Способ получения субстанции из каллусных культур зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.)
METHOD FOR OBTAINING SUBSTANCE FROM CALLUS CULTURES OF ST. JOHN'S WORT (HYPERICUM PERFORATUM L.)

Изобретение относится к области биотехнологии, фармации, медицины, сельского хозяйства.
В пат. RU 2771960 A01H 4/00 (2006.01) предложен способ введения в культуру in vitro, получения каллусов и растений-регенерантов вздутоплодника сибирского  (PHLOJODICARPUS SIBIRICUS (STEPH.) К.-POL.), с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных или генеративных органов.  Заявленный способ обеспечивает получение каллусных культур и растений-регенерантов вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.), относящегося к редким лекарственным видам растений, с целью сохранения и воспроизводства как в природе, так и питомниках, а также для дальнейшего использования каллусов в качестве ценного источника вторичных метаболитов. Способ микроклонального размножения in vitro вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) осуществляют на питательной среде Мурасиге-Скуга из соцветий, оберточного листа и корня материнского растения.
Недостатком данного способа является невозможность его использования для  других видов растений, например, для Hypéricum perforátum L. (зверобоя продырявленного), так как известно, что каждое растение требует своих индивидуально подобранных стерилизаторов, времени воздействия и концентрации и определенного состава питательных сред и регуляторов роста для выращивания растений регенерантов и калллусных тканей.
В статье Бабаян А.М.,Исаджян С.А.,Петросян М.Т.,Саакян Н.Ж.,Трчунян А.А. Оценка антимикробной и антиоксидантной активностей изолированной культуры (интернет ссылка:  https://publikacia.net/archive/2014/6/1/9?) предложен способ получения каллусных тканей растений с антибактериальной и антиоксидантной активностью из растений зверобоя вытянутого (Hypericum elongatum Ledeb.) .
Особенностью данного способа является то, что он предназначен для получения каллусных тканей для  другого вида, а именно зверобой вытянутый (Hypericum elongatum Ledeb.), а не для зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), что обусловило использование других регуляторов роста и их концентраций. Так, авторы получали каллусные ткани на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга (МС), отличающейся составом фитогормонов 0.5мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК), 1.0 мг/л кинетина и 0.2мг/л гиббереллиновой кислоты (ГК).
Из  статьи  Е.Н. Щербакова, А.Н. Арзуманян, Ю.Г. Попов, Ереван, 2004 г. Фармакологическое действие вторичных метаболитов изолированных культур некоторых растений рода Hypericum (интернет ссылка:
известно, что  антибактериальную активность проявляют экстракты как каллусных тканей, так и интактных растений исследуемых видов зверобоя, причем активность экстрактов из каллусных тканей была выше.  Согласно полученным данным ни каллусные ткани, ни интактные растения Н. perforatum, не ингибировали рост Escherichia coli.
Следовательно, есть потребность в разработке способа  получения субстанций на основе каллусных культур Hypéricum perforátum L. в лабораторных условиях, обладающих подтвержденной антиоксидатной и антибактериальной активностью, в том числе в отношении Escherichia coli и Staphylococcus aureus.
Техническая задача – разработка способа получения субстанций на основе каллусных культур Hypéricum perforátum L. в лабораторных условиях, обладающих подтвержденной антиоксидатной и антибактериальной активностью.
Технический результат заключается в получении субстанции с антиоксидантными и антибактериальными свойствами,  в том числе в отношении Escherichia coli  и Staphylococcus aureus, методом культивирования растительных клеток и тканей Hypéricum perforátum L., причем процесс получения каллусной культуры осуществляется в лабораторных условиях и не связан с выращиванием и сбором растений в поле.
Решение технической задачи достигается предложенным способом получения субстанции на основе каллусных культур Hypéricum perforátum L., который  характеризуется тем, что в качестве растительных эксплантов используют семена растений, которые дезинфицируют ступенчатой стерилизацией. Для этого первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает белизна 50% или 100% при воздействии в течение 10-20 минут, или перекись водорода 36% при воздействии в течение 15 минут, или сулема 0,1% при воздействии в течение не более 15 минут. Далее семена отмывают автоклавированной дистиллированной водой в трёхкратной повторности по 15 минут и помещают растительные экспланты на питательную среду Мурасиге и Скуга, без использования фитогормонов для получения проростков, культивируют в термостате при температуре 24°С. Полученные проростки в стерильных условиях разрезают и помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 0,2 мг/л ИУК (индолил-уксусная кислота) и 0,5 мг/ л кинетина для индукции каллусогенеза. Через 28-30 дней получают каллусную культуру, которую высушивают при температуре не выше 40°С и далее измельчают и готовят экстракт, для чего 1 грамм исследуемого объекта измельчают, добавляют  2 мл  40% спирта, перемешивают и центрифугируют 15 минут на скорости 10000 оборотов, с последующим сливанием жидкости в пустую стерильную пробирку. Повторно добавляют растворитель и повторяют смешивание и центрифугирование, потом сливают жидкость в ту же пробирку, снова заливают растворителем, перемешивают и ставят в холодильник отстаиваться на сутки при температуре 4°С Через сутки снова повторяют перемешивание и центрифугирование, сливают жидкость в ту же пробирку и высушивают полученный экстракт.
Изобретение характеризуется на следующих графических изображениях.
Фиг. 1  – Антибактериальная активность Hypéricum perforátum
Фиг. 2 – Антиоксидантная активность Hypéricum perforátum
Новизна и изобретательский уровень заявленного способа подтверждается тем, что из уровня техники не выявлены состав и концентрация используемых фитогормонов, для получения субстанции с антиоксидантными и антибактериальными свойствами,  в том числе в отношении Escherichia coli  и Staphylococcus aureus, а также способ стерилизации растительный эксплантов при введении семян зверобоя продырявленного в условиях in vitro.
Примеры получения субстанции из каллусных культур зверобоя продырявленного (Hypéricum perforátum L.), обладающей антимикробной и антиоксидантной активностью.
Пример 1
Первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает белизна 50%  для воздействия в течение 20 минут.  Далее семена отмывают автоклавированной дистиллированной водой в трёхкратной повторности по 15 минут и помещают растительные экспланты на питательную среду Мурасиге и Скуга, без использования фитогормонов для получения проростков, культивируют в термостате при температуре 24°С. Полученные проростки в стерильных условиях разрезают и помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 0,2 мг/л ИУК (индолил-уксусная кислота) и 0,5 мг/ л кинетина для индукции каллусогенеза. Через 28-30 дней получают каллусную культуру, которую высушивают при температуре не выше 40°С и далее измельчают и готовят спиртовой экстракт, для чего  1 грамм порошка измельчают в ступке при помощи пестика, затем добавляют 2 мл  40% спирта и перемешивают при помощи «Вортекса», далее центрифугируют 15 минут. Надосадочную жидкость, полученную в результате центрифугирования сливают в пустую стерильную пробирку. К оставшемуся после центрифугирования осадку повторно добавляют 2 мл спирта 40%, вновь перемешивают, центрифугируют и сливают надосадочную жидкость, добавляя ее к первой порции в стерильной пробирке. В третий раз заливают осадок 2 мл спирта 40% и ставят в холодильник при температуре 4°С на сутки. Через сутки снова повторяют все этапы  и высушивают трехкратно полученную жидкость в темном месте при комнатной температуре в течение 48 часов.
Пример 2
Первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает перекись водорода 36% при воздействии в течение 15 минут.  Далее семена отмывают автоклавированной дистиллированной водой в трёхкратной повторности по 15 минут и помещают растительные экспланты на питательную среду Мурасиге и Скуга, без использования фитогормонов для получения проростков, культивируют в термостате при температуре 24°С. Полученные проростки в стерильных условиях разрезают и помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 0,2 мг/л ИУК (индолил-уксусная кислота) и 0,5 мг/ л кинетина для индукции каллусогенеза. Через 28-30 дней получают каллусную культуру, которую высушивают при температуре не выше 40°С и далее измельчают и готовят спиртовой экстракт, для чего  1 грамм порошка измельчают в ступке при помощи пестика, затем добавляют 2 мл  40% спирта и перемешивают при помощи «Вортекса», далее центрифугируют 15 минут. Надосадочную жидкость, полученную в результате центрифугирования сливают в пустую стерильную пробирку. К оставшемуся после центрифугирования осадку повторно добавляют 2 мл спирта 40%, вновь центрифугируют и сливают надосадочную жидкость, добавляя ее к первой порции в стерильной пробирке. В третий раз заливают осадок 2 мл спирта 40% и ставят в холодильник при температуре 4°С на сутки. Через сутки снова повторяют все этапы  и высушивают трехкратно полученную жидкость в термостате при температуре 36°С в течении 24 часов.
Пример 3
Первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает сулема 0,1% при воздействии в течение 15 минут.  Далее семена отмывают автоклавированной дистиллированной водой в трёхкратной повторности по 15 минут и помещают растительные экспланты на питательную среду Мурасиге и Скуга, без использования фитогормонов для получения проростков, культивируют в термостате при температуре 24°С. Полученные проростки в стерильных условиях разрезают и помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 0,2 мг/л ИУК (индолил-уксусная кислота) и 0,5 мг/ л кинетина для индукции каллусогенеза. Через 28-30 дней получают каллусную культуру, которую высушивают при температуре не выше 40°С и далее измельчают и готовят спиртовой экстракт, для чего  1 грамм порошка измельчают в ступке при помощи пестика, затем добавляют 2 мл  40% спирта и перемешивают при помощи «Вортекса», далее центрифугируют 15 минут. Надосадочную жидкость, полученную в результате центрифугирования сливают в пустую стерильную пробирку. К оставшемуся после центрифугирования осадку повторно добавляют 2 мл спирта 40%, вновь центрифугируют и сливают надосадочную жидкость, добавляя ее к первой порции в стерильной пробирке. В третий раз заливают осадок 2 мл спирта 40% и ставят в холодильник при температуре 4°С на сутки. Через сутки снова повторяют все этапы и высушивают трехкратно полученную жидкость в темном месте при комнатной температуре 22°С в течении 48 часов.
Пример 4
Первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает белизна 100% при воздействии в течение 10 минут.  Далее семена отмывают автоклавированной дистиллированной водой в трёхкратной повторности по 15 минут и помещают растительные экспланты на питательную среду Мурасиге и Скуга, без использования фитогормонов для получения проростков, культивируют в термостате при температуре 24°С. Полученные проростки в стерильных условиях разрезают и помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 0,2 мг/л ИУК (индолил-уксусная кислота) и 0,5 мг/ л кинетина для индукции каллусогенеза. Через 28-30 дней получают каллусную культуру, которую высушивают при температуре не выше 40°С и далее измельчают и готовят спиртовой экстракт, для чего  1 грамм порошка измельчают в ступке при помощи пестика, затем добавляют 2 мл  40% спирта и перемешивают при помощи «Вортекса», далее центрифугируют 15 минут. Надосадочную жидкость, полученную в результате центрифугирования сливают в пустую стерильную пробирку. К оставшемуся после центрифугирования осадку повторно добавляют 2 мл спирта 40%, вновь перемешивают,  центрифугируют и сливают надосадочную жидкость, добавляя ее к первой порции в стерильной пробирке. В третий раз заливают осадок 2 мл спирта 40% и ставят в холодильник при температуре 4°С на сутки. Через сутки снова повторяют все этапы  и высушивают трехкратно полученную жидкость в термостате при температуре 36°С в течении 24 часов.
Пример 5.
Полученные по примерам 1-4 образцы субстанции растительного происхождения из каллусной культуры зверобоя далее подвергали проверке на антимикробную и антиоксидантную активность.
Для чего сначала готовили 100% экстракт путем разведения 1 части полученной каллусной культуры в 1 части стерильной (автоклавированной) воды. Для получения разбавления 1:10 отбирали с помощью автоматического дозатора 1 мл 100% экстракта и добавляли его в пробирку с 9 мл стерильной (автоклавированной) воды и взбалтывали с помощью «Вортекса». В качестве контроля использовали антибиотик цефепим для Escherichia coli, а для Staphylococcus aureus использовали левофлоксацин.
Антибактериальная активность полученной субстанции растительного происхождения из каллусной ткани Hypéricum perforátum L. доказана по отношению к  Escherichia coli и  Staphylococcus aureus (Фиг.1). 100% экстракт из каллусной культуры обладал наибольшей антибактериальной активностью по отношению к Escherichia coli и Staphylococcus aureus, а антибактериальную активность к Staphylococcus aureus проявлял и при  разведении 1/10.
Полученный экстракт из каллусной ткани H. perforátum был протестирован на антиоксидантную активность. Как видно из фиг. 2, экстракт из каллусной ткани H. perforátum обладает более высокой антиоксидантной активностью, по сравнению с раствором аскорбиновой кислоты (контроль) и интактным растением (экстракт из листьев растений).
Таким образом, поставленная задача решена и заявленный способ обеспечивает получение субстанции из каллусной культуры зверобоя продырявленного (Hypéricum perforátum L.) с антибактериальными свойствами по отношению к Escherichia coli и Staphylococcus aureus, и с высокой антиоксидатной активностью.