Изменение жирнокислотного состава ДНК-связанных липидов селезенки крыс при фолат-индуцированной гипергомоцистеинемии как результат нестабильности геномной ДНК

нокислотном составе отмечается уже при манифестном течении заболевания, когда отсутствуют клинические признаки поражения миокарда. Более выраженные изменения наблюдаются у пациентов с диастолической дисфункцией левого желудочка. Достижение эутиреоидного состояния не приводит к нормализации показателей, что оказывает, вероятно, неблагоприятный эффект на дальнейшее течение заболевания и ведет к прогрессированию поражения миокарда при тиреотоксикозе.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бакшеева Е.В, Говорин А.В., Просяник В.И. и др. // Кардиоваск. тер. и профилакт. - Томск, 2004. - № 4. -С.44.

2. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. - Екатеринбург, 1994.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М., 1990.

4. Говорин А.В., Филев А.П. Гипертоническое сердце: механизмы развития, диагностика, применение ß-адреноблокаторов. - Чита, 2006.

5. Ольбинская Л.И., Литвицкий П.Ф. Коронарная и миокардиальная недостаточность. - М., 1986.

6. Опи Л.Х. Физиология и патофизиология сердца./ Под. ред. Н. Сперелакиса. - М., 1990. - Т.2.- С. 7-63.

7. Родионова Т.И., Костенко М.А. // Пробл. эндокринол. - 2003. - № 5. - С. 42-45.

8. Синяк К.М., Оргель М.Я., Крук В.И. // Лаб. дело. -1976. - № 1. - С. 37-41.

9. Старкова Н.Т. Клиническая эндокринология: руководство (3-е изд.). СПб, 2002.

10. Титов В. Н. // Кардиология. - 1998. - № 1. -С. 43-49.

11. Тишенина Р.С., Филоненко Т.А., Древаль А.В. и др. // Пробл. эндокринол. - 2000. - № 6. - С. 26 - 28.

12. ТуракуловЯ.Х, Абидов А.А., РахимджановаМ.Т. // Вопр. мед. химии. - 1973. - № 11. - C. 212 - 214.

13. Шульгина В.Ю., Фадеев В.В., Мельниченко Г.А. // Клин. экспер. тиреоидол. - 2006. - № 1(4). - С. 21-31.

14. Olivieri O., Lombardi S., Russo C. et al. // J. Hypertens. - 1998. - Vol. 16. - P. 585 - 592.

Поступила 03.05.07.

COMPOSITION OF ERYTHROCYTE

MEMBRANE LIPID ACIDS IN PATIENTS

WITH LEFT VENTRICULAR DIASTOLIC DYSFUNCTION WITH THYROTOXICOSIS

O.V. Serebryakova, A.V. Govorin,

V.I. Prosyanik, E.V. Baksheeva

Summary

Acid composition of erythrocyte membrane li pids in patients with thyrotoxicosis and left ventricular diastolic dysfunction was studied. An increase in the sum of saturated fatty acids and decrease in unsaturated , mostly fraction of polyene fatty acids, were found. The biggest decline was noted in the level of arachidonic acid. The usage of traditional thyrostatic therapy did not normalize the studied indexes.

УДК 577.164.175:616.411:577.113.7:577.115.3

ИЗМЕНЕНИЕ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ДНК-СВЯЗАННЫХ ЛИПИДОВ СЕЛЕЗЕНКИ КРЫС ПРИ ФОЛАТ-ИНДУЦИРОВАННОЙ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ КАК РЕЗУЛЬТАТ НЕСТАБИЛЬНОСТИ

ГЕНОМНОЙ ДНК

Р. И. Жданов, А. С. Крылов, Н. Б. Стражевская, А. С. Шмырина,

И. И. Салафутдинов, М. Я. Ибрагимова, А. Краус, В. Лоренц

НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (директор - акад. РАМН, проф. А.А. Кубатиев), г. Москва, Институт химии пищи и окружающей среды, Университет им. М. Лютера, г. Халле (Заале), Германия

Гипергомоцистеинемия является следствием нарушения метаболизма метионин / цистеин и вызывается дефицитом витаминов В6, В12 и фолата. Гомоцистеин (ГЦ) — продукт естественной деградации незаменимой аминокислоты метионина, обладает рядом токсических свойств. Высокий уровень ГЦ в сыворотке крови — это важный и независимый фактор риска развития атеросклероза, тромбоза вен и других сердечно-сосудистых заболеваний [12], а также при

таких нейродегенеративных нарушениях, как болезнь Альцгеймера [9] и Паркинсона [5]. Предполагается, что ГЦ может действовать как прооксидант, так как метаболизм и аутоокисление ГЦ идут параллельно при образовании свободных радикалов кислорода [4].

Было обнаружено [7], что образование микроядер и индекс генетических повреждений в лимфоцитах человека прямо коррелируют с уровнем ГЦ плазмы, но обрат-

но пропорциональны уровню витамина В12 в плазме. Таким образом, для внутриядерных повреждений требуется определенная комбинация конкурирующих агентов, т. е. увеличение ГЦ и уменьшение уровня витамина В12 или фолата. Последнее ставит под вопрос гипотезу о влиянии ГЦ как единственного агента на регуляторные механизмы окислительного стресса и апоптоза, в основе которых лежит гипергомоцистеин-ин-дуцированная цитотоксичность [8].

Пациенты с гипергомоцистеинемией (ГГЦ) страдают от дефицита цистатионин Р-синтазы (СББ) — транссульфурирую-щего фермента, превращающего ГЦ в цис-татионин. В 2004 г. обнаружено [10] существенное нарушение метаболизма липидов в печени и сыворотке СББ-дефицит-ных мышей (с делецией гена цистатионин Р-синтазы). В их плазме крови увеличен уровень триглицеридов, жирных кислот, но снижены концентрация холестерина, фосфолипидов и активность тиолазы — ключевого фермента Р-окисления липидов, а также активность лецитин/холестерин ацилтрансферазы. Молекулярные механизмы патогенеза ГГЦ носят сложный характер и недостаточно изучены.

В нашей работе [2] на экспериментальной модели фолат-индуцированной гипер-гомо-цистеинемии трехмесячных крыс изучались структурные параметры ДНК и состав жирных кислот фракций ДНК-связан-ных липидов печени, тимуса и селезенки. При содержании ГЦ в плазме крови, равном 31,41±8,10 мкМ/л, констатированы снижение молекулярной массы и эластовяз-кости ДНК трех органов крыс и значительный дисбаланс состава ЖК фракций ДНК-связанных липидов. Кроме того, обнаружено появление новых полиненасыщенных ЖК, из которых 4 кислоты ю-3 (18:3п3, 20:3п3, 20:5п3, 22:6п3) и четыре кислоты ю-6 (18:2п61, 18:3п6, 20:5п6, 20:4п6) могут служить биомаркерами. На основании полученных данных мы заключили, что элас-товязкость ДНК и состав ЖК двух фракций ДНК-связанных липидов в целом, их распределение по количеству (базовые, минорные, следы) и природе (насыщенные, моно- и полиненасыщенные ю-3 и ю-6) чувствительны к фолат-индуцированной гипер-гомоцистеинемии.

В настоящей работе мы повторили этот эксперимент при более длительной фолат-индуцированной гипергомоцистеинемии, т. е. на шестимесячных крысах, с целью выяснения судьбы (репарация или усиление эффекта) нарушений молекулярной и надмолекулярной структуры ДНК и дисбаланса состава ЖК фракций ДНК-связанных липидов селезенки. Для получения информации о молекулярном механизме нарушения структуры ДНК мы исследо-вали не только её молекулярную массу и эласто-вязкость, но и доступность к действию ДНКазы I и рестриктазы ЕсоШ.

Полученные результаты представлены в виде М+т и обработаны методами статистического анализа с использованием 1-критерия Стьюдента.

Стабильность геномной ДНК (ее молекулярная масса и значение эластовяз-кости) была исследована рядом стандартных физико-химических методов.

В контроле (10,4±2,3 мкМ ГЦ / л плазмы) ДНК селезенки крыс высокополимерна (175±-8х106 Да) и имеет высокую эла-стовязкость (911 ±45 дл/г), которая тканеспецифична и отражает степень супер-спирализации ДНК, но немного снижена (на 9%) по сравнению с эластовязкостью ДНК селезенки 3-месячных крыс [2]. Обнаружено, что эти важные структурные параметры ДНК селезенки снижаются при ГГЦ (33,2±6,3 мкМ ГЦ / л плазмы): эла-стовязкость и молекулярная масса были снижены на 15—18% по сравнению с контролем [2]. Фолат-индуцированная ГГЦ, возможно, индуцирует однонитевые разрывы в ДНК селезенки шестимесячных крыс, что приводит к снижению величины элас-товязкости. Обнаруженное явление вносит вклад в понимание путей релаксации суперспиралей ДНК. Влияние ГЦ на свойства геномной ДНК селезенки сохраняется на том же уровне и на модели шестимесячных крыс.

Препараты ДНК обрабатывали ДНКазой I методом трехкратных последовательных разведений последней (рис. 1). На представленной фотографии видно, что на дорожках 1-5 фермент гидролизует молекулу ДНК только на мелкие фрагменты, а на дорожках 6 и 7 образуется полный набор фрагментов с размерами от 12,0 до 0,1 т.п.о.

1234 5 б 7 Я 9

Рис. 1. Оптимизация ДНКазой I гидролиза геномной ДНК крыс в норме и при патологии. На первой дорожке наносили 0,4 единицы фермента на 0,7 мкг ДНК, инкубация 37оС, 25 минут. На каждой последующей дорожке количество фермента в 3 раза меньше, чем в предыдущей.

При дальнейшем уменьшении концентрации фермента образуются только крупные фрагменты, плохо входящие в гель. При исследовании контрольного и опытного образцов использовали соотношения ДНКаза I/ ДНК (соответствуют дорожкам 6, 7, 8 и 9).

Сравнительное титрование контрольного и опытного образцов ДНК проводили в таких же условиях, как описано выше (рис. 2). При высоких соотношениях фермент / субстрат молекула ДНК была гид-ролизована на мелкие фрагменты, поэтому на рис. 2 приведена фотография агарозного геля, начиная с 6-й дорожки. На дорожках 8 и 9 распределение фрагментов ДНК после гидролиза в контрольных и в опытных образцах существенно различается. В контрольных образцах фрагменты ДНК более крупные (от 2 до 12 килобаз) и соответственно находятся в начале дорожки. В опытных образцах фрагменты ДНК более мелкие (от 0,1 до 1,0 килобазы) и находятся в конце дорожки. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о том, что в опытном образце препарат ДНК гораздо более доступен действию ДНКазы I и, по-видимому, менее компактизован.

Аналогичный опыт был проделан с другим ферментом — рестриктазой EcoRI, и получен набор фрагментов ДНК после гидролиза контрольного и опытного образцов при различном соотношении фермент/субстрат (рис. 3). В отличие от ДНКазы I, рестриктазы менее чувствительны к "маскировке" молекул ДНК. Однако на фотографии видно, что 1 и 2-я

пары дорожек демонстрируют явную разницу между контролем и опытом: ДНК контроля не была гидролизована и не вошла в гель, а ДНК опыта подверглась гидролизу и вошла в гель. Таким образом, даже для такого "маленького" фермента как рестриктаза EcoRI, молекула ДНК из опытного образца более открыта и доступнее для гидролиза.

Таким образом, при ГГЦ происходит существенное нарушение структуры геномной ДНК селезенки крыс, о чем свидетельствуют разрывы, декомпактизация и десу-перспирализация ДНК.

Вслед за определением структурных характеристик препаратов ДНК крыс с ГГЦ мы изучили изменения в липидоме ДНК-связанных липидов в их ЖК профиле, что позволяет характеризовать степень их стабильности.

---1 12Т.Л.0.

-4-1 1.РТ.П.0. |

-«---1 Г1 I г'~ п г

Рис. 2. Сравнительное титрование контрольного и опытного образцов геномной ДНК крыс в норме и при патологии ферментом ДНКаза I. Каждая пара дорожек -это "контроль" и "опыт". На крайней правой дорожке набор маркеров ДНК.

КО кокококо М

Рис. 3. Сравнительное титрование геномной ДНК крыс в норме и при патологии рестриктазой ЕсоШ. Как и в предыдущем эксперименте, на соседних дорожках пары "контроль-опыт" титровали уменьшающимися концентрациями фермента. Для первой пары "контроль-опыт" брали 12 единиц фермента на 0,7 мкг ДНК. Далее концентрация фермента уменьшалась в 2,5 раза на каждом шаге.

Нами установлено, что среди короткоцепочечных насыщенных ЖК доминируют 12:0 (2 — 4%) и 14:0 (3 — 5%), среди длинноцепочечных — 16:0 (22 — 42%) и 18:0 (10—12%), среди длинноцепочечных нена-сы-щенных ЖК — 18:1n9c (8—10%), а минорные — 16:1 (4 — 6%) и 18:2n6c (6 — 8%). Сравнительный анализ профиля ЖК фракций ДНК-связанных липидов показал, что в норме фракция I представлена базовыми ЖК в следующем порядке в зависимости от их содержания, т. е. 16:0, 18:0, 18:1п9^ хотя несколько отличается от фракции II (16:0, 14:0, 18:0, 18:1п9^. Важно отметить, что при патологии базовые ЖК фракции I имеют несколько другой порядок — 16:0, 18:0, 18:2п9^ Вместе с тем во фракции II порядок распределения базовых ЖК одинаков и в норме и при патологии, т. е. 16:0, 18:0, 18:1п9^ Во всех вариантах (норма, опыт, I и II фракции) первой базовой ЖК является пальмитиновая (16:0). Для нормы характерно, что фракция I содержит пальмитиновой кислоты в 2 раза больше, чем фракция II, и обе фракции содержат близкое количество стеариновой (18:0) и олеиновой кислот (18:1п9^. Следовательно, в норме фракции I и II ДНК-связанных липидов селезенки крыс имеют различный профиль ЖК, что согласуется с нашими предыдущими данными [4]. Следует подчеркнуть, что значимый эффект при патологии связан только с влиянием на ЖК профиль фракции I и с уровнем определенных базовых и минорных ЖК. В опыте тестировано меньше пальмитиновой (16:0, на 30%) и появление трех новых ЖК, а именно ю-6 линоленовой (18:3п6, 10,22%) и следы 20:1 (0,06%) и 20:3п6 (0,56%) кислот. Фракция I липидов в норме и при патологии имеет один и тот же порядок распределения минорных ЖК, т. е. 18:2п6^ 16:1, 14:0. В случае фракции II порядок распределения ЖК в норме (16:1, 18:2п6^ 14:0) отличался от такового при патологии (18:2п6^ 16:1, 14:0). Важно отметить, что эффект в опыте обнаружен, как и в случае базовых ЖК, только для I фракции, т. е. увеличение на 40% концентраций миристи-новой (14:0) и пальмитолеиновой кислот (16:1). Факт увеличения минорных ЖК (14:0, 16:1) во фракции I ДНК-связанных липидов селезенки опытных крыс согласу-

ется с данными, полученными нами на модели трехмесячных крыс [2].

В норме фракция I содержит больше насЖК, чем фракция II и, наоборот, фракция I содержит меньше ненас.ЖК, чем фракция II. Однако эффект патологии обнаружен только во фракции I, при этом с отрицательным эффектом для ненас.ЖК и полиненас.ЖК. Обнаруженный дисбаланс свидетельствует о нарушении метаболизма липидов при фолат-индуцирован-ной ГГЦ.

Подводя итоги представленного выше исследования, считаем необходимым отметить, что ЖК являются сигнальными молекулами, которые участвуют в регуляции экспрессии генов, и эффект ЖК (положительный или отрицательный) зависит от степени их ненасыщенности, специфики клетки и природы гена-мишени [6]. Концентрация и состав ЖК плазмы, являясь результатом питания, могут определять патогенез, а именно возникновение ожирения, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний и рака. В связи с этим важно изучать механизмы регуляции транскрипции генов ЖК. Два главных класса ПНЖК — ю-3, ю-6, предшественники которых поступают в организм человека с пищей, имеют различное биологическое действие, и диета с наличием ю-6 ведет к развитию патологических процессов, а питание с преобладанием ю-3 ЖК, наоборот, ингибирует их. Так, диета с линолевой кислотой (18:2n6c) подавляла липогенез печени и активность синтазы ЖК, а пальмитиновая (16:0) и олеиновая (18:1n9c) не проявляли такого эффекта [3]. При изученной нами патологии кислот ю-6 значительно больше, чем кислот ю-3. В опыте фракция I сильно обогащена (в 3 раза) кислотами ю-6 (18,23%), т. е. линолевой (18:2n6c, 7,35%) и, особенно, новой линоле-новой (18:3n6, 10,22%). Таким образом, ли-нолевая и линоленовая кислоты класса ю-6 могут служить биомаркерами патологии. Полученный нами результат согласуется с данными работы М. Томпсона и Д. Кима [11], обнаруживших прямое влияние моно-ненасыщенной олеиновой (18:1n9c) и НЖК всех классов (ю-6, ю-3) на экспрессию генов, кодирующих семейство белков UCP (uncoupling protein). Белки ИСР найдены в жировой ткани селезенки, мышцах

скелета и сердца. Они участвуют в регуляции энергетических затрат при различных болезнях (сахарный диабет, сепсис, рак, ги-пертиреоидизм). Так, например, олеиновая кислота (18:1п9с) стимулирует в 2 раза активность промоторной области генов иСР2 и иСР3 вблизи сайта инициации транскрипции (42 п.о.).

В заключение отметим, что в норме (10,4±2,3 мкМ ГЦ / л плазмы) геномная ДНК селезенки крыс имела высокую молекулярную массу (175106 Да) и высокую эластовязкость (911 ±45 дл/г), что отражает степень суперспирализации ДНК. Высокое значение молекулярной массы ДНК было подтверждено также методом пульс-электрофореза.

ВЫВОДЫ

1. На модели фолат-индуцированной гипергомоцистеинемии обнаружена нестабильность геномной ДНК селезенки крыс, выражающаяся снижением значений эла-стовязкости и молекулярной массы, а также увеличением ее доступности гидролизу ДНКазой I и рестриктазой EcoRI.

2. В ЖК профиле фракций ДНК-свя-занных липидов селезенки в контроле среди 27 ЖК базовыми являются 16:0, 18:0, 18:1п9с, минорными — 14:0, 16:1, 18:2п6с, а остальные ЖК присутствуют в следовых количествах.

3. Нестабильность геномной ДНК как следствие патологии ( в нашем случае — гипергомоцистеинемии) приводит к нестабильности липидома, а именно к изменениям в ЖК профиле ДНК-связанных липидов. Эффект ГГЦ наблюдается в жирнокислотном профиле фракции I ДНК-связан-ных липидов и проявляется в изменении уровня базовых (16:0) и минорных (14:0, 16:1, 18:2п6с) ЖК, а также в появлении двух новых ю-6 ЖК (18:3п6, 20:3п6). Обнаружение последних может служить биомаркером при изучении молекулярных механизмов патогенеза, в частности фолат-ин-дуцированной гипергомоцистеинемии.

Авторы выражают благодарность академику РАМН А.А. Кубатиеву за поддержку и внимание к работе и профессору Н.А. Чурикову за помощь в определении свойств геномной ДНК. Работа поддержана грантами фонда им. А. фон Гумбольдта № V-8121/RUS/1032332 (Бонн, Германия; Р.Ж.) и 2004 FEBS Summer Fellowship № 261793 (А.Ш.).

ЛИТЕРАТУРА

1. Жданов Р.И., Кубатиев А.А. // Патогенез. - 2003. -№ 1. - С. 2-11.

2. Кубатиев А.А., Стражевская Н.Б., Шмырина А.С. и др. // Патогенез. - 2005. - № 3. - С. 59-67.

3. Сергеева М.Г., Варфоломеева А.Т. Каскад арахидоновой кислоты. - M., 2006.

4. Abdelfatah A., Ducloux D., Toubin G. et al. // Transplantation. - 2002. - Vol. 73. - P. 663-665.

5. Duan W., Ladenheim B., Culter R.G. et al. // J. Neurochem. - 2002. - Vol. 80. - P. 101-110.

6. Duplus E., Glorian M., Forest C. // J. Biol. Chem. -2000. - Vol. 270. - P. 30749-30752.

7. Fenech M. // Mutat. Res. - 1999. - Vol. 428. -P. 299-304.

8. Guilland Y.C., Favier A., Potier de Courcy G. et al. // Pathol. Biol. - 2003. - Vol. 51. - P. 101-110.

9. Miller J.W. // Nutr. Rev. - 1999. - Vol. 57. -P. 126-129.

10. Namekata K., Enokido Y., Ishii I. et al. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 52961-52969.

11. Thompson M.P., Kim D. // FEBS Letters. - 2004. -Vol. 568. - P. 4-9.

12. Verhoef P., Stampfer M.J., Buring J.E. et al. // Am. J. Epidemiol. - 1996. - Vol. 143. - P. 845-847.

Поступила 13.06.07.

CHANGES OF THE LIPID ACID COMPOSITION OF DNA-RELATED LIPIDS IN RAT SPLEEN DURING FOLAT-INDUCED HYPERHOMOCYSTINEMIA AS A RESULT OF DNA GENOMIC INSTABILITY

R.I. Zhdanov, A.S. Krylov, N.B. Strazhevskaya, A.S. Shmyrina, A.I. Salafutdinov,

M.Ya. Ibragimova, A. Kraus, B. Lorenz

Summary

In the model of folat-induced hyperhomo-cystinemia in rats, the influence of the blood plasma homocystinemia on properties of genomic DNA and the lipid profile oа DNA-associated spleen lipids was studied. These profiles can serve as biomarkers in the study of molecular mechanisms of pathogenesis, in particular folat-induced hyperhomocystinemia.