Изменение уровня экспрессии молекул адгезии клеток врождённого иммунитета человека гликополимерами морских бактерий

Изменение уровня экспрессии молекул адгезии клеток врождённого иммунитета человека гликополимерами морских бактерий

Т. П. СМОЛИНА, Т. С. ЗАПОРОЖЕЦ, Н. Н. БЕСЕДНОВА

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

Modification of Levels of Adhesion Molecule Expression of Human Innate Immune Cells by Glycopolymers of Marine Bacteria

T. P. SMOLINA, T. S. ZAPOROZHEC, N. N. BESEDNOVA

G. P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok

С помощью цитометрического метода показано, что липополисахарид и экзополисахарид морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens изменяют экспрессию молекул адгезии на нейтрофилах и моноцитах человека, снижая уровень экспрессии молекул CD62L и увеличивая экспрессию CD11b, CD11c и CD54.

Ключевые слова: морские бактерии, липополисахарид, экзополисахарид, молекулы адгезии.

By flow cytometry it was demonstrated that lipopolysaccharide and exopolysaccharide of marine proteobacteria Pseudoalteromonas nigrifaciens alter the expression of adhesion molecules on human neutrophils and monocytes, reducing the expression level of molecules CD62L and increasing the expression of CD11b, CD11c and CD54.

Key words: marine bacteria, lipopolysaccharide, exopolysaccharide, adhesion molecules.

Введение

Врождённый иммунитет является первой линией защиты организма от патогенов и реализуется с помощью клеток-эффекторов. Движение лейкоцитов — одних из главных эффекторных клеток врождённого иммунитета — в очаг воспаления начинается с серии адгезионных событий, каждое из которых связано с изменением экспрессии определённого типа поверхностных молекул [1]. В связи с этим актуален поиск препаратов, активирующих процессы адгезии эффекторов врождённого иммунитета. Наиболее изученными и эффективными индукторами активации иммунной системы организма являются бактериальные липополиса-хариды (ЛПС), однако они содержат токсический компонент липид А, что ограничивает использование ЛПС в качестве основы для получения лекарственных препаратов [2]. Другими перспективными для биомедицины гликополимерами являются экзополисахариды (ЭПС) бактерий, которые характеризуются сложной химической структурой, большим количеством функциональных групп и проявляют биологическую активность [3].

© Коллектив авторов, 2015

Адрес для корреспонденции: 690087 Владивосток, ул. Сельская, 1. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова

В последнее десятилетие наблюдается повышенный научный интерес к морской микробиологии. Специфические особенности морской среды обитания приводят к разнообразию физиологических возможностей морских микроорганизмов. Многие соединения, изолированные из морских гетеротрофных бактерий, оказались уникальными по своей структуре и/или физиологическому действию [4, 5]. Морские аэробные бактерии рода РзгийоаИгготопаз — важная в фундаментальном и практическом отношении группа микроорганизмов. Бактерии этой группы продуцируют широкий набор биологически активных соединений, перспективных для биотехнологии, обнаруживаются во всех районах Мирового Океана на поверхности биотических и абиотических объектов, в морской воде, а также могут культивироваться в искусственных условиях [6]. ЛПС морских бактерий Р5вийоаИвготопа5 т^/аавт содержат необычные структурные варианты липида А с низким эндотоксическим потенциалом [7] и оказывают активирующее действие на клетки крови человека [8].

Цель работы — изучение влияния ЛПС и эк-зополисахарида (ЭПС) P.nigri/aciвns (штамм КММ 156) на миграционный потенциал клеток врождённого иммунитета, от которого сущест-

Уровень экспрессии молекул адгезии на поверхности лейкоцитов после инкубации с гликополимерами P.nigrifaciens

Маркёры Сроки инкубации_Моноциты_Гранулоциты_

Контроль_ЛПС_ЭПС_Контроль_ЛПС_ЭПС_

Средняя интенсивность флюоресценции (МП), Ме [Мт—шах]

CD62L 1 ч 70,6 52,6* 2,9* 171 167 15*

24 ч 10 15 21* 100 55* 21*

CD11b 1 ч 1506 1855* 3347* 1010 1207* 3788*

24 ч 701 1842* 1823* 739 1338* 1254*

CD11c 1 ч 448 537* 973* 101 98 327*

24 ч 387 1247* 1253* 105 189* 186*

CD54 1 ч 91 113 292* 16,6 17,4 28,9*

24 ч 143 1267* 2507* 45 120* 235*

Примечание. Ме - медиана; (Мт—тах) - минимальное и максимальное значение; * - различия статистически значимы (р<0,05) по отношению к контролю.

венно зависит эффективность элиминации патогенных микроорганизмов. Для этого исследовали динамику экспрессии молекул адгезии трёх семейств: селектинов (CD62L), интегринов (CD11b и CD11c) и иммуноглобулинов (CD54) — на мембранах моноцитов и гранулоцитов человека.

Материал и методы

ЛПС и ЭПС получены из штамма Pseudoalteromonas nigrifaciens КММ 156, выделенного из ткани желудка дальневосточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus. ЭПС состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы, один остаток 2-ацета-мидо-2-дезокси^-глюкозы и один остаток 3-0-[(К)-1-кар-боксиэтил]^-глюкозы (глюколактиловой кислоты) [9]. Гликополимеры выделены и любезно предоставлены нам для исследования сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г. Б. Елякова.

Материалом для исследования служила периферическая кровь с гепарином (25 ЕД/мл), полученная от здоровых доноров. Использование цельной крови не требует выделения и подготовки клеток к культивированию, устраняет неспецифическую активацию клеток на этапах сепарации, и при этом сохраняется существующий in vivo баланс различных типов клеток крови [10].

Исследуемые гликополимеры растворяли в физиологическом растворе (NaCl 0,9 %) и вносили в кровь в конечной концентрации 10 мкг/мл. В контрольные пробы вносили физиологический раствор в объёме, равном объёму раствора гликополимеров. Уровень экспрессии молекул определяли методом цитометрического анализа в программе «CellQuest Pro» на проточном цитометре «FACSCalibur» («Becton Dickinson») c использованием моноклональных антител к молекулам CD45-FITC/ CD14-PE, CD62L-FITC, CD11b-PE, CD11c-PE, CD54-PE, CD14-FITC («Beckman Coulter») и соответствующих изотипических контролей. Гейтирование субпопуляций гранулоцитов, основную часть которых составляют нейтрофилы, осуществляли по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию. Моноциты дифференцировали от других клеток по параметрам FSC и SSC, а также по экспрессии клетками молекул CD14. В каждой пробе анализировали не

менее 104 клеток. Экспрессию молекул адгезии на поверхности клеток определяли через 1 и 24 ч.

Результаты отражают плотность (количество) молекул на поверхности клеток и представлены в виде условных единиц средних интенсивностей флюоресценции (МИ).

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами непараметрической статистики с использованием пакета компьютерных программ ОЕ08ТАТ, которые включали расчёт медианы и квартального размаха (разность значений 75-го и 25-го процентиля), а также оценку различий с использованием критерия Вилкоксона для связанных групп.

Результаты и обсуждение

Селектины. Анализ экспрессии Ь-селектинов показал, что инкубация цельной крови с гликополимерами P.nigrifaciens приводила к статистически значимому снижению (^<0,05) уровня экспрессии молекул СБ62Ь на мембранах моноцитов и гранулоцитов по сравнению с контролем (рисунок, таблица). ЭПС P.nigrifaciens оказывал на моноциты и гранулоциты более выраженный эффект, чем ЛПС, инициируя максимальное снижение количества молекул Ь-селек-тинов уже через 1 ч инкубации. К 24 ч инкубации шеддинг (слущивание) Ь-селектинов с поверхности моноцитов, инкубированных с ЭПС, прекращался, и начиналось восстановление экспрессии мембранных молекул СБ62Ь. Снижение экспрессии СБ62Ь под действием ЛПС продолжалось до окончания эксперимента (до 24 ч), но степень снижения плотности этих молекул была ниже, чем при использовании ЭПС. В ходе эксперимента количество мембранных молекул СБ62Ь на моноцитах снижалось и в опытной, и в контрольной группах, так как клетки вне организма могут активироваться и без стимулирующего агента. В результате этого значимого различия между уровнями экспрессии Ь-селектинов

Уровень экспрессии L-селектинов и уЗ-интегринов моноцитами и гранулоцитами после инкубации с гликополимерами P.nigrifaciens.

опытных (ЛПС) и контрольных моноцитов к 24 ч не наблюдалось.

Миграция иммунокомпетентных клеток к тканям-мишеням — сложный многоэтапный процесс, который включает в себя каскад последовательных взаимодействий между лейкоцитами и

клетками эндотелия. Молекулы адгезии, относящиеся к селектинам, играют специализированную роль в процессе передвижения лейкоцитов в участок воспаления и передаче различных межклеточных сигналов. Ь-селектины принимают участие в процессе «роллинга» клеток, а затем бы-

стро слущиваются с их поверхности для остановки лейкоцитов и дальнейшей миграции в ткани [11]. Известно, что Ь-селектин конститутивно экспрессируется на всех классах лейкоцитов , действует как низкоаффинный рецептор ЛПС. Взаимодействие ЛПС с молекулами Ь-селектинов на нейтрофилах опосредует не только первый этап миграции, но и активацию клеток, продукцию супероксидных радикалов [12]. Ь-селектиноы, экс-прессированные на моноцитах, играют ключевую роль в инициации миграции моноцитов из крови в место воспаления [11]. Снижение уровня экспрессии СБ62Ь на гранулоцитах и моноцитах под действием гликополимеров свидетельствует о мобилизации и активации эффекторных клеток, готовности их к миграции.

Интегрины. Инкубация цельной крови с ЛПС в течение 1 ч приводила к увеличению в2-интег-ринов (СБ11Ъ и СБ11с) на мембранах моноцитов по сравнению с контролем (см. рисунок, таблицу). К 24 ч инкубации уровень экспрессии интег-ринов на моноцитах превышал контрольные показатели: СБ11Ъ — в 2,6 раза; СБ11с — в 3,2 раза. ЭПС P.nigrifaciens оказывал на моноциты более выраженный эффект, увеличение — в2-интегри-нов (СБ11Ъ и СБ 11с) на клеточных мембранах наблюдалось уже через 1 ч инкубации. К 24 ч инкубации уровень СБ11Ъ начинал снижаться, но всё ещё превышал контрольный показатель, в то время как экспрессия молекул СБ11с продолжала увеличиваться.

Анализ экспрессии адгезионных молекул гра-нулоцитов показал, что при инкубации клеток крови с ЛПС в течение 1 ч увеличивалась экспрессия только молекул СБ11Ъ, а уровень СБ11с. не превышал показателя контрольной группы. Ко второму сроку эксперимента (24 ч) оба маркёра адгезии: СБ11Ъ и СБ11с — значительно возросли. ЭПС индуцировал максимальное увеличение уровня экспрессии молекул СБ11Ъ и СБ11с в течение первого часа инкубации. К 24 ч инкубации разница между уровнем экспрессии этих адгезионных молекул контрольной и опытной групп (ЭПС) уменьшалась, но оставалась значимой.

Комплекс СБ11/СБ18 является в2-интегри-ном, который экспрессируется на поверхности нейтрофилов и моноцитов. Интегрины относятся к семейству трансмембранных гликопротеинов, состоят из а- и в-субъединиц и образуют различные гетеродимеры. Интегрины принимают участие в процессах миграции и адгезии клеток, формировании межклеточных контактов, регуляции фагоцитоза. СБ11Ъ — субъединица аМ рецептора СЯ3 для компонента комплемента Ю3Ъ, принадлежит к семейству в2-интегринов (аМв2). СБ11Ъ обеспечивает адгезию лейкоцитов между собой и к поверхности эндотелия, а также фагоцитоз частиц, опсонизированных Ю3Ъ. СБ 11с — белок с

внеклеточной, трансмембранной и цитоплазма-тической частями. Является субъединицей ах рецептора СЯ4 для компонента комплемента Ю3Ъ. Принадлежит к семейству в2-интегринов (а^в2). Молекулы СБ11с участвуют в удалении опсонизированных частиц и иммунных комплексов, связываются с фибриногеном, необходимы для адгезии макрофагов и нейтрофилов к эндотелию. Комплекс СБ11/СБ18 накапливается во вторичных гранулах нейтрофилов и моноцитов. При активации клеток происходит быстрое перемещение комплекса из гранул и их экспрессия на поверхности клеток [13].

Молекулы межклеточной адгезии. В исследовании показано, что под действием ЭПС плотность молекул СБ54 на моноцитах и гранулоци-тах значимо возрастала уже через 1 ч инкубации и продолжала увеличиваться до конца срока эксперимента (24 ч). ЛПС увеличивал уровень экспрессии СБ54 только к 24 ч инкубации.

Молекулы межклеточной адгезии, 1САМ-1 (СБ54) экспрессируются на лейкоцитах крови при активации и участвуют в обеспечении адгезии нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов к активированному сосудистому эндотелию с последующей их экстравазацией и миграцией в очаг воспаления. Также молекулы СБ54 функционируют как сигнальные и принимают участие в передаче сигнала с клеточной мембраны внутрь клетки и запуске каскада событий, результатом чего является продукция супероксидных радикалов [14]. На экспрессию молекул СБ54 оказывают влияние цитокины, особенно ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у [15].

В исследовании показано, что под действием ЭПС плотность молекул СБ54 на моноцитах и гранулоцитах значимо возрастала уже через 1 ч инкубации и продолжала увеличиваться до конца срока эксперимента (24 ч). ЛПС увеличивал уровень экспрессии СБ54 только к 24 ч инкубации.

Таким образом, проведённое исследование демонстрирует значимые изменения в уровне экспрессии Ь-селектинов (СБ62Ь), интегринов (СБ11Ъ и СБ11с) и иммуноглобулинов (СБ54) на мембранах моноцитов и гранулоцитов человека под действием гликополимеров морских бактерий P.nigrifaciens. ЛПС и ЭПС эффективно воздействуют как на гранулоциты, так и на моноциты крови, но ЭПС оказывает более быстрый эффект, чем ЛПС. Возможно, это связано с тем, что ЭПС был выделен путём экстракции клеток физиологическим раствором и сохранил натив-ную конформацию в сравнении с ЛПС, полученным с помощью обработки клеток горячим водным фенолом.

Изменение экспрессии молекул адгезии моноцитов и гранулоцитов определяет особенности

активации и осуществление эффекторных функций клеток. Экспрессированные на клетках рецепторы проводят сигналы, запускающие внутриклеточные каскадные реакции, которые могут активировать процессы адгезии, миграции, фагоцитоза, дегрануляции, продукции хемокинов и цитокинов, необходимых для инициации гуморального и клеточного иммунитета [16].

Известно, что дефект адгезии лейкоцитов приводит к нарушению бактерицидной функции фагоцитов. Из-за отсутствия на лейкоцитах молекул адгезии нарушается их взаимодействие с другими клетками, нейтрофилы не связываются с клетками эндотелия и не мигрируют в ткани в ответ на хемотаксические стимулы [17]. Защитное действие иммуномодуляторов бактериального происхождения, несущих патоген-ассоцииро-ванные молекулярные структуры микроорганизмов активирующих клетки врождённого иммуни-

ЛИТЕРАТУРА

1. Beutler B. Innate immunity: an overview. J Mol Immunol 2004; 40: 845-859.

2. Alexander C, Rietschel E.T. /.Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. J Endotox Res 2001; 7: 3: 167—202.

3. Nwodo U, Green E, Okoh A.I. Bacterial exopolysaccharides: functionality and prospects. Int J Mol Sci 2012; 13: 14002—14015.

4. Okami Y. The search for bioactive metabolites from marine bacteria. J Mar Biotechn 1993; 1: 59—65.

5. Laurienzo P. Marine polysaccharides in pharmaceutical applications: An overview. Mar Drugs 2010; 8: 2435—2465.

6. Bowman /.P. Bioactive compound synthetic capacity and ecological significance of marine bacterial genus Pseudoalteromonas. Mar Drugs 2007; 5: 220—241.

7. Красикова И.Н., Капустина Н.В., Исаков В В. Установление структуры липида А из морской грамотрицательной бактерии Pseudoalteromonas haloplanktis АТСС 14393т. Биоорган хим 2004; 30: 4: 409-416. / Krasikova I.N., Kapustina N.V., Isakov V.V. Ustanovlenie struktury lipida A iz morskoj gramotricatel'noj bakterii Pseudoalteromonas haloplanktis ATSS 14393t. Bioorgan him 2004; 30: 4: 409—416. [in Russian]

8. Смолина Т.П., Запорожец T.C., ГоршковаР.П., НазаренкоЕ.Л. Ранняя активация лимфоцитов и моноцитов периферической крови человека компонентами протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifa-ciens. Тихоокеан мед журн 2009; 3: 45—48. / Smolina T.P., Zaporozhec T.S., Gorshkova R.P., Nazarenko E.L.. Rannjaja aktivaci-ja limfocitov i monocitov perifericheskoj krovi cheloveka komponentami proteobakterij Pseudoalteromonas nigrifaciens. Tihookean med zhurn 2009; 3: 45—48. [in Russian]

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Смолина Татьяна Павловна — к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

Запорожец Татьяна Станиславовна — д.м.н., с.н.с. (звание), вр.и.о директора НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, Владивосток

тета, наступает быстро, является относительно неспецифичным, а значит эффективным против больших групп патогенов. В этой связи ЛПС и ЭПС P.nigrifaciens представляют интерес для фундаментальных и биотехнологических исследований как перспективные активаторы клеток врождённого иммунитета.

Выводы

1. ЛПС и ЭПС, выделенные из морских бактерий P.nigrifaciens, усиливают миграционный потенциал нейтрофилов и моноцитов человека, снижая уровень экспрессии молекул CD62L и увеличивая экспрессию CD11b, CD11c и CD54.

2. ЭПС оказывает более эффективное действие на изменение экспрессии молекул адгезии нейтрофилами и моноцитами крови человека, чем ЛПС.

9. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков А.А. и др. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas haloplanktis KMM156. Биоорган хим 1993; 19(3): 327-336. / Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov A.A. i dr. Struktura povtorjajushhegosja zvena kislogo polisaharida Alteromonas haloplanktis KMM156. Bioorgan him 1993; 19 (3): 327-336. [in Russian]

10. Glasser L, Fiederlein R. The effect of various cell separation procedures on assays of neutrophil function. A critical appraisal. Am J Clin Pathol 1990; 93: 662-669.

11. Smalley D.M, Ley K. L-Selectin: mechanisms and physiological significance of ectodomain cleavage. J Cell Mol Med 2005; 9: 255—266.

12. Rosen S.D. Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond. Annu Rev Immunol 2004; 22: 129—156.

13. Rosales C., Juliano, R. L. Signal transduction by cell adhesion receptors in leukocytes. J Leukocyte Biol 1995; 57: 189—198.

14. Takashi S, Okubo J., Horie S. J. Contribution of CD54 to human eosinophil and neutrophil superoxide production. J Appl Physiol 2001; 91: 613—622.

15. Roebuck K.A., Finnegan K.A. Regulation of intercellular adhesion mol-ecule-1 (CD54) gene expression. J Leukocyte Biol 1999; 12: 66.

16. Aplin A.E, Howe S.K, Alahari K, and Juliano R.L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. J Pharmacol Rev 1998; 50: 197—263.

17. Etzioni A. Adhesion molecules: their role in health and disease. Pediatric Research 1996; 39: 191—198.

Беседнова Наталия Николаевна — д.м.н., академик РАН, главный научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток