Мультиплексная серодиагностика инфекционных заболеваний

ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ | СЕРОДИАГНОСТИКА | ИССЛЕДОВАНИЕ

Мультиплексная серодиагностика инфекционных заболеваний

Ерш A.B., Полтавченко А.Г.

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Новосибирск, Российская Федерация

Ерш Анна Васильевна - e-mail: erach_av@vector.nsc.ru

В статье приведены данные о возможности эффективного использования мультиплексных наборов для комплексной диагностики инфекционных заболеваний. Мультиплексные тесты могут служить эффективным инструментом для первичного скрининга, дифференциальной диагностики и серомониторинга инфекционных заболеваний. Работа выполнена при частичной поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (грант № 14.607.21.0020).

Ключевые слова: диагностика, тест-системы, исследование, скрининг.

The article presents data on the possibility of efficient use of multiplex sets for complex diagnostics of infectious diseases. Multiplex assays can serve as an effective tool for primary screening, differential diagnosis and seromonitoringa infectious diseases. This work was partially supported by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (grant №14.607.21.0020).

Keywords: diagnosis, test systems, research, screening.

Для определения этиологии инфекционного заболевания часто бывает необходимо выполнение нескольких иммунологических тестов. Такие ситуации возникают при так называемых смешанных инфекциях, когда организм поражается сразу несколькими возбудителями, а также при дифференциации заболеваний, имеющих сходную клиническую картину. Современный рынок иммунодиаг-ностических тестов предлагает моноспецифические тест-системы и комплексное обследование пациента с их применением представляет длительную и дорогостоящую процедуру.

Успехи последних лет в развитии иммунохимии, в частности получение моноклональных антител, рекомби-нантных и синтетических антигенов позволяют в значительной степени унифицировать их свойства и сделать возможным совместное использование в мультиплексном (многопрофильном, комплексном) анализе на белковых матрицах (protein arrays). Белковые матрицы (часто их называют «белковыми чипами» или «иммуночипами») могут иметь различный дизайн и методологию применения [1].

В развитых зарубежных странах разработка таких устройств направлена по пути размещения больших белковых библиотек на миниатюрных подложках, роботизации процесса изготовления и применения чипов [2]. Такой подход требует создания новых дорогостоящих технологий, материалов, оборудования и поэтому в настоящее время далек от внедрения в широкую клиническую практику [3].

ЦЕЛЬРАБОТЫ

Исследование возможности эффективного использования мультиплексных наборов для комплексной диагностики инфекционных заболеваний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы: В работе использовали: Tris-HCI, Tween-20, сахарозу, казеинат натрия, азид натрия (Sigma, США); химические реактивы отечественного производства с квалификацией не ниже «чда». Синтетическая бумага «Pentaprint» марки PR-M480/09-07/8101-482D8.

Антигены: Антиген вируса краснухи, представленный композицией рекомбинантных белков El, Е2 и С, приобретен в фирме «Капель» (Москва).

cfmrn)

С/ XjMm^f

ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ | СЕРОДИАГНОСТИКА | ИССЛЕДОВАНИЕ

Антиген вируса кори получали из штамма НовО/96 вируса кори, а антиген вируса паротита - из штамма Драгун вируса паротита, депонированных в коллекции культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (№VB-04 И №VB-05, соответственно). Антигены сифилиса, микоплазмы, хлами-дии, токсоплазмы, уреаплазмы и ЦМВ получены в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Сыворотки: В работе использовали рабочую панель из донорских сывороток, предоставленную ЗАО «ИмДи», а также калибровочные образцы из наборов «ВекторКорь-lgG» и «ВекторРубелла-lgG» производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Иммуноферментный анализ (ИФА): В качестве тестов сравнения при оценке показателей многопрофильного анализа использовали коммерческие наборы для ИФА: «Век-торКорь-lgG», «ВекторПаротит-lgG» и «ВекторРубелла-lgG» производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); «Корь- IgG-ДС», «Мелиса Паротит- IgG» и «Мелиса Краснуха- IgG» производства ЗАО «МБС» (Новосибирск); «Корь-lgG-антитела», «Паротит-1дС-антитела» и «Краснуха-lgG-антитела» производства ООО «ИмДи-спектр» (Новосибирск). ИФА выполняли в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Результаты регистрировали на сканирующем спектрофотометре «Multiscan 310С» (Titerteck, Финляндия) приЛ=450нм.

Дот-иммуноанализ: Принципиальная схема дот-иммуноанализа и время, необходимое для выполнения его отдельных этапов, приведены на рисунке 1. Анализ выполняли при комнатной температуре в аналитических ваннах с объемом рабочих растворов в ячейках 0,25 мл. Перед анализом вскрывали фольгу перфоратором и вносили в первый ряд ячеек ванны по 5 мкл исследуемых препаратов крови, а в 8-й ряд -100 мкл бидистиллированной воды (для растворения сухого компонента проявителя). Иммуночипы погружали в первый ряд ячеек, а затем последовательно перемещали по следующим рядам с периодами инкубации, указанными на рисунке 1. Непосредственно перед внесением иммуночипов в 8-ю ячейку в нее добавляли 150 мкл 0,3 %-го раствора азотнокислого серебра на бидистиллированной воде. После выемки из последней ячейки иммуночипы подсушивали на воздухе и визуально учитывали результаты анализа по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения соответствующих антигенов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мы описываем подход к комплексной диагностике, сочетающий мультиплексность с простотой изготовления и применения иммуночипов. Наши наборы для комплексного анализа антител включают в себя блоки белковых матриц, изготовленных в виде пластмассовой гребенки с 5 зубцами, на каждом из которых размещен иммуночип; и аналитичес-

кие ванны, ячеики которых заполнены готовыми растворами и герметизированы фольгой. На рабочей части иммуночипа в определенном порядке нанесены в виде отдельных пятен (2-3 мм) антигены нескольких (не более 8) возбудителей инфекционных заболеваний и антитела человека - контроль работоспособности системы. При выполнении анализа фольга над нужным числом (по числу исследуемых проб) колонок ячеек ванны вскрывается перфоратором, в первый ряд ячеек вносится по 10 мкл исследуемых сывороток крови и погружаются иммуночипы. Далее они перемещаются с определенными интервалами по следующим рядам ячеек.

После выемки из последней ячейки результат визуально учитывается по наличию темных пятен в местах нанесения антигенов. Возможен полуколичественный инструментальный учет результатов путем анализа оцифрованного изображения иммуночипа с помощью специальной компьютерной программы [4].

Методология применения иммуночипов представляет собой дот-иммуноанализ с применением золотых иммунозо-лей и усилением оптического сигнала физическим проявлением [5]. Схема и длительность этапов анализа представлена на рисунке 1. Анализ выполняется в течение 60 мин при комнатной температуре, не требует особой квалификации оператора и может применяться во внелабораторных условиях.

Одним из примеров системы для мультиплексного анализа антител является тест для комплексной оценки поствакцинального иммунитета к детским вакциноуправляемым инфекциям - кори, паротиту и краснухе [4].

Сравнительные данные эффективности выявления антител класса С к вирусам краснухи, кори и паротита с применением моноспецифических наборов для ИФА новосибирских фирм «Вектор-Бест», «МБС» и «ИмДи», а также мультиплексной тест-системы на панели из 45 сывороток, свидетельствуют о том, что мультиплексный тест адекватно определяет исследуемые образцы и в этом отношении выглядит не хуже, чем тесты сравнения (табл. 1).

Задачей оценки поствакцинального гуморального иммунитета является не только констатация наличия или отсутствия антител к инфекционному агенту, но и определение их уровня, достаточного для защиты от заболевания. Для калибровки многопрофильного теста использовали образцы с определенным содержанием специфических антител. Образцы с содержанием антител к вирусам кори и краснухи, превышающем протективные уровни (0,5 МЕ/мл для кори и 10 МЕ/мл для краснухи), продуцируют в нашей тест-систе-ме отчетливо различимые невооруженным глазом пятна в местах нанесения соответствующих антигенов.

Другим примером может служить мультиплексный тест для комплексного обследования беременных женщин на

Рисунок 1. Общая схема комплексного дот-иммуноанализа антител с применением иммунозоля золота, усилением сигнала физическим проявлением и стабилизацией окраски щелочным раствором мочевины.

Таблица 1

Результаты сравнительного исследования панели из 45 сывороток с использованием наборов для ИФА фирм «Вектор-Бест»,«МБС» и «ИмДи», а также мультиплексной тест-системы

cfmrn)

\ß XjMm^f

ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ | СЕРОДИАГНОСТИКА | ИССЛЕДОВАНИЕ

Время выполнения операций (мин) Общее время анализа 60 минут

20 2x2 20 2x3 7 1 1 1

Этап 1

Инкубация с образцом крови

О о

Аг-1 Аг-2

V

О

Y

Этап 2

Инкубация с иммунозолем Au-SpA

О Y

О

О

ООО

Иммунозоль Au-SpA

V

ЭтапЗ

Усиление сигнала

О Y

°°%Аи

О

Физический проявитель

V

Этап 4

Стабилизация окраски

О

о

Y

Ад

О

V

о

Щелочной раствор тиомочевины

Этап 5

Учет результатов

О Y

О

АдгБ

Тест-система Вектор-Бест МБС ИмДи Иммуночип

Результат + ~ + ~ + ~ + ~

Корь 32 13 29 16 23 22 31 14

Паротит 16 29 24 21 16 29 17 28

Краснуха 33 12 27 18 32 13 34 11

наличие антител к возбудителям инфекций перинатального периода: сифилиса (Treponema pallidum), простого герпеса (HSV-1), микоплазмоза (Mycoplasma hominis), хлами-диоза (Chlamydia trachomatis), цитомегаловирусной инфекции (CMV), токсоплазмоза (Toxoplasma gondii) и уреа-плазмоза (Ureaplasma urealyticum). Состав диагностического набора и схема выполнения анализа аналогичны описанному выше, а схема нанесения антигенов на матрицу и вид иммуночипов после тестирования приведены на рисунке 2.

Оценка показателей этого комплексного теста, выполненная с использованием стандартных панелей сывороток и референс-тестов, показала, что диагностическая чувствительность и специфичность мультиплексного теста не уступают характеристикам использующихся в практике моноспецифическим тест-системам для ИФА, и имеют перед ними ряд эксплуатационных преимуществ [6].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные выше данные свидетельствуют о возможности эффективного использования мультиплексных наборов для комплексной диагностики инфекционных заболеваний. Такой анализ может выполняться в отдаленных районах, где количество подлежащих обследованию невелико, а аппаратное обеспечение не позволяет провести ИФА-диагностику. По себестоимости комплексный тест незначительно превышает одно исследование в моноспецифическом ИФА.

Таким образом, мультиплексные тесты могут служить эффективным инструментом для первичного скрининга, дифференциальной диагностики и серомониторинга инфекционных заболеваний. В перспективе планируется создание тестов для дифференциальной диагностики к возбудителям гемотрансмиссивных инфекций, а в более отдаленной перспективе - мультиплексные системы для

ûfklÄ \ß XjMm^f

ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ | СЕРОДИАГНОСТИКА | ИССЛЕДОВАНИЕ

О о 2

о о 4 • Лк

о о 6 m

о о 8

• il

» •

•

• v>

Рисунок 2. Вид иммуначипов после выявления антител к возбудителям инфекций перинатального периода в сыворотках от больных с различной урогенитальной патологией.

Примечание к таблице 1:

Слева приведена схема нанесения на белковый чип антигенов (2 мкл, 20 мкг/мл):

1 - lgG-Hum(K+), 5 - Chlamydia trachomatis,

2 - р17+р41 Treponema pallidum, 6 - Toxoplasma gondii,

3 - HSV-1, 7 - СШ,

4 - Mycoplasma hominis, 8 - Ureaplasma urealyticum.

выявления маркеров аллергических и соматических заболеваний (онко- и кардиомаркеры).

Технология изготовления иммуночипов универсальна и позволяет создавать системы, как для выявления антител, так и для обнаружения антигенов с любым набором и сочетанием специфичностей. Основным фактором, сдерживающим разнообразие наборов, является недоступность качественных иммунореагентов.

Данная работа выполнена при частичной поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (грант №14.607.21.0020).

ЛИТЕРАТУРА

1. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук H.A., Зайцев Б.Н. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. Выбор формата белковых чипов и материала для изготовления подложки II Биотехнология. - 2006. - № 5. - С. 77-87.

2. Cretich М., Damin F., Pirri G., Chiari M. Protein and

peptide arrays: Recent trends and new directions II Biomolecular Engineering. - 2006. - Vol. 23. - P. 77-88.

3. Lueking A., Cahill D.J., Mtillner S. Protein biochips: a new and versatile platform technology for molecular medicine. Rewiev II Drag discovery today: Targets. - 2005. -Vol. 10.-P. 789-794.

4. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. Лабораторные испытания многопрофильного теста II Биотехнология. - 2007. - № 3. - С. 88-94.

5. Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Пьянков С.А. и др. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. Инструментальный учет результатов анализа// Биотехнология. - 2013. - № 4. - С. 74-82.

6. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Карпышев Н.Н. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 3. Визуализация результатов анализа// Биотехнология. - 2007. - № 2. - С. 63-71.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ

Ерш Анна Васильевна - аспирант ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 363-48-86, e-mail: erach_av@vector.nsc.ru

Полтавченко Александр Георгиевич - доктор биологических наук, Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 363-48-86, e-mail: poltav@vector.nsc.ru