СПОСОБ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ БЕЛКА-ПЕРЕНОСЧИКА ГЛЮКОЗЫ GLUT-1 ПРИ ПСОРИАЗЕ
METHOD FOR IMMUNOHISTOCHEMICAL EVALUATION OF GLUT-1 GLUCOSE TRANSPORT PROTEIN IN PSORIASIS

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии и патологической анатомии и может быть использовано в качестве дополнительного критерия определения тяжести течения патологического процесса и оценки эффективности проводимой терапии при псориазе.
Глюкоза является ключевым источником энергии для большинства живых клеток, но из-за полярной природы и больших размеров, молекулы глюкозы не могут пройти через липидную мембрану клетки путем простой диффузии. Поэтому каждой клетке необходимы белки транспортеры для поступления глюкозы внутрь через плазматическую мембрану. Транспортный процесс осуществляется с участием представителей двух разных групп переносчиков глюкозы. В настоящее время SGLT и GLUT являются двумя известными интегральными семействами белков транспортера глюкозы. SGLT осуществляют натрий зависимый транспорт глюкозы, a GLUT участвуют в облегченном переносе глюкозы на основе градиента концентрации [K. Shah, 2012]. GLUT-1 в нормальных условиях обнаруживается практически во всех тканях, наибольшая экспрессия встречается в эритроцитах, в тканях мозга, в эндотелиальных клетках барьерных тканей, особенно в гематоэнцефалическом барьере [P. Zhao, 2016]. Повышенная экспрессия белка транспортера GLUT-1 при онкологических процессах является прогностически неблагоприятным признаком, характеризуется наличием метастазов в лимфатических узлах, рецидивами, резистентностью к проводимимой терапии, низкой выживаемостью больных [Y. Kanjanapan, 2017; R.В. Leite, 2017; М.L. Macheda, 2005].
Повышение активности GLUT-1 способствует улучшению метаболизма глюкозы, что необходимо для гипепролиферирующих клеток. Псориаз и любые опухоли имеют общие проявления такие, как чрезмерная пролиферация клеток, неоангиогенез и наличие местной гипоксии. Повышенная экспрессия GLUT-1 обнаружена у больных с псориазом и является отражением эпидермальной пролиферации [A.G. Abdou, 2013; F. Montazer, 2017]. Участие GLUT-1 в молекулярных механизмах, имеющих значение в патогенезе псориаза путем обеспечения клеточной пролиферации эпидермиса и поддержания воспаления за счет ангиогенеза, позволяет считать оценку уровня синтеза в клетках этого белка важной для определения тяжести течения патологического процесса и эффективности проводимой терапии [A.A. Hodeib, 2018].
Для иммуногистохимической оценки белка применяют различные подходы, основывающиеся на его детекции на мембране и в цитоплазме. Не существует общепринятой схемы оценки иммуногистохимической метки GLUT-1. Авторами предложены различные варианты оценки иммуногистохимической экспрессии белка транспортера глюкозы GLUT-1 на клеточной мембране и в цитоплазме в зависимости от изучаемых показателей. Количественный метода Ohba et al учитывает количество позитивно окрашенных эпителиальных клеток, выраженных в процентах от общего количества эпителиальных клеток в поле зрения [С.F. Demeda, 2014]. Другие авторы присваивают индивидуальный балл в зависимости от интенсивности окраски клеточных структур [P. Parente, 2008; J. Leon-Villapalosa, 2005]. Существует подход использования балльной оценки в зависимости от интенсивности окраски клеточного ядра [P.J. Bostrom, 2016]. Предложен балльный индекс, равный произведению интенсивности окраски на процент положительно окрашенных клеток (IRS: 0-12; SI × РР) [P. Sadlecki, 2014; Y. Kanjanapa, 2017]. Также для оценки экспрессии использовали оценку локализации, интенсивности окраски и распространения метки, при этом каждый показатель оценивался отдельно [F. Montazer, 2017; J-H. Park, 2016; A. G. Abdou, 2013]. Использовали разные шкалы от 0 до 3 и от 0 до 4 баллов с учетом процента окрашенных клеток [С. Boyaci, 2019; А.N. Husain, 2013. R.В. Leite, 2017; Е. Luczynska, 2012]. Также была предложена балльная оценка от 0 до 3 с учетом мембранного или цитоплазматического окрашивания, интенсивности окраски и процента позитивно окрашенных клеток [Н. Ito, 2016].
Недостатками существующих методов оценки иммуногистохимической метки GLUT-1 является:
1. Отсутствие общей балльной системы, учитывающей все показатели выбранные для оценки экспрессии GLUT-1. Каждый показатель оценивается отдельно, при этом учитывается количество наблюдаемых случаев в исследуемой группе.
2. Предложенная шкала оценки Remmele-Stegner, как произведение интенсивности окраски на процент положительно окрашенных клеток [P. Sadlecki, 2014] не учитывает варианты окраски клеточных структур и распространение метки.
3. Предложенный индекс равный сумме произведений: число один умноженное на процент слабо окрашенных клеток, число два умноженное на процент умеренно окрашенных клеток, число три умноженное на процент сильно окрашенных клеток [I. Seleitl, 2017] является трудоемким и не учитывает других параметров экспрессии белка переносчика глюкозы GLUT-1.
4. Равный вклад мембранной и цитоплазматической метки, без описания вариантов окрашивания клеточных структур с учетом преобладания мембранной или цитоплазматической метки.
5. Варианты окрашивания предложенные Т. Higashi et al.: «цитоплазматический гранулированный», «однородный или гомогенный» и «сетчатый» не имеют оценочной шкалы и носят описательный характер, учитывается количество наблюдаемых случаев в исследуемой группе [Т. Higashi, 1997].
Учитывая недостатки существующих вариантов полуколичественной оценки экспрессии белка переносчика глюкозы, в серии наблюдений и экспериментов был разработан собственный способ полуколичественной оценки белка транспортера глюкозы GLUT-1 иммуногистохимическим методом в эпидермисе больных псориазом. Предлагаемый способ основывается на подсчете Индекса экспрессии GLUT-1 в эпидермисе, который рассчитывается путем суммации баллов показателей интенсивности окрашивания (ИО), при этом интенсивность окрашивания определяется по наиболее выраженной интенсивности иммунного окрашивания в базальном и/или шиповатом слоях эпидермиса, локализации экспрессии белка GLUT-1 в слоях эпидермиса (ЛЭ), распространенности окрашивания слоев эпидермиса (РО) и варианта окраски клеточных структур (ВО).
Экспрессия белка GLUT-1 в эпидермисе рассчитывается по следующей формуле:
Индекс экспрессии GLUT-1=ИО+ЛЭ+РО+ВО
Для удобства подсчета баллов разработана таблица, где каждый показатель имеет балл от 0 до 3.
Максимальное значение общего индекса составляет 12 баллов, минимальное - 0. При этом выделяются 4 группы:
0 - отрицательный результат;
1-6 - слабая экспрессия;
7-9 - умеренная экспрессия;
10-12 - выраженная экспрессия.
Индекс экспрессии GLUT-1 от 0 до 6 баллов свидетельствует о низкой интенсивности метаболизма глюкозы в кератиноцитах, что характерно для нормального эпидермиса.
Индекс экспрессии GLUT-1 от 7 до 12 баллов отражает повышенную активность метаболизма глюкозы в эпидермисе, что характерно для псориаза.
Предлагаемый способ полуколичественной оценки белка GLUT-1 иммуногистохимическим методом в тканях больных псориазом отличается комплексной оценкой четырех показателей: интенсивность окраски, локализация, распространенность и вариант окраски клеточных структур, при этом индекс экспрессии GLUT-1 рассчитывается по следующей формуле:
Индекс экспрессии GLUT-1=ИО+ЛЭ+РО+ВО, где
ИО - интенсивность окрашивания слоев эпидермиса определяется по наиболее выраженной интенсивности иммунного окрашивания в базальном и/или шиповатом слоях эпидермиса.
При этом окрашивание считается сильным, если по интенсивности оно соответствует окраске мембран эритроцитов, принятой за положительный внутренний контроль.
0 - отсутствие окрашивания /метка отсутствует;
1 - слабое окрашивание /метка светло-коричневого цвета;
2 - умеренное окрашивание /метка коричневого цвета;
3 - сильное окрашивание /метка темно-коричневого цвета.
ЛЭ - локализация экспрессии белка GLUT-1 в слоях эпидермиса:
0 - отсутствует метка
1 - окрашивание кератиноцитов только базального слоя;
2 - окрашивание кератиноцитов базального и шиповатого слоев эпидермиса;
3 - окрашивание кератиноцитов всех слоев эпидермиса.
РО - распространенность окрашивания слоев эпидермиса:
0 - Отсутствует;
1 - Локальное, проявляется отдельными участками с положительной экспрессией GLUT-1;
2 - Прерывистое, характеризуется неравномерным окрашиванием слоев эпидермиса, при этом наблюдаются участки без экспрессии GLUT-1;
3 - Диффузное, проявляется равномерным окрашиванием слоев эпидермиса с экспрессией GLUT-1.
ВО - вариант окраски клеточных структур (экспрессия GLUT-1):
0 - Отсутствует
1 - Цитоплазматическая преобладает: характеризуется преобладанием цитоплазматической картины окраски клеточных структур, при этом могут наблюдаться единичные клетки с экспрессией GLUT-1 на клеточной мембране;
2 - Цитоплазматическая и очаговая мембранная: проявляется цитоплазматической картиной окраски клеточных структур, при наличии очаговой мембранной экспрессии GLUT-1;
3 - Выраженная мембранная в базальном и/или шиповатом слоях и цитоплазматическая: наблюдается выраженная мембранная окраска клеточных структур в базальном и/или шиповатом слоях, которая сопровождается цитоплазматической картиной окраски в шиповатом слое эпидермиса.
Любое количество клеток с мембранной или цитоплазматической картиной окраски клеточных структур оценивалось как положительная экспрессия GLUT-1.
Такой способ комплексной оценки уровня экспрессии белка переносчика глюкозы GLUT-1 в тканях дает возможность с большей точностью фиксировать изменение его количества в эпителиальных клетках и судить об активности метаболизма глюкозы, что позволит использовать его в качестве дополнительного критерия определения тяжести течения патологического процесса и оценки эффективности проводимой терапии при псориазе.
Пример 1 подсчета баллов индекса экспрессии GLUT-1:
Фиг. 1 - микрофотография биоптата кожи больного №1 с псориазом.
Балльная оценка экспрессии GLUT-1 для данного случая представлена в таблице 1.
ИО - интенсивность окрашивания в данном случае соответствует 3 баллам, так как в базальном и шиповатом слоях мы наблюдаем наиболее выраженное иммунное окрашивание, которое по интенсивности соответствует сильному окрашиванию, имеются метки темно-коричневого цвета. При этом ориентируемся на окраску мембран эритроцитов, которая соответствует по интенсивности сильному окрашиванию (3 балла), так как они являются положительным внутренним контролем.
ЛЭ - локализации экспрессии белка GLUT-1: мы наблюдаем экспрессию в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, что соответствует 2 баллам.
РО - распространенность окрашивания: диффузное, так как проявляется равномерным окрашиванием слоев эпидермиса и соответствует 3 баллам.
ВО - вариант окраски клеточных структур: мы наблюдаем преимущественно цитоплазматическую и очаговую мембранную окраску клеточных структур и это соответствует 2 баллам.
Индекс экспрессии GLUT-1=3+2+3+2=10
Индекс экспрессии GLUT-1 равный 10 баллам соответствует выраженной экспрессии, отражает повышенную активность метаболизма глюкозы и характерен для псориаза.
Пример 2 подсчета баллов индекса экспрессии GLUT-1:
Фиг. 2 - микрофотография биоптата здоровой кожи пациента №2, взятого во время проведения пластических операций.
Балльная оценка экспрессии GLUT-1 для данного случая представлена в таблице 2.
ИО - интенсивность окрашивания в данном случае составляет 1 балл, так как мы наблюдаем метки только светло-коричневого цвета (1 балл) в базальном и шиповатом слоях эпидермиса. При этом ориентируемся на окраску мембран эритроцитов, которая соответствует по интенсивности сильному окрашиванию (3 балла), так как они являются положительным внутренним контролем.
ЛЭ - локализация экспрессии белка GLUT-1: мы наблюдаем экспрессию в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, что соответствует 2 баллам.
РО - распространенность окрашивания: прерывистое, так как проявляется неравномерным окрашиванием базального и шиповатого слоев эпидермиса и соответствует 2 баллам.
ВО - вариант окраски клеточных структур: мы наблюдаем цитоплазматическую окраску клеточных структур и это соответствует 1 баллу.
Индекс экспрессии GLUT-1=1+2+2+1=6
Индекс экспрессии GLUT-1 равный 6 баллам соответствует слабой экспрессии, отражает низкую активность метаболизма глюкозы в кератиноцитах и характерен для нормального эпидермиса.