Особенности дифференцировки Т-лимфоцитов при угрозе прерывания беременности

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Иваненкова Н.И., Борзова Н.Ю., Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В.

Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова,

г. Иваново

ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ УГРОЗЕ ПРЕРЫВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

Цель исследования - выявить особенности дифференцировки Т-клеток памяти в группах женщин с угрозой спорадического и привычного выкидыша.

Установлено, что у женщин с угрозой спорадического выкидыша достоверно повышалось содержание Тет в популяции Т-хелперов. Тогда как у женщин с угрозой привычного выкидыша отмечалось достоверное повышение содержания Тетга в популяции CD4^ CD8+ лимфоцитов и достоверное снижение центральных клеток в популяции Т-хелпе-ров и снижение претерминально-дифференцированных клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: угрожающий выкидыш; привычное невынашивание беременности; дифференцировка Т-лимфоцитов.

Ivanenkova N.I., Borzova N.Yu., Sotnikova N.Yu., Kudryashova A.V.

Federal State Research Institute of Maternity and Childhood by V.N. Gorodkov, Ivanovo CHARACTER OF THE DIFFERENTIATION OF T LYMPHOCYTES IN THE THREATENED ABORTION Research objective - to reveal the character of differentiation of memory T-cells in women with threatened sporadic and recurrent spontaneous abortion.

It is established that in women with threatened sporadic abortion the amount of Тem cells in Th subpopulation was significantly raised. Whereas in women with threatened recurrent spontaneous abortion the significant increase of Тemra level in CD4+ and CD8+ lymphocytes subsets was noted, and the decrease in the amount of central memory cells in populations of Th and in the preterminally-differentiated memory cells in the cytotoxic T-lymphocytes population was seen.

KEY WORDS: threatened abortion; recurrent spontaneousl abortion; differentiation of T-lymphocytes memory cells.

Невынашивание беременности остается одной из самых актуальных проблем современного акушерства и гинекологии, так как не только приводит к снижению рождаемости, но и отрицательно сказывается на репродуктивном здоровье и качестве жизни женщины. За последние годы проведено достаточно исследований и получено много данных об этиологии и патогенезе невынашивания беременности, однако уровень данной патологии не имеет тенденции к снижению и остается неизменным, составляя, по данным разных авторов, от 2 до 55 %, достигая в первом триместре гестации 50 %, при этом 25 % из этого числа приходится на долю привычного невынашивания [1-4].

Этиология спорадического и привычного невынашивания беременности различна. Если первое часто обусловлено аномалиями развития плода, то привычное невынашивание имеет более сложный генез и ведет к возрастанию риска прерывания следующей беременности [5, 6]. В настоящее время одним из приоритетных направлений является изучение иммунологических аспектов невынашивания беременности. Исследования последних лет показывают, что плацентарный барьер не является абсолютно непроницаемым для антигенов плода [7]. Поступление их в кровоток беременной женщины создает предпосыл-

Корреспонденцию адресовать:

ИВАНЕНКОВА Наталья Ивановна,

153045, г. Иваново, ул. Победы, д. 20,

ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Тел.: 8 (4932) 33-70-55.

E-mail: ivanenkov.im@mail.ru

ки для возникновения специфического ответа иммунной системы матери на антигены плодового происхождения и формирования эффекторных клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-хелперов. Однако характер дифференцировки Т-лимфоцитов и формирования клеток памяти при угрозе прерывания беременности в ранние сроки не изучен.

Цель исследования — выявить особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов у женщин с физиологически протекающей беременностью и угрозой ее прерывания в ранние сроки гестации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследованы 110 беременных женщин в сроке гестации до 12 недель, из них 37 женщин с физиологически протекающей беременностью составили контрольную группу, 34 женщины с угрозой спорадического выкидыша включены в 1 группу и 39 женщин с угрозой выкидыша и привычным невынашиванием беременности в анамнезе — во 2 группу. У пациенток 2 группы в анамнезе было от 2 до 5 самопроизвольных выкидышей ранних сроков.

Кроме стандартного клинико-лабораторного обследования, ультразвукового исследования, проводилось определение уровня антител классов IgM и IgG к HSV1,2, CMV, EBV, Chlamydia trachomatis и Toxoplasma gondii, IgA и IgG антител к Ureaplasma ure-alyticum, Mycoplasma hominis, IgG антител к Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae методом иммуноферментного анализа на микропланшет-

сУ$(ръ и^ггя в^^узбассе

№2(57) 2014

ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ УГРОЗЕ ПРЕРЫВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

ном ридере Multiscan EX Labsystems с использованием коммерческих тест-систем.

Методом трехцветной проточной цитофлюоромет-рии в периферической венозной крови определяли содержание наивных клеток — Tn (CD45RA+CD62 L+), центральных клеток памяти — Tcm (CD45RA-CD62L+), претерминально-дифференцированных — Tem (CD45RA-CD62L-) и терминально-дифференцированных — Temra (CD45RA+CD62L-) клеток памяти в популяциях цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) и Т-хелперов (CD4+) на проточном цитофлюоримет-ре FACSCantoII в программе FACSDiva. В работе использовали моноклональные антитела: анти-CD8 PerCP-Cy5.5 (clone RPA-T4), анти-CD45RA APC (clone HI100), анти-CD62L FITC (clone DREG-56).

Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000. Достоверность различий сравниваемых показателей определялась по t-критерию Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показывают исследования различных авторов, процесс формирования клеток памяти в популяции Т-лимфоцитов во многом определяется длительностью воздействия антигенной (АГ) стимуляции, в том числе и АГ инфекционных возбудителей [8]. Кроме того, известно, что с возрастом в организме накапливается содержание различных клонов клеток памяти [9].

Средний возраст обследованных в контрольной группе составил 26,75 ± 1,15 лет, и был сопоставим с возрастом женщин в 1-й (28,5 ±

0,97 лет; р = 0,243 ) и 2-й (29,68 ± 0,73 лет; p = 0,05) группах. Частота встречаемости маркеров активного вирусного и бактериального инфицирования изучаемого спектра инфекций в группе контроля составила 35,1 %, в 1-й группе — 41,2 %, во 2-й группе — 37,8 % (без достоверных различий между группами). Достоверных различий в частоте выявления маркеров хронических инфекций в контрольной, 1 и 2 группах выявлено не было: 75,7 %, 76,5 %,

62,2 %, соответственно. Таким образом, сравниваемые группы были сопоставимы по среднему возрасту и наличию маркеров острой и хронической инфекции.

Проанализировав данные о характере дифферен-цировки Т-лимфоцитов в популяции Т-хелперов установлено, что в 1-й группе отмечалось достоверное повышение уровня претерминально-дифференциро-ванных клеток памяти по сравнению с показателями группы контроля (р = 0,038), а во 2-й группе достоверно снижалось содержание центральных клеток памяти (р = 0,041) и повышалось содержание терминально-дифференцированных клеток памяти (р = 0,029) по сравнению с таковым в группе контроля (табл. 1).

Сравнительный анализ данных в 1 и 2 группах показал, что в группе женщин с привычным невынашиванием уровень CD4+ Temra был достоверно выше, чем в группе с угрозой спорадического выкидыша (р = 0,016).

Наряду с этим, были проанализированы данные дифференцировки клеток памяти в популяции CD8+ лимфоцитов (табл. 2).

Выявлено, что в группе пациенток с привычным невынашиванием беременности достоверно повышалось содержание Temra по сравнению с группой женщин с неосложненной беременностью (р = 0,022) и

Таблица 1

Содержание наивных клеток и клеток памяти в популяции периферических CD4+ лимфоцитов

Показатель % Контрольная 1 группа 2 группа

группа

CD45RA+CD62L+ (Tn) 35,99 ± 1,89 33,98 ± 1,71 33,24 ± 2,17

CD45RA-CD62L+ (Tcm) 38,46 ± 1,65 35,23 ± 1,24 33,57 ± 1,67*

CD45RA-CD62L- (Tem) 23,12 ± 1,81 28,39 ± 1,70* 23,79 ± 2,08

CD45RA+CD62L- (Temra) 2,50 ± 0,45 2,40 ± 0,36 4,42 ± 0,73*°

Примечание: * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с контрольной группой (* p < 0,05); ° - коэффициент достоверности разности результатов 2 группы по сравнению с 1 группой (° p < 0,02).

Таблица 2

Содержание наивных клеток и клеток памяти в популяции периферических CDe+лимфоцитов

Показатель % Контрольная 1 группа 2 группа

группа

CD45RA+CD62L+ (Tn) 33,99 ± 2,21 33,89 ± 1,52 36,09 ± 2,01

CD45RA-CD62L+ (Tcm) 13,90 ± 1,20 16,89 ± 1,62 12,78 ± 0,80°

CD45RA-CD62L- (Tem) 27,78 ± 1,87 26,09 ± 1,63 22,65 ± 1,48*

CD45RA+CD62L- (Temra) 22,26 ± 1,86 25,12 ± 2,14 28,46 ± 1,89*

Примечание: * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с контрольной группой (* p < 0,05); ° - коэффициент достоверности разности результатов 1 группы по сравнению со 2 группой (° p < 0,05).

Сведения об авторах:

ИВАНЕНКОВА Наталья Ивановна, аспирант, отдел акушерства и гинекологии, ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России, г. Иваново, Россия. E-mail: ivanenkov.im@mail.ru

БОРЗОВА Надежда Юрьевна, доктор мед. наук, профессор, гл. науч. сотрудник, отдел акушерства и гинекологии, «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России, г. Иваново, Россия. E-mail: www.ivniimid@ivnеt.ru

СОТНИКОВА Наталья Юрьевна, доктор мед. наук, профессор, зав. лабораторией клинической иммунологии, ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Го-родкова» Минздрава России, г. Иваново, Россия. E-mail: www.niimid.immune@mail.ru

КУДРЯШОВА Анна Владимировна, доктор биол. наук, ст. науч. сотрудник, отдел клинической иммунологии, ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Го-родкова» Минздрава России, г. Иваново, Россия.

№2(57) 2014 с/^ть и^пя вД^узбассе

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

достоверно снижалось содержание Tem по сравнению с таковым в группе контроля (р = 0,035). В группе беременных женщин с угрозой спорадического выкидыша мы не выявили достоверных изменений в содержании Tn, ^m, Tem, Temra в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с показателями в группе контроля. Между собой две группы женщин с угрозой невынашивания различались достоверно более высоким содержанием центральных клеток памяти в группе женщин с угрозой спорадического выкидыша (p = 0,028).

Обобщая полученные результаты, мы отметили, что все сравниваемые группы не имели достоверных различий между собой по возрастному показателю и наличию маркеров активной и хронической инфекции. Именно эти показатели часто обсуждаются в литературе как факторы формирования клеток памяти [5, 9]. Следовательно, выявленные различия в характере дифференцировки клеток памяти в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лим-фоцитов в группах женщин с угрозой спорадического и привычного выкидыша определялись другими факторами.

Нами установлено, что в группе женщин с угрожающим спорадическим выкидышем формирование клеток памяти отмечалось только в популяции CD4+ лимфоцитов, и в ранние сроки беременности рос пул претерминально-дифференцированных клеток памяти. Как известно, одной из причин ранних выкидышей является нарушение инвазии трофобласта, при котором отмечается неполноценность формирования плацентарного барьера, и усиленное поступление плодовых АГ в кровоток матери [10]. Пул претерминаль-но-дифференцированных клеток памяти появляется уже на 5-й день после антигенной стимуляции [11]. Процесс же инвазии трофобласта завершается к 1213-му дню внутриутробного развития. Учитывая, что минимальный срок беременности у женщин на мо-

мент обследования составлял 4-5 недель гестации, то стимуляция антигенами плодового происхождения была достаточна для формирования пула претерми-нально-дифференцированных CD4+ клеток памяти.

У женщин с привычным невынашиванием беременности наблюдаются более выраженные изменения в дифференцировке клеток в популяции CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Снижение содержания Tem в популяции Т-хелперов в этой группе женщин, скорее всего, обусловлено гибелью данных клеток, так как они способны достаточно быстро реагировать на антигенную стимуляцию, а при завершении иммунного ответа уходят в апоптоз [12]. Повышение же пула клеток Temra в популяциях CD4+ и CD8+ у женщин с привычным невынашиванием могло определяться пролиферацией ранее сформировавшихся клеток памяти в ответ на повторную стимуляцию АГ плода. Как известно, данный вид эффекторных клеток является наиболее длительно живущим и способен к циркуляции в кровотоке в течение всей жизни организма.

Таким образом, при угрожающем выкидыше, независимо от наличия или отсутствия привычного невынашивания в анамнезе, на системном уровне формируются клоны клеток памяти, способные при повторной АГ стимуляции мгновенно отвечать продукцией эффекторных цитокинов. Однако только при угрожающем привычном выкидыше в периферической крови матери выявлялся повышенный уровень CD8+ Temra, что, вероятно, свидетельствует о значимости цитотоксических реакций в патогенезе привычного невынашивания. Кроме того, существует мнение о том, что претерминально-дифференцирован-ные клетки памяти являются промежуточной стадией дифференцировки для Temra [8]. Можно предположить, что повторное прерывание беременности сопровождается нарушением эффективной элиминации Tem и формированием патологических высоко-эффекторных клеток памяти.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Мисник, В.В. Генетические и иммунологические причины привычного невынашивания беременности: автореф. дис. ... канд. мед. наук /В.В. Мисник. - М., 2004. - 151 с.

2. Сидельникова, В.М. Профилактика преждевременных родов /В.М. Сидельникова // Мать и дитя: матер. форума. - 2006. -С. 241.

3. Тетруашвили, Н.К. Роль системы цитокинов в патогенезе привычного выкидыша и преждевременных родов /Н.К Тетруашвили., В.М. Сидельникова., В.М. Верясов и др. //Вестн. Рос. ассоц. акуш.-гин. - 1999. - № 3. - С. 37-45.

4. Тетруашвили, Н.К. Роль системы цитокинов в патогенезе привычного выкидыша и преждевременных родов: автореф. дис. . канд. мед. наук /Н.К. Тетруашвили. - М., 2000. - 28 с.

5. Радзинский, В.Е. Экстраэмбриональные и околоплодные структуры при нормальной и осложненной беременности / Радзинский В.Е., Милованов А.П., Ордиянц И.М. - М., 2004. - 393 с.

6. Сидельникова, В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием: метод. пособия и клин. протоколы /В.М. Сидельникова. - М., 2013. - 224 с.

7. Sallusto, F. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance /F. Sallusto, J. Geginat, A. Lanza-vecchia //Annu. Rev. Immun. - 2004. - V. 22. - Р. 745-763.

Information about authors:

IVANENKOVA Natalya Ivanovna, postgraduate, department of obstetrics and gynecology, Federal State Research Institute of Maternity and Childhood by V.N. Gorodkov, Ivanovo, Russia. Е-mail: www.ivanenkov.im@mail.ru

BORZOVA Nadezhda Yurevna, doctor of medical sciences, professor, chief researcher, department of obstetrics and gynecology, Federal State Research Institute of Maternity and Childhood by V.N. Gorodkov, Ivanovo, Russia. Е-mail: www.ivniimid@ivnet.ru

SOTNIKOVA Natalya Yurevna, doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory of clinical immunology, Federal State Research Institute of Maternity and Childhood by V.N. Gorodkov, Ivanovo, Russia. Е-mail: www.niimid.immune@mail.ru

KUDRYASHOVA Anna Vladimirovna, doctor of biological sciences, senior scientific worker, laboratory of clinical immunology, Federal State Research Institute of Maternity and Childhood by V.N. Gorodkov, Ivanovo, Russia. Е-mail: www. niimid.immune@mail.ru

с/$(ръ и^тя в^^узбассе

№2(57) 2014

ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ УГРОЗЕ ПРЕРЫВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

8. Clonal expansions in acute EBV infection are detectable in the CD8+ and not the CD4+ subset and persist with a variable CD45 phenotype /Maini M.K. et al. //J. Immun. - 2000. - V. 165. - P. 5729-5737.

9. Koch, S. Multiparameter flow cytometric analysis of CD4 and CD8 T cell subsets in young and old people /S. Koch, A. Larbi, E. Derhovanes-sian et al. //Immun. Ageing. - 2008. - V. 5. - P. 6.

10. Сидорова, И.С. Клинико-диагностические аспекты фетоплацентарной недостаточности /И.С. Сидорова, И.О. Макаров. - М., 2005. -296.с.

11. Life and death of lymphocytes: a role in immunesenescence /S. Gupta, H. Su, R. Bi et al. //Immun. & Ageing. - 2005. - V. 2. - P. 1-15.

12. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and pre-eclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles /S.J. Germain, G.P. Sacks, S.R.Sooranna et al. //J. Immun. - 2007. - V. 178. - Р. 5949-5956.

Кадырова Л.В., Сотникова Н.Ю.

Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова,

г. Иваново

СЫВОРОТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ IL-2 И IL-15 В ДИНАМИКЕ БЕРЕМЕННОСТИ

Цитокины участвуют в осуществлении практически всех этапов гестационного процесса. Помимо этого, система цитокинов является относительно доступной для исследования при различных физиологических и патологических состояниях, а изменение характера продукции цитокинов могут служить дополнительным диагностическим критерием нарушений гомеостаза.

Цель исследования - определить особенности продукции IL-2 и IL-15 при неосложненном течении беременности и при угрозе прерывания беременности в 1 триместре гестации.

Материалом для исследований служила периферическая венозная кровь из локтевой вены 68женщин. Обследовались 15 небеременных женщин и 40 женщин с неосложненным течением беременности, обследованных трехратно в 1, 2 и 3 триместрах гестации. А также 13 женщин 1 триместра гестации с клиническими признаками угрозы прерывания беременности. Содержание IL-2 и IL-15 в сыворотке крови определяли методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems. Результаты исследований показали, что наступление беременности сопровождалось достоверным увеличением содержания IL-2 и IL-15 в сыворотке периферической крови по сравнению с аналогичным показателем группы небеременных доноров. Во 2 триместре беременности нами также отмечалось увеличение уровня исследуемых цитокинов. В 3 триместре беременности наблюдалось снижение уровня IL-2 относительно аналогичного показателя 2 триместра гестации. При угрозе невынашивания в ранние сроки беременности мы отмечали увеличение количества IL-2 и IL-15 по сравнению с группой женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации. Таким образом, при беременности мы отмечаем выраженные изменения цитокинового профиля как при неосложненной беременности, так и при угрозе прерывания беременности в 1 триместре гестации.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: IL-2: IL-15; беременность; угроза самопроизвольного выкидыша.

Kadyrova L.V., Sotnikova N. Yu.

Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood by V.N. Gorodkov, Ivanovo THE SERUM LEVEL OF IL-2 AND IL-15 IN THE DYNAMIC OF PREGNANCY

Cytokines participate practically in mediation of all stages of gestational process. Besides, the cytokine system is relatively available for the investigation during different physiological and pathological conditions, and changes in the character of cytokine production can be used as additional diagnostic criterion for the homeostasis impairment.

The aim of the study - to assess the character of IL-2 and IL-15 production during normal pregnancy and threatened spontaneous abortion in the first trimester of gestation.

Peripheral venous blood from 68 women was used as the material for the investigation. 15 non pregnant and 40 women with normal pregnancy were examined three times in the 1, 2 and 3 trimesters of gestation. 13 patients with clinical manifestations of threatened abortion in the 1 trimester of gestation were examined as well. The serum level of IL-2 and IL-15 was studied by ELISA method using Multiscan EX Labsystems reader.

The results of the investigation had shown, that the onset of pregnancy was followed by the significant elevation of IL-2 and IL-15 serum level in comparison to that of non pregnant donors. In the 2 trimester of pregnancy we had also noted the increase of the studied cytokines level. In the 3 trimester of pregnancy the decrease of IL-2 and IL-15 level comparing to that in the 2 trimester of gestation. In threatened abortion at early stages of pregnancy we noted rise of IL-2 and IL-15 serum level comparing to that in women with early normal pregnancy. Thus, the cytokine profile during pregnancy shifted significantly both in the dynamic of normal pregnancy and early threatened abortion as well.

KEY WORDS: IL-2; IL-15; pregnancy: threatened spontaneous abortion.

Корреспонденцию адресовать:

КАДЫРОВА Людмила Викторовна,

153045, г. Иваново, ул. Победы, д. 20,

ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Тел.: 8 (4932)-33-83-20.

E-mail: niimid.immune@mail.ru

Цитокины традиционно были предметом особого внимания со стороны исследователей, занимающихся проблемами иммунологии репродукции. Это связано с тем, что цитокины участвуют в осуществлении практически всех этапов гестационного процесса [1]. Помимо этого, система ци-

№2(57) 2014 с/^ть и^пя вс7|узбассе