Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на морфофункциональное состояние миокарда кролика после инфаркта

Оригинальные исследования

Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на морфофункциональное состояние миокарда кролика после инфаркта

ВВ. Давыденко1, АА. Матюков', Н.В. Цупкина 2, Т.Д. Власов1, В.В. Гриценко1,

АА. Кузнецов1, |XX. Аминева1 \ Р.В. Деев 3, А.Н. Ялфимов1, ГЛ. Пинаев 2

1 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

3 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Different bone marrow cells autotransplantation influence on morphofunctional state of myocardium after experimental infarction

V.V. Davydenko1, A A. Matyukov1, N.V. Tsupkina3, T.D. Vlasov1. V.V. Gritsenko1,

AA. Kuznetsov1 ,\Kh.K. Amineva11, R.V. Deev3, A.N. Yalfimov1, GP. Pinaev3 1 Saint-Petersburg IP. Pavlov State Medical University 3 Institute of Cytology, RAS, Saint-Petersburg 3 Kirov Military Medical Academy, Saint-Petersburg

В работе представлены результаты исследования по сравнительной оценке влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и ядросодержащих клеток костного мозга на морфофункциональное состояние миокарда после инфаркта. Эксперименты проведены на кроликах породы Шиншилла. Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии. Оценку результатов проводили с помощью функциональных [электрокардиография, эхокардиография) и морфологических методов. Были сформированы три группы животных. Животным 1-й группы [контроль, п = 13} в пораженную зону инъекционным способом вводилась ростовая среда а-МЕМ, животным 2-й группы [л = 14} вводилась культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга [ВхЮ3}, животным 3-й группы [п= 14}—ядросодержащие клетки костного мозга х

лантация культуры мультипотентныъх мезенхимальных стромальных клеток костного мозга при экспериментальном инфаркте миокарда приводила к уменьшению площади зоны ишемического повреждения, нормализации показателей систолической функции сердца, а также к стимуляции ангиогенеза. В то же время интрамиокарди-альная аутотрансплантация ядросодержащих клеток костного мозга сопровождалась увеличением зоны ишемического повреждения и ухудшением показателей систолической функции сердца по сравнению с контрольной группой, хотя и сочеталась с активацией ангиогенеза.

Ключевые слова: инфаркт миокарда, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, ядросодержащие клетки, костный мозг, аутогенная трансплантация, электрокардиография, зхокардиография.

The contribution aims to compare influence of intramyocardial autotransplantation of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells and bone marrow nucleated cells on a myocardium morphofunctional state after infarction. Chinchilla rabbits were exposed in the experiment. Myocardial infarction was modeled by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery. The condition was evaluated with functional [electrocardiography, echocardiography} and morphologic methods. There were three groups of animals. To the first group animals [control, n = 13} a-MEM growth medium was injected into the damaged area; a culture of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells [2x1 CP] was introduced to the 2nd group animals [n= 14), while the animals of the 3^ group [n= 14} being given

x

intramyocardial autotransplantation of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in experimental myocardial infarction resulted in ischemic area restriction, normalization of systolic function indices as well as stimulation of angiogenesis. At the same time intramyocardial autotransplantation of bone marrow nucleated cells was followed by an expansion of ischemic area and reduction of systolic function indices as compared with the controls, although angiogenesis activation occurred.

Key words: myocardial infarction, multipotent mesenchymal stromal cells, nucleated cells, bone marrow, autologous transplantation, electrocardiography, echocardiography.

Введение

Несмотря на значительные успехи современной меди цины, сердечно сосудистые заболевания по прежнему ос таются главной причиной смертности и инвалидизации на селения [1, 2]. Высокий уровень летальности во многом определяется особенностями регенерации миокарда. Отсут ствие пролиферативного потенциала у кардиомиоцитов при водит к тому, что, погибая в ходе различных патологических процессов, они замещаются соединительной тканью [3]. Используемые в настоящее время для лечения ишемии ми окарда консервативные и оперативные методы не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин [4]. В связи с этим разрабатываются новые способы реге нерации пораженного миокарда на основе современных

достижений молекулярной и клеточной биологии [2, 3, 5]. Таким новым направлением в кардиологии и кардиохирур гии является использование клеток костного мозга. Данный подход основан на способности этих клеток участвовать в регенерации поврежденного миокарда [2, 6]. В терапии ин фаркта миокарда используют различные клетки костного мозга [7 10]. Применяется как аллогенная, так и аутоген ная трансплантация клеток, причем наиболее перспектив ной считается трансплантация аутогенных клеток в связи с отсутствием необходимости иммуносупрессивной терапии и отсутствием этических и юридических проблем. В настоящее время ведется поиск оптимального типа клеток для клеточной терапии инфаркта миокарда. Чаще всего используются либо ядросодержащие клетки костного мозга, либо культура

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007

Оригинальные исследования

мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток ко стного мозга. Однако результаты по трансплантации этих ти пов клеток в поврежденный миокард противоречивы. Кроме того, во многих исследованиях изучалось влияние только од ного типа клеток, в то время как весьма важным является проведение сравнительного анализа по влиянию обоих ти пов клеток на течение инфаркта миокарда на одной модели.

Цель работы

Изучить и сравнить влияние аутотрансплантации куль туры мультипотентных мезенхимальных стромальных кле ток (ММСК) костного мозга и ядросодержащих клеток (ЯСК) костного мозга на морфофункциональное состояние мио карда кролика после инфаркта.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на кроликах самцах породы Шиншилла массой 2,7 3,0 кг. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3 4 мес.

Получение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и ядросодержащих клеток костного мозга В работе использовали культуру ММСК и ЯСК, получен ные из аспирата костного мозга. Клетки культивировали в среде a MEM (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов ко ров (Hyclone, Новая Зеландия).

Характеристику культуры проводили путем окрашивания её стандартной смесью реактивов BCIP NBT (Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и Суданом III (BDH Chemicals Ltd, Англия) для идентификации клеток адипоцитарной диф ференцировки [11, 12].

Моделирование инфаркта миокарда Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца. Сразу после коро нароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрами окардиально вводили клетки или эквивалентное количество ростовой среды [11, 12].

Электрокардиографическое исследование Электрокардиография во всех группах животных выпол нялась до операции (норма), через 3 сут., 7 сут., 30 сут. после операции и перед выведением животного из эксперимента (1 год после операции). После премедикации (дроперидол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) животное фиксировалось в специальном станке на спине. Использовали портативный одноканальный электрокардиограф ЭКГ 001 («Красно гвардеец», Россия) Амплитуда устанавливалась на 20 мм, а скорость лентопротяжного механизма - на 50 мм/с. Оцен ку ЭКГ проводили по второму стандартному отведению.

У ль тразвуковое эхокардиографи чес кое исследование

Ультразвуковое эхокардиографическое исследование выполнено на эхокамере Sequoia 512 (Acuson, США) с ис пользованием линейного датчика 13 МГц. В каждой группе животных эхокардиографическое исследование выполнялось до операции, через 14 сут. и через 1 год после операции по стандартной методике. Эхокардиография проводилась с обязательной параллельной регистрацией ЭКГ сигнала. Из парастернального доступа по длинной оси левого желудочка (с контролем из этого же доступа по короткой оси левого желудочка) в режиме М модального сканирования регистри ровался конечно диастолический размер левого желудочка. Систолическую функцию левого желудочка регистрировали

с помощью 2D сканирования из верхушечного доступа в четырехкамерной и двухкамерной позициях. Расчеты фрак ции выброса по модифицированному дисковому методу Simpson проводили, используя встроенные программы эхо камер. Кровоток в аорте оценивали в режиме импульсно волновой допплерографии.

Гистологическое исследование

После эвтаназии сердце кролика ниже лигатуры разре зали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины - апикаль ный, средний, базальный. Затем срезы помещали в 10% раствор формалина на 4 сут. После фиксации каждый сег мент сердца заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм по общепринятой методике. Гистологичес кие препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по Маллори (13]. Препараты исследовали на микроскопе «Био лам» (Россия).

Количественная оценка васкуляризации

Оценивалась пограничная с рубцом зона. В каждом пре парате в пяти последовательных полях зрения при увели чении х400 (окраска по Маллори) производился подсчет количества всех сосудов: артериол, капилляров, венул, вен, синусов (14].

Все эксперименты на животных выполнены в соответ ствии с требованиями этического комитета СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты

Все животные были разделены на 3 группы. Животным сразу после коронароокклюзии в пораженную зону инъекци онным способом вводилась в 1 й группе (контроль, п = 13) a

х

х

При анализе ЭКГ оценивали сердечный ритм, проводи мость, желудочковый комплекс QRST.

До моделирования инфаркта миокарда во всех группах регистрировался правильный синусовый ритм с ЧСС 172±82 в 1 мин. При анализе комплекса QRST изменений не отмечалось. Нарушений проводимости выявлено не было (рис. 1 3). Сводные данные ЭКГ после операции представ лены в табл. 1.

Таким образом, во всех группах после коронароокклюзии развивались электрокардиографические признаки острого инфаркта миокарда, которые имели отчетливую закономер ную динамику. Однако в контрольной группе и в группе жи вотных, которым выполняли трансплантацию ЯСК костного мозга, регистрировались признаки трансмурального инфар кта миокарда, тогда как в группе животных, которым транс плантировали культуру ММСК костного мозга, ЭКГ данные указывали на развитие субэндокардиального инфаркта мио карда. Кроме того, в контрольной группе и в группе животных после трансплантации ЯСК костного мозга предсердные эк страсистолы возникали значительно чаще, чем в группе животных, которым выполняли трансплантацию культуры ММСК костного мозга. Нарушения проводимости развива лись только в первой и третьей группах.

По данным УЗИ сердца в динамике были проанализиро ваны показатели систолической функции сердца: фракция выброса (ФВ), размер левого желудочка в диастолу (конечно диастолический размер КДР), скорость кровотока через аор тальный клапан (VAo). Динамика изменений показателей си столической функции сердца представлена в табл. 2 и на рис. 4 6.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

Оригинальные исследования

Таблица 1, Показатели ЭКГ в контрольной и опытных группах

после интрамиокардиальной аутотрансплантации

Параметры ЭКГ

Группы Сроки наблюдения Частота сердечных сокращений в I мин Нарушение ритма Нарушение функции проводимости Характеристика желудочкового комплекса ОРБТ

3 суток после операции 190±S2 Единичные предсердные экстрасистолы (у 80%) Нет Снижение амплитуды зубца К, элевация сегмента ЭТ, слабоотрицательный зубец Т

1-я 7 суток 140±46 Единичные АВ-блокада Комплекс ОЭ, снижение

(контроль) после операции предсердные экстрасистолы (у 30%) 1 степени (у 20%) приподнятого сегмента ЭТ, отрицательный зубец Т

30 суток после операции 182±64 Нет Нет Снижение приподнятого сегмента ЭТ, двухфазный зубец Т

1 год после операции 166±42 Нет Нет Сегмент ЭТ на изолинии, отсутствие зубца Т

3 суток после операции 174±38 Единичные предсердные экстрасистолы (у 10%) Нет Высокоамплитудный зубец К, депрессия сегмента ЭТ

2-я (трансплантация ММСККМ) 7 суток после операции 1S2±S8 Единичные предсердные экстрасистолы (у 10%) Нет Сегмент ЭТ на изолинии, глубокий отрицательный зубец Т

30 суток после операции 1 год после операции 210±46 166±44 Нет Нет Нет Нет Сегмент ЭТ на изолинии, низкоамплитудный положительный зубец Т Сегмент ЭТ на изолинии, низкоамплитудный

положительным или изоэлектрический зубец Т

З-я

(трансплантация

ЯСККМ)

3 суток

после операции

7 суток

после операции

30 суток после операции

1 год

после операции

196±44

2O6±46

18O±62

2O4±44

Единичные предсердные экстрасистолы

Единичные предсердные экстрасистолы

Нет

Нет

Нарушение

внутри-

желудочковой

проводимости

Нарушение

внутри-

желудочковой

проводимости

Нарушение

внутри-

желудочковой

проводимости

Нарушение

внутри-

желудочковой

проводимости

Комплекс QS, элевация сегмента ST

Комплекс ОЭ, снижение приподнятого сегмента ЭТ, отрицательный зубец Т

Комплекс ОЭ, снижение приподнятого сегмента ЭТ, отрицательный зубец Т

Комплекс ОЭ, сегмент ЭТ на изолинии, низкоамплитудный положительный или изоэлектрический зубец Т

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

Оригинальные исследования

Рис. 1. Динамика изменений ЭКГ кролика после коронароокклюзии и интрамиокардиального введения ростовой среды [контроль}

Рис. 2. Динамика изменений ЭКГ кролика после коронароокклюзии и интрамиокардиальной трансплантации культуры ММСК костного мозга

Рис. 3. Динамика изменений ЭКГ кролика после коронароокклюзии и интрамиокардиальной трансплантации ЯСК костного мозга

Таблица 2. Показатели систолической функции сердца в контрольной и опытных группах после интрамиокардиальной аутотрансплантации

Величина показателя

Показатель 1-я группа

исходная 14 суток после операции 1 год после операции исходная 14 суток после операции 1 год после операции исходная 14 суток после операции 1 год после операции

ФВ, % 64,9±4,З 46,7±З^ 48,7±З,9 61,7±4,O S8,1±4,8* S8,2±8,1* S9,7±З,2 З8,8±2,9*** 28,7±4,1***

КДР, мм 14,1±O,4 16,8±1,2 16,6±O,8 14,7±O,9 17,З±1^ 1S,2±O,7* 14,9±1,2 17,9±O,8* 19,8±O,9*  **

V Ao, м/с 94±З S8±6 7З±6 96±4 81±6* 89±4* 97±S SS±4** 4S±з*,**

Примечание: ФВ - фракция выброса; КДР - конечно диастолический размер; V Ао - скорость кровотока через аортальный клапан. Различия достоверны (р<0,05): * по сравнению с контролем; * * по сравнению со 2 й группой.

Рис. 4.

Динамика фракции выброса левого желудочка в контрольной и опытных группах

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 2, 2007

I I I I I

і ~m

До операции

14 суток после операции

1 год после операции

10:12:16 pm

15L8

ЕЕДИЭ 35mm

Neonatal

Neonatal

65dB S1/+1/1/4 Gain= 16dB A=1

Контроль

Трансплантация культуры ММСК костного мозга

Трансплантация ЯСК костного мозга Рис. 5. Эхография левого желудочка в контрольной и опытных группах до операции, через 14 суток и через 1 год после операции

Анализ региональной сократимости левого желудочка показал, что в контроле и в третьей группе животных через 14 сут. после операции на передней стенке определялись акинетичные участки. Во второй группе выявлялись гипоки нетичные участки в области передней стенки левого желудоч ка. Через 1 год после операции в контрольной и в третьей группах сохранялись акинетичные участки на передней стенке левого желудочка. Во второй группе нарушений со кратимости выявлено не было.

Как видно из представленных данных, после интрами окардиальной аутотрансплантации культуры ММСК кос тного мозга наблюдались выраженные положительные изменения показателей систолической функции сердца, проявляющиеся в полной нормализации всех показателей через 1 год после операции. В то время как у животных после аутотрансплантации ЯСК костного мозга, наоборот, выявлялось резкое снижение показателей систолической функции левого желудочка по сравнению с контрольной группой.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

Морфологический анализ проводили по 3 препаратам (по одному препарату с каждого парафинового блока) с каждого сердца. В данных сериях эксперимента помимо контрольной группы, в которой животным вводилась ростовая среда, в качестве сравнения была введена группа неоперированных животных (норма).

Сводные данные гистоморфологической структуры мио карда кроликов контрольной и опытных групп представлены в табл. 3.

Гпатологическая характеристика миокарда кроликов

контрольной группы

На гистологических препаратах миокарда апикального сегмента у всех животных определялась аневризма, состав ляющая 1/2 1/3 окружности левого желудочка и состоя щая из плотной фиброзной ткани. Фиброзная ткань состояла из грубых коллагеновых волокон и содержала артерии с утолщенными стенками. Субэндокардиально располагались группы или прослойка кардиомиоцитов. В пограничной зоне располагались сосуды синусоидного типа.

А

І І І І І

ш

До операции

14 суток после операции

1 год после операции

А

50СІВ 2-/+1/0/2 ~ Р\Л/ Оер№= ЗЗтт PW Са1е= 1.5тт Ш PWGain=22dB

10:47:07 рт Оэес Иг 35тт

НР=187Ьрт

8\л/еер=150тт/5

4. - . /[ .. .. ц \ -

* И ик Г. І І» і

V = 0.941 т/э Р<3 = З.бттНд

PW Оер№= ЗЗтт Р\М Са1е= 1.5тт PW Саіп= 22СІВ

іау»жиді:а е=п°

3:10:46 рт 151.8 Зэес

ІЗ.ОМНг 35тт

МеопаїаІ МеопаїаІ

НР=196Ьрт

8\«еер=150тт/$

Контроль

PW Оер1И= 18тт PW Оа1е= 1 .Отт Р\Л/ 6аіп=18гіВ

У = 0.564 т/э Рв = 2.6ттНд

10:36:48 рт 151.8 Зэес

13.0МНг 40тт

МеопаїаІ МеопаїаІ

НР=232Ьрт

Sweep=150mm/s

6=35° Ао сіезс

V = 0.846т/в РС5 = 1.3ттНд

PW Оер№= 16тт PW Са1е= 1,5тт PW 6аіп= '\2ciB

11:02:03 рт 1518 Зэес

Ю.ОМНг 45тт

МеопаїаІ МеопаїаІ

НК=190Ьрт

Sweep=150mm/s

жУР 'ІіУІІ “І

50гіВ 3 -/+1/0/ 2 ^ PWDepth=22mm в Р\М Са1е= З.Отт I PWGain=23dB

V = 0.730т/в РЭ = 2.9ттНд

2:38:15 рт 1518 Зэес

8.0МНг 50тт

МеопаїаІ МеопаїаІ

НР=206Ьрт

Э\«еер=150тт/8

т/в ІДО ^ІаїХит'

ЕЖЕ 6=45°

К».. .ІЙ-Ц*. .

Трансплантация культуры ММСК костного мозга

Р\Л/ ОерИі= 17тт Р\Л/ Оа1е= 1.5тт PWGain= 9dB

10:22:21 рт 1518 4зес

8.0МНг 40тт

МеопаїаІ МеопаїаІ

PW ОерИі= 21 тт РУ\1 6а1е= 1,5тт PW Саіп=ШВ

НВ=166Ьрт Sweep=150т т/э

V = О.вббт/э Р(3 = 2.9ттНд

10:12:07 рт 15І.8 Овес

Ю.ОМНг 35тт

МеопаїаІ МеопаїаІ

413=215Ьрт Sweep=150тт/в

'ЖіійііЄ 0=39° Ао гіевс

V = 0.530 т/э РЄ = 1.5ттНд

Трансплантация ЯСК костного мозга Рис. 6. Допплерография аорты в контрольной и опытных группах до операции, через 14 суток и через 1 год после операции

На гистологических препаратах миокарда среднего сег мента у всех животных определялась аневризма передней и боковой стенок левого желудочка с переходом на межжелу дочковую перегородку. Стенка аневризмы была истончена, представлена фиброзной тканью, тонкими прослойками или мелкими группами субэндокардиально расположенных кар диомиоцитов и сосудами разных типов. Имелись признаки прогрессирующего фиброза. В пограничной зоне определя лись сосуды синусоидного типа.

На гистологических препаратах миокарда базального сег мента у всех животных определялась аневризма передней стенки левого желудочка. Стенка аневризмы была истончена, представлена фиброзной тканью. Под эндокардом тонкими прослойками и островками располагались кардиомиоциты. Имелись признаки прогрессирующего фиброза. Интима в ар териях была резко утолщена, в пограничной зоне определя лись сосуды синусоидного типа (рис. 7, 8).

Гистологическая характеристика миокарда кроликов второй группы

На гистологических препаратах миокарда апикального сег мента у всех животных аневризма не обнаружена. В передней стенке левого желудочка определялся участок фиброзной тка ни с выжившими мышечными волокнами, которые распола гались в толще рубца. Имелось небольшое количество всех элементов интрамиокардиального кровеносного русла.

На гистологических препаратах миокарда среднего сег мента у всех животных на ограниченном участке передней стенки левого желудочка или на границе передней стенки ле вого и правого желудочков определялась небольшая аневриз ма. В остальных отделах левого желудочка имелись лишь су бэндокардиальные прослойки соединительной ткани. В рубцах и в пограничной зоне определялось большое количество ком понентов интрамиокардиального кровеносного русла.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007

А

I I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

Таблица 3. Гистологическая характеристика миокарда кроликов контрольной и опытных групп после интрамиокардиальной аутотрансплантации

Признак 1-я группа

Апикальный сегмент Средний сегмент Базальный сегмент Апикальный сегмент Средний сегмент Базальный сегмент Апикальный сегмент Средний сегмент Базальный сегмент

Аневризма C C C - C - C C C

Поражение правого желудочка C

Поражение межжелудочковой перегородки C C

Прогрессирующий кардиосклероз - C C - - - - - C

Группы кардиомиоцитов, сохранившихся в рубце C C C C C C - - -

Норма

S I

Я ?

і і .0 (D

q 5

Трансплантация Трансплантация Контроль культуры арі/

ММСК

Рис. 7.

Гистотопограммы миокарда неоперированных животных, животных контрольной и опытных групп через 1 год после операции

Рис. 8. Микрофотографии миокарда кроликов контрольной и опытных групп через 1 год после операции.

Передняя стенка левого желудочка, средний сегмент:

А - стенка аневризмы, стрелками обозначен сохранившийся субэндокардиальный слой кардиомиоцитов;

В - стрелками обозначен интрамуральный рубец; С - стенка аневризмы, резкое истончение стенки левого желудочка;

х2

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 2, 2007

11111

ш

На гистологических препаратах миокарда базального сег мента у всех животных аневризма не определялась. В пере дней стенке левого желудочка определялся небольшой межуточный фиброз с участками периваскулярного фибро за. В рубцах и пограничной зоне определялось большое количество компонентов интрамиокардиального кровенос ного русла (см. рис. 7, 8).

Гистологическая характеристика миокарда кроликов третьей группы

Гистологически в препаратах миокарда апикального сег мента у всех животных определялась прогрессирующая циркулярная аневризма с признаками расслоения, представ ленная фиброзной тканью. Мышечные клетки отсутствовали. В артериях выявляли грубый фиброз и гиалиноз.

В среднем сегменте у всех животных определялась про грессирующая циркулярная аневризма с признаками рас слоения, представленная фиброзной тканью. В толще анев ризмы выявлялась прослойка жировой ткани и единичные островки мышечных клеток. В пограничной зоне определя лись не только обычные компоненты гемоциркуляторного русла, но и сосуды синусоидного типа.

В базальном сегменте у всех животных определялась гигантская аневризма, захватывающая переднюю стенку левого и правого желудочка, 2/3 межжелудочковой пере городки, часть боковой и задней стенки левого желудочка. Это сопровождалось резко выраженной гипертрофией правого желудочка и межжелудочковой перегородки с признаками кардиосклероза. В фиброзной ткани и в пограничной зоне определялись сосуды разных типов (см. рис. 7, 8).

Результаты количественной оценки сосудов погранич ной зоны после интрамиокардиальной аутотрансплантации представлены на рис. 9, 10.

Как видно из представленных данных, общее количество сосудов в контрольной группе составило 9±2 в одном поле зрения. Во второй группе количество сосудов было почти в

2 раза больше, чем в контроле, и составляло 16±3 в одном

поле зрения. В третьей группе также отмечалось значительно большее число сосудов по сравнению с контрольной группой, что соответствовало 14±3 в одном поле зрения.

Таким образом, интрамиокардиальная трансплантация культуры ММСК костного мозга и ЯСК костного мозга при водила к формированию принципиально иной морфологи ческой структуры миокарда, чем в контрольной группе. После трансплантации культуры ММСК костного мозга наблюда лась картина мелкоочагового склероза с последующим вое становлением структуры миокарда. Кроме того, в исследуе мых препаратах отмечалась повышенная, по сравнению с контролем, васкуляризация миокарда. Трансплантация ЯСК костного мозга сопровождалась формированием огромных фиброзных аневризм в сердцах подопытных животных, ком пенсаторной гипертрофией сохранившегося миокарда, межжелудочковой перегородки и правого желудочка. В то же время в исследуемых препаратах была отмечена высо кая васкуляризация миокарда, значительно превышающая уровень васкуляризации в контроле.

Обсуждение результатов

Представленные в данной работе результаты показали, что трансплантация клеток костного мозга влияла на мор фофункциональное состояние миокарда после инфаркта. После интрамиокардиальной трансплантации культуры ММСК костного мозга нами была отмечена нормализация показателей систолической функции сердца, по данным морфологического исследования - развитие мелкоочаго вого кардиосклероза.

Выявленные изменения, по видимому, могут быть обус ловлены либо паракринным действием трансплантирован ных клеток, либо их дифференцировкой в те или иные струк туры миокарда. В I фазу инфаркта миокарда, которая характеризуется гибелью кардиомиоцитов, трансплантирован ная культура ММСК костного мозга, скорее всего, способна ингибировать апоптоз и оказывать цитопротективное дей ствие. К. Агагпоив еЬ а1. (2005) продемонстрировали спо собность скелетных миобластов после трансплантации в

Рис. 9. Микрофотография миокарда кроликов контрольной и опытных групп через 1 год после операции: А - контроль; В - трансплантация культуры ММСК костного мозга; С - трансплантация ЯСК костного мозга.

Стрелками обозначены сосуды. Ув.: х 400, окраска по Маллори

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, N° 2, 2007

Оригинальные исследования

контроль

I

Рис, 10, Количество сосудов в пограничной зоне в миокарде кроликов контрольной и опытных групп через 1 год после операции

поврежденный миокард крыс вырабатывать цитокин HIF 1 а (hypoxia inducible factor 1 alpha), который оказывает цитоп ротективное действие и ингибирует апоптоз (15). S. Zhang et al. (2004) показали, что трансплантированные в поврежден ный миокард клетки костного мозга способны выделять белки теплового шока (heat shock proteins HSPs) HSP32, HSP70, а также индуцировать синтез этих белков кардио миоцитами (16). Ингибирование апоптоза и цитопротекция, по видимому, позволяют кардиомиоцитам и трансплантиро ванным клеткам выжить в условиях ишемии.

Помимо того, обнаруженные особенности могут быть связаны с изменением степени выраженности воспали тельной реакции за счет влияния на цитокиновый профиль. В ходе воспаления, развивающегося в ответ на ишемичес кое повреждение миокарда, участвуют 2 группы цитокинов: провоспалительные (IL 1 — 1р, 6, 8, TNF а,-р и другие), секретируемые, главным образом, макрофагами и нейтрофи

р

секретируемые в основном лимфоцитами, моноцитами и макрофагами (17). In vitro показано, что ММСК костного мозга наряду с провоспалительными цитокинами (IL 1 а 1 р, 6, 7, 8, TNF а -р) продуцируют весь спектр противовес

р

для11_1а, 1р, 1, 3, 4, 6, 7, 8, TNF а р (10]. Кроме того, показано, что ММСК костного мозга секретируют monocyte chemoattractant protein (МСР) 1, regulated on activation normally T cell expressed and secreted (RANTES),

р

всего, такое изменение цитокинового профиля приводит к изменению клеточной популяции: увеличению количества макрофагов, лимфоцитов и моноцитов, которые в свою оче редь секретируют преимущественно противовоспалительные цитокины. Возможно, данный механизм позволяет снизить степень выраженности воспалительной реакции и умень шить зону повреждения.

Таким образом, выявленные нами изменения в морфофун кциональном состоянии миокарда, скорее всего, обусловлены цитопротективным действием культуры ММСК костного моз га и уменьшением степени выраженности воспалительного процесса.

Данные функциональных и морфологических методов оценки состояния ишемизированного миокарда показали, что интрамиокардиальная трансплантация ЯСК костного мозга ухудшает сократительную функцию миокарда, расши ряет зону повреждения и приводит к формированию выра женной фиброзной аневризмы. Такой эффект, вероятно, обусловлен способностью ЯСК костного мозга влиять на

воспалительную реакцию как за счёт изменения количествен ного и качественного состава цитокинов в очаге поврежде ния, так и их непосредственного участия. ЯСК костного мозга представляют собой гетерогенную популяцию и содержат мезенхимальные стромальные клетки, гемопоэтические стволовые клетки, прогениторные эндотелиальные клетки, а также незрелые и зрелые клетки миелоидного и лимфо идного ряда. Среди ЯСК костного мозга содержится большое количество зрелых клеток крови. По видимому, попадая в ишемизированную зону миокарда, ЯСК в большом количе стве начинают секретировать протеолитические ферменты и цитокины (IL 1— 1 р, 6, 7, 8, TNF — -р, МСР 1, MIP 1 а, р

альтерации циркулирующие клетки крови, усиливая тем са мым, воспалительную реакцию (19]. Ключевым моментом в репарации миокарда является баланс между деградацией внеклеточного матрикса (это необходимо для миграции клеток) и его образованием мигрировавшими в зону по вреждения клетками. Высвобождаемые ЯСК костного моз га протеолитические ферменты лизируют межклеточные коллагеновые сшивки и активируют матриксные металле протеиназы. Скорее всего, в результате каскада фермен тативных реакций происходит деградация внеклеточного матрикса и расширение зоны инфаркта. Помимо протеоли тических ферментов матриксные металлопротеиназы акта вируются такими цитокинами как IL 1 р и TNF — р (20, 21]. G. Ertl и S. Frantz (2005) было показано, что у мышей с не р

были меньше, чем у животных с нормальным уровнем ци токина (22]. Кроме того, под действием протеолитических ферментов, продуцируемых трансплантированными ЯСК костного мозга, происходит массовая гибель кардиомиоци тов. Из некротизированных кардиомиоцитов в тканевой дет рит попадает сердечный миозин, который, являясь главным аутоантигеном, способен запускать аутоиммунную реакцию через активацию Т лимфоцитов. Активированные Т лим фоциты усиливают повреждение кардиомиоцитов и влияют на ремоделирование внеклеточного матрикса (23, 24].

Таким образом, выявленные нами изменения в морфо функциональном состоянии миокарда после трансплантации ЯСК костного мозга, по видимому, определены преоблада нием воспалительного процесса.

Результаты нашего исследования показали, что интра миокардиальная трансплантация культуры ММСК и ЯСК костного мозга приводила к повышению васкуляризации зоны повреждения. Мы полагаем, что ангиогенный эффект этих клеток реализуется за счёт секреции ангиогенных фак торов и, возможно, дифференцировки трансплантированных клеток в компоненты сосудистой стенки.

Участие культуры ММСК костного мозга в ангиогенезе, по видимому, связано со способностью этих клеток секре тировать ангиогенные факторы, такие как VEGF, bFGF, HGF

р

Y. Tang et al. (2005) показали, что трансплантация ММСК костного мозга в ишемизированный миокард сопровожда лась более высоким уровнем VEGF и bFGF, чем эндогенный уровень VEGF и bFGF в контрольной группе (10]. По данным J. Yoon et al. (2005) вырабатываемые ММСК костного мозга ангиогенные факторы также способны мобилизовать про гениторные эндотелиальные клетки из костного мозга, сти мулировать пролиферацию эндотелиоцитов сосудов миокар да и вызывать дифференцировку трансплантированных в миокард ММСК в эндотелиоциты, гладкие миоциты, пери циты, фибробласты, которые затем становятся компонента ми сосудистой стенки (27]. Y. Tang et al. (2005) установили, что трансплантация ММСК костного мозга в ишемизиро ванный миокард приводит к секреции цитокина SDF 1

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

Оригинальные исследования

(stromal cell derived factor 1), который является хемоаттрак тантом для предшественников эндотелиоцитов и гемопоэти ческих стволовых клеток (10]. Мигрировавшие из перифери ческой крови в очаг повреждения предшественники эндотелиоцитов способны дифференцироваться в зрелые эндотелиоциты и участвовать в ангиогенезе (28 31]. По данным A. Kocher (2001) гемопоэтические стволовые клет ки также обладают выраженным ангиогенным потенциалом (32]. Ещё один механизм участия ММСК костного мозга в неоангиогенезе, по видимому, связан со способностью ММСК дифференцироваться в эндотелиоциты и другие структуры сосудистой стенки. Многие исследователи демон стрируют способность ММСК костного мозга после транс плантации в ишемизированный миокард дифференциро ваться в эндотелиоциты и гладкие миоциты (10, 33 37].

Участие ЯСК костного мозга в ангиогенезе, скорее всего, обусловлено несколькими механизмами. Во первых, мезен химальные стромальные клетки, гемопоэтические стволовые клетки, прогениторные эндотелиальные клетки, а также не зрелые клетки миелоидного и лимфоидного ряда секрети руют многочисленные ангиогенные факторы (VEGF, bFGF, р

которые стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и прогениторных эндотелиальных клеток (составляющих часть трансплантированных ЯСК) (16, 26, 38]. Во вторых, как и мезенхимальные стромальные клетки, ЯСК костного мозга обладают способностью секре тировать БОР 1, который является хемоаттрактантом для предшественников эндотелиоцитов и гемопоэтических стволо вых клеток. В третьих, мезенхимальные стромальные клетки, по видимому, способны дифференцироваться в эндотелио циты и другие структуры сосудистой стенки (10, 36, 37].

Выводы

Таким образом, нами было показано, что интрамиокар диальная аутотрансплантация культуры ММСК костного мозга в условиях экспериментального инфаркта миокарда уменьшала зону ишемического повреждения, улучшала по казатели систолической функции сердца, а также стимули ровала ангиогенез. В то время как интрамиокардиальная аутотрансплантация ЯСК костного мозга сопровождалась увеличением зоны ишемического повреждения и ухудшением показателей систолической функции сердца, что сочеталось с активацией ангиогенеза.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Беленков Ю.Н., Агеев Ф.Т., Мареев В.Ю. и соавт. Стволовые клетки и их применение для регенерации миокарда. Журнал сердечная недостаточность 2003; 4(4): 168 73.

2. Шахов В.П., Попов С.В. Стволовые клетки и кардиомиогенез в норме и патологии. Томск: SST; 2004.

3. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: БЗБиМ; 1998.

4. Бокерия Л.А., Асланиди И.П., Беришвили И.И. и соавт. Непосредственные и отдаленные результаты различных методов хирургического лесения больных с диффузным поражением коронарных артерий. Бюллетень НЦССХ им. А.В.Бакулева РАМН 2004; 5(4): 116 29.

5. Шевченко Ю.Л. Медико биологические и физиологические основы клеточных технологий в сердечно сосудистой хирургии. СПб.: Наука; 2006.

6. Chachques J.S, Salanson Lajos С., Lajos С. et al. Cellular cardiomyoplasty fop myocardial regeneration. Asian. Cardiovasc. Thorac. Ann. 2005; 13(3): 287 96.

7. Limbourg F.P., Ringes Lichtenberg S., Schaefer A. et al. Haematopoietic stem cells improve cardiac function after infarction without permanent cardiac engraftment. Eur. J. Heart Fail. 2005; 7(5): 722 9.

8. Katritsis D.G., Sotiropoulou PA, Karvouni E. et al. Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cellsand endothelial progenitors into infarcted human myocardium. Catheter Cardiovasc. Interv. 2005; 65(3): 321 9.

9. Zhang S., Guo J., Zhang P. et al. Long term effects of bone marrow mononuclear cell transplantation on left ventricular function and remodeling in rats. Life Sci. 2004; 74(23): 2853 64.

10. Tang Y.L. Autologous mesenchymal stem cells for post ischemic myocardial repair. Methods Mol. Med. 2005; 112: 183 92.

11. Матюков AA. Влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на перфузию ишемизированного миокарда в эксперименте. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 3(5): 42 7.

12. Матюков А.А., Цупкина Н.В., Власов Т.Д. и др. Сравнение влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации различных клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 11(1): 48 52.

13. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Иностранная литература; 1953.

14. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина; 1990.

15. Azarnoush К, Maurel A, Sebbah L. et. al. Enhancement of the functional benefits of skeletal myoblast transplantation by means of coadministration of hypoxia inducible factor 1 alpha. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2005; 130(1): 173 9.

16. Zhang S., Zhang P., Guo J. et al. Enhanced cytoprotection and angiogenesis by bone marrow cell transplantation may contribute to improved ischemic myocardial function. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2004; 25: 188 95.

17. Liao Y., Cheng X. Autoimmunity in myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 2006; 112: 21 6.

18. Vandervelde S, Luyn M.J., Tio R.A. et. al. Signaling factors in stem cell mediated repair of infarcted myocardium. Mol. Cell Cardiol. 2005; 39(2): 363 76.

19. Frangogiannis N.G., Entman M.L. Chemokines in myocardial ischemia. Trends Cardiovasc. Med. 2005; 15(5): 163 9.

20. Frantz S, Ducharme A, Sawyer D. et al. Targeted deletion of caspase 1 reduces early mortality and left ventricular dilatation following myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 2003; 35: 685 94.

21. Pagani F.D, Baker L.S., Hsi C. et al. Left ventricular systolic and diastolic dysfunction after infusion of tumor necrosis factor alpha in conscious dogs. J. Clin. Invest. 1992; 90: 389 98.

22. Ertl G, Frantz S. Healing after myocardial infarction. Cardiovasc. Research 2005; 66: 22 32.

23. Cheng X, Liao Y.H, Li B, et al. Changes of rat lymphocyte proliferation and cytotoxic activity after acute myocardial infarction in vitro. Chin. J. Pathophysiol. 2005; 21 (9): 1848 50.

24. Zhang J, Chen J, Liao Y.H. et al. Myocardial autoimmune respons induced by myosin activated T lymphocytes. Chin. J. Cell. And Mol. Immunology 2007; 23[4):343 5.

25. Matsumoto R, Qmura T, Yoshiyama M. et. al. Vascular endothelial growth factor expressing mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction. Arteriosder. Thromb. Vase. Biol. 2005; 25(6): 1168 73.

26. Kamihata H, Matsubara H., Nishiue T. et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation 2001; 104: 1046 52.

27. Yoon J., Min B.G., Kim Y.H. Differentiation, engraftment and functional effects of pre treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 2005; 60(3): 277 84.

28. Kahn J, Byk T., Jansson Sjostrand L. et al. Overexpression of CXCR4 on human CD34~ progenitors increases their proliferation, migration, and NQD/SCID repopulation. Blood 2004; 103: 2942 9.

29. Luttun A, Carmeliet G., Carmeliet P. Vascular progenitors: from biology to treatment. Trends Cardiovasc. Med. 2002; 12:88 96.

30. Rafii S., Heissig B, Hattori K. Efficient mobilization and recruitment of marrow derived endothelial and hematopoietic stem cells by adenoviral vectors expressing angiogenic factors. Gene Ther. 2002; 9:631 41.

31. Szmitko P.E, Fedak P.W, Weisel R.D. et al. Endothelial progenitor cells: new hope for a broken heart. Circulation 2003; 107: 3093 100.

32. Kocher A.A., Schuster M.D, Szabolcs M.J. et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone marrow derived angioblasts prevents cardio myocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat. Med. 2001; 7:430 6.

33. Huss R. Perspectives on the morphology and biology of CD34 negative stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 2000; 9: 783 93.

34. Tomanek R.J., Schatteman G.C. Angiogenesis: new insights and therapeutic potential. Anat. Rec. 2000; 261: 126 35.

35. Davani S, Marandin A, Mersin N. et al. Mesenchymal progenitor cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density, and improve heart function in a rat cellular cardiomyoplasty model. Circulation 2003; 108 Suppl: II253 8.

36. Reyes M, Lund T, LenvikT. et al. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 2001; 98: 2615 25.

37. Eliopoulos N., Al Khaldi A., Beausejour C.M. et al. Human cytidine deaminase as an ex vivo drug selectable marker in gene modified primary bone marrow stromal cells. Gene Ther. 2002; 9:452 62.

38. Waksman R, Fournadjiev J, Baffour R. et al. Transepicardial autologous bone marrow derived mononuclear cell therapy in a porcine model of chronically infarcted myocardium. Cardiovasc. Rad. Med. 2004; 5: 125 31.

Поступила в редакцию 13,05,2007

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 2, 2007