Активность алкогольокисляющих ферментных систем миокарда при хронической интоксикации этанолом

В. А. ПОРОДЕНКО, Е. И. БЫСТРОВА, А. В. ИЛЬИНА

АКТИВНОСТЬ АЛКОГОЛЬОКИСЛЯЮЩИХ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ МИОКАРДА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ЭТАНОЛОМ

Кафедра судебной медицины Кубанского государственного медицинского университета

Медико-демографические исследования показывают, что значительная часть проблем здоровья связана с употреблением алкоголя, приводящим к негативным социальным и медицинским последствиям, к физической и нравственной деградации человека [22].

Изучение влияния этанола на сердечно-сосудистую систему в последние десятилетия имеет приоритетное направление в различных отраслях медицинских наук [3—7, 9]. Особое внимание уделяется проблеме хронического алкоголизма (ХА), которая приобрела как социальную, так и медицинскую значимость. Количество судебно-медицинских вскрытий трупов лиц, страдающих хроническим алкоголизмом, прогрессивно увеличивается, что подчеркивает необходимость его дальнейшего научного изучения [10].

Смертность от последствий хронической алкогольной интоксикации и связанное с ней расстройство здоровья составляют все более значимую долю в общей смертности населения [25].

Отмеченная во многих исследованиях тенденция к постоянному росту кардиомиопатий зачастую имеет в своей основе хроническую алкоголизацию [11, 13, 18, 19, 23].

Системный характер заболевания, обусловленного интоксикацией этиловым алкоголем, позволил выделить понятие «алкогольная болезнь» в самостоятельную нозологическую единицу [8, 14, 15]. В Российской Федерации в конце 20 — начале 21-го века ежегодно алкоголем была обусловлена преждевременная смерть от 400 до 700 тысяч человек [12]. По статистической отчетности 2003 года, 18% мужского и 5% женского населения России регулярно употребляет в большом количестве спиртные напитки, из них пятая часть страдает алкоголизмом и официально состоит на учете у наркологов — 2,2 миллиона человек, т. е. примерно один из каждых 50 человек в стране [20].

Углубление знаний в области этиологии и патогенеза алкогольной болезни, а также разработка достоверных морфологических критериев диагностики острых и хронических отравлений алкоголем названы в качестве приоритетных задач судебной медицины на 4-м Всероссийском съезде судебных медиков [21].

Целью данного исследования явилось изучение гистохимической активности алкогольокисляющих ферментных систем (АОФС) — алкогольдегидрогеназной (АДГ), микросомальной этанолокисляющей, маркерным ферментом которой является никотонамид аденин-динук-леотидфосфат-диафораза (НАДФ-Д), и каталазно-перок-сидазной (КТ-ПО) — в миокарде скоропостижно умерших лиц для расширения возможностей судебно-медицинской диагностики хронической алкогольной интоксикации. Преимуществом гистохимических методов является возможность одновременного изучения активности ферментов и патоморфологии исследуемого органа.

Материалы и методы исследования

На материале практических судебно-медицинских экспертиз трупов, выполненных на кафедре судебной медицины, проведено комплексное исследование трупов лиц, умерших от хронической алкогольной интоксикации (ХАИ), исходом которой явилась алкогольная кардиомиопатия (АКМП). В группу исследования вошли 57 наблюдений, 89% из которых составляли лица мужского пола со средним возрастом 45—50 лет.

Активность АОФС изучали и с помощью гистохимических исследований, которые выполняли сразу после исследования трупов. Давность наступления смерти, как правило, не превышала 1—1,5 суток.

В качестве контрольной группы изучены 35 трупов лиц, смерть которых наступила от механической травмы, признаки алкогольной интоксикации отсутствовали.

Изучен комплекс патоморфологических изменений в сердце (макро- и микроскопическое исследование), а также прослежена с помощью постановки гистохимических реакции динамика активности АОФС в миокарде. Кусочки сердца размером 1,0х 1,0х 0,5 см вырезали в каждом случае из четырех отделов сердца: верхушки, передней стенки левого желудочка, задней стенки левого желудочка и перегородки.

Макроскопическое исследование сердца проводили по методике А. И. Абрикосова [1], при атеросклеротическом поражении венечных артерий их степень учитывали по методике Г. Г. Автандилова [2]. Патоморфологию при АКМП учитывали в соответствии с данными В. Г. Цыпленковой [24]. Гистохимическую реакцию на АДГ проводили методом Hess, Scarpelli, Pears [26] в модификации Т. П. Перовой (удостоверение на рацпредложение № 512 от 12.04.83 г.). Реакцию на маркерный фермент МЭОС — НАДФ-Д выполняли по Hess, Scarpelli, Pears [26]. О ферментативной активности судили по интенсивности формазановой реакции с красителем — нитросиним тетразолием. Специфичность реакции в нашей методике была достигнута введением кратковременной предварительной фиксации в холодном ацетоне, оптимальным подбором концентрации кофактора, субстрата, соли тетразолия, рН инкубационной среды [17].

Этапы приготовления препаратов для проведения гистохимических реакций: 1) вырезали стандартные блоки тканей внутренних органов толщиной не более 3—4 мм; 2) вырезанные блоки ткани переносили на полоски фильтровальной бумаги, которые погружали на 10 секунд в ацетон, охлажденный жидким азотом (последняя процедура проводится в камере криостата при температуре -25°С); 3) оставляли охлажденным таким образом блок тканей в криостате на 10—15 минут, а затем помещали его с помощью тонкой подложки из ткани печени на металлический держатель, постоянно хранившийся в камере криостата; 4) изготавливали криостатные срезы толщиной 10 мкм, расправляли их

УДК 616.89-008.441.13-06:616.127

на охлажденном стекле в капле холодного ацетона и оставляли в камере криостата на 10 минут; 5) готовые препараты сначала подсушивали в камере криостата, а затем на воздухе и помещали для гистохимической окраски в соответствующую инкубационную среду, подогретую до 37° С; 6) после инкубации в термостате срезы на стеклах осторожно промывали в дистиллированной воде и заключали в желатиновый гель стандартной прописи.

Активность КТ-ПО выявляли с помощью разработанного на кафедре ортодианизидинового метода [6], который предусматривает: 1) быстрое получение блоков тканей; 2) фиксацию их в охлажденном до

4 градусов 4%-ном растворе формальдегида, забуфе-ренном ацетатом кальция (1,5%) при постоянном кондиционировании среды в течение 3 часов; 3) промывку блоков в 7,5%-ном растворе охлажденной сахарозы; 4) изготовление серийных криостатных срезов толщиной 10 мкм при температуре -25° С; 5) инкубацию в течение 30 минут свободных срезов в подогретой до 37° С смеси:

5 мл этилового спирта, 20 мг ортодианизидина, 4,9 мл буфера трис-Н рН 9,0, 0,2 мл 3%-ного раствора перекиси водорода; 6) промывку в нескольких порциях водопроводной воды и постфиксацию в кальций-формоле.

Оценку активности АОФС проводили методом количественной морфометрии продукта гистохимических реакций. Ввод микроскопических изображений срезов миокарда в компьютер осуществляли с помощью платы фрейм-граббера «Октет 512», установленной на ПЭВМ 1ВМ 286-12.16 PX-116 G, и телеустановки ПТУ-61, сопряженной с МБИ-15. Контроль за поступлением телевизионного сигнала вели по экрану отдельного монитора. Ввод телесигналов выполняли программными пакетами записи и анализа графических изображений «IML» и «NASA».

Для выполнения количественной морфометрии и первичной статистической обработки полученных данных применяли специально разработанную на кафедре под руководством В. А. Породенко компьютерную программу «Morfolog», которая позволяет вычислять площадь и оптическую плотность (ОП) продуктов гистохимических реакций по 16 и 256 градациям цвета. Сканирование изображений осуществляли по 16 цветовым градациям ОП — с 0 по 15. Для АДГ и НАДФ-Д ОП формазана находилась в пределах шести градаций — от 0 до 5. Компьютерная математическая обработка данных морфометрии велась с десятичным логарифмированием.

Всего изготовлено и изучено 720 гистохимических препаратов. Полученные цифровые данные подвергнуты компьютерной статистической обработке для вычисления средней арифметической (М), средней ошибки средней арифметической (1Т1), показателя степени достоверности (р).

Параллельно производили окраску срезов тканей гематоксилин-эозином, суданом 3 и суданом черным В стандартными методиками.

Результаты исследований и их обсуждение

При гистохимическом изучении состояния алкоголь-окисляющих ферментных систем, в частности алко-гольдегидрогеназы (АДГ), и анализе результатов компьютерной количественной морфометрии выявлено, что при смерти от АКМП в различных отделах сердца активность фермента была неравномерной. Приняв показатели формазановой реакции в передней стенке

левого желудочка за 100%, определили, что в верхушке они составляли 92,6%, в задней стенке — 97,5%, а в перегородке — 95%. Ферментативная активность в области верхушки была снижена по сравнению с передней стенкой левого желудочка на 7,4%, в задней стенке и перегородке — на 2,5% и 5% соответственно.

При изучении качественного состояния формазана обнаружена устойчивая закономерность. Так, в нулевой градации ОП формазана в передней стенке левого желудочка, верхушке, задней стенке левого желудочка и перегородке показатели составляли 100, 50%, 75%, 50% соответственно. В 1-й градации ОП — 100%, 57%, 71%, 57%, во 2-й — 100%, 72,4%, 89,6%, 75%. Оптическая плотность в градациях с 0 по 2 в верхушке и перегородке была равной, несколько выше — в задней стенке левого желудочка по отношению к передней его стенке. В градациях с 3 по 5 оптическая плотность формазана была неравномерной; она составила 100%, 87,5%, 112,5%, 106%. В 4 и 5 градациях продукт оптической плотности равномерно повышался — 100%, 102,8%, 97,1%, 111,4% и 100%, 147,6%, 114,2%, 138% соответственно.

Исследование НАДФ-Д показало, что общая активность фермента (средние абсолютные величины) в верхушке сердца, передней стенке левого желудочка, задней стенке левого желудочка и перегородке составила 1,29±0,08 — 1,30±0,08 — 1,24±0,10 — 1,22±0,10 соответственно (таблица). Приняв показатели форма-зановой реакции в передней стенке левого желудочка за 100%, определили их в верхушке, задней стенке левого желудочка, перегородке: 99,2%, 95,3%, 93,8% соответственно. Таким образом, наибольшей по сравнению с другими отделами сердца активность НАДФ-Д была в передней стенке левого желудочка и, соответственно, снижалась в верхушке — 0,8%, задней стенке левого желудочка — 4,7%, перегородке — 6,2%.

При анализе качественного состояния формазана оказалось, что выявленная закономерность его неравномерного структурного распределения в реакциях на АДГ наблюдалась и с НАДФ-Д. В нулевой градации ОП формазана в верхушке, задней стенке левого желудочка и перегородке составляла по 150% и 100% соответственно, в 1-й и во 2-й градациях — 111% и 100%, в третьей — 92,5% и по 87,5% соответственно. Колебания же показателей формазана наименьшей оптической плотности в различных отделах сердца были весьма незначительными — 95%, 100%, 85%, 87,5% и 112,5%, 100%, 95,8%, 100% (4 и 5 градации ОП соответственно).

Общая активность КТ-ПО в различных отделах сердца составляла 1,98 ±0,1 — 1,91±0,10 — 1,90±0,10 — 2,14±0,10 (таблица). Приняв показатели ОП продукта в передней стенке левого желудочка за 100%, определили их в верхушке, задней стенке левого желудочка, перегородке: 103,6%, 99,4%, 112% соответственно. Активность КТ-ПО была повышена по сравнению с активностью в передней стенке левого желудочка и составила: в верхушке — 3,6%, задней стенке левого желудочка — 0,6%, перегородке — 12%. С понижением плотности количественные значения продукта гистохимической реакции на КТ-ПО прогрессивно нарастали и составили в градации 3—4: в верхушке, задней стенке левого желудочка и перегородке — 104,9%, 96,2%, 150% соответственно. В 5—6 градациях продукт реакции превышал свои показатели на 12,5% в верхушке и задней стенке левого желудочка и на 50% в области верхушки. Такая же закономерность присутствовала

Показатели общей активности АОФС в миокарде

Группы наблюдений Отдел сердца Общая активность АОФС

АДГ % к К НАДФ-Д % к К КТ-ПО % к К

Контроль (К) Верхушка 1,24±0,1 - 1,17±0,1 - 2,02±0,1 -

Передняя стенка 1,16±0,7 - 1,08±0,1 - 1,06±0,05 -

Задняя стенка 1,17±0,1 - 1,39±0,1 - 1,68±0,3 -

Перегородка 1,20±0,1 - 1,27±0,1 - 1,29±0,3 -

АКМП Верхушка 1,13±0,09 91,1 1,29±0,08 110,2 1,98±0,10 98

Передняя стенка 1,22±0,12 104 1,30±0,08 140,4 1,91±0,10 180,1

Задняя стенка 1,19±0,10 101 1,24±0,10 89,2 1,90±0,10 113

Перегородка 1,16±0,10 96,6 1,22±0,10 96 2,14±0,10 16б,8

и в 7—8 градациях ОП продукта: превышала на 22%, 27,7%, 88% соответственно в верхушке, задней стенке левого желудочка и перегородке. В 9 градации ОП продукта несколько снизила свои показатели, исключение составили показатели в области верхушки: они повысились на 85,7%, в остальных отделах ОП снизилась: в задней стенке левого желудочка — на 13,5% и в области верхушки — на 45,2%.

Анализируя данные таблицы, можно сделать вывод, что показатели общей активности всех АОФС миокарда были наибольшими в передней стенке левого желудочка по сравнению с другими отделами, что косвенно свидетельствует о готовности к токсическому воздействию этанола отделов левого желудочка, в частности его передней стенки. Это объясняется характером кровоснабжения сердца, которое осуществляется двумя венечными артериями — правой и левой. Через правую венечную артерию проходит 15% всей крови; через левую — 85% крови, которая поступает к сердечной мышце и снабжает кровью переднюю стенку левого желудочка практически на 100%.

Выводы

Учитывая вышеизложенное, можно сделать вывод, что при ХАИ, исходом которой является алкогольная кардиомиопатия, на гистологическое и гистохимическое исследования целесообразнее всего брать кусочки сердца из левых отделов сердца, в частности, из передней стенки левого желудочка, где наиболее часто развивается энергетический дефицит и возникают метаболические и структурные нарушения.

По данным количественной морфометрии нами разработаны графические модели состояния АДГ, НАДФ-Д, КТ-ПО в случаях алкогольной кардиомиопа-тии на фоне хронической алкогольной интоксикации. Данные графические модели можно использовать в качестве стандартов для сравнительного анализа гистохимических данных, поскольку линейная зависимость при АКМП имеет характерный тип кривой. Комплексное патоморфологическое и гистохимическое исследование дает возможность оценить морфофункциональное состояние сердца, уточнить танатогенез и объективно сделать экспертные выводы о причине наступления смерти.

Поступила 17.04.2008

ЛИТЕРАТУРА

1. Абрикосов А. И. Техника патолого-анатомических вскрытий трупов. М.-Л.: Медгиз, 1939. 200 с.

2. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина, 1990. 384 с.

3. Вихерт А. М., Цыпленкова В. Г. Алкогольная кардиомио-патия — фактор риска внезапной смерти // Арх. патологии. 1984. № 1. С. 14—21.

4. Гулямов М. Г., Хасанов И. Р., Коломиец В. Ф., Мамкин А. Б. Алкоголизм. Актуальные вопросы клиники, патогенеза и терапии алкогольных заболеваний: Метод. пособие для врачей-нарколо-гов. Душанбе: Дониш, 1978. 144 с.

5. Ерохин Ю. А. Поражение сердца при хронической алкогольной интоксикации // Вестник новых мед. технологий. 2003. Т. 10. № 4. С. 19—20.

6. Капустин А. В. Изменения сердечных мышечных волокон при скоропостижной смерти от ишемической болезни сердца и остром отравлении алкоголем // Судеб.-мед. экспертиза. 1977. № 4. С. 34—37.

7. Капустин А. В. Микроскопические изменения миокарда и их значение для судебно-медицинской диагностики // Суд.-мед. экспертиза, 2006. № 6. С. 3—6.

8. Моисеев В. С. Алкогольная болезнь. Поражение внутренних органов при алкоголизме. М.: из-во университета Дружбы народов, 1990. 129 с.

9. Митин К. С., Науменко Б. Г. Ультраструктурные показатели морфофункционального состояния сердца при острых и хронических алкогольных интоксикациях // Суд.-мед. экспертиза, 1990. № 4. С. 36—40.

10. Николаев О. В., Коцюрбий Е. А., Дмитриева О. А. Алкогольный гепатоз в патогенезе печеночной энцефалопатии // Суд.-мед. экспертиза, 2007. № 6. С. 3—6.

11. Немцов А. В., Симонова О. Н. Потребление алкоголя и продолжительность жизни в России // Матер. съезда. М., 1995. С. 787—788.

12. Немцов А. В. Алкогольная смертность в регионах России // Население и общество. Информ. бюллетень Центра демографии и экологии человека Института народнохозяйственного прогнозирования РАН, 2003. № 78. С. 1—2.

13. Пауков В. С., Лебедев С. П. Алкогольная кардиомиопатия// Итоги науки и техники. Сер.: Патологическая анатомия ВИНИТИ. 1985. Т. 5. С. 100—136.

14. Пауков В. С., Угрюмов А. И. Медико-биологические проблемы алкоголизма. М., 1988. С. 92—97.

15. Пауков В. С., Угрюмов А. И. Сер. «Медицина». Алкогольная болезнь. ВИНИТИ. 1997. № 5. С.1—4.

УДК 616.831 — 001.34:616 — 084

16. Породенко В. А., Перова Т. П., Резников А. Ю. Способ гистохимического выявления каталазы и пероксидазы как диагностического показателя алкогольной интоксикации: Информ. письмо. Краснодар, 1987. 6 с.

17. Породенко В. А. Состояние эта нолокисляющих ферментных систем при смертельных отравлениях алкоголем // Судебномедицинская экспертиза. 1997. № 3. С. 15—18.

18. Породенко В. А. К вопросу о путях танатогенеза алкогольной кардиомиопатии // Мат. 13-го пленума Всерос. общества суд. медиков. 1998. С. 48—49.

19. Пурдяев Ю. С., Алисеевич В. И., Алексеевских Ю. Г. Показатели массы и липидов отделов сердца трупов при хронической кардиомиопатии и отравлении этанолом // Судеб.-мед. экспертиза. 1992. № 4. С. 26—29.

20. Ржаницына Л. С. Трезвая экономика (Экономическая модель противодействия алко- и наркозависимости). М.: ООО «Сол-тэкс» при участии ООО «Невский простор», 2005. 96 с.

21. Томилин В. В., Капустин А. В. О наиболее актуальных научных проблемах современной судебной медицины // Проблемы идентификации в теории и практике судебной медицины: Матер. 4-го Всерос. съезда суд. мед. Ч. 1. М.: Владимир, 1996. С. 5—6.

22. Тапилина В. С. Качество жизни населения и потребление алкоголя в современной России // Журнал «ЭКО». 2005. № 9. С. 15—29.

23. Новоселов В. П., Савченко С. В., Хамович О. В. Патоморфология миокарда в диагностике отравлений этанолом и его метаболитами: Монография. Новосибирск, 2005. 170 с.

24. Цыпленкова В. Г., Шольц Д. Н. Критический анализ экспериментальных моделей алкогольной кардиомиопатии // Пат. архив, 11, 79, TL, 1988.

25. Энтин Г. М. Алкогольная и наркотическая зависимость: Практическое руководство для врачей / Г. М. Энтин, А. Г. Гофман, А. П. Музыченко и др. М.: Медпрактика. М., 2002. С. 5—24.

26. Hess R., Scarpelli D., Pearse A. G. E. The cytochemical localization of pyridine nucleotide-linked dehydrogenase. Nature., 1958, Vol. 181. Р. 1531—1532.

V. A. PORODENKO, E. I. BYSTROVA, A. V. ILINA

ACTIVITY ALCOHOLOXIDING FERMENTS SYSTEMS OF THE MYOCARDIUM FROM CHRONIC ALCOHOLIC INTOXICATION

Studied distribution to activities alcoho-ldehydrogenase, mikrosamalinaya etanoloxiding and katalazno-perocsidaznye alcoholoxidase ferments systems of the myocardium in four its divisions near death from chronic alcoholic intoxication. It is installed that top activity she reached in front wall left gastric. On this base is made conclusion that reasonable to slice for gistochemical and gistological study bit heart from front wall left gastric. Gistochemical study enables to value the morfofunkcional condition of the heart, elaborate tanatogenez, can be it is used for judicial-medical diagnostics chronic alcoholic intoxication.

А. А. СТАРОДУБЦЕВ, А. И. СТАРОДУБЦЕВ

ВТОРИЧНАЯ НЕМЕДИКАМЕНТОЗНАЯ ПРОФИЛАКТИКА

_

ТРАВМАТИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ

Кафедра неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики Ставропольской государственной медицинской академии

Лечение последствий черепно-мозговой травмы (ЧМТ), в том числе и легкой, — сложная и порой трудно решаемая проблема. Обусловлено это тем, что на ранней стадии заболевания, в особенности после сотрясения головного мозга (СГМ), всерьез эта проблема не воспринималась, так как считалось, что это самая легкая, обратимая форма закрытой ЧМТ, при которой достаточным является проведение симптоматической терапии, а для профилактики возможных поздних осложнений — проведение сосудистой и метаболической терапии [4, 6, 7, 8, 14, 15, 18].

В последние годы убедительно доказано [3, 11, 16], что СГМ целесообразно относить к легким диффузным аксональным повреждениям мозга, при которых развиваются ультраструктурные, цитохимические, биохимические и другие изменения, преимущественно в синапсах и аксонах, которые приводят в отдаленном периоде к новой неустойчивой организации нервной деятельности и, в первую очередь, к нарушению интегративной деятельности мозга и обусловливают формирование травматической энцефалопатии [7, 8, 10, 15].

Лечение ТЭ — процесс длительный, многогранный, который должен учитывать стадию заболевания, ведущие ее синдромы, степень компенсации и многие

другие факторы. В лечении ТЭ преимущественно используется масса разнообразных медикаментозных препаратов [1, 5, 12, 13, 17], что не только приводит к различным осложнениям подобной терапии (аллергия, непереносимость), но и тесно связано с фармако-эко-номическими проблемами (высокая стоимость современных медикаментозных препаратов с необходимостью их длительного применения).

Поэтому целью исследования была вторичная профилактика ТЭ с использованием немедикаментозных методов лечения (чжень-цзю, су-джок и аурикуло-терапия) с оценкой полученных результатов.

Пациенты и методы исследования

В исследовании участвовало 130 больных молодого возраста, перенесших СГМ и лечившихся в нейрохирургическом, неврологическом отделениях МУЗ 4-я ГКБ и поликлиниках города Ставрополя.

Критериями включения больных в исследование были: возраст больных (16—45 лет), наличие в анамнезе перенесенного СГМ (14—15 баллов по шкале комы Глазго), достаточный срок посттравматическо-го периода (не менее 6 месяцев), подтвержденный