НОВЫЕ БЕЛКИ, ОБЛАДАЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ НАСЕКОМЫХ
NOVEL PROTEINS HAVING INHIBITORY ACTIVITY ON INSECTS

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[001] В настоящей заявке заявляется приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/082,504, поданной 20 ноября 2014 года, которая включена в данный документ путем ссылки в полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[002] Перечень последовательностей в машиночитаемой форме подан с этой заявкой путем электронного представления. Перечень последовательностей, включенный путем ссылки, содержится в полном объеме в файле, созданном 13 ноября 2015 года, с именем файла MONS387WO_ST25.txt и размером 114 Кбайт (как измерено в операционной системе MS-Windows).
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[003] Настоящее изобретение в целом относится к области белков, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых. В настоящей заявке описан новый класс белков, обладающих ингибирующей активностью против сельскохозяйственных вредителей возделываемых растений и семян. В частности, описанный класс белков обладает инсектицидной активностью против сельскохозяйственных вредителей возделываемых растений и семян, особенно чешуекрылых и жесткокрылых видов насекомых-вредителей. В изобретении предлагаются растения, части растений и семена, содержащие конструкт рекомбинантного полинуклеотида, кодирующий один или более описанных токсических белков.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[004] Все большее значение приобретает повышение урожайности сельскохозяйственных культур, включая, среди прочих, кукурузу, сою, сахарный тростник, рис, пшеницу, овощи и хлопок. По прогнозам, в дополнение к растущей потребности в сельскохозяйственной продукции для обеспечения пищей, одеждой и обеспечения энергией растущего населения, климатическим последствиям и давлению со стороны растущего населения на использование земель несельскохозяйственного значения, уменьшается количество доступных пахотных земель для ведения сельского хозяйства. Данные факторы привели к неоптимистичным прогнозам в отношении продовольственной безопасности, особенно в условиях отсутствия значительных улучшений в области биотехнологии растений и агрономических приемов. В свете данных обстоятельств, экологически устойчивые усовершенствования в области технологий, агротехники и борьбы с вредителями являются жизненно важными инструментами для расширения производства сельскохозяйственных культур на ограниченном количестве пахотных земель, доступных для ведения сельского хозяйства.
Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicosta
Phyllocnistis citrella
Agriotes
Anthonomus
Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis
Cosmopolites
Curculio
Dermestes
Diabrotica
Epilachna
Eremnus
Leptinotarsa decemlineata
Lissorhoptrus
Melolontha
Orycaephilus
Otiorhynchus
Phlyctinus
Popillia
Psylliodes
Rhizopertha
Scarabeidae
Sitophilus
Sitotroga
Tenebrio
Tribolium
Trogoderma
Diabrotica virgifera virgifera
Diabrotica barberi
Diabrotica virgifera zeae
Diabrotica balteata
Diabrotica undecimpunctata howardii
Diabrotica viridula
Diabrotica speciosa
[005] Насекомые, особенно насекомые в пределах отряда Lepidoptera (чешуекрылые) и Coleoptera (жесткокрылые), считаются основной причиной повреждения полевых культур, тем самым снижая урожайность культур в зараженных районах. Виды вредителей-чешуекрылых с неблагоприятным воздействием на ведение сельского хозяйства включают, но не ограничиваются ими, и . Виды вредителей-жесткокрылых с неблагоприятным воздействием на ведение сельского хозяйства включают, но не ограничиваются ими, spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp. и spp., в частности вредителем является (западный кукурузный жук, WCR), (северный кукурузный жук, NCR), (мексиканский кукурузный жук, MCR), (бразильский кукурузный жук (BZR), (южный кукурузный жук, SCR) и комплекс бразильского кукурузного жукa (BCR), состоящий из видов и ).
[006] Исторически сложилось так, что в качестве средства борьбы с вредителями в сельском хозяйстве интенсивно применяли синтетические химические инсектициды. Опасения по поводу влияния на окружающую среду и здоровье человека, помимо возникающих проблем с развитием устойчивости, стимулировали исследования и разработку биологических пестицидов. Данное исследование привело к прогрессивному открытию и применению различных энтомопатогенных видов микроорганизмов, включая бактерии.
Bacillus
Bacillus thuringiensis
Bt
Bt
Bt'
Bt
Bacillus sphaericus
Brevibacillus laterosporus
[007] Парадигма биологических методов борьбы изменилась, когда был открыт потенциал энтомопатогенных бактерий, особенно бактерий, относящихся к роду , и их применили в качестве агента для биологической борьбы с вредителями. Штаммы бактерии () использовали в качестве источника белков, проявляющих пестицидную активность, так как было обнаружено, что штаммы проявляют высокую токсичность против конкретных насекомых. Основным признаком является продукция параспоральных телец, содержащих один или более кристаллов, которые содержат специфические инсектицидные эндотоксины (белки Cry), действующие при поглощении чувствительным насекомым посредством механизма действия, образующего поры, повреждающие эпителий пищеварительного тракта насекомого. Кроме , потенциал для борьбы с вредителями показали другие виды Bacillus, такие как , и другие виды бактерий, которые содержат гены, способствующие проявлению энтомопатогенного фенотипа, такие как .
[008] Инсектицидные белки-токсины применяют в различных сельскохозяйственных целях для защиты хозяйственно-ценных растений и повышения урожайности. Инсектицидные белки-токсины применяют для борьбы с сельскохозяйственными вредителями культурных растений механизированными способами, такими как распыление дисперсных микробных составов, содержащих различные штаммы бактерий, на поверхности растений, и путем использования методов генетической трансформации для получения трансгенных растений и семян, экспрессирующих инсектицидный белок-токсин.
Bt
[009] Применение трансгенных растений, экспрессирующих инсектицидные белки-токсины, признано в мировом масштабе. Например, в 2012 году 26,1 миллиона гектаров были засажены трансгенными культурами, экспрессирующими -токсины (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2012. Краткое содержание отчета ISAAA (Международная служба по сбору сведений о применении биотехнологий в сельском хозяйстве) № 44). Глобальное применение трансгенных культур, защищенных от насекомых, и ограниченное количество коммерчески доступных инсектицидных белков-токсинов создает давление отбора на аллели, которые придают устойчивость к применяемым в настоящее время инсектицидным белкам. Развитие у целевых вредителей устойчивости к инсектицидным белкам-токсинам отрицательно сказывается на эффективности и преимуществах данной технологии. Такие преимущества включают увеличенную урожайность сельскохозяйственных культур, снижение использования химических пестицидов и снижение затрат и труда, связанных с использование химических пестицидов.
[010] Открытие и разработка новых форм инсектицидных белков-токсинов, являются центральной задачей для борьбы с увеличением устойчивости насекомых к трансгенным культурам, экспрессирующим инсектицидные белки-токсины. Новые белковые токсины с повышенной эффективностью, и которые проявляют воздействие на более широкий спектр восприимчивых видов насекомых, уменьшат количество выживающих насекомых, у которые могут развиваться резистентные аллели. Кроме того, применение в одном растении двух или более трансгенных токсинов, токсических для одного и того же насекомого-вредителя и демонстрирующих различные механизмы действия, дополнительно снижает вероятность возникновения устойчивости у целевых видов насекомых.
Brevibacillus laterosporus
B. laterosporus
[011] Следовательно, существует настоятельная необходимость в выявлении и разработке эффективных инсектицидных белков с улучшенными инсектицидными свойствами, такими как повышенная эффективность против более широкого спектра целевых видов насекомых-вредителей и различные механизмы действия по сравнению с белками, известными в данной области техники. A данной заявке описано новое семейство белковых токсинов из () вместе с сходными белками-токсинами, вариантами белков и типовыми рекомбинантными белками, проявляющими инсектицидную активность против значимых целевых видов вредителей чешуекрылых и твердокрылых, в частности против западного кукурузного жука.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[012] Описанная в данном документе новая группа рекомбинантных полинуклеотидных молекул и кодируемых ими полипептидов (белков-токсинов), обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, тем самым относится в данном документе к белкам типа TIC3668, которые, как показано, проявляют ингибирующую активность против одного или более вредителей возделываемых растений. Каждый из данных белков может применяться по отдельности или в комбинации друг с другом и с другими инсектицидными белками и токсическими агентами в составах и in planta (в растении); таким образом обеспечивая альтернативу инсектицидным белкам и химикатам-инсектицидам, применяемым в настоящее время в сельскохозяйственных системах.
[013] В одном аспекте в изобретении представлена рекомбинантная полинуклеотидная молекула, кодирующая полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:31. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная полинуклеотидная молекула кодирует полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, обладающий по меньшей мере 35% идентичностью, к примеру, по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:31. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантная полинуклеотидная молекула содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 и SEQ ID NO:72.В еще одном варианте реализации изобретения рекомбинантная полинуклеотидная молекула обладает по меньшей мере 35% идентичностью, к примеру, по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 и SEQ ID NO:72. В дополнительном варианте реализации изобретения рекомбинантная полинуклеотидная молекула содержит последовательность, которая гибридизируется с: (i) обратной комплементарной последовательностью данной нуклеотидной последовательности в положениях 4-885 последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 и SEQ ID NO:72; или (ii) обратной комплементарной последовательностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:61.В другом варианте реализации изобретения условия гибридизации являются жесткими, к примеру, такие жесткие условия могут включать гибридизацию в течение от 4 до 12 часов в 50% формамиде, 1 M NaCl и 1% SDS при 37C, и промывку в 0,1 X растворе SSC при 6°C - 65C. В дополнительном варианте реализации изобретения рекомбинантная полинуклеотидная молекула функционально связана с гетерологичным промотором.
[014] В другом аспекте в изобретении представлен рекомбинантный полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, кодируемый рекомбинантной полинуклеотидной молекулой, предложенной в данном документе. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантный полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:31. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантный полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, обладает по меньшей мере 35% идентичностью, к примеру, по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:31.
Diabrotica viridula
Diabrotica speciosa
[015] В дополнительном варианте реализации изобретения рекомбинантный полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, проявляет ингибирующую активность против видов насекомых из отряда Coleoptera, к примеру, включающих западного кукурузного жука, южного кукурузного жука, северного кукурузного жука, мексиканского кукурузного жука, бразильского кукурузного жука или комплекса бразильского кукурузного жука, состоящего из видов и . В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения рекомбинантный полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, проявляет ингибирующую активность против видов насекомых из отряда Lepidoptera, к примеру, включающих европейского кукурузного мотылька, юго-западного кукурузного мотылька, совку-ипсилон, совку травяную, совку хлопковую и совку соевую.
Agrobacterium, Rhizobium
Bacillus thuringiensis
Brevibacillus lacterosporus
Bacillus cereus
E. coli
Pseudomonas
Klebsiella
Erwinia.
[016] В еще одном аспекте в изобретении представлена клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную полинуклеотидную молекулу по данному изобретению, причем клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки-хозяина и растительной клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения бактериальные клетки-хозяева включают виды , , , , , , и В других вариантах реализации изобретения растительные клетки включают клетки из растения люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, декоративной капусты, моркови, маниока, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквы, огурца, ели Дугласа, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата, сосны Лоблолли, проса, дыни, грецкого ореха, овса, маслины, лука, декоративной пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, хурмы, голубиного гороха, сосны, граната, тополя, картофеля, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, корневищных злаков, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[017] В дополнительном аспекте в изобретении представлена композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, которая содержит рекомбинантную полинуклеотидную молекулу по данному изобретению. В одном варианте реализации изобретения композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один пестицидный агент. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один пестицидный агент отличается от полипептида по данному изобретению типа TIC3668, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, и может выбираться из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, молекулы дцРНК, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, и вспомогательного белка. В других вариантах реализации изобретения другой пестицидный агент проявляет активность против одного или более видов вредителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Hemiptera. В некоторых вариантах реализации изобретения другой пестицидный агент выбран из группы, состоящей из белка Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, VIP3A и VIP3B. В еще одном дополнительном в настоящем изобретении представлена композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая рекомбинантный полипептид по данному изобретению, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, такой как полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, типа TIC3668, в эффективном количестве для обеспечения ингибирующего действия в отношении насекомых.
[018] В еще одном аспекте в изобретении представлен способ борьбы с видами-вредителями жесткокрылых или чешуекрылых и борьбы с заражением растений видами-вредителями жесткокрылых или чешуекрылых, к примеру, растений сельскохозяйственных культур, причем способ включает приведение в контакт вредителя с обладающим ингибирующей активностью в отношении насекомых количеством рекомбинантного полипептида по данному изобретению, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, типа TIC3668.
[019] В еще одном дополнительном аспекте в изобретении представлено семя, содержащее рекомбинантную полинуклеотидную молекулу или рекомбинантный полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, такой как полипептид типа TIC3668, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, по данному изобретению.
[020] В другом аспекте в изобретении представлен товарный продукт, содержащий выявляемое количество рекомбинантной полинуклеотидной молекулы или рекомбинантного полипептида, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как полипептид типа TIC3668, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, по данному изобретению. В дополнительном аспекте изобретения товарный продукт по данному изобретению может содержать клетку-хозяина, включающую рекомбинантную полинуклеотидную молекулу по данному изобретению, причем товарный продукт содержит выявляемое количество рекомбинантной полинуклеотидной молекулы или обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых рекомбинантного полипептида, кодируемого данным рекомбинантным полинуклеотидом. В некоторых вариантах реализации изобретения товарные продукты включают товарное зерно кукурузы, упакованное в мешки дозатором для зерна, кукурузные хлопья, кукурузный жмых, кукурузную муку, кукурузную крупу, кукурузный сироп, кукурузное масло, кукурузный силос, кукурузный крахмал, кукурузное зерно и тому подобное, и соответствующие товарные продукты соевых бобов, риса, пшеницы, сорго, голубиного гороха, арахиса, фруктов, дыни и овощей, включая, если применимо, соки, концентраты, варенья, желе, мармелады и тому подобные съедобные формы таких товарных продуктов, содержащих выявляемые количества таких полинуклеотидов и полипептидов данной заявки.
[021] В еще одном аспекте в изобретении представлен способ получения семени, содержащего рекомбинантный полинуклеотид по данному изобретению, причем способ включает: (a) высаживание по меньшей мере одного семени, содержащего рекомбинантную полинуклеотидную молекулу; (b) выращивание растений из семени и (c) сбор семян из растений, при этом собранные семена содержат рекомбинантную полинуклеотидную молекулу.
[022] В дополнительном аспекте в изобретении представлен рекомбинантный вектор, содержащий рекомбинантную полинуклеотидную молекулу по данному изобретению. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантный вектор выбран из группы, состоящей из плазмиды, бакмиды, фагмиды и космиды.
[023] В другом аспекте в изобретении представлено растение, устойчивое к заражению насекомыми, причем клетки указанного растения содержат рекомбинантную полинуклеотидную молекулу или рекомбинантный полипептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, по данному изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[024] На Фиг. 1 иллюстрируется выравнивание составного белка TIC4260 из пяти типовых белков типа TIC3668. Положения различий последовательностей в результате этого выравнивания последовательностей выделены серым затенением.
in planta
[025] На Фиг. 2 иллюстрируется ингибирующая активность в отношении западного кукурузного мотылька (WCR) типовых нацеленных на хлоропласты и ненацеленных белков зрелой длины типа TIC3668.
in planta
[026] На Фиг. 3 иллюстрируется ингибирующая активность WCR типовых нацеленных на хлоропласты и ненацеленных белков зрелой длины типа TIC-3668.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Brevibacillus laterosporus
[027] SEQ ID NO:1 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC3668 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[028] SEQ ID NO:2 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции белка-предшественника TIC3668 из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:1.
Brevibacillus laterosporus
[029] SEQ ID NO:3 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC3669 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[030] SEQ ID NO:4 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции белка TIC3669 из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:3.
Brevibacillus laterosporus
[031] SEQ ID NO:5 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC3670 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[032] SEQ ID NO:6 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции белка-предшественника TIC3670 из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:5.
Brevibacillus laterosporus
[033] SEQ ID NO:7 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4076 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[034] SEQ ID NO:8 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции белка-предшественника TIC4076 из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:7.
Brevibacillus laterosporus
[035] SEQ ID NO:9 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4078 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[036] SEQ ID NO:10 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции белка-предшественника TIC4078 из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:9.
Brevibacillus laterosporus
[037] SEQ ID NO:11 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4260 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции, созданный путем комбинирования сегментов ДНК из каждой из кодирующих последовательностей, указанных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9 внутри рамки считывания так, чтобы включать вариации последовательности из этих пяти различных открытых рамок считывания.
[038] SEQ ID NO:12 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции составного белка-предшественника TIC4260 из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:11.
Brevibacillus laterosporus
[039] SEQ ID NO:13 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4346 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[040] SEQ ID NO:14 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:13.
Brevibacillus laterosporus
[041] SEQ ID NO:15 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4826 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[042] SEQ ID NO:16 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:15.
Brevibacillus laterosporus
[043] SEQ ID NO:17 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4861 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-918 и кодон терминации трансляции.
[044] SEQ ID NO:18 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:17.
Brevibacillus laterosporus
[045] SEQ ID NO:19 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4862 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-945 и кодон терминации трансляции.
[046] SEQ ID NO:20 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:19.
Brevibacillus laterosporus
[047] SEQ ID NO:21 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC4863 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[048] SEQ ID NO:22 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:21.
[049] SEQ ID NO:23 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC3668, mTIC3668.
[050] SEQ ID NO:24 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC3669, mTIC3669.
[051] SEQ ID NO:25 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC3670, mTIC3670.
[052] SEQ ID NO:26 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC4076, mTIC4076.
[053] SEQ ID NO:27 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC4078, mTIC4078.
[054] SEQ ID NO:28 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC4260, mTIC4260.
[055] SEQ ID NO:29 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC4346, mTIC4346.
[056] SEQ ID NO:30 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC4826, mTIC4826.
[057] SEQ ID NO:31 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого белка TIC4861, mTIC4861.
[058] SEQ ID NO:32 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC3668, предназначенную для экспрессии в растениях.
[059] SEQ ID NO:33 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC3668, mTIC3668, предназначенную для экспрессии в растениях.
[060] SEQ ID NO:34 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC3669, предназначенную для экспрессии в растениях.
[061] SEQ ID NO:35 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC3669, mTIC3669, предназначенную для экспрессии в растениях.
[062] SEQ ID NO:36 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC3670, предназначенную для экспрессии в растениях.
[063] SEQ ID NO:37 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC3670, mTIC3670, предназначенную для экспрессии в растениях.
[064] SEQ ID NO:38 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4076, предназначенную для экспрессии в растениях.
[065] SEQ ID NO:39 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4076, mTIC4076, предназначенную для экспрессии в растениях.
[066] SEQ ID NO:40 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4078, предназначенную для экспрессии в растениях.
[067] SEQ ID NO:41 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4078, mTIC4078, предназначенную для экспрессии в растениях.
[068] SEQ ID NO:42 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4260, предназначенную для экспрессии в растениях.
[069] SEQ ID NO:43 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4260, mTIC4260, предназначенную для экспрессии в растениях.
[070] SEQ ID NO:44 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4346, предназначенную для экспрессии в растениях.
[071] SEQ ID NO:45 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4346, mTIC4346, предназначенную для экспрессии в растениях.
[072] SEQ ID NO:46 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4826, предназначенную для экспрессии в растениях.
[073] SEQ ID NO:47 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4826, mTIC4826, предназначенную для экспрессии в растениях.
[074] SEQ ID NO:48 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4861, предназначенную для экспрессии в растениях.
[075] SEQ ID NO:49 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4861 (mTIC4861), зрелый белок TIC4862 (mTIC4862) и зрелый белок TIC4863 (mTIC4863), предназначенную для экспрессии в растениях.
[076] SEQ ID NO:50 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4682, предназначенную для экспрессии в растениях.
[077] SEQ ID NO:51 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4863, предназначенную для экспрессии в растениях.
[078] SEQ ID NO:52 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 1 до 36 SEQ ID NO:1 (прямой праймер TIC3668).
[079] SEQ ID NO:53 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 920 до 954 SEQ ID NO:1 (обратный праймер TIC3668).
[080] SEQ ID NO:54 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 1 до 41 SEQ ID NO:3 (прямой праймер TIC3669).
[081] SEQ ID NO:55 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 920 до 954 SEQ ID NO:3 (обратный праймер TIC3669).
[082] SEQ ID NO:56 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 1 до 36 SEQ ID NO:5 (прямой праймер TIC3670).
[083] SEQ ID NO:57 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 920 до 954 SEQ ID NO:5 (обратный праймер TIC3670).
[084] SEQ ID NO:58 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 1 до 41 SEQ ID NO:7 (прямой праймер TIC4076).
[085] SEQ ID NO:59 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 920 до 954 SEQ ID NO:7 (обратный праймер TIC4076).
[086] SEQ ID NO:60 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 1 до 36 SEQ ID NO:9 (прямой праймер TIC4078).
[087] SEQ ID NO:61 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую синтетический олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей описанный в этой заявке белок, и соответствующей положениям от 920 до 954 SEQ ID NO:9 (обратный праймер TIC4078).
Brevibacillus laterosporus
[088] SEQ ID NO:62 представляет собой рекомбинантную полинуклеотидную последовательность, полученную из вида , кодирующую белок TIC2462 из открытой рамки считывания в положении нуклеотидов 1-951 и кодон терминации трансляции.
[089] SEQ ID NO:63 представляет собой аминокислотную последовательность трансляции из открытой рамки считывания, как указано в SEQ ID NO:62.
[090] SEQ ID NO:64 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC3668, mTIC3668, для экспрессии в бактериях.
[091] SEQ ID NO:65 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC3669, mTIC3669, для экспрессии в бактериях.
[092] SEQ ID NO:66 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC3670, mTIC3670, для экспрессии в бактериях.
[093] SEQ ID NO:67 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4076, mTIC4076, для экспрессии в бактериях.
[094] SEQ ID NO:68 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4078, mTIC4078, для экспрессии в бактериях.
[095] SEQ ID NO:69 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4260, mTIC4260, для экспрессии в бактериях.
[096] SEQ ID NO:70 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4346, mTIC4346, для экспрессии в бактериях.
[097] SEQ ID NO:71 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4826, mTIC4826, для экспрессии в бактериях.
[098] SEQ ID NO:72 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый белок TIC4861 (mTIC4861), TIC4862 (mTIC4862) и TIC4863 (mTIC4863), для экспрессии в бактериях.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[099] Проблема в области борьбы с сельскохозяйственными вредителями может быть охарактеризована как потребность в новых белках-токсинах, которые эффективны против целевых вредителей, проявляют токсичность широкого спектра против целевых видов вредителей, способны экспрессироваться в растениях, не вызывая нежелательных агрономических проблем, и обеспечивают альтернативный способ воздействия по сравнению с существующими на сегодняшний день токсинами, которые используют в растениях в коммерческих целях. В данном документе описаны новые инсектицидные белки, в качестве примера представленные TIC3668, и рассмотрена каждая из этих потребностей, в частности, широкий спектр против жесткокрылых и чешуекрылых насекомых-вредителей, а конкретнее против видов-вредителей кукурузного жука.
[0100] Ссылка в этой заявке на «TIC3668», «белок TIC3668», «белковый токсин TIC3668», «белки-токсины TIC3668», «родственные TIC3668 токсины», «класс или семейство родственных TIC3668 белковых токсинов», «родственные TIC3668 белки-токсины», «белки типа TIC3668», «подобные TIC3668 белки», «родственные TIC3668 полипептиды-токсины», «родственные TIC3668 пестицидные белки» или «полипептид типа TIC3668, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых» и тому подобные относится к любому новому белку, обладающему ингибирующей активностью в отношении насекомых, который содержит, состоит из, практически гомологичный, сходный с или полученный из любой полипептидной последовательности, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, TIC3668 (SEQ ID NO:2) и ее обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых сегментов, или их комбинаций, которые наделены активностью против жесткокрылых вредителей и чешуекрылых вредителей, включая любой белок, проявляющий ингибирующую активность в отношении насекомых, если выравнивание таких белков с TIC3668 (SEQ ID NO:2), TIC3669 (SEQ ID NO:4), TIC3670 (SEQ ID NO:6), TIC4076 (SEQ ID NO:8), TIC4078 (SEQ ID NO:10), TIC4346 (SEQ ID NO:14), TIC4826 (SEQ ID NO:16), TIC4861 (SEQ ID NO:18), TIC4862 (SEQ ID NO:20) и TIC4863 (SEQ ID NO:22) приводит к идентичности аминокислотной последовательности в любой части в процентах от около 35% до около 100% процентов. Белковые токсины типа TIC3668, описанные в данной заявке, включают TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862, TIC4863 и составной белок TIC4260 (SEQ ID NO:12). Предполагается, что класс белка типа TIC3668 включает формы предшественников, а также формы полной длины этих белков.
[0101] Термин «сегмент» или «фрагмент» используется в настоящей заявке для описания непрерывных аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, которые короче, чем полная аминокислотная или нуклеотидная последовательность, описывающая белок типа TIC3668. Сегмент или фрагмент, проявляющий ингибирующую активность в отношении насекомых, также описан в настоящей заявке, если выравнивание такого сегмента или фрагмента с соответствующим участком белка типа TIC3668, указанного в SEQ ID NO:2, приводит к идентичности аминокислотной последовательности любой части в процентах от около 35 до около 100 процентов между данным сегментом или фрагментом и соответствующим участком белка типа TIC3668.
[0102] Ссылка в настоящей заявке на термины «активный» или «активность», «пестицидная активность» или «инсектицидная активность», «ингибитор в отношении насекомых» или «инсектицидный» относятся к эффективности токсического агента, такого как белок-токсин, в отношении ингибирования (ингибирование роста, питания, плодовитости или жизнеспособности), подавления (подавление роста, кормления, плодовитости или жизнеспособности), борьбы (борьба с заражением вредителями, контроль активности питания вредителей на определенной сельскохозяйственной культуре, содержащей эффективное количество белка типа TIC3668) или уничтожения (вызывая патологические нарушения, летальность или снижение плодовитости) вредителя. Данные термины предназначены для охвата результата обеспечения эффективного количества для пестицидного действия токсического белка на вредителя, причем воздействие токсического белка на вредителя приводит к патологическим нарушениям, летальности, снижению плодовитости или задержке роста. Данные термины также включают отпугивание вредителя от растения, ткани растения, части растения, семян, растительных клеток или от конкретного географического местоположения, в котором может выращиваться растение, в результате обеспечения эффективного количества для пестицидного действия токсического белка в или на растении. В общем, пестицидная активность относится к способности токсического белка быть эффективным для ингибирования роста, развития, жизнеспособности, кормового поведения, брачного поведения, плодовитости или любого измеримого снижения, вызванного неблагоприятными эффектами, вызванными введением в рацион насекомого данного белка, фрагмента белка, сегмента белка или полинуклеотида, конкретному целевому вредителю, включая, но не ограничиваясь ими, насекомые отряда Lepidoptera или Coleoptera. Токсический белок может продуцироваться растением или может применяться к растению или к окружающей среде в том месте, где находится растение. Термины «биологическая активность», «эффективный», «действенный» или их вариации также являются терминами, взаимозаменяемо используемыми в настоящей заявке, для описания воздействия белков по настоящему изобретению на целевых насекомых-вредителей.
[0103] Эффективное количество для пестицидного действия токсического агента, обеспечиваемое в рационе целевого вредителя, проявляет пестицидную активность при контакте токсического агента с вредителем. Токсическим агентом может быть инсектицидный белок или один или более химических агентов, известных в данной области техники. Инсектицидные химические агенты и инсектицидные белковые агенты можно применять по отдельности или в комбинациях друг с другом. Химические агенты включают, но не ограничивается ими, молекулы дцРНК, нацеленные на специфические гены для подавления в целевом вредителе, органические хлориды, органические фосфаты, карбаматы, пиретроиды, неоникотиноиды и рианоиды. Инсектицидные белковые агенты включают белковые токсины, представленные в настоящей заявке, а также другие белковые токсические агенты, в том числе такие, которые нацелены на виды чешуекрылых и жесткокрылых, а также белковые токсины, которые используются для борьбы с другими вредителями растений, такие как Cry-белки, доступные в данной области техники для применения в борьбе с видами Hemipteran (полужесткокрылых) и (Homopteran) равнокрылых.
[0104] Предполагается, что ссылка на вредителя, в частности вредителя сельскохозяйственного растения, означает вредителей культурных растений, особенно тех чешуекрылых, с которыми борются с помощью класса родственных типу TIC3668 белковых токсинов. Однако, ссылка на вредителя может также включать насекомых-вредителей растений полужесткокрылых и равнокрылых, а также нематоды и грибы при тех условиях, когда токсические агенты, нацеленные на этих вредителей, совместно локализуются или присутствуют вместе с одним или более белками класса родственных TIC3668 белковых токсинов.
Spodoptera frugiperda
Spodoptera exigua
Mamestra configurata
Agrotis ipsilon
Trichoplusia ni
Pseudoplusia includens
Anticarsia gemmatalis
Hypena scabra
Heliothis virescens
Agrotis subterranea
Pseudaletia unipuncta
Agrotis orthogonia
Ostrinia nubilalis
Amyelois transitella
Crambus caliginosellus
Herpetogramma licarsisalis
Homoeosoma electellum
Elasmopalpus lignosellus
Cydia pomonella
Endopiza viteana
Grapholita molesta
Suleima helianthana
Plutella xylostella
Pectinophora gossypiella
Lymantria dispar
Alabama argillacea
Archips argyrospila
Archips rosana
Chilo suppressalis
Cnaphalocrocis medinalis
Crambus caliginosellus
Crambus teterrellus
Diatraea grandiosella
Diatraea saccharalis
Earias insulana
Earias vittella
Helicoverpa armigera
Helicoverpa zea
Heliothis virescens
Herpetogramma licarsisalis
Lobesia botrana
Phyllocnistis citrella
Pieris brassicae
Pieris rapae
Plutella xylostella
Spodoptera exigua
Spodoptera litura
Tuta absoluta
Agriotes
Anthonomus
Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis
Cosmopolites
Curculio
Dermestes
Diabrotica
Epilachna
Eremnus
Leptinotarsa decemlineata
Lissorhoptrus
Melolontha
Orycaephilus
Otiorhynchus
Phlyctinus
Popillia
Psylliodes
Rhizopertha
Scarabeidae
Sitophilus
Sitotroga
Tenebrio
Tribolium
Trogoderma
Diabrotica virgifera virgifera
Diabrotica barberi
Diabrotica virgifera zeae
Diabrotica balteata
Diabrotica undecimpunctata howardii
Diabrotica viridula
Diabrotica speciosa
[0105] Отдельные белки, которые включают класс родственных TIC3668 белков связаны общей функцией и проявляют инсектицидную активность в отношении насекомых-вредителей из видов насекомых Coleoptera и Lepidoptera, включая взрослых особей, куколок, личинок и молодых особей. Насекомые отряда Lepidoptera включают, но не ограничиваются ими, малые совки, совки, пяденицы и представители подсемейства Heliothinae семейства Noctuidae, например, совку травяную (), совку карадрину (), совку латуковую (), совку-ипсилон (), совку ни (), соевую совку (), гусеницу совки бархатных бобов (), гусеницу-вредитель клевера (), табачную совку (), совку хлопковую (), совку (), совку прямоугольную (); точильщики, чехликовые моли, гусеницы, выпускающих паутину, вредители шишек, мермитиды и огневки, скелетирующие листья, из семейства Pyralidae, например, европейский кукурузный мотылек (), огневку (), огневку кукурузную (), луговой мотылек (), огневку подсолнечника (), огневку кукурузную стеблевую малую (); трубковерты, листовертки, вредители семян и вредители фруктов из семейства Tortricidae, например, яблонная плодожерка (), листовертку виноградную (), плодожорку восточную (), листовертку подсолнечника () и многие другие экономически важные вредители отряда Lepidoptera, например, капустная моль (), хлопковая моль () и непарный шелкопряд (). Другие насекомые вредители отряда Lepidoptera включают, например,(совка хлопковая американская), (листовертка плодовых деревьев), (розанная листовертка) и другие виды Archips, (огневка азиатская стеблевая или сверлильщик рисовый стеблевой), (рисовая листовертка), (кукурузная огневка), (огневка мятлика), (огневка кукурузная юго-западная), (американская тростниковая огневка), (совка хлопковая), (совка хлопковая пятнистая), (совка американская), (совка хлопковая американская или совка хлопковая), (совка табачная), (луговой мотылек), (листовертка виноградная), (цитрусовая минирующая моль), (капустная белянка), (белянка репная или репница), (капустная моль), (совка-карадрина), (табачная совка, пожирающая соцветия гусеница) и (томатная минирующая моль). Насекомые отряда Coleoptera включают виды, но не ограничиваются ими, spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp. и spp., в частности вредителями является (западный кукурузный жук, WCR), (северный кукурузный жук, NCR), (мексиканский кукурузный жук, MCR), (бразильский кукурузный жук (BZR), (южный кукурузный жук, SCR) и комплекс бразильского кукурузного жукa (BCR), состоящий из видов и ).
т. е.
[0106] Ссылка в настоящей заявке на термин «выделенная молекула ДНК», «выделенная молекула полинуклеотида» или эквивалентный термин или фразу, предназначена для обозначения того, что молекула ДНК представляет собой молекулу ДНК, которая присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не в ее природной среде. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, терминирующая последовательность транскрипции и тому подобные, которые естественным образом находятся в ДНК генома организма, не считаются «выделенными» до тех пор, пока такой элемент находится в геноме организма и в том месте генома, в котором он встречается в природе. Тем не менее, каждый из этих элементов и их части могут быть «выделенными» в рамках настоящего раскрытия при условии, что элемент не находится внутри генома организма и в том месте в геноме, в котором он встречается в природе. Точно так же нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет представлять собой выделенную нуклеотидную последовательность, если нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой встречается в природе последовательность, кодирующая данный белок. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность инсектицидного белка природного происхождения, будет считаться выделенной для целей этого описания. Для целей настоящего описания трансгенная нуклеотидная последовательность, нуклеотидная последовательность ДНК, вставленная в геном клеток растения или бактерии, или присутствующая во внехромосомном векторе, считается выделенной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она внутри плазмиды или сходной структуры, используемой для трансформации клеток, внутри генома растения или бактерии или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из данного растения или бактерии.
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus laterosporus
[0107] Как дополнительно описано в данной заявке открытая рамка считывания (ORF) (SEQ ID NO:1), кодирующая TIC3668 (SEQ ID NO:2), обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG5552 . Затем проводили скрининг других бактериальных геномов на наличие последовательностей, кодирующих родственный TIC3668 белок. В этих других бактериальных геномах идентифицировали несколько других открытых рамок считывания, кодирующих аминокислотные последовательности, напоминающие белок TIC3668 EG5552, включая подобные TIC3668 белки - TIC3669, которая обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG5551 (SEQ ID NO:3, кодирующая SEQ ID NO:4), TIC3670, которая обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG5553 (SEQ ID NO:5, кодирующая SEQ ID NO:6), TIC4076, которая обнаружена в ДНК, полученной из штамма ATCC6456 (SEQ ID NO:7, кодирующая SEQ ID NO:8), TIC4078, которая обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG4227 (SEQ ID NO:9, кодирующая SEQ ID NO:10), TIC4346, которая обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG5551 (SEQ ID NO:13, кодирующая SEQ ID NO:14), TIC4826, которая обнаружена в ДНК, полученной из штамма AG0021D10 (SEQ ID NO:15, кодирующая SEQ ID NO:16), TIC4861 (SEQ ID NO:17, кодирующая SEQ ID NO:18), TIC4862 (SEQ ID NO:19, кодирующая SEQ ID NO:20) и TIC4863 (SEQ ID NO:21, кодирующая SEQ ID NO:22), которая обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG4227 . Один дополнительный подобный TIC3668 белок, TIC4260 (SEQ ID NO:11, кодирующая SEQ ID NO:12) создан комбинированием варианта аминокислотной последовательности природного происхождения из пяти различных нативных подобных TIC3668 белков для получения составного белка.
Diabrotica
Diabrotica virgifera virgifera
Ostrinia nubialis
Diatraea grandiosella
Chrysodeixis includens
[0108] Соответствующие кодирующие последовательности клонировали и экспрессировали в микробных клетках-хозяевах для получения рекомбинантных белков для использования в биологических анализах на насекомых. Как дополнительно описано в данной заявке, показано, что эти белки проявляют биологическую активность против видов , включая западного кукурузного жука (WCR, ), западно-европейского кукурузного мотылька (ECB, ), юго-западного кукурузного мотылька (SWC, ) и соевой совки (SBL, ).
in planta
[0109] Неожиданным признаком белков типа TIC3668 является присутствие N-концевого аминокислотного сегмента, соответствующего аминокислотным положениям от 1 до 23 для TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826, TIC4863; от 1 до 12 для TIC4861 и от 1 до 21 для TIC4862. Каждый из этих N-концевых аминокислотных сегментов может быть удален из соответствующего белка, и также может быть удалена полинуклеотидная последовательность, кодирующая соответствующий сегмент. При экспрессии удаление этих соответствующих сегментов неожиданно приводит к увеличению инсектицидной активности против видов кукурузного жука, по сравнению с экспрессией полноразмерного белкового токсина, содержащего удаленный сегмент. Сегменты белковых токсинов без N-концевых аминокислотных сегментов, упомянутых выше, в данном документе названы «зрелыми белками-токсинами типа TIC3668». В целом, ссылка на зрелый вариант белка типа TIC3668 отмечена в данном документе буквой «m» перед названием токсина для отличия ссылки на зрелую последовательность от полноразмерной нативной последовательности. Например, зрелый вариант аминокислотной последовательности для TIC3668 (SEQ ID NO:2) представляет собой mTIC3668 (SEQ ID NO:23).Зрелые варианты TIC3669 (SEQ ID NO:4), TIC3670 (SEQ ID NO:6), TIC4076 (SEQ ID NO:8), TIC4078 (SEQ ID NO:10), TIC4260 (SEQ ID NO:12), TIC4346 (SEQ ID NO:14) и TIC4826 (SEQ ID NO:16) представляют собой mTIC3669 (SEQ ID NO:24), mTIC3670 (SEQ ID NO:25), mTIC4076 (SEQ ID NO:26), mTIC4078 (SEQ ID NO:27), mTIC4260 (SEQ ID NO:28), mTIC4346 (SEQ ID NO:29) и mTIC4826 (SEQ ID NO:30), соответственно. Полноразмерные белки TIC4861 (SEQ ID NO:18), TIC4862 (SEQ ID NO:20) и TIC4863 (SEQ ID NO:22) представляют собой варианты длины последовательностей друг друга и отличаются только по длине своего N-концевого аминокислотного сегмента. Удаление N-концевого аминокислотного сегмента в TIC4861, TIC4862 и TIC4863 создает идентичную зрелую аминокислотную последовательность для mTIC4861, mTIC4862 и mTIC4863. Таким образом, аминокислотные последовательности для mTIC4861, mTIC4862 и mTIC4863 кодируются одной и той же полинуклеотидной последовательностью (mTIC4861, SEQ ID NO:31). Зрелые последовательности подобных TIC3668 белков кодируются SEQ ID NO:64 (кодирующая mTIC3668), SEQ ID NO:65 (кодирующая mTIC3669), SEQ ID NO:66 (кодирующая mTIC3670), SEQ ID NO:67 (кодирующая mTIC4076), SEQ ID NO:68 (кодирующая mTIC4078), SEQ ID NO:69 (кодирующая mTIC4260), SEQ ID NO:70 (кодирующая mTIC4346), SEQ ID NO:71 (кодирующая mTIC4826) и SEQ ID NO.72 (кодирующая mTIC4861, mTIC4862 и mTIC4863) для экспрессии в бактериальных хозяевах.
[0110] Дополнительные представители семейства типа TIC3668 можно создавать путем использования аминокислотных вариантов природного происхождения из некоторых или всех представителей семейства для получения новых белков с большим уровнем разнообразия аминокислотных последовательностей и с новыми свойствами. Варианты класса белковых токсинов типа TIC3668 получали путем выравнивания аминокислотных последовательностей представителей семейства типа TIC3668 и комбинированных различий на уровне аминокислотной последовательности в новой аминокислотной последовательности и внесения соответствующих изменений в полинуклеотиды, кодирующие такие варианты. Одним таким примером является TIC4260. SEQ ID NO:11 представляет собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC4260 (SEQ ID NO:12).Зрелый белок (mTIC4260, SEQ ID NO:28) кодируется полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:43.
[0111] Фрагменты белковых токсинов типа TIC3668 могут быть усеченных форм, в которых одна или более аминокислот удалены из N-концевого конца, C-концевого конца, середины белка или их комбинаций с ингибирующей активностью в отношении насекомых. Эти фрагменты могут быть природного происхождения или синтетическими вариантами TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 или TIC4863, но должны сохранять или улучшать ингибирующую активность в отношении насекомых TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 или TIC4863. Усеченные N-концевые или C-концевые делеционные варианты включают, но не ограничиваются ими, белки TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 или TIC4863, у которых отсутствуют аминокислотные остатки любого из N-конца и/или C-конца. Например, N-концевые аминокислотные остатки от 1 до 23 белка TIC3668 могут быть удалены с получением белка-токсина, содержащего аминокислоты 24-317 SEQ ID NO:2. Удаление 10 или 20 аминокислот с C-концевого аминокислотного конца белка TIC3668 приводило к потере инсектицидной активности, тогда как удаление единственной аминокислоты не влияло на активность.
см.
et al.(
[0112] Белки класса белков типа TIC3668 и белки, которые напоминают белки класса белков типа TIC3668, могут быть идентифицированы путем сравнения друг с другом с использованием различных компьютерных алгоритмов, известных в данной области техники (таблицы 1 и 2). Идентичности аминокислотных последовательностей, о которых сообщается в данном документе, являются результатом выравнивания программой Clustal W с использованием таких параметров по умолчанию: весовая матрица: blosum, штраф за внесение пропуска: 10,0, штраф за продолжение пропуска: 0,05, гидрофильные пропуски: вкл., гидрофильные остатки: GPSNDQERK, штрафы за пропуски по специфическим остаткам: вкл. (Thompson, 1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Процент идентичности аминокислот далее рассчитывают в виде результата умножения 100% на (идентичность аминокислот/длина исследуемого белка). Другие алгоритмы выравнивания также доступны в данной области техники и обеспечивают результаты, аналогичные результатам, полученным с использованием выравнивания программой Clustal W.
[0113] Предполагается, что белок, проявляющий ингибирующую активность против видов чешуекрылых насекомых представляет собой представителя класса белковых токсинов типа TIC3668, если данный белок используется в запросе, например, при выравнивании в программе Clustal W, и по меньшей мере один из белков по данному изобретению, указанный как mTIC4260, идентифицирован как совпадение в таком выравнивании, при котором данный запрашиваемый белок проявляет по меньшей мере от около 85% до около 100% идентичности аминокислотной последовательности по всей длине запрашиваемого белка, что составляет 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или любую часть в процентах в данном диапазоне; или по меньшей мере один из белков по данному изобретению, указанный как mTIC3668, идентифицирован как совпадение в таком выравнивании, при котором данный запрашиваемый белок проявляет по меньшей мере от около 89% до около 100% идентичности аминокислотной последовательности по всей длине запрашиваемого белка, что составляет 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или любую часть в процентах в данном диапазоне; или по меньшей мере один из белков по данному изобретению, указанный как mTIC3669 и/или mTIC3670, идентифицирован как совпадение в таком выравнивании, при котором данный запрашиваемый белок проявляет по меньшей мере от около 90% до около 100% идентичности аминокислотной последовательности по всей длине запрашиваемого белка, что составляет 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или любую часть в процентах в данном диапазоне; или по меньшей мере один из белков по данному изобретению, указанный как mTIC4826, идентифицирован как совпадение в таком выравнивании, при котором данный запрашиваемый белок проявляет по меньшей мере от около 91% до около 100% идентичности аминокислотной последовательности по всей длине запрашиваемого белка, что составляет 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или любую часть в процентах в данном диапазоне.
[0114] Предполагается, что белок, проявляющий ингибирующую активность в отношении насекомых против видов жесткокрылых насекомых представляет собой представителя класса белковых токсинов типа TIC3668, если данный белок используется в запросе, например, при выравнивании в программе Clustal W, и по меньшей мере один из белков по данному изобретению, указанный как mTIC3668, mTIC3669, mTIC3670, mTIC4076, mTIC4078, mTIC4260, mTIC4346, mTIC4826, mTIC4861, mTIC4862, и mTIC4863, идентифицирован как совпадение в таком выравнивании, при котором данный запрашиваемый белок проявляет по меньшей мере от около 35% до около 100% идентичности аминокислотной последовательности по всей длине запрашиваемого белка, что составляет 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или любую часть в процентах в данном диапазоне.
[0115] Типовые белки класса белковых токсинов типа TIC3668 выравнивали друг с другом с использованием алгоритма Clustal W. Как показано в таблице 1, для каждой пары полноразмерных белков была создана попарная матрица процентных идентичностей аминокислотных последовательностей. Как показано в таблице 2, для каждой пары белков зрелой длины была создана попарная матрица процентных идентичностей аминокислотных последовательностей.
Таблица 1
Попарная матрица отображает типовые полноразмерные белки
Описание таблицы: Выравнивание Clustal W между (X) и (Y) показано в попарной матрице. Столбцы под (N) относятся к SEQ ID NO. Столбцы (M) относятся к названию белков (№ TIC). Процент идентичности аминокислот между всеми парами рассчитан и представлен первым числом в каждой ячейке. Второе число в каждой ячейке (в скобках) представляет количество идентичных аминокислот между парой.
Таблица 2
Попарная матрица отображает типовые зрелые белки
Описание таблицы: Выравнивание Clustal W между (X) и (Y) показано в попарной матрице. Столбцы под (N) относятся к SEQ ID NO. Столбцы (M) относятся к названию белков (№ TIC). Процент идентичности аминокислот между всеми парами рассчитан и представлен первым числом в каждой ячейке. Второе число в каждой ячейке (в скобках) представляет количество идентичных аминокислот между парой.
[0116] Полноразмерные и зрелые белки класса белковых токсинов типа TIC3668 также могут быть родственными по первичной структуре (консервативные аминокислотные мотивы), по длине (около 295 аминокислот для зрелых белков и около 317 аминокислот для полноразмерных белков) и по другим свойствам. Полноразмерные белки из данного изобретения обладают измеренной массой около 35 кДа, при анализе в гелях для белков в денатурирующих условиях, а зрелые белки обладают измеренной массой около 32 кДа. Свойства полноразмерных и зрелых форм класса белковых токсинов типа TIC3668, представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Свойства полноразмерных белков.
Белок
Молекулярная масса(в Дальтонах)
Длина в аминокислотах
Изоэлектрическая точка
Заряд при рН 7,0
Кол-во сильноосновных (-) аминокислот
Кол-во сильнокислотных аминокислот
Кол-во гидрофобных аминокислот
Кол-во полярных аминокислот
TIC3668
34770,96
317
9,049
5,229
34
29
95
111
TIC3669
34769,91
317
8,898
4,231
34
30
95
111
TIC3670
34788,89
320
8,898
4,231
34
30
93
112
TIC4076
34652,83
317
8,721
3,232
32
29
95
112
TIC4078
34676,86
317
8,936
4,397
32
28
96
110
TIC4260
34743,98
317
9,077
5,395
33
28
96
109
TIC4826
34734,97
317
8,899
4,231
33
29
95
111
TIC4861
33448,24
306
8,439
2,233
31
29
87
110
TIC4862
34392,43
315
8,439
2,233
31
29
94
112
TIC4863
34648,77
317
8,899
4,231
33
29
94
112
TIC4346
34717,95
317
8,437
2,235
32
30
97
109
Таблица 4
Свойства зрелых белков
Белок
Молекулярная масса(в Дальтонах)
Длина в аминокислотах
Изоэлектрическая точка
Заряд при рН 7,0
Кол-во сильноосновных (-) аминокислот
Кол-во сильнокислотных аминокислот
Кол-во гидрофобных аминокислот
Кол-во полярных аминокислот
mTIC3668
32317,06
295
8,722
3,064
32
29
83
104
mTIC3669
32303,95
295
8,436
2,067
32
30
82
105
mTIC3670
32334,99
295
8,436
2,067
32
30
81
105
mTIC4076
32186,87
295
8,000
1,068
30
29
82
106
mTIC4078
32222,96
295
8,466
2,233
30
28
84
103
mTIC4260
32290,07
295
8,747
3,230
31
28
84
102
mTIC4826
32269,01
295
8,436
2,066
31
29
82
105
mTIC4861 mTIC4862 mTIC4863
32182,81
295
8,436
2,066
31
29
81
106
mTIC4346
32251,99
295
7,092
0,071
30
30
84
103
B. laterosporous
[0117] Белки, описанного класса белковых токсинов типа TIC3668, представляют новый класс инсектицидных белков. На основании таблицы 5 все числа выше диагональной линии, соответствующей 100% идентичности, представляют количество отличающихся аминокислот между соответствующими белками, которых сравнивали, на пересечении конкретной строки и столбца. Числа ниже диагональной линии, соответствующей 100% идентичности, представляют процент идентичности соответствующих белков, которых сравнивали, на пересечении конкретной строки и столбца. Представители этого класса белков зрелой длины проявляют не более 90,54% идентичности аминокислот к любому другому инсектицидному белку, известному в данной области техники, как показано в таблице 5. Инсектицидный белок, проявлющий наибольшую идентичность с любыми белками зрелой длины по данному изобретению, представляет собой SEQ ID NO:50 в публикации заявки на патент номер 20110030093 (AXMI-209) с 90,5% идентичности последовательности к mTIC4076, mTIC4346, mTIC4826 и mTIC4863. В данном описании представлена активность только против Lepidoptera, тогда как типовые белки по данному изобретению демонстрируют активность против Coleoptera. H0UDD3_BRELA, F7TVP6_BRELA и U4WSU1_BRELA представляют собой неаннотированные белковые последовательности, предсказанные по открытой рамке считывания в геномных последовательностях, о которых сообщалось как о полученных из . Для данных белков не сообщалось об инсектицидной активности.
Таблица 5
Выравнивание белков TIC3886 зрелой длины с белками предшествующего уровня техники
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
mTIC3668
1
100
6
2
11
18
12
8
8
10
36
32
32
33
mTIC3669
2
98,0
100
4
10
16
14
10
8
9
35
32
32
32
mTIC3670
3
99,3
98,6
100
9
16
14
8
6
8
34
30
30
31
mTIC4076
4
96,3
96,6
97,0
100
11
20
5
6
6
30
28
30
29
mTIC4078
5
93,9
94,6
94,6
96,3
100
12
11
12
13
37
34
36
34
mTIC4260
6
95,9
95,3
95,3
93,2
95,9
100
19
20
22
48
44
44
43
mTIC4346
7
97,3
96,6
97,3
98,3
96,3
93,6
100
4
6
30
26
28
29
mTIC4826
8
97,3
97,3
98,0
98,0
95,9
93,2
98,6
100
4
30
24
24
25
mTIC4863
9
96,6
97,0
97,3
98,0
95,6
92,5
98,0
98,6
100
30
28
28
27
AXMI_209
10
88,6
89,0
89,3
90,5
88,3
84,9
90,5
90,5
90,4
100
6
8
7
H0UDD3_BRELA
11
89,9
89,9
90,5
91,2
89,3
86,1
91,8
92,4
91,2
98,1
100
2
3
F7TVP6_BRELA
12
89,9
89,9
90,5
90,5
88,6
86,1
91,2
92,4
91,2
97,5
99,4
100
3
U4WSU1_BRELA
13
89,6
89,9
90,2
90,9
89,3
86,4
90,9
92,1
91,5
97,8
99,1
99,1
100
[0118] Белки TIC3668, описанные в данной заявке, в биологических анализах влияния рациона проявляют активность против Coleoptera, включая WCR. В некоторых случаях также наблюдается активность в отношении чешуекрылых.
[0119] Как описано дополнительно в примерах настоящей заявки, были сконструированы полинуклеотидные последовательности, кодирующие белки-токсины TIC3668, для применения в растениях. Типовые полинуклеотиды, которые сконструированы для экспрессии в растениях и кодируют полноразмерные белки TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076, TIC4078, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 и TIC4863, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, указаны в SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:51. Типовые полинуклеотиды, которые сконструированы для экспрессии в растениях и кодируют зрелую форму белков mTIC3668, mTIC3669, mTIC3670, mTIC4260, mTIC4076, mTIC4078, mTIC4346, mTIC4826, mTIC4861, mTIC4862 и mTIC4863, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, указаны в SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:49.
[0120] Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие данные полинуклеотидные последовательности, конструировали и вводили в клетки растений кукурузы в соответствии со способами и методиками трансформации, которые известны в данной области техники. Трансформированные клетки регенерировали в трансформированные растения, которые, как было обнаружено, экспрессировали белки-токсины TIC3668. Для проверки пестицидной активности, проводили биологические анализы в присутствии личинок чешуекрылых или жесткокрылых вредителей с использованием дисков листьев растений, полученных из трансформированных растений.
[0121] Ингибирующая активность в отношении насекомых типовых представителей класса белковых токсинов типа TIC3668 подробнее описана в примерах. Типовые белки связаны общей функцией и проявляют инсектицидную активность в отношении видов насекомых Coleoptera и Lepidoptera, включая взрослых особей, куколок, личинок и молодых особей.
Bt
Bt
Bacillus
т. е.
[0122] Подразумеваются рекомбинантные полинуклеотидные композиции, кодирующие белки типа TIC3668. Например, белки типа TIC3668 могут экспрессироваться конструктами рекомбинантной ДНК, в которых полинуклеотидная молекула с ORF, кодирующая такой белок, функционально связана с генетическими экспрессионными элементами, такими как промотор и любым другим регуляторным элементом, необходимым для экспрессии в системе, для которой предназначен данный конструкт. Неограничивающие примеры включают функциональный промотор растений, функционально связанный с последовательностями, кодирующими белки типа TIC3668, для экспрессии данного белка в растениях, или -функциональный промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей белок типа TIC3668, для экспрессии белка в -бактерии или в другом виде . Другие элементы могут быть функционально связаны с последовательностями, кодирующими белки типа TIC3668, включающими, но ограничивающимися ими, энхансеры, интроны, нетранслируемые лидеры, кодированные белковые метки для иммобилизации (HIS-метка), пептиды для транслокации (транзитные пептиды пластид, сигнальные пептиды), полипептидные последовательности для посттрансляционных модифицирующих ферментов, сайты связывания рибосом и сайты-мишени для РНКи. Типовые рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, предложеные в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, гетерологичным промотором, функционально связанным с полинуклеотидом, таким как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:21, который кодирует соответствующие полипептиды или белки, имеющие аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:22. Кодоны рекомбинантной полинуклеотидной молекулы, кодирующие белки, описанные в данном документе, могут быть заменены синонимичными кодонами (известными в данной области техники как молчащие замены). Неограничивающие примеры модифицированных полинуклеотидов, кодирующих любой из белков типа TIC3668, описанных в данной заявке, указаны в SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:51 для последовательностей полноразмерных белков и SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:49 для последовательностей зрелых белков.
[0123] Конструкт рекомбинантной ДНК, содержащий последовательности, кодирующие белки типа TIC3668, может дополнительно содержать участок ДНК, который кодирует один или более агентов, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, которые могут быть сконструированы для одновременной экспрессии или коэкспрессии с последовательностью ДНК, кодирующей белок типа TIC3668, белок отличный от белка типа TIC3668, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых, или вспомогательный белок. Вспомогательные белки включают, но не ограничиваются ими, кофакторы, ферменты, партнеры по связыванию или другие агенты, которые способствуют повышению эффективности агента, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, например, способствуя его экспрессии, влияя на его стабильность в растениях, оптимизируя свободную энергию олигомеризации, увеличивая его токсичность и увеличивая спектр его активности. Вспомогательный белок может облегчать усвоение, например, одного или более агентов, обладающих ингибирующих активностью в отношении насекомых, или усиливать токсическое действие данного токсического агента.
т. е.
[0124] Конструкт рекомбинантной ДНК можно собирать так, чтобы все белки или молекулы дцРНК экспрессировались от одного промотора, или каждый белок или молекула дцРНК экспрессировалась под контролем отдельного промотора или определенной их комбинации. Белки по настоящему изобретению могут экспрессироваться из мультигенной экспрессирующей системы, в которой один или более белков TIC3668 экспрессируются из общего нуклеотидного сегмента, который также содержит другие открытые рамки считывания и промоторы, в зависимости от выбранного типа экспрессирующей системы. Например, в бактериальной мультигенной экспрессирующей системе может использоваться единственный промотор для управления экспрессией множества связанных/тандемных открытых рамок считывания, находящихся в одном опероне (полицистронная экспрессия). В другом примере в растительной мультигенной экспрессирующей системе могут использоваться множества несвязанных экспрессионных кассет, каждая из которых экспрессирует отличающийся белок или другой агент, такой как одна или более молекул дцРНК.
[0125] Рекомбинантные полинуклеотиды или конструкты рекомбинантной ДНК, содержащие последовательность, кодирующую белок типа TIC3668, могут быть доставлены в клетки-хозяева векторами, например, плазмидой, бакуловирусом, синтетической хромосомой, вирионом, космидой, фагмидой, фагом или вирусным вектором. Такие векторы могут быть использованы для достижения стабильной или транзиентной экспрессии последовательности, кодирующей белок типа TIC3668, в клетке-хозяине, или более поздней экспрессии кодируемого полипептида. Экзогенный рекомбинантный полинуклеотид или конструкт рекомбинантной ДНК, который содержит последовательность, кодирующую белок типа TIC3668, и которая вводится в клетку-хозяина, упоминается в данном документе как «трансген».
Agrobacterium
Bacillus
Escherichia
Salmonella
Pseudomonas
Rhizobium
[0126] В данном документе предложены трансгенные бактерии, трансгенные растительные клетки, трансгенные растения и части трансгенных растений, которые содержат рекомбинантный полинуклеотид, который экспрессирует любой одну или более последовательностей, кодирующих белки типа TIC3668. Термин «бактериальная клетка» или «бактерия» может включать, но не ограничивается клеткой , , , , или . Термин «растительная клетка» или «растение» может включать, но не ограничиваться, растительной клеткой или растением однодольного, двудольного, люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, моркови, маниока, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, клевера, хлопчатника, тыквы, огурца, ели Дугласа, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата, сосны Лоблолли, проса, дыни, грецкого ореха, овса, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, злака, ржи, американского шафрана, кустарник, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза, пшеницы. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены трансгенные растения и части трансгенных растений, которые регенерировали из трансгенной растительной клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенные растения могут быть получены из трансгенного семени путем разрезания, срывания, измельчения или иного отделения части от растения. В некоторых вариантах реализации изобретения часть растения может быть семенем, коробочкой, листом, цветком, стеблем, корнем или любой его частью или нерегенерируемой частью трансгенной части растения. Как используется в данном контексте, «нерегенерируемая» часть трансгенной части растения представляет собой часть, которая не может быть индуцирована на образование целого растения или которая не может быть индуцирована на образование целого растения, способного к половому и/или бесполому размножению. В некоторых вариантах реализации изобретения нерегенерируемая часть отбираемой части растения представляет собой часть трансгенного семени, коробочки, листа, цветка, стебля или корня.
[0127] Приведены способы получения трансгенных растений, которые содержат ингибирующие в отношении насекомых Coleoptera и Lepidoptera количества белков типа TIC3668. Такие растения могут быть получены путем введения рекомбинантного полинуклеотида, который кодирует любой из белков типа TIC3668, представленных в этой заявке, в растительную клетку и отбором растения, полученного из указанной растительной клетки, которое экспрессирует ингибирующее в отношении насекомых Coleoptera или Lepidoptera количество белков типа TIC3668. Растения могут быть получены из растительных клеток путем регенерации семян, пыльцы или меристемы, полученных методиками трансформации. Способы трансформации растений известны в данной области техники.
[0128] В данной заявке также описаны переработанные растительные продукты, причем такие переработанные продукты содержат обнаруживаемое количество белка типа TIC3668, его сегмент и фрагмент, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, или его любую отличительную часть. В некоторых вариантах реализации изобретения переработанный продукт выбирают из группы, состоящей из частей растений, биомассы растений, растительного масла, крупы, сахара, корма для животных, муки, хлопьев, отрубей, волокон, шелухи, семян и переработанных семян. В определенных вариантах реализации изобретения переработанный продукт не способен к регенерации. Растительный продукт может включать товар или другие коммерческие продукты, полученные из трансгенного растения или части трансгенного растения, причем товар или другие продукты можно отслеживать путем обнаружения нуклеотидных сегментов или экспрессированной РНК или белков, которые кодируют или содержат отличительные части белка типа TIC3668.
[0129] Растения, экспрессирующие белки TIC3668, можно скрещивать путем селекции с трансгенными объектами, экспрессирующими другие белки-токсины и/или экспрессирующими другие трансгенные признаки, такие как гены устойчивости к гербицидам, гены, повышающие урожайность, или признаки, обеспечивающие устойчивость к стрессу, и тому подобные, или такие признаки могут быть объединены в один вектор, так что все признаки будут связаны между собой.
[0130] Последовательности, кодирующие белки типа TIC3668, и последовательности, имеющие значительную процентную идентичность с последовательностями, кодирующими белки типа TIC3668, можно идентифицировать с использованием способов, известных среднему специалисту в данной области техники, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), термическая амплификация и гибридизация. Например, белки класса белковых токсинов типа TIC3668 могут быть использованы для получения антител, которые специфически связываются с этим классом белков, и могут быть использованы для скрининга и поиска других представителей белков данного класса.
[0131] Дополнительно, нуклеотидные последовательности, кодирующие класс белковых токсинов типа TIC3668 (и обратные комплементарные последовательности), могут быть использованы в качестве зондов и праймеров для скрининга и идентификации других представителей данного класса с использованием способов термоциклической или изотермической амплификации и гибридизации. Конкретно, олигонуклеотиды, полученные из последовательностей, указанных в любой из SEQ ID NO: от 52 до 61, могут быть использованы для определения наличия или отсутствия трансгена типа TIC3668 в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученном из товарного продукта. Учитывая чувствительность определенных методов обнаружения нуклеиновых кислот, в которых используются олигонуклеотиды, предполагается, что олигонуклеотиды, полученные из последовательностей, указанных в любой из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:61, могут быть использованы для обнаружения трансгена TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078 или TIC4260 в товарных продуктах, полученных из объединенных источников, где только часть товарного продукта получена из трансгенного растения, содержащего любую из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:61. Дополнительно принимается во внимание, что такие олигонуклеотиды могут применяться для введения варианта нуклеотидной последовательности в каждую из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:61. Такие олигонуклеотиды «мутагенеза» пригодны для идентификации TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078 или TIC4260, вариантов аминокислотных последовательностей, проявляющих диапазон ингибирующей активности в отношении насекомых или различную экспрессию в трансгенных растительных клетках-хозяевах.
[0132] Гомологи нуклеотидных последовательностей, например, инсектицидные белки, кодируемые нуклеотидными последовательностями, которые гибридизируются с каждой или любой из описанных в данной заявке последовательностей в жестких условиях гибридизации, также являются вариантом реализации настоящего изобретения. В данном изобретении также предложен способ выявления первой нуклеотидной последовательности, которая гибридизируется со второй нуклеотидной последовательностью, причем первая нуклеотидная последовательность (или ее обратная комплементарная последовательность) кодирует инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент и гибридизируется в жестких условиях гибридизации со второй нуклеотидной последовательностью. В таком случае вторая нуклеотидная последовательность может быть одной из нуклеотидных последовательностей, описанных в классе белковых токсинов типа TIC3668, проходящих гибридизацию в жестких условиях. Кодирующие нуклеотиды последовательности гибридизируются друг с другом в соответствующих условиях гибридизации, а белки, кодируемые этими нуклеотидными последовательностями, перекрестно реагируют с антисывороткой, полученной против любого из других белков. Жесткие условия гибридизации известны в данной области техники и могут изменяться в соответствии с требуемым применением и результатом и могут охватывать множество реактивов и условий. К примеру, промывки при более высоких температурах являются составной частью более жестких условий. В некоторых вариантах реализации изобретения условия гибридизации по настоящему изобретению могут включать по меньшей мере гибридизацию при 42°C с последующими двумя промывками, каждая в течение пяти минут, при комнатной температуре с помощью 2X SSC, 0,1% SDS, с последующими двумя промывками, каждая в течение тридцати минут, при 65°C в 0,5X SSC, 0,1% SDS; или гибридизацию при 68°C с последующей промывкой при 68°C, в 2X SSC, содержащем 0,1% SDS; или гибридизацию от 4 до 12 часов в 50% формамиде, 1 M NaCl и 1% SDS при 37C и промывку в 0,1 X SSC при 6°C - 65°C.
Bacillus
Bacillus
[0133] Специалист в данной области техники поймет, что из-за избыточности генетического кода многие другие последовательности способны кодировать такие родственные белки и такие последовательности, до той степени, в которой они функционируют для обеспечения экспрессии инсектицидных белков, либо в штаммах , либо в растительных клетках, которые представляют собой варианты реализации настоящего изобретения, конечно понимая, что многие такие избыточные кодирующие последовательности не будут гибридизироваться в этих условиях с нативными последовательностями , кодирующими TIC3668. Данным применением подразумевается использование этих и других методов идентификации, известных средним специалистам в данной области техники, для идентификации последовательностей, кодирующих белки типа TIC3668, и последовательностей, имеющих значительную процентную идентичность с последовательностями, кодирующими белки типа TIC3668.
Bacillus
[0134] В данном описании также подразумевается использование молекулярных методов, известных в данной области техники, для конструирования и клонирования полезных для коммерческого применения белков, содержащих химеры белков из пестицидных белков; например, химеры могут быть собраны из сегментов белков типа TIC3668 для получения дополнительных полезных вариантов реализации изобретения, включающих сборку сегментов белков типа TIC3668 с сегментами различных белков, отличных от TIC3668 и родственных белков. Класс белков типа TIC3668 может подвергаться выравниванию друг с другом и с другими пестицидными белками (на предмет наличия между ними близкого или отдаленного филогенетического родства) и можно идентифицировать сегменты каждого из таких белков, что полезно для установления замен между выравниваемыми белками, в результате получая конструкцию химерных белков. Такие химерные белки можно подвергать биологическому анализу на вредителях и характеризовать их на наличие или отсутствие увеличенной биологической активности и/или расширенного спектра в отношении целевого вредителя по сравнению с исходными белками, из которых получен каждый сегмент в данной химере. Пестицидная активность полипептидов может дополнительно конструироваться для получения активности в отношении конкретного вредителя или более широкого спектра вредителей путем обмена доменов или сегментов с другими белками или путем использования методов направленной эволюции, известных в данной области техники.
[0135] В данной заявке также описаны способы борьбы с насекомыми, в частности, заражениями культурных растений насекомыми Lepidoptera или Coleoptera с помощью класса белков-токсинов TIC3668. Такие способы могут включать выращивание растения, содержащего ингибирующее в отношении насекомых Coleoptera или Lepidoptera количество белка класса белков-токсинов TIC3668. В некоторых вариантах реализации изобретения такие способы могут дополнительно включать один или более из этапов: (I) нанесения любой композиции, содержащей или кодирующей белок класса белковых токсинов типа TIC3668, на растение или семя, которое дает начало растению; и (II) трансформации растения или растительной клетки, которые дают начало растению, полинуклеотидом, кодирующим белок класса белковых токсинов типа TIC3668. В общем, предполагается, что в композиции может быть представлен любой белок в классе белковых токсинов типа TIC3668, предоставляемый микроорганизмом или предоставляемый трансгенным растением, чтобы обеспечить ингибирующую активность против чешуекрылых и жесткокрылых насекомых.
Bacillus
Bacillus
[0136] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный полипептид класса белковых токсинов типа TIC3668 является инсектицидно активным ингредиентом композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, полученной культивированием рекомбинантной или любой другой рекомбинантной бактериальной клетки, трансформированной для экспрессии белкового токсина типа TIC3668 в условиях, подходящих для экспрессии и продукции белков класса белковых токсинов типа TIC3668. Такая композиция может быть получена путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, седиментации или концентрирования культуры таких рекомбинантных клеток, экспрессирующих/продуцирующих указанный рекомбинантный полипептид. Такой процесс может приводить к получению клеточного экстракта, клеточной суспензии, клеточного гомогената, клеточного лизата, клеточного супернатанта, клеточного фильтрата или клеточного осадка из или других энтомопатогенных бактерий. Получением данных рекомбинантных полипептидов таким образом создают композицию, включающую рекомбинантные полипептиды, которые могут содержать бактериальные клетки, бактериальные споры, а также параспоральные тельца-включения, и композиция может быть приготовлена для различных применений, включая сельскохозяйственные продукты-спреи, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, или составы, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, для биологических анализов влияния рациона.
et al
[0137] В одном варианте реализации изобретения для снижения вероятности развития резистентности композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая один или более белков из класса белковых токсинов типа TIC3668, может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность против тех же видов чешуекрылых и жесткокрылых насекомых, но который отличается от белкового токсина типа TIC3668. Возможные дополнительные полипептиды для такой композиции содержат белок, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, и молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых. Один пример использования таких рибонуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми-вредителями описан в Baum, . (публикация патента США 2006/0021087 A1). Такой дополнительный полипептид для борьбы с чешуекрылыми-вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry1A (патентСША № 5880275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (публикация патента США № 10/525318), Cry1C (патент США № 6033874), Cry1D, Cry1Da и их варианты, химеры Cry1E, Cry1F и Cry1A/F (патенты США № 7070982; 6962705 и 6713063), химеры Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, типа Cry1, такие как, без ограничений, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 и TIC1100, Cry2A, Cry2Ab (патент США № 7064249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-184, AXMI-196, DIG-3, DIG-4, DIG-5, DIG-11, AfIP-1A и их производные (публикация патента 2014-0033361 A1), AfIP-1B и его производные (публикация патента 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (публикация патента 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (публикация патента 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (публикация патента 2014-0007292 A1), Pput_1063 (публикация патента 2014-0007292 A1), Pput_1064 (публикация патента 2014-0007292 A1), GS-135 и его производные (публикация патента 2012-0233726 A1), GS153 и его производные (публикация патента 2012-0192310 A1), GS154 и его производные (публикация патента 2012-0192310 A1), GS155 и его производные (публикация патента 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в публикации патента 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 или 4, или ее производные, как описано в публикации патента 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 и ее производные, как описано в патенте США № 7772465 (B2), CF161_0085 и его производные, как описано в WO2014/008054 A2, токсические для чешуекрылых белки и их производные, как описано в публикациях патентов США US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 и US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 и их производные, как описано в US7510878(B2), SEQ ID NO:2 и их производные, как описано в патенте США № 7812129(B1) и другие белки, обладающие ингибирующей активностью в отношении чешуекрылых, известные средним специалистам в данной области техники. Такой дополнительный полипептид для борьбы с жесткокрылыми-вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry3Bb (патент США № 6501009), варианты Cry1C, варианты Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, Axmi184, Axmi205, AxmiR1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10, eHIPs (публикация заявки на патент США № 2010/0017914) и другие белки, обладающие ингибирующей активностью в отношении жесткокрылых, известные средним специалистам в данной области техники.
[0138] В других вариантах реализации изобретения такая композиция/состав может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность в отношении насекомых, причем на насекомое не оказывает ингибирующего действия другие белки, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, по настоящему изобретению, с тем чтобы расширить спектр ингибирующей активности в отношении насекомых. Например, для борьбы с полужесткокрылыми вредителями можно использовать комбинации белков, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, по данному изобретению с белками, активными в отношении полужесткокрылых, такие как TIC1415 (публикация заявки на патент США № 2013/0097735), TIC807 (патент США № 8609936), TIC834 (публикация заявки на патент США № 2013/0269060) и другие белки, обладающие ингибирующей активностью в отношении полужесткокрылых, известные средним специалистам в данной области техники. Дополнительные полипептиды для борьбы с жесткокрылыми, чешуекрылыми и полужесткокрылыми насекомыми-вредителями можно найти на веб-сайте номенклатуры токсинов Bacillus thuringiensis, поддерживаемым Нилом Крикмором (во всемирной паутине по адресу btnomenclature.info).
[0139] В данной области техники задокументирована возможность развития устойчивости к определенным инсектицидам у насекомых. Одной стратегией борьбы с устойчивостью насекомых является внедрение трансгенных сельскохозяйственных культур, которые экспрессируют два различных агента, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, которые воздействуют посредством разных механизмов действия. Поэтому с любыми насекомыми с устойчивостью к любому из агентов, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, можно бороться другим агентом, обладающим ингибирующей активностью в отношении насекомых. В другой стратегии борьбы с устойчивостью насекомых используется применение растений, которые не защищены от целевых видов-вредителей жесткокрылых или чешуекрылых, для обеспечения экологической ниши из таких незащищенных растений. Конкретный пример описан в патенте США № 6551962, который включен в настоящий документ в полном объеме путем ссылки.
[0140] Другие варианты реализации изобретения, такие как местное нанесение химикатов-пестицидов, которые предназначены для борьбы с вредителями, с которыми также борются белками, описанными в данном документе в отношении применения белков при обработке семян, распыления, пропитки или нанесения тонким слоем, составы можно применять непосредственно на почве (промачивание почвы), наносить на растущие растения, экспрессирующие белки, описанные в данном документе, или готовить составы, применяемые для семян, содержащих один или более трансгенов, кодирующих один или более описанных белков. Такие составы для использования при обработках семян можно применять с различными клейкими веществами и придающими липкость агентами, известными в данной области техники. Такие составы могут содержать пестициды, которые по способу действия являются синергичными с описанными белками таким образом, что составы пестицидов действуют посредством другого механизма действия на тех же или сходных вредителей, с которыми можно бороться описанными белками, или что такие пестициды действуют на контролируемых вредителей с более широким диапазоном хозяев или видов вредителей растений, с которыми не эффективно борется класс белковых токсинов типа TIC3668.
Bacillus
[0141] Вышеупомянутая композиция/состав может дополнительно содержать приемлемый для сельскохозяйственного применения носитель, такой как приманка, порошок, пыль, таблетки, гранулы, спреи, эмульсия, коллоидная суспензия, водный раствор, препарат спор/кристаллов , обработанные семена, рекомбинантную бактериальную клетку/растительную ткань/семя/растение, трансформированные для экспрессии одного или более белков, или бактерию, трансформированную для экспрессии одного или более белков. В зависимости от уровня ингибирования в отношении насекомых или инсектицидного ингибирования, присущего рекомбинантному полипептиду, и уровня состава, который должен применяться к растению или при анализе влияния рациона, композиция/состав могут содержать различные массовые количества рекомбинантного полипептида, например, от 0,0001% до 0,001%, до 0,01%, до 1%, до 99% от массы рекомбинантного полипептида.
ПРИМЕРЫ
[0142] Исходя из сказанного выше, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в конкретных аспектах изобретения могут быть сделаны изменения, которые описаны и еще могут быть получены в виде похожего или подобного результата, без отступления от сущности и объема изобретения. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, описанные в данном документе, не должны интерпретироваться как ограничивающие. Следует понимать, что полное описание каждой ссылки, цитируемой в данном документе, включено в данное описание настоящей заявки.
ПРИМЕР 1
Обнаружение класса белковых токсинов родственных белку TIC3668
in vitro
Brevibacillus laterosporus
B. laterosporus
[0143] Были идентифицированы и подготовлены для секвенирования геномов с использованием методов, известных в данной области техники, бактериальные штаммы, проявляющие различные свойства, например, предполагаемую токсичность, протеомное разнообразие и морфологические вариации при сравнении друг с другом. Белок TIC3668 (SEQ ID NO:2), проявляющий ингибирующую активность против жесткокрылых насекомых в биологических анализах выделили из штамма EG5552 (). Обнаружено, что другие штаммы содержат белки, напоминающие TIC3668. Клонировали полинуклеотидные сегменты, кодирующие эти белки, и вставляли их в рекомбинантный штамм-хозяин для проверки экспрессии.
B. laterosporus
Bacillus thuringiensis
Bt
Bt
E. coli
[0144] Конструировали праймеры для термальной амплификации с целью амплификации полноразмерной копии гена из полной геномной ДНК различных бактериальных штаммов , включая EG5552. Из каждого штамма получали отдельные продукты термальной амплификации (ампликоны) и анализировали их на наличие открытых рамок считывания, которые могли бы кодировать родственные TIC3668 белки. Определяли, что каждый ампликон имел единственную открытую рамку считывания, содержащую кодон инициации трансляции, за которым в рамке следовала непрерывная открытая рамка считывания, которая завершалась находящимся в рамке кодоном терминации трансляции. Установленные аминокислотные последовательности, полученные из каждого из данных дополнительных различных бактериальных штаммов, указаны соответственно в SEQ ID NO:2 (TIC3668), SEQ ID NO:4 (TIC3669), SEQ ID NO:6 (TIC3670), SEQ ID NO:8 (TIC4076), SEQ ID NO:10 (TIC4078), SEQ ID NO:14 (TIC4346), SEQ ID NO:16 (TIC4826), SEQ ID NO:18 (TIC4861), SEQ ID NO:20 (TIC4862), SEQ ID NO:22 (TIC4863). Эти ампликоны клонировали в рекомбинантном плазмидном экспрессионном векторе () слева от специфического экспрессионного промотора споруляции и этими ампликонами трансформировали необразующую кристаллы клетку-хозяина . Ампликоны также клонировали в экспрессионную систему . Обнаружено, что получаемые рекомбинантные штаммы экспрессируют рекомбинантный белок.
ПРИМЕР 2
Активность в отношении жесткокрылых класса белковых токсинов родственных белку TIC3668
[0145] В данном примере иллюстрируется ингибирующая активность, проявляемая подобными TIC3668 белками, против насекомых Coleoptera.
Leptinotarsa decemlineata
Diabrotica virgifera virgifera
Diabrotica barberi
Diabrotica virgifera zeae
Diabrotica balteata
Diabrotica undecimpunctata howardii
Diabrotica viridula
Diabrotica speciosa
[0146] Препараты белков получали из рекомбинантных бактерий, как описано в примере 1, полноразмерные белки TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260, TIC4076 и TIC2462 направляли на биологические анализы с добавлением в рацион насекомых для колорадского картофельного жука (, CPB) и для по меньшей мере одного вида кукурузного жука. Известные представители видов кукурузных жуков представлены (западный кукурузный жук, WCR), (северный кукурузный жук, NCR), (мексиканский кукурузный жук, MCR), (бразильский кукурузный жук (BZR), (южный кукурузный жук, SCR) и комплексом бразильского кукурузного жукa (BCR), состоящим из видов и ).
[0147] Как продемонстрировано в таблице 6, результаты показывают, что TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4260 и TIC4076 проявили летальность в отношении кукурузного жука.TIC2462 (SEQ ID NO:62, кодирующая SEQ ID NO:63), белок близкородственный белку AXMI-209 (в сравнении с TIC2462 на >99% идентичный на уровне аминокислот и проявляющий отличия только по двум аминокислотам), не проявил летальность в отношении кукурузного жука, таким образом показав отличие активности класса подобных белку TIC3668 белковых токсинов от белков, напоминающих AXMI-209. Неожиданно обнаружено, что летальность в отношении колорадского картофельного жука, обычно используемого вида для тестов в биологических анализах в качестве индикатора активности против жесткокрылых, не наблюдалась для любых из протестированных белков.
Таблица 6
Наблюдаемая летальность типовых белков в отношении жесткокрылых насекомых-вредителей
Токсин
Кукурузный жук
CPB
TIC2462
-
-
TIC3668, TIC3669, TIC3670
+
-
TIC4260, TIC4076
+
-
TIC4078
NT
-
TIC4346
+
+
TIC4826, TIC4861, TIC4862, TIC4863
NT
NT
+=Наблюдалась летальность.
-=Летальность не наблюдалась.
NT=испытание не проводили.
ПРИМЕР 3
Зрелая форма белкового токсина TIC3668
[0148] В данном примере иллюстрируется наличие пересекающих мембрану пептидов в аминоконце нативных белков среди класса белковых токсинов TIC3668 и обнаружение активных зрелых белков-токсинов класса белковых токсинов TIC3668.
et. al
Nature Methods
[0149] Анализ с применением методов биоинформатики с использованием программы SignalP (Petersen, (2011), , 8:785-786) трансляции аминокислотной последовательности из кодирующей TIC3668 последовательности (SEQ ID NO:1) спрогнозировал наличие пересекающего мембрану сегмента, соответствующего N-концевым первым 23 аминокислотам.
Bt
Bt
[0150] Моделировали эксперименты для подтверждения наличия пересекающего мембрану сегмента внутри каждого представителя класса белковых токсинов подобных TIC3668. TIC3668 клонировали в клетке-хозяине после неспорулирующего специфического промотора . Получаемые культуральные супернатанты исследовали на инсектицидную активность. Формы белка, соответствующие TIC3668, выделяли в виде смеси из супернатанта. Данные различные фрагменты, меньшие чем полноразмерный белок TIC3668, позже определяли методом масс-спектрометрии и анализом N-концевой последовательности на содержание в их соответствующих аминоконцов либо аминокислоты 16, 19 или 24, как указано в SEQ ID NO:2. В культуральной среде обнаружили только небольшое количество этих трех усеченных форм TIC3668. Обнаружено, что наиболее распространенная форма выявленного белка на своем аминоконце содержит серин в положении 24, как указано в SEQ ID NO:2. Концентрированный и очищенный белок из культурального супернатанта проявил биологическую активность против WCR при исследовании в биологическом анализе с искусственным рационом.
B. thuringiensis
E. coli
Bt
E. coli
E. coli
E. coli
[0151] Для идентификации наименьшего пептидного сегмента для каждого белка типа TIC3668, проявляющего инсектицидную активность, создавали различные экспрессионные конструкты. Эти конструкты вводили в необразующий кристаллы штамм или штамм . Один конструкт предназначался для экспрессии полноразмерного белка TIC3668, как указано в SEQ ID NO:2 от аминокислоты 1 до 317, в необразующем кристаллы штамме . Конструкты разрабатывали для экспрессии полноразмерного белка TIC3668 и различных более коротких форм белка TIC3668 в системе экспрессии , имеющей последовательность-маркер HIS на карбоксильном конце (HHHHAHHH). Данные конструкты, предназначенные для экспрессии в состояли из: (1) конструкта, разработанного для экспрессии полноразмерного белка TIC3668, как указано в SEQ ID NO:2 от аминокислотного положения 1 до 317; (2) конструкта, разработанного для экспрессии варианта белка TIC3668, содержащего от аминокислоты 16 до 317, как указано в SEQ ID NO:2; (3) конструкта, разработанного для экспрессии варианта белка TIC3668 от аминокислоты 24 до 317, как указано в SEQ ID NO:2; (4) конструкта, разработанного для экспрессии варианта белка TIC3668 от аминокислоты 26 до аминокислоты 317, как указано SEQ ID NO:2; (5) конструкта, разработанного для экспрессии варианта белка TIC3668 от аминокислоты 28 до 317, как указано в SEQ ID NO:2. Дополнительно в экспрессионной системе получали белок TIC3668 с маркером N-концевых 10-his и сайтом протеазы (MHHHHHHHHHHGTETVRFQ) TVMV (вируса мозаики жилок табака) для продукции белка TIC3668 с началом по остатку № 24, как указано в SEQ ID NO:2.
Bt
Bt
E. coli
E. coli
[0152] Белок получали из супернатанта экспрессионной системы и подвергали анализу методом масс-спектрометрии и анализу N-концевой последовательности. В экспрессионной системе продуцировали зрелый токсин TIC3668 из кислот 24-317, как указано в SEQ ID NO:2. Белок не наблюдали в супернатантах . Белок получали из каждого из соответствующих конструктов путем осмотического шока для высвобождения белков из периплазмы. Для белков, продуцируемых из конструктов, которые были разработаны, чтобы содержать аминокислоты 16 или 24 на аминоконце белка меньшего, чем полноразмерный белок, подтверждено содержание этих аминокислот по соответствующему аминоконцу. Белок, получаемый из конструкта, разработанного для экспрессии полноразмерного TIC3668 и продуцировавшего белок зрелой длины, содержал на аминоконце серин в положении 24, как указано в SEQ ID NO:2. Каждый из белков, полученных при использовании конструктов, разработанных так, чтобы содержать в виде N-концевой аминокислоты либо аминокислоту 26, либо аминокислоту 28, как указано в SEQ ID NO:2, неожиданно содержал в виде N-концевой аминокислоты только аминокислоту 28, что дает основание предположить, что процессинг, сохраняющий аминокислоту номер 24 на N-конце, как указано в SEQ ID NO:2, может быть важен для обеспечения стабильности токсина.
E. coli
[0153] Образцы белков, полученные при таких анализах экспрессионных систем, направляли на исследование в отношении личинок западного кукурузного жука в биологических анализах с добавлением в рацион, как описано в примере 2. Определили, что некоторые N-концевые усечения из этого исследования, проявляют уменьшенную биологическую активность. Конкретно, наблюдали, что инсектицидная активность была значительно снижена, когда концевой аминокислотой была 26 или 28, как указано в SEQ ID NO:2. Этот факт можно экстраполировать на других представителей семейства белков TIC3668, которые являются усеченными на N-конце больше, чем зрелый белок (начиная с аминокислотного остатка № 24 для TIC3668, TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826 и TIC4863; начиная с аминокислоты 13 для TIC4861 и начиная с аминокислоты 22 для TIC4862), которые являются самым коротким вариантом исследованных белков типа TIC3668, показывающих инсектицидную активность против WCR. Все варианты TIC3668 равной длины или более длинные, чем зрелый белок, показывают высокую активность против WCR, даже в относительно низких концентрациях. Эти данные также демонстрируют, что процессинг TIC3668 изменяется в зависимости от структуры конструкта.
ПРИМЕР 4
Синтез генов, кодирующих белки типа TIC3668, для экспрессии в растениях
B. laterosperous
[0154] Были сконструированы нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные и зрелые варианты белка TIC3668, белка TIC3669, TIC3670, TIC4076, TIC4078, белка TIC4260, белка TIC4346, белка TIC4826, белка TIC4861, белка TIC4862 и белка TIC4863. Нуклеотидные последовательности, кодирующие TIC3668, TIC3669 и TIC3670, синтезировали в соответствии со способами, в целом, описанными в патенте США 5500365, избегая некоторых неподходящих проблемных последовательностей, таких как последовательности полиаденилирования растений, обогащенные ATTTA и A/T, при сохранении аминокислотной последовательности нативного белка . Эти нуклеотидные последовательности предложены в данном документе как SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:51 для полноразмерных последовательностей, и SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:49 для зрелых последовательностей.
ПРИМЕР 5
Экспрессионные кассеты для экспрессии в растениях белков типа TIC3668
т. е.,
[0155] Были сконструированы различные экспрессионные кассеты для растений с последовательностями, указанными в SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:51. Такие экспрессионные кассеты пригодны для транзиентной экспрессии в протопластах растений или для трансформации растительных клеток. Типичные экспрессионные кассеты были разработаны с учетом возможного местонахождения белка внутри клетки. Один набор экспрессионных кассет был сконструирован таким образом, чтобы белок транслировался с нативным N-концевым сегментом. Для обеспечения экспрессии белка без N-концевого сегмента (белок зрелой длины) была сконструирован другой набор экспрессионных кассет. Другой набор экспрессионных кассет был сконструирован так, чтобы содержать транзитный пептид, экспрессируемый в рамке считывания и функционально связанный с белком-токсином зрелой длины, для обеспечения нацеливания на органеллы клетки, такие как хлоропласт или пластиду. Все экспрессионные кассеты были сконструированы с началом на 5'-конце с промотором, который может состоять из множества последовательно связанных промоторных элементов, энхансерных элементов или других экспрессионных элементов, известных средним специалистам в данной области техники, для усиления экспрессии трансгена. За промоторной последовательностью обычно следовали непрерывно одна или более лидерных последовательностей на 3'-конце промотора. Интронная последовательность располагалась на 3'-конце лидерной последовательности для повышения экспрессии трансгена. Последовательность, кодирующая токсин или транзитный пептид, и последовательность, кодирующая токсин, располагались на 3'-конце промоторной, лидерной и интронной конфигурации. Последовательность 3'-НТО была представлена на 3'-конце кодирующей последовательности для облегчения терминации транскрипции и обеспечения последовательностями, важными для полиаденилирования получаемого транскрипта. Все элементы, описанные выше, были расположены последовательно, часто с дополнительными последовательностями, введенными для конструирования экспрессионной кассеты, такими как сайты рестрикционных эндонуклеаз или сайты лигирования, независимые от клонирования.
ПРИМЕР 6
Векторы трансформации, содержащие кассету экспрессии белка типа TIC3668
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
т. е.,
[0156] Конструировали векторы трансформации для , чтобы они доставляли ДНК в геном растения, которые экспрессируют белки TIC3668, mTIC3668, TIC3669, mTIC3669, TIC3670 и mTIC3670. Экспрессионные кассеты клонировали в подходящих векторах между границами последовательностей так, чтобы их можно было перенести в геном хозяйской растительной клетки с помощью содержащих векторы-конструкты хозяев вместе с селектируемым маркерным геном. Конкретнее, в векторе трансформации растений клонировали фрагмент рестрикции, содержащий целую цитозольную экспрессионную кассету, кодирующую один из белков, упоминаемых выше. Аналогичным образом, в векторе трансформации растения клонировали фрагмент рестрикции, содержащий целую экспрессионную кассету, нацеленную на пластиды. В методом электропорации или скрещиванием с использованием трех родителей вводят векторы, содержащие экспрессионные кассеты белка типа TIC3668 (ненацеленные кассеты или нацеленные кассеты).
B. laterosperous
Agrobacterium
[0157] Экспрессионные кассеты, содержащие искусственные гены, кодирующие TIC4076, TIC4078, TIC4260, TIC4346, TIC4826, TIC4861, TIC4862 и TIC4863, каждая с или без последовательностей, кодирующих N-концевые 23 аминокислоты, присутствующие в нативной открытой рамке считывания (аминокислоты 1-23, как указано в SEQ ID NO:2), клонировали в подходящих векторах между границами последовательностей так, чтобы они переносились в геном клетки-хозяина, и проводили исследования на экспрессию и биологическую активность кодируемого белка.
ПРИМЕР 7
Активность белков типа TIC3668 в растениях в отношении жесткокрылых
[0158] В данном примере показана ингибирующая активность, проявляемая при экспрессии в растениях подобными TIC3668 белками, против насекомых Coleoptera, таких как личинки кукурузного жука, и предложенных в качестве рациона для соответствующих насекомых-вредителей.
[0159] Трансгенные растения кукурузы R0, экспрессирующие белки TIC3668, mTIC3668, TIC3669, mTIC3669, TIC3670 и mTIC3670, получали с использованием векторов, содержащих экспрессионные кассеты, описанные в примере 5.
et al
Journal of Economic Entomology
[0160] Трансгенные растения кукурузы F1 выращивали из семян, полученных опылением початков нетрансформированных коммерческих растений c зародышевой плазмой дикого типа пыльцой из трансформантов R0. После переноса на грунт в горшках с ограждением растения F1 заражали вылупившимися личинками кукурузного жука и выращивали в течение 13 суток в контролируемых условиях. Определяли значения оценки повреждения корней (RDR) с использованием шкалы оценок Oleson, . 0-3, где 0 обозначает отсутствие повреждения, а 3 обозначает наличие трех или более узлов, прогрызенных до 1,5 дюймов внутри стебля (J.D.Oleson, Y-L.Park, T.M.Nowatzki, J.J.Tollefson, ʺNode-Injury Scale to Evaluate Root Injury by Corn Rootwormsʺ, , 98(1):1-8, 2005). Летальность в отношении насекомых оценивали подсчетом количества личинок третьей стадии линьки, оставшихся в конце периода выращивания.
[0161] В первом наборе экспериментов растения, экспрессировавшие полноразмерные белки TIC3668, TIC3669 и TIC3670, исследовали в отношении WCR. Некоторые объекты показали статистически значимое снижение узловых повреждений, по сравнению с отрицательным контролем со средним значением повреждения корней (RDR) между 2 и 2,5, но значимая для коммерческого применения активность для полноразмерных белков не наблюдалась.
[0162] Во втором наборе экспериментов зрелые белки mTIC3668 (SEQ ID NO:23), mTIC3669 (SEQ ID NO:24) и mTIC3670 (SEQ ID NO:25) с или без пептида, нацеливающего на хлоропласты, экспрессировали в растении кукурузы и исследовали в отношении WCR. Для каждого зрелого белка наблюдали значимую летальность для WCR. Для каждого растения, экспрессировавшего mTIC3668, mTIC3669 и mTIC3670, при наличии и отсутствии дополнительных нацеливающих последовательностей, показано статистически значимое снижение узлового повреждения по сравнению с отрицательным контролем. На Фиг. 2 изображены средние значения RDR для нескольких объектов с белками mTIC3668 и mTIC3669, а на Фиг. 3 изображено среднее значение RDR для нескольких объектов с mTIC3670, при экспрессии в растениях кукурузы F1 независимо от нацеливания белка в хлоропласт. «TS» в названии объекта на Фиг. 2 и 3 указывает на наличие последовательности нацеливания. Значимая для коммерческого применения активность наблюдалась для многих из этих объектов, экспрессирующих зрелые белки mTIC3668, mTIC3669 и mTIC3670.
[0163] Неожиданно обнаружено, что удаление пересекающего мембрану сегмента (аминокислоты 1-23, как указано в SEQ ID NO:2) из подобных TIC3668 белков, увеличивает эффективность против кукурузного жука, при экспрессии в растениях кукурузы. При экспрессии в растениях подобные TIC3668 белки зрелой длины продемонстрировали более высокие уровни инсектицидной активности против жесткокрылых вредителей, чем полноразмерные белки.
ПРИМЕР 8
Инсектицидная активность родственных TIC3668 белков, экспрессируемых в кукурузе, против устойчивого к Cry3Bb1 WCR
Bt
[0164] В данном примере проиллюстрирована инсектицидная активность, проявляемая подобными TIC3668 белками, против разновидности западного кукурузного жука (WCR), у которого развилась устойчивость к -токсину Cry3Bb1. Растения трансгенной кукурузы F1, экспрессирующие mTIC3668, mTIC3669 или mTIC3670, полученные с использованием способов, описанных в примере 7, заражали 2000 яиц WCR разновидности Hopkinton на растение.
Diabrotica virgifera virgifera
et al.(
et al.(
[0165] Разновидность Hopkinton западного кукурузного жука (LeConte) представляет собой разновидность без диапаузы с приобретенной в полевых условиях устойчивостью к Cry3Bb1, экспрессируемому в растениях кукурузы. Разновидность походит от взрослых экземпляров WCR, полученных из полей, на которых выращивали кукурузу Cry3Bb1 в течение семи последовательных лет. Проводили три раза обратное скрещивание популяции с разновидностью WCR без диапаузы и проводили три раза отбор на устойчивость к Cry3Bb1 (Gassmann, 2011) PLoS ONE 6(7): e22629; Gassmann, 2012) GM Crops Food 3(3):235-244). Колонию получали в лабoратории д-раАарона Гассмана в Университете штата Айова и поддерживали в энтомологической группе Monsanto Biotech в г. Честерфилд, штат Миссури.
[0166] После заражения в течение 48 часов вылуплялись яйца разновидности WCR-Hopkinton и вылупившиеся личинки начинали питаться на корнях. Через 24 суток корни удаляли из почвы и оценивали повреждения корней кукурузы, как описано в примере 7 с использованием шкалы 0-3.Как показано в таблице 7, растения, экспрессирующие mTIC3668, mTIC3669 и mTIC3670 были в высокой степени эффективны в плане защиты корней кукурузы от повреждения в присутствии вылупившихся насекомых разновидности Hopkinton WCR по сравнению с контрольными растениями, таким образом преодолевая WCR устойчивость к токсину Cry3Bb1.
Таблица 7
Средние RDR значения у трансгенных растений кукурузы, зараженных устойчивым к Cry3Bb1 WCR
Токсин
N
Среднее RDR (0-3)
Стандартная ошибка
mTIC3668
18
0,06
0,004
mTIC3669
15
0,05
1.82e-10
mTIC3670
14
0,05
1.95e-10
Отрицательный контроль
6
2,14
0,24
N: количество оцененных растений.
ПРИМЕР 9
Инсектицидная активность родственных TIC3668 белков, экспрессируемых в кукурузе, против природного заражения WCR в полевых условиях на исследуемых участках
[0167] В данном примере проиллюстрирована эффективность в отношении уменьшения повреждения корней, проявленная трансгенными растениями кукурузы, экспрессирующими подобные TIC3668 белки против природного WCR заражения на возделываемых полях Среднего Запада США.
[0168] Растения трансгенной кукурузы F1, экспрессирующие mTIC3668, mTIC3669 или mTIC3670, полученные с использованием способов, описанных в примере 7, высаживали на пяти территориях Среднего Запада США в течение конца апреля - начала мая. В исследования на этих территориях полагались на существующие природные источники заражения от давления присутствия кукурузного жука. Для оценки повреждений проводили выкапывание корней в конце июля. Повреждение кукурузным жуком определяли в соответствии со шкалой узловых повреждений, как описано в примере 7.
[0169] Результаты исследований выкопанных корней показали, что в фактических условиях возделывания в открытом поле, растения, экспрессирующие mTIC3668, mTIC3669 и mTIC3670 были в высокой степени эффективны в плане защиты корней кукурузы от повреждения в присутствии природного давления кукурузного жука. В таблице 8 показано количество оцененных растений (N), среднее значение RDR и стандартная ошибка для исследованных растений по территориям объединены.
Таблица 8
Средние значения RDR для трансгенных растений кукурузы, исследованных на возделываемых полях с природным заражением WCR
Токсин
N
Среднее RDR (0-3)
Стандартная ошибка
mTIC3668
755
0,144
0,009
mTIC3669
1108
0,159
0,008
mTIC3670
1311
0,120
0,007
Отрицательный контроль
362
1,426
0,047
ПРИМЕР 10
Активность в отношении чешуекрылых класса белковых токсинов родственных белку TIC3668
Agrotis ipsilon
Striacosta albicosta
Helicoverpa zea
Ostrinia nubilalis
Diatraea saccharalis
Diatraea grandiosella
Trichoplusia ni
Chrysodeixis includes
Spodoptera frugiperda
[0170] В данном примере иллюстрируется ингибирующая активность, проявляемая подобными TIC3668 белками, против насекомых Lepidoptera. Препараты белков, описанные в примере 1, для полноразмерных белков TIC3668, TIC3669 TIC3670, TIC4076 и TIC4078 направляли на проведение биологических анализов с добавлением в рацион против совки ипсилон (BCW, ), западной совки бобовых (WBC, ), совки хлопковой (CEW, ), европейских кукурузных мотыльков (ECB, ), тростниковой огневки (SCB, ), юго-западного кукурузного мотылька (SWC, ), совки ни (CLW, ), соевой совки (SBL, ) и совки травяной (FAW, ). Протоколы и способы подготовки и выполнения биологических анализов с ингибирующими белками известны в данной области техники.
[0171] Активность против определенных чешуекрылых насекомых-вредителей наблюдалась для определенных белков типа TIC3668, как продемонстрировано в таблице 9.
Таблица 9
Наблюдаемое замедление роста типовых белков в отношении чешуекрылых насекомых-вредителей
Токсин
ECB
SWC
BCW
FAW
CEW
SBL
TIC3668
++
+
NT
-
-
-
TIC3669
+
+
NT
-
-
-
TIC3670
++
++
NT
-
-
+
TIC4076
-
+++
-
-
-
+
TIC4346
+
+
NT
+
+
+
TIC4078
NT
NT
NT
-
-
+
TIC4260, TIC4826 TIC4862, TIC4863
NT
NT
NT
NT
NT
NT
+=Наблюдалась задержка роста.
++= Задержка роста и летальность.
-=Летальность не наблюдалась.
NT=испытание не проводили.
ПРИМЕР 11
Активность в растениях в отношении чешуекрылых белков типа TIC3668
[0172] В данном примере показана ингибирующая активность белков типа TIC3668 в отношении ECB, SWC, BCW, FAW, CEW, SBL, при экспрессии в растениях, и предложенных в качестве рациона для соответствующих насекомых-вредителей.
[0173] Биологические анализы в отношении чешуекрылых вредителей с использованием листовых дисков растений выполняли по аналогии с теми, которые описаны в патенте США № 8344207, на экспрессирующих TIC3668, TIC3669 и TIC3670 растениях кукурузы R0. Показателю повреждения листьев (LDR) присваивали оценку показателя на основе процента листового диска, погрызенного насекомым по шкале от 0 (съедено 0%) до 11 (съедено более 50%). Уровни показателя оценки увеличиваются поступательно на 5%. Растения R0, которые не содержат инсектицидных белков, служили в качестве отрицательных контролей. Цитозольная экспрессия полноразмерного белка типа TIC3668 снижала повреждения от питания CEW, FAW и SWC относительно нетрансформированного контроля. Цитозольная экспрессия белка TIC3670 снижала повреждения от питания SWC относительно нетрансформированного контроля.
ПРИМЕР 12
Создание составного белка TIC4260
[0174] В данном примере изложено создание новой генной последовательности на основе семейства представителей TIC3668. Комбинировали аминокислотный вариант из пяти нативных белков типа TIC3668 для создания нового составного белка TIC4260 (SEQ ID NO:12), который проявляет отличие по разным аминокислотным последовательностям по сравнению с белками природного происхождения. На Фиг. 1 изображены результаты выравнивания пяти нативных белков типа TIC3668 с TIC4260. Положения различий последовательностей в результате этого выравнивания последовательностей выделены серым затенением. Конструировали искусственную полинуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:11), которая кодирует белок TIC4260. Зрелый белок TIC4260 (mTIC4260, SEQ ID NO:28) кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:43.
[0175] Можно получить сходные выравнивания других белков типа TIC3668 для создания новых белков, проявляющих токсическую активность в отношении Lepidoptera и/или Coleoptera. Эти новые белки экспрессируют, очищают и исследуют в отношении чешуекрылых и жесткокрылых насекомых в биологических анализах с введением в рацион. Создают экспрессионные кассеты для этих новых белков и трансформируют ими растения для экспрессии этих белков для борьбы с чешуекрылыми и жесткокрылыми вредителями растений.
[0176] Все композиции и способы, описанные и заявленные в данном документе, могут быть изготовлены и выполнены без излишнего экспериментирования в свете настоящего описания. Хотя композиции и способы настоящего изобретения были описаны с точки зрения вышеизложенных иллюстративных вариантов реализации, специалистам в данной области техники будет понятно, что к композиции, описанной в данном документе, можно применять варианты, изменения, модификации и перестройки без отступления от концепции, сущности и объема данного изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые агенты, родственные как химически, так и физиологически, могут быть заменены агентами, описаными в данном изобретении, при этом будут достигнуты такие же или сходные результаты. Все таковые сходные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы сущности, объема и концепции настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
[0177] Специалистам в данной области техники будет понятно, что эти отличающиеся, улучшенные варианты последовательностей можно комбинировать для создания вариантов, которые также находятся в пределах объема настоящего изобретения.
[0178] Все публикации и опубликованные патентные документы, цитируемые в настоящем описании, включены в данный документ путем ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была конкретно и отдельно указана для включения путем ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Monsanto Technology LLC
<120>  НОВЫЕ БЕЛКИ, ОБЛАДАЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ
НАСЕКОМЫХ
<130>  MONS:387wo
<150>  62/082504
<151>  2014-11-20
<160>  72
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  1
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttaca agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaagatgaa      120
gctggaacct ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcgtatagtc caactgaagg aattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagtagg aagtccaacc      300
gaagcatcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
atggatcaag agctgttaac acccgagttt aactatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaataactc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctatagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtatagc ttggagggtt tcaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcaaatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  2
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  2
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Thr Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Val
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Ala Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Ile Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Arg Val Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  3
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  3
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaagatgaa      120
gctggaacct ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcgtatagtc caactgaagg aattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaagtatcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
atcgatcaag agctgttaac acccgagttt agttatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaacaactc atggattaaa agtaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctatagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtatagc ttggagggtt tcaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcaaatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  4
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  4
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Ile Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Ser Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Val Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Arg Val Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  5
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  5
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttaca agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaagatgaa      120
gctggaacct ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcttatagtc caactgaagg aattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaagcatcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
atggatcaag agctgttaac acccgagttt aactatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaacaaccc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctatagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtatagc ttggagggtt tcaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcaaatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  6
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  6
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Thr Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Ala Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Arg Val Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  7
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  7
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaaaatgaa      120
gctggaaccc ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcttatagtc caactgaagg tattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaaatgtcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
agcgatcaag agctgttaac acccgagttt acctatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaacaactc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaga ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctttagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtatagc ttggggggtt ttaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcacatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  8
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  8
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Met Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Ser Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Thr Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Gly Val Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Thr Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  9
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  9
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttaca agtgtgttcc ttttttcgag tacacaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaaaatgaa      120
gctggaaccc ttaatgtagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcttatagtc caactgaagg ttttattttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacattataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaagtatcgg ggacaccttt atatgcggga agaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
atagatcaag agatgttaac acccgagttt aactatacct atacggaagg cacttcaaat      420
acaacaactc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctttagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtgtagc ttggggggtt ttaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcacatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  10
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  10
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Thr Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Val Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Phe Ile Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser His Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Arg Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Ile Asp Gln Glu Met Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Asn Thr Thr Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Val Ala Trp Gly Val Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Thr Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  11
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, кодирующая
составной белок TIC4260, созданный комбинированием варианта
природной последовательности из шести нативных последовательностей
из вида Brevibacillus laterosporus.
<400>  11
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttaca agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccataga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaagatgaa      120
gctggaacct ttaatgtagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcgtatagtc caactgaagg ttttattttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacattataa agtaaataat gcatgggcta cattagtagg aagtccaacc      300
gaagcatcgg ggacaccttt atatgcggga agaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
atggatcaag agatgttaac acccgagttt agttatacct atacggaagg cacttcaaat      420
acaataactc atggattaaa agtaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctatagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtgtagc ttggagggtt tcaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcacatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  12
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность трансляции открытой рамки
считывания, как указано в SEQ ID NO:11.
<400>  12
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Thr Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Ile Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Val Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Phe Ile Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser His Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Val
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Ala Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Arg Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Met Asp Gln Glu Met Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Ser Tyr Thr Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Asn Thr Ile Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Val Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Val Ala Trp Arg Val Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Thr Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  13
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  13
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa agattacggg acttagcaag agaaaatgaa      120
gctggaaccc ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcttatagtc caactgaagg aattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaagtatcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
atggatcaag agctgttaac acccgagttt aactatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaataactc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctttagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtatagc ttggggggtt ttaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcgaatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  14
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  14
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Ile Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Gly Val Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Glu Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  15
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  15
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaaaatgaa      120
gctggaaccc ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcttatagtc ccactgaagg tattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaagtatcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
atggatcaag agctgttaac acccgagttt aactatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaacaactc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctatagag ttttagcata cctaaatact ggatctatat caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtatagc ttggggggtt ttaccaggtt atcccaatgg cggaggaata      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcaaatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  16
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  16
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Gly Val Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Ile
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  17
<211>  921
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  17
atgttccttt tttcgagtac gcaatttgtt catgcgtcat ccacagatgt tcaagaacga       60
ttacgggact tggcaagaga aaatgaagct ggaaccctta atgaagcatg gaatactaac      120
ttcaaaccca gtgatgaaca acaattctct tatagtccaa ctgaaggtat tgttttctta      180
acaccaccta aaaatgttat tggcgaaaga agaatttcac agtataaagt aaataatgca      240
tgggctacat tagaaggaag tccaaccgaa gtatcgggga cacctttata tgcgggaaaa      300
aacgtattag ataactcaaa agggacaagc gatcaagagc tgttaacacc cgagtttaac      360
tatacctata cggaaagcac ttcaaataca acaactcatg gattaaaatt aggagtcaaa      420
accactgcta ccatgaaatt cccgattgct cagggtagca tggaagcttc tactgaatat      480
aactttcaaa attcttccac tgatactaaa actaaacaag tatcatataa aagcccatca      540
caaaaaatta aagtaccagc aggtaaaacc tatagagttt tagcatacct aaatactgga      600
tctatttcag gtgaagctaa cctttacgca aatattgggg gtatagcttg ggggggttta      660
ccaggttatc ccaatggcgg aggagtaaat ataggtgctg tacttaccaa atgccaacaa      720
aaaggatggg gagatttcag aaactttcaa cctagtggaa gagatgtaat cgttaaaggc      780
caaggtactt tcaaatctaa ttatggaacg gacttcattt taaaaattga agacatcaca      840
gattcaaagt tacgaaacaa taacgggagt ggaactgtcg ttcaagagat taaagttcca      900
ctaattagaa ctgaaatata g                                                921
<210>  18
<211>  306
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  18
Met Phe Leu Phe Ser Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp
1               5                   10                  15
Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr
20                  25                  30
Leu Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln
35                  40                  45
Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys
50                  55                  60
Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala
65                  70                  75                  80
Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu
85                  90                  95
Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Ser Asp Gln
100                 105                 110
Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser
115                 120                 125
Asn Thr Thr Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr
130                 135                 140
Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr
145                 150                 155                 160
Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr
165                 170                 175
Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg
180                 185                 190
Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu
195                 200                 205
Tyr Ala Asn Ile Gly Gly Ile Ala Trp Gly Gly Leu Pro Gly Tyr Pro
210                 215                 220
Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln
225                 230                 235                 240
Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val
245                 250                 255
Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe
260                 265                 270
Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn
275                 280                 285
Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr
290                 295                 300
Glu Ile
305
<210>  19
<211>  948
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  19
atgtttgcaa gtttaattct tataagtgtg ttcctttttt cgagtacgca atttgttcat       60
gcgtcatcca cagatgttca agaacgatta cgggacttgg caagagaaaa tgaagctgga      120
acccttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcttat      180
agtccaactg aaggtattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      240
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaagta      300
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg gacaagcgat      360
caagagctgt taacacccga gtttaactat acctatacgg aaagcacttc aaatacaaca      420
actcatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      480
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      540
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaacctat      600
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      660
attgggggta tagcttgggg gggtttacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      720
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      780
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca aatctaatta tggaacggac      840
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      900
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   948
<210>  20
<211>  315
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  20
Met Phe Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ser Val Phe Leu Phe Ser Ser Thr
1               5                   10                  15
Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp
20                  25                  30
Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp Asn Thr
35                  40                  45
Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu
50                  55                  60
Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg
65                  70                  75                  80
Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser
85                  90                  95
Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu
100                 105                 110
Asp Asn Ser Lys Gly Thr Ser Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe
115                 120                 125
Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His Gly Leu
130                 135                 140
Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln
145                 150                 155                 160
Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr
165                 170                 175
Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile
180                 185                 190
Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr
195                 200                 205
Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Ile Gly Gly Ile
210                 215                 220
Ala Trp Gly Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile
225                 230                 235                 240
Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg
245                 250                 255
Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr
260                 265                 270
Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile
275                 280                 285
Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln
290                 295                 300
Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  21
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  21
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccacaga tgttcaagaa cgattacggg acttggcaag agaaaatgaa      120
gctggaaccc ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcttatagtc caactgaagg tattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaagtatcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaagggaca      360
agcgatcaag agctgttaac acccgagttt aactatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaacaactc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aaaattcttc cactgatact      540
aaaactaaac aagtatcata taaaagccca tcacaaaaaa ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctatagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatattg ggggtatagc ttgggggggt ttaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcaaatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  22
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  22
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Ser Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Lys Thr Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Ile Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Gly Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  23
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC3668.
<400>  23
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Val Gly Ser Pro Thr Glu Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Ile Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Ile Ala Trp Arg Val
195                 200                 205
Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Lys Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  24
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC3669.
<400>  24
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Val
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Ile Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Ser Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His Gly Leu Lys Val Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Ile Ala Trp Arg Val
195                 200                 205
Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Lys Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  25
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC3670.
<400>  25
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Ile Ala Trp Arg Val
195                 200                 205
Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Lys Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  26
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC4076.
<400>  26
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Met
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Ser Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Thr Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Phe Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Ile Ala Trp Gly Val
195                 200                 205
Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  27
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC4078.
<400>  27
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Val Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Phe Ile Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser His Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Val
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Arg Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Ile Asp Gln Glu Met Leu Thr Pro Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Gly Thr Ser Asn Thr Thr Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Phe Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Val Ala Trp Gly Val
195                 200                 205
Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  28
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC4260.
<400>  28
Met Ser Ser Ile Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asp Glu Ala Gly Thr Phe Asn Val Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Phe Ile Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser His Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Val Gly Ser Pro Thr Glu Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Arg Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Met Asp Gln Glu Met Leu Thr Pro Glu Phe Ser Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Gly Thr Ser Asn Thr Ile Thr His Gly Leu Lys Val Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Val Ala Trp Arg Val
195                 200                 205
Ser Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  29
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC4346.
<400>  29
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Val
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Ile Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Phe Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Ile Ala Trp Gly Val
195                 200                 205
Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Glu Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  30
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC4826.
<400>  30
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Val
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Met Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly Gly Ile Ala Trp Gly Val
195                 200                 205
Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Ile Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Lys Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  31
<211>  295
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность зрелого белка TIC4861.
<400>  31
Met Ser Ser Thr Asp Val Gln Glu Arg Leu Arg Asp Leu Ala Arg Glu
1               5                   10                  15
Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp Asn Thr Asn Phe Lys Pro
20                  25                  30
Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro Thr Glu Gly Ile Val Phe
35                  40                  45
Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu Arg Arg Ile Ser Gln Tyr
50                  55                  60
Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu Gly Ser Pro Thr Glu Val
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn Val Leu Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Gly Thr Ser Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr
100                 105                 110
Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His Gly Leu Lys Leu Gly Val
115                 120                 125
Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile Ala Gln Gly Ser Met Glu
130                 135                 140
Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asn Ser Ser Thr Asp Thr Lys Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln Lys Ile Lys Val Pro Ala
165                 170                 175
Gly Lys Thr Tyr Arg Val Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Gly Ser Ile Ser
180                 185                 190
Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Ile Gly Gly Ile Ala Trp Gly Gly
195                 200                 205
Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val Asn Ile Gly Ala Val Leu
210                 215                 220
Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp Phe Arg Asn Phe Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln Gly Thr Phe Lys Ser Asn
245                 250                 255
Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu Asp Ile Thr Asp Ser Lys
260                 265                 270
Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Val Gln Glu Ile Lys Val
275                 280                 285
Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
290                 295
<210>  32
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC3668.
<400>  32
atgaagaagt tcgcgtcgct gatcctcacc agcgtgttcc tgtttagtag cacgcagttc       60
gtccacgcct catccacgga cgtgcaagag cgcctgcggg acttggcgcg cgaagacgag      120
gcgggaacgt tcaacgaggc ttggaacacc aacttcaagc cgtcggacga gcagcaattc      180
agctactcgc cgacggaggg aattgtcttc ctcacgccgc ctaagaacgt catcggtgag      240
cggcgcatct cccagtacaa ggtgaacaat gcctgggcaa ctctggtggg ctctcccacc      300
gaggcgagcg gtacgccgtt gtacgcgggc aagaatgtac tggacaactc gaaaggcaca      360
atggaccagg agttgcttac acccgagttc aactacacct acacggagag cacgagcaac      420
acgatcacgc acggcctcaa actcggcgtg aagaccaccg cgaccatgaa gttccctatc      480
gctcaaggct cgatggaggc gagcaccgag tacaatttcc agaactcctc caccgatacc      540
aagaccaaac aagtgtctta caagtctccg agccagaaga ttaaggttcc tgcgggcaag      600
acgtaccgcg tgctggcgta cctgaacacc ggctctatct ctggcgaggc taacctgtac      660
gcgaacgtcg gcggcatcgc gtggcgggtc tcgccaggct atcctaacgg cggcggcgtg      720
aacatcggcg ctgtcctgac caagtgccag cagaagggtt ggggcgactt ccgcaacttc      780
cagccctccg ggcgcgacgt catcgtgaag ggtcagggca ccttcaagtc caactacggc      840
accgacttca tccttaagat tgaggacatc accgacagca agctccgcaa caacaacggc      900
tccgggacgg tcgtacagga gatcaaggtg ccactcatcc gcaccgagat ttga            954
<210>  33
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC3668.
<400>  33
atgtcatcca cggacgtgca agagcgcctg cgggacttgg cgcgcgaaga cgaggcggga       60
acgttcaacg aggcttggaa caccaacttc aagccgtcgg acgagcagca attcagctac      120
tcgccgacgg agggaattgt cttcctcacg ccgcctaaga acgtcatcgg tgagcggcgc      180
atctcccagt acaaggtgaa caatgcctgg gcaactctgg tgggctctcc caccgaggcg      240
agcggtacgc cgttgtacgc gggcaagaat gtactggaca actcgaaagg cacaatggac      300
caggagttgc ttacacccga gttcaactac acctacacgg agagcacgag caacacgatc      360
acgcacggcc tcaaactcgg cgtgaagacc accgcgacca tgaagttccc tatcgctcaa      420
ggctcgatgg aggcgagcac cgagtacaat ttccagaact cctccaccga taccaagacc      480
aaacaagtgt cttacaagtc tccgagccag aagattaagg ttcctgcggg caagacgtac      540
cgcgtgctgg cgtacctgaa caccggctct atctctggcg aggctaacct gtacgcgaac      600
gtcggcggca tcgcgtggcg ggtctcgcca ggctatccta acggcggcgg cgtgaacatc      660
ggcgctgtcc tgaccaagtg ccagcagaag ggttggggcg acttccgcaa cttccagccc      720
tccgggcgcg acgtcatcgt gaagggtcag ggcaccttca agtccaacta cggcaccgac      780
ttcatcctta agattgagga catcaccgac agcaagctcc gcaacaacaa cggctccggg      840
acggtcgtac aggagatcaa ggtgccactc atccgcaccg agatttga                   888
<210>  34
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC3669.
<400>  34
atgaagaagt tcgcgtcgct gatcctcatc agcgtgttcc tgtttagtag cacgcagttc       60
gtccacgcct catccacgga cgtgcaagag cgcctgcggg acttggcgcg cgaagacgag      120
gcgggaacgt tcaacgaggc ttggaacacc aacttcaagc cgtcggacga gcagcaattc      180
agctactcgc cgacggaggg aattgtcttc ctcacgccgc ctaagaacgt catcggtgag      240
cggcgcatct cccagtacaa ggtgaacaat gcctgggcaa ctctggaggg ctctcccacc      300
gaggtcagcg gtacgccgtt gtacgcgggc aagaatgtac tggacaactc gaaaggcaca      360
atagaccagg agttgcttac acccgagttc tcgtacacct acacggagag cacgagcaac      420
acgacgacgc acggcctcaa agtcggcgtg aagaccaccg cgaccatgaa gttccctatc      480
gctcaaggct cgatggaggc gagcaccgag tacaatttcc agaactcctc caccgatacc      540
aagaccaaac aagtgtctta caagtctccg agccagaaga ttaaggttcc tgcgggcaag      600
acgtaccgcg tgctggcgta cctgaacacc ggctctatct ctggcgaggc taacctgtac      660
gcgaacgtcg gcggcatcgc gtggcgggtc tcgccaggct atcctaacgg cggcggcgtg      720
aacatcggcg ctgtcctgac caagtgccag cagaagggtt ggggcgactt ccgcaacttc      780
cagccctccg ggcgcgacgt catcgtgaag ggtcagggca ccttcaagtc caactacggc      840
accgacttca tccttaagat tgaggacatc accgacagca agctccgcaa caacaacggc      900
tccgggacgg tcgtacagga gatcaaggtg ccactcatcc gcaccgagat ttga            954
<210>  35
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC3669.
<400>  35
atgtcatcca cggacgtgca agagcgcctg cgggacttgg cgcgcgaaga cgaggcggga       60
acgttcaacg aggcttggaa caccaacttc aagccgtcgg acgagcagca attcagctac      120
tcgccgacgg agggaattgt cttcctcacg ccgcctaaga acgtcatcgg tgagcggcgc      180
atctcccagt acaaggtgaa caatgcctgg gcaactctgg agggctctcc caccgaggtc      240
agcggtacgc cgttgtacgc gggcaagaat gtactggaca actcgaaagg cacaatagac      300
caggagttgc ttacacccga gttctcgtac acctacacgg agagcacgag caacacgacg      360
acgcacggcc tcaaagtcgg cgtgaagacc accgcgacca tgaagttccc tatcgctcaa      420
ggctcgatgg aggcgagcac cgagtacaat ttccagaact cctccaccga taccaagacc      480
aaacaagtgt cttacaagtc tccgagccag aagattaagg ttcctgcggg caagacgtac      540
cgcgtgctgg cgtacctgaa caccggctct atctctggcg aggctaacct gtacgcgaac      600
gtcggcggca tcgcgtggcg ggtctcgcca ggctatccta acggcggcgg cgtgaacatc      660
ggcgctgtcc tgaccaagtg ccagcagaag ggttggggcg acttccgcaa cttccagccc      720
tccgggcgcg acgtcatcgt gaagggtcag ggcaccttca agtccaacta cggcaccgac      780
ttcatcctta agattgagga catcaccgac agcaagctcc gcaacaacaa cggctccggg      840
acggtcgtac aggagatcaa ggtgccactc atccgcaccg agatttga                   888
<210>  36
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC3670.
<400>  36
atgaagaagt tcgcgtcgct gatcctcacc agcgtgttcc tgtttagtag cacgcagttc       60
gtccacgcct catccacgga cgtgcaagag cgcctgcggg acttggcgcg cgaagacgag      120
gcgggaacgt tcaacgaggc ttggaacacc aacttcaagc cgtcggacga gcagcaattc      180
agctactcgc cgacggaggg aattgtcttc ctcacgccgc ctaagaacgt catcggtgag      240
cggcgcatct cccagtacaa ggtgaacaat gcctgggcaa ctctggaggg ctctcccacc      300
gaggcgagcg gtacgccgtt gtacgcgggc aagaatgtac tggacaactc gaaaggcaca      360
atggaccagg agttgcttac acccgagttc aactacacct acacggagag cacgagcaac      420
acgacgacgc acggcctcaa actcggcgtg aagaccaccg cgaccatgaa gttccctatc      480
gctcaaggct cgatggaggc gagcaccgag tacaatttcc agaactcctc caccgatacc      540
aagaccaaac aagtgtctta caagtctccg agccagaaga ttaaggttcc tgcgggcaag      600
acgtaccgcg tgctggcgta cctgaacacc ggctctatct ctggcgaggc taacctgtac      660
gcgaacgtcg gcggcatcgc gtggcgggtc tcgccaggct atcctaacgg cggcggcgtg      720
aacatcggcg ctgtcctgac caagtgccag cagaagggtt ggggcgactt ccgcaacttc      780
cagccctccg ggcgcgacgt catcgtgaag ggtcagggca ccttcaagtc caactacggc      840
accgacttca tccttaagat tgaggacatc accgacagca agctccgcaa caacaacggc      900
tccgggacgg tcgtacagga gatcaaggtg ccactcatcc gcaccgagat ttga            954
<210>  37
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC3670.
<400>  37
atgtcatcca cggacgtgca agagcgcctg cgggacttgg cgcgcgaaga cgaggcggga       60
acgttcaacg aggcttggaa caccaacttc aagccgtcgg acgagcagca attcagctac      120
tcgccgacgg agggaattgt cttcctcacg ccgcctaaga acgtcatcgg tgagcggcgc      180
atctcccagt acaaggtgaa caatgcctgg gcaactctgg agggctctcc caccgaggcg      240
agcggtacgc cgttgtacgc gggcaagaat gtactggaca actcgaaagg cacaatggac      300
caggagttgc ttacacccga gttcaactac acctacacgg agagcacgag caacacgacg      360
acgcacggcc tcaaactcgg cgtgaagacc accgcgacca tgaagttccc tatcgctcaa      420
ggctcgatgg aggcgagcac cgagtacaat ttccagaact cctccaccga taccaagacc      480
aaacaagtgt cttacaagtc tccgagccag aagattaagg ttcctgcggg caagacgtac      540
cgcgtgctgg cgtacctgaa caccggctct atctctggcg aggctaacct gtacgcgaac      600
gtcggcggca tcgcgtggcg ggtctcgcca ggctatccta acggcggcgg cgtgaacatc      660
ggcgctgtcc tgaccaagtg ccagcagaag ggttggggcg acttccgcaa cttccagccc      720
tccgggcgcg acgtcatcgt gaagggtcag ggcaccttca agtccaacta cggcaccgac      780
ttcatcctta agattgagga catcaccgac agcaagctcc gcaacaacaa cggctccggg      840
acggtcgtac aggagatcaa ggtgccactc atccgcaccg agatttga                   888
<210>  38
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4076.
<400>  38
atgaagaagt tcgcgagttt gatcctgatc agtgtgttcc tcttctcctc tacccagttc       60
gtgcacgcga gcagcaccga cgtgcaagag cgcctgcggg acctcgcacg ggagaacgaa      120
gccgggacct taaacgaggc ctggaacact aacttcaagc cctccgacga gcagcagttc      180
tcctacagcc ctactgaggg tatcgtcttc ttgacgcctc ctaagaacgt catcggtgag      240
cgccgcatca gccagtacaa ggtgaacaat gcctgggcca cgttggaagg aagccctacc      300
gagatgtccg gtacgccgtt gtacgccggc aagaacgtgc tagacaactc caaaggcacg      360
tccgaccagg agctgctcac tccagagttc acttacacct acaccgagag tacatcaaac      420
accaccaccc acggcctgaa gctgggcgtg aagaccactg caaccatgaa gtttccgata      480
gcccagggct ccatggaggc gagcacagag tacaacttcc agaactcctc gaccgacacg      540
aagaccaagc aagtatctta caagtcgccg tcacagaaga tcaaggtccc tgcgggcaag      600
acgttcaggg tcctggcgta cctgaacacc ggatcaatct ccggcgaggc gaatctgtac      660
gctaatgtag gtggcatcgc ctggggtgtg ctgccaggct accctaacgg tggaggcgta      720
aacatcggag ccgtgttgac gaaatgccag cagaagggct ggggcgattt cagaaacttt      780
caaccgagcg ggagggacgt cattgtgaag ggccagggca cattcacatc caactacggg      840
acagacttca tcctgaagat cgaggacata accgacagca aactgaggaa caataacgga      900
tcgggtacgg tagtacagga gatcaaagtc ccgctgatcc ggacggagat ctag            954
<210>  39
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC4076.
<400>  39
atgagcagca ccgacgtgca agagcgcctg cgggacctcg cacgggagaa cgaagccggg       60
accttaaacg aggcctggaa cactaacttc aagccctccg acgagcagca gttctcctac      120
agccctactg agggtatcgt cttcttgacg cctcctaaga acgtcatcgg tgagcgccgc      180
atcagccagt acaaggtgaa caatgcctgg gccacgttgg aaggaagccc taccgagatg      240
tccggtacgc cgttgtacgc cggcaagaac gtgctagaca actccaaagg cacgtccgac      300
caggagctgc tcactccaga gttcacttac acctacaccg agagtacatc aaacaccacc      360
acccacggcc tgaagctggg cgtgaagacc actgcaacca tgaagtttcc gatagcccag      420
ggctccatgg aggcgagcac agagtacaac ttccagaact cctcgaccga cacgaagacc      480
aagcaagtat cttacaagtc gccgtcacag aagatcaagg tccctgcggg caagacgttc      540
agggtcctgg cgtacctgaa caccggatca atctccggcg aggcgaatct gtacgctaat      600
gtaggtggca tcgcctgggg tgtgctgcca ggctacccta acggtggagg cgtaaacatc      660
ggagccgtgt tgacgaaatg ccagcagaag ggctggggcg atttcagaaa ctttcaaccg      720
agcgggaggg acgtcattgt gaagggccag ggcacattca catccaacta cgggacagac      780
ttcatcctga agatcgagga cataaccgac agcaaactga ggaacaataa cggatcgggt      840
acggtagtac aggagatcaa agtcccgctg atccggacgg agatctag                   888
<210>  40
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4078.
<400>  40
atgagcagca ccgacgtgca agagcgcctg cgggacctcg cacgggagaa cgaagccggg       60
accttaaacg aggcctggaa cactaacttc aagccctccg acgagcagca gttctcctac      120
agccctactg agggtatcgt cttcttgacg cctcctaaga acgtcatcgg tgagcgccgc      180
atcagccagt acaaggtgaa caatgcctgg gccacgttgg aaggaagccc taccgagatg      240
tccggtacgc cgttgtacgc cggcaagaac gtgctagaca actccaaagg cacgtccgac      300
caggagctgc tcactccaga gttcacttac acctacaccg agagtacatc aaacaccacc      360
acccacggcc tgaagctggg cgtgaagacc actgcaacca tgaagtttcc gatagcccag      420
ggctccatgg aggcgagcac agagtacaac ttccagaact cctcgaccga cacgaagacc      480
aagcaagtat cttacaagtc gccgtcacag aagatcaagg tccctgcggg caagacgttc      540
agggtcctgg cgtacctgaa caccggatca atctccggcg aggcgaatct gtacgctaat      600
gtaggtggca tcgcctgggg tgtgctgcca ggctacccta acggtggagg cgtaaacatc      660
ggagccgtgt tgacgaaatg ccagcagaag ggctggggcg atttcagaaa ctttcaaccg      720
agcgggaggg acgtcattgt gaagggccag ggcacattca catccaacta cgggacagac      780
ttcatcctga agatcgagga cataaccgac agcaaactga ggaacaataa cggatcgggt      840
acggtagtac aggagatcaa agtcccgctg atccggacgg agatctag                   888
<210>  41
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC4078.
<400>  41
atgagctcca ccgacgttca ggagcgcctc cgggacttgg caagagagaa tgaggcgggt       60
acgctcaatg tcgcctggaa caccaacttc aagccgtccg acgaacagca gttctcctac      120
tctcctacgg aagggttcat cttcctgaca ccgcccaaga acgtcatcgg cgagcggcgc      180
atcagccatt acaaggtcaa caatgcgtgg gctacgctgg agggcagtcc gaccgaggtg      240
agcggcactc cactctacgc cgggagaaac gtcctcgaca attccaaggg caccatcgac      300
caggagatgt tgacgcctga gttcaactac acgtacaccg agggcacctc taacaccacc      360
actcatggcc tcaagcttgg cgtgaagaca actgcgacaa tgaagtttcc catcgcccaa      420
ggcagtatgg aggcctcgac ggagtacaac ttccagaaca gcagcaccga cactaagacc      480
aagcaagtgt cctacaagag tccatcacag aagatcaaag tcccggccgg caagacattc      540
cgagtgctgg cgtacctaaa caccgggtcg atctcgggcg aggccaacct ttacgccaat      600
gtgggcggcg tcgcatgggg cgtgctgccc ggctatccga acggaggcgg cgtgaacatc      660
ggcgctgtgc tcaccaagtg ccaacagaag ggatggggcg acttccgcaa cttccaaccc      720
tccggtaggg acgtcatagt gaagggccag ggcacgttta catctaacta cgggacggac      780
ttcatactca agatcgagga catcacagat agtaagctca ggaacaacaa cgggtccggc      840
accgtcgttc aggagatcaa ggtcccgttg attaggacgg agatctga                   888
<210>  42
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4260.
<400>  42
atgaagaagt tcgcctcact gatccttacc tcggtcttcc tgttctcttc cactcagttc       60
gtgcacgcca gctccataga cgtccaggag cggctcaggg acttggcgcg ggaggacgag      120
gccggcacct ttaacgtggc ctggaacacg aactttaagc cttcagacga gcagcagttc      180
tcctacagcc ctactgaggg cttcatcttt ctgactccgc caaagaatgt gatcggcgaa      240
aggcggatca gtcactacaa agtgaacaac gcttgggcca cgctcgtggg ctcacccacg      300
gaagcgtcag ggacgcctct ctacgccggt aggaacgtgc tggataattc caagggtacg      360
atggaccagg agatgctgac gcccgagttc agctacactt acacagaggg cacgtccaac      420
acgatcacac atgggctcaa ggtgggtgtc aagaccaccg ctaccatgaa gttcccgatc      480
gctcagggct ccatggaagc gagcacagag tacaactttc agaactcttc gacggacacg      540
aagaccaagc aagtttccta caagagccct agccagaaga tcaaggtccc tgcgggcaag      600
acgtaccgcg ttctggccta tctgaacacc ggctccataa gcggcgaggc gaacctgtac      660
gctaatgtgg gtggcgtcgc ttggcgcgtc agtccgggtt acccgaacgg cggcggcgtg      720
aacatcggcg ccgtgttaac taagtgccag cagaagggct ggggcgactt cagaaatttc      780
cagccttccg gccgggacgt catcgtgaag ggccagggca ccttcacctc aaactacggg      840
acagacttta tccttaagat cgaggacatc accgacagca agctccgaaa caacaacggc      900
tccggcaccg tcgtgcaaga gattaaggtc ccgctcatta ggacggagat ctaa            954
<210>  43
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC4260.
<400>  43
atgagctcca tagacgtcca ggagcggctc agggacttgg cgcgggagga cgaggccggc       60
acctttaacg tggcctggaa cacgaacttt aagccttcag acgagcagca gttctcctac      120
agccctactg agggcttcat ctttctgact ccgccaaaga atgtgatcgg cgaaaggcgg      180
atcagtcact acaaagtgaa caacgcttgg gccacgctcg tgggctcacc cacggaagcg      240
tcagggacgc ctctctacgc cggtaggaac gtgctggata attccaaggg tacgatggac      300
caggagatgc tgacgcccga gttcagctac acttacacag agggcacgtc caacacgatc      360
acacatgggc tcaaggtggg tgtcaagacc accgctacca tgaagttccc gatcgctcag      420
ggctccatgg aagcgagcac agagtacaac tttcagaact cttcgacgga cacgaagacc      480
aagcaagttt cctacaagag ccctagccag aagatcaagg tccctgcggg caagacgtac      540
cgcgttctgg cctatctgaa caccggctcc ataagcggcg aggcgaacct gtacgctaat      600
gtgggtggcg tcgcttggcg cgtcagtccg ggttacccga acggcggcgg cgtgaacatc      660
ggcgccgtgt taactaagtg ccagcagaag ggctggggcg acttcagaaa tttccagcct      720
tccggccggg acgtcatcgt gaagggccag ggcaccttca cctcaaacta cgggacagac      780
tttatcctta agatcgagga catcaccgac agcaagctcc gaaacaacaa cggctccggc      840
accgtcgtgc aagagattaa ggtcccgctc attaggacgg agatctaa                   888
<210>  44
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4346.
<400>  44
atgaagaagt tcgcgagttt gatcctgatc agtgtgttcc tcttctcctc tacccagttc       60
gtgcacgcgt cctccaccga cgtgcaagag aggctgaggg acttggctcg agagaacgag      120
gccgggaccc tgaacgaggc gtggaacacg aatttcaagc cttccgatga gcaacagttc      180
tcctacagcc ctaccgaagg gattgtgttc ctcacgcctc ccaagaacgt gatcggcgag      240
cgccgcatct cgcagtacaa ggtgaacaac gcctgggcga cgctcgaggg ctcacccacc      300
gaggtctcgg gcactccgct gtacgccggc aagaacgtcc ttgacaactc caagggaacc      360
atggatcaag agctattgac gccggagttc aactacacgt acaccgagag caccagcaac      420
acgatcacac acggcctcaa gctaggcgtg aagacgactg cgacaatgaa gttcccgatc      480
gcacagggct cgatggaggc cagcacggag tacaacttcc agaactcgtc caccgacacg      540
aagactaagc aagtgtcata caagtctccc tcacagaaga taaaggtgcc ggccggcaag      600
acgtttcgcg tcctggccta cttaaacacg ggttccatta gcggtgaggc caacctctat      660
gcgaatgtgg gcggaattgc gtggggcgtc ctgcccggat acccgaacgg cggcggcgtc      720
aacatcggcg ccgtgttgac gaaatgtcag cagaagggct ggggcgattt ccgtaacttc      780
cagccgtccg gccgcgacgt gatagtgaag ggacagggaa cgttcgagtc aaactacggc      840
acagacttca tcttaaagat cgaagacata acagactcga agctgcgcaa caataacggc      900
tcaggcacgg tcgttcagga gattaaggtg cctctcatcc ggacagagat ctag            954
<210>  45
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC4346.
<400>  45
atgtcctcca ccgacgtgca agagaggctg agggacttgg ctcgagagaa cgaggccggg       60
accctgaacg aggcgtggaa cacgaatttc aagccttccg atgagcaaca gttctcctac      120
agccctaccg aagggattgt gttcctcacg cctcccaaga acgtgatcgg cgagcgccgc      180
atctcgcagt acaaggtgaa caacgcctgg gcgacgctcg agggctcacc caccgaggtc      240
tcgggcactc cgctgtacgc cggcaagaac gtccttgaca actccaaggg aaccatggat      300
caagagctat tgacgccgga gttcaactac acgtacaccg agagcaccag caacacgatc      360
acacacggcc tcaagctagg cgtgaagacg actgcgacaa tgaagttccc gatcgcacag      420
ggctcgatgg aggccagcac ggagtacaac ttccagaact cgtccaccga cacgaagact      480
aagcaagtgt catacaagtc tccctcacag aagataaagg tgccggccgg caagacgttt      540
cgcgtcctgg cctacttaaa cacgggttcc attagcggtg aggccaacct ctatgcgaat      600
gtgggcggaa ttgcgtgggg cgtcctgccc ggatacccga acggcggcgg cgtcaacatc      660
ggcgccgtgt tgacgaaatg tcagcagaag ggctggggcg atttccgtaa cttccagccg      720
tccggccgcg acgtgatagt gaagggacag ggaacgttcg agtcaaacta cggcacagac      780
ttcatcttaa agatcgaaga cataacagac tcgaagctgc gcaacaataa cggctcaggc      840
acggtcgttc aggagattaa ggtgcctctc atccggacag agatctag                   888
<210>  46
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4826.
<400>  46
atgaagaagt tcgcgagttt gatcctgatc agtgtgttcc tcttctcctc tacccagttc       60
gtgcacgcga gctcgacgga cgtccaggaa cggctccggg accttgcgcg cgagaacgag      120
gccgggacgt tgaacgaggc ctggaacacc aacttcaaac cgagcgacga gcagcagttc      180
agctactctc ccacggaggg catagtcttc ctcacgcctc ccaagaacgt gatcggcgag      240
aggcgcatct cccagtacaa ggtgaacaac gcctgggcga ccttggaggg ctctcccacg      300
gaggtgtccg gcactccgct ctacgccggc aagaacgtct tagacaacag caaagggacc      360
atggatcagg agctattgac gccggagttc aattacacgt acaccgaaag tacaagtaat      420
acgaccactc atggcctgaa gctcggcgtg aagactacag caacaatgaa gtttcccatt      480
gcccaagggt cgatggaggc ctcgaccgag tacaatttcc agaactcctc aacagacact      540
aagaccaaac aggtgtcgta caagagccct agccagaaga tcaaagtccc ggccggcaag      600
acctacaggg tgctggcgta cctcaacacc ggctctatct cgggcgaggc gaacctctac      660
gcgaacgtgg gcgggatcgc atggggtgtg ctacctggtt acccgaacgg aggcggcatc      720
aacatcggcg cggtgctgac aaagtgccag cagaagggtt ggggcgactt tcgcaacttc      780
cagccgagcg ggagagacgt catcgtgaag ggccagggca ccttcaagag caattacggc      840
acggacttca tcctcaagat tgaagacatc accgacagca agctgcgaaa taacaacggg      900
tcgggcaccg tcgtccagga gatcaaagtg ccgctcatcc ggaccgagat ctag            954
<210>  47
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC4826.
<400>  47
atgagctcga cggacgtcca ggaacggctc cgggaccttg cgcgcgagaa cgaggccggg       60
acgttgaacg aggcctggaa caccaacttc aaaccgagcg acgagcagca gttcagctac      120
tctcccacgg agggcatagt cttcctcacg cctcccaaga acgtgatcgg cgagaggcgc      180
atctcccagt acaaggtgaa caacgcctgg gcgaccttgg agggctctcc cacggaggtg      240
tccggcactc cgctctacgc cggcaagaac gtcttagaca acagcaaagg gaccatggat      300
caggagctat tgacgccgga gttcaattac acgtacaccg aaagtacaag taatacgacc      360
actcatggcc tgaagctcgg cgtgaagact acagcaacaa tgaagtttcc cattgcccaa      420
gggtcgatgg aggcctcgac cgagtacaat ttccagaact cctcaacaga cactaagacc      480
aaacaggtgt cgtacaagag ccctagccag aagatcaaag tcccggccgg caagacctac      540
agggtgctgg cgtacctcaa caccggctct atctcgggcg aggcgaacct ctacgcgaac      600
gtgggcggga tcgcatgggg tgtgctacct ggttacccga acggaggcgg catcaacatc      660
ggcgcggtgc tgacaaagtg ccagcagaag ggttggggcg actttcgcaa cttccagccg      720
agcgggagag acgtcatcgt gaagggccag ggcaccttca agagcaatta cggcacggac      780
ttcatcctca agattgaaga catcaccgac agcaagctgc gaaataacaa cgggtcgggc      840
accgtcgtcc aggagatcaa agtgccgctc atccggaccg agatctag                   888
<210>  48
<211>  921
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4861.
<400>  48
atgtttctgt tctcgagcac ccagtttgtg cacgcgtcct ccacggatgt gcaagagcgg       60
ctccgcgacc tagcccgcga gaacgaggct ggcacactga acgaggcgtg gaacacgaac      120
ttcaagccga gcgacgagca gcagttctcc tactcgccga ctgagggcat cgtcttcctg      180
acgcctccca agaacgtaat cggcgagcgg aggattagtc agtacaaggt gaacaatgcg      240
tgggcaacgc tcgagggtag cccaaccgag gtctccggca cgccgctcta cgcgggaaag      300
aacgtcctgg acaattccaa gggcaccagc gaccaggagc tgcttacgcc ggagtttaat      360
tacacctaca cagagtcgac ctcgaatacg acaacacacg gccttaagct gggcgttaag      420
acaacggcga cgatgaagtt tcccattgcc cagggttcga tggaagcttc tacggagtac      480
aactttcaga actcgagcac agacacaaag acgaagcaag tgtcctacaa gagccctagc      540
cagaagataa aggtccctgc cggcaagaca tacagggtct tagcgtacct caacaccggc      600
tcgatctcag gagaggccaa cctgtacgcc aacatcggcg ggatcgcctg gggtggcctc      660
ccgggctacc ctaacggcgg cggtgtgaac atcggcgctg tcctgacgaa atgccagcag      720
aaagggtggg gcgacttccg aaacttccag ccgagcgggc gcgacgttat cgtcaagggt      780
cagggcactt tcaagtctaa ttacggaacc gatttcattc tgaagatcga ggacattacc      840
gatagcaagc tccggaacaa caacggcagc ggtacggttg tccaggagat caaggtccct      900
ctgatacgaa cagagatttg a                                                921
<210>  49
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый
белок TIC4861, зрелый белок TIC4862 и зрелый белок TIC4863.
<400>  49
atgtcctcca cggatgtgca agagcggctc cgcgacctag cccgcgagaa cgaggctggc       60
acactgaacg aggcgtggaa cacgaacttc aagccgagcg acgagcagca gttctcctac      120
tcgccgactg agggcatcgt cttcctgacg cctcccaaga acgtaatcgg cgagcggagg      180
attagtcagt acaaggtgaa caatgcgtgg gcaacgctcg agggtagccc aaccgaggtc      240
tccggcacgc cgctctacgc gggaaagaac gtcctggaca attccaaggg caccagcgac      300
caggagctgc ttacgccgga gtttaattac acctacacag agtcgacctc gaatacgaca      360
acacacggcc ttaagctggg cgttaagaca acggcgacga tgaagtttcc cattgcccag      420
ggttcgatgg aagcttctac ggagtacaac tttcagaact cgagcacaga cacaaagacg      480
aagcaagtgt cctacaagag ccctagccag aagataaagg tccctgccgg caagacatac      540
agggtcttag cgtacctcaa caccggctcg atctcaggag aggccaacct gtacgccaac      600
atcggcggga tcgcctgggg tggcctcccg ggctacccta acggcggcgg tgtgaacatc      660
ggcgctgtcc tgacgaaatg ccagcagaaa gggtggggcg acttccgaaa cttccagccg      720
agcgggcgcg acgttatcgt caagggtcag ggcactttca agtctaatta cggaaccgat      780
ttcattctga agatcgagga cattaccgat agcaagctcc ggaacaacaa cggcagcggt      840
acggttgtcc aggagatcaa ggtccctctg atacgaacag agatttga                   888
<210>  50
<211>  948
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4682.
<400>  50
atgttcgcgt cgctcattct gatctccgtg tttctcttct cgtcgaccca gttcgtgcac       60
gcgtcctcca cggatgtgca agagcggctc cgcgacctag cccgcgagaa cgaggctggc      120
acactgaacg aggcgtggaa cacgaacttc aagccgagcg acgagcagca gttctcctac      180
tcgccgactg agggcatcgt cttcctgacg cctcccaaga acgtaatcgg cgagcggagg      240
attagtcagt acaaggtgaa caatgcgtgg gcaacgctcg agggtagccc aaccgaggtc      300
tccggcacgc cgctctacgc gggaaagaac gtcctggaca attccaaggg caccagcgac      360
caggagctgc ttacgccgga gtttaattac acctacacag agtcgacctc gaatacgaca      420
acacacggcc ttaagctggg cgttaagaca acggcgacga tgaagtttcc cattgcccag      480
ggttcgatgg aagcttctac ggagtacaac tttcagaact cgagcacaga cacaaagacg      540
aagcaagtgt cctacaagag ccctagccag aagataaagg tccctgccgg caagacatac      600
agggtcttag cgtacctcaa caccggctcg atctcaggag aggccaacct gtacgccaac      660
atcggcggga tcgcctgggg tggcctcccg ggctacccta acggcggcgg tgtgaacatc      720
ggcgctgtcc tgacgaaatg ccagcagaaa gggtggggcg acttccgaaa cttccagccg      780
agcgggcgcg acgttatcgt caagggtcag ggcactttca agtctaatta cggaaccgat      840
ttcattctga agatcgagga cattaccgat agcaagctcc ggaacaacaa cggcagcggt      900
acggttgtcc aggagatcaa ggtccctctg atacgaacag agatttga                   948
<210>  51
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок
TIC4863.
<400>  51
atgaagaagt tcgcgagttt gatcctgatc agtgtgttcc tcttctcctc tacccagttc       60
gtgcacgcgt cctccacgga tgtgcaagag cggctccgcg acctagcccg cgagaacgag      120
gctggcacac tgaacgaggc gtggaacacg aacttcaagc cgagcgacga gcagcagttc      180
tcctactcgc cgactgaggg catcgtcttc ctgacgcctc ccaagaacgt aatcggcgag      240
cggaggatta gtcagtacaa ggtgaacaat gcgtgggcaa cgctcgaggg tagcccaacc      300
gaggtctccg gcacgccgct ctacgcggga aagaacgtcc tggacaattc caagggcacc      360
agcgaccagg agctgcttac gccggagttt aattacacct acacagagtc gacctcgaat      420
acgacaacac acggccttaa gctgggcgtt aagacaacgg cgacgatgaa gtttcccatt      480
gcccagggtt cgatggaagc ttctacggag tacaactttc agaactcgag cacagacaca      540
aagacgaagc aagtgtccta caagagccct agccagaaga taaaggtccc tgccggcaag      600
acatacaggg tcttagcgta cctcaacacc ggctcgatct caggagaggc caacctgtac      660
gccaacatcg gcgggatcgc ctggggtggc ctcccgggct accctaacgg cggcggtgtg      720
aacatcggcg ctgtcctgac gaaatgccag cagaaagggt ggggcgactt ccgaaacttc      780
cagccgagcg ggcgcgacgt tatcgtcaag ggtcagggca ctttcaagtc taattacgga      840
accgatttca ttctgaagat cgaggacatt accgatagca agctccggaa caacaacggc      900
agcggtacgg ttgtccagga gatcaaggtc cctctgatac gaacagagat ttga            954
<210>  52
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от 1
до 36 SEQ ID NO:1 (прямой праймер TIC3668).
<400>  52
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttaca agtgtg                                 36
<210>  53
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от
920 до 954 SEQ ID NO:1 (обратный праймер TIC3668).
<400>  53
ctatatttca gttctaatta gtggaacttt aatc                                   34
<210>  54
<211>  41
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от 1
до 41 SEQ ID NO:3 (прямой праймер TIC3669).
<400>  54
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc t                           41
<210>  55
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от
920 до 954 SEQ ID NO:3 (обратный праймер TIC3669).
<400>  55
ctatatttca gttctaatta gtggaacttt aatc                                   34
<210>  56
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от 1
до 41 SEQ ID NO:5 (прямой праймер TIC3670).
<400>  56
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttaca agtgtg                                 36
<210>  57
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от
920 до 954 SEQ ID NO:5 (обратный праймер TIC3670).
<400>  57
ctatatttca gttctaatta gtggaacttt aatc                                   34
<210>  58
<211>  41
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от 1
до 41 SEQ ID NO:7 (прямой праймер TIC4076).
<400>  58
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc t                           41
<210>  59
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от
920 до 954 SEQ ID NO:7 (обратный праймер TIC4076).
<400>  59
ctatatttca gttctaatta gtggaacttt aatc                                   34
<210>  60
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (-)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от 1
до 36 SEQ ID NO:9 (прямой праймер TIC4078).
<400>  60
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttaca agtgtg                                 36
<210>  61
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность, представляющая синтетический
олигонуклеотид для гибридизации с (+)-цепью ДНК, кодирующей
белок, описанный в данной заявке и соответствующий положениям от
920 до 954 SEQ ID NO:9 (обратный праймер TIC4078).
<400>  61
ctatatttca gttctaatta gtggaacttt aatc                                   34
<210>  62
<211>  954
<212>  ДНК
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  62
atgaaaaaat ttgcaagttt aattcttata agtgtgttcc ttttttcgag tacgcaattt       60
gttcatgcgt catccataga tgttcaagaa agattacggg acttggcaag agaaaatgaa      120
gctggaaccc ttaatgaagc atggaatact aacttcaaac ccagtgatga acaacaattc      180
tcttatagtc caactgaagg tattgttttc ttaacaccac ctaaaaatgt tattggcgaa      240
agaagaattt cacagtataa agtaaataat gcatgggcta cattagaagg aagtccaacc      300
gaagtatcgg ggacaccttt atatgcggga aaaaacgtat tagataactc aaaaggaaca      360
agcgatcaag agctgttaac acccgagttt aactatacct atacggaaag cacttcaaat      420
acaacaactc atggattaaa attaggagtc aaaaccactg ctaccatgaa attcccgatt      480
gctcagggta gcatggaagc ttctactgaa tataactttc aagattcttc cactgatact      540
acaactaaaa cagtatcata taaaagccca tcacaaaaga ttaaagtacc agcaggtaaa      600
acctttagag ttttagcata cctaaatact ggatctattt caggtgaagc taacctttac      660
gcaaatgttg ggggtatagc ttggggagtt ttaccaggtt atcccaatgg cggaggagta      720
aatataggtg ctgtacttac caaatgccaa caaaaaggat ggggagattt cagaaacttt      780
caacctagtg gaagagatgt aatcgttaaa ggccaaggta ctttcaaatc taattatgga      840
acggacttca ttttaaaaat tgaagacatc acagattcaa agttacgaaa caataacggg      900
agtggaactg tcgttcaaga gattaaagtt ccactaatta gaactgaaat atag            954
<210>  63
<211>  317
<212>  ПРТ
<213>  Brevibacillus laterosporus
<400>  63
Met Lys Lys Phe Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ser Val Phe Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gln Phe Val His Ala Ser Ser Ile Asp Val Gln Glu Arg Leu
20                  25                  30
Arg Asp Leu Ala Arg Glu Asn Glu Ala Gly Thr Leu Asn Glu Ala Trp
35                  40                  45
Asn Thr Asn Phe Lys Pro Ser Asp Glu Gln Gln Phe Ser Tyr Ser Pro
50                  55                  60
Thr Glu Gly Ile Val Phe Leu Thr Pro Pro Lys Asn Val Ile Gly Glu
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ile Ser Gln Tyr Lys Val Asn Asn Ala Trp Ala Thr Leu Glu
85                  90                  95
Gly Ser Pro Thr Glu Val Ser Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Asn
100                 105                 110
Val Leu Asp Asn Ser Lys Gly Thr Ser Asp Gln Glu Leu Leu Thr Pro
115                 120                 125
Glu Phe Asn Tyr Thr Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Asn Thr Thr Thr His
130                 135                 140
Gly Leu Lys Leu Gly Val Lys Thr Thr Ala Thr Met Lys Phe Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Gln Gly Ser Met Glu Ala Ser Thr Glu Tyr Asn Phe Gln Asp Ser
165                 170                 175
Ser Thr Asp Thr Thr Thr Lys Thr Val Ser Tyr Lys Ser Pro Ser Gln
180                 185                 190
Lys Ile Lys Val Pro Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Leu Ala Tyr Leu
195                 200                 205
Asn Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Asn Val Gly
210                 215                 220
Gly Ile Ala Trp Gly Val Leu Pro Gly Tyr Pro Asn Gly Gly Gly Val
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Ala Val Leu Thr Lys Cys Gln Gln Lys Gly Trp Gly Asp
245                 250                 255
Phe Arg Asn Phe Gln Pro Ser Gly Arg Asp Val Ile Val Lys Gly Gln
260                 265                 270
Gly Thr Phe Lys Ser Asn Tyr Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile Glu
275                 280                 285
Asp Ile Thr Asp Ser Lys Leu Arg Asn Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val
290                 295                 300
Val Gln Glu Ile Lys Val Pro Leu Ile Arg Thr Glu Ile
305                 310                 315
<210>  64
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC3668.
<400>  64
atgtcatcca cagatgttca agaaagatta cgggacttgg caagagaaga tgaagctgga       60
acctttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcgtat      120
agtccaactg aaggaattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag taggaagtcc aaccgaagca      240
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg aacaatggat      300
caagagctgt taacacccga gtttaactat acctatacgg aaagcacttc aaatacaata      360
actcatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaacctat      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggta tagcttggag ggtttcacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca aatctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  65
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC3669.
<400>  65
atgtcatcca cagatgttca agaaagatta cgggacttgg caagagaaga tgaagctgga       60
acctttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcgtat      120
agtccaactg aaggaattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaagta      240
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg aacaatcgat      300
caagagctgt taacacccga gtttagttat acctatacgg aaagcacttc aaatacaaca      360
actcatggat taaaagtagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaacctat      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggta tagcttggag ggtttcacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca aatctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  66
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC3670.
<400>  66
atgtcatcca cagatgttca agaaagatta cgggacttgg caagagaaga tgaagctgga       60
acctttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcttat      120
agtccaactg aaggaattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaagca      240
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg aacaatggat      300
caagagctgt taacacccga gtttaactat acctatacgg aaagcacttc aaatacaaca      360
acccatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaacctat      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggta tagcttggag ggtttcacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca aatctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  67
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC4076.
<400>  67
atgtcatcca cagatgttca agaaagatta cgggacttgg caagagaaaa tgaagctgga       60
acccttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcttat      120
agtccaactg aaggtattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaaatg      240
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg aacaagcgat      300
caagagctgt taacacccga gtttacctat acctatacgg aaagcacttc aaatacaaca      360
actcatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aagattaaag taccagcagg taaaaccttt      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggta tagcttgggg ggttttacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca catctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  68
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC4078.
<400>  68
atgtcatcca cagatgttca agaaagatta cgggacttgg caagagaaaa tgaagctgga       60
acccttaatg tagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcttat      120
agtccaactg aaggttttat tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacatt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaagta      240
tcggggacac ctttatatgc gggaagaaac gtattagata actcaaaagg aacaatagat      300
caagagatgt taacacccga gtttaactat acctatacgg aaggcacttc aaatacaaca      360
actcatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaaccttt      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggtg tagcttgggg ggttttacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca catctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  69
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC4260.
<400>  69
atgtcatcca tagatgttca agaaagatta cgggacttgg caagagaaga tgaagctgga       60
acctttaatg tagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcgtat      120
agtccaactg aaggttttat tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacatt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag taggaagtcc aaccgaagca      240
tcggggacac ctttatatgc gggaagaaac gtattagata actcaaaagg aacaatggat      300
caagagatgt taacacccga gtttagttat acctatacgg aaggcacttc aaatacaata      360
actcatggat taaaagtagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaacctat      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggtg tagcttggag ggtttcacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca catctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  70
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC4346.
<400>  70
atgtcatcca cagatgttca agaaagatta cgggacttag caagagaaaa tgaagctgga       60
acccttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcttat      120
agtccaactg aaggaattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaagta      240
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg aacaatggat      300
caagagctgt taacacccga gtttaactat acctatacgg aaagcacttc aaatacaata      360
actcatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaaccttt      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggta tagcttgggg ggttttacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttcg aatctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  71
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC4826.
<400>  71
atgtcatcca cagatgttca agaaagatta cgggacttgg caagagaaaa tgaagctgga       60
acccttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcttat      120
agtcccactg aaggtattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaagta      240
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg aacaatggat      300
caagagctgt taacacccga gtttaactat acctatacgg aaagcacttc aaatacaaca      360
actcatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaacctat      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atatcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
gttgggggta tagcttgggg ggttttacca ggttatccca atggcggagg aataaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca aatctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<210>  72
<211>  888
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая
зрелый белок TIC4861, зрелый белок TIC4862 и зрелый белок TIC4863.
<400>  72
atgtcatcca cagatgttca agaacgatta cgggacttgg caagagaaaa tgaagctgga       60
acccttaatg aagcatggaa tactaacttc aaacccagtg atgaacaaca attctcttat      120
agtccaactg aaggtattgt tttcttaaca ccacctaaaa atgttattgg cgaaagaaga      180
atttcacagt ataaagtaaa taatgcatgg gctacattag aaggaagtcc aaccgaagta      240
tcggggacac ctttatatgc gggaaaaaac gtattagata actcaaaagg gacaagcgat      300
caagagctgt taacacccga gtttaactat acctatacgg aaagcacttc aaatacaaca      360
actcatggat taaaattagg agtcaaaacc actgctacca tgaaattccc gattgctcag      420
ggtagcatgg aagcttctac tgaatataac tttcaaaatt cttccactga tactaaaact      480
aaacaagtat catataaaag cccatcacaa aaaattaaag taccagcagg taaaacctat      540
agagttttag catacctaaa tactggatct atttcaggtg aagctaacct ttacgcaaat      600
attgggggta tagcttgggg gggtttacca ggttatccca atggcggagg agtaaatata      660
ggtgctgtac ttaccaaatg ccaacaaaaa ggatggggag atttcagaaa ctttcaacct      720
agtggaagag atgtaatcgt taaaggccaa ggtactttca aatctaatta tggaacggac      780
ttcattttaa aaattgaaga catcacagat tcaaagttac gaaacaataa cgggagtgga      840
actgtcgttc aagagattaa agttccacta attagaactg aaatatag                   888
<---