СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2,3,7-ТРИОКСИЮГЛОНА (СПИНОХРОМА В)
METHOD FOR PRODUCING 2,3,7-TRIOXYJUGLONE (SPINOCHROME B)

Изобретение относится к технологии переработки природных объектов и касается способа получения пигмента спинохрома В из отходов переработки промысловых морских ежей вида Strongylocentrotus intermedius.
Структура спинохрома В впервые была установлена Куродой [Kuroda С, Koyasu К. // Proceedings of the Imperial Academy. 1944. V. 20. N. 1. P. 23-25.] и подтверждена Андерсоном [Anderson H.A. et al. // Comp.Biochem. Physiol. 1969. V. 28. P. 333-345]. Показано, что доминирующим пигментом промыслового морского ежа S. intermedius является спинохром В [Li D. - M. et al. // Eur. Food Res. Technol. DOI 10.1007/s00217-013-1996-8].
Известно, что пигменты морских ежей являются эффективными антиоксидантами. Антиоксидантные свойства спинохромов были изучены на моделях инициированного окисления алкилбензолов, термического окисления метиленолеата и окисления минеральных и растительных масел. Константа взаимодействия спинохромов с перекисными радикалами существенно превышает эффект ионола и природного антиоксиданта токоферола [Кольцова Е.А. и др. Хиноидные пигменты иглокожих // Рукопись деп. ВИНИТИ. 1974. №106. С. 74; Карпов Р.С., Дудко В.А. Атеросклероз: патогенез, клиника, функциональная диагностика, лечение // Томск.: Изд. STT, 1998. 672 с.]. Кроме того, нафтохиноны проявляют цитотоксическую активность в отношении различных линий опухолевых клеток [Thomson R.Н. Naturally Occurring guinones // London N-Y: Academic Press, 1971. 2 ed. p 257-276].
Наряду с известными антиоксидантами морских ежей, такими как эхинохром А, спинохром А, спинохром Е [RU 2283298 С1, 10.09.2006; Лебедев А.В. и др. // Вопросы медицинской химии. 1999. Т: 45(2). С. 123-130; RU 2362573 С1, 27.07.2009, RU 2411939 С1, 20.02.2011], спинохром В проявляет антиоксидантную активность [Li D. - M. et al. // Eur Food Res Technol DOI 10.1007/s00217-013-1996-8; Kuwahara R. et al. // Food Science and Technology. 2010. V. 43. P. 1185-1190; Pozharitskaya O.N. et al. // Planta Med. 2013. V. 79(18). Р.1698-1704].
Кроме антиоксидантной активности спинохром В проявляет ярко выраженные антиаллергенные свойства. В настоящее время аллергии различной этиологии являются широко распространенными заболеваниями. Спинохром В оказался эффективным при лечении аллергического конъюнктивита и местных раздражений кожи [Pozharitskaya O.N. et al. // Planta Med. 2013. V. 79(18). Р. 1698-1704].
Известен способ получения пигментов из панцирей красных морских ежей Strongylocentrotus franciscanus [Amarowicz R. et al. // Food Chemistry. 1994. V. 51 P. 227-229]. Замороженное сырье оттаивают, внутренние органы удаляют, панцири промывают холодной водой, высушивают на воздухе при 20°C в течение 24 ч, сухие панцири измельчают в блендере. Размолотые панцири растворяют в 10%-ной HCl при комнатной температуре, затем экстрагируют диэтиловым эфиром (1:1 по объему), эфирный слой промывают водой, высушивают над безводным сульфатом натрия. Растворитель удаляют потоком азота. Осадок растворяют в метаноле, помещают на колонку с Sephadex LH-20 и элюируют метанолом. Идентификация состава проводится на спектрофотометре. Определяли фракцию, содержащую спинохром В, по абсорбционному максимуму при 270, 324 и 464 нм.
Известен способ получения суммы хиноидных пигментов из морских ежей Strongylocentrotus droebachiensis путем дефростации замороженного сырья, удаления внутренностей, промывки водой, высушивания, измельчения, растворения в концентрированной соляной кислоте, экстрагирования серным эфиром, промывания эфирного слоя 10%-ным NaCl, упаривания, растворения в этиловом спирте, концентрирования и разделения методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на стеклянных пластинках с кизельгелем в системе: хлороформ: метанол: уксусная кислота: вода, высушивания, элюирования метанолом и идентификацией методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). [Shikov A.N. et al. // Journal of Chromatography A. 2011. V 1218. P. 9111-9114].
Однако известные способы не обеспечивают получения индивидуального пигмента - спинохрома В, в них используются высокотоксичные и пожароопасные растворители - диэтиловый эфир и метанол. Они относятся к лабораторно-аналитическим способам получения суммы хиноидных пигментов и не пригодны для технологических целей.
В качестве прототипа выбран способ получения спинохрома В из игл морского ежа Strongylocentrotus intermedius [Li D. - M. et al. // Eur Food Res Technol DOI 10.1007/s00217-013-1996-8]. Собранные иглы промывают холодной водой, лиофилизуют и измельчают до порошкообразного состояния. Порошок растворяют в водном растворе неорганической кислоты, центрифугируют, нейтрализуют и повторно центрифугируют. Хроматографию образца проводят в статическом режиме на полярной макропористой смоле, соотношение сорбент - образец 1:10. Десорбцию проводят этиловым спиртом, элюат упаривают на роторном испарителе до удаления этанола.
Разделение спинохромов и идентификацию состава проводят методом ВЭЖХ масс-спектрометрии при 475 нм. Получают образец, содержащий преимущественно спинохром В неопределенной концентрации.
Однако этот способ относится к лабораторно-аналитическим способам. Одноступенчатая хроматография в статическом режиме не дает возможности разделять сумму пигментов на индивидуальные компоненты, поэтому способ-прототип не обеспечивает получения спинохрома В высокой степени очистки. Спинохром В выделен в виде индивидуального вещества только методом ВЭЖХ с целью его идентификации, что неприемлемо в промышленном масштабе. В качестве сырья используют только иглы морских ежей, а не полностью весь биоминеральный панцирь, содержащий идентичный набор спинохромов.
Морские ежи вида S. intermedius являются основным промысловым видом япономорского побережья России благодаря значительным запасам биомассы и высоких товарных показателей пищевых гонад [Левин B.C., Коробков В.А. Морские ежи России. Биология, промысел, использование // СПб.: Изд. ДОРН, 2003. 256 с.]. Панцири и иглы морских ежей являются промышленными отходами.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении спектра биологически активных веществ, получаемых из отходов промышленной переработки промысловых морских ежей S. intermedius, что обеспечивает технологичность заявляемого способа.
Технический результат заключается также в повышении степени очистки целевого продукта. В результате осуществления заявляемого способа получают индивидуальное соединение - спинохром В, являющееся эффективным антиоксидантом и проявляющее антиаллергические свойства.
Заявляемый способ получения 2,3,7-триоксиюглона (спинохрома В) заключается в следующем.
Панцири с иглами промысловых морских ежей S. intermedius, оставшиеся после извлечения гонад, свежие, дефростированные или законсервированные, промывают водой для удаления внутренностей, механических примесей и морских солей. При использовании консервированного сырья консервант предварительно отделяют декантацией. Содержащиеся в сырье вещества липидной природы удаляют экстракционной промывкой 96%-ным этиловым спиртом с последующей регенерацией этанола. Обезжиренное сырье высушивают на воздухе или в сушильном шкафу с принудительной вентиляцией при температуре 30-40°C. Высушенное сырье измельчают.
Затем подготовленное сырье деминерализуют стехиометрическим количеством концентрированной фосфорной кислоты (соотношение сырье: кислота 5:1) с последующим добавлением дистиллированной воды при соотношении кислота: вода 2:(1-0,5) для улучшения отвода образующегося в ходе процесса углекислого газа.
Полученный продукт экстрагируют 96%-ным этиловым спиртом трехкратно при соотношении продукт: этанол (1:1,0-1,2) в течение 10-14 ч. Затем спиртовый экстракт интенсивного красного цвета отделяют фильтрованием с последующим центрифугированием. Он содержит суммарный пигментный комплекс морских ежей S. intermedius и имеет pH 3-3,5.
Далее суммарный спиртовый комплекс спинохромов очищают от посторонних примесей на хитозане. Для этого спиртовые экстракты объединяют и пропускают через хроматографическую колонку, заполненную хитозаном. Остаточная кислотность этанольного экстракта не позволяет полигидроксинафтохинонам сорбироваться на хитозане. Спинохромы проходят колонку с хитозаном без задержки. В то же время содержащиеся в экстракте примесные соединения закрепляются на хитозане. В частности, таким образом, происходит разделение нафтохинонов и бинафтохинонов.
Затем этанольный раствор нафтохинонов упаривают досуха, остаток растворяют в дистиллированной воде. Спинохром В выделяют из пигментного комплекса на гидрофобном сорбенте полихром-1. Водный раствор пигментного комплекса, полученный на предыдущей стадии, фильтруют и пропускают через хроматографическую колонку с полихромом-1. Адсорбированные компоненты отмывают от кислоты дистиллированной водой. Элюирование спинохрома В осуществляют 5%-ным водным раствором этилового спирта. Элюат упаривают в вакууме досуха. Затем сухой остаток растворяют в этилацетате и высаживают спинохром В гексаном. Полученный микрокристаллический осадок отфильтровывают, промывают гексаном и высушивают в вакуумном сушильном шкафу при температуре не выше 60°C.
Технологичность заявляемого способа обеспечивают следующие процедуры.
Применение деминерализации отходов промышленной переработки гидробионтов (панцирей и игл морских ежей), а не трудоемкой и не приемлемой в промышленном масштабе процедуры сбора и измельчения игл морских ежей до порошкообразного состояния, как в способе-прототипе.
Использование очистки экстракта, содержащего суммарный пигментный комплекс, от примесных соединений на хитозане и колоночной хроматографии на полихроме-1, позволяющей избирательно извлекать спинохром В из суммы пигментов, а не хроматографии на макропористой смоле в статическом режиме, как в способе-прототипе, не имеющей достаточной разрешающей способности для избирательного извлечения индивидуальных соединений из суммы пигментов.
Проведение высаждения спинохрома В гексаном из этилацетата, обеспечивающего получение индивидуального соединения - спинохрома В, что не предусматривает способ-прототип.
Для подтверждения чистоты продукта проведен анализ образцов спинохрома В методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
ВЭЖХ проводили на хроматографе «LaChrom» (Merck Hitachi), снабженном УФ детектором L-7400, насосом L-7100, термостатом L-7300, интегратором D-7500 и колонкой Agilent Technologies Zorbax Eclipse XDB-C18, 5 µm (75 мм×4.6 мм) с защитной колонкой Hypersil ODS, 5 µm (4.0 мм×4.0 мм). Колонку термостатировали при 30°C. Разделение примесей проводили смесью растворителей: А (вода+1% ледяной уксусной кислоты) и В (ацетонитрил+1% ледяной уксусной кислоты) в следующем режиме: 0-5 мин - изократический, 90% А, 10% В; 5-35 мин градиентный, 90-10% А, 10-90% В. Скорость подачи растворителей 1 мл/мин. Детектирование проводили при 270 нм.
На фиг. 1 представлена ВЭЖХ суммы спинохромов S. intermedius (элюат с хитозана).
На фиг. 2 представлена ВЭЖХ смеси спинохромов S. intermedius, полученной в результате гидрофобной хроматографии на полихроме-1.
На фиг. 3 представлена ВЭЖХ микрокристаллического осадка спинохрома В.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример
Панцири с иглами морских ежей Strongylocentrotus intermedius, оставшиеся после извлечения гонад, свежие или дефростированные, в количестве 10 кг промывают питьевой водой для удаления механических примесей, морских солей. Затем сырье обезжиривают 10 л 96%-ного этилового спирта. Спирт этиловый регенерируют. Сырье высушивают в темноте и дробят. Измельченное сырье загружают в реактор-экстрактор, добавляют 2,2 л концентрированной фосфорной кислоты, а затем последовательно, порционно добавляют 1 л дистиллированной воды.
После разложения кальциевого скелета и прекращения газообразования полученный продукт трехкратно экстрагируют 96%-ным этиловым спиртом (3×11 л). Экстракцию проводят в течение 12 ч при комнатной температуре. Затем экстракты, содержащие комплекс нафтохинонов, объединяют, фильтруют через тканевый фильтр и центрифугируют. Полученный спиртовый экстракт имеет pH 3,5.
Далее спиртовый экстракт в количестве 33 л пропускают через колонку с 0,5 кг измельченного хитозана, уравновешенного 96%-ным этиловым спиртом. Примесные соединения сорбируются на хитозане. Регенерацию колонки проводят 2 л 96%-ного этилового спирта.
Затем полученный элюат, содержащий комплекс спинохромов, упаривают в вакууме досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 л дистиллированной воды. Раствор фильтруют и пропускают через колонку с 0,5 кг полихрома-1, уравновешенную дистиллированной водой. При этом пигменты адсорбируются на полихроме-1. Адсорбированные пигменты отмывают от кислоты 2 л дистиллированной воды. Далее элюируют спинохром В с колонки 2 л 5%-ного водного раствора этилового спирта. Полученный элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,2 л этилацетата и высаждают спинохром В 0,5 л гексана, осадок отфильтровывают, промывают гексаном и высушивают в вакуумном сушильном шкафу при температуре не выше 60°C.
Выход продукта составляет 2,72 г (0,0272% от веса исходного сырья) с чистотой 80-90%.