Сравнительный цитогенетический анализ мультипотентных мезенхиамльных стромальных клеток ранних пассажей и лимфоцитов человека

Оригинальные исследования

63

Сравнительный цитогенетический анализ мультипотентных мезенхиамльных стромальных клеток ранних пассажей и лимфоцитов человека

ЮА. Шалыгина \ О А. Ефимова 1-2, П.В. Кругляков 3, А А. Пендина 2, A.C. Григорян 3,

Т.В. Кузнецова 2, ДГ. Полынцев 3, B.C. Баранов 2

1 Санкт-Петербургский Государственный Университет

2 ГУ НИИ Акушерства и Гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, лаборатория пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека, Санкт-Петербург

3 ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург

The comparative cytogenetic analysis multipotent mesenchymal stromal cells of early passages and lymphocytes the person

J.A. Shaiygina 1. O.A. Yefimova 1. P.V. Krugiiakov3. AA.Pendina 3, AS. Grigoryan 3. T.V. Kuznetsova 3, D.G. Polyntsev 3. VS. Baranov 3 1 The St.-Petersburg State University

3 GU Scientific research institute of Obstetrics and Gynecology ofD.O. Otta RAMS, St.-Petersburg 3 Open Company «Trans-technology». St.-Petersburg

Проведено изучение хромосомного набора мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) ранних пассажей и сопоставление его с таковым лимфоцитов периферической крови тех же доноров. Выполнено кариотипирование культуры ММСК и ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови, полученных от шести здоровых лиц обоих полов. В результате цитогенетического анализа культур ММСК, проведенного после каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, не было выявлено метафазных пластинок с измененным числом и структурой хромосом. Во всех случаях был установлен нормальный кариотип, соответствующий кариотипу ФГА-стимулированных лимфоцитов тех же индивидов. Таким образом, на ранних пассажах в культурах ММСК доноров с нормальным конституциональным кариотипом, установленным при цитогенетическом анализе лимфоцитов, не было зарегистрировано клеток с хромосомными и геномными мутациями.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стро-мальные клетки, кариотипирование, хромосомные аберрации.

We have analyzed karyotype of early-passaged human mesenchymal stem cells (hMSC) compared to that of peripheral blood lymphocytes from the same individuals. Karyotyping was performed on cultures of hMSC and PHA-stimulated peripheral blood lymphocytes donated by 6 healthy men and women volunteers. Cytogenetic analysis of hMSC cultures after each passage, from fourth to seventh, revealed no metaphase plates with abnormal chromosome number and/or structure. In all cases we established normal karyotype, corresponding karyotype of PHA-stimulated lymphocytes from the same individuals. Thus, in early-passaged cultures of hMSC from donors with normal karyotype in lymphocytes, no cells with chromosomal and/or genomic mutations were detected.

Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, karyotyping, chromosomal aberrations.

Введение

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) человека обладают способностью к ограниченному самообновлению и дифференцировке в нескольких направлениях. Возможность ММСК дифференцироваться в клетки мезенхимного происхождения, такие как адипоциты, хондроциты и остеоциты, является чрезвычайно привлекательной для развития биомедицинских технологий [1, 2]. Свойства ММСК позволяют использовать их для восстановления структуры и функций поврежденных тканей, в особенности в тех ситуациях, когда традиционные методы лечения малоэффективны. Применение ММСК открывает широкие возможности для лечения и профилактики таких тяжелых заболеваний, как сахарный диабет, печеночная недостаточность [3], инфаркт миокарда и кардиомиопатии [4-6]. Немаловажно при этом, что трансплантация аутогенных стволовых клеток костного мозга не приводит к иммунному конфликту и не противоречит биоэтическим нормам.

ММСК, являясь резидентами стромы костного мозга, присутствуют в ней в небольшом количестве: 1 на

e-mail: pitkus@alkorbio.ru

104—*105 клеток [7]. Недостаточное для терапевтических целей число ММСК, получаемых непосредственно из красного костного мозга, требует их наращивания в культуре. Согласно данным ряда исследований, при увеличении объема клеточной массы методом пассирования в культуре, появляются клетки с возникшими de novo нарушениями хромосомного набора, дающие впоследствии аномальные клеточные линии [8—11]. Среди аномалий кариотипа ММСК одни авторы обнаруживают анеуплоидию — отличное от нормального (46, XX или 46, XY) число хромосом [10], другие — выявляют структурные аберрации хромосом [8, 9]. Также исследователи отмечают сочетанные аномалии, при которых идентифицируют как анеуплоидный хромосомный набор, так и структурно перестроенные хромосомы [10, 11]. Изменение количества генетического материала может привести к аномальному функционированию генома, что оказывает крайне негативное влияние на клетку, вплоть до опухолевой трансформации [12]. В связи с этим применение в терапии клеточных линий с аномальным кариотипом недопустимо. Однако изменение кариотипа

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009

И I и и

TD

Оригинальные исследования

ММСК при пассировании было установлено не всеми авторами. Таким образом, вопрос об изменениях кариотипа ММСК в культуре остается открытым.

Выделяют несколько факторов, приводящих к изменениям кариотипа ММСК in vitro. Возможными причинами возникновения аномалий хромосомного набора ММСК могут быть собственно биологические свойства стволовых клеток, особенности условий культивирования и, наконец, индивидуальные свойства генома донора клеток, предрасполагающие к появлению хромосомных аберраций. Эти факторы необходимо учитывать при цитогенетическом анализе ММСК, так же как наличие сбалансированных перестроек хромосом в конституциональном кариотипе донора ММСК. В связи с этим целью настоящей работы является цитогенетический анализ культур ММСК ранних пассажей и лимфоцитов доноров-добровольцев.

Материал и методы

Добровольными донорами ММСК и лимфоцитов явились трое мужчин и три женщины в возрасте от 28 до 46 лет. Перед получением биологического материала проводили анкетирование доноров-добровольцев, результаты которого приведены в таблице 1.

ММСК эксплантировали из стернального пунктата костного мозга объёмом 2^8 мл. Полученный пунктат разбавляли в два раза питательной средой аМЕМ (Hyclone, Новая Зеландия), фракционировали в градиенте Ficoll (1:1), отбирали слой мононуклеарных клеток. Отобранные мононуклеарные клетки промывали питательной средой аМЕМ, центрифугировали при скорости 1500 об./мин., осадок суспензировали в культуральной среде аМЕМ с добавлением 20% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Hyclone, Новая Зеландия) и высевали во флакон для культивирования Т-75 (Sarstedt, Германия). Через 48 час. после эксплантации костного мозга проводили двукратную процедуру отмывки ММСК и островков костного мозга от форменных элементов крови, находящихся в суспензии, с помощью раствора PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCI), и снова помещали в питательную среду. Для пересева культуры использовали раствор трипсина и ЗДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Первый пересев культуры ММСК проводили через 6^10 сут. после эксплантации, далее культуру пересевали каждые 5^7 сут. с исходной плотностью 1,27х103 клеток/см2. Замену

питательной среды производили каждые трое сут. После третьего пассажа культуру криоконсервировали по стандартной методике [13] и хранили от 1 мес. до 1 года, затем размораживали и культивировали до 7-го пассажа.

Перед замораживанием и после размораживания проводили иммунофенотипирование культуры ММСК методом проточной цитофлуориметрии с окрашиванием антителами к специфическим поверхностным маркерам. Для фенотипирования ММСК использовали антитела к CD34 и CD45 (Beckton Dickinson, США), CD90, CD44, CD105, CD106 (Beckton Dickinson, США). Для окрашивания антителами к поверхностным маркерам клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЗДТА (Hyclone, Новая Зеландия), промывали два раза раствором PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCI), затем на 1 час переносили в раствор моноклональных антител, коньюгированных с флуорохромом, в разведении 1:20. Далее клетки промывали два раза раствором PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США).

После каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, для части культуры ММСК каждого донора проводили хромосомный анализ, а оставшиеся клетки пересевали в другой флакон, для того чтобы провести аналогичный анализ после следующего пассажа (рис.1).

Для получения препаратов метафазных хромосом с целью дальнейшего кариотипирования, после пассажей 4, 5, 6, 7 непосредственно в культуральные флаконы объемом 40 мл, содержащие 3,5 мл культуральной среды бМЕМ (Hyclone, Новая Зеландия), добавляли раствор колхицина в конечной концентрации 0,05 мг/мл, и инкубировали при комнатной температуре в течение 4^6 час. Для получения суспензии клеток культуру ММСК обрабатывали раствором трипсина с раствором Версена в соотношении 1:3. Суспензию клеток переносили в центрифужные пробирки, добавляли по 3 мл 0,55% KCI для гипотонической обработки и инкубировали 20 мин. при комнатной температуре. Проводили префиксацию, добавляя в пробирку 75 мкл фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота, 3:1), центрифугировали 10 мин. при 1000 об./мин., удаляли надосадочную жидкость, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. Осадок разбивали пипетированием и струйно добавляли 3 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота, 3:1) и перемешивали.

Таблица 1, Результаты анкетирования доноров-добровольцев ММСК

№ Пол Возраст Хронические заболевания Перед получением биологического материала

индивида Прием лекарственных препаратов Перенесенные острые инфекционные заболевания

I Муж. 29 Нет Витамины гр. В Нет

2 Муж. 46 Нет Кавинтон Нет

3 Муж. 28 Нет Нет Нет

4 Жен. 29 Нет Арбидол, парацетамол Нет

5 Жен. 30 Нет Арбидол, санорин, Кальций ДЗ Нет

6 Жен. 46 Гастрит в стадии ремиссии Пенталгин, фезам, нурофен, витамины, гормональные контрацептивы Нет

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009

Оригинальные исследования

Начальная культура MCK

Пассаж 1

rv

Пассаж 2

rv

Пассаж З

rv

Наращивание

культуры

Аспирация

костного

мозга

Замораживание

Размораживание

Пассаж 4

I

Пассаж 5

rv

Пассаж 6

rv

Пассаж 7

rv

I 1 { \ С= 1 1

Кариотипирование

Рис. 1. Дизайн исследования

Фиксацию проводили при + 4°С в течение 20 мин. Затем меняли фиксатор, центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин., удаляли надосадочную жидкость, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. Раскапывание суспензии проводили на предметные стекла, охлажденные в воде при + 4°С, нанося на препарат по 30^50 мкл суспензии с высоты 30^50 см. Стекла высушивали на воздухе при комнатной температуре.

Получение препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови доноров проводили в соответствии со стандартным протоколом [14]. В стерильный шприц, содержащий 100^500 ед. гепарина, забирали 3^5 мл венозной крови. В пенициллиновые флаконы добавляли: 4,5 мл среды ВРМ1-1640 (Биолот, Россия) с глутамином; 0,5 мл сыворотки крови эмбрионов коров (Биолот, Россия); 0,3 мл гепарини-зированной крови, фитогемагглютинин (ФГА) в концентрациях, рекомендуемых фирмой-производителем. Стандартное время культивирования составляло 72 ч. при +37°С в закрытой системе. На 72-м часу культивирования за 40 мин. до начала фиксации, в культуру вводили колхицин в конечной концентрации 0,05 мг/мл. Содержимое флаконов переносили в центрифужные пробирки, клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин. при 1000 об./мин., супернатант удаляли пипеткой, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. Осадок разбивали пипетированием, добавляли 5 мл гипотонического раствора (0,55% КС1), перемешивали и инкубировали 25 мин. при комнатной температуре. Проводили префиксацию, добавляя в пробирку 0,5 мл фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота, 3:1), центрифугировали 10 мин. при 1000 об./мин., удаляли надосадочную жидкость, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. К осадку струйно приливали 5 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1) и перемешивали. Фиксацию проводили при +4°С в течение 20 мин. Затем 2 раза меняли фиксатор, каждый раз центрифугируя клеточную взвесь в течение 10 мин. при 10ОО об./мин. и удаляя надосадочную жидкость. Время второй и третьей фиксации составляло 20 и 15 мин.

соответственно. Раскапывание суспензии проводили на предметные стекла, охлажденные в воде при +4°С, нанося на препарат по 30^50 мкл суспензии с высоты 30^50 см. Стекла высушивали на воздухе при комнатной температуре.

После получения препаратов метафазных хромосом из ММСК и лимфоцитов периферической крови доноров проводили их окрашивание раствором Hoechst 33258 с последующим контрастированием актиноми-цином D и заключением препарата в раствор на основе цитратно-фосфатного буфера Мак-Ильвейна по стандартной методике. Препараты анализировали с помощью микроскопа LEICA DM LS, оборудованного объективами FLUOTAR х20/0,40 и х100/1,30^0,60, автоматической фотонасадкой и цветной камерой Leica DFC 320. Для получения фотоизображения использовали программное обеспечение Leica DFC Twain.

Кариотипирование ММСК и лимфоцитов периферической крови доноров проводили при разрешении 400^ 450 хромосомных сегментов на гаплоидный геном. Производили подсчет числа хромосом и анализ их структуры на 8^15 метафазных пластинках из ММСК после каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, и 11 —15 метафазных пластинках из лимфоцитов периферической крови каждого донора.

Исследование проведено с письменного информированного согласия доноров ММСК и лимфоцитов и одобрено этическим комитетом и ученым советом ГУ НИИ АГ им. ДО. Отта РАМН.

Результаты

Первым этапом исследования был хромосомный анализ ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови всех доноров, проведенный с целью исключения возможных конституциональных аномалий кариотипа. В результате кариотипирования ни у одного из доноров не было обнаружено метафазных пластинок с отличным от нормального числом хромосом, а также не установлено структурных изменений хромосом (рис. 2).

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009

Оригинальные исследования

* & .V

< »/ и

* * Я

о * «»

Л V «Й** * *

в «

*4

и« О

»«

В М

И К «і й5 гг и

113р11.2-13 , |14р11.2-13 ^ ^ |15р11.2-13

к А »* і* П

4 |13р11.2-13

й« Й

І» П1 “і11-2

11 12

121Р11.2-13 % 122р11.2-13

17 18

0«

Рис. 2. Метафазная пластинка [А] и кариограмма [Б] из лимфоцита периферической крови донора ММСК. Нормальный женский кариотип 46, XX

Вторым этапом исследования стал анализ кариоти-па ММСК ранних пассажей и сопоставление его с таковым лимфоцитов тех же индивидов. Отметим, что фенотип популяции ММСК, использованной для карио-типирования, не изменился после размораживания и последующего культивирования и был определен как С034-, С045-, С044 + , С090 + , С0105 + , С0106 + (рис. 3). В результате цитогенетического анализа культур ММСК, проведенного после каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, не было вы-

явлено изменений числа и структуры хромосом во всех исследованных метафазных пластинках (рис. 4). Во всех случаях был установлен нормальный кариотип, соответствующий кариотипу лимфоцитов периферической крови тех же индивидов (табл. 2).

Таким образом, в пассированных культурах ММСК доноров с нормальным конституциональным кариотипом, установленным при цитогенетическом анализе ФГА-сти-мулированных лимфоцитов, не было зарегистрировано клеток с измененным числом и/или структурой хромосом.

Рис. 3.

Иммунофенотип культуры ММСК человека после четвертого пассажа:

А - 99,8% ММСК [СП44');

Б - 99,8% ММСК (С0105');

В - 99% ММСК [СОЮ6 );

Г - 99,6% ММСК [С090');

Д - 0% клеток гемопоэтического ряда [С045'); Е - 0% клеток гемопоэтического ряда [СОЭ4’}

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009

Оригинальные исследования

» "В **

\. »

\' .

ч

; *

V*

V

*» *

О 11Ч12 $ ^

«|) т ** ««• аг*

11 12

| ІЗрІ 1.2-13 114р11.2-13 ^ л 115р11.2-13

І) * по

19 20

& А*

16 17 18

|21р11.2-и ш _ |22р11.2-13

Ні ЛІ

Рис. 4. Метафазная пластинка [А] и кариограмма [Б] ММСК донора. Нормальный женский кариотип 46, XX

Таблица 2. Результаты кариотипирования пассированных культур ММСК Є добровольных доноров

№ донора Номер пассажа, после которого проводили кариотипирование Кариотип (число проанализированных метафаз) Всего метафаз

4 S 6 7

1 46,ХУ [15] 46,ХУ [14] 46,ХУ [15] 46,ХУ [15] 59

2 46,ХУ [15] 46,ХУ [8] 46,ХУ [15] 46,ХУ [15] 53

3 46,ХУ [9] 46,ХУ [10] 46,ХУ [15] 46,ХУ [15] 49

4 46,ХХ [8] 46,ХХ [8] 46,ХХ [16] 46,ХХ [15] 47

5 46,ХХ [11] 46,ХХ [11] 46,ХХ [15] 46,ХХ [15] 52

6 46,ХХ [8] 46,ХХ [11] 46,ХХ [15] 46,ХХ [15] 49

Обсуждение

Изучению кариотипа культур стволовых клеток (СК) — как региональных, так и эмбриональных, — уделяется все больше внимания в связи с активным развитием клеточных технологий и перспектив их применения в медицине. Тем не менее, из-за противоречивости накопленных результатов, полученных рядом авторов, единого мнения по вопросу сохранения стволовыми клетками нормального хромосомного набора при пассировании до сих пор не существует [8, 10, 15—17].

В настоящей работе установлен нормальный кариотип клеточных культур ММСК, полученных от здоровых доноров-добровольцев. В рамках выполненного цитогенетического анализа на ранних пассажах — с четвертого по седьмой — нами не было зарегистрировано клеток с аберрантными кариотипами, что позволяет предположить отсутствие в исследованных культурах ММСК аномальных клонов. В результате кариотипирования культур ММСК ни у одного из доноров не было выявлено полиморфных вариантов хромосом, что полностью соответствует кариотипу, установленному для ФГА-стимулиро-ванных лимфоцитов каждого донора. Проведенное нами исследование позволяет говорить об отсутствии межтка-невых различий кариотипа между ММСК ранних пассажей и лимфоцитами человека.

Результаты выполненного нами исследования согласуются с данными ряда авторов. ММСК, донорами которых были пациенты с нарушениями функций головного мозга, характеризуются нормальным кариотипом в первичной культуре и сохраняют его на ранних пассажах — с первого по третий [18]. На пассажах со второго по одиннадцатый в культурах ММСК, полученных от здоровых доноров, установлен нормальный кариотип [19]. Среди модельных объектов нормальный кариотип имеют СК, выделенные из мышечной ткани крыс [20], а также ММСК свиней, как в первичной культуре, так и при длительном пассировании [21].

В то же время результаты других исследований демонстрируют появление хромосомных аберраций в культурах как региональных, так и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [8—10, 22—25]. Противоречивость литературных данных может быть обусловлена несколькими причинами. Одной из них являются собственно биологические свойства СК. Так, эмбриональные и региональные СК различаются по ряду характеристик, в основном касающихся выраженности степени специализации, способности к дифференцировке, пролиферации, ассиметричному делению и регенерации. При этом ЭСК, обладая более выраженным потенциалом к пролиферации, при культивировании в большей степени

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009

Оригинальные исследования

подвержены изменениям кариотипа, чем региональные СК, в том числе и мезенхимные (табл. 3).

Другой причиной противоречивости накопленных данных может быть применение авторами разных методик культивирования и пассирования СК. Так, в работах, где показано наличие хромосомных аберраций в культурах СК, в основном применяли методы энзиматического пассирования, а авторы, не обнаружившие аномалий кариотипа, применяли механическое пассирование, при котором селекция клеток основывается на их морфологических характеристиках [22, 23, 26, 28, 33]. Однако в нашей работе применялся именно метод энзиматического пассирования. Отметим, что на возникновение хромосомных перестроек и/или появление дополнительных хромосом в кариотипе СК, по крайней мере, отчасти, могут влиять реагенты, применяемые одними исследователями и не используемые другими. Не исключено, что для сохранения стабильности кариотипа СК требуется подбор особых условий культивирования и пассирования.

На возникновение аномалий кариотипа культуры СК могут также влиять индивидуальные особенности донора клеток. Так, известно, что употребление донорами ряда сильнодействующих лекарственных средств, в число которых входят цитостатические препараты, используемые при лечении онкологических заболеваний, в значительной мере повышает вероятность появления клеток

с аберрантными кариотипами [34—38]. Сходный эффект может наблюдаться, если на момент получения биологического материала или незадолго до него донор перенес острое инфекционное заболевание [39— 40].

Вышесказанное позволяет предположить, что результаты работ, демонстрирующих аномальный кариотип в культурах ММСК, вероятно, могут объясняться условиями культивирования или индивидуальными особенностями доноров клеток. Разработанная нами схема эксперимента позволила учесть возраст и пол доноров ММСК, особенности их конституционального кариотипа, а также возможное влияние на результаты кариотипи-рования ММСК внешних факторов и состояния здоровья доноров. Несмотря на различные данные, касающиеся состояния здоровья доноров и применения ими лекарственных препаратов, цитогенетическое исследование лимфоцитов и ММСК во всех случаях позволило установить нормальный кариотип. Кроме того, полученные нами результаты являются подтверждением принципиальной возможности подбора условий пассирования, в которых хромосомный набор ММСК остается нормальным в течение шести пассажей.

Таким образом, результаты настоящего исследования подтверждают, что в использованных нами условиях культивирования и пассирования ММСК человека сохраняют нормальный конституциональный кариотип на ранних пассажах. Однако наши данные не позволяют

Таблица 3, Результаты кариотипирования пассированных эмбриональных и региональных СК

Кариотип культур СК Источник

(В 2 % 46,ХХ; 46,ХУ X 17

47,ХУ,+12 26

47,ХУ,+12; 27

* 44,Х,с1ег

05 1 46,Х,1Сю(Х)(я21) 22

8 S0,ХХY,+12,+14,+17/S1,ХХY,+12,+14,+17,+20 о 28

£ 47,ХХ,+20 24

С 46^Д(Х;17)(р11;р13) 22

Амплификация длинного плеча хромосомы 17 (метод тюгоаггау) 2S

46,ХХ,Се1(4)(р1ег^я2::я3^Я1ег); 29

46,ХХ,Сир

46^ 30

46,ХХ; 46^ 19

5 46,ХХ; 46^ ^ ’ ’ ’ 18

£ 46^ 21

* 46,Х^14рэ+ 10

ф 46,ХХ; 46^ 31

х 45,Х,Сег(10)(я26),Сег(16)(р13.3),Сег(18)(р11.2) 9

£ 45,ХХ,Сег(21;22)(я10;я10)[18]/46,ХХ;

о 45,ХХ,-6[30]/46,ХХ;

| | 47,ХХ,+18[11]/46,ХХ; 10

съ о 48,ХХ,+С,+С[5]/46,ХХ[39]

Ь 47,Х^(8); 8

с 45,ХД

47,ХХ,+таг[40%]/46,ХХ[60%] 32

Множественные аберрации кариотипа, затрагивающие большую часть хромосомного набора 11

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009

Оригинальные исследования

предсказать возможности появления клонов клеток с числовыми и/или структурными аберрациями хромосом при более длительном пассировании культур, в связи с тем, что это требует увеличения числа проанализированных пассажей и метафазных пластинок. Возникновение аномалий кариотипа в культурах ММСК является серьезным препятствием для их применения в медицине из-за высокого риска появления нежелательных побочных эффектов. Поэтому для клеточных технологий допустимо использовать стволовые клетки только ранних пассажей. Тем не менее, мы считаем целесооб-

разным для обеспечения безопасности применения ММСК кариотипировать их культуры непосредственно перед использованием в терапии для оценки стабильности хромосомного набора клеток.

Авторы выражают глубокую благодарность Федоровой Ирине Дмитриевне, Чиряевой Ольге Гавриловне, Петровой Любови Ивановне, Садик Наталии Александровне, Дудкиной Вере Святославовне и Вяткиной Светлане Вячеславовне за помощь при анализе результатов и оформлении манускрипта. Работа поддержана грантом Правительства Санкт-Петербурга для студентов и аспирантов.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Кгатрега М., Franchini М., Pizzolo G., Aprili G. Mesenchymal stem cells: from biology to clinical use. Blood Transfus. 2007; 5(3): 120-9.

2. Abdallah В.М., Kassem M. The use of mesenchymal [skeletal] stem cells for treatment of degenerative diseases: current status and future perspectives. J. Cell Physiol. 2DD9; 218C1 ]: 9-12.

3. Gohari S., Gambia C., Healey M. et al. Evaluation of tissue-engineered skin [human skin substitute] and secondary intention healing in the treatment of full thickness wounds after Mohs micrographie or excisional surgery. Dermatol. Surg. 2DD2; 28Î12): 11D7-14.

4. Smits P.C., van Geuns R.J., Poldermans D. et al. Catheter-based intramyocardial injection of antologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 2DD3; 42: 2D63-9.

5. Hill J.M., Syed M.A., Arai A.E. et al. Outcomes of granulocyte colony-stimulating factor administration to patients with severe coronary artery disease. Circul. 2DD4; 11Dtsuppl III]: 352.

6. Kang H.J., Kim H.S., Zhang S.Y. et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet 2DD4; 363: 751-6.

7. Jorgensen С., Djouad F., Apparailly F., Noel D. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy. Gene Ther. 2DD3; 10C10): 928-31.

8. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2DD5; 15; 65t8): 3D35-9. Erratum in: Cancer Res. 2DD5; 1; 65[113: 4969.

9. Wang Y., Huso D.L., Harrington J. et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. Cytotherap. 2DD5; 7 [61: 5D9-19.

1D. Bochkov N.P., Voronina E.S., Kosyakova N.V. et al. Chromosome variability of human multipotent mesenchymal stromal cells. Bull. Exp. Biol. Med. 2007; 143(11: 122-6.

11. Tolar J., Nauta A.J., Osborn M.J. et al. Sarcoma Derived from Cultured Mesenchymal Stem Cells 2007; 25: 371-9.

12. Burns J.S., Abdallah В.М., Schroder H.D., Kassem M. The histopathology of a human mesenchymal stem cell experimental tumor model: support for an hMSC origin for Ewing’s sarcoma? Histol Histopathol. 2008; 23(101: 1229-40.

13. Stacey G.N., Masters J.R. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines. Nat. Protoc. 2008; 3(12): 1981-9.

14. Кузнецова T.B., Логинова (О.А., Чиряева О.Г. и др. Цитогенетические методы. В кн.: Медицинские лабораторные технологии / Под редакцией А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика; 1999: 550-78.

15. Baker D.E., Harrison N.J., Maltby E. et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat. Biotechnol. 2007 ; 25(21: 207-15.

16. Caisander G., Park H., Frej K. et al. Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 2006; 14(2): 131-7.

17. Suemori H., Yasuchika K., Hasegawa K. et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochem. Biophys. Res. Comm. 2006; 345: 926-32.

18. Zhang Z.X., Guan L.X., Zhang K. et al. Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro. Cell Biol. Int. 2007; 31: 645-8.

19. Bernardo M.E., Zaffaroni N.. Novara F. et al. Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Do Not Undergo Transformation after Long-term In vitro Culture and Do Not Exhibit Telomere Maintenance Mechanisms. Cancer Res. 2007; 67(191: 9142-9.

20. Henson N.L., Heaton M.L., Holland B.H. et al. Karyotypic analysis

of adult pluripotent stem cells. Histol. Histopathol. 2005; 20(3): 769-84.

21. Nakamura Y., Wang X., Xu C. et al. Xenotransplantation of longterm-cultured swine bone marrow-derived mesenchymalstem cells. Stem Cells 2007; 25(3): 612-20.

22. Buzzard J.J., Gough N.M., Crook J.M. et al. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 381-2.

23. Inzunza J., Sahle?n S., Holmberg K. et al. Comparative genomic hybridization and karyotyping of human embryonic stem cells reveals the occurrence of an isodicentric X chromosome after long-term cultivation. Mol. Hum. Reprod. 2004; 10: 461-6.

24. Rosier E.S., Fisk G.J., Ares X. et al. Long-Term Culture of Human Embryonic Stem Cells in Feeder-Free Conditions. Dev. Dyn. 2004; 229: 259-74.

25. Maitra A., Arking D.E., Shivapurkar N. et al. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nature genetics 2005; 37(10): 1099-103.

26. Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J. et al. Derivation of Embryonic Stem-Cell Lines from Human Blastocysts. N. Engl. J. Med. 2004: 350(13): 1353-6.

27. Buzzard J.J., Gough N.M., Crook J.M. et al. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 381-2.

28. Mitalipova M.M., Rao R.R., Hoyer D.M. et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature biotechnol. 2005; 23(1): 19-20.

29. Prokhorovich M.A., Lagar’kova M.A., Shilov A.G. et al. Cultures of hESM human embryonic stem cells: chromosomal aberrations and karyotype stability. Bull. Exp. Biol. Med. 2007; 144(1): 126-9.

30. Serakinci N.. Guldberg P., Burns J.S. et al. Adult human mesenchymal stem cell as a target for neoplastic transformation. Oncogene 2004; 23: 5095-8.

31.Shiras A., Chettiar S.T., Shepal V. et al. Spontaneous Transformation of Human Adult Nontumorigenic Stem Cells to Cancer Stem Cells Is Driven by Genomic Instability in a Human Model of Glioblastoma. Stem Cells 2007; 25: 1478-89.

32. Foroni C., Galli R., Cipelletti B. et al. Resilience to Transformation and Inherent Genetic and Functional Stability of Adult Neural Stem Cells Ex vivo. Cancer Res. 2007; 67(8): 3725-3.

33. Amit M., Carpenter M.K., Inokuma M.S. et al. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 2000; 227(2): 271-8.

34. Oestreicher U., Stephan G., Glatzel M. Chromosome and SCE analysis in peripheral lymphocytes of persons occupationally exposed to cytostatic drugs handled with and without use of safety covers. Mutat Res. 1990; 242(4): 271-7.

35. Carbonell E., Demopoulos N.A., Stefanou G. et al. Cytogenetic analysis in peripheral lymphocytes of cancer patients treated with cytostatic drugs: results from an EC Collaborative Study. Anticancer Drugs. 1996; 7(5): 514-9.

36. Rubes J., Kucharova S., Vozdova M., Musilova P., Zudova Z. Cytogenetic analysis of peripheral lymphocytes in medical personnel by means of FISH. Mutat Res. 1998; 412(3): 293-8.

37. Pilger A., Kohler I., Stettner H. et al. Long-term monitoring of sister chromatid exchanges and micronucleus frequencies in pharmacy personnel occupationally exposed to cytostatic drugs. Int. Arch. Occup. Environ. Health. 2000; 73(7): 442-8.

38. Bajic V., Spremo-Potparevic B., Milicevic Z., Zivkovic L. Deregulated sequential motion of centromeres induced by antitumor agents may lead to genome instability in human peripheral blood lymphocytes. J. BUON. 2007; 12(1): 77-83.

39. Urazova O.I., Litvinova L.S., Novitskii V.V., Pomogaeva A.P. Cytogenetic impairments of peripheral blood lymphocytes during infectious mononucleosis. Bull. Exp. Biol. Med. 2001; 131(4): 392-3.

Giannelli F., Moscarella S., Giannini C. et al. Effect of antiviral treatment in patients with chronic HCV infection and t(14;18) translocation. Blood 2003;102(4): 1196-201.

Поступила 12.05.2009

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009