ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА ОСНОВЕ ПОРОШКОВОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
PREPARATION OF POLYFUNCTIONAL SULPHATED CELLULOSE POWDER DERIVATIVES EXHIBITING ANTICOAGULANT ACTIVITY

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективных средств профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты различной локализации).
3
-
Применяемый в нашей стране антикоагулянт прямого типа действия нефракционированный гепарин (НФГ) является полисахаридом с молекулярной массой 2-40 кДа, в среднем 15 кДа, и обладает рядом нежелательных побочных эффектов (остеопорозы, тромбоцитопении, повышение функциональной активности тромбоцитов, геморрагические осложнения). С целью разработки новых антикоагулянтных средств, лишенных побочных эффектов гепаринов, получают сульфатированные полисахариды (СП) растительного происхождения (выделенные из водорослей, лишайников, грибов, высших растений), а также выделенные из тканей морских беспозвоночных, членистоногих или млекопитающих [Mayer A.M.S., Rodriguez A.D., Berlinck R.G.S., et al. Marine pharmacology in 2003-4: marine compounds with anthelminthic, antibacterial, anticoagulant, antifungal, antiinflammatory, antimalarial, antiplatelet, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the cardiovascular, immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action. // Comp Biochem Physiol С Toxicol Pharmacol. - 2007, N.4. Vol.145. - P.553-581; Yoona S.J., Yub M.A., Pyunb Y.R., et al. The nontoxic mushroom Auricularia auricula contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated by antithrombin // Thrombosis Research. - 2003. Vol.112. P.151-158; Shen W.Z., Zhou R.F., Wang X.F., Ding Q.L., Wang H.L. Antithrombotic mechanisms of holothurian glycosaminoglycan extracted from sea cucumber Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. // 2006. - N.9. - Vol.27. P.579-83; Jayakumar R., Nwe N., Tokura S., Tamura H. Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials // International Journal of Biological Macromolecules. - 2007. - N.40. P.175-181]. Для придания молекулам полисахаридов необходимых свойств их деполимеризуют [Noti С., Seeberger P. Chemical approaches to define the structure-activity relationship of heparin-like glycosaminoglycans. // Chemistry & Biology. - 2005. - V.12. N 7. P.731-756], в них встраивают функциональные группы [Yang J., Du Y., Huang R., et al. The structure - anticoagulant activity relationships of sulfated lacquer polysaccharide. Effect of carboxyl group and position of sulfation // International Journal of Biological Macromolecules. - 2005. N.36. - P.9-15], объединяют (конъюгируют) с молекулами других полисахаридов [Du J., Zhang S., Sun R., Zhang L. Novel polyelectrolyte carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles for drug delivery. I. Physicochemical characterization of the carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles. // Biopolymers. - 2005. - V.78, N 1. P.1-8]. Структура макромолекулы полисахарида играет важную роль при проявлении антикоагулянтной активности (АА). Так, под действием модифицированного аргинином хитозана (конъюгат хитозан - аргинин) происходят конформационные изменения молекулы тромбина [Liu W.G., Zhang J.R., Cao Z.O., Xu F.Y., Yao К.D. A chitosan-arginine conjugate as a novel anticoagulation biomaterial. // J. Mater Sci Mater Med. - 2004. N11. Vol.15. - P.1199-203]. Введение функциональных групп для получения химически модифицированного N-propanoyl-, N-hexanoyl-сульфата хитозана, и сульфата хитозана, содержащего кватернизованные атомы азота, приводит к увеличению АА [Huang R., Du Y., Yang J., Fan L. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate. // Carbohydr Res. - 2003. N.6. - Vol.14, - P.483-489]. При изменении положительного заряда поверхности полимерного биоматериала на основе хитозана с боковыми цепями из полиэтиленгликоля и гексанала на нейтральный или отрицательный при введении SO  групп, снижается адгезия тромбоцитов и возрастает биосовместимость с кровью, которая положительно коррелирует с содержанием полиэтиленгликоля внутри полимера [de Vasconcelos С.L., Bezerril P.M., dos Santos D.E.S., Dantas T.N.С. Effect of molecular weight and ionic strength on the formation of polyelectrolyte complexes based on poly(methacrylic acid) and chitosan. // Biomacromolecules. - 2006. N.7. - P.1245-1252].
Препятствиями для широкого внедрения антикоагулянтов на основе полисахаридов микробного и животного происхождения или их модификаций являются либо их малодоступность, дороговизна, сложности, связанные с последующей химической модификацией и очисткой целевого соединения, либо недостаточная биологическая совместимость.
Большей части указанных недостатков лишены полисахариды растительного происхождения и, прежде всего, целлюлоза - доступные и биосовместимые, они представляют собой прекрасную основу для создания новых антикоагулянтных средств. Поскольку сульфаты целлюлозы являются полусинтетическими аналогами распространенных в природе сульфатированных полисахаридов, а синтез сульфатированных производных целлюлозы экономически оправдан, активно разрабатываются методы их получения, исследуются их свойства.
Известны работы, посвященные исследованию производных целлюлозы в качестве антикоагулянтов крови [Dedgumjorn А.С., Toyoda H., Woo E. Effect of (1→3)-and (1→4)-linkages of fully sulfated polysaccharides on the ir anticoagulant activity // Carbohydrate Research V.337. - 2002. P.925-933]. Отмечено, что наиболее перспективны в этом отношении производные, содержащие сильные электроотрицательные группы - сульфатные, сульфонатные, фосфатные, что предполагает механизм действия, связанный с кооперативным электростатическим комплексообразованием между белковыми телами крови и производным целлюлозы.
Для введения в структуру целлюлозы сульфатных групп используют различные методы: этерификацию целлюлозы серной кислотой и ее смесями с алифатическими спиртами [Петропавловский Г.А., Крунчак М.М. Сернокислые эфиры целлюлозы (сульфатцеллюлоза) // ЖПХ. - 1967. -Т.38. - №10. - С.2209-2220], сульфатирование серным ангидридом в присутствии пиридина, N,N-диметилформамида (ДМФА) и других органических оснований; реакции переэтерификации ацетатов и формиатов целлюлозы триоксидом серы или хлорсульфоновой кислотой в гомогенной среде органического растворителя [Fhilipp В., Wagenknecht W., Nehls I. Untersuhungen zur sulfatirung von celluloseformiat im vergleich zu cellulose acetat unter homogen reaktionbedingungen // Cellulose chem. and tech. -1990. - 24. - P.667-678]. Описан метод гомогенного сульфатирования целлюлозы в среде N,N-диметилформамида, который состоит в обработке набухшей в этом растворителе целлюлозы газообразным оксидом азота (V) и в последующей обработке полученного гомогенного раствора газообразным оксидом серы (IV). После выделения и очистки получают сульфаты целлюлозы с высокой степенью замещения [Schuldt U., Wagenknecht W., Richter A. Electrosorption of sodium cellulose sulfates with different substitution patterns // Cellulose. - 2002. - №9. - P.271-282].
Для использования в качестве антикоагулянтов крови значительный интерес представляют также смешанные эфиры целлюлозы, содержащие помимо сульфатной группы дополнительные функциональные группы (ацетатную, карбоксильную, аминную и другие). Способы получения таких производных, как правило, включают несколько стадий [Miyamoto К., Shimizu P., Tokita M. Adhesion of 3-carboxymethyl-cellulose-6-sulfate to extra domain A-containing fibronectin: development of ligands for cryogel removal // J. Artif. Organs - 2002. - V.5. P.132-135; Baumann H. Exclusive and complete introduction of aminogroups and thier N-sulfo and N-carboxymethyl groups into the 6-position cellulose with out the use of protecting groups // Carbohydrate Research. - 2002. N.337. - P.1297-1307].
3
Исходным материалом для синтеза сульфатов целлюлозы тем или иным способом с дополнительными заместителями или без служат различные структурные модификации целлюлозы - хлопковая волокнистая целлюлоза со степенью полимеризации от 800 и выше [Richter A., Klemm D. Regioselective sulfation of trimethylsilyl cellulose using different SO-complexes // Cellulose. - 2003. N.10. - P.133-138], а в последнее время также микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) [Ardisone S., Dioguardi F.S., Mussini Т., et al. Microcrystalline cellulose powders: structure, surface feature sand water sorption capability // Cellulose. - 1999. - N 6. - P.57-69] и прочие порошковые формы целлюлозы (ПЦ), получаемые из целлюлозы хлопка, древесины или другого сырья тем или иным способом.
Задачей настоящего изобретения является получение эффективных средств профилактики и лечения тромботических состояний на основе порошковых форм целлюлозы, выделенной из различного сырья растительного происхождения.
S
Технический результат состоит в том, что в структуру целлюлозной макромолекулы вводятся сульфатные группы, либо сульфатные группы совместно с карбоксиметильными, либо амидоэтильными, либо фосфатными группами в различном соотношении, но со степенью замещения по сульфатным группам (CЗ) не менее 1.0, в этом и состоит технический результат.
Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования целлюлозного материала, согласно изобретению в качестве такового используются порошковые формы целлюлозы со степенью полимеризации от 250 и ниже, выделенные из растительного сырья, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру
,
3
-
где заместитель Х=Н, -SO , при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.
Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат карбоксиметилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, согласно изобретению перед реакцией сульфатирования натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают моногидратом n-толуолсульфокислоты в эквимолярном соотношении карбоксиметильная группа - n-толуолсульфокислота в безводном N,N-диметилформамиде, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру
,
3-
2
-
где заместитель X=Н, -SO, CHCOO, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.
Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат амидоэтилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, согласно изобретению перед реакцией сульфатирования проводят активацию цианоэтилцеллюлозы в растворе N,N-диметилформамида, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру
,
3
2
2
2
где заместитель Х=Н, -SO, CHCHCONH, при этом сульфатирование осуществляют в растворе N,N-диметилформамида.
Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат фосфата целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозного сырья, согласно изобретению реакционная смесь включает от 2 до 8 моль воды на моль целлюлозы, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру
,
3
2
2
где заместитель X=Н, -SO, PO(ONa) либо RO-PO(ONa), где R - целлюлоза, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.
3
3
Ближайшим к заявляемому способу получения сульфатированных полисахаридов с указанной степенью замещения или выше является способ, предложенный для синтеза трисульфатов курдлана [Yoshida Т., Yasuda Y., Mimura T. Synthesis of curdlan sulfates having inhibityory effects in vitro against AIDS viruses HIV-1 and HIV-2 // Carb. Res. - 1995. V.276, - P.425-436]. По этому способу готовят сульфатирующую смесь прибавлением ClSOH (33.2 моль) к сухому пиридину (80 см). После чего вносят курдлан (3.1 моль). Реакционную смесь термостатируют при 100°С в течение часа. Затем охлаждают и прибавляли избыток 10%-ного NaOH. Полисахарид осаждают ацетоном, выделяют и очищают методом диализа.
3
3
В отличие от описанного способа, для получения сульфатов порошковой целлюлозы (СЦ) нами предлагаются следующие условия проведения реакции: порошковую целлюлозу диспергируют в сухом пиридине и термостатируют при 100°С в течение часа для активации полимера. Затем к реакционной смеси при охлаждении до 0-5°С прибавляют 1-6 моль ClSOH в расчете на моль элементарного звена целлюлозы в зависимости от желаемой степени сульфатирования получаемой СЦ. Также нами предлагается использовать меньший избыток пиридина (40-60 см на 1.0 г целлюлозы, в зависимости от вида ПЦ). Наконец, предлагается использовать следующий температурный режим проведения реакции: 100°С в течение первого часа, затем 1 ч при 90°С и в течение последнего часа - 80°С.
s
Известно несколько методов получения сульфатов карбоксиметлцеллюлозы (СКМЦ) (СКМЦ). В работе [Miyamoto К., Shimizu P., Tokita M. Adhesion of 3-carboxymethyl-cellulose-6-sulfate to extra domain A-containing fibronectin: development of ligands for cryogel removal // J. Artif. Organs -2002.- V.5. P. 132-135] описан метод получения СКМЦ исходя из СЦ. По нему, карбоксиметилирование СЦ, синтезированного тем или иным способом, осуществляют монохлоруксусной кислотой в среде воды и изо-пропилового спирта в присутствии гидроксида натрия, при температуре 60°С. Недостатком этого метода является затруднения в карбоксиметилировании СЦ с большой степенью сульфатированияя, т.к. с увеличением СЗ в препаратах СЦ, при последующем карбоксиметилировании нарастают процессы взаимоотталкивания одноименно заряженных сульфатных и монохлорацетатных групп. Среди других недостатков метода следует отметить процессы отщепления сульфатных групп, возможные в условиях такого алкилирования СЦ.
Способ одновременного введения сульфатной и карбоксиметильной группы в структуру целлюлозы предложен авторами работы [Тимохин И.М., Прокофьева М.В. и др. Получение и свойства некоторых смешанных эфиров целлюлозы // Химия и технология производных целлюлозы. Владимир, 1971, с.223-227]. Для этого предлагается использовать обработку целлюлозы смесью монохлоруксусной и фторсульфоновой кислот в присутствии щелочи. Реакция осуществляется в водной среде. По этому способу получены препараты СКМЦ со степенью замещения по сульфатным группам до 0.7, по карбоксиметильным группам до 0.9. Однако недостатком метода является дороговизна и токсичность фторсульфоновой кислоты.
3
3
Ближайший к заявляемому способ получения СКМЦ предложен авторами работы [Vogt S., Heinze T. Preparation of carboxymethylcellulose sulfate of high degree of substitution // Carbohydrate Research. 1995. V.266. P.315-320]. По нему сульфатированию КМЦ предшествует стадия активации, которая состоит в обработке КМЦ-Na безводной n-толуолсульфоновой кислотой в N,N-диметилацетамиде в течение 30 минут при 60°С. В результате чего реакционная смесь гомогенизируется. Далее вносят сульфатирующий агент - SO, или ClSOH. Реакцию ведут в гомогенном растворе при комнатной температуре в течение часа.
Недостатками этого способа являются использование дорогой и неудобной в обращении безводной n-толуолсульфоновой кислоты, а также процессы деструкции целлюлозных макроцепей в присутствии сульфатирующих агентов и образующихся продуктов реакции.
3
В отличие от описанного способа, нами предлагается использовать вместо безводной n-толуолсульфоновой кислоты ее более доступный, дешевый и удобный в обращении моногидрат.Отличительной особенностью предлагаемого способа также является замена N,N-диметилацетамида на N,N-диметилформамид, что позволяет осуществить гомогенную этерификацию в более мягких условиях, значительно снижая тем самым процессы деструкции, т.к. сульфатирующим агентом в этом случае служит комплекс N,N-диметилформамид - ClSOH, образующимся in situ. Существенно и то, что N,N-диметилформамид является доступным, недорогим растворителем.
CN
s
Сульфаты целлюлозы, содержащие в структуре макромолекулы дополнительно амидные группы - сульфат амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ) были впервые получены нами сульфатированием цианэтилцеллюлозы и последующим мягким омылением CN-групп. Для сульфатирования использовали препараты цианэтилцеллюлозы, полученные обычными методами. Высокое сродство препаратов цианэтилцеллюлозы к органическим растворителям позволяет осуществлять сульфатирование в ДМФА при гомогенном составе реакционной среды. Раствор препарата цианэтилцеллюлозы со CЗ=0.36 в ДМФА может быть получен после перемешивания и кратковременного нагревания. Сульфатирование осуществляли хлорсульфоновой кислотой при комнатной температуре. Через час обработки был получен сульфат цианэтилцелюлозы со CЗ=0.79. Увеличение продолжительности реакции до 2-3 ч приводит к препаратам со степенью замещения около 1.30. Непосредственно после окончания реакции выделяли полупродукт - сульфат цианэтилцеллюлозы, омылением CN-групп которой получали САЭЦ. Омыление цианэтиловых групп осуществляли в щелочной среде (рН=10) в присутствии пероксида водорода. При такой обработке цианэтильные группы количественно омылялись до амидных и, частично, до карбоксиэтильных. По данным потенциометрического титрования, содержание карбоксиэтильных групп в препаратах САЭЦ не превышает 5-10% от количества цианэтильных групп.
Получение смешанного эфира целлюлозы, содержащего одновременно сульфатные и фосфатные группы, - сульфата фосфата целлюлозы (СФЦ) осуществляли по разработанному нами одностадийному методу. По структуре и свойствам СФЦ является аналогом известных водорастворимых ионогенных эфиров целлюлозы, содержащих сильные электроотрицательные группы (сульфатные, сульфонатные, фосфатные), например сульфатов или фосфатов целлюлозы.
Ближайшим соединением аналогичного с СФЦ функционального состава является сульфатированный фосформаннан, получение которого описано в работе [Yu G., Gunay N.S., Linhardt R.J. et al. Preparation and anticoagulant activity of the phosphosulfomannan PI-88 // European Journal of Medicinal Chemistry - 2002. V.37. P.783-791]. Авторами произведено сульфатирование экзополисахарида микробиологического происхождения PI-88, содержащего фосфатные группы. Полученные препараты фосфорсульфоманнана содержат одновременно сульфатные и фосфатные группы и обладают высокой антикоагулянтной активностью.
Ближайшими способом этерификации целлюлозы с целью получения сульфатированных эфиров целлюлозы, содержащих дополнительные (ацетатные) группы, является метод, предложенный в патенте [Пат. Евраз. РСТ/ЕР2006/060626]. По данному методу целлюлозу этерифицируют смесью, включающей хлорсульфоновую кислоту и ангидрид (или хлорангидрид) уксусной кислоты в безводном N,N-диметилформамиде (ДМФА). Исходная гетерогенная реакционная смесь гомогенизируется в процессе реакции. После выделения и очистки получают препараты со степенью замещения по сульфатным группам до 1.0.
Ближайший метод-аналог фосфорилирования целлюлозы описан авторами [Петропавловский Г.А., Котельникова Н.Е. Дегидратация и фосфорилирование целлюлозы оксидом фосфора (5) в среде диметилформамида // Cellulose chemistry and technology 1985. - N.19. P.591-600]. По этому методу хлопковую микрокристаллическую целлюлозу обрабатывают раствором оксида фосфора (V) в безводном ДМФА при 70°С. Получают не растворимый в воде фосфат целлюлозы с содержанием фосфора до 7% в виде преимущественно дву- и трехзамещенных фосфатных групп.
2
5
Принципиальным отличием предлагаемого метода от сходных методов сульфатирования целлюлозы в гомогенных условиях в среде N,N-диметилформамида является получение в результате этерификации сульфата целлюлозы, содержащего дополнительные (фосфатные) группы, а также обязательная добавка воды в процессе приготовления этерифицирующей смеси. Отличием предлагаемого метода от метода фосфорилирования раствором РО в ДМФА, кроме прочего, является получение водорастворимого продукта с низким содержанием двух- и трехзамещенных фосфатных групп. К достоинствам метода относится также возможность получения полифункционального производного целлюлозы в одну стадию.
2
5
Нами предлагается способ одностадийного получения СФЦ, состоящий в следующем. Посредством одностадийной этерификации порошковой или волокнистой целлюлозы раствором оксида фосфора (V) и хлорсульфоновой кислоты (в различных мольных соотношениях) в N,N-диметилформамиде с содержанием воды 2 моль на 1 моль РО при температуре 30-70°С и продолжительности реакции 1-3 ч.
Получение СЦ
Пример 1. Сульфат целлюлозы (СЦ)
3
3
+
Образец порошковой целлюлозы (1.00 г; 6.17 ммоль), высушенный до постоянной массы при 103°С, суспендировали в пиридине при 0°С. Охлаждая и интенсивно перемешивая реакционную смесь, в нее по каплям вносили хлорсульфоновую кислоту (1-4 моль в пересчете на моль ангидроглюкозных единиц). После термостатирования в течение 1 ч при 100°С реакцию продолжали в течение 1 ч при 90°С и затем 1 ч при 80°С. Продукт отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали 20 см ацетона и растворяли в 50 см 4%-ного NaOH. Образовавшуюся натриевую соль сульфата целлюлозы (СЦ-Na) осаждали 100 см этанола, промывали водно-этанольной смесью от неорганических солей и сушили в вакууме [Du J., Zhang S., Sun R., Zhang L. Novel polyelectrolyte carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles for drug delivery. I. Physicochemical characterization of the carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles. // Biopolymers. - 2005. - V.78, N 1. P.1-8].
-1
-1
-
-1
13
3
1
6
6
2
3
ИК спектр: 1240 см (полоса средней интенсивности, асимметричные колебания S=O); в области 810 см (интенсивная полоса поглощения, валентные колебания -C-SO ); широкая полоса в области 3400 см (колебания связи -ОН). ЯМР С спектр: химические сдвиги 102.2, 73.71, 76.1, 79.6, 77.4 и 60.1 м.д. (C-С). Сигнал 66.4 м.д. (C-6S), для высокозамещенных образцов СЦ все -ОН группы при С замещены. Химические сдвиги 81.5 и 77.1 м.д. указывают на сульфатирование по С и С атому соответственно.
Пример 2. Сульфат карбоксиметилцеллюлозы (СКМЦ)
3
3
+
Высушенный до постоянной массы образец КМЦ-Na (1.0 г) суспендировали в 10 смДМФА. При интенсивном перемешивании и охлаждении до 5°С добавляли безводную n-толуолсульфоновую кислоту (1.0-2.0 моль в пересчете на моль карбоксильной группы полимера) и термостатировали 0.5 ч при 60°С. Затем колбу с сильно набухшим полимером охлаждали до 0°С, добавляли по каплям хлорсульфоновую кислоту (2.0 моль в пересчете на моль мономерного звена) и термостатировали от 3 до 5 ч. Для выделения полимера к охлажденной реакционной смеси прибавляли 20 см безводного ацетона. Осадок отфильтровывали, обрабатывали водным раствором гидроксида натрия. Из полученного раствора этанолом осаждали СКМЦ-Na, полимер отделяли, промывали водно-этанольной смесью для очистки от неорганических солей и сушили в вакууме при 60°С.
+
-1
-
-1
-1
13
СОО
SO2
SO
2
6
5
4
3
2
1
2
2
6
ИК-спектр СКМЦ-Na: 1626 см (υ ), 1240 см (υ), 814 см (υ). ЯМР-С спектр (в DO): химические сдвиги 61.6 (С), 75.3 (С), 79.8 (С), 76.1 (С), 74.7 (С), 102.8 (C), 179.3 (-СН-СООН), 71.8 (СН при С), 72.8 и 68.1 (C-2S и C-6S).
Пример 3. Сульфат цианоэтилцэллюлозы (СЦЭЦ) и амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ)
CN
2
2
3
3
3
+
3
Для сульфатирования цианэтилцеллюлозы (CЗ=0.36) 1.0 г образца растворяли в 10 см ДМФА и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Колбу с сильно набухшим и частично растворившимся полимером охлаждали до 0°С, по каплям прибавляли хлорсульфоновую кислоту (2.0 моль в пересчете моль мономерного звена) и термостатировали при 20°С. По окончании реакции, охлаждая и перемешивая, реакционную смесь нейтрализовали насыщенным раствором ацетата натрия в этаноле. Осажденный полупродукт отделяли на фильтре, растворяли в 20 см раствора 3%-ного НО при рН=10. Гидролиз нитрильных групп проводили в течение суток при комнатной температуре, после чего полимер осаждали этанолом (100 см), отделяли на стеклянном фильтре и очищали диализом на целлофановых мембранах. Полученную Na-соль САЭЦ осаждали этанолом (150 см), отделяли, промывали водно-этанольной смесью, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60°С.
+
-1
-1
-1
CONH
SO2
SO
ИК спектр САЭЦ-Na 1626 см (υ «амид 1»), 1240 см (υ), 814 см (υ).
13
2
6
3
2
1
2
4
2
2
2
2
ЯМР С спектр (в DO): сигнал для С отсутствует; 74.3 (С), 73.5 (С), 103.8-102.2 (С); δ178.5 (-CH-CONH); 36.9 и 37.5 (αСН и βСН при CONH), 83.8 и 68.6 (C-2S и С-6S). В области 70-73 м.д. может также находится сигнал C-3S.
+
Пример 4. Сульфат фосфата целлюлозы (СФЦ-Na)
3
3
3
3
2
5
3
1.00 г коммерческой микрокристаллической целлюлозы или ПЦ, полученной кислотно-катализируемым гидролизом волокнистой целлюлозы, выделенной из хлопка или древесины, суспендировали в 10 см сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см ДМФА с содержанием 1.2% мас. воды растворяли 0.88 г РО при охлаждении. К полученной смеси по каплям прибавляли 1.43 г ClSOH, обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0-5°С. Раствор оставляли на 5-6 ч, после чего вносили к набухшей целлюлозе, реакционную массу перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50°С. По истечении этого строка, гомогенную реакционную смесь диспергировали в 250 см холодного ацетона. Осадок отфильтровывали, диспергировали в 100 см холодной воды и нейтрализовали 4%-ным NaOH по фенолфталеину. Полученный раствор диализовали на целлофановых мембранах против дистиллированной воды (до отрицательной реакции на сульфат-ионы); полимер осаждали этанолом и сушили в вакууме при 60°С.
Получали водорастворимый смешанный эфир целлюлозы с содержанием фосфора 6.0% и серы 9.0%, представляющий собой порошок белого цвета.
Пример 5.
3
3
2
5
3
К 1.00 г порошковой целлюлозы (полученной частичным кислотным гидролизом волокон беленой целлюлозы лиственных пород древесины) прибавляли 30 см сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см ДМФА с содержанием 1.2% мас. воды растворяли 0.88 г РО при охлаждении. К полученной смеси по каплям прибавляли 1.43 г ClSOH, обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0-5°С. Полученный раствор оставляли на 5-6 ч, после чего вносили к набухшей целлюлозе, реакционную массу перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50°С. Дальнейшую обработку вели, как в примере 1.
Получали водорастворимый смешанный эфир целлюлозы с содержанием фосфора 8,0% и серы 9.6%, представляющий собой порошок белого цвета.
+
-1
-1
-1
-1
13
31
+
SO
SO2
P=O
2
S
S
P
POC
2
ИК спектр СФЦ-Na 814 см (υ), 1240 см (υ); в области 1250-1235 см также возможно поглощение фосфатных групп (υ для групп, включенных и не включенных в водородную связь). Полоса в области 1640 см может быть соотнесена с валентными колебаниями связи Р=О, -ОН, кроме того, в этой области поглощает сорбированная вода. ЯМР С спектр (в DO): сигналы для С6 и С2 отсутствуют; 74.7 (С3), 103.6-101.7 (С1); 83.4 и 67.8 (C2 и C6). В области 81-83 м.д. может также находиться сигнал С3. Сигналы ядер углерода C1, C2, С3 дополнительно расщеплены на дуплеты в результате спин-спинового взаимодействия с фосфором (J=4.0-6.0 Гц). ЯМР Р спектр СФЦ-Na (в DO,):δ 2,4.
Влияние модифицированных образцов целлюлозы СЦ, СКМЦ, САЭЦ и СФЦ (Табл. 1-4) на изменение времени свертывания плазмы крови человека исследовали в коагулологических тестах активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам" (влияние на активность фактора Ха) [Колмен Р.У. Нарушения реакций образования тромбина. М., Медицина, 1988, с.175-208]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIa, aIIa) и антифактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 5-го Международного стандарта нефракционированного гепарина (NIBSC).
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 6.
3
3
3
2
К смеси 0.06 см плазмы и 0.06 см аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли растворы модифицированной целлюлозы в конечных концентрациях 0.01-2.50 мкг/см. Через 3 мин инкубации добавляли 0.05 мл 0.025 М раствора CaCl и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов. В таблице 5 показаны специфические антитромбиновые активности исследованных образцов модифицированной целлюлозы.
Пример 7.
3
3
3
3
2
К смеси 0.025 см плазмы и 0.05 см раствора смеси фактора Ха (НПО "Ренам") и фосфолипидов добавляли растворы модифицированной целлюлозы в конечных концентрациях 0.0022-2.6700 мкг/ см. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0.05 см0.035 М раствора CaCl и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов. В таблице 5 показаны специфические анти-Ха активности исследованных образцов модифицированной целлюлозы.
Образцы модифицированной целлюлозы демонстрировали антитромбиновую активность от 2.8 до 118.5 ЕД/мг. Активность против фактора Ха составила 0.14-32.9 ЕД/мг. Особенно перспективными антикоагулянтами являются образцы СЦ 4, СЦ 5, СЦ 6, которые показывали антитромбиновую активность более 70 ЕД/мг. Образцы СФЦ отличаются тем, что демонстрируют отношение активностей aXa/aIIa более 2. У используемых в настоящее время в клинической практике прямых антикоагулянтов - низкомолекулярных гепаринов - отношение активностей aXa/aIIa составляет 1.5-3.5 [Kishimoto T.K., Viswanathan К., Ganguly T., Elankumaran S., et al. Contaminated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system // N. Engl. J Med. - 2008. N.358. Vol.23. - P.2457-2467].
13
2
Контроль чистоты исходных веществ и анализ продуктов реакции осуществляли с использованием следующих методов: ИК спектры записывали на спектрометре "Prestige-21", в таблетках KBr. Спектры ЯМР С полученных веществ записывали на спектрометре "Bruker DRX-300" (300 МГц) в DO. Элементный анализ образцов (определение серы) в сульфатированных производных целлюлозы осуществляли на приборе ЕА-1110 фирмы «СЕ instruments».
Таблица 1
Условия и результаты сульфатирования ПЦ
Образец
Исходный препарат
Сульфатирующий агент
Растворитель
Мольное соотношение<sup>а</sup>
Температура, °С
Время реакции, ч
CЗ<sub>S</sub>
СЦ1
МКЦ
SO<sub>3</sub>/Pyr
Пиридин
3
50
3
0.24
СЦ2
МКЦ
SO<sub>3</sub>/Pyr
Пиридин
3
б
3
0.74
СЦ3
МКЦ
SO<sub>3</sub>/Pyr
Пиридин
3
в
3
1.28
СЦ4
ПЦ
SO<sub>3</sub>/Pyr
Пиридин
2
в
3
1.30
СЦ5
ПЦ
SO<sub>3</sub>/Pyr
Пиридин
3
в
3
1.63
СЦ6
ПЦ
SO<sub>3</sub>/Pyr
Пиридин
4
в
3
2.95
а - ангидроглюкозная единица: сульфатирующий агент, моль/моль; б - 1 ч 90°С, 2 ч 80°С; в - 1 ч 100°С, 1 ч 90°С, 1 ч 80°С
Таблица 2
Условия и результаты сульфатирования КМЦ
Образец
СЗ<sub>СООН</sub>
Экв. ClSO<sub>3</sub>H на мономерное звено КМЦ
CЗ<sub>S</sub>
СКМЦ 1
0.97
2
0.48
СКМЦ 2
0.97
2
1.01
СКМЦ 3
0.97
3
1.50
СКМЦ 4
1.53
2
0.60
Таблица 3
Условия и результаты сульфатирования цианэтилцеллюллозы<sup>а</sup>
Образец
CЗ<sub>CN</sub>
Продолжительность реакции, мин
CЗ<sub>S</sub>
САЭЦ-1
0.14
60
0.75
САЭЦ-2
0.14
120
0.83
САЭЦ-3
0.14
180
0.87
САЭЦ-4
0.36
60
0.79
САЭЦ-5
0.36
120
1.29
САЭЦ-5
0.36
180
1.37
а - 2 моль ClSO<sub>3</sub>H на ангидроглюкозную единицу
б - Определение методом ГПХ, средняя молекулярная масса основной фракции, элюент 0.15 M NaCl
Таблица 4
Результаты этерификации целлюлозы смесью Р<sub>2</sub>О<sub>5</sub> - ClSO<sub>2</sub>OH - ДМФА-вода
Образец
Исходный материал
Соотношение ClSO<sub>3</sub>H:P<sub>2</sub>O<sub>5</sub>, моль/моль
Содержание S, %
Содержание Р, %
Выход Na-соли (% к массе целлюлозы)
СФЦ 1
МКЦ
2
9.0
6.0
152
СФЦ 2
ПЦ
2
9.6
8.0
140
СФЦ 3
ПЦ
2
10.0
7.5
н/о
СФЦ 4
МКЦ
3
11.1
7.0
142
СФЦ 5
ПЦ
3
12.6
8.8
164
Таблица 5
Специфические антикоагулянтные активности образцов модифицированной целлюлозы
Шифр образца
Анти-IIa, ЕД/мг
Анти-Ха, ЕД/мг
aXa/aIIa
СЦ 3
27.8±6.2
7.5±3.0
0.27
СЦ 4
118.5±6.9
23.3±2.1
0.20
СЦ 5
77.9±5.5
20.3±1.9
0.26
СЦ 6
86.5±5.2
32.9±3.7
0.38
СКМЦ 2
4.1±0.7
0.43±0.09
0.10
САЭЦ 4
6.0±1.8
0.14±0.07
0.02
САЭЦ 6
22.2±4.1
3.4±0.5
0.15
СФЦ 1
4.5±1.9
19.6±1.6
4.38
СФЦ 3
5.6±2.1
11.9±1.1
2.12
СФЦ 4
12.6±3.4
9.6±0.9
0.76
СФЦ 5
2.8±1.8
31±17
11.0