Противоопухолевые бесфосфорные алкильные катионные глицеролипиды с гетероциклическими полярными доменами вызывают значительно меньший гемолиз, чем препарат-прототип эдельфозин

ТОМ 5

НОМЕР 2

201 2

КЛИНИЧЕСКАЯ

ОНКОгематология

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ

Противоопухолевые бесфосфорные алкильные катионные глицеролипиды с гетероциклическими полярными доменами вызывают значительно меньший гемолиз, чем препарат-прототип эдельфозин

А.А. Маркова1, Н.В. Плявник2, М.В. Плетнева2, Г.А. Серебренникова2,

А.А. Штиль1

____________________РЕФЕРАТ________________________

Изучена способность новых бесфосфорных алкильных катионных гли-церолипидов с гетероциклическими полярными доменами вызывать гемолиз. Гемолитическую активность новых соединений сравнивали с таковой фосфорсодержащего противоопухолевого препарата эдель-фозина. В отличие от эдельфозина бесфосфорные глицеролипиды практически не вызывают гемолиз, однако цитотоксичность новых соединений в отношении культивируемых опухолевых клеток сохраняется. Эти результаты демонстрируют клинически важное преимущество бесфосфорных алкильных катионных глицеролипидов перед эдельфозином.

Ключевые слова:

гемобластозы, бесфосфорные алкильные катионные глицеролипиды, эдельфозин, гемолиз.

Antitumor non-phosphorous alkyl cationic glycerolipids with heterocyclic polar domains are significantly less hemolytic than the prototype drug edelfosine

A.A. Markova1, N.V. Plyavnik2, M.V. Pletneva2,

G.A. Serebrennikova2, A.A. Shtil1

SUMMARY

We compared the hemolytic potency of the novel nonphosphorous cationic alkyl glycerolipids containing a heterocyclic polar domain. The phosphorus containing antitumor drug edelfosine was used as a reference. Edelfosine was hemolytic; in contrast, all novel glycerolipids demonstrated low-to-null ability to cause hemolysis whereas the ability to kill cultured tumor cells retained. These results strongly suggest that non-phosphorous cationic alkyl glycerolipids may have clinical advantage over edelfosine as non-hemolytic antitumor drug candidates.

Keywords: hematological malignancies, non-phosphorous cationic alkyl glycerolipids, edelfosine, hemolysis.

1 N.N. Blokhin Russian Cancer Center, RAMS, Moscow

2 Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies, Moscow

Контакты: alenmark25@gmail.com Принято в печать: 25 апреля 2012 г.

ВВЕДЕНИЕ

Эдельфозин [(1 -октадецил-2-метил-sw-глицеро-З-фосфохолин (I)] —

глицеролипид, вызывающий гибель опухолевых клеток при минимальном повреждении неопухолевых. Это соединение накапливается в гидрофобных компартментах (отделах) клеток и вызывает программированную гибель (апоптоз) [1]. Наиболее выраженное цитотоксическое действие эдельфозина выявлено для линий гемобластозов различного тканевого происхождения (К562, HL60, Namalwa, СЕМ, HUT78), а также для клеток аденокарциномы яичника SCOV3, меланомы кожи SK-MEL2, нейрогенной опухоли XF498, аденокарциномы толстой кишки НСТ15 [2, 3]. В 1996 г. была показана перспективность эдельфозина при аутологичной трансплантации костного мозга у больных острыми миелоид-ными острым лимфобластным лейкозами [4].

Вместе с тем выраженный гемолиз, вызываемый эдельфозином, считается серьезным препятствием

для дальнейшей разработки лекарственного средства на его основе. Уменьшение этого клинически неблагоприятного эффекта — актуальная задача [5]. Одним из способов снижения гемолитической активности может быть введение эдельфо-зина в липосомы, содержащие другие липиды: холестерин, кампестерин, Р-ситостерин [6]. Альтернативным путем контроля гемолиза служит поиск новых соединений, сходных по структуре с эдельфозином и обеспечивающих гибель опухолевых клеток при меньшей способности вызывать гемолиз.

В результате многолетних структурно-функциональных исследований нами разработан класс алкильных катионных глицеролипидов, близких по структуре эдельфозину [7], но не содержащих фосфатную группу. Синтезированы алкильные катионные глицеролипиды, различающиеся типом гетероциклического катионного домена. Установлена зависимость цитотоксичности от конфигурации катионного домена для следующих соединений: rac-N-{4-

1 ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

2 ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова»

141

А.А. Маркова и др.

н3с-о-

-0-с18н37

о

сн3

I©

-о—Р—О—(CH2)-N—сн

I©

сн.

О С18Н37

-о-с2н5 О-*jj'— (сн2)4—X о

Соединение X*

п © Br

ш —N V- ОН © 1

IV / \ —N О Нзс ^ / © 1

V -О © Br

VI © 1

vn © 1

Рис. 1. Структурные формулы исследуемых соединений:

А (I) — эдельфозин; Б (II-VII) — бесфосфорные катионные глицеролипи-ды с гетероциклическими полярными доменами Х — катионный домен липида; Y — анион.

[(2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил] бутил}-А-метилпиперидинийбромид (II), rac-N-{4-

[(2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил] бутил}-А-метил-4-гидроксипиперидиниййодид (III),

гас-А-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илокси-карбонил]бутил}-А-метилморфолиниййодид (IV), rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил] бутил }пиридинийбромид (V), гас-А-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил]бутил}-А' -этилимидазолиййодид (VI), гас-А-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил]бутил}-А' -метилимидазолиййодид (VII) [8]. В настоящей работе исследована способность новых соединений вызывать гемолиз донорских эритроцитов и гибель культивируемых опухолевых клеток (линии гемобластозов и солидных опухолей). Эдельфозин служил препаратом сравнения (рис. 1).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цитотоксичность соединений I—VII изучали в колориметрическом тесте (МТТ-тест) [9]. Для исследования гемолиза эритроциты получали из крови доноров. Кровь собирали в пробирки, содержащие цитрат натрия, перемешивали и инкубировали при температуре 4 °С в течение 60 мин. Эритроциты смешивали с 0,154 М раствором натрия хлорида, pH 7,2 в объемном соотношении 1:1 и добавляли соединение I до конечной концентрации 2—8 мкмоль/л, а соединения II—VII до конечной концентрации 12—25 мкмоль/л. В контрольную пробу (взвесь эритроцитов, не содержащая липиды) добавляли 50 мкл дистиллированной воды. Образцы инкубировали при температуре 37 °С в течение 60 мин, перемешивая содержимое. Центрифугировали при 2000 об./мин. Измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости на спектрофотометре LKB (Швеция) при длине волны поглощения X = 545 нм. Сравнивали полученные величины поглощения с таковыми при гемолизе, вызванном дистиллированной водой (величина поглощения принята за 100 %).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эдельфозин (см. рис. 1, А) и новые бесфосфорные катионные глицеролипиды (см. рис. 1, Б) вызывали гибель опухолевых клеток в культуре (линии промиелоцитарного лейкоза К562, рака толстой кишки НСТ116, аденокарциномы яичника SCOV3, лимфолейкоза HL60, рака молочной железы MCF7, меланомы В16) (табл. 1). Установлено, что соединения I—VII вызывали гибель опухолевых клеток в микромолярных концентрациях. Эдельфозин (I) более активен для всех исследованных линий. Среди бесфосфорных липидов наиболее активным оказались соединения V—VII. Для линии промиелоцитарного лейкоза HL60 цитотоксичность этих липидов сопоставима с таковой эдельфозина (I).

Исследовали гемолиз, вызываемый соединениями

1— VII в концентрации, при которой они токсичны для опухолевых клеток в культуре. Поскольку цитотоксические концентрации исследуемых соединений оказались неодинаковыми (см. табл. 1), мы сравнивали гемолитический эффект эквитоксических концентраций, т. е. тех, которые вызывают гибель приблизительно одинакового количества клеток. Для фосфатсодержащего эдельфозина (I) диапазон цитотоксических концентраций составил

2— 8 мкмоль/л, для бесфосфорных глицеролипидов (II—VII) — 12—25 мкмоль/л. Гемолитический эффект эдельфозина (I) оказался выраженным: уже при действии малой концентрации [2 мкмоль/л (I)] средняя величина гемолиза составила 8 %; при повышении концентрации

Таблица 1. Цитотоксичность липидов для линий опухолевых клеток"

Соединение Линия клеток

К562 HCT116 SCOV3 HL60 MCF7 B16

I 4,2 ± 0,3 0,8 ± 0,1 3,4 ± 0,2 2,0 ± 0,2 6,5 ± 0,5 6,0 ± 0,7

II 43 ± 0,6 14,3 ± 0,3 40,0 ± 1,8 17,2 ± 1,3 > 50 36,2 ± 1,7

III 38 ± 0,8 14,5 ± 0,4 35,2 ± 0,9 17,3 ± 0,9 > 50 41,0 ± 2,1

IV > 50 15,0 ± 0,8 42,5 ± 1,9 28,0 ± 1,2 > 50 > 50

V 17 ± 0,5 12,8 ± 0,2 12,8 ± 0,8 4,8 ± 0,4 10,9 ± 1,3 16,1 ± 0,7

VI 18 ± 0,4 11,5 ± 0,4 8,9 ± 0,7 4,9 ± 0,6 30,0 ± 1,0 14,8 ± 0,4

VII 16,5 ± 0,5 10,8 ± 0,3 8,0 ± 0,5 3,8 ± 0,6 20,4 ± 0,6 14,1 ± 0,5

* Приведена IC50 (мкмоль/л; концентрация, при которой выявлена гибель 50 % клеток) соединений I-VII после инкубации клеток в течение 72 ч. Результаты 3 независимых измерений.

142

Клиническая онкогематология

Бесфосфорные глицеролипиды и гемолиз

-T  2 мкмоль/л

4 мкмоль/л

8 мкмоль/л

12 мкмоль/л

18 мкмоль/л

25 мкмоль/л

Ы ГШ г

I II III IV V VI VII

Соединение

Рис. 2. Гемолиз, вызванный соединениями I-VII

до 8 мкмоль/л гемолиз достигал около 20 % (рис. 2). В отличие от эдельфозина (I) новые бесфосфорные соединения (II—VII) в концентрации, обеспечивающей гибель опухолевых клеток (см. табл. 1), практически не вызывают гемолиз (см. рис. 2).

Гемолиз, вызванный дистиллированной водой, принимали за 100 %. Приведены результаты одного репрезентативного эксперимента из трех независимых измерений. Разброс средних величин был менее 10 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные указывают на важное преимущество соединений нового класса перед препаратом

сравнения эдельфозином. Новые бесфосфорные алкильные катионные глицеролипиды, способные вызывать гибель опухолевых клеток и не повреждать эритроциты, перспективны для дальнейших исследований.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 10-03-00995-а) и Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.» (госконтракт № П1340).

ЛИТЕРАТУРА

1. Mollinedo F., Gajate C., Martin-Santamara S., Gago F. ET-18-OCH3 (Edelfosine): a selective antitumour lipid targeting apoptosis through intracellular activation of Fas/CD95 death receptor. Curr. Med. Chem. 2004; 11: 3163-84.

2. Duclos R.I. Jr., Chia H.H., Abdelmageed O.H. et al. Syntheses of racemic and nearly optically pure ether lipids and evaluation of in vitro antineoplastic activities. J. Med. Chem. 1994; 37: 4147-54.

3. Naseer A, Bok Hee B., Jongki H. et al. Additional Bioactive Lyso-PAF Congeners from the Sponge Spirastrella abata. J. Nat. Prod. 2001; 6: 533-5.

4. Vogler W.R., Berdel W.E., Winton E.F. et al. A phase I/II trial of edelfosine purging of autologous bone marrow transplantation (ABMT) in acute leukemia. ASCO Ann. Meet. 1996: 1063.

5. Ahmad I., Filep J.J., Franklin C. et al. Enhanced therapeutic effects of liposome-associated 1-O-Octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Cancer Res. 1997; 57: 1915-21.

6. Busto J.V., del Canto-Janez E., Goni F.M. et al. Combination of the antitumor cell ether lipid edelfosine with sterols abolishes haemolytic side effects of the drug. J. Chem. Biol. 2008; 1(1-4): 89-94.

7. Plyavnik N.V., Shtil A.A., Serebrennikova GA. Ether lipids as anticancer agents: focus on non-phosphorus cationic glycerolipids. Mini-Rev. Med. Chem. 2006; 6: 109-20.

8. Плявник Н.В., Крамарева Т.В., Серебренникова Г.А. Синтез катионных алкильных глицеролипидов с гетероциклическими азотистыми основаниями в качестве полярного домена. Биоорган. хим. 2011; 37(4): 552-8.

9. Shchekotikhin A.E., Dezhenkova L.G., Susova O.Y. et al. Naphthoindole-based analogues of tryptophan and tryptamine: synthesis and cytotoxic properties. Bioorg. Med. Chem. 2007; 15: 2651-9.

www.medprint.ru

143