ЭЛЕКТИВНО-ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ (ВАРИАНТЫ)
ELECTIVE-DIFFERENTIAL NUTRIENT MEDIUM FOR EXTRACTION OF CHOLERAIC VIBRIOS

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и является элективной питательной средой, которая может быть использована в лабораторной практике для выделения возбудителя холеры.
Известна среда для селективного выделения холерного вибриона TCBS (1) (аналог), включающая, г/л: дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 10,0; тиосульфат натрия - 10,0; цитрат натрия - 10,0; желчь бычья - 8,0; сахароза - 20,0; хлористый натрий - 10,0; цитрат железа - 1,0; бромтимолблау - 0,042; тимолблау - 0,04; агар - 14,0; дистиллированная вода - 1 л при рН 8,6.
Недостатком известной среды является ее высокая себестоимость и низкая селективность при повышенной нагрузке посевного материала.
Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является элективно-дифференциальная питательная среда (СЭДХ) для выделения холерных вибрионов (прототип), разработанная в Ростовском-на-Дону противочумном институте (Гос.регистрация лекарственных средств и изделий медицинского назначения №93/ 270/17, Временная фармакопейная статья ВФС 42-41, ВС - 93 (2)), содержащая, г/л: пептон Д - 6,0; агар микробиологический - 10,0; натрий карбонат - 1,0; натрий хлористый - 8,0; моющее средство «Прогресс» по ТУ 36-10719-77 - 6,0; калий теллуристокислый - 0,03; бромтимоловый синий - 0,04; сахароза - 20,0; дистиллированная вода - 1 л при рН 8,6.
5
Однако промышленное производство питательной основы среды - пептона Д (перевар углеводородокисляющих дрожжей) было прекращено, а препарат «Прогресс» претерпел технологическую модификацию, в результате чего значительно утратил свою активность, и среда в целом снизила свои ингибирующие свойства по отношению к комменсальным микроорганизмам, в частности, к тест-микробам - протею и кишечной палочке (ингибировала рост обоих микробов только в концентрации 10 м.к.). В связи с необходимостью проведения мониторинга за холерными вибрионами потребность в элективной среде, позволяющей выделять от человека и из окружающей среды холерный вибрион, остается высокой.
Технической задачей предлагаемого изобретения является создание новой элективно-дифференциальной среды СЭДХ-М (модернизированной) для выделения холерных вибрионов с повышенной способностью ингибировать сопутствующую постороннюю микрофлору.
Поставленная задача достигается тем, что в известной элективно-дифференциальной питательной среде для выделения холерных вибрионов,
содержащей питательную основу, агар микробиологический, сахарозу, натрий хлористый, натрий карбонат, теллурит калия, бромтимоловый синий и дистиллированную воду, в качестве ингибиторов посторонней микрофлоры в среде дополнительно использован нитрат висмута пятиводный, цитрат натрия, желчь КРС, ЭДТА железо (III) - натриевая соль, бромтимоловый синий введен в большем количестве, а для стимуляции роста холерного вибриона вводят мезоинозит, активированный уголь сульфит натрия и L-цистеин, при этом питательной основой является сухой питательный бульон из панкреатического перевара каспийской кильки при следующем соотношении компонентов, г/л:
Сухой питательный бульон из панкреатического
перевара каспийской кильки
8,0-12,0
Агар микробиологический
8,0-12,0
Сахароза
18,0-22,0
Натрия хлорид
6,0-10,0
Натрия карбонат
0,7-0,9
Натрия цитрат
8,0-12,0
Натрия сульфит
0,2-0,4
Бромтимоловый синий
0,6-1,0
Мезоинозит
0,6-1,0
ЭДТА железо (III) натриевая соль
0,4-0,6
Уголь активированный
1,0-1,4
L-цистеин
0,2-0,4
Калия теллурит
0,001-0,003
Нитрат висмута пятиводный
0,06-0,1
Желчь КРС
2,0-4,0
Дистиллированная вода
1 л
при рН - 8,0.
При этом, в элективно-дифференциальной питательной среде для выделения холерных вибрионов в качестве основы использован сухой питательный бульон из гидролизата рыбо-костной муки при следующем соотношении компонентов, г/л:
Сухой питательный бульон из гидролизата
рыбо-костной муки
8,0-12,0
Агар микробиологический
8,0-12,0
Сахароза
18,0-22,0
Натрия хлорид
6,0-10,0
Натрия карбонат
0,7-0,9
Натрия цитрат
8,0-12,0
Натрия сульфит
0,2-0,4
Бромтимоловый синий
0,6-1,0
Мезоинозит
0,6-1,0
ЭДТА железо (III) натриевая соль
0,4-0,6
Уголь активированный
1,0-1,4
L-цистеин
0,2-0,4
Калия теллурит
0,001-0,003
Нитрат висмута пятиводный
0,06-0,1
Дистиллированная вода
1 л
при рН - 8,0.
Кроме того, в элективно-дифференциальной питательной среде для выделения холерных вибрионов в качестве питательной основы использован комплекс - дрожжевой экстракт и пептон при следующем соотношении компонентов, г/л:
Дрожжевой экстракт
5,0
Пептон
10,0
Агар микробиологический
8,0-12,0
Сахароза
18,0-22,0
Натрия хлорид
6,0-10,0
Натрия карбонат
0,7-0,9
Натрия цитрат
8,0-12,0
Натрия сульфит
0,2-0,4
Бромтимоловый синий
0,6-1,0
Мезоинозит
0,6-1,0
ЭДТА железо (III) натриевая соль
0,4-0,6
Уголь активированный
1,0-1,4
L-цистеин
0,2-0,4
Калия теллурит
0,001-0,003
Нитрат висмута пятиводный
0,06-0,1
Желчь КРС
2,0-4,0
Дистиллированная вода
1 л
при рН - 8,0.
Питательную среду готовят следующим образом.
В качестве питательной основы берут сухой питательный бульон производства НПО «Питательные среды» г.Махачкала (Россия), (см. Меджидов М.М. «Справочник по микробиологическим питательным средам», М. Медицина, 2003 г., стр.24), приготовленный на основе панкреатического перевара каспийской кильки, либо иные подходящие питательные основы, указанные ниже (варианты).
В емкость последовательно вносят: сухой питательный бульон 8,0-12,0; агар микробиологический 8,0-12,0; сахарозу 18,0-22,0; натрия хлорид 6,0-10,0; натрия карбонат 0,7-0,9; натрия цитрат 8,0-12,0; натрия сульфит 0,2-0,4; бромтимоловый синий 0,6-0,1,0; мезоинозит 0,6-1,0; ЭДТА железо (III) натриевая соль 0,4-0,6; уголь активированный 1,0-1,4; L-цистеин 0,2-0,4; калия теллурит 0,001-0,003; висмута нитрат пятиводный 0,06-0,1 и добавляют 1 литр холодной дистиллированной воды. Смесь кипятят в паровом стерилизаторе в течение 20 мин при 100°С при тщательном перемешивании. Затем жидкость остужают и вводят желчь КРС 2,0-4,0. Раствор фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Проверяют реакцию среды и рН доводят до 8,0 с помощью 18% раствора соляной кислоты или 20% раствора гидроокиси натрия.
Готовую среду, имеющую темно-фиолетовый цвет, разливают во флаконы или чашки Петри. Среда в стерилизации не нуждается.
Холерные вибрионы на среде СЭДХ-М через сутки при инкубации при 25-40°С растут в виде гладких, блестящих, плоско-выпуклых, красно-оранжевых колоний, иногда с темно-коричневатым центром и узким ободком прозрачной голубоватой периферии. При погружении и извлечении иглы или петли из колонии образуется короткий тяж (полувязкость). Для холерных колоний не характерны тускло желтоватый цвет, жидковатая консистенция без тяжа. При работе со средой СЭДХ-М для поиска подозрительных колоний и обора иглой материала из них полезен стереомикроскоп с косым верхним освещением (увеличение - 12,5×2).
На средах СЭДХ и TCBS колонии вибрионов гомогенные, выпуклые, гладкие, желтые.
Предлагаемая среда СЭДХ-М подвергнута серии лабораторных и полевых испытаний, в ходе которых проверялись ее ростовые и элективные свойства, а в модельных опытах испытывалась способность к выделению холерных вибрионов из искусственно контаминированных образцов испражнений и проб воды из естественных водоисточников.
Данные о ростовых и элективных свойствах среды СЭДХ-М, приготовленной на питательной основе из панкреатического перевара каспийской кильки с различными концентрациями этого и других ингредиентов, (примеры 1, 2, 3, 4, 5) получены с использованием холерных тест-штаммов: Vibrio cholerae O-1 P-1 (145) классический биовар, V. cholerae O-1 М-878 биовар эль тор и комменсальных штаммов кишечной палочки Escherichia coli 18 и протея Proteus vulgaris HS 19 N 222. Средой сравнения была при этом среда-прототип СЭДХ. Подобным же образом испытывали ростовые и элективные качества среды СЭДХ-М, приготовленной с использованием двух других питательных основ - сухого питательного бульона из гидролизата рыбо-костной муки ГРМ производства ГНЦ г.Оболенск, Россия, и комбинации дрожжевого экстракта с пептоном производства фирмы Мерк, Германия (примеры 6, 7 соответственно).
В модельных опытах в сравнении со средой-прототипом СЭДХ и средой-аналогом TCBS последовательно проверили ростовые свойства среды СЭДХ-М в отношении семи полевых штаммов холерных вибрионов - V.cholerae O139 17918 ctx-; V.cholerae O139 16064 ctx+; V.cholerae O1 26 ctx-; V.cholerae O1 24 ctx-; V.cholerae O1 12278 ctx+; V. cholerae O1 43 ctx-; V.cholerae nоn O1 16147 ctx - из коллекции Ростовского НИПЧИ (пример 8), - изучили вероятность выделения V. cholerae на всех трех средах из образцов испражнений здорового человека (пример 9) и из проб естественной речной воды, не содержавших первоначально вибрионов (пример 10) и искусственно контаминрованных указанными семью полевыми штаммами. В заключение испытаний представлены результаты обследований с помощью среды СЭДХ-М проб воды р.Дон на холерные вибрионы, проведенных в рамках мониторинга на холеру в 2010 г/ (пример 11).
Пример 1
Для приготовления среды СЭДХ-М используют ингредиенты в следующих минимальных концентрациях, г/л: сухой питательный бульон из панкреатического перевара каспийской кильки - 6,0; агар микробиологический - 6,0; сахароза - 16,0; натрия хлорид - 4,0; натрия карбонат - 0,6; натрия цитрат - 6,0; натрия сульфит - 0,1; бромтимоловый синий - 0,5; мезоинозит - 0,4; ЭДТА железо (III) натриевая соль - 0,3; уголь активированный - 0,8; L-цистеин - 0,1; калия теллурит - 0,0005; нитрат висмута пятиводный - 0,04; желчь КРС - 1,0.
Данные реагенты заливают 1,0 л дистиллированной воды, и растворяют при помешивании и кипячении в течение 20-30 мин. Реакцию среды доводят до 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри. Аналогичным образом готовили среду-прототип СЭДХ в оригинальной прописи. Посев двух тест-культур холерного вибриона и двух тест-культур комменсальной микрофлоры и инкубирование чашек с посевами производили согласно общепринятой методике (3, 4).
Результаты, характеризующие ростовые и ингибирующие свойства среды СЭДХ-М, приготовленной согласно данной прописи, и среды-прототипа СЭДХ, отражены в таблице 1.
Из таблицы видно, что обе среды при удовлетворительном ростовом эффекте (из 100 посеянных м.к. холерных вибрионов должно вырастать не менее 30-40 колоний) и отсутствии атипичных по морфологии колоний холерных вибрионов не обеспечивали требуемого уровня ингибирования комменсальной микрофлоры и не подавляли роста тест-штаммов кишечной палочки и протея при высеве последних на чашку в количестве 10/6 м.к.
Пример 2
Для приготовления среды СЭДХ-М использовали вышеозначенные ингредиенты в следующих концентрациях, г/л: сухой питательный бульон из панкреатического перевара каспийской кильки - 8,0; агар микробиологический - 8,0; сахароза - 18,0; натрия хлорид - 6,0; натрия карбонат - 0,7; натрия цитрат - 8,0; натрия сульфит - 0,2; бромтимоловый синий - 0,7; мезоинозит - 0,7; ЭДТА железо (III) натриевая соль - 0,4; уголь активированный - 1,0; L-цистеин - 0,2; калия теллурит - 0,001; нитрат висмута пятиводный - 0,06; желчь КРС - 2,0.
В таблице 2 представлены характеристики ростовых и ингибирующих сред СЭДХ-М, приготовленной по прописи данного примера, и среды прототипа СЭДХ.
Как видно из таблицы 2, среда СЭДХ-М данного состава как по ростовым, так и по элективным (ингибирующим) свойствам соответствовала требуемым нормам. Атипичных колоний холерных вибрионов на среде СЭДХ-М не зарегистрировано. Среда СЭДХ (прототип) по элективным свойствам была малоэффективной.
Пример 3
Для приготовления среды СЭДХ-М использовали вышеозначенные ингредиенты в следующих концентрациях, г/л: сухой питательный бульон из панкреатического перевара каспийской кильки - 10,0; агар микробиологический - 10,0; сахароза - 20,0; натрия хлорид - 8,0; натрия карбонат - 0,8; натрия цитрат - 10,0; натрия сульфит - 0,3; бромтимоловый синий - 0,8; мезоинозит - 0,8; ЭДТА железо (III) натриевая соль - 0,5; уголь активированный - 1,2; L-цистеин - 0,3; калия теллурит - 0,002; нитрат висмута пятиводный - 0,08, желчь КРС - 3,0. Технология приготовления среды такая же как в примере 1, 2.
В таблице 3 представлены данные по ростовым и ингибирующим свойствам сред СЭДХ-М, приготовленной по прописи данного примера, и среды-прототипа СЭДХ.
Как видно из таблицы 3, среда СЭДХ-М данного состава как по ростовым, так и по элективным свойствам соответствовала требуемым нормам. Атипичных колоний холерных вибрионов на среде СЭДХ-М не отмечено. Среда СЭДХ по элективным свойствам оставалась малоэффективной.
Пример 4
Для приготовления среды СЭДХ-М использовали вышеозначенные ингредиенты в следующих концентрациях, г/л: сухой питательный бульон из панкреатического перевара каспийской кильки - 12,0; агар микробиологический - 12,0; сахароза - 22,0; натрия хлорид - 10,0; натрия карбонат - 0,9; натрия цитрат - 12,0; натрия сульфит - 0,4; бромтимоловый синий - 1,0; мезоинозит - 1,0; ЭДТА железо (III) натриевая соль - 0,6; уголь активированный - 1,4; L-цистеин - 0,4; калия теллурит - 0,0025; нитрат висмута пятиводный - 0,1; желчь КРС - 4,0.
Среду готовили как в примерах 1, 2, 3. Аналогичным образом готовили среду-прототип СЭДХ в оригинальной прописи. Посев двух тест-культур холерного вибриона и двух тест-культур комменсальной микрофлоры и инкубирование чашек с посевами производили согласно общепринятой методике.
В таблице 4 показаны ростовые и ингибирующие свойства сред СЭДХ-М, приготовленной по прописи настоящего примера, и среды-прототипа СЭДХ. Как видно из таблицы 4, среда СЭДХ-М данного состава как по ростовым, так и по элективным свойствам соответствовала требуемым нормам. Атипичных колоний холерных вибрионов на среде СЭДХ-М не было. Среда СЭДХ по элективным свойствам оставалась малоэффективной.
Пример 5
Для приготовления среды СЭДХ-М использовали вышеозначенные ингредиенты в следующих максимальных концентрациях, г/л: сухой питательный бульон из панкреатического перевара каспийской кильки - 14,0; агар микробиологический - 14,0; сахароза - 24,0; натрия хлорид - 13,0; натрия карбонат - 1,0; натрия цитрат - 14,0; натрия сульфит - 0,5; бромтимоловый синий - 1,2; мезоинозит - 1,2; ЭДТА железо (III) натриевая соль - 0,7; уголь активированный - 1,6; L-цистеин - 0,5; калия теллурит - 0,003; нитрат висмута пятиводный - 0,12; желчь КРС - 5,0.
Технология приготовления среды как в примерах 1, 2, 3, 4. Аналогичным образом готовили среду-прототип СЭДХ в оригинальной прописи. Посев тест-культур холерного вибриона и тест-культур комменсальной микрофлоры и инкубирование чашек с посевами производили согласно общепринятой методике.
В таблице 5 представлены результаты испытания ростовых и ингибирующих свойств среды СЭДХ-М, приготовленной по прописи настоящего примера, и среды-прототипа СЭДХ. Как видно из таблицы 5, среда СЭДХ-М данного состава по ростовым и элективным свойствам соответствовала требуемым нормам. Атипичных колоний холерных вибрионов на среде СЭДХ-М не было. Среда СЭДХ по элективным свойствам оставалась малоэффективной.
Пример 6
Для приготовления среды СЭДХ-М в данном случае вместо сухого питательного бульона на основе панкреатического перевара каспийской кильки был взят сухой питательный бульон из гидролизата рыбо-костной муки (см.каталог продукции «Диагностические препараты», Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ, 2012 г.) при сохранении всех остальных ингредиентов в концентрациях, соответствующих примеру 3 (средние концентрации),г/л: сухой питательный бульон из гидролизата рыбо-костной муки - 10,0; агар микробиологический - 10,0; сахароза - 20,0; натрия хлорид - 8,0; натрия карбонат - 0,8; натрия цитрат - 10,0; натрия сульфит - 0,3; бромтимоловый синий - 0,8; мезоинозит - 0,8; ЭДТА железо (III) натриевая соль - 0,5; уголь активированный - 1,2; L-цистеин - 0,3; калия теллурит - 0,002; нитрат висмута пятиводный - 0,08, желчь КРС - 3,0.
Данные реагенты заливали 1,0 л дистиллированной воды, растворяли при помешивании и кипятили в течение 20-30 мин. Реакцию среды доводили до 8,0. Готовую среду разливали в чашки Петри. Аналогичным образом готовили среду-прототип СЭДХ в оригинальной прописи. Посев двух тест-культур холерного вибриона и двух тест-культур комменсальной микрофлоры и инкубирование чашек с посевами производили согласно общепринятой методике.
В таблице 6 представлены данные по ростовым и ингибирующим свойствам среды СЭДХ-М.
Как видно из таблицы 6, ростовые и элективные свойства среды СЭДХ-М целиком сохранялись и соответствовали нормативам. Среда СЭДХ по элективным свойствам оставалась неудовлетворительной. Таким образом, обе питательных основы обеспечивают хорошее прорастание холерного вибриона и достаточное ингибирование тест-микрофлоры.
Пример 7
Для приготовления среды СЭДХ-М в данном случае использована та же пропись, что и в примере 6, за исключением того, что в качестве питательной основы здесь использована комбинация двух компонентов среды-аналога - дрожжевого экстракта и пептона (см. Microbiology Manual, Merek K GaA, Darmstadt, Deutschland,1996 s.250). Состав среды, г/л: дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 10,0; агар микробиологический - 10,0; сахароза - 20,0; натрия хлорид - 8,0; натрия карбонат - 0,8; натрия цитрат - 10,0; натрия сульфит - 0,3; бромтимоловый синий - 0,8; мезоинозит - 0,8; ЭДТА железо (III) натриевая соль - 0,5; уголь активированный - 1,2; L-цистеин - 0,3; калия теллурит - 0,002; нитрат висмута пятиводный - 0,08; желчь КРС - 3,0. Технология приготовления сред и испытаний та же, что и в предыдущих примерах. Результаты испытаний представлены в таблице 7.
Как видно из таблицы 7, ростовые и элективные свойства среды СЭДХ-М в данном случае соответствовали современным требованиям, в то время как среда СЭДХ по своим ингибирующим свойствам оставалась неудовлетворительной. Результаты испытаний подтверждают пригодность дрожжевого экстракта и пептона в качестве питательной основы для искомой среды СЭДХ-М.
Пример 8
2
Ростовые свойства среды СЭДХ-М, среды-прототипа СЭДХ и среды-аналога TCBS в отношении семи полевых штаммов холерных вибрионов. В качестве основного варианта испытуемой среды брали среду СЭДХ-М, приготовленную согласно прописи примера 3 с использованием в качестве питательной основы сухого питательного бульона на переваре каспийской кильки. Среду СЭДХ готовили по оригинальной прописи, среду TCBS готовили согласно рекомендациям производителя (1). Культуры холерных вибрионов выращивали в течение суток на общепринятом щелочном агаре (рН-7,6) и засевали на агаровые пластинки испытуемых сред по 10 м.к. Учет посевов производили через 1 сутки инкубации. Результаты опыта представлены в таблице 8. Как видно из таблицы 8, рост всех семи полевых штаммов холерных вибрионов на всех трех средах был удовлетворительным.
Пример 9
2
Представлены данные опыта по моделированию выделения холерных вибрионов из испражнений человека. Испражнения, взятые у здорового человека, с помощью среды TCBS исследовали на отсутствие вибрионной флоры, в том числе холерных вибрионов. Фецес искусственно контаминировали всеми семью полевыми штаммами холерных вибрионов с расчетом получить концентрацию возбудителя 10 м.к. в объеме 0,2 мл жидкости, которые составляли посевную дозу. Посевы совершали на три среды: СЭДХ-М, TCBS и СЭДХ. Среду СЭДХ-М готовили с использованием сухого питательного бульона на переваре каспийской кильки, концентрации компонентов среды соответствовали прописи примера 3. Среды СЭДХ и TCBS приготовили как указано в предыдущем примере. Среды СЭДХ и TCBS с посевами согласно инструкциям по эксплуатации этих сред инкубировали при 37°С, среду СЭДХ-М - при температуре 30°С, что оптимально для подавления кишечной микрофлоры.
В таблице 9 отражены результаты, демонстрирующие эффективность выделения холерных вибрионов из искусственно контаминированных образцов испражнений здорового человека.
Как видно из таблицы 9, среды СЭДХ-М и TCBS позволили выделить возбудитель холеры всех семи полевых штаммов при посеве весьма больших количеств нативных испражнений (0,2 мл). На среде СЭДХ-М во всех случаях выросли холерные колонии без признаков роста кишечной микрофлоры. Среда TCBS по сравнению со средой СЭДХ-М в этих условиях отличалась сниженной ростовой и элективной способностью, что выражалось в меньшем количестве колоний холерных вибрионов, выраставших на чашках, и наличием некоторого пророста кишечной микрофлоры. Среда СЭДХ оказалась абсолютно неэлективной. Таким образом, предлагаемая нами среда по изучаемому эффекту значительно превосходит среду-прототип и отличается большей элективностью, чем среда-аналог (TCBS).
Пример 10
2
Представлены данные по моделированию выделения холерных вибрионов из воды естественного водоема. Образцы речной воды взяты в весенний период и с помощью среды TCBS проверены на отсутствие в ней вибриомикрофлоры. Холерные вибрионы (семь полевых штаммов из коллекции Ростовского НИПЧИ) были внесены в воду с расчетом получить концентрацию возбудителя 10 м.к. в объеме 0,2 мл, составлявшие посевную дозу. Посевы совершали на три среды: СЭДХ-М, TCBS и СЭДХ. Среда СЭДХ-М приготовлена по прописи примера 3 с использованием сухого питательного бульона из перевара каспийской кильки. Среда СЭДХ и TCBS - по оригинальной прописи. Посевы на среде СЭДХ и TCBS инкубировали, как это общепринято, при 37°С в течение 1 суток, на среде СЭДХ-М - при температуре 40°С, что по нашему опыту оптимально для подавления водной микрофлоры.
Результаты, демонстрирующие эффект выделения холерных вибрионов из контаминированной воды, представлены в таблице 10.
Как видно из таблицы 10, обе среды СЭДХ-М и TCBS позволяли выделить холерные вибрионы из исследуемых образцов, причем, последняя была несколько менее эффективной. Среда СЭДХ была слабоингибирующей и не позволяла добиться необходимого результата.
Пример 11
Представлены данные по полевому испытанию среды СЭДХ-М. Всего исследовано 80 проб естественной речной воды (р.Дон), период обследования - май-август 2010 г. Посев осуществляли по 0,5 мл нативной речной воды, доставленной в лабораторию, чашки подсушивали до полного подсыхания посева и инкубировали при 40°С в течение 1 суток, после чего их просматривали в стереомикроскопе с косым освещением. Красно-оранжевые колонии, выросшие на среде СЭДХ-М, агглютинировали O-1 холерной сывороткой в разведении 1:100. Колонии, дававшие позитивную агглютинацию при отрицательном контроле в 0,9% растворе NaCl, отбирали для дальнейшего изучения и идентификации культур согласно инструктивным документам по общепринятой схеме (5). В результате обследований выделено 6 атоксигенных штаммов V.cholerae, свойства которых представлены в таблице 11. Представленные культуры обладают типичными свойствами вибрионов и отнесены к виду V.cholerae (атоксигенные, неэпидемические штаммы). Два штамма проявляют признаки перехода в шероховатую форму. Таким образом, получены прямые доказательства пригодности среды СЭДХ-М для выделения холерных вибрионов из объектов внешней среды.
Таким образом можно сделать вывод, что результаты проведенных комплексных испытаний новой элективно-дифференциальной среды для выделения холерных вибрионов, модифицированной, (СЭДХ-М) показали, что среда-прототип СЭДХ при равенстве ростовых качеств значительно уступает искомой среде по ингибирующей постороннюю микрофлору активности. Это нашло выражение в значительно большей эффективности среды СЭДХ-М при выделении холерных вибрионов из искусственно контаминированных образцов испражнений человека и проб речной воды. Полученные результаты свидетельствовали также, что среда СЭДХ-М не уступала международноизвестной селективной среде для выделения холерных вибрионов TCBS в модельных опытах с искусственно контаминированными образцами испражнений и проб воды. Среда СЭДХ-М может изготавливаться в трех вариантах с различными питательными основами: сухим питательным бульоном из панкреатического перевара каспийской кильки, сухого питательного бульона из гидролизата рыбо-костной муки и комплекса дрожжевой экстракт-пептон. Среда СЭДХ-М может быть использована для полевого выделения холерных вибрионов как из испражнений человека, так и из естественной воды при прямом посеве материала и, естественно, при посеве после обогащения в пептонной воде.
Предлагаемое изобретение создано за счет новой композиции среды, включающей активные ингибиторы комменсальной кишечной и водной микрофлоры, а именно, цитрата натрия, нитрата висмута пятиводного, ЭДТА железо (III) натриевой соли, желчи КРС, теллурита калия, бромтимолового синего в высокой концентрации при одновременной стимуляции роста холерного вибриона в условиях повышенного давления вышеуказанных ингибиторов с помощью мезоинозита, сульфита натрия, L-цистеина и активированного угля, что в итоге создает хорошие ростовые и ингибирующие свойства у среды.
При этом среда создает четкий дифференцирующий цветовой эффект: холерные вибрионы образуют на темно-фиолетовом фоне красно-оранжевые колонии, легко отличимые по морфологии и расцветке от немногих прорастающих колоний других видов. Важным преимуществом среды СЭДХ-М является взаимозаменяемость трех ее различных питательных основ: сухого питательного бульона из перевара каспийской кильки (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), сухого питательного бульона из гидролизата рыбо-костной муки (ГНЦ ПМБ г.Оболенск) и комплекса дрожжевой экстракт-пептон, производимыми рядом зарубежных фирм, что создает возможность экономического маневра при изготовлении среды.
Источники информации
1. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 17 ed. Washington, D.C. American Public Health Association, 1989.
2. Временная фармакопейная статья ВФС. 42-411 ВС-93. Питательная среда для выделения холерного вибриона элективно-дифференциальная сухая (СЭДХ). Утв. Зам.министра МЗ РФ 19.07.1993 г. Гос. Регистр лекарств. Средств и изделий мед. назначения - №93/270/17.
3. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза. МУ 3.3.2.2124-06, М., - 2006.
4. Методы контроля бактериологических питательных сред. МУК 4.2.2316-08, М, - 2008.
5. Методические указания «Лабораторная диагностика холеры»: МУ 4.2.2218-07, М., - 2007.
Таблица 1.
Тест-штамм
Ростовые свойства сред - количество колоний холерных вибрионов, выросших при посеве:
Ингибирующие свойства сред - остаточный пророст колоний комменсалов при посеве:
10 м.к.
100 м.к.
10<sup>3</sup> м.к.
10<sup>4</sup> м.к.
10<sup>5</sup> м.к.
10<sup>6</sup> м.к.
1
2
3
4
5
6
7
Среда СЭДХ-М
V.cholerae O1 Р-1
0±0,6
9±1,2
V.cholerae O1 M-878
0±0,8
16±2
E.coli 18
P.vulgaris HX-19
0
0
120
380
№222
0
0
250
750
Среда-прототип
V.cholerae O1 P-1
0
24±1
V.cholerae O1 M-878
5±1
39±4
E.coli 18
0
0
0
13±1
P.vulgaris HX-19
0
20±7
160±30
>200
№222
Таблица 2.
Тест-штамм
Ростовые свойства сред - количество колоний холерных вибрионов, выросших при посеве:
Ингибирующие свойства сред - остаточный пророст колоний комменсалов при посеве:
10 м.к.
100 м.к.
10<sup>3</sup> м.к.
10<sup>4 </sup>м.к.
10<sup>5</sup> м.к.
10<sup>6</sup> м.к.
1
2
3
4
5
6
7
Среда СЭДХ-М
V.cholerae O1 P-l
3±1
32±3
V.cholerae O1 M-878
3±1
38±2
E.coli 18
0
0
0
0
P.vulgaris HX-19
0
0
0
0
№222
Среда-прототип
V.cholerae O1 P-l
0
24±1
V.cholerae O1 M-878
5±1
39±4
E.coli 18
0
0
0
33±1
P.vulgaris HX-19
0
20±7
160±30
>200
№222
Таблица 3.
Тест-штамм
Ростовые свойства сред - количество колоний холерных вибрионов, выросших при посеве:
Ингибирующие свойства сред - остаточный пророст колоний комменсалов при посеве:
10 м.к.
100 м.к.
10<sup>3</sup> м.к.
10<sup>4</sup> м.к.
10<sup>5</sup> м.к.
10<sup>6</sup> м.к.
1
2
3
4
5
6
7
Среда СЭДХ-М
V.cholerae O1 Р-1
4±1
35±5
V.cholerae O1 M-878
3±1
36±3
E.coli 18
0
0
0
0
P.vulgaris HX-19
0
0
0
0
№222
Среда-прототип
V.cholerae O1 P-1
2±1
27±2
V.cholerae O1 M-878
5±1
30±5
E.coli 18
0
0
40±6
84±10
P.vulgaris HX-19
0
78±12
230±30
>300
№222
Таблица 4.
Тест-штамм
Ростовые свойства сред - количество колоний холерных вибрионов, выросших при посеве:
Ингибирующие свойства сред - остаточный пророст колоний комменсалов при посеве:
10 м.к.
100 м.к.
10<sup>3</sup> м.к.
10<sup>4</sup> м.к.
10<sup>5</sup> м.к.
10<sup>6</sup> м.к.
1
2
3
4
5
6
7
Среда СЭДХ-М
V.cholerae O1 Р-1
2±0,5
37±5
V.cholerae O1 M-878
3±0,6
31±4
E.coli 18
0
0
0
0
P.vulgaris HX-19
0
0
0
0
№222
Среда-прототип
V.cholerae O1 P-1
2±0,5
19±1
V.cholerae O1 M-878
2±0,5
28±6
E.coli 18
0
0
0
13±1
P.vulgaris HX-19
0
34±6
110±28
160±26
№222
Таблица 5.
Тест-штамм
Ростовые свойства сред - количество колоний холерных вибрионов, выросших при посеве:
Ингибирующие свойства сред - остаточный пророст колоний комменсалов при посеве:
10 м.к.
100 м.к.
10<sup>3</sup> м.к.
10<sup>4</sup> м.к.
10<sup>5</sup> м.к.
10<sup>6</sup> м.к.
1
2
3
4
5
6
7
Среда СЭДХ-М
V.cholerae O1 Р-1
0
4±1
V.cholerae O1 M-878
0
6±1
E.coli 18
0
0
0
0
P.vulgaris HX-19
0
0
0
0
№222
Среда-прототип
V.cholerae O1 P-1
2±0,5
19±1
V.cholerae O1 M-878
2±0,5
28±6
E.coli 18
0
0
0
13±1
P.vulgaris HX-19
0
34±6
110±28
160±26
№222
Таблица 6.
Тест-штамм
Ростовые свойства сред - количество колоний холерных вибрионов, выросших при посеве:
Ингибирующие свойства сред - остаточный пророст колоний комменсалов при посеве:
10 м.к.
100 м.к.
10<sup>3</sup> м.к.
10<sup>4</sup> м.к.
10<sup>5</sup> м.к.
10<sup>6</sup> м.к.
1
2
3
4
5
6
7
Среда СЭДХ-М
V.cholerae O1 Р-1
5±1
34±5
V.cholerae O1 M-878
4±1
35±3
Е.coli 18
0
0
0
0
P.vulgaris HX-19
0
0
0
0
№222
Среда-прототип
V.cholerae O1 P-1
2±1
27±2
V.cholerae O1 M-878
5±1
30±5
E.coli 18
0
0
40±6
84±10
P.vulgaris HX-19
0
78±12
230±30
>300
№222
Таблица 7.
Тест-штамм
Ростовые свойства сред - количество колоний холерных вибрионов, выросших при посеве:
Ингибирующие свойства сред - остаточный пророст колоний комменсалов при посеве:
10 м.к.
100 м.к.
10<sup>3</sup> м.к.
10<sup>4</sup> м.к.
10<sup>5</sup> м.к.
10<sup>6</sup> м.к.
1
2
3
4
5
6
7
Среда СЭДХ-М
V.cholerae O1 Р-1
6±1
37±5
V.cholerae O1 M-878
5±1
38±3
Е.coli 18
0
0
0
0
P.vulgaris HX-19
0
0
0
0
№222
Среда-прототип
V.cholerae O1 P-1
2±1
24±2
V.cholerae O1 M-878
5±1
31±5
E.coli 18
0
0
40±6
84±10
P.vulgaris HX-19
0
78±12
230±30
>300
№222
Таблица 8.
№ п/п
Наименование штамма холерных вибрионов
Количество колоний, выросших из 10<sup>2</sup> м.к. инокулума на средах:
СЭДХ-М
СЭДХ
TCBS
1
2
3
4
5
1.
V.cholerae O1 39 17918 ctx-
42±1
44±1
30±2
2.
V.cholerae O1 39 16064 ctx+
39±2
41±3
34±1
3.
V.cholerae O1 26 ctx-
40±2
42±1
26±3
4.
V.cholerae O1 24 ctx-
35±1
41±2
27±2
5.
V.cholerae O1 12278 ctx+
40±4
51±1
26±3
6.
V.cholerae O1 43 ctx-
34±1
45±2
23±2
7.
V.cholerae non O1 16147 ctx-
45±2
47±1
24±1
Таблица 9.
№ п/п
Наименование штамма холерных вибрионов
Рост микрофлоры на средах при посеве 0,2 мл испражнений, контаминированных холерными вибрионами (10<sup>2</sup> м.к.)
СЭДХ-М
СЭДХ
TCBS
1
2
3
4
5
1.
V.cholerae O1 39 17918 ctx-
40±1 колоний холерных вибрионов
Рост кишечной микрофлоры
13±2 колоний холерных вибрионов
2.
V.cholerae O1 39 16064 ctx+
35±1 колоний холерных вибрионов
Рост кишечной микрофлоры
Рост кишечной микрофлоры 14±1 колоний холерных вибрионов
3.
V.cholerae O1 26 ctx-
30±2 колоний холерных вибрионов
Рост кишечной микрофлоры
16±1 колоний холерных вибрионов
4.
V.cholerae O1 24 ctx-
35±1 колоний холерных вибрионов
Рост кишечной микрофлоры
Рост кишечной микрофлоры 17±2 колоний холерных вибрионов
5.
V.cholerae O1 12278 ctx+
40±1 колоний холерных вибрионов
Рост кишечной микрофлоры
16±32 колоний холерных вибрионов
6.
V.cholerae O1 43 ctx-
24±1 колоний холерных вибрионов
Рост кишечной микрофлоры
Рост кишечной микрофлоры 13±1 колоний холерных вибрионов
7.
V.cholerae non O1 16147 ctx-
35±2 колоний вибрионов
Рост кишечной микрофлоры
Рост кишечной микрофлоры 14±1 колоний вибрионов
Таблица 10.
№ п/п
Наименование штамма холерных вибрионов
Рост микрофлоры на средах при посеве 0,2 мл речной воды, контаминированной холерными вибрионами (10<sup>2</sup> м.к.)
СЭДХ-М
СЭДХ
TCBS
1
2
3
4
5
1.
V.cholerae O139 17918 ctx-
36±1 колоний холерных вибрионов
Рост речной микрофлоры
Рост речной микрофлоры 14±2 колоний холерных вибрионов
2.
V.cholerae O139 16064 ctx+
Рост речной микрофлоры 30±1 колоний холерных вибрионов
Рост речной микрофлоры
Рост речной микрофлоры 10±1 колоний холерных вибрионов
3.
V.cholerae O1 26 ctx-
30±2 колоний холерных вибрионов
Рост речной микрофлоры
Рост речной микрофлоры 15±1 колоний холерных вибрионов
4.
V.cholerae O1 24 ctx-
Рост речной микрофлоры 35±1 колоний холерных вибрионов
Рост речной микрофлоры
Рост речной микрофлоры 19±2 колоний холерных вибрионов
5.
V.cholerae O1 12278 ctx+
41±1 колоний холерных вибрионов
Рост речной микрофлоры
15±2 колоний холерных вибрионов
6.
V.cholerae O1 43 ctx-
25±1 колоний холерных вибрионов
Рост речной микрофлоры
Рост речной микрофлоры 18±1 колоний холерных вибрионов
7.
V.cholerae non O1 16147 ctx-
25±2 колоний вибрионов
Рост речной микрофлоры
Рост речной микрофлоры 19±1 колоний вибрионов
Таблица 11.
№ п/п
Рабочий номер штамма
Дата взятия пробы воды
Свойства культур
Морфология колоний
Агглютинабельность
ПЦР
Люм проба с O1xc
Наличие токсина (генотип)
1
2
3
4
5
6
7
8
1
65-119-8
27.07.10
S
O1 xc 1:800
+
+
ctx-
2
66-125-3
27.07.10
S
O1 xc 1:400
+
+
3
82-5-52
06.07.10
S
O1 xc 1:400
+
+
ctx-
4
151-69-15
16.08.10
RS
O1 xc 1:800 RO xc 1:100
+
+
ctx-
5
155-65-27
16.08.10
S
O1 xc 1:800
+
+
ctx-
6
155-65-29
16.07.10
RS
O1 xc 1:800 RO xc 1:100
+
+
ctx-