Способ использования мезенхимальных стволовых клеток для улучшения состояния рубца на матке
METHOD OF USING MESENCHYMAL STEM CELLS FOR IMPROVING UTERINE SCAR CONDITION

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, фармакологии и может быть использовано при создании клеточного продукта, используемых в тканевой инженерии при пластике или замещении дефектов тканей организма с обеспечением стимуляции их регенерации.
В настоящее время в связи с увеличивающимся объемом разработок клеточных препаратов, особое значение приобретает разработка скаффолдов (матриц) для клеточных культур, которая будет обеспечивать фиксацию клеток в месте нанесения, и создавать благоприятные условия для клеточной адгезии, транспортировки питательных веществ, кислорода, и продуктов обмена.
Определенными условиями для матрицы является ее биосовместимость и замещение регенерирующими тканями, которые будут сохранять функциональную структуру требуемой ткани и нетоксичность.
Известно много различных видов матриц, которые пытаются использовать в клеточной трансплантологии. Они подразделяются на матрицы с использованием фрагментов биологических тканей и синтетические скаффолды (Ларионов П.М., Терещенко В.П., Кирилова И.А. МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ МАТРИЦ-НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ТКАНЕВЫХ ЭКВИВАЛЕНТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ // Успехи современного естествознания. - 2015. - №9-1. - С. 117-121; Uemura Т., Dong Y., Wang Y. et al. Transplantation of cultured bone cells using combinations of scaffolds and culture techniques. Biomaterials 2003; 24: 2277-86; Фомина Г.А., Масгутов Р.Ф., Штырлин В.Г. и др. Гидрогелевый матрикс на основе биосовместимых карбомеров для восполнения дефектов нервной ткани. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; II (4): 63-7; Бухарова Т.Б., Антонов Е.Н., Попов В.К. и др. Биосовместимость тканеинженерных конструкций на основе пористых полилактидных носителей, полученных методом селективного лазерного спекания, и мультипотентных стромальных клеток костного мозга; Клеточные технологии в биологии и медицине 2010; 1: 40-6; Мелихова B.C., Сабурина И.Н., Орлов А.А. и др. Моделирование функционального остеогенеза с использованием биодеградируемого матрикса и аутогенных стромальных клеток подкожной жировой ткани. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; IV (1): 59-68; Бармашева А.А., Шарутина И.А., Николаенко Н.С. и др. Культивирование стромальных клеток костного мозга крысы на коллагене I типа разного происхождения. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; IV (4): 41-7; КОЛЛАГЕН-ХИТОЗАНОВАЯ МАТРИЦА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В КЛЕТКИ НЕЙРОНАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ. МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ // Фундаментальные исследования. - 2012. - №1. - С. 18-23; Волков А.В. Краткий обзор коммерчески доступных клеточных продуктов для восстановления кожных покровов. Гены и клетки. - 2006; 1 (4): 62-65).
4
Рассасывающиеся силикагели известны из уровня техники. Так, например, в немецкой заявке на патент DE 19609551 С1 (C08L 83/00; D01D 5/00; D01F 9/08; D01F 9/20) описаны биологически расщепляющиеся и рассасывающиеся волокна. Подобные волокна могут быть изготовлены с помощью зольгель технологии, в соответствии с которой из прядильной массы вытягивают нити, при необходимости подвергаемые последующей сушке. Прядильная масса содержит одно или несколько частично или полностью гидролитически конденсированных соединений кремния, образующихся в результате гидролитической конденсации мономеров общей формулы SiX. Недостаток предлагаемых в цитируемой заявке волокон состоит в том, что их испытание на цитотоксичность при расщеплении, осуществляемом непосредственно по завершении процесса прядения, не приводит к оптимальным результатам, в связи с чем указанные волокна следует считать в определенной степени цитотоксичными. Подобная токсичность волокон, проявляющаяся при их применении в медицине или медицинской технике, например, в сфере заживления ран, как правило, является нежелательной. Кроме того, предлагаемый в цитируемой заявке способ изготовления волокон страдает недостатком, состоящим в том, что смесь, образующаяся на стадии гидролитической конденсации после удаления растворителя, является многофазной, и для удаления твердого вещества приходится осуществлять ее фильтрование. Помимо этого вследствие образования твердой фазы и необходимости фильтрования теряют значительную часть пригодного для прядения золя. В соответствии с предлагаемым в цитируемой заявке способом не удается также надежно предотвращать происходящее во время созревания образование довольно значительного количества твердой фазы, прежде всего гелеобразование. Подобное образование твердой фазы обусловливает дополнительное сокращение количества пригодной для прядения зольмассы.
Основной недостаток натуральных матриц является непредсказуемая резорбция и нежелательная защитная реакция макрофагов, что существенно замедляет образование новой ткани. Также аллогенные и ксеногенные трансплантаты несут с собой иммунологический и инфекционный риск.
Недостатком синтетических матриц чаще всего является их плохая биосовместимость, токсичность и отсутствие питательной среды для культуры помещенных на нее клеток.
Целью нашего изобретения является создание более эффективного способа использования мезенхимальных стволовых клеток для улучшения состояния рубца на матке за счет использования матрицы с клеточной культурой, которая будет представлять собой синтетический комплекс со свойствами биологически совместимой матрицы. Скаффолд будет отвечать необходимым условиям, а именно, отсутствие токсичности, возможность адгезии, пролиферации и дифференцировки помещенных клеток и резорбция обычными биологическими путями.
6
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе использования мезенхимальных стволовых клеток для улучшения состояния рубца на матке мезенхимальные стволовые клетки, полученные из периваскулярного пространства пупочного канатика человека, перед применением наносят на матрицу на основе геля из натрия карбоксиметилцеллюлозы и гиалуроновой кислоты конечной концентрации 1,5*10/мл, и затем матрицу размещают в области рубца в дозе 300 тыс. клеток в 250 мкл раствора-носителя.
В качестве клеточной культуры были взяты мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из периваскулярного пространства пупочного канатика человека. Данный вид клеток является оптимальным клеточным источником, ввиду своих свойств. Это плюрипотентность и способность дифференцироваться в клетки мезенхимального ряда, а так же видимый иммунофенотипический профиль МСК, позволяющий избегать отторжения иммунной системой хозяина.
В качестве скоффолда был взят гидрогель на основе натрия карбоксиметилцеллюлозы и гиалуроната натрия.
Натрий карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) является анионным водорастворимым полимером, полученным из целлюлозы и обладает следующими функциями и свойствами: действует в качестве связующего вещества, стабилизатора, защитного коллоида и вещества, контролирующего реологию или поток. Вещество физиологически инертно и является анионным полиэлектролитом. Растворы всех типов КМЦ демонстрируют псевдопластичные свойства.
Гиалуронат натрия - это полисахарид, состоящий из дисахаридных повторяющихся цепей. Является производным от глюкозамина несульфированного, который входит в состав эпителиальной, соединительной и нервной ткани и является главным элементом матрикса клетки.
Он создает физиологическую среду для деления и дифференциации клеток, участвует в создание оптимальных условий для нормального клеточного и тканевого гомеостаза, обеспечивает выведение продуктов жизнедеятельности, транспортировку питательных веществ.
Также гиалуронат натрия обладает следующими свойствами: участвует в синтезе коллагена и эластина, выполняет пластическую функцию, способствует понижению показателей эндогенной интоксикации, способствует предотвращению образования рубцовой ткани и равномерному заполнению дефектов новообразовавшейся тканью.
Изобретение поясняется фиг. 1 и 2. На фиг. 1 показана область рубца группы, где МСК вводились на растворе NaCl 0,9% (физиологический раствор).
На рисунке А мы видим выраженное преобладание соединительной ткани (1) над мышечной тканью (2). Отмечается слабая инвазия миоцитов в область рубца. Большинство сосудов (3) (рисунок В) тонкие, с несостоятельной стенкой. Пласты мышечной ткани (рисунок С) разделены грубыми, толстыми соединительнотканными септами (4).
На фиг. 2 показано состояние области рубца после введения в нее МСК на гелевой матрице, что позволило им воздействовать именно в месте нанесения. На рисунке D, мы видим преобладание мышечной ткани (2) над соединительной (1). Область характеризуется высокой степенью инвазии миоцитов. Много толстых сосудов (3) (рисунок Е) с полноценной мышечной стенкой. Соединительнотканные септы (4) тонкие (рисунок F).
Заявляемая матрица была апробирована на 40 лабораторных самках альбиноса серых крыс породы Wistar, массой тела 200-230 г.
6
Для введения животным использовали мезенхимные стволовые клетки периваскулярного пространства пупочного канатика человека. Образцы (фрагмент пуповины 5-10 см) использовали в экспериментах только после получения подписанного информированного согласия родителей ребенка. Клетки выделяли согласно методике, описанной ранее, в условиях сертифицированного чистого помещения с соблюдением процедур контроля качества - подтверждением кариотипа, иммунофенотипа, отсутствия инфекций, генетической идентификацией методом STR-типирования (Айзенштадт и др., 2018 - 2018 Характеристики мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика человека при длительном культивировании in vitro. Айзенштадт А.А., Сказина М.А., Котелевская Е.А., Елсукова Л.В., Золина Т.Л., Пономарцев Н.В., Галактионов Н.К., Галембо И.А., Иволгин Д.А., Масленникова И.И., Енукашвили Н.И. Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, том 10, №1, с. 11-19; 2017 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ИЗ ПЕРИВАСКУЛЯРНОГО ПРОСТРАНСТВА ВЕНЫ ПУПОЧНОГО КАНАТИКА Авторы: Багаева В.В., Айзенштадт А.А., Александрова Л.В., Енукашвили Н.И., Адылов Ш.Ф., Золина Т.Л., Урусова М.Е. патент РФ №2620981). Клетки культивировали без использования материалов животного происхождения. В день эксперимента клетки снимали с подложки, обрабатывая раствором трипсина (0,25%) с добавлением ЭДТА до 0,02%, затем отмывали от остатков трипсина и ресуспендировали в физиологическом растворе или в геле из натрия карбоксиметилцеллюлозы и гиалуроновой кислоты конечной концентрации 1,5*10/мл. Каждому животному вводили 300 тыс. клеток в 250 мкл раствора-носителя
Модель: травма неизмененной мышцы матки, нанесенная скальпелем. После в шов на левом роге матки у 20 крыс вводилась культура МСК на физиологическом растворе, другим 20 животным в шов на матке инъецировались МСК на основе геля с натрием гиалуроната и натрием карбоксиметилцеллюлозы, рана на правом роге матки во всех 40 случаях дополнительному воздействию не подвергалась и являлась контрольной для дальнейшего сравнения сформированных рубцов. Выведение из эксперимента проводилось на 14-е сутки после операции.
На фиг. 1, рисунок А, мы видим выраженное преобладание соединительной ткани (1) над мышечной тканью (2). Отмечается слабая инвазия миоцитов в область рубца. Большинство сосудов (3) (рисунок В) тонкие, с несостоятельной стенкой. Пласты мышечной ткани (рисунок С) разделены грубыми, толстыми соединительнотканными септами (4).
На фиг. 2 показано состояние области рубца после введения в нее МСК на гелевой матрице, что позволило им воздействовать именно в месте нанесения. На рисунке D, мы видим преобладание мышечной ткани (2) над соединительной (1). Область характеризуется высокой степенью инвазии миоцитов. Много толстых сосудов (3) (рисунок Е) с полноценной мышечной стенкой. Соединительнотканные септы (4) тонкие (рисунок F).
Оценка результатов исследования проводилась с помощью разработанной шкалы гистологических изменений, которая оценивала степень восстановления поврежденных миоцитов, а именно, учитывала соотношение мышечной и соединительной ткани в области рубца, толщину фиброзных септ, степень инвазии миоцитов в область рубца, количество сосудов, а также толщину сосудистой стенки и калибр сосудов.
Сравнительная характеристика матриц, на которую были нанесены МСК, показала большую эффективность воздействия клеточной культуры при использовании геля на основе натрия гиалуроната и натрия карбоксиметилцеллюлозы. Предположительно это связано с более плотной структурой и адгезивными свойствами геля, который позволил клеткам воздействовать именно в той области, на которую они были нанесены.