Компонентный состав протективного антигенного комплекса туляремийного микроба

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.841.95:579.222].083.3

Е. М. Кузнецова, О. А. Волох, И. А. Шепелёв, А. К. Никифоров

компонентный состав протективного антигенного комплекса

туляремийного микроба

ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов

В работе представлена структурная характеристика протективного антигенного комплекса Francisella tularensis - водорастворимого антигена внешних мембран туляремийного микроба, обладающего сложной химической природой с молекулярной массой около 280 кД. Установлено, что входящие в его состав иммунохимически активные субъединицы с молекулярными массами от 81 до 19 кД имеют белковую природу, а 14-17 кД - липопротеидную. В составе ПАК идентифицированы стрессовые белки-шапероны (GroES, GroEL), белки ВМ (FTL_0617, OmpH), рецепторные белки (EF-Tu, RplL), бактериальные ферменты (KatG, GAPDH) и липополисахарид, присутствие которых обусловливает его высокую иммунобиологическую активность.

Ключевые слова: Francisella tularensis, туляремия, антигены, липополисахарид, белки внешней мембраны

В последнее десятилетие активно проводятся исследования, направленные на изучение поверхностных антигенов Francisella tularensis и конструирование на их основе препаратов для профилактики и диагностики туляремийной инфекции [2, 8, 14, 21]. В этом аспекте важными условиями являются совершенствование приемов выделения протектив-ных антигенов в иммунологически активной форме и их детальная характеристика. В отечественной литературе описано несколько методов экстракции липополисахаридо-белковых комплексов (ЛПБК) из внешних мембран (ВМ) клеток F. tularensis: ультразвуковая обработка с многократным ультрацентрифугированием [11], двухстадийная гель-хроматография [15], гель-хроматография в денатурирующих условиях [12], аффинная хроматография [1]. Полученные препараты различаются по химическому составу и иммунобиологическим свойствам, основными иммунореактивными полипептидами в их составе являются субъединицы с молекулярными массами около 63, 43 и 17 кД. В нашей работе использовали поверхностный протективный антигенный комплекс (ПАК) F. tularensis, который был получен фракционированием водорастворимого пула компонентов ВМ сульфатом аммония с последующим осаждением в изоточке (pH 4,3). Данный антиген представляет собой ЛПБК ВМ клеток возбудителя туляремии, на 65% состоящий из белка, и рассматривается в качестве компонента при конструировании диагностических и профилактических туляремийных препаратов [3, 6]. В настоящей работе представлены результаты исследования компонентного состава ПАК туляре-мийного микроба.

Материалы и методы

В работе использовали препарат ПАК, полученный с поверхности бактериальных клеток штамма F. tularensis 15 НИИЭГ [7]. Анализ химического состава антигенных препаратов проводили калориметрическими методами: концентрацию белка определяли по Лоури при длине волны 750 нм [17] с применением набора реактивов DC Protein Assay («Bio-Rad», США); углеводы регистрировали по реакции с тимоловым реактивом при длине

волны 509 нм; количество липидов определяли бихроматным методом при длине волны 650 нм [13]; гептозы определяли по Осборну-Дише при длинах волн 505 и 545 нм [5]. Колоночную гель-хроматографию проводили на хроматографе низкого давления Biologic LP («Bio-Rad», США). Использовали носитель Sephacryl S-300 (120 х 1 см). Для калибровки использовали маркеры молекулярной массы («Sigma», США) от 29 до 669 кД.

Для определения иммунохимической активности препарата ПАК применяли иммуноферментный анализ (ИФА) и дот-иммуноанализ (ДИА) с экспериментальными поликлональными антителами к ПАК туляремийного микроба.

Состав белковых фракций ПАК исследовали методами электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии до-децилсульфата натрия (SDS-PAGE) по U. К. Laemmli [16] в 10% разделительном геле. Иммуноблоттинг проводили по методу Н. Towbin [23] с использованием экспериментальных по-ликлональных кроличьих антител к ПАК в разведении 1:100, а в качестве конъюгата - антикроличьих антител, меченных пероксидазой (НИИЭМ имени Н. Ф. Гамалеи). Для обнаружения белков в SDS-PAGE использовали окраску Кумасси ярко-синим R-250 ("ДиаэМ", Германия), на липополисахарид (ЛПС) гели окрашивали азотнокислым серебром с помощью набора реактивов фирмы Silver Stain ("Bio-Rad", США). Определение молекулярной массы фракций протеинов проводили по калибровочному графику зависимости логарифмов молекулярной массы от величины относительного пробега с набором калибровочных белков 11-250 кД ("Fermentas", США).

Протеомный анализ проводили в ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России (г. Москва). Масс-спектры пептидных карт белков ПАК туляремийного микроба были получены с помощью гидролиза трипсином непосредственно в PAG [4, 19] на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенным УФ-лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона в диапазоне 7004000 Д и в тандемном режиме. Точность моноизотопных масс в рефлекто-моде после докалибровки по пикам автолиза трипсина соответствовала 0,005%, а моноизотопных масс фрагментов - 1 Д. Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot (опция "пептидный фингер-принт") в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information, 2010) по соотношению значений масс пептидов в спектре с первичной структурой после трипсинолиза, с учетом их возможной модификации. Белки, имеющие критерии достоверности score > 74, считались идентифицированными надежно (р < 0,05).

Для изучения компонентного состава препарата ПАК проводили его ферментативный гидролиз протеиназой К («Appli-Chem», Германия) и проназой Е («Serva», Германия), а также химический гидролиз растворами анионных (2% SDS - «Serva», Германия, и 2% саркозил NL-30 «Serva», Германия) и неионных (2% Тритон Х-100 - "Мегск", Германия) поверхностно-активных веществ (ПАВ) и фенол-водную экстракцию (50% водным раствором фенола). Все модифицированные образцы центрифугировали при 13 000 об/мин для освобождения от нерастворенных частиц и после диализа использовали для дальнейшего анализа.

Результаты и обсуждение ПАК туляремийного микроба, полученный из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, представляет собой антиген сложной химической

природы, в состав которого входят белки, липиды и углеводы в соотношении 3:1:1. Ранее нами было показано, что иммунизация лабораторных животных препаратом ПАК вызывает выраженный антительный ответ и активацию клеточного звена иммунитета, обладает протективной активностью для белых мышей при экспериментальной туляремийной инфекции. Средняя иммунизирующая доза ПАК составляла 3,1 (2,4-11,3) мкг при заражении вирулентным штаммом голарктического подвида и 95,5 (55,9-169) мкг при заражении штаммом неарктического подвида. В то же время этот антигенный комплекс не токсичен in vivo при подкожном введении лабораторным животным, а также in vitro для тимоцитов и спленоцитов белых мышей [7].

При изучении физико-химических свойств ПАК было установлено, что он термостабилен, устойчив к действию кислот и щелочей в диапазоне pH от 1,0 до 13,0, имеет изоэлектрическую точку 4,2 ± 0,1, обратимо преципитирует при 50-55% насыщении сульфатом аммония. Данный препарат взаимодействует со специфическими антителами в ИФА в концентрации 0,6 ± 0,4 нг/мл. Биохимический анализ нескольких серий препаратов ПАК показал, что содержание белка в нем соответствует 65,1 ± 1,9%, липидов - 23,0 ± 2,4%, углеводов - 10,9 ± 1,6%. Белковый профиль ПАК по результатам SDS-PAGE был представлен субъединицами с молекулярной массой около 81-85, 57-60, 43, 32, 23, 19 и 14-17 кД, а также несколькими низкомолекулярными зонами с молекулярной массой от 12 кД (рис. 1, а). Все мажорные белковые фракции препарата ПАК-15 взаимодействовали в иммуноблоттинге со специфическими антителами (см. рис. 1, а). Окраска электрофореграммы азотнокислым серебром показала наличие компонентов липополисахаридной природы, которые представлены липидом А и боковыми

цепями (см. рис. 1, а). Отсутствие типичной полной "лестницы" может быть связано как с присутствием неполного ЛПС в ПАК, так и с особенностями строения ЛПС у туляремийного микроба, что согласуется с литературными данными [10]. Отмечено, что количество альдогептоз (углеводных компонентов, характерных для бактериальных ЛПС) в препаратах ПАК было в 10 раз меньше, чем в S-ЛПС Е tularensis 15 НИИЭГ. С помощью протеомного анализа в составе ПАК туляремийного микроба были достоверно идентифицированы восемь белков (см. рис. 1, б): белки-шапероны (GroES и GroEL), ферменты (перокситаза/ каталаза KatG, глицеральдегид-3-фосфат дегидроге-наза GAPDH), регуляторные белки (фактор элонгации EF-Tu, 50S рибосомальный белок RplL) и белки ВМ ^^_0617, ОтрН). По данным J. Su и соавт. [22] и А. G. Savitt и соавт. [18], идентифицированный в составе ПАК гипотетический белок FTL_0617 с молекулярной массой около 17 кД также относится к группе белков-шаперонов и является бактерио-ферретином (Б&). Таким образом, в составе ПАК, выделенного из вакцинного штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ, идентифицированы стрессовые белки-шапероны, рецептор-ные белки EF-Tu и RplL, бактериальные ферменты, наличие которых обусловливает его высокую иммунобиологическую активность.

Были установлены хроматографическая гомогенность препарата ПАК и его молекулярная масса около 280 кД. Необходимо отметить, что в процессе хранения в течение 3-5 лет молекулярная масса ПАК менялась от 280 ± 34 до 450 ± 68 кД. Эта особенность может быть связана со способностью ЛПБК к самоагрегации, что согласуется с литературными данными [12].

На следующем этапе исследований препарат ПАК подвергали ферментативному и химическому

Рис. 1. Результаты электрофоретического анализа и иммуноблоттинга препарата ПАК Е. tularensis. а - SDS-PAG электрофорез: 1 - окраска кумасси ярко-синим Я-250; 2 - окраска азотнокислым серебром; 3 - имму-ноблоттинг с ^ "ПАК"; б - двумерный PAG-электрофорез с идентифицированными белками по базе данных NCBI

(2010). М - маркеры молекулярной массы.

гидролизу в нескольких вариантах опытов, касающихся выбора концентраций ингредиентов реакционной смеси и продолжительности воздействия. Все денатурированные препараты сравнивали с исходным методами SDS-PAGE, иммуноблоттинга (рис. 2) и проводили анализ их иммунохимической активности в ДИА. После водно-фенольной экстракции препарата ПАК в полученной водной фракции были визуально идентифицированы в SDS-PAGE все мажорные белковые субъединицы ПАК, сохраняющие активность в иммуноблоттинге. Фе-нольная фракция ПАК содержала полипептиды с молекулярными массами менее 19 кД и S-ЛПС, последний идентифицировался методом иммуноблот-тинга. С помощью ДИА было отмечено, что водная (белковая) фракция ПАК обладала гораздо большей активностью (титр в ДИА 1/25600), чем углеводная (титр в ДИА 1/3200). Обработка исследуемого антигенного комплекса растворами ПАВ привела к его модификации. При использовании анионных ПАВ в SDS-PAGE наблюдалась солюбилизация полипептидов ПАК, в частности, с молекулярными массами около 57 и 23 кД. Использование же ПАВ с низкой ионной силой привело, наоборот, к фрагментации полипептидов ПАК в диапазоне молекулярных масс от 57 до 14 кД. Наиболее устойчивыми к действию детергентов оказались субъединицы ПАК с молекулярными массами около 81-85 и 14-17 кД. Обработка ПАК детергентами повлияла на проявление его иммунохимической активности в ДИА, при этом обработка растворами SDS и тритона Х-100 привела к уменьшению активности исследуемого антигена (титр в ДИА 1/25600), а раствор сарко-зила, наоборот, увеличил активность ПАК в 2 раза (титр в ДИА 1/102400) по сравнению с нативным (титр в ДИА 1/51200). Ферментативный гидролиз препарата ПАК протеиназой К («АррИЗДет», Германия) привел к полному гидролизу всех белковых субъединиц и позволил получить компонент липо-

полисахаридной природы, содержащий примесь 14-17 кД белка. Стабильность ЛПС препаратов ВМ F tularensis по отношению к протеолитическим ферментам и длительному окислению метоперйо-датом натрия была описана в работах ранее и объясняется отсутствием а-гликольных группировок в структуре его полисахарида [9]. Иммунохимиче-ская активность данного препарата в ДИА по отношению к контролю была значительно ниже и составила 1/800. Из полученных результатов следует, что серологическая активность компонентов ПАК зависит от содержания в них белка. При использовании Проназы Е из спектра ПАК в зависимости от времени протеолиза сначала исчезали белки с молекулярной массой 57-60 и 32-19 кД, что может служить доказательством их чисто белковой природы, а затем все остальные белковые субъединицы. Кроме того, 6-часовой протеолизный продукт ПАК содержал только 2 белковые субъединицы с молекулярными массами 43 и 14-17 кД и О-антиген (см. рис. 2). Полученная фракция являлась хроматогра-фически гомогенной, имела молекулярную массу около 56 ± 1 кД, содержала до 62 ± 3% белка и 30 ± 7% полисахаридов и обладала иммунохимической активностью в ДИА (титр 1/12800).

На основе выше изложенного можно предположить, что белковые субъединицы ПАК с молекулярными массами в диапазоне от 81 до 19 кД являются достаточно чистыми протеинами, которые подвергаются модификации под воздействием растворов ПАВ и ферментов. Согласно протеомному анализу, к белкам ПАК с молекулярными массами в данном диапазоне относятся белковые субъединицы KatG, GroEL, EF-Tu, GAPDH и ОтрН.

Низкомолекулярная белковая фракция ПАК с молекулярной массой около 14-17 кД, скорее всего, относится к липопротеинам, поскольку при водно-фенольной экстракции она идентифицировалась в углеводной фракции и плохо гидролизовалась проте-

2501309575553628-

17-

—^ 5 ш

——  I

- - •

шш — л

М

1

1

Рис. 2. Результаты химического и ферментативного гидролиза препарата протективного антигенного комплекса Е tularensis. а - электрофореграмма, окрашенная кумасси ярко-синим R-250; б - иммуноблоттинг с ^ "ПАК". 1 - углеводная фракция; 2 - водная фракция; 3 -

об-

работка анионными ПАВ; 4 - обработка неионным ПАВ; 5 - обработка протеиназой К; 6 - обработка проназой Е; 7 - иммуноблоттинг ПАК после обработки проназой Е с МкАт к ЛПС Francisella tularensis 15 НИИЭГ. М - маркеры молекулярной массы.

иновыми ферментами. Это согласуется с полученными ранее данными о гликопротеидной природе белковых субъединиц ВМ Е tularensis с молекулярными массами от 15 кД [9]. Согласно протеомному анализу, в составе ПАК идентифицирован гипотетический белок FTL_0617, а кроме того, согласно литературным данным, в состав ВМ Е. tularensis входит липопроте-ин Ти14, имеющий близкую к указанным значениям молекулярную массу [20].

В результате проведенной работы были охарактеризованы компоненты ПАК туляремийного микроба, что является необходимым этапом для последующего его использования при разработке профилактических и диагностических препаратов.

Авторы выражают благодарность сотрудникам ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России М. А. Галяминой, И. А. Деминой и М. В. Серебряковой за проведение протеомного анализа.

Сведения об авторах:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Кузнецова Екатерина Михайловна - мл. науч. сотр. лаб. экспериментальной биотехнологии, е-таЛ:гшгар1@ microbe.ru;

Волох Оксана Александровна - канд. биол. наук, зав. лаб. экспериментальной биотехнологии, e-mail:rusrapi@ microbe.ru;

Шепелёв Иван Анатольевич - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. экспериментальной биотехнологии, e-mail:rusrapi@microbe.ru;

Никифоров Алексей Константинович - канд. мед. на-ук, доц., зам. дир. по научной и экспериментально-производственной работе, e-mail:rusrapi@microbe.ru;

ЛИТЕРАТУРА

1. Аверин С. Ф., Хлебников В. С., Головлев И. Р. и др. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ: Материалы Рос. науч. конф. - Волгоград, 1992. - С. 68.

2. Аронова Н. В., Павлович Н. В. // Журн. микробиол. - 2000. - № 5. - С. 75-78.

3. Волох О. А., Кузнецова Е. М., Еремин С. А. и др. // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. - Н. Новгород, 2009. - С. 329-331.

4. Говорун В. М., Мошковский С. А., Тихонова О. В. и др. // Биохимия. - 2003. - № 1. - С. 52-60.

5. Захарова И. Я., Косенко Л. В. Методы изучения микробных полисахаридов. - Киев, 1982.

6. Кузнецова Е. М., Волох О. А., Шепелев И. А. и др. // Биологическая безопасность в современном мире: Материалы науч.-практ. конф. - Оболенск, 2009. - С. 129-131.

7. КузнецоваЕ. М., Волох О. А., СмольковаЕ. А. и др. // Пробл. особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 109, № 3. - С. 46-49.

8. Лящук А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Биотехнология.

- 2006. - № 5. - С. 32-38.

9. Родионова И. В., Захаренко В. И. // Молекул. генетика. - 1990. -№ 11. - С. 16-18.

10. Сухарь В. В., Непомнящая Н. Б. // Журн. микробиол. - 2009. - №

5. - С. 110-113.

11. Хлебников В. С., Головлев И. Р., Кулевацкий Д. П. и др. // Молекул. генетика. - 1991. - № 7. - С. 15-20.

12. Хлебников В. С., Кулевацкий Д. П., Головлев И. Р. и др. // Журн. микробиол. - 1992. - № 3. - С. 13-17.

13. Amenta J. J. // Lipid Res. - 1964. - N 5. - P. 270-272.

14. Conlan J. W. // Future Microbiol. - 2011. - Vol. 6, N 4. - P. 391-405.

15. Khlebnicov V., Korovina O., Golovliov I. et al. // 20-th Meeting FEBS: Abstracts. - Budapest, 1990. - P. 173.

16. Laemmli U. K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

17. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265.

18. Savitt A. G., Mena-Taboada P., Monsalve G., Benach J. L. // CVI. -2009. - Vol. 16, N 3. - P. 414-422.

19. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. // Anal. Chem. - 1996.

- Vol. 68, N 5. - P. 850-858.

20. SjostedtA., TarnvikA., Sandstrom G. // Infect. and Immun. - 1991. -Vol. 59, N 9. - P. 3163-3168.

21. Splettstoesser W. D., Tomaso H., Dahouk S. A. et al. // J. Vet. Med. -2005. - Vol. 52. - P. 249-261.

22. Su J., Yang J., Zhao D. // Infect. and Immun. - 2007. - Vol. 75, N

6. - P. 3089-3101.

23. Towbin H., Stacbelin T., Gordon J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.

Поступила 01.02.12

THE COMPONENTS OF FRANCISELLA TULARENSIS PROTECTIVE ANTIGENE COMPLEX

E. М. Kuznetsova, O. A. Volokh, I. A. Shepelev, and А. K. Nikiforov

Microbe Russian Anti-Plague Research Institute, Saratov, Russia

The structural characteristics of Francisella tularensis protective antigene complex (PAC) were discussed. PAC is the water-soluble antigene of outer membranes F. Tularensis with sophisticated chemical nature. The molecular weight of PAC is 280 kD. It was found that PAC is composed of some immunoreactivity protein subunits with molecular weight from 81 to 19 kD, and 14-17 kD lipoprotein subunit. The stress proteins-chaperones (GroES, GroEL), outer membrane proteins (FTL_0617, OmpH), receptor proteins (EF Tu, RplL), bacterial enzymes (KatG, GAPDH), and lipopolysaccharide were identified in the PAC structure. Their presence determines the PAC high immunobiological activity.

Key words: Francisella tularensis, tularemia, antigen, lipopolysaccharide, outer membrane proteins