СПОСОБЫ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ

1. Способ получения амплифицированного метилома, включающий:
(а) фрагментирование последовательности двухцепочечной ДНК, имеющей паттерн метилирования, для получения матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК, имеющих паттерн метилирования и включающих участок связывания праймера на каждом 5'-конце и 3'-конце матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК;
(b) разделение матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК на верхнюю и нижнюю матричные цепи;
(c) удлинение верхней и нижней матричных цепей с использованием праймеров, полимеразы и нуклеотидов для получения неметилированных комплементарных цепей, с получением полуметилированных последовательностей двухцепочечной ДНК, соответствующих матричным последовательностям-фрагментам двухцепочечной ДНК, имеющим паттерн метилирования;
(d) обработку полуметилированных последовательностей двухцепочечной ДНК метилтрансферазой и источником метильных групп для добавления метильных групп в положениях, соответствующих метилированному цитозину в соответствующих матричных последовательностях-фрагментах двухцепочечной ДНК, для получения полностью метилированных матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК; и
(e) повторение стадий (b) - (d) для получения полностью метилированных ампликонов матричных последовательностей - фрагментов двухцепочечной ДНК.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий обработку полностью метилированных ампликонов матричных последовательностей - фрагментов двухцепочечной ДНК реагентом для превращения остатков цитозина в урацил и анализ паттерна метилированного цитозина.
3. Способ по п. 1, в котором фрагментация на стадии (а) происходит в результате контакта последовательности двухцепочечной ДНК с библиотекой транспосом, причем каждая транспосома из библиотеки имеет свою собственную уникальную ассоциированную штрих-кодовую последовательность, причем каждая транспосома из библиотеки включает транспозазу и гомодимер ДНК транспозона, где каждая ДНК транспозона из гомодимера включает участок связывания транспозазы, уникальную штрихкодовую последовательность и участок связывания праймера, где библиотека транспосом связывается с целевыми местоположениями в последовательности двухцепочечной ДНК, а транспозаза расщепляет последовательность двухцепочечной ДНК на матричные последовательности-фрагменты двухцепочечной ДНК, причем каждая матричная последовательность-фрагмент двухцепочечной ДНК включает по одному члену пары уникальных штрихкодовых последовательностей на каждом конце матричной последовательности-фрагмента двухцепочечной ДНК; заполнение гэпа между ДНК транспозона и матричной последовательностью- фрагментом двухцепочечной ДНК с образованием библиотеки из матричных последовательностей-фрагментнов двухцепочечной ДНК, имеющих участки связывания праймеров на каждом конце.
4. Способ по п. 1, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление хелатирующего агента для хелатирования ионов магния.
5. Способ по п. 1, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление ЭДТА для хелатирования ионов магния.
6. Способ по п. 1, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление ЭДТА для хелатирования ионов магния эквимолярным способом для создания идеальных буферных условий для метилтрансферазы.
7. Способ по п. 1, в котором стадия (е) включает добавление иона магния на повторяющейся стадии (с) для создания идеальных условий буфера для удлинения праймера с целью удлинения праймера.
8. Способ по п. 1, в котором метилтрансферазой является DNMT1.
9. Способ по п. 3, в котором транспозаза представляет собой Tn5 транспозазу, Mu транспозазу, Tn7 транспозазу или IS5 транспозазу.
10. Способ по п. 2, в котором реагентом для превращения остатков цитозина в урацил является бисульфит натрия.
11. Способ по п. 1, в котором последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой геномную ДНК.
12. Способ по п. 1, в котором последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой ДНК целого генома, полученную из одной клетки, или представляет собой внеклеточную ДНК.
13. Способ по п. 1, в котором последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой геномную ДНК пренатальной клетки, раковой клетки или циркулирующей опухолевой клетки.
14. Способ по п. 1, в котором последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой внеклеточную геномную ДНК опухолевой клетки, полученную из образца крови индивидуума.
15. Способ по п. 1, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 20 раз.
16. Способ по п. 1, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 10 раз.
17. Способ по п. 1, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 5 раз.
18. Способ по п. 1, в котором полностью метилированные ампликоны матричных последовательностейфрагментнов двухцепочечной ДНК обрабатывают реагентом для превращения остатков цитозина в урацил.
19. Способ по п. 2, в котором реагент для превращения остатков цитозина в урацил представляет собой фермент семейства APOBEC.
20. Способ по п. 2, в котором реагентом для превращения остатков цитозина в урацил является APOBEC3A.
21. Способ по п. 1, в котором праймеры представляют собой локус-специфические праймеры.
22. Способ по п. 1, в котором праймеры представляют собой специфические для заболевания праймеры.
23. Способ по п. 1, в котором праймеры представляют собой онкоспецифические праймеры.
24. Способ диагностики индивидуума, страдающего раком, включающий:
(а) фрагментирование последовательности двухцепочечной ДНК, полученной из жидкого образца биопсии от индивидуума, где последовательность двухцепочечной ДНК имеет паттерн метилирования, для получения матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК, имеющих паттерн метилирования и включающих участок связывания праймера на каждом 5' конце и 3' конце матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК;
(b) разделение матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК на верхнюю и нижнюю матричные цепи;
(c) удлинение верхней и нижней матричных цепей с использованием онкоспецифических праймеров, полимеразы и нуклеотидов для получения неметилированных комплементарных цепей, с получением полуметилированных последовательностей двухцепочечной ДНК, соответствующих матричным последовательностям-фрагментам двухцепочечной ДНК, имеющим паттерн метилирования;
(d) обработку полуметилированных последовательностей двухцепочечной ДНК метилтрансферазой и источником метильных групп для добавления метильных групп в положениях, соответствующих метилированному цитозину в соответствующих матричных последовательностях-фрагментах двухцепочечной ДНК, для получения полностью метилированных матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК;
(e) повторение стадий (b) - (d) для получения полностью метилированных ампликонов матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК;
обработку полностью метилированных ампликонов матричных последовательностей-фрагментов двухцепочечной ДНК реагентом для превращения остатков цитозина в урацил;
определение паттерна метилированного цитозина;
сравнение паттерна метилированного цитозина со стандартным паттерном метилированного цитозина для раковой ДНК;
определение различий между паттерном метилированного цитозина и стандартным паттерном метилированного цитозина для раковой ДНК; и
диагностирование у человека рака, когда определенный паттерн метилированного цитозина соответствует стандартному паттерну метилированного цитозина для раковой ДНК.
25. Способ по п. 24, в котором жидкий образец от биопсии представляет собой образец крови, образец спинномозговой жидкости или образец мочи.
26. Способ по п. 24, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление хелатирующего агента для хелатирования ионов магния.
27. Способ по п. 24, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление ЭДТА для хелатирования ионов магния.
28. Способ по п. 24, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление ЭДТА для хелатирования ионов магния эквимолярным способом для создания идеальных буферных условий для метилтрансферазы.
29. Способ по п. 24, в котором стадия (е) включает добавление иона магния на повторяющейся стадии (с) для создания идеальных условий буфера для удлинения праймера с целью удлинения праймера.
30. Способ по п. 24, где метилтрансферазой является DNMT1.
31. Способ по п. 24, в котором реагентом для превращения остатков цитозина в урацил является бисульфит натрия.
32. Способ по п. 24, в котором реагент для превращения остатков цитозина в урацил представляет собой фермент семейства APOBEC.
33. Способ по п. 24, где реагентом для превращения остатков цитозина в урацил является APOBEC3A.
34. Способ по п. 24, в котором последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой ДНК целого генома, полученную из одной клетки.
35. Способ по п. 24, в котором последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой геномную ДНК из раковой клетки или циркулирующей опухолевой клетки.
36. Способ по п. 24, в котором последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой внеклеточную геномную ДНК опухолевой клетки, полученную из образца крови индивидуума.
37. Способ по п. 24, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 20 раз.
38. Способ по п. 24, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 10 раз.
39. Способ по п. 24, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 5 раз.
40. Способ по п. 24, в котором праймеры представляют собой онкоспецифические праймеры.
41. Способ по п. 24, в котором определение паттернов метилированного цитозина включает секвенирование следующего поколения, специфическую для метилирования кПЦР или выявляющую метилирование микроматрицу.
42. Способ по п. 24, в котором рак представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из инвазивной карциномы молочной железы, аденокарциномы толстой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы печени, аденокарциномы простаты, аденокарциномы желудка и карциномы эндометрия.
43. Способ ранней диагностики рака для индивидуума, включающий:
(а) извлечение внеклеточной ДНК или геномной ДНК, которая может содержать внеклеточную ДНК опухоли, из жидкого биоптата от индивидуума, где последовательность внеклеточной ДНК опухоли имеет иной паттерн метилирования по сравнению с нормальными соматическими клетками;
(b) разделение последовательностей двухцепочечной ДНК на верхнюю и нижнюю матричные цепи;
(c) удлинение верхней и нижней матричных цепей с использованием полимеразы, нуклеотидов и избранных наборов праймеров, которые нацелены на области генома, в которых раковая клетка и нормальная клетка имеют различные паттерны метилирования, с получением полуметилированных последовательностей двухцепочечной ДНК для избранных дифференциально метилированных локусов;
(d) обработку полуметилированных последовательностей двухцепочечной ДНК метилтрансферазой для добавления метильных групп в положениях, соответствующих метилированному цитозину в соответствующих последовательностях двухцепочечной ДНК, с получением полностью метилированных последовательностей двухцепочечной ДНК из выбранных дифференциально метилированных локусов;
(e) повторение стадий (b) - (d) для получения полностью метилированных ампликонов избранных дифференциально метилированных локусов;
(f) обработку полностью метилированных ампликонов реагентом для превращения остатков цитозина в урацил при сохранении остатков метилированного цитозина без изменений;
(g) определение паттерна метилированного цитозина;
(h) определение наличия в образце внеклеточной ДНК опухоли путем сравнения паттерна метилированного цитозина внеклеточной ДНК с паттерном метилированного цитозина различных раковых тканей, определения различий между паттерном метилированного цитозина внеклеточной ДНК и паттерном метилированного цитозина различных раковых тканей, определение наличия в образце внеклеточной ДНК опухоли; и
(i) диагностирование индивидуума с определенным типом рака, когда определенный паттерн метилированного цитозина содержит онкоспецифический паттерн метилирования.
44. Способ по п. 43, в котором жидкий образец от биопсии представляет собой образец крови, образец спинномозговой жидкости или образец мочи.
45. Способ по п. 43, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление хелатирующего агента для хелатирования ионов магния.
46. Способ по п. 43, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление ЭДТА для хелатирования ионов магния.
47. Способ по п. 43, в котором стадия (с) включает ионы магния, а обработка на стадии (d) включает добавление ЭДТА для хелатирования ионов магния эквимолярным способом для создания идеальных буферных условий для метилтрансферазы.
48. Способ по п. 43, в котором стадия (е) включает добавление иона магния на повторяющейся стадии (с) для создания идеальных условий буфера для удлинения праймера с целью удлинения праймера.
49. Способ по п. 43, где метилтрансферазой является DNMT1.
50. Способ по п. 43, где реагентом для превращения цитозиновых остатков в урацил является бисульфит натрия.
51. Способ по п. 43, в котором реагент для превращения цитозиновых остатков в урацил представляет собой фермент семейства APOBEC.
52. Способ по п. 43, где реагентом для превращения цитозиновых остатков в урацил является APOBEC3A.
53. Способ по п. 43, где последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой ДНК целого генома, полученную из одной клетки.
54. Способ по п. 43, где последовательность двухцепочечной ДНК представляет собой геномную ДНК из раковой клетки или циркулирующей опухолевой клетки.
55. Способ по п. 43, где последовательностью двухцепочечной ДНК является внеклеточная геномная ДНК опухолевых клеток, полученная из образца крови индивидуума.
56. Способ по п. 43, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 20 раз.
57. Способ по п. 43, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 10 раз.
58. Способ по п. 43, в котором стадии (b) - (d) повторяют от 1 до 5 раз.
59. Способ по п. 43, где праймеры представляют собой онкоспецифические праймеры.
60. Способ по п. 43, в котором определение паттернов метилированного цитозина включает секвенирование следующего поколения, специфическую для метилирования кПЦР или выявляющую метилирование микроматрицу.
61. Способ по п. 43, где рак представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из инвазивной карциномы молочной железы, аденокарциномы толстой кишки, гепатоцеллюлярной карциномы печени, аденокарциномы предстательной железы, аденокарциномы желудка и карциномы эндометрия.