Регулирование каталитической активности и функциональности лизоцима куриного яйца с использованием алкилоксибензолов

УДК 57.033

РЕГУЛИРОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОСТИ ЛИЗОЦИМА КУРИНОГО ЯЙЦА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ

Е.И. Мартиросова1, И.Л. Журавлева1, И.Г. Плащина1, А.С. Петровский2, Н.Г. Лойко3, Г.И. Эль-Регистан3

Продемонстрирована способность алкилоксибензолов изменять ферментативную активность лизоцима яичного белка и эффективность катализируемых им реакций гидролиза неспецифических (хитин, дрожжи) субстратов. В качестве модифицирующей добавки использован гомолог С7-АОБ, который во всем исследованном диапазоне концентраций повышал ферментативную активность лизоцима. Исследовано влияние концентрации С7-АОБ (0,1254,0 мг/мл), формы С7-АОБ (исходной и окисленной), а также времени инкубирования смеси (1-24 часов) лизоцима и С7-АОБ в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 25°С на активность лизоцима и термодинамические параметры его денатурации методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Определены кинетические параметры гидролиза хитина лизоцимом, модифицированным С7-АОБ.

Ключевые слова: лизоцим, алкилоксибензолы, хитин, ферментативная активность, ферментативный гидролиз, термодинамические параметры, ДСК.

Введение

Лизоцим широко применяют как в медицине при лечении инфекционных заболеваний, так и в пищевой промышленности - для предотвращения бактериаль-ныгс заражений продуктов, поэтому проблема приобретения микроорганизмами устойчивости к лизоциму очень важна [1]. В последнее время возросло внимание к исследованиям, направленным на модификацию лизоцима, приводящую к изменению его характеристик при сохранении активности [2, 3].

Один из наиболее эффективнык способов модификации ферментов - использование их слабыгс неспецифических взаимодействий с низкомолекулярными лигандами. К биологически активным веществам, способным оказывать влияние на активность и стабильность лизоцимов, относятся микробные низкомолекулярные внеклеточные метаболиты, имеющие функции аутоиндукторов анабиоза. Эти ауторегулято-ры, представленные у ряда бактерий и дрожжей алки-локсибензолами (АОБ), в частности алкилрезорцина-ми, индуцируют переход микробных клеток в гипоме-таболическое (анабиотическое) состояние и реализуют эту функцию через взаимодействие с широким кругом биополимеров бактериальной клетки [4, 5]. Неспецифический эффект воздействия этих ауторегу-ляторов на ферментные белки определяется хими-

ческой структурой АОБ и типом их взаимодействий с молекулами белков [6, 7].

В случае лизоцима ранее было установлено существенное влияние на эффективность катализируемых им реакций модификации структуры как фермента, так и специфического (пептидогликана) и неспецифического (коллоидного хитина) субстратов в результате взаимодействия с С7-АОБ. Выывлено стабилизирующее действие С7-АОБ, которое проявлялось в сохранении более высокого уровня активности (по сравнению с контролем) модифицированного АОБ-фермента после его термической обработки, а также при неоптимальныгс температурах катализа [8]. Установлена корреляция между изменением каталитической активности лизоцима под действием С7-АОБ и его дестабилизирующим действием на нативную кон-формацию фермента, что проявляется в понижении избыточной свободной энергии денатурации с увеличением концентрации модификатора. Это свидетельствует о преимущественном взаимодействии С7-АОБ с денатурированной формой белка [9].

Понимание механизма регуляции активности и функциональной стабильности лизоцима с помощью АОБ представляет интерес для теории персистенции (особенно воздушно-капельных инфекций) и использо-

вания высокоактивного и стабильного лизоцима в медицинской практике. Модификация лизоцима для повышения его активности и стабильности может также быть востребована в производстве синергетических пребиотиков, применение которых является новым направлением в создании синбиотических продуктов [10].

Цель данной работы состояла в изучении влияния концентрации С7-АОБ, его формы (исходной и окисленной), а также времени инкубирования смеси лизо-цима и С7-АОБ на активность лизоцима и термодинамические параметры его денатурации, а также в определении кинетических параметров гидролиза хитина лизоцимом, модифицированным С7-АОБ.

Материалы и методы

В исследованиях использовали коммерческий препарат лизоцима яичного белка КФ 3.2.1.17 ("Sigma", США), М = 14,7 кДа.

В качестве модификатора лизоцима использовали гомолог алкилоксибензолов С7-АОБ ("Sigma", США), М = 124 г/моль. Окисленную форму С7-АОБ получали выдерживанием концентрированного раствора на свету в присутствии кислорода воздуха при температуре 25 °С в течение 14 дней.

Растворы фермента и С7-АОБ готовили в PBS-бу-фере в концентрациях, в два раза больше заданных, смешивали в отношении 1:1 и выдерживали при комнатной температуре определенное время (предынкуба-ция). В контрольных вариантах вместо раствора АОБ использовали эквивалентное количество растворителя.

Приготовление субстратов

Клетки Saccharomyces cerevisiae культивировали на 2,5 Б сусле в течение 12 ч при 28°С (экспоненциальная фаза). Клетки, отделенные от среды роста, ресуспендировали в PBS-буфере рН 7,4 до оптической плотности 0,5 ед. ("Specord", Германия, l = 1 см, X = 540 нм), что соответствовало численности дрожжевых клеток «5х 10' КОЕ/мл.

Коллоидный хитин получали растворением кристаллического хитина в 85%-й фосфорной кислоте. Отмытый методом декантации в дистиллированной воде осадок отделяли центрифугированием и разбавляли до нужной концентрации буфером (рН субстрата 7,0).

Определение ферментативной активности лизоцима

Гидролитическую активность лизоцима в отношении коллоидного хитина определяли, смешивая

0,3 мл раствора субстрата (15 мг/мл) с 0,1 мл раствора лизоцима (2 мг/мл) и инкубируя в течение 10 и более часов при 42°С.

Гидролитическую активность лизоцима в отношении клеток & сегеу181ае определяли, смешивая 2 мл дрожжевой суспензии с 0,5 мл раствора лизоцима (2 мг/мл) и инкубируя в течение 20 ч при 37°С. Затем образцы центрифугировали и в супер-натанте определяли концентрацию ацетилглюкоза-мина с ДСК [11].

Микрокалориметрические исследования

Исходные растворы лизоцима («10 мг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,4 готовили за 1 день до эксперимента. После центрифугирования растворов в течение 1 ч при 20 000 g ("Весктап 21", Германия) определяли концентрацию лизоцима спектрофотометрическим методом ("Specord иУ УШ", Германия), измеряя поглощение при 280 нм. Для расчета концентрации лизоцима использовали коэффициент удельной экстинции 26,4 [12]. Рабочие растворы готовили, смешивая равные объемы растворов белка и С7-АОБ в 0,05 М РБ8-буфере. Концентрация С7-АОБ составляла 4,6 мг/мл, г = 50 (г - молярное отношение С7-АОБ/лизоцим). Полученные растворы выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч перед введением в рабочую ячейку калориметра. В качестве растворов сравнения использовали свежеприготовленные растворы С7-АОБ той же концентрации, что и в рабочей ячейке.

Эксперименты по микрокалориметрии выполнены с использованием адиабатного сканирующего микрокалориметра "ДАСМ-4" (НПО "Биоприбор", г. Пущи-но, Россия) в температурном диапазоне 10-110°С при скорости сканирования 2 град/мин и избыточном давлении 0,2 МПа. В каждом эксперименте шкалу теплоемкости микрокалориметра калибровали на основе эффекта Джоуля-Ленца.

Калориметрическая энтальпия денатурации рассчитана как площадь под термограммой с учетом изменения теплоемкости между нативной и денатурированной формами белка [13] с использованием стандартной программы Wscal.

Результаты и обсуждение

В работе исследовали влияние одного из гомологов алкилоксибензолов (С7-АОБ) на ферментативную активность лизоцима яичного белка в отношении неспецифического субстрата - коллоидного хитина (рН реакции 7,0). Поскольку для модификации структуры

макромолекул необходимо определенное время [14], то были проведены исследования, в которых варьировали время инкубирования лизоцима и С7-АОБ в диапазоне от 1 до 24 ч при температуре 25°С. Пред-ынкубация лизоцима с С7-АОБ в течение 1 ч во всем диапазоне исследуемых концентраций (0,1254 мг/мл или г = 6-200) стимулировала каталитическую активность фермента, что выражалось в увеличении накопления продукта ацетилглюкозамина до 150% от контроля (рис. 1). Следует отметить, что в области низких концентраций (0,125 мг/мл) наблюдался максимум активности. Увеличение времени пре-дынкубации до 24 ч повышало эффективность воздействия С7-АОБ на фермент до максимального значения - 300% от контроля.

Рост неспецифической активности лизоцима, модифицированного С7-АОБ, продемонстрирован в опытах, где в качестве субстрата использовали дрожжевые клетки сегвУ131ав. Максимальный выход редуцирующих сахаров наблюдался при концентрации модификатора 1,75 мг/мл, что коррелировало с данными по хитину (рис. 2). Дальнейшее увеличение концентрации модификатора в обоих случаях приводило к спаду/фиксации активирующего эффекта. Таким образом, представленные в работе результаты демонстрируют способность С7-АОБ изменять субстратную специфичность, повышая активность лизоцима в отношении неспецифических субстратов, т.е. увеличивать скорость гидролиза связей, неспецифических для данного фермента.

Получение лизоцимов, активных против дрожжевых клеток, представляет практический интерес. В литературе подобный эффект обнаружить не удалось. Имеются отдельные работы, в которых рассматривается увеличение активности лизоцима в отношении дрожжей после их предварительной обработки антимикотиками (нистатин, амфотерицин В) [15]. Остальные примеры модификации лизоцимов приводят к получению ферментов, активных в отношении большого числа грамположительных и грам-отрицательных бактерий.

Стимуляция каталитической активности стабилизированного С7-АОБ лизоцима предполагала соответствующие изменения основных кинетических параметров реакции гидролиза (константы Михаэлиса, КМ и максимальной скорости реакции гидролиза, ^макс), позволяющих интерпретировать взаимодействия фермента с модификатором [16]. В работе определены кинетические параметры гидролиза хитина лизоци-мом, модифицированным С7-АОБ, в диапазоне акти-

Рис. 1. Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на ферментативную активность лизоцима при гидролизе коллоидного хитина. Условия реакции: концентрация субстрата 28 мг/мл; рН 7,0; время 10 ч; температура 42°С. Время предынкубации фермента с С7-АОБ, ч: 1 - 1, 2 - 24

Рис. 2. Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на ферментативную активность лизоцима в отношении клеток дрожжей в варианте предынкубации фермента. Температура ферментативной реакции 37°С, время 20 ч, время предынкубации фермента с С7-АОБ 1 ч

вирующих концентраций (0,125-4 мг/мл). В экспериментах использовали разные концентрации коллоидного хитина (14-28 мг/мл) при стандартной концентрации лизоцима 2 мг/мл. Полученные результаты были проанализированы графически в координатах Лайнуивера-Берка для расчета значений КМ и Кмакс (рис. 3, табл. 1).

При использовании высоких концентраций С7-АОБ (2 и 4 мг/мл) увеличивается значение Кмакс, но не измененяется значение КМ, что характерно для неконкурентного типа активации. Зависимости, построенные для вариантов концентраций С7-АОБ 0,125, 0,5, 1 мг/мл, имели одинаковое значение КМ, в 3,5 раза превышающее контрольное, при этом величина Кмакс изменялась пропорционально КМ, что характерно для неконкурентного типа активации. Таким образом, можно предположить, что эффекты С7-АОБ в отно-

Т а б л и ц а 1

Влияние С7-АОБ иа изменение кинетических параметров лизоцима в реакции гидролиза

коллоидного хитина

Концентрация С7-АОБ, мг/мл Контроль 0,125 0,5 1 2 4

Кт, мг/мл 38,0 135,7 135,7 135,7 38,0 38,0

Vмакс, мг/млпродукта'ч 0,056 0,18 0,19 0,20 0,09 0,12

шении лизоцима характерны для действия активаторов неконкурентного типа. Полученные данные по действию АОБ на кинетические параметры реакции гидролиза с участием лизоцима подтверждаются и для других модельных ферментов (трипсина, Р-ами-лазы), модификация которых С7-АОБ приводила к неконкурентной активации [7, 17].

Известно, что многие фенольные соединения, к классу которых относятся АОБ, обладают антиокси-дантными свойствами. Фенолы и их производные легко окисляются в присутствии кислорода воздуха с образованием активных промежуточных соединений, причем некоторые из них обладают более выраженными антиокислительными свойствами, чем исходные молекулы.

Согласно ранее проведенным исследованиям водных растворов С7-АОБ с использованием методов импульсного радиолиза и высокоэффективной жидкостной хроматографии, было доказано образование низкомолекулярных и длинноцепочечных продуктов окисления в окислительно-восстановительных реакциях, инициированных ионизирующим излучением [18].

Рис. 3. Зависимости между концентрацией субстрата - коллоидного хитина (£), и скоростью (V) его гидролиза лизоцимом, модифицированным С7-АОБ в концентрациях (мг/мл): 1 - контроль; 2 - 0,125; 3 - 0,5; 4 - 1; 5 - 2; 6 - 4

Отмечалось, что зарегистрированные продукты окисления С7-АОБ близки к так называемым красным формам, которые детектированы в спектрах продуктов окисления природных полифенольных соединений. В работе [18] упомянуто, что антоцианы, имеющие в своей структуре пирилиевое кольцо и поглощение в области 450-600 нм, обладают более высокой антирадикальной и радиопротекторной активностью по сравнению с флавонолами. Все выше сказанное позволяет нам сделать вывод, что наблюдаемое нами развитие красной окраски хранившихся на свету при Т = 25 °С в течение 15 сут концентрированных растворов С7-АОБ, имеющих максимум поглощения при длине волны 500 нм, свидетельствует об окислительном превращении С7-АОБ с образованием красных форм.

В работе были проведены исследования по влиянию окисленной формы С7-АОБ на активность лизоцима в реакции гидролиза коллоидного хитина (время предынкубации 1 ч). Модификация лизоцима окисленной формой С7-АОБ также, как и интактной формой, приводила к повышению выхода продуктов реакции (рис. 4).

Максимальное значение прироста активности в данном случае практически совпадает со значением, полученным для неокисленной формы модификатора при одном и том же времени инкубации (до 160% от контроля при концентрации модификатора 0,5 мг/мл). Более эффективным воздействием при этом обладают низкие концентрации лиганда, а с повышением концентрации модификатора выход продукта реакции снижается.

Известно, что взаимодействие белков с лигандами обычно приводит к изменению их термостабильности, поскольку происходит наложение равновесий кон-формационного перехода и связывания лиганда [19]. Изменение стабильности белка, вызванное взаимодействием с лигандом, коррелирует с изменением подвижности молекул [20] и, следовательно, с ее функционированием. Влияние степени окисления

Рис. 4. Концентрационная зависимость действия окисленной формы С7-АОБ на ферментативную активность лизоцима при гидролизе коллоидного хитина. Условия реакции: концентрация субстрата 28 мг/мл; рН 7,0; время 10 ч; T = 42°С, время предынкубации фермента с С7-АОБ 1 ч

С7-АОБ (г = 50) на конформационную термостабильность макромолекулы лизоцима в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4) исследовали методом дифференциальной адиабатной сканирующей микрокалориметрии. Полученные данные представлены в табл. 2.

В данном эксперименте сохраняется установленная ранее корреляция между понижением температуры денатурации (Тд) и присутствием С7-АОБ в сравнении с интактным ферментом [9]. Известно, что понижение температуры денатурации белка в присутствии лиганда в первую очередь свидетельствует о предпочтительном взаимодействии последнего с денатурированной формой белка [21]. В нашем случае уменьшение Тд в присутствии С7-АОБ указывает на

уменьшение термостабильности лизоцима. Существенное отличие системы, содержащей окисленную форму С7-АОБ, от неокисленной проявляется в 1,5-кратном увеличении АСр (разница теплоемкости лизоцима в денатурированном и нативном состояниях). Представленные результаты указывают на повышение доступной для растворителя гидрофобной поверхности молекулы лизоцима вследствие взаимодействия с С7-АОБ.

Заключение

Проведенные исследования свидетельствуют о способности С7-АОБ (химического аналога одного из гомологов аутоиндукторов анабиоза бактерий) модифицировать функциональную активность лизоци-ма яичного белка и регулировать эффективность катализируемых им реакций гидролиза неспецифических субстратов. Показано, что эффективность модификации лизоцима зависит от концентрации С7-АОБ и от времени инкубирования их совместных растворов. Полученные результаты в значительной степени согласуются с эффектами, продемонстрированными в отношении действия АОБ на другие моносубъеди-ничные ферменты (трипсин, а-, в- и глюкоамилаза, рибонуклеаза и др.), и подтверждают способность АОБ к модификации ферментных белков неспецифически к их структуре [5-7]. Показано, что изменение активности лизоцима в комплексе с С7-АОБ обусловлено изменением его конформационной стабильности и термодинамического сродства к растворителю и проявляется в увеличении скорости ферментативного гидролиза субстрата.

Т а б л и ц а 2

Зависимость изменения термодинамических параметров денатурации модифицированного

лизоцима от формы С7-АОБ

Термодинамические характеристики Интактный лизоцим Форма модификатора

исходная окисленная

Ад HCal, кДж/моль* 476 502 460

АСр, кДж/(моль-К) 2,63 7,59 12,56

T °С ± макс? ^ 74,4 73,5 73,2

^Калориметрическая энтальпия денатурации.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Deckers D., Masschalck B., Aertsen A., Callewaert L., van 2. Radwan I.H., Mamoru Y., Kazunobu M., Kunihiko K., Akio K.

Tiggelen C. G, Atanassova M., Michiels C. W.// Cell Mol. Life // J. Biol. Chem. 1994. 269. Р. 5059. Sci. 2004. 61. Р. 1229.

3. Lesnierowski G., Cegielska-Radziejewska R., Kijowski J. // World's Poultry Sci. J. 2004. 60. Р. 303.

4. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А., Сузина

H.Е., ГальченкоВ.Ф., ДудаВ.И. //Микробиология. 2006. 75. С. 446.

5. El-Registan G.I. Mulyukin A.L., Nikolaev Yu.A., Stepanenko

I.Yu., Kozlova A.N., Martirosova E.I., Shanenko E.F., StrakhovskayaM.G., RevinaA.A.// J. Adv. Space Res. 2005. 36. Р. 1718.

6. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И.// Микробиология. 2004. 73. С. 708.

7. Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Степаненко И.Ю., Шаненко Е.Ф., Мартиросова Е.И., Плакунов В.К., Козлова А.Н., БорзенковИ.А., Коротина О.А., Родин Д.С., Крупянский -Ю. Ф., Эль-Регистан Г.И. //Прикладная биохимия и микробиология. 2008. 44. С. 159.

8. Петровский А.С., Дерябин Д.Г., Лойко Н.Г., Михайленко Н.А., Кобзева Т.Г., Канаев П.А., Николаев Ю.А., Крупянский Ю.Ф., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. // Микробиология. 2009. 78. С. 146.

9. PlashchinaI.G., ZhuravlevaI.L., Martirosova E.I., Petrovskii A.S., Loiko N.G., Nikolaev Yu.A., El'-Registan G.I. // Biotechnology, Biodegradation, Water and Foodstuffs. N.Y., 2009. Р. 45.

10. Евдокимов И.А.// Молочная промышленность. 2004. 4. С. 41.

11. Miller G.L.// Anal. Chem. 1959. 31. Р. 426.

12. Page C.N., VajdosF., Fee L., Grimsley G., Gray Th.//Prot. Sci. 1995. 4. Р. 2411.

13. PrivalovP.L., Potekhin S.A.//Methods in Enzymology. 1986. 131. Р. 4.

14. Беспалов М.М., Колпаков А.И., Лойко Н.Г., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Варламова Е.А., Курганов Б.И., Эль-Регистан Г.И.// Микробиология. 2000. 69. С. 217.

15. AnilS, SamaranayakcL.P. //Oral Dis. 2002. 8. Р. 199.

16. Плакунов В.К. //Основы энзимологии. М., 2001.

17. МартиросоваЕ.И. Дис. ... канд. биол. наук. М., 2007.

18. Ревина А.А., Ларионов О.Г., КочетоваМ.В., Зимина Г.М., Золотаревский В.И., Эль-Регистан Г.И. //Химия высоких энергий. 2004. 38. С. 176.

19. Homans S. W. //Top Curr. Chem. 2007. 272. Р. 51.

20. CelejM.S., Montich G.G., Fidelio G.D.//Prot. Sci. 2003. 12. Р. 1496.

21. Cooper A. // Differential scanning microcalorimetry/ S.E.Harding and B.Z. Chowdhry (Eds.) Oxford; N.Y., 2000. Р. 287.

Поступила в редакцию 20.01.10

CONTROLLING OF THE CATALYTIC ACTIVITY AND FUNCTIONALITY OF HEN EGG WHITE LYSOZYME BY ALKYLHYDROXYBENZENES

E.I. Martirosova, I.L. Zhuravleva, I.G. Plashchina, A.S. Petrovskii, N.G. Loiko, G.I. El-Registan

The study demonstrates the ability of alkylhydroxybenzenes (C7-AHB homolog) to stimulate the enzymatic activity of hen egg white lysozyme and the efficiency of hydrolysis reactions of nonspecific substrates. The influence of both the C7-AHB concentration and the C7-AHB form (primary and oxidized), as well as the incubation time of the mixture of lysozyme and C7-AHB on the activity of lysozyme and thermodynamic parameters of its denaturation has been studied using DSC. Kinetic parameters of chitin hydrolysis by C7-AHB -modified lysozyme have been estimated.

Key words: lysozyme, alkylhydroxybenzenes, chitin, enzymatic activity, enzymatic hydrolysis, thermodynamic parameters, DSC.

Сведения об авторах: Мартиросова Елена Игоревна - науч. сотр. лаборатории физико-химической модификации биополимеров ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН, канд. биол. наук (ms_martins@mail.ru.); Журавлева Ирина Леонидовна - ст. науч. сотр. лаборатории физико-химической модификации биополимеров ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН, канд. хим. наук (igplashchina@sky.chph.ras.ru); Плащина Ирина Германовна - заведующая лабораторией физико-химической модификации биополимеров ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН, канд. хим. наук (igplashchina@sky.chph.ras.ru); Петровский Арсений Сергеевич - аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева (arseniyy@mail.ru); Лойко Наталья Геннадиевна - науч. сотр. лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, канд. биол. наук (loikonat@mail.ru); Эль-Регистан Галина Ивановна - глав. науч. сотр. лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, профессор, докт. биол. наук (loikonat@mail.ru).