Частичная характеристика структуры основной фенилметилсульфонилфторидингибируемой карбоксипептидазы из печени крыс

чего достаточно сложно добиться в условиях обычной аудиторной работы. Важно также подчеркнуть, что проектная деятельность способствует развитию и активизации творческого мышления, так как цель проекта заключается не в том, чтобы воспроизвести добытую информацию, а в том, чтобы найти способ применить ее для решения конкретной задачи. Несомненным преимуществом разноуровневого состава каждой группы является постепенное повышение успеваемости слабых студентов в результате оказания им помощи со стороны более сильных, которые извлекают не меньшую пользу из такого взаимодействия, актуализируя и конкретизируя свои знания, закрепляя их и придавая им большую гибкость.

Говоря о роли преподавателя в проектной деятельности, необходимо отметить ее ответственность и трудоемкость. Его функция заключается в том, чтобы способствовать формированию у студентов умения находить нужную информацию, пользоваться ею для решения определенной проблемы, руководствуясь собственной логикой. Роль преподавателя меняется в зависимости от этапа выполнения проекта: на начальном этапе он выполняет роль мотиватора, объясняет цели выполнения проекта, на этапе планирования проекта - помогает в анализе проблемы, консультирует по вопросу выбора методов ее решения, по просьбе студентов советует определенные источники информации, на стадии выполнения - по необходимости направляет процесс анализа высказанных идей и полученных сведений на этапе защиты проекта - в качестве равноправного участника проектной работы вместе со

студентами осуществляет оценку ее результатов. но на любом этапе преподавателю следует помнить, что его главная задача - не передача конкретных знаний, а ознакомление студентов со способами работы и помощь в их применении.

Кроме того, невозможно не отметить такие преимущества данного вида работы, как создание прочной языковой базы, обогащение словарного запаса, применение и развитие коммуникативных умений. При правильной организации данного вида деятельности удается достичь главной цели ее внедрения: студенты проявляют высокий уровень самостоятельности при поиске и обработке и обработке информации, не только не ожидая руководства извне, но и противясь непрошеному вмешательству. необходимо также обратить внимание на значительно более высокий интерес к заданной теме и желание самостоятельно добывать знания по ней, что позволяет говорить о повышении мотивации студентов к учению. Даже для слабых и обычно пассивных учащихся выполнение таких заданий не является принудительным, а позволяет им поднять свою самооценку и почувствовать себя полноправными участниками творческой группы, а не отстающими неудачниками.

Следовательно, метод проектов может рассматриваться как высокоэффективный способ усиления автономии студентов даже в условиях жестко регламентированного вузовского обучения, а также помогает решать массу других проблем обучения в вузе, оказывая всестороннее благотворное влияние на успеваемость и результативность работы студентов.

ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ

УДК 577.1

ЧАСТИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ ОСНОВНОЙ ФЕНИЛМЕТИЛСУЛЬФОНИЛФТОРИД-ИНГИБИРУЕМОй КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Из пЕчЕНИ кРЬ1С

А. К. ВЕЛИЧКО, И. Н. СОЛОМАДИН, Н. М. ГЕНГИНА, В. Б. СОЛОВЬЁВ, М. Т. ГЕНГИН Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра биохимии

Метаболизм нейропептидов в организме осуществляется на многих уровнях. Их обмен контролируется с этапов транскрипции до инактивации и деградации. Ведущая роль в обмене пептидов принадлежит проте-олитическим ферментам, участвующим в процессинге и дальнейшей их модификации [1-3, 13-15]. В связи с этим в настоящее время широко исследуется семейство карбоксипептидазо-В-подобных ферментов отщепляющих остатки аргинина и лизина с С-конца пептидов, как регуляторов уровня нейротрансмиттеров пептидной природы. Сюда входят Карбоксипептидаза Н (К.Ф. 3.4.17.10), лизосомальная Карбоксипептидаза В (К.Ф. 3.4.18.1), Карбоксипептидаза А (К.Ф. 3.4.16.1),

Карбоксипептидаза N (К.Ф. 3.4.17.3), Карбоксипептидаза и (К.Ф. 3.4.17.2), Карбоксипептидаза D (К.Ф. 3.4.16.6.), Карбоксипептидаза М (К.Ф. 3.4.17.12.) [11].

В лаборатории нейрохимии Пензенского государственного педагогического университета имени В. Г. Белинского в головном мозге котов был обнаружен еще один карбосипептидазо-В-подобный фермент, который получил название по специфическому его ингибитору - фенилметилсульфонилфториду (ФМСФ) [14]. Тканевое и региональное распределение ФМСФ-КП соответствует распределению нейропептидов и секре-тируемых белков, однако функции данной карбокси-пептидазы в организме еще не выяснены. Субстратная

специфичность фермента сходна с таковой у карбок-сипептидазы Н, хотя ее физико-химические свойства совпадают с таковыми у лизосомальной карбоксипеп-тидазы А [10, 12].

Ранее в нашей лаборатории (неопубликованные данные) в ходе очистки ФМСФ-КП методом гель-фильтрации было обнаружено несколько её фракций. В то же время по данным, полученным ранее, молекулярная масса ФМСФ-ингибируемой КП составляет 100-110 кДа [11]. Однако большинство основных кар-боксипептидаз (или их активные субъединицы) имеют молекулярную массу порядка 50-55 кДа, что даёт основание предполагать наличие четвертичной структуры у данного фермента.

В работе была предпринята попытка изучения структуры ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Печень и головной мозг извлекали у белых беспородных крыс. Печень очищали от крови, проводя перфузию 0,9 % раствором №С1, головной мозг очищали от оболочек. Все операции проводились на холоду. Навески органов (из расчёта получения 20 % гомогената) гомогенизировали в блэндере в 50 мМ натрий-ацетат-ном буфере (рН=5,6), содержавшем 50 мМ №С1, и центрифугировали при 21000 g 60 мин. Осадок отбрасывали, а надосадочную фракцию использовали для изучения фермента.

Осаждение сульфатом аммония проводилось сначала до 0,35, затем до 0,6 насыщения [4]. Осадки, полученные осаждением сульфатом аммония растворяли в

исходном буфере и проводили обессоливание на колонке с сефадексом G-25.

Исходный супернатант и фракции с 0,35 и 0,6 насыщением (NH4)2SO4 фракционировали методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-150. Рабочий объём 55 мл, скорость элюции 25 мл/ч [5-7].

Активность фермента определяли флуори-метрически [10, 11]. Препарат фермента объёмом 50 мкл смешивали с 150 мкл натрий-ацетатного буфера pH=5,6 и инкубировали 8 мин при 37°С. В контрольную пробу вносили 10 мкл 25мМ спиртового раствора ФМСФ. Затем в пробы добавляли по 50 мкл раствора субстрата dansyl-Phe-Leu-Arg и через 60 мин инкубации реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1н HCl. Экстракцию продукта реакции dansyl-Phe-Leu проводили добавлением к пробам 1,5 мл хлороформа. В хлороформной фракции измеряли флуорисценцию при X = 360 нм, X = 530 нм.

г ex ; em

Активность фермента определяли как разницу прироста флуорисценции а пробах, не содержавших и содержавших ФМСФ, и выражали в нмоль dansyl-Phe-Leu, образовавшихся за 1мин инкубации, на 1 мг белка. Белок в пробах определяли по методу Bredford [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Гель-фильтрация супернатанта, полученного из гомогената печени (рис. 1) показала наличие двух пиков ферментативной активности, что свидетельствовало либо о существовании изоформ ферментов, либо о его распаде в процессе фракционирования на субъединицы.

V, мл

Фракционирование водорастворимых белков печени крыс. "V., Активность^»-.. Белок

По два пика активности фермента было обнаружено также при гель-фильтрации как фракции

0,35, так и 0,6 насыщения сульфатом аммония (рис. 2, 3).

V, мл

Фракционирование растворимых белков печени крыс фракции 0,35 насыщения^Н

4)2^°4

Активность Белок

По данным,

трация супернатанта на колонке с С-150 объёмом 120 мл не выявила раздвоения пика активности исследуемой карбоксипептидазы [11, 15]. Но в данном случае элюция осуществлялась натрий-ацетатным буфером с концентрацией №С1 120 мМ, что в 2,4 раза выше концентрации соли используемой в нашем эксперименте. Как известно высокие концентрации солей оказывают стабилизирующее действие на четвертичную структуру белков [6, 7]. По всей видимости, концентрация №С1 в нашем эксперименте не обеспечивала подобной стабилизации ФМСФ-КП, что приводило к распаду молекулы в колонке на субъединицы, обладающие ферментативной активностью.

Проведённые исследования позволяют предположить существование четвертичной структуры молекулы ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидзы. В работах опубликованных ранее указывалось, что единственный пик ферментативной активности обнаруженный при гель-фильтрации соответствовал фракции

-110 кДа [11]. В сопоставлении с этими данными в нашем эксперименте вторая фракция соответствовала молекулярной массе в 50-55 кДа, что даёт основания предполагать наличие димерной структуры у данного фермента. С целью доказательства высказанного предположения димерной структуры ФМСФ-ингибируемой карбок-сипептидазы будут проведены дальнейшие исследования с применением других высокоразрешающих методов.

список ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dixon M., Webb E.C. Enzymes. Longman Group Ltd., 1979. Vol. 1. 389 pp.

2. Hucho F. Neurochemistry. Fundamentals and Concepts. Weinheim: Verlagsgesellschaft, 1986. 383 pp.

3. Ашмарин И. П. Нейрохимия М.: Институт биомедици-еской химии РАМН, 1996. 469 с.

4. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика М.: Мир, 1991. С. 461-463.

V, мл

Фракционирование растворимых белков печени крыс фракции 0,6 насыщения

опубликованным ранее гель филь- фермента с молекулярной массой 100

5. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Мир, 1976. С. 220-230.

6. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. С. 109-166.

7. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. 358 с.

8. Fricker L. D., Snyder S. H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephalin-synthesizing carboxypeptidase // Biol Chem.1983. Vol 258. P. 10950-10955.

9. Fricker L. D., Snyder S. H. Enkephalin convertase: purification and characterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenal chromaffin granules // Proc Natl Acad Sci U S A. 1982. Vol. 79. P. 3886-3890.

10. Vernigora А. N., Gengin M. T. «Proteolytic enzymes: subcellular location, properties, and involvement in neuropeptide turnover. A review» // Biochemistry (Moscow). 1996. Vol. 61. № 5.

11. Вернигора А. Н., Генгин М. Т. Частичная характеристика основной фенилметилсульфонилфторид-ингибиру-емой карбоксипептидазы из головного мозга кошки // Биохимия. 1995. Т. 60. № 11.

12. Вернигора А. Н., Щетинина Н. В., Генгин М. Т. Исследование активности основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипептидаз у крыс разного возраста // Биохимия. 1996. Т. 61. № 10.

13. Гомазков О.А. Нейропептиды - универсальные регуляторы. Почему? // Природа. 1999. № 4.

14. Панченко Л. Ф., Митюшина Н. В., Фирстова Н. В., Генгин М. Т. Метаболизм энкефалинов при различных функциональных и патологических состояниях организма // Вопросы медицинской химии. 1999. № 4.

15. Генгин М. Т. Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нели-зосомальных пептидгидролаз мозга животных: Дисс. ... докт. биол. наук. Пенза, 2002. 275 с.

УДК 612.015

ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ДНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ

А. А. ВЕНЕДИКТОВ, Г. В. АФАНАСЬЕВА, Е. А. ШЛЯПНИКОВА, И. П. БЕЛЕЦКИЙ, М. Т. ГЕНГИН Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра биохимии

Биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют - microarrays - это один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века. Изобретены биочипы были в конце 90-х годов в России и в США. Технология микрочипов - это принципиально новый уровень лабораторных исследований, так как она позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Тысячи молекул ДНК или белков помещаются на стеклянные пластинки для создания ДНК- и белковых чипов соответственно. На основании экспериментальных данных сотрудниками лаборатории клеточной инженерии Института теоретической и экспериментальной биофизики (г. Пущино Московская обл.) под руководством И. П. Белецкого была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК-чипов, а также их использования при гибриди-зационном анализе ДНК. В его основе лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов. Биочипы используются для самых разных целей. В медицине биочипы позволяют за сравнительно короткое время обнаруживать у больных лекарственно устойчивые формы туберкулеза и лейкоза, а так же некоторые виды раковых заболеваний. Биочипы являются незаменимым инструментом для биологов, которые могут за один эксперимент обнаружить влияние различных лекарственных препаратов и алиментарных факторов на функциональное состояние десятков тысяч генов.

Биологические микрочипы, технологии создания и производства которых активно развиваются в РФ и за рубежом, являются мощнейшим из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. В основе применения

микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены либо определенные фрагменты нуклеиновых кислот, а также другие молекулы-зонды, которые необходимо идентифицировать. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.

К основным достоинствам широкого распространения биочипов относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же факторы заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства. Биочипы применяются для обнаружения бактериальных и вирусных контаминаций в продуктах питания, косметике и окружающей среде, выявления генно-модифицированных организмов в пищевых продуктах, диагностики и прогнозирования различных заболеваний, детекции особо опасных инфекционных агентов в анти-биотеррористических целях и др. [2].

ДНК-микрочипы

ДНК-чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последо-