СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ ДЛЯ МАЛОИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ ТРИСОМИИ 21-ОЙ ХРОМОСОМЫ У ПЛОДА ПО КРОВИ БЕРЕМЕННОЙ ЖЕНЩИНЫ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПРАЙМЕРЫ И ЗОНДЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ В СООТВЕТСТВИИ С ЭТИМ СПОСОБОМ, И МАЛОИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ, В КОТОРОМ ИСПОЛЬЗУЮТ УКАЗАННЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ЗОНДЫ

1. Способ получения ДНК-праймеров и зондов для малоинвазивной пренатальной ПЦР-диагностики трисомии 21-ой хромосомы у плода по крови беременной женщины, в котором используют:
(а) сайт-специфичную(-ые) эндонуклеазу(-ы) рестрикции, чувствительную(-ые) к метилированию,
(б) образец гиперметилированной или фетальной ДНК человека,
(в) образец гипометилированной ДНК или ДНК взрослого человека,
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
(1) выбирают сайт дифференциального метилирования фетальной ДНК 21-ой хромосомы и ДНК 21-ой хромосомы взрослого человека, чувствительный к упомянутой эндонуклеазе(-ам),
(2) синтезируют прямой и обратный праймер, соответствующие ампликону длиной от 60 до 300 пар нуклеотидов, содержащему сайт(ы) дифференциального метилирования 21-ой хромосомы, а также зонд, соответствующий этому ампликону,
(3) проводят полимеразную цепную реакцию смеси образцов (б) и (в) после их обработки эндонуклеазой рестрикции (а), по меньшей мере, при трех различных соотношениях концентрации этих образцов,
(4) отбирают пары праймеров и зонды, обеспечивающие эффективность реакции ПЦР выше 90% и линейность при изменении относительной концентрации образцов (б) и (в) выше 0,9.
2. Набор для малоинвазивной пренатальной ПЦР-диагностики трисомии 21-ой хромосомы у плода по крови беременной женщин, содержащий, по меньшей мере, одну пару, состоящую из прямого и обратного праймеров, полученных в соответствии со способом по п. 1, и, по меньшей мере, один соответствующий им зонд.
3. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что размер ампликона составляет целое число в диапазоне от 60 до 300 пар нуклеотидов, предпочтительно, целое число в диапазоне от 71 до 105 пар нуклеотидов.
4. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он включает в себя
пару праймеров SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42, и/или гомологичную им, по меньшей мере, на 95% пару праймеров, и/или
пару праймеров SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72, и/или гомологичную им, по меньшей мере, на 95% пару праймеров, и/или
пару праймеров SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102, и/или гомологичную им, по меньшей мере, на 95% пару праймеров.
5. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя ДНК индивидуума с трисомией 21-ой хромосомы для положительного контроля.
6. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя термостабильную ДНК-полимеразу 10 единиц/мкл.
7. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя водный раствор, содержащий:
приблизительно 67 мМ трис-HCl, pH 8,8 при 25°C,
4
2
4
приблизительно 16,6 мМ (NH)SO,
2
приблизительно 6,7 мМ MgCl,
приблизительно 6,7 мкм ЭДТА,
приблизительно 170 мкг БСА, и
смесь четырех основных dNTP в концентрации приблизительно 0,2 мМ каждого.
8. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя воду ампулированную.
9. Малоинвазивный способ пренатальной ПЦР-диагностики трисомии 21-ой хромосомы у плода по крови беременной женщины, в котором используют:
(а) образец крови беременной женщины;
(б) праймеры и зонды по любому из пп. 1 или 4;
(в) сайт-специфичную(-ые) эндонуклеазу(-ы) рестрикции, чувствительную(-ые) к метилированию,
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
(1) выделяют ДНК из образца (а);
(2) обрабатывают ДНК, выделенную на стадии (1) эндонуклеазами (в);
(3) проводят количественную полимеразную цепную реакцию продуктов реакции, полученных на стадии (2), состоящую из начального плавления и ряда циклов из плавления, отжига и синтеза;
(4) определяют количество продуктов ПЦР посредством флуоресцентной спектрометрии в присутствии зондов (б).
10. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что в нем дополнительно используют:
(г) пару праймеров и зонд к гиперметилированному фрагменту референсной хромосомы, полученных аналогично способу по п. 1, при этом
(4) в качестве диагностического показателя используют соотношение сигналов от зондов (б) и (г).
11. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что референсная хромосома представляет собой 13-ую хромосому.
12. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что пара праймеров и зонд (г) имеют последовательности SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132 и SEQ ID NO: 133, и/или гомологичную им, по меньшей мере, на 95% последовательность.
13. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что сайт-специфичная эндонуклеаза рестрикции, чувствительная к метилированию, представляет собой HpaII и/или BstFNI.
14. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что при проведении стадии ПЦР
проводят начальное плавление в течение 2 мин при температуре 95°C,
50-60 раз проводят цикл, включающий плавление при 94-96°C в течение от 10-30 с, отжиг и синтез при температуре 62-66°C в течение 30-60 мин,
детекцию продуктов ПЦР проводят во время стадии отжига.
15. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что в нем, расщепление проводят 100 единицами эндонуклеазы в течение 16 ч.
16. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что в нем концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 500 нМ, зондов - 250 нМ, а температура отжига - 60°C.