АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА, ИЛИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА, ИЛИ ЭШЕРИХИОЗА
ANTIBACTERIAL AGENTS AND METHOD FOR TREATING INTESTINAL YERSINIOSIS OR PSEUDOTUBERCULOSIS, OR COLIBACILLOSIS

Изобретение относится к медицине, более точно к фармации, и может быть использовано для приготовления лечебного средства для борьбы с кишечными инфекциями.
Кишечные инфекции - это целая группа заразных заболеваний, которые в первую очередь повреждают пищеварительный тракт. Их больше тридцати, самое безобидное из них - пищевое отравление, а самое опасное - холера. Кишечные инфекции вызываются бактериями или вирусами и протекают, как правило, очень тяжело. Заражение возможно воздушно-капельным, пищевым, водным, фекально-оральным или контактно-бытовым путем.
В ходе длительной эволюции человеческого организма и микроорганизмов сформировался единый микробно-тканевый комплекс, объединяющий микроорганизмы и стенку кишечника человека. При рассогласовании взаимоприемлемых отношений между микрофлорой и слизистой оболочкой кишечника и возникновении микроэкологических нарушений в нем с неизбежностью наступает расстройство пищеварения, нарушение детоксикации и выделения токсических веществ, нарушение регуляции гомеостаза, кроветворения, иммунной защиты [Kelly D., Conway S., Aminov R. Commensal gut bacteria: mechanism of immune modulation // Trends Immunol. - 2005. - Vol. 26. - P. 326-333].
На протяжении многих лет с целью восстановления нормальной кишечной микробиоты применяли пробиотикотерапию. Сами по себе пробиотики - это безвредные (непатогенные) микроорганизмы, которые при введении в организм в определенных дозах могут оказывать на него положительное влияние [Sanders М.Е., Gibson G., Gill H.C. et al. Probiotics: their potential to impact human health. Council for Agricultural Science and Technology (CAST). Issue Paper, CAST, Ames, 2007. 20 p.].
Для борьбы с кишечными инфекциями также применяют пробиотики. Но даже при длительном применении пробиотиков, как об этом свидетельствует опыт клиницистов, их положительный эффект носит временный характер или полностью отсутствует [Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза // Эффективная фармакотерапия. - 2011. - №3. - С. 77-84].
Пробиотики представлены такими препаратами, как: «Биобаланс К», «Бификол», «Лактобактерин», «Ацилакт» и другие сухие препараты. Однако, как показала практика, применение пробиотиков не обеспечивает требуемый терапевтический эффект.Это обусловлено тем, что они являются «чужеродными» для микроорганизмов (микробиоценоза) конкретного человека. Иммунитет биопленки практически сводит на нет действие пробиотиков. Микробы, выращенные искусственно, являются инородными, они отторгаются вследствие бионесовместимости (см. Сателлитный симпозиум. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Новые подходы терапии заболеваний желудочно-кишечной системы. Под ред. Н.А. Токаревой. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2011, №3, стр. 77-84; опубликованные заявки на изобретения РФ №94021356, №94027332; патент РФ №2572225).
Существует еще группа антисептиков для борьбы с кишечными инфекциями, таких как интестопан, интетрикс и энтероседив, эрсефурил (нифураксазид). Однако эффективность лечения острых кишечных инфекций вышеуказанными лекарственными средствами недостаточна и, как правило, носит вспомогательный характер.
В настоящее время для борьбы с кишечными инфекциями широко применяются антибактериальные средства, действующие на возбудителей кишечных инфекций бактерицидно или бактериостатически. Наиболее распространенными препаратами являются аминопенициллины, цефалоспорины, монобактамы, карбапенемы, аминогликозиды, тетрациклины, хлорамфеникол, полимиксины, хинолоны, фторхинолоны, нитрофураны, комбинированные препараты сульфаниламидов с триметопримом, а также ансамицины (рифамицины).
В патенте РФ №2564014/15 описаны антибактериальное средство и способ лечения кишечного иерсиниоза, или псевдотуберкулеза, или эшерихиоза, содержащее молочную кислоту, калий фосфорнокислый однозамещенный, валин, треонин, аспарагиновую кислоту, масляную кислоту, пропионовую кислоту. Однако, приготовление этого средства сложного состава требует много времени и финансовых затрат. Это средство трудно стандартизировать, дозировать, его состав имеет форму раствора. Оно еще не вошло в клиническую практику и не имеет промышленного производства.
На практике для лечения кишечных инфекций широко применяется антибиотикотерапия как мера воздействия на этиологический фактор при острых кишечных инфекциях, признается необходимой и выступает на первый план. Однако проводимая антибиотикотерапия при острых кишечных инфекциях оказывает ингибирующее действие как на специфический иммунитет, так и на факторы неспецифической защиты, препятствует выработке полноценного постинфекционного иммунитета, подавляет продукцию иммуноглобулинов М и G, снижает активность лизоцима сыворотки крови, фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов, активность гидролитических ферментов в клеточных структурах крови, способствует возникновению суперинфекцнй, формированию дисбактериоза, длительного бактерионосительства, затяжного, рецидивирующего и хронического течения болезни (см. Автореферат дисс. д.м.н. Бобровицкая А.И. «Факторы естественной резистентности организма при острых кишечных инфекциях у детей в условиях антибиотикотерапии и разработка методов их стимуляции».
Таким образом, недостатком применения всех антибиотиков является то, что они способствуют развитию дисбактериоза и более медленному восстановлению морфофункциональной структуры слизистой оболочки кишечника после лечения.
Одним из наиболее мощных антибиотиков (антибиотиком резерва) для устранения опасных кишечных инфекций является рифампицин. Этот антибиотик обладает широким спектром действия и эффективен в отношении многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, возбудителей болезни легионеров, бруцеллеза, лепры, туберкулеза. Действует он бактерицидно (см. патент РФ №2418585; Еремушкина Я.М. Принципы лечения острых кишечных инфекций. Приложение РМЖ «Болезни органов пищеварения», №1, 2006 г., с. 61; Кишечная инфекция у детей. Медицинский справочник заболеваний / http://med-zabolevaniya.ru/kishechnaya-infekciya-u-detev.html; Е.В. Горбачева. Фармакоэпидемиологический анализ использования антимикробных препаратов у детей при острых кишечных инфекциях в Дальневосточном регионе. Вестник ВолгГМУ, Выпуск 3 (39), 2011, с. 109-112).
Техническое решение по (см. Е.В. Горбачева. Фармакоэпидемиологический анализ использования антимикробных препаратов у детей при острых кишечных инфекциях в Дальневосточном регионе. Вестник ВолгГМУ, Выпуск 3 (39), 2011, с. 109-112) с использованием антибиотика Рифампицин для лечения кишечных инфекций было выбрано нами в качестве прототипа заявленного изобретения в части средства, а способ лечения кишечных инфекций с помощью рифампицина выбран в качестве прототипа в части способ.
Неожиданно было установлено, что известный лекарственный препарат лактат кальция (кальций молочнокислый) оказывает выраженное протективное действие при таких кишечных инфекциях, как кишечный иерсиниоз, псевдотуберкулез и эшерихиоз.
Лактат кальция используется в медицине как источник кальция при остеопорозах, для поддержания сердечной деятельности, для осуществления передачи нервных импульсов (http://www.neboleem.net/laktat-kalсija.php).
Лактат кальция используется также в качестве пищевой добавки, поскольку способен предупредить окисление и некоторые изменения в продуктах питания (см. патенты РФ №2512330, №2507911, 2202213).
Лактат кальция применяют в фармацевтической промышленности в качестве наполнителя при изготовлении твердых лекарственных форм. В этой связи необходимо подчеркнуть следующее.
При изучении состава надосадочной жидкости нативной культуры лакобацилл Lactobacillus plantarum 8Р-А3 методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием нами было показано, что основным ее компонентом является молочная кислота, составляющая до 70% от общего количества метаболитов. Логично предположить, что в живом организме лактобациллы из состава кишечной микробиоты, продуцируя молочную кислоту, содействуют «витальному» синтезу лактата кальция, который, в свою очередь, участвует в указанной выше реакции синтеза источника энергии АТФ.
Являясь ведущим компонентом метаболитов лактобацилл и одним из основных компонентов метаболитов бифидобактерий, лактат кальция теоретически можно отнести к перспективному классу метаболитных пробиотиков - метабиотиков, которые способны положительно влиять на состояние микробно-тканевого комплекса, поддерживать оптимальный уровень колонизационной резистентности, а также стимулировать размножение в кишечнике ведущих представителей индигенной микробиоты при кишечных инфекциях.
Техническим результатом заявленного изобретения как в части средства, так и в части способ является повышение терапевтической активности средства и способа за счет повышения колонизационной резистентности кишечника больного, выражающейся в наступлении противоинфекционного эффекта у большего количества испытуемых, а также исключение развития дисбактериоза (дисбиоза) и предупреждения тем самым морфофункциональных нарушений слизистой оболочки кишечника.
Технический результат в части средство достигается тем, что антибактериальным средством для лечения кишечного иерсиниоза, или псевдотуберкулеза, или эшерихиоза, является органическое соединение - лактат кальция в эффективной терапевтической дозе, обеспечивающей колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника.
Антибактериальное средство лактат кальция может иметь форму таблеток по 0,5 г.
Антибактериальное средство лактат кальция может иметь форму порошка. Антибактериальное средство лактат кальция может иметь форму раствора.
Технический результат в части способ достигается тем, что в известном способе лечения кишечного иерсиниоза, или псевдотуберкулеза, или эшерихиоза путем энтерального введения в организм антибактериального средства, обладающего противомикробным действием, в качестве антибактериального средства используют лактат кальция в эффективной терапевтической дозе, обеспечивающей колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника.
Эффективная суточная терапевтическая доза для мыши равна 1,7-2,6 мг.
Эффективная суточная терапевтическая доза для взрослого человека равна 0,5-1,5 г.
Для доказательства указанного технического результата были проведены следующие исследования.
В эксперименте создавались следующие модели кишечных инфекций: эшерехиоз, вызванный энтеротоксикогенной кишечной палочкой, иерсиниоз и псевдотуберкулез.
Так, энтеротоксигенная кишечная палочка (Escherichia coli GE) устойчива к ряду антибактериальных препаратов (содержит ген NDM-1, детерминирующий синтез металло-β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к пенициллинам, цефалоспоринам и карбапенемам) и патогенна для пациентов в реанимационных отделениях интенсивной терапии и для ослабленных больных.
Спектр заболеваний включает инфекции различной локализации - инфекции мочевыводящих путей, гнойно-септические инфекции, инфекции ран, сепсис.
Кишечный иерсиниоз - острая зоонозная бактериальная инфекция, вызываемая микроорганизмами Yersinia enterocolitica. Для болезни характерны фекально-оральный механизм передачи возбудителя, полиморфизм клинической симптоматики, нередко стертая картина начальных проявлений болезни, сходство клинических проявлений с другими заболеваниями кишечника различной этиологии, вовлечение в патоморфологический процесс ряда органов и систем, преимущественная спорадичность возникновения заболевания, возможность хронизации.
Псевдотуберкулез - острая зоонозная бактериальная инфекция, вызываемая возбудителем Yersinia pseudotuberculosis. Для нее характерны: полиморфизм клинических проявлений, поражение желудочно-кишечного тракта и суставов, кожные высыпания, интоксикация, лихорадка, склонность к рецидивам, обострениям и переходу в хроническую форму. Смертность при септицемии псевдотуберкулезной этиологии может достигать 75%, несмотря на проводимое лечение.
В экспериментах использовали:
50
7
- энтеротоксигенный штамм кишечной палочки Escherichia coli GE (ЛД 8,9⋅10 КОЕ), отличается от лабораторного штамма Escherichia coli 803 большей (в 10 раз) устойчивостью к дезинфектантам. Штамм выделен от больного с симптомами гастроэнтероколита. Выращивание штамма Escherichia coli GE проводили в бульоне и на агаре Хоттингера при температуре 37°C;
50
50
8
- кальцийнезависимый штамм бактерий кишечного иерсиниоза Y. enterocolitica 1407 серотипа 0:9, содержит плазмиду с молекулярной массой 42 МДа. Штамм выделен от больного с манифестной формой заболевания, выраженными симптомами гастроэнтероколита и поражением суставов. Величина ЛД для белых мышей при пероральном способе введения составляет 7,4-107 живых микробов, заражающая доза 10 ЛД (7,4⋅10 КОЕ) обеспечивает развитие инфекционного процесса при пероральном введении животным. Выращивание штамма Y. enterocolitica 1407 с учетом его специфической активности проводили в бульоне и на агаре Хоттингера при температуре 24°C;
4
50
- патогенный штамм псевдотуберкулезного микроба Y. pseudotuberculosis 1471 I серотипа, содержащий плазмиду кальцийзависимости с молекулярной массой 47 МДа. Величина для белых мышей при пероральном введении составляет 8,5⋅10 живых микробов. Выращивание культуры псевдотуберкулезного микроба с учетом его психрофильности проводили в бульоне и на агаре Хоттингера при температуре (4-5)°C. Заражающая доза возбудителя псевдотуберкулеза Y. pseudotuberculosis 147 составила 10 ЛД (855000 КОЕ), что обеспечивало гарантированное развитие инфекционного процесса при пероральном введении бактериальной суспензии;
выращивание представителей кишечной микробиоты, выделенных из фекалий животных, проводили на селективной среде с гемином в микроаэрофильных условиях при температуре 37°CЖ
- лактат кальция российского производства;
- антибиотик рифампицин для перорального введения.
9
-1
6
-1
7
-1
4
-1
В начале экспериментов было определено состояние микробиоты у интактных животных, которые находились на обычном пищевом рационе. Было установлено, что общее количество микроорганизмов составило (6,5-6,9)⋅10 КОЕ⋅г, бифидобактерий - (5,5-5,9)⋅10 КОЕ⋅г; лактобацилл - (2,3-2,6)⋅10 КОЕ⋅г; эшерихиий - (2,0-2,1)⋅10 КОЕ⋅г.
Результаты наблюдений представлены в таблице №1 «Протективная эффективность лактата кальция» и таблице №2 «Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом инфицированных конвенциональных белых мышей».
50
Согласно этим таблицам при кишечной инфекции, вызванной энтеротоксигенной кишечной палочкой (E. coli GE) при вводимой дозе бактерий, равной 10 ЛД, возникает смертельная инфекция с обильным размножением микробов в кишечнике и к 3 сут в фекалиях выявлялась только культура штамма GE. Падеж животных начался на 7 сут (4 шт), 8 сут (3 шт), 9 сут (1 шт), 10 сут (2 шт). Инфекция купируется введением per os рифампицина и лактата кальция.
Лактат кальция в дозировке 2,6 мг предотвращает развитие летальной инфекции, но в дозировке 1,7 мг у некоторых животных протективный эффект не достигается в полном объеме (падеж 2 животных). Как при введении рифампицина, так и лактата кальция, к 10 суткам эксперимента у выживших животных выявляется пониженная численность микробиоты и отдельных ее представителей, что свидетельствует:
1) о перенесенной инфекции;
2) о достаточной защищенности организма;
3) о формировании колонизационной резистентности слизистой кишечника под воздействием лактата кальция;
4) в фекалиях животных, получавших лактат кальция, морфологически определяются практически те же виды бактерий, что и у интактных животных;
5) отличный внешний вид животных, особенно получавших лактат кальция, их активность, опрятность и т.д. свидетельствуют о сохранении функций микробиоты, а восстановление ее исходной численности - функция времени.
При моделировании лечения кишечного иерсиниоза (К enterocolitica 1407) обнаружено, что бактерии чувствительны к большинству лекарственных средств. Из-за трудностей диагностики иерсиниоз своевременно не лечится и превращается в терапевтическую или хирургическую проблему. Летальность невелика, но возможны различные осложнения. Белые мыши относятся к чувствительному к иерсиниозу виду: в эксперименте погибло 9 из 10 инфицированных животных; из фекалий животных выделяются иерсинии в больших количествах, но в то же время наблюдается угнетение индигенной микробиоты.
Введение рифампицина привело к излечению 8 из 10 взятых в опыт животных: в кишечном содержимом павших животных доминируют бактерии кишечного иерсиниоза; у выживших животных иерсинии из фекалий не выделялись, а содержание собственной микробиоты снижено как от пребывания иерсиний в кишечнике, так и от воздействия антибиотика.
Лактат кальция, вводимый перорально, в дозе 2,6 мг полностью предотвратил летальный исход; при дозе 1,7 мг выжило 9 из 10 инфицированных животных. В кишечном содержимом павшего животного доминировали бактерии кишечного иерсиниоза, а содержание собственной микробиоты было в значительной степени редуцировано. У выживших после введения лактата кальция животных выявлялось снижение численности микробиоты и отдельных ее представителей по сравнению с чистыми (интактными) животными.
В тоже время следует отметить, что интенсивность прироста кишечной микробиоты наблюдалась в период с 7 по 10 сут, что может свидетельствовать о полном купировании инфекционного процесса, сохранении колонизационной резистентности слизистой кишечника и последующем восстановлении численности кишечной микробиоты.
При моделировании псевдотуберкулеза (Y. pseudotuberculosis 147) выявлено, что бактерии более вирулентны, чем предыдущие бактерии. При септической форме инфекции летальность может доходить до 75%. Поражение желудочно-кишечного тракта является наиболее ярким и довольно быстрым проявлением инфекции.
50
Считается, что высокая патогенность ассоциируется с психрофильностью возбудителя, синхронизацией во времени экспрессии факторов патогенности и в целом фенотипизации бактерий, «готовых» безотлагательно инициировать инфекционный процесс. Белые мыши чувствительны к иерсиниям псевдотуберкулеза. Как следует из таблицы 1 и таблицы №2, от 10 ЛД, введенных перорально, пали все животные. Из фекалий павших животных на среде Серова выделена чистая культура исходного штамма, собственная микробиота практически полностью угнетена.
Рифампицин в эксперименте при лечебном курсе введения белым мышам per os излечивает до 60% животных, что подтверждено настоящим экспериментом: в кишечном содержимом павших животных доминируют бактерии псевдотуберкулеза, выделенные на среде Серова. У выживших животных иерсинии из фекалий не выделялись, а содержание собственной микробиоты снижено как вследствие частичной (начальной, т.е. в течение первых 24 ч после инфицирования) колонизации иерсиний в кишечнике, так и от воздействия микробных токсинов и самого антибиотика.
50
50
Лактат кальция, введенный перорально инфицированным летальной дозой (10 ЛД) животным в суточной дозировке 2,6 мг, полностью оборвал развитие инфекционного процесса: и хотя содержание микробиоты в кишечном содержимом на 10 сут не дотягивает до уровня здоровых животных, необходимо сделать скидку на глубокий дисбиоз, вызванный первичной колонизацией патогеном слизистой кишечника (10 ЛД). Лактат кальция в дозе 1,7 мг защитил от неизбежного падежа 9 из 10 животных, обеспечив состояние колонизационной резистентности слизистой кишечника. У погибшего животного на среде Серова выделена чистая культура исходного штамма Y. pseudotuberculosis 147.
Рассматривая действие лактата кальция как протективного фактора при кишечных инфекциях за счет повышения колонизационной резистентности и стимуляции кишечной микробиоты, необходимо иметь в виду следующее:
1) антибиотики действуют на микробы (патогенные и индигенные) и поэтому восстановление кишечной микробиоты происходит после уничтожения патогенов, снижении численности самой микробиоты и при одновременном влиянии на колонизационную резистентность слизистой кишечника;
2) коррекцию нарушений микробиоты начинают спустя 3-4 суток после прекращения перорального введения антибиотика (при антибиотико-ассоциированном дисбиозе);
3) в случае кишечных патогенов дисбиотические нарушения в кишечнике возникают в результате колонизации и экспансивного роста патогенных бактерий и вытеснения индигенных микроорганизмов в результате их бионесовместимости с патогенами и прямого повреждающего действия факторов патогенности последних на микроорганизмы биопленки и на эпителиоциты слизистой оболочки кишечника;
4) лактат кальция действует на микробы иначе, по другому механизму (бактерицидно и как стимулятор кишечной микробиоты), однако неизвестно, когда завершается элиминация патогена и лактат кальция максимально начинает стимулировать индигенную микробиоту при восстановленной колонизационной резистентности.
Или же, что наиболее вероятно, лактат кальция как соль молочной кислоты - основного компонента надосадочной жидкости пробиотических культур, проявляя метабиотическую активность, стимулирует рост индигенной микробиоты и тем самым в обычных условиях (условиях индуцированного дисбиоза) повышает, а в случае развития инфекционного процесса в кишечнике восстанавливает колонизационную резистентность слизистой оболочки, что приводит к выраженному лечебному эффекту вплоть до отсутствия летального исхода.
В этой связи оказываемое влияние лактата кальция на микробиоту инфицированных белых мышей должно отличаться от такового при антибиотико-ассоциированном дисбиозе как по временным параметрам, так и по скорости восстановления микробиоты.
При этом важно, что определена начальная доза (1,7 мг) лактата кальция, оказывающая влияние на состояние защищенности слизистой оболочки кишечника, а доза 2,6 мг полностью купировала развитие инфекции.
Для определения механизма действия лактата кальция были проведены исследования по определению взаимодействия лактата кальция с кишечными патогенами в опытах in vitro.
Взаимодействие лактата кальция с кишечными патогенами изучали с использованием диско-диффузионного метода. На газон посеянных на агар Хоттингера бактериальных культур E. coli GE, Y. enterocolitica 1407 и Y. pseudotuberculosis 147 помещали бязевые тест-объекты, пропитанные раствором лактата кальция (2 мг в 1 мл).
Результаты представлены на Фото 1: Зоны ингибирования лактатом кальция микробного роста штамма Е. coli 803 (A), E. coli GE (Б), Y. enterocolitica 1407 (В) и Y. pseudotuberculosis 147 (Г).
Из представленных фотографий следует, что зоны микробного лизиса сформировались непосредственно под тест-объектами (квадратиками, пропитанными раствором лактата кальция). Это дает основание полагать, что лизис микробных культур происходит в результате длительного (24 ч) контакта бактерий с тест-объектом в статических условиях и, таким образом, лактат кальция может обладать бактерицидным эффектом, в том числе и на патогенные микробы, в опытах in vivo.
На основании проведенных исследований были сделаны следующие выводы.
1. В экспериментах на конвенциональных белых мышах изучено влияние лактата кальция на колонизационную резистентность кишечника и предотвращение развития эшерихиоза, кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза при пероральном введении животным бактериальных патогенов.
2. Введенный перорально инфицированным возбудителем эшерихиоза, кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза конвенциональным белым мышам лактат кальция в суточных дозах 1,7 мг и 2,6 мг характеризуется хорошей переносимостью и отсутствием побочных эффектов.
50
3. Установлена высокая протективная эффективность лактата кальция в суточной дозе 2,6 мг при пероральном введении инфицированным возбудителями эшерихиоза, кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза конвенциональным белым мышам в количестве, равном 10 ЛД.
4. При бактериологическом изучении фекалий выживших в опытах перорального инфицирования возбудителями эшерихиоза, кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза конвенциональных белых мышей на фоне введения рифампицина выявлено снижение численности кишечной микробиоты и отдельных ее представителей в сравнении с таковой в группах животных, получавших лактат кальция в дозе 2,6 мг.