Использование 3,4,5-триметокси-N'(2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-4-илиден)бензогидразида гидрохлорида в качестве анксиолитического средства
USE OF 3,4,5-TRIMETHOXY-N'(2,2,6,6-TETRAMETHYL-PIPERIDIN-4-YLIDENE)BENZOHYDRAZIDE HYDROCHLORIDE AS AN ANXIOLYTIC AGENT

Изобретение относится к области новых свойств биологически активного соединения, относящееся к группе 2,2,6,6-тетраметил-пиперидона:
(I): 3,4,5-триметокси-N`(2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-4-илиден)бензогидразид гидрохлорид
Технический результат: выявлен анксиолитический эффект соединения (I), который может применяться в медицине.
Одним из перспективных направлений развития психофармакологии является разработка и изучение соединений, избирательно воздействующих на обратный захват серотонина (5-НТ). В то же время, ряд авторов отмечает недостаточную клиническую эффективность известных модуляторов 5-НТ рецепторов и блокаторов обратного захвата 5-НТ (D.J. Nutt, CNS Spectr., 10, 49-56, 2005). Более того, установлено, что уменьшение содержания 5-НТ в структурах мозга вызывает снижение степени тревожности (J.D. Olivier, C.H. Vinkers, B. Olivier, Front. Pharmacol, 4, 74, 2013) тогда как использование селективных ингибиторов обратного захвата серотонина в качестве анксиолитических средств приводит к обратному эффекту, т.е. к возрастанию уровня 5-НТ (7. J. Kent, S. Mathew, J. Gorman, Biol. Psychiat, 52, 1008-1030, 2002).
Еще с конца 50-х годов XX века значительный интерес привлекает группа производных пиперидина, представители которых обладают как нейролептической (группа бутирофенонов, в первую очередь, галоперидол), так и другими видами психотропной активности, в т.ч. антидепрессивной (ипрониазид, ниаламид и др.). Не ослабевает интерес к поиску новых соединений с антидепрессантными и анксиолитическими свойствами среди веществ данной группы и в настоящее время (J. Kent, S. Mathew, J. Gorman, Biol. Psychiat, 52, 1008-1030, 2002). Так, обнаружено противотревожное действие у веществ группы ацетамидов пиперидина (C.P. Kordik, С. Luo, M. Gutherman, Bioorg. Med. Chem. Lett., 16(11), 3065-3072, 2006). Сходными эффектами обладают и производные фенциклидина (1-(1-фенилциклогексил)пиперидин, РСР) 6. R.Hajikhani, A. Ahmadi, N. Naderi, Adv. Clin. Exp. Med., 21(3), 307-312, 2012).
Среди соединений  анксиолитического профиля, наиболее широко используемых для терапии тревожных расстройств, значительный интерес представляет производное имидазола афобазол, разработанный в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» и использованный в наших экспериментах в качестве препарата сравнения (С.Б. Середенин, М.В. Воронин, Экспер. и клин, фармакол, 72 (1), 3-10, 2009).
Впервые соединение I было синтезировано в Болгарии в 1974 году. Было показано, что это вещество обладает вазодилатирующим эффектом, что было продемонстрировано на изолированном сердце кролика, а также проявляет слабое кратковременное гипотензивное и спазмолитическое и сильное центральное никотинолитическое и анальгезирующее действие. (Trudove na Nauchnoizsledovatelskiya Khimikofarmatsevtichen Institut, Vol. 9, 19-26, 1974).
Несмотря на то, что соединение I было синтезировано достаточно давно, изучения его возможных нейрофармакологических эффектов до настоящего времени не проводилось. В связи с этим, представляется актуальным и важным выявление и изучение нейропсихотропного спектра действия этого вещества.
Фармакологическое изучение заявляемых соединений.
Для оценки анксиолитического эффекта заявляемых соединений были использованы базисные сертифицированные методики, рекомендуемые Фармакологическим комитетом МЗ РФ для исследования веществ, обладающих анксиолитическим действием (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению веществ с фармакологической активностью». М., Гриф и К, 2012, С. 255).
Для всех примеров эксперименты проводились на белых беспородных мышах-самцах массой 20-25 г., содержавшихся в условиях лабораторного вивария при 12-ти часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму. Для исключения влияния суточных биоритмов на скорость биосинтеза и метаболизма нейромедиаторов, эксперименты проводили между 10 и 12 часами дня. Эксперименты проводились в соответствии с этическими правилами гуманного обращения с животными, утвержденными этической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».
Животным опытных групп однократно внутрибрюшинно вводили соединение I в дозах 5, 10, 20 и 40 мг/кг и препарат сравнения - афобазол в дозе 5 мг/кг. Афобазол и соединение I растворяли в физиологическом растворе. Мышам контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор из расчета 0,4 мл/20 г массы тела. Регистрацию эффектов осуществляли через 60 минут после введения препаратов.
Пример 1. Анксиолитическое действие соединения I в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринта (Таблица 1).
Для оценки анксиолитического действия применялась стандартная методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ), основанная на возникновении у животного стресса и страха при реализации ориентировочно-исследовательского поведения и норкового рефлекса в сложных условиях (новизна обстановки, страх высоты и освещенность) (S. Pellow, P. Chopin, S.E. File, M. Briley et al., J. Neurosci. Meth., 14 (3), 149-167, 1985).
Крестообразный лабиринт расположен на высоте 50 см от пола и состоит из двух открытых (не имеющих стенок) (ОР) и двух закрытых (имеющих стенки высотой 20 см) рукавов (ЗР), расположенных под углом 90°, а также центральной площадки (ЦП) размерами 5×5 см. Мышь помещали на центральную площадку ПКЛ головой к открытому рукаву. В течение 5 мин регистрировали время пребывания в OP, ЗР, число заходов (пересечение границы рукава четырьмя лапами) в ОР и ЗР. Заход в рукава ПКЛ засчитывали в том случае, когда животное пересекало границу рукава четырьмя лапами. Чем активнее мыши выходят в ОР лабиринта, тем меньше степень их тревожности. Каждая доза вещества была изучена на 10-ти животных. В виду того, что эксперимент проводился трижды в разные дни, для каждого дня учитывался свой контроль (контроль 1, контроль 2, контроль 3). Статистическую обработку полученных результатов и достоверность различий определяли с помощью критерия Стьюдента. Вычисляли средние величины количества заходов и времени пребывания в отсеках для каждой группы и стандартные отклонения (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, М.А. Яркова, М.В. Воронин, Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, Москва (2012), 264-275).
Установлено, что соединение I в дозах 10 и 20 мг/кг обладало выраженной анксиолитической активностью, что выражалось в значительном возрастании длительности пребывания животных в открытых рукавах ПКЛ и увеличении числа заходов в них (Таблица 1). По эффективности соединение I в дозе 10 мг/кг превосходило афобазол в дозе 5 мг/кг.
Пример 2. Антикомпульсивный эффект соединения I в тесте закапывания шариков (Фигура 1).
Методика закапывания шариков (marble burying test) используется для изучения антикомпульсивного действия веществ и основана на инстинкте грызунов избавляться от инородных предметов в убежище посредством их закапывания в подстилку, что является аналогом проявления обсессивно-компульсивного синдрома у человека (C.L. Broekkamp, H.W. Rijk, D. Joly-Gelouin, Eur. J. Pharmacol., 126 (3), 223-229, 1986). Соединение I и афобазол были изучены в дозах 10 и 5 мг/кг соответственно на 9-ти животных.
В тесте использовалось 6 клеток размерами 17×28 см и высотой 12 см. Перед посадкой мыши в клетку на слой плотно утрамбованных опилок толщиной 5 см выкладывалось 9 пластиковых шариков диаметром 1,5 см. Животное помещалось в один из углов и клетка накрывалась решеткой. Через 30 минут подсчитывалось количество закопанных шариков. Шарик считался закопанным при погружении на 2/3 своего объема в опилки. При статистической обработке данных вычисляли среднее количество закопанных шариков для каждой группы животных, их процентное отношение к общему числу шариков и стандартные отклонения. Достоверность различий между группами определяли с помощью точного критерия Фишера.
В тесте закапывания шариков установлено, что животные контрольной группы закапывают 61% от общего количества шариков. Мыши, которым вводили афобазол в дозе 5 мг/кг, закапывают 38% от общего количества шариков, а грызуны, получавшие соединение I в дозе 10 мг/кг - 32%.
Таким образом, соединение I в дозе 10 мг/кг обладает антикомпульсивным действием и по эффективности превосходит афобазол в дозе 5 мг/кг.
Пример 3. Изучение острой токсичности и возможных побочных эффектов соединений.
Острая токсичность соединения I при внутрибрюшинном однократном введении в дозе 200 мг/кг оценивалась в опытах на беспородных мышах-самцах массой 20-25 г. (Е.В. Арзамасцев, И.В. Березовская, Т.А. Гуськова и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, Москва (2012), 13-25.). Оценка общего состояния, поведения и гибели животных проводилась через 1 ч, 24 ч, 4 сут, 10 сут и 14 сут после введения соединений. Степень нарушения координации движений оценивали по способности животных удерживаться на вращающемся стержне Rota Rod. Животных помещали на горизонтальный стержень диаметром 2,5 см, вращающийся с постоянной скоростью 10 оборотов в минуту. Регистрировали время удерживания животных на вращающемся стержне (максимально в течение 300 с).
При изучении возможных побочных эффектов соединения I в дозе 200 мг/кг (т.е. в 20 раз превышающей терапевтическую (10 мг/кг)) было показано, что данное вещество не вызывает развития побочных эффектов и признаков неврологического дефицита как через 1 ч, так и в более отдаленные сроки (24 ч, 4 сут, 10 сут и 14 сут) после введения соединений. Соединение I в дозе 200 мг/кг не нарушает координации движений животных (100% мышей удерживаются на вращающемся стержне в течение 5 минут).
Пример 4. Изучение нейрохимических эффектов соединения.
На следующем этапе исследований было проведено изучение эффектов соединения I на нейрохимический профиль структур мозга (Таблица 2, Таблица 3). Опыты проведены на 20 беспородных мышах массой тела 20-24 г. (питомник РАМН "Столбовая"), содержавшихся в условиях лабораторного вивария при 12-ти часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму.
Вещества вводились однократно внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за 1 час до декапитации животных. Мышам контрольной группы вводили изотонический раствор 0,9% NaCl. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 животных.
Животных декапитировали при помощи гильотины, после чего структуры мозга (фронтальная кора (ФК), гипоталамус, стриатум и гиппокамп) извлекались на льду, замораживались в жидком азоте и взвешивались. Перед экспериментами по определению содержания нейротрансмиттеров пробы размельчали в гомогенизаторе Поттера (тефлон-стекло) в 1 мл 0,1 н HCIO4 с добавлением 3,4-диоксибензиламина (0,5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Содержание моноаминов и их метаболитов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (ВAS, США) с аналитической колонкой ReproSil-Pur ODS (C18, 100×4 мм, 3 мкм) (Dr.Maisch, Германия), при скорости элюции подвижной фазы 1,0 мл/мин и давлении до 200 атм. Мобильная фаза состояла из: 0.1 М цитратно-фосфатного буфера, содержащего 1.1 mM октансульфоновой кислоты, 0.1 mM ЭДТА и 9% ацетонитрила (pH 3.0). Измерение проводили с помощью электрохимического детектора LC-4B (ВAS США) на двойном стеклоугольном электроде (+0.85 V)против электрода сравнения Ag/AgCl. Регистрация образцов проводилась с применением аппаратно-програмного комплекса МУЛЬТИХРОМ 1,5 (АМПЕРСЕНД). Все использовавшиеся для анализа реактивы были высокой степени чистоты: о.с.ч., х.ч. или analytical grade.
Обработку полученных данных проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента в программе Excel 2003. Подсчитывались средние значения и стандартные ошибки среднего (M±s.e.m.). Различия между экспериментальными группами считались статистически достоверными при p<0,05; на уровне тенденции - при 0,05<p<0,1.
Было обнаружено, что вещество вызывало значительный рост величины комплексных показателей во фронтальной коре, характеризующих скорость превращения дофамина (ДА) в его метаболиты диоксифенилуксусную (ДОФУК) и гомованилиновую (ГВК) кислоты, ДОФУК/ДА и ГВК/ДА - до 170 и 233% соответственно. Достоверных эффектов изучаемого вещества на тонус серотонинергической системы выявлено не было.
Таким образом, соединение I в дозе 10 мг/кг обладает выраженной анксиолитической и антикомпульсивной активностью, не вызывая при этом неврологического дефицита и превосходит афобазол в дозе 5 мг/кг по эффективности.
Описание чертежа.
Фигура 1. Антикомпульсивный эффект соединения I в сравнении с афобазолом в тесте закапывания шариков.
По оси OX (абсцисс) - экспериментальные группы: 1 столбец - контроль, 2 столбец - аофбазол 5 мг/кг, 3 столбец - соединение I 10 мг/кг
По оси ОУ (ординат) - количество зарытых шариков в процентах по отношению к общему числу шариков
* - достоверность различий по сравнению с контролем при p<0,05 (сравнение двух выборочных долей вариант)