ШТАММЫ Cryptococcus flavescens, УСТОЙЧИВЫЕ К ПРОТИОКОНАЗОЛУ, ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ФУЗАРИОЗА
PROTHIOCONAZOLE-RESISTANT STRAIN OF Cryptococcus flavescens FOR BIOLOGICAL CONTROL OF FUSARIOSIS

Уровень техники
[0001] Настоящее изобретение посвящено новым агентам биоконтроля для контроля фузариоза.
Уровень техники
[0002] Фузариоз представляет собой тяжелое заболевание пшеницы и ячменя, распространенное по всему миру в полувлажных и влажных регионах выращивания зерновых (McMullen et al., 1997, Scab of wheat and barley: are emerging disease of devastating impact. Plant Disease, 81, 1340-1348; Muthomi et al, 2002, Susceptibility of Kenyan wheat varieties to head blight, fungal invasion and deoxynivalenol accumulation inoculated with Fusarium graminearum, Journal of Phytopathology, 150, 30-36; Yu.Gagkaeva and Yli-Mattila, 2004, Genetic diversity of Fusarium graminearum in Europe and Asia, European Journal of Plant Pathology, 110, 551-562). Основным возбудителем фузариоза является Fusarium graminearum Schwabe группы 2 (Aoki and O'Donnell, 1999, Morphological and molecular characterization of Fusarium pseudograminearum sp.nov., formerly recognized as the Group 1 population of F.graminearum, Mycologia, 91, 597-609) [совершенная стадия=Gibberella zeae (Schwein.) Petch]. Кроме потерь урожая зерновых, G. zeae может образовывать микотоксины, например эстрогенный токсин зеараленон (F-2) (Hesseltine et al., 1978, Fungi, especially Gibberella zeae, and zearalenone occurrence in wheat. Mycologia, 70, 14-18) и трихотеценовый микотоксин дезоксиниваленол (DON, вомитоксин) (Snijders, 1990, Fusarium head blight and mycotoxin contamination of wheat, a review. Netherlands Journal of Plant Pathology, 96, 187-198), которые могут оказывать отрицательное воздействие на качество зерна [Cardwell et al, 2001, Mycotoxins:the cost of achieving food security and food quality, APS Net: Feature story August, 2001] и вредить здоровью животных [Marasas, 1991, Toxigenic Fusaria, in: Mycotoxins and Animal Foods, J.E.Smith and R.S.Henderson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Beardall and Miller, 1994, Diseases in humans with mycotoxins as possible causes, in Mycotoxins in Grain: Compounds Other than Aflatoxin (MILLER, J.D. & TRENHOLM, H.L., Eds.). Eagan Press, St.Paul, MN, pp.387-39; Pestka and Bondy, 1994, Immunotoxic effects of mycotoxins, in Mycotoxins in Grain: Compounds Other than Aflatoxin (MILLER, J.D. & TRENHOLM, H.L., Eds.) Eagan Press, St. Paul, MN, pp.339-358].
[0003] Снижение воздействия фузариоза на урожай и качество зерна остается трудноразрешимой проблемой. Иногда фузариоз подавляют с помощью фунгицидов [Wilcoxson, 1996, Fungicides for control of Fusarium head blight, Int. J. Tropical Plant Disease, 14, 27-50; Suty and Mauler-Machnik, 1997, Fusarium ear blight on wheat-epidemiology and control of Gibberella zeae, the teleomorph of Fusarium graminearum with Folicur, in Diagnosis and Identification of Plant Pathogens, Proceedings of the 4th International Symposium of the European Foundation for Plant Pathology (DEHNE, H.W., ADAM, G., DIEKMANN, M., FRAHM, J., MAULER-MACHNIK & VAN HALTEREN, P., Eds). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht., pp.243-246; Jones, 1999, Seedling blight development and control in spring wheat damaged by Fusarium graminearum Group 2. Plant Disease, 83, 1013-1018], однако при их использовании следует учитывать возможность потенциальных проблем, связанных с остаточными количествами, сообщениями об устойчивости к фунгицидам и случаями возрастания содержания DON в зерне [Mauler-Machnik and Zahn, 1994, Ear fusarioses in wheat-new findings on their epidemiology and control with Folicur (tebuconazole). Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer, 47, 129-155; Ramirez et al, 2004, Impact of environmental factors and fungicides on growth and deoxynivalenol production by Fusarium graminearum isolates from Argentinian wheat. Crop Protection, 23, 117-125; Chen et al, 2000, Recent advances in wheat head scab research in China, in Proc. Int. Symp. Wheat Improvement for Scab Resistance (RAUPP, W. J., MA, Z., CHEN, P. & LIU, D., Eds.). Nanjing Agricultural University, Jiangsu, China, pp.258-273; Gale et al, 2002, Population analysis of Fusarium graminearum from wheat fields in eastern China, Phytopathology, 92, 1315-1322]. Хотя разработка устойчивых культиваров или анатомически измененных разновидностей (Legzdina and Buerstmayr, 2004, Comparison of infection with Fusarium head blight and accumulation of mycotoxins in grain of hulless and covered barley, Journal of Cereal Science, 40, 61-67) мелкозерновых культур считается перспективным подходом для подавления фузариоза, культивары с высокой степенью устойчивости и идеальными агрономическими характеристиками до сих пор не разработаны (Johnston, 1994; Bushnell et al, 1998, Genetic engineering of disease resistance in cereals, Canadian Journal of Plant Pathology, 20, 137-149; Bai et al., 2000, Inheritance of resistance to Fusarium graminearum in wheat, Theoretical and Applied Genetics, 100,1-8). Генетическое разнообразие G. zeae [O'Donnell et al, 2004, Genealogical concordance between the mating type locus and seven other nuclear genes supports formal recognition of nine phylogenetically distinct species within the Fusarium graminearium clade, Fungal Genetics and Biology, 41, 600-623; McCallum et al, 2004, Barrage zone formation between vegetatively incompatible Fusarium graminearum (Gibberella zeae) isolates. Phytopathology, 94, 432-437; Walker al, 2001, Variation among isolates of Fusarium graminearum associated with Fusarium head blight in North Carolina, Plant Disease,85, 404-410; Cumagun et al, 2004, Genetic mapping of pathogenicity and aggressiveness of Gibberella zeae (Fusarium graminearum) toward wheat, Phytopathology, 94, 520-526] усиливает потенциальные проблемы, связанные с продолжительностью эффективного действия фунгицидов и устойчивых культиваров. Традиционная почвообработка полей является частично эффективной в отношении подавления образования посевного материала патогена и, следовательно, фузариоза (Miller et al, 1998, Effect of tillage practice on Fusarium head blight of wheat, Canadian Journal of Plant Pathology, 20, 95-103; Dill-Macky and Jones, 2000, The effect of previous crop residues and tillage on Fusarium head blight of wheat, Plant Disease, 84, 71-76; Pereyra et al, 2004, Survival and inoculum production of Gibberella zeae in wheat residue, Plant Disease, 88, 724-730), однако с точки зрения сохранения почв предпочтительным агротехническим приемом является минимальная почвообработка. Принимая во внимание большой радиус распространения посевного материала и разнообразие культур, способных играть роль альтернативных хозяев для данного патогена (Chongo et al, 2001, Reaction of seedling roots of 14 crop species to Fusarium graminearum from wheat head, Canadian Journal of Plant Pathology, 23, 132-137), севооборот является несостоятельным решением.
[0004] Биологический контроль фузариоза привлекает значительный интерес с середины 1990-х, и с тех пор в этой области достигнуты значительные успехи [Perondi et al., 1996, Controle microbiologico da giberela do trigo, Fitopatologia Brasiliera, 21, 243-249; Bujold et al., 2001, Effect of Microsphaeropsis sp. on the production of perithecia and ascospores of Gibberella zeae, Plant Disease, 85, 977-984; Schisler et al., 2002, Biological control of Fusarium head blight of wheat and deoxynivalenol levels in grain via use of microbial antagonists, in Mycotoxins and Food Safety (DeVRIES, J.W., TRUCKSESS, M.W. & JACKSON, L.S., Eds.). Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, pp.53-69; da Luz et al, 2003, Biological control of Fusarium graminearum, in Fusarium head blight of wheat and barley (LEONARD, K.J. & BUSHNELL, W.R., Eds.) APS Press, St. Paul, MN, 381-394; Gilbert & Fernando. 2004, Epidemiology and biological control of Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Canadian Journal of Plant Pathology, 26, 1-9]. Общественное признание, совместимость с другими мерами борьбы с данным заболеванием и продолжительность действия являются привлекательными факторами, поддерживающими стратегию разработки средств биологического контроля фузариоза.
[0005] Schisler et al. (патент США №6562337) описали выделение четырех дрожжевых и одной бактериальной культуры, являвшихся эффективными антагонистами, способными подавлять фузариоз. Эти микроорганизмы, полученные из пыльников зерновых, включали дрожжевой штамм Cryptococcus flavescens ОН 182.9 (первоначально классифицированный как С.nodaensis), депонированный в Коллекции культур Службы сельскохозяйственных исследований США (NRRL) под учетным номером депонирования NRRL Y-30216. Недавно Schisler et al. (2006, Selection and evaluation of the potential of choline-metabolizing microbial strains to reduce Fusarium head blight, Biological Control, 39,497-506) описали выбор холинутилизирующих штаммов микроорганизмов в качестве агентов биологического контроля фузариоза.
[0006] Хотя меры, направленные на разработку агентов биологического контроля фузариоза, являются эффективными, разработка и использование химических фунгицидов остается важным инструментом в арсенале средств борьбы с фузариозом злаков. В последнее время для борьбы с фузариозом пшеницы во время цветения наиболее часто используют химический фунгицид протиоконазол.
[0007] В то же время несмотря на эти и другие достижения остается потребность в усовершенствованных микроорганизмах для биологического контроля фузариоза.
Сущность изобретения
[0008] Авторы настоящего изобретения открыли новые штаммы Cryptococcus flavescens, являющиеся эффективными антагонистами F. graminearum. Эти микроорганизмы являются эффективным средством подавления и контроля фузариоза злаков, в частности пшеницы и ячменя. Штаммы согласно изобретению представляют собой устойчивые к протиоконазолу варианты ранее описанного C.flavescens OH 182.9 (NRRL Y-30216). Более того, эти устойчивые к протиоконазолу варианты, как ни удивительно, демонстрируют существенно повышенную эффективность против F.graminearum по сравнению с исходным штаммом ОН 182.9.
[0009] В соответствии с этими данными целью настоящего изобретения является представление новых штаммов микроорганизмов, подавляющих размножение F.graminearum в колосьях пшеницы и ячменя.
[0010] Еще одной целью настоящего изобретения является представление новых штаммов микроорганизмов, эффективно подавляющих F.graminearum в колосьях пшеницы и ячменя, а также обладающих устойчивостью к действию фунгицида протиоконазола.
[0011] Дополнительной целью настоящего изобретения является представление новых штаммов микроорганизмов, являющихся эффективным средством контроля F.graminearum в колосьях пшеницы и ячменя, которые можно использовать вместе с фунгицидом протиоконазолом и его производными.
[0012] Эта и другие цели настоящего изобретения очевидны из следующего описания.
Депонирование биологического материала
[0013] Два штамма Cryptococcus flavescens, устойчивых к протиоконазолу, OH 182.9 вариант 3C и OH 182.9 вариант 4С, депонировали 21 мая 2010 г., в соответствии с положениями Будапештского договора, в Коллекции культур Службы сельскохозяйственных исследований США (NRRL), 1815 Н.Юниверсити-стрит, Пеория, штат Иллинойс, 61604, США, с присвоением учетных номеров депонирования NRRL Y-50378 и NRRL Y-50379, соответственно. Эти штаммы представляют собой дрожжи, обладающие морфологическими и культуральными свойствами, характерными для Cryptococcus flavescens; их идентичность подтверждена секвенированием доменов D1/D2 гена 26S рРНК и областей ITS 1+2 гена рРНК с использованием стандартных методик (Okoli etal, 2006, Cryptotrichosporon anacardii gen. nov., sp.nov., a new trichosporonoid capsulate basidiomycetous yeast from Nigeria that is able to form melanin on niger seed agar. FEMS Yeast Res, 7:339-350). Филогенетическое древо сконструировали с помощью методики объединения соседних пар с моделью некорректированной ('р') замены, промежутки при выравнивании обрабатывали как пропущенные символы, все символы обрабатывали как неупорядоченные и обладающие одинаковым весом. Значения бутстрэпов вычисляли на основе 100 повторов.
Подробное описание изобретения
[0014] Следует понимать, что для целей настоящего изобретения предполагают, что использование термина Fusarium включает как половую (телеоморфную), так и бесполую (анаморфную) стадию развития этого организма, также называемые совершенной и несовершенной стадиями, соответственно. Например, анаморфная стадия Gibberella zeae известна как Fusarium graminearum - возбудитель фузариоза. Это заболевание возникает в результате засева цветка или колоса (также называемого соплодием) конидиями, образованными несовершенной формой, или аскоспорами, образованными совершенной формой этого гриба, причем заражение колоса следует за событием засева.
[0015] Выражение "эффективный антагонист", используемое в настоящем документе по отношению к микроорганизму, означает тот факт, что штамм, о котором идет речь, демонстрирует степень ингибирования фузариоза, статистически значимо превышающую этот показатель для необработанного контроля.
[0016] Термин "злаки" или "зерновые" в настоящем описании означает любой вид злаков, в норме подверженный фузариозу. Сообщалось, что злаки, подверженные фузариозу, включают пшеницу, ячмень, овес и тритикале, хотя пшеница и ячмень представляют собой те две культуры, по отношению к которым данное заболевание представляет собой существенную экономическую проблему. Любой из этих злаков может являться видом-мишенью для контроля фузариоза.
[0017] F.graminearum заражает главным образом колосья (соцветия или соплодия) злаков, начиная с периода цветения до стадии мягкой восковой спелости развития колоса. Проросшие конидии или аскоспоры F. graminearum проникают в пыльники и связанные с ними ткани, инициируя заражение хозяина и развитие симптомов фузариоза.
[0018] Антагонисты F.graminearum в соответствии с настоящим изобретением представляют собой варианты штаммов, происходящие от Cryptococcus flavescens OH 182.9 (NRRL Y-30216, в прошлом идентифицированного как С.nodaensis), описанного ранее в патенте США №6562337, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Хотя C.flavescens OH 182.9 эффективно подавляет фузариоз злаков, он, к сожалению, является чувствительным к фунгициду протиоконазолу даже в низких концентрациях. Эта чувствительность ограничивает применение C.flavescens против фузариоза на полях, которые также обрабатывают или будут обрабатывать протиоконазолом. Авторы изобретения обнаружили, что можно получить варианты или мутанты C.flavescens OH 182.9, обладающие существенно большей устойчивостью к протиоконазолу (способные расти в присутствии протиоконазола), чем исходный штамм OH 182.9. Более того, авторы обнаружили, что по меньшей мере некоторые из этих устойчивых к протиоконазолу штаммов являются эффективными антагонистами F.graminearum и обладают существенно большей эффективностью против фузариоза, чем исходный штамм C.avescens ОOH 182.9.
[0019] Устойчивые к протиоконазолу штаммы согласно изобретению получали путем продолжительной серии культивирований, при которых дрожжи подвергали воздействию увеличивающихся концентраций протиоконазола. В соответствии с подробным описанием в разделе Примера, исходный штамм C.flavescens OH 182.9 культивировали в питательной среде, содержащей по меньшей мере от следовых концентраций до приблизительно 4 м.д. протиоконазола, предпочтительно приблизительно 1 м.д. протиоконазола; штаммы, демонстрировавшие рост, отбирали для культивирования при более высоких концентрациях протиоконазола. Этот процесс повторяли, культивируя выбранные штаммы в присутствии постепенно нарастающих концентраций фунгицида, в конечном итоге выделяя штаммы, способные расти в питательной среде, содержащей по меньшей мере от приблизительно 2 м.д. до приблизительно 10 м.д. протиоконазола, предпочтительно 5 м.д. протиоконазола.
4
6
5
7
8
[0020] Выделенные штаммы C.flavescens, устойчивые к протиоконазолу, в дальнейшем испытывали на эффективность в отношении снижения тяжести фузариоза желательного злака, предпочтительно пшеницы. Вкратце, варианты, устойчивые к протиоконазолу, пересевали в ходе биопробы на растениях, при которой клетки дрожжей вносили в колосья злаков, засеянные конидиями F.graminearum. В одном из предпочтительных вариантов реализации F.graminearum получали на плотной ростовой среде, а уровень собранного посевного материала должен был находиться в пределах порядка 10-10 конидий/мл, предпочтительно приблизительно 10 конидий/мл водной суспензии. Клетки дрожжей-антагонистов, устойчивых к протиоконазолу, вносили в среде или подходящем буфере в концентрации приблизительно 10-10 КОЕ/мл. В одном из вариантов реализации изобретения конидии F.graminearum и клетки тестируемого штамма объединяли в слабом фосфатном буфере, а для засева колосьев растений использовали приблизительно 10 мкл этой суспензии. Затем растения культивировали в условиях приблизительно 100% относительной влажности, благоприятных для грибной инфекции, в течение приблизительно 3 суток. Спустя промежуток времени, достаточный для развития заметных признаков заболевания (обычно по меньшей мере около 2 недель после засева), те варианты дрожжей, использованных для обработки колосьев, которые вызвали уменьшение видимых симптомов фузариоза, отбирали для дальнейшей оценки.
[0021] Варианты дрожжей, устойчивые к протиоконазолу, отобранные в ходе вышеописанной биопробы па растениях, необязательно подвергали второй биопробе на колосьях растений, сходной с первой, но выполненной в большем количестве повторов. Дрожжи вновь выращивали на подходящей среде до наработки их количества, достаточного для использования в ходе биопробы. Однако в ходе этой второй биопробы на растениях было предпочтительно выращивать штаммы в жидкой культуре, поскольку такой подход широко используется в промышленности, и антагонисты должны обладать биологической эффективностью при выращивании в условиях жидкой культуры. Среду, содержащую клетки отдельных штаммов и суспензию конидий F.graminearum, использовали для засева колосьев согласно вышеприведенному описанию. Клетки и суспензию конидий можно было предварительно объединить перед засевом. Как и в первой биопробе на растениях, те варианты дрожжей, использованных для обработки колосьев, которые вызвали уменьшение видимых симптомов фузариоза, отбирали в качестве потенциальных антагонистов.
[0022] Подтвердить эффективность антагониста в отношении контроля F.graminearum можно в ходе тепличных опытов в увеличенном масштабе или полевых исследований, в которых цветущие растения обрабатывают клетками тестируемых штаммов до, во время или после засева конидиями F.graminearum. Обработку растений можно выполнять так же, как при настоящем применении в полевых условиях.
[0023] Авторы определили, что устойчивые к протиоконазолу варианты OH 182.9 превосходили штамм-предшественник дикого типа 182.9, если в ходе тепличных опытов или полевых испытаний на пшенице при сходной методике выращивания клеток предшественника и варианта в жидкой культуре варианты, устойчивые к протиоконазолу, снижали симптомы тяжести заболевания по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 25% сильнее по сравнению со штаммом-предшественником. Тяжесть заболевания определяли, рассчитывая среднее процентное соотношение площади поверхности отдельных колосьев пшеницы, на которой проявлялись симптомы инфекции F.graminearum.
[0024] С помощью вышеупомянутого способа авторы изобретения выделили два новых штамма, устойчивых к протиоконазолу и являющихся эффективными антагонистами фузариоза: Cryptococcus flavescens, ОН 182.9 вариант 3C и OH 182.9 вариант 4С. Предполагается, что этот метод можно воспроизводить с целью выделения дополнительных вариантов C.flavescens OH 182.9, устойчивых к протиоконазолу и обладающих существенно большей эффективностью в отношении подавления фузариоза злаков.
[0025] Варианты C.flavescens OH 182.9, устойчивые к протиоконазолу, обычно растут в аэробных жидких культурах, содержащих источники углерода, азота и неорганические соли, усваиваемые микроорганизмом и способствующие эффективному росту клеток. Предпочтительными источниками углерода являются гексозы, например глюкоза, но их можно замещать другими усваиваемыми источниками, например аминокислотами. В качестве источников азота в процессе роста можно использовать многие неорганические и белковоподобные вещества. Предпочтительными источниками азота являются аминокислоты и мочевина; другие источники азота включают газообразный аммиак, неорганические соли нитратов и аммиака, витамины, пурины, пиримидины, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, протеозопептон, соевую муку, гидролизаты казеина, фильтрат барды и т.п. Неорганические вещества, которые можно включать в состав питательной среды, включают стандартные соли, способные высвобождать ионы кальция, цинка, железа, марганца, магния, меди, кобальта, калия, натрия, а также молибдатные, фосфатные, сульфатные, хлоридные, боратные и т.п. ионы.
[0026] Рост клеток дрожжей согласно изобретению можно осуществить при температурах между 1 и 36°C, причем диапазон предпочтительных температур составляет 15-30°C. pH питательной среды можно менять от 4 до 9, однако предпочтительным рабочим диапазоном является область pH 6-8. Обычно максимальный выход клеток наблюдают в промежуток времени 20-72 часа после засева.
[0027] В соответствии с подробным описанием, приведенным далее, контроль фузариоза можно осуществлять путем нанесения одного или нескольких вариантов C.flavescens OH 182.9, устойчивых к протиоконазолу, на колос (также называемый соплодием) злака. В настоящем описании термины "колос" или "соплодие" относятся к колосу, содержащему семена или зародыши семян. Антагонисты наносят в количестве, эффективно снижающем уровень развития фузариоза по сравнению с необработанным контролем.
[0028] Хотя вышеупомянутые варианты, устойчивые к протиоконазолу, являются эффективными при использовании по отдельности, в необязательном, но предпочтительном варианте реализации их используют в комбинации с другими известными химическими или биологическими агентами для контроля фузариоза. Как указано выше, благодаря устойчивости к протиоконазолу эти варианты можно использовать в комбинации с протиоконазолом или его производными. В качестве альтернативы, эти варианты можно наносить на злаки, которые отдельно обработаны или будут обработаны протиоконазолом или его производными. Для использования в рамках настоящего изобретения подходят многие другие агенты биологического контроля, включающие агенты, описанные в публикациях Perondi et al, 1996, ibid; Bujold et al, 2001, ibid; Schisler et al., 2002, ibid; da Luz et al, 2003, ibid; Gilbert & Fernando, 2004, ibid; Schisler et al, патенты США №№6562337 и 6312940 и патентная заявка США №11/640,091, поданная 15 декабря 2006 г.; содержание всех этих источников включено в настоящий документ посредством ссылок. Предпочтительным является использование в комбинации с микробными антагонистами, описанными Schisler в патентах США и заявке, находящейся на стадии рассмотрения, а именно, Bacillus sp. (NRRL B-30210), Bacillus sp. (NRRL B-30211), Torula aurea (недавно переименован в Cryptococcus aureus) (NRRL Y-30213), неидентифицированными дрожжами (NRRL Y-30214), Bacillus sp. (NRRL B-30212) и Torula sp. (недавно переименован в Cryptococcus aureus) (NKRL Y-30215). Эти дополнительные антагонисты можно применять вместе с антагонистами согласно изобретению, например, в смеси, либо по отдельности, либо в разное время.
[0029] Варианты согласно изобретению, устойчивые к протиоконазолу, можно наносить на поверхность колосьев злаков в соответствии с любым общепринятым способом. Например, их можно наносить в виде водного спрея, смачиваемого порошка или тонкодисперсного порошка. Составы, разработанные для этих способов нанесения, обычно включают подходящий жидкий или твердый агрономически приемлемый носитель вместе с другими адъювантами, например увлажнителями, липкими веществами и т.п. Крахмал, полисахариды, альгинат натрия, целлюлозу и т.д. часто используют в таких составах в качестве носителей и липких веществ.
3
10
6
9
6
9
[0030] Выражения "эффективное количество" и "подавляющее количество" используют в настоящем документе по отношению к такому количеству антагониста, которое при подходящих условиях обработки в соответствии с описанием в настоящем документе является достаточным для снижения уровня заболевания по сравнению с уровнем, наблюдаемым для контроля, не подвергавшегося обработке. Фактическую норму внесения жидкого состава обычно варьируют от минимального значения, приблизительно равного 1×10, до приблизительно 1×10 жизнеспособных клеток/мл, предпочтительно от приблизительно 1×10 до приблизительно 5×10 жизнеспособных клеток/мл. При большинстве условий штаммы согласно изобретению, описанные ниже в примере, должны быть наиболее эффективны при норме внесения в диапазоне от приблизительно 1×10 до 1 х 10 жизнеспособных клеток/мл, исходя из способа внесения, позволяющего достичь практически однородного контакта по меньшей мере с 50% поверхности колоса пшеницы. Если антагонисты используют в виде твердого препарата, норму внесения следует устанавливать так, чтобы она обеспечивала нанесение сопоставимого количества жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности колоса злака по сравнению с количеством, получаемым при использовании вышеупомянутых норм внесения жидкого препарата.
[0031] Предполагают, что диапазон температур, при которых антагонисты являются эффективными, должен составлять от приблизительно 5°C до приблизительно 35°C. Предпочтительный температурный диапазон составляет 15-30°C, а оптимальный диапазон считают равным 18-28°C.
[0032] Антагонисты теоретически можно наносить на колосья в любое время развития зерновых после фазы трубкования и до фазы твердой спелости. Колос злаков восприимчив к инфекции F.graminearum в процессе формирования зерна только с начала цветения (пыления) до фазы мягкой восковой спелости. Таким образом, наилучшим временем для внесения агентов биологического контроля должен являться интервал от времени, непосредственно предшествующего цветению, до фазы мягкой восковой спелости. Нанесение антагонистов на колосья до цветения может позволить антагонистам колонизировать колосья пшеницы до того, как они станут восприимчивы к инфекции.
Кроме того, антагонисты должны быть правильно расположены для колонизации и защиты пыльников, как только они выйдут из цветков. В то же время ожидается, что антагонисты должны сохранять эффективность при их нанесении после начала цветения, но до наступления фазы твердой спелости. В то же время предполагают, что длительные задержки могут снизить эффективность обработки в зависимости от способов изготовления и нанесения препаратов клеток.
[0033] Следующий пример предназначен лишь для дополнительного пояснения настоящего изобретения и не предназначен для ограничения рамок изобретения, определенных формулой изобретения.
Пример 1
[0034] Для получения устойчивых к протиоконазолу вариантов антагониста фузариоза - Cryptococcus flavescens OH 182.9 (NRRL Y-30216) - чистые культуры этого штамма высевали на 1/5-разбавленный триптический соевый агар (TSBA) с исходной культуры, хранившейся с 10% глицерином при -80°C. Спустя 24 часа роста при 25°C клетки переносили в 10 мл 1/5-разбавлениого триптического соевого бульона (TSB), содержавшего 1 м.д. фунгицида протиоконазола (РТС) в 50-мл колбы Эрленмейера, получая суспензию с исходной оптической плотностью (А620), приблизительно равной 0,100. Колбы ставили на качалку при 250 об/мин и пересевали на чашки после 5 суток инкубирования при 2°C на 1/5 TSBA+1 м.д. РТС. После инкубирования при 25°C в течение нескольких суток чашки содержали несколько колоний, достигавших большего размера, чем большинство колоний, полученных на среде 1/5 TSBA+1 м.д. РТС. Четыре из этих колоний отобрали и высеяли штрихом для проверки чистоты на 1/5 TSBA+1 м.д. РТС. Затем процесс роста на жидкой среде этих 4 вариантов, предположительно устойчивых к РТС, повторяли 4-5 раз на жидких и твердых средах в присутствии концентраций РТС, постепенно возрастающих до конечной концентрации, равной 5 м.д.; крупнейшую колонию, полученную для каждой из этих 4 отдельных вариантных линий, выбирали для начала следующего цикла роста в жидкой культуре, содержащей несколько большую концентрацию РТС.
4
7
[0035] Каждую из этих 4 вариантных линий затем оценивали на эквивалентность штамму-предшественнику ОН 182.9 дикого типа на основе эффективности подавления фузариоза пшеницы в тепличных опытах следующим образом. Для выполнения биопроб на растениях стекловидную краснозерную яровую пшеницу (культивар Norm) выращивали в камерах для выращивания растений на тепличных стеллажах. Биомассу штамма-предшественника ОН 182.9 и устойчивых к РТС вариантов 1С, 3C, 4С и 5С получали в 125-мл колбах Эрленмейера без отбойников, содержавших 25 мл жидкой среды (SDCL, Slininger et al. 2003. Postharvest biological control of potato sprouting by Fusarium dry rot suppressive bacteria. Biocontrol Science and Technology. 13:477-494), которые инкубировали на качалке с размахом 2,5 см при 250 об/мин и 25°C в течение 72 ч, и разбавляли перед использованием dH20 до концентрации 1/4. Инокулят, содержавший конидии возбудителя фузариоза - штамма Gibberella zeae Z-3639, получали на осветленном сусло-агаре V8 в течение 7 суток при флуоресцентном освещении по 12 ч/сут и 24°C. Клетки OH 182.9 наносили в виде аэрозоля во время цветения пшеницы на приблизительно 14 колосьев пшеницы за сеанс обработки, после чего немедленно наносили суспензию конидий в виде аэрозоля (3×10 конидий/мл). Колосья, обработанные водой после нанесения суспензии конидий, использовали в качестве контроля "только патоген". Растения помещали в камеры с повышенной влажностью на 3 суток, спустя 16 суток оценивали тяжесть заболевания и скорость роста в логарифмической фазе в 1/5 TSB, не содержавшем РТС. Тяжесть заболевания определяли, рассчитывая среднее процентное соотношение площади поверхности отдельных колосьев пшеницы, на которой проявлялись симптомы инфекции F.graminearum. Вариантные линии также сравнивали по общему количеству колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл), достигаемому при росте на среде 1/5 TSB+5 м.д. РТС. Штамм-предшественник OH 182.9 не рос на этой среде, в то время как все варианты OH 182.9, устойчивые к РТС, продуцировали более 5×10 КОЕ/мл.
[0036] Варианты C.flavescens OH 182.9 3C и 4С, устойчивые к протиоконазолу, демонстрировали значительно большую эффективность, чем исходный штамм OH 182.9, и были сохранены для дальнейшей работы. Результаты представлены в Таблицах 1-3.
[0037] Следует понимать, что вышеупомянутое подробное описание приведено лишь для пояснительных целей и что в него можно внести модификации и изменения без выхода за рамки настоящего изобретения.
Таблица 1
Влияние дрожжей-антагонистов OH 182.9, варианта 4С OH 182.9, устойчивого к протиоконазолу, и их комбинаций на фузариоз в ходе тепличных испытаний<sup>a, b</sup>
Культивар пшеницы
Norm
Обработка<sup>c</sup>
ТЗ (%)
Изменение по сравнению с контролем (%)
43 (%)
Изменение по сравнению с контролем (%)
100 м.з. (г)
Изменение по сравнению с контролем, %
Необработанный контроль
42<sup>A</sup>
0
54<sup>А</sup>
0
3,0<sup>B</sup>
0
OH 182.9 дикого типа
27<sup>AB</sup>
-36
38<sup>АВ</sup>
-30
3,6<sup>A</sup>
20
OH 182.9 вариант 4С
7<sup>CD</sup>
-83
16<sup>BC</sup>
-70
4,1<sup>A</sup>
37
OH 182.9 д.т.+Proline
1<sup>D</sup>
-98
8<sup>C</sup>
-85
4,3<sup>A</sup>
37
OH 182.9 4С+Proline
0<sup>D</sup>
-100
0<sup>C</sup>
-100
4,1<sup>A</sup>
37
Только Proline
0<sup>D</sup>
-100
0<sup>C</sup>
-100
4,0<sup>A</sup>
33
Значение Р
0,001
0,001
0,001
<sup>a</sup>В пределах столбца средние значения, после которых не поставлены одинаковые буквы, являются значимо различными (P≤0,05, разделение средних с поправкой Бонферрони)
<sup>b</sup>ТЗ=тяжесть заболевания, ЧЗ=частота заболевания, 100 м.з.=масса зерна*100
<sup>c</sup>Proline=коммерческий препарат протиоконазола, вносимый в количестве, эквивалентном 5 унций/акр, OH 182.9 д.т.=штамм OH 182.9 дикого типа
Таблица 2
Результаты полевых испытаний 2008 г. в Пеории, штат Иллинойс, США: Влияние протиоконазола, дрожжей-антагонистов ОH 182.9, вариантов 3C 4С OH 182.9, устойчивых к протиоконазолу, и их комбинаций на параметры заболевания культивара озимой пшеницы Pioneer Brand 2545 фузариозома<sup>a, b</sup>
Культивар пшеницы
Pioneer Brand 2545
ТЗ (%)
43 (%)
100 м.з. (г)
DON (м.д.)
Обработка<sup>с</sup>
Необработанный контроль
8,0<sup>А</sup>
41,3<sup>A</sup>
3,07<sup>DE</sup>
11,8<sup>A</sup>
Proline (5 унций/акр)
l,5<sup>DEF</sup>
8,0<sup>F</sup>
3,57<sup>AB</sup>
3,9<sup>BC</sup>
ОН 182.9 д.т.
7,6<sup>АВ</sup>
31,2<sup>ABC</sup>
2,99<sup>E</sup>
13,6<sup>A</sup>
ОН 182.9 вариант ЗС
5,3<sup>АВС</sup>
29,6<sup>BCD</sup>
3,26<sup>BCDE</sup>
10,4<sup>AB</sup>
ОН 182.9 вариант 4С
4,6<sup>BCD</sup>
24,5<sup>CD</sup>
3,13<sup>CDE</sup>
7,0<sup>ABC</sup>
ОН 182.9 3С+Proline
1,4<sup>DEF</sup>
8,8<sup>F</sup>
3,49<sup>ABC</sup>
2,3<sup>C</sup>
ОН 182.9 4С+Proline
1,6<sup>DEF</sup>
10,7<sup>EF</sup>
3)47<sup>ABC</sup>
2,4<sup>C</sup>
Proline+д.т. (задержка 24 ч)
2,3<sup>CDEF</sup>
10,9<sup>EF</sup>
3,64<sup>A</sup>
2,6<sup>C</sup>
Proline+/С (задержка 24
0,6<sup>F</sup>
4,5<sup>F</sup>
3,43<sup>ABCD</sup>
1,1<sup>С</sup>
Значение P
0,001
0,001
0,001
0,001
<sup>a</sup>B пределах столбца средние значения, после которых не поставлены одинаковые буквы, являются значимо различными (P≤0,05, разделение средних с поправкой Бонферрони)
<sup>b</sup>ТЗ=тяжесть заболевания, ЧЗ=частота заболевания, 100 м.з.=масса зерна*100, DON=дезоксиниваленол
<sup>c</sup>Proline=коммерческий препарат протиоконазола, вносимый в количестве, эквивалентном 5 унций/акр, OH 182.9 д.т.=штамм OH 182.9 дикого типа
Таблица 3
Результаты полевых испытаний 2008 г. в Вустере, штат Огайо, США: Влияние протиоконазола, дрожжей-антагонистов OH 182.9, вариантов 3C и 4С OH 182.9, устойчивых к протиоконазолу, и их комбинаций на параметры заболевания культивара озимой пшеницы Pioneer Brand 2545 фузариозом<sup>a,b</sup>
Культивар пшеницы
Pioneer Brand 2545
Обработка<sup>c</sup>
ТЗ (%)
43 (%)
ЗПФ (%)
Урожай бушель/акр
Масса, фунтов/бушель
DON (м.д.)
Необработанный контроль
11,9<sup>A</sup>
32,4<sup>А</sup>
42,5<sup>А</sup>
47,4<sup>C</sup>
47,3<sup>D</sup>
8,1<sup>А</sup>
Proline (5 унций/акр)
3,5<sup>ВС</sup>
11,3<sup>BC</sup>
12,8<sup>АВС</sup>
57,8<sup>АВ</sup>
51,4<sup>A-D</sup>
4,0<sup>АВ</sup>
ОН 182.9 д.т.
12,6<sup>А</sup>
28,0<sup>А</sup>
29,5<sup>АВС</sup>
49,4<sup>BC</sup>
49,0<sup>A-D</sup>
6,8<sup>АВ</sup>
ОН 182.9 вариант ЗС
9,4<sup>А</sup>
24,3<sup>АВ</sup>
25,5<sup>АВС</sup>
49,8<sup>АВС</sup>
47,7<sup>CD</sup>
6,7<sup>АВ</sup>
ОН 182.9 вариант 4С
9,0<sup>АВ</sup>
22,9<sup>АВ</sup>
17,4<sup>ABC</sup>
50,4<sup>АВС</sup>
48,2<sup>BCD</sup>
6,6<sup>АВ</sup>
ОН 182.9 3C+Proline
2,5<sup>C</sup>
8,2<sup>ВС</sup>
6,3<sup>BC</sup>
55,3<sup>АВС</sup>
52,4<sup>АВ</sup>
4,2<sup>AB</sup>
ОН 182.9 4С+Proline
2,8<sup>C</sup>
8,2<sup>ВС</sup>
12,5<sup>ВС</sup>
58,5<sup>А</sup>
52,6<sup>А</sup>
3,5<sup>B</sup>
Proline+д.т. (задержка 24 ч)
2,6<sup>C</sup>
8,2<sup>ВС</sup>
15,7<sup>АВС</sup>
55,6<sup>ABC</sup>
52,6<sup>А</sup>
3,9<sup>АВ</sup>
Proline+3C (задержка 24 ч)
2,3<sup>C</sup>
8,4<sup>ВС</sup>
2,5<sup>C</sup>
57,1<sup>AB</sup>
52,2<sup>AB</sup>
3,5<sup>B</sup>
Значение Р
0,001
0,001
0,001
0,001
0,001
0,001
<sup>a</sup>В пределах столбца средние значения, после которых не поставлены одинаковые буквы, являются значимо различными (P<0,05, разделение средних с поправкой Бонферрони)
<sup>b</sup>ТЗ=тяжесть заболевания, ЧЗ=частота заболевания, ЗПФ=зерна, поврежденные фузариозом, Урожай=выражен в бушелях на акр, Масса=масса испытываемого зерна, выраженная в фунтах на бушель, DON=дезоксиниваленол
<sup>c</sup>Proline=коммерческий препарат протиоконазола, вносимый в количестве, эквивалентном 5 унций/акр, OH 182.9 д.т.=штамм OIH 182.9 дикого типа
ДАННЫЕ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ ИЛИ ДРУГОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ
Дата депонирования: 21 мая 2010 г.
Номер доступа: NRRL Y-50378
NRRL Y-50379
Название и адрес депозитного учрсяедения:
Коллекция культур Службы сельскохозяйственных исследований США (NRRL)
1815 Север-Юниверсити-стрит
Пеория, штат Иллинойс 61604
Соединенные Штаты Америки
Дата депонирования: 07 September 1999
Номер доступа: NRRLB-30210
NRRLB-30211
NRRLB-30212
NRRLY-30213
NRRLY-30214
NRRLY-30215
NRRL Y-30236
Название и адрес депозитного учреждения:
Коллекция культур Службы сельскохозяйственных исследований США (NRRL)
1815 Север-Юниверсити-стрит
Пеория, штат Иллинойс 61604
Соединенные Штаты Америки