УСТРОЙСТВО ДЛЯ МОНИТОРИНГА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЭТИЛОВОГО СПИРТА В ФЕРМЕНТАЦИОННОЙ СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ УКСУСНУЮ КИСЛОТУ

Полезная модель относится к области пищевой биотехнологии, а именно, ферментационному процессу получения уксусной кислоты. Также полезная модель относится к области разработок биосенсоров. В данной полезной модели биосенсор используется для определения содержания этилового спирта в присутствии уксусной кислоты в процессе микробиологического производства уксуса из пищевого сырья.
Получение уксуса промышленным микробиологическим способом основано на окислении этилового спирта уксуснокислыми бактериями. В производстве уксусной кислоты для оптимального проведения технологического процесса необходимо иметь информацию о содержании количества наработанной уксусной кислоты; данная информация может быть получена путем измерения содержания этилового спирта. На начальной стадии процесса в ферментере находится его максимальное количество, которое снижается в процессе роста содержания уксусной кислоты. Снижение концентрации этилового спирта до определенного уровня свидетельствует о завершении процесса (Бекер М.Е. Введение в биотехнологию. М.: Пищевая промышленность, 1978. С.143-145). Это дает основание судить о фазе процесса наработки уксусной кислоты по содержанию этилового спирта.
Для контроля ферментационного процесса получения уксусной кислоты используют такие параметры как концентрация уксусной кислоты и этилового спирта (Hekmat D., Vortmeyer D. Measurement, control, and modeling of submerged acetic acid fermentation // Journal of fermentation and bioengineering. 1992. V. 73. №1. P. 26-30).
Для определения алифатических спиртов применяют в основном методы газовой (Clarkson S.P., Onnrod I.H.L., Sharpe F.R. Determination of ethanol in beer by direct injection gas chromatography. A comparison of 6 identical systems // J. Inst. Brew. 1995. V. 101. P. 191-193) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (Liden H., Vijayakumar A.R., Gorton L., Marko Varga G. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. Pharm. Biomed. Anal. 1998. V. 17. P. 1111-1128); используют также методы спектрофотометрии (Wilson Scoggins M. Determination of trace quantities of alcohols by ultraviolet spectrophotometry of alkyl nitrobenzoates // Anal. Chem. 1964. V. 36. №6. P. 1152 - 1154), рефрактометрии (Williams S. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 15th ed. Inc. Washington DC: Association of Official Analytical Chemists. 1990. P. 702). Однако, несмотря на низкие пределы обнаружения спиртов, общими недостатками этих методов являются сложность применяемого оборудования, в некоторых случаях - пробоподготовки, а также длительность анализа. На результаты рефрактометрического определения оказывают влияние цвет и неоднородность раствора (Wagner К., Bilitewski U., Schmid R.D. Flow injection analysis of wine - accomplishments and needs // Microchemical Journal. 1992. V. 45. P. 114-120).
Содержание уксусной кислоты определяют методом газовой хроматографии (Brett J. Savary, Alberto Nuñez. Gas chromatography-mass spectrometry method for determining the methanol and acetic acid contents of pectin using headspace solid-phase microextraction and stable isotope dilution. Journal of Chromatography A. 2003. V. 1017. №1-2. P. 151-159). Данный метод является довольно длительным и сложным для мониторинга ферментационного процесса в режиме реального времени.
Существуют различные биосенсорные подходы для детекции этилового спирта и уксусной кислоты, основанные на использовании ферментов или клеток микроорганизмов. Один из принципов анализа основан на детекции кислорода, являющегося косубстратом реакции окисления этанола, уксусной кислоты. Скорость поглощения кислорода рецепторным элементом биосенсора пропорциональна концентрации уксусной кислоты (Hikuma M., Kubo Т., Yasuda Т., Karube I., Suzuki S. Amperometric determination of acetic acid with immobilized Trichosporon brassicae // Analytica Chimica Acta. 1979. V. 109. P. 33-38) или этанола (Hikuma M. Microbial electrode sensor for alcohols // Biotechnol. Bioeng. 1979. V. 21. №10. P. 1845-1853).
Ниже перечислены аналоги предлагаемого микробного сенсора для контроля концентрации этилового спирта. Так, описаны биосенсоры на основе клеток микроорганизмов и кислородного электрода для детекции этилового спирта. Один из первых промышленно выпускаемых этанольных сенсоров включал иммобилизованные клетки Trichosporon brassicae и кислородный электрод (Hikuma M. Microbial electrode sensor for alcohols // Biotechnol. Bioeng. 1979. V. 21. №10. P. 1845-1853). Время отклика сенсора составляло 6 мин. Линейная зависимость между уменьшением тока и концентрацией этанола наблюдалась в диапазоне концентраций от 2 до 22.5 мг/л. Разностный токовый сигнал был воспроизводим с относительной погрешностью 6%. Стабильность сенсора составляла 3 недели. Сенсор был покрыт газопроницаемой мембраной и не проявлял чувствительности к таким летучим соединениям как метанол, муравьиная, уксусная и пропионовая кислоты, а также к нелетучим веществам (углеводам и аминокислотам).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Разработаны два типа электрохимических биосенсоров для детекции спиртов на основе мутантных клеток метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha (Gonchar M.V., Maidan M.M., Moroz O.M., Woodward J.R. Sibirny A.A. Microbial О- and HO-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements // Biosens. Bioelectron 1998. V. 13. P. 945-952.). Клетки были иммобилизованы в кальций-альгинатный гель и помещены на поверхность O или НО-электрода. Биосенсор на основе O-электрода содержал мутантные клетки с повышенной алкогольоксидазной активностью. Биосенсор, использующий в качестве преобразователя НO-электрод, содержал мутантные клетки, дефицитные по каталазе, которые продуцировали НО при окислении спирта. Оба штамма были обработаны дигитонином, что позволяло значительно снизить чувствительность к глюкозе и глицерину и повысить селективность биосенсоров. Линейные диапазоны определения этанола и метанола для биосенсора на основе кислородного электрода составляли 0.2-1.2 и 0.4-4.0 мМ, соответственно. Биосенсор, основанный на детекции пероксида водорода, позволял определять этанол и метанол в диапазонах 0.03-0.35 мМ и 0.05-1.2 мМ, соответственно.
Амперометрический биосенсор на основе клеток Candida tropicalis, содержащих АО, представлен в работе (Akyilmaz E., Dinçkaуa E. A new enzyme electrode based on ascorbate oxidase immobilized in gelatin for specific determination of L-ascorbic acid // Talanta. 1999. V. 50. P. 87-93). Клетки иммобилизовали в желатине с добавлением глутарового альдегида. Детекция этанола была основана на регистрации дыхательной активности клеток с помощью кислородного датчика. Ответ микробного сенсора линейно зависел от концентрации этанола в диапазоне 0.5-7.5 мМ, время ответа составляло при этом 2 мин.
В качестве прототипа использован амперометрический биосенсор на основе клеток Gluconobacter suboxydans, разработанный Karube с соавт.(Kitagawa Y., Ameyama M., Nakashima К., Tamiya E. and Karube I.. Amperometric Alcohol Sensor Based on an Immobilised Bacteria Cell Membrane // Analyst. 1987. V. 112. P. 1747). Диапазон детекции этилового спирта составлял 5-25 мг/л. Сенсор был чувствителен также к пропанол-1 и бутанол-1 и нечувствителен к глюкозе. Стабильность сенсора составила 15 дней при падении активности за указанное время на 70%.
В отличие от вышеуказанного прототипа в предлагаемой модели используется штамм Gluconobacter oxydans BKM В-1280, принадлежащий Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ РАН). Другим отличием является использование натрий-фосфатного буферного раствора (в прототипе модели используется ацетатный буфер). Штамм, используемый при создании полезной модели, нечувствителен к высоким концентрациям уксусной кислоты (400 мМ (2.4%) в измеряемой пробе, которая разбавляется до 20 мМ (0.12%) в измеряемой кювете; изменение рН измеряемой среды при этом составляет ~1 рН). Штамм G. oxydans BKM В-1280 обладает способностью окислять ряд сахаров, в т.ч. глюкозу. В прототипе не представлены такие характеристики как чувствительность биосенсора в отношении детекции этанола при изменении рН среды, вызванное уксусной кислотой. В отношении данного биосенсора можно отметить, что его чувствительность в отношении этанола составляет 2.2 (нА/с)/мМ, а низший предел детекции составляет 12.5 мкМ. Оба данных параметра статистически достоверно не изменяются при измерениях в среде, содержащей указанную концентрацию уксусной кислоты.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель состоит в создании устройства для определения содержания этилового спирта в присутствие высоких концентрация уксусной кислоты.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обладает устойчивостью к пробам, содержащим уксусную кислоту и высокой чувствительностью к этиловому спирту.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения этилового спирта включает электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий G. oxydans BKM В-1280. Штамм чувствителен к наличию этилового спирта и нечувствителен к уксусной кислоте (Луста К., Решетилов А.Н. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. V. 34. Р. 339-353.)
На фиг.1 представлена схема устройства для определения этилового спирта в присутствии уксусной кислоты. Предлагаемое устройство включает следующие элементы: биосенсор, состоящий из преобразователя - электрода Кларка (1), на котором размещен биорецептор (2), представляющий собой иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий G. oxydans ВКМ В-1280, а также измерительную кювету (3) и магнитную мешалку (4).
Основным аналитическим параметром биосенсора является градуировочная зависимость. Для ее построения в измерительную кювету вносили различные концентрации этилового спирта. На фиг.2 представлена градуировочная зависимость сенсора на основе клеток штамма G. oxydans ВКМ В-1280 Диапазон определяемых концентраций этилового спирта составил 0.0125-2.00 мМ. Отклики сенсора были сняты в 30 мМ натрий-фосфатном буферном растворе с рН 6.6. Чувствительность в области линейного диапазона составила 2.2 (нА/с)/мМ.
Для этилового спирта (концентрация в пробе составляла 0.025%) исследованы рН - зависимости для различных буферных растворов (фиг.3). При использовании натрий-фосфатного буфера биорецептор стабилен в диапазоне значений рН 5-7 при анализе проб этилового спирта (кривая 2а). При анализе проб, содержащих этиловый спирт (0.025%) и уксусную кислоту (2.4%) (кривая 2б) ответы сенсора были стабильны в диапазоне рН 6-6.6.
Диапазон исследованных значений рН для цитратного буферного раствора (по Макилвэйну) составлял 3.2-7. Как видно из фиг.3 биорецептор без потери активности позволял выполнять измерения в диапазоне рН от 3.2 до 6.4. При рН 7 ошибка измерения превышала 10%.
При использовании буферного раствора, содержащего трис-малеат, диапазон исследованных значений рН составлял 5-6.1. Оптимальным рН для этого буферного раствора является рН 5, при остальных определяемых рН наблюдали заметное снижение ответов сенсора.
Тип буферного раствора оказывал влияние на абсолютную величину ответа сенсора. Так, при использовании цитратного буферного раствора получена наибольшая величина ответа сенсора. Однако при исследовании стабильности сенсора в нитратном буфере в течение 6 ч наблюдали снижение ответов сенсора. Таким образом, в качестве оптимального базового раствора был выбран натрий-фосфатный буферный раствор.
В производстве уксусной кислоты для оптимального проведения технологического процесса необходимо иметь информацию о содержании этилового спирта, поскольку его снижение до определенного конечного уровня (0.1%) свидетельствует о завершении процесса.
Был проведен анализ проб, моделирующих получение уксусной кислоты на различных этапах технологического процесса. Зависимость откликов сенсора от содержания этилового спирта в пробе уксусной кислоты представлена в Таблице 1. При анализе пробы, содержащей 9% уксусной кислоты (концентрация в измерительной кювете 0.11%) и 0.1% этилового спирта (0.00125% в кювете) рН буферного раствора снижался на единицу. Для анализа последующих проб разбавление составляло 800 и более раз, что практически не оказывало влияния на рН буферного раствора.
Таблица. 1.
Зависимость откликов сенсора от концентрации этилового спирта в модельной пробе.
Проба
pH проб
Разбавление проб буфером
рН проб в измерительной кювете
Начальное значение рН буфера
Отклик сенсора, нА/с
0.1% этанола в 9% уксусной кислоты
2.4
80 раз
5.5
6.6
0.201
1% этанола в 9% уксусной кислоты
2.4
800 раз
6.6
0.206
5% этанола в 5% уксусной кислоты
2.5
4000 раз
6.6
0.200
10% этанол
5.0
8000 раз
6.6
0.217
Таким образом, для оценки этилового спирта в анализируемых пробах необходимо их разбавление в 80 (конечное разбавление в кювете) и более раз. При использовании такого разбавления рН базового буферного раствора изменяется незначительно и не приводит к изменению величины ответа биосенсора.
Проведена оценка остаточного содержания этилового спирта образцах пищевого уксуса, полученного микробиологическим способом (Табл. 2). Коэффициент корреляции данных, полученных при использовании микробного и ферментного на основе алкогольоксидазы сенсоров составил 0.98.
Таблица 2.
Содержание остаточного этилового спирта в яблочном виноградном и виноградном уксусе.
Образец
Этанол, мМ
G. oxydans
Алкогольоксидаза
Яблочный уксус («Егорье»)
12.0±0.7
11.9±1.1
Яблочный уксус («Абрико»)
10.9±1.0
11.7±0.8
Виноградный уксус («Балтимор»)
16.6±1.2
14.9±1.1
Полученные данные показывают возможность мониторинга процесса уксусной кислоты как микробным, так и ферментным биосенсорами. Ферментный биосенсор, обладающий более высокой субстратной специфичностью по сравнению с микробным, может быть использован в качестве контрольного метода оценки общего содержания спиртов.
Таким образом, показана возможность анализа содержания этилового спирта в пробах с высоким содержанием уксусной кислоты микробным сенсором на основе Gluconobacter oxydans BKM В-1280. Исследован рабочий диапазон рН буферного раствора. Высокая степень разбавления проб не оказывает значительного влияния на рН буфера.