СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ РАКА ЖЕЛУДКА
METHOD FOR IMMUNODIAGNOSIS OF STOMACH CANCER

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и онкологии, и может быть использовано для диагностики рака желудка.
Известен способ диагностики рака желудка путем проведения эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) с биопсией [Назаров В.Е. и др. Эндоскопия пищеварительного тракта. М.: Триада-Фарм, 2002. - 176 с.]. Указанный метод позволяет определить также локализацию и размер опухоли, выраженность воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка (СОЖ).
Но в применении ЭГДС существуют медицинские ограничения: проведение данной процедуры затруднено у пациентов с хроническими заболеваниями дыхательной, сердечно-сосудистой систем, у пожилых пациентов и у детей, а так как метод инвазивный, существует риск вирусного и бактериального инфицирования.
Известен способ применения тестовой панели для оценки состояния и функциональной активности СОЖ - «Гастропанель», с помощью которой в плазме крови определяют наличие антител к Helicobacter pylori, уровни пепсиногена I, пепсиногена II и гастрина-17 [P. Sipponen et al., Application of blood levels of gastrin-17, pepsinogen I and H. pylory antibody for nonendoscopic diagnosis of atrophic gastritis // DDW, 20-23 May, Atlannta, USA; RU №2519646, МПК G01N 33/50, опубл. 20.06.2014]. Исследования основаны на технологии твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и проводятся в соответствии с инструкцией, разработанной фирмой-производителем (Biochit, Финляндия). Однако этот метод требует чрезвычайно дорогостоящих импортных реактивов, что делает практически невозможным его использование в качестве скрининга во многих лечебных учреждениях. Кроме того, «Гастропанель» не включает определение маркеров ангиогенеза и канцерогенеза.
Известен способ применения фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor VEGF) 165 в качестве биомаркера для прогнозирования рака, мониторинга эффективности противораковой терапии, в качестве биомаркера для мультикиназных ингибиторов (RU №2395090, МПК G01N 33/577, A61K 49/16, опубл. 20.07.10).
Известно, что рак желудка развивается на фоне имеющихся предраковых состояний (атрофический гастрит, хроническая язва, полипоз желудка), что сопровождается морфофункциональными изменениями СОЖ. Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ диагностики атрофического гастрита на основе определения сывороточной концентрации VEGF [RU 2474824, МПК], включающий определение концентрации фактора роста эндотелия сосудов VEGF в сыворотке крови, и при условии значения этого показателя выше 226 пг/мл устанавливают наличие атрофии слизистой оболочки гастродуоденальной зоны [RU 2474824, МНК 33/53, опубл. 10.02.2013].
Однако известный способ позволяет выявить лишь одно из предраковых состояний желудка, но не рак.
Техническим результатом является разработка скринингового, малоинвазивного, не требующего больших материальных затрат способа выявления больных раком желудка.
Сущность изобретения заключается в том, что способ включает определение клинических показателей и иммунологическое исследование факторов крови. Для этого определяют в сыворотке крови концентрацию фактора роста эндотелия сосудов, раково-эмбрионального антигена и пепсиногена-1, при соблюдении одного из следующих условий: значения VEGF больше или равны 226 360 пг/мл, СЕА больше или равны 2,8 нг/мл, PG-1 меньше 30 мкг/л; значения VEGF больше 360 пг/мл, СЕА больше или равны 5,2 нг/мл, PG-1 меньше 49 мкг/л; значения VEGF больше 1000 пг/мл, СЕА больше или равны 5,0 нг/мл, PG-1 больше или равны 105 мкг/л, устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия.
Способ осуществляют следующим образом: забор крови для исследования проводят в утренние часы натощак из локтевой вены в объеме 5 мл в сухую стерильную пробирку, отделяют сыворотку с помощью центрифугирования при скорости 1500 оборотов в минуту в течение 10-15 минут. Определение сывороточных концентраций VEGF, СЕА, PG-1 проводят твердофазным иммуноферментным методом с использованием соответствующих моноклональных антител (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).
При определении концентрации VEGF во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора для разведения образцов, затем последовательно вносят по 100 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°C в течение 120 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. После 1-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл конъюгата №1, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°C в течение 60 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. После 2-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл конъюгата №2, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°C в течение 30 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. После 3-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в темноте при температуре 18-25°C в течение 25 мин. Вносят во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается. Через 2-3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. Сывороточную концентрацию VEGF определяют при построении калибровочного графика на прилагаемом трафарете. Достоверность результатов анализа оценивают по концентрации показателя в контрольном образце.
При определении концентрации СЕА и PG-1 в лунки планшета последовательно вносят соответственно по 25 и 10 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Во все лунки вносят по 200 мкл конъюгата, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37°C в течение 60 мин при интенсивности перемешивания 650 об/мин. После инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37°C в течение 15 мин при интенсивности перемешивания 650 об/мин. Вносят во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, перемешивают 10-15 сек на шейкере с интенсивностью 650 об/мин, содержимое лунок окрашивается. Через 2-3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. Сывороточную концентрацию СЕА и PG-1 определяют при построении калибровочных графиков на прилагаемых трафаретах. Достоверность результатов анализа оценивают по концентрации показателя в контрольном образце.
Способ апробирован на 40 больных раком желудка обоего пола (мужчин было 27 (67,5%), женщин - 13 (32,5%)) в возрасте от 35 до 79 лет. Средний возраст больных составил 63,15±10,21 года. II стадия опухолевого процесса была определена у 11 (27,5%) пациентов, III - у 15 (37,5%), IV - у 14 (35%).
Диагноз определяли на основании клинических данных, результатов ЭГДС и гистологического исследования. ЭГДС проводили в утренние часы, натощак, с взятием биоптатов из зоны поражения слизистой оболочки.
Кровь для исследования брали при первичном обращении до проведения хирургического или комбинированного лечения при получении информированного согласия обследуемых лиц. В качестве сравнения использовали серологические показатели, полученные в группе здоровых добровольцев (n-40).
Определение сывороточных концентраций VEGF, СЕА, PG-1 у здоровых добровольцев позволило установить интервал нормы (табл. 1).
Анализ результатов, полученных при оценке уровня VEGF, СЕА у большинства больных раком желудка, выявил повышение их количества, зависящее от стадии опухолевого процесса, по сравнению с контрольной группой (р<0,001), превышая верхние границы нормальных значений в 75, 60% случаев соответственно (табл. 1). Уровень PG-1 у большинства больных раком желудка снижался, что указывало на атрофию СОЖ, у части больных с локализацией опухолевого процесса в антральном отделе желудка - повышался.
Таким образом, проведенное исследование позволило выявить зависимость количеств VEGF, СЕА, PG-1 от стадии опухолевого процесса.
Пример. Больная Ш., 55 лет, история болезни №514, поступила на стационарное лечение во 2-е хирургическое отделение Мордовского республиканского онкологического диспансера 20.06.2013 г. с жалобами на ноющие боли в эпигастрии, похудание. После проведенного обследования выставлен диагноз: Рак антрального отдела желудка II ст., II кл. гр.
ЭГДС от 24.06.2013 г.: рак антрального отдела желудка.
Гистологическое исследование биоптата желудка: низкодифференцированный рак.
Рентгенография желудка от 26.06.2013 г.: Блюдцеобразный рак антрального отдела желудка.
Иммунологическое исследование от 25.06.2013 г.: количество VEGF - 1020 пг/мл, СЕА - 5 нг/мл, PG-1 - 105 мкг/л.
Наличие злокачественного новообразования желудка у больной подтвердилось данными ЭГДС, гистологического, рентгенологического и иммунологического исследований. При хирургическом лечении были выявлены прорастание опухоли через все слои желудка, метастатические очаги опухоли в эпигастральных лимфатических узлах, лимфатических узлах ворот печени, правой доле печени, установлена IV стадия опухолевого процесса.
Пример. Больной Б., 57 лет, история болезни №234, поступил на стационарное лечение во 2-е хирургическое отделение Мордовского республиканского онкологического диспансера 17.06.2014 г. с жалобами на тяжесть и боли в эпигастрии после еды, отрыжку, тошноту, похудание. После проведенного обследования выставлен диагноз: Рак тела желудка II ст., II кл. гр.
ЭГДС от 18.06.2014 г.: Инфильтративный рак тела желудка.
Гистологическое исследование биоптата желудка: умереннодифференцированная аденокарцинома.
Рентгенография желудка от 20.06.2014 г.: Инфильтративный рак тела желудка.
Иммунологическое исследование от 19.06.2014 г.: количество VEGF - 226 пг/мл, СЕА - 5,2 нг/мл, PG-1 - 21 мкг/л.
При хирургическом лечении диагноз, установленный по результатам ЭГДС, гистологического, рентгенологического, иммунологического исследований, подтвердился.
Пример. Больной Н., 60 лет, история болезни №268, поступил на стационарное лечение во 2-е хирургическое отделение Мордовского республиканского онкологического диспансера 02.07.2014 г. с жалобами на боли в эпигастрии, тошноту, похудание, слабость. После проведенного обследования выставлен диагноз: Рак тела желудка III ст., II кл. гр.
ЭГДС от 03.07.2014 г.: Инфильтративный рак тела и антрального отдела желудка.
Гистологическое исследование биоптата желудка: низкодифференцированная аденокарцинома.
Рентгенография желудка от 04.07.2014 г.: Инфильтративный рак тела и антрального отдела желудка с изъязвлением.
Иммунологическое исследование от 03.07.2014 г.: количество VEGF - 610 пг/мл, СЕА - 7,8 нг/мл, PG-1 - 47 мкг/л.
При хирургическом лечении диагноз, установленный по результатам ЭГДС, гистологического, рентгенологического, иммунологического исследований, подтвердился.
Способ предусматривает сочетанное определение сывороточной концентрации фактора роста эндотелия сосудов, карциноэмбрионального антигена и пепсиногена-1. При соблюдении одного из следующих условий: 1) значения VEGF больше или равны 226-360 пг/мл, СЕА больше или равны 2,8 нг/мл, PG-1 меньше 30 мкг/л; 2) значения VEGF больше 360 пг/мл, СЕА больше или равны 5,2 нг/мл, PG-1 меньше 49 мкг/л; 3) значения VEGF больше 1000 пг/мл, СЕА больше или равны 5,0 нг/мл, PG-1 больше или равны 105 мкг/л, устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия. Данный способ может быть использован для скринингового выявления рака желудка, позволяя быстро, без больших материальных и технических затрат, с высокой вероятностью (75%) выявить у пациентов с заболеваниями гастродуоденальной зоны наличие онкотрансформации желудочного эпителия.