МИКРОКАПСУЛИРОВАНИЕ ПРОБИОТИКА ВЕТОМ 1 И ОЦЕНКА ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

УДК 636:611.6

МИКРОКАПСУЛИРОВАНИЕ ПРОБИОТИКА ВЕТОМ 1 И ОЦЕНКА ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

СЕИН ОБ.,

доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-15-55

КЕРИМОВ КБ.,

аспирант кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-15-55. СОБОЛЕВА В.М.,

аспирант кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-15-55.

Реферат. В статье описывается способ микрокапсулирования пробиотика Ветома 1 и результаты оценки его фармако-технологических параметров. Показано, что разработанный авторами способ (Патент РФ №2781792. - 2022 г.) не сложный в техническом исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Основные этапы способа включают перемешивание пробиотика Ветом 1 с очищенной водой до однородного состояния, смешивание полученной суспензии с равным по объёму 4%-ным раствором альгината натрия и диспергирование полученной смеси с использованием устройства-дозатора авторской конструкции (Патент РФ №194572. - 2019 г.) с высоты 20-25 см в 0,2 М раствор кальция хлорида. Процесс диспергирования проводили при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 50-60 об/мин в течение 20-25 мин до образования постоянной взвеси. Сформировавшиеся микрокапсулы помещали в 0,4-0,5%-ный раствор хитозана на 50-60 мин, затем отделяли их на фильтре Шотта, промывали очищенной водой и высушивали при 30-35°С. Результаты оценки фармако-технологических свойств препарата показали, что микрокапсулы сохраняли свою структуру как в физиологическом растворе, так и в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты. Бактериологическими исследованиями было установлено, что количество жизнеспособных бактерий в заявляемом препарате составляло 5,0 104-5,4 104, а в препарате, использованном в качестве прототипа - 3,8 104-4,7 104 в 1 г. Разработанный способ рекомендуется для микрокапсулирования пробиотических препаратов, применяемых в животноводстве и ветеринарной медицине.

Ключевые слова: пробиотик, суспензия, альгинат натрия, устройство-дозатор, диспергирование, микрокапсулы, бактериологические исследования.

MICROCAPSULATION OF PROBIOTIC VETOM 1 AND ASSESSMENT OF ITS BIOLOGICAL PROPERTIES

SEIN O.B.,

Doctor of Biological Sciences, Professor, Professor of the Department of Surgery and Therapy, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-15-55.

KERIMOV KB.,

postgraduate student of the Department of Surgery and Therapy, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-15-55.

SOBOLEVA V.M.,

postgraduate student of the Department of Surgery and Therapy, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-15-55.

Essay. The article describes the method of microencapsulation of Vetom 1 probiotic and the results of evaluation of its pharmaco-technological parameters. It is shown that the method developed by the authors (RF Patent No. 2781792. - 2022) is not technically complicated and does not require expensive equipment and reagents. The main stages of the method include mixing the probiotic Vet 1 with purified water until a homogeneous state, mixing the resulting suspension with an equal volume of 4% sodium alginate solution and dispersing the resulting mixture using a dosing device of the author's design (RF Patent No. 194572. -2019). ) from a height of 20-25 cm in a 0.2 M solution of calcium chloride. The dispersion process was carried out with constant stirring at a stirrer rotation speed of 50-60 rpm for 20-25 min until a constant suspension was formed. The formed microcapsules were placed in a 0.4-0.5% chitosan solution for 50-60 min, then they were separated on a

Schott filter, washed with purified water, and dried at 30-35°C. The results of the evaluation of the pharmaco-technological properties of the drug showed that the microcapsules retained their structure both in physiological saline and in 0.1 M hydrochloric acid solution. Bacteriological studies have established that the number of viable bacteria in the claimed preparation was 5.0104-5.4104, and in the preparation used as a prototype -3.8-104-4.7-104 per 1 g. the method is recommended for microencapsulation of probiotic preparations used in animal husbandry and veterinary medicine.

Keywords: probiotic, suspension, sodium alginate, dosing device, dispersion, microcapsules, bacteriological studies.

Введение. Роль симбионтной микрофлоры, к которой относятся пробиотики, в жизнедеятельности организма многообразна. Прежде всего пробиотики оказывают положительное влияние на организм «хозяина», изменяют состав и метаболическую активность кишечной микрофлоры (мик-робиоты), стимулируют метаболизм в целом [1-4]. Помимо этого симбионтная микрофлора кишечника оказывает детоксикационное действие в отношении соединений, попадающих извне и образующих токсические метаболиты в организме «хозяина». При этом процесс детоксикации с участием нормомикрофлоры идёт по нескольким направлениям: биотрансформация с образованием нетоксичных конечных продуктов; микробная трансформация, сопровождающаяся образованием метаболитов, подвергающихся быстрому разрушению в печени; изменение полярности соединений, приводящей к ускорению их эвакуации во внешнюю среду или к снижению их транслокации из кишечника в кровяное русло. Важными и перспективными, указывающим на возможность широкого использования пробиотиков в практике животноводства и ветеринарной медицине, явля-ляются также преимущества, которые они имеют перед антибиотиками [5-9].

Учитывая вышеуказанные биологические свойства пробиотиков, в последние годы им уделяется пристальное внимание как со стороны учёных, так и со стороны производственников. Ежегодно разрабатываются и апробируются новые пробиотические препараты для разных видов животных, оценивается эффективность дозировок и схем их применения.

Из множества пробиотических препаратов, которые в последние годы предлагались животноводству и ветеринарии, особенно хорошо зарекомендовал себя пробиотик серии «Ветом». Разработчиком и производителем данного пробиотика является ООО Научно-производственная фирма «Исследовательский центр» (Новосибирская обл. п.Кольцово). Препарат представляет собой порошкообразную массу белого цвета, содержащую живые спорообразующие бактерии штамма Bacillus subtilis DSM 32424 и вспомогательные вещества. В 1 г препарата содержится живых микробных клеток бактерий subtillis не менее 1106 КОЕ. Препарат без запаха, хорошо растворим в воде. Ветом 1 стимулирует неспецифические факторы защиты, повышает устойчивость животных к инфекцион-

ным заболеваниям. Однако, несмотря на все положительные стороны, Ветом 1, как и преобладающее большинство других пробиотиков, после попадания в желудок подвергается действию соляной кислоты. В результате большая часть пробиотических бактерий погибает и эффективность препарата снижается.

Цель и задачи исследований. Учитывая вышеизложенное, целью настоящих исследований являлось микрокапсулирование пробиотика Ветом 1 с использованием разработанного способа (Патент РФ №2781792. - 2022 г., авт. Сеин О.Б. и др.) и оценка его технологических и бактериологических свойств.

Материал и методы исследований. Экспериментальная часть работы проводилась в условиях научно-исследовательской лаборатории кафедры хирургии и терапии ФГБОУ ВО Курская ГСХА и состояла из двух этапов.

Во время первого этапа работы был разработан новый способ микрокапсулирования пробиотика Ветом 1. Во время второго этапа работы было изучено влияние водной, желудочной и кишечной среды на структуру полученных микрокапсул.

Все исследования проводили в сравнительном варианте с препаратом-прототипом, который был получен по ранее разработанному нами способу (Патент РФ №2689164. - 2019 г. Трубников Д.В., Сеин О.Б. и др.).

Цифровой материал, полученный в ходе проведения экспериментов, подвергался биометрической обработке (Рокицкий П.Ф., 1973) с использованием ПЭВМ.

Результаты исследований. Перед микрокап-сулированием пробиотика Ветом 1 его предварительно перемешивали с очищенной водой до однородного состояния и полученную суспензию смешивали с равным по объёму количеством 4% раствора альгината натрия. Затем с использованием специального устройства-дозатора авторской конструкции (Патент РФ №194572. - 2019 г., авт. О.Б. Сеин и др.), с высоты 20-25 см полученную смесь диспергировали в 0,2 М раствор кальция хлорида. Процесс диспергирования проводили при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 50-60 об/мин в течение 20-25 мин до образования постоянных взвесей. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяли фильтрованием и помещали в 0,4-0,5%-ный раствор хитозана, в котором их выдерживали 50-60 мин. После этого

микрокапсулы отделяли на фильтре Шотта, промывали очищенной водой и высушивали при 30-35°С.

Полученные микрокапсулы имели сферическую форму серого цвета с желтоватым оттенком (рисунок 1). Размеры их были более стабильными (55-75 мкм) по сравнению с микрокапсулами полученными с использованием способа-прототипа (80-150 мкм). При этом выход готовых микрокапсул в первом случае составлял 85-90%, а во втором 95-98%.

Отличительной особенностью разработанного способа получения микрокапсулированного препарата является: использование в качестве ядра про-биотика Ветом 1; применение для диспергирования пробиотика в смеси с альгинатом натрия в раствор кальция хлорида специального устройства-дозатора (Патент РФ №194572. - 2019 г., авт. Сеин О.Б. и др.), имеющего 8 капельниц, что позволяло получать микрокапсулы более стабильного (одинакового) размера; дополнительная обработка сформировавшихся микрокапсул в 0,4-0,5%-ном растворе хитозана, что повышало устойчивость микрокапсул к кислой среде желудка.

Используемый в процессе микрокапсулирова-ния альгинат натрия относится к полисахаридам, широко применяется в медицине и пищевой промышленности. С химической точки зрения это линейный гетерополисахарид морских водорослей, он способен образовывать вязкие растворы в присутствии растворов кальция. Альгинат натрия широко используют для формирования микрокапсул со-

держащих пробиотики, что объясняется его способностью формировать оболочку вокруг бактериальной клетки. При этом альгинатные микрокапсулы нетоксичны, обладают хорошими технологическими характеристиками, способны разрушаться в кишечнике высвобождая микроорганизмы.

Хитозан относится к природным целлюлозопо-добным полимерам, класс полисахаридов. Он может полимеризоваться путём формирования поперечной связи в присутствии анионов и полианионов. Хитозан используют при микрокапсулирова-нии в качестве дополнительной оболочки (покрытия) микрокапсул, полученных из других полимеров.

С целью оценки влияния водной среды на структуру изготовленных микрокапсул их выдерживали в очищенной воде. Результаты исследований показали (таблица 1), что после нахождения в воде в течение 60 минут микрокапсулы сохраняли свою структуру и определялись в виде плотных образований. В то же время у микрокапсул полученных с применением способа-прототипа оболочка была мягкой и набухшей.

Во втором эксперименте изучили влияние желудочной и кишечной среды на структуру микрокапсул. Эксперименты были проведены в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи РФ (М.: Науч. Центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - Вып. 1. - 704 с).

Препарат Состояние микрокапсул

Опытный препарат Структура сохранена, внешняя оболочка без изменений, капсулы упругие

Препарат-прототип Структура сохранена, внешняя оболочка набухшая, капсулы мягкие

б

а

Рисунок 1 - Микрокапсулированный пробиотик Ветом 1: а - микрокапсулы полученные с использованием разработанного способа; б - микрокапсулы полученные с использованием способа - прототипа

Таблица 1 - Состояние структуры микрокапсул Ветома 1, полученных разработанным способом после нахождения в очищенной воде

Таблица 2 - Характеристика микрокапсул Ветом 1, полученных разработанным способом после нахождения в модельных средах_

Модельная среда Препарат Состояние микрокапсул

Физиологический раствор Опытный препарат Структура сохранена, внешняя оболочка без изменений, капсулы упругие

Препарат-прототип Структура сохранена, внешняя оболочка без изменений, капсулы набухшие

0,1 М раствор хлористоводородной кислоты Опытный препарат Структура сохранена, капсулы мягкой консистенции

Препарат-прототип Структура сохранена, капсулы мягкой консистенции, встречаются разрушенные капсулы с частично сохранившейся цельностью

Раствор натрия гидрокарбоната Опытный препарат Полное разрушение капсул

Препарат-прототип Полное разрушение капсул с образованием мутного осадка

С этой целью оболочку микрокапсул разрушали с использованием фосфатного буфера (рН 8,0), титровали культуру и делали посевы пробиотических бактерий на питательную среду. Контролем являлась стандартная культура в соответствующих разведениях.

В ходе проведенных исследований установили (таблица 2), что после помещения полученных микрокапсул в физиологический раствор и в 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты их структура не изменялась. При этом микрокапсулы изготовленные с применением способа-прототипа после нахождения в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты размягчались, теряли упругость, некоторые микрокапсулы имели частичное разрушение оболочки. После нахождения микрокапсул опытного препарата и препарата-прототипа в растворе натрия гидрокарбоната (рН 8,0) в течение 60 мин они полностью разрушались.

Исследование изготовленных микрокапсул в модельных растворах указывает на то, что они устойчивы к соляной кислоте и будут проходить желудок «без потерь». В то же время в кишечнике

альгинатные микрокапсулы будут разрушаться под действием щелочной среды и высвобождать пробиотик.

Количественное содержание изучаемых про-биотических микроорганизмов, входящих в состав препаратов, определяли оптическим методом (по стандартам мутности) и с использованием камеры Горяева.

Результаты бактериологического анализа показали, что количество жизнеспособных бактерий в разработанном препарате составляло 5,0 1045,5 104 в 1 г, что достоверно было выше по сравнению с препаратом-прототипом 3,8-104-4,7104 в 1 г.

Выводы. Проведенные исследования и полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанный способ микрокапсулирования про-биотика Ветом 1 не сложный в технологическом исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и дефицитных реактивов. Микрокапсулиро-ванный пробиотик Ветом 1 рекомендуется для применения в практике животноводства и ветеринарной медицины.

Список использованных источников

1. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Воробьева М.А. Механизм действия пробиотических препаратов // Биопрепараты. - 2003. - № 3. - С. 2-5.

2. Бондаренко В.М. Молекулярно-клеточные механизмы терапевтического действия пробиотических препаратов // Фарматека. - 2010. - № 2. - С. 26-32.

3. Бондаренко В.М. Поликомпонентные пробиотики: механизм действия и терапевтический эффект при дисбиозах кишечника // Фарматека. - 2005. - № 20. - С. 46-54.

4. Малик Н.И., Панин .Н., Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты // Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2006. - № 6. - С. 48-50.

5. Гамко Л.Н., Черненок .Ю.Н. Влияние пробиотиков на продуктивность свиноматок и сохранность поросят // Зоотехния. - 2008. - № 6. - С. 24-25.

6. Данилевская Н.В. Фармакологические аспекты применения пробиотиков в ветеринарии // Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2011. - № 10. - С. 8-14.

7. Панин А.Н., Малик Н.И., Илаев О.С. Пробиотики в животноводстве - состояние и перспективы // Ветеринария. - 2012. - № 3. - С. 3-8.

8. Тараканов Б.В. Механизм действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных // Ветеринария. - 2000. - № 1. - С. 47-54.

9. Fox S.M. Probiotics: Intestinal inoculans for productio animals // Veter. Med. (Edvardsville). - 1988. -V.83. - №8. - P. 806-810.

10. Fuller R., Gibson G. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health // Clin, Microbiol. аnd Infect. - 1998, - V. 4. - P. 477 - 480.

11. Патент РФ №2781792. - 2022 г. Способ получения микрокапсул пробиотика Ветом 1. Авт. Сеин О.Б., Сеин Д.О., Керимов К.Б., Локтионова Е.А.

12. Патент РФ №2689164. - 2019 г. Способ микрокапсуляции энзимспорина. Авт. Трубников Д.В., Сеин О.Б., Горобец А.Ю., Трубникова Е.А.

13. Патент РФ №194572. - 2019 г. Устройство для дозирования жидкости каплями. Авт. Сеин О.Б., Сеин Д.О., Черников Д.П., Локтионова Е.А.

Spisok ispolzovannyx istochnikov

1. Bondarenko V.M., Chuprinina R.P., Vorob'eva M.A. Mexanizm dejstviya probioticheskix preparatov // Biopreparaty' . - 2003. - № 3. - S. 2-5.

2. Bondarenko V.M. Molekulyarno-kletochny'e mexanizmy' terapevticheskogo dejstviya probioticheskix preparatov // Farmateka. - 2010. - № 2. - S. 26-32.

3. Bondarenko V.M. Polikomponentny'e probiotiki: mexanizm dejstviya i terapevticheskij e'ffekt pri disbiozax kishechnika // Farmateka. - 2005. - № 20. - S. 46-54.

4. Malik N.I., Panin .N., Vershinina I.Yu. Probiotiki: teoreticheskie i prakticheskie aspekty' // Veterinariya sel'skoxozyajstvenny'x zhivotny'x. - 2006. - № 6. - S. 48-50.

5. Gamko L.N., Chernenok .Yu.N. Vliyanie probiotikov na produktivnost' svinomatok i soxrannost' porosyat // Zootexniya. - 2008. - № 6. - S. 24-25.

6. Danilevskaya N.V. Farmakologicheskie aspekty' primeneniya probiotikov v veterinarii // Veterinariya sel'skoxozyajstvenny'x zhivotny'x. - 2011. - № 10. - S. 8-14.

7. Panin A.N., Malik N.I., Ilaev O.S. Probiotiki v zhivotnovodstve - sostoyanie i perspektivy' // Veterinariya. - 2012. - № 3. - S. 3-8.

8. Tarakanov B.V. Mexanizm dejstviya probiotikov na mikrofloru pishhevaritel'nogo trakta i organizm zhivotny'x // Veterinariya. - 2000. - №1. - S. 47-54.

9. Fox S.M. Probiotics: Intestinal inoculans for productio animals // Veter. Med. (Edvardsville). - 1988. -V.83. - №8. - P. 806-810.

10. Fuller R., Gibson G. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health // Clin, Microbiol. and Infect. - 1998, - V. 4. - P. 477 - 480.

11. Patent RF №2781792. - 2022 g. Sposob polucheniya mikrokapsul probiotika Vetom 1. Avt. Sein O.B., Sein D.O., Kerimov K.B., Loktionova E.A.

12. Patent RF №2689164. - 2019 g. Sposob mikrokapsulyacii e'nzimsporina. Avt. Trubnikov D.V., Sein O.B., Gorobecz A.Yu., Trubnikova E.A.

13 Patent RF №194572. - 2019 g. Ustrojstvo dlya dozirovaniya zhidkosti kaplyami. Avt. Sein O.B., Sein D.O., Chernikov D.P., Loktionova E.A.