Рассасывающиеся имплантируемые устройства на основе сшитых гликозаминогликанов и способ их получения
ABSORBABLE IMPLANTED DEVICES BASED ON CROSS-LINKED GLYCOSAMINOGLYCANS, AND THEIR PRODUCTION METHOD

Изобретение относится к способу получения гидрогелей, состоящих из сшитых гибридных кооперативных комплексов гликозаминогликанов. Также изобретение относится к полученным с помощью указанного способа имплантируемым устройствам, которые характеризуются высокой стойкостью к гиалуронидазам и оптимальными реологическими свойствами, которые остаются стабильными во времени. Устройства по изобретению могут быть составлены в монофазной и/или бифазной комбинациях, опционально, в сочетании с местным анестетиком.
Уровень техники
Благодаря их реологическим свойствам, а также свойствам в отношении биологической совместимости и биоразлагаемости, гликозаминогликаны, особенно гиалуроновую кислоту и ее соли, используют в различных медико-биологических областях, таких как, например, офтальмология, ортопедия - для восстановления функциональных свойств синовиальной жидкости, а также дерматокосметология и эстетическая и регенеративная медицина, для составления интрадермальных филлеров.
Физиологические и физико-химические свойства гиалуроновой кислоты связаны с ее молекулярной массой. Полимерные цепи с достаточно высокой массой, такие как полимерные цепи, присутствующие в синовиальной жидкости, обладают высокой вязкостью, что формирует основу их ударопоглощающей способности и смазывающих свойств. Нежелательное снижение молекулярной массы, например, в результате фрагментации полимерных цепей в случае ферментативного расщепления специфичными ферментами (гиалуронидазами) приводит к потере характерных свойств гиалуроновой кислоты.
Для этой цели был разработан ряд полусинтетических производных, полученных сшивкой цепей гиалуроновой кислоты. Сшитые производные являются более стойкими к ферментативному расщеплению. Способы сшивки гиалуроновой кислоты описаны в WO 2010/015900, ЕР 2236529, ЕР 1303542 и US 7741476.
Гибридные кооперативные комплексы, полученные путем нагревания водных растворов гликозаминогликанов с низкой и высокой молекулярной массой при 80-160°С, были описаны в WO 2012032151. Указанные комплексы, характеризующиеся низкой вязкостью и постоянными реологическими свойствами, были использованы в качестве активных ингредиентов офтальмологических композиций (WO 2017016873).
Описание изобретения
Теперь был обнаружен способ сшивки гибридных кооперативных комплексов гликозаминогликанов, который позволяет получать имплантируемые гидрогели, характеризующиеся высокой вязкостью в состоянии покоя (что обеспечивает превосходную фиксацию в месте нанесения, без нежелательного распространения в ткани) и низкой вязкостью при введении, что, следовательно, приводит к легкой экструдируемости и лучшей способности к обработке.
Гидрогели, полученные способом по изобретению, отличаются высокими значениями модуля упругости G', в диапазоне от 200 Па до 500 Па, и величинами упругой деформации, в диапазоне от 75% до 95%, а также превосходными механическими свойствами, превосходными свойствами в отношении набухания, хорошим сроком службы и повышенной стойкостью к ферментативному расщеплению, особенно в отношении действия гиалуронидаз.
Действительно, является неожиданным, что при сшивке упомянутых гибридных комплексов (в противоположность гиалуроновой кислоте или линейным гликозаминогликанам), модуль упругости G' конечного гидрогеля значительно выше, чем модуль упругости, полученный с помощью стандартных реакций, описанных в литературе, в которых используют гиалуроновую кислоту (ГК), или смеси гиалуроновых кислот, не подвергнутые предварительной термообработке.
Способ по изобретению включает сшивку гибридных комплексов, описанных в WO 2012032151, небольшими количествами диэпоксидов, с последующей очисткой посредством диализа, ультрафильтрации и диафильтрации.
Гибридные комплексы получают путем нагревания смеси первого компонента, выбранного из гиалуроновой кислоты с низкой молекулярной массой, хондроитина и сульфата хондроитина, и второго компонента, состоящего из гиалуроновой кислоты с высокой молекулярной массой, при температуре в диапазоне от 80°С до 160°С, предпочтительно от 80°С до 120°С, в течение времени реакции от 10 мин до 30 мин, с последующим быстрым охлаждением до 20/25°С в течение 5-15 мин.
Массовая концентрация первого компонента с низкой молекулярной массой находится в диапазоне от 0,1 до 50%, а массовая концентрация второго компонента с высокой молекулярной массой находится в диапазоне от 0,01 до 10%.
Применение гибридных комплексов гликозаминогликанов, особенно гиалуроновой кислоты, позволяет увеличить стабильность трехмерной сшитой структуры после сшивки, что гарантирует лучшие и более длительно сохраняемые реологические свойства.
В частности, способ по изобретению включает:
a) проведение реакции по меньшей мере одного гибридного кооперативного комплекса, полученного путем нагревания водных растворов гликозаминогликанов с низкой и высокой молекулярной массой при 80-160°С, предпочтительно от 80°С до 120°С, с диэпоксидом в качестве сшивающего агента, предпочтительно с 1,4-бутандиолдиглицидиловым простым эфиром, в соотношении с комплексом в диапазоне от 0,1 до 1 эквивалентов, предпочтительно от 0,2 до 0,4 эквивалентов; при этом массовая концентрация комплекса в растворе находится в диапазоне от 1% до 15%, предпочтительно от 2% до 10%;
b) осуществление очистки посредством диализа, ультрафильтрации и диафильтрации.
Реакцию проводят при температуре в диапазоне от 10°С до 50°С, предпочтительно от 15°С до 30°С, в течение времени реакции от 2 ч до 48 ч, предпочтительно от 12 ч до 24 ч.
Предпочтительными гликозаминогликанами являются гиалуроновые кислоты с высокой и низкой молекулярной массой.
3
3
6
6
Выражение «гиалуроновая кислота с низкой молекулярной массой» означает гиалуроновую кислоту, имеющую молекулярную массу Mw, определенную методом эксклюзионной хроматографии (SEC) и/или методом эксклюзионной хроматографии с аналитическим блоком из трех детекторов (SEC-TDA), в диапазоне от 50⋅10 Да до 900⋅10 Да, в то время как выражение «гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой» означает гиалуроновую кислоту, имеющую молекулярную массу Mw, также определенную методом SEC и/или SEC-TDA, в диапазоне от 1⋅10 Да до 3⋅10 Да. В качестве альтернативы, гликозаминогликан с низкой молекулярной массой может представлять собой хондроитин или сульфат хондроитина, с молекулярной массой Mw в диапазоне от 5000 до 150000 Да.
Особенно предпочтительной является ультрачистая гиалуроновая кислота, полученная способом, раскрытым в US 9347079 или ЕР 2870255, имеющаяся в продаже под торговым названием Shyalt.
Способ по изобретению можно также осуществить, исходя из многочисленных гибридных комплексов, обычно от 1 до 4 различных комплексов. Например, комплекс, полученный путем нагревания гиалуроновых кислот с низкой и высокой молекулярной массой, как определено выше, можно одновременно сшить с комплексом, полученным путем нагревания хондроитина (особенно предпочтительным является ультрачистый хондроитин, полученный способом, описанным в US 8592186) или сульфата хондроитина и гиалуроновой кислоты с высокой молекулярной массой, как определено выше. Применение многочисленных комплексов позволяет тонко регулировать реологические свойства гидрогеля, которые таким образом можно оптимизировать для предполагаемых косметических или терапевтических применений.
Массовое отношение между гликозаминогликаном с низкой молекулярной массой и гликозаминогликаном с высокой молекулярной массой может находиться в пределах широкого диапазона, например, от 0,1 до 1. Предпочтительным является массовое отношение 0,5.
Предпочтительные условия реакции сшивки включают применение высокоэффективной системы смешивания, которая гарантирует максимальное взаимодействие комплексов в ходе реакции благодаря нисходящему и восходящему усилию (descending and ascending force) от 100 H до 700 Н. Медленное, изменяющееся перемешивание, при котором протекает реакция, происходит в диапазоне скоростей от 10 об/мин до 120 об/мин, предпочтительно от 10 об/мин до 50 об/мин, при геометрии реактора, выраженной как отношение диаметра к высоте, в диапазоне от 0,5 до 1,5.
Сочетание упомянутых параметров гарантирует эффективное получение эффективной степени сшивки с использованием минимального количества сшивающего агента, при однородном распределении связей.
Стадии очистки осуществляют при градиентах температуры в диапазоне от 10°С до 58°С, предпочтительно от 20°С до 50°С; ультрафильтрацию предпочтительно проводят с от 1 до 10 объемов диафильтрации, при скорости просачивания в диапазоне от 0,1 л/ч до 10 л/ч, с ΔР от 0,1 до 0,2 МПа (от 1 до 2 бар), с применением половолоконных мембран, с номинальным отсечением от 250 до 750 кДа.
Для стадии диализа предпочтительно используют целлюлозные мембраны с номинальным отсечением от 10 кДа до 50 кДа, с использованием в качестве диализной среды очищенной воды или фосфатного буфера с осмолярностью в диапазоне от 200 мОсм/л до 400 мОсм/л.
Стадии очистки проводят в течение времени, достаточного для удаления нежелательных микрозагрязнений (БДДЭ (бутандиолдиглицидиловый простой эфир), металлы и т.д.).
Применение упомянутых технологий гарантирует высокую чистоту и, таким образом, превосходную безопасность продукта in vivo, со средним остаточным содержанием сшивающего агента в диапазоне от 25 частей на миллиард до 100 частей на миллиард, что значительно ниже, чем повсеместно допустимые по техническим условиям пределы (≤2000 частей на миллиард) для других устройств, имеющихся в настоящее время в продаже.
Продукт реакции, то есть сшитый гидрогель, также фильтруют, чтобы стандартизировать его до стандартного размера в диапазоне от 45 мкм до 450 мкм, в зависимости от его конечного применения in vivo.
Гидрогель, имеющий различные степени сшивки, может входить в состав конечного устройства в аликвотах в диапазоне от 1% до 100%, в соответствии с конкретными требованиями по использованию в составе человеческого организма, с различными конечными концентрациями гибридных комплексов сшитой гиалуроновой кислоты (ГК) в диапазоне от 1,5% до 4%. Неожиданно было обнаружено, что даже составы с самыми высокими концентрациями легко экструдируются и, следовательно, они очень практичны в использовании, при хорошей приемлемости для пациента.
Гидрогели, полученные способом по изобретению, подходящим образом изготавливают в форме имплантируемых устройств, например, в фосфатном буфере или в соляном растворе, для применения в медицинской, хирургической, эстетической, ортопедической, стоматологической, офтальмологической и дерматокосметологической областях.
В имплантируемых устройствах по изобретению к гидрогелям можно добавить гиалуроновую кислоту, хондроитин или производные целлюлозы (карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, этилцеллюлозу и т.п.), объединение с которыми значительно увеличивает стойкость по отношению к гиалуронидазам.
Для того, чтобы снизить непосредственное ощущение боли и вызвать онемение обработанной области, может быть полезно добавление местных анестетиков, таких как, например, прокаина, мепивакаина, бензокаина, этилхлорида, и предпочтительно гидрохлорида лидокаина, в концентрациях в диапазоне от 0,1% до 3%.
Пример 1: реакция с одним комплексом.
- Получение Комплекса 1:
3
3
27,42 г гиалуроната натрия (потеря массы при высушивании (LOD) 9,7%) с характеристической вязкостью 2,1 м/кг и 27,12 г гиалуроната натрия (LOD 8,5%) с характеристической вязкостью 3,0 м/кг растворяли при механическом перемешивании в 395,45 мл воды. Раствор доводили до температуры 90°С в течение 15 минут и быстро охлаждали до температуры 25°С.
- Реакция сшивки:
Раствор Комплекса 1 переносили в термостатированный контейнер, снабженный механической мешалкой, и добавляли 50 мл 0,25 н раствора гидроксида натрия. Примерно через 3 часа перемешивания добавляли 11,7 мл 95% раствора БДДЭ (0,5 эквивалента). Реакция происходит при регулируемой температуре (30±5°С), при перемешивании со скоростью 40±5 об/мин в течение 12 часов и при перемешивании со скоростью 25±5 об/мин в течение дополнительных 12 часов.
Сшитый продукт нейтрализовали до рН 7,4 путем добавления раствора HCl, затем подвергали диализу, диафильтрации (5 объемов) и снова диализу.
Гидрогель получали путем добавления 0,3% гидрохлорида лидокаина, затем корректировали концентрацию до 25 мг/г и механически гомогенизировали.
Продукт подвергали фильтрации с целью стандартизации до 450 мкм.
Гидрогель помещали во флаконы и стерилизовали в автоклаве.
Модуль упругости G': 350 Па.
Эластичность: 82%.
Усилие при экструзии: 35 Н.
Пример 2: реакция с двумя комплексами
- Получение Комплекса 1:
3
3
13,71 г гиалуроната натрия (LOD 9,7%) с характеристической вязкостью 2,1 м/кг и 13,56 г гиалуроната натрия (LOD 8,5%) с характеристической вязкостью 3,0 м/кг растворяли при механическом перемешивании в 197,72 мл воды. Раствор доводили до температуры 90°С в течение 15 минут и быстро охлаждали до температуры 25°С.
- Получение Комплекса 2:
3
3
13,71 г гиалуроната натрия (LOD 9,7%) с характеристической вязкостью 2,1 м/кг и 13,68 г гиалуроната натрия (LOD 9,5%) с характеристической вязкостью 0,2 м/кг растворяли при механическом перемешивании в 197,6 мл воды. Раствор доводили до температуры 90°С в течение 15 минут и быстро охлаждали до температуры 25°С.
- Реакция сшивки
Растворы Комплекса 1 и Комплекса 2 переносили в один термостатированный контейнер, снабженный механической мешалкой, и добавляли 50 мл 0,25 н раствора гидроксида натрия. Примерно через 3 часа перемешивания добавляли 11,7 мл 95% раствора БДДЭ (0,5 эквивалента). Реакция происходит при регулируемой температуре (30±5°С), при перемешивании со скоростью 40±5 об/мин в течение 12 часов и при перемешивании со скоростью 25±5 об/мин в течение дополнительных 12 часов.
Сшитый продукт нейтрализовали до рН 7,3 путем добавления раствора HCl, затем подвергали диализу, диафильтрации (5 объемов) и снова диализу.
Гидрогель получали путем добавления 0,3% гидрохлорида лидокаина, затем корректировали концентрацию до 25 мг/г и механически гомогенизировали.
Продукт подвергали фильтрации с целью стандартизации до 450 мкм.
Гидрогель помещали во флаконы и стерилизовали в автоклаве.
Модуль упругости G': 292 Па.
Эластичность: 85%.
Усилие при экструзии: 25 Н.
Пример 3: реакция с двумя комплексами
- Получение Комплекса 1:
3
3
13,71 г гиалуроната натрия (LOD 9,7%) с характеристической вязкостью 2,1 м/кг и 13,56 г гиалуроната натрия (LOD 8,5%) с характеристической вязкостью 3,0 м/кг растворяли при механическом перемешивании в 197,72 мл воды. Раствор доводили до температуры 90°С в течение 15 минут и быстро охлаждали до температуры 25°С.
- Получение Комплекса 2:
3
3
13,71 г гиалуроната натрия (LOD 9,7%) с характеристической вязкостью 2,1 м/кг и 13,68 г гиалуроната натрия (LOD 9,5%) с характеристической вязкостью 0,2 м/кг растворяли при механическом перемешивании в 197,6 мл воды. Раствор доводили до температуры 90°С в течение 15 минут и быстро охлаждали до температуры 25°С.- Реакция сшивки
Растворы Комплекса 1 и Комплекса 2 переносили в один термостатированный контейнер, снабженный механической мешалкой, и добавляли 50 мл 0,25 н раствора гидроксида натрия. Примерно через 3 часа перемешивания добавляли 4,7 мл 95% раствора БДДЭ (0,2 эквивалентов). Реакция происходит при регулируемой температуре (30±5°С), при перемешивании со скоростью 40±5 об/мин в течение 12 часов и при перемешивании со скоростью 25±5 об/мин в течение дополнительных 12 часов.
Сшитый продукт нейтрализовали до рН 7,3 путем добавления раствора HCl, затем подвергали диализу, диафильтрации (5 объемов) и снова диализу.
Гидрогель получали путем добавления 0,3% гидрохлорида лидокаина, затем корректировали концентрацию до 25 мг/г и механически гомогенизировали.
Продукт подвергали фильтрации с целью стандартизации до 450 мкм.
Гидрогель помещали во флаконы и стерилизовали в автоклаве.
Модуль упругости G': 250 Па.
Эластичность: 79%.
Усилие при экструзии: 19 Н.