СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ДЕПОНИРОВАНИЯ ИМИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
METHOD FOR INCREASING ERYTHROCYTE MEMBRANE PERMEABILITY FOR DRUG DEPOSITION

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к гематологии.
В качестве прототипа выбран способ повышения проницаемости мембраны клеток крови для депонирования ими лекарственных веществ, заключающийся в центрифугировании крови для выделения клеточной массы, добавлении к ней антибиотика и последующей инкубации клеток крови с антибиотиком при температуре 37°C при одновременном облучением ее гелий-неоновым лазером с длиной волны 633 нм в течение 15-20 минут (см. Абу Идда А.Ш., Горелов С.В., Коган О.Ф. Роль экстракорпоральной антибиотикотерапии в комплексном лечении больных с гнойно-воспалительными заболеваниями почек // Клиническая эфферентология - 2005. - №4. - efferens.dsmu.edu.ua/index.shtml).
Однако известный способ не позволяет определить, какие конкретно клетки (эритроциты, лейкоциты или тромбоциты) «захватывают» лекарственное вещество. Кроме того, в способе оценивается результат «захвата» клеткой лекарственного вещества только по клинической картине.
Задача предлагаемого изобретения - усовершенствование способа.
Технический результат - повышение точности и информативности исследования.
2
Поставленный технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем добавление к клеточной массе, полученной путем центрифугирования крови, лекарственных препаратов и последующее проведение фотогемотерапии, в качестве «контейнеров» для лекарственного вещества используют отмытые в физиологическом растворе эритроциты, выделенные из клеточной массы после удаления тромбоцитарно-лейкоцитарной пленки, помещают в среду с лекарственным веществом, воздействуют на эритроциты ультрафиолетовым облучением (УФО) с длиной волны 360 нм и общей дозой облучения 0,72 Дж/см.
2
Способ повышения проницаемости мембраны эритроцитов для депонирования ими лекарственных средств осуществляют следующим образом. Для выделения клеточной массы центрифугируют кровь в течение 20 минут при 3000 об/мин. Удаляют плазму и тромбоцитарно-лейкоцитарную пленку. Отмывают эритроциты в физиологическом растворе, удаляют надосадочную жидкость и используют эритроциты в качестве «контейнеров». Для этого добавляют к суспензии эритроцитов лекарственное вещество. Смесь подвергают воздействию фотогемотерапии, а именно ультрафиолетовому облучению (УФО) с длиной волны 360 нм в течение часа (общая доза облучения 0,72 Дж/см).
Пример
В качестве лекарственного препарата был использован гепарин.
Для выделения клеточной массы центрифугировали кровь в течение 20 минут при 3000 об/мин. Удаляли плазму, которую затем использовали для определения скорости ее свертывания тромбином (тромбиновое время), затем удаляли тромбоцитарно-лейкоцитарную пленку. Отмывали эритроциты один раз в физиологическом растворе. Удаляли надосадочную жидкость и разливали оставшуюся суспензию эритроцитов по 0,5 мл в три пробирки. Затем в первую пробирку добавляли 1 мл физиологического раствора. Во вторую и третью - 1 мл гепарина, разведенного в физиологическом растворе (4000 ME гепарина и 1,5 мл физиологического раствора). Содержимое третьей пробирки подвергали воздействию фотогемотерапии, а именно ультрафиолетовому облучению (УФО) с длиной волны 360 нм в течение часа. Первую и вторую пробирки в это время инкубировали при комнатной температуре. По истечении часа суспензию эритроцитов во всех пробирках отмывали физиологическим раствором 3 раза для удаления внеклеточного гепарина. Для высвобождения депонированного эритроцитами гепарина путем гемолиза эритроцитов к отмытым эритроцитам добавляли по 1 мл дистиллированной воды. Затем 0,1 мл полученного гемолизата смешивали с 0,1 мл аутоплазмы плазмы, 0,1 мл полученной смеси помещали в кювету гемокоагулографа, инкубировали 1 минуту при 37°C, после чего добавляли 0,1 мл тромбина. По времени свертывания плазмы определяли наличие или отсутствие гепарина в гемолизате и судили о «захвате» эритроцитами лекарственного вещества.
Все исследования проведены на крови 15 здоровых доноров.
Полученные результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние УФО на депонирование эритроцитами гепарина
1-я пробирка (эритроциты + физиологический раствор) контроль
2-я пробирка (эритроциты + гепарин, разведенный физиологическим раствором)
3-я пробирка (эритроциты + гепарин, разведенный физиологическим раствором + УФО)
8.0±0.16
8.1±0.27* (р<0.05)
11.3±0.43* (р≤0.001)
* - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона
Полученные данные свидетельствовали о том, что время свертывания плазмы в первой (отсутствие гепарина в суспензии эритроцитов) и во второй пробирке (наличие гепарина в суспензии эритроцитов) практически одинаковое. Из этого следует, что инкубация суспензии эритроцитов с гепарином при комнатной температуре не сопровождалась увеличением проницаемости мембран эритроцитов, и гепарин не попадал внутрь эритроцитов. В третьей пробирке воздействие ультрафиолетового облучения приводило с высокой достоверностью к увеличению времени свертывания аутоплазмы (р<0,001) и, следовательно, увеличивало проницаемость мембран и способность эритроцитов «захватывать» гепарин. Эритроциты при этом не изменяли ни свои реологические свойства, ни свою морфологию.
Для доказательства этого положения проведены следующие исследования. Деформируемость эритроцитов определяли в ригидометре собственной конструкции. (А.с. №1363065 Россия, МКИ J01N 33/14. Устройство для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке / Левин Г.Я., Яхно В.Г., Царевский Н.Н., Котяева Н.П.; опубл. 30.12.1987, бюл. №48 (заявка №3954988/28-14 от 16.09.1085). Оценка деформируемости эритроцитов осуществлялась по соотношению деформируемых (вытянутых) и недеформируемых эритроцитов в микроскопе. Было установлено, что деформируемость эритроцитов в пробах, которые в течение 1 часа обрабатывались УФО, снижалась очень незначительно (табл.2). Морфологию эритроцитов изучали в световом микроскопе Primo Star Carl Zeiss (Германия). Определяли количество дискоцитов, эхиноцитов и стоматоцитов. Было установлено, что морфологические свойства эритроцитов практически не изменялись (табл.2). Наблюдалось небольшое увеличение количества эхиноцитов, которые, как известно, являются обратимой формой и могут при определенных условиях свободно трансформироваться обратно в дискоциты.
Таблица 2
Влияние УФО на деформируемость и морфологию эритроцитов
Деформируемость эритроцитов (%)
Морфология эритроцитов (%)
дискоциты
эхиноциты
стоматоциты
1-я проба (контроль) Эритроциты + физиологический раствор
83,00±4,74
88,15±5,56
11,15±5,09
0,76±0,83
2-я проба Эритроциты + гепарин
81,6±4,89
87,90±4,93
10,36±5,26
0,82±0,87
3-я проба Эритроциты + физиологический раствор + УФО
79,92±4,05*
84,77±5,23*
13,54±5,08*
0,92±0,95
* - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона
-1
-1
-1
10
15
20
Агрегацию и дезагрегацию эритроцитов исследовали на приборе собственной конструкции, в котором использован принцип, предложенный Н. Schmid-Schonbain et. al. (Пат. 2278381 РФ, Устройство для исследования агрегации тромбоцитов [Текст] / Левин Г.Я., Модин А.П., Кудрицкий С.Ю., Соснина Л.Н. (РФ). - №2005100408/14; заявл. 11.01.05; опубл. 20.06.06, Бюл. №17). Процесс агрегации и дезагрегации эритроцитов регистрировали на самописце (по изменению оптической плотности) после гидродинамического перемешивания суспензии клеток и остановки вращения. По полученной агрегатограмме рассчитывали максимальную амплитуду МА (показатель степени агрегации), а также степень дезагрегации - при скоростях сдвига 10 с (D), 15 с (D), 20 с (D). Было показано, что после воздействия УФО агрегационная способность эритроцитов и их дезагрегация при различных скоростях сдвига не менялась (табл.3).
Таблица 3
Влияние УФО на агрегацию эритроцитов
Степень агрегации (мм)
Дезагрегация эритроцитов
Скорость сдвига D<sub>10</sub> (%)
Скорость сдвига D<sub>15</sub> (%)
Скорость сдвига D<sub>20</sub> (%)
1-я проба (контроль) Эритроциты + физиологический раствор
103,90±6,82
32,90±14,78
62,10±15,74
75,10±13,22
2-я проба Эритроциты + гепарин
103,80±10,59
35,20±19,42
59,30±14,74
70,20±12,42
3-я проба Эритроциты + физиологический раствор + УФО
104,40±10,89
41,90±18,68
55,70±20,19
69,70±13,89
* - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона
Предложенный способ повышения проницаемости мембран эритроцитов для депонирования ими лекарственных веществ является точным и объективным, так как позволяет определить, что именно эритроциты «захватывают» препарат. Важным достоинством способа является его малоинвазивностью для эритроцитов.