Способ коррекции дисфункции эндотелия при нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина
METHOD FOR CORRECTION OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION IN CARBOHYDRATE METABOLISM DISORDERS ACCOMPANIED BY END-STAGE INSULIN DEFICIENCY

Изобретение относится к области медицины, биологии, ветеринарии и может быть использовано для коррекции дисфункции эндотелия при нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина.
Сахарный диабет, на сегодняшний день, является одной из наиболее значимых проблем общественного здравоохранения во всем мире. В последние десятилетия увеличение распространенности данного заболевания наблюдалось практически во всех странах, и в настоящее время насчитывается около 415 миллионов человек больных сахарным диабетом [Ogurtsova K., da Rocha Fernandes J.D., Huang Y., Linnenkamp U., Guariguata L., Cho N.H., Cavan D., Shaw J.E., Makaroff  L.E. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040 // Diabetes Res Clin Pract. 2017. 128. Р. 40-50.]. Ускоренный рост заболеваемости сахарным диабетом приобретает характер неинфекционной эпидемии, сопровождающейся развитием значительного процента осложнений [Saeedi P., Petersohn I., Salpea P., Malanda B., Karuranga S., Unwin N., Colagiuri S., Guariguata L., Motala A.A., Ogurtsova K., Shaw J.E., Bright D., Williams R. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition // Diabetes Res Clin Pract. 2019.157. Р. 107843; Дедов И.И., Шестакова М.В., Викулова О.К. Эпидемиология сахарного диабета в Российской Федерации: клинико-статистический анализ по данным Федерального регистра сахарного диабета // Сахарный диабет. 2017. №20(1).  С. 13-41]. Самой распространенной причиной инвалидности и смертности при сахарном диабете являются сосудистые осложнения, развитие которых, как правило, начинается с поражений микрососудов [Strain W.D., Paldánius P.M. Diabetes, cardiovascular disease and the microcirculation // Cardiovasc Diabetol. 2018. №17(1). Р. 57]. Ключевую роль в обеспечении адекватной микроциркуляции играет функциональная активность эндотелия, а при сахарном диабете развитие эндотелиальной дисфункции способствует возникновению и прогрессированию сосудистых осложнений [Giraldo-Grueso M., Echeverri D. From Endothelial Dysfunction to Arterial Stiffness in Diabetes Mellitus // Curr Diabetes Rev. 2020. 16(3). Р. 230-237]. В связи с этим проблема коррекции эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете является одной из наиболее актуальных задач.
Существующие в настоящее время подходы к коррекции дисфункции эндотелия у пациентов с сахарным диабетом, включают коррекцию гипергликемии, как основного фактора альтерации эндотелия, а также использование нефармакологических и фармакологических методов, направленных на восстановление и/или профилактику нарушения функционального состояния эндотелия [Галенко А.С., Шуленин С.Н. Способы немедикаментозной и фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции // ФАРМиндекс-Практик. 2006. 10. С. 2-10]. При нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина, (у пациентов с сахарным диабетом 1 типа) коррекция гипергликемии осуществляется заместительной терапией инсулином. Однако известно, что инсулинотерапия, как в высоких, так и в низких дозах оказывает негативное влияние на эндотелий-зависимую дилатацию сосудов, то есть способствует развитию эндотелиальной дисфункции [Arcaro G., Cretti A., Balzano S., Lechi A., Muggeo M., Bonora E., Bonadonna R.C. Insulin Causes Endothelial Dysfunction in Humans. Sites and Mechanisms// Circulation. 2002. 105. Р. 576-582].
Немедикаментозные методы коррекции функционального состояния эндотелия при нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина, включают диету, богатую антиоксидантами и флавонойдами, отказ от курения, адекватные физические нагрузки [Галенко А.С., Шуленин С.Н. Способы немедикаментозной и фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции // ФАРМиндекс-Практик. 2006. 10. С. 2-10].
Однако указанные способы обладают больше профилактической, чем лечебной направленностью, то есть эффективность их недостаточна.
Известны также способы фармакологической коррекции нарушений функционального состояния эндотелия при абсолютной недостаточности инсулина, включающие применение препаратов ряда групп эндотелиопротекторов, обладающих разными механизмами действия: 1) донаторы оксида азота - L-аргинина; 2) ингибиторы фосфодиэстеразы-5; 3) антиоксиданты; 4) метаболиты фолиевой кислоты; 5) ингибиторы протеинкиназы С [Тюренков И.Н., Воронков А.В., Слиецанс А.А. Роль эндотелиальной дисфункции в развитии сосудистых осложнений сахарного диабета // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2013. №2. С. 82-84]. Кроме того, доказанную эффективность в коррекции дисфункции эндотелия при сахарном диабете имеют способы применения статинов, ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, блокаторов рецепторов А II [Чернов Ю.Н., Красюкова В.А., Батищева Г.А., Мубаракшина О.А.Эндотелиальная дисфункция при сахарном диабете и возможные пути фармакологической коррекции// Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. 73(2). С. 39-43].
Однако при применении указанных способов коррекции используют фармакологические группы препаратов, которые могут оказывать нежелательные побочные эффекты и не обладают эффективностью в регуляции уровня глюкозы в крови.
В последние годы появились данные о разработке новых способов коррекции, включающих применение новых фармакологических препаратов, представляющих собой аналоги или агонисты эндогенных регуляторных пептидов, в частности дельта-сон индуцирующий пептид (дельталицин), глюкогоноподобный пептид 1 типа (лираглутид), которые способны оказывать эндотелий-протекторное действие и обладают метаболическими эффектами, способствующими нормализации гликемического профиля [Аметов А.С., Невольникова А.О., Тертычная Е.А. Возможности агонистов рецепторов глюкагоноподобного пептида-1 в снижении сердечно-сосудистого риска у пациентов с сахарным диабетом типа 2: что нового? // Эндокринология: новости, мнения, обучение. 2019. Т.8. № 3. С. 44-53; Белых А.Е., Бобынцев И.И. Дельта-сон индуцирующий пептид: отдельные биологические эффекты и механизмы их развития // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2016. 1. С. 79-90]. В частности, известен «Способ лечения эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете [патент RU на изобретение №2703567]. Он характеризуется тем, что экспериментальному животному, которому было выполнено моделирование сахарного диабета, парентерально вводят растворенный в физиологическом растворе хлорида натрия препарат дельталицин в дозе 100,0 мкг/кг массы тела, десятикратно с интервалом в 24 часа между инъекциями, начиная с третьего дня после моделирования сахарного диабета.
Недостатком указанного способа является необходимость введения препарата,  начиная с ранних стадий развития сахарного диабета (на 3 сутки в условиях эксперимента), когда альтерирующее действие гипергликемии на эндотелий еще не достигло максимума. Это вероятно, обусловлено высокой лабильностью и быстрым разрушением экзогенных молекул дельта-сон индуцирующего пептида при введении в организм [Эндокринология: новости, мнения, обучение. 2019. Т.8. № 3. С. 44-53].
Известен также способ коррекции дисфункции эндотелия, включающий подкожное введение лираглутида – агониста глюкагоно-подобного пептида 1 типа, который обладает способностью снижать уровень гликемии, потребность в инсулине у пациентов с первым типом сахарного диабета [Dimitrios P., Michael D., Vasilios K. Liraglutide as Adjunct to Insulin Treatment in Patients with Type 1 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis. Curr Diabetes Rev. 2020. 16(4). С. 313-326] и независимо от влияния гликемический профиль улучшать вазомоторную функцию, в частности за счет снижения концентрации ЭТ-1 в крови [Симаненкова А.В., Макарова М.Н., Васина Л.В., Бутомо М.И., Дора С.В., Шляхто Е.В. Агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 уменьшает дисфункцию эндотелия у больных сахарным диабетом 2-го типа // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2018. 17(2). С. 59-65].
Недостатком заявляемого способа является, то что применение лираглутида не полностью нормализует концентрацию эндотелина-1, следовательно не полностью корректирует дисфункцию эндотелия.
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является способ коррекции  дисфункции эндотелия при нарушении углеводного обмена [TZU-HSIEN TSAI et al. Liraglutide Inhibits Endothelial-to-Mesenchymal Transition and Attenuates Neointima Formation after Endovascular Injury in Streptozotocin-Induced Diabetic Mice // Cells.2019 Jun 14. №8(6).Р. 589], включающий подкожное введение лираглутида на фоне стойкой гипергликемии.
Задачей заявляемого изобретения является повышение эффективности коррекции эндотелиальной дисфункции лираглутидом при обеспечении сокращения до минимума риска возникновения побочных эффектов, связанных, в большинстве случаев, с  введением дополнительных фармакологических препаратов.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе коррекции дисфункции эндотелия при нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина, включающем  подкожное введение лираглутида в дозе 0,4 мг/кг на фоне стойкой гипергликемии, одновременно с началом курса терапии лираглутидом в зоне с развитой подкожной жировой клетчаткой иссекают полнослойный кожный лоскут  размером порядка 0,1% от площади поверхности тела, выполняют обработку иссеченного лоскута поочередно раствором Н2О2 3% с экспозицией 1 минуту, C2Н5ОН 70% – 30 секунд, NaCl 0,9% с экспозицией 2 минуты, в зоне забора лоскута формируют между кожным покровом и собственной фасцией полость, которая по форме и размерам достаточна для помещения в неё забранного лоскута, помещают предварительно обработанный лоскут в сформированную полость, фиксируя его положение.
Технический результат заявляемого изобретения.
Использование комбинации введения лираглутида и нефармакологической биостимуляции путем аутотрансплантации полнослойного кожного лоскута позволяют увеличить эффективность коррекции лираглутидом эндотелиальной дисфункции при нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина. Способ не требует дополнительного введения препаратов, что позволяет избежать нежелательных побочных эффектов. Использование для биостимуляции аутотрансплантата кожи при реализации способа позволяет избежать риска гемотрансмиссивных инфекций и реакции отторжения. Подкожное размещение аутотранспланта выполняемое при реализации способа, не требует сложной хирургической техники, что позволяет минимизировать риски осложнений оперативного вмешательства. Применение процедуры аутотрансплантации не требует специальных расходных материалов и инструментов, что позволяет избежать значимого увеличения стоимости лечения.
Заявляемое изобретение поясняется с помощью Фиг. 1-3, на которых изображено:
на Фиг. 1 – уровень гликированного гемоглобина и концентрация эндотелина 1 в крови у животных с аллоксановым диабетом (группа сравнения);
на Фиг. 2 – уровень гликированного гемоглобина и концентрация эндотелина 1 в крови у животных с аллоксановым диабетом, которым с 21-х до 42-х суток вводился лираглутид;
на Фиг. 3 – уровень гликированного гемоглобина и концентрация эндотелина 1 в крови у животных с аллоксановым диабетом, которым с 21-х до 42-х суток вводился лираглутид.
Способ коррекции дисфункции эндотелия при нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина, осуществляют следующим образом.
В условиях сформировавшихся нарушений углеводного обмена, сопровождающихся, абсолютной недостаточностью инсулина, проводят ежедневное подкожное введение лираглутида в дозе 0,4 мг/кг и одновременно с началом курса терапии лираглутидом в зоне с развитой подкожной жировой клетчаткой иссекают полнослойный кожный лоскут  размером порядка 0,1% от площади поверхности тела с дальнейшим его забором. Выбор такого соотношения обусловлен тем, что при увеличении размеров кожного лоскута повышается риск развития гнойных осложнений, а уменьшение его геометрических размеров не сопровождается надлежащим стимулирующим эффектом. Выполняют обработку иссеченного лоскута поочередно раствором  Н2О2 3% с экспозицией 1 минуту, C2Н5ОН 70% - 30 секунд, NaCl 0,9% с экспозицией 2 минуты. Использование именно этих реактивов позволяет добиться удаления разрушенных при иссечении клеток кожного лоскута, а также обеспечить его надлежащую дезинфекцию. В зоне забора лоскута формируют между кожным покровом и собственной фасцией полость, которая по форме и размерам достаточна для помещения в неё забранного лоскута. Помещают предварительно обработанный лоскут в сформированную полость. Фиксируют положение лоскута путем ушивания раны послойно наглухо.
Для упрощения процессов формирования полости, помещения в неё забранного лоскута и ушивания раны путем обеспечения притяжения краев кожной раны друг к другу, а, следовательно, с целью снижения риска возникновения осложнений, рекомендуется выполнять лоскут обтекаемой эллипсоообразной формы, т.е. с широким участком в центральной части лоскута с плавно сужающимися участками в сторону двух противоположно расположенных его краев.
Пример 1
Заявляемый способ был апробирован на 40 лабораторных белых крысах массой 200-250 г. Исследование выполнено в соответствии с рекомендациями этического комитета Саратовского ГМУ им. В.И. Разумовского (протокол №1 от 05.02.2019 года). За 10 минут до проведения инвазивных манипуляций (забор крови, выполнение оперативного вмешательства) животных наркотизировали путем внутримышечного введения препаратов «Телазол» («Zoetis Inc», Испания) в дозе 0,1 мл/кг и «Ксиланит» (ООО «Нита-Фарм», Россия) в дозе 1 мг/кг веса животного.
Все животные были разделены на 4 равные группы: 1-я группа – контрольная – включала интактных крыс, 2-я группа включала крыс с аллоксановым диабетом (группа сравнения), 3-я группа – крыс, которым с 21-х суток после введения аллоксана ежедневно вводился лираглутид, 4-я группа – крыс, которым на 21-е сутки после введения аллоксана проводилась подкожная аутотрансплантации полнослойного кожного лоскута в межлопаточной области.
Для создания экспериментального диабета использовали аллоксан. Перед его введением животные подвергались суточному голоданию. Крысам сравнительной и опытных групп однократно подкожно вводили 5% раствор аллоксана, растворенного в 0,9% растворе NaCl в дозировке 100 мг/кг веса.
На 42 сутки производили забор крови. Забор цельной крови производили с помощью пункции сердца в вакуумные пробирки с К3ЭДТА, а для получения сыворотки в вакуумные пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем. Содержание гликозилированного гемоглобина (HbA1c) определяли автоматическим биохимическим анализатором Sapphire 400 (Япония) с использованием реактивов фирмы DiaSys (Германия).
Для выявления эндотелиальной дисфункции проводили определение концентрации эндотелина-1 методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием реагентов ELISA KIT for Endothelin 1 (Rat) (Cloud-Clone Corp., КНР), регистрацию показателей осуществляли на иммуноферментном планшетном анализаторе StatFax 4200 (Awareness Technology, США).
Статистическую обработку данных осуществляли средствами программы Statistica 10.0. Большинство полученных данных имели распределение отличное от нормального, поэтому при статистической обработке вычислялись медианна, верхний и нижний квартили, а для сравнения групп использовали U-критерий Мана-Уитни, на основании которого рассчитывался показатель достоверности р.
Полученные в 2 группе (группе сравнения) данные (Фиг. 1) свидетельствовали о том, что у животных на 42-е сутки после введения аллоксана содержание гликозилированного гемоглобина у животных варьировало от 6,9 до 14,3 %,, составляя в среднем по группе 9,6 (7,7; 11,3) %. Уровень гликозилированного гемоглобина в крови у животных группы сравнения превышал значения контроля на 77%, что отражало выраженную и стойкую гипергликемию. У крыс группы сравнения концентрация эндотелина-1 в крови варьировала от 47,7 до 52,9 пг/мл, составляя в среднем по группе 50,6(49,8;52,3) пг/мл, что превышало контрольные значения в 3,4 раза и свидетельствовало о развитии эндотелиальной дисфункции.
Таким образом, пример 1 демонстрирует, что однократное подкожное введение 5% раствор аллоксана, растворенного в 0,9% растворе NaCl в дозировке 100 мг/кг веса вызывает у крыс выраженную и стойкую гипергликемию и развитие эндотелиальной дисфункции.
Пример 2
Животным 3-й группы с 21-х до 42-х суток после инъекции аллоксана (100 мг/кг веса) ежедневно (20 инъекций) проводили подкожное введение лираглутида в дозировке 0,4 мг/кг. На 42-е сутки эксперимента у животных данной группы содержание гликозилированного гемоглобина в крови варьировало от 3,5 до 6,4 %, составляя в среднем по группе 4,5 (4,1; 5,2)%, что соответствовало контрольным значениям (Фиг. 2). Отсутствие статистически значимых различий (p = 0,053903) уровня гликозилированного гемоглобина в крови у животных данной группы и контрольной, свидетельствует о нормализации углеводного обмена под влиянием курса подкожного введения лираглутида. У крыс данной группы концентрация эндотелина-1 в крови варьировала от 17,34 до 39,44 пг/мл, составляя в среднем по группе 27,4 (26,7; 36,7) пг/мл, что превышало контрольные значения на 86 %. Концентрация эндотелина-1 в крови у крыс данной группы была в 1,8 раза ниже, чем в группе сравнения, что свидетельствовало о частичном восстановлении функционального состояния эндотелия под влиянием курса подкожных инъекций лираглутида.
Таким образом, пример 2 демонстрирует, что ежедневное подкожное введение лираглутида крысам в период с 21-х до 42-х сутки эксперимента вызывает полностью корректирует уровень гликемии и частично снижает проявления эндотелиальной дисфункции.
Пример 3
Животным 4-й группы на 21-е сутки после инъекции аллоксана (100 мг/кг веса) проводили аутотрансплантацию полнослойного кожного лоскута в межлопаточной области. Для этого в области холки на депилированном участке кожи в асептических условиях иссекали полнослойный кожный лоскут размером 0,1% от площади поверхности тела. Расчет размера кожного лоскута проводился отдельно для каждого животного, составляя в среднем 30 (27; 35) мм2. После иссечения кожного лоскута в ране между кожей и собственной фасцией формировали полость. В сформированную полость помещали кожный лоскут, который предварительно обрабатывали поочередно раствором Н2О2 3% с экспозицией 1 минуту, C2Н5ОН 70%- 30 секунд, NaCl 0,9% с экспозицией 2 минуты. Для фиксации лоскута в сформированной полости, рану ушивали послойно наглухо. С 21-х до 42-х суток после инъекции аллоксана животным 4-й группы ежедневно проводили подкожное введение лираглутида в дозировке 0,4 мг/кг (20 инъекций).
Полученные в 4 группе данные (Фиг. 3) свидетельствовали о том, что у животных, которым на 21-е сутки после инъекции аллоксана проводили аутотрансплантацию полнослойного кожного лоскута и ежедневно вводили лираглутид в дозировке 0,4 мг/кг, на 42-е сутки эксперимента содержание гликозилированного гемоглобина в крови варьировало от 4,2 до 6 %, составляя в среднем по группе 4,9 (4,8; 5,2)%, что соответствовало контрольным значениям. Отсутствие статистически значимых различий уровня гликозилированного гемоглобина в крови у животных данной группы и контрольной, свидетельствует о нормализации углеводного обмена, также как и 3-й группе крыс, у которых лираглутид применялся изолированно. У крыс данной группы концентрация эндотелина-1 в крови варьировала от 12,62 до 25,58 пг/мл, составляя в среднем по группе 16,9 (13,4; 24,9) пг/мл, что соответствовало контрольным значениям. Концентрация эндотелина-1 в крови у крыс данной группы была на 38 % ниже, чем в 3-й группе крыс, у которых лираглутид применялся изолировано, что свидетельствовало о более эффективной коррекции эндотелиальной дисфункции.
Таким образом, пример 3 подтверждает, что применение комплекса медикаментозных и немедикаментозных методов по описанному в данной заявке способу обладает большей эффективностью в коррекции эндотелиальной дисфункции при нарушениях углеводного обмена, сопровождающихся абсолютной недостаточностью инсулина, по сравнению с изолированным применением лираглутида.