Способ прогнозирования развития экстраретинальной вазопролиферации при экспериментальной ретинопатии недоношенных (РН)
METHOD FOR PREDICTING THE DEVELOPMENT OF EXTRARETINAL VASOPROLIFERATION IN EXPERIMENTAL RETINOPATHY OF PREMATURITY (ROP)

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования развития экспериментальной ретинопатии недоношенных для последующего определения новых возможностей лабораторного скрининга недоношенных детей из группы риска развития ретинопатии недоношенных.
Ретинопатия недоношенных (РН) - тяжелая вазопролиферативная витреоретинальная патология, которая остается одной из ведущих причин необратимого билатерального нарушения зрительных функций у детей во всем мире [Yonekawa Y., Thomas B.J., Thanos A., Todorich В., Drenser K.А. et al. The cutting edge of retinopathy of prematurity care: expanding the boundaries of diagnosis and treatment. Retina. 2017; 37(12): 2208-25].
Известно, что в основе развития заболевания лежит незавершенность формирования структуры сетчатки и ее васкуляризации на момент преждевременных родов. Соответственно, чем раньше срока рождается ребенок и чем более он «незрел», тем выше вероятность развития РН. Современная система скрининга заболевания предусматривает необходимость офтальмологического обследования всех недоношенных детей, рожденных на сроке менее 32 недель постконцептуального возраста и с массой тела при рождении менее 1500 г [Федеральные клинические рекомендации "Диагностика, мониторинг и лечение активной фазы ретинопатии недоношенных" (национальный протокол), 2013]. Мониторинг РН предполагает проведение многократных осмотров, являющихся значимой рабочей нагрузкой для врача-офтальмолога, а также оказывающих стрессовое действие на детей и сопряженных с рядом возможных осложнений в связи с развитием окуло-кардиальных и окуло-пульмональных рефлексов. При этом, следует отметить, что заболевание развивается менее, чем у половины детей группы риска (у 43,1%, по данным одного из последних исследований) и только у 6,9% из них достигает «пороговой» стадии, требующей лечения [Quinn G.E., Ying G.S., Bell E.F., Donohue P.K., Morrison D. et al. Incidence and Early Course of Retinopathy of Prematurity: Secondary Analysis of the Postnatal Growth and Retinopathy of Prematurity (G-ROP) Study. JAMA Ophthalmol. 2018; 136(12): 1383-9].
С учетом указанных обстоятельств, а также принимая во внимание экономическую составляющую, в последние годы предпринимаются попытки совершенствования существующего протокола скрининга РН. В основе новых подходов лежит поиск дополнительных клинических и, в особенности, лабораторных критериев, позволяющих выявлять пациентов высокого риска развития РН - для планирования ведения на этапах выхаживания, а также пациентов без риска или с низким риском развития РН - для сокращения числа «лишних» осмотров [Chen J., Stahl A., Hellstrom A., Smith L.E. Current update on retinopathy of prematurity: screening and treatment. Curr. Opin. Pediatr. 2011; 23(2): 173-8].
Поиск подобных критериев неразрывно связан с углублением понимания патогенеза заболевания, поскольку несмотря на многолетние исследования, многие аспекты его до конца не ясны. Значимое место в изучении механизмов развития РН занимает экспериментальное моделирование. В исследованиях, посвященных данному вопросу, наиболее широко применяются модели ретинальной неоваскуляризации на грызунах, в частности на крысятах, в силу довольно высокого сходства развивающейся у них экспериментальной ретинопатии недоношенных (ЭРН) с РН у детей и целого ряда преимуществ работы с мелкими лабораторными животными [Grossniklaus Н.Е., Kang S.J., Berglin L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 2010; 29(6): 500-19; Barnett J.M., Yanni S.E., Penn J.S. The Development of Rat Model of Retinopathy of Prematurity. Doc. Ophthalmol. 2010; 120(1): 3-12]. Степень васкуляризации сетчатки новорожденных доношенных крысят схожа с таковой у детей, рожденных на 24-26 неделе гестации. При этом основным фактором, провоцирующим развитие ретинопатии в эксперименте, являются колебания концентрации кислорода, подаваемого в кювез с новорожденными крысятами в течение периода «планового» завершения ретинального ангиогенеза. Колебания концентрации кислорода не достигают высоких значений и копируют колебания уровня кислорода в крови недоношенных детей, отмечаемые в первые недели их жизни вследствие ряда нарушений общесоматического статуса, что позволяет сравнивать патогенетические основы развития ретинопатии в эксперименте и клинике.
Актуальность проведения исследований с использованием экспериментальных моделей, помимо изучения вопросов этиопатогенеза РН, обусловлена возможностью поиска новых патогенетически обоснованных прогностических критериев ее развития.
Важно отметить, что ретинальный ангиогенез представляет собой крайне сложный процесс, который регулируется многоуровневой системой взаимодействующих про- и ангиогенных факторов [Катаргина Л.А., Слепова О.С., Демченко Е.Н., Осипова Н.А. Роль системного дисбаланса цитокинов в патогенезе ретинопатии недоношенных. Российская педиатрическая офтальмология. 2015; 0 4: 16-20]. При преждевременном рождении детей васкуляризация сетчатки «вынуждена» завершаться во внеутробных «экстремальных» условиях на фоне развивающегося дисбаланса регуляторных факторов, что, в ряде случаев, приводит к нарушению данного процесса.
В последние годы предметом активного изучения являются ангиогенные свойства моноаминов, а частности, дофамина (ДА). Значительная часть проводимых в данном направлении исследований посвящена опухолевому неоангиогенезу. Работы, посвященные изучению участия моноаминов в развитии вазопролиферативных заболеваний сетчатки, немногочисленны.
На сегодняшний день известно, что единственным источником синтеза ДА в сетчатке является подкласс специализированных дофаминергических амакриновых клеток. Впервые в онтогенезе эти клетки, содержащие тирозингидроксилазу, выявляются в сетчатке крыс на 10-14 постнатальные дни жизни [Witkovsky P., Arango Gonzalez В., Haycock J.W., Kohler K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. J. Comp. Neurol. 2005; 481(4): 352-62]. Далее содержание ДА в сетчатке у крыс в норме растет, что связывают с данными морфологии об увеличении числа амакриновых клеток и разрастании их отростков [Witkovsky P., Arango Gonzalez В., Haycock J.W., Kohler K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. J. Comp. Neurol. 2005; 481(4): 352-62]. Причем развитие сети данных клеток и становление их физиологической функции приходится на основной период развития РН в эксперименте - патологическую неоваскуляризацию и последующий регресс новообразованных сосудов.
В мировой литературе существуют единичные работы, посвященные определению содержания ДА в сетчатках крыс при РН, и данные в них весьма противоречивы [Spix N.J., Liu L.L., Zhang Z., et al. Vulnerability of Dopaminergic Amacrine Cells to Chronic Ischemia in a Mouse Model of Oxygen-Induced Retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2016; 57(7): 3047-57; Zhang N., Favazza T.L., Baglieri A.M., et al. The rat with oxygen-induced retinopathy is myopic with low retinal dopamine. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2013; 54(13): 8275-84].
L-дезоксифенилаланин (L-ДОФА) в нервной системе является предшественником ДА и синтезируется из тирозина с участием фермента тирозингидроксилазы. Однако L-ДОФА также является предшественником меланина, который синтезируется в пигментном эпителии сетчатки с помощью фермента тирозиназы. На культуре клеток пигментного эпителия человека было показано, что L-ДОФА является антиангиогенным фактором, вызывая снижение VEGF через путь GPR143 [Falk Т., Congrove N.R., Zhang S., McCourt A.D., Sherman S.J., McKay B.S. PEDF and VEGF-A output from human retinal pigment epithelial cells grown on novel microcarriers. J. Biomed. Biotechnol. 2012; 2012:278932]. Эти данные позволяют рассматривать L-ДОФА как одну из ключевых молекул, вовлеченных в патогенез РН.
Это явилось предпосылкой для изучения патогенетической и прогностической роли ДА и его предшественника L-ДОФА в развитии РН путем определения их содержания в плазме крови крысят с ЭРН на разных сроках патологического процесса, в частности, на 14 неделе жизни животных, т.е. на сроке, соответствующем индукции патологической неоваскуляризации при ретинопатии. Актуальность проведения исследования именно в указанный срок обусловлена тем, что, переводя параллель с эксперимента на клинику, у недоношенных детей на данном сроке может развиваться «преретинопатия» или 1-2 стадия РН, которая в дальнейшем может подвергнуться самопроизвольному регрессу либо прогрессировать до стадии, требующей проведения лазеркоагуляции зон сетчатки. Возможность раннего прогнозирования «неблагоприятного» течения РН позволит выделять таких детей в особую группу, что может иметь большое клиническое значение в плане коррекции протокола скрининга и тактики ведения таких детей на этапах выхаживания, а также сократить число осмотров детей с минимальным риском прогрессирования заболевания.
Аналогом предлагаемого способа является способ определения уровня инсулиноподобного фактора роста - 1 (IGF-1) в сыворотке крови в качестве прогностического фактора развития РН [ С., Andersson Е., Sigurdsson J., Engstrom E.,  A.L., Niklasson A., Smith L.E.,  A. Longitudinal postnatal weight and insulin-like growth factor I measurements in the prediction of retinopathy of prematurity. Arch. Ophthalmol. 2006; 124(12): 1711-8]. Алгоритм WINROP (Weight, IGF-I, Neonatal, ROP), основанный на еженедельном измерении массы тела, а также уровня IGF-1 в сыворотке крови недоношенных детей, тестировался в течение ряда лет в большом мультицентровом мультинациональном клиническом исследовании [Lofqvist С., Hansen-Pupp I., Andersson Е. et al. Validation of a new retinopathy of prematurity screening method monitoring longitudinal postnatal weight and insulinlike growth factor I. Arch. Ophthalmol. 2009; 127(5): 622-7], однако не нашел широкого клинического применения. К недостаткам алгоритма WINROP можно отнести необходимость проведения многократных иммунологических обследований, что связано с неоднократным взятием крови у детей с тяжелым общесоматическим статусом.
В литературе отсутствуют сведения об экспериментальных работах, касающихся прогнозирования ЭРН.
Задачей предлагаемого способа является разработка способа прогнозирования риска развития ЭРН на сроке до развития патологической экстраретинальной неоваскуляризации.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность прогнозирования риска развития экстраретинальной вазопролиферации при экспериментальной ретинопатии недоношенных на крысиной модели заболевания с целью обоснования возможности лабораторного скрининга РН в клинике.
Технический результат достигается за счет определения уровня L-ДОФА в плазме крови крысят с моделью ЭРН на 14 сутки эксперимента.
Исследование выполнено на 68 крысятах породы Вистар в соответствии с ГОСТ 53434-2009 от 02.12.2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики GLP", постановлением главного государственного врача РФ №51 от 29.08.2014 "Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)", Федеральным законом №61-ФЗ от 12.04.2010 "Об обращении лекарственных средств". Протокол исследования был утвержден локальным этическим комитетом.
С целью воспроизведения ЭРН, крысят (n=32) вместе с родившей их самкой (n=6), начиная с первых суток после рождения на 14 суток помещали в инкубатор, где каждые 12 часов концентрация кислорода менялась от 60 до 15%. Затем крысят помещали в условия с нормальным содержанием кислорода (21%). На протяжении эксперимента в помещении поддерживали постоянный температурный (+26°С) и световой (12 часов день, 12 часов ночь) режимы. Предлагаемая нами модель является более совершенной по сравнению с моделью Пенна «50/10», в которой новорожденные крысята в течение первых двух недель своей жизни подвергаются воздействию 12-часовых колебаний концентрации кислорода от 50% до 10%. С целью моделирования мы применяли колебания концентрации кислорода от 60 до 15%, создавая переменную гипоксию более умеренной степени, чем в модели «50/10». Развивающаяся ретинопатия максимально приближена по развитию и механизмам к РН у детей в клинике. Контрольную группу составили крысята (n=36 также из 6 пометов), находившиеся с момента рождения в условиях с нормальным содержанием кислорода (21%) [Катаргина Л.А., Хорошилова-Маслова И.П., Майбогин A.M., Панова И.Г., Осипова Н.А. Патоморфологические особенности развития экспериментальной ретинопатии недоношенных. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2017; 3(2): 190-4].
Крысят выводили из эксперимента на 14-е (n=20), 21-е (n=32) и 30-е (n=16) сутки. Проводили забор крови из сердца. Для определения катехоламинов кровь собирали в пробирку 30 мкл 5% раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Sigma, США) и 10 мкл 10% раствора метабисульфита натрия (Sigma, США). Затем отделяли плазму от форменных элементов центрифугированием при 1350 g в течение 10 минут и добавляли в нее 50 пмоль ДГБА (Sigma, США) в 0,1 Н HCIO4. Для освобождения от высокомолекулярных белков плазму центрифугировали при 16500 g 20 минут. Перед определением катехоламинов пробы экстрагировали осаждением на оксиде алюминия. Далее в плазме каждого образца определяли содержание ДА и L-ДОФА.
Анализ полученных результатов показал, что на 14-е сутки эксперимента, т.е. на сроке, соответствующем, согласно проведенным ранее гистологическим исследованиям [Катаргина Л.А., Хорошилова-Маслова И.П., Майбогин A.M., Панова И.Г., Осипова Н.А. Патоморфологические особенности развития экспериментальной ретинопатии недоношенных. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2017; 3(2): 190-4], индукции патологической неоваскуляризации при ЭРН, уровень L-ДОФА в плазме крови крысят опытной группы был достоверно снижен по сравнению с данным показателем в группе контроля (таблица 1). На 21-е сутки эксперимента, соответствующие активному развитию патологической экстраретинальной неоваскуляризации, уровень L-ДОФА также был достоверно снижен в опытной группе (таблица 1). На 30-е сутки эксперимента, соответствующие регрессу новообразованных сосудов, уровень данного показателя в обеих группах находился на одном уровне (таблица 1. Средний уровень L-ДОФА в плазме крови крысят опытной и контрольной групп на 14-е, 21-е и 30-е сутки эксперимента (нг/мл).). В отношении уровня ДА достоверных отличий между группами получено не было, отмечалась лишь тенденция к его снижению в опытной группе по сравнению с контрольной на 14-е и 21-е сутки. Таким образом, показатель уровня L-ДОФА на 14 сутки у экспериментальных крысят с РН является показателем риска развития в дальнейшем ЭРН. Таких животных можно в дальнейшем использовать для изучения патогенеза заболевания, динамики развития и оценки методов лечебного воздействия.
Способ осуществляют следующим образом.
У крысят с моделью ретинопатии недоношенных на 14-е сутки жизни в плазме крови определяют содержание L-дезоксифенилаланина. При его уровне, равном или ниже 0,31 нг/мл, прогнозируют развитие экстраретинальной вазопролиферации.
Примеры.
Пример 1. Крысенок №1 с рождения находился в условиях с нормальным содержанием кислорода, выведен из эксперимента на 14е сутки. Уровень L-ДОФА в плазме крови составил 0,45 нг/мл.
Согласно гистологическим исследованиям, на данном сроке у крысят контрольной группы отмечается завершение нормальной васкуляризации сетчатки, а в сетчатке крысят с экспериментальной РН - начало аномального роста сосудов на границе с персистирующей аваскулярной зоной, значение уровня L-дезоксифенилаланина выше 0,31 нг/мл позволяет отнести крысенка из примера к контрольной группе.
Пример 2. Крысенок №2 с рождения находился в условиях с нормальным содержанием кислорода, выведен из эксперимента на 14е сутки. Уровень L-ДОФА в плазме крови составил 0,52 нг/мл.
Согласно гистологическим исследованиям, на данном сроке у крысят контрольной группы отмечается завершение нормальной васкуляризации сетчатки, а в сетчатке крысят с экспериментальной РН - начало аномального роста сосудов на границе с персистирующей аваскулярной зоной, значение уровня L-дезоксифенилаланина выше 0,31 нг/мл позволяет отнести крысенка из примера к контрольной группе.
Пример 3. Крысенок №3, начиная с первых суток после рождения, на 14 суток помещен в инкубатор, где каждые 12 часов концентрация кислорода менялась от 60 до 15%, выведен из эксперимента на 14е сутки. Уровень L-ДОФА в плазме крови составил 0,27 нг/мл.
Согласно гистологическим исследованиям, на данном сроке у крысят контрольной группы отмечается завершение нормальной васкуляризации сетчатки, а в сетчатке крысят с экспериментальной РН - начало аномального роста сосудов на границе с персистирующей аваскулярной зоной, значение уровня L-дезоксифенилаланина ниже 0,31 нг/мл позволяет отнести крысенка из примера к опытной группе.
Пример 4. Крысенок №4, начиная с первых суток после рождения, на 14 суток помещен в инкубатор, где каждые 12 часов концентрация кислорода менялась от 60 до 15%, выведен из эксперимента на 14е сутки. Уровень L-ДОФА в плазме крови составил 0,31 нг/мл.
Согласно гистологическим исследованиям, на данном сроке у крысят контрольной группы отмечается завершение нормальной васкуляризации сетчатки, а в сетчатке крысят с экспериментальной РН - начало аномального роста сосудов на границе с персистирующей аваскулярной зоной, значение уровня L-дезоксифенилаланина, равное 0,31 нг/мл, позволяет отнести крысенка из примера к опытной группе.
Таким образом, на 14е сутки уровень L-ДОФА в сетчатке крысят с ЭРН был достоверно снижен, по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о патогенетической роли данного фактора в индукции патологической неоваскуляризации при ЭРН и о его прогностической роли на сроке до ее развития.
Таким образом, на сроке, соответствующем непосредственному развитию патологической неоваскуляризации при ЭРН уровень L-ДОФА продолжал оставаться достоверно сниженным в плазме крови крысят опытной группы, по сравнению с контрольной, а на сроке, соответствующем регрессу патологической неоваскуляризации при ЭРН, данный показатель был сопоставим в обеих группах, что может вносить свой вклад в регресс патологического процесса.
Полученные данные позволяют рассматривать низкий уровень L-ДОФА в плазме крови крысят на 14е сутки, т.е. на сроке, соответствующем началу патологического ангиогенеза сетчатки, в качестве прогностического признака развития экстраретинальной вазопролиферации при ЭРН, и являются основой для планирования проведение клинических исследований с целью определения прогностического значения уровня L-ДОФА в сыворотке крови недоношенных детей в качестве потенциального прогностического лабораторного критерия скрининга РН.