Экспериментальные аспекты изучения хондрогенного потенциала мезенхимальных плюрипотентных и малодифференцированных клеток, "культивированных" in vivo

© Группа авторов, 2002

Экспериментальные аспекты изучения хондрогенного потенциала мезенхимальных плюрипотентных и малодифференцированных клеток, "культивированных" in vivo

Д.А. Маланин, В.Б. Писарев, В.Г. Шилов, Г.Л. Снигур, Л.Л. Черезов, Р.А. Михайлов, И.В. Деревянко

Experimental aspects of studying of chondrogenic potential of mesenchymal pluripotent and little-differentiated cells, "cultivated"

in vivo

D-А. МаЫии, V.B. Pisarev, V.G. Shilov, G.L. Singour, L.L. Cherezov, R-А. Mikhailov,

I.V. Derevianko

Волгоградская медицинская академия

Представлены результаты изучения хондрогенного потенциала мезенхимальных плюрипотентных и малодифференцированных клеток, пересаженных в составе дистракционного регенерата костной мозоли в область полнослойных дефектов суставного гиалинового хряща.

Ключевые слова: гиалиновый хрящ, замещение дефектов, регенерация, дистракция, остеобласты, хондроциты.

The results of the study of the chondrogenic potential of mesenchymal pluripotent and low-differentiated cells, which were transplanted into the zone of full-layer defects of articular hyaline cartilage as a part of callus distraction regenerated bone are presented in the work.

Keywords: hyaline cartilage, defect filling, regeneration, distraction, osteoblasts, chondrocytes.

Приходится согласиться с тем, что разработанные к концу второго тысячелетия экспериментальные и клинические подходы к решению проблемы биологического восстановления повреждений суставного гиалинового хряща (СГХ) еще далеки от совершенства. Известные способы пластики его полнослойных дефектов - «мезенхи-мальная стимуляция» (насверливание, абразия, микропереломы), пересадка хрящевых или кост-но-хрящевых ауто- или аллотрансплантатов большого и малого размеров, пересадка аутогенной надкостницы или надхрящницы в сочетании (или без) с хирургической коррекцией биомеханической оси конечности - используются в клинической практике с различной степенью эффективности [3, 9, 14, 17, 21, 25, 31, 46, 47, 50, 52, 58, 60, 69]. Ожидаемый результат применения этих способов - органотипичное замещение дефектов СГХ и восстановление полноценной функции сустава -характеризуется малой предсказуемостью [19, 25, 33, 39, 40, 41, 55]. Образующийся регенерат обычно представляет собой грубоволокнистую соединительную ткань, волокнистый хрящ или смешанный тип ткани - фибро- и гиалиноподобный хрящ [5, 14, 19, 21, 25, 33, 39, 54, 55, 63]. Биомеханиче-

ские свойства новообразованной ткани изучены недостаточно, но, очевидно, уступают таковым в нормальном СГХ. Отдельные исследовательские работы демонстрируют прогрессирующие дегенеративные изменения регенерата в отдаленные сроки после пластики [32, 53, 54, 63]. Нередко между морфологическим субстратом его и клиническим результатом не отмечается коррелятивных взаимоотношений [33, 37, 39, 55].

Стремление воссоздать не только первоначальную анатомическую форму, но и внутреннюю структуру поврежденной суставной поверхности в настоящее время связывают с развитием таких направлений в медицине, как тканевая инженерия, генная терапия и молекулярная биология, призванных обеспечить достаточную по объему популяцию клеток с хондро-генной экспрессией и матрикс для их развития [1, 49, 55, 61, 66, 67].

Целью настоящего исследования являлось изучение хондрогенного потенциала ме-зенхимальных плюрипотентных и малодиффе-ренцированных клеток, пересаженных в составе дистракционного регенерата костной мозоли в область полнослойных дефектов СГХ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на 12 беспородных собаках (23 коленных сустава) в возрасте от 2 до 5 лет, с массой от 5 до 15 кг.

Оперативные вмешательства выполняли под внутривенным тиопенталовым наркозом. На первом этапе восьми животным 1-й группы осуществляли поперечную остеотомию костей голени одной из задних конечностей (подбугор-ковую - большеберцовой кости, в нижней трети диафиза - малоберцовой кости) и фиксировали сегмент аппаратом Илизарова из двух опор. Дозированную дистракцию (по 2 мм в сутки в два приема) начинали через 3-4 дня после остеотомии и продолжали до 14-15-ти или 22-23-х дней. По окончании дистракции в межмыщелковой области бедренной кости 16-ти коленных суставов с помощью пробойника цилиндрической формы диаметром 5 мм создавали полно-слойный дефект СГХ, проникающий через суб-хондральный слой кости. Из разреза мягких тканей голени противоположной конечности забирали участок дистракционного регенерата (ДР). Последний помещали путем "плотной посадки" в дефект суставной поверхности таким образом, чтобы он выступал над окружающим хрящом на 2-3 мм. В области забора ДР создавали компрессию между отломками до сращения перелома. После восстановления функции обеих задних конечностей описанную выше

операцию из нескольких этапов проводили на костях другой голени и противоположном коленном суставе.

У 4-х животных 2-й группы (7 коленных суставов) создавали аналогичные дефекты суставной поверхности, но не заполняли их тканью ДР.

Динамику репаративного процесса в области восстановленных дефектов СГХ прослеживали при артротомиях через 2, 8, 16 и 24 недели после пластики. Интраоперационные биоптаты забирали в форме костно-хрящевых блоков, приготовляли по общепринятым гистологическим методикам, окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и изучали микроскопически. По прошествии вышеуказанных временных интервалов визуально и микроскопически оценивали следующие параметры: клеточный состав ткани, степень заполнения дефекта, структуру поверхностных и глубоких слоев дефекта, окрашивание матрикса, сращение образующейся ткани с окружающим СГХ, восстановление субхондраль-ного слоя кости. Количественные показатели подсчитывали с помощью стереометрического метода [1]. Кроме этого, морфологическому исследованию подвергали участки ДР, которые забирали в момент пересадки в область дефектов суставной поверхности.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ДР, взятые в сроки до 14-15-ти дней с момента остеотомии, визуально представляли собой хорошо кровоточащие мягкотканные образования розового цвета эластической консистенции.

Микроскопически ткань ДР в эти сроки состояла из тонких пучков коллагеновых волокон и плотно лежащих друг к другу широких пучков, имеющих продольную ориентацию, многочисленных групп малодифференцированных фибробластоподобных клеток, большого количества сосудов капиллярного типа (рис. 1). Вокруг последних отмечалась выраженная пролиферация перицитов. В промежутках между волокнистыми структурами присутствовали очаги свободно расположенных эритроцитов.

В отдельных препаратах наблюдался процесс остеогенеза, заключающийся в образовании скелетогенных элементов - остеобластов и костных трабекул, направленных вдоль основных пучков коллагеновых волокон.

Клеточную популяцию новообразованной ткани можно было условно разделить на два типа. Первый тип (до 20-30% всех клеток) составляли клетки овальной формы с ги-перхромным ядром, которые находились в рых-

лой аморфной эозинофильной массе. Второй тип представляли клетки вытянутой формы (до 70-80%), имеющие менее интенсивно окрашенное ядро.

Рис. 1. Четырнадцатидневный ДР. Присутствуют малодифференцированные мезенхимальные клетки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 320.

В более зрелых ДР (до 22-23 дней) признаки костеобразования носили отчетливый характер. Грубоволокнистая костная ткань встречалась очагами в виде первичных костных балок, ориентированных вдоль широких коллагеновых волокон и вертикальных сосудистых петель, и

клеток остеобластического ряда с большим ядром и светлой цитоплазмой (рис. 2). Менее зрелые формы остеобластов находились в эози-нофильно окрашенном основном веществе, имеющем нитевидную волокнистую структуру. Изменения, произошедшие в морфологической структуре, предопределяли макроскопические различия между ДР 14-15-дневной и 22-23-дневной зрелости. При внешнем сходстве ткань последних казалась более плотной при остром отделении и менее эластичной при надавливании инструментом.

Через 2 недели область пластики дефекта ДР у животных 1 -ой группы была заполнена тканью бледно-розового цвета, которая несколько выступала над уровнем окружающего нормального СГХ. Хорошего сращения между краями её и хряща не наблюдалось: пластический материал без усилий смещался инструментом. Такая попытка вызывала кровотечение из глубины костной раны.

Рис. 2. Двадцатитрёхдневный ДР. Образование первичных костных балок. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 320.

У животных 2-й группы в эти же сроки на суставной поверхности мыщелков бедренной кости отмечался дефект СГХ правильной округлой формы, заполненный на 1/2 или 2/3 глубины мягкой тканью розового цвета и желеподоб-ным фибриновым сгустком.

Микроскопическое исследование препаратов, взятых из области пластики, показало, что в трансплантатах пересаженных ДР происходят разной степени выраженности дегенеративные изменения. Они были более заметны в поверхностных слоях и заключались в некотором уменьшении количества малодифференциро-ванных клеток, серозном отёке и разволокне-нии. Особенностью дегенерации в трансплантатах ДР 22-23-х дней являлся лизис костных тра-бекул и значительное уменьшение численности клеток остеобластического ряда. В подлежащий к субхондральной кости слой трансплантатов врастало множество сосудов синусоидного типа. С краями окружающего СГХ ткань пересаженных ДР соединялась посредством тонких

разнонаправленных волокон фибрина. Между ними встречались клетки форменных элементов крови, окружающие немногочисленные сосудистые петли, врастающие также из стромы костной ткани.

В препаратах из области сформированных дефектов СГХ у животных 2-й группы микроскопически определялось развитие незрелой грануляционной ткани, многочисленные сосуды которой врастали из подлежащей губчатой кости в расположенный на поверхности фибрино-вый сгусток.

По прошествии 8 недель после пластики дефектов визуально отмечалось их хорошее восполнение. Суставная поверхность выглядела ровной и гладкой, хотя зона пересаженного ДР все еще отличалась по цвету и консистенции от окружающего СГХ: она была белесоватая, а при надавливании инструментом - более эластичная, чем хрящ (рис. 3). Формирующийся регенерат по периферии хорошо срастался с СГХ таким образом, что создавалось впечатление о плавном переходе одной ткани в другую. У животных 2-й группы в аналогичные сроки определялся дефект СГХ, дно которого было покрыто тонким слоем ткани розового цвета, Хрящевые края дефекта несколько сгладились и хорошо срастались с новообразованной тканью. Однако регенерат не достигал своей поверхностью уровня окружающего СГХ, занимая приблизительно 1/3 его толщины.

Рис. 3. Через восемь недель после пересадки 14-дневного ДР. Визуально отмечается хорошее восполнение дефекта новообразованной тканью.

Морфологическое изучение регенератов через 8 недель с момента пересадки показало, что у животных 1 -й группы в препаратах присутствует смешенный тип ткани: среди элементов волокнистой соединительной ткани, содержащей фибробластоподобные клетки, встречались очаги гиалинового хряща с пролиферирующими хондроцитами (рис. 4).

Рис. 4. Через восемь недель после пересадки 14-дневного ДР. Дефект заполняется элементами хрящевой ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 320.

Образование хряща наблюдалось как в поверхностных и средних слоях регенератов, так и на границе с субхондральной костью (рис. 5). Интенсивность хондрогенеза в препаратах после пластики ДР 22-23-х дней имела менее выраженный характер, а очаги гиалинового хряща располагались только на границе с костной тканью. В поверхностных и средних слоях происходило созревание фиброзной ткани: основным видом клеток являлись фибробласты, коллаге-новые волокна уплотнялись и приобретали параллельную суставной поверхности ориентацию. Количество сосудов значительно уменьшалось по сравнению с первоначальными наблюдениями, тогда как в базальных отделах ангиогенез продолжался. Новообразованная ткань хорошо интегрировала с краями окружающего СГХ на всю его толщину. Интересно было отметить, что в краевых отделах СГХ имело место значительное усиление пролифера-тивной и синтетической активности хондроци-тов, которые формировали изогенные группы и продуцировали межклеточное вещество, выступающее за пределы ровных краев (рис. 6).

Рис. 5. Через восемь недель после пересадки 14-дневного ДР. Область дна дефекта. Пролиферация хрящевой ткани на границе с субхондральной костью. Окраска гематоксилином и эозином. У в. X 460.

Рис. 6. Через двадцать четыре недели после пересадки 14-дневного ДР. Индукция хондрогенеза на границе с окружающим СГХ. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.х320.

Репаративный процесс затрагивал и подлежащую костную ткань, где происходило образование первичных костных пластинок и балок, хотя непрерывность субхондрального слоя в зоне дефекта еще не была восстановлена.

В препаратах из области дефектов суставной поверхности у животных 2-й группы наблюдалась волокнистая соединительная ткань. Сетчатая структура её межклеточного вещества не имела определенной организации. Коллагено-вые волокна прорастали через края дефекта окружающего СГХ, обеспечивая сращение с новообразованной тканью. На границе с костью в отдельных препаратах обнаруживались скопления немногочисленных групп хондроцитов. Субхондральный слой восстановлен не был, но образование костной ткани происходило достаточно интенсивно в большинстве дефектов.

Спустя 16 недель, при артротомии у животных 1 -й группы, область артропластики мыщелков бедренной кости напоминала окружающий её СГХ. Граница перехода регенерата в хрящ оставалась различимой, несмотря на плотное сращение между краями. При надавливании инструментом регенерат выглядел более плотным, чем по прошествии 8 недель. Напротив, у животных 2-й группы на суставной поверхности отмечалась дуфигурация за счет округлого углубления диаметром 5 мм со сглаженными краями. Дно углубления выстилала ткань белого цвета, которая микроскопически представляла собой грубоволокнистую соединительную ткань (рис. 7). Сетчатая структура её приобретала более упорядоченное строение - коллагеновые волокна поверхностного слоя ориентировались параллельно. Однако в некоторых препаратах имелись очаги разволокнения, а также зоны образования больших и малых полостей. Клеточную популяцию представляли фибробла-сты, количество наблюдаемых в глубоких слоях хон-дроцитов не превышало 5-6%.

Рис. 7. Чрез двадцать четыре недели после создания дефекта. Спонтанное заживление грубоволокнистой соединительной тканью. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 320.

Морфологическое исследование регенерата из области пластики у животных 1 -й группы через 16 недель свидетельствовало об образовании гиалиноподобного хряща. Он отличался от нормального СГХ значительной клеточной насыщенностью и отсутствием чёткой зональной организации. В отдельных препаратах регенерат был представлен смешанным типом ткани -фиброхрящом с очагами гиалиновой хрящевой

Большинство исследователей указывают на необходимость соблюдения ряда условий для достижения органотипичного заживления СГХ даже при его незначительных повреждениях. К ним относят плотный контакт и обездвиженность краев хрящевой раны, наличие популяции клеток, способных дифференцироваться в хонд-роциты, и матрикса для их развития, воздействие механических стимулов на воссозданную анатомически правильную форму суставной поверхности, купирование асептического посттравматического воспаления в суставе, нормализацию синовиальной среды и защиту восстановленного хряща от избыточной нагрузки [5, 18, 19, 33, 55, 59, 65].

Несоблюдение этих условий или малейшее отклонение от них исключает формирование регенерата, характерного для СГХ даже при его незначительных повреждениях [19]. Поэтому спонтанный репаративный процесс во многих случаях завершается замещением дефектов суставной поверхности другим видом ткани (волокнистая соединительная ткань, фиброхрящ, смешанный вид ткани). Еще более высокие требования предъявляются к обеспечению заживления средних и больших по размеру дефектов (более 2 см), и особенно тех, которые не проникают через субхондральный слой кости. Среди них на первом месте стоит создание достаточной по численности популяции пролиферирую-щих клеток с хондрогенной экспрессией, способных синтезировать необходимое количество

ткани или только волокнистым видом хряща. Большинство из этих наблюдений относились к пластике дефектов 22-23-дневными ДР. Новообразованный хрящ хорошо срастался по краям с окружающим нормальным СГХ.

Через 24 недели суставная поверхность области пластики выглядела ровной и гладкой, однако её все еще можно было различить на фоне окружающего СГХ. Последний, как и противолежащий к дефекту хрящ надколенника, не имел визуальных признаков дегенерации.

В коленных суставах животных 2-й группы форма суставной поверхности оставалась измененной, а на соответствующем СГХ надколенника у нескольких собак наблюдалось поверхностное разволокнение.

Морфологическая картина в указанные сроки характеризовалась незначительной динамикой в направлении упорядочения структуры и ориентации регенераторных элементов в обеих группах животных. Субхондральный слой был восстановлен менее чем на 50%. При этом процесс структурной перестройки более активно протекал в дефектах с восстановленным под регенератом слоем кости, чем в зонах, где она отсутствовала.

коллагена Ц типа и протеогликанов [19, 33,40, 55, 59, 68].

Возможности хондроцитов поврежденного хряща участвовать в восстановительном процессе крайне ограничены и складываются из кратковременного всплеска пролиферативной и синтетической активности групп клеток, расположенных по краям дефекта [39, 33, 55, 59].

Известны несколько источников получения клеточного материала для оптимизации течения репаративного хондрогенеза. Т.П. Виноградова [б], развивая учение А.А. Максимова [20], А.В. Русакова [23] о соединительной ткани и репара-тивном потенциале мезенхимального резерва клеток у позвоночных, убедительно показала, что убыль хряща может восполняться путём развития хрящевой ткани из окружающих соединительно-тканных недифференцированных элементов. Реализующие этот принцип способы так называемой "мезенхимальной стимуляции" - абразия, насверливание, микропереломы - включают в репаративный процесс малодифференциро-ванные клетки эндоста губчатой кости, костного мозга и приводят к замещению дефектов волокнистой хрящевой тканью [9, 25, 47, 50, 54, 60]. Дополнительное использование пластики аутогенной надкостницей или реберной надхрящницей, сохраняющих в определенной степени способность к хондрогенной диф-ференцировке на протяжении всей жизни животных и человека, не приближает в полной мере морфологические характеристики новообразованной ткани к ис-

тинному СГХ [3, 21, 46, 52, 58, 62, 63]. Нельзя не отметить и значительное уменьшение с возрастом хондрогенного потенциала малодифферен-цированных камбиальных клеток надкостницы и надхрящницы [33, 38, 55, 58].

Пересадка клеточного материала в составе зрелого хряща, в том числе СГХ, не позволяет рассчитывать на такой уровень его пролифера-тивной и синтетической активности, который бы способствовал формированию дополнительного объема хрящевой ткани. Заместительная функция аутогенных костно-хрящевых трансплантатов наиболее совершенна за счет установленного выживания хондроцитов и приближения репаративного хондрогенеза к физиологическому, но ограничена размерами донорских областей и, соответственно, воспроизведением точной формы суставной поверхности в зоне повреждения [5, 19, 31, 39, 59]. Последнее требование вполне достижимо при применении аллотрансплантатов хряща. Двухэтапно замороженный или свежий аллохрящ содержит после пересадки жизнеспособные хондроциты, обладающие пониженной синтетической активностью [19, 33, 41, 55, 69]. Надежды на выживание их и постепенное замещение аналогичными клетками реципиента, имеющими мезенхималь-ное происхождение, нередко не оправдываются, и возникающий регенерат содержит в себе участки аллохряща, волокнистый и гиалиноподоб-ный хрящ, волокнистую соединительную ткань [6, 9, 14, 17, 25]. Весьма вероятно, что степень участия выживающих хондроцитов аллоткани в репаративном хондрогенезе, согласно существующей концепции о неоспоримых преимуществах пересадки "живой ткани", несколько преувеличена. К тому же клетки последней могут содержать источник инфекционных и вирусных заболеваний, например ВИЧ [33, 34, 55].

Наличие рассмотренных выше недостатков известных способов восстановления дефектов СГХ как с биологической, так и с клинической точек зрения явилось одним из факторов развития нового направления в хондропластике -пересадки культивированных клеток.

Впервые клетки-хондроциты были выделены из СГХ и трансплантированы в дефект головки плечевой кости кроликов A.U. Smith [44, 64] в 1965 году.

В настоящее время для получения культуры клеток с хондрогенной экспрессией в эксперименте и клинике проводятся работы по использованию аллогенных или аутогенных хондроци-тов, выделенных из СГХ, хряща эпифизарной зоны роста, костной мозоли, костного мозга, надкостницы, эмбриональной ткани [33, 35, 40, 44, 48, 49, 55, 59, 61, 65, 68]. На период времени до 1997 года, согласно сведениям International Cartilage Repair Society, во всем мире была уже выполнена 891 трансплантация хондроцитов

410 хирургами [43]. Данные современных исследований позволяют предположить, что создание необходимой для заживления дефекта культуры клеток с высокой пролиферативной и синтетической активностью возможно путём внесения изменений в геном уже дифференцированных или использования плюрипотентных клеток, начальные формы направленного развития которых обладают такой способностью [36, 51, 59, 66]. В представленной работе мы предприняли попытку изучить хондрогенный потенциал мезенхимальных клеток, помещенных в синовиальную среду функционирующего сустава и соответствующее окружение. Для получения популяции плюрипотентных клеток была использована модель дистракционного остео-синтеза перелома. Способность остеогенных клеток образовывать под влиянием растягивающих нагрузок волокнистую или хрящевую ткань была отмечена S. КштреЛег [51]. Г.А. Илизаровым и его школой проведены глубокие исследования механизмов остеогенной дифференцировки этих клеток [8, 11, 15, 16].

Согласно концепции Илизарова Г.А. [8, 15, 16], малодифференцированные клетки дистрак-ционного регенерата могут иметь несколько источников происхождения. Один из них - эн-дост противостоящих костных отломков, второй - костный мозг отломков, а третий связан с существующей в организме популяцией свободно циркулирующих остеогенных клеток-предшественников, способных к миграции из костного мозга интактных костей в зону формирования регенерата. Участие в репаративном процессе надкостницы и околокостных мягких тканей - незначительно [12]. Д.С. Саркисов и др. [30] выявили при дистракционном остеосинтезе переломов преобразование околососудистых клеток эндотелиоцитов и перицитов, обладающих высокой пролиферативной активностью, в фибробластоподобные клетки, которые, как известно, способны дифференцироваться как в направлении остебластов, так и хондробластов (хондроцитов). С другой стороны, малодиффе-ренцированные фибробластоподобные клетки "зоны роста" дистракционного регенерата могут быть источником не только костной (или хрящевой) ткани, но и эндотелиоцитов кровеносных сосудов, что не только поддерживает теорию Г.А. Илизарова [10, 16] о единстве клеточных источников новообразования костной и кроветворной тканей, но и свидетельствует в пользу сохраняющейся в онтогенезе общей по-липотентной стволовой клетки [22, 42].

Течение репаративного процесса в ДР определяется в некоторой степени режимом дистрак-ции, который изменяет местные условия кровоснабжения и влияет таким образом на направленность дифференцировки скелетогенных клеточных элементов или формирует метаболиче-

ский профиль будущего ДР [24, 27]. В нашей работе темп дистракции достигал 2 мм в сутки в два приема, что, как установлено [24], замедляет процесс остеогенеза вследствие большого по величине и травматичного разового перемещения отломков. Нарушение оксибиотического характера метаболизма приводит к образованию в зоне диастаза ткани с преимущественно анаэробным типом обмена [12, 19, 29]. Морфологическая картина препаратов ДР 14-15-дневной зрелости показала преобладание фибробластоподобных клеток, находящихся среди пучков коллагеновых волокон, что ранее наблюдали в своих исследованиях и другие авторы [24, 29]. Несмотря на сохраняющийся прежний темп дистракции, в биоптатах из более зрелых ДР (22-23 дня) процессы образования костной ткани были выражены уже в значительной степени. Объяснение этому наблюдению, по всей видимости, не связано с предположением некоторых авторов [4, 19] об отсутствии различий в характере репаратив-ного процесса, развивающегося под влиянием повторной травматизации, в зависимости от скорости и дробности дистракции, а находится в плоскости технического обеспечения операции.

Малодифференцированные клетки регенерата помещались в область дефектов СГХ в составе матрикса, значение которого для репаратив-ного хондрогенеза также велико. Основой мат-рикса регенерата является коллагеновая структура, представленная коллагеном III и I типов [36, 57]. Коллагеновые волокна способны защищать клетки в условиях динамических компрессионных нагрузок в суставе. Определяющее воздействие их на направленность регенерации и трофику СГХ уже не вызывает сомнений [5, 9, 19, 25, 39, 56, 65]. Поэтому активные движения в коленных суставах у собак после операции не ограничивались. Хондрогенной дифференци-ровке клеток регенерата способствует и содержание в межклеточном веществе большого количества гликозаминогликанов [13, 36]. Источником гликопротеинов в регенерате, по мнению В.И. Шевцова и др. [26], могут быть разрушенные костные клетки, хотя нельзя исключить биосинтетическую активность фибробласто-подобных клеток, субпопуляции которых увеличиваются в первые недели дистракции [2], а также поступление гликопротеинов из крови. Матрикс ДР, благодаря наличию очагов воспаления, является субстанцией, где аккумулируются и синтезируются мощные модуляторы, хемоаттрактанты, индукторы и стимуляторы, среди которых трансформирующий фактор роста р, фактор роста фибробластов, инсулинопо-добный фактор роста, обладающие несомненным воздействием на хондрогенез [26, 45]. С достаточной долей уверенности можно предположить участие этих соединений в репаратив-ном процессе после пересадки ДР в дефект

СГХ. Наличие факторов роста объясняет и выраженное индуцирующее влияние на пролиферацию и синтетическую активность хондроци-тов нормального СГХ по краям дефекта у животных 1 -й группы. В свою очередь, существующая обратная индукция, обусловленная нахождением в синовиальной среде сустава, способствует направленному развитию трансплантата [6, 9, 19, 25, 32, 59].

Помещенный в дефект СГХ и кости ДР в ранние сроки подвергался в большей или меньшей степени дистрофическим изменениям, включающим гибель части клеток. Влияние микронекроза клеточных элементов регенерата, согласно исследованиям В.И. Шевцова, А.В. Попкова [28], заключается в стимуляции про-лиферативных процессов, в том числе в окружающих тканях. Клеточная популяция вновь увеличивалась к 8 неделям после пластики, что происходило, вероятно, не только вследствие пролиферации клеток трансплантата, но и в связи с поступлением малодифференцированных клеток из подлежащей костной ткани, костного мозга и прилежащей синовиальной мембраны. Процесс этот в глубоких слоях трансплантата сопровождался инвазией новообразованных сосудов, вокруг которых - периваскулярно -располагались малодифференцированные клетки. Более выраженные дистрофические изменения мы наблюдали после пересадки участков зрелых 22-23-дневных регенератов, уже имеющих остеогенную направленность в своем развитии, а следовательно, высокую чувствительность к недостатку кислорода. Несмотря на исчезновение первичных костных элементов в трансплантатах, этот процесс нельзя было отнести к обратному развитию, а результатом пластики дефекта СГХ более зрелым ДР являлось образование фиброхрящевой или фиброзной ткани. Напротив, через 16-24 недели после пересадки менее зрелых регенератов наблюдалось замещение дефектов гиалиноподобной хрящевой тканью. Морфологическая структура её отличалась от таковой в контрольной группе животных, где дефекты в указанные сроки были заполнены волокнистой соединительной тканью или волокнистым хрящом.

Отличие гиалиноподобного от нормального СГХ заключалось в гиперклеточности и отсутствии типичной зональной организации новообразованной ткани. S. Takahashi и др. [36] в своей работе по пересадке костной мозоли в дефект СГХ подчеркнули другую черту гиалиноподоб-ного хряща - неполноценное формирование поверхностного тангенциального слоя, которое подтвердилось и в нашем исследовании. Важная роль этого слоя в предотвращения дегенеративных изменений регенерата рассматривается в отдельных исследовательских работах на одном уровне по значимости с восстановлением суб-

хондрального слоя кости и сращением с окружающим СГХ [54, 63]. В этой связи хотелось бы отметить важность сохранения субхондральной кости для более равномерного распределения динамической компрессионной нагрузки на трансплантат. В нашем исследовании для прочной фиксации ДР непрерывность костной ткани нарушалась, что могло быть причиной как замедления репаративного хондрогенеза, так и последующей дегенерации новообразованной хрящевой ткани, особенно при больших по размерам дефектах суставной поверхности. Однако детальное изучение процесса развития дегенеративных изменений в новообразованной ткани не

входило в задачи нашего исследования. Максимальная продолжительность наблюдения за заживлением дефектов после пластики (24 недели) была выбрана исходя из известных данных экспериментальных работ о завершении, в целом, репаративного хондрогенеза спустя 3-4 месяца с момента операции [19, 36, 56, 59, 62, 63, 68].

Представленный в работе способ пластики дефектов СГХ по вполне понятным соображениям мы не рассматриваем с точки зрения возможного клинического применения, но надеемся, что экспериментальная модель окажется полезной для развития современных направлений в хондропластике.

Результаты проведенного экспериментального исследования подтверждают концепцию о плюрипотентности мезенхимального ростка клеток и, в частности, малодифференцирован-ных клеток незрелого ДР костной мозоли. Под влиянием биологических и механических факторов внешнего окружения ДР, помещенный в дефект СГХ, способен трансформироваться в

гиалиноподобную хрящевую ткань. Мезенхи-мальные клетки могут рассматриваться как потенциальный источник для получения культуры клеток с хондрогенной экспрессией, а экспериментальная модель пластики дефектов СГХ -как представляющая определенный интерес для развития тканевой инженерии в хондропласти-ке.

ЛИТЕРАТУРА

1. Автандилов Г.Г. и др. Системная стереометрия в изучении патологического процесса / Г.Г. Автандилов, Н.И. Яблучанский, В.Г. Губенко. - М.: Медицина, 1981. - 192с.

2. Леонова С.Н. Механизм морфогенеза соединительнотканных структур конечности в условиях дозированного растяжения // Гений ортопедии. -1996. - №2-3. - С. 124.

3. Беллендир Э.Н. Теоретическое обоснование и применение пластических операций при костно-суставном туберкулезе // Травматол. ортопед. России. - 1995. - №6. - С. 7-13.

4. Биологические аспекты удлинения конечностей / В. И. Стецула, Г.И. Лаврищева, В.П. Штин и др. // Ортопед., травматол. - 1984. - № 9. - С. 2126.

5. Виноградова Т.П. Биологические особенности хрящевой ткани и их значение в клинической ортопедии и травматологии: Актовая речь. - М.: ЦИТО, 1964. - 16с.

6. Виноградова Т.П. Судьба пересаженного хряща у человека (на материале ауто- и гомопластики): Дис... д-ра мед. наук. - М., 1946. - 140с.

7. Волков М.В., Оганесян О.В. Восстановление формы и функции суставов и костей. - М.: Медицина. - 256с.

8. Десятниченко К.С., Балдин Ю.П. Экспериментально-теоретические исследования, подтверждающие концепцию Г.А. Илизарова о единстве генеза костной и кроветворной тканей // Гений ортопедии. - 1995. - № 1. -С. 32-38.

9. Ежов Ю.И. Реконструктивно-восстановительные операции при дегенеративно-дистрофических заболеваниях тазобедренного сустава: Автореф. дис.....д-ра мед. наук. - Горький, 1989. - 30с.

10. Илизаров Г.А., Палиенко Л.А., Шрейнер А.А. Кроветворная функция костного мозга и её связь с активностью остеогенеза при репаративной регенерации в условиях удлинения конечности // Онтогенез. - 1984. - Т. 15, №2. - С. 617-623.

11. Илизаров Г.А., Хелимский А.М. Особенности репаративной регенерации при чрескостном компрессионно-дистракционном остеосинтезе // Современные проблемы регенерации. - Йошкар-Ола, 1980. - С. 28-55.

12. Илизаров Г.А., Штин В.П., Ледяев В.И. Репаративная регенерация компактной кости отломков диафиза при различных условиях дистракцион-ного остеосинтеза // Второй съезд травматологов-ортопедов СССР: Материалы съезда. - М., 1969. - С. 89-91.

13. Имерлишвили И.А., Бахлыков Ю.Н., Дьячкова Г.В. Морфо-гистохимическая характеристика ранних стадий дистракционного регенерата // Чрескостный компрессионный и дистракционный остеосинтез в ортопедии и травматологии: Сб. науч. тр. - Курган, 1980. - Вып. 6. - С. 90-96.

14. Имамалиев А. С., Варсобин В.И., Тимашкевич К. Д. Костно-хрящевые гомотрансплантаты при артропластике коленного сустава // Ортопед., травматол. - 1973. - № 5. - С. 74-77.

15. Ирьянов Ю.М. Морфологические исследования костных регенератов, формирующихся в условиях дистракционного остеосинтеза // Гений ортопедии. - 1998. - № 2. - С. 5-10.

16. К воцросу об участии стромальных клеток-предшественников костного мозга в регенерации кости при чрескостном остеосинтезе / Г.А. Илиза-ров, Л.А. Палиенко, П.Ф. Переслыцких и др. // Бюлл. эксперим. биол. - 1984. - № 4. - С. 489-490.

17. Коваленко Д.Г., Ерков В.П., Маракуша И.Г. О гомопластическом восстановлении суставов при туберкулезе и его последствиях // Ортопед., травматол. - 1972. - № 7. - С. 22-26.

18. Лаврищева Г.И. Об условиях регенерации хряща // Регенерация и клеточное деление. - М.: Медицина, 1968. - С. 222-227.

19. Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А. Морфологические и клинические аспекты репаративной регенерации опорных органов и тканей. - М.: Медицина, 1996. - С. 144-146.

20. Максимов А.А. (Махsimov А.) Morphologe of mesenchymal reactios // Arch. Patol. lab. Medicine. - 1927. - ВА 4. - №8. - P. 557-606.

21. Маленков И.Ю. Экспериментально-теоретическое обоснование перихондропластики в костно-суставной хирургии // Травматол. ортопед. России. - 1995. - № 6. - С. 58-61.

22. Родионова Н.В. Функциональная морфология клеток в онтогенезе. - Киев: Наукова думка, 1984. - 192с.

23. Русаков А.В. К физиологии и патологии тканей внутренней среды. - М.: Медгиз, 1954. - 131с.

24. Теоретические аспекты дистракционного остеосинтеза. Значение режима дистракции /А.А. Шрейнер, С.А. Ерофеев, М.М. Щудло и др. // Гений ортопедии. - 1992. - № 2. - С. 13-17.

25. Троценко В. В. Мобилизирующие операции на коленном суставе у больных ревматоидным артритом: Дис... д-ра мед. наук. - М., 1993. - 352с.

26. Шевцов В.И., Ирьянов Ю.М., Дьячков А.Н. Морфофункциональная характеристика геморрагии при заживлении костных ран в условиях чре-скостного остеосинтеза и в дистракционных регенератах // Гений ортопедии. - 1999. - № 4. - С. 5-12.

27. Шевцов В.И., Попков А.В. Оперативное удлинение нижних конечностей. - М.: Медицина, 1998. - 192с.

28. Шевцов В.И., Попков А.В. Стимуляция перестройки дистракционного регенерата // Анналы травматол. ортопед. - 1995. - № 2. - С. 23-26.

29. Штин В.П. Особенности костеообразования в зоне диастаза большеберцовой кости при удлинении голени аппаратом Илизарова (экспериментально-морфологическое исследование): Автореф. дис... д-ра мед. наук. - Новосибирск, 1979.- 41 с.

30. Электронно-радиоавтографическое исследование костеобразования при дистракционном остеосинтезе / Д.С. Саркисов, Б.М. Кюстюченок, Ю.А. Ампрасланов и др. // Бюлл. эксперим. биол - 1984. - № 7. - С. 97-99.

31. Arthroscopic autogenous osteochondral mosaicplasty for the treatment of femoral condilar articular defects / L. Hangody, G. Kish, Z. Karpati et al. // Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. - 1997. - Vol. 5, N4. - P. 262-267.

32. Arthroscopic debridement of the arthritic knee / M.R. Baumgaertner, W.D. Cannon, J.M. Vittori et al. // Clin. Orthop. - 1990. - No 253. - P. 197-202.

33. Articular cartilge lesions of the knee / B.R. Mandelbaum, J.E. Browne, F. Fu et al. // Am. J. Sports Med. - 1998. - Vol.26, № 6. - P. 853-861.

34. Asselmeier M.A., Caspar! R.B., Bottenfield S. A. review of allograft processing and sterilization techniques and their role in transmission of the human immunodeficiency virus // Am. J. Sports Med. - 1993. - Vol. 21, No2. - P. 170-175.

35. Aston J. E., Bentley G. Repair of articular surfaces by allografts of articular and growth-plate cartilage // J. Bone Joint Surg. - 1986. - Vol 68-A, No1. - P. 29-35.

36. Autogenous callo-osseous grafts for the repair of osteochondral defects / S. Takahashi, M. Oka, Y. Kotoura, T. Yamamuro // J. Bone Joint Surg. - 1995. -Vol.77-B, No 2. - P. 194-204.

37. Bert J.M. Role of abrasion arthroplasty and debridement in the management of osteoarthritis of the knee // Rheum. Dis. Clin. North. Am. - 1993. - Vol.19, No 3. - P. 725-739.

38. Biological resurfacing of a major joint defect with cryopreserved allogene periosteum under the influence of continuous passive motion in a rabbit model / H.J. Kreder, M. Moran, F.W. Keeley, R.B. Salter // Clin. Orthop. - 1994. - No 300. - P. 288-296.

39. Buckwalter J.A. Articular cartilage. Part II. Degeneration and ostearthrosis, repair, regeneration and transplantation // J. Bone Joint Surg. - 1997. - Vol. 79-A. - P. 612-631.

40. Buckwalter J.A., Mow V.C., Ratcliffe A. Restoration of injured or degenerated arthicular cartilage // J. Am. Acad. Orthop. Surg. - 1994. - Vol. 2, No.4. - P. 192-201.

41. Buliek D.D., Kelly M. Osteochondral and chondral fractures of the knee. In: Siliski J.M. (Ed.) Traumatic disorders of the knee. - New York: SpringerVerlag, 1994.-P. 37-37.

42. Buring K. On the origin of cells in heterotopic bone formation // Clin. Orthop. -1975. - N 110. - P. 293- 301.

43. Cartilage repair registry periodic report // Registry Report. - Vol. 4. - Cambridge, M.A., Genzyme Tissue Repair, february 1998.

44. Chesterman P.J., Smith A.U. Homotrasplantation of articular cartilage and isolated chondrocytes. An experimental study in rabbits // J. Bone Joint Surg. (Am.) . - 1968. - .No 50. - P. 184-197.

45. Cornell C.N, Lane J.M. Newest factors in fracture healing // Clin. Orthop. - 1992. -№277.-P. 297-311.

46. Engkvist 0., Johansson S.H. Perichondrial arthroplasty. A clinical study in twenty-six patients // Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. - 1980. - Vol. 14, No1. - P. 71-87.

47. Improvement of full-thickness chondral defect healing in the human knee after debridement and microfracture using continious passive motion / J.J. Rodrigo, J.R. Steadman, J.F. Siliman // Am. J. Knee Sur^. - 1994. - Vol. 7. - P. 109-116.

48. In vivo osteochondrogenic potential of cultured cells derived from the periosteum / H. Nakahara, S.P. Bruder, V.M. Goldberg, A.I. Caplan // Clin. Orthop. -1990. - No 259. - P. 223-232.

49. Itay S., Abramovici A., Nevo Z. Use of cultered embrional chick epiphyseal chondrocytes as grafts for defects in chick articular cartilage // Clin. Orthop. -1987. - No 220. - P. 284-303.

50. Johnson L.L. The sclerotic lesion: pathology and the response to arthroscopic abrasion arthroplasty. In: Ewing J.W. (Ed.) Articular cartilage and knee joint function. - New York: Paven Press, 1990 - P. 319-333.

51. Krompecher S. Die Knochenbildung. - Jena, 1937. - 217 S.

52. Lorentzon R., Alfredson H., Hildingsson C. Treatment of deep cartilage defects of the patella with periosteal transplantations // Knee Surg. Sports Trauma-tol. Arthrosc. - 1998. - Vol.64, N° 3. - P. 202-208.

53. Mankin H.J. The responce of articular cartilage to mechanical injury // J. Bone Joint Surg. (Am.) . - 1982. - Xo 64. - P. 460-466.

54. Mitchell N., Shepard N. The resurfacing of adult rabbit articular cartilage by multiple perforations through the subchondral bone // J. Bone Joint Surg. (Am.). -1976. -Vol.58, No 2. - P. 230-233.

55. Newman A.R. Articular cartilge repair. Current concept // Am. J. Sports Med. -1998. -Vol.2. - P. 309-324.

56. O'Driscoll S.W., Keeley F.W., Salter R.B. Durability of regenerated articular cartilage produced by free autogenous periosteal grafts in major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion. A follow-up report at one year // J. Bone Joint Surg. - 1988. - Vol. 70, N4. - P. 595-606.

57. Page M., Hogg J., Ashhurst D.E. The effects of mechanical stability on the macromolecules of the connective tissue matrices produced during fractures healing. I. The collagens // Histochem. J. - 1986. - Vol. 18, N5. - P. 251-265.

58. Perichondrial graft for cartilage lesion of the knee / G.N. Homminga, S.K. Bupstra, P.S. Bouwmeester, A.J. van der Linden // J. Bone Joint Surg. - 1990. -Vol.72-B, No 6. - P. 1003-1007.

59. Principles of cartilage repair and regeneration / A. Caplan, M. Elyaderani, Y. Mochizuki et al. // Clin. Orthop. - 1997. - N 342. - P. 254-269.

60. Rae P.L., Noble J. Arthroscopic drilling of osteochondral lesion of the knee // J. Bone Joint Surg. - 1989. - Vol.71-B. - P. 534-542.

61. Repair of rabbit articular surfaces with allograft chondrocytes embedded in collagen gel / S. Wakitani, T. Kimura, A. Hirooka et al. // J. Bone Joint Surg. -1985. - Vol. 71-B. - P. 74-80.

62. Rib perichondrial autografts in full-thickness articular cartilage defects in rabbits / R.D. Coutts, S.L. Woo, D. Amiel et al. // Clin. Orthop. - 1992. - No 275. -P. 263-273.

63. Shapiro F., Koide S., Glimcher M.J. Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage // J. Bone Joint Surg. - 1993. -Vol.75- B, N 4. - P. 532-553.

64. Smith A.U. Survival of frozen chondrocytes isolated from cartilage of adult mammals // Nature. - 1965. - Vol. 205. - P. 782-789.

65. The biological effect of continuous passive motion on the healing of full-thickness defects in arthicular cartilage. An experimental investigation in the rabbit / R.B. Salter, D.F. Simmonds, B.W. Malcolm et al. // J. Bone Joint Surg. - 1980. -Vol.62- B, N8. - P. 1232-1251.

66. The effects ofalginate on gene expression and its use for cell delivery in cartilage defects / Diduch D.R., C.M. Mierisch, L. Jordan et al. // Arthroscopy. -1999. - Vol.7. - P. 531-532.

67. TGF-P gene transfer in articular chondrocytes implication for improved matrix regeneration following chodral injuries in arthritic joints / H.D. Moeller, F.H. Fu, C. Nikibiri et al. // Arthroscopy. - 1999. - Vol.7, Suppl. 1. - P. 58.

68. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation / M. Brittberg, A. Lindahl, A. Nilsson et al. // N. Engl. J. Med. -1994. -Vol.331, N14. - P. 889-895.

69. Zukor D.J., Oakeshott D., Brooks P.J. et al. Fresh, small fragment osteochondral allografts for posttraumatic defects of the knee. In: Ewing J.W. (Ed.). Articular cartilage and knee joint function. - New York: Raven Press, 1990 - P. 153-165.

Рукопись поступила 19.03.01.