ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА
VACCINE AGAINST RABIES VIRUS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По этой заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. §119(e) по временной заявке на патент США с серийным номером №62/581955, поданной 6 ноября 2017 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым вакцинам против вируса бешенства. Также изобретение относится к способам получения и применения вакцины отдельно или в комбинациях с другими защитными средствами.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бешенство представляет собой предотвратимое зоонозное заболевание, которое приводит к воспалению головного мозга у человека и других млекопитающих. Клиническое бешенство представляет собой острый прогрессирующий энцефалит, который обычно подразделяют на буйное или паралитическое бешенство. Буйное бешенство характеризуется беспокойством, раздражительностью и агрессией. Паралитическое бешенство характеризуется чрезмерным слюноотделением, глубоким затрудненным дыханием, параличом и в конечном итоге комой.
et al.
Semin Vet Med Surg
Этиологическим фактором бешенства является вирус бешенства, который способен инфицировать большинство млекопитающих и поддерживает резервуар заболевания в диких и восприимчивых домашних животных. Вирус бешенства присутствует в большинстве частей света, хотя в различных географических областях в качестве первичного резервуара для вируса бешенства выступают различные виды, включая бродячих собак, енотов, скунсов, лис, летучих мышей и мангустов [Robinson ,  (small Anim) 6:203-211 (1991)]. Вирус бешенства наиболее часто передается через укус инфицированного животного. После того как вирус бешенства инфицирует центральную нервную систему проявляются клинические признаки бешенства.
et al.
Crit Rev Immunol
et al.
Infect Immun
et al.
Vet Res
Вирус бешенства представляет собой оболочечный РНК-вирус, который кодирует пять структурных белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), гликопротеин (G) и РНК-зависимую РНК-полимеразу [Dietzschold , 10:427-439 (1991)]. Гликопротеин (G) считается защитным антигеном, который индуцирует нейтрализующие вирус антитела [Cox ,  16:754-759 (1977)]. Для борьбы с этим заболеванием было получено несколько типов вакцин. В США наиболее часто используются цельно-вирионные вакцины на основе происходящего из инактивированной клеточной культуры убитого вируса бешенства. Эти цельно-вирионные вакцины на основе убитого вируса бешенства требуют высокого уровня антигена и, таким образом, требуют адъюванта. К сожалению, это применение адъюванта ассоциировано с реактивностью области инъекции, гиперчувствительностью и даже с предполагаемым риском сарком в области инъекции у кошек. Недавно модифицированную живую вакцину успешно использовали с приманками для пероральных вакцин для иммунизации диких животных [Mahl ,  45(1):77 (2014)]. Кроме того, рекомбинантная вакцина, экспрессирующая гликопротеин (G), в настоящее время продается в США для применения у кошек. Вакцины на основе нуклеиновых кислот также использовали в лабораторных испытаниях, хотя ни одна из них не была лицензирована в США.
et al. Anim Health Res Rev
et al
J Gen Virol.
et al.,
Virology
et al.
Journal of Virology
in vivo
et al.
Virology
et al. Anim Health Res Rev
Ряд векторных стратегий используют в вакцинах на протяжении лет в попытках защитить против определенных патогенов животных. Одна такая векторная стратегия включает использование происходящих из альфавирусов РНК-репликонных частиц (RP) [Vander Veen, . 13(1):1-9. (2012) doi: 10, 1017/ S1466252312000011; Kamrud .,  91(Pt 7):1723-1727 (2010)], которые были разработаны из нескольких различных альфавирусов, включая вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) [Pushko  239:389-401 (1997)], Синдбис (SIN) [Bredenbeek ,  67:6439-6446 (1993)] и вирус леса Семлики(SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1361 (1991)]. RP-вакцины доставляют РНК-репликоны альфавируса с дефектом увеличения в количестве в клетки-хозяева и обеспечивают экспрессию желаемого антигенного трансгена(ов)  [Pushko ,  239(2):389-401 (1997)]. RP имеют привлекательный профиль безопасности и эффективности по сравнению с некоторыми традиционными вакцинными составами [Vander Veen, . 13(1):1-9. (2012)]. Платформу RP используют для кодирования патогенных антигенов, и она является основой для нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птиц.
Несмотря на широкую доступность цельно-вирионных убитых вакцин против бешенства, а также внедрение новых вакцин, бешенство все еще продолжает представлять угрозу как для домашних животных, так и для людей. Таким образом, остается продолжительная потребность в новых вакцинах против бешенства, которые будут способствовать защите млекопитающих, включая кошек, собак, лошадей, хорьков, овец и крупный рогатый скот, от этого изнуряющего заболевания.
Цитирование любых ссылок в настоящем описании не следует истолковывать как признание того, что такая ссылка доступна в качестве "уровня техники" для настоящей заявки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, настоящее изобретение относится к векторам, которые кодируют один или несколько антигенов вируса бешенства. Такие векторы можно использовать в иммуногенных композициях, содержащих эти векторы. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно использовать в вакцинах. В одном аспекте настоящего изобретения вакцина защищает вакцинированного индивидуума (например, млекопитающего) против вируса бешенства. В одном варианте осуществления этого типа вакцинированным индивидуумом является животное семейства собачьих. В другом варианте осуществления вакцинированным индивидуумом является животное семейства кошачьих. В более конкретном варианте осуществления этого типа вакцинированным индивидуумом является домашняя кошка. В другом варианте осуществления млекопитающим является животное семейства лошадиных (например, лошадь). Кроме того, настоящее изобретение относится к комбинированным вакцинам для индукции защитного иммунитета против бешенства и других заболеваний, например, других инфекционных заболеваний животных семейства собачьих, животных семейства лошадиных и/или животных семейства кошачьих. Также предусматриваются способы получения и применения иммуногенных композиций и вакцин по настоящему изобретению.
В конкретных вариантах осуществления вектор представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует один или несколько антигенов, которые происходят из вируса бешенства. В еще более конкретных вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE). В еще более конкретных вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса VEE представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса VEE TC-83. В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса Синдбис (SIN). В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса леса Семлики (SFV). В альтернативном варианте осуществления вектор с голой ДНК содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует антиген гликопротеина (G) вируса бешенства. Настоящее изобретение относится ко всем конструкциям нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включая РНК-плазмиды, РНК-репликоны, а также все РНК-репликонные частицы альфавирусов по настоящему изобретению, векторы с голой ДНК и иммуногенные композиции и/или вакцины, которые содержат конструкции нуклеиновых кислот (например, РНК-плазмиды, РНК-репликоны) РНК-репликонных частиц альфавирусов, и/или векторы с голой ДНК по настоящему изобретению.
В определенных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавируса кодируют один антиген G вируса бешенства. В родственных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют один или несколько антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В конкретных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов представляют собой РНК-репликонные частицы альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE).
Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, которые содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один антиген G вируса бешенства. В родственных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько антигенов G вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В более конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые представляют собой РНК-репликонные частицы альфавирусов венесуэльского энцефалита лошадей (VEE).
В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит два или более наборов РНК-репликонных частиц альфавирусов. В конкретных вариантах осуществления этого типа один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов кодирует антиген G вируса бешенства или его антигенный фрагмент, и второй набор РНК-репликонных частиц альфавирусов кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV) или его антигенный фрагмент. В определенных вариантах осуществления этого типа антиген FCV происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек. В других вариантах осуществления антиген FCV происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек. В других вариантах осуществления второй набор РНК-репликонных частиц альфавируса кодирует два антигена FCV, один из которых происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек, в то время как другой происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек.
Таким образом, в определенных вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует один или несколько антигенов Gвируса бешенства или их антигенных фрагментов. В конкретных вариантах осуществления этого типа конструкция нуклеиновой кислоты кодирует от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В родственных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавируса содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует от двух до четырех антигенов G или их антигенных фрагментов.
В конкретных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В родственных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В конкретных вариантах осуществления этого типа РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют антиген Gвируса бешенства или его антигенные фрагменты. В более конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые представляют собой РНК-репликонные частицы альфавирусов венесуэльского энцефалита лошадей (VEE). В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит два или более наборов РНК-репликонных частиц альфавирусов. В конкретных вариантах осуществления этого типа один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов содержит первую конструкцию нуклеиновой кислоты, в то время как другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты.
В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, и третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте осуществления этого типа первая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген G вируса бешенства или его антигенный фрагмент, вторая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент, и третья конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент. В конкретных вариантах осуществления антиген кальцивируса кошек (FCV) представляет собой капсидный белок FCV.
В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, которые содержат первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, и третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты, четвертый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит четвертую конструкцию нуклеиновой кислоты, и пятый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит пятую конструкцию нуклеиновой кислоты. В таких вариантах осуществления все из нуклеотидных последовательностей первой конструкции нуклеиновой кислоты, второй конструкции нуклеиновой кислоты, третей конструкции нуклеиновой кислоты, четвертой конструкции нуклеиновой кислоты и пятой конструкции нуклеиновой кислоты различаются.
Таким образом, иммуногенная композиция по настоящему изобретению может содержать РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая, кроме того, кодирует по меньшей мере один антиген не вируса бешенства, для индукции защитного иммунитета против патогена не вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из вируса герпеса кошек (FHV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из кальцивируса кошек (FCV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из пневмовируса кошек (FPN).В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из парвовируса кошек (FPV).
В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты, и четвертый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит четвертую конструкцию нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте осуществления этого типа, первая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген G вируса бешенства или его антигенный фрагмент, вторая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент, третья конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент, четвертая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген FeLV или его антигенный фрагмент.
В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, которые содержат первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты, четвертый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит четвертую конструкцию нуклеиновой кислоты, и пятый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит пятую конструкцию нуклеиновой кислоты. В таких вариантах осуществления все из нуклеотидных последовательностей первой конструкции нуклеиновой кислоты, второй конструкции нуклеиновой кислоты, третьей конструкции нуклеиновой кислоты, четвертой конструкции нуклеиновой кислоты и пятой конструкции нуклеиновой кислоты различаются.
Таким образом, иммуногенная композиция по настоящему изобретению может содержать РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует по меньшей мере один антиген не вируса бешенства, для индукции защитного иммунитета против патогена не вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа, антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из вируса герпеса кошек (FHV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из кальцивируса кошек (FCV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из пневмовируса (FPN).В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из парвовируса кошек (FPV).
Настоящее изобретение, кроме того, относится к комбинированным иммуногенным композициям и/или вакцинам, которые содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют антиген или его антигенный фрагмент, происходящий из вируса бешенства, вместе с одним или несколькими модифицированными живыми (например, ослабленными) или убитыми патогенами млекопитающих.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антиген вируса бешенства представляет собой антиген G вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа антиген G вируса бешенства содержит аминокислотную последовательность, обладающую 95% или идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. В более конкретных вариантах осуществления этого типа антиген G вируса бешенства содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В еще более конкретных вариантах осуществления этого типа антиген G вируса бешенства кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4.
.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к вакцинам и поливалентным вакцинам, содержащим иммуногенные композиции по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцина представляет собой безадъювантную вакцину. Вакцины по настоящему изобретению могут способствовать предупреждению заболевания, ассоциированного с вирусом бешенстваВ определенных вариантах осуществления антитела индуцируются у млекопитающего, когда млекопитающего иммунизируют вакциной. В конкретных вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства собачьих. В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства кошачьих. В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства лошадиных (лошадь). В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства куньих. В конкретных вариантах осуществления этого типа, животным семейства куньих является хорек. В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства полорогих. В конкретных вариантах осуществления этого типа, животным семейства полорогих является животное подсемейства бычьих. В других вариантах осуществления этого типа, животным семейства полорогих является овца.
Настоящее изобретение также относится к способам иммунизации млекопитающего против вируса бешенства, включающим введение млекопитающему иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутримышечной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления вакцину вводят посредством подкожной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутривенной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутрикожной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством перорального введения. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством интраназального введения. В конкретных вариантах осуществления млекопитающим является кошка. В других конкретных вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства собачьих. В других вариантах осуществления млекопитающим является лошадь.
Вакцины (включая поливалентные вакцины) по настоящему изобретению можно вводить в качестве примирующей вакцины и/или в качестве бустерной вакцины. В конкретных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят в качестве однократной вакцины (одна доза), без необходимости в последующих введениях. В случае введения как примирующей вакцины, так и бустерной вакцины, в определенных вариантах осуществления примирующую вакцину и бустерную вакцину можно вводить одним и тем же путем. В других вариантах осуществления этого типа, как примирующую вакцину, так и бустерную вакцину, вводят посредством подкожной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления введение примирующей вакцины можно проводить одним путем, а введение бустерной вакцины можно проводить другим путем. В определенных вариантах осуществления этого типа примирующую вакцину можно вводить посредством подкожной инъекции, и бустерную вакцину можно вводить перорально.
5
10
6
9
7
8
Кроме того, изобретение относится к способам иммунизации млекопитающего против вируса бешенства, включающим инъекцию млекопитающему иммунологически эффективного количества вакцины по изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцина может включать от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 RP или более. В более конкретных вариантах осуществления вакцины могут включать от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10RP. В еще более конкретных вариантах осуществления вакцины могут включать от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 RP.
В определенных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению вводят в дозах от 0,03 мл до 5 мл. В конкретных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению вводят в дозах от 0,05 мл до 3 мл. В более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,1 мл до 2 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,2 мл до 1,5 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,3 до 1,0 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,4 мл до 0,8 мл.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут лучше понятны посредством приведенного ниже подробного описания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к вакцинным композициям, которые включают иммунологически эффективное количество антигена из одного или нескольких штаммов вируса бешенства, который способствует индукции защитного иммунитета у вакцинированного животного, являющегося реципиентом. В одном аспекте настоящего изобретения вакцины содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов (RP), которые содержат капсидный белок и гликопротеины вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), и кодируют гликопротеин (G) бешенства или его антигенный фрагмент. В еще более конкретных вариантах осуществления вакцины содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов (RP), которые содержат капсидный белок и гликопротеины авирулентного штамма VEE TC-83 и кодируют бешенство гликопротеин (G) или его антигенный фрагмент. В другом аспекте настоящего изобретения вакцины содержат векторы с голой ДНК, которые кодируют гликопротеин (G) бешенства. Вакцины, содержащие РНК-репликонные частицы альфавирусов, кодирующие гликопротеин (G) бешенства, можно вводить в отсутствие адъюванта, и они еще могут эффективно способствовать индукции защитного иммунитета у вакцинированного млекопитающего против вируса бешенства.
Таким образом, один аспект изобретения относится к усовершенствованной неадъювантной вакцине против вируса бешенства. В родственном аспекте вакцины по настоящему изобретению не индуцируют саркому в области инъекции и, тем не менее, обеспечивают защиту вакцинированного животного от изнуряющего болезненного состояния, вызываемого инфекцией вирусом бешенства, и являются по меньшей мере настолько же эффективными, как и соответствующие адъювантные вакцины.
Для более полного понимания изобретения приводятся следующие определения.
Использование терминов в единственном числе для удобства в описании никоим образом не предназначено для ограничения. Таким образом, например, указание на композицию, содержащую "полипептид", включает указание на один или несколько таких полипептидов. Кроме того, указание на "РНК-репликонную частицу альфавирусов" включает указание на множество таких РНК-репликонных частиц альфавирусов, если нет иных указаний.
8
7
8
Как используют в рамках изобретения, термин "примерно" используют взаимозаменяемо с термином термин "приблизительно", и он означает, что величина находится в пределах пятидесяти процентов от указанной величины, т.е. композиция, содержащая "примерно" 1×10 РНК-репликонных частиц альфавирусов на миллилитр, содержит от 5×10 до 1,5×10 РНК-репликонных частиц альфавирусов на миллилитр.
Как используют в рамках изобретения, термин "животное семейства кошачьих" относится к любому представителю семейства Felidae. Все из домашних кошек, чистокровных и/или беспородных кошек-компаньонов, и диких или бездомных кошек являются животными семейства кошачьих.
Как используют в рамках изобретения термин "животное семейства собачьих" включает всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris, если нет иных указаний.
Как используют в рамках изобретения, "хорек" представляет собой млекопитающее, которое является одним из млекопитающих, которые относятся к семейству куньих.
Как используют в рамках изобретения, "семейство полорогих" представляет собой семейство млекопитающих, включающее двухкопытных жвачных млекопитающих, которые включают антилоп, овец (овечьи), коз, овцебыка и животных подсемейства бычьих, например, бизона, африканского буйвола, азиатского буйвола и крупный рогатый скот.
Как используют в рамках изобретения, термин "репликон" относится к модифицированному вирусному РНК-геному, который лишен одного или несколько элементов (например, кодирующих последовательностей для структурных белков), которые, если бы они присутствовали, обеспечивали бы успешное увеличение в количестве родительского вируса в клеточных культурах или в животных-хозяевах. В подходящем клеточном контексте репликон будет амплифцироваться и может продуцировать один или несколько типов субгеномной РНК.
et al.
Virology
,
Как используют в рамках изобретения, термин "РНК-репликонная частица альфавируса", сокращенно обозначаемый как "RP", представляет собой происходящий из альфавируса РНК-репликон, упакованный в структурные белки, например, капсид и гликопротеины, которые также происходят из альфавирусов, например, как описано в Pushko , [ 239(2):389-401 (1997)]. RP не может увеличиваться в количестве в клеточных культурах или в животных-хозяевах (без плазмиды-помощника или аналогичного компонента), поскольку репликон не кодирует структурные компоненты альфавируса (например капсид и гликопротеины).
Термин "вирус не бешенства" используют для определения терминов, таких как патоген и/или антиген (или иммуноген), для указания на то, что соответствующий патоген и/или антиген (или иммуноген) не является ни вирусом бешенства, ни антигеном (или иммуногеном) вируса бешенства, и что белковый антиген (или иммуноген) не вируса бешенства не происходит из вируса бешенства.
Термины "происходить из", "происходит из" и "происходящий из" используют взаимозаменяемо в отношении данного белкового антигена и патогена или штамма этого патогена, который в природе кодирует его, и, как используют в рамках изобретения, означает, что немодифицированная и/или укороченная аминокислотная последовательность данного белкового антигена кодируется этим патогеном или штаммом этого патогена. Кодирующую последовательность в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению для белкового антигена, происходящего из патогена, можно подвергать генетическому манипулированию, чтобы достигнуть модификации и/или укорочения аминокислотной последовательности экспрессируемого белка относительно соответствующей последовательности этого белкового антигена в патогене или штамме патогена (включая естественным образом ослабленные штаммы), из которого она происходит.
Как используют в рамках изобретения, термины "защита" или "обеспечение защиты" или "индукция защитного иммунитета" или "способствует предупреждению заболевания" и "способствует защите" не требуют полной защиты от какого-либо признака инфекции. Например, "способствует защите" может означать, что защита является достаточной, так что после заражения симптомы основной инфекции по меньшей мере уменьшаются, и/или что один или несколько из основных клеточных, физиологических или биохимических этиологических факторов или механизмов, вызывающих симптомы, уменьшаются и/или устраняются. Понятно, что "уменьшенный" как используют в этом контексте, означает относительно состояния инфекции, включая молекулярное состояние инфекции, не только физиологическое состояние инфекции.
Как используют в рамках изобретения, "вакцина" представляет собой композицию, которая является пригодной для применения у животного, например, у животного семейства собачьих (включая, в определенных вариантах осуществления людей, в то время как в других вариантах осуществления для применения конкретно не у человека), содержащую один или несколько антигенов, как правило в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как жидкость, содержащая воду, который при введении животному индуцирует иммунный ответ, достаточно сильный, чтобы способствовать защите от заболевания, возникающего в результате инфицирования микроорганизмом дикого типа, т.е. достаточно сильный, чтобы способствовать предупреждению заболевания и/или предупреждению, смягчению или излечению заболевания.
Как используют в рамках изобретения, поливалентная вакцина представляет собой вакцину, которая содержит два или более различных антигена. В конкретном варианте осуществления этого типа поливалентная молекула стимулирует иммунную систему реципиента против двух или нескольких различных патогенов.
Термины "адъювант" и "иммунный стимулятор" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько вакцинных антигенов/изолятов. Таким образом, "адъюванты" представляют собой средства, которые неспецифически повышают иммунный ответ на конкретный антиген, таким образом, снижая количество антигена, необходимое в любой данной вакцине, и/или частоту инъекций, необходимых для индукции надлежащего иммунного ответа на представляющий интерес антиген. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько антигенов/изолятов вакцин.
Как используют в рамках изобретения, "неадъювантная вакцина" представляет собой вакцину или поливалентную вакцину, которая не содержит адъювант.
Как используют в рамках изобретения, термин "фармацевтически приемлемый" используют в качестве прилагательного для обозначения того, что определяемое им существительное является пригодным для применения в фармацевтическом продукте. Когда его используют, например, для описания эксципиента в фармацевтической вакцине, он характеризует эксципиент как совместимый с другими ингредиентами композиции и не причиняющий вреда предполагаемому животному-реципиенту, например, животному семейства собачьих.
"Парентеральное введение" включает подкожные инъекции, подслизистые инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и инфузию.
Как используют в рамках изобретения, термин "антигенный фрагмент" в отношении конкретного белка (например, белкового антигена) представляет собой фрагмент этого белка, который является антигенным, т.е. способен специфически взаимодействовать с распознающей антиген молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или рецептор T-клеточного антигена. Предпочтительно, антигенный фрагмент по настоящему изобретению является иммунодоминантным для распознавания антителом и/или T-клеточным рецептором. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент в отношении данного белкового антигена представляет собой фрагмент этого белка, который сохраняет по меньшей мере 25% антигенности полноразмерного белка. В предпочтительных вариантах осуществления антигенный фрагмент сохраняет по меньшей мере 50% антигенности полноразмерного белка. В более предпочтительных вариантах осуществления антигенный фрагмент сохраняет по меньшей мере 75% антигенности полноразмерного белка. Антигенные фрагменты могут составлять только 20 аминокислот или наоборот могут представлять собой крупные фрагменты, в которых отсутствует всего одна аминокислота из полноразмерного белка. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 25 до 150 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 50 до 250 аминокислотных остатков.
Как используют в рамках изобретения одна аминокислотная последовательность на 100% "идентична" или обладает 100% "идентичностью" со второй аминокислотной последовательностью, когда аминокислотные остатки обеих последовательностей идентичны. Таким образом, аминокислотная последовательность является на 50% "идентичной" второй аминокислотной последовательности, когда 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнение последовательностей проводят на протяжении непрерывного блока аминокислотных остатков, составляющих данный белок, например, белок или часть полипептида, подвергаемые сравнению. В конкретном варианте осуществления учитывают выбранные делеции или инсерции, которые в остальном могут изменять соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.
Как используют в рамках изобретения, процентную идентичность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей можно определять с использованием алгоритма C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и Clustal W с параметрами выравнивания по умолчанию и параметрами по умолчанию для идентичности. Эти коммерчески доступные программы также можно использовать для определения сходства последовательностей с использованием одних и тех же или аналогичных параметров по умолчанию. Альтернативно можно использовать поиск Advanced Blast с условиями фильтра по умолчанию, например, с использованием программы GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) pileup с использованием параметров по умолчанию.
Для целей настоящего изобретения "инактивированный"микроорганизм представляет собой организм, который способен индуцировать иммунный ответ у животного, но который не способен инфицировать животное. Например, инактивированный вирус бешенства может быть инактивирован посредством средства, выбранного из группы, состоящей из бинарного этиленимина, формалина, бета-пропиолактона, тимеросала или нагревания.
РНК-репликонные частицы альфавирусов по настоящему изобретению можно лиофилизировать и регидратировать посредством стерильного водного разбавителя. С другой стороны, когда РНК-репликонные частицы альфавирусов хранят по отдельности, но предполагается их смешение с другими компонентами вакцины перед введением, РНК-репликонные частицы альфавирусов можно хранить в стабилизирующем растворе этих компонентов, например, в растворе с высоким содержанием сахарозы.
Вакцину по настоящему изобретению можно без труда вводить любым стандартным путем, включая внутривенную, внутримышечную, подкожную, пероральную, интраназальную, внутрикожную и/или внутрибрюшинную вакцинацию. Специалисту в данной области будет понятно, что вакцинную композицию предпочтительно составляют надлежащим образом для каждого типа реципиентного животного и пути введения. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам иммунизации млекопитающего против бешенстваи/или других патогенов млекопитающих. Один такой способ включает инъекцию млекопитающему иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению, так чтобы у млекопитающего продуцировались подходящие антитела против гликопротиена (G) вируса бешенства.
Поливалентные вакцины:
Настоящее изобретение также относится к поливалентным вакцинам.Любойантиген или комбинацию таких антигенов, пригодных в вакцине для млекопитающего, можно добавлять к дефектной в отношении увеличения в количестве РНК-репликонной частице (RP) альфавирусов, которая кодирует антиген вируса бешенства для млекопитающего [например, гликопротеин (G) бешенства] в вакцине. Таким образом, такие поливалентные вакцины включены в настоящее изобретение.
ТАБЛИЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<b></b><b><u>SEQ ID NO:</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Описание</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Тип</u></b><b></b>
1
Гликопротеин бешенства
Нуклеиновая кислота(ДНК)
2
Гликопротеин бешенства
Аминокислотная
3
GGCGCGCCGCACC
нуклеиновая кислота
4
Гликопротеин бешенства
нуклеиновая кислота(РНК)
TTAATTAA
нуклеиновая кислота
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Ген гликопротеина (G) бешенства подвергали кодон-оптимизации для человека. Полученный ген имеет только ~85% нуклеотидную идентичность с последовательностью гликопротеина (G) живого вируса бешенства, несмотря на наличие 100% аминокислотной идентичности.
G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 1)
G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 2)
G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 4)
ПРИМЕРЫ
Приведенные ниже примеры служат для обеспечения дальнейшего понимания изобретения, но они не предназначены для ограничения каким-либо образом эффективного объема изобретения.
ПРИМЕР 1
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, КОДИРУЮЩИХ ГЛИКОПРОТЕИН ВИРУСА БЕШЕНСТВА, В РНК-РЕПЛИКОННЫЕ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСОВ
ВВЕДЕНИЕ
et al.
et
al.
Journal of Virology
Biotechnology
РНК-вирусы можно использовать в качестве векторных носителей для введения вакцинных антигенов, которые встроены способами генной инженерии в их геномы. Однако их применение на сегодняшний день ограничено в основном включением вирусных антигенов в РНК-вирус, а затем введением вируса в хозяина-реципиента. Результатом является индукция защитных антител против включенных вирусных антигенов. РНК-репликонные частицы альфавирусов используют для кодирования патогенных антигенов. Такие платформы репликонов альфавирусов разработаны на основе нескольких различных альфавирусов, включая вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) [Pushko , Virology 239:389-401 (1997)], вирус Синдбис (SIN) [Bredenbeek ,  67:6439-6446 (1993), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме], и вирус леса Семлики (SFV) [Liljestrom and Garoff, (NY) 9:1356-1361 (1991), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме]. Более того, РНК-репликонные частицы альфавирусов являются основой для нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птиц. Они включают вакцину от эпидемической диареи свиней, РНК-частицы (код продукта 19U5.P1), вакцину против свиного гриппа, РНК (код продукта 19A5.D0), вакцину против птичьего гриппа, РНК (код продукта 19O5.D0) и рецептурный препарат, РНК-частицы (код продукта 9PP0.00).
КОНСТРУИРОВАНИЕ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА
Получали вакцину, содержащую РНК-репликонную частицу альфавируса, кодирующую гликопротеин (G) вируса бешенства, из вируса бешенства, упакованного в капсидный белок, и гликопротеинов авирулентного штамма TC-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей. Нуклеотидную последовательность белка G вируса бешенства подвергали кодон-оптимизации для человека. Полученная последовательность обладает только ~85% идентичностью нуклеотидов с последовательностью гликопротеина (G) живого вируса бешенства, несмотря на наличие 100% идентичности аминокислот. Вакцину можно использовать в качестве однократной дозы, вводимой млекопитающему, например, подкожно кошкам и собакам в возрасте 12 недель или старше, или альтернативно в качестве многократных доз, включающих первичное введение, за которым следует одно или несколько вспомогательных введений.
in silico
Аминокислотную последовательность гликопротеина (G) вируса бешенства использовали для получения кодон-оптимизированных (использование кодонов человека) нуклеотидных последовательностей . Оптимизированные последовательности получали в качестве синтетической ДНК от коммерческого поставщика (ATUM, Newark, CA). Таким образом, конструировали синтетический ген [SEQ ID NO: 1] на основе аминокислотной последовательности гликопротеина вируса бешенства. Конструкция (RABV-G) представляла собой аминокислотную последовательность дикого типа [SEQ ID NO: 2], кодон-оптимизированную для человека, с фланкирующей последовательностью, пригодной для клонирования в репликонную плазмиду альфавируса.
.
AscI
PacI
AscI
PacI
AscI
PacI
Репликонные векторы VEE, сконструированные для экспрессии G вируса бешенства, конструировали, как описано выше [см, U.S. 9441247 B2; содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки], со следующими модификациями. Происходящий из TC-83 репликонный вектор "pVEK" [раскрытый и описанный в U.S. 9441247 B2] расщепляли ферментами рестрикции  и . ДНК-плазмиду, содержавшую нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированной открытой рамки считывания гена G бешенства с 5’-фланкирующей последовательностью (5’-GGCGCGCCGCACC-3’) [SEQ ID NO: 3] и 3’-фланкирующей последовательностью (5’-TTAATTAA-3’), аналогичным образом расщепляли ферментами рестрикции  и . Затем синтетическую генную кассету лигировали в расщепленный вектор pVEK и полученный клон переименовали как "pVHV-RABV-G". Номенклатура вектора "pVHV" была выбрана для указания на происходящие из pVEK репликонные векторы, содержащие трансгенные кассеты, клонированные через участки  и  в участок множественного клонирования pVEK.
NotI
in vitro
et al
J Gen Virol.

Получение РНК-репликонных частиц (RP) TC-83 проводили способами, описанными ранее [U.S. 9441247 B2 и U.S. 8460913 B2; содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок]. В кратком изложении, ДНК репликонного вектора pVHV и ДНК плазмид-помощников линеаризовывали с использованием фермента рестрикции  перед транскрипцией  с использованием РНК-полимеразы MegaScript T7 и аналога кэпа (Promega, Madison, WI). Важно, что РНК-помощники, использованные для получения, лишены субгеномной промоторной последовательности VEE, как описано ранее [Kamrud .,  91(Pt 7):1723-1727 (2010)]. Очищенную РНК для репликонных и хелперных компонентов объединяли и смешивали с суспензией клеток Vero, подвергали электропорации в кюветах размером 4 мм и возвращали в клеточную культуральную среду OptiProSFM (Thermo Fisher, Waltham, MA). После инкубации в течение ночи РНК-репликонные частицы альфавирусов очищали от клеток и среды, пропуская суспензию через глубинный фильтр ZetaPlus BioCap (3M, Maplewood, MN), промывая фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% сахарозу (масс./об.), и, наконец, элюируя оставшиеся RP 400 мМ буфером NaCl. Элюированные RP составляли до конечного содержания сахарозы 5% (масс./об.), пропускали через 0,22-микронный мембранный фильтр и распределяли на аликвоты для хранения. Титр функциональных RP определяли с использованием иммунофлуоресцентного анализа монослоев инфицированных клеток Vero.
ПРИМЕР 2
ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РНК-РЕПЛИКОННЫЕ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСОВ, КОДИРУЮЩИЕ ГЛИКОПРОТЕИН ВИРУСА БЕШЕНСТВА, ВВОДИМЫЕ ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ
Первоначальное испытание проводили для оценки безопасности и серологического ответа у собак после вакцинации вакциной на основе RP-G вируса бешенства. Вакцины на основе RP-G вируса бешенства для испытания составляли с 5% сахарозе и 1% собачьей сыворотке в качестве стабилизатора и жидкую вакцину замораживали для хранения. Проводили вакцинацию пяти групп по пять собак, как обобщенно представлено ниже:
ТАБЛИЦА 1
ВВЕДЕНИЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ RP G ВИРУСА БЕШЕНСТВА ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ
Группа
№ животных
Вакцина
RP/доза
Сутки вакцинации
1
5
RP-Бешенство
4,1×10<sup>8</sup>
0
2
5
RP-Бешенство
5,0×10<sup>7</sup>
0
3
5
RP-Бешенство
8,3×10<sup>6</sup>
0
4
5
Коммерческая <sup>#</sup>
0
5
5
Плацебо <sup>*</sup>
3,9×10<sup>7</sup>
0, 21
#

Коммерческая вакцина представляла собой DEFENSOR 3 (продаваемый Zoetis).
*
Плацебо-вакцина представляла собой RP, кодирующие вставку не вируса бешенства для животного семейства собачьих (RP-NR), вместо антигена вируса бешенства.

Собак в возрасте 12-13 недель вакцинировали 1,0 мл соответствующей вакцины (см. таблицу 1 выше), вводимой подкожно в правую лопаточную область. Как указано, собакам в четвертой группе вводили лицензированную в настоящее время коммерческую вакцину против бешенства DEFENSOR 3, продаваемую Zoetis. Собакам в пятой группе вводили постороннюю конструкцию RP, вставку не из вируса бешенства животного семейства собачьих (RP-NR), в качестве плацебо. После вакцинации собак наблюдали в отношении неблагоприятных реакций на вакцины путем проведения клинической оценки и пальпации области инъекции через 4-8 часов после вакцинации и каждые сутки в течение семи суток после вакцинации. Не наблюдали неблагоприятных локальных или системных реакций на какую-либо из вакцин. У собак проводили взятие крови за сутки до вакцинации и с интервалами один месяц после вакцинации в течение первых трех месяцев испытания. Сыворотку тестировали в отношении титра антител против вируса бешенства посредством теста быстрого ингибирования флуоресцентных очагов (RFFIT).
Результаты серологии против бешенства приведены в таблице 2 ниже. Титры выражены в качестве международных единиц на мл (МЕ/ мл), причем 0,5 МЕ/ мл считались защитным титром.
ТАБЛИЦА 2
РЕЗУЛЬТАТЫ СЕРОЛОГИИ ДЛЯ ПЕРИОДА 3 МЕСЯЦА ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ
ID собаки
Группа
Сутки -1
Сутки 30
Сутки 59
Сутки 90
64914
1
< 0,1
37,0
8,9
4,0
65822
1
0,2
33,0
10,0
4,0
66313
1
0,1
38,0
11,1
4,7
66356
1
< 0,1
33,0
11,1
3,3
67743
1
< 0,1
18,5
6,6
3,3
64052
2
< 0,1
12,5
2,6
2,8
66062
2
< 0,1
8,5
3,1
2,2
67034
2
< 0,1
17,5
3,8
2,4
67085
2
< 0,1
14,5
11,1
2,4
68022
2
0,1
11,0
2,8
1,3
63586
3
< 0,1
13,7
3,8
2,2
65864
3
0,2
3,5
1,1
0,7
66593
3
< 0,1
4,3
2,0
1,3
67379
3
< 0,1
4,7
1,3
2,0
67816
3
< 0,1
13,7
1,2
0,9
64451
4
< 0,1
6,6
1,1
0,5
66097
4
< 0,1
0,2
< 0,1
< 0,1
66292
4
< 0,1
2,2
0,4
0,1
67620
4
< 0,1
3,4
0,7
0,1
67867
4
< 0,1
3,4
0,6
0,1
62032
5
< 0,1
< 0,1
< 0,1
< 0,1
66003
5
< 0,1
< 0,1
< 0,1
< 0,1
66984
5
< 0,1
< 0,1
< 0,1
< 0,1
67051
5
< 0,1
0,1
< 0,1
< 0,1
67701
5
< 0,1
0,1
< 0,1
< 0,1
Хотя изначально предполагалось, что исследование закончится через три месяца после вакцинации, исследование продлили, поскольку серологические титры в группах RP вируса бешенства неожиданно: (i) сохранялись на защитных уровни в течение этого периода времени и (ii) были лучшими, чем у лицензированной на настоящий момент коммерческой вакцины против бешенства. Были оставлены пять собак из группы 1, три собаки из группы 2 и две собаки из группы 4.
У оставленных собак проводили взятие крови для получения сыворотки с интервалами приблизительно один месяц для испытания в течение одного года после вакцинации.
Результаты серологии против бешенства для первого года для выбранных собак представлены в таблице 3 ниже. Титры выражают в качестве международных единиц на мл (МЕ/ мл), причем защитным титром считался титр 0,5 МЕ/мл:
ТАБЛИЦА 3
РЕЗУЛЬТАТЫ СЕРОЛОГИИ ДЛЯ ПЕРИОДА 1 ГОД ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ
ID собаки
Группа
Сутки -1
Сутки 30
Сутки 59
Сутки 90
Сутки 120
Сутки 150
Сутки 181
Сутки 210
Сутки 240
Сутки 300
Сутки 330
Сутки 365
64914
1
< 0,1
37,0
8,9
4,0
2,0
0,9
1,3
0,6
2,2
0,6
0,6
0,5
65822
1
0,2
33,0
10,0
4,0
3,8
2,8
2,3
1,6
2,7
2,0
2,2
2,6
66313
1
0,1
38,0
11,1
4,7
5,9
9,0
10,6
11,1
11,8
16,0
10,8
11,0
66356
1
< 0,1
33,0
11,1
3,3
3,4
3,1
1,9
2,3
2,3
1,6
2,3
2,2
67743
1
< 0,1
18,5
6,6
3,3
3,4
1,6
0,5
0,5
0,8
0,5
0,3
0,5
64052
2
< 0,1
12,5
2,6
2,8
3,1
3,0
2,1
1,6
2,5
0,8
0,7
2,0
66062
2
< 0,1
8,5
3,1
2,2
1,8
2,7
1,3
1,1
1,1
1,0
0,6
1,5
68022
2
0,1
11,0
2,8
1,3
0,7
0,6
0,1
0,1
0,1
<0,1
<0,1
<0,1
64451
4
< 0,1
6,6
1,1
0,5
0,1
0,1
0,1
0,1
0,2
<0,1
<0,1
0,1
67620
4
< 0,1
3,4
0,7
0,1
<0,1
0,1
<0,1
<0,1
0,1
<0,1
≤0,1
<0,1
После этого первоначального испытания следовало второе испытание (в настоящее время продолжающееся), которое дало аналогичные результаты, по меньшей мере на протяжении истекшего периода шести месяцев.
ПРИМЕР 3
ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РНК-РЕПЛИКОННЫЕ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСОВ, КОДИРУЮЩИЕ ГЛИКОПРОТЕИН ВИРУСА БЕШЕНСТВА, ВВОДИМЫЕ ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ
,
Первоначальное испытание проводили для оценки безопасности и серологического ответа у кошек после вакцинации RP-вакциной на основе G вируса бешенства. RP-вакцины на основе G вируса бешенства для этого испытания составляли в экспериментальном жидком стабилизаторе [см., например U.S. 9314519 B2] и хранили охлажденными при 2-7°C. Вакцинировали четыре группы кошек, как обобщенно представлено в таблице 4 ниже:
ТАБЛИЦА 4
ВВЕДЕНИЕ RP-ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ G ВИРУСА БЕШЕНСТВА ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ
Группа
№ животных
Вакцина
RP/доза
1
10
RP-Бешенство
2,7×10<sup>7</sup>
2
10
RP-Бешенство
2,6×10<sup>6</sup>
3
10
RP-Бешенство
4,0×10<sup>5</sup>
4
5
Коммерческая <sup>#</sup>
#

Коммерческая вакцина представляла собой DEFENSOR 3 (продаваемую Zoetis).

Кошек в возрасте 15-16 недель вакцинировали 1,0 мл репрезентативной вакцины (см. таблицу 4 выше), вводимой подкожно в правую лопаточную область. Как указано, кошкам в четвертой группе вводили лицензированную в настоящее время коммерческую вакцину против бешенства DEFENSOR 3, продаваемую Zoetis, которая содержит химически инактивированный вирус бешенства вместе с адъювантом гидроксидом алюминия.
После вакцинации кошек наблюдали в отношении неблагоприятных реакций на вакцины путем проведения клинической оценки и пальпации области инъекции через 4-8 часов после вакцинации и каждые сутки в течение семи суток после вакцинации. Кошек также наблюдали в течение периода 10-15 минут сразу после вакцинации в отношении системных реакций. Некоторые немедленные системные реакции наблюдали у кошек в группах 1, 2 и 3, что указывало на то, что кошки испытывали жжение и болезненную реакцию при инъекции. Эти реакции сохранялись в течение не более чем пять минут. Эти реакции области инъекции были приписаны композиции экспериментального жидкого стабильного состава. Не наблюдали локальных неблагоприятных реакций после вакцинации. У кошек проводили взятие сыворотки за сутки до вакцинации и с интервалами один месяц после вакцинации в ходе испытания в течение трех месяцев. Сыворотку тестировали в отношении титра антител к вирусу бешенства посредством теста быстрого ингибирования флуоресцентных очагов (RFFIT). Результаты серологии против вируса бешенства представлены в таблице 5 ниже. Титры выражены в качестве международных единиц на мл (МЕ/ мл), причем 0,5 МЕ/мл считаются защитным титром.
ТАБЛИЦА 5
РЕЗУЛЬТАТЫ СЕРОЛОГИИ ДЛЯ ПЕРИОДА 5 МЕСЯЦЕВ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ
ID ЖИВОТНОГО
Группа
Сутки -1
Сутки 30
Сутки 58
Сутки 91
Сутки 120
Сутки 149
16CNH2
1
<0,1
119,0
69,0
40,0
37,0
106,0
16CNL4
<0,1
30,0
24,0
16,0
12,5
11,0
16CNM6
<0,1
37,0
28,0
32,0
29,0
71,0
16JNA2
<0,1
19,0
30,0
27,0
22,0
23,0
16JNE1
<0,1
45,0
31,0
28,0
15,0
23,0
16JNF1
<0,1
113,0
40,0
31,0
27,0
34,0
16JNG3
<0,1
45,0
31,0
16,0
12,5
26,0
16JNI1
<0,1
26,0
25,0
28,0
10,0
22,0
16JNM1
<0,1
27,0
30,0
31,0
27,0
30,0
16JNM2
<0,1
50,0
28,0
32,0
26,0
26,0
Геометрический средний титр
<0,1
42,7
32,0
27,1
20,0
30,4
16CMX5
2
<0,1
25,0
28,0
32,0
33,0
106,0
16CNF4
<0,1
10,0
9,0
5,0
5,5
5,1
16CNH4
<0,1
24,0
14,8
6,0
10,8
17,0
16CNJ2
<0,1
32,0
31,0
27,0
22,0
27,0
16JNB3
<0,1
25,0
31,0
31,0
18,0
23,0
16JNB4
<0,1
23,0
30,0
31,0
23,0
26,0
16JNG2
<0,1
10,5
12,6
11,0
13,5
21,0
16JNJ1
<0,1
11,0
22,0
25,0
6,0
23,0
16JNJ2
<0,1
23,0
28,0
28,0
18,0
23,0
16JNK1
<0,1
10,0
13,4
7,0
8,3
5,0
Геометрический средний титр
<0,1
17,6
20,2
16,3
13,6
19,6
16CMV3
3
<0,1
6,0
6,0
6,0
12,3
9,4
16CNB4
<0,1
25,0
28,0
25,0
16,0
24,0
16CNB5
<0,1
33,0
36,0
40,0
27,0
38,0
16CNC5
<0,1
25,0
22,0
8,0
13,5
19,0
16CNC6
<0,1
26,0
24,0
20,0
20,0
28,0
16CNM7
<0,1
68,0
126,0
134,0
115,0
210,0
16JNF2
<0,1
11,0
12,6
6,0
10,8
9,4
16JNG1
<0,1
8,0
14,8
7,0
12,3
11,0
16JNJ5
<0,1
19,0
14,8
25,0
23,0
27,0
16JNK2
<0,1
10,5
3,1
3,0
2,8
3,5
Геометрический средний титр
<0,1
18,1
17,9
14,5
16,4
19,8
16CNM8
4
<0,1
26,0
10,0
3,0
6,3
9,4
16CNO1
<0,1
24,0
14,1
6,0
11,5
23,0
16JNC1
<0,1
11,0
3,8
1,0
1,0
1,5
16JNJ3
<0,1
9,4
2,8
1,0
1,3
2,2
16JNO1
<0,1
113,0
31,0
14,0
9,0
8,8
Геометрический средний титр
<0,1
23,6
8,6
3,0
3,9
5,7
RP-вакцина против вируса бешенства индуцирует высокие серологические титры против бешенства при введении кошкам в качестве однократной дозы. Примечательно, что титры RFFIT у кошек являются более высокими, чем титры, наблюдаемые для собак, вакцинированных сходной дозой. Титр 0,5 МЕ/мл в соответствии с тестом RFFIT считается защитным титром, однако известно, что кошки с серологическим титром ниже этого уровня часто защищены от заражения вирулентным вирусом в испытаниях длительного иммунитета. Все три группы, вакцинированных различными дозами RP-вакцины против вируса бешенства, имеют более высокие групповые геометрические средние титры против вируса бешенства согласно RFFIT, чем группа, вакцинированная лицензированным в настоящее время коммерческим продуктом против бешенства, которая имеет указание на ярлыке о трехлетней длительности иммунитета.
После этого первоначального испытания следовало второе испытание (в настоящее время продолжающееся), которое дало аналогичные результаты, по меньшей мере на протяжении истекшего периода шести месяцев.
Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным в настоящем описании, станут понятными специалистам в данной области из приведенного выше описания. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Кроме того, должно быть понятно, что все размеры оснований или размеры аминокислот, и все величины молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предоставлены для описания.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
<110>  Intervet, Inc.
Intervet, International, BV
Tarpey, Ian
<120> ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА
<130>  24532
<150>  62/581,955
<151>  2017-11-06
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1575
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  кодон-оптимизированная для человека
<400>  1
atggtgccgc aggctctcct gtttgtcccc cttctggtct ttccattgtg ttttgggaaa       60
ttccctatct acacaattcc ggacaagttg ggaccctgga gcccaattga cattcatcat      120
ctcagctgcc cgaacaattt ggtcgtggag gacgaaggat gcaccaacct gtcggggttc      180
tcctacatgg aattgaaagt cggatacatc agtgccatta agatgaacgg gttcacttgc      240
acaggcgtcg tgactgaagc tgagacatac actaacttcg tgggatatgt cactaccact      300
ttcaaaagaa agcatttccg ccctactcct gatgcttgta gggccgcata caactggaag      360
atggccggtg accccagata tgaggaatca cttcacaatc cgtaccctga ctaccactgg      420
cttcggactg tcaaaaccac caaggagtca ctcgtgatca ttagtccaag tgtggctgat      480
cttgacccat acgaccggtc acttcactca cgggtgttcc cgggggggaa ttgctctggt      540
gtcgcagtgt cgtcaaccta ctgctccaca aaccacgatt acaccatttg gatgccagaa      600
aatcctcggc ttggtatgtc atgtgacatt ttcaccaatt ctcgggggaa gagggcttcc      660
aaagggtctg aaacttgcgg ctttgtcgat gagcggggct tgtataagtc acttaaaggt      720
gcttgcaaac tcaagctttg tggtgtcttg ggattgagat tgatggatgg aacttgggtc      780
gcaatgcaga cttctaacga aaccaaatgg tgccctcccg gacagcttgt gaatttgcat      840
gactttcgct ctgacgaaat tgagcatctt gtcgtcgagg agttggtcaa gaagcgggaa      900
gagtgtctgg atgctttgga atcaatcatg accaccaagt cagtgtcttt cagacggctc      960
tcacatctta ggaaattggt gccaggtttt ggaaaagcat ataccatttt caacaagacc     1020
cttatggaag ccgatgctca ctacaagtct gtcaggactt ggaatgagat catcccgtct     1080
aaagggtgtc ttagggtcgg agggagatgt catcctcatg tcaacggagt ctttttcaat     1140
ggtatcattc ttggacctga cggaaatgtc cttatccctg agatgcaatc ttccctcctc     1200
cagcaacaca tggaacttct tgtctcatcg gtcatccccc ttatgcaccc cctggctgac     1260
ccatcaaccg tgttcaagaa cggtgacgag gcagaggatt ttgtcgaggt ccaccttccc     1320
gatgtgcatg aacggatctc tggtgtcgac cttggactcc ctaactgggg aaagtatgtc     1380
cttctgtcgg caggagccct gactgccttg atgttgatta tcttcctgat gacttgttgg     1440
aggagagtca atcggtcgga gccaacacaa cataatctca gaggaacagg aagggaggtg     1500
tcagtcacac cccaaagcgg gaagatcatt tcgtcttggg agtcatacaa gagcggaggt     1560
gaaaccggac tgtga                                                      1575
<210>  2
<211>  524
<212>  БЕЛОК
<213>  Вирус бешенства
<400>  2
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
20                  25                  30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35                  40                  45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
50                  55                  60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85                  90                  95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
100                 105                 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115                 120                 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val
130                 135                 140
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp
145                 150                 155                 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly
165                 170                 175
Asn Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
180                 185                 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys
195                 200                 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu
210                 215                 220
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225                 230                 235                 240
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245                 250                 255
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro
260                 265                 270
Pro Gly Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu
275                 280                 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290                 295                 300
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305                 310                 315                 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325                 330                 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
340                 345                 350
Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly
355                 360                 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370                 375                 380
Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385                 390                 395                 400
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Val Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His
405                 410                 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asn Gly Asp Glu Ala Glu
420                 425                 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Glu Arg Ile Ser Gly
435                 440                 445
Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala
450                 455                 460
Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Trp
465                 470                 475                 480
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
485                 490                 495
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
500                 505                 510
Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Thr Gly Leu
515                 520
<210>  3
<211>  13
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  5'-фланкирующая последовательность
<400>  3
ggcgcgccgc acc                                                          13
<210>  4
<211>  1575
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  кодон-оптимизированная для человека
<400>  4
auggugccgc aggcucuccu guuugucccc cuucuggucu uuccauugug uuuugggaaa       60
uucccuaucu acacaauucc ggacaaguug ggacccugga gcccaauuga cauucaucau      120
cucagcugcc cgaacaauuu ggucguggag gacgaaggau gcaccaaccu gucgggguuc      180
uccuacaugg aauugaaagu cggauacauc agugccauua agaugaacgg guucacuugc      240
acaggcgucg ugacugaagc ugagacauac acuaacuucg ugggauaugu cacuaccacu      300
uucaaaagaa agcauuuccg cccuacuccu gaugcuugua gggccgcaua caacuggaag      360
auggccggug accccagaua ugaggaauca cuucacaauc cguacccuga cuaccacugg      420
cuucggacug ucaaaaccac caaggaguca cucgugauca uuaguccaag uguggcugau      480
cuugacccau acgaccgguc acuucacuca cggguguucc cgggggggaa uugcucuggu      540
gucgcagugu cgucaaccua cugcuccaca aaccacgauu acaccauuug gaugccagaa      600
aauccucggc uugguauguc augugacauu uucaccaauu cucgggggaa gagggcuucc      660
aaagggucug aaacuugcgg cuuugucgau gagcggggcu uguauaaguc acuuaaaggu      720
gcuugcaaac ucaagcuuug uggugucuug ggauugagau ugauggaugg aacuuggguc      780
gcaaugcaga cuucuaacga aaccaaaugg ugcccucccg gacagcuugu gaauuugcau      840
gacuuucgcu cugacgaaau ugagcaucuu gucgucgagg aguuggucaa gaagcgggaa      900
gagugucugg augcuuugga aucaaucaug accaccaagu cagugucuuu cagacggcuc      960
ucacaucuua ggaaauuggu gccagguuuu ggaaaagcau auaccauuuu caacaagacc     1020
cuuauggaag ccgaugcuca cuacaagucu gucaggacuu ggaaugagau caucccgucu     1080
aaaggguguc uuagggucgg agggagaugu cauccucaug ucaacggagu cuuuuucaau     1140
gguaucauuc uuggaccuga cggaaauguc cuuaucccug agaugcaauc uucccuccuc     1200
cagcaacaca uggaacuucu ugucucaucg gucauccccc uuaugcaccc ccuggcugac     1260
ccaucaaccg uguucaagaa cggugacgag gcagaggauu uugucgaggu ccaccuuccc     1320
gaugugcaug aacggaucuc uggugucgac cuuggacucc cuaacugggg aaaguauguc     1380
cuucugucgg caggagcccu gacugccuug auguugauua ucuuccugau gacuuguugg     1440
aggagaguca aucggucgga gccaacacaa cauaaucuca gaggaacagg aagggaggug     1500
ucagucacac cccaaagcgg gaagaucauu ucgucuuggg agucauacaa gagcggaggu     1560
gaaaccggac uguga                                                      1575
<---