СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ-ПОЛОСОК ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ И КОНЦЕНТРАЦИИ ОКСИПРОЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
METHOD OF PRODUCING TEST STRIPS FOR RAPID DETERMINATION OF THE PRESENCE AND CONCENTRATION OF OXYPROLINE IN BIOLOGICAL MATERIAL

Изобретение относится к химической промышленности, а именно к производству тест-полосок для экспресс-определения присутствия и/или концентрации оксипролина в биологическом материале на предмет наличия заболевания или для самоконтроля состояния здоровья.
Определение оксипролина в биологическом материале (слюне, моче, сыворотки крови и пр.) является важным инструментом при диагностировании целого ряда заболеваний [Герасимов A.M., Фурцева Л.Н. Биохимическая диагностика в травматологии и ортопедии. - М.: Медицина, 1986, 234 с. Вавилова Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полости рта, М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008 г., с. 215].
Проблема заключается в сложности и трудоемкости этого анализа. Кроме того, не все способы определения обладают требуемой точностью.
Известен способ диагностики заболеваний тканей пародонта на разных стадиях, в котором, в качестве показателя воспалительного процесса, определяют концентрацию свободного оксипролина в слюне спектрофотометрическим методом [Патент 2581921 Российская Федерация МПК G01N 21/00, G01N 33/487. Способ диагностики заболеваний тканей пародонта на разных стадиях / Алексахина Е.Л., Томилова И.К; заявитель и патентообладатель Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ивановская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации - №: 2014128102/15, заявл. 09.07.2014, опубл. 20.04.2016 Бюл. №11]. Концентрацию свободного оксипролина в слюне пациентов определяли спектрофотометрически с помощью модифицированного метода С.С. Тетянец, который используется для определения свободного оксипролина в сыворотке крови [Тетянец С.С. Метод определения свободного оксипролина в сыворотке крови. Лабораторное дело, 1985, N 1, стр. 61-62]. Для проведения анализа 0,25 мл слюны наливали в пробирки, прибавляли 1 мл абсолютного этанола, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Всю надосадочную жидкость переносили в мерные центрифужные пробирки. При перемешивании добавляли 0,25 мл раствор хлорамина Т в ацетатном буфере (1:4). Добавляли 0,25 мл изопропилового спирта. Через 4 мин приливали 0,75 мл реактива Эрлиха. Общий объем раствора доводили этиловым спиртом до 2,5 мл. После перемешивания пробирки закрывали пробками и термостатировали при 60°С 30 мин. Затем охлаждали до 20°С. На спектрофотометре СФ 2000 определяли оптическую плотность при длине волны 558 нм против холостой пробы, в которой биологическая жидкость заменялась водой. Содержание оксипролина в каждой пробе определяли спектрофотометрическим методом по калибровочной прямой.
Известен способ определения белково-связанного оксипролина, основанный на осаждении его смесью трихлоруксусной и хлорной кислот [Шарарев П.Н., Ботникова Е.А., Иванов В.М., Зубарев О.М., Малинин О.В., Зубкова СВ. Определение свободного и связанного оксипролина в моче // Лабораторное дело. 1990, №12, с. 23-25]. В центрифужную пробирку наливают 2 мл мочи, 1 мл 0,3 М трихлоруксусной кислоты и 1 мл 8,5 М хлорной кислоты. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют в течение 5-6 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость количественно переносят в мерную пробирку, осадок сохраняют для дальнейших исследований. Ровно половину надосадочной жидкости переносят в другую центрифужную пробирку. В первую пробирку добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и нейтрализуют 6 М раствором едкого натра, добиваясь появления устойчивой слабо-пурпурной окраски по всему объему жидкости. В случае появления интенсивной окраски в смесь добавляют каплю хлорной кислоты и вновь нейтрализуют ее щелочью. Вторую половину надосадочной жидкости закрывают специальным каплеуловителем и гидролизуют в кипящей водяной бане в течение 40 мин, охлаждают до 18-22°С и нейтрализуют как указано выше. К осадку добавляют по 1 мл дистиллированной воды, 0,3 М трихлоруксусной и 8,5 М хлорной кислоты. Полученную смесь закрывают каплеуловителем, гидролизуют в кипящей водяной бане в течение 4 часов. Охлажденную смесь (18-22°С) нейтрализуют в мерной центрифужной пробирке (3-я пробирка). Контрольная, 4-я пробирка содержит 4 мл воды. Во все 4 пробирки при перемешивании добавляют по 0,5 мл раствора хлорамина, а через 4-5 мин - по 0,5 мл раствора парадиметиламинобензальдегида и 8,5 М хлорной кислоты. Содержимое пробирок перемешивают в кипящей водяной бане в течение 120 с. Через 2 мин. Смесь охлаждают до 18-22°С и добавляют в нее 4 мл н-бутанола. Содержимое пробирок тщательно встряхивают, центрифугируют в течение 5-6 мин при 3000 об/мин. Супернатант фотометрируют против контроля при длине волны 560 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Содержание оксипролина рассчитывают по калибровочной кривой и выражают в микромолях в сут.
4
4
4
4
Попытки упрощения способа определения оксипролина предпринимались неоднократно, например, был исключен этап титрования с фенолфталеином в окрашенном гидролизате, занимающий много времени [Большакова С.Б., Дроздова Л.Н., Лада Е.В. Определение содержания оксипролина в моче больных системным остеохондрозом // Лабораторное дело, 1982, №9, с. 27-29]. В 4 пробирки отбирали по 1 мл мочи. Затем во все пробирки добавляли по 0,5 мл HClO и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Пробирки помещали на 40 мин в кипящую водяную баню и через 10 мин добавляли 1 мл парадиметиламинобензальдегида в 8,5 М HClO, а в контроль 1 мл HClO и помещали на 1,5 мин в кипящую водяную баню. После охлаждения окрашенный комплекс экстрагировали 4 мл смеси бутанол-CCl. Обработку гидролизата проводили аналогично. Органическую фазу отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и колориметрировали опыт против контроля в кювете с длиной оптического пути 5 мм на зеленом светофильтре. Концентрацию оксипролина определяли по калибровочному графику, построенному исходя из указанных выше растворов оксипролина.
2
4
Известен способ определения концентрации оксипролина в биологическом материале, основанный на выделении и очистке оксипролина на ионообменной смоле Dowex, последующим центрифугированием 20 мин при 3000 об/мин, добавлением 4 мл охлажденного этилового спирта, нагреванием 2 мин при 100°С, охлаждением и добавлением 0,2 мл трихлоруксусной кислоты и 0,4 мл 55%-ной хлорной кислоты, повторным центрифугированием при 3000 об/мин, титрованием NaOH по фенолфталеину, последующим добавлением 2 мл HSO и 0,5 мл 10% парадиметиламинобензальдегида в 96% этаноле и измерении оптической плотности на фотоэлектроколориметре [Патент 2024872 Российская Федерация МПК G01N 33/48. Способ определения оксипролина в биологическом материале / Намазбаева З.И., Джангозина Д.М., Меркурьева Р.В.; заявитель и патентообладатель Институт физиологии и гигиены труда НАН Республики Казахстан - №4950767/14, заявл. 27.06.1991, опубл. 15.12.1994].
Существует методика определения содержания оксипролина, описанная в способе диагностики гипероксипролинурии у пациентов, пребывающих не менее суток на бесколлагеновой диете. [Патент 2315996 Российская Федерация MПК G01N 33/52. Способ экспресс-диагностики гипероксипролинурии / Накоскин А.Н., Лунева С.Н., Стогов М.В.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение науки "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию". - №2005132676/15, заявл 24.10.2005, опубл. 27.01.2008, Бюл. №3]. Для этого используют индикаторную бумагу, которая представляет собой отрезок фильтровальной бумаги размером 3×30 мм, смоченный наполовину 7% раствором хлорамина Б, другой половиной раствором, содержащим 10 г лимонной кислоты, 5 г п-диметиламинобензальдегида, 10 мл HCl в 25 мл воды. П-диметиламинобензальдегид подвергают предварительной очистке перекристаллизацией из 96%-ного этанола. Обработанная таким образом бумага тщательно высушивается. В суточную мочу погружают конец индикаторной бумаги, смоченный хлорамином Б, и ожидают, когда полоска намокнет до уровня, смоченного раствором п-диметиламинобензальдегида. Полоску вынимают и тщательно высушивают в струе горячего воздуха феном. При избыточной экскреции оксипролина в моче на индикаторной полоске в центральной части возникает коричневое пятно, при нормальной экскреции пятно не возникает.
Все вышеперечисленные способы, хотя и стремятся к упрощению, но, по сути, являются длительными и трудоемкими и требует предварительной подготовки материала с применением дефицитных сорбентов и токсичных химреактивов (хлорсодержащие препараты). При контроле содержания оксипролина возникает необходимость использования дорогостоящей спектрофотометрической аппаратуры и проведения стандартной пробы, что делает невозможным применение их в домашних условиях для самоконтроля здоровья пациентов. Изготовление тест-полосок из-за технической сложности и неустойчивости реактивов возможно лишь в небольших количествах исключительно вручную в лабораторных условиях.
Задачей настоящего изобретения является создание тест-полосок для технически простого и доступного, не требующего длительной предподготовки и технически сложного оборудования, экспресс-определения присутствия и/или концентрации оксипролина в биологическом материале, для реализации которого не требуется использование дефицитных сорбентов и токсичных химреактивов (хлорсодержащих препаратов) и, вместе с тем, он должен быть надежным и достаточно точным. Кроме того, задачей изобретения является возможность изготовления тест-полосок не только в лаборатории, но и промышленным и полупромышленным способами в условиях малых производств, а также возможность определения присутствия и/или концентрации оксипролина в биологическом материале в домашних условиях для самоконтроля состояния здоровья.
Поставленная задача решается способом получения тест-полосок для экспресс-определения наличия и концентрации оксипролина в биологическом материале, характеризующимся нанесением на фильтровальную бумагу прямоугольной формы методом печати через сетчатые шаблоны на стандартном печатном оборудовании последовательно полос составов, содержащих: 1 полоса - интенсификатор пероксида водорода - гидроксид натрия; 2 полоса - пероксид водорода (35%) 20-30 мл в качестве окислителя оксипролина и метасиликат натрия 0,05-0,15 г в качестве стабилизатора; 3 полоса - парадиметилбензальдегид 50-70 г; 4 полоса парафин, при этом составы полос 1-3 полос загущают 7,5%-ной метилцеллюлозой; на 2 полосу, содержащую окислитель и стабилизатор, приклеивают защитный слой тонкой бумаги; полученный полуфабрикат сушат при температуре 20-40°С, разрезают на тест-полоски необходимого формата и упаковывают для транспортировки и хранения
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 приведен общий вид тест-полоски, на фиг. 2 - цветовая шкала для определения концентрации оксипролина, на фиг. 3 вариант нанесения полос составов на бумагу при производстве (получении) тест-полосок в соответствии с примером 1.
Способ осуществляют следующим образом.
Пример 1: фильтровальную бумагу прямоугольной формы 1000×700 мм помещают в плоскопечатный станок с параллельной рамой А1 (ООО «Оптимум и К») и трафаретами, на которые нанесен рисунок в форме смещенных полос; для каждого трафарета готовят составы на основе 7,5%-ной метилцеллюлозы: 1 - гидроксид натрия (10 г); пероксид водорода (35%) 30 мл + метасиликат натрия 0,15 г; 3 - парадиметилбензальдегид 70 г; 4 - парафин. На пятой раме без трафарета происходит приклей защитного слоя тонкой бумаги. Полученный лист высушивается на сушильном стеллаже, идущем в комплекте с плоскопечатным станком, при 20°С, разрезается на тест-полоски 25×70 мм ручным резаком (фиг. 3) и упаковывается для транспортировки и хранения.
Пример 2: фильтровальную бумагу прямоугольной формы 800×500 мм помещают на печатный стол автоматической трафаретной карусельной печатной машины Workman; на печатные головки подаются составы на основе 7,5%-ной метил целлюлозы: 1 - гидроксид натрия (7 г); пероксид водорода (35%) 25 мл + метасиликат натрия 0,1 г; 3 - парадиметилбензальдегид 60 г; 4 - парафин. Приклей защитного слоя тонкой бумаги происходит в автоматическом режиме на пятом печатном столе. Оборудование имеет функцию нижней подсушки при температуре 30°С, поэтому дополнительной сушки не требуется. Листы в автоматическом режиме разрезается на тест-полоски 25×80 мм и упаковываются для транспортировки и хранения.
Пример 3: фильтровальную бумагу прямоугольной формы 500×700 мм помещают на полуавтоматический трафаретный печатный станок производства ARGON НТ (Италия) с трафаретами, на которые нанесен рисунок в форме смещенных полос и методом печати наносят составы на основе 7,5%-ной метил целлюлозы: 1 - гидроксид натрия (5 г); 2 - пероксид водорода (35%) 20 мл + метасиликат натрия 0,05 г; 3 - парадиметилбензальдегид 50 г; 4 - парафин. Полосы печатают последовательно. Последней операцией производят приклей защитного слоя тонкой бумаги. Напечатанный полуфабрикат помещают в сушильный шкаф SPE-HBX при температуре 40°С, разрезают на тест-полоски 25×70 мм ручным резаком и упаковывают для транспортировки и хранения.
Пример применения тест-полоски. Не убирая защитную бумагу, тест-полоску со стороны активатора (1) погружают в подготовленный жидкий биоматериал, например, в сыворотку крови, и ожидают, когда полоска намокнет до уровня (2), содержащего пероксид водорода, стабилизированный метасиликатом натрия, далее жидкость поднимется до уровня (3), содержащего парадиметилбензальдегид. При избыточной экскреции оксипролина в биоматериале на этом уровне проявляется окраска. Количественное содержание оксипролина определяется в соответствии со шкалой (фиг. 2) [Тетянец С.С. Метод определения свободного оксипролина в сыворотке крови. Лабораторное дело, 1985, N 1, стр. 61-62].
Предложенный способ позволяет выпускать тестовые полоски как вручную, так и в полупромышленном и промышленном вариантах. В составе контрольного вещества не присутствуют хлорсодержащие препараты, что повышает его безопасность и экологичность. Благодаря защитному слою полоски долго остаются активными, они просты в использовании и могут применяться как в лечебном учреждении, так и в домашних условиях для самоконтроля здоровья. Измерение содержания оксипролина может проводиться в любом жидком биоматериале, точность измерений соответствует шкале, представленной на фиг. 2 из литературы [Тетянец С.С. Метод определения свободного оксипролина в сыворотке крови. Лабораторное дело, 1985, N 1, стр. 61-62].