МОЛЕКУЛА СУБСТРАТА

1. Субстрат для никирования и достройки, включающий дуплекс нуклеиновой кислоты, содержащий:
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу;
или
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу.
2. Субстрат по п. 1, где первая цепь нуклеиновой кислоты никируется никующей эндонуклеазой.
3. Субстрат по п. 1 или 2, где флуоресцентная детектируемая метка представляет собой FAM, TET, HEX, TAMRA, JOE или ROX.
4. Субстрат по любому из пп. 1-3, где компонент-тушитель представляет собой Iowa Black RQ (5IabRQ), дабцил, дабсил или краситель Black Hole Quencher.
5. Субстрат по любому из пп. 1-4, где 3'-конец второй нуклеиновой кислоты модифицирован с помощью C3-спейсера, дидезоксинуклеотида, фосфорилирования, красителя, флуорофора, тушителя, спейсера или линкера.
6. Субстрат по любому из пп. 1-5, включающий модифицированный нуклеотид.
7. Субстрат по любому из пп. 1-6, где один или более нуклеотидов первой нуклеотидной цепи в положениях 1 или 2 по направлению к 5'-концу от сайта никирования, и в положении 1 по направлению к 3'-концу от сайта никирования, модифицированы.
8. Субстрат по любому из пп. 1-7, где в первой цепи нуклеиновой кислоты модифицирован один или более нуклеотидов между сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и сайтом никирования.
9. Субстрат по любому из пп. 1-8, где субстрат включает модификации в одной или более позициях в пределах сайта узнавания никующей эндонуклеазы.
2
2
2
10. Субстрат по любому из пп. 1-9, где один или более модифицированных нуклеотидов содержат 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-флуорогруппу, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тиогруппу, 4'-CH-O-2'-мостик, 4'-(CH)-O-2'-мостик, 2'-O-(N-метилкарбамат), метилирование, биотинилирование, нуклеотидный аддукт или аналог основания.
11. Субстрат по любому из пп. 1-10, где никующая эндонуклеаза представляет собой Nt.BstNBI, N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI, Nb.Bpu10I, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.Bpu10I, Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI, или Nt.CviPII.
12. Субстрат по любому из пп. 1-11, который имеет длину от примерно 30 п.н. до примерно 2 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 1 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 500 п.н., от примерно 30 п.н. до примерно 200 п.н., от примерно 30 п.н. до примерно 60 п.н., от примерно 35 п.н. до примерно 50 п.н.
13. Субстрат по любому из пп. 1-12, где цепи нуклеиновой кислоты имеют длину от примерно 30 н. до примерно 2000 н., от примерно 100 н. до примерно 1000 н., от примерно 100 н. до примерно 500 н., от примерно 30 н. до примерно 200 н., от примерно 30 н. до примерно 60 н., от примерно 35 н. до примерно 50 н.
14. Субстрат по любому из пп. 1-13, где длина нуклеиновой цепи от сайта никирования до 3'-конца составляет около 25 н., около 35 н., около 40 н. или более.
15. Субстрат по любому из пп. 1-14, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет 10 н., около 15 н., около 20 н. или более.
16. Субстрат по любому из пп. 1-15, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет примерно 10 н., примерно 5 н., примерно 3 н. или менее.
17. Субстрат по п. 16, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта узнавания никующей эндонуклеазы составляет 4, 3, 2 или 1 н.
18. Субстрат по любому из пп. 1-17, содержащий одну или более пар "флуоресцентная детектируемая метка-компонент-тушитель", ковалентно пришитых к противоположным нуклеотидным цепям и внутри дуплекса.
19. Субстрат по любому из пп. 1-17, где первые и вторые нуклеотидные цепи ковалентно связаны.
20. Способ детекции активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции, включающей: а) контакт дуплекса нуклеиновой кислоты с никующей эндонуклеазой, причем дуплекс включает:
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу;
или
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу;
b) контакт никированного дуплекса с полимеразой в присутствии дНТФ;
c) полимеразную достройку, замещающую участок цепи по направлению к 3'-концу от сайта никирования, который связан с флуоресцентной детектируемой меткой или компонентом-тушителем; и
d) детекцию сигнала от флуоресцентной детектируемой метки, которая отделяется от тушителя, выявляющую активность никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции.
21. Способ амплификации специфического продукта в реакции никующей амплификации, включающий:
a) контакт с целевой молекулой нуклеиновой кислоты в существенно изотермическых условиях с двумя или более праймерами, каждый из которых специфически связывается с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, в присутствии дНТФ, никующей эндонуклеазы и дуплекса, включающего:
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу;
или
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу;
b) генерацию ампликонов, включающих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты;
c) никирование дуплекса и полимеразную достройку, замещающую участок цепи по направлению к 3'-концу от сайта никирования, который связан с флуоресцентной детектируемой меткой или компонентом-тушителем; и
d) детекцию сигнала от флуоресцентной детектируемой метки, которая отделяется от тушителя, выявляющую активность никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции.
22. Способ по п. 21, дополнительно включающий контакт молекулы нуклеиновой кислоты с двумя или более праймерами в присутствии детектируемого полинуклеотидного зонда; и
e) детекцию сигнала, специфического для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликону, причем сигнал указывает количество целевой молекулы нуклеиновых кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
23. Способ по п. 21 или 22, где детекция сигнала от дуплекса используется в качестве положительного контроля.
24. Способ по любому из пп. 21-23, где момент, в который сигнал от дуплекса достигает заданной относительной флуоресценции (ОФЕ), указывает конечную точку наблюдения за реакцией никующей амплификации.
25. Способ по п. 29, где реакция осуществляется в существенно изотермических условиях.
26. Способ по любому из пп. 20-24, где реакция дополнительно включает праймеры, зонд, и/или целевые молекулы нуклеиновой кислоты.
27. Способ по любому из пп. 20-26, где цепи нуклеиновой кислоты имеют последовательности, не связывающиеся с другими молекулами нуклеиновой кислоты, присутствующим в реакции.
28. Способ по любому одному или более из пп. 20-27, где флуоресцентная детектируемая метка на дуплексе нуклеиновой кислоты и флуоресцентная детектируемая метка на зонде различаются.
29. Способ по любому из пп. 20-28, где флуоресцентная детектируемая метка, ковалентно пришитая к первой цепи нуклеиновой кислоты, представляет собой FAM, TET, HEX, TAMRA, JOE или ROX.
30. Способ по любому из пп. 20-29, где компонент-тушитель, ковалентно связанный со второй цепью нуклеиновой кислоты, представляет собой Iowa Black RQ (5IabRQ), дабцил, дабсил или краситель Black Hole Quencher.
31. Способ по любому из пп. 20-30, где 3'-конец второй нуклеиновой кислоты модифицирован с помощью C3-спейсера, дидезоксинуклеотида, фосфорилирования, красителя, флуорофора, тушителя, спейсера или линкера.
32. Способ по любому из пп. 20-31, где дуплекс нуклеиновой кислоты включает модифицированный нуклеотид.
33. Способ по любому из пп. 20-32, где один или более нуклеотидов первой нуклеотидной цепи в положениях 1 или 2 по направлению к 5'-концу от сайта никирования, и в положении 1 по направлению к 3'-концу от сайта никирования, модифицированы.
34. Способ по любому из пп. 20-33, где в первой цепи нуклеиновой кислоты модифицированы один или более нуклеотидов между сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и сайтом никирования.
35. Способ по любому из пп. 20-34, где дуплекс нуклеиновой кислоты включает модификации в одной или более позициях в пределах сайта узнавания никующей эндонуклеазы.
2
2
2
36. Способ по любому из пп. 20-35, где один или более модифицированных нуклеотидов содержат 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-флуорогруппу, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тиогруппу, 4'-CH-O-2'-мостик, 4'-(CH)-O-2'-мостик, 2'-O-(N-метилкарбамат), метилирование, биотинилирование, нуклеотидный аддукт или аналог основания.
37. Способ по любому из пп. 20-36, где никующая эндонуклеаза представляет собой Nt.BstNBI, N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI, Nb.Bpu10I, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.Bpu10I, Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI, или Nt.CviPII.
38. Способ по любому из пп. 20-37, где полимераза представляет собой ДНК-полимеразу I Bst, ДНК-полимеразу Bsu, ДНК-полимеразу I Gst, или ДНК-полимеразу I Gka. В других вариантах осуществления примеры полимераз включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, BST (большой фрагмент), ДНК-полимеразу I (E. coli), ДНК-полимеразу I, большой (Klenow-) фрагмент, Klenow-фрагмент (3'-5' exo-), ДНК-полимеразу T4, ДНК-полимеразу T7, ДНК-полимеразу Deep VentR(exo-), ДНК-полимеразу Deep VentR, DyNAzyme, High-Fidelity ДНК-полимеразу, ДНК-полимеразу Therminator, Therminator II, ДНК-полимеразу AmpliTherm, ДНК-полимеразу Taq, ДНК-полимеразу Tth, ДНК-полимеразу Tfl, ДНК-полимеразу Tgo, ДНК-полимеразу SP6, ДНК-полимеразу Tbr или их активные фрагменты.
39. Способ по любому из пп. 20-38, где дуплекс нуклеиновой кислоты имеет длину от примерно 30 п.н. до примерно 2 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 1 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 500 п.н., от примерно 30 п.н. до примерно 200 п.н., от примерно 30 п.н. до примерно 60 п.н., от примерно 35 п.н. до примерно 50 п.н.
40. Способ по любому из пп. 20-39, где цепи нуклеиновой кислоты субстрата, или дуплекса, имеют длину от примерно 30 н. до примерно 2000 н., от примерно 100 н. до примерно 1000 н., от примерно 100 н. до примерно 500 н., от примерно 30 н. до примерно 200 н., от примерно 30 н. до примерно 60 н., от примерно 35 н. до примерно 50 н.
41. Способ по любому из пп. 20-40, где длина нуклеиновой цепи от сайта никирования до 3'-конца составляет около 25 н., около 35 н., около 40 н. или более.
42. Способ по любому из пп. 20-41, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет 10 н., около 15 н., около 20 н. или более.
43. Способ по любому из пп. 20-42, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет примерно 10 н., примерно 5 н., примерно 3 н. или менее.
44. Способ по п. 43, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта узнавания никующей эндонуклеазы составляет 4, 3, 2 или 1 н.
45. Способ по любому из пп. 20-44, где первые и вторые нуклеотидные цепи ковалентно связаны.
46. Способ по любому из пп. 20-45, включающий использование одного или более дуплексов нуклеиновой кислоты, различающихся по своим модификациям.
47. Набор для детекции активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции, содержащий субстрат реакций никирования и достройки, включающий дуплекс нуклеиновой кислоты, включающий:
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, содержащую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель на 5'-конце;
или
i) первую цепь нуклеиновой кислоты, содержащую сайт узнавания никующей эндонуклеазы и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и
ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу.