Способ повышения жизнеспособности и плодовитости плодовой мушки дрозофилы (Drosophila melanogaster)
METHOD FOR INCREASING THE VIABILITY AND FERTILITY OF THE DROSOPHILA FRUIT FLY (DROSOPHILA MELANOGASTER)

Изобретение относится к массовому культивированию насекомых, а именно к способам повышения жизнеспособности и плодовитости плодовой мушки дрозофилы (Drosophila melanogaster).
Известен способ повышения жизнеспособности и продуктивности полезных насекомых, при котором вскармливают гусениц дубового шелкопряда младших возрастов листьями кормовых растений, обработанным перед скармливанием препаратом химической природы аквааминоортопирофосфатом кобальта (II) цинка из расчета 2-3 мг на 100 г корма (патент UA 37496 U, A01K 67/04, 2008).
Недостатком данного способа является использование препарата химической природы, что ведет к дополнительным материальным затратам, и отсутствие сведений о положительном влиянии аквааминоортопирофосфатом кобальта (II) цинка на биологические показатели дрозофилы.
Известен способ стимуляции продуктивности и плодовитости мухи черной львинки, по которому используют для ее питания в период от момента выхода их из куколок до момента откладывания яиц, кормовой субстрат, содержащий смесь углеводов: сахарозы или глюкозы, лактозы и крахмала, и дополнительно - янтарную кислоту в количестве 0,05-0,15% от массы субстрата (патент RU 2692659 C1, A01K 67/033, 2019).
Однако применение данного способа ограничено сферой биотехнологии, и отсутствуют сведения о положительном влиянии янтарной кислоты на рост и развитие дрозофилы.
Известен способ стимуляции размножения насекомых с использованием витаминно-экдистеронового стимулятора насекомых (ВЭСП), преимущественно пчел, представляющего собой комплекс биологически активных веществ в виде таблеток весом 0,1 г, состоящих из витамина В12, экдистерона и наполнителя (патент RU 2034504 С2, 10.05.1995).
Недостатком данного способа является малая доступность основной функциональной субстанции препарата - экдистерона, что повышает затраты на достижение результатов, и отсутствие данных о его влиянии на жизнеспособность дрозофилы.
Известен способ массового разведения дрозофилы, включающий ее содержание в емкости с искусственным кормом и уничтожение дрозофильного клеща путем обновления зараженного корма на свежий, осуществляемого с помощью сменного дна емкости, после полного окукливания дрозофилы и обработки куколок акарицидным составом (патент SU 1598938, A01K 67/00, 1990).
Недостатком данного способа является использование сложных по конструкции лабораторных емкостей со съемным дном и акарицида, что повышает экономические затраты на содержание насекомых и увеличение выхода дрозофил.
Известен способ повышения плодовитости полезных насекомых (на примере D. melanogaster) путем скрещивания между собой предыдущих "родительских" линий и получения в результате гетерозисных форм потомков в первом поколении (гетерозисных гибридов), обработки кладок яиц на ранних стадиях онтогенеза дрозофилы красным лазерным излучением (патент UA 94452 U, G01N 33/554, 2014).
Однако данный прием приводит к большим затратам времени из-за необходимости последующего скрещивания обработанных излучением родительских линий (отобранных самцов) с интактными виргиннимы самками индивидуально в соотношении 1:1. К тому же, явление гетерозиса сохраняется только в первом поколении, а затем постепенно затухает, что приводит к необходимости периодически повторять данный процесс. Кроме этого, отсутствуют данные о положительном влиянии на другие биологические показатели дрозофилы.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ повышения жизнеспособности D. melanogaster с использованием в качестве биологически активного компонента в питательной среде экстракта гребней винограда (характеризуется высоким содержанием полифенольных соединений - 30%), включающий использование для питания дрозофил D. melanogaster искусственной питательной среды (ИПС) с добавлением экстракта гребней винограда (25 и 50 мг/мл). (Зиновьева и др. Изучение геропротекторных свойств экстракта гребней винограда на модели дрозофилы//Генетика продолжительности жизни и старения: Материалы докладов Международной конференции. - Сыктывкар, 2010. - С. 34-38.).
Недостатками известного прототипа являются:
- ограниченная двумя вариантами схема опыта, что снижает информативность полученных данных о возможном для использования диапазоне концентраций стимулирующего препарата;
- недостаточное количество оценочных биологических показателей D. melanogaster,
- способ является дорогостоящим из-за высокой нормы расхода экстракта и необходимости закупки препарата.
Цель изобретения - повышение жизнеспособности и плодовитости D. melanogaster за счет использования в качестве биологически активного компонента питательной среды экстракта, полученного из дешевого доступного сырья при одновременном снижении расхода препарата.
Указанная цель достигается тем, что в способе повышения жизнеспособности и плодовитости плодовой мушки дрозофилы (D. melanogaster), включающем использование искусственной питательной среды, согласно изобретению в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный водный раствор экстракта растений рейнутрии японской (Reynoutria japonica) в количестве 3-5% от массы питательной среды.
По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа повышения жизнеспособности и плодовитости плодовой мушки D. melanogaster являются:
1. «…в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный водный раствор экстракта растений рейнутрии японской (Reynoutria japonica)…», что позволяет:
- предложить в качестве биологически активного компонента питательной среды экстракт R. japonica для повышения жизнеспособности и плодовитости D. melanogaster,
- значительно увеличить область применения экстракта рейнутрии японской, а именно в качестве стимулятора биологических показателей дрозофилы, широко применяемой в качестве модельного объекта для оценки влияния различных факторов для исследований в области генетики, медицины, фармакологии и др.;
- расширить ассортимент экологически безопасных средств - препаратов растительного происхождения, в качестве биологически активного вещества для питания насекомых.
2. «…в количестве 3-5% от массы питательной среды», что позволяет:
- уменьшить объемы экстракта R. japonica и избежать перерасхода действующего биологически активного вещества;
- упростить процесс повышения жизнеспособности и плодовитости дрозофилы, снизить его трудоемкость.
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемый способ повышения жизнеспособности и плодовитости плодовой мушки дрозофилы (D. melanogaster) обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.
Техническим результатом изобретения является использования в качестве биологически активного компонента питательной среды экстракта, полученного из дешевого доступного сырья при одновременном снижении расхода препарата.
2
5
Предлагаемый способ повышения жизнеспособности и плодовитости плодовой мушки дрозофилы (D. melanogaster) осуществляется следующим образом. Приготовление экстракта. Листья и молодые побеги R. japonica высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстрагируют СНОН 70% (ЕtOН 70%) при температуре 95°С, проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракт темно-зеленого цвета с коричневатым оттенком и травяным ароматом. Готовый препарат хранят в герметически закрывающейся емкости из темного стекла в холодильнике. По данным С.П. Зориковой, в экстракте R. japonica, произрастающей в Приморском крае, содержится не менее 11 соединений флавоноидной природы. Общее количество флавоноидов составляет в среднем 3,66%, рутина - 1,28%, кверцетина - 0,53% (Зорикова С.П., Рейнутрия японская (Reynoutria. japonica Houtt.) в Приморском крае: автореф. дис. канд. биол. наук/С.П. Зорикова. - Владивосток, 2011. - 21 с.). Перед внесением в питательную среду необходимое количество экстракта деалкоголизируют выпариванием на водяной бане при температуре +90°С до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема. Исследования по дрозофиле проводятся по общепринятой методике (Павлов Д.И. Биотехнология в защите растений. Практикум по выполнению лабораторных работ. - Аргус, 2013. - 240 с.).
В состав искусственной питательной среды входит сахароза (3,6%), манная крупа (3,6%), дрожжи (2,4%), агар (0,64%), нистатин 250 тыс. ЕД (0,01%). Среда разливается по пробиркам объемом 80 мл. Непосредственно на стадии приготовления ИПС вносят деалкоголизированный водный экстракт R. japonica в концентрации 1%, 2%, 3%,4% и 5% от массы питательной среды, за контроль берется ИПС без добавления экстракта. Пробирки прикрываются ватно-марлевыми тампонами.
В эксперименте использовалась линия дрозофил дикого типа, собранных в природе, без учета мутаций. Для потомства изучали скорость прохождения онтогенеза, продолжительность жизни, а также индекс массы тела у пяти поколений дрозофил. Для определения исследуемых показателей (подсчетов) дрозофил наркотизировали хлороформом.
Ниже приведены примеры выполнения изобретения.
Пример 1. Для проведения эксперимента в каждую пробирку с ИПС, содержащей 5 вариантов концентраций (от 1 до 5%) деалкоголизированного водного экстракта R. japonica от массы среды, подсаживается пара - самец и самка, отобранные из лабораторной популяции, воспитанной на стандартной ИПС. В качестве контроля используется стандартная ИПС. Дрозофилы воспитываются при температуре 24-25°С и влажности воздуха 75%.
Пары формируются в первые три дня лета, чтобы исключить оплодотворение самок вне эксперимента. Через 2 суток, после откладки яиц, насекомых пересаживают в новые пробирки. Для исследования плодовитости D. melanogaster проводят учет количества мух (имаго), развившихся из отложенных родительскими особями яиц от каждого скрещивания. Оценку проводят на пяти поколениях дрозофил в 5-кратной повторности. Результаты исследования плодовитости дрозофил приведены в таблице 1.
Сравнение контрольных групп и вариантов с добавлением экстракта показало, что все изученные концентрации R. japonica положительно влияют на плодовитость дрозофил, достоверно увеличивая популяции мух и повышая жизнеспособность потомства D. melanogaster. Так, если на контроле количество особей в пяти поколениях практически неизменно (33,2-34,2 шт.), то в вариантах с экстрактом наблюдается рост количества D. melanogaster от поколения к поколению имаго. Увеличение концентрации экстракта в питательной среде до 4-5% приводит к резкому возрастанию численности дрозофил практически в 2,5 раза, достигая 72,0-80,5 шт. в пятом поколении.
Пример 2. Условия и методика проведения опыта - как в примере 1, но для исследования массы тела D. melanogaster проводят взвешивание каждой пары на 1, 10, 20, 30 и 40-е сутки. Результаты исследования динамики массы тела дрозофил приведены в таблице 2.
Исследования показали, что добавление к питательной среде экстракта R. japonica способствует увеличению массы тела дрозофил. Если на контрольном варианте масса насекомого на 40 сутки в среднем составила 0,38 мг, то в вариантах с различными концентрациями экстракта отмечается достоверное увеличение по данному показателю, особенно существенное в вариантах с 3-5 процентным содержанием экстракта, превышающего в 2,3-3,3 раза (0,89-1,25 мг) контрольный показатель. Кроме этого, использование экстракта в питательной среде способствует постепенному набору массы тела насекомых от начального этапа роста и развития мух до окончания периода наблюдений, в то время как на контроле наблюдается ее снижение с минимумом на 40 сутки, составляя 65,5% от исходного веса при постановке эксперимента.
Пример 3. Условия и методика проведения опыта - как в примере 1, но продолжительность жизни учитывается дополнительно еще по трем вариациям опыта при разных температурных режимах - 18°С, 25°С и 27°С. Каждый стеклянный садок ежедневно проверяется на смертность. Муха считается мертвой при первой проверке, если она не реагирует на механическую стимуляцию при трех проверках подряд. Результаты исследования продолжительности жизни дрозофил приведены в таблице 3.
Как показывает анализ табл. 3, экстракт R. japonica оказывает значительное стимулирующее действие на жизнеспособность дрозофил. Максимальные показатели получены при использовании 3-5% деалкоголизированных водных растворов экстракта в питательной среде, где продолжительность жизни мух составила в среднем 40-43 суток, что достоверно выше контроля на 14-23%. При этом увеличение температурного фона до 27°С оказывает положительное влияние на данный показатель.
Таким образом, анализ полученных данных, приведенных в таблицах 1-3, показал, что полученный из зеленой массы растений экстракт R. japonica является полезным биологически активным компонентом питательной среды для плодовой мушки дрозофилы D. melanogaster, обладающим полифункциональным эффектом в отношении полезных (модельных) насекомых. Он значительно улучшает важнейшие биологические показатели и физические параметры дрозофилы, тем самым повышая жизнеспособность и стимулируя ее выход. Наибольшее положительное влияние на массу тела, продолжительность жизни и плодовитость оказали водные растворы экстракта в диапазоне концентраций от 3% до 5%.