ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА PRAME, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTI-CANCER VACCINES TARGETING PRAME AND THEIR APPLICATIONS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет относительно предварительной заявки на патент США № 62/598 290, поданной 13 декабря 2017 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[002] Заявка содержит перечень последовательностей, который представлен в электронном формате ASCII и полностью включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 12 декабря 2018 года, названа 104409_000445_sequence_listing.txt и составляет 7 231 байтов по размеру.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[003] Настоящее изобретение относится к антигенам предпочтительно экспрессируемого антигена меланомы (PRAME) и молекулам нуклеиновых кислот, которые их кодируют. Настоящее изобретение также относится к вакцинам, содержащим такие иммуногены PRAME и/или молекулы нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам использования вакцин для индукции иммунных ответов и предотвращения и/или лечения субъектов, имеющих раковые клетки и опухоли, которые экспрессируют PRAME.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[004] Рак является одной из основных причин смерти во всем мире, а в Соединенных Штатах является второй по частоте причиной смерти, на которую приходится почти каждый четвертый случай смерти. Рынок противораковых вакцин быстро растет. Эффективные противоопухолевые вакцины могут использоваться для предотвращения роста опухоли и/или могут использоваться в качестве более эффективной, менее токсичной альтернативы стандартному лечению пациентов с запущенными формами рака. Антигеном, ассоциированным с раком, и, следовательно, мишенью для противоопухолевых вакцин является PRAME.
[005] PRAME, первоначально идентифицированный как ген, кодирующий ограниченный антигенный пептид HLA-A24 при меланоме человека, запускает иммунные ответы, опосредованные аутологичными цитотоксическими Т-клетками. Человеческий ген PRAME, расположенный на хромосоме 22 (HSA22), кодирует белок с семью мотивами, обогащенными лейцином (LXXLL), через которые PRAME влияет на путь рецептора ретиноевой кислоты (RAR) и приводит к ингибированию дифференцировки, вызванной RA, задержке роста и апоптозу (Epping, MT et al. The human tumor antigen PRAME is a dominant repressor of retinoic acid receptor signaling. Cell 122, 835-847, doi:10.1016/j.cell.2005.07.003 (2005)). Таким образом, PRAME действует как транскрипционный репрессор сигнальных путей, а избыточная экспрессия PRAME приводит к онкогенезу.
[006] Поскольку его экспрессия низкая или отсутствует почти во всех нормальных взрослых тканях, кроме яичек, PRAME считается антигеном яичек (CTA). Помимо меланомы, PRAME сверхэкспрессируется при множестве других злокачественных опухолей человека, включая острую и хроническую лейкемию, множественную миелому, медуллобластому, саркому, рак головы и шеи, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легких, рак почек и яичников. В исследовании карциномы яичника экспрессия PRAME была идентифицирована в 100% хирургических образцов (n=27) (Brenne, K., Nymoen, D. A., Reich, R. & Davidson, B. PRAME (preferentially expressed antigen of melanoma) is a novel marker for differentiating serous carcinoma from malignant mesothelioma. American journal of clinical pathology 137, 240-247, doi:10.1309/AJCPGA95KVSAUDMF (2012)).
[007] Профилактика, диагностика и лечение рака могут принимать различные формы. Профилактика может включать скрининг на предрасполагающие факторы (например, конкретные генетические варианты), изменение поведения (например, курение, диета и уровень физической активности) и вакцинацию против вирусов (например, от вируса гепатита В, вируса папилломы человека). Лечение может включать химиотерапию, лучевую терапию и хирургическое удаление опухоли или раковой ткани. Несмотря на наличие многочисленных способов профилактики и лечения, такие способы часто имеют ограниченный успех в эффективной профилактике и/или лечении рака.
in vivo
[008] Представляют интерес вакцины для лечения и профилактики рака. Однако существующие вакцины, нацеленные на антигены опухолевых клеток, ограничены плохой экспрессией антигена . Соответственно, в данной области техники сохраняется потребность в безопасных и эффективных вакцинах и способах их применения для профилактики и/или лечения рака и снижения смертности у субъектов, страдающих от рака.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[009] Настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие SEQ ID NO:1, и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1. В дополнительных вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты содержат последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в нуклеотидах с 55 по 1584 последовательности SEQ ID NO: 1. В других дополнительных вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В дополнительных вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В других вариантах воплощения вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 формулы изобретения.
[0010] В других дополнительных вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты кодируют антиген PRAME. В некоторых вариантах воплощения кодируемый антиген PRAME содержит аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения кодированный антиген PRAME содержит SEQ ID NO: 2.
[0011] Молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, могут быть встроены в вектор, такой как плазмида или вирусный вектор. В некоторых вариантах воплощения вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленной в нуклеотидах с 55 по 1584 SEQ ID NO: 1. В дополнительных вариантах воплощения вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В других дополнительных вариантах воплощения вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
[0012] В некоторых вариантах воплощения описанные в данном документе нуклеиновые кислоты функционально связаны с регуляторным элементом. В некоторых вариантах воплощения регуляторный элемент представляет собой промотор и/или сигнал полиаденилирования. В дополнительных вариантах воплощения промотор представляет собой немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека (промотор hCMV). В других дополнительных вариантах воплощения сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH polyA).
[0013] Дополнительно в настоящем документе предложен антигенный белок PRAME, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME содержит SEQ ID NO: 2.
[0014] Также предложены вакцины, содержащие антиген PRAME, где антиген содержит аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME содержит SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME кодируется нуклеотидами с 55 по 1584 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO: 1.
[0015] В данном документе также предложены вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую раскрытый антиген PRAME. В некоторых вариантах воплощения кодируемый антиген PRAME содержит аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения кодированный антиген PRAME содержит SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME кодируется нуклеотидами с 55 по 1584 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты встроена в вектор, включая, но не ограничиваясь этим, плазмиду или вирусный вектор.
[0016] Раскрытые вакцины могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах воплощения вакцины могут дополнительно содержать адъювант. В некоторых вариантах воплощения адъювант представляет собой IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
[0017] Кроме того, в настоящем документе предложены способы лечения субъекта, имеющего клетку, характеризующуюся аберрантной экспрессией PRAME, включая введение терапевтически эффективного количества вакцины. В некоторых вариантах воплощения введение включает стадию электропорации. В других вариантах воплощения введение осуществляется в одно или более мест субъекта.
[0018] В данном документе также описаны способы лечения рака у субъекта, причем способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества вакцины. Также предложены способы вакцинации субъекта против клеток, характеризующихся аберрантной экспрессией PRAME, включая введение вакцины в количестве, эффективном для того, чтобы вызвать иммунный ответ. Вакцина, вводимая способами, описанными в этом раскрытии, содержит нуклеиновую кислоту, как описано выше. В некоторых вариантах воплощения введение включает стадию электропорации. В других вариантах воплощения введение осуществляется в одно или более мест субъекта.
[0019] В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, предназначены для использования в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, предназначены для применения в качестве лекарственного средства при лечении рака. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, предназначены для использования при приготовлении лекарственного средства. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, предназначены для использования при приготовлении лекарственного средства для лечения рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0020] На ФИГ. 1A и ФИГ. 1B проиллюстрировано схематическое изображение PRAME. На ФИГ. 1A графически представлено расположение номеров аминокислотных остатков семи боксов предполагаемого ядерного рецептора (NR) (мотивы LXXLL) в белке PRAME. На ФИГ. 1В представлены данные о аминокислотной последовательности, включая соседние аминокислотные остатки, для каждого бокса NR.
[0021] На ФИГ. 2 представлено выравнивание последовательностей модифицированного синтетического консенсусного PRAME с человеческими последовательностями PRAME.
[0022] На ФИГ. 3 в общем изображена реакция клонирования, которая на выходе дает pGX1421.
[0023] На ФИГ. 4 проиллюстрировано подтверждение экспрессии антигена PRAME в клеточных линиях, трансфицированных синтетическим консенсусным PRAME, с помощью вестерн-блоттинга.
[0024] На ФИГ. 5 изображены результаты иммуноанализа, сравнивающего экспрессию синтетического консенсусного PRAME с контролем (pVAX).
[0025] На ФИГ. 6 изображены графики иммунизации и забора крови для исследования иммуногенности, выполненного на мышах C57Bl/6.
[0026] На ФИГ. 7 изображена зависимость доза-ответ pGX1411 у мышей.
[0027] На ФИГ. 8A проиллюстрировано подтверждение того, что pGX1411 является иммуногенным для мышей. На ФИГ. 8B графически изображен иммунный ответ у мышей после введения pGX1411 или необработанных мышей.
[0028] На ФИГ. 9A - 9F графически изображены результаты анализа проточной цитометрией для определения ответов CD4+и CD8+Т-клеток у мышей. В частности, на ФИГ. 9A и 9B показан ответ CD4+и CD8+на продуцирование IFNγ у мышей, получающих pGX1411, по сравнению с необработанными контролями, соответственно. На ФИГ. 9C и 9D показан ответ CD4+и CD8+на продуцирование CD107a+ у мышей, получающих pGX1411, по сравнению с необработанными контролями, соответственно. На ФИГ. 9E и 9F показан ответ CD4+и CD8+на продуцирование TNFα у мышей, получающих pGX1411, по сравнению с необработанными контролями, соответственно.
[0029] На ФИГ. 10 графически изображены титры конечных точек после обработки 5, 25 и 50 мкг pGX1411 по сравнению с необработанными контролями.
[0030] На ФИГ. 11 представлено иммуногистохимическое окрашивание раковой ткани.
[0031] На ФИГ. 12 графически проиллюстрировано сравнение иммунного ответа у мышей, которым вводили синтетический консенсус PRAME и модифицированный синтетический консенсус PRAME.
[0032] На ФИГ. 13 проиллюстрирован график иммунизации и забора крови для исследований приматов, не являющихся человеком (NHP).
[0033] На ФИГ. 14A-14C изображена клеточная иммуногенность, как определено с помощью IFNγ ELISpot. На ФИГ. 14A проиллюстрирован средний ответ IFNγ с иммунизированной группой с течением времени. На ФИГ. 14B проиллюстрированы ответы IFNγ для отдельных NHP. На ФИГ. 14C проиллюстрированы ответы IFNγ в группах вместе с вариацией в группе. Время введения pGX1421 и pGX6006 указано стрелками 1-4.
[0034] На ФИГ. 15A-15D проиллюстрированы ответы Т-клеток CD4+и CD8+в NHP, которым вводили pGX1421 и PGX6006. На ФИГ. 15A графически отображен ответ CD4+ Т-клеток. На ФИГ. 15B графически изображен CD8+ ответ. На ФИГ. 15C графически изображен ответ CD8+GrB+ T-клеток. На ФИГ. 15D проиллюстрирован сдвиг в фенотипе CD8+Т-клеток после иммунизации.
[0035] На ФИГ. 16A-16C проиллюстрированы клеточные иммунные ответы, индуцированные pGX1421 и pGX1421 в комбинации с pGX6006 (IL-12). На ФИГ. 16A изображен ответ IFNγ в отдельных NHP, которым вводили pGX1421. На ФИГ. 16B проиллюстрирован ответ IFNγ в отдельных NHP, которым вводили как pGX1421, так и pGX6006. На ФИГ. 16C обеспечивает сравнение ответов, изображенных на ФИГ. 16A и 16B. Время введения pGX1421 и pGX1421 в комбинации с pGX6006 указано стрелками 1-4.
[0036] На ФИГ. 17A-17F проиллюстрированы клеточные иммунные ответы, индуцированные pGX1421 и pGX1421 в комбинации с pGX6006 как охарактеризовано проточной цитометрией. На ФИГ. 17A изображен минимальный ответ CD4+ у любого отдельного реципиента, а фиг. FIG. 17B проиллюстрировано различие в INFγ и TNFα между группами. На ФИГ. 17C отображен больший ответ CD8+T-клеток на введение pGX1421/pGX6006, чем на введение pGX1421, а на ФИГ. 17D проиллюстрировано различие в INFγ и TNFα между группами. На ФИГ. 17E отображен ответ CD8+GrB+T-клеток у NHP, которым вводят pGX1421 отдельно или в комбинации с pGX6006, а на ФИГ. 17F проиллюстрировано различие в INFγ и TNFα между группами.
[0037] На ФИГ. 18A-18C сравнивают ответы IFNγ, индуцированные введением pGX1421 в комбинации с pGX6006 (ФИГ. 18A) с теми ответами, которые индуцированные введением pGX1411 в комбинации с pGX6006 (ФИГ. 18B). На ФИГ. 18C объединяет данные ФИГ. 18A и 18В для удобства сравнения. Время введения pGX1421 в комбинации с pGX6006 и pGX1411 в комбинации с pGX6006 указано стрелками 1-4.
[0038] На ФИГ. 19A-19F проиллюстрированы клеточные иммунные ответы, индуцированные введением pGX1421 в комбинации с pGX6006, и те же самые ответы, индуцированные введением pGX1411 в комбинации с pGX6006. В частности, на ФИГ. 19A проиллюстрированы ответы CD4+Т-клеток, индуцированные введением pGX1421 в комбинации с pGX6006, и ответы CD4+Т-клеток, индуцированные введением pGX1411 в комбинации с pGX6006, а на ФИГ. 19D проиллюстрированы INFγ и TNFα между этими двумя группами. На ФИГ. 19B проиллюстрированы ответы CD8+Т-клеток, индуцированные введением pGX1421 в комбинации с pGX6006, и ответы CD4+Т-клеток, индуцированные введением pGX1411 в комбинации с pGX6006, а на ФИГ. 19E проиллюстрированы INFγ и TNFα между этими двумя группами. На ФИГ. 19C проиллюстрированы ответы CD8 +GrB+ Т-клеток, индуцированные введением pGX1421 в комбинации с pGX6006, и ответы CD4+GrB+ Т-клеток, индуцированные введением pGX1411 в комбинации с pGX6006, а на ФИГ. 19F проиллюстрированы INFγ и TNFα между группами.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0039] Настоящее изобретение относится к вакцинам, содержащим антиген PRAME. Вакцины обеспечивают лечение и/или профилактику рака, экспрессирующего PRAME. Вакцина по изобретению может обеспечить любую комбинацию конкретных раковых антигенов для конкретной профилактики или лечения рака у субъекта, который нуждается в лечении.
[0040] Одним из способов конструирования нуклеиновой кислоты и ее кодируемой аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена является введение мутаций, которые изменяют конкретные аминокислоты в общей аминокислотной последовательности нативного ракового антигена. Введение мутаций не настолько изменяет раковый антиген, что его нельзя универсально применять у субъекта-млекопитающего и предпочтительно субъекта-человека или собаки, но изменяет его настолько, что полученная аминокислотная последовательность нарушает толерантность или считается чужеродным антигеном в организме для того, чтобы генерировать иммунный ответ. Другим способом может быть создание консенсусного рекомбинантного ракового антигена, который имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере от 85% до 99% с его соответствующим нативным раковым антигеном; предпочтительно по меньшей мере 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген представляет собой 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с его соответствующим нативным раковым антигеном. Нативный раковый антиген является антигеном, обычно ассоциированным с конкретным раком или раковой опухолью. В зависимости от ракового антигена консенсусная последовательность ракового антигена может встречаться у разных видов млекопитающих или внутри подтипов вида, или среди вирусных штаммов или серотипов. Некоторые раковые антигены не сильно отличаются от аминокислотной последовательности дикого типа ракового антигена. Некоторые раковые антигены имеют последовательности нуклеиновых кислот/аминокислот, которые настолько различаются между видами, что консенсусная последовательность не может быть получена. В этих случаях рекомбинантный раковый антиген, который будет нарушать толерантность и генерировать иммунный ответ, создается таким образом, что имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере от 85% до 99% с его соответствующим нативным раковым антигеном; предпочтительно по меньшей мере 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген представляет собой 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с его соответствующим нативным раковым антигеном. Вышеупомянутые подходы могут быть объединены так, что конечный рекомбинантный раковый антиген имеет процентное сходство с аминокислотной последовательностью нативного ракового антигена, как обсуждалось выше.
[0041] Антигеном PRAME по настоящему изобретению может быть синтетический консенсусный антиген PRAME, полученный из аминокислотных или нуклеиновых последовательностей PRAME из разных видов или из разных изоформ в пределах вида, и, таким образом, синтетический консенсусный антиген PRAME не является нативным. Синтетический консенсусный антиген PRAME также содержит аминокислотные замены в домене белка, который взаимодействует с рецептором ретиноевой кислоты (RAR) или опосредует его. В частности, аминокислотные остатки лейцина в аминокислотных остатках 487 и 488 могут быть заменены остатками валина. Кроме того, антиген PRAME может содержать регуляторную последовательность Козака и/или лидерную последовательность IgE для усиления экспрессии и иммуногенности соответственно.
[0042] Рекомбинантный PRAME может индуцировать ответы антиген-специфических Т-клеток и/или высокий титр антител, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может представлять собой клеточный, гуморальный или как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может снижать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, но не ограничиваясь ими, факторы, которые подавляют презентацию МНС, факторы, которые стимулируют антиген-специфические регуляторные Т-клетки (Treg), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-β, опухоль-ассоциированные макрофаги, ассоциированные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1 и молекулу иммунной контрольной точки.
[0043] Вакцина может быть дополнительно комбинирована с антителами к ингибиторам контрольных точек, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 не позволяет PD-1 или PDL-1 подавлять ответы Т-клеток и/или В-клеток. В целом, разработка раковых антигенов, распознаваемых иммунной системой, помогает преодолеть другие формы иммуносупрессии опухолевыми клетками, и эти вакцины можно использовать в сочетании с терапией подавления или ингибирования (например, терапия анти-PD-1 и анти-PDL-1 антителами) для дальнейшего усиления Т-клеточных и/или В-клеточных ответов.
Определения
[0044] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как общедоступное обычному специалисту в области техники. В случае конфликта настоящий документ, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены в качестве ссылки во всей их полноте. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов воплощения и не предназначена для ограничения.
[0045] Термины «состоят(состоит)», «включают(включает)», «имеющий», «имеет», «может», «содержат(содержит)» и их варианты, в контексте данного документа, предполагаются неограничивающими переводимыми фразами, терминами или словами, которые не исключают возможности дополнительных действий или структур. Формы существительного единственного числа и «и» включают формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное. В настоящем раскрытии также рассматриваются другие варианты воплощения, «содержащие», «состоящие из» и «состоящие по существу из», представленные в данном документе варианты воплощения или элементы, независимо от того, изложены они явно или нет.
[0046] Для перечисления числовых диапазонов в настоящем документе каждое промежуточное значение, имеющее ту же степень точности, что и минимум и максимум приведенного диапазона, четко предусмотрено. Например, для диапазона 6-9 числа 7 и 8 предусмотрены в дополнение к 6 и 9, а для диапазона 6,0-7,0 - числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0 предусмотрены явно.
[0047] «Адъювант», в контексте данного документа, означает любую молекулу, добавленную к вакцинам, описанным в данном документе, для усиления иммуногенности антигенов PRAME и/или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антигены, как описано в данном документе.
2
[0048] «Антитело», в контексте данного документа, означает классы антител IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или их фрагменти или производные, включая Fab, F(ab'), Fd и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифичные антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из образца сыворотки млекопитающего, поликлонального антитела, аффинно-очищенного антитела или любой их смеси, которое проявляет достаточную специфичность связывания с желаемым эпитопом или последовательностью, полученной из него.
[0049] «Антиген PRAME» относится к: белкам, имеющим мутированные аминокислотные последовательности PRAME, включая аминокислотные остатки с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. Антигены PRAME могут необязательно включать сигнальные пептиды, такие как пептиды из других белков. Например, антиген PRAME, содержащий сигнальный пептид, может включать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
[0050] Термины «кодирующая последовательность» или «кодирующая нуклеиновая кислота», в контексте данного документа, означают нуклеиновые кислоты (молекулы РНК или ДНК), которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках субъекта или млекопитающего, которым вводят нуклеиновую кислоту.
[0051] Термины «комплемент» или «комплементарность», используемые в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, могут означать спаривание оснований Уотсона-Крика (например, A-T/U и C-G) или Хугстина между нуклеотидами или аналогами нуклеотидов молекул нуклеиновой кислоты.
[0052] Термины «консенсус» или «консенсусная последовательность», в контексте данного документа, означают полипептидную последовательность, основанную на анализе выравнивания множества последовательностей для одного и того же гена из разных организмов. Могут быть получены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консенсусную полипептидную последовательность. Вакцины, содержащие белки, которые содержат консенсусные последовательности, и/или молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют такие белки, могут быть использованы для индукции широкого иммунитета против антигена.
[0053] Термин «постоянный ток», в контексте данного документа, описывает ток, который воспринимается или испытывается тканью или клетками, определяющими указанную ткань, в течение воздействия электрического импульса, доставляемого в ту же ткань. Электрический импульс подается от устройств электропорации, описанных в данном документе. Плотность тока остается постоянной в указанной ткани в течение всего времени воздействия электрического импульса, поскольку устройство электропорации, предложенное в настоящем документе, имеет элемент обратной связи, предпочтительно обладающий мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи позволяет измерять сопротивление ткани (или клеток) на протяжении всего времени воздействия импульса и заставлять устройство электропорации изменять выходную электрическую мощность (например, увеличивать напряжение) таким образом, чтобы плотность тока в одной и той же ткани оставалась постоянной в течение всего времени воздействия электрического импульса (порядка микросекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи содержит контроллер.
[0054] Термины «обратная связь по току» или «обратная связь», в контексте данного документа, могут использоваться взаимозаменяемо и могут означать активную реакцию предоставленных устройств электропорации, которая включает измерение тока в ткани между электродами и соответствующее изменение выходной мощности, передаваемой устройством EP, для поддержания плотности тока на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем перед инициацией последовательности импульсов или электрического воздействия. Обратная связь может быть обеспечена компонентом электропорации, например, контроллером устройства электропорации, поскольку электрическая цепь в нем способна непрерывно контролировать ток в ткани между электродами и сравнивать этот контролируемый ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно производить регулировку выходной мощности для поддержания контролируемого тока на заданных уровнях. Цикл обратной связи может быть мгновенным, поскольку он является аналоговой замкнутой обратной связью.
[0055] Термин «децентрализованный ток», используемый в данном документе, может означать структуру электрических токов, подаваемых из различных наборов игольчатых электродов устройств электропорации, описанных в данном документе, при этом схемы минимизируют или предпочтительно устраняют возникновение теплового напряжения, связанного с электропорацией, в любой области ткани, являющейся электропорированной.
[0056] «Электропорация», «электропермеабилизация» или «электрокинетическое усиление» («EP»), используемые в данном документе взаимозаменяемо, означают воздействие импульса трансмембранного электрического поля для индукции микроскопических путей (пор) в биомембране; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарственные препараты, ионы и вода, проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
[0057] Используемый в данном документе термин «фрагмент» в отношении последовательностей нуклеиновой кислоты означает последовательность нуклеиновой кислоты или ее часть, которая кодирует полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут быть фрагментами ДНК, выбранными по меньшей мере из одной из различных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют фрагменты белка, изложенные ниже. Фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, за исключением добавления гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, и дополнительно необязательно включать последовательность, кодирующую гетерологичный сигнальный пептид, который не включен при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, кодирующая N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть связана с фрагментом кодирующей последовательности.
[0058] В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут содержать по меньшей мере 20 нуклеотидов или более, по меньшей мере 30 нуклеотидов или более, по меньшей мере 40 нуклеотидов или более, по меньшей мере 50 нуклеотидов или более, по меньшей мере 60 нуклеотидов или более, по меньшей мере 70 нуклеотидов или более, по меньшей мере 80 нуклеотидов или более, по меньшей мере 90 нуклеотидов или более, по меньшей мере 100 нуклеотидов или более, по меньшей мере 150 нуклеотидов или более, по меньшей мере 200 нуклеотидов или более, по меньшей мере 250 нуклеотидов или более, по меньшей мере 300 нуклеотидов или более, по меньшей мере 350 нуклеотидов или более, по меньшей мере 400 нуклеотидов или более, по меньшей мере 450 нуклеотидов или более, по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, по меньшей мере 550 нуклеотидов или более, по меньшей мере 600 нуклеотидов или более, по меньшей мере 650 нуклеотидов или более, по меньшей мере 700 нуклеотидов или более, по меньшей мере 750 нуклеотидов или более, по меньшей мере 800 нуклеотидов или более, по меньшей мере 850 нуклеотидов или более, по меньшей мере 900 нуклеотидов или более, по меньшей мере 950 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1000 нуклеотидов или более по меньшей мере одной из последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже.
[0059] «Фрагмент» или «иммуногенный фрагмент» в отношении полипептидных последовательностей означает полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут быть полипептидными фрагментами, выбранными из по меньшей мере одной из различных аминокислотных последовательностей, приведенных ниже. Фрагменты консенсусных белков могут составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% консенсусного белка, исключая добавление любого гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% одной или более аминокислотных последовательностей, указанных ниже, и дополнительно необязательно включать гетерологичный сигнальный пептид, который не включен при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG.
[0060] В некоторых вариантах воплощения фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 20 аминокислот или более, по меньшей мере 30 аминокислот или более, по меньшей мере 40 аминокислот или более, по меньшей мере 50 аминокислот или более, по меньшей мере 60 аминокислот или более, по меньшей мере 70 аминокислот или более, по меньшей мере 80 аминокислот или более, по меньшей мере 90 аминокислот или более, по меньшей мере 100 аминокислот или более, по меньшей мере 110 аминокислот или более, по меньшей мере 120 аминокислот или более, по меньшей мере 130 аминокислот или более, по меньшей мере 140 аминокислот или более, по меньшей мере 150 аминокислот или более, по меньшей мере 160 аминокислот или более, по меньшей мере 170 аминокислот или более, по меньшей мере 180 аминокислот или более последовательности белка, раскрытого в данном документе.
[0061] Используемый в данном документе термин «генетическая конструкция» относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках субъекта, которому вводят нуклеиновую кислоту. Используемый в данном документе термин «экспрессируемая форма» относится к генной конструкции, которая содержит необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок, таким образом, что при наличии в клетке субъекта будет экспрессироваться кодирующая последовательность.
гомологичная
гомологичный
гомологичный
[0062] Используемый в данном документе термин «гомология» относится к степени комплементарности. Может быть частичная гомология или полная гомология (то есть идентичность). Частично комплементарная последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью, называется функциональным термином «по существу ». При использовании в отношении двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон, термин «по существу », используемый в настоящем документе, относится к зонду, который может гибридизоваться с цепью двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. При использовании в отношении последовательности одноцепочечной нуклеиновой кислоты термин «по существу », используемый в данном документе, относится к зонду, который может гибридизоваться (т.е. является комплементом) с одноцепочечной матрицей последовательности нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.
[0063] Термины «идентичный» или «идентичность», используемые в данном документе в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов означают, что последовательности имеют определенный процент остатков, которые являются одинаковыми в указанной области. Процент может быть рассчитан путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в указанной области, определения количества позиций, в которых одинаковый остаток встречается в обеих последовательностях, для получения количества совпадающих позиций, деления количества совпавших позиций на общее количество позиций в указанной области и умножение результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности. В тех случаях, когда две последовательности имеют разную длину или выравнивание приводит к одному или более ступенчатым концам и указанная область сравнения включает только одну последовательность, остатки одной последовательности включаются в знаменатель, но не в числитель вычисления. При сравнении ДНК и РНК тимин (T) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентификация может быть выполнена вручную или с помощью компьютерного алгоритма последовательностей, такого как BLAST или BLAST 2.0.
[0064] «Импеданс», используемый в данном документе, может использоваться при рассмотрении в деталях механизма обратной связи и может быть преобразован в текущее значение в соответствии с законом Ома, что позволяет проводить сравнение с заданным током.
[0065] Термин «иммунный ответ», в контексте данного документа, означает активацию иммунной системы хозяина, например, млекопитающего, в ответ на введение антигена. Иммунный ответ может быть в форме клеточного или гуморального ответа, или обоих.
[0066] Термины «нуклеиновая кислота», или «олигонуклеотид», или «полинуклеотид», в контексте данного документа, означают по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных друг с другом. Описание одной цепи также определяет последовательность дополнительной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также охватывает комплементарную цепь описанной одной цепи. Многие варианты нуклеиновой кислоты могут быть использованы для той же цели, что и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает по существу идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементы. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизоваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации.
[0067] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или могут содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, как геномную, так и кДНК, РНК или гибридную, где нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены способами химического синтеза или рекомбинантными способами.
[0068] Термин «функционально связанный», в контексте данного документа, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен на 5’ (слева) или 3' (справа) от гена под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует, в гене, из которого происходит промотор. Как известно в данной области техники, изменение этого расстояния может быть осуществлено без потери функции промотора.
[0069] Используемый в данном документе термины «пептид», «белок» или «полипептид» могут означать связанную последовательность аминокислот и могут быть природными, синтетическими или быть модификацией или комбинацией природного и синтетического.
[0070] Термин «промотор», в контексте данного документа, означает синтетическую молекулу или молекулу природного происхождения, которая способна предоставлять, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или более специфических последовательностей, регулирующих транскрипцию, для дополнительного усиления экспрессии и/или изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор также может содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут находиться на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусные, бактериальные, грибковые, растительные, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия, или относительно стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или возбуждающие агенты. Типичные примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор SP6, промотор lac оператора, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE.
[0071] Термины «сигнальный пептид» и «лидерная последовательность» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислотной последовательности, которая может быть связана на аминоконце белка, указанного в данном документе. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности обычно направляют локализацию белка. Используемые в данном документе сигнальные пептиды/лидерные последовательности предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он продуцируется. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляются от остатка белка, часто называемого зрелым белком, при секреции из клетки. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности связаны на амино-конце (то есть на N-конце) белка.
[0072] «Жесткие условия гибридизации», в контексте данного документа, означают условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет гибридизоваться со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), таких как в сложной смеси нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными в разных обстоятельствах. Жесткие условия могут быть выбраны так, чтобы они были приблизительно на 5-10°C ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при pH определенной ионной силы. Tm может быть температурой (при определенной ионной силе, pH и нуклеиновой концентрации), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Tm, 50% зондов заняты в равновесии). Жесткие условия могут быть такими, в которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,0 М иона натрия, например, концентрация иона натрия приблизительно 0,01-1,0 М (или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, приблизительно 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, больше, чем приблизительно 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты с добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал может по меньшей мере в 2-10 раз превышать фоновую гибридизацию. Примерные строгие условия гибридизации включают следующее: 50% формамид, 5x SSC и 1% SDS, инкубирование при 42°C или 5x SSC, 1% SDS, инкубирование при 65°C, с промывкой в 0,2x SSC и 0,1% SDS при 65°C.
[0073] Термин «субъект», в контексте данного документа, может означать млекопитающее, которому необходима или требуется иммунизация описанными в данном документе вакцинами. Млекопитающим может быть человек, шимпанзе, собака, кошка, лошадь, корова, мышь или крыса.
[0074] Термин «практически комплементарный», в контексте данного документа, означает, что первая последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичны комплементу второй последовательности в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизуются в жестких условиях гибридизации.
[0075] Термин «практически идентичный», в контексте данного документа, означает, что первая и вторая последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичны в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или, в отношении аминокислот, если первая последовательность по существу комплементарна комплементу второй последовательности.
[0076] Термины «лечить», «лечение» или «лечащий», в контексте данного документа, могут означать защиту животного от заболевания посредством средств предотвращения, супрессии, подавления или полного устранения заболевания. Профилактика заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному до начала заболевания. Супрессия заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после клинического проявления заболевания.
[0077] Термин «вариант», используемый в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, означает (i) часть или фрагмент эталонной нуклеотидной последовательности; (ii) комплемент эталонной нуклеотидной последовательности или ее часть; (iii) нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична эталонной нуклеиновой кислоте или ее комплементу; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с эталонной нуклеиновой кислотой, ее комплементом или последовательностью, по существу идентичной ей.
[0078] Термин «вариант», используемый в данном документе в отношении пептида или полипептида, означает пептид или полипептид, который отличается по аминокислотной последовательности вставкой, делецией или консервативной заменой аминокислот, но сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Вариант также может означать белок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична эталонному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Консервативная замена аминокислоты, то есть замена аминокислоты другой аминокислотой со схожими свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей), как известно, в данной области техники обычно включает незначительные изменения. Эти незначительные изменения могут быть идентифицированы, частично, с учетом индекса гидрофобности аминокислот, как понимается в данной области техники. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на оценке ее гидрофобности и заряда. В данной области техники известно, что аминокислоты с подобными индексами гидрофобности могут быть замещены и при этом сохранять функцию белка. В одном аспекте аминокислоты с индексами гидрофобности ± 2, являются замещенными. Гидрофильность аминокислот также может быть использована для выявления замен, которые приводят к тому, что белки сохраняют биологическую функцию. Оценка гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, что является полезным измерением, которое, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США 4554101, полностью включен в данный документ посредством ссылки. Замена аминокислот, имеющих сходные значения гидрофильности, может привести к тому, что пептиды сохраняют биологическую активность, например иммуногенность, как понимается в данной области техники. Замены могут быть выполнены с аминокислотами, имеющими значения гидрофильности у друг друга в пределах ± 2. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияет конкретная боковая цепь этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением считается, что аминокислотные замены, которые совместимы с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, от боковых цепей этих аминокислот, что проявляется в гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и других свойствах.
[0079] Вариант может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична по всей длине полной последовательности гена или ее фрагмента. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентична по всей длине генной последовательности или ее фрагмента. Вариант может представлять собой аминокислотную последовательность, которая по существу идентична по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента. Аминокислотная последовательность может быть на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентична по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента.
[0080] Термин «вектор», в контексте данного документа, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой вирусный вектор, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть вектором ДНК или РНК. Вектор может быть самореплицирующимся внехромосомным вектором и предпочтительно представляет собой ДНК-плазмиду. Вектор может содержать или включать одну или более гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.
Вакцина
[0081] В данном документе предложены вакцины, содержащие описанный в данном документе антиген PRAME или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такой антиген. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME содержит аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты кодирует антиген PRAME, имея аминокислотную последовательность, представленную в аминокислотных остатках с 19 по 526 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения антиген PRAME содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты кодирует антиген PRAME, имея аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген PRAME, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в нуклеотидах с 55 по 1584 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген PRAME, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1. Вакцины могут быть способны вызывать у субъекта иммунный ответ против антигена. Иммунный ответ может представлять собой терапевтический или профилактический иммунный ответ. Вакцины могут содержать вектор или множество векторов, как более подробно описано ниже.
[0082] Вакцины могут быть использованы для защиты от рака, например, рака или опухоли, экспрессирующей PRAME. Вакцины могут быть использованы для профилактики и/или лечения рака яичников, экспрессирующего PRAME, у субъекта, нуждающегося в этом. Вакцины могут индуцировать клеточные ответы и/или ответы антител против PRAME и против опухолей, экспрессирующих PRAME у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах воплощения настоящего раскрытия вакцина может быть использована для защиты, предотвращения, лечения и/или индукции клеточных и/или ответов антител против клеток, характеризующихся аберрантной экспрессией PRAME. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вакцина может быть использована для защиты, предотвращения, лечения и/или индукции клеточных и/или ответов антител против раковых клеток яичников, характеризующихся аберрантной экспрессией PRAME, в частности эпителиальных раковых клеток яичников а, более конкретно, клеток серозного рака яичника, экспрессирующих
[0083] Разработка противораковой вакцины, как описано в данном документе, включает идентификацию ракового антигена, например, PRAME, который не распознается иммунной системой и является аутоантигеном. Идентифицированный раковый антиген изменяется от аутоантигена к чужеродному антигену для распознавания иммунной системой. Перестройка нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена от ауто- к чужеродному антигену нарушает толерантность антигена иммунной системой. Для того, чтобы нарушить толерантность, можно использовать несколько мер редизайна для получения ракового антигена, как описано ниже.
[0084] Нарушение толерантности может индуцировать ответы антиген-специфических Т-клеток и/или высокий титр антител, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может представлять собой клеточный, гуморальный или как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может снижать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, но не ограничиваясь ими, факторы, которые подавляют презентацию МНС, факторы, которые стимулируют антиген-специфические регуляторные Т-клетки (Treg), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-β, опухоль-ассоциированные макрофаги, ассоциированные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1 и молекулу иммунной контрольной точки.
+
[0085] В конкретном варианте воплощения вакцина может обеспечивать клиренс или предотвращать рост опухолевых клеток путем (1) увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов, таких как CD8 (CTL), для атаки и уничтожения опухолевых клеток; (2) увеличения ответов Т-хелперов; и/или (3) усиления воспалительных реакций посредством IFN-γ и TFN-α или предпочтительно всего вышеупомянутого. Вакцина может увеличить выживаемость без опухолей на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44% и 45%. Вакцина может уменьшить массу опухоли на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60% после иммунизации. Вакцина может предотвращать и блокировать повышение белка 1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1), цитокина, секретируемого клетками-супрессорами миелоидного происхождения. Вакцина может увеличить выживаемость без опухолей на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%.
[0086] Вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, приблизительно от 100 до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от 200 раз до 6000 раз, приблизительно от в 250 раз до в 6000 раз или приблизительно в 300 раз приблизительно в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0087] Вакцина может повышать уровни интерферона гамма (IFN-γ) у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, приблизительно от 100 до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от 200 раз до 6000 раз, приблизительно от в 250 раз до в 6000 раз или приблизительно в 300 раз приблизительно в 6000 раз по сравнению с уровнями IFN-γ у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вакцина может повышать уровни IFN-γ у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз по сравнению с уровнями IFN-γ у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0088] Вакцина может быть ДНК-вакциной. ДНК-вакцины описаны в патентах США № 5593972, 5739118, 5817637, 5830876, 596242, 5981505, 5580859, 5303055 и 5676954, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки. ДНК-вакцина может дополнительно содержать элементы или реагенты, которые препятствуют ее интеграции в хромосому.
[0089] Вакцина может содержать РНК, кодирующую раковый антиген. РНК-вакцина может быть введена в клетку.
[0090] Вакцина может представлять собой аттенуированную живую вакцину, вакцину с использованием рекомбинантных векторов для доставки антигена, субъединичные вакцины и гликопротеиновые вакцины, например, но не ограничиваясь этим, вакцины, описанные в патентах США №№: 4510245; 4797368; 4722848; 4790987; 4920209; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5,453,364; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579; 5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6156319 и 6589529, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.
[0091] В некоторых вариантах воплощения вакцина из нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать кодирующую последовательность для молекулярного адъюванта, в некоторых случаях молекулярным адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES, а в некоторых случаях молекулярный адъювант представляет собой ингибитор контрольной точки, включая против цитотоксического антигена Т-лимфоцитов 4 (CTLA-4), против рецептора запрограммированной смерти-1 (PD-1) и против гена активации лимфоцитов (LAG-3). Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые содержат кодирующую последовательность для одного или более антигенов. Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в отдельные молекулы нуклеиновой кислоты, такие как отдельная плазмида.
[0092] Вакцина по настоящему изобретению может иметь свойства, требуемые для эффективных вакцин, такие как безопасность, таким образом, что сама вакцина не вызывает заболевания или смерти; защита от болезней; индукция нейтрализующего антитела; индукция защитных Т-клеточных ответов; и обеспечение простоты введения, небольшое количество побочных эффектов, биологическую стабильность и низкую стоимость на дозу. Вакцина может достигать некоторых или всех из этих свойств путем содержания ракового антигена, как обсуждается ниже.
[0093] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация класса MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любой цитокин, хемокин или передача сигналов пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток. Как также более подробно описано ниже, вакцина может быть дополнительно комбинирована с антителами к ингибиторам контрольных точек, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 не позволяет PD-1 или PDL-1 подавлять ответы Т-клеток и/или В-клеток.
Антиген
[0094] Как описано выше, вакцина может содержать антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген. Антигеном может быть PRAME, его фрагмент, его вариант или их комбинация. PRAME экспрессируется в яичках, но не типично или в относительно небольших количествах в нормальных нераковых тканях. Белок PRAME является репрессором рецептора ретиноевой кислоты, и, не ограничиваясь теорией, считается, что эта репрессия дает преимущество роста раковым клеткам за счет подавления задержки пролиферации и апоптоза клеток, индуцированных ретиноевой кислотой. Например, PRAME ассоциируется с несколькими формами рака и является известным раковым антигеном. Экспрессия PRAME увеличивается при раке эндометрия, раке яичка, меланоме и раке яичников.
[0095] Соответственно, вакцина может быть использована для лечения субъектов, страдающих от рака, экспрессирующего PRAME. Вакцина может также использоваться для лечения субъектов с раком или опухолями, которые экспрессируют PRAME, или для предотвращения развития таких опухолей у субъектов. Антиген PRAME по настоящему изобретению отличается от нативного, «нормального» антигена PRAME и, таким образом, обеспечивает терапию или профилактику против опухоли, экспрессирующей антиген PRAME. Соответственно, в данном документе предложены последовательности антигена PRAME, которые отличаются от нативного гена PRAME (т.е. варианты генов или последовательностей PRAME). Некоторые аспекты настоящего изобретения предусматривают вакцину, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1, и некоторые аспекты предусматривают вакцину, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
[0096] Предусмотрены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие описанные выше гетерологичные последовательности. Предложены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, состоящие из описанных выше гетерологичных последовательностей. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вышеописанные гетерологичные последовательности, могут быть встроены в векторы, такие как плазмиды, вирусные векторы и другие формы молекул нуклеиновой кислоты, как описано ниже. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты встроена в плазмиду. В других вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты встроена в вектор. Некоторые аспекты настоящего изобретения предусматривают композиции, содержащие нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность нуклеотидной кислоты SEQ ID NO:1 или имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
[0097] В данном документе предложены молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие последовательности, которые кодируют антигены PRAME. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты встроена в вектор, включая, но не ограничиваясь этим, плазмиду или вирусный вектор. Кодирующие последовательности, кодирующие синтетические антигены PRAME, имеют последовательности, как описанные выше.
[0098] Предусмотрены молекулы белка, содержащие описанные выше гетерологичные аминокислотные последовательности. Предложены молекулы белка, состоящие из описанных выше гетерологичных аминокислотных последовательностей. В данном документе предложены белки и полипептиды, имеющие описанные выше последовательности. Белки и полипептид по настоящему изобретению могут упоминаться как антигены PRAME и иммуногены PRAME. Антигены PRAME способны вызывать иммунный ответ против рака и/или опухолей, экспрессирующих антиген PRAME.
[0099] В одном аспекте желательно, чтобы консенсусный антиген обеспечивал улучшенную транскрипцию и трансляцию, включая наличие одного или более из следующего: лидерной последовательности с низким содержанием GC для увеличения транскрипции; стабильности мРНК и оптимизации кодонов; и, насколько это возможно, устранения мотивов цис-действующей последовательности (то есть внутренних TATA-боксов).
[00100] В некоторых аспектах желательно создавать консенсусный антиген, который генерирует широкий иммунный ответ для множества линий, причем консенсусный антиген может иметь одно или более из следующего: включать все доступные полноразмерные последовательности; сгенерированные компьютером последовательности, которые используют наиболее часто встречающуюся аминокислоту в каждой позиции; и увеличивать перекрестную реактивность между линиями.
[00101] Антиген PRAME может быть последовательностью консенсусного антигена (или иммуногена), полученной из двух или более видов. Антиген PRAME может содержать консенсусную последовательность и/или модификацию(модификации) для улучшения экспрессии. Модификация может включать оптимизацию кодонов, оптимизацию РНК, добавление последовательности Козак (например, GCC ACC) для усиления инициации трансляции и/или добавление лидерной последовательности иммуноглобулина для повышения иммуногенности антигена PRAME. Антиген PRAME может содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, но не ограничиваясь этим, сигнальный пептид иммуноглобулина E (IgE) или иммуноглобулина G (IgG). В некоторых вариантах воплощения консенсусный антиген PRAME может содержать метку гемагглютинина (HA). Консенсусный антиген PRAME может быть сконструирован так, чтобы вызывать более сильные и более широкие клеточные и/или гуморальные иммунные ответы, чем соответствующий оптимизированный по кодонам антиген PRAME.
[00102] Консенсусный антиген PRAME может содержать один или более вариантов в одном или более функциональных доменах белка, вызывая тем самым более сильные и широкие клеточные и/или гуморальные иммунные ответы, чем соответствующий оптимизированный по кодонам антиген PRAME. Одна или более мутаций могут быть заменой одной или более аминокислот в домене белка PRAME, который опосредует взаимодействие с RAR.
Вакцина в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки
[00103] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация класса MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любой цитокин, хемокин или передача сигналов пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток.
[00104] Такой ингибитор может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малая молекула может представлять собой низкомолекулярное, например, менее 800 Дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить в качестве субстрата фермента, лиганда (или его аналога), связанного с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятора биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
[0105] В некоторых вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию. В других вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
1. Молекула иммунной контрольной точки
[0106] Молекула иммунной контрольной точки может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малая молекула может представлять собой низкомолекулярное, например, менее 800 Дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить в качестве субстрата фермента, лиганда (или его аналога), связанного с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятора биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
a. PD-1 и PD-L1
PDCD1
+
[0107] Молекулой иммунной контрольной точки может быть белок запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), лиганд запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-L1), его фрагмент, его вариант или их комбинация. PD-1 представляет собой белок клеточной поверхности, кодируемый геном . PD-1 является членом суперсемейства иммуноглобулинов и экспрессируется на Т-клетках и про-В-клетках и, таким образом, способствует участию и/или дифференцировке этих клеток. В частности, PD-1 является мембранным белком типа 1 семейства регуляторов Т-клеток CD28/CTLA-4 и отрицательно регулирует сигналы рецептора Т-клеток (TCR), тем самым отрицательно регулируя иммунные ответы. PD-1 может отрицательно регулировать ответы CD8 T-клеток и, таким образом, ингибировать, цитотоксичность опосредованную CD8, и усиливать рост опухоли.
[0108] PD-1 имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые являются членами семейства B7. PD-L1 активируется на макрофагах и дендритных клетках (DC) в ответ на обработку LPS и GM-CSF и на T-клетках и B-клетках при передаче сигналов TCR и B-клеточных рецепторов. PD-L1 экспрессируется многими линиями опухолевых клеток, включая миеломы, мастоцитомы и меланомы.
2. Антитело против молекулы иммунной контрольной точки
[0109] Как описано выше, ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело. Антитело может связываться или реагировать с антигеном (т.е. молекулой иммунной контрольной точки, описанной выше). Соответственно, антитело может считаться антителом против иммунной контрольной точки или антителом иммунной контрольной точки. Антитело может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в
[0110] Антитело может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи может включать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи (CH). По меньшей мере одна константная область тяжелой цепи может включать константную область тяжелой цепи 1 (СН1), константную область тяжелой цепи 2 (СН2) и константную область тяжелой цепи 3 (СН3) и/или шарнирную область.
[0111] В некоторых вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH и область CH1. В других вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3.
[0112] Полипептид тяжелой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области области VH. Начиная с N-конца полипептида тяжелой цепи, эти CDR обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида тяжелой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[0113] Полипептид легкой цепи может включать область вариабельной легкой цепи (VL) и/или область константной легкой цепи (CL). Полипептид легкой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области области VL. Начиная с N-конца полипептида легкой цепи, эти CDR обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида легкой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[0114] Антитело может содержать набор областей, определяющих комплементарность («CDR») тяжелой цепи и легкой цепи, и, соответственно, помещаться между набором каркасной тяжелой цепи и легкой цепи («FR»), которые обеспечивают поддержку CDR и определяют пространственную взаимосвязь CDR относительно друг друга. Набор CDR может содержать три гипервариабельных участка V-области тяжелой или легкой цепи. Начиная с N-конца тяжелой или легкой цепи, эти области обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий сайт может включать шесть CDR, содержащих набор CDR из каждой V-области тяжелой и легкой цепи.
[0115] Антитело может представлять собой иммуноглобулин (Ig). Ig может быть, например, IgA, IgM, IgD, IgE и IgG. Иммуноглобулин может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3. Полипептид легкой цепи иммуноглобулина может включать область VL и область CL.
2
2
[0116] Кроме того, протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, два из которых (фрагменты F(ab)) содержат ковалентный гетеродимер, который включает интактный антигенсвязывающий сайт. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, включая фрагмент F(ab'), который содержит оба антигенсвязывающих сайта. Соответственно, антитело может представлять собой Fab или F(ab'). Fab может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи Fab может включать область VH и область CH1. Легкая цепь Fab может включать область VL и область CL.
[0117] Антитело может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело. Антитело может представлять собой химерное антитело, одноцепочечное антитело, аффинно-зрелое антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. Гуманизированное антитело может представлять собой антитело от видов, не являющихся человеком, которое связывает желаемый антиген, имея одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR), от видов, не являющихся человеком, и каркасные области от молекулы иммуноглобулина человека.
a. Антитело к PD-1
[0118] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD-1 (также обозначаемое в данном документе как «антитело к PD-1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело к PD-1 может представлять собой ниволумаб. Антитело против PD-1 может ингибировать активность PD-1, таким образом индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
b. Антитело к PD-L1
[0119] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD-L1 (также обозначаемое в данном документе как «антитело к PD-L1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело против PD-L1 может ингибировать активность PD-L1, таким образом индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
Вектор
[00105] Вакцина может содержать один или более векторов, которые включают гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген PRAME. Один или более векторов могут быть способны экспрессировать антиген в количестве, эффективном, для того, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающего. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Вектор может иметь последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть либо самовоспроизводящимся внехромосомным вектором, либо вектором, который интегрируется в геном хозяина.
[00106] Один или более векторов могут быть экспрессионной конструкцией, которая представляет собой плазмиду, которая обычно используется для введения специфического гена в целевую клетку. Как только экспрессирующий вектор оказывается внутри клетки, белок, который кодируется геном, продуцируется рибосомальными комплексами клеточно-транскрипционной и трансляционной машинерии. Плазмиду часто конструируют так, чтобы она содержала регуляторные последовательности, которые действуют как энхансерные и промоторные области и приводили к эффективной транскрипции гена, переносимого на векторе экспрессии. Векторы по настоящему изобретению экспрессируют большие количества стабильной матричной РНК и, следовательно, белков.
[00107] Векторы могут иметь энхансеры экспрессии, такие как сильный промотор, сильный кодон терминации, регулирование расстояния между промотором и клонированным геном и вставка последовательности терминации транскрипции и PTIS (переносимая последовательность инициации трансляции).
[00108] Вектор может представлять собой кольцевую плазмиду или линейную нуклеиновую кислоту. Кольцевая плазмида и линейная нуклеиновая кислота способны направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке субъекта. Вектор может иметь промотор, функционально связанный с антиген-кодирующей нуклеотидной последовательностью, который может быть функционально связан с сигналами терминации. Вектор также может содержать последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности. Вектор может содержать последовательности, которые необходимы или повышают эффективность клонирования в вектор желаемых фрагментов, включая, но не ограничиваясь этим, антиген PRAME или другие кодирующие последовательности, регуляторные последовательности и последовательности, кодирующие селективный и/или скрининговый маркер. Вектор, содержащий интересующую нуклеотидную последовательность, может быть химерным, что означает, что по меньшей мере один из его компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из его других компонентов. Экспрессия нуклеотидной последовательности в экспрессионной кассете может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда на клетку-хозяина воздействует какой-то конкретный внешний стимул. В случае многоклеточного организма промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа или стадии развития.
[00109] Вектор может представлять собой плазмиду. Плазмида может использоваться для трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген PRAME, и трансформированные клетки-хозяева культивируют и поддерживают в условиях, в которых имеет место экспрессия антигена.
[00110] Плазмида может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или более антигенов PRAME, раскрытых в данном документе, включая кодирующие последовательности, которые кодируют синтетический консенсусный антиген, способный вызывать иммунный ответ против антигена, фрагменты таких белков, варианты таких белков, фрагменты вариантов или слитые белки, которые состоят из комбинаций консенсусных белков и/или фрагментов консенсусного белка и/или вариантов консенсусного белка и/или фрагментов вариантов консенсусных белков.
[00111] Одна плазмида может содержать кодирующую последовательность для одного антигена, кодирующую последовательность для двух антигенов, кодирующую последовательность для трех антигенов или кодирующую последовательность для четырех антигенов.
[00112] В некоторых вариантах воплощения плазмида может дополнительно содержать кодирующую последовательность, которая кодирует CCR20 отдельно или как часть одной из этих плазмид. Аналогично, плазмиды могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для IL-12, IL-15 и/или IL-28.
[00113] Плазмида может дополнительно содержать кодон инициации, который может быть слева от кодирующей последовательности, и стоп-кодон, который может быть справа от кодирующей последовательности. Кодон инициации и терминации может находиться внутри рамки с кодирующей последовательностью.
[00114] Плазмида также может содержать промотор, который функционально связан с кодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может быть промотором из вируса обезьяны 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотором вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), таким как промотор длинного концевого повтора (LTR) бычьего вируса иммунодефицита (BIV), промотором вируса Молони, промотором вируса птичьего лейкоза (ALV), промотором цитомегаловируса (CMV), таким как немедленно-ранний промотор CMV, промотором вируса Эпштейна-Барра (EBV) или промотором вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор также может быть промотором человеческого гена, такого как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или человеческий металлотионеин. Промотором также может быть тканеспецифичный промотор, такой как мышечный или кожный специфический промотор, природный или синтетический. Примеры таких промоторов описаны в публикации США № 2004/0175727, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
[00115] Плазмида также может содержать сигнал полиаденилирования, который может быть справа от кодирующей последовательности. Сигналом полиаденилирования может быть сигнал полиаденилирования SV40, сигнал полиаденилирования LTR, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигнал полиаденилирования гормона роста человека (hGH) или сигнал полиаденилирования β-глобина человека. Сигнал полиаденилирования SV40 может быть сигналом полиаденилирования от плазмиды pCEP4 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния).
[00116] Плазмида также может содержать энхансер слева от кодирующей последовательностью. Энхансером может быть энхансер человеческого актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатина или вирусный энхансер, такой как энхансер CMV, FMDV, RSV или EBV. Энхансеры полинуклеотидной функции описаны в патентах США № 5593972, 5962248 и WO 94/016737, содержание каждого из которых полностью включено в данный документ посредством ссылки.
[00117] Плазмида также может содержать точку начала репликации млекопитающего для поддержания внехромосомной плазмиды и получения множества копий плазмиды в клетке. Плазмидой может быть pVAXI, pCEP4 или pREP4 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния) Плазмида может содержать точку начала репликации вируса Эпштейна-Барра и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, что может приводить к высококопийной эписомной репликации без интеграции. Основой плазмиды может быть pAV0242. Плазмида может быть плазмидой дефектного по репликации аденовируса типа 5 (Ad5).
[00118] Плазмида также может содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для экспрессии генов в клетке, в которой содержится плазмида. Кодирующая последовательность может содержать кодон, который может обеспечить более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.
[00119] Кодирующая последовательность также может содержать лидерную последовательность иммуноглобулина (Ig). Лидерная последовательность может быть 5’ кодирующей последовательностью. Консенсусные антигены, кодируемые этой последовательностью, могут содержать N-концевой лидер Ig, за которым следует консенсусный белок антигена. Лидером N-концевого Ig может быть IgE или IgG.
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
[00120] Плазмидой может быть pSE420 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в  (E.coli). Плазмидой также может быть pYES2 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в штаммах дрожжей . Плазмида также может быть полной системой экспрессии бакуловируса MAXBAC™ (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в клетках насекомых. Плазмида также может быть pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которые могут быть использованы для продуцирования белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO).
[00121] Вектор может быть кольцевой плазмидой, которая может трансформировать клетку-мишень путем интеграции в клеточный геном или существовать внехромосомно (например, автономная реплицирующаяся плазмида с точкой начала репликации).
[00122] Вектором может быть pVAX, pcDNA3.0 или provax или любой другой вектор экспрессии, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген и позволяющий клетке выполнять трансляцию последовательности в антиген, который распознается иммунной системой.
[00123] Также в данном документе предоставлена линейная вакцина на основе нуклеиновых кислот или кассета с линейной экспрессией («LEC»), которая способна эффективно доставляться субъекту посредством электропорации и экспрессии одного или более желаемых антигенов. LEC может представлять собой любую линейную ДНК, лишенную какого-либо фосфатного остова. ДНК может кодировать один или более антигенов. LEC могут содержать промотор, интрон, стоп-кодон и/или сигнал полиаденилирования. Экспрессия антигена может контролироваться промотором. LEC может не содержать генов устойчивости к антибиотикам и/или фосфатного остова. LEC может не содержать других последовательностей нуклеиновых кислот, не связанных с желаемой экспрессией гена антигена.
[00124] LEC может быть получен из любой плазмиды, способной к линеаризации. Плазмида может быть способной экспрессировать антиген. Плазмида может быть pNP (Пуэрто-Рико/34) или pM2 (Новая Каледония/99). Плазмидой может быть WLV009 , pVAX, pcDNA3.0 или provax или любой другой вектор экспрессии, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген и позволяющий клетке выполнять трансляцию последовательности в антиген, который распознается иммунной системой.
[00125] LEC может быть pcrM2. LEC может быть pcrNP. pcrNP и pcrMR могут быть получены из pNP (Пуэрто-Рико/34) и pM2 (Новая Каледония/99) соответственно.
[00126] Вектор может иметь промотор. Промотор может быть любым промотором, который способен управлять экспрессией гена и регулировать экспрессию выделенной нуклеиновой кислоты. Такой промотор представляет собой цис-действующий элемент последовательности, необходимый для транскрипции через ДНК-зависимую РНК-полимеразу, которая транскрибирует последовательность антигена, описанную в настоящем документе. Выбор промотора, используемого для прямой экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Промотор может быть расположен приблизительно на том же расстоянии от начала транскрипции в векторе, что и от начального сайта транскрипции в его естественных условиях. Тем не менее, изменение этого расстояния может быть обеспечено без потери функции промотора.
[00127] Промотор может быть функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген и сигналы, необходимые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайтов связывания рибосом и терминации трансляции.
[00128] Промотором может быть промотор CMV, ранний промотор SV40, поздний промотор SV40, металлотионеиновый промотор, промотор вируса опухоли молочной железы мыши, промотор вируса саркомы Рауса, промотор полиэдрина или другой промотор, показанный эффективным для экспрессии в эукариотических клетках.
[0105] Вектор может включать энхансер и интрон с функциональными донорными и акцепторными сайтами сплайсинга. Вектор может содержать область терминации транскрипции справа от структурного гена для обеспечения эффективной терминации. Область терминации может быть получена из того же гена, что и последовательность промотора, или может быть получена из разных генов.
Способы получения вектора
[0106] В данном документе предложены способы получения вектора, которые содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген PRAME, обсуждаемый в данном документе. После заключительной стадии субклонирования в плазмиду для экспрессии в млекопитающих вектор может быть использован для инокуляции культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре с использованием известных в данной области способов.
[0107] Вектор для использования с устройствами EP, которые более подробно описаны ниже, может быть приготовлен или изготовлен с использованием комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии изготовления плазмид, которая описана в лицензированной, находящейся на рассмотрении заявке США № 12/126 611, которая была подана 23 мая 2008 года. В некоторых примерах молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антиген PRAME, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии изготовления также включают или объединяют различные устройства и протоколы, которые обычно известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в заявке США № 60/939 792, включая те, которые описаны в лицензированном патенте США № 7238522, выданном 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент США № 60/939792 и патент США № 7238522, соответственно, включены в данный документ посредством ссылки полностью.
Наполнители и другие компоненты вакцины
[0108] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой функциональные молекулы, такие как наполнители, переносчики или разбавители. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой агент, облегчающий трансфекцию, который может включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид A, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные средства, облегчающие трансфекцию.
[0109] Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая L-глутамат (LGS) или липид. Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой поли-L-глутамат, а поли-L-глутамат может присутствовать в вакцине в концентрации менее 6 мг/мл. Средство, облегчающее трансфекцию, может также включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновую кислоту также могут быть использованы в сочетании с генетической конструкцией. Вакцины на основе ДНК-плазмид могут также включать средство, облегчающее трансфекцию, такое как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосом (см., например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные средства, облегчающие трансфекцию. Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая L-глутамат (LGS) или липид. Концентрация трансфекционного средства в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл. менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[0110] Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой один или более адъювантов. Адъювант может представлять собой другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или доставляются в виде белков в комбинации с указанной выше плазмидой в вакцине. Один или более адъювантов могут быть выбраны из группы, состоящей из: CCL20, α-интерферона (IFN-α), β-интерферона (IFN-β), γ-интерферона, фактора роста тромбоцитов (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермального фактора роста (EGF), хемокина, привлекающего Т-клетки кожи (CTACK), эпителиального тимус-экспрессированного хемокина (TECK), эпителиального хемокина, связанного со слизистой оболочкой (MEC), MHC, CD80, CD86, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-28, IL-33, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-селектина, P-селектина, E-селектина, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, мутантных форм IL-18, CD40, CD40L, фактора роста сосудов, фактора роста фибробластов, IL-7, фактора роста нервов, фактор роста сосудистого эндотелия, Fas, рецептора TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазы ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивного NIK, SAP K, SAP-I, JNK, генов ответа интерферона, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, IL-15, имеющих сигнальную последовательность или кодирующую последовательность, которая кодирует удаленную сигнальную последовательность, и необязательно включает другой сигнальный пептид, такой как из IgE, или кодирующую последовательность, которая кодирует другой сигнальный пептид, такой как из IgE, и его функциональные фрагменты или их комбинацию. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, IL-33, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 или их комбинация.
[0111] В некоторых вариантах воплощения адъювант может представлять собой один или более белков и/или молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки, выбранные из группы, состоящей из: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, IL-33, CTACK, TECK, MEC или RANTES. Примеры конструкций и последовательностей IL-12 раскрыты в заявке PCT № PCT/US1997/019502 и соответствующей заявке США № 08/956,865, а также в заявке PCT № PCT/US2012/069017, поданной 11 декабря 2012 г., и соответствующей заявке США № 14/365086, поданной 12 июня 2014 года, поданной 12 декабря 2011 года, и 15/055,002, поданной 26 февраля 2016 года, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-15 раскрыты в заявке PCT № PCT/US04/18962 и соответствующей заявке США № 10/560650, и в заявке PCT № PCT/US07/00886 и соответствующей заявке США № 12/160766, и в заявке PCT № PCT/US10/048827, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-28 раскрыты в заявке PCT № PCT/US09/039648 и соответствующей заявке США № 12/936192, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT № PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке США № 09/622 452, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT № PCT/US11/024098, которая включена в данный документ посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT № PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке США № 09/622 452, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT № PCT/US11/024098, которая включена в данный документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей хемокинов CTACK, TECK и MEC раскрыты в заявке PCT № PCT/US2005/042231 и соответствующей заявке США № 11/719646, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры ОХ40 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 10/560653, которая включена в данный документ посредством ссылки. Примеры DR5 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 09/622 452, которая включена в данный документ посредством ссылки.
[0112] Другие гены, которые могут быть использованы в качестве адъювантов, включают те, которые кодируют: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, IL-22, фактора роста нервов, фактор роста сосудистого эндотелия, Fas, рецептор TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивный NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены ответа интерферона, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
[0113] Вакцина может дополнительно содержать средство, способствующее генетической вакцине, как описано в заявке США № 021579, поданной 1 апреля 1994 года, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.
[0114] Вакцина может содержать антиген и плазмиды в количестве от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграмм; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; или предпочтительно от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; или более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 2 мг. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина по настоящему изобретению содержит от приблизительно 5 нанограмм до приблизительно 1000 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 10 нанограмм до приблизительно 800 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм, от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм, от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграмм; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; от приблизительно 1 миллиграмма до приблизительно 2 миллиграмм, от приблизительно 5 нанограмм до приблизительно 1000 микрограмм, от приблизительно 10 нанограмм до приблизительно 800 микрограмм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм, от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм, от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм, от приблизительно 100 до приблизительно 200 мкг антигена или его плазмиды.
[0115] Вакцина может быть составлена в соответствии с применяемым способом введения. Фармацевтическая композиция для инъекционных вакцин может быть стерильной, апирогенной и не содержат твердых частиц. Можно использовать изотонический состав или раствор. Добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Вакцина может содержать вазоконстриктор. Изотонические растворы могут включать забуференный фосфатом физиологический раствор. Вакцина может дополнительно содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы могут обеспечивать стабильность состава при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение продолжительных периодов времени, включая LGS или поликатионы или полианионы.
Фармацевтические композиции вакцины
[0116] Вакцина может быть в форме фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать вакцину. Фармацевтические композиции могут содержать от приблизительно 5 нанограмм (нг) до приблизительно 10 миллиграмм (мг) молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат от приблизительно 25 нг до приблизительно 5 мг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 50 нг до приблизительно 1 мг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 5 до приблизительно 250 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 до приблизительно 200 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 15 до приблизительно 150 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 20 до приблизительно 100 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 75 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 30 до приблизительно 50 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 35 до приблизительно 40 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 микрограмм до приблизительно 100 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 20 микрограмм до приблизительно 80 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 микрограмм до приблизительно 60 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 30 нг до приблизительно 50 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 35 нг до приблизительно 45 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины.
[0117] В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг или более молекулы нуклеиновой кислоты вакцины.
[0118] В других вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать до и включая 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать до и включая 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины.
[0119] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие средства для целей составления в соответствии с используемым способом введения. В тех случаях, когда фармацевтические композиции представляют собой фармацевтические композиции для инъекций, они являются стерильными, апирогенными и не содержат твердых частиц. Предпочтительно использовать изотонический состав. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях предпочтительными являются изотонические растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах воплощения вазоконстрикторный агент добавляют к препарату.
[0120] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой функциональные молекулы, такие как наполнители, адъюванты, переносчики или разбавители. Фармацевтически приемлемый наполнитель может быть средством, облегчающим трансфекцию.
[0121] В некоторых вариантах воплощения средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая L-глутамат (LGS) или липид. В одном варианте воплощения средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой поли-L-глутамат, а более предпочтительно поли-L-глутамат присутствует в вакцине в концентрации менее чем 6 мг/мл. Средство, облегчающее трансфекцию, может также включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновую кислоту также могут быть использованы в сочетании с генетической конструкцией. В некоторых вариантах воплощения средство, облегчающее трансфекцию, может содержать липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосом (см., например, WO/9324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные средства, облегчающие трансфекцию. Концентрация трансфекционного средства в вакцине может быть менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл. менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
Способы вакцинации
[0122] В данном документе представлены способы лечения и/или профилактики PRAME-экспрессирующего рака с использованием фармацевтических составов, описанных выше. Также в данном документе описаны способы применения фармацевтических составов, описанных выше, для лечения и/или профилактики PRAME экспрессирующего рака у субъекта. В данном документе также описаны способы вакцинации субъекта. Также в данном документе описаны способы введения фармацевтических составов, описанных в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Способы, описанные в данном документе, в совокупности называемые способами лечения с использованием фармацевтических составов, описанных в данном документе, могут включать введение одной или более вакцин, как описано в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом, для индукции терапевтического и/или профилактического иммунного ответа. Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта и усиления иммунного ответа. Введение вакцины может быть трансфекцией раковых антигенов, как описано в данном документе, в виде молекулы нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется в трансфецированной клетке и доставляется на поверхность клетки, после чего иммунная система распознает антиген и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Введение вакцины может быть использовано для того, чтобы индуцировать или вызвать иммунный ответ у субъектов против одного или более раковых антигенов, как описано в настоящем документе, путем введения субъекту вакцины, как описано в настоящем документе.
[0123] Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта и, таким образом, усиления иммунного ответа. В некоторых вариантах субъектом является млекопитающее. При введении вакцины млекопитающему и тем самым введении вектора в клетки млекопитающего трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать один или более раковых антигенов, как описано в данном документе. Эти секретируемые белки или синтетические антигены будут распознаваться иммунной системой как чужеродные, что приведет к возникновению иммунного ответа, который может включать: антитела, созданные против одного или более раковых антигенов, и ответ Т-клеток, конкретно против одного или более раковых антигенов. В некоторых примерах млекопитающее, вакцинированное вакцинами, обсуждаемыми в данном документе, будет иметь примированную иммунную систему, и при заражении одним или более антигенами рака, как описано в настоящем документе, примированная иммунная система позволит быстро избавиться от последующих антигенов рака, как описано в настоящем документе, независимо от того, через гуморальный, клеточный или как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ.
[0124] Способы введения молекулы нуклеиновой кислоты вакцины описаны в патентах США №№ 4945050 и 5036006, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
[0125] Вакцина может быть введена млекопитающему, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающего. Млекопитающее может быть человеком, приматом, не являющимся человеком, коровой, свиньей, овцой, козой, антилопой, бизоном, водяным буйволом, быками, оленем, ежами, слонами, ламой, альпакой, мышами, крысами и предпочтительно человеком, коровой или свиньей Вакцина также может быть введена субъекту, не являющемуся млекопитающим, например курице, чтобы вызвать иммунный ответ.
[0126] Доза вакцины может составлять от 1 микрограмм до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) массы тела во времени (компонент/кг массы тела/время) и может составлять от 20 микрограмм до 10 мг компонента/кг массы тела/время. Вакцину можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.
Способы генерации иммунного ответа с помощью вакцины
[0127] Вакцина может быть использована для генерирования иммунного ответа у млекопитающего или немлекопитающего субъекта, включая терапевтический или профилактический иммунный ответ. Иммунный ответ может генерировать антитела и/или Т-клетки-киллеры, которые направленные на один или более раковых антигенов, как описано в данном документе. Такие антитела и Т-клетки могут быть выделены.
[0128] Некоторые варианты воплощения предоставляют способы генерирования иммунных ответов против одного или более раковых антигенов, как описано в данном документе, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины субъекту. Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы профилактической вакцинации субъекта против рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, как описано выше, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Некоторые варианты воплощения предоставляют способы терапевтической вакцинации субъекта, который страдает от рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Диагностика рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, как описано в данном документе, до введения вакцины может проводиться в обычном режиме.
Способы лечения рака с помощью вакцины
[0129] Вакцина может быть использована для генерирования или индукции иммунного ответа у млекопитающего или субъекта, нуждающегося в этом, который является реактивным или направленным на HPV-опосредованный PRAME-экспрессирующий рак, такой как, но не ограничиваясь, рак яичника и, в частности, эпителиальный рак яичника. Вызванный иммунный ответ может предотвратить рак или рост опухоли. Вызванный иммунный ответ может предотвращать и/или уменьшать метастазирование раковых или опухолевых клеток. Соответственно, вакцина может быть использована при способе, который лечит и/или предотвращает рак или опухоли у млекопитающего или субъекта, которому вводят вакцину.
+
[0130] В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может опосредовать клиренс или предотвращать рост опухолевых клеток путем индуцирования (1) гуморального иммунитета посредством ответов В-клеток, чтобы генерировать антитела, которые блокируют выработку моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1), тем самым задерживая клетки-супрессоры миелоидного происхождения (MDSC) и подавляя роста опухоли; (2) увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов, таких как CD8 (CTL), для атаки и уничтожения опухолевых клеток; (3) увеличения ответов Т-хелперов; (4) и усиления воспалительных реакций посредством IFN-γ и TFN-α или предпочтительно путем всего вышеупомянутого.
[0131] В некоторых вариантах воплощения иммунный ответ может генерировать гуморальный иммунный ответ и/или ответ антигенспецифического цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ), который не вызывает повреждения или воспаления различных тканей или систем (например, мозга или неврологической системы и т.д.) у субъекта, которому вводили вакцину.
[0132] В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может увеличить выживаемость без опухоли, уменьшить массу опухоли или их комбинацию у субъекта. Введение вакцины может увеличить выживаемость у субъекта без опухолей на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%. Введение вакцины может снижать массу опухоли у субъекта на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69% и 70% после иммунизации. Вводимая вакцина может предотвращать и блокировать PRAME-опосредованное ингибирование рецептора ретиноевой кислоты.
[0133] В некоторых вариантах воплощения вакцину можно вводить периферично (как описано более подробно ниже) для установления антиген-специфического иммунного ответа, нацеленного на раковые или опухолевые клетки или ткань, чтобы очистить или устранить рак или опухоль, экспрессирующую один или более видов раковых антигенов, не повреждая субъекта и не вызывая заболевания или смерти у субъекта, которому вводят вакцину.
[0134] Введенная вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта кратно приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, приблизительно от 100 до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от 200 раз до 6000 раз, приблизительно от в 250 раз до в 6000 раз или приблизительно в 300 раз приблизительно в 6000 раз. В некоторых вариантах воплощения введенная вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта кратно приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз.
[0135] Введенная вакцина может повышать уровни интерферона гамма (IFN-γ) у субъекта кратно приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, приблизительно от 100 до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от 200 раз до 6000 раз, приблизительно от в 250 раз до в 6000 раз или приблизительно в 300 раз приблизительно в 6000 раз. В некоторых вариантах воплощения введенная вакцина может повышать уровни интерферона гамма (IFN-γ) у субъекта кратно приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз.
[0136] Доза вакцины может составлять от 1 микрограмма до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) массы тела во времени (компонент/кг массы тела/время) и может составлять от 20 микрограмм до 10 мг компонента/кг массы тела/время. Вакцину можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.
Пути введения
[0137] Вакцина или фармацевтическая композиция может вводиться различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, посредством ингаляции, посредством буккального введения, внутриплеврально, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, интраназально, интратекально и/или внутрисуставно, или их комбинациями. Для ветеринарного применения композицию можно вводить в виде подходящей приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить режим дозирования и путь введения, который наиболее подходит для конкретного животного. Вакцину можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами» или других физических способов, таких как электропорация («EP»), «гидродинамический способ» или ультразвук.
[0138] Вектор вакцины может быть введен млекопитающему с помощью нескольких хорошо известных технологий, включая инъекцию ДНК (также называемую ДНК-вакцинацией) с in vivo электропорацией и без нее, трансфекцию, опосредованную липосомами, трансфекцию, обеспеченную наночастицами, и использование рекомбинантных векторов, таких как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус-ассоциированный вирус и рекомбинантная вакцинация. Один или более раковых антигенов вакцины можно вводить путем инъекции ДНК вместе с in vivo электропорацией.
Электропорация
[0139] Вакцину или фармацевтическую композицию могут вводить путем электропорации. Введение вакцины посредством электропорации может быть выполнено с использованием устройств электропорации, которые могут быть сконфигурированы для доставки в желаемую ткань млекопитающего импульса энергии, эффективного для образования обратимых пор в клеточных мембранах, и предпочтительно импульс энергии представляет собой постоянный ток аналогично входящему току, заданному пользователем. Устройство электропорации может содержать компонент электропорации и электродную установку или ручную установку. Компонент электропорации может включать и объединять один или более различных элементов устройств электропорации, в том числе: контроллер, генератор сигналов тока, измеритель импеданса, регистратор сигналов, элемент ввода, элемент сообщения о состоянии, порт связи, компонент памяти, источник питания и выключатель. Электропорацию можно проводить с использованием устройства электропорации in vivo, например системы CELLECTRA EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Блу Белл, Пенсильвания) или электропоратора Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.), чтобы облегчить трансфекцию клеток плазмидой.
[0140] Примеры устройств электропорации и способов электропорации, которые могут облегчать введение ДНК-вакцин по настоящему изобретению, включают те, которые описаны в патенте США 7245963; публикации США № 2005/0052630, содержание которой полностью включено в качестве ссылки. Другие устройства электропорации и способы электропорации, которые можно использовать для облегчения введения ДНК-вакцин, включают устройства, представленные в одновременно находящейся на рассмотрении и находящейся в совместном владении заявке на патент США № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., заявки США № 60/852149, поданной 17 октября 2006 г., и 60/978 982, поданной 10 октября 2007 г., все из которых включены в данный документ посредством ссылки полностью.
[0141] Патент США № 7245963 описывает модульные электродные системы и их использование для обеспечения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Модульные электродные системы могут содержать множество игольчатых электродов; игла для подкожных инъекций; электрический разъем, который обеспечивает проводящую связь от программируемого импульсного контроллера постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может обхватить множество игольчатых электродов, которые установлены на опорной конструкции и плотно вставить их в выбранную ткань в теле или растении. Затем биомолекулы вводят через подкожную иглу в выбранную ткань. Программируемый контроллер импульсов постоянного тока активируется, и электрический импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Применяемый электрический импульс постоянного тока облегчает введение биомолекулы в клетку между совокупностью электродов. Все содержание патента США № 7245963 полностью включено в данный документ посредством ссылки.
[0142] Публикация США № 2005/0052630 описывает устройство электропорации, которое можно использовать для эффективного обеспечения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Устройство электропорации содержит электрокинетическое устройство («устройство EKD»), работа которого определяется программным обеспечением или встроенным программным обеспечением. Устройство EKD генерирует серию программируемых паттернов импульсов постоянного тока между электродами в массиве на основе пользовательского управления и ввода параметров импульсов, а также позволяет хранить и получать данные о форме сигнала тока. Устройство электропорации также содержит сменный электродный диск, имеющий ряд игольчатых электродов, центральный канал для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Все содержание публикации США № 2005/0052630 полностью включено в данный документ посредством ссылки.
[0143] Массивы электродов и способы, описанные в патенте США № 7245963 и публикации США № 2005/0052630, могут быть адаптированы для глубокого проникновения не только в такие ткани, как мышцы, но также в другие ткани или органы. Из-за конфигурации массива электродов инъекционная игла также полностью вставляется в орган-мишень, и инъекция вводится перпендикулярно целевому проблемному участку в места, которые изначально заданы электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7245963 и публикации США № 2005/005263, предпочтительно имеют длину 20 мм и ширину 21 мм.
[0144] Кроме того, в некоторых вариантах воплощения, которые включают устройства электропорации и их применение, существуют устройства электропорации, которые описаны в следующих патентах: патент США 5 273 525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США 6 110 161, выданные 29 августа 2000 г., 6 261 281, выданный 17 июля 2001 г., 6 958 060, выданный 25 октября 2005 г., и патент США 6 939 862, выданный 6 сентября 2005 г. Кроме того, в настоящем документе рассматриваются патенты, охватывающие объект изобретения, предложенный в патенте США 6 697 669, выданном 24 февраля 2004 г., который касается введения ДНК с использованием любого из множества устройств, и патент США 7 328 064, выданный 5 февраля 2008 г., который относится к способам введения ДНК. Вышеуказанные патенты включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Способы получения вакцины
[0145] В настоящем документе предложены способы получения векторов, включая вакцины, обсуждаемые в данном документе. Векторы после заключительного этапа субклонирования могут быть использованы для инокуляции культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре с использованием способов, известных в данной области техники.
[0146] ДНК-плазмиды для использования с EP-устройствами по настоящему изобретению могут быть составлены или изготовлены с использованием комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии получения плазмид, которая описана в публикации США № 2009/0004716, поданной 23 мая 2007 года. В некоторых примерах ДНК-плазмиды, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии изготовления также включают или объединяют различные устройства и протоколы, которые обычно известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в заявке США № 60/939 792, включая те, которые описаны в лицензированном патенте США № 7238522, выданном 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент США № 60/939792 и патент США № 7238522, соответственно, включены в данный документ посредством ссылки полностью.
[0147] Настоящее изобретение имеет множество аспектов, иллюстрируемых следующими неограничивающими примерами.
Примеры
[0148] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры, хотя и указывают предпочтительные варианты воплощения изобретения, приведены только в качестве иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники может определить основные характеристики этого изобретения и, не отступая от его сущности и объема, может внести различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в данном документе, будут очевидны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Такие модификации также должны попадать в объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1
Синтетический консенсус PRAME
[0149] Для получения человеческого консенсуса PRAME из GenBank было собрано 10 последовательностей PRAME (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Номера доступа GenBank для выбранных последовательностей PRAME являются:
[0150] NP_006106.1, AFX65483.1, XP_001090516.1, AFI35054.1, AFJ71405.1, XP_003805956.1, XP_525643.2, BAK62424.1, XP_003919211.1 и XP_003919212.1.
[0151] Консенсусная последовательность была получена с помощью программного пакета DNASTAR Lasergene (версия 13.0.0.357). Последовательности, перечисленные выше, были импортированы в MegAlign и выровнены с использованием программы выравнивания множественных последовательностей ClustalW. Полученная последовательность PRAME разделяет 95,1% - 95,5% гомологии с последовательностями нативного человеческого PRAME.
Homo Sapiens
[0152] Как только была получена синтетическая консенсусная PRAME последовательность ДНК, для того, чтобы иметь более высокий уровень экспрессии, к N-концу добавляли левую последовательность Kozak и лидерную последовательность IgE. Кроме того, использование кодонов этого гена было адаптировано к смещению кодонов генов . Кроме того, была проведена оптимизация РНК: избегали областей с очень высоким (> 80%) или очень низким (<30%) содержанием GC и мотивами цис-действующей последовательности, таких как внутренние TATA боксы, chi-сайты и сайты рибосомного входа. Чтобы исключить потенциальную функцию экспрессируемой молекулы PRAME в репрессии передачи сигналов ретиноевой кислоты, были введены две точечные мутации (L487V и L488V) в боксе ядерных рецепторов LRELL PRAME, что привело к измененному синтетическому консенсусу PRAME. Эта модифицированная синтетическая консенсусная белковая последовательность PRAME имеет идентичность 94,7% - 95,1% с нативными белками PRAME человека. Характеристики синтетического консенсуса PRAME приведены в таблице 1.
<b>Таблица 1: Характеристики синтетического консенсуса PRAME</b>
<b>Характеристики</b>
<b>Модифицированный синтетический консенсус PRAME</b>
Идентичность к нативному PRAME человека
<b>94.7% - 95.1%</b>
Идентичность к нативному PRAME макаки-резус
<b>98.6%</b>
Идентичность к нативному PRAME мыши
<b>35.2%</b>
Количество аминокислотных мутаций (по сравнению с нативным человеческим)
<b>25-27</b>
Количество встроенных мутаций (происхождение не от консенсуса)
<b>2</b>
Молекулярная масса
<b>528 aa (58 КДа)</b>
Длина кодирующей последовательности (bp)
<b>1584</b>
[0153] Ссылаясь на ФИГ. 2, выравнивание последовательности модифицированного консенсусного PRAME с пятью человеческими последовательностями PRAME иллюстрирует аминокислотные различия между последовательностями. Замены лейцина на валин в аминокислотных остатках 487 и 488 модифицированного синтетического консенсуса PRAME выделены как аминокислотные различия. Процент идентичности между выровненными последовательностями представлен в таблице 2.
<b>Таблица 2: Процент идентичности модифицированного консенсуса PRAME с человеческим PRAME</b>
1
2
3
4
5
1
95,1
94,7
94,9
94,9
PRAMEmut-GenScript.pro
2
5,1
99,6
99,8
99,8
huPRAME(AAH39731.pro)
3
5,5
0,4
99,8
99,8
huPRAME(AFX65483).pro
4
5,3
0,2
0,2
100
huPRAME(NP_006106).pro
5
5,3
0,2
0,2
0,0
huPRAME(78395).pro
Сравнения неизмененного синтетического консенсуса PRAME и модифицированного консенсуса PRAME приведены в таблице 3.
<b>Таблица 3: Сравнение модифицированного и неизмененного консенсуса PRAME</b>
Человеческая последовательность
Мышиная последовательность
Последовательность макаки-резус
Консенсус PRAME
95,1% - 95,5%
39,8% - 42,6%
98,6% - 98,8%
Модифицированный консенсус PRAME
94,7% - 95,1%
39,8% - 42,1%
98,4% - 98,6%
Bam
Xho
[0154] Ссылаясь на ФИГ. 3, синтезированный синтетический консенсус PRAME был расщеплен HI и I и клонирован в экспрессирующий вектор Inovio pGX0001 с экспрессионной кассетой, помещенной под транскрипционный контроль немедленно-раннего промотора цитомегаловируса. Полученная плазмида была обозначена pGX1421, и для подтверждения последовательности было выполнено секвенирование во всю длину.
[0155] pGX1421 представляет собой ДНК-плазмиду, кодирующую белок синтетического консенсусного антигена PRAME. Связанное продуцирование мРНК управляется человеческим промотором CMV (промотором hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH polyA). Основа pGX0001 (модифицированный вектор экспрессии pVAX1, исходный pVAX1, полученный от ThermoFisher, Сент-Луис, Миссури) включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и точку начала репликации плазмиды (pUC ori) для цели продуцирования. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках.
[0156] Модификации были введены в pVAX1 для создания pGX0001 и идентифицированы на основе описанной последовательности pVAX1, доступной от Thermo Fisher Scientific. Эти модификации перечислены ниже, и не было обнаружено никаких проблем, касающихся амплификации плазмиды и транскрипции и трансляции антигена.
[0157] C>G 241 в CMV промоторе
[0158] C>T 1158 основная цепь, справа от сигнала полиаденилирования (bGH polyA) бычьего гормона роста
[0159] A> - 2092 основная цепь, справа от гена устойчивости к канамицину
[0160] C>T 2493 в точке начала репликации pUC (pUC ori)
[0161] G>C 2969 в самом конце Ori pUC слева от сайта RNASeH
[0162] Пары оснований 2, 3 и 4 изменяются с ACT на CTG в основной цепи слева от промотора CMV.
Пример 2
Экспрессия PRAME
[0163] Экспрессию PRAME исследовали в клеточных линиях, трансфицированных плазмидой, кодирующей синтетический консенсус PRAME (pGX1411) или контролем, чтобы определить, экспрессировался ли синтетический антиген. Вестерн-блот анализ клеточных линий с использованием коммерчески доступного антитела против PRAME и контрольного антитела к β-актину показывает, что только те клетки, которые были трансфицированы pGX1411, демонстрировали экспрессию белка PRAME, который мигрировал с правильной молекулярной массой (ФИГ. 4). В непрямом иммунофлуоресцентном анализе сравнивали экспрессию гена PRAME с экспрессией pVAX в клетках рабдомиосаркомы и клетках Hek293. Ссылаясь на ФИГ. 5, синтетический консенсус PRAME был экспрессирован в обеих клеточных линиях, в то время как pVAX-отрицательный контроль не был.
Пример 3:
Иммуногенность у мышей
[0164] Исследования иммуногенности проводили на мышах C57Bl/6 в соответствии с графиком иммунизации и забора крови, изображенным на фиг. 6. Вкратце, дозировки 5, 10, 15, 25 и 50 мкг pGX1411 на иммунизацию вводили мышам в моменты времени на неделе 0 (начальная иммунизация), неделе 2, неделе 4 и при ELISpot. У мышей брали кровь в моменты времени недели 0 (базовое измерение) и недели 5. Изначально было проведено исследование доза-эффект для определения наиболее эффективной дозы, а со ссылкой на ФИГ. 7, все исследованные дозы приводили к большей реакции, чем наивные. Наблюдалось незначительное увеличение ответа при увеличении дозы до 15 мкг pGX1411 ДНК. При более высоких дозах 25 и 50 мкг ДНК pGX1411 ответ выходил на плато.
[0165] Синтетический консенсус PRAME был высокоиммуногенным (ФИГ. 8А) у мышей и иммунодоминантные эпитопы были идентифицированы с помощью картирования эпитопов (ФИГ. 8B и таблица 4). Вкратце, были получены пептиды, охватывающие весь консенсус PRAME, каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков, перекрывающихся на 8 аминокислот. Эти пептиды были объединены в 3 пептидных пула (таблица 4). Спленоциты от наивных и иммунизированных pGX1411 мышей стимулировали с помощью 3 пептидных пулов в анализах IFN ELISpot на мышах. Результаты показаны на ФИГ. 8A. Иммунодоминантные эпитопы идентифицировали с использованием подхода картирования пептидной матрицы (ФИГ. 8B). Иммунодоминантные эпитопы подчеркнуты в таблице 4.
<b>Таблица 4</b>. Иммунодоминантные эпитопы, идентифицированные у мышей, иммунизированных pGX1411
<b>Номер пула</b>
<b>Количество эпитоп-содержащих пептидов</b>
<b>Последовательность эпитоп-содержащих пептидов</b>
Пул 1aa 1-197
22 пептида
RVHSERRRLRGSIQS - RLRGSIQSRYISMSV - SRYISMSVWTSPRRL - VWTSPRRLVELAGQS - LVELAGQSLLKDEAL - SLLKDEALAIAALEL - LLPRELFPPLFMAAF - PPLFMAAFDGRHSQT - FDGRHSQTLKAMVQA - TLKAMVQAWPFTCLP - AWPFTCLPLGVLMKG - PLGVLMKGQQLHLET -GQQLHLETFKAVLDG - TFKA<u>VLDGLDVLL</u>AQ - GLDVLLAQEVRPRRW - QEVRPRRWKLEVLDL - WKLEVLDLRKNSHQD - LRKNSHQDFWTVWSG - DFWTVWSGNRASLYS - GNRA<u>SLYSFPE</u>PEAA - SFPEPEAAQPMRKKR - AQPMRKKRKVDGLST - RKVDGLSTEAEQPFT
Пул 2aa 190- 372
10 пептидов
TPIEVLVDLSLKEGA - DLSLKEGACDELFSY - ACDELFSYLMEKVKR - YLMEKVKRQKNVLHL - RQKNVLHLCCKKLKI - LCCKKLKIFAMPMQD - IFAMPMQDIKMILKM - DIKMILKMVQLDSIE - EDLEVTCTWKLPTLA - TWKLPTLAKFSPYLG -
Пул 3aa 365-526
15 пептидов
ASATLQDLDFDECGI - LDFDECGIMDDQLLV - IMDDQLLVLLPSLSH - VLLPSLSHCSQLTTL - HCSQLTTLSFCGNPI - LSFCGNPISISVLQN - NLLHHLIGLSNLTHV - GLS<u>NLTHVLYPV</u>PLE -ESYEDVHGTLHLGRL - GTLHLGRLAYLHARL - LAYLHARLRELLCEL - LRELLCELGRPSMVW LGRPSMVWLSANPCP - PHCGDRTFYDPEPIL - FYDPEPILCPCFMPN
(Ранее опубликованные HLA-A * 02 - ограниченные пептиды PRAME: ALYVDSLFFL, VLDGLDVLL, SLYSFPEA, SLLQHILGL и NLTHVLYPV (Quintarelli et al. 2011)).
[0166] Антиген-специфические CD4+и CD8+Т-клеточные ответы, индуцированные pGX1411, оценивали путем окрашивания внутриклеточных цитокинов стимулированных пептидом спленоцитов от наивных и обработанных pGX1411 мышей. Клетки CD4+от мышей, обработанных pGX1411, показали небольшое, хотя значимое, увеличение IFN-γ после обработки pGX1411 (ФИГ. 9А), тогда как клетки CD8+приводили к почти 10-кратному большему значительному увеличению (ФИГ. 9B). Для TNF-α и CD107a +, CD8+клетки приводили к значительно большему увеличению при обработке pGX1411 (ФИГ. 9D и 9F), тогда как для клеток CD4+не было различий между наивными и pGX1411 обработкой (фиг. 9C и 9E). В целом, синтетический консенсусный PRAME индуцирует как CD4 +, так и CD8+T-клетки, причем CD8+демонстрируют более высокий цитокиновый ответ.
[0167] Титры конечной точки определяли в зависимости от дозы для pGX1411, а именно 5, 25 и 50 мкг, как показано на ФИГ. 10. Каждая исследованная доза увеличивала титр конечной точки по сравнению с наивной, хотя увеличение дозы не увеличивало ответ титра конечной точки значимо. Чтобы определить, могут ли индуцированные pGX1411 антитела распознавать нативный PRAME, экспрессируемый при раке человека, реакционную способность pGX1411 при раке исследовали с помощью иммуногистохимии, как показано на ФИГ. 11. Срезы тканей из биоптатов рака человека окрашивали сыворотками наивных или обработанных pGX1411 мышей. После обработки биотинилированным вторичным антителом срезы ткани окрашивали диаминобензидином с перекисью водорода и контрастировали с гематоксилином. В качестве сравнения использовали окрашивание ткани коммерческим антителом PRAME. Положительное окрашивание было обнаружено в образце ткани рака меланомы с использованием вакцинированной pGX1411 сыворотки мыши и коммерческого антитела PRAME, но не с использованием наивной мышиной сыворотки. Следовательно, вакцинация pGX1411 обладает способностью индуцировать PRAME-специфические антитела.
6
6
[0168] Модифицированный синтетический консенсус PRAME, кодируемый pGX1421, индуцирует иммунный ответ, сходный с генерируемым немодифицированным синтетическим консенсусом PRAME, кодируемым pGX1411. Ссылаясь на ФИГ. 12, этот вызванный иммунный ответ pGX1421 сравним с таковым, вызванным pGX1411, при исследовании ELISpot у мышей. Как pGX1411, так и pGX1421 в дозе 5 мкг дали приблизительно 900 SFU/10 мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) по сравнению с исходными уровнями для наивных (0 SFU/10 PBMC).
Пример 4:
Иммуногенность у приматов, не являющихся человеком (NHP)
6
6
[0169] Исследования иммуногенности проводили на приматах, не являющихся человеком (NHP), в соответствии с графиком иммунизации и забора крови, изображенным на ФИГ. 13. pGX1421 доставлялся внутримышечно (IM) с 5P CELLECTRA в чередующиеся контралатеральные конечности с оптимизированным резусом IL-12 (pGX6006) на неделе 0, 4, 8 и 12 с заборами крови каждые 2 недели после иммунизации. Ссылаясь на ФИГ. 14A-14C клеточную иммуногенность оценивали с помощью IFNγ ELISpot, ICS, и измеренные ответы IFNγ выявили общее увеличение при четырех иммунизациях pGX1421 и pGX6006. После третьей иммунизации IFNγ увеличился до приблизительно 600 SFU/10 PBMC по сравнению с исходными уровнями. Четвертая иммунизация слегка усилила ответ по сравнению с третьей иммунизацией приблизительно с 700 SFU/10 PBMC (фиг. 14A). Отдельные ответы показаны на фиг. 14B и 14C, с двумя из шести NHP, имеющими более чем средний ответ после третьей иммунизации. Это число увеличилось до трех из шести NHP, имеющих более высокий, чем средний, ответ после четвертой иммунизации. В целом, шесть из шести NHP ответили, как определено с помощью IFNγ ELISpot, через две недели после третьей иммунизации (10-я неделя) по сравнению с неделей 0.
[0170] Ссылаясь на ФИГ. 15A-15D, pGX1421 и pGX6006 индуцируют минимальные ответы CD4+T-клеток по сравнению с ответами CD8+T-клеток. Ответы CD4+Т-клеток не наблюдались ни в одном NHP, но надежные ответы CD8+Т-клеток были обнаружены ICS в NHP с наивысшим ответом ELISpot IFNγ через две недели после четвертой иммунизации, в NHP 5840 и 5967 (ФИГ. 15C).
Пример 5:
Характеристика адъювантного эффекта pGX6006 на иммуногенность, вызванную PRAME
[0171] Пятнадцать NHP были разделены на три группы, как показано в таблице 5, чтобы определить адъювантный эффект pGX6006. Схема иммунизации и заборов крови была одинаковой для всех трех групп и изображена на фиг. 13.
Таблица 5. Группы исследований
<b>Группа</b>
<b>N</b>
<b>Конструкция антигена</b>
<b>Конструкция адъюванта</b>
1
5
pGX1421 (2,0 мг)
N/A
2
5
pGX1421 (2,0 мг)
pGX6006 (0,20 мг)
3
5
pGX1411 (2,0 мг)
pGX6006 (0,20 мг)
[0172] Ссылаясь на ФИГ. 16A-16C, IL-12 значительно увеличивал ответы IFNγ на PRAME, кодируемый pGX1421, через две недели PD3 (10-я неделя) и PD4 (14-я неделя). После третьей иммунизации средний IFNγ SFU, индуцированный одним pGX1421 (108 ± 124), был значительно ниже, чем средний ответ, индуцированный pGX1421 и pGX6006 вместе (609 ± 597, p <0,08). Ответы IFNγ усилились в группе 2 после четвертой иммунизации (1636 ± 999 SFU, p <0,08, фиг. 16C).
+
[0173] Клеточные иммунные ответы, индуцированные pGX1421 и pGX1421 в комбинации с pGX6006, дополнительно характеризовались проточной цитометрией через две недели PD4 (неделя 14, фиг. 17A-17C). Были минимальные ответы, обнаруженные в компартменте CD4 Т-клеток в обеих группах, как показано на фиг. 17A. Минимальные ответы были обнаружены в компартменте CD8+Т-клеток, когда pGX1421 вводили без pGX6006 (фиг. 17B). Большая часть PRAME-специфической популяции CD8+T-клеток, обнаруженных в pGX1421 в комбинации с pGX6006 в течение двух недель PD4, продуцировала как IFNγ, так и TNFα. Остальная часть популяции была преимущественно положительной только по продукции IFNγ. Большинство антиген-специфических CD8+T-клеток, индуцированных pGX1421 в комбинации с pGX6006, были положительными как для CD107a, так и для гранзима B, что указывает на потенциал для CTL и эффекторной функции (фиг. 17C).
[0174] Клеточные иммунные ответы, индуцированные pGX1411 в комбинации с pGX6006 и pGX1421 в комбинации с pGX6006, сравнивали с помощью ELISpot IFNγ (фиг. 18A-18C) и с помощью проточной цитометрии две недели PD4 (14-я неделя, фиг. 19A-19F). Специфичные для PRAME ответы IFNγ через две недели PD3 (666 ± 597 SFU) и PD4 (1931 ± 2795 SFU), индуцированные PGX1411 в сочетании с pGX6006, были сопоставимы с pGX1421 в сочетании с pGX6006 (PD3: 609 ± 597; PD4: 1636 ± 999 SFU). Не было значительного различия между ответами ELISpot IFNγ, индуцированными pGX1411 в комбинации с pGX6006 и pGX1421 в комбинации с pGX6006 в любой момент времени во время исследования (фиг. 18C). Дополнительная характеристика с помощью проточной цитометрии показала тенденцию к более устойчивым ответам CD4+T-клеток с pGX1411 в комбинации с pGX6006 по сравнению с pGX1421 в сочетании с pGX6006 через две недели PD4 (фиг. 19A). Фенотип и величина ответов в компартменте CD8+Т-клеток были сопоставимы для pGX1411 в комбинации с pGX6006 и pGX1421 в комбинации с pGX6006 (фиг. 19B и 19C).
[0175] Таким образом, клеточные иммунные ответы, направленные на PRAME, были сопоставимы для pGX1411 в комбинации с pGX6006 и pGX1421 в комбинации с pGX6006. Включение IL-12, кодируемого pGX6006, значительно усиливало клеточные иммунные ответы, индуцированные pGX1421.
[0176] Нуклеотидная (SEQ ID NO. 1) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO. 2) для синтетического консенсуса Prame представлены в Таблице 6 и Таблице 7 соответственно.
[0177] Понятно, что вышеприведенное подробное описание и сопровождающие примеры являются просто иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничения объема изобретения, который определяется исключительно прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
[0178] Различные изменения и модификации раскрытых вариантов воплощения будут очевидны для специалистов в данной области техники. Такие изменения и модификации к раскрытым вариантам осуществления, включая без ограничения изменения, относящиеся к химическим структурам, заместителям, производным, промежуточным соединениям, синтезам, композициям, составам или способам применения изобретения, могут быть сделаны без отклонения от его сущности и объема.
<b>Таблица 7:</b> Синтетическая консенсусная PRAME белковая последовательность pGX1421
SEQ ID NO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
2
MDWTWILFLVAAATRVHSERRRLRGSIQSRYISMSVWTSPRRLVELAGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQQLHLETFKAVLDGLDVLLAQEVRPRRWKLEVLDLRKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMRKKRKVDGLSTEAEQPFTPIEVLVDLSLKEGACDELFSYLMEKVKRQKNVLHLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLEVTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSSISPEKEEEYIAQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFLRGRLDQLLRHVMNPLETLSVTNCRLSEGDVMHLSQSPNVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLERASATLQDLDFDECGIMDDQLLVLLPSLSHCSQLTTLSFCGNPISISVLQNLLHHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDVHGTLHLGRLAYLHARLREVVCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPN
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  INOVIO PHARMACEUTICALS, INC
YAN, Jian
SLAGER, Anna
GARMAN, Bradley
COOCH, Neil
<120>  ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ НАЦЕЛЕННЫЕ НА PRAME И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  INO-1003WO / 104409.000445
<150>  US 62/598,290
<151>  2017-12-13
<160>  2
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  1584
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная PRAME кодирующая последовательность ДНК pGX1421
<400>  1
atggactgga catggattct gttcctggtc gctgctgcta cacgggtgca ttcagagaga       60
cgaagactgc ggggctcaat tcagagtagg tacatcagta tgtcagtctg gacctcacca      120
cggagactgg tggaactggc cgggcagagc ctgctgaagg atgaggccct ggctattgcc      180
gctctggaac tgctgccccg agagctgttc cctcccctgt tcatggcagc cttcgacgga      240
cgccacagcc agactctgaa ggctatggtc caggcatggc cctttacctg cctgcctctg      300
ggcgtgctga tgaaggggca gcagctgcat ctggagactt tcaaagcagt gctggatggc      360
ctggacgtgc tgctggccca ggaagtgagg cctaggcgct ggaagctgga ggtcctggat      420
ctgcgcaaaa acagccacca ggacttttgg accgtgtggt ccgggaatcg ggccagtctg      480
tactcattcc cagaacccga ggctgcacag ccaatgcgga agaaaagaaa ggtggatgga      540
ctgtccaccg aagctgagca gccttttaca ccaatcgaag tgctggtcga tctgtccctg      600
aaagaaggcg catgcgacga gctgttctct tatctgatgg agaaggtcaa aagacagaag      660
aacgtgctgc acctgtgctg taagaaactg aaaatctttg ctatgcccat gcaggacatc      720
aagatgattc tgaaaatggt ccagctggat tccattgaag acctggaggt cacttgtacc      780
tggaagctgc caacactggc caaattctct ccctacctgg gacagatgat caatctgcga      840
cggctgctgc tgtctcacat ccatgctagc tcctctatta gtcctgagaa ggaggaagag      900
tacattgcac agtttacttc tcagttcctg agtctgcagt gcctgcaggc cctgtatgtg      960
gatagcctgt tctttctgag aggcaggctg gaccagctgc tgcgacacgt catgaacccc     1020
ctggaaacac tgagtgtgac taattgtaga ctgtcagagg gcgatgtgat gcatctgagc     1080
cagtccccta acgtgagcca gctgtccgtc ctgtctctga gtggcgtgat gctgacagac     1140
gtgagccctg aaccactgca ggccctgctg gagcgagcat ctgccactct gcaggacctg     1200
gattttgacg agtgtgggat catggacgat cagctgctgg tgctgctgcc ttcactgagc     1260
cactgctccc agctgaccac actgtctttc tgtgggaacc caatctccat ttctgtgctg     1320
cagaatctgc tgcaccatct gattggactg agcaacctga cccatgtgct gtaccccgtc     1380
cctctggaaa gctatgagga tgtgcacgga acactgcatc tgggcaggct ggcctatctg     1440
cacgctcgcc tgcgagaagt ggtgtgcgag ctgggcagac cctcaatggt gtggctgagc     1500
gccaatccat gtccccattg cggcgaccgg acattctacg accccgaacc tattctgtgc     1560
ccctgcttca tgcctaactg ataa                                            1584
<210>  2
<211>  526
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная PRAME белковая кодирующая последовательность pGX1421
<400>  2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Glu Arg Arg Arg Leu Arg Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile
20                  25                  30
Ser Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly
35                  40                  45
Gln Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu
50                  55                  60
Leu Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly
65                  70                  75                  80
Arg His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr
85                  90                  95
Cys Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln Gln Leu His Leu Glu
100                 105                 110
Thr Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu
115                 120                 125
Val Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Glu Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn
130                 135                 140
Ser His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Arg Lys Lys Arg
165                 170                 175
Lys Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Thr Pro Ile
180                 185                 190
Glu Val Leu Val Asp Leu Ser Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu
195                 200                 205
Phe Ser Tyr Leu Met Glu Lys Val Lys Arg Gln Lys Asn Val Leu His
210                 215                 220
Leu Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile
225                 230                 235                 240
Lys Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr
260                 265                 270
Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His
275                 280                 285
Ala Ser Ser Ser Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Glu Tyr Ile Ala Gln
290                 295                 300
Phe Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val
305                 310                 315                 320
Asp Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His
325                 330                 335
Val Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Val Thr Asn Cys Arg Leu Ser
340                 345                 350
Glu Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Asn Val Ser Gln Leu
355                 360                 365
Ser Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu
370                 375                 380
Pro Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu
385                 390                 395                 400
Asp Phe Asp Glu Cys Gly Ile Met Asp Asp Gln Leu Leu Val Leu Leu
405                 410                 415
Pro Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Cys Gly
420                 425                 430
Asn Pro Ile Ser Ile Ser Val Leu Gln Asn Leu Leu His His Leu Ile
435                 440                 445
Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser
450                 455                 460
Tyr Glu Asp Val His Gly Thr Leu His Leu Gly Arg Leu Ala Tyr Leu
465                 470                 475                 480
His Ala Arg Leu Arg Glu Val Val Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met
485                 490                 495
Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe
500                 505                 510
Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
515                 520                 525
<---