ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка, способная экспрессировать апофотопротеин и продуцировать биолюминесцентный сигнал в присутствии подходящего хромофора в качестве субстрата в ответ на изменения внутриклеточной концентрации кальция.
2. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.1, являющаяся нечеловеческой тотипотентной или плюрипотентной клеткой; человеческой или нечеловеческой плюрипотентной опухолевой клеткой или мультипотентной клеткой или ее предшественником и происходящая из эмбриона, плаценты или амниотической жидкости, или же из взрослого организма.
3. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.1 или 2, где геном апофотопротеина является любой ген апофотопротеина природного или рекомбинантного или синтетического происхождения.
4. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.3, где апофотопротеином является природный или подвергнутый мутагенезу мутант, имеющий улучшенную люминесцентную активность и/или чувствительность к кальцию.
5. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.3, где ген апофотопротеина имеет последовательность, оптимизированную для использования кодонов млекопитающих и/или слитую с целевыми митохондриальными последовательностями.
6. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.1, где последовательность апофотопротеина соответствует последовательности SEQ ID No 1.
142
7. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.1, где последовательность апофотопротеина соответствует последовательности клитина (с номером доступа в GenBank Q08121), подвергнутой мутагенезу в следующем положении: Gly→Cys.
58
69
70
76
77
78
81
86
87
90
92
97
8. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.1, где последовательность апофотопротеина соответствует последовательности клитина (с номером доступа в GenBank Q08121), подвергнутой мутагенезу в следующих 12 положениях: Gly→Glu, Asp→Val, Ala→ Cys, Lys→Arg, Lys→Gly, Ile→Cys, Asp→Glu, Val→ Ile, Glu→Ala, Ala→Gln, Val→Leu и Glu→Gln.
9. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.1, дифференцированная в конкретную клеточную линию, для получения экспрессии мишени.
10. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.9, где конкретная клеточная линия представляет собой линию клеток сердечной мышцы или нейрональную линию клеток или линию клеток мезенхимы.
11. Стабильная рекомбинантная стволовая клетка по п.1, где ген апофотопротеина находится под контролем повсеместного, органоспецифического, тканеспецифического, специфичного в отношении клетки, стадии развития или индуцибельного промотора.
12. Способ идентификации факторов, стимулирующих дифференцировку стволовых клеток в специфическую линию клеток, включающий в себя стадии
a) получения стабильных рекомбинантных стволовых клеток по пп.1-8 в недифференцированной стадии;
b) обработки указанных клеток библиотекой соединений, содержащей факторы, предположительно индуцирующие дифференцировку, для получения экспрессии по меньшей мере одной специфической линии клеток-мишеней;
c) нагружения клеток подходящим хромофором в качестве субстрата;
d) стимуляции указанной специфической линии клеток-мишеней лигандом, так, чтобы достичь изменения внутриклеточного Ca++;
e) обнаружения биолюминесценции фотопротеина.
13. Способ по п.12, где специфической линией клеток является линия клеток сердечной мышцы или нейрональная линия клеток.
14. Способ по п. 12 или 13, выполняемый с применением высокопроизводительного скрининга.
15. Способ идентификации факторов, ингибирующих дифференцировку стволовых клеток в специфическую линию клеток, включающий в себя стадии
a) получения стабильных рекомбинантных стволовых клеток по пп.1-8 в недифференцированной стадии;
b) обработки указанных клеток библиотекой соединений, содержащей факторы, предположительно ингибирующие дифференцировку;
с) обработки указанных клеток фактором, известным в качестве индуктора дифференцировки для получения экспрессии по меньшей мере одной специфической линии клеток-мишеней;
d) нагружения клеток подходящим хромофором в качестве субстрата;
e) стимуляции указанной специфической линии клеток-мишеней лигандом так, чтобы достичь изменения внутриклеточного Ca++;
f) обнаружения биолюминесценции фотопротеина.
16. Способ по п.15, где специфической линией клеток является линия клеток сердечной мышцы или нейрональная линия клеток.
17. Способ по п. 15 или 16, выполняемый с применением высокопроизводительного скрининга.
18. Способ идентификации лиганда, способного стимулировать специфическую мишень таким образом, что достигается изменение внутриклеточного Ca++, включающий в себя стадии
a) получения стабильных рекомбинантных стволовых клеток по пп.1-8;
b) дифференцировки указанных клеток в конечном счете в специфическую линию клеток для получения экспрессии мишени;
c) нагружения клеток подходящим хромофором в качестве субстрата;
d) обработки клеток библиотекой соединений, содержащей предположительные лиганды для указанной мишени;
e) обнаружение биолюминесценции фотопротеина.
19. Способ по п.18, где специфической линией клеток является линия клеток сердечной мышцы или нейрональная линия клеток.
20. Способ по п. 18 или 19, выполняемый с применением высокопроизводительного скрининга.
21. Способ идентификации антагонистов в отношении мишени, приводящих к изменению внутриклеточного Ca++, включающий в себя стадии
a) получения стабильных рекомбинантных стволовых клеток по пп.1-8;
b) дифференцировки указанных клеток в конечном счете в специфическую линию клеток для получения экспрессии мишени;
c) нагружения клеток подходящим хромофором в качестве субстрата;
d) обработки клеток библиотекой соединений, содержащей предположительные антагонисты для указанной мишени;
e) обработки клеток лигандом, способным стимулировать указанную мишень;
f) обнаружения биолюминесценции фотопротеина.
22. Способ по п.21, где специфической линией клеток является линия клеток сердечной мышцы или нейрональная линия клеток.
23. Способ по п. 21 или 22, выполняемый с применением высокопроизводительного скрининга.
24. Применение стабильных рекомбинантных стволовых клеток по пп.1-11 для тестирования in vitro токсичности и/или тератогенности вещества.