Спектральное и электрохимическое изучение лакказ базидиальных грибов

УДК 577.152.3

СПЕКТРАЛЬНОЕ И ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛАККАЗ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

С.В. Шлеев1, Е.А. Зайцева2, Е.С. Горшина3, О.В. Морозова1, В.А. Сереженков4, Д.Ш. Бурбаев4, Б.А. Кузнецов1, А.И. Ярополов1

В работе получены новые данные по основным электрохимическим и спектральным свойствам голубых лакказ трех видов базидиальных грибов: Coriolus zonatus, Coriolus hirsutus и Cerrena maxima. Показано, что лакказа Coriolus zonatus обладает рядом аномальных параметров, что, возможно, связано со строением активного центра фермента. Выведено уравнение, описывающее зависимость кажущегося окислительно-восстановительного потенциала фермента от соотношения окисленных и восстановленных форм белка в растворе.

Лакказа (п-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) катализирует окисление орто-, пара-дифено-лов, аминофенолов, полифенолов, полиаминов, лигни-нов, а также некоторых неорганических ионов с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды [1-3].

Известно, что в состав лакказы входят 4 иона меди, находящиеся в различном окружении. По принятой классификации эти активные центры делятся на три типа: Т1, Т2, Т3 [1, 2, 4, 5]. Для некоторых лакказ строение активных центров и их свойства хорошо изучены [1-3, 5-9]. Показано, что медь первого типа обеспечивает голубой цвет фермента. Данный центр на спектрах поглощения характеризуется максимумом поглощения в области 600 нм, а ЭПР-спектры характеризуются следующими параметрами: §ц ~ 2,2 и Ац = 43-9510-4 см-1. Медь второго типа спектрофотометри-

чески не детектируется, но обеспечивает характерный ЭПР-спектр лакказ ~ 2,3; Ац 160-21010-4 см-1). Бия-дерный медный кластер (медь третьего типа) диамагнитен. На спектре поглощения он обеспечивает плечо в области 330 нм, для него также характерны спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции [7, 9].

Одной из важнейших характеристик лакказы является стандартный редокс-потенциал Т1-центра фермента. Ранее было показано, что эффективность катализа окисления некоторых субстратов зависит от потенциала Т1-центра [10, 11]. Поэтому лакказы с высоким окислительно-восстановительным потенциалом представляют значительный интерес. В настоящий момент редокс-потенциал Т1-центра определен у значительного числа ферментов этого класса, выделенных из различных источников, и составляет от 420 до 770 мВ [11-15]. Одним из критериев эффективности действия

18 ВМУ, химия, № 1

лакказ является изучение их электрокаталитической активности в реакциях восстановления кислорода. Так, в работе [16] было показано, что потенциал начала электровосстановления кислорода на электроде с адсорбированной лакказой зависит от используемого фермента.

Возможности широкого использования лакказ в биотехнологических системах требуют как проведения поиска и изучения новых ферментов, так и дальнейшего накопления и систематизации экспериментальных данных по уже описанным лакказам.

Целью настоящей работы являлось изучение окислительно-восстановительных и спектральных свойств активных центров "голубых" лакказ трех базидиальных грибов, а также систематизация и последующее сравнение основных характеристик данных ферментов.

Методы исследования

Штаммы-продуценты внеклеточной лакказы Coriolus hirsutus, Coriolus zonatus были предоставлены из лабораторной коллекции Федерального государственного унитарного предприятия "ГосНИИсинтезбе-лок". Частично очищенный препарат внеклеточной лакказы Cerrena maxima был предоставлен доктором О.В. Королевой и доктором В.П. Гавриловой в рамках проведения совместных исследований по гранту INCO Copernicus № ICA2-CT-2000-10050. Культивирование базидиомицетов Coriolus hirsutus и Coriolus zonatus, а также получение гомогенных по SDS-электрофорезу препаратов лакказ осуществляли по ранее описанным методикам [8, 15].

Все виды колоночной хроматографии низкого давления проводили с помощью комплекта стандартного оборудования для жидкостной хроматографии низкого давления фирмы ("LKB", Sweden) при температуре 4°. Для проведения жидкостной хроматографии высокого давления использовали HPLC-system "Стайер" ("Аквилон", Россия) при температуре 20°.

Спектры оптического поглощения записывали на спектрофотометре "Hitachi-557", спектры флуоресцен-

ции и возбуждения флуоресценции на спектрофлуори-метре МРF-4 ("Hitachi", Япония). ^ек^ы ЭПР регистрировали на ЭПР-спектрометре ESC-106 ("Bruker", Германия).

Для измерения и контроля рН использовали микроэлектрод и иономер "Orion" 701A (США).

Изоэлектрофокусирование проводили по методу [17] при естественном градиенте рН, стабилизированном глицерином.

Для определения потенциала Т1-центра лакказ использовали метод окислительно-восстановительного титрования, описанный в работе [15].

Циклические вольтамперограммы с адсорбированными лакказами записывали в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере при разных значениях рН на вольтамперометри-ческом анализаторе CV-50W ("BAS", США). Адсорбцию фермента проводили на рабочем электроде из спектрального графита (Ringsdorff Werke GmbH, Bonn, Germany, type RWOOl, S.05 diameter), как описано в работе [16]. В качестве электрода сравнения использовали хлорсеребряный электрод "BAS", в качестве вспомогательного электрода - платиновую проволочку.

Белок определяли спектрофотометрическим методом, описанным в работе [18]. Для приготовления всех растворов использовали воду "Milli Q".

Реактивы, использованные в работе: Toyopearl HW-55 ("Toyo Soda", Япония); 2-меркаптоэтанол ("Ferak", ФРГ); амфолины ("LKB", Швеция); трис, глицин ("ICN", США); кумасси голубой G-250 и R-250, наборы белков-метчиков для гель-хроматографии и электрофореза ("Serva", ФРГ); Сервацел ДЕАЕ 52, акриламид, ^^метиленбисакриламид, аммоний над-сернокислый ("Reanal", Венгрия) (реактивы для электрофореза ("Reanal") были предварительно перекристаллизованы); catechol ("Sigma", USA); 2,2'- бихино-лин, Na2HPO4, K3Fe(CN)6, K4Fe(CN)6 ("Merck", ФРГ); глицерин, уксусная кислота, метанол, этанол, MoO2, HCl, H3PO4, Na2CO3, КН2РО4, KCl, (NH4)2SO4 (отечественные препараты марки "ос.ч" и "х.ч.").

Лакказа E1,

Coriolus zonatus 805 32 50/1 770

Coriolus hirsutus 800 49 100/1 800

Cerrena maxima 750 56 120/1 760

Т а б л и ц а 1

Основные характеристики окислительно-восстановительного титрования лакказ

Ь - угол наклона кривой титрования

Т а б л и ц а 2

Спектральные параметры Т1-, Т2- и ТЗ-центров лакказ, полученные на основании данных спектрофотометрии, ЭПР- спектроскопии и флуоресцентного анализа

Лакказа T1

Максимум поглощения

Coriolus zonatus 608 2,20 9410-4 2,24 194-10-4 422 315

Coriolus hirsutus 607 2,19 95-10-4 2,26 186-10-4 418 344

Cerrena maxima 607 2,18 94-10-4 2,24 193-10-4 425 322

Результаты и их обсуждение

По ранее разработанным методикам были получены в гомогенном состоянии лакказы Coriolus zonatus, Coriolus hirsutus и Cerrena maxima.

Были определены потенциалы меди первого типа данных ферментов (табл. 1). Показано, что исследуемые лакказы относятся к группе высокопотенциальных лакказ и поэтому могут с успехом использоваться в разных областях биотехнологиии.

Установлено, что для лакказ угол наклона прямой E - lg[Ox/Red] титрования составляет от 49 мВ (для Coriolus hirsutus) до 56 мВ (для Cerrena maxima), т.е. около 59 мВ (табл. 1). Можно предположить, что протекает одноступенчатый, одноэлектронный процесс восстановления меди первого типа. Это хорошо согласуется с литературными данными, полученными для лакказ из других источников [1, 2, 11-15].

Было показано, что процесс титрования центра Т1 лакказы Coriolus zonatus по своим параметрам значительно отличается от процесса титрования ферментов из других источников (табл. 1). Угол наклона прямой E - lg[Ox/Red] составляет приблизительно 32 мВ, что указывает на сложный характер электронного переноса с участием центра Т1 данного фермента. На основании литературных данных можно предположить, что процесс восстановления меди Т1-центра является двухступенчатым. Двустадийность процесса восстановления и высокий окислительно-восстановительный потенциал Т1-центра лакказы Coriolus zonatus связаны, возможно, с аномальными характеристиками лигандного окружения меди в активном центре фермента. Уменьшение угла наклона линейного участка кривой титрования

может быть связано с тем, что имеет место реакция, не относящаяся к непосредственному восстановлению иона меди. Известно, что электродные процессы с участием сложных органических соединений могут протекать при наличии предшествующей или последующей неэлектрохимической реакции, что отражается на углах наклона участков кривых в координатах E - lg[i], где Е - редокс-потенциал электрода, а i - плотность тока [19]. Необходимо отметить, что при окисилительно-вос-становительном титровании регистрации тока не происходит, поэтому применение приведенных в данной работе уравнений неправомерно. В настоящей работе выведено уравнение, отражающее возможное влияние неэлектрохимической стадии на угол наклона кривой титрования.

Для выяснения строения активных центров лакказ из базидиомицетов Coriolus zonatus, Coriolus hirsutus и Cerrena maxima были проведены их спектроскопические исследования. Спектры поглощения лакказ, используемых в настоящей работе, типичны для нативных голубых лакказ базидиальных грибов. В них присутствуют сигналы обоих центров меди (Т1 и Т3). Спектры флуоресценции и возбуждения флюоресценции (T3-центр), а также ЭПР-спектры (рис. 1) лакказ Coriolus zonatus, Coriolus hirsutus и Cerrena maxima также незначительно различаются между собой. Данные по спектральным характеристикам ферментов представлены в табл. 2.

Таким образом, несмотря на имеющиеся отличия в спектральных параметрах исследуемых ферментов можно утверждать, что общий характер строения активных центров всех исследованных голубых лакказ, содержащих в своем составе 4 атома меди, приблизительно одинаков.

Рис. 1. ЭПР-спектры лакказ Coriolus zonatus (а), Cerrena maxima (б) и Coriolus hirsutus (в); 0,1 М фосфатный буфер рН 6,0; Х - диапазон, микроволновая мощность 20 мВ; амплитуда модуляции 0,5; температура 77 К (а - усиление 110-4, 8 накоплений; б - усиление 110-4, 4 накопления; в - усиление 110-4, 8 накоплений

Ранее в литературе было высказано предположение о существовании в растворе двух форм лакказы - активной и неактивной [1]. Природа форм и их взаимные превращения окончательно не выяснены. Однако можно предположить, что при наличии в растворе неактивной формы фермента окислительно-восстановительное титрование лакказ может осуществляется по следующей схеме:

Sn ~ Xsox + e ~ Sred :

где Sn - неактивная форма, Sox - активная окисленная форма, Snd - восстановленная форма лакказы, х - коэффициент.

Легко показать, что с учетом наличия в растворе нескольких форм фермента (например, активной и неактивной), в простейшем случае зависимость кажущегося окислительно-восстановительного потенциала от соотношения окисленных и восстановленных форм фермента преобразуется в следующее уравнение:

E = E0 + (RT / F)ln

x / k (Sox)x + Sox x/ k((Sox°)x - (Sox)x) + Sox° - So,

где к - константа равновесия процесса перехода активной и неактивной формы фермента друг в друга (к = к/к2).

Очевидно, что множитель х/к влияет на множитель ВТ/¥, а значит и на наклон кривой редокс-титрования исследуемых ферментов.

Среди изученных лакказ наиболее высокий потенциал меди первого типа имеет лакказа Coriolus zonatus [1, 2, 11-15]. Определение редокс-потенциалов меди первого типа лакказ из разных источников необходимо для выявления наиболее высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях окисления субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных ин-термедиатов.

Одним из критериев ферментативной эффективности лакказ является изучение их электрокаталитической активности в реакциях восстановления кислорода. Для исследования этого процесса на графитовом электроде с адсорбированной лакказой в растворе, насыщенном кислородом, использовали метод циклической вольтам-перометрии.

На рис. 2 представлены циклические вольтамперог-раммы, записанные на электродах из спектрального графита в насыщенном кислородом цитрат-фосфатном буфере (вольтамперные кривые электрода спектрального графита с адсорбированной лакказой Coriolus hirsutus не представлены). Как видно из табл. 1, значения окислительно-восстановительных потенциалов меди типа T1 и начальные потенциалы электровосстановления кислорода на электродах с адсорбированными лакказами близки. Совпадение значений окислительно-восстановительного потенциала центра Т1 фермента и потенциала электровосстановления кислорода для большинства лакказ можно объяснить тем, что именно ион меди центра Т1 является первичным акцептором электронов в молекуле фермента. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что ферментативный процесс электровосстановления кислорода для конкретной лакказы определяется потенциалом меди типа T1.

Таким образом, в биотехнологических целях более рационально использовать высокопотенциальные грибные ферменты, так как в этом случае ферментативный процесс окисления смещается в область, более близкую к равновесному кислородному потенциалу, что дает основание перейти к исследованию широкого круга органических и неорганических соединений для ферментативного получения высокопотенциальных интермедиатов. Последние могут найти широкое промышленное применение при ферментативной деградации ксенобиотиков, при органическом синтезе, а также могут быть использованы в разных аналитических системах.

Авторы выражают благодарность доктору О. В. Королевой и доктору В.П. Гавриловой за предоставление препарата внеклеточной лакказы Cerrena maxima.

а

в

6

k

2

Потенциал, мВ

Рис. 2. Циклические вольтамперограммы электровостановления кислорода на графитовом электроде с адсорбированными лакказами Coriolus zonatus (а) и Cerrena maxima (б) в насыщенном кислородом буфере (0,1 M цитрат-фосфатный

буфер рН 3,0; скорость развертки потенциала 10 мВ/ с-1)

Работа выполнена при поддержке грантов ШСО-Сорегшсш (контракт № 1СА2-СТ-2000-10050), ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники" (контракт № 43.073.1.1.2505), а

также РФФИ, грант № 02-04-48885.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Solomon E.I., Sundraham U.M., Machonkin T.E. II Chem. Rew.

1996. 96. P. 2563.

2. The Enzymes II Ed. by P.D. Boyer. N.Y. etc.: Acad. Press, 1981. V.

XII. Part B. P. 557.

3. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolo-

meyev S.D. II Appl. Biochem. Biotech. 1994. 49. P. 257.

4. Хьюз М. Неорганическая химия биологичесих процессов. М.,

1983. С. 209.

5. Лихтенштейн Г.И. Многоядерные окислительно-восстанови-

тельные металлоферменты. М., 1979. С. 236.

6. Messerschmidt A., Huber R.. II Eur. J. Biochem. 1990. 187. P. 341.

7. Shin K-S., Lee Y-J. II Archives of Biochem. Biophys. 2000. 384. P.

109.

8. Koroleva O., Stepanova E., Gavrilova V., Morozova O., Lubimova

N., Dzchafarova A., Yaropolov A., Makower A. II J. Biotech. Applied Biochem. 1998. 28. P. 47.

9. Wynn R.M., Sarkar H.K., Holwerda R.A., Knaff D.B. II FEBS

Letters. 1983. 156. P. 23.

10. Xu F., Kulis J.J., Duke K., Li K., Krikstopaitis K., Deussen H.-J.W.,

Abbate E., GalinyteV., Schneider P. II Applied Environ. Microbiol. 2000. 66. P. 2051.

11. Xu F., Shin W., Brown S.H., Wahleithner J.A., Sundaram U.M., Solomon E.I. II Biochem. Biophis. Acta. 1996. 1292. P. 303.

12. Reinhammar B. II Bichem. Biophys. Acta. 1972. 275. P. 245.

13. Xu F., Palmer A.E., Yaver D.S., Berka R.M., Gambetta G.A., Brown S.H., Solomon E.I. II J. Biol. Chem. 1999. 274. P. 12372.

14. Schneider P., Caspersen M.B., Mondorf K., Halkier T., Skol L.K., Ostergaard P.R., Brown K.M., Brown S.H., Xu F. II Enzyme Microb. Technol. 1999. 25. P. 502.

15. Koroleva O.V., Yavmetdinov I.S., Shleev S.V., Stepanova E.V., Gavrilova V.P. II Boikhimia. 2001. 66. P. 762.

16. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. II Bioelectrochem. Bioenerg. 1996. 40. P. 49.

17. Vesterberg O, Svensson H. II Acta Chem. Scand. 1966. 20. № 3. P. 820.

18. Ehresmann B., ImbaultP., Well J.H. II Analyt. Biochem. 1973. 54. P. 307.

19. Галюс З. Теоретические основы электрохимического анализа. М., 1974. C. 296.

Поступила в редакцию 25.10.02