Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий Bordetella pertussis генотипа ptxP3

Л ИТЕРАТУРА

1. Богданова Е.А., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А.Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта крыс при пероральном введении пробиоти-ческих препаратов. Вестн. РАМН. 2006, 2: 6-10.

2. Зоров Д.Б. и др.Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота. Биохимия. 2005, 70 (2): 265-272.

3. Завгородняя Е.Ф. Особенности микробиологической характеристики дисбиозов кишечника в современных условиях. Дальневост. журн. инфекц. патологии. 2008, 12: 161-162.

4. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимические и патофизиологические аспекты М.: Наука/Интерпериодика, 2001.

5. Костюкевич О.И. Современное представление о микробиоценозе кишечника. Дисбактериоз и его коррекция. РМЖ. 2007, 28: 2176-2182.

6. Королюк М.А. и др. Метод определения активности каталазы. Лаб. дело. 1988, 1: 16-19.

7. Макаренко Е.В. Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глу-татионредуктазы в эритроцитах больных с хроическими заболеваниями печени. Лаб. дело. 1988, 11: 48-50.

8. Несвижский Ю.В. и др. Микробиоценоз пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс с индуцированным дисбиозом Журн. микробиол. 2007, 3: 57-60.

9. Несвижский Ю.В. Изучение изменчивости кишечного микробиоценоза человека в норме и патологии. Вестн. РАМН. 2003, 1: 49-53.

10.Шишкина Л.Н. Особенности функционирования физико-химической системы регуляции перекисного окисления липидов в биологических объектах разной степени сложности в норме и при действии повреждающих факторов. Дис. д-ра хим. наук. М., 2003.

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018

Е.Г.Семин, Л.Н.Синяшина, А.Ю.Медкова, Г.И.Каратаев

КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АТТЕНУИРОВАННЫХ БАКТЕРИЙ BORDETELLA PERTUSSIS ГЕНОТИПА PTXP3

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва

Цель. Конструирование рекомбинантных бактерий B. pertussis генотипа ptxP3 и характеристика их генетической и биологической стабильности. Материалы и методы. В качестве реципиента при конструировании аттенуированных бактерий генотипа ptxP3 использованы вирулентные бактерии B. pertussis 475 генотипа ptxPl, применяемые для производства вакцины АКДС в Российской Федерации. Мутантные бактерии B. pertussis 475 получены в результате аллельного обмена между нативной копией целевой последовательности в составе хромосомы и ее мутантной копией в рекомбинантной суицидной плазмиде, переданной в реципиентную бактерию с помощью коньюгации. Конструирование рекомбинантных плазмид осуществлено стандартными методами генетической инженерии. Структура модифицированных участков хромосомы аттенуированных бактерий определена с помощью ПЦР и секвенирования фрагментов амплификации. Стабильность структуры и свойств аттенуированных бактерий определена после 15 пассажей бактерий на питательной среде и 5 — в организме мышей. Результаты. Сконструированы изогенные аттенуированные бактерии PtxPl B. pertussis 4M и PtxP3 B. pertussis 4MKS, продуцирующие коклюшный токсин (КТ), лишенный ферментативной токсической активности, и не продуцирующие дермонекротический токсин. Промоторная область оперона ptx аттенуированных бактерий PtxP3 B. pertussis 4М^ содержит мутацию, характерную для «нового» генотипа циркулирующих в настоящее время вирулентных бактерий B. pertussis и увеличивающую продукцию КТ. Структура модифицированных фрагментов ДНК и свойства аттенуированных бактерий

не изменяются при хранении и пассажах на питательной среде и в организме мышей. Заключение. Сконструированы рекомбинантные аттенуированные бактерии B. pertussis 4М^ «нового» генотипа ptx*P3 и показана перспективность направленной генноин-женерной модификации изогенных бактерий B. pertussis для создания инновационных препаратов для профилактики коклюша.

Журн. микробиол., 2018, № 4, С. 33—41

Ключевые слова: коклюш, рекомбинантные аттенуированные бактерии B.pertussis, конструирование, генотип, вакцина

E.G.Semin, L.N.Sinyashina, A.Yu.Medkova, G.I.Karataev

CONSTRUCTION OF RECOMBINANT ATTENUATED BORDETELLA PERTUSSIS BACTERIA OF PTXP3 GENOTYPE

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

Aim. The construction of recombinant attenuated Bordetella pertussis bacteria of ptxP3 genotype and its genetic and biological stability characteristics. Materials and methods. During construction of recombinant attenuated bacteria of ptxP3 genotype virulent Bordetella pertussis bacteria of ptxP1 genotype were used as a recipient. PtxP1 genotype bacteria are used for whole cell pertussis (wP) vaccine production in Russia. Mutant bacteria B. pertussis 475 were received by crossing-over between chromosome comprising native copy of target sequence and its mutant copy in recombinant suicide plasmid transferred in recipient bacteria by conjugation. Genetically engineered construction of recombinant plasmids was conducted. The structure of modified chromosome locus of attenuated bacteria was determined by PCR and amplification fragments sequence. The stability of structure and characteristics of attenuated bacteria was defined after 15 passages of strains on culture medium and 5 passages in mice. Results. Isogenic attenuated ptxP1 B. pertussis 4M and ptxP3 B. pertussis 4MKS were constructed. These bacteria produce non-toxic pertussis toxin (PT) and do not produce dermonecrotic toxin (DNT). The promoter region of ptx operon contains mutation, typical for «new» genotype of circulating virulent bacteria and increasing PT production. The structure of modified DNA fragments and characteristics of attenuated bacteria did not change while storing and after passages on culture medium and in mice. Conclusion. Recombinant attenuated bacteria B. pertussis 4MKS of «new» ptxP3 genotype are constructed. Application perspectiveness of genetically engineered modification of isogenic B.pertussis bacteria for pertussis vaccines development is shown.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 4, P. 33—41

Key words: pertussis, recombinant attenuated bacteria B. pertussis, construction, genotype, vaccines

ВВЕДЕНИЕ

Коклюш — высококонтагиозное инфекционное заболевание, вызываемое бактериями Bordetella pertussis, передающееся воздушно-капельным путем. Специфическая профилактика коклюша, проводимая с 50-х годов прошлого века цельноклеточными коклюшными вакцинами (ЦКВ), позволила снизить заболеваемость до единичных случаев на 100 тыс. населения [3]. Однако наряду с положительным эффектом наблюдали нежелательные побочные реакции и поствакцинальные осложнения, которые в 90-х годах инициировали отмену в ряде стран вакцинации против коклюша и, как следствие, резкое увеличение тяжелых форм заболевания и смертности детей [12], что послужило основанием для разработки бесклеточных коклюшных вакцин

(БКВ), признанных ВОЗ менее реактогенными [11,13]. В настоящее время для массовой иммунизации применяют оба типа коклюшных вакцин в составе комбинированных препаратов. Тем не менее, показатели заболеваемости коклюшем растут как во всем мире, так и в России, особенно среди детей в возрасте до 1 года [1, 2, 13], наиболее значимо в тех странах, где для первичной иммунизации применяют только БКВ [10]. Одной из причин роста заболеваемости коклюшем является краткосрочная эффективность современных вакцин [7].

В развитии инфекционного процесса бактерии B.pertussis реализуют множественные факторы патогенности. Важнейшим фактором вирулентности признан коклюшный токсин. В настоящее время в геноме циркулирующих бактерий B.pertussis отмечают существенные изменения по сравнению со штаммами довакцинального периода. Накопление в популяции вирулентных бактерий B.pertussis с так называемыми «новыми» генотипами позволяет возбудителю «ускользать» от коллективного иммунитета, формируемого современными коклюшными вакцинами. Особенно быстрое формирование «новых» генотипов бактерий B.pertussis наблюдается с начала периода применения бесклеточных коклюшных вакцин (БКВ). К «новым» генотипам относятся бактерии генотипа ptxP3 с мутацией в промоторной области оперона ptx, увеличивающие продукцию КТ и вирулентность бактерий. Частота встречаемости «новых» генотипов возбудителя коклюша достигает 30-70% от общего числа циркулирующих бактерий B. pertussis [10]. Изменение иммунобиологических свойств возбудителя коклюша отражается и на эффективности ЦКВ [6].

Изучение механизма патогенеза коклюша и изменчивости бактерий привело научное сообщество к пониманию необходимости создания нового поколения вакцин и замены «старых» вакцинных штаммов на «новые». Разрабатываемые в течение последних десятилетий методы генетической модификации бактерий B. pertussis позволяют конструировать аттенуирован-ные рекомбинтные бактерии и разрабатывать эффективные препараты для профилактики коклюша [8, 9]. В предыдущей работе нами было проведено конструирование аттенуированных бактерий B. pertussis на основе реципиентов, несущих генотип ptx Р1 [8]. Аттенуированные бактерии B. pertussis KS содержат две мутации в опероне ptx, нокаутную мутацию гена dnt, продуцируют нетоксичную форму коклюшного токсина (КТ*) и не синтезируют дермонекротический токсин. Показана их высокая протективная активность и низкая токсичность. Можно ожидать, что увеличение уровня продукции КТ*, характерное для «нового» генотип ptxP3, способно повысить защитную активность аттенуированных бактерий B. pertussis.

Целью настоящей работы было конструирование рекомбинантных бактерий B. pertussis генотипа ptxP3 и характеристика их генетической и биологической стабильности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и плазмиды, использованные и сконструированные в работе, представлены в табл. 1 и 2.

Клонирование, рестрикционный анализ, лигирование, электрофорез ДНК, генетические манипуляции (трансформацию клеток Escherichia coli плазмидной ДНК или лигированной смесью) проводили в соответствии со стандартными рекомендациями [4].

Выделение ДНК плазмид, хромосомы и продуктов ПЦР из геля проводили с помощью систем Wizard Plus SV Mini Preps DNA purification system

Таблица 1. Плазмиды, использованные и сконструированные в настоящей работе

Название Маркеры Структура Источник

pJQ GmR вектор (y-ori-R6K и mob-сайт oriTRP4), чувствительность к Sm НИЦЭМ

pKS2 GmR pJQ::ptx*::kan Н.Р.

pKS7 pJQ::dnt::cat (в Tth111 I ) Н.Р.

рGemT ApR Вектор для клонирования Promega

pKS9 ApR рGemT:: ptxP3 (ампликон) Н.Р.

pKS10 GmR pJQ::ptxP3(EcorI ф-т pKS9) Н.Р.

Таблица 2. Штаммы бактерий B. pertussis и Escherichia coll, использованные и сконструированные в настоящей работе

Штамм Генотип Фенотип Источник

B. pertussis 475 Ri^m^m SSmSNalS 1.2.3. Bvg+ НИЦЭМ

B. pertussis 476 SmRNalR 1.2.3. Bvg+ Н.Р.

B. pertussis 4 SmRNalR Km R ptx* 1.2.3. B. p 476 ptx* Н.Р.

B. pertussis 4M ^^m^aP Km R ptx*dnt::cat 1.2.3.7. B. p 4 Dnt- Н.Р.

B. pertussis 4MKS СmRSmRNalRKmSptx*dnt PtxP3 1.2.3.7. B. p 4M PtxP3 Н.Р.

E. coli Sm 10 KmRrecA, RP4:2-Tc::Mu aph:: Tn7 pir НИЦЭМ

Примечание. Н.Р. сконструированы в настоящей работе; НИЦЭМ коллекция НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; ptx * мутантный оперон ptx.

(Promega, США), Wizard Plus Mini Preps DNA purification system (Promega, США) и Wizard SV Geland PCR Clean-up System (Promega, США). ПЦР проводили на приборе Терцик (Россия) с использованием специфических прай-меров, синтезированных ЗАО «СИНТОЛ».

Мышей усыпляли эфиром, легкие извлекали и гомогенизировали в 0,85 % растворе хлорида натрия рН 7.2-7.4, инкубировали 15 мин при температуре 36 0С и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5-10 мин. По 0,1 мл супернатанта высевали на три чашки Петри с селективной средой и использовали для выделения ДНК. Супернатанты гомогенатов легких обрабатывали раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте фирмы «Promega» США.

Автоматическое секвенирование проводили на 373А Automatic Sequencer (Applied Biosysthems, USA) с использованием реактивов Dye Deoing Terminator AB Isequencing Kit с Taq-полимеразой FS (Perkin Elmer, USA). Для реакции использовали плазмиды или продукты амплификации ДНК.

Фенотипические характеристики аттенуированных бактерий B. pertussis изучали на отдельных колониях, выросших на среде КУА с добавлением селективных антибиотиков и 15% дефибринированной крови барана для регистрации гемолитической активности. Для серотипирования использовали сухие диагностические коклюшные сыворотки для реакции агглютинации (РА) к главным агглютиногенам бактерий B. pertussis — 1, 2, 3, в соответствии с рекомендациями МУК 4.2.2317-080 и производителя [5].

Изучение структуры модифицированных фрагментов генома аттенуиро-ванных бактерий B. pertussis проводили с помощью генетических (методом реплик на селективные среды) и молекулярно-биологических методов (анализ структуры и последовательности продуктов ПЦР ДНК хромосомы B. pertussis, содержащих мутантные гены). Для проведения ПЦР были использованы прай-меры. специфичные для последовательностей генов ptx, kan, cat и dnt.

Специфическую активность КТ — лейкоцитозстимулирующую (ЛСА) и гистаминсенсибилизирующую (ГСА) активность определяли в соответствии со стандартными методиками при внутрибрюшинном и интраназальном введении лабораторным мышам. Активность дермонекротического токсина аттенуированных бактерий B. pertussis определяли при внутрикожном введении кроликам и морским свинкам [5].

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

Ранее нами было описано конструирование мутантного оперона ptx, гена dnt, генома аттенуированных бактерий на основе реципиентов B. pertussis 135 и 232 и их иммунобиологические характеристики [8].

В настоящей работе в качестве реципиента использованы бактерии B. pertussis 475 генотипа ptxР1, входящие в состав коклюшного компонента вакцины АКДС. Последовательность оперона ptx содержала описанные ранее мутации аминокислот Arg9 и Glu129, а ген dnt — нокаутную инсерцию последовательности cat [8]. Для аллельного обмена использовали суицидные плазмиды, сконструированные на основе вектора pJQ. Характеристики ре-комбинантных плазмид pKS2 и pKS7, содержащих мутантный, маркированный геном kan, оперон ptx, и последовательность гена dnt с инсерцией гена cat в сайте Tth111, представлены в табл. 1.

Рекомбинантные бактерии Ptx* Р1 B. pertussis 4М, содержащие мутацию в опероне ptx, сконструированы в результате скрещивания StrRNalR B. pertussis 475 х E. coli Sm10/pSK2. Селекцию NalRKmR трансконьюгантов проводили на селективной среде КУА, содержащей налидиксовую кислоту и канамицин. Доминантность признака StrS в составе плазмиды pJQ позволяла осуществить отбор трансконъюгантов, содержащих в хромосоме B. pertussis только копию целевой мутантной последовательности, и исключить транско-нъганты, имеющие коинтеграт хромосомы с плазмидой. Искомые транско-нъганты должны иметь фенотип StrRGmSKmRNalR. Поэтому после расчистки NalRKmR трансконьюганты высевали на чашки КУА со стрептомицином или стрептомицином и канамицином. Выросшие колонии двукратно расчищали на чашках со стрептомицином + канамицин и проверяли по маркерам устойчивости к Str, Nal, Km и Gm. Клоны StrRNalRKmRGmS использовали для дальнейшего анализа. Генетический анализ трансконюъгантов показал, что все клоны StrRNalRKmR, выросшие на среде с добавлением стрептомицина, чувствительны к Gm. ПЦР, рестрикция и секвенирование фрагментов амплификации нескольких StrRNalRKmRGmS трансконъюгантов показали, что они являются искомыми рекомбинантными бактериями B. pertussis, в хромосоме которых на месте дикого аллеля ptx находится его мутантная копия, маркированная геном устойчивости к канамицину. Один из охарактеризованных трансконъюгантов назван B. pertussis 4.

Аналогичным образом были отобраны и проанализированы StrRNalRKmRGmS СmR трансконьганты, полученные в скрещивании Sm10/ pKS7 х StrRNalRKmR B. pertussis 4. Для дальнейшего конструирования использован охарактеризованный Dnt-Ptx*Р1 StrRNalRKmRСmR рекомбинант, названный B. pertussis 4М.

Рекомбинантные бактерии Dnt-Ptx*r3 B. pertussis сконструированы в результате замены фрагмента, содержащего последовательность ptxP1 в геноме бактерий B. pertussis 4М, на последовательность ptxP3 в составе плазмиды p^10. Источником последовательности ptxP3 являлась хромосома B. pertussis «нового», синтезированная в результате амплификации ДНК B. pertussis 55-12, выделенного

в России, описанного и предоставленного нам Борисовой О.Ю. Для амплификации целевого фрагмента, содержащего мутацию и сайт узнавания StuI, использованы праймеры K1KS и K2KS. Амплифицированный фрагмент клонирован в векторе pGemT (плазмида pKS9) (Promega, USA) и переклонирован в вектор pJQ. Рекомбинантная плазмида получила название pKS10. Плазмиду pKS10 трансформировали в бактерии E. coli SMlO-донора в скрещивании с аттенуированны-ми бактериями B. pertussis 4М. Трансконъюганты отбирали на селективной среде, содержащей Cm, Str и Gm. Поскольку целевой фрагмент содержит сайт StuI хромосомы B. pertussis 4M с интегрированной последовательностью гена kan, то событие аллельного обмена, приводящее к искомой замене последовательности регуляторной области ptxPl на ptxP3, должно сопровождаться потерей маркера устойчивости к канамицину. В связи с этим, после расчистки трансконъюгантов на селективной среде бактерии B. pertussis высевали до отдельных колоний на среду КУА с добавлением Cm и Str. Отдельные колонии методом реплик переносили на селективные среды, содержащие один из пяти антибиотиков: Cm, Str, Gm, Km или Nal. Трансконъюганты с фенотипом KmSCmRNalRStrRGmS проверяли на наличие последовательности гена kan, соответствие структуры регуляторной области оперона ptx* генотипу ptxP3 и инсерции в гене dnt. Анализ структуры модифицированных участков проводили с помощью ПЦР и секвенирова-ния. На рис. показано расположение мутации на хромосоме бактерий «нового» генотипа ptxP3, названных B. pertussis 4MKS. Амплификация ДНК, рестрикция и секвенирование подтвердили идентичность модифицированных участков

EcoRV Асс I

сс gta ta ccgc tat да cc gta ta taag tat да

Б

EcoRI EcoRI

Структура фрагментов хромосомы Bordetella pertussis 4M (А) и Bordetella pertussis 4MKS (Б).

Ломаные линии показывают положение праймеров, использованных для определения структуры модифицированных фрагментов генома B.pertussis; квадратный бокс с надписью Р отображает положение промотора оперона ptx; S1-S5 — положение соответствующих генов КТ в опероне ptx; заглавные и прописные буквы курсива обозначают описанные в тексте последовательности; EcoRI — сайты рестрикции на карте фрагментов хромосомы Bordetella pertussis.

Бактерии Доза Nü1' Способ Nn2) через 72 ч

введения

B. pertussis 4MKS 10 МЕ 10 i/n3) 9700+ 900

B. pertussis 4MKS 10 МЕ 10 1/р4) 12700+ 1000

ОСО-3 10 МЕ 17000+ 1050

0,85 % р-р NaCl 0,5 мл 5 i/р 7990 +1151

0,85 % р-р NaCl 25 мкл 5 i/ n 6840 +737

Примечание. 1) количество мышей в эксперименте; 2) количество лейкоцитов в мкл крови; 3) интрана-зальное введение; 4) интраперитониальное введение.

хромосом B. pertussis 4MKS И B. Таблица 3. Лейкоцитозстимулирующая активность -nertiissk 4M наличие Замен амино- аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS ptxP3 при pertussis 4M, наличие замен амиНо интраназальном и интраперитониальном введении мышам

кислот Arg9 (CGC) И Glu129(AAG) линии Balb/c и замену нуклеотида с на t в положении — 65, соответствующую «новому» генотипу ptxP3 в хромосоме B. pertussis 4MKS (рис.).

После 15 пересевов на среде КУА с добавлением дефибрини-рованной крови и пяти пассажей в легких мышей аттенуированных бактерий PtxP3 B. pertussis 4MKS изучали стабильность морфологических и фенотипи-ческих характеристик микробных

клеток и колоний, гемолитическую активность, состав видоспецифических агглютиногенов, маркеры устойчивости к антибиотикам, структуру модифицированных участков хромосомы. Наблюдали формирование типичных для B. pertussis округлых блестящих колоний, размером около 1 мм, с четко очерченными краями, гладкой поверхностью и зоной гемолиза диаметром 1-2 мм. При микроскопии грамотрицательные коккобациллы располагались отдельно или парами. Все изученные клоны сохранили серовар 1.2.3. При определении маркеров CmR и KmS в составе модифицированных участков генома аттенуированных бактерий PtxP3 B. pertussis 4MKS методом реплик не было выявлено ни одной колонии, потерявшей устойчивость к хлорамфе-николу (проверено около 500 КОЕ).

Изучение токсической активности КТ*, экспрессируемого рекомбинан-тными бактериями PtxP3 B. pertussis 4MKS, проводили в тестах ЛСА и ГСА после интраназального (i/n) и интраперитонеального (i/р) введения мышам Balb/C. Интраназально вводили 1010 м.к. (200 МЕ) в 25 мкл 0,85 % р-р NaCl; интраперитонеально — 1010 м.к. в 0,5 мл 0,85 % р-р NaCl (табл. 3 и 4). В соответствии с МУК (4.2.2317-080) ЛСА рекомбинантных бактерий PtxP3 B. pertussis 4MKS определяли параллельно с отраслевым стандартным образ-

Таблица 4. Гйстаминсенсибилизирующая активность аттенуированных бактерий B. pertussis 4М^ при интраназальном и интраперитониальном введении мышам линии C57 BL/6

Бактерии Доза

2 ч 24 ч

B.pertussis 4М^ 10,0 10 i/n 0 0 10 0 0 >10,0

2,0 10 0 0 10 0 0

0,4 10 0 0 10 0 0

B.pertussis 4М^ 10,0 10 i/р 0 0 9 1 10 > 10,0

2,0 10 0 0 10 0 0

0,4 10 0 0 10 0 0

ОСО-5 10,0 10 i/р 8 0 2 8 80 2,0

42-28-87-02П 2,0 10 6 0 4 6 60

0,4 10 0 0 10 0 0

Контроль 0,85% NaCl 10 i/р 0 0 0 0 0 -

Контроль 0,85% NaCl 10 i/n 0 0 0 0 0 -

Примечание. 1) количество мышей в опыте; 2) количество выживших мышей; 3) количество погибших мышей.

цом — ОСО-3 (42-28-89) и ГСА сравнительно с ОСО-5 (42-28-87-02П). Расчет ГСД50 (ГСА) представлен только для ОСО-5, поскольку после введения разрешающей дозы гистамина не было гибели мышей, иммунизированных бактериями B. pertussis 4MKS. ГСА препарата ОСО-5 имела дозозависимый характер, что позволило считать эксперимент корректным. Дермонекротическую активность аттенуированных бактерий PtxP3 B. pertussis 4MKS изучали в сравнении с изогенными вирулентными бактериями B. pertussis 475. При внутрикожном введении кроликам и морским свинкам 0,2 мл суспензии, содержащей от 10 до 50 МОЕ B. pertussis 4MKS, активности дермонекротичес-кого токсина выявлено не было, в то время как при введении вирулентных бактерий B. pertussis 475 в дозе 2х108 м.к. наблюдали образование выраженного некроза, достигающего 20±0,5 мм в диаметре. Аналогичные результаты получены при изучении токсической активности бактерий PtxPl B. pertussis 4М.

О БСУЖДЕН И Е

Исследования последнего десятилетия в разных странах, в том числе и в России, показали, что в настоящее время на фоне массовой вакцинации циркулирующие штаммы бактерии B. pertussis содержат измененные последовательности ptx, fga, prn, отличающиеся от последовательностей в штаммах B. pertussis довакцинального периода. Высказываются предположения, что рост заболеваемости коклюшем непосредственно связан с циркуляцией бактерий «новых» генотипов [2, 10]. Для производства современных коклюшных вакцин рассматривается возможность замены вакцинных штаммов на «новые», несущие современные генотипы. Большинство выявленных мутаций в последовательности ptx, кодирующей KT, расположены в области, ответственной за формирование структур протективных эпитопов. На данный момент нет достоверных данных, подтверждающих практическую целесообразность использования бактерий с «новыми» генотипами, касающимися структуры протективных антигенов для производства вакцин, однако они, вероятно, появятся, так как исследования в этом направлении проводятся в ряде лабораторий мира. Исключение составляет генотип ptxP3, доминирующий в последнее десятилетие. Бактерии, несущие генотип ptxP3, содержат точечные мутации в регуляторной области промотора оперона ptx, ответственной за связывание белка BvgA, усиливающего экспрессию оперона и продукцию KT, и не затрагивающие его структуру. Показано, что бактерии B. pertussis генотипа ptxP3 продуцируют увеличенное количество коклюшного токсина и более вирулентны в экспериментах на животных. Сконструированные нами ранее аттенуированные бактерии B. pertussis имеют довакцинный генотип ptxPl [8].

Для увеличения продукции КТ* как основного протективного антигена возбудителя коклюша и создания модели для изучения влияния этой мутации на протективность коклюшной вакцины нами были сконструированы рекомбинантные бактерии B. pertussis 4MKS с «новым» генотипом ptxP3 на основе изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis 4M генотипа ptxPl.

Сопоставление рекомбинантов PtxP3 B. pertussis 4MKS и PtxPl B. pertussis 4М показало полное отсутствие у них токсической активности, независимо от уровня продукции КТ*.

Стабильность структуры модифицированных участков оперона ptx и гена dnt после хранения бактерий, пассажей на питательной среде и в организме

животных подтверждена амплификацией соответствующих фрагментов хромосомы, их рестрикционным картированием, секвенированием и не зависела от генотипа бактерий. На следующем этапе будет проведено сравнительное изучение защитной активности изогенных аттенуированных бактерий с генотипами ptx* P1 и ptx* P3.

Таким образом, сконструированые нами аттенуированные рекомбинан-тные бактерии B. pertussis 4MKS с «новым» ptxP3 генотипом регуляторной области оперона ptx сохранили кодирующую последовательность ptx* бактерий Ptx*P1 B. pertussis 4М и нокаутную мутацию в гене dnt. Генетическая структура и биологические свойства бактерий Ptx*P3 B. pertussis 4MKS стабильны при пересевах на селективных питательных средах и пассажах в организме лабораторных животных. Аттенуированные бактерии Ptx*P3 B. pertussis 4MKS могут быть более эффективными при создании новых ре-комбинантных препаратов для профилактики коклюша, в частности, живой коклюшной вакцины (Патент РФ № 2455024 (13) С1. 10.07.2012).

ЛИТЕРАТУРА

1. Алексеева И.А., Чупринина Р.П., Борисова В.Н. Сравнительный анализ безопасности и эффективности отечественных и зарубежных комплексных вакцин, содержащих цельноклеточную коклюшную вакцину. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012, 3(64): 48-54.

2. Борисова О.Ю., Пименова А.С., Попова О.П. и др. Структура популяции штаммов возбудителя коклюша на территории России. Эпидемиология и вакцинопрофилакти-ка. 2016, 4(86): 22-27.

3. Захарова М.С. Влияние вакцинации на эпидемиологию коклюша в СССР. В кн.: Эпидемиология и иммунопрофилактика коклюша в СССР, ВНР, НРБ и ЧССР. М., 1985.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.

5. МУК 4.2.2317-08. Методические указания. Издание официальное. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. М., 2009.

6. Перелыгина О.В., Алексеева И.А. Безопасность комбинированных вакцин с цель-ноклеточным коклюшным компонентом. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016, 6 (91): С. 62-69.

7. Пименова А.С., Борисова О.Ю., Цвиркун О.В. и др. Эффективность применения мо-лекулярно-генетической диагностики при обследовании очагов коклюшной инфекции. Журн. инфекция и иммунитет. 2017, 7(2): 162-170.

8. Синяшина Л.Н., Синяшина Л.С., Семин Е.Г. и др. Конструирование генетически аттенуированных бактерий Bordetella pertussis, утративших активность дермонекро-тического токсина и продуцирующих измененную нетоксичную форму коклюшного токсина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010, 3: 31-36.

9. Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. Live attenuated B. pertussis as a single-dose nasal vaccine against whooping cough. PLoS Pathog. 2006, 2 (7): 65-69.

10.Mooi F.R. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen. Infect. Genet. Evol. 2010, 10 (1): 36-49.

11.Sato Y, Sato H. Development of acellular pertussis vaccines. Biologicals. 1999, 27: 61-67.

12.WHO. Expert committee on biological standardization. Recommendation to Assure the Quality, Sаfety and Efficacy of Acellular Pertussis Vaccines. Geneva, 17-20 October. 2011.

13.WHO. Weekly epidemiological record. 2014, 89(21).