Штамм нового генотипа Escherichia coli 1654-1 для молекулярно-генетического типирования бактерий рода Escherichia
ESCHERICHIA COLI 1654-1 NEW GENOTYPE STRAIN FOR MOLECULAR GENETIC TYPING OF ESCHERICHIA BACTERIA

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии, касается нового штамма Escherichia coli 1654-1, как референс-штамма нового генотипа, геном которого отличается от генома Escherichia coli и геномов других представителей рода Escherichia - Escherichia albertii, Escherichia fergusonii, Escherichia marmotae, может быть использован для микробиологических, диагностических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований и разработки диагностических наборов полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Escherichia coli - представитель семейства Enterobacteriaceae, является одним из наиболее изученных видов микроорганизмов. Эти бактерии отличаются значительной внутривидовой гетерогенностью: среди штаммов Escherichia coli встречаются как комменсалы, так и безусловные патогены, ответственные за широкий спектр кишечных инфекций. Обитая в толстом кишечнике, как сапрофиты, они принимают участие в различных метаболических процессах, синтезе витаминов, обеспечивают колонизационную резистентность. Штаммы разных серологических и филогенетических групп имеют достаточно специфическую локализацию, а также патогенетические особенности персистирования в организме [1]. При транслокации эшерихий, связанной с оперативными вмешательствами, либо с миграцией в мезентериальные лимфатические узлы и кровоток, происходит инфицирование паренхиматозных органов (печень, почки, селезенка, мозг, легкие) с развитием инфекций [2].
С развитием молекулярной биологии появилось такое направление, как молекулярная филогенетика, которая получает сведения об эволюционных взаимоотношениях между организмами путем сравнения их геномов. Использование данных филогенетического анализа в медицине позволяет изучать эволюцию патогенов, проводить реконструкцию генома штаммов бактерий, отслеживать путь передачи и распространения инфекции, оценивать наличие генов, ответственных за резистентность либо патогенность возбудителей инфекционных заболеваний. Это позволит обнаруживать новые генетические маркеры лекарственной устойчивости, разрабатывать новые диагностические методы для инфекционных заболеваний [3].
Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента штаммов рода Escherichia, пригодных для микробиологических, диагностических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований и разработки диагностических наборов для ПЦР.
Указанный технический результат изобретения достигается выделением и проведением полногеномного секвенирования нового штамма Escherichia coli 1654-1, как референс-штамма нового генотипа, геном которого отличается от генома Escherichia coli и геномов других представителей рода Escherichia -Escherichia albertii, Escherichia fergusonii, Escherichia marmotae, предназначенного для разработки праймеров диагностических наборов ПЦР исследований. Указанный штамм выделен из содержимого толстой кишки пациента с диагнозом лямблиоз. Заявляемый штамм Escherichia coli 1654-1, нового генотипа депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8794 от 27 сентября 2019 года. GenBank accession no. JAATUR010000001; SRR 11426068.
Характеристика заявляемого штамма. По современным представлениям вид Escherichia coli 1654-1 входит в род Escherichia, относится к семейству Enterobacteriaceae, порядку Enterobacterales, классу Gamma proteobacteria, типу Proteobacteria, домену - бактерии.
Культуральные свойства штамма Escherichia coli 1654-1. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки, одиночные или в парах, спор не образуют. На среде Эндо при температуре культивирования 35-37°С образуют плоские красные колонии средней величины с темным металлическим блеском, на 5% кровяном агаре образуют серые колонии без гемолиза. Биохимические свойства штамма Escherichia coli 1654-1 определены с помощью тест-системы Sensititre планшет GNID и постановкой дополнительных тестов (индол, оксидазный тест, подвижность, реакция Фогеса-Проскауэра, проба с метиленовым красным). Штамм оксидазоотрицательный, ферментирует глюкозу, лактозу, расщепляет цитрат Симмонса, продуцирует В галактозидазу, не ферментирует инозит. Проба с метиленовым красным положительная. Реакция Фогеса-Проскауэра отрицательная. Образует индол. Не разжижают желатину. Фосфотаза отрицательный. Лизоцимной активностью не обладает.
Выросшие на плотной питательной среде колонии были исследованы с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF Biotyper (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Для этого проводили экстракцию белков посредством последовательной обработки микробной взвеси этиловым спиртом, 70% муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила. В качестве вещества, обеспечивающего процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения, использовали MALDI-матрицу (насыщенный водный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, содержащий 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Анализ проводили в автоматическом режиме. Согласно проведенным исследованиям, показатель подобия варьировался от 2,316 до 2,567, что соответствует высокому уровню видовой идентификации. Однако следует отметить, что данная методика не позволяет дифференцировать Escherichia coli (далее Е. coli) и представителей рода Shigella вследствие их близкого генетического родства. Проведенные исследования позволяют заключить, что исследуемые культуры идентифицированы как Escherichia coli или Shigella spp. с надежной степенью достоверности и не содержат примеси других бактериальных культур.
Полногеномное секвенирование штамма Е. coli-1654-1 осуществлено на платформе Illumina MiSeq, с использованием наборов Nextera DNA Library Preparation Kit и MiSeq Reagent Kits v3 (600-Cycle Kit), согласно рекомендациям производителя. Полученные единичные прочтения полногеномного секвенирования штамма Е. coli были собраны в контиги при помощи программы Unicycler v.0.4.7. Для штамма покрытие составило 26. Общая длина полученных контигов и GC состав образцов соответствуют значениям размеров геномов и GC составу референсных штаммов Е. coli, находящихся в базе данных NCBI Genome.
Для филогенетического исследования использовали программу Wombac 2.0 (http://www.bioinformatics.net.au/software.wombac.shtml). Для построения филогенетического дерева использовали программу SplitsTree4 (http://www.splitstree.org/). На основе определенных коровых SNP исследованных штаммов Escherichia coli и полных геномов (хромосом) Escherichia coli, находящихся в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank построено филогенетическое древо (Фиг. 1). Штамм Е. coli-1654-1 находится на отдельной далеко отходящей ветви. В филогенетическое исследование были добавлены геномы штаммов других видов рода Escherichia - Escherichia albertii, Escherichia fergusonii, Escherichia marmotae. Показано, что заявляемый штамм Е. coli 1654-1, нового генотипа, отличается от генома Е. coli и геномов других представителей рода Escherichia - Escherichia albertii, Escherichia fergusonii, Escherichia marmotae. Это не помогло уточнить систематическое положение образца Е. coli-1654-1, который оказался равноудаленным от других видов рода Escherichia. Штамм также нельзя классифицировать как Shigella spp., которые являются клональными видами и располагаются внутри группы штаммов Е. coli (Фиг. 2).
Дальнейшее исследование генотипа штамма Е. coli-1654-1 проведено с помощью программы Mauve (http://gel.ahabs.wisc.edu/mauve/), определена последовательность гена 16S рРНК.
Последовательность гена 16S рРНК
Последовательность гена 16S рРНК была проанализирована в базе данных BLAST 16S рРНК (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Гомология гена 16S рРНК штамма Е. coli-1654-1 с генами 16S рРНК референсных штаммов представлена в таблице 1.
Наиболее близким референсным штаммом к исследуемому штамму Е. coli-1654-1 по степени гомологии гена 16S рРНК является Escherichia fergusonii АТСС 35469 (NR 074902.1). При этом показано отличие в 4-х SNP, что свидетельствует о выявлении нового генотипа Escherichia coli.
Пример
Проведено полногеномное секвенирование 30 штаммов Escherichia coli, изолированных из толстой кишки пациентов, страдающих паразитарной и инфекционной патологией, результаты представлены в таблице 2.
Филогенетическое исследование проводили в программе Wombac 2.0 (http://www.bioinfoirnatics.net.au/software.wombac.shtrnl), которая позволяет находить коровые SNP в нуклеотидных последовательностях и производить выравнивание этих полиморфизмов. Для построения филогенетического дерева использовали программу SplitsTree4 (http://www.splitstree,org/). Филогенетическое древо на основе определенных коровых SNP исследованных штаммов Escherichia coli и полных геномов (хромосом) Escherichia coli, находящихся в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank (Фиг. 3). Геномы 29 исследованных штаммов совпадают с геномами референс-штаммов Е. coli, имеющихся в базе данных, представлены в таблице 3. Геном штамма Е. coli-1654-1 не соотносится с геномами референс-штаммов Е. coli. В филогенетическое исследование были добавлены геномы штаммов других видов рода Escherichia - Escherichia albertii, Escherichia fergusonii, Escherichia marmotae. Систематическое положение штамма E.coli-1654-1 среди других штаммов бактерий рода Escherichia не определилось, что подтверждается фиг. 2. Это свидетельствует о том, что выделен штамм нового генотипа.
Таким образом, проведение молекулярно-генетических исследований, в частности, филогенетического анализа на основе полногеномного секвенирования позволяет определять таксономическое положение штаммов, геномы которых имеют отличия от референс-штаммов.
Литература
1. Кузнецова М.В., Гизатуллина Ю.С. Филогенетическое разнообразие и биологические свойства уропатогенных штаммов Escherichia coli. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН, 2019, №3: 1-29.
2. Бухарин О.В., Гриценко В.А., Вялкова А.А. Факторы уропатогенности бактерий: роль в патогенезе и значение в диагностике пиелонефрита. Нефрология и диализ. 2001.3(4): 469-475.
3. Фомченко Н.Е., Воропаев Е.В. Филогенетические аспекты молекулярной биологии в медицине. Проблемы здоровья и экологии, 2014, №3 (41): 30-34.