Питательные среды аспекты применения и направления совершенствования

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 9, 2013

Клинико-рентгенологическая картина при внебольничной пневмонии (ВП) у детей не всегда позволяет даже ориентировочно судить об этиологии болезни, что затрудняет выбор адекватной терапии.

Цель работы - оценка эффективности комплексной этиологической лабораторной диагностики и определение доли вирусов в спектре возбудителей ВП у детей. Обследовано 56 детей (1-17 лет) с рентгенологически подтвержденной ВП средней тяжести. Трахеальный аспират (39 проб) и мазки из ротоглотки (56 проб), полученные у детей до антибиотикотерапии, подвергались бактериологическому исследованию и ПЦР с наборами производства ФБУН ЦНИИЭ для обнаружения РНК вирусов гриппа А (InfA) и В; респираторно-синцитиального вируса (RSv), метапневмо-вируса (Mpv), коронавирусов, вирусов парагриппа 1-4, ринови-русов (Rv), ДНК аденовирусов (Adv), бокавируса, Mycoplasma pneumoniae (M.pn.) и Chlamydophila pneumoniae (C.pn.). Методом ИФА тестировали парные сыворотки на антитела к M.pn. и C.pn. («Savyon Diagnostics», Израиль и «ELISA-medac», Германия). В качестве контроля исследовались мазки из носо-ротоглотки 474 условно здоровых детей. По совокупности исследований этиология ВП определена у 53 (94,6%) детей. В этиологической

структуре ВП Streptococcus pneumoniae (S. pn.) составил 26,8%, M.pn. - 30,3%, C. pn. - 10,7%, вирусы - 32,1%. Тем не менее вирусы обнаружены у 71,7% детей, из них в виде моноинфекции - в 39,5%, ко-инфекции - в 7,9%, вирусно-бактериальной инфекции - в 52,6% случаев. НК вирусов и M. pn. чаще обнаружены в аспиратах, чем в мазках (78,9% против 34,2%, p < 0,001). Среди вирусов превалировал RSv (22,6% против 2,1% в группе сравнения), Mpv, Adv и InfA обнаружены у больных (по 11,3%) чаще, чем в контроле (по 0,2 и 0,6%). Вирусно-бактериальные ассоциации чаще включали S. pn., чем M. pn. (73,3% против 23,5%, p < 0,01). Положительные результаты ПЦР на M. pn. и C.pn. совпали с результатами ИФА. Таким образом, комплекс лабораторных методов исследования повышает эффективность этиологической диагностики ВП. Аспираты из трахеи являются наиболее адекватным биологическим материалом для ПЦР и бактериологических исследований при диагностике ВП у детей. Вирусная инфекция может быть причиной ВП у детей младшего возраста, или во многих случаях предшествует ВП, что объясняет высокую частоту обнаружения вирусов при ВП. В спектре вирусной этиологии ВП средней тяжести у детей в нашем исследовании (2008 г., 2011 г.) превалировал RSv.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ - АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ И НАПРАВЛЕНИЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

А.П. Шепелин, О.В. Полосенко, И.И. Марчихина, Л.П. Шолохова. Разработка и оценка качества новых питательных сред на основе различных гидролизатов. ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии МИнздрава РФ

Оснащение бактериологических лабораторий новыми качественными питательными средами (ПС) для успешного контроля качества воды, пищевых продуктов, клинического материала, лекарственных препаратов в соответствии с требованиями Фармакопеи США (ШР XXIII, 1995), Европейской фармакопеи (ЕР II) и Государственной фармакопеи РФ дает возможность получения сопоставимых результатов анализов, проводимых отечественными и зарубежными лабораториями. В ФБУН ГНЦПМБ разрабатываются и совершенствуются новые ПС, сбалансированные по своему составу, характеризующиеся высоким качеством и экономичностью, не уступающие импортным аналогам. В течение последних лет были разработаны питательные среды с использованием питательных основ, выпускаемых в институте. Специфическую активность питательных сред оценивали общепринятыми методами. Тест-штаммы, выращенные на разработанных ПС, проверяли на видовое соответствие с помощью анализатора MALDI-TOF («М1кгоАех, Вгикег Daltomcs», Германия) и идентификационных тест-систем.

Установили, что разработанные ПС по физико-химическим и биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам-аналогам и имеют ряд преимуществ.

Замена в прописи цетримидного агара хлорида магния на сульфат в присутствии фосфатов калия усиливает образование пиоцианина; применение вместо сульфата калия 1- и 2-замещенных фосфатов улучшает дифференцирующие свойства ПС; её обогащение дрожжевым экстрактом стимулирует рост псевдомонад, а налидиксовая кислота усиливает ингиби-цию сопутствующей микрофлоры.

Использование обработанной по специальной технологии желчи повысило селективные свойства бульона Мосселя, а эффективность накопления ряда энтеробактерий на этой среде намного выше, чем у сред-аналогов.

Введение малахитового зеленого в состав агара БФЛС усилило ингибирующую способность ПС.

Комбинация 1-изопропил-Р-Э1-тиогалактопиранозида с 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-Э-глюкуронидом усилила интенсивность окрашивания колоний энтеробактерий в хромагаре, что улучшило дифференциацию колиформных микроорганизмов и кишечных патогенов.

Включение в состав лактозного ТТХ-агара с тергитолом-7 додецилсульфата натрия повысило ее ингибиторные свойства. Упрощен способ приготовления ПС - исключены этапы автокла-вирования и стерилизации раствора ТТХ методом мембранной фильтрации.

А.П. Шепелин1, О.В. Полосенко1, Г.Г. Харсеева2, Э.Л. Алути-на2, О.М. Бут2. Питательные среды для культивирования дифтерийных микробов. 'ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Минздрава РФ, г. Оболенск; 2ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава РФ, Ростов-на-Дону

В настоящее время для культивирования коринебактерий применяют транспортные среды, селективно-элективные среды (среда Тинсдаля-Садыковой, среда Клауберга II, кровяной теллуритовый агар, коринебакагар) и среды для накопления чистой культуры (сывороточный агар). В отделе питательных сред ФБУН ГНЦПМБ (Оболенск) разработана питательная среда -коринебакагар, содержащая стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, полученный посредством ферментативного гидролиза суспензии черного альбумина, панкреатический гидро-лизат рыбной муки, глюкозу, агар и 2% раствор теллурита калия. Коринебакагар обладает по сравнению с кровяно-теллуритовым агаром улучшенными ростовыми свойствами: чувствительностью - 10-7 , скоростью роста - 19-20 ч, количеством колоний при посеве взвеси дифтерийных микробов из разведения 10-6 -63-123.

Для выделения дифтерийных бактерий при минимальном их содержании в аналите была разработана на основе коринеба-кагара двухфазная питательная среда. Двухфазность и введение дополнительных стимуляторов роста способствовали повышению показателей ростовых свойств питательной среды за счет сокращения логарифмической фазы роста дифтерийных микробов в процессе культивирования.

И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов. Дифференциально-диагностические среды для выявления гемолитической активности у бактерий с низкой продукцией данного признака. ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, РАСХН

Гемолитическая активность относится к основным факторам патогенности многих бактерий и используется в качестве диагностического признака. Однако, несмотря на значимость гемолизинов, их выявляемость у некоторых микроорганизмов вследствие низкого уровня экспрессии затруднена. К данной группе микроорганизмов, например, относятся листерии, сибиреязвен-

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ - АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ И НАПРАВЛЕНИЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

ный микроб, микоплазмы - на стандартном кровяном агаре у возбудителей этих зооантропонозов гемолитическая активность практически не регистрируется.

Для повышения эффективности выявления этого признака у патогенных листерий и возбудителя сибирской язвы нами проведены работы по разработке более чувствительных тест-систем. В качестве основы использовали двухфазную твердую среду, первый слой которой был представлен 1,5%-м голодным агаром, а второй содержал питательные основы и субстраты, необходимые для выявления признака у соответствующего патогена (для B. anthracis - отмытые эритроциты барана, для листерий - цельная кровь кролика).

Концентрации и способы подготовки эритроцитов, питательные основы для покрывного слоя агара, индукторы роста и синтеза гемолизинов, подбирались с учетом биологических особенностей патогенов. На разработанных средах изучена способность различных видов листерий и культур сибиреязвенного микроба экспрессировать гемолизины и получена полуколичественная оценка уровня их продукции.

Разработанные среды по чувствительности превосходят однослойные, применяемые для определения гемолитической активности, позволяют одновременно работать с большим количеством штаммов, изучать гетерогенность популяций по этому признаку, проводить клональный анализ и решать другие сопутствующие задачи.

С.В. Поликарпова1, С.В. Жилина1, И.М. Протас2. Тест-системы для идентификации и определения антибиотико-резистентности микроорганизмов: вчера, сегодня, завтра. 'ФГУЗ Городская клиническая больница № 15 им. О.М. Филатова ДЗ г Москвы; представительство «Эрба Лахема» в РФ

Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП) - диско-диффузионный и серийных разведений - были разработаны во второй половине 60-х - начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений. Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотикорезистентности у микроорганизмов потребовали более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.

Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для обоснования целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни отдельным пациентам; назначения эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов; наблюдения за распространением антибиотикорезистентности в отдельных учреждениях или географических регионах и т.д.

Анализ с помощью тест-систем СЕНСИ-ЛА-ТЕСТ («Эрба Лахема») основан на определении бактериального роста при пограничных (break-point) концентрациях антибиотика в соответствии со стандартами Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам (European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST) в редакции от 05.01.2011. Методика включает регидратирование лунок с антибиотиками с помощью суспензионной среды и внесение в них бактериальной суспензии. Результаты чувствительности микроорганизмов роста учитывают через 18-24 ч инкубации визуально или фотометрически по наличию бактериального роста в микролунках планшета.

Спектр антибактериальных средств, выбранный для наборов, является актуальным для использования в современной клинической практике. Удобным и экономически целесообразным является разделение на два отдельных набора выбранных антибактериальных препаратов для тестирования грамотрица-

тельных бактерий. Преимуществом тест-системы является разделение планшета на отдельные стрипы, что даёт возможность рационально использовать набор.

В.В. Меньшиков1, В.С. Михайлова1, .Л.О. Иноземцева2, М.С. Поляк3, С.М. Суханова4, .Б.Ф. Шуляк5, Р.С. Козлов6, О.У. Сте-цюк6. О разработке проекта стандартизованной технологии «Внутрилабораторный контроль качества питательных сред для КДЛ, выполняющих микробиологические исследования». ТБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России; 2ЗАО «Даниес»; 3НИЦ фармакотерапии, Санкт-Петербург; 4ФГБУ Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России; 5ООО ГЕМ, Москва; 6НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия Минздрава России

Необходимым условием улучшения качества медицинского обслуживания является стандартизация клинической лабораторной диагностики.

В микробиологических практических лабораториях основой почти всех применяемых методов, как традиционных, так и автоматизированных систем, является питательная среда, от качества которой зависит диагностическая и лечебная эффективность микробиологических исследований. С целью установления пригодности сухих и готовых коммерческих форм при проведении клинических микробиологических исследований был разработан проект стандартизованной технологии контроля наиболее распространенных питательных сред с использованием контрольных тест-штаммов.

При разработке проекта были использованы отечественные и зарубежные нормативные документы, в которых содержались требования к питательным средам, используемым для медицинских учреждений: ГОСТ Р ЕН 12332-2010 «Изделия медицинские для диагностики in vitro. Питательные среды для микробиологии. Критерии функциональных характеристик питательных сред»; Методические указания МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред»; ISO/TS 11133-2-2003 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководство по подготовке и приготовлению культуральных сред. Часть 2. Практическое руководство по тестированию эффективности культуральных сред».

Проект подготовлен в соответствии с «Положением о разработке стандартизованных технологий клинических лабораторных исследований» и содержит: требования к компетентности специалистов, участвующих в выполнении технологии; условия безопасности выполнения процедур; перечень необходимых для выполнения технологии приборов и реагентов; трудозатраты на выполнение технологии.

Обеспечение и контроль качества микробиологических исследований состоят в визуальной оценке структуры и цвета среды, оценке ее стерильности, оценке чувствительности (ростовых свойств) среды. Так как эффективность бактериологического анализа определяется высокими ростовыми качествами компонентов и стандартностью состава питательных сред, биологический показатель чувствительности является приоритетным тестом.

По данным NCCLS, применение большого количества тестов вызывает затруднения при проведении контроля в практических лабораториях.

В проекте указаны коллекции микроорганизмов, из которых можно получить референтные штаммы, их хранение, подготовка к работе с применением отечественного стандартного образца и стандартного образца Мак-Фарленда.

Применение стандартизованной технологии «Внутрилабо-раторного контроля качества питательных сред для КДЛ, выполняющих микробиологические исследования», повысит надежность результатов исследований и улучшит качество медицинской помощи.