Штамм метилотрофных дрожжей PICHIA PASTORIS Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, продуцирующий рекомбинантный человеческий трансферрин, содержащий аминокислотные замены N413D и N611D
METHYLOTROPHIC YEAST STRAIN PICHIA PASTORIS YST-PPIC9PGAPZALPHA-SHORT_HTFNG, PRODUCING RECOMBINANT HUMAN TRANSFERRIN CONTAINING AMINO ACID SUBSTITUTES N413D AND N611D

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению модифицированного рекомбинантного трансферрина человека, содержащего аминокислотные замены N413D и N611D (ТФР). Изобретение может быть использовано для получения бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих.
Объектом изобретения является штамм метилотрофных дрожжей Pichia Pastoris Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, продуцирующий модифицированный рекомбинантный человеческий трансферрин, содержащий аминокислотные замены N413D и N611D.
3+
Трансферрин является гликопротеином, связывающим железо, и его используемые концентрации в бессывороточной среде находятся в диапазоне 1-30 мкг/мл. Трансферрин взаимодействует с определенными рецепторами клеточной поверхности и играет важную роль в транспортировке железа через плазматическую мембрану [Bretscher, М.S. // Sci Am., 1985; Trowbridge, I.S. et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1981]. Белок имеет в своей структуре два высокоаффинных сайта связывания ионов Fe [Barnes D. et al. // Cell 1980.]. Железо, проникающее в клетки за счет трансферрин-опосредованного эндоцитоза поддерживает обменные процессы и рост эукариотических клеток [Richardson, D.R. et al. // Cell Physiol. 1994.]. Также трансферрин может иметь дополнительные функции in vitro, такие как хелатирование вредных следовых металлов в культуральной среде. Добавление солей железа без хелатирующего агента может приводить к образованию свободных радикалов и токсическому воздействию на клетки. Кроме того, образование нерастворимых гидроксидов железа может сделать железо биологически недоступным. Таким образом, трансферрин является необходимым компонентом культуральных сред.
В настоящее время ряд коммерчески доступных бессывороточных уже содержат в своем составе рекомбинантный трансферрин, однако, абсолютное большинство содержит трансферрин, очищенный из сыворотки крови животных и человека. Однако, при получении ТФР таким образом существует риск его контаминации различными биологически активными инфекционными агентами, обусловленный сложностями их детекции и инактивации. Использование ростовых сред, содержащих в своем составе трансферрин сыворотки крови может, привести к дальнейшей контаминации подобными агентами получаемых фармацевтических белков. В связи с этим получение рекомбинантного трансферрина для последующего его использования в составе бессывороточных питательных сред представляется востребованным с точки зрения современных требований биобезопастности фармпрепаратов, применяемых для профилактики и лечения различных заболеваний человека.
Известен способ получения рекомбинантного ТФР в прокариотической системе Escherichia coll В случае бактериальных клеток Е. coli нуклеотидная последовательность трансферрина была клонирована под контролем taq-промотора. Уровень экспрессии ТФР достигал 60 мг/л [DeSmit М.Н. et al. // bit J Biochem Cell Biol. 1995].
Недостатком данного способа является накопление до 95% целевого белка в виде нерастворимых агрегатов, что может быть обусловлено сложной структурой трансферрина и большим количеством дисульфидных связей. Авторы не приводят уровень продукции функционально-активного ТФР.
Известны способы получения рекомбинантного ТФР клетками фибробластов почки сирийского хомячка (ВНК). Авторы показали, что уровень экспрессии ТФР составил 125 мг/л, однако полученный белок представлял из себя смесь гликозилированных форм 16 различных молекулярных масс. Мутации двух аспарагиновых остатков привели к уменьшению уровня экспрессии целевого белка до 25 мг/л, однако, наряду с гликозилированными формами, белок сохранял свою биологическую активность, сравнимую с таковой нативного белка [Mason А.В. et al. // Biochemistry. 1993]. Авторам [Mason А.В. et al. //Protein Expression Purif. 2001] удалость получить продуктивность 40 мг/л в случае рекомбинантного ТФР, содержащего последовательность шести гистидинов и 50 мг/л в случае негликозилированного ТФР.
Недостатками данных способов является гетерогенность целевого белка в случае гликозилированной формы или невысокий уровень экспрессии в случае негликозилированного ТФР наряду низкой производительностью, обусловленной медленными темпами роста культуры ВНК и высокими затратами на получение.
Известен способ получения трансгенного ТФР в Nicotiana tabacum (табак обыкновенный) и в Oryza sativa (рис посевной) в виде как полноразмерного так и фьюжн белка [Brandsma М.Е. et al. // Plant Biotechnol J. 2010; Zhang D. et al. // Protein Expr Purif. 2010], с содержанием целевого белка в 33.5 мг/кг свежих листьев и 10 г/кг сухих семян соответственно. Функциональная активность полученного белка подтверждалась обратимым связыванием железа in vitro. Помимо этого, полученный таким образом ТФР, проявляет бактериостатическую активность, поддерживает пролиферацию клеток в бессывороточной среде и эффективно интернализуется в клетки млекопитающих in vitro [Zhang D, et al. // BMC Biotechnol. 2012].
Недостатками данного способа является медленный темп роста трансгенных растений и трудоемкость процесса выделения целевого белка.
Известен способ получения рекомбинантного ТФР в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
Коллективу авторов [Finnis C.J. et al. //Microbial Cell Factories 2010] удалось получить уровень продукции более 2.2 г/л негликозилированной формы трансферрина, содержащей мутации N413Q и N611Q, в условиях культивирования в ферментере. Авторы использовали различные штаммы S. cerevisiae, содержащие эписомальные вектора на основе 2um дрожжевых плазмид, имеющих в своем составе последовательность ТФР вместе с различными сигнальными последовательностями под контролем PRB1 промотора, ADH1 терминатор и селективный LEU2 маркер. Исследователями также показано, что использование сигнальных последовательностей ЧСА и гибридной ЧСА-MFα-1 приводит к более высокому уровню экспрессии ТФР, однако в результате неполного или неспецифического процессинга лидерного пептида секретируемый белок представляет собой гетерогенную смесь. Секрецию корректно процессированного и гомогенного функционально активного ТФР обеспечивала только сигнальная последовательность инвертазы Suc2.
Другой коллектив авторов показал, что полученный в дрожжах S. cerevisiae негликозилированный ТФР может успешно применятся в составе бессывороточных ростовых сред [Sargent P.J. et al. // Biometals. 2006].
Недостатками данного способа является нестабильность используемых дрожжевых эписомальных плазмид, которая может приводить к уменьшению уровня продукции рекомбинантных белков в течение длительных культивационных процессов, особенно при промышленном производстве [Ruben Н. et al. // Yeast 2017; Ruben H. et al. // FEMS Yeast Research 2019; Ruben H. et al. // Appl Microbiol Biotechnol. 2017].
Известен способ получения функционально активного, корректно процессированного рекомбинантного ТФР в дрожжах Pichia pastoris [Mizutani K. et al. // Biosci Biotechnol Biochem 2010.]. Полученный белок имел два сайта гликозилирования с углеводными цепями, содержащими 12 и 6 маннозных остатков. Уровень экспрессии ТФР в условиях экспрессии в «богатой» среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт и дрожжевую азотную основу составил 30 мг/л.
Недостатками данного способа является невысокий уровень продукции ТФР. Присутствие в структуре ТФР гетерогенных олигосахаридных цепей ограничивает его использование в составе ростовых сред, поскольку это может привести к контаминации получаемых в них фармацевтических белков и, как следствие, нежелательными иммунными реалиями.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма метилотрофных дрожжей P. pastoris, секретирующий рекомбинантный сывороточный трансферрин, не содержащий N-гликозилирования, в культуральную среду на уровне 100 мг/л в условиях роста в минимальной солевой среде.
Ближайшим аналогом заявленного изобретения является публикация [Mizutani K. et al. // Biosci Biotechnol Biochem 2010.], в которой описано получение функционально активного, корректно процессированного рекомбинантного ТФР в дрожжах Pichia pastoris, секретирующих ТФР в культуральную среду на уровне 30 мг/л, которая принята в качестве прототипа.
Поставленная задача решается за счет:
увеличения числа копий кДНК гена ТФР, интегрированных в дрожжевой геном, за счет котрансформации штамма метилотрофных дрожжей P.pastoris экспрессионными генетическими конструкциями pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG, каждая из которых содержит последовательность кДНК кодирующая модифицированный сывороточный трансферрин человека, содержащий мутации N413Q и N611Q,
использования нуклеотидной пре-последовательность alpha-short сигнального пептида альфа-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae, что в ряде случаев может увеличивать уровень экспрессии рекомбинантных белков дрожжами P. pastoris [Zlobin А. et al. // Front Pharmacol. 2018],
культивирования клеток штамма-продуцента в минимальной солевой среде в условиях роста при высокой плотности в ферментере.
Обозначение «рР1С9» и «pGAPZ» в экспрессионных генетических конструкциях pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG (Рис. 1А и Б) отражает содержание структурных элементов плазмидных ДНК pPIC9k и pGAPZaA ("Invitrogen", США) соответственно. Генетические конструкции pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG содержат:
промотор гена глицерид-3-фосфат дегидрогеназы GAP дрожжей Pichia pastoris (указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «GAP»),
нуклеотидную пре-последовательность alpha-short сигнального пептида альфа-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae, находящуюся в единой рамке считывания с кДНК гена модифицированного ТФР (N413Q и N611Q), что обеспечивает секрецию ТФР в культуральную среду (указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «alpha-short»),
нуклеотидную последовательность кДНК гена модифицированного трансферрина человека, кодирующую ТФР с аминокислотными заменами N413Q и N611Q, что обеспечивает продукцию белка, не содержащего N-гликозилирования (указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «hTFNG»),
нативный терминатор и сигнал полиаденилирования гена алкоголь оксид азы АОХ1 дрожжей Pichia pastoris,
точку начала репликации плазмид pUCori.
Помимо указанных нуклеотидных последовательностей экспрессионная генетическая конструкция pPIC9GAPalpha-short_hTFNG содержит:
последовательность гена bla, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов E.coli к антибиотику ампициллин,
последовательность гена HIS4, продукт которого позволяет комплементировать ауксотрофность по гистидину у трансформантов дрожжей P. pastoris штамма GS115.
Помимо указанных выше нуклеотидных последовательностей экспрессионная генетическая конструкция pGAPZalpha-short_hTFNG содержит:
последовательность гена фактора элонгации 1 Saccharomyces cerevisiae TEF1, конститутивную синтетическую промоторную последовательность ЕМ7, последовательность гена блеомицина BleoR Streptoalloteichus hindustanus, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к антибиотику зеоцину,
3'-концевую последовательность гена цитохрома C1 CYC1 Saccharomyces cerevisiae.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, секретирующих модифицированный ТФР в культуральную среду на уровне 100 мг/л в условиях роста в минимальной солевой среде.
Заявленное изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:
Рис. 1. Схема экспрессионных генетических конструкций pPIC9GAPalpha-short_hTFNG (А) и pGAPZalpha-short_hTFNG (Б).
Рис. 2. Вестерн-блот анализ аликвот культуральной среды. 1 - культуральная среда после культивирования клеток штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, 2 - культуральная среда после культивирования нетрансформированных клеток P.pastoris штамма GS115, 3 - препарат трансферрина человека, выделенный из плазмы крови «Sigma aldrich», США. Визуализацию проводили, используя поликлональные антитела козы к трансферрину человека и антивидовые антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена.
Рис. 3. Гистограмма значений результатов ИФА, отражающая уровень экспрессии ТФР клетками штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG при культивировании в минимальной солевой среде в условиях роста при высокой плотности в ферментере. Визуализацию проводили, используя поликлональные антитела козы к трансферрину человека и антивидовые антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена.
Изобретение иллюстрируют следующими примерами.
ПРИМЕР 1
Создание генетических конструкций pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG.
Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную пре-последовательность alpha-short сигнального пептида альфа-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью кДНК гена модифицированного трансферрина человека (N413Q и N611Q), амплифицируют методом ПЦР с плазмиды pNUTN6HishTFNG, («Addgene», США), с использованием набора перекрывающихся олигонуклеотидов:
(5') atcaattcgaaacgatgagatttccttcaatttttactgctg
(5') agatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcc
(5') gctgttttattcgcagcatccagcgcgctagctgtccctg
(5') cgcgctagctgtccctgataaaactgtgagatggtgtgc
(5') tattgtcgacctattaaggtctacggaaagtgcag
Полученный фрагмент ДНК клонируют в плазмидную ДНК pGAPZaA ("Invitrogen", США) с использованием эндонуклеаз рестрикции BstBI и SalI, с получением экспрессионной генетической конструкции pGAPZalpha-short_hTFNG (Рис. 1Б).
Плазмидную ДНК pPIC9 ("Invitrogen", США) последовательно обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SphI и PciI, затем Т4 ДНК полимеразой и лигируют с элиминацией из исходной конструкции pPIC9 фрагмента 3'АОХ1 фрагмента. Далее в полученную генетическую конструкцию из полученной ранее генетической конструкции pGAPZalpha-short_hTFNG, переносят фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидные последовательности GAP-промотора и пре-последовательность alpha-short в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью кДНК гена модифицированного трансферрина человека (N413Q и N611Q) по сайтам рестрикции Bg1II и AgeI с элиминацией АОХ1 промотора, получая экспрессионную генетическую конструкцию pPIC9GAPalpha-short_hTFNG (Рис. 1А).
ПРИМЕР 2
Получение штамма-продуцента рекомбинантного модифицированного сывороточного трансферрина человека в дрожжах P. pastoris.
Плазмидную ДНК экспрессионных генетических конструкций pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG линеаризуют эндонуклеазой рестрикции AvrII, и 1 мкг эквимолярной смеси фрагментов ДНК котрансформируют электрокомпетентные клетки P. pastoris штамма GS115 методом электропорации. Селекцию трансформантов проводят на минимальной среде RDB, содержащий антибиотик зеоцин. Для выбора клона с наибольшим уровнем секреции ТФР 95 случайно выбранных колоний переносят в индивидуальную лунку 96-луночного планшета в полную жидкую среду BMMG, рН=6.0 (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 50 мМ глюкоза, 100 mM калий-фосфатный буфер, рН=6.0, 13.4 г/л дрожжевой азотной основы, 1.6 мкМ биотин). Планшеты инкубируют 48 часов при 30°С при перемешивании. Далее проводят синхронизацию клонов, необходимую для последующего корректного сравнения экспрессии, которая зависит от стадии роста и плотности клеток. Для этого 20 мкл клеточной суспензии индивидуально переносят в 180 мкл свежей среды BMMG. Через 24 и 48 часов процедуру повторяют, и далее клоны оставляют для наработки целевого белка. По окончании экспрессии через 72 часа клетки удаляют центрифугированием, и клон-продуцент Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG с максимальным уровнем продукции отбирают, анализируя супернатант культуральной среды с помощью сэндвич-ИФА с использованием антител к трансферрину и антивидовых антител.
ПРИМЕР 3
Анализ уровня продукции модифицированного ТФР штаммом Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG при культивировании в минимальной солевой среде в условиях роста при высокой плотности в ферментере.
600
Анализ уровня экспрессии модифицированного ТФР полученным штаммом Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG проводят с использованием ферментационного аппарата с автоматическим регулированием рН 28%-ым раствором гидроксида аммония, скорость перемешивания 800 об/мин, расход воздуха 0.1-0.3 л/л×мин. Контроль уровня растворенного кислорода в среде осуществляют с помощью датчика растворенного кислорода. Пеногаситель добавляют автоматически по мере необходимости. Единичную колонию штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG помещают в 100 мл среды YPD (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 50 мМ глюкоза) и инкубируют с интенсивным перемешиванием в течение 18 часов при 30°С до достижения OD 10. Полученный инокулят засевают в ферментер, содержащий 900 мл солевого раствора BSM (26.7 мл/л 85% фосфорной кислоты, 0.93 г/л сульфата кальция, 18.2 г/л сульфата калия, 14.9 г/л сульфата магния семиводного, 4.13 г/л гидроксида калия, 40 г/л глицерина), 4.35 мл солевого стока РТМ1 (6.0 г/л сульфата меди пятиводного, 0.08 г/л йодида натрия, 3 г/л моногидрата сульфата марганца, 0.2 г/л молибдата натрия, 0.02 г/л борной кислоты, 0.5 г/л хлорида кобальта, 20.0 г/л хлорида цинка, 35.0 г/л соли Мора, 0.2 г/л биотина, 5 мл/л серной кислоты). Условия ферментации - рН среды 5.0, температура 30°С, уровень растворенного кислорода свыше 30%. Подрост культуры производят в течение 18-22 часов до увеличения уровня растворенного кислорода до 95%. Затем в культуру начинают подавать раствор глюкозы (550 г/л), содержащий 12 мл солевого стока РТМ1 и 2 г сульфата аммония на каждый литр раствора глюкозы, с постоянной скоростью 5 мл/час в течение первых 24 часов. Также в течение первых пяти часов с момента начала подачи раствора глюкозы изменяют значение рН до 6.5 и температуру культивирования снижают до 28°С. Далее скорость увеличивают до 8 мл/час еще на 24 часа, и далее скорость увеличивают до 12 мл/час. Культивирование продолжают в течение последующих 24 часов, поддерживая все параметры на заданном уровне.
2
4
По окончании культивирования клетки удаляют центрифугированием, супернатант культуральной среды разводят фосфатно-солевым буфером (0,01М КHPO, 0,1 M NaCl) и анализируют с помощью электофоретического разделения в 10% ПААГе с последующим Вестерн-блот анализом (Рис. 2) и сэндвич-ИФА (Рис. 3) с использованием антител к трансферрину и антивидовых антител. Как можно видеть из рисунка 2, в среде после культивирования штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG накапливается белок, обладающий сходной молекулярной массой с таковым в препарате ТФР, полученном из сыворотки крови и специфически взаимодействующий с моноклональными антителами к ТФР. В случае нетрансформированных клеток нетрансформированных клеток P.pastoris штамма GS115 подобный белок отсутствует. Содержание ТФР в культуральной среде методом сэндвич-ИФА (рис. 3) проводилось с использованием серии концентраций ТФР, выделенного из сыворотки крови («Sigma aldrich», США) и серии последовательных разведений супернатанта культуральной среды после культивирования штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG. Полученные результаты свидетельствуют, что полученный штамм Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG продуцирует трансферрин человека на уровне 100 мг/л.
--->
Перечень последовательностей
<110> IBCh RAS
Bobik T.V., Popov R. Yu., Mokrushina Yu.A., Smirnov I.V., Gabibov A.G.
<120> ШТАММ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ТРАНСФЕРРИН, СОДЕРЖАЩИЙ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ N413D И N611D
<140> 2019128651/20(056395)
<141> 2019-09-12
<160> 2
<170> PatentIn 3.5.1
<210> 1
<211> 9319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant plasmid pPIC9GAPalpha-short_hTFNG
<400> 1
agatctctgc tactctggtc ccaagtgaac caccttttgg accctattga ccggacctta        60
acttgccaaa cctaaacgct taatgcctca gacgttttaa tgcctctcaa cacctccaag       120
gttgctttct tgagcatgcc tactaggaac tttaacgaac tgtggggttg cagacagttt       180
caggcgtgtc ccgaccaata tggcctacta gactctctga aaaatcacag ttttccagta       240
gttccgatca aattaccatc gaaatggtcc cataaacgga catttgacat ccgttcctga       300
attatagtct tccaccgtgg atcatggtgt tccttttttt cccaaagaat atcagcatcc       360
cttaactacg ttaggtcagt gatgacaatg gaccaaattg ttgcaaggtt tttctttttc       420
tttcatcggc acatttcagc ctcacatgcg actattatcg atcaatgaaa tccatcaaga       480
ttgaaatctt aaaattgccc ctttcacttg acaggatcct tttttgtaga aatgtcttgg       540
tgtcctcgtc caatcaggta gccatctctg aaatatctgg ctccgttgca actccgaacg       600
acctgctggc aacgtaaaat tctccggggt aaaacttaaa tgtggagtaa tggaaccaga       660
aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc gtccctagga aattttactc       720
tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct cttcccagca ttacgttgcg       780
ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg atggaaaagt cccggccgtc       840
gctggcaata atagcgggcg gacgcatgtc atgagattat tggaaaccac cagaatcgaa       900
tataaaaggc gaacaccttt cccaattttg gtttctcctg acccaaagac tttaaattta       960
atttatttgt ccctatttca atcaattgaa caactatcaa ttcgaaacga tgagatttcc      1020
ttcaattttt actgctgttt tattcgcagc atccagcgcg ctagctgtcc ctgataaaac      1080
tgtgagatgg tgtgcagtgt cggagcatga ggccactaag tgccagagtt tccgcgacca      1140
tatgaaaagc gtcattccat ccgatggtcc cagtgttgct tgtgtgaaga aagcctccta      1200
ccttgattgc atcagggcca ttgcggcaaa cgaagcggat gctgtgacac tggatgcagg      1260
tttggtgtat gatgcttacc tggctcccaa taacctgaag cctgtggtgg cagagttcta      1320
tgggtcaaaa gaggatccac agactttcta ttatgctgtt gctgtggtga agaaggatag      1380
tggcttccag atgaaccagc ttcgaggcaa gaagtcctgc cacacgggtc taggcaggtc      1440
cgctgggtgg aacatcccca taggcttact ttactgtgac ttacctgagc cacgtaaacc      1500
tcttgagaaa gcagtggcca atttcttctc gggcagctgt gccccttgtg cggatgggac      1560
ggacttcccc cagctgtgtc aactgtgtcc agggtgtggc tgctccaccc ttaaccaata      1620
cttcggctac tcgggagcct tcaagtgtct gaaggatggt gctggggatg tggcctttgt      1680
caagcactcg actatatttg agaacttggc aaacaaggct gacagggacc agtatgagct      1740
gctttgcctg gacaacaccc ggaagccggt agatgaatac aaggactgcc acttggccca      1800
ggtcccttct cataccgtcg tggcccgaag tatgggcggc aaggaggact tgatctggga      1860
gcttctcaac caggcccagg aacattttgg caaagacaaa tcaaaagaat tccaactatt      1920
cagctctcct catgggaagg acctgctgtt taaggactct gcccacgggt ttttaaaagt      1980
cccccccagg atggatgcca agatgtacct gggctatgag tatgtcactg ccatccggaa      2040
tctacgggaa ggcacatgcc cagaagcccc aacagatgaa tgcaagcctg tgaagtggtg      2100
tgcgctgagc caccacgaga ggctcaagtg tgatgagtgg agtgttaaca gtgtagggaa      2160
aatagagtgt gtatcagcag agaccaccga agactgcatc gccaagatca tgaatggaga      2220
agctgatgcc atgagcttgg atggagggtt tgtctacata gcgggcaagt gtggtctggt      2280
gcctgtcttg gcagaaaact acgataagag cgataattgt gaggatacac cagaggcagg      2340
gtattttgct gtagcagtgg tgaagaaatc agcttctgac ctcacctggg acaatctgaa      2400
aggcaagaag tcctgccata cggcagttgg cagaaccgct ggctggaaca tccccatggg      2460
cctgctctac aataagatca accactgcag atttgatgaa tttttcagtg aaggttgtgc      2520
ccctgggtct aagaaagact ccagtctctg taagctgtgt atgggctcag gcctaaacct      2580
gtgtgaaccc aacaacaaag agggatacta cggctacaca ggcgctttca ggtgtctggt      2640
tgagaaggga gatgtggcct ttgtgaaaca ccagactgtc ccacagaaca ctgggggaaa      2700
aaaccctgat ccatgggcta agaatctgaa tgaaaaagac tatgagttgc tgtgccttga      2760
tggtaccagg aaacctgtgg aggagtatgc gaactgccac ctggccagag ccccgaatca      2820
cgctgtggtc acacggaaag ataaggaagc ttgcgtccac aagatattac gtcaacagca      2880
gcacctattt ggaagcgacg taactgactg ctcgggcaac ttttgtttgt tccggtcgga      2940
aaccaaggac cttctgttca gagatgacac agtatgtttg gccaaacttc atgacagaaa      3000
cacatatgaa aaatacttag gagaagaata tgtcaaggct gttggtaacc tgagaaaatg      3060
ctccacctca tcactcctgg aagcctgcac tttccgtaga ccttaatagg tcgaccatca      3120
tcatcatcat cattgagttt gtagccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca      3180
cttacgagaa gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc      3240
tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt      3300
ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct      3360
gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta      3420
tttcccactc ctcttcagag tacagaagat taagtgagaa gttcgtttgt gcaagcttat      3480
cgataagctt taatgcggta gtttatcaca gttaaattgc taacgcagtc aggcaccgtg      3540
tatgaaatct aacaatgcgc tcatcgtcat cctcggcacc gtcaccctgg atgctgtagg      3600
cataggcttg gttatgccgg tactgccggg cctcttgcgg gatatcgtcc attccgacag      3660
catcgccagt cactatggcg tgctgctagc gctatatgcg ttgatgcaat ttctatgcgc      3720
acccgttctc ggagcactgt ccgaccgctt tggccgccgc ccagtcctgc tcgcttcgct      3780
acttggagcc actatcgact acgcgatcat ggcgaccaca cccgtcctgt ggatctatcg      3840
aatctaaatg taagttaaaa tctctaaata attaaataag tcccagtttc tccatacgaa      3900
ccttaacagc attgcggtga gcatctagac cttcaacagc agccagatcc atcactgctt      3960
ggccaatatg tttcagtccc tcaggagtta cgtcttgtga agtgatgaac ttctggaagg      4020
ttgcagtgtt aactccgctg tattgacggg catatccgta cgttggcaaa gtgtggttgg      4080
taccggagga gtaatctcca caactctctg gagagtaggc accaacaaac acagatccag      4140
cgtgttgtac ttgatcaaca taagaagaag cattctcgat ttgcaggatc aagtgttcag      4200
gagcgtactg attggacatt tccaaagcct gctcgtaggt tgcaaccgat agggttgtag      4260
agtgtgcaat acacttgcgt acaatttcaa cccttggcaa ctgcacagct tggttgtgaa      4320
cagcatcttc aattctggca agctccttgt ctgtcatatc gacagccaac agaatcacct      4380
gggaatcaat accatgttca gcttgagaca gaaggtctga ggcaacgaaa tctggatcag      4440
cgtatttatc agcaataact agaacttcag aaggcccagc aggcatgtca atactacaca      4500
gggctgatgt gtcattttga accatcatct tggcagcagt aacgaactgg tttcctggac      4560
caaatatttt gtcacactta ggaacagttt ctgttccgta agccatagca gctactgcct      4620
gggcgcctcc tgctagcacg atacacttag caccaacctt gtgggcaacg tagatgactt      4680
ctggggtaag ggtaccatcc ttcttaggtg gagatgcaaa aacaatttct ttgcaaccag      4740
caactttggc aggaacaccc agcatcaggg aagtggaagg cagaattgcg gttccaccag      4800
gaatatagag gccaactttc tcaataggtc ttgcaaaacg agagcagact acaccagggc      4860
aagtctcaac ttgcaacgtc tccgttagtt gagcttcatg gaatttcctg acgttatcta      4920
tagagagatc aatggctctc ttaacgttat ctggcaattg cataagttcc tctgggaaag      4980
gagcttctaa cacaggtgtc ttcaaagcga ctccatcaaa cttggcagtt agttctaaaa      5040
gggctttgtc accattttga cgaacattgt cgacaattgg tttgactaat tccataatct      5100
gttccgtttt ctggatagga cgacgaaggg catcttcaat ttcttgtgag gaggccttag      5160
aaacgtcaat tttgcacaat tcaatacgac cttcagaagg gacttcttta ggtttggatt      5220
cttctttagg ttgttccttg gtgtatcctg gcttggcatc tcctttcctt ctagtgacct      5280
ttagggactt catatccagg tttctctcca cctcgtccaa cgtcacaccg tacttggcac      5340
atctaactaa tgcaaaataa aataagtcag cacattccca ggctatatct tccttggatt      5400
tagcttctgc aagttcatca gcttcctccc taattttagc gttcaacaaa acttcgtcgt      5460
caaataaccg tttggtataa gaaccttctg gagcattgct cttacgatcc cacaaggtgg      5520
cttccatggc tctaagaccc tttgattggc caaaacagga agtgcgttcc aagtgacaga      5580
aaccaacacc tgtttgttca accacaaatt tcaagcagtc tccatcacaa tccaattcga      5640
tacccagcaa cttttgagtt gctccagatg tagcaccttt ataccacaaa ccgtgacgac      5700
gagattggta gactccagtt tgtgtcctta tagcctccgg aatagacttt ttggacgagt      5760
acaccaggcc caacgagtaa ttagaagagt cagccaccaa agtagtgaat agaccatcgg      5820
ggcggtcagt agtcaaagac gccaacaaaa tttcactgac agggaacttt ttgacatctt      5880
cagaaagttc gtattcagta gtcaattgcc gagcatcaat aatggggatt ataccagaag      5940
caacagtgga agtcacatct accaactttg cggtctcaga aaaagcataa acagttctac      6000
taccgccatt agtgaaactt ttcaaatcgc ccagtggaga agaaaaaggc acagcgatac      6060
tagcattagc gggcaaggat gcaactttat caaccagggt cctatagata accctagcgc      6120
ctgggatcat cctttggaca actctttctg ccaaatctag gtccaaaatc acttcattga      6180
taccattatt gtacaacttg agcaagttgt cgatcagctc ctcaaattgg tcctctgtaa      6240
cggatgactc aacttgcaca ttaacttgaa gctcagtcga ttgagtgaac ttgatcaggt      6300
tgtgcagctg gtcagcagca tagggaaaca cggcttttcc taccaaactc aaggaattat      6360
caaactctgc aacacttgcg tatgcaggta gcaagggaaa tgtcatactt gaagtcggac      6420
agtgagtgta gtcttgagaa attctgaagc cgtattttta ttatcagtga gtcagtcatc      6480
aggagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccgacctgca gggggggggg gggcgctgag      6540
gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca      6600
gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga      6660
ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat      6720
ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt      6780
aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat      6840
caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg      6900
tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta      6960
tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa      7020
aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa      7080
aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa      7140
atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac      7200
gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac      7260
tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc      7320
tgttttcccc atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt      7380
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag      7440
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc      7500
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc      7560
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt      7620
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt      7680
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc      7740
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa      7800
gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa      7860
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg      7920
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga      7980
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg      8040
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg      8100
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt      8160
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact      8220
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat      8280
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg      8340
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg      8400
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat      8460
tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc      8520
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt      8580
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc      8640
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga      8700
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc      8760
gtcaacacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa      8820
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta      8880
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg      8940
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg      9000
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat      9060
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt      9120
tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa      9180
aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct tcaagaatta attctcatgt ttgacagctt      9240
atcatcgata agctgactca tgttggtatt gtgaaataga cgcagatcgg gaacactgaa      9300
aaataacagt tattattcg                                                   9319
<210> 2
<211> 5389
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant plasmid pGAPZalpha-short_hTFNG
<400> 2
agatctctgc tactctggtc ccaagtgaac caccttttgg accctattga ccggacctta        60
acttgccaaa cctaaacgct taatgcctca gacgttttaa tgcctctcaa cacctccaag       120
gttgctttct tgagcatgcc tactaggaac tttaacgaac tgtggggttg cagacagttt       180
caggcgtgtc ccgaccaata tggcctacta gactctctga aaaatcacag ttttccagta       240
gttccgatca aattaccatc gaaatggtcc cataaacgga catttgacat ccgttcctga       300
attatagtct tccaccgtgg atcatggtgt tccttttttt cccaaagaat atcagcatcc       360
cttaactacg ttaggtcagt gatgacaatg gaccaaattg ttgcaaggtt tttctttttc       420
tttcatcggc acatttcagc ctcacatgcg actattatcg atcaatgaaa tccatcaaga       480
ttgaaatctt aaaattgccc ctttcacttg acaggatcct tttttgtaga aatgtcttgg       540
tgtcctcgtc caatcaggta gccatctctg aaatatctgg ctccgttgca actccgaacg       600
acctgctggc aacgtaaaat tctccggggt aaaacttaaa tgtggagtaa tggaaccaga       660
aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc gtccctagga aattttactc       720
tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct cttcccagca ttacgttgcg       780
ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg atggaaaagt cccggccgtc       840
gctggcaata atagcgggcg gacgcatgtc atgagattat tggaaaccac cagaatcgaa       900
tataaaaggc gaacaccttt cccaattttg gtttctcctg acccaaagac tttaaattta       960
atttatttgt ccctatttca atcaattgaa caactatcaa ttcgaaacga tgagatttcc      1020
ttcaattttt actgctgttt tattcgcagc atccagcgcg ctagctgtcc ctgataaaac      1080
tgtgagatgg tgtgcagtgt cggagcatga ggccactaag tgccagagtt tccgcgacca      1140
tatgaaaagc gtcattccat ccgatggtcc cagtgttgct tgtgtgaaga aagcctccta      1200
ccttgattgc atcagggcca ttgcggcaaa cgaagcggat gctgtgacac tggatgcagg      1260
tttggtgtat gatgcttacc tggctcccaa taacctgaag cctgtggtgg cagagttcta      1320
tgggtcaaaa gaggatccac agactttcta ttatgctgtt gctgtggtga agaaggatag      1380
tggcttccag atgaaccagc ttcgaggcaa gaagtcctgc cacacgggtc taggcaggtc      1440
cgctgggtgg aacatcccca taggcttact ttactgtgac ttacctgagc cacgtaaacc      1500
tcttgagaaa gcagtggcca atttcttctc gggcagctgt gccccttgtg cggatgggac      1560
ggacttcccc cagctgtgtc aactgtgtcc agggtgtggc tgctccaccc ttaaccaata      1620
cttcggctac tcgggagcct tcaagtgtct gaaggatggt gctggggatg tggcctttgt      1680
caagcactcg actatatttg agaacttggc aaacaaggct gacagggacc agtatgagct      1740
gctttgcctg gacaacaccc ggaagccggt agatgaatac aaggactgcc acttggccca      1800
ggtcccttct cataccgtcg tggcccgaag tatgggcggc aaggaggact tgatctggga      1860
gcttctcaac caggcccagg aacattttgg caaagacaaa tcaaaagaat tccaactatt      1920
cagctctcct catgggaagg acctgctgtt taaggactct gcccacgggt ttttaaaagt      1980
cccccccagg atggatgcca agatgtacct gggctatgag tatgtcactg ccatccggaa      2040
tctacgggaa ggcacatgcc cagaagcccc aacagatgaa tgcaagcctg tgaagtggtg      2100
tgcgctgagc caccacgaga ggctcaagtg tgatgagtgg agtgttaaca gtgtagggaa      2160
aatagagtgt gtatcagcag agaccaccga agactgcatc gccaagatca tgaatggaga      2220
agctgatgcc atgagcttgg atggagggtt tgtctacata gcgggcaagt gtggtctggt      2280
gcctgtcttg gcagaaaact acgataagag cgataattgt gaggatacac cagaggcagg      2340
gtattttgct gtagcagtgg tgaagaaatc agcttctgac ctcacctggg acaatctgaa      2400
aggcaagaag tcctgccata cggcagttgg cagaaccgct ggctggaaca tccccatggg      2460
cctgctctac aataagatca accactgcag atttgatgaa tttttcagtg aaggttgtgc      2520
ccctgggtct aagaaagact ccagtctctg taagctgtgt atgggctcag gcctaaacct      2580
gtgtgaaccc aacaacaaag agggatacta cggctacaca ggcgctttca ggtgtctggt      2640
tgagaaggga gatgtggcct ttgtgaaaca ccagactgtc ccacagaaca ctgggggaaa      2700
aaaccctgat ccatgggcta agaatctgaa tgaaaaagac tatgagttgc tgtgccttga      2760
tggtaccagg aaacctgtgg aggagtatgc gaactgccac ctggccagag ccccgaatca      2820
cgctgtggtc acacggaaag ataaggaagc ttgcgtccac aagatattac gtcaacagca      2880
gcacctattt ggaagcgacg taactgactg ctcgggcaac ttttgtttgt tccggtcgga      2940
aaccaaggac cttctgttca gagatgacac agtatgtttg gccaaacttc atgacagaaa      3000
cacatatgaa aaatacttag gagaagaata tgtcaaggct gttggtaacc tgagaaaatg      3060
ctccacctca tcactcctgg aagcctgcac tttccgtaga ccttaatagg tcgaccatca      3120
tcatcatcat cattgagttt gtagccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca      3180
cttacgagaa gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc      3240
tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt      3300
ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct      3360
gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta      3420
tttcccactc ctcttcagag tacagaagat taagtgagac cttcgtttgt gcggatcccc      3480
cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac      3540
tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat tttccctctt      3600
tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc      3660
gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc      3720
ttgaaatttt tttttttagt ttttttctct ttcagtgacc tccattgata tttaagttaa      3780
taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt      3840
ttacttcttg ttcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaaggggcg gtgttgacaa      3900
ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat      3960
ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga      4020
gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt      4080
ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa      4140
caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt      4200
cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc      4260
gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga      4320
ggagcaggac tgacacgtcc gacggcggcc cacgggtccc aggcctcgga gatccgtccc      4380
ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc      4440
ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt      4500
atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt      4560
ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt      4620
tgggacgctc gaaggcttta atttgcaagc tggagaccaa catgtgagca aaaggccagc      4680
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc      4740
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat      4800
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc      4860
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct      4920
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg      4980
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc      5040
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga      5100
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa      5160
ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta      5220
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc      5280
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg      5340
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatc                  5389
<---