ДИГИДРОХЛОРИД 3-ЦИКЛОГЕКСИЛАМИНОМЕТИЛТИАЗОЛО[3,2-a]БЕНЗИМИДАЗОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ИММУНОТРОПНУЮ И АНТИАГРЕГАЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ
3-CYCLOHEXYLAMINOMETHYLTHIAZOLE[3,2-a]BENZIMIDAZOLE DIHYDROCHLORIDE HAVING IMMUNOTROPIC AND ANTI-AGGREGATION ACTIVITY

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической химии и фармакологии, и может быть использовано для создания новых иммунотропных и антиагрегационных средств.
Прототипом и препаратом сравнения иммунотропной активности является левамизол (гидрохлорид 6-фенил-2,3,5,6-тетрагидроимидазо[1,2-b]тиазола, декарис, Гедеон Рихтер А.О., Венгрия), который длительное время используется в клинике как иммуномодулирующее средство, стимулирующее клеточные факторы иммунитета (Renoux G. // Drugs. The general immunopharmacology of levamizole. Drugs. 1980. V.20 - P.89-99). Препаратом сравнения антиагрегационной активности является пентоксифиллин (3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1H-пурин-2,6-дион, Aventis, Германия), используемый в клинике как корректор реологических нарушений (Hikiami Н., Goto Н., Sekiya N. [et al.] // Phytomedicine. - 2003. - Vol.10, №6-7. - P.459-466.).
Задача изобретения - расширение арсенала биологически активных веществ, обладающих иммунотропными и антиагрегационными свойствами.
Технический результат - получение вещества, обладающего иммунотропной и антиагрегационной активностью.
Сущность изобретения: дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-a]бензимидазола формулы:
,
проявляющий иммунотропные и антиагрегационные свойства.
Заявляемое соединение - дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола (I), получено следующим образцом.
Реакцией 3-хлорметилтиазоло[3,2-а]бензимидазола (Дианов В.М., Сибиряк С.А., Садыков Р.Ф. и др. // Хим.-фарм. журн., - 1991. - №1. - С.40-42.) с циклогексиламином в кипящем этаноле в течение 2 часов образуется 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазол. Хлористоводородную соль получают обработкой основания хлористым водородом в этилацетате до pH раствора 1-2.
Пример 1. Синтез дигидрохлорида 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола(I).
Раствор 4,4 г (20 ммоль) 3-хлорметилтиазоло[3,2-а]бензимидазола и 8,0 г (80 ммоль) циклогексиламина в 60 мл этилового спирта нагревают на водяной бане 2 часа. Часть растворителя удаляют под вакуумом. Охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат. Получают 5,0 г (87,7%) 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола. Хлористоводородную соль 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола получают растворением основания I в этилацетате и пропусканием через раствор газообразного хлористого водорода до pH раствора 1-2. Перекристаллизовывают из этанола. Т. пл. 247-250°C.
16
19
3
Найдено, %: C 53,8; H 6,0; N 11,8; S 9,9; Cl 19,8. CHNS·2РCl. Вычислено: C 53,6; H 5,9; N 11,7; S 8,9; Cl 19,7.
1
2
Спектр-ЯМР Н (ТФУК, ГМДС), δ, м.д.: 1,17 (сл. м, 10H, CH-циклогекс), 3,47-3,02 (м, 1Н, N-CH), 4,95-4,50 (д, 2H, CH2-NH), 7,55 сл. м. (5Н, аром.).
-1
ИК спектр: 1480, 1540, 1604, 2950 см (C=C, C=N, CH).
Пример 2. Острая токсичность заявляемого соединения.
Острая токсичность соединения I изучена на белых мышах массой 14-16 г по методу Литчфилда и Уилкоксона (Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - 2-е изд. - Рига, 1963) и на крысах массой 140-160 г по методу Ван дер Вердена (Van der Waerden В.L. // Arch. exp. Path. Pharmacol. - 1990. - Bd.195. - S.389). Результаты испытаний приведены в таблице 1.
Таким образом, заявляемое соединение в зависимости от пути введения в 2-4 раза ниже токсичности левамизола.
Пример 3. Изучение имунотропной активности дигидрохлорида 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола (соединение I).
50
В качестве модели аутоиммунного процесса использованы адьювантный артрит и экспериментальный аллергический энцефаломиелит у крыс. Адьювантный артрит воспроизводили путем внутрикожной инъекции полного адьюванта Фрейнда (ПАФ) в основание хвоста в объеме 0,1 мл при дозе микробактерий 5 мг в 1 мл. Отек конечностей измеряли на электронно-механическом онкометре. Оценку тяжести артрита проводили в период манифестации (+14 день после индукции) внутрибрюшинно 1 раз в три дня в дозе 20 ЛД с +1 по +14 день (всего 5 введений). Левамизол вводили по аналогичной схеме в эквивалентной дозе (табл.2).
50
При использовании соединения I и левамизола в дозе 1/9 ЛД ежедневно внутрибрюшинно с +14 по +22 день эффекта не наблюдалось. Описанный характер действия характерен для иммунотропных препаратов и исключает подавление артрита за счет прямого антифлогистического эффекта.
50
Экспериментальный аллергический энцефаломиелит воспроизводили путем подкожного введения крысам 0,1 мл энцефалитогенной эмульсии, содержащей 200 мг изологичного спинного мозга и 2 мг в 1 мл БЦЖ в неполном адьюванте Фрейнда. Оценку тяжести неврологических симптомов проводили на +14 день. Соединение I и левамизол вводили внутрибрюшинно в дозе 1/20 ЛД 1 раз в три дня с +1 по +14 день (табл.4).
50
Таким образом, в проведенных экспериментах левамизол, при введении в дозе 2,5 мг/кг (1/20 ЛД) 1 раз в три дня, вызывал лишь тенденцию к снижению тяжести артрита, в то время как соединение I при использовании по аналогичной схеме в эквивалентной дозе вызывало существенное подавление заболевания, превосходя левамизол по активности в 1,6-1,8 раз. Соединение I в условиях использованной модели не обладало антифлогистической активностью, так как при введении соединения с +14 по +22 день болезни эффекта не наблюдалось.
50
На модели экспериментального аллергического энцефалита у крыс соединение I при внутрибрюшном введении в дозе 1/20 ЛД 1 раз в 3 дня с +1 по +14 день полностью подавляло развитие болезни, в то время как левамизол эффекта не оказывал.
50
Для оценки влияния соединения I и левамизола на неспецифическую иммунологическую реактивность был использован интегральный тест-модель летальной инфекции, вызванной введением микробного агента. Инфекцию вызывали внутрибрюшинным введением 1,25 ЛД суточной культуры синегнойной палочки, что составило 60-70 млн микробных тел на одно животное.
50
Соединение I и левамизол вводили в эквивалентных дозах (1/20 ЛД), используя профилактический режим введения - во всех случаях последнее введение проводилось за сутки (-1 день) до инокуляции возбудителя (0-день). Результаты испытаний приведены в табл.5.
50
Таким образом, как соединение I, так и эталонный препарат левамизол независимо от пути введения при использовании в дозах, равных 1/20 ЛД, для соответствующего пути введения вызывали стимуляцию неспецифической резистентности животных, наиболее отчетливый эффект наблюдался при введении в мышцу и в вену. Существенных преимуществ соединения I в сравнении с левамизолом выявлено не было.
Для оценки влияния соединения I и левамизола на опухолевый процесс были использованы перевиваемые штаммы солидных опухолей - карциносаркома Уокера (W-256), саркома Крокера (S-180) и асцитная опухоль Эрлиха (АОЭ-дипл.), полученные из ОНЦ АМН СССР. Методические аспекты эксперимента разработаны, а оценка эффекта проводилась согласно общепринятым требованиям к оценке противоопухолевых препаратов.
50
Соединение I и левамизол вводили с +1 дня и после имплантации опухолевого материала по +7 день, внутрибрюшинно или в вену, 1 раз в три дня в дозе 1/20 ЛД для соответствующего пути введения. Результаты испытаний приведены в табл.6 и 7.
50
По факту, соединение I угнетает развитие солидных опухолей при введении с 0 дня имплантации опухолевого материала, трехкратно, внутрибрюшинно и внутривенно в дозе 1/20 ЛД.
50
Таким образом, как соединение I, так и левамизол угнетают развитие солидных опухолей при введении с 0 дня имплантации опухолевого материала, трехкратно, внутрибрюшинно и внутривенно в дозе 1/20 ЛД, причем на модели саркомы-180 соединение I существенно угнетало рост опухоли, в то время как левамизол вызывал лишь тенденцию к уменьшению роста. На модели карциносаркомы-256 как соединение I, так и левамизол существенно угнетали рост опухоли, однако эффект соединения I был более выражен. Как соединение I, так и левамизол вызывали тенденцию к уменьшению роста асцитной опухоли.
-4
Антиагрегационная активность соединения I изучена на модели необратимой агрегации тромбоцитов, вызванной (конечная концентрация 2·10 М) на плазме здоровых доноров по методу В.А.Люсова с незначительной модификацией (Люсов В.А., Белоусов Ю.Б., Савенков М.П. Метод определения агрегации тромбоцитов и эритроцитов // Лаб. дело. - 1976. - №8. с.463-468). В качестве эталонного антиагреганта использован пентоксифиллин (3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1Н-пурин-2,6-дион, Aventis, Германия), который длительное время используется в клинике как корректор реологических нарушений. Результаты испытаний приведены в таблице 8.
Таким образом, по антиагрегационной активности соединение 1 превосходит пентоксифиллин в 7,9 раз.
Таким образом, новое соединение обладает выраженной иммунотропной активностью, в ряде случаев (аутоиммунитет и опухолевый процесс) превосходящей активность эталонного иммуномодулятора левамизола, выраженной антиагрегационной активностью, также превосходящей активность эталонного дезагреганта пентоксифиллина, и может найти применение в практической медицине.
«Дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-a]бензимидазола, проявляющий иммунотропную и антиагрегационную активность»
Таблица 1
Острая токсичность соединения I и левамизола
Соединение и путь введения
Острая токсичность ЛД<sub>50</sub>, мг/кг
мыши
крысы
Соединение I
1. Внутрибрюшинно
187 (174÷201)
180
2. Внутрь
737 (554÷980)
3. Под кожу
296 (272÷322)
4. В вену
50 (45÷56)
Левамизол
1. Внутрибрюшинно
43 (39÷47)
47
2. Внутрь*
210
3. Под кожу*
84
4. В вену*
22
* - известные данные
Таблица 2
Влияние соединения I и левамизола на развитие адьювантного артрита у крыс при введении в дозе 1/20 ЛД<sub>50</sub> с+1 по+14 день
Соединение
n*
Доза, мг/кг
Тяжесть артрита, балл
+14 день
+22 день
Соединение I
10
9
3,3±0,8<sup>1</sup>
3,9±0,7<sup>1,2</sup>
Левамизол
10
2,5
5,5±1,3
7,2±1,4
Контроль
10
-
8,9±1,5
10,4±1,2
Примечание: * - здесь и далее количество животных в группе
<sup>1</sup> - значение существенно (P<0,05) отличается от контроля
<sup>2</sup> - значение существенно (P<0,05) отличается от «левамизольной» группы.
Таблица 3
Влияние соединения I и левамизола на течение адьювантного артрита при введении в дозе 1/9 ЛД<sub>50</sub> c +14 по +22 день
Соединение
n*
Доза, мг/кг
Тяжесть артрита, балл
Соединение I
8
20
4,8±1,6
Левамизол
8
5
5,3±2,0
Контроль
9
-
6,0±1,8
Таблица 4
Влияние соединения I и левамизола на развитие экспериментального энцефалита у крыс
Соединение
n*
Доза, мг/кг
Тяжесть артрита, балл
Соединение I
9
9
0,0±0,0
Левамизол
10
2,5
85,7±14,3
Контроль
10
-
100,0±14,3
Таблица 5
Влияние соединения I на резистентность мышей к летальной инфекции, вызванной синегнойной палочкой
Соединение
Схема введения и доза, мг/кг
Выживаемость животных, %
Средняя продолжительность жизни, сут.
+2 день
+7 день
1
2
3
4
5
Введение внутрь
Соединение I
ежедневно:
с -7 по -1,
37 мг/кг
46
31
2,7±0,3*
Трехкратно:
-7, -4, -1 день,
37 мг/кг
35
25
3,0±0,5*
Левамизол
ежедневно:
с -7 по -1,
11 мг/кг
20
8
1,6±0,2
Трехкратно:
-7, -4, -1 день,
11 мг/кг
44
33
3,5±0,5*
Контроль
-
23
14
1,8±0,2
Введение внутрибрюшинно
Соединение I
ежедневно:
с -7 по -1,
9 мг/кг
60
30
3,9±0,5*
Трехкратно:
-7, -4, -1 день,
9 мг/кг
100*
25
5,9±0,3*
Левамизол
ежедневно:
с -7 по -1,
2,5 мг/кг
70*
20
3,7±0,5*
Трехкратно:
-7, -4, -1 день,
2,5 мг/кг
90*
20
4,9±0,3*
Контроль
-
27
4
2,2±0,3
Введение в мышцу
Соединение I
ежедневно:
с -7 по -1,
15 мг/кг
90*
90*
6,4±0,7
трехкратно:
-7, -4, -1 день,
15 мг/кг
90*
90*
6,4±0,7*
двукратно:
-4, -1 день,
15 мг/кг
90*
90*
5,5±0,5*
однократно: -1,15 мг/кг
50
40
3,7±0,7
Левамизол
ежедневно:
с -7 по -1,
4 мг/кг
100*
100*
7,0±0,0*
трехкратно:
-7, -4, -1 день,
4 мг/кг
100*
70
6,4±0,2*
двукратно:
-4, -1 день,
4 мг/кг
75
75
5,5±0,7*
однократно: -1,4 мг/кг
60
50
4,4±0,7
Контроль
-
33
28
2,9±0,4
Введение под кожу и в вену
Соединение I
ежедневно под кожу:
с -7 по -1,
15 мг/кг
90*
56
5,6±0,7*
двукратно в вену:
-4, -1 день,
2,5 мг/кг
100*
100*
7,0±0,0*
Левамизол
ежедневно под кожу:
с -7 по -1,
4 мг/кг
80*
40
4,4±0,7
двукратно в вену: -4, -1 день, 1,1 мг/кг
100
100
7,0±0,0
Контроль
-
33
28
2,9±0,4
* - значение существенно отличается от контрольной группы (выживаемость оценивалась по критерию X<sup>2</sup> Пирсона, средняя продолжительность жизни по критерию Стьюдента)
Таблица 6
Влияние соединения I и левамизола на рост перевиваемых солидных опухолей w-235 (крысы-самки) и s-180 (белые мыши-самцы)
Соединение
n
Доза и схема введения
Объем опухоли, на +7 день наблюдения, см<sup>3</sup>
Подавление роста, %
1
2
3
4
5
Карциносаркома w-235
Соединение I
10
9 мг/кг в/б0, +3, +6,
0,03±0,0
88
Левамизол
10
2,5 мг/кг в/бр0, +3, +6
0,05±0,02*
75
Контроль
10
-
0,21±0,04
Технический контроль
10
-
Спонтанных опухолей нет
Саркома s-180
Соединение I
14
9 мг/кг в/б0, +3, +6,
0,50±0,09*
56
14
2,5 мг/кг в/бр0, +3, +6
0,46±0,12
59
Левамизол
14
9 мг/кг в/б0, +3, +6,
0,74±0,11
35
14
2,5 мг/кг в/бр
0,56±50,11
50
0, +3, +6
Контроль
14
-
1,13±0,24
Технический контроль
-
Спонтанных опухолей нет
* - значение существенно (P<0,05) отличается от контроля
Таблица 7
Влияние соединения I и левамизола на рост асцитной опухоли (АОЭ-дипл.) у мышей самцов при внутрибрюшинном введении
Соединение
n
Доза и схема введения
Объем асцита, мл
Подавление, %
I
10
9 мг/кг в/б0, +3, +6,
4,2±0,8
30
Левамизол
10
2,5 мг/кг в/бр0, +3, +6
3,6±1,2
40
Контроль
10
-
6,0±0,9
Технический контроль
10
Спонтанных опухолей нет
Таблица 8
Влияние соединения I на агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ
Соединение
EC<sub>50</sub>-концентрация, вызывающая 50% дезагрегацию тромбоцитов, мкмоль/мл
Соединение I
0,17(0,14÷0,19)
Левамизол
2,56(1,87÷3,50)
Пентоксифиллин
1,34(0,79÷2,25)