Способ профилактики хронической фтористой интоксикации при моделировании в эксперименте
METHOD OF PREVENTION OF CHRONIC FLUORINE INTOXICATION IN EXPERIMENT SIMULATION

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для профилактики хронической фтористой интоксикации (ХФИ).
Действие фторида натрия как системного патогенетического фактора достаточно хорошо изучено. Так, высокие его концентрации и хроническое действие вызывают в первую очередь повреждение костной ткани (Измеров Н.Ф., Бухтияров И.В., Прокопенко Л.В. и др. Современные аспекты сохране-ния и укрепления здоровья работников, занятых на предприятиях по производству алюминия. - В ж-ле: Медицина труда и промышленная экология. -2012. - №11. - С. 1-7). В то же время, при ХФИ выявлены изменения в брон-холегочной, сердечно-сосудистой (Мухамеджанов Р.Ш. Функциональное состояние сердца у работников алюминиевого производства с хронической фтористой интоксикацией. - автореф. дис…к.м.н. - Томск, 2004. - 22 с; Рослая Н.А., Лихачева Е.И., Оранский И.Е. и др. Клинико-патогенетические осо-бенности хронической профессиональной интоксикации соединениями фтора в современных условиях. - В ж-ле: Медицина труда и промышленная экология. - 2012. - №11. - С. 17-22) и эндокринной системах (Шалина Т.И., Васильева Л.С. Общие вопросы токсического действия фтора (обзор литературы). - В ж-ле: Сибирский медицинский журнал. - 2009. - №5. - С. 5-9). В последнее время показано, что при длительном фтористом воздействии поражаются печень и почки (Ядыкина Т.К. Гепаторенальные механизмы поддержания гомеостаза в условиях воздействия на организм фторида натрия. -дис…канд. биол. наук. - Томск. - 2013. - С. 80; 104). Кроме того, фторид натрия обладает цитотоксическим действием, вызывая нарушения углеводного, липидного и антиокислительного метаболизма (Алехина Д.А. Экспериментальное исследование субхронического воздействия фторида натрия на компоненты редокс-сигнальной системы. - дис…канд. биол. наук. - Новосибирск. - 2017. - С. 35,36;  Е.А,  Н., Del Razo L.M. Fluoride exposure impairs glucose tolerance via decreased insulin expression and oxidative stress. В ж-ле: Toxicology. - 2009. - Vol. 263. - P. 75-83).
Известен способ профилактики фтористой остеопатии при моделировании ХФИ в эксперименте с помощью витаминно-минерального комплекса с кальцием и магнием «ALKA-Mine» (Уланова Е.В., Михайлова Н.Н., Данилов И.П., Анохина А.С., Фоменко Д.В., Кизиченко Н.В. Способ профилактики хронической фтористой остеопатии при моделировании фтористой интоксикации в эксперименте. - Патент RU №2300374, МПК А61K 31/375, А61K 33/06, А61K 33/16, А61K 33/38, А61Р 19/10, опубл. Бюл. №16, от 10.06.2007).
Недостатком этого способа является только положительное влияние на метаболизм костной ткани, но при этом не предотвращаются токсические эффекты фторида натрия для ткани печени и почек.
Наиболее близким способом профилактики является использование в качестве биологически активной добавки листьев Tamarindus indica L. в пищу по 2,5 гр.% - 10 гр.% ежедневно в течение 30 дней действия на животных водного раствора фторида натрия в концентрации 100 мг/л (Vasant R.A., Narasimhacharya A.V.R.L. Ameliorative effect of tamarind leaf on fluoride-induced metabolic alterations. В ж-ле: Environ Health Prev Med. - 2012 - Vol. 17. - C. 484-493). Листья Tamarindus indica L. содержат фитостерины, сапонины, полифенолы, флавоноиды и витамин С; в этом исследовании они нормализировали углеводный и липидный метаболизм при фтористом воздействии.
Однако и этот способ профилактики имеет недостатки:
1) используется токсичная доза фторида натрия, которая приводит к быстрому развитию повреждений;
2) краткая экспозиция действия препарата - в течение 30 дней;
3) не рассматриваются эффекты Tamarindus indica L. при длительной интоксикации фтором, что является актуальным для здоровья людей, проживающих в регионах с высоким содержанием фторидов в питьевой воде, а также имеющих профессиональные контакты с ними.
Назначение изобретения состоит в повышении эффективности профилактических мер при ХФИ за счет использования растительного препарата, обладающего адаптогенными свойствами.
Поставленное назначение достигается способом профилактики хронической фтористой интоксикации, при моделировании в эксперименте действием на экспериментальных животных водного раствора фторида натрия и профилактического препарата из растительного сырья.
Фторид натрия вводят с питьевой водой в концентрации 10 мг/л, при суточной дозе фтора 1,2 мг/кг массы тела экспериментального животного. В качестве профилактической добавки вводят один раз в сутки адаптогенный препарат Родиолы розовой экстракт-ВИС в количестве 27 мг/кг массы тела экспериментального животного в 1% крахмальном геле, перед первым кормлением, при режиме кормления 2 раза в день, перорально, индивидуально каждому животному, с помощью канюли, при продолжительности эксперимента 12 недель.
Новизна изобретения состоит в том, что:
- Фторид натрия вводят с питьевой водой в концентрации 10 мг/л, при суточной дозе фтора 1,2 мг/кг массы тела экспериментального животного - эта доза фтора соответствует нормам ПДК вредных веществ в воздухе рабочей зоны и взята из расчета, что крыса массой в среднем 250 г за сутки выпивает около 30 мл воды (10:1000×30=0,3 мг фтора на крысу=1,2 мг/кг);
- В качестве профилактической добавки вводят адаптогенный препарат Родиолы розовой экстракт-ВИС, содержащий в качестве действующего вещества экстракт из корней и корневищ Rhodiola rosea L., а также витамин С. Основным компонентом корней и корневищ Rhodiola rosea L. является салидрозид, составляющий около 50% от массы сухого экстракта - водорастворимое соединение, которое может оказывать влияние на компоненты клеточных мембран, в том числе на связанные с ней рецепторы;
- Родиолы розовой экстракт-ВИС вводят в количестве 27 мг/кг массы тела экспериментального животного в 1% крахмальном геле, один раз в сутки, перед первым кормлением, при режиме кормления 2 раза в день, перорально, индивидуально каждому животному, с помощью канюли;
- Продолжительность эксперимента 12 недель - выбор такой продолжительности эксперимента обусловлен формированием к данному сроку патологических изменений, характерных для ХФИ.
Совокупность существенных признаков изобретения позволит получить новый результат - при длительном воздействии фторида натрия прием адаптогенного препарата Родиолы розовой экстракт-ВИС способствует улучшению метаболизма в тканях, сокращению выраженности дегенеративных, дистрофических и некротических изменений в печени и почках, а также восстановлению синтетической и детоксикационной функций печени.
Адаптогенный препарат Родиолы розовой экстракт-ВИС может быть рекомендован в качестве одного из профилактических средств повреждений, вызываемых длительным воздействием фторида натрия на организм.
Известно, что соединения фтора и их длительное действие являются цитотоксическим фактором, который вызывает значительные изменения в клеточном метаболизме (Жукова А.Г., Михайлова Н.Н., Казицкая А.С., Алехина Д.А. Современные представления о молекулярных механизмах физиологического и токсического действия соединений фтора на организм (обзор литературы). - В ж-ле: Медицина в Кузбассе. - 2017. - Т. 16, №3. - С. 4-11). Как прооксидант фторид натрия изменяет проницаемость клеточных мембран, ингибирует ферменты основных метаболических циклов и активирует свободнорадикальные процессы. В результате чего, избыточное поступление фтора ведет к многочисленным структурным изменениям в разных тканях, в первую очередь в печени и почках (Михайлова Н.Н., Захаренков В.В., Бугаева М.С., Бондарев О.И., Казицкая А.С., Кизиченко Н.В., Уланова Е.В. Специфичность морфологических изменений в органах-мишенях, ассоциированных с воздействием на организм угольно-породной пыли и соединений фтора. - В ж-ле: Медицина труда и промышленная экология. - 2016. - №5. - С. 11-15; Ядыкина Т.К., Горохова Л.Г., Корсакова Т.Г. Парциальные функции почек и водно-солевой баланс в условиях экспериментального флюороза. - В ж-ле: Медицина в Кузбассе. - 2017. - Т. 16, №3. - С. 57-63).
Одним из наиболее эффективных путей ограничения патологических реакций при ХФИ является непосредственное воздействие на внутриклеточный метаболизм и морфоструктуру гепаторенальной системы при помощи растительных препаратов, повышающих адаптацию организма к неблагоприятным условиям. К таким препаратам относится Родиола розовая {Rhodiola rosea L.) - многолетнее травянистое растение семейства толстянковых (Cras-sulaceae) (Краснов Е.А. Флора Сибири - источник биологически активных веществ и лекарственных средств. - В ж-ле: Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - Приложение 2. - С. 11-18). В медицине используют экстракты ее корней и корневищ. Основным компонентом корней и корневищ Rhodiola rosea L. является салидрозид, составляющий около 50% от массы сухого экстракта - водорастворимое соединение, которое может оказывать влияние на компоненты клеточных мембран, в том числе на связанные с ней рецепторы. Показано, что салидрозид участвует в регуляции уровня глюкозы и синтеза АТФ в клетках, а также является индуктором синтеза индуцибельных и конститутивных белков семейства HSP в различных тканях (Андреева Л.И., Бой-кова А.А., Никифорова Д.В. Оценка адаптогенных свойств Родиолы розовой в культуре изолированных мононуклеарных клеток крови человека и в тканях крысы. - В ж-ле: Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. - Т. 76, №2. - С. 23-27). Таким образом, экстракт Родиолы розовой способен активировать адаптационные процессы в клетках и повышать неспецифическую устойчивость тканей организма к действию неблагоприятных факторов.
Профилактический препарат Родиолы розовой экстракт-ВИС (производитель ВИС ООО, Россия) содержит в одной капсуле массой 0,4 г.: Extactum Rhodiolae siccum (экстракт Родиолы) 100 мг, Vitamin С (витамин С) 40 мг, вспомогательный компонент - микрокристаллическая целлюлоза (Изготовитель ООО «ВИС» RU. 77.99.11.003.Е.049668.11.1110.11.2011. Изготовлен в соответствии с документами ТУ 9197-071-89101403-11).
Препарат Родиолы розовой экстракт-ВИС в качестве профилактического средства рекомендуют принимать из расчета на человека средней массой 60 кг по 2 капсулы массой 0,4 г в день во время еды, запивая теплой водой. Расчетная доза препарата при этом составляет: 400 мг × 2=800 мг на человека в сутки, то есть 13,3 мг на 1 кг массы тела человека. Доза для крыс была рассчитана пропорционально дозе, приходящейся на 1 кг массы тела человека в сутки и увеличена в 2 раза по сравнению с профилактической, что составило 27 мг/кг, в целях получения более выраженных защитных эффектов от проявлений фтористой интоксикации.
Патогенетически обусловленная фармакологическая коррекция адаптогенным препаратом Родиолы розовой экстракт-ВИС способствует сокращению выраженности дегенеративных, дистрофических и некротических изменений в печени и почках, а также восстановлению синтетической и детокси-кационной функций печени.
Способ осуществляется следующим образом.
Развитие фтористой интоксикации в эксперименте моделировали свободным доступом крыс к раствору фторида натрия в концентрации 10 мг/л, что составляло суточную дозу фтора 1,2 мг/кг массы тела - эта доза фтора соответствует нормам ПДК вредных веществ в воздухе рабочей зоны и взята из расчета, что крыса массой в среднем 250 г за сутки выпивает около 30 мл воды (10:1000×30=0,3 мг фтора на крысу=1,2 мг/кг).
Продолжительность эксперимента составляла 12 недель.
Длительность эксперимента 12 недель по моделированию фтористой интоксикации является достаточной для определения профилактической дозы препарата.
Экстраполяция возраста крыс на возраст человека (Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. М., 2004.), позволила нам приблизительно соотнести длительность экспериментальной интоксикации фтором со стажем работы во вредных условиях. Так, фтористая интоксикация в течение 1-3 нед соответствует примерно 1-5-летнему стажу работы, 4-6 нед - 6-10-летнему, 7-12 нед и более - свыше 10 лет (Н.Н. Михайлова, А.С.Казицкая, Л.Г. Горохова, А.Г. Жукова Экспериментальный поиск иммунологических критериев определения стадий развития хронической фтористой интоксикации. - В ж-ле: Медицина труда и промышленная экология. - 2012. - №11. - С. 32-37). Кроме того, критерием развития хронической фтористой интоксикации являлось клиническое состояние экспериментальных животных - утрата блеска шерсти, отставание в весе, «тигроидность» окраски зубной эмали. На молекулярном уровне показано, что начиная с 6 недели фтористого воздействия в ткани сердца развиваются нарушения метаболизма и активируются свободнорадикальные процессы (А.Г. Жукова, Д.А. Алехина, Т.Г. Сазонтова и др. Механизмы внутриклеточной защиты и активность свобод-норадикального окисления в миокарде крыс в динамике хронической фтористой интоксикации. - В ж-ле: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2013. - Том 156, №8. - С. 190-194).
Все это определило выбор сроков действия профилактического препарата - адаптогенный препарат вводили одновременно с моделированием фтористой интоксикации (то есть ежедневно в течение 12 недель). Это подтверждается профилактическим действием в эксперименте других препаратов «Кораллового кальция» и «Микрогидрина», которые назначали ежедневно с одновременным моделированием фтористой интоксикации (Е.В. Уланова, А.С. Анохина, И.В. Горбунова, Н.В. Кизиченко Экспериментальные исследования профилактики хронической фтористой интоксикации. - В ж-ле: Бюллетень СО РАМН. - 2006. - №3 (121). - С. 86-89; Уланова Е.В., Михайлова Н.Н., Данилов И.П., Анохина А.С, Фоменко Д.В., Кизиченко Н.В. Способ профилактики хронической фтористой остеопатии при моделировании фтористой интоксикации в эксперименте. - Патент RU №2300374, МПК А61K 31/375 (2006.01), А61K 33/06 (2006.01), А61K 33/16 (2006.01), А61K 33/38 (2006.01), А61Р 19/10 (2006.01), Опубл. Бюл. №16, 10.06.2007).
Крысы были разделены на три группы: 1 - контрольная; 2 - крысы с ХФИ; 3 - крысы, получавшие раствор фторида натрия с одновременным введением один раз в сутки Родиолы розовой экстракт-ВИС в дозе 27 мг/кг в 1% крахмальном геле перед первым кормлением, при режиме кормления 2 раза в день, перорально, индивидуально каждому животному с помощью канюли. Крахмальный гель готовят путем растворения крахмала в горячей воде в соотношении 1:100. Количество вводимого препарата рассчитывалось индивидуально для каждой крысы согласно весу животного и еженедельно корректировалось.
Через 12 недель эксперимента для биохимических и гистологических исследований осуществляли забор крови и тканей: печень, почки после дека-питации под эфирным наркозом. Условия содержания экспериментальных животных и проведение экспериментов соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утверждены приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003, №267).
Биохимический спектр исследования крови осуществлялся унифицированными методами с помощью реактивов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) на фотометре РМ-750 (Robert Riele, Германия) и включал:
- определение концентрации общего белка, альбумина, глюкозы, кальция, магния и фосфора;
- определение активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ), алани-наминотрансферазы (АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), γ-глутамилтрансферазы (γ-ГТ).
Гистологическому исследованию подвергали ткань печени и почек. Биологический материал выдерживали в нейтральном 12% формалине до полной фиксации, затем отмывали от фиксирующей жидкости в водопроводной воде и подвергали химической обработке с применением аппарата для гистологической проводки АТ-4М. Приготовление тонких срезов 3-7 микрон достигалось резкой кусочков на микротоме МС-1. Окрашивание микропрепаратов осуществлялось гематоксилин-эозином, а также пикрофуксином по методу Ван Гизона для выявления соединительной ткани. Микроскопирование гистологических препаратов проводились с помощью микроскопа Olympus СХ31 RBSF (Германия) при увеличении окуляра - 10 крат, поле зрения - 20 мм и объектива 20, 40 и 100 с водной и масляной иммерсией.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0 согласно рекомендациям по проведению биомедицинской статистики. Для сравнения независимых выборок использовали непараметрический Mann-Whitney U Test. Различия между выборками считались статистически значимыми при Р≤0,05 или, в ряде случаев, Р≤0,01,Р≤0,001.
Хроническое действие фторида натрия приводило к разнонаправленным изменениям активности ферментов основных метаболических циклов (группа «ХФИ») в сыворотке крови крыс.Из таблицы 1 видно, что в 1,2-1,7 раза снижена активность АлАТ, γ-ГТ и ЩФ и в 1,2 раза повышена активность АсАТ. Эти данные свидетельствуют, что ХФИ приводила к нарушению синтетической (ингибирование глюкозо-аланинового шунта) и детоксикаци-онной (ингибирование протеолиза денатурированных белков и транспорта ксенобиотиков) функций печени. В результате в сыворотке крови крыс с ХФИ зарегистрирован сниженный уровень глюкозы и альбумина по сравнению с контрольной группой.
ХФИ приводила к увеличению уровня общего белка сыворотке крови (табл. 1, группа «ХФИ»), что может быть связано с ростом белков, участвующих в воспалительном ответе на действие фторида натрия (Казицкая А.С. Сравнительная оценка влияния угольно-породной пыли и фторида натрия на иммунный статус организма (экспериментальные исследования). -дис.канд. биол. наук. -Москва. - 2017. - С. 71).
Кроме того, при ХФИ происходило нарушение гомеостатической функции почек, что проявлялось увеличением концентрации кальция в 1,2 раза и снижением уровня магния в 1,3 раза в крови экспериментальных крыс (табл. 1; группа «ХФИ»).
Изменения на биохимическом уровне подтверждаются данными гистологических исследований тканей печени и почек. В печени к 12-й неделе ХФИ была нарушена балочная структура, гепатоциты находились в состоянии ярко выраженной белковой дистрофии, и большая часть клеток имела просветленную цитоплазму. Отмечалось большое количество фокусов некроза. В портальных трактах развивались фибропластические изменения.
В почках на 12-й неделе фтористого воздействия увеличены в размерах клубочки за счет утолщения стенок капиллярных петель, просветы капсул сужены. Эпителий канальцев в состоянии некронефроза или с дистрофическими изменениями белкового характера, ядра в большей части клеток не прослеживались. Кроме того, в строме отмечалось формирование зон фиброза, что приводило к сдавливанию канальцев.
Профилактическое применение Родиолы розовой экстракт-ВИС оказало положительное влияние на обменные процессы при ХФИ (табл.1, группа «ХФИ+Родиола розовая»), что проявлялось восстановлением до контрольных значений активности ферментов АлАТ, ЩФ и γ -ГТ. Также, улучшались синтетическая и детоксикационная функции печени, о чем свидетельствовало повышение в сыворотке крови концентрации глюкозы, альбумина и активности фермента, участвующего в детоксикации организма - γ-ГТ.
Назначение Родиолы розовой экстракт-ВИС крысам с ХФИ восстанавливало гомеостатические функции почек - до контрольных значений в сыворотке крови концентрация ионов кальция снижалась, а ионов магния повышалась (табл. 1, группа «ХФИ+Родиола розовая»).
Положительный эффект адаптогенного препарата Родиолы розовой экстракт-ВИС проявлялся и на морфологическом уровне. Так, в печени отмечалось снижение выраженности зернистой и баллонной дистрофии гепатоци-тов и уменьшение размеров фокусов некроза. В почках Родиолы розовой экстракт-ВИС также уменьшал дистрофические изменения клеток нефроэпителия по сравнению с группой «ХФИ». Кроме того, в большей части нефроци-тов отмечалось сохранение ядер и целостности цитоплазматических мембран.
Перечисленные положительные эффекты Родиолы розовой экстракт-ВИС на биохимическом и морфологическом уровнях могут быть обусловлены стабилизирующим действием компонентов препарата на клеточные мембраны тканей и окислительный метаболизм. Наблюдаемый защитный эффект также можно объяснить индуцирующим действием Родиолы розовой на экспрессию как индуцибельных, так и конститутивных белков семейства HSP -HSP72 и HSC70 (Андреева Л.И., Бойкова А.А., Никифорова Д.В. Оценка адаптогенных свойств Родиолы розовой в культуре изолированных мононуклеарных клеток крови человека и в тканях крысы. - В ж-ле: Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. - Т. 76, №2. - С. 23-27). Известно, что HSC70 выполняет уникальную шаперонную функцию по отношению к большому числу белков, в том числе активных участников адаптационного процесса, тогда как HSP72 - повышает неспецифическую устойчивость тканей организма к действию повреждающих факторов.
Таким образом, профилактическое применение адаптогенного препарата Родиолы розовой экстракт-ВИС при длительном воздействии фторида натрия способствует улучшению метаболизма в тканях, сокращению выраженности дегенеративных, дистрофических и некротических изменений в печени и почках, а также восстановлению синтетической и детоксикационной функций печени. Родиолы розовой экстракт-ВИС может быть рекомендован в качестве профилактического средства хронической фтористой интоксикации.
Примечание: * - P≤0,05; ** - P≤0,01; *** - P≤0,001 - достоверные различия по сравнению с контрольной группой (Mann-Whitney U test);
Δ
ΔΔ
- P≤0,05;  - P≤0,01 - достоверные различия по сравнению с группой крыс с ХФИ