ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ МЫШЬЯКА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОТТОРЖЕНИЯ ТКАНИ ИЛИ ОРГАНА
USE OF ARSENIC COMPOUNDS TO TREAT TISSUE OR ORGAN REJECTION

Для настоящей заявки испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой № 60/899007, поданной 2 февраля 2007 г., включенной в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки на нее.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
2
2
3
4
6
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения боли и воспаления, а также к лечению аутоиммунных и иммунологических нарушений с помощью соединений мышьяка. Более конкретно, способы и композиции настоящего изобретения относятся к применению метаарсенита натрия (NaAsO), триоксида мышьяка (AsO) и/или гексоксида мышьяка (AsO) или их солей для лечения боли, воспаления, и аутоиммунных и иммунологических нарушений.
Уровень техники изобретения
Восприятие боли, или ноцицепция, опосредуется периферическими терминалями группы специализированных сенсорных нейронов, называемых ноцицепторами. Широкое разнообразие физических и химических стимулов индуцирует активацию таких нейронов млекопитающих, приводящую к распознаванию потенциально опасного стимула. Несоответствующая или чрезмерная активация ноцицепторов, однако, может привести к изнуряющей острой или хронической боли.
Как правило, боль ощущается, когда свободные нервные окончания, которые образуют рецепторы боли в коже, а также в некоторых внутренних тканях, подвергаются механическим, тепловым, химическим или другим вредным стимулам. Рецепторы боли могут передавать сигналы по афферентным нейронам в центральную нервную систему и оттуда в мозг.
Причины боли могут включать воспаление, физическое повреждение, инфекционное заболевание, химическое или аноксическое повреждение, мышечный спазм и приступ невропатического явления или синдрома. Неэффективное лечение боли может быть изнуряющим для ощущающего ее человека из-за ограничения функциональности, уменьшения подвижности, осложненного сна и резкого изменения качества жизни.
Воспаление представляет собой физиологическое состояние, в острой форме характеризуемое такими классическими признаками, как боль, жар, покраснение, опухание и потеря функциональности. Воспалительная боль может возникать, когда ткань повреждена. Например, физические, химические и тепловые явления, оперативное вмешательство, инфекция и аутоиммунные заболевания могут вызывать повреждение ткани и воспаление. Когда ткань повреждена, большое количество эндогенных индуцирующих боль веществ, например брадикинина и гистамина, может высвобождаться из поврежденной ткани. Индуцирующие боль вещества могут связываться с рецепторами на чувствительных нервных окончаниях и посредством этого вызывать афферентные болевые сигналы.
Кроме того, индуцирующие боль вещества могут высвобождаться из ноцицептивных афферентных терминалей, и нейропептиды, высвобождаемые чувствительными терминалями, могут обострять воспалительный ответ. Таким образом, во время воспаления может иметь место спрутинг пептидергических периферических волокон и повышенное содержание пептида, причем многие волокна демонстрируют одновременное наличие вещества P (SP) и кодируемого геном кальцитонина пептида (CGRP). Вещество P может индуцировать сокращение эндотелиальных клеток, которое в свою очередь вызывает экстравазацию плазмы, позволяющее другим веществам (брадикинину, AIP, гистамину) получить доступ к участку повреждения и афферентным нервным терминалям. Высвобождение вещества P чувствительными нервными терминалями может также дегранулировать тучные клетки. Полагают, что данный процесс является важным фактором нейрогенного воспаления вследствие высвобождения воспалительных медиаторов, таких как гистамин и серотонин, и высвобождения протеолитических ферментов, которые катализируют продукцию брадикинина. CGRP, по всей видимости, не производит излияния плазмы, но является сильным вазодилататором и также действует синергически с SP и другими воспалительными медиаторами, усиливая экстравазацию плазмы. Все вышеперечисленные воспалительные медиаторы могут или сенсибилизировать ноцицепторы или вызывать боль. Следовательно, ингибирование высвобождения и/или активности воспалительных медиаторов может оказаться полезным для лечения распространенных воспалительных заболеваний, таких как, например, астма, артрит, дерматит, ринит, цистит, гингивит, тромбофлебит, глаукома, гастроинтестинальное заболевание или мигрень.
Хотя воспалительная боль, как правило, обратима и утихает, когда восстанавливается поврежденная ткань или исчезает вызывающий боль стимул, используемые в настоящее время способы лечения хронической воспалительной боли имеют много недостатков и изъянов. Так обычное оральное, парентеральное или топическое введение анальгезирующего препарата для лечения симптомов боли, например, антибиотика для лечения факторов, вызывающих воспалительную боль, может приводить к широкому системному распространению препарата и нежелательным побочным эффектам. Кроме того, используемая в настоящее время терапия воспалительной боли имеет недостатком малую продолжительность периода эффективности препарата, что делает необходимым частое повторное введение препарата, возможным результатом чего является повышение толерантности и устойчивости к препарату, развитие антител и/или зависимость от препарата и привыкание к нему, все это не является удовлетворительным. Более того, частое введение препарата увеличивает стоимость курса для пациента и может требовать от пациента помнить о том, чтобы придерживаться графика приема.
Примеры лечения воспаления и мышечной боли включают нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП), включая аспирин и ибупрофен, и опиоиды, такие как морфин.
НСПВП ослабляют боль посредством ингибирования производства простагландинов, выбрасываемых поврежденными тканями. Было показано, что простагландины являются периферическими медиаторами боли и воспаления, как, например, при артритических заболеваниях, и уменьшение их концентрации приносит пациентам облегчение. Было предположено, что простагландины участвуют в передаче боли в спинной и головной мозг, что может объяснить анальгезирующее воздействие НСПВП при некоторых болезненных состояниях, которые не связаны с воспалением или повреждением периферической ткани. Однако простагландины являются только одним из нескольких медиаторов боли. Как таковые, НСПВП обладают потолком активности, выше которого повышающиеся дозы больше не приносят ослабления боли.
Более того, у НСПВП присутствуют побочные эффекты, которые ограничивают их полезность. Например, они могут вызывать раздражение желудочно-кишечного тракта, и продолжительное использование может приводить к развитию обширного изъязвления пищеварительного канала. Это особенно верно для пожилых пациентов, которые часто применяют НСПВП в связи с артритическими состояниями.
Опиоиды оказывают терапевтическое действие на центральную нервную систему, включая мозг и спинной мозг. Опиоиды ингибируют эффективность передачи нервного сигнала между первичными чувствительными афферентами (в основном, C-волокнами) и проекционными нейронами. Они достигают этого, вызывая продолжительную гиперполяризацию обоих элементов данных синапсов. Применение опиоидов эффективно в облегчении большинства типов острой боли и хронической боли, вызванных злокачественными опухолями. Существует, однако, ряд хронических злокачественных болезненных состояний, которые частично или полностью невосприимчивы к опиоидной анальгезии, в частности те, которые включают в себя сдавливание нерва, например из-за образования и роста опухоли. К сожалению, опиоиды также проявляют нежелательные побочные действия, включая угнетение респираторной системы, констипацию и психоактивные действия, включая седацию, эйфорию и зависимость от препарата. Данные побочные эффекты проявляются при дозах, близких к тем, которые производят анальгезию и, следовательно, ограничивают дозы, которые могут быть введены пациентам. Кроме того, опиоиды, такие как морфин и героин, являются хорошо известными наркотиками, что часто приводит к быстрому возрастанию толерантности к препарату и физической зависимости. С развитием толерантности доза и частота препарата, необходимая, чтобы получить то же анальгезирующее действие, увеличивается со временем. Это может приводить к состоянию, при котором дозы, необходимые, чтобы ослабить хроническую непрерывную боль, могут стать опасными для жизни из-за вышеупомянутых побочных действий. Как он применяется в настоящем описании, термин «хроническая» обозначает боль, продолжающуюся в течение одного месяца или дольше. «Острая боль» определяется, как боль меньшей продолжительности, чем хроническая боль, и большей интенсивности.
Хотя боль, возникающая из-за воспаления и мышечного спазма, может быть вызвана механической или химической стимуляцией свободной терминали первичного чувствительного нейрона, невропатическая боль не требует начального стимула периферической свободной нервной терминали. Невропатическая боль представляет собой постоянный или хронический болевой синдром, который может быть результатом повреждения нервной системы, периферических нервов, ганглия дорсального корешка, дорсального корешка или центральной нервной системы.
Невропатическая боль включает в себя передачу болевого сигнала в отсутствие стимула, и обычно является результатом повреждения нервной системы. Полагают, что в большинстве случаев такая боль случается из-за сенсибилизации в периферической и центральной нервных системах после первоначального повреждения периферической системы (например, путем непосредственного повреждения или системного заболевания). Невропатическая боль, как правило, является жгучей, стреляющей и неослабевающей по интенсивности и может иногда быть более изнуряющей, чем исходное повреждение или патологический процесс, который вызвал ее.
Существующие способы лечения невропатической боли большей частью неэффективны. Опиаты, такие как морфин, являются эффективными анальгетиками, но их полезность ограничена из-за вредных побочных действий, отмеченных ранее, таких как быстрое развитие толерантности к препарату, физическое привыкание и абстинентные свойства, а также респираторная депрессия, изменения ментального статуса и пониженная сократительная способность кишечника с сопутствующей констипацией, тошнотой, рвотой и изменениями в эндокринной и вегетативной нервной системах. Кроме того, невропатическая боль часто не поддается или только частично поддается обычным опиоидным обезболивающим процедурам. Лечение с использованием антагониста N-метил-D-аспартата кетамина или альфа(2)-адренергического агониста клонидина может уменьшить острую или хроническую боль и позволяет уменьшить потребление опиоидов, но указанные средства часто плохо переносятся из-за значительных побочных эффектов.
Невропатические болевые синдромы включают аллодинию, различные невралгии, такие как постгерпетическая невралгия и тригеминальная невралгия, фантомую боль, и комплексные регионарные болевые синдромы, такие как рефлекторная симпатическая дистрофия и каузалгия. Каузалгия часто характеризуется спонтанной жгучей болью в сочетании с гиперальгезией и аллодинией.
К сожалению, не существует способа адекватного, предсказуемого и специфического лечения установленной невропатической боли (Woolf C. et al., Neuropathic Pain: A etiology, Symptoms, Mechanisms, and Management, Lancet 1999; 353: 1959-64), поскольку применяемые в настоящее время способы лечения невропатической боли состоят только лишь в попытках помочь пациенту справиться с ней посредством психологической или трудовой терапии, а не в уменьшении или устранении испытываемой боли.
Поэтому сохраняется необходимость в усовершенствованном способе или веществе для лечения неослабевающей хронической и острой боли, включая воспалительную боль. Существует также необходимость в усовершенствованных способах и средствах лечения иммунологических и аутоиммунных заболеваний и состояний. Это достигается посредством введения соединений мышьяка в соответствии с настоящим описанием.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2
2
3
4
6
Настоящее изобретение направлено на ограничения, отмеченные для уровня техники, и предлагает новые способы уменьшения воспаления и/или хронической и/или острой боли. Настоящее изобретение частично основано на обнаружении и демонстрации того, что соединения мышьяка, такие как метаарсенит натрия (NaAsO), триоксид мышьяка (AsO) и/или гексоксид мышьяка (AsO), или их соли, могут применяться для уменьшения воспаления и боли.
2
2
3
4
6
Данное раскрытие, в соответствии с аспектом настоящего изобретения, предлагает способы лечения млекопитающего (например, человека), страдающего хронической и/или острой болью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение предлагает способы применения соединений мышьяка, предпочтительно метаарсенита натрия (NaAsO), триоксида мышьяка (AsO) и/или гексоксида мышьяка (AsO), или их солей для лечения или предупреждения боли, включая, например, висцеральную боль (такую как панкреатит), боль, связанную с раком (таким как метастатический рак), центральные болевые синдромы (такие как боль, вызванная ударом), постхирургические болевые синдромы (например, постмастэктомический синдром), боли костей и суставов (остеоартрит), боль позвоночника (например, острая и хроническая боль внизу спины), миофасциальную боль (мышечное повреждение), послеоперационную, периоперационную боль и упреждающую анальгезию, хроническую боль, дисменорею, а также боль, связанную с ангиной, и воспалительную боль различного происхождения (например, при астме, остеоартрите, ревматоидном артрите).
2
2
3
4
6
В типичном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает применение метаарсенита натрия (NaAsO), триоксида мышьяка (AsO) и/или гексоксида мышьяка (AsO) или их солей в получении топической, оральной или парентеральной композиции для лечения острой и хронической гиперальгезии.
2
2
3
4
6
В аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения воспаления, предусматривающий введение терапевтически достаточного количества неорганического соединения мышьяка, например, метаарсенита натрия (NaAsO), триоксида мышьяка (ASO) и/или гексоксида мышьяка (AsO), млекопитающему, где введение соединения приводит к клинически значительному улучшению воспалительного состояния млекопитающего. В варианте осуществления настоящего изобретения клинически значительное улучшение воспалительного состояния включает в себя один или несколько пунктов из следующих: a) уменьшение или ингибирование боли; b) уменьшение или ингибирование опухания; c) уменьшение или ингибирование покраснения; d) уменьшение или ингибирование температуры обработанной ткани; и e) и уменьшение или ингибирование потери функциональности.
Теоретически предполагается, но не является необходимым для цели настоящего изобретения, что при воспалительных состояниях, как, например, в легких у пациентов с астмой, происходит, вероятно, высвобождение гистамина, цитокинов и других полипептидов. Соответственно, в варианте осуществления способы настоящего изобретения включают в себя местное или системное введение метаарсенита натрия для лечения воспаления и/или повреждения ткани, наблюдаемых, например, в дыхательных путях астматиков и связанном с раком некрозе.
В другом варианте осуществления способы настоящего изобретения предлагают местное введение метаарсенита натрия, триоксида мышьяка и/или гексоксида мышьяка для лечения воспаления в участке поврежденной ткани индивидуума.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы лечения боли и/или повреждения ткани, связанных с воспалением, например, фиброза ткани при связанном с раком или аутоиммунно индуцированном заболевании. Примеры иммунных и аутоиммунных заболеваний, которые можно лечить настоящими способами, включают иммунное и аутоиммунное заболевание эндокринной, нервно-мышечной, соединительной ткани, сердечно-легочной, скелетной и желудочно-кишечной систем. В частности, соединения мышьяка настоящего изобретения можно применять для лечения аутоиммунных нарушений и иммунологически опосредованных нарушений, таких как множественный склероз и другие связанные с иммунной системой состояния.
В другом варианте осуществления воспаление и боль, вызванные инфекционным заболеванием, включая бактериальные, вирусные, паразитарные инфекции, лечат способами по настоящему изобретению.
Способы настоящего изобретения предусматривают введение терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия, триоксида мышьяка и/или гексоксида мышьяка по обстоятельствам. В предпочтительных вариантах осуществления терапевтическое количество лежит в диапазоне от приблизительно 10 мкг до приблизительно 200 мг, предпочтительно в дробных дозах, которые вводят парентерально, интратекально, орально, посредством ингаляции или топически. Предпочтительная полная ежедневная доза составляет от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 70 мг, наиболее предпочтительно приблизительно 10 мг/кг.
Кроме того, теоретически предполагается, но не является необходимым для цели настоящего изобретения, что метаарсенит натрия, триоксид мышьяка и/или гексоксид мышьяка ингибируют и/или ослабляют лейкоциты и лимфоциты, которые принимают участие в производстве аутоиммунных антител и повреждении тканей. Соответственно, в типичном варианте осуществления способы настоящего изобретения предлагают местное или системное введение метаарсенита натрия, триоксида мышьяка и/или гексоксида мышьяка для лечения аутоиммунно индуцированных воспалений и/или повреждений ткани.
Термин «гиперальгезия» или «гипералгезическая чувствительность», как применяется в настоящем описании, обозначает чрезвычайную чувствительность к боли, которая в одной форме вызвана повреждением ноцицепторов в мягких тканях организма. Гиперальгезия может ощущаться в фокальных, дискретных областях или в более диффузной форме, охватывающей все тело. Исследования формирования поведения установили, что возможно приобретенное ощущение гиперальгезии последней, диффузной формы. Фокальная форма, как правило, связана с повреждением и подразделяется на два подтипа: Первичная гиперальгезия характеризуется болевой чувствительностью, которая происходит непосредственно в поврежденных тканях. Вторичная гиперальгезия характеризуется болевой чувствительностью, которая происходит в окружающих неповрежденных тканях.
Следует понимать, что как вышеприведенное общее описание, так и нижеследующее подробное описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают настоящее изобретение, как оно заявлено в формуле изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 представляет собой диаграмму данных, полученных с помощью гистопатологического анализа костного некроза и воспаления, вызванных опухолевой нагрузкой у крыс, получавших метаарсенит натрия.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, демонстрирующую воздействие метаарсенита натрия на продукцию оксида азота (iNOS).
Фиг. 3 состоит из двух диаграмм, которые демонстрируют воздействие метаарсенита натрия на продукцию PGE2.
Фиг. 4 демонстрирует воздействие метаарсенита натрия на экспрессию белков iNOS и COX-2, измеренную с помощью вестерн-блоттинга.
Фиг. 5 демонстрирует воздействие метаарсенита натрия на экспрессию белков TNF-α и IL-1β, измеренную с помощью вестерн-блоттинга.
Фиг. 6 демонстрирует воздействие метаарсенита натрия на экспрессию генов iNOS и COX-2.
Фиг. 7 демонстрирует воздействие метаарсенита натрия на экспрессию мРНК iNOS с помощью ОТ-ПЦР.
Фиг. 8 демонстрирует воздействие метаарсенита натрия на экспрессию генов TNF-a, IL-b и IFN-b с помощью ОТ-ПЦР.
Фиг. 9 представляет собой диаграмму, демонстрирующую воздействие транскрипционной активности NF-κB.
Фиг. 10 представляет собой вестерн-блоттинг, демонстрирующий воздействие метаарсенита натрия на уровень NF-κB.
Фиг. 11 представляет собой вестерн-блоттинг, демонстрирующий воздействие метаарсенита натрия на деградацию IκB.
Фиг. 12 представляет собой вестерн-блоттинг, демонстрирующий воздействие метаарсенита натрия на экспрессию Akt и ERK.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2
2
3
4
6
Настоящее изобретение предлагает способы лечения млекопитающего (например, человека), страдающего от боли и/или воспалительных заболеваний или состояний. В конкретных вариантах осуществления такие способы предусматривают местное или системное введение соединений мышьяка, предпочтительно метаарсенита натрия (NaAsO), триоксида мышьяка (AsO) и/или гексоксида мышьяка (AsO), или их солей, для лечения воспаления и острой и/или хронической боли.
2
2
3
4
6
В некоторых вариантах осуществления метаарсенит натрия (NaAsO), триоксид мышьяка (AsO) и/или гексоксид мышьяка (AsO) или их соли применяют для лечения или предупреждения боли, включая, например, висцеральную боль (такую как панкреатит, интерстициальный цистит, почечные колики, простатит, хроническая тазовая боль), боль, связанную с раком, «dynias», например, вульводинию, фантомную боль в ампутированных конечностях, корневые авульсии, радикулопатию, болезненную травматическую мононевропатию, болезненную невропатию сдавления, синдром канала запястья, локтевую невропатию, синдром предплюсневого канала, болезненную диабетическую невропатию, болезненную полиневропатию, тригеминальную невралгию, центральные болевые синдромы (потенциально вызываемые практически любым повреждением на любом уровне нервной системы, включая, без ограничения, удар, множественный склероз, повреждение спинного мозга) и постхирургические болевые синдромы (например, постмастэктомический синдром, постторакотомический синдром, фантомную боль), боль костей и суставов (остеоартрит), спинальную боль (например, острую и хроническую боль в нижней части спины, боль в шее, спинальный стеноз), боль в плече, боль от повторяющихся движений, острую боль, такую как зубная боль, боль в горле, раковую боль, миофасциальную боль (мышечное повреждение, фибромиалгию), послеоперационную, периоперационную боль и упреждающую анальгезию (включая, без ограничения, общехирургическую, ортопедическую и гинекологическую), хроническую боль, дисменорею (первичную и вторичную), а также боль, связанную с ангиной, и воспалительную боль различного происхождения, включая иммунологические реакции и аутоиммунные заболевания (например, остеоартрит, ревматоидный артрит, ревматизм, теносиновит и подагру, анкилозирующий спондилит, бурсит, волчанку).
Соединения мышьяка настоящего изобретения можно также применять для лечения головной боли, включая кластерную головную боль, мигрени, включая профилактику и применение в стадии обострения, удара, закрытой травмы головы, рака, сепсиса, гингивита, остеопороза, доброкачественной гиперплазии простаты и гиперактивного мочевого пузыря.
Специалисту понятно, что боль представляет собой гетерогенное нарушение. В способах и композициях в соответствии с настоящим изобретением термин «боль» обозначает все типы боли, включая острую и постоянную боль. Предпочтительно данный термин обозначает постоянные боли, такие как, без ограничения, диабетическая невропатия, фибромиалгия, боль, связанная с соматизированными расстройствами, артритическая боль, раковая боль, боль в шее, боль в плече, боль в спине, кластерные головные боли, головная боль напряжения, мигрень, герпетическая невралгия, фантомная боль в ампутированных конечностях, центральная боль, зубная боль, устойчивая к НСПВП боль, висцеральная боль, хирургическая боль, послеоперационная боль, боль при повреждении кости, боль во время схваток и родов, боль, происходящая от ожогов, включая солнечный ожог, послеродовая боль, боль при ангине и боль в мочеполовом тракте, включая цистит. Термин постоянная боль также предпочтительно обозначает ноцицептивную боль или ноцицепцию.
2
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения воспаления, предусматривающий введение терапевтически достаточного количества неорганического соединения мышьяка, например, метаарсенита натрия (NaAsO), млекопитающему, где введение соединения приводит к клинически значительному улучшению воспалительного состояния млекопитающего. В варианте осуществления настоящего изобретения клинически значительное улучшение воспалительного состояния включает в себя один или несколько пунктов из следующих: a) уменьшение или ингибирование боли; b) уменьшение или ингибирование опухания; c) уменьшение или ингибирование покраснения; d) уменьшение или ингибирование жара; и e) и уменьшение или ингибирование потери функциональности.
Астма представляет собой заболевание дыхательных путей, которое включает в себя элементы как воспаления, так и сужения бронхов. Лечебные курсы для астмы зависят от тяжести состояния. Легкие случаи или не лечат, или лечат только ингаляциями бета(B)-агонистов, которые воздействуют на бронхоконстрикционную составляющую, тогда как пациентов с более тяжелой астмой, как правило, лечат регулярными ингаляциями кортикостероидов, которые по своей природе являются в значительной степени противовоспалительными.
В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения метаарсенит натрия применяют для лечения или предупреждения гиперреактивных дыхательных путей и для лечения или предупреждения случаев воспаления, связанных с заболеванием дыхательных путей, например, астмы, включая аллергическую астму (атопическую или неатопическую), а также бронхоконстрикцию от физического напряжения, профессиональную астму, вирусное или бактериальное обострение астмы, другие неаллергические астмы и «синдром младенческого хрипа».
Хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) представляет собой другое распространенное заболевание с воспалительными и бронхоконстрикционными компонентами. Заболевание является потенциально летальным, и заболеваемость и смертность от данного состояния значительны. В настоящее время не известно фармакологическое лечение, способное изменить развитие заболевания.
Соединения мышьяка настоящего изобретения, например, метаарсенит натрия, в соответствии с типичным вариантом осуществления настоящего изобретения, можно также применять для лечения хронического обструктивного заболевания легких, включая эмфизему, респираторный дистресс-синдром взрослых, бронхит, пневмонию, аллергический ринит (сезонный и круглогодичный) и вазомоторный ринит. Он может также быть эффективным против пневмокониоза, включая алюминоз, антракоз, асбестоз, халикоз, птилоз, сидероз, силикоз, табакоз и биссиноз.
Более того, соединения мышьяка настоящего изобретения, такие как метаарсенит натрия, в соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения можно также применять для лечения воспалительного заболевания пищеварительного тракта, включая болезнь Крона и язвенный колит, синдрома раздраженного кишечника, панкреатита, нефрита, цистита (интерстициального цистита), увеита, воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз и экзема, ревматоидного артрита и эдемы, происходящих от травмы, связанной с ожогами, растяжениями или переломом, церебральной эдемы и ангиоэдемы. Его можно применять для лечения диабетической васкулопатии, диабетической невропатии, диабетической ретинопатии, резистентности посткапилляров или диабетических симптомов, связанных с инсулитом (например, гипергликемии, диуреза, протеинурии и повышенного мочевыделения нитритов и калликреина). Соединения мышьяка настоящего изобретения, предпочтительно метаарсенит натрия, можно применять в качестве миорелаксантов гладких мышц для лечения спазма желудочно-кишечного тракта или матки. Кроме того, они могут оказаться эффективными против заболевания печени, множественного склероза, сердечно-сосудистого заболевания, например атеросклероза, застойной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда; нейродегенеративных заболеваний, например, болезней Паркинсона и Альцгеймера, эпилепсии, септического шока, например, в качестве противогиповолемических и/или противогипотензивных средств.
В другом варианте осуществления соединения мышьяка настоящего изобретения применяют для предупреждения и/или лечения воспалительного заболевания печени или множественного склероза.
Другой вариант осуществления предлагает, в соответствии с настоящим изобретением, применение соединений мышьяка, в частности метаарсенита натрия, в топической композиции для лечения, уменьшения или предупреждения местного воспаления. В варианте осуществления соединение мышьяка, например, метаарсенит натрия, вводят млекопитающему, чтобы уменьшить или предупредить высвобождение гистамина.
В других вариантах осуществления, в соответствии с настоящим изобретением, метаарсенит натрия или другое соединение (соединения) мышьяка настоящего изобретения вводят млекопитающему (например, человеку) для лечения или уменьшения симптомов воспаления, связанных с иммуно-опосредованными и/или аутоиммунными заболеваниями, такими как, например, системная красная волчанка (СКВ), аутоиммунный ревматоидный артрит (РА), системный васкулит; инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД; диабет типа I), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), глютеиновая болезнь, аутоиммунная тироидная болезнь, синдром Шегрена, аутоиммунный гастрит, язвенный колит; болезнь Крона; аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз; первичный склерозирующий холангит; кожные аутоиммунные заболевания, аутоиммунная дилатационная кардиомиопатия, множественный склероз (МС), миастения гравис (МГ), васкулит (например, артериит Такаясу и гранулематоз Вегенера), аутоиммунные заболевания мышцы, аутоиммунные нейромышечные нарушения, такие как анкилозирующий спондилит, множественный склероз и острый диссеминированный энцефалит; иммуно-опосредованные невропатии; аутоиммунные заболевания семенника, аутоиммунное овариальное заболевание, аутоиммунный увеит, болезнь Грейвса, псориаз, анкилозирующий спондилит, болезнь Аддисона, тиреоидит Хашимото, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунное заболевание легких, такое как болезнь Вегенера и синдром Черджа-Стросс; иммунологическое заболевание легких, такое как астма, инфильтративное заболевание легких, болезнь гиперчувствительности легких и саркоидоз; дерматомиозит, включая склеродермию и полимиозит; и витилиго.
Ожидается, что способы настоящего изобретения замедлят или остановят развитие воспаления, улучшат по меньшей мере некоторые симптомы, функционирование и/или увеличат выживание и восстановление.
2
2
3
4
6
В соответствии с некоторыми другими аспектами настоящего изобретения метаарсенит натрия (NaAsO), триоксид мышьяка (AsO) и/или гексоксид мышьяка (AsO) или их соли можно применять для ингибирования и/или ослабления лейкоцитов или лимфоцитов и их секретов, которые связаны с началом аутоиммунных нарушений у человека. В соответствии с одним вариантом осуществления данного аспекта настоящего изобретения введение метаарсенита натрия может приводить к понижению уровня аутоантител, B-клеток, производящих аутоантитела, и/или аутореактивных T-клеток. Уменьшение количества любого из данных типов клеток или их секретов может составлять, например, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 50%, 70% или больше по сравнению с уровнем перед введением.
В соответствии с настоящим изобретением соединения мышьяка настоящего изобретения можно применять отдельно или в комбинации с другими известными обезболивающими и/или противовоспалительным лекарственными средствами и, такими как, например, НСПВП. Комбинации соединений мышьяка также предусмотрены.
Модели на животных вышеуказанных заболеваний и состояний широко известны в данной области техники и могут быть пригодными для оценки потенциальной полезности соединений настоящего изобретения. Наконец, соединения настоящего изобретения также полезны в качестве инструментов исследования (in vivo и in vitro).
Способы настоящего изобретения можно применять для лечения млекопитающего, у которого наличествует боль и/или воспаление, например, боль, связанная с ревматоидным артритом, или воспаление, связанное с астмой. Примеры млекопитающих включают людей или других приматов (например, шимпанзе), грызунов (например, мышей, крыс или морских свинок), кроликов, кошек, собак, лошадей, коров и свиней. Ожидается, что у некоторых из страдающих от боли субъектов лечение приведет к ингибированию развития и улучшению симптомов боли и/или воспаления.
Способ введения
Можно применять любой подходящий способ введения в соответствии с настоящим изобретением, включая, без ограничения, парентеральное введение, такое как внутривенное, подкожное, внутримышечное и интратекальное введение; также можно применять оральное, интраназальное, ректальное или вагинальное введение; непосредственно в опухоль; трансдермальный пластырь; имплантированные приборы (в частности, для медленного высвобождения); можно применять ингаляторы, введение пролонгированной депо-формы, и, наконец, топическое введение. Способ введения будет варьироваться в зависимости от типа применяемого соединения мышьяка и подвергаемого лечению заболевания.
Применяемые фармацевтические композиции могут быть в форме стерильных физиологически приемлемых (водных или органических) растворов, коллоидальных суспензий, кремов, мазей, паст, капсул, каплет, таблеток и крахмальных капсул. Фармацевтические композиции, содержащие соединения мышьяка настоящего изобретения, могут содержаться в закрытых стерильных стеклянных сосудах и/или ампулах. Кроме того, активный ингредиент может быть микроинкапсулированным, инкапсулированным в липосому, ниосому или lipofoam отдельно или вместе с направляющими антителами. Следует понимать, что формы введения с отстроченным или замедленным высвобождением также включены.
Составление препарата
Из соединений мышьяка настоящего изобретения можно составить фармацевтические препараты для введения млекопитающему для лечения боли и воспаления.
Для орального введения фармацевтический препарат может иметь жидкую форму, например, растворов, сиропов или суспензий, или может представлять собой лекарственный продукт для разбавления водой или другой подходящей основой перед использованием. Такие жидкие препараты можно изготовить обычными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрированные съедобные жиры); эмульгирующие средства (например, лецитин или гуммиарабик); неводные основы (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Фармацевтические композиции могут принимать форму, например, таблеток или капсул, изготовленных обычными способами с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или вторичный кислый фосфат кальция); скользящие вещества (например, стеарат меагния, тальк или оксид кремния); дезинтегрирующие средства (например, картофельный крахмал или натрия гликолят крахмала); или увлажняющие средства (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты оболочкой с помощью способов, хорошо известных в данной области техники.
Препараты для орального введения могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить контролируемое высвобождение активного компонента.
Для буккального введения композиции могут принимать форму таблеток или пастилок, составленных обычным способом.
Для введения с помощью ингаляции соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением удобно доставляются в форме подачи спрея-аэрозоля из упаковки под давлением или распылителя, с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторпентана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением стандартную дозу можно задать, предусмотрев клапан, чтобы доставлять дозированное количество. Капсулы и картриджи из, например, желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе можно изготовить содержащими порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Соединения могут быть составлены для парентерального введения путем инъекции, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Такие составы являются стерильными. Составы для инъекции могут быть представлены в виде порционных лекарственных форм, например, в ампулах или в емкостях, содержащих несколько доз, с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных основах, и могут содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Или же активный ингредиент может иметь форму порошка для разведения подходящей основой, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.
Из соединений могут быть составлены также ректальные композиции, такие как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.
В дополнение к составам, описанным ранее, соединения могут также быть составлены в виде депо-препаратов. Такие составы пролонгированного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, соединения могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменной смолой, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли. Липосомы и эмульсии представляют собой хорошо известные примеры средств доставки или носителей для гидрофильных препаратов.
Композиции могут, если необходимо, быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько порционных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, состоять из металлической или пластиковой фольги, как например блистерная упаковка. К упаковке или дозирующему устройству могут прилагаться инструкции по введению.
Настоящее изобретение также предлагает наборы для осуществления терапевтических курсов настоящего изобретения. Такие наборы состоят из одной или нескольких емкостей с терапевтически эффективными количествами соединений мышьяка в фармацевтически приемлемой форме. Соединение мышьяка во флаконе из набора настоящего изобретения может быть в форме фармацевтически приемлемого раствора, например, в комбинации со стерильным солевым раствором, раствором декстрозы или буферным раствором, или другой фармацевтически приемлемой стерильной жидкостью. Или же комплекс может быть лиофилизован или высушен; в данном случае набор, кроме того, необязательно содержит в емкости фармацевтически приемлемый раствор (например, солевой раствор, раствор декстрозы и т.д.), предпочтительно стерильный, чтобы разбавлять комплекс для получения раствора инъекции. Набор может также содержать другое терапевтическое средство(а) для лечения боли и/или воспаления в соответствующем количестве. Такое другое терапевтическое средство может быть составлено как комбинированный препарат с соединением мышьяка, содержащимся в наборе, или может быть составлено отдельно.
В другом варианте осуществления набор настоящего изобретения, кроме того, содержит иглу или шприц, предпочтительно упакованный стерильным образом, для инъецирования комплекса и/или упакованную спиртовую салфетку. Необязательно включают инструкции по введению соединений мышьяка врачом или пациентом.
Величина терапевтической дозы соединения мышьяка при лечении острой или хронической боли и/или воспаления изменяется в зависимости от тяжести подвергаемого лечению состояния и способа введения. Доза и, может быть, частота введения дозы также изменяются в соответствии с возрастом, весом тела, состоянием и реакцией конкретного пациента. Как правило, диапазон полной ежедневной дозы для состояний, описанных в настоящем описании, обычно составляет от приблизительно 10 мкг до приблизительно 200 мг, вводимых отдельными дозами, вводимыми парентерально, или орально, или топически. Предпочтительная полная ежедневная доза составляет от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 70 мг/кг активного ингредиента; и наиболее предпочтительно приблизительно 10 мг/кг.
Эффективная дозировка, достигаемая в одном животном, может быть пересчитана для применения в другом животном, включая людей, с помощью переводных коэффициентов, известных в данной области техники. См., например, Freireich et al., Cancer Chemother. Reports 50(4): 219-244 (1966) и таблицу 1 для коэффициентов эквивалентной по площади поверхности дозировки.
Таблица 1
От:К:
Мышь (20г)
Крыса (150 г)
Обезьяна (3,5 кг)
Собака (8 кг)
Человек (60 кг)
Мышь (20г)
1
0,5
0,25
0,17
0,08
Крыса (150 г)
2
1
0,5
0,25
0,14
Обезьяна (3,5 кг)
4
2
1
0,6
0,33
Собака (8 кг)
6
4
1,7
1
0,5
Человек (60 кг)
12
7
3
2
1
Требуемый уровень в крови, определяемый по уровню в плазме, можно поддерживать с помощью непрерывной инфузии соединения мышьяка. Следует отметить, что лечащий врач должен знать, как и когда окончить, прервать или изменить терапию в сторону более низкой дозировки вследствие токсичности или дисфункций костного мозга, печени или почек. И наоборот, лечащий врач должен также знать, как и когда изменить терапию в сторону более высокого уровня, если клиническая реакция неадекватна (предотвращая токсические побочные эффекты).
Кроме того, можно применять любой подходящий способ введения, чтобы обеспечить пациента эффективной дозой соединения мышьяка. Например, можно применять оральный, ректальный, вагинальный, трансдермальный, парентеральный (подкожный, внутримышечный, интратекальный и тому подобное). Лекарственные формы включают таблетки, пастилки, крахмальные капсулы, дисперсии, суспензии, растворы, капсулы, пластыри и тому подобное. (Смотри Remington's Pharmaceutical Sciences.)
Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат соединение мышьяка в качестве активного ингредиента или его фармацевтически приемлемую соль и могут также содержать фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, другие терапевтические ингредиенты, например, обычные лекарственные средства для обезболивания. Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к солям, полученным из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот и оснований, включая неорганические и органические кислоты и основания.
Фармацевтические композиции включают композиции, подходящие для орального, ректального, мукозального способов, трансдермального, парентерального (включая подкожный, внутримышечный, интратекальный и внутривенный), хотя наиболее подходящий способ в каждом конкретно случае зависит от природы и тяжести подвергаемого лечению состояния.
В случае, когда применяется композиция для внутривенной инъекции или инфузии, подходящий диапазон доз для применения составляет, например, от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 150 мг полной ежедневной дозы.
Кроме того, носитель мышьяка можно доставлять через заряженные и незаряженные матрицы, используемые в качестве средств доставки препарата, такие как мембраны из ацетата целлюлозы, а также посредством направленных систем доставки, таких как фузогенные липосомы, присоединенные к антителам или специфическим антигенам.
При практическом применении соединение мышьяка может быть соединено в качестве активного ингредиента в однородной смеси с фармацевтическим носителем в соответствии с обычными фармацевтическими способами составления смесей. Носитель может принимать большое количество разнообразных форм в зависимости от формы препарата, требуемого для введения, например, орального или парентерального (включая таблетки, капсулы, порошки, внутривенные инъекции или инфузии). В получении композиций для оральной лекарственной формы может быть задействована любая обычная фармацевтическая среда, например, вода, гликоли, масла, спирты, ароматизирующие средства, консерванты, красящие средства и тому подобное в случае оральных жидких препаратов, например, суспензий, растворов, эликсиров, липосом и аэрозолей; крахмалы, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, гранулирующие средства, скользящие средства, связывающие вещества, дезинтегрирующие средства и тому подобное в случае оральных твердых препаратов, например, порошков, капсул и таблеток. В получении композиций для парентеральной лекарственной формы, такой как внутривенная инъекция или инфузия, может быть задействована аналогичная фармацевтическая среда, например, вода, гликоли, масла, буферы, сахар, консерванты и тому подобное, известная специалистам в данной области техники. Примеры таких парентеральных композиций включают, без ограничения, декстрозу 5% вес/об, нормальный солевой раствор или другие растворы. Полная доза соединения мышьяка может быть введена во флакон с жидкостью для внутривенного введения, например, в диапазоне от приблизительно 2 мл до приблизительно 2000 мл. Объем разбавляющей жидкости будет изменяться в соответствии с полной вводимой дозой.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут понятны специалистам в данной области техники из рассмотрения данной спецификации и осуществления на практике настоящего изобретения, раскрытого в настоящем описании.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. Применение моделей на животных для исследования анальгезирующей активности
Модели химически индуцированной боли на животных использовали для определения анальгезирующей активности различных концентраций метаарсенита натрия и триоксида мышьяка.
Формалиновый тест на мышах. Метаарсенит натрия или триоксид мышьяка вводили соответственно орально (PO) или интраперитонеально (IP) группам из десяти самцов мыши линии CD-1 (Crl.) весом 24 +/-2 г. Метаарсенит натрия и основу (дистиллированную воду) или триоксид мышьяка и основу вводили за один час до субплантарной инъекции формалина (0,02 мл, 2% раствор). Уменьшение времени индуцированного формалином лизания задней лапы, фиксируемое с пятиминутными интервалами во время следующего периода продолжительностью от 0 до 35 минут после инъекции формалина, на 50% или более (>50%) указывает на значительную анальгезирующую активность. Статистический анализ осуществляли с помощью однофакторного ANOVA, после чего использовали критерий Даннетта для сравнения результатов, полученных с метаарсенитом натрия или триоксидом мышьяка, с результатами, полученными только с основой (контролем). Принимали значимость P<0,05. Результаты приведены ниже:
Метаарсенит натрия
Препарат
Способ введения
Доза мг/кг
Время лизания задней лапы (секунды) (Среднее значение±СОС)Время (минуты)
0-5
5-10
10-15
15-20
20-25
25-30
30-35
Основа
--
66,7±6,4
0,9±0,9
10,1±4,3
81,7±20,7
72,4±25,4
30,8±10,1
4,8±10,6
SMA
10
51,2±5,2
0,1±0,1
4,7±4,6
6,5*±4,5
20,5±10,8
29,2±7,6
6,6±4,2
SMA
1
54,9±6,3
2,7±1,8
7,6±2,8
44,6±13,5
55,7±13,9
45,0±19,3
21,3±9,7
SMA
0,1
76,1±8,6
4,3±4,2
24,0±10,4
69,4±13,0
46,0±11,8
44,6±13,0
4,9±1,8
Морфин
30
20,8±3,6
0,1±0,1
2,0±1.8
2,0*±2,0
10,4*±8,2
16,2±8,4
3,3±1,8
SMA: метаарсенит натрия*P<0,05 по отношению к контрольной группе, получавшей основу
Результаты указывают на то, что оральное введение метаарсенита натрия в количестве 10 мг/кг вызывает значительную анальгезирующую активность через 15-20 минут после введения пробы формалина. Стандарт, морфин, вызывает значительный анальгезирующий эффект во время ранней (0-5 минут) и поздней (15-25 минут) фаз после инъекции формалина, как и ожидалось.
Триоксид мышьяка
Препарат
Способ введения
Доза мг/кг
Время лизания задней лапы (секунды) (Среднее значение±СОС)Время (минуты)
0-5
5-10
10-15
15-20
20-25
25-30
30-35
Основа
IP-5 мл/кг
X
78,9
8,5
40,5
58,7
78,8
61,3
20,7
SEM
6,8
2,7
10,5
18,8
15,0
20,2
12,4
AT
IP 10 мг/кг
X
9,0*
0,3*
0,0*
0,0*
0,0*
0,0*
0,0
SEM
6,3
0,3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
AT
IP 1 мг/кг
X
74,6
2,6*
15,6*
40,0
57,1
53,5
30,0
SEM
11,3
1,5
5,5
13,3
18,1
15,3
18,8
Морфин
IP 10 мг/кг
X
29,7*
0,0*
0,7*
3,3*
22,8*
30,1
40,8
SEM
5,2
0,0
0,7
1,7
13,8
6,4
11,5
AT: Триоксид мышьяка*: P<0,05 по отношению к контрольной группе, получавшей основу, по однофакторному ANOVA с последующим критерием Даннетта
Интраперитонеальная инъекция 10 мг/кг триоксида мышьяка вызывает значительное ингибирование реакции лизания на пробу формалина в интервалах 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25 и 25-30 минут после введения пробы формалина, тогда как реакция на более низкую дозу триоксида мышьяка (1 мг/кг) ограничивается интервалами 5-10 и 10-15 минут после пробы. Одновременно протестированный стандартный морфин HCl оказывал анальгезирующий эффект через 0-25 минут после введения пробы формалина.
Анализ болевой реакции, индуцированной уксусной кислотой. Определяли возможную анальгезирующую активность метаарсенита натрия в анализе болевой реакции, индуцированной уксусной кислотой, у мышей. Метаарсенит натрия вводили орально в дозах 10, 1 и 0,1 мг/кг для возможной анальгезии у мыши. В качестве основы использовали дистиллированную воду. За один час до инъекции уксусной кислоты (0,5%, 20 мл/кг IP) орально вводили метаарсенит натрия группе из 10 самцов мыши линии CD-1 весом 24 ± 2 г. Значительную анальгезирующую активность определяли как уменьшение количества зарегистрированных реакций на 50% или более (≥50%) по отношению к контрольным группам через 5-10 минут после введения уксусной кислоты.
Введение 10 мг/кг метаарсенита натрия было связано с значительной анальгезирующей активностью (в среднем 7 зарегистрированных реакций по сравнению с 16 для контроля). При более низких дозах метаарсенит натрия не оказывал анальгезирующего воздействия.
ПРИМЕР 2. Применение моделей на животных для исследования противовоспалительной активности метаарсенита натрия и триоксида мышьяка
Метаарсенит натрия и триоксид мышьяка проверяли на возможное защитное действие против индуцированного липополисахаридами септического шока у мышей.
Индуцированная ЛПС продукция провоспалительных цитокинов. Метаарсенит натрия вводили орально в дозах 0,1, 1 и 10 мг/кг за один час до введения липополисахаридной пробы (ЛПС; 30 мг/кг IP; Escherechia coli 055:B5). Через два часа после введения пробы ЛПС у мышей отбирали образцы крови по 0,1 мл через ретроорбитальный синус и центрифугировали, чтобы получить плазму для измерения цитокинов с помощью Luminex. После забора крови наблюдали за смертностью и фиксировали ее каждые 12 часов в течение трехдневного периода. Уменьшение смертности на 50 процентов или более (>50%) указывает на значительную защиту. Результаты показаны в таблице ниже:
Метаарсенит натрия:
Способ введения
Доза
% Защиты
PO
10 мг/кг
25
PO
1,0 мг/кг
25
PO
0,1 мг/кг
12
Дексаметазон-21-ацетат
PO
3 мг/кг
(75)
Результаты показывают, что метаарсенит натрия в дозах 0,1, 1,0, и 10 мг/кг PO обеспечивает среднюю защиту против индуцированного ЛПС септического шока у мышей. Также наблюдали значительное ингибирование секреции IL-1β при 1 и 10 мг/кг PO метаарсенита натрия и ингибирование IL-6 (по сравнению с 3 мг/кг дексаметазона) при 10 мг/кг. Метаарсенит натрия не оказывал воздействия на секрецию TNF-α, KC или MCP-1.
Индуцированная ЛПС нейтрофилия в легочной ткани. Определяли возможную защитную активность метаарсенита натрия в модели на мышах индуцированной ЛПС нейтрофилии в легочной ткани. Метаарсенит натрия в дозах 0,1, 1 и 10 мг/кг вводили орально (PO) за два часа до введения пробы ЛПС. Через двадцать четыре часа после пробы ЛПС собирали бронхо-альвеолярную лаважную жидкость у отдельных животных для общего и дифференциального подсчета клеток.
Метаарсенит натрия при 10 мг/кг PO не вызывал какого-либо значительного изменения количества клеток. Однако при 1 мг/кг наблюдалось значительное уменьшение количества белых кровяных телец (общее) и нейтрофилов (дифференциальное) и моноцитов по сравнению с получавшим основу контролем, обработанным ЛПС.
Дексаметазон при 1 мг/кг PO обеспечивал значительную защиту в единицах уменьшения общего количества белых кровяных телец, а также дифференциального количества нейтрофилов и моноцитов по отношению к контролю.
При 10 мг/кг, но не при 1 или 0,1 мг/кг введение метаарсенита натрия коррелировало с значительным подавлением TNF-α аналогично стандарту дексаметазону. При 10 мг/кг, но не при 1 или 0,1 мг/кг введение метаарсенита натрия коррелировало с значительным уменьшением KC аналогично дексаметазону. Эффект на KC оказался не связанным с дозой. При нулевой концентрации метаарсенита натрия наблюдали секрецию IL-1β, IL-6 или MCP-1 в бронхо-альвеолярной лаважной жидкости.
ПРИМЕР 3. Исследования иммуносупрессии
Гиперплазию подколенных лимфатических узлов (PLN) использовали в качестве надежного индикатора реакции лимфатической системы в исследованиях реакции «хозяин против трансплантата». Успешно использовали модель гетеротропной трансплантации сердца на крысах, чтобы оценить иммуносупрессорные средства. Использовали комбинацию анализа гиперплазии PLN и модели трансплантации сердца, чтобы получить информацию, касающуюся эффективности лимфоцитов хозяина как в аллореактивной пролиферации, так и отторжении аллотрансплантата. Результаты показывают, что метаарсенит натрия обладает иммуносупрессорным воздействием.
Трансплантация сердца. Донорские сердца трансплантировали мыши-реципиенту, как описано (Chen et al., Transplantation, 56:661-666, 1993; Chen et al., The Journal of Immunology, 152:3107-3318, 1994). Трансплантированные донорские сердца каждый день контролировали и вводили метаарсенит натрия в течение двух недель или до тех пор, пока трансплантат не отторгался, смотря что происходило раньше.
В модели трансплантации сердца более высокая доза (10 мг/кг) метаарсенита натрия демонстрировала слабый иммуносупрессорный эффект в животных, получавших аллоантиген, и общий положительный эффект на трансплантат. Оказалось, что метаарсенит натрия при более высокой дозе может нарушать реакцию лимфоцитов хозяина на аллоантиген. Таким образом, соединения мышьяка настоящего изобретения также являются иммуносупрессорными средствами.
ПРИМЕР 4. Артрит, вызванный коллагеном II типа
Коллагеновый артрит крыс представляет собой экспериментальную модель полиартрита, которая широко используется для преклинических тестов различных противоартритических средств, которые изучаются или преклинически, или клинически или применяются в настоящее время в качестве лекарств при данном заболевании. Отличительными признаками данной модели являются надежные начало и развитие устойчивого легко измеряемого полиартикулярного воспаления, значительное разрушение хрящей с образованием паннуса и от слабой до средней костной резорбцией и пролиферация периостальной кости. Терапевтические средства, которые ингибируют продукцию или активность IL-1, особенно активны в данной тест-системе, но и другие типы противовоспалительных средств обладают активностью от хорошей до отличной.
Данное исследование проводили, чтобы определить дозозависимую оральную (PO) эффективность метаарсенита натрия и интраперитонеальную (IP) эффективность триоксида мышьяка соответственно, вводимых ежедневно для ингибирования воспаления (опухание лапы), разрушения хрящей и костной резорбции, которые имеют место при развитии артрита, вызванного коллагеном типа II у крыс.
Животных (8 на группу, 4 на интактную группу) анестезировали изофураном и им инъецировали 300 мкл неполного адъюванта Фрейнда (Difco, Detroit, MI), содержащего 2 мг/мл бычьего коллагена II типа (Elastin products, Owensville, Missouri), в основание хвоста и в два участка на спине на 0 и 6 день. Дозирование IP или оральным способом (каждый день с интервалами 24 часа) начинали на 0 день исследования и продолжали до 16 дня. Экспериментальные группы представляли собой следующее:
Метаарсенит натрия:
Группа
N
Введение: орально, ежедневно с 0 по 16 день, 5 мл/кг
1
4
Интактный контроль плюс вода
2
10
Артрит плюс вода
3
10
Артрит плюс метаарсенит натрия 10 мг/кг
4
10
Артрит плюс метаарсенит натрия 5 мг/кг
5
10
Артрит плюс метаарсенит натрия 0,1 мг/кг
6
10
Артрит плюс MTX 0,075 мг/кг
Триоксид мышьяка:
Группа
N
Дни ежедневного введения 0-16, 10 мл/кг IP группам 1-4
1
4
Интактный контроль плюс основа IP
2
8
Артрит плюс основа
3
8
Артрит плюс триоксид мышьяка 10 мг/кг IP
4
8
Артрит плюс триоксид мышьяка 1 мг/кг IP
5
8
Артрит плюс триоксид мышьяка 10 мг/кг PO (5 мл/кг)
Крыс взвешивали на 0, 3, 6, 9-17 дни исследования и каждый день проводили измерения голеностопов штангенциркулем начиная с 9 дня (или 0 дня артрита). После окончательного измерения веса тела на 17 день животных анестезировали для получения сыворотки и усыпляли для получения ткани. Задние лапы разрезали на уровне медиальной и латеральной лодыжки, взвешивали и помещали в формалин вместе с коленными суставами для микроскопии. Печень, селезенку и тимус удаляли у всех животных, взвешивали и выбрасывали.
Образцы для ФК получали на 16 день, используя 6 животных на группу (артритическую) следующим образом: у животных 1, 2, 3 отбирали кровь для образцов перед введением, через 2 и 8 часов; у животных 6, 7 и 8 отбирали кровь для образцов через 1, 4 и 12 часов после введения.
Исследовали морфологическую патологию крыс, получавших метаарсенит натрия, но ничего не проводили для животных, получавших триоксид мышьяка. Для данных исследований законсервированные и декальцифицированные голеностопные и коленные суставы разрезали пополам продольно (голеностопные) или во фронтальной плоскости (коленные суставы), пропускали через спирты повышающейся концентрации и просветляющее средство, пропитывали и заливали в парафин, разделяли на срезы и окрашивали толуидиновым синим. Все ткани исследовались микроскопически профессионально сертифицированным ветеринарным патологом.
Голеностопным и коленным суставам с коллагеновым артритом присваивали баллы от 0 до 5 (0 = нормальное состояние; 5 = тяжелое состояние) по воспалению, образованию паннуса и костной резорбции. Статистический анализ весов тел/лап, параметры AUC (площадь под кривой) для лап и гистопатологические параметры определяли с помощью критерия Стьюдента со значимостью, установленной на 5% уровень значимости.
Процентное ингибирование веса лап и AUC вычисляли с помощью следующей формулы:
% ингибирования = A-B/A×100
A = среднее значение у контрольных больных – среднее значение у интактных
B = среднее значение у получавших препарат – среднее значение у интактных
50
Результаты: Метаарсенит натрия: Потерю веса тела (из-за артрита) значительно ингибировало введение 10 мг/кг метаарсенита натрия (100% ингибирование) или MTX (96%) по сравнению с контрольными крысами, получавшими основу. Вычисленное значение ED= 1,929 мг/кг.
Значительное ингибирование диаметра голеностопа наблюдалось у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (9, 11-17 дни) или MTX (10-17 дни).
50
Ингибирование диаметра голеностопа (AUC) было значительным у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 73%) или MTX (97%), по сравнению с контрольными больными. Вычисленное значение ED= 8,499 мг/кг.
50
Ингибирование окончательного веса лапы было значительным у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (83%) или MTX (95%), по сравнению с контрольными больными. Вычисленное значение ED= 7,116 мг/кг.
Относительные веса печени становились больше, чем у интактных и больных артритом контрольных, у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (на 17% выше, чем у контрольных больных).
Относительные веса селезенки были уменьшены введением 10 мг/кг метаарсенита натрия (10%) или MTX (10%) по сравнению с контрольными больными крысами. Относительные веса тимуса были значительно уменьшены у крыс, получавших 1 мг/кг метаарсенита натрия (20%) по сравнению с контрольными больными.
50
У всех получавших основу контрольных больных крыс наблюдались синовит и периартикулярное воспаление от заметных до тяжелых в по меньшей мере одном, а обычно обоих голеностопных суставах, с паннусом и костной резорбцией от минимальных до средних, и повреждение хрящей от минимального до заметного. Напротив, все гистопатологические параметры голеностопов были значительно ингибированы до нормальных у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 85%) или MTX (97%). Вычисленное значение ED= 7,080 мг/кг.
50
У всех десяти получавших основу контрольных больных крыс наблюдались синовит и периартикулярное воспаление от средних до тяжелых в по меньшей мере одном коленном суставе, с паннусом и костной резорбцией от минимальных до средних, и повреждение хрящей. Напротив, гистопатологические параметры колена были значительно ингибированы по направлению к нормальным у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 87%) или MTX (100%). Вычисленное значение ED= 7,924 мг/кг.
Результаты, полученные в данном исследовании, демонстрируют, что оральное ежедневное получение крысами 10 мг/кг метаарсенита натрия эффективно ингибирует клинические и гистопатологические изменения, связанные с развитием артрита, вызванного коллагеном типа II.
Результаты: Триоксид мышьяка и метаарсенит натрия: Потерю веса тела значительно ингибирует ежедневное IP введение 10 мг/кг триоксида мышьяка (55% ингибирование) или ежедневное PO введение 10 мг/кг метаарсенита натрия (85%) по сравнению с получавшими основу контрольными больными крысами.
Значительное ингибирование уменьшения диаметра голеностопа наблюдалось у крыс, получавших 10 мг/кг триоксида мышьяка (10-17 дни) или 10 мг/кг метаарсенита натрия (11-17 дни). AUC для ингибирования диаметра голеностопа были значительными для крыс, получавших IP ежедневно 10 мг/кг триоксида мышьяка (80% ингибирование) и PO ежедневно 10 мг/кг метаарсенита натрия (66%), по сравнению с контрольными больными.
Ингибирование окончательного веса лапы было значительным у крыс, получавших IP ежедневно 10 мг/кг триоксида мышьяка (71% ингибирование) или PO ежедневно 10 мг/кг метаарсенита натрия (69%), по сравнению с контрольными больными.
Относительные веса печени становились больше, чем у контрольных больных артритом, у крыс, получавших 1 или 10 мг/кг триоксида мышьяка (6% и 10% соответственно) или 10 мг/кг метаарсенита натрия (14%).
Относительные веса селезенки становились меньше, чем у интактных и больных артритом контрольных, при введении 10 мг/кг триоксида мышьяка (21%) или 10 мг/кг метаарсенита натрия (10%), по сравнению с контрольными больными крысами. Относительные веса тимуса становились меньше, чем у больных артритом контрольных, у крыс, получавших 10 мг/кг триоксида мышьяка.
Результаты данного исследования демонстрируют, что интраперитонеальное ежедневное введение крысам 10 мг/кг триоксида мышьяка или оральное ежедневное введение 10 мг/кг метаарсенита натрия эффективно ингибирует клинические изменения, связанные с развитием артрита, вызванного коллагеном типа II.
ПРИМЕР 5. Артрит, вызыванный адъювантом
Данное исследование было предпринято, чтобы определить эффективность метаарсенита натрия (PO ежедневно на 0-13 дни) в ингибировании периартикулярного воспаления и костной резорбции верифицированного адъювантного артрита. Адъювантный артрит крыс представляет собой экспериментальную модель полиартрита, которая широко используется для преклинических тестов различных противоартритических средств. Отличительными признаками данной модели являются надежные начало и развитие устойчивого легко измеряемого полиартикулярного воспаления, значительная костная резорбция и пролиферация периостальной кости. Разрушение хрящей происходит, но является непропорционально слабым по сравнению с происходящим воспалением и разрушением костей. Применение адъювантной модели дает возможность исследовать патологические изменения в различных тканях, отличных от суставов.
Животные были случайным образом распределены по группам (8 на группу для адъюванта, 4 на группу для интактного контроля) и анестезированы изофураном и им инъецировали 100 мкл полного адъюванта Фрейнда (Sigma, st. Louis, MO), содержащего липоидный амин (60 мг/мл), в основание хвоста на 0 день. Дозирование PO способом начинали на 0 день (профилактическое введение) с основой (водой), метаарсенитом натрия (3, 10, или 30 мг/кг) или метотрексатом (MTX) (0,1 мг/кг). Процедуру продолжали вплоть до 13 дня. Экспериментальные группы представляли собой следующее:
Группа
N
Введение: PO, ежедневно с 0 по 13 день
1
4
Интактный контроль плюс вода
2
8
Адъювант плюс вода
3
8
Адъювант плюс метаарсенит натрия 30 мг/кг
4
8
Адъювант плюс метаарсенит натрия 10 мг/кг
5
8
Адъювант плюс метаарсенит натрия 3 мг/кг
6
8
Адъювант плюс MTX 0,1 мг/кг
Крыс взвешивали на 0, 4 и 8-13 дни, в это время уточняли объемы дозы. На 7 день (перед началом опухания, но после установления системного заболевания), проводили измерения голеностопных суставов штангенциркулем. Голеностопы снова измеряли на 8-14 день. Окончательные веса тела получали на 14 день. На 14 день животных усыпляли и удаляли и взвешивали задние лапы, печень и селезенку. Лапы и селезенку помещали в формалин и подвергали окрашиванию гематоксилином-эозином и микроскопии.
Голеностопам с адъювантным артритом (только правым) присваивали баллы от 0 до 5 (0=нормальное состояние; 5=тяжелое состояние) по воспалению и костной резорбции. Статистический анализ диаметра голеностопного сустава проводили посредством определения площади под дозовой кривой (AUC). Для вычисления AUC ежедневные измерения голеностопных суставов (с помощью штангенциркуля) для каждой крысы вводили в Microsoft Excel, в котором рассчитали площадь между днями исследования от начала заболевания до дня окончания. Определили средние значения для каждой группы и рассчитали % ингибирования для контроля с артритом посредством сравнения значений для получавших препарат и интактных животных. Веса лап, веса селезенки и печени и гистологические параметры (среднее ± СО) для каждой группы анализировали на различия с помощью критерия Стьюдента или другого подходящего метода анализа, что определяли после рассмотрения данных. В обоих случаях значимость составляла p≤ 0,05.
Процентное ингибирование веса лап и AUC вычисляли с помощью следующей формулы:
% ингибирования = A-B/A×100
A=среднее значение у контрольных больных – среднее значение у интактных
B=среднее значение у получавших препарат – среднее значение у интактных
50
50
Вычисления ED осуществляли посредством построения графика % ингибирования по отношению к натуральному логарифму концентрации дозы и получения сигмоидальной кривой дозовой зависмости (переменного наклона). Дозу нулевой концентрации (группа, получавшая основу) включали в график, присваивая ей значение дозы на 2 логарифмические единицы меньше, чем наименьшей из введенных доз. Границы кривой были установлены на 0 и 100%. Чтобы получить уравнение кривой, использовали программное обеспечение, и вычислили концентрацию, при которой животные продемонстрируют 50% ингибирование параметра (ED).
Результаты. Среднее уменьшение веса тела со временем (из-за артрита) было ингибировано у крыс, получавших PO 0,1 мг/кг MTX (показательны 10-14 дни), по сравнению с получавшими основу контрольными крысами. Средняя потеря веса тела со временем значительно увеличивалась у крыс, получавших 30 мг/кг метаарсенита натрия (4, 8, 9 дни), по сравнению с получавшими основу контрольными.
Ингибирование потери веса тела с нулевого дня было значительным у крыс, получавших 0,1 мг/кг MTX (91% ингибирование). Потеря веса тела с 0 дня была (2-14%) ингибирована введением метаарсенита натрия (3, 10 и 30 мг/кг) незначительно по сравнению с получавшими основу контрольными.
Значительное ингибирование увеличения диаметра голеностопа наблюдалось у крыс, получавших PO 3 мг/кг метаарсенита натрия (показателен 9 день), 10 мг/кг метаарсенита натрия (показательны 8-14 дни), 30 мг/кг метаарсенита натрия (показательны 8-14 дни) и 0,1 мг/кг MTX (показательны 8-14 дни), по сравнению с получавшими основу контрольными.
50
Значительное и дозозависимое ингибирование увеличения AUC диаметра голеностопа наблюдалось у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 46%), 30 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 83%) и 0,1 мг/кг MTX (ингибирование 96%), по сравнению с получавшими основу контрольными. Вычисленное ED для метаарсенита натрия = 10,62 мг/кг.
50
Увеличение окончательного веса лапы из-за артрита было значительно и дозозависимо ингибировано у животных, получавших PO 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 28%), 30 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 83%) и 0,1 мг/кг MTX (ингибирование 99%), по сравнению с получавшими основу контрольными. Вычисленное ED для метаарсенита натрия = 14,21 мг/кг.
Относительные веса селезенки (увеличенные из-за воспаления и усиленного экстрамедуллярного гемопоэза) были значительно и дозозависимо уменьшены в сторону нормальных у крыс, получавших PO 10 мг/кг метаарсенита натрия (уменьшение 50%), 30 мг/кг метаарсенита натрия (уменьшение 91%) и 0,01 MT (уменьшение 77%), по сравнению с получавшими основу контрольными.
Относительные веса печени были значительно уменьшены в сторону нормальных у крыс, получавших MTX (уменьшение 100%). Относительные веса печени были незначительно уменьшены (7-29%) введением метаарсенита натрия (3, 10 и 30 мг/кг).
50
Гистопатологическая костная резорбция была значительно и дозозависимо ингибирована у крыс, получавших PO 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 59%), 30 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 81%) и 0,1 мг/кг MTX (ингибирование 100%), по сравнению с получавшими основу контрольными. Вычисленное ED для метаарсенита натрия = 9,243 мг/кг.
50
Значительное и дозозависимое ингибирование гистопатологического воспаления по сравнению с получавшими основу контрольными наблюдалось у крыс, получавших PO 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 24%), 30 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 76%) и 0,1 мг/кг MTX (ингибирование 99%). Вычисленное ED для метаарсенита натрия = 17,25 мг/кг.
50
Размеры голеностопа (с дорсальной стороны до вентральной) были значительно и дозозависимо ингибированы введением 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 36%), 30 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 81%) и 0,1 мг/кг MTX (ингибирование 97%), по сравнению с получавшими основу контрольными. Вычисленное ED для метаарсенита натрия = 13,65 мг/кг.
Воспаление селезенки и атрофия лимфоидной ткани были значительно и дозозависимо ингибированы у крыс, получавших 10 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 32% и 29% соответственно), 30 мг/кг метаарсенита натрия (ингибирование 89% и 39% соответственно) и 0,1 мг/кг MTX (ингибирование 100% и 50% соответственно), по сравнению с получавшими основу контрольными.
Результаты данного исследования демонстрируют, что оральное (PO) введение 10 мг/кг (ежедневно), или 30 мг/кг (через день) метаарсенита натрия эффективно и дозозависимо ингибирует клинические и гистопатологические изменения, связанные с развитием адъювантного артрита. Дневная доза 30 мг/кг метаарсенита натрия оказалась токсичной (исходя из изменений веса тела), но все остальные данные дозировки во время активной фазы заболевания были хорошо переносимы, и тогда веса тела соответствовали больным контрольным от 10 дня до окончания исследования.
ПРИМЕР 6. Лечение вызванного опухолью остеолиза метаарсенитом натрия
В данном исследовании потенциальное средство для лечения вызванного опухолью остеолиза костей, метаарсенит натрия, исследовали с помощью сингенной модели рака костей на крысах. Коротко говоря, клеточную линию карциномы молочной железы крысы MRMT-1 инъецировали в костномозговую полость проксимального отдела большеберцовой кости на 1 день и животным дозами вводили метаарсенит натрия орально с помощью желудочного зонда с основой один раз в день с 1 по 14 день. Морфин использовали в качестве контроля и вводили дозами непосредственно перед поведенческим тестированием. В конце эксперимента левые большеберцовые кости вырезали для радиографического подтверждения опухолевого остеолиза. Чтобы выбрать по две типичные кости из каждой группы для микро-КТ сканирования, использовали рентгенограммы. Все костные образцы декальцифицировали для окрашивания TRAP и определения активности остеокластов (резорбированных поверхностей) и для гистопатологической оценки структуры кости и опухолевой нагрузки. Эффективность метаарсенита натрия была основана на сравнении с зараженной опухолью получавшей основу группой.
Гистопатологические результаты показали, что при уровне дозы 10 мг/кг метаарсенит натрия демонстрируют положительную тенденцию в улучшении различных аспектов индуцированного раком костного повреждения. Данные показывают, что при 10 мг/кг метаарсенит натрия имеет сильную положительную тенденцию к улучшению индуцированных опухолью остеокластов и остеолиза. Данные показаны на фигуре 1.
ПРИМЕР 7. Фармакокинетический профиль метаарсенита натрия после орального и IV введения
Определили фармакокинетические профили в плазме и мозге после орального (PO) и внутривенного (IV) введения метаарсенита натрия самцам CD-1 мыши. Семьдесят три самца CD-1 (ICR) мыши-альбиноса (возраст приблизительно четыре недели, 18-27 г в начале тестирования) были случайным образом распределены по группам условий. Животные голодали в течение двух часов до введения тестируемого препарата. Животным вводили 10 мг/кг (PO) или 5 мг/кг (IV) с объемом целевой дозы 10 мл/кг. После введения получали образцы крови (от 0,2 до 0,3 мл) через полую вену под анестезией изофураном на 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 14490, 1920, 2880, 3360, и 4320 минуты после введения дозы. Непосредственно после каждого сбора крови животных забивали и собирали мозг на 5, 30, 60, 120, 240, 480, 1440, 2880 и 4320 минуты после введения дозы.
Образцы плазмы и цельного мозга расщепляли концентрированной азотной кислотой в тефлоновом автоклаве при 105°C. Дигестат разбавляли до 40 мл для анализа с помощью ICP-MS. Дигестат засасывали в индуктивно-связанную плазму, и полученные ионы направляли с помощью вакуумного интерфейса в квадрупольный масс-спектрометр. Количество мышьяка в образцах измеряли при сравнении с сигналом в растворе стандарта массы 75. В качестве стандартных образцов анализировали NRCC-DOLT-3 и DORM-2.
Концентрации исследуемого образца были проанализированы по отношению к данным с помощью анализа без компартментализации (WinNonlin, version 2.1), что дало следующие ФК параметры:
Параметр
Единицы
Примечания
T<sub>max</sub>
Часы
Время достижения максимальной концентрации
C<sub>max</sub>
Нг/мл
Наивысшая концентрация во временном интервале
AUC<sub>all</sub>
нг∙ч/мл
Площадь под кривой, полученная линейно-логарифмическим методом трапеций для интерполяции
F%
%
Биодоступность при оральной дозировке животным
Результаты приведены в таблицах ниже:
ФК результаты в плазме: метаарсенит натрия (PO, 10 мг/кг)
Фармакокинетический (ФК) параметр
Единицы
ФК результаты (N=3)
AUC<sub>all</sub>
мг∙ч/кг
6,85
C<sub>max</sub>
мг/кг
0,52
T<sub>max</sub>
часы
4
F%
%
101%
Фармакокинетический анализ выполнен с использованием среднего (N=3) значения концентрации для каждого момента сбора материала.
ФК результаты в плазме: метаарсенит натрия (IV, 5 мг/кг)
Фармакокинетический (ФК) параметр
Единицы
ФК результаты (N=3)
AUC<sub>all</sub>
мг∙ч/кг
3,38
C<sub>max</sub>
мг/кг
0,41
T<sub>max</sub>
часы
0,25
F%
%
N/A
Фармакокинетический анализ выполнен с использованием среднего (N=3) значения концентрации для каждого момента сбора материала.
N/A: не применимо
ФК результаты в мозге: метаарсенит натрия (PO, 10 мг/кг)
Фармакокинетический (ФК) параметр
Единицы
ФК результаты (N=3)
AUC<sub>all</sub>
мг∙ч/кг
6,73
C<sub>max</sub>
мг/кг
0,33
T<sub>max</sub>
часы
8
F%
%
87%
Фармакокинетический анализ выполнен с использованием среднего (N=3) значения концентрации для каждого момента сбора материала.
ФК результаты в мозге: метаарсенит натрия (IV, 5 мг/кг)
Фармакокинетический (ФК) параметр
Единицы
ФК результаты (N=3)
AUC<sub>all</sub>
мг∙ч/кг
3,86
C<sub>max</sub>
мг/кг
0,32
T<sub>max</sub>
часы
4
F%
%
N/A
Фармакокинетический анализ выполнен с использованием среднего (N=3) значения концентрации для каждого момента сбора материала.
N/A: не применимо
ПРИМЕР 8. Воздействие метаарсенита натрия на боль у пациентов с нерезектабельной или неоперабельной холангиокарциномой (фаза 1/2)
Воздействие метаарсенита натрия на боль у пациентов с холангиокарциномой проанализировали в клиническом исследовании фазы I/II, кратко описанном ниже:
Название исследования
Открытое исследование фазы I/II для определения безопасности и эффективности монотерапии оральным метаарсенитом натрия (KML001) у пациентов с нерезектабельной запущенной или метастатической холангиокарциномой
Фаза
Фаза 1/2
Показание
нерезектабельная запущенная или метастатическая холангиокарцинома
План исследования
Фаза 1: увеличение дозы 3+3Фаза 2: открытое, с использованием многократных доз, с группами пациентов
Первичная цель
[Часть, относящаяся к фазе 1]Определить эффективность и безопасностьОпределение максимальной переносимой дозы (MTD) и ограничивающих дозу токсичностей (DLT) KML001[Часть, относящаяся к фазе 2]Частота контроля заболевания (DCR %)
Вторичная цель
[Часть, относящаяся к фазе 1]Определить рекомендуемую дозу KOMINOX (KML001) для исследования фазы II[Часть, относящаяся к фазе 2]Частота объективных ответов (ORR)Общая выживаемость (OS)Выживаемость без прогрессирования (PFS)Время до прогрессирования (TTP)Изменение в опухолевом маркере (CA19-9) относительно исходных значений к концу леченияСнятие боли: VAS, количество доз средства для снятия раковой боли в день, PMIОпределение качества жизни (QOL): FACT-HepПараметры безопасности, включающие нежелательные явления (AE) и лабораторные данные.
Количество пациентов
[Часть, относящаяся к фазе 1]Приблизительно 9-18 субъектов, 3-6 субъектов в каждой группе[Часть, относящаяся к фазе 2]По меньшей мере 34 субъекта, всего 43 субъекта (предполагаемый процент отсева 20%)
Критерии включения
1) Возраст 20-75 лет2) Нерезектабельная запущенная или метастатическая холангиокарцинома, подтвержденная гистологически или цитологически (включая смешанную гепатоклеточную холангиокарциному [смешанная HCC-CCC])3) Общее состояние по ECOG ≤ 24) Ожидаемая продолжительность жизни по меньшей мере 3 месяца5) По меньшей мере одно поддающееся одномерному измерению образование (RECIST версии 1.1)6) Необходимы достаточные гематологические, печеночные и почечные функции:ANC ≥ 1500/мм<sup>3</sup>, гемоглобин ≥ 9,0 г/дл (допускается коррекция посредством переливаний крови), тромбоциты ≥ 100000/мм<sup>3</sup>Нормальный диапазон сывороточного креатинина или CCr ≥ 60 мл/мин (по уравнению Кокрофта-Голта)Нормальные сывороточные электролиты (включая кальций, магний, фосфор, калий)кальций: 8,3~10,5 мг/дл, магний: 1,58~3,0 мг/дл, фосфор: 2,4~4,5 мг/дл, калий: 3,3~5,5 ммоль/лСывороточный билирубин < двух верхних границ нормы (ULN), AST/ALT <2,5 x ULN, ALP < 5 x ULN(в случае гепатических метастазов: AST/ALT < 5 x ULN)PT или PTT ≤ 1,5 x ULN7) Отсутствие истории предыдущей химиотерапии или биологической терапии (допускается местное лечение, такое как эмболизация)8) Скорректированный интервал QT < 0,48 сек9)Подписано информированное согласие
Критерии исключения
1) Симптоматические метастазы головного мозга(но радиологически и неврологически стабильные пациенты допускаются)2) История значительного гастроинтестинального хирургического вмешательства или патологии, вероятно оказывающей влияние на абсорбцию исследуемого препарата3) Пациенты, ранее подвергавшиеся лечению с помощью препаратов мышьяка4) Активная инфекция, требующая лечения с помощью парентеральных антибиотиков в пределах 7 дней (исключение: местные антибиотики)5) Любой одновременный рак другого типа (исключение: пациенты с базальноклеточной карциномой, или in situ раком шейки матки, или папиллярным раком щитовидной железы в пределах 5 лет до участия)6) Периферическая невропатия ≥ 2 степени7) Известная история повышенного риска двунаправленной тахикардии (TdP), такого как гипокалемия, семейная история синдрома удлиненного интервала QT8) Инфаркт миокарда за 6 месяцев до участия в данном клиническом исследовании, класс 3 или 4 застойной сердечной недостаточности по критериям Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA), неконтролируемая гипертензия (диастолическое КД > 100, или неконтролируемая гипертензия и нестабильная ангина с систолическим > 180, или кардиомиопатия и аритмия фракции выброса)9) Беременные или кормящие женщины10) Пациенты, не согласные на контрацепцию11) Пациенты с неконтролируемыми хроническими заболеваниями (например, хроническим гепатитом, хроническим заболеванием почек, неконтролируемым диабетом)12) Пациенты, участвующие в другом клиническом исследовании13) Известная повышенная чувствительность к любому из активных или неактивных компонентов конечного продукта14) ВИЧ-положительные пациенты15) Пациенты, принимающие препараты, о которых сообщалось, что они вызывают удлинение QT и/или двунаправленную тахикардию (например, индапамид, добутамин, амиодарон, ибутилид и т.д.)
Составление
Таблетки KML001, содержащие 2,5 мг метаарсенита натрияПроизводитель: Stason Pharmaceuticals, Inc. Калифорния, США
Дозировка исследуемого лекарственного средства
[Фаза 1]: Исследование с увеличением дозы 3+3-1 уровень: 5 мг/день (2,5 мг перед завтраком + 2,5 мг перед ужином)1 уровень: 7,5 мг/день (2,5 мг перед завтраком + 2,5 мг перед обедом + 2,5 мг перед ужином)2 уровень: 10 мг/день (5,0 мг перед завтраком + 5,0 мг перед ужином)3 уровень: 12,5 мг/день (5,0 мг перед завтраком + 2,5 мг перед обедом + 5,0 мг перед ужином)[Фаза 2]Дозировка определена в исследовании фазы 1
Способ введения
Орально, перед приемом пищи
Продолжительность лечения с помощью исследуемого лекарственного средства
6 циклов (1 цикл: 28 дней)
Результаты исследования в отношении боли приведены в таблице ниже. Как можно видеть, измерение боли посредством визуальной аналоговой шкалы (VAS) демонстрирует, что величина боли, испытываемой каждым из пяти подвергнутых лечению пациентов, значительно уменьшилась при лечении с помощью метаарсенита натрия.
№ субъекта
Е113
День
Скрининг (1/20)
C1D1 (1/26)
CD1D15 (2/9)
C2D1
C2D15
C3D1
C3D15
C4D1
C4D15
C5D1
C5D15
C6D1
VAS
16 (1 степень)
19 (1 степень)
0 (0 степень)
Сопутствующие препараты – болеутоляющее средство
1/21 ультрацет (1) 2Т/день
1/21-2/5 ультрацет (1) 2Т/день
№ субъекта
Е116
День
Скрининг (3/28)
C1D1 (3/29)
CD1D15 (4/13)
C2D1 (4/27)
C2D15 (5/11)
C3D1 (5/23)
C3D15
C4D1
C4D15
C5D1
C5D15
C6D1
VAS
10 (1 степень)
10 (1 степень)
8 (1 степень)
0 (0 степень)
4 (0 степень)
2 (0 степень)
Сопутствующие препараты – болеутоляющее средство
3/25-26 петидин (3)25 мг/день
0
0
0
0
0
№ субъекта
ЕU001
День
C1D1
C1D7
C2D14
C2D1
C2D15
C3D1
C3D15
C4D1
C4D15
C5D1
VAS
50 (2 степень)
50 (2 степень)
60 (2 степень)
50 (2 степень)
20 (1 степень)
-
-
30 (1 степень)
20 (1 степень)
Сопутствующие препараты – болеутоляющее средство
Журниста (3) 2 мг 3Т/день
Журниста (3) 2 мг 3Т/день
Журниста (3) 2 мг 3Т/день
Журниста (3) 2 мг 5Т/день
Журниста (3) 2 мг 3Т/день
Журниста 1R (3) 2 мг 3Т/деньУльтрацел ER1T (1)2T/день
Журниста 1R (3) 2 мг 3Т/день
Журниста (3) 2 мг 3Т/день
0
№ субъекта
ЕU005
День
C1D1
C1D7
C1D14
C2D1
C2D15
VAS
0
20 (1 степень)
30 (1 степень)
20 (1 степень)
0
Сопутствующие препараты – болеутоляющее средство
mypol (1) 2Т/день
mypol (1) 2Т/день
mypol (1) 3Т/день
mypol (1) 3Т/день
0
№ субъекта
ЕU020
День
C1D1
C1D14
C2D1
VAS
-
30 (1 степень)
30 (1 степень)
Сопутствующие препараты – болеутоляющее средство
Таргин CR (3) 10/5 [1Т/T]
Таргин CR (3) 10/5 [1Т/T]IR кодон (3) 5 мг
0
1. 1 цикл = 28 дней
2. Болеутоляющие средства
3
2
1
0
сильные опиоиды
мягкие опиоиды
неопиоиды
без болеутоляющего средства
морфин
кодеин
Наксен-F
Дюрогезик D-trans
Налоксон
IR кодон
mypol
Таргин
трамадол
оксикодон
ультрацет
3. Степени боли по VAS
0 степень
< 10
1 степень
10-30
2 степень
40-70
3 степень
80-100
ПРИМЕР 9. Противовоспалительное и болеутоляющее действие метаарсенита натрия: исследования in vitro
Введение. Исследовали болеутоляющую активность метаарсенита натрия в модели корчей, вызванных уксусной кислотой, на мышах, и было показано, что он обладает болеутоляющим действием 56% в количестве 10 мг/кг перорально. В качестве второй модели воспалительной боли выбрали модель вызванного формалином лизания лап. В данной модели было показано, что метаарсенит натрия (10 мг/кг) и препараты морфина обладают болеутоляющим действием 92% и 98% соответственно после введения формалина.
2
2
2
2
Оксид азота (NO) стимулирует ферментативную активность циклооксигеназы (СОХ), а активированная СОХ в свою очередь увеличивает продукцию простагландина Е (PGE). Повышенные уровни СОХ-2 и PGE связаны с воспалением и канцерогенными процессами. PGEусиливает ангиогенез и развитие опухоли, а блокада активности СОХ-2 ингибирует ангиогенез и развитие опухоли. С другой стороны, простагландины также вовлечены в развитие боли.
2
κ
Данное исследование показало, что метаарсенит натрия подавляет продукцию NO и PGE, который вовлечен в развитие боли, посредством уменьшения экспрессии iNOS и СОХ-2. Результаты исследования, опубликованные в настоящем описании, также показывают, что метаарсенит натрия регулирует пути передачи сигнала NF-B и регулирует воспаление посредством сигнального пути Akt в активированных макрофагах.
Цели. Целью данного исследования являлось определение противовоспалительного и болеутоляющего действия метаарсенита натрия в стимулированных липополисахаридами клетках Raw 264.7. В данном исследовании мы изучили, может ли метаарсенит натрия подавлять вызванные липополисахаридами (LPS) воспалительные реакции в клетках мышиных макрофагов Raw 264.7.
κ
Макрофаги, активированные липополисахаридами, производят множество молекул и белков, таких как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6), IL-1β, индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS), циклооксигеназа-2 (СОХ-2), и свободных радикалов, которые связаны с воспалением. Данная реакция вызывается посредством внутриклеточных каскадов, например пути NF-B. Поэтому регуляция данного пути очень важна при контроле воспаления.
Воздействие метаарсенита натрия на продукцию оксида азота (NO). Оксид азота (NO) является хорошо известным провоспалительным медиатором в патогенезе воспаления. Большая часть NO синтезируется индуцибельной синтазой оксида азота (iNOS). iNOS представляет собой фермент, который принимает участие в воспалительной реакции и образовании рака. Описано, что NO, производимый iNOS, влияет на активность и экспрессию СОХ-2. Для того чтобы изучить, обладает ли метаарсенит натрия ингибирующей NO активностью, определили продукцию NO в присутствии метаарсенита натрия в количестве 0,625~10 мкМ в индуцированных LPS клетках RAW 264.7 макрофагов мыши (Американская коллекция типовых культур, АТСС, Manassas, VA, США). Цитотоксичность определяли с применением анализа с сульфородамином-В или 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ).
50
Продукция NO значительно и зависимым от концентрации образом ослабляется метаарсенитом натрия (в концентрациях, равных 10, 5, 2,5, 1,25 и 0,625 мкМ) на 100,2, 77,2, 42,2, 21,5 и 12,5% соответственно. Значение IC для ингибирования продукции NO составило приблизительно 2,87 мкМ (Фиг. 2). Фиг. 2 демонстрирует морфологические изменения в клетках RAW 264.7 при обработке метаарсенитом натрия.
2
2
2
2
Воздействие метаарсенита натрия на продукцию PGE. iNOS сильно экспрессируется в макрофагах и приводит к разрушению органов при некоторых воспалительных и аутоиммунных заболеваниях. СОХ-2, также провоспалительный фермент, производит простагландин Е (PGE) посредством превращения арахидоновой кислоты в простагландины. PGEявляется важным медиатором при воспалительных реакциях. В обычных условиях продукты iNOS и СОХ-2, включая NO и простагландины, участвуют в модуляции клеточных функций и гомеостазе.
2
2
2
2
2
Для того чтобы изучить, регулирует ли метаарсенит натрия продукцию PGEс помощью СОХ-2, продукцию PGEизмерили в стимулированных LPS (1 мг/мл) клетках RAW 264.7 после обработки метаарсенитом натрия в течение 30 минут (2,5, 5, 7,5 или 10 мкМ). После 20 часов инкубирования клеточную среду проанализировали посредством PGEфермент-связанного иммуносорбентного исследования (PGE-ELISA). В данных исследованиях активность определяли как разницу между аккумулированием PGEв отсутствии и в присутствии метаарсенита натрия.
2
2
2
Метаарсенит натрия ингибировал продукцию PGE дозозависимым образом. При максимальной дозе (10 мкМ) метаарсенита натрия продукция PGE была ингибирована на 20% (Фиг. 3). Данные результаты демонстрируют, что метаарсенит натрия является эффективным ингибитором продукции NO, но ингибирующее действие метаарсенита натрия на продукцию PGEс помощью СОХ-2 ограничено.
Воздействие метаарсенита натрия на экспрессию белка.
(1) Воздействие метаарсенита натрия на экспрессию белков iNOS и СОХ-2.
Для того чтобы определить ингибирующее действие метаарсенита натрия на вызванное iNOS продукцию СОХ-2, проанализировали уровни белков iNOS и СОХ-2 посредством анализа с помощью вестерн-блоттинга. Клетки Raw 264.7 предварительно обработали 2,5, 5, 7,5 или 10 мкМ метаарсенита натрия в течение 30 минут и стимулировали 1 мг/мл LPS в течение 16 часов. Клетки лизировали и определили концентрацию белка с применением БСА анализа. Как показано на фигуре 4, метаарсенит натрия значительно ингибирует экспрессию iNOS зависимым от концентрации образом. Тем не менее, метаарсенит натрия только слабо ингибирует экспрессию СОХ-2.
2) Воздействие метаарсенита натрия на экспрессию белков TNF-α и IL-1β
2
Воспалительный цитокин фактор некроза опухоли-α (TNF-α) считается важнейшим медиатором при воспалительной реакции. В ответ на LPS он также опосредует воспалительную реакцию посредством секреции различных провоспалительных медиаторов, включая IL-1β и PGE. IL-1β представляет собой провоспалительный цитокин, о котором известно, что он обладает широким спектром функций. Воздействие метаарсенита натрия на уровни белков TNF-α и IL-1β проанализировали посредством вестерн-блоттинга, как описано выше.
Клетки Raw 264.7 предварительно обработали 2,5, 5, 7,5 или 10 мкМ метаарсенита натрия в течение 30 минут и стимулировали 1 мг/мл LPS в течение 8 часов. Экспрессия TNF-α и IL-1β оказалась значительно ингибирована метаарсенитом натрия зависящим от концентрации образом (Фиг. 5).
Воздействие метаарсенита натрия на экспрессию генов.
1) Воздействие метаарсенита натрия на экспрессию мРНК iNOS и СОХ-2
Воздействие метаарсенита натрия на экспрессию мРНК iNOS и СОХ-2 исследовали посредством ОТ-ПЦР. Клетки Raw 264.7 предварительно обработали 2,5, 5, 7,5 или 10 мкМ метаарсенита натрия в течение 30 минут и стимулировали 1 мкг/мл LPS в течение 8 часов. Клетки лизировали и выделили общую РНК. 1 мкг общей РНК подвергли ОТ-ПЦР.
Метаарсенит натрия значительно ингибировал экспрессию iNOS зависящим от концентрации образом. При этом метаарсенит натрия не влиял на экспрессию СОХ-2. Данные результаты подтверждают, что метаарсенит натрия обладает ингибирующим действием на iNOS, а не на СОХ-2, подтверждая, что метаарсенит натрия сильно ингибирует воспалительную реакцию посредством регуляции экспрессии iNOS (Фиг. 6). Экспрессию генов iNOS и СОХ-2 проанализировали посредством анализа с помощью вестерн-блоттинга. Уровень мРНК iNOS измерили с помощью ПЦР в реальном времени, и он оказался значительно ингибирован метаарсенитом натрия зависящим от концентрации образом (Фиг. 7).
2) Воздействие метаарсенита натрия на экспрессию мРНК TNF-α и IL-1β
2
Воспалительный цитокин фактор некроза опухоли-α (TNF-α) считается важнейшим медиатором при воспалительной реакции. В ответ на LPS он также опосредует воспалительную реакцию посредством секреции различных провоспалительных медиаторов, включая TNF-альфа, IL-1β и PGE. Среди провоспалительных цитокинов IL-1β или IFN-β обладает одним из наивысших потенциалов вызывать повреждение тканей хозяина, и, фактически, различные механизмы направлены на ограничение его внутриклеточной активности посредством тщательного ограничения его транскрипции и процессинга воспалительной реакцией.
Воздействие метаарсенита натрия на уровни мРНК TNF-α, IL-1β и IFN-β проанализировали посредством ОТ-ПЦР анализа. Клетки Raw 264.7 предварительно обработали 2,5, 5, 7,5 или 10 мкМ метаарсенита натрия в течение 30 минут и стимулировали 1 мкг/мл LPS в течение 5 часов. Затем клетки лизировали, выделили общую РНК и 1 мкг общей РНК использовали для ОТ-ПЦР.
Метаарсенит натрия значительно понижал уровень мРНК TNF-α зависящим от концентрации образом, но метаарсенит натрия не оказывал воздействия на экспрессию мРНК IL-1β и IFN-β в макрофагах Raw 264.7 (Фиг. 8).
Воздействие метаарсенита натрия на транскрипционную активность ядерного фактора каппа В (NF-κB)
Было показано, что транскрипционный фактор NF-κB играет значительную роль в индуцированной LPS экпрессии провоспалительных медиаторов, включая iNOS. Область промотора гена, кодирующего iNOS, содержит связывающие NF-κB мотивы, и было показано, что связывание NF-κB с сайтами связывания NF-κB, расположенными против хода транскрипции относительно промотора iNOS, играет важную роль в индуцируемой LPS положительной регуляции гена iNOS. Для того чтобы изучить молекулярный механизм ингибирования транскрипции NF-κB, опосредованного метаарсенитом натрия, изучили транскрипционную активность NF-κB с применением системы для анализа по гену-репортеру. Клетки RAW 264.7 стабильно трансфицировали плазмидой pNF-κB-секретируемая щелочная фосфатаза (SEAP)-NTP, содержащей четыре копии последовательности κB, слитой с SEAP в качестве репортера. Плазмиду pNF-κB-SEAP-NPT, которая содержит ген неомицинфосфотрансферазы (NPT) для генетической резистентности в клетках-хозяевах, создали и трансфицировали в макрофаги RAW 264.7. Аликвоты культуральной жидкости нагрели при 65°С в течение пяти минут и затем ввели в реакцию с 4-метилумбеллиферилфосфатом (MUP). Активность SEAP измерили в относительных единицах флуоресценции (RFU).
Результаты демонстрируют, что обработка трансфицированных клеток LPS в течение 18 часов повышает экспрессию SEAP приблизительно в три раза относительно исходного уровня при сравнении с контрольными клетками, которые не были обработаны LPS. Обработка клеток метаарсенитом натрия значительно ингибировала индуцированную LPS экспрессию SEAP зависящим от концентрации образом (Фиг. 9).
Воздействие метаарсенита натрия на пути передачи сигнала в клетке.
1) Воздействие метаарсенита натрия на сигнальную систему NF-κB
NF-κB действует как связь между воспалением и развитием рака, что делает NF-κB существенным и потенциальной мишенью для препаратов при гематологических злокачественных опухолях и солидных опухолях. NF-κB секретируется в цитоплазму в виде неактивного комплекса, связанного с ингибиторными белками κB (IκB). Он принадлежит к семейству белков Rel, которое включает в себя c-Rel, RelA (p65), RelB, NF-κB1 (p50 и его предшественник p105) и NF-κB2 (p52 и его предшественник p100), все из которых могут образовывать гетеро- и гомодимеры. Воздействие LPS активирует клеточный комплекс киназы IκB (IKK). Комплекс IKK состоит из каталитических субъединиц IKKα и IKKβ и регуляторной субъединицы IKKγ. Почти все воспалительные стимулы требуют, чтобы IKKβ фосфорилировала белки IκB. После отсоединения от белков IκB NF-κB перемещается в ядро и связывается с мотивами κB, для того чтобы регулировать экспрессию иммунных и воспалительных генов, включая индуцибельную iNOS, COX-2, TNF-α и IL-1β и IL-6.
Для того чтобы проверить, регулирует ли метаарсенит натрия пути передачи сигнала NF-κB, макрофаги RAW 264.7 обработали LPS (1 мкг/мл) в течение 15 минут в ходе предварительной обработки перед воздействием метаарсенита натрия (2,5, 5, 7,5 или 10 мкМ) в течение 30 минут. Затем клетки лизировали и проанализировали уровни р65, р50, IκB и IKK посредством анализа с помощью вестерн-блоттинга.
Метаарсенит натрия заметно снижал уровень белка NF-κB зависящим от концентрации образом (Фиг. 10) и также заметно ингибировал деградацию IκB зависящим от концентрации образом (Фиг. 11).
2) Воздействие метаарсенита натрия на сигнальную систему Akt и ERK
2
Недавние исследования продемонстрировали взаимосвязь между путями выживания Akt и МАРК и структурно схожими активируемыми стрессом членами семейства МАРК, которое включает в себя внеклеточные сигнал-регулируемые киназы (ERK), активируемую стрессом протеинкиназу (SAPK)/с-JUN-NH-терминальную протеинкиназу (JNK), и путями р38 с точки зрения баланса между клеточной смертью и пролиферацией. МАРК активируются в ответ на предшествующие рецепторы-тирозинкиназы и/или рецепторы цитокинов, которые связываются с гетеротримерными G-белками таким образом, что переключают последующие пути. Было обнаружено, что группа МАРК принимает участие в воспалении, клеточном росте, дифференцировке клеток, прохождении клеточного цикла и смерти клеток.
Воздействие LPS на моноциты/макрофаги приводит к фосфорилированию различных внутриклеточных киназ, включая киназу IκBβ (IKK)7 и митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК) ERK1/2, p38 и JNK1/2. Активация данных внутриклеточных сигнальных путей приводит к активации множества факторов транскрипции, включая NF-κB, и индуцированию генов, кодирующих провоспалительные цитокины, такие как TNF-α и IL-6.
В целом, NF-κB активируется в ответ на LPS, который индуцирует активацию NF-κB посредством возрастания ядерного белка p65, связанного со снижением цитозольного белка I-κB. Несколько исследований продемонстрировали, что LPS также активирует NF-κB посредством пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)-протеинкиназы В (Akt). Для того чтобы проверить воздействие метаарсенита натрия на сигнальную систему Akt и ERK, макрофаги RAW 264.7 обработали LPS (1 мкг/мл) в течение 15 минут в ходе предварительной обработки перед воздействием метаарсенита натрия (2,5, 5, 7,5 или 10 мкМ) в течение 30 минут. Клетки лизировали и проанализировали уровни белков Akt и ERK посредством анализа с помощью вестерн-блоттинга.
Результаты показали, что метаарсенит натрия ингибировал экспрессию Akt, но не оказывал никакого воздействия на экспрессию ERK (Фиг. 12).
Заключение
2
Результаты данных исследований in vitro демонстрируют, что метаарсенит натрия может быть полезным в качестве противовоспалительного и болеутоляющего средства со значительным ингибиторным воздействием на важнейшие воспалительные медиаторы, т.е., на секрецию iNOS, COX-2, PGE и TNF-α, посредством инактивации сигнальных путей NF-κB, MAPK и Akt.