СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ДИСФУНКЦИИ У КРЫС, ИНДУЦИРОВАННОЙ АДАПТАЦИЕЙ ОРГАНИЗМА К НИЗКИМ СЕЗОННЫМ ТЕМПЕРАТУРАМ
METHOD FOR CORRECTION OF TESTICULAR DYSFUNCTION IN RATS INDUCED BY BODY ADAPTATION TO LOW SEASONAL TEMPERATURES

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной морфологии.
Репродуктивная система человека и животных чрезвычайно чувствительна к действию экстремальных факторов среды, в связи с этим поиск средств, повышающих адаптационные возможности органов репродуктивной системы, является важнейшей медико-биологической проблемой. Одним из направлений современной экспериментальной репродуктологии является разработка препаратов, корригирующих тестикулярную дисфункцию, возникающую при взаимодействии организма животных с неблагоприятными факторами среды. Значимость данного направления определяется, по меньшей мере, двумя обстоятельствами. Во-первых, за последние десятилетия наблюдается существенное снижение репродуктивной функции у мужчин, что отрицательно сказывается на демографической ситуации в стране. Во-вторых, лечение инфертильных состояний у мужчин осложняется высокой чувствительностью половых клеток даже к неспецифической терапии, включающей адаптогены, витамин E, поливитамины и микроэлементы. Наиболее перспективными средствами для коррекции тестикулярной дисфункции являются биологически активные вещества (модификаторы биологического ответа) природного происхождения.
В результате проведенного патентного поиска других препаратов для коррекции тестикулярной дисфункции у крыс, индуцированной адаптацией к низким сезонным температурам, выявлено не было.
Задача изобретения заключается в создании способа коррекции структурного и функционального состояния семенников лабораторных животных при адаптации к низким сезонным температурам.
Предложен способ применения препарата «Моллюскам», получаемого путем гидролиза из моллюсков Тихого океана в качестве средства, оказывающего корригирующее действие при тестикулярной дисфункции у крыс. В его состав входят такие аминокислоты, как лизин - 4,1%, лейцин - 4,0%, фенилаланин - 3,2%, триптофан - 3,2%, треонин - 3,2%, валин - 2,5%, изолейцин - 2,4% метионин - 2,1%, аргинин - 4,0%, гистидин - 0,9%, глицин - 11,2%, глутаминовая кислота - 4,2%, аланин - 3,2%, аспарагиновая кислота - 3,0%, серин - 1,6%, тирозин - 1,3%, пролин - 1,2%, таурин - 7,8%, гистидинсодержащие дипептиды - от 2,0 до 4,0% [1, Беседнова, Н.Н. Биологически активная добавка к пище «Моллюскам» (в помощь практическому врачу) / Н.Н. Беседнова, Т.Н. Пивненко, Т.С Запорожец // Методическое пособие для врачей. - Владивосток: ТИНРО-центр. - 2007. - 40 с.].
Способ осуществляется следующим образом.
В эксперименте изучены свойства моллюскама как корректора тестикулярной дисфункции у крыс, индуцированной адаптацией животных к низким температурам. Для этого экспериментальные животные (40 беспородных половозрелых белых крыс-самцов) были разделены на три группы: группу контроля составили интактные крысы (n 10), содержавшиеся в виварии при 18-20°C, крысы второй группы (группа сравнения, n 15) и третьей группы (группа коррекции, n 15) охлаждались в климатокамере «ILKA» при температуре - 15°C по 3 часа ежедневно на протяжении четырех недель с соблюдением адекватных условий влажности и вентиляции. Режим охлаждения был выбран с учетом возникновения в таких условиях в тканях и органах подопытных животных выраженных биохимических и морфологических изменений [2, И.Ю. Саяпина, С.С. Целуйко. Окислительный стресс в предстательной железе на этапах адаптации организма к низким температурам // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - №4. - С.31-34]. Крысы из группы коррекции ежедневно перед охлаждением получали перорально моллюскам в дозе 10 мг/кг массы тела. После окончания эксперимента животных умерщвляли под тиопенталовым наркозом путем декапитации. В качестве объекта исследования были использованы семенники и кровь животных.
Тестикулярную дисфункцию, а также корригирующие эффекты моллюскама оценивали при помощи гистологических, иммуногистохимических (выявление индуцибельной формы NO-синтетазы при помощи моноклональных антител, Lab Vision, США), количественных (программно-аппаратный комплекс для количественного анализа «Видео-Тест-Морфология 5.0», Россия), электронно-микроскопических (трансмиссионный микроскоп Tecnai Spirit Twin, Нидерланды), иммуноферментного анализа (набор для определения концентрации тестостерона в сыворотке крови, Вектор-Бест, Россия), биохимических и статистических методов (Statistica 6.0.).
Результаты способа представлены на чертежах:
Фиг.1 - Семенник. Иммуноцитохимическая реакция на индуцибельную NO-синтетазу:
1а - крысы из группы контроля;
1б - крысы из группы сравнения;
1в - крысы из группы коррекции.
Фиг.2 - Семенник. Фрагмент круглой сперматиды. Электронограмма. Окраска уранилацетатом и цитратом свинца:
2а - крысы из группы сравнения;
2б - крысы из группы коррекции.
Фиг.3 - Семенник. Фрагмент клетки Сертоли. Электронограмма. Окраска уранилацетатом и цитратом свинца:
3а - крысы из группы сравнения;
3б - крысы из группы коррекции.
Фиг.4 - Семенник. Фрагмент клетки Лейдига. Электронограмма. Окраска уранилацетатом и цитратом свинца:
4а - крысы из группы сравнения;
4б - крысы из группы коррекции.
На Фиг.1а показано, что у интактных крыс в клетках эпителиосперматогенного слоя в извитых семенных канальцах присутствуют продукты иммуноцитохимической реакции на индуцибельную NO-синтетазу в виде преципитатов коричневого цвета (поз. 1). На Фиг.1б показано, что после 4-х недель адаптации отмечается выраженное угнетение экспрессии индуцибельной NO-синтетазы в клетках эпителиосперматогенного слоя (поз. 1).
Оксид азота, синтез которого обеспечивает фермент NO-синтетаза, принимает активное участие в регуляции сперматогенеза, обеспечивая гомеостаз специфического микроокружения в извитых семенных канальцах семенников. Кроме того, оксид азота регулирует поддержание целостности специализированных межклеточных контактов, таких как плотные контакты Сертоли-Сертоли, а также контакты между сустентоцитами и сперматидами [3, Lee, N.P. Nitric oxide and cyclic nucleotides: their roles in junction dynamics and spermatogenesis / N.P. Lee, C.Y. Cheng // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2008. - Vol.1. - №1. - P.25-32]. Угнетение экспрессии NO-синтетазы является одной из причин нарушений сперматогенеза в семенниках крыс, обнаруженных при холодовой адаптации.
На Фиг.1 в показано, что в семенниках крыс, получавших во время холодовой адаптации моллюскам, отмечается хорошо выраженная реакция на NO-синтетазу. Цитоплазма сустентоцитов, прелептотенных и пахитенных сперматоцитов, а также удлиненных сперматид содержит продукты реакции на NO-синтетазу в виде преципитатов светло-коричневого цвета (поз. 1).
Восстановление экспрессии NO-синтетазы в семенниках крыс, получавших моллюскам, может быть связано с участием его компонентов в метаболизме данного фермента. Оксид азота образуется в результате окисления L-аргинина кислородом при участии фермента NO-синтетазы [4, Petrovic, V. Antioxidative defence alterations in skeletal muscle during prolonged acclimation to cold: role of L-arginine/NO-producing pathway / V. Petrovic, B. Buzadzic, A. Korac, A. Vasilijevic, A. Jankovic, K. Micunovic, B. Korac // The Journal of Experimental Biology. - 2008. - Vol.211. - P.114-120]. Аргинин составляет 4% сухой массы БАД «Моллюскам», следовательно, дополнительное поступление в организм животных аргинина, являющегося субстратом для синтеза оксида азота, могло привести к усилению экспрессии NO-синтетазы.
На Фиг.2а показано, что после 4-х недель адаптации к низким температурам в цитоплазме круглых сперматид отмечаются дезинтеграция комплекса Гольджи (поз. 1) и вакуолизация митохондрий (поз. 2).
На Фиг.2б показано, что у крыс, получавших моллюскам, в цитоплазме круглых сперматид комплекс Гольджи имеет характерную для интактных крыс полусферическую организацию, представленную корковым и мозговым веществом (поз. 1), митохондрии не вакуолизированы (поз. 2).
На Фиг.3а показано, что после 4-х недель адаптации к низким температурам в цитоплазме клеток Сертоли встречаются единичные митохондрии небольших размеров (поз. 1), имеются ультраструктурные признаки истощения цитоплазмы клеток Сертоли в виде вакуолизации (поз. 2) и просветления клеточного матрикса.
На Фиг.3б показано, что у крыс, получавших моллюскам, в цитоплазме клеток Сертоли находятся многочисленные митохондрии (поз. 1), отсутствует вакуолизация цитоплазмы, клеточный матрикс имеет умеренную электронную плотность. Дополнительное поступление в организм животных заменимых, частично заменимых и незаменимых аминокислот, входящих в состав моллюскама [1, Беседнова, Н.Н. Биологически активная добавка к пище «Моллюскам» (в помощь практическому врачу) / Н.Н. Беседнова, Т.Н. Пивненко, Т.С Запорожец // Методическое пособие для врачей. - Владивосток: ТИНРО-центр. - 2007. - 40 с.], предупреждает развитие «пластической недостаточности» клеток Сертоли, способствует полноценному протеканию процессов внутриклеточной регенерации сустентоцитов, тем самым обеспечивая структурную и функциональную основу для нормально протекающего сперматогенеза.
На Фиг.4а показано, что после 4-х недель адаптации в цитоплазме клеток Лейдига имеют место ультраструктурные признаки функционального напряжения. Отмечается размытость крист в митохондриях (поз. 1), вакуолярные элементы агранулярной эндоплазматической сети резко расширены (поз. 2).
На Фиг.4б показано, что у крыс, получавших моллюскам, митохондрии в цитоплазме клеток Лейдига имеются хорошо выраженные везикулярные кристы с четкими контурами (поз. 1), вакуолярные элементы агранулярной эндоплазматической сети не расширены.
Результаты количественного исследования генеративной активности семенников (табл.1), показали, что после 4-х недель адаптации в семенниках крыс по сравнению с контролем диаметр извитых семенных канальцев уменьшается в среднем на 22 мкм (p<0,05), относительное количество прелептотенных сперматоцитов уменьшается по сравнению с контролем на 13,9%, пахитенных сперматоцитов на 18,8%, круглых сперматид на 18,2% и удлиненных сперматид на 25,03% (p<0,05).
Результаты количественного исследования инкреторной активности семенников (табл.1), показали, что после 4-х недель адаптации в интерстициальной соединительной ткани семенников крыс по сравнению с контролем на 19% уменьшается относительное количество клеток Лейдига (p<0,05), увеличивается диаметр ядра и цитоплазмы клеток Лейдига (p<0,05), что указывает на развитие компенсаторной гипертрофии.
В семенниках крыс, получавших моллюскам, диаметр семенных канальцев, относительное количество прелептотенных сперматоцитов, пахитенных сперматоцитов, круглых и удлиненных сперматид, статистически значимо выше, чем в группе сравнения (p<0,05). Индекс сперматогенеза, характеризующий генеративную активность семенников, у крыс, получавших моллюскам, не отличается от крыс из группы контроля.
Таким образом, результаты сравнительного анализа количественных данных показали, что БАД «Моллюскам» предупреждает нарушения сперматогенеза, индуцированные адаптацией организма животных к низким сезонным температурам, предотвращает развитие компенсаторной гипертрофии и гибель клеток Лейдига.
Результаты биохимического исследования показали (табл.2), что после 4-х недель адаптации к низким температурам, в сыворотке крови крыс и тканях семенника развивается окислительный стресс. Содержание гидроперекисей липидов в тканях семенника повышено на 68%, диеновых конъюгатов на 13%, а содержание витамина Е снижено на 18% (p<0,05). В сыворотке крови содержание диеновых конъюгатов повышено на 76%, гидроперекисей липидов и малонового диальдегида на 25%, в то время как содержание витамина Е снижено на 34% (p<0,05). Окислительный стресс различной этиологии является основной причиной тестикулярной дисфункции. Окислительный стресс нарушает процессы пролиферации и дифференцировки сперматогенных клеток, индуцирует их гибель путем апоптоза, является основной причиной дегенеративных изменений и гибели клеток Лейдига путем апоптоза [5, Fujii, j. Cooperative function of antioxidant and redox systems against oxidative stress in male reproductive tissues / J. Fujii, Y. Iuchi, S. Matsuki, T. Ishii // Asian Journal of Andrology. - 2003. - Vol. 5. - P.231-242].
В сыворотке крови крыс, получавших моллюскам (табл.2), содержание малонового диальдегида ниже, чем у животных из группы сравнения (p<0,05), концентрация витамина Е выше, чем у крыс из сравнения (p<0,05). В тканях семенника у крыс, получавших моллюскам, снижается содержание диеновых конъюгатов (p<0,05). Свободные аминокислоты в комплексе с дипептидами, входящие в состав моллюскама, представляют собой комплекс антиокислителей, выполняющих роль скэвенджеров свободных радикалов [1, Беседнова, Н.Н. Биологически активная добавка к пище «Моллюскам» (в помощь практическому врачу) / Н.Н. Беседнова, Т.Н. Пивненко, Т.С Запорожец // Методическое пособие для врачей. - Владивосток: ТИНРО-центр. - 2007. - 40 с.]. Дополнительное введение молекул с антиоксидантной активностью уменьшает расход витамина E как представителя антиоксидантной системы организма, приводя к увеличению его концентрации в сыворотке крови. Содержание гидроперекисей липидов в тканях семенника остается повышенным, а содержание витамина Е в тканях семенника меньше контрольных значений (p<0,05), что может быть обусловлено высокой интенсивность стероидогенеза при адаптации животных к низким температурам.
Пример 1.
В течение четырех недель одна группа крыс подвергалась охлаждению в климатокамере «ILKA» при температуре -15°C по 3 часа ежедневно. В это же время другая группа крыс ежедневно на протяжении четырех недель перед охлаждением получала перорально вместе с пищей моллюскам в дозе 10 мг/кг массы тела. После завершения эксперимента животных умерщвляли путем декапитации, функциональную активность семенников изучали при помощи гистологических, количественных, иммуноцитохимических и электронно-микроскопических методов, в сыворотке крови и тканях семенника определяли содержание продуктов перекисного окисления липидов и витамина E, методом иммуноферментного анализа определяли концентрацию тестостерона в сыворотке крови.
Морфометрическое исследование показало, что после 4-х недель адаптации в семенниках крыс уменьшается диаметр извитых семенных канальцев (табл.1). В семенниках крыс, получавших моллюскам, диаметр семенных канальцев статистически значимо больше, чем у крыс, которым не проводилась коррекция (табл.1).
Изучение цитологического профиля сперматогенеза показало, что после 4-х недель адаптации к низким температурам в семенниках крыс уменьшается относительное количество прелептотенных сперматоцитов, пахитенных сперматоцитов, круглых и удлиненных сперматид статистически значимо выше, чем у крыс, не получавших  коррекцию (табл.1).
Количественная оценка иммуноцитохимической реакции на индуцибельную NO-синтетазу показала, что после 4-х недель адаптации оптическая плотность продуктов реакции в эпителиосперматогенном слое статистически значимо снижена по сравнению с контролем (табл.1), в то время как оптическая плотность продуктов реакции у крыс, получавших моллюскам, достоверно выше (табл.1).
Электронная микроскопия показала, что после 4-х недель адаптации в извитых канальцах появляются клетки Сертоли с ультраструктурными признаками истощения цитоплазмы в виде вакуолизации, просветления клеточного матрикса, уменьшения количества митохондрий. В семенниках крыс, получавших моллюскам, в цитоплазме клеток Сертоли присутствуют многочисленные митохондрии, клеточный матрикс имеет среднюю электронную плотность, вакуолизация отсутствует.
После 4-х недель адаптации в цитоплазме первичных сперматоцитов, вступивших в мейоз, и в цитоплазме круглых сперматид отмечались вакуолизация митохондрий и дезинтеграция комплекса Гольджи. У крыс, получавших моллюскам, в цитоплазме пахитенных сперматоцитов и круглых сперматид митохондрии не вакуолизированы, комплекс Гольджи имеет полусферическую организацию, представлен хорошо развитым корковым и мозговым веществом.
Количественный анализ инкреторной активности семенника показал, что после 4-х недель адаптации в интерстициальной ткани семенника уменьшается относительное количество клеток Лейдига (табл.1), однако уровень тестостерона находится на уровне интактных крыс (табл.1). Структурной основой увеличения концентрации тестостерона в условиях уменьшения популяции интерстициальных гландулоцитов является компенсаторная гипертрофия клеток Лейдига (табл.1), электронная микроскопия выявила ультраструктурные признаки функционального напряжения клеток Лейдига. В семенниках крыс, получавших моллюскам, относительное количество клеток Лейдига статистически значимо выше, чем у крыс, не получавших коррекцию, ультраструктурная характеристика клеток Лейдига соответствует интактным крысам.
Таблица 1
Количественные показатели функциональной активности семенников (M±m)
Показатель
Группа контроля
Группа сравнения
Группа коррекции
Диаметр канальцев (мкм)
277,86±1,27
255,76±1,08 p<sub>1</sub><0,05
267,98±1,26 p<sub>2</sub><0,05
Индекс сперматогенеза (усл. ед.)
3,3±0,45
3,28±0,44 p<sub>1</sub>>0,05
3,38±0,47 p<sub>2</sub>>0,05
Прелептотенные сперматоциты (число)
66,03±1,29
56,83±1,15 p<sub>1</sub><0,05
70,65±2,25 p<sub>2</sub><0,05
Пахитенные сперматоциты (число)
81,13±1,78
65,83±1,28 p<sub>1</sub><0,05
76,75±2,54 p<sub>2</sub><0,05
Круглые сперматиды (число)
199,13±3,68
162,93±3,31 p<sub>1</sub><0,05
202,75±5,7 p<sub>2</sub><0,05
Удлиненные сперматиды (число)
219,23±4,47
163,8±3,65 p<sub>1</sub><0,05
246,75±7,45 p<sub>2</sub><0,05
Диаметр ядра клеток Лейдига (мкм)
6,23±0,02
6,57±0,03 p<sub>1</sub><0,05
6,40±0,02 p<sub>2</sub>>0,05
Диаметр цитоплазмы клеток Лейдига (мкм)
8,31±0,03
9,04±0,04 p<sub>1</sub><0,05
8,29±0,09 p<sub>2</sub><0,05
Относительное количество клеток Лейдига (число)
10,9±0,28
8,84±0,27 p<sub>1</sub><0,05
12,5±0,37 p<sub>2</sub><0,05
Тестостерон (нмоль/л)
32,36±2,03
32,17±0,83 p<sub>1</sub>>0,05
30,57±2,27 p<sub>2</sub>>0,05
NO-синтетаза, единицы оптической плотности
0,272±0,009
0,199±0,009 p<sub>1</sub><0,05
0,248±0,012 p<sub>2</sub><0,05
Здесь и в табл.2: p<sub>1</sub> - уровень доверительной вероятности при сравнении показателей группы контроля и группы сравнения; p<sub>2</sub> - уровень доверительной вероятности при сравнении показателей группы коррекции и группы сравнения.
Биохимическое исследование показало, что после 4-х недель адаптации в сыворотке крови крыс повышается уровень малонового диальдегида, снижается содержание витамина Е. (табл.2). В сыворотке крови крыс, получавших моллюскам, содержание малонового диальдегида достоверно ниже, а концентрация витамина Е выше, чем у крыс, которым не проводилась коррекция (табл.2). В сыворотке крови крыс из группы сравнения статистически значимо снижается уровень витамина E, в сыворотке крови крыс из группы коррекции уровень витамина E достоверно выше, чем в группе сравнения (табл.2). В тканях семенника у крыс, получавших моллюскам, снижается содержание диеновых конъюгатов (табл.2).
Таблица 2
Содержание основных продуктов перекисного окисления липидов и витамина Е в сыворотке крови и ткани семенников (M±m)
Группы животных
ДК (нмоль/г)
ГЛ (нмоль/г)
МДА (нмоль/л)
Витамин E (мкг/г)
Группа контроля
Сыворотка крови
27,2±3,0
26,06±1,46
4,84±0,27
51,12±4,11
Группа сравнения
48,9±3,4 p<sub>1</sub><0,05
32,76±1,81 p<sub>1</sub><0,05
6,06±0,34 p<sub>1</sub><0,05
32,48±2,29 p<sub>1</sub><0,05
Группа коррекции
44,96±2,31 p<sub>2</sub>>0,05
31,05±2,79 p<sub>2</sub>>0,05
4,97±0,24 p<sub>2</sub><0,05
39,77±2,15 p<sub>2</sub><0,05
Семенник
Группа контроля
69,98±5,44
25,81±0,9
-
52,63±3,81
Группа сравнения
78,9±5,03 p<sub>1</sub><0,05
43,35±2,81 p<sub>1</sub><0,05
-
32,51±0,82 p<sub>1</sub><0,05
Группа коррекции
74,5±3,4 p<sub>2</sub><0,05
43,85±2,58 p<sub>2</sub>>0,05
-
41,4±2,19 p<sub>2</sub>>0,05
ДК - диеновые конъюгаты, ГЛ - гидроперекиси липидов, МДА - малоновый диальдегид.
Результаты морфологического, количественного и ультраструктурного исследования показывают, что моллюскам предупреждает нарушения сперматогенеза, индуцированные адаптацией организма животных к низким сезонным температурам. На фоне приема моллюскама отмечается количественное и качественное восстановление сперматогенных клеток, относящихся к разным популяциям, восстанавливается экспрессия NO-синтетазы в клетках эпителиосперматогенного слоя, нормализуется ультраструктура клеток Сертоли. Прием моллюскама предотвращает гибель клеток Лейдига и развитие компенсаторной гипертрофии оставшихся клеток. Таким образом, биостимулирующие эффекты моллюскама в совокупности с умеренным антиоксидантным действием предотвращают развитие тестикулярной дисфункции у крыс при адаптации к низким температурам.
Технический результат изобретения заключается в коррекции моллюскамом тестикулярной дисфункции, вызванной адаптацией к низким сезонным температурам, и повышении резистентности организма животных к неблагоприятным факторам среды.
Источники информации
1. Беседнова, Н.Н. Биологически активная добавка к пище «Моллюскам» (в помощь практическому врачу) / Н.Н. Беседнова, Т.Н. Пивненко, Т.С Запорожец // Методическое пособие для врачей. - Владивосток: ТИНРО-центр. - 2007. - 40 с.
2. И.Ю. Саяпина, С.С. Целуйко. Окислительный стресс в предстательной железе на этапах адаптации организма к низким температурам // Сибирский медицинский журнал. - 2011 - №4. - С.31-34.
3. Lee, N.P. Nitric oxide and cyclic nucleotides: their roles in junction dynamics and spermatogenesis / N.P. Lee, C.Y. Cheng // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2008. - Vol. 1, №1. - P.25-32.
4. Petrovic, V. Antioxidative defence alterations in skeletal muscle during prolonged acclimation to cold: role of L-arginine/NO-producing pathway / V. Petrovic, B. Buzadzic, A. Korac, A. Vasilijevic, A. Jankovic, K. Micunovic, B. Korac // The Journal of Experimental Biology. - 2008. - Vol.211, P.114-120.
5. Fujii, J. Cooperative function of antioxidant and redox systems against oxidative stress in male reproductive tissues / J. Fujii, Y. Iuchi, S. Matsuki, T. Ishii // Asian Journal of Andrology. - 2003. - Vol.5. - P.231-242.