Реакцияантиоксидантной системы мышей с асцитной карциномой Эрлиха на действие комбинированных постоянного и низкочастотного перемел ii1о1о магнитных полей

Сергеева Е.Ю., Титова Н.М., Щербинина A.C., Сергеев Н.В.

РЕАКЦИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ МЫШЕЙ С АСЦИТНОЙ КАРЦИНОМОЙ ЭРЛИХА НАДЕЙСТВИЕ КОМБИНИРОВАННЫХ

ПОСТОЯННОГО И НИЗКОЧАСТОТНОГО ПЕРЕМЕННОГО МАГНИТНЫХПОЛЕЙ

ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Росздрава»

ГОУ ВПО Сибирский федеральный университет, г.Красноярск

В последнее время очень остро стоит проблема опухолевых заболеваний. Изучается влияние целого ряда физических факторов на опухолевый рост. К числу таких факторов относятся магнитные поля. В экспериментальной биологии и практической медицине накоплено множество информации об эффектах магнитных полей. В частности, зафиксирован эффект влияния магнитных полей на симпатоадреналовую систему и двигательную активность миоцитов, уровень глутатиона, высшую нервную деятельность [Prolic Z., 2005; Mostert S., 2005; Jelenkovic A., 2005] Обилие гипотез по этой проблеме свидетельствует, скорее, о ее нерешенности, чем о достаточном уровне понимания механизмов взаимодействия живого с естественными и искусственными магнитными полями [Беркутов А.М., 2000].

Изучение организма на квантовом уровне показывает, что химические реакции, протекающие в условиях in vivo, имеют много общего с «пробирочными» реакциями, а механизмы действия магнитных полей на живой организм основаны на адекватном изменении энергии химических связей в биологических процессах. Результатом химических реакций, как правило, является превращение молекул одних веществ в другие за счет перестройки электронных оболочек ядер. Физические механизмы влияния магнитных полей связаны с вероятностью протекания элементарных химических актов, когда в результате химических превращений, вследствие распаривания электронов, появляются

свободнорадикальные продукты реакции с некомпенсированными спинами.. Переход между различными спиновыми состояниями пары возможен в случае воздействия внешним магнитным полем, тем самым изменяется вероятность течения химических реакций и, как следствие, имеет место проявление тех или иных магнитобиологических эффектов [Беркутов А.М., 2000].

Методика исследования

В наших экспериментах мы изучали комбинированное влияние слабых постоянного магнитного поля и переменного магнитного поля на активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), глутатионпероксидазы (ГПО) и глутатион^-трансферазы1 (TST) у мышей с асцитной карциномой Эрлиха (АКЭ).

В работе использовались белые беспородные мыши, весом 18-20 граммов. Мышам инокулировали внутрибрюшинно 1х107 клеток АКЭ в 0,2 мл раствора Хенкса. Животные были разделены на две группы: контрольную и опытную. В течение 5 суток на животных опытной группы воздействовали магнитными полями. Длительность облучения составляла (ежедневно) 1 час.

Магнитные поля создавались с помощью экспериментальной установки, состоящей из генератора сигналов, усилителя-регулятора сигнала с градуировкой по индукции переменного магнитного поля, источника постоянного тока стабилизированного, блока создания сочетания постоянного магнитного поля с интенсивностью 25 мкТл с переменным магнитным полем частотой 3,12 Гц и интенсивность 5 мкТл.

Активность антиоксидантных ферментов определяли в асцитных клетках, гомогенатах печени и костного мозга. Печень и костный мозг извлекали и гомогенизировали в стеклянной ступке электрическим гомогенизатором с тефлоновым пестиком при 3000 об/ мин. В качестве среды гомогенизации использовали 0,9%-ый раствор NaCl. Гомогенат печени разводили в 4 раза, костного мозга - в 67 раз. Опухолевые клетки отделяли от асцитной жидкости центрифугированием при 3000 об/ мин в течение 15 минут и далее гомогенизировали при вышеназванных условиях. Гомогенат опухолевых клеток разводили в 4 раза.

Активность СОД определяли по степени ингибирования реакции автоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии фермента. [Сирота Т.В., 1999]. Об интенсивности автоокисления адреналина судили по динамическому нарастанию поглощения при длине волны 347 нм, обусловленному накоплением продукта окисления, опережающим по времени образование адренохрома с максимумом поглощения при 480 нм.

Метод определения активности каталазы основан на образовании окрашенного в желтый цвет комплекса неразрушенного в ходе каталазной реакции пероксида водорода с молибдатом аммония, интенсивность окраски которого регистрировалась на ФЭКе при длине волны 400 нм [Королюк М.А.,1988].

Мерой активности ГПО является скорость окисления восстановленного глутатиона (rSH) в присутствии t-бутилгидропероксида [Beutler E., 1990]. Концентрацию rSH до и после инкубации определяли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 412 нм. В основе развития цветной реакции лежит

взаимодействие SH-групп восстановленного глутатиона с 5,5’-дитио(бис)-нитробензойной кислотой (ДТНБК) с образованием окрашенного продукта -тионитрофенильного аниона. Количество последнего прямо пропорционально количеству SH-групп восстановленного глутатиона, прореагировавших с ДТНБК.

Метод определения активности глутатион-S-трансферазы основан на скорости образования глутатион^-коньюгатов между rSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ). Увеличение концентрации коньюгатов регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм [Beutler E., 1990].

Результаты исследований оценивали непараметрическим критерием Манна-Уитни с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0.

Результаты исследования

Данные наших экспериментов показывают, что активность СОД в клетках асцитной карциномы Эрлиха при действии комбинированных постоянного и переменного магнитных полей возрастала в 3,7 раза (р <

0,05), активность же этого фермента в клетках печени и костного мозга достоверно не увеличивалась (Таблица 1).

Активность каталазы определялась только в гомогенате печени мышей-опухоленосителей. Действие магнитных полей с данными параметрами приводило к достоверному (р < 0,05) увеличению активности этого фермента от 9,00±0,86 х 103 мкат./г белка в контроле до 11,40±0,80 х 103 мкат./г белка в опытном образце(п = 15). Таким образом, активность каталазы в клетках печени увеличивалась в 1,3 раза.

Результаты исследования активности глутатионпероксидазы приведены в таблице 2.

Действие магнитных полей с данными параметрами приводило к достоверному увеличеню активности этого фермента в печени в 2,3 раза(р < 0,05); в костном мозге в 1,5 раз(р < 0,05) по сравнению с показателями в соответствующих тканях у контрольных животных ; в асцитных клетках зафиксирована тенденция к увеличению активности этого фермента.

В таблице 3 приведены данные по активности глутатион^-транферазы в гомогенате печени и асцитных клетках. Установлено достоверное увеличение активности этого фермента в печени в 3,1 раза(р < 0,05); в асцитных клетках в 1,7 раза (р < 0,05); по сравнению с контрольными величинами.

Таблица 1

Изменение активности супероксидцисмутазы в гомогенатах асцитных клеток, клеток печени и костного мозга мышей с асцитной карциномой Эрлиха при действии комбинированных слабых постоянного и низкочастотного переменного магнитных полей

Клетки печени Клетки костного Асцитные клетки

Вид воздействия усл.ед./г ткани мозга усл.ед./г ткани усл.ед.10-5/клетку

Контроль 182,00±1,63 154,29±9,76 0,120±0,028

Магнитные поля 183,40±1,79 155,31±8,16 0,440±0,017

Таблица 3

Изменение активности глутатион-8-трансферазы в гомогенате печени и асцитных клетках мышей с асцитной карциномой Эрлиха при действии комбинированных слабых постоянного и низкочастотного переменного магнитных полей

Вид воздействия Клетки печени, мкмолü/мцш г белка Асцитные клетки, мкмолы/мин г белка

Контролй 61,2±0,66 36,6±0,12

Магнитные поля 190,5±0,77 61,3±0,47

Следовательно, действие комбинированных слабых постоянного и низкочастотного переменного магнитных полей приводило к повышению активности ферментов антиоксидантной системы в клетках асцитной карциномы Эрлиха, клетках костного мозга и гепатоцитах мышей -опухоленосителей, что может являеться показателем повышения продукции свободных радикалов при действии магнитных полей с данными параметрами.

Известно, что активные формы кислорода вызывают клеточную гибель. Получены данные, что ряд веществ, например, кальцивин, мотексафин

гадолиниум способные повышать продукцию А^^

4.Турпаев К. Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов/ К.Т. Турпаев. // Биохимия.-2002.- Т 67.- вып. 3.- С. 339 - 352.» 2

5.Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods./ E Beutler // New-York, London, Tokyo: Grun & Stratton, 1990.-118 p.6

6.Evens A.M. Motexafin gadolinium generates reactive oxygen species and induces apoptosis in sensitive and highly resistant multiple myeloma cells/ A.M. Evens, P. Lecane, D. Magda et al. //Blood, Feb 2005; 105: 1265 -

1273.9

7. Jelenkovic A. The Effects of Exposure to Extremely

T аблица 2 hetamine on the

Изменение активности глутатионперосксидазы із гомогенатах асцитных клеток, клеток: печени и костного M03raikovic, B. Janac, мышей с асцитной карциномой Эрлиха при дейатвии комбииированных слабых постоянного и низкочастотноп2005; 1048: 377 -переменного магнитных полей

Вид воздействия1 а травма IcllL ішььішійил ииидук Клетки печени, тическом, воздействии ILing мкмолй/мин г белка "Г"1 КЛе5к™lK¡0оTшого моз8аЪ^ г мкмолы/м ин^г^елкаогу shock < ^ 3 • ==, О s ^ § ic * ^ without circela->: role of reactive ng, L.Hei-Rong, ysiol, Jen 2005;

тл которь Контролй .е исполйзу ют АФК, ІШІІІ иируя 3п 0пт0з, nitrogen an Л 54a3±ve$oxygen species / Г L:

Магнитные поля активи] ю^^каскад каспаз через дау н^еТулятіию Bcl 288 H281 1 I. //вJта^J34^УSiol Heart Circ PI

2 [Moungjaroen J., 2005]. Известно, что незначительно выраженный окислительный стресс является причиной апоптоза, при выраженном же окислительном стрессе происходит некротическая гибель клетки, следовательно, зафиксированное нами увеличение активности ферментов антиоксидантной системы свидетельствует об увеличении продукции активных форм кислорода при действии магнитных полей, что, в свою очередь, может инициировать любой из путей клеточной гибели [Турпаев К.Т.,2002; Tan S ,1998].

Литература

1. Беркутов А.М.Системы комплексной электромагнитотерапии / А.М Беркутов., Жулев Г.А., Кураев Г.А. и др. - М.: Бином.- 2000.- С. 1-45. 3

2.Королюк М.А. Метод определения активности каталазы/М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова //Лабораторное дело.-1988.-№.1.-С. 16-17 1

3. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы / Т.В Сирота // Вопр. мед. химии.- 1999 № 3.- 4

9.Lu H. Reactive Oxygen Species Elicit Apoptosis by Concurrently Disrupting Topoisomerase Iland DNA-Dependent Protein Kinase / H.Lu, Z. Hong, H.Min et. al. // Mol. Pharmacol., Oct 2005; 68: 983 - 994.7

10.Mostert S. Effect of pulsed magnetic field therapy on the level of fatigue in patients with multiple sclerosis -a randomized controlled trial /S. Mostert, J. Kesselring // Multiple Sclerosis, Jun 2005; 11: 302 - 305.12

11.Moungjaroen J. Reactive Oxygen Species Mediate Caspase Activation and Apoptosis Induced by Lipoic Acid in Human Lung Epithelial Cancer Cells through Bcl-2 Down-Regulation /J. Moungjaroen, U. Nimmannit, P. S. Callery et. al. //J. Pharmacol. Exp. Ther., Dec 2006; 319: 1062 -

1069.10

12.Prolic Z. The Effect of Extremely Low-Frequency Magnetic Field on Motor Activity of Rats in the Open Field / Z. Prolic, B. Janac, V. Pelic et al.,// Ann. N.Y. Acad. Sci., Jun 2005; 1048: 381 - 384.11

13.Tan S The regulation of reactive oxygen species production during programmed cell death / S. Tan., Y. Sagara, Y.Liu et al. // J. Cell Biol. - 1998. - N. 6. - Vol. 141. - P. 1423 - 1432.5