СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ MYCOBACTERIA
METHOD OF BINDING MYCOBACTERIA

Настоящее изобретение относится к способам связывания микроорганизмов из суспензии, а также к их последующему детектированию и/или идентификации.
Предшествующий уровень
Во множестве применений требуется выделение микроорганизма из суспензии в качестве первой стадии, позволяющей специалисту проводить дальнейшую работу с микроорганизмом, например, концентрировать микроорганизм в небольшом объеме без примесей и загрязнений, например, для диагностических целей. Микроорганизмы изначально могут присутствовать в материале образца с большим объемом, таком как мокрота, кровь, диспергированная пища или питьевая вода. Концентрированно в небольшом объеме без загрязнителей образца оптимизирует чувствительность и удаляет ингибиторы в диагностических процедурах, таких как микроскопия, иммуноанализ или процессы амплификации нуклеиновых кислот, такие как ПЦР. Существующие способы концентрирования микроорганизмов включают использование парамагнитных микросфер, покрытых специфичных к микроорганизму антителами; микросферы могут использоваться для специфического связывания микроорганизмов из образца, что позволяет проводить их последующее детектирование различными способами (US 7166425).
Однако в некоторых применениях условия связывания могут не подходить для системы на основе антител: например, в выделении микобактерий из мокроты, которая была разбавлена гидроксидом натрия и которая остается при высоком значении pH, при котором антитела будут инактивироваться. В этих и других обстоятельствах жестких условий использование связывания антителами невозможно. Кроме того, в других применениях может потребоваться выделение любого микроорганизма, присутствующего в образце. Например, при сепсисе для проведения диагностики важно выделение любых бактериальных или грибных клеток, которые могут присутствовать в крови. Аналогично, при тестировании препаратов крови, например при скрининге тромбоцитов, важно знать о малейшем загрязнении препаратов крови (в данном случае тромбоцитов) микроорганизмами. При таких обстоятельствах было бы тяжело работать со способом, в основе которого лежит применение антител, поскольку антитела обладают специфичностью в отношении организма или для вида.
Существуют описания способов, основанных не на антителах. В JP 2001112497 описано удаление Mycobacteria из жидкости, обработанной щелочью, путем осаждения в ней фосфата кальция, причем в осадок преимущественно выпадали бактерии, которые там присутствовали. В WO 2009/086343 описано применение поверхности, покрытой углеводами, вместе с биотин-связывающим белком и амфифильным гликозидом стероида или тритерпеном для связывания микроорганизмов. В WO 28072242A2 в качестве связывающей поверхности описана модифицированная аминокислотами полимерная матрица, а в WO 29046191A2 описано применение частиц диатомитовой земли с различными металлическими или неорганическими поверхностями для достижения такого же результата. Эти способы являются более универсальными, чем способы на основе антител, но фактически не являются универсальными для некоторых видов бактерий, которые связываются лучше, чем другие, а некоторые виды или штаммы бактерий могут не связываться совсем. Кроме того, было продемонстрировано, что с помощью этих способов связываются грибы.
Эти проблемы являются следствием использования свойства поверхности связывающей матрицы, которое, безусловно, ограничено по своей природе, для связывания бактерий, которые могут иметь различные структуры внешней клеточной стенки. В данном изобретении нами описан новый способ, который менее зависим от природы поверхности матрицы и, как было показано, работает с грамположительными и грамотрицательными бактериями, а также с грибами в дополнение к Mycobacateria, которые обладают уникальной гидрофобной клеточной стенкой.
Краткое описание изобретения
Нами обнаружена возможность применения водорастворимого полимера для связывания суспендированного микроорганизма на твердой поверхности. Способ также работает при связывании на твердой поверхности седиментируемых и неседиментируемых фрагментов микроорганизмов. Хотя в течение некоторого периода времени было известно, что белки в растворе можно осаждать добавлением водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (PEG) или декстран, без использования твердой поверхности, эти сведения в отношении микроорганизмов и их фрагментов оказались неожиданными.
В WO 95/32304 используется водная двухфазная полимерная система разделения для селективного повышения количества микроорганизмов-мишеней по отношению к фоновой флоре, но не предполагается связывание на твердой поверхности.
Соответственно, в настоящем изобретении предлагается способ связывания на твердой поверхности микроорганизмов и/или фрагментов микроорганизмов, присутствующих в водной жидкости, который включает добавление к указанной жидкости достаточного количества водорастворимого полимера в присутствии указанной твердой поверхности для вытеснения указанных микроорганизмов и/или фрагментов из жидкости на твердую поверхность.
Иначе говоря, в способе вместе предлагаются твердая поверхность и водная жидкость, содержащая микроорганизмы и/или их фрагменты, и водорастворимый полимер для вытеснения указанных микроорганизмов и/или их фрагментов из жидкости на указанную твердую поверхность.
Фрагменты микроорганизмов, которые могут связываться таким образом, включают осаждаемые фрагменты, которые для депонирования могли бы центрифугироваться из жидкости при 4000×g в течение 20 мин, то есть при скорости, которая обычно используется для осаждения бактерий. Удивительно, но способ также работает для связывания фрагментов, которые могут включать растворимые белки или другие растворимые клеточные компоненты, которые не могут депонироваться в таких условиях центрифугирования и которые могут быть обозначены как не осаждаемые.
Концентрация добавляемого водорастворимого полимера в водной жидкости может свободно регулироваться согласно природе полимера для достижения искомого вытеснения микроорганизма и/или его фрагмента из суспензии или раствора в жидкость, депонированную на твердой поверхности. Необязательно, концентрация полимера составляет от 2 до 30% мас./об., предпочтительно, 5-20% мас./об., более предпочтительно, 7-15% мас./об., наиболее предпочтительно, около 10% мас./об. Эти концентрации особенно подходят для использования с PEG или с поливинилпирролидоном (PVP) в качестве полимера,
Предпочтительно, если водорастворимый полимер представляет собой неионный гидрофильный полимер. Например, он может представлять собой декстран, PVP или PEG. PEG может быть полидисперсным по молекулярной массе или монодисперсным, может быть разветвленным или может представлять собой линейную цепь и может иметь структуру типа звезды.
Удобно, если водорастворимый полимер имеет среднемассовую молекулярную массу от 200 до 100000. Например, он может иметь молекулярную массу от 1000 до 20000, более предпочтительно, 5000-13000, например около 8000. Эти молекулярные массы особенно подходят в случае PEG или PVP.
Связывание микроорганизма с твердой поверхности может усиливаться при использовании условий с высокой ионной силой. Удобно, если ионная сила водной жидкости растет при добавлении к ней водорастворимой неорганической соли от 150 мМ до 6 М, более предпочтительно, от 0,25 до 0,75 М, например, 0,5 М.
Для достижения высокой ионной силы к раствору может добавляться множество различных солей, например сульфат аммония, хлорид аммония, сульфат магния, хлорид магния, но хлорид натрия является предпочтительным.
Связывание с поверхностью может осуществляться при условиях высокого или низкого pH в интервале 1-14. В случае, когда микроорганизмом является Mycobacteria, высокое значение рН, например от 9 до 14, может быть предпочтительным для уничтожения других типов бактерий, которые могут присутствовать, или для уменьшения их способности к размножению.
Кроме того, связывание с поверхностью может осуществляться в присутствии детергента, который может включать ионные (такие как додецилсульфат натрия) или неионные детергенты (такие как Tween 20 и Triton X100).
Предпочтительно, если твердая поверхность имеет весьма характерную площадь поверхности и, следовательно, в качестве предпочтительной твердой поверхности предлагаются микросферы. Термин «микросферы» включает, в частности, нерастворимые частицы, которые имеют сферическую или неправильную форму и размер в интервале от 0,1 микрона до 5 мм.
Способ согласно изобретению может дополнительно включать отделение указанной твердой поверхности от указанной жидкости.
Существуют хорошо известные физические способы универсального концентрирования микроорганизмов, например: фильтрация образца, где клетки связываются либо поверхностью размерно-эксклюзионного фильтра, либо в структуре пористого фильтра; или центрифугирование, при котором клетки осаждаются. Хотя эти способы применимы для получения концентрированной суспензии микроорганизма без загрязнителей образца, они также имеют недостатки. В способе фильтрации просто связывать цельные организмы определенного размера, но фрагменты организмов неопределенного размера связывать таким образом труднее (это является типичным недостатком фильтрации). Кроме того, возможны трудности извлечения микроорганизмов после связывания фильтром, а при извлечении элюцией или промывкой в противотоке микроорганизмы могут оказаться в относительно большом объеме жидкости, что невыгодно. С другой стороны центрифугирование может использоваться для концентрирования цельных организмов, но фрагменты организмов могут не осаждаться при используемых скоростях и времени. Кроме того, центрифугирование требует прибора, а также данная стадия не может быть легко включена в автоматизированную процедуру для концентрирования и детектирования микроорганизмов. Кроме того, после центрифугирования бывает трудно надежно ресуспендировать в искомом небольшом объеме седиментированный осадок, содержащий микроорганизмы, и часто требуются более крупные объемы для гарантии полного диспергирования осадка в пробирке.
Соответственно, предпочтительно, чтобы характер твердой поверхности, на которую принимаются микроорганизмы и/или фрагменты, был таковым, чтобы твердая поверхность могла отделяться от суспендируемой жидкости без использования фильтрации или центрифугирования. Таким образом, предпочтительно, чтобы микросферы притягивались к магниту для разделения или были достаточно плотными, чтобы они могли разделяться путем осаждения, даже если бы полимер-содержащая жидкость является достаточно вязкой. Таким образом, предпочтительно, если указанные микросферы являются парамагнитными или имеют плотность в достаточной степени выше, чем у жидкости, чтобы они могли осаждаться без центрифугирования, например, выше 2 г/мл, более предпочтительно, выше 3 г/мл. В ином случае, они могут иметь плотность в достаточной степени ниже, чем у жидкости, так чтобы они могли отделяться, плавая на жидкости, например, полые микросферы, которые могут быть сделаны из стекла. Такие всплывающие микросферы могут иметь плотность ниже 0,8 г/мл, например, от 0,4 до 0,7 мг/мл.
Материалами микросфер подходящей плотности или материалами сердцевины микросфер являются оксид алюминия, карбид кремния, нитрид кремния, карбид титана, оксид железа (такой как магнетит) и стекло.
Твердая поверхность может быть из полимера, содержащего положительно заряженные или отрицательно заряженные группы. Примерами подходящих поверхностных групп являются аминогруппа, группы четвертичного аммония, карбоновой кислоты, сульфокислоты или сульфата. Подходящие материалы включают декстран сульфат и поли(диаллилдиметиламмоний хлорид) (pDADMAC).
Микросфера может быть вся из одного материала, а может иметь сердцевину, имеющую поверхностное покрытие. Мы обнаружили, что использование частиц, поверхность которых представляет собой магнетит, частиц из магнетита без покрытия, имеет особые преимущества. Такие частицы являются ферромагнитными (в широком смысле, включая ферримагнетизм) и поэтому они легко отделяются от жидкой среды, а микроорганизмы и/или их фрагменты легко прилипают с поверхности таких частиц в присутствии жидкой среды растворимых полимеров. Кроме того, удаление жидкой среды, содержащей такие полимеры, и ее вытеснение жидкостью, в которой такие полимеры не присутствуют, обеспечивают легкий способ удаления связанных материалов с твердой поверхности.
Способ по изобретению может дополнительно включать элюцию указанных микроорганизмов и/или фрагментов с указанной твердой поверхности после их отделения от указанной жидкости. Элюция может осуществляться в широком спектре условий, например, в буферах с концентрацией соли в интервале от 150 мМ до 6 М. Кроме того, для помощи элюции с поверхности микросфер могут быть включены неионные, ионные или цвиттерионные детергенты, такие как Tween 20, Triton Х-100, CTAB, саркозил или SDS.
Для осуществления концентрирования микроорганизмов и/или фрагментов предпочтительно, чтобы микроорганизмы и/или фрагменты элюировали с твердой поверхности в объеме жидкости, который меньше чем объем жидкости, в котором микроорганизмы и/или фрагменты были исходно суспендированы, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 4 раза.
Способ по изобретению может дополнительно включать детектирование микроорганизмов и/или фрагментов, которые связываются на твердой поверхности. Детекция может осуществляться после элюции с твердой поверхности или в то время, пока микроорганизмы и/или фрагменты остаются на твердой поверхности. Детекция может осуществляться как после удаления водной жидкости с твердой поверхности, так и в тот момент, когда она еще остается. Например, после связывания микроорганизмов и/или их фрагментов на микросферах, может быть добавлен меченый связывающий агент, такой как антитело, специфичное к микроорганизмам и/или их фрагментам, или аураминовый краситель, и жидкость может пропускаться через клеточный сортер для детекции меченых микросфер.
Микросферы или другие формы твердой поверхности, несущие микроорганизмы и/или фрагменты, могут быть окрашены красителем для микроорганизмов, или сразу или после культивирования организмов для повышения их количества. Например, Mycobacteria могут быть обнаружены при применении красителя для прокрашивания кислотоустойчивых бактерий для их визуализации. Могут использоваться и другие формы детекции, такие как методы амплификации нуклеиновых кислот (например, ПЦР), методы детекции метаболитов, методы детекции на основе антител, такие как тИФА, самих микроорганизмов или их клеточных компонентов. Один из подходящих методов тИФА для детекции Mycobacteria и/или их фрагментов, например, раскрыт в GB 1004710.8. Методы связывания, описанные в данном документе, могут использоваться в качестве модификаций способов, описанных в GB 1004709.0. Используемые методы детекции могут быть того типа, который требует присутствия живых микроорганизмов, таких как культивирование.
Микроорганизмы и/или их фрагменты, которые могут быть связаны согласно изобретению, включают бактерии, вирусы, грибные клетки, животные клетки и растительные клетки, а также их компоненты.
Изобретение дополнительно описано и проиллюстрировано следующими конкретными примерами.
Пример 1. Демонстрация связывания организмов с различными типами микросфер
Обоснование
Ночные культуры Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Candida glabrata использовали для исследования связывания с различными типами микросфер при различных условиях. Использовали достаточное количество культуры так, чтобы раствор был мутным и чтобы за связыванием и последующей элюцией можно было проследить визуально.
Способ
10 мл бактериальных культур центрифугировали при 8000×g в течение 5 мин и ресуспендировали в 10 мл дистиллированной воды с получением мутной суспензии организмов.
500 мкл каждой суспензии разводили до 1 мл либо в 1 М NaCl, либо в 1 М NaCl, 20% (мас./об.) PEG 8000 (приводя к получению концентрации PEG в среде 10%).
Добавляли 25 мкл суспензии различных парамагнитных микросфер (около 1 мг микросфер) и инкубировали в течение 10 мин.
С помощью магнитного штатива собирали микросферы на одной стороне пробирки и удаляли надосадочную жидкость.
Фиксировали в надосадочной жидкости помутнение и присутствие осадка организмов после центрифугирования при 8000×g в течение 5 мин.
Для элюции связанных организмов микросферы ресуспендировали в 250 мкл 0,5 М NaCl и помещали обратно в магнитный штатив.
Фиксировали в надосадочной жидкости помутнение и присутствие осадка организмов после центрифугирования при 8000×g в течение 5 мин.
Результаты
Результаты представлены в нижеследующей Таблице. Типы используемых парамагнитных микросфер перечислены ниже:
A. Микросферы «BioMag Amine» («Bangs Laboratories», каталожный номер BM546).
B. Как в A, но покрытые pDADMAC.
C. Как в B, но покрытые сверху декстран сульфатом.
D. Микросферы «Dynalbeads M-270 amine» («Invitrogen»).
E. Микросферы из карбида кремния (50 микрон), покрытые pDADMAC
F. Микросферы из карбида кремния (50 микрон) без покрытия
Условия связывания
Тип микросфер
Связавшиеся организмы (%)
Элюированные организмы
Штаммы Е. coli
С помощью PEG
A
100
Да
B
100
Да
C
100
Да
D
100
Да
E
<50
Да
F
<25
Да
Без PEG
A
0
NA
B
0
NA
C
0
NA
D
0
NA
E
0
NA
F
0
NA
S. aureus
С помощью PEG
A
100
Да
B
100
Да
C
100
Да
D
100
Да
E
<50
Да
F
<25
Да
Без PEG
A
0
NA
B
0
NA
C
0
NA
D
0
NA
E
0
NA
F
0
NA
Candida glabrata
С помощью PEG
A
100
Да
B
100
Да
C
100
Да
D
100
Да
E
<50
Да
F
<25
Да
Без PEG
A
0
NA
B
0
NA
C
0
NA
D
0
NA
E
0
NA
F
0
NA
NA, не применимо. Не было связывания и никаких организмов для элюции.
<50% обозначает 25%-50% связывания
Обсуждение
Все организмы (грамположительные и грамотрицательные бактерии и грибы) связывались в присутствии 10% (мас./об.) PEG для всех тестированных типов микросфер, хотя связывание на микросферы с карбидом кремния был менее эффективен. Связывание парамагнитных микросфер в присутствии PEG было очень эффективным; после центрифугирования надосадочная жидкость после связывания не была мутной и не наблюдалось осадка, содержащего организмы. Аналогично, после центрифугирования элюат был мутным, и наблюдался осадок, содержащий организмы, и размер элюата был сравним с объемом культуры, до проведения процесса связывания и элюции. Без PEG в процессе связывания организмы не связывались, и оставались в надосадочной жидкости. Меньшая степень связывания pDADMAC, при его нанесении на карбид кремния, по сравнению с парамагнитными микросферами может быть связано с различиями в эффективности покрытия.
Пример 2. Исследование требования присутствия NaCl в связывании с использованием PEG
Обоснование
В данном примере Е. coli концентрировали с использованием карбоксипарамагнитных микросфер («Invitrogen») в буферах, содержащих различные комбинации PEG и NaCl.
Способ
Достаточное количество культуры Escherichia coli использовали так, чтобы раствор был мутным и связывание можно было наблюдать визуально.
Способ
10 мл бактериальных культур центрифугировали при 8000×g в течение 5 мин и ресуспендировали в 10 мл дистиллированной воды с получением мутной суспензии организмов.
500 мкл каждой суспензии разводили до 1 мл с помощью или 1 М NaCl или 1 М NaCl, 20% (мас./об.) PEG 8000 или с помощью 20% (мас./об.) PEG 8000.
100 мкл (около 0,4 мг микросфер) суспензии карбоксипарамагнитных микросфер («Invitrogen») добавляли и инкубировали в течение 10 мин.
С помощью магнитного штатива собирали микросферы на одной стороне пробирки и удаляли надосадочную жидкость.
Фиксировали в надосадочной жидкости помутнение и присутствие осадка организмов после центрифугирования при 8000×g в течение 5 мин.
Результаты
Используемый связывающий буфер
Степень связывания (%)
0.5 М NaCl
0
0.5 М NaCl, 10% (мас./об.) PEG 8000
100
10% (мас./об.) PEG 8000
25
Обсуждение
Бактерии в основном отрицательно заряжены и отталкиваются отрицательно заряженными карбоксимикросферами. Такое отталкивание может помочь в удалении бактерий из микросфер на последней стадии. В отсутствии PEG (только NaCl) связывание Е. coli с микросферами отсутствует. С использованием только PEG имеет место некоторое связывание, но эффективность повышается в присутствии NaCl, что преимущественно помогает отделять отрицательные заряды как на бактериях, так и на микросферах, и, таким образом, это стимулирует связывание бактерий с микросферами.
Пример 3. Концентрирование Mycobacterium tuberculosis из мокроты с использованием парамагнитных микросфер
Обоснование
В данном примере Mycobacterium tuberculosis (TB) концентрировали из разведенной мокроты, которая имела высокое значение pH, с использованием микросфер (микросферы «BioMag Amine», «Bangs Laboratories», каталожный номер BM546), покрытых полидиаллилдиметиламмоний хлоридом (pDADMAC). Присутствие TB на микросферах затем подтверждали микроскопией с прокрашиванием кислотоустойчивых бактерий.
Способ
Для сравнения образцы мокроты разводили в гидроксиде натрия и N-ацетилцистеине, затем разделяли и одну половину обрабатывали связыванием микросферами, а другую обрабатывали стандартной лабораторной процедурой, которая включает концентрированно бактерий центрифугированием и окрашивание осадков аурамином.
Протокол связывания микросферами
Мокроту разводили согласно стандартной лабораторной процедуре путем добавления равного объема 0,5 М NaOH, 2% (мас./об.) N-ацетилцистеина.
Образцы оставляли на 10 мин.
2 мл разведенной мокроты затем добавляли к равному объему 20% PEG 8000, 3 М NaCl и 80 мкл микросфер, покрытых pDADMAC (около 5 мг микросфер), и инкубировали в течение 10 мин. (следует отметить: образец не нейтрализовали перед данной стадией, и связывание проводилось при высоком pH 14, измеренном с помощью индикаторной бумаги).
Затем микросферы собирали с помощью магнита и удаляли надосадочную жидкость.
Микросферы ресуспендировали в 1 мл PBS, содержащем 0,75 М NaCl, и снова собирали на магните.
Надосадочную жидкость удаляли и ресуспендировали микросферы в 50 мкл PBS перед распределением на стеклянном предметном стекле и сушкой.
Предметное стекло окрашивали с помощью аурамина O для кислотостойких микобактерий по стандартному протоколу.
Результаты
Протестировали десять образцов мокроты. Как положительные были определены шесть образцов с помощью микроскопии при использовании обоих способов (т.е. традиционного способа концентрирования центрифугированием и способа со связыванием на микросферы). Четыре образца были отрицательными при определении с помощью микроскопии при использовании обоих способов. Таким образом, наблюдали 100-процентную корреляцию между двумя способами.
Обсуждение
Данный пример демонстрирует, что TB может быть связан из мокроты в щелочных условиях и что способ сравним по своей эффективности с традиционным способом концентрирования центрифугированием.
Пример 4. Концентрирование Mycobacterium tuberculosis из мокроты с использованием осаждающихся микросфер
Обоснование
В данном примере Mycobacterium tuberculosis (TB) концентрировали из разведенной мокроты, которая имела высокое значение PH, с использованием 50 микронных микросфер из карбида кремния, как не покрытых, так и покрытых полидиаллилдиметиламмоний хлоридом (pDADMAC). Связывание ТВ микросферами затем подтверждали микроскопией с прокрашиванием кислотоустойчивых бактерий.
Способ
Для сравнения образцы мокроты разводили с помощью гидроксида натрия, N-ацетилцистеина, затем половину обрабатывали непокрытыми микросферами, а другую половину обрабатывали покрытыми микросферами.
Протокол связывания микросферами
Мокроту разводили согласно стандартной лабораторной процедуре путем добавления равного объема 0,5 М NaOH, 2% (мас./об.) N-ацетил цистеина.
Образцы оставляли на 10 мин.
Затем 2 мл разведенной мокроты добавляли к равному объему 20% PEG 8000, 3 М NaCl и 200 мкл 50% суспензии покрытых или не покрытых микросфер из карбида кремния и смешивали (следует отметить: образец не нейтрализовали перед данной стадией, и связывание проводилось при высоком pH 14, измеренном с помощью индикаторной бумаги).
После того как микросферы осаждались под действием собственного массы, их промывали ресуспендированием в 1 М Tris pH 7,5 и осаждали снова.
Микросферы промывали последний раз в PBS и после их осаждения удаляли надосадочную жидкость.
Связанные бактерии элюировали добавлением 50 мкл хлороформа и интенсивным перемешиванием.
После осаждения микросфер надосадочную жидкость удаляли и наносили на предметное стекло.
После сушки предметное стекло окрашивали с помощью аурамина O для кислотостойких микобактерий с использованием стандартного протокола.
Результаты
Тестировали четыре образца мокроты, которые были положительны на микобактерии, с прокрашиванием в нативном мазке кислотостойких бактерий. После обработки обоими, непокрытыми и покрытыми микросферами, с помощью микроскопа было обнаружено, что все образцы положительны.
Обсуждение
Данный пример демонстрирует, что микобактерий могут быть связаны из разведенной мокроты при высоком рН с использованием покрытых и непокрытых микросфер из карбида кремния при высоких концентрациях PEG.
Пример 5. Концентрированно Mycobacterium tuberculosis из мокроты
Обоснование
В данном примере Mycobacterium tuberculosis (TB) концентрировали из мокроты с использованием двухстадийной процедуры. Во-первых, TB концентрировали с помощью центрифугирования, и осадок из данной стадии связывался микросферами в присутствии высокой концентрации соли и PEG 8000. Присутствие TB на микросферах затем подтверждали микроскопией с прокрашиванием кислотоустойчивых бактерий.
Способ
Мазки получали из мокроты и окрашивали аурамином O стандартным способом. Затем с помощью флуоресцентного микроскопа предметные стекла исследовали на присутствие флуоресцентных микобактерий.
Добавляли равный объем 1 М NaOH, 2-процентный N-ацетилцистеин добавляли к оставшейся мокроте и дополнительно перемешивали встряхиванием в течение 20 мин.
Мокроту затем центрифугировали при 4000×g в течение 20 минут.
Осадки ресуспендировали в 0,5 мл 100 мМ натрий-фосфатного буфера pH 7,5 и добавляли 0,5 Мл 1 М NaCl, 20% (мас./об.) PEG 8000 и смешивали с использованием 100 мкл микросфер типа В, как определено в примере 1.
Через 10 мин микросферы собирали на магнит и ресуспендировали в 50 мкл 1 М NaCl.
Микросферы распределяли на предметном стекле и окрашивали их аумарином O для кислотостойких микобактерий по стандартному протоколу.
Результаты
Все образцы, положительные по нативному мазку, также были положительными после центрифугирования и связывания с микросферами. Кроме того, по сравнению с нативным мазком, после центрифугирования и связывания с микросферами микроскопией было определено гораздо больше бактерий, что показало, что ТВ сконцентрировались из образца.
Обсуждение
Данный пример демонстрирует двухстадийное концентрирование TB из мокроты. Первая стадия включает в себя центрифугирование, которое концентрирует TB в объеме 1 мл. Данный объем также был слишком большим для непосредственного нанесения на предметное стекло микроскопа, поэтому TB дополнительно концентрировали с помощью связывания на микросферы до объема, который был достаточно маленьким для нанесения на предметное стекло микроскопа.
Пример 6. Концентрирование Mycobacterium tuberculosis из мокроты с использованием микросфер с различными покрытиями и при различных условиях связывания
Обоснование
В данном примере различные покрытия микросфер и различные условия связывания были исследованы на предмет связывания и концентрирования Mycobacterium tuberculosis (TB) из мокроты перед микроскопией.
Способ
Равный объем 1 М NaOH, 2-процентный N-ацетилцистеин добавляли мокроте с положительной реакцией по мазку и инкубировали в течение 10 мин для разведения мокроты.
Затем обрабатывали аликвоты мокроты по 0,5 мл: а) непосредственным добавлением равного объема 20% PEG 8000 и 100 мкл микросфер «BioMag Amine» («Bangs Laboratories», каталожный номер BM546), покрытых полибреном (polybreen), или b) центрифугированием, с промывкой осадка 1 М Tris pH 7, и ресуспендированием в 1 мл 1 М Tris pH 7, 1 М NaCl, 10% PEG 8000, с добавлением 100 мкл микросфер, покрытых полибреном. Для контроля 0,5 мл микросфер обрабатывали микросферами, покрытыми PEG 8000 и pDADMAC, как описано в примере 5.
Через 10 мин микросферы собирали на магнит и ресуспендировали в 1 мл 10×PBS.
Микросферы опять собирали на магнит, ресуспендировали в 50 мкл 5×PBS, распределяли на предметном стекле, окрашивали аумарином O для кислотостойких микобактерий по стандартному протоколу.
Результаты
Все методы продемонстрировали связывание микобактерий. Количество микобактерий, связанных микросферами, покрытыми полибреном в присутствии PEG при высоком pH, было почти эквивалентно контрольному связыванию. Количество микобактерий, связанных микросферами, покрытыми полибреном в присутствии высокой концентрации соли и при нейтральном pH, было немного меньше по сравнению с контрольным связыванием.
Обсуждение
Данный пример демонстрирует, что микросферы, покрытые полибреном, могут использоваться для связывания микобактерий из мокроты.
Пример 7. Демонстрация связывания не осаждаемых фрагментов микроорганизмов
Обоснование
В данном примере цельные интактные микобактерий удаляли из разведенной мокроты центрифугированием. Надосадочную жидкость затем тестировали, чтобы показать, что не осаждаемые фрагменты микобактерий могут связываться и концентрироваться с помощью микросфер в присутствии PEG 8000.
Способ
1. Образцы мокроты, которые имели положительную реакцию мазка и отрицательную реакцию мазка на микобактерий, разводили согласно стандартной лабораторной процедуре путем добавления равного объема 0,5 М NaOH, 2% (мас./об.) N-ацетил цистеина.
2. Образцы оставляли на 10 мин.
3. Затем 1 мл разбавленной мокроты центрифугировали при 13000×g в течение 5 мин и удаляли надосадочную жидкость.
4. 0,7 мл надосадочной жидкости добавляли к 0,7 мл 20% PEG 8000, 3 М NaCl, добавляли 100 мкл 50% суспензии 50 микронных не покрытых микросфер из карбида кремния и смешивали.
5. После того как микросферы оседали под действием собственной массы, их промывали ресуспендированием в 1 М Tris pH 7,5 и осаждали снова.
6. Микросферы последний раз промывали в PBS и после оседания надосадочную жидкость удаляли.
7. Не осаждаемые фрагменты микроорганизмов элюировали из микросфер добавлением 50 мкл лизирующих микросфер (микросферы с лизирующей матрицей В из «Fischer Scientific»), и проводили разрушение в течение 5 мин при 2800 об/мин на дезинтеграторе «Disruptor Genie» («Scientific Industries»).
8. 100 мкл каждого элюата анализировали непосредственно с помощью коммерчески доступного микропланшета «LAM ELISA» («Clearview», «Invernesss Medical»), который распознает антигены, специфичные для микобактерий.
Результаты
Анализируемый образец
Поглощение 450 нм*
Микроскопия надосадочной жидкости с мокротой
2,20
Микроскопия надосадочной жидкости без мокроты
0,00
* считывание после вычитания пустых контролей с конъюгатом
Обсуждение
Микросферы из карбида кремния в присутствии 10% PEG были способны к связыванию и концентрированию не осаждаемых фрагментов микобактерий, которые затем можно было детектировать с помощью тИФА.
Пример 8. Концентрированно Mycobacterium tuberculosis из мокроты с использованием различных полимеров и магнитных микросфер, состоящих из магнетита
Обоснование
Тестировали различные полимеры различной структуры. Включая следующие:
Поливинилпирролидон средней молекулярной массы 10000; Полиэтиленгликоль средней молекулярной массы 200; Полиэтиленгликоль средней молекулярной массы 8000 (все из «Sigma Aldrich», США).
Способ
1. Каждый из различных полимеров готовили до получения 15-процентного раствора, содержащего 1,5 М NaCl и 2% магнетитных микросфер, диаметром <5 мкм («Sigma Aldrich», США, 310069-500G, порошок оксида железа II, III).
2. Образец мокроты, который имел положительную реакцию при микроскопии на кислотостойкие Mycobacterium tuberculosis, разводили равным объемом 0,5 М NaOH в течение 10 мин, затем отбирали аликвоты по 2 мл.
К этим аликвотам добавляли равный объем полимерного раствора, смешивали с разведенной мокротой и оставляли на 2 мин.
Затем микросферы связывали на магнит и удаляли жидкость.
После удаления с магнита микросферы промывали ресуспендированием в 10 мл 10 мМ NaOH.
После помещения обратно на магнит 10 мМ NaOH удаляли и элюировали любые связанные TB ресуспендированием микросфер в 100 мкл элюирующего буфера (100 мМ фосфатный буфер pH 7,0,5-процентный N-лароилсаркозин).
3. После удаления микросфер магнитом, 50 мкл надосадочной жидкости исследовали стандартной микроскопией с прокрашиванием кислотоустойчивых бактерий.
Результаты
Количество бактерий TB в поле микроскопа оценивали после связывания из разведенной мокроты с использованием различных растворов полимеров (смотри таблицу ниже). Хотя полиэтиленгликоль с высокой молекулярной массой (около 8000), по-видимому, работает лучше всех, полиэтиленгликоль с более низкой молекулярной массой также работает хорошо. Полимер, поливинилпирролидон также хорошо работал.
Поливинилпирролидон (средняя молекулярная масса 10000)
23
Полиэтиленгликоль (средняя молекулярная масса 200)
22
Полиэтиленгликоль 8000 (средняя молекулярная масса 8000)
33
Без полимерного контроля
6
Мазок (без концентрирования)
8
Заключение
Ряд полимеров способен концентрировать TB из мокроты по сравнению с не полимерным контролем и мазком (микроскопия без концентрирования). Данный эксперимент демонстрирует, что различные полимеры различной химической структуры и различной молекулярной массы могут быть эффективны при концентрировании TB из мокроты совместно с использованием магнетитных микросфер.
Пример 9. Демонстрация связывания растворимых фрагментов бактерий
Обоснование
Мы ранее демонстрировали связывание интактпых бактерий. В данном эксперименте мы удаляли интактные бактерии из клинического образца с помощью высокоскоростного центрифугирования, известного способа для осаждения бактерий, и затем использовали полиэтиленгликоль 8000 (PEG 8000) и магнетитные микросферы для связывания растворимых фрагментов из надосадочной жидкости. Присутствие этих растворимых бактериальных фрагментов демонстрируется с помощью тИФА после элюции из микросфер.
Способ
Образцы мокроты исследовали стандартной микроскопией с прокрашиванием кислотоустойчивых бактерий на предмет присутствия микобактерий. Мокроту с положительной и отрицательной реакцией собирали и обрабатывали стандартным образом гидроксидом натрия с целью разведения мокроты.
Затем 1 мл каждого образца центрифугировали на высокой скорости; 13000×g, в течение 10 мин, что превышало центробежную силу 4000×g, которая обычно используется для осаждения бактерий.
Надосадочную жидкость удаляли для тестирования, а осадок также ресуспендировали в 1 мл PBS для дальнейшего тестирования.
Бактерии и бактериальные фрагменты в образцах экстрагировали добавлением равного объема 15-процентного полиэтиленгликоля 8000, 1,5 М NaCl, 2% магнетитных микросфер. После смешивания и инкубирования в течение 2 мин микросферы собирали на магнит и удаляли надосадочную жидкость.
Микросферы ресуспендировали в 10 мМ NaOH и повторно связывали магнитом.
10 мМ NaOH удаляли и микросферы ресуспендировали в 100 мкл элюирующего буфера (100 мМ фосфатный буфер pH 7, 0,5-процентный N-лаурилсаркозин).
Микросферы удаляли магнитом и 100 мкл элюата тестировали на присутствие микобактериального липоарабиноманнана (ЛАМ) с помощью стандартной процедуры тИФА. Присутствие ЛАМ, который является компонентом клеточной стенки микобактерий, является маркером присутствия фрагментов бактериальной клеточной стенки.
Результаты
Как ожидалось, экстрагированная надосадочная жидкость и осадок из мокроты с отрицательной реакцией на микобактерий, которые их не содержали, не давали сигнал в анализе тИФА. Напротив, сигнал тИФА был у экстрагированной мокроты с положительной реакцией на микобактерий как в надосадочной жидкости, так и в осадке (смотри таблицу ниже).
Анализируемый образец
Считывание тИФА (OD 450 нм)
Микроскопия надосадочной жидкости с мокротой
2,05
Микроскопия осадка с мокротой
0,78
Микроскопия надосадочной жидкости без мокроты
0,00
Микроскопия осадка без мокроты
0,07
Заключение
Комбинация PEG 8000 и магнетита позволила получить сигнал ЛАМ-тИФА из надосадочной жидкости, из которой центрифугированием были удалены интактные бактерии. Это говорит о том, что процедура с использованием PEG/магнетита может использоваться для экстракции фрагментов бактериальной клеточной стенки из образцов. Интересно, что при использовании образца мокроты с положительной реакцией сигнал в надосадочной жидкости был выше, чем сигнал осадка, что предполагает, что большая часть экстрагируемых микобактериальных компонентов в мокроте находится в растворимой форме.
Пример 10. Исследование экстракции растворимых бактериальных компонентов, помещенных в мочу
Обоснование
В данном эксперименте нам хотелось продемонстрировать, что PEG 8000 в комбинации с магнетитом может использоваться для экстракции растворимых микобактериальных компонентов из мочи, что измеряется с помощью антилипоарабиноманнан (ЛАМ) тИФА.
Способ
1 мл культуры микобактерий бациллы Кальмета-Герена (БЦЖ) центрифугировали при 13000×g в течение 5 мин, и 50 мкл надосадочной жидкости помещали в 2 мл мочи.
Мочу с введенным компонентом и контрольную мочу, не содержащую введенный компонент, экстрагировали добавлением равного объема 15-процентного полиэтиленгликоля 8000, 1,5 М NaCl, 2% магнетитных микросфер. После смешивания и инкубации в течение 2 мин микросферы собирали на магнит и удаляли надосадочную жидкость.
Микросферы ресуспендировали в 10 мМ NaOH и повторно связывали магнитом.
10 мМ NaOH удаляли и ресуспендировали микросферы в 100 мкл элюирующего буфера (100 мМ фосфатный буфер pH 7, 0,5-процентный N-лауроилсаркозин).
Микросферы удаляли магнитом и 100 мкл элюата тестировали на присутствие LAM с помощью стандартной процедуры тИФА. Присутствие ЛАМ, который является компонентом клеточной стенки микобактерий, является маркером присутствия фрагментов бактериальной клеточной стенки.
Результаты
Анализируемый образец
Считывание тИФА (OD 450)
Надосадочная жидкость культуры бациллы Кальметта-Герена, добавленная к мочевине
1,03
Контрольная моча
0,00
Заключение
Комбинация PEG 8000 и магнетита позволяет извлекать растворимые компоненты БЦЖ, помещенные в мочу.
Пример 11. Демонстрация связывания вируса
Обоснование
Экстрагирующая система PEG/магнетит может экстрагировать бактерии, грибы и растворимые бактериальные компоненты. В данном эксперименте мы демонстрируем, что она также может экстрагировать вирусы.
Способ
2
1. Различные количества аденовируса разводили в 250 мкл HO.
2. Добавляли равный объем 30% PEG 8000, 3 М NaCl, 4% магнетита и смешивали.
3. Через 10 мин магнетитные микросферы промывали дважды с помощью 0,5 мл 7,5% PEG 8000,0,5 M NaCl с использованием магнита.
4. Наконец микросферы ресуспендировали в 20 мкл PBS 0,1% Triton X-100 для элюции связанного вируса.
5. После удаления микросфер с использованием магнита 2 мкл элюата анализировали с помощью ПЦР с использованием праймеров: AdF, 5' GGACGCCTCGGAGTACCTGAG 3' и AdR, 5' ACCGTGGGGTTTCTAAACTTGTT 3'
Результаты
Циклы ПЦР, при которых реакция становилась положительной (значение ct), показаны в таблице.
Количество добавленного аденовируса (нг/мл)
ПЦР Ct
300
23
30
26
3
28
0,3
Нет значения Ct
0
Нет значения Ct
Можно было детектировать 3 нг/мл аденовируса, что соответствует 0,75 нг в объеме тестируемого образца.
Заключение
Аденовирус связывался из раствора с помощью комбинации PEG 8000 и магнетита и удерживался на микросфере на протяжении двух промываний перед элюцией и детекцией с помощью ПЦР.
Для решения проблемы универсального способа концентрирования из больших объемов самого широкого спектра микроорганизмов и их фрагментов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, микобактерии и грибы, что может включать жесткие условия pH или концентрации соли, нами разработан улучшенный способ, который включает использование полиэтиленгликоля и подобных веществ для отложения микроорганизмов или их фрагментов на поверхности связывающей матрицы. Использование полиэтиленгликоля снимает зависимость связывания от характера поверхности связывающей матрицы, и нами продемонстрировано, что множество различных связывающих матриц с множеством поверхностей различного характера могут использоваться для связывания широкого спектра микроорганизмов и грибов.
Наше наблюдение, которое заключается в том, что тестируемые бактерии и грибы, включая грамотрицательные и грамположительные бактерии, могут связываться с поверхностями, такими как заряженные парамагнитные микросферы в присутствии водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль (PEG). Могут использоваться полиэтиленгликоли многих других размеров. Кроме того, может использоваться множество различных типов микросфер, включая микросферы с карбокси-покрытием, амино-покрытием, pDADMAC или с декстрансульфатным покрытием, или могут использоваться микросферы непосредственно без покрытия. Микросферы могут быть парамагнитными, ферромагнитными (включая ферримагнитные), или простые из карбида кремния или оксида алюминия, но в особенно применимых воплощениях для большинства бактерий и грибов используются парамагнитные микросферы с карбокси-поверхностью, или непокрытые микросферы из карбида кремния, или непокрытые магнетитные микросферы.
При использовании парамагнитных или ферромагнитных поверхностей микросфер, микроорганизмы могут быть сконцентрированы с использованием магнита для удаления микросфер из суспензии и затем могут элюированы в небольшом объеме буфера с пониженным содержанием полиэтиленгликоля или без него.
Аналогично, при использовании микросфер из карбида кремния, которые осаждаются под действием силы тяжести, микроорганизмы могут быть сконцентрированы и элюированы после осаждения микросфер в небольшом объеме буфера с уменьшенным содержанием полиэтиленгликоля или без него.
В данном описании до тех пор, пока не указано иначе слово «или» используется в смысле оператора, который возвращает истинное значение, когда встречаются каждое или оба из условий, в противоположность оператору «исключающее или», который требует, чтобы встречалось только одно условие. Слово «содержащий» используется в смысле «включающий», а не для обозначения «состоящий из». Все предыдущие описания, приведенные выше, включены в настоящий документ ссылкой. Указание любого ранее опубликованного документа в данном описании не должно быть использовано для признания или изложения того, что описание является общепринятыми сведениями в Австралии или где-либо еще на момент даты подачи данного документа.