СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ ОЛИГОГАЛАКТУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ С БИОГЕННЫМИ МЕТАЛЛАМИ (II), КАК СИСТЕМ ДОСТАВКИ БИОГЕННЫХ МЕТАЛЛОВ (II) И СИСТЕМ ВЫВЕДЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (II)
METHOD OF PRODUCING COORDINATION COMPOUNDS OF OLIGOGALACTURONIC ACID WITH BIOGENIC METALS (II) AS DELIVERY SYSTEMS OF BIOGENIC METALS (II) AND SYSTEMS FOR REMOVING HEAVY METALS (II)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения лекарственных средств на основе олиго-галактуроновой кислоты (олигоГК), играющей роль носителя ионов биогенных металлов (II) (БМе (II)) и выводящей ионы тяжелых металлов (II) (ТМе (II)).
2+
Описан способ получения медицинского (очищенного) пектина из пектиновых образцов, выделенных из выжимок сахарной свеклы, цитрусовых плодов и яблок (Кайшева Н.Ш. Способ получения медицинского очищенного пектина. Пат. РФ 2116075, МКИ А61К 31/725, опубл. 27.07.1998, 16 с.), основанный на растворении пектинов в 0,5% растворе цитрата аммония (1:25), процеживании полученного раствора, его диализе через целлофановую мембрану (24 ч), концентрировании и обработке диализата 96% этанолом (1:3), деметоксилировании целевого продукта раствором гидрата аммиака (рН 10,5, 1:10, 2 ч) и деминерализации хлороводородной кислотой (рН 2,0, 1 ч). Данный способ получения пектинов близок к предлагаемому способу. Несмотря на достижение указанным способом высокой степени чистоты (отсутствие примесных катионов металлов, флавоноидов), подтверждаемой выраженной комплексообразующей способностью (1078-1525 мг Pb/г) и характером УФ-спектров, целевой продукт (очищенный пектин) предназначен только для детоксикации катионов ТМе (II), эталоном которых служат ионы свинца (II). Продукты взаимодействия - координационные соединения или пектинаты ТМе (II) - значительно устойчивее, чем пектинаты БМе (II), поэтому конкуренция между катионами ТМе (II) и БМе (II) в условиях in vivo за связывание с пектинами происходит в пользу ТМе (II). С другой стороны, относительно слабая связь катионов БМе (II) с олигоГК и прочная связь катионов БМе (II) с биологическими субстратами не способствуют выведению катионов этих металлов (II) из биологических систем с помощью олигоГК. Указанные свойства позволили предположить использование олигоГК не только как детоксикантов, связывающих и ускоряющих выведение из биологических систем и жидкостей катионов ТМ (II), но и как систем доставки БМе (II) в биологические среды. Катионами подобных БМе (II), входящих в состав ферментов, гормонов, витаминов, являются катионы меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния (Ершов Ю.А., Попков В.А., Берлянд А.С. и др. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. - М., ВШ, 2002, 560 с.). Дефицит катионов этих БМе (II) приводит к нарушению нормальной жизнедеятельности человека: развитию анемии, диабета, атеросклероза, нефролитиаза и т.д. Для лечения пациентов с указанными нозологиями крайне редко используются неорганические соли БМе (II); в подавляющем большинстве случаев лекарственными средствами являются координационные соединения БМе (II) с биолигандами (углеводами, витаминами, органическими кислотами и др.), обладающие высокой биологической доступностью и фармакологической активностью (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2000, 14 изд., 2 т.). Применение физических смесей пектинов и неорганических солей БМе (II) оказывает более выраженный фармакологический эффект, чем отдельных компонентов, но значительно меньшую активность по сравнению с пектинатами БМе (II) (Ашубаева З.Ж., Молдошев A.M., Джумалиев А.Д. и др. Применение пектинов в медицине. - Фрунзе: Илим, 1990, 65 с.).
z+
z+
+
6
7
6
2-3
n
2
2-3
В этой связи целесообразна разработка пектинатов Me (II) как систем доставки БМе (II) и систем выведения ТМе (II) из организма Наиболее близким способом получения подобных пектинатов, принятым за прототип, является способ получения координационных соединений БМе с олигоГК или полигалактуроновыми кислотами (полиГК) общей формулы: [Me(CHO)](HO), где n (степень полимеризации)=10-145, Me - 2-8 ионов БМе, выбранных из группы: железо (II), калий, кобальт (II), марганец (II), цинк, хром (III), молибден (V), ванадий (IV), магний, никель (II), при условии, что один из катионов является катионом калия или магния, z - заряд иона Me (Лакатош Б., Майзель Ю., Варью М. Способ получения комплекса иона металла с олиго- или полигалактуроновыми кислотами. Пат. СССР 886750, МКИ С07Н 23/00, опубл. 30.11.1981). Способ заключается в том, что сначала из пектинового яблочного порошка получают полиГК путем суспендирования порошка водой (1:20, 10 ч), разбавления суспензии водой (1:4), доведения рН до ~12 с помощью 0,1 М раствора щелочи, катализа разложения хлоридом натрия или алюминия (1000 г смеси: 1 г соли), выдерживания смеси (20°C, 2 ч), создания рН ~0,5 концентрированной хлороводородной кислотой, осаждения спиртом, гомогенизации полиГК с водой и установления рН ~4,5 раствором щелочи, очистки и сушки продуктов (60°C). Операции гидролиза и осаждения проводят 4-кратно. Технологический выход полиГК составляет 40%, n ~140, содержание свободных карбоксильных групп 25,2%, содержание метоксильных групп 0,1%. Далее получают декагалактуроновую кислоту (декаГК) путем смешивания полиГК с 0,1 М раствором гидроксида натрия (1:32÷36), выдерживания при рН ~4,5 (10 ч), доведения рН до ~3 с помощью 0,05 М раствора серной кислоты, кипячения (1 ч), охлаждения, осаждения спиртом, сушки (60°C). Технологический выход декаГК 80%. Для получения целевого продукта олигоГК или полиГК (n=10-145) подвергают взаимодействию в водном растворе или системе растворителей из воды и полярного органического растворителя с солями (сульфатами, хлоридами) или комплексами 2-8 ионов Me с более низкими константами устойчивости, чем у целевого продукта. Для получения фармацевтических композиций предпочтительными являются соединения с n=2-20.
Недостатками способа являются:
- неэффективность использования полиГК в качестве транспортных систем доставки и выведения катионов БМе в связи с их низкой биологической доступностью в биологические субстраты (особенно в костную ткань, депонирующую катионы ТМе);
- создание кислой среды (рН 4,5-6,5) при получении металлических производных за счет подавления диссоциации ГК способствует снижению степени комплексообразования ГК;
- соосаждение избытка ионов БМе с целевыми продуктами и невозможность их удаления промывкой водой; так, с 1 молем диГК (1/5 декаГК) осаждается 1,4 моль меди (II), по 3 моль кобальта (II), железа (II), цинка, 3,4 моль марганца (II), 4 моль никеля (II), 6,8 моль магния;
- относительно низкий технологический выход целевых продуктов (49,1-76,0%);
- многостадийность и трудоемкость технологии получения целевого продукта (гомогенизация яблочного порошка, щелочной гидролиз пектина, нейтрализация сильными кислотами, выделение, щелочной гидролиз и термолиз полиГК, выделение декаГК, получение, отделение и очистка металлических производных);
- большая продолжительность способа - 8 суток (получение полиГК - 4 суток, декаГК - 0,5 суток, металлических производных декаГК - 3,5 суток).
Цель изобретения - увеличение степени полноты протекания реакции взаимодействия олигоГК с катионами БМе (II) (образования олигоГК-БМе (II)) и исключение избытка солей металлов (II); повышение технологического выхода целевых продуктов; упрощение и сокращение продолжительности способа; использование целевых продуктов как носителей катионов БМе (II) и систем выведения катионов ТМе (II) из организма.
-3
-2
Поставленная цель достигается тем, что способ получения олигоГК-БМе (II) осуществляют сначала путем получения из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075) медицинского (очищенного) пектина, представляющего собой олигоГК (с молярной массой 3200 г/моль, n=18, рН 3,50), после чего к 1 л 5,0·10 М водного раствора олигоГК при интенсивном перемешивании добавляют 2 М водный раствор гидрата аммиака до установления рН реакционной смеси ~ 8, затем приливают 1 л 4,5·10 М водного раствора ацетата одного из Me (II): меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния. Образующийся гелеобразный осадок обрабатывают 96% этанолом (1:2), выдерживают смесь при комнатной температуре (2 ч), образовавшуюся уксусную кислоту нейтрализуют 2 М раствором гидрата аммиака, декантируют надосадочную жидкость, промывают осадок трижды водой по 100 мл, центрифугируют и сушат при температуре 60°С до постоянной массы. Общая продолжительность способа, включая получение олигоГК (30 ч) и олигоГК-БМе (II) (3 ч), составляет 33 ч.
-3
-2
Используемые в предлагаемом способе количества реагентов (моль): 5,0·10 олигоГК и 4,5·10 катионов Me (II), или соотношение олигоГК:катионы Me (II) 1:9, обеспечивающее максимальный технологический выход целевых продуктов, является оптимальным, что показано на примере олигоГК-меди (II) (таблица 1). Увеличение количества ионов меди (II) не ведет к увеличению выхода олигоГК-меди (II). Подобное соотношение является оптимальным и для получения других металлических производных олигоГК: кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния.
Изучение влияния осадителя - этанола различной концентрации - на полноту осаждения олигоГК-БМе (II) на примере олигоГК-меди (II) (таблица 2) свидетельствует о максимальном выходе целевого продукта при использовании 96% этанола.
Изучение влияния объемного соотношения первоначально образовавшегося гелеобразного осадка олигоГК-БМе (II) (на примере олигоГК-меди (II)) и 96% этанола на полноту осаждения (таблица 3) свидетельствует об оптимальном соотношении 1:2.
Оптимальной продолжительностью экспозиции реакционной смеси после осаждения олигоГК-БМе (II) (на примере олигоГК-меди (II)) 96% этанолом при соотношении 1:2 является 2 ч (таблица 4).
Состав полученных олигоГК-БМе (II) установлен на деривато-графе марки «Q-1500» фирмы MOM (Венгрия) с применением различных вариантов термического анализа: термогравиметрическим (ТГА), дифференциальным термогравиметрическим (ДТГА), дифференциальным термическим (ДТА). В качестве примера на рисунке 1 приведены термические кривые олигоГК-меди (II), в соответствии с которыми отмечены характерные эндотермические эффекты. Первый эффект отмечен в области температур 80-115°C на кривой ДТГА и 100-120°C на кривой ДТА; ему соответствует на кривой ТГА потеря адсорбционной воды 7,4%. Второй эндотермический эффект отмечен при температуре 150-165°C на кривой ДТГА и при 155-160°C на кривой ДТА; этому эффекту на кривой ТГА соответствует потеря внутри-координационной воды 2,8%. Кроме того, обнаружены эндотермические эффекты при температурах 200-220°C (декарбоксилирование), 240°C и выше (деструкция).
Используя метод потенциометрического титрования 0,3% водной суспензии олигоГК-БМе (II) 0,1 М раствором гидроксида натрия на рН-метре марки «рН-340» (индикаторный электрод - стеклянный, электрод сравнения - хлорсеребряный), на примере олигоГК-меди (II) установлена точка эквивалентности при рН 4,87, соответствующая объему титранта 4,0 мл при ΔрН/ΔV=1,62 (рисунок 2). Выявленная в кислой среде точка эквивалентности для олигоГК-меди (II), аналогичная и для других олигоГК-БМе (II), доказывает проявление ими кислотных свойств за счет содержащихся во внутренней сфере молекул воды, образующих гидроксокомплекс.
6
7
6
2
2
2
9
Учитывая потерю адсорбционной воды (7,4%), «внутрисферной» воды (2,8%) и установленное гравиметрическим методом после озоления соотношение 1 моль ионов меди (II):1 моль диГК, состав олигоГК-меди (II) выражается формулой: [Cu(CHO)(HO)]. Для других олигоГК-БМе (II) получены идентичные результаты.
-1
-1
-1
Изучение ИК-спектров поглощения полученных заявляемым способом олигоГК-БМе (II) в виде таблеток с бромидом калия на ИК-фурье-спектрометре «Magna-750» фирмы «Nicolet» (разрешение 2 см) показало сходство в наличии полос поглощения в области 1630-1600 и 1430-1400 см, характерных для карбоксилат ионов и молекул воды. Положение этих полос и разница частот для несимметричных и симметричных колебаний Δν (as-s) карбоксилат ионов (таблица 5), являющихся функциями массы, радиуса, электростатического поля и поляризующего действия катионов (Филиппов М.П. Инфракрасные спектры пектина и его производных. Изв. АН МССР, 1976, №4, с. 80-87), свидетельствуют об образовании катионами БМе (II) несимметричных структур с карбоксильными группами олигоГК, выполняющими роль монодентатных лигандов. Наличие молекул воды, координированной с ионами БМе (II), помимо указанной полосы, подтверждается и другой полосой поглощения - в области 880-650 см. В этой связи, структура элементарного звена олигоГК-БМе (II) включает ячейку из катиона БМе (II), карбоксильных групп олигоГК и молекул воды (рисунок 3).
На основании вышеизложенного можно сделать заключение, что реакция образования олигоГК-БМе (II) выражается уравнением:
равн.
Для расчета константы равновесия (К), определяющей направление и полноту протекания данной реакции, определены значения:
дис.
дис.олигоГК
3
4
-4
а) константы диссоциации (К), или кислотности, олигоГК (0,1% раствор) методом алкалиметрического титрования (0,1 М раствор гидроксида натрия) при ионной силе 0,091, создаваемой 1 М раствором хлорида натрия, с потенциометрической фиксацией точки эквивалентности. На кривой титрования (рисунок 4) наблюдается один скачок титрования, что, по-видимому, связано с отличием ступенчатых констант олигоГК менее чем в 10-10 раз. По молярной массе эквивалента титранта рассчитано значение рК (3,50), антилогарифм которого представил собой К=3,2·10.
s
s
s
s
s
s
-8
7
-8
7
-10
9
б) константы растворимости (K), или произведения растворимости, рассматриваемой как функция комплексообразования, методом растворимости с последующим определением равновесных концентраций в растворе олигоГК методом спектрофотометрии в УФ области (Кайшева Н.Ш., Компанцев В.А., Щербак С.Н. и др. Изучение взаимодействия пектинов с металлами. Фармация, 1992, т.41, №2, с. 45-49) и ионов БМе (II) методом комплексонометрического титрования (Шварценбах Г., Флашка Г. Комплексонометрическое титрование. Пер. с нем. - М.: Химия, 1970, 360 с.). В зависимости от рН реакционной среды, в которой образуется олигоГК-меди (II), выбранный в качестве примера олигоГК-БМе (II), значения K и соответствующие константы устойчивости (13) составили при рН 2: K=1,64·10, β=6,10·10; при рН 5: K=4,98·10, β=2,01·10; при рН 8: K=3,43 10, β=2,92·10. Для других олигоГК-БМе (II) полученные значения K и β имеют такой же порядок.
равн.
Учитывая стехиометрические коэффициенты перед слабыми электролитами в уравнении (1) и исключая воду как реагент, не претерпевший изменения в ходе реакции, выражение К имеет вид:
равн.
Рассчитанные для олигоГК-меди (II) значения К составили
равн.
-4
-8
4
при рН 2: К=3,2·10/1,64·10=1,95·10;
равн.
-4
-8
3
при рН 5: К=3,2·10/4,98·10=6,43·10;
равн.
-4
-10
5
при рН 8: К=3,2·10/3,43·10=9,33·10.
равн.
равн.
4
4
Полученные данные свидетельствуют о том, что реакция образования олигоГК-меди (II) как и других олигоГК-БМе (II) протекает практически полно как при рН 8, так и при рН 2 (К>10), причем степень полноты протекания реакции при рН 8 в 48 раз больше, чем при рН 2. При рН 5, используемой в способе - прототипе, реакция комплексообразования протекает практически неполно (К<10); степень полноты в 145 раз меньше, чем при рН 8. В этой связи, оптимальной средой, обусловливающей наиболее высокую полноту протекания реакции, является рН 8.
Оставшийся после выделения олигоГК-меди (II) центрифугат (маточный раствор) проанализирован на наличие катионов меди (II) по очень чувствительной реакции взаимодействия с 3 М водным раствором гидрата аммиака (Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика). В 2 кн. Кн. 1. Общие теоретические основы. Качественный анализ. - М., ВШ, 2001, 615 с.) и наличие олигоГК методом спектрофо-тометрии в УФ области (Кайшева Н.Ш. и др. … Фармация, 1992). Полученные отрицательные результаты (отсутствие интенсивно синего окрашивания раствора и отсутствие характерного максимума поглощения при 286 нм соответственно) свидетельствовали об отсутствии в фильтрате ионов меди (II) и олигоГК, что дополнительно доказывает практическую полноту протекания реакции. В промывных водах, полученных после очистки декаГК-меди (II)-калия (способ-прототип), указанная реакция на ионы меди (II) оказалась положительной.
Аналогичные олигоГК-меди (II) результаты изучения состава и полноты протекания реакций получены для других олигоГК-БМе (II): кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния.
дис.
-5
Выбор солей БМе (II) в виде ацетатов в заявляемом способе обусловлен необходимостью образования в результате реакций слабой уксусной кислоты с К=1,74·10 (Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. - М.: Химия, 1989, 6 изд., 448 с.), практически не влияющей на рН среды и устойчивость целевых продуктов, в отличие от серной или соляной кислот, выделяющихся при использовании сульфатов или хлоридов (способ-прототип).
Выбор свекловичного пектина для получения олигоГК обусловлен его наибольшей среди других пектинов (яблочного, цитрусового, подсолнечного, хлопкового) комплексообразующей способностью (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075).
-2
-2
-2
-2
В молекулах олигоГК карбоксильные группы независимо от степени замещения катиона водорода доступны для ионного обмена (Кайшева Н.Ш., Кайшев А.Ш. Катионообменные свойства полиуронатов s-металлов. Химико-фармацевтический журнал, 2014, т. 48, №4, с. 43-46). Предполагая возможность обмена в олигоГК-БМе (II) ионов БМе (II) (меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния) на ионы ТМе (II) (использованы ионы свинца (II) и кадмия), определены степени десорбции (высвобождения) катионов БМе (II) и сорбции (связывания) катионов ТМе (II). С этой целью олигоГК-БМе (II) массой около 0,1 г (точные навески) вносили в 20 мл 1,25·10 М раствора ацетата свинца (II) (5,18·10 г ионов свинца (II)) или в 20 мл 5,0·10 М раствора ацетата кадмия (11,24·10 г ионов кадмия). Смеси выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании, после чего твердую и жидкую фазы отделяли центрифугированием. Далее катионы ТМе (II) (свинца (II), кадмия), оставшиеся в растворе после ионного обмена, и катионы БМе (II) (меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния), перешедшие из олигоГК-БМе (II) в раствор, отделяли друг от друга и определяли количественное содержание:
1. Для отделения катионов свинца (II) от катионов БМе (II) к анализируемому раствору добавляли 1 М водный раствор серной кислоты до полного выделения белого осадка сульфата свинца (II), смесь центрифугировали; в растворе оставались катионы БМе (II) (Харитонов Ю.Я. … 2001).
Количественное содержание катионов свинца (II) определяли методом гравиметрии по массе гравиметрической формы - сульфата свинца (II) - с учетом гравиметрического (аналитического) фактора 0,6832 (Лурье Ю.Ю. … 1989).
Количественное содержание катионов железа (II) определяли методом фотометрии по реакции с сульфосалициловой кислотой в аммиачной среде (=631,5) (Шарло Г. Методы аналитической химии. Количественный анализ неорганических соединений. - М.: Химия, 1965, 976 с.).
Количественное содержание катионов других БМе (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА (Шварценбах Г. … 1970): катионов меди (II) (рН 8 с помощью аммиачного буферного раствора, индикатор - мурексид); катионов кобальта (II) (рН 8 с помощью 1 М раствора гидрата аммиака, индикатор - мурексид); катионов цинка (рН 10 с помощью универсальной буферной смеси, индикатор - эриохром черный Т); катионов марганца (II) (в присутствии 20% раствора триэта-ноламина гидрохлорида, аскорбиновой кислоты, рН 10 с помощью универсальной буферной смеси, индикатор - эриохром черный Т); катионов магния (рН 10 с помощью универсальной буферной смеси, индикатор - эриохром черный Т).
2. Для отделения катионов кадмия от катионов магния, железа (II), марганца (II) к анализируемым растворам добавляли 25% раствор гидрата аммиака до создания рН 12, смеси центрифугировали: в бесцветных растворах оставались ионы кадмия в виде аммиаката, в осадках - гидроксиды магния (белого цвета), железа (II) (черного цвета), марганца (II) (белого цвета). Осадки отделяли, промывали водой, обрабатывали 3 М раствором хлорида аммония (для растворения гидроксида магния) или 2 М раствором хлороводородной кислоты (для растворения гидроксидов железа (II) и марганца (II)) (Харитонов Ю.Я. … 2001).
Количественное содержание катионов Me (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА: катионов кадмия (рН 10 с помощью аммиачного буферного раствора, индикатор - пирокатехиновый фиолетовый), катионов марганца (II) и магния (как указано выше) (Шварценбах Г. … 1970). Содержание катионов железа (II) определяли методом фотометрии по реакции с сульфосалициловой кислотой в аммиачной среде (Шарло Г. … 1965).
3. Для отделения катионов кадмия от катионов цинка к анализируемому раствору при нагревании (60°C) прибавляли 2 М водный раствор гидроксида натрия до создания рН 13, смесь центрифугировали: в осадке находился гидроксид кадмия (белого цвета), в бесцветном растворе - ионы цинка. Осадок отделяли, промывали водой, обрабатывали 2 М водным раствором хлороводородной кислоты (Харитонов Ю.Я. … 2001).
Количественное содержание катионов кадмия и цинка (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА, как указано выше (Шварценбах Г. … 1970).
4. Для отделения катионов кадмия от катионов кобальта (II) к анализируемому раствору прибавляли 1 М раствор хлороводородной кислоты до создания рН 0,5, затем при нагревании (60°C) добавляли 1 М раствор сероводородной кислоты: в растворе (розового цвета) оставались ионы кобальта (II), в осадке (желтого цвета) - сульфид кадмия. Осадок отделяли, промывали водой, при 60°C обрабатывали 3 М раствором азотной кислоты до растворения (Харитонов Ю.Я. … 2001).
Количественное содержание катионов кадмия и кобальта (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА, как указано выше (Шварценбах Г. … 1970).
5. Для отделения катионов кадмия от катионов меди (II) к анализируемому раствору при рН 5, создаваемом 1 М раствором серной кислоты, при нагревании (60°C) прибавляли кристаллический тиосульфат натрия: в осадке (черного цвета) находился сульфид меди (II), в бесцветном растворе - ионы кадмия. Осадок отделяли, промывали водой, обрабатывали 2 М раствором азотной кислоты до растворения (Харитонов Ю.Я. … 2001).
Количественное содержание катионов кадмия и меди (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА, как указано выше (Шварценбах Г. … 1970).
По соотношению количеств (моль) ионов БМе (II), выделившихся в результате катионного обмена и содержавшихся в олигоГК-БМе (II), судили о степени их десорбции (высвобождения) из олигоГК-БМе (II). Степень сорбции (связывания) олигоГК катионов ТМе (II) определяли как отношение количеств (моль) связанных ионов ТМе (II) и ионов БМе (II), содержавшихся в исходном олигоГК-БМе (II). Полученные данные (таблица 6) свидетельствуют о высокой степени десорбции катионов БМе (II) как в растворе свинца (II): 58,7-93,1% (в среднем 81,0%), так и в растворе кадмия: 55,8-92,0% (в среднем 79,5%). Примерно на таком же уровне находятся показатели сорбции олигоГК катионов свинца (II): 56,8-92,6% (в среднем 79,7%) и кадмия: 51,5-91,0% (в среднем 77,2%).
Исследование биологических свойств олигоГК-БМе (II) на примере олигоГК-железа (II) проведено в опытах на белых беспородных крысах-самцах массой по 180-220 г; каждая опытная группа состояла из 6 особей. Животные в течение эксперимента находились на стандартном режиме питания. Для приготовления растворов в качестве растворителя использовали изотонический раствор (0,9%) хлорида натрия. Результаты биологических исследований обрабатывали методом множественной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента; определяли среднюю арифметическую величину, ее стандартную ошибку и вероятность различий результатов сравниваемых групп животных (Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований. Патол. физиология и эксперим. терапия, 1960, т. 4, №4, с. 76-85).
50
50
Острую токсичность олигоГК-железа (II) определяли методом Кербера (Сидоров К.К. Методы определения острой токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). - М.: Медицина, 1970, 117 с.) путем одноразового перорального введения препарата в дозах 5000 мг/кг, 1000 мг/кг, 500 мг/кг, 250 мг/кг, 100 мг/кг. Введение более высоких доз было невозможным из-за низкой растворимости исследуемого вещества. За состоянием животных наблюдали в течение 14 дней; гибели крыс не отмечалось. При вскрытии животных через 14 дней изменений со стороны печени, почек, селезенки не обнаружено. Данные по изучению острой токсичности олигоГК-железа (II) приведены в таблице 7. Поскольку даже максимально введенная доза олигоГК-железа (II) (5000 мг/кг) не вызвала токсичности, то рассчитать LD не представилось возможным; по-видимому, LD>5000 мг/кг. В связи с этим, согласно классификации токсических веществ (Сидоров К.К. … 1970), олигоГК-железа (II) отнесен к группе практически нетоксичных веществ.
При интоксикации соединениями ТМе, типичным представителем которых являются катионы свинца (II), нарушаются различные звенья биологического окисления: блокируются SH-группы дегидрогеназ, участвующих в окислении субстратов, снижается поступление водорода в дыхательную цепь, нарушаются процессы окислительного фосфорилирования, интенсифицируется окисление жирных кислот фосфолипидов, ведущее к образованию пероксидов (свободных радикалов). Образующиеся продукты пероксидного окисления липидов снижают устойчивость клеток, в т.ч. эритроцитов, приводя их к разрушению и развитию гемической анемии (Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы токсического действия неорганических соединений. - М.: Медицина, 1989, 272 с.). Поэтому в качестве модели для проведения биологических испытаний олигоГК-БМе (II) как лекарственных средств, перспективных в терапии гемической анемии, выбрана модель интоксикации животных ацетатом свинца (II).
Испытания проводили с олигоГК-железа (II) на фоне свинцовой интоксикации путем изучения показателей крови крыс: количество эритроцитов, содержание гемоглобина и содержание катионов свинца (II). Для исследования использовали 5 групп животных:
№1 - интактные животные;
№2 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) ежедневно в течение 7 дней (контроль) (Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы. 1989);
№3 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) и через 1 ч олигоГК-железа (II) в однократной дозе 150 мг/кг в день (3 мл 1% суспензии) ежедневно в течение 7 дней;
№4 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) и через 1 ч олигоГК в однократной дозе 150 мг/кг в день (3 мл 1% суспензии) ежедневно в течение 7 дней;
№5 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) и через 1 ч лекарственный препарат сравнения, содержащий железа (II) сульфат, «Ферроплекс» (Машковский М.Д. … 2000) в однократной дозе 30 мг/кг в день (0,6 мл 1% суспензии) ежедневно в течение 7 дней.
Забор крови у животных проводили по завершении опытов (на 8 сутки) путем декапитации под легким эфирным наркозом. Количество эритроцитов в крови животных определяли с помощью прибора «Целлоскопа ИКМ-II» путем автоматической цифровой регистрации электрических импульсов, возникающих при прохождении каждого эритроцита через микроотверстие капсулы прибора при протяжке через капсулу фиксированного объема суспензии эритроцитов, полученной из образцов крови. Содержание гемоглобина в крови определяли гемиглобинцианидным методом (методика Сали) (Камышников B.C., Волотовская О.А., Ходюкова А.Б. и др. Методы клинических лабораторных исследований. - Минск: Бел. наука, 2001, 695 с.). Содержание катионов свинца (II) в крови определяли методом комплексоно-метрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА (рН 10, индикатор - эриохром черный Т) после гидролиза субстрата смесью концентрированных азотной и серной кислот (1:1) и растворения минерального остатка в растворах ацетата аммония (Шварценбах Г. … 1970).
1
4
Полученные данные (таблица 8) свидетельствуют о снижении как количества эритроцитов, так и содержания гемоглобина в крови животных, интоксицированных ацетатом свинца (II). Влияние трех исследованных препаратов на фоне свинцовой интоксикации достоверно способствовало увеличению указанных показателей, но в раз ной степени. Наиболее эффективно подобное воздействие проявил олигоГК-железа (II), на 82,51% приблизивший количество эритроцитов к норме и практически нормализовавший содержание гемоглобина (P>0,05). Активность препарата сравнения «Ферроплекса» оказалась ниже, чем у олигоГК-железа (II): на 20,54% при влиянии на количество эритроцитов и на 22,76% - на содержание гемоглобина. Практически на уровне «Ферроплекса» находилась олигоГК по воздействию на оба гемических показателя (Р>0,05). Примечательна аналогичная тенденция изменения указанных гемических показателей между собой под влиянием всех трех исследованных препаратов.
В отличие от «Ферроплекса», и олигоГК-железа (II) и олигоГК достоверно снижали концентрацию катионов свинца (II) в крови интоксицированных животных: соответственно в 2 раза и 1,5 раза; эффект олигоГК-железа (II) на 28,6% превосходил подобное действие олигоГК.
Таким образом, при введении олигоГК-железа (II) степень уменьшения количества эритроцитов и содержания гемоглобина в крови животных на фоне свинцовой интоксикации значительно ниже, чем при применении как «Ферроплекса», так и олигоГК. С другой стороны, олигоГК-железа (II) и в меньшей степени олигоГК способствуют связыванию и ускорению выведения катионов свинца (II) в отличие от «Ферроплекса». Иначе говоря, если «Ферроплекс» способствует только снижению интенсивности гемоглобинопении и эритро-цитопении, хотя и в меньшей степени, чем олигоГК-железа (II), то последний, кроме того, выполняет роль эффективного антидота катионов свинца (II).
Предлагаемый способ получения олигоГК-БМе (II) как систем доставки БМе (II) и систем выведения ТМе (II) поясняется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Получение олигоГК-меди (II)
2
-4
дис.
1. Вначале получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075). 2 г сухого свекловичного пектина помещают в коническую колбу вместимостью 1 л, приливают 50 мл 0,5% раствора цитрата аммония и перемешивают содержимое колбы на магнитной мешалке в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствору дают отстояться (5 мин), после чего его процеживают через тройной слой марли. К полученному раствору приливают 25 мл 0,1 М раствора хлорида калия, перемешивают и диализуют раствор в диализной трубке длиной 15 см и рабочей площадью 9 см, конец которой закрыт целлофановой мембраной толщиной 0,4 нм. Трубку помещают в стакан, в котором находится 100 мл 0,1 М раствора хлорида калия. Стакан и трубку с раствором выдерживают в термостате (38°C, 24 ч). Полученный диализат концентрируют под вакуумом до 1/3 от первоначального объема, обрабатывают 96% этанолом в соотношении 1:3. Выпавший осадок фильтруют под вакуумом, промывают дважды на фильтре 90% этанолом (по 30 мл), переносят в колбу вместимостью 100 мл, приливают 10 мл воды (примерно 5% раствор), добавляют 5 мл 5% раствора гидрата аммиака до достижения рН смеси 10,5 (потенциометрически). Колбу со смесью плотно закрывают крышкой и выдерживают 2 ч при комнатной температуре (происходит деметоксилирование олигоГК и раствор приобретает форму желе). Полученное желе постепенно подкисляют разбавленным (8,3%) раствором хлороводородной кислоты до рН ~ 2 и оставляют смесь на 1 ч при температуре 18°C. Выпавший осадок фильтруют через бумажный фильтр, промывают на фильтре 90% этанолом (дважды по 30 мл), сушат при температуре 60°C. Полученная олигоГК имеет среднюю молярную массу 3200 г/моль, n=18, К(0,1% водный раствор)=3,2·10.
-3
-2
2. Далее из олигоГК получают олигоГК-меди (II). К 1 л 5,0·10 М водного раствора олигоГК, имеющему рН 3,50, при перемешивании на магнитной мешалке добавляют 2 М водный раствор гидрата аммиака до установления рН 8 (потенциометрически), затем приливают 1 л 4,5·10М водного раствора ацетата меди (II). Сразу образующийся гелеобразный осадок обрабатывают 96% этанолом в объемном соотношении 1:2, выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Высвободившуюся уксусную кислоту нейтрализуют 2 М водным раствором гидрата аммиака. Декантируют надосадочную жидкость, осадок центрифугируют, трижды промывают водой по 100 мл, снова декантируют надосадочную жидкость и центрифугируют осадок. Осадок олигоГК-меди (II) сушат при температуре 60°C в сушильном шкафу до постоянной массы.
9
108
162
126
6
7
6
2
2
2
9
Технологический выход олигоГК-меди (II) составил 17,38 г, или 85,9% к теоретически возможному выходу олигоГК-меди (II) (20,23 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-меди (II), определенная методом вискозиметрии (Нелина В.В., Донченко Л.В., Карпович Н.С. и др. Пектин. Методы контроля в пектиновом производстве. - Киев, Пектин, 1992, 114 с.), составила 4046 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-меди (II) (%): С 32,0, Н 4,0, О 49,8, Си 14,2, позволил вывести эмпирическую формулу: CuCHO или [Cu(CHO)(HO)]. Общая продолжительность способа получения олигоГК-меди (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-меди (II) - 3 ч.
Пример 2. Получение олигоГК-кобальта (II)
Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.
-2
-2
Далее получают олигоГК-кобальта (II) из олигоГК (1 л 5,0·10 М водный раствор) и ацетата кобальта (II) (1 л 4,5·10 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.
9
108
162
126
6
7
6
2
2
2
9
Технологический выход олигоГК-кобальта (II) составил 16,94 г, или 84,6% к теоретически возможному выходу олигоГК-кобальта (II) (20,02 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-кобальта (II), определенная методом вискозиметрии, составила 4004 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-кобальта (II) (%): С 32,4, Н 4,0, О 50,3, Со 13,3, позволил вывести эмпирическую формулу: CoCHO или [Со(CHO)(HO)]. Общая продолжительность способа получения олигоГК-кобальта (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-кобальта (II) - 3 ч.
Пример 3. Получение олигоГК-железа (II)
Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.
-3
-2
Далее получают олигоГК-железа (II) из олигоГК (1 л 5,0·10 М водный раствор) и ацетата железа (II) (1 л 4,5·10 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.
9
108
162
126
6
7
6
2
2
2
9
Технологический выход олигоГК-железа (II) составил 15,27 г, или 76,8% к теоретически возможному выходу олигоГК-железа (II) (19,88 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-железа (II), определенная методом вискозиметрии, составила 3977 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-железа (II) (в %): С 32,6, Н 4,1, О 50,7, Fe 12,6, позволил вывести эмпирическую формулу: FeCHO или [Fe(CHO)(HO)]. Общая продолжительность способа получения олигоГК-железа (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-железа (II) - 3 ч.
Пример 4. Получение олигоГК-цинка
Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.
-3
-2
Далее получают олигоГК-цинка из олигоГК (1 л 5,0·10 М водный раствор) и ацетата цинка (1 л 4,5·10 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.
9
108
162
126
6
7
6
2
2
2
9
Технологический выход олигоГК-цинка составил 15,68 г, или 77,2% к теоретически возможному выходу олигоГК-цинка (20,31 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-цинка, определенная методом вискозиметрии, составила 4063 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-цинка (%): С 31,9, Н 4,0, О 49,6, Zn 14,5, позволил вывести эмпирическую формулу: ZnCHO или [Zn(СНО)(HO)]. Общая продолжительность способа получения олигоГК-цинка составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-цинка - 3 ч.
Пример 5. Получение олигоГК-марганца (II)
Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.
-3
-2
Далее получают олигоГК-марганца (II) из олигоГК (1 л 5,0·10 М водный раствор) и ацетата марганца (II) (1 л 4,5·10 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.
9
108
162
126
6
7
6
2
2
2
9
Технологический выход олигоГК-марганца (II) составил 16,11 г, или 81,2% к теоретически возможному выходу олигоГК-марганца (II) (19,84 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-марганца (II), определенная методом вискозиметрии, составила 3968 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-марганца (II) (%): С 32,7, Н 4,1, О 50,8, Мn 12,4, позволил вывести эмпирическую формулу: MnCHO или [Mn(CHO)(HO)]. Общая продолжительность способа получения олигоГК-марганца (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-марганца (II) - 3 ч.
Пример 6. Получение олигоГК-магния
Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.
-3
-2
Далее получают олигоГК-магния из олигоГК (1 л 5,0·10 М водный раствор) и ацетата магния (1 л 4,5·10 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.
9
108
162
126
6
7
6
2
2
2
9
Технологический выход олигоГК-магния составил 14,28 г, или 77,4% к теоретически возможному выходу олигоГК-магния (18,46 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-магния, определенная методом вискозиметрии, составила 3693 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-магния (%): С 35,1, Н 4,4, О 54,6, Mg 5,9, позволил вывести эмпирическую формулу: MgCHO или [Mg(CHO)(HO)]. Общая продолжительность способа получения олигоГК-магния составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-магния - 3 ч.
Таким образом, предлагаемый способ получения олигоГК-БМе (II) обеспечивает следующий положительный эффект:
2+
2+
1. Использование в качестве источника получения олигоГК и олигоГК-БМе (II) свекловичного пектина, имеющего в 1,4 раз более высокую комплексообразующую способность (1525 мг Pb/г), чем яблочный пектин (1078 мг Pb/г) (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075).
2. Повышение биологической доступности галактуронидов за счет использования олигоГК, способной концентрироваться не только в биологических жидкостях, но и тканях, особенно в костной ткани, являющейся местом депонирования катионов ТМе (Кайшева Н.Ш. Научные основы применения полиуронидов в фармации. - Пятигорск: ПятГФА, 2003, 194 с.).
3. Использование олигоГК не только как системы доставки катионов БМе (II) в биологические ткани и жидкости, но и как системы выведения катионов ТМе (II). Об этом свидетельствуют результаты определения степени десорбции катионов БМе (II) из олигоГК-БМе (II) в растворы свинца (II) (в среднем 81,0%) и кадмия (в среднем 79,5%) и степени сорбции олигоГК ионов свинца (II) (в среднем 79,7%) и кадмия (в среднем 77,2%). На модели развития гемической анемии, вызванной интоксикацией животных ацетатом свинца (II), достоверно доказана способность олигоГК-железа (II) увеличивать количество эритроцитов в 1,6 раз, содержание гемоглобина в крови в 1,8 раз и уменьшать содержание катионов свинца (II) в крови в 2 раза.
равн.
равн.
равн.
3
7
5
9
4. Повышение в 145 раз по сравнению со способом-прототипом полноты протекания реакции взаимодействия олигоГК с катионами БМе (II) и устойчивости целевых продуктов за счет создания слабощелочной реакции среды (рН 8) и использования солей Me (II) в виде ацетатов. Об этом свидетельствуют значения К реакции комплексообразования и В олигоГК-БМе (II) на примере олигоГК-меди (II) при различных рН: при рН 5 (способ-прототип) К=6,43·10, β=2,01·10; при рН 8 (заявляемый способ) К=9,33·10, β=2,92·10.
5. Устранение избытка соосаждаемых с целевыми продуктами трудно или не удаляемых ионов Me (II) путем использования стехиометрического соотношения реагентов: 1 моль олигоГК: 9 моль катионов Me (II). Результаты качественного анализа маточного раствора и промывных вод при получении олигоГК-БМе (II) на наличие катионов Me (II) в отличие от способа-прототипа отрицательные.
6. Увеличение технологического выхода олигоГК-БМе (II) относительно теоретически возможного выхода по сравнению со способом-прототипом (за счет создания слабощелочной среды и использования в качестве осадителя 96% этанола): на 28,1% для олигоГК цинка, 14,8% для олигоГК-меди (II), 13,3% для олигоГК-кобальта (II), 12,5% для олигоГК-железа (II), 6,8% для олигоГК-магния, 5,2% для олигоГК-марганца (II).
7. Упрощение способа получения олигоГК-БМе (II) за счет исключения стадий гомогенизации пектинсодержащего порошка, щелочного гидролиза и термолиза полиГК, очистки целевых продуктов от избытка ионов Me (II).
8. Сокращение как общей продолжительности способа получения олигоГК-БМе (II) в 5,3 раз (по способу-прототипу 8 суток, по заявляемому способу 1,5 сутки), так и длительности получения олигоГК-БМе (II) из олигоГК в 28 раз (по способу-прототипу 3,5 суток, по заявляемому способу 3 ч).