Роль молекулярно-генетических методов в таксономии хламидий и диагностике хламидиозов

Роль молекулярно-генетических методов в таксономии хламидий и диагностике хламидиозов*

Т.И. Полянина, соискатель, В.А. Фёдорова, д.м.н., профессор, С.С. Коннова, аспирантка, С.С. Зайцев, соискатель, Саратовский НИВИ РАСХН; В.Л. Мотин, к.б.н., профессор, Университет Техаса, г. Галвестон, США

Хламидиозы (Chlamydiosis) — это группа заболеваний, включающая генитальные и экстра-генитальные патологии, вызываемые представителями семейства Chlamydiaceae. Хламидиозами болеют все виды млекопитающих, птиц, а также рептилии и амфибии [1]. Особенностью хламидиозов является зачастую бессимптомное течение болезни, которое может вызывать серьёзные нарушения в организме, приводящие к бесплодию, самопроизвольным абортам, пневмонии, полиартритам, энтеритам, энцефаломиелитам и конъюнктивитам и т.д. Это позволяет возбудителям персистировать в организме в течение многих лет, а иногда и десятилетий, вызывая серьёзные заболевания и беспрепятственно распространяясь среди людей и животных. Большое значение имеют половой и контактный пути заражения, а при пситтакозе заражение людей возможно и алиментарным путём при употреблении инфицированных мясных и молочных продуктов, не подвергнутых качественной термической обработке [1, 2].

Хламидии являются древними микроорганизмами. Современными молекулярными методами было установлено, что хламидии появились на Земле около пятидесяти миллионов лет назад, и их развитие пошло по пути редуктивной эволюции, результатом которой явилась потеря около 900 генов [8].

Впервые возбудитель хламидиоза был открыт S. Prowazek и L. Halberstadter в 1907 г. и назывался в честь первооткрывателей гальпровией. Впоследствии данный возбудитель также называли бедсониями, миягаванеллами, агентами ПЛТ (пситтакоза-лимфогранулемы-трахомы), ОЛТ (орнитоза-лимфогранулемы-трахомы). Решением комиссии Международной ассоциации микробиологических обществ (1980) эти микроорганизмы получили родовое название Chlamydia, принадлежащее к семейству Chlamydiaceae, порядку Chlamydiales. В 1968 г. L. Page, интенсивно изучавший данный микроорганизм, предложил различать два вида в одном роде, а именно Chlamydia trachomatis и Chlamydia psittaci.

На ранних этапах исследования хламидии

было сложно отнести к вирусам либо к бактериям. Небольшие размеры и неспособность поддерживать рост на искусственных питательных средах приближала их к вирусам, а химическая структура и метаболизм — к бактериям. Значительно позже благодаря развитию молекулярной биологии появилась возможность использования новых подходов, в частности технологии ДНК-ДНК гибридизации, для анализа вновь выделенных хламидий и штаммов, помещённых в коллекцию ATCC (Американская коллекция типовых культур). Данные, полученные в результате этих исследований, параллельно с результатами серологических и микроморфологических наблюдений, позволили идентифицировать новые виды — Chlamydia pneumoniae и Chlamydia pecorum. Изучение генома хламидий с помощью методов рестрикции и молекулярной гибридизации существенно дополнило результаты филогенетического анализа первичной структуры генов 16S и 23S рРНК различных представителей порядка Chlamydiales. В итоге вышеперечисленные исследования позволили поставить точку в дискуссии и однозначно причислить данный возбудитель к бактериям, что послужило основой для изменения номенклатуры и таксономии хламидий и родственных им микроорганизмов [3].

Окончательно классификация возбудителей хламидиозов была утверждена на четвёртом Европейском конгрессе «Хламидия-2000». Вместо одного было предложено четыре семейства, а семейство Chlamydiaceae разделили на 2 рода. В каждом роде представлено от трёх до шести видов, отличающихся между собой по ряду молекулярно-генетических характеристик и фенотипических признаков (рис. 1).

В 2009 году в неё были внесены изменения и уточнения, которые основывались на результатах, полученных после детального изучения хламидий современными методами молекулярной диагностики. В соответствии с последними данными порядок Chlamydiales включает 4 семейства, все патогенные хламидии относятся к семейству Chlamydiaceae, в котором выделяют 1 род и 9 видов хламидий (рис. 2).

Считалось, что характерной особенностью представителей семейства Chlamydiaceae является их строгое соответствие определённому хозяину, т. е видовая специфичность. Однако в последние годы появилось множество сообщений о том,

* Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ. Государственный контракт № 12.741.11.0126

222

Cp.pnfciiiTüöfiia

Cppecorum Cp.cjvfre \

Cpiibtiftui j CppfriEUfi

Chl.imydophiLi рад

. tp.lelis

Chlamydiuiceac

шзридда

СЫлтуНЫеч

Рис. 1 - Классификация хламидий, принятая на четвёртом Рис. 2 - Классификация хламидий, утверждённая Европейском конгрессе «Хламидия-2000» в 2009 г. [9, 10]

Патогенные виды хламидий и их способность инфицировать различные виды млекопитающих и птиц

Вид хламидий Люди Жвачные Птицы Домашние животные Свиньи Грызуны Лошади

C. trachomatis + + + +

C. pecorum + + + +

C.felis + +

C. abortus + + + + + +

C. caviae

C. psittaci + + + + + +

C. pneumonia + +

C. suis + +

C. muridarum +

Примечания: «+» — способность инфицировать данный вид; пустая клетка — данные об инфицировании в настоящее время отсутствуют

что хламидии, выделенные от животных и птиц, при попадании в организм человека могут вызывать разнообразные по клинической картине заболевания, от лёгкой формы ОРЗ и пневмонии до менингоэнцефалита, от энтерита до аборта и тяжёлой генерализованной инфекции [2]. Так, до недавнего времени C. trachomatis традиционно считалась этиологическим фактором хламидий-ной инфекции только человека, однако в настоящее время применение высокочувствительных молекулярных методов (полимеразная цепная реакция, ПЦР, лигазная цепная реакция, ЛЦР, метода микроэрреев, ДНК-гибридизации и т.д.) позволяет обнаружить C. trachomatis у домашних и сельскохозяйственных животных [11—13]. Более того, установлено, что C. trachomatis является одной из причин абортов у крупного рогатого скота и свиней в естественных условиях (табл.).

С появлением новейших технологий в молекулярной биологии и генетике было показано, что хламидийная инфекция может также приводить к возникновению злокачественных опухолей,

таких, как рак шейки матки, рак лёгких и рак придатков глаза [14].

Имеются серьёзные разработки, доказывающие, что заболевание трахомой и урогенитальным хламидиозом коррелирует с НЬЛ-типом, что свидетельствует о генетической предрасположенности человека к данному заболеванию и характеру течения болезни [4, 15].

Из-за отсутствия ярко выраженных клинических симптомов первостепенное значение для диагностики и лечения хламидиоза имеют методы лабораторных исследований.

В течение многих лет общепризнанным эталоном выявления хламидий считался метод прямого выделения возбудителя в культуре клеток и на куриных эмбрионах. Серьёзные недостатки метода, связанные в первую очередь с его большой трудоёмкостью, зависимостью результатов от правильной транспортировки клинических образцов для исследований и относительно невысокой чувствительностью, не превышающей 70—85%, существенно затруднили его широкое использование как в практической ветеринарии,

так и в здравоохранении [1]. В последние годы большое значение в молекулярной диагностике хламидий приобрёл подход, основанный на выявлении антигенов хламидий методом им-муноферментного анализа (ИФА), особенно с моноклональными антителами, позволяющий проводить как молекулярную диагностику, так и серотипирование C. trachomatis на 17 основных сероваров (обозначены буквами латинского алфавита от A до L, A-C — возбудители трахомы, D-K — возбудители генитального хламидиоза, L — этиологический фактор лимфогранулемы венереум). В то же время при ИФА-детекции антигенов в ряде случаев отмечалась относительно невысокая чувствительность (по сравнению с другими патогенами) в связи с низкой концентрацией возбудителя в пробе, особенно при латентном течении инфекции [1].

Методы серодиагностики, такие, как реакции прямой и непрямой гемагглютинации, связывания комплемента и т.д., ввиду невысокой чувствительности и специфичности в настоящее время имеют больше историческое значение, поскольку и обнаружение антихламидийных АТ, зачастую обладающих межвидовой кроссреактивностью, в диагностических титрах возможно только в период обострения заболевания не более чем у 55 —65% больных [5].Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) на основе поли-или моноклональных антител относят к методам иммунодиагностики. Преимуществом считается возможность проведения прямой индикации хламидий в поражённых клетках больного, визуально контролируемой в флуоресцентном микроскопе, и быстрота получения результатов анализа — от момента забора материала до просмотра мазков требуется не более 0,5—1 ч. Однако довольно низкая разрешающая способность метода (не более 2,5 х 105 м.кл/мл), потребность в специальном оборудовании (флуоресцентный микроскоп), отсутствие объективных методов регистрации результатов ограничивают его диагностическую значимость, хотя ПИФ продолжает использоваться в некоторых диагностических лабораториях.

Молекулярно-генетические методы диагностики хламидиоза в последние годы заняли место «золотого стандарта» [6]. Их применение для характеристики хламидий позволяет устанавливать внутривидовые различия между штаммами микроорганизмов по особенностям нуклеотидного состава ДНК, характеризовать штаммовый состав популяции и следить за распространением инфекции [1], составляя, таким образом, основу современной молекулярной эпидемиологии.

Совокупность молекулярно-биологических тестов, используемых для идентификации хламидий в зависимости от этапов, принци-

пов и специфики проведения анализа, можно разделить на две группы: тесты, связанные с гибридизацией и амплификацией нуклеиновых кислот [16]. В качестве гибридизационных зондов использовали фрагменты ДНК, полученные путём клонирования в плазмидных или фаговых векторах специфических участков исследуемых объектов, а также искусственно синтезированные одноцепочечные олигонуклеотиды (преимущественно ДНК), последовательность которых комплементарна определённому видоспецифическому участку генома патогена [7].

Прямая детекция хламидий является важным этапом в развитии лабораторной диагностики в медицине и ветеринарии, особенно если речь идёт о слаборастущих или некультивируемых инфекционных агентах. В последнее десятилетие наиболее значительный прогресс в этом вопросе был достигнут при применении техники амплификации нуклеиновых кислот, реализующейся в ПЦР. В настоящее время ПЦР-детекция фактически разработана для анализа всех наиболее важных патогенов и созданы стандартизированные протоколы использования этого метода [17].

В основе ПЦР лежит многократная амплификация определённого фрагмента ДНК, который является маркёрным для данного патогена. С помощью ПЦР можно обнаружить плазмид-ную ДНК хламидий, фрагменты хромосомной ДНК, кодирующие основной белок внешней мембраны (от англ. Major Outer Membrane Protein, МОМР), рибосомальную РНК и др. К преимуществам этого метода относятся высокая чувствительность (70—95%) и специфичность (97—99%), а также возможность одновременного тестирования большого числа образцов, быстрота и автоматизация [18]. Однако наибольший успех с точки зрения чувствительности и специфичности анализа был достигнут при использовании ПЦР в реальном времени, особенно в системе TaqMan [19].

В последнее время появились сообщения о разработке новых методов протеомики с использованием микрочипов, которые по своей чувствительности и специфичности должны значительно превосходить все существующие аналоги [20].

Таким образом, молекулярно-генетические методы имеют большое значение для своевременной и качественной диагностики хламидио-зов. Данные методы позволяют более подробно изучать генетическую структуру и свойства микроорганизма для создания на основе полученных результатов новейших методов диагностики с учётом всех возможных серовариантов возбудителя, также они имеют большое значение для развития фундаментальной науки и построения филогенетического дерева возбудителей хламидиозов.

Литература

1. Обухов И.Л. Молекулярно-генетическая характеристика хламидий и экспресс-диагностика хламидиоза: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М., 2000. 35 с.

2. Митрофанов П.М., Митрофанова. Возбудителихламидиозов домашних животных и патогенность их дня человека // Проблемы репродукции. 2007. № 5. С. 28-32.

3. Эйделыптейн И.А. Фундаментальные изменения в классификации хламидий и родственных им микроорганизмов порядка Chlamydiales // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 1999. Т. 1. № 1. С. 5—11.

4. Фёдорова В.А., Коннова С.С., ДружкинИ.Н., Федотов Э.А., Мотин B.JI. Корреляция HLA-B27 генотипа и хронизация хламидийной инфекции урогенитального тракта у людей // Сб. матер. VII междунар. конф. «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 28—29 октября 2010. 2010. С, 194-195.

5. Позняк A.JL, Шестаев А.Ю., Нуралова Н.В. и др. Особенности лабораторной диагностики хламидиозов с системными проявлениями // Клиническая лабораторная диагностика. № 6. 2002. С, 42-45.

6. Метельская В.А., Алешкин В.А., Зверев В.В. и др. Современные методы лабораторной диагностики хламидиозов // ЖМЭИ. 2008. № 4. С, 111-117.

7. Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путём. М.: Мед. лит., 2006. 272 с.

8. Harry Е., Monahan L., Thompson L. Bacterial cell division: the mechanism and its precison. // Int Rev Cytol. 2006. Vol. 253. P. 27-94.

9. Stephens R., Sanchez-Pescador R., Wager E. et ah Diversity of the major outer membrane proteins of Chlamydia! trachomatis // J Bacteriol. 1987. Vol. 169. P. 3879-3885.

10. Schautteet K., Vanrompay D. Chlamydiaceae infections in pig // Veterinary Research. 2011. Vol. 42. P. 29-39.

11. Busch М., Thoma R., Schiller I. et al. Occurrence of chlamydiae in the genital tracts of sows at slaughter and their possible

significance for reproductive failure // J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 2000. Vol. 47(6). P. 471-80.

12. Deptula W., Ruczkowska J., Szenfeld Let al. Immunologic status in cattle naturally infected with the microorganisms Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci // Vet Med (Praha). 1990. Vol. 35(2). P. 73-80.

13. Ozbek A., Ozbek E., Kalkan Y. et at. Can Chlamydia trachomatis human biovars cause abortion in cattle. An immunohistochemical study on a new host-pathogen relationship // Mikrobiyol Bui. 2008. Vol. 42(4). P. 599-605.

14. Schell M., Moore C., Novak M. et ah C. trachomatis Infection Incereases Host Cellular Mutation Frequency// Proceedings book of the 7th Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Amsterdam, the Netherlands. University Amsterdam. Amsterdam — The Netherlands — July 1-6, 2012. P. 218-219.

15. Roberts C., Molina S., Makalo P. et ah Increased risk of early onset scarring in trachoma associates with the HLA-C2 ligand of KIR in individuals who possess the CEN-B sub-haplotype // Ibid. P. 276-277.

16. Pedersen L., Herrmann B., Möller J. Typing Chlamydia trachomatis: from egg yolk to nanotechnology // FEMS Immunol Med Microbiol. 2009. Vol. 55. P. 120 130^

17. Hoorfar J., Cook N. Critical aspects of standardization of PCR. In: Sachse K., Frey J., editors. Methods in molecular biology. PCR detection of microbial pathogens, vol. 216. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 51-64.

18. Stary A. European Guideline for management of Chlamydia infection // Int. J. STD&AIDS. 2001. Vol. 12. P. 31-33.

19. Schächter J. Diagnosis of Chlamydia trachomatis infection // Proceedings of the 12th Intermational Symposium on Human Chlamydial Infections, Lake Fuschl, Hof bei Salzburg, Austria, June, 20—25, 2010. p. 203-212.

20. TengA, Cruz-Fisher MI, Cheng C. etal. Proteomic identification of immunodominant chlamydial antigens in a mouse model. // J Proteomics. 2012.