СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ МОЗГОВЫХ ГЕМОРРАГИЙ У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ МЫШЕЙ
METHOD FOR MODELING THE DEVELOPMENT OF BRAIN HEMORRHAGE IN HYPERTENSIVE MICE

Изобретение относится к области медицины, в частности, к экспериментальной медицине и касается способов моделирования развития мозговых геморрагий у гипертензивных мышей, в частности пред- и постгемморагического состояния животных.
Известен способ моделирования мозговых геморрагий у новорожденных крыс (см. патент РФ № 2505865, МПК G09B23/28, опуб. 27.01.2014), заключающийся в том, что крыс в возрасте 1-3 дня помещают в камеру и подвергают воздействию звука силой 70 дБ, частотой 110 Гц на протяжении 60 мин. Через 4 часа после отмены стресса у всех животных появляются признаки развития внутримозговой гипотензии и гипоксии. 24 часа спустя от начала эксперимента у 100% новорожденных крыс развиваются мелкоочаговые мозговые геморрагии в коре головного мозга. Метод может быть использован с целью исследования механизмов и поиска ранних маркеров развития церебральных геморрагий в неонатальный период, а также для поиска новых подходов и лекарственных средств профилактики и лечения мозговых геморрагий у неонатальных детей.
Однако, данный метод не воспроизводится у взрослых животных и пригоден только для индуцирования и изучения пред- и постгеморрагического состояния в первые дни после рождения.
Известен также способ моделирования стресс-индуцированной гипертонии на животных (см. патент РФ № 2409872, МПК G09B23/28, опуб. 20.01.2011), характеризующийся тем, что животных подвергают социальному стрессу в виде перенаселения или изоляции в течение не менее 4 месяцев.
Однако, способ не позволяет осуществлять моделирование мозговых геморрагий у гипертензивных мышей, в частности пред- и постгеморрагического состояния животных.
2
Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования внутримозговых гематом при артериальной гипертензии у половозрелых крыс (Способ моделирования внутримозговых гематом при артериальной гипертензии // Патол. физиол. эксперим. тер. – 1989. -3: 80-81). Способ заключается в том, что взрослых крыс линии КСГСИ со спонтанной гипертензией, склонных к инсульту, фиксируют на спине, обеспечивая полную иммобилизацию. Затем крыс подвергают воздействию сильного прерывистого звука (120 дБ) по модифицированной методике О.В. Крушинского и Л.П. Доброхотовой (Крушинский Л.В., Доброхотова Л.П. // Бюл. эксперим. биол. 1957. № 8., С. 46): звук 1 мин, перерыв 1 мин, прерывистый звук 15 мин (10 с звук, 10 с перерыв), перерыв 5 мин, звук 1 мин. Этот цикл повторяется 5 раз с минутными интервалами так, чтобы общая продолжительность сочетанного действия стрессорных факторов составляла 2 часа. Воздействие звуковым стрессом осуществляется в течение 2 часов. При сочетанном воздействии иммобилизации и звукового раздражителя у 76% животных на фоне резкого полнокровия мозга развивается крупноочаговые геморрагии в разных областях мозга – в подкорковых узлах, зрительных буграх с прорывом в желудочки. В веществе мозга крупные кровоизлияния сопровождаются разрушением ткани мозга на значительном протяжении до 5 мм.
Недостатком указанного способа является использование специальных линейных крыс, у которых показатели артериального давления достигают 200 до 250 мм рт.ст. Это обязательное условие для развития стресс-индуцированных мозговых геморрагий, т.к. крысы с более низким уровнем артериального давления более устойчивы к инсульту. При этом, даже при достижении ярко выраженного гипертензивного статуса развитие мозговых геморрагий отмечается только у 76% крыс, т.е. способ не обеспечивает 100% воспроизводимость. Кроме этого, способ имеет высокую травматичность, поскольку наблюдается гибель животных за счет развития крупных кровоизлияний, что делает его непригодным для широкого использования.
Технической проблемой является возможность изучения развития пред- и постгеморрагического состояния у гипертензивных мышей и, как следствие, получить новые знания о патогенезе заболеваний центральной нервной системы.
Техническим результатом является моделирование условий нарушения дренажной функции мозга по лимфатическим сосудам путём обеспечения обширных геморрагий в коре головного мозга и в области желудочков.
Техническая проблема решается тем, что в способе моделирования развития мозговых геморрагий у гипертензивных лабораторных животных, заключающемуся в иммобилизации животных и воздействии стрессорного фактора, согласно изобретению, в качестве стрессорного фактора используют создание условий социального стресса в виде перенаселения мышей в течение не менее 4-х месяцев и при достижении гипертензивных уровней артериального давления и частоты сердечных сокращений у животных осуществляют пережатие лимфатических сосудов выше глубоких шейных лимфатических узлов, через 3 суток после воздействия стрессорного фактора осуществляют иммобилизацию путем фиксации животного за лапки в течение 2-х часов спиной вниз, затем животное освобождают и в течение первых 8 часов осуществляют оценку развития предгеморрагического состояния по наличию острого нарушения венозного и микроциркуляторного звена мозгового кровотока, а спустя 24 часа после иммобилизации осуществляют оценку развития постгеморрагического состояния по наличию внутричерепных геморрагий в коре и в области желудочков головного мозга.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа моделирования мозговых геморрагий у гипертензивных мышей, в котором при достижении гипертензивных уровней артериального давления и частоты сердечных сокращений у животных осуществляют пережатие лимфатических сосудов выше глубоких шейных лимфатических узлов и через 3-е суток осуществляют иммобилизацию в течение 2-х часов путем привязывания спиной вниз за лапки.
Через 24 часа после иммобилизации у 100% мышей развиваются обширные внутричерепные геморрагии в коре и в области желудочков головного мозга, что фиксируется гистологически и обозначается как постгеморрагический период. Период в течение первых 8 часов после иммобилизации обозначается как пред-геморрагический, который также фиксируется гистологически и характеризуется острым нарушением венозного и микроциркуляторного звена мозгового кровотока.
У гипертензивных мышей, которые повергаются одному стрессу без перевязки лимфатических сосудов, не отмечается развития мозговых геморрагий. В этой группе животных наблюдаются ишемические явления в тканях мозга, но без признаков повреждения церебральных сосудов.
Данная модель имеет важное преимущество по отношению к уже существующим методам экспериментального индуцирования мозговых геморрагий, т.к. основана на принципиально новых подходах к моделированию, основанному на нарушении дренажной функции мозга по лимфатическим сосудам. Предлагаемая модель является важным инструментом изучения роли лимфатической системы в менингеальных оболочках мозга, которая была открыта в 2015 году (Nature, 2015; 523: 337–341. DOI:10.1038/nature14432) и которая требует новых технологий для ее детального исследования.
Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».
Способ поясняется иллюстрациями, где представлены:
на фиг. 1 - стандартная операционная процедура прямой регистрации сигналов кровяного давления и частоты сердечных сокращений путём имплантации полиэтиленового катетера в сонную артерию;
на фиг.2 - схема наложения лигатуры на лимфатический сосуд выше глубокого шейного лимфатического узла;
на фиг.3. - гистологические данные состояния тканей мозга у гипертензивных мышей, подвергнутых хирургической окклюзии лимфатических сосудов на шее и иммобилизационному стрессу: А – нормальное состояния тканей коры больших полушарий; Б - мозговое кровоизлияние в области коры больших полушарий; В – нормальный размер бокового желудочка головного мозга; Г – расширение бокового желудочка у мышей после перевязки лимфатических сосудов; Д и Е – кровоизлияния в область желудочка и рядом с ним у мышей после перевязки лимфатических сосудов;
на фиг.4. – гистологическая картина пред-геморрагических изменений сосудов малого и крупного калибра спустя 8 часов после сочетанного воздействия стресса и окклюзии лимфатических сосудов у гипертензивных мышей: А – нормальное состояние сосудов; Б – выраженное кровенаполнение сосудов мозга с развитием периваскулярного отека (показано стрелками).
Способ осуществляется следующим образом.
2
Используют биомодель – беспородных мышей. Воздействуют на них стрессорным фактором путём создания условий социального стресса в виде перенаселения. Для этого мышей помещают в клетку из расчёта соотношения площади клетки к массе тела, равном 0,3. В частности, 10 мышей массой 20 гр. на площади 60 см.
В течение 4-х месяцев у животных проводят измерения уровня артериального давления и частоты сердечных сокращений в соответствии со стандартной операционной процедурой прямой регистрации сигналов кровяного давления путём имплантации полиэтиленового катетера в сонную артерию.
При достижении гипертензивных уровней артериального давления и частоты сердечных сокращений у животных осуществляют пережатие лимфатических сосудов выше глубоких шейных лимфатических узлов, через 3-е суток после операции проводят иммобилизацию животных в течение 2-х часов путем привязывания спиной вниз за лапки.
Развитие геморрагий через 24 часа после стрессирования животных с перевязанными лимфатическими узлами в мозге фиксируется гистологически.  Пред-геморрагический период – это время в течение суток после указанных стрессирований мышей (воздействия стрессорного фактора и иммобилизации). Через 8 часов после окончания воздействия иммобилизации отмечается полнокровие венозных сосудов головного мозга и сосудов микроциркуляторного звена, являющееся признаком повышения внутричерепного давления.
2
2
Эксперименты проводились на беспородных белых мышах, которых селили в клетки в условия высокой популяционной плотности, когда соотношение площади и массы тела было (см/г массы тела = 0,3), то есть в три раза превышающее нормативы. В частности, в клетку площадью 60 см было поселено 10 мышей массой 20 гр.
Было использовано 70 мышей массой 20 гр, распределённых по 5 клеткам, где из каждой клетки брали по 5 мышей единовременно раз в месяц для проверки показателей давления и пульса, после чего эти животных уже не участвовали в эксперименте.
Животные находились в одинаковых условиях с постоянным доступом к еде и воде. За животными вели наблюдения.
На протяжении 4-х месяцев ежемесячно у части животных проводили контрольные измерения уровня артериального давления и частоты сердечных сокращений в соответствии со стандартной операционной процедурой прямой регистрации сигналов кровяного давления путём имплантации полиэтиленового катетера в сонную артерию.
Результаты эксперимента представлены в таблице.
Таблица
Показатели среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений у мышей, проживающих в течение 4 месяцев в условиях высокой популяционной плотности
Показатели
Контроль n=10
1 месяц n=10
2 месяца n=10
3 месяца n=10
4 месяца n=10
Среднее артериальное давление, мм рт.ст.
109±3
115±4
112±5
117±3
149±3*
Частота сердечных сокращений, уд/мин
382±14
397±12
394±11
401±12
444±14*
*-p<0.05 по отношению к контролю
При наличии высоких показателей артериального давления и частоты сердечных сокращений мышей подвергают операции наложения лигатуры на лимфатические сосуды, несущие спинномозговую жидкость из мозга в глубокие шейные лимфатические узлы (см. фиг.2).
Таким образом, создаются условия нарушения дренажной функции мозга.
Через трое суток животных подвергают иммобилизационному стрессу. Для этого их привязывают спиной вниз за лапки в течение 2 часов. Через сутки после стресса у 100% животных наблюдаются мозговые кровоизлияния в коре головного мозга и в области желудочков.
Данные гистологического анализа состояния тканей мозга у гипертензивных мышей, подвергающихся стрессу на фоне острого нарушения дренажной функции мозга, представлены на Фиг. 3
Через 8 часов после комбинированного воздействия стресса и острого нарушения дренажа спинномозговой жидкости отмечается полнокровие венозных сосудов головного мозга и сосудов микроциркуляторного звена, являющееся признаком повышения внутричерепного давления (см. Фиг. 4).
Таким образом, получена новая модель развития мозговых геморрагий у гипертензивных животных путем комбинирования стресса и нарушения дренажной функции мозга с возможностью изучения процессов в пред- и постгеморрагийческий периоды.
Предлагаемый метод позволит существенно расширить научные представления о механизмах очищения мозга от продуктов метаболизма и выявить инновационные пути коррекции дренажной функции мозга. Это позволит разработать новые стратегии в предотвращении и лечении заболеваний центральной нервной системы, связанные с аутоиммунными процессами, включая инсульты, болезнь Альцгеймера, онкологию мозга и др.