ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
ANTIVIRAL AGENT FOR PREVENTING AND TREATING TICK-BORNE ENCEPHALITIS

Заявляемое изобретение относится к медицине и фармации, в частности к лечению и профилактике вирусных заболеваний, преимущественно, вызванных вирусом клещевого энцефалита.
В последние годы в России и за рубежом проводятся интенсивные исследования по разработке химиопрепаратов для лечения и профилактики вирусных инфекций. Особое внимание уделяется инфекциям, протекающим с поражением центральной нервной системы (бешенство, клещевой энцефалит и др.), которые вызывают у человека острые заболевания с высоким уровнем летальности и тяжелыми постинфекционными осложнениями (см., например, И.Ф.Баринский, О.М.Попова, Г.А.Галегов и др. Антивирусные вещества. - Рига, 1982. - С.7-8; Ф.И.Ершов, И.Ф.Баринский. Вопросы вирусологии. - 1983. - №4. - С.74-78).
Проблема заболеваемости людей клещевым энцефалитом весьма актуальна в настоящее время для многих территорий Российской Федерации. Имеющиеся в настоящее время вакцины недостаточно эффективны. Клещевой энцефалит по эпидемиологической значимости, тяжести течения инфекции и летальности занимает существенное место среди природно-очаговых вирусных инфекций (см., например, Д.К.Львов, С.М.Клименко, С.Я.Гайдамович. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. - М., 1989. - 336 с.; Н.П.Мишаева, И.К.Зубович, А.А.Згиревская и др. Антивирусные вещества при экспериментальной терапии вирусных инфекций. - Минск, 1986. - С.83-85; А.Б.Тарасенко, А.А.Згировская. Антивирусные вещества при экспериментальной терапии вирусных инфекций. - Минск, 1986. - С.85-89). В настоящее время насчитываются единицы эффективных и разрешенных к применению низкомолекулярных противовирусных соединений. За рубежом для лечения и профилактики вирусных инфекций используют такие соединения, как ацикловирин, рибовирин, амантадин, азидомидин и др., в нашей стране нашли широкое применение ремантадин, рибамидил, оксолон, метисазон, мекасин, полудан и др. Эти препараты чаще всего применяют при лечении паротита у детей, гриппозных пневмоний, генитального герпеса, опоясывающего лишая (см., например, Г.И.Фокина, Т.В.Фролова, В.М.Ройхель. Вопросы вирусологии. - М. - 1993. - №1. - С.18-21; F.I.Hayden, R.I.Douglas, R.Simons. Antimicrob Agents chemother. - 1980. - Vol.18 - P.536-541).
Одним из перспективных противовирусных лекарственных соединений для лечения клещевого энцефалита является натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат (далее Средство).
К настоящему времени стратегия отбора эффективных неспецифических медицинских средств защиты для ряда вирусных инфекций описана в Руководствах по доклинической оценке лекарственных средств (см. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., Минздрав РФ, 2005).
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, является расширение ассортимента лекарственных средств, обладающих широким спектром действия и предназначенных для лечения и профилактики вируса клещевого энцефалита.
Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению для лечения и профилактики клещевого энцефалита применяют противовоспалительное и противовирусное лекарственное Средство.
При этом заболевание или состояние представляет собой клещевой энцефалит, вызвано вирусом клещевого энцефалита, лекарственное средство предназначается для системного введения с использованием дозированного количества лекарственного средства, например 30-100 мг/кг - для лечения и профилактики заболевания.
Лекарственное средство выполнено в виде раствора, таблеток или капсул и предназначено для введения человеку, домашним и сельскохозяйственным животным перорально или в виде инъекций.
Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «новизна».
Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного выполнения.
Исследования противовирусной активности Средства проводили в экспериментах на клеточных культурах и на модели экспериментальной инфекции мышей клещевого энцефалита.
Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами (см. Г.Ф.Лакин. Биометрия. - М. - 1990).
Пример 1.
Для изучения противовирусной активности Средства в культуре клеток СПЭВ использовали 24-луночные планшеты с применением методов ЦПД и бляшкообразования по следующим схемам.
Схема 1. 1.1. Монослой клеток во флаконах Т-25 заражали вирусом клещевого энцефалита с множественностью 0,01 БОЕ/кл.
1.2. После адсорбции вируса в течение 60 мин монослой клеток тщательно отмывали раствором Хенкса и заливали по 6 мл среды поддержки с Средством в концентрации 0,5 мкг/мл.
1.3. Ежедневный отбор проб для дальнейших исследований.
1.4. Исследование проб методом бляшкообразования.
Схема 2. 2.1. 20 мышам массой 18-20 г вводили внутрибрюшинно по 12 мг на 1 животное.
2.2. Через 18 часов у мышей забирали тотально кровь и получали сыворотку по общепринятой методике.
2.3. Сыворотку инактивировали при 56°C в течение 30 мин.
-1
-9
2.4. Вирус титровали десятикратными разведениями от 10 до 10 и вносили в 24-луночные планшеты (1 разведение в 4 лунки). Вирус адсорбировали в течение 60 мин.
2.5. После адсорбции вносили агаровое покрытие, при этом сыворотку плодов коров заменяли на сыворотку мышей, содержащую Средство.
2.6. Учет опыта проводили на 4-5 сутки.
В опытах отрабатывали 2 схемы экспериментов с постоянной дозой Средства 0,5 мкг/мл (что составляет 1/16 от дозы острой токсичности в культуре клеток). Для экспериментальной инфекции готовили 10-кратные разведения вируса на среде поддержки (рабочая среда 199 + 2% сыворотки плодов коров). При выявлении противовирусной активности Средства методом ЦПД с использованием дозы 0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл цитопатический эффект наступал одновременно на 4-7 сутки в зависимости от дозы вируса в опыте и в контроле. Дальнейшее изучение противовирусной активности Средства проводили методом бляшкообразования.
2-3-суточную культуру клеток СПЭВ, выращенную в 24-луночных планшетах, заражали 10-кратными разведениями вируса. После адсорбции вируса в течение 60 минут в планшеты вносили по 1 мл агарового покрытия с содержанием 1 мкг/мл Средства в конечном объеме. На 4-5 сутки монослой клеток фиксировали, после чего окрашивали кристаллическим фиолетовым и проводили подсчет бляшек. В экспериментах с использованием схемы №1 отмечено снижение репродукции вируса в 10 раз.
В опытах, поставленных по схеме 2, отмечали снижение репродукции вируса в 100 раз. Для постановки этих экспериментов сыворотку от мышей получали и использовали в день постановки опыта. При проведении опытов с использованием сыворотки, хранящейся при температуре -70°C, снижения репродукции вируса не отмечено.
Таким образом, при введении Средства в дозе 0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл в среду поддержки и агаровое покрытие, а также при использовании сыворотки крови мышей, содержащей Средство, отмечено снижение репродукции вируса от 10 до 100 раз.
Пример 2.
Для исследования противовирусной активности Средства на модели экспериментальной инфекции мышей клещевого энцефалита использовали белых мышей массой 18-20 г. Животных инфицировали внутрибрюшинно по 0,5 мл десятикратными разведениями вируса - по 4 животных на одно разведение. Средство вводили в различные сроки по 3 и 12 мг на 1 животное. Титр вируса высчитывали по методу Рида и Менча.
В работе применяли следующие схемы введения Средства лабораторным животным.
Схема 1. 1.1. Вирус вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл двум группам животных.
1.2. Через 6 дней опытной группе животных вводили Средство по 12 мг на 1 животное.
1.3. Через 24 ч этой же группе животных вводили по 3 мг Средства на 1 животное до окончания клинических проявлений инфекции в контрольной группе животных.
Схема 2. 2.1. Средство вводили за 6 дней до введения вируса в дозе 12 мг на 1 животное через каждые 24 ч.
2.2. На седьмой день одновременно вводили 12 мг Средства и 0,5 мл вируса в рабочей дозе одному животному.
Схема 3. 3.1. Средство в дозе 3 мг на 1 животное вводили за сутки до введения вируса.
3.2. Через 2 ч после заражения вводили Средство в дозе 3 мг.
3.3. В дальнейшем проводили ежедневную инъекцию Средства в дозе 3 мг до окончания клинических проявлений в контрольной группе.
Схема 4. 4.1. 12 мг на 1 животное вводили в день введения вируса.
4.2. Через каждые 24 ч вводили по 3 мг Средства до окончания клинических проявлений инфекции в контрольной группе животных.
За всеми группами животных наблюдали в течение 30 суток. Учет опытов проводили ежедневно по клиническим проявлениям и гибели животных.
Оценку противовирусного действия Средства проводили по трем параметрам: проявлению клинических признаков инфекции, выживаемости животных и увеличению средней продолжительности жизни.
Основные результаты исследований представлены в таблице. Из полученных данных следует, что Средство обладает противовирусной активностью. Внутрибрюшинное введение Средства создает определенную защиту животных от экспериментальной инфекции. Противовирусную активность отмечали по тесту выживаемости животных, а также по увеличению средней продолжительности жизни (СПЖ) от 17 до 25 дней. Снижение дозы вводимого Средства до 3 мг на 1 животное (что составило 1/32 от дозы острой токсичности) вызывало защиту животных от экспериментальной инфекции до 70%.
Результаты изучения эффективность экстренно-профилактического действия Средства на белых мышей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита, представлены в таблице 1.
Таблица 1
Эффективность экстренно-профилактического действия Средства на белых мышей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита
Группа животных
Способ введения вируса
Доза Средства, способ введения
Количество инъекций вируса
Количество инъекций Средства
СПЖ
Гибель животных в %
острый контроль
п/к по 0,5 мл
-
1
-
16,67
65
схема 1
п/к по 0,5 мл
12 мг/кг и 3 мг/кг в/бр по 0,5 мл
1
8
16,6
50
схема 2
п/к по 0,5 мл
12 мг/кг в/бр по 0,5 мл
1
4
25,0
30
схема 3
п/к по 0,5 мл
3 мг/кг в/бр по 0,5 мл
1
6
16,67
60
схема 4
п/к по 0,5 мл
12 мг/кг и 3 мг/кг в/бр по 0,5 мл
1
12
20,0
30
Примечание: п/к - подкожное; в/бр - внутрибрюшинно
Таким образом, введение Средства с целью профилактического предупреждения развития инфекции защищало от гибели до 70% животных. Средняя продолжительность жизни летально инфицированных животных в результате действия Средства возрастала на 8,3 суток.
Заявляемое изобретение способствует расширению ассортимента лекарственных средств, обладающих широким спектром действия и предназначенных для лечения и профилактики вируса клещевого энцефалита.