СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СЕПТИЧЕСКОГО ШОКА В СОСТОЯНИИ АГРАНУЛОЦИТОЗА
METHOD OF TREATING SEPTIC SHOCK ACCOMPANIED WITH AGRANULOCYTOSIS

Изобретение относится к медицине, а именно к интенсивной терапии и реаниматологии.
Септический шок является одной из основных причин смерти больных с агранулоцитозом. У больных с агранулоцитозом септический шок, искусственная вентиляция легких и тяжесть состояния больных более 27 баллов по шкале APACHE II в 82% случаев приводит к летальному исходу [1]. Проблема улучшения результатов лечения септического шока у больных в агранулоцитозе остается крайне актуальной.
Известен способ лечения септического шока, включающий: антибиотическую терапию, инфузионную терапию, введение вазопрессоров и глюкокортикостероидных препаратов, искусственную вентиляцию легких, коррекцию гемостаза, гемодиализ, нутритивную поддержку [2].
Недостатками этого способа являются сохраняющаяся высокая смертность пациентов в первые часы развития септического шока, так как уделяется мало внимания иммунному статусу пациента [3, 4], учитывается только микробиологическая составляющая инфекционного процесса, не учитываются происходящие в организме человека изменения иммунной системы. Особенно актуально это при септическом шоке среди иммунокомпрометированных больных, в том числе больных в состоянии агранулоцитоза, среди которых выживаемость при септическом шоке в 1,7 раз меньше чем среди больных без иммунодефицита [5].
Другим способом лечения септического шока у больных кроме проводимой комплексной терапии служит рекомбинантный активированный протеин С, который воздействует на систему воспаления несколькими путями: снижает присоединение селектинов к лейкоцитам, снижает высвобождение цитокинов из моноцитов, блокирует высвобождение фактора некроза опухоли-α из лейкоцитов, угнетает выработку тромбина, который потенцирует воспалительный ответ. В исследовании PROWES [6] было показано снижение смертности при введение активированного протеина C больных с сепсисом в течение 96 ч в дозе 24 мкг/кг мин.
Недостатками этого способа лечения являются высокий риск развития геморрагических осложнений [7], а также отсутствие увеличения выживаемости у больных в выполненном позже исследовании PROWES-SHOCK [8].
Еще одним способом лечения септического шока является терапия человеческими иммуноглобулинами, действие которых направлено непосредственно против антигенов, находящихся на поверхности микроорганизмов. Также происходит прямая инактивация медиаторов сепсиса и нейтрализация рецепторов для этих медиаторов, расположенных на поверхности клеток.
Недостатком этого метода является отсутствие доказанного влияния на выживаемость у пациентов с сепсисом и септическим шоком [9].
6
9
Прототипом способа лечения сепсиса и септического шока является способ профилактики острой реакции трансплантат против хозяина после трансплантации аллогенного костного мозга (патент на изобретение №2454247, 2010 год), при котором используется введение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток для лечения и профилактики острой реакции «трансплантат против хозяина», возникающей после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток [10, 11]. При этом способе мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора, полученные из костного мозга, выращенные на среде с плазмой крови человека, обогащенной лизированными тромбоцитами, вводят внутривенно в количестве 1×10 трансплантируемых клеток на кг веса больного в момент восстановления лейкоцитов в периферической крови больного после трансплантации аллогенного костного мозга более 1,0×10/л. Способ обеспечивает эффективную профилактику острой реакции трансплантат против хозяина при аллогенной трансплантации костного мозга.
9
Недостатками метода являются применение его у больных без инфекционных осложнений, только с признаками острой реакции «трансплантат против хозяина», невозможность его использования у больных в состоянии агранулоцитоза (с числом лейкоцитов менее 1×10/л).
Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности лечения больных с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза.
Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что больному в состоянии агранулоцитоза в первые 10 часов с момента развития септического шока вводят внутривенно мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора в количестве 1-1,5 млн на кг массы тела больного однократно.
При внедрении в организм инфекционного агента мультипотентные мезенхимные стромальные клетки выделяют факторы роста, которые регулируют иммунный эффект T- и B-клеток, дендритных клеток, моноцитов, нейтрофилов, макрофагов, влияя тем самым на эндотелиальную и эпителиальную проницаемость, продукцию противовоспалительных и провоспалительных цитокинов и уменьшая выраженность воспаления [12, 13]. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки отвечают на наличие инфекционного агента увеличением синтеза простагландина E2, активацией рецепторов простагландина Е2 на макрофагах, увеличением синтеза интерлейкина-10 и уменьшением синтеза интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли-α. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки способствуют бактериальному киллингу и клиренсу через паракринные взаимодействия с локальными иммунными клетками, замедляют созревание B-клеток и нарушают в них переключение синтеза антител, подавляя хемотаксис и регулируя тем самым синтез антител. Секретируемые мультипотентными мезенхимные стромальными клетками растворимые факторы (трансформирующий ростовой фактор-β, фактора роста гепатоцитов, простагландин Е2 и NO) ингибируют пролиферацию T-клеток и продукцию цитокинов, уменьшают цитотоксический эффект цитолитических Т-клеток [14, 15]. Эффективность мультипотентных мезенхимных стромальных клеток при сепсисе подтверждена в экспериментальных моделях сепсиса на животных [15]. Данные о их применении для лечения сепсиса и септического шока у людей отсутствуют.
Практически способ осуществляют следующим образом.
6
Сепсис - патологический процесс, в основе которого лежит реакция организма в виде генерализованного (системного) воспаления на инфекцию различной этиологии (бактериальной, вирусной, грибковой). При этом происходит системная продукция ряда цитокинов клетками-эффекторами воспаления (Т-лимфоциты, макрофаги, эндотелиоциты, тромбоциты), при нарушении существующего равновесия между провоспалительными (интерлейкины-1, -6, -8, фактор некроза опухоли) и противовоспалительными (интерлейкины-4, -10, -14, растворимые рецепторы к фактору некроза опухоли) медиаторами развивается септический шок [3]. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора, полученные из костного мозга, выращенные на среде с плазмой крови человека, обогащенной лизированными тромбоцитами, вводят внутривенно в количестве 1-1,5×10 трансплантируемых клеток на кг массы тела больного однократно в первые десять часов от момента развития септического шока.
2
9
2
6
Получают мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора из ядросодержащих клеток костного мозга донора [16]. Ядросодержащие клетки костного мозга донора получают ресуспендированием костного мозга в питательной среде с 0,1% метилцеллулозы, инкубацией смеси при комнатной температуре в течение 40 минут и последующим центрифугированием фракции, не содержащей эритроцитов, при 1500 об/мин в течение 10 минут. Ядросодержащие клетки культивируют в среде MEM с 4% плазмы, обогащенной тромбоцитами, 200 мМ L-глутамина и антибиотиками в концентрации 120000 клеток на один см площади дна флакона. Плазму крови человека, обогащенную тромбоцитами (концентрация тромбоцитов 0,5-1.9×10/мл), получают в результате размораживания предварительно замороженного при -70°C концентрата тромбоцитов с последующим осаждением лизата тромбоцитов при 12000 об/мин в течение 15 минут. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора, достигшие конфлуэнтности, снимают с подложки с помощью 0,025% трипсина и пассируют в концентрации 4500 клеток на 1 см площади дна флакона. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора после снятия с подложки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут и ресуспендируют в полиглюкине в необходимом количестве. Далее клетки замораживают в пробирках в жидком азоте. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора вводят в количестве 1-1,5×10 /кг веса больного внутривенно в течение 10 мин однократно. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора могут быть использованы как непосредственно после их получения, так и после размораживания клеток, ранее замороженных в парах жидкого азота в среде с 10% диметилсульфоксида.
Непосредственно перед введением мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в организм больного септическим шоком в состоянии агранулоцитоза пробирка с клетками размораживается в теплой воде с температурой не более 37°C. Сразу же после размораживания мультипотентные мезенхимные стромальные клетки вводятся внутривенно пациенту.
Клинический пример 1
9
2
2
2
5
9
2
2
Больной З., 31 г. с впервые диагностированным острым миеломонобластным лейкозом, протекающим с гиперлейкоцитозом, с 24.01.2014 по 30.01.2014 был проведен индукционный курс химиотерапии по программе 7+3 [17]. После окончания химиотерапии у больной развился миелотоксический агранулоцитоз (лейкоциты крови 0,3×10/л), течение которого осложнилось развитием синегнойного сепсиса: лихорадка до 40°C, двусторонняя пневмония, повышение сывороточной концентрации прокальцитонина более 10 нг/мл (полуколичественный метод), C-реактивного белка (СРБ) до 124 г/л, в посевах крови получен рост Pseudomonas aeruginosae. В связи с развитием острой дыхательной недостаточности (PaO/FiO=120) больная была переведена на искусственную вентиляцию легких. В повторных посевах образцов крови, мочи, жидкости бронхоальвеолярного лаважа выявлены штаммы Pseudomonas aeruginosae, резистентные к цефалоспоринам, карбапенемам, аминогликозидам, но сохранявшие чувствительность к колистину и фосфомицину. Была назначена антибактериальная терапия меропенемом (6 г/сут), колистином (10 млн/сут) и фосфомицином (12 г/сут). Однако несмотря на это спустя неделю у больной развился септический шок: артериальная гипотензия до 65/30 мм рт.ст., концентрация лактата в артериальной крови 6 ммоль/л, по данным транспульмональной термодилюции - гиперкинетический тип гемодинамики (сердечный индекс 7,2 л/мин/м, ударный индекс 57 мл/м, индекс общего периферического сосудистого сопротивления 480 дин сек м/см). Сывороточная концентрация прокальцитонина составила 21 нг/мл, СРБ - 227 мг/л, концентрация пресепсина в плазме - 2550 пг/мл. Начата вазопрессорная терапия норадреналином (1,4 мкг/кг/мин), гидрокортизоном (200 мг/сут). Больная была включена в проспективный исследовательский протокол терапии септического шока у больных с агранулоцитозом. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. В рамках протокола на третий час развития септического шока ей внутривенно были введены мультипотентные мезенхимные стромальные клетки в количестве 1,28 млн/кг (вес больной составил 74 кг), которые были получены из костного мозга донора-женщины в возрасте 34 лет. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки культивировали по стандартной методике (в среде альфа MEM с добавлением 4% человеческой плазмы, обогащенной тромбоцитами). Клетки были использованы на 1-м пассаже. Антибиотическая терапия была продолжена в прежнем объеме. Спустя 2-е суток после введения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток отмечено восстановление лейкопоэза (лейкоциты крови 1,5×10/л), стабилизация АД, нормализация сердечного индекса и периферического сосудистого сопротивления, прекращена инфузия норадреналина, сохранялась лихорадка до 39,6°C. Концентрация прокальцитонина сыворотки снизилась до 12 нг/мл, СРБ - до 160 мг/л, концентрация пресепсина в плазме - 2789 пг/мл. Постепенно состояние больной улучшилось: нормализовалась температура тела, регрессировали воспалительные изменения в легких, регрессировала острая дыхательная недостаточность. Синегнойная палочка прекратила выделяться из крови спустя 23 сут. Спустя 57 сут прекращена искусственная вентиляция легких, и больная была выписана из отделения реанимации. По данным исследования костного мозга констатирована ремиссия острого лейкоза. В последующем ей было проведено еще несколько курсов химиотерапии. 9 января 2015 г. больной выполнена трансплантация аллогенного костного мозга от неродственного донора. В течение пяти месяцев у больной сохраняется ремиссия заболевания, выписана из стационара домой.
Данный результат указывает на эффективность терапии мультипотентными мезенхимными стромальными клетками сепсиса и септического шока у больной с миелотоксическим агранулоцитозом.
Пример 2. Данные проспективного контролируемого рандомизированного исследования
В рамках проводимого в ФГБУ «Гематологический научный центр» (ГНЦ) МЗ РФ проспективного контролируемого рандомизированного исследования изучалась эффективность терапии септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Критериями включения в исследование было развитие септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза, подписанное информированное согласие больного на включение в исследование. Критериями исключения из исследования были резистентность к химиотерапии и плохой прогноз заболевания системы крови. В качестве главного критерия эффективности лечения выбрана выживаемость пациентов за 28-дневный период наблюдения. Пациенты с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза были распределены случайным образом на две группы:
- группу, которая получала стандартную терапию септического шока, включающую антибиотическую, инфузионную терапию, введение вазопрессоров и глюкокортикостероидных гормонов, нутритивную поддержку, по показаниям - искусственную вентиляцию легких, заместительную почечную терапию;
- группу лечения мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, в которой наряду со стандартной терапией септического шока в течение первых 10 ч его развития внутривенно однократно вводили 1-1,5 млн/кг массы тела больного мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, полученных из костного мозга доноров. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки культивировали по стандартной методике (в среде альфа MEM с добавлением 4% человеческой плазмы, обогащенной тромбоцитами). Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки вводили внутривенно в течение 10 мин. Статистический анализ. Эффективность применения мультипотентных мезенимальных стволовых клеток в лечении СШ больных в состоянии агранулоцитоза оценивали по выживаемости больных септическим шоком с применением лог-ранг критерия и критерия Вилкоксона.
При включении в исследование не было статистически значимых различий между группами: группа больных, получивших только стандартную терапию, состояла из 12 пациентов (6 мужчин, 6 женщин) в возрасте от 41 до 81 года (медиана 58 лет); группа больных, получивших терапию мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, состояла из 14 человек (6 мужчин, 8 женщин) в возрасте от 30 до 75 лет (медиана 47 лет). При включении в исследование группа стандартной терапии не отличалась значимо от группы, леченной мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, по тяжести состояния, оцененной по шкале APACHE II (соответственно 32,5±5,9 и 29,9±5,2 баллов). Больные из группы мультипотентных мезенхимных стволовых клеток получили в первые 10 ч развития септического шока однократно 1-1,5 млн/кг мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, полученных от здоровых доноров костного мозга.
На рисунке 1 изображен показатель общей выживаемости для группы больных с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза, с использованием мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (МСК+), который статистически значимо выше, чем для группы больных, леченных без мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (МСК-): 51% (SE 15) против 17% (SE 15); медианы выживаемости: 29 мес. против 7 мес. соответственно (p=0,01, логранговый критерий и критерий Вилкоксона; SE - стандартная ошибка показателя выживаемости); риск летального исхода при лечении без использования мультипотентных мезенхимных стволовых клеток увеличивается в 3 раза: отношение рисков (Hazard Ratio, HR) равно 3,0 (95% ДИ: 1,2-7,0).
Выживаемость в группе больных, получивших наряду со стандартной терапией септического шока мультипотентные мезенхимные стволовые клетки, была значимо выше, чем среди больных, которые получили только стандартную терапию: 6 (43%) из 14 против 1 (8%) из 12 против (рис. 1). Риск летального исхода у больных, леченных только по схеме стандартной терапии, был в 3 раза выше, чем при использовании наряду со стандартной терапией мультипотентных мезенхимных стволовых клеток: HR=3.0 (95% ДИ 1,2-7,0), причем летальные исходы в группе стандартной терапии происходили в течение 10 первых дней после развития септического шока. В группе терапии мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками летальные исходы наступали позже (примерно на неделю) и были более растянуты во времени (рис. 1). Таким образом, включение мультипотентных мезенхимных стволовых клеток в терапию септического шока позволяет достичь большей выживаемости при лечении септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза по сравнению со стандартной терапией.
Пример 3. Данные об эффективности терапии септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза
В рамках проводимого в ФГБУ «Гематологический научный центр» (ГНЦ) МЗ РФ проспективного контролируемого рандомизированного исследования изучалась эффективность терапии септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Критериями включения в исследование было развитие септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза, подписанное информированное согласие больного на включение в исследование. Критериями исключения из исследования были резистентность к химиотерапии и плохой прогноз заболевания системы крови. В качестве критерия эффективности лечения выбрано изменения выраженности полиорганной недостаточности, оцененной по шкале SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) [18]. Пациенты с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза были распределены случайным образом на две группы:
- группу, которая получала стандартную терапию септического шока, включающую антибиотическую, инфузионную терапию, введение вазопрессоров и глюкокортикостероидных гормонов, нутритивную поддержку, по показаниям - искусственную вентиляцию легких, заместительную почечную терапию;
- группу лечения мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, в которой наряду со стандартной терапией септического шока в течение первых 10 ч его развития внутривенно однократно вводили 1-1,5 млн/кг массы тела больного мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, полученных из костного мозга доноров.
На рисунке 2 показаны изменения баллов по шкале SOFA у больных, леченных мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками. При развитии септического шока группа больных, получавшая только стандартную терапию, не отличалась от группы больных, леченных стандартной терапией и мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, по выраженности полиорганной недостаточности, оцененной по шкале SOFA (соответственно 16,5±2,1 и 15,9±2,0 баллов). В процессе лечения в группе стандартной терапии выраженность органной недостаточности по шкале SOFA значимо не изменилась за все время наблюдения. В группе больных, леченных мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, начиная со второй недели лечения, отмечено уменьшения выраженности органной недостаточности, оцененной по шкале SOFA (рис. 2).
Таким образом, включение мультипотентных мезенхимных стволовых клеток в терапию септического шока позволяет уменьшить выраженность полиорганной недостаточности и тем самым улучшает результаты лечения больных септическим шоком в состоянии агранулоцитоза, увеличить выживаемость больных в состоянии агранулоцитоза при септическом шоке.
Список литературы
1. Khwankeaw J, Bhurayanontachai R. Mortality correlation factors in patients with lymphoma and acute myeloid leukemia admitted into the intensive care unit at a referral center in the south of Thailand. J Med Assoc Thai. 2014 Jan; 97 Suppl 1: S77-83.
2. Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, Annane D, Gerlach H, Opal SM, Sevransky JE, Sprung CL, Douglas IS, Jaeschke R, Osborn TM, Nunnally ME, Townsend SR, Reinhart K, Kleinpell RM, Angus DC, Deutschman CS, Machado FR, Rubenfeld GD, Webb S, Beale RJ, Vincent JL, Moreno R; Surviving Sepsis Campaign Guidelines Committee including The Pediatric Subgroup. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Med. 2013 Feb; 39(2): 165-228.
3. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med. 2003; 348(2): 138-150.
4. Remick DG. Pathophysiology of sepsis. Am J Pathol. 2007; 170(5): 1435-1444.
5. Tolsma V, Schwebel C, Azoulay E, Darmon M, Souweine B, Vesin A, Goldgran-Toledano D, Lugosi M, Jamali S, Cheval С, Adrie С, Kallel H, Descorps-Declere A, Garrouste-Orgeas M, Bouadma L, Timsit JF. Sepsis severe or septic shock: outcome according to immune status and immunodeficiency profile. Chest. 2014; 146 (5): 1205-13.
6. http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/DrugSafetyPodcasts/ucm277212.htm. Accessed 18 Dec. 2011.
7. Bernard G.R., Vincent J-L., Laterre P-F., et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein С for severe sepsis. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 699-709.
8. Ranieri V.M., Thompson В.T., Philip S.В., et al. Drotrecogin Alfa (Activated) in Adults with Septic Shock. The new England journal of medicine. 2012; vol. 366: no. 22.
9. Werdan K, Pilz G, Bujdoso O, Frauberger P, Neeser G, Schmeider RE, et al. Score-based immunoglobulin G therapy of patients with sepsis: The SBITS study. Critical Care Med. 2007; 35: 2693-701.
10. Introna M., Rambaldi A. Mesenchymal stromal cells for prevention and treatment of graft-versus-host disease: successes and hurdles. Curr. Opin. Organ Transplant. 2015, 20(1): 72-78.
11. Kuzmina L.A., Petinati N.A., Parovichnikova E.N. et al. Multipotent Mesenchymal Stromal Cells for the Prophylaxis of Acute Graft-versus-Host Disease-Α Phase II Study. Stem Cells Int. 2012 2012 968213.
12. Jones B.J. and McTaggart S.J. Immunosuppression by mesenchymal stromal cells: from culture to clinic. Exp. Hematol. 2008, 36(6): 733-741.
13. Stagg J. and Galipeau J. Mechanisms of Immune Modulation by Mesenchymal Stromal Cells and Clinical Translation. Curr. Mol. Med. 2013, 13(5): 856-867.
14. Wannemuehler T.J., Manukyan M.C., Brewster B.D., Rouch J., Poynter J.A., Wang Y., Meldrum D.R. Advances in Mesenchymal Stem Cell Research in Sepsis. J Surg Res. 2012; 173(1): 113-26.
15. Németh К., Leelahavanichkul Α., Yuen P.S., Mayer В., Parmelee Α., Doi K., Robey P.G., Leelahavanichkul K., Koller B.H., Brown J.M., Hu X., Jelinek I., Star R.A., Mezey E. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat Med. 2009; 15 (1): 42-9.
16. Svinareva DA, Shipunova IN, Ol′shanskaia I, Momotiuk KS, Drize NI, Savchenko VG. The basic properties of mesenchymal stromal cells from the donor bone marrow: superficial markers. Ter. Arkh. 2010; 82: 52-56.
17. Программное лечение заболеваний системы крови. Сборник алгоритмов диагностики и протоколов лечения заболеваний системы крови. Под ред. Савченко В.Г. Том II. Практика 2012. - 1056 с.
18. Vincent J.-L., Moreno R., Takala J., et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. Intensive Care Med. 1996; 22: 707-710.