СМЕСЬ ДЛЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОБИОТИКИ
BABY MIXTURE CONTAINING PROBIOTICS

Настоящее изобретение относится к смеси для грудных детей, содержащей пробиотики.
Материнское молоко рекомендуется всем грудным детям. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным или неблагоприятным по медицинским показаниям, либо сама мать отказывается от кормления грудью. Для таких ситуаций разработаны смеси для грудных детей.
В недавнем прошлом некоторые штаммы бактерий привлекли особое внимание, поскольку они, как было установлено, при попадании в организм человека проявляют ценные для него свойства. В частности, определенные штаммы рода лактобацилл и бифидобактерий способны, как было установлено, заселять слизистую кишечника, снижать способность патогенных бактерий прилипать к эпителию кишечника, оказывать иммуномодуляторное действие и содействовать поддержанию хорошего самочувствия. Такие бактерии иногда называют пробиотиками.
Проведено большое число исследований по идентификации новых пробиотических штаммов. Например, ЕР 0199535, ЕР 0768375, WO 97/00078, ЕР 0577903 и WO 00/53200 раскрывают конкретные штаммы лактобацилл и бифидобактерий и их полезный эффект.
Поскольку это касается конкретно грудных детей, то считается, что непосредственно перед родами желудочно-кишечный тракт ребенка является стерильным. В процессе родов он контактирует с бактериями пищеварительного тракта и кожи матери и начинает заселяться ими. Существуют существенные различия в составе микробиоты кишечника среди грудных детей, обусловленные их питанием. Микрофлора фекалий грудных детей, вскармливаемых материнским молоком, характеризуется преобладанием популяций бифидобактерий с некоторыми видами лактобацилл, в то время как грудные дети, вскармливаемые молочными смесями, имеют более сложную микробиоту, в которой обычно присутствуют все виды бифидобактерий, бактероиды, клостридии и стрептококки. После отнятия ребенка от груди в возрасте около 2 лет состав его кишечной микробиоты постепенно приближается к составу микробиоты взрослого человека.
7
12
Поэтому было предложено добавлять пробиотики в смеси для грудных детей с тем, чтобы инициировать заселение кишечника и стимулировать его заселение скорее "хорошими" бактериями (различными видами бифидобактерий и лактобацилл), чем вредными патогенными бактериями, такими как клостридии и др. В типичных случаях добавляют минимум 10 КОЕ (колониеобразующих единиц)/г смеси, хотя в большинстве случаев предпочитают добавлять повышенные количества, например, до 10 КОЕ/г смеси.
В последнее время стала выражаться некоторая озабоченность по поводу добавления пробиотических бактерий в смеси для грудных детей, предназначенные в качестве единственного источника питания для младенцев в первые шесть месяцев жизни. Причины такой озабоченности суммированы с медицинской точки зрения в докладе ESPGHAN Комитета по питанию, озаглавленном "Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants" (Пробиотические бактерии в диетических продуктах для грудных детей) (Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 38: 365-374).
Тем временем опережающими темпами проводятся исследования по изучению компонентов женского молока. Всегда предполагалось, что женское молоко стерильно. Однако совсем недавно, и как описывает, например, Martin et al. в статье "Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut" (Женское молоко как источник молочнокислых бактерий для кишечника грудного ребенка) (J. Pediatr. 2003; 143: 754-758), из женского грудного молока был выделен ряд бактериальных штаммов. В настоящее время невозможно окончательно утверждать, что эти бактерии способны размножаться или, по меньшей мере, что все идентифицированные штаммы обладают такой способностью. И тем не менее думается, что такие бактерии и бактериальные фрагменты должны присутствовать в женском молоке для особой цели или целей.
С учетом полезности для грудных детей, вскармливаемых не полностью материнским молоком, отмечается все возрастающая необходимость разработки смесей для грудных детей, которые максимально, насколько это возможно, были бы приближены к женскому молоку как по своей питательной ценности, так и по биоактивным свойствам.
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы настоящей заявки совершенно неожиданно открыли, что по мере того, как продолжаются исследования по вопросу присутствия бактерий и бактериальных фрагментов в женском молозиве и женском молоке, начинает выявляться общая тенденция, а именно: какие бы специфические штаммы не были обнаружены, их концентрация, по-видимому, намного ниже тех концентраций, которые рекомендовались ранее для добавления в смеси для грудных детей.
2
5
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает смесь для грудных детей, содержащую источник белка в количестве не более 2,0 г/100 ккал, источник липидов, источник углеводов и пробиотик, в которой пробиотик присутствует в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси.
2
5
Изобретение распространяется также на применение пробиотика в производстве смеси для грудных детей с целью стимулирования созревания иммунной системы новорожденного в первые несколько недель его жизни, в которой пробиотик присутствует в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси.
2
5
Изобретение охватывает далее применение пробиотика в производстве смеси для грудных детей с целью модулирования иммунной системы новорожденного, чтобы активизировать в первые несколько недель жизни ребенка развитие у него полезной кишечной микробиоты, сравнимой с микробиотой у детей на грудном вскармливании, в которой пробиотик присутствует в смеси в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси.
2
5
В следующем аспекте изобретение охватывает способ стимуляции созревания иммунной системы новорожденного в первые несколько недель его жизни, который включает скармливание ребенку терапевтически активного количества смеси для грудных детей, содержащей пробиотик в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси.
2
5
В последнем аспекте изобретение обеспечивает способ модулирования иммунной системы новорожденного с целью активизации развития в первые несколько недель его жизни полезной кишечной микробиоты, сравнимой с микробиотой у детей на грудном вскармливании, который включает скармливание ребенку терапевтически активного количества смеси для грудных детей, содержащей пробиотик в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси.
Не желая связываться какой-либо теорией, авторы настоящей заявки полагают, что введение относительно низких уровней пробиотических бактерий в пищеварительный тракт новорожденного, по всей вероятности, будет активизировать в определенной мере созревание иммунной системы ребенка и подготавливать или стимулировать иммунную систему ребенка на подавление любой тенденции, вызывающей воспалительную реакцию в ответ на колонизацию полезными организмами, и благоприятствовать тем самым развитию полезной кишечной микробиоты в течение последующих нескольких недель и месяцев жизни ребенка при одновременном поддержании нормальной иммунной защиты организма от колонизации патогенами. Вполне возможно, что такое действие, хотя и иммуномодуляторное по своей сути, физиологически отличается от воздействия на иммунную систему намного более высоких количеств пробиотических бактерий, которые традиционно вводились в смеси для грудных детей, а фактически и в другие пищевые продукты для человека. Возможно даже, что настоящее изобретение обеспечивает способ "переобучения" иммунной системы детей более старшего возраста и взрослых, страдающих заболеваниями, причиной которых служит неспособность иммунной системы распознавать полезные бактерии-симбионты, такие как бифидобактерии, вследствие чего иммунная система начинает атаковать эти бактерии таким же путем, каким она атакует патогенные бактерии.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании нижеприведенные термины даются в том определении, в каком их следует воспринимать при чтении и интерпретации описания, примеров и формулы изобретения.
Приведенные ниже определения смесей для грудных детей и смесей для детей младшего возраста интерпретируются в настоящем описании в соответствии со статьей 1.2 Директивы Европейской Комиссии 91/321/ЕЕС от 14 мая 1991 г.
"Infant" (грудной ребенок): ребенок младше 12 месяцев.
"Infant formula" (смесь для грудных детей): пищевой продукт, предназначенный для полноценного питания грудных детей в первые шесть месяцев жизни.
Выражение "полезная кишечная микробиота, сравнимая с микробиотой детей, вскармливаемых материнским молоком", обозначает кишечную микробиоту, в которой преобладают значительные популяции таких видов, как бифидобактерии и лактобациллы, и в которой не присутствуют значительные популяции таких видов, как бактероиды, клостридии и стрептококки.
"Пробиотики": пробиотики определяются как препараты микробных клеток или компоненты микробных клеток, оказывающие полезное воздействие на здоровье или самочувствие организма-хозяина (Salminen S., Ouwehand A., Benno Y. et al. "Probiotics: how should they be defined". Trend Food Sci. Technol. 1999: 10, 107-110).
Выражение "первые несколько недель жизни ребенка" означает первые два месяца жизни.
2
5
2
4
3
4
Пробиотик присутствует в смеси в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси. Это выражение включает все возможные случаи, т.е. когда бактерии являются жизнеспособными, инактивированными или нежизнеспособными либо присутствуют даже в виде фрагментов, таких как ДНК или материалы клеточных стенок. Другими словами, количество бактерий, которое содержит смесь, выражается в рамках колониеобразующей способности такого количества бактерий, как если бы они все были жизнеспособными, независимо от того, являются ли они на самом деле жизнеспособными, инактивированными или нежизнеспособными, фрагментированными или представляют собой смесь любых или всех из указанных состояний. Предпочтительно пробиотик присутствует в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси, более предпочтительно - в количестве, эквивалентном от 10 до 10 КОЕ/г сухой смеси.
Смесь для грудных детей согласно настоящему изобретению содержит источник белка в количестве не более 2,0 г/100 ккал, предпочтительно - от 1,8 до 2,0 г/100 ккал. Предполагается, что вид белка не является критическим в настоящем изобретении при условии, что он удовлетворяет минимальным потребностям по содержанию незаменимых аминокислот и обеспечивает удовлетворительный рост, хотя предпочитается, чтобы свыше 50 мас.% источника белка составлял белок молочной сыворотки. Так, в смесях могут использоваться источники белка на основе молочной сыворотки, казеина и их смесей, а также источники белка на основе сои. Что касается белков молочной сыворотки, то основу источника белка могут составлять кислая сыворотка или сладкая сыворотка, либо их смеси, и источник белка может включать альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в требуемых количественных соотношениях.
Но предпочтительно основу источника белка составляет модифицированная сладкая сыворотка. Сладкая сыворотка является легко доступным побочным продуктом сыроделия и часто используется в производстве смесей для грудных детей на основе коровьего молока. Однако сладкая сыворотка включает компонент, который, что крайне нежелательно, имеет высокое содержание треонина и низкое содержание триптофана и который называется казеино-глико-макропептидом (CGMP). Удаление CGMP из сладкой сыворотки приводит к получению белка с содержанием треонина, близким к его содержанию в женском молоке. Затем модифицированная таким путем сладкая сыворотки может дополняться теми аминокислотами, которые содержатся в ней на низком уровне (главным образом гистидином и триптофаном). Способ удаления CGMP из сладкой сыворотки описан в ЕР 880902, а смесь для грудных детей на основе такой модифицированной сладкой сыворотки - в WO 01/11990. Использование модифицированной сладкой сыворотки в качестве основного белка в источнике белка позволяет обеспечить все незаменимые аминокислоты при содержании белка от 1,8 до 2,0 г/100 ккал. В исследованиях на животных и человеке было показано, что такие источники белка имеют коэффициент эффективности белка, усвояемость азота, биологическую ценность и утилизацию чистого белка, сравнимые с аналогичными показателями стандартных, адаптированных по сывороточным белкам источников белка с более высоким содержанием белка/100 ккал, и обеспечивают удовлетворительный рост, несмотря на пониженное содержание белка в них. Если в качестве источника белка используется модифицированная сладкая сыворотка, то она предпочтительно дополняется свободным гистидином в количестве от 0,1 до 1,5 мас.% источника белка.
Белки могут быть нативными или гидролизованными, либо представлять собой смесь нативного и гидролизованного белков. В некоторых случаях может быть желательным использование частично гидролизованных белков (степень гидролиза от 2 до 20%), например, для грудных детей, которые предположительно относятся к группе риска развития аллергии на коровье молоко. Если необходимы гидролизованные белки, то процесс гидролиза может проводиться требуемым образом и известным из уровня техники способом. Например, гидролизат белков молочной сыворотки можно получить путем ферментативного гидролиза сывороточной фракции в одну или более стадий. Для получения белка с высокой степенью гидролиза белки молочной сыворотки могут подвергаться трехкратному гидролизу с использованием сначала Alcalase 2.4L (ЕС 940459), затем Neutrase 0,5L (выпускается Novo Nordisk Ferment AG) и, наконец, панкреатина при 55°С. Альтернативно для получения белка с меньшей степенью гидролиза белки молочной сыворотки могут подвергаться двукратному гидролизу с применением NOVOZYMES, а затем панкреатина. Если сывороточная фракция, используемая в качестве исходного материала, не содержит, в основном, лактозы, то в процессе гидролиза, как было установлено, белок подвержен блокаде лизина в намного меньшей степени. Это позволяет снизить степень блокады лизина примерно с 15 мас.% общего лизина до менее чем 10 мас.% общего лизина; например, степень блокады лизина может составлять около 7 мас.% лизина, что значительно повышает питательную ценность источника белка.
Смесь для грудных детей согласно настоящему изобретению содержит источник углеводов. Может использоваться любой источник углеводов, который традиционно можно обнаружить в смесях для грудных детей, такой как лактоза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси, хотя предпочтительным источником углеводов является лактоза. Предпочтительно источники углеводов составляют от 35 до 65% общего количества энергии в смеси.
Смесь для грудных детей согласно настоящему изобретению содержит источник липидов. Источник липидов может быть любым липидом или жиром, который пригоден для использования в смесях для грудных детей. Предпочтительные источники жира включают пальмовый олеин, высокоолеиновое подсолнечное масло и высокоолеиновое сафлоровое масло. Незаменимые жирные кислоты - линолевая кислота и α-линоленовая кислота - также могут добавляться, равно как и небольшие количества масел с высоким содержанием арахидоновой и докозагексаеновой кислот, такие как рыбий жир или масла микробного происхождения. В целом содержание жира предпочтительно должно быть таким, чтобы жир поставлял от 30 до 55% общего количества энергии смеси. Источник жира предпочтительно имеет соотношение n-6 жирных кислот к n-3 жирным кислотам примерно от 5:1 до 15:1, например примерно от 8:1 до 10:1.
1
2
6
12
Смесь для грудных детей содержит также все витамины и минералы, считающиеся незаменимыми в каждодневном рационе питания, в значительных в питательном отношении количествах. Установлены минимальные потребности для некоторых витаминов и минералов. Примеры минералов, витаминов и других нутриентов, необязательно присутствующих в смеси для грудных детей, включают витамин А, витамин B, витамин B, витамин В, витамин В, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозит, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минералы обычно добавляются в форме солей. Присутствие и количества конкретных минералов и других витаминов будет варьировать в зависимости от аудитории грудных детей, для которой предназначена данная смесь.
При необходимости смесь для грудных детей может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соевый лецитин, эфиры лимонной кислоты и моно- и диглицеридов и др. Они используются преимущественно в том случае, если указанная смесь изготавливается в жидком виде.
Смесь для грудных детей может необязательно содержать другие вещества, которые могут обладать полезным действие, такие как пищевые волокна, лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.
Пробиотик может выбираться из любых штаммов, которые удовлетворяют определению пробиотика, данному выше. Это могут быть, например, лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки, лактококки, лейконостоки, энтеробактерии или энтерококки. Примерами предпочтительных видов лактобацилл являются Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus paracasei. Особенно предпочтительными штаммами являются Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, выпускаемые Valio Oy (Финляндия) под торговой маркой LGG; Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 и Lactobacillus paracasei CNCM I-2116. Примерами предпочтительных видов бифидобактерии являются Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium animalis. Особенно предпочтительными штаммами являются штамм Bifidobacterium lactis, реализуемый фирмой Christian Hansen (Дания) под торговой маркой ВВ12, Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, выпускаемый фирмой Morinaga Milk Industry (Япония) под торговой маркой ВВ536, и Bifidobacterium breve, выпускаемый фирмой Rhodia под торговой маркой Вb-03. Примерами предпочтительных видов стрептококков являются Streptococcus thermophilus и Streptococcus salivarius. Особенно предпочтительным штаммом является штамм Streptococcus thermophilus, реализуемый фирмой Christian Hansen под торговой маркой ТН4. Примером предпочтительного вида лактококков является Lactococcus lactis. Примером предпочтительного вида лейконостоков является Leuconostoc lactis. Примером предпочтительного вида лактококков является Enterococcus faecium.
5
Предпочтительно присутствуют по меньшей мере два различных пробиотика при условии, что не нарушается верхний предел 10 КОЕ/г сухой смеси. Одной из особенно предпочтительных комбинаций является комбинация лактобацилл, таких как, например, виды Lactobacillus rhamnosus или Lactobacillus paracasei, с бифидобактериями, такими как, например, виды Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve и Bifidobacterium animalis. Примерами таких комбинаций штаммов являются Bifidobacterium longum АТСС ВАА-999 с Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 или Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724. Другой особенно предпочтительной комбинацией является комбинация из двух штаммов бифидобактерий. Одним из примеров такой комбинации является комбинация Bifidobacterium longum АТСС ВАА-999 с Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446.
5
3
4
Как отмечалось выше, количество используемого пробиотика или пробиотиков не должно превышать эквивалент 10 КОЕ/г сухого продукта, предпочтительно эквивалент от 10 до 10 КОЕ/г. При добавлении в детский продукт или смесь штаммы могут быть жизнеспособными или инактивированными, или нежизнеспособными, или фрагментированными. Альтернативно может использоваться смесь бактерий в любом или во всех этих различных состояниях.
Смесь для грудных детей может изготавливаться любым, пригодным для этого путем. Например, смесь для грудных детей может изготовляться путем смешивания источника белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих соотношениях. Далее в смесь могут вводиться эмульгаторы, если таковые требуются. В это же время могут добавляться витамины и минералы, но обычно они добавляются позднее во избежание термического разрушения. Липофильные витамины, эмульгаторы и т.п. могут растворяться в источнике жира перед смешиванием. Затем может подмешиваться вода, предпочтительно вода, подвергнутая обратноосмотической обработке, при изготовлении жидкой смеси.
После этого жидкая смесь может подвергаться тепловой обработке в целях снижения бактериальной нагрузки. Например, жидкая смесь может подвергаться кратковременной тепловой обработке при температуре примерно от 80°С до 110°С в течение примерно от 5 секунд до 5 минут. Это может осуществляться инжекцией пара или в теплообменнике, например в пластинчатом теплообменнике.
Затем жидкая смесь может охлаждаться до температуры примерно от 60°С до 85°С, например, мгновенным охлаждением. После этого жидкая смесь может гомогенизироваться, например, в две стадии под давлением примерно от 7 МПа до 40 МПа на первой стадии и примерно от 2 МПа до 14 МПа на второй стадии. Гомогенизированная смесь может подвергаться последующему охлаждению для добавления чувствительных к нагреванию компонентов, таких как витамины и минералы. В это же время обычно проводится нормализация гомогенизированной смеси по величине рН и содержанию сухих веществ.
Гомогенизированная смесь подается в пригодную для этой цели сушильную установку, например в распылительную сушилку или сублимационную сушилку, и превращается в порошок. Порошок должен иметь влагосодержание ниже примерно 5 мас.%.
Выбранный пробиотик(и) может подвергаться культивированию пригодным для этого способом и подготавливаться соответствующим образом для добавления в смесь для грудных детей, например, с применением сублимационной сушки или распылительной сушки. Альтернативно можно закупить у специализированных фирм-поставщиков, таких как Christian Hansen и Morinaga, уже готовые бактериальные препараты в пригодном для добавления в пищевые продукты, такие как смесь для грудных детей, виде.
Пример 1
Пример композиции смеси для грудных детей согласно настоящему изобретению дается ниже. Эта композиция приводится с целью иллюстрации изобретения.
Нутриент
На 100 ккал
На литр
Энергетическая ценность (ккал)
100
670
Белок (г)
1,83
12,3
Жир (г)
5,3
35,7
Линолевая кислота (г)
0,79
5,3
α-линоленовая кислота (мг)
101
675
Лактоза (г)
11,2
74,7
Минералы (г)
0,37
2,5
Na (мг)
23
150
K (мг)
89
590
Сl (мг)
64
430
Са (мг)
62
410
Р (мг)
31
210
Mg (мг)
7
50
Мn (мкг)
8
50
Se (мкг)
2
13
Витамин А (мкг RE)
105
700
Витамин D (мкг)
1,5
10
Витамин Е (мг ТЕ)
0,8
5,4
Витамин K1 (мкг)
8
54
Витамин С (мг)
10
67
Витамин В1 (мг)
0,07
0,47
Витамин В2 (мг)
0,15
1,0
Ниацин (мг)
1
6,7
Витамин В6 (мг)
0,075
0,50
Фолиевая кислота (мкг)
9
60
Пантотеновая кислота (мг)
0,45
3
Витамин В12 (мкг)
0,3
2
Биотин (мкг)
2,2
15
Холин (мг)
10
67
Fe (мг)
1,2
8
I (мкг)
15
100
Сu (мг)
0,06
0,4
Zn (мг)
0,75
5
L. rhamnosus ATCC 53103
10<sup>3</sup> КОЕ/г порошка, жизнеспособные бактерии
В. longum BB 536
10<sup>2</sup> КОЕ/г порошка, жизнеспособные бактерии
Пример 2
Ниже описывается эксперимент на животных, в ходе которого проводилось исследование с целью оценки воздействия приема пробиотиков согласно изобретению на созревание иммунной системы у новорожденных мышей.
30 беременных стерильных (т.е. безмикробных) мышей распределяли в произвольном порядке по пяти группам. Новорожденных мышей помещали в одну из пяти групп (n= от 24 до 28 мышат/группа). Всех новорожденных мышей от одной матки помещали в ту же группу. Четыре группы получали только пробиотики или комбинации пробиотиков с бактериями нормальной микробиоты (энтеробактерии) мышей по следующей схеме:
группа 1: контроль (плацебо)
4
группа 2: пробиотики (10 КОЕ)
4
3
группа 3: пробиотики плюс микрофлора мышей (10 КОЕ пробиотиков и 10 КОЕ энтеробактерий)
8
группа 4: пробиотики (10 КОЕ)
8
3
группа 5: пробиотики плюс микрофлора мышей (10 КОЕ пробиотиков и 10 КОЕ энтеробактерий).
Такая схема эксперимента использовалась для тестирования следующих пробиотиков: Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 и комбинации Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 с Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 и Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 с Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.
Взрослые мыши-матки и новорожденные мыши получали классический стерильный рацион. Они содержались в изоляторах в течение 10 дней после рождения и имели свободный доступ к пище и воде.
Новорожденные мыши в группах 2-5 получали концентрат бактерий в одной капле PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером) (что соответствует примерно 10 мкл), в то время как новорожденные мыши контрольной группы получали только PBS. PBS с или без добавления бактерий в зависимости от группы начинали давать перорально и ежедневно новорожденным мышам спустя 7 дней после рождения и до отъема. Новорожденных мышей и мышей-маток переносили в обычную окружающею среду спустя 10 дней после рождения.
Новорожденных мышей в каждой группе распределяли по четырем подгруппам. Одну подгруппу новорожденных мышей из каждой группы умерщвляли спустя 7 дней после рождения с целью определения исходных уровней различных показателей. Две следующие подгруппы новорожденных мышей из каждой группы умерщвляли соответственно на 10-й и 14-й день после рождения. Новорожденных мышей в оставшейся подгруппе из каждой группы иммунизировали системной вакциной (подкожное введение противостолбнячной вакцины 0,125 Lf/мышь в гидроксиде алюминия) при отъеме (на 21-й день). Иммунную реакцию на вакцину отмечали еженедельно в течение трех недель, после чего оставшихся новорожденных мышей умерщвляли. Образцы крови (для обнаружения IgG-антител) и фекалий (для оценки микробиоты и обнаружения IgA-антител) отбирали у всех новорожденных мышей на 21-й, 28-й и 35-й дни после рождения. Образцы крови и тканей (селезенки, кишечника, печени, кишечных лимфатических узлов и молочных желез) отбирали после смерти (post mortem) в стерильных условиях.
Измеряли следующие выходные переменные параметры:
иммунную зрелость, которую оценивали гистологией и иммуно-гистохимией ткани кишечника и определением соотношения и фенотипа иммунных клеток, а также подвидов и уровней IgA в фекалиях;
иммунную реакцию на вакцинацию по уровню специфических IgG цитокинов в крови с применением метода ELISA;
анализ эндогенной микробиоты, подсчет и определение бактерий в фекалиях.