УСТРОЙСТВО КОНТРОЛЯ НА ОСНОВЕ РЕШЕТКИ
ARRAY-BASED CONTROL DEVICE

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биосенсоров и более конкретно к биосенсору на основе дифракционной решетки.
Уровень техники
Технология биосенсоров хорошо известна в технике.
Патентная заявка США № 2003/0174992 описывает способ и устройство для обеспечения волновода нулевой моды, включающего в себя исследуемый компонент, который подвергается активации электромагнитным излучением для анализа исследуемого компонента.
WO 2006/136991, под названием "Люминесцентные сенсоры, использующие длину волн гармоник отверстий или щелей", описывает биосенсор с пространственным разрешением длин волн гармоник.
WO 2007/072415, под названием "Люминесцентный сенсор, функционирующий в отражательной моде", описывает способ обнаружения флуоресцентного излучения, произведенного молекулами в отверстии.
Такой биосенсор может содержать непрозрачный материал, расположенный на подложке прозрачного материала, и формирующий, по меньшей мере, одно отверстие для заполнения так называемой исследуемой жидкостью. Отверстия имеют величину первого измерения в плоскости меньше предела дифракции возбужденного света в среде внутри отверстия и величину второго измерения в плоскости больше предела дифракции возбужденного света в среде внутри отверстия. Плоскость отверстия определяется первым вектором, направленным вдоль первого измерения отверстия в плоскости, и вторым вектором, направленным вдоль второго измерения отверстия в плоскости. У такой решетки есть ось переноса, где свет, поляризованный, так что электрическое поле параллельно плоскости переноса, которая определена первым вектором и третьим вектором, нормальным к плоскости отверстия, ниже называемый T поляризованным светом, в целом передается, а свет, поляризованный, так что электрическое поле является ортогональным плоскости переноса, ниже называемый R поляризованным светом, в основном блокируется.
Исследуемый компонент применяется к биосенсору и проникает в отверстия. Исследуемый компонент содержит целевую молекулу для анализа. Целевая молекула маркирована люминофором и агрегат молекулы люминофор/цели иммобилизован на поверхности подложки отверстий, в то время как свободные люминофоры и люминофоры, присоединенные к целевым молекулам, присутствуют на стороне исследуемого компонента отверстий в исследуемом компоненте. Иммобилизованные люминофоры соответствуют качественному или количественному представлению целевой анализируемой молекулы.
Эмиссионное излучение от иммобилизованных люминофоров определяется детектором. Чтобы отличить желаемое излучение иммобилизованных люминофоров от фонового излучения свободных люминофоров и целевых молекул, маркированных люминофорами, фоновое излучение должно быть подавлено. Фоновое излучение может быть величиной на несколько порядков больше, чем полезное излучение от иммобилизованных люминофоров. Значительное подавление люминесцентного фонового излучения допускает измерения, по существу свободные от фона, что иначе потребовало бы очистки, но очистка, например, была бы невозможна во время измерений в реальном времени. Для реального биосенсора на основе решетки, освещенного поляризованным светом возбуждения, подавление фонового излучения ограничено приблизительно тремя порядками по величине. Это ограниченное подавление фона, в конечном счете, приводит к уменьшению точности и зависимости сенсора от специфики поверхности. Кроме того, есть потребность в технологии для биосенсора, которая может использовать неполяризованный источник света, такой как светоизлучающий диод, СИД, который более дешев и может произвести большую выходную мощность.
Сущность изобретения
Соответственно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы смягчить, ослабить или устранить один или более из вышеуказанных недостатков и неудобств отдельно или в любой комбинации.
Согласно одному аспекту изобретения, предоставлено устройство мониторинга излучения, испускаемого люминофорами, присутствующими в исследуемой жидкости, содержащее: биосенсор, имеющий, по меньшей мере, один непрозрачный материал на подложке из прозрачного материала и формирующий, по меньшей мере, одно отверстие для наполнения указанной исследуемой жидкостью, имеющее первое измерение в плоскости, меньшее, чем половина эффективной длины волны излучения в биосенсоре, и второе измерение в плоскости, большее, чем половина эффективной длины волны излучения биосенсора, и имеет плоскость передачи; возбуждающий источник для возбуждения люминофоров, присутствующих в исследуемой жидкости вышеуказанного биосенсора; детектор для обнаружения излучения, испущенного люминофорами после возбуждения; и поляризационный фильтр, расположенный между биосенсором и детектором. Детектор может быть расположен со стороны подложки биосенсора. Источником возбуждения может быть источник света, испускающий поляризованный свет, такой как поляризованный свет, имеющий эллиптическую поляризацию, такую как круговую или линейную поляризацию, или вышеуказанным источником возбуждения может быть световой источник, испускающий неполяризованный свет. Поляризационный фильтр может быть расположен для существенного ослабления излучения с электрическим полем, параллельным плоскости передачи отверстия. Поляризационный фильтр может быть вращаемым.
В одном варианте осуществления источник света содержит фильтр полосы пропускания для прохождения излучения, имеющего полосу пропускания длины волны, соответствующую полосе поглощения длины волны для возбуждения вышеуказанных люминофоров, и для блокирования излучения, имеющего длину волны, соответствующую длине волны излучения вышеуказанных люминофоров. Кроме того, фильтр пропускания длины волны может быть расположен перед детектором для прохождения излучения, имеющего длину волны, соответствующую длине волны излучения вышеуказанных люминофоров, и блокирования излучения, пропущенного вышеуказанным фильтром полосы пропускания.
В другом варианте осуществления поляризационный фильтр может содержать поляризационный делитель луча, пропускающий излучение, имеющее плоскость поляризации, параллельную плоскости передачи отверстия к вышеуказанному детектору, и отражающий или блокирующий излучение, имеющее поляризацию, ортогональную к плоскости передачи отверстия ко второму детектору, или поляризационный фильтр может содержать дихроичное зеркало, расположенное для направления вышеуказанного излучения возбуждения к биосенсору и передающее эмиссионное излучение к детектору.
В дополнительном варианте осуществления излучение от вышеуказанного источника света может быть направлено для прохождения поляризационного фильтра до освещения биосенсора.
В еще одном дополнительном варианте осуществления источник света может быть расположен со стороны подложки биосенсора и обнаружение выполняется в отражательной моде. Альтернативно, источник света может быть расположен со стороны исследуемой жидкости биосенсора и обнаружение выполняется в моде передачи. Источник света может испускать свет, имеющий малую длину когерентности, такой как, например, имеющий ширину полосы больше чем 1 нм.
Устройство может содержать исследуемую жидкость, и исследуемый компонент может содержать целевую молекулу и люминофор, такой как флуорофор, в среде, которая содержится в вышеуказанном отверстии. Молекула захвата может быть расположена на поверхности подложки отверстия, причем вышеуказанная молекула захвата предназначена для формирования агрегата с вышеуказанной целевой молекулой и люминофором. Исследуемая жидкость может быть расположена на одной стороне подложки, содержащей вышеуказанные отверстия, а детектор и поляризационный фильтр расположены с другой стороне подложки.
Краткое описание чертежей
Дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения будут очевидны из последующего подробного описания вариантов осуществления изобретения со ссылками на чертежи, в которых:
Фиг.1 - схематический чертеж для объяснения принципов;
Фиг.2 - схематический чертеж одного варианта осуществления биосенсора;
Фиг.3 - схематический чертеж другого варианта осуществления биосенсора; и
Фиг.4 - схематический чертеж дополнительного варианта осуществления биосенсора;
Фиг.5 - схематическая структурная схема еще одного дополнительного варианта осуществления изобретения;
Фиг.6 - схематическая структурная схема еще дополнительного варианта осуществления изобретения;
Фиг.7 - схематическая структурная схема еще дополнительного варианта осуществления изобретения;
Фиг.8 - схематическая структурная схема другого варианта осуществления изобретения;
Фиг.9 - схематическая структурная схема другого варианта осуществления изобретения;
Фиг.10 - схематическая структурная схема другого варианта осуществления изобретения;
Фиг.11 включает в себя две фотографии, показывающие изображение детектора с поляризационным фильтром, расположенным параллельно и перпендикулярно, соответственно, решетке, которая покрыта образцом маркированных молекул.
Подробное описание вариантов осуществления
Ниже будут описаны несколько вариантов осуществления изобретения со ссылками на чертежи. Эти варианты осуществления описаны в иллюстративных целях, чтобы позволить квалифицированному специалисту реализовать изобретение и описать лучший режим. Однако эти варианты осуществления не ограничивают изобретение. Более того, другие комбинации различных признаков возможны в рамках изобретения.
Биосенсор согласно вариантам осуществления, описанным ниже, может содержать исследуемый компонент, расположенный в отверстиях, образованных в материале, который непрозрачен, по меньшей мере, для одного из светов возбуждения и люминесценции, типичные примеры - алюминий, золото, серебро, хром, имеющих первое измерение в плоскости меньше предела дифракции света возбуждения в среде внутри отверстия и второе измерение в плоскости больше предела дифракции света возбуждения в среде внутри отверстия. Под размером в плоскости понимается размер в плоскости, параллельной подложке.
Исследуемый компонент может быть помещен в жидкость. Люминофор, присутствующий в жидкости, будет испускать электромагнитное излучение, когда подвергнется воздействию до энергии возбуждения. Испускаемое излучение собирается детектором.
Полная энергия испущенного излучения, то есть сумма энергий излучения отдельных люминофоров, испускаемого люминофорами, имеет предопределенную зависимость от свойства исследуемого компонента, как, например, пропорциональная зависимость от концентрации молекул исследуемого компонента. Анализируя испущенное излучение, свойства исследуемого компонента могут быть определены количественно и/или качественно.
Способ иммобилизации молекул исследуемого компонента в нижнем слое каждого отверстия будет описан ниже. Каждая молекула исследуемого компонента снабжена люминофором, таким как флуоресцентная метка. При возбуждении люминофора и улавливании испускаемого излучения обнаружение молекул исследуемого компонента может быть обеспечено. Обнаружение может быть качественным и/или количественным.
Лиганды или молекулы захвата могут быть расположены или иммобилизованы в конкретных частях отверстия, вышеуказанные лиганды формируют люминофоры при контакте с целевой молекулой исследуемого компонента. Такое формирование люминофоров может происходить различными способами, такими, как описано в статье: "Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул", S.Weiss, Science, том 283, стр. 1676-1683, техническое содержание которой здесь включено по ссылке. Лиганды могут иммобилизовать люминофоры так, что они испускают излучение из иммобилизованных позиций при возбуждении.
Лиганды могут быть иммобилизованы в канавках, расположенных в подложке рядом с основанием отверстий.
Люминофоры могут быть возбуждены для испускания излучения различными способами, как, например, электрической или химической энергией. Испускаемое излучение может происходить в различных физических процессах, таких как люминесценция, фосфоресценция, флуоресценция, Рамановское рассеяние, гипер-Рамановское рассеяние или гипер-Рэлеевское рассеяние и т.д. Испускаемое излучение может быть электромагнитным излучением, таким как свет, включающим в себя инфракрасный свет.
Будут рассмотрены люминофоры, возбужденные электромагнитным излучением, конкретно светом, включающим в себя ультрафиолетовый, видимый и инфракрасный свет, с длиной волны в соответствующей среде, по меньшей мере, в два раза большего размера, чем первое измерение в плоскости отверстия. Эффективная длина волны - это длина волны излучения в вакууме, деленная на показатель преломления среды.
Люминесцентное излучение, испускаемое люминофором, может быть обнаружено с любой стороны биосенсора. Если исследуемая жидкость присутствует на передней стороне, излучение может быть обнаружено на задней стороне подложки. Когда источник света направлен к подложке с ее задней стороны, R-поляризованный свет возбуждения создаст недолговечную область внутри отверстий, в то время как T-поляризованный свет возбуждения создаст распространяющуюся волну внутри отверстия. Такая недолговечная область может возбуждать люминофоры, присутствующие в отверстии на поверхности подложки. Недолговечная область будет экспоненциально распадаться в отверстии со стороны подложки отверстия. Таким образом, люминофоры, присутствующие близко к поверхности подложки отверстия, будут более эффективно возбуждены, чем люминофоры, присутствующие в или вне стороны исследуемого компонента отверстия. Свет возбуждения, который деполяризован или находится в других поляризационных состояниях, таких как круговая, эллиптическая или линейная поляризация света, которые являются линейной комбинацией R- и T-поляризованного света, может быть разложен на R- и T-поляризованный свет, что приведет к комбинации недолговечного и проходящего света возбуждения внутри отверстия.
У произведенного люминесцентного излучения вообще будет поляризационное состояние и с R-, и с T-компонентами поляризации. T-поляризационная часть люминесцентного света будет в целом передана отверстием, в то время как R-поляризационная компонента будет существенно подавлена отверстием.
Во многих применениях фоновое подавление примерно в 1000 раз было бы достаточным, но можно было бы использовать неполяризованный источник света, такой как светоизлучающий диод, СИД, который обычно менее дорог, чем лазер, и еще может предоставлять необходимую мощность возбуждения.
Фиг.1 описывает систему согласно первому варианту осуществления. Система содержит биосенсор на основе решетки, например, типа, описанного в WO 2007/072241.
Биосенсор 1 содержит несколько "проводов" 3, расположенных на прозрачной подложке 2. Подложка может быть сделана из стекла, кремния или другого подобного материала, такого как акриловое стекло, эпоксидная смола, поливинилхлорид (ПВХ), и т.д. Чтобы быть достаточно прозрачным, у материала должен быть показатель преломления с мнимой частью, меньше чем 10^-4. Провода можно сформировать из металла, такого как золото, алюминий, серебро, хром, и т.д., который гравирован или расплющен, чтобы получить желательную структуру, то есть множество отверстий 4. Формирование таких проводов и решетки известны специалистам, смотри, например WO 2006/136991.
Множество отверстий 4 сформировано между проводами 3. Отверстия имеют ограниченный дифракцией размер по первому измерению в плоскости. Это первое в плоскости измерение меньше чем половина эффективной длины волны излучения возбуждения. Если вода (n=1,3) присутствует в отверстии, и длина волны излучения возбуждения в вакууме 633 нм, эффективная длина волны составит 487 нм и первое в плоскости измерение отверстий, меньшее, чем половина эффективной длины волны, будет 243 нм. Первое в плоскости измерение может быть меньше чем 0,25 часть эффективной длины волны или 121 нм. Первое в плоскости измерение может быть меньше чем 0,2 часть эффективной длины волны или 97 нм. Первое в плоскости измерение может быть меньше чем 0,15 часть эффективной длины волны или 73 нм. Второе в плоскости отверстия измерение больше чем половина эффективной длины волны, как, по меньшей мере, 0,5 часть эффективной длины волны или, по крайней мере, 243 нм. Второе в плоскости измерение может быть в 10-100 раз больше эффективной длины волны, или от 4,9 до 49 мкм. Второе в плоскости измерение может быть от 100 до 1000 раз больше эффективной длины волны, или от 49 до 490 мкм. Второе в плоскости измерение может быть, по меньшей мере, в 1000 раз больше эффективной длины волны, или, по меньшей мере, 490 мкм.
Исследуемая жидкость 5 может быть введена в отверстия биосенсора. Исследуемый компонент может содержать целевые молекулы 7, обеспеченные метками люминофора или флуорофора 8, которые в состоянии испускать электромагнитное излучение после возбуждения.
Подложка 2 может быть снабжена молекулами захвата или лигандами 6, которые показывают сродство к целевым молекулам 7 и иммобилизованы на поверхности вышеуказанной подложки 2 в основании или на стороне подложки отверстия. Когда целевая молекула 7 приближается достаточно близко к лиганду 6, целевая молекула захватывается лигандом и формируется агрегат 9, содержащий лиганд 6, целевую молекулу 7 и флуорофор 8. Целевая молекула и метка, или присоединенный флуорофор, становятся иммобилизованными вблизи поверхности подложки отверстия 4.
Биосенсор 1 подвергается действию излучения возбуждения 10 от внешнего источника излучения, содержащего, например, свет с длиной волны приблизительно 700 нм. Излучение другой длины волны также может использоваться, такое как микроволны, инфракрасный свет, почти инфракрасный (NIR) свет, видимый свет, ультрафиолетовый свет, рентгеновское излучение и т.д.
В случае света с круговой поляризацией излучение возбуждения может быть разложено (примерно) на 50% T- и (примерно) на 50% R-поляризованное излучение. В результате (примерно) 50% излучения возбуждения в основном передается и другие (примерно) 50% излучения возбуждения создают недолговечную область в отверстии, которая распадается по экспоненте и в целом не передается. Существенное подавление света возбуждения для положений, далеких от поверхности образца решетки, поэтому требует, чтобы свет был существенно R-поляризованным.
Биосенсор может эксплуатироваться в режиме отражения. Биосенсор подвергается действию излучения возбуждения 10, направленного со стороны подложки отверстий.
Агрегат 9, содержащий флуорофор 8, иммобилизованный вблизи поверхности подложки, будет поглощать энергию возбуждения и испускать флуоресцентное излучение во всех направлениях, в зависимости от направления переходного дипольного момента, флуоресцирование более или менее выделено в некоторых направлениях, как обозначено стрелками 11a и 11b. Часть 11a испускаемого излучения направлена к детектору 12, расположенному ниже подложки 2, в то время как другая часть 11b направлена к стороне исследуемого компонента отверстия.
Даже когда используется должным образом поляризованный свет возбуждения, малая часть η света возбуждения (для типичного отверстия, описанного выше, переданная часть R-поляризованного света возбуждения составляет 1/1000 часть падающего R-поляризованного света возбуждения 10) передается отверстием. Эта переданная часть η может быть поглощена флуорофорами 8, присутствующими в жидкости 5 на стороне исследуемого компонента отверстия, и возбудить такие флуорофоры до испускания излучения, как обозначено стрелками 14a и 14b. У испускаемого излучения есть вообще компоненты и T-, и R-поляризации. Жидкость может содержать свободные целевые молекулы 7, снабженные флуорофорами 8, так же как и свободные флуорофоры 8. Часть излучения, обозначенного стрелками 14a, будет проходить через отверстие, а часть такого излучения, которая является T-поляризованной, будет, в отличие от компонентов с R-поляризацией, передана отверстием и породит нежелательное фоновое излучение.
Если большое количество внешних флуорофоров 8, которые не связаны с лигандами 6, присутствует в жидкости 5 на стороне исследуемого компонента отверстия, такое фоновое излучение будет большим. Такие внешние флуорофоры могут быть уменьшены промывкой, но промывка может быть невозможна, например, во время измерений в реальном времени.
Отмечено, что обычно наибольшая часть излучения 14a от флуорофоров, присутствующих в жидкости 5 на стороне исследуемого компонента, и проходящая через отверстие на стороне подложки, является T-поляризованным светом. Малая часть, которая составляет примерно 0,5*η, излучения 14a, проходящего через отверстие, является R-поляризованным светом.
Поляризационный фильтр 33 расположен перед детектором 12. Поляризационный фильтр имеет высокое подавление, которое равно или лучше чем подавление 1/η отверстия, как больше чем 10,000 для T-поляризованного света. Таким образом, большая часть излучения 14a от флуорофоров, находящихся в жидкости 6, будет заблокирована фильтром 33. Таким образом, фоновое излучение будет уменьшено с показателем между 0,5*η и η в зависимости от подавления фильтра 33, что является значительным уменьшением. Полезное излучение, или излучение 11a, которое необходимо обнаружить, будет также уменьшено, но только с меньшим коэффициентом. Таким образом, улучшение отношения сигнала к фону между 0,5/η и 1/η было получено с помощью фильтра 33.
Фильтр 33 может иметь коэффициент подавления, по меньшей мере, такой же, как вышеуказанный коэффициент подавления η решетки, но может иметь еще больший коэффициент подавления более чем примерно 10*η. Такие поляризационные фильтры коммерчески доступны, как Глан-лазерные поляризаторы с типичным коэффициентом подавления 100000.
Поляризационный фильтр 33 может быть решеткой, подобной биосенсору 1, в этом случае поляризационный фильтр 33 имеет то же самое подавление η, как решетка. В этом случае, подавление составит только 50% от теоретически максимально доступного улучшения.
Дополнительное уменьшение фонового излучения может быть получено при использовании R-поляризованного излучения возбуждения. В этом случае, излучение возбуждения будет подавлено при прохождении отверстия на вышеуказанный коэффициент подавления η, что означает, что фоновое излучение, достигающее детектора 12, будет уменьшено с коэффициентом от 0,5*η^2 до η^2 в зависимости от коэффициента подавления фильтра 33, то есть в случае, показанном выше с коэффициентом 500,000.
Тот же самый поляризационный фильтр 33 может использоваться как для излучения возбуждения, так и для блокировки фонового излучения к детектору, как показано пунктирными линиями 33a на Фиг.1.
Излучение возбуждения, отраженное от подложки 2 и решетки, может также достигать детектор, как и фоновое излучение. Такое фоновое излучение возбуждения может быть уменьшено различными мерами, такими как фильтры, пропускающие только флуоресцентное испускаемое излучение. Излучение возбуждения может также быть направлено к биосенсору под углом, так чтобы отраженное излучение не достигало бы детектора. В этом случае, рассеянное излучение возбуждения, направленное к детектору, может быть удалено фильтром 37 длины волны, который передает флуоресцентное излучение и блокирует излучение возбуждения.
Фиг.2 показывает вариант осуществления, содержащий подложку 2 из стекла, обеспеченного решеткой 3 из металла, такого как алюминий, золото, серебро, хром, и т.д. Решетка содержит отверстия в форме продольных разрезов, имеющих первое измерение в плоскости (ширина) меньше, чем ограниченная дифракцией ширина 270 нм, такое как 70 нм. Второе измерение в плоскости (длина) продольного разреза больше чем ограниченная дифракцией ширина, такое как 1 мм. Целевая молекула, имеющая флуорофор 20, иммобилизована/привязана на поверхности подложки отверстия и другой флуорофор 21 присутствует в жидкости 5, присутствующей на стороне исследуемого компонента отверстия.
Излучение возбуждения, такое как свет, имеющий длину волны в вакууме приблизительно 700 нм, обозначенное стрелками 10b, направлено из источника к дихроичному зеркалу 31. От дихроичного зеркала 31 излучение возбуждения проходит через вышеуказанный поляризационный фильтр 33 к линзе 32 для фокусирования поляризованного излучения возбуждения 10b к поверхности биосенсора.
Излучение возбуждения влияет на флуорофоры для испускания излучения. Испускаемое излучение 20a от флуорофора 20, присутствующего на стороне подложки отверстия, проходит через линзу 32 и через поляризационный фильтр 33, пропускающий только R-поляризованное излучение 20b. Пропущенное излучение 20b отражается дихроичным зеркалом 31 к линзе 34 и детектору 22.
R-поляризованное излучение возбуждения 10b на стороне подложки отверстия формирует недолговечную область внутри отверстий, распадающуюся по экспоненте. Излучение возбуждения будет подавлено с вышеуказанным коэффициентом подавления η и только малая часть излучения возбуждения достигнет флуорофора 21 на стороне исследуемого компонента отверстия. Флуорофор 21 испускает излучение 2la, которое проходит отверстие и достигает линзы 32 и поляризационного фильтра 33. T-поляризованный компонент 21b излучения от флуорофора 21 проходит отверстия, но будет заблокирован поляризационным фильтром 33. R-поляризованный компонент излучения от флуорофора 21, подавляемый при прохождении отверстия с вышеуказанным коэффициентом подавления η, проходит через линзу 32, поляризационный фильтр 33 и будет направлен дихроичным зеркалом 31 к линзе 34 и детектору 22. Таким образом, фоновое излучение от флуорофора 21 будет подавлено с коэффициентом η^2 по сравнению с ситуацией без поляризационного фильтра 33.
Поляризационный фильтр 33 может быть юстирован с решеткой при установке биосенсора, с помощью измерения уровня излучения возбуждения на стороне исследуемого компонента отверстия. Когда таким образом измеренный уровень излучения минимален, поляризационный фильтр 33 юстирован с решеткой, означая, что поляризационный фильтр пропускает только излучение с поляризацией, перпендикулярной к решетке.
С помощью вращения поляризационного фильтра уменьшение фона может быть сделано переменным. Это улучшает гибкость, так как ориентация внешнего поляризационного фильтра может вращаться, что позволяет не только подавлять фон, но также измерять фон и определять поляризационное состояние связанных флуорофоров.
Фиг.3 показывает другой вариант осуществления, в котором поляризационный фильтр 24 проходится только излучением, испускаемым флуорофорами. В этом случае, поляризационный фильтр 24 не должен быть прозрачным для излучения возбуждения, которое может быть важным для флуорофоров с большим стоксовским сдвигом, больше чем 100 нм. У излучения возбуждения может быть круговая поляризация. Альтернативно, возбуждение может быть линейно поляризованным излучением, тогда поляризация должна быть юстирована, как описано выше.
Фиг.4 показывает дополнительный вариант осуществления, в котором поляризационный фильтр 24 из варианта осуществления на Фиг.3 замещен поляризационным делителем луча 35. Поляризационный делитель луча 35 пропускает R-поляризованное излучение 20b к линзе 34 и детектору 22, при этом поляризационный делитель 35 луча направляет T-поляризованное излучение 20c и 21b ко второй линзе 36 и второму детектору 23. Таким образом, фоновый сигнал может быть оценен.
Фиг.5 показывает другой вариант осуществления биосенсора 1, который подвергается действию излучения возбуждения 10 от внешнего источника излучения, содержащего, например, ультрафиолетовый, видимый или инфракрасный свет. Источник излучения включен в устройство обнаружения 30, которое отделено от биосенсора 1, определенного выше.
В настоящем варианте осуществления используется неполяризованный источник света, такой как один или несколько СИД. Такой источник света может испускать излучение возбуждения большой мощности и намного более дешевый, чем лазерный источник.
Блок 40 источника света содержит один или несколько СИД 41, которые испускают излучение с длиной волны примерно 630 нм, линзу 42 и пропускающий фильтр 43 для пропускания света возбуждения и для удаления света, который накладывается на полосу излучения флуоресцентных меток и полосу пропускания эмиссионного фильтра 54. Таким образом, у фильтра может быть полоса пропускания, которая является обычно 20-30 нм шириной и пропускает свет 10, который накладывается на полосу поглощения или возбуждения флуоресцентных меток. Пример подходящего диапазона длины волны полосы пропускания для таких СИД составляет 620-650 нм; подходящий пропускающий фильтр - фильтр 3RD Миллениум 620-650, доступный от Omega Optical, Inc.
Свет направляется под углом к биосенсору со стороны подложки, и свет частично отражается решеткой, как показано лучом света 15. Таким образом, свет возбуждения в целом не достигает датчика 71. Только малая часть рассеянного света возбуждения направлена к датчику 71, как показано пунктирными линиями 16.
Блок 50 формирования изображения расположен в основном под прямым углом к биосенсору с задней его стороны. Блок 50 формирования изображения содержит первую линзу 51 и вторую линзу 52 для направления эмиссионного излучения 17 к детектору 71 через поляризатор 53 и один или несколько эмиссионных фильтров 54, которые пропускают эмиссионное излучение 17 и блокируют излучение возбуждения 16, если оно есть. Для флуоресцентных меток, таких как краска Атто-680 или краска Флюор 633, имеющих спектр испускания со спектральной шириной приблизительно 50 нм, сосредоточенных вокруг длины волны 700 нм и 650 нм, соответственно, подходящие длины волны пропускания для эмиссионных фильтров 54 имеют минимальную длину волны пропускания 660 нм или больше, как 695AF55 Излучатель XF3076 фильтр, доступный от Omega Optical, Inc, у которого минимальная длина волны пропускания 665 нм.
Детектор 71 может быть камерой, содержащей CCD или детектор CMOS. Дополнительные альтернативы появятся ниже.
В случае неполяризованного света излучение возбуждения может быть разложено на T- и R-поляризованное излучение. В результате примерно половина излучения возбуждения в целом проходит через решетку, и другая половина излучения возбуждения создает недолговечную область в отверстии, которая затухает по экспоненте и в целом не пропускается. Только малая часть R-поляризованного излучения пройдет через отверстие. Таким образом, решетка функционирует в целом как поляризационный фильтр.
Отношение между излучением, проходящим решетку, и излучением, подавляемым на решетке, называют коэффициентом подавления, и это обычно примерно 0,001 для R-поляризованного излучения для типичной решетки.
Излучение возбуждает флуоресцентные метки для испускания флуоресцентного излучения. Для множества флуорофоров метки могут испускать примерно 75% такой же поляризации, как поляризация излучения возбуждения.
Флуоресцентные метки 61, расположенные в отверстии рядом с поверхностью подложки, возбуждаются излучением возбуждения, имеющим T- и R-поляризацию, причем T обычно приблизительно равно R для неполяризованного света возбуждения. Полное излучение возбуждения - T+E, что составляет флуоресцентную эмиссию от меток. Эмиссия происходит во всех направлениях и предполагается, что 50% будет направлено к детектору.
Флуоресцентная метка 62, расположенная вне отверстия возле внешней стороны или стороны образца биосенсора, будет возбуждаться компонентом T света возбуждения, который проходит решетку, почти без подавления. Кроме того, R компонента света возбуждения будет подавляться с коэффициентом подавления n. Таким образом, компонент T и компонент R составят эмиссионное излучение. Эта эмиссия будет происходить во всех направлениях и предполагается, что 50% повторно пройдут через отверстие к детектору. Однако R компонента будет подавлена с коэффициент подавления n. Наконец, поляризационный фильтр уменьшит T компонент фактором N. Отношение между обнаруженной флюоресценцией, которая происходит от меток 61 и 62 после поляризационного фильтра:
(N+1)/[(N*3/4+n*1/4)+n*(n*3/4+N*1/4)]
Если предполагается, что N=n, тогда отношение будет 1/n, показывая, что первый вариант осуществления настоящего изобретения приводит к фоновому подавлению, сходному с коэффициентом подавления решетки. Если N<<n, отношение будет примерно 4/n. Типичный коэффициент подавления решетки n=0,001.
Поляризационный фильтр 53 может иметь коэффициент подавления N, по меньшей мере, тот же самый, как вышеуказанный коэффициент подавления решетки n, но может иметь меньший коэффициент подавления, примерно 0,1*n. Такие поляризационные фильтры коммерчески доступны, как Glan-лазерные поляризаторы с типичным коэффициентом подавления 10^-5.
Поляризационный фильтр 53 может быть решеткой, подобной решетке 1, в этом случае у поляризационного фильтра 53 такой же коэффициент подавления n, как у решетки.
Излучение возбуждения, рассеянное от подложки 2 и решетки, также достигает детектора как фоновое излучение. Такое фоновое излучение возбуждения уменьшается эмиссионным фильтром 54, который подавляет свет с длиной волны короче, чем длина волны испускания, и, таким образом, в целом блокирует свет возбуждения.
Вариант осуществления согласно Фиг.5 функционирует в режиме отражения, в котором источник света и детектор расположены с задней стороны биосенсора, а исследуемая жидкость находится на противоположной стороне проводов на подложке. Свет направлен к подложке под углом, большим, чем числовая апертура первой линзы 51, для отражения в другом направлении, чем направление к детектору.
Фиг.6 показывает другой вариант осуществления с решеткой, имеющей отверстия, подобные первому варианту осуществления, функционирующему в проходящем режиме, в котором источник света расположен с передней стороны биосенсора и детектор расположен на задней стороне биосенсора. Работа подобна варианту осуществления согласно Фиг.5.
Свет, испускаемый СИД 41, фокусируется линзой 42 и освещает отверстие, или множество отверстий решетки после прохождения фильтра пропускания 43. Свет возбуждения, имеющий T-поляризацию, проходит отверстие в целом без подавления, в то время как свет возбуждения, имеющий R-поляризацию, будет в целом заблокирован.
Свет возбуждения, проходящий через отверстие, будет по существу Т-поляризованным светом возбуждения, который в целом блокируется поляризационным фильтром 53. Любой T-поляризованный свет возбуждения, проходящий через поляризационный фильтр 53 и подавленный с коэффициентом подавления N, и любой R-поляризованный свет возбуждения, проходящий через решетку и подавленный с коэффициентом подавления n, будет заблокирован фильтром пропускания 54, который может содержать несколько фильтров каскадом, прежде чем достигнуть детектора 71.
Флуоресцентная метка 61, расположенная на поверхности подложки отверстия, возбуждается в целом только Т компонентом света возбуждения, а это означает, что она испускает примерно половину эмиссионного излучения по сравнению с первым вариантом осуществления на Фиг.5.
Фоновая метка 62, расположенная вне отверстия вблизи стороны образца отверстия, испускает эмиссионное излучение. Т компонента проходит и R компонента уменьшается с коэффициент подавления n.
Таким образом, отношение между испусканием метки 61 поверхности подложки и метки 62 стороны образца, достигающим детектора:
(N*3/4+1/4+n*3/4+N*n*1/4)/(N+n)
Если N=n и n<<1 (типичное значение для n=0,001), отношение будет примерно 1/(8*n). Если n<<1 и N<<n (случай поляризатора 53 с коэффициентом подавления, существенно меньшим, чем у решетки), отношение будет примерно 1/(4*n).
В другом варианте осуществления излучение возбуждения направлено к решетке главным образом параллельно подложке, как показано на Фиг.7. Дихроичное зеркало 91 расположено на пути света, например, света от СИД, и направляет свет перпендикулярно к подложке. Дихроичное зеркало разработано для отражения света возбуждения длиной волны 620-650 нм и пропускания эмиссионного света длиной волны больше чем 670 нм. Таким образом, эмиссионный фильтр 54 может быть убран, как показано на Фиг.7, но эмиссионный фильтр 54 может быть и оставлен, если дихроичное зеркало еще передает малую часть света возбуждения.
Поляризационный фильтр 53 может быть выполнен с решеткой при установке биосенсора, например, освещением решетки со стороны образца (то есть через жидкость впереди) и уменьшением мощности на детекторе 71. Когда таким образом измеряемая мощность минимальна, поляризационный фильтр 53 выровнен с решеткой, то есть, расположен перпендикулярно к решетке, означая, что поляризационный фильтр передает только излучение, имеющее R-поляризацию, перпендикулярную к плоскости передачи решетки.
С помощью вращения поляризационного фильтра уменьшение фона может быть сделано переменным. Это улучшает гибкость, так как ориентация внешнего поляризационного фильтра может вращаться, что позволяет не только подавлять фон, но также и измерять фон и определять поляризационное состояние связанных флуорофоров.
Фиг.8 описывает дополнительный вариант осуществления, в котором поляризационный фильтр 93 расположен в другом положении по сравнению с вариантом осуществления на Фиг.5, а именно, между блоком 50 формирования изображения и подложкой 2. В добавление, поляризационный фильтр 93 расположен между блоком 40 света и подложкой так, чтобы свет от СИД 41 проходил поляризационный фильтр 93 прежде, чем достигнуть подложки. Таким образом, свет возбуждения от СИД до подложки и эмиссионный свет от флуоресцентных меток проходит через тот же самый поляризационный фильтр 93. Поляризационный фильтр расположен в таком положении, что неполяризованный свет возбуждения проходит через поляризационный фильтр 93, который пропускает R-поляризованное излучение, но подавляет Т-поляризованное излучение с фактором N, который может быть от
10^-3 до 10^-6. Флуоресцентная метка 61, расположенная на поверхности подложки отверстия, и флуоресцентная метка 62, расположенная на стороне образца отверстия, испускают эмиссионное излучение. При прохождении обратно через отверстие, R компонент будет дополнительно подавлен с фактором n, и затем, при прохождении через поляризационный фильтр, Т компонент будет подавлен с фактором N. Отношение между эмиссионными излучениями от метки 61 и метки 62 после поляризационного фильтра:
(3/4+N*1/4)+(N*N*3/4+N*1/4)/(n*n*3/4+N*n*1/4)+(N*N*3/4+n*N*1/4)
Если N=n, отношение будет 3/(8*n*n). Если N<<n, отношение будет примерно 1/(n*n).
Поляризационный фильтр 93 выполнен с направлением поляризации перпендикулярно к направлению поляризации решетки. Если поляризационный фильтр 93 является решеткой, направление решетки фильтра должно быть перпендикулярным направлению используемой решетки.
Как показано на Фиг.9, поляризационный фильтр 53 из варианта осуществления на Фиг.7 может быть заменен на поляризационный делитель 92 луча. Поляризационный делитель 92 луча пропускает R-поляризованное излучение 18 к детектору 71, в то время как поляризационный делитель 92 луча направляет Т-поляризованное излучение 19 на второй детектор 94. Таким образом, фоновый сигнал может быть измерен. Поляризационный делитель 92 луча может заменить поляризационный фильтр 53 также в вариантах осуществления согласно Фиг.1 и 2.
Фиг.10 показывает дополнительный вариант осуществления, подобный показанным на Фиг.7 или Фиг.9, в котором поляризационный фильтр расположен в той же самом положении, как в варианте осуществления на Фиг.8, то есть близко к подложке. Таким образом, свет возбуждения от неполяризованного источника 41 света направлен к дихроичному зеркалу 91 и отражается к подложке через поляризационный фильтр 93, который пропускает в целом только R-поляризованное излучение. Излучение возбуждения приводит к флуоресцентному эмиссионному излучению от флуорофорной метки 61, которое проходит через поляризационный фильтр 93, дихроичное зеркало 91 к детектору 71, и от флуорофорной метки 62, которое проходит через отверстие, поляризационный фильтр 93, дихроичное зеркало 91 к детектору 71. Вычисление отношения между эмиссионными излучениями от флуоресцентных меток 61 и 62 является аналогичным варианту осуществления на Фиг.8.
В вышеупомянутых вариантах осуществления может использоваться биосенсор на основе решетки простой и дешевой конструкции, что означает доступность решетки.
Поляризационный фильтр расположен вне биосенсора и может использоваться несколько раз. Поляризационный фильтр расположен без контакта с исследуемым компонентом для анализа. Поляризационный фильтр всегда располагается между прозрачной подложкой и датчиком. Таким образом, могут использоваться более универсальные поляризационные фильтры, приводя к очень большому ослаблению фонового излучения без существенного увеличения общей стоимости анализа.
Различные элементы блока 40 источника света и блока 50 формирования изображения могут быть расположены в другом порядке, чем показано выше. Так, пропускающий фильтр 43 излучения возбуждения может быть расположен между источником 41 света и линзой 42. В варианте осуществления на Фиг.7 дихроичное зеркало может быть выполнено с возможностью осуществления операций пропускающего фильтра 43, который становится лишним и может быть удален. В блоке 50 формирования изображения порядок элементов может быть различным. Например, поляризационный фильтр может быть расположен в любом положении между подложкой и детектором 71.
Вариант осуществления согласно Фиг.5 использовался в тестовой среде, имеющей следующие свойства:
Чтобы продемонстрировать подавление фона, образцы с сотовой структурой маркированных белков были изготовлены посредством разбрызгивания разделителя SiO2 с шахматной структурой образца на решетку, сопровождаемого затем иммобилизацией белков, маркированных краской Флуор 633 на частях прозрачной подложки 2, который перекрывался отверстиями 4 и не покрывался разделителем. На передней части изготовленных образцов были присоединены толщиной 0,5 мм камеры гибридизации, наполненные раствором краской очень высокой концентрации, именно 4,5 микромолярный раствор, такой как краска атто-680, доступная от Atto-Tec GmbH. Эти образцы были использованы для снятия характеристик в устройстве, подобном устройству на Фиг.1, используя 4 красных СИДа, которые спектрально отфильтровали для ограничения длины волны возбуждения между 620-650 нм. Вращая ось передачи поляризатора, было возможно переключать объем обнаружения от в значительной степени недолговечного или приблизительного к в целом полной камере гибридизации.
Фиг.11 показывает измеренные изображения флюоресценции: слева, измеренные изображения флюоресценции для поляризатора, параллельного оси передачи решетки, и справа для поляризатора, ортогонального к оси передачи решетки. Объем обнаружения был ограничен в целом только маркированными белками на стороне подложки отверстия и малым недолговечном объемом красильного раствора краски высотой только 20-30 нм. Время интеграции для левого изображения примерно в 500 раз меньше, чем для правого изображения. Из Фиг.11 можно ясно заметить, что фон, произведенный флуоресцентной жидкостью на передней стороне решетки, может эффективно быть подавлен. Факт, что время интеграции для левого изображения примерно в 500 раз меньше, ясно демонстрирует, что возможно подавить фоновую флюоресценцию, которая значительно больше чем сигнал.
Кроме того, в варианте осуществления согласно Фиг.5, темное освещение решетки используется, где угол падения падающего света больше, чем угол, соответствующий числовой апертуре совокупности линз, используемой для отображения на детекторе. Таким путем, зеркально отраженный свет не отображается на детекторе.
Настоящие варианты осуществления имеют одно или несколько следующих преимуществ: критическая юстировка между поляризационной осью источника возбуждения и осью передачи решетка больше не требуется. В предыдущих вариантах осуществления поляризационная ось источника должна быть юстирована перпендикулярно оси передачи решетки для генерации безупречной недолговечной области в пространстве между проводами.
Лазеры обычно более дороги, чем неполяризованные источники. Для применений, таких как флюоресценция, полоса поглощения молекул метки весьма широка, и это допускает использование СИД. СИДы особенно привлекательны, потому что они предлагают схожие мощности как лазеры за существенно более низкую цену. Кроме того ожидается, что оптические мощности СИД значительно увеличатся в будущем.
Поляризационная чистота типичного лазера 100:1, в то время как типичное подавление решеток, используемых в биосенсорах на основе решетки, лучше, чем 1000. Это подразумевает, что каждый лазер требует специального поляризатора с подавлением, равным или лучше, чем подавление решетки.
Большая длина когерентности лазера подразумевает пятна и это ограничивает однородность освещения. В настоящих вариантах осуществления используется источник света, имеющий малую длину когерентности, такой как с шириной полосы больше чем 1 нм (пожалуйста, рассмотрите эту часть).
Варианты осуществления могут использоваться в различных применениях, таких как оптический биосенсор для измерения с высокой поверхностной спецификой, как требуется для измерения в высокофоновой среде, например химический анализ ДНК-гибридизации с высоким мультиплексным номером.
Варианты осуществления могут использоваться в качестве микроскопа, причем датчик 71 по существу может быть заменен глазом пользователя.
Хотя настоящее изобретение было описано выше в связи с конкретными вариантами осуществления, это не предназначено для ограничения конкретной формой, сформулированной здесь. Вместо этого, изобретение ограничено только в соответствии с сопутствующей формулой изобретения и другие варианты осуществления, отличные от конкретизированных выше, одинаково возможны в рамках этой приложенной формулы.
В формуле изобретения термин "содержит/содержащий" не исключает присутствия других элементов или этапов. Кроме того, хотя индивидуально перечислено, множество средств, элементов или этапов способа может быть осуществлено, например, одним блоком или процессором. Также, хотя индивидуальные признаки могут быть включены в различные пункты формулы, возможно, полезно их комбинировать, и включение в различные пункты формулы не подразумевает, что комбинация признаков невыполнима и/или невыгодна. Также, ссылки единственного числа не исключают множество. Цифры ссылок в формуле предоставлены исключительно как поясняющий пример и не должны рассматриваться как ограничение объема формулы изобретения в любом случае.