Изучение кинетики синтеза рекомбинантного α2интерферона в клетках Escherichia coli

пептиды, только с изменившейся массой на Дт = 147 - 131 = 16 Да. К списку добавляются пептиды MNK и MNKOPR (зеленый цвет на рис. 2).

Получившийся список масс пептидов и есть пептидный фингерпринт или пептидная карта белка. Такую же карту получают после проведения масс-спектрометрического анализа образца в лаборатории. Пептидная карта записывается в файл, и модуль переходит к следующему белку для совершения тех же операций. После того как модуль форматирования обработает все белки в базе данных подобным образом и запишет их пептидные карты в файл, формируется список параметров для передачи ядру программы.

Разработанный алгоритм позволяет программно получить пептидные карты всех известных белков из базы данных при тех же лабораторных условиях, в которых проводился опыт. Таким образом, имея экспериментально полученную пептидную карту неизвестного белка, можно идентифицировать белок путем сравнения пептидных карт данного белка с пептидными картами известных белков из базы данных. Такие же данные можно было бы получить, проведя несколько тысяч опытов с каждым известным белком, что заняло бы не один месяц непрерывной работы. Алгоритм позволяет это сделать за секунды. Например, база данных, состоящая из 3000 белков, форматируется за 15 секунд. Такая высокая скорость была достигнута почти полным отказом в программе от строковых переменных и переходом к числовым. Кроме того, в модуле были реализованы принципы объектно-ориентированного программирования.

Этот модуль является частью одной будущей программы для идентификации белка MSA, которая позволит распознать белок с высокой скоростью и точностью. Это даст в будущем возможность автоматизации процесса построения белковых карт человека, которые уже широко применяются в медицине для диагностики и лечении заболеваний.

Список литературы

1. Cottrell John Database Searching for Protein Identification and Characterization // 2005. - P. 3-6.

2. Lim H., Eng. J., Yates J.R.3rd, Tollaksen S.L., Giometti C.S., Holden J.F., Adams M.W., Reich C.I., Olsen G.J., Hays L.G. Identification of 2D-gel proteins: a comprasion of MALDI/TOF peptide mass mapping to ц LC-ESI tandem mass spectrometry // J.Am.Soc. Mass Spectrom.,14 2003. - P. 957-970.

УДК: 663.1: 576.8.095.6

И.В. Казеев, НИ. Воронова, Е.В. Гусева, Н.В. Меньшутина

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ СИНТЕЗА РЕКОМБИНАНТНОГО А2-ИНТЕРФЕРОНА В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI

The influence of aeration and agitation on production of rhIFN-a has been studied. The analyzer ProLine was applied for the estimation of respiratory metabolism of culture. This equipment allows to measure the concentration of waste gases from fermenter. On the basis of experimental data the general direction for process bee determined.

Были проведены экспериментальные исследования процесса получения альфа-2 интерферона при помощи E.coli при различных условиях аэрации и перемешивания. Для оценки дыхательного метаболизма штамм-продуцента был использован анализатор ProLine, позволяющий измерять концентрации отходящих газов из ферментера. На основе анализа экспериментальных данных было определено основное направление оптимизации процесса (высокая скорость перемешивания при лимитировании по кислороду).

Задача синтеза альфа-2 интерферона в наши дни весьма актуальна. Это связано с широким спектром биологических свойств интерферона как иммуномодулятора. Он используется для лечения некоторых типов раковых заболеваний, таких как лейкоз ворсистых клеток, меланома, гипернефрома (почечно-клеточная карцинома), лимфома (опухоль лимфатической ткани), хроническая лейкемия. Также они используются для лечения некоторых видов гепатита [1].

Escherichia coli является одной из наиболее изученных бактерий и поэтому очень часто используется для экспрессии рекомбинантных белков.

Моделирование кинетики образования продукта в рекомбинантных культурах является очень сложной задачей, так как в ряде случаев не удается надежно описать элементарные процессы, не говоря уже об условиях их взаимосвязи. В литературе описано большое количество подходов к созданию кинетических моделей, зависящих от разных параметров [2, 3, 4].

Для построения математической модели и проверки ее адекватности необходимо исследование кинетики данного процесса и влияния различных факторов на данный процесс [5].

В работе использовался штамм E.coli SGK25/pIF TREN с конститутивным типом экспрессии рекомбинантного альфа-2 интерферона (рчИФН-а2). В экспериментах использовались отдельные клоны трансформированных клеток, полученные на LB-агаре или глицериновые стоки штамма продуцента, находящиеся на хранении при температуре -70°С в банке клеток.

Для засева ферментера использовался посевной материал, выращенный в колбах до средне-логарифмической фазы роста, который вносился в количестве 5% от общего объема среды в биореакторе.

Рост штамма-продуцента в ферментёре оценивали по значению оптической плотности при длине волны 560 нм, экспрессию - по процентному содержанию рчИФН-а2 относительно суммарного белка клеток методом электрофореза с последующим сканированием геля и математической обработкой полученных результатов.

Культивирование осуществлялось в аппарате фирмы Electrolux с общим объемом 15 литров. Анализ отходящей газо-воздушной смеси проводился с помощью газового масс-спектрометра AMETEK ProLine.

С целью изучения кинетики процесса была проведена серия экспериментов, в которых менялись скорости перемешивания и расход воздуха.

Результаты первой серии экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Экспериментальные данные

Время

Скорость

Расход

воздуха,

л/мин

Оптическая

эксперимента, перемешивания,

плотность

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13

об/мин

180

180

180

200

200

200

200

200

200

220

220

250

250

300

8

8

8

8

8

8

8

8

8

10

10

10

10

10

(ОП) абс 0,238 0,270 0,520 0,867 1,380 1,750 2,030 2,270 2,470 2,670 2,800 2,890 2,914 2,942

Анализ динамики накопления целевого продукта клетками проводился с помощью отбора проб с последующим проведением электрофореза (Рис. 1).

В н утр и |<л ет04 н ы е б ел к и

- рч ИФН-а2

7 8 9 Ю 11 12 13 14

Время от начала культивирования, ч

Рис. 1. Результаты электрофореза

Из анализа экспериментальных данных видно, что высокая скорость перемешивания и большой расход воздуха не способствуют хорошему росту культуры.

Во второй серии экспериментов замечено увеличение оптической плотности при высокой скорости перемешивания и ограничении расхода воздуха.

Результаты второй серии экспериментов представлены в таблице 2 и на рисунке 2.

Таблица 2. Экспериментальные данные

Время Скорость Расход Оптическая

эксперимента, перемешивания, воздуха, плотность

(час) об/мин л/мин (ОП) абс.

0 50 4 0,107

1 80 5 0,185

2 150 6 0,480

3 200 10 0,920

4 250 10 1,600

5 270 10 2,460

6 270 10 3,300

7 300 8 4,160

8 320 8 5,070

9 280 5 5,600

10 250 5 5,950

11 300 7 6,200

12 300 10 6,800

>

внутриклеточные

белки

7 8 9 10 11 12 13 14

Время от начала культивирования, ч

рч ИФН-а2

Рис. 2. Результаты электрофореза

Анализ потребления кислорода и выделяемого углекислого газа в процессе ферментации был проведен с использованием анализатора РгоЬте. Было замечено, что наибольшее потребление кислорода и выделение углекислого газа происходит в период с 3-7 часов после начала эксперимента (Рис. 3).

СО2

О2

текущее время

Рис. 3. Соотношение газов на выходе из ферментёра

Анализатор РгоЬте одновременно осуществляет измерение на входе и выходе из реактора и определяет концентрации всех «выдыхаемых » компонентов, которые используются для контроля процесса. Благодаря этому, в дальнейшем может быть определен точный материальный баланс и рассчитаны поправочные коэффициенты газовых потоков, необходимые для поддержания оптимального режима. С помощью газоанализатора можно обеспечить полный контроль процесса ферментации для оптимального роста культуры. В последней серии опытов была зафиксирована скорость мешалки и варьировалась подача кислорода с целью нахождения зависимостей между этими параметрами и ростом культуры. Результаты третьей серии экспериментов представлены в таблице 3 и на рисунке 3.

Таблица 3. Экспериментальные данные

Время Скорость Расход Оптическая

т н е м и р е м перемешивания, воздуха, плотность

(час) об/мин л/мин (ОП) абс.

0 50 2 0,05

1 100 2 0,14

2 130 10 0,21

3 130 12 0,4

4 130 12 0,82

5 130 12 1,32

6 130 10 1,59

7 130 16 1,92

8 130 16 2,64

9 130 10 2,92

11 130 16 3,87

12 130 10 4,3

13 130 16 4,62

14 130 10 4,9

15 130 16 5,44

16 130 10 5,52

17 130 12 5,52

m я— —  1 1

=f== 4 • * 1

6 8 10 12

Время

Эксперимент №1 Эксперимент №2 —é— Эксперимент №3

Рис. 4. Динамика роста культуры

Сравнительный анализ экспериментальных данных (Рис. 4) показал, что наилучшие результаты были достигнуты во втором эксперименте, где поддерживалась высокая скорость перемешивания при ограничении по кислороду. В данном случае использование прибора ProLine дало возможность контролировать и корректировать значения входных параметров по перемешиванию и расходу воздуха в режиме on-line.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что воздействие на физиологию продуцента является одним из эффективных способов оптимизации экспрессии рекомбинантных белков в клетках E.coli. Использование прибора ProLine позволило определить, что скорость перемешивания является важнейшим параметром для дальнейшей оптимизации процесса культивирования.

Список литературы

1. Poonam Srivastava, Palash Bhattacharaya, Gaurav Pandey, K.J. Mukherjeero Overexpression and purification of recombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 41, 2005, 313-322.

2. A.F. Mohedano, J.A. Casas, M. Nuñez, J. Fernández, F. García-Ochoa, M. Nuñez. Modeling the Influence of pH, Temperature and Culture Medium Composition on the Kinetics of Growth and Cysteine Proteinase Production by Micrococcus sp. INIA 528 in Batch Culture. Food Science and Technology International, Vol. 7, No. 1, 2001, 49-57

3. Poonam Srivastava, K.J. Mukherjee. Kinetic studies of recombinant human interferon-alpha (rhIFN-a) expression in transient state continuous cultures. Biochemical Engineering Journal 26, 2005, 50-58

4. Delia M. Ramirez, William E. Bentley. Characterization of stress and protein turnover from protein overexpression in fed-batch E. coli cultures. Journal of Biotechnology,

71, 1999, 39-58

5. Бирюков В. В.Основы промышленной биотехнологии. М., КолосС, 2004.