ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ШТАММЫ Lactobacillus И ИХ КОНСОРЦИУМ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ЖЕНЩИН
PROBIOTIC STRAINS Lactobacillus AND THEIR CONSORTIUM FOR PROPHYLAXIS AND TREATMENT OF UROGENITAL INFECTIOUS DISEASES OF FEMALES

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской и пищевой промышленности и может быть использовано в производстве бактериальных препаратов и продуктов функционального питания, предназначенных для коррекции вагинальной микрофлоры у женщин и девочек старше 10 лет. Согласно статистическим данным один миллиард человек в мире ежегодно обращаются в клиники по поводу лечения различных урогенитальных инфекций. Учитывая такую высокую распространенность этих инфекций у женщин и увеличение числа устойчивых к различным лекарственным препаратам патогенов, проблему пробиотической терапии в клинической гинекологии и урологии можно признать сверхактуальной [1].
В настоящее время основным приемом коррекции нарушенного вагинального микробиоценоза женщин является применение пробиотических препаратов. В России производство таких препаратов основано на использовании лактобацилл и бифидобактерий - представителей нормофлоры желудочно-кишечного тракта человека и использовании отдельных штаммов вагинальных лактобацилл без учета особенностей структуры и функций микробиоценоза репродуктивного тракта женщин.
Микробиоценоз влагалища динамично изменяется с возрастом и в зависимости от циклических процессов, происходящих в женском организме. Особенностью этого микробиоценоза является его многокомпонентность. Структура микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста характеризуется сочетанием резидентной и транзиторной микрофлоры. Резидентная микрофлора делится на облигатную и факультативную. К облигатным резидентным микроорганизмам микробиоценоза влагалища относятся лактобактерии. Они преобладают во влагалище здоровой женщины, в то время как доминирование уропатогенов имеет место у пациенток с уроинфекционным анамнезом. Использование только культуральных методов в изучении видового спектра лактобацилл у здоровых женщин репродуктивного возраста позволяет обнаружить один, два и реже три штамма в вагинальном биотопе одной женщины. Сочетание культуральных и других альтернативных методов идентификации позволяет обнаружить в вагинальном эпитопе одной женщины более трех видов лактобацилл. К факультативной резидентной флоре относятся Gardnerella vaginalis и грибы рода Candida. Эти микроорганизмы в низких концентрациях часто выделяются из здорового женского полового тракта. Наиболее сильное влияние на вагинальный микробиоценоз оказывают гормональные изменения, которые определяют репродуктивные фазы жизни женщины [2]. Действие гормонов на микробиоценоз влагалища происходит опосредованно, в первую очередь, через фермент лактатдегидрогеназу (ЛДГ), который катализирует превращение продукта бактериального метаболизма молочной кислоты в пировиноградную, являющуюся субстратом для глюконеогенеза и синтеза гликогена. Повышение активности ЛДГ приводит к усилению пролиферации влагалищного эпителия и накоплению гликогена, что обеспечивает оптимальные условия существования нормального микробиоценоза. Неотъемлемым условием этих процессов является закисление среды влагалища за счет образования молочной кислоты в результате бактериальной утилизации гликогена. Это и обусловливает формирование определенного спектра бактерий, которые могут существовать в здоровом влагалище и составляют нормальный микробиоценоз. Малейшее изменение pH слизистой оболочки приводит к повышенной уязвимости влагалища к патогенным микроорганизмам и усилению патогенности условно-патогенной флоры.
При рождении девочки и на протяжении первых 1-2 месяцев жизни на ее организм еще продолжают действовать материнские гормоны, поэтому вагинальный эпителий новорожденных соответствует таковому у женщин фертильного возраста, а микробиоценоз в норме представлен в основном лактобактериями. В этом периоде у ребенка формируется иммунологическая толерантность. Штаммы лактобацилл, полученные от матери в процессе родов и заселившие вагинальный биотоп девочки, воспринимаются ее иммунной системой как «свои». Такие штаммы бактерий получили название - аутоштаммы. После окончательного распада гормонов матери (к концу второго месяца жизни) и до периода полового созревания у девочки имеет место выраженная атрофия влагалищного эпителия, который представлен монослоем базальных клеток и характеризуется щелочной средой слизистой оболочки. Микрофлора такого влагалища состоит из скудного количества грамположительных кокков, преимущественно анаэробов. После полового созревания эпителий становится многослойным, происходит закисление влагалищной среды, микробиоценоз соответствует микробному составу вагинальной слизистой оболочки женщин фертильного возраста. В менопаузе постепенно происходят обратные процессы: развиваются атрофические изменения эпителия, имеют место повышение pH влагалищной среды, снижение количества лактобактерий, увеличение популяции грамположительных кокков.
9
11
2
2
2
2
Отсутствие лактобацилл в составе микробиоты влагалища женщин репродуктивного возраста служит серьезным предвестником преждевременных родов. Изменения микрофлоры влагалища женщины репродуктивного возраста происходят постоянно, но в здоровом организме нормальный микробиоценоз быстро восстанавливается. Дисгормональные и иммунологические нарушения закономерно сказываются на количественном и качественном составе микробиоценоза влагалища, при этом часто требуется медикаментозная коррекция. Пероральное применение антибиотиков приводит к развитию у женщин не только дисбиоза желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), но и к нарушению микроэкологии вагинального тракта, что свидетельствует о серьезном повреждении микробиоценоза всего организма. В связи с тем, что лактобациллы являются важным фактором в предупреждении колонизации влагалища женщины репродуктивного возраста уропатогенными бактериями, уменьшение их количества или отсутствие может предрасполагать к инфекциям мочевыводящих путей. Если ранее инфекционная патология в акушерстве и гинекологии была обусловлена мономикробным возбудителем, то в настоящее время в клинической практике все чаще встречается полимикробная ассоциация микроорганизмов. К числу таких заболеваний относится бактериальный вагиноз (БВ) - инфекционный невоспалительный синдром, характеризующийся резким снижением или отсутствием лактобацилл и их заменой на полимикробные ассоциации условно-патогенных бактерий G. vaginalis со строгими анаэробами Atopobiumvaginae, Prevotella, Mobilincus и др., концентрация которых возрастает в несколько раз и достигает 10-10 КОЕ/мл [3]. Вторым наиболее распространенным инфекционным заболеванием женской половой сферы является кандидозный вульвовагинит (КВВ). Он относится к оппортунистическим инфекциям, развивающимся на фоне иммунологической недостаточности. В связи с этим КВВ весьма актуален во время беременности, отличается рецидивирующим и резистентным к терапии течением. К факторам риска кандидозной инфекции относятся также гипофункция яичников, частое лечение антибиотиками, особенно пенициллинового ряда. В последние годы у человека все чаще КВВ вызывается не Candida albicans, а другими разновидностями грибов рода Candida (С. tropicalis, С. glabrata, С. krusei). Если раньше такие случаи были редки, то сейчас на долю этих грибков приходится 30-50% всех кандидозных инфекций. В настоящее время довольно часто встречаются БВ и КВВ одновременно в качестве смешанной инфекции, составляя от 10 до 39% всех случаев инфекционных заболеваний влагалища [4]. При лечении пациенток со смешанной инфекцией используется двухэтапная схема - элиминация возбудителя и поддерживающая противорецидивная терапия, которая проводится на протяжении нескольких месяцев. Но есть пациентки, которым требуется постоянная (пожизненная) поддерживающая терапия, поскольку при отмене антимикотиков у них обязательно происходит рецидив кандидозного воспаления, и эта проблема на сегодня не решена. Установлено, что отсутствие в вагинальном биотопе женщины штаммов лактобацилл, продуцирующих HO, значительно повышает риск заболевания БВ и KB В с хроническим рецедивирующим течением [5]. В связи с вышеизложенным актуальным является создание новых пробиотических препаратов, в состав которых будет входить консорциум, состоящий из различных видов лактобацилл, продуцирующих HO.
Ключ к решению проблемы БВ - нормализация вагинальной микрофлоры. На первом этапе с помощью системных и местных антибактериальных препаратов (метронидазол, клиндамицин) проводится санация влагалища, целью которой является элиминация G. vaginalis и строгих анаэробных условно-патогенных бактерий. Несмотря на высокую эффективность данной терапии в 30-40% случаев отмечается развитие рецидивов БВ и в 20% случаев заболевание осложняется развитием КВВ. На втором этапе для восстановления нормальной микрофлоры используются местные пробиотические препараты. Однако существующие в России пробиотические препараты (Ацилакт, Лактобактерин и др.) содержат лакто- и бифидобактерии кишечного происхождения или монопрепараты на основе отдельных вагинальных лактобацилл, которые не способны эффективно приживаться во влагалище из-за низких адгезивных свойств по отношению к вагинальным эпителиоцитам [6]. В результате лечение приводит к нестойкому эффекту. В отличие от вышеупомянутых отечественных пробиотиков зарубежный препарат Вагилак (Лактогин) является первой в мире комбинацией двух пробиотических штаммов орального применения с целью нормализации вагинальной микрофлоры и снижения вагинальной колонизации патогенными и условно-патогенными бактериями. Препарат представляет собой консорциум Lactobacillus rhamnosus GR-1 и Lactobacillus reuteri RC-14, выделенных из дистальных отделов уретры и влагалища здоровых женщин. Оба штамма обладают адгезивными свойствами в отношении к вагинальным эпителиоцитам [7].
Исследования показали, что Вагилак можно принимать перорально, ежедневно, в течение двух месяцев, и при этом не отмечается никаких побочных явлений [8, 9]. Прием этого препарата женщинами, страдающими БВ, приводит к восстановлению вагинальной флоры в 82% случаев [10].
2
2
5
7
Целесообразность орального применения пробиотических лактобацилл для коррекции вагинального микробиоценоза объясняется тем, что толстый кишечник представляет собой резервуар, из которого постоянно происходит высвобождение микроорганизмов микробиоты человека, в том числе и лактобацилл. Благодаря анатомической близости анального отверстия и преддверия влагалища лактобациллы соответствующего видового спектра, важнейшими представителями которого являются Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum и др., легко проникают во влагалище, колонизуют его и дистальные отделы уретры [11]. Первые три вида (Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus jensenii), продуцирующие HO, являются доминирущими представителями и детектируются примерно в 90% случаев у здоровых женщин методами высева содержимого влагалища на питательные среды, используемые при культивировании лактобактерий [12, 13]. Другие виды, например Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus reuteri, обнаруживаются в 1,5% и 0,3% случаев [14]. Количество лактобацилл в норме составляет 10-10 КОЕ/мл, что соответствует 95-98% от всей микрофлоры влагалища [15].
Известен штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3, входящий в состав препарата Лактобактерин, имеющего показания к применению при заболеваниях женской половой сферы интравагинально. Однако по данным [6] препарат малоэффективен при лечении БВ. Известен штамм Lactobacillus crispatus CTV-05, продуцирующий перекись водорода, который либо в составе интравагинальных капсул или суппозиториев [16, 17] предлагается к использованию для коррекции вагинальной микрофлоры. Недостатком штамма Lactobacillus crispatus CTV-05 является ограничения по его использованию при пероральном применении, или в составе кисломолочных продуктов функционального питания.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является препарат Вагилак, представленный консорциумом штаммов лактобактерий Lactobacillus rhamnosus GR-1 и Lactobacillus reuteri RC-14 [18]. Показано, что штаммы Lactobacillus rhamnosus GR-1 и Lactobacillus reuteri RC-14 колонизируют влагалище после приема в пероральной форме [7, 10], способствуют восстановлению естественной кислой среды во влагалище (pH 3,8-4,5), повышают устойчивость слизистой к воздействию патогенных микроорганизмов, создавая условия для улучшения качества (нормализации) микрофлоры.
Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента консорциумов лактобактерий за счет получения консорциума, который может быть использован для изготовления бактериального препарата, биологически активной добавки (БАД), а также закваски прямого внесения для ферментации молока и получения кисломолочных продуктов функционального питания, направленных на сохранение и укрепление урогенитального здоровья у женщин, профилактику и лечение урогенитальных инфекционных заболеваний.
Поставленная задача решена тем, что получены пробиотические штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, на основе которых создан консорциум, используемый для изготовления бактериального препарата, биологически активной добавки (БАД) и закваски прямого внесения для ферментации молока и получения кисломолочного продукта функционального питания.
Штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 выделены из влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста, идентифицированы методом секвенирования гена 16S rRNA и депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Московская обл., г. Пущино) под следующими регистрационными номерами:
Штамм Lactobacillus crispatus 2029 имеет регистрационный номер ВКМ B-2727D;
Штамм Lactobacillus gasseri 2016 имеет регистрационный номер ВКМ B-2728D;
Штамм Lactobacillus plantarum 2025 имеет регистрационный номер ВКМ В-273 ID.
Штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 характеризуются следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
При выращивании на поверхности агаризованной среды MFC pH-6,5 (Himedia, Индия) методом истощающего штриха в термостате при 37°C в течение 24-48 часов:
- штамм Lactobacillus crispatus 2029 - колонии средние, бледно-белые, круглые, плоские с ровным краем,
- штамм Lactobacillus gasseri 2016 - колонии мелкие, бледно-белые, круглые, плоские с ровным краем,
- штамм Lactobacillus plantarum 2025 - колонии средние, белые, круглые, выпуклые с ровным краем.
При выращивании на жидкой среде МРС pH-6,5 (Himedia, Индия) или молоке при 37°C в течение 24-48 часов клетки штамма Lactobacillus crispatus 2029 представляют собой средние палочки размером ~5-6 мкм, образуют короткие цепочки; клетки штамма Lactobacillus gasseri 2016  представляют собой средние палочки размером ~4-5 мкм, образуют цепочки, клетки штамма Lactobacillus plantarum 2025 представляют короткие палочки размером ~3 мкм, образуют короткие цепочки.
Физиолого-биологические признаки.
Все штаммы являются факультативными анаэробами, температурный оптимум 37±2°C, растут при 42°C, слабый рост при 30°C. Оптимальное значение pH среды 5,5-6,0.
Биохимические свойства.
Способность штаммов, входящих в состав консорциума, ферментировать углеводы оценивали в API-тесте в соответствии с инструкцией фирмы производителя (BioMerieux, Франция).
Штамм Lactobacillus crispatus 2029 усваивает D-Глюкозу, D-Фруктозу, D-Сазарозу, Эскулин железа цитрат.
Штамм Lactobacillus gasseri 2016 усваивает D-Глюкозу, D-Фруктозу, N-Ацетилглюкозамин, Эскулин железа цитрат, D-Сазарозу, D-Трегалозу,
Штамм Lactobacillus plantarum 2025 усваивает D-Рибозу, D-Галактозу, D-Глюкозу, D-Фруктозу, D-Маннит, D-Сорбит, МетилαD-маннопиранозид, N-Ацетилглюкозамин, Амигдалин, Арбутин, Эскулин железа цитрат. Салицин, D-Целлобиозу, D-Мальтозу, D-Лактозу, D-Мелибиозу, D-Трегалозу, D-Сазарозу, D-Мелицитозу, Гентиобиозу и имеет таксономическую характеристику ID=99.8%; Т=0.89.
Геномный фингерпринтинг
Для выделения ДНК из бактерий применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли и Wizard-технологии фирмы Promega (США) [21].
4
4
2
Штаммоспецифичную идентификацию Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 осуществляли методом геномного фингерпринтинга с использованием праймеров на основе дивергированных инвертированных повторов (DIR) в кодирующих областях генома [22]. DIR-PCR проводили в 25 мкл смеси следующего состава: 1х буфер полимеразы BioTaq (17 мМ (NH)SO, 6 мМ трис-HCl, pH 8,8, 2,5 мМ MgCl), 7,5 нМ dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, 10 пкМ праймера и 1,25 ед. BioTaq DNA Polymerase ("Диалат ЛТД", Россия). Температурно-временной профиль реакции был следующим: первый цикл - 94°C ×30 сек.; 30°C ×30 сек., 72°C ×1 мин. 30 сек.; последующие 43 цикла - 94°C ×5 сек., 30°C ×30 сек. и 72°C ×1 мин. 30 сек.; окончательная элонгация - 7 мин. при 72°C. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле окрашенном бромистым этидием при напряженности поля 6 В/см.
На фигуре представлены результаты геномного фингерпринтинга Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 с использованием ERIC - праймеров, специфичных к повторяющимся межгенным консенсусным последовательностям энтеробактерий (ERIC - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensussequences), и BOXA1, BOXS1-праймеров, специфичных к повторяющимся BOX последовательностям. L - маркеры молекулярных масс; k - контроль (вода); 1 - Lactobacillus crispatus 2029; 2 - Lactobacillus gasseri 2016; 3 - Lactobacillus plantarum 2025.
Чувствительность к антибиотикам.
Штамм L. crispatus 2029 устойчив к линкомицину, метронидазолу, гентамицину и ципрофлоксацину.
Штамм L. gasseri 201 6 устойчив к метронидазолу и ципрофлоксацину.
Штамм L. plantarum 2025 устойчив к метронидазолу и ципрофлоксацину.
Способ, условия и состав сред для размножения штаммов консорциума.
Штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025 выращивают при 37±2°C на жидкой среде МРС или в обезжиренном молоке (0,01-0,03% жира).
Коммерчески приобретенное обезжиренное молоко (0,01-0,03% жира) стерилизуют 20 минут автоклавированием при давлении 0.5 атм и температуре 110°C.
Для выращивания индивидуальных колоний штаммов используют агаризованную среду МРС, содержащую 1,4% агара (Difco, США).
Способ, условия и состав сред для хранения штаммов консорциума.
Штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025 могут храниться:
- в стерильном обезжиренном молоке при 4°C с периодическим пересевом 1 раз в 15-20 дней;
- в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах (защитная среда при высушивании - сахароза 10%, pH 7,0 или стерильное обезжиренное молоко) в течение 2-х лет при температуре 4°C;
- в замороженном виде при -70°C. Длительность хранения 6 месяцев.
Консорциум штаммов может храниться:
- в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах (защитная среда при высушивании - сахароза 10%, pH 7,0 или стерильное обезжиренное молоко) в течение 2-х лет при температуре 4°C;
- в замороженном виде при -70°C. Длительность хранения 6 месяцев.
Заявленное решение иллюстрируется следующей фигурой.
Фиг. Геномные фингерпринты для штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Культивирование штамма Lactobacillus crispatus 2029 в лабораторных условиях.
Для получения посевного материала в ампулу, содержащую 10 мг лиофилизированной культуры Lactobacillus crispatus 2029, добавляют 0,5 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9% и выращивают культуру на поверхности агаризованной среды МРС методом истощающего штриха в термостате при 37°C в течение 18 часов. Затем изолированную колонию помещают в бактериологическую пробирку, содержащую 7 мл жидкой среды МРС и выращивают в термостате при 37°C в течение 15 часов.
8
8
Полученный посевной материал в количестве 1% вносят во флаконы, содержащие 500 мл жидкой среды МРС и выращивают при 37°C в течение 18 часов. Титр полученной культуры 7,0×10 КОЕ/мл. Путем доведения концентрации клеток до 5,0×10 КОЕ/мл получают стандартизованную стартовую биомассу штамма Lactobacillus crispatus 2029.
Для длительного хранения клетки освобождают от компонентов среды выращивания путем центрифугирования, переводят в среду высушивания (защитная среда при высушивании - стерильное обезжиренное молоко), расфасовывают по 1 мл в пенициллиновые флаконы и лиофилизируют. В лиофильно высушенном состоянии стартовая биомасса может храниться в течение двух лет при температуре 4°C.
Пример 2. Культивирование штамма Lactobacillus gasseri 2016 в лабораторных условиях.
8
Культивирование штамма Lactobacillus gasseri 2016 осуществляют по примеру 1. Получают культуру с титром 8,0×10 КОЕ/мл. Получение стандартизованной стартовой биомассы штамма Lactobacillus gasseri 2016 и ее лиофилизацию осуществляют по примеру 1.
Пример 3. Культивирование штамма Lactobacillus plantarum 2025 в лабораторных условиях.
9
Культивирование штамма Lactobacillus plantarum 2025 осуществляют по примеру 1. Получают культуру с титром 2,0×10 КОЕ/мл. Получение стандартизованной стартовой биомассы штамма Lactobacillus plantarum 2025 и ее лиофилизацию осуществляют по примеру 1.
Пример 4. Получение бактериального препарата консорциума штаммов Lactobacillus crispatus 2029. Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025.
8
Для получения бактериального препарата на основе консорциума штаммов лактобактерий производят механическое смешивание стандартизованных жидких культур штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025, полученные по примерам 1, 2 и 3 соответственно. Культуры смешивают в равных объемах и получают стартовую биомассу бактериального препарата - консорциума штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025. Для получения бактериального препарата могут быть использованы и другие соотношения исходных штаммов (от 1:100 до 100:1), но соотношение 1:1:1 является предпочтительным. Полученный препарат лиофилизируют по примеру 1. В лиофильно высушенном состоянии бактериальный препарат может храниться в течение двух лет при температуре 4°C. Стандартная концентрация клеток каждого штамма в полученной биомассе составляет 1,66×10 КОЕ/мл.
Полученный бактериальный препарат может быть использован в виде биологически активной добавки (БАД) или в качестве закваски прямого внесения для получения ферментированных продуктов.
Пример 5. Оценка активности кислотообразования штаммов и консорциума.
Активность кислотообразования определяют титриметрическим методом [23]. В качестве закваски используют жидкие или лиофилизированные стандартизованные стартовые биомассы штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, полученные по примерам 1,2,3 и консорциума, полученного по примеру 4. Закваски (каждый штамм в отдельности и консорциум) в количестве 1% вносят во флаконы, содержащие молоко 1,5% жирности, и культивируют при 37°C. Измерения проводят в течение 48 часов. Результат выражают в градусах Тернера (Т° - величина, выражающая количество 0,1 N щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца).
Результаты, приведенные в табл.1, показывают, что штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025 не сквашивают молоко за 48 часов, кислотность продукта составляет 40,8±1.1° Т, 47,5±1.2°Т, и 56.2±1.2°Т. При инокуляции консорциума образование сгустка происходит за 24 часа и к 48 часам кислотность продукта достигает 102.0±1.2°Т, что соответствует нормативам кисломолочных напитков и йогуртов 70-140°Т. При этом полученный продукт обладает хорошими вкусовыми свойствами и имеет легкий кисломолочный запах.
Таблица 1. Активность кислотообразования штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 и консорциума при сквашивании молока.
Штамм
Титр бактерий в закваске, КОЕ/мл
Образование сгустка (сквашивание молока, йогурт)
Кислотность продукта (градус Тернера, °Т) (48 ч)
pH продукта (48 ч)
Титр бактерий в продукте, КОЕ/мл (48 ч)
24 ч
48 ч
Lactobacillus crispatus 2029
5.0×10<sup>8</sup>
-
-
40,8±1.1
5.50
1.4×10<sup>s</sup>
Lactobacillus gasseri 2016
5.0×10<sup>8</sup>
-
-
47,5±1.2
5,35
2.3×10<sup>8</sup>
Lactobacillus plantarum 2025
5.0×10<sup>8</sup>
-
-
56.2±1.2
4.8
4.6×10<sup>8</sup>
L.crispat 2029
1.66×10
+
+
102±1.2
4.0
5.2×10<sup>8</sup> (общий титр)
+
L. gasseri 2016
1.66×10<sup>8</sup>
+
L. plant arum 2025
1.66×10<sup>8</sup>
Примечание: 24 ч, 48 ч - время сквашивания, часы.
Проведенные исследования показали, что свойства заявляемого консорциума при использовании его в качестве закваски прямого внесения соответствуют технологическим требованиям производства кисломолочных продуктов.
2
2
Пример 6. Способность штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Laclobacillus plantarum 2025 и консорциума продуцировать HO.
2
2
Для определения перекиси водорода (HO), продуцируемой культурами лактобацилл, использовали жидкие стандартизованные стартовые биомассы штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025, полученные по примерам 1, 2, 3, и консорциума, полученного по примеру 4. Бактерии (каждый штамм в отдельности и консорциум) в количестве 1% вносят в пробирки, содержащие жидкую среду МРС, и культивируют при 37°C в течение 18 часов.
2
2
Количественное определение перекиси водорода (HO), продуцируемое культурами лактобацилл, осуществляют колориметрическим методом, используя хромофор 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) (Sigma) в присутствии пероксидазы хрена (Sigma) [24].
2
2
2
2
Как видно из табл.2, наиболее эффективная продукция HO отмечалась при культивировании консорциума. Концентрация HO в среде культивирования консорциума составляла 120 мг/л.
Таблица 2. Продукция H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> штаммами консорциума
Штамм
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, мг/л
Lactobacillus crispatus 2029
115
Lactobacillus gasseri 2016
76
Lactobacillus plantarum 2025
24
L. crispatus 2029
120
+
L. gasseri 2016
+
L. plantarum 2025
Пример 7. Исследование устойчивости штаммов консорциума к желудочному и кишечному стрессам (способность расти в среде с низким значением pH или в среде, содержащей желчь).
Ранние стадии БВ и КВВ могут протекать без проявления специфической симптоматики. Пероральное применение пробиотических препаратов создает возможность предотвращать дисбиоз и симптоматическое развитие БВ и КВВ. В связи с этим необходимо, чтобы штаммы лактобацилл, входящие в консорциум, были устойчивы к желудочному и кишечному стрессам.
При исследовании используют следующие методики.
Имитация желудочного стресса in vitro
Композиция искусственного желудочного сока:
NaCl (Sigma S9625)
2.2 г/л
L-молочная кислота (Sigma L1750)
9.9 г/л (0,11 М)
Pepsin (Sigma P7125)
3.5 г/л
pH
2.7±0.02 (доводить 35% NaOH)
pH после разведения 1/11
3.10±0.10 (контролировать для каждой культуры);
2
1 мл искусственного желудочного сока добавляют к 100 мкл культуры в стационарной фазе (1/11 разведение). Культуры инкубируют в течение 10 минут, 30 минут и 60 минут при 37°C, 10% CO. В качестве контроля вместо искусственного желудочного сока используют 1 мл МРС. Измерения выполняют в двух повторах для каждой культуры.
2
9
2
После инкубации культуру (каждую повторность и контроли) разводят от 10 до 10 или 10 в МРС, разведения высевают на чашках с МРС-агаром и инкубируют в течение 24-48 часов при 37°C, 10% CO). Определяют титр культуры в условиях стресса и без стресса путем подсчета количества колоний для разведения.
Имитация кишечного стресса in vitro
Композиция искусственного кишечного сока:
Желчные соли (желчь свиньи Sigma В 8631) 3,3 г/л (конечная концентрация: 0.3%)
3
Карбонатный буфер NaHCO (Sigma S 8875) 16.5 г/л (конечная концентрация: 1.5%)
pH
6.3
2
1 мл искусственного кишечного сока добавляют к 100 мкл культуры в стационарной фазе (1/11 разведение). Культуры инкубируют в течение 5 часов при 37°C, 10% CO. В качестве контроля используют 1 мл МРС. Измерения выполняют в двух повторах для каждой культуры.
2
9
10
3
Культуры и контроли разводят от 10 до 10 или 10 в МРС, разведения высевают на чашках с МРС-агаром и инкубируют в течение 24-48 часов при 37°C, 10% CO. Определяют титр в условиях стресса и без стресса путем подсчета количества колоний для разведениия.
Подсчет микроорганизмов в миллилитре культуры КОЕ осуществляют по формуле:
1
2
ΣC/(n+0.1 n)d
где: ΣC - сумма всех характерных колоний, подсчитанных на всех чашках, содержащих от 15 до 300 колоний;
1
n - количество чашек, в самом низком разведении (2 чашки на разведение);
2
n - количество чашек, в самом высоком разведении (2 чашки на разведение);
d - величина первого разведения (низкое разведение), взятого для подсчета.
2
Для определения устойчивости лактобацилл к желудочному и кишечному стрессам используют культуры в стационарной фазе роста, выращенные на жидкой среде МРС, pH-6,5 в течение 18 часов при 37°C, 10% CO.
Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Laclobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 являются устойчивыми к желудочному и кишечному стрессам.
Таблица 3. Устойчивость штаммов к желудочному и кишечному стрессам
Штамм
Желудочный стресс
Кишечный стресс
10 мин
30 мин
60 мин
5 час
КОЕ/мл
КОЕ/мл
КОЕ/мл
КОЕ/мл
Опыт
Контроль
Опыт
Контроль
Опыт
Контроль
Опыт
Контроль
Lactobacillus crispatus 2029
1,87×10<sup>7</sup>
2,16×10<sup>7</sup>
1,75×10<sup>7</sup>
2,18×10<sup>7</sup>
1,05×10<sup>7</sup>
2,20×10<sup>7</sup>
1,55×10<sup>6</sup>
2,23×10<sup>7</sup>
Lactobacillus gasseri 2016
2,25×10<sup>7</sup>
2,48×10<sup>7</sup>
1,95×10<sup>7</sup>
2,56×10<sup>7</sup>
1,15×10<sup>7</sup>
2,67×10<sup>7</sup>
2,20×10<sup>6</sup>
2,71×10<sup>7</sup>
Lactobacillus plantarum 2025
1,32×10<sup>8</sup>
2,59×10<sup>8</sup>
1,16×10<sup>8</sup>
2,62×10<sup>8</sup>
1,06×10<sup>8</sup>
2,78×10<sup>8</sup>
2,13×10<sup>7</sup>
2,80×10<sup>8</sup>
Пример 8. Исследование адгезии лактобацилл, входящих в состав консорциума, к перевиваемым клеткам Hela.
Адгезивность пробиотических бактерий рассматривается как положительный признак, позволяющий обеспечить защиту макроорганизма от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Пробиотические лактобациллы, предназначенные для профилактики и лечения урогенитальных инфекций, должны обладать адгезивностью к эпителию урогенитального тракта [25].
2
2
5
Культуры клеток Hela выращивают в среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки +1% пенициллин-стрептомицин +0,2 мМ Hepes +2 мМ L-глутамин при 37°C в CO-инкубаторе. Клетки в концентрации 3,0×10 л/мл высевают на 6-луночные плейты в объеме 2,0 мл на лунку и культивируют 24 часа. По достижении 70-80% монослоя, клетки 3-кратно промывают средой ДМЕМ без сыворотки и затем к ним добавляют среду ДМЕМ с L-глутамином. Перед добавлением бактерий к клеткам Hela (18 часовая культура на среде МРС) их дважды промывают PBS pH 7,2, используя центрифугирование при 5000 об/мин в течение 15 минут, и ресуспендируют в среде ДМЕМ с L-глутамином. Концентрацию бактерий для определения соотношения бактерия/соматическая клетка регулируют по оптической плотности (ODλ=590 нм) и контролируют высевом на соответствующие твердые среды. Множественность инфицирования (MOI) составляет 50 и 100 бактерий/клетка. Клетки Hela с внесенными к ним лактобациллами инкубируют еще 5 часов при 37°C в CO-инкубаторе. После инкубации клетки промывают 3-кратно PBS pH 7,2, затем фиксируют в холодном этаноле (3 мин) и окрашивают красителем Романовского-Гимза в течение 30 мин. Далее плейты промывают дистиллированной водой, высушивают при комнатной температуре и исследуют микроскопически. Осуществляют подсчет количества клеток Hela с прикрепившимися бактериями (процент адгезии) и количество бактерий, прикрепившихся к одной клетке (индекс адгезии). Как видно из табл.4, все штаммы консорциума обладают выраженной адгезией к клеткам Hela.
Таблица 4. Адгезия штаммов лактобацилл, входящих в состав консорциума, к монослою клеток Hela
Штамм
Процент адгезии
Индекс адгезии
Lactobacillus crispatus 2029
100±0
38±6
Lactobacillus gasseri 2016
95±2
26±4
Lactobacillus plantarum 2025
87±3
16±5
Пример 9. Исследование адгезии лактобацилл, входящих в состав консорциума, к клеткам буккального эпителия.
2
2
Изучение адгезии лактобацилл, входящих в состав консорциума, к клеткам буккального эпителия осуществляют по методу, описанному в работе [26]. Множественность инфицирования составляла 100 бактерий на клетку. Клетки буккального эпителия с внесенными к ним лактобациллами инкубировали 5 ч. При 37°C в CO-инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% CO. Как видно из табл.5, все штаммы консорциума обладают выраженной адгезией к клеткам буккального эпителия.
Учитывая способность лактобацилл консорциума к адгезии на клетках буккального эпителия, целесообразно включение консорциума в состав жевательной резинки. Колонизация ротовой полости штаммами лактобацилл консорциума может обеспечить их пролонгированное поступление в желудочно-кишечный и репродуктивный тракты.
Таблица 5. Адгезия штаммов лактобацилл, входящих в состав консорциума, к буккальному эпителию
Штамм
Процент адгезии
Индекс адгезии
Lactobacillus crispatus 2029
96±3
30±5
Lactobacillus gasseri 2016
89±3
18±6
Lactobacillus plantarum 2025
75±4
12±4
Пример 10. Исследование антагонистической активности штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 и консорциума штаммов.
Таблица 6. Антагонистическая активность отдельных штаммов лактобацилл Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 и их консорциума в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий
Индикаторная культура
Зоны задержки роста индикаторных микроорганизмов для отдельных штаммов лактобацилл и их консорциума, мм (М±m)
Lactobacillus crispatus 2029
Lactobacillus gasseri 2016
Lactobacillus plantarum 2025
Консорциум
Escherichia coli АТСС29212
5,8±0,3
4,5±0,1
3,7±0,1
12,7±0,7
Escherichia coli*
6,4±0,5
5,3±0,2
4,2±0,3
12,6±0,5
Proteus vulgar is ATCC 13315
4,8±0,4
4,6±0,3
3,9±0,5
10,2±0,8
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
9,7±1,3
7,5±0,8
8,2±0,9
15,8±1,9
Shigella sonnei*
7,5±0,4
8,3±0,5
6,4±0,8
14,9±1,8
Shigella flexnery*
8,7±0,8
9,4±1,2
7,9±0,8
16,3±2,6
Enterococcus faecal is ATCC 29212
5,4±0,6
4,5±0,3
3,9±0,2
11,4±0,9
Enlerococcus faecalis*
5,6±0,7
4,7±0,4
4,3±0,2
12,3±1,1
Bacillus coagulans 429
5,3±0,5
4,9±0,8
5,8±0,7
12,5±1,3
Streptococcus agalactiae*
7,4±1,8
7,0±0,9
6,9±1,2
15,4±1,8
Staphylococcus aureus FDA 29P
4,5±0,2
3,9±0,1
5,4±0,3
10,3±0,9
Staphylococcus aureus *
5,7±0,3
4,8±0,3
5,9±0,4
11,6±0,7
Staphylococcus aureus**
6,9±0,5
4,5±0,2
6,3±0,5
11,3±0,9
Gargnerella vaginalis ATCC 14018
9,8±1,1
9,5±0,8
8,2±0,5
18,2±1,6
Gargnerellavag inalis КИ-24*
10,1±1,2
9,3±0,9
8,9±0,8
18,7±1,5
*- клинические изоляты урогенитальных и кишечных инфекций;** - резистентность к метициллину.
Исследование антагонистической активности проводят методом двухслойного агара [27] на широком спектре индикаторных культур.
Антагонистическую активность исследуемых культур в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий (табл.6) определяют по зоне задержки роста индикаторных штаммов вокруг колоний отдельных штаммов лактобацилл и консорциума (в мм).
Антагонистическая активность в отношении грибов рода Candida (табл.7) выражают минимальной ингибирующей концентрацией антагониста (МИКА) - это минимальное количество антагониста, ингибирующего размножение индикаторной культуры. Показатели для отдельных штаммов Lactobacillus crispalus 2029, Laclobacillus gasseri 2016, Laclobacillus plantarum 2025 и консорциума штаммов представлены в табл.6 и 7.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что заявляемый консорциум штаммов проявляет более выраженную антагонистическую активность, чем отдельные штаммы Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025.
Таблица 7. Антагонистическая активность штаммов лактобацилл Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016, Lactobacillus plantarum 2025 и их консорциума в отношении грибов рода Candida
Препарат
МИКА отдельных штаммов лактобацилл и их консорциума, Lg КОЕ/мл
C. albicans АТСС 10231
С. albicans КИ-8*
C. tropicalis АТСС 750
C. glabrata АТСС 15126
C. krusei АТСС 24408
Laclobacillus crispatus 2029
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
Lactobacillus gasseri 2016
5,0
4,0
5,0
5,0
5,0
Lactobacillus planlarum 2025
6,0
7,0
6,0
6,0
7,0
Консорциум
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
* - клинический изолят, выделенный при КВВ с хроническим рецидивирующим течением.
Пример 11. Приготовление кисломолочного продукта функционального питания для сохранения и улучшения урогенитального здоровья женщин репродуктивного возраста с использованием бактериального препарата на основе консорциума в качестве закваски прямого внесения.
8
Закваску прямого внесения (бактериальный препарат консорциума, полученный по примеру 4) в объеме 5% вносят в стерильное молоко, перемешивают и культивируют при температуре 37°C в течение 18-24 ч до образования сгустка, после чего продукт охлаждают до 4°C и расфасовывают. В результате получают кисломолочный продукт функционального питания с содержанием полезной микрофлоры не менее 10 КОЕ/мл.
Пример 12. Использование кисломолочного продукта функционального питания или БАД с целью лечения и профилактики кандидоза (молочницы) у женщин репродуктивного возраста.
5
2
Девять женщин - добровольцев возраста 27-37 лет с диагнозом кандидоз (молочница), подтвержденным лабораторным анализом, были разделены на три группы, по три в каждой группе. Первая группа ежедневно в течение 14 дней выпивала во время ужина по 100 мл кисломолочного продукта, полученного по примеру 11. Вторая группа ежедневно в течение 14 дней выпивала по 100 мл готового кефира с добавлением в объеме 5% бактериального препарата консорциума, полученного по примеру 4. Третья группа (контрольная) ежедневно в течение 14 дней выпивала во время ужина по 100 мл кефира, не обогащенного препаратом консорциума. Через 14 дней у женщин первой и второй групп исчезли симптомы, характерные для кандидоза (молочницы). Уровень С. albicans в вагинальном отделяемом первой и второй групп снизился с 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл, что соответствует норме. Побочные эффекты от приема кисломолочного продукта функционального питания или БАД отсутствовали. В третьей группе симптоматика кандидоза сохранилась.
Результаты исследований свидетельствуют о перспективности использования препарата консорциума пробиотических штаммов Lactobacillus crispatus 2029, Lactobacillus gasseri 2016 и Lactobacillus plantarum 2025 для получения кисломолочных продуктов функционального питания или БАД с целью профилактики и лечения кандидоза. Способ прост, экономичен, доступен и может быть эффективно применен в домашних условиях.
Литература
1. Кочеровец В.И., Бунятян Н.Д. Нормальная микрофлора женских мочеполовых путей и препараты для ее коррекции. Учебное пособие. М.: Издательский дом «АКТЕОН», 2011, 72 с.
2. Farage М., Miller K., Sober J. Dynamics of the vaginal ecosystem - Hormonal influences. Infect. Diseases: Research and Treatment, 2010, 3, 1-15.
3. Анкирская А.С. Акушерство и гинекология, 2005, №3.
4. Redondo-Lopez V., Veriwether С., Schmitt С. et al. Vullvovaginal candidiasis complicating recruitment bacterial vaginosis. Sex. Transm. Dis. 1990. 17, 51-53.
5. В. Vitali, С. Pugliese, E. Biagi et al. "Dynamics of vaginal bacterial communities in women developing bacterial vaginosis, candidiasis, or no infection, analyzed by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and real-time PCR," Applied and Environmental Microbiology, vol.73, №18, p.5731-5741, 2007.
6. Кира Е.Ф. «Бактериальный вагиноз». СПб., 2001.
7. Reid G., Bruce A.W., Fraser N. et al. Oral probiotics can resolve urogenital infections. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2001 Feb; 30 (1): 49-52.
8. Reid G., Charbonneau D., Erb J. et al. Oral use of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14 significantly alters vaginal flora: randomized, placebo-controlled trial in 64 healthy women. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003 Mar 20; 35 (2): 131-4.
9. Gardiner G., Heinemann-Gijzen C., Madrenas J. et al. Oral administration of the probiotic combination Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 for human intestinal applications. Int Dairy J 2002; 12:2/3: 191-196.
10. Reid G., Beuerman D., Heinemann C., and Bruce A.W. (2001) Probiotic Lactobacillus dose required to restore and maintain a normal vaginal flora. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 32, 37-41.
11. Reid G., Bruce A.W. Urogenital infections in women: can probiotics help? Postgrad. Med. J. 2003; 79: 428-432.
th
12. Hillier S. Normal vaginal flora. In: Holmes K., Sparling P., Stamm V. et al. editors. Sexually transmitted diseases. 4 ed. New York, NY: McGraw-Hill; 2008, p.289-307.
13. Pavlova S., Kilic A., Kilic S., et. al. Genetic diversity of vaginal lactobacilli from women in different countries based on 16S rRNA gene sequences. J. Appl. Microbial., 2002, 92, p.451-459.
14. Antonio М., Hawes S., Hillier S. The identification of vaginal lactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics of women colonized by these species. J. Infect. Dis., 1999, 180, p.1950-1956.
15. Сафронова М.М., Гренкова Ю.М. Нарушение влагалищного микробиоценоза: современные методы коррекции. 2009. Клиническая дерматология и венерология №6.
16. Czaja С., Stapleton A., Yarov-Yarovaya Y. et al. Phase I trial of a lactobacillus crispatus vaginal suppository for prevention of recurrent urinary tract infection in women. Hindawi publishing corp. Infect. Dis. In Obstetr/And Gynec. Vol.2007, Art. ID 35387, 8 pages doi:10.1155/2007/35387/
17. Stapleton A., Au-Yeung M., Hooton T. et al. Randomized, placebo-controlled phase 2 trial of a lactobacillus crispatus probiotic given intravaginally for prevention of recurrent urinary tract infection. Clin. Infect Dis., 2011 doi:10, 1093/cid/cir 183.
18. US Patent 705160
19. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. et al. Current protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons. New York. 1994.
20. Lane DJ.16S/23S rRNA sequencing, p.115-175. In: E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, United Kingdom. 1991.
21. Булыгина B.C., Колганова Т.В., Сухачева М.В. и др. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифицированного щелочного метода. Биотехнология. №2, с.83-90, 2009.
22. Цыганкова С.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б. и др. Получение внутрипопуляционных диссоциантов некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации // Микробиология. 2004. Т.73. №3. С.398-405.
23. ГОСТ 3624-92. Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности.
2
2
24. Martin R., Suarez J. Biosynthesis and Degradation of HO by Vaginal Lactobacilli. 2010. Appl. Environ. Microbiol. vol.76 №2 p.400-405.
25. Reid G. Probiotic Lactobacilli for urogenital health in women. J. Clin. Gastroenterol. 2008 Sep; 42 Suppi 3 Pt 2: S234-6. 2008.
26. RU 2210770.
27. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл. // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - 5. - С.94-98.