СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ПРОБ ВОДЫ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD FOR BIOTESTING WATER SAMPLES AND DEVICE FOR REALISING SAID METHOD

Предлагаемое изобретение относится к охране окружающей среды и предназначено для биотестирования проб воды (водных вытяжек).
Известен способ оценки токсичности водных сред, основанный на выживаемости рачков дафний в результате экспонирования их в тестируемом растворе (а.с. СССР №1234770, кл. G01N 33/18, 1986).
Известен способ биотестирования сточных, поверхностных, подземных вод и водных вытяжек по гибели ракообразных Daphnia magna Straus (дафнии) (Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений загрязняющих веществ и буровых растворов.- М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).
Недостатками известных способов являются недостаточно высокая чувствительность и длительность определения.
Ближайшим аналогом является известный способ биотестирования проб воды и водных вытяжек по оценке токсичности исследуемого раствора на основе поведенческой реакции (фототаксиса) у Daphnia magna Straus (патент RU 2245367 С2, кл. C12Q 1/02, G01N 33/18 // (C12Q 1/02, C12R 1:90, опубл. 27.01.05, Бюл. №3).
Недостатком известного способа является имеющий место элемент неоднозначности результатов определения, вызванный наложением на поведение дафний сразу двух факторов: освещенности, которая, в общем случае, может влиять как положительно, так и отрицательно на двигательную активность беспозвоночных и токсичности, которая, в свою очередь, способна как повышать, так и понижать двигательную активность дафний.
Задачей предлагаемого способа является повышение чувствительности метода и достоверности получаемых результатов при сокращении времени проведения анализа.
Поставленная задача достигается благодаря способу биотестирования, основанному на сравнительной оценке ориентировочно-исследовательской активности и динамики снижения активности дафний, предварительно выдержанных в тестируемом и контрольном растворах соответственно.
Для сокращения времени биотестирования и повышения чувствительности метода перед проведением оценки активности дафнии выдерживают в тестируемом и контрольном растворах соответственно в течение 1 часа плюс-минус 5 мин в термостате с температурой 35°С плюс-минус 0,5°С. В качестве контрольного раствора может использоваться нейтральная водная среда (культивационная или отстоянная водопроводная вода).
Для полной реализации возможностей предлагаемого способа биотестирования предлагается устройство, описанное в том же патенте, которое включает сосуд с крышкой, заполненный нейтральной водной средой, представляющий собой светонепроницаемую камеру кубической формы с выходным отверстием.
Недостатком известного устройства является сложность изготовления (наличие деталей, требующих подгонки (крышка)) и неоднозначность конструкции (нестрого регламентирован размер выходного отверстия, требующий проводить предварительные измерения габаритов дафний) и, как следствие, необходимость изготавливать устройство непосредственно в процессе биотестирования.
Недостатком также является расположение отверстия на жестко фиксированной боковой стенке рабочей камеры, а не на съемной крышке, что заставляет иметь большое число камер с разными размерами отверстий или каждый раз заново изготавливать камеру под размер имеющихся в данный момент дафний.
Задачей предлагаемого изобретения является сокращение времени подготовки и времени проведения анализа, упрощение конструкции устройства и процедуры испытаний.
Поставленная задача решается благодаря устройству, представляющему собой плоский сосуд (рабочий сосуд) с прозрачным основанием (дном) и с прозрачной крышкой (возможна стеклянная чашка Петри), на нижней поверхности которого нанесена разметка в виде сетки с квадратной ячеей. В вариантном исполнении устройства разметка наносится на прозрачную крышку рабочего сосуда.
Линейные размеры ячеек сетки разметки задаются превышающими две длины типичной дафнии, но не более четырех длин типичной дафнии (от 2 мм до 2,5 мм), т.е. от 5 мм до 10 мм и толщину линий, превышающую одну четверть, но не более одной второй длины типичной дафнии, т.е. от 0,5 мм до 1,2 мм. Размеры ячеек зависят от выбранного варианта проведения испытаний. При автоматизированном (основном) варианте, схема которого представлена на чертеже, размер ячейки предпочтительно выбирается минимальным из указанного, а толщина линий максимальной.
Приведенные размеры определяются особенностями поведения дафний и являются оптимальными (предпочтительными). При значительных отклонениях размеров от вышеуказанных результаты тестирования становятся невоспроизводимыми и недостоверными.
Рабочий сосуд помещается между источником света и фотоприемником, соединенным с регистратором импульсов. Регистратор импульсов совмещен с электрическим блоком питания и управления. Каждое пересечение дафнии линии разметки формирует световой импульс, улавливаемый фотоприемником и фиксируемый регистратором импульсов. Временной интервал между импульсами соответствует единичному расстоянию, пройденному дафнией (расстоянию между линиями разметки). Количество зарегистрированных импульсов в единицу времени соответствует скорости движения дафний.
Предлагаемый способ допускает также простую визуальную регистрацию движения дафний.
При визуальном наблюдении для удобства работы и исключения ошибок сторона квадрата берется максимальной (от 8 мм до 10 мм), а толщина линий минимальной (от 0,5 до 0,7 мм).
Токсические вещества тестируемой пробы воды оказывают влияние на двигательную активность дафний, что приводит к ее достоверному изменению (уменьшению или увеличению). Степень изменения оценивается по разности числа пересечений линий (границ квадратов) в единицу времени для тестируемой и контрольной проб. Одновременно оценивается скорость изменения скорости движения дафнии во времени (динамика снижения активности).
Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами и примерами. На чертеже представлена схема предлагаемого устройства для биотестирования проб воды, включающего: фотоприемник 1, рабочий сосуд 2 с разметкой дна рабочего сосуда 3, прозрачную крышку 4, источник света 5, соединительные провода 6, блок питания и управления 7.
Пример 1
В стеклянный стакан объемом 150 мл наливают 100 мл тестируемой пробы воды и помещают шесть дафний. В другой такой же стакан (контрольный) наливают 100 мл отстоянной водопроводной воды и также помещают шесть дафний. Оба стакана помещают на 60 мин плюс-минус 5 мин в суховоздушный термостат при температуре 35°С плюс-минус 0,5°С.
Через один час каждую дафнию по одной переносят в чашку Петри с разграфленным на квадраты дном и заполненную нейтральной водной средой (отстоянной водопроводной водой) слоем толщиной 8÷10 мм. Сторона квадрата 5 мм, толщина линий сетки 1,2 мм. Чашку Петри закрывают стеклянной крышкой и помещают между источником света (системой подсветки) и фотоприемником, соединенным с регистратором импульсов. Регистрируют двигательную активность по числу пересеченных сторон квадратов (число импульсов) за каждую минуту опыта в течение трех минут. После процедуры дафнию вынимают из чашки Петри и помещают в один из двух других (промежуточных) сосудов, заполненных тестируемой пробой воды и отстоянной водопроводной водой соответственно.
Вместо нее в чашку Петри помещают другую дафнию из числа прошедших термообработку.
Принципиальным является четкий перенос дафний в соответствующий сосуд, исключающий попадание «контрольных» дафний в тестируемую пробу и наоборот.
Через 6 и 24 часа от момента начала биотестирования повторяют процедуру. Затем рассчитывают средние величины и сравнивают с контролем. Статистическую обработку данных проводят с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Критерием токсического действия изучаемой пробы является достоверная степень изменения спонтанной двигательной активности дафний и динамика изменения активности.
Пример 2
В стеклянный стакан объемом 150 мл наливают 100 мл тестируемой пробы воды и помещают шесть дафний. В другой такой же стакан (контрольный) наливают 100 мл отстоянной водопроводной воды и также помещают шесть дафний. Оба стакана помещают на 60 мин плюс-минус 5 мин в суховоздушный термостат при температуре 35°С плюс-минус 0,5°С.
В стеклянный сосуд, представляющий собой чашку Петри с разграфленным на квадраты дном с размерами квадрата 10 мм и толщиной линий сетки 0,5 мм слоем толщиной 8÷10 мм, наливают отстоянную водопроводную воду. Затем в центральную часть сосуда помещают дафнию, закрывают его стеклянной крышкой и с помощью увеличительного стекла × 4 диаметром 90 мм визуально отслеживают перемещения дафнии, отмечая число пересечений дафнией линий разметки за одну минуту в течение трех минут. После процедуры дафнию вынимают из чашки Петри и помещают в один из двух других (промежуточных) сосудов, заполненных тестируемой пробой воды и отстоянной водопроводной водой соответственно.
Вместо нее в чашку Петри помещают другую дафнию из числа прошедших термообработку. Повторяют процедуру с остальными дафниями затем рассчитывают средние величины и сравнивают с контролем.
Через 6 и 24 часа от момента начала биотестирования повторяют процедуру. Затем рассчитывают средние величины и сравнивают с контролем. Статистическую обработку данных проводят с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Критерием токсического действия изучаемой пробы является достоверная степень изменения спонтанной двигательной активности дафний и динамика изменения активности.