ДЕТЕКЦИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ IN VITRO

1. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты, содержащая первую и вторую сенсорные части на основе одноцепочечной ДНК, которые при лигировании друг с другом образуют единую цепь кассеты экспрессии ДНК, которая содержит
i) промотор;
ii) сайт связывания рибосомы (RBS); и
iii) кодирующую последовательность;
причем последовательность гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой расположена внутри первой и второй сенсорных частей на основе одноцепочечной ДНК.
2. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты, содержащая первую и вторую сенсорные части на основе одноцепочечной ДНК, которые при лигировании друг с другом образуют единую цепь кассеты экспрессии ДНК, которая содержит
i) промотор;
ii) сайт связывания рибосомы (RBS);
iii) кодирующую последовательность,
единая цепь которой содержит:
iv) последовательность гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой, содержащую 3’- и 5’-гибридизационные участки, причем 3’-гибридизационный участок включен в первую сенсорную часть, а 5’-гибридизационный участок включен во вторую сенсорную часть так, что при приведении сенсорной системы в контакт с образцом, который включает целевую нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется с последовательностью гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой, гибридизация с целевой нуклеиновой кислотой обеспечивает лигирование первой и второй частей с образованием единой цепи.
3. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1, 2, причем кассета экспрессии ДНК представляет собой нематричную кассету экспрессии ДНК.
4. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, причем первая и вторая сенсорные части кассеты экспрессии разделены в любом заданном положении внутри кассеты экспрессии.
5. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по п. 4, причем разделение приходится на последовательность гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой.
6. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4, причем последовательность гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой расположена в любом заданном положении внутри кассеты экспрессии.
7. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-6, причем либо первая, либо вторая сенсорная часть содержит кодирующую последовательность, а оставшаяся сенсорная часть содержит промотор.
8. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7, причем либо первая, либо вторая сенсорная часть содержит промотор и сайт связывания рибосомы, а оставшаяся сенсорная часть содержит кодирующую последовательность.
9. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-8, причем либо первая, либо вторая сенсорная часть содержит промотор, сайт связывания рибосомы и стартовый кодон кодирующей последовательности, а оставшаяся сенсорная часть содержит остальную часть кодирующей последовательности.
10. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по п. 9, причем первая сенсорная часть содержит в направлении от 5’ к 3’:
i) промотор;
ii) сайт связывания рибосомы (RBS);
iii) стартовый кодон для кодирующей последовательности; и
іv) 3’-гибридизационный участок в форме рамки считывания, которая находится в одной рамке считывания со стартовым кодоном;
а вторая сенсорная часть содержит в направлении от 5’ к 3’:
i) 5’-гибридизационный участок в форме рамки считывания, которая находится в одной рамке считывания с остальной частью кодирующей последовательности; и
ii) остальную часть кодирующей последовательности, связанную ниже 5’-гибридизационного участка и находящуюся в одной рамке считывания с ним.
11. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10, причем либо первая, либо вторая сенсорная часть содержит промотор, а оставшаяся сенсорная часть содержит сайт связывания рибосомы и кодирующую последовательность.
12. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по п. 11, причем первая сенсорная часть содержит в направлении от 5’ к 3’:
i) промотор; и
ii) 3’-гибридизационный участок;
а вторая сенсорная часть содержит в направлении от 5’ к 3’:
i) 5’-гибридизационный участок;
ii) последовательность связывания рибосомы;
iii) кодирующую последовательность.
13. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, причем либо первая, либо вторая сенсорная часть содержит промотор, сайт связывания рибосомы и 5’-часть кодирующей последовательности, а оставшаяся сенсорная часть содержит остальную часть кодирующей последовательности.
14. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по п. 13, причем первая сенсорная часть содержит в направлении от 5’ к 3’:
i) промотор;
ii) RBS;
iii) первую часть кодирующей последовательности, содержащую стартовый кодон и по меньшей мере один дополнительный кодон;
іv) 3’-гибридизационный участок в форме рамки считывания, которая находится в одной рамке считывания со стартовым кодоном;
а вторая сенсорная часть содержит в направлении от 5’ к 3’:
i) 5’-гибридизационный участок в форме рамки считывания, которая находится в одной рамке считывания с первой частью кодирующей последовательности и которая находится в одной рамке считывания со второй частью кодирующей последовательности; и
ii) вторую часть связанной кодирующей последовательности, связанную ниже 5’-гибридизационного участка и находящуюся в одной рамке считывания с ним.
15. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-14, причем по меньшей мере часть 3’-гибридизационного участка находится в промоторе, сайте связывания рибосомы или кодирующей последовательности.
16. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-15, причем по меньшей мере часть 5’-гибридизационного участка находится в промоторе, сайте связывания рибосомы или кодирующей последовательности.
17. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-16, причем 3’-гибридизационный участок не находится в промоторе, сайте связывания рибосомы или кодирующей последовательности.
18. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17, причем 3’-гибридизационный участок находится 3’ относительно любого промотора, сайта связывания рибосомы или кодирующей последовательности в первой сенсорной части.
19. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-18, причем 5’-гибридизационный участок не находится в промоторе, сайте связывания рибосомы или кодирующей последовательности.
20. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-19, причем 5’-гибридизационный участок находится 5’ относительно любого промотора, сайта связывания рибосомы или кодирующей последовательности во второй сенсорной части.
21. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-20, причем 3’-гибридизационный участок и 5’-гибридизационный участок совместно составляют в длину по меньшей мере 12 нуклеотидов.
22. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-21, причем каждый из 3’-гибридизационного участка и 5’-гибридизационного участка составляет в длину по меньшей мере 6 нуклеотидов.
23. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-22, причем первая и вторая сенсорные части находятся на одной и той же молекуле.
24. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-23, причем 5’-конец первой сенсорной части соединен с 3’-концом второй сенсорной части через промежуточные последовательности ssDNA так, чтобы первая и вторая сенсорные части образовывали единую молекулу.
25. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-24, причем система дополнительно содержит праймер, комплементарный последовательности в последовательностях нематричной кассеты экспрессии или промежуточной ssDNA.
26. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-22, причем первая и вторая сенсорные части находятся по меньшей мере на двух отдельных молекулах.
27. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-22 или п. 26, причем 5’-конец первой сенсорной части дополнительно содержит последовательность, которая образует концевую петлю шпильки.
28. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-22 или п. 26-27, причем система дополнительно содержит праймер, комплементарный 3’-участку второй сенсорной части.
29. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 23-25, причем система дополнительно содержит праймер, комплементарный последовательности, которая находится 3’ относительно любого промотора, сайта связывания рибосомы или кодирующей последовательности во второй сенсорной части.
30. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 23-25, причем система дополнительно содержит праймер, комплементарный участку, который находится 5’ от любого промотора, сайта связывания рибосомы или кодирующей последовательности во второй сенсорной части.
31. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-22 и пп. 26-30, причем вторая сенсорная часть дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, которая на своем 3’-конце содержит праймер в концевой петле шпильки.
32. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-31, причем кодирующая последовательность кассеты экспрессии ДНК кодирует полипептид.
33. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по п. 32, причем полипептид представляет собой репортерный белок.
34. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 13-14, причем 3’-гибридизационный участок и 5’-гибридизационный участок расположены в кодирующей последовательности, в участке, кодирующем доступную для контакта с растворителем петлю репортерного белка.
35. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 13-14 или п. 34, причем 3’-гибридизационный участок и 5’-гибридизационный участок расположены в последовательности, кодирующей репортерный белок, и не оказывают существенного влияния на функцию репортерного гена.
36. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по п. 33, причем к репортерному белку относятся люцифераза, нанолюцифераза, бета-лактамаза, бета-галактозидаза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, каталаза, карбоангидраза, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, голубой флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок, трипсин, протеаза, пептид, который дополняет и активирует укороченный репортерный белок, и полипептид, который поддается детекции с помощью анализа.
37. Система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-36, дополнительно содержащая бесклеточную систему экспрессии.
38. Система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-37, дополнительно содержащая лигазу.
39. Система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-38, дополнительно содержащая обратную транскриптазу.
40. Система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-39, дополнительно содержащая рибонуклеазу, которая гидролизирует РНК, гибридизированную с ДНК.
41. Система на основе нуклеиновой кислоты по п. 40, причем рибонуклеаза представляет собой РНКазу H.
42. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-41, дополнительно содержащая одно или несколько из лигазы, замещающей цепь ДНК-полимеразы, различных dNTP, ингибитора РНКазы и бесклеточной системы экспрессии.
43. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 37-42, причем бесклеточная система экспрессии представляет собой экстракт цельных клеток.
44. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-43, дополнительно содержащая ДНК-полимеразу.
Psychrobacillus
Psychrobacillus
B. subtilis
45. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по п. 44, причем ДНК-полимераза выбрана из группы, состоящей из фрагмента Кленова с экзонуклеазной частью, фрагмента Кленова без экзонуклеазной части, полимеразы phi29, модифицированной ДНК-полимеразы Т7, полимеразы от , полимеразы от  с усиленным замещением цепи, полимеразы от , секвеназы версии 2.0, большого фрагмента ДНК-полимеразы Bsu, ДНК-полимеразы Bst 3.0, высокоточной ДНК-полимеразы Phusion, ДНК-полимеразы Vent без экзонуклеазной части, ДНК-полимеразы Vent, высокоточной ДНК-полимеразы Q5 и большого фрагмента (Кленова) ДНК-полимеразы I.
46. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, причем полиморфизм целевой нуклеиновой кислоты гибридизируется с последовательностью на 3’-конце гибридизационного участка первой сенсорной части и 5’ относительно гибридизационного участка второй сенсорной части.
47. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-46, причем 3’-гибридизационный участок первой сенсорной части или 5’-гибридизационный участок второй сенсорной части способен гибридизироваться с полиморфизмом целевой нуклеиновой кислоты.
48. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-47, причем свободный конец 3’-гибридизационного участка первой сенсорной части или свободный конец 5’-гибридизационного участка второй сенсорной части способен гибридизироваться с полиморфизмом целевой нуклеиновой кислоты.
49. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-48, причем гибридизационная последовательность полиморфизма содержит одно или оба из наиболее 3’ основания гибридизационного участка первой сенсорной части и 5’ основания гибридизационного участка второй сенсорной части.
50. Сенсорная система на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-49, причем гибридизационный участок целевой нуклеиновой кислоты содержит один или несколько полиморфизмов.
51. Способ детекции целевой нуклеиновой кислоты в образце, предусматривающий:
а) получение образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту;
b) приведение образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, в контакт с сенсорной системой на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-50 в присутствии лигазы в условиях, способствующих гибридизации целевой нуклеиновой кислоты с 3’-гибридизационным участком первой сенсорной части и с 5’-гибридизационным участком второй сенсорной части кассеты экспрессии, с образованием в результате продукта реакции, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, гибридизированную с первой сенсорной частью и второй сенсорной частью, которые функционально связаны друг с другом;
c) приведение продукта реакции, полученного на стадии b), в контакт с бесклеточной системой экспрессии в присутствии замещающей цепь ДНК-полимеразы и праймера в условиях, способствующих продуцированию репортерного белка;
d) приведение продукта реакции, полученного на стадии c), в контакт с реагентом, позволяющим детектировать экспрессию репортерного белка;
e) измерение экспрессии репортерного белка, полученного на стадии d), с определением наличия и/или количества целевой нуклеиновой кислоты в образце.
52. Способ по п. 51, причем лигаза представлена как часть бесклеточной системы.
53. Способ детекции целевой нуклеиновой кислоты в образце, предусматривающий:
а) получение образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту;
b) приведение образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, в контакт с сенсорной системой на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-50 в присутствии лигазы и необязательно праймера в условиях, способствующих гибридизации целевой последовательности нуклеиновой кислоты с 3’-гибридизационным участком первой сенсорной части и с 5’-гибридизационным участком второй сенсорной части кассеты экспрессии, с образованием в результате продукта реакции, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, гибридизированную с первой сенсорной частью и второй сенсорной частью, которые функционально связаны друг с другом;
c) приведение продукта реакции, полученного на стадии b), в контакт с бесклеточной системой экспрессии в присутствии замещающей цепь ДНК-полимеразы в условиях, способствующих продуцированию репортерного белка;
d) приведение продукта реакции, полученного на стадии c), в контакт с реагентом, позволяющим детектировать экспрессию репортерного белка;
e) измерение экспрессии репортерного белка, полученного на стадии d), с определением наличия и/или количества целевой нуклеиновой кислоты в образце.
54. Способ по п. 53, причем лигаза представлена как часть бесклеточной системы.
55. Способ детекции целевой нуклеиновой кислоты в образце, предусматривающий:
а) получение образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту;
b) приведение образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, в контакт с i) сенсорной системой на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-50 в присутствии лигазы и ii) бесклеточной системой экспрессии в присутствии замещающей цепь ДНК-полимеразы и праймера в условиях, способствующих гибридизации целевой нуклеиновой кислоты с 3’-гибридизационным участком первой сенсорной части и 5’-гибридизационным участком второй сенсорной части кассеты экспрессии, и с получением репортерного белка;
c) приведение продукта реакции, полученного на стадии b), в контакт с реагентом, позволяющим детектировать экспрессию репортерного белка;
d) измерение экспрессии репортерного белка, полученного на стадии c), с определением наличия и/или количества целевой нуклеиновой кислоты в образце.
56. Способ по п. 55, причем лигаза представлена как часть бесклеточной системы.
57. Способ детекции целевой нуклеиновой кислоты в образце, предусматривающий:
а) получение образца, содержащего целевую последовательность нуклеиновой кислоты;
b) приведение образца, содержащего целевую последовательность нуклеиновой кислоты, в контакт с i) сенсорной системой на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-50 в присутствии лигазы, ii) бесклеточной системой экспрессии в присутствии замещающей цепь ДНК-полимеразы и праймера и iii) реагентом, позволяющим детектировать экспрессию репортерного белка, в условиях, способствующих гибридизации целевой нуклеиновой кислоты с 3’-гибридизационным участком первой сенсорной части и 5’-гибридизационным участком второй сенсорной части кассеты экспрессии, и с получением репортерного белка;
c) измерение экспрессии репортерного белка, полученного на стадии b), с определением наличия и/или количества целевой нуклеиновой кислоты в образце.
58. Способ по п. 57, причем лигаза представлена как часть бесклеточной системы.
59. Набор, содержащий
а) композицию, содержащую сенсорную систему на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-50 в упаковочном материале;
b) устройство для сбора образцов;
c) положительный контроль;
d) инструкции по применению.