ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ООЦИТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

1. Способ получения человеческих стволовых клеток, включающий в себя
2
2
а) партеногенетическую активацию человеческого ооцита, где активация включает в себя i) контактирование ооцита с ионофором при высоком давлении кислорода (О) и ii) контактирование ооцита с ингибитором серин-треониновой киназы при низком давлении О;
2
b) культивирование активированного ооцита со стадии а) при низком давлении О до формирования бластоцисты;
2
с) перенос бластоцисты на слой питающих клеток и культивирование перенесенной бластоцисты при высоком давлении О;
d) механическое отделение клеточной массы внутренней области (ICM) от трофэктодермы бластоцисты со стадии с); и
е) культивирование клеток ICM со стадии d) на слое питающих клеток,
2
где стадию (е) культивирования ICM проводят при высоком давлении О.
2
2
2
2
2. Способ по п.1, в котором низкое давление Оподдерживают путем инкубации в среде газовой смеси, содержащей Ов концентрации, примерно составляющей от 2% Одо 5% О.
2
2
2
3. Способ по п.2, в котором среда газовой смеси дополнительно содержит примерно 5% СО и примерно от 90% Nдо 93% N.
2
2
2
4. Способ по п.1, в котором высокое давление Оподдерживают путем инкубации в среде газовой смеси, содержащей примерно 5% СО и примерно 20% О.
5. Способ по п.1, в котором ионофор выбран из группы, состоящей из иономицина и А23187.
6. Способ по п.1, в котором ингибитор серин-треониновой киназы выбран из группы, состоящей из стауроспорина, 2-аминопурина, сфингозина и 6-диметиламинопурина (DMAP).
7. Способ по п.1, в котором среда содержит сыворотку крови из пупочного канатика человека.
8. Способ по п.1, в котором слой питающих клеток содержит человеческие фибробласты.
9. Способ по п.8, в котором фибробласты являются фибробластами кожи человека в постнатальном периоде.
10. Выделенная стволовая клетка, полученная способом по п.1.
11. Способ активации человеческого ооцита, находящегося на стадии метафазы II, включающий в себя
а) инкубацию человеческого ооцита на стадии метафазы II в среде для оплодотворения в условиях in vitro (IVF);
b) инкубацию клетки со стадии а) в среде (IVF), содержащей ионофор;
с) инкубацию клетки со стадии b) в среде (IVF), содержащей ингибитор серин-треониновой киназы; и
d) инкубацию клетки со стадии с) в свежей среде IVF до формирования бластоцисты,
2
где стадии инкубации а) и b) проводят при высоком давлении О и где клеточная масса внутренней области (ICM), полученная из бластоцисты со стадии d), продуцирует культивируемые стволовые клетки.
2
2
2
12. Способ по п.11, в котором среда газовой смеси дополнительно содержит примерно 5% СО и примерно от 90% N до 93% N.
13. Выделенная клеточная масса внутренней области, полученная из ооцита по п.11.
14. Способ получения человеческих стволовых клеток из криоконсервированного ооцита или партенота, включающий в себя
а) микроинъецирование в цитоплазму ооцита или партенота криоконсервирующего агента;
b) замораживание ооцита или партенота до криогенной температуры для индукции вхождения ооцита или партенота в состояние покоя;
с) хранение ооцита или партенота в состоянии покоя;
d) размораживание ооцита или партенота;
2
2
е) партеногенетическую активацию ооцита со стадии d), включающую в себя i) контактирование ооцита с ионофором при высоком давлении О и ii) приведение ооцита в контакт с ингибитором серин-треониновой киназы при низком давлении О;
2
f) культивирование партенота со стадии d) или ооцита со стадии е) при низком давлении О до формирования бластоцисты;
g) отделение клеточной массы внутренней области (ICM) от трофэктодермы бластоцисты; и
h) культивирование клеток ICM со стадии g) на слое питающих клеток или субстрате внеклеточного матрикса (ЕСМ),
2
где стадию культивирования g) проводят при высоком давлении О.
15. Способ по п.14, в котором питающие клетки имеют человеческую природу.
16. Способ по п.14, в котором криоконсервирующий агент i) содержит сахар, ii) является по существу не проникающим в отношении мембран клеток млекопитающих и iii) сохраняет жизнеспособность ооцита или партенота, так, что их можно хранить временно в состоянии покоя и восстанавливать, по существу, до активного состояния.
17. Аутологичная стволовая клетка, полученная из партеногенетически активированного ооцита от человека-донора.
18. Стволовая клетка по п.17, обладающая, по существу, гаплотипом, идентичным гаплотипу ооцита донора.
19. Стволовая клетка по п.17, где стволовая клетка i) будет пролиферировать при культивировании в условиях in vitro в течение 1 года, ii) сохраняет способность к дифференцировке в производные эндодермальной, мезодермальной и эктодермальной тканей при культивировании, и iii) дифференцировка которой подавляется при культивировании на питающем слое из фибробластов.
20. Стволовая клетка по п.17, экспрессирующая один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 и ОСТ-4.
21. Дифференцированная клетка, происходящая из стволовой клетки, полученной из партеногенетически активированного ооцита от человека-донора.
22. Дифференцированная клетка по п.21, являющаяся гистосовместимой с донором ооцита.
23. Дифференцированная клетка по п.21, выбранная из группы, состоящей из нейрона, кардиоцита, клетки гладкой мускулатуры, клетки поперечно-полосатой мускулатуры, эндотелиальной клетки, остеобласта, олигодендроцита, гематопоэтической клетки, жировой клетки, стромальной клетки, хондроцита, астроцита, дендритной клетки, кератиноцита, клетки островков поджелудочной железы, клетки-предшественника лимфоидной ткани, тучной клетки, мезодермальной клетки и эндодермальной клетки.
24. Клеточная линия, содержащая аутологичные стволовые клетки, где стволовые клетки получены из партеногенетически активированных ооцитов от человека-донора.
25. Клеточная линия по п.24, где каждая клетка имеет кариотип 46, ХХ.
26. Клеточная линия по п.24, где каждая клетка является по существу генетически идентичной ооциту донора.
27. Библиотека стволовых клеток, содержащая аутологичные стволовые клетки, где стволовые клетки получены из партеногенетически активированных ооцитов от одного или более людей-доноров.
28. Библиотека по п.27, в которой каждый член библиотеки идентифицирован как полный «двойник», «полудвойник» или «неродственный» донору, по данным определения маркеров однонуклеотидного полиморфизма (SNP).
29. Библиотека по п.27, в которой донор ооцитов является гистосовместимым с членом библиотеки.
30. Библиотека по п.27, в которой член библиотеки геномно импринтирован соответственно природе донора ооцитов.
31. Банк клеток, содержащий криоконсервированные партеноты, где партеноты получены из партеногенетически активированных ооцитов от одного или более людей-доноров.
32. Банк клеток по п.31, в котором партеноты культивируют при низком давлении
2
О до формирования бластоцисты.
33. Банк клеток, содержащий криоконсервированные аутологичные стволовые клетки, где стволовые клетки получены из партеногенетически активированных ооцитов от одного или более людей-доноров.
34. Способ лечения нуждающегося в этом субъекта, включающий в себя введение клеточной композиции, содержащей дифференцированные клетки, где дифференцированные клетки происходят из стволовой клетки, полученной из партеногенетически активированного ооцита от человека-донора.
35. Способ получения клонированных человеческих эмбриональных линий стволовых клеток, включающий в себя
а) удаление первого пронуклеуса из предварительно оплодотворенного человеческого ооцита;
b) перенос второго пронуклеуса в энуклеированный ооцит со стадии а), где второй пронуклеус получен из
i) ооцита донора или ооцита от матери донора, или
ii) партеногенетически активированного ооцита, где пронуклеус ооцита замещен на ядро соматической клетки донора до активации; и
с) культивирование полученного ооцита со стадии b) до формирования бластоцисты,
где клеточная масса внутренней области бластоцисты содержит эмбриональные стволовые клетки.