СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ Т-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ И САРКОМЫ КАПОШИ
METHOD OF TREATING T-CELL LYMPHOMAS AND KAPOSIS'S SARCOMA

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и иммунологии, и может быть использовано в лечении Т-клеточных лимфом кожи, саркомы Капоши. Изобретение позволяет обеспечивать выраженный специфический клеточный и гуморальный противоопухолевый иммунный ответ.
Несмотря на достигнутые успехи в хирургическом, химиотерапевтическом и радиологическом лечении опухолей, онкологические заболевания во всем мире продолжают оставаться одной из основных причин смертности.
Большие надежды в лечении онкологических больных возлагаются на методы адаптивной клеточной иммунотерапии. В процессе этого лечения приготовленные ex vivo клетки с выраженной активностью против чужеродного антигена передаются больному с онкологическим заболеванием. Это лечение направлено на усиление эффекторного звена иммунного ответа путем формирования популяции (клона) лимфоидных клеток, призванных вести борьбу с опухолевыми клетками в качестве неспецифической или специфической иммунотерапии.
Потенциальные возможности неспецифической иммунотерапии ограничены высокой стоимостью этого лечения, серьезными побочными эффектами в виде цитокиновых реакций, развитие которых порой вынуждает прекращать лечение, и относительно невысоким уровнем объективного эффекта.
Одна из основных и наиболее предпочтительных технологий для преодоления иммунологической толерантности, вызванной опухолевым процессом, и реализации протективного иммунного ответа заключается в разработке вакцин методом активации дендритных клеток (ДК) пациента. Наибольшее распространение получили вакцины на основе миелоидных ДК.
Известен способ иммунотерапии костно-мозговыми ДК больных солидными опухолями (Патент РФ на изобретение №02203683, МПК А61К 39/395, публ. 2003), в котором предложено после оперативного удаления опухолевого очага вводить внутрикожно в область опухоли и область регионарных лимфатических узлов вакцину, включающую костно-мозговые ДК в смеси физиологического раствора и раствора альбумина человека.
Недостатком этого способа является длительная и очень трудоемкая предподготовка, связанная со стимуляцией выхода кроветворных стволовых клеток из костного мозга в периферическую кровь, затем длительное выращивание клеточной суспензии в течение 12-14 дней в специально оборудованной лаборатории для клеточного культивирования с последующей активацией ДК аутологичным опухолевым лизатом в течение 48 часов. Ограничивает применение данной технологии большое количество противопоказаний, токсичность этого метода и недостаточно выраженный клинический эффект.
9
2
Известен способ лечения лейкемической формы Т-клеточной лимфомы кожи методом трансиммунизации (ТИ) (Berger CL, Xu A-L, Hanlon D, Lee C, Schechner J, Glusac E, et al. Induction of human tumor-loaded dendritic cells. Int J Cancer 2001; 91:438-47, прототип), заключающийся в том, что методом лейкафереза у больного извлекают примерно 4-6×10 мононуклеарных клеток крови, суспендированных в плазме больного, вводят фотосенсебилизатор uvadex и подвергают мононуклеарные клетки ультрафиолетовому облучению с длиной волны 320-400 нм, с интенсивностью 1-2 Дж/см в статическом режиме. Злокачественные Т-лимфоциты подвергаются апоптозу, а моноциты трансформируются в ранние дендритные клетки. Данную клеточную суспензию больного инкубируют в течение ночи для того, чтобы оптимизировать процессинг антигенов, и реинфузируют больному. Процедуру проводят 1 раз в неделю ежемесячно.
Однако, как следует из самой методики, для достижения клинического эффекта необходимо наличие в крови больного опухолевых клеток как источника антигенных эпитопов для насыщения ими антиген-презентирующих ДК, которые в последующем индуцируют выработку специфических противоопухолевых цитолитических Т-лимфоцитов. В связи с этим данный метод лечения эффективен только у больных лейкемическим вариантом опухолевого процесса, в частности при синдроме Сезари Т-клеточной лимфомы кожи. При других формах Т-клеточных лимфом и других опухолевых заболеваниях при отсутствии злокачественных клеток в крови данный метод не эффективен. Это обстоятельство существенно ограничивает широту его применения. Кроме того, этот способ имеет существенные недостатки, связанные с присутствием плазменных белков в облучаемой взвеси лейкоцитов. Такие белки способствуют перекрытию спектральных полос излучения: практически все ультрафиолетовое излучение поглощается белками крови и лишь незначительная его часть оказывает фотоактивирующее воздействие на фотосенсибилизатор и мембранные структуры лимфоцитов крови. При поглощении света аминокислотами плазмы происходит фотоинактивация и меняется структура сывороточных белков, что при многократном использовании может вызвать аутосенсибилизацию. Повышение интенсивности УФО крови только расширяет спектр побочных реакций и увеличивает вероятность их возникновения. Кроме этого, проведение УФО по данной методике осуществляется в статическом режиме, что существенно снижает эффективность ультрафиолетового воздействия на клеточные компоненты крови. Ночной (12 часовой) инкубационный период также недостаточен для адекватного взаимодействия трансформированных ДК с опухолевыми клетками, подвергшимися апоптозу. В результате этого незрелые ДК возвращаются в организм пациента вместе с большим количеством апоптических фрагментов опухолевых клеток, где происходит их дальнейшее взаимодействие. Однако в организме больного такое взаимодействие недостаточно эффективно в связи с присутствием значительного количества разнообразных блокирующих факторов, продуцируемых опухолевыми клетками. В результате вместо развития эффективного иммунного ответа имеет место негативный исход Т-клеточной активации в виде индукции анергии - антиген-специфической толерантности. Этим объясняется недостаточная эффективность ТИ, поскольку индукция иммунного ответа очень кратковременна и подавляется опухолевой средой. Кроме того, следует учесть, что состояние, в котором пребывают ранние ДК, транзиторно. При отсутствии контакта с антигеном они подвергаются обратной трансформации в моноциты.
Задача предлагаемого изобретения - устранение указанных недостатков, повышение эффективности лечения и продление сроков ремиссии за счет обеспечения адекватного противоопухолевого иммунного ответа у больных Т-клеточными лимфомами кожи и саркомы Капоши.
Указанная задача достигается путем исключения белкового и аминокислотного экранирования квантов УФ-света, а также предотвращения негативных последствий, связанных с аутосесибилизацией в результате изолированного физического воздействия на мононуклеарные клетки крови, выделенные из плазмы и помещенные в изотонический раствор натрия хлорида.
Для этого в способе лечения Т-клеточных лимфом и саркомы Капоши, включающем прием пациентом фотосенсибилизатора перед каждым сеансом трансляционной иммунотерапии, эксфузию крови, извлечение мононуклеарных клеток вместе с плазмой, ультрафиолетовое облучение, инкубацию с последующей реинфузией обработанной крови, предложено перед облучением осуществлять отделение мононуклеарных клеток от плазмы. Реинфузируют мононуклеарные клетки в 200-300 мл 0,9% раствора NaCl, а ультрафиолетовое воздействие проводят в проточном режиме, затем раствор NaCl удаляют, в полученный материал возвращают плазму крови и инкубируют, причем инкубацию проводят в течение 18-24 часов. После этого осуществляют реинфузию, на курс лечения 4 сеанса 2 раза в неделю, повторный курс через 4 недели, 3 месяца, 6 месяцев.
Способ осуществляется следующим образом.
За 1,5-2 часа до процедуры больной принимает фотосенсибилизатор, например аммифурин в дозе 1,2 мг/кг веса больного. Затем производят эксфузию крови в пластиковый контейнер с консервантом в количестве 500 мл. Методом цитафереза извлекают мононуклеарные клетки вместе с плазмой и переводят в первый трансферный контейнер. Отделяют плазму от клеток методом центрифугирования и переводят ее во второй трансферный контейнер. Добавляют в первый трансферный контейнер с мононуклеарными клетками 200-300 мл 0,9% раствора NaCl, перемешивают и подвергают ультрафиолетовому облучению в проточном режиме. При этом длина волны - 365 нм, мощность излучения - 16 мВ, время экспозиции - 180 мин. После облучения удаляют физиологический раствор методом центрифугирования. В первый трансферный контейнер возвращают плазму крови больного из второго трансферного контейнера. После этого их инкубируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. После инкубационного периода реинфузируют. Длительность реинфузии не менее 30 минут во избежание цитокиновой реакции. Курс лечения состоит из 4 сеансов 2 раза в неделю. Повторный курс лечения назначают через 4 недели, затем через 3 месяца и через 6 месяцев.
Было установлено, что в крови больных Т-клеточной лимфомой кожи (ТЛК) не зависимо от формы заболевания (синдром Сезари, эритродермическая, бляшечная или опухолевая формы), стадии заболевания, а также при заболевании саркомой Капоши количество зрелых ДК составляет в среднем 48,1±26,9% от всех моноцитов. Однако отсутствие экспрессии молекулы коактивации В7.2 на их поверхности свидетельствует об их функциональной несостоятельности и невозможности активировать Т-клеточный рецептор.
После УФ-воздействия и 24-часового инкубационного периода было отмечено снижение количества неиммуногенных ДК, перегруженных антигенными пептидами с 48,1±26,9% до 17,3±14,5%, р<0,05. Это наблюдение свидетельствует о том, что данная популяция ДК является неустойчивой к УФ-воздействию и другим экзогенным факторам и подвергается некротической гибели с выходом экзосом. Экзосомы представляют собой «антиген-представляющие пузырьки» и являются источником доставки опухолевых антигенных пептидов для ДК. Подтверждением того, что неиммуногенные ДК подвергаются некрозу, а не апоптозу, служит отсутствие экспрессии на них маркера апоптоза - CD95.
В процессе инкубационного периода в результате контакта с пластиковой поверхностью в экстракорпоральном контуре часть моноцитов трансформируются в незрелые ДК, которые активно используют эндоцитоз и эффективно захватывают экзосомы для доставки иммуногенного белка или антигенных комплексов. Результатом этого является трансформация незрелых ДК в зрелые активные профессиональные АПК, которые лишены блокирующих факторов и активно экспрессируют молекулы коактивации и адгезии.
Данный метод был назван: «трансляционная иммунотерапия», имея в виду доставку антигенных пептидов в иммуногенной форме посредством дендритных АПК в присутствии костимуляторных и акцессорных молекул Т-клеточным рецепторам с выработкой в последующем стойкого противоопухолевого иммунного ответа.
Таким образом, это изобретение обеспечивает, с одной стороны, некротическое разрушение зрелых нефункциональных ДК с выходом экзосом, а с другой стороны, трансформацию моноцитов в ранние ДК, которые способны поглощать экзосомы с полным набором антигенных молекул для представления их в иммуногенной форме Т-клеточным рецепторам.
Изобретение предоставляет средство для индукции выраженного персонифицированного в отношении типа опухолевого антигена у конкретного больного противоопухолевого иммунного ответа без необходимости идентифицировать чужеродный антиген, а также вне зависимости от наличия опухолевых клеток в крови больного. При этом нет необходимости использовать факторы роста и цитокины.
Кроме того, разработанный метод иммунизации при помощи ДК обеспечивает и эффективное средство для индукции специфических антител против опухолевых белков через активацию CD4+ лимфоцитов. Легкость и доступность насыщения ДК опухолевыми эпитопами выгодно отличаются от традиционной методики - длительной инкубации в присутствии опухолевого антигена, цитокинов и факторов роста. Этот метод позволяет презентировать все имеющиеся чужеродные антигенные протеины в иммуногенной форме ТКР, даже те, которые нам пока неизвестны. Причем иммуногенность белков, полученных из экзосом клеток, подвергнутых некротическому распаду, значительно выше, чем при апоптотической деградации. Важно также отметить, что при эндоцитозе экзосом дендритные клетки характеризуются отсутствием факторов, блокирующих коактивационные молекулы.
Пример 1
Больной В., 54 г. Диагноз: Т-клеточная лимфома кожи, фоликулотропный вариант, IIb стадия. Диагноз установлен на основании биопсии в августе 2005 года. Поступил с жалобами на поражение всего кожного покрова, кожный зуд. Процесс носит генерализованный характер. На лице в области бровей бляшки инфильтрировались и приобрели опухолевидный характер. Стали выпадать волосы на бровях. При осмотре больного кожные покровы в состоянии полной эритродермии, розово-синюшного оттенка, кожный процесс представлен множеством мелких акнеформных папул и узлов на фоне гиперемированной кожи; на брови опухолевидная бляшка, диффузное поредение волос на бровях. Выраженная инфильтрация в области конечностей. На ладонях и подошвах гиперкератоз. Ногти изменены и утолщены. Лимфоузлы увеличены в подмышечной области, подвижные безболезненные. До начала процедуры трансиммунизации получал десенсибилизирующую терапию, преднизолон 4 табл., проспидин 100 мг внутримышечно. На фоне проводимой терапии процесс прогрессировал.
На фоне проводимого лечения отмечалась выраженная положительная динамика со стороны кожного процесса. После 1-го курса уменьшилась инфильтрация в области бровей и на руках, уменьшилась интенсивность гиперемии и зуд. Пациент прошел еще 3 курса с интервалом в 1, 3 и 6 месяцев с хорошим эффектом. К концу 4-го курса отмечалось уменьшение инфильтрации в области лица и конечностей, в области бровей начали расти волосы, регресс лимфоузлов в подмышечной области, оставались лишь участки гиперкератоза на ладонях и подошвах, которые разрешились в течение месяца после окончания трансиммунизации на фоне проводимой местной терапии. Преднизолон был отменен. Побочных реакций и осложнений на фоне проводимой терапии не отмечалось.
Пример 2
Больная В., 47 лет. Диагноз: Т-клеточная лимфома кожи, инфильтративно-бляшечная форма, IIа стадия. Диагноз был установлен на основании результатов PCR теста: выявлена клональность по реанжировкам генов гамма-цепи Т-клеточного рецептора. Поступила в клинику с жалобами на кожные высыпания, интенсивный зуд. Больна с февраля 2005 г. При поступлении процесс на коже подостро воспалительный, распространенный, симметричный, локализован на коже туловища, конечностей, лица, представлен пятнами, бляшками, местами сливающимися в крупные. Бляшки розового цвета, некоторые пигментированные преимущественно на спине, с поверхностным шелушением, четкими границами, неправильными очертаниями. На лице процесс представлен пятнами розового цвета. Субъективно зуд. Региональные лимфоузлы увеличены, размером 1,0×0,5 см, подвижные безболезненные.
Было проведено 4 курса по предлагаемому способу.
После проведения первого курса отмечается значительное уменьшение зуда, уменьшение инфильтрации и побледнение бляшечных элементов и пятен. В дальнейшем пациентка получила еще 3 курса с интервалом в 1 мес, 3 мес и полгода.
После 2 курса терапии зуд практически отсутствует, бляшки значительно уплостились, в области лица пятна регрессировали. После 4-го курса также отмечалось уплощение бляшек в области живота и спины, в области верхних и нижних конечностей бляшки регрессировали. Побочных реакций и осложнений на фоне проводимой терапии не отмечалось. Во время контрольного осмотра через 3 месяца после окончания 4 курса у больной отмечаются единичные уплостившиеся бляшки в области спины и живота, зуд не беспокоит.
Пример 3
Больной Д., 58 лет. Диагноз: Т-клеточная лимфома кожи, эритродермическая форма, IIIb стадия. Диагноз установлен на основании данных кожной биопсии и иммуногистохимии. Поступил в клинику 22.10.2008 с жалобами на поражение всего кожного покрова, выраженный зуд, жжение, озноб. Болен в течение 2,5 лет. Процесс распространенный, подостро воспалительный. Высыпания мономорфные, симметричные, локализованы по всему кожному покрову, представлены пятнами буровато-розового цвета от 2 до 4 см в диаметре неправильной формы с четкими границами на эритематозном фоне, с мелкопластинчатым шелушением. Субъективно - зуд. Лимфоузлы увеличены в подмышечной области, подвижные безболезненные.
После первого сеанса у больного значительно уменьшился зуд, после второго - в течение недели зуд практически исчез. Кожный процесс после 1 курса разрешился на 30%, после второго курса эритематозные очаги разрешились полностью, лимфатические узлы уменьшились вдвое. По окончании курса лечения по предлагаемому способу побочных реакций и осложнений на фоне проводимой терапии не отмечалось, обострения заболевания не отмечалось.
Пример 4
Больной П., 1938 г.р. Диагноз: саркома Капоши, идиопатический тип, подострая форма, подтвержден гистологически. Болен с 2003 года, когда появились пятна на коже левой голени. Патологический процесс распространенный, симметричный, локализован на коже туловища, верхних конечностей (кисти, предплечья), нижних конечностей (бедра, голени, стопы), представлен множественными пятнами, бляшками, возвышающимися над уровнем здоровой кожи на 0,2 см, размером от 1,0×1,5 см до 3,0×4,5 см, темно-бурого цвета, с четкими границами, гладкой, блестящей поверхностью. На боковых поверхностях туловища элементы располагались по линиям Лангера.
Проведен курс предлагаемой терапии. После 1 курса лечения уменьшились проявления гиперемии. После окончания лечения отмечалась выраженная положительная динамика: значительное уплощение бляшечных элементов, уменьшение размеров пятен, снижение интенсивности окраски элементов.
При контрольном обследовании через 6, 12 месяцев после окончания курса лечения рецидива заболевания не наблюдается. Частично разрешились пятна на боковых поверхностях туловища, на коже кистей; оставшиеся элементы значительно уменьшились в размерах, снизилась интенсивность окраски. Побочных реакций и осложнений на фоне проводимой терапии не отмечалось.
Способ позволяет добиться выраженной клинической ремиссии в кратчайшие сроки, улучшить качество жизни больного, избежать приема цитотоксических и гормональных препаратов.