СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКЗОСОМ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ
METHOD FOR PLASMA EXOSOME RELEASE

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины, может быть использовано при разработке диагностических методик для выделения экзосом из плазмы крови.
Экзосомы - мембранные нановезикулы (80-130 нм), которые секретируются практически всеми клетками многоклеточных организмов во внеклеточное пространство. Биохимический состав экзосом близок к составу клеток, которые их секретируют. В состав мембраны экзосом входят специфические белки, так называемые, экзосомальные маркеры - тетраспанины CD63, CD81, CD9 и др. Кроме того, мембрана экзосом, секретируемых клетками определенных тканей, имеет в своем составе тканеспецифичные белковые маркеры. Например, мембрана везикул, секретируемых клетками жировой ткани (адипоцитами), содержит адипоспецифичные белки FABP-4 и адипонектин [Kranendonk M.E.G., Visseren F.L.J., van Balkom B.W.M., Nolte-'tHoen E.N.M., van Herwaarden J.A., de Jager W., et al. Human Adipocyte Extracellular Vesicles in Reciprocal Signaling between Adipocytes and Macrophages // Obesity. [Internet]. - Сер. 22. - 2014 - N5. - C. 1296-308. Availablefrom: http://doi.wiley.com/10.1002/oby.20679]. В составе экзосом, секретируемых клетками предстательной железы, определяется мембранная форма простат-специфичного антигена, MPSA [Mizutani K., Terazawa R., Kameyama K., Kato Т., Horie K., Tsuchiya Т., et al. Isolation of Prostate Cancer-Related Exosomes // Anticancer research. [Internet]. - Сер. 34. - 2014 - N7. - C. 3419-23. Availablefrom: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24982349]. Так как популяция циркулирующих в плазме экзосом представлена преимущественно везикулами, секретируемыми клетками крови и эндотелия, то появление в плазмотоке или рост концентрации экзосом, несущих ткане-или опухоль-специфические маркеры, может иметь диагностическое значение.
Одним из основных методов анализа состава поверхностных мембранных белков является проточная цитометрия. Но так как размер экзосом сопоставим с пределом (размерным) разрешения большинства современных проточных цитометров, то для анализа экзосом методом проточной цитометрии, эти везикулы предварительно «фиксируются» к микрочастицам достаточного размера (1-10 мкм). При этом эффективность анализа определяется двумя основными факторами: (1) достаточным количеством экзосом, «фиксированных» на поверхности микрочастиц, (2) отсутствием контаминации поверхности микрочастиц компонентами плазмы неэкзосомальной природы (плазменные белки, белковые комплексы, крупные везикулы, фрагменты клеточных мембран). С учетом перспективы внедрения таких методов в клиническую практику, дополнительными условиями их успешности являются экономичность, возможность стандартизации и масштабирования.
Существующие способы выделения экзосом для последующего анализа методом проточной цитометрии можно условно разделить на две группы. Во-первых, экзосомы могут быть выделены из плазмы более или менее «чисто» и затем «фиксированы» к микрочастицам за счет неспецифических механизмов межмолекулярного взаимодействия (силы Ван-дер-Ваальса). Во-вторых, экзосомы могут быть выделены непосредственно из биологических жидкостей путем специфического аффинного взаимодействия с экзосом-специфичными лигандами (например, антителами к т.н. «экзосомальным» маркерам CD63, CD81, CD9), предварительно «фиксированными» на поверхности микрочастиц.
Для первой группы способов выделения экзосом из плазмы характерны все особенности и недостатки соответствующих методов выделения тотальной популяции экзосом из плазмы, включая процедуру поэтапного центрифугирования и ее модификаций [Langevin S.M., Kuhnell D., Orr-Asman M.A., Biesiada J., Zhang X., Medvedovic M, et al. Balancing Yield, Purity and Practicality: A Modified Differential Ultracentrifugation Protocol for Efficient Isolation of Small Extracellular Vesicles from Human Serum // RNA Biology. [Internet]. - Сер. 16. - 2019 - N1. - C. 5-12. Availablefrom: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15476286.2018.1564465], таких как, например, центрифугирование в «градиентеплотности» [Iwai K., Yamamoto S., Yoshida М., Shiba K. Isolation of Extracellular Vesicles in Saliva Using Density Gradient UltracentrifugationIn: Methods in molecular biology (Clifton, NJ) [Internet]. - p.343-50. Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-l-4939-7253-l_27] или через, так называемую, «сахарозную подушку» (sucrose cushion) [Li K., Wong D.K., Hong K.Y., Raffai R.L. Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC): A Refined and High Performance Method for the Isolation, Characterization, and Use of ExosomesIn: Methods in Molecular Biology [Internet]. - p. 69-83. Availablefrom: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-7652-2_7], и различные варианты фильтрации [Grant R., Ansa-Addo E., Stratton D., Antwi-Baffour S., Jorfi S., Kholia S., et al. A Filtration-Based Protocol to Isolate Human Plasma Membrane-Derived Vesicles and Exosomes from Blood Plasma // Journal of Immunological Methods. [Internet]. - Сер. 371. - 2011 - N1-2. С. 143-51. Availablefrom: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022175911001487]. В частности, все эти методы относительно трудоемки, требуют дорогостоящего оборудования и высокой квалификации исполнителей. Низкая эффективность выделения (большие методологические «потери») перечисленных выше методов определяет необходимость использования относительно больших стартовых объемов биологического материала (плазмы), что затрудняет внедрение в клиническую практику. После выделения везикулы могут быть «фиксированы» к поверхности микрочастиц, обычно латексных (aldehyde sulfate latex beads) за счет сил неспецифического межмолекулярного взаимодействия (силы Ван-дер-Ваальса). Образовавшиеся комплексы инкубируются с антителами к исследуемым маркерам и анализируются с помощью проточной цитометрии. В научной литературе можно найти примеры использования данной технологии с целью, например, полуколичественного анализа экзосом методом проточной цитометрии [ Carrascosa J.L., et al. A Bead-Assisted Flow Cytometry Method for the Semi-Quantitative Analysis of Extracellular Vesicles // Scientific Reports. - Сер. 7. - 2017 - N1. - С. 11271.]. На рынке представлены оптимизированные наборы микрочастиц, буферов и антител (например, Exo-FACS kit for FACS analysis / Hansa BioMed), в которых реализована технология неспецифической «фиксации» экзосом, заранее выделенных из плазмы или других биологических жидкостей.
Вторая группа способов выделения экзосом из плазмы предполагает модификацию микрочастиц лигандами к так называемым экзосомальным маркерам - белкам (CD63, CD9, CD81) или липидам (phosphatidylserine, PS), специфически представленным на мембране экзосом. Такие частицы сначала используются для связывания (capturing) экзосом непосредственно из плазмы или других комплексных биологических жидкостей. При этом, в отличие от ранее описанного подхода, происходит прочная и специфическая «фиксация» экзосом за счет взаимодействия белков экзосомальной мембраны с лигандами (антителами) на поверхности частиц. Образовавшиеся комплексы «отмывают» от компонентов плазмы неэкзосомальной природы, инкубируют с антителами к исследуемым маркерам и анализируются с помощью проточной цитометрии. Основным преимуществом данного подхода представляется исключение этапа выделения экзосом, чем определяется экономный расход биологического материала и технологичность всей процедуры. Недостатки обоснованы фактом использования антител: (1) эффективность связывания экзосом зависит от качества антител, которое может отличаться у разных производителей; (2) антитела всегда имеют жесткие ограничения по условиям / срокам хранения и относительно высокую стоимость. Методика часто применяется в исследовательских работах, авторы которых самостоятельно проводят «фиксацию» нужных антител к микрочастицам, оптимального размера и химического состава поверхности [Tugutova Е.А., Tamkovich S.N., Patysheva M.R., Afanas'ev S.G., Tsydenova A.A., Grigor'eva A.E., et al. Relation between Tetraspanin- Associated and Tetraspanin-Non-Associated Exosomal Proteases and Metabolic Syndrome in Colorectal Cancer Patients//Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. [Internet]. - Сер. 20. - 2019 - N3. - C. 809-15. Available from: http://journal.waocp.org/article_84242.html.]. Эта технология также реализована в ряде коммерческих наборов (например, Exosomes Flow Cytometry kit / Wako Holdings USA, Inc).
Известен способ выделения из крови или плазмы опухолевых клеток с помощью суперпарамагнитных частиц (СПМЧ), конъюгированных с ДНК аптамерами. [Chen X., Huang Y.-F., Tan W. Using Aptamer-Nanoparticle Conjugates for Cancer Cells Detection // Journal of Biomedical Nanotechnology. - Сер. 4. - 2008 - N4. - С.400-9].
СПМЧ - это ферромагнитные частицы, обладающие качеством суперпарамагнетизма. При отсутствии внешнего магнитного поля средняя намагниченность таких частиц равна нулю (и они не «слипаются»), но при действии магнитного поля СПМЧ ведут себя как парамагнетики, т.е. намагничиваются
ДНК аптамеры - олигонуклеотиды, которые благодаря строго определенной третичной структуре и пространственному распределению зарядов, могут с высокой аффинностью и специфичностью связывать определенные молекулы-мишени. В рамках задач молекулярной биологии или биотехнологии аптамеры обычно получают путем последовательной селекции отдельных молекул из больших произвольных библиотек [Zhuo Z., Yu Y., Wang M., Li J., Zhang Z., Liu J., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine // International Journal of Molecular Sciences. - Сер. 18. - 2017 - N10. - C. 2142.]
В существующем виде технология применима для выделения из биологических жидкостей клеток, но не внеклеточных нановезикул или экзосом.
Техническим результатом изобретения является создание быстрого и относительно дешевого способа выделения из плазмы крови экзосом с целью последующего анализа поверхностных экзосомальных белков методом проточной цитометрии.
Указанный технический результат достигается в способе выделения экзосом из плазмы крови, отличающийся тем, что используют комплексы СПМЧ/АптСD63, содержащие супермагнитные частицы (СПМЧ) диаметром 1 мкм, покрытые стрептавидином и ДНК аптамеры АптСD63, модифицированные молекулой биотина, при этом комплексы СПМЧ/АптСD63 формируют путем инкубации 1 мкг СПМЧ и 5 наномоль AптCD63 при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего комплексы СПМЧ/АптСD63 отмывают от не связавшихся молекул аптамера фосфатно-солевым буфером, добавляют к плазме крови объемом 10-100 мкл и инкубируют в течение 10-12 часов при температуре +4°C с целью образования комплекса СПМЧ/АптСD63/экзосома, который может быть использован для последующего анализа экзосомальных белков методом проточной цитометрии.
В течение последних лет появились научные публикации, описывающие возможность использования ДНК аптамеров, аффинно взаимодействующих с экзосомальными маркерами типа CD63, для связывания экзосом с различными поверхностями или микрочастицами [Chen X., Huang Y.-F., Tan W. Using Aptamer-Nanoparticle Conjugates for Cancer Cells Detection // Journal of Biomedical Nanotechnology. - Сер. 4. - 2008-N4. - C. 400-9.].
Примеров формирования стабильных комплексов СПМЧ/АптСD63 и использования их для анализа белкового состава мембраны экзосом методом проточной цитометрии в печати не представлено.
В рамках заявляемого способа для формирования комплексов СПМЧ/АптСD63 используют СПМЧ, размером 1 мкм и покрытые стрептавидином, что позволяет фиксировать к ним молекулы ДНК аптамера за счет формирования связи стрептавидин-биотин. Способ предполагает использование ДНК аптамеров АптСD63, модифицированных молекулой биотина по 3'-концу (СА ССС САС СТС GCT ССС GTG АСА СТА ATG СТА -Biotin), что обеспечивает возможность их фиксации к СПМЧ за счет формирования связи стрептавидин-биотин. Сформированный таким образом комплекс СПМЧ/АптСD63 отмывается от не связавшихся молекул АптСD63 и используется для выделения экзосом из плазмы. В процессе инкубации комплекса СПМЧ/АптСD63 с плазмой происходит образование комплекса СПМЧ/АптСD63/экзосома за счет взаимодействия аптамера AптCD63, фиксированного на поверхности СПМЧ, и молекулы тетраспанина CD63, экспанированной на мембране экзосом.
Таким образом, заявляемый способ позволяет с помощью СПМЧ и аптамеров выделять из биологических жидкостей не клетки, как в известном способе [Chen X., Huang Y.-F., Tan W. Using Aptamer-Nanoparticle Conjugates for Cancer Cells Detection // Journal of Biomedical Nanotechnology. - Сер. 4. - 2008 - N4. - С. 400-9], а внеклеточные мембранные нановезикулы, экзосомы.
В целом, задача, решаемая заявляемым способом, сводится к выделению экзосом (CD63-позитивных нановезикул) непосредственно из плазмы путем их фиксации к микрочастицам. Получаемый препарат может быть использован для последующего анализа поверхностных экзосомальных маркеров методом проточной цитометрии.
Способ иллюстрируется фиг. 1-3, где:
на фиг. 1 представлен принцип и поэтапный анализ формирования комплекса «СПМЧ/Апт-СD63/экзосома»;
на фиг. 2-3 - примеры результатов количественного и качественного анализа мембранных белков (CD9, EpCam) экзосом.
На схеме комплекса (фиг. 1А) показано, что связь СПМЧ и AптCD63 обеспечивается за счет взаимодействия стрептавидина и биотина. На схеме изображено формирование комплекса из одной СПМЧ и одной молекулы AптCD63, но в действительности одна СПМЧ взаимодействует с множеством молекул AптCD63. В процессе инкубации этого комплекса с плазмой происходит взаимодействие аптамера AптCD63 и тетраспанина CD63 на поверхности экзосом, что приводит к формированию комплекса «СПМЧ/АптСD63/экзосома». Эффективность «фиксации» экзосом может быть оценена методом проточной цитометрии, после инкубации с антителами к мембранному белку CD9, меченному флуоресцентным красителем FITC. Обозначения компонентов комплекса приведены на фиг. 1.А. Оценка эффективности формирования комплекса методом проточной цитометрии представлена на фиг. 1В. На панели слева - результат анализа комплекса СПМЧ/Апт-63, при этом использован ДНК аптамер, с флуоресцентной меткой Су5,5 на 5'-конце. На панели справа «наложение» результатов анализа того же комплекса после инкубации с плазмой для образования комплекса «СПМЧ/АптСD63/экзосома» и последующей инкубации с антителами к мембранному белку CD9, меченному флуоресцентным красителем FITC (abCD9-FITC).
По сравнению с существующими методами (аналогами), предполагающими использование микрочастиц для анализа экзосом методом проточной цитометрии, предложенная технология имеет существенные отличия.
В отличие от первой группы методов, включающих этапы выделения экзосом из плазмы и их неспецифическое связывание с микрочастицами, патентуемая технология предполагает
- выделение экзосом непосредственно из плазмы, что существенно упрощает процедуру и исключает необходимость использования дорогостоящего оборудования.
- выделение экзосом путем специфического связывания экзосомального маркера CD63, что делает такое выделение существенно специфичней, а прочность связи «АптСD63/экзосома» позволяет «отмыть» комплексы от контаминаций. В результате, метод позволяет получить более чистый препарат, что существенно повышает качество и информативность последующей проточной цитометрии.
В отличие от второй группы методов, предполагающих использование микрочастиц с «фиксированными» на их поверхности антителами, в рамках предложенной технологии
- используется ДНК аптамер АптСD63, что существенно снижает стоимость технологии, упрощает требования к условиям транспортировки и хранения необходимых реагентов, облегчает процесс стандартизации и масштабирования.
Заявленные преимущества предложенной технологии обеспечиваются оригинальным сочетанием компонентов комплекса «СПМЧ/АптСD63/экзосома» и их характеристиками.
С целью демонстрации эффективности применения предложенной технологии, как метода выделения экзосом плазмы для последующего анализа путем проточной цитометрии, представлены примеры количественного и качественного анализа мембранных белков (CD9, EpCam) экзосом (фиг. 2-3).
Пример 1. Полуколичественная оценка состава экзосом плазмы. Технология применима для сравнительного анализа количества экзосом, несущих определенный поверхностный маркер. В данном примере представлены результаты сравнительной оценки количества EpCam-позитивных экзосом в образцах, содержащих 100, 50 или 10 микролитров плазмы.
Подготовка комплекса: комплекс СПМЧ/АптСD63-Су5,5 был сформирован с использованием 1 микрограмма СПМЧ, покрытых стрептавидином (ООО «Силекс», Москва) и 5 пикомолей Апт-CD63-Cy5,5, модифицированного биотином по 3'-концуи флуоресцентной меткой Су5,5 по 5'-концу / Су5,5 - СА ССС САС СТС GCT ССС GTG АСА СТА ATG СТА - Biotin (ООО «Синтол», Москва) путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в 100 мкл фосфатно-солевого буфера.
Подготовка проб: перед выделением экзосом плазму центрифугировали последовательно при 300xG - 5 мин, 1000xG 5 мин, 2500xG - 5 мин, 10000xG - 10 мин, каждый раз отбирая супернатант в чистую пробирку. Из очищенной таким образом плазмы были сформированы три пробы объемом 100 мкл, содержащие различные соотношения плазмы и фосфатно-солевого буфера: (1) 100 мкл: 0 мкл; (2) 50 мкл: 50 мкл; (3) 10 мкл: 90 мкл.
Выделение экзосом и анализ экспрессии молекулы EpCam в составе экзосомальной мембраны: комплексы СПМЧ/АптСD63-Су5,5 были трижды отмыты от не связавшихся молекул аптамера в 100 мкл фосфатно-солевого буфера, ресуспендированы том же буфере (90 мкл), добавлены к образцу (100 мкл). Таким образом, были приготовлены три пробы, содержащие равное количество СПМЧ/АптСD63-Су5,5 комплексов, но разное количество плазмы и, соответственно, экзосом. Образцы инкубировались при +4°С в течение 10-12 часов при постоянном перемешивании. Предполагается, что в течение этого времени произошло образование комплексов СПМЧ/АптСD63-Су5,5/экзосома за счет образования связи между аптамером AптCD63 и тетраспанином CD63. Образовавшиеся комплексы были трижды отмыты от не связавшихся экзосом и компонентов плазмы в 100 мкл фосфатно-солевого буфера, ресуспендированы том же буфере (100 мкл). К образцам были добавлены антитела (2 мкл) к белку EpCam, меченные флуоресцентной меткой FITC (AbCam8666). После двух часов инкубации, образовавшиеся комплексы СПМЧ/АптСD63-Су5,5/экзосома/аbЕрСаm-FITC были отмыты от не связавшихся антител. Анализ интенсивности флуоресценции комплексов был проведен с помощью проточного цитометра CytoFLEX по двум каналам: Су5,5 и FITC, которые отражали эффективность связывания аптамера (АптСD63) и EpCam(+) экзосом.
На Фиг. 2 представлены результаты анализа. На фиг. 2А можно видеть разницу интенсивности флуоресцентного сигнала по каналу FITC между тремя образцами. На фиг. 2В показаны результаты измерения по двум каналам. Комплексы, несущие две флуоресцентные метки, составляли 97,99%; 82,80%; 37,53% после инкубации с 100; 50 и 10 мкл плазмы, соответственно. Так, результаты измерений отчетливо коррелируют с концентрацией экзосом в использованных образцах.
Пример 2. Сравнительный анализ экспрессии белков CD9 и ЕрСаmна в экзосомах различного происхождения. Технология применима для анализа коэкспрессии двух (или более) маркеров на экзосомах различного происхождения. В данном примере представлены результаты параллельной оценки экспрессии молекулы клеточной адгезии EpCam и тетраспанина CD9 на мембране экзосом (CD63(+) везикул), секретируемых in vitro клетками колоректальной карциномы HuTu-80, SW837 и экзосом, выделенных из плазмы пациента с диагнозом колоректальный рак.
Подготовка комплекса: комплекс СПМЧ/АптСD63 был сформирован с использованием 1 микрограмма СПМЧ, покрытых стрептавидином (ООО «Силекс», Москва) и 5 пикомолей АптСD63, модифицированного биотином по 3'-концу / СА ССС САС СТС GCT ССС GTG АСА СТА ATG СТА - Biotin (ООО «Синтол», Москва) путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в 100 мкл фосфатно-солевого буфера.
Подготовка проб: перед выделением экзосом плазму центрифугировали последовательно при 300xG - 5 мин, 1000xG - 5 мин, 2500xG - 5 мин, 10000xG - 10 мин, каждый раз отбирая супернатант в чистую пробирку. 10 мкл очищенной таким образом плазмы развели в 90 мкл фосфатно-солевого буфера. Для получения экзосом, секретируемых клетками in vitro, клеточные линии HuTu-80 и SW-837 культивировали в стандартных условиях в среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, лишенной экзосом. После 4-6 дней инкубации (до достижения клетками 90-100%) «плотности») среду собирали. Было суммарно собрано по 120 мл среды от каждой линии, клетки и клеточный детрит был удален путем центрифугирования при 10000 xG - 60 мин, и последующей фильтрации супернатанта через фильтр с диаметром пор 200 нм. Затем экзосомы были выделены путем ультрацентрифугирования при 120000 xG - 6 часов, осадок был ресуспендирован в 100 мкл фосфатно-солевого буфера.
Выделение экзосом и анализ экспрессии EpCam и CD9 в составе экзосомальной мембраны: комплексы «СПМЧ/АптСD63» были трижды отмыты от не связавшихся молекул аптамера в 100 мкл фосфатно-солевого буфера, ресуспендированы в том же буфере (90 мкл), добавлены к образцам: экзосомы HuTu-80: 20 мкл, экзосомы SW-837: 20 мкл, плазма (10% в фосфатно-солевом буфере): 20 мкл.
Таким образом, были приготовлены три пробы, содержащие равное количество СПМЧ/АптСD63 комплексов, но различные по происхождению экзосомы. Образцы инкубировались при +4°С в течение 10-12 часов при постоянном перемешивании. Предполагается, что в течение этого времени произошло образование комплексов СПМЧ/АптСD63/экзосома за счет образования связи между аптамером АптСD63 и тетраспанином CD63 на мембране экзосом. Образовавшиеся комплексы были трижды отмыты в 100 мкл фосфатно-солевого буфера, ресуспендированы в том же буфере (100 мкл). К образцам были добавлены антитела (2 мкл) с белку EpCam (abEpCam-FITC - AbCam, 8666) и CD9 (abCD9-PE - BioLegend, 312105). После двух часов инкубации, образовавшиеся комплексы были отмыты от не связавшихся антител. Анализ интенсивности флуоресценции комплексов был проведен с помощью проточного цитометра CytoFLEX по двум каналам: РЕ и FITC, которые отражали эффективность связывания антител к CD9 и EpCam на поверхности экзосом.
На фиг. 3 представлены результаты анализа. Заметна разница интенсивности флуоресцентного сигнала по каналу FITC (EpCam) и РЕ (CD9), наблюдаемая между образцами. Например, почти 100% экзосом плазмы содержат в своей мембране оба белка. На мембране экзосом, секретируемых клетками колоректальной карциномы, можно заметить, что все везикулы имеют в составе молекулы клеточной адгезии EpCam, но лишь фракция везикул является CD9-позитивными. Комплексы, несущие две флуоресцентные метки, составляли 50%; 82%; 99% после инкубации с везикулами, выделенными из культуральных сред (HuTu-80, SW-837) или из плазмы.
Способ позволяет осуществить быстрое и относительно дешевое выделение из плазмы крови экзосом с возможностью последующего анализа поверхностных экзосомальных белков методом проточной цитометрии.