ПРИМЕНЕНИЕ АНТАГОНИСТОВ CRTH2 В ТЕРАПИИ
APPLICATION OF CRTH2 ANTAGONISTS IN THERAPY

2
2
Настоящее изобретение относится к соединениям, которые являются полезными в качестве фармацевтических средств, к способам получения этих соединений, составам, содержащим их, и к их применению для лечения и предотвращения аллергических заболеваний, в частности астмы, аллергического ринита и атопического дерматита, а также других воспалительных заболеваний, опосредованных простагландином D (PGD), который действует через рецептор CRTH2 на клетки, включающие эозинофилы, базофилы и лимфоциты Th2.
2
2
2
PGD представляет собой эйкозаноид класса химических медиаторов, синтезируемый клетками в ответ на локальное повреждение ткани, нормальные или гормональные стимулы или как часть путей клеточной активации. Эйкозаноиды связываются со специфическими поверхностными рецепторами клеток в различных тканях всего организма и опосредуют в этих тканях различные эффекты. Известно, что PGD продуцируется мастоцитами, макрофагами и лимфоцитами Th2 и обнаруживается в высоких концентрациях в дыхательных путях у страдающих астмой пациентов, которым вводят антиген (Murray et al. (1986), N. Engl. J. Med. 315: 800-804). Инсталляция PGD в дыхательные пути может вызывать многие признаки астматической реакции, включая бронхоконстрикцию (Hardy et al. (1984) N. Engl. J. Med. 311: 209-213; Sampson et al. (1997) Thorax 52: 513-518) и аккумуляцию эозинофилов (Emery et al. (1989) J. Appl. Physiol. 67: 959-962).
2
2
Способность экзогенно введенного PGD вызывать воспалительные реакции подтверждается сверхсинтезом PGD-синтазы человека у трансгенных мышей, которые проявляют повышенное эозинофильное легочное воспаление и генерацию цитокинов Th2 в качестве реакции на антиген (Fujitani et al. (2002) J. Immunol. 168: 443-449).
2
2
2
2
2
2
2
2
Первым обнаруженным рецептором, специфичным для PGD, был рецептор DP, который связан с повышением внутриклеточных уровней сАМР. Однако предполагают, что PGD опосредует большую часть своей провоспалительной активности посредством взаимодействия с рецептором, сопряженным с G-белком, который называют CRTH2 (молекула, гомологичная хемоаттрактантному рецептору, экспрессируемая в клетках Th2) и который экспрессируют лимфоциты Th2, эозинофилы и базофилы (Hirai et al. (2001). J. Exp. Med. 193: 255-261, EP 0851030, EP-A-1211513 и Bauer et al. EP-A-1170594). Представляется очевидным, что влияние PGD на активацию лимфоцитов Th2 и эозинофилов осуществляется посредством CRTH2, поскольку селективные антагонисты CRTH2 13,14-дигидро-15-кето-PGD (DK-PGD) и 15Р-метил-PGD могут вызывать эту реакцию, а влияние PGD блокируется анти-СРТН2 антителом (Hirai et al. 2001; Monneret et al, (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther. 304: 349-355). В отличие от этого селективный антагонист DP BW245C не способствует миграции лимфоцитов Th2 или эозинофилов (Hirai et al. 2001; Gervais et al. (2001) J. Allergy din. Immunol. 108: 982-988). На основании этих данных использование антагонистов PGD на рецепторе CRTH2 представляет собой привлекательный подход к лечению воспалительного компонента аллергических заболеваний, зависимых от Th2, в частности астмы, аллергического ринита и атопического дерматита.
2
EP-A-1170594 предполагает, что способ, к которому он относится, может быть использован для идентификации соединений, полезных для лечения астмы, атопического дерматита, аллергического ринита, аутоиммунного заболевания, реперфузионного нарушения и при различных воспалительных состояниях, все из которых вызываются действием PGD на рецептор CRTH2.
Соединения, которые связываются с CRTH2, описаны в WO-A-03066046 и WO-A-03066047. Эти соединения не являются новыми и были впервые описаны наряду с другими аналогичными соединениями в GB 1356834, GB 1407658 и GB 1460348, где указано, что они обладают противовоспалительной, болеутоляющей и жаропонижающей активностью. В WO-A-03066046 и WO-A-03066047 указано, что соединения, к которым они относятся, представляют собой модуляторы активности рецептора CRTH2 и поэтому полезны для лечения или предотвращения обструктивных заболеваний дыхательных путей, в частности астмы, хронических обструктивных легочных заболеваний (COPD) и ряда других болезней, включая различные состояния костей и суставов, кожи и глаз, желудочно-кишечного тракта, центральной и периферийной нервной системы и других тканей, а также отторжения аллотрансплантата.
PL 65781 и JP 43-24418 также относятся к индольным производным, которые аналогичны по структуре индометацину и, как сообщается, аналогично индометацину обладают противовоспалительной и жаропонижающей активностью. Таким образом, хотя во время публикации указанных документов это могло не приниматься во внимание, соединения, которые в них описаны, представляют собой ингибиторы СОХ, и их активность существенно отличается от соединений настоящего изобретения. Действительно, ингибиторы СОХ противопоказаны при лечении многих заболеваний и состояний, например астмы и воспаления кишечника, для лечения которых соединения настоящего изобретения являются полезными, хотя иногда их можно использовать для лечения артритов.
2
2
Авторы настоящего изобретения установили, что некоторые индольные производные, в которых азот индола замещен группой карбоновой кислоты, являются антагонистами PGD на рецепторе CRTH2 и являются полезными в способе лечения заболеваний и состояний, опосредованных PGD через рецептор CRTH2, при этом указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соответствующей дозы одного из таких соединений.
Таким образом, согласно первому аспекту изобретения предложено применение соединения общей формулы (I)
где
1
2
3
4
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
6
1
6
2
2
2
2
2
2
2
R, R, R и R независимо представляют собой водород, галоген, C-Салкил, -O(С-Салкил), -CON(R), -SOR, -SOR, -SON(R), -N(R), -NRCOR, -COR, -COR, -SR, -OH, -NO или -CN;
11
5
6
1
6
1
6
3
7
каждый R независимо представляет собой водород или C-Салкил; каждый R и R независимо представляет собой водород или C-Салкил или совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С-С циклоалкильную группу;
7
1
6
R представляет собой водород или C-Салкил;
8
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
1
6
1
6
2
2
2
2
2
2
2
R представляет собой ароматическую группу, возможно, содержащую замещение одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, включающей галоген, C-Салкил, -O(C-Cалкил), -CON(R), -SOR, -SOR, SON(R), -N(R), -NRCOR, -COR, -COR, -SR, -OH, -NO или -CN;
11
где R определен выше;
9
1
6
R представляет собой водород или C-С алкил;
при условии, что
8
R не является фенилом, содержащим замещение -СООН;
1
2
3
4
1
2
3
4
3
6
если любые два из R, R, R и R представляют собой водород, то ни один из двух остальных R, R, R и R не является С-Салкилом;
2
или его фармацевтически допустимой соли, гидрата, сольвата, комплекса или пролекарства для получения агента, предназначенного для лечения или предотвращения аллергической астмы, перманентного аллергического ринита, сезонного аллергического ринита, атопического дерматита, контактной гиперчувствительности (включая контактный дерматит), конъюктивита, в особенности аллергического конъюктивита, эозинофильного бронхита, пищевых аллергий, эозинофильного гастроэнтерита, воспаления кишечника, язвенного колита и болезни Крона, мастоцитоза, других заболеваний, опосредованных PDG, например, аутоиммунных заболеваний, в частности гипер-IgE-синдрома, системной красной волчанки, псориаза, акне, рассеянного склероза, отторжения аллотрансплантата, реперфузионного нарушения, хронического обструктивного заболевания дыхательных путей, а также в некоторых случаях - инфектартрита, псориатического артрита и остеоартрита.
2
8
WO-A-9950268, WO-A-0032180, WO-A-0151849 и WO-A-0164205 относятся к соединениям, которые аналогичны соединениям общей формулы (I). Однако, как сообщается, эти соединения являются ингибиторами альдозоредуктазы, полезными для лечения сахарного диабета (WO-A-9950268, WO-A-0032180 и WO-A-0164205) или гипоурекимическими агентами (WO-A-0151849). В этих документах не содержится указаний на то, что указанные соединения полезны для лечения заболеваний и состояний, опосредованных PGD через рецептор CRTH2. Большинство предпочтительных соединений, описанных в этих известных документах, содержит бензотиазольный заместитель в положении, эквивалентном R в общей формуле (I).
8
US 4363912 относится к соединениям, которые аналогичны соединениям настоящего изобретения и, как сообщается, являются ингибиторами тромбоксансинтетазы, полезными для лечения таких состояний, как тромбоз, ишемическая болезнь сердца и апоплектический удар. Указанные соединения содержат группу пиридила в положении, эквивалентном R в общей формуле (I).
2
WO-A-9603376 относится к соединениям, которые, как сообщается, являются ингибиторами sPLA и полезны для лечения бронихальной астмы и аллергического ринита. Все эти соединения содержат амидные или гидразидные заместители вместо производных карбоновых кислот, которые содержат соединения согласно настоящему изобретению.
JP 2001247570 относится к способу получения 3-бензотиазолметилинол-уксусной кислоты, которая, как сообщается, является ингибитором альдозоредуктазы.
8
US 4859692 относится к соединениям, которые, как сообщается, являются антагонистами лейкотриена, полезными для лечения таких состояний, как астма, сенная лихорадка и аллергический ринит, а также некоторых воспалительных состояний, в частности бронхита, атопической и эктопической экземы. Соединения согласно этому документу аналогичны соединениям общей формулы (I), однако общая формула (I) включает, в частности, соединения, в которых R содержит замещение фенила группой -СООН, являющейся единственной зоной перекрытия. Кроме того, в работе J. Med. Chem., 6(33), 1781-1790 (1990), авторами которой являются авторы вышеуказанной более ранней патентной завки, указано, что соединения с группой уксусной кислоты, связанной с атомом азота индола, не обладают значительной активностью к пептидолейкотриену. В этой связи оказалось весьма удивительным, что соединения согласно настоящему изобретению, все из которых содержат группу уксусной кислоты, связанной с атомом азота индола, полезны для лечения таких состояний, как астма, сенная лихорадка и аллергический ринит.
2
8
US 4273782 относится к соединениям, аналогичным соединениям общей формулы (I), которые, как сообщается, полезны для лечения таких состояний, как тромбоз, ишемическая болезнь сердца, апоплектический удар, преходящее ишемическое нарушение, мигрень и сосудистые нарушения, вызванные диабетом. В документе не упоминаются состояния, опосредованные действием PGD на рецептор CRTH2. Все соединения согласно этому известному документу содержат группу имидазола в положении, эквивалентном R в общей формуле (I).
US 3557142 относится к 3-замещенным-1-индольным карбоновым кислотам и и сложным эфирам, которые, как сообщается, полезны для лечения воспалительных состояний.
8
WO-A-03/097598 относится к соединениям, которые являются антагонистами рецептора CRTH2. Они не содержат ароматического заместителя в положении, эквивалентном R в общей формуле (I).
8
Работа Cross et al. J. Med, Chem. 29, 342-346 (1986) относится к способу получения соединений, аналогичных соединениям общей формулы (I), из соответствующих сложных эфиров, аналогичным соединениям общей формулы (II). Сообщается, что все соединения, к которым она относится, являются ингибиторами тромбоксансинтетазы и содержат группу имидазола в положении, эквивалентном R в общей формуле (I).
ЕР-А-0539117 относится антагонистам лейкотриена, которые аналогичны по структуре соединениям общей формулы (I).
2
US 2003/0153751 относится к соединениям, которые являются ингибиторами sPLA. Хотя их структурная формула включает соединения, аналогичные соединениями общей формулы (I), все приведенные примеры соединений содержат обширные заместители в положениях 2 и 5 индольной системы и поэтому существенно отличаются от соединений согласно настоящему изобретению.
US 2004/011648 описывает соединения, которые аналогичны соединениям общей формулы (I) и являются ингибиторами of PAI-1. Указания о том, что эти соединения могут обладать антагонистической активностью по отношению к CRTH2, отсутствуют.
WO 2004/058164 относится к соединениям, которые, как сообщается, являются модуляторами астмы и аллергических воспалений. Соединения, активность которых продемонстрирована, полностью отличаются по структуре от соединений общей формулы (I).
Соединения, которые связываются с рецептором CRTH2, описаны в WO-A-03/097042 и WO-A-03/097598. Эти соединения представляют собой индолуксусные кислоты, однако в WO-A-03/097042 индольная система слита по положениям 2-3 с карбоциклическим ядром, содержащим 5-7 членов. В WO-A-03/097598 в положении 3 индола указана группа пирролидина.
2
2
WO-A-03/101981 и WO-A-03/101961 относятся к соединениям которые, как сообщается, являются антагонитстами CRTH2, однако отличаются по структуре от соединений общей формулы (I), поскольку содержат группу -S- или -SO-, связанную в положении 3 индола, вместо группы CH в соединениях общей формулы (I).
1
6
3
7
В настоящем описании термин "C-Салкил" относится к прямой или разветвленной насыщенной углеводородной цепи, содержащей от одного до шести атомов углерода и, возможно, содержащей замещения одним или несколькими галогенными заместителями или одной или несколькими С-С циклоалкильными группами. Примеры включают метил, этил, n-пропил, изопропил, t-бутил, n-гексил, трифторметил, 2-хлорэтил, метиленциклопропил, метиленциклобутил и метиленциклопентил.
1
4
1
18
Термины "C-Cалкил" и "C-Cалкил" имеют аналогичные значения за исключением того, что они содержат от одного до четырех и от одного до восемнадцати атомов углерода соответственно.
3
7
С-С циклоалкил относится к насыщенному карбоциклическому ядру, содержащему от 3 до 7 членов. Примеры таких групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.
В настоящем описании термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или йоду.
Термины "ароматическая группа" и "арил" в контексте настоящего описания относятся к системе ароматического ядра, содержащей от 5 до 14 атомов углерода в ядре и включающей до трех ядер, одно или несколько из которых могут содержать замещения атомом азота, кислорода или серы. Примерами ароматических групп являются бензол, пиридин, нафталин, бифенил, хинолин, изохинолин, хиназолин, тиазол, бензотиазол, бензоксазол, бензимидазол, индол, индазол и имидазольные ядерные системы.
Соответствующие допустимые в фармацевтике и ветеринарии соли соединений с общими формулами (I) и (II) включают основные аддитивные соли, в частности соли натрия, калия, кальция, алюминия, цинка, магния и других металлов, а также холин, диэтаноламин, этаноламин, этилдиамин и другие хорошо известные основные аддитивные соли.
В соответствующих случаях допустимые в фармацевтике и ветеринарии соли могут включать также соли органических кислот, в особенности карбоновых кислот, включая, в частности, но без ограничения, ацетат, трифторацетат, лактат, глюконат, цитрат, тартрат, малеат, малат, пантотенат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бутират, диглюконат, циклопентанат, глюкогептанат, глицерофосфат, оксалат, гептаноат, гексаноат, фумарат, никотинат, памоат, пектинат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, тартрат, лактобионат, пиволат, камфорат, ундеканоат и сукцинат, соли органических сульфоновых кислот, в частности метансульфонат, этансульфонат, 2-оксиэтансульфонат, камфорсульфонат, 2-нафталинсульфонат, бензолсульфонат, р-хлорбензолсульфонат и р-толуолсульфонат; и соли неорганических кислот, в частности гидрохлорид, гадробромид, гидройодид, сульфат, бисульфат, полусульфат, тиоцианат, персульфат, соли фосфорных и сульфоновых кислот.
Соли, не допустимые в фармацевтике или ветеринарии, тем не менее могут использоваться в качестве промежуточных соединений.
Пролекарства представляют собой соединения с ковалентными связями, которые выделяют активное исходное лекарственное вещество общей формулы (I) in vivo. Примеры пролекарств включают сложные алкильные эфиры соединений общей формулы (I), например сложные эфиры общей формулы (II), приведенной ниже.
Если в соединении согласно настоящему изобретению присутствует хиральный центр или другая форма изомерного центра, то все формы такого изомера или изомеров, включая энантиомеры и диастереоизмеры, включаются в изобретение. Соединения согласно изобретению, содержащие хиральный центр, могут быть использованы в качестве рацемической смеси, смеси, обогащенной энантиомером, или рацемическая смесь может быть разделена с помощью хорошо известных способов, а индивидуальный энантиомер может быть использован отдельно.
В соединениях общей формулы (I) предпочтительно, чтобы независимо или в каком-либо сочетании:
1
R представлял собой галоген или водород;
2
R представлял собой галоген или водород;
3
R представлял собой галоген или водород;
4
R представлял собой галоген или водород.
1
3
4
2
В более предпочтительных соединениях R, R и R представляют собой водород, в то время как R представляет собой галоген, в частности фтор.
5
6
5
6
1
4
В предпочтительных соединениях общей формулы (I) каждый член R и R независимо представляет собой водород или C-Cалкил. Однако в более активных соединениях по меньшей мере один, а предпочтительно - оба члена R и R представляют собой водород.
9
1
4
Предпочтительно также, чтобы R представлял собой водород или C-Cалкил, наиболее предпочтительно - водород.
7
7
1
6
Соединения общей формулы (I) предпочтительно содержат группу R, которую выбирают из Н или C-Салкила, наиболее предпочтительно R представляет собой метил.
8
В предпочтительных соединениях общей формулы (I) R представляет собой фенил, нафталинил, хинолинил, хиноксалинил, тиазолил, бифенил или бензотиазолил, все из которых могут содержать замещения одним или несколькими заместителями, как определено выше.
8
В особенности предпочтительно, чтобы R представля собой фенил, содержащий замещение в положении 4, или нафталин-2-ил, хинолин-2-ил, хиноксалин-2-ил, тиазол-2-ил или бензотиазол-2-ил, все из которых могут содержать замещения одним или несколькими заместителями, как определено выше.
8
1
4
1
4
1
4
1
4
Если группа R содержит замещение, предпочтительные заместители включают галоген, C-Cалкил, C-Cгалоалкил, C-Cалкоксил, C-Cалкилсульфонил и гидроксил.
8
Особенно предпочтительные заместители для группы R включают хлор, фтор, метил, этил, t-бутил, трифторметил, метокси, метансульфонил и гидроксил.
В качестве наиболее предпочтительных соединений можно указать следующие:
1. {3-[1-(4-хлорфенил)-этил]-5-фтор-2-метилиндол-1-ил}-уксусная кислота
2. {5-фтор-2-метил-3-[1-(4-трифторметилфенил)-этил]-индол-1-ил}-уксусная кислота
3. {3-[1-(4-трет-бутил-фенил)-этил]-5-фтор-2-метилиндол-1-ил}-уксусная кислота
4. {5-фтор-3-[1-(4-метансульфонилфенил)-этил]-2-метилиндол-1-ил}-уксусная кислота
5. [5-фтор-2-метил-3-(1-нафталин-2-илэтил)-индол-1-ил]-уксусная кислота
6. (5-фтор-2-метил-3-хинолин-2-илметил-индол-1-ил)-уксусная кислота
7. (5-фтор-2-метил-3-нафталин-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
8. [5-фтор-3-(8-оксихинолин-2-илметил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
9. (5-фтор-2-метил-3-хиноксалин-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
10. [5-фтор-3-(4-метоксибензил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
11. (5-фтор-2-метил-3-тиазол-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
12. [3-(4-хлорбензил)-5-фтор-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
13. (3-бензотиазол-2-илметил-5-фтор-2-метилиндол-1-ил)-уксусная кислота
14. [5-фтор-2-метил-3-(4-трифторметилбензил)-индол-1-ил]-уксусная кислота
15. [5-фтор-2-метил-3-(4-трет-бутилбензил)-индол-1-ил]-уксусная кислота
16. (3-бифенил-4-илметил-5-фтор-2-метилиндол-1-ил)-уксусная кислота
17. [5-фтор-3-(4-метансульфонилбензил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
18. [5-фтор-3-(6-фторхинолин-2-илметил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
19. (±)-3-(1-бензотиазол-2-илэтил)-5-фтор-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
20. [3-(4,5,7-трифторбензотиазол-2-илметил)-индол-1-ил]-уксусная кислота (лидорестат)
21. (2-метил-3-хинолин-2-илметил-индол-1-ил)-уксусная кислота
22. (5-хлор-2-метил-3-хинолин-2-илметил-индол-1-ил)-уксусная кислота
1
6
2
m
1
6
2
m
2
2
m
2
13
14
или C-С алкил, арил, (CH)OC(=O)C-Cалкил, (CH)N(R), CH((CH)O(C=O)R) сложные эфиры вышеуказанных соединений; где
m равно 1 или 2;
13
R представляет собой водород или метил;
14
1
18
R is C-Cалкил.
8
2
Хотя некоторые соединения общей формулы (I) известны из уровня техники, другие соединения являются новыми, поскольку они отсутствуют среди приведенных примеров и отсутствуют указания на предпочтительность ароматической группы в положении R. Кроме того, как показано авторами настоящего изобретения, эти соединения обладают активностью в качестве антагонистов PGD в рецепторе CRTH2.
1
2
3
4
5
6
7
9
8
11
1
6
1
6
2
Таким образом, согласно следующему аспекту изобретения обеспечивается соединение общей формулы (I), где R, R, R, R, R, R, R и R определены выше, а Rпредставляет собой группу фенила, нафталинила, тиазола, бифенила, хинолинила или хиноксалинила, которые могут содержать замещение одним или несколькими галогенами, C-Салкилом, -O(С-С)алкилом, группами -OR или -ОН;
при условии, что
8
R не является фенилом, не содержащим замещения или содержащим замещение группой -СООН;
1
2
3
4
1
2
3
4
3
6
если любые два из R, R, R и R представляют собой водород, ни один из двух других R, R, R и R не является С-Салкилом;
1
2
3
4
8
если все R, R, R и R представляют собой водород, R не является 4-хлорфенилом.
8
В этих новых соединениях предпочтительные группы R представляют собой фенил, содержащий замещение в положении 4, нафталин-2-ил, хинолин-2-ил, хиноксалин-2-ил или тиазол-2-ил, а предпочтительными заместителями для этих групп являются хлор, фтор, метил, этил, t-бутил, трифторметил, метоксил, метансульфонил и гидроксил.
1
2
3
4
5
6
7
9
Предпочтительные группы R, R, R, R, R, R, R и R указаны выше.
К наиболее предпочтительным новым соединениям относятся соединения 1-19, 21 и 22, перечисленные выше, и эти соединения образуют следующий аспект изобретения. Соединение 20 описано в патентной заявке WO-A-9950268.
Соединение общей формулы (I) можно получать in vivo из пролекарства. Пролекарство может представлять собой соединение общей формулы (II)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
13
14
1
6
2
m
1
6
2
m
2
2
m
2
где R, R, R, R, R, R, R, R и R определены для общей формулы (I); Rпредставляет собой C-Салкил, арил, (CH)OC(=O)C-C алкил, (СН)N(R), CH((CH)O(C=O)R);
m равно 1 или 2;
13
R представляет собой водород или метил;
14
1
18
R представляет собой C-Cалкил.
2
Таким образом, согласно следующему аспекту изобретения, предложено применение соединения общей формулы (II), как определено выше, для получения агента, предназначенного для лечения или предотвращения заболеваний и состояний, опосредованных PGD на рецепторе CRTH2.
12
14
14
2
2
2
2
2
2
2
2
2
При использовании соединения общей формулы (II) в качестве пролекарства примеры особенно пригодных групп R включают: метил, этил, пропил, фенил, CHOC(=O)tBu, CHCHN(Me), CHCHNH или CH(CHO(CO)R), где R определен выше.
8
11
1
6
1
6
2
Соединения общей формулы (II), где R представляет собой группу фенила, нафталинила, бифенила, хинолила или хиноксалила, все из которых могут содержать замещение одной или несколькими группами галогенов, C-Салкилов, -O(С-С)алкилов, -SOR или -ОН;
при условии, что
8
R не является фенилом, не содержащим замещения или содержащим замещение группой -СООН;
1
2
3
4
1
2
3
4
3
6
если любые два из R, R, R и R представляют собой водород, ни один из двух других R, R, R и R не является С-Салкилом;
1
2
3
4
8
если все R, R, R и R представляют собой водород, R не является 4-хлорфенилом,
являются новыми.
1
6
2
m
1
6
2
m
2
2
m
2
13
14
13
14
Некоторые из наиболее предпочтительных соединений общей формулы (II) включают C-Салкил, арил, (CH)OC(=O)C-Cалкил, (CH)N(R), CH((CH)O(C=O)R), сложные эфиры соединений 1-19, где m, R и R определены выше.
Если соединение общей формулы (II) действует в качестве пролекарства, оно позднее трансформируется в лекарство под действием эстеразы, содержащейся в крови или ткани пациента.
12
1
6
Как описано в WO-A-9950268, соединения общей формулы (I) можно получить из соединений общей формулы (II), где R представляет собой C-Салкил, путем гидролиза со щелочью, в частности с гидроксидом натрия или лития. Реакция может протекать в водном растворителе, в органическом растворителе или в их смеси. Типичным растворителем для реакции является смесь тетрагидрофурана и воды.
Соединения общей формулы (II) можно получить из соединений общей формулы (III)
1
2
3
4
5
6
7
12
где R, R, R, R, R, R и R определены в общей формуле (I), a R определен в общей формуле (II), в результате реакции с соединением общей формулы (IV)
9
где R определен для общей формулы (I);
в условиях кислого восстановительного алкилирования. Соединения общих формул (III) и (IV) легко доступны или могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники.
Другие способы получения соединений с общими формулами (I) и (II) описаны в WO-А-9950268 и WO-A-0151489.
2
2
Соединения общей формулы (I) являются антагонистами PGD в рецепторе CRTH2, а соединения общей формулы (II) являются пролекарствами соединений общей формулы (I). Поэтому соединения общих формул (I) и (II) полезны для способа лечения заболеваний и состояний, опосредованных PGD в рецепторе CRTH2, при этом указанный способ включает введение пациенту, который нуждается в таком лечении, соответствующей дозы соединения общей формулы (I) или (II).
2
Согласно следующему аспекту изобретения обеспечивается новое соединение общей формулы (I) или (II) для применения в медицине, в частности для лечения или предотвращения заболеваний и состояний, опосредованных PGD в рецепторе CRTH2.
2
Как указано выше, такие заболевания и состояния включают аллергическую астму, перманентный аллергический ринит, сезонный аллергический ринит, атопический дерматит, контактную гиперчувствительность (в том числе контактный дерматит), конъюктивит, в особенности аллергический конъюктивит, эозинофильный бронхит, пищевые аллергии, эозинофильный гастроэнтерит, воспаление кишечника, язвенный колит и болезнь Крона, мастоцитоз, а также другие заболевания, опосредованные PGD, например аутоиммунные заболевания, в частности гипер-IgE-синдром и системную красную волчанку, псориаз, акне, рассеянный склероз, отторжение аллотрансплантата, реперфузионное нарушение, хронические обструктивные легочные заболевания, а также инфектартрит, псориатический артрит и остеоартрит.
Соединения общей формулы (I) или (II) должны быть приготовлены соответствующим образом в зависимости от заболевания или состояния, для лечения которого они требуются.
Таким образом, следующим аспектом изобретения является фармацевтический состав, содержащий новое соединение общей формулы (I) или (II) вместе с фармацевтическим наполнителем или носителем. Другие активные материалы также могут присутствовать, если они являются подходящими или рекомендуемыми для лечения или предотвращения соответствующего заболевания или состояния.
Носитель или, если присутствует несколько носителей, то все носители должны быть совместимыми с другими ингредиентами состава и безопасными для реципиента.
Составы включают пригодные составы для перорального, ректального, назального, бронхиального (респираторного), топического (включая глазные капли, трансбуккальное и сублингвальное введение), вагинального или парентерального введения (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное введение) и могут быть получены любыми способами, известными специалистам в области фармацевтики.
Способ введения зависит от состояния, подлежащего лечению, однако предпочтительные составы приготавливают для перорального, назального, бронхиального или топического введения.
Составы можно получить путем соединения вышеуказанного активного агента с носителем. В общем случае составы получают путем равномерного и тщательного перемешивания активного агента с жидкими носителями или с тонко диспергированными твердыми носителями или с обоими видами носителей, а затем в случае необходимости формуют продукт. Изобретение относится также к способам получения фармацевтического состава, которые включают связывание или объединение соединения общей формулы (I) или (II) с носителем или связующим агентом, допустимыми в фармацевтике или ветеринарии.
Составы для перорального введения согласно настоящему изобретению могут быть представлены в форме дискретных элементов, в частности капсул, саше или таблеток, содержащих определенную дозу активного агента; порошка или гранул; раствора или суспензии активного агента в водной или неводной жидкости; эмульсии типа "масло в воде" или "вода в масле" или болюсов и т.п.
Для составов, предназначенных для перорального введения (например, таблеток и капсул), термин "допустимый носитель" включает носители, в частности обычные наполнители, например связующие агенты, в том числе сироп, гуммиарабик, желатин, сорбит, трагакант, поливинилпирролидон (повидон), метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, сахарозу и крахмал; наполнители и носители, например кукурузный крахмал, желатин, лактозу, сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннитол, дикальцийфосфат, хлорид натрия и альгиновую кислоту; смазочные агенты, в частности стеарат магния, стеарат натрия и другие металлические стеараты, глицеролстеарат, стеарировую кислоту, силиконовое масло, тальковые воски, масла и коллоидный кремнезем. Можно использовать также вкусовые добавки, в частности мятное масло, винтергриновое масло, вишневый ароматизатор и т.п. Может оказаться желательным добавить краситель, чтобы сделать лекарственную форму легко идентифицируемой. На таблетки можно также нанести покрытие способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Таблетку можно изготовить способом прессования или литья, возможно, с добавлением одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. Прессованные таблетки можно получить путем прессования в соответствующей машине активного агента в свободносыпучей форме, например в форме порошка или гранул, возможно, смешанных со связующим, смазкой, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Литые таблетки можно изготовить способом литья в соответствующей машине смеси порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. На таблетки можно нанести покрытие или рифление и составить их рецептуру таким образом, чтобы обеспечить замедленное или регулируемое выделение активного агента.
Другие составы, пригодные для перорального введения, включают пастилки, содержащие активный агент во вкусовой основе, обычно - в сахарозе, гуммиарабике или трагаканте, пастилки, содержащие активный агент в инертной основе, в частности в желатине и глицерине или сахарозе и гуммиарабике, и жидкости для полоскания рта, содержащие активный агент в пригодном жидком носителе.
Для местного нанесения на кожу соединения общей формулы (I) или (II) можно ввести в крем, мазь, желе, раствор или суспензию и т.п. Рецепты крема или мази, которые можно использовать для лекарства, представляют собой обычные составы, хорошо известные специалистам в данной области техники, например, описанные в стандартных справочниках по фармацевтике, в частности в Британской Фармакопее.
Соединения общей формулы (I) или (II) можно использовать для лечения дыхательных путей с помощью назального, бронхиального или трансбуккального введения, например, аэрозолей или спреев, которые могут диспергировать фармакологически активный ингредиент в форме порошка или в форме капель раствора или суспензии. Фармацевтические составы, диспергирующие порошки обычно кроме активного ингредиента содержат жидкий газ-вытеснитель с точкой кипения ниже комнатной температуры и, если требуется, соответствующие добавки, в частности жидкие или твердые неионнные или анионные поверхностно-активные агенты и/или разбавители. Кроме того, фармацевтические составы, в которых фармакологически активный ингредиент находится в растворе, содержат соответствующий газ-вытеснитель и, если требуется, дополнительный растворитель и/или стабилизатор. Вместо газа-вытеснителя можно использовать сжатый воздух, применяя для его получения устройство, обеспечивающее соответствующее сжатие и расширение воздуха.
Составы для парентерального введения в общем случае должны быть стерильными.
2
Обычно доза соединения составляет примерно от 0,01 до 100 мг/кг, чтобы поддерживать концентрацию препарата в плазме на уровне, эффективном для ингибирования PGD на рецепторе CRTH2. Точную дозу соединения общей формулы (I) или (II), которая является терапевтически эффективной, и оптимальный способ введения такого соединения может легко определить рядовой специалист в данной области техники путем сравнения содержания агента в крови с концентрацией, которая требуется для создания терапевтического эффекта.
2
Соединения общей формулы (I) или (II) можно применять в сочетании с одним или несколькими активными агентами, которые являются полезными при лечении заболеваний и состояний, перечисленных выше, однако эти активные агенты не обязательно являются ингибиторами PGD на рецепторе CRTH2.
Таким образом, фармацевтические составы, описанные выше, могут дополнительно содержать один или несколько указанных активных агентов.
2
Изобретение обеспечивает также применение соединения общей формулы (I) или (II) для получения агента, предназначенного лечения заболеваний и состояний, опосредованных PGD на рецепторе CRTH2, при этом указанный агент содержит также дополнительный активный агент, полезный для лечения таких заболеваний и состояний.
Эти дополнительные активные агенты, которые могут действовать совершенно различными способами, включают существующие терапевтические средства для лечения аллергических и других воспалительных заболеваний, в том числе:
антагонисты β2, в частности сальметерол;
кортикостероиды, в частности флутиказон;
антигистамины, в частности лоратидин;
лейкотриеновые антагонисты, в частности монтелукаст;
анти-IgЕ-антительные терапевтические агенты, в частности омализумаб;
антиинфекционные агенты, в частности фусидовую кислоту (особенно для лечения атопического дерматита);
противогрибковые агенты, в частности клотримазол (особенно для лечения атопического дерматита);
иммунодепрессанты, в частности такролимус и особенно пимекролимус в случае воспалительного заболевания кожи.
Антагонисты CRTH2 можно также комбинировать с терапевтическими агентами, которые разрабатываются для лечения воспалительных симптомов, включая:
2
другие антагонисты PGD, действующие на другие рецепторы, в частности антагонисты DP;
ингибиторы фосфодиэстеразы типа 4, в частности цилониласт;
препараты, которые модулируют образование цитокина, в частности ингибиторы фермента, (ТАСЕ), трансформирующего TNFα;
препараты, которые модулируют активность цитокинов Th2 IL-4 и IL-5, в частности блокирующие моноклональные антитела и растворимые рецепторы;
антагонисты PPAR-γ, в частности росиглитазон;
ингибиторы 5-липоксигеназы, в частности цилейтон.
2
Следующий аспект изобретения обеспечивает продукт, содержащий новое соединение общей формулы (I) или (II) и один или несколько вышеперечисленных агентов в форме комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания или состояния, опосредованного действием PGD в рецепторе CRTH2.
Далее приведено более подробное описание со ссылками на следующие неограничительные примеры.
Пример 1 - Получение соединений 1-19
1. Сложный этиловый эфир {3-[1-(4-хлорфенил)-этил]-5-фтор-2-метилиндол-1-ил}-уксусной кислоты
+
+
Триэтилсилан (0,34 мл, 2,13 ммоль) и трифторуксусную кислоту (0,10 мл, 1,29 ммоль) последовательно добавили по каплям в течение 1 минуты в перемешанный раствор (0,10 г, 0,43 ммоль) сложного этилового эфира (5-фтор-2-метилиндол-1-ил)-уксусной кислоты и 4-ацетилхлорбензола (64 мг, 0,41 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (2 мл) при 0°С. Затем смесь нагрели до комнатной температуры и перемешали в течение 16 часов. Полученную смесь сконцентрировали в вакууме, получив осадок, который распределился между этилацетатом (10 мл) и насыщенным раствором бикарбоната натрия (10 мл). Органический слой отделили, высушили и сконцентрировали в вакууме, получив осадок, который очистили способом колоночной флеш-хроматографии (Flashmaster) на силикагеле с элюированием 10% этилацетат:гептан до 25% этилацетат:гептан, получив сложный этиловый эфир (57 мг, 37%) в форме белого порошка, Tr=1,88 мин (92%), m/z (ES) (M+H) 374,30.
2. Соединение 1-{3-[1-(4-хлорфенил)-этил]-5-фтор-2-метилиндол-1-ил}-уксусная кислота
H
3
3
3
3
3
3
+
+
Гидроксид лития моногидрат (70 мг, 1,67 ммоль) добавили одной порцией в перемешанный раствор сложного этилового эфира (57 мг, 0,15 ммоль){3-[1-(4-хлорфенил)-этил]-5-фтор-2-метилиндол-1-ил}-уксусной кислоты в смеси тетрагидрофуран:вода (5 мл; 1:1) и перемешали при комнатной температуре в течение 2 часов. Откорректировали рН раствора концентрированной соляной кислотой до 1 и экстрагировали продукт этилацетатом (3×10 мл). Объединенные органические экстракты высушили и сконцентрировали в вакууме, получив карбоновую кислоту (35 мг, 67%) в форме желтоватого порошка, δ (400 МГц, CDCl) 7,26-7,21 (4Н, m, Ar), 7,06 (1Н, dd J 9,0, 4,2 Гц, Ar), 6,97 (1H, dd J 10,0, 2,4 Гц, Ar), 6,86 (1H, dt J 9,0, 2,4 Гц, Ar), 4,80 (2H, s, CHCOH), 4,35 (1H, q 7,3 Гц, CHCH), 2,29 (3Н, s, CH), 1,73 (3Н, d 7,3 Гц, CHCH); Tr=1,73 мин (90%), m/z (ES) (M+H) 346,09.
Соединения 2-19, 21 и 22 получили способом, аналогичным описанному для соединения 1, но из соответствующих выбранных исходных материалов.
Соединение 2 - {5-фтор-2-метил-3-[1-(4-трифторметилфенил)-этил]-индол-1-ил}-уксусная кислота
H
3
2
2
3
3
+
+
δ (400 МГц, CDCl) 7,50 (2Н, d J 8,3 Гц, Ar), 7,39 (2H, d J 8,3 Гц, Ar), 7,07 (1H, dd J 8,8, 4,1 Гц, Ar), 6,98 (1H, dd J 10,0, 2,5 Гц, Ar), 6,85 (1H, dt J 9,0, 2,5 Гц, Ar), 4,80 (2H, s, CHCOH), 4,42 (1H, q J 7,1 Гц, CHCH), 2,29 (3Н, s, ОД), 1,77 (3Н, dJ7,3 Гц, CHCH); Tr=1,65 мин (96%), т/г (ES) (M+H)380,15.
Соединение 3 - {3-(1-(4-трет-бутилфенил)-этил]-5-фтор-2-метилиндол-1-ил}-уксусная кислота
H
3
2
2
3
3
3
3
3
+
+
δ (400 МГц, CDCl) 7,32-7,21 (4Н, m, Ar), 7,08-7,03 (2H, m, Ar), 6,89-6,83 (1H, m, Ar), 4,82 (2H, s, CHCOH), 4,36 (1H, q J 7,3 Гц, CHCH), 2,33 (3Н, s, CH), 1,75 (3Н, d J 7,3 Гц, CHCH), 1,29 (9Н, s, С(CH)); Tr=1,78 мин (97%), m/z (ES) (M+H)368,21.
Соединение 4 - {5-фтор-3-[1-(4-метансульфонилфенил)-этил]-2-метил-индол-1-ил}-уксусная кислота
H
3
2
2
3
3
3
3
+
+
δ (400 МГц, CDCl) 7,81 (2H, d J 8,3 Гц, Ar), 7,47 (2H, d J 8,1 Гц, Ar), 7,06 (1H, dd J 8,8, 4,1 Гц, Ar), 6,96 (1H, dd J 10,0, 2,5 Гц, Ar), 6,85 (1H, dt J 9,0, 2,5 Гц, Ar), 4,78 (2H, s, CHCOH), 4,43 (1H, q 7,1 Гц, CHCH), 2,99 (3Н, s, CH), 2,29 (3Н, s, CH), 1,79 (3Н, d J 7,3 Гц, CHCH); Tr=1.34 мин (100%), m/z (ES) (М+H) 390,16.
Соединение 5 - [5-фтор-2-метил-3-(1-нафталин-2-илэтил)-индол-1-ил]-уксусная кислота
H
3
2
2
3
3
3
+
+
δ (400 МГц, CDCl) 7,81-7,74 (3Н, m, Ar), 7,69 (1H, d J 8,5 Гц, Ar), 7,47-7,39 (2H, m, Ar), 7,39-7,33 (1H, m, Ar), 7,09-7,02 (2H, m, Ar), 6,86 (1H, dt J 9,0, 2,4 Гц, Ar), 4,83 (2H, s, CHCOH), 4,54 (1H, q J 7,3 Гц, CHCH), 2,32 (3Н, s, CH), 1,86 (3Н, d J 7,3 Гц, CHCH); Tr=1,66 мин (97%), m/z (ES) (M+H)362,19.
Соединение 6 - (5-фтор-2-метил-3-хинолин-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
H
6
2
3
3
+
+
δ (400 МГц, d-DMSO - диметилсульфоксид) 8,42 (1H, d J 9,0 Гц, Ar), 8,23 (1H, d J 9,0 Гц, Ar), 8,11 (1H, m, Ar),7,97(1H, m, Ar), 7,60 (1H, m, Ar) 7,51 (3Н, m, Ar и Ar), 7,09 (1H, m, Ar), 5,19 (2H, s, CH), 4,56 (2H, CH), 2,63 (3Н, s, CH); Tr=1,06 мин (100%), m/z (ES) (M+H)349,35.
Соединение 7 - (5-фтор-2-метил-3-нафталин-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
Н
6
2
2
3
+
δ (400 МГц, d-DMSO) 7,87 (4Н, m, Ar), 7,47 (4Н, m, Ar), 7,22 (1Н, dd J 6,0, 1,5 Гц, Ar), 6,91 (1H, ddd J 9,0, 2,5 Гц, Ar), 5,04 (2H, s, CH), 4,23 (2H, s, СН), 2,42 (3H, s, СН); Tr=2,09 мин, m/z (ES+) (M+H) 348,13.
Соединение 8 - [5-фтор-3-(8-оксихинолин-2-илметил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
H
6
2
3
+
+
δ (400 МГц, d-DMSO) 9,53 (1H, s, ОН), 8,20 (1H, d J 8,0 Гц, Ar), 7,42 (5H, m, Ar), 7,13 (1H, dd J 6,0, 1,5 Гц, Ar), 6,91 (1H, dd J 9,0, 2,5 Гц, Ar), 5,00 (2H, s, СН), 4,41 (2H, s, W, 2,47 (3H, s, СН); Tr=1,13 мин, m/z (ES)M+H) 365,12.
Соединение 9 - (5-фтор-2-метил-3-хиноксалин-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
H
6
2
2
3
+
+
δ (400 МГц, d-DMSO) 9,02 (1H, s, H-3 Ar), 8,30 (2H, m, Ar), 8,05 (2H, m, Ar), 7,53 (2H, m, Ar), 7,07 (1H, m, Ar), 5,01 (2H, br s, CH), 4,64 (2H, s, CH), 2,64 (3H, s, СН); Tr=1,35 мин, m/z (ES) (M+H) 350,12.
Соединение 10 - [5-фтор-3-(4-метоксибензил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
H
6
2
2
3
3
+
+
δ (400 МГц, d-DMSO) 7,39 (1H, m, Ar), 7,16 (3H, m, Ar), 6,91 (3H, m, Ar) 5,00 (2H, s, CH), 3,98 (2H, s, CH), 3,74 (3H, s, OCH) 2,36 (3H, s, СН); Tr=1,93 мин, m/z (ES) (M+H)328,13.
Соединение 11 - (5-фтор-2-метил-3-тиазол-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
+
+
Tr=1,09 мин, m/z (ES) (M+H) 305,26.
Соединение 12 - [3-(4-хлорбензил)-5-фтор-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
+
+
Tr=1,63 мин (100%), m/z (ES) (M+H) 332,16.
+
+
Tr=1,66 мин, m/z (ES) (M+H) 366,6.
Соединение 15 - [5-фтор-2-метил-3-(4-трет-бутилбензил)-индол-1-ил]-уксусная кислота
+
+
Tr=1,73 мин, m/z (ES) (M+H) 354,21.
Соединение 16 - (3-бифенил-4-илметил-5-фтор-2-метилиндол-1-ил)-уксусная кислота
+
+
Tr=2,10 мин, m/z (ES)(M+H) 374,16.
Соединение 17 - [5-фтор-3-(4-метансульфонилбензил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
+
Tr=1,35 мин, m/z (ES)=376,05.
Соединение 18 - [5-фтор-3-(6-фторхинолин-2-илметил)-2-метилиндол-1-ил]-уксусная кислота
H
6
2
2
3
+
+
δ (400 МГц, d-DMSO) 8,20 (1Н, d J 8,6 Гц, Ar), 8,06 (1H, dd J 9,3, 5,6 Гц, Ar), 7,70 (1H, dd J 9,4, 2,8 Гц, Ar), 7,64 (1H, td J 8,8, 2,9 Гц, Ar), 7,37-7,32 (2H, m, Ar), 7,26 (1H, dd J 9,9, 2,6 Гц, Ar), 6,86 (1H, td J 9,2, 2,4 Гц, Ar), 4,94 (2H, s, CH), 4,33 (2H, s, CH), 2,40 (3Н, s, CCH); Tr=1,28 мин (100%), m/z (ES) (M+H) 367.50.
Соединение 22 - (5-хлор-2-метил-3-хинолин-2-илметилиндол-1-ил)-уксусная кислота
H
6
2
2
2
3
+
+
δ (400 МГц, d-DMSO) 8,21 (1H, d J 8,4 Гц, Ar), 8,00 (1H, d J 8,4 Гц, Ar), 7,89 (1H, d J 8,0 Гц, Ar), 7,77-7,73 (1H, m, Ar), 7,57-7,53 (2H, m, Ar), 7,40 (1H, d J 8,7 Гц, Ar), 7,29 (1H, d J 8,5 Гц, Ar), 7,04 (1H, dd J 8,6, 2,1 Гц, Ar), 5,00 (2H, s, CHCOH), 4,35 (2H, s, CH), 2,41 (3Н, s, CH); Tr=1,17 мин (95%), m/z (ES) (M+H) 365,28.
Пример 2 - Измерение антагонистической активности к CRTH2
Материалы и методики
Материалы
3
3
2
Краситель кальций-3 приобрели у Molecular Devices (Wokingham, UK). Монопольную разрешающую среду получили у Dainippon Pharamceuticals (Osaka, Japan). Микрошарики Macs anti-CD 16 получили у Miltenyi biotec (Bisley, Surrey). Пластинки ChemoTx приобрели у Neuroprobe (Gaithesburg, MD). Планшеты на 96 лунок с покрытием поли-О-лизином получили у Greiner (Gloucestershire, UK). [H]PGD получили у Amersham Biosciences (Buckinghamshire, UK). [H]SQ29548 приобрели у Perkin Elmer Life Sciences (Buckinghamshire, UK). Если не указано иного, то все остальные реагенты были получены у Sigma-Aldrich (Dorset, UK).
Методики
Клеточная культура
2
-1
2
Клетки яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary, CHO) трансфицировали рецепторами CRTH2 или DP (CHO/CRTH2 и CHO/DP) и поддерживали в культуре в увлажненной атмосфере при 37°С (5% CO) в минимальной эссенциальной среде (Minimum Essential Medium, MEM) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глутамина и 1 мг мл активного G418. Клетки пересевали каждые 2-3 дня. Для анализа связывания радиолигандов клетки переносили в трехслойные колбы или в колбы объемом 175 см с квадратным сечением (для получения мембран). Для анализа мобилизации кальция клетки выращивали перед анализом в планшете с 96 лунками в течение 24 часов при плотности 80000 клеток в лунке.
Получение клеточных мембран
2
Мембраны получили из клеток CHO/CRTH2 и CHO/DP или из тромбоцитов (как источник рецепторов ТР). Клетки CHO, выращенные до конфлюэнтности, промыли PBS (Phosphate-Buffered Saline, забуференный фосфатом физиологический раствор) и отделили с помощью раствора версена (15 мл на колбу). После выращивания клеток в колбе объемом 175 см с квардатным сечением их отобрали соскабливанием в PBS. Клеточные суспензии центрифугировали (1700 об/мин, 10 мин, 4°С) и ресуспендировали в 15 мл буфера [1xHBSS (Hanks' Balaced Salt Solution, сбалансированный солевой раствор Хенкса) с добавлением 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота), рН 7,3]. Затем клеточные суспензии гомогенизировали с помощью Ultra Turrax в режиме 4-6 в течение 20 секунд. Гомогенат центрифугировали при 1700 об/мин в течение 10 мин, а затем отобрали надосадочную жидкость и центрифугировали ее при 20000 об/мин в течение 1 часа при 4°С. Полученный осадок ресуспендировали в буфере и хранили при -80°С в аликвотах 200-500 мкл. Концентрацию белка определили способом Бредфорда (1976), используя в качестве стандарта альбумин сыворотки крупного рогатого скота. Тромбоциты промыли центрифугированием при 600g в течение 10 мин, ресуспедировали в охлажденном на льду аналитическом буфере (10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 5 мМ глюкозы, 120 мМ NaCl, 10 мкМ индометацина) и непосредственно центрифугировали при 20000 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Полученный осадок обработали, как описано выше.
Анализ связывания радиолигандов
3
3
2
2
2
Опыты по связыванию [H]PGD (160 Кюри/ммоль) проводили на мембранах, полученных описанным выше способом. Анализ выполняли в конечном объеме 100 мкл буфера (1xHBSS/HEPES 10 мМ, рН 7,3). 15 мкг клеточных мембран предварительно выдержали с различной концентрацией конкурирующего лиганда при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем добавили [H]PGD (моль, конечная концентрация) и дополнительно выдержали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакцию прекратили добавлением в каждую лунку 200 мкл охлажденного на льду аналитического буфера с последующей быстрой фильтрацией через стекловолоконные фильтры Whatman GF/B с помощью коллектора клеток Unifilter (PerkinElmer Life Sciences) и с шестикратной промывкой 300 мкл охлажденным на льду буфером. Пластинки Unifilter высушили при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 часа и определили остаточную радиоактивность на фильтрах с помощью счетчика Beta Trilux (PerkinElmer Life Sciences), а затем добавили 40 мкл сцинтилляционной жидкости Optiphase Hi-Safe 3 (Wallac). Неспецифическое связывание определили в присутствии of 10 мкМ немеченого PGD. Каждый анализ выполняли дважды.
Результаты экспериментов с рецепторами CRTH2 и DP по определению радиолигандного связывания представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Результаты радиолигандного связывания (Ki на рецепторе CRTH2)
Соединения
Ki (нМ)
Соединение 4
5±4
Соединение 6
9±3
Соединение 8
6±4
Соединение 12
11±2
Соединение 17
7±2
Соединение 18
1,3±0,6
Таблица 2
Результаты радиолигандного связывания (Ki на рецепторе DP)
Соединения
Ki (нМ)
Соединение 4
30440±9805
Соединение 6
17870±7290
Соединение 8
7710±1780
Соединение 12
12220±2250
Соединение 18
7740±1442
3
Связывание рецептора ТР с радиолигандами производили на мембранах, полученных из тромбоцитов. 15-40 мкг белка предварительного выдержали с различными концентрациями конкурирующего лиганда в течение 15 минут при комнатной температуре в аналитическом буфере (10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 5 мМ глюкозы, 120 мМ NaCl, 10 мкМ индометацина). Затем добавили [H]SQ29548 (38 Кюри/ммоль, конечная концентрация 10 нМ) и дополнительно выдержали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакцию прекратили добавлением в каждую лунку 200 мкл охлажденного на льду аналитического буфера с последующей быстрой фильтрацией через стекловолоконные фильтры Whatman GF/B с помощью коллектора клеток Unifilter (PerkinElmer Life Sciences) и с шестикратной промывкой 300 мкл охлажденным на льду буфером. Радиоактивность определяли, как описано выше.
Все соединения, обследованные в данном эксперименте, имели низкое сродство к связыванию с рецептором ТР (Ki>1 мкМ).
3
2
Соединения общей формулы (I), связанные с рецептором CRTH2, выделялись в клетках СНО со сродством в пределах от очень высокого до умеренного. Фактически значения Ki определяли в сравнении с [H]PGD при изменении концентрации от 500 пМ до 1 мкМ. Соединения общей формулы (I) не имели активности (или имели очень слабую активность) в рецепторах DP и ТР. Селективность связывания соединений общей формулы (I) с рецетором CRTH2 была в 200 раз выше, чем с рецепторами DP и ТР.
Анализ мобилизации кальция
Клетки посеяли на планшеты с 96 лунками с покрытием из поли-D-лизина с плотностью 80000 клеток на лунку и выдержали при 37°С в течение ночи, чтобы обеспечить адгезию клеток. Клетки дважды промыли HBSS и выдержали в течение 1 часа при 37°С в растворе 100 мкл HBSS и 100 мкл красителя кальций-3 (Molecular Devices) с добавлением 4 мМ пробенецида. Изменения флуоресценции контролировали с помощью Flexstation (Molecular Devices) в течение 50 с с добавлением антагониста на 17 с.
Влияние антагонистов CRTH2 на мобилизацию кальция в клетках CHO-CRTH2
2
50
2+
Индуцированное PGD дозозависимое увеличение внутриклеточной мобилизации Са в клетках CHO/CRTH2 с EC=2,4±0,5 нМ (n=3).
2
Влияние соединения общей формулы (I) на мобилизацию кальция, индуцированную PGD
2+
2
50
50
2
Соединения общей формулы (I) полностью ингибировали поток Са, стимулированный PGD, при этом величина IC для каждого соединения при определении кальция была сравнима с его величиной Ki при радиолигандном связывании. Значения IC соединений общей формулы (I) изменялись от 5 нМ to 1 мкМ. Результаты для некоторых соединений общей формулы (I) представлены в таблице 3. Увеличение доз соединений общей формулы (I) вызывало дозозависимый и параллельный сдвиг кривой дозовой зависимости PGD в клетках CHO/CRTH2, указывая тем самым, что эти соединения являются конкурентными антагонистами CRTH2.
2+
Антагонистическое влияние соединений общей формулы (I) является селективным для CRTH2, поскольку ингибиторующий эффект не наблюдали для потока Са, стимулированного АТР.
Таблица 3
Ингибирование потока кальция, индуцированного PGD<sub>2</sub>
Соединения
IC<sub>50</sub> (нМ)
Соединение 4
55±18
Соединение 6
30±6
Соединение 7
38±16
Соединение 8
11±6
Соединение 10
47±8
Соединение 12
108±29
Соединение 17
64±5
Соединение 18
10±5
Пример 3 - Исследование эффективности (5-фтор-2-метил-3-хинолин-2-илметилиндол-1-ил)-уксусной кислоты в отношении уменьшения воспаления дыхательных путей у коричневых норвежских крыс, подвергнутых стимуляции аллергеном
Коричневых норвежских крыс подвергали стимуляции антигеном, к которому крысы были предварительно сенсибилизированы. Сенсибилизацию животных проводили по отношению к овальбумину путем многократных внутрибрюшинных инъекций указанного антигена, к которому в качестве вспомогательного вещества был добавлен гидроксид алюминия. В результате указанной сенсибилизации вырабатывался антигенспецифичный иммуноглобулин Е (IgE) и развивалось состояние аллергической реактивности к овальбумину. Указанная сенсибилизация сходна с процессом, протекающим естественным образом у субъектов с атопическими нарушениями, у которых повышено содержание IgE. Кожные контактные пробы у таких субъектов могут показывать положительную реакцию к ряду аллергенов, которые могут вызывать приступы астмы или другие формы аллергического ответа.
Подвергнутым сенсибилизации коричневым норвежским крысам перорально вводили исследуемое соединение или носитель за 0,5 часа до стимуляции, которую проводили путем ингаляции с применением аэрозоля антигена, представляющего собой овальбумин. Через 24 ч после проведения стимуляции антигеном животных умерщвляли. Легкие животных промывали физиологическим раствором. Проводили общий и дифференцированный подсчеты клеток в пробах указанного физиологического раствора для определения количества инфильтрующих лейкоцитов различных типов.
При воздействии аллергена на подверженных аллергии коричневых норвежских крыс в дыхательных путях происходит аккумуляция ряда популяций лейкоцитов, включая лимфоциты, эозинофилы и базофилы. Аналогичный процесс происходит у больных, страдающих аллергической астмой, при воздействии бронхиального аллергена. Результаты эксперимента представлены на чертеже.
Как видно из чертежа, у животных, которым вводили исследуемое соединение, наблюдается значительное уменьшение воспаления дыхательных путей по сравнению с животными, которым вводили носитель. Указанный эффект сходен с эффектом, наблюдаемым для противовоспалительных стероидов, представляющих собой класс лекарственных препаратов, эффективных для лечения астмы и других аллергических состояний. Сходство эффекта, проявляемого антагонистом CRTH2 в указанной модели заболевания, с эффектом, характерным для стероидов, позволяет предположить, что предложенный новый класс соединений эффективен для уменьшения воспаления дыхательных путей и, таким образом, подходит для улучшения контроля протекания заболевания при астме. Это подтверждается и тем, что исследования на коричневых норвежских крысах и других видах животных, включающие стимуляцию аллергеном, в данной области техники традиционно используют для испытания новых противовоспалительных лекарственных препаратов, потенциально эффективных для лечения астмы и связанных с ней состояний.