ШТАММ ВИРУСА ГРИППА A/pochard/Siberia/249/08-MA H10N7-СУБТИПА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СОДЕРЖАЩЕГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА И ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ, ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО РЕФЕРЕНС-ОБРАЗЦА ПРИ ОЦЕНКЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПЦР И ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ in vitro И in vivo
STRAIN OF INFLUENZA VIRUS OF SUBTYPE A/pochard/Siberia/249/08-MA H10N7 FOR OBTAINING ANTIGEN-CONTAINING DIAGNOSTIC PREPARATION AND DIAGNOSTIC POLYCLONAL SERUM, APPLICATION AS CONTROL REFERENCE-SAMPLE IN EVALUATING SPECIFICITY OF TEST SYSTEMS BASED ON PCR AND FOR STUDY OF ANTIVIRAL PREPARATIONS in vitro AND in vivo

Изобретение относится к разделу общей и медицинской вирусологии, а именно к получению нового штамма вируса гриппа H10N7-субтипа адаптированного к мышам, и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего препарата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н10-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа А (H1-H17) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа H10-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА. Штамм также может быть применен в качестве контрольного референс-штамма H10 при проведении апробации тест-систем на основе ПЦР и проверки лечебных и профилактических препаратов против гриппа.
Вирусы гриппа a (Orthomyxoviridae, Influenzavirus А) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса [1]. Вирусы гриппа A подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. На сегодняшний день известно 17 субтипов гемагглютинина (H) и 10 субтипов нейраминидазы (N) [2].
К настоящему моменту циркуляция вирусов гриппа A со всеми известными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, кроме H17N10, зарегистрирована только среди птиц [3]. В процессе эволюции нередко возникают высокопатогенные для человека и животных варианты вируса гриппа. Яркий пример - возникновение нового азиатского варианта вируса H5N1-субтипа, впервые зарегистрированного у домашних птиц в 1996 [4].
Первые упоминая о вирусе гриппа H10-субтипа, как высокопатогенного для домашней птицы встречаются с 1949 года, тогда он был выделен от мертвой курицы на ферме в Баварии [5]. Этот вирус (A/chicken/Germany/N49) был охарактеризован как H10N7. В дальнейшем сыворотку, полученную с использованием этого вируса стадии применять для серологического субтипирования вирусов гриппа H10-субтипа. В некоторых панелях этот штамм используется до настоящего времени. Позднее были зафиксированы две вспышки гриппа на фермах по выращиванию индюков в Минесоте, в 1979 и 1980 годах [8].
В научной литературе описан случай, произошедший в 1996 году. Тогда во время ежегодного мониторинга в Сингапуре был выделен изолят вируса гриппа, который серологически субтипировали как H10N5. При изучении биологических свойств данного штамма IVPI индекс был равен 1.76, что по современным оценкам позволяет его отнести к высокопатогенным [6].
В марте 2010 года была зарегистрирована вспышка низкопатогенного вируса гриппа субтипа H10N7 на ферме по разведению кур в Австралии. После этой вспышки вирус гриппа Н10 субтипа был выделен у двух сотрудников фермы, из семи человек, которые жаловались на коньюнктивит и слабые респираторные синдромы [7].
Также сообщалось о вспышках низкопатогенного вируса гриппа НЮ субтипа у домашних птиц в других странах. Наиболее характерным он является для таких видов домашней птицы, как индюки и эму в США [8, 9], у китайской утки на фермах в Южной Африке [10], и у кур в Канаде [11]. Также есть информация, о выделении вируса гриппа A субтипа H10N7 от домашней птицы, незаконно ввезенной на территорию Италии из Китая [12].
Неоднократно вирус гриппа Н10 сутбтипа выделялся от диких птиц в таких странах, как Америка [13, 14, 15], Перу - (H10N9) [16], Иран 2003-2007 H10N7 [17]. В Китае также выделяли этот вирус из окружающей среды (вода) [18].
Основываясь на этих данных, можно утверждать, что вирус широко распространен в популяции дикой и домашней птицы. Но литературные данные также свидетельствуют о распространении вируса гриппа Н10 субтипа среди млекопитающих. Так, в 1984 году в Швеции это вирус вызвал эпизоотию на ферме норок, при этом смертность от вируса достигала почти 100%. Серологическое исследование идентифицировало этот вирус как H10N4. Основная симптоматика болезни - анорексия, кашель и насморк [19]. В дальнейшем изучение того вируса методом Oligonucleotide (ON) fingerprinting позволило установить, что его предшественниками послужили вирусы, выделенные от птиц [20]. Филогенетический анализ показал, что NP ген исследуемого вируса также попадает в одну филогенетическую группу (кладу), с вирусами, выделенными от птиц [21].
Более поздние исследования шведских ученых показали, трансмиссия вируса гриппа H10 субтипа может происходить непосредственно от птиц норкам, в дальнейшем вызывая инфекцию в популяции норок на ферме [22].
Вирус, выделенный в Китае из окружающей среды и субтипированный как H10N8, был протестирован на курицах, в результате этого эксперимента, вирус отнесли к низкопатогенным. При исследовании биологических свойств этого же штамма environment/DT/Hunan/3-9/07 у мышей наблюдалась легкая потеря в весе, но при этом на третий и пятый день после заражения было показано высокое содержание вируса в легких. Для дальнейшего изучения патогенности вируса у млекопитающих китайские ученые провели несколько пассажей на мышах, каждый раз заражая животных вирусом, выделенным из легких. Вирулентность изучаемого штамма выросла после второго пассажа и вирус стал вызывать летальную инфекцию у мышей с седьмого по одиннадцатый день после заражения. Во время течения болезни большинство лабораторных животных обнаруживали тяжелые клинические симптомы - такие как сильная потеря в весе, взъерошенность волосяного покрова и потеря подвижности.
После 4-6 вирусного пассажа мыши показывали те же симптомы, но на более ранних сроках, и смерть наступала на 4-5 день после заражения.
Эти факты указывают на актуальность получения адаптированного к мышам штамма H10 и использования его для изучения патогенеза инфекции и тестирования противовирусных препаратов.
Филогенетический анализ environment/DT/Hunan/3-9/07 показал, что все гены относятся к Европейской линии. Но предположительно он является мультиреассортаном между различными вирусами, включая вирусы гриппа H5 и H7 субтипов. При анализе первичных последовательностей всех генов после шести пассажей на мышах было выявлено 22 аминокислотные замены, большинство из которых возникли вследствие адаптации вируса к новому хозяину [18].
Неоднократно вирус гриппа H10 субтипа вызывал слабые респираторные симптомы и коньюктивит у людей. В основном это были работники ферм, где разводили домашнюю птицу или норок, так в Австралии на ферме по разведению норок у двух работников был выделен вирус гриппа H10N7 [7]. А у работников фермы в США были обнаружены специфические антитела к вирусу гриппа H10 субтипа [23]. Также на территории Египта было зафиксировано два случая выделения вируса гриппа H10N7 у людей, при этом о гибели птиц или норок, вызванной этим вирусом, не сообщалось [24, 25].
Первые работы по адаптации вируса гриппа к мышам начались в 1947 году. Тогда основной целью исследования было изучение иммунного ответа и возможности заражения мышей вирусами, наработанными на куриных эмбрионах. Проведенные работы подтвердили, что вирус гриппа типа A, наработанный на РКЭ, может легко реплицироваться в легких мышей [26].
В основном в работах по адаптации вирусов гриппа типа A на мышах используются вирусы гриппа, выделенные от людей, и основой целью является выявление роли различных аминокислотных замен на увеличение патогенности вирусов. Так в 1998 г. канадские ученые изучали роли в вирулентности генов NA, PB1, PB2 вируса A/FM/1/47/H1N1 адаптированного на мышах [27].
Для моделирования летальной инфекции, вызванной вирусом сезонного гриппа H1N1-субтипа, используется адаптированный к мышам штамм A/Puerto Rico/8/1934 [28]. Он часто используется для экспериментальной инфекции хорьков и мышей, чтобы изучить патогенез вируса, иммунный ответ и протестировать противовирусные соединения.
После пандемии, вызванной H1N1 в 2009 году многие лаборатории стали проводить работы по адаптации этого вируса на мышах. Так, в ходе адаптации вирус стал высокопатогенным и вызывал смертность у мышей на 5 и 10 день после заражения. В ходе изучения аминокислотных последовательностей было показано, что ряд AK замен, произошедших в ходе адаптации, влияет на смертность у мышей, в частности в генах РВ, HA и NP [29].
Были получены штаммы пандемического вируса гриппа, адаптированные к мышам, - A/California/04/2009-МА и A/TN/1-560/09-MA [30]. Однако дикие штаммы A/California/04/2009 и A/TN/1 -560/09 были выделены в апреле 2009 г., в самом начале развития пандемии. Вследствие колоссальной изменчивости вируса гриппа уже с осени 2009 г. в мире циркулировали штаммы, отличные по молекулярно-генетическим свойствам от референс-штамма A/California/04/2009. Кроме того, оба штамма выделены в Америке.
Существует также штамм другого субтипа: A/Swine/1976/31(H1N1) -адаптированный к мышам вирус гриппа, выделенный от свиней [31]. Однако указанный штамм генетически и по антигенным свойствам также значительно отличается от штаммов вируса гриппа A (H1N1) 2009 г.
В ходе адаптации сезонного вируса гриппа H1N1 было выделено три AK замены в гемагглютинине (T89I, N125T, и D221G), которые увеличили вирулентность вируса у мышей, но при этом не оказали никакого влияния на такие свойства вируса как рецептороспецифичность и pH-зависимое слияние с мембрной [31].
Также существуют работы, по адаптации вирусов гриппа типа A к разным видам птиц. Например, в ходе 19 кратного пассирования вируса гриппа H3N2, выделенного от утки, на перепеле вирус приобрел ряд мутаций, которые способствовали репликации на бронхиальных эпителиальных клетках человека, в то время как вирус до пассирования таких свойств не показывал. Полученные данные указывают на то, что птицы отряда перепелиных могут служить промежуточными хозяевами между вирусами гриппа птиц и людей [32].
В мировой медицинской и научной практике нет широко применяемого штамма H10 субтипа, адаптированного к мышам (являющегося летальным для мышей, при интраназальном заражении), для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов в культуре клеток и на животных. Это затрудняет оценку эффективности лекарственных препаратов in vivo. При использовании непатогенных для мышей штаммов эффективность используемых противовирусных препаратов оценивают по динамике размножения вируса в легких подопытных мышей, что значительно затрудняет оценку результатов.
Установлено, что большинство известных штаммов вируса гриппа A субтипа H10N7, выделяемые в природе, не являются летальными для мышей. Однако вирус гриппа A H10 субтипа был детектирован у человека, вызывая коньюктивит и респираторное заболевание, в связи с чем представляет потенциальную опасность для млекопитающих, в том числе для человека. Поэтому для моделирования гриппозной инфекции мышей существует необходимость их адаптации к данным хозяевам.
Таким образом, в настоящее время в России отсутствует оригинальный штамм вируса гриппа H10N7-субтипа, адаптированный к мышам и доступный для моделирования летальной гриппозной инфекции с целью исследования профилактической и лечебной эффективности противовирусных препаратов; а также для использования в диагностических препаратах и контрольных референс-образцах.
Анализ известных аналогов.
При совершенствовании методик диагностики и усилении надзора за вирусом гриппа А в природе, вероятно, что новые субтипы HA и NA будут обнаруживаться. Это подтверждается выделением нового субтипа H17N10 от летучих мышей Южной Америки [2].
В связи с этим получение информации по всему спектру субтипов вируса гриппа, циркулирующих в окружающей среде, и развитие новых методов и подходов диагностики, в том числе с использованием предлагаемого штамма A/pochardVSiberia/249/08-МА (H10N7), остаются важными задачами мероприятий по эпиднадзору за гриппом и контролю эпизоотической ситуации животных.
В настоящее время в основном используются тест-системы для определения субтипов вируса гриппа на основе полимеразной цепной реакции, на основе микрочипов [36, 37, 38, 39, 40]. Однако при апробации этих тест-систем необходимо применять контрольный референс-штамм H10 субтипа, наиболее близкий к циркулирующим в настоящее время в природе. В вышеупомянутых исследованиях проверки систем в отношении штамма вируса гриппа H10 проведено не было. Это связано, в том числе, с отсутствием на отечественном рынке коммерческого референс-штамма H10.
За рубежом для исследований и в качестве компонента панели референс-штаммов для РТГА и ПЦР применяют целый ряд вирусов.
Для исследования мембранного слияния используют штаммы H10N7 (Dr. David Steinhauer; mailto:dsteinh@emory.edu):
A/turkey/VA/31409/91
A/chicken/Germany/N/49
Штамм A/chicken/Germany/N/49 применялся как контрольный при апробации ПЦР-системы детекции вирусов гриппа A и B в реальном времени [41].
Оригинальный штамм хранится в коллекции Department of Virology, Erasmus Medical Center, The Netherlands (Drs. R.A.Fouchier; A.D.Osterhaus)
При проведении исследований методом нейтрализации с моноклональными антителами к H5N1 (ELISA), в качестве контрольного был использован штамм выделенный в Дании A/Chicken Germany/N/1949 (H10N7) [42].
Штамм H10N4-A/Turkey/England/384/79 был использован в качестве контрольного для разработки и исследования иммуномагнитной ПЦР ловушки вируса гриппа [43].
Для апробации тест-системы экспресс-диагностики высокопатогенного вируса гриппа Н7 была применена панель контрольных штаммов вируса гриппа различных субтипов, которая включала штамм A/chicken/Germany/N/1949. Нуклеотидная последовательность этого же штамма была использована для филогенетического анализа штаммов вируса гриппа, выделенных на территории Японии [44].
Для апробации экспресс тест-системы H5 Dot ELISA на основе двух комплементарных моноклональных антител к вирусу гриппа H5 субтипа в качестве контроля был использован штамм A/Mandarin Duck/Singapore/93 H10N5 [45].
На мировом рынке компания Sino Biological Inc. предлагает продукцию, компонентом которой является рекомбинантные штаммы H10N3 (A/duck/Hong Kong/786/1979) и H10N9 (A/duck/HongKong/562/1979).
В панели по диагностике вируса гриппа методом РТГА применяют штамм A/Chicken Germany/N/1949 (H10N7).
Исследования методом РТГА нескольких штаммов различных субтипов, выделенных в Северной Америке, показали, что они достоверно антигенно отличны от вирусов, циркулирующих в Евразии [46].
Таким образом, для производства коммерческих систем и наборов, а также для научных исследований в настоящее время используется несколько штаммов вируса гриппа H10 субтипа. Однако все они имеют ряд недостатков.
Во-первых, все они были выделены в основном более чем 10 лет назад. Вместе с тем, описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа A могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа H10-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа H10-субтипа как компоненты диагностических тест-систем. Этому условию удовлетворяет предлагаемый штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА (H10N7), выделенный в 2008 г.
Во-вторых, известные штаммы, в основном представленные американскими вариантами, антигенно отличны от евроазиатских штаммов, и образуют различные филогенетические линии. Они не проявляют значительной кросс-реактивности со штаммами, циркулирующими в Евразии. Следовательно, они не могут использоваться как референс-штаммы для панели РТГА в этом регионе и необходимо использовать с этой целью современные штаммы, циркулирующие в Евразии. Однако, ввиду большой территории Евразии, очевиден поиск вариантов, локально представленных в Азии. Этому условию удовлетворяет предлагаемый нами штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА (H10N7), выделенный в азиатской части России.
Кроме того, анализ доступной в настоящее время информации показывает, что на рынке отсутствует отечественный аналог референс-штамма вируса гриппа Н10-субтипа для серодиагностики вируса гриппа.
При оценке эффективности разработанных методов ПЦР типирования необходим анализ референс-штаммов, в том числе H10 субтипа. При этом важно, чтобы не было отмечено перекрестного взаимодействия с референс-штаммами других субтипов и результаты полностью совпадали с данными определения вирусного субтипа иммунологическими методами (РТГА).
Предлагаемый штамм может быть использован для этих задач и в полной мере может удовлетворять этим двум условиям апробации тест-систем ПЦР.
Следует отметить, что во многих панелях референс-антисывороток используется в основном старый штамм A/chicken/Germany/N/49 (H10N7), выделенный в 1947 Н10-субтипа [47].
В референс-панели ВОЗ в качестве антигена также используется A/chicken/Germany/N/49 (H10N7) [33].
В международной базе данных Genbank по состоянию на 1 марта 2013 существует следующая информация о 211 сиквенсах гена НА вирусов H10N7.
Ранее вирусы с субтипом H10 были выделены на европейской территории России сравнительно редко - отмечены единичные случаи выделения. При этом данные о выделении вируса H10-субтипа и его характеризации на территории России крайне немногочисленны. Однако это не исключает возможности его появления, поэтому существует необходимость готовности его диагностики.
Упомянутые источники содержат информацию о некоторых свойствах штаммов вируса гриппа H10-субтипа, выделенных в России. Однако в этих работах не была сделана попытка использовать их свойства при разработке диагностических препаратов, в том числе с использованием метода РТГА.
Все вышеперечисленные факты делают актуальным эффективную диагностику вируса гриппа H10-субтипа в области медицины, ветеринарии, экологии.
Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого штамма является A/chicken/Germany/N/49 (H10N7), выделенный в 1947. Однако он был выделен более 50 лет назад, и антигенно может быть отличным от ныне существующих вариантов (данные о сравнительных исследованиях отсутствуют). Отсутствует и подробная антигенная характеристика, поэтому применение его в дальнейшем как компонента диагностических систем является нецелесообразным.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение такого штамма-продуцента вируса гриппа птиц H10N7-субтипа, который обладал бы более высоким антигенным сродством к современным вариантам вируса гриппа H10, и был пригоден для получения антигенсодержащего диагностического препарата, поликлональной сыворотки для определения принадлежности вируса гриппа к H10-субтипу, а также мог быть использован как контрольный референс-образец при оценке специфичности тест-систем на основе ПЦР.
Указанный технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, а также для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции и проверки лечебных и профилактических препаратов против гриппа, депонированный в государственной Коллекции вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационным номером V-592.
Характеристика заявляемого штамма.
Источник получения. Штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА является представителем вирусов гриппа род Influenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Принадлежность к H10N7-cy6rany определена методом PCR. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (Н1-Н16) и нейраминидазу (N1-N9) [33, 34]. Заявляемый штамм изначально выделен из клоакального смыва красноголового нырка. Материал был собран в августе 2008 в Республике Хакасия (Ширинский район, оз. Сухой Иткуль). Выделенный штамм прошел 2 пассажа на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), 8 пассажей на мышах линии BALB/c, а затем 1 пассаж на клетках MDCK. Гибель клеток по апоптотическому пути наблюдалась через 2-3 суток с момента инфицирования. Штамм депонирован в Коллекцию микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером № V-592.
Индикация вируса была проведена в РГА с эритроцитами гуся. Вирус агглютинировал эритроциты человека и гуся, но не агглютинировал эритроциты петуха: гемагглютинирующая активность составила 3,11±0,15 lg ГАЕ/мл. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 6,9±0,09 lg EID50/мл.
Адаптация штамма вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08 к мышам. Штамм A/pochard/Siberia/249/08 адаптировали в серии последовательных пассажей через легкие мышей линии BALB/c. Для чего по три мыши заражали интраназально 50 мкл физиологического раствора, содержащего 100 или 10 TCID50 вируса A/pochard/Siberia/249/08. Эти дозы заражения выбраны, исходя из того, что в предварительных экспериментах было показано наличие выраженных симптомов заболевания на четвертые-пятые сутки после инфицирования мышей в этом диапазоне концентраций. На третьи сутки после инфицирования мышей умерщвляли и из их легких готовили 10%-ные гомогенаты на физиологическом растворе. Остальных мышей в группе оставляли в живых для наблюдения возможной клинической картины, а также для получения сывороток крови. После этого вновь проводили интраназальное заражение мышей 10%-ными гомогенатами легких в объеме 50 мкл. Параллельно инфекционные титры вируса в легких мышей определяли титрованием 10%-ного гомогената на клетках MDCK (табл.1).
Было проведено 7 последовательных пассажей. Клинические признаки заболевания начали проявляться после заражения мышей гомогенатами третьего пассажа. Гибель мышей начала проявляться на 7 пассаже для зараженных штаммом A/pochard/Siberia/249/08(H10N7) В связи с этим было решено определить значение летальной дозы для мышей и инфекционного титра вируса в РКЭ.
Определение летальной дозы для мышей было проведено путем заражения 4 групп мышей различными разведениями вируса (от 0 до -3). Было использовано 12-14 мышей на каждое разведение. Клиническая картина заболевания у мышей начала проявляться на 3 сутки после заражения. На 4-е сутки был отмечен первый случай гибели животных.
Наблюдение за животными проводили до прекращения гибели мышей, которое было отмечено на 11 сутки после заражения, т.е. в следующие дни гибели животных не наблюдалось. В итоге значение летальной дозы для мышей составило: MLD50=2,35±0,1 lgTCIDSO/мл для A/pochard/Siberia/249/08(H10N7). Инфекционный титр составил 7,53 lg EID50/мл.
Таблица 1
Инфекционные титры штамма вируса A/pochard/Siberia/249/08 при пассировании через легкие мышей линии Balb/c на 3 сутки после заражения
Номер пассажа
Титр вируса в легких мышей, IgTCID5o/ml±S.D.
I
4,50±0,16
II
4,63±0,12
III
4,50±0,18
IV
4,50±0,10
V
4,50±0,14
VI
5,37±0,07
VII
5,5±0,10
Как следует из данных, представленных в табл.1, инфекционный титр вируса A/pochard/Siberia/249/08-МА увеличивался от пассажа к пассажу (исключение составил только пятый пассаж вируса через легкие мышей). После того как вирус прошел 7 пассажей на мышах, был наработан его пул на клетках MDCK. Инфекционный титр пула вируса сравнялся с титром исходного вируса и составил 7,38±0,24 lg TCID50/мл. При этом 50%-ная летальная для мышей доза (MLD50) составила 2,35±0,1 lgTCID50/Mn.
2
Культуральные свойства. Штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА при культивировании на монослое клеток MDCK вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-3 сутки (температура культивирования 37°С, в атмосфере 5% CO). Для культивирования штамма на клетках MDCK используют следующие питательные среды: DMEM, MEM, среда 199, RPMI, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.
Патогенность для человека. Нет информации о патогенности вируса гриппа субтипа H10, циркулирующего на территории Российской Федерации. В зарубежных работах экспериментальное инфицирование волонтеров показало, что вирус гриппа птиц H10N7 способен реплицироваться в носоглотке человека. Возможен конъюнктивит и незначительные симптомы заболевания верхних дыхательных путей.
Патогенность для млекопитающих. Штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА относится к вариантам вируса гриппа, патогенным для мышей: вызывает тяжелое заболевание и гибель мышей линии BALB/c при интраназальном инфицировании.
Биологические свойства адаптированного и исходного штаммов представлены в таблице 2.
Таблица 2
Биологические характеристики исходного штамма A/pochard/Siberia/249/08 и его адаптированного к мышам варианта A/pochard/Siberia/249/08-МА
Штамм
число пасса-жей
lgTCID50/мл+S.D.
lgГАЕ/мл+S.D.
lgEID50/мл±S.D.
MLD50(lgTCID50/мл±S.D.)
A/pochard/Siberi а/249/08
2/РКЭ
7,25±0,12
3,11±0,15
6,9±0,09
Не летален
A/pochard/Siberi а/249/08-МА
2/РКЭ, 7/BALB /с, 2/MDC К
7,38±0,24
3,7+0,15
7,53±0,09
2,35±0,1
Была получена поликлональная сыворотка на курах к предлагаемому штамму A/pochard/Siberia/249/08, которая обладает значимым титром в РТГА (Пример 1). Она позволит выявлять вирус гриппа Н10-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигеном отношении вариантов. Шести 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного. Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (таблица 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 [33].
Для контроля был проведен эксперимент с антигеном и сывороткой, полученными для другого штамма вируса гриппа H10-субтипа. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Результаты проведения РТГА
Сыв. Ag.
A/pochard/Siberia/249/08(H10N7)
A/common teal/Tynda/6114/2008(10N6)
A/pochard/Siberia/249/08(H10N7)
1/640
1/160
A/common teal/Туnda/6114/2008(H10N6)
1/640
1/160
Сыворотка, полученная на предлагаемый антиген, проявляет сродство к антигену штамма A/common teal/Tynda/6114/2008 (H10N6), принадлежность которого к H10 субтипу подтверждена сиквенированием фрагментом гена НА гемагглютинина (GenBank: GU227358). Значение титра является диагностическим [33], в связи с чем возможно использование сыворотки на предлагаемый штамм для диагностики близких антигенно вариантов вируса гриппа H10-субтипа.
Таким образом, поликлональная сыворотка к предлагаемому штамму A/pochard/Siberia/249/08 обладает значимым титром в РТГА. Она позволит выявлять вирус гриппа H10-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигенном отношении вариантов.
Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 5 лет при хранении на -70°C. Ранее показано, что одним из способов, обеспечивающих длительное хранение жизнеспособности вирусов, является получение лиофилизированных культур (А.Ю.Селезнева, 1978). Для хранения пулы штаммов необходимо разливать в стеклянные ампулы объемом 3-5 мл и лиофильно высушивать [35].
Антиген штамма A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа также можно длительно хранить в лиофилизированном состоянии (см. выше). Для использования его необходимо разводить фосфатно-солевым (pH 7,2) буфером соответствующего объема.
При использовании разведенного готового антигена штамма в течение одной недели допускается его хранение в холодильнике при температуре +4°C.
Таким образом, рекомендуемый штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа эффективно культивируется на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) в титрах 6,7±0,18 lg EID50/мл и на культуре клеток MDCK - в титрах 7,375±0,24 lg TCID50/мл. Штамм вызывает заболевание с летальным исходом у мышей при интраназальном пути введения. Следует отметить стабильное, закономерное проявление клинических признаков заболевания и 100% летальность штамма для мышей в дозе 2,35 lg TCID50/мл. Штамм может быть использован для получения поликлональной сыворотки, используемой в диагностике вируса гриппа методом РТГА.
Анализ показывает актуальность и целесообразность использования штамма A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-cy6rana для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа H10-субтипа. Он может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H10-субтипа и диагностики вновь выделяемых изолятов. Кроме того, штамм может быть использован для моделирования гриппозной инфекции и изучения противовирусной активности препаратов.
При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 7,53 lg EID50/мл. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/pochard/Siberia/249/08-МА (Н10N7).
В эксперименте штамм имеет одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.
Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа H10-субтипа, выделенным на азиатской территории России за последние 5 лет. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.
По причине быстрой изменчивости вируса гриппа A, его антигенных свойств, крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа A. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа H10-субтипа в России в РТГА не существует. Отсутствует также отечественный штамм-продуцент H10 субтипа для моделирования гриппозной инфекции на мышах.
Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на основе штамма вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08 H10N7-субтипа.
Шести 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения были у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/pochard/Siberia/249/08. РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.
Таблица 4
Титры сывороток крови от куриц в РТГА с антигеном штамма A/pochard/Siberia/249/08.
Животное
Титр сыворотки до инфицирования
Титр сыворотки на 21 сутки после инфицирования
1
≤1/10
1/320
2
≤1/10
1/320
3
≤1/10
1/640
4
≤1/10
1/640
5
≤1/10
1/640
6
≤1/10
1/640
После 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.
Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (таблица 4). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 [33]
Таким образом, получена поликлональная сыворотка к предлагаемому штамму A/pochard/Siberia/249/08, которая обладает значимым титром в РТГА. Она позволит выявлять вирус гриппа H10-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигеном отношении вариантов.
Пример 2. Приготовления антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08.
Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37°С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы - 3 пассажа (РКЭ). Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4 - +7С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.
Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа H10-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H10-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (таблица 2).
Пример 3. Моделирование летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c. Сравнение патогенности A/pochard/Siberia/249/08-МА с диким штаммом
Поскольку доклинические испытания противогриппозных лекарственных препаратов проводят, главным образом, на мышах, патогенность полученного штамма была тщательно исследована в экспериментах на этих животных с использованием различных доз заражения.
Пул вируса A/pochard/Siberia/249/08-МА использовали для интраназального заражения мышей линии BALB/c. На растворе Хенкса готовили десятичные разведения вируса в диапазоне концентраций 10-1 - 10-5. Под легким эфирным наркозом по 10 мышей заражали подготовленными разведениями вируса в объеме 50 мкл. В течение 21 сут вели наблюдение за мышами: ежедневно проводили учет павших животных. Дозу вируса, вызывающую 50%-ную гибель мышей, рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [9]. Рассчитанное значение MLD50 составило 2,35±0,1 lg TCID50/мл.
После определения MLD50 были проведены эксперименты по моделированию гриппозной пневмонии мышей с различной степенью летальности. Для этого мышей заражали 0,5 и 10 MLD50. Наблюдение за мышами вели в течение 16 дней после инфицирования. Мышей взвешивали через день. Ежедневно учитывали павших животных и высчитывали среднюю продолжительность жизни мышей (MSD) по формуле: MSD=Σf(d-1)/n, где f - количество мышей умерших на день d, а также мыши, выжившие на момент завершения эксперимента (d в этом случае - 15), n - количество мышей в группе.
При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 0,5MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости на 7-8 день после инфицирования наблюдали клинические симптомы заболевания (снижение активности, потеря аппетита, одышка, тремор, изменение качества шерсти), а также снижение массы тела на 10±7%. На 14 день после заражения две мыши погибли (MSD - 14,6 дней). Снижение массы тела прекратилось после 13-го дня наблюдения.
При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 10MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости первые признаки заболевания, а также снижение массы тела на 12±4% наблюдали уже на 4-5 сутки после инфицирования. Гибель мышей регистрировали, начиная с седьмого дня после заражения. К 10 сут наблюдения все 10 мышей погибли, а средняя продолжительность жизни мышей составила 6,1±0,6 дней.
Дикий штамм A/pochard/Siberia/249/08 в эквивалентных в дозах не оказывал видимого негативного воздействия на мышей. Не было зарегистрировано гибели мышей. При заражении мышей линии BALB/ отмечали снижение активности, потерю аппетита. Однако через 6 сут от момента инфицирования наблюдали полное клиническое выздоровление животных.
Нами была определена кинетика репликации адаптированного штаммов в легких подопытных животных. Гомогенаты легких мышей, зараженных 10 MLD50 штамма A/pochard/Siberia/249/08 -ma и 106 TCID50 штамма A/pochard/Siberia/249/08, титровали через 1,3,6 и 9 сут после заражения. Вирус A/pochard/Siberia/249/08 -ma реплицировался в легких мышей вплоть до 9 сут. Надо отметить, что к этому времени у мышей исчезли клинические симптомы заболевания, что, видимо, напрямую связано со снижением эффективности репликации вируса в легких животных.
Таблица 5
Репликация в легких мышей A/pochard/Siberia/249/08 -ma
Штамм
Титр вируса, lgTCIDSO/мл±S.D.
1 сут
3 сут
6 сут
9 сут
A/pochard/Siberia/249/08 -ma
6,2±0,53
5,5±0,19
5,35±0,9
2,015±0,5
Таким образом, адаптированный к мышам штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА вызывает гибель мышей (2,35±0,1 lg TCID50/мл). Он может быть использован для моделирования гриппозной инфекции H10-субтипа и использоваться для исследования эффективности противовирусных препаратов согласно стандартным методикам [48].
Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа H10-субтипа, выделенным на азиатской территории России за последние 5 лет. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.
Использованные источники информации
1. Webster R.G, Bean W.J, Gorman О.Т, Chambers T.M, Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev. 1992 Mar;56(l): 152-79.
2. Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang К, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13;109(11):4269-74.
3. Capua I, Alexander DJ. Avian influenza vaccines and vaccination in birds. Vaccine. 2008 Sep 12;26 Suppl 4:D70-3.
4. Alexander DJ, Brown IH. Recent zoonoses caused by influenza A viruses. Rev Sci Tech. 2000 Apr; 19(l):197-225.
5. DIETER, Z.: Eine Variante des Virus der Gefliigelpest:in Bayern ? Tier~rztl. Umschau4,185-186(1949).
6. Wood GW, Banks J, Strong I, Parsons G, Alexander DJ An avian influenza virus of H10 subtype that is highly pathogenic for chickens, but lacks multiple basic amino acids at the haemagglutinin cleavage site. Avian Pathol. 1996 Dec; 25(4):799-80.
7. George G. Arzey, Peter D. Kirkland, K. Edla Arzey, Melinda Frost, Patrick Maywood, Stephen Conaty, Aeron C. Hurt, Yi-Mo Deng, Pina Iannello, Ian Barr, Dominic E. Dwyer, Mala Ratnamohan, Kenneth McPhie, and Paul Selleck Influenza Virus A (H10N7) in Chickens and Poultry Abattoir Workers, Australia Emerg Infect Dis. 2012 May; 18(5): 814-816.
8. Karunakaran D, Hinsaw V, Poss P, Newman J, Halvorson D. Influenza A outbreaks in Minnesota turkeys due to subtype H10N7. Avian Dis. 1983;27:357-66.
9. Woolcock PR, Shivaprasad HL, De Rosa M. Isolation of avian infl uenza virus (H10N7) from an emu (Dromaius novaehollandiae) with conjunctivitis and respiratory disease. Avian Dis. 2000;44:737-44.
10. Abolnik C, Gerdes HG, Sinclair M, Ganzevoort BW, Kitching JP, Burger CE, et al. Analysis of infl uenza A viruses (H6N8, H1N8, H4N2, H9N2, H10N7) isolated from wild birds, ducks, and ostriches in South Africa from 2007 to 2009. Avian Dis. 2010;54:313-22.
11. Senne DA. Avian infl uenza in the Western Hemisphere including the Pacifi с Islands and Australia. Avian Dis. 2003;47:798-805.
12. Serena Beato M, Terregino C, Cattoli G, Capua I. Isolation and characterization of an H10N7 avian infl uenza virus from poultry carcasses smuggled from China into Italy. Avian Pathol. 2006;35:400-3.
13. Ito T, Okazaki K, Kawaoka Y, Takada A, Webster RG, Kida H. Perpetuation of influenza A viruses in Alaskan waterfowl reservoirs.Arch Virol. 1995; 140(7):1163-72
14. Wilcox BR, Knutsen GA, Berdeen J, Goekjian V, Poulson R, Goyal S, Sreevatsan S, Cardona C, Berghaus RD, Swayne DE, Yabsley MJ, Stallknecht DE. Influenza-A viruses in ducks in northwestern Minnesota: fine scale spatial and temporal variation in prevalence and subtype diversity. PLoS One. 201 l;6(9):e24010. doi: 10.1371/journal.pone.0024010. Epub2011 Sep 13
15. Siembieda JL, Johnson CK, Cardona C, Anchell N, Dao N, Reisen W, Boyce W. Influenza A viruses in wild birds of the Pacific flyway, 2005-2008. Vector Borne Zoonotic Dis. 2010 Oct;10(8):793-800. doi: 10.1089/vbz.2009.0095. Epub 2010 Jan 8.
16. Bruno M. Ghersi, David L. Blazes, Eliana Icochea, Rosa I. Gonzalez, Tadeusz Kochel, Yeny Tinoco, Merly M. Sovero, Stephen Lindstrom, Bo Shu, Alexander Klimov, Armando E. Gonzalez, and Joel M. Avian Influenza in Wild Birds, Central Coast of Peru MontgomeryEmerg Infect Dis. 2009 June; 15(6): 935-938. doi: 10.3201/eidl506.080981 PMCID: PMC2727326
17. Fereidouni SR, Werner O, Starick E, Beer M, Harder TC, Aghakhan M, Modirrousta H, Amini H, Moghaddam MK, Bozorghmehrifard MH, Akhavizadegan MA, Gaidet N, Newman SH, Hammoumi S, Cattoli G, Globig A, Hoffmann B, Sehati ME, Masoodi S, Dodman T, Hagemeijer W, Mousakhani S, Mettenleiter TC. Avian influenza virus monitoring in wintering waterbirds in Iran, 2003-2007. Virol J. 2010 Feb 19;7:43. doi: 10.1186/1743-422X-7-43
18. Zhang H, Xu B, Chen Q, Chen J, Chen Z. Characterization of an H10N8 influenza virus isolated from Dongting lake wetland. Virol J. 2011 Jan 27;8:42. doi: 10.1186/1743-422X-8-42.
19. Klingeborn B, Englund L, Rott R, Juntti N, Rockborn G., An avian influenza A virus killing a mammalian species~the mink. Brief report.Arch Virol. 1985;86(3-4):347-51.
20. Berg M, Englund L, Abusugra IA, Klingeborn B, Linne T.Close relationship between mink influenza (H10N4) and concomitantly circulating avian influenza viruses.Arch Virol. 1990;113(1-2):61-71.
21.Gammelin M, Altmuller A, Reinhardt U, Mandler J, Harley VR, Hudson PJ, Fitch WM, Scholtissek C. Phylogenetic analysis of nucleoproteins suggests that human influenza A viruses emerged from a 19th-century avian ancestor. Mol Biol Evol. 1990 Mar;7(2): 194-200.)
22. Englund L. Studies on influenza viruses H10N4 and H10N7 of avian origin in mink. Vet Microbiol. 2000 May 22;74(l-2):101-7.)
23.Kayali G, Ortiz EJ, Chorazy ML, Gray GC. Evidence of previous avian influenza infection among US turkey workers. Zoonoses Public Health. 2010 Jun;57(4):265-72. doi: 10.1111/j.1863-2378.2009.01231.xEpub2009 Apr 8.)
24. Centers for Disease Control and Prevention. Avian infl uenza A virus infection of humans [cited 2011 Sep 23]. http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/avian-fl u-humans.htm)
25. Pan American Health Organization. Avian infl uenza virus A (H10N7) circulating among humans in Egypt. 2004 [cited 2011 Sep23]. http://new.paho.org/hq/dmdocuments/2010/Avian_Infl uenzaEgypt_070503.pdf
26. Hirst GK. Studies on the mechanism of adaptation of influenza virus to mice. J Exp Med. 1947 Oct 31;86(5):357-66.)
27. Brown EG, Bailly JE. Genetic analysis of mouse-adapted influenza A virus identifies roles for the NA, PB1, and PB2 genes in virulence. Virus Res. 1999 May;61(l):63-76.).
28. Francis T. Immunological relationships of strains of filterable virus recovered from cases of human influenza. // Proc. Soc. Exp.Biol. Med. - 1935. - Vol.32. - P. 1172.
29. Ilyushina NA, Khalenkov AM, Seiler JP, Forrest HL, Bovin NV, Marjuki H, Barman S, Webster RG, Webby RJ Adaptation of pandemic H1N1 influenza viruses in mice. J Virol. 2010 Sep;84(17):8607-16.
30. Грипп A/H1N1 как типичная эмерджентная инфекция (вирусологические, клинико-эпидемиологические особенности, вопросы терапии и профилактика): пособие для врачей / под ред. Киселева О.И., Ершова Ф.И., Малого В.П., Сологуб Т.В., Романцова М.Г. - С.-Пб.-Харьк.-Ужгород. -2009. - С. 30-32.
31. Xu L, Bao L, Li F, Lv Q, Ma Y, Zhou J, Xu Y, Deng W, Zhan L, Zhu H, Ma C, Shu Y, Qin C. Adaption of seasonal H1N1 influenza virus in mice. PLoS One. 2011;6(12):e28901. doi: 0.1371/journal.pone.0028901. Epub 2011 Dec 16.)
32. Yamada S, Shinya K, Takada A, Ito T, Suzuki T, Suzuki Y, Le QM, Ebina M, Kasai N, Kida H, Horimoto T, Rivailler P, Chen LM, Donis RO, Kawaoka Y. Adaptation of a duck influenza A virus in quail. J Virol. 2012 Feb;86(3): 1411-20. doi: 10.1128/JVI.06100-ll.Epub2011 Nov 16.
33. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). -2002. -105P
34. Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. -2009. -155. -P. 193-198.
35. Селезнева, А.Ю. Выживаемость вируса гриппа при длительном хранении / А.Ю. Селезнева // Вопросы вирусологии. - 1978. - №6. - С. 738-739.
36. В.А.Рябинин, Е.В.Костина, Г.А.Максакова, А.Н.Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа а с использованием гибридизационного микрочипа//Биоорганическая Химия, 2010, том 36, №6, с. 849-852
37. Михайлович, В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис.... доктор, биол. наук / В. М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с.
38. Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr;27(2): 120-31.
39. Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar;54(3): 129-34.
40. Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep;160(l-2):163-6.
41.Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Realtime RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1(4): 167-75.
42. Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies to different clades of Influenza A H5N1 viruses. J Virol Methods. 2009 May;157(2):161-7.
43. Dhumpa R, Handberg KJ, Jθrgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar;69(3):258-65.
44. Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4-21.
45. He F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30;10:330.
46.Krauss S, Obert CA, Franks J, Walker D, Jones K, Seiler P, Niles L, Pryor SP, Obenauer JC, Naeve CW, Widjaja L, Webby RJ, Webster RG. Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange. PLoS Pathog. 2007 Nov;3(ll):el67.
47. Lee CW, Senne DA, Suarez DL. Development and application of reference antisera against 15 hemagglutinin subtypes of influenzavirus by DNA vaccination of chickens. Clin Vaccine Immunol. 2006 Mar;13(3):395-402.
48. Ward AC. Virulence of influenza A virus for mouse lung. Virus Genes. 1997;14(3):187-94).