Материалы VIII симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 1–3 февраля 2013 г

Материалы

VIII Российского симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний»

Москва, 1-3 февраля 2013 г.

4 ’201 2

4 ’201 2

Молекулярные механизмы движения хромосом в митозе

Ф.И. Атауллаханов

ФГБУ«Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва; Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва; физический факультет ФГБОУВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»

Моделирование неонатального роста эмбриональной опухоли

И.В. Бегун1, О.В. Красько2,

О.И. Быданов1, О.В. Алейникова1

1ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь; 2Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, Минск, Республика Беларусь

В последние 5—6 лет был в значительной степени выяснен механизм работы нанодвигателя, обеспечивающего движение хромосомы при делении клетки. Оказалось, что хромосомы двигает машина, механизм работы которой уникален и не имеет аналогов ни в биологии, ни в технике, ни в других областях науки. Главными движителями хромосом являются микротрубочки. Эти трубки, имеющие диаметр в 25 нм и состоящие из одного белка — тубулина, могут запасать химическую энергию в виде механического напряжения, которое потом используется для движения хромосомы. Проведенное нами исследование динамики деполимеризации такой трубки с помощью лазерного динамометра показало, что они могут развивать довольно большие по молекулярным меркам силы — до 70—80 пиконьютон (R. McIntosh, F. Ataullakhanov et al. Cell, 2008; R. McIntosh, F. Ataullakhanov. J Cell Sci, 2010). Эти силы микротрубочка развивает в ходе процесса, называемого «катастрофой», — стенки микротрубочки растрескиваются вдоль ее оси и образующиеся длинные узкие «протофиламенты» изгибаются наружу и толкают специальный комплекс белков, связанных с хромосомой. Кинетохорный комплекс белков, обеспечивающих динамическое сопряжение движения хромосомы с разбирающимся концом микротрубочки, формирует сложное устройство, структуру и работу которого мы только начинаем понимать. Возможные гипотезы об устройстве этого комплекса будут проанализированы и сопоставлены с экспериментальными данными.

Задача исследования. Моделирование динамики роста эмбриональной опухоли в раннем неонатальном периоде.

Пациенты и методы. Для выполнения экстраполяции обобщены результаты первичной ультразвуковой визуализации новообразования у 133 детей обоего пола в возрасте от 1 до 729 дней (медиана — 301 день) с морфологически подтвержденными эмбриональными опухолями: гепатобластомой, нейробластомой и нефробластомой. Известно уравнение роста массы

±_

М(0 — И02ВТ,

аналогично, разделив массу на плотность ткани и логарифмируя, можно записать

^ + 1о§2 V).

Принимая гипотезу линейного роста периода удвоения для эмбриона (Г.П. Седова, 2008) и выдвигая гипотезу о подобии параметров роста эмбриональной опухоли и наиболее интенсивно растущего в периоде от зачатия до 2 лет организма, нами рассматривалось уравнение

О).

где ? — время; У(1) — объем опухоли в зависимости от времени; У0 — У(1 — 0) — объем в момент времени; ? — 0; ВТ — Ь + к х ? — время удвоения как линейная функция. Если за ? — 0 принять некий момент в раннем неонатальном периоде, то Ь интерпретируется как ВТ данного момента, к — постоянная скорость роста ВТ. Основная задача заключалась в оценке параметров нелинейного уравнения (1): ВТ (период удвоения опухоли в раннем неонатальном периоде) и к с учетом различий в объемах типов опухолей. Расчеты выполнялись в статистическом пакете Я.

Результаты. Для характеристики предклинической фазы неонатального роста эмбриональной опухоли построена нелинейная регрессионная модель по уравнению (1), даны оценки параметров в момент времени ? — 0 (момент раннего неонатального периода жизни младенца). Расчетные параметры модели:

DT

Нозо-

логи- для

ческая неона-

форма тального

периода

Для всей 25,42

95 % ДИ

Скорость прироста DT

95 % ДИ

3,96 46,88 0,02183 0,21 0,17 0,26 < 0,0001

группы

Полученные данные могут быть полезны для определения «перинатальной визуализационной точки отсчета роста» эмбриональной злокачественной опухоли.

Экспансия ЕК-клеток в присутствии EBV-трансформированной лимфобластоидной клеточной линии и интерлейкина-2

Е.П. Вашкевич, А.В. Тарасова, Т.В. Шман

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Для экспансии естественных киллерных (ЕК, CD3-CD56+) клеток используют различные стимуляторы, в том числе фидерные клетки, например, EBV-трансформированную лимфобластоидную клеточную линию (LCL), которую получают путем заражения нормальных В-лимфоцитов вирусом Epstein—Barr. Целью данной работы была оценка влияния LCL, полученной в нашей лаборатории, на рост ЕК-клеток in vitro.

Объектом исследования являлись селектированные иммуномагнитным способом ЕК-клетки периферической крови доноров (n = 6). Клетки культивировали в среде AIM-V с добавлением 10 % AB сыворотки человека, L-глютамина и антибиотиков в присутствии или без LCL, облученной дозой 50 Гр, и интерлейкина (ИЛ) 2 (500 МЕ/мл) в течение 21 суток со сменой среды каждые 3—4 дня с добавлением или без ИЛ-2.

На 7, 14 и 21-е сутки определяли прирост клеток в культуре с использованием красителя трипанового синего; субпопуляционный состав лимфоцитов (окраска антителами к CD3, CD56, CD69) и противоопухолевую активность против линии К-562 определяли методом проточной цитофлуориметрии.

При экспансии селектированных клеток наблюдали активный рост ЕК-клеток в присутствии LCL и/или ИЛ-2 на 2-й неделе культивирования, который увеличивался к 21-м суткам. При этом прирост ЕК в присутствии LCL + ИЛ-2 на 21-е сутки составил 23,5 ± 5,8 раза и был значительно выше, чем в при-

сутствии только ИЛ-2 — 8,8 ± 2,0 (р = 0,08). Чистота популяции ЕК-клеток после экспансии на 21-е сутки составила 81,9 ± 3,5 %. В образцах без добавления ИЛ-2 роста ЕК не наблюдалось.

Также было показано, что экспансия с использованием ИЛ-2 и его комбинации с LCL достоверно (р < 0,05) увеличивала количество активированных (CD69+) ЕК-клеток с 3,8 % на 0-й день до более чем 80 % на 21-е сутки. При анализе противоопухолевого действия экспансированных в присутствии LCL и/или ИЛ-2 ЕК-клеток получено достоверное (р < 0,05) повышение их цитотоксичности до 60 % на 21-е сутки по сравнению с таковой на 0-й день.

Таким образом, нами показана возможность экспансии и активации обогащенной популяции ЕК-кле-ток в присутствии LCL.

Эволюция представлений о роли свободных радикалов в патогенезе болезней человека

Ю.А. Владимиров

Кафедра медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Первые исследования роли свободных радикалов в сложных химических и биологических системах были выполнены под руководством академика РАН Н.М. Эмануэля в Институте химической физики им. Н.Н. Семенова РАН. В основе проводимых исследований было изучение реакций цепного окисления полиненасыщенных жирных кислот. Следующий важный шаг по изучению роли свободных радикалов в биологических системах был сделан Д. Харманом, который исследовал влияние антиоксидантов (перехватчиков свободных радикалов) на продолжительность жизни животных и развитие дегенеративных заболеваний при старении. Результатом этих исследований стало появление свободно-радикальной теории старения. Важным этапом развития представлений о роли свободных радикалов в метаболизме стало обнаружение Фридовичем и МакКордом фермента су-пероксиддисмутазы — фермента, субстратом которого является супероксидный радикал. Открытие суперок-сиддисмутазы стало важной вехой на пути детального понимания механизма участия свободных радикалов в реакциях, протекающих в норме в клетках и тканях. Интересным аспектом таких исследований стал тот факт, что реакции взаимодействия радикалов друг с другом сопровождаются свечением и за протеканием и интенсивностью этих реакций можно наблюдать, используя метод хемилюминесценции. Применение метода хемилюминесценции для изучения свободнорадикальных процессов в биологических системах позволило построить схему реакций и смоделировать

4 ’201 2

4 ’201 2

процессы, протекающие в полиненасыщенных липидных системах, где индукция свободных радикалов происходит под действием ионов двухвалентного железа. Исследование реакций перекисного окисления липидов позволило понять важную роль этого процесса в изменении структуры и функции биологических мембран при развитии патологических процессов. В последние годы благодаря исследованиям, проводимым в нашей лаборатории и в некоторых лабораториях за рубежом, стало известно, что свободные радикалы играют ведущую роль в реакциях запрограммированной клеточной гибели (апоптозе). В основе этих реакций лежит образование комплекса цитохрома и анионных фосфолипидов, и появления у этого комплекса пероксидазной активности. Все перечисленные выше исследования однозначно доказывают, что свободные радикалы занимают важное место в жизнедеятельности организма.

Клеточный биочип для исследования костного мозга детей с острыми лейкозами

А.О. Доронина1’ 3, А.Н. Хвастунова1’ 2, О.С. Федянина2, Ф.И. Атауллаханов1’ 2’ 3, С.А. Кузнецова1’ 2’ 3

Лаборатория биофизики ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;

2ЦТП ФХФ РАН, Москва;

3лаборатория физической биохимии системы крови ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва

Основополагающими методами при диагностике онкогематологических заболеваний являются микроскопическое (морфологическое) исследование клеток крови и костного мозга и иммунофенотипирование. Однако невозможность проведения этих исследований на одних и тех же клетках может приводить в ряде случаев к противоречиям при формулировке диагноза. Нашей группой разработан метод, совмещающий в себе определение поверхностных антигенов лейкоцитов с возможностью проведения их полноценного морфологического исследования.

Метод основан на использовании клеточного биочипа. Биочип представляет собой прозрачную подложку, на которой иммобилизованы антитела к 36 поверхностным антигенам лейкоцитов. При инкубации биочипа с суспензией лейкоцитов клетки, несущие определенный поверхностный антиген, связываются с иммобилизованными антителами. После отмывки на поверхности биочипа остаются области, покрытые лимфоцитами, несущими тот или иной поверхностный антиген, морфология которых затем исследуется стандартными цитологическими методами. Таким образом, биочип позволяет исследовать морфологию клеток крови, для которых известен один из ее поверхностных СБ-антигенов.

Данным методом были исследованы лейкоциты, полученные методом гипотонического лизиса эритроцитов из пунктата костного мозга детей с острыми лейкозами, поступивших на лечение в ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Показано соответствие определяемых с помощью биочипа морфологии и иммунофенотипа опухолевых клеток результатам, полученным стандартными диагностическими методами (с помощью морфологического исследования клеток в мазке и методом проточной цитометрии).

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-31275.

Применение методов MLPA, ПЦР и FISH для выявления амплификации гена MYCN и делеции 1P у пациентов с нейробластомой

А.Е. Друй1’ 2’ 3, Г.А. Цаур1’ 3, А.М. Попов1’ 3,

О.М. Плеханова1, С.Н. Тупоногов1, Е.В. Шориков1’ 3, Л.И. Савельев1’ 2’ 3, С.В. Цвиренко1’ 2, Л.Г. Фечина1’ 3

]ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург;

2ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург;

3ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург

Клиническое течение нейробластомы во многом определяется биологическими свойствами опухолевых клеток. При этом с большой частотой выявляются аберрации, связанные с увеличением или уменьшением числа копий (амплификации и делеции) определенных хромосомных регионов, и ряд из них имеют неблагоприятное прогностическое значение в отношении общей и бессобытийной выживаемости пациентов. К данным молекулярно-генетическим маркерам относятся амплификация гена MYCN и делеция короткого плеча хромосомы 1 (dellp), их точное определение необходимо для корректной стратификации больных на группы риска и выбора оптимальной терапевтической стратегии. На сегодняшний день предложено большое количество молекулярно-генетических методов, служащих для выявления аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных локусов, среди них полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), FISH, сравнительная геномная гибридизация, анализ однонуклеотидных полиморфизмов и др. Относительно новой методикой является множественная лигазно-зависимая амплификация зондов (MLPA), основанная на амплификации олиго-нуклеотидных зондов, специфичных к анализируемым локусам, при условии лигирования их составных частей. Целью исследования явилось проведение качественного сравнения результатов определения количес-

тва копий гена MYCN и dellp методами MLPA, ПЦР, ПЦР-РВ и FISH.

Сто двадцать шесть образцов ДНК, выделенной из ткани опухоли 122 больных нейробластомой, были исследованы методом MLPA с использованием наборов SALSA P251 и P252 (MRC Holland) и ПЦР-РВ для выявления амплификации MYCN. Из них 23 образца нейробластомы анализировались методом FISH. Определение dellp было выполнено 70 пациентам с помощью анализа вариабельного числа тандемных повторов микросателлитных локусов в области короткого плеча хромосомы 1 (ПЦР VNTR), 22 пациентам — с помощью FISH.

Амплификация гена MYCN была выявлена методами MLPA и ПЦР-РВ в 22 образцах ткани опухоли от 21 пациента. В 6 из 23 образцов нейробластомы, исследованных методом FISH, была выявлена амплификация MYCN. В данных образцах аберрация определялась как с помощью MLPA, так и с помощью ПЦР-РВ. Таким образом, качественная сходимость результатов анализируемых методик достигла 100 %. В 7 из 70 образцов была определена del1p с использованием ПЦР VNTR, в 6 (8,57 %) из них делеция была выявлена MLPA. В 2 (2,86 %) образцах del1p определялась только MLPA и в 1 (1,43 %) — только ПЦР VNTR. В 61 (87,14 %) образце делеция не была обнаружена ни одним методом, качественная сходимость результатов составила 95,71 %. При сравнении результатов выявления del1p методами ПЦР VNTR и FISH расхождения были получены в 2 (9,09 %) случаях, еще в 2 образцах делеция была обнаружена обоими методами. При этом сходимость результатов составила 90,91 %.

Таким образом, все анализируемые методики, предложенные для выявления аномалий, связанных с изменением числа копий отдельных регионов, продемонстрировали высокую качественную сходимость результатов. Все они, включая технологию MLPA, могут быть применены в клинической практике для определения прогностических биологических маркеров.

Подбор условий для in vitro дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондрогенном направлении

А.А. Жерносеченко, Я.И. Исайкина

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

служить синтез клетками протеогликанов и различных типов коллагена.

Цель — подбор условий для in vitro дифференцировки МСК в хондрогенном направлении.

Материалы и методы. МСК, полученные из костного мозга доноров, дифференцировали в 3Б-системе под воздействием трансформирующего ростового фактора TGFß1 или TGFß3, инсулиноподобного ростового фактора IGF, дексаметазона и аскорбиновой кислоты в течение 28 дней. Оценка экспрессии генов коллагена 1, 10 и аггрекана проводилась методом RT-qPCR. Материалом для иммуногистохимического исследования синтеза коллагена II являлись МСК до и после дифференцировки в присутствии TGFß1, инкубированные с раствором первичных антител ан-ти-СОЬ2Л1 (1 : 50) и раствором вторичных антител: AlexaFluor 488 (1 : 400) с последующим анализом на конфокальном микроскопе Leica. Гистологический анализ проводили окраской толуидином синим и сафранином О.

Результаты. Гистологическое окрашивание культуры клеток после 7 суток дифференцировки в присутствии как TGFß1, так и TGFß3 показало более интенсивную окраску толуидином синим и сафранином О по сравнению с недифференцированными МСК, что является доказательством синтеза клетками кислых мукополисахаридов, характерных для хондроцитов. Изменение степени интенсивности флуоресценции Col2A в культуре МСК с 16,42 ± 2,38 на 0-й день до 56,15 ± 5,50 на 28-й день дифференцировки свидетельствует об активации клетками синтеза коллагена II, причем характерным является основная его локализация в составе внеклеточного матрикса. При культивировании МСК в присутствии TGFß3 на 21-е сутки выявлена более интенсивная экспрессия коллагена X (0,09 (00024-2,694)) и аггрекана (0,15 (0,0234-0,158)), но более низкая экспрессия коллагена I (0,0001 (0-256)), чем при использовании TGFß1 (0,0595 (0,032-0,135), 0,0994 (0,667-0,262) и 0,0029 (0,00159-0,0041) соответственно). Таким образом, полученные нами результаты могут свидетельствовать о том, что приоритетным ростовым фактором для дифференцировки МСК в хондроцитоподобные клетки может быть TGFß3.

Кинетическая хемилюминесценция как метод оценки антиоксидантной активности

Д.Ю. Измайлов, Ю.А. Владимиров

Факультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают способностью дифференцироваться по хондро-генному пути под воздействием ряда ростовых факторов in vitro. Подтверждением дифференцировки может

Хемилюминесцентный метод является наиболее информативным для изучения реакций с участием свободных радикалов и действия антиоксидантов, поскольку он позволяет осуществить непосредствен-

4 ’201 2

4 ’201 2

ное детектирование свободных радикалов, а также регистрировать кинетику образования свободных радикалов.

Антиоксиданты оказывают различное влияние на кинетику хемилюминесценции — одни антиоксиданты преимущественно влияют на интенсивность свечения, другие вызывают появление задержки свечения на начальном этапе (латентный период). Как следствие, в хемилюминесцентных методах до сих пор не существует единых и универсальных характеристик антиоксидантного действия. Наиболее адекватным методом анализа антиоксидантного действия различных веществ может служить математическое моделирование кинетики хемилюминесценции.

Показано, что влияние антиоксидантов на кинетику хемилюминесценции может быть описано одной общей реакцией взаимодействия антиоксиданта со свободными радикалами. По значению константы этой реакции антиоксиданты можно условно разделить на «сильные» и «слабые». Сильные антиоксиданты, обладающие высокими значениями константы скорости реакции взаимодействия с радикалами, вызывают полное подавление свечения на начальных этапах. Слабые антиоксиданты имеют низкие значения константы скорости реакции взаимодействия с радикалами и для них характерно частичное подавление интенсивности свечения в течение длительного периода времени.

Таким образом, математическое моделирование позволяет объяснить характер влияния антиоксидантов на кинетику хемилюминесценции и предложить универсальный параметр для оценки и сравнения антиоксидантной активности различных веществ.

Получение противоопухолевой вакцины на основе аутологичных дендритных клеток для иммунотерапии пациентов с опухолями головного мозга

Я.И. Исайкина, Р.Л. Высоцкая, Т.В. Шман,

Е.П. Вашкевич

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Глиобластома является одной из наиболее агрессивных первичных опухолей головного мозга, поэтому применение иммунотерапии, а именно вакцины на основе дендритных клеток (ДК) в качестве адъювантной, является многообещающим, так как направлено на активацию противоопухолевого ответа пациента.

Целью работы было оценить фенотипические и функциональные свойства генерированной in vitro вакцины ДК, разработать схему проведения вакцино-

терапии и осуществить подбор эффективной дозы вводимых клеток.

Вакцину ДК генерировали in vitro из моноцитов пациентов, культивируя их в присутствии IL-4 и GM-CSF и нагружая лизатом аутологичных опухолевых клеток. Фагоцитарную активность ДК определяли по степени поглощения ими опухолевого гомогената методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии. В смешанной культуре с лимфоцитами оценивали противоопухолевую активность вакцины ДК по экспрессии СВ107а на лимфоцитах и антигенпре-зентирующую функцию — по степени активации и пролиферации Т-лимфоцитов.

Результаты. Полученная вакцина содержала 83,55 ± 6,87 % клеток, экспрессирующих CD83+CD209+. После инкубации с опухолевым гомогенатом уровень флуоресценции ДК в области спектра испускания PKH-26, которым был обработан гомогенат, составил 90,8 ± 4,8 %, что свидетельствовало о высокой фагоцитарной активности ДК. При культивировании лимфоцитов в присутствии вакцины ДК наблюдалось увеличение популяции CD3+CD8+, CD3+CD8- и CD3+ в 13,0 ± 6,6; 20,9 ± 8,2 и 17,3 ± 6,0 раз соответственно по сравнению с контролем (р < 0,05), а также достоверное повышение по сравнению с контролем активированных CD3+CD8+CD69+ (р < 0,05). Относительное количество CD3+107a+ и CD3+CD8+107a+ клеток было в 2 раза выше, чем в контроле (р < 0,05). Таким образом, вакцина ДК способна индуцировать активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов в смешанной культуре. Установлена рекомендуемая доза ДК для получения иммунологического эффекта, равная 1,0—1,2 х 107 клеток, минимальная доза — 0,5—0,7 х 107 и влияние кумулятивной дозы вакцины ДК на иммунный ответ. Разработан метод вакцинотерапии, включающий получение опухолевого лизата из клеток опухоли пациента, проведение пациенту процедуры лейкафереза после окончания химиолучевой терапии, генерация вакцины ДК in vitro и ее введение в дозе 0,7—1,2 х 107 внутрикожно, в следующем режиме: 1-я вакцина — день 7—8 после лейкафереза; 2-я и 3-я вакцины — с интервалом в 2 недели после первой, 4-я и каждая последующая вакцина — 1 раз в месяц.

Прогностическая значимость L- и Н-изоферритинов при миелодиспластических синдромах

Ж.М. Козич, Л.А. Смирнова, Д.К. Новик

ГУ «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека», Гомель, Беларусь; ГУ «Белорусская медицинская академия последипломного образования», Минск, Беларусь

Миелодиспластический синдром (МДС) — это гетерогенная группа заболеваний, объединенных общи-

ми признаками: цитопенический синдром, наличие дисмиелопоэза и высокая частота трансформации в острый лейкоз.

В 1997 г. с целью оценки прогноза и выбора тактики лечения для пациентов с впервые установленным диагнозом МДС была разработана Шкала IPSS (International Scoring Prognostic System — Международная Шкала оценки прогноза). Используя эту систему, пациентов с МДС подразделяют на группы низкого и высокого риска. Согласно этой Шкале пациенты РАИБ-1 и РАИБ-2 относятся к высокой группе риска с низкой общей выживаемостью, поэтому необходим поиск новых прогностических маркеров для определения тактики ведения и лечения таких пациентов.

Гиперферритинемия описана ранее как при различной онкопатологии, так и при ряде гемобластозов. В последние годы обнаружено, что ферритин рассматривают как биомаркер, связанный с пролиферирующим опухолевым клоном.

В нашем исследовании мы определяли уровень H- и L-изоферритинов у пациентов с МДС РАИБ-1 и РАИБ-2 и провели оценку взаимосвязи изучаемых показателей с общей выживаемостью пациентов с МДС, рассчитанной с момента постановки диагноза. Оценка взаимосвязи производилась с использованием регрессионного анализа Кокса. При этом только для принадлежности пациентов к одной из подгрупп с высоким (> 1500 мкг/мл) или низким (< 1500 мкг/мл) уровнем L-ферритина (р = 0,01) была достигнута статистическая значимость. Относительный риск смерти при уровне L-ферритина больше 1500 мкг/мл составил

7,06 (95 % ДИ 1,39 - 35,77; р = 0,018).

Общая выживаемость у пациентов с МДС с уровнем L-ферритина менее 1500 мкг/мл значительно выше по сравнению с пациентами с уровнем L-ферритина более 1500 мкг/мл, где не только снижена общая выживаемость, но и повышен риск трансформации в острый лейкоз. Уровень содержания L-ферритина может быть использован как дополнительный параметр для выявления вероятности трансформации МДС в острый лейкоз, так как отражает стадию процесса.

Значение молекулярно-генетической диагностики BCR-ABL1 у детей с хроническим миелолейкозом

В.А. Лавриненко, Т.В. Савицкая,

А.Н. Лилей, Р.И. Юцкевич

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Молекулярная диагностика химерного онкогена BCR-ABL1 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР) является самым чувс-

твительным методом мониторинга ответа на терапию у пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ). С началом использования ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) (иматиниба и др.), позволяющих достигать молекулярного ответа на лечение, все большее значение приобретает стандартизация лабораторных методов мониторинга и интерпретации результатов, а также изучение механизмов устойчивости к ИТК.

Цель работы: анализ молекулярного ответа у детей с ХМЛ и оценка минимальной резидуальной болезни (МРБ), сравнение уровня МРБ в костном мозге (КМ) и периферической крови (ПК), изучение причин потери ответа на ИТК.

Материалы и методы. В исследование включены 25 детей с ХМЛ. Мониторинг МРБ на терапии имати-нибом проводили методом количественной РВ-ПЦР (EAC, 2003) в образцах КМ и/или ПК. В качестве стандартов использовали наборы Ipsogen (Франция). Метод секвенирования использовали для определения точечных мутаций в гене BCR-ABL1. Цитогенетические исследования проводили с использованием методов FISH и дифференциальной окраски (G).

Результаты. Медиана уровня BCR-ABL1/ABL1 на момент постановки диагноза составила 1,3 (0,46—2,05). Медиана уровня МРБ составила на 3-й месяц лечения 5 (0,3—47) %, на 6-й месяц — 0,36 (0,03—35) %, на 12-й месяц — 0,41 (0,001—133) %, на 15-й месяц — 0,065 (0,006—126) %, на 18—24-й месяц — 0,024 (0,0001—150) %. Для определения клинической значимости МРБ в ПК уровни BCR-ABL1/ABL1 сравнивали в 80 парных КМ и ПК. Уровень корреляции составил r = 0,8805, р < 0,05 (для КМ среднее = 1,1622 %, медиана = 0,0189 %; для ПК среднее = 1,1044 %, медиана = 0,0192 %).

Потерю ответа на иматиниб наблюдали у 5 пациентов, причинами которой явилась мутация BCR-ABL1-E255V у 1 пациента; а также могло стать появление дополнительных хромосомных перестроек: +der(22) t(9;22)(q34;q11) у 2 больных и del(21)(q22) у 1 пациента на этапах лечения, появление одновременной экспрессии 2 транскриптов b2a2 + b3a2 у 1 пациента с началом потери ответа на терапию.

Выводы. Для мониторинга МРБ у пациентов с ХМЛ возможно использовать ПК. Механизмы резистентности к иматинибу у детей разнообразны и включают как точечные мутации, так и дополнительные хромосомные перестройки.

4 ’201 2

4 ’201 2

Клиническая эффективность комбинации бендамустина и ритуксимаба в лечении пациентов с рецидивами и/или рефрактерными формами хронического лимфолейкоза

А.И. Лукина1, С.В. Сёмочкин2, В.Л. Иванова3, Н.К. Хуажева3, Л.А. Муха3, Е.Г. Аршанская3,

И.Е. Лазарев3, М.М. Панкрашкина1, В.В. Птушкин1

1ФГБУФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;

2ГБОУ ВПО «Российский научно-исследовательский

медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва;

3ГУЗ «Городская клиническая больница им. С.П. Боткина» Департамента здравоохранения г. Москвы

Цель настоящего исследования заключалась в оценке клинической эффективности комбинации бендамустина и ритуксимаба у больных с рецидивами и/или рефрактерным течением хронического лимфолейкоза (ХЛЛ).

Пациенты и методы. В исследование включено 20 пациентов (мужчин — 15, женщин — 5) с рецидивами и/или рефрактерным ХЛЛ. Семнадцать (85 %) пациентов получили терапию по схеме БЯ: бендамустин 90 мг/м2 в/в в день 1 и 2 + ритуксимаб 375 мг/м2 в день

1 цикла 1 и 500 мг/м2 в последующие циклы. В 3 (15 %) случаях назначался бендамустин в монорежиме в дозе 100 мг/м2 в дни 1 и 2 каждые 28 дней. Планировалось проводить 6 циклов терапии.

Результаты. Медиана возраста больных составила 63,4 (52—77) года. У 10 (50 %) пациентов была установлена стадия С по Бте! В 2 (10 %) случаях пациенты имели (1е117р. Семь (35 %) были с рецидивами, 13 (65 %) — рефрактерными. Медиана количества линий предшествующей терапии — 2 (1—6). Большинство пациентов ранее получали флударабин — 15 (75 %), ритуксимаб в комбинации с полихимиотерапией — 17 (85 %) и в качестве поддерживающей терапии — 9 (45 %). Наилучшим ответом на предшествующую терапию была полная ремиссия (ПР) у 5 (25 %), частичная ремиссия (ЧР) — у 8 (40 %) и стабилизация болезни (СБ) — у 5 (25 %) больных. При медиане наблюдения

5,6 мес от начала терапии бендамустином живы все пациенты. Не зарегистрировано ни одной смерти вследствие токсичности. Медиана количества циклов проведенной терапии составила 4 (2—6). Ответ оценен у 17 (85 %) пациентов: > ЧР достигли 9 (53%) из 17 пациентов, СБ — 6 (35 %). Не ответили на лечение 2 (12 %) пациента. Вероятность достижения > ЧР была выше у пациентов, получивших менее 3 линий терапии (р = 0,004), и в случае рецидива заболевания против рефрактерности к предшествующему лечению (р = 0,01). Не влияли на вероятность достижения от-

вета предшествующая терапия флударабином, наличие “bulky disease”, В-симптомов и С-стадия (p < 0,05).

Выводы. Комбинация химиотерапии BR является эффективным и безопасным методом лечения рецидивирующего и/или рефрактерного ХЛЛ после флу-дарабинсодержащих режимов.

Влияние профилактического рентгеновского облучения на жизнеспособность резидуальных лейкоцитов компонентов крови

Н.П. Масленникова1, М.В. Пешикова2,

И.И. Спичак1, 2, Е.В. Жуковская3

]ГБУЗ «Челябинская областная детская клиническая больница»;

2ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России;

3ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, Москва

Актуальность. Для предотвращения развития посттрансфузионной реакции «трансплантат против хозяина» у пациентов с онкогематологическими заболеваниями применяется рентгеновское облучение компонентов крови. Процедура облучения контролируется исключительно дозиметрическими методами. На сегодняшний день нет стандартизованной методики валидации процедуры профилактического облучения компонентов крови с контролем качества конечного продукта.

Целью исследования мы поставили изучение количественного и качественного состава резидуальных лейкоцитов компонентов крови, а также динамику изменения этих показателей при воздействии профилактического рентгеновского облучения суммарной дозой 25 Грей.

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили эритроцитная масса, обедненная лейкоцитами (n = 25) и фильтрованные эритроциты (n = 25). Рентгеновское облучение образцов компонентов крови проводилось на установке RadGil (Gilardoni, Италия) суммарной дозой 25 Грей за 30 мин. Жизнеспособность остаточных лейкоцитов определялась методом проточной цитометрии на проточном лазерном цитофлюориметре Facs Canto II (Becton Dickinson, США). Гейтирование проводилось по интенсивности экспрессии CD45. Жизнеспособность лейкоцитов оценивалась по включению клетками витального красителя Via-Probe™ (BD Biosciences), содержащего 7-Амино-актиномицин D (7-AAD). Каждый образец анализировался до и сразу же после рентгеновского облучения, отсроченный эффект изучали через 4 и 24 ч.

Результаты. Особенности цитометрического анализа резидуальных лейкоцитов компонентов крови

обусловлены следующим: низкая концентрация лейкоцитов (0,23 ± 0,09 х 10 9/л), их низкая жизнеспособность (70,1 ± 4,1 %), изменение морфологических характеристик клеток в процессе заготовки и хранения. Нами выявлено достоверное снижение количества витальных лимфоцитов в облученной пробе (64,74 ± 4,33 %) сразу после облучения на 5,36 ± 0,63 % (р = 0,04) по сравнению с исходной и необлученной пробами.

Выводы. Определение количества жизнеспособных лимфоцитов в компонентах крови методом проточной цитометрии с использованием витального красителя 7-ААО может включаться в контроль качества профилактического облучения гемакомпо-нентов.

Механизмы действия низкоинтенсивного лазерного излучения

Т.В. Мачнева, А.Н. Осипов

ГБОУВПО РНИМУим. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) нашло широкое применение в различных областях современной медицины. Однако подбор доз и выбор вида излучения осуществляется в основном эмпирическим путем, и результаты лазерной терапии не всегда оказывают положительное действие. Важную роль в этом процессе играют акцепторы лазерного излучения. При этом фотоакцепторами могут являться, например, эндогенные (ЭП) и экзогенные порфирины и другие соединения. Количество ЭП возрастает при целом ряде патологических состояний, в том числе при раневых процессах и при шоковых состояниях. Выявление роли ЭП может позволить добиться большего эффекта в профилактике и лечении многих патологических состояний, например раневых процессов и эндотоксического шока. Кроме того, данные патологические состояния являются показательными моделями исследования эффектов НИЛИ при развитии воспалительных процессов и нарушении микроциркуляции соответственно.

Целью работы было исследование роли ЭП в действии лазерного излучения в норме и при экспериментальных патологических состояниях — раневом процессе и эндотоксическом шоке у крыс, а также выявление патофизиологических мишеней действия НИЛИ.

В наших экспериментах мы использовали низкоинтенсивное лазерное излучение в красном (632 нм), синем (442 нм) и зеленом (530 нм) диапазонах спектра. Обнаружили, что облучение животных НИЛИ увеличивало супероксиддисмутазную активность, активность раневых экссудатов и плазмы крови, при этом наиболее существенные изменения наблюдали при патологических состояниях. При исследовании лазер-индуцированных изменений функциональной актив-

ности полиморфно-ядерных лейкоцитов раневых экссудатов и крови крыс обнаружили аналогичные зависимости. Указанные эффекты зависели от дозы и длины волны излучения. Также исследовали уровень перекисного окисления липидов мембран лейкоцитов и эритроцитов. Обнаружили и исследовали зависимость выявленных эффектов от количества ЭП. Выявили возможную роль ЭП как первичных акцепторов НИЛИ в эффектах на супероксиддисмутазную активность и функциональную активность лейкоцитов.

Измерение экспрессии изоформ гена IKZF1 при остром лимфобластном лейкозе методом RQ-PCR

А.Н. Мелешко, И.В. Прохореня

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Современные методы молекулярно-генетических исследований в диагностике острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) в последние годы выявили нарушения в ряде генов, вовлеченных в патогенез этого заболевания. Среди них интерес представляют гены транскрипционных факторов (ТФ), специфически контролирующие лимфоидную дифференцировку, такие как pax5, EBF-1, IKZF1 (Ikaros), IKZF2 (Helios), IKZF3 (Aiolos). Структурные изменения в этих генах обнаружены у 40 % больных В-линейным ОЛЛ, особенно для рах5-гена (31,7 %) и Ikaros (28,6 %).

Ikaros, кодируемый геном IKZF1, является ключевым транскрипционным фактором, регулирующим ранние этапы дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток и дендритных клеток. Частичный или полный knock-out гена Ikaros у мышей ведет к высокой частоте спонтанных лейкозов и лимфом, а также к аутоиммунным заболеваниям.

Белок Ikaros в ДНК-связывающем домене содержит 4 структуры «цинковых пальцев». Ген Ikaros включает 7 экзонов и транскрибируется в виде по меньшей мере 8 различных изоформ посредством альтернативного сплайсинга с использованием альтернативных экзонов. Так, длинные Ik-1, Ikx, Ik-2 и Ik-3, которые содержат по меньшей мере 3 «цинковых пальца», сохраняют высокоаффинное ДНК-связывание и локализуются в ядре. Короткие изоформы Ik-4—8, которые имеют менее 3 «цинковых пальцев», теряют свою ДНК-связывающую активность и локализуются в цитоплазме. Такие изоформы сохраняют способности образовывать гетеродимеры с полными изоформами, что приводит к потере их транскрипционной активности, поэтому они получили название доминантнонегативных изоформ (DN-Ik).

Нами был разработан метод ПЦР-анализа в реальном времени для количественного измерения уровня

4 ’201 2

4 ’201 2

экспрессии отдельных изоформ гена Ikaros. Независимо оценивалась экспрессия длинных изоформ Ik1, Ikx, Ik2 и коротких Ik4, Ik5, Ik8, Ik6. Экспрессия оценивалась в относительных единицах относительно экспрессии контрольного гена ABL. В исследование включены 49 образцов костного мозга от 36 больных ОЛЛ, включая 19 рецидивов и 13 парных случаев. Девять образцов здорового костного мозга составляли контрольную группу. В лейкозных клетках профиль экспрессии изоформ гена Ikaros в большинстве случаев сходен с таковым для нормального костного мозга. При этом отмечено снижение уровня экспрессии изоформ гена Ikaros относительно здорового костного мозга, достоверно для Ikx, Ik2, Ik4 и Ik8. В 31 % случаев ОЛЛ наблюдалась аберрантная сверхэкспрессия Ik6, превышающая средний уровнь экспрессии этой изоформы у остальных пациентов (или здоровый костный мозг) на 2—3 порядка. Это основное качественное изменение в экспрессии гена Ikaros при ОЛЛ. В парных случаях первичный диагноз — рецидив (2-й рецидив) сохраняется сверхэкспрессия Ik6, либо сохраняется его отсутствие. Сверхэкспрессия Ik6 не является фактором возникновения рецидива, но может выступать в качестве инициального события при развитии первичного лейкоза.

Аномалии кариотипа у детей с острым лейкозом в Пермском крае

Д.В. Меркурьев1’ 2, Н.Б. Мерзлова2, О.Е. Никонова1

]ГБУЗ ПК «Пермская краевая детская клиническая больница»;

2ГБОУВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера»

Цель исследования — выявить частоту и структуру аномалий кариотипа при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) в Пермском крае.

Материалы и методы. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга проведено у 60 детей с первично диагностированным ОЛЛ в возрасте от

11 месяцев до 14 лет (медиана — 4 года); анализировалось не менее 11 метафаз.

Результаты. Клональные аномалии кариотипа выявлены у 38 (63,3 %) детей. Наиболее часто (18 детей, 30 %) диагностировалась высокая гипердиплоидия (51—67 хромосом), встречавшаяся при В-II и B-III вариантах ОЛЛ. У 10 (55,5 %) из 18 больных в составе высокогипердиплоидного кариотипа верифицировались структурные аберрации, самой частой из которых была инвертированная дупликация длинного плеча хромосомы 1 (3 пациента). При этом в 1 случае эта дупликация сочеталась с неслучайной транслокацией 1(9;12)(р12;р13). У других пациентов с гипердиплои-дией структурные аномалии были представлены транслокациями t(12;14)(p13;q11), t(14;18)(q21;q21),

1(16;17)(р13.3^11.2), делецией de1(6)(q15q22), маркерными хромосомами.

Одной из частых аномалий при ОЛЛ явилась транслокация !(4; 11)^21^23) — она отмечена у 3 детей с В-1 ОЛЛ. В 1 случае она являлась единственной аберрацией, в другом сочеталась с изохромосомой 7 (по длинному плечу), у 3-го пациента имелся минорный субклон с дупликацией Ц. У единичных больных при В-линейных ОЛЛ выявлялись транслокации 1(9;22)^34^11), несбалансированная 1(1;19)^23;р13), 1(12;21)(р13^22), 1(6;11)(р21^13), инверсия ту(12) (р11^13). Комплексный кариотип отмечен у 2 детей с В-ОЛЛ. В 1 случае отмечалось сочетание транслокаций !(1; 12)^21;р13) и !(9;12)(р11;р13) с делецией de1(9) ^22). У другого пациента верифицированы de1(9) (р22), inv(1)(p13q25), моносомия хромосомы 4 и маркерная хромосома.

При Т-линейном ОЛЛ чаще выявлялась !(11;14) (р13-р15^11) — в 1 случае в сочетании с 1(Х;7)^22^34), в другом — в сочетании с 1(8;11)(р12^13). У 2 детей с Т-ОЛЛ наблюдались транслокации с вовлечением 20q - 1(2;20)(р21^12) и 1(12;20)(р13^11.2).

Выводы. Клональные аномалии кариотипа диагностировались у 63,3 % детей с ОЛЛ. В структуре аберрантного кариотипа преобладала высокая гипер-диплоидия (30 %), сопровождавшаяся в половине случаев наличием структурных хромосомных аномалий.

Факторы прогноза клинического течения хронического лимфолейкоза

Е.Л. Назарова, М.Г. Крюкова,

В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина

ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови» ФМБА России

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - один из вариантов В-клеточных опухолей лимфатической системы, который характеризуется разнообразием клинических проявлений и вариантов течения. В ряде случаев отмечается довольно благоприятное течение заболевания, в других наблюдается крайне агрессивный характер лейкозного процесса. В этой связи большое внимание уделяется поискам маркеров выраженной агрессии опухолей. К ним относится, прежде всего, определение уровня сывороточной тимидинкиназы, принимающей участие в синтезе ДНК и клеточном делении. Ее уровень значительно повышается при опухолях, характеризующихся усиленной пролиферацией клеток, поэтому ее используют в качестве маркера темпа роста злокачественных клеток, а также для контроля лечения, установления стадии заболевания и его прогноза.

Целью исследования явилась оценка диагностической и прогностической значимости активности

тимидинкиназы, а также уровней ряда цитокинов у пациентов с впервые выявленным ХЛЛ.

Исследованы сыворотки периферической крови 40 больных в возрасте от 43 лет до 81 года (медиана возраста составила 59 лет). Активность тимидинкиназы определялась с использованием наборов реагентов для радиоферментного анализа. Параллельно проводились исследования содержания сывороточных цитокинов/ хемокинов с помощью иммуноферментного анализа.

Уровень тимидинкиназы в исследуемой группе пациентов достоверно превышал соответствующий показатель у здоровых лиц (17,67 Ед/л vs 6,3 Ед/л; p < 0,05). На основании расчета коэффициента ранговой корреляции Спирмена выявлено, что показатель активности тимидинкиназы в сыворотке периферической крови свыше 30 Ед/л коррелировал с повышением концентраций интерлейкинов (IL) 2, IL-10 и IL-18.

Следовательно, с учетом того, что высокое содержание тимидинкиназы отражает активный пролиферативный потенциал опухолевых клеток, исследование уровней IL-2, IL-10 и IL-18 в случаях впервые выявленного В-ХЛЛ может быть рекомендовано в качестве критериев неблагоприятного течения опухолевого процесса уже на ранних этапах диагностики.

Иммунологические и генетические особенности при аутоиммунном лимфопролиферативном синдроме

А.С. Невмержицкая, А.А. Мигас,

С.О. Шарапова, М.В. Белевцев

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЛПС) — генетическое заболевание, приводящее к дефекту FAS-зависимого апоптоза лимфоцитов, характеризующееся лимфаденопатией (ЛАП), гепато-спленомегалией и аутоиммунной патологией. Вторым после лимфопролиферации, наиболее частым клиническим проявлением АЛПС является аутоиммунная патология, а именно иммуноопосредованные цитопении (иммунная тромбоцитопения (ИТП), аутоиммунная гемолитическая анемия (АИГА), нейтропения), которые встречаются более чем в 70 % случаев.

Диагноз АЛПС был выставлен 5 пациентам согласно диагностическим критериям National Institutes of Health International Workshop (2009). Медиана возраста на момент исследования периферической крови составила 5 лет (д — 3, м — 2). Для оценки иммунологических параметров пациентов была взята группа здоровых доноров с соответствующей медианой по возрасту (п — 23, м — 14, д — 10). Исследование субпопуляций лимфоцитов в периферической крови пациентов и доноров (CD3+ Т-лимфоциты, CD19+

В-лимфоциты, CD16+CD56+ натуральные киллеры, CD3+HLADR+ активированные Т-лимфоциты, CD3+CD4+ Т-хелперы, CD3+CD8+ цитотоксические Т-клетки) проводилось методом проточной цитофлуо-риметрии. Осуществлено молекулярно-генетическое исследование гена Fas.

У пациентов с АЛПС помимо лимфопролифера-ции в 80 % случаев отмечались аутоиммунные гематологические нарушения в виде АИГА и/или ИТП.

Было выявлено, что в группе пациентов с АЛПС достоверно превышают возрастную норму следующие показатели в абсолютных значениях CD3+ Т-лимфо-циты (р = 0,0006), CD3+ HLADR активированные Т-лимфоциты (р = 0,01), CD3+CD4+ Т-хелперы (р = 0,006), CD3+CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты (р = 0,001), IgG (р = 0,02), IgA (р = 0,001). В относительном составе популяций лимфоцитов достоверные различия обнаружены только для лимфоцитов с фенотипом CD3+CD8+ (р = 0,002) и CD3+ HLADR (р = 0,001).

Мутация была найдена у 4 из 5 пациентов. У 3 пациентов мутации в виде аминокислотных замен локализованы в 9-м экзоне гена Fas и были получены по наследству. У 1 пациентки de novo делеция со сдвигом рамки считывания локализована в 7-м экзоне. Особенностью гена Fas является вариабельная пенет-рантность. Часто у членов семьи носителей мутации нет клинических проявлений либо они представлены очень мягким фенотипом, не снижающим качество жизни. Так, у двоих пациентов отцы-носители не имели клинической картины заболевания.

Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и хромосомные аберрации при хроническом лимфолейкозе

В.А. Овсепян, В.А. Росин, С.В. Баранчикова

ФГБУНКНИИГиПК ФМБА России

Целью настоящей работы являлось изучение возможной ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) — цитохрома P450 1A1 (CYP1A1), глутатион-Б-трансфераз ц1 (GSTM1), 01 (GSTT1) и п1 (GSTP1) - с типом наиболее часто приобретаемых хромосомных нарушений лейкозных клеток при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ) на момент диагностики.

В анализ включены результаты исследований полиморфизма указанных генов и FISH-анализа 69 больных ХЛЛ (средний возраст 61,2 года). Материалом для исследования полиморфизма послужила ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови больных стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Детекцию делеционного полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 проводили методом мультиплексной

4 ’201 2

4 ’201 2

полимеразной цепной реакции (ПЦР). Генотипирова-ние же полиморфизмов А24550 (11в462УаГ) в гене СУР1Л1, А15780 (Пв105УаГ) и в ОБТР1 выполняли методом ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Анализ наиболее часто встречающихся хромосомных нарушений у больных ХЛЛ проводился с помощью панели ДНК-проб (зондов), состоящей из 2 коктейлей: ЬБ1 р53/ЬБ1 АТМ (SpectrumOrange/SpectrumGreen) и ЬБ1 В13Б319/Ь81 13q34/CEP 12 (SpectrumOrange/SpectrumAqua/SpectrumGreen).

Теоретическим основанием для осуществления настоящей работы послужило предположение, согласно которому полиморфные варианты вышеуказанных генов могут быть вовлечены в патогенез ХЛЛ, в частности за счет влияния на уровень внутриклеточного генотоксического фона, который сам по себе уже способен модулировать стабильность генома. В результате проведенного исследования впервые показана возможная ассоциация гомозиготного носительства мажорного (полноценного) аллеля ОБТР1*105Пв с прогностически благоприятной моноаллельной интерстициальной делецией 13q14.3 при ХЛЛ, являющейся на момент диагностики единственным хромосомным нарушением в лейкозных клетках, содержание которых составляет не более 70 % от общего количества проанализированных клеток. Среди больных с подобной делецией гомозиготы по мажорному аллелю встречались чаще, чем носители хотя бы 1 минорного (неполноценного) аллеля (35,7 % против 64,3 % у гомозигот X = 4,09;р < 0,05; ОЯ = 3,40; 95 % С1 = 1,00-11,60).

Роль анионных фосфолипидов в передаче сигналов при апоптотических процессах

А.Н. Осипов, М.Н. Пучков, Е.А. Корепанова

Кафедра общей и медицинской биофизики медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

Хорошо известно, что в основе многих важнейших заболеваний (например, онкологических или иммунных) лежит нарушение запрограммированной клеточной гибели (апоптоза), которое приводит либо к неполной гибели мутировавших клеток, либо к избыточной гибели клеток, необходимых организму. Научиться управлять такими процессами - одна из актуальных задач современной науки. Благодаря недавним исследованиям молекулярных и клеточных механизмов апоптоза стало известно, что одну из главных ролей в процессе апоптоза играет цитохром С, который может образовывать комплексы с отрицательно заряженными фосфолипидами, и в первую очередь с кардиолипином. Образование комплекса кардиолипин - цитохром С приводит к изменению

структуры активного центра цитохрома С и превращению его в пероксидазу, т. е. появлению у цитохрома С способности окислять различные субстраты в присутствии пероксида водорода. К таким субстратам в первую очередь относятся липиды мембран митохондрий, окисление которых приводит к появлению в мембранах дефектов, через которые цитохром С может выходить в цитоплазму клетки и активировать каспазы, сериновые протеазы, от которых главным образом и зависит развитие апоптоза в клетке. В предлагаемой работе были проведены исследования перокси-дазной активности комплекса цитохрома С и кар-диолипина на модельных бислойных липидных мембранах. Опыты показали, что благодаря взаимодействию комплекса цитохрома С и кардиолипина с мембраной могут образовываться каналы шириной около 2 нм, достаточные для выхода цитохрома С в цитоплазму. Полученные результаты позволяют сделать вывод о ключевой роли анионных фосфолипидов в развитии апоптотических процессов и о возможности регуляции таких реакций посредством изменения количества анионных фосфолипидов в мембране.

Исследование проапоптогенных механизмов противоопухолевого эффекта флавоноидов корней солодки

С.И. Павлова1, 3, М.Д. Цицуашвили1, М.А. Тимаков2, И.Г. Козлов1, 2

1ФГБУФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 2ГБОУВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва; 3ФГБОУВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», Чебоксары, Республика Чувашия

В предыдущих исследованиях нами было показано, что флавоноиды корней солодки (ФКС) подавляют пролиферацию как активированных лимфоцитов, так и опухолевых клеток. Ингибирование пролиферации лимфоцитов ФКС не было связано с индукцией апоптоза, а сопровождалось изменением баланса Т-хелперных цитокинов и снижением секреции интерлейкина 2. Однако антипролиферативный эффект ФКС по отношению к опухолевым клеткам мог быть реализован через другие механизмы. Целью настоящей работы являлось исследование проапоптогенных эффектов ФКС в культуре опухолевых клеток различного происхождения. В экспериментах использовались клеточные линии человека: А-431, и-373, GL-6 и и-937, которые культивировали в среде ЯРМ1-1640 (и-937) или БМЕМ (А-431, И-373, GL-6), содержащей сыворотку и антибиотики. К преинкубированным в течение 24 ч клеткам добавляли ФКС (20 мкг/мл) и продолжали инкубацию 24-72 ч. Апоптоз оценивали путем окрашивания фиксированных клеток про-пидий йодидом цитометрическим методом.

Диаграммы флуоресценции ДНК распределялись преимущественно на 3 пика. Через 24 ч после внесения ФКС в культуру уровень апоптоза недостоверно увеличивался на 5—15 %, что сопровождалось значимым (р < 0,05) снижением диплоидного (соответствует G1/G0 фазам клеточного цикла) и повышению тет-раплоидного (соответствует G2/M фазам клеточного цикла) пиков гистограмм. Такие изменения могут свидетельствовать о нарушении вхождения клеток в фазу митоза — остановке клеточного цикла в G^/M-фазе. Спустя 48 ч инкубации с ФКС происходило увеличение доли апоптозирующих клеток на 20—40 % (р < 0,05) по сравнению с контрольными пробами. Через 72 ч инкубации этот показатель увеличивался, возрастание апоптоза под влиянием ФКС сопровождалось снижением уровней как пролиферирующих, так и покоящихся клеток, что выражалось в уменьшении численности тетра- и диплоидных клеток по сравнению с 24—48-часовой инкубацией.

Таким образом, на основании анализа диаграмм флуоресценции ДНК-пропидий можно заключить, что ФКС обладают проапоптогенным эффектом по отношению к различным линиям опухолевых клеток (A-431, GL-6, U-373, U-937) в условиях in vitro, что, по-видимому, является следствием остановки флавоноидами солодки опухолевых клеток в G^/M-фазе клеточного цикла.

Особенности иммунофенотипа острого лимфобластного лейкоза у детей первого года жизни

А.М. Попов1’ 2, Г.А. Цаур1’ 2, Т.Ю. Вержбицкая1’ 2, О.В. Стренева1’ 2, Е.В. Шориков1’ 2,

Л.И. Савельев1’ 2’ 3’ Л.Г. Фечина1’ 2

1ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург;

2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточньх технологий», Екатеринбург;

3ГБОУВПО УралГМА, Екатеринбург

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей первого года жизни характеризуется высокой частотой выявления перестроек гена MLL, особенным, отличающимся от более старших детей, профилем экспрессии генов и крайне неблагоприятным прогнозом. Цель исследования — описание иммунофенотипа ОЛЛ у детей первого года жизни. В исследование было включено 64 пациента (29 мальчиков и 35 девочек) с острым лейкозом (ОЛ) в возрасте от 0 до 11 месяцев включительно. Частота выявления ОЛЛ составила 67,19 % от всех ОЛ у детей первого года жизни, что было несколько реже, чем у более старших детей (87,69 %). В исследуемой группе преобладал BI-ОЛЛ (60,46 %), на долю же наиболее частого в других возрастных группах BII-ОЛЛ приходилось лишь 30,23 %.

Отсутствие экспрессии или низкая экспрессия CD10, CD20 и CD22, а также высокая экспрессия CD45, CD15, CD65 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек гена MLL. Диагностическая эффективность выявления экспрессии NG2 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой. Экспрессия CD34 и CD65 была более характерна для пациентов с наличием MLL-AF4(+). Таким образом, иммунофенотип ОЛЛ из В-линейных предшественников у детей младше 1 года существенно различается в зависимости от наличия или отсутствия перестроек гена MLL. Экспрессия NG2, CD45, CD133, CD15, а также слабая экспрессия или отсутствие экспрессии CD10, CD20 и CD22 позволяют прогнозировать наличие какой-либо перестройки гена MLL при ОЛЛ у детей первого года жизни, при этом наибольшей диагностической эффективностью обладает наличие экспрессии NG2.

Исследования геминовых белков и эритроцитов при помощи термолинзовой и оптоакустической микроспектроскопии

М.А. Проскурнин1, Д.А. Недосекин2, В.П. Жаров2 Д.С. Волков1, Е.С. Рындина1, Т.А. Горькова1

1 Химический факультет ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова;

2лазерные лаборатории Арканзасского университета медицинских наук, Филлипс-Классик, Литл-Рок, Арканзас, США

Термолинзовая и оптоакустическая микроспектроскопия (ТОМ) — наиболее чувствительные силовые лазерные методы абсорбционной спектроскопии, дополняющие традиционные, — применены для определения геминовых белков в водных растворах, а также гемоглобина в индивидуальных эритроцитах.

Предложены условия термолинзового определения гемоглобина в плазме крови без предварительного концентрирования, а также цитохрома C. Предел обнаружения составляет 0,1 пг для энергии 0,5 мДж и 10 пг для энергии 5 мкДж. Облучаемый объем 80 мкм3 делает возможным использовать ТОМ для определения гемоглобина в отдельных эритроцитах.

При помощи ТОМ на модели мышей с нормальной (nu/nu) и с генетически модифицированной кровью (STOCK Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg(HBA-HBBs)41Paz/J) показаны различная концентрация гемоглобина в нормальных эритроцитах и характерных эритроцитах в крови больных серповидной клеточной анемией. Кроме того, показано различное распределение гемоглобина в эритроцитах здоровой крови и в крови с серповидными эритроцитами, а также разная пороговая устойчивость нормальных и серпо-

4 ’201 2

4 ’201 2

видных эритроцитов к действию низкоэнергетического импульсного лазерного излучения. Это в сумме позволяет разрабатывать методики диагностики состава крови на основе ТОМ.

Оценка функциональной активности нейтрофилов методом ч хемилюминесценции

о

I— Е.В. Проскурнина, И.В. Образцов, Ю.А. Владимиров

^ Факультет фундаментальной медицины

Е ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

ш

_ Хемилюминесценция широко востребована в фун-

О даментальных и прикладных исследованиях в биологии

ЭВ и медицине. Достоинствами хемилюминесцентных ме-

* тодов являются высокая чувствительность, специфич-

ность хемилюминесцентного отклика и относительная

простота эксперимента. В большинстве работ, посвященных применению хемилюминесценции в целях медицинской практики, изучаются реакции активных форм кислорода, в частности респираторный взрыв гранулоцитов под действием различных стимулов.

Проблема оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов не теряет актуальности до настоящего времени. Эта информация имеет ценность прежде всего при воспалительных процессах, в том числе аутоиммунных и неопластических. Существует ряд методик оценки активности, но большинство из них трудоемки и субъективны или требуют использования сложного дорогостоящего оборудования, что исключает их использование в качестве скрининговых тестов.

В исследовании определены оптимальные условия пробоподготовки и хемилюминесцентного анализа нейтрофилов цельной крови. Разработана методика хемилюминесцентного анализа функциональной активности фагоцитов цельной крови, основанная на последовательном внесении 4р-форбол-12-миристат-13-ацетата и К-формил-метионил-лейцил-фенил-аланина в клеточную суспензию и последующей регистрации активированной люминолом хемилюми-несценции. Обследована контрольная группа доноров для использования в качестве базы сравнения при диагностическом использовании хемилюминограмм. Показаны различия в хемилюминограммах, полученных от доноров и пациентов с термической травмой. Предложены критерии оценки хемилюминограмм; построены пределы значений показателей, свидетельствующих о благоприятном прогнозе течения ожоговой болезни.

Генетические субтипы анемии Фанкони . Случай неблагоприятного исхода при мутации в гене FANCC

А.С. Романцова, С.О. Шарапова, О.В. Алейникова

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Анемия Фанкони (АФ) — это генетически и фенотипически гетерогенное рецессивное заболевание, которое характеризуется различными врожденными аномалиями, прогрессивной панцитопенией и предрасположенностью к гемобластозам и солидным опухолям. Генетической основой АФ являются мутации в 15 генах FANC, которые формируют соответствующие комплементарные группы. Мутации чаще всего встречаются в генах FANCA, FANCC и FANCG (65 %, 10 % и 15 % соответственно) и приводят к нарушению пролиферации, повышенной клеточной гибели, увеличению числа генетически поврежденных клеток и повышенному риску развития неоплазий, который коррелирует с возрастом.

Целью работы было проведение генетической диагностики наиболее распространенных субтипов АФ, диагностированной в Республике Беларусь.

Мутационный анализ генов FANCA, FANCC, FANCG был проведен методом SSCP и с ресеквенированием ДНК из мононуклеаров периферической крови, с последующим сопоставлением результатов с базой данных (www.rockefeller.edu/fanconi/mutate, GenBank: NM_000136.2 (cDNA)).

Скрининг гена FANCA был проведен у 9 пациентов. Мутации выявлены у 5 (55,6 %) человек — 2 крупные делеции, 2 аминокислотные замены и 1 со сдвигом рамки считывания. Мутационный анализ генов FANCC, FANCG был выполнен еще у 9 пациентов с АФ. Мутация выявлена у 1 пациента (обнаружены 2 гетерозиготные мутации в гене FANCC).

При АФ с мутацией в гене FANCC выявлена новая клинико-генетическая ассоциация. Диагноз АФ (резидент Украины) был выставлен в 11 лет (ДЭБ-ин-дуцированные разрывы наблюдалась в 38 % хромосом) и подтвержден в РНПЦ детской онкологии и гематологии (Минск, Беларусь) в 16 лет на основании клинико-лабораторных и цитогенетических исследований. В 17 лет обнаружена гепатоцеллюлярная аденома правой доли печени (терапия андрогенами не проводилась), а также, как осложнение АФ, выставлен диагноз миелодиспластический синдром (МДС), рефрактерная анемия с избытком бластов (МДС, РАИБ), через 5 мес после трансформации в МДС девочка умерла.

Мутация в гене FANCC в экзоне 12 с. 1207 T>C, обнаруженная в нашем исследовании, описывается при АФ в литературе впервые, так же как и ее сочетание

с крайне редкой мутацией в интроне 7 c.844-1 G>C. Ассоциированный с данной генетической аномалией фенотип представлен апластической анемией средней тяжести с синостозом локтевой и лучевой костей обеих рук, а также довольно ранним развитием быстро прогрессирующей доброкачественной опухоли печени (гепатоцеллюлярной аденомы) и прогностически крайне неблагоприятного гемобластоза (МДС, РАИБ).

Роль трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в терапии вторичного острого миелоидного лейкоза у детей

И.П. Ромашевская1’ 2, Н.Н. Савва2,

Н.П. Литвинко2, О.В. Алейникова2

]ГУРНПЦРМиЭЧ, Гомель, Беларусь;

2ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Введение. Современная стратегия терапии острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у детей основана на использовании риск-адаптированной интенсивной полихимиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Больные со вторичным ОМЛ относятся к группе неблагоприятного прогноза. Наибольший противолейкемический эффект наблюдается при аллогенной ТГСК. На основании современных достижений в изучении ОМЛ кооперативной группой Россия — Беларусь был разработан протокол терапии ОМЛ-ММ, по которому в Республике Беларусь с 2000 г. лечились дети и подростки со вторичным ОМЛ.

Цель. Оценить результаты лечения и исход вторичного ОМЛ у детей и подростков в ракурсе сравнения с de novo ОМЛ с учетом проведения ТГСК.

Материал и методы. В исследование были включены 7 пациентов со вторичным ОМЛ и 103 пациента с de novo ОМЛ, получавших лечение по программе ОМЛ-ММ-2000/2006 в период с 2000 по 2009 г. Анализировались результаты лечения вторичного ОМЛ в ракурсе сравнения с группой высокого риска de novo ОМЛ (n = 40). Статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения STATISTICA 6.0.

Результаты и обсуждение. Достижение полной ремиссии отмечено у всех 7 пациентов со вторичным ОМЛ, а в группе высокого риска de novo ОМЛ у 5-й части больных зафиксирована смерть в индукции и отсутствие ответа на лечение, однако различия не были статистически значимыми (р > 0,2). У пациентов группы высокого риска de novo ОМЛ достоверно чаще развивались рецидивы заболевания (р = 0,05) за счет группы больных, получивших аутоТГСК. В полной продолжительной ремиссии находится 71 % пациентов

со вторичным ОМЛ, что выше в сравнении с группой de novo ОМЛ (р = 0,06). В связи с неблагоприятным прогнозом у пациентов со вторичным ОМЛ им всем была показана аллоТГСК, однако она была выполнена у 5 (71,4 %) из 7 детей. Двадцать одному пациенту высокой группы риска de novo ОМЛ была выполнена ТГСК. В группе вторичного ОМЛ ТГСК выполнялась чаще — 71,4 % против 52,5 % пациентов с de novo ОМЛ.

Выводы. У пациентов со вторичным ОМЛ ремиссия была достигнута в 100 % случаев. В полной продолжительной ремиссии находится 71 % пациентов со вторичным ОМЛ, что выше в сравнении с группой высокого риска de novo ОМЛ (p = 0,06). У пациентов группы высокого риска de novo ОМЛ достоверно чаще развивались рецидивы заболевания (р = 0,05) за счет группы больных, получивших аутоТГСК. Общая выживаемость для больных вторичным ОМЛ составила 75 %. Рецидивы ОМЛ были ведущими причинами смерти в обеих сравниваемых группах. Посттранс-плантационная выживаемость пациентов со вторичным ОМЛ составила 80 % за счет проведения аллоТГСК, но статистически значимых различий не выявлено в сравнении с группой высокого риска de novo ОМЛ, где чаще проводилась аутоТГСК (р > 0,1).

Пероксидазная активность цитохрома С, усиленная фосфатидилхолином в присутствии фосфолипазы D

Г.О. Степанов, А.Н. Осипов

ГБОУВПО РНИМУим. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

Уже на протяжении многих лет проблема апоптоза не теряет своей актуальности по причине участия данного процесса в патогенезе онкологических заболеваний. При этом все новые особенности молекулярных взаимодействий в этом процессе появляются в мировой научной литературе еженедельно. Одним из ключевых моментов в развитии апоптоза является выход из митохондрий цитохрома С, которому предшествует появление у последнего высокой пероксидазной активности. Данная активность стимулируется при взаимодействии цитохрома С с ненасыщенным кар-диолипином или фосфатидной кислотой, но никогда до сегодняшнего дня в этом процессе не участвовал фосфатидилхолин. Более того, ненасыщенный фос-фатидилхолин в большинстве исследований выступал как отрицательный контроль. В нашей работе представлен новый факт — фосфатидилхолин может в десятки раз увеличивать пероксидазную активность цитохрома С в присутствии фосфолипазы D, и эта активность может регулироваться при действии оксида азота и лазерного излучения.

Мы показали, что в присутствии фосфолипазы D в системе фосфатидилхолин — цитохром С резко по-

4 ’201 2

4 ’201 2

вышается пероксидазная активность за счет ферментативной наработки ненасыщенной фосфатидной кислоты из фосфатидилхолина, а фосфатидная кислота является сильным активатором пероксидазной активности цитохрома С. При этом, если в системе присутствуют диолеоилфосфатидилхолин и фосфоли-паза D, то пероксидазная активность увеличивалась в 90 раз; если липиды предварительно экстрагировались из митохондрий, то в 18 раз; и при работе с целыми митохондриями в 3 раза.

Во всех экспериментах при продолжительной инкубации фосфатидилхолина с фосфолипазой D наблюдается незначительное уменьшение пероксидаз-ной активности цитохрома С после ее многократного увеличения. Данный факт опосредован действием сте-рических факторов межмолекулярного взаимодействия и подтверждается методами флуоресценции триптофана 59 и ЭПР-спектроскопии с этопозидом. Главным результатом нашего исследования стало подтверждение возможности значимого увеличения пероксидазной активности цитохрома С (тесно связанной с инициацией апоптоза) при действии фосфатидилхолина в условиях ее инкубации с фосфолипазой D.

Анализ мутаций гена CEBPA в группе нормального кариотипа при остром миелоидном лейкозе у детей

М.В. Стёганцева, А.М. Кустанович, Р.И. Юцкевич, Н.А. Соколова, О.В. Алейникова

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

C/EBPA относится к семейству CCAAT/энхан-серсвязывающих белков (CEBP), регулирующих баланс процессов пролиферации и терминальной диф-ференцировки. С мРНК гена может транслироваться как белок размером 42 кДА, так и доминантно-негативная изоформа размером 30 кДА, в которой отсутствует N-концевая область, включающая трансактивационный домен 1 (TAD1). Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) с мутацией CEBPA включены в классификацию ВОЗ и составляют 7—24 % от общего числа случаев ОМЛ. Наиболее часто они встречаются у пациентов с нормальным кариотипом (НК). Мутации в ДНК-связывающем домене (bZIP) приводят к нарушению C/EBPA-опосредованной регуляции клеточного цикла, что сопровождается увеличением количества бластных клеток. Если же мутации затрагивают TAD, то экспрессия CEBPA смещается в сторону изоформы р30. Выбор CEBPA в качестве объекта исследования обусловлен возможностью его использования в качестве мишени для мониторинга минимальной остаточной болезни, а также прогностического и классификационного маркера.

Мутации в гене CEBPA были проанализированы у 17 пациентов с НК ОМЛ с использованием секвени-рования. Мутации в кодирующей области были обнаружены у 5 человек (35 % НК ОМЛ). В 4/5 случаев (80 %) определялись мутации со сдвигом рамки считывания. У 1 (20 %) из пациентов мутация затрагивала bZIP домен, в 3 случаях — один из TAD-доменов. В 1 случае определялась двойная мутация, приводящая к изменению нуклеотидной последовательности в доменах TAD1 и bZIP, что, как считают, ассоциировано с благоприятным прогнозом (S. Fröhling et al., 2004). У 4 пациентов — 1 с мутацией и 3 без мутации (28 % НК ОМЛ) — определялась вставка 6 нуклеотидов, затрагивающая полиморфную область в домене TAD2 (B.J. Wouters et al., 2007). Пациенты с мутацией CEBPA характеризовались повышенным содержанием лейкоцитов и более высокой частотой экспрессии CD34 (p < 0,05). В 2 раза чаще в группе CEBPA-позитивных лейкозов встречался М2-подтип ОМЛ (80 % vs 40 %, p > 0,05). Анализ выживаемости не выявил достоверных различий между пациентами с наличием и отсутствием мутации CEBPA в группе с НК ОМЛ.

Мутации гена CEBPA встречаются у трети пациентов с НК ОМЛ. CEBPA-позитивные лейкозы характеризуются повышенным лейкоцитозом и уровнем экспрессии CD34. Отсутствие различий по параметрам выживаемости в проанализированной группе может объясняться как малым размером проанализированной выборки, так и тем, что в анализ были включены пациенты с различным типом мутаций (моно-/биал-лельные) в гене CEBPA.

Репарация индуцированных разрывов ДНК в нормальных гемопоэтических и лейкемических стволовых клетках in vitro

А.В. Тарасова, Т.В. Шман

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Высокий уровень репарации ДНК в лейкемиче-ских стволовых клетках (ЛСК) обеспечивает их резистентность к химиопрепаратам и облучению. Целью работы было сравнить эффективность репарации ДНК в лейкемических клетках и нормальных гемопоэтиче-ских стволовых клетках (ГСК) после воздействия на них этопозида.

Исследовали мононуклеарные клетки костного мозга 8 доноров и 10 пациентов с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). После 3 и 24 ч инкубации с этопозидом (VP-16, 10 мкг/мл) часть клеток окрашивали анти-CD45-PE-Cy7, CD34-PC-5 и CD38-PE антителами. Затем клетки фиксировали параформальдеги-

дом и ледяным этанолом, дополнительно окрашивали affm-yH2AX-AlexaFluor488 (Ser139) антителами и анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC-500.

Клетки с фенотипом CD34+CD38-CD19+ наиболее часто рассматривают в качестве потенциальных ЛСК при ОЛЛ (K. Wilson, 2010). По полученным нами данным, корреляция между количеством лейкозных клеток в популяциях CD34+CD38- и CD34+CD38-CD19+ составила 0,98 (р < 0,05).

Было установлено, что через 3 ч инкубации с VP-16 количество ЛСК с фенотипом CD45lowCD34+CD38-, экспрессирующих yH2AX, составило 55,1 ± 8,8 %, а через 24 ч — 36,1 ± 9,3 %. Для ГСК-доноров было характерно отсутствие репаративного ответа — уровень уН2АХ-позитивных CD45lowCD34+CD38--клеток составил 22,2 ± 4,4 % через 3 ч и 23,8 ± 4,7 % через 24 ч. Можно предположить, что ранние ГСК с разрывами ДНК элиминируются из организма, чтобы предотвратить передачу поврежденной или «некорректно» репа-рированной ДНК последующим клеточным поколениям, тогда как эффективная репарация ДНК в ЛСК с фенотипом CD45lowCD34+CD38- обеспечивает их устойчивость к генотоксическому воздействию. При этом клетки доноров с более зрелым CD45lowCD34+CD38+-фенотипом характеризовались значительно более высокой способностью репарировать ДНК и снижением количества уН2АХ-позитивных клеток с 47,7 ± 9,6 % до 25,4 ± 5,8 %, тогда как лейкемические клетки с данным фенотипом репарировали ДНК менее интенсивно и уровень уН2АХ-экспрессирующих клеток снижался с 74,8 ± 6,3 % до 65,1 ± 10,4 %.

Антиоксидантная активность биологических жидкостей как критерий функционального состояния антиоксидантной системы человека

Ю.О. Теселкин, О.Б. Любицкий

Кафедра общей и медицинской биофизики ГБОУВПО РНИМУим. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

Известно, что оксиданты — свободные радикалы, активные формы кислорода, азота и другие — являются необходимыми участниками многих физиологических процессов в живой клетке. Вместе с тем, высокая реакционная способность делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем. В норме регуляция продукции оксидантов в тканях и органах человека осуществляется многоуровневой антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения различной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты. Однако нарушение баланса между оксидантами и антиоксидантами в сторону первых

может привести к развитию оксидативного стресса -неконтролируемого усиления свободнорадикальных реакций, в результате которого происходит окислительное повреждение различных биомолекул. Так, установлено, что активация свободнорадикальных реакций играет важную роль в патогенезе нейродеге-неративных, сердечно-сосудистых, бронхолегочных и других заболеваний. В связи с этим важной задачей медико-биологических исследований является изучение антиоксидантного потенциала организма человека.

Один из подходов, позволяющих оценить состояние антиоксидантной системы человека, заключается в определении антиоксидантной активности (АОА) его биологических жидкостей. АОА биологической жидкости — это интегральный показатель, отражающий способность входящих в ее состав антиоксидантов противодействовать развитию свободнорадикальных реакций в какой-либо модельной системе. Для количественной оценки величины АОА биологической жидкости ее выражают через концентрацию стандартного антиоксиданта, например тролокса или аскорбиновой кислоты.

В наших исследованиях с использованием метода хемилюминесценции показано, что АОА биологических жидкостей человека может служить дополнительным клиническим лабораторным показателем, применение которого повышает эффективность проводимых лечебных мероприятий, в том числе антиок-сидантной терапии. При этом объем исследуемой биологической жидкости (например, сыворотки крови) составляет не более 10—20 мкл. Это дает возможность осуществлять забор крови из пальца, что очень важно при динамическом наблюдении за больными.

Использование процессного подхода для совершенствования качества получения криопреципитата

Л.В. Удалова1, Н.М. Поздеев2

]ГУЗ «Липецкая областная станция переливания крови»;

2ФГБУНКНИИГиПК ФМБА России

Введение. В современной практике управления качеством производственных процессов наиболее перспективным является применение процессного подхода. Его использование позволяет рассматривать производственную деятельность как единую систему взаимосвязанных процессов, вносить изменения в одни, не ухудшая при этом другие, производить эффективную оптимизацию использования человеческих и материальных ресурсов.

Материалы и методы. Использование процессного подхода для управления технологическими этапами получения криопреципитата с регламентируемым содержанием фактора VIII базировалось на методологии функционального моделирования ГОЕБО.

4 ’201 2

4 ’201 2

Результаты исследования. Разработана функциональная модель получения криопреципитата, позволившая определить в конечном продукте «Криопреципитат» зависимость содержания фактора VIII в количестве не менее 70 МЕ (элемент выхода) от температуры и способа размораживания исходного сырья, в качестве которого используется плазма свежезамороженная (элемент входа). Описание и идентификация технологических этапов с применением процессного подхода позволили организовать работу по производству криопреципитата с максимальным сокращением движения полупродукта по отделению и сокращению времени пребывания его в условиях комнатной температуры. Анализ критических точек, определенных в ходе построения функциональной модели, выявил объективную необходимость использования для получения криопреципитата строенных (500/400/400) полимерных контейнеров и внесения изменений в порядок организации работы, исключив ошибки на этапах этикетировки и маркировки.

Заключение. Доказана необходимость и возможность управления производством криопреципитата с помощью процессного подхода. Построение функциональной модели получения криопреципитата позволило стандартизовать процедуру, обозначило необходимость внесения изменений в наиболее важные этапы производства с целью улучшения качества конечного продукта.

Процессный подход позволяет оценить влияние внесенных изменений на результаты деятельности, ведет к оптимизации работы оборудования и персонала.

Эффективность лечения по протоколу MLL-Baby прогностически неблагоприятного MLL/AF4 позитивного острого лимфобластного лейкоза у детей младше года

Л.Г. Фечина1, 2, Е.В. Шориков1, 2, О.П. Хлебникова1, О.В. Стренева1, 2, М.С. Карачева1, 2, Г.А. Цаур1, 2, А.М. Попов1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 3, Д.В. Литвинов4, Н.В. Мякова4, С.Р. Варфоломеева4, К.Л. Кондратчик5, Д.А. Перегудов6, А.В. Шамардина7, Э.Г. Бойченко8, Е.В. Лапотентова9, О.В. Алейникова9,

А.И. Карачунский4, Г. Хенце10, А.Г. Румянцев4 1ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург;2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3ГБУЗ ВПО УралГМА, Екатеринбург; 4ФГБУФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 5Морозовская детская городская клиническая больница, Москва; 6ГУЗ «Московский областной онкологический диспансер», Балашиха;

7ГУ «Нижегородская областная детская клиническая больница», Нижний Новгород;

8ГУЗ «Детская городская больница № 1», Санкт-Петербург; 9ГУ «Республиканский

научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь; 10Медицинский центр Charite, Университет им. Гумбольдта, Берлин, Германия

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей младше года в 70 % случаев сопровождается перестройками с участием MLL-гена, наиболее неблагополучной из которых является MLL/AF4. По данным международных публикаций ведущих исследовательских групп, результаты лечения детей с этой генетической перестройкой до настоящего времени являются крайне неудовлетворительными.

В России был разработан оригинальный протокол MLL-Baby для лечения младенческих ОЛЛ с включением полностью трансретиноевой кислоты (АТРА), с 2003 г. было пролечено 28 детей с перестройкой MLL/AF4, что составило 34 % от числа всех включенных в исследование MLL-Baby пациентов.

Медиана возраста больных составила 3 мес (от 0 до 11 мес), инициальный лейкоцитоз 99 х 109/л (1,8 х 109/л — 612 х 109/л). Инициальный нейролейкоз был зарегистрирован у 9 (32 %) пациентов. На этапе индукционной терапии погибло 4 (14,3 %) ребенка, а на этапе консолидирующей терапии, во время проведения блоков высокого риска, погибло также 4 (14,3 %) ребенка в сроки от 1,3 до 2,5 мес с момента начала противоопухолевой терапии. Из 24 младенцев, достигших ремиссии, у 9 (32 %) пациентов были зарегистрированы очень ранние рецидивы. Одиннадцать (39,3 %) пациентов находятся в длительной клинико-гематологической ремиссии. Бессобытийная выживаемость составила 0,38 ± 0,09, а безрецидивная выживаемость — 0,54 ± 0,11.

Полученные результаты показали, что на протоколе MLL-Baby удалось добиться снижения частоты развития рецидивов в самой неблагополучной группе пациентов в возрасте до 1 года, страдающих ОЛЛ с t(4; 11).

Сокращение частоты токсических летальных исходов на терапии путем оптимизации условий и качества лечения младенческих лейкозов позволит добиться улучшения показателей долгосрочной бес-событийной и безрецидивной выживаемости.

Использование клеточного биочипа для дифференциальной диагностики волосатоклеточного лейкоза и лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки

А.Н. Хвастунова1, 2, А.О. Доронина1, 3, О.С. Федянина2, Ф.И. Атауллаханов1, 2 3, С.А. Кузнецова1, 2, 3

Лаборатория биофизики ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;

2ЦТП ФХФ РАН; 3лаборатория физической биохимии системы крови ФГБУ ГНЦМинздрава России, Москва

Успешная диагностика онкогематологических заболеваний базируется на сочетании иммунофено-типирования, морфологического и молекулярно-биологического анализа клеток крови. Однако невозможность проведения анализа поверхностных антигенов и морфологического исследования на одних и тех же клетках может затруднять дифференциальную диагностику волосатоклеточного лейкоза и лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки с циркулирующими ворсинчатыми лимфоцитами, для которой необходимо определение иммунофенотипа ворсинчатых лимфоцитов, составляющих в некоторых случаях всего несколько процентов от всех лимфоцитов периферической крови и костного мозга.

Клеточный биочип представляет собой прозрачную подложку, на которой иммобилизованы антитела к 36 поверхностным антигенам лейкоцитов. При инкубации биочипа с клеточной суспензией клетки связываются с иммобилизованными антителами. После отмывки на поверхности биочипа остаются области, покрытые лейкоцитами, несущими тот или иной поверхностный антиген, морфология которых исследуется стандартными цитологическими методами. С помощью клеточного биочипа были исследованы лимфоциты периферической крови 27 пациентов с подозрением на волосатоклеточный лейкоз. Показано, что у больных волосатоклеточным лейкозом (у 23 из 27) ворсинчатые лимфоциты связываются с антителами к СБ11с (100 % случаев), СБ19 (100 % случаев), СБ20 (100 % случаев), СБ25 (96 % случаев), СБ103 (100 % случаев). В периферической крови 3 из оставшихся 4 пациентов было обнаружено небольшое количество ворсинчатых лимфоцитов, положительных по СБ19 (1—10 % от общего числа В-лимфоцитов и небольшое количество СБ11с+ лимфоцитов, но ворсинчатых клеток среди них не было). У больных данной группы на основании иммуно-фенотипирования, гистологических и цитохимических исследований была диагностирована лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки. Таким образом, клеточный биочип может быть использован для дифференциальной диагностики волосатоклеточного лейкоза.

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-31275.

Молекулярно-генетические аспекты прогнозирования острого лимфобластного лейкоза у детей

С.А. Ходулева1, И.П. Ромашевская2, Т.В. Хартон1,

А.Н. Демиденко2, Е.Ф. Мицура2, О.В. Жук2

УО «Гомельский государственный медицинский университет», Беларусь;

2ГУРНПЦРМиЭЧ, Гомель, Беларусь

С целью оценки молекулярно-генетических изменений методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией проведено исследование клеток неопластического клона при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей. Всего обследовано 35 детей с впервые выявленным ОЛЛ в возрасте от 10 месяцев до 17 лет, средний возраст составил 6 лет и 11 месяцев, соотношение мальчиков и девочек — 1,3 : 1. Молекулярно-генетические аномалии выявлены у 29 % пациентов. В 60 % случаев обнаружена t(12;21)TEL/AML, при этом преимущественно (83 %) у детей в возрастной группе от 1 до 10 лет, и только в 17 % случаев в возрасте старше 10 лет. Все дети с данной транслокацией имели В-клеточную иммунологию бластных клеток, причем пре-пре-В вариант, который относится к факторам с благоприятным прогнозом, встречался в 67 %. Инициальный уровень лейкоцитов у всех пациентов был менее 10 х 109/л. Во всех случаях ОЛЛ с t(12;21) TEL/AML достигнута полная ремиссия, однако в 17 % случаев диагностирован ранний костномозговой рецидив. Период наблюдения составил 10 лет. Транслокация t(9;22) BCR/ABL выявлена у 1 ребенка мужского пола, в возрасте 6 лет, бластные клетки имели В-клеточную природу (пре-В-вариант). Анализ уровня инициального лейкоцитоза показал, что количество лейкоцитов было в пределах до 30 х 109/л. Достигнута полная ремиссия, период наблюдения составил 8 лет. Транслокация t(1;19) E2A/PBX1 диагностирована у 2 детей. Все дети на момент постановки диагноза были старше 10 лет, иммунофенотип бластов в половине случаев соответствовал пре-пре-В варианту, в половине — Т-клеточному варианту. Инициальный лейкоцитоз в 100 % был в пределах 10—30 х 109/л. Несмотря на неблагоприятные факторы, все дети достигли полной ремиссии. Период наблюдения составил от 2 до 6 лет. Транслокация t(11;19)MLL/ENL выявлена в 10 % случаев. Наличие t(11;19)MLL/ENL, ассоциированной с инициальным лейкоцитозом, Т-клеточным вариантом, мужским полом, возрастом до 2 лет, может быть рассмотрена как неблагоприятный прогностический фактор, так как в данном случае наблюдалась резистентность к проводимой полихимиотерапии.

4 ’201 2

4 ’201 2

Перестройки 11а23/Ш у детей первого года жизни с острым миелоидным лейкозом

Г.А. Цаур1, 2, Е.В. Флейшман3, Т.Л. Гиндина4,

О.М. Плеханова1, А.М. Попов1, 2, О.И. Сокова3, О.В. Алейникова5, Е.В. Волочник5, А.С. Демина1, 2, О.В. Каленник6, И.И. Калинина7, Н.П. Кирсанова5, К.Л. Кондратчик8, А.М. Кустанович5, Т.В. Наседкина6,

В.А. Овсепян9, Ю.В. Ольшанская7, А.В. Попа3, Т.О. Ригер1, 2, Л.И. Савельев1, 2 10, О.В. Стренева1, 2, Е.В. Шориков1, 2, C. Meyer11, R. Marschalek11,

Л.Г. Фечина1, 2 1ГБУЗ CO «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», Москва; 4Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ГБОУВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»; 5ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь; 6ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва; 7ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 8Морозовская детская городская клиническая больница, Москва; 9ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России; 10ГБОУВПО УралГМА, Екатеринбург; 11Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology/ ZAFES, Goethe- University of Frankfurt, Франкфурт-на-Майне, Германия

Нами проведен анализ результатов цитогенетического и молекулярно-генетических исследований (FISH, различные варианты полимеразной цепной реакции) у 57 пациентов в возрасте младше 1 года с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Перестройки 11q23/MLL были выявлены у 28 (49 %) детей. Самыми частыми были транслокации t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 — в 32 % случаев и t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 — в 28 % случаев. Перестройки 11q23/MLL встречались приблизительно с равной частотой у пациентов младше и старше 6 месяцев (р = 0,904). В группе пациентов с перестройками 11q23/MLL острый моноб-ластный лейкоз (FAB М5) наблюдался достоверно чаще, а острый мегакариобластный лейкоз (FAB М7) — достоверно реже, чем в группе пациентов, у которых изменения 11q23/MLL не были обнаружены (р = 0,024 и р = 0,001 соответственно). У 6 (50 %) из 12 пациентов, которым проводилось определение точки разрыва в гене MLL, она располагалась в интроне 9. Дополнительные хромосомные аномалии у пациентов с наличием перестроек 11q23/ MLL и известным кариотипом были выявлены в 33 % случаев, комплексный кариотип — в 24 %. Также нами дана детальная характеристика редких вариантов пере-

строек MLL, включая MLL-MYO1F, MLL-SEPT6, MLL-SEPT9, а также частичного тандемного повтора в гене MLL при ОМЛ у пациентов первого года жизни. Показана важность комбинирования цитогенетического и молекулярно-генетических методов для корректного установления типа перестройки 11q23/MLL.

Сравнение антипролиферативной эффективности флавоноидов корня солодки и доксорубицина in vitro

М.Д. Цицуашвили1, С.И. Павлова2, 3, И.Г. Козлов1, 2

1ГБОУВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва; 2ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 3ФГБОУВПО ЧГУ им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Республика Чувашия

Противоопухолевый антибиотик доксорубицин широко используется в терапии онкологических заболеваний различного генеза. Однако в ряде случаев отмечено развитие резистентности некоторых опухолей к этому препарату, что представляет существенную проблему для практической онкологии. Известно, что низкомолекулярные полифенольные соединения растительного происхождения, флавоноиды, обладают широким спектром биологической активности. Есть сведения, что в основе механизма антипролиферативного эффекта флавонои-дов лежит ингибирование фосфорилирования внутриклеточных сигнальных молекул. Целью данного исследования явилась оценка и сравнение рост-ингибирующей активности флавоноидов корня солодки (ФКС) и доксорубицина (Sigma, США) по отношению к опухолевой линии K-562/DOX, резистентной к данному цитостатику. Оценка пролиферации лейкозных клеток проводилась с помощью радиоизотопного метода. Клетки засевали в 96-луночный планшет в концентрации 1,0 х 104 клеток/лунку и инкубировали в течение 24 ч. Далее в опытные лунки вносили ФКС (0,1—20 мкг/мл) и доксорубицин (10-8—10-5 М). Затем во все лунки добавляли АТФ (100 цМ) и радиоактивную метку 3Н-тимидин (1 мкКю/мл) и продолжали инкубацию еще в течение 24 ч. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы этанола до конечной концентрации 1 %. Пролиферацию оценивали путем измерения радиоактивности включенного в ДНК 3Н-тимидина; результат выражали в процентах к контролю. Исследуемые агенты подавляли пролиферацию клеток дозозависимо: ФКС (10—20 мкг/ мл) — до 30—35 %, доксорубицин (10-6—10-5 М) — до 30— 40 %, при этом он не оказывал эффекта в терапевтических концентрациях 10-8—10-7 М. При совместном введении ФКС (20 мкг/мл) и доксорубицина в опухолевую культуру пролиферация клеток линии K-562/DOX ингибировалась в большей степени: эффект комбинации был равен сумме эффектов отдельных препаратов. Таким образом, комбинация ФКС с доксорубицином приводит к усилению противоопухолевого эффекта in vitro.