Изучение вирус-индуцированного апоптоза опухолевых клеток in vitro

ИЗУЧЕНИЕ ВИРУС-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК IN VITRO

И.Г Видяева, Л.Н. Уразова, Т.И. Кузнецова

ГУ «НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН»

В работе показана способность вакцинных штаммов вирусов осповакцины, паротита и венесуэльского энцефаломиелита индуцировать апоптоз опухолевых клеток в системе in vitro. Установлено, что вакцинный штамм вируса паротита проявляет апоптоз-индуцирующие свойства в отношении клеток эритромиелолейкоза человека К-562 в ранние сроки инкубации, а вирус ВЭЛ - в более поздние. Апоптоз-индуцирующие свойства вируса осповакцины наиболее ярко проявляются в отношении клеток аденокарциномы Эрлиха. Отсутствие индукции апоптоза клеток карциномы Эрлиха вирусом ВЭЛ может объясняться как типом и индивидуальной чувствительностью клеток к применяемым индукторам апоптоза, так и природой и индивидуальными свойствами этих агентов.

STUDY OF VIRUS-INDUCED APOPTOSIS OF TUMOR CELLS IN VITRO I.G. Vidyaeva, L.N. Urazova, T.I. Kuznetsova Oncology Research Institute, Tomsk Scientific Center of SB RAMS This review shows the ability of vaccine strains of pox vaccine, parotitis and Venezuelan encephalomyelitis viruses to induce tumor cell apoptosis in vitro. Vacine stain of parotitis virus has been found to demonstrate apoptosis-induced characteristics with respect to human erythromyeloleukosis K-562 in early, whereas Venezuelan encephalomyelitis virus (VEV) in late terms of incubation. Apoptosis-induced characteristics of pox vaccine virus are manifested most clearly in Erlich’s adenocarcinoma cells. Inability of VEV to induce apoptosis of Erlich’s carcinoma cells can be explained both by the type and individual sensitivity of cells to apoptosis inductors and by the nature and individual properties of these agents.

В настоящее время в онкологическую практику прочно входит биотерапия - новый метод, имеющий на вооружении целый арсенал различных модификаторов биологических реакций, таких как факторы роста, антитела, цитокины, вирусные агенты [12, 16]. При этом онколитиче-ским вирусам уделяется большое внимание, так как их противоопухолевое действие реализуется путем нескольких потенциальных механизмов, в первую очередь за счет прямого литического действия, возникающего в результате репликации вирусов в малигнизированных клетках [17]. Другой механизм - посреднический, при котором онколитические вирусы воздействуют на опухолевые клетки, индуцируя специфический и неспецифический противоопухолевый иммунитет [19].

В проведенных нами ранее исследованиях было показано, что вакцинные штаммы вирусов (паротита, венесуэльского энцефаломиелита (ВЭЛ) и осповакцины) вызывают торможение роста первичных опухолей, обладают высоким антиметастатическим потенциалом [3, 8]. Было установлено, что вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ, оспы, паротита вызывают различные ци-

тодеструктивные нарушения в клетках экспериментальных опухолей. Кроме того, изученные препараты оказывают стимулирующее действие на некоторые параметры Т-клеточного звена иммунитета. Наблюдается повышение цитоста-тической и мембранотоксической активности клеток тимуса и селезенки в отношении клеток перевиваемых опухолей [2].

Недавно в литературе появились сообщения о способности вирусов индуцировать в опухолевых клетках апоптоз, в частности на примере онколитического аденовируса [18]. Нарушения процесса апоптоза лежат в основе развития многих патологических процессов, в том числе опухолевого [1, 9, 13]. В клетках опухолей человека апоптоз может быть спонтанным или индуцированным. Индуцированный апоптоз является важнейшим механизмом действия различных схем противораковой терапии, показателем его эффективности [4, 9, 11, 14]. Руководствуясь вышеизложенным, мы сочли целесообразным исследовать вакцинные штаммы вирусов паротита, ВЭЛ и осповакцины в качестве апоптоз-индуцирующих агентов.

Таблица 1

Влияние вакцинных штаммов вирусов на апоптотическую гибель клеток эритромиелолейкоза человека

Время инкубации (часы) Группы наблюдения

К-562 К-562 + вирус ВЭЛ К-562 + вирус осповакцины К-562 + вирус паротита

% апоптотических клеток

3 15,8 ± 3,3 17,2 ± 6,2 21,3 ± 3,5 30,9 ± 4,2*

6 17,1 ± 6,5 16,2 ± 1,8 20,1 ± 2,8 31,1 ± 3,2*

24 10,5 ± 2,4 30,3 ± 5,8* н.д. 12,4 ± 2,9

Примечания: К-562 - клетки эритромиелолейкоза человека; * - различия достоверны с группой «К-562» (р<0,05); н. д. - нет данных.

Материал и методы

Экспериментальные модели:

- К-562 - суспензионная культура клеток эритромиелолейкоза человека;

- клетки аденокарциномы Эрлиха (асцитный вариант).

Вирусные вакцины:

- вакцина паротитная, культуральная, живая, сухая, производства ФГУП «НПО Микроген». Московское подразделение по производству бактерийных препаратов;

- вакцина вируса осповакцины живая, сухая, производства НПО «Вирион» (Томск);

- аттенуированный штамм 2621 вируса венесуэльского энцефаломиелита, разработан в Томском НИИВС и прошел контроль как вакцинный препарат в ГИСК им. А. Тарасевича (Москва).

Индукцию апоптоза в опухолевых клетках регистрировали методом С.Н. Орлова (1996), который позволяет фиксировать дефрагментацию ДНК как конечную стадию апоптоза. Опухолевые клетки брали в концентрации 106/мл ростовой среды. Образцы помещали в планшеты, пробирки или флаконы (по 1,0 мл), добавляли 3Н-тимидин (1 мкКи /50 мкл на пробу). Пробы инкубировали 24 ч при 37ОС в атмосфере 5 % СО2, после чего клетки 2-кратно отмывали и добавляли в каждую пробу по 1,0 мл свежей питательной среды. Далее инкубировали еще 24 ч, после чего в опытные образцы в качестве предполагаемого апоптоз-индуцирующего агента

добавляли вирусные вакцины (104—105 ТЦД50) и инкубировали еще 3, 6 или 24 ч. Затем пробирки с пробами центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин, после чего осторожно снимали супернатант (1,0 мл), помещали в сцинтилляционную жидкость. В оставшуюся взвесь добавляли по 0,5 мл лизис-буфера SDS, переносили в виалы со сцинтилляционной жидкостью. Измерение радиоактивности проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Mark -3» (Trakor Analytic, USA) в импульсах/мин (cpm).

Количественную оценку апоптоза проводили по формуле

% апоптоза = 1,5 х ( A1t - A10)/ (A2 + A1t

- 1,5 х A10) х 100%,

где A1t - число имп./мин в супернатанте;

А2 - число имп./мин в осадке;

А10 - контроль до индукции апоптоза (число имп./мин в супернатанте).

Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксо-на-Манна-Уитни. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (Х), ошибку среднего (m). Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение

При изучении апоптоз-индуцирующего действия вирусных вакцин на модели клеток

Таблица 2

Влияние вакцинных штаммов вирусов на апоптотическую гибель клеток асцитной карциномы Эрлиха

Время инкубации (часы) Группы наблюдения

АКЭ АКЭ +вирус ВЭЛ АКЭ + вирус осповакцины

% апоптотических клеток

3 18,8 ± 4,4 б,5± 1,5 * Зб,1 ± 7,б *

б 2б,7 ± 4,9 19,б ± 7,3 45,7 ± 7,3*

24 35,2 ± 7,7 13,3 ± 1,3* 4б,7 ± 2,б

Примечания: АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха; ВЭЛ - вирус венесуэльского энцефаломиелита; * - различия статистически значимы с группой «АКЭ» (р<0,05).

эритромиелолейкоза человека К-5б2 выявлено, что все изученные препараты увеличивают данный показатель в течение всего периода наблюдения, в сравнении с контрольной группой, представленной нативными клетками К-5б2 (табл.1).

Значительное увеличение процентного содержания апоптотических клеток при воздействии вируса паротита наблюдается в ранние сроки инкубации (3, б ч). Вирус ВЭЛ вызывает аналогичный эффект в более поздние (24 ч) сроки наблюдения. При этом процент апоптотически гибнущих под воздействием вируса паротита клеток увеличивается в 1,8-2 раза, вируса ВЭЛ

- в 2,9 раза. Вирус осповакцины также вызывает некоторое увеличение данного показателя, но эти отличия статистически незначимы. Таким образом, результаты исследования показали, что вакцинные штаммы вирусов паротита и ВЭЛ обладают апоптоз-индуцирующим действием в отношении клеток эритромиелолейкоза человека. При этом вирус осповакцины не показал существенной способности индуцировать апоп-тоз в клетках К-5б2.

Изучение апоптоз-индуцирующей активности вирусных вакцин в отношении клеток аденокарциномы Эрлиха (табл. 2) показало, что под действием вируса осповакцины уже в ранние сроки инкубации (3, б ч) происходит статистически значимое увеличение изучаемого показателя. По сравнению с группой контроля процент апоптотически гибнущих клеток карциномы Эрлиха увеличивается под действием этого вируса на 17-19 %. Однако вирус ВЭЛ в

2,7-2,9 раза снижает процент апоптотических клеток, т.е. этот вирус, согласно полученным данным, не проявляет апоптоз-индуцирующих свойств по отношению к клеткам аденокарциномы Эрлиха. Очевидно, противоопухолевые свойства вируса ВЭЛ, подтвержденные нашими предыдущими исследованиями, обусловлены другими механизмами действия, в том числе более высоким цитодеструктивным потенциалом, в сравнении с другими изученными вирусными вакцинами [2].

Таким образом, можно предположить, что опухолевые клетки, инфицированные вирусом ВЭЛ, быстро подвергаются некрозу, не успев вступить в апоптоз. Отсутствие апоптоз-инду-цирующего эффекта может объясняться также типом и индивидуальной чувствительностью клеток к применяемым индукторам апоптоза, что не противоречит имеющимся литературным данным [5, 10, 14, 15].

Поскольку популяция опухолевых клеток гетерогенна по своей способности к апоптозу, цитоморфологическое действие онколитиче-ских вирусов может складываться, очевидно, из двух компонентов - цитодеструктивного и апоптоз-индуцирующего. Но если цитоде-структивное действие в отношении опухолевых клеток у всех исследованных вирусных вакцин, как показали наши ранние исследования, было четко выражено, то апоптоз-индуцирующее проявлялось у каждого вируса индивидуально, что подтверждается представленными результатами. В перспективе использование индукторов апоптоза вирусной природы для лечения злока-

чественных опухолей весьма заманчиво, так как, с одной стороны, потеря опухолевыми клетками функций р53 может являться причиной опухолеселективной репликации вирусов [7, 13, 15], а с другой стороны, вирусы способны размножаться в опухолевых клетках с сохраненной функцией р53 и индуцировать их апоптотическую гибель с участием иммунных клеток, ответственных за этот процесс, который протекает по тем же законам, что и апоптоз в нормальных клетках, инфицированных вирусом. В настоящее время проводятся исследования, направленные на изучение механизмов этого явления с целью создания вирусных штаммов с максимально выраженной способностью индуцировать апоптоз в опухолевых клетках [7, 18].

Литература

1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю. В. Программированная клеточная смерть // Российский онкологический журнал. 1996. № 1. С. 58-61.

2. ВидяеваИ.Г. Вирусные вакцины и их онколизаты в терапии экспериментальных опухолей: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Томск, 2005. 21 с.

3. Громова А.Ю. Противоопухолевые свойства вакцинного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита и его онколизата: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб., 1999. 25 с.

4. Петухов В.И. Роль Fas-опосредованного апоптоза в реализации противоопухолевого эффекта а-интерферона при хроническом миелолейкозе // Гематология и трансфузиология. 2000. № 4. С. 29-33.

5. Погорелов В.М., Козинец Г.И. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом апоптозе // Гематология и транс-фузиология. 1995. № 5. С. 17-24.

6. Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Исследование экспрессии CD95 (FAS/APO-1), опосредующего апоптоз, с помощью моноклональных антител ICO-160 при гемобластозах // Гематология и трансфузиология. 2000. № 4. С. 29-33.

7. Сергеев А.Н., ПетрищенкоВ.А., Пьянков О.В. и др. Возможность культивирования мутантного варианта Ade12 аденовируса на культуре клеток 293 // Вопросы вирусологии. 2003. № 6. С. 30-33.

8. Уразова Л.Н. Эффективность и механизмы противоопухолевого действия вирусных вакцин при экспериментальном онкогенезе: Автореф. дис. ... д-ра. биол. наук. СПб., 2003. 36 с.

9. Хетсс С.В. Умирать или не умирать. Описание апоптоза и его роли в протекании болезни // Амер. мед. ассоц. 1998. № 1. С. 12-26.

10. Циплакова В.Г., Бескровнова Н.Н. Апоптоз // Архив патологии. 1999. № 5. С. 71-74.

И. ФильченковА.А., СтойкаР.С. Апоптоз и рак. Киев, 1999. 137 с.

12. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака // Русский биотерапевтический журнал. 2002. Т. 1, № 3. С. 5-14.

13. Agol V, Belov G., BienzK. Two types of death of poliovirus-infected cells // Virology. 1998. Vol. 252. P. 343-353.

14. Bowen J., Bowen S., Jones A. Mitosis and Apoptosis // Matters of Life and Death. London: Chapman & Hall, 1998. 182 p.

15. Galazka K., Stachura J. Apoptosis and proliferative activity in primary gastric lymphoma // Virch. Arch. 1999. Vol. 435. P. 244-252.

16. Gavilondo I., Larrick J., Borrebaeck C. Human antibodies therapy // Immunologist. 2000. Vol. 8. P. 58-65.

17. Kirn D. Replicating oncolytic viruses: an overview // Expert Opin. Investig. Drugs. 1996. Vol. 5. P. 753-762.

18. Mullen J., Tanabe K. Viral oncolysis // The Oncologist. 2002. Vol. 7. P 106-119.

19. TodaM., Rabkin S., KojimaH. et al. Herpes simplex virus as an in situ cancer vaccine for the induction of specific antitumor immunity // Hum. Gene Ther. 1999. Vol. 10. P. 385-393.

Поступила 12.03.06