ВЛИЯНИЕ ТРИПСИНА И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА БИОПЛЕНКИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS

МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ

ВЛИЯНИЕ ТРИПСИНА И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА БИОПЛЕНКИ

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Алиева Лейла Октай

студент 3 курса лечебного факультета, Пермский государственный медицинский университет

имени академика Е.А. Вагнера, г. Пермь Щукина Валентина Павловна

студент 3 курса лечебного факультета, Пермский государственный медицинский университет

имени академика Е.А. Вагнера, г. Пермь Башев Сергей Сергеевич

студент 2 курса стоматологического факультета, Пермский государственный медицинский

университет имени академика Е.А. Вагнера, г. Пермь Гордина Екатерина Михайловна

аспирант кафедры микробиологии и вирусологии с курсом КЛД, Пермский государственный медицинский

университет имени академика Е.А. Вагнера, г. Пермь

EFFECT OF TRIPSIN AND ANTIMICROBIALS AGENTS ON BIOFILMS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS Alieva Leyla, 3rd year student of the medical faculty Academician Wagner Medical University of Perm Schukina Valentina, 3rd year student of the medical faculty, Academician Wagner Medical University of Perm Bashev Sergey, 2nd year student of the Faculty of Dentistry, Academician Wagner Medical University of Perm Gordino Ekaterina, Department of Microbiology and Virology with a course of Clinical Laboratory Diagnostics Academician Wagner Medical University of Perm

АННОТАЦИЯ

Изучено влияние трипсина и антибактериальных препаратов (линкомицина и ципрофлоксацина) на 24-х часовые биопленки Staphylococcus aureus. Все штаммы были чувствительны к действию данных препаратов и характеризовались способность формировать биопленки. В результате часового воздействия трипсина обнаружено уменьшение толщины сформированных биопленок, в то же время антибактериальные препараты оказывали стимулирующий эффект, более выраженный у ципрофлоксацина. Совместное применение трипсина и антибиотиков нивелировало усиливающий эффект антибактериальных препаратов.

ABSTRACT

There was examined the effect of trypsin and antimicrobials agents (ciprofloxacin and lincomycin) on daily (24 hours) biofilms of Staphylococcus aureus. All strains were sensitive to these drugs, and were characterized by the ability to form biofilms. As a result, an hour lasting trypsin effect showed a decrease in the thickness of biofilms, while antibiotics showed a stimulating effect more pronounced in ciprofloxacin. The combined use of trypsin and antimicrobials agents removed the reinforcing effect of antibacterial agents.

Ключевые слова: биопленкообразование, Staphylococcus aureus, трипсин, линкомицин, ципрофлоксацин

Key words: biofilm formation, Staphylococcus aureus, trypsin, lincomycin, ciprofloxacin

Принято считать, что в настоящее время более 80% всех инфекционных заболеваний обусловлено микроорганизмами, существующими в форме организованного сообщества - биопленок. Эта специфика организации этиологических агентов наиболее характерна для практически всех искусственных имплантатов.

Биопленкообразование это сложный комплексный процесс, сформировавшийся в процессе эволюции микроорганизмов, как способ выживания в различных условиях обитания. Стафилококки обладают разнообразным набором факторов для его реализации. Это позволяет им «комфортно» существовать в неблагоприятных условиях

и, самое главное, противостоять действию различных антибактериальных препаратов [4, с. 304]. Внутри биопленок бактерии приобретают особые формы антибиотико-резистетности. Благодаря этому сесильные микроогра-низмы способны выживать и при воздействии антибиотиков. В этих условиях для достижения бактерицидного эффекта иногда необходимо создать концентрации антибиотиков в сотни раз превышающие терапевтические [7, с. 167]. Бактерии в составе биопленок, как правило, отличаются полирезистентностью ко многим антибактериальным препаратам различных классов [8, с. 895]. Более того, известен факт усиления интенсивности биопленко-

образования у штаммов Staphylococcus capitis в присутствии максимальных терапевтических концентраций ок-сациллина [6, с. 6]. В клинических условиях такая высокая выживаемость сесильных бактерий приводит к неэффективности проводимой антибактериальной терапии и как следствие к хронизации инфекционного процесса [2, c. 59].

Структурные характеристики стафилококковых биопленок определяются организацией и количеством бактериальных слоев, а также особенностями внеклеточного биопленочного матрикса [2,с. 59]. Для Staphylococcus aureus характерно образование белковых биопленок (PIA-независимых), при этом участвуют белок Rbf («Regulator of biofilm formation»). В результате, биопленки изолятов S. aureus чувствительны к трипсину [3, c. 101].

На процесс биопленкообразования могут оказывать влияние многочисленные факторы, в том числе концентрация глюкозы, присутствие ионов железа, хлорида натрия, нитриты и другие соединения [2, с. 59]. В своем исследование мы изучили влияние на суточные биопленки S. aureus трипсина, а также ряда антибиотиков (линкозамидов и фторхинолонов) и их комбинированное влияние.

Цель исследования - оценить действие трипсина, линкомицина и ципрофлоксацина на суточные биопленки S. aureus.

Материалы и методы. Изучена биопленкообразующая способность 26 клинических изолятов S. aureus. Использовали 96-луночные полистироловые планшеты для иммуноферментного анализа. В 12 лунок каждого ряда планшета вносили по 100 мкл инокулума определенного штамма, содержащего 107 КОЕ/мл, после чего планшеты инкубировали в течение 24 часов (370С). Через сутки планктонную культуру удаляли и биопленки дважды промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2). Затем в несколько лунок каждого ряда вносили по 150 мкл мясопеп-тонного бульона (МПБ) с трипсином в концентрации 1000 мкг/мл, в другие также по 150 мкл МПБ с линкомицином и ципрофлоксацином в концентрациях 125 мкг/мл (бакте-

Результаты часового влияния трипсина и антибактери

рицидная доза). Для изучения комбинированного влияния на биопленки S. aureus лунки обрабатывали смесью трипсина и раствора линкомицина, а также ципрофлоксацина по 75 мкл в тех же концентрациях. В контрольные лунки вносили по 150 мкл МПБ. Планшеты инкубировали при температуре 370С. Через час лунки промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2). Биомассу сформированных биопленок определяли при их окрашивании 0,1% раствором генцианвиолета с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на ридере BenchmarkPlus при длине волны 570 нм. Результаты выражали в единицах оптической плотности. Степень интенсивности биопленкообразования (БПО) стафилококков определяли в соответствии с критериями, разработанными S. Stepanovic [5, с. 897].

Минимальные подавляющие концентрации антибиотиков для изучаемых штаммов S. aureus определяли в соответствии с требованиями МУК 4.2.1890 (2004 г.) [1, с. 324]. В исследование были включены только чувствительные к ципрофлоксацину и линкомицину культуры.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. О статистически значимых различиях полученных результатов в сравниваемых группах судили по величине цифровых значений р (критерий Манна-Уитни). Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты. Все изученные штаммы S. aureus обладали способностью образовывать биопленки, причем 46,15±3,55% из них характеризовались низкой степенью биопленкообразования, 53,85±4,14% - средней.

При изучении влияния трипсина на 24-х часовые биопленки S. aureus выявлено, что уже после его часового воздействия происходило статистически значимое снижение биомассы сформированных биопленок. Напротив, антибактериальные препараты усиливали процесс биопленкообразования тестируемых культур S. aureus, толщина биопленок при воздействии данных препаратов статистически значимо увеличилась (Таблица 1).

Таблица 1

ьных препаратов на 24-х часовую биопленку S. aureus

Действующий фактор Среднее значение толщины биопленки (единицы ОП) р

Трипсин 0,194±0,014 0,039

Линкомицин 0,401±0,029 0,023

Ципрофлоксацин 0,559±0,040 0,007

Мясопептонный бульон (контроль) 0,243±0,017

Примечание: р - статистическая значимость различий между влиянием трипсина, антибактериальных препаратов и контролем

Полученные результаты подтверждают существующие данные о преобладание белкового компонента в матриксе биопленок S. aureus, в силу чего их обработка протеолитическим ферментом уже в течении часа приводила к снижению ее толщины. Что касается антибактериальных препаратов, то независимо от класса, тот и другой оказывали стимулирующее воздействие на формирова-

ние биопленок S. aureus. В то же время для ципрофлоксацина в большей мере было характерно это влияние, в сравнении с линкомицином (р=0,034). В этой связи следует отметить, что практически все тестируемые штаммы были более чувствительны к этому антибиотику.

В последующем выполнена оценка комбинированного влияния трипсина и антибактериальных препаратов на суточные биопленки S. aureus (Таблица 2).

Таблица 2

Комбинированное действие трипсина и антибактериальных препаратов на 24-х часовую биопленку S. aureus

Действующий фактор Среднее значение толщины биопленки (единицы ОП) р

Трипсин+Линкомицин 0,237±0,017 0,053

Трипсин+Ципрофлоксацин 0,237±0,017 0,053

Трипсин 0,194±0,014 -

Примечание: р - статистическая значимость различий между комбинированным влиянием изученных неблагоприятных факторов и трипсина

Полученные данные указывают на то, что трипсин является активным противобиопленочным фактором для штаммов S. aureus, причем даже при его совместном воздействии с антибактериальными препаратами, усиливающими биопленкообразование, не происходит статистически значимого увеличения биомассы биопленок. Следует отметить, что средние значения толщины биопленки S. aureus под влиянием ципрофлоксацина и линкомицина в 2 раза превышали показатели, которые были получены при их использовании с трипсином (0,559±0,040 и 0,401±0,029 соответственно против 0,237±0,017). Выводы:

1. При часовом воздействии трипсина на 24-х часовую биопленку S. aureus происходит статистически значимое снижение ее биомассы.

2. Линкомицин и ципрофлоксацин усиливают биопленкообразование S. aureus, причем действие последнего более выражено.

3. Совместное применение трипсина и антибактериальных препаратов уменьшают толщину биопленок S. aureus.

Список литературы

1. МУК 4.2.1890 - 04 "Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам". - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора МЗ России, 2004. - 91 с.

2. Коробов, В. П. Анализ чувствительности процессов формирования биопленок S. epidermidis 33 к некоторым факторам внешней среды / В. П. Коробов, Л. М. Лемкина, В. И. Монахов // Вестник Пермского университета. - 2010. - Том 13, № 5. - С. 59-63.

3. Маянский, А. Н. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение / Маянский, А.

H., Чеботарь И. В. // Журн. микробиол. - 2011. - №

I. - С. 101-108.

4. Чеботарь, И.В. / Новый метод исследования анти-биотикорезистентности бактериальных биопленок // И. В. Чеботарь, Н.А. Маянский, Е.Д. Кончакова // Клин микробиол антимикроб химиотер. - 2012. -Том 14, № 4. - С. 303-308.

5. Stepanovic, S., Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci / Stepanovic S., Vukovic D., Hola V., Di Bonaventura G., Djukic S., Cirkovic I. // APMIS. - 2007. - Vol. 115, No. 8. - P. 891-899.

6. Antibiotic susceptibility of coagulase-negative staphylococci isolated from very low birth weight babies: comprehensive comparisons of bacteria at different stages of biofilm formation [Электронный ресурс] / Y. Qu, A.J Daley, T.S Istivan et al. // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. - 2010. - Vol. 9, No16.

7. Donlan, R.M. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms / R.M. Donlan, J.W. Costerton // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15, No2.

- Р. 167-193.

8. High-level antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilm: the ndvB gene is involved in the production of highly glycerol-phosphorylated ß-(1^3)-glucans, which bind aminoglycosides / I. Sadovskaya, E. Vinogradov, J. Li et al. // Glycobiology.

- 2010. - Vol. 20, No7. - Р. 895-904.

ПЕРВИЧНАЯ ИНВАЛИДНОСТЬ ДЕТЕЙ В ВОЗРАСТЕ 0-14 ЛЕТ КАБАРДИНО-БАЛКАРИИ

Анаева Лима Асланбиевна

Кандидат медицинских наук, ассистент, Кабардино-Балкарский государственный университет,

г. Нальчик

PRIMARY DISABILITY OF CHILDREN AGED 0-14 IN KABARDINO-BALKARIAN REPUBLIC Lima Aslanbievna Anaeva, PhD, Assistant, Kabardino-Balkarian State University, Nalchik АННОТАЦИЯ

С целью изучения динамики первичной инвалидности детей в возрасте 0-14 лет в Кабардино-Балкарской республике изучены показатели детской инвалидности и проведен статистический анализ по данным годовой отчетности формы №19 «Сведения о детях-инвалидах» государственного учреждения здравоохранения «Медицинский информационно-аналитический центр» Министерства здравоохранения КБР за период 2009-2013 гг. За исследуемый период в республике на фоне увеличения общей численности детского населения на 4% выявлено снижение показателя первичной инвалидности детей 0-14 лет на 21,1%, составив в 2013 году 1,91%>.