Изучение эффектов леветирацетама и нового производного 4-фенилпирролидона гиж-290 в закрытом крестооразном лабиринте у мышей линий BALB/c и C57BL/6

Изучение эффектов леветирацетама и нового производного 4-фенилпирролидона ГИЖ-290 в закрытом крестообразном лабиринте у мышей линий BALB/c и C57BL/6

ГКовалёв И.Г.2, Васильева Е.В.1, Боков Р.О.1, Салимов Р.М.1, Ковалёв Г.И.1

1 - Лаборатория радиоизотопных методов исследований ФГБНУ «НИИ фармакологии

имени В.В. Закусова», г. Москва 2 - Лаборатория психофармакологии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва

Резюме. Целью исследования явилось сравнительное изучение эффектов противосудорожных веществ леветирацетама и нового производного пирролидона-2 соединения ГИЖ-290 на спектр поведенческой активности инбредных мышей BALB/c и C57BL/6 в условиях теста «закрытый крестообразный лабиринт». Установлено, что леветирацетам (600 мг/кг/день, 5 дней, в/б) ухудшает когнитивные функции у мышей линии C57BL/6, усиливает тревожность и уменьшает двигательную активность у мышей линии BALB/с. Соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/день, 5 дней, в/б) не оказывает влияния на поведение мышей линии C57BL/6, а у мышей BALB/c снижает локомоторную активность.

Ключевые слова: противоэпилептический препарат, леветирацетам, соединение ГИЖ-290, мыши BALB/c и C57BL/6, ноотропное действие, тревожность, двигательная активность, закрытый крестообразный лабиринт

The effects of levetiracetam and a new 4-phenylpyrrolidone derivative GIZh-290 in a closed cross-maze in BALB/c and C57BL / 6 mice

Kovalev I.G.2, VasiLeva E.V.1, Bokov R.O.1, SaLimov R.M.1, Kovalev G.I.1 1 - Laboratory of Radioizotopic Research Methods, FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow 2 - Laboratory of Psychopharmacology, FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow

Resume. The study was aimed to compare the psychopharmacological effects of 2 anticonvulsant drugs levetiracetam ((S)-2-(2-oxopyrrolidin-1-yl) butanamide) and the new compound, GIZh-290 (2-oxo-4-phenylpyrrolidine-1-yl) acetic acid) on behavioral spectra of inbred mice BALB/c and C57BL/6 under conditions of "closed cross-maze" test. It was found that after 5-fold i.p. injections levetiracetam (600 mg/kg/day) reduced the cognitive and motor ability of C57BL/6 mice, while in BALB/c mice the drug increased anxiety and diminished motor activity. In contrast, the substance GIZh-290 (5 mg/kg/day, i.p.) had no effect in C57BL/6. Compound GIZh-290 (5 mg/kg/day, 5 days, ip) does not affect the behavior of C57BL/6 mice, but depressed the motor activity in BALB/c mice.

Keywords: anticonvulsant, levetiracetam, 4-phenylpyrrolidone derivative, mice, BALB/c, C57BL/6, nootropic action, anxiety, motor activity, closed cross-maze test

Автор, ответственный за переписку:

Ковалёв Иван Георгиевич - аспирант, Лаборатория радиоизотопных методов исследований ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; тел.: +7 (966) 121-23-31; vanneit@yandex.ru

Введение

Леветирацетам (^)-2-(2-оксопирролидин-1-ил) бутанамид) является противоэпилептическим препаратом 2-го поколения, используемым в лечении эпилепсии как у детей, так и у взрослых. Соединение ГИЖ-290 (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил) уксусной кислоты) имеет сходство по химическому строению с леветирацетамом и синтезирован в Отделе химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (зав. член-корр. РАН профессор Гудашева Т.А.). Установлено, что ГИЖ-290 обладает выраженным противосудорожным действием и превосходит леветирацетам по активности и эффективности и, кроме того, ГИЖ-290 оказывает положительное влияние на обучаемость и воспроизведение навыка в тесте

«водного лабиринта Морриса» [1]. Известно, что течению эпилепсии сопутствуют поведенческие и психиатрические отклонения, в частности тревожность, депрессия и нарушение когнитивных функций [2, 3]. Адекватной моделью для исследования этих поведенческих нарушений в эксперименте является методика «закрытого крестообразного лабиринта», при использовании которой установлено, что мыши линии BALB/c характеризуются в сравнении с мышами линии C57BL/6 когнитивным дефицитом и повышенной тревожностью [4].

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния леветирацетама и соединения ГИЖ-290 на спектр поведенческой активности мышей BALB/c и C57BL/6 в условиях теста «закрытый крестообразный лабиринт».

Материалы и методы

Исследования проводили на самцах мышей линий C57BL/6 и BALB/c массой 25—30 г, которые были поставлены питомником «Столбовая» (Московская обл., РФ) и были помещены в условия с контролируемой постоянной температурой и влажностью (40—60%) воздуха, регулярно сменяемым циклом «день—ночь» (12 ч — 12 ч), свободным доступом к воде и еде. Организация экспериментов соответствовала этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123 от 18 марта 1986 г., Страсбург; Об утверждении правил лабораторной практики: приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19 июня 2003 г. М., 2003).

Препараты применяли в дозах, соответствующих их противосудорожному эффекту [1]. Леветирацетам (600 мг/кг/день) и соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/ день) вводили внутрибрюшинно, в течение 5 дней. Вещества растворяли в физиологическом растворе. Контрольным животным вводили 0,9% NaCl.

Тест закрытого крестообразного лабиринта (ЗКЛ) основан на врождённой способности мышей к спонтанному поведению в незнакомой обстановке, исключающей элемент предварительного обучения, преимуществом которого является минимальная степень инвазивности [4, 5]. Закрытый крестообразный лабиринт состоял из 4 пластмассовых закрытых пустых отсеков, соединённых с центральным отсеком с помощью входных отверстий. Мышь помещали в центральный отсек лабиринта и в полуавтоматическом режиме с помощью программы Bеhаvюur регистрировали последовательность и продолжительность её переходов из одного рукава в другой. Последующий анализ данных позволял выделить ряд показателей

эффективности исследовательского поведения (когнитивные функции), тревожности и двигательной активности.

Показатели величины 1-го цикла патрулирования и числа циклов патрулирования (Ра^^ используются для оценки ноотропного действия веществ: чем больше число заходов требуется мыши, чтобы посетить все 4 боковых рукава (совершить один цикл патрулирования), тем менее «систематично» и менее эффективно исследование лабиринта. Число циклов патрулирования, совершённых за время эксперимента, ещё один показатель эффективности исследовательского поведения. Чем больше циклов патрулирования, тем более «систематично» и более эффективно исследование лабиринта животным.

Латентный период (Р_СИш) и продолжительность 1-го визита в боковой отсек (F_GITm) — показатели, которые отражают уровень тревожности животного в новой обстановке и могут рассматриваться как показатель баланса между любопытством и тревогой животного в новой обстановке. Эти показатели отрицательно коррелируют с продолжительностью пребывания животного в открытых рукавах в известном тесте приподнятого крестообразного лабиринта, что позволяет использовать избирательное изменение этих показателей в качестве индикатора тревожности.

Общее время, проведённое животным в центральном и боковых отсеках лабиринта (Т_СМш и Т_01Тш) — это показатели, которые отражают уровень двигательной активности, а также характеризуют интенсивность обследования новой среды и могут быть использованы для оценки стимулирующего (тимолептического) или, наоборот седативного эффекта веществ.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 с привлечением методов параметрической и непара-

Таблица 1

Поведенческие эффекты препарата леветирацетам (600 мг/кг) и вещества ГИЖ-290 (5 мг/кг) в тесте «закрытый крестообразный лабиринт» при внутрибрюшинном введении мышам ВАЬВ/с и С57ВЬ/6

Линия мышей Вещества Ноотропная активность Тревожность Двигательная активность

длина 1-го цикла патрулирования

BALB/c Контроль 6,15±0,54 1,77±0,12# 9,73±2,06# 10,72±2,08 41,34±3,15 107,45±11,07#

Леветирацетам 5,92±0,46 1,85±0,19 19,03±3,34* 11,83±2,29 48,29±6,72 154,73±19,48*

ГИЖ-290 6,00±0,49 1,67±0,14 9,07±2,16 15,7±4,29 35,13±3,97 143,78±13,51*

C57BL/6 Контроль 5,13±0,38 2,25±0,11# 3,88±0,56# 20,11±3,90 37,78±1,84 177,49±20,15#

Леветирацетам 6,11±0,40 1,67±0,12* 4,72±0,75 13,92±2,17 45,61±2,19* 181,31±15,16

ГИЖ-290 5,67±0,33 2,11±0,08 3,37±0,35 13,98±2,13 40,07±3,18 184,78±21,03

Примечание: # — межлинейное различие (Wald-Wolfovitz, p < 0,05); * — отличие от контроля (t-тест Стьюдента, p < 0,05).

метрической статистики (t-тест Стьюдента, тест Манна— Уитни, критерий Колмогорова—Смирнова, тест Вальда— Вольфовица).

Результаты

Анализ поведенческих параметров мышей контрольных групп обеих инбредных линий C57BL/6 и BALB/c подтвердил наличие межлинейных различий, описанных нами ранее [4]: мыши C57BL/6 превосходили мышей линии BALB/c по ноотропной активности, оцениваемой по эффективности исследовательской (более высокое количество полных обходов всех боковых отсеков, PatrN) и уступали по общей двигательной активности (большее суммарное время нахождения в

отсеках за сессию, T_GITm), тогда как мыши линии BALB/c проявляли существенно большую тревожность в незнакомой обстановке (меньший латентный период 1-го захода в боковой отсек, (F_ChTm) (табл. 1).

Леветирацетам (600 мг/кг/день, 5 дней) не обладал ноотропной активностью у мышей BALB/c, что выражалось в отсутствии изменения показателей: числа заходов 1-го цикла (F_PtrN, 5,92±0,46 против 6,15±0,54 в контроле) и числа полных обходов (PatrN, 1,85+0,19 против 1,77+0,12 в контроле). У мышей C57BL/6 леветирацетам не влиял на 1-й показатель ноотропной активности (F_PtrN), однако уменьшал число полных обходов с 2,25+0,11 до 1,67+0,12 (р < 0,05; Student's t-test), что означает ухудшение эффективности исследовательской активности, а следовательно и ког-

б

а

в

г

Рис.1. Сравнительные поведенческие спектры эффектов 5-кратного введения леветирацетама (а, в) и ГИЖ-290 (б, г) у инбредных мышей BALB/c (а, б) и C57BL/6 (в, г) в закрытом крестообразном лабиринте (% к контролю).

Примечание: за 100% приняты показатели в группах контроль (сплошная линия); достоверное отличие от контроля по t-тесту Стьюдента (p < 0,05).

нитивных функций (табл. 1). Соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/день, 5 дней) не оказывало влияния на показатели, отражающие ноотропный эффект (см. табл. 1).

У мышей ВЛЬВ/с, исходно более тревожных в незнакомой обстановке теста, леветирацетам ещё более увеличивал латентное время 1-го захода (с 9,73±2,06 с в контроле до 19,03±3,34 с в опыте;р < 0,05), что свидетельствует о способности леветирацетама повышать уровень тревожности (см. табл. 1). Леветирацетам не изменял уровень тревожности у мышей линии C57BL/6, а ГИЖ-290 не изменял показатели тревожности у мышей обеих линий.

Леветирацетам и ГИЖ-290 у мышей ВЛЬВ/с повышали показатель общего времени пребывания в боковых отсеках, соответственно до 154,73+19,48 с и 143,78±13,51 с по сравнению с контролем (107,45+11,07 с; р < 0,05), что отражало снижение двигательной активности. Кроме того, у мышей С57ВЬ/6 леветирацетам повышал показатель общего времени пребывания и в центральном отсеке: с 37,78+1,84 с в контроле до 45,61+2,19 с в опыте (см. табл. 1).

Изменение профилей поведенческой активности мышей линий ВЛЬВ/с и С57ВЬ/6 под влиянием леветирацетама и ГИЖ-290 представлены на рис. 1. Из представленных графиков следует, что эффекты обоих веществ во многом зависят от исходного поведенческого паттерна линии мышей. Так, у мышей BALB/c, исходно характеризующихся высокими уровнями тревожности и двигательной активности, леветирацетам способствовал ещё большему усилению тревожности (+96% относительно контроля, рис. 1, а), тогда как ГИЖ-290 не оказывал влияния на тревожность (рис. 1, б). При этом оба вещества не изменяли показателей тревожности у мышей линии С57ВЬ/6 (рис. 1, в, г).

Качественное совпадение эффектов наблюдалось и в отношении двигательной активности: у мышей ВЛЬВ/с как леветирацетам, так и ГИЖ-290 она снижалась за счёт возрастания суммарного времени пребывания в боковых отсеках лабиринта T_GlTш на 44 и 34% (см. рис. 1, а, б), соответственно. У мышей С57ВЬ/6, спонтанно менее «быстрых», некоторое снижение перемещений по показателю суммарного времени пребывания в центральном отсеке (Т_С^Тт) вызывал лишь леветирацетам.

В этой же группе мышей было обнаружено ухудшение показателя эффективности исследовательского поведения (-26%) (рис. 1, в).

Таким образом, леветирацетам (600 мг/кг/день, 5 дней, в/б) у мышей ВЛЬВ/с усиливал тревожность и снижал двигательную активность, а у мышей линии С57ВЬ/6 ухудшал когнитивные функции и уменьшал двигательную активность (табл. 2). Соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/день, 5 дней, в/б) существенно не изменяло профилей поведения мышей линий ВЛЬВ/с и С57ВЬ/6, за исключением снижения двигательной активности у мышей линии ВЛЬВ/с (см. табл. 2).

Известно, что наиболее типичными психиатрическими расстройствами при эпилепсии являются тревожность, депрессия, эмоциональная лабильность, ажитация, враждебность [2, 6] и когнитивный дефицит [7]. В настоящем исследовании показано, что леветирацетам может усиливать эти патологические состояния, что подтверждается отдельными клиническими наблюдениями [8—10]. Соединение ГИЖ-290 не оказывает существенного влияния на психоэмоциональные показатели поведения мышей как линии ВЛЬВ/с, так и линии С57ВЬ/6, демонстрирующих различные паттерны поведения в тесте закрытого крестообразного лабиринта, что позволяет предполагать отсутствие у него негативного влияния на психиатрические ко-морбидные состояния, сопровождающие эпилепсию у пациентов, и свидетельствует о преимуществе нового соединения перед леветирацетамом.

Выводы

1. Леветирацетам (600 мг/кг/день, 5 дней, в/б) в тесте закрытого крестообразного лабиринта у мышей линии ВЛЬВ/с усиливает тревожность и снижает двигательную активность, а у мышей линии С57ВЬ/6 ухудшает когнитивные функции и уменьшает двигательную активность.

2. Соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/день, 5 дней, в/б) в тесте закрытого крестообразного лабиринта не оказывает влияния на уровень тревожности и на когнитивные функции у мышей линий ВЛЬВ/с и С57ВЬ/6 и лишь незначительно понижает двигательную активность у мышей линии ВЛЬВ/с.

Таблица 2

Сопоставление психофармакологической активности леветирацетама и ГИЖ-290 на инбредных мышах

Линия мышей ВАЬВ/с С57ВЬ/6

Активность Ноотропная Тревожность Двигательная Ноотропная Тревожность Двигательная

Леветирацетам 0 т 0

ГИЖ-290 0 0 1 0 0 0

Примечание: -1/Т/0 — снижение/увеличение/отсутствие эффекта.

Литература

1. Ковалёв И.Г., Воронина Т.А., Литвинова С.А., Жмуренко Л.А., Мокрое Г.В. Сравнение противосудорожных и мнемотропных свойств новых производных 4-фенилпирролидона, леветирацетама и пираце-тама. Эксперим. и клин. Фармакол. 2017; (в печати).

2. Jones J.E. Treating anxiety disorders in children and adolescents with epilepsy: What do we know? Epilepsy & Behavior. 2014; 39: 137-142.

3. Brand Ch., Mula M. Anxiety disorders in people with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 2016; 59: 87-91.

4. Васильева Е.В., Салимов Р.М., Ковалёв Г.И. Влияние интраназаль-ного и внутрибрюшинного введений пептидов семакса и ноопепта на поведенческие характеристики мышей BALB/c. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2016; 2: 31-36.

5. Salimov R.M. Behavioral patterns related to alcohol use in rodents: a factor analysis. Alcohol. 1999; 17: 157-162.

6. Kanner A.M., Hesdorffer D.C. Neuropsychiatry complications of epilepsy. In: H.Stefan and W.H. Theodore, editors. Handbook of Clinical Neurology, Vol.107 (3rd series) Epilepsy, Part I. Elsevier B.V.; 2012; 461-482.

7. Ortinski P., MeadorK.J. Cognitive side effects of antiepileptic drugs. Epilepsy & Behavior. 2004; 5: S60-S65.

8. Mukhin K.Y., Pylaeva O.A. Efficacy and Tolerability of Levetiracetam (Keppra) in the Treatment of Epilepsy: Review of Literature. Russian Journal of Child Neurology. 2015; 2 (10): 38.

9. Cramer J.A., De Rue K., Devinsky O. et al. A systematic review of the behavioral effects of levetiracetam in adults with epilepsy, cognitive disorders, or an anxiety disorder during clinical trials. Epilepsy Behav 2003; 4 (2): 124-32.

10. Mula M, Sander J.W. Negative effects of antiepileptic drugs on mood in patients with epilepsy. Drug Safety. 2007; 30(7): 555-67.