Пептидные экстракты из лекарственного растительного сырья и первичные испытания in vivo на мышиной модели рака молочной железы

ПЕПТИДНЫЕ ЭКСТРАКТЫ ИЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ПЕРВИЧНЫЕ ИСПЫТАНИЯ IN VIVO НА МЫШИНОЙ МОДЕЛИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

И.И. Тепкеева, Ю.В. Кесслер

Выделены пептидные экстракты из ряда лекарственных растений. Изучен аминокислотный состав и проведен анализ компонентов пептидных экстрактов с помощью метода ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Изучено противоопухолевое действие экстрактов на мышиной модели рака молочной железы. Установлено, что пептидные экстракты зверобоя и смеси растительного сырья - PE-PM и PE-Hp при локальной однократной инъекции обладают выраженной противоопухолевой активностью.

Введение

Рак молочной железы (далее РМЖ) - одно из самых распространенных опухолевых заболеваний у женщин [1, 2]. Механизмы этиологии и патогенеза этого заболевания включают большое количество молекулярных процессов, поэтому для лечения РМЖ наиболее перспективны препараты сочетанного действия, в частности препараты из растительного сырья [3, 4]. Недавно открытые противоопухолевые свойства растительных циклотидов [5-7] послужили предпосылкой к поиску других пептидов растений, обладающих аналогичным эффектом. Нами на основании анализа опубликованной информации о растениях, которые в народной медицине применяются как противоопухолевые [8, 9], в качестве источника пептидного материала выбрано растительное сырье, производимое на территории РФ и разрешенное фармакопеей РФ для использования в качестве лекарственных препаратов.

Целью исследования явилось получение пептидных экстрактов из лекарственного растительного сырья; анализ аминокислотного состава пептидных экстрактов и компонентов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и изучение противоопухолевого действия экстрактов in vivo на трансплантируемой мышиной модели рака молочной железы.

Материалы и методы

Методика экстракции пептидного материала. Для получения пептидных экстрактов использовали ранее опубликованную нами методику экстракции пептидного материала, свободного от аминокислот, белков и высокомолекулярных пептидов [10]. Сухое растительное сырье (100 г) растирали в фарфоровой ступке, замачивали в 500600 мл 1 М уксусной кислоты (ХИММЕД, «хч»), выдерживали 1 час при комнатной температуре. Суспензию 3-5 раз через 10 мин подвергали ультразвуковому воздействию (ультразвуковая баня фирма Elma, серия LC T 890/H). Суспензию нагревали на бане при 100°С в течение 30 мин. Смесь охлаждали и центрифугировали в стаканах емкостью 250 мл на центрифуге Beckman Model J 2-21 (ротор 14000 RPM, ser E3628) 40 мин при 75000 g. К супернатанту добавляли ацетон (ХИММЕД, «осч 9-5») в объемном соотношении 2:5 и оставляли на ночь в холодильнике при +4°С. Выпавший осадок отделяли центрифугированием в стаканах емкостью 50 мл (ротор 17000 RPM, ser E21759) в течение 40 мин при 40000 g, растворяли в 0,1 М уксусной кислоте и центрифугировали 20 мин при 40000 g. Полученный супернатант лиофилизовали дважды, растворяя сухой остаток в 20-50 мл воды. Выход пептидного материала 120-180 мг.

Получены пептидные экстракты из сухого растительного сырья (АОЗТ «Здоровье», Москва): девясила высокого (Inula helenium L.) - PE-Ih, зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) - PE-Hp, лавра благородного (Laurus nobilis L.) - PE-Ln, чистотела большого (Chelidonium majus) - PE-Cm, хвоща полевого (Equisetum arvense L.) - PE-Ea, чаги (гриб) (Inonotus obliquus) - PE-Io и смеси (девясила, чистотела, хвоща и чаги) - PE-PM.

Анализ аминокислотного состава. К 0,2-0,3 мг пептидного экстракта в реакционных пробирках (vacuum reaction tube, PIERCE, USA) добавляли 0,2 мл смеси конц. НС1 - пропионовой кислоты (50:50 v/v, PIERCE, USA). Пробирки замораживали, ва-куумировали на водоструйном насосе и нагревали при 140°С 2,5 часа. Раствор из пробирок упаривали, к остатку добавляли 0,2 мл деионизованной воды и еще раз упаривали. Сухой остаток растворяли в 0,1-0,2 мл буфера А, содержащего в 1 л 8,20 г ацетата натрия, 75,0 мл метанола, 5,0 мл ледяной уксусной кислоты, 4,0 мл муравьиной кислоты и 100 мкл каприловой кислоты, рН 3.30; центрифугировали. Анализ аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе Biotronik LC-3000 (Biotronik, Германия). Пробу в объеме 20 мкл наносили на колонку 4x125 мм со смолой ВТС-2410 и элюиро-вали последовательно системой буферных растворов по протоколам фирмы Biotronik (Германия). Скорость элюции - 0,2 мл/мин. Для визуализации использовали раствор нингидрина, содержащий 20 г нингидрина, 0,6 г гидриндантина, 50 мл фенола, 550 мл монометилового эфира этиленгликоля и 400 мл 4 М ацетата натрия (рН 5.5). Детекцию проводили при 440 и 570 нм.

Ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Ионообменную ВЭЖХ проводили на аминокислотном анализаторе LC 3000 (Biotronik, Германия) по методике, разработанной в лаборатории химии пептидов ИБХ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Пептидные экстракты растворяли в 20-60 мкл буфера, содержащего в 1 л 0,82 г ацетата натрия, 75,0 мл метанола, 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мкл каприловой кислоты и 10 % муравьиной кислоты, так чтобы концентрация пептидов составляла 10-100 мг/мл, и наносили на колонку 1 х 125 мм со смолой ВТ-2410 (Biotronik, Германия), уравновешенную буфером А.

Для элюции использовали: буфер А, буфер Б, содержащий в 1 л 4,0 г гидроксида натрия, 2,7 мл ледяной уксусной кислоты, 2,5 мл муравьиной кислоты и 100 мкл каприловой кислоты, рН 3.60; буфер В, содержащий в 1 л 4,0 г гидроксида натрия, 2,7 мл ледяной уксусной кислоты, 2,5 мл муравьиной кислоты и 100 мкл каприловой кислоты, рН 4.90, и буфер Г, содержащий в 1 л 1,0 мл ледяной уксусной кислоты, 83 мМ тринат-рий-фосфата, 1,0 г EDTA и 100 мкл каприловой кислоты, рН 10.50.

Пептиды элюировали последовательно буфером А (30,5 мин при 40°С), Б (7,5 мин при 60°С), В (12 мин при 60°С) и Г (27 мин при 60°С). Скорость элюции 0,2 мл/мин. Для визуализации использовали раствор нингидрина. Детекцию проводили при 440 и 570 нм.

Данные анализа фиксировали в виде хроматограмм и в виде пептидограмм, полученных с помощью компьютерной программы реализованной с помощью Delphi 7.0 (лаборатория химии пептидов ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).

Методика биологических испытаний пептидных экстрактов

Для исследования противоопухолевой активности использовали зарегистрированную линию мышей CBRB-Rb(8.17)1Iem (далее называемые СBRB) [11]. Были использованы самцы данной линии в возрасте 4.5+0.5 месяцев (в каждой группе по 7-9 животных). На день 0 реципиентам были перевиты 106 опухолевых клеток, полученных из медленно растущей спонтанной аденокарциномы молочных желез сингенной

самки по разработанной ранее методике [12]. На следующий день опытным животным однократно подкожно в область перевивки ввели пептидные экстракты растений в количестве 1 мг в объеме 0,1 мл физиологического раствора. Контрольным животным вводили таким же образом одновременно лишь физиологический раствор в том же объеме.

Противораковую активность препаратов оценивали по динамике появления и роста перевитого пальпируемого РМЖ мышей. Измеряли три взаимно перпендикулярных размера опухоли и на основании полученных данных вычисляли средний диаметр опухоли для каждого реципиента, как описано ранее [12]. Результаты оценивали с использованием ^критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Получение и анализ пептидных экстрактов из растений. Полученные пептидные экстракты подвергали аминокислотному анализу и анализу пептидного состава.

Анализ аминокислотного состава пептидных экстрактов. В табл. 1 показано различие в соотношениях аминокислот в полученных пептидных экстрактах.

Аминокислота (нмоль/проба) Растительное сырье

PE-Ih PE-Hp PE-Ln PE-Io PE-Cm PE-Ea PE-PM

Asp 2.49 2.9б 2.71 8.21 5.95 4.04 5.1б

Glu 1.56 4.5б 2.95 9.13 5.2б 5. 31 7.24

Thr 0.01 0.б1 1.42 0.55 1.57 1.б2 1.52

Ser 0.01 0.79 1.45 1.43 1.47 1.85 1.б3

Pro 2.56 1.83 1.84 0.49 1.85 2.38 2.23

Gly 0.67 2.4б 2.31 3.49 3.4б 3.22 3.7б

Ala 0.01 1.01 1.53 0.б4 1.9б 2.28 1.02

Val 0.01 0.42 0.98 0.27 1.13 1.24 0.87

Met 0.01 0.01 0.18 0.01 0.29 0.37 0.22

Ile 0.01 0.0б 0.51 0.01 0.б5 0.б8 0.2б

Leu 0.01 0.22 0.83 0.01 0.88 0.98 0.33

Phe 0.01 0.01 0.2б 0.01 0.04 0.35 0.02

Tyr 0.01 0.01 0.79 0.01 0.0б 0.71 0.03

His 0.55 0.32 0.58 0.53 0.07 0.11 0.27

Lys 1.05 1.08 2.15 1.42 1.5б 1.37 1.74

Arg 17.8 0.б1 0.48 0.82 0.б1 0.41 2.59

Таблица 1. Аминокислотный состав гидролизатов пептидных экстрактов из растительного сырья

Все пептидные экстракты содержат относительно малое количество метионина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, гистидина, небольшие количества ала-нина, треонина, серина, валина, лизина. Некоторые экстракты, например, экстракт из девясила, содержит относительно малое количество гидрофобных аминокислот и значительное количество заряженных аминокислот и пролина. Содержание аргинина в этом препарате намного больше, чем в других пептидных экстрактах. В пептидном экстракте из зверобоя большое содержание глутаминовой кислоты. Пептидный экстракт из чаги богат аспарагиновой и глутаминовой кислотами, но содержит мало гидрофобных аминокислот. Пептидный экстракт из смеси растений и гриба чаги богат глутаминовой и апарагиновой кислотами и глицином.

На основании данных количественного анализа аминокислот после гидролиза в пептидных экстрактах содержание пептидного материала составляет 85-95%.

Сравнительный анализ биологических активностей пептидных экстрактов.

Для тестирования противоракового эффекта однократной инъекции пептидных экстрактов была использована перевивка из медленно растущей спонтанной аденокарци-номы молочных желез мышей СВЯВ. Эта модель позволила проследить динамику как появления, так и последующего роста пальпируемых опухолей в течение четырех недель после перевивки.

Динамика появления пальпируемых РМЖ по группам представлена на рис. 1 как доля мышей с уже появившимися опухолями. Как видно из представленных данных, исследуемые препараты отличались по степени и продолжительности проявленной противоопухолевой активности, оказав или краткосрочное (первая неделя) или долгосрочное действие (вплоть до третьей недели после перевивки опухоли).

И1 нед. Р2 нед.

Рис. 1. Задержка появления опухолей у мышей CBRB, однократно обработанных

пептидными экстрактами растений

На первую неделю после перевивки задержка появления опухолей была выявлена для всех пептидных экстрактов. Пальпируемые опухоли были обнаружены у 33% леченых мышей, в то время как в контроле опухоли пальпировались уже у 60% мышей.

На вторую неделю после перевивки задержку появления опухолей наблюдали только в группах, однократно обработанных пептидными экстрактами РЕ-Нр и РЕ-РМ. Пальпируемые опухоли были обнаружены у 67% леченых мышей, в то время как в контроле опухоли пальпировались уже у 100% мышей.

Таким образом, однократные инъекции пептидным экстрактом РЕ-Ьи оказала краткосрочное влияние на динамику появления опухолей. Наиболее длительную задержку появления опухолей наблюдали у мышей, обработанных пептидными экстрактами РЕ-РМ и РЕ-Нр.

На рис. 2 представлена динамика роста опухолей у мышей, однократно леченных пептидными экстрактами. Достоверное замедление роста опухолей на 20 и 25% на четвертую неделю после перевивки наблюдали только для пептидов РЕ-Нр и РЕ-РМ, соответственно. Под действием пептидного экстракта из лавра РЕ-Ьи рост опухолей практически не отличался от контроля.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы. Экстракты из зверобоя продырявленного и смеси растений обладали выраженной противоопухолевой активностью после локальной однократной инъекции РМЖ мышей

СВЯВ. Пептидный экстракт из лавра благородного оказал лишь краткосрочное действие на динамику появления и роста пальпируемого РМЖ.

недели

»контр  л* РБ-Ир РЕ-РМ

Рис. 2. Замедление роста опухолей у мышей ОВРВ, однократно обработанных

пептидными экстрактами

Сравнительный анализ компонентов пептидных экстрактов методом ионообменной ВЭЖХ. Анализ компонентов проводили с помощью ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Результаты анализов представлены на рис. 3-10 в виде хроматограмм и пептидограмм. Пептидограммы построены из данных хроматограмм в виде зависимости времени выхода пика и его площади в логарифмической шкале, что позволяет проводить сравнительный анализ различных пептидных экстрактов, выявляя сходные и различные по хроматографическим данным компоненты.

Рис. 3. Данные ВЭЖХ анализа состава РЕ-!И А - хроматограмма; Б - пептидограмма

Рис. 4. Данные ВЭЖХ анализа состава РЕ-Нр А - хроматограмма; Б - пептидограмма

Рис. 5. Данные ВЭЖХ анализа состава РЕ-Ьп А - хроматограмма; Б - пептидограмма

Рис. 6. Данные ВЭЖХ анализа состава РЕ-Еа А - хроматограмма; Б - пептидограмма

На рис. 7 представлены данных ВЭЖХ состава РЕ-1о. В пептидном экстракте, полученном из чаги, наименьшее количество пептидных компонентов.

Рис. 7. Данные ВЭЖХ анализа состава PE-Io А - хроматограмма; Б - пептидограмма

Рис. 8. Данные ВЭЖХ анализа состава PE-Cm А - хроматограмма; Б - пептидограмма

Рис. 9. Данные ВЭЖХ анализа состава PE-PM А - хроматограмма; Б - пептидограмма

Для пептидных экстрактов PE-Hp и PE-PM, обладающих противоопухолевой активностью, провели сравнительный анализ пептидограмм на наличие сходных и различных компонентов. На рис. 10 представлены пептидограммы препаратов PE-PM и PE-Hp, из которых следует, что лишь 6 пептидных фракций в обоих препаратах имеют одинаковую хроматографическую подвижность, а остальные фракции, представленные на рис.10, характерны лишь для сравниваемых экстрактов.

Рис. 10. Индивидуальные компоненты на основании сравнительного анализа пептидо-

грамм PE-PM и PE-Hp

Можно предположить, что именно совпадающие по подвижности при хроматографии компоненты определяют противоопухолевую активность данных двух препаратов.

Заключение

Выделено семь пептидных экстрактов из растительного лекарственного сырья. Методика включает экстракцию исследуемого растительного лекарственного материала уксусной кислотой с последующим осаждением пептидной фракции добавлением ацетона. Пептидные экстракты охарактеризованы аминокислотным составом и данными хроматографического анализа методом ионообменной ВЭЖХ. Изучена биологическая активность пептидных экстрактов на мышиной модели РМЖ. Результаты биологических испытаний показали, что для дальнейших исследований наиболее перспективными являются пептидные препараты из зверобоя продырявленного - PE-Hp, чистотела большого, девясила высокого, хвоща полевого и гриба чаги - PE-PM.

Литература

1. Старинский В.В., Мирабишвилли В.М., Грецова О.П., Дьяченко О.Т., Простов Ю.И., Цветкова Т.Л., Аналькова Т.А. Развитие системы популяционных раковых регистров в России // Вопросы онкологии. - 2003. - Т. 49. - С. 422-426.

2. American Cancer Society: Cancer facts and figures, 2003. - Режим доступа: [http://www.cancer.org/downloads/STT/CAFF2003PWSecured.pdf]

3. Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А., Шретер А.И., Биологически активные вещества растительного происхождения. - М.: Наука, 2001. Т. 1. - 349 с.

4. Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. - М.: Практическая медицина, 2005. -270 с.

5. Craik D.J., Cemazar M., Daly N.L. The chemistry and biology of cyclotides // Curr.Opin Drug Discov Devel., 2007. - V. 10. - P. 176-184.

6. Svangard E., Burman R., Gunasekera S., Lovborg H., Gullbo J., Goransson U. Mechanism of action of cytotoxic cyclotides: cycloviolacin O2 disrupts lipid membranes // J Nat Prod. - 2007. - V. 70. - P. 643-647.

7. Svangard E., Goransson U., Hocaoglu Z., Gullbo J., Larsson R., Claeson P., Bohlin L. Cytotoxic cyclotides from Viola tricolor // J. Nat. Prod. - 2004. - V. 67. - P. 144-147.

8. Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А., Шретер А.И. Биологически активные вещества растительного происхождения. - М.: Наука, 2001. Т. 2. - 763 с. Т.3. -216 с.

9. Пустырников И.Н., Прохоров В.Н. Универсальная энциклопедия лекарственных растений. - М.: Книжный дом «Махаон», 2000. - 656 с.

10. Шваб О.В., Тришкин С.В., Шепель Е.Н., Васьковский Б.В., Сухих Г.Т., Демуш-кин В.П. Анализ пептидов из тканей животных и растений // Биоорганическая химия. - 1999. - Т. 25. - С. 20-24.

11. The Mouse Tumour Biology Database, 1999. - Режим доступа: [http://www.informatics.jax.org/external/festing/mouse/docs/CBRB.shtml]

12. Moiseeva E.V., Merkulova I.B., Bijleveld C., Koten J.W., Miroshnikov A.I., Den Otter W. Therapeutid effect of a single peritumoural dose of IL-2 on transplanted murine breast cancer // Cancer Immunol. Immunother. - 2003. - V. 8. - P. 487-496.