СПОСОБ ОТБОРА И ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНЫХ И МУЛЬТИСПЕЦИФИЧНЫХ НАЦЕЛИВАЮЩИХ ГРУПП С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ, ВКЛЮЧАЮЩИХ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ДВЕ РАЗЛИЧНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ ГРУППИРОВКИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ получения биспецифичного антитела, включающий стадию инкубирования
(i) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков,
(ii) фрагмента в виде неполного одноплечевого антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела,
при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт,
при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и
m
при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце,
и
(iii) фермента сортазы А,
и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.
2. Способ получения биспецифичного антитела, включающий следующие стадии:
(i) определение маркеров поверхности клетки, присутствующих в образце, содержащем клетки, и выбор из них по меньшей мере первого маркера поверхности клетки и второго маркера поверхности клетки,
m
(ii) инкубирование (а) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab антитела или scFv антитела специфично связывается с первым маркером поверхности клетки или его лигандом, (б) фрагмента в виде неполного одноплечевого антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым маркером поверхности клетки или его лигандом, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А,
и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.
3. Способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов, включающий следующие стадии:
m
(i) определение специфичности связывания и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полувыведения in vivo множества биспецифичных антител, полученных объединением (а) каждого члена первого множества фрагментов Fab антитела или фрагментов scFv антитела, при этом каждый член содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab или scFv антитела специфично связывается с первым эпитопом или антигеном, с (б) каждым членом из множества фрагментов в виде неполного одноплечевого антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым эпитопом или антигеном, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) ферментом сортазой А,
и
(ii) выбор биспецифичного антитела с подходящей специфичностью связывания и/или селективностью, и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полувыведения in vivo и, посредством этого, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.
4. Биспецифичное антитело, полученное способом по п. 1 или 2.
5. Биспецифичное антитело, содержащее аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в одной из его тяжелых цепей.
6. Способ по любому из пп. 1-3 или антитело по любому из пп. 4 или 5, характеризующееся тем, что область Fc содержит мутацию встречающегося в природе аминокислотного остатка в положении 329 и по меньшей мере одну другую мутацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, содержащей аминокислотные остатки в положении 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 и 331, на другой остаток, где остатки в области Fc пронумерованы согласно индексу EU по Kabat, причем замена данных конкретных аминокислотных остатков приводит к изменению эффекторной функции области Fc по сравнению с немодифицированной (дикого типа) областью Fc.
7. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифичное антитело по п. 4 или 5.
8. Применение биспецифичного антитела по п. 4 или 5 при изготовлении лекарственного средства.