lmanihot2

Looillnol

-L-Sharpea&

|L.rtiamnos2 'L.rhamrosu iL.zeael ¡L.casei ca 1D86518 LL.casel Lcase334 L. picas to Lprcasei

-AJ132757

Lcoryntto -L.blfermen

Scale: t-

Рис. 2. Филогенетическое дерево (дендограмма) штамма Lactobacillus plantarum 21

ВСЕ О МЯСЕ, 6-2007.

13

coccus carnosus и Staphylococcus xylosus традиционно используются в мясной промышленности, не имеют никаких факторов вирулентности и подтвердили свою безопасность за долгие годы их применения в качестве стартовых культур для мясной промышленности (http://www.effca.com). В тоже время стафилококки других видов являются возбудителями многих госпитальных инфекций, например Staphylococcus aureus. Поэтому идентификации стафилококков всегда отводится пристальное внимание.

Для выявления вида Staphylococcus carnosus были использованы видоспецифические праймеры Scal (gaa-ccg-cat-ggt-tct-gcaa) и Scall (ccg-tca-agg-tgc-gca-tagt); для выявления вида Staphylococcus xylosus: Sxyl FA (aag-tcg-gtt-gaa-aac-cca-aa), Sxyl FB (aaa-atc-ggc-tga-aaa-cct-aaa), Sxyl RA (cat-tga-cat-att-gtc-ttc-ag) и Sxyl RB (cat-tga-cat-att-gta-ttc-ag) (Aymerich T., 2003).

Характерным признаком Staphylococcus carnosus является наличие фрагмента размером 305 п.н. при использовании праймеров Scal - Scall (рис. 3).

Исследуемые штаммы В-8947, В-8950 и В-8951 относятся к виду Staphylococcus carnosus, так как электрофоретическая полоса размером 305 п. н. (фрагмент, характерный для S. carnosus) присутствует на рис. 3 только у этих трех штаммов.

Наличие фрагментов размерами 217, 317, 417 п. н. при использовании праймеров SxylFA, SxylFB, SxylRA,

SxylRB свидетельствует о том, что исследуемые штаммы относятся к виду Staphylococcus xylosus.

Результаты исследования позволяют сделать вывод, что исследуемые штаммы В-8944 и В-8945 принадлежат к виду Staphylococcus xylosus, о чем свидетельствует наличие трех электрофоретических полос на рис. 4, расположенных на уровне 417/317/217 п. н. - фрагменты, характерные для вида S. xylosus.

На основе изучения культуральных, физиолого-биохимических, технологических и пробиотических свойств были отобраны и идентифицированы бактерии, отнесенные к 11 видам: Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum (семейство Lactobacillaceae); Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii(семейство Pediococcaceae); Enterococcus faecalis (семейство Enterobacteriaceae); Macrococcus caseolyticus (семейство Micrococcaceae); Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus (семейство Staphylococcaceae). Эти микроорганизмы рекомендуются к использованию в качестве стартовых культур.

Неправильная идентификация штаммов микроорганизмов не только не позволит получить продукт с заданными свойствами и характеристиками, но и может нести угрозу безопасности ферментированных продуктов, поэтому для идентификации микроорганизмов должен быть использован комплекс всех доступных фенотипических и генотипических методов. Однако, по мере того, как будет накапливаться новая информация для большого разнообразия микроорганизмов, маркеры последовательностей, определенные к настоящему времени, могут утрачивать свое значение. Даже штамм - представитель низшего ранга иерархической структуры - не является набором генетически идентичных клеток, а представлен клонами, которые несколько отличаются один от другого по генотипу и фенотипу. Проведение идентификации микроорганизмов традиционно только по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим признакам, а также только по анализу последовательности нуклеотидов 16S рРНК или по ГЦ-составу недостаточно. Для того, чтобы исключить ошибки, которые могут возникнуть в процессе идентификации, следует рассматривать совокупность фенотипических и моле-кулярно-генетических характеристик.

ЛИТЕРАТУРА

Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ./Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля.//М.: Мир. 2005. 496с.: ил., 24 с. цв. ил. - (Лучший зарубежный учебник).

Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probi-otics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria//Argentina 1-4 October 2001, Canada, April30 and May 1, 2002.

Aymerich T., Martin B., Garriga M., Hugas M Microbial quality and direct PCR identification of lactic acid bacteria and nonpathogenic Staphylococci from artisanal low-acid sausages//Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 8. Р. 4583-4594.

Рис. 3. Результаты идентификации исследуемых штаммов для выявления

Staphylococcus carnosus (праймеры Seal - ScaII) М - маркер GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (10000, 8000, 6000, 5000, 4000,3500, 3000, 2500,2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п. н.); 1 - В-8933; 2 - В-8937; 3 - В-8938; 4 - В-8944; 5 - В-8945; 6 - В-8947; 7 - В-8950; 8 - В-8954; 9 - В-8951; 10 - В-8940.

Рис. 4. Результаты идентификации исследуемых штаммов для выявления

Staphylococcus xylosus (праймеры Sxyl FA, Sxyl FB, Sxyl RA, Sxyl RB) М - маркер GeneRuler™ 100bp DNA Ladder (1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п. н.); 1 - В-8933; 2 - В-8937; 3 - В-8938; 4 - В-8944; 5 - В-8945, 6 - В-8947; 7 - В-8950; 8 - В-8954; 9 - В-8951; 10 - В-8940.